(57)【要約】  本発明は、患者のサンプルから得た血中循環腫瘍ＤＮＡの分析を介して腫瘍の遺伝的不均一性を測定することを含む、結腸直腸がん患者における治療法に対する応答を予測する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの固形腫瘍サンプルおよび少なくとも１つの血漿サンプルを含む、患者から得たサンプルを用意するステップ、
（ｂ）サンプルにおいて、表１で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、
（ｃ）バイオマーカー配列における遺伝的不均一性の尺度を決定するステップであって、不均一性の尺度が、血漿内回収率（ＰＲＲ）、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、およびマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）から選択されるステップ、
（ｄ）遺伝的不均一性の尺度が低ければ、治療レジメンに対して正に応答する可能性が高いと患者を識別するステップ、または
（ｅ）遺伝的不均一性の尺度が高ければ、治療レジメンに対して正に応答する可能性が高くないと患者を識別するステップ
を含む、治療レジメンに対して正に応答する可能性が高いとがん患者を識別するための方法。
【請求項２】
がんが、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸がん（ＣＲＣ）の中から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療法に対する正の応答が、無増悪生存期間（ＰＦＳ）の増大および全生存期間（ＯＳ）の増大から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療レジメンが、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ−ベバシズマブでの処置およびＦＯＬＦＯＸ−ベバシズマブでの処置から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
遺伝的不均一性の尺度が、血漿内回収率（ＰＲＲ）、組織内回収率（ＴＲＲ）、およびジャカード係数（ＪＩ）の１つまたは複数として測定される、組織−血漿の一致である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遺伝的不均一性の尺度が、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＭＡＴＨが、染色体重み付きＭＡＴＨ（ｃｗＭＡＴＨ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝的不均一性の尺度がマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）であり、高い不均一性がＭＶＣＧ＞０であり、低い不均一性がＭＶＧＣ＝０である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
血漿サンプルが、化学療法の前、間および後の２つ以上の時点の間で回収され、遺伝的不均一性の尺度が時点間で比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝的不均一性の尺度が、遺伝子切断の存在である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）少なくとも１つの固形腫瘍サンプルおよび少なくとも１つの血漿サンプルを含む、患者から得たサンプルを用意するステップ、
（ｂ）サンプルにおいて、表１で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、
（ｃ）バイオマーカー配列における遺伝的不均一性の尺度を決定するステップであって、不均一性の尺度が、血漿内回収率（ＰＲＲ）、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、およびマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）から選択されるステップ、
（ｄ）遺伝的不均一性の尺度が低ければ、より消極的な治療レジメンに対して正に応答する可能性が高いと患者を識別し、より消極的な治療レジメンを投与するステップ、または
（ｅ）遺伝的不均一性の尺度が高ければ、より消極的な治療レジメンに対して正に応答する可能性が高くないと患者を識別し、より積極的な治療レジメンを投与するステップ
を含む、ステージＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸がん（ＣＲＣ）の患者を処置する方法。
【請求項１２】
患者におけるがんの遺伝的不均一性の尺度を決定するためのアルゴリズムを実装するように設計されたコンピュータシステムであって、アルゴリズムが、患者のサンプルから得た１つまたは複数のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析し、かつ、突然変異の検出、突然変異頻度のスコアリング、エラーの訂正、サンプルが突然変異陽性であるか否かの最終決定、から選択される１つまたは複数のステップと、血漿内回収率（ＰＲＲ）、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、およびマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）から選択される値を決定して、がんの遺伝的不均一性を決定するステップとを含む、コンピュータシステム。
【請求項１３】
がんの遺伝的不均一性の尺度を決定することによってがん患者に対する治療法を選択するためのアルゴリズムを実装するように設計されたコンピュータシステムであって、アルゴリズムが、患者のサンプルから得た１つまたは複数のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析し、かつ、突然変異の検出、突然変異頻度のスコアリング、エラーの訂正、サンプルが突然変異陽性であるか否かの最終決定、から選択される１つまたは複数のステップと、血漿内回収率（ＰＲＲ）、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、およびマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）から選択される値を決定して、がんの遺伝的不均一性を決定し、遺伝的不均一性が高ければより積極的な治療法を選択し、遺伝的不均一性が低ければより消極的な治療法を選択するステップとを含む、コンピュータシステム。
【請求項１４】
（ａ）少なくとも１つの固形腫瘍サンプルおよび少なくとも１つの血漿サンプルを含む、患者から得たサンプルを用意するステップ、
（ｂ）サンプルにおいて、表１で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、
（ｃ）血漿内回収率（ＰＲＲ）としてのバイオマーカー配列における遺伝的不均一性の尺度を決定するステップ、
（ｄ）ＰＲＲが高ければイリノテカンを投与するステップ、または
（ｅ）ＰＲＲが低ければイリノテカンを投与しないステップ
を含む、ステージＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸がん（ＣＲＣ）の患者を処置する方法。
【請求項１５】
（ａ）少なくとも１つの固形腫瘍サンプルおよび少なくとも１つの血漿サンプルを含む、患者から得たサンプルを用意するステップ、
（ｂ）サンプルにおいて、表１で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、
（ｃ）患者のサンプルにおける遺伝的不均一性の尺度を決定するステップ、
（ｄ）遺伝的不均一性が高ければ転移標的療法薬を投与するステップ
を含む、ステージＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸がん（ＣＲＣ）の患者を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、がん患者の核酸ベースの試験の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸がん（ＣＲＣ）患者の多くは、より早期のステージの疾患から進行した後に転移性疾患と診断される。この時点で、予後は不良であり、効果的な治療法の最適な選択が重要である。現在のところ、ｍＣＲＣ患者は、ＲＡＳ野生型状態に基づいて、いずれかの標的化された抗ＥＧＦＲ療法と化学療法とを受けるか、又は、誰もが抗血管新生と化学療法とを受けることができる。従来、外科標本を突然変異の存在について試験することができた。最新の診断アプローチは、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）で見られる突然変異に依拠して、腫瘍の耐性および再発を予測する。例えば、耐性突然変異の突然変異対立遺伝子頻度（ＡＦ）の増大は、特定の標的療法に対する耐性の獲得を示す。しかし、適切な治療法を選択するために、治療前から治療後までの腫瘍の進展をより全体的に評価することが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一部の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの固形腫瘍サンプルおよび少なくとも１つの血漿サンプルを含む、患者から得たサンプルを用意するステップ；サンプルにおいて、表１で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ；バイオマーカー配列における遺伝的不均一性の尺度を決定するステップであって、不均一性の尺度が、血漿内回収率（ＰＲＲ）、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、およびマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）から選択されるステップ；遺伝的不均一性の尺度が低ければ、治療レジメンに対して正に応答する可能性が高いと患者を識別するステップ；または遺伝的不均一性の尺度が高ければ、治療レジメンに対して正に応答する可能性が高くないと患者を識別するステップを含む、治療レジメンに対して正に応答する可能性が高いとがん患者を識別するための方法である。がんは、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸がん（ＣＲＣ）でもよい。治療法に対する正の応答は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）の増大または全生存期間（ＯＳ）の増大でもよい。治療レジメンは、同時または連続的である、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ−ベバシズマブでの処置およびＦＯＬＦＯＸ−ベバシズマブでの処置でもよい。
【０００４】
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の尺度は、血漿内回収率（ＰＲＲ）、組織内回収率（ＴＲＲ）、およびジャカード係数（ＪＩ）の１つまたは複数として測定される、組織−血漿の一致である。ＰＲＲでは、高い不均一性はＰＲＲ＝０であり、低い不均一性はＰＲＲ＝１であり、中間の不均一性は０＜ＰＲＲ＜１である。ＰＲＲは、血漿バリアント全体に対する、血漿と対応（ｍａｔｃｈｅｄ）組織との間で共有されたバリアントの比率として決定し得る。
【０００５】
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の尺度は、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）である。高い不均一性は、中央値より上、最高の三分位中、または最高の四分位中にあるＭＡＴＨでもよい。ＭＡＴＨは、式１に従って決定してもよく、または、式２に従って例えば決定される、染色体重み付きＭＡＴＨ（ｃｗＭＡＴＨ）でもよい。
【０００６】
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の尺度はマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）であり、高い不均一性はＭＶＣＧ＞０であり、低い不均一性はＭＶＧＣ＝０である。ＭＶＧＣは、複数の突然変異を有する遺伝子の数として決定し得る。
【０００７】
一部の実施形態において、血漿サンプルが、化学療法の前、間および後の２つ以上の時点の間で回収され、遺伝的不均一性の尺度が時点間で比較され、そして、比較によって時点間での増大が検出されれば、遺伝的不均一性は高い。
【０００８】
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の尺度は、例えばＡＰＣ、ＴＰ５３、またはＦＢＸＷ７における、遺伝子切断の存在である。遺伝子切断の存在は、治療後の血漿においてのみ測定し得る。
【０００９】
一部の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの固形腫瘍サンプルおよび少なくとも１つの血漿サンプルを含む、患者から得たサンプルを用意するステップ；サンプルにおいて、表１で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ；バイオマーカー配列における遺伝的不均一性の尺度を決定するステップであって、不均一性の尺度が、血漿内回収率（ＰＲＲ）、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、およびマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）から選択されるステップ；遺伝的不均一性の尺度が低ければ、より消極的な治療レジメンに対して正に応答する可能性が高いと患者を識別し、より消極的な治療レジメンを投与するステップ；または遺伝的不均一性の尺度が高ければ、より消極的な治療レジメンに対して正に応答する可能性が高くないと患者を識別し、より積極的な治療レジメンを投与するステップを含む、ステージＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸がん（ＣＲＣ）の患者を処置する方法である。より積極的な治療レジメンは、より高い用量の治療法、１つまたは複数の治療剤の追加、およびより消極的な治療レジメンと比較して長い治療期間でもよい。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明は、患者におけるがんの遺伝的不均一性の尺度を決定するためのアルゴリズムを実装するように設計されたコンピュータシステムであって、アルゴリズムが、患者のサンプルから得た１つまたは複数のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析し、かつ、突然変異の検出、突然変異頻度のスコアリング、エラーの訂正、サンプルが突然変異陽性であるか否かの最終決定、から選択される１つまたは複数のステップと、血漿内回収率（ＰＲＲ）、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、およびマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）から選択される値を決定して、がんの遺伝的不均一性を決定するステップとを含む、コンピュータシステムである。
【００１１】
一部の実施形態において、本発明は、がんの遺伝的不均一性の尺度を決定することによってがん患者に対する治療法を選択するためのアルゴリズムを実装するように設計されたコンピュータシステムであって、アルゴリズムが、患者のサンプルから得た１つまたは複数のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析し、かつ、突然変異の検出、突然変異頻度のスコアリング、エラーの訂正、サンプルが突然変異陽性であるか否かの最終決定、から選択される１つまたは複数のステップと、血漿内回収率（ＰＲＲ）、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、およびマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）から選択される値を決定して、がんの遺伝的不均一性を決定し、遺伝的不均一性が高ければより積極的な治療法を選択し、遺伝的不均一性が低ければより消極的な治療法を選択するステップを含む、コンピュータシステムである。
【００１２】
一部の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの固形腫瘍サンプルおよび少なくとも１つの血漿サンプルを含む、患者から得たサンプルを用意するステップ；サンプルにおいて、表１で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ；血漿内回収率（ＰＲＲ）を決定し、ＰＲＲが高ければ（例えば、≧０．８）イリノテカンを投与し、ＰＲＲが低ければ（例えば、＜０．８）イリノテカンを投与しないステップを含む、ステージＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸がん（ＣＲＣ）の患者を処置する方法である。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの固形腫瘍サンプルおよび少なくとも１つの血漿サンプルを含む、患者から得たサンプルを用意するステップ；サンプルにおいて、表１で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ；患者のサンプルにおける遺伝的不均一性の尺度を決定するステップ；遺伝的不均一性が高ければ転移標的療法薬を投与するステップを含む、ステージＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または結腸直腸がん（ＣＲＣ）の患者を処置する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】治療応答予測研究（ＳＴＥＡＭ試験）の設計を示す図である。
【図２】血漿内回収率（ＰＲＲ）によってグループ分けされた患者の全生存期間（ＯＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図３】血漿内回収率（ＰＲＲ）によってグループ分けされた患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図４】治療前に測定された突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）によってグループ分けされた患者の全生存期間（ＯＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図５】治療後に測定された突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）によってグループ分けされた患者の全生存期間（ＯＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図６】治療後に検出された遺伝子切断突然変異の存在によってグループ分けされた患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図７】治療後に検出されたＡＰＣ遺伝子における切断突然変異の存在によってグループ分けされた患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図８】治療後に測定されたマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）によってグループ分けされた患者の全生存期間（ＯＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図９】治療前の測定と治療後の測定との間の遺伝子数（ＭＶＧＣ）の増大によってグループ分けされた患者の全生存期間（ＯＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図１０】０．８のカットオフを有する血漿内回収率（ＰＲＲ）によってグループ分けされた患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【図１１】０．８のカットオフを有するＰＰＲによって、また治療レジメンによってもグループ分けされた患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）のカプラン・マイヤーグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
以下の定義は限定的なものではなく、本開示の理解の助けとなるものにすぎない。
用語「ＰＦＳ」は、患者の無増悪生存の期間を説明するために、本明細書において使用される。
【００１６】
用語「ＯＳ」は、患者の全生存の期間を説明するために、本明細書において使用される。
用語「血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）」は、腫瘍に由来する、ヒトの血漿または血清で見られる無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の一部分を説明するために、本明細書において使用される。血中循環腫瘍ＤＮＡは、腫瘍の特徴である突然変異によって、非腫瘍ＤＮＡと区別される。
【００１７】
用語「バイオマーカー」は、生物学的または臨床的現象に関連する情報を含むヌクレオチド配列を説明するために、本明細書において使用される。例えば、情報は、ヌクレオチド配列の突然変異の状態の場合もある。バイオマーカーは、遺伝子（コード配列、調節配列、イントロン、もしくはスプライス部位を含む）または遺伝子間領域とし得る。臨床的現象は、患者のサンプルにおける悪性細胞、例えば腫瘍細胞の存在とし得る。
【００１８】
本発明は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者または転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）患者を含む結腸直腸がん（ＣＲＣ）患者のための処置レジメンを選択する方法を記載する。
【００１９】
一部の実施形態において、本発明は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって体細胞突然変異およびがん関連遺伝子における遺伝子変異量を識別するためのバイオマーカーパネルを使用する。一部の実施形態において、本発明は、患者の血液または血液由来サンプルを利用した。サンプルは、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ）を含む無細胞ＤＮＡを含有する血液の任意の画分、例えば血清または血漿を含み得る。一部の実施形態において、サンプルは、処置の間の様々な時点で、例えば、外科手術の前および後、または化学療法レジメンの前、後、および最中に連続的に採取される。一部の実施形態において、固形腫瘍サンプルなどの腫瘍サンプルが、血液サンプルとの比較のために使用される。固形組織サンプルまたは血液サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、新鮮な凍結組織、または保存媒体内に回収された血液組織を含む、ＤＮＡをその中に保存する適切な手段によって回収し得る。
【００２０】
一部の実施形態において、本発明は、遺伝子パネルまたは突然変異パネルまたは体細胞バリアントパネルを含む、バイオマーカーパネルを利用する。突然変異は、遺伝子のコード領域内で生じる場合、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、およびフレームシフト突然変異に対応する、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、欠失および挿入（インデル）を含み得る。他のタイプの突然変異としては、遺伝子の融合および転座が含まれる。このようなパネルの選択、サイズ、および内容は、例えば、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ」という発明の名称の米国特許出願第１４／２０９，８０７号、米国特許出願第１４／７７４，５１８号、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４９８３８号において記載されている。一部の実施形態において、本発明は、パネル内のバイオマーカーの、例えば表１で列挙する遺伝子の配列を決定することを含む。一部の実施形態において、遺伝子の配列全体が決定される。他の実施形態において、遺伝子のコード配列全体が決定される。他の実施形態において、がんにおいて突然変異生成されることが知られている遺伝子の一部分の配列のみが決定される。さらに他の実施形態において、バイオマーカーは、コード配列を伴っていないが、調節配列、またはヒト腫瘍において突然変異することが知られている、機能が未知の配列を伴っている。
【００２１】
本発明の文脈において、バイオマーカーの配列は、当技術分野において知られているあらゆる適切な方法を介して決定し得る。適切な方法は、エラーの割合が低い希少配列を検出するための十分な精度、例えば感度および特異性を有する。一部の実施形態において、シーケンシング方法は、分子バーコード、エラーステレオタイピング、および、例えば上記の特許出願「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ」において記載されている他の化学的または計算的なエラー抑制方法の使用などの、エラー訂正ステップを含む。シーケンシング方法としては、アレイベースのシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ．）、エマルジョンベースのシーケンシング（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、光学測定ベースのシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌ．）、またはナノポアベースのシーケンシング（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌ．）を含む、大規模並列シーケンシング方法を含み得る。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明は、患者の組織および血液を分析してサンプルにおける腫瘍特異的な突然変異を識別および定量することができる、ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ分析キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）などの、バイオマーカーパネルを利用する。ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ分析キットにおけるバイオマーカーパネル（ｅｘｐａｎｄｅｄパネル）のを表１に示す。ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ分析キットにおけるバイオマーカーパネル（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅパネル）の構成を表２に示す。
【００２３】
【表１】
2021513342.tif 000002
【００２４】
【表２】
2021513342.tif 000003
【００２５】
一部の実施形態において、表１に列挙する７７の遺伝子からなるパネルが使用される。一部の実施形態において、表２に列挙する１９７の遺伝子からなるパネルが使用される。一部の実施形態において、突然変異の状態は、化学療法の前、間および後の血漿サンプルにおいて決定され、変化が決定される。一部の実施形態において、突然変異の状態が化学療法前の腫瘍サンプルにおいて決定され、血漿サンプルの突然変異の状態と比較される。
【００２６】
本発明者らは、処置レジメンを定めるために腫瘍不均一性の血漿ベースの測定を使用する方法を考案した。一部の実施形態において、処置は、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩとベバシズマブ（ＢＥＶ）との組み合わせまたはＦＯＬＦＯＸとベバシズマブ（ＢＥＶ）との組み合わせから選択される。一部の実施形態において、本発明は、腫瘍の遺伝的不均一性に基づいて、治療法をより消極的な治療法からより積極的な治療法に変更する方法である。より積極的な治療レジメンは、より高い用量の治療法、１つまたは複数の治療剤の追加、およびより消極的な治療レジメンと比較して長い治療期間、の１つまたは複数を含み得る。
【００２７】
本発明は、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における体細胞突然変異の全プロファイルを分析することによって患者のサンプルにおける遺伝的不均一性を測定するステップを含む。本発明者らは、ｃｔＤＮＡから分かる突然変異で予想外に良好な予測結果を得た。特定の理論に拘束されることは意図しないが、本発明者らは、この予想外に良好な予測結果は、ｃｔＤＮＡが原発性腫瘍の複数の領域に由来する核酸、および複数の転移性腫瘍（未だに検出不可能な転移性腫瘍を含む）に由来する核酸を含み得るという事実に起因すると仮定する。逆に、既存の方法は、単一の腫瘍の単一の領域に相当する腫瘍生検を利用する。一部の実施形態において、本方法は、同一の患者の腫瘍およびｃｔＤＮＡにおける遺伝的不均一性を比較するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、同一の患者から処置の間の複数の時点で回収されたｃｔＤＮＡサンプルにおける遺伝的不均一性を比較するステップを含む。
【００２８】
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の測定は、血漿内回収率（ＰＲＲ）、組織内回収率（ＴＲＲ）、およびジャカード係数（ＪＩ）の１つまたは複数として測定できる血漿−組織の不一致の測定を含む。
【００２９】
一部の実施形態において、血漿−組織の不一致の尺度は、血漿内回収率（ＰＲＲ）である。ＰＲＲは、血漿バリアント全体に対する、血漿と対応組織との間で共有されたバリアントの比率である。完全な組織−血漿の不一致および一致は、それぞれＰＲＲ＝０およびＰＲＲ＝１と定義された。０であるＰＲＲは、血漿で見られたバリアントのいずれも組織において見られなかったことを意味し、不均一性および迅速ながんの進展の強力な指標であり、すなわち、転移性クローンは、原発性腫瘍とバリアントを共有していない。ＰＲＲの使用の例を、図２および図３に示す。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、処置の方法である。本発明者らは、イリノテカンを投与されている患者における腫瘍の遺伝的不均一性を評価した（ＰＲＲとして）。この評価に基づいて、本発明は、がん患者をイリノテカンで処置する方法を含む。本方法は、ＰＲＲを決定するステップを含む。ＰＲＲが高ければ、イリノテカンが患者に投与される。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、肝臓ではない遠隔転移性腫瘍などの転移性腫瘍のリスクが高い患者を処置する方法である。遺伝的不均一性の評価に基づいて、本発明は、がん患者を転移標的処置する方法を含む。本方法は、遺伝的不均一性を決定し、遺伝的不均一性が高ければ転移標的処置を投与するステップを含む。一部の実施形態において、転移標的処置は、脳転移の放射線照射である。一部の実施形態において、転移標的処置は、骨転移によって生じる骨折を減少させるビスホスホネート（ｂｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）の投与である。Ｒｉｉｈｉｍａｋｉら、（２０１６）Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  第６巻、論文番号：２９７６５  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ２９７６５を参照されたい。
【００３２】
一部の実施形態において、血漿−組織の不一致の尺度は、組織内回収率（ＴＲＲ）、すなわち、組織バリアント全体に対する、血漿と対応組織との間で共有されたバリアントの比率である。一部の実施形態において、血漿−組織の不一致の尺度は、ジャカード係数（ＪＩ）、すなわち、血漿または組織のいずれかにおいて検出されたバリアント全体に対する、血漿と対応組織との間で共有されたバリアントの比率である。
【００３３】
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の測定は、染色体重み付きＭＡＴＨ（ｃｗＭＡＴＨ）を含む突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）、および処置前から処置後までのＭＡＴＨまたはｃｗＭＡＴＨの変化として測定できる、血漿ベースの対立遺伝子率の分散の測定を含む。
【００３４】
一部の実施形態において、血漿ベースの対立遺伝子率の分散の尺度は、突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）である。ＭＡＴＨは、ここでは血漿に適用される変異対立遺伝子頻度の分散の尺度である。ＭＡＴＨは、基本的に、変動係数に類似の、分布の中心に対する分布の幅の比率であり、Ｍｒｏｚ，Ｅ．Ａ．＆  Ｒｏｃｃｏ，Ｊ．Ｗ．ＭＡＴＨ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ，ｉｓ  ｈｉｇｈ  ｉｎ  ｐｏｏｒ−ｏｕｔｃｏｍｅ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１３）において最初に定義された。ＭＡＴＨは、式１に従って計算される。
式１:
ＭＡＴＨ＝１００×ＭＡＤ／ｍｅｄｉａｎ（Ｘ）
ＭＡＤ（中央絶対偏差）＝ｍｅｄｉａｎ（｜Ｘｉ−ｍｅｄｉａｎ（Ｘ）｜）。
Ｘｉは、ｉ番目のバリアントの変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）である
ｍｅｄｉａｎ（Ｘ）は、サンプルにおける体細胞バリアントの全てのＶＡＦの中央値である。
【００３５】
ＭＡＴＨは、対応正常組織を用いた組織サンプルについての全エキソームシーケンシングデータを使用して、固形腫瘍にこれまでに適用されている。本発明者らは、対応正常組織を用いずに血漿サンプルについてＭＡＴＨを使用する方法を考案した。本発明者らは、高い血漿分散を有する患者（最高の四分位におけるＭＡＴＨ）の方が、全生存期間が悪いことを見出した。ＭＡＴＨの使用の例を図４および図５に示す。
【００３６】
一部の実施形態において、本方法は、体細胞系と生殖細胞系との単一ヌクレオチドバリアントまたは単一ヌクレオチド多型（ＳＮＶまたはＳＮＰ）を呼び出すステップを含む。本方法はさらに、ホモ接合性のＳＮＶ（ＳＮＰ）を排除し、ヘテロ接合性のＳＮＰ（ｈｅｔＳＮＰ）分布を利用してバックグラウンド不均一性を計算して、ｃｗＭＡＴＨと呼ばれる修正されたスコアを計算するステップを含む。ｃｗＭＡＴＨは、サブクローン性ではなく、コピー数の変動だけで動く対立遺伝子頻度の分散を補正する。
【００３７】
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の尺度は、式２に従って決定されるｃｗＭＡＴＨである。式２:
ｃｗＭＡＴＨ＝１００×｛ｍｅｄｉａｎ（ＣＷｓｃａｌｅ｜Ｘｉ−ｍｅｄｉａｎ（Ｘ）｜）｝／ｍｅｄｉａｎ。
【００３８】
一実施例では、ＣＷｓｃａｌｅおよびｃｗＭＡＴＨは、以下のステップを使用して計算される。
ｉ．  重み付けのために、染色体ごとに０．５からのｈｅｔＳＮＰの平均偏差を計算する（ＣＷｓｃａｌｅ）。平均は、ｓＳＮＶ（体細胞のＳＮＶ）のＡＦに影響し得る潜在的に限局的なＣＮＶを捉えるために、中央値の代わりに選択された。平均偏差は、ｍｅａｎ（ａｂｓ（ｘ−０．５）／０．５）と定義され、式中、ｘは、ｈｅｔＳＮＰ対立遺伝子頻度である。ｘは、０から１の範囲である。ＣＷｓｃａｌｅは、１−ｍｅａｎ（ａｂｓ（ｘ−０．５）／０．５）であり、そのため、予測された０．５からのｈｅｔＳＮＰ偏差がより大きい染色体上のｓＳＮＶは、ＭＡＴＨの計算における中央値により近づけ戻してスケールされる。
【００３９】
ｉｉ．  ｓＳＮＶのＡＦの中央値を計算する。これをｍｅｄｉａｎ（ｓＳＮＶ．ＡＦｓ）とする。
【００４０】
ｉｉｉ．  ＣＷを使用して、各ｓＳＮＶについて中央値からの絶対偏差をスケールする。言い換えると、ＳｃａｌｅｄＭｅｄｉａｎＡｂｓＤｅｖ＝ａｂｓ（ｓＳＮＶ．ＡＦ−ｍｅｄｉａｎ（ｓＳＮＶ．ＡＦｓ））ｔｉｍｅｓ（その染色体についてのＣＷｓｃａｌｅ）である。
【００４１】
ｉｖ．  ｓＳＮＶの絶対偏差の中央値を得、ｓＳＮＶのＡＦの中央値で割り、１４８．２６によってスケールする（ＭＡＴＨにおけるものとして）。数学的には、これは、ｍｅｄｉａｎＡｂｓＤｅｖＭｅｄ＝１．４８２６×ｍｅｄｉａｎ（ＳｃａｌｅｄＭｅｄｉａｎＡｂｓＤｅｖ）であり、ｃｗＭＡＴＨ＝１００×ｍｅｄｉａｎＡｂｓＤｅｖＭｅｄ／ｍｅｄｉａｎ（ｓＳＮＶ．ＡＦｓ）である。
【００４２】
一部の実施形態において、血漿ベースの対立遺伝子率の分散の尺度は、ＭＡＴＨまたはｃｗＭＡＴＨの前にログスケールの対立遺伝子率または他の変換された対立遺伝子率を利用するように修正されている。
【００４３】
一部の実施形態において、血漿ベースの対立遺伝子率の分散の尺度は、処置前から処置後までのＭＡＴＨまたはｃｗＭＡＴＨの変化である。
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の測定は、血漿中のマルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）、すなわち、複数の突然変異を有する遺伝子の数として測定される、遺伝子内バリアント不均一性の測定を含む。このスコアは＞０であり得（すなわち、少なくとも１つの遺伝子が、２つ以上の体細胞突然変異を有する）、それは、がんの適合の指標である、不均一性（サブクローンは同一の遺伝子において異なる突然変異を有する）またはホモ接合性の体細胞活性化／不活化のためである。ＭＶＧＣは、単一の耐性経路／遺伝子／バリアントの識別を必要とせず、むしろ、がんが治療に対して遺伝的に適合する可能性を捉えるため、強力な包括的な尺度である。ＭＶＧＣの使用の例を図８に示す。
【００４４】
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の測定は、処置前から処置後までのＭＶＧＣの変化の測定を含む。ＭＶＧＣの変化の使用の例を図９に示す。
一部の実施形態において、遺伝的不均一性の測定は、遺伝子における切断突然変異の測定を含む。一部の実施形態において、遺伝子は、ＴＰ５３、ＦＢＸＷ７、およびＡＰＣの１つまたは複数を含む。一部の実施形態において、遺伝子切断は、固形腫瘍組織サンプルを用いずに血漿においてのみ測定される。一部の実施形態において、遺伝子切断は、治療後（導入後）の血漿においてのみ測定される。切断突然変異の使用の例を、図６および図７に示す。
【００４５】
ＳＴＥＡＭ臨床試験においてＣＲＣ患者に対してＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡキットで行われたｃｔＤＮＡの分析は、血漿ベースの腫瘍内不均一性の測定の潜在的な予後的価値を明らかにした。本発明者らは、導入前の、より大きな組織−血漿の不一致および高い血漿分散が、より短い生存期間と相関することを発見した。導入後の、高い血漿分散および遺伝子内不均一性もまた、より短い生存期間と相関した。導入後の血漿におけるＡＰＣ切断突然変異もまた、より短い生存期間と相関し、転移のバイオマーカーとなり得た。したがって、一部の実施形態において、本発明は、ＰＲＲ、ＭＡＴＨ、またはＭＶＧＣの１つまたは複数を測定することによって腫瘍の遺伝的不均一性の変化を評価するステップの後に、追加量の治療剤を投与する（現在の処置を維持する）または異なる治療剤を投与するステップを含む、がんを有する患者を処置する方法である。本発明の方法は、血中がん胎児性（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｙｏｎｉｃ）抗原（ＣＥＡ）レベルの変化、ならびに原発性腫瘍のサイズおよび転移の放射線学的に評価された変化を含む、処置の有効性を評価するための現在の方法を補い得る。
【実施例】
【００４６】
実施例１
転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）患者の無細胞腫瘍ＤＮＡおよび固形腫瘍ＤＮＡを使用して突然変異を検出する。
【００４７】
この実施例において、ＳＴＥＡＭ臨床試験から得たサンプルを使用した。ＳＴＥＡＭ（ＮＣＴ０１７６５５８２）は、ｍＣＲＣの第一選択処置のための、同時の（ｃ）および連続的な（ｓ）ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ−ベバシズマブ（ＢＥＶ）とＦＯＬＦＯＸ−ＢＥＶとの有効性および安全性を評価した。次世代シーケンシングに基づくＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ  ＥｘｐａｎｄｅｄキットおよびＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）を使用して、体細胞突然変異および遺伝子変異量を識別した。Ｅｘｐａｎｄｅｄキットを使用して、組織サンプルならびに導入前および導入後の血漿サンプル（それぞれｎ＝１８２、１５０、および１１８）における次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって、７７のがん関連遺伝子を分析した。Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅキットを使用して、導入前および導入後の血漿サンプルにおける１９７のがん関連遺伝子における体細胞突然変異をプロファイルした。
【００４８】
実施例２
突然変異の状態を使用して腫瘍不均一性を決定する。
実施例１で記載した両キットによって検出されたバリアントを集計して、腫瘍不均一性を計算した。不均一性は、組織−血漿の不一致、血漿ベースの腫瘍内の突然変異対立遺伝子率の分散、遺伝子間のバリアント不均一性、および複数のＡＰＣ切断突然変異の存在、として測定した。
【００４９】
血漿ベースの腫瘍内不均一性は、血漿内回収率（ＰＲＲ）、すなわち、血漿バリアント全体に対する、血漿と対応組織との間で共有されたバリアントの比率として測定される、血漿−組織の不一致を測定することによって計算した。完全な組織−血漿の不一致および一致は、それぞれＰＲＲ＝０およびＰＲＲ＝１と定義した。０であるＰＲＲは、血漿で見られたバリアントのいずれも組織において見られなかったことを意味し、不均一性および迅速ながんの進展の強力な指標であり、すなわち、転移性クローンは、原発性腫瘍とバリアントを共有していない。患者をＰＲＲによってグループ分けして、生存期間を評価した（図２および図３の結果を参照されたい）。
【００５０】
血漿ベースの対立遺伝子率の分散は、処置前および処置後の突然変異対立遺伝子の腫瘍不均一性（ＭＡＴＨ）として測定した。患者をＭＡＴＨによってグループ分けして、生存期間を評価した（図４および図５の結果を参照されたい）。
【００５１】
遺伝子内バリアント不均一性は、マルチバリアント遺伝子数（ＭＶＧＣ）、および処置前から処置後までのＭＶＧＣの変化として測定した（図８および図９の結果を参照されたい）。
【００５２】
特異的分子マーカーの変化は、任意の遺伝子におけるまたは具体的にはＡＰＣ遺伝子における切断突然変異として、および処置前から処置後までの切断突然変異の数の変化として測定した（図６および図７の結果を参照されたい）。
【００５３】
クローン性および限定的ながんの進展を示唆する完全な組織−血漿の一致を有する対象は、より長いＰＦＳを有していた（１８．３対９．５カ月（ｍｏ）、ＨＲ  ０．４３、ログランクｐ＝０．０３７）。完全な組織−血漿の不一致は、より不良な予後に関連することが知られている、肝臓ではない限局性の疾患とある程度の関連を有していた（ｐ＝０．０８９５）（Ｒｉｉｈｉｍａｋｉら、Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｐｒｅａｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６年８月９日、７（３２）：５２３０７〜５２３１６）。導入前または導入後の高い血漿ＭＡＴＨを有する対象は、より短いＰＦＳを有していた（それぞれ、８．１対１１．７カ月、ＨＲ  １．８、ログランクｐ＝０．０２６；７．４対１２．２カ月、ＨＲ  ２．９、ログランクｐ＝０．０００１２）。類似の傾向がＯＳで見られた。導入後に遺伝子内血漿不均一性を有する対象もまた、より短いＯＳを有しており、導入前から導入後までに血漿のＭＶＧＣが増大した患者は、より短いＯＳを有していた（１４．８対２６．４カ月、ＨＲ  ４．６、ログランクｐ＝０．０００２９）。ＡＰＣ切断突然変異は、遺伝的に多様な転移の蓄積と合致して、より短いＰＦＳと相関しており（７．６対１２．２カ月、ＨＲ  ２．３、ログランクｐ＝０．００１７）、導入後の高いＭＡＴＨと有意に関連していた（ログランクｐ＝０．００６）。原発性腫瘍におけるＡＰＣ突然変異数および転移可能性の役割は研究されており（Ｓｃｈｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．ら、Ａ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４６８  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＡＰＣ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６年６月１５日、７：１１７４３）、処置後の血漿サンプルにおける新たなＡＰＣ切断突然変異の蓄積が転移拡散の進行速度と相関していると思われることは、この文脈において特に興味深いことである。
【００５４】
実施例３
腫瘍不均一性を使用して処置プロトコルを決定する。
血漿内回収率（ＰＲＲ）を、実施例２で記載したように測定した。不均一性は、ＰＲＲ＜０．８（低）およびＰＲＲ≧０．８（高）と定義した（図１０の結果を参照されたい）。患者をＰＲＲによってグループ分けし、イリノテカンありおよびイリノテカンなしの治療レジメンによってさらにグループ分けして、生存期間をＰＦＳおよびＯＳとして評価した（図１１）。この結果に基づいて（図１１）、イリノテカンは、高い不均一性（ＰＲＲ高）に適応され、低い不均一性（ＰＲＲ低）には適応されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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