(57)【要約】一部分では、本開示は、異所性骨化または異所性骨化の１つもしくは複数の合併症を処置するための方法に関する。特に、本開示は、１つまたは複数のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、必要な患者に投与することによって、異所性骨化を処置するための方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴβＲＩＩポリペプチドを必要な患者に投与することによって、異所性骨化を処置するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）アンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、異所性骨化（ＨＯ）を処置するための方法。
【請求項２】
前記異所性骨化が、脊髄損傷、外傷、脳損傷、熱傷、骨折、筋肉挫傷、関節形成術／関節置換術、股関節手術／人工股関節置換術、寛骨臼手術／寛骨臼置換術、肘の骨折、下腿の長骨の骨折、戦闘関連外傷、肢切断、成人の呼吸促迫症候群を管理するために使用される神経筋遮断、非外傷性脊髄症からなる群から選択される１つもしくは複数の障害または状態と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有効量のＴＧＦβアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を処置するための方法。
【請求項４】
有効量のＴＧＦβアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、進行性骨性異形成症（ＰＯＨ）を処置するための方法。
【請求項５】
有効量のＴＧＦβアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、線維性骨異形成症を処置するための方法。
【請求項６】
関節拘縮、関節強直、疼痛、痙縮、腫脹の発熱、神経血管圧迫症候群および褥瘡からなる群から選択されるＨＯの１つまたは複数の合併症の重症度または期間を予防または低減する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記患者における異所性骨化の重症度または期間を予防または低減する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記異所性骨化が、骨、皮膚、皮下組織、骨格筋、関節の近傍の線維症組織、血管壁および靱帯からなる群から選択される１つまたは複数の組織で起こる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
異所性骨化、ＦＯＰ、ＰＯＨまたは線維性骨異形成症を処置するための追加の活性薬剤または支持療法の投与をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
異所性骨化、ＦＯＰ、ＰＯＨまたは線維性骨異形成症を処置するための前記追加の活性薬剤または支持療法が、イソトレチノイン、エチドロネートと経口コルチコステロイド、マレイン酸ペルヘキシリン、ＡＬＫ２低分子阻害剤、パロバロテン、レチノイン酸受容体ガンマアゴニスト、レチノイン酸受容体アルファアゴニスト、アクチビン抗体（例えば、ＲＥＧＮ  ２４７７などのアクチビンＡ抗体）、ＡＬＫ２の対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉、ビスホスホネート、放射線療法、抗炎症剤（例えば、インドメタシン、イブプロフェンおよびアスピリン）および他動可動域の訓練または他の可動化技術などの保存的処置からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
前記追加の活性薬剤または支持療法が、アクチビンアンタゴニストによる処置である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アクチビンアンタゴニストが、アクチビン抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アクチビン抗体が、アクチビンＡ抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、形質転換成長因子−β受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）ポリペプチドである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終了する配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列；および
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終了する配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終了する配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終了する配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終了する配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終了するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終了する配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終了する配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終了する配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終了するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１８と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ．ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメイン；および
ｂ．異種部分
を含む融合ポリペプチドであり、
前記ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインが、
ｉ）配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列、または
ｉｉ）配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列
と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、
請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１８と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインが、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインが、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記異種部分が、免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記異種部分が、配列番号４９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記異種部分が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
融合タンパク質が、リンカードメインをさらに含む、請求項２７から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記リンカーが、１０〜２５アミノ酸長の間である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカーが、
ａ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧２）；
ｂ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧３）；
ｃ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧４）；ならびに
ｄ．配列番号４〜７、１９、２１、２５、２６および４０のいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ≠≧５）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１３、６５または６８のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２を含まない、請求項１４から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜２２を含まない、請求項１４から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含むＴβＲＩＩポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列、および５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含むリンカー部分；
ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む異種部分；ならびに
ｃ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）
からなるか、またはこれらから本質的になる、請求項１４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含むＴβＲＩＩポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含むリンカー部分；
ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む異種部分；ならびに
ｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）
からなるか、またはこれらから本質的になる、請求項１４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ）配列番号１８の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメイン；
ｂ）配列番号４９の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種部分；
ｃ）前記細胞外ドメインおよび前記異種部分を連結するリンカー部分であって、前記リンカーが、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、リンカー部分
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメイン；
ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む、異種部分；
ｃ）前記細胞外ドメインおよび前記異種部分を連結するリンカー部分であって、前記リンカーが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、リンカー部分
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、リーダー配列を含まないか、または前記リーダー配列が、除去されている、請求項１４から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分とコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の改変アミノ酸残基を含む、請求項１４から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、グリコシル化される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、ＣＨＯ細胞におけるポリペプチドの発現のグリコシル化パターン特性を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する、請求項１４から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のシグナル伝達を阻害する、請求項１４から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、ホモ二量体である、請求項１４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つもしくは複数に結合する抗体または抗体の組合せである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する抗体または抗体の組合せである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体が、フレソリムマブである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する抗体または抗体の組合せであるが、前記抗体または抗体の組合せが、ＴＧＦβ２に結合しない、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つもしくは複数を阻害する低分子または低分子の組合せである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つもしくは複数を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記アクチビンアンタゴニストが、低分子またはヌクレオチドから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項６５】
前記アクチビンアンタゴニストが、アクチビンＡを阻害する低分子またはヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項６６】
有効量の形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）アンタゴニストおよびアクチビンアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、異所性骨化（ＨＯ）を処置するための方法。
【請求項６７】
有効量のＴＧＦβアンタゴニストおよびアクチビンアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を処置するための方法。
【請求項６８】
有効量のＴＧＦβアンタゴニストおよびアクチビンアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、進行性骨性異形成症（ＰＯＨ）を処置するための方法。
【請求項６９】
有効量のＴＧＦβアンタゴニストおよびアクチビンアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、線維性骨異形成症を処置するための方法。
【請求項７０】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、請求項１４から６３に定義されるいずれか１つに対応する、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記アクチビンアンタゴニストが、抗体、低分子またはヌクレオチドから選択される、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記アクチビンアンタゴニストが、アクチビンＡを阻害する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２もしくはＴＧＦβ３の１つまたは複数に結合する抗体であり、前記アクチビンアンタゴニストが、アクチビンに結合する抗体である、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＴＧＦβ抗体が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＴＧＦβ抗体が、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合するが、ＴＧＦβ２に結合しないか、またはＴＧＦβ２に（例えば、少なくとも１×１０−７ＭのＫＤを超えて）実質的に結合しない、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体が、アクチビンＡに結合する、請求項７３から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＴＧＦβアンタゴニストおよびアクチビンアンタゴニストが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３およびアクチビンＡに結合する多重特異性抗体である、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ベータグリカンポリペプチドである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびＡＬＫ５ポリペプチドを含むヘテロ多量体である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびベータグリカンポリペプチドを含むヘテロ多量体である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ＡＬＫ５ポリペプチドおよびベータグリカンポリペプチドを含むヘテロ多量体である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記ベータグリカンポリペプチドが、配列番号５１もしくは５５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物活性断片を含む、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＡＬＫ５ポリペプチドが、配列番号７０もしくは７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物活性断片を含む、請求項７９または８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記ヘテロ多量体が、ヘテロ二量体である、請求項７９から８１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月９日に出願された米国仮出願第６２／６２８，６４９号および２０１８年５月３日に出願された米国仮出願第６２／６６６，２３５号の優先権の利益を主張する。前述の出願は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
異所性骨化（ＨＯ）は、軟組織における骨外性（ｅｘｔｒａ−ｓｋｅｌｅｔａｌ）の骨の病的形成である。Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｏｓｓｃｈｅ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒｓｔｒａｅｔｅｎ，  Ｊ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｍｅｄ  ２７，  １２９  （２００５）。一般に、このプロセスは、広い表面積の熱傷、筋骨格損傷、整形外科手術および脊髄損傷を含む重度の外傷を有する患者集団、ならびに進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）として公知の遺伝性疾患を有する患者集団において起こる。ＦＯＰは、Ｉ型骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体のＡＣＶＲ１における過剰活性化突然変異によって引き起こされ、ＦＯＰを有する患者は、任意の実質的な外傷の非存在中で異所性骨病変を発生する。これらの病的な異所性の骨の形成の臨床の続発症は、外傷または遺伝的突然変異の状況に関わらず、非治癒性の創傷、慢性疼痛および関節の非可動性を含む。ＦＯＰの場合において、進行性骨化は、胸郭の伸展性の喪失が原因で、死をもたらすことがある。
ＨＯのための処置の選択肢は、骨が、多くの場合、外科的切除後に再発するので、限定されており、一部の患者は、その感覚がある場所に起因して、切除不能のＨＯを有し得る。手術の危険性は、特に、再発を前にすると、切除の利益を上回り得る。したがって、ＨＯを処置するための有効な治療のための満たされていない高い必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｏｓｓｃｈｅ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒｓｔｒａｅｔｅｎ，  Ｊ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｍｅｄ  ２７，  １２９  （２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一部分では、本開示は、ＴＧＦβアンタゴニスト（阻害剤）が異所性骨化（ＨＯ）を処置するために使用することができるという発見に関する。特に、本明細書において提示されるデータは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する可溶性のＴβＲＩＩポリペプチドが、ＨＯのマウスモデルにおいて、骨沈着および骨髄腔の形成の減少を伴うＨＯ原基（ａｎｌａｇｅｎ）の発生の減弱に有効であることを示す。さらにまた、ＴβＲＩＩポリペプチドによる処置は、この動物モデルにおいて、成熟ＨＯの体積を顕著に低減させた。任意の特定の機構に拘束されることを望まないが、ＴβＲＩＩポリペプチドの効果は、ＴＧＦβのシグナル伝達のアンタゴニスト効果、特に、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３のシグナル伝達のアンタゴニスト効果によって主に引き起こされると予想される。したがって、他のＴＧＦβアンタゴニスト［例えば、ＴβＲＩＩ受容体のアンタゴニスト、１つもしくは複数のＴβＲＩＩ結合リガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）のアンタゴニスト、１つもしくは複数のＴβＲＩＩ関連Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）のアンタゴニスト、１つもしくは複数のＴβＲＩＩ関連共受容体（ベータグリカン）のアンタゴニスト、１つもしくは複数のＴβＲＩＩの下流のシグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）のアンタゴニスト、またはこのようなアンタゴニストの組合せ］がＨＯの処置において有用であると予想される。このような薬剤は、本明細書において、まとめて「ＴＧＦβアンタゴニスト」または「ＴＧＦβ阻害剤」と称する。
【０００５】
ある特定の態様では、本開示は、有効量の形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）アンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、ＨＯを処置するための方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、ＨＯの１つまたは複数の合併症の重症度および／または期間を予防または低減する。例えば、ＴＧＦβアンタゴニストによる処置は、関節拘縮、関節強直、疼痛、痙縮、腫脹の発熱、神経血管圧迫症候群および褥瘡からなる群から選択されるＨＯの１つまたは複数の合併症の重症度ならびに／または期間を予防または低減し得る。一部の実施形態では、この方法は、脊髄損傷、外傷、脳損傷、熱傷、骨折、筋肉挫傷、関節形成術／関節置換術、股関節手術／人工股関節置換術、寛骨臼手術／寛骨臼置換術、肘の骨折、下腿の長骨の骨折、戦闘関連外傷、肢切断、成人の呼吸促迫症候群を管理するために使用される神経筋遮断、非外傷性脊髄症からなる群から選択される１つもしくは複数の障害または状態と関連するＨＯを処置することに関する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を処置する方法に関する。例えば、この方法は、ＦＯＰの１つまたは複数の合併症（例えば、異所性骨化）の重症度および／または期間を予防または低減する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を処置する方法に関する。例えば、この方法は、ＦＯＰの１つまたは複数の合併症（例えば、異所性骨化）の重症度および／または期間を予防または低減する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを必要な患者に投与することを含む、線維性骨異形成症を処置する方法に関する。例えば、この方法は、線維性骨異形成症の１つまたは複数の合併症（例えば、異所性骨化）の重症度および／または期間を予防または低減する。一部の実施形態では、異所性骨化は、骨、皮膚、皮下組織、骨格筋、関節の近傍の線維症組織、血管壁および靱帯からなる群から選択される１つまたは複数の組織で起こる。必要に応じて、このような本明細書に記載の方法は、有効量のＨＯを処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法を患者に投与することをさらに含む。例えば、このような追加の活性薬剤または支持療法としては、イソトレチノイン、エチドロネートと経口コルチコステロイド、マレイン酸ペルヘキシリン、ＡＬＫ２低分子阻害剤、パロバロテン、レチノイン酸受容体ガンマアゴニスト、レチノイン酸受容体アルファアゴニスト、アクチビン抗体（例えば、ＲＥＧＮ  ２４７７などのアクチビンＡ抗体）、ＡＬＫ２の対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉、ビスホスホネート、放射線療法、抗炎症剤（例えば、インドメタシン、イブプロフェンおよびアスピリン）および他動可動域の訓練または他の可動化技術などの保存的処置が挙げられる。一部の実施形態では、追加の活性薬剤または支持療法は、アクチビンアンタゴニストによる処置である。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストは、アクチビン抗体である。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンＡ抗体である。一部の実施���態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の１つまたは複数に結合し、これらの１つまたは複数によって媒介されるシグナル伝達を阻害し、ならびにアクチビン（例えば、アクチビンＡ）にさらに結合および阻害する、多重特異性抗体である。
【０００６】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＴＧＦβ１を阻害する薬剤（例えば、ＴＧＦβ１アンタゴニスト）である。ＴＧＦβ１阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達アッセイ）を使用して、決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＴＧＦβ１に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む結合親和性アッセイを使用して、決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＴＧＦβ１に結合する。本明細書に記載するように、ＴＧＦβ１を阻害する様々なＴＧＦβアンタゴニストは、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびそのバリアント）、抗体、低分子、ヌクレオチド配列およびこれらの組合せを含む本明細書に記載の方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ１を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害し得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ３をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ３をさらに阻害するが、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。
【０００７】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＴＧＦβ２を阻害する薬剤（例えば、ＴＧＦβ２アンタゴニスト）である。ＴＧＦβ２阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達アッセイ）を使用して、決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＴＧＦβ２に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む結合親和性アッセイを使用して、決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＴＧＦβ２に結合する。本明細書に記載するように、ＴＧＦβ２を阻害する様々なＴＧＦβアンタゴニストは、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびそのバリアント）、抗体、低分子、ヌクレオチド配列およびこれらの組合せを含む本明細書に記載の方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ２を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【０００８】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＴＧＦβ３を阻害する薬剤（例えば、ＴＧＦβ３アンタゴニスト）である。ＴＧＦβ３阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達アッセイ）を使用して、決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＴＧＦβ３に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む結合親和性アッセイを使用して、決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＴＧＦβ３に結合する。本明細書に記載するように、ＴＧＦβ３を阻害する様々なＴＧＦβアンタゴニストは、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびそのバリアント）、抗体、低分子、ヌクレオチド配列およびこれらの組合せを含む本明細書に記載の方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ３を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害し得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ１をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ１をさらに阻害するが、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。
【０００９】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＴβＲＩＩを阻害する薬剤（例えば、ＴβＲＩＩ受容体アンタゴニスト）である。ＴβＲＩＩ阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達アッセイ）を使用して、決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＴβＲＩＩに結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む結合親和性アッセイを使用して、決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＴβＲＩＩに結合する。本明細書に記載するように、ＴβＲＩＩを阻害する様々なＴＧＦβアンタゴニストは、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびそのバリアント）、抗体、低分子、ヌクレオチド配列およびこれらの組合せを含む本明細書に記載の方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩを阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害し得る。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩを阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。
【００１０】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害する薬剤（例えば、ＡＬＫ５アンタゴニスト）である。ＡＬＫ５阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達アッセイ）を使用して、決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ５に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む結合親和性アッセイを使用して、決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ５アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＡＬＫ５に結合する。本明細書に記載するように、ＡＬＫ５を阻害する様々なＴＧＦβアンタゴニストは、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびそのバリアント）、抗体、低分子、ヌクレオチド配列およびこれらの組合せを含む本明細書に記載の方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩおよびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害し得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ５を阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。
【００１１】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともベータグリカンを阻害する薬剤（例えば、ベータグリカンアンタゴニスト）である。ベータグリカン阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達アッセイ）を使用して、決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともベータグリカンに結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む結合親和性アッセイを使用して、決定され得る。一部の実施形態では、本開示のベータグリカンアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともベータグリカンに結合する。本明細書に記載するように、ベータグリカンを阻害する様々なＴＧＦβアンタゴニストは、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびそのバリアント）、抗体、低分子、ヌクレオチド配列およびこれらの組合せを含む本明細書に記載の方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ベータグリカンを阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５の１つまたは複数をさらに阻害し得る。一部の実施形態では、ベータグリカンを阻害するＴＧＦβアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。
【００１２】
ある特定の態様では、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチド、ならびにＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３のための選択的アンタゴニストとしてのこのようなＴβＲＩＩポリペプチドの使用を提供する。本明細書に記載するように、ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の一部またはすべてを含むポリペプチドは、追加の突然変異ありまたはなしで、親和性の変化を有するＴＧＦβ１および／もしくはＴＧＦβ３に結合ならびに／または阻害する。したがって、ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリー関連障害の選択的な阻害における使用のためのＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。
【００１３】
一部分では、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドの融合タンパク質、およびＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３のための選択的アンタゴニストとしてのこのような融合タンパク質の使用を提供する。本明細書に記載するように、ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の一部またはすべてを含むポリペプチドは、追加の突然変異ありまたはなしで、親和性の変化を有するＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３に結合および／または阻害する。特に、異種部分（例えば、Ｆｃ免疫グロブリンドメイン）を含むＴβＲＩＩポリペプチド、および少なくとも１０アミノ酸長のリンカー（例えば、配列番号６のアミノ酸配列を有するリンカー）は、より短いリンカーを有するＴβＲＩＩポリペプチドと比較して、驚くほど優れたＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３結合特性と関連する。したがって、ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリー関連障害の選択的な阻害における使用のためのＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、ａ）ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメイン；ｂ）異種部分；およびｃ）リンカー部分を含む形質転換成長因子−β受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）融合ポリペプチドであって、リンカーが、少なくとも１０アミノ酸長であり、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインが、ｉ）配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列、またはｉｉ）配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、形質転換成長因子−β受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配���番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了する配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１の２３〜３５位のいずれかで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれかで終了するアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了する配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号２の２３〜６０位のいずれかで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれかで終了するアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端リーダー配列を含む。一部の実施形態では、Ｎ末端リーダー配列は、配列番号２２〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｎ末端リーダー配列は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、免疫グロブリンＦｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号４９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号４９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号４９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号４９と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、２５アミノ酸長未満である。一部の実施形態では、リンカーは、１０〜２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、１５〜２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、１７〜２２アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、２１アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧２）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ���≧３）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧４）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ≠≧５）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号４〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリ���プチドは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２を含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含むＴβＲＩＩポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列、および５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含むリンカー部分；ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む異種部分；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含むＴβＲＩＩポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含むリンカー部分；ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む異種部分；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ａ）配列番号１８の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメイン；ｂ）配列番号４９の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、異種部分；ｃ）細胞外ドメインおよび異種部分を連結するリンカー部分であって、リンカーが、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、リンカー部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む、ＴβＲＩＩ部分の細胞外ドメイン；ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む、異種部分；ｃ）細胞外ドメインおよび異種部分を連結するリンカー部分であって、リンカーが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、リンカー部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同���であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、リーダー配列を含まないか、またはリーダー配列は、除去されている。一部の実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分とコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤とコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の改変アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドはグリコシル化される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞におけるポリペプチドの発現のグリコシル化パターン特性を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、１００ｐＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、７５ｐＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、６０ｐＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、５０ｐＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、１．０ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ１を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、０．２５ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ１を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、０．１ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ１を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、０．０５ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ１を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、０．３ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ３を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、０．１ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ３を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、０．０５ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ３を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、０．０４
ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ３を阻害する。一部の実施形態では、レポーター遺伝子アッセイは、ＣＡＧＡレポーターアッセイである。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるいずれか２つのポリペプチドを含むホモ二量体を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるいずれかのポリペプチドに対するコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるいずれかのポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０、１２、１４、４６または４７のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるいずれかのポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞またはヒト細胞である。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤、および本明細書に開示されるいずれかのポリペプチドまたは本明細書に開示されるいずれかのホモ二量体を含む、医薬調製物を提供する。
【００１９】
ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストは、抗体または抗体の組合せである。ある特定の態様では、抗体は、少なくともＴβＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩに結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、必要に応じて、本明細書に記載のアッセイなどの細胞に基づくアッセイで測定される、ＴβＲＩＩのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩに結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、１つもしくは複数のＴＧＦベータスーパーファミリーのリガンド、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体、またはＴＧＦβスーパーファミリー共受容体がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩに結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３からなる群から選択される１つまたは複数のＴＧＦベータスーパーファミリーのリガンドがＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、抗体は、少なくともＡＬＫ５に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、必要に応じて、本明細書に記載のアッセイなどの細胞に基づくアッセイで測定される、ＡＬＫ５のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、１つもしくは複数のＴＧＦベータスーパーファミリーのリガンド、ＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体、またはＴＧＦβスーパーファミリー共受容体がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３からなる群から選択される１つまたは複数のＴＧＦベータスーパーファミリーのリガンドがＡＬＫ５に結合するのを阻害する。ある特定の態様では、抗体は、少なくともベータグリカンに結合する。一部の実施形態では、ベータグリカンに結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、必要に応じて、本明細書に記載のアッセイなどの細胞に基づくアッセイで測定される、ベータグリカンのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ベータグリカンに結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、１つもしくは複数のＴＧＦベータスーパーファミリーのリガンド、ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型受容体、またはＴＧＦβスーパーファミリーＩＩ型受容体がベータグリカンに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ベータグリカンに結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３からなる群から選択される１つまたは複数のＴＧＦベータスーパーファミリーのリガンドが、ベータグリカンに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、少なくともＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、必要に応じて、本明細書に記載のアッセイなどの細胞に基づくアッセイで測定される、ＴβＲＩＩのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１−ＴβＲＩＩ、ＴＧＦβ１−ＡＬＫ５、および／またはＴＧＦβ１−ベータグリカン（ｂｅｔａｇｌｃｙａｎ）の結合を阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、少なくとも��ＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、必要に応じて、本明細書に記載のアッセイなどの細胞に基づくアッセイで測定される、ＴβＲＩＩのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ２−ＴβＲＩＩ、ＴＧＦβ１−ＡＬＫ５、および／またはＴＧＦβ１−ベータグリカンの結合を阻害する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、少なくともＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、必要に応じて、本明細書に記載のアッセイなどの細胞に基づくアッセイで測定される、ＴβＲＩＩのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ３−ＴβＲＩＩ、ＴＧＦβ１−ＡＬＫ５、および／またはＴＧＦβ１−ベータグリカンの結合を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数の細胞に基づくアッセイにおいてシグナル伝達を阻害する、多重特異性抗体または多重特異性抗体の組合せである。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体、タンデム一本鎖Ｆｖ断片、タンデム一本鎖ダイアボディ、または一本鎖ダイアボディおよび免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部分を含む融合タンパク質である。
【００２０】
ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストは、低分子阻害剤または低分子阻害剤の組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの低分子阻害剤は、少なくともＴβＲＩＩの阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの低分子阻害剤は、少なくともＡＬＫ５の阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの低分子阻害剤は、少なくともベータグリカンの阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの低分子阻害剤は、少なくともＴＧＦβ１の阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの低分子阻害剤は、少なくともＴＧＦβ２の阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの低分子阻害剤は、少なくともＴＧＦβ３の阻害剤である。
【００２１】
ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストは、核酸阻害剤または核酸阻害剤の組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの核酸阻害剤は、少なくともＴβＲＩＩの阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの核酸阻害剤は、少なくともＡＬＫ５の阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの核酸阻害剤は、少なくともベータグリカンの阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの核酸阻害剤は、少なくともＴＧＦβ１の阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの核酸阻害剤は、少なくともＴＧＦβ２の阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストの核酸阻害剤は、少なくともＴＧＦβ３の阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ型（ｈＴβＲＩＩ）（ＮＰ＿００３２３３．４）のＢ（短い）アイソフォームのための天然前駆体のアミノ酸配列を示す。実線下線は、成熟細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（残基２３〜１５９）を示し、二重下線は、Ａ（長い）アイソフォームにおいて置き換えられたバリンを示す。点線下線は、リーダー（残基１〜２２）を表す。
【００２３】
【図２】図２は、ヒトＴβＲＩＩ（ＮＰ＿００１０２００１８．１）のＡ（長い）アイソフォームのための天然前駆体のアミノ酸配列を示す。実線下線は、成熟ＥＣＤ（残基２３〜１８４）を示し、二重下線は、スプライスで生じたイソロイシン置換を示す。点線下線は、リーダー（残基１〜２２）を表す。
【００２４】
【図３】図３は、５つの異なるＴβＲＩＩ構築物のリンカー配列の比較を示す。
【００２５】
【図４−１】図４Ａおよび４Ｂは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３、ならびにいくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の１つとの間の結合親和性を表形式で示す。
【図４−２】同上。
【００２６】
【図５−１】図５Ａおよび５Ｃは、いくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の１つに対するＴＧＦβ１の親和性を試験するレポーター遺伝子アッセイからの結果をグラフで表す。図５Ｂおよび５Ｄは、いくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の１つに対するＴＧＦβ３の親和性を試験するレポーター遺伝子アッセイからの結果をグラフで表す。図５Ｅおよび５Ｆは、これらの同じ実験からのＩＣ５０のデータを表形式で提示する。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図５−５】同上。
【図５−６】同上。
【００２７】
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ炎症モデルおよび異所性骨化の動物モデルにおけるｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃの効果を示す。図６Ａは、ｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの炎症環境において、再生Ｍ２マクロファージによるＴＧＦβ１分泌を抑止することができることを示す。図６Ｂは、ｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃによる処置が、外傷性異所性骨化の動物モデルにおいて、骨沈着および骨髄腔の形成を減少させることを示す。図６Ｃは、ｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃによる処置が、外傷性異所性骨化の動物モデルにおいて、成熟ＨＯの体積を顕著に減少させることを示す。
【００２８】
【図７】図７は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用する、ヒトＩｇＧアイソタイプからのＦｃドメインの多重配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は、点線下線によって示される。二重下線は、非対称鎖の対形成を促進するためのＩｇＧ１  Ｆｃにおいて設計された位置の例、ならびに他のアイソタイプであるＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関して対応する位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
１．概要
本明細書に記載のタンパク質は、他に規定のない限り、ヒト形態である。タンパク質についてのＮＣＢＩ参照は以下の通りである：ヒトＴβＲＩＩアイソフォームＡ（ｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ）、ＮＰ＿００１０２００１８．１およびヒトＴβＲＩＩアイソフォームＢ（ｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ）、（ＮＰ＿００３２３３．４）。ヒトからの天然ＴβＲＩＩタンパク質の配列は、図１および２において説明される。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩタンパク質は、マウス、ラット、ウシまたはサルなどの非ヒト動物由来である。
【００３０】
ＴＧＦβスーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の成長因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における多種多様な細胞型に対する生物学的効果を発揮することが公知である。スーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン形成および組織の特定化において重要な機能を果たし、脂肪形成、筋形成、軟骨形成、心発生、造血、神経形成および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を与え得る。ＴＧＦβファミリーのメンバーの活性を操作することによって、多くの場合、生物体における顕著な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ウシ品種のピエモンテ・ブルーおよびベルジャン・ブルーは、筋肉量の著しい増加を引き起こすＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子における機能欠失突然変異を持つ。Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９７，  １７（１）：７１−４。同様に、ヒトにおいて、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子は、筋肉量の増加、および報告によれば非常に優れた強度と関連する。Ｓｃｈｕｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４，  ３５０：２６８２−８。
【００３１】
ＴＧＦβのシグナルは、Ｉ型（例えば、ＴβＲＩ）およびＩＩ型（例えば、ＴβＲＩＩ）のセリン／トレオニンキナーゼ受容体の異種複合体によって媒介され、リガンド刺激の際に下流のＳＭＡＤタンパク質をリン酸化および活性化する（Ｍａｓｓａｇｕｅ，  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １：１６９−１７８）。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／トレオニン特異性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達のために必須であり、ＩＩ型受容体は、リガンドと結合するため、およびＩ型受容体の発現のために必要である。Ｉ型およびＩＩ型受容体は、リガンドと結合した後、安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。ＴＧＦβは、ｉｎ  ｖｉｖｏでそれぞれ明確に異なる機能を有するＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の３つの哺乳動物のアイソフォームを有する。ＴＧＦβのＴβＲＩＩへの結合は、ＴＧＦβのシグナル伝達経路の活性化の開始、ＳＭＡＤ２のリン酸化の主導、および遺伝子発現を調節するための活性化されたＳＭＡＤ２／ＳＭＡＤ４複合体の核への移行における重要なステップである。
【００３２】
したがって、ある特定の態様では、本開示は、様々なＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３関連障害の処置における使用のための、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３のアンタゴニストとしてのＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。任意の特定の作用機構に拘束されることを望まないが、このようなポリペプチドは、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３に結合することによって、および３つのシグナル伝達複合体を形成するこれらのリガンドの能力を阻害することによって、作用すると予想される。
【００３３】
本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび異種部分（例えば、Ｆｃ部分）を含む融合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分および異種部分は、リンカーによって融合される。下記により詳細に記載するように、本開示は、ある特定の長さのリンカー（例えば、２１アミノ酸を有するリンカー）を含むＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、驚くべきことに、４アミノ酸のみのリンカーを有するＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質よりも強い親和性で、ＴＧＦβ−１およびＴＧＦβ−３に結合することが可能であったことを実証する。
【００３４】
本明細書において実証されるように、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する可溶性のＴβＲＩＩポリペプチドは、異所性骨化（ＨＯ）のマウスモデルにおいて、骨沈着および骨髄腔の形成の減少を伴うＨＯ原基の発生の大幅な減弱に有効である。さらにまた、ＴβＲＩＩポリペプチドによる処置は、この動物モデルにおいて、成熟ＨＯの体積を顕著に低減した。任意の特定の機構に拘束されることを望まないが、ＴβＲＩＩポリペプチドの効果は、ＴＧＦβのシグナル伝達のアンタゴニスト効果、特に、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３のシグナル伝達のアンタゴニスト効果によって主に引き起こされると予想される。機構に関わらず、本明細書に提示されるデータから、ＴＧＦβシグナル伝達アンタゴニストが、ＨＯにおける骨沈着の重症度を低減することは明らかである。異所性骨化が動的であり、ＨＯを増加させる因子およびＨＯを減少させる因子のバランスに依存して変化することに留意しなければならない。ＨＯは、ＨＯを低減させる因子の増加、ＨＯを増加させる因子の減少、または両方によって、減少し得る。したがって、ＨＯを減少する（低減する）という用語は、骨沈着における観察可能な物理的変化を指し、変化が起こる機構に関して中立であることが意図される。
【００３５】
本明細書に記載の研究において使用されるＨＯのための動物モデルは、ヒトにおける有効性を叙述すると考えられ、したがって、本開示は、ＨＯを処置するためにＴＧＦβシグナル伝達アンタゴニストを使用するための方法、特に、ヒトにおいて、１つまたは複数のＨＯの合併症の重症度または期間を予防または低減するための方法を提供する。本明細書に開示されるように、ＴＧＦβアンタゴニストという用語は、例えば、１つまたは複数のＴＧＦβリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３］を阻害するアンタゴニスト；１つまたは複数のＴＧＦβと相互作用するＩ型、ＩＩ型または共受容体（例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカン）を阻害するアンタゴニスト；ならびに１つまたは複数の下流のシグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および３などのＳｍａｄタンパク質）を阻害するアンタゴニストを含む、ＴＧＦβシグナル伝達をアンタゴナイズするために使用され得る種々の薬剤を指す。本開示の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストは、種々の形態、例えば、リガンドトラップ（例えば、可溶性ＴβＲＩＩポリペプチドおよびベータグリカンポリペプチド）、抗体アンタゴニスト（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩおよびベータグリカンの１つまたは複数を阻害する抗体）、低分子アンタゴニスト［例えば、１つまたは複数のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）の１つまたは複数を阻害する低分子］、およびヌクレオチドアンタゴニスト［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）の１つまたは複数を阻害するヌクレオチド配列］を含む。
【００３６】
本明細書において使用される用語は、一般に、本発明の文脈内およびそれぞれの用語が使用される特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。ある特定の用語は、本発明の組成物および方法、ならびにこれらを作成および使用する方法の記載において、技術者に追加的な指針を提供するために、下記で、または本明細書の他の箇所で議論される。用語の任意の使用の範囲または意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかであろう。
【００３７】
「相同」とは、すべてのその文法的形態および綴りの変化において、「共通の進化上の起源」を持つ２つのタンパク質の間の関係を指し、同じ生物種におけるスーパーファミリー由来のタンパク質、および異なる生物種由来の相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれらのコード核酸）は、同一性パーセントの用語に関わらず、それらの配列類似性を反映するか、または特定の残基またはモチーフおよび保存位置の存在を反映する、配列相同性を有する。
【００３８】
「配列類似性」という用語は、すべてのその文法的形態において、共通の進化上の起源を共有していてもよく、または共有していなくてもよい核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または対応の程度を指す。しかしながら、通常の用法および本出願において、「相同」という用語は、「高い」などの副詞で修飾される場合、配列類似性を指してもよく、共通の進化上の起源に関連していてもよく、または関連していなくてもよい。
【００３９】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関する「配列同一性パーセント（％）」または「同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントさせ、必要により、最大配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列中のアミノ酸残基（または核酸）と同一である候補配列中のアミノ酸残基（または核酸）のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、当技術分野の技量内の様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書における目的のために、しかしながら、アミノ酸（核酸）配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザー文書とともに提出されており、そこで、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から公に利用可能であり、またはソースコードからコンパイルされてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムにおける使用のためにコンパイルされなければならない。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化させない。
【００４０】
「アゴナイズする」とは、すべてのその文法的形態において、タンパク質および／または遺伝子を（例えば、タンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによって、または不活性のタンパク質を活性状態となるように誘導することによって）活性化するプロセス、あるいはタンパク質および／または遺伝子の活性を増加させるプロセスを指す。
【００４１】
「アンタゴナイズする」とは、すべてのその文法的形態において、タンパク質および／または遺伝子を（例えば、タンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは減少させることによって、または活性のタンパク質を不活性状態となるように誘導することによって）阻害するプロセス、あるいはタンパク質および／または遺伝子の活性を減少させるプロセスを指す。
【００４２】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって数値に関して使用される「約」および「およそ」という用語は、当業者によく知られ、許容される精度区間を意味する。
【００４３】
本明細書に開示される数値範囲は、範囲を規定する数を含む。
【００４４】
「ａ」および「ａｎ」という用語は、この用語が使用される文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の対象物を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において、互換可能に使用することができる。さらにまた、本明細書において使用される「および／または」は、他のものを伴うか、もしくは伴わない、２つまたはそれよりも多くの特定の特徴または成分のそれぞれの特定の開示とすべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００４５】
本明細書全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、言及された整数または整数の群の包含という意味を含むが、任意の他の整数または整数の群の除外という意味を含まないことが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、より狭い「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語の使用も包含する。
【００４６】
「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、特定の材料またはステップ、および本明細書に開示される本発明の基本および新規の特性に著しく影響を与えないものに限定される。
【００４７】
本明細書で使用される「認識可能な親和性」という用語は、５０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）での結合を意味する。
【００４８】
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書において互換可能に使用される。鎖は、直鎖状または分岐状であってもよく、これは、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、および／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、天然で、または介入によって修飾されたアミノ酸鎖も包含し；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションなど。また、この定義内には、例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）および当技術分野において公知の他の修飾を含有する、ポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、一本鎖または会合鎖として存在し得ることが理解される。
２．ＴＧＦβアンタゴニスト  
【００４９】
本明細書に開示されるように、ＴＧＦβアンタゴニストという用語は、例えば、１つまたは複数のＴＧＦβリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３］を阻害するアンタゴニスト；１つまたは複数のＴＧＦβと相互作用するＩ型、ＩＩ型または共受容体（例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカン）を阻害するアンタゴニスト；ならびに１つまたは複数の下流のシグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および３などのＳｍａｄタンパク質）を阻害するアンタゴニストを含む、ＴＧＦβが媒介するシグナル伝達をアンタゴナイズするために使用され得る種々の薬剤を指す。本開示の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストは、種々の形態、例えば、リガンドトラップ（例えば、可溶性ＴβＲＩＩポリペプチドおよびベータグリカンポリペプチド）、抗体アンタゴニスト（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩおよびベータグリカンの１つまたは複数を阻害する抗体）、低分子アンタゴニスト［例えば、１つまたは複数のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）の１つまたは複数を阻害する低分子］、およびヌクレオチドアンタゴニスト［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）の１つまたは複数を阻害するヌクレオチド配列］を含む。
Ａ．ＴβＲＩＩポリペプチドおよびベータグリカンポリペプチド
【００５０】
天然に存在するＴβＲＩＩタンパク質は、細胞の外側に位置するタンパク質の部分（細胞外部分）および細胞の内側に位置するタンパク質の部分（細胞内部分）を有する膜貫通タンパク質である。本開示の態様は、ＴβＲＩＩの細胞外ドメイン内の突然変異、および／またはＴβＲＩＩの細胞外ドメインの切断された部分を含むバリアントＴβＲＩＩポリペプチドを包含する。上記に記載するように、ヒトＴβＲＩＩは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）における選択的スプライシングによって生じた、Ａ（長い）およびＢ（短い）の少なくとも２つのアイソフォームで天然に存在する（図１および２、配列番号１および２）。配列番号１の残基２３〜１５９に対応する配列番号２７は、ＴβＲＩＩの天然の全長細胞外ドメインの短いアイソフォームを表す。配列番号２の残基２３〜１８４に対応する配列番号１８は、ＴβＲＩＩの天然の全長細胞外ドメインの長いアイソフォームを表す。他に言及されない限り、ＴβＲＩＩの短いアイソフォームおよび長いアイソフォームに基づくバリアントに関するアミノ酸位置の番号付けは、それぞれ、天然前駆体の配列番号１および配列番号２における対応する位置を指す。
【００５１】
ある特定の実施形態では、本開示は、バリアントＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。本開示のＴβＲＩＩポリペプチドは、限定されるものではないが、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３などのＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーと結合し得、これらの機能を阻害し得る。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの切断ＥＣＤドメインと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、必要に応じて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなるか、またはこれらのアミノ酸配列を含み、そのＣ末端が、配列番号１のアミノ酸１５３〜１５９のいずれかに存在する、ポリペプチドを含み得る。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの切断ＥＣＤドメインと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、必要に応じて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなるか、またはこれらのアミノ酸配列を含み、そのＣ末端が、配列番号２のアミノ酸１７８〜１８４のいずれかに存在する、ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、必要に応じて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。必要に応じて、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７からなる配列から、または配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２からなる配列から、５より多くの連続したアミノ酸、あるいは１０、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくは２００またはそれよりも多くの連続したアミノ酸を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２２および１６０〜５６７を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２および１８５〜５９２を含まない。プロセシングされていないＴβＲＩＩポリペプチドは、任意のシグナル配列、および任意のＮ末端からシグナル配列への配列を、含むか、または除かれているかのいずれかであり得る。本明細書で詳細に述べるように、成熟（プロセシングされた）ＴβＲＩＩポリペプチドのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸２３〜３５または配列番号２のアミノ酸２３〜６０のいずれかに存在し得る。成熟ＴβＲＩＩポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、配列番号１のアミノ酸２３〜１５９（配列番号２７に記述）、��列番号１のアミノ酸２９〜１５９（配列番号２８に記述）、配列番号１のアミノ酸３５〜１５９（配列番号２９に記述）、配列番号１のアミノ酸２３〜１５３（配列番号３０に記述）、配列番号１のアミノ酸２９〜１５３（配列番号３１に記述）、配列番号１のアミノ酸３５〜１５３（配列番号３２に記述）、配列番号２のアミノ酸２３〜１８４（配列番号１８に記述）、配列番号２のアミノ酸２９〜１８４（配列番号３３に記述）、配列番号２のアミノ酸６０〜１８４（配列番号２９に記述）、配列番号２のアミノ酸２３〜１７８（配列番号３４に記述）、配列番号２のアミノ酸２９〜１７８（配列番号３５に記述）、および配列番号２のアミノ酸６０〜１７８（配列番号３２に記述）が挙げられる。ＴβＲＩＩの長いアイソフォームに基づく対応するバリアントが、挿入に隣接するＣ末端位で保存的なＶａｌ−Ｉｌｅ置換とともに２５アミノ酸挿入をコードするヌクレオチド配列を含むことは当業者によって理解される。したがって、ＴβＲＩＩポリペプチドは、単離されたＴβＲＩＩポリペプチドの細胞外部分を含んでいてもよく、これは、短いアイソフォームおよび長いアイソフォームの両方、これらのバリアント（例えば、配列番号１のアミノ酸２３〜１５９または配列番号２のアミノ酸２３〜１８４に対応する配列中に、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５以下のアミノ酸置換を含むバリアントを含む）、これらの断片、および前述のいずれかを含む融合タンパク質を含むが、それぞれの場合において、好ましくは、前述のＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかは、ＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３の少なくとも１つまたは両方について実質的に親和性を維持する。一般に、ＴβＲＩＩポリペプチドは、生物学的に関連する温度、ｐＨレベルおよびオスモル濃度で、水溶液に可溶性であるように設計される。
【００５２】
一部の実施形態では、本開示のバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、変更されたリガンド結合プロファイルを付与する１つまたは複数の突然変異を細胞外ドメイン中に含む。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの対応する部分に対して、アミノ酸配列中に１つ、２つ、５つまたはそれよりも多くの変更を含んでいてもよい。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の７０位に対応する位置で、置換、挿入または欠失をもたらす。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の１１０位に対応する位置で、置換、挿入または欠失をもたらす。例としては、限定されるものではないが、配列番号１のそれぞれ７０位および１１０位に対応する位置における、ＮからＤへの置換、またはＤからＫへの置換が挙げられる。このようなバリアントＴβＲＩＩポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、配列番号３６〜３９に記述される配列が挙げられる。ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６もしくは４７、またはこれらのサイレントバリアント、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの相補体とハイブリダイズする核酸のいずれか１つによってコードされる、ポリペプチドまたはその部分を含んでいてもよい。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１２、またはこのサイレントバリアント、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの相補体とハイブリダイズする核酸のいずれか１つによってコードされる、ポリペプチドまたはその部分を含んでいてもよい。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示のバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、ヒトＴβＲＩＩアイソフォームＣにおいて天然に存在するように（Ｋｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：３１８，  ２００７）、ヒトＴβＲＩＩ  ＥＣＤのＣ末端の近くに位置するグルタミン酸残基の対（配列番号１の１５１位および１５２位、または配列番号２の１７６位および１７７位）の間の３６アミノ酸（配列番号４１）の挿入をさらに含む。
【００５４】
ＴβＲＩＩポリペプチドが、ＴβＲＩＩリガンドを選択的にアンタゴナイズするように改変され得ることが実証されている。Ｎ７０残基は、可能性があるグリコシル化部位を表す。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、グリコシル化されていない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、グリコシル化されていないか、またはＡｓｎ１５７位でのグリコシル化が低減されている。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、グリコシル化されていないか、またはＡｓｎ７３位でのグリコシル化が低減されている。
【００５５】
ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドはＴＧＦβ１に結合し、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３への実質的な結合を示さない。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドはＴＧＦβ３に結合し、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１への実質的な結合を示さない。結合は、溶液中、またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどの表面プラズモン共鳴システムにおいて、精製されたタンパク質を使用して評価され得る。
【００５６】
ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１細胞内シグナル伝達を阻害し、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３シグナル伝達に対する中程度または限定的な阻害効果を有する。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３細胞内シグナル伝達を阻害し、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１シグナル伝達に対する中程度または限定的な阻害効果を有する。細胞シグナル伝達に対する阻害効果は、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
【００５７】
これらを基に、ＴβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号１のアミノ酸配列２３〜１５３、２３〜１５４、２３〜１５５、２３〜１５６、２３〜１５７または２３〜１５８、および配列番号１のアミノ酸２４〜３５のいずれかで開始するこれらの配列のバリアントを含んでいてもよい。同様に、ＴβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号２のアミノ酸配列２３〜１７８、２３〜１７９、２３〜１８０、２３〜１８１、２３〜１８２または２３〜１８３、および配列番号２のアミノ酸２４〜６０のいずれかで開始するこれらの配列のバリアントを含んでいてもよい。例示的なＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列２９〜１５９、３５〜１５９、２３〜１５３、２９〜１５３および３５〜１５３、または配列番号２のアミノ酸配列２９〜１８４、６０〜１８４、２３〜１７８、２９〜１７８および６０〜１７８を含む。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号１または配列番号２の対応する部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するものも企図される。配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７または配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２からなる配列を含まないＴβＲＩＩポリペプチドが選択されてもよい。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、必要に応じて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
「ベータグリカンポリペプチド」という用語は、任意の天然に存在するベータグリカンタンパク質（ＴＧＦＢＲ３、またはその非ヒトオルソログの１つによってコードされる）、および有用な活性を維持した任意のこれらのバリアント（突然変異体、断片、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。
【００５９】
ヒトベータグリカンのアイソフォームＡの前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３２３４．２）は以下の通りである。
【化１】
2021512919.tif 000002
【００６０】
シグナルペプチドは一重下線によって示され、細胞外ドメインは太字フォントで示され、膜貫通ドメインは点線下線によって示される。このアイソフォームは、二重下線によって上記で示された単一のアラニンの挿入によって、ベータグリカンのアイソフォームＢと異なる。
【００６１】
プロセシングされたベータグリカンのアイソフォームＡのポリペプチド配列は以下の通りである。
【化２】
2021512919.tif 000003
【化３】
2021512919.tif 000004
【００６２】
ヒトベータグリカンのアイソフォームＡのプロセシングされていない前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号５２）、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００３２４３．４のヌクレオチド５１６〜３０６８に対応する。シグナル配列は実線下線によって示され、膜貫通領域は点線下線によって示される。
【化４】
2021512919.tif 000005
【化５】
2021512919.tif 000006
【００６３】
プロセシングされたベータグリカンのアイソフォームＡの細胞外ドメインをコードする核酸配列を下記に示す（配列番号５３）。
【化６】
2021512919.tif 000007
【００６４】
ヒトベータグリカンのアイソフォームＢの前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１８２６１２．１）は以下の通りである。
【化７】
2021512919.tif 000008
【００６５】
シグナルペプチドは一重下線によって示され、細胞外ドメインは太字フォントで示され、膜貫通ドメインは点線下線によって示される。
【００６６】
プロセシングされたベータグリカンのアイソフォームＢのポリペプチド配列は以下の通りである。
【化８】
2021512919.tif 000009
【００６７】
ヒトベータグリカンのアイソフォームＢのプロセシングされていない前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号５６）、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９５６８３．１のヌクレオチド５１６〜３０６５に対応する。シグナル配列は実線下線によって示され、膜貫通領域は点線下線によって示される。
【化９】
2021512919.tif 000010
【００６８】
プロセシングされたベータグリカンのアイソフォームＢの細胞外ドメインをコードする核酸配列を下記に示す（配列番号５７）。
【化１０】
2021512919.tif 000011
【化１１】
2021512919.tif 000012
【００６９】
ある特定の実施形態では、本開示は、断片、機能的バリアント、およびこれらの改変形態を含む、ベータグリカンポリペプチドに関する。好ましくは、本開示の発明による使用のためのベータグリカンポリペプチドは可溶性である（例えば、ベータグリカンの細胞外ドメインを含む）。他の好ましい実施形態では、本開示の発明による使用のためのベータグリカンポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦベータスーパーファミリーのリガンドと結合し、および／またはこれらの活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する（アンタゴナイズする）。一部の実施形態では、ベータグリカンポリペプチドは、配列番号５０、５１、５４または５５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ベータグリカンポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２１〜２８のいずれか１つで開始し、配列番号５０のアミノ酸３８１〜７８７のいずれか１つで終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２１〜３８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２１〜７８７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２８〜３８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２８〜７８７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２１〜７８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２８〜７８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２１〜２８のいずれか１つで開始し、配列番号５４のアミノ酸３８０〜７８６のいずれか１つで終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２１〜３８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２１〜７８６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２８〜３８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２８〜７８６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２１〜７８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２８〜７８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２１〜２８のいずれか１つで開始し、配列番号５０のアミノ酸７３０〜７８７のいずれか１つで終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２１〜７８７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２８〜７３０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２１〜２８のいずれか１つで開始し、配列番号５０のアミノ酸７３０〜７８７のいずれか１つで終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２１〜７８７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸２８〜７３０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、２１〜２８のアミノ酸（例えば、配列番号５４のアミノ酸残基）のいずれか１つで開始し、配列番号５４のアミノ酸７３０〜７８７のいずれか１つで終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２１〜７８６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸２８〜７２９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドで構成される。
【００７０】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ５ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ５」という用語は、任意の種由来のアクチビン受容体様キナーゼ−５タンパク質のファミリー、および突然変異誘発または他の改変によるそのようなＡＬＫ４タンパク質に由来するバリアントを指す。本明細書におけるＡＬＫ５への言及は、現在特定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡＬＫ５ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通タンパク質である。
【００７１】
「ＡＬＫ５ポリペプチド」という用語は、任意の天然に存在するＡＬＫ５のポリペプチドのファミリーのメンバー、および有用な活性を維持した任意のこれらのバリアント（突然変異体、断片、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。
【００７２】
ヒトＡＬＫ５の前駆体タンパク質のアイソフォーム１配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４６０３．１）は以下の通りである。
【化１２】
2021512919.tif 000013
【００７３】
シグナルペプチドは一重下線によって示され、細胞外ドメインは太字フォントで示される。
【００７４】
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチド配列は以下の通りである。
【化１３】
2021512919.tif 000014
【００７５】
ＡＬＫ５前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号３２）、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４６１２．２のヌクレオチド７７〜１５８５に対      
【００７６】
【化１４】
2021512919.tif 000015
【化１５】
2021512919.tif 000016
【００７７】
細胞外ヒトＡＬＫ５ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである。
【化１６】
2021512919.tif 000017
【００７８】
ヒトＡＬＫ５の前駆体タンパク質配列のアイソフォーム２の代替アイソフォーム（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５２５２２０７．１）は以下の通りである。
【化１７】
2021512919.tif 000018
【００７９】
シグナルペプチドは一重下線によって示され、細胞外ドメインは太字フォントで示される。
【００８０】
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチド配列（アイソフォーム２）は以下の通りである。
【化１８】
2021512919.tif 000019
【００８１】
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号７５）、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＸＭ＿００５２５２１５０．１のヌクレオチド７７〜１５９７に対応する。シグナル配列は下線が付され、細胞外ドメインは太字フォントで示される。
【化１９】
2021512919.tif 000020
【００８２】
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチドをコードする核酸配列は以下の通りである。
【化２０】
2021512919.tif 000021
【００８３】
ある特定の実施形態では、本開示は、断片、機能的バリアント、およびこれらの改変形態を含む、少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関する。好ましくは、本開示による使用のためのＡＬＫ５ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ５ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびその使用）は可溶性である（例えば、ＡＬＫ５の細胞外ドメイン）。他の好ましい実施形態では、本開示による使用のためのＡＬＫ５ポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦベータスーパーファミリーのリガンドと結合し、および／またはこれらの活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する（アンタゴナイズする）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号６９、７０、７３または７４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号６９のアミノ酸２５〜３６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６）で開始し、配列番号６９のアミノ酸１０１〜１２６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５または１２６）で終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号６９のアミノ酸２５〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号６９のアミノ酸２５〜１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号６９のアミノ酸３６〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号６９のアミノ酸３６〜１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号７３のアミノ酸２５〜３６のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６）で開始し、配列番号７３のアミノ酸１０１〜１３０のいずれか１つ（例えば、アミノ酸残基１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９または１３０）で終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号７３のアミノ酸２５〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号７３のアミノ酸２５〜１３０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号７３のアミノ酸３６〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号７３のアミノ酸３６〜１３０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。
【００８４】
上記に記載するように、本開示は、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチドと特定の程度の配列同一性または類似性を共有する、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチドを提供する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のためにアラインメントされる（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の１つまたは両方に導入することができ、非相同配列は、比較の目的のために無視することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置でのアミノ酸残基が比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置で同じアミノ酸残基によって占められる場合、その結果、分子はその位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸「同一性」はアミノ酸「相同性」と等価である）。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００８５】
配列の比較、ならびに２つの配列の間の同一性および類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１）を使用して達成することができる。
【００８６】
一実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （４８）：４４４−４５３  （１９７０））のアルゴリズムを使用して決定される。詳細な実施形態では、以下のパラメーターがＧＡＰプログラムにおいて使用される：Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびにギャップの重みが１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さの重みが１、２、３、４、５または６。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２（１）：３８７  （１９８４））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムを使用して決定される。例示的なパラメーターは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびにギャップの重みが４０、５０、６０、７０または８０、および長さの重みが１、２、３、４、５または６を使用することを含む。他に規定のない限り、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列、ＧＡＰの重みが１０および長さの重みが３を使用するＧＡＰプログラムを使用して決定されるべきであり、このようなアルゴリズムが所望の同一性パーセントをコンピュータで計算できない場合、本明細書に開示される好適な代替を選択すべきである。
【００８７】
別の実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０の重みの残余テーブル、ギャップ長さペナルティが１２およびギャップペナルティが４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ．  ＭｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，  ４：１１−１７  （１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される。
【００８８】
２つのアミノ酸配列の間の最良の全体的なアラインメントを決定するための別の実施形態は、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ６：２３７−２４５  （１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリーおよび対象の配列は両方ともアミノ酸配列である。前記網羅的配列アラインメントの結果は、同一性パーセントに関して提示される。一実施形態では、アミノ酸配列同一性は、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ６：２３７−２４５  （１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して行なわれる。詳細な実施形態では、アミノ酸アラインメントの同一性および類似性パーセントを計算するために用いられるパラメーターは、行列＝ＰＡＭ  １５０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、連結ペナルティ＝２０、ランダム化群の長さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５およびギャップサイズペナルティ＝０．０５を含む。
【００８９】
本開示のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）は、Ｎ末端で様々なリーダー配列のいずれかを追加で含んでいてもよい。このような配列は、ペプチドが、真核系において発現し、分泌経路を標的にすることを可能にするであろう。例えば、Ｅｒｎｓｔら、米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２年）を参照されたい。あるいは、天然のシグナル配列（例えば、天然のＴβＲＩＩまたはベータグリカンのシグナル配列）は、細胞からの放出を生じさせるために使用されてもよい。可能なリーダー配列は、天然のリーダー、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）およびミツバチのメリチン（それぞれ、配列番号２２〜２４）を含む。ＴＰＡリーダー配列が組み込まれるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の例としては、配列番号１１、１３、１５および１７が挙げられる。シグナルペプチドのプロセシングは、他の変数の中で、選択されるリーダー配列、使用される細胞型および培養条件に応じて変化し得、したがって、成熟ポリペプチドのための実際のＮ末端開始部位は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかの方向で、１、２、３、４または５アミノ酸までシフトし得る。ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の例としては、配列番号１１、１３、１５および１７が挙げられる。ＴβＲＩＩの長いアイソフォームに基づく対応するバリアントが、挿入に隣接するＣ末端位で保存的なＶａｌ−Ｉｌｅ置換とともに２５アミノ酸挿入を含むことは当業者によって理解される。
【００９０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるいずれかのＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるが、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のＮ末端アミノ酸が欠如している。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のいずれか１つの１番目のアミノ酸（トレオニン）に対応するアミノ酸が欠如している。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のいずれか１つの１番目および２番目のアミノ酸（それぞれ、トレオニンおよびイソロイシン）に対応するアミノ酸が欠如している。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のいずれか１つの１番目、２番目および３番目のアミノ酸（それぞれ、トレオニン、イソロイシンおよびプロリン）に対応するアミノ酸が欠如している。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のいずれか１つの１番目、２番目、３番目および４番目のアミノ酸（それぞれ、トレオニン、イソロイシン、プロリン、プロリン）に対応するアミノ酸が欠如している。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるいずれかのＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８または４８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるが、配列番号１８または４８のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のＮ末端アミノ酸が欠如している。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８または４８のいずれか１つの１番目および２番目のアミノ酸（それぞれ、トレオニンおよびイソロイシン）に対応するアミノ酸が欠如している。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８または４８の１番目、２番目および３番目のアミノ酸（それぞれ、トレオニン、イソロイシンおよびプロリン）に対応するアミノ酸が欠如している。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８または４８の１番目、２番目、３番目および４番目のアミノ酸（それぞれ、トレオニン、イソロイシン、プロリン、プロリン）に対応するアミノ酸が欠如している。
【００９２】
一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドの混合物を含む組成物であって、組成物中のＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列をそれぞれ含むが、組成物中のＴβＲＩＩポリペプチドの少なくとも一部分（例えば、少なくとも１％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％）が、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のいずれか１つの１番目、２番目、３番目および４番目のアミノ酸（それぞれ、トレオニン、イソロイシン、プロリンおよびプロリン）に対応するアミノ酸を含み；組成物中のＴβＲＩＩポリペプチドの少なくとも一部分（例えば、少なくとも１％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％）が、配列番号１８、２０、２７、３０、３４、３６、３７、３８、３９または４８のいずれか１つの１番目、２番目、３番目および４番目のアミノ酸（それぞれ、トレオニン、イソロイシン、プロリンおよびプロリン）に対応するアミノ酸の１つまたは複数を欠如している、組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドの混合物を含む組成物であって、ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１８または４８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるが、組成物中のＴβＲＩＩポリペプチドの少なくとも３０％〜８０％が、配列番号１８または４８の１番目のアミノ酸（トレオニン）に対応するアミノ酸を欠如している、組成物を提供する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号６３〜６８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一である。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一である。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するように、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）の特定の突然変異を企図する。このような突然変異は、Ｏ連結もしくはＮ連結グリコシル化部位などの１つまたは複数のグリコシル化部位を導入あるいは取り除くように、選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞内グリコシル化酵素によって特異的に認識される、トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−トレオニン（または、アスパラギン−Ｘ−セリン）（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。変更はまた、（Ｏ連結グリコシル化部位のための）野生型ポリペプチドの配列への１つもしくは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加あるいは置換によって行なわれてもよい。グリコシル化認識部位の１番目もしくは３番目のアミノ酸位置の１つまたは両方での種々のアミノ酸置換または欠失（および／または２番目の位置でのアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列で非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的または酵素的カップリングによる。使用されるカップリングの様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着し得る。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、１９８７年９月１１日に公開された国際公開第８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ  （１９８１）  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｐｐ．  ２５９−３０６に記載されている。ポリペプチドに存在する１つまたは複数の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、例えば、ポリペプチドのトリフルオロメタンスルホン酸化合物または等価な化合物への曝露を含み得る。この処理は、連結されている糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖の切断をもたらすが、アミノ酸配列は無傷なままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９：５２およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８：１３１によってさらに記載されている。ポリペプチドにおける糖質部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３８：３５０による記載の種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞が、すべて、ペプチドのアミノ酸配列に影響を与え得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るので、ポリペプチドの配列は、必要により、使用される発現系の種類に応じて調整��れてもよい。一般に、ヒトにおける使用のためのポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞系、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞系で発現するが、他の哺乳動物発現細胞系、操作されたグリコシル化酵素を有する酵母細胞系および昆虫細胞も同様に有用であると予想される。
【００９４】
本開示は、突然変異体、特に、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）のコンビナトリアル突然変異体のセット、ならびに切断型突然変異体を作製する方法をさらに企図し、コンビナトリアル突然変異体のプールは、機能的バリアント配列を特定するために特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとして作用し得るか、あるいはすべて一緒になって新規の活性を持つ、ポリペプチドバリアントを作製することであり得る。種々のスクリーニングアッセイを下記に提供し、このようなアッセイは、バリアントを評価するために使用され得る。例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドバリアントは、ＴβＲＩＩリガンドに結合する能力、ＴβＲＩＩリガンドのＴβＲＩＩポリペプチドへの結合を予防する能力、またはＴβＲＩＩリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を干渉する能力についてスクリーニングされてもよい。ＴβＲＩＩポリペプチドまたはそのバリアントの活性はまた、細胞に基づくアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、特に実施例に開示されるいずれかのアッセイで試験され得る。
【００９５】
天然に存在するポリペプチドの細胞外ドメインを含むポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）に対する選択性または一般に増加した効力を有するコンビナトリアル誘導バリアントを作製することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ポリペプチドと劇的に異なる血清半減期を有するバリアントを生じさせることができる。例えば、変更されたタンパク質は、天然ＴβＲＩＩポリペプチドの破壊、またはそうでなければ除外または不活性化をもたらす、タンパク質分解または他のプロセスに対して、より安定またはより不安定のいずれかにすることができる。このようなバリアント、およびこれらをコードする遺伝子は、ＴβＲＩＩポリペプチドの半減期を調節することによって、ＴβＲＩＩポリペプチドのレベルを変更するために利用することができる。例えば、短い半減期は、より一時的な生物学的効果を生じさせることができ、患者内での組換えポリペプチドのレベルのより厳密な制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質中では、突然変異を、リンカー（もしあれば）および／またはＦｃ部分中に生じさせて、タンパク質の半減期を変更することができる。
【００９６】
コンビナトリアルライブラリーは、可能性があるポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）配列の少なくとも一部分をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーの手段で生成してもよい。例えば、可能性があるポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいはより大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ用）のセットとして、発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲートすることができる。
【００９７】
可能性があるポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）バリアントのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができる、多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で行なうことができ、次いで、合成遺伝子を発現用の適切なベクターにライゲートすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，  ＳＡ  （１９８３）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；  Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８１）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐｒｏｃ．  ３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ｅｄ．  ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １１：４７７を参照されたい）。このような技術は、他のタンパク質の指向進化において用いられている（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：  ４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：  ６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，１９８，３４６号および米国特許第５，０９６，８１５号を参照されたい）。
【００９８】
あるいは、他の形態の突然変異誘発を利用して、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。例えば、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）バリアントは、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発など（Ｒｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）を使用してスクリーニングすることにより；リンカースキャニング突然変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）により；飽和突然変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）により；ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）により；または化学的突然変異誘発等を含むランダム突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）により、作製およびライブラリーから単離することができる。リンカースキャニング突然変異誘発は、特に、コンビナトリアル条件では、ポリペプチドの切断（生体活性）型を特定するための魅力的な方法である。
【００９９】
広範囲の技術が、点突然変異および切断により作られたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするために、さらに言えば、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、当技術分野で公知である。このような技術は、一般に、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）のコンビナトリアル突然変異誘発により作製される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクターにクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出が、生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。好ましいアッセイとしては、リガンド結合アッセイおよびリガンド媒介細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。
【０１００】
ある特定の実施形態では、本開示のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）は、天然ポリペプチド中に天然に存在する任意のものに加えて、翻訳後修飾をさらに含んでいてもよい。このような修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ペグ化（ポリエチレングリコール）およびアシル化が挙げられる。結果として、修飾されたポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、モノサッカリドまたはポリサッカリド、およびホスフェートなどの非アミノ酸要素を含有し得る。ポリペプチドの機能性に対するこのような非アミノ酸要素の効果は、他のポリペプチドバリアントについて、本明細書に記載するようにして試験され得る。ポリペプチドが、ポリペプチドの新生型を切断することによって細胞中で生成される場合、翻訳後プロセシングも、タンパク質の適正なフォールディングおよび／または機能のために重要であり得る。異なる細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３など）は、このような翻訳後の活性に関する特異的な細胞内の仕組みおよび特徴的機構を有し、ポリペプチドの適正な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０１０１】
ある特定の態様では、本開示は、融合タンパク質（例えば、ＴβＲＩＩ融合タンパク質またはベータグリカン融合タンパク質）を提供し、一部の実施形態では、第１の部分（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド部分またはベータグリカンポリペプチド部分）は、リンカーによって異種部分（例えば、Ｆｃ部分）と接続される。一部の実施形態では、リンカーはグリシンおよびセリンリッチリンカーである。他の中性に近いアミノ酸、例えば、限定されるものではないが、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＰｒｏおよびＡｌａもリンカー配列中で使用され得る。一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の様々な順列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長より大きい。さらなる実施形態では、リンカーは、少なくとも１２、１５、２０、２１、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、リンカーは、４０、３５、３０、２５、２２または２０アミノ酸未満である。一部の実施形態では、リンカーは、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２１、１０〜１５、１０、１５〜２５、１７〜２２、２０または２１アミノ酸長である。一部の好ましい実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１９）、またはその反復の（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ≧２）を含む。特定の実施形態では、ｎ≧３またはｎ＝３〜１０である。本出願は、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーによって一緒に融合したＴβＲＩＩ部分および異種部分を含むタンパク質が、ｎ＜４の場合のＴβＲＩＩ融合タンパク質と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対してより強い親和性で会合するという驚くべき知見を教示する。このため、好ましい実施形態では、ｎ≧４またはｎ＝４〜１０である。本出願は、ｎ＞４である（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーを含むタンパク質が、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーを有するタンパク質と同様の阻害特性を有していたことも教示する。このため、一部の実施形態では、ｎは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーにおいて、４を超えない。一部の実施形態では、ｎ＝４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜８、５〜７または５〜６である。一部の実施形態では、ｎ＝３、４、５、６または７である。特定の実施形態では、ｎ＝４である。一部の実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）ｎ配列を含むリンカーは、Ｎ末端トレオニンも含む。一部の実施形態では、リンカーは、以下のいずれか１つである。
【化２１】
2021512919.tif 000022
【０１０２】
一部の実施形態では、リンカーは、ＴＧＧＧＰＫＳＣＤＫ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｎ末端トレオニンが欠如した、配列番号２１、４〜７、２５〜２６または４０のいずれか１つである。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２６または４０のアミノ酸配列を含まない。
【０１０３】
ある特定の態様では、ＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）ポリペプチドの機能的バリアントまたは改変形態は、ＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）ポリペプチドの少なくとも一部分および１つまたは複数の異種部分を有する融合タンパク質を含む。このような異種部分の周知の例としては、限定されるものではないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが挙げられる。異種部分は、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、一部の異種部分は、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離のために特に有用である。アフィニティー精製の目的のためには、グルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、およびニッケルまたはコバルト結合樹脂などの、アフィニティークロマトグラフィー用の関連するマトリックスが使用される。このようなマトリックスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーを用いる有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」の形態で入手可能である。別の例としては、異種部分は、ＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）ポリペプチドの検出を容易にするために選択され得る。このような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、および特異的抗体が入手可能である通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能である周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。一部の場合では、異種部分は、Ｘａ因子またはトロンビンに対するものなどの、プロテアーゼ切断部位を有し、これは、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって融合タンパク質から組換えタンパク質を自由にすることを可能にする。次いで、自由になったタンパク質は、その後のクロマトグラフィー分離によって、異種部分から単離することができる。ある特定の好ましい実施形態では、ＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）ポリペプチドは、ＴβＲＩＩポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合される。「安定化する」とは、これが破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態効果によるものかに関わらず、血清半減期を増加させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質における望ましい薬物動態学的特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンとの融合は、望ましい特性を付与することができる。選択され得る異種部分の他の種類としては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能的ドメインが挙げられる。
【０１０４】
詳細な例として、本開示は、配列番号４９のＦｃドメイン配列に融合したＴβＲＩＩポリペプチドのバリアントを含む融合タンパク質を提供する。必要に応じて、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、Ｌｙｓ−３２２およびＡｓｎ−４３４（対応する全長ＩｇＧに従う番号付け）などの残基で１つまたは複数の突然変異を有する。ある特定の場合では、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５突然変異）を有する突然変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対して、Ｆｃγ受容体への結合能力が低減されている。他の場合では、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４突然変異）を有する突然変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能力が増加している。
【０１０５】
融合タンパク質の異なる要素は、所望の機能性と合致する任意の様式で配置されてもよいことが理解される。例えば、ＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）ポリペプチドは、異種ドメインに対してＣ末端に置かれてもよく、あるいは、異種ドメインは、ＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）ポリペプチドに対してＣ末端に置かれてもよい。ＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）ポリペプチドドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインのＣ末端もしくはＮ末端に、またはドメイン間に含まれていてもよい。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンＦｃドメイン」または単に「Ｆｃ」という用語は、免疫グロブリン鎖の定常領域のカルボキシル末端部分、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域またはこれらの部分を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つまたはそれよりも多くのドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域の組合せを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、好ましくは、ＣＨ１ドメインが欠如している。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域である。
【０１０７】
一実施形態では、重鎖定常領域の由来となる免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。
【０１０８】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）のために使用され得る天然アミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号５８）。点線下線はヒンジ領域を示し、実線下線は天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部分では、本開示は、配列番号５８と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおいて天然に存在するバリアントは、配列番号５８（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照されたい）において使用される番号付け体系によるＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう。
【化２２】
2021512919.tif 000023
【０１０９】
必要に応じて、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２およびＡｓｎ−４３４などの残基で１つまたは複数の突然変異を有する。ある特定の場合では、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５突然変異）を有する突然変異体ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対して、Ｆｃγ受容体への結合能力が低減されている。他の場合では、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４突然変異）を有する突然変異体Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインに対して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能力が増加している。
【０１１０】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）のために使用され得る天然アミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号５９）。点線下線はヒンジ領域を示し、二重下線は、配列中で矛盾するデータベースが存在する位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９による）。一部分では、本開示は、配列番号５９と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
【化２３】
2021512919.tif 000024
【０１１１】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）のために使用され得るアミノ酸配列の２つの例を下記に示す。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖の最大で４倍程度の長さであり得、類似の１７残基セグメントに先行する３つの同一の１５残基セグメントを含有する。下記に示す第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号６０）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有するが、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号６１）は全長ヒンジ領域を含有する。それぞれの場合で、点線下線はヒンジ領域を示し、実線下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９による天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部分では、本開示は、配列番号６０または６１と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
【化２４】
2021512919.tif 000025
【０１１２】
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在するバリアント（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照されたい）は、配列番号６０において使用される番号付け体系に変換される場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの１つまたは複数のバリエーションを含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジの長さによって特徴付けられる構造的多形を示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照されたい）。詳細には、バリアントＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域のすべてが欠如している。これは、ヒンジ領域中に通常存在する１１個に加えて、７位に余分な鎖間ジスルフィド結合を有する。バリアントＺＵＣは、大部分のＶ領域、ＣＨ１領域のすべて、およびヒンジの一部分が欠如する。バリアントＯＭＭは、対立遺伝子型または別のガンマ鎖サブクラスを表わし得る。本開示は、これらのバリアントの１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加の融合タンパク質を提供する。
【０１１３】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）のために使用され得る天然アミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号６２）。点線下線はヒンジ領域を示す。一部分では、本開示は、配列番号６２と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
【化２５】
2021512919.tif 000026
【０１１４】
Ｆｃドメイン中の種々の遺伝子操作された突然変異は、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号５８）に関して本明細書において提示され、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃ中の類似の突然変異は、図７におけるＧ１Ｆｃとのそれらのアラインメントから誘導することができる。不均一なヒンジ長に起因して、アイソタイプアラインメント（図７）に基づく類似のＦｃの位置は、配列番号５８、５９、６０、６１および６２中で異なるアミノ酸数を持つ。ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号５８、５９、６０、６１および６２）中の所与のアミノ酸位置は、番号付けが、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおけるように全ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）を包含する場合に、同じ位置とは異なる数字により特定されることも明らかであり得る。
【０１１５】
免疫グロブリンの他のクラスであるＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用してもよい。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および米国特許第５，７２６，０４４号において詳細に議論されている。特定の結果を達成するためのある特定の免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当技術分野における技量のレベル内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、少なくともヒンジドメインの部分を含み、好ましくは、ＦｃガンマのＣＨ３ドメイン、またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれか中の相同ドメインの少なくとも一部分を含む。
【０１１６】
さらにまた、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が、本明細書に開示される方法および組成物の実施において有用であり得ることが企図される。一例は、ＣＨ２領域の上部にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃ受容体に対する親和性が低減されたＦｃバリアントを作製することあろう（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５９：３６１３）。
【０１１７】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１、１３、１５および１７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含むＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１１、１３および１５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号６３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号４８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号６４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号６５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号６６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号６７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号６８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号４９のアミ��酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらの生物学的に活性な断片を含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対する改善された結合親和性を有する。一部の実施形態では、少なくとも１０アミノ酸長のリンカーを含む融合タンパク質（例えば、配列番号１１、１３、１５、４８および６３〜６８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する融合タンパク質）は、参照融合タンパク質（例えば、配列番号９のアミノ酸配列を有する融合タンパク質）と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対する改善された結合親和性を有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、または２５ｐＭ未満のＫＤでＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、７５ｐＭ未満、７０ｐＭ未満、６０ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３５ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、または５ｐＭ未満のＫＤでＴＧＦβ３に結合する。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるいずれかのポリペプチドは、測定可能なアッセイにおいて、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０８、０．０９、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３または０．０２ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ１を阻害する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３または０．０２ｎＭ未満のＩＣ５０でＴＧＦβ３を阻害する。一部の実施形態では、レポーター遺伝子アッセイは、ＣＡＧＡレポーターアッセイである。一部の実施形態では、ＣＡＧＡアッセイは、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Ｄｅｎｎｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  ＥＭＢＯ  １７：  ３０９１−３１００）、およびトランスフェクト効率について制御するためのＲｅｎｉｌｌａレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）でトランスフェクトされたヒト肺癌細胞系に基づく。ＣＡＧＡモチーフは、ＴＧＦβ応答遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在し、そのため、このベクターは、一般に、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介してシグナル伝達する因子のために使用される。例えば、実施例２を参照されたい。
【０１２０】
一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）含有融合ポリペプチドを提供する。融合ポリペプチドは、本明細書に開示される方法または当技術分野において公知の方法のいずれかにより調製され得る。
【０１２１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるいずれかの融合ポリペプチドは、以下の成分を含む：ａ）本明細書に開示されるいずれかのＴβＲＩＩ（またはベータグリカン）ポリペプチド（「Ａ」）、ｂ）本明細書に開示されるいずれかのリンカー（「Ｂ」）、ｃ）本明細書に開示されるいずれかの異種部分（「Ｃ」）、および必要に応じてリンカー（「Ｘ」）。このような実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ａ−Ｂ−ＣまたはＣ−Ｂ−Ａで配列され得る。このような実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ａ−Ｂ−ＣまたはＸ−Ｃ−Ｂ−Ａで配列され得る。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ａ、ＢおよびＣのそれぞれ（および必要に応じて、配列番号２３のアミノ酸配列などのリーダー配列）を含み、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）。
【０１２２】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃに位置するリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み、融合ポリペプチドは、ＸおよびＡの間に１、２、３、４または５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａに位置するリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み、融合ポリペプチドは、ＸおよびＣの間に１、２、３、４または５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃに位置するリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み、融合ポリペプチドは、ＸおよびＡの間にアラニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａに位置するリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み、融合ポリペプチドは、ＸおよびＣの間にアラニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃに位置するリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み、融合ポリペプチドは、ＸおよびＡの間にグリシンおよびアラニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａに位置するリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み、融合ポリペプチドは、ＸおよびＣの間にグリシンおよびアラニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃに位置するリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み、融合ポリペプチドは、ＸおよびＡの間にトレオニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、以下の様式（Ｎ末端〜Ｃ末端）：Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａに位置するリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み、融合ポリペプチドは、ＸおよびＣの間にトレオニンを含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号１８）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書に開示される異種部分の配列のいずれか（例えば、配列番号４９）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号１８）を含み、融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）を含み、融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書に開示される異種部分の配列のいずれか（例えば、配列番号４９）を含み、融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）。
【０１２４】
一部の実施形態では、本開示は、融合ポリペプチドであって、融合ポリペプチドが、ａ）本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号１８）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列であって、融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ｂ）本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列であって、融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含み（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）、ならびにｃ）本明細書に開示される異種部分の配列のいずれか（例えば、配列番号４９）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列であって、融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなるか、またはこれらから本質的になる（必ずしもこの順序ではない）。一部の実施形態では、本開示は、融合ポリペプチドであって、融合ポリペプチドが、ａ）本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号１８）であって、融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ｂ）本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）であって、融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含み（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）、ならびにｃ）本明細書に開示される異種部分の配列のいずれか（例えば、配列番号４９）であって、融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸を含む（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなるか、またはこれらから本質的になる（必ずしもこの順序ではない）。
【０１２５】
一部の実施形態では、本開示は、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸からなるＴβＲＩＩポリペプチド部分（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列、および５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸からなるリンカー部分（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ならびにｃ）配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸配列からなる異種部分（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなるか、またはこれらから本質的になる（必ずしもこの順序ではない）融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸からなるＴβＲＩＩポリペプチド部分（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸からなるリンカー部分（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ならびにｃ）配列番号４９のアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下の追加のアミノ酸からなる異種部分（しかし、ペグ化などのさらなる翻訳後修飾を含んでいてもよい）；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなるか、またはこれらから本質的になる（必ずしもこの順序ではない）融合ポリペプチドを提供する。
【０１２６】
一部の実施形態では、融合タンパク質はリーダー配列を含まない。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【化２６】
2021512919.tif 000027
【０１２７】
一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合部分を含まない、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、形質転換成長因子ベータスーパーファミリーのリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３）以外のサイトカインと認識可能な親和性で結合しない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３以外のサイトカインと認識可能な親和性で結合しない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３以外のサイトカインと認識可能な親和性で結合しない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ受容体、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ１、ＣＤ２０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ２、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＴＬＲ１−１０、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ−３／ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ−４／ＨＥＲ４、ＩＧＦＲ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫ受容体、エフリン受容体、ＡＸＬ受容体、ＬＴＫ受容体、ＴＩＥ受容体、アンジオポエチン１、２、ＲＯＲ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＥＴ受容体、ＫＬＧ受容体、ＲＹＫ受容体、ＭｕＳＫ受容体、ＩＬβＲ、ＩｌαＲ、ＴＮＴＲＳＦ、ＴＲＡＩＬ受容体、ＡＲＴＣ１、アルファ−アクチニン−４、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂ−ＲＡＦ、カスパーゼ、ベータ−カテニン、フィブロネクチン、ＧＰＮＭＢ、ＧＤＰ−Ｌ、ＬＤＬＲ、ＨＬＡ−Ａ２、ＭＬＡ−Ａ１１、ＨＳＰ７０、ＫＩＡＡ２０５、ＭＡＲＴ２、ＭＵＭ−１、２、３、ＰＡＰ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、ＫＲＡＳ２、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２．ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１または−ＳＳＸ２融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ、ＢＡＧＥ−１、ＢＡＧＥ−２、３、４、５、ＧＡＧＥ−１、２、３、４、５、６、７、８、ＧｎＴ−Ｖ、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ、ＫＭ−ＨＮ−１、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＭＥＬ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−ＡＳ、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ（ＭＬＡＮＡ）、ｇｐ１００、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７（Ｓ１ＬＶ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＴＲＰ−１、ＨＡＧＥ、ＮＡ−８８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７．ＳＳＸ−１、２、３、４、ＴＲＰ２−１ＮＴ２、癌胎児性胚抗原（ＣＥＡ）、カリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｆｅｉｎ）４、マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｍ）−Ａ、ＯＡ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原、Ｔ��Ｐ−１／、７５．ＴＲＰ−２、ＡＩＭ−２．ＢＩＮＧ−４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｂＡ３、ＦＧＦ−５、ｇｐ２５０、ｉＣＥ、ＡＦＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ｍｄｍ−２、ＭＵＣＩ、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＰＢＦ、ＦＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１．ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン（ＢＩＲＣＳ）、ｈＴＥＲＴ、テロメラーゼ、ＷＴ１、ＳＹＣＰ１、ＢＲＤＴ、ＳＰＡＮＸ、ＸＡＧＥ、ＡＤＡＭ２、ＰＡＧＥ−５、ＬＩＰ１、ＣＴＡＧＥ−１、ＣＳＡＧＥ、ＭＭＡ１、ＣＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＡＦ１５ｑ１４、ＨＣＡ６６Ｉ、ＬＤＨＣ、ＭＯＲＣ、ＳＧＹ−１、ＳＰＯ１１、ＴＰＸ１、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＦＴＨＬＩ７、ＮＸＦ２  ＴＤＲＤ１、ＴＥＸ  １５、ＦＡＴＥ、ＴＰＴＥ、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＡ  ７２−４、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７−２９、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １９−９、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、１−２ミクログロブリン、扁平上皮癌抗原、ニューロン特異的ｅｎｏＪａｓｅ、熱ショックタンパク質ｇｐ９６、ＧＭ２、サルグラモスチム、ＣＴＬＡ−４、７０７−ＡＰ、ＡＲＴ−４、ＣＡＰ−１、ＣＬＣＡ２、Ｃｙｐ−Ｂ、ＨＳＴ−２、ＨＰＶタンパク質、ＥＢＶタンパク質、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、および／またはＨＩＶタンパク質と、認識可能な親和性で結合しない。
【０１２８】
一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドが、ＴβＲＩＩドメインに加えて追加のリガンド結合ドメインを含まない、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴβＲＩＩドメインおよび異種部分（例えば、Ｆｃ部分）を含む直鎖状アミノ酸配列を含むが、直鎖状アミノ酸配列は、任意の追加のリガンド結合ドメインを含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴβＲＩＩドメインおよびＦｃ部分を含む直鎖状アミノ酸配列を含むが、直鎖状アミノ酸配列は、任意の追加のリガンド結合ドメインを含まない。一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドが、単一の直鎖状アミノ酸配列中に複数のリガンド結合ドメインを含まない、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドが、単一の直鎖状アミノ酸配列中に２つ以上の連続するリンカー配列を含まない、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、単一の直鎖状アミノ酸配列中に複数の連続するグリシンおよび／またはセリンリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝＞４）を含むリンカー）を含まない。一部の実施形態では、本開示は、異種部分がＦｃドメインであり、唯一の連続するリンカーがＦｃドメインと共有結合する、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、唯一の連続するリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー（式中、ｎ＝＞４）を含むか、またはこれからなる。
【０１２９】
本出願は、遺伝子操作されたＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域を有するＦｃ融合タンパク質をさらに提供する。このような抗体およびＦｃ融合タンパク質は、例えば、抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の調節において有用であり得る。加えて、改変は、抗体およびＦｃ融合タンパク質の安定性を改善し得る。抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化をＤＮＡに導入することによって、またはペプチド合成によって、調製される。このようなバリアントとしては、例えば、本明細書に開示される抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列からの欠失、ならびに／またはこのアミノ酸配列への挿入、ならびに／またはこのアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、最終構築物が所望の特性を持つならば、最終構築物に達するために行なわれる。グリコシル化部位の数または位置の変化などのアミノ酸の変化はまた、抗体およびＦｃ融合タンパク質の翻訳後プロセスを変更し得る。
【０１３０】
低減されたエフェクター機能を有する抗体およびＦｃ融合タンパク質は、限定されないが、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（国際公開第９４／２８０２７号および国際公開第９８／４７５３１号を参照されたい；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００；  １６−２６も参照されたい）に記載のＡｌａ−Ａｌａ突然変異を含む、アミノ酸配列における変化を導入することによって生成され得る。したがって、ある特定の実施形態では、Ａｌａ−Ａｌａ突然変異を含む定常領域内の突然変異を有する本開示のＦｃ融合タンパク質は、エフェクター機能を低減または無効化するために使用され得る。これらの実施形態によれば、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、２３４位でのアラニンへの突然変異、もしくは２３５位でのアラニンへの突然変異、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。一実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ４フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ突然変異は、２３４位でのフェニルアラニンからアラニンへの突然変異、および／または２３５位でのロイシンからアラニンへの突然変異を記載する。別の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ突然変異は、２３４位でのロイシンからアラニンへの突然変異、および／または２３５位でのロイシンからアラニンへの突然変異を記載する。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、代替で、または追加で、ＣＨ２ドメイン中の点突然変異Ｋ３２２Ａを含む他の突然変異を保有していてもよい（Ｈｅｚａｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：  １２１６１−８）。
【０１３１】
特定の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強または阻害するかのいずれかのために改変されていてもよい。調節されたＣＤＣ活性は、Ｆｃ領域中の１つもしくは複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失を導入することによって、達成され得る（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照されたい）。あるいは、または加えて、システイン残基が、Ｆｃ領域に導入されていてもよく、それによって、この領域において鎖間のジスルフィド結合の形成を可能にする。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善もしくは低減された内部移行能、および／または増加もしくは減少した補体媒介細胞死滅を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １７６：１１９１−１１９５  （１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，  Ｂ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：２９１８−２９２２  （１９９２）、国際公開第９９／５１６４２号、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：  ７３８−４０  （１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；ならびに国際公開第９４／２９３５１号を参照されたい。
Ｂ．核酸および製造の方法  
【０１３２】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）の単離された形態および／または精製された形態を入手可能にし、これは、他のタンパク質および／もしくは他のポリペプチド種から単離されるか、またはそうでなければ、これらを実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％含まない）。ポリペプチドは、一般に、組換え核酸からの発現によって生成される。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本開示は、タンパク質（例えば、ＴβＲＩＩタンパク質またはベータグリカンタンパク質）の細胞外部分のためのコード配列を含む可溶性のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）をコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、本開示は、このような核酸を含む宿主細胞にも関連する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系の使用）、酵母または哺乳動物細胞において発現され得る。他の好適な宿主細胞が当業者に公知である。したがって、本開示の一部の実施形態は、ポリペプチドを生成する方法にさらに関連する。
【０１３４】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に開示される断片、機能的バリアントおよび融合タンパク質を含む、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）のいずれかをコードする単離された核酸および／または組換え核酸を提供する。配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６または４７は、ＩｇＧ  Ｆｃドメインと融合したＴβＲＩＩ細胞外ドメインのバリアントをコードする。対象の核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、ポリペプチドを作成するための方法において、または直接治療剤（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉまたは遺伝子治療アプローチ）として使用され得る。
【０１３５】
ある特定の態様では、ポリペプチドをコードする対象の核酸は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６または４７のバリアントである核酸を含むことがさらに理解される。バリアントのヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントなどの、１つもしくは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失によって異なる配列を含む。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６もしくは４７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離された核酸配列または組換え核酸配列を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号１２またはその断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離された核酸配列または組換え核酸配列を提供する。当業者には、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６または４７と相補的な核酸配列、および配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６または４７のバリアントも本開示の範囲内であることは明らかである。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離されているか、組換えであるか、および／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合されているか、またはＤＮＡライブラリー中の核酸配列であり得る。
【０１３７】
他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６もしくは４７において指定されたヌクレオチド配列、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６もしくは４７の相補体配列、またはその断片に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上記で議論されたように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシーな条件が多様であり得ることを容易に理解する。例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、２．０×ＳＳＣで、５０℃での洗浄を行なうことができる。例えば、洗浄ステップ中の塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ、５０℃の低ストリンジェンシーから、約０．２×ＳＳＣ、５０℃の高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。温度および塩の両方を変化させることができ、または、他の変数を変えながら、温度もしくは塩濃度を一定に保持してもよい。一部の実施形態では、本開示は、６×ＳＳＣ、室温の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、続いて、２×ＳＳＣ、室温で洗浄した核酸を提供する。
【０１３８】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６または４７において記述された核酸と異なる単離された核酸も、遺伝コードにおける縮重に起因して、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸が、２つ以上の三連塩基によって指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、またはシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対するシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」突然変異をもたらし得る。しかしながら、対象のタンパク質のアミノ酸配列における変更をもたらすＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞の間に存在すると予想される。当業者には、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（最大でヌクレオチドの約３〜５％）におけるこれらのバリエーションが、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して所与の種の個体の間で存在し得ることは明らかである。ありとあらゆるこのようなヌクレオチドバリエーションおよび結果として生じるアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
【０１３９】
ＴβＲＩＩの長いアイソフォームに基づく対応するバリアントが、挿入に隣接するＣ末端位で保存的なＶａｌ−Ｉｌｅ置換とともに２５アミノ酸挿入をコードするヌクレオチド配列を含むことは当業者には明らかである。ＴβＲＩＩの長い（Ａ）アイソフォームまたは短い（Ｂ）アイソフォームのいずれかに基づく対応するバリアントが、天然に存在するＴβＲＩＩのアイソフォームＣについての記載と同じ場所で、１０８ヌクレオチドの挿入を含み、３６アミノ酸の挿入をコードするバリアントヌクレオチド配列（配列番号４１）を含むことも明らかである。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物中で、１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞について適切である。多数の種類の適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が、種々の宿主細胞に対して当技術分野で公知である。典型的には、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合性部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得る。当技術分野で公知の構成プロモーターまたは誘導プロモーターは、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソームにおいて細胞中で存在していてもよく、または発現構築物は染色体に挿入されてもよい。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞とともに変わる。
【０１４１】
本明細書に開示されるある特定の態様では、対象の核酸は、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）をコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター中で提供される。調節配列は、当技術分野で認識され、Ｔポリペプチドの発現を指示するために選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：    Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）に記載されている。例えば、作動可能に連結された場合に、ＤＮＡ配列の発現を制御する広い範囲の発現制御配列のいずれかを、これらのベクター中で使用して、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の早期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、発現がＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質に対する制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素に対するプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター、ならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにこれらの様々な組合せが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現される所望のタンパク質の種類などの因子に依存し得ることが理解されるべきである。また、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現も、考慮されるべきである。
【０１４２】
本開示に含まれる組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれかまたはその両方における発現のために好適なベクターにライゲートすることによって、生成することができる。組換えポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）の生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、好適なベクターとしては、以下の種類のプラスミド：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。
【０１４３】
一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするための原核生物配列、および真核細胞中で発現される１つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇに由来するベクターは、真核細胞のトランスフェクションのための好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞および真核細胞の両方で複製および薬物耐性選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタインバーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現のために使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療の送達システムの説明において、下記に見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方に対する他の好適な発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  ｅｄ．  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）を参照されたい。一部の例では、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩなど）が挙げられる。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）などのベクターは、ＣＨＯ細胞における対象のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）の生成のために設計される。好ましい実施形態では、ベクターは、ＨＥＫ−２９３細胞における対象のポリペプチドの生成のために設計される。明らかであるように、対象の遺伝子構築物を使用して、例えば、精製のために、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含むタンパク質を生成させるために、培養中に増殖された細胞における対象のポリペプチドの発現を引き起こすことができる。
【０１４５】
本開示は、対象のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）の１つまたは複数に対するコード配列（例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６または４７）を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関連する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞において発現させてもよい。他の好適な宿主細胞が当業者に公知である。
【０１４６】
したがって、本開示は、対象のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）を生成するための方法にさらに関連する。例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、適切な条件下で培養して、ポリペプチドの発現を生じさせることができる。ポリペプチドを、分泌させ、細胞およびポリペプチドを含有する培地の混合物から単離することができる。あるいは、ポリペプチドは、細胞質または膜画分に維持されてもよく、細胞は、回収され、溶解され、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞および培地を含む。細胞培養のための好適な培地は、当技術分野において周知である。対象のポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ポリペプチドの特定のエピトープに対して特異的な抗体を用いる免疫アフィニティー精製、ならびにポリペプチドに融合したドメインに結合する薬剤を用いるアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムがＦｃ融合を精製するために使用され得る）を含む、タンパク質を精製するための、当技術分野において公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。例としては、精製は、例えば、以下の３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーによって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて終了することができる。
【０１４７】
別の実施形態では、組換えポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）の所望の部分のＮ末端で、ポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列についてコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、発現した融合タンパク質の精製を可能にし得る。次いで、精製リーダー配列は、その後、エンテロキナーゼによる処理によって除去されて、精製されたポリペプチドを提供することができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２を参照されたい）。
【０１４８】
融合遺伝子を作成するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端または交互末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要によりコヒーシブ末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、ならびに酵素的ライゲーションを用いる、慣用の技術に従って行なわれる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む慣用の技術によって、合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を作製するためにその後にアニーリングすることができる、２つの連続的な遺伝子断片の間の相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して、行なうことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：  １９９２を参照されたい）。
Ｃ．抗体  
【０１４９】
ある特定の態様では、本明細書に開示される方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストは、抗体（ＴＧＦβアンタゴニスト抗体）または抗体の組合せである。ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、例えば、１つもしくは複数のリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、ＴβＲＩＩ受容体、ＴβＲＩＩ関連Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）および／またはＴβＲＩＩ共受容体（例えば、ベータグリカン）を阻害し、および／またはこれらに結合し得る。一部の実施形態では、シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し、および／または標的に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せについての能力は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたは細胞に基づくアッセイにおいて決定される。本明細書に記載されるように、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体の組合せは、単独で、あるいは異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の支持療法または活性薬剤と組み合わせて使用されてもよく、好ましくは、異所性骨化の１つもしくは複数の合併症の重症度または期間を予防または低減する。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ１を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ１に結合する。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ１抗体（抗ＴＧＦβ１抗体）とは、一般に、抗体がＴＧＦβ１の標的化における診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＴＧＦβ１に結合する能力がある抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ１抗体の無関係の非ＴＧＦβ１タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体のＴＧＦβ１への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ１抗体は、異なる種由来のＴＧＦβ１の中で保存されたＴＧＦβ１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ１抗体はヒトＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１抗体は、ＴＧＦβ１が、Ｉ型、ＩＩ型および／または共受容体（例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５および／またはベータグリカン）に結合するのを阻害し得、したがって、ＴＧＦβ１シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ＴＧＦβ１がＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３といくらかの配列相同性を共有することに留意すべきである。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ１に結合する抗体は、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３にも結合し得る。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβ１に結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のリガンド（例えば、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、またはＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、１つもしくは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／あるいは１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）にさらに結合する、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１に結合する多重特異性抗体は、ＴＧＦβ３にさらに結合するが、ＴＧＦβ２に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍを超えるＫＤでＴＧＦβ２に結合するか、または、例えば、約１×１０−８Ｍまたは約１×１０−９Ｍの比較的中程度の結合を有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用であって、抗体の組合せが、ＴＧＦβ１抗体、ならびに例えば、１つもしくは複数の追加のＴβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、またはＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、１つもしくは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／あるいは１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む、抗体の組合せおよびその使用に関する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１抗体を含む抗体の組合せは、ＴＧＦβ３抗体をさらに含むが、ＴＧＦβ２抗体を含まない。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ２を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、Ｔβ  ＴＧＦβ  ＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ２に結合する。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ２抗体（抗ＴＧＦβ２抗体）とは、一般に、抗体がＴＧＦβ２の標的化における診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＴＧＦβ２に結合する能力がある抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ２抗体の無関係の非ＴＧＦβ２タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体のＴＧＦβ２への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ２抗体は、異なる種由来のＴＧＦβ２の中で保存されたＴＧＦβ２のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ２抗体はヒトＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２抗体は、ＴＧＦβ２が、Ｉ型、ＩＩ型および／または共受容体（例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５および／またはベータグリカン）に結合するのを阻害し得、したがって、ＴＧＦβ２シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ＴＧＦβ２がＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３といくらかの配列相同性を共有することに留意すべきである。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ２に結合する抗体は、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３にも結合し得る。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβ２に結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３）、１つもしくは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／あるいは１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）にさらに結合する、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用であって、抗体の組合せが、ＴＧＦβ２抗体、ならびに例えば、１つもしくは複数の追加のリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３）、１つもしくは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／あるいは１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む、抗体の組合せおよびその使用に関する。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ３を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ３に結合する。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ３抗体（抗ＴＧＦβ３抗体）は、一般に、抗体がＴＧＦβ３の標的化における診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＴＧＦβ３に結合する能力がある抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ３抗体の無関係の非ＴＧＦβ３タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体のＴＧＦβ３への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ３抗体は、異なる種由来のＴＧＦβ３の中で保存されたＴＧＦβ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ３抗体はヒトＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３抗体は、ＴＧＦβ３が、Ｉ型、ＩＩ型および／または共受容体（例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５および／またはベータグリカン）に結合するのを阻害し得、したがって、ＴＧＦβ３シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ＴＧＦβ３がＴＧＦβ２およびＴＧＦβ１といくらかの配列相同性を共有することに留意すべきである。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ３に結合する抗体は、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ１にも結合し得る。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβ３に結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のＴβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、またはＴＧＦβ２およびＴＧＦβ１）、１つもしくは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／あるいは１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）にさらに結合する、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３に結合する多重特異性抗体は、ＴＧＦβ２に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍを超えるＫＤでＴＧＦβ２に結合するか、または、例えば、約１×１０−８Ｍまたは約１×１０−９Ｍの比較的中程度の結合を有する）。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３に結合する多重特異性抗体は、ＴＧＦβ１にさらに結合するが、ＴＧＦβ２に結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍを超えるＫＤでＴＧＦβ２に結合するか、または、例えば、約１×１０−８Ｍまたは約１×１０−９Ｍの比較的中程度の結合を有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用であって、抗体の組合せが、ＴＧＦβ３抗体、ならびに例えば、１つもしくは複数の追加のリガンド（例えば、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、またはＴＧＦβ２およびＴＧＦβ１）、１つもしくは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／あるいは１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む、抗体の組合せおよびその使用に関する。一部の実施形態では、���ＧＦβ３抗体を含む抗体の組合せは、ＴＧＦβ１抗体をさらに含むが、ＴＧＦβ２抗体を含まない。
【０１５３】
一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、３つのＴＧＦβアイソフォームのすべて、すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体はフレソリムマブである。
【０１５４】
ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴβＲＩＩを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴβＲＩＩに結合する。本明細書で使用される場合、ＴβＲＩＩ抗体（抗ＴβＲＩＩ抗体）とは、一般に、抗体がＴβＲＩＩの標的化における診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＴβＲＩＩに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴβＲＩＩ抗体の無関係の非ＴβＲＩＩタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用アッセイもしくは結合親和性アッセイによって測定される、抗体のＴβＲＩＩへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴβＲＩＩ抗体は、異なる種由来のＴβＲＩＩの中で保存されたＴβＲＩＩのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴβＲＩＩ抗体はヒトＴβＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、抗ＴβＲＩＩ抗体は、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１；ＴＧＦβ２；ＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２；ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３；またはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］がＴβＲＩＩに結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＴβＲＩＩ抗体は、ＴβＲＩＩ、ならびに１つもしくは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）および／または共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用であって、抗体の組合せが、抗ＴβＲＩＩ抗体、ならびに例えば、１つもしくは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）、および／または共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む、抗体の組合せおよびその使用に関する。
【０１５５】
ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ５に結合する。本明細書で使用される場合、ＡＬＫ５抗体（抗ＡＬＫ５抗体）とは、一般に、抗体がＡＬＫ５の標的化における診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＡＬＫ５に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体の無関係の非ＡＬＫ５タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用アッセイもしくは結合親和性アッセイによって測定される、抗体のＡＬＫ５への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、異なる種由来のＡＬＫ５の中で保存されたＡＬＫ５のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体はヒトＡＬＫ５に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１；ＴＧＦβ２；ＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２；ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３；またはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］がＡＬＫ５に結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、ＡＬＫ５、ならびに１つもしくは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］、ＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩ）および／または共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用であって、抗体の組合せが、抗ＡＬＫ５抗体、ならびに例えば、１つもしくは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］、ＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩ）、および／または共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む、抗体の組合せおよびその使用に関する。
【０１５６】
ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともベータグリカンを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともベータグリカンに結合する。本明細書で使用される場合、ベータグリカン抗体（抗ベータグリカン抗体）とは、一般に、抗体がベータグリカンの標的化における診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でベータグリカンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ベータグリカン抗体の無関係の非ベータグリカンタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用アッセイもしくは結合親和性アッセイによって測定される、抗体のベータグリカンへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、異なる種由来のベータグリカンの中で保存されたベータグリカンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ベータグリカン抗体はヒトベータグリカンに結合する。一部の実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１；ＴＧＦβ２；ＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２；ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３；またはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］がベータグリカンに結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、ベータグリカン、ならびに１つもしくは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩ）に結合する、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用であって、抗体の組合せが、抗ベータグリカン抗体、ならびに例えば、１つもしくは複数のリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）、および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴβＲＩＩ）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む、抗体の組合せおよびその使用に関する。
【０１５７】
抗体という用語は、最も広い意味で本明細書で使用され、限定されるものではないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む、様々な抗体構造を包含する。抗体断片とは、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の一部分を含む、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）；国際公開第９３／１６１８５号；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号、米国特許第５，５８７，４５８号および米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。特定の実施形態では、本開示の抗体は、それらに付着され、検出されることが可能な標識（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）を含む。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る、２つの抗原結合性部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４  （２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ６４４４−６４４８を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４に記載されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である。例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい。抗体断片は、限定されるものではないが、無傷抗体のタンパク質消化、および本明細書に記載の組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による生成を含む様々な技術によって作成することができる。
【０１５８】
本明細書における抗体は、任意のクラスの抗体であり得る。抗体のクラスとは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。５つの主要な抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューとよばれる。
【０１５９】
一般に、本明細書に開示される方法における使用のための抗体は、好ましくは、高い結合親和性で、その標的抗原に特異的に結合する。親和性は、ＫＤ値として表わされてもよく、固有の結合親和性（例えば、最小アビディティ効果を有する）を反映する。典型的には、結合親和性は、無細胞の状況または細胞に関連する状況に関わらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される。本明細書に開示されるアッセイを含む、当技術分野において公知のいくつかのアッセイのいずれかを使用して、結合親和性測定値を得ることができ、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）、放射性標識抗原結合性アッセイ（ＲＩＡ）およびＥＬＩＳＡが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、少なくとも、１×１０−７もしくはそれよりも強い、１×１０−８もしくはそれよりも強い、１×１０−９もしくはそれよりも強い、１×１０−１０もしくはそれよりも強い、１×１０−１１もしくはそれよりも強い、１×１０−１２もしくはそれよりも強い、１×１０−１３もしくはそれよりも強い、または１×１０−１４もしくはそれよりも強いＫＤで、それらの標的抗原（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＡＬＫ５、ベータグリカンおよびＴβＲＩＩ）に結合する。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイによって記載されるようにして、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその標的抗原を用いて行なわれるＲＩＡによって、測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の滴定系列の存在中、最低濃度の放射性標識抗原（例えば、１２５Ｉ標識）でＦａｂを平衡化すること、次いで、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて結合した抗原を捕捉することによって、測定される［例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：８６５−８８１を参照されたい］。アッセイのための条件を確立するために、マルチウェルプレート（例えば、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を、捕捉性抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ製）でコーティングし（例えば、終夜）、その後、好ましくは、室温（およそ２３℃）でウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。非吸着プレートにおいて、放射性標識抗原を、目的のＦａｂの連続希釈により混合する［例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７：４５９３−４５９９における、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する］。次いで、目的のＦａｂを、好ましくは、終夜インキュベートして、しかし、インキュベーションは、平衡に達することを確実にするために、より長い時間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、好ましくは、室温で約１時間、インキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくは、ポリソルベート２０およびＰＢＳの混合物で数回洗浄する。プレートが乾燥したら、シンチレーション剤（例えば、ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標）、Ｐａｃｋａｒｄ製）を添加し、プレートを、ガンマカウンター（例えば、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標）、Ｐａｃｋａｒｄ製）でカウントする。
【０１６１】
別の実施形態によれば、ＫＤは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップとともに使用して、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランのバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の使用説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。例えば、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流速で注入して、カップリングしたタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成することができる。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを、未反応基をブロッキングするために注入する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中に、およそ２５μｌ／分の流速で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア  バージョン３．２）を使用して、会合および解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、計算する。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する［例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：８６５−８８１を参照されたい］。会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１秒−１を超える場合、次いで、会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）は、ストップフローを備える分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で、撹拌キュベットを用いて測定される場合に、増加させた濃度の抗原の存在中で、ＰＢＳ中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する、蛍光消光技術を使用して決定することができる。
【０１６２】
ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の核酸ならびにアミノ酸配列、特にヒト配列は、当技術分野において周知であり、したがって、本開示による使用のための抗体アンタゴニストは、当技術分野における知識および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者によって日常的に作成され得る。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来するが、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１−６８５５に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるキメラ抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）由来のアミノ酸残基、およびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＶＲのすべてまたは実質的にすべて（例えば、ＣＤＲ）が非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１６５】
ヒト化抗体およびこれらを作成する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ  （２００８）  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−１６３３に概説されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号および米国特許第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４［ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト化を記載している］；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９１）  ２８：４８９−４９８（「再表面化」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（「ＦＲシャッフリング」を記載している）；Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８；ならびにＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （２０００）  ８３：２５２−２６０  （ＦＲシャッフリングへの「ガイド付き選択」アプローチを記載している）に記載されている。
【０１６６】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されるものではないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２２９６を参照されたい］；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体の定常配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：４２８５；およびＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５１：２６２３を参照されたい］；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域［例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ  （２００８）  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−１６３３を参照されたい］：およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域［例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ｃｄ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１０６７８−１０６８４；およびＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ｃｄ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２２６１１−２２６１８を参照されたい］が挙げられる。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５：  ３６８−７４およびＬｏｎｂｅｒｇ  （２００８）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０：４５０−４５９に記載されている。
【０１６８】
ヒト抗体は、免疫原（例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３ポリペプチド）を、抗原負荷に応答して、無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって、調製され得る。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに統合される、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部分を含有する。このようなトランスジェニック動物において、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説として、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  （２００５）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１１１７−１１２５；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している）；ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している）を参照されたい。このような動物によって作製される無傷抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変され得る。
【０１６９】
本明細書に提供されるヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作成することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系が記載されている［例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  （１９８４）  １３３：  ３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  ５１−６３，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７：  ８６を参照されたい］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により作製されるヒト抗体はまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０３：３５５７−３５６２に記載されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）およびＮｉ，  Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ  （２００６）  ２６（４）：２６５−２６８  （２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ  （２００５）  Ｈｉｓｔｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．，  ２０（３）：９２７−９３７  （２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ  （２００５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ２７（３）：１８５−９１に記載されている。
【０１７０】
本明細書に提供されるヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製してもよい。このような可変ドメイン配列は、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わされ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、本明細書に記載される。
【０１７１】
例えば、本開示の抗体は、所望の活性（１つまたは複数）を有する抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを作製するため、および所望の結合特性を保有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための、種々の方法が当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７，  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．において概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：  ６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ  （２００３）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５，  Ｌｏ，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８（２）：２９９−３１０；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０（５）：１０７３−１０９３；  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ  （２００４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２；およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：  １１９−１３２にさらに記載されている。
【０１７２】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別にクローニングし、ファージライブラリーにランダムに組換えし、次いで、これをＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：  ４３３−４５５に記載されているようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する要件なしで、免疫原（例えば、ＴβＲＩＩ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３ポリペプチド）に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ，  １２：  ７２５−７３４に記載されるようにして、ナイーブレパートリーを、クローニングして（例えば、ヒトから）、任意の免疫化なしで、広範囲の非自己抗原に対し、自己抗原にも対する抗体の単一供給源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：  ３８１−３８８に記載されるようにして、幹細胞由来の再構成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再構成を達成することによって、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許刊行物としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号、米国特許出願公開第２００５／０２６６０００号、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２６号、米国特許出願公開第２００７／０１６０５９８号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４号、米国特許出願公開第２００７／０２９２９３６号および米国特許出願公開第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体（典型的には、モノクローナル抗体）は、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６またはそれよりも多い）抗原に対する、少なくとも２つの異なるエピトープ（例えば、２、３、４、５もしくは６またはそれよりも多い）に対する結合特異性を有する。
【０１７４】
「オクトパス抗体」を含む、３つまたはそれよりも多くの機能的抗原結合部位を有する遺伝子操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照されたい）。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、この集団を構成する個々の抗体が、同一であるか、および／または同じエピトープに結合することを指すが、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の生成の間に生じる、可能性があるバリアント抗体は除き、このようなバリアントは、一般に、少量で存在する。典型的には異なるエピトープに対して作られる異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して作られる。そのため、「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む種々の技術によって作成され得、このような方法およびモノクローナル抗体を作成するための他の例示的な方法は本明細書に記載される。
【０１７６】
例えば、ＴβＲＩＩに由来する免疫原を使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコールによって作成することができる［例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）  ｅｄ．  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい］。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、ＴβＲＩＩポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発する能力がある抗原性断片、または融合タンパク質で免疫することができる。タンパク質またはペプチドに対して免疫原性を付与するための技術としては、担体へのコンジュゲーション、または当技術分野において周知の他の技術が挙げられる。ＴβＲＩＩポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在中で投与することができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体価の検出によって、監視することができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを、抗体産生のレベルおよび／または結合親和性のレベルを評価するための抗原としての免疫原とともに使用することができる。
【０１７７】
ＴβＲＩＩの抗原性調製物による動物の免疫後、抗血清を得ることができ、所望により、ポリクローナル抗体を、血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生細胞（リンパ球）を、免疫された動物から回収し、標準的な体細胞融合手順によって、ミエローマ細胞などの不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は、当技術分野において周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術［例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：  ４９５−４９７を参照されたい］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［例えば、Ｋｏｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ４：７２を参照されたい］、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術［Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  ｐｐ．  ７７−９６］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、ＴβＲＩＩポリペプチドと特異的反応性の抗体の産生のために、免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を、このようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離することができる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによってＦｃ領域バリアントを作製し得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換、欠失および／または付加）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでいてもよい。
【０１７９】
例えば、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要である適用に対する望ましい候補にする、一部の、しかしすべてではないエフェクター機能を持つ抗体バリアントを企図し、それにもかかわらず、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）］は不必要または有害である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合性を欠くが（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ  （１９９１）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７−４９２に概説されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２；米国特許第５，８２１，３３７号；およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）    Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６６：１３５１−１３６１に記載されている。あるいは、非放射活性アッセイ法を用いてもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）、フローサイトメトリー用の非放射活性細胞傷害アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）、非放射活性細胞傷害性アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６に開示されているものなどの動物モデルで評価してもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイもまた、抗体がＣ１ｑに結合することができず、そのため、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために行ってもよい［例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい］。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行なってもよい［例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３；Ｃｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２；およびＣｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｊ．  Ｇｌｅｎｎｉｅ  （２００４）  Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３を参照されたい］。ＦｃＲｎ結合およびｉｎ  ｖｉｖｏのクリアランス／半減期の決定は、当技術分野において公知の方法を使用して行うこともできる［例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，  Ｓ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８（１２）：１７５９−１７６９を参照されたい］。
【０１８０】
低減したエフェクター機能を有する本開示の抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１つまたは複数の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ突然変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７の２つまたはそれよりも多くに置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられ、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、システインが遺伝子操作された抗体を作出することが望ましいことがあり、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」は、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基と置換されている。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、抗体を、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分とコンジュゲートするために使用して、本明細書においてさらに記載されるようにして、免疫コンジュゲートを作出し得る。ある特定の実施形態では、以下の残基のいずれか１つまたは複数が、システインで置換されていてもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システインが遺伝子操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるようにして、作製してもよい。
【０１８２】
加えて、望ましい抗体を特定するために、抗体をスクリーニングするために使用される技術は、得られる抗体の特性に影響を与えることがある。例えば、抗体が溶液中で抗原を結合するために使用される場合、溶液の結合を試験することが望ましくあり得る。様々な異なる技術を、特定の望ましい抗体を特定するために、抗体および抗原の間の相互作用を試験するために利用可能である。様々な技術としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）結合アッセイ、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイおよび免疫組織化学的検査が挙げられる。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体および／もしくは結合ポリペプチドの結合親和性ならびに／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、抗体および／または結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、あるいはペプチド合成によって、調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体および／もしくは結合ポリペプチドのアミノ酸配列からの欠失、ならびに／またはこのアミノ酸配列への挿入、ならびに／またはこのアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、最終構築物が所望の特性、例えば、標的との結合（ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３）を持つならば、最終構築物に達するために行うことができる。
【０１８４】
変更（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて行なってもよい。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基において（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  （２００８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０７：１７９−１９６  （２００８）を参照されたい）、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行なうことができ、得られるバリアントＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、二次ライブラリーから再選択することによる親和性成熟は、当技術分野において記載されている［例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ    Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７，  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  （２００１）を参照されたい］。親和性成熟の一部の実施形態では、多様性は、任意の種々の方法によって、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発）。次いで、二次ライブラリーが作出される。次いで、ライブラリーを、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定するためにスクリーニングする。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）がランダム化される、ＨＶＲ定方向アプローチを含む。抗原結合性に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に特定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３が、多くの場合、標的にされる。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、このような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内で生じさせ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的変更（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）を、ＨＶＲにおいて行なってもよい。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であり得る。上記において提供されるバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、それぞれのＨＶＲは、変更されていないか、または１、２もしくは３以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
【０１８６】
突然変異誘発のために標的にされ得る抗体および／または結合ポリペプチドの残基または領域の特定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）の残基または基が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体または結合ポリペプチドと抗原の相互作用が影響を受けるか否かを決定する。さらなる置換を、最初の置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置に導入してもよい。あるいは、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体および抗原の間の接触点を特定することができる。このような接触残基および隣接する残基は、置換の候補として標的にされてもよく、または除外されてもよい。バリアントは、それらが所望の特性を含有するか否かを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１８７】
アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００またはそれよりも多くの残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴについて）もしくは抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドとの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が挙げられる。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体および／または結合ポリペプチドは、当技術分野において公知であって、容易に入手可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変されていてもよい。抗体および／または結合ポリペプチドの誘導体化のために好適な部分としては、限定されるものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造中の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐または非分岐であってもよい。抗体および／または結合ポリペプチドに付着するポリマーの数は変更されてもよく、２以上のポリマーが付着する場合、それらは、同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または種類は、限定されるものではないが、抗体誘導体および／または結合ポリペプチド誘導体が規定された条件下での治療において使用されるかに関わらず、改善される抗体および／もしくは結合ポリペプチドの特定の特性または機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
Ｄ．低分子
【０１８９】
ある特定の態様では、本明細書に開示される方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストは、低分子（ＴＧＦβアンタゴニスト低分子）または低分子の組合せである。ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、例えば、１つもしくは複数のリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、ＴβＲＩＩ受容体、ＴβＲＩＩ関連Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）、ＴβＲＩＩ関連共受容体（例えば、ベータグリカン）および／または下流のシグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害し得る。一部の実施形態では、シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害するＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せについての能力は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む、細胞に基づくアッセイにおいて決定される。ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、単独で、あるいは異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の支持療法または活性薬剤と組み合わせて使用されてもよく、好ましくは、異所性骨化の１つもしくは複数の合併症の重症度または期間を予防または低減する。
【０１９０】
ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、少なくともＴＧＦβ１を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ１の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ１の発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ３をさらに阻害するが、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、少なくともＴＧＦβ２を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ２の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ２の発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ１、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、少なくともＴＧＦβ３を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ３の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ３の発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ１をさらに阻害するが、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、少なくともＴβＲＩＩを阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＴβＲＩＩの低分子阻害剤は、ＴβＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩの低分子阻害剤は、ＴβＲＩＩの発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩの低分子阻害剤は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ２がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子ま���は低分子の組合せは、ＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１がＴβＲＩＩに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＴβＲＩＩに結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＴβＲＩＩに結合するのを阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＴβＲＩＩに結合するのを阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、Ｔβ  ＴＧＦβ  ＲＩＩアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ５の低分子阻害剤は、ＡＬＫ５に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５の低分子阻害剤は、ＡＬＫ５の発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５の低分子阻害剤は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩおよびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ２がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１がＡＬＫ５に結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＡＬＫ５に結合するのを阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＡＬＫ５に結合するのを阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＡＬＫ５に結合するのを阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、少なくともベータグリカンを阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ベータグリカンの低分子阻害剤は、ベータグリカンに結合する。一部の実施形態では、ベータグリカンの低分子阻害剤は、ベータグリカンの発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ベータグリカンの低分子阻害剤は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５の１つまたは複数をさらに阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１がベータグリカンに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ２がベータグリカンに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１がベータグリカンに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がベータグリカンに結合するのを阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がベータグリカンに結合するのを阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がベータグリカンに結合するのを阻害しないか、または実質的に阻害しない。
【０１９１】
ＴＧＦβアンタゴニスト低分子は、直接的阻害剤または間接的阻害剤であり得る。例えば、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３の少なくとも１つもしくは複数、および／または下流のシグナル伝達因子（Ｓｍａｄ）の１つもしくは複数の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはこれらの組合せ）を阻害し得る。あるいは、直接的ＴＧＦβアンタゴニスト低分子または低分子の組合せは、例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の１つもしくは複数、または下流のシグナル伝達因子の１つもしくは複数に直接結合し得る。１つまたは複数の間接的ＴＧＦβアンタゴニスト低分子、および１つまたは複数の直接的ＴＧＦβアンタゴニスト低分子の組合せは、本明細書に開示の方法に従って使用され得る。
【０１９２】
本開示の結合有機低分子アンタゴニストは、公知の方法論（例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第００／００８２３号および国際公開第００／３９５８５号を参照されたい）を使用して、特定および化学合成され得る。一般に、本開示の低分子アンタゴニストは、通常、約２０００ダルトン未満のサイズ、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満のサイズであり、このような有機低分子は、好ましくは、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）に特異的に結合する能力がある。このような低分子アンタゴニストは、周知の技術を使用して、過度の実験なく特定され得る。これに関して、ポリペプチド標的に結合する能力がある分子についての有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技術は、当技術分野において周知であることに留意されたい（例えば、国際出願公開の国際公開第００／００８２３号および国際公開第００／３９５８５号を参照されたい）。
【０１９３】
本開示の結合有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、ウレア、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホネート、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
Ｅ．核酸
【０１９４】
ある特定の態様では、本明細書に開示される方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストは、ポリヌクレオチド（ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチド）またはポリヌクレオチドの組合せである。ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、例えば、１つもしくは複数のリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、ＴβＲＩＩ受容体、ＴβＲＩＩ関連Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）、ＴβＲＩＩ関連共受容体（例えば、ベータグリカン）および／または下流のシグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害し得る。一部の実施形態では、シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害するＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せについての能力は、例えば、本明細書に記載のアッセイを含む、細胞に基づくアッセイにおいて決定される。ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、単独で、あるいは異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の支持療法または活性薬剤と組み合わせて使用されてもよく、好ましくは、異所性骨化の１つもしくは複数の合併症の重症度または期間を予防または低減する。
【０１９５】
ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、少なくともＴＧＦβ１を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ１の発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ３をさらに阻害するが、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、少なくともＴＧＦβ２を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ２のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ２の発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ１、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、少なくともＴＧＦβ３を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ３のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ３の発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ１をさらに阻害するが、ＴＧＦβ２を阻害しないか、またはＴＧＦβ２を実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、少なくともＴβＲＩＩを阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＴβＲＩＩのポリヌクレオチド阻害剤は、ＴβＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩのポリヌクレオチド阻害剤は、ＴβＲＩＩの発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩのポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＡＬＫ５およびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト���リヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ２がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１がＴβＲＩＩに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＴβＲＩＩに結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＴβＲＩＩに結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がＴβＲＩＩに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＴβＲＩＩに結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ５のポリヌクレオチド阻害剤は、ＡＬＫ５に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５のポリヌクレオチド阻害剤は、ＡＬＫ５の発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５のポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩおよびベータグリカンの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ２がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１がＡＬＫ５に結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ���がＡＬＫ５に結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＡＬＫ５に結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がＡＬＫ５に結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がＡＬＫ５に結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。ある特定の態様では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、少なくともベータグリカンを阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達の阻害）。したがって、一部の実施形態では、ベータグリカンのポリヌクレオチド阻害剤は、ベータグリカンに結合する。一部の実施形態では、ベータグリカンのポリヌクレオチド阻害剤は、ベータグリカンの発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはこれらの組合せ）を阻害する。一部の実施形態では、ベータグリカンのポリヌクレオチド阻害剤は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴβＲＩＩおよびＡＬＫ５の１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１がベータグリカンに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ２がベータグリカンに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１がベータグリカンに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がベータグリカンに結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がベータグリカンに結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３がベータグリカンに結合するのを阻害するが、ＴＧＦβ２がベータグリカンに結合するのを、阻害しないか、または実質的に阻害しない。
【０１９６】
本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムであり得る。ヒトＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の核酸ならびにアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、したがって、本開示の方法による使用のためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当技術分野における知識および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者によって日常的に作成され得る。
【０１９７】
例えば、アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または三重らせん形成により、遺伝子発現を制御するために使用することができる。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ  （１９９１）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：５６０；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．  （１９８８）において議論されている。三重らせん形成は、例えば、Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６；およびＤｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３００において議論されている。これらの方法は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、所望の遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に対して相補的な一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。しかしながら、絶対的な相補性は、好ましいが、必要でない。
【０１９８】
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部分に対して相補的」な配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味し；本明細書に開示される遺伝子の二本鎖アンチセンス核酸の場合では、したがって、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、それが含有し得、安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を依然として形成し得るＲＮＡとの塩基ミスマッチが多くなる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的手順の使用によって、容認できるミスマッチの程度を確かめることができる。
【０１９９】
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまで、およびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列に対して相補的であるポリヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効率的に働くはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に対して相補的な配列は、同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示されている［例えば、Ｗａｇｎｅｒ，  Ｒ．，  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５を参照されたい］。したがって、本開示の遺伝子の５’または３’非翻訳非コード領域のいずれかに対して相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用することができるであろう。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に対して相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、あまり効果的ではない翻訳の阻害剤であるが、本開示の方法に従って使用することができるであろう。本開示のｍＲＮＡの５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域またはコード領域とハイブリダイズするように設計されているかに関わらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長でなければならず、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。詳細な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２００】
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部分は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有するであろう。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成することができる限り、エピソームに残ったままであり得るか、または染色体に統合され得る。このようなベクターは、当技術分野において標準的な組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現のために使用される、プラスミド、ウイルス、または当技術分野において公知の他のものであり得る。本開示の所望の遺伝子をコードする配列、またはその断片の発現は、脊椎動物細胞、好ましくは、ヒト細胞中で作用する、当技術分野において公知の任意のプロモーターによってであり得る。このようなプロモーターは、誘導的または構成的であり得る。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、ＳＶ４０早期プロモーター領域［例えば、Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ  （１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９：３０４−３１０を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含有されるプロモーター［例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７を参照されたい］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：１４４１−１４４５を参照されたい］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列［例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２を参照されたい］が挙げられる。
【０２０１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、１つまたは複数の遺伝子の発現を標的にする干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子である。ＲＮＡｉとは、標的化ｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。詳細には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）による特異的ｍＲＮＡとの相互作用を介して、標的化遺伝子を発現抑制する。ｄｓＲＮＡ複合体は、次いで、細胞による分解に対して標的にされる。ｓｉＲＮＡ分子は、十分に相補的（例えば、その遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性）な標的遺伝子の発現に干渉する、１０〜５０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ二重鎖である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２０２】
追加のＲＮＡｉ分子としては、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、また短干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって連結された標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡとともに分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＵ６プロモーターは、ＲＮＡｉのためにＲＮＡを発現するために使用することができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  （２００２）  １６：９４８−９５８，  ２００２］は、ＲＮＡｉに影響を及ぼす手段としてヘアピンへフォールディングされる低分子ＲＮＡ分子を使用している。したがって、このような短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子はまた、本明細書に記載の方法において有利に使用される。機能的ｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは様々であり、ステムの長さは約２５〜約３０ｎｔのどこかの範囲であり得、ループのサイズは、サイレンシング活性に影響を与えることのない、４〜約２５ｎｔの範囲内であり得る。任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）生成物と共通点があり、任意のイベントにおいて、特異的遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有する。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、「ステム−ループ」構造によって特徴付けられるプレｍｉＲＮＡとして最初に転写される約１０〜７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡであり、その後、ＲＩＳＣによるさらなるプロセシング後に、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。
【０２０３】
限定されないがｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉを媒介する分子は、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９，  ２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，  ２００２）によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって（Ｄｏｎｚｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，  ２００２；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，  ２００２）、およびＥ．ｃｏｌｉのＲＮａｓｅ  ＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解によって（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，  ２００２）、生成され得る。
【０２０４】
別の態様によれば、本開示は、限定されるものではないが、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、カプセル化ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、カプセル化ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じさせる能力がある分子、またはこれらの組合せを含む、ポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
【０２０５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、二本鎖ＤＮＡ分子および一本鎖ＲＮＡ分子を含む、核酸分子であって、これは、結合して、ＴβＲＩＩ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３ポリペプチドなどの標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する。アプタマーの作製および治療的使用は、当技術分野において十分に確立されている。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。アプタマーについての追加の情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見ることができる。核酸アプタマーは、例えば、指数的富化によるリガンドの系統進化（ＳＥＬＥＸ）プロセスを介して、当技術分野において公知の方法を使用して選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、米国特許第５，５８０，７３７号、米国特許第５，５６７，５８８号、米国特許第５，７０７，７９６号、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，０１１，５７７号および米国特許第６，６９９，８４３号に記載の、標的分子に対する高度に特異的な結合を有する核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化のための方法である。アプタマーを特定するための別のスクリーニング方法は、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、種々の二次元および三次元構造を形成するための核酸の能力、ならびに実質的に、単量体または多量体のいずれであるかに関わらず、他の核酸分子およびポリペプチドを含む、任意の化学化合物とともに、リガンドとして機能する（特異的結合対を形成する）ためのヌクレオチド単量体内で利用可能な化学的多様性に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的としての機能を果たし得る。ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに所望の結合親和性および選択性を達成するために、同じ一般的な選択スキームを使用して、結合、分割および増幅の段階的な反復を含む。ランダム化配列のセグメントを含み得る、核酸の混合物から開始して、ＳＥＬＥＸ法は、混合物を結合のために有利な条件下で標的と接触させるステップ；標的分子に特異的に結合しているそれらの核酸から未結合の核酸を分割するステップ；核酸−標的複合体を解離させるステップ；核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得るステップを含む。結合、分割、解離および増幅のステップは、所望により、多くのサイクルを繰り返して、標的分子に対して非常に特異的な高親和性の核酸リガンドを与える。
【０２０６】
典型的には、このような結合分子は、動物に対して別々に投与されるが［例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  （１９９１）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：５６０を参照されたい］、このような結合分子はまた、宿主細胞によって取り込まれ、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるポリヌクレオチドから、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる［例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．  （１９８８）を参照されたい］。
３．スクリーニングアッセイ
【０２０７】
ある特定の態様では、本発明は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３およびＴβＲＩＩのシグナル伝達経路のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（薬剤）を特定するためのＴβＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性ＴβＲＩＩポリペプチド）の使用に関する。このスクリーニングにより特定された化合物は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のシグナル伝達活性を調節するそれらの能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するために試験することができる。必要に応じて、これらの化合物は、組織増殖を調節するそれらの能力をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、動物モデルにおいてさらに試験することができる。
【０２０８】
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３およびＴβＲＩＩポリペプチドを標的にすることによって、組織増殖を調節するための治療剤についてのスクリーニングに対する多数のアプローチがある。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットスクリーニングを、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３またはＴβＲＩＩ媒介細胞シグナル伝達を撹乱する薬剤を特定するために行なうことができる。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３に対する結合を特異的に阻害または低減する化合物をスクリーニングおよび特定するために、アッセイが行なわれる。あるいは、ＴβＲＩＩポリペプチドのＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３に対する結合を増強する化合物を特定するために、アッセイを使用することができる。さらなる実施形態では、化合物は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３またはＴβＲＩＩポリペプチドと相互作用するそれらの能力によって特定することができる。
【０２０９】
種々のアッセイ形式が、本開示を考慮すると、十分であり、本明細書に明示的に記載されないものは、それにもかかわらず、当業者により理解される。本明細書に記載されるように、本発明の試験化合物（薬剤）は、任意のコンビナトリアル化学法によって作出され得る。あるいは、対象の化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖のモジュレーターとして作用するそれらの能力について試験される化合物（薬剤）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物体（例えば、天然生成物）により生成され得、化学的に生成され得（例えば、ペプチド模倣体を含む低分子）、または組換え的に生成され得る。本発明により企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。詳細な実施形態では、試験薬剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する小有機低分子である。
【０２１０】
本発明の試験化合物は、単一の別々の実体として提供され得、または、コンビナトリアル化学によって作成されたものなどの、より高い複雑性のライブラリー中に提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含むことができる。試験システムへの試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニングステップにおいて、化合物の単離形態または混合物としてのいずれかであり得る。必要に応じて、化合物は、必要に応じて他の化合物により誘導体化されてもよく、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有していてもよい。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化型架橋剤またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０２１１】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間中に調査される化合物の数を最大化するために、ハイスループットアッセイが望ましい。精製形態または半精製形態のタンパク質により誘導され得るものなどの、無細胞系で行なわれるアッセイは、多くの場合、それらが、迅速な開発および試験化合物により媒介される分子標的中の変更の比較的容易な検出を可能にするために作製することができるという点で、「一次」スクリーニングとして好ましい。また、試験化合物の細胞毒性または生物学的利用率の効果は、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において無視することができ、アッセイは、代わりに、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３の間の結合親和性の変更に現われ得る、分子標的に対する薬物の効果を主に重視する。
【０２１２】
単に説明するために、本発明の例示的なスクリーニングアッセイでは、目的の化合物を、通常ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３に結合する能力がある単離および精製されたＴβＲＩＩポリペプチドと接触させる。次いで、化合物およびＴβＲＩＩポリペプチドの混合物に、ＴβＲＩＩリガンドを含有する組成物を添加する。ＴβＲＩＩ／ＴＧＦβ１複合体またはＴβＲＩＩ／ＴＧＦβ３複合体の検出および定量化は、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３の間の複合体形成を阻害する（または増強する）化合物の有効性を決定するための手段を提供する。化合物の有効性は、様々な濃度の試験化合物を使用して得られるデータから用量反応曲線を作製することによって、評価することができる。また、対照アッセイを、比較用のベースラインを提供するために行なうこともできる。例えば、対照アッセイでは、単離および精製されたＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３を、ＴβＲＩＩポリペプチドを含有する組成物に添加し、ＴβＲＩＩ／ＴＧＦβ１複合体またはＴβＲＩＩ／ＴＧＦβ３複合体の形成を、試験化合物の非存在中で定量化する。一般に、反応物を混合し得る順序は変化させることができること、および同時に混合することができることが理解される。また、精製されたタンパク質に代えて、細胞抽出物および溶解物を、好適な無細胞アッセイ系にするために使用してもよい。
【０２１３】
ＴβＲＩＩポリペプチドおよびＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３の間の複合体形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節を、例えば、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または酵素標識されたＴβＲＩＩポリペプチドもしくはＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３などの検出可能に標識されたタンパク質を使用して、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって、定量化することができる。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびその結合タンパク質の間の相互作用の程度を、直接的または間接的のいずれかで測定する際に、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波路（ＰＣＴ公開の国際公開第９６／２６４３２号および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサー、および表面力センサーに基づくものなどの他の検出様式は、本発明の多くの実施形態に適合する。
【０２１５】
また、本発明は、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびその結合タンパク質の間の相互作用を破壊または増強する薬剤を特定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知の、相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；  Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６を参照されたい。詳細な実施形態では、本発明は、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびその結合タンパク質の間の相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を特定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する。例えば、Ｖｉｄａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｇｒａｉｎ，  （１９９９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：９１９−２９；Ｖｉｄａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｇｒａｉｎ，  （１９９９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：３７４−８１；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；米国特許第５，９５５，２８０号；および米国特許第５，９６５，３６８号を参照されたい。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、対象の化合物は、本発明のＴβＲＩＩまたはＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３ポリペプチドと相互作用するそれらの能力によって特定される。化合物およびＴβＲＩＩポリペプチドまたはＴＧＦβ１ポリペプチドまたはＴＧＦβ３ポリペプチドの間の相互作用は、共有的または非共有的であり得る。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合およびアフィニティークロマトグラフィーを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生化学的方法を使用して、タンパク質レベルで特定することができる（Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６：  １）。ある特定の場合では、化合物は、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３またはＴβＲＩＩポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイなどの、機構に基づくアッセイでスクリーニングしてもよい。これは、固相または流動相の結合イベントを含み得る。あるいは、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３またはＴβＲＩＩポリペプチドをコードする遺伝子を、レポーターシステム（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）とともに細胞にトランスフェクトし、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによってライブラリーに対して、またはライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングすることができる。他の機構に基づく結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイを使用してもよい。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されるか、固定された抗体によって捕捉されるか、またはキャピラリー電気泳動によって分解される標的を用いて行なうことができる。結合した化合物は、通常、比色分析もしくは蛍光、または表面プラズモン共鳴を使用して、検出され得る。
【０２１７】
ある特定の態様では、本発明は、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３が媒介する細胞シグナル伝達を調節する（刺激する、または阻害する）ための方法および薬剤を提供する。したがって、特定された任意の化合物は、全細胞または組織において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで試験して、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３シグナル伝達を調節するそれらの能力を確認することができる。当技術分野において公知の様々な方法をこの目的のために利用することができる。
４．例示的な治療的使用
【０２１８】
本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬とは、統計学的試料中で、未処置の対照試料と比べて、処置試料における障害もしくは状態の発生を低減させるか、あるいは未処置の対照試料と比べて、障害または状態の１つもしくは複数の症状の発生を遅延させるか、またはその症状の重症度を低減させる化合物を指す。
【０２１９】
「処置」、「処置すること」、「緩和」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味し、処置される状態の１つもしくは複数の症状の重症度を改善すること、緩和すること、および／または減少させることを指すためにも使用され得る。効果は、疾患、状態もしくはその症状の開始または再発を、完全または部分的に遅延させる観点から予防的であってもよく、ならびに／あるいは疾患もしくは状態、および／または疾患もしくは状態に起因する有害効果を、部分的または完全に治癒させる観点で治療的であってもよい。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物、特に、ヒトの疾患または状態の任意の処置を包含し、（ａ）疾患もしくは状態に罹患しやすくあり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において生じる疾患または状態を予防すること；（ｂ）疾患もしくは状態を阻害すること（例えば、その発生を阻止すること）；あるいは（ｃ）疾患もしくは状態を軽減すること（例えば、疾患もしくは状態の退行を引き起こすこと、１つもしくは複数の症状の改善を提供すること）を含む。
【０２２０】
「患者」、「対象」または「個体」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語には、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、実験動物、家畜動物（ウシ、ブタ、ラクダなどを含む）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、他の飼育動物など）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の実施形態では、患者、対象または個体はヒトである。
【０２２１】
本明細書で使用される場合、「組合せ」、「との組み合わせで」、「共投与」などは、第２の療法が身体内で依然として有効であるように（例えば、２つの化合物が、患者において同時に有効であり、これは、２つの化合物の相乗効果を含み得る）、任意の形態の投与を指す。有効性は、血液、血清または血漿中の薬剤の測定可能な濃度に関連しないことがある。例えば、異なる治療用化合物は、同じ製剤中または別々の製剤中のいずれかで、同時的または逐次的のいずれかで、異なるスケジュールで投与することができる。したがって、このような処置を受ける個体は、異なる療法の組合せ効果から利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数のＴＧＦβアンタゴニストは、１つもしくは複数の他の追加薬剤または支持療法と同時に、その前に、またはその後に、投与することができる。一般に、それぞれの治療剤は、特定の薬剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与される。レジメンにおいて用いられる特定の組合せは、達成される療法および／または所望の治療効果とともに、本開示のアンタゴニストの適合性を考慮に入れる。
【０２２２】
一部分では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを必要な患者に投与することによる、異所性骨化を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストにより、必要な患者における異所性骨化の重症度および／または期間を予防または低減することに関する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを必要な患者に投与することによって、異所性骨化に関連する疾患または状態を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストにより、必要な患者における異所性骨化に関連する疾患または状態の重症度および／または期間を予防または低減することに関する。必要に応じて、このような方法は、異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、ＴＧＦβアンタゴニストを投与することをさらに含む。
【０２２３】
一般に、異所性骨化（ＨＯ）は、骨格の骨膜（骨格系）の外側の軟組織部位における成熟した層板骨の類骨形成の結果である。多くの場合、ＨＯの開始の前の刺激する事象、通常、血腫をもたらし得る外傷のエピソードがある。一般に、ＨＯの進行は、骨芽細胞または軟骨芽細胞に分化することができる、多能性（多分化能）間葉系細胞の供給を必要とする。しかしながら、他のＨＯ発生の背後の作用機構は、大部分は未知である。類骨形成は、多くの場合、局所的腫脹、疼痛、紅斑、および時々発熱によって特徴付けられる炎症期に関連する。この病理学的プロセスは、皮膚、皮下組織、骨格筋、および関節に隣接する線維性組織などの部位において起こり得る。骨は、血管壁および靱帯においても形成されることがある。病変は、小さな臨床的に重要でない病巣から、身体全体に及ぶ非常に多くの沈着の範囲である。ＨＯは、関節拘縮および関節強直、疼痛、痙縮、腫脹の発熱、神経血管圧迫症候群、褥瘡および著しい身体障害において生じ得る。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、異所性骨化（例えば、骨沈着、骨髄腔の形成、関節拘縮、関節強直、疼痛、痙縮、腫脹、発熱、神経血管圧迫症候群および褥瘡）に関連する１つまたは複数の合併症を処置する方法に関する。
【０２２４】
ＨＯは、最も一般的には、脊髄損傷、外傷、脳損傷、熱傷、骨折、筋肉挫傷および関節形成術に関連する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、脊髄損傷、外傷、脳損傷、熱傷、骨折、筋肉挫傷および関節形成術からなる群から選択される１つもしくは複数の障害または状態に関連する異所性骨化を処置する方法に関する。
【０２２５】
ＨＯは、臀部、寛骨臼および肘の骨折の外科手術の深刻な合併症である。完全股関節形成術（関節置換術）または下腿の長骨の重度の骨折を有する約３人に１人の患者は、ＨＯを発生するが、まれに症候性である。以前の股関節形成術後にＨＯを発生した５０％〜９０％の患者は、さらに異所性骨化を発生する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、関節、臀部、寛骨臼および肘の骨折の外科手術（例えば、置換手術）の１つまたは複数に関連する異所性骨化を処置する方法に関する。
【０２２６】
ＨＯは、多くの場合、外傷を有する患者において発生する。特に、ＨＯは、脳および脊髄損傷に関連し、これは、外傷性脳損傷が骨折治癒の促進を引き起こす臨床的観察の主な原因であり得る。Ｍｏｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｉｎｊｕｒｙ  ３６（３）：  ３６３。ＨＯは、重度の熱傷、戦闘関連外傷および肢切断にも関連する。外傷性異所性骨化において、患者は、筋肉における温感、圧痛、硬い腫脹、ならびに関与する筋肉によって支配される関節における可動域の減少を訴えることがある。多くの場合、数週間から数か月前にその領域への打撃または他の外傷の病歴がある。異所性骨化を発生した、外傷性神経損傷、重度の神経障害または重度の熱傷を有する患者は、影響がある領域における運動制限を経験する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、必要な患者に投与することによって、外傷、脳または脊髄損傷、熱傷、戦闘関連外傷および肢切断の１つまたは複数に関連する異所性骨化を処置する方法に関する。
【０２２７】
進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）などの異所性骨化を引き起こす稀な遺伝性障害も存在する。ＦＯＰは、極めて稀な結合組織疾患である。この疾患は、身体の修復機構の突然変異によって引き起こされ、線維性組織（筋肉、腱および靱帯を含む）に、自然発症的、または損傷を受けた場合に、骨化を引き起こす。多くの場合、傷害は、関節をその場所で永久にこわばらせ得る。未知の理由により、ＦＯＰを有する小児の骨は、変形した足の親指、場合により関節の欠損を有し、または単にマイナーな関節に目立つしこりを示す。ＦＯＰの骨の形成をもたらす第１の「フレアアップ」は、通常、１０歳より前に起こる。胎児において骨が成長するのと全く同じように、骨の成長が、上から下に進行する。ＦＯＰを有する小児は、典型的には、首から始まって、次いで、肩、腕、胸部領域、最終的に足に、骨が発生する。特に、骨化は、典型的には、最初、身体の背部、軸部、頭蓋および基部領域に見られる。その後、疾患は、身体の腹部、体肢、尾側、および末端領域に進行する。しかしながら、フレアアップを引き起こす損傷に起因して、必ずしもこの順序で起こるわけではない。多くの場合、この疾患を特徴付ける腫瘍様のしこりが突然現れる。この状態は、関節に影響を与える運動機能の喪失を引き起こし、発話および食事を制限する完全な開口を不可能にすることを含む。胸郭の周囲での余分な骨形成は、呼吸の合併症を引き起こす肺および横隔膜の拡張を制限する。この疾患は非常に稀であるので、症状は、多くの場合、がんまたは線維症と誤診される。これは、医師を生検の指示に誘導し、これは、これらのしこりの成長を悪化させ得る。生存の年齢の中央値は、適切な管理により、４０歳である。しかしながら、診断が遅れると、外傷および感染症が平均余命を減少させ得る。一般に、ＦＯＰは、染色体２ｑ２３−２４における常染色体優性の対立遺伝子によって引き起こされる。対立遺伝子は、可変の発現度を有するが、完全な浸透率を有する。ほとんどの症例は、配偶子における自然突然変異によって引き起こされる。類似しているが、難治性がより低い疾患は、線維性骨異形成症であり、これは、接合後の突然変異によって引き起こされる。ＡＣＶＲ１遺伝子（アクチビン様キナーゼ２（ＡＬＫ２）としても公知）における突然変異は、この疾患の原因である。ＡＣＶＲ１は、アクチビン受容体１型、ＢＭＰ１型受容体をコードする。突然変異は、ＡＣＶＲ１タンパク質において、コドン２０６のアルギニンからヒスチジンへの置換を引き起こす。この置換は、ＡＣＶＲ１の異常活性化を引き起こし、結合組織および筋肉組織の二次骨格への変換をもたらす。これは、内皮細胞を、間葉系幹細胞に、次いで骨に変換させる。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化および／または進行性骨化性線維異形成症を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、進行性骨化性線維異形成症に関連する異所性骨化を処置する方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化および／または線維性骨異形成症を処置す��ための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、線維性骨異形成症に関連する異所性骨化を処置する方法に関する。
【０２２８】
ＦＯＰについての治療法または承認された処置は存在しない。骨を外科的に除去する試みは、爆発的な骨の成長をもたらす。イソトレチノイン、エチドロネートと経口コルチコステロイド、およびマレイン酸ペルヘキシリンの臨床試験は、有効性を実証することに失敗したとはいえ、この疾患の経過の変動性および低い有病率は不確実性を誘導する。希少疾患に目を向ける一握りの製薬会社は、現在、ＦＯＰのための異なる治療アプローチへの検討の様々な段階にある。２０１５年８月に、米国食品医薬品局のオーファン製品開発部は、ＦＯＰのための２つの新規化合物のために、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのオーファンドラッグ指定を認めた。この化合物は、ＡＣＶＲ１（ＡＬＫ２）を選択的に遮断するように設計された低分子キナーゼ阻害剤である。２０１５年８月に、Ｃｌｅｍｅｎｔｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも、ＦＯＰの処置のためにパロバロテンを検討するフェーズＩＩの臨床試験への小児の登録を開始した。前臨床研究は、レチノイン酸受容体ガンマアゴニストであるパロバロテンが、ＢＭＰ経路における二次メッセンジャー系の阻害を介して、動物モデルにおいて異常な骨形成を阻止したことを実証した。２０１５年９月に、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎは、アクチビンＡによるＡＣＶＲ１受容体の活性化が関与する疾患の機構への新たな洞察を公表した。２０１６年に、この会社は、健康なボランティアにおけるＲＥＧＮ  ２４７７（アクチビンＡ抗体）のフェーズ１研究を開始した。別の可能性がある治療アプローチは、正常なＡＣＶＲ１遺伝子発現を保ちながら、分解のために突然変異したｍＲＮＡを標的にする対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉を含む。Ｊ．Ｗ．  Ｌｏｗｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（７０１−７０２）：  ７０１−７０２。強力な構成的に活性なＡＬＫ２  Ｒ２０６Ｈ突然変異体を発現するＦＯＰのマウスモデルは、間葉系細胞における核レチノイン酸受容体−α（ＲＡＲ−α）に対する選択的アゴニストの特定において有用であることが見出された。ＲＡＲ−αアゴニストは、部分的にＨＯを阻害することが見出されたが、ＲＡＲ−γに対するアゴニストは、ＦＯＰモデルにおける筋肉内および皮下のＨＯの強力な阻害剤であることが見出された。Ｓｈｉｍｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７：４５４−６０）。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、ＦＯＰを処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、ＦＯＰに関連する異所性骨化を処置する方法であって、追加の活性薬剤または支持療法が、イソトレチノイン、エチドロネートと経口コルチコステロイド、マレイン酸ペルヘキシリン、ＡＬＫ２低分子阻害剤、パロバロテン、レチノイン酸受容体ガンマアゴニスト、レチノイン酸受容体アルファアゴニスト、アクチビン抗体（例えば、ＲＥＧＮ  ２４７７などのアクチビンＡ抗体）およびＡＬＫ２の対立遺伝子特異的ＲＮＡ干渉からなる群から選択される、方法に関する。
【０２２９】
異所性骨化を引き起こす別の稀な遺伝性障害は、進行性骨異形成症（ＰＯＨ）であり、これは、皮膚または皮下の骨化によって特徴付けられる状態である。ＰＯＨは、アデニリルシクラーゼの活性化において多くのＧタンパク質共役受容体の下流で作用する刺激性グアニンヌクレオチド結合タンパク質のアルファサブユニットであるＧαｓをコードするＧＮＡＳ遺伝子における不活性化突然変異に関連する。Ｋａｐｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９４，  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ  ７６，  ４２５−４３６；Ｓｈｏｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６，  ９９−１０６；およびＥｄｄｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １５，  ２０７４−２０８３。臨床的には、ＰＯＨは、乳児期に皮膚および皮下の骨化を示し、小児期に骨格筋および深部結合組織（例えば、腱、靭帯、筋膜）に進行する。時間と共に、これらの骨化は、関節の硬直、骨および関節の融合、ならびに影響を受けた手足の成長遅延をもたらす。現在、ＰＯＨを有する患者は、異所性骨の大幅な外科的切除を受けて、病変の拡大を抑止する。これは、多くの場合、部分的または完全な手足の切断をもたらし、病変は頻繁に再発し（Ｋａｐｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １５，  ２０８４−９４；およびＳｈｅｈａｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４３，  ３４６−３５３）、これは、改善された治療的介入の開発の重要性を明確に示す。ＰＯＨを有する患者において行なわれた観察は、軟組織に存在する間葉系幹細胞が、骨芽細胞に不適切に分化し、骨への沈着を開始することを示唆する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルは両方とも欠いているので、ＰＯＨの病態形成は、未知のままであり、ＨＯのすべての形態と同様に、適切な処置は不足している。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化および／または進行性骨異形成症を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、進行性骨異形成症に関連する異所性骨化を処置する方法に関する。
【０２３０】
ＨＯはまた、成人の呼吸促迫症候群を管理するために神経筋遮断されている患者、および非外傷性脊髄症を有する患者において起こることがある。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、成人の呼吸促迫症候群の管理に使用される神経筋遮断に関連する異所性骨化を処置する方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、必要に応じて異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、非外傷性脊髄症に関連する異所性骨化を処置する方法に関する。
【０２３１】
ＨＯのための処置の明確な形態は存在しない。当初は、ビスホスホネートが、股関節手術後に価値があると期待されたが、予防的に使用されたにもかかわらず、利益の説得力のある証拠はなかった。異所性骨化の予防のための予防的な放射線療法も１９７０年代から用いられている。様々な用量および技術が使用されている。一般に、放射線療法は、外科手術の時点にできるだけ近い時点で送達しなければならない。外科手術の２４〜４８時間以内の単一区画への７〜８グレイの用量で成功裏に使用された。処置体積は、関節周囲の領域を含み、臀部、膝、肘、肩、顎のために、または脊髄損傷後の患者において使用することができる。単一用量の放射線療法は、十分に耐容性を示すことが見出され、出血、感染または創傷の治癒の妨害の増加はなく、費用効果が高い。インドメタシン、イブプロフェンおよびアスピリンなどのある特定の抗炎症剤は、全人工股関節置換術後の異所性骨化の再発の予防において多少の効果を示した。理学療法士または作業療法士によって提供される他動可動域の訓練または他の可動化技術などの保存的処置も、ＨＯの予防の助けになり得る。一部の実施形態では、本開示は、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを、異所性骨化を処置するための１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって、異所性骨化を処置する方法であって、１つもしくは複数の追加の活性薬剤または支持療法が、ビスホスホネート、放射線療法、抗炎症剤（例えば、インドメタシン、イブプロフェンおよびアスピリン）、および他動可動域の訓練または他の可動化技術などの保存的処置からなる群から選択される、方法に関する。
５．医薬組成物  
【０２３２】
本明細書に記載の治療剤（例えば、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド）は、医薬組成物に製剤化され得る。本開示による使用のための医薬組成物は、１つもしくは複数の生理的に許容される担体または賦形剤を使用して、慣用の方法で製剤化され得る。このような製剤は、一般に、ほとんどの規制上の要件に適合する、実質的にパイロジェンフリーである。
【０２３３】
ある特定の実施形態では、本開示の治療方法は、組成物を全身的または局所的に、インプラントまたはデバイスとして投与することを含む。投与される場合、本開示における使用のための治療用組成物は、パイロジェンフリーの、生理学的に許容される形態である。上記に記載の組成物中に、必要に応じて含まれていてもよい、ＴＧＦβシグナル伝達アンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤は、本明細書に開示される方法において、対象の化合物（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド）と同時にまたは連続的に投与され得る。
【０２３４】
典型的には、本明細書に開示されるタンパク質治療剤は、非経口で、特に、静脈内または皮下に投与される。非経口投与に好適な医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌の等張の水溶液もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、あるいは使用の直前に無菌注射溶液または分散液に再構成され得る無菌粉末と組み合わせて、１つまたは複数のＴＧＦβアンタゴニストを含んでいてもよく、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有していてもよい。本開示の医薬組成物において用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０２３５】
組成物および製剤は、所望により、活性成分を含有する１つもしくは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで提供されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック製のホイルを含んでいてもよい。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与についての使用説明書が添付されていてもよい。
【０２３６】
さらに、組成物は、標的組織部位への送達のための形態でカプセル化または注射されてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数の治療用化合物（例えば、ＴＧＦβアンタゴニスト）を標的組織部位に送達する能力があり、組織が成長するための構造を提供し、最適には、身体内に再吸収される能力があるマトリックスを含んでいてもよい。例えば、マトリックスは、ＴＧＦβアンタゴニストの徐放を提供し得る。このようなマトリックスは、他の移植医学適用のために現在使用されている材料で形成されてもよい。
【０２３７】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観および界面特性に基づく。対象の組成物の特定の適用は、適切な製剤を規定する。組成物のための有望なマトリックスは、生分解性で、化学的に規定される、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の有望な材料は、骨または皮膚コラーゲンなどの、生分解性で、生物学的に十分に規定されるものである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分で構成される。他の有望なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミナートまたは他のセラミックなどの、非生分解性で、化学的に規定されるものである。マトリックスは、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなどの上記で述べた種類の材料のいずれかの組合せで構成され得る。バイオセラミックは、カルシウム−アルミナート−ホスフェート中などの組成物中で改変されてもよく、処理して孔径、粒子径、粒子形状および生分解性が改変される。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、経口的に、所定量の薬剤を活性成分としてそれぞれ含有する、例えば、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味付けされた基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用する）、散剤、顆粒剤の形態で、あるいは水性もしくは非水性液体中の液剤または懸濁剤として、あるいは水中油型もしくは油中水型の液体エマルジョンとして、あるいはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、あるいはトローチ（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用する）として、ならびに／あるいは洗口剤などとして投与することができる。薬剤はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与されてもよい。
【０２３９】
経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、散剤、顆粒剤など）において、本発明の１つまたは複数の治療用化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかと混合され得る：（１）フィラーまたは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレー；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合において、医薬組成物はまた、緩衝剤を含んでいてもよい。同様の種類の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する、軟および硬ゼラチンカプセルにおいてフィラーとして用いられてもよい。
【０２４０】
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有していてもよい。不活性希釈剤以外に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、香料ならびに保存剤などの補助剤も含み得る。
【０２４１】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物を含有していてもよい。
【０２４２】
本発明の組成物はまた、補助剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含有していてもよい。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含によって、確実にされ得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることも望ましくあり得る。加えて、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の包含によって、もたらされ得る。
【０２４３】
投薬量レジメンは、対象の本発明の化合物（例えば、ＴＧＦβアンタゴニスト）の作用を変える様々な要因を考慮して、主治医によって決定されることが理解される。様々な要因としては、限定されるものではないが、患者の年齢、性別および食事、疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられる。必要に応じて、投薬量は、再構成において使用されるマトリックスの種類、および組成物中の化合物の種類によって変化し得る。最終組成物への他の公知の成長因子の添加も投薬量に影響を与え得る。進行は、骨の成長および／または修復、例えば、Ｘ線（ＤＥＸＡを含む）、組織形態計測的決定およびテトラサイクリン標識の定期的評価によって、監視することができる。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＴＧＦβアンタゴニストのｉｎ  ｖｉｖｏ産生のための遺伝子治療も提供する。このような治療は、上記で列挙したような障害を有する細胞または組織へのＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチド配列の導入によって、その治療効果を達成するであろう。ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクター、またはコロイド分散系を使用して、達成することができる。標的化リポソームの使用が、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチド配列の治療的送達のために好ましい。
【０２４５】
本明細書において教示されている遺伝子治療のために利用され得る様々なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたは鳥類レトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。いくつかの追加のレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組み込むことができる。すべてのこれらのベクターは、形質導入細胞を特定および作製することができるように、選択マーカー用の遺伝子を移行または組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することによって、達成される。当業者は、特定のポリヌクレオチド配列が、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするために、レトロウイルスゲノムに挿入され、またはウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。好ましい実施形態では、ベクターは、骨または軟骨に標的化される。
【０２４６】
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドで直接トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られる細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地に放出する。
【０２４７】
ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドのための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンが水性の内部に封入され、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ６：７７，  １９８１を参照されたい）。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子導入のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ６：６８２，  １９８８を参照されたい。リポソーム組成物は、通常、リン脂質の組合せ、通常、ステロイド、特に、コレステロールとの組合せである。他のリン脂質または他の脂質も使用し得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
【０２４８】
リポソームの製造において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームの標的化はまた、例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づくことによっても可能であり、当技術分野において公知である。
【０２４９】
本開示は、ｐＨを調整するための酸および塩基；ならびに狭い範囲内でｐＨを保つための緩衝剤を含んで、変更され得る製剤を提供する。
例示
【０２５０】
以下、本発明を一般に記載し、本発明のある特定の実施形態の例示の目的のために単に含まれ、本発明を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０２５１】
（実施例１）
受容体融合タンパク質バリアントの作製
ＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアント
ヒトＴβＲＩＩの可溶性細胞外部分およびヒトＦｃ部分を含むＴβＲＩＩ融合タンパク質を作製した。それぞれの融合タンパク質について、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＴβＲＩＩアミノ酸配列を、いくつかの異なるリンカーの１つによって、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＩｇＧ  Ｆｃ部分と融合した。それぞれの融合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列（下記）を有するＴＰＡリーダー配列も含んでいた。
【０２５２】
組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２３）
【０２５３】
いくつかの設計された構築物の実例の概要を図３として提示する。例示項において試験された異なる構築物についての配列を詳述した表を下記に提示する。
【表１】
2021512919.tif 000028
【０２５４】
構築物の成分についてのアミノ酸配列およびそれぞれの構築物を、これらの構築物を発現するために使用される核酸配列とともに、下記に提示する。
【化２７】
2021512919.tif 000029
【化２８】
2021512919.tif 000030
【０２５５】
下記に記載の動物実験のために、配列番号９のマウスバージョンを、ヒトＴβＲＩＩのアイソフォームＡに対応するＴβＲＩＩのマウス細胞外ドメインを、リンカードメイン（ＴＧＧＧ）を介してマウスＧ１Ｆｃに融合することによって、作製した。この融合タンパク質は、本明細書においてｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃという。
【０２５６】
【化２９】
2021512919.tif 000031
【化３０】
2021512919.tif 000032
【化３１】
2021512919.tif 000033
【化３２】
2021512919.tif 000034
【化３３】
2021512919.tif 000035
【化３４】
2021512919.tif 000036
【化３５】
2021512919.tif 000037
【０２５７】
様々な構築物は、ＣＨＯ細胞中で成功裏に発現され、分析的なサイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、高純度に精製された。ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃタンパク質は、３７℃で１３日間ＰＢＳ中で保持された場合に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定される同様の強い安定性を示した。ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃタンパク質は、ラット、マウスまたはヒト血清中でも保持され、同様の強い安定性を示した。
ＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアント
【０２５８】
上記に記載の融合タンパク質（例えば、配列番号１８）に含まれるＴβＲＩＩドメインに加えて、本開示は、代替のＴβＲＩＩドメインを含む融合タンパク質も企図する。例えば、融合タンパク質は、下記に示す野生型ｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２３〜１５９）配列（配列番号２７）、または下記に開示する任意の他のＴβＲＩＩポリペプチドを含んでいてもよい。
【化３６】
2021512919.tif 000038
【０２５９】
（１）下記に示すｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）アミノ酸配列（配列番号３６）、ここで、置換された残基に下線を引いている。
【化３７】
2021512919.tif 000039
【０２６０】
（２）下記に示すＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２９〜１５９）アミノ酸配列（配列番号２８）。
【化３８】
2021512919.tif 000040
【０２６１】
（３）下記に示すＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（３５〜１５９）アミノ酸配列（配列番号２９）。
【化３９】
2021512919.tif 000041
【０２６２】
（４）下記に示すＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２３〜１５３）アミノ酸配列（配列番号３０）。
【化４０】
2021512919.tif 000042
【０２６３】
（５）下記に示すＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）アミノ酸配列（配列番号３８）、ここで、置換された残基に下線を引いている。
【化４１】
2021512919.tif 000043
【０２６４】
出願人はまた、上記および下記に示す野生型ｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１８４）配列（配列番号２０）に基づいて、対応する５つのバリアント（配列番号３７、３３、３４、３９）も構想し、ここで、２５アミノ酸の挿入に下線を引いている。スプライシングが、挿入に隣接するＣ末端位での保存的アミノ酸置換（Ｖａｌ→Ｉｌｅ）をもたらすことに留意されたい。
【化４２】
2021512919.tif 000044
【０２６５】
（１）下記に示すｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１８４／Ｄ１３５Ｋ）アミノ酸配列（配列番号３７）、ここで、置換された残基に二重下線を引いている。
【化４３】
2021512919.tif 000045
【０２６６】
（２）下記に示すＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２９〜１８４）アミノ酸配列（配列番号３３）。
【化４４】
2021512919.tif 000046
【０２６７】
（３）下記に示すＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（６０〜１８４）アミノ酸配列（配列番号２９と同じ）。
【化４５】
2021512919.tif 000047
【０２６８】
（４）下記に示すＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３４）。
【化４６】
2021512919.tif 000048
【０２６９】
（５）下記に示すＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１７８／Ｎ９５Ｄ）アミノ酸配列（配列番号３９）、ここで、置換された残基に二重下線を引いている。
【化４７】
2021512919.tif 000049
【化４８】
2021512919.tif 000050
【０２７０】
追加のＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアントとしては、以下が挙げられる。
（Ａ）下記に示すＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（３５〜１５３）またはｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（６０〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３２）。
【化４９】
2021512919.tif 000051
【０２７１】
（Ｂ）下記に示すＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２９〜１５３）アミノ酸配列（配列番号３１）。
【化５０】
2021512919.tif 000052
【０２７２】
（Ｃ）下記に示すＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２９〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３５）。
【化５１】
2021512919.tif 000053
【０２７３】
上記のバリアント（配列番号３６、２８、２９、３０、３８、３７、３３、３４、３９、３２、３１および３５）のいずれかは、ｈＴβＲＩＩアイソフォームＣにおいて天然に存在するように（Ｋｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：３１８，  ２００７）、ｈＴβＲＩＩ  ＥＣＤのＣ末端の近くに位置するグルタミン酸残基の対（配列番号１の１５１位および１５２位、または配列番号２の１７６位および１７７位）の間の３６アミノ酸（配列番号４１）の挿入を組み込むことができた。
【化５２】
2021512919.tif 000054
【０２７４】
例として、任意の挿入部位に隣接する対のグルタミン酸残基を、ｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２９〜１５９）バリアント（配列番号２８）について、下記に表す（下線）。
【化５３】
2021512919.tif 000055
Ｆｃドメインバリアント
【０２７５】
上記に記載の構築物を、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＦｃドメインを用いて作製したが、本開示は、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（配列番号４２、下記）または全長ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ｈＧ１Ｆｃ）（配列番号４３、下記）を含む、代替Ｆｃドメインを含むｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ融合タンパク質を企図する。必要に応じて、Ｆｃドメインと無関係のポリペプチドを、Ｆｃドメインの場所に付着させることができた。
【化５４】
2021512919.tif 000056
リーダー配列バリアント
【０２７６】
上記に記載の作製された構築物は、ＴＰＡリーダー配列を含んでいたが、天然のリーダー配列（配列番号２２、下記）またはミツバチメリチン（配列番号２４、下記）のリーダー配列などの代替リーダー配列を使用し得る。
【化５５】
2021512919.tif 000057
（実施例２）
細胞に基づくアッセイにおける受容体融合タンパク質バリアントによる分化リガンド阻害
【０２７７】
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ拡張ヒンジ−ｈＦｃタンパク質に対するＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２ならびにＴＧＦβ３の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価し、結果を図４Ａおよび４Ｂにまとめる。それぞれの融合タンパク質は、高親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する能力があったが、（Ｇ４Ｓ）４より長いか、または（Ｇ４Ｓ）４と同じ長さのリンカーを有する構築物は、驚くべきことに、（Ｇ４Ｓ）４より短い長さのリンカーを有する構築物よりも、高親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の両方に結合する能力があった。ＴＧＦβ２およびいずれかの構築物の間の結合は、低いか、または一過性であった。構築物の脱グリコシル化は、結合を変化させなかった。
【０２７８】
Ａ５４９細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の活性を阻害するｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃバリアントの能力を決定した。このアッセイは、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Ｄｅｎｎｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  ＥＭＢＯ  １７：  ３０９１−３１００）、およびトランスフェクト効率について制御するためのＲｅｎｉｌｌａレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）でトランスフェクトされたヒト肺癌細胞系に基づく。ＣＡＧＡモチーフは、ＴＧＦβ応答遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在し、そのため、このベクターは、一般に、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介してシグナル伝達する因子のために使用される。
【０２７９】
アッセイの初日に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＣＣＬ−１８５（商標））を４８ウェルプレートに分配した。２日目に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、ｐＲＬＣＭＶ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶液をプレインキュベートし、次いで、０．１％のＢＳＡで補充されたＥａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））に添加し、これを、３７℃、５％のＣＯ２で終夜、インキュベーションのために、蒔かれた細胞に適用した。３日目に、培地を除去し、細胞を、下記に記載のようにして調製されたリガンドおよび阻害剤の混合物とともに、３７℃、５％のＣＯ２で終夜インキュベートした。
【０２８０】
被験物質の連続希釈を、アッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ＋０．１％のＢＳＡ）中、４８ウェルプレートで行った。試験リガンドを含有する等体積のアッセイ緩衝液を添加して、以前に決定されたＥＣ５０と等しい最終リガンド濃度を得た。ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手した。試験溶液を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、混合物の一部をすべてのウェルに添加した。試験溶液との終夜のインキュベートの後、細胞をリン酸緩衝食塩水ですすぎ、次いで、ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）で溶解し、−７０℃で終夜保管した。４日目および最終日に、プレートを穏やかに振とうしながら室温に温めた。細胞溶解物を二反復で化学発光プレート（９６ウェル）に移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）からの試薬を用いて発光光度計で分析して、正規化されたルシフェラーゼ活性を決定した。
【０２８１】
図５Ａ〜５Ｆにおいて示されるように、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ拡張ヒンジ−ｈＦｃタンパク質はすべて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の両方を阻害する能力があった。興味深いことに、改善されたＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３阻害とｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ構築物についてのリンカーの長さの間に相関が存在したが（図５Ｅ）、この改善傾向は、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ構築物について、プラトーになったように見えた（図５Ｆ）。
（実施例３）
異所性骨化動物モデルにおけるＴβＲＩＩ−Ｆｃの効果
【０２８２】
異所性骨化（ＨＯ）は、一般に重度の外傷、火傷の後に起こり得、先天性疾患の進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）の衰弱の帰結である。病因は、十分に理解されていないままであり、しかしながら、炎症は、ＨＯの発生部位に動員されるいくつかの炎症細胞の種類とともに重要な役割を果たしていると推定される。ＨＯの進行における上記に記載のｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃの効果を、ＨＯ動物モデルを使用して検討した。
【０２８３】
動員されたマクロファージは、炎症微小環境に影響を与えるサイトカインの公知の起源である。したがって、培養マクロファージにおけるＴＧＦβ１の分泌を最初に評価した。骨髄由来マクロファージを分離し、Ｍ２表現型にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極させた。分泌されたＴＧＦβを、ＥＬＩＳＡを使用して条件培地中で測定した。興味深いことに、Ｍ０マクロファージは、最小限のＴＧＦβ１のみを分泌するが、ＨＯにおける骨沈着の部位で起こるものなどの炎症部位に動員されることが公知の再生Ｍ２マクロファージは、ＴＧＦβ１分泌において５００倍の増加であることが観察された。さらにまた、ＴＧＦβ１分泌における増加は、ｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃ（５．４４μｇ／ｍｌ）が培養培地中に存在する場合、完全に無効化された（図６Ａ）。
【０２８４】
次に、全身投与されたｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃの効果を、３０％の背面の熱傷およびアキレス腱切除術を含む外傷性異所性骨化のモデルで観察した。Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１３（３）：  Ｅ３３８−３４７。６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＨＯについて誘導し、次いで、１）ｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）による処置（ｎ＝１０）または２）ＰＢＳ対照（ｎ＝１０）の２つの処置群の１つに無作為化した。これに、週に２回、３週間、皮下投与した。３週目に、組織学試料を収集し、脱灰し、サフラニンＯで染色して、ＨＯ原基の形成を評価した。成熟型ＨＯの体積を、９週目に、マイクロＣＴ分析および画像再構成を使用して、定量化した。３週間の処置の後、ｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃで処置されたマウスにおける実質的に減弱されたＨＯ原基の発生を、骨沈着および骨髄腔の形成の減少とともに、組織学的実験の際に観察した（図６Ｂ）。さらにまた、成熟ＨＯの体積は、ｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃ処置群において顕著に減少した（図６Ｃ）。
【０２８５】
この研究において、ＴＧＦβ１シグナル伝達が、ＨＯ形成において重要な役割を果たし、ｍＴβＲＩＩ−ｍＦｃによる処置が、異所性骨沈着の減弱において有効であり、したがって、ＨＯの体積の減少をもたらすことを実証した。したがって、これらのデータは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび他のＴＧＦβアンタゴニストがＨＯを処置するために使用され得ることを示唆し、ヒト患者におけるこの状態の処置のための新たな手段を明らかにする。
参照による組み込み
【０２８６】
本明細書において言及されたすべての刊行物および特許は、各個の刊行物または特許が、参照により本明細書に組み込まれると具体的かつ個々に示されている場合のように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
主題の特定の実施形態を説明してきたが、上記の明細書は例示的なものであって、限定的なものではない。多くの改変は、本明細書および下記の特許請求の範囲の検討の際に、当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を均等物のその全範囲と一緒に参照し、本明細書をこのような変形と一緒に参照することによって、決定されるべきである。
【図１】
2021512919.tif 000058
【図２】
2021512919.tif 000059
【図３】
2021512919.tif 000060
【図４−１】
2021512919.tif 000061
【図４−２】
2021512919.tif 000062
【図５−１】
2021512919.tif 000063
【図５−２】
2021512919.tif 000064
【図５−３】
2021512919.tif 000065
【図５−４】
2021512919.tif 000066
【図５−５】
2021512919.tif 000067
【図５−６】
2021512919.tif 000068
【図６】
2021512919.tif 000069
【図７】
2021512919.tif 000070
【配列表】
2021512919000001.app
【国際調査報告】
2021512919.tif 000071
2021512919.tif 000072
2021512919.tif 000073