(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、グリコシル化されたＣｏｍＰタンパク質、それらのフラグメント及び融合タンパク質、ならびに例えば、コンジュゲートワクチンの製造に使用するための製造方法である。細菌性疾患を含む疾患に対する複合ワクチンも本明細書で提供される。
2021528059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質に共有結合したオリゴ糖または多糖を含み、前記融合タンパク質が、ＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ）またはそのグリコシル化タグフラグメントを含む、バイオコンジュゲート。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基において、前記ＣｏｍＰタンパク質上のオリゴ糖もしくは多糖、またはそのグリコシル化タグフラグメントでグリコシル化される、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３】
前記ＣｏｍＰタンパク質が、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み；任意選択で、
前記ＣｏｍＰタンパク質が、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ−２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）を含む、請求項１または２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４】
前記ＣｏｍＰタンパク質が、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５】
前記ＣｏｍＰタンパク質が、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ−２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項６】
前記ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基１から２８に対応するアミノ酸残基を欠くＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項７】
前記ＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択される、請求項６に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項８】
前記ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントが、アルファベータループをベータストランド領域に接続するジスルフィド結合に隣接する、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の８２位のセリン残基を含む、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の領域に対応する領域を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項９】
前記ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントが、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記グリコシル化タグフラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、任意選択で、
前記ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントが、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）、または１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントが、配列番号３７のアミノ酸コンセンサス配列、または少なくとも５、１０、１５、２０、３０、３５、または４０個の連続的なアミノ酸のそのフラグメントを含み、前記グリコシル化タグフラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、または前記グリコシル化タグが、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、前記バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１１】
前記ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントが、配列番号３８、もしくは配列番号４５のアミノ酸コンセンサス配列、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続的なアミノ酸のそのフラグメントを含み、前記グリコシル化タグフラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、または前記グリコシル化タグが、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、前記バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１２】
前記オリゴ糖または多糖が、ストレプトコッカス属の細菌によって産生され、任意選択で、
前記多糖が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ．ｓｕｉｓのきょう膜多糖である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１３】
前記きょう膜多糖が、ＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである、請求項１２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１４】
前記オリゴ糖または多糖が、クレブシエラ属の細菌によって産生され、任意選択で、
前記オリゴ糖または多糖が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａのきょう膜多糖である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１５】
前記多糖が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのきょう膜多糖である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１６】
前記多糖が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２のきょう膜多糖である、請求項１５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１７】
前記オリゴ糖または多糖が、その還元末端にグルコースを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１８】
前記バイオコンジュゲートが、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生され、任意選択で、
細菌細胞で産生される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される担体タンパク質を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２０】
前記ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントが前記融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、及び／または前記融合タンパク質の内部に位置し、任意選択で、
前記担体タンパク質またはそのフラグメントが、アミノ酸リンカーを介して、前記ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントに連結する、請求項１９に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、８以上、１０以上、１５以上、または２０以上のＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２２】
前記融合タンパク質が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０のうちのいずれかから３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２５のうちのいずれかまでのＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２３】
前記バイオコンジュゲートが、コンジュゲートワクチンであり、任意選択で、
前記コンジュゲートワクチンが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８に対するワクチンである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２４】
前記コンジュゲートワクチンが対象に投与され、それは免疫応答を誘導する、請求項２３に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２５】
前記免疫応答が、長期記憶（メモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞）を誘発し、抗体応答であり、任意選択で、血清型特異的免疫応答である、請求項２３または２４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２６】
前記抗体応答がＩｇＧまたはＩｇＭ応答である、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２７】
前記抗体応答がＩｇＧ応答であり、任意選択でＩｇＧ１応答である、請求項２６に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２８】
前記コンジュゲートワクチンが、ワクチンを投与された対象において免疫学的記憶を生成する、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２９】
ＣｏｍＰグリコシル化タグであって、ＣｏｍＰタンパク質の単離されたフラグメントを含み、前記フラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む、前記グリコシル化タグ。
【請求項３０】
前記フラグメントが、ＣｏｍＰタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７を含む、２８、２９、３０、３５、または４０のアミノ酸を含む、請求項２９に記載のグリコシル化タグ。
【請求項３１】
前記ＣｏｍＰタンパク質が、請求項３〜５のいずれか１項に記載のＣｏｍＰタンパク質である、請求項２９または３０に記載のグリコシル化タグ。
【請求項３２】
異種担体タンパク質に結合している請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のグリコシル化タグ。
【請求項３３】
前記異種担体タンパク質が、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項３２に記載のグリコシル化タグ。
【請求項３４】
前記グリコシル化タグが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基１から２８に対応するアミノ酸残基を欠くＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドである、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載のグリコシル化タグ。
【請求項３５】
前記ＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドが、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ−２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、及び配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）からなる群から選択される、請求項３４に記載のグリコシル化タグ。
【請求項３６】
前記グリコシル化タグが、アルファベータループをベータストランド領域に接続するジスルフィド結合に隣接する、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の８２位のセリン残基を含む、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の領域に対応する領域を含む、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のグリコシル化タグ。
【請求項３７】
前記グリコシル化タグが、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記グリコシル化タグが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、任意選択で、
前記グリコシル化タグが、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）、または１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３８】
前記グリコシル化タグが、配列番号３７のアミノ酸コンセンサス配列、または少なくとも５、１０、１５、２０、３０、３５、または４０個の連続的なアミノ酸のそのフラグメントを含み、前記グリコシル化タグフラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、または前記グリコシル化タグが、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、前記バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のグリコシル化タグ。
【請求項３９】
前記グリコシル化タグが、配列番号３８、もしくは配列番号４５のアミノ酸コンセンサス配列、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続的なアミノ酸のそのフラグメントを含み、前記グリコシル化タグフラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、または前記グリコシル化タグが、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、前記バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４０】
前記グリコシル化タグが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、または８２のうちのいずれかから、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、または１４７のうちのいずれかまでに対応するＣｏｍＰタンパク質アミノ酸配列を含み、任意選択で、
前記グリコシル化タグが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、または８２のうちのいずれかから、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、または１４７のうちのいずれかまでを含むアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４１】
前記グリコシル化タグが、１２４、１２０、１１５、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、または５アミノ酸以下の長さである、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４２】
前記グリコシル化タグが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基でオリゴ糖または多糖に共有結合している、請求項２８〜４１のいずれか１項に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４３】
前記オリゴ糖または多糖が、ストレプトコッカス属の細菌によって産生され、任意選択で、
前記多糖が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ．ｓｕｉｓのきょう膜多糖である、請求項４２に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４４】
前記きょう膜多糖が、ＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである、請求項４３に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４５】
前記オリゴ糖または多糖が、クレブシエラ属の細菌によって産生され、任意選択で、
前記オリゴ糖または多糖が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａのきょう膜多糖である、請求項４２に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４６】
前記多糖が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのきょう膜多糖である、請求項４５に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４７】
前記多糖が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２のきょう膜多糖である、請求項４６に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４８】
前記オリゴ糖または多糖が、その還元末端にグルコースを含む、請求項４２〜４７のいずれか１項に記載のグリコシル化タグ。
【請求項４９】
請求項２９〜４８のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグを含む融合タンパク質であって、任意選択で、
配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するグリコシル化タグのセリン残基でグリコシル化されている、前記融合タンパク質。
【請求項５０】
ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される担体タンパク質を含む、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
アミノ酸リンカー配列を含む、請求項４９または５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
オリゴ糖または多糖をアクセプターポリペプチドにｉｎ  ｖｉｖｏで結合する方法であって、ＰｇｌＳオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）によって、前記オリゴ糖または多糖を前記アクセプターポリペプチドに共有結合させることを含み、前記アクセプターポリペプチドがＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントを含み、任意選択で、
前記ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントが、異種担体タンパク質に連結されている、前記方法。
【請求項５３】
前記ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅが、ＰｇｌＳ１１０２６４、ＰｇｌＳＡＤＰ１、ＰｇｌＳＧＦＪ−２、ＰｇｌＳ５０ｖ１、ＰｇｌＳ４４６６、またはＰｇｌＳＳＦＣであり、任意選択で、
前記ＣｏｍＰタンパク質が、ＣｏｍＰ１１０２６４、ＣｏｍＰＡＤＰ１、ＣｏｍＰＧＦＪ−２、ＣｏｍＰ５０ｖ１、ＣｏｍＰ４４６６、またはＣｏｍＰＳＦＣであり、任意選択で、
前記ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅが、ＰｇｌＳＡＤＰ１である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅがＰｇｌＳＡＤＰ１であるが、前記ＣｏｍＰタンパク質がＣｏｍＰＡＤＰ１ではなく、任意選択で、
前記ＣｏｍＰタンパク質がＣｏｍＰ１１０２６４である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記オリゴ糖または多糖が、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に対応するセリン残基において、前記ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントに連結している、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏのコンジュゲーションが宿主細胞内で起こる、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が細菌細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記細菌宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
以下を含む宿主細胞を培養することを含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法：（ａ）前記オリゴ糖または多糖を合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター；（ｂ）ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅ；及び（３）前記アクセプターポリペプチド。
【請求項６０】
前記オリゴ糖または多糖の産生が、Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの転写活性化因子ｒｍｐＡ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨ  Ｋ−２０４４）、またはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの転写活性化因子ｒｍｐＡ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨ  Ｋ−２０４４）の相同体によって増強される、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記担体タンパク質が、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項５２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記方法がコンジュゲートワクチンを産生する、請求項５２〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
宿主細胞であって、（ａ）オリゴ糖または多糖を合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター；（ｂ）ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅ；及び（３）ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントを含むアクセプターポリペプチドを含む、前記宿主細胞。
【請求項６４】
前記アクセプターポリペプチドが融合タンパク質である、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
前記宿主細胞がＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅをコードする核酸を含む、請求項６３または６４に記載の宿主細胞。
【請求項６６】
前記宿主細胞が、前記アクセプターポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
請求項２９〜４８のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ、及び／または請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードし、任意選択で
ベクターである、単離された核酸。
【請求項６８】
請求項６７に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項６９】
請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のコンジュゲートワクチンまたは請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及びアジュバントを含む組成物。
【請求項７０】
細菌性病原体に対する宿主免疫応答を誘導する方法であって、免疫応答を必要とする対象に、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のコンジュゲートワクチン、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項６９に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項７１】
前記免疫応答が抗体応答である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記免疫応答が、先天性応答、適応応答、体液性応答、抗体応答、細胞媒介性応答、Ｂ細胞応答、Ｔ細胞応答、サイトカインの上方制御または下方制御、免疫系クロストーク、及び前記免疫応答の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記免疫応答が、先天性応答、体液性応答、抗体応答、Ｔ細胞応答、及び前記免疫応答の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
対象における細菌性疾患及び／または感染症を予防または治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のコンジュゲートワクチン、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項６９に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７５】
前記感染症が、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の局所的または全身的な感染症であるか、または本質的に自己免疫性である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患が肺炎である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記感染症が、全身感染症及び／または血液の感染症である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象がヒトである、請求項７０〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記組成物が、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与される、請求項７０〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
肺炎球菌感染症に対する肺炎球菌コンジュゲートワクチンを製造する方法であって、
（ａ）請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項４９〜５１のいずれか１項に記載のグリコシル化融合タンパク質を単離することと、
（ｂ）前記単離されたコンジュゲートワクチンまたは単離されたグリコシル化融合タンパク質をアジュバントと組み合わせることと、を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この国際出願は、２０１８年６月１６日に出願された米国仮出願第６２／６８５，９７０号及び２０１８年１２月２１日に出願された米国仮出願第６２／７８３，９７１号の権益を主張しており、これらは両方ともその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本出願は、２０１５年２月２６日に出願された米国仮出願第６２／１２１，４３９号の権益を主張する、２０１６年２月１６日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１６／０５０２０８の米国国内段階出願である２０１７年８月２５日に出願された米国仮出願第１５／５５３，７３３号に関連する。Ｎｏ．  ６２／１２１，４３９，  ｆｉｌｅｄ  ｏｎ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２６，  ２０１５．
【０００３】
政府の資金提供声明
本発明は、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）によって授与されたＲ４１  ＡＩ１３１７４２助成金の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、世界的に肺炎の主な原因であり、特に５歳以下の子供を苦しめている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，  Ｋ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７４，８９３−９０２（２００９））。推定によると、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の結果として毎年約１５０万人が死亡しており、そのうちのほぼ１００万人が子供である（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ−ＷＨＯ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｐａｐｅｒ．Ｗｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｒｅｃ  ８２，  ９３−１０４（２００７））。推奨される予防的治療には、複数の商業的に認可されたワクチンが含まれる（ワールドワイルドウェブの、ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｖｐｄ／ｐｎｅｕｍｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｃ．ｆ．Ｄ．Ｃ．ａ．  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）。２３価の多糖ワクチンであるＰＮＥＵＭＯＶＡＸ２３（登録商標）は、多糖ワクチンが通常Ｔ細胞非依存性抗原として作用し、高親和性ＩｇＧ応答またはＢ細胞記憶を誘発せず、子供には効果がないため、高齢者に使用される（Ｐａｃｅ，  Ｄ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３，  １１−３３  （２０１３）；Ｖｅｌｌａ，  Ｍ．  ＆  Ｐａｃｅ，  Ｄ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５，  ５２９−５４６（２０１５））。一方、担体タンパク質に共有結合した肺炎球菌きょう膜多糖で構成される肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、Ｔ細胞依存性抗原として作用する能力があるため、全ての年齢層で効果的であり、免疫記憶を生成することが示されている（Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ａ．Ｊ．，  Ｐｅｒｒｅｔｔ，  Ｋ．Ｐ．  ＆  Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，  Ｐ．Ｃ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９，  ２１３−２２０  （２００９）；Ａｖｃｉ，  Ｆ．Ｙ．，  Ｌｉ，  Ｘ．，  Ｔｓｕｊｉ，  Ｍ．  ＆  Ｋａｓｐｅｒ，  Ｄ．Ｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １７，  １６０２−１６０９（２０１１））。
【０００５】
２０００年以降、３つの肺炎球菌コンジュゲートワクチンが商業的に認可されている。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）；ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ；及びＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）は、最も広く保護する肺炎球菌コンジュゲートワクチンであり、肺炎球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆからなる１３のタンパク質−多糖コンジュゲートで構成され、それぞれが遺伝的に不活化されたジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７に個別に結合している（ワールドワイドウェブの、ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／Ｖａｃｃｉｎｅｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ／ＵＣＭ２０１６６９．ｐｄｆの添付文書、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）−ＦＤＡ）。Ｐｒｅｖｎａｒ  １３は、３回の初回投与スケジュールでは高度に保護されるが、製造プロセスが複雑なため、最も高価なワクチンの１つであり、初回予防接種と追加予防接種の価格は約６００米ドルになる（ワールドワイドウェブの、ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｖｆｃ／ａｗａｒｄｅｅｓ／ｖａｃｃｉｎｅ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ／ｐｒｉｃｅ−ｌｉｓｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞のＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｃ．ｆ．Ｄ．Ｃ．ａ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  （ＶＦＣ）（２０１８））。実際、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）は、２０１５年から２０１７年にかけてＰｆｉｚｅｒの主要な収益創出製品であり、総収益は１７５億米ドルを超えている（ワールドワイドウェブの、ｓｅｃ．ｇｏｖ／Ａｒｃｈｉｖｅｓ／ｅｄｇａｒ／ｄａｔａ／７８００３／０００００７８００３１８００００２７／ｐｆｅ−ｅｘｈｉｂｉｔ１３ｘ１２３１２０１７ｘ１０ｋ．ｈｔｍ  （２０１８）のＰｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．  ２０１７  Ｆｉｎａｎｃｉａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ）。肺炎球菌コンジュゲートワクチン、すなわちＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）及びＳＹＮＦＬＯＲＩＸは、侵襲性肺炎球菌感染症の負担を大幅に軽減したが、世界的な血清型分布の変動、ならびに血清型の交換及び転置の事象は、脆弱な患者集団に対する追加の保護を提供するより広範なＰＣＶの導入を必要とする。
【０００６】
現在認可されている肺炎球菌コンジュゲートワクチンは化学的に合成されるが、これは技術的な課題、低収量、バッチ間のばらつきに悩まされている退屈なプロセスであり、改良されたコンジュゲートワクチン合成方法論の必要性を強調する（Ｆｒａｓｃｈ，  Ｃ．Ｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７，  ６４６８−６４７０（２００９））。過去１５年間で、細菌タンパク質のグリコシル化システムを使用したｉｎ  ｖｉｖｏコンジュゲーションは、化学的コンジュゲーションの実行可能な代替手段として浮上しており、複数のバイオコンジュゲートワクチン候補が現在、開発及び臨床試験の様々な段階にある（Ｈｕｔｔｎｅｒ，  Ａ．  ＆  Ｇａｍｂｉｌｌａｒａ，  Ｖ．  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ（２０１８）；Ｈｕｔｔｎｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７，  ５２８−５３７  （２０１７）；Ｒｉｄｄｌｅ，  Ｍ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３，  ９０８−９１７（２０１６））。タンパク質のグリコシル化は、糖またはグリカンとしても知られる炭水化物がタンパク質（別名ポリペプチド）に共有結合している、遍在する翻訳後修飾である（Ａｐｗｅｉｌｅｒ，  Ｒ．，  Ｈｅｒｍｊａｋｏｂ，  Ｈ．  ＆  Ｓｈａｒｏｎ，  Ｎ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４７３，  ４−８（１９９９））。細菌では、グリカンは通常、アスパラギン及びセリン／トレオニン残基のそれぞれのＮ−またはＯ−結合を介してタンパク質に結合する（Ｎｏｔｈａｆｔ，  Ｈ．  ＆  Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，  Ｃ．Ｍ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８，  ７６５−７７８（２０１０））。細菌のグリコシル化のいくつかの経路が特徴づけられており、最もよく説明されているものの１つは、グラム陰性菌におけるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）依存性のグリコシル化経路である（Ｉｗａｓｈｋｉｗ，  Ｊ．Ａ．，  Ｖｏｚｚａ，  Ｎ．Ｆ．，  Ｋｉｎｓｅｌｌａ，  Ｒ．Ｌ．＆  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．  Ｆ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８９（２０１３））。この系では、一般に脂質結合型オリゴ糖が内膜の細胞質リーフレットで逐次的に組み立てられ、ペリプラズムリーフレットに反転され、次いでグリカン付着部位に応じてＮ−またはＯ−ＯＴａｓｅのいずれかによってアクセプタータンパク質に転移され、様々な糖タンパク質を生成する（Ｉｗａｓｈｋｉｗ，  Ｊ．Ａ．，  Ｖｏｚｚａ，  Ｎ．Ｆ．，  Ｋｉｎｓｅｌｌａ，  Ｒ．Ｌ．  ＆  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．Ｆ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８９，  １４−２８（２０１３））。
【０００７】
糖タンパク質は、以下の３つの成分を共発現させることにより、ワクチン及び／または診断薬としての使用のために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （Ｅ．  ｃｏｌｉ）で組換え合成されている：（１）目的のグリカンを合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター；（２）ＯＴａｓｅ；及び（３）アクセプタータンパク質（Ｃｉｏｃｃｈｉｎｉ，  Ａ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７２，  ４５５−４６５  （２０１４）；Ｇａｒｃｉａ−Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ，  Ｆ．，  Ｉｗａｓｈｋｉｗ，  Ｊ．Ａ．，  Ｐｒｉｃｅ，  Ｎ．Ｌ．，  Ｓｔｒａｔｉｌｏ，  Ｃ．  ＆  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．Ｆ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５，  ３８１  （２０１４）；Ｉｗａｓｈｋｉｗ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  １１，  １３  （２０１２））。このプロセスの１つの欠点は、還元末端糖（すなわち成長している多糖鎖の最初の単糖）によって調節されることが示唆されている既知のＯＴａｓｅの見かけの基質特異性である（Ｗａｃｋｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３，  ７０８８−７０９３（２００６））。ＯＴａｓｅは多くの異なるオリゴ糖及び多糖構造を転移することができるが、一部の糖は既知のＯＴａｓｅによってアクセプタータンパク質に効率的にコンジュゲートされない。したがって、新規ＯＴａｓｅの特性評価は、次世代のコンジュゲートワクチンを開発するために最も重要である。
【０００８】
複合糖質の商業的合成に現在使用されているＯＴａｓｅは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｎ−ＯＴａｓｅ  ＰｇｌＢとＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｏ−ＯＴａｓｅ  ＰｇｌＬであり、その両方ともグリカン基質に対してかなりの無差別性を示す（Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，  ３０１６−３０２１  （２００５）；Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ，  Ａ．，  Ｆｅｎｔａｂｉｌ，  Ｍ．Ａ．，  Ｍｉｌｌｓ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｋｌａｓｓｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  ＆  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．Ｆ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８９，  ８０８８−８０９８  （２００７））。しかしながら、どちらの酵素も、タンパク質に対する還元末端糖としてグルコースを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅきょう膜多糖（ＣＰＳ）をタンパク質にコンジュゲートさせることが実験的に実証されていない（Ｇｅｎｏ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２８，  ８７１−８９９  （２０１５））。９０を超えるＣＰＳ血清型が肺炎球菌について特徴づけられており、それぞれが構造的に異なるきょう膜多糖構造を有している。しかしながら、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣＰＳの７０％を超えるものには、還元末端糖としてグルコースが含まれている（Ｇｅｎｏ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２８，  ８７１−８９９  （２０１５））。したがって、次世代の肺炎球菌コンジュゲートワクチンをより迅速に生成するために既存の製造パイプラインを補完及び／または置き換えるには、肺炎球菌ワクチン合成の新しい方法が必要である。
【０００９】
発明の概要
本明細書で提供されるのは、バイオコンジュゲートであり、例えば、その特定の態様及び特徴がこの段落に記載されており、融合タンパク質に共有結合したオリゴ糖または多糖を含み、ここで融合タンパク質は、ＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ）またはそのグリコシル化タグフラグメントを含む。特定の態様では、融合タンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基において、ＣｏｍＰタンパク質上のオリゴ糖もしくは多糖、またはそのグリコシル化タグフラグメントでグリコシル化される。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ−２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ−２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基１から２８に対応するアミノ酸残基を欠くＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドである。特定の実施形態では、ＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群から選択される。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、アルファベータループをベータストランド領域に接続するジスルフィド結合に隣接する、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の８２位のセリン残基を含む、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の領域に対応する領域を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、上記グリコシル化タグフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）、または１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここでバリアントは配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、配列番号３７のアミノ酸コンセンサス配列、または少なくとも５、１０、１５、２０、３０、３５、または４０個の連続的なアミノ酸のそのフラグメントを含み、上記グリコシル化タグフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、またはＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、ここでバリアントは配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、配列番号３８または４５のアミノ酸コンセンサス配列、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続的なアミノ酸のそのフラグメントを含み、ここで上記グリコシル化タグフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、またはＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、ここでバリアントは配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、ストレプトコッカス属からの細菌によって産生される。特定の態様では、多糖は、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ．  ｓｕｉｓのきょう膜多糖である。特定の態様では、きょう膜多糖は、ＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである。特定の態様では、きょう膜多糖は、ＣＰＳ８である。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、クレブシエラ属からの細菌によって産生される。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａのきょう膜多糖である。特定の態様では、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのきょう膜多糖である。特定の態様では、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２のきょう膜多糖である。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、その還元末端にグルコースを含む。特定の態様では、バイオコンジュゲートはｉｎ  ｖｉｖｏで産生される。特定の態様では、バイオコンジュゲートは、細菌細胞において産生される。特定の態様では、融合タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される担体タンパク質を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントは、融合タンパク質のＮ末端、融合タンパク質のＣ末端、及び／または融合タンパク質の内部に位置する。特定の態様では、担体タンパク質またはそのフラグメントは、アミノ酸リンカーを介してＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントに連結されている。特定の態様では、融合タンパク質は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、８以上、１０以上、１５以上、または２０以上のＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントを含む。特定の態様では、融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０のうちのいずれかから３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２５のうちのいずれかまでのＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントを含む。特定の態様では、バイオコンジュゲートはコンジュゲートワクチンである。特定の態様では、コンジュゲートワクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８に対するワクチンである。特定の態様では、コンジュゲートワクチンは対象に投与され、それは免疫応答を誘導する。特定の態様では、免疫応答は長期記憶（記憶Ｂ及びＴ細胞）を誘発し、抗体応答である。特定の態様では、抗体反応は、血清型特異的抗体応答である。特定の態様では、抗体応答はＩｇＧまたはＩｇＭ応答である。特定の態様では、抗体応答はＩｇＧ応答である。特定の態様では、ＩｇＧ応答はＩｇＧ１応答である。特定の態様では、コンジュゲートワクチンは、ワクチンを投与された対象において免疫学的記憶を生成す���。
【００１０】
本明細書で提供されるのは、ＣｏｍＰグリコシル化タグであり、例えば、その特定の態様及び特徴がこの段落に記載されており、ＣｏｍＰタンパク質の単離されたフラグメントを含み、そのフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、フラグメントは、ＣｏｍＰタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７を含む、２８、２９、３０、３５、または４０のアミノ酸を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は上述のＣｏｍＰタンパク質である。特定の態様では、グリコシル化タグは異種担体タンパク質に結合している。特定の態様では、異種担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される。特定の態様では、グリコシル化タグは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基１から２８に対応するアミノ酸残基を欠くＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドである。特定の態様では、ＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドは、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ−２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、及び配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）からなる群から選択される。特定の態様では、グリコシル化タグは、アルファベータループをベータストランド領域に接続するジスルフィド結合に隣接する、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の８２位のセリン残基を含む、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の領域に対応する領域を含む。特定の態様では、グリコシル化タグは、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、上記グリコシル化タグは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、グリコシル化タグは、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡ���ＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）、または１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここでバリアントは配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、グリコシル化タグは、配列番号３７のアミノ酸コンセンサス配列、または少なくとも５、１０、１５、２０、３０、３５、または４０個の連続的なアミノ酸のそのフラグメントを含み、上記グリコシル化タグフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、またはグリコシル化タグは、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、ここでバリアントは配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、グリコシル化タグは、配列番号３８または４５のアミノ酸コンセンサス配列、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続的なアミノ酸のそのフラグメントを含み、ここで上記グリコシル化タグフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、またはグリコシル化タグは、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、ここでバリアントは配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、グリコシル化タグは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、または８２のうちのいずれかから、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、または１４７のうちのいずれかまでに対応するＣｏｍＰタンパク質のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、グリコシル化タグは、���列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、または８２のうちのいずれかから、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、または１４７のうちのいずれかまでを含むアミノ酸配列を含む。特定の態様では、グリコシル化タグは、１２４、１２０、１１５、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、または５アミノ酸以下の長さである。特定の態様では、グリコシル化タグは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基でオリゴ糖または多糖に共有結合している。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、ストレプトコッカス属からの細菌によって産生される。特定の態様では、多糖は、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ．  ｓｕｉｓのきょう膜多糖である。特定の態様では、きょう膜多糖は、ＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである。特定の態様では、きょう膜多糖は、ＣＰＳ８である。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、クレブシエラ属からの細菌によって産生される。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａのきょう膜多糖である。特定の態様では、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのきょう膜多糖である。特定の態様では、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２のきょう膜多糖である。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、その還元末端にグルコースを含む。
【００１１】
本明細書で提供されるのは、融合タンパク質であり、例えば、その特定の態様及び特徴がこの段落に記載されており、上述のＣｏｍＰグリコシル化タグを含む。特定の態様では、融合タンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するグリコシル化タグのセリン残基でグリコシル化されている。特定の態様では、融合タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される担体タンパク質を含む。特定の態様では、融合タンパク質はアミノ酸リンカー配列を含む。
【００１２】
本明細書で提供されるのは、オリゴ糖または多糖をアクセプターポリペプチドにｉｎ  ｖｉｖｏで結合する方法であり、例えば、その特定の態様及び特徴がこの段落に記載されており、この方法は、ＰｇｌＳオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）によって、オリゴ糖または多糖をアクセプターポリペプチドに共有結合させることを含み、ここでアクセプターポリペプチドはＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントを含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントは、異種担体タンパク質に連結されている。特定の態様では、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅは、ＰｇｌＳ１１０２６４、ＰｇｌＳＡＤＰ１、ＰｇｌＳＧＦＪ−２、ＰｇｌＳ５０ｖ１、ＰｇｌＳ４４６６、またはＰｇｌＳＳＦＣである。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、ＣｏｍＰ１１０２６４、ＣｏｍＰＡＤＰ１、ＣｏｍＰＧＦＪ−２、ＣｏｍＰ５０ｖ１、ＣｏｍＰ４４６６、またはＣｏｍＰＳＦＣである。特定の態様では、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅは、ＰｇｌＳＡＤＰ１である。特定の態様では、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅは、ＰｇｌＳＡＤＰ１であるが、ＣｏｍＰタンパク質は、ＣｏｍＰＡＤＰ１ではない。特定の態様では、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅは、ＰｇｌＳＡＤＰ１であり、ＣｏｍＰタンパク質は、ＣｏｍＰ１１０２６４である。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に対応するセリン残基において、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントに連結している。特定の態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコンジュゲーションは、宿主細胞において起きる。特定の態様では、宿主細胞は細菌細胞である。特定の態様では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。特定の態様では、方法は以下を含む宿主細胞を培養することを含む：（ａ）オリゴ糖または多糖を合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター；（ｂ）ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅ；及び（３）アクセプターポリペプチド。特定の態様では、オリゴ糖または多糖の生成は、Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの転写活性化因子ｒｍｐＡ（Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨ  Ｋ−２０４４）、またはＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの転写活性化因子ｒｍｐＡ（Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨ  Ｋ−２０４４）の相同体によって増強される。特定の態様では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される。特定の態様では、方法はコンジュゲートワクチンを生成する。
【００１３】
本明細書で提供されるのは宿主細胞であり、例えば、その特定の態様及び特徴がこの段落に記載されており、（ａ）オリゴ糖または多糖を合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター；（ｂ）ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅ；及び（３）ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントを含むアクセプターポリペプチドを含む。特定の態様では、アクセプターポリペプチドは融合タンパク質である。特定の態様では、宿主細胞は、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅをコードする核酸を含む。特定の態様では、宿主細胞は、アクセプターポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００１４】
本明細書で提供されるのは、単離された核酸であり、例えば、その特定の態様及び特徴がこの段落に記載されており、上述のＣｏｍｐグリコシル化タグ及び／または上述の融合タンパク質をコードしている。特定の態様では、核酸はベクターである。単離された核酸を含む宿主細胞も提供される。
【００１５】
本明細書で提供されるのは、上述のコンジュゲートワクチンまたは上述の融合タンパク質と、アジュバントとを含む組成物である。
【００１６】
本明細書で提供されるのは、細菌性病原体に対する宿主免疫応答を誘導する方法であり、例えば、その特定の態様及び特徴がこの段落に記載されており、この方法は、免疫応答を必要とする対象に有効量の上述のコンジュゲートワクチン、上述の融合タンパク質、または上述の組成物を投与することを含む。特定の態様では、免疫応答は抗体応答である。特定の態様では、免疫応答は、先天性応答、適応応答、体液性応答、抗体応答、細胞媒介性応答、Ｂ細胞応答、Ｔ細胞応答、サイトカインの上方制御または下方制御、免疫系クロストーク、及び上記免疫応答の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。特定の態様では、免疫応答は、先天性応答、体液性応答、抗体応答、Ｔ細胞応答、及び上記免疫応答の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００１７】
本明細書で提供されるのは、対象における細菌性疾患及び／または感染症を予防または治療する方法であり、例えば、その特定の態様及び特徴がこの段落に記載されており、それを必要とする対象に上述のコンジュゲートワクチン、上述の融合タンパク質、または上述の組成物を投与することを含む。特定の態様では、感染症は、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の局所的または全身的な感染症であるか、または本質的に自己免疫性である。特定の態様では、疾患は肺炎である。特定の態様では、感染症は、全身感染症及び／または血液の感染症である。特定の態様では、対象はヒトである。特定の態様では、組成物は、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与される。
【００１８】
本明細書で提供されるのは、肺炎球菌感染症に対する肺炎球菌コンジュゲートワクチンを製造する方法であり、方法は以下を含む：（ａ）上述のバイオコンジュゲートまたは上述のグリコシル化融合タンパク質を単離すること；（ｂ）単離されたコンジュゲートワクチンまたは単離されたグリコシル化融合タンパク質をアジュバントと組み合わせる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ａ、Ｂ、及びＣは、ＰｇｌＢ（Ｂ）でもＰｇｌＬ（Ａ）でもなく、ＰｇｌＳ（Ｃ）が、肺炎球菌ＣＰＳ１４をその同族のアクセプター／担体タンパク質に結合させることができることを示す。ヘキサヒスチジンタグ付きアクセプタータンパク質バリアントを探索するＥ．  ｃｏｌｉ全細胞溶解物のウエスタンブロット分析。
【図２】Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１（ＰｇｌＳＡＤＰ１）由来のＰｇｌＳが複数の肺炎球菌きょう膜多糖をＡ．ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１（ＣｏｍＰＡＤＰ１）からＣｏｍＰに転移することができることを示す。ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰＡＤＰ１バリアント及び肺炎球菌ＣＰＳ８（左）、ＣＰＳ９Ｖ（中央）、またはＣＰＳ１４（右）のいずれかを探索する精製ＣｏｍＰＡＤＰ１バリアントのウエスタンブロット分析。抗Ｈｉｓシグナルと抗グリカンシグナルの共局在は、ＣｏｍＰＡＤＰ１が正しい肺炎球菌多糖でグリコシル化されたことを示す。アスタリスクは、プロテイナーゼＫで２時間処理された試料を示す。
【図３】Ａ及びＢは、ＰｇｌＳＡＤＰ１がＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  のＫ１及びＫ２のきょう膜多糖をＣｏｍＰＡＤＰ１に転移することができることを示す。ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰＡＤＰ１バリアント及びＲＮＡポリメラーゼを探索するＥ．  ｃｏｌｉ全細胞溶解物のウエスタンブロット分析。ＲＮＡポリメラーゼをローディング対照として使用した。
【図４Ａ】単一のグリコシル化ペプチドが同定されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰＡＤＰ１の質量分析を示す。ＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）。
【図４Ｂ】単一のグリコシル化ペプチドが同定されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰＡＤＰ１の質量分析を示す。ＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）。
【図５】ＣｏｍＰＡＤＰ１のセリン８４がＰｇｌＳ依存性グリコシル化部位であることを示す。ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰＡＤＰ１バリアント及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ七糖を探索するＥ．  ｃｏｌｉ全細胞溶解物のウエスタンブロット分析。ＣｏｍＰ［Ｓ８４Ａ］ＡＤＰ１バリアントが発現したが、抗ｈＲ６七糖抗血清で探索する反応性バンドが非存在であることで示されるように、グリコシル化されていなかった。
【図６】ＣｏｍＰオーソログのアミノ酸配列を列挙する。予測されるアルファベータループをベータストランド領域に連結する予測されるジスルフィド結合（下線付き）が隣接する予測されるグリコシル化の部位が太字で示される。
【図７】ＰｇｌＳ１１０２６４ではなく、ＰｇｌＳＡＤＰ１が、同族のＣｏｍＰＡＤＰ１とＡ．  ｓｏｌｉのＣＩＰ１１０２６４由来のＣｏｍＰ１１０２６４の両方を効率的にグリコシル化することを示す。ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰバリアント及びＲＮＡポリメラーゼを探索するＥ．  ｃｏｌｉ全細胞溶解物のウエスタンブロット分析。ＲＮＡポリメラーゼをローディング対照として使用した。
【図８】ＰｇｌＳＡＤＰ１がＤｓｂＡ−ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４融合体を効率的にグリコシル化するが、ＤｓｂＡ−ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１融合体をグリコシル化しないことを示す。全ての融合物は、トリプルアラニンペプチド（ＡＡＡ；配列番号２４）またはグリシン−グリシン−グリシン−セリンペプチド（ＧＧＧＳ；配列番号２３）のいずれかを有し、ＤｓｂＡをヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰΔ２８１１０２６４またはＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１のいずれかに連結していた。ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰバリアント及びＲＮＡポリメラーゼを探索するＥ．  ｃｏｌｉ全細胞溶解物のウエスタンブロット分析。ＲＮＡポリメラーゼをローディング対照として使用した。
【図９】ＰｇｌＳＡＤＰ１がＭＢＰ−ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４融合体を効率的にグリコシル化するが、ＭＢＰ−ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１融合体をグリコシル化しないことを示す。全ての融合物は、トリプルアラニンペプチド（ＡＡＡ；配列番号２４）またはグリシン−グリシン−グリシン−セリンペプチド（ＧＧＧＳ；配列番号２３）のいずれかを有し、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰΔ２８１１０２６４またはＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１のいずれかに連結していた。ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰバリアント及びＲＮＡポリメラーゼを探索するＥ．  ｃｏｌｉ全細胞溶解物のウエスタンブロット分析。ＲＮＡポリメラーゼをローディング対照として使用した。
【図１０】ＰｇｌＳ１１０２６４ではなく、ＰｇｌＳＡＤＰ１がＥＰＡ−ＧＧＧＳ−ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４融合体を効率的にグリコシル化する。ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰバリアントを探索するＥ．  ｃｏｌｉ全細胞溶解物またはペリプラズム抽出物のウエスタンブロット分析。ＥＰＡ−ＧＧＧＳ−ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰΔ２８１１０２６４バリアントを連結するグリシン−グリシン−グリシン−セリンペプチド（ＧＧＧＳ；配列番号２３）を伴う外毒素Ａ。
【図１１】代表的なＣｏｍＰΔ２８１１０２６４融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１２Ａ】一価のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰＡＤＰ１バイオコンジュゲートワクチンが血清型特異的ＩｇＧ抗体を誘導することを示す。
【図１２Ｂ】一価のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰＡＤＰ１バイオコンジュゲートワクチンが血清型特異的ＩｇＧ抗体を誘導することを示す。
【図１２Ｃ】一価のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰＡＤＰ１バイオコンジュゲートワクチンが血清型特異的ＩｇＧ抗体を誘導することを示す。
【図１３】血清型８、９Ｖ、及び１４に対する３価のバイオコンジュゲートワクチンが、Ｐｒｅｖｎａｒ１３と同等のレベルで血清型特異的ＩｇＧ力価を誘導することを示す。
【図１４】ＣｏｍＰ  Δ２８オーソログアミノ酸配列を列挙し、ここで、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の２８のＮ末端アミノ酸に対応するアミノ酸が除去されている。予測されるアルファベータループをベータストランド領域に連結する予測されるジスルフィド結合（下線付き）が隣接する予測されるグリコシル化の部位が太字で示される。
【図１５】配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に対応するセリン（Ｓ）残基（四角の囲み）を含むＣｏｍＰ配列の領域のアライメントを示す。
【図１６】ＧｌｕＣで消化されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメンテーションスペクトルを示す。ＧｌｕＣで消化されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰをＨＣＤフラグメンテーションにかけ、ＣＰＳ１４繰り返しサブユニットでグリカンに結合したｓｅｍｉ−ＧｌｕＣ由来の単一ペプチドの確認を可能にした。最大４つの四糖繰り返し単位に対応する拡張グリカンで装飾された追加の糖ペプチドも観察された。
【図１７】Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉの七糖（ＣｏｍＰ−グリカンＣｊ）でグリコシル化されたＧｌｕＣ消化ＣｏｍＰの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメンテーションスペクトルを示す。ＧｌｕＣで消化されたＣｏｍＰ−グリカンＣｊをＨＣＤフラグメンテーションにかけ、ＣＰＳ１４繰り返しサブユニットでグリカンに結合した単一ペプチドの確認を可能にした。６＊ＨｅｘＮＡｃ、１＊Ｈｅｘｏｓｅに対応する１３８０．５３ＤａグリカンによるペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）のグリコシル化を確認するために、低衝突エネルギーレジームが実施された。
【図１８】Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉの七糖（ＣｏｍＰ−グリカンＣｊ）でグリコシル化されたＧｌｕＣ消化ＣｏｍＰの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメンテーションスペクトルを示す。ＧｌｕＣで消化されたＣｏｍＰ−グリカンＣｊをＨＣＤフラグメンテーションにかけ、ＣＰＳ１４繰り返しサブユニットでグリカンに結合した単一ペプチドの確認を可能にした。６＊ＨｅｘＮＡｃ、１＊Ｈｅｘｏｓｅに対応する１３８０．５３ＤａグリカンによるペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）のグリコシル化を確認するために、高衝突エネルギーレジームが実施された。
【図１９】Ａ〜Ｉは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＳがアクセプタータンパク質ＣｏｍＰを肺炎球菌ＣＰＳ１４多糖でグリコシル化できることを示す。アクセプタータンパク質（ＤｓｂＡ、ＡｃｒＡ、またはＣｏｍＰ）、ＯＴａｓｅ（ＰｇｌＬ、ＰｇｌＢ、またはＰｇｌＳ）、及びＣＰＳ１４多糖を共発現するＥ．  ｃｏｌｉのＳＤＢ１細胞を、アフィニティー精製されたアクセプタータンパク質のウエスタンブロット分析によってタンパク質のグリコシル化について分析した。（Ａ〜Ｃ）：ＰｇｌＬの存在下または非存在下でＳＤＢ１細胞から精製されたＤｓｂＡ。（Ａ）：ヘキサヒスチジンタグ付きＤｓｂＡの抗Ｈｉｓチャネルでの探索。（Ｂ）：  ＣＰＳ１４の抗グリカンチャネルでの探索。（Ｃ）：パネルＡとＢをマージした画像。（Ｄ〜Ｆ）：ＰｇｌＢの存在下または非存在下でＳＤＢ１細胞から精製されたＡｃｒＡ。（Ｄ）：ヘキサヒスチジンタグ付きＡｃｒＡの抗Ｈｉｓチャネルでの探索。（Ｅ）：ＣＰＳ１４の抗グリカンチャネルでの探索。（Ｆ）：パネルＤとＥをマージした画像。（Ｇ〜Ｉ）：ＰｇｌＳの存在下または非存在下でＳＤＢ１細胞から精製されたＣｏｍＰ。（Ｇ）：ヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰの抗Ｈｉｓチャネルでの探索。（Ｈ）：ＣＰＳ１４の抗グリカンチャネルでの探索。（Ｉ）：パネルＧとＨをマージした画像。アスタリスクは、５５℃で１時間プロテイナーゼＫ処理された試料を示す。
【図２０Ａ】ＧｌｕＣで消化されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメンテーションスペクトルを示す。ＧｌｕＣで消化されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰをＨＣＤフラグメンテーションにかけ、ＣＰＳ１４繰り返しサブユニットでグリカンに結合した単一ペプチドの確認を可能にした。ＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘｏｓｅ６に対応する１３７８．４７ＤａグリカンによるペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）のグリコシル化を確認するために、高衝突エネルギーレジーム（Ａ）及び高衝突エネルギーレジーム（Ｂ）が実施された。
【図２０Ｂ】ＧｌｕＣで消化されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメンテーションスペクトルを示す。ＧｌｕＣで消化されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰをＨＣＤフラグメンテーションにかけ、ＣＰＳ１４繰り返しサブユニットでグリカンに結合した単一ペプチドの確認を可能にした。ＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘｏｓｅ６に対応する１３７８．４７ＤａグリカンによるペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）のグリコシル化を確認するために、高衝突エネルギーレジーム（Ａ）及び高衝突エネルギーレジーム（Ｂ）が実施された。
【図２１】Ａ〜Ｆは、ＣＰＳ８−ＣｏｍＰ及びＣＰＳ９Ｖ−ＣｏｍＰ糖タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。ＣｏｍＰ、ＰｇｌＳ、及び肺炎球菌ＣＳＰ８またはＣＰＳ９Ｖのいずれかを共発現するＥ．  ｃｏｌｉのＳＤＢ１細胞が調製された。各菌株からアフィニティー精製されたグリコシル化ＣｏｍＰを、ウエスタンブロット分析によってタンパク質のグリコシル化について分析した。（Ａ−Ｃ）：ＣｏｍＰ単独と比較したＣＰＳ８−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートのウエスタンブロット分析（Ａ）：ＰｇｌＳの存在下または非存在下でＣＰＳ８を発現するＳＤＢ１から精製されたヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰの抗Ｈｉｓチャネルでの探索。（Ｂ）：ＣＰＳ８の抗グリカンチャネルでの探索。（Ｃ）：パネルＡとＢをマージした画像。（Ｄ〜Ｆ）：ＣｏｍＰ単独と比較したＣＰＳ９Ｖ−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートのウエスタンブロット分析（Ｄ）：ＰｇｌＳの存在下または非存在下でＣＰＳ９Ｖを発現するＳＤＢ１から精製されたヘキサヒスチジンタグ付きＣｏｍＰの抗Ｈｉｓチャネルでの探索。（Ｅ）：ＣＰＳ９Ｖの抗グリカンチャネルでの探索。（Ｆ）：パネルＤとＥをマージした画像。アスタリスクは、５５℃で１時間プロテイナーゼＫ処理された試料を示す。
【図２２】Ａ〜Ｆは、ＣｏｍＰ、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）、一価のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲート、及び３価のＣＰＳ８−／ＣＰＳ９Ｖ−／ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイコンジュゲートをワクチン接種したマウスのＩｇＧ応答を示す。マウスの群に、ＣｏｍＰ単独、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）、一価のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートワクチン、またはＣＰＳ８−／ＣＰＳ９Ｖ−／ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイコンジュゲートワクチンをワクチン接種した。血清は４９日目に採取され、０日目に採取された血清と比較するＥＬＩＳＡによって血清型特異的ＩｇＧ応答について分析された。（Ａ〜Ｃ）：血清型８（Ａ）、９Ｖ（Ｂ）、または１４（Ｃ）のプラセボワクチン接種マウスでは、ＩｇＧ応答の検出可能な増加は検出されなかった。（Ｄ〜Ｆ）：ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）ワクチン接種マウスでは、血清型８（Ｄ）に対するＩｇＧ応答力価の増加は検出されなかったが、血清型９Ｖ（Ｅ）及び１４（Ｆ）に特異的なＩｇＧ応答の増加があった。独立ｔ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）を実行して、４９日目の血清からの免疫前の血清を統計的に分析した。試験された各ケースのＰ値は＊＊＊＊ｐ＝０．０００１であった。各点は単一のワクチン接種されたマウスを表す。エラーバーは平均値の標準偏差を示す。Ｇ〜Ｌは、ＣｏｍＰ、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）、一価のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲート、及び３価のＣＰＳ８−／ＣＰＳ９Ｖ−／ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイコンジュゲートをワクチン接種したマウスのＩｇＧ応答を示す。マウスの群に、ＣｏｍＰ単独、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）、一価のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートワクチン、またはＣＰＳ８−／ＣＰＳ９Ｖ−／ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイコンジュゲートワクチンをワクチン接種した。血清は４９日目に採取され、０日目に採取された血清と比較するＥＬＩＳＡによって血清型特異的ＩｇＧ応答について分析された。（Ｇ〜Ｉ）：ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートワクチンをワクチン接種したマウスでは、血清型８（Ｇ）または９Ｖ（Ｈ）に特異的なＩｇＧ力価の検出可能な増加はなかったが、血清型１４（Ｉ）に対するＩｇＧ応答の統計的に有意な増加があった。（Ｊ〜Ｌ）：三価のＣＰＳ８−／ＣＰＳ９Ｖ−／ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートをワクチン接種したマウスは全て、血清型８（Ｊ）、９Ｖ（Ｋ）、及び１４（Ｌ）に対するＩｇＧ力価の統計的に有意なＩｇＧ応答の増加を示した。独立ｔ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）を実行して、４９日目の血清からの免疫前の血清を統計的に分析した。試験された各ケースのＰ値は＊＊＊＊ｐ＝０．０００１であった。各点は単一のワクチン接種されたマウスを表す。エラーバーは平均値の標準偏差を示す。
【図２３】Ａ、Ｂは、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型８及び１４に対するワクチン接種されたマウス由来の血清の殺菌活性を示す。Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型８（Ａ）と１４（Ｂ）の両方に対して、緩衝液対照、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）、またはバイオコンジュゲートワクチンのいずれかでワクチン接種されたマウス由来の血清のオプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）。血清型特異的な市販のウサギ抗Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清を陽性対照として使用した。ナイーブマウスの新鮮な全血に５％（ｖ／ｖ）試料血清と０．０１の細菌ＭＯＩを添加して、アッセイを実施した。４時間のインキュベーション後に生菌計数を実施した。細菌の殺傷を決定するために、試料血清とインキュベートしたチューブからの生菌数を、対照のナイーブマウス血清とインキュベートしたものと比較した。結果は、個々のマウスの殺菌パーセントとして表され、横棒は平均の標準偏差を表す。
【図２４Ａ】ＣＰＳ８きょう膜多糖によるＥＰＡグリコシル化の分析を示す。ＥＰＡ単独と比較したＥＰＡ−ＣＰＳ８バイオコンジュゲートのウエスタンブロット分析。（Ａ−左パネル）ＰｇｌＳの存在下または非存在下でＣＰＳ８を発現するＳＤＢ１から精製されたヘキサヒスチジンタグ付きＥＰＡの抗Ｈｉｓチャネルでの探索。（Ａ−真ん中のパネル）ＣＰＳ８の抗グリカンチャネルでの探索。（Ａ−右）左パネルと真ん中のパネルのマージした画像。
【図２４Ｂ】ＣＰＳ８きょう膜多糖によるＥＰＡグリコシル化の分析を示す。（Ｂ）：クーマシーで染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離したＥＰＡ−ＣＰＳ８。
【図２４Ｃ】精製されたＥＰＡ−ＣＰＳ８のＭＳ１質量スペクトルを示すインタクトタンパク質質量分析を示す。ＥＰＡ融合タンパク質の理論質量は７９，５２６．１５ダルトンであり、７９，５１４．７６のピークとして観察できる。ＥＰＡ融合タンパク質は、理論質量６６２ダルトンのＣＰＳ８繰り返しサブユニットに対応する質量増加の複数の状態でも観察された。ＥＰＡ−ＣＰＳ８の様々なグリコフォームが観察され、「ｇ数」で表され、ここで「ｇ」はグリコフォームを表し、「数」は繰り返しＣＰＳ８サブユニットの数に対応する。ＥＰＡ融合タンパク質は、ＣＰＳ８グリカンの最大１１の繰り返しサブユニットで修飾された。パネルＤは、様々なＥＰＡ−ＣＰＳ８グリコフォームの拡大表示を提示する。
【図２４Ｄ】図２４Ｃの様々なＥＰＡ−ＣＰＳ８グリコフォームの拡大表示を提示する。
【図２５】Ａ、Ｂは、マウスにおけるＣｏｍＰ−ＣＰＳ８及びＥＰＡ−ＣＰＳ８のバイオコンジュゲートに対する免疫応答の分析を示す。（Ａ）：ＣＰＳ８バイオコンジュゲートワクチンで免疫したマウスのＣＰＳ８ＩｇＧ抗体の力価。マウス群は以下のとおりであった：ＥＰＡ（ｎ＝９、５μｇの総タンパク質をワクチン接種したマウス）、ＣｏｍＰ−ＣＰＳ８（ｎ＝１０、５μｇの総多糖をワクチン接種したマウス）、及びＥＰＡ−ＣＰＳ８（ｎ＝１０、１００ｎｇの総多糖をワクチン接種したマウス）。１、１４、及び２８日目に、全てのマウスをＩｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ  Ａｄｊｕｖａｎｔで１：１に希釈した１００μＬのワクチンで免疫した。血清は４日目に採取した。力価測定のために、ＥＬＩＳＡプレートを全細胞の血清型８の肺炎球菌でコーティングし、血清の２倍段階希釈液とインキュベートした。個々のマウスの力価が示され、水平バーは平均の標準誤差を表す。ＥＰＡプラセボ群と比較して統計的に有意な力価はアスタリスクで示され、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析を使用して決定さた。＊＊、Ｐ＝０．０２２３及び＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。分析と表現の目的で、負の力価値（＜１００）には１０の任意値が与えられた。（Ｂ）：ＣｏｍＰ−ＣＰＳ８及びＥＰＡ−ＣＰＳ８のバイオコンジュゲートワクチンで免疫したマウス由来の４２日目の血清によるＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８のオプソニン化貪食作用による殺傷。ＩｇＧ力価について記載したのと同じマウス群をＯＰＡに使用した。血清の４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）試料と０．０１の細菌ＭＯＩを、ナイーブマウス由来の新鮮な全血に加えてアッセイを実施した。結果は、個々のマウスの殺菌パーセントとして表され、横棒は平均の標準偏差を表す。ＥＰＡプラセボ群と比較して統計的に有意な殺傷はアスタリスクで示され、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析を使用して決定さた。＊＊、Ｐ＝０．００１５。
【図２６Ａ】保存された相同セリンがＡ．  ｂａｙｌｙｉのＡＤＰ１及びＡ．  ｓｏｌｉの１１０２６４由来のＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化部位であると考えられていることを示す。ＣｏｍＰＡＤＰ１のセリン８２及び８４とＣｏｍＰ１１０２６４の相同セリン７９及び８２をアラニンに変異させ、ＰｇｌＳ及び血清型８のきょう膜多糖の存在下でのグリコシル化を探索した。ＰｇｌＳ及びＣＰＳ８の存在下でＣｏｍＰバリアントを発現するＳＤＢ１細胞を、タンパク質のグリコシル化についてウエスタンブロッティングによって探索した。ＣｏｍＰ発現及びグリコシル化のための抗Ｈｉｓチャネルでの探索。
【図２６Ｂ】保存された相同セリンがＡ．  ｂａｙｌｙｉのＡＤＰ１及びＡ．  ｓｏｌｉの１１０２６由来のＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化部位であると考えられていることを示す。ＣｏｍＰＡＤＰ１のセリン８２及び８４とＣｏｍＰ１１０２６４の相同セリン７９及び８２をアラニンに変異させ、ＰｇｌＳ及び血清型８のきょう膜多糖の存在下でのグリコシル化を探索した。ＰｇｌＳ及びＣＰＳ８の存在下でＣｏｍＰバリアントを発現するＳＤＢ１細胞を、タンパク質のグリコシル化についてウエスタンブロッティングによって探索した。ＣＰＳ８の抗グリカンチャネルでの探索。
【図２６Ｃ】保存された相同セリンがＡ．  ｂａｙｌｙｉのＡＤＰ１及びＡ．  ｓｏｌｉの１１０２６由来のＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化部位であると考えられていることを示す。ＣｏｍＰＡＤＰ１のセリン８２及び８４とＣｏｍＰ１１０２６４の相同セリン７９及び８２をアラニンに変異させ、ＰｇｌＳ及び血清型８のきょう膜多糖の存在下でのグリコシル化を探索した。ＰｇｌＳ及びＣＰＳ８の存在下でＣｏｍＰバリアントを発現するＳＤＢ１細胞を、タンパク質のグリコシル化についてウエスタンブロッティングによって探索した。パネルＡとＢをマージした画像。
【図２７】Ａ、Ｂ、Ｃは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＫ１及びＫ２きょう膜多糖によるＥＰＡグリコシル化の分析を示す。精製された、（Ａ）グリコシル化されていないＥＰＡ、（Ｂ）Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＫ１きょう膜多糖によりグリコシル化されたＥＰＡ、または（Ｃ）Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＫ２きょう膜多糖によりグリコシル化されたＥＰＡのウエスタンブロット分析。「ｇ０」は、グリコシル化されていないＥＰＡ融合体を示し、「ｇｎ」は、それぞれパネルＢまたはＣに示されているように、異なるサイズのＫ１またはＫ２繰り返しサブユニットでグリコシル化されたＥＰＡ融合体を示す。
【図２８Ａ】精製されたＥＰＡ−Ｋ２のＭＳ１質量スペクトルを示すインタクトタンパク質質量分析を示す。ＥＰＡ融合タンパク質の理論質量は７９，５２６．１５ダルトンであり、７９，５１８．７３のピークとして観察できる。ＥＰＡ融合タンパク質は、理論質量６６２ダルトンのＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＫ２きょう膜多糖の繰り返しサブユニットに対応する質量増加の複数の状態でも観察された。ＥＰＡ−Ｋ２の様々なグリコフォームが観察され、「ｇ数」で表され、ここで「ｇ」はグリコフォームを表し、「数」は繰り返しＫ２サブユニットの数に対応する。ＥＰＡ融合タンパク質は、Ｋ２きょう膜の最大１１の繰り返しサブユニットで修飾された。
【図２８Ｂ】精製されたＥＰＡ−Ｋ２のＭＳ１質量スペクトルを示すインタクトタンパク質質量分析を示す。ＥＰＡ融合タンパク質の理論質量は７９，５２６．１５ダルトンであり、７９，５１８．７３のピークとして観察できる。ＥＰＡ融合タンパク質は、理論質量６６２ダルトンのＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＫ２きょう膜多糖の繰り返しサブユニットに対応する質量増加の複数の状態でも観察された。Ａの拡大図も提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
説明的なサポートを提供するために必要な範囲で、添付の特許請求の範囲の主題及び／または文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
本明細書に記載及び請求される例示的な態様及び実施形態は、本明細書に具体的に開示されている、または具体的に開示されていない列挙された特徴、要素またはステップがない場合に適切に実施され得ることが、この書面による説明の全ての読者によって理解される。
【００２２】
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「多糖」は、１つまたは複数の多糖を表すと理解されることに留意されたい。そのようなとき、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００２３】
さらに、「及び／または」は、本明細書で使用される場合、他のものを伴ってまたは伴わずに、特定の特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示として受け取られるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」等の語句で使用されるとき、「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ］のような語句で使用されるとき、「及び／または」という用語は、以下の実施形態の各々を包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００２４】
本明細書で「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という言葉で態様が記載されている場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語で記載されている類似の態様も提供されることを理解されたい。
【００２５】
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本開示の関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。数値範囲は範囲を定義する数を含む。「及びその間の任意の範囲」などによって明示的に識別されていない場合、または例えば、１，２，３または４のように値の列挙が記載されている場合でも、特に明記しない限り、本開示は、値の間の任意の範囲、例えば、１〜３、１〜４、２〜から４などを具体的に含む。
【００２６】
本明細書で提供される見出しは、単に参照を容易にするためのものであり、本明細書全体を参照することによって得られることができる本開示の様々な態様または態様の限定ではない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」状態、物質、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組成物、実体、生物、個体、及び／またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらの任意の文法的異形という用語は、当業者によって「天然に存在する」と十分に理解されている、または「天然に存在する」と裁判官または行政または司法機関によっていつでも判定または解釈される可能性のある形式を明示的に除外するが除外するだけである条件付き用語である。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「バイオコンジュゲート」という用語は、糖（糖、オリゴ糖、多糖など）に共有結合したペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドなどを含む分子である。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、「オリゴ糖または多糖」は、一緒に結合された１つを超える単糖単位からなる炭水化物を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「脂質結合オリゴ糖または多糖」という用語は、ピロリン酸によってオリゴ糖または多糖に結合された任意のイソプレノイド部分を指す。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」という用語は、それらが天然には生じない配置で共有結合している２つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。そのようなアミノ酸配列は、異種タンパク質からの配列、同じタンパク質の異なる領域からの配列、及び／または同じタンパク質からの繰り返し配列を含み得る。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「同一性」または「同一」という用語、例えば、本明細書に開示されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に対して「同一性パーセント（％）」または「パーセント（％）同一である」は、２つ以上のヌクレオチド配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の関係を指す。ある配列の位置が、比較配列の対応する位置の同じ核酸塩基またはアミノ酸によって占められている場合、その配列はその位置で「同一である」と言われる。「配列同一性」のパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸が両方の配列に存在する位置の数を決定して、「同一である」位置の数を得ることによって計算される。次に、「同一である」位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、１００を掛けて、「配列同一性」のパーセンテージを得る。「配列同一性」のパーセンテージは、参照配列の全長の比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される。比較のために配列を最適に整列させるために、比較ウィンドウ内のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の部分は、参照配列が一定に保たれている間、ギャップと呼ばれる付加または欠失を含み得る。最適なアライメントは、ギャップがあっても、参照配列と比較配列の間に可能な限り多くの「同一である」位置を生成するアライメントです。２つの配列間の「配列同一性」のパーセンテージは、例えば、国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能であり、プログラムＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列比較用）及びＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列比較）を組み込んだプログラム「ＢＬＡＳＴ」を使用して決定することができ、このプログラムは、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムに基づいている（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，  １９９３）。
【００３３】
本明細書において使用されるとき、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」及び複数形の「ポリペプチド」を包含し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結した単量体（アミノ酸）からなる分子を指すことを意図する。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。したがって、２つ以上のアミノ酸の鎖または複数の鎖を指すのに使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代わりに、または互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非標準アミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって生成され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。それは化学合成によることを含む任意の方法で生成することができる。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「タンパク質」は、単一のポリペプチド、すなわち上述で定義された単一のアミノ酸鎖を指すことができるが、例えば、ジスルフィド結合、水素結合、または疎水性相互作用によって結合されて多量体タンパク質を生成する２つ以上のポリペプチドを指すこともできる。
【００３５】
「単離された」ポリペプチドまたはそのフラグメント、バリアント、もしくは誘導体とは、その天然の環境にはないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルが求められるわけではない。例えば、単離されたポリペプチドはその天然のまたは自然な環境から取り出され得る。いずれかの適切な技法によって、分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された天然のポリペプチドまたは組み換えポリペプチドと同様に、宿主細胞で発現させた組み換え産生ポリペプチドとタンパク質は、本発明の目的において、単離されているものとみなす。単離されたポリペプチドまたはフラグメント、バリアント、またはそれらの誘導体などは、補因子と会合、結合などすることができる。同様に、精製されたか、または精製及び単離されたポリペプチドまたはフラグメント、バリアント、またはそれらの誘導体などは、補因子と会合、結合などすることができる。
【００３６】
本明細書で開示される他のポリペプチドは、本明細書で開示されるポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログ、またはバリアント、及びそれらの任意の組み合わせである。本明細書に開示されるポリペプチドサブユニットまたは多量体タンパク質を指す場合の「フラグメント」、「バリアント」、「誘導体」、及び「類似体」という用語は、完全なポリペプチドまたはタンパク質の活性の少なくとも一部を保持する（例えば、グリコシル化される能力を保持する）が、構造的に異なる任意のポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。ポリペプチドのフラグメントとしては、例えば、タンパク質分解フラグメント、及び欠失フラグメントが挙げられる。バリアントとしては、上述のようなフラグメント、及びアミノ酸の置換、欠失、または挿入に起因して改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。バリアントは、自発的に発生しても、意図的に作成してもよい。意図的に構築されたバリアントは、当該技術分野で知られている変異導入技法を使用して生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る（当業者は、「保存的アミノ酸置換」が「保存的アミノ酸残基／位置」と同じではないことを理解するであろう）。バリアントポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド類似体」と呼ぶこともできる。誘導体は、天然のポリペプチドには見られないさらなる特徴を示すように改変されているポリペプチドのバリアントである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。本明細書中で使用されるとき、「誘導体」とは、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有する本発明のポリペプチドを指す。「誘導体」としても含まれるのはまた、２０個の標準アミノ酸のうちの１つまたは複数の標準の、または合成のアミノ酸誘導体を含むペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンの代わりになり得；５−ヒドロキシリジンはリジンの代わりになり得；３−メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりになり得；ホモセリンはセリンの代わりになり得；オルニチンはリジンの代わりになり得る。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「単一アミノ酸置換」は、別段の定めがない限り、ポリペプチド配列のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることを意味する（例えば、野生型配列の天然残基を非天然アミノ酸で置き換える）。「単一アミノ酸の欠失」及び／または「単一アミノ酸の挿入」も本開示に包含される。
【００３８】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸が類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義され、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。例えば、チロシンをフェニルアラニンに置換することは、保存的置換である。タンパク質の活性または機能性を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野でよく知られている（ｓｅｅ，  ｅ．ｇ．，  Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２：  １１８０−１  １８７  （１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １２（１０）：８７９−８８４  （１９９９）；Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：．４１２−４１７  （１９９７））。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その本来の環境から回収された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドサブユニットをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるように単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのポリヌクレオチドのＲＮＡ転写物が含まれる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に生成されたそのような分子がさらに含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得るか、またはそれらを含み得る。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンを含む核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されず、コード領域の一部とみなすことができるが、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどの隣接配列は、コーディング領域の一部ではない。２つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、単一のベクター上、または別個のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、別個の（異なる）ベクター上に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含むことができ、または２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターは、選択マーカー遺伝子及び目的の遺伝子を別々にコードすることができる。さらに、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本明細書で提供されるポリペプチドサブユニットまたは融合タンパク質をコードする核酸に融合または非融合のいずれかの異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特化した要素またはモチーフが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
特定の態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つまたは複数のコード領域に作動可能に結合するプロモーター及び／または他の転写または翻訳調節エレメントを含むことができる。作動可能な結合または連鎖は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列（複数可）の影響または制御下に置くような方法で、１つまたは複数の調節配列と結合し得る場合であり得る。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を誘導する能力を妨害しないか、または転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨害しない場合、２つのＤＮＡフラグメント（ポリペプチドコード領域及びそれに関連するプロモーターなど）は「作動可能に結合した」または「作動可能に連結した」ものとすることができる。したがって、プロモーターがポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合しているのは、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合である。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を誘導する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写調節エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を誘導するためにポリヌクレオチドと作動可能に連結させることができる。
【００４２】
当業者には、様々な転写調節領域が知られている。これらには、サイトメガロウイルス（イントロンＡと組み合わせた最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントなどであるがこれらに限定されない、脊椎動物細胞で機能する転写調節領域が含まれまるが、これらに限定されない。他の転写調節領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、ウサギβグロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する領域、及び真核細胞での遺伝子発現を制御できる他の配列が含まれる。追加の適切な転写調節領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサーが含まれる。
【００４３】
同様に、様々な翻訳調節エレメントが当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる配列内リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
他の態様では、ポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡであり得る。
【００４５】
ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と結合することができ、これは、本明細書に開示されるように、ポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの分泌を指示する。
【００４６】
「ベクター」は、宿主細胞に導入される核酸分子であり、それにより、形質転換された宿主細胞を生成する。ベクターは、複製起点などの宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、当該技術分野で知られている、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子及び他の遺伝子エレメントを含んでもよい。例示的なタイプのベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス、及びレトロウイルスが含まれる。
【００４７】
「形質転換された」細胞、または「宿主」細胞は、分子生物学技法によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で使用されるとき、形質転換という用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、及びエレクトロポレーション、リポフェクション、及びパーティクルガン加速によるネイキッドＤＮＡの導入を含む、核酸分子をそのような細胞に導入することができる技法を包含する。形質転換された細胞または宿主細胞は、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、哺乳動物）であり得る。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えばポリペプチドを生成するプロセスを指す。このプロセスには、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現と安定発現の両方を含むがこれらに限定されない、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の発現が含まれる。これには、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、及びそのようなｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳が含まれるが、これらに限定されない。最終的な所望の製品が生化学物質である場合、発現にはその生化学物質及び任意の前駆体の作成が含まれる。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用されるとき、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断などを有するポリペプチドをさらに含む。
【００４９】
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性を有効にさせる形態であり、組成物が投与される対象にとって許容しがたい程度に毒性であるさらなる成分を含まない製剤を指す。そのような組成物は無菌であり得る。
【００５０】
概要。タンパク質に連結した多糖からなるコンジュゲートワクチンは、命を救う予防薬である。伝統的に、コンジュゲートワクチンは化学的方法論を使用して製造されている。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏ細菌コンジュゲーションは、製造の代替手段として浮上している。Ｉｎ  ｖｉｖｏコンジュゲーション（バイオコンジュゲーション）は、多糖をタンパク質に結合するためにオリゴサッカリルトランスフェラーゼに依存している。現在、バイオコンジュゲーションに使用されるオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、多糖が還元末端にグルコースを含む場合、コンジュゲートワクチンの生成には適さない。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅきょう膜の約７５％に還元末端糖としてグルコースが含まれているため、この制限には大きな影響がある。本明細書に開示されるのは、それらの還元末端にグルコースを含む多糖を有する初めての多価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを生成するためのＯ−結合型オリゴ糖トランスフェラーゼの使用である。肺炎球菌バイオコンジュゲートは免疫原性、防御性があり、組換え技法で迅速に生成された。本明細書に開示される特定の態様は、ワクチン担体として天然アクセプタータンパク質ＣｏｍＰを使用する多価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチン、ならびに従来のワクチン担体、例えば、特定の態様では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  外毒素Ａタンパク質を含むものを使用する一価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンの工学的、特性評価、及び免疫学的応答を提供する。これにより、他のコンジュゲート酵素の制限を克服するためのプラットフォームが確立され、多くの重要なヒト及び動物の病原体に対するバイオコンジュゲートワクチンの開発が可能になる。
【００５１】
過去２０年間に肺炎球菌コンジュゲートワクチンが導入及び実施されたとしても、毎年約１５０万人の死がＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因している。これは、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの９０を超える血清型と、肺炎球菌コンジュゲートワクチンの合成に必要な複雑な製造方法に一部起因する。これらの要因が合わさって、ワクチンのより広く、より保護的なバリエーションの世界的な流通と開発を妨げている。開発を促進し、製造コストを下げるために、本明細書に開示されるのは、ｉｎ  ｖｉｖｏコンジュゲーションを使用して、コンジュゲートワクチン、例えば肺炎球菌コンジュゲートワクチンを開発するためのプラットフォームである。この合理化されたプロセスは、既存の製造パイプラインを補完するか、化学コンジュゲーション方法論への依存を完全に回避する可能性があり、より包括的なコンジュゲートワクチンの製造を可能にする。
【００５２】
従来の化学コンジュゲートワクチン合成は、複雑で、費用がかかり、面倒であると考えられている（Ｆｒａｓｃｈ，  Ｃ．Ｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７，  ６４６８−６４７０  （２００９））。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏコンジュゲーションは、実行可能な生合成の代替手段として徹底的に進歩している（Ｈｕｔｔｎｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７，  ５２８−５３７  （２０１７））。これらの進歩は、ＧｌｙｃｏＶａｘｙｎ（現在はＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅと直接関係のある独立企業であるＬｉｍｍａＴｅｃｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＡＧ）の成功によって最もよく強調されている。これは、臨床試験の様々なフェーズで複数のバイオコンジュゲートワクチンを使用する臨床段階のバイオ医薬品企業であり、そのうちの１つ（Ｆｌｅｘｙｎ２ａ）はフェーズ２ｂチャレンジ研究を完了した。ＧｌｙｃｏＶａｘｙｎはｉｎ  ｖｉｖｏコンジュゲーション革命の最前線にあるが、還元末端糖としてグルコース（Ｇｌｃ）を含む多糖で担体／アクセプタータンパク質をグリコシル化する能力はとらえどころのないものであり、予想通り、肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンの開発を妨げてきた。
【００５３】
Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＭＩＤ２３６５８７７２）によってＰｇｌＬと、及びＨａｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５（ＰＭＩＤ  ２６７２７９０８）によってＰｇｌＬＣｏｍＰと以前は呼ばれていたオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、機能的なＯＴａｓｅとして最近特徴付けられた（Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｂ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，  ｅ６２７６８  （２０１３））。総糖ペプチドに関するその後の質量分析研究は、ＰｇｌＳが一般的なＰｇｌＬ様ＯＴａｓｅとして作用せず、複数のペリプラズム及び外膜タンパク質をグリコシル化することを示した（Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｃ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９６，  １０２３−１０４１  （２０１５））。実際、Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１のゲノムは、２つのＯＴａｓｅ、ＰｇｌＬ様オーソログ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ６ＦＦＳ６．１）をコードし、これは一般的なＯＴａｓｅ及びＰｇｌＳ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：  Ｑ６Ｆ７Ｆ９．１）として作用し、単一ンタンパク質ＣｏｍＰをグリコシル化する（Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｃ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９６，  １０２３−１０４１  （２０１５））。
【００５４】
ＣｏｍＰは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＰｉｌＡ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ由来のＰｉｌＥなどのＩＶ型ピリンタンパク質とオルソロガスであり、そのどちらもそれぞれ、ＯＴａｓｅｓ  ＴｆｐＯ（Ｃａｓｔｒｉｃ，  Ｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１  （  Ｐｔ  ５），  １２４７−１２５４  （１９９５））及びＰｇｌＬ（Ｐｏｗｅｒ，  Ｐ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４９，  ８３３−８４７  （２００３））によってグリコシル化される。ＴｆｐＯとＰｇｌＬもセリン残基で同族のピリンをグリコシル化するが、グリコシル化の部位は各システム間で異なる。ＴｆｐＯは、ＣｏｍＰには存在しないＣ末端のセリン残基で同族のピリンをグリコシル化する（Ｃｏｍｅｒ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｍ．Ａ．，  Ｂｌａｎｃｈ，  Ｖ．Ｊ．，  Ｄｅａｌ，  Ｃ．Ｄ．＆  Ｃａｓｔｒｉｃ，  Ｐ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０，  ２８３７−２８４５  （２００２））。ＰｇｌＬは６３位にある内部セリンでＰｉｌＥをグリコシル化する（Ｓｔｉｍｓｏｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７，  １２０１−１２１４  （１９９５））。ＣｏｍＰは６３位付近にセリン残基も含み、周囲の残基はＮ．  ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ由来のＰｉｌＥに対して中程度の保存を示している。しかし、包括的な糖ペプチド分析により、このセリンと周囲の残基はＣｏｍＰのグリコシル化部位ではないことが明らかになった。ここで、ＰｇｌＳが、ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６３１（配列番号１）（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１（配列番号２）の８２位の保存されたセリンにも対応する）の８４位の保存されたセリンに対応する位置に位置する単一のセリン残基でＣｏＭＰをグリコシル化することが開示され、これは、ＩＶ型ピリンスーパーファミリー内ではこれまで見られなかった新規のグリコシル化部位である。ピリンスーパーファミリー内のグリコシル化の新規部位の同定と組み合わされ、還元末端糖としてグルコースを含む多糖を転移するＰｇｌＳの能力は、ＰｇｌＳがＰｇｌＬ及びＴｆｐＯとは機能的に異なるＯＴａｓｅであることを実証する。
【００５５】
ＰｇｌＢまたはＰｇｌＬではなく、ＰｇｌＳは、還元末端にグルコースを含む多糖をアクセプタータンパク質ＣｏｍＰに転移した。２つのクラスのＯＴａｓｅ、ＰｇｌＢ、及びＰｇｌＬは、以前はｉｎ  ｖｉｖｏコンジュゲーションに使用されていた（Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，  ３０１６−３０２１  （２００５）；Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ，  Ａ．，  Ｆｅｎｔａｂｉｌ，  Ｍ．Ａ．，  Ｍｉｌｌｓ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｋｌａｓｓｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  ＆  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．Ｆ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８９，  ８０８８−８０９８（２００７））。記載された最初のＯＴａｓｅであるＰｇｌＢは、基質認識に役割を果たすと考えられているため、還元末端のＣ−２位置にアセトアミド基を含むグリカン（すなわちＮ−アセチルグルコサミン）を優先的に転移する（Ｗａｃｋｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３，  ７０８８−７０９３  （２００６））。しかしながら、Ｓ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｏ抗原など、還元末端にガラクトース（Ｇａｌ）を含む多糖は、操作されたＰｇｌＢバリアントによって転移できる（Ｉｈｓｓｅｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｌ  ５，  １４０２２７（２０１５））。２番目に記載されたＯＴａｓｅであるＮ．  ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ由来のＰｇｌＬは、ＰｇｌＢよりも基質特異性が緩和されており、Ｃ−２位にアセトアミド基を持つ多糖と還元末端にガラクトース（Ｇａｌ）を含む多糖を自然に転移する（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ，  Ａ．，  Ｆｅｎｔａｂｉｌ，  Ｍ．Ａ．，  Ｍｉｌｌｓ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｋｌａｓｓｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  ＆  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．Ｆ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８９，  ８０８８−８０９８  （２００７）；Ｐａｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．ＭＢｉｏ  ７  （２０１６））。しかしながら、還元末端にグルコース（Ｇｌｃ）を含む多糖のＰｇｌＢまたはＰｇｌＬを介した転移について利用できる証拠はなく、これは、肺炎球菌ＣＰＳの大部分が還元末端にグルコースを含むことを考えると特に興味深い（Ｇｅｎｏ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２８，  ８７１−８９９  （２０１５））。肺炎球菌血清型１４きょう膜多糖（ＣＰＳ１４）をそれらの同族のグリコシル化標的であるＡｃｒＡ（Ｗａｃｋｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，  １７９０−１７９３  （２００２））及びＤｓｂＡ  （Ｖｉｋ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６，  ４４４７−４４５２  （２００９））に転移するＰｇｌＢ及びＰｇｌＬの能力がそれぞれ試験された。図１Ａ及び図１Ｂに見られるように、両方のアクセプタータンパク質が発現したが、いずれかのアクセプタータンパク質へのＣＰＳ１４グリコシル化の証拠は観察されなかった。
【００５６】
アシネトバクター種は、３つのＯ−結合型；複数のタンパク質のグリコシル化に関与する一般的なＰｇｌＬ  ＯＴａｓｅ、及び２つのピリン特異的ＯＴａｓｅＯＴａｓｅを含むと記載されている（Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｃ．Ｍ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９６，  １０２３−１０４１  （２０１５））。最初のピリン特異的ＯＴａｓｅはＴｆｐＯ（ＰｉｌＯとしても知られる）のオーソログであり、１つを超える繰り返し単位を持つ多糖を転移できないため、ｉｎ  ｖｉｖｏコンジュゲーションシステムには使用されない（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ，  Ａ．，  Ｆｅｎｔａｂｉｌ，  Ｍ．Ａ．，  Ｍｉｌｌｓ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｋｌａｓｓｅｎ  Ｊ．Ｓ．＆  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．Ｆ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８９，  ８０８８−８０９８（２００７））。２番目のピリン特異的ＯＴａｓｅであるＰｇｌＳは、単一のタンパク質であるＩＶ型ピリンＣｏｍ２８をグリコシル化する。バイオインフォマティクス分析は、ＰｇｌＳがＯＴａｓｅの異なるファミリーの原型であることを示した。ＰｇｌＳが新しいクラスのＯ−ＯＴａｓｅであることを考え、肺炎球菌ＣＰＳ１４をその同族のアクセプタータンパク質であるＣｏｍＰに転移する能力（Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｃ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９６，  １０２３−１０４１（２０１５））を試験した。図１Ｃに見られるように、ＰｇｌＳ及びＣｏｍＰのヘキサヒスタグ付きバリアントと組み合わせたＣＰＳ１４生合成遺伝子座の共発現は、ウエスタンブロッティングで分析した場合、タンパク質のグリコシル化と互換性のある典型的なはしご状のバンドパターンをもたらした（図１Ｂ）。シグナルの高分子量のモーダル分布は、分子量が増加するグリカンサブユニットの繰り返しによるタンパク質のグリコシル化を示す。まとめると、これらの結果は、以前に特徴付けられたＯＴａｓｅとは異なり、ＰｇｌＳが還元末端にグルコースを含む多糖を転移できることを示す。
【００５７】
Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅには９０を超える血清型がある（Ｇｅｎｏ，  Ｋ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２８，  ８７１−８９９（２０１５））。血清型８、２２Ｆ、及び３３Ｆなど、ますます流行している多くの血清型は、現在認可されているワクチンには含まれていない。したがって、ＰｇｌＳの汎用性を試験して、Ｐｒｅｖｎａｒ  １３に含まれる２つの血清型（血清型９Ｖ及び１４）と含まれない１つの血清型（血清型８）に対する多価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを生成した（添付文書−Ｐｒｅｖｎａｒ  １３−ＦＤＡ、ワールドワイドウェブの（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／Ｖａｃｃｉｎｅｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ／ＵＣＭ２０１６６９．ｐｄｆ）。重要なことに、これらの３つのきょう膜多糖は全て、還元末端糖としてグルコースを含む（Ｇｅｎｏ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２８，  ８７１−８９９（２０１５））。図２に見られるように、ＰｇｌＳ、ヘキサヒスタグ付きＣｏｍＰバリアント、及びＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１４のいずれかを共発現する全細胞からのアフィニティー精製タンパク質のウエスタンブロット分析により、ＣＰＳ特異的バイオコンジュゲートが生成された。さらに、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１４抗原のいずれかに特異的な抗血清も、抗Ｈｉｓ反応性バンドに反応し、ＣｏｍＰ−Ｈｉｓが正しい多糖でグリコシル化されたことを示す。精製された材料が脂質結合多糖で汚染されていないことを確認するために、試料をプロテイナーゼＫで処理し、ウエスタンブロッティングで分析したときにシグナルの喪失を観察し、バイオコンジュゲートがタンパク質性であることを確認した。
【００５８】
したがって、ＰｇｌＳはＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多糖をＣｏｍＰに転移することができるが、ＰｇｌＢとＰｇｌＬは転移することができないことが実証された。具体的には、ＰｇｌＳは、還元末端にグルコースを含む多糖を転移することができる、世界で知られている中の唯一のＯＴａｓｅである。特定の態様では、ＰｇｌＳは、還元末端にグルコースを含む脂質結合型オリゴ糖または多糖（本明細書では総称して「オリゴ糖または多糖」と呼ぶ）をＣｏｍＰまたはＣｏｍＰのフラグメントを含む融合タンパク質に転移するために使用できる。
【００５９】
ＰｇｌＳは、クレブシエラのきょう膜多糖をＣｏｍＰに転移することができる。グラム陰性の日和見ヒト病原菌であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、病原性に重要であることが知られているきょう膜多糖を生成する。現在までに、クレブシエラ種について少なくとも７９の抗原的に異なるきょう膜多糖が報告されている（Ｐａｎ，  Ｙ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５，  １５５７３（２０１５））。さらに、Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  は、７７のきょう膜多糖のうち少なくとも５９を生成することが知られており、その半分以上が還元末端糖としてグルコースを含む（Ｐａｎ，  Ｙ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５，  １５５７３（２０１５））。ＰｇｌＳがＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅきょう膜多糖をＣｏｍＰに転移できるかどうかを判断するために、Ｋ１またはＫ２莢膜多糖の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子をＩＰＴＧ誘導性ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２ベクターにクローニングした（Ｋｏｖａｃｈ，  Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６６，  １７５−１７６（１９９５））。Ｋ１きょう膜遺伝子座は、以前に特徴付けられたＫ１きょう膜産生株であるＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨＫ−２０４４からクローン化された（Ｗｕ，  Ｋ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９１，  ４４９２−４５０１（２００９））。Ｋ２きょう膜遺伝子座は、以前に特徴付けられたＫ２きょう膜産生株であるＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ５２．１４５からクローン化された（Ｌｅｒｙ，  Ｌ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ  １２，  ４１（２０１４））。次いで、Ｋ１またはＫ２きょう膜多糖発現プラスミドを、別のプラスミドベクターからＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅとアクセプタータンパク質ＣｏｍＰを共発現するＥ．  ｃｏｌｉに個別に導入した。Ｋ１及びＫ２特異的多糖の発現を増強するために、Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨＫ−２０４４由来のＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  転写活性化因子ｒｍｐＡを続いてｐＡＣＴ３（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｓｔ  Ｐｉｅｒｒｅ，  Ｒ．  ＆  Ｌｉｎｎ，  Ｔ．  Ｇｅｎｅ  １７７，  １３３−１３６（１９９６））低コピー、ＩＰＴＧ誘導性ベクターにクローニングしたが、それが以前にＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのきょう膜の調節因子として特徴づけられていたためである（Ａｒａｋａｗａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５９，  ２０４３−２０５０（１９９１））；Ｙｅｈ，  Ｋ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４５，  ４６６−４７１（２００７））。ＰｇｌＳとヘキサヒスタグ付きＣｏｍＰバリアント、及びＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＫ１またはＫ２きょう膜多糖のいずれかを共発現するＥ．  ｃｏｌｉ株にｒｍｐＡ遺伝子を導入すると、ウエスタンブロッティングで分析した場合、タンパク質のグリコシル化と互換性のある、バンドの典型的なラダーようなパターンで示されるように、高分子ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの強力な発現と検出が得られた（図３Ｂ）。シグナルのモーダル分布は、分子量が増加するグリカンサブユニットの繰り返しによるタンパク質のグリコシル化を示す。したがって、まとめると、ＰｇｌＳはＣｏ��ＰをＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のＫ１及びＫ２きょう膜多糖でグリコシル化することができた。Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の転写活性化因子ｒｍｐＡの共発現により、コンジュゲーション効率の増加が観察された。
【００６０】
ＰｇｌＳは、Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖をＣｏｍＰに転移することができる。ほとんどのＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅきょう膜多糖が還元末端糖としてグルコースを含んでいることを考えると、他の商業的に認可されたＯＴａｓｅ（ＰｇｌＢ及びＰｇｌＬ）のみがこれらの多糖を使用してコンジュゲートワクチンを生成できないはずである。さらに、転写活性化因子であるＲｍｐＡときょう膜遺伝子クラスターの共発現により、きょう膜の発現が検出可能なレベルまで増強された。特定の態様では、クレブシエラコンジュゲートの製造方法を使用してＫ．  ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋ．  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、及びＫ．  ｏｘｙｔｏｃａなどの他の種を含む全ての血清型を包含する汎クレブシエラコンジュゲートワクチンを生成できる。
【００６１】
質量分析及び部位特異的変異導入により、ＰｇｌＳがＯ−結合型ＯＴａｓｅであることが確認され、ＣｏｍＰがＣｏｍＰＡＤＰ１の８４位に対応するセリン残基でグリコシル化されていることが確認された。細菌のＮ−グリコシル化は、一般に、シークオンＤ−Ｘ−Ｎ−Ｓ−Ｔ（配列番号２１）内で発生し、ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である（Ｋｏｗａｒｉｋ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２５，  １９５７−１９６６  （２００６））。これに対して、Ｏ−グリコシル化は定義されたシークオンに従わないように見える。細菌タンパク質のほとんどのＯ−グリコシル化イベントは、セリン、アラニン、及びプロリンが豊富な低複雑度（ＬＣＲ）の領域で発生する（Ｖｉｋ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６，  ４４４７−４４５２  （２００９））。代替的に、いくつかのピリンは、Ｃ末端のセリン残基でＯ−グリコシル化される（Ｃｏｍｅｒ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｍ．Ａ．，  Ｂｌａｎｃｈ，  Ｖ．Ｊ．，  Ｄｅａｌ，  Ｃ．Ｄ．＆  Ｃａｓｔｒｉｃ，  Ｐ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０，  ２８３７−２８４５（２００２））。ＣｏｍＰは、他のピリン様タンパク質に見られるものと相同な明らかなＬＣＲまたはＣ末端セリン残基を持っていないようであるため、質量分析を使用してグリコシル化の部位（複数可）を決定した。精製されたＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートは、タンパク質分解消化、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ糖ペプチド濃縮、及び複数のＭＳ分析にかけられた。図４Ａ及び図４Ｂに見られるように、ペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）からなる単一の糖ペプチドが、公開されているＣＰＳ１４組成に一致するグリカンに結合していることが同定された（Ｇｅｎｏ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２８，  ８７１−８９９（２０１５））。ペプチドと結合したグリカン配列の両方を確認できるようにするために、複数の衝突エネルギーレジームを実行して、ＨｅｘＮＡＣ２Ｈｅｘｏｓｅ６に対応する１３７８．４７Ｄａグリカンによるｓｅｍｉ−ＧｌｕＣ由来ペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）のグリコシル化を確認した（図４Ｂ）。最大４つの四糖繰り返し単位に対応する拡張グリカンで装飾された追加の糖ペプチドも観察された（図１６）。
【００６２】
アシネトバクター種は主にセリン残基でタンパク質をグリコシル化することが以前に示されており、したがって、配列番号１で番号が付けられているセリン（Ｓ）８２または８４のいずれかがグリコシル化の部位であると仮定された（Ｓｃｏｔｔ，  Ｎ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １３，  ２３５４−２３７０  （２０１４））。どのセリン残基がグリコシル化の部位であるかを決定するために、これらのセリン残基を個別にアラニン（Ａ）に変異させ、両方の変異タンパク質のグリコシル化状態を分析した。この実験では、Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ  七糖の生合成遺伝子座をドナーグリカンとして使用した。これは、ｈＲ６抗グリカン抗血清で、また電気泳動移動度の増加によって、グリコシル化が容易に検出できるためである（Ｓｃｈｗａｒｚ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ６，  ２６４−２６６（２０１０））。図５に示すように、野生型ヘキサヒスタグ付きＣｏｍＰは、ＰｇｌＳと共発現した場合の電気泳動移動度の増加と、ｈＲ６抗血清シグナルとの共局在によって示されるように、Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ七糖でグリコシル化された。ＭＳ分析では、ＣＰＳ１４で修飾された同一のｓｅｍｉ−ＧｌｕＣ由来ペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）にＣ．  ｊｅｊｕｎｉ七糖が存在することも確認された（図１７及び図１８）。陰性対照として、触媒的に不活性なＰｇｌＳ変異体（Ｈ３２４Ａ）が生成され、Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ七糖グリカンと共発現すると、野生型ＣｏｍＰをグリコシル化できなかった。部位特異的変異導入が行われ、Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ七糖によるＣｏｍＰのグリコシル化がＣｏｍＰ［Ｓ８４Ａ］変異体で廃止されたのに対し、ＣｏｍＰ［Ｓ８２Ａ］は野生型レベルでグリコシル化されたことが観察された。まとめると、これらの結果は、ＣｏｍＰがセリン８４（配列番号１で番号付け）でＰｇｌＳによって単独でグリコシル化されていることを示し、これは、以前に特徴付けられた他のピリン様タンパク質とは異なる固有の部位である。これは、配列番号２で番号付けされたセリン８２に対応する。
【００６３】
ＣｏｍＰピリンオーソログのバイオインフォマティクス特徴。ＣｏｍＰは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１の自然形質転換に必要な因子として最初に記載された（Ｐｏｒｓｔｅｎｄｏｒｆｅｒ，  Ｄ．，  Ｄｒｏｔｓｃｈｍａｎｎ，  Ｕ．  ＆  Ａｖｅｒｈｏｆｆ，  Ｂ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６３，  ４１５０−４１５７（１９９７））。その後の研究では、Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１（本明細書ではＣｏｍＰＡＤＰ１と呼ぶ）由来のＣｏｍＰが、染色体上の他の場所にある一般的なＯＴａｓｅ  ＰｇｌＬではなく、ＣｏｍＰのすぐ下流にある新しいＯＴａｓｅ、ＰｇｌＳによってグリコシル化されることが示された（Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｃ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９６，  １０２３−１０４１（２０１５））。ＣｏｍＰＡＤＰ１タンパク質（ＮＣＢＩ識別子ＡＡＣ４５８８６．１）は、ＩＶ型ピリンと呼ばれるタンパク質ファミリーに属している。具体的には、ＣｏｍＰはＩＶａ型の主要なピリンと相同性を共有している（Ｇｉｌｔｎｅｒ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｙ．  ＆  Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ｌ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７６，  ７４０−７７２（２０１２））。ＩＶａ型ピリンは、高度に保存されたリーダー配列とＮ末端アルファヘリックスをコードするＮ末端で高い配列相同性を共有しているが、Ｃ末端は属間及び種内でさえ顕著な相違を示す（Ｇｉｌｔｎｅｒ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｙ．  ＆  Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ｌ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７６，  ７４０−７７２（２０１２））。ＣｏｍＰオーソログを他のＩＶａ型ピリンタンパク質、例えば、Ａ．  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＰｉｌＡならびにナイセリア種由来のＰｉｌＥなど（Ｐｅｌｉｃｉｃ，  Ｖ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８，  ８２７−８３７（２００８））と区別するために、ＢＬＡＳＴｐ分析を実行して、ＣｏｍＰＡＤＰ１  の一次アミノ酸配列をアシネトバクター属の細菌由来の全てのタンパク質と比較した。予想通り、ＣｏｍＰＡＤＰ１を含む多くのアシネトバクターＩＶａ型ピリンオーソログは、Ｎ末端で高い相同性を共有している。しかしながら、ＣｏｍＰのアミノ酸配列全体で高い配列保存を示すタンパク質はほとんどない。少なくとも６つのＣｏｍＰオーソログ（図６）は、ＣｏｍＰＡＤＰ１に対して８４位の保存されたセリンの存在と、予測されるアルファベータループをベータストランド領域に接続する予測されるグリコシル化の部位に隣接する保存されたジスルフィド結合に基づいて同定された（Ｇｉｌｔｎｅｒ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｙ．  ＆  Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ｌ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７６，  ７４０−７７２（２０１２））。さらに、６つのＣｏｍＰオーソログは全て、ｃｏｍＰ遺伝子のすぐ下流にあるｐｇｌＳホモログと、染色体上のいずこかにあるｐｇｌＬホモログの両方を有する。まとめると、少なくとも８４位の保存されたセリンの存在、グリコシル化の部位に隣接するジスルフィドループ、ｃｏｍＰのすぐ下流のｐｇｌＳ遺伝子の存在、及び���色体上のいずこかにあるｐｇｌＬホモログの存在は、ＣｏｍＰピリンバリアントを他のＩＶａ型ピリンバリアントと区別する。
【００６４】
したがって、異なるアシネトバクター種のＣｏｍＰオーソログを同定するＣｏｍＰタンパク質に共通の特徴が本明細書に開示されている。ＣｏｍＰタンパク質は、ＡＤＰ１  ＣｏｍＰタンパク質に対して８４位に位置する保存されたグリコシル化セリンの存在と、グリコシル化部位に隣接するジスルフィドループの存在によって、他のピリンと区別することができる。さらに、ＣｏｍＰのすぐ下流にｐｇｌＳホモログが存在することはＣｏｍＰの指標である。さらに、ＰｇｌＬ  ＯＴａｓｅタンパク質ではなくＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅタンパク質として分類されるために、ＣｏｍＰの下流のＯＴａｓｅは、Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１のＰｇｌＬ（ＡＣＩＡＤ０１０３）と比較した場合、ＰｇｌＳ（ＡＣＩＡＤ３３３７）でより高い配列保存を示す必要がある。
【００６５】
本明細書に開示される特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ−２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。本明細書に開示される特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。これらの態様のいくつかでは、ＣｏｍＰタンパク質は、アルファベータループをベータストランド領域に接続するジスルフィド結合に隣接する、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の８２位のセリン残基を含む、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の領域に対応する領域を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号４５（以下の表３）のコンセンサス配列を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、ＡＤＰ１  ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、１１０２６４  ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＧＦＪ−２  ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＳＦＣ  ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、Ｐ５０ｖ１  ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及び４４６６  ＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）、または１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有する配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４のバリアントのアミノ酸配列を有し、バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。本明細書に開示される任意の態様において、ＣｏｍＰタンパク質が、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基上でグリコシル化され得ることも当業者には明らかである。
【００６６】
Ａ．  ｓｏｌｉ  ＣＩＰ  １１０２６４由来のＣｏｍＰは、Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１由来のＰｇｌＳによってグリコシル化される。複数のＣｏｍＰオーソログの存在を考慮して、Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１由来のＰｇｌＳが多様なＣｏｍＰタンパク質をグリコシル化できるかどうかを調べた。Ａ．  ｓｏｌｉ  ＣＩＰ  １１０２６４由来のＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ１１０２６４）は、ＣｏｍＰＡＤＰ１と比較した場合、アミノ酸レベルで７１％同一である。しかしながら、上述の特徴と一致して、ＣｏｍＰ１１０２６４には、予測されるアルファベータループと第２のベータストランドの間の予測されるジスルフィド架橋と、ＣｏｍＰＡＤＰ１に対して８４位の保存されたセリンが含まれている。さらに、ＰｇｌＳオーソログはＣｏｍＰ１１０２６４のすぐ下流にあり得る。Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１由来のＰｇｌＳ（ＰｇｌＳＡＤＰ１）がＣｏｍＰ１１０２６４をグリコシル化できるかどうかを判断するために、ＰｇｌＳＡＤＰ１をｐＡＣＴ３に、ＣｏｍＰ１１０２６４をｐＥＸＴ２０にクローニングし（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｓｔ  Ｐｉｅｒｒｅ，  Ｒ．  ＆  Ｌｉｎｎ，  Ｔ．  Ｇｅｎｅ  １７７，  １３３−１３６  （１９９６））、これらのプラスミドを、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の血清型８きょう膜多糖（ＣＰＳ８）を発現するＥ．  ｃｏｌｉに導入された。さらに、Ａ．  ｓｏｌｉ  ＣＩＰ  １１０２６４由来のＰｇｌＳ（ＰｇｌＳ１１０２６４）をＣｏｍＰＡＤＰ１と共にクローニングして発現することにより、逆の実験を実施した。図７に示すように、ＰｇｌＳ１１０２６４は、ＰｇｌＳ１１０２６４を欠く全細胞溶解物と比較した場合、高分子量のＣｏｍＰピリン変異体によって示されるように、同族のアクセプターピリンＣｏｍＰ１１０２６４を最小限にグリコシル化した。ウエスタンブロット分析に基づくと、ＰｇｌＳ１１０２６４はＣｏｍＰＡＤＰ１をグリコシル化しないように見える。一方、ＰｇｌＳＡＤＰ１は、電気泳動移動度の増加によるＨｉｓ反応性シグナルの強力な増加によって示されるように、ＣｏｍＰＡＤＰ１とＣｏｍＰ１１０２６４の両方を効率的にグリコシル化した。まとめると、ＰｇｌＳＡＤＰ１は、複数のＣｏｍＰ基質を交差グリコシル化する独自の能力を備えた、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける異種グリコシル化の最適なＯＴａｓｅであるように見える。したがって、異なるアシネトバクター種からのＰｇｌＳタンパク質は、多様な非ネイティブのＣｏｍＰ配列をグリコシル化できることが実証された。
【００６７】
ＰｇｌＳによってグリコシル化されることができる可溶性のペリプラズム融合タンパク質の生成。ＩＶａ型ピリンファミリーの全てのメンバーは、それらのＮ末端のアルファヘリックスの一部が内膜に埋め込まれているため、膜タンパク質とみなされる（Ｇｉｌｔｎｅｒ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｙ．  ＆  Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ｌ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７６，  ７４０−７７２（２０１２））。したがって、ＰｇｌＳによってグリコシル化できるＣｏｍＰの可溶性バリアントを生成するために、３つの異なる担体タンパク質上にトランケートされたＣｏｍＰフラグメントタンパク質の翻訳融合を構築した。Ｅ．  ｃｏｌｉ由来の担体タンパク質であるＤｓｂＡ及びＭａｌＥ（マルトース結合タンパク質−ＭＢＰとしても知られる）は、ペリプラズムの局在化とそれらのＣ末端で融合したアクセプタータンパク質の溶解性を促進することが以前に示されているため、適切な担体として選択された（Ｍａｌｉｋ，  Ａ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６，  ４４（２０１６））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＰＡ）由来の外毒素Ａも、他のコンジュゲートワクチン製剤で免疫原性担体タンパク質として作用することが以前に示されているため、選択された（Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２６，  ５１−６２（２０１６））。融合タンパク質は、リーダー配列、担体タンパク質、短いリンカーペプチド、最初の２８アミノ酸を含まないＣｏｍＰバリアント、及びヘキサヒスチジンタグからなった。ＣｏｍＰＡＤＰ１とＣｏｍＰ１１０２６４の最初の２８アミノ酸は、リーダー配列と、内膜に埋め込まれると予測されるＮ末端アルファヘリックスの疎水性領域を含むため、削除された。次いで、融合コンストラクトを、肺炎球菌血清型８きょう膜多糖（ＣＰＳ８）及びｐＡＣＴ３単独、またはｐｇｌＳ１１０２６４もしくはｐｇｌＳＡＤＰ１を保有するｐＡＣＴ３のいずれかを発現するＥ．  ｃｏｌｉに導入した。図８に示すように、ＤｓｂＡ−ＡＡＡ−ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４またはＤｓｂＡ−ＧＧＧＳ−ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４のいずれかをＰｇｌＳＡＤＰ１と組み合わせて発現するＥ．  ｃｏｌｉ細胞は、電気泳動移動度の増加という反応性シグナルのモーダル分布によって示されるように、検出可能なレベルのグリコシル化を示した。ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１を含む融合体を発現するＥ．  ｃｏｌｉ細胞は、検出可能なグリコシル化を示さなかった。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合体を発現するＥ．  ｃｏｌｉ細胞でも同じグリコシル化パターンが観察された。特に、図９に示すように、ＭＢＰ−ＡＡＡ−ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４またはＭＢＰ−ＧＧＧＳ−ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４のいずれかをＰｇｌＳＡＤＰ１と組み合わせて発現するＥ．  ｃｏｌｉ細胞は、抗Ｈｉｓ反応性シグナルのモーダル分布によって示されるように、検出可能なレベルのグリコシル化を示したが；一方で、ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１との融合は最小限のグリコシル化にすぎなかった。最後に、コンジュゲートワクチン製剤に使用される以前に確立された担体タンパク質が肺炎球菌ＣＰＳ８でＰｇｌＳによってグリコシル化できることを実証するために、ＥＰＡに融合したＤｓｂＡシグナルペプチド配列を含む融合タンパク質を改変した。次いで、ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４ペプチドをＥＰＡのＣ末端へのグリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ；配列番号２３）リンカーと融合し、全細胞抽出物とペリプラズム抽出物の両方でＰｇｌＳＡＤＰ１の存在下及び非存在下でのグリコシル化を試験した。図１０に示すように、ＥＰＡ−ＧＧＧＳ−ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４コンストラクトは、抗Ｈｉｓ反応性シグナルのモーダル分布によって示されるように、ＣＰＳ８グリカンとＰｇｌＳＡＤＰ１を共発現する細胞の全細胞抽出物とペリプラズム抽出物の両方でグリコシル化されていることが判明した。ＰｇｌＳオーソログを欠く試料またはＰｇｌＳ１１０２６４を発現する試料では、検出可能なグリコシル化は観察されなかった。まとめると、ＰｇｌＳＡＤＰ１は、還元末端にグルコースを含む多糖を短縮型ＣｏｍＰ融合タンパク質に転移するための最適なＯＴａｓｅである。各融合コンストラクトの具体的なアミノ酸配列を図１１に示す。
【００６８】
グリコシル化されたＣｏｍＰバイオコンジュゲートによる免疫は免疫応答を誘発する。コンジュゲートワクチンに対するＴ細胞依存性免疫応答は、高親和性ＩｇＧ１抗体の分泌を特徴とする（Ａｖｃｉ，  Ｆ．Ｙ．，  Ｌｉ，  Ｘ．，  Ｔｓｕｊｉ，  Ｍ．  ＆  Ｋａｓｐｅｒ，  Ｄ．Ｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １７，  １６０２−１６０９（２０１１））。マウスワクチン接種モデルにおけるＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの免疫原性を評価した。図１２Ａに見られるように、ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートでワクチン接種されたマウスから採取された血清は、ＣＰＳ１４特異的ＩｇＧ力価が有意に増加しましたが、ＩｇＭ力価は増加しなかった。さらに、二次ＨＲＰタグ付き抗ＩｇＧサブタイプ抗体を使用して、どのＩｇＧサブタイプが力価を上昇させたかを決定した。図１２Ｂに見られるように、ＩｇＧ１力価は他のサブタイプよりも高いように見えた。
【００６９】
次に、３価のＣＰＳ８−、ＣＰＳ９Ｖ−、及びＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの免疫原性を現在の標準治療であるＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）と比較する２回目のワクチン接種試験を実施した。血清型９Ｖ及び１４はＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）に含まれ、これら２つの血清型に対してＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）免疫マウスでＩｇＧ力価の上昇が見られた（図１３）。血清型１４に対する一価免疫も、予備免疫と同様の血清型特異的ＩｇＧ力価の有意な誘導を示した（図１２及び図１３）。三価バイオコンジュゲートを投与されたマウスは、予想通り、対照と比較した場合、全て血清型特異的ＩｇＧ力価が上昇し、４９日目の血清は血清型９Ｖと比較して血清型８及び１４のＩｇＧ力価の上昇を示した。それにもかかわらず、９Ｖに対するＩｇＧ力価は、プラセボよりも有意に高かった（図１３）。
【００７０】
バイオコンジュゲート。本明細書に提供されるのは、融合タンパク質に共有結合されたオリゴ糖または多糖を含むバイオコンジュゲートである。特定の態様では、融合タンパク質は、ＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ）を含む。特定の態様では、融合タンパク質は、（本明細書のいずこかで詳細に説明されているように）ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグまたはグリコシル化タグフラグメントを含む。
【００７１】
本明細書に記載されるように、ＣｏｍＰがセリン（Ｓ）残基上でグリコシル化されることが発見された。このセリン残基はＣｏｍＰで保存されており、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位に対応する。このセリン残基はまた、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の８２位に対応する（図２６Ａ、Ｂ、及びＣ）。したがって、特定の態様では、融合タンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に対応するセリン残基において、ＣｏｍＰタンパク質上のオリゴ糖もしくは多糖、またはそのグリコシル化タグフラグメントでグリコシル化される。図１５は、ＣｏｍＰ配列間で保存されている、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に対応するセリン（Ｓ）残基（四角の囲み）を含むＣｏｍＰ配列の領域のアライメントを示す。
【００７２】
当業者は、ＣｏｍＰ配列を配列番号１と（例えば、全長配列または部分配列と）整列させることによって、配列番号１の８４位のセリン残基に対応する本明細書に開示される配列番号１ではないＣｏｍＰタンパク質の保存された残基を同定することができることを認識するであろう。さらに、当業者は、ＣｏｍＰ配列を配列番号１と整列させることにより、本明細書で言及される配列番号１の残基、領域、及び／または特徴に対応する他の残基、領域、及び／または特徴を、配列番号１ではないＣｏｍＰ配列で同定され、配列番号１に関して参照され得ることを理解するであろう。そして、ここでは一般的に配列番号１が参照されるが、類推により、本明細書に開示される任意のＣｏｍＰ配列の任意の残基、領域、特徴などを同様に参照することができる。
【００７３】
ＣｏｍＰタンパク質は、本明細書で提供される記載と一致するＣｏｍＰタンパク質として同定されたタンパク質である。例えば、ＣｏｍＰタンパク質の代表的な例には、ＡＡＣ４５８８６．１  ＣｏｍＰ［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＡＤＰ１］；ＥＮＶ５８４０２．１  仮想タンパク質  Ｆ９５１＿００７３６［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌｉ  ＣＩＰ  １１０２６４］；ＡＰＶ３６６３８．１  コンピテンスタンパク質［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌｉ  ＧＦＪ−２］；ＰＫＤ８２８２２．１  コンピテンスタンパク質［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ  ５０ｖ１］；ＳＮＸ４４５３７．１  ＩＶ型線毛集合タンパク質ＰｉｌＡ［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｙａｎｇｅｎｓｉｓ  ＡＮＣ  ４４６６］；及びＯＡＬ７５９５５．１  コンピテンスタンパク質［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＳＦＣ］が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。配列番号１は、２８アミノ酸のリーダー配列を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、２８アミノ酸のリーダー配列を含まないが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ−２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、２８アミノ酸のリーダー配列を含まないが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ−２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ−２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号���（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）である。
【００７４】
特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、細菌または哺乳動物の細胞によって産生される。特定の態様では、細菌はグラム陰性菌である。特定の態様では、細菌はストレプトコッカス属由来である。特定の態様では、細菌はクレブシエラ属由来である。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ．  ｓｕｉｓのきょう膜多糖であり、例えば、きょう膜多糖は、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである。特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａのきょう膜多糖である。特定の態様では、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのきょう膜多糖である。例えば、特定の態様では、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２のきょう膜多糖である。
【００７５】
特定の態様では、オリゴ糖または多糖は、その還元末端にグルコース（Ｇｌｃ）を含み、その重要性は本明細書のいずこかで論じられている。
【００７６】
特定の態様では、バイオコンジュゲートは、本明細書に開示される生産方法のいずれかによってなど、宿主細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏで産生される。特定の態様では、バイオコンジュゲートは、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、鳥類細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞で産生される。特定の態様では、バイオコンジュゲートは無細胞系で産生される。ＰｇｌＳ以外のＯＴａｓｅを利用する無細胞システムの使用例は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０６７５２３Ａ１に見出すことができる。
【００７７】
本明細書のいずこかで論じられるように、特定の用途では、担体タンパク質またはそのフラグメントと融合タンパク質を形成することが有利であり得る。特定の用途において、担体タンパク質は、コンジュゲートワクチンの産生に有用であると当該技術分野で認識されているものである。特定の態様では、ＣｏｍＰグリコシル化タグフラグメントが担体タンパク質またはそのフラグメントに融合される場合、グリコシル化タグフラグメント、したがって融合タンパク質は、本明細書のいずこかに記載されている保存されたセリン残基でグリコシル化され得る。特定の態様では、融合タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される担体タンパク質を含む。特定の態様では、前記担体タンパク質またはそのフラグメントは、アミノ酸リンカー、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２３）〔式中、ｎは少なくとも１〕、またはＡＡＡ（配列番号２４）を介して、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントに連結する。ＣｏｍＰ融合タンパク質の潜在的な免疫原性を高めるために、１つを超えるグリコシル化タグを含めることが有利であり得る。したがって、特定の態様では、融合タンパク質は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、８以上、１０以上、１５以上、または２０以上のＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントを含む。特定の態様では、融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０のうちのいずれかから３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２５のうちのいずれかまでのＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントを含む。特定の態様では、複数のグリコシル化タグフラグメントは、融合タンパク質内で互いにタンデムに配置される。特定の態様では、複数のグリコシル化タグフラグメントは、融合タンパク質内で互いに離れて配置され、例えば、担体タンパク質の配列によって分離されている。特定の態様では、グリコシル化タグフラグメント（複数可）は、例えば、担体タンパク質及び／または融合タンパク質のＮ末端に位置してもよい。特定の態様では、グリコシル化タグフラグメント（複数可）は、例えば、担体タンパク質及び／または融合タンパク質のＣ末端に位置してもよい。特定の態様では、グリコシル化タグフラグメント複数可）は、例えば、担体タンパク質及び／または融合タンパク質の内部に位置することができ、ここで、グリコシル化タグフラグメントは、融合タンパク質中の複数の担体タンパク質の間に位置する。特定の態様では、複数の担体タンパク質は、タイプが同じでもタイプが異なっていてもよい。
【００７８】
グリコシル化タグフラグメント。本明細書に記載の態様のいずれかなどの特定の用途では、リーダー配列を除去するか、またはまだグリコシル化できるＣｏｍＰのさらに小さなフラグメントを使用するなど、全長未満のＣｏｍＰタンパク質を使用することに利点がある場合がある。ＣｏｍＰのグリコシル化部位は、配列番号１の残基８４のセリン、または他のＣｏｍＰ配列の対応するセリン残基として本明細書に開示されているので、ＣｏｍＰタンパク質のフラグメントは、ＣｏｍＰグリコシル化部位を含むと同定することができる。本明細書で使用されるとき、配列番号１の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含み、融合タンパク質に組み込まれるとＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅによってグリコシル化され得る、Ｃｏｍｐタンパク質のフラグメントは、本明細書では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグまたはグリコシル化タグフラグメントと呼ばれる。
【００７９】
特定の態様では、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、ＣｏｍＰの単離されたフラグメントを含み、フラグメントは、ＣｏｍＰタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７を含む、２８、２９、３０、３５、４０、４５、または５０のアミノ酸を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、グリコシル化タグは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、または８２のうちのいずれかから、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、または１４７のうちのいずれかまでに対応するＣｏｍＰタンパク質アミノ酸配列を含む。特定の態様では、グリコシル化タグは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、または８２のうちのいずれかから、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、または１４７のうちのいずれかまでを含むＣｏｍＰタンパク質アミノ酸配列を含む。特定の態様では、グリコシル化タグは、１２４、１２０、１１９、１１８、１１７、１１６、１１５、１００、９０、８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５以下のアミノ酸の長さである。
【００８０】
特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）のアミノ酸残基１から２８に対応するアミノ酸残基を欠くＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドである。例えば、ＣｏｍＰΔ２８ポリペプチドの代表的な例には、配列番号７〜１２が含まれるが、これらに限定されない特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、予測されるアルファベータループをベータストランド領域に接続するジスルフィド結合に隣接する、８４位のセリン残基を含む、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の領域に対応する領域を含む。例えば、予測されるアルファベータループをベータストランド領域に接続するジスルフィド結合に隣接する、８４位のセリン残基を含む、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の領域に対応する領域の代表的な例は、ＡＤＰ１  ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、１１０２６４  ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＧＦＪ−２  ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＳＦＣ  ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、Ｐ５０ｖ１  ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及び４４６６  ＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
本明細書に開示される特定の態様では、ＣｏｍＰのグリコシル化タグフラグメントは、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、グリコシル化タグが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰのグリコシル化タグフラグメントは、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、ＴＧＶＴＱＩＡＳＧＡＳＡＡＴＴＮＶＡＳＡＱ（配列番号４０）、ＶＧＶＱＥＩＮＡＳＳＳＴＳＮＶＡＴＡＴ（配列番号４１）、ＡＧＶＥＴＩＧＡＳＮＫＴＫＮＶＥＳＡＡ（配列番号４２）、ＶＧＶＱＴＩＡＡＳＮＡＴＫＮＶＡＴＡＴ（配列番号４３）、及びＮＧＶＩＳＡＳＡＴＴＮＶＡＳＳＡ（配列番号４４）、または１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。特定の態様では、ＣｏｍＰのグリコシル化タグフラグメントは、ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、グリコシル化タグが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰのグリコシル化タグフラグメントは、アミノ酸配列ＶＧＶＱＥＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号３９）、または１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそれらのバリアントを含み、バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。
【００８２】
特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、配列番号３７（以下の表３）のアミノ酸コンセンサス配列のうちの少なくとも５、１０、１５、２０、３０、３５、または４０の連続的なアミノ酸のアミノ酸配列を含み、グリコシル化タグフラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、配列番号３７のアミノ酸コンセンサス配列、またはまたは１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有する配列番号３７のバリアントを含み、バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。
【００８３】
特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、配列番号３８または４５（以下の表３）のアミノ酸コンセンサス配列のうちの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続的なアミノ酸のアミノ酸配列を含み、上記グリコシル化タグフラグメントが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を含む。特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグフラグメントは、配列番号３８または４５のアミノ酸コンセンサス配列、または１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有する配列番号３８または４５のバリアントを含み、バリアントが配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存されたセリン残基に対応するセリン残基を維持する。特定の態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。
【００８４】
特定の態様では、グリコシル化タグは担体タンパク質などの異種タンパク質に結合している。したがって、特定の態様は、本明細書に開示されるＣｏｍＰグリコシル化タグを含む融合タンパク質を提供する。特定の態様では、融合タンパク質は担体タンパク質を含み、その代表的な例は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントを含むが、これらに限定されない。特定の態様では、融合タンパク質は、本明細書のいずこかに開示されているようなリンカー配列を含む。特定の態様では、融合タンパク質はグリコシル化され、さらに特定の態様では、融合タンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に対応するセリン残基のグリコシル化タグ領域でグリコシル化される。
【００８５】
コンジュゲートワクチン。本明細書に開示されるのは、従来のワクチン担体を含む肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンである。特定の態様は、グリコシル化タグ（別名「グリコタグ」）としてのＣｏｍＰフラグメントの使用を含む。特定の態様では、グリコタグは、担体タンパク質のＣ末端及び／またはＮ末端に付加することができる。例えば、特定の態様では、従来の担体タンパク質であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）のＣ末端にグリコタグが付加されている。特定の態様では、グリコタグ／担体融合タンパク質は、ＣＰＳ８多糖及びＰｇｌＳの使用と組み合わせて、その種の肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンとしては初めての担体タンパク質−ＣＰＳ８バイオコンジュゲートを生成できることが実証された。例えば、特定の態様では、ＥＰＡ融合物をＣＰＳ８多糖及びＰｇｌＳの使用と組み合わせて、ＥＰＡ−ＣＰＳ８バイオコンジュゲートを生成することができる。ＥＰＡ−ＣＰＳ８バイオコンジュゲートワクチンは、殺菌性殺傷によって決定されたように保護的である血清型８特異的に特異的な高いＩｇＧ力価を誘発することが実証された。重要なことに、ＥＰＡ−ＣＰＳ８バイオコンジュゲート中の１００ｎｇの多糖をワクチン接種することで、保護を提供することができた。したがって、特定の態様は、ＣＰＳ８肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを提供する。
【００８６】
コンジュゲートワクチン（ＥＰＡワクチンコンストラクトなど）は、包括的な肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを開発するために、グリカン対タンパク質比を増加させるだけでなく、血清型の数を拡大するためのグリコシル化の追加／複数部位を含むことができると考えられる。
【００８７】
特定の態様では、本明細書に開示されるバイオコンジュゲートまたはグリコシル化融合タンパク質は、感染症及び／または疾患の予防及び／または治療のために対象に投与することができるコンジュゲートワクチンである。特定の態様では、コンジュゲートワクチンは、例えば、感染症及び／または疾患に対して対象を免疫するために使用することができる予防法である。特定の態様では、バイオコンジュゲートは、（治療用組成物などで）アジュバントにと関連し、及び／またはアジュバントとともに投与されている。特定の態様は、本明細書に記載のコンジュゲートワクチン及びアジュバントを含む組成物（治療用組成物など）を提供する。特定の態様では、コンジュゲートワクチンが対象に投与されるとき、それは免疫応答を誘導する。特定の態様では、免疫応答は長期記憶（記憶Ｂ及びＴ細胞）を誘発する。特定の態様では、免疫は抗体応答である。特定の態様では、抗体反応は、血清型特異的抗体応答である。特定の態様では、抗体応答はＩｇＧまたはＩｇＭ応答である。抗体応答がＩｇＧ応答である特定の態様において、ＩｇＧ応答はＩｇＧ１応答である。さらに、特定の態様では、コンジュゲートワクチンは、ワクチンを投与された対象において免疫学的記憶を生成する。
【００８８】
特定の態様は、感染症及び／または疾患に対するワクチンの製造を提供する。特定の態様では、方法は、本明細書に開示されるバイオコンジュゲートまたは融合タンパク質（コンジュゲートワクチン）を単離し、コンジュゲートワクチンをアジュバントと組み合わせることを含む。特定の態様では、ワクチンは肺炎球菌感染症に対するコンジュゲートワクチンである。特定の態様では、疾患は肺炎である。
【００８９】
重要なことに、本明細書に開示される態様は、肺炎球菌多糖に限定されないが、実際、ＰｇｌＢ及びＰｇｌＬと適合しない多くの重要なヒト及び動物の病原体に対するバイオコンジュゲートワクチンを生成するための広範な適用性を有する。注目すべき例としては、ヒトの病原体であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＢ群連鎖球菌、及びブタの病原体であるＳ．  ｓｕｉｓがあり、利用可能な認可されたワクチンがない、非常に関連性の高い全ての病原体が含まれる。
【００９０】
ｉｎ  ｖｉｖｏグリコシル化の方法と試薬。本明細書に開示されるのは、オリゴ糖または多糖のポリペプチドへのｉｎ  ｖｉｖｏコンジュゲーション（ｉｎ  ｖｉｖｏグリコシル化）のための方法である。特定の態様では、方法は、オリゴ糖または多糖を、ＰｇｌＳオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）（本明細書のいずこかに記載されている）でポリペプチドに共有結合させることを含む。特定の態様では、ポリペプチドは、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントを含む。特定の態様では、ポリペプチドは、担体タンパク質などのポリペプチドに異種に連結されているＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントを含む。ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅの代表的な例には、ＰｇｌＳ１１０２６４、ＰｇｌＳＡＤＰ１、ＰｇｌＳＧＦＪ−２、ＰｇｌＳ５０ｖ１、ＰｇｌＳ４４６６、及びＰｇｌＳＳＦＣが含まれるが、これらに限定されない。ＣｏｍＰタンパク質はいずこかで詳細に説明されており、代表的な例には、ＣｏｍＰ１１０２６４、ＣｏｍＰＡＤＰ１、ＣｏｍＰＧＦＪ−２、ＣｏｍＰ５０ｖ１、ＣｏｍＰ４４６６、及びＣｏｍＰＳＦＣが含まれるが、これらに限定されない。生物由来のＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅは、その生物由来のＣｏｍＰタンパク質を自然にグリコシル化し（例えば、ＰｇｌＳ１１０２６４は、ＣｏｍＰ１１０２６４グリコシル化し）、特定の態様では、ある生物由来のＰｇｌＳは、別の生物由来のＣｏｍＰをグリコシル化する（例えばＰｇｌＳＡＤＰ１はＣｏｍＰ１１０２６４をグリコシル化する）ことが認識されよう。例えば、特定の態様では、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅは、ＰｇｌＳＡＤＰ１である。特定の態様では、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅがＰｇｌＳＡＤＰ１である場合、グリコシル化されたＣｏｍＰタンパク質は、ＣｏｍＰＡＤＰ１ではない。例えば、特定の態様では、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅがＰｇｌＳＡＤＰ１である場合、ＣｏｍＰタンパク質は、ＣｏｍＰ１１０２６４である。当然に、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントが異種担体タンパク質に連結されている場合、ＰｇｌＳ  Ｏｔａｓｅと同じ生物由来であっても、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅはＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントを自然にグリコシル化しないことが認識されるであろう。
【００９１】
ＰｇｌＳとＣｏｍＰの任意の組み合わせの特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に対応するセリン残基でグリコシル化される。
【００９２】
本明細書に開示される特定の態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏでのグリコシル化は、宿主細胞において起きる。特定の態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、藻類細胞、または細菌細胞であり得る。特定の態様では、宿主細胞は細菌細胞、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉである。
【００９３】
特定の態様では、方法は、オリゴ糖または多糖のポリペプチドへのコンジュゲーションに必要な成分を含む宿主細胞を培養することを含む。一般に、これらの成分は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシル化されるアクセプターポリペプチド、及びオリゴ糖または多糖である。特定の態様では、方法は以下を含む宿主細胞を培養することを含む：（ａ）前記オリゴ糖または多糖を合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター；（ｂ）ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅ；及び（３）前記アクセプターポリペプチド。さらに、オリゴ糖または多糖の生成は、転写活性化因子によって増強され得ることが発見された。特定の態様では、オリゴ糖または多糖の産生は、Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの転写活性化因子ｒｍｐＡ（Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨ  Ｋ−２０４４）、またはＫ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの転写活性化因子ｒｍｐＡ（Ｋ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨ  Ｋ−２０４４）の相同体によって増強される。特定の態様では、方法は、他の成分とともに宿主細胞においてそのような転写活性化因子を発現及び／または提供することをさらに含む。
【００９４】
特定の態様では、ＣｏｍＰタンパク質に連結された担体タンパク質、またはそのグリコシル化タグフラグメントは、例えば、融合タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、コレラ毒素Ｂサブユニット、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらのフラグメントである。
【００９５】
特定の態様では、方法は本明細書に記載のコンジュゲートワクチンを生成する。
【００９６】
特定の態様はまた、アクセプターＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントのｉｎ  ｖｉｖｏグリコシル化のための成分を含む宿主細胞を提供する。特定の態様では、宿主細胞は以下を含む：（ａ）オリゴ糖または多糖を合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター；（ｂ）ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅ；及び（３）ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグフラグメントを含むアクセプターポリペプチド。特定の態様では、アクセプターポリペプチドは融合タンパク質である。特定の態様では、宿主細胞は、他の成分とともに、上述のような転写活性化因子をさらに含む。
【００９７】
特定の態様では、宿主細胞は、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅをコードする単離された核酸を含む。特定の態様では、宿主細胞は、ＣｏｍＰアクセプターポリペプチドをコードする単離された核酸を含む。特定の態様では、宿主細胞は、オリゴ糖または多糖を合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスターを含む。特定の態様では、宿主細胞は、ＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅをコードする単離された核酸、ＣｏｍＰアクセプターポリペプチドをコードする単離された核酸、及びオリゴ糖または多糖を合成するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスターのうちの少なくとも２つを含む。特定の態様では、宿主細胞は、ある生物のＰｇｌＳ  ＯＴａｓｅをコードする核酸と、別の生物のＣｏｍＰアクセプターポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００９８】
特定の態様は、本明細書のいずこかに記載されている、ＣｏｍＰタンパク質、ＣｏｍＰグリコシル化タグフラグメント、及び／またはＣｏｍＰ融合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。特定の態様では、本明細書で言及される単離された核酸は、ベクターであるか、またはベクター内に含まれる。特定の態様では、本明細書で言及される単離された核酸は、異種ゲノムまたはゲノムの異種領域に挿入及び／または組み込まれている。
【００９９】
投与。本明細書で提供されるのは、病原体に対する宿主免疫応答を誘導する方法である。特定の態様では、病原体は細菌性病原体である。特定の態様では、宿主は病原体に対して免疫されている。特定の態様では、方法は、免疫応答を必要とする対象に、有効量のＣｏｍＰコンジュゲートワクチン、グリコシル化融合タンパク質、または本明細書に開示される任意の他の治療／免疫原性組成物を投与することを含む。特定の態様は、細菌性病原体に対する宿主免疫応答の誘導及び細菌性病原体に対する免疫に使用するための、本明細書に開示されるコンジュゲートワクチン、グリコシル化融合タンパク質、または他の治療／免疫原性組成物を提供する。免疫応答の例としては、先天性応答、適応応答、体液性応答、抗体応答、細胞媒介性応答、Ｂ細胞応答、Ｔ細胞応答、サイトカインの上方制御または下方制御、免疫系クロストーク、及び上記免疫応答の２つ以上の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、免疫応答は抗体応答である。特定の態様では、免疫応答は、先天性応答、体液性応答、抗体応答、Ｔ細胞応答、または上記免疫応答の２つ以上の組み合わせである。
【０１００】
また、本明細書に開示されるコンジュゲートワクチン、融合タンパク質、または組成物を必要とする対象に投与することを含む、対象における細菌性疾患及び／または感染症を予防または治療する方法も本明細書に提供される。特定の態様では、感染症は、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の局所的または全身的な感染症であるか、または本質的に自己免疫性である。特定の態様では、疾患は肺炎である。特定の態様では、感染症は、全身感染症及び／または血液の感染症である。本明細書に開示される特定の態様では、対象は脊椎動物である。特定の態様では、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、モルモット、サル、類人猿などの哺乳動物である。そして、例えば、特定の態様では、哺乳動物はヒトである。
【０１０１】
本明細書に開示される投与の任意の態様では、組成物は、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与される。
【実施例】
【０１０２】
菌株、プラスミド、及び増殖条件  この研究で使用した菌株とプラスミドを表１に示す。
【表１−１】
2021528059.tif 000003
【表１−２】
2021528059.tif 000004
【表１−３】
2021528059.tif 000005
【０１０３】
特に明記しない限り、Ｅ．  ｃｏｌｉ株はＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）で３７℃で一晩増殖させた。Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は、脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロスまたはヒツジ血液寒天プレートで３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。プラスミドの選択には、抗生物質を次の濃度で使用した：アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（２０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（８０μｇ／ｍＬ）。これらは必要に応じて追加された。
【０１０４】
大腸菌における異種グリコシル化。全ての異種グリコシル化実験では、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＳＤＢ１細胞株を使用した。これは、糖鎖工学に適した株として以前に確立されているためである。エレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＳＤＢ１は、Ｄｏｗｅｒらの岸あに従って調製した。細胞は、グリカン合成遺伝子座、アクセプタータンパク質、及びＯＴａｓｅをコードするプラスミドでエレクトロポレーションされた。コロニーを採取し、適切な抗生物質を選択してＴＢ中で３７℃で増殖させ、必要に応じて０．０５〜０．１ｍＭのＩＰＴＧまたは０．２％アラビノースで直ちに誘導し、３７℃で一晩放置した。アラビノース誘導を必要とする培養物は、４時間後に２回目のアラビノース投与を受けた。細胞ペレットは固定相で得られ、ウエスタンブロット分析のために調製された。
【０１０５】
ウエスタンブロッティング。ＯＤ６００＝０．１ユニットの相当物を含む細胞溶解物を１２．５％の社内で調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、ニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏｒａｄ）に転写した。以前に公開されたプロトコールに従ってウエスタンブロッティングを行った。次いで、ニトロセルロースメンブレンをＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬｉＣｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用して視覚化した。
【０１０６】
タンパク質及び糖タンパク質の精製。Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ付きのＣｏｍＰ及びＣｏｍＰバイオコンジュゲートは、Ｅ．  ｃｏｌｉの全膜調製物から精製された。細胞を３７℃の２Ｌのｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈで一晩増殖させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液で洗浄し、６０ｍＬの同じ緩衝液に再懸濁した。フレンチプレス（Ａｍｉｎｃｏ）を使用して約２０ｋＰＳＩで２ラウンドの細胞破壊を行い、続いてプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加して、細胞を溶解した。溶解物を２０，０００×ｇで３０分間２回遠心分離し、細胞残屑をペレット化した。上清を１００，０００×ｇで６０分間超遠心分離し、全膜をペレット化した。ペレットを０．５％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を含むＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、膜タンパク質を４８時間タンブリングして可溶化した。等量のＰＢＳを懸濁液に加えて界面活性剤濃度を０．２５％に下げ、懸濁液を１００，０００×ｇで６０分間超遠心分離しました。可溶化した膜を０．４５μｍ及び０．２２μｍフィルターで濾過し、ＡＫＴＡ精製器（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，スウェーデン）に取り付けられたＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。試料をロードする前に、カラムを２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ／ＤＤＭ緩衝液で平衡化した。ＰＢＳに２０ｍＭ及び３０ｍＭのイミダゾールを含む７カラム容量の緩衝液でカラムを段階的に洗浄することにより、未結合のタンパク質を除去した。カラムに結合したタンパク質を溶出するために、イミダゾール濃度を徐々に増加する勾配溶出を使用した。非コンジュゲート及びコンジュゲートしたＣｏｍＰの大部分は、１８０ｍＭから２５０ｍＭのイミダゾールで溶出した。イミダゾールは、０．２５％ｗ／ｖＤＤＭを含むＰＢＳで構成される２５０ｍＬ透析緩衝液中で３．５ｋＤａ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｌａｂｓ）を通して、一晩ラウンドの透析とそれに続く２回の２時間ラウンドの透析によって除去された。透析後のイミダゾールの最終理論濃度は約０．００７ｍＭであった。ＤＣキット（ｂｉｏｒａｄ）を使用してタンパク質を定量した後、試料をマウス免疫に適した濃度に希釈した。
【０１０７】
マウスモデルの免疫。マウスワクチン接種モデルにおけるＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの免疫原性を評価した。２つの群のマウス（ｎ＝１０）は、３μｇの非グリコシル化ＣｏｍＰまたはＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートのいずれかを個別に投与された。１４日目と２８日目にマウスを追加免疫し、４９日目に全血採取のために屠殺した。各ワクチンは総タンパク質に基づいて製剤化された。Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型１４株を各ウェルに吸着させた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＣＰＳ１４に対するＩｇＭ及びＩｇＧの応答を比較した。図１２Ａ、Ｂに見られるように、ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートでワクチン接種されたマウスから採取された血清は、ＣＰＳ１４に特異的なＩｇＧ応答が増加したが（図１２Ａ）、ＩｇＭ応答は増加しなかった（図１２Ｂ）。さらに、使用される二次ＨＲＰタグ付き抗ＩｇＧサブタイプ抗体は、ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰワクチン接種マウスにどのＩｇＧサブタイプが存在するかを決定する（図１２Ｃ）。図１２Ｃに見られるように、ＣＰＳ１４特異的ＩｇＧ１応答は他のサブタイプよりも高く、これは肺炎球菌コンジュゲートワクチンの以前の発見と一致している（Ｗｕｏｒｉｍａａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８４，  １２１１−１２１５（２００１）；Ｓｏｉｎｉｎｅｎ，  Ａ．，  Ｓｅｐｐａｌａ，  Ｉ．，  Ｎｉｅｍｉｎｅｎ，  Ｔ．，  Ｅｓｋｏｌａ，  Ｊ．  ＆  Ｋａｙｈｔｙ，  Ｈ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １７，  １８８９−１８９７（１９９９））。
【０１０８】
Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅには９０を超える血清型がある（Ｇｅｎｏ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２８，  ８７１−８９９（２０１５）；Ｂｅｎｔｌｅｙ，  Ｓ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ２，  ｅ３１（２００６））。血清型８、２２Ｆ、及び３３Ｆなど、ますます流行している多くの血清型は、現在認可されているワクチンには含まれていない（Ｐｉｌｉｓｈｖｉｌｉ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０１，  ３２−４１（２０１０））。したがって、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）に含まれる２つの血清型（血清型９Ｖ及び１４）と含まれない１つの血清型（血清型８）に対する多価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを生成するＰｇｌＳの多能性を試験した。前述のＣＰＳは全て、還元末端糖としてＧｌｃを含んでいるため、他の商業的に利用されているコンジュゲート酵素とは互換性がない。図２１Ａ〜Ｆに見られるように、ＰｇｌＳ、ＣｏｍＰ、及びＣＰＳ８またはＣＰＳ９Ｖの多糖のいずれかを共発現する全細胞からのアフィニティー精製タンパク質のウエスタンブロット分析により、それぞれＣＰＳ特異的ＣｏｍＰバイオコンジュゲートが生成された。同様に、精製された材料が脂質結合多糖で汚染されていないことを確認するために、試料をプロテイナーゼＫで処理し、ウエスタンブロッティングで分析したときにシグナルの喪失を観察し、バイオコンジュゲートがタンパク質性であることを確認した。
【０１０９】
次に、ワクチン接種試験を実施して、３価のＣＰＳ８−、ＣＰＳ９Ｖ−、及びＣＰＳ１４−ＣｏｍＰ肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンの免疫原性を判定した（図２２Ａ−Ｌ）。３つの対照群が含まれていた。１つの群は担体タンパク質のみを投与された（非グリコシル化ＣｏｍＰ）。別の群は、他の血清型に対する免疫応答を分析する際にＩｇＧ特異性を説明するために一価用量のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートを投与された。第３の群は陽性対照としてＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）を投与された。ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）を投与されたマウスを含む全ての免疫原群には、均等に混合されたフロイントのアジュバントを含んだ。各群の４９日目の血清を、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型８、９Ｖ、及び１４でコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡに使用した。上述のように、血清型９Ｖ及び１４はＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）に含まれ、ワクチン接種の４９日後にこれら２つの血清型に対してＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）免疫マウスでＩｇＧ応答の上昇が見られた（図１３）。一価のＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートを投与されたマウスも、血清型１４に特異的なＩｇＧの有意な増加を示した（図１２及び図１３）。３価のＣＰＳ８／ＣＰＳ９Ｖ／ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートを投与されたマウスでも、ワクチン接種の４９日後に血清型特異的ＩｇＧ応答が統計的に有意に増加した（図１３）。
【０１１０】
免疫は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ａｌｂｅｒｔａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＡＣＲＩ）の抗体サービスで実施された。ＣＰＳ１４  ＣｏｍＰ一価免疫では、４〜６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、５０μｌのフロイントアジュバントを含む１００μＬの精製タンパク質／糖タンパク質（総タンパク質３μｇ）を注射した。マウスの２つの群（ｎ＝１０）に、グリコシル化されていないＣｏｍＰ（プラセボ）またはＣＰＳ−ＣｏｍＰコンジュゲートのいずれかを注射した。マウスからの血清は、免疫化の前、及び免疫化の７、２１、３５、及び４９日後に得られた。追加免疫用量は１４日目と２８日目に投与された。マウスの４つの群（ｎ＝１０）が４つの異なる免疫群に使用されたことを除いて、３価の免疫のために同じ手順に従った。これらの群には、３μｇの非コンジュゲートＣｏｍＰ（プラセボ）とフロイントアジュバントを含む１００μＬ、３μｇのＣｏｍＰ−ＣＰＳ１４コンジュゲートとフロイントアジュバントを含む１００μＬ、９μｇの糖タンパク質混合物（ＣｏｍＰ−ＣＰＳ８、ＣｏｍＰ−ＣＰＳ９Ｖ、及びＣｏｍＰ−ＣＰＳ１４）とフロイントのアジュバントを含む１００μＬ、またはＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）とフロイントのアジュバントの１：３希釈ストックの１００μＬが注射された。ＣＰＳ−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートは、この免疫のために総タンパク質によって製剤化された。
【０１１１】
フロイントのアジュバントはヒトの臨床開発に適したアジュバントではないため、水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムの混合物を含む穏やかなアジュバントであるＩｍｊｅｃｔ  ＡｌｕｍＡｄｊｕｖａｎｔを配合したワクチンを使用して別の免疫試験を実施した。ワクチン接種コホートには、緩衝液／アジュバント試験群、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）試験群、及び３価のＣＰＳ８−／ＣＰＳ９Ｖ−／ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲート試験群が含まれていた。３匹のマウスの群は１、１４、及び２８日目にワクチン接種された。４２日目に血清を採取し、オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）を介してエフェクター機能を決定するために使用した。個々のマウスから採取された血清の量が限られていることを考慮して、１つの血清型がＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）（血清型１４）に含まれ、もう１つが含まれていない（血清型８）ため、血清は血清型８及び１４に対する殺菌活性について試験された。図２３Ａ及び２３Ｂに見られるように、３価のＣＰＳ８−／ＣＰＳ９Ｖ−／ＣＰＳ１４−ＣｏｍＰバイオコンジュゲートでワクチン接種された代表的なマウスの血清は、モックワクチン接種マウスの血清と比較して、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４株に対する殺菌活性が増加した。重要なことに、同じバイオコンジュゲートワクチン接種血清は、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８株に対して高い殺菌活性を示した。これは、その製剤中にこのコンジュゲートが存在しないため、ＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）ワクチン接種血清では観察されなかった。
【０１１２】
別の三価免疫実験は、３匹の４〜６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの群で実施された。各免疫群に、１００μＬの１：１免疫原（３μｇの３価バイオコンジュゲートのそれぞれのタンパク質またはＰＲＥＶＮＡＲ  １３（登録商標）の１：１０希釈ストック）を皮下注射して、ミョウバンアジュバントを注射した。マウスは、０、１４、及び２８日目にワクチン接種され、次いで、血清採取のために４２日目に屠殺された。
【０１１３】
別の免疫実験は、３匹の４〜６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの群で実施された（群あたり５匹のメスと５匹のオス）。０、１４、及び２８日目に、１００μＬのＥＰＡ（５μｇの総タンパク質）、１００μＬのＣｏｍＰ−ＣＰＳ８（５μｇの総多糖）、または１００μＬのＥＰＡ−ＣＰＳ８（０．１μｇの総多糖）でマウスを皮下免疫した。次いで、４２日目に血清採取のために屠殺した。ワクチンは、Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ  Ａｄｊｕｖａｎｔと１：１で製剤化された。
【０１１４】
従来のワクチン担体を用いた肺炎球菌バイオコンジュゲートの糖鎖工学。これまで、Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１由来のＣｏｍＰの使用は、肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチン生産の担体タンパク質として利用されてきた。しかしながら、この技術の商業的適用性を高めるために、従来のワクチン担体は、Ｏ−結合型ＯＴａｓｅと互換性があることが求められていた。最初の２８アミノ酸を欠くＣｏｍＰフラグメント（ＣｏｍＰΔ２８）にＣ末端で融合したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＰＡ）由来の外毒素ＡのΔＥ５５３バリアントからなるキメラ融合タンパク質を生成した。Ａ．  ｓｏｌｉ株１１０２６４のＣｏｍＰオーソログは、ＰｇｌＳによって最も効率的にグリコシル化され、Ａ．  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１由来のＣｏｍＰと同じ保存されたセリンでグリコシル化されることが判明したために使用された。ＥＰＡ融合は、グリシン−グリシン−グリシン−セリン（ＧＧＧＳ；配列番号２３）リンカーでＣｏｍＰΔ２８に連結され、ＤｓｂＡシグナル配列でペリプラズムに輸送された。
【０１１５】
肺炎球菌コンジュゲートワクチンの現在の製剤には血清型８に対するコンジュゲートが含まれていないため、ＥＰＡ−ＣＰＳ８肺炎球菌バイオコンジュゲートの生成に焦点が当てられた。ＥＰＡ融合体は、ＰｇｌＳとＣＰＳ８を共発現するＳＤＢ１細胞に導入され、続いて精製され、次いでグリコシル化について探索された。ＥＰＡ融合体はＣＰＳ８で効率的にグリコシル化された。さらに、インタクト糖タンパク質質量分析により、ＥＰＡ融合体が、単一のＣＰＳ８サブユニットの計算された質量である６６２Ｄａの増加する質量単位で繰り返し修飾されていることが確認された。ＥＰＡ融合物は、インタクトタンパク質分析により、少なくとも１１個のＣＰＳ８サブユニットでグリコシル化されていることが判明した。しかしながら、ウエスタンブロット及びクーマシー分析は、１５を超えるサブユニットを転移することができたことを示した。
【０１１６】
続いて、ＥＰＡ−ＣＰＳ８肺炎球菌バイオコンジュゲートの免疫原性をＣｏｍＰ−ＣＰＳ８肺炎球菌バイオコンジュゲートと比較するワクチン接種実験を行った。１０匹のマウスの群に、５μｇのＥＰＡ単独（総タンパク質に基づく）、５μｇのＣｏｍＰ−ＣＰＳ８（アントロン硫酸によって決定される多糖に基づく）、または１００ｎｇのＥＰＡ−ＣＰＳ８（インタクトＥＰＡ−ＣＰＳ８質量分析による決定される多糖に基づく）のいずれかをワクチン接種した。マウスは、４２日目に採取された血清で１、１４、及び２８日目にワクチン接種された。全てのワクチンは、Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ  Ａｄｊｕｖａｎｔと１：１で製剤化された。続いてＥＬＩＳＡを実施して、ＣＰＳ８に特異的なＩｇＧ力価を決定した。図２５Ａに見られるように、ＣｏｍＰ−ＣＰＳ８またはＥＰＡ−ＣＰＳ８のいずれかでワクチン接種されたマウスは、ＥＰＡワクチン接種マウスと比較した場合、ＣＰＳ８に特異的なＩｇＧ力価が統計的に有意に増加している。さらに、ワクチン接種されたマウスからの血清の保護能力は、全血白血球を用いたマウス適応オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）を使用して決定された。図２５Ｂに示すように、ＣｏｍＰ−ＣＰＳ８で免疫したワクチン接種マウスの血清は、８４〜５０％の範囲の高レベルの殺菌性殺傷を示し、１匹のマウスは殺傷活性を示さなかった。さらに、ＥＰＡ−ＣＰＳ８ワクチン接種マウスの血清も８８％〜１０％の範囲の殺菌性を示し、３匹のマウスは殺傷活性を示さなかった。予想通り、ＥＰＡワクチン接種マウスからの血清は殺傷活性を示さなかった。
【０１１７】
酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）。５％ＣＯ２中３７℃のＢＨＩブロスで一晩増殖させたＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株をＰＢＳで洗浄し、光学密度をＯＤ６００＝０．６単位に調整した。細胞を６０℃で２〜４時間熱失活させた後、５０μＬ／ウェルを添加して高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に固定した。プレートをタンブラー上で４℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェルをＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水−ｔｗｅｅｎ）（１００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、５％スキムミルク（２５０μＬ／ウェル）で２時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳＴ中の２．５％スキムミルクで１：５００に希釈したマウス血清（１００μＬ／ウェル）とともに室温で１時間インキュベートした。陽性対照には、ＣＰＳに対する市販のウサギポリクローナル抗体（Ｓｔａｔｅｎｓ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用した。陰性対照ウェルは、一次抗体を含まないスキムミルクで処理した。一次抗体とのインキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＰＢＳＴ中の２．５％スキムミルクで希釈した二次ＨＲＰコンジュゲート抗体（１００μＬ／ウェル）で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの発色基質ＴＭＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を各ウェルに添加した。プレートを室温で５分間インキュベートした後、ＢｉｏＴｅｋ（商標）プレートリーダーを使用して６５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１１８】
ＩｇＧ力価を測定するために、ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬの１×０８ＣＦＵ／ｍＬの、ほぼ対数増殖期中期まで増殖させたＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８でコーティングした。細菌をＰＢＳで２回洗浄し、コーティング前に水に懸濁した。ＥＬＩＳＡプレートを生物学的フード内で２４時間風乾させた。次いで、５０マイクロリットルのメタノールを各ウェルに加え、風乾させた。プレートは、使用するまで光から保護された再封可能なバッグに保管された。マウス総ＩｇＧ抗体の力価測定を行うために、４２日目の血清をＰＢＳＴで段階希釈（２倍）し、１：４０００に希釈した抗マウスＨＲＰ結合ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃７０７６）を使用して抗体を検出した。マウス血清力価測定では、４５０ｎｍで０．２以下の光学密度をもたらした最後の血清希釈の逆数をその血清の力価とみなした。表現の目的で、負の力価（カットオフ以下）には任意の力価１０を与えた。プレート間の変動は、各プレートに内部参照陽性対照を含めることによって制御された。この対照は、以前にＣｏｍＰ−ＣＰＳ８バイオコンジュゲートワクチンで免疫されたマウスからの過免疫血清であった。ＴＭＢでのＥＬＩＳＡ反応は、内部陽性対照で約１のＯＤ４５０ｎｍが得られたときに停止した。
【０１１９】
部位特異的変異導入。以前に記載されたように（Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｉ，  １９９７）、部位特異的変異導入を実施して、ＰｇｌＭにおけるＨ３２５ならびにＣｏｍＰのＳ８２及びＳ８４の残基を変異させた。変異プライマーは、Ｗｅｂベースのプライマー設計プログラムであるＰｒｉｍｅｒ  Ｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｐｒｉｍｅｒｘ／）を使用して設計された。使用したプライマーを補足表１に示す。ＰＣＲ反応は、Ｐｆｕポリメラーゼと２〜１０ｎｇのｐＭＮ２をテンプレートとして使用して行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の初期変性と、それに続く９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、６８℃で３６０秒の１６サイクルで構成され、最後の伸長はなかった。ＰＣＲ反応を２時間ＤｐｎＩ消化してテンプレートプラスミドを除去し、次いでエレクトロコンピテントＤＨ５α細胞に形質転換し、プラスミド選択のためにアンピシリン上で増殖させた。変異導入を確認するためにコロニーを配列決定した。
【０１２０】
ＣｏｍＰ−ＣＰＳ１４コンジュゲートの消化。単離されたＣｏｍＰバンドは、わずかな変更を加えて前述のように処理された。簡潔に述べると、ゲルで分離されたＣｏｍＰバンドを切り出し、５０  ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３：１００％エタノールの５０：５０溶液で、７５０ｒｐｍで振とうしながら室温で２０分間脱色した。次いで、脱色したバンドを１００％エタノールで洗浄し、２０分間真空乾燥し、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の１０ｍＭＤＴＴで再水和した。振とうしながら５６℃で６０分間還元を行った。次いで還元緩衝液を除去し、ゲルバンドを１００％エタノールで１０分間２回洗浄して、残っているＤＴＴを確実に除去した。還元エタノールで洗浄した試料を、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミドで室温の暗所で４５分間で逐次的にアルキル化した。次いで、アルキル化試料を２ラウンドのＭｉｌｌｉ−Ｑ水と１００％エタノールで洗浄し、次いで真空乾燥した。次いで、アルキル化試料を４０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の１０ｎｇ／μｌのＧｌｕＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）で４℃で１時間再水和した。過剰なＧｌｕＣを除去し、ゲル片を４０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で覆い、３７℃で２４時間インキュベートした。ペプチドは、Ｃ１８ステージチップを使用して濃縮及び脱塩し（Ｉｓｈｉｈａｍａ，  Ｙ．，  Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，  Ｊ．  ＆  Ｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ５，  ９８８−９９４  （２００６）；Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，  Ｊ．，  Ｍａｎｎ，  Ｍ．  ＆  Ｉｓｈｉｈａｍａ，  Ｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，  １８９６−１９０６（２００７））、４℃でチップ上に保存した。ペプチドを緩衝液Ｂ（０．５％酢酸、８０％ＭｅＣＮ）で溶出し、乾燥させてからＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１２１】
逆相ＬＣ−ＭＳ及びＨＣＤ  ＭＳ−ＭＳを使用した糖ペプチドの同定。精製したペプチドを緩衝液Ａ＊に再懸濁し、ＨＦエッチングされたｎＥＳＩチップが組み込まれた、社内で充填した２５ｃｍ、内径７５μｍ、外径３６０μｍ、１．７ｕｍ  １３０Å  ＣＳＨ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，  ＵＫ）逆相分析カラムを使用して分離した。試料は、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｍ−Ｃｌａｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して６００ｎｌ／分で２０分間、緩衝液Ａ（０．１％ＦＡ）を使用してカラムに直接ロードし、緩衝液Ｂ（９９．９％ＡＣＮ、０．１％ＦＡ）の濃度を、６０分間で２％から３２％Ｂに、次の１０分間で３２％から４０％Ｂに、次いで８分間で８０％Ｂに増加し、２分間１００％Ｂに保持、次いでさらに１０分間で２％Ｂに低下するように変更する勾配を使用して３００ｎｌ／分で溶出した。ＲＰで分離されたペプチドをＱ−ＥＸＡＣＴＩＶＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計に注入し、データ依存型取得を使用してデータを取得した。推定糖ペプチドを同定するために２つの方法が使用された。方法Ａは、１回のフルプリカーサースキャン（解像度７０，０００；３５０−１８５０  ｍ／ｚ、ＡＧＣターゲット１×１０６）の後に１０個のデータ依存型ＨＣＤ  ＭＳ−ＭＳイベント（解像度３５ｋ  ＡＧＣターゲット１×１０５、最大注入時間１１０ｍｓ、ＮＣＥ  ２６、２５％ステッピング）、９０秒の動的除外が有効である、ロバストなペプチド同定を可能にすることを目的とした。方法Ｂは、１回のフルプリカーサースキャン（解像度７０，０００；３５０−１８５０  ｍ／ｚ、ＡＧＣターゲット１×１０６）、続いて１０個のデータ依存型ＨＣＤ  ＭＳ−ＭＳイベント（解像度３５ｋ  ＡＧＣターゲット５×１０５、最大注入時間２５０ｍｓ、ＮＣＥ  １３、２５％ステッピング）、９０秒の動的除外が有効である、糖ペプチド内のグリカンのより完全な特性強化を可能にすることを目的とした。
【０１２２】
同定された糖ペプチドのデータベース調査。生ファイルを手動で処理して、診断用オキソニウム２０４．０８ｍ／ｚイオンに基づいて潜在的な糖ペプチドを同定した。Ｅｘｐａｓｙ  ＦｉｎｄＰｅｐｔツール（ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｆｉｎｄｐｅｐｔ／のワールドワイドウェブ上）を使用して、１０ｐｐｍ以内で一致する、強力な脱グリコシル化ＣｏｍＰ由来ペプチドイオンの存在に基づいて、推定糖ペプチド由来スキャンを手動で検査し、ＧｌｕＣ由来ＣｏｍＰ糖ペプチドの可能性を同定した。ペプチドの割り当てを容易にするために、得られた糖ペプチドに、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒツールＭＳ−Ｐｒｏｄｕｃｔ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｓｆｏｒｍ．ｃｇｉ？ｆｏｒｍ＝ｍｓｐｒｏｄｕｃｔのワールドワイドウェブ上）で補助しながら、（Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，  Ｐ．  ＆  Ｆｏｈｌｍａｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １１，  ６０１  （１９８４））に従って手動で注釈を付けた。
【０１２３】
インタクトタンパク質分析インタクト分析は、６５２０  Ａｃｃｕｒａｔｅ質量Ｑ−ＴＯＦ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を使用して実行された。タンパク質試料を２％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡに再懸濁し、すぐにＡｇｉｌｅｎｔ１２００を使用するＣ５  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μｍ  ３００Å  ５０ｍｍ×２．１ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）  にロードした。試料は、緩衝液Ａ（２％アセトニトリル、０．１％ギ酸）で４分間洗浄して脱塩し、０．２００ｍｌ／分の流速で、２〜１００％緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸）の１２分間の直線勾配で分離した。ＭＳ１マススペクトルは、１Ｈｚで３００〜３，０００ｍ／ｚの質量範囲で取得された。ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｂ．０６．００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、インタクト質量分析と逆重畳積分を実行した。
【０１２４】
オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）  アッセイは以前に記載されたように実施され（；）４７，４８、以下に簡単に記載される。採血。ナイーブメスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）から心臓内穿刺により血液を採取し、ヘパリンナトリウムで処理した後、希釈して、５％熱不活化ウシ胎児血清、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び５０μＭの２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０中の６．２５×１０６白血球／ｍＬを得た。全ての試薬はＧｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＯＮ，  Ｃａｎａｄａ）から入手した。細菌懸濁液の調製。Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８または１４（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）のいずれかの羊血液寒天プレート上の単離されたコロニーを５ｍｌのＴｏｄｄ−ＨｅｗｉｔｔＢｒｏｔｈ（ＴＨＢ）（Ｏｘｏｉｄ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｅｐｅａｎ，  Ｃａｎａｄａ）に接種し、５％ＣＯ２で３７℃で１６時間インキュベートした。０．１ｍＬの１６時間培養物を１０ｍＬのＴＨＢに移し、５時間インキュベートすることにより、作業培養物を調製した。細菌を３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して、ＯＤ６００値が０．６になるようにした。これは、血清型８及び血清型１４でそれぞれ１．５×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ及び３．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当する。最終的な細菌懸濁液は、６．２５×１０４ＣＦＵ／ｍＬの濃度になるように完全な細胞培養培地で調製された。最終懸濁液中のＣＦＵ／ｍＬの数は、試料をＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ  Ａｇａｒ（ＴＨＡ）に播種することによって決定された。オプソニン化貪食作用アッセイ希釈した全血（５×１０５の総白血球）を、５×１０３ＣＦＵのＳ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８または１４（ＭＯＩ  ０．０１）及び対照（プラセボ）またはワクチン接種マウスの血清５％（ｖ／ｖ）と混合し、マイクロチューブ中で最終容量０．２ｍＬにした。マイクロチューブを振とうしながら、５％ＣＯ２で３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＴＨＡで生菌計数を実施した。ナイーブマウス血清（５％ｖ／ｖ）または市販のウサギ抗Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８または１４血清（５％ｖ／ｖ）（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）を添加したチューブを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。細菌の殺傷パーセントは、次の式を使用して決定された。細菌の殺傷パーセント＝［１−（試料チューブから回収された細菌／ナイーブ血清を含む陰性対照チューブから回収された細菌）］×１００。
【０１２５】
【表２】
2021528059.tif 000006
【０１２６】
表３  グリコシル化タグ配列
【数１】
2021528059.tif 000007
式中：
Ｘ１は、Ｖ、Ａ、またはアミノ酸不在であり；
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはアミノ酸不在であり；
Ｘ５は、Ｐ、Ｓ、またはＱであり；
Ｘ６は、Ｓ、Ｍ、またはＩであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｐ、またはＶであり；
Ｘ８は、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ１０は、Ｎ、またはアミノ酸不在であり；
Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、またはＡであり；
Ｘ１２は、ＳまたはＮであり；
Ｘ１４は、Ｖ、Ｔ、またはＡであり；
Ｘ１７は、Ｑ、Ｔ、またはＥであり；
Ｘ１８は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり；
Ｘ２０は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり；
Ｘ２１は、Ｓ、またはアミノ酸不在であり；
Ｘ２２は、Ｇ、またはアミノ酸不在であり；
Ｘ２５は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり；
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ２８は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ３１は、ＡまたはＥであり；
Ｘ３２は、ＴまたはＳであり；
Ｘ３４は、Ｔ、Ｑ、またはＡであり；
Ｘ３６は、Ｇ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ３７は、Ａ、Ｇ、またはＤであり；
Ｘ３８は、Ｓ、Ｌ、またはＡであり；
Ｘ３９は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＴであり；
Ｘ４０は、Ａ、Ｖ、またはＧであり；
Ｘ４１は、Ｇ、Ｉ、またはＶであり；
Ｘ４２は、Ｑ、Ｔ、またはＩであり；
Ｘ４３は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、またはＬであり；
Ｘ４４は、Ｉ、Ｔ、またはＶであり；
Ｘ４５は、Ｍ、またはアミノ酸不在であり；
Ｘ４６は、Ｄ、またはアミノ酸不在である。
【数２】
2021528059.tif 000008
式中：
Ｘ１４は、Ｖ、Ｔ、またはＡ、任意選択でＶであり；
Ｘ１７は、Ｑ、Ｔ、またはＥ、任意選択でＱであり；
Ｘ１８は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり；
Ｘ２０は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり；
Ｘ２１は、Ｓ、またはアミノ酸不在であり；
Ｘ２２は、Ｇ、またはアミノ酸不在であり；
Ｘ２５は、Ｎ、Ｓ、またはＡ、任意選択でＮであり；
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、またはＫ、任意選択でＡであり；
Ｘ２８は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ３１は、ＡまたはＥ、任意選択でＡであり；
Ｘ３２は、ＴまたはＳ、任意選択でＴであり；あるいは
Ｘ３４は、Ｔ、Ｑ、またはＡ、任意選択でＴである。
【０１２７】
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される、記載された特定の態様または先行する実施例によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に同等である任意の組成物または方法は、本開示の範囲内である。実際、示されたそれらのもの及び本明細書に記載されるものに加えて、本開示の様々な改変が、上述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０１２８】
本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、各々個別の刊行物または特許出願が、参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２９】
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２３．  Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ，  Ａ．，  Ｆｅｎｔａｂｉｌ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｍｉｌｌｓ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｋｌａｓｓｅｎ，  Ｊ．  Ｓ．  ＆  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｍ．  Ｆ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８９，  ８０８８−８０９８，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．０１３１８−０７  （２００７）．
２４．  Ｇｅｎｏ，  Ｋ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｃａｐｓｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｔｙｐｅｓ：  Ｐａｓｔ，  Ｐｒｅｓｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ．  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２８，  ８７１−８９９，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＣＭＲ．０００２４−１５  （２０１５）．
２５．  Ｉｈｓｓｅｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｎ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＰｇｌＢ  ｂｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｌ  ５，  １４０２２７，  ｄｏｉ：１０．１０９８／ｒｓｏｂ．１４０２２７  （２０１５）．
２６．  Ｐａｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｏ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ．  ＭＢｉｏ  ７，  ｅ００４４３−００４１６，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００４４３−１６  （２０１６）．
２７．  Ｗａｃｋｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｅ．  ｃｏｌｉ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，  １７９０−１７９３，  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２９８．５５９９．１７９０  （２００２）．
２８．  Ｖｉｋ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，  ４４４７−４４５２，  ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０９５０４１０６  （２００９）．
２９．  Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｃ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｃａｒｒｙ  ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，  ｏｎｅ  ｄｅｖｏｔｅｄ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ｔｏ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｐｉｌｉｎ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｏｎｅ  ｄｅｄｉｃａｔｅｄ  ｔｏ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９６，  １０２３−１０４１，  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｍｍｉ．１２９８６  （２０１５）．
３０．  Ｐａｎ，  Ｙ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  ７９  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５，  １５５７３，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１５５７３  （２０１５）．
３１．  Ｋｏｖａｃｈ，  Ｍ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｏｕｒ  ｎｅｗ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ，  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．  Ｇｅｎｅ  １６６，  １７５−１７６  （１９９５）．
３２．  Ｗｕ，  Ｋ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４，  ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ａｂｓｃｅｓｓ  ａｎｄ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９１，  ４４９２−４５０１，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．００３１５−０９  （２００９）．
３３．  Ｌｅｒｙ，  Ｌ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ  １２，  ４１，  ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４１−７００７−１２−４１  （２０１４）．
３４．  Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｓｔ  Ｐｉｅｒｒｅ，  Ｒ．  ＆  Ｌｉｎｎ，  Ｔ．  Ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｇｅｎｅ  １７７，  １３３−１３６  （１９９６）．
３５．  Ａｒａｋａｗａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｋ２  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｍｐＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｃｐｓ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｃｈｅｄｉｄ  （Ｏ１：Ｋ２）．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５９，  ２０４３−２０５０  （１９９１）．
３６．  Ｙｅｈ，  Ｋ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｐｓｕｌａｒ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｋ１  ｏｒ  Ｋ２，  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｍａｇＡ  ａｎｄ  ｒｍｐＡ，  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｆｏｒ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｂｓｃｅｓｓ  ｉｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  ａｎｄ  Ｔａｉｗａｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４５，  ４６６−４７１，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０１１５０−０６  （２００７）．
３７．  Ｋｏｗａｒｉｋ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２５，  １９５７−１９６６，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６０１０８７  （２００６）．
３８．  Ｃｏｍｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｂｌａｎｃｈ，  Ｖ．  Ｊ．，  Ｄｅａｌ，  Ｃ．  Ｄ．  ＆  Ｃａｓｔｒｉｃ，  Ｐ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  １２４４  ｐｉｌｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０，  ２８３７−２８４５  （２００２）．
３９．  Ｓｃｏｔｔ，  Ｎ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １３，  ２３５４−２３７０，  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１４．０３８３１５  （２０１４）．
４０．  Ｓｃｈｗａｒｚ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ６，  ２６４−２６６，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．３１４  （２０１０）．
４１．  Ｐｏｒｓｔｅｎｄｏｒｆｅｒ，  Ｄ．，  Ｄｒｏｔｓｃｈｍａｎｎ，  Ｕ．  ＆  Ａｖｅｒｈｏｆｆ，  Ｂ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ，  ｃｏｍＰ，  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＤ４１３．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６３，  ４１５０−４１５７  （１９９７）．
４２．  Ｇｉｌｔｎｅｒ，  Ｃ．  Ｌ．，  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｙ．  ＆  Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ｌ．  Ｌ．  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｐｉｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｕｌｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７６，  ７４０−７７２，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＭＭＢＲ．０００３５−１２  （２０１２）．
４３．  Ｐｅｌｉｃｉｃ，  Ｖ．  Ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｐｉｌｉ：  ｅ  ｐｌｕｒｉｂｕｓ  ｕｎｕｍ？  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８，  ８２７−８３７，  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２９５８．２００８．０６１９７．ｘ  （２００８）．
４４．  Ｍａｌｉｋ，  Ａ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐａｃｅ  ｏｆ  Ｅ．  ｃｏｌｉ．  ３  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６，  ４４，  ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１３２０５−０１６−０３９７−７  （２０１６）．
４５．  Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ，  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２６，  ５１−６２，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｇｌｙｃｏｂ／ｃｗｖ０７７  （２０１６）．
４６．  Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｂ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，  ｅ６２７６８，  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６２７６８  （２０１３）．
４７．  Ｃａｓｔｒｉｃ，  Ｐ．  ｐｉｌＯ，  ａ  ｇｅｎｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  １２４４  ｐｉｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１  （  Ｐｔ  ５），  １２４７−１２５４，  ｄｏｉ：１０．１０９９／１３５００８７２−１４１−５−１２４７  （１９９５）．
４８．  Ｐｏｗｅｒ，  Ｐ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｌｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４９，  ８３３−８４７  （２００３）．
４９．  Ｓｔｉｍｓｏｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｐｉｌｉｎ：  ａ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｇａｌａｃｔｏｓｙｌ  ２，４−ｄｉａｃｅｔａｍｉｄｏ−２，４，６−ｔｒｉｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７，  １２０１−１２１４  （１９９５）．
５０．  Ｉｓｈｉｈａｍａ，  Ｙ．，  Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，  Ｊ．  ＆  Ｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｔｏｐ  ａｎｄ  ｇｏ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｔｉｐｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｃｋｅｄ  ｄｉｓｋｓ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ５，  ９８８−９９４，  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｐｒ０５０３８５ｑ  （２００６）．
５１．  Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，  Ｊ．，  Ｍａｎｎ，  Ｍ．  ＆  Ｉｓｈｉｈａｍａ，  Ｙ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，  ｐｒｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ＳｔａｇｅＴｉｐｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，  １８９６−１９０６，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００７．２６１  （２００７）．
５２．  Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，  Ｐ．  ＆  Ｆｏｈｌｍａｎ，  Ｊ．  Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １１，  ６０１，  ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｍｓ．１２００１１１１０９  （１９８４）．
５３．  Ｈａｕｒａｔ，  Ｍ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｒｇｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６，  １２６９−１２７６，  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１０．１８５７４４  （２０１１）．
５４．  Ｐｒｉｃｅ，  Ｎ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６，  ２４９３１，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ２４９３１  （２０１６）．
５５．  Ｋａｙ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｙａｔｅｓ，  Ｌ．  Ｅ．，  Ｔｅｒｒａ，  Ｖ．  Ｓ．，  Ｃｕｃｃｕｉ，  Ｊ．  ＆  Ｗｒｅｎ，  Ｂ．  Ｗ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｌ  ６，  １５０２４３，  ｄｏｉ：１０．１０９８／ｒｓｏｂ．１５０２４３  （２０１６）．
【図１】
2021528059.tif 000009
【図２】
2021528059.tif 000010
【図３】
2021528059.tif 000011
【図４Ａ】
2021528059.tif 000012
【図４Ｂ】
2021528059.tif 000013
【図５】
2021528059.tif 000014
【図６−１】
2021528059.tif 000015
【図６−２】
2021528059.tif 000016
【図７】
2021528059.tif 000017
【図８】
2021528059.tif 000018
【図９】
2021528059.tif 000019
【図１０】
2021528059.tif 000020
【図１１−１】
2021528059.tif 000021
【図１１−２】
2021528059.tif 000022
【図１１−３】
2021528059.tif 000023
【図１２Ａ】
2021528059.tif 000024
【図１２Ｂ】
2021528059.tif 000025
【図１２Ｃ】
2021528059.tif 000026
【図１３】
2021528059.tif 000027
【図１４−１】
2021528059.tif 000028
【図１４−２】
2021528059.tif 000029
【図１５】
2021528059.tif 000030
【図１６】
2021528059.tif 000031
【図１７】
2021528059.tif 000032
【図１８】
2021528059.tif 000033
【図１９】
2021528059.tif 000034
【図２０Ａ】
2021528059.tif 000035
【図２０Ｂ】
2021528059.tif 000036
【図２１】
2021528059.tif 000037
【図２２−１】
2021528059.tif 000038
【図２２−２】
2021528059.tif 000039
【図２３】
2021528059.tif 000040
【図２４Ａ】
2021528059.tif 000041
【図２４Ｂ】
2021528059.tif 000042
【図２４Ｃ】
2021528059.tif 000043
【図２４Ｄ】
2021528059.tif 000044
【図２５】
2021528059.tif 000045
【図２６Ａ】
2021528059.tif 000046
【図２６Ｂ】
2021528059.tif 000047
【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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