(57)【要約】  本開示は、ＩｇおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）タンパク質を持つヒトＴ細胞免疫受容体に対する特異性を有する抗体およびその断片を提供する。癌およびウイルス感染症などの疾患を治療および診断するために抗体またはその断片を使用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを持つヒトＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）タンパク質に対する特異性を有する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、
（ａ）ＨＣＤＲ１：ＥＮＴＭＨ（配列番号２９）、ＨＣＤＲ２：ＧＩＮＰＮＱＧＧＮＲＮＮＱＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＨＣＤＲ３：ＳＧＬＲＤＹＡＭＤＹ（配列番号３１）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＨＶＳＴＡＶＶ（配列番号３２）、ＬＣＤＲ２：ＳＰＳＹＲＹＴ（配列番号３３）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号３４）；
（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＤＹＹＭＹ（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２：ＳＩＴＫＧＧＧＳＴＹＹＰＤＴＬＫＧ（配列番号４４）、ＨＣＤＲ３：ＱＳＳＹＤＦＶＭＤＹ（配列番号４５）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＤＴＡＶＡ（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＡＲＨＴ（配列番号４７）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ（配列番号４８）；ならびに
（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５７）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５８）、ＨＣＤＲ３：ＫＹＹＧＳＷＦＰＹ（配列番号５９）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＦＴＡＶＡ（配列番号６０）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号６１）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号６２）
からなる群から選択される、抗体またはその断片。
【請求項２】
重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
前記抗体またはその断片が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのアイソタイプである、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３が、ＨＣＤＲ１：ＥＮＴＭＨ（配列番号２９）、ＨＣＤＲ２：ＧＩＮＰＮＱＧＧＮＲＮＮＱＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＨＣＤＲ３：ＳＧＬＲＤＹＡＭＤＹ（配列番号３１）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＨＶＳＴＡＶＶ（配列番号３２）、ＬＣＤＲ２：ＳＰＳＹＲＹＴ（配列番号３３）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号３４）である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
ヒト化されており、前記重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ番号付けに従って１２Ｖ、２０Ｌ、２４Ｔ、３８Ｋ、４８Ｉ、６８Ａ、７０Ｌ、７２Ｖおよび９１Ｓ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、請求項５に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
ヒト化されており、前記軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ番号付けに従って１３Ｔ、７３Ｆ、７８Ｖおよび１０４Ｌ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、請求項５に記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
配列番号１および３５〜３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１および３５〜３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項５に記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
配列番号２および３９〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２および３９〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項５に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３が、ＨＣＤＲ１：ＤＹＹＭＹ（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２：ＳＩＴＫＧＧＧＳＴＹＹＰＤＴＬＫＧ（配列番号４４）、ＨＣＤＲ３：ＱＳＳＹＤＦＶＭＤＹ（配列番号４５）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＤＴＡＶＡ（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＡＲＨＴ（配列番号４７）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ（配列番号４８）である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
ヒト化されており、前記重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ番号付けに従って３Ｋ、４４Ｒおよび８２Ｒ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、請求項１０に記載の抗体またはその断片。
【請求項１２】
ヒト化されており、前記軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ番号付けに従って３Ｖ、４２Ｑ、４３Ｓおよび８７Ｆ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、請求項１０に記載の抗体またはその断片。
【請求項１３】
配列番号２７および４９〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号２７および４９〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項１０に記載の抗体またはその断片。
【請求項１４】
配列番号２８および５３〜５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２８および５３〜５６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項１０に記載の抗体またはその断片。
【請求項１５】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３が、ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５７）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５８）、ＨＣＤＲ３：ＫＹＹＧＳＷＦＰＹ（配列番号５９）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＦＴＡＶＡ（配列番号６０）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号６１）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号６２）である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１６】
ヒト化されており、重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ番号付けに従って４９Ｍ、６８Ｉ、７２Ｒ、８３Ｆおよび９７Ｓ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、請求項１５に記載の抗体またはその断片。
【請求項１７】
ヒト化されており、前記軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ番号付けに従って１３Ｔ、７３Ｆおよび７８Ｖ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、請求項１５に記載の抗体またはその断片。
【請求項１８】
配列番号３および６３〜６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号３および６３〜６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項１５に記載の抗体またはその断片。
【請求項１９】
配列番号４および６７〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号４および６７〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項１５記載の抗体またはその断片。
【請求項２０】
ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを持つヒトＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）タンパク質に対する特異性を有する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、
（ａ）ＨＣＤＲ１：ＥＮＴＭＨ（配列番号２９）、ＨＣＤＲ２：ＧＩＮＰＮＱＧＧＮＲＮＮＱＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＨＣＤＲ３：ＳＧＬＲＤＹＡＭＤＹ（配列番号３１）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＨＶＳＴＡＶＶ（配列番号３２）、ＬＣＤＲ２：ＳＰＳＹＲＹＴ（配列番号３３）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号３４）；
（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＤＹＹＭＹ（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２：ＳＩＴＫＧＧＧＳＴＹＹＰＤＴＬＫＧ（配列番号４４）、ＨＣＤＲ３：ＱＳＳＹＤＦＶＭＤＹ（配列番号４５）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＤＴＡＶＡ（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＡＲＨＴ（配列番号４７）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ（配列番号４８）；
（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５７）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５８）、ＨＣＤＲ３：ＫＹＹＧＳＷＦＰＹ（配列番号５９）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＦＴＡＶＡ（配列番号６０）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号６１）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号６２）；ならびに
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも１つが、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸付加、欠失、保存的アミノ酸置換またはそれらの組合せを含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、
からなる群から選択される、抗体またはその断片。
【請求項２１】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３が、
ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５７）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５８）、ＨＣＤＲ３：ＫＹＹＧＳＷＦＰＹ（配列番号５９）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＦＴＡＶＡ（配列番号６０）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号６１）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号６２）、または
配列番号５７〜６２であって、そのうちの少なくとも１つが、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含む、配列番号５７〜６２である、請求項２０に記載の抗体またはその断片。
【請求項２２】
前記アミノ酸置換が、Ｋａｂａｔ番号付けに従ってＶＨ−３１Ｓ、ＶＨ−５７Ｎ、ＶＨ−５９Ｒ、ＶＨ−６６Ｓ、ＶＨ−１００Ｙ、ＶＨ−１０３Ｓ、ＶＨ−１０７Ｙ、ＶＬ−５３Ｙ、ＶＬ−５５Ｙ、ＶＬ−５６ＴおよびＶＬ−９１Ｈ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の残基における置換である、請求項２０に記載の抗体またはその断片。
【請求項２３】
前記置換が、以下から選択される１つまたは複数である、請求項２２に記載の抗体またはその断片。
【表２３】
2021510141.tif 000026
【請求項２４】
ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを持つヒトＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）タンパク質に対する特異性を有する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３および７１〜７５からなる群から選択される重鎖可変領域の前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４および７６〜８０からなる群から選択される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する、抗体またはその断片。
【請求項２５】
二重特異性である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項２６】
前記二重特異性が、免疫チェックポイントタンパク質または腫瘍抗原に対する第２の特異性を含む、請求項２５に記載の抗体またはその断片。
【請求項２７】
前記二重特異性が、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４−１ＢＢ、ＴＩＭ３、ＯＸ−４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＥＶＭ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＣＥＡおよびＶＥＧＦからなる群から選択されるタンパク質標的に対する第２の特異性を含む、請求項２５に記載の抗体またはその断片。
【請求項２８】
前記二重特異性が、ＰＤ−Ｌ１に対する第２の特異性を含む、請求項２５に記載の抗体またはその断片。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３０】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
【請求項３１】
癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
前記癌が、膀胱癌、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
感染症の治療または抑制を必要とする患者において感染症を治療または抑制する方法であって、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を患者に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記感染症が、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または寄生虫感染症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記感染症がＨＩＶ感染症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を用いて、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで治療するステップ；および
（ｂ）治療された前記Ｔ細胞を患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項３７】
ステップ（ａ）の前に、個体から前記Ｔ細胞を単離することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｔ細胞が、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはそれらの組合せである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
サンプル中のＴＩＧＩＴの発現を検出する方法であって、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片が前記ＴＩＧＩＴに結合する条件下で前記サンプルを前記抗体またはその断片と接触させることと、前記サンプル中の前記ＴＩＧＩＴの発現を示す結合を検出することとを含む、方法。
【請求項４０】
抗ＴＩＧＩＴ療法による治療に適した癌患者を同定する方法であって、前記癌患者から細胞を単離することと、請求項１から２８のいずれか一項記載の抗体またはその断片を用いてＴＩＧＩＴタンパク質の存在を検出することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを持つＴ細胞免疫受容体とも呼ばれる）は、特定のＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現した免疫受容体である。研究では、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ融合タンパク質が樹状細胞上のＰＶＲと相互作用し、ＬＰＳ刺激下でＩＬ−１０分泌量を増加させ、ＩＬ−１２分泌量を減少させ、さらにはｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞の活性化を阻害し得ることが明らかになっている。ＴＩＧＩＴのＮＫ細胞毒性阻害は、ＰＶＲとの相互作用に対する抗体によって遮断され、その活性はＩＴＩＭドメインを介して誘導される。
【０００２】
ＴＩＧＩＴは、活性化された細胞毒性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞によって発現され、また、複数の癌モデルのＴ細胞上でアップレギュレートされることが確認されている。リガンドＣＤ１５５とＣＤ１１２は樹状細胞とマクロファージに見られ、いくつかのタイプの癌でも高発現される。さらに、ＴＩＧＩＴの発現は、ＰＤ−１をはじめとする共抑制性分子の発現と高い相関がある。全体的に、このことは、腫瘍が他の抑制性チェックポイントネットワークと共にＴＩＧＩＴ経路をアップレギュレートし、免疫抑制機構を促進することを示唆している。
【０００３】
さらに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染中には、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞が拡大し、ＨＩＶ感染者の多様な群におけるＨＩＶ疾患の進行の臨床マーカーに関連付けられることが確認されている。ＴＩＧＩＴレベルの上昇は、ウイルス量が検出不可能な患者でも保持され続け、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大部分が同時に、ＴＩＧＩＴと、別のネガティブチェックポイント受容体であるプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）との両方を発現し、疲弊したＴ細胞のいくつかの機能を維持した標的化モノクローナル抗体を用いてこれらの経路を遮断することで、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が相乗的に回復した。この経路は「Ｓｈｏｃｋ  ａｎｄ  Ｋｉｌｌ」ＨＩＶ治癒アプローチ中にＨＩＶ感染細胞の殺傷を高めるために潜在的に標的化され得る。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを持つヒトＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）タンパク質に対する特異性を有する抗体およびその断片を提供する。実験データは、これらの抗体がＴＩＧＩＴに対して高い親和性を示し、機能的に活性であることを実証している。癌およびウイルス感染症などの疾患の治療および診断に抗体またはその断片を使用する方法も提供される。
【０００５】
本開示の一実施形態は、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを持つヒトＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）タンパク質に対する特異性を有する単離された抗体またはその断片を提供し、抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、
（ａ）ＨＣＤＲ１：ＥＮＴＭＨ（配列番号２９）、ＨＣＤＲ２：ＧＩＮＰＮＱＧＧＮＲＮＮＱＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＨＣＤＲ３：ＳＧＬＲＤＹＡＭＤＹ（配列番号３１）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＨＶＳＴＡＶＶ（配列番号３２）、ＬＣＤＲ２：ＳＰＳＹＲＹＴ（配列番号３３）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号３４）；
（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＤＹＹＭＹ（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２：ＳＩＴＫＧＧＧＳＴＹＹＰＤＴＬＫＧ（配列番号４４）、ＨＣＤＲ３：ＱＳＳＹＤＦＶＭＤＹ（配列番号４５）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＤＴＡＶＡ（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＡＲＨＴ（配列番号４７）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ（配列番号４８）；ならびに
（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５７）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５８）、ＨＣＤＲ３：ＫＹＹＧＳＷＦＰＹ（配列番号５９）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＦＴＡＶＡ（配列番号６０）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号６１）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号６２）
からなる群から選択される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、抗体または断片はさらに、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、ＨＣＤＲ１：ＥＮＴＭＨ（配列番号２９）、ＨＣＤＲ２：ＧＩＮＰＮＱＧＧＮＲＮＮＱＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＨＣＤＲ３：ＳＧＬＲＤＹＡＭＤＹ（配列番号３１）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＨＶＳＴＡＶＶ（配列番号３２）、ＬＣＤＲ２：ＳＰＳＹＲＹＴ（配列番号３３）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号３４）である。
【０００８】
そのような抗体または断片は、ヒト化することができ、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って１２Ｖ、２０Ｌ、２４Ｔ、３８Ｋ、４８Ｉ、６８Ａ、７０Ｌ、７２Ｖおよび９１Ｓ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って１３Ｔ、７３Ｆ、７８Ｖおよび１０４Ｌ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号１および３５〜３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１および３５〜３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号２および３９〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２および３９〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、ＨＣＤＲ１：ＤＹＹＭＹ（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２：ＳＩＴＫＧＧＧＳＴＹＹＰＤＴＬＫＧ（配列番号４４）、ＨＣＤＲ３：ＱＳＳＹＤＦＶＭＤＹ（配列番号４５）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＤＴＡＶＡ（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＡＲＨＴ（配列番号４７）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ（配列番号４８）である。
【００１１】
そのような抗体または断片は、ヒト化することができ、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って３Ｋ、４４Ｒおよび８２Ｒ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って３Ｖ、４２Ｑ、４３Ｓおよび８７Ｆ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号２７および４９〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号２７および４９〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号２８および５３〜５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２８および５３〜５６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５７）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５８）、ＨＣＤＲ３：ＫＹＹＧＳＷＦＰＹ（配列番号５９）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＦＴＡＶＡ（配列番号６０）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号６１）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号６２）である。
【００１４】
そのような抗体または断片は、ヒト化することができ、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って４９Ｍ、６８Ｉ、７２Ｒ、８３Ｆおよび９７Ｓ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って１３Ｔ、７３Ｆおよび７８Ｖ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号３および６３〜６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号３および６３〜６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、抗体または断片は、配列番号４および６７〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号４および６７〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む。
【００１７】
また、一実施形態では、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを持つヒトＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）タンパク質に対する特異性を有する単離された抗体またはその断片が提供され、抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、
（ａ）ＨＣＤＲ１：ＥＮＴＭＨ（配列番号２９）、ＨＣＤＲ２：ＧＩＮＰＮＱＧＧＮＲＮＮＱＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＨＣＤＲ３：ＳＧＬＲＤＹＡＭＤＹ（配列番号３１）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＨＶＳＴＡＶＶ（配列番号３２）、ＬＣＤＲ２：ＳＰＳＹＲＹＴ（配列番号３３）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号３４）；
（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＤＹＹＭＹ（配列番号４３）、ＨＣＤＲ２：ＳＩＴＫＧＧＧＳＴＹＹＰＤＴＬＫＧ（配列番号４４）、ＨＣＤＲ３：ＱＳＳＹＤＦＶＭＤＹ（配列番号４５）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＤＴＡＶＡ（配列番号４６）、ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＡＲＨＴ（配列番号４７）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ（配列番号４８）；
（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５７）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５８）、ＨＣＤＲ３：ＫＹＹＧＳＷＦＰＹ（配列番号５９）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＦＴＡＶＡ（配列番号６０）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号６１）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号６２）；ならびに
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３であって、ただし、そのうちの少なくとも１つが、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸付加、欠失、保存的アミノ酸置換またはそれらの組合せを含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、
からなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５７）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５８）、ＨＣＤＲ３：ＫＹＹＧＳＷＦＰＹ（配列番号５９）、ＬＣＤＲ１：  ＫＡＳＱＤＶＦＴＡＶＡ（配列番号  ６０）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号６１）およびＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＴＰＷＴ（配列番号６２）、または配列番号５７〜６２であって、そのうちの少なくとも１つが、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含む、配列番号５７〜６２である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｋａｂａｔ番号付けに従ってＶＨ−３１Ｓ、ＶＨ−５７Ｎ、ＶＨ−５９Ｒ、ＶＨ−６６Ｓ、ＶＨ−１００Ｙ、ＶＨ−１０３Ｓ、ＶＨ−１０７Ｙ、ＶＬ−５３Ｙ、ＶＬ−５５Ｙ、ＶＬ−５６ＴおよびＶＬ−９１Ｈ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の残基である。いくつかの実施形態では、置換は、表１３から選択される１つまたは複数である。
【００２０】
また、それぞれ配列番号３および７１〜７５からなる群から選択される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４および７６〜８０からなる群から選択される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３とを有する抗体またはその断片も提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、抗体または断片は、二重特異性である。二重特異性は、免疫チェックポイントタンパク質または腫瘍抗原に対する第２の特異性を含み得る。いくつかの実施形態では、第２の特異性は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＣＥＡおよびＶＥＧＦからなる群から選択されるタンパク質標的に対するものである。いくつかの実施形態では、第２の特異性はＰＤ−Ｌ１である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体または断片と、薬学的に許容される担体とを含み得る組成物も提供される。また、本開示の抗体または断片をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む単離細胞も提供される。
【００２３】
方法も提供される。一実施形態では、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、本開示の抗体またはその断片を患者に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌および甲状腺癌からなる群から選択される。
【００２４】
別の実施形態では、感染症の治療または抑制を必要とする患者において感染症を治療または抑制する方法であって、本開示の抗体またはその断片を患者に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または寄生虫感染症である。いくつかの実施形態では、感染症はＨＩＶ感染症である。
【００２５】
さらにまた、一実施形態では、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、（ａ）請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を用いて、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで治療するステップ；および（ｂ）治療されたＴ細胞を患者に投与するステップを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ステップ（ａ）の前に、個体からＴ細胞を単離することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組合せである。
【００２６】
また、一実施形態では、サンプル中のＴＩＧＩＴの発現を検出する方法であって、本開示の抗体またはその断片がＴＩＧＩＴに結合する条件下でサンプルを抗体またはその断片と接触させることと、サンプル中のＴＩＧＩＴの発現を示す結合を検出することとを含む、方法が提供される。
【００２７】
さらにまた、一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ療法による治療に適した患者を同定する方法であって、癌患者から細胞を単離することと、本開示の抗体またはその断片を用いてＴＩＧＩＴタンパク質の存在を検出することとを含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】抗体９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈについての、ヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合のＥＣ５０を示す。
【００２９】
【図２】９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈ、３５０Ｄ１０Ｈ抗体がＪｕｒｋａｔ細胞株上に発現したＴＩＧＩＴに用量依存的に結合したことを示す。
【００３０】
【図３】９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体が、活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現したＴＩＧＩＴに用量依存的に結合したことを示す。
【００３１】
【図４】９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体が、ＣＤ１５５のその受容体ＴＩＧＩＴに対する結合を用量依存的に阻害したことを示す。
【００３２】
【図５】９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体が、ＣＤ１５５の細胞表面に発現したその受容体ＴＩＧＩＴに対する結合を用量依存的に阻害したことを示す。
【００３３】
【図６】９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体がＪｕｒｋａｔ細胞媒介性ＩＬ−２産生を用量依存的に増強したことを示す。
【００３４】
【図７】抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体が相乗的にＩＬ−２の産生を増強したことを示す。
【００３５】
【図８】抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＰＤＬ１抗体によるＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−ｒ産生の相乗的刺激の結果を示す。
【００３６】
【図９】９０Ｄ９および１０１Ｅ１が腫瘍増殖の軽度の阻害を示したことを示す。
【００３７】
【図１０】乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出によって測定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを示す。
【００３８】
【図１１】ＭＣ３８同系マウスモデルにおける（ｍＩｇＧ２ａ）ＡＤＣＣ効果を有する場合または（ｍＩｇＧ１）ＡＤＣＣ効果を有しない場合の９０Ｄ９および１０１Ｅ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効力を示す。
【００３９】
【図１２】ＭＣ３８同系マウスモデルにおける異なる３５０Ｄ１０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効力を示す。
【図１３】ＭＣ３８同系マウスモデルにおける異なる３５０Ｄ１０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効力を示す。
【００４０】
【図１４】抗ＴＩＧＩＴまたは対照抗体処置群の後の脾臓および腫瘍浸潤性ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【００４１】
【図１５】抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗ＰＤＬ１抗体の併用療法が、単剤療法と比較して相乗的に腫瘍増殖を阻害したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
「ａ」または「ａｎ」の実体という用語は、その実体の１つまたは複数を指すことに留意されたい；例えば、「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、１つまたは複数の抗体を表すものと理解される。このように、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に結合されたモノマー（アミノ酸）で構成された分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、産物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖または複数の鎖を指すために使用される他の任意の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含められ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと互換的に使用することができる。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然に存在するアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことを意図している。ポリペプチドは、天然の生物学的起源に由来するものであってもよいし、組換え技術によって産生されたものであってもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成をはじめとする任意の方法で生成してもよい。
【００４４】
細胞、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、高分子の天然源に存在する、それぞれ他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。本明細書で使用される「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって産生された場合には細胞材料、ウイルス材料または培地を実質的に含まない核酸もしくはペプチド、または化学的に合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質を指す。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然には存在せず、天然の状態では見られないであろう核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すために本明細書で使用される。単離されたポリペプチドは、精製ポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連する「組換え」という用語は、天然には存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意図しており、その非限定的な例は、通常は一緒に存在しないであろうポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって作製することができる。
【００４６】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のためにアラインメントされていてもよい各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較された配列における位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、分子はその位置で相同性がある。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致した位置または相同な位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
【００４７】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が、別の配列と「配列同一性」の一定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）を有するとは、アラインメントされたときに２つの配列を比較すると、塩基（またはアミノ酸）のそのパーセンテージが同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野で知られているソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを用いて決定することができる。好ましくは、アラインメントにはデフォルトパラメータが使用される。デフォルトパラメータを使用する１つのアラインメントプログラムがＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ値＝６０；基体値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート順＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複性，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳物＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に同等のポリヌクレオチドとは、上記の特定のパーセント相同性を有し、かつ同一または類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４８】
「同等の核酸またはポリヌクレオチド」という用語は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列とある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体とは、当該核酸またはその相補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを意図している。一態様では、核酸の相同体は、核酸またはその相補体にハイブリダイズすることができる。同様に、「同等のポリペプチド」とは、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の相同性、すなわち配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様では、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％である。いくつかの態様では、同等のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの付加、欠失、置換およびそれらの組合せを有する。いくつかの態様では、同等の配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）を保持する。
【００４９】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。一般に、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、約１０×ＳＳＣ中または同等のイオン強度／温度の溶液中で約４０℃にて行われる。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、典型的には約６×ＳＳＣ中で約５０℃にて行われ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、一般的には約１×ＳＳＣ中で約６０℃にて行われる。ハイブリダイゼーション反応は、当業者に周知である「生理学的条件」下で行うことができる。生理学的条件の非限定的な例は、細胞内に通常見られるＭｇ２＋の温度、イオン強度、ｐＨおよび濃度である。
【００５０】
ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）の４つのヌクレオチド塩基の特定の配列で構成されており、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にはチミンの代わりウラシル（Ｕ）で構成されている。このように、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は、中央処理装置を有するコンピュータのデータベースに入力することができ、機能的ゲノミクスおよびホモロジー検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。「多型」という用語は、遺伝子またはその一部の形態が２つ以上共存していることを意味する。少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は単一のヌクレオチドである可能性があり、その同一性は異なる対立遺伝子によって異なる。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例を以下に示す：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲートによるなどの重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。特に指摘または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知または予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。
【００５２】
ポリヌクレオチドに適用されるときの「コードする」という用語は、本来の状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、ポリヌクレオチドが転写および／または翻訳されて当該ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを産生することができるならば、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コード化配列をそこから推定することができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」とは、抗原を特異的に認識および結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、抗体全体、任意の抗原結合断片またはその単鎖であってもよい。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。そのような例として、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれらの任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも１つの部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部分を意味する。構造に関係なく、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識される抗原と同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、アプタマー、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒおよびダイアボディを含む。「抗体断片」という用語はまた、特定の抗原と結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する、合成または遺伝子操作されたタンパク質も含む。
【００５５】
「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」とは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、領域は、１０〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されている。リンカーは、可動性のためにグリシンだけでなく、溶解性のためにセリンまたはスレオニンも豊富に含み得、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続することができ、またはその逆も可能である。このタンパク質は、定常領域が除去され、かつリンカーが導入されているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。
【００５６】
抗体という用語は、生化学的に区別することができるポリペプチドのさまざまな広範なクラスを包含する。当業者であれば、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中にはいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があることを理解する。この鎖の性質により、抗体の「クラス」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧまたはＩｇＥとして決定される。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特徴付けられており、機能的な特殊性を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾バージョンは、本開示を考慮して当業者に容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内にある。すべての免疫グロブリンクラスは、明らかに本開示の範囲内にあるが、以下の議論は、一般的には免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。４本の鎖は、典型的には「Ｙ」字型のジスルフィド結合によってつながれており、軽鎖は、「Ｙ」の口部で始まり、可変領域を通じて続く重鎖を囲む。
【００５７】
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、変異体、またはそれらの誘導体として、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されるＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００５８】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（Κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかに結合され得る。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合的に結合しており、２つの重鎖の「尾」部は、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって免疫グロブリンが産生されたときに、共有結ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字型の分岐した端部のＮ末端から各鎖の下部のＣ末端まで延びる。
【００５９】
軽鎖と重鎖の両方は、構造的相同性と機能的相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、軽鎖（ＶＫ）と重鎖（ＶＨ）の部分の両方の可変ドメインが抗原の認識および特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖（ＣＫ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から、より遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である；ＣＨ３およびＣＫドメインは、実際にはそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００６０】
上記のように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することが可能である。すなわち、抗体のＶＫドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが結合して、三次元の抗原結合部位を画定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＫ鎖のそれぞれの３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）によって定義される。いくつかの例では、例えば、ラクダ科の種に由来する、またはラクダ科の免疫グロブリンに基づいて操作された特定の免疫グロブリン分子では、完全な免疫グロブリン分子は、重鎖のみからなり、軽鎖は含まれない場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照。
【００６１】
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境でその三次元配置をとったときに、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されたアミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、抗原結合ドメインのアミノ酸の残りの部分は、分子間変動がより少ない。フレームワーク領域は、大部分がβ−シート構造をとり、ＣＤＲは、β−シート構造を接続し、場合によってはβ−シート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間、非共有結合の相互作用によって、ＣＤＲを正しい方向に位置決めするための足場を形成するように機能する。位置決めされたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補的な表面を画定する。この相補的な表面は、その同族のエピトープに対する抗体の非共有結合的な結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、それらが正確に定義されていることから、当業者によって任意の所与の重鎖または軽鎖の可変領域について容易に同定することができる。（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照）。
【００６２】
当該技術分野で使用および／または許容される用語の定義が２つ以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、そうではないと明示されていない限り、そのような意味をすべて含むことを意図している。特定の例は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用であり、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位を説明する。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって説明されている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義には、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲに言及するためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内であることを意図している。上記で引用される参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基を、比較として下記の表に示す。特定のＣＤＲを含む正確な残基番号は、ＣＤＲの配列およびサイズによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
【表１】
2021510141.tif 000002
【００６３】
Ｋａｂａｔ  ｅｔ．ａｌ．はまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付け体系を定義した。当業者は、配列自体を超える実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」の体系を任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用されるように、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ"（１９８３）」によって示される番号付け体系を指す。
【００６４】
上記の表に加えて、Ｋａｂａｔ番号体系では、ＣＤＲ領域は次のように説明されている：ＣＤＲ−Ｈ１は、およそアミノ酸３１（すなわち、最初のシステイン残基の後からおよそ９残基目）で始まり、およそ５〜７個のアミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の端部の後から１５番目の残基で始まり、およそ１６〜１９個のアミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリジン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の端部の後からおよそ３３番目のアミノ酸残基で始まり、３〜２５個のアミノ酸を含み、配列Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終わり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。ＣＤＲ−Ｌ１は、およそ残基２４（すなわち、システイン残基の後）で始まり、およそ１０〜１７個の残基を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の端部の後からおよそ１６番目の残基で始まり、約７個の残基を含む。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の端部の後からおよそ３３番目の残基（すなわち、システイン残基の後）で始まり、およそ７〜１１個の残基を含み、配列ＦまたはＷ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終わり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。
【００６５】
本明細書に開示される抗体は、鳥および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマまたはニワトリの抗体である。別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚類（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）由来（例えば、サメ由来）であり得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央および／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体もしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、本開示で使用するための抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示で使用するための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）が無い場合がある。上記のように、重鎖定常領域は、天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることが当業者によって理解される。
【００６７】
本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖定常領域は、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【００６９】
「軽鎖−重鎖ペア」は、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合を介して二量体を形成することができる軽鎖および重鎖の集合を指す。
【００７０】
前述のように、さまざまな免疫グロブリンのクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元配置は周知である。本明細書で使用される場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の最初（最もアミノ末端）の定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端にある。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けスキーム（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付け体系；および残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付け体系；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）を参照）を使用して、抗体の約２４４残基から３６０残基まで延びる重鎖分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接にペアリングされていないという点で特殊である。それどころか、インタクトなネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に２つのＮ結合型分岐炭水化物鎖が挿入されている。また、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで延びており、およそ１０８残基を含むことも十分に立証されている。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインにつなげる重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、およそ２５残基を含み、可動性があるため、２つのＮ末端抗原結合領域を独立して移動させる。ヒンジ領域は、３つの異なるドメインに分割され得る：上部、中央および下部のヒンジドメイン（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：４０８３（１９９８））。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成するか、または第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＫ領域とはジスルフィド結合によって結合されており、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付け体系を使用して２３９および２４２に対応する位置（位置２２６または２２９、ＥＵ番号付け体系）で２つのジスルフィド結合によって結合されている。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られるかまたは由来し、定常領域（本開示に従ってインタクト、部分的または改変されいてもよい）が第２の種から得られる任意の抗体を意味すると考えられる。特定の実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト起源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来することになり、定常領域はヒトである。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ヒト化パーセント」は、ヒト化ドメインと生殖系列ドメインとの間のフレームワークのアミノ酸の相違（すなわち、非ＣＤＲ相違）の数を求め、その数をアミノ酸の総数から減算し、次にそれをアミノ酸の総数で割って１００を掛けることにより算出される。
【００７６】
「特異的に結合する」または「特異性を有する」とは、一般的には、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、およびその結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間でいくらかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、それがランダムな関連のないエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合するとき、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。本明細書では、「特異性」という用語は、ある抗体があるエピトープに結合するときの相対親和性を表すために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所定のエピトープに対して高い特異性を有するとみなすことができるか、または抗体「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、治療処置と予防的または防止的措置の両方を指し、その目的は、癌の進行などの望ましくない生理学的変化または障害を防止または遅延（軽減）させることである。有益なまたは望ましい臨床結果として、症状の緩和、疾患の範囲の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行の引き延ばしまたは遅延、疾患の状態の改善または緩和、および寛解（部分的もしくは全体的であるかどうかにかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合、予想される生存期間と比較して、生存期間を延ばすことを意味し得る。治療を必要とする人たちとして、すでに病的状態もしくは障害を患っている人、および病的状態もしくは障害を起こしやすい人、または病的状態もしくは障害が予防されるべき人が挙げられる。
【００７８】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物の対象を意味する。哺乳動物の対象として、ヒト、飼育動物、有用動物、および動物園用、スポーツ用またはペット用動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、雌ウシ、家畜ウシなどが挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「治療を必要とする患者に」または「治療を必要とする対象」などの語句は、例えば、検出、診断手順および／または治療のために使用される本開示の抗体または組成物の投与から恩恵を受ける対象、例えば哺乳動物の対象を含む。
抗ＴＩＧＩＴ抗体
【００８０】
本開示は、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対して高い親和性および阻害活性を有する抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。抗体は、遊離ＴＩＧＩＴと、Ｊｕｒｋａｔ細胞および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞などの細胞表面のＴＩＧＩＴとの両方に効果的に結合することができる。さらに、抗体は、溶液中であろうとＴＩＧＩＴが細胞表面で発現される場合であろうと、受容体ＣＤ１５５に対するＴＩＧＩＴの結合を効果的に阻害することができる。その他に、そのような結合および阻害は、Ｊｕｒｋａｔ細胞媒介性ＩＬ−２産生の増強および腫瘍増殖の阻害をもたらす。
【００８１】
本開示の一実施形態によれば、ＶＨ−ＶＬペアに示されるＣＤＲ領域を有する重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む抗体が提供される。
【表２】
2021510141.tif 000003
【００８２】
特に、ＣＤＲ領域は、９０Ｄ９−ＶＨ（配列番号２９〜３１のＣＤＲ）および９０Ｄ９−ＶＬ（配列番号３２〜３４のＣＤＲ）、１０１Ｅ１−ＶＨ（配列番号５７〜５９のＣＤＲ）および１０１Ｅ１−ＶＬ（配列番号６０〜６２のＣＤＲ）、または３５０Ｄ１０−ＶＨ（配列番号４３〜４５のＣＤＲ）および３５０Ｄ１０−ＶＬ（配列番号４６〜４８のＣＤＲ）からのＣＤＲ領域であり得る。
【００８３】
これらの抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得るが、これらに限定されない。ヒト化中に、抗体の結合親和性を確保するのに役立つ特定の復帰突然変異が同定された。いくつかの実施形態では、９０Ｄ９のＣＤＲを有する抗体のそのような復帰突然変異は、すべてＫａｂａｔ番号付けに従って、重鎖では１２Ｖ（すなわち、ヒト化抗体の１２位の残基がＶａｌに復帰突然変異する）、２０Ｌ、２４Ｔ、３８Ｋ、４８Ｉ、６８Ａ、７０Ｌ、７２Ｖおよび９１Ｓ、ならびに軽鎖では１３Ｔ、７３Ｆ、７８Ｖおよび１０４Ｌを含む。
【００８４】
３５０Ｄ１０のＣＤＲを有する抗体または断片の場合、復帰突然変異は、すべてＫａｂａｔ番号付けに従って、重鎖における３Ｋ、４４Ｒおよび８２Ｒ、ならびに軽鎖における３Ｖ、４２Ｑ、４３Ｓおよび８７Ｆの１つまたは複数であり得る。
【００８５】
１０１Ｅ１のＣＤＲを有する抗体または断片の場合、復帰突然変異は、すべてＫａｂａｔ番号付けに従って、重鎖における４９Ｍ、６８Ｉ、７２Ｒ、８３Ｆおよび９７Ｓ、ならびに軽鎖における１３Ｔ、７３Ｆおよび７８Ｖの１つまたは複数であり得る。
【００８６】
実験例で示されているように、これらのＣＤＲ領域を含む抗体は、マウス抗体であれ、ヒト化抗体であれ、キメラ抗体であれ、強力なＴＩＧＩＴ結合および阻害活性を有していた。更なる実験により、ＣＤＲ内の特定の残基を修飾して、抗体の特性を保持または改善できることが示された。そのような残基は「ホットスポット」と呼ばれ、下記の表で下線を引いている。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、１つ、２つまたは３つの更なる修飾を伴う、下記に列挙されるようなＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを含む。そのような修飾は、アミノ酸の付加、欠失または置換であり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは２つまたは３つを超えないＣＤＲがアミノ酸置換を含む。１０１Ｅ１に由来するＣＤＲを有する抗体に関するいくつかの置換の例を下記に示す。
【表３】
2021510141.tif 000004
【表４】
2021510141.tif 000005
【００８７】
いくつかの実施形態では、修飾は、各ＣＤＲからの１つを超えないホットスポット位置での置換である。いくつかの実施形態では、修飾は、１つ、２つまたは３つのそのようなホットスポット位置での置換である。一実施形態では、修飾は、ホットスポット位置の１つでの置換である。そのような置換は、いくつかの実施形態では、保存的置換である。
【００８８】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野で定義されている。これらの側鎖として、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基が、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。別の実施形態では、アミノ酸のストリングが、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる、構造的に類似したストリングで置き換えられ得る。
【００８９】
保存的アミノ酸置換の非限定的な例を下記の表に示すが、ここで、０以上の類似性スコアが２つのアミノ酸間の保存的置換を示す。
【表５】
2021510141.tif 000006
【表６】
2021510141.tif 000007
【００９０】
本明細書に開示される抗体は、それらが由来する天然に存在する結合ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることも当業者によって理解される。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は類似していてもよく、例えば、出発配列と一定の同一性パーセントを有していてもよく、例えば、それは出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であってもよい。
【００９１】
特定の実施形態では、抗体は、通常は抗体と関連しない、アミノ酸配列または１つもしくは複数の部分を含む。例示的な修飾を、下記でより詳細に説明する。例えば、本開示の抗体は、可動性リンカー配列を含んでもよいし、機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素または標識）を付加するように修飾されてもよい。
【００９２】
本開示の抗体、それらの変異体または誘導体として、修飾された誘導体、すなわち、共有結合が抗体のエピトープに対する結合を妨げないように、任意のタイプの分子の抗体に対する共有結合によって修飾された誘導体が挙げられる。例えば、限定するものではないが、抗体は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質に対する結合などによって修飾することができる。多数の化学的修飾のいずれかを、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない既知の技術によって行うことができる。さらに、抗体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答修飾因子、医薬品またはＰＥＧにコンジュゲートされてもよい。
【００９４】
抗体は、検出可能な標識、例えば放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤または診断剤、薬物もしくは毒素であり得る細胞毒性剤、超音波増強剤、非放射性標識、それらの組合せ、および当該技術分野で既知の他のそのような試剤を含み得る治療剤にコンジュゲートまたは融合され得る。
【００９５】
抗体は、それを化学発光化合物にカップリング結合することにより検出可能に標識することができる。次に、化学発光タグ付き抗原結合ポリペプチドの存在は、化学反応の過程で現れる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００９６】
抗体はまた、１５２Ｅｕなどの蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を使用して抗体に結合することができる。さまざまな部分を抗体にコンジュゲートするための技術は周知である（例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  '８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（５２：１１９−５８（１９８２）を参照）。
二官能性分子
【００９７】
ＴＩＧＩＴは、一部のＴ細胞およびＮＫ細胞に存在する免疫受容体である。免疫受容体標的分子として、ＴＩＧＩＴに特異的な抗体または抗原結合断片を、腫瘍細胞または免疫チェックポイントに特異的な第２の抗原結合断片と組み合わせて二重特異性抗体を産生することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、食細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球およびマスト細胞からなる群から選択される。標的化され得る免疫細胞上の分子として、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２８およびＣＤ６４が挙げられる。他の例として、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３としても知られている）、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られている）、ＴＩＭ３、ＯＸ−４０もしくはＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＥＶＭまたはＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても知られている）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）およびＣＤ４７が挙げられる。二重特異性の特定の例として、ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ３およびＴＩＧＩＴ／ＣＤ４７が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
免疫受容体阻害剤として、ＴＩＧＩＴに特異的な抗体または抗原結合断片を腫瘍抗原に特異的な第２の抗原結合断片と組み合わせて二重特異性抗体を産生することができる。「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞で産生される抗原性物質であり、すなわち、それは宿主において免疫応答を誘発する。腫瘍抗原は腫瘍細胞の同定に有用であり、癌治療で使用するための潜在的な候補である。体内の正常なタンパク質は抗原性ではない。しかしながら、特定のタンパク質は腫瘍形成中に産生または過剰発現されるため、体にとって「異質」であるように見える。このタンパク質として、免疫系から十分に隔絶された正常なタンパク質、通常は非常に少量で産生されるタンパク質、通常は発生の特定の段階でのみ産生されるタンパク質、または変異により構造が修飾されたタンパク質が挙げられる。
【０１００】
豊富な腫瘍抗原が当該技術分野で知られており、スクリーニングによって新しい腫瘍抗原を容易に同定することができる。腫瘍抗原の非限定的な例として、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰおよびテネイシンが挙げられる。
【０１０１】
いくつかの態様では、一価単位は、対応する非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現されるタンパク質に対する特異性を有する。本明細書で使用される「対応する非腫瘍細胞」は、腫瘍細胞の起源と同じ細胞型である非腫瘍細胞を指す。そのようなタンパク質は必ずしも腫瘍抗原と異なるわけではないことに留意されたい。非限定的な例として、ほとんどの結腸、直腸、乳房、肺、膵臓および胃腸管の癌で過剰発現される癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌および子宮頸癌で頻繁に過剰発現されるヘレグリン受容体（ＨＥＲ−２、ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２）；乳房、頭頸部、非小細胞肺および前立腺の固形腫瘍をはじめとする幅広い固形腫瘍で高度に発現される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；アシアロ糖タンパク質受容体；トランスフェリン受容体；肝細胞上に発現されるセルピン酵素複合体受容体；膵管腺癌細胞上で過剰発現される線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）；抗血管新生遺伝子治療のための血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）；非ムチン性卵巣癌の９０％で選択的に過剰発現される葉酸受容体；細胞表面糖衣；炭水化物受容体；ならびに呼吸器上皮細胞への遺伝子送達に有用であり、かつ嚢胞性線維症などの肺疾患の治療に魅力的な高分子免疫グロブリン受容体が挙げられる。この点における二重特異性の非限定的な例として、ＴＩＧＩＴ／ＥＧＦＲ、ＴＩＧＩＴ／Ｈｅｒ２、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ３３、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１３３、ＴＩＧＩＴ／ＣＥＡおよびＴＩＧＩＴ／ＶＥＧＦが挙げられる。
【０１０２】
異なるフォーマットの二重特異性抗体も提供される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ断片および第２の断片の各々は、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体からそれぞれ独立して選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体はＦｃ断片をさらに含む。
【０１０３】
抗体または抗原結合断片だけを含むのではない二官能性分子も提供される。腫瘍抗原標的分子として、ＴＩＧＩＴに特異的な抗体または抗原結合断片、例えばここに記載されているものは、任意選択的にペプチドリンカーを介して免疫サイトカインまたはリガンドと組み合わせることができる。結合された免疫サイトカインまたはリガンドとして、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴおよびＧＩＴＲＬが挙げられるが、これらに限定されない。そのような二官能性分子は、免疫チェックポイント遮断効果を腫瘍部位の局所免疫調節と組み合わせることができる。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法
【０１０４】
本開示はまた、本開示の抗体、その変異体または誘導体をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子または別個のポリヌクレオチド分子上の抗原結合ポリペプチド、その変異体または誘導体の重鎖および軽鎖可変領域全体をコードし得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子または別個のポリヌクレオチド分子上の抗原結合ポリペプチド、その変異体または誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の部分をコードし得る。
【０１０５】
抗体を作製する方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。特定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域と定常領域の両方は、完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当該技術分野で記載されている技術を使用し、本明細書で記載されているように作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原投与に応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、内因性遺伝子座が欠損しているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製することができる。そのような抗体を作製するために使用することができる例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、米国特許第６，４５８，５９２号明細書、米国特許第６，４２０，１４０号明細書に記載されており、それらは参照により全体が組み込まれる。
治療方法
【０１０６】
本明細書に記載されるように、本開示の抗体、変異体または誘導体は、特定の治療および診断方法で使用され得る。
【０１０７】
本開示はさらに、本明細書に記載される障害または病的状態の１つまたは複数を治療するための、動物、哺乳動物およびヒトなどの患者に本開示の抗体を投与することを含む抗体ベースの治療を対象とする。本開示の治療化合物として、本開示の抗体（本明細書に記載されるその変異体および誘導体を含む）ならびに本開示の抗体（本明細書に記載されるその変異体および誘導体を含む）をコードする核酸またはポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法が提供される。この方法は、一実施形態では、有効量の本開示の抗体を患者に投与することを伴う。いくつかの実施形態では、患者の癌細胞（例えば、間質細胞）の少なくとも１つがＴＩＧＩＴを過剰発現する。
【０１０９】
癌の非限定的な例として、膀胱癌、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌および甲状腺癌が挙げられる。
【０１１０】
細胞療法、より具体的にはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法もまた、本開示で提供される。本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体と接触させられる（あるいは本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体を発現するように操作される）適切なＴ細胞を使用することができる。そのように接触または操作されると、次にＴ細胞は治療を必要とする癌患者に導入され得る。癌患者は、本明細書に開示されるタイプのいずれかの癌を有し得る。Ｔ細胞は、例えば、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組合せであり得るが、これらに限定されない。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、癌患者本人から単離された。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ドナーによって、または細胞バンクから提供された。Ｔ細胞を癌患者から単離すると、望ましくない免疫反応を最小限に抑えることができる。
【０１１２】
本開示の抗体、またはその変異体もしくは誘導体を用いて治療、予防、診断および／または予後診断され得る、細胞生存の増加に関連する更なる疾患または病的状態として、悪性腫瘍ならびに関連疾患、例えば白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および、赤血球性白血病を含む）を含む）および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病））、真性赤多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍であって、肉腫および癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない固形腫瘍の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
特定の患者の特定の投与量および治療レジメンは、使用される特定の抗体、その変異体または誘導体、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事、および投与時間、排泄率、薬物の組合せ、および治療下の特定の疾患の重症度を含むさまざまな要因に依存する。医療介護者によるそのような要因の判断は、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。量はまた、治療される個々の患者、投与経路、製剤のタイプ、使用される化合物の特徴、疾患の重症度、および所望の効果に依存する。使用量は、当該技術分野で周知の薬理学的および薬物動態学的原理によって決定され得る。
【０１１４】
抗体、その変異体または誘導体の投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含むが、これらに限定されない。抗原結合ポリペプチドまたは組成物は、任意の好都合な経路、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収により投与され得、かつ他の生物学的活性薬剤と一緒に投与され得る。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含有する医薬組成物は、経口、直腸、非経口、大槽内、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、点滴または経皮パッチによる）、口腔内に、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与され得る。
【０１１５】
本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与方法を指す。
【０１１６】
投与は全身的でも局所的であってもよい。さらに、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって、本開示の抗体を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある。脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進され得る。例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方によって、肺投与も使用され得る。
【０１１７】
本開示の抗原結合ポリペプチドまたは組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入によって、例えば、手術後の創傷被覆材と組み合わせた局所塗布によって、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラント（前述のインプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料からなり、膜、例えばサイラスティックな膜、または繊維を含む）によって達成され得る。好ましくは、本開示の抗体を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない材料を使用するように注意を払わなければならない。
【０１１８】
更なる実施形態では、本開示の組成物は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤または抗生剤または抗真菌剤と組み合わせて投与される。当該技術分野で知られているこれらの薬剤のいずれも、本開示の組成物と組み合わせて投与することができる。
【０１１９】
別の実施形態では、本開示の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与される。本開示の組成物と共に投与され得る化学療法剤として、抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、６−チオグアニン）；細胞毒性薬（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン、硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、２リン酸ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン、クロラムブシル、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイドとその組合せ（例えば、リン酸ベタメタゾンナトリウム）；ならびにその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
追加の実施形態では、本開示の組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。本開示の組成物と共に投与することができるサイトカインとして、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０ＬおよびＴＮＦ−αが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
追加の実施形態では、本開示の組成物は、例えば放射線療法などの他の治療または予防レジメンと組み合わせて投与される。
【０１２２】
本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤と共に使用することができる。免疫チェックポイントは、シグナルを上げる（共刺激分子）か、またはシグナルを下げる免疫系の分子である。多くの癌は、Ｔ細胞シグナルを阻害することによって免疫系からその身を守っている。免疫チェックポイント阻害剤は、細胞によるそのような保護機構の停止を助けることができる。免疫チェックポイント阻害剤は、以下のチェックポイント分子：ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３としても知られている）、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られている）、またはＢＴＬＡ（ＣＤ２７２とも知られている）のいずれか１つまたは複数を標的化することができる。
【０１２３】
プログラムＴ細胞死１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞の表面に見られる膜貫通タンパク質であり、これは腫瘍細胞上のプログラムＴ細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合すると、Ｔ細胞活性が抑制され、Ｔ細胞媒介性細胞毒性が減少されることになる。したがって、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１は、免疫ダウンレギュレーターまたは免疫チェックポイント「オフスイッチ」である。ＰＤ−１阻害剤の例として、ニボルマブ（オプジーボ）（ＢＭＳ−９３６５５８）、ペムブロリズマブ（キトルーダ）、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９およびＭＳＢ００１０７１８Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）とも呼ばれ、ヒトではＣＤ２７４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１阻害剤の非限定的な例として、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ９３５５５９（ＭＤＸ−１１０５）およびＡＭＰ−２２４が挙げられる。
【０１２５】
ＣＴＬＡ−４は、免疫系をダウンレギュレートするタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ−４阻害剤の非限定的な例として、イピリムマブ（ヤーボイ）（ＢＭＳ−７３４０１６、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１としても知られている）およびトレメリムマブ（かつてのチシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）が挙げられる。
【０１２６】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）は、細胞表面上の免疫チェックポイント受容体であり、Ｔｒｅｇに対する作用による免疫応答を抑制するだけでなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞に直接作用する。ＬＡＧ−３阻害剤として、ＬＡＧ５２５およびＢＭＳ−９８６０１６が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
ＣＤ２８は、ほぼすべてのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上、およびすべてのＣＤ８Ｔ細胞の約半分で恒常的に発現され、Ｔ細胞の増殖を促す。ＣＤ２８阻害剤の非限定的な例として、ＴＧＮ１４１２が挙げられる。
【０１２８】
ＣＤ１２２は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の増殖を増加させる。非限定的な例として、ＮＫＴＲ−２１４が挙げられる。
【０１２９】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られている）は、Ｔ細胞増殖に関与している。ＣＤ１３７媒介性シグナル伝達は、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化誘導細胞死から保護することも知られている。ＰＦ−０５０８２５６６、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）およびリポカリンはＣＤ１３７阻害剤の例である。
【０１３０】
上記の併用治療のいずれにおいても、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、他の抗癌剤と同時にまたは別々に投与することができる。別々に投与する場合、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、他の抗癌剤の前または後に投与することができる。
【０１３１】
一実施形態では、感染症の治療または抑制を必要とする患者において感染症を治療または抑制する方法であって、有効量の本開示の抗体またはその断片を患者に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または寄生虫による感染症である。
【０１３２】
感染症は、病原体による生物の体組織への侵入、それらの増殖、ならびにこれらの生物およびそれらが産生する毒素に対する宿主組織の反応である。感染症は、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、線虫類、例えば寄生性回虫およびギョウチュウ、節足動物、例えばマダニ、ダニ、ノミおよびシラミ、菌類、例えば白癬、ならびに他の大型寄生虫、例えばサナダムシおよび他の蠕虫などの感染性因子によって引き起こされ得る。一態様では、感染性因子は、グラム陰性菌などの細菌である。一態様では、感染性因子は、ウイルス、例えばＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、および逆転写ウイルスである。ウイルスの非限定的な例として、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、８型ヒトヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸系発疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられる。
【０１３３】
本開示の抗体はまた、微生物および免疫細胞を標的化して微生物の排除をもたらすことにより、微生物によって引き起こされる感染症を治療するか、または微生物を殺傷するために使用することができる。一態様では、微生物は、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスをはじめとするウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、原虫または真菌である。
診断方法
【０１３４】
ＴＩＧＩＴの過剰発現は、特定の腫瘍サンプルで観察され、ＴＩＧＩＴ過剰発現細胞を有する患者は、本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いた治療に応答する可能性が高い。したがって、本開示の抗体はまた、診断および予後診断の目的で使用することができる。
【０１３５】
好ましくは細胞を含むサンプルは、癌患者または診断を望む患者であり得る患者から得ることができる。細胞は、腫瘍組織の細胞または腫瘍ブロック、血液サンプル、尿サンプルまたは患者からの任意のサンプルとする。サンプルの任意の前処理の際、サンプルは、抗体がサンプル中に潜在的に存在するＴＩＧＩＴタンパク質と相互作用することを可能にする条件下で、本開示の抗体とインキュベートすることができる。ＥＬＩＳＡなどの方法を使用して、抗ＴＩＧＩＴ抗体の利点を活かし、サンプル中のＴＩＧＩＴタンパク質の存在を検出することができる。
【０１３６】
サンプル中のＴＩＧＩＴタンパク質の存在（任意選択的に量または濃度と共に）を、患者が抗体を用いた治療に適していることを示すものとして、または患者が癌治療に応答した（もしくは応答しなかった）ことを示すものとして、癌の診断に使用することができる。予後診断の方法の場合、検出は、治療の進行を示すために癌治療の開始時に、特定の段階で１回、２回、またはそれ以上行うことができる。
組成物
【０１３７】
本開示はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の抗体と、許容される担体とを含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに第２の抗癌剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）を含む。
【０１３８】
特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の監督機関によって承認されたこと、または動物、より具体的にはヒトでの使用のために米国薬局方もしくは他の一般に認可された薬局方にリストされていることを意味する。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般には、無毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、封入材料、または任意のタイプの製剤補助剤である。
【０１３９】
「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、添加剤または賦形剤を指す。そのような薬学的担体は、無菌液体、例えば、水、および石油起源、動物起源、植物起源または合成起源の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与されるときの好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液も、特に注射可能な溶液のための液体担体として用いることができる。適切な医薬品添加剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩も含むことができる。抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調節するための試剤も想定される。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、従来のバインダーおよび担体、例えばトリグリセリドを用いて坐剤として処方することができる。経口製剤として、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられることができる。適切な薬物担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されており、この文献は参照により組み込まれる。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体と一緒に、好ましくは精製された形態で治療有効量の抗原結合ポリペプチドを含む。処方は投与方法に適合しなければならない。親製剤は、ガラス製もしくはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０１４０】
一実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、日常的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。一般的には、成分は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々にまたは一緒に混合して単位剤形で供給される。組成物が注入により投与される場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルで調剤することができる。組成物が注射により投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１４１】
本開示の化合物は、中性または塩の形態として処方され得る。薬学的に許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンを用いて形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンで形成されるものが挙げられる。
実施例
例１  ヒトＴＩＧＩＴに対するマウスモノクローナル抗体の作製
【０１４２】
この例は、ハイブリドーマ技術を使用した抗ヒトＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体の産生を示している。
免疫化
【０１４３】
ヒト免疫グロブリンＦｃドメインに融合したヒトＴＩＧＩＴの細胞外領域全体を含む組換えヒトＴＩＧＩＴ融合タンパク質を、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を惹起させるための免疫原として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃまたはＳＪＬマウスを、最初に皮下（ｓ．ｃ．）に５０μｇの免疫原を用いて免疫化し、次に腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下に隔週で２５μｇの免疫原を用いて免疫化した。免疫応答を眼窩後出血により監視した。血漿をＥＬＩＳＡ結合アッセイによりスクリーニングした。要するに、Ｈｉｓタグ付きＴＩＧＩＴを０．５μｇ／ｍｌで一晩コーティングし、次にＰＢＳ中５％ＢＳＡで遮断した。連続希釈血清を、コーティングされた抗原と共に室温で１時間インキュベートした。得られたプレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰと共に室温で１時間インキュベートした。プレートはＴＭＢ基質を用いて開発し、分光光度計によりＯＤ４５０〜６３０ｎｍで分析した。高力価の抗ＴＩＧＩＴ免疫グロブリンを有するマウスを融合および更なるスクリーニングのために選択した。屠殺および脾臓の除去の４日前に、マウスを２５μｇの抗原を用いて腹腔内に追加免疫した。脾臓を融合に使用した。
融合およびハイブリドーマのスクリーニング
【０１４４】
脾臓細胞をマウス黒色腫細胞株ＳＰ２／０細胞と電気融合させ、９６ウェル培養プレートに播種した。ハイブリドーマ上清をヒトＴＩＧＩＴ結合について試験した。陽性クローンの上清を、ＥＬＩＳＡベースの受容体遮断アッセイにより、ｈＴＩＧＩＴのそのリガンドｈＣＤ１５５に対する結合を遮断する機能についてスクリーニングした。簡単に言えば、ヒトＴＩＧＩＴ  ｈｕＩｇＧ  Ｆｃタンパク質（０．３μｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレートに一晩コーティングした。上清をＰＢＳで希釈し、コーティングされたＴＩＧＩＴ−ｈｕＦｃと共に室温で１時間インキュベートした。ビオチン化ｈＣＤ１５５−ＥＣＤ−ｈＦｃタンパク質（０．３μｇ／ｍＬ）を抗体−抗原複合体と共に室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジンＨＲＰを使用して、ビオチン化ｈＣＤ１５５を、それがコーティングされたＴＩＧＩＴに結合したときに検出した。このアッセイで強い遮断能を示すクローンをサブクローニング用に選択した。１ラウンドのサブクローンの上清を使用して、ＥＬＩＳＡベースのヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴ結合能ならびに受容体遮断能を確認し、その後、シーケンシングおよび更なる解析を行った。これらのスクリーニングの後、１４個のクローン（９０Ｄ９、１０１Ｅ１、１１６Ｈ８、１１８Ａ１２、１３１Ａ１２、１４３Ｂ６、１６７Ｆ７、２２１Ｆ１１、２２２Ｈ４、３２７Ｃ９、３４２Ａ９、３４４Ｆ２、３４９Ｈ６および３５０Ｄ１０）を選択した。これらのクローンの配列を表１に示す。これらのハイブリドーマのヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合されたキメラ抗体を、更なる特性決定のために生成した。
【表７】
2021510141.tif 000008
【表２４】
2021510141.tif 000009
【表２５】
2021510141.tif 000010
＊元のマウス配列からの一部のアミノ酸を変異させて抗体の安定性を高めた（たとえば、一部のＮは、脱アミド化またはグリコシル化を回避するためにＱまたはＳに変異させた）。
例２  抗ＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体の結合特性
【０１４５】
この例では、ＴＩＧＩＴタンパク質に対する抗ＴＩＧＩＴマウス抗体の結合特性をテストした。
【０１４６】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果を表２にまとめており、この表は、ヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合のＥＣ５０を示している。結果は、すべてのクローンの中で、９０Ｄ９、１０１Ｅ１、２２２Ｈ４および３５０Ｄ１０が、ヒトＴＩＧＩＴに対する最も強力で選択的なバインダーであることを示した。９０Ｄ９および３５０Ｄ１０は、ヒトＴＩＧＩＴに対するものに匹敵するカニクイザルＴＩＧＩＴに対する結合能を示した。２２２Ｈ４は、カニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対する弱い結合を示した。１０１Ｅ１は、カニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に結合しなかった。効果的なカニクイザルＴＩＧＩＴ結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性研究に役立ち得るため、付加価値を有する。
【表８】
2021510141.tif 000011
Ｎ．Ｂ．＝結合しない  ＴＩＧＩＴ抗体ＢＩＡＣＯＲＥ解析
【０１４７】
組換えＨｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴ−ＥＣＤタンパク質に対する抗体の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００によってキャプチャー法を使用して調べた。抗ＴＩＧＩＴ抗体を、チップ上にコーティングされた抗ヒトＦｃ抗体またはタンパク質Ａを使用してキャプチャーした。ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴ−ＥＣＤタンパク質（０〜８ｎＭ）の連続濃度を３０μｌ／ｍｉｎの流速でキャプチャー抗体に注入した。解離領域は６００秒または１２００秒であった。結果を下記の表３に示す。抗ＴＩＧＩＴ抗体のＢｉａｃｏｒｅの結果により、これらの抗ＴＩＧＩＴ抗体がヒトＴＩＧＩＴに対する高親和性バインダーであることが実証された。
【表９】
2021510141.tif 000012
例３  抗ＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ
【０１４８】
ヒトＴＩＧＩＴとそのカウンター受容体ＣＤ２２６は、Ｔ細胞にそれぞれ負または正のシグナル伝達を提供するために、競合してそれらのコリガンドＣＤ１５５に結合し、その結果、ＴＩＧＩＴを発現したＴ細胞の増殖、およびインターロイキン２（ＩＬ−２）などのサイトカイン産生が阻害される。Ｔ細胞活性化時のＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断における抗ＴＩＧＩＴ抗体の機能を評価するために、堅牢なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースの機能アッセイを確立した。簡単に言えば、ヒトＴＩＧＩＴとそのカウンター受容体ＣＤ２２６を、固定化されたヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上で同時に過剰発現させ、一方で、それらのコリガンドヒトＣＤ１５５は、ヒトバーキットリンパ腫Ｒａｊｉ細胞上で強制的に過剰発現させた。これら２つの細胞タイプをスーパー抗原の存在下で共培養した場合、ＴＩＧＩＴ−ＣＤ１５５ライゲーションによってＪｕｒｋａｔ細胞に送達された負のシグナル伝達は、インターロイキン２の産生を阻害する。連続希釈された抗ＴＩＧＩＴ抗体を培養システムに追加すると、抗体はＪｕｒｋａｔ−ＴＩＧＩＴ細胞のＩＬ−２産生を用量依存的に増強する。このアッセイを利用することにより、上述のキメラ抗体をスクリーニングした。これらの抗体のＥＣ５０を表４に示す。これらの抗体のうち、９０Ｄ９、１０１Ｅ１および３５０Ｄ１０抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞媒介性ＩＬ−２産生の増強に優れた効力を示した。したがって、９０Ｄ９、１０１Ｅ１および３５０Ｄ１０を、ヒト化および更なる特性評価のために選択した。
【表１０】
2021510141.tif 000013
例４  マウスｍＡｂヒト化および親和性成熟
Ａ．９０Ｄ９
【０１４９】
マウス抗体９０Ｄ９可変領域遺伝子を用いて、ヒト化ＭＡｂを作製した。このプロセスの最初のステップでは、９０Ｄ９のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列をヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体的に最も一致するヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を同定した。重鎖の場合、最も近いヒトマッチはＩＧＨＶ１−３＊０１遺伝子であった。軽鎖の場合、最適なヒトマッチはＩＧＫＶ１−３９＊０１遺伝子であった。
【０１５０】
次に、９０Ｄ９  ＶＨのＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３０）およびＣＤＲ３（配列番号３１）配列がＩＧＨＶ１−３＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植されたヒト化可変ドメイン配列を設計し、９０Ｄ９軽鎖のＣＤＲ１（配列番号３２）、ＣＤＲ２（配列番号３３）および３（配列番号３４）をＩＧＫＶ１−３９＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植した。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えた場合に結合および／またはＣＤＲ構造に影響を及ぼし得る任意のフレームワーク位置があるかどうかを判断した。重鎖の場合、ヒトフレームワークのＫ１２、Ｖ２０、Ａ２４、Ｒ３８、Ｍ４８、Ｖ６８、Ｉ７０、Ｒ７２およびＴ９１（Ｋａｂａｔ番号付け）を同定し、それらの対応するマウスアミノ酸、すなわち、Ｋ１２Ｖ、Ｖ２０Ｌ、Ａ２４Ｔ、Ｒ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｉ７０Ｌ、Ｒ７２ＶおよびＴ９１Ｓに復帰突然変異させた。軽鎖の場合、ヒトフレームワークのＡ１３、Ｌ７３、Ｌ７８およびＶ１０４（Ｋａｂａｔ番号付け）を同定し、それらの対応するマウスアミノ酸、すなわち、Ａ１３Ｔ、Ｌ７３Ｆ、Ｌ７８ＶおよびＶ１０４Ｌに復帰突然変異させた。
【表１１】
2021510141.tif 000014
【０１５１】
ヒト化配列を表６に示す：９０Ｄ９−ＶＨ１、９０Ｄ９−ＶＨ２、９０Ｄ９−ＶＨ３、９０Ｄ９−ＶＨ４、９０Ｄ９−ＶＬ１、９０Ｄ９−ＶＬ２、９０Ｄ９−ＶＬ３および９０Ｄ９−ＶＬ４。
【表１２】
2021510141.tif 000015
Ｂ．３５０Ｄ１０
【０１５２】
マウス抗体３５０Ｄ１０可変領域遺伝子を用いてヒト化抗体を作製した。このプロセスの最初のステップでは、３５０Ｄ１０のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列をヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体的に最もマッチするヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を検索した。重鎖の場合、最も近いヒトマッチはＩＧＨＶ３−７＊０１／ＪＨ６遺伝子であった。軽鎖の場合、最適なヒトマッチはＩＧＫＶ１−３３＊０１／ＪＫ２遺伝子であった。次に、３５０Ｄ１０  ＶＨのＣＤＲ１（配列番号４３）、ＣＤＲ２（配列番号４４）およびＣＤＲ３（配列番号４５）配列がＩＧＨＶ３−７＊０１／ＪＨ６遺伝子のフレームワーク配列に移植されたヒト化可変ドメイン配列を設計し、３５０Ｄ１０軽鎖のＣＤＲ１（配列番号４６）、ＣＤＲ２（配列番号４７）および３（配列番号４８）をＩＧＫＶ１−３３＊０１／ＪＫ２遺伝子のフレームワーク配列に移植した。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えた場合に結合および／またはＣＤＲ構造に影響を及ぼし得る任意のフレームワーク位置があるかどうかを判断した。重鎖の場合、ヒトフレームワークのＱ３、Ｇ４４、Ｓ８２（Ｋａｂａｔ番号付け）を同定し、それらの対応するマウスアミノ酸、すなわち、Ｑ３Ｋ、Ｇ４４ＲおよびＳ８２Ｒに復帰突然変異させた。軽鎖の場合、ヒトフレームワークのＱ３、Ｋ４２、Ａ４３、Ｙ８７（Ｋａｂａｔ番号付け）を同定し、それらの対応するマウスアミノ酸、すなわち、Ｑ３Ｖ、Ｋ４２Ｑ、Ａ４３Ｓ、Ｙ８７Ｆに復帰突然変異させた。
【表１３】
2021510141.tif 000016
【０１５３】
ヒト化配列を表８にリストする：３５０Ｄ１０−ＶＨ１、３５０Ｄ１０−ＶＨ２、３５０Ｄ１０−ＶＨ３、３５０Ｄ１０−ＶＨ４、３５０Ｄ１０−ＶＬ１、３５０Ｄ１０−ＶＬ２、３５０Ｄ１０−ＶＬ３および３５０Ｄ１０−ＶＬ４。
【表１４】
2021510141.tif 000017
Ｃ．１０１Ｅ１
【０１５４】
マウス抗体１０１Ｅ１可変領域遺伝子を用いてヒト化抗体ＭＡｂを作製した。このプロセスの最初のステップでは、１０１Ｅ１のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列をヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体的に最もマッチするヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を検索した。重鎖の場合、最も近いヒトマッチはＩＧＨＶ４−３０−４＊０１遺伝子であった。軽鎖の場合、最適なヒトマッチはＩＧＫＶ１−３９＊０１遺伝子であった。次に、１０１Ｅ１  ＶＨのＣＤＲ１（配列番号５７）、ＣＤＲ２（配列番号５８）およびＣＤＲ３（配列番号５９）配列がＩＧＨＶ４−３０−４＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植されたヒト化可変ドメイン配列を設計し、１０１Ｅ１軽鎖のＣＤＲ１（配列番号６０）、ＣＤＲ２（配列番号６１）および３（配列番号６２）をＩＧＫＶ１−３９＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植した。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えた場合に結合および／またはＣＤＲ構造に影響を及ぼし得る任意のフレームワーク位置があるかどうかを判断した。重鎖の場合、ヒトフレームワークのＩ４９、Ｖ６８、Ｖ７２、Ｌ８３およびＡ９７（Ｋａｂａｔ番号付け）を同定し、それらの対応するマウスアミノ酸、すなわち、Ｉ４９Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ｖ７２Ｒ、Ｌ８３ＦおよびＡ９７Ｓに復帰突然変異させた。軽鎖の場合、ヒトフレームワークのＡ１３、Ｌ７３およびＬ７８（Ｋａｂａｔ番号付け）を同定し、それらの対応するマウスアミノ酸、すなわち、Ａ１３Ｔ、Ｌ７３ＦおよびＬ７８Ｖに復帰突然変異させた。
【表１５】
2021510141.tif 000018
【０１５５】
ヒト化配列を表１０にリストする：１０１Ｅ１−ＶＨ１、１０１Ｅ１−ＶＨ２、１０１Ｅ１−ＶＨ３、１０１Ｅ１−ＶＨ４、１０１Ｅ１−ＶＬ１、１０１Ｅ１−ＶＬ２、１０１Ｅ１−ＶＬ３および１０１Ｅ１−ＶＬ４。
【表１６】
2021510141.tif 000019
定義
ヒト化ＶＨおよびＶＫ遺伝子を合成により生成し、次にそれぞれヒトγ１およびヒトκ定常ドメインを含むベクターにクローニングした。ヒトＶＨとヒトＶＫのペアリングにより、親抗体ごとに１６のヒト化抗体を作製した。
Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の親和性ランキング
【０１５６】
ヒト化抗体の結合動態を調査するために、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８ＫまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用して親和性ランキング（９０Ｄ９の場合は３．１２５ｎＭ、１２．５ｎＭおよび５０ｎＭ、３５０Ｄ１０の場合は１２．５ｎＭおよび２５ｎＭ、１０１Ｅ１の場合は３．１２５ｎＭ、１２．５ｎＭおよび５０ｎＭ）を行った。表１１に示されるように、９０Ｄ９Ｈ−３、９０Ｄ９Ｈ−５、９０Ｄ９Ｈ−６、９０Ｄ９Ｈ−７、３５０Ｄ１０Ｈ−４、３５０Ｄ１０Ｈ−８、３５０Ｄ１０Ｈ−１２、３５０Ｄ１０Ｈ−１６、１０１Ｅ１Ｈ−６および１０１Ｅ１Ｈ−１３は優れた親和性を示した。
【表１７】
2021510141.tif 000020
例５  ＴＩＧＩＴ抗体ＢＩＡＣＯＲＥ解析
【０１５７】
それぞれ９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈと呼ばれる３つのヒト化抗体の組換えＨｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴ−ＥＣＤタンパク質に対する結合を、キャプチャー法を使用してＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００によって調べた。抗ＴＩＧＩＴ抗体を、チップ上にコーティングされた抗ヒトＦｃ抗体またはタンパク質Ａを使用してキャプチャーした。Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴ−ＥＣＤタンパク質（０〜８ｎＭ）の連続濃度を３０μｌ／ｍｉｎの流速でキャプチャー抗体に注入した。解離領域は６００秒または１２００秒であった。結果を下記の表１２に示す。抗ＴＩＧＩＴ抗体のＢｉａｃｏｒｅの結果により、これらの抗ＴＩＧＩＴ抗体がヒトＴＩＧＩＴに対する高親和性バインダーであることが示された。表に示されるように、９０Ｄ９Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈは、個々の親キメラ抗体に匹敵する親和性を示し、一方で、１０１Ｅ１Ｈは、ヒト化後にわずかな親和性の喪失を示す。
【表１８】
2021510141.tif 000021
例６  抗ＴＩＧＩＴヒトモノクローナル抗体の結合特性
【０１５８】
この例では、ＴＩＧＩＴタンパク質に対するヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合特性をテストした。
ＴＩＧＩＴタンパク質に対する抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の結合特性
【０１５９】
結合特異性を評価するために、９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈモノクローナル抗体を、Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴおよびカニクイザルＴＩＧＩＴ抗原のＥＬＩＳＡ結合試験に供した。ＥＬＩＳＡの結果を図１にまとめており、これは、ヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合のＥＣ５０を示し、９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈ、３５０Ｄ１０ＨがヒトＴＩＧＩＴに対する強力で選択的な結合剤であることを実証している。９０Ｄ９Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈは、カニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合を示さない１０１Ｅ１Ｈを除いて、ヒトＴＩＧＩＴに匹敵するカニクイザルＴＩＧＩＴに対する結合能を示す。
ＴＩＧＩＴを発現したＪｕｒｋａｔ細胞株に対する抗ＴＩＧＩＴヒトモノクローナル抗体の結合特性
【０１６０】
ＴＩＧＩＴを過剰発現したＪｕｒｋａｔ細胞株を使用して、細胞表面に発現したＴＩＧＩＴに対するＴＩＧＩＴ抗体の結合能を評価した。ヒト化抗体をＦＡＣＳ緩衝液で連続的に希釈し、Ｊｕｒｋａｔ−ＴＩＧＩＴ−ＣＤ２２６細胞と共に氷上で３０分間インキュベートした。標識された細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて氷上で３０分間、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて標識した。得られた細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。標識された細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）でのフローサイトメトリーによって蛍光強度について評価した。図２に示されるように、９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈは、Ｊｕｒｋａｔ細胞株上に発現したＴＩＧＩＴに対して用量依存的に結合することができる。
活性化されたヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合特性
【０１６１】
ＴＩＧＩＴを、活性化または消耗したヒトＴ細胞上に発現させる。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８磁気ビーズを使用して単離した。精製ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８で７２時間刺激した。抗体をＦＡＣＳ緩衝液で段階的に希釈した。結合を評価するために、氷上で３０分間、さまざまな濃度のＴＩＧＩＴ抗体を活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に添加した。標識された細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて氷上で３０分間、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて標識した。得られた細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。標識された細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）でのフローサイトメトリーによって蛍光強度について評価した。図３に示されるように、９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体は、活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現したＴＩＧＩＴに対して用量依存的に結合することができる。
例７  抗ＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体の機能特性
ＴＩＧＩＴタンパク質のそのリガンドＣＤ１５５に対する結合の遮断
【０１６２】
ＴＩＧＩＴのそのリガンドＣＤ１５５に対する結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力を評価するために、例１に前述したＥＬＩＳＡベースの受容体遮断アッセイを使用した。９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体を、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬから段階希釈した。図４に示されるように、９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体は、ＣＤ１５５のその受容体ＴＩＧＩＴに対する結合を用量依存的に阻害することができる。
Ｋ５６２細胞上に発現したＴＩＧＩＴのそのリガンドＣＤ１５５に対する結合の遮断
【０１６３】
細胞表面ＴＩＧＩＴのそのリガンドＣＤ１５５に対する結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力を評価するために、細胞ベースの受容体遮断アッセイを設計した。簡単に言えば、ヒトＴＩＧＩＴを、ヒト慢性骨髄性白血病リンパ芽球細胞株Ｋ５６２細胞上に過剰発現させた。抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬから段階希釈し、ＴＩＧＩＴを過剰発現させたＫ５６２細胞（１×１０５細胞／テスト）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次に、ｈＣＤ１５５−ｈＦｃタンパク質（３μｇ／ｍＬ）を抗体−細胞複合体と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＰＥ抗ヒトＣＤ１５５抗体（Ｒ＆Ｄ、ＦＡＢ２５３０１Ｐ）を使用して、ｈＣＤ１５５を、それが細胞表面上に発現したＴＩＧＩＴに結合したときに検出した。図５に示されるように、９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体は、ＣＤ１５５の細胞表面上に発現したその受容体ＴＩＧＩＴに対する結合を用量依存的に阻害することができる。
Ｊｕｒｋａｔ機能アッセイにおけるＴＩＧＩＴ抗体によるＴＩＧＩＴ−ＣＤ１５５シグナル媒介性ＩＬ−２産生阻害の遮断
【０１６４】
ヒト化抗体のＴＩＧＩＴ遮断機能を評価するために、例３に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｊｕｒｋａｔ機能アッセイを使用した。図６に記載されるように、９０Ｄ９Ｈ、１０１Ｅ１Ｈおよび３５０Ｄ１０Ｈ抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞媒介性ＩＬ−２産生を用量依存的に増強することができる。
例８  １０１Ｅ１の親和性成熟
【０１６５】
１０１Ｅ１のＫｏｆｆを最適化するために、この例では親和性成熟手順を開始した。簡単に言えば、ＣＤＲ領域でアラニンスキャニングを使用してパラトープマッピングを行って、ＴＩＧＩＴに対する抗体の結合または産生に影響を及ぼす主要な残基を同定した。次に、主要な残基を囲むＣＤＲアミノ酸を選択してＮＮＫライブラリーを構築し、親和性ランキングによりスクリーニングして、ヒトＴＩＧＩＴのオフレートは改善するが、抗体の発現レベルには影響を及ぼさない変異を同定した。１０１Ｅ１のＫｏｆｆ結合を改善することができる突然変異アミノ酸を表１３にリストする。これらのアミノ酸のすべての変異型を組み込んだコンビナトリアルライブラリーを構築し、スクリーニングした。ヒトＴＩＧＩＴのオフレートがより低いリードクローンの配列を表１４に示す。これらの配列の抗体を生成し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００により親和性ランキングを行った。結果を表１５に示す。ここで説明されるように、１０１Ｅ１ＨＭ−３は、親抗体と比較してＫｏｆｆレートの向上を示す。
【表１９】
2021510141.tif 000022
【表２０】
2021510141.tif 000023
【表２１】
2021510141.tif 000024
例９  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースの機能アッセイにおける抗ＴＩＧＩＴと抗ＰＤＬ１抗体の相乗効果
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によるＩＬ２放出の刺激
【０１６６】
Ｔ細胞活性化を高めた時の抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤＬ１抗体の相乗効果を評価するために、堅牢なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースの機能アッセイを確立した。簡単に言えば、ヒトＴＩＧＩＴ、ＣＤ２２６およびＰＤ１を、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上で同時に過剰発現させ、一方で、それらの個々のリガンドＣＤ１５５およびＰＤＬ１はＲａｊｉ細胞上で強制的に過剰発現させた。これら２つの細胞タイプをスーパー抗原の存在下で共培養した場合、ＴＩＧＩＴ−ＣＤ１５５およびＰＤ１−ＰＤＬ１ライゲーションによってＪｕｒｋａｔ細胞に送達された負のシグナル伝達は、ＩＬ−２の産生を阻害した。図７に示されるように、連続希釈された抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗ＰＤＬ１抗体を培養システムに追加すると、抗体は、Ｊｕｒｋａｔ−ＴＩＧＩＴ細胞のＩＬ−２産生を穏やかにかつ用量依存的に増強することができた。しかしながら、抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤＬ１抗体の組合せにより、ＩＬ−２産生が有意に増強され、これら２つの抗体の強力な相乗効果が示された。
活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ放出の刺激
【０１６７】
初代ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に及ぼす抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤＬ１抗体の相乗効果を、健康なドナーからＰＢＭＣを使用してさらに研究した。簡単に言えば、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アクチベーターを構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞、ヒトＣＤ１５５およびＰＤＬ１（ＣＨＯ−ＴＣＲ−ＣＤ１５５−ＰＤＬ１細胞）を１ウェルあたり３５，０００個の細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。健康なドナーから単離された精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１ウェルあたり５０，０００個の細胞の密度でＣＨＯ−ＴＣＲ−ＣＤ１５５−ＰＤＬ１細胞と共にインキュベートした。次に、段階希釈された抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤＬ１、またはこれら２つの抗体の組合せを３日間共培養システムに追加し、標準的なＥＬＩＳＡキットを使用してＩＦＮ−γ測定のために培地を回収した。図８に示されるように、抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＰＤＬ１抗体は、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を濃度依存的に弱く刺激し得るが、これら２つの抗体の組合せはＩＦＮ−γ産生を有意に増強し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの初代ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に及ぼすこれら２つの抗体の強力な相乗効果を実証した。
例１０  抗ＴＩＧＩＴ抗体単独療法のｉｎ  ｖｉｖｏ効力
【０１６８】
マウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞をＴＩＧＩＴヒト化Ｃ５６／ＢＬ６マウスの皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。マウスは、平均腫瘍体積が１５０±５０ｍｍ３に達したら腫瘍体積に従って分類し、３日毎に異なるＴＩＧＩＴ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を６回投与した。腫瘍体積は週２回監視した。図９に示されるように、９０Ｄ９および１０１Ｅ１は、腫瘍増殖の穏やかな阻害を示した（ＴＧＩ：３０．４％および３０．９％；Ｐ値：分類後１８日目に０．０３４および０．１３６）。
【０１６９】
次に、抗ＴＩＧＩＴ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効力に及ぼすＡＤＣＣ効果の寄与を評価した。Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行う前に、ヒトシステムにおいて強力なＡＤＣＣ効果を示した野生型ヒトＩｇＧ１を有する９０Ｄ９、１０１Ｅ１および３５０Ｄ１０のＡＤＣＣ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイで評価した。簡単に言えば、ＴＩＧＩＴを過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ−ＴＩＧＩＴ）を、１ウェルあたり２Ｅ４の密度で標的細胞として使用した。Ｆｃγ受容体ＣＤ１６ａ（ＮＫ９２−ＣＤ１６ａ）の発現が強化されたヒトナチュラルキラー細胞株ＮＫ９２細胞をエフェクター細胞として使用した。ＮＫ９２−ＣＤ１６ａをＪｕｒｋａｔ−ＴＩＧＩＴ細胞と３：１の比率で４時間共培養した。連続希釈された抗ＴＩＧＩＴ抗体を共培養システムに追加した。抗ＲＡＣ−ｈＩｇＧ１抗体を、無関係のネガティブコントロールとして使用した。細胞毒性を、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出によって測定した。図１０に示されるように、３つの抗ＴＩＧＩＴ抗体はすべて、５０％の最大ＡＤＣＣ活性および同等のＥＣ５０でＪｕｒｋａｔ−ＴＩＧＩＴ細胞を効果的に溶解し、これらの抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＩＧＩＴを発現する細胞に細胞毒性を誘発し得ることを示している。
【０１７０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ効力に及ぼすＡＤＣＣ効果の寄与を評価するために、強力なＡＤＣＣ効果を有するｍＩｇＧ２ａをＡＤＣＣ有効アイソタイプとして使用し、マウスシステムにおいてＡＤＣＣ無効アイソタイプであるｍＩｇＧ１と比較した。図１１に示されるように、９０Ｄ９−ｍＩｇＧ２ａは、９０Ｄ９−ｍＩｇＧ１と比較して腫瘍増殖を抑制する強力な効力を示した（ＴＧＩ：４７．２％対３１．７％；Ｐ値：０．０１２対０．０６６）。１０１Ｅ１の場合、１０１Ｅ１−ｍＩｇＧ２ａは１０１Ｅ１−ｍＩｇＧ１よりも強い腫瘍阻害効果を示した（ＴＧＩ：６８．８％対３０．９％、Ｐ値：０対０．１３６）。用量と効力の関係を評価するために、ＭＣ３８マウスモデルでは、複数回用量の３５０Ｄ１０−ｍＩｇＧ２ａ（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。図１２および図１３に示されるように、３５０Ｄ１０−ｍＩｇＧ２ａの３つすべての用量群での単剤治療は、賦形剤と比較して腫瘍増殖を有意に抑制し、初回投与から２４日後に１０ｍｇ／ｋｇで最大７７．５％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を達成した（Ｐ値＜０．０５、表１６）。対照的に、３５０Ｄ１０−ｍＩｇＧ１治療は、非常に弱い腫瘍阻害を示し、ＴＩＧＩＴ抗体による抗腫瘍効力に対するＡＤＣＣ機能の重要性を示している。
【表２２】
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注：ａ、平均±ＳＤ；ｂ、スチューデントのｔ検定による初回投与から２４日後の抗体治療群と賦形剤群との間の腫瘍体積の統計分析。Ｐ＜０．０５が統計的に有意であると見なされる。
【０１７１】
抗ＴＩＧＩＴ抗体媒介性腫瘍増殖阻害のメカニズムを評価するために、研究の終わりに、腫瘍浸潤性細胞を、賦形剤、３５０Ｄ１０−ｍＩｇＧ１および３５０Ｄ１０−ｍＩｇＧ２ａ  １０ｍｇ／ｋｇの群の腫瘍組織から単離した（図１２）。脾臓および腫瘍浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合をＦＡＣＳで解析した。図１４に示されるように、ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞は、賦形剤および３５０Ｄ１０−ｍＩｇＧ１群と比較して３５０Ｄ１０−ｍＩｇＧ２ａ処置群の脾臓および腫瘍組織の両方で有意に濃縮された。ＮＫ細胞は３つの群間で有意な変化はなかった。興味深いことに、３５０Ｄ１０−ｍＩｇＧ２ａの群では、他の２つの群と比較してＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の穏やかな減少が観察されたが、この変化は統計的に有意ではなかった。これらのデータは、ＡＤＣＣ機能を備えた抗ＴＩＧＩＴ抗体が腫瘍微小環境を調節して抗腫瘍ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を促進することで腫瘍増殖を抑制し得ることを示している。
例１１  抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＰＤＬ１抗体の併用療法のｉｎ  ｖｉｖｏ効力
【０１７２】
抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＰＤＬ１抗体の相乗効果をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、ヒト化ＰＤＬ１を含むＭＣ３８腫瘍細胞をＰＤＬ１およびＴＩＧＩＴ二重ヒト化マウスに移植した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したら、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤＬ１、またはこれら２つの抗体の組合せを、３日毎に１ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）に６回投与した。結果は、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗ＰＤＬ１抗体の単剤療法が、初回投与から２０日後にＩｇＧ群と比較して腫瘍増殖を穏やかに阻害したことを示した（ＴＧＩ：４７．５％および２４．５％）（図１５）。これら２つの抗体の組合せは、ＩｇＧ群と比較して腫瘍増殖の抑制に有意な相乗効果を示し（ＴＧＩ：５８．５％、Ｐ値：０．０４５）、将来の免疫療法における併用療法の潜在的な利益を示している。
【０１７３】
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図されている、記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に同等である任意の組成物または方法は、本開示の範囲内にある。本開示の精神または範囲から逸脱することなく、本開示の方法および組成物にさまざまな修正および変更を行うことができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内に入るという条件で、本開示の修正および変更を網羅することを意図している。
【０１７４】
本明細書で言及されるすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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