(57)【要約】【要約書】  本発明は、新規なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、これを含む遺伝子発現用組成物、微生物、及びこれを用いたプリンヌクレオチドの製造方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のポリヌクレオチド配列でｉ）１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、ｉｉ）１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、またはｉｉｉ）１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されて１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現用組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、ベクター。
【請求項５】
前記目的タンパク質が、アデニロコハク酸シンテターゼである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載のベクターを含む、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項８】
前記目的タンパク質が、アデニロコハク酸シンテターゼである、請求項７に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項７に記載の微生物。
【請求項１０】
請求項７に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、プリンヌクレオチドの製造方法。
【請求項１１】
前記培養する段階の後、前記微生物または培地からプリンヌクレオチドを回収する段階をさらに含む、請求項１０に記載のプリンヌクレオチドの製造方法。
【請求項１２】
目的タンパク質の発現増加のための、請求項１に記載のポリヌクレオチドの用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、これを含む遺伝子発現用組成物、微生物、これを用いたプリンヌクレオチドの製造方法及び前記ポリヌクレオチドの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系物質の１つである５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate；以下ＩＭＰ）は、核酸生合成代謝系の中間物質であって、医薬品及び各種医療的利用などの多方面に利用されている。また、５’−グアニル酸（5'-guanine monophosphate；以下ＧＭＰ）と共に食品調味添加剤または食品用として広く利用されている物質である。ＩＭＰは、それ自体で牛肉の味を出すことが知られており、ＧＭＰと共にグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を強化することが知られて、呈味性核酸系の調味料として脚光を浴びている。
【０００３】
ＩＭＰを製造する方法としては、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素的に分解する方法、発酵によって生産されたイノシンを化学的にリン酸化する方法（非特許文献１など）及びＩＭＰを直接生産する微生物を培養して、培養液内のＩＭＰを回収する方法などがある。これらの方法の中で、現在最も多く使われている方法は、ＩＭＰを直接生産可能な微生物を用いた方法である。
【０００４】
また、ＧＭＰを製造する方法として、微生物発酵法によって生産した５’−キサンチル酸（5'-xanthosine monophosphate；以下、ＸＭＰ）をコリネ型微生物を用いてＧＭＰに変換する方法及び微生物発酵法によって生産したＸＭＰを大腸菌を用いてＧＭＰに転換させる方法がある。前記方法の中で、ＸＭＰを生産した後にＧＭＰに転換する方法で生産する場合、微生物発酵時に転換反応の前駆体であるＸＭＰの生産性が強化されるべきであり、生産されたＸＭＰだけでなく転換反応の全過程の間に既に生成されたＧＭＰが失われないようにしなければならない。
【０００５】
一方、自然な状態での酵素は、産業的な活用において要求される活性、安定性、光学異性体に対する基質特異性などにおいて、常に最適の特性を示すものではないため、アミノ酸配列の変異などを介して目的とする用途に適した酵素を改良する様々な試みがなされてきた。そのうち、酵素の合理的デザイン（rational design）及び位置選択的突然変異（site-directed mutagenesis）方法が酵素機能を向上するために適用された例であるが、多くの場合、目的酵素の構造に関する情報が不足したり、構造−機能の相関関係が明確ではなく、効果的に適用できないという欠点がある。このような場合、酵素遺伝子のランダム変異を介して構築された変異酵素ライブラリから目的の形質の酵素をスクリーニングする方向的進化（directed evolution）方法により酵素の改良を試みて活性を改善させることが報告されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献２】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０６２００９２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Agri. Biol. Chem., 36, 1511（1972）
【非特許文献２】Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276−２77
【非特許文献４】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献５】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math（1981）2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National BiomedicalＲesearch Foundation, pp. 353−３58（1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986） Nucl. AcidsＲes. 14: 6745
【非特許文献８】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7−１1.8
【非特許文献９】Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記微生物発酵を介してプリンヌクレオチドを生産する方法で高収率のプリンヌクレオチドを生産するために、本発明者らは広範な研究を行い、より高収率のプリンヌクレオチドの生産に有用なプロモーターを見出すことにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの目的は、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、前記ポリヌクレオチドを含む遺伝子発現用組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ベクターを含むコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記微生物を培地で培養する段階を含む、プリンヌクレオチドの製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、目的タンパク質の発現増加のための、前記ポリヌクレオチドの用途を提供することにある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規なプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを用いてコリネバクテリウム属微生物を培養することにより、高収率のプリンヌクレオチド生産が可能である。また、製造されたプリンヌクレオチドは、動物飼料または動物飼料添加剤の他に、人間の食品または食品添加剤、調味料、医薬品などのさまざまな製品に応用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
これを具体的に説明すると、次のとおりである。一方、本明細書で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の発明の説明及び実施形態にも適用できる。すなわち、本明細書で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記に記載された具体的な記述によって、本発明のカテゴリが制限されることはない。
【００１２】
前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の１つ以上のヌクレオチド置換を含むプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供することにある。具体的には、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列内に１つ以上のヌクレオチド置換を含むプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチド置換は、１４３番目のヌクレオチド置換及び１８９番目ヌクレオチドの置換からなる群から選択される少なくともいずれか１つを含む。
【００１３】
本発明のもう一つの様態は、配列番号１のポリヌクレオチド配列でｉ）１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、ｉｉ）１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、またはｉｉｉ）１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されて１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１４】
本明細書において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー（polymer）であって、一定の長さ以上のＤＮＡ鎖である。
本明細書において、用語、「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」は、後ろに連結させる目的遺伝子の発現のためにＲＮＡポリメラーゼまたはエンハンサーなどが結合する部位を含む、目的遺伝子が転写される部位の近くに存在するＤＮＡ領域を意味する。本発明の目的上、前記ポリヌクレオチドは、汎用的弱化プロモーターとして用いられてもよい。その例として、アデニロコハク酸シンテターゼの発現を弱化させうるプロモーターとして用いてもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、プリンヌクレオチドを生産または増加させるのに関与するポリヌクレオチドを意味するが、これに制限されない。
【００１５】
本発明において、前記配列番号１はプロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列を意味する。前記配列番号１のポリヌクレオチド配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。一例として、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）由来であってもよいが、これに制限されない。
【００１６】
また、ポリヌクレオチドは配列番号１の配列で１４３番目及び／または１８９番目のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドであってもよい。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１及び／または配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性（homology）または同一性（identity）を有するヌクレオチド配列で１４３番目及び／または１８９番目のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたものを意味する。相同性または同一性を有するヌクレオチド配列は、１００％同一性を有する配列は除かれる前記範囲のものであってもよく、または１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。
【００１７】
一例として、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列でｉ）１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、ｉｉ）１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、またはｉｉｉ）１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されて１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換された、プロモーター活性を有するものであってもよいが、これに制限されない。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含んでもよいが、これに制限されない。より具体的には、本発明の１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されたポリヌクレオチドは配列番号２、１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されたポリヌクレオチドは配列番号３、または１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されて１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されたポリヌクレオチドは配列番号４のヌクレオチド配列からなってもよいが、これに制限されない。前記ポリヌクレオチドは、前記配列番号２，３または４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性（homology）または同一性（identity）を有するものであってもよい。前記相同性または同一性を有するポリヌクレオチド配列は、前記範囲の中で、１００％同一性を有する配列は除かれるか、１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。
【００１８】
また、本発明で「特定の配列番号で記載されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」と記載されている場合でも、該当配列番号のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも、本発明で使用できることは自明である。例えば、前記ポリヌクレオチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、特定の活性を付与する前記特定１４３番目または１８９番目の変異の他に、該当配列番号のヌクレオチド配列の前後の無意味な配列追加、または自然に発生しうる突然変異、あるいはそのサイレント突然変異（silent mutation）を除外せず、これらの配列追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本発明の範囲内に属するものは自明である。
【００１９】
相同性（homology）及び同一性（identity）は、２つの与えられた塩基配列と関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性（homologous）を有するか同一（identical）の配列は、一般的に、配列全体または全長と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【００２０】
任意の２つのポリヌクレオチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（ Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００２１】
ポリヌクレオチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータープログラムを利用して配列情報を比較することによって決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはヌクレオチド）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップでの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本発明で用いられるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【００２２】
また、本発明のポリヌクレオチドはコドンの縮退性（degeneracy）により、または前記ポリヌクレオチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、ポリヌクレオチド配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよい。配列番号１のポリヌクレオチド配列で１４３番目及び／または１８９番目のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含んでもよい。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェント（厳格）な条件下でハイブリッド化して、配列番号１のヌクレオチド配列で１４３番目及び／または１８９番目のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。前記「ストリンジェントな（厳しい）条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化（ハイブリッド化）を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性（homology）または同一性（identity）が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には、８０％以上、８５％以上、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリッド化する。そして、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を挙げられる。
【００２３】
混成化（ハイブリッド化）は、たとえ混成化の厳密度によって塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに混成化が可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節してもよい。
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている（非特許文献８参照）。
【００２４】
本発明の他の一つの様態は、前記ポリヌクレオチドを含む遺伝子発現用組成物を提供することにある。
前記遺伝子発現用組成物は、本発明のプロモーターによって発現させうる遺伝子を発現する組成物を意味する。その例として、前記遺伝子発現用組成物は、新規なプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含み、さらに前記ポリヌクレオチドをプロモーターとして作動させうる構成を制限なく含んでもよい。本発明の遺伝子発現用組成物において、前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させるように、ベクター内に含まれた形態であってもよい。
【００２５】
本発明の別の一つの様態は、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含む。具体的には、前記目的タンパク質は、アデニロコハク酸シンテターゼであってもよいが、これに制限されない。
本明細書で使用される用語、「ベクター」は、適合な宿主内で目的のポリペプチドを発現できるように、適合な調節配列に作動可能に連結された、前記目的ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【００２６】
本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ4、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系とｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
【００２７】
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを使用して、染色体内に目的のポリヌクレオチドに交替させてもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換え（homologous recombination）によって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち、目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
【００２８】
本発明のもう一つの様態として、本発明のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含む、コリネバクテリウム属微生物を提供する。
また、本発明のもう一つの様態として、本発明のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、コリネバクテリウム属微生物を提供する。
具体的には、前記微生物は、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換によって製造される微生物であるか、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子が含まれた微生物であってもよいが、これに制限されない。
【００２９】
本明細書において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよく、これに限定されない。
また、前記において、用語、「作動可能に連結された」ものとは、本発明のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようなプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００３０】
本明細書で使用される用語、「ポリヌクレオチド及び目的タンパク質を含む微生物」とは、前記ポリヌクレオチドで目的タンパク質の発現が調節された微生物を意味する。前記微生物は、プリンヌクレオチドを生産しうる微生物、自然的に弱いプリンヌクレオチドの生産能を有している微生物、またはプリンヌクレオチドの生産能のない親菌株にプリンヌクレオチドの生産能が付与された微生物であってもよい。具体的には、前記微生物は、アデニロコハク酸シンテターゼを弱化させた微生物であってもよく、例えば、配列番号１のポリヌクレオチド配列で１４３番目及び／または１８９番目のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドを含む微生物であってもよいが、これに制限されない。より具体的には、前記微生物は、配列番号１のポリヌクレオチド配列内に１つ以上のヌクレオチド置換を含むプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む微生物であって、前記ポリヌクレオチド置換は、１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、及び／または１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）への置換を含んでもよい。
【００３１】
前記宿主細胞または微生物は、本発明の目的上、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質を含み、プリンヌクレオチドを生産しうるものであれば、すべて本発明の範囲に含まれてもよい。
本発明で、前記プリンヌクレオチドを生産する微生物は、プリンヌクレオチドを生産する微生物、プリンヌクレオチドの生産能を有する微生物として使用してもよい。
【００３２】
本発明の目的上、「プリンヌクレオチド」は、プリン系の構造を含んでいるヌクレオチドを意味する。その例として、ＩＭＰ、ＸＭＰまたはＧＭＰであってもよいが、これに制限されない。
具体的には、前記用語、「ＩＭＰ(5'-inosine monophosphate)」は、下記の化学式（１）で構成されている核酸系物質の中の一つである。
【００３３】
【化１】
2021510062.tif 000002
【００３４】
ＩＵＰＡＣ名では５’−イノシン一リン酸（5'-inosine monophosphate）、５’−イノシン酸（5'-inosine acid）とも呼ばれ、食品ではＸＭＰ、またはＧＭＰとともに風味増進剤として広く用いられている。
【００３５】
前記用語、「ＧＭＰ（5'-guanine monophosphate）」は、下記の化学式（２）で構成されている核酸系物質の一つである。
【００３６】
【化２】
2021510062.tif 000003
【００３７】
ＩＵＰＡＣ名は[（２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ,５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−オキソ−１,６−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３,４−ジヒドロキシテトラヒドロ−２−フラニル]リン酸二水素メチルであり、他の名前では、５’−グアニジン酸（5'-guanidylic acid）、５’−グアニル酸（5'-Guanylic acid）、またはグアニル酸（guanylic acid）で呼ばれる。
【００３８】
ＧＭＰは塩の形態でグアニル酸ナトリウム、グアニル酸ジカリウム、グアニル酸カルシウムのような食品添加剤として広く用いられ、ＩＭＰと共に添加物として用いられる時、風味を強化するシナジー効果を有する。ＧＭＰはＸＭＰから転換されて製造されてもよいが、これに制限されない。本発明の一実施例で確認されたように、本発明のプロモーターはＸＭＰの生産を増加させることができ、生産量が増加されたＸＭＰからＧＭＰにも転換され、その生産量が増加されうるため、前記ＧＭＰも本発明の範囲に含まれるのは自明である。
【００３９】
前記用語、「ＸＭＰ（5'-xanthosine monophosphate）」は、下記の化学式（３）で構成されているプリン代謝の中間体物質である。ＩＵＰＡＣ名では５’−イノシン一リン酸（5'-inosine monophosphate）、５’−キサンチル酸（5'-xanthylic acid）とも呼ばれ、ＩＭＰ脱水素酵素の作用を介してＩＭＰから形成されるか、ＸＭＰはＧＭＰシンターゼの作用を介してＧＭＰに転換されうる。また、ＸＭＰは（ｄ）ＸＴＰａｓｅ活性を含む酵素、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ピロホスホヒドロラーゼ（deoxyribonucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase）によってＸＴＰから形成されうる。
【００４０】
【化３】
2021510062.tif 000004
【００４１】
本明細書において、用語、「プリンヌクレオチドを生産する微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定メカニズムが弱化されたり強化された微生物であって、目的とするプリンヌクレオチドの生産のために、遺伝的変異が起きたり活性を強化させた微生物であってもよい。本発明の目的上、前記プリンヌクレオチドを生産する微生物は、前記ポリヌクレオチドを含み、目的とするプリンヌクレオチドの生産能が増加したことを特徴とし、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、本発明でプリンヌクレオチドを生産する微生物またはプリンヌクレオチドの生産能を有する微生物は、プリンヌクレオチド生合成経路内の遺伝子の一部が強化または弱化されるか、プリンヌクレオチド分解経路内の遺伝子の一部が強化または弱化された微生物であってもよい。例えば、前記微生物は、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐｕｒＦの発現が強化されるか、ｐｕｒＡの発現が強化されたものであってもよい。さらに、プリンヌクレオチドによって、５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ（inosine-5'-monophosphate dehydrogenase）をコードする遺伝子であるｇｕａＢの発現が調節されてもよい。具体的に、プリンヌクレオチドがＩＭＰである場合、ｇｕａＢ の発現が弱化されたものであってもよく、プリンヌクレオチドがＸＭＰまたはＧＭＰである場合は、ｇｕａＢ の発現が強化されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４２】
本明細書において、用語、「プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介してプリンヌクレオチドの生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、本発明でプリンヌクレオチドの生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、本発明のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むか、または前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されて、向上されたプリンヌクレオチドの生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。前記「向上されたプリンヌクレオチドの生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物」は、形質変化前の親菌株または非変形微生物より、プリンヌクレオチドの生産能が向上された微生物を意味する。前記「非変形微生物」は、天然型菌株自体であるか、前記プリンヌクレオチドを生産するタンパク質変異体を含まない微生物、または前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
【００４３】
本発明において、「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）などであるが、必ずこれに限定されるものではない。
【００４４】
本発明はもう一つの様態として、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、目的物質を生産する方法を提供することにある。一例として、本発明の方法は、前記培養する段階の後、前記微生物または培地から目的物質を回収する段階をさらに含んでもよい。具体的には、前記目的物質は、プリンヌクレオチドであってもよいが、これに制限されない。
【００４５】
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたプリンヌクレオチドは、培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
【００４６】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でん粉及びセルロース）、油及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、ヌクレオチド及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【００４７】
本発明の前記培養段階で生産されたプリンヌクレオチドを回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて、培養液から目的とするプリンヌクレオチドを収集（collect）してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とするプリンヌクレオチドを回収してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収されたプリンヌクレオチドは、精製された形態またはプリンヌクレオチドを含有した微生物発酵液であってもよい（非特許文献９）。
【００４８】
また、本発明の目的上、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む微生物の場合、目的物質の生産量が増加することを特徴とする。特に、野生型コリネバクテリウム属菌株が、プリンヌクレオチドを生産できないか、またはプリンヌクレオチドを生産しても、非常に極微量を生産できるのに対し、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを用いてプリンヌクレオチド生産量を増加させることができる。
【００４９】
本発明のもう一つの様態として、目的タンパク質の発現増加のための、前記ポリヌクレオチドの用途を提供することにある。
【００５０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではなく、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００５１】
実施例１：野生型基盤のＩＭＰ生産株の製作
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ＩＭＰを生産できないか、ＩＭＰを生産しても非常に極微量を生産することができる。したがって、野生型コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２を基にＩＭＰ生産株を製作した。より具体的には、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐｕｒＦの活性を強化させて、５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｇｕａＢ の活性を弱化させたＩＭＰ生産菌株を製造した。
【００５２】
実施例１−１：ｐｕｒＦ強化菌株の製作
ｐｕｒＦの開始コドンが変更された菌株を製作するために、まず、ｐｕｒＦ が含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにｐｕｒＦ遺伝子をクローニングするために、具体的には、ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡ（genomic DNA）を鋳型として、配列番号６と７、配列番号８と９のプライマーを用いて行い、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で２分の伸長（extension）過程を３０回繰り返した。前記ＰＣＲ反応で獲得した２つのＤＮＡ切片を鋳型として、配列番号６と９をプライマーとして再びＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で２分の伸長（extension）過程を３０回繰り返した。得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素で切断されたｐＤＺ（特許文献１及び２）ベクターにクローニングした。前記方法で製作したベクターをｐＤＺ−ｐｕｒＦ−ｇ１ａと命名した。
【００５３】
【表１】
2021510062.tif 000005
【００５４】
コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２に組換えベクターであるｐＤＺ−ｐｕｒＦ−ｇ１ａを電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差を経て、選定された菌株でシーケンシングを行い、最終的に変異が導入された菌株を選別し、選別菌株は６８７２−ｐｕｒＦ（ｇ１ａ）と命名した。
【００５５】
実施例１−２：ｇｕａＢ弱化菌株の製作
ｇｕａＢの開始コドンが変更された菌株を製作するために、まず、ｇｕａＢが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにｇｕａＢ遺伝子をクローニングするために、具体的に、ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡを鋳型として、配列番号１１と１２及び配列番号１３と１４のプライマーを用いて行った。前記ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号１１と１４をプライマーに再びＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を実施例１−１と同様にクローニングを進めた。製作されたベクターをｐＤＺ−ｇｕａＢ−ａ１ｔと命名した。これを同様の方法で６８７２−ｐｕｒＦ（ｇ１ａ）に導入し、最終的に変異が導入された菌株を選別した。前記選別された菌株はＣＪＩ２３３０と命名した。
【００５６】
【表２】
2021510062.tif 000006
【００５７】
実施例１−３：ＣＪＩ２３３０の発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ２３３０をそれぞれ接種して３０℃の温度で２４時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表３の通りである。下記のような結果は、前記ＣＪＩ２３３０がＩＭＰ生産能を有することを示唆する。
【００５８】
【表３】
2021510062.tif 000007
【００５９】
− 種培地：ぶどう糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．５
− 発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ぶどう糖２．５５％、果糖１．４５％になるように添加して用いた。
【００６０】
実施例２：ｐｕｒＡプロモーター活性弱化変異の発掘
プリンヌクレオチドの生産能を向上させるために、アデニロコハク酸シンテターゼの発現を弱化しようと、これをコードする遺伝子であるｐｕｒＡのプロモーター変異ライブラリを製作し、プリンヌクレオチドの生産能が増加するプロモーター弱化変異を発掘した。
【００６１】
実施例２−１：ｐｕｒＡプロモーターを含むベクターの製作
ｐｕｒＡプロモーター変異ライブラリを製作するために、まず配列番号１のｐｕｒＡプロモーターを含むＧＦＰ（green fluorescent protein）発現ベクターを製作した。ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡを鋳型として、配列番号１５と１６のプライマーを用い、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で２分の伸長（extension）過程を３０回繰り返した。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＥｃｏＲＶで切断した後、同じ制限酵素で切断されたｐ１１７−ｇｆｐベクター（特許文献３）にクローニングした。前記方法で製作されたベクターをｐ１１７−ＰｐｕｒＡ−ｇｆｐと命名した。
【００６２】
【表４】
2021510062.tif 000008
【００６３】
実施例２−２：ｐｕｒＡプロモーター変異ライブラリの製作
前記実施例２−１で製作したベクターを基にｐｕｒＡプロモーター変異ライブラリを製作した。ライブラリは、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（clontech Diversify(R) PCR Random Mutagenesis Kit）を用いて製作した。変異が発生しうる条件で、配列番号１５及び配列番号１７をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。具体的には、１０００ｂｐ当たり２〜４つの変異が発生する条件で、９４℃で３０秒予熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で１分３０秒の過程を２５回繰り返して行った。このとき得られたＰＣＲ産物をメガプライマー（５００〜１２５ｎｇ）とし、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で１２分の過程を２５回繰り返した。その後、ＤｐｎＩを処理して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得してポリヌクレオチド配列を分析した結果、３．５変異／ｋｂの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約１０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これをｐ１１７−ＰｐｕｒＡ−ｇｆｐ−ｌｉｂｒａｒｙと命名した。
【００６４】
実施例３：製作したライブラリの評価及び変異体の選別
実施例３−１：ライブラリの評価
前記実施例２−２で製作したｐ１１７−ＰｐｕｒＡ−ｇｆｐ−ｌｉｂｒａｒｙを実施例１で製作した菌株ＣＪＩ２３３０に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有した栄養培地に塗抹して変異ベクターが挿入された菌株から５，０００個のコロニーを確保し、各コロニーをＣＪＩ２３３０_ｐ１１７_ＰｐｕｒＡ（ｍｔ）１からＣＪＩ２３３０_ｐ１１７_ＰｐｕｒＡ（ｍｔ）５０００までと命名した。
−栄養培地：ペプトン１％、肉汁１％、塩化ナトリウム０．２５%、酵母エキス１％、寒天２%、ｐＨ７．２
【００６５】
確保された５，０００個のコロニーをそれぞれ加圧殺菌した種培地２００μｌに接種した９６ディープウェルプレートを、マイクロプレート振とう機（Microplate shaker（TAITEC））を用いて３０℃の温度、１２００ｒｐｍで２４時間振とう培養し、種培養液として用いた。加圧殺菌した発酵培地２９０μｌを９６ディープウェルプレートに分注した後、種培養液２０μｌずつ接種し、前記条件と同様に７２時間振とう培養して遠心分離して細胞を得た。次に、回収された細胞を１×リン酸バッファ（１０× phosphate-buffered saline：塩化ナトリウム８０ｇ、塩化カリウム２ｇ、リン酸ナトリウム１４．４ｇ、リン酸カリウム２．４ｇ、滅菌水０．８Ｌ）で洗浄した後、同じバッファに再懸濁させた後、蛍光強度を測定した。蛍光強度は、 マイクロプレートリーダー（Microplate reader）を利用して、４８８ｎｍで励起光を照射し、５１１ｎｍでの発出光を用いて測定することにより、ＧＦＰ遺伝子の発現程度を測定した。測定後、野生型のＰｐｕｒＡ−ｇｆｐに比べて蛍光強度が弱化された２つの変異コロニーであるＰｐｕｒＡ（ｍｔ３）及びＰｐｕｒＡ（ｍｔ３７８）を選別した。
【００６６】
実施例３−２：ｐｕｒＡプロモーター変異の確認
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、配列番号１５と１７のプライマーを用いて、ＰｐｕｒＡ（ｍｔ３）及びＰｐｕｒＡ（ｍｔ３７８）それぞれでＰＣＲを行い、シーケンシングを進めて、ｐｕｒＡプロモーター内の変異を確認した。
具体的には、ＰｐｕｒＡ（ｍｔ３）は、配列番号１で表われるポリヌクレオチド配列から１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されたポリヌクレオチド配列を含んでいた。また、ＰｐｕｒＡ（ｍｔ３７８）は、配列番号１で表われるポリヌクレオチド配列から１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されたポリヌクレオチド配列を含んでいた。したがって、以下の実施例では、前記変異がそれぞれコリネバクテリウム属微生物のプリンヌクレオチドの生成量に影響を与えるかを確認した。
【００６７】
実施例４：ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株におけるＩＭＰ生産能の確認
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株を製作し、実施例３で確認した変異を導入してＩＭＰの生産能を確認した。
【００６８】
実施例４−１：ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株の選別
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産株を製作するために、ＡＴＣＣ６８７２をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、またはクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８細胞／ｍｌと懸濁させた。ここにＵＶ処理して、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた。２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、希釈した後、１．７％寒天を含有する適切な濃度の耐性付与物質を添加した最小培地上に塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した。発酵培地で３〜４日間培養した後、培養液に蓄積されたＩＭＰ生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度ＩＭＰ生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、３,４−ジヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するための前記過程をそれぞれの物質に対して順次行った。その後、前記物質に対する耐性が付与されてＩＭＰ生産能の優れたＣＪＩ２３３２を最終選別した。表７にＡＴＣＣ６８７２に比べたＣＪＩ２３３２の耐性程度を比較して示した。
【００６９】
【表５】
2021510062.tif 000009
【００７０】
−最小培地：ぶどう糖２％、硫酸ナトリウム０．３％、リン酸第１カリウム０．１％、リン酸第２カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．３％、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、硫酸鉄１０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／ｌ、塩化マンガン３．６ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／Ｌ、アデニン２０ｍｇ／ｌ、グアニン２０ｍｇ／ｌをｐＨ７．３になるように添加して用いた。
前記ＣＪＩ２３３２はブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年６月２２日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２７７Ｐを与えられた。
【００７１】
実施例４−２：ＣＪＩ２３３２発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注し、加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ２３３２をそれぞれ接種して３０℃の温度で２４時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表８の通りである。
【００７２】
【表６】
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【００７３】
実施例４−３：ｐｕｒＡプロモーター変異を含む挿入ベクターの製作
前記実施例３で選別された変異を菌株内に導入するために、挿入用ベクターを製作した。ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）、ＰｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）、ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ、ａ１８９ｔ）変異導入用ベクターの製作過程は次の通りである。
ＡＴＣＣ６８７２菌株のゲノミックＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８と配列番号１９及び配列番号２０と配列番号２１を用いＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果得られたＤＮＡ断片を鋳型として、配列番号１８と配列番号２１を用いて前記と同様の方法でＰＣＲを行って、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記ＤＮＡ断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングし、ｐＤＺ−ｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）−ｐｕｒＡを製作した。ＡＴＣＣ６８７２菌株のゲノミックＤＮＡを鋳型とし配列番号１８と配列番号２２及び配列番号２３と配列番号２１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果得られた遺伝子断片を鋳型として配列番号１８と配列番号２１を用い、前記と同様の方法でＰＣＲを行って得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記ＤＮＡ断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングし、ｐＤＺ−ｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ を製作した。
【００７４】
また、２つの変異が同時に導入された時の影響性を確認するために、２つ変異が導入されたベクターを製作した。製作されたｐＤＺ−ｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）をバックボーン（backbone）として、位置選択的突然変異（Site-directed mutagenesis）を行った。具体的には、配列番号２４と配列番号２５のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。この時、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び６８℃で１２分の伸長（extension）過程を含み、前記過程は１８回繰り返した。その結果得られた産物をＤｐｎＩ処理した後、ＤＨ５αに形質転換して、ｐＤＺ−ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ、ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡベクターを獲得した。
【００７５】
【表７】
2021510062.tif 000011
【００７６】
実施例４−４：ＡＴＣＣ６８７２由来のＣＪＩ２３３０及びＣＪＩ２３３２菌株内にｐｕｒＡプロモーター変異体の導入及び評価
前記実施例１で製作した野生型由来のＩＭＰ生産菌株であるＣＪＩ２３３０と実施例４−１で選別した菌株であるＣＪＩ２３３２にｐｕｒＡ変異を導入してＩＭＰ生産量を評価した。ＣＪＩ２３３２菌株のｐｕｒＡプロモーター内に変異が含まれているかどうかを確認するために、ＣＪＩ２３３２のゲノミックＤＮＡをＰＣＲを用いて増幅した。具体的には、まず、前記ＣＪＩ２３３２のゲノミックＤＮＡを鋳型として、配列番号１５と２１のプライマーを用いて、９４℃で１分、５８℃で３０秒、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２８回繰り返すＰＣＲ方法を通じて、ｐｕｒＡプロモーター断片を増幅し、塩基配列を分析した。ＣＪＩ２３３２菌株のｐｕｒＡプロモーターの塩基配列は野生型コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２のｐｕｒＡプロモーター配列と同一であった。
【００７７】
その後、ｐＤＺ−ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）−ｐｕｒＡ、ｐＤＺ−ＰｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ、ｐＤＺ−ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ、ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡのベクターをＣＪＩ２３３０とＣＪＩ２３３２に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子のプロモーター変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に変異が導入されたかどうかは、配列番号１５と配列番号２１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することにより確認できた。製作された菌株は、それぞれＣＪＩ２３３０＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）−ｐｕｒＡ、ＣＪＩ２３３０＿ＰｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ、 ＣＪＩ２３３０＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ、ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ、ＣＪＩ２３３２＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）−ｐｕｒＡ、ＣＪＩ２３３２＿ＰｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ、ＣＪＩ２３３２＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ、ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡと命名した。
前記ＣＪＩ２３３２＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）−ｐｕｒＡはＣＪＩ２３５２と呼ばれており、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年９月１０日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２３１５Ｐを与えられた。また、前記製作されたＣＪＩ２３３２＿ＰｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡはＣＪＩ２３６５と呼ばれており、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年９月１０日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２３１４Ｐを与えられた。
それぞれ菌株のＩＭＰ生産能を評価した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法でＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表１０の通りである。
【００７８】
【表８】
2021510062.tif 000012
【００７９】
実施例５：ｐｕｒＡプロモーター変異の導入時の５’−キサンチル酸生産能の確認
実施例５−１：ＡＴＣＣ６８７２由来のＸＭＰ生産菌株の選別
ＡＴＣＣ６８７２由来のＸＭＰ生産株を製作するために、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、またはクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８細胞／ｍｌと懸濁させた。ここにＵＶ処理して、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた。２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、希釈した後、１．７％寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度で含有した培地に塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した。発酵培地で３〜４日間培養した後、培養液に蓄積されたＸＭＰの生産量が最も優れたコロニーを選別した。具体的には、フルオロトリプトファンが濃度別に添加された培地（添加培地）で生育できる変異株の中から選別し、より具体的には、フルオロトリプトファンの濃度１００ｍｇ／Ｌでも生育する５’−キサンチル酸の濃度が向上された菌株を選別した。選別された菌株は、ＣＪＸ１６６４と命名された。
- 最小培地：ぶどう糖２０ｇ／ｌ、リン酸第１カリウム１ｇ／ｌ、リン酸第２カリウム１ｇ／ｌ、ウレア２ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ、塩化カルシウム１００ｍｇ／ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／ｌ、チアミン塩酸塩０．１ｍｇ／ｌ、硫酸銅０．８ｍｇ／ｌ、アデニン２０ｍｇ／ｌ、グアニン２０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
- 添加培地：最小培地にフルオロトリプトファン１０、２０、５０、７０、１００、２００ｍｇ／ｌを添加した培地
【００８０】
前記ＣＪＸ１６６４の生化学的特性は、下記表１１に示した。表１１を参照すれば、前記ＣＪＸ１６６４は１００ｍｇ／ｌ濃度のフルオロトリプトファン添加培地でも生育可能である。
【００８１】
【表９】
2021510062.tif 000013
【００８２】
前記ＣＪＩ１６６４はブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年７月６日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２８５Ｐを与えられた。
【００８３】
実施例５−２：ＣＪＸ１６６４発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注し、加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＸ１６６４をそれぞれ接種して３０℃の温度で２４時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表１２の通りである。
【００８４】
【表１０】
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【００８５】
実施例５−３：ＣＪＸ１６６４菌株内に変異体の導入及び評価
前記実施例５−１で選別したＣＪＸ１６６４菌株のｐｕｒＡプロモーター内に変異を含んでいるかどうかを確認するために、ＣＪＸ１６６４ゲノミックＤＮＡをＰＣＲを用いて増幅した。具体的には、まず、前記ＣＪＸ１６６４のゲノミックＤＮＡを鋳型として、配列番号１５と配列番号２１のプライマーを用いて、９４℃で１分の変性、５８℃で３０秒の結合、７２℃で１分間のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２８回繰り返すＰＣＲ方法を通じて、ｐｕｒＡプロモーター断片を増幅し、塩基配列を分析した。前記ＣＪＸ１６６４菌株のｐｕｒＡプロモーター塩基配列は野生型コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２のｐｕｒＡプロモーター配列と同一であった。
前記実施例４−３で製作したベクターをそれぞれＣＪＸ１６４４に形質転換し、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、塩基配列を分析して確認した。
【００８６】
前記ＣＪＸ１６６４及びＣＪＸ１６６４＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）−ｐｕｒＡ、ＣＪＸ１６６４＿ＰｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ、 ＣＪＸ１６６４＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ、ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ菌株のＸＭＰ生産能を評価した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表１３の通りである。
前記ＣＪＸ１６６４＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）−ｐｕｒＡはＣＪＸ１６８０と呼ばれており、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年９月１０日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２３１１Ｐを与えられた。また、前記製作されたＣＪＸ１６６４＿ＰｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡはＣＪＸ１６６８と呼ばれており、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年９月１０日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２３１０Ｐを与えられた。
【００８７】
【表１１】
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【００８８】
前記表で示したように、ＣＪＸ１６６４＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ）−ｐｕｒＡ、ＣＪＸ１６６４＿ＰｐｕｒＡ（ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ、ＣＪＸ１６６４＿ＰｐｕｒＡ（ｃ１４３ｔ、ａ１８９ｔ）−ｐｕｒＡ菌株は、ＡＴＣＣ６８７２基盤ＸＭＰ生産菌株であるＣＪＸ１６６４に比べて、ＸＭＰの生産量が約２７％増加したことを確認した。
【００８９】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００９０】
2021510062.tif 000016
【００９１】
2021510062.tif 000017
【００９２】
2021510062.tif 000018
【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月4日(2019.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のポリヌクレオチド配列でｉ）１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、ｉｉ）１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換、またはｉｉｉ）１４３番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換されて１８９番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）に置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現用組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、ベクター。
【請求項５】
前記目的タンパク質が、アデニロコハク酸シンテターゼである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載のベクターを含む、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項８】
前記目的タンパク質が、アデニロコハク酸シンテターゼである、請求項７に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項７に記載の微生物。
【請求項１０】
請求項７に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、プリンヌクレオチドの製造方法。
【請求項１１】
前記培養する段階の後、前記微生物または培地からプリンヌクレオチドを回収する段階をさらに含む、請求項１０に記載のプリンヌクレオチドの製造方法。
【国際調査報告】
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