(57)【要約】  本発明は、改変された複製能力および腫瘍溶解性を有するアデノウイルス；それを含む医薬組成物；およびそれを用いた癌の治療方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的癌細胞において溶解活性を有する改変された複製アデノウイルスであって：
ａ)   アミノ酸９２３〜９４６をコードするヌクレオチドの欠失である、Ｅ１Ａ遺伝子欠失；
ｂ)    血清型５ Ａｄのノブが血清型３ Ａｄのノブによって置換されている、アデノウイルス繊維タンパク質のノブの５／３キメラ置換；
ｃ)    １４．７ｋ遺伝子欠失であって、前記欠失が野生型アデノウイルスに関して塩基対３０４４８〜３０８３４の欠失であり、配列GGA GGA GAT GAC TGAが、GGA GAC GAC TGAに置換されるているもの；
ｄ)   ｇｐ１９ｋ遺伝子欠失および７．１ｋ遺伝子欠失であって、前記欠失が野生型アデノウイルスに関して塩基対２８５４１〜２９２１１の欠失であるもの；
を含む、改変された複製アデノウイルス。
【請求項２】
前記アデノウイルスが、ＯＸ４０Ｌをコードする分子の挿入によってさらに改変されている、請求項１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項３】
前記ＯＸ４０ＬがヒトＯＸ４０Ｌである、請求項２に記載の改変アデノウイルス。
【請求項４】
前記ＯＸ４０ＬがＥ３Ｂ領域に挿入され、遺伝子１４．７Ｋ欠失を置換する、請求項２または３に記載の改変アデノウイルス。
【請求項５】
ＣＣ塩基ペアをＲＩＤβ遺伝子の終始コドンとＯＸ４０Ｌの開始コドンの間に挿入して、ＲＩＤβ遺伝子の配列をＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ／Ｃ  ＧＡＣ  ＴＧＡに変換することにより翻訳を最適化する、請求項２〜４のいずれか１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項６】
前記アデノウイルスが、ＣＤ４０Ｌをコードする分子の挿入によって改変される、請求項１〜５のいずれか１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項７】
前記ＣＤ４０ＬがヒトＣＤ４０Ｌである、請求項６に記載の改変アデノウイルス。
【請求項８】
前記ＣＤ４０Ｌ分子が、２Ａプロセッシング部位を用いてＯＸ４０Ｌのすぐ下流に挿入される、請求項６又は７に記載の改変アデノウイルス。
【請求項９】
前記２Ａプロセシング部位が２つの導入遺伝子の間に挿入され、前記２Ａプロセシング部位の前に切断部位およびＳＧＳＧリンカーがあり、前記導入遺伝子の有効な切断を確実にする、請求項８に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１０】
前記２Ａプロセシング部位が、口蹄疫ウイルス２Ａプロセシング部位（Ｆ２Ａ）または豚テシオウイルス−１ ２Ａプロセシング部位である、請求項８または９に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１１】
前記ＣＤ４０Ｌ分子が、ウイルスの後期領域、特に後期領域３（Ｌ３）に挿入される、請求項６または７に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１２】
前記ＣＤ４０Ｌ分子が、ポリアデニル化部位に先行する２３Ｋ遺伝子から下流に挿入される、請求項１１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１３】
スプライスアクセプター部位および／またはＫｏｚａｋ配列が、前記ＣＤ４０Ｌ分子の上流に提供または挿入される、請求項１１または１２に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１４】
ＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌの少なくとも１つまたは両方の全ｃＤＮＡをコードする分子が、前記アデノウイルスに挿入される、請求項２〜１３のいずれか１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの改変された複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルスと、適切なキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、皮内、腔内もしくは腹腔内注射、または経口投与のために製剤化されている、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
癌を治療に使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの改変された複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルス、または請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの改変された複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルス、または請求項１５〜１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
患者における癌を治療する方法であって、有効量の、請求項１５または１６に記載の医薬組成物、または請求項１〜１４のいずれか１に記載の少なくとも１つの改変された複製能および標的細胞溶解性を有するアデノウイルスを含む組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか１に記載の少なくとも１つの改変された複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルスが、細胞チェックポイントモジュレーターと共に投与される、請求項１９に記載の癌を治療する方法。
【請求項２１】
前記チェックポイントモジュレーターが、抗ＰＤ１分子、抗ＰＤ−Ｌ１分子または抗ＣＴＬＡ−４分子である、請求項２０に記載の癌を治療する方法。
【請求項２２】
前記癌が、鼻咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎がん、結合組織がん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、喉がん、口腔がん、肝がん、骨がん、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、フェオクロモサイトーマ、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルシノイド、胃腸管の癌腫、線維肉腫、乳癌、パジェット病、頸部癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼がん、頸がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝がん、カポシ肉腫、前立腺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、栄養芽細胞がん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリン腫、カルチノイド症候群、体細胞スタチン腫、歯肉がん、心臓がん、唇がん、髄膜がん、口腔がん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がん、扁桃がんを含むまたはそれらよりなる群から選択される、請求項１７に記載のアデノウイルス、請求項１８に記載の使用、または請求項１９〜２１のいずれか１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変された複製能力および腫瘍溶解性を有するアデノウイルス；それを含む医薬組成物；およびそれを用いた癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における腫瘍溶解性ウイルスの役割の認識は、癌を標的として攻撃するための免疫療法や患者自身の免疫系の刺激が普及することにつれて、過去１０年の間に劇的に変化してきた。今世紀初頭、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍溶解を介して腫瘍細胞を溶解する固有の能力を介してのみ作用し、癌治療において活性物質として認識された。最近、癌ワクチンとしての使用が関心を集めており、免疫系を活性化するための腫瘍崩壊時に癌細胞から腫瘍抗原を放出するそれらの能力は、癌に対する最終的な免疫療法をデザインする際の重要な特徴として認識されている。
【０００３】
アデノウイルスは、感染症に対する様々なワクチンアプローチにおいてベクターとしてしばしば使用される免疫原性の高いウイルスである。重要なことに、これらは、免疫応答をプライミングおよびブーストする両方の例外的な能力を有する。さらに、腫瘍内に腫瘍崩壊性アデノウイルスが存在し、それが引き起こす免疫原性細胞死は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）のようなＴＨ１型免疫モジュレーターの発現を引き起こすことによって、臨床的に重要な抗腫瘍免疫が生じるためのより感受性の高い状態に向かって、敵対的な腫瘍微小環境を形作る可能性が高い。腫瘍への免疫細胞浸潤は腫瘍溶解性ウイルスによる治療の結果としてしばしば起こるものであり、重要なことに、アデノウイルスは、癌免疫において重要なエフェクター細胞であるＣＤ８+ Ｔ細胞による浸潤を誘導する。アデノウイルスは免疫原性癌細胞溶解を引き起こし、その際に、免疫系から以前に隠されているか、または免疫原性状況で提示されていない、固有の患者特異的新抗原を含む腫瘍抗原が、免疫原性環境に放出される。これは、腫瘍溶解性アデノウイルスによって引き起こされる腫瘍特異的免疫応答の基礎である。
【０００４】
しかし、腫瘍は体の免疫細胞に対抗するためにいくつかの免疫抑制機構を進化させてきた。免疫細胞は、その活性化およびエフェクター機能を調節する細胞表面分子、特に補助刺激分子および補助阻害分子を発現する。ネガティブフィードバック分子、すなわちチェックポイント分子は通常の生理学的状況下で自己寛容を可能にするが、腫瘍細胞によって重度の免疫抑制を引き起こすためにしばしば利用される。最もよく特徴づけられているチェックポイント経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球蛋白質４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム細胞死蛋白質１経路（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１）である。腫瘍内のこれらの強力な免疫抑制機構のために、ウイルス誘導性の抗腫瘍免疫応答は免疫刺激性導入遺伝子の使用によって強化されない限り、弱いことができる。免疫刺激性ヒト導入遺伝子をコードする高度免疫原性腫瘍溶解性アデノウイルスの存在が免疫療法アプローチに対してより感受性である「免疫炎症」表現型に向かって腫瘍微小環境を形作るので、現在のアプローチは、腫瘍部位での免疫抑制の問題に取り組んでいる。重要なことに、現在のアプローチの腫瘍溶解性ウイルスは抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＴＬＡ−４分子のようなチェックポイントモジュレーターと組み合わせて利用して、免疫抑制性腫瘍環境に対抗し、強力な抗免疫応答を引き起こすことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kanerva et al ２００３ Mol Ther １２：４４９−４５８．
【非特許文献１】Fueyo et al ２０００．。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：２−１２．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、標的癌細胞において溶解活性を有する改変された複製アデノウイルスであって：
ａ)   アミノ酸９２３〜９４６をコードするヌクレオチドの欠失である、Ｅ１Ａ遺伝子欠失；
ｂ)    血清型５ Ａｄのノブが血清型３ Ａｄのノブによって置換されている、アデノウイルス繊維タンパク質のノブの５／３キメラ置換；
ｃ)   １４．７ｋ遺伝子欠失であって、前記欠失が野生型アデノウイルスに関して塩基対３０４４８〜３０８３４の欠失であり、配列GGA GGA GAT GAC TGAが、GGA GAC GAC TGAに置換されるているもの；
ｄ)   ｇｐ１９ｋ遺伝子欠失および７．１ｋ遺伝子欠失であって、前記欠失が野生型アデノウイルスに関して塩基対２８５４１〜２９２１１の欠失であるもの；
を含む、改変された複製アデノウイルスが提供される。
【０００７】
上記の改変アデノウイルスにおいて、アミノ酸９２３〜９４６は、野生型(ｗｔ)Ａｄ５配列から欠失される。ウイルスＥ１Ａ蛋白質は網膜芽細胞腫（Ｒｂ）分子に結合できず、ウイルス遺伝子転写のためにＲｂから転写因子Ｅ２Ｆを放出するので、この欠失は安全対策である。したがって、アデノウイルスは宿主細胞中の遊離Ｅ２Ｆの存在に依存しており、遊離Ｅ２Ｆが常に利用可能な分裂正常細胞または癌細胞のいずれかにおいてそのゲノムを複製することができる。したがって、修飾は非分裂細胞を比較的保護し、分裂細胞または癌細胞に対して標的化される。
【０００８】
さらに、５／３キメラ置換、すなわち、血清型５アデノウイルス線維ノブ領域を血清型３アデノウイルスノブ領域のものと置換することにより、ウイルスがＡｄ５天然受容体コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を回避し、代わりにインターナリゼーションのためにＡｄ３天然受容体デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を使用することを可能にする。ＤＳＧ２は癌細胞に豊富に存在する。従って、この改変は非分裂細胞を比較的保護し、そして分裂細胞または癌細胞に対して標的化される。
【０００９】
アデノウイルス感染は、ウイルス表面上の特殊なタンパク質、すなわちアデノウイルス繊維タンパク質、特にアデノウイルス繊維タンパク質の球状カルボキシ末端ドメイン（カルボキシ末端ノブドメインと呼ばれる）の手段による宿主細胞受容体の認識で始まる。従って、本明細書中において、アデノウイルス繊維タンパク質のノブへは、アデノウイルス繊維タンパク質の球状カルボキシ末端ドメインを意味する。
【００１０】
さらに、１４．７ｋ遺伝子欠失は、感染細胞がＴＮＦａｌｐｈａ誘導細胞溶解によって死滅するのを防ぎ、したがって欠失は有利である。重要なことは、１４．７ｋ遺伝子の始まりと上流のＲＩＤベータ（１４．５ｋ）遺伝子には短い重複が見られることから、最後のアミノ酸を削除せずに１４．７ｋ遺伝子の改変を行い、ＲＩＤベータ遺伝子の停止コドンを取り除くことができるようにすることである。具体的には、ネイティブジャンクション配列が下線配列がＲＩＤベータ遺伝子のＣ末端であり、残りが１４．７ｋ遺伝子のＮ末端で「ＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＡＴＴＡＧＧＴＡ(配列番号３）」として読み取られる。アミノ酸への翻訳は、ＲＩＤベータ遺伝子のGG D停止(「GGA GGA GAT GAC TGA：配列番号１」）として読み取られる。従って、ＲＩＤベータ遺伝子のＯＲＦ内のＡＴＧを排除して、導入遺伝子が欠失部位内に挿入される場合に誤った読み取りがないようにし、そしてＲＩＤベータのＣ末端を機能的に維持することを確実にするために、本発明では、ＲＩＤベータの配列をわずかに変化させた：GGA GGA GAC GAC TGA(配列番号２）。このように、配列は依然としてG G D D停止として読み取られるが、導入遺伝子発現を妨害し得る任意の不正確な下流リードスルーのためのＡＴＧを含まない。
【００１１】
最後に、ｇｐ１９ｋは感染細胞上のＭＨＣＩをダウンレギュレートする遺伝子であり、アデノウイルス複製、パッケージングなどに重複しているため、除去することができる。さらに、アデノウイルスが免疫系から隠すために用いる免疫調節遺伝子であるため、それを欠失させることは有益である。７．１ｋはＴＲＡＩＬ受容体２の分解に関連する遺伝子であり、小胞体（ＥＲ）からのＣａ２＋放出により誘導されるアポトーシスを阻害する。しかし、７．１ｋ遺伝子の終止コドンはｇｐ１９ｋのオープンリーディングフレーム内に存在するので、この欠失部位に導入遺伝子は付加されない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、断片ＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｆ２Ａ／ＣＤ４０ＬおよびＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０ＬのＰＣＲ増幅Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応のアガロース電気泳動分析を示すものである。
【図２】図２は、フローサイトメトリーにより、ウイルス産生ＯＸ４０Ｌ蛋白質の受容体ＯＸ４０結合能が確認されたことを示すものである。
【図３】図３は、受容体ＯＸ４０に結合可能なＯＸ４０Ｌは、Ａｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０．Ｃ１（図中Ｃ１）およびＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０．Ｃ３（図中Ｃ３）ダブルトランスジーンウイルスならびにＯＸ４０Ｌ−トランスジーンのみを発現するウイルス（発現対照として使用）から発現されることを示す。
【図４】図４は、レポータールシフェラーゼ系を用いてＨＥＫ−２９３細胞を発現するＯＸ４０受容体を用いて決定したウイルス発現ＯＸ４０Ｌの機能性を示す。
【図５】図５は、機能的ＣＤ４０Ｌ発現レベルを決定するために、Ramos Blue細胞アッセイを用いて測定した吸光度を示すものである。
【図６】図６は、ペプチドコーティングなしの腫瘍溶解性ウイルス（ＶＡＬＯ−Ｃ１）、ＮＹＥＳＯ−１またはＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド抗原コーティングを有する腫瘍溶解性ウイルス（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ）またはペプチド単独で処理した場合の、処理および対側の未処理腫瘍におけるＴ細胞の頻度を示す。
【図７】図７は、ペプチドコーティングを伴わない腫瘍溶解性ウイルス（ＶＡＬＯ−Ｃ１）、ＮＹＥＳＯ−１またはＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド抗原コーティングを伴う腫瘍溶解性ウイルス（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ）またはペプチド単独で処理した場合の、処理および対側の未処理腫瘍におけるすべての免疫細胞（ＣＤ４５＋細胞）の頻度を示す。
【図８】図８は、ＶＡＬＯ−Ｃ１およびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理が処理された腫瘍におけるすべてのＴＩＬからの制御性Ｔ細胞の割合を減少させることを示す。
【図９】図９は、ペプチＣＲＡｄ（ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質でコーティングされたＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ発現ウイルスを含む）が大きな十分に確立された腫瘍に対して治療を開始しても、ヒト化マウスメラノーマモデルにおいて腫瘍増殖を停止させることができることを示している。
【図１０】図１０は、模擬処置動物と比較して、ＯＸ４０Ｌ（単独）−ＰｅｐｔｉＣＲＡｄが末梢血中のＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ８+ T細胞数を増加させたことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、前記アデノウイルスは、１４．７ｋ遺伝子欠失におけるＯＸ４０Ｌ、理想的にはヒトＯＸ４０Ｌをコードする分子の挿入によってさらに改変される。ＯＸ４０ＬはＴ細胞アクチベーターであり、従って、本発明の機能に有利である。
【００１４】
ＯＸ４０Ｌ遺伝子は独自の開始コドン（ＡＴＧ）を有しており、１４．７ｋ遺伝子削除に挿入されると、ＲＩＤベータ遺伝子の停止コドンとＯＸ４０Ｌの開始コドンの間にＣＣ塩基ペアを加えて、翻訳を最適化すること（すなわち、Ｋｏｚａｋ配列ＡＣＣＡＴＧＧを生成すること）が望ましい。
【００１５】
最も好ましくは、ヒトＯＸ４０ＬがＥ３Ｂ領域に位置し、遺伝子１４．７Ｋ欠失を置換する。ＲＩＤベータ遺伝子の３’末端と１４．７Ｋの５’末端はｗｔアデノいウイルスと重複しており、したがって上述したＴ／Ｃ改変は、トランス遺伝子の正確な転写を可能にするためにＲＩＤベータの３’末端に行われた。
【００１６】
本発明のさらに好ましい実施形態では、前記アデノウイルスがＣＤ４０Ｌ、理想的にはヒトＣＤ４０Ｌの挿入によって、交互に、またはさらに修飾される。ヒトＣＤ４０Ｌはウイルスの後期領域、特に後期領域３（Ｌ３）、理想的には２３Ｋ遺伝子の下流に挿入される。ＣＤ４０Ｌは抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化し、従って、本発明の機能に有利である。
【００１７】
好ましくは、導入遺伝子ＣＤ４０Ｌがそのポリアデニル化部位に先立って、アデノウイルス２３Ｋ遺伝子のコード領域の直後に位置する。典型的には（これに限定されるものではないが）、遺伝子を収容するための欠失は行われず、したがって、導入遺伝子の発現はアデノウイルス選択的スプライシング機構および導入遺伝子の前のスプライス受容部位（ＳＡＳ）（例えば、ＵＳ２００６／０２９２６８２ Ａ１およびＷＯ２００６／０１２３９３から適合されたＳＡＳ）に依存する。
【００１８】
本発明のなお好ましい実施形態において、前記アデノウイルスはＣＤ４０Ｌの転写を補助するために、導入遺伝子ＣＤ４０Ｌの上流にスプライスアクセプター部位（ＳＡＳ）および／またはＫｏｚａｋ配列を挿入することによってさらに改変される。
【００１９】
あるいは、最も好ましくは、ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子がＯＸ４０Ｌのすぐ下流に、以下のいずれかを用いて挿入される：
Ａ)   口蹄疫ウイルス２Ａプロセシング部位（Ｆ２Ａ) (例えば、図中のＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−Ｆ２Ａ−ＣＤ４０Ｌ、コンストラクトＣ１を参照）
Ｂ)   豚テシオウイルス１ ２Ａプロセシング部位（Ｐ２Ａ)(例えば、図中のＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−Ｐ２Ａ−ＣＤ４０Ｌ、コンストラクトＣ３を参照）。
【００２０】
２Ａプロセシング部位は２つの導入遺伝子の間に挿入され、理想的には、２Ａプロセシング部位の両方が、切断部位（例えば、フリン切断部位: RKRR)およびＳＧＳＧ−リンカーによって先行されるこれにより、導入遺伝子の有効な切断を確実にできる。
【００２１】
当業者は、２Ａプロセシング部位がピコルナウイルスにおいて見出される「自己切断」小ペプチドであることを理解するであろう。宿主リボソームは２ＡペプチドのＣ末端におけるグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップし、２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドとの間の切断を導く。結果として、切断された下流ペプチドはそのＮ末端にプロリンを有し、これは、本明細書に記載されるウイルス構築物から産生されるＣＤ４０Ｌタンパク質がそのＮ末端にプロリンを有することを意味する。
【００２２】
従って、本発明の好ましい実施形態において、前記改変アデノウイルスは、１つ、より好ましくは２つの導入遺伝子：OX４０ＬおよびＣＤ４０Ｌを含む。さらに、典型的には前記ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子が前記ＯＸ４０Ｌ導入遺伝子のほぼすぐまたはすぐ下流に、またはその逆に提供されるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
抗原−ＭＨＣＩ／ＩＩ複合体によるＴ細胞レセプターの結合が、ナイーブＴ細胞の活性化の主なシグナルであるシグナル１を構成している。しかし、シグナル１は、エフェクターＴ細胞の生産的生成および維持を開始するのに十分ではない。ＣＤ８+Ｔ細胞の完全な活性化には活性化されたＡＰＣまたはヘルパーＴ細胞上に存在する補助刺激分子によって駆動されるさらなるシグナルが必要であるが、腫瘍上に存在することはまれである。本発明において導入遺伝子として使用するために選択した共刺激分子、すなわちＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌは、リガンドの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーである。ＴＮＦスーパーファミリーリガンドの大部分は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球およびＤＣを含む免疫系に関与する細胞上で主に発現される。
【００２４】
ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）とＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、比較的長い細胞外ドメインと短い細胞質領域をもつＩＩ型膜貫通タンパク質である。細胞外ドメイン（特に、ＴＮＦ相同ドメイン）は、リガンドの機能性に不可欠な受容体結合特異性を示す。ほとんどのＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、細胞表面上のホモトリマーとして発現され、そして不活性であるか、または可溶性三量体融合タンパク質として不十分に活性である。従って、膜貫通領域を有さない可溶性形態は、本発明者らのアプローチに適用可能ではない。それゆえ、本発明では、各導入遺伝子のｃＤＮＡ全体を利用する。このようにして、導入遺伝子産物は細胞から産生されるタンパク質中に自然に存在するすべてのドメイン、すなわち、タンパク質を分泌経路に導き、それを細胞膜に保持する膜貫通ドメイン、ならびにプロテイナーゼによる細胞表面からの切断を引き起こす自然に存在する部位を含む。
【００２５】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つまたは各導入遺伝子の全体をコードする分子、理想的には少なくとも１つまたは各導入遺伝子の全体をコードするｃＤＮＡが前記アデノウイルスに挿入される。
【００２６】
主に、抗腫瘍免疫を誘発／増強するための治療剤として補助刺激分子を利用するアプローチは、ＴＮＦリガンドのレセプターに特異的なモノクローナルアゴニスト抗体、またはリガンドの可溶性形態のいずれかを使用する。このアプローチは、治療分子の全身送達を必要とする。対照的に、われわれのアプローチは、リガンドが感染がん細胞の細胞機構によって産生される膜係留タンパク質として同族の受容体に提示される、体内の自然な状況に似ている。
【００２７】
ＣＤ４+Ｔ細胞は、持続性ウイルス感染における効果的なＣＤ８+Ｔ細胞応答の維持に極めて重要な役割を果たす。共刺激因子導入遺伝子を有する本発明の新規ウイルス構築物は、腫瘍環境内でＴｈ１型抗ウイルス免疫を誘発する。ウイルス表面に腫瘍抗原が存在し、局所的な炎症があると他の腫瘍抗原が放出されるとともに、決定因子が広がることで、抗腫瘍免疫Ｔ細胞クローンが形成される。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のエフェクター期を維持するために、共刺激分子（すなわち、ＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ）は、免疫抑制性癌の治療に適用したい独自の特徴を有する。
【００２８】
驚くべきことに、我々のデータは免疫刺激遺伝子、ヒトＯＸ４０ＬおよびヒトＣＤ４０Ｌの１４．７Ｋ座標への追加はバックボーンウイルスＡｄ５／３Ｄ２４または免疫刺激遺伝子（例えばヒトＧＭ−ＣＳＦ）を持つウイルスと比較して、本発明のウイルスのがん効能を損なうものではないことを示している。これは削除されたｇｐ１９Ｋ／７．１Ｋ遺伝子に代わるものである。導入遺伝子がウイルス複製に大きく影響するのは、導入遺伝子の大きさと、感染した細胞に対する導入遺伝子の直接的な影響によるの可能性があることから、これは驚くべきことである。さらに、１４．７Ｋ遺伝子の削除は、ｇｐ１９Ｋ／７．１Ｋ遺伝子の削除ほど広範に研究されていないため、特に１４．７Ｋ削除サイトに遺伝子を組み込む場合、ウイルスの複製機械に予期せぬ結果をもたらす可能性がある。
【００２９】
また、本発明のウイルスは１４．７Ｋ遺伝子軌跡から機能的ヒト導入遺伝子を生産できることも示している。これは、２つの導入遺伝子の間にウイルスの２Ａプロセシング部位をもつ転写カセットを用いたため、予想外であった。
【００３０】
さらに、本発明者らは、本発明のウイルスがＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１特異的免疫応答を誘発することができることも実証した。
【００３１】
したがって、さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明による複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルスと、適切なキャリアとを含む医薬組成物に関する。
【００３２】
ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ
ＯＸ４０Ｌは、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含む活性化されたＡＰＣ上に発現される。それは、３つのＯＸ４０分子に結合することを可能にする三量体として細胞表面上に発現される。Ｔ細胞の活性化は、ＯＸ４０Ｌの受容体であるＯＸ４０のＣＤ８＋およびＣＤ４+ T細胞上での発現に必要である。ＯＸ４０の誘導は２４時間以内に起こり、最初のＴＣＲ刺激の４８〜７２時間後にピークに達し、典型的には３〜４日続く。Ｔ細胞上に発現されるＯＸ４０受容体の相対的レベルは、ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現するプロフェッショナル抗原提示細胞との接触を介して、またはＴＮＦαまたは類似の炎症性サイトカインが豊富な環境を介して、局所環境によって大きく影響される。さらに、ＯＸ４０Ｌの発現は、通常、主に炎症部位で認められる。したがって、ＴＣＲシグナル伝達を介して活性化されるＯＸ４０発現Ｔ細胞は、炎症部位においてＯＸ４０Ｌを介して補助刺激を受ける。ＯＸ４０を介する同時刺激のこの特異性は炎症性環境から受信される危険シグナルに類似しており、それによって、その使用に安全管理層を追加する。さらに、プライミングイベント後のＴ細胞表面でのＯＸ４０の時間的発現は、エフェクターＴ細胞の後期増殖および生存におけるその重要性を示唆する。ＯＸ４０刺激Ｔ細胞における抗アポトーシス分子ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ｘＬ、およびスルビビンの活性化は、クローン増殖の増加および記憶Ｔ細胞のより大きなプールの原因であることが示唆される。
【００３３】
ＣＤ４０/ＣＤ４０Ｌ
補助刺激シグナルをＴ細胞に直接提供することに加えて、腫瘍抗原を交差提示する可能性の高いＡＰＣの活性化を促進し、その場で補助刺激リガンド発現の増加を達成することも魅力的である。ＣＤ４０は、Ｂ細胞およびそれを恒常的に発現するＤＣの機能にとってきわめて重要である。ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、主に活性化されたヘルパーＴ細胞に発現している。ＣＤ４０の連結はＡＰＣを免許化し、それらが、部分的にはＩＬ−１２分泌の誘導を介して、またＢ７ファミリーメンバー（ＣＤ８０、ＣＤ８６）のアップレギュレーションを介して、エフェクターＣＴＬ応答を駆動することを可能にすることが示されている。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激は効果的な抗腫瘍Ｔ細胞応答の誘導に重要であり、腫瘍細胞ベースのワクチンへのＣＤ４０Ｌの取り込みは、マウスにおける免疫原性の低い腫瘍に対する免疫応答を有意に増強することが示されており、抗腫瘍免疫におけるＡＰＣを介した適応免疫に対する間接的効果の重要性を強調している。
【００３４】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態において、前記アデノウイルスは任意の型および種のアデノウイルスであり得、例えば、ヒトアデノウイルスに限定されないが、最も典型的にはヒトアデノウイルスである。最も好ましいのは、アデノウイルスが腫瘍に対する抗ウイルス免疫応答を転換しながら、癌細胞を複製し、殺傷することができることである。
【００３５】
上記から、本発明の改変アデノウイルスは、癌に対する免疫応答、特に腫瘍環境（ここで、典型的には免疫系が癌細胞によって使用される回避メカニズムによって損なわれる）において刺激するように操作されたことになる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、前記ウイルスが前記アデノウイルスベクターによって遺伝的にコードされることなく、ウイルスキャプシド上に共有結合または非共有結合で付着した以下のポリペプチドの少なくとも１つを有する
ｉ)   VFGIELMEVDPIGHLYIFAT [配列番号：１］；
ｉｉ) YLAMPFATPMEAELARRSLA [配列番号：２］；
ｉｉｉ)      RGPESRLLEFYLAMPFATPM [配列番号：３］；または
ｉｖ) それらと少なくとも６０％同一であるポリペプチド。
【００３７】
従って、さらなる態様において、本発明は患者における癌を処置する方法に関し、この方法は、本発明に従う、少なくとも１つの複製能力および標的細胞溶解を有する改変アデノウイルスを含む組成物の有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００３８】
さらに、または代替的に、本発明は、癌を治療する際に使用するための、本発明による少なくとも１つの複製能力および標的細胞溶解を有する改変アデノウイルスに関する。
【００３９】
さらに、または代替的に、本発明は、癌を治療するための、本発明による少なくとも１つの複製能力および標的細胞溶解を有する改変アデノウイルスの使用に関する。
【００４０】
さらに、または代替的に、本発明は、癌を治療するための医薬の製造における、本発明による少なくとも１つの複製能力および標的細胞溶解を有する改変アデノウイルスの使用に関する。
【００４１】
最も好ましくは、本明細書における癌は、以下の癌のいずれか１つ以上を含む：鼻咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎がん、結合組織がん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、喉がん、口腔がん、肝がん、骨がん、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、フェオクロモサイトーマ、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルシノイド、胃腸管の癌腫、線維肉腫、乳癌、パジェット病、頸部癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼がん、頸がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝がん、カポシ肉腫、前立腺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、栄養芽細胞がん（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胞状奇胎（ｈｙｄａｔｉｄｉｆｏｒｍ ｍｏｌｅ）、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリン腫、カルチノイド症候群、体細胞スタチン腫、歯肉がん、心臓がん、唇がん、髄膜がん、口腔がん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がん、扁桃がん。
【００４２】
本発明は、少なくとも１つ、理想的には２つの免疫刺激剤、すなわちＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌを使用する癌治療療法における活性アジュバントとしての、安全性および生存のために最適化された改変アデノウイルスの使用に関することになる。
【００４３】
改変されたアデノウイルスは標的ペプチドに対する最適な免疫応答に必要な危険シグナルを提供するが、それが感染してゲノムを複製する癌細胞を腫瘍化する能力も保持するので、活性アジュバントとして作用する。腫瘍溶解性細胞殺傷は本質的に免疫原性であり、これは、ペプチド／腫瘍に対する免疫応答を強化するよう腫瘍微小環境における変化を引き起こす。
【００４４】
本願の特許請求の範囲および本発明の前述の説明において、文脈が明示的な言葉または必要な含意のために別途必要とする場合を除いて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は包括的な意味で使用される、すなわち、記載された特徴の存在を指定するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【００４５】
本明細書に引用された、任意の特許または特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成することは許可されない。さらに、先行技術のいずれも、当該技術分野における一般的な知識の一部を構成することを認めるものではない。
【００４６】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関連して記載されるとおりであり得る。
【００４７】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるのであろう。一般的に、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物または化学部分は、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例に適合しない限り適用可能であると理解されるべきである。
【００４８】
さらに、特に断らない限り、本明細書に開示される任意の特徴は、同じまたは同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。
【００４９】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形はその状況が他のことを要求していない限り、複数形を含む。特に、不定冠詞が使用される場合は本明細書がその状況が他のことを要求していない限り、単数だけでなく複数も意図していると理解されたい。
【実施例】
【００５０】
本発明の実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。
【００５１】
図１は、断片ＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｆ２Ａ／ＣＤ４０ＬおよびＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０ＬのＰＣＲ増幅Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応のアガロース電気泳動分析を示す。レーン１において、アセンブルされたフラグメント１、２および３のＰＣＲ増幅は、３９７４ｂｐのサイズの完全長ＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｆ２Ａ／ＣＤ４０Ｌフラグメントを作製する。レーン２において、アセンブルされたフラグメント１、２および３のＰＣＲ増幅は、３９２９ｂｐのサイズの完全長ＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０Ｌフラグメントを作製する。レーン３では、３５６４ｂｐのサイズの断片を増幅するバックボーンウイルスプラスミドｐＡｄ５／３Ｄ２４のＰＣＲ増幅を行った。レーン１および２の両方において、ウイルスバックボーンのいくらかの増幅も見ることができることに注意されたい。
【００５２】
図２は、フローサイトメトリーにより、ウイルス産生ＯＸ４０Ｌ蛋白質の受容体ＯＸ４０結合能が確認されたことを示すものである。ＯＸ４０受容体抗体（ウサギ）およびAlexa fluor ４８８で標識したヤギ抗ウサギ抗体を用いて、感染したＡ５４９細胞表面上のウイルスから発現したＯＸ４０Ｌタンパク質を結合させた。未染色細胞、未感染染色細胞、および導入遺伝子を含まないウイルスに感染した染色細胞を陰性対照として使用した。データは、Ａ）ヒストグラムまたはＢ）絶対頻度または比例頻度の平均として提示される。GM = Alexa fluor ４８８標識陽性細胞の幾何平均；Ｆｒｅｑ親 = Alexa fluor ４８８標識陽性細胞の割合；Ctrl-virus = Ad５／３Ｄ２４、同一の骨格だが導入遺伝子を持たないウイルス；ＯＸ４０L-virus = OX４０Ｌのみを導入遺伝子とするウイルス；ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ１およびＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ３ = OX４０ＬおよびＣＤ４０Ｌを導入遺伝子とするウイルス。
【００５３】
図３は、受容体ＯＸ４０に結合可能なＯＸ４０Ｌは、Ａｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０．Ｃ１（図中Ｃ１）およびＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０．Ｃ３（図中Ｃ３）ダブルトランスジーンウイルスならびにＯＸ４０Ｌ−トランスジーンのみを発現するウイルス（発現対照として使用）から発現されることを示す。機能的サンドイッチＥＬＩＳＡを、ウイルスから感染細胞の上清中に発現されたＯＸ４０Ｌの天然型の検出のために使用した。非感染細胞からの上清を陰性対照として使用した。希釈は、図中の各サンプルについて描かれている。
【００５４】
図４は、レポータールシフェラーゼ系を用いてＨＥＫ−２９３細胞を発現するＯＸ４０受容体を用いて決定したウイルス発現ＯＸ４０Ｌの機能性を示す。導入遺伝子を持たないウイルス（Ｃｔｒｌ‐ウイルス）、導入遺伝子としてＯＸ４０Ｌのみを持つウイルス（ＯＸ４０Ｌ‐ウイルス）、導入遺伝子としてＯＸ４０ＬとＣＤ４０Ｌを持つウイルス（ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ１とＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ３）について、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０相互作用依存性ルシフェラーゼ活性を誘発する能力を分析した。明確なルシフェラーゼ活性がＯＸ４０Ｌ発現ウイルスで検出され、ウイルスゲノムから発現されたＯＸ４０Ｌが機能的であることを示した。
【００５５】
図５は、機能的ＣＤ４０Ｌ発現レベルを決定するために、Ramos Blue細胞アッセイを用いて測定した吸光度を示すものである。(Ａ)二重導入遺伝子ウイルス（ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ１およびＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ３）からＣＤ４０Ｌを発現させ、導入遺伝子を持たないウイルス（Ｃｔｒｌウイルス）または単一導入遺伝子としてのＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０Ｌウイルス）、または非感染細胞（Ａ５４９）を陰性対照として用いた。(Ｂ)組換えヒトＣＤ４０Ｌで処理したRamos Blue細胞の吸光度測定。
【００５６】
図６は、ペプチドコーティングなしの腫瘍溶解性ウイルス（ＶＡＬＯ−Ｃ１）、ＮＹＥＳＯ−１またはＭＡＧＥ−Ａ３−ペプチド抗原コーティングを有する腫瘍溶解性ウイルス（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ）またはペプチド単独で処理した場合の、処理および対側の未処理腫瘍におけるＴ細胞の頻度を示す。ＣＤ３+Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ４+Ｔ細胞（Ｂ）およびＣＤ８+Ｔ細胞（Ｃ）の数は、各治療群の腫瘍組織１ｇ当たりの細胞として描出される。処置は、モックと比較して、全ての群においてより高いＴ細胞頻度をもたらした。最も多かったのはＶＡＬＯ−Ｃ１またはＰｅｐｔｉＣＲＡｄで治療された腫瘍であった。
【００５７】
図７は、ペプチドコーティングを伴わない腫瘍溶解性ウイルス（ＶＡＬＯ−Ｃ１）、ＮＹＥＳＯ−１またはＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド抗原コーティングを伴う腫瘍溶解性ウイルス（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ）またはペプチド単独で処理した場合の、処理および対側の未処理腫瘍におけるすべての免疫細胞（ＣＤ４５＋細胞）の頻度を示す。頻度はすべての群で類似しており、偽処置動物ではいくらか低い数であった。
【００５８】
図８は、ＶＡＬＯ−Ｃ１およびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理が処理された腫瘍におけるすべてのＴＩＬからの制御性Ｔ細胞の割合を減少させることを示す。
【００５９】
図９は、ペプチＣＲＡｄ（ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質でコーティングされたＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ発現ウイルスを含む）が大きな十分に確立された腫瘍に対して治療を開始しても、ヒト化マウスメラノーマモデルにおいて腫瘍増殖を停止させることができることを示している。実験計画： ２ｘ１０6 ＳＫ‐ＭＥＬ‐２細胞をＮＯＤ／Ｓｈｉ‐ｓｃｉｄ／ＩＬ‐２Ｒγ欠損免疫不全マウスの側面に１日目に皮下（１匹当たり１腫瘍）移植した。１３日目に、５ｘ１０6のＰＢＭＣを静脈内注射した。１６日目に、５ｘ１０4形質細胞様細胞および骨髄性樹状細胞を腫瘍内に注射した。１×１０9の用量での腫瘍内ペプチドＣＲＡｄ処置を、１６日目、１７日目、１８日目（初回投与）、および２５日目（追加免疫）に与えた。最初のＰｅｐｔｉＣＲａｄ投与は、ＤＣ注射直後に投与した。腫瘍増殖を追跡した。動物を３２日目に屠殺した。PeptiCRAd = Ad５／３‐Ｄ２４‐ＯＸ４０Ｌ‐ＣＤ４０Ｌ、Ｅ１Ａにおける２４ｂｐ欠損を伴うオンコリチックアデノビラス、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１およびＭＡＧＥ‐Ａ３ペプチドで被覆した１４．７Ｋ軌跡から発現した５／３キメラキャプシドおよびＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌトランスジェン; OX４０ＬペプチCRAd = Ad５／３‐Ｄ２４‐ＯＸ４０Ｌ、Ｅ１Ａにおける２４ｂｐ欠損を伴うオンコリチックアデノビラス、１４．７Ｋ軌跡から発現した５／３キメラキャプシドおよびＯＸ４０Ｌトランスジェン、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１およびＭＡＧＥ‐Ａ３ペプチドで被覆した。
【００６０】
図１０は、模擬処置動物と比較して、ＯＸ４０Ｌ（単独）−ＰｅｐｔｉＣＲＡｄが末梢血中のＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ８+ T細胞数を増加させたことを示している。ＰｅｐｔｉＣＲＡｄで処理した２匹の動物は、血液中のＭＡＧＥ‐Ａ３特異的ＣＤ８+ T細胞数の増加も示した。抗ＭＡＧＥ−Ａ３ Ｔ細胞は、３２日目の前述の腫瘍増殖試験の終了時にフローサイトメトリー（五量体分析）により評価した。
【００６１】
詳細
＜材料および方法＞
アミノ酸９２３−９４６をコードするヌクレオチドのＥ１Ａ遺伝子欠失を有する腫瘍溶解性アデノウイルスの作製
２４塩基対の欠失を、Ｅ１Ａ領域を標的とするシャトルプラスミドを使用することによってＡｄ５バックボーン配列に導入し、このクローニング方法はＫａｎｅｒｖａらに記載されており、この欠失はＦｕｅｙｏらに最初に記載されている。
【００６２】
アデノウイルス繊維蛋白質の５／３キメラ置換を有する腫瘍溶解性アデノウイルスの作製
血清型５ノブを、修飾されたファイバー領域を有するシャトルプラスミドを用いて血清型３ノブと置換し、相同組換えを介してウイルスバックボーンに配列を導入した。特定のクローニング方法は、Ｋａｎｅｒｖａらに記載されている。
【００６３】
野生型アデノウイルスに関して塩基対３０４４８〜３０８３４の１４．７ｋ遺伝子欠失を有し、配列GGA GGA GAT GAC TGA(配列番号：１）がGGA GGAC GAC TGA(配列番号：２）に置換された腫瘍溶解性アデノウイルスの作製、および野生型アデノウイルスに関してｇｐ１９ｋ遺伝子欠失および塩基対２８５４１〜２９２１１の７．１ｋ遺伝子欠失を有する腫瘍溶解性アデノウイルスの作製。
【００６４】
GGA GGA GAC GAC TGA (配列番号２）に対するGGA GGA GAT GAC TGA(配列番号１）の１４．７Ｋ欠失および置換（１４．７Ｋの代わりに導入遺伝子ＯＸ４０Ｌの挿入を伴う）ならびにｇｐ１９ｋ／７．１ｋ遺伝子の欠失を、化学合成によってシャトルプラスミド（ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＯＸ４０Ｌ）に導入した。Vector NTIプログラムで設計された仮想配列に基づいて、重複オリゴヌクレオチドをGeneArt(Thermo Fisher Scientific)で設計し、これは一緒になって全配列を構成した。固体材料として制御細孔ガラスを適用した固相合成によりオリゴ合成を達成した。次いで、オリゴを液相に放出し、完全に自動化されたアセンブリステーション上でＰＣＲを使用することによってアセンブルした。合成的にクローニングした配列をｐＭＸクローニングベクターに導入し、配列決定によって検証した。
【００６５】
ｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ／Ｆ２Ａ／ＣＤ４０ＬおよびｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０Ｌを得るためのｐＡＤ５／３−Ｄ２４へのＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌのクローニング
ＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ遺伝子の両方を含み、口蹄疫ウイルス２Ａプロセシング部位（Ｆ２Ａ）または豚テシオウイルス１−２Ａプロセシング部位（Ｐ２Ａ）のいずれか一方を導入遺伝子間に挿入して共翻訳プロセシングを行うウイルスを作製するために、各コンストラクトの３断片をＰＣＲ法で増幅した。
【００６６】
Ｆ２Ａ含有構築物については、ＯＸ４０Ｌ配列およびＦ２Ａプロセシング部位の一部を含有するフラグメント１を、プライマーGibson OX４０ＬおよびＦ２Ａ逆ＯＸ４０Ｌを使用してｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＯＸ４０Ｌから増幅し（表１で使用される全てのプライマーのリストを参照のこと）、Ｆ２Ａプロセシング部位の一部を含有するフラグメント２を、そしてＣＤ４０Ｌの完全配列を、プライマーＦ２Ａ順方向ＣＤ４０ＬおよびＦ２Ａ逆方向ＣＤ４０Ｌを使用してｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＤ４０Ｌから増幅した。
【００６７】
Ｐ２Ａ含有構築物については、ＯＸ４０Ｌ配列およびＰ２Ａプロセシング部位の一部を含有する断片１を、プライマーGibson OX４０ＬおよびＰ２Ａ逆ＯＸ４０Ｌを使用してｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＯＸ４０Ｌから増幅し（表１で使用される全てのプライマーのリストを参照のこと）、Ｐ２Ａプロセシング部位の一部を含有する断片２を、プライマーＰ２Ａ順方向ＣＤ４０ＬおよびＰ２Ａ逆方向ＣＤ４０Ｌを使用してｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＤ４０Ｌから増幅した。
【００６８】
Ｆ２ＡおよびＰ２Ａ構築物の両方について、ＣＤ４０Ｌの３’末端に隣接するアデノウイルスゲノム配列を含むフラグメント３を、プライマーＦ２ＡフォワードＡｄｅｎｏ末端（挿入有り、無し）およびGibson OX４０L REVを使用して、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＯＸ４０Ｌから増幅した。全てのＰＣＲ反応はPhusion High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher製、Ｆ５３０）を用いて、製造業者の説明書に従って行い、続いてＤｐｎＩ処理（ＮＥＢ、Ｒ０１７６）を行った。反応物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲルおよびＰＣＲクリーンアップキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ製、７４０６０９．５０）で精製した。次いで、精製したフラグメントを一緒に組み立てて、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ、Ｅ２６１１）を用いてＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｆ２Ａ／ＣＤ４０ＬおよびＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０Ｌを作製し、続いて、プライマーGibson OX４０L FWおよびGibson OX４０L REVを用いて組み立てたフラグメントのＰＣＲ増幅を行った（最終フラグメントのアガロースゲル分析については図１を参照）。
【００６９】
ＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｆ２Ａ／ＣＤ４０ＬまたはＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０Ｌをウイルス骨格に導入するために、ｐＡｄ５／３−Ｄ２４をＳｒｆＩ(ＮＥＢ、Ｒ０６２９Ｌ）およびＢａｒＩ(ＳｉｂＥｎｚｙｍｅ(登録商標）、Ｅ５４８）で消化し、続いてエタノール沈殿させた。消化されたウイルス骨格ｐＡｄ５／３−Ｄ２４を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ、Ｅ２６１１）を用いて、ＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｆ２Ａ／ＣＤ４０ＬまたはＧＡ−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０Ｌフラグメントと組み立て、ｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０ＬおよびｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ／Ｐ２Ａ／ＣＤ４０Ｌを生成した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応物を、製造業者の説明書に従って、ＮＥＢ（登録商標）５−α Competent Ecoli(NEB、Ｃ２９８７Ｈ）に形質転換した。陽性コロニーをＰＣＲによってスクリーニングし、構築物を配列決定することによって正しい組換え事象をさらに確認した。
【００７０】
ｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＣＤ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｌを得るためのｐＡＤ５／３−Ｄ２４へのＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌのクローニング
特異的相同組換え反応（ブランド名Gibson Assembly、New England Biolabs)によってウイルス骨格ｐＡｄ５／３−Ｄ２４にクローニングされるＣＤ４０Ｌ(ＣＤ４０Ｌ−ＧＡ）を含むフラグメントを作製するために、３つのＰＣＲ産物をまずＧｉｂｓｏｎアセンブリ組換え反応と一緒にアセンブルした。一緒に融合されたフラグメントは、以下の配列を含んでいた：フラグメントＡがｐＡｄ５／３−Ｄ２４プラスミドのヌクレオチド２１３７６〜２２１１４に対応する。フラグメントＢはｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＤ４０Ｌプラスミドのヌクレオチド９９９〜２６２３に相当する。フラグメントＣは、ｐＡｄ５／３−Ｄ２４プラスミドのヌクレオチド２２８２０−２７１０７に対応する（使用したプライマーおよびプライマー配列のリストについては表１ｂ−３ｂを参照のこと）。ＰＣＲ反応はPhusion High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher製、Ｆ５３０）を用いて製造者の指示に従って行い、反応物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびPCR Clean-upキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ製、７４０６０９．５０）で精製した。次に、ＣＤ４０Ｌ−ＧＡを作製するために、精製されたＰＣＲフラグメントを、製造業者の説明書(Gibson assembly master mix、NEB E２６１１）に従って、Gibson Assembly組換え反応によって一緒に組み立てた。相同組換え後、新たに作製されたＣＤ４０Ｌ−ＧＡフラグメントを、製造業者の説明書に従って、Phusion High−Fidelity DNAポリメラーゼを使用して、プライマーＡＡおよびＤＤ(プライマー配列については、表１ｂおよび３ｂを参照）を使用するＰＣＲによってさらに増幅した。ＰＣＲ増幅したＣＤ４０Ｌ−ＧＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびPCR Clean−ｕｐキットを使用してゲル精製した。ＣＤ４０Ｌ−ＧＡをウイルス骨格にクローニングするために、ｐＡｄ５／３−Ｄ２４をＳｐｅＩ(ＮＥＢ、Ｒ０１３３Ｓ）およびＡｓｉＳＩ(ＮＥＢ、Ｒ０６３０Ｓ）で消化し、続いてエタノール沈殿させた。消化されたウイルス骨格ｐＡｄ５／３−Ｄ２４を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ、Ｅ２６１１）を使用して、製造者の指示に従ってＣＤ４０Ｌ−ＧＡフラグメントとアセンブルして、ｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＣＤ４０Ｌを生成した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応物を、製造業者の指示に従ってＮＥＢ（登録商標）５−αコンピテント大腸菌（ＮＥＢ、Ｃ２９８７Ｈ）に形質転換した。陽性コロニーをＰＣＲによってスクリーニングし、構築物を配列決定することによって正しい組換えをさらに確認した。最終構築物、すなわち、ＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌ遺伝子の両方を含むウイルスを作製するために、ＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌ−ＧＡ）を含むフラグメントを、以下のプライマーを使用して増幅した：Gibson OX４０L FWおよびGibson OX４０L REV(ヌクレオチド１１〜３２８７に対応するｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＯＸ４０Ｌ中の領域を増幅する）プライマー配列については、表４ｂを参照のこと。ＰＣＲ反応はPhusion High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher、Ｆ５３０）を用いて、製造者の説明書に従って行い、反応物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびPCR Clean-upキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ製、７４０６０９．５０）で精製した。ＯＸ４０Ｌ−ＧＡをウイルス骨格にクローニングするた��に、ｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＣＤ４０ＬをＳｒｆＩ(ＮＥＢ、Ｒ０６２９Ｌ）およびＢａｒＩ(ＳｉｂＥｎｚｙｍｅ(登録商標）、Ｅ５４８）で消化し、続いてエタノール沈殿させた。消化されたウイルス骨格ｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＣＤ４０Ｌを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ、Ｅ２６１１）を使用して、製造者の指示に従ってＯＸ４０Ｌ−ＧＡフラグメントと組み立て、ｐＡｄ５／３−Ｄ２４−ＣＤ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｌを生成した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応物を、製造業者の指示に従ってＮＥＢ（登録商標）５−αコンピテント大腸菌（ＮＥＢ、Ｃ２９８７Ｈ）に形質転換した。陽性コロニーをＰＣＲによってスクリーニングし、構築物を配列決定することによって正しい組換えをさらに確認した。
【００７１】
１つの導入遺伝子または２つの導入遺伝子を有する改変されたアデノウイルスのインビトロ試験のための方法
ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０相互作用を測定するためのフローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析を行って、ウイルスから発現されたＯＸ４０Ｌがその天然受容体ＯＸ４０に結合できることを確認した（図２）。ヒトＡ５４９細胞を６ウェルプレート上に平板培養し、ダブルトランスジーンウイルス（Ａｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０Ｌ．Ｃ１およびＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０Ｌ．Ｃ３、ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ１およびＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ３と呼ばれる）、ＯＸ４０Ｌのみを有するウイルス（図ではＯＸ４０Ｌ−ウイルスと呼ばれるＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ）または導入遺伝子を持たないウイルス（Ａｄ５／３−Ｄ２４、ｃｔｒｌ−ウイルスと呼ばれる、細胞あたり１０ウイルス）を感染多重度１０で感染させた。
【００７２】
感染後７２時間後、細胞を採取しカウントし、３ｘ１０ＯＢセルを９６の井戸プレート・複製物上で井戸あたりに塗布した。プレートを４００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁した。この工程を２回繰り返し、次いで、細胞を、ＯＸ４０受容体抗体およびヤギ抗ウサギAlexa fluor ４８８抗体の混合物中に懸濁し、３０分間インキュベートし、３回洗浄し、次いで、BD Accuriフローサイトメーター中で泳動して、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０複合体細胞の幾何平均を検出した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【００７３】
ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０相互作用を検証するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ウイルスから発現されたＯＸ４０Ｌがその天然受容体であるＯＸ４０に結合することができることをさらに検証するために、機能的サンドイッチＥＬＩＳＡを行った（図３）。９６ウェルプレートを、その天然形態の２ ｕｇ／ｍｌのＯＸ４０受容体で一晩コーティングし、続いてＰＢＳ中の０．０５% Tween２０ｖ／ｖで３回洗浄した。ウイルス感染Ａ５４９細胞からの上清をウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、続いて再び３回洗浄した。ウェルをマウス抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体（ＰＢＳ中１：１０００希釈）と共に１時間インキュベートし、３回洗浄し、抗マウス−ＨＲＰコンジュゲート（ＰＢＳ中１：１０００希釈）と共に１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、９０μｌのＴＭＢ基質を添加し、プレートを暗所で室温で１０分間インキュベートした。抗マウス抗体に結合したＨＲＰは基質ＴＭＢと比色的に反応し、色の強度を４５０ｎｍで分光光度的に測定した。
【００７４】
ＯＸ４０/ＮＦ-ｋＢ-ＨＥＫ２９３組換え細胞株を用いた機能性アッセイ
ウイルスが産生するＯＸ４０Ｌ（単一導入遺伝子ウイルスまたは二重導入遺伝子ウイルスのいずれか）が機能的であり、その受容体に結合すると下流シグナルを活性化できることを検証するため、ＯＸ４０を恒常的に発現するヒト胚性腎細胞株２９３（ＨＥＫ−２９３）を用いた機能性アッセイを実施した（図４）。
【００７５】
ＯＸ４０Ｌ遺伝子を発現するウイルスに感染させたＡ５４９細胞培養の培地でＯＸ４０Ｌ産物を産生する。培地を回収し、ＯＸ４０受容体を構成的に発現するＯＸ４０／ＮＦ−κＢレポーター−ＨＥＫ２９３細胞の培養物に添加する。ＯＸ４０ＬのＯＸ４０受容体への結合は、ＮＦ−κＢ活性化を介してホタルＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子の発現を導く細胞内シグナル伝達経路を誘発する。ルシフェラーゼ活性を、ＯＮＥステップルシフェラーゼアッセイシステムおよびルミノメーターを用いて測定し、既知濃度のＯＸ４０Ｌ標準の相対生物発光を決定する。次いで、ウイルスサンプルのＯＸ４０Ｌ濃度を、ルミネセンス読み取り値および標準曲線に基づいて分析することができる。ＯＸ４０Ｌ濃度を決定する前に、既知濃度の組換えヒトＯＸ４０Ｌを用いてＯＸ４０Ｌの標準曲線を定義した。
【００７６】
簡潔に述べると、１，５ｘ１０ＯＢＡ５４９細胞を、１０% DMEM中の９６ウェルプレート上にプレーティングした。翌日、Ａ５４９細胞を１０ウイルス、すなわち細胞当たり１０ウイルスの多重感染に感染させ、２% DMEM中の単一導入遺伝子ウイルス（図中ではＯＸ４０Ｌウイルスと呼ばれるＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ）、二重導入遺伝子ウイルス（Ａｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０Ｌ．Ｃ１およびＡｄ５／３−Ｄ２４−ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０Ｌ．Ｃ３、ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ１およびＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ３と呼ばれる）または導入遺伝子を持たないウイルス（Ａｄ５／３−Ｄ２４、ｃｔｒｌウイルスと呼ばれる）のいずれかを用いた。
【００７７】
いくつかのウェルは、ネガティブコントロールとして使用するために感染させないままにした。感染の７２時間後、細胞を５００ｇで５分間遠心分離し、培地を廃棄し、１００ｕｌの１０% MEM中の２×１０ＯＢＯＸ４０／ＮＦ−ｋＢ−ＨＥＫ２９３細胞をＡ５４９細胞の上に添加した。４００ｇで１分間遠心分離した後、細胞を３７oＣで６時間インキュベートした後、溶解緩衝液で溶解し、透明な９６ウェルプレートウェル上に２０ ｕｌのそれぞれの溶解物を添加した。基質として１００ ｕｌのルシフェラーゼ試薬を添加した後、ルミノメーターで直ちに発光を読み取った。
【００７８】
ＣＤ４０Ｌ導入遺伝子産物の機能性アッセイ
ダブルトランスジーンウイルスから発現されたＣＤ４０Ｌタンパク質がその天然受容体ＣＤ４０と結合し、ＣＤ４０発現細胞上の下流シグナルを活性化できることを検証するために、Ramos Blue細胞に基づく機能性アッセイを実施した（図５）。
【００７９】
Ramos Blueは、ＮＦ−κＢ誘導性ＳＥＡＰ(分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を安定発現するＢリンパ球細胞株である。ＣＤ４０Ｌ産物は、ＣＤ４０Ｌ遺伝子を発現するＰｅｐｔｉＣＲＡｄウイルスに感染させた細胞培養の培地中で産生される。培地を回収し、ＣＤ４０受容体を構成的に発現するRamos Blue細胞の培養物に添加する。ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合はＳＥＡＰの分泌を導く細胞内シグナル伝達経路を誘発し、これは基質を青色に変え、６２０〜６５５ｎｍで分光光度的に測定することができる。機能性ＣＤ４０Ｌの相対濃度は、組換えヒトＣＤ４０Ｌの標準曲線を用いて決定する。
【００８０】
簡潔に述べると、ヒトＡ５４９細胞を６ウェルプレート上に平板培養し、ダブルトランスジーンウイルス（ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ１またはＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ．Ｃ３）、導入遺伝子としてＯＸ４０Ｌのみを有するウイルス（ＯＸ４０Ｌ−ウイルス）または導入遺伝子を持たないウイルス（Ｃｔｒｌ−ウイルス）に感染させ、感染の多重度は１０であった。７２時間後に上清を回収し、５００ｇで５分間遠心分離することにより、細胞および細胞破片を除去した。２倍希釈系列を、１００ ｕｇ／ｍｌの出発濃度で、上清および組換えＣＤ４０Ｌタンパク質から調製した。１００μｌの各上清を９６ウェルプレート（１００μｌにプレーティング）中の４×１０OBRamos Blue細胞に添加し、プレートを３７ＯＯＣｏＯＤＣで１８時間インキュベートした。インキュベーション後、４００ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清４０μｌを新しい９６ウェルプレートに添加した。１６０ μｌのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ基質を添加し、プレートを１時間インキュベートし、ＳＥＡＰレベルを分光光度的に測定した。
【００８１】
ペプチド抗原コーティングの有無において、改変アデノウイルスをインビボで試験する方法
ＮＯＤ／Ｓｈｉ‐ｓｃｉｄ／ＩＬ‐２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウスを、ヒト臍帯血から単離した造血幹細胞（ＣＤ３４＋，ＨＬＡ‐Ｂ３５＋）を用いてヒト化した。Ａ３７５ヒト黒色腫腫瘍を皮下に移植し（１００ ｕｌ当たり２×１０6細胞）、動物をヒト化速度および腫瘍の大きさに基づいて群に無作為化した。動物を、ペプチドコーティングなしの腫瘍溶解ウイルス（ＶＡＬＯ−Ｃ１）またはペプチド抗原コーティングありのｎｃｌｏｌｙｔｉｃウイルス(ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ)(両方の群についてウイルス用量１×１０8；１×１０7の準最適用量もまた、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄについて試験した）で処置した。ペプチドワクチン（０．１２または３０ｕｇ）をアジュバントとしてＰｏｌｙ−ＩＣを皮内投与した。
【００８２】
処理は、シクロホスファミドのボーラス投与（１ｍｇ／マウスｉ．ｖ．）による無作為化（Ｄ０）の２５日後に開始した。治療は、１、２、３および１２日目に腫瘍内（模擬、ウイルスおよびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ）または皮内（ペプチド対照）に行った。二次腫瘍は、３回目の治療（５日目）の２日後に対側側腹部に移植した。二次性腫瘍に対する治療は行われなかった。
【００８３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および腫瘍浸潤ＣＤ８＋リンパ球（ＴＩＬ）を、ペプチド抗原ＮＹ‐ＥＳＯ‐１およびＭＡＧＥ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞について、デキストラマー分析によるフローサイトメトリーにより分析した。ＰＢＭＣとＴＩＬの間の異なる免疫細胞サブセットを評価した。フローサイトメトリー分析は、Attune NxT Flow Cytometer(Life Technologies製)で行った。
【００８４】
ＰＢＭＣマウスモデル免疫化
３５匹の８週齢のＮＯＤ−Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２／ＩＬ−２Ｒγ ２６em Cd２２／ＮｊｕＣｒｌ免疫不全マウス（ＮＣＧ）に、２．１０6のＳＫＭＥＬ−２腫瘍細胞（ＨＬＡ−Ｂ３５＋）を右側腹部に移植した（０日目）。１３日目に、２人の異なったドナーからの５×１０6のＨＬＡ−Ｂ３５＋ヒト末梢血単核細胞を静脈内注射した。ＮＹＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３ −複合体化５／３カプシドを用い、ＯＸ４０Ｌ発現ウイルス（「ＯＸ４０L PeptiCRAd」）またはＮＹＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３ −複合体化５／３カプシド含有ＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ発現ウイルス（「ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ」）を含む腫瘍内処置を、それぞれのペプチドと複合体化した１ｘ １０ 9 ＶＰのウイルス投与量で１６日目に開始した。最初のＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理と同時に、５０’０００自家形質細胞様および骨髄系樹状細胞を腫瘍内に注入した。１７日目、１８日目（初回治療でプライム）および２５日目（ブースト）に、腫瘍内ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ注射により、樹状細胞の添加なしに腫瘍を処置した。治療スキーマを図１０に示し、腫瘍の増殖を追跡した。動物を３２日目に屠殺した。ＯＸ４０Ｌ−ＰｅｐｔｉＣＲａｄとＰｅｐｔｉＣＲＡｄは、１４．７Ｋ軌跡と５／３キメリック繊維から表現されるヒトＯＸ４０Ｌトランスジーンである削除ｇｐ１９ｋ／７．１Ｋ領域、Ｅ１Ａに２４ｂｐの削除を含んでいる。
【００８５】
結果：
ウイルスから発現されるＯＸ４０Ｌの機能性
フローサイトメトリー分析ならびにサンドイッチＥＬＩＳＡはウイルスから感染細胞の細胞表面上に発現されたＯＸ４０Ｌ導入遺伝子産物が細胞表面からある程度脱落するとともに、その受容体ＯＸ４０に結合することができることを示している（それぞれ図２および３）。最も重要なことは、ウイルスから発現したＯＸ４０Ｌの機能性を解析すると、安定してＯＸ４０受容体を発現しているＨＥＫ−２９３細胞を利用すると、明らかな下流遺伝子の活性化が見られたことである（図４）。ＯＸ４０ＬのＯＸ４０への結合はこれらの細胞における細胞内シグナル伝達経路を誘発し、ＮＦ−κＢ活性化を介してホタルＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子の発現を導く。ＯＸ４０Ｌ発現ウイルスに感染させたＡ５４９細胞を用いて得られた生物ルミネセンスのレベルは導入遺伝子または陰性細胞対照を用いないウイルスを用いて得られた生物ルミネセンスレベルと比較した場合、ＯＸ４０Ｌタンパク質が機能的であり、ＯＸ４０に結合すると下流のシグナル伝達を活性化することを明確に示す。
【００８６】
ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ４０Ｌ発現ウイルスから発現されるＣＤ４０Ｌの機能性
ＣＤ４０受容体を安定発現するRamos Blue細胞を利用してＣＤ４０Ｌ機能性を解析したところ、明らかな下流遺伝子活性化が見られた（Ｆｉｇｕｒｅ ５）。ＣＤ４０ＬがＣＤ４０に結合すると、これらの細胞で細胞内シグナル伝達経路が引き起こされ、ＮＦ−κＢの活性化を介してＳＥＡＰ遺伝子の発現が引き起こされる。ＣＤ４０Ｌ発現ウイルスに感染させたＡ５４９細胞を用いた場合に得られた吸光度レベルは導入遺伝子または陰性細胞対照としてＣＤ４０Ｌを含まないウイルスを用いて得られた吸光度レベルと比較した場合、ＣＤ４０Ｌタンパク質が機能しており、ＣＤ４０に結合すると下流のシグナル伝達を活性化することを明確に示している。
【００８７】
ヒト化マウスモデルにおいて、ペプチド表面抗原の有無にかかわらず、改変腫瘍溶解ウイルスはペプチド特異的免疫応答を誘発する
全ての活性処理（ペプチド単独、ペプチドを含まないウイルス［ＶＡＬＯ−Ｃ１］、およびペプチドを含むウイルス［ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ］）は、模擬処理動物と比較して、原発腫瘍における免疫細胞数を増加させた。ＶＡＬＯ−Ｃ１およびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１処置動物の両方は処置後にペプチドワクチンまたは模擬処置動物と比較して、原発腫瘍においてより多くのＴ細胞（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）を示したが、全体的な浸潤免疫細胞（ＣＤ４５）の数はすべての群で類似していた（それぞれ、図６および７）。
【００８８】
さらに、Ｔ調節細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋）の数は、ペプチドワクチンまたは模擬処置動物由来の原発腫瘍と比較して、ＶＡＬＯ−Ｃ１およびＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１処置原発腫瘍で少なかった（図８）。このことは、腫瘍内に投与された免疫原性アデノウイルス（裸のウイルスＶＡＬＯ−Ｃ１またはＰｅｐｔｉＣＲＡｄ−１のいずれか）が局所の免疫抑制を低下させることによって腫瘍微小環境を調節することを示唆している。
【００８９】
全身性腫瘍標的ＣＤ８+ T細胞応答および未治療の遠隔腫瘍へのＣＤ８+ TILの浸潤を誘発する上で、腫瘍溶解性アデノウイルス（ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ）またはペプチド抗原非存在下（ＶＡＬＯ−Ｃ１）は、スーパーまたは標準的ペプチドワクチン接種に対するものである。このデータは、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄが標準的な腫瘍崩壊性ウイルスの腫瘍標的特異性を改善することを示唆している。
【００９０】
ペプチＣＲＡｄはＰＢＭＣマウスモデルにおいてペプチド特異的免疫応答を誘発する
ＮＹ−ＥＳＯ−１−およびＭＡＧＥ−Ａ３−複合体化ペプチＣＲＡｄによる治療は、大きな十分に確立された腫瘍に対して治療を開始した場合でも、ヒト化マウスメラノーマモデルにおいて腫瘍増殖停止をもたらした（図９）。ＯＸ４０Ｌ−ＰｅｐｔｉＣＲＡｄで処理したマウスは、模擬処理マウスよりもＰＢＭＣの全ＣＤ８+ T細胞の中でＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＣＤ８+ T細胞が有意に多く、ＰｅｐｔｉＣＲＡｄ処理がヒト化マウスにおいてペプチド特異的応答を誘発できることを示した（図１０）。
【００９１】
参考文献
Kanerva et al ２００３ Mol Ther １２：４４９−４５８．。
【００９２】
Fueyo et al ２０００．。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：２−１２．。
【００９３】
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2021518126.tif 000003
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月16日(2019.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的癌細胞において溶解活性を有する血清型５の改変された複製アデノウイルスであって：
ａ)   塩基対９２３〜９４６をコードするヌクレオチドの欠失である、Ｅ１Ａ遺伝子欠失；
ｂ)    血清型５ Ａｄのノブが血清型３ Ａｄのノブによって置換されている、アデノウイルス繊維タンパク質のノブの５／３キメラ置換；
ｃ)    １４．７ｋ遺伝子欠失であって、前記欠失が野生型アデノウイルスに関して塩基対３０４４８〜３０８３４の欠失であり、配列GGA GGA GAT GAC TGAが、GGA GAC GAC TGAに置換されるているもの；
ｄ)   ｇｐ１９ｋ遺伝子欠失および７．１ｋ遺伝子欠失であって、前記欠失が野生型アデノウイルスに関して塩基対２８５４１〜２９２１１の欠失であるもの；
を含む、改変された複製アデノウイルス。
【請求項２】
前記アデノウイルスが、ＯＸ４０Ｌをコードする分子の挿入によってさらに改変されている、請求項１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項３】
前記ＯＸ４０ＬがヒトＯＸ４０Ｌである、請求項２に記載の改変アデノウイルス。
【請求項４】
前記ＯＸ４０ＬがＥ３Ｂ領域に挿入され、遺伝子１４．７Ｋ欠失を置換する、請求項２または３に記載の改変アデノウイルス。
【請求項５】
前記アデノウイルスが、ＣＤ４０Ｌをコードする分子の挿入によって改変される、請求項１〜４のいずれか１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項６】
前記ＣＤ４０ＬがヒトＣＤ４０Ｌである、請求項５に記載の改変アデノウイルス。
【請求項７】
前記ＣＤ４０Ｌ分子が、２Ａプロセッシング部位を用いてＯＸ４０Ｌのすぐ下流に挿入される、請求項５又は６に記載の改変アデノウイルス。
【請求項８】
前記２Ａプロセシング部位が２つの導入遺伝子の間に挿入され、前記２Ａプロセシング部位の前に切断部位およびＳＧＳＧリンカーがあり、前記導入遺伝子の有効な切断を確実にする、請求項７に記載の改変アデノウイルス。
【請求項９】
前記２Ａプロセシング部位が、口蹄疫ウイルス２Ａプロセシング部位（Ｆ２Ａ）または豚テシオウイルス−１ ２Ａプロセシング部位である、請求項７または８に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１０】
前記ＣＤ４０Ｌ分子が、ウイルスの後期領域、特に後期領域３（Ｌ３）に挿入される、請求項５または６に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１１】
前記ＣＤ４０Ｌ分子が、ポリアデニル化部位に先行する２３Ｋ遺伝子から下流に挿入される、請求項１０に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１２】
スプライスアクセプター部位および／またはＫｏｚａｋ配列が、前記ＣＤ４０Ｌ分子の上流に提供または挿入される、請求項１０または１１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１３】
ＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌの少なくとも１つまたは両方の全ｃＤＮＡをコードする分子が、前記アデノウイルスに挿入される、請求項２〜１２のいずれか１に記載の改変アデノウイルス。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの改変された複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルスと、適切なキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、皮内、腔内もしくは腹腔内注射、または経口投与のために製剤化されている、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
癌を治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの改変された複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルス、または請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの改変された複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルス、または請求項１４または１５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
患者における癌を治療する方法であって、有効量の、請求項１５または１６に記載の医薬組成物、または請求項１〜１３のいずれか１に記載の少なくとも１つの改変された複製能および標的細胞溶解性を有するアデノウイルスを含む組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１に記載の少なくとも１つの改変された複製能力および標的細胞溶解性を有するアデノウイルスが、細胞チェックポイントモジュレーターと共に投与される、請求項１８に記載の癌を治療する方法。
【請求項２０】
前記チェックポイントモジュレーターが、抗ＰＤ１分子、抗ＰＤ−Ｌ１分子または抗ＣＴＬＡ−４分子である、請求項１９に記載の癌を治療する方法。
【請求項２１】
前記癌が、鼻咽頭がん、滑膜がん、肝細胞がん、腎がん、結合組織がん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、喉がん、口腔がん、肝がん、骨がん、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、フェオクロモサイトーマ、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルシノイド、胃腸管の癌腫、線維肉腫、乳癌、パジェット病、頸部癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼がん、頸がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝がん、カポシ肉腫、前立腺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、内分泌膵臓がん、グルカゴノーマ、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、栄養芽細胞がん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリン腫、カルチノイド症候群、体細胞スタチン腫、歯肉がん、心臓がん、唇がん、髄膜がん、口腔がん、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がん、扁桃がんを含むまたはそれらよりなる群から選択される、請求項１６に記載のアデノウイルス、請求項１７に記載の使用、または請求項１８〜２０のいずれか１に記載の方法。
【国際調査報告】
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