(57)【要約】  本発明は、羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防、改善、または治療用組成物に関するものであって、本発明の羅漢果残渣抽出物は、卵白アルブミン(OVA)で誘導された喘息動物モデルにおいて気道過敏性減少、気管支肺胞洗浄液内の炎症細胞抑制及び気管支肺胞洗浄液内のTh2サイトカイン(IL-4、IL-5、及びIL-13)減少、肺組織の炎症及び組織損傷減少、気道平滑筋収縮及び気道炎症抑制効果、肺組織でIL-13、TARC、TNF-a、IL-17、及び粘液遺伝子MUC5ACの発現抑制効果、微細ホコリによって増加した肺胞細胞でのROSを減少させる効果がある。
2021528107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項２】
前記羅漢果残渣抽出物は、
(1)乾燥した羅漢果に抽出溶媒を加えて抽出及び濾過して上澄液を除去する段階と、
(2)前記上澄液を除去して残った羅漢果残渣にエタノールを加えて羅漢果残渣抽出物を獲得する段階と、を含む方法で製造されたことを特徴とする請求項１に記載の呼吸器疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項３】
前記抽出溶媒は、水、C1〜C4の低級アルコールまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項２に記載の呼吸器疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項４】
前記呼吸器疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の呼吸器疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項５】
前記呼吸器疾患は、微細ホコリによって誘発されたことを特徴とする請求項１に記載の呼吸器疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項６】
前記組成物は、粉末、顆粒、丸、錠剤、カプセル、キャンデー、シロップ及び飲料のうちから選択されたいずれか１つの剤形によって製造されることを特徴とする請求項１に記載の呼吸器疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項７】
羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する、呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項８】
前記羅漢果残渣抽出物以外に薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記呼吸器疾患は、微細ホコリによって誘発されたことを特徴とする請求項７に記載の呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防、改善、または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、急慢性気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎、喉頭炎などは呼吸器疾患の代表的な疾患である。喘息(asthma)は、気道、特に、気管支に発生する慢性炎症を言う。喘息によって誘発される炎症は、煤煙、アレルギー性抗原、寒風、運動、呼吸器感染など非常に多様な素因によっても悪化され、持続的な炎症は、気道の変形及び気道の過敏性(hyper-responsiveness)を引き起こす。そのような原因によって喘鳴(wheezing、気道が細くなってゼーゼー、ゼロゼロという呼吸音が現われる症状)や、息切れして咳が出て、過度な喀痰が排出されるなどの一般的な症状が現われる。
【０００３】
気道は、大きく粘膜と気管支平滑筋という筋肉からなっており、粘膜には、多くの分泌腺があって必要な分泌物を分泌し続けており、気管支平滑筋が収縮すれば、気道が細くなる。煤煙、アレルギー性抗原、寒風、運動、呼吸器感染など非常に多様な素因によって炎症反応が起これば、分泌腺から出る分泌物がさらに増加し、この分泌物が気道を閉塞して、粘膜が気道の内側に腫れ上がり、気道をさらに狭くする。これにより、喘鳴を伴う発作的な咳と呼吸困難が激しくなり、発作時には空咳が発生して胸部圧迫感を感じることになる。喘鳴なしに、慢性咳と胸部圧迫感がある原因不明の呼吸困難症状のみある喘息も多いが、このような症状は、日常生活の中で急に発作的に現われる傾向がある。
【０００４】
一方、羅漢果(Siraitia grosvenori)は、中国の広東省、広西省の高冷地で栽培されるウリ科の多年生草本であり、果実は、直径4〜5cmの卵形または球形であり、本来、中国桂林地方では、清凉飲料の原料や調味料として使用されてきて、のどの痛みや咳、胃や腸に問題がある場合、民間で使用された。
【０００５】
羅漢果抽出物に係わる知られた従来技術の一例としては、韓国公開特許第2015-0051369号に、羅漢果(Siraitia grosvenori)を有効成分として含有する喘息及びアトピーの予防及び治療用薬学的組成物が開示されているが、まだ本発明の羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防、改善、または治療用組成物について知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＫＲ１０−２０１５−０１３２６５４Ａ
【特許文献２】ＫＲ１０−２０１３−０１３１５０８Ａ
【特許文献３】ＫＲ１０−２０１４−０１３３０１６Ａ
【特許文献４】ＫＲ１０−２０１５−００５１３６９Ａ
【特許文献５】ＫＲ１０−２０１５−００５１３６７Ａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記のような要求によって導出されたものであって、本発明は、羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防、改善、または治療用組成物を提供し、羅漢果残渣抽出物が卵白アルブミン(OVA)で誘導された喘息動物モデルにおいて気道過敏性減少、気管支肺胞洗浄液内の炎症細胞抑制及び気管支肺胞洗浄液内のTh2サイトカイン(IL-4、IL-5、及びIL-13)減少、肺組織の炎症及び組織損傷減少、気道平滑筋収縮及び気道炎症抑制効果、肺組織においてIL-13、TARC、TNF-a、IL-17、及び粘液遺伝子MUC5ACの発現抑制効果、血清内卵白アルブミン特異IgE含量減少効果、微細ホコリによって増加した肺胞細胞でのROSを減少させる効果及び羅漢果残渣抽出物と羅漢果抽出物のUPLCプロファイルが互いに異なるということを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために本発明は、羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防、改善、または治療用組成物に関するものであって、本発明の羅漢果残渣抽出物は、卵白アルブミン(OVA)で誘導された喘息動物モデルにおいて気道過敏性減少、気管支肺胞洗浄液内の炎症細胞抑制及び気管支肺胞洗浄液内のTh2サイトカイン(IL-4、IL-5及びIL-13)減少、肺組織の炎症及び組織損傷減少、気道平滑筋収縮及び気道炎症抑制効果、肺組織においてIL-13、TARC、TNF-a、IL-17、及び粘液遺伝子MUC5ACの発現抑制効果、血清内卵白アルブミン特異IgE含量減少効果、微細ホコリによって増加した肺胞細胞でのROSを減少させる効果がある。本発明の羅漢果残渣抽出物の炎症抑制活性が可溶性部分である羅漢果抽出物に比べて優秀なので、さらに有用に使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】喘息動物モデルを用いた羅漢果残渣抽出物の投与による気道過敏性(Airway hyperresponsiveness)分析結果である。**、***は、対照群と対比して、本発明の羅漢果残渣抽出物を投与した群においてPenh値が統計的に有意に減少したということを示し、**は、p<0.01であり、***は、p<0.001である。
【図２】喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、気管支肺胞洗浄液(BALF)内の炎症細胞の減少効果を確認した結果である。###は、正常群と対比して、アルブミン(OVA)を処理した対照群のBALF内の炎症細胞数及び好酸球数が統計的に有意に増加したということを示し、p<0.001であり、*、**は、対照群と対比して、陽性対照群(Mon)及び本発明の羅漢果残渣抽出物を処理した群においてBALF内の炎症細胞数及び好酸球数が統計的に有意に減少したということを示し、*は、p<0.05であり、**は、p<0.01である。
【図３】喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、H&E染色を通じた肺組織の炎症減少効果を確認した結果である。
【図４】喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、MT染色を通じた肺組織のコラーゲン沈着増加による組織損傷の減少効果を確認した結果である。
【図５】喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、H&E染色を通じた気道炎症の減少効果を確認した結果である。
【図６】喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、AB/PAB染色を通じた気道平滑筋の収縮による気道閉塞及び気道炎症の減少効果を確認した結果である。
【図７】喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、肺組織における炎症誘発因子(IL-13、TARC、TNF-α、MUC5AC、IL-17)の減少効果を確認した結果である。##、###は、正常群と対比して、アルブミン(OVA)を処理した対照群の炎症誘発因子(IL-13、TARC、TNF-α、MUC5AC、IL-17)が統計的に有意に増加したということを示し、##は、p<0.01であり、###は、p<0.001であり、*、**、***は、対照群と対比して、陽性対照群(Mon)及び本発明の羅漢果残渣抽出物を処理した群において炎症誘発因子(IL-13、TARC、TNF-α、MUC5AC、IL-17)が統計的に有意に減少したということを示し、*は、p<0.05であり、**は、p<0.01であり、***は、p<0.001である。
【図８】喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、血清内卵白アルブミン特異IgE含量が減少したことを確認した結果である。###は、正常群と対比して、アルブミン(OVA)を処理した対照群の卵白アルブミン特異IgE含量が統計的に有意に増加したということを示し、p<0.001であり、*、**は、対照群と対比して、陽性対照群(Mon)及び本発明の羅漢果残渣抽出物を処理した群において卵白アルブミン特異IgE含量が統計的に有意に減少したということを示し、*は、p<0.05であり、**は、p<0.01である。
【図９】本発明の羅漢果残渣抽出物を、微細ホコリによってROSが増加したMH-S細胞に処理してROSを減少させることを確認した結果である。###は、正常群と対比して、微細ホコリ(CF)を処理した対照群のROS含量が統計的に有意に増加したということを示し、p<0.001であり、**、***は、対照群と対比して、本発明の羅漢果残渣抽出物を処理した群においてROS含量が統計的に有意に減少したということを示し、**は、p<0.01であり、***は、p<0.001である。
【図１０】本発明の羅漢果残渣抽出物(A)、羅漢果エタノール抽出物(B)、及び羅漢果水抽出物(C)のUPLCプロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防または改善用健康機能食品組成物に関するものである。
【００１３】
前記羅漢果残渣抽出物は、
(1)乾燥した羅漢果に抽出溶媒を加えて抽出及び濾過して上澄液を除去する段階と、
(2)前記上澄液を除去して残った羅漢果残渣にエタノールを加えて羅漢果残渣抽出物を獲得する段階と、を含む方法によって製造されたものが望ましいが、これに限定されるものではない。前記抽出溶媒は、水、C1〜C4の低級アルコールまたはこれらの混合物であるものが望ましく、さらに望ましい抽出溶媒は、水であるが、これに限定されるものではない。前記呼吸器疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、咽喉炎、扁桃炎、及び喉頭炎からなる群から選択されることが望ましいが、それらに限定されるものではない。前記呼吸器疾患は、微細ホコリによっても誘発されるが、その限りではない。
【００１４】
本発明の健康機能食品組成物は、粉末、顆粒、丸、錠剤、カプセル、キャンデー、シロップ、及び飲料のうちから選択されたいずれか１つの剤形によっても製造され、これに限定されるものではない。
【００１５】
本発明の健康機能食品組成物を食品添加物として使用する場合、前記健康機能食品組成物をそのまま添加するか、他の食品または食品成分とともに使用され、通常の方法によって適切に使用されうる。有効成分は、その使用目的(予防または改善)によって適切に使用されうる。一般的に、食品または飲料の製造時、本発明の健康機能食品組成物は、原料に対して、15重量部以下、望ましくは、10重量部以下の量を添加する。しかし、健康を目的とする長期間摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下でもあり、安全性面で何らの問題もないため、有効成分は、前記範囲以上の量で使用されうる。
【００１６】
前記健康機能食品の種類に特に制限はない。前記健康機能食品組成物を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶ドリンク剤、アルコール飲料、及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康食品をいずれも含む。また、本発明の健康機能食品組成物は、食品、特に機能性食品として製造されうる。本発明の機能性食品は、通常の添加される成分を含んでもよい。例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、及び調味剤を含む。例えば、ドリンク剤として製造される場合には、有効成分以外に天然炭水化物または香味剤を追加成分として含んでもよい。前記天然炭水化物は、モノサッカライド(例えば、グルコース、フルクトースなど)、ジサッカライド(例えば、マルトース、スクロースなど)、オリゴ糖、ポリサッカライド(例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど)、または糖アルコール(例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなど)であることが望ましい。前記香味剤は、天然香味剤(例えば、ソーマチン、ステビア抽出物など)と合成香味剤(例えば、サッカリン、アスパルテームなど)を利用することができる。前記健康機能食品組成物以外にさまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などをさらに含んでもよい。そのような前記添加成分の比率は、特に重要ではないが、本発明の健康機能食品組成物100重量部に対して、0.01〜0.1重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【００１７】
また、本発明は、羅漢果残渣抽出物を有効成分として含有する呼吸器疾患の予防または治療用薬学組成物に関するものである。
【００１８】
前記呼吸器疾患は、微細ホコリによっても誘発されるが、その限りではない。
【００１９】
本発明による羅漢果残渣抽出物を含む薬学組成物は、カプセル剤、散剤、顆粒剤、錠剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、及びエアロゾルのうちから選択されたいずれか１つの剤形であることが望ましいが、それに限定しない。前記羅漢果残渣抽出物以外に薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含んでもよく、羅漢果残渣抽出物を含む薬学組成物に含まれる担体、賦形剤、または希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤されうる。本発明の羅漢果残渣抽出物の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されうる。しかし、望ましい効果のため、本発明の羅漢果残渣抽出物を含む薬学組成物は、1日0.0001〜100mg/kg、望ましくは、0.001〜10mg/kgを投与することが望ましい。投与は、一日一回投与してもよく、一日数回投与してもよい。前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００２０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらによって制限されないということは、当該技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００２１】
実施例1.羅漢果抽出物の製造
乾燥羅漢果は、200gを粉砕した後、水2lを加えて3時間還流抽出した。抽出液を濾過して残った残渣を乾燥して得られた乾燥残渣50gに、1lの70%(v/v)エタノールを添加した後、3時間還流抽出した。抽出液を濾過した後、濃縮、乾燥して羅漢果残渣抽出物を製造した。
【００２２】
実施例2.喘息動物モデルを用いた羅漢果残渣抽出物の投与による気道過敏性分析
卵白アルブミン(OVA)によって気管支喘息を誘導した動物モデルで実験を進めた。実験動物は、 7週齢のBalb/c雄ネズミをJackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)から供給されて1週間適応させた後、実験に使用した。1週間の順化期間を経たネズミに2週間隔で0.26mgの水酸化アルミニウム(A8222、Sigma-Aldrich、MO、USA)と12.5μg(A5503、Sigma-Aldrich)の卵白アルブミンを懸濁した0.25mlのリン酸緩衝溶液を腹腔に注入して感作させた。最初の卵白アルブミン腹腔投与後、3日目、10日目に2mgのOVAをネズミに気管支内投与(intratracheal injection)した後、21日目から4週間、卵白アルブミン(1〜3週:1%卵白アルブミン露出、4週:2%卵白アルブミン露出)を超音波噴霧器(NE-U12,Omron Co.,Tokyo,Japan)を用いて30分間吸入させた。最後の卵白アルブミン露出後、48時間後、麻酔させて血液採取及び解剖して病理学的変化を観察した。
【００２３】
実験群は、正常群(Normal、卵白アルブミン投与及び吸入しない群)、喘息誘導群(OVA-Control、卵白アルブミン投与及び吸入した群)、陽性対照群(OVA-Mon、montelukast 10mg/kg投与+卵白アルブミン投与及び吸入した群)、試料投与群1(OVA-羅漢果残渣200mg/kg、羅漢果残渣抽出物200mg/kg+卵白アルブミン投与及び吸入した群)、試料投与群2(OVA-羅漢果残渣100mg/kg、羅漢果残渣抽出物100mg/kg+卵白アルブミン投与及び吸入した群)に設定して進めた。
【００２４】
薬物及び試料は、最初の卵白アルブミン投与後、21日目から4週間経口投与した。各群当たり10匹のネズミを使用した。
【００２５】
気道過敏性分析のために、最後の卵白アルブミンを露出させた後、24時間経過時点に、Buxco system(Biosystems XA、DSI、MN、USA)を用いて喘息発生による気道過敏性を測定した。気道抵抗の程度は、enhanced pause(Penh)を測定して評価した。メタコリン(A2251、Sigma-Aldrich)を6.25、12.5、及び25mg/mlの濃度で漸増させつつ、吸入させた後、Penh値を数式1を使用して測定した。
【００２６】
［数式１］
Penh = Pause×PEF/PIF, Pause = (Te-Tr)/Tr
(PIF: peak inspiratory flow, PEF: peak expiratory flow, Te: e time, Tr: relaxation time).
【００２７】
その結果、図1に開示したように、喘息誘導群は、メタコリン(methacholine)の濃度に比例して、Penh値が顕著に増加し、これに対比される本発明の羅漢果残渣抽出物を100または200mg/kgの濃度で処理した場合、喘息誘導群に比べて、低いPenh値が測定された。特に、25mg/kgのメタコリンを処理した場合に対比して、統計的に有意な差を示した。
【００２８】
実施例3.喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、気管支肺胞洗浄液(BALF)内の炎症細胞の減少効果確認
卵白アルブミンに露出された動物モデルが最後に卵白アルブミンに露出された後、48時間経過時点で、麻酔させて気管支を切開した。総1.0mlのIce-cold DMEM培地で気管支肺胞洗浄し、洗浄液を収去した。各個体の気管支肺胞洗浄液は、回収されやいなや、遠心分離して血球を分離し、0.04%trypan blueで染色した後、総細胞数を血球計数器(hematocytometer)を用いて計算した後、Cytospinで標本塗抹後、Diff-Quick染色(Romanowsky stain)を実施して、400倍倍率の光学顕微鏡(Light microscope,  Nikon,  Japan)を通じて好酸球とその他の炎症細胞を鑑別計算した。
【００２９】
その結果、図2に開示したように、喘息誘導群の気管支肺胞洗浄液内の炎症細胞が統計的に有意に増加し、本発明の羅漢果残渣抽出物を投与した群では、統計的に有意に気管支肺胞洗浄液(BALF)内の炎症細胞が減少したことを確認した。
【００３０】
実施例4.喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、気管支肺胞洗浄液(BALF)内のTh2サイトカイン(IL-4、IL-5、及びIL-13)生成抑制効果確認
各個体から分離した気管支肺胞洗浄液においてインターロイキン(Interleukin)-4、-5、-13の生成量は、市販用酵素免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) kit (R&D System, USA)を用いて測定した。各サイトカイン分析は、製造社の実験方法によって実施し、ELISAリーダーを用いて450nmで吸光度を測定した。
【００３１】
その結果、表1に開示したように、喘息誘導群の気管支肺胞洗浄液内のインターロイキン(Interleukin)-4、IL-5、IL-13の生成量は、統計的に有意に増加し、本発明の羅漢果残渣抽出物を投与した群においては、喘息誘導群に対比して統計的に有意に気管支肺胞洗浄液(BALF)内のIL-4、IL-5、IL-13の生成量が減少したことを確認した。
【００３２】
【表１】
2021528107.tif 000003
【００３３】
実施例5.喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、組織病理学的検査(H&E、MT、AB/PAS染色)
肺と気道(trakea)組織の病理的損傷程度を観察するために、肺組織を摘出した後、10% neutral buffered formalin固定とパラフィン包埋を経てblockを製作した後、4μm厚さに組織切片を製作した。その後、肺と気道組織内の炎症を観察するためにH&E(Hematoxylin & Eosin)染色を行い、コラーゲン(collagen)deposition染色であるMT(Masson's trichrome)染色、粘液分泌及び気道平滑筋の収縮による気道閉塞観察のためのAB-PAS(AB-periodic acid Schiff)染色を遂行した。光学顕微鏡を用いて肺と気道の病理学的変化を観察した。
【００３４】
その結果、図3ないし図6に開示したように、喘息誘導群で現われた肺組織の炎症及び組織損傷減少と、気道平滑筋収縮及び気道炎症が本発明の羅漢果残渣抽出物を投与した群において緩和されたことを確認した。
【００３５】
実施例6.喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、肺組織での炎症誘発因子(IL-13、TARC、TNF-a、MUC5AC、IL-17)の減少効果確認
肺組織を摘出してRNAzol B reagent(Tel-Test, Austin, TX, USA)を用いてtotal RNAを抽出し、3μgのtotal RNAは、ReverTraAce-a-cDNA Synthesis kit(Toyobo, Osaka, Japan)を使用してcDNAを合成した。合成されたcDNAは、Applied Biosystems 7500 Real-time PCR system(Applied Biosystems, USA)を用いたリアルタイム重合連鎖反応(real-time PCR)を行い、IL-13、TNF-α、IL-17、TARC、MUC5ACの発現を分析した。リアルタイム連鎖重合反応の条件としては、pre-denaturationは、50℃で2分、94℃で10分、及び40サイクルを94℃で1分、60℃で1分間遂行した。GAPDH probeは、CATCCTGCACCACCAACTGCTTAGCC(VIC)(配列番号11)を使用し(probeは、Applied Biosystems社で提供される製品である)、試料投与群と対照群は、internal standardでGAPDHを使用して下記数式2を用いてRQ(relative quantitative)を測定した。
【００３６】
［数式２］
ターゲットグループのQuantitative PCR y=x(1+e)n
x= starting quantity
y = yield
n = number of cycles
e = efficiencyで計算し、RQ(relative quantitative)を測定した。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
その結果、図7に開示されたように、喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、肺組織で炎症誘発因子(IL-13、TARC、TNF-α、MUC5AC、IL-17)の発現が減少したことを確認した。
【００３９】
実施例7.血清内卵白アルブミン特異免疫グロブリンE測定
血清内卵白アルブミン特異免疫グロブリンEを測定するために、心臓穿刺穿刺を通じて収得した血液を常温で30分間反応させた後、遠心分離(2500rpm、15min)して血清を得た。血清内卵白アルブミン特異IgEの測定をELISA kit(Shibayagi、日本)を利用し、製造社の実験方法によって実施した。発色は、450nmで吸光度を測定した。
【００４０】
その結果、図8に開示されたように、喘息動物モデルに羅漢果残渣抽出物を投与した後、血清内卵白アルブミン特異IgE含量が減少したことを確認した。
【００４１】
実施例8.微細ホコリによって誘発された炎症緩和能評価
MH-S alveolar macrophage細胞を96-ウェルプレートに分注して培養した。微細ホコリ50μg/mlと羅漢果残渣抽出物を濃度別(25、50、100、200、400μg/ml)に処理し、24時間培養した後、MH-S細胞を分離してFACStubeに分注し、洗浄し、各tube当たり10μMの濃度でDCF-DA溶液を分注して細胞を懸濁した。37℃の暗室で30分間染色した後、フローサイトメトリー(FACS Calibur flow cytometry system, BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)を用いてROSを分析した。
【００４２】
微細ホコリは、肺胞上皮細胞と大食細胞に作用して酸化的ストレスを誘発し、活性酸素(ROS)を増加させ、炎症を誘発する物質である。本発明の実施例で使用した微細ホコリ混合物(CF)は、石炭燃焼物(Coal)、フライアッシュ(JIS type-II Fly ash)、ディーゼル燃焼粉じん(DEP)を混合して製造した。
【００４３】
その結果、ネズミ肺胞の大食細胞MH-Sで微細ホコリ混合物を処理した場合、微細ホコリを処理していない正常群に比べて、統計的に有意にROS生成が増加し、増加したROSを100〜400μg/mlの本発明の羅漢果残渣抽出物を同時処理した場合、統計的に有意に減少した(図9)。
【００４４】
実施例9.羅漢果残渣抽出物と羅漢果抽出物の成分プロファイル比較
本発明の羅漢果残渣抽出物が羅漢果抽出物と互いに異なるということを確認するために、UPLC-quadrupole time of flight mass spectrometry(qTof MS)を用いてプロファイルを比較した。具体的に、UPLCは、Waters(USA)社のACQUITY UPLCTM systemを利用し、カラムは、ODS系のBEH  C18(100×2.1mm)を使用した。移動相は、0.1%ギ酸を含有した水と0.1%ギ酸を含有したアセトニトリルを使用し、アセトニトリル溶媒が初期15%から13分間100%に増加する勾配溶出(gradient elution)を適用した。流速は、0.4ml/minに調節し、注入された抽出溶液の量は、2μlであり、検出器は、qTof MSでnegative ionモードで分析した。
【００４５】
その結果、図10に開示されたように、羅漢果水抽出物及び羅漢果エタノール抽出物のプロファイルは、類似して示されたが、本発明の羅漢果残渣エタノール抽出物は、前記羅漢果水またはエタノール抽出物と互いに異なるということを確認することにより、両発明の有効成分は異なると判断した。
【００４６】
[統計処理]
全ての測定結果は、平均(mean)と標準誤差(standard error of the mean; SE)で示し、実験群間の差は、Student's  t-testを使用して統計学的分析を行い、p<0.05値である場合に統計的有意性があると判定した。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
添付された配列表の電子ファイル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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