(57)【要約】本開示は、ＣＤ４０に結合およびアンタゴナイズする抗体に関する。これらの抗体は、免疫応答を阻害し、自己免疫疾患を処置するために特に有用である。本開示は、本明細書で開示される抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含むおよび／もしくは生成する、ならびに／または本明細書で開示される核酸を含む細胞をさらに提供し、好ましくは、ここで上記細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＮＳ０細胞またはＰＥＲ−Ｃ６ＴＭ細胞である。開示はさらに、本明細書で開示される細胞を含む、細胞培養物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで前記軽鎖可変領域は、
−配列ＲＳＳＱＳＬＡＺ６ＳＺ７ＧＮＴＹＬＨを有するＣＤＲ１であって、ここでＺ６はＳであり、Ｚ７は、ＳまたはＱであるＣＤＲ１；
−配列ＫＶＳＮＲＦＳを有するＣＤＲ２；および
−配列ＳＱＳＴＨＶＰＷＴを有するＣＤＲ３、
を含み、ここで前記重鎖可変領域は、
−配列ＧＦＳＸ１１ＳＲＹを有するＣＤＲ１であって、ここでＸ１１は、Ｉ、Ｌ、またはＶであり、好ましくはここでＸ１１はＬであるＣＤＲ１；
−配列ＷＧＧＧＳＴＤを有するＣＤＲ２；および
−配列ＴＤＧＤＹを有するＣＤＲ３、
を含む、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列：
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＸ３ＧＬＶＫＰＸ４Ｘ５Ｘ６ＬＸ７Ｘ８Ｘ９ＣＸ１０ＶＳＧＦＳＸ１１ＳＲＹＳＶＹＷＸ１２ＲＱＸ１３ＰＧＫＧＸ１４ＥＷＸ１５ＧＭＭＷＧＧＧＳＴＤＹＸ１６Ｘ１７ＳＸ１８ＫＸ１９ＲＸ２０ＴＩＳＫＤＸ２１Ｘ２２ＫＸ２３Ｘ２４ＶＸ２５ＬＸ２６Ｘ２７Ｘ２８ＳＬＸ２９Ｘ３０Ｘ３１ＤＴＡＸ３２ＹＹＣＶＲＴＤＧＤＹＷＧＱＧＴＸ３３ＶＴＶＳＳ
を含む重鎖可変領域を有し、ここで：
Ｘ１は、Ｑであり；
Ｘ２は、ＱまたはＶであり：
Ｘ３は、ＰまたはＧであり；
Ｘ４は、ＳまたはＧであり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｑ、またはＧであり；
Ｘ６は、ＴまたはＳであり；
Ｘ７は、ＳまたはＲであり：
Ｘ８は、ＩまたはＬであり；
Ｘ９は、ＴまたはＳであり；
Ｘ１０は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１１は、Ｉ、Ｌ、またはＶであり；このましくは、Ｘ１１は、Ｌであり；
Ｘ１２は、Ｉ、Ｌ、またはＶであり；好ましくは、Ｘ１２は、ＩまたはＶであり、
Ｘ１３は、ＰまたはＡであり；
Ｘ１４は、ＰまたはＬであり；
Ｘ１５は、ＭまたはＩであり；
Ｘ１６およびＸ１７は、ＳＴまたはＮＰであり；
Ｘ１８は、ＬまたはＶであり；
Ｘ１９は、ＳまたはＧであり；
Ｘ２０は、ＬまたはＦであり；
Ｘ２１は、ＴまたはＮであり；
Ｘ２２は、ＳまたはＡであり；
Ｘ２３は、ＳまたはＴであり；
Ｘ２４は、ＱまたはＳであり；
Ｘ２５は、ＳまたはＹであり；
Ｘ２６は、ＫまたはＱであり；
Ｘ２７は、ＭまたはＬであり；
Ｘ２８は、Ｓであり；
Ｘ２９は、ＲまたはＴであり；
Ｘ３０は、Ａであり；
Ｘ３１は、ＡまたはＥであり；
Ｘ３２は、Ｖであり、そして
Ｘ３３は、Ｌである、
請求項１に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
Ｘ２は、Ｑであり；
Ｘ３は、Ｐであり；
Ｘ４は、Ｓであり；
Ｘ５は、ＥまたはＱであり；
Ｘ６は、Ｔであり；
Ｘ７は、Ｓであり；
Ｘ９は、Ｔであり；
Ｘ１０は、Ｔであり；
Ｘ１３は、Ｐであり；
Ｘ１８は、Ｌであり；
Ｘ１９は、Ｓであり；
Ｘ２０は、Ｌであり；
Ｘ２１は、Ｔであり；
Ｘ２２は、Ｓであり；
Ｘ２３は、Ｓであり；
Ｘ２４は、Ｑであり；
Ｘ２５は、Ｓであり；
Ｘ２６は、Ｋであり；
Ｘ２９は、Ｔであり；そして
Ｘ３１は、Ａである、
請求項２に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
Ｘ２は、Ｖであり；
Ｘ３は、Ｇであり；
Ｘ４は、Ｇであり；
Ｘ５は、Ｇであり；
Ｘ６は、Ｓであり；
Ｘ７は、Ｒであり：
Ｘ８は、Ｌであり；
Ｘ９は、Ｓであり；
Ｘ１０は、Ａであり；
Ｘ１３は、Ａであり；
Ｘ１４は、Ｌであり；
Ｘ１５は、Ｍであり；
Ｘ１６およびＸ１７は、ＳＴであり；
Ｘ１８は、Ｖであり；
Ｘ１９は、Ｇであり；
Ｘ２０は、Ｆであり；
Ｘ２１は、Ｎであり；
Ｘ２２は、Ａであり；
Ｘ２３は、Ｔであり；
Ｘ２４は、Ｓであり；
Ｘ２５は、Ｙであり；
Ｘ２６は、Ｑであり；
Ｘ２７は、Ｍであり；
Ｘ２９は、Ｒであり；そして
Ｘ３１は、Ｅである、
請求項２に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４ＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＺ５ＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＡＺ６ＳＺ７ＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱ  Ｚ８ＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ；
を含む軽鎖可変領域を有し、ここで：
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は、ＥＬＱＬまたはＤＩＶＭであり；
Ｚ５は、ＬまたはＰであり；
Ｚ６は、ＳまたはＤであり；
Ｚ７は、ＳまたはＱであり；そして
Ｚ８は、ＲまたはＫである、
請求項１に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は、ＥＬＱＬであり；
Ｚ５は、Ｌであり；そして
Ｚ８は、Ｒである、
請求項５に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は、ＤＩＶＭであり；
Ｚ５は、Ｐであり；
Ｚ６は、Ｓであり；
Ｚ７は、Ｑであり；そして
Ｚ８は、Ｋである、
請求項５に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体は、アンタゴニスト的抗ヒトCＤ４０モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト抗体の定常領域、好ましくは、ＩｇＧ定常領域を含み、ここで好ましくは、前記定常領域は、補体活性化が欠けている領域であり、好ましくはヒトＩｇＧ４定常領域または変異ヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体を含むおよび／もしくは生成する、ならびに／または請求項１０に記載の核酸を含む細胞であって、好ましくは、ここで前記細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＮＳ０細胞またはＰＥＲ−Ｃ６ＴＭ細胞である、細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞のうちのいずれか１種に従う細胞を含む、細胞培養物。
【請求項１３】
請求項１〜９に記載の抗体のうちのいずれかを生成するおよび／または精製するための方法であって、ここで好ましくは、前記抗体は生成され、前記方法は、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の細胞を培養する工程、および前記抗体を前記培養物から採取する工程を包含する方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体、請求項１０に記載の核酸、および／または請求項１１に記載の細胞を含む、好ましくは、医薬としての使用のための、医薬組成物。
【請求項１５】
自己免疫障害、および／もしくは炎症性障害の症状を改善する、ならびに／または移植片拒絶を低減する、ならびに／またはＣＤ４０陽性がんの処置のための医薬としての使用のための、好ましくは、ここで前記自己免疫障害および／もしくは炎症性障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、水疱性類天疱瘡および／またはアトピー性皮膚炎の群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体、および／または請求項１０に記載の核酸、および／または請求項１１に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、ＣＤ４０に結合およびアンタゴナイズする抗体に関する。これらの抗体は、免疫応答を阻害し、自己免疫疾患を処置するために特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＣＤ４０分子は、５０ｋＤａのＩ型膜糖タンパク質である。このタンパク質は、抗原提示細胞（Ｂ細胞、単球／マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）を含む）の表面で主に発現され、他の細胞タイプ（内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞およびケラチノサイトを含む）の広範な種類でも見出され得る。ＣＤ４０レセプターのリガンドはＣＤ４０Ｌであり、ＣＤ１５４ともいわれる。この３２ｋＤａタンパク質は、ＩＩ型膜内在性糖タンパク質であり、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞および活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞の小さな集団上で一過性に発現される。さらに、ＣＤ４０Ｌは、多くの他の免疫細胞および他の細胞タイプ上で見出されている。ＣＤ４０およびそのリガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する。
【０００３】
ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用は、種々の下流の効果を誘導する。それがＣＤ４０Ｌとライゲーションした後に、ＣＤ４０は、その細胞を活性化して進入し、多くの炎症促進性および血栓形成促進性の（prothrombic）遺伝子の発現を刺激する。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、細胞性および体液性の両方の免疫応答に関わっている。いくつかの研究は、種々の慢性炎症性疾患および自己免疫疾患においてＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の関与を明らかに示している。従って、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用における干渉は、免疫応答をモジュレートして、免疫関連疾患を処置するための潜在的な標的を構成する。
【０００４】
マウスモデルにおける研究は、種々の疾患におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの機能的役割を示している。例えば、ＣＤ４０Ｌトランスジェニックマウスは、致死的な炎症性腸疾患を獲得する。他方で、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス炎症性腸疾患モデルにおいて、Ｔ細胞再構成の日からの抗ＣＤ４０Ｌ抗体での処置は、実験的大腸炎の臨床上のおよび組織学的出現を完全に防止することが示された。
【０００５】
クローン病を有する患者は、消化管の消耗性炎症性障害に苦しんでいる。この疾患は、病的な粘膜への活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの流入によって特徴づけられる。粘膜免疫細胞は、クローン病における炎症ループを開始することにおいて中心的な役割を果たすことが示される。その活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞に対するＣＤ４０Ｌの主な役割は、クローン病におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ発現に関する以前の研究によって示唆されている。Ｍａｂ  ５Ｄ１２抗体は、非刺激性アンタゴニスト的ＣＤ４０抗体として開発された。その５Ｄ１２抗体での免疫組織化学を使用して、ＣＤ４０発現のレベルの増加が、クローン病患者の病的でない粘膜に対して病的な粘膜において見出された。さらに、５Ｄ１２での患者由来のＴ細胞の処置は、共培養した単球によって低減したＩＬ−１２およびＴＮＦ−α生成を生じた。これらの知見は、そのＣＤ４０アンタゴニスト的抗体５Ｄ１２が、クローン病における免疫応答を潜在的に阻害することを意味する。本開示は、ＣＤ４０をアンタゴナイズするための改善された抗体を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本開示の一局面は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで上記軽鎖可変領域は、配列ＲＳＳＱＳＬＡＺ６ＳＺ７ＧＮＴＹＬＨを有するＣＤＲ１であって、ここでＺ６は、Ｓであり、Ｚ７は、ＳまたはＱであるＣＤＲ１；配列ＫＶＳＮＲＦＳを有するＣＤＲ２；および配列ＳＱＳＴＨＶＰＷＴを有するＣＤＲ３を含み、ここで上記重鎖可変領域は、配列ＧＦＳＸ１１ＳＲＹを有するＣＤＲ１であって、ここでＸ１１は、Ｉ、Ｌ、またはＶであり、好ましくはここでＸ１１はＬであるＣＤＲ１；配列ＷＧＧＧＳＴＤを有するＣＤＲ２；および配列ＴＤＧＤＹを有するＣＤＲ３を含むものを提供する。
好ましくは、上記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列：
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＸ３ＧＬＶＫＰＸ４Ｘ５Ｘ６ＬＸ７Ｘ８Ｘ９ＣＸ１０ＶＳＧＦＳＸ１１ＳＲＹＳＶＹＷＸ１２ＲＱＸ１３ＰＧＫＧＸ１４ＥＷＸ１５ＧＭＭＷＧＧＧＳＴＤＹＸ１６Ｘ１７ＳＸ１８ＫＸ１９ＲＸ２０ＴＩＳＫＤＸ２１Ｘ２２ＫＸ２３Ｘ２４ＶＸ２５ＬＸ２６Ｘ２７Ｘ２８ＳＬＸ２９Ｘ３０Ｘ３１ＤＴＡＸ３２ＹＹＣＶＲＴＤＧＤＹＷＧＱＧＴＸ３３ＶＴＶＳＳ
を含む重鎖可変領域を有し、ここで：
Ｘ１は、Ｑであり；Ｘ２は、ＱまたはＶであり；Ｘ３は、ＰまたはＧであり；Ｘ４は、ＳまたはＧであり；Ｘ５は、Ｅ、Ｑ、またはＧであり；Ｘ６は、ＴまたはＳであり；Ｘ７は、ＳまたはＲであり；Ｘ８は、ＩまたはＬであり；Ｘ９は、ＴまたはＳであり；Ｘ１０は、ＴまたはＡであり；Ｘ１１は、Ｉ、Ｌ、またはＶであり；このましくは、Ｘ１１は、Ｌであり；Ｘ１２は、Ｉ、Ｌ、またはＶであり；好ましくは、Ｘ１２は、ＩまたはＶであり；Ｘ１３は、ＰまたはＡであり；Ｘ１４は、ＰまたはＬであり；Ｘ１５は、ＭまたはＩであり；Ｘ１６およびＸ１７は、ＳＴまたはＮＰであり；Ｘ１８は、ＬまたはＶであり；Ｘ１９は、ＳまたはＧであり；Ｘ２０は、ＬまたはＦであり；Ｘ２１は、ＴまたはＮであり；Ｘ２２は、ＳまたはＡであり；Ｘ２３は、ＳまたはＴであり；Ｘ２４は、ＱまたはＳであり；Ｘ２５は、ＳまたはＹであり；Ｘ２６は、ＫまたはＱであり；Ｘ２７は、ＭまたはＬであり；Ｘ２８は、Ｓであり；Ｘ２９は、ＲまたはＴであり；Ｘ３０は、Ａであり；Ｘ３１は、ＡまたはＥであり；Ｘ３２は、Ｖであり、そしてＸ３３は、Ｌである。
好ましくは、ここで：
Ｘ２は、Ｑであり；Ｘ３は、Ｐであり；Ｘ４は、Ｓであり；Ｘ５は、ＥまたはＱであり；Ｘ６は、Ｔであり；Ｘ７は、Ｓであり；Ｘ９は、Ｔであり；Ｘ１０は、Ｔであり；Ｘ１３は、Ｐであり；Ｘ１８は、Ｌであり；Ｘ１９は、Ｓであり；Ｘ２０は、Ｌであり；Ｘ２１は、Ｔであり；Ｘ２２は、Ｓであり；Ｘ２３は、Ｓであり；Ｘ２４は、Ｑであり；Ｘ２５は、Ｓであり；Ｘ２６は、Ｋであり；Ｘ２９は、Ｔであり；そしてＸ３１は、Ａである。
好ましくは、ここで：
Ｘ２は、Ｖであり；Ｘ３は、Ｇであり；Ｘ４は、Ｇであり；Ｘ５は、Ｇであり；Ｘ６は、Ｓであり；Ｘ７は、Ｒであり；Ｘ８は、Ｌであり；Ｘ９は、Ｓであり；Ｘ１０は、Ａであり；Ｘ１３は、Ａであり；Ｘ１４は、Ｌであり；Ｘ１５は、Ｍであり；Ｘ１６およびＸ１７は、ＳＴであり；Ｘ１８は、Ｖであり；Ｘ１９は、Ｇであり；Ｘ２０は、Ｆであり；Ｘ２１は、Ｎであり；Ｘ２２は、Ａであり；Ｘ２３は、Ｔであり；Ｘ２４は、Ｓであり；Ｘ２５は、Ｙであり；Ｘ２６は、Ｑであり；Ｘ２７は、Ｍであり；Ｘ２９は、Ｒであり；そしてＸ３１は、Ｅである。
好ましくは、上記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４ＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＺ５ＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＡＺ６ＳＺ７ＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱ  Ｚ８ＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ；
を含む軽鎖可変領域を有し、ここで：
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は、ＥＬＱＬまたはＤＩＶＭであり；  Ｚ５は、ＬまたはＰであり；Ｚ６は、ＳまたはＤであり；Ｚ７は、ＳまたはＱであり；そしてＺ８は、ＲまたはＫである。
好ましくは、ここで
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は、ＥＬＱＬであり；Ｚ５は、Ｌであり；そしてＺ８は、Ｒである。
好ましくは、ここで
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は、ＤＩＶＭであり；Ｚ５は、Ｐであり；Ｚ６は、Ｓであり；Ｚ７は、Ｑであり；そしてＺ８は、Ｋである。
【０００７】
好ましくは、上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、アンタゴニスト的抗ヒトCＤ４０モノクローナル抗体である。好ましくは、上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体の定常領域、好ましくは、ＩｇＧ定常領域を含み、好ましくはここで上記定常領域は、補体活性化が欠けている領域であり、好ましくはヒトＩｇＧ４定常領域または変異ヒトＩｇＧ１定常領域である。本開示は、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントのうちのいずれかをコードする核酸をさらに提供する。
【０００８】
本開示は、本明細書で開示される抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含むおよび／もしくは生成する、ならびに／または本明細書で開示される核酸を含む細胞をさらに提供し、好ましくは、ここで上記細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＮＳ０細胞またはＰＥＲ−Ｃ６ＴＭ細胞である。開示はさらに、本明細書で開示される細胞を含む、細胞培養物を提供する。
【０００９】
本開示の一局面は、上記抗体または抗原結合フラグメントのうちのいずれかを生成するおよび／または精製するための方法であって、好ましくは、ここで上記抗体は生成され、上記方法は、先に記載されるとおりの細胞を培養する工程、および上記抗体を上記培養物から採取する工程を包含する方法に関する。
【００１０】
本開示の一局面は、開示されるとおりの抗体もしくはその抗原結合フラグメント、核酸および／または細胞を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、本明細書で開示されるとおりの組成物または抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、医薬の製造における使用のためのものである。好ましくは、上記医薬は、自己免疫障害、および／もしくは炎症性障害の症状を改善する、ならびに／または移植片拒絶を低減する、ならびに／またはＣＤ４０陽性がんの処置のためのものであり、好ましくはここで上記自己免疫障害および／もしくは炎症性障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、水疱性類天疱瘡（bullous  pemphigoides）および／またはアトピー性皮膚炎の群から選択される。好ましくはここで上記自己免疫障害および／または炎症性障害は、炎症性腸疾患を含み、好ましくは、潰瘍性大腸炎またはクローン病を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】可変ドメインのアミノ酸配列アラインメント。ＰＧ１０２抗体の可変領域と比較した、軽鎖および重鎖両方の可変領域のアミノ酸配列アラインメント。アミノ酸配列中の差異を、アミノ酸レベルでの変化の程度に応じて灰色または白で強調する。同一の配列を、黒で強調する。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従って図面の中で示される。
【００１２】
【図２】ＰＧ１０２バリアントのＣＤ４０に対する結合親和性。Ａ．  ＰＧ１０２  ｗｔ（親）および操作されたバリアントを、それらのＣＤ４０に対する結合親和性に関して試験した。結合親和性を、ＰＧ１０２  ｗｔと比較して、パーセンテージとして示す。Ｂ．  ＰＧ１０２  ｗｔ（親）および操作されたバリアントを、それらの倍数力価改善（fold  titer  improvement）に関して試験した。倍数力価改善を、１で設定されるＰＧ１０２と比較して示す。
【００１３】
【図３】ＴＮＦ分泌を、モノクローナル抗体での処理によって阻害する。ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体によるＣＤ４０Ｌ誘導性ＴＮＦ分泌の阻害。ＰＧ１０２  ＷＴおよび新たな抗体バリアントを、４名の異なるドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（データ点によって表される）に対して、１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で試験する。グラフは、ＴＮＦ分泌の阻害のパーセンテージを示す。
【００１４】
【図４】４名の異なるドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して試験したモノクローナル抗ＣＤ４０抗体での処理によるＴＮＦ分泌阻害。種々の抗体バリアントを、４名の異なるドナーに対して、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０のリガンド）での誘導後にＴＮＦ分泌を低減する能力に関して試験する。細胞を、１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲に及ぶ４種の異なる濃度に曝露する。最高濃度では、全ての抗体バリアントは、ＴＮＦ分泌の強い阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
開示される実施形態の詳細な説明
本開示は、ＣＤ４０に結合およびアンタゴナイズする抗体に関する。これらの抗体は、免疫応答を阻害し、自己免疫疾患を処置するために特に有用である。
【００１６】
Ｍａｂ  ５Ｄ１２抗体を、非刺激性アンタゴニスト的ＣＤ４０抗体として開発した。ＷＯ２００７／１２９８９５は、ヒトＩｇＧ定常ドメインとともにＭａｂ  ５Ｄ１２の可変重鎖および可変軽鎖を有するキメラ抗体（ｃｈ５Ｄ１２）の生成を記載する。ＷＯ２００７／１２９８９５は、５Ｄ１２抗体の脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）バージョンをさらに記載する。ＷＯ２００７／１２９８９５に記載される抗体のうちの１つは、ＰＧ１０２である。
【００１７】
本開示は、抗ＣＤ４０抗体の発現および製造に関して良好な特性を有する、操作された可変領域、ならびに上記操作された可変領域を含む抗体および抗原結合フラグメントを提供する。このような特性としては、例えば、タンパク質安定性、収量、ＣＤ４０結合親和性、生成細胞の生存性、および低減した免疫原性が挙げられ得る。このような特性は、上記抗体またはその抗原結合フラグメントを大規模で製造する場合に有用である。好ましくは、その特性のうちの少なくとも１つは、そのＰＧ１０２抗体を超えて改善される。
【００１８】
用語「抗体とは、本明細書で使用される場合、ポリペプチド鎖の２つの同一の対（鎖の各対は、１本の「重」鎖および１本の「軽」鎖からなる）から代表的には構成される免疫グロブリン分子に言及する。そのヒト軽鎖は、κおよびλとして分類される。その重鎖は、種々のクラス、すなわち：μ、δ、γ、αまたはεを含む。これらのクラスは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥのような抗体のアイソタイプを規定する。これらのクラスは、その抗体の機能にとって重要であり、免疫応答を調節する助けとなる。重鎖および軽鎖の両方は、可変領域および定常領域からなる。その重鎖の定常領域は、その軽鎖の定常領域より明らかに大きく、その重鎖および軽鎖の呼称を説明している。各重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（ＦＲ）が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。その可変領域は、合計４個のＦＲおよび３個のＣＤＲで構成される。これらは、アミノ末端からカルボキシル末端へと、以下のとおりに配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。その軽鎖および重鎖の可変領域は、一緒になって抗体結合部位を形成し、エピトープに対する特異性を規定する。本開示の各領域またはドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従う。
【００１９】
本明細書で使用される場合、抗原結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、および他の抗原認識免疫グロブリンフラグメントが挙げられる。場合によっては、用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、その抗原結合フラグメントをも含むことが理解され得る。
【００２０】
本開示の一局面は、軽鎖可変領域を含む抗体および／またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、その軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１としてＶＬ−ＣＤＲ１ＡまたはＶＬ−ＣＤＲ１Ｂを、ＣＤＲ２としてＶＬ−ＣＤＲ２を、およびＣＤＲ３としてＶＬ−ＣＤＲ３を含む。軽鎖ＣＤＲは、以下のように規定される：
【化１】
2021513367.tif 000002
【００２１】
ＰＧ１０２およびマウス５Ｄ１２抗体の両方において、軽鎖のＣＤＲ１は、３個のアスパラギン残基を含む。そのアスパラギン残基のうちの２個は、本明細書で記載される軽鎖ＣＤＲ１ｓにおいて置換される。理論によって拘束されることは望まないが、本発明者らは、そのＣＤＲ１置換が、アスパラギン脱アミド化の効果を回避し、タンパク質収量における増加をもたらし、それと同時に、ＣＤ４０結合をなお保持すると考える。
【００２２】
好ましい実施形態において、その軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１としてＶＬ−ＣＤＲ１Ａを、ＣＤＲ２としてＶＬ−ＣＤＲ２を、およびＣＤＲ３としてＶＬ−ＣＤＲ３を含む。別の好ましい実施形態において、その軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１としてＶＬ−ＣＤＲ１Ｂを、ＣＤＲ２としてＶＬ−ＣＤＲ２を、およびＣＤＲ３としてＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、以下のとおり規定されるように、フレームワーク領域１としてＶＬ−ＦＲ１ＡまたはＶＬ−ＦＲ１Ｂを、フレームワーク領域２としてＶＬ−ＦＲ２ＡまたはＶＬ−ＦＲ２Ｂを、フレームワーク領域３としてＶＬ−ＦＲ３を、およびフレームワーク領域４としてＶＬ−ＦＲ４を含む：
【化２】
2021513367.tif 000003
【００２４】
好ましい実施形態において、その軽鎖可変領域は、フレームワーク領域１としてＶＬ−ＦＲ１Ａを、フレームワーク領域２としてＶＬ−ＦＲ２Ａを、フレームワーク領域３としてＶＬ−ＦＲ３を、およびフレームワーク領域４としてＶＬ−ＦＲ４を含む。別の好ましい実施形態において、その軽鎖可変領域は、フレームワーク領域１としてＶＬ−ＦＲ１Ｂを、フレームワーク領域２としてＶＬ−ＦＲ２Ｂを、フレームワーク領域３としてＶＬ−ＦＲ３を、およびフレームワーク領域４としてＶＬ−ＦＲ４を含む。
【００２５】
好ましくは、その軽鎖可変領域は、以下のとおりのアミノ酸配列：  Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４ＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＺ５ＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＡＺ６ＳＺ７ＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱ  Ｚ８ＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲを含み；ここでＺ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４は、ＥＬＱＬまたはＤＩＶＭであり；Ｚ５は、ＬまたはＰであり；Ｚ６は、ＳまたはＤであり；Ｚ７は、ＳまたはＱであり；そしてＺ８は、ＲまたはＫである。
その軽鎖可変領域の好ましい実施形態は、以下のとおりである：
【化３】
2021513367.tif 000004
【００２６】
異なる軽鎖可変領域のアラインメントは、図１に示される。
【００２７】
本開示の一局面は、以下のとおりに規定されるＣＤＲを有する重鎖可変領域を含む抗体および／またはその抗原結合フラグメントを提供する：
【化４】
2021513367.tif 000005
【００２８】
ＷＯ２００７／１２９８９５に記載されるように、ＶＨ  ＣＤＲ１は、ＶＨ−ＣＤＲ１Ａ、ＶＨ−ＣＤＲ１ＢまたはＶＨ−ＣＤＲ１Ｃであり得る。なぜならこれらのアミノ酸配列を有する抗体は、全て類似のＣＤ４０結合を示すからである。好ましくは、ＶＨ  ＣＤＲ１は、ＶＨ−ＣＤＲ１ＡまたはＶＨ−ＣＤＲ１Ｃである。最も好ましくは、ＶＨ  ＣＤＲ１は、ＶＨ−ＣＤＲ１Ａである。
【００２９】
いくつかの実施形態において、その重鎖可変領域は、以下のとおり規定されるように、フレームワーク領域１としてＶＨ−ＦＲ１Ａ、ＶＨ−ＦＲ１ＢまたはＶＨ−ＦＲ１Ｃを、フレームワーク領域２としてＶＨ−ＦＲ２Ａ、ＶＨ−ＦＲ２Ｂ、ＶＨ−ＦＲ２ＣまたはＶＨ−ＦＲ２Ｄを、フレームワーク領域３としてＶＨ−ＦＲ３Ａ、ＶＨ−ＦＲ３ＢまたはＶＨ−ＦＲ３Ｃを、およびフレームワーク領域４としてＶＨ−ＦＲ４を含む：
【化５】
2021513367.tif 000006
【００３０】
ＰＧ１０２およびマウス５Ｄ１２抗体の両方において、ＦＲ１は、３位においてリジン残基を含む。このリジン残基は、本明細書で開示される操作された重鎖バリアントの全てにおいてグルタミン残基に置換される。理論によって拘束されることは望まないが、本発明者らは、リジンからグルタミンへの置換が、凝集の低減およびタンパク質発現における増加をもたらすと考える。
【００３１】
好ましい実施形態において、その重鎖可変領域は、フレームワーク領域１としてＶＨ−ＦＲ１Ａを、フレームワーク領域２としてＶＨ−ＦＲ２Ａを、フレームワーク領域３としてＶＨ−ＦＲ３Ａを、およびフレームワーク領域４としてＶＨ−ＦＲ４を含む。別の好ましい実施形態において、その重鎖可変領域は、フレームワーク領域１としてＶＨ−ＦＲ１Ａを、フレームワーク領域２としてＶＨ−ＦＲ２Ｂを、フレームワーク領域３としてＶＨ−ＦＲ３Ａを、およびフレームワーク領域４としてＶＨ−ＦＲ４を含む。別の好ましい実施形態において、その重鎖可変領域は、フレームワーク領域１としてＶＨ−ＦＲ１Ｂを、フレームワーク領域２としてＶＨ−ＦＲ２Ｃを、フレームワーク領域３としてＶＨ−ＦＲ３Ｂを、およびフレームワーク領域４としてＶＨ−ＦＲ４を含む。別の好ましい実施形態において、その重鎖可変領域は、フレームワーク領域１としてＶＨ−ＦＲ１Ｃを、フレームワーク領域２としてＶＨ−ＦＲ２Ｄを、フレームワーク領域３としてＶＨ−ＦＲ３Ｃを、およびフレームワーク領域４としてＶＨ−ＦＲ４を含む。
【００３２】
好ましくは、その重鎖可変領域は、以下のとおりのアミノ酸配列：
ＱＶＸ１ＬＸ２ＥＳＧＸ３ＧＬＶＫＰＸ４Ｘ５Ｘ６ＬＸ７Ｘ８Ｘ９ＣＸ１０ＶＳＧＦＳＸ１１ＳＲＹＳＶＹＷＸ１２ＲＱＸ１３ＰＧＫＧＸ１４ＥＷＸ１５ＧＭＭＷＧＧＧＳＴＤＹＸ１６Ｘ１７ＳＸ１８ＫＸ１９ＲＸ２０ＴＩＳＫＤＸ２１Ｘ２２ＫＸ２３Ｘ２４ＶＸ２５ＬＸ２６Ｘ２７Ｘ２８ＳＬＸ２９Ｘ３０Ｘ３１ＤＴＡＸ３２ＹＹＣＶＲＴＤＧＤＹＷＧＱＧＴＸ３３ＶＴＶＳＳ
を含み：ここで
Ｘ１は、Ｑであり；Ｘ２は、ＱまたはＶであり；Ｘ３は、ＰまたはＧであり；Ｘ４は、ＳまたはＧであり；Ｘ５は、Ｅ、Ｑ、またはＧであり；Ｘ６は、ＴまたはＳであり；Ｘ７は、ＳまたはＲであり；Ｘ８は、ＩまたはＬであり；Ｘ９は、ＴまたはＳであり；Ｘ１０は、ＴまたはＡであり；Ｘ１１は、Ｉ、Ｌ、またはＶであり；好ましくはここでＸ１１は、Ｌであり；Ｘ１２は、Ｉ、Ｌ、またはＶであり；好ましくはここでＸ１２は、ＩまたはＶであり；Ｘ１３は、ＰまたはＡであり；Ｘ１４は、ＰまたはＬであり；Ｘ１５は、ＭまたはＩであり；Ｘ１６およびＸ１７は、ＳＴまたはＮＰであり；Ｘ１８は、ＬまたはＶであり；Ｘ１９は、ＳまたはＧであり；Ｘ２０は、ＬまたはＦであり；Ｘ２１は、ＴまたはＮであり；Ｘ２２は、ＳまたはＡであり；Ｘ２３は、ＳまたはＴであり；Ｘ２４は、ＱまたはＳであり；Ｘ２５は、ＳまたはＹであり；Ｘ２６は、ＫまたはＱであり；Ｘ２７は、ＭまたはＬであり；Ｘ２８は、Ｓであり；Ｘ２９は、ＲまたはＴであり；Ｘ３０は、Ａであり；Ｘ３１は、ＡまたはＥであり；Ｘ３２は、Ｖであり、そしてＸ３３は、Ｌである。
【００３３】
その重鎖可変領域の好ましい実施形態は、以下のとおりである：
【化６】
2021513367.tif 000007
【化７】
2021513367.tif 000008
【００３４】
種々の重鎖可変領域のアラインメントを、図１に示す。
【００３５】
本開示の一局面は、本明細書で記載されるとおりの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体および／またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３６】
好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−１のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−４のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−１の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ４の配列を含む（ｖａｒ４）。
【００３７】
好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−２のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−３のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−２の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ３の配列を含む（ｖａｒ７）。
【００３８】
好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−２のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−４のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−２の配列を含み。その重鎖は、ＶＨ４の配列を含む（ｖａｒ８）。
【００３９】
好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−４のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−１のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−４の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ１の配列を含む（ｖａｒ１３）。
【００４０】
好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−４のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−３のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−４の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ３の配列を含む（ｖａｒ１５）。
【００４１】
好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−４のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−４のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−４の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ４の配列を含む（ｖａｒ１６）。
【００４２】
より好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−１のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−１のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−１の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ１の配列を含む（ｖａｒ１）。
【００４３】
より好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−１のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−２のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−１の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ２の配列を含む（ｖａｒ２）。
【００４４】
より好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−１のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−３のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−１の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ３の配列を含む（ｖａｒ３）。
【００４５】
より好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−２のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−１のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−２の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ１の配列を含む（ｖａｒ５）。
【００４６】
より好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−２のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−２のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−２の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ２の配列を含む（ｖａｒ６）。
【００４７】
より好ましくは、その抗体および／またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ−４のＣＤＲを含む軽鎖およびＶＨ−２のＣＤＲを含む重鎖を含み、好ましくは、その軽鎖は、ＶＬ−４の配列を含み、その重鎖は、ＶＨ２の配列を含む（ｖａｒ１４）。
【００４８】
本開示は、ＣＤ４０に対してアンタゴニスト的特性を有する一群の改善された非常に選択的な抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。これらの抗体バリアントは、発現を増加させるように最適化され、それと同時に、ＣＤ４０に対するそれらの結合親和性を維持するかまたはさらに改善する。例示的実施形態として、Ｖａｒ１−８および１３−１６といわれるバリアントは、全て、タンパク質発現およびＣＤ４０結合親和性の増加をともに示す（表２を参照のこと）。
【００４９】
好ましくは、本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書で開示される重鎖可変領域のうちのいずれかもしくは元のＰＧ１０２重鎖可変領域と組み合わせて、本明細書で開示される軽鎖可変領域のうちのいずれか１つから構成されるか；または本明細書で開示される重鎖可変領域のうちのいずれか１つと組み合わせて、本明細書で開示される軽鎖可変領域のうちのいずれか１つまたは元のＰＧ１０２軽鎖可変領域から構成される。
【００５０】
本開示は、そのＰＧ１０２抗体と比較して、種々の位置で変化したアミノ酸配列を有する可変ドメインを提供する。その操作された可変ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）は、その抗体の安定性および／または発現を改善し、それと同時に、そのＣＤ４０結合特性を維持および／または改善するためにデザインされる。安定性の増加は、生成プロセスならびにインビボおよびインビトロでの安定性にとって重要である。
【００５１】
本開示に従う抗体は、好ましくは、動物および／またはヒトにおいて十分に耐容性のある抗体である。本明細書で開示される操作された可変領域は、そのＰＧ１０２抗体に由来する。ＰＧ１０２は、元のマウス５Ｄ１２抗体と比較して、ヒトにおいて低減された免疫原性を有する脱免疫化抗体である。用語「脱免疫化」とは、本明細書で使用される場合、動物および／またはヒトにおいて元の抗体より免疫原性が小さいとして定義される。
【００５２】
本開示は、本明細書で開示されるように、ヒトＣＤ４０に対するモノクローナル抗体の形態で、上記軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインをさらに提供する。その抗体可変領域は、例えば、ヒト抗体の定常領域を含む、より大きな抗体分子の中に組み込まれ得る。それらの重鎖定常ドメインにおける差異によれば、抗体は、５つのクラス、またはアイソタイプ：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥに分けられる。これらのクラスまたはアイソタイプは、対応するギリシャ文字で名付けられる上記重鎖のうちの少なくとも１つを含む。好ましい実施形態において、本開示は、本開示に従う抗体であって、ここで上記定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの定常領域の群から選択され、より好ましくは、上記定常領域が、ＩｇＧ定常領域、より好ましくは、ＩｇＧ１定常領域、好ましくは変異したＩｇＧ１定常領域を含み、より好ましくは、上記定常領域が、ＩｇＧ４定常領域である抗体を提供する。さらに、上記ＩｇＧ４定常領域は、好ましくは、ヒトＩｇＧ４定常領域である。好ましくは、本開示のＩｇＧ４定常領域は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の定常領域を含む。ＩｇＧ４の定常領域におけるいくつかのバリエーションは、天然で起こる、および／またはその得られた抗体の免疫学的特性を変化させることなく許容される。代表的には、約１〜５個の間のアミノ酸置換が、その定常領域の中で許容される。ＩｇＧ４定常領域または変異したＩｇＧ１定常領域を有する抗体は、抗体の薬理学的特性のうちの少なくとも大部分を有するが、補体に結合せず、従って、インビボでその抗体が結合する細胞の枯渇を誘導しない。好ましくは、上記定常領域は、ヒト抗体の定常領域である。
【００５３】
好ましくは、上記定常領域は、補体活性化が欠損した領域、好ましくは、ヒトＩｇＧ４定常領域または変異したヒトＩｇＧ１定常領域である。
【００５４】
本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントによるＣＤ４０結合は、当業者に公知の多くの適切なアッセイにおいて確認され得る。このようなアッセイとしては、例えば、アフィニティーアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、およびＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked  immunosorbant  assay））が挙げられる。実施例は、ＣＤ４０結合を測定するために使用され得る多くのアッセイのうちの１つを詳細に記載する。
【００５５】
さらなる局面において、本開示は、上記抗体および抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。本開示において使用されるとおりの核酸は、代表的には、しかし排他的ではなく、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。遺伝コードに基づけば、当業者は、本明細書で開示される抗体バリアントをコードする核酸配列を決定し得る。その遺伝コードの縮重に基づけば、６４個のコドンが、２０個のアミノ酸および翻訳終結シグナルをコードするために使用され得る。当業者に公知であるように、異なる生物におけるコドン使用バイアスが、遺伝子発現レベルをもたらし得る。種々のコンピューター計算ツールが、所望の核酸が発現される生物に依存してコドン使用を最適化するために、当業者に利用可能である。
【００５６】
上記核酸が細胞において発現される場合、その細胞は、本開示に従う抗体を生成する。従って、一実施形態において、本開示に従う抗体および／または核酸を含む細胞が、提供される。その宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、細菌または酵母の細胞であり得る。上記細胞は、好ましくは動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。宿主細胞として適切な哺乳動物細胞株の例としては、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＮＳ０細胞、またはＰＥＲ−Ｃ６ＴＭ細胞が挙げられる。本開示の目的のために、適切な細胞は、上記抗体および／または上記核酸を含み得る、および好ましくは生成し得る任意の細胞である。本開示は、上記細胞を含む細胞培養物をさらに包含する。
【００５７】
本明細書で開示される抗体は、当業者に公知の任意の方法によって生成され得る。好ましい実施形態において、その抗体は、細胞を使用して生成され、好ましくは、ここでその細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＮＳ０細胞、またはＰＥＲ−Ｃ６ＴＭ細胞である。特に好ましい実施形態において、上記細胞は、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞であり、好ましくは、上記細胞は、無血清培地中で培養される。これは、上記抗体を上記培養物から採取する工程を包含する。その抗体は、好ましくは、培地から精製され、好ましくは、上記抗体は、アフィニティー精製される。あるいは、上記抗体は、合成して生成され得る。
【００５８】
種々の施設および会社が、抗体の大規模生成のために、例えば、臨床的使用のために、細胞株を開発してきた。これらの細胞はまた、タンパク質の生成のような他の目的のために使用される。タンパク質および抗体の産業スケールの生成のために開発された細胞株は、本明細書で産業用細胞株とさらに言及される。従って、本開示の好ましい実施形態は、上記抗体の大規模生成のために開発された細胞株の使用を提供する。
【００５９】
本開示の抗ヒトＣＤ４０抗体または抗原結合フラグメントは、好ましくは、本明細書で記載されるとおりの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。このような抗体は、良好な特性を有する。当然のことながら、このような元の抗体のバリアントを、その中で１またはこれより多くのアミノ酸を改変することによって生成することは可能である。このようなバリアントの多くは、上記の元の抗体と比較した場合に多かれ少なかれ同様に挙動する。このようなバリアントはまた、本開示の範囲内に包含される。このような改変の非限定的な例は、グルタミン酸の代わりにピログルタミン酸を含む抗体である。このような改変の他の非限定的な例は、上記元の抗体と比較した場合に、１またはこれより多くのアミノ酸の挿入、欠失、反転および／または置換である。
【００６０】
本開示は、本明細書で開示されるとおりの抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはこれをコードする核酸、あるいは本明細書で開示されるとおりの抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはこれをコードする核酸を含む細胞を含む医薬組成物をさらに包含する。このような組成物は、医薬としての使用に特に適している。その組成物は、任意の適切な形態（例えば、液体、半固体および固体の投与形態）にあり得る。選択される製剤のための投与量およびスケジューリングは、当業者によって周知である標準的手順によって決定され得る。このような手順は、動物モデルから投与スケジュールを外挿および予測すること、および次いで、ヒト臨床用量範囲試験において最適な投与量を決定することを含む。医薬組成物中の投与量は、多くの要因（例えば、所望の放出特性および薬物動態特性）に依存して様々である。
【００６１】
本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントは、それらの非刺激性ＣＤ４０アンタゴニスト的特性に起因して、炎症性障害の症状を改善するために特に適している。本明細書で記載されるとおりの炎症性障害は、炎症性構成要素が関わる任意の疾患に言及する。これは、具体的には、自己免疫障害または移植片拒絶を含む。免疫応答の開始、増幅および延長におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の中心的役割は、上記抗体を、自己免疫障害における免疫モジュレーションに対して特に適切にする。好ましくは、本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントは、自己免疫障害および／または抗炎症性障害の症状を改善するためのものである、および／または移植片拒絶を低減するためのものである、および／またはＣＤ４０陽性がんの処置のためのものである。好ましい実施形態において、上記自己免疫障害および／または炎症性障害は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、水疱性類天疱瘡およびアトピー性皮膚炎の群から選択される。好ましくは、ここで上記自己免疫障害および／または炎症性障害は、炎症性腸疾患を含み、好ましくは、潰瘍性大腸炎またはクローン病を含む。
【００６２】
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用に関する以下の情報は、炎症性障害におけるＣＤ４０およびそのリガンドの役割を例証するために提供される。ＣＤ４０分子は、５０ｋＤａのＩ型膜糖タンパク質である。このタンパク質は、抗原提示細胞（Ｂ細胞、単球／マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）を含む）の表面で主に発現される。しかし、ＣＤ４０は、他の細胞タイプ（内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞およびケラチノサイトを含む）の広範な種類でも見出され得る。ＣＤ４０レセプターのリガンドはＣＤ４０Ｌであり、ＣＤ１５４ともいわれる。この３２ｋＤａタンパク質は、ＩＩ型膜内在性糖タンパク質であり、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞および活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞の小さな集団上で一過性に発現される。さらに、ＣＤ４０Ｌは、多くの他の免疫細胞および他の細胞タイプ上で見出されている。ＣＤ４０およびそのリガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する。
【００６３】
ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用は、種々の下流の効果を誘導する。それがＣＤ４０Ｌとライゲーションした後に、ＣＤ４０は、その細胞を活性化して進入し、多くの炎症促進性および血栓形成促進性の遺伝子の発現を刺激する。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、細胞性および体液性の両方の免疫応答に関わっている。Ｂ細胞では、ＣＤ４０活性化は、増殖、活性化マーカーの発現、免疫グロブリン生成、アイソタイプスイッチング、ホモタイプ接着およびアポトーシスからの救済（ｒｅｓｃｕｅ  ｆｏｒｍ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を含む多くの生物学的事象をもたらす。単球／マクロファージにおけるＣＤ４０の活性化は、多量の炎症促進性メディエーター（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の分泌を誘導し、これは、炎症応答および腫瘍殺滅活性を誘導し、それらをアポトーシスから救済する。ＣＤ４０活性化はまた、樹状細胞の分化および活性化の増強、共刺激分子（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＣＤ５８）の発現の増強、サイトカイン生成の増加、およびアポトーシスの阻害を引き起こす。さらに、炎症状態下で発現される場合、ＣＤ４０シグナル伝達は、内皮細胞上での細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）およびＥ−セレクチン（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）の発現を誘導し得る。インビボ研究は、体液性免疫応答の生成において、抗原特異的Ｔ細胞のプライミングおよび活性化において、マクロファージの一時的活性化において、ならびにＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａのような細胞内寄生生物感染に対するＴ細胞媒介性マクロファージ活性化を通じた防御的細胞媒介性免疫応答において、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の重要性を示した。
【００６４】
いくつかの研究は、種々の慢性炎症性疾患および自己免疫疾患においてＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の関与を明らかに示している。マウスモデルにおける研究は、種々の疾患におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの機能的役割を示している。例えば、ＣＤ４０Ｌトランスジェニックマウスは、致死的な炎症性腸疾患を獲得する。他方で、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス炎症性腸疾患モデルにおいて、Ｔ細胞再構成の日からの抗ＣＤ４０Ｌでの処置は、実験的大腸炎の臨床上のおよび組織学的出現を完全に防止することが示された。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用がまた、炎症性腸疾患（これは、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）の病因において役割を果たすという証拠が示された。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路との干渉は、移植モデルにおいて強く免疫抑制性であることがまた、示された。従って、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用における干渉は、潜在的な標的を構成し、免疫応答をモジュレートして、免疫関連疾患を処置する。
【００６５】
多発性硬化症は、中枢神経系の自己免疫疾患である。この障害では、神経線維を取り囲む白質が、硬化する。用語、多発性硬化症とは、文字どおり「多くの瘢痕」を意味する。おそらく、そのＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、その疾患の始まりおよび／または進行に関与し、このことは、これらの患者がＣＤ４０アンタゴニスト的抗体から利益を得る可能性があることを意味する。
【００６６】
乾癬は、集団のうちの１〜２％が罹患する炎症性皮膚疾患である。この疾患では、病変におけるＴ細胞およびケラチノサイトが活性化され、活性化マーカーおよび共刺激分子を発現する。ケラチノサイトおよびＴ細胞で発現されるいくつかの共刺激因子分子が、互いに相互作用し、これらの相互作用が疾患活性に寄与すると考えられる。このような分子のセットに関しては、ＣＤ４０（これは、活性化ケラチノサイト上で発現される）およびＣＤ４０Ｌ（これは、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞上で一過性に発現される）があり得る。従って、抗ＣＤ４０抗体は、乾癬の処置のために使用され得る。
【００６７】
本開示の別の局面は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいてがんを処置するための方法であって、その哺乳動物に、治療上有効な量の、本明細書で記載されるとおりの抗体または抗原結合フラグメントを投与することを包含する方法を包含する。別の好ましい実施形態において、本開示は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいてがんを防止するための方法であって、その哺乳動物に、治療上有効な量の、本明細書で記載される抗体または抗原結合フラグメントを投与することを包含する方法を提供する。用語「がんを防止すること」または「がんの防止」とは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいてがんの開始を遅らせる、阻害する、または防止することをいう。その用語はまた、前がん状態を有する哺乳動物を処置して、悪性腫瘍への進行を止めるかまたは退縮を誘導することを包含する。前がん状態の例としては、過形成、異形成および化生が挙げられる。本開示のさらなる局面は、ヒトＣＤ４０媒介性抗腫瘍免疫応答のモジュレーションのための方法を提供する。
【００６８】
その抗体は、単剤療法として単独で投与されてもよいし、１またはこれより多くのさらなる治療剤または治療と組み合わせて投与されてもよい。がんを処置するために併用療法において使用され得るさらなる治療剤の種類の例としては、以下が挙げられる：（１）化学療法剤、（２）免疫療法剤、および（３）ホルモン療法剤。抗体または組成物は通常、複数の機会に投与される。単回投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月ごとに１回、または毎年であり得る。
【００６９】
１つの特定の局面において、哺乳動物において免疫応答を阻害するための方法であって、その哺乳動物に、治療上有効な量の、本明細書で開示される抗体およびその抗原結合フラグメントを投与することを包含する方法が提供される。いくつかの実施形態において、その哺乳動物はヒトである。その阻害された免疫応答は、細胞応答（すなわち、細胞媒介性応答）または体液性応答（すなわち、抗体媒介性応答）であり得る。そして一次免疫応答または二次免疫応答であり得る。阻害された免疫応答の例としては、ＣＤ４＋  ヘルパーＴ細胞活性の減少およびＢ細胞による抗体生成の低減が挙げられる。その阻害された免疫応答は、当業者に公知のように、多くのインビトロおよびインビボでの測定を使用して評価され得る（can  be  asses）。細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、サイトカインの放出、腫瘍の退縮、腫瘍を有する動物の生存、抗体生成、免疫細胞増殖、細胞表面マーカーの発現、および細胞傷害性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「含む、包含する」およびその語形変化は、その文言に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されないことを意味するために、その非限定的な意味で使用される。その動詞に加えて、「からなる」は、本明細書で定義されるとおりの化合物または付属する化合物が、具体的に特定されたもの以外のさらなる構成要素を含み得る（上記さらなる構成要素は、本発明の特有の特性を変化させない）ことを意味する「から本質的になる」によって置き換えられ得る。
【００７１】
冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の対象の１または１より大きい（すなわち、少なくとも１）に言及するために本明細書で使用される。例示によれば、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１より多くの要素を意味する。
【００７２】
文言「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」とは、数値と合わせて使用される場合（およそ１０、約１０）、好ましくは、その値が、１０という所定の値の±１％であってもよいことを意味する。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」とは、本明細書で記載されるように、疾患もしくは障害、またはこれらの１もしくはこれより多くの症状を改善する、軽減する、それらの始まりを遅らせる、またはそれらの進行を阻害することに言及する。いくつかの実施形態において、処置は、１またはこれより多くの症状が発生した後に投与され得る。他の実施形態において、処置は、症状の非存在下で投与されてもよい。例えば、処置は、症状が始まる前に（例えば、症状の履歴に照らしておよび／または遺伝的もしくは他の感受性因子に照らして）、感受性の個体に投与されてもよい。処置はまた、処置が解消した後に、例えば、それらの再発を防止するもしくは遅らせるために、継続されてもよい。
【００７４】
本明細書で引用される全ての特許および参考文献は、それらの全体において参考として援用される。
【００７５】
本発明は、以下の実施例の中でさらに説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を明瞭にするために役立つに過ぎない。
【実施例】
【００７６】
実施例１．  ＰＧ１０２抗体の操作されたバリアントのインビトロでの特徴付け．
野生型組換えＰＧ１０２抗体を、長期安定性を改善するためにデザインした１６種の操作されたバリアントとともに、小規模一過性発現を使用して、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）において発現させ、続いて、続いてプロテインＡ精製および生成物品質分析を行った。バリアントのデザインを表１に詳述し、そのアミノ酸配列を、「付表」の節に詳述する。
【００７７】
単一の遺伝子ＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ’ｓ  ＧＳ  ＸｃｅｅｄＴＭ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用）を確立し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞における一過性トランスフェクションへと進めて、生成物を発現させた。その生成物を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、０．２２μｍフィルターカートリッジを使用して濾過滅菌し、限外濾過によっておよそ１０倍濃縮した。ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＤ４０結合アッセイの形態の生成物品質分析を、１ｍｇ／ｍｌの精製物質を使用して行った。
【００７８】
バリアント１〜１６の発現力価は、野生型抗体と比較して、非常に低レベルの凝集した物質を維持しながら（≦４％）およそ３．５〜６倍増加した（表２を参照のこと）。相対的結合値は、ＥＬＩＳＡからのＣＤ４０結合をその計算したタンパク質濃度で除算することによって計算できた。Ｖａｒ９〜Ｖａｒ１２は、ＣＤ４０への低減した結合親和性を示した。その残りの抗体は、匹敵したまたはさらには改善した結合親和性を維持した（表２および図２を参照のこと）。
【００７９】
【表１】
2021513367.tif 000009
【００８０】
【表２】
2021513367.tif 000010
【００８１】
材料および方法
遺伝子合成
重鎖および軽鎖の可変領域を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＧＳ  ＸｃｅｅｄＴＭ遺伝子発現システムベクター、ｐＸＣ−ＫａｐｐａおよびｐＸＣ−ＩｇＧ４ｐｒｏ（ｄｅｌｔａＫ）へとサブクローニングした。２０アミノ酸のシグナル配列を、軽鎖配列のＮ末端に付加し、１９アミノ酸のシグナル配列を、重鎖生成物配列のＮ末端に付加した。コザック配列をそのシグナル配列の前に配置し、Ｎ末端制限部位が続いた（「付表」の節）。
【００８２】
単一遺伝子ベクター構築
単一遺伝子ベクターを、５’制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’制限部位ＡｐａＩを使用して、その重鎖可変領域をベクターｐＸＣ−ＩｇＧ４ｐｒｏ（ｄｅｌｔａＫ）へとサブクローニングすることによって構築した。軽鎖可変領域を、５’制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよび３’制限部位ＢｓｉＷＩを使用して、ベクターｐＸＣ−Ｋａｐｐａへとクローニングした。制限消化物を、１％  アガロースゲルで電気泳動し、関連するフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，  ２８７０４）を使用して、製造業者の指示に従ってゲル抽出した。最終容積２１μｌにおいてライゲーションを設定し、室温において５分間インキュベートした。そのライゲーション反応物のうちの１０μｌのアリコートを使用して、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｔｏｐ  １０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃ４０４００３）を、ヒートショック法を使用して製造業者の指示に従って形質転換した。細胞を、アンピシリン含有（５０μｇ／ｍｌ）  Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉアガープレート（ＬＢ  Ａｇａｒ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ７０２５）上に拡げ、細菌コロニーが明らかになるまで一晩３７℃でインキュベートした。組換え体をスクリーニングするために、単一の細菌コロニーを採集して、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含む５ｍｌ  Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（ＬＢ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ７２７５）に入れ、振盪しながら一晩３７℃でインキュベートした。重鎖ベクターについては、ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮミニプレップシステム（ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット，  ２７１０４）を使用して単離し、３０μｌ  ＥＢ緩衝液中に溶離した。ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、重鎖挿入物の存在を検証し、アガロースゲルで分析した。軽鎖ベクターについては、コロニーを、その軽鎖ｃＤＮＡのいずれかの末端に結合するプライマーを使用して、ＰＣＲによってスクリーニングした。重鎖および軽鎖両方の組換え体の陽性コロニーを、その目的の遺伝子のヌクレオチド配列決定によって検証した。
【００８３】
ＤＮＡ増幅
Ｇｉｇａ  ｐｒｅｐのために、単一の細菌培養物を使用してスターター培養物に接種し、その後、これを使用して、５０μｇ  アンピシリンを含む１．０Ｌ  ＬＢ培地に接種し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。ベクターＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｉｇａｐｒｅｐシステム（Ｑｉａｇｅｎ，  １２２９１）を使用して単離した。全ての場合に、ＤＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定し、１ｍｇ／ｍｌに調節した。ＤＮＡ品質を、２６０および２８０ｎｍでの吸光度比を測定することによって評価した。
【００８４】
ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞の慣用的培養
ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞を、６ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ２５０３０−１２３）を補充したＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  １０７４３−０２９）中で培養した。細胞を、３６．５℃、５％  ＣＯ２、８５％  湿度、１４０ｒｐｍにおいて振盪インキュベーター中でインキュベートした。細胞を、３〜４日ごとに、０．２×１０６  細胞／ｍｌで播種して慣用的に継代培養し、トランスフェクションに利用可能な十分な細胞があるように増殖させた。細胞を、２０継代目で廃棄した。
【００８５】
ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞の一過性トランスフェクション
一過性トランスフェクションを、最低２週間培養状態にあったＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞を使用して行った。細胞を、トランスフェクションの２４時間前に継代培養した。全てのトランスフェクションを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅ  ＸＣｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するエレクトロポレーションを介して行った。各トランスフェクションのために、生細胞を、６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充した予め加温したＣＤ−ＣＨＯ培地中に２．８６×１０７  細胞／ｍｌへと再懸濁した。４０μｇの重鎖ＳＧＶ  ＤＮＡおよび４０μｇの軽鎖ＳＧＶ  ＤＮＡの組み合わせを、各キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット，  ０．４ｃｍギャップ，  １６５−２０９１）へと、表２中のスキームに従ってアリコートに分け、７００μｌ  細胞懸濁物を添加した。細胞を、３００Ｖ、９００μＦでエレクトロポレーションした。トランスフェクトした細胞を、エルレンマイヤーフラスコ中で予め加温した培地中に移し、予め加温した培地で２回すすいだそのキュベットの内容物をまた、そのフラスコに移した。トランスフェクト体培養物を、３６．５℃、５％  ＣＯ２、８５％  湿度、１４０ｒｐｍにおいて６日間、振盪インキュベーター中でインキュベートした。細胞生存率を、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓ自動化細胞カウンター（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、採取のときに測定した。
【００８６】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
培養上清を、遠心分離によって清澄化し、続いて、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、ＡＫＴＡ精製機（１０ｍｌ／分で実行）上のプレパック５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲＥカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  １１−００３４−９４）を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。全ての場合に、そのカラムを、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１２５ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化し、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムおよび１Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で洗浄し、続いて、溶離前の平衡化の再導入を行った。その分子を、１０ｍＭ  ギ酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶離させた。溶離した画分を、２×ＰＢＳ  緩衝液、ｐＨ７．４で中和することによって直ぐにｐＨ調整し、希水酸化ナトリウム溶液を添加することによっておよそｐＨ７．２に滴定した。
【００８７】
ＳＥ−ＨＰＬＣ
二連のサンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣシステムにおいてＳＥ−ＨＰＬＣによって、Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０  ９．４ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析した。１ｍｇ／ｍｌ  サンプル（またはサンプルが＜１ｍｇ／ｍｌである場合にはストック濃縮物）の８０μｌ  アリコートを注入し、１ｍｌ／分において、１５分間、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、５００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、ｐＨ６．０で実行した。可溶性凝集物レベルを、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアを使用して分析した。緩衝液成分から生じるシグナルを、ブランク緩衝液注入によって分析したが、別段の指定がない限り、データ分析では省略されている。
【００８８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
還元したサンプルを、ＮｕＰａｇｅ  ４×  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＮＰ０００７）およびＮｕＰａｇｅ  １０×  サンプル還元剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＮＰ０００９）と混合することによって分析用に調製し、７０℃で１０分間、インキュベートした。非還元サンプルに関しては、その還元剤および熱インキュベーションを省略した。サンプルを、１．５ｍｍ  ＮｕＰａｇｅ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘプレキャストゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＮＰ０３１６）上で、変性条件下でＮｕＰａｇｅ  ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液を用いて電気泳動した。ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２染色済み分子量標準（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＬＣ５９２５）および１ｍｇ／ｍｌのコントロール抗体の１０μｌ  アリコートを、そのゲルに含めた。各サンプルの１．５μｇを、そのゲルに載せた。いったん電気泳動した後、ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（ＴｒｉｐｌｅＲｅｄ，  ＩＳＢ０１Ｌ）で室温において３０分間染色した。その染色したゲルの画像を、ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＶＰ）で分析した。
【００８９】
ＣＤ４０結合アッセイ
ＣＤ４０への抗体バリアントの結合を、ＵＫＳＬ−２０５７に基づくＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して測定した。マイクロタイタープレートを、組換えＣＤ４０でコーティングし、その後、その抗体バリアントを添加し、アルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトκＩｇＧを使用して検出した。
【００９０】
結果
ベクター構築
全ての構築物をサブクローニングして、４．２節に記載されるように単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）を生成し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化またはＰＣＲによって確認した。最終的なＳＧＶをまた、第三者の供給業者を通じて、目的の遺伝子コード領域のヌクレオチド配列決定によって検証した。
【００９１】
ＤＮＡ増幅
ベクター増幅を、材料および方法の節に記載される方法に従って達成した。その二重遺伝子ベクターのＤＮＡ品質を、吸光度比Ａ２６０／Ａ２８０を測定することによって評価した。これは、１．８８〜１．９２の間であることが見出された。
【００９２】
一過性トランスフェクション
生成されたSGVを使用して２００ｍｌの一過性トランスフェクションを確立した。その培養物を、示されるようにインキュベートした。採取の際の細胞計数を、表３に示す。全ての培養物は、代表的に観察される範囲内の細胞成長および生存率を有することが見出された。
【００９３】
【表３】
2021513367.tif 000011
【００９４】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
培養物を、トランスフェクション後６日目に採取した。上清を遠心分離および濾過によって清澄化し、５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲＥカラムに載せ、溶離した。全ての生成物の溶離プロフィール（ＦＦＰ１０４＿ｗｔおよびＦＦＰ１０４＿Ｖａｒ１〜ＦＦＰ１０４＿Ｖａｒ１６）は、予測されるように、その溶離相の間に単一のタンパク質種ピークを示す。これらの一過性培養物の得られた収量を、表２にまとめる。
【００９５】
精製した生成物のＳＥ−ＨＰＬＣ分析
その小規模評価トランスフェクションから精製した生成物のサンプルを、Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０  ９．４ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。主な（＞９７．６％）タンパク質種のピークは、抗体コントロール（約８．７分、ここではデータは示さず）に匹敵するおよそ８．５８分という保持時間で、全ての生成物に関して観察された。その生成物は、約７．９分においてより短い保持時間のさらなる小さなピークを示した。これは、より高分子量の種（例えば、可溶性凝集物）の存在を示す。
【００９６】
精製した生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
その精製した生成物の還元および非還元サンプルを電気泳動し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅで染色した。これは、全ての生成物の存在およびＰＧ１０２＿ＷｔおよびＰＧ１０２＿Ｖａｒ１〜ＰＧ１０２＿Ｖａｒ１６の高い純度レベルを確認した。その生成物は、コントロール抗体と十分に匹敵する：非還元条件下では、＞９８ｋＤａのタンパク質バンドがその生成物について認められ、同じ条件下で実行したコントロールＩｇＧ１抗体と匹敵する。２つのバンドは、還元条件下では、重鎖（＞４９ｋＤａ）および軽鎖（＜２８ｋＤａ）のサイズと一致し、そのコントロール抗体について形成されたバンドと匹敵することが認められた。
【００９７】
ＣＤ４０結合アッセイ
その清澄化した培養上清中の抗体の濃度を、プロテインＡアフィニティー精製からの生成物の回収された収量から予測し、サンプルを、ＥＬＩＳＡの範囲内になるように、およそ１００ｎｇ／ｍｌに希釈した。次いで、サンプルを調製し、分析した。その結果を、その清澄化した上清における有効濃度へと変換して、比較を可能にした。このアッセイは、ＣＤ４０に対する抗体バリアントの親和性の評価を提供する。そのデータは、ＦＦＰ１０４＿Ｖａｒ１、ＦＦＰ１０４＿Ｖａｒ２、ＦＦＰ１０４＿Ｖａｒ５、およびＦＦＰ１０４＿Ｖａｒ６が、プロテインＡで得られる力価によって予測されるよりＣＤ４０  ＥＬＩＳＡによる応答のレベルの増加を示すことを示す。これは、ＣＤ４０に対するこれらのバリアントの匹敵するまたは改善された結合親和性を示唆する（表２および図２）。バリアントＦＦＰ１０４＿Ｖａｒ９〜ＦＦＰ１０４＿Ｖａｒ１２は、低減した応答を示す。これは、ＣＤ４０に対する結合親和性の減少を示唆する。
【００９８】
この情報は、ＶＬ３を含むバリアントが、ＣＤ４０への低減した結合を示すことを示唆する。
【００９９】
結論
１６種のバリアントとともにＰＧ１０２＿Ｗｔの小規模一過性トランスフェクションを確立して、抗原ＣＤ４０への結合を含む、そのバリアントの発現レベル、プロテインＡ精製および生成物品質を評価した。そのＰＧ１０２＿Ｗｔの発現力価は、１０．２ｍｇ／Ｌであることが見出された。全１６種のバリアント（ＰＧ１０２＿Ｖａｒ１〜ＰＧ１０２＿Ｖａｒ１６）は、そのＰＧ１０２＿Ｗｔより３．５〜６倍高い改善された発現レベルを示した。これらのバリアントはまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣによって良好な、より高分子量の不純物（例えば、可溶性凝集物）が低レベル（≦１．０８％）で、ＰＧ１０２＿Ｗｔ親分子（０．６％）に匹敵する純度レベルを示した。ＣＤ４０結合ＥＬＩＳＡからの結果は、ＣＤ４０に対するそのサンプルの親和性によって影響される。なぜならこれは、そのＰＧ１０２＿Ｗｔおよび標準結合曲線を生成するために使用したＰＧ１０２の参照物質（ロット番号３６４１９０ＡＲＳ）に関して変動し得るからである。相対的結合値は、ＣＤ４０  ＥＬＩＳＡ結合データを、プロテインＡ精製後に確立されたとおりのタンパク質濃度で除算することによって決定され得る。後者は、その発現された生成物に関するありそうな上清濃度を予測する。なぜなら幾分小さいレベルの生成物喪失（代表的には＜１０％）が、そのプロテインＡ精製、溶離液中和および緩衝液交換の間に予測され得るからである。そのＰＧ１０２＿Ｗｔ抗体に関して、ＥＬＩＳＡとプロテインＡ後に得た濃度との間の相関は、１４３％であり、これは、その２つのアッセイ間のかなりの一致を示す。そのデータは、ＰＧ１０２＿Ｖａｒ１、ＰＧ１０２＿Ｖａｒ２、ＰＧ１０２＿Ｖａｒ５、およびＰＧ１０２＿Ｖａｒ６が、プロテインＡで得た力価によって予測されるより、ＣＤ４０  ＥＬＩＳＡによる応答のレベルの増加を示すことを示し、これは、ＣＤ４０に対するこれらのバリアントの匹敵するまたは改善された結合親和性を示唆する。バリアントＰＧ１０２＿Ｖａｒ９〜ＰＧ１０２＿Ｖａｒ１２は、応答の低下を示す。これは、ＣＤ４０に対する結合親和性の減少を示唆する。これは、ＶＬ３を含むバリアントが、ＣＤ４０に対して結合の低下を示すことを示唆する。
【０１００】
実施例２．  ７種の選択したＰＧ１０２バリアントの生物学的活性の試験
選り抜きの７種のＰＧ１０２バリアントを、その生物学的活性に関して試験した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ドナーの血液から単離した。ＰＢＭＣ細胞によるＴＮＦ分泌を、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０のリガンド）を使用して誘導した。７種のＰＧ１０２バリアントを、合計で４名のドナーに由来するＰＢＭＣで試験する。全ての試験条件は、二連で行う。１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ｎｇ／ｍｌ  モノクローナル抗体の添加は、ＴＮＦ分泌の低減したレベルをもたらした。そのアッセイは、７種のモノクローナル抗体のうちの５種が、ＰＧ１０２＿ＷＴと比較して、少なくとも類似またはわずかに増加した生物学的活性を有することを示した（表４、図３および４）。これは、以下のバリアントに関する：  ＰＧ１０２＿ｖａｒ２、ＰＧ１０２＿ｖａｒ３、ＰＧ１０２＿ｖａｒ５、ＰＧ１０２＿ｖａｒ６およびＰＧ１０２＿ｖａｒ１６。ＰＧ１０２＿ｖａｒ１およびＰＧ１０２＿ｖａｒ１０は、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのレベルで低減した生物学的活性を示し、おそらくＰＧ１０２＿ｗｔより余り有効でない（表４）。ＰＧ１０２＿ｖａｒ  １０に関しては、これは、ＣＤ４０結合データと一致し、ＶＬ３を有する抗体バリアントの低減した結合親和性を示す（表２）。
【０１０１】
材料および方法
１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ｎｇ／ｍｌ  モノクローナル抗体の存在下でのＰＢＭＣからのＣＤ４０Ｌ誘導性ＴＮＦ分泌の測定
全ての培養条件：２連。
結果測定：ＴＮＦ分泌の阻害のパーセンテージ
【０１０２】
【表４】
2021513367.tif 000012
【０１０３】
実施例３：  ＰＧ１０２バリアントのインシリコ分析
インシリコ分析は、凝集およびＰＴＭの潜在的リスクの製造可能性評価から構成される。
材料および方法
抗体操作
【０１０４】
抗体操作手順を、以下に概説するように行った：
１．バックグラウンド情報を分析した。
２．その抗体配列を、一群の参照配列に対して整列させた。
３．Ｌｏｎｚａ’ｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎプラットフォームを、その抗体に適用した。
４．重要な位置を同定した。
５．その抗体の３Ｄ構造モデルを、構築し、分析した。
６．その配列を、ＰＴＭに関してスクリーニングした。潜在的ＰＴＭを、製造可能性のリスクに関して分類した。
７．潜在的リスクを分析し、記載した。
８．その集めたデータに基づいて、各位置を置換する可能性の評価を行った。位置を、中立、寄与または重要と分類した。
９．一群の凝集およびＰＴＭ緩和配列をデザインし、結合親和性に負の影響を及ぼすことなく、凝集またはＰＴＭのリスクを低減するそれらの潜在的可能性に基づいてランク付けした。配列および構造比較を必要な場合行った。
１０．候補配列を、ＥｐｉｂａｓｅＴＭでスクリーニングした。各残りのＴｈエピトープまたはエピトープのクラスターを試験し、その中の位置を、その推定される免疫原性を低減する能力に関してＥｐｉｂａｓｅＴＭによって評価した。
１１．脱免疫化置換を可能なところに導入した。
１２．一群の推奨される操作したバリアントを、編集した。
１３．その操作されたＦＦＰ１０４バリアントのＥｐｉｂａｓｅＴＭイムノプロファイリングを行い、親抗体に対する比較を行った。
【０１０５】
配列註釈
更新されたＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ定義（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）を、参照として使用する。この定義は、そのＣＤＲ  Ｈ２定義の中に重鎖Ｃｈｏｔｈｉａ位置Ｈ：５７およびＨ：５８を含めることによって、元のＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  １９８７刊行物とは異なる。位置の番号付けは、別段特定されなければ順序を示し、この場合、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  １９８７）を使用する。
【０１０６】
配列アラインメント
そのマウスおよびヒト生殖系列配列に対する親配列の多数のアラインメントを生成し、各アラインメントにおけるエントリーを、その親配列との配列同一性（ＳｅｑＩＤ）に従って整理した。参照セットを、１００％  ＳｅｑＩＤにおいてクラスター化し、冗長なエントリーを排除することによって、特有の一群の配列に低減した。
【０１０７】
抗体凝集
この研究において使用した抗体凝集プラットフォームを、抗体の配列および構造特徴に基づいて機械学習アルゴリズムを使用して開発した（Ｏｂｒｅｚａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）。その推定凝集モデルをトレーニングして、抗体のセットに対して試験し、広い化学的空間を網羅し、低発現および高発現を含み、凝集する抗体および凝集しない抗体を含むためにデザインした。そのセットの中の全抗体の特性を、組織内で実験的に決定した。そのアルゴリズムは、高い凝集リスクまたは低い凝集リスクのカテゴリー出力を与える；高次の分類にある抗体は、１工程プロテインＡ精製の後に５％を上回る凝集リスクの増加を有する。高い凝集リスクまたは低い凝集リスクの分類に加えて、その抗体凝集プラットフォームは、関連抗体の凝集傾向を比較するために使用され得るある種のスコアを生成する。
【０１０８】
重要な位置にある残基の同定
抗体可変ドメイン（Ｆｖ）は、ＶＨ／ＶＬ鎖間界面を構成する多くの重要な位置を有するか、またはそのＣＤＲのうちの５個に関して定義されている標準構造の別個のセットに関与する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  １９８７，  Ａｌ  Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）；これらの位置は、置換がそれらの位置に関して提唱される前に、詳細に考慮されるべきである。以下の表５および表６は、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従う番号付けで、そのＶＨ／ＶＬ界面内の保存された位置およびＣＤＲ標準クラスを（それぞれ）決定する位置を示す。
【０１０９】
【表５】
2021513367.tif 000013
【０１１０】
【表６】
2021513367.tif 000014
【０１１１】
３Ｄモデルの構築
抗体ＰＧ１０２、およびそのバリアントのＦｖ領域の構造モデルを、Ｌｏｎｚａ’ｓモデリングプラットフォームを使用して生成した。そのフレームワーク（ＦＲ）およびＣＤＲならびに全Ｆｖの候補構造テンプレートフラグメントを、スコア付けし、ランク付けし、標的に対するそれらの配列同一性、ならびにそのテンプレート構造の定性的結晶学的尺度（例えば、分離能（オングストローム（Å）単位）に基づいて組織内抗体データベースから選択した。
【０１１２】
そのＣＤＲを、そのＦＲテンプレートに対して構造的に整列させるために、そのＣＤＲのいずれかの側の５残基を、そのＣＤＲテンプレートの中に含めた。そのフラグメントのアラインメントを、重なり合うセグメントに基づいて生成し、構造的配列アラインメントを生成した。そのアラインメントとともに、そのテンプレートフラグメントを、ＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ｓａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３）によって処理した。このプロトコールは、整列させた構造的テンプレートのセットから得られるコンホメーション拘束を作り出す。その拘束を満足させる構造の集団は、共役勾配およびシミュレートされたアニーリング最適化手順によって作られる。１またはこれより多くのモデル構造は、タンパク質構造のスコアおよびそのコンホメーション拘束の満足度から得られる、エネルギースコアに基づいてこの集団から選択される。そのモデルを検査し、その標的とテンプレートとの間で異なる位置の側鎖を、側鎖最適化アルゴリズムを使用して最適化し、エネルギーを最小化した。一揃いの可視化およびコンピューター計算ツールを使用して、ＣＤＲのコンホメーション変動性、ならびにドメインおよび領域のコアおよびローカルパッキング、ならびに１またはこれより多くの好ましいモデルを選択する表面分析を評価した。
【０１１３】
モデル化した構造の比較
親および操作されたＦｖ領域の構造モデルを、上記で記載されるように（４．６）、個々にモデル化して、そのバリアントモデルが、その親モデル構造に向かういくらかの固有のバイアスを伴って構築されていないことを確実にする。しかし、その親配列に対する操作されたバリアントの高い配列同一性は、多くのモデルに関して選択されている同一の構造テンプレートをしばしば生じる。
【０１１４】
親和性および安定性に対する異なる置換の影響を評価するために、多くの構造基準を使用する。溶媒接近性、局所的原子充填、および推定される抗原結合界面またはＦｖダイマー界面に対する置換の位置が、重要な基準である。不利な溶媒和状態、原子間接触の悪さ、または重要な位置での不適切な残基の不十分な配置の観察は、潜在的な置換の拒絶をもたらす。他の基準（例えば、静電的効果、水素結合パターンまたは潜在的水素結合パターン）はまた、置換が適切であるかを評価するために使用される。いくつかの位置は、置換の受容に関して他より適切である。なぜなら一連の重要な位置は、ＣＤＲの標準クラス、その個々のドメインコアの充填またはドメイン間界面を支持するにあたって役割を果たすからである。
【０１１５】
翻訳後修飾
ＰＴＭは、治療用タンパク質の開発の間に問題（例えば、不均質性の増加、生体活性の低下、安定性の低下、免疫原性、フラグメント化および凝集）を引き起こし得る。ＰＴＭの潜在的影響は、それらの位置に依存し、いくつかの場合には、溶媒曝露に依存する。その配列を、以下の潜在的ＰＴＭについて分析した：  アスパラギン脱アミド化、アスパラギン酸異性化、遊離システインチオール基、Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化、Ｎ末端環化、酸化およびピログルタミン酸形成。この研究において２種の抗体に関連することが決定されたＰＴＭのうちの３つのタイプが、以下でより詳細に記載される。
【０１１６】
・アスパラギン脱アミド化
アスパラギンの側鎖のアミド基の加水分解である脱アミド化は、そのもたらされる位置において、アスパラギン、イソアスパラギン酸およびアスパラギン酸の不均質混合物を経時的に生成する非酵素的反応である。電荷の不均一性を引き起こすことに加えて、アスパラギン脱アミド化は、これが、抗体ＣＤＲにおけるように結合界面において起こる場合、タンパク質機能に影響を及ぼし得る（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。その脱アミド化率は、ｐＨおよび局所コンホメーション、特に、アスパラギンの連続する残基によって影響される（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ２００４）。
【０１１７】
・アスパラギン酸異性化
アスパラギン酸異性化は、アスパラギン酸およびイソアスパラギン酸アミノ酸残基の非酵素的相互変換である。電荷の不均一性を引き起こすことと同様に、アスパラギン脱アミド化は、これが、抗体ＣＤＲにおけるように結合界面において起こる場合、タンパク質機能に影響を及ぼし得る（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。その異性化反応は、アスパラギン脱アミド化反応のものに類似の中間体を経て進み、そのリスクは通常、プロセスパラメーターおよび製剤化の注意深い調整によって最小化され得る。
【０１１８】
・酸化
メチオニンおよびより少ない程度には、トリプトファンは、非部位特異的酸化に感受性である。メチオニンは、遊離活性酸素種に主に感受性である一方で、トリプトファンは、光誘導性酸化により感受性である。感受性の程度は、その側鎖の溶媒接近性によって大部分は決定される；埋め込まれた残基は、それほど感受性でないか、または反応するのにより長時間かかる。酸化的損傷は、生成、精製、製剤化または貯蔵の間に引き起こされ得、安定性および生物学的活性に影響を及ぼし得る。
【０１１９】
潜在的置換の評価
抗体の可変ドメインにおける全ての位置を、結合親和性および安定性に対するそれらの潜在的影響に関して評価した。各位置を、中立、重要または寄与のいずれかとして分類した。
・中立  −  この位置における別のアミノ酸への置換は、結合親和性および安定性に影響を及ぼさないはずである。
・寄与  −  置換は行われ得るが、その位置は、結合親和性または安定性に寄与している可能性がある。この位置における親アミノ酸の保持は、考慮されるべきである。
・重要  −  その位置は、親アミノ酸を保持されなければならない。そうでなければ、結合親和性の減少または安定性の低下のリスクがある。
【０１２０】
親和性および安定性の両方についての懸念に起因する、このカテゴリー分類に寄与する多くの要因が存在する。その分類に寄与する要因は、以下である：
・抗原結合を担う位置
・重要な位置
○  ＶＨ／ＶＬ界面内の保存された残基
○  ＣＤＲ標準クラスを決定する位置
・ＣＤＲからの距離
・参照アラインメント中の位置における保存またはバリエーション
・溶媒接近性
・局所的原子充填
・局所的二次構造
・静電的効果
・水素結合パターン
・水素結合の潜在性
・翻訳後修飾
【０１２１】
重要な位置は、最初に、ＶＨ／ＶＬ界面における重要な位置に（表５）；ＣＤＲコンホメーションを決定することを助ける（表６）かまたは参照アラインメントにおいて高度に保存されている位置にあることが決定された、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲにあるものとして定義される。
【０１２２】
中立の置換は、概して、フレームワークにおける溶媒に曝露される位置であり、任意のＣＤＲ残基の任意の側鎖原子から５Å超にある。この領域内の残基は、その親和性に寄与すると分類される。寄与位置は置換され得、多くの場合、これは、抗体を効率的にヒト化、脱免疫化または別の方法で操作するために行われる。全ての位置のリスクカテゴリーは、他の置換の状況において継続して再評価される。
【０１２３】
多くの位置は、保存されており、アミノ酸の小さなセット、または１個のみのタイプを受容するに過ぎない。他の位置は、より変動性であるので、それらが溶媒に曝露され、そのＣＤＲから離れていることがわかっている場合、それらはほぼ任意の置換を支持し得る。
【０１２４】
エピトープの分析
エピトープ、または隣接するエピトープのクラスターを、ＨＬＡアロタイプへの結合を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１アロタイプに焦点をあてて、可能な最大の程度まで除去または低減する置換に関してＥｐｉｂａｓｅＴＭを使用して分析した。中立位置での置換は、寄与位置より好ましく、重要位置での置換は、視覚的検査およびその位置を寄与として再分類した後にのみ提唱できた。置換を、可能な限り保存的であるように選択した。ヒト生殖系列配列を、免疫原性であるとはみなさなかった。なぜならそれらは、循環する抗体のプールにおいて見出されるからである。新たなエピトープを導入する置換または既存のエピトープのためにさらなるアロタイプに結合する置換を同定し、考慮から外した。
【０１２５】
置換の組み合わせは、エピトープを除去するために、特に、エピトープのクラスターまたは無差別のエピトープが存在する場合に、ときおり必要とされる。単一の置換と同様に、組み合わせは、これらがさらなるＨＬＡアロタイプへの結合を導入しないように、モニターされなければならない。
【０１２６】
イムノプロファイル比較
グローバルセットにおける８５のＨＬＡクラスＩＩアロタイプに対するその操作された抗体バリアントのＥｐｉｂａｓｅＴＭイムノプロファイルを、親配列に関するものと同じ様式で行った。
【０１２７】
ＨＬＡ結合予測のみを使用するそれらの免疫原性リスクに関する抗体バリアントの比較は、非常に困難である。これは、いくつかの重要な因子が考慮されていないからである：
・結合ペプチドは、プロセシング機構によって生成されなくてもよいので、それは、決してペプチド−ＨＬＡ複合体として、抗原提示細胞によってＴｈ細胞へ曝露されない。
・そのペプチド−ＨＬＡ複合体は、Ｔｈ細胞によって認識されなくてもよい。
【０１２８】
これらの検討事項を考慮すると、定量的比較の３つのタイプが、バリアント配列の間でＥｐｉｂａｓｅＴＭイムノプロファイリングを使用して行われ得る。第１に、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱおよびＤＰアロタイプセットの各々に関する重要なエピトープの数は、１として数えられる同じ群の多数のアロタイプに結合するペプチドと比較され得る。このようなエピトープのカウントは、各セット内の特有のエピトープの数を示し、その親と操作されたタンパク質との間の差異は、潜在的なＴｈエピトープの完全除去を明らかにする。
【０１２９】
しかし、多くのエピトープ、特に、多数のアロタイプを結合する無差別なエピトープは、完全に除去することは困難である。結論として、固有のＴｈエピエトープカウントにおける変化は、免疫原性の潜在性の実際の低減を不明確にし得る。従って、第２の定量的比較は、全てのＴｈエピトープに対する各ＨＬＡアロタイプのレベルにある。その場合、その親および操作されたバリアントに関して１アロタイプにつき結合するペプチドのカウントは、血清型および集団頻度を一緒に用いると、その血清型またはアロタイプレベルのいずれかでの比較を可能にする（結果を参照のこと）。第３に、最悪の場合の免疫原性リスクを発現する近似のスコアは、以下のように計算され得る：
スコア＝Σ（エピトープカウント×アロタイプ頻度）
【０１３０】
各影響を受けたアロタイプについての乗法の積は、所定のアロタイプに結合すると推測されるエピトープの数、およびその影響を及ぼされるアロタイプのアレル頻度から計算される。その積は、その研究において使用される全てのＤＲＢ１アロタイプに関して合計される。そのスコアが、免疫原性リスクを測定する絶対的な計量ではなく、その提唱される置換、およびそれらの順序が、全て選択されたＨＬＡアロタイプ（ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱおよびＤＰ）を、その置換位置および分類と同様に考慮に入れることを、注記するべきである。
【０１３１】
ＰＧ１０２のさらなる特徴付けは、トリプシン消化後に質量分析法で検出した３つの領域が存在することを示した。ここではそのトリプシン処理ペプチドは、比較的低レベル（≦４％）を上回る脱アミド化を有した。１つは、保存されたドメインにおける既知の脱アミド化部位であり、２つは、可変ドメインにある：  ＶＨにおけるトリプシン処理ペプチドＨ１０（ＭＮＳＬＲ）およびＶＬにおけるトリプシン処理ペプチドＬ２（ＳＳＱＳＬＡＮＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＲＰＧＱＳＰＲ）。
【０１３２】
そのＬ２トリプシン処理ペプチドは、軽鎖のＣＤＲ  Ｌ１領域にあり、その分子に関する結合効率に潜在的に影響を及ぼす。軽鎖ＣＤＲ  Ｌ１は、３個の潜在的脱アミド化モチーフを含む。そのうちの２つを実験的に検証した（Ｌ：Ａｓｎ３１およびＬ：Ａｓｎ３３）。しかし、その安定性研究は、ＣＤＲ  Ｌ１における脱アミド化が、抗原結合に対して比較的小さな影響を有することを示す。＋２５℃で１２ヶ月後および１００％  脱アミド化を伴う場合、その生成物特異的抗原結合ＥＬＩＳＡは、参照と比較して、９５％の活性である。
【０１３３】
低レベルのメチオニン酸化したバリアントは、質量分析法結果において３種のトリプシン処理ペプチドに関して検出された。そのトリプシン処理ペプチドＨ１（Ｈ：Ｍｅｔ９２を含む）は、ＰＧ１０２薬物生成物が＋２５℃で貯蔵される場合、メチオニン酸化により感受性であり得るということを注記する報告とともに、２個のＶＨ部位が影響を受けた（Ｈ：Ｍｅｔ８２およびＨ：Ｍｅｔ９２）。
【０１３４】
最初の分析は、凝集問題の潜在的な原因として、重鎖のＣＤＲ  Ｈ２においてメチオニンを強調した。その安定性研究結果は、そのメチオニン  Ｈ：Ｍｅｔ４８、Ｈ：Ｍｅｔ５０およびＨ：Ｍｅｔ５１が、その抗体内部に全て埋め込まれ、接近可能ではないことを示す。
【０１３５】
ＥｐｉｂａｓｅＴＭイムノプロファイリング
グローバルセットにおける８５の  ＨＬＡクラスＩＩアロタイプに対するＥｐｉｂａｓｅＴＭイムノプロファイリングを、親抗体および操作されたバリアントＰＧ１０２＿ｖａｒ１６の配列に対して行った。
【０１３６】
翻訳後修飾
翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、治療用タンパク質の開発の間に問題（例えば、不均質性の増加）を、および場合によっては、生体活性の低下または安定性の低下を引き起こし得る。ＣＤＲに位置したＰＴＭは、その修飾が生体活性を変更し得ることから、抗体に関しては特に懸念される。潜在的な製造可能性のリスクを課すいくつかの潜在的なＰＴＭ（表７に記載される）が存在する。
【０１３７】
【表７−１】
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【表７−２】
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【０１３８】
潜在的な操作されたバリアント配列を、Ｌｏｎｚａ’ｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎプラットフォームおよびＥｐｉｂａｓｅＴＭを使用してスクリーニングした。
【０１３９】
各位置を、Ｌｏｎｚａ’ｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎプラットフォームを使用して、全ての考えられるアミノ酸置換でスクリーニングし、結果を記録した。各位置の評価は、作業が進むにつれ更新し、スクリーニングツールならびに配列および構造分析に基づいて、凝集、ＰＴＭおよび免疫原性に対する位置の影響を反映させた。
【０１４０】
軽鎖のＰＴＭ操作に続いて、軽鎖における置換によって凝集傾向リスクを減少させることによって、その抗体を改善するいくつかの手段が存在することが見出された。従って、その操作された軽鎖は、ＣＤＲ  Ｌ１  ＰＴＭに焦点を当て、さらなる置換を伴う単一の操作された鎖を有する。
【０１４１】
重鎖における推定凝集傾向リスクを減少させることによって、抗体を改善するより多くの余地が存在した。脱凝集フレームワーク置換の数の増加が、３個の操作された重鎖において提唱されている。さらに、その凝集リスクが、参照として別のヒトＶＨファミリーに由来する生殖系列、この場合はＶＨ３−３−１１を使用することによって、さらに減少され得ることが見出された。この選択肢は、１つの操作された重鎖、ＦＦＰ＿ＶＨ＿４において調査されている。
【０１４２】
最終的な提唱される置換およびそれらの効果は、その軽鎖および重鎖に関して以下に記載される。軽鎖については８個の置換を、および重鎖については３０個の置換を提唱しており、多くは、最後の操作された重鎖ＦＦＰ１０４＿ＶＨ＿４に関して採用したアプローチに由来する。その操作された鎖を、それぞれ、軽鎖および重鎖に関して図１に示す。全ての操作された鎖のアミノ酸配列は、「開示される実施形態の詳細な説明」の中で入手可能である。その親に対するその操作された配列のアラインメントは、図１に見出され得る。
【０１４３】
各候補配列を、その推定免疫原性を改変する置換について分析し、それを増加させるものを回避した。本研究は、ＤＲＢ１アロタイプが免疫原性評価に最も関連性があることから、ＥｐｉｂａｓｅＴＭにおいて入手可能な４３のＤＲＢ１アロタイプに焦点を当てた。
【０１４４】
抗体凝集結果
親ＰＧ１０２およびその操作されたバリアントに関する抗体凝集推定結果を、表８に示す。そのプラットフォームは、その抗体が、低い凝集リスククラスにあるか高い凝集リスククラスにあるかを推定する。その凝集スコアはそのクラスに関連しており、正のスコアが高いリスククラスを、かつ負のスコアが低いリスククラスを示す。その凝集スコアの絶対値は、その推測における確実性の増加を示す。よって、より負である凝集スコアは、このプロジェクトにおいて求められる。そのΔスコアは、その親抗体からの変化を示し、より負であるスコアが好ましい。
【０１４５】
その親抗体ＰＧ１０２は、低リスククラスにあると既に推測されたが、比較的高スコア、すなわち、ゼロに近かった。１つの操作された重鎖ＰＧ１０２＿ＶＨ＿２は、４つのバリアントに関して凝集スコアの増加をもたらした。上記で注記されるように、この鎖を、最小数のフレームワーク置換を評価するためにデザインした。
【０１４６】
【表８】
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【０１４７】
ＥｐｉｂａｓｅＴＭイムノプロファイリング比較
ＰＧ１０２の操作されたバリアント組み合わせ（ＰＧ１０２＿ｖａｒ１６）を、ＥｐｉｂａｓｅＴＭイムノプロファイリングを通じて採用した。ＥｐｉｂａｓｅＴＭプロファイルにおける詳細レベルは、詳細に比較するには粗すぎることから、３種のイムノプロファイル統計に基づく比較を、その親抗体とその操作されたバリアントとの間で行った。
【０１４８】
全体の推定された免疫原性リスクの潜在性は、その操作されたバリアントでは低い；しかし、それはなお、その親ＰＧ１０２のものに匹敵する。
【０１４９】
実施例４：  
本開示は、軽鎖可変ドメインにおける変更をさらに提供する（図１）。その軽鎖において、その可変ドメインにおける３１位および３３位の２個のアスパラギン（Ｎ）アミノ酸を、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって置き換える（図１）。これらの変更は、アスパラギン脱アミド化を防止すると考えられる。アスパラギンの側鎖におけるアミド基の加水分解である脱アミド化は、そのもたらされる位置において、アスパラギン、イソアスパラギン酸およびアスパラギン酸の不均質混合物を経時的に生成する非酵素的反応である。電荷の不均一性を引き起こすことに加えて、アスパラギン脱アミド化は、これが、抗体ＣＤＲのように結合界面において起こる場合、タンパク質機能に影響を及ぼし得る。両方のアスパラギン残基は、その軽鎖のＣＤＲ１に位置したので、脱アミド化を防止するために置き換える。
【０１５０】
本開示はさらに、重鎖可変領域においてデザインされた変更を提供する（図１）。重鎖可変領域のアミノ酸の３位を、全ての新たな抗体バリアントに関してリジン（Ｋ）からグルタミン（Ｑ）に変更する。この変更は、その抗体の安定性を改善し、精製および貯蔵の間の凝集特性を低減する。そのＰＧ１０２抗体のフレームワーク領域３は、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸として含まれる配列ＭＮＳＬＲから構成される。このアミノ酸は、その抗体の脱アミノ化を防止するために、セリン（Ｓ）によって置換される。その重鎖可変領域の８６位、８７位および８８位のアミノ酸ＲＴＤは、凝集を低減するために、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）に置換される。その重鎖可変領域における９２位のメチオニン残基は、メチオニン酸化を防止するためにバリン（Ｖ）によって置き換えられる。
【０１５１】
付表：アミノ酸配列
可変領域には下線を付し、分泌シグナル配列（Ｎ末端）および定常領域（Ｃ末端）が隣接している。
【０１５２】
【表９−１】
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【表９−２】
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【０１５３】
【表１０−１】
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【表１０−２】
2021513367.tif 000021
【図１】
2021513367.tif 000022
【図２】
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【図３】
2021513367.tif 000024
【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021513367.tif 000027
2021513367.tif 000028
2021513367.tif 000029
2021513367.tif 000030
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