(57)【要約】本発明は、（ｉ）残基Ｃ３０２または機能的に等価な残基に相当する位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここで上記位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、（ｉｉ）テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、および（ｉｉｉ）上記核酸フラグメントに改変ヌクレオチドを組み込み得る、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）残基Ｃ３０２または機能的に等価な残基に相当する位置において少なくとも１個のアミノ酸置換を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここで前記位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、（ｉｉ）テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、および（ｉｉｉ）前記核酸フラグメントに改変ヌクレオチドを組み込み得る、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体。
【請求項２】
前記置換は、Ｃ３０２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄから、好ましくはＣ３０２Ｇ／Ｒから選択される、請求項１に記載のＴｄＴの改変体。
【請求項３】
前記改変体は、Ｍ１９２、Ｌ２６０、Ｒ３３６、Ｄ３７９、Ｒ４５４およびＥ４５７から選択される残基、機能的に等価な残基に相当する位置で少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１または２に記載のＴｄＴの改変体。
【請求項４】
前記改変体は、Ｍ１９２、Ｌ２６０、Ｒ３３６、Ｄ３７９、Ｒ４５４およびＥ４５７から選択される残基に相当する位置で、少なくとも２個のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも３個の、より好ましくは少なくとも４個の、さらにより好ましくは少なくとも５個の、およびより好ましくは６個のアミノ酸置換をさらに含む、請求項３に記載のＴｄＴの改変体。
【請求項５】
前記置換は、Ｍ１９２Ｒ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｖ／Ｄ／Ｎ／Ｈ／Ｅ、Ｌ２６０Ｐ／Ｍ／Ｅ／Ｎ／Ｆ／Ｋ／Ｄ／Ａ／Ｇ、Ｒ３３６Ｎ／Ｌ／Ｋ／Ｈ／Ｇ／Ｄ／Ａ／Ｐ、Ｄ３７９Ｖ／Ａ／Ｇ／Ｎ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｔ、Ｒ４５４Ｐ／Ｎ／Ａ／Ｌ／Ｋ／Ｈ／Ｇ／Ｄ、およびＥ４５７Ｎ／Ｔ／Ｓ／Ｌ／Ｖ／Ｋ／Ｈ／Ｇ／Ｄから選択され、好ましくはＭ１９２Ｒ／Ｑ、Ｌ２６０Ｐ、Ｒ３３６Ｌ／Ｎ、Ｄ３７９Ｖ、Ｒ４５４Ｐ／ＮおよびＥ４５７Ｎ／Ｌ／Ｔ／Ｓから選択される、請求項３または４に記載のＴｄＴの改変体。
【請求項６】
前記改変体は、Ｔ３４０、Ｇ４１３、Ｈ４１６、Ｅ４１８、Ｗ４５０、およびＡ５１０から選択される残基、または機能的に等価な残基に相当する位置で、好ましくはＴ３４０Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｍ／Ｋ／Ｄ、Ｇ４１３Ｌ／Ｓ／Ｐ／Ｒ、Ｈ４１６Ｄ、Ｅ４１８Ａ／Ｖ、Ｗ４５０Ｙ／Ｆ／Ｐ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｇ／Ｅ、およびＡ５１０Ｖ／Ｔ／Ｇから選択される少なくとも１個の置換をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載のＴｄＴの改変体。
【請求項７】
前記改変体は、Ｌ１８１、Ａ２３７、Ｌ２６０、Ｔ３４０、Ｇ４１３、Ｈ４１６、Ｅ４１８、Ｗ４５０、Ｒ４８０およびＡ５１０から選択される残基、または機能的に等価な残基に相当する位置で少なくとも１個の置換を、好ましくは置換の組み合わせＬ１８１Ｆ＋Ａ２３７Ｖ＋Ｒ４８０Ｋおよび／もしくはＧ４１３Ｌ／Ｓ＋Ｈ４１６Ｄ＋Ｅ４１８Ａ、または機能的に等価な残基をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載のＴｄＴの改変体。
【請求項８】
前記改変体は、配列番号２、または機能的に等価な配列のＮ末端および／またはＣ末端において、Ｈｉｓタグ配列のようなタグ配列をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載のＴｄＴの改変体。
【請求項９】
前記改変体は、少なくとも、表１で開示される置換の組み合わせから選択される置換の組み合わせ、または機能的に等価な残基を含む、前記請求項のいずれか１項に記載のＴｄＴの改変体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに定義されるとおりのＴｄＴの改変体をコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸分子または請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに定義されるとおりのＴｄＴの改変体を生成するためのプロセスであって、ここで請求項１２に記載の宿主細胞は、前記改変体をコードする前記核酸の発現を可能にする培養条件下で培養され、前記改変体は、必要に応じて回収される、プロセス。
【請求項１４】
３’Ｏ−改変ヌクレオチドを用いて、テンプレートなしに核酸分子を合成するための、請求項１〜９のいずれかに定義されるとおりのＴｄＴの改変体の使用。
【請求項１５】
テンプレートなしで核酸分子を合成するためのプロセスであって、前記プロセスは、核酸プライマーと、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１個の３’Ｏ−改変ヌクレオチド、および請求項１〜９のいずれかに定義されるとおりのＴｄＴの改変体の両方とを接触させる工程を包含するプロセス。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに定義されるとおりのＴｄＴの改変体、および１種またはこれより多くのヌクレオチド、好ましくは、１種またはこれより多くの３’Ｏ−改変ヌクレオチド、ならびに必要に応じて少なくとも１種の核酸プライマーを含む、ヌクレオチド組み込み反応を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、テンプレートなしで核酸配列を酵素的に合成するための、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体およびその使用に関する。より詳細には、本発明は、決定されたおよび制御された配列を有する核酸分子を合成するための、改変ヌクレオチドの組み込みに適したそのような改変体に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
固相ホスホルアミダイト化学に基づく核酸のデノボ化学合成のための方法は、過去４０年間にわたって、主に使用されかつ改良されてきた。その技術は、固体支持体マトリクスに結合された、成長しているオリゴヌクレオチド鎖上に、１サイクルあたり１個の塩基を付加する、４工程の鎖伸長サイクルからなる。その技術は、過去数十年間の間に核酸を合成する一般に好まれる方法であったが、この技術は、いくつかの顕著な限界がある：それは、多数の溶媒および試薬の使用を要求し、化学反応効率における限界に起因して、合成オリゴヌクレオチドの長さは、代表的には、１５０〜２００塩基を超えない。さらに、これらの短いフラグメントは、所望のＤＮＡ配列を提供するためにさらにアセンブリされる必要がある。
【０００３】
化学合成に代わる１つの代替手段は、可逆的ターミネーター改変ヌクレオチドを、成長している核酸の一本鎖の鎖に付加するテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにある。これは、制御された様式で、１サイクルあたり１つのタイプのヌクレオチドを付加することを可能にする。
【０００４】
いくつかの天然酵素は、テンプレートの非存在下で天然のヌクレオチドに対して作用し得るので、制御されていない様式で核酸の合成を触媒し得る。しかし、それらは、改変ヌクレオチドを、およびより詳細には、可逆的ターミネーター改変ヌクレオチドを組み込むためには特に非効率的である。改変ヌクレオチドに対して作用し得る新たなＤＮＡポリメラーゼを開発する努力がなされてきたが、その得られた酵素は、任意のタイプの核酸の合成に対する性能に関しては、十分に満足のいくものではない。
【０００５】
これまでは、１本鎖ＤＮＡに対して（テンプレートの使用なしで）効率的に作用し得るごくわずかなＤＮＡポリメラーゼが同定されている。このようなテンプレート非依存性活性を有するその最も特徴づけられたポリメラーゼは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である。ＴｄＴ酵素は、１本鎖ＤＮＡを、バイオテクノロジー、生物医学研究および合成生物学を含む種々のタイプの適用のために改変するために広範に使用されてきた。しかし、天然のＴｄＴは、改変ヌクレオチドを不十分にしか使用できない。
【０００６】
改変ヌクレオチドの組み込みの許容可能な性能を有する改変ＴｄＴを開発しようとするいくつかの試みが、行われてきた。しかし、このような改変ヌクレオチドの組み込みの性能は、なお制限因子である。組み込み効率は、全体の純度および合成収量を駆動する重要なパラメーターである。その合成プロセスのこれらの２つの特性は、核酸生成物の品質、所要時間およびコストに重大な影響を与える。
【０００７】
従って核酸合成のための効率的かつ費用効果のある方法を開発するために、テンプレートの非存在下で改変ヌクレオチドを使用し得る改善されたＴｄＴを開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
制御された配列を有するポリヌクレオチドのデノボ合成のための、テンプレートを使用しないＴｄＴに関して研究することによって、本発明者らは、上記ＴｄＴの触媒ドメインのいくつかの標的としたアミノ酸残基を具体的に改変して、このような改変ＴｄＴの能力をポリヌクレオチドの合成のために改善し得ることを発見した。より詳細には、本発明者らは、改変ヌクレオチドを用いるとしても、特注の核酸を合成する全体的なコストを低減するようにもたらす、標的としたアミノ酸置換（複数可）を有する改変ＴｄＴを開発した。上記改変ＴｄＴは、野生型ＴｄＴと比較して、１個またはこれより多くの標的としたアミノ酸置換を示し得る。より詳細には、上記改変ＴｄＴは、少なくとも、１個またはこれより多くの標的としたアミノ酸置換（複数可）を有する触媒ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。本発明のテンプレート非依存性ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドを、より速く、より安価に、および／またはより良好な品質で合成することを可能にする。
【０００９】
従って、本発明の目的は、（ｉ）残基Ｃ３０２または機能的に等価な残基に相当する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここで上記位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、（ｉｉ）テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、および（ｉｉｉ）上記核酸フラグメントに改変ヌクレオチドを組み込み得る、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体を提供することである。
【００１０】
特定の実施形態において、上記置換は、Ｃ３０２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄから、好ましくはＣ３０２Ｇ／Ｒから選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、対照標準すなわち配列番号１の野生型ＴｄＴ配列と少なくとも８０％同一性を有するＴｄＴ改変体を含む組成物に関し、ここで（ｉ）このようなＴｄＴ改変体は、Ｃ３０２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄ、より好ましくはＣ３０２Ｇ／Ｒからの変異、またはその機能的等価物を有する、および（ｉｉ）このようなＴｄＴ改変体は、３’−Ｏ−改変ヌクレオシド三リン酸を、上記対照標準すなわち野生型ＴｄＴより高い効率で組み込む。
【００１２】
また、本発明の目的は、（ｉ）Ｍ１９２Ｒ／Ｑ、Ｌ２６０Ｐ、Ｃ３０２Ｇ／Ｒ、Ｒ３３６Ｌ／Ｎ、Ｄ３７９Ｖ、Ｒ４５４Ｐ／ＮおよびＥ４５７Ｎ／Ｌ／Ｔ／Ｓ、または機能的に等価な残基から選択される少なくとも２個のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸置換を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここでその位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、（ｉｉ）テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、ならびに（ｉｉｉ）上記核酸フラグメントに改変ヌクレオチドを組み込み得る、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、上記で定義したとおりのＴｄＴの改変体をコードする核酸分子および／またはこのような核酸分子を含む発現ベクター、および／またはこのような核酸分子もしくは発現ベクターを含む宿主細胞を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、本発明に従うＴｄＴの改変体を生成するためのプロセスであって、ここで上記に定義されるとおりの宿主細胞が、上記改変体をコードする核酸の発現を可能にする培養条件下で培養され、上記改変体は、必要に応じて回収されるプロセスを提供することである。
【００１５】
本発明はさらに、１種またはこれより多くの３’Ｏ−改変ヌクレオチドを用いて、テンプレートなしで核酸分子を合成するための、ＴｄＴの改変体の使用に関する。いくつかの実施形態において、このような方法は、（ａ）遊離３’−ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドを含む開始フラグメントを提供する工程；（ｂ）酵素的伸長条件下で、本発明のＴｄＴ改変体と、上記開始フラグメントまたは伸長した開始フラグメントとを、３’−Ｏ−可逆的ブロックヌクレオチドの存在下で反応させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、このような方法は、（ｃ）上記伸長した開始フラグメントを脱ブロックして、遊離３’−ヒドロキシルを有する伸長した開始フラグメントを形成する工程、および（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を、所定の配列の核酸分子が合成されるまで反復する工程、をさらに包含する。
【００１６】
また、本発明の目的は、核酸プライマーと、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１個の３’Ｏ−改変ヌクレオチド、および本発明に従うＴｄＴの改変体の両方とを接触させる工程を包含する、テンプレートなしで核酸分子を合成するためのプロセスを提供することである。
【００１７】
本発明はさらに、本発明に従うＴｄＴの改変体、および１種またはこれより多くのヌクレオチド、好ましくは、１種またはこれより多くの３’Ｏ−改変ヌクレオチド、ならびに必要に応じて少なくとも１種の核酸プライマーを含む、ヌクレオチド組み込み反応を行うためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】野生型（ｗｔ）ＴｄＴおよび本発明の種々のＴｄＴ改変体の精製アッセイ。タンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ゲル上に載せ、電気泳動を通じて移動させた。
【００１９】
【図２】ｗｔ  ＴｄＴおよび本発明のＴｄＴ改変体を使用する伸長アッセイの成績の比較結果。そのアッセイは、蛍光標識プライマーおよび３’−Ｏ−アミノ可逆的ターミネーター改変ヌクレオチドを含む。その結果は、各酵素についてｎ＝３の実験の平均値を表す。
【００２０】
【図３】本発明の種々のＴｄＴ改変体での伸長アッセイに関して得た結果の質量スペクトル分析。質量スペクトルの関連部分のみが示される。矢印は、予測される伸長したプライマーのピーク（質量）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の説明
ＤＮＡポリメラーゼファミリーは、それらの配列相同性および結晶構造に基づいて７つのファミリーに分けられる。それらの中で、ＰｏｌＸファミリーのポリメラーゼは、複製ポリメラーゼからターミナルトランスフェラーゼ酵素までの広く種々のポリメラーゼを代表する。ＰｏｌＸファミリーのポリメラーゼは、非常に広い範囲の真核生物にわたって存在する。ＰｏｌＸファミリーのポリメラーゼは、多種多様な生物学的プロセスに、特に、ＤＮＡ損傷修復機構またはエラー修正機構に関わっている。そのＰｏｌＸファミリーは、ポリメラーゼβ（Ｐｏｌ  β）、μ（Ｐｏｌ  μ）、λ（Ｐｏｌ  λ）、酵母由来のＩＶ（Ｐｏｌ  ＩＶ）およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）に再編成する。ＴｄＴは、ＤＮＡ修復および維持機構に天然に関わっている。特に、ＴｄＴは、テンプレート鎖の非存在下ですら、ヌクレオチド重合活性を保存する特有の能力を有する。特異的条件においてかつ天然のヌクレオチドを用いると、ＴｄＴは、数百ヌクレオチドを有するＤＮＡフラグメントを、いかなる相補鎖の非存在下でも伸長できる。しかし、野生型ＴｄＴは、糖−改変ヌクレオチドを効率的に組み込むことが完全にできない。
【００２２】
従って、本発明の目的は、ヌクレオチドフラグメントの合成の間に、そのヌクレオチドフラグメントへと改変ヌクレオチドを組み込むことを可能にする、標的とした変異（複数可）を有するＴｄＴの改変体を提供することである。より詳細には、本発明者らは、有利には、単独でまたは組み合わせにおいて置換されて、改変ヌクレオチドを使用することによることを含め、酵素が種々の長さのおよび所定の配列を有する核酸フラグメントを合成する能力を改善し得る特定のアミノ酸残基を同定した。
【００２３】
定義
本明細書で使用される場合、用語「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」および「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、配列番号２に由来し、かつ改変または変更、すなわち、１個またはこれより多くの（例えば、数個の）位置において置換、挿入、および／または欠失を含みかつテンプレートなしのポリメラーゼ活性および１種またはこれより多くの改変ターミネーターヌクレオチドを組み込む能力の両方を有するポリペプチドをいうために、交換可能に使用され得る。その改変体は、当該分野で周知の種々の技術によって得られ得る。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を変更するための技術の例としては、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発および合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられるが、これらに限定されない。変異誘発活性は、タンパク質の、または本発明の場合には、ポリメラーゼの配列中の１または数個のアミノ酸を欠失、挿入、または置換することにある。標的としたアミノ酸は、そのポリメラーゼの配列全体に沿って付随または分布され得る。例えば、特異的モチーフまたは構造的特徴は、標的とされ得る。
【００２４】
用語「改変」または「変更」とは、位置またはアミノ酸に関して本明細書で使用される場合、その特定の位置にあるアミノ酸が、野生型タンパク質のアミノ酸と比較して改変されていることを意味する。
【００２５】
「置換」とは、アミノ酸残基が、別のアミノ酸残基によって置き換えられていることを意味する。好ましくは、用語「置換」とは、あるアミノ酸残基を、天然に存在する標準の２０種のアミノ酸残基、希な天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６−Ｎ−メチルリジン（６−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｙｓｉｎｅ）、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、および天然に存在しないアミノ酸残基（しばしば合成して作製される（例えば、シクロヘキシル−アラニン））から選択される別のものによって置き換えることをいう。好ましくは、用語「置換」とは、あるアミノ酸残基を、その天然に存在する標準の２０種のアミノ酸残基から選択される別のものによって置き換えることをいう。記号「＋」は、置換の組み合わせを示す。
【００２６】
アミノ酸は、以下の命名法に従って、それらの１文字記号または３文字記号によって本明細書で表される：  Ａ：アラニン（Ａｌａ）；  Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；  Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；  Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；  Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；  Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；  Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；  Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；  Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；  Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；  Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；  Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；  Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；  Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；  Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；  Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；  Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）；  Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；  Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。
【００２７】
本文書において、以下の用語法が、置換を指定するために使用される：  Ｌ２３８Ａは、親配列の２３８位におけるアミノ酸残基（ロイシン，Ｌ）が、アラニン（Ａ）に変えられていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位におけるアミノ酸残基（アラニン，Ａ）が、以下のアミノ酸のうちの１つ：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、またはメチオニン（Ｍ）によって置換されていることを示す。その置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギンおよびスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システインおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および小さいアミノ酸（グリシン、アラニンおよびセリン）のグループ内である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」または「同一性」とは、２つのポリペプチド配列間のマッチ（同一のアミノ酸残基）の数（またはパーセンテージ％として表される割合）を指す。その配列同一性は、配列ギャップを最小にしながら重複および同一性を最大にするように整列させた場合に、その配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、その２つの配列の長さに依存して、多くの数学的な全体または局所のアラインメントアルゴリズムのうちのいずれかを使用して決定され得る。類似の長さの配列は、好ましくは、その配列を全体の長さにわたって最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０）を使用して整列されるが、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、局所アラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  １９８１）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５））を使用して整列される。％アミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、当該分野の技術範囲内である種々の方法によって、例えば、インターネットウェブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／  ｏｒ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／）上で入手可能な公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。本明細書での目的のために、％  アミノ酸配列同一性の値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適な全体アラインメントを作り出す、ペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成された値に言及し、ここで全ての検索パラメーターは、デフォルト値に設定される（すなわず、スコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０およびエンドギャップ伸長＝０．５）。
【００２９】
本明細書では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」とは、その鎖を形成するアミノ酸の数に拘わらず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の鎖を指す。
【００３０】
別段特定されなければ、本出願において開示される位置は、マウスＴｄＴのアミノ酸配列に相当する、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる。
【００３１】
ＴｄＴの改変体
本発明は、所定の配列のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、テンプレート鎖を使用せずに合成するために使用され得るＴｄＴ酵素の改変体を提供する。本発明のＴｄＴ改変体は、改変ヌクレオチド、およびより詳細には、３’Ｏ−改変ヌクレオチドが、ポリヌクレオチド合成の酵素媒介性方法において使用されることを可能にする。
【００３２】
本発明の状況において、「改変ターミナルデスオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ」、「改変ＴｄＴ」、「ターミナルデスオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼの改変体」および「ＴｄＴの改変体（ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ＴｄＴ）」とは、ＴｄＴのアミノ酸配列と少なくとも２５％  同一性を共有し、少なくとも１個のアミノ酸残基置換を除いて、少なくとも、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または任意の機能的に等価なフラグメントを含む酵素を指す。好ましくは、ＴｄＴの改変体は、配列番号１と少なくとも４０％  同一性を共有する。
【００３３】
ＴｄＴがＮ末端からＣ末端に、それぞれ、核局在ドメイン（ＮＬＳ）、ＢＲＣＴ様ドメインおよび触媒ドメイン（Ｃ−ＴｄＴ）に相当する異なるドメインから構成されることは公知である。その触媒ドメイン（配列番号２）は、ポリメラーゼ活性を示す。
【００３４】
本発明の改変体は、特定の残基上のそれらの変異に従って記載され、その残基の位置は、マウスＴｄＴのアミノ酸配列に相当する酵素配列  配列番号１とのアラインメントまたは配列番号１を参照することによって決定される。より詳細には、本発明の改変体は少なくとも、ＴｄＴの触媒ドメインを含む。本開示において、その残基は、マウスＴｄＴの触媒ドメイン（配列番号２）の残基に相当する。しかし、本発明の状況において、配列番号２および／または配列番号１に機能的に等価な配列を有する任意の改変体はまた、本発明の一部である。同様に、機能的に等価な残基上で同じ変異を有する任意の改変体はまた、本発明の一部である。
【００３５】
本発明の状況において、「機能的に等価な配列」とは、配列番号１または配列番号２に相同なＴｄＴの配列を指す。「機能的に等価な残基」とは、配列番号１に相同であり、かつ同一の機能的役割を有する配列のＴｄＴの配列中の残基を意味する。機能的に等価な残基は、配列アラインメントを使用する、例えば、Ｍｕｔａｌｉｎラインアラインメントソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ；  １９８８，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １６  （２２），  １０８８１−１０８９０）を使用することによって、同定される。アラインメントの後、その機能的に等価な残基は、考慮される異なる配列上の相同な位置にある。配列アラインメントおよび機能的に等価な残基の同定は、種間を含め、任意のＴｄＴとそれらの天然の改変体との間で行われ得る。
【００３６】
ＴｄＴは、多くの他の生物または微生物において見出され得る。全てのそれらＴｄＴは、本発明を行うための良好な候補である。特に、特定のＴｄＴ配列を変更して、改変ヌクレオチドを組み込む増大した能力を上記ポリメラーゼに与える改変は、任意の他のＴｄＴ配列を標的とし得る。よって、配列番号１を参照することによって、およびより詳細には、配列番号１のアミノ酸残基１３０〜５１０に相当する配列番号２を参照することによって本明細書で記載される変異または組み合わせは、任意の他のＴｄＴ配列に転置され得る。
【００３７】
本発明の第1の局面によれば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体は、（ｉ）残基Ｃ３０２または機能的に等価な残基に相当する位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここでその位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、（ｉｉ）テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、および（ｉｉｉ）その核酸フラグメントに可逆的改変ターミネーターヌクレオチドを組み込み得る。実際に、本発明者らは、アミノ酸残基Ｃ３０２または任意の機能的に等価な残基上の置換が、核酸配列における３’Ｏ−改変ヌクレオチドの組み込みを可能にし得る、表面特性およびその酵素とヌクレオチドとの相互作用特性の両方に大きな影響を有することを発見した。
【００３８】
有利なことには、その置換は、Ｃ３０２Ｇ／Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｄから、好ましくはＣ３０２Ｇ／Ｒから選択される。
【００３９】
特定の実施形態において、その改変体は、Ｍ１９２、Ｌ２６０、Ｒ３３６、Ｄ３７９、Ｒ４５４およびＥ４５７から選択される残基、または機能的に等価な残基に相当する位置において少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含む。興味深いことに、残基Ｍ１９２、Ｒ３３６、Ｒ４５４および／またはＥ４５７に対する置換（複数可）は、その触媒ポケットのサイズおよび形状の両方に影響を有し、残基Ｌ２６０および／またはＤ３７９に対する置換（複数可）は、その成長している核酸鎖との相互作用ドメインに影響を有する。
【００４０】
特定の実施形態において、その改変体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または任意の機能的に等価な配列、およびＣ３０２およびＲ３３６、または機能的に等価な残基の両方の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００４１】
代わりに、または加えて、その改変体は、Ｍ１９２、Ｌ２６０、Ｒ３３６、Ｄ３７９、Ｒ４５４およびＥ４５７から選択される残基、または機能的に等価な残基に相当する位置において、少なくとも２個のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、さらにより好ましくは少なくとも５個、およびより好ましくは６個のアミノ酸置換をさらに含む。
【００４２】
好ましくは、その置換は、Ｍ１９２Ｒ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｖ／Ｄ／Ｎ／Ｈ／Ｅ、Ｌ２６０Ｐ／Ｍ／Ｅ／Ｎ／Ｆ／Ｋ／Ｄ／Ａ／Ｇ、Ｒ３３６Ｎ／Ｌ／Ｋ／Ｈ／Ｇ／Ｄ／Ａ／Ｐ、Ｄ３７９Ｖ／Ａ／Ｇ／Ｎ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｔ、Ｒ４５４Ｐ／Ｎ／Ａ／Ｌ／Ｋ／Ｈ／Ｇ／Ｄ、およびＥ４５７Ｎ／Ｔ／Ｓ／Ｌ／Ｖ／Ｋ／Ｈ／Ｇ／Ｄから選択され、好ましくは、Ｍ１９２Ｒ／Ｑ、Ｌ２６０Ｐ、Ｒ３３６Ｌ／Ｎ、Ｄ３７９Ｖ、Ｒ４５４Ｐ／ＮおよびＥ４５７Ｎ／Ｌ／Ｔ／Ｓから選択される。
【００４３】
代わりにまたは加えて、その改変体は、Ｔ３４０、Ｇ４１３、Ｈ４１６、Ｅ４１８、Ｗ４５０、およびＡ５１０から選択される残基、または機能的に等価な残基、好ましくは、Ｔ３４０Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｍ／Ｋ／Ｄ、Ｇ４１３Ｌ／Ｓ／Ｐ／Ｒ、Ｈ４１６Ｄ、Ｅ４１８Ａ／Ｖ、Ｗ４５０Ｙ／Ｆ／Ｐ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｇ／Ｅ、およびＡ５１０Ｖ／Ｔ／Ｇから選択される残基に相当する位置において少なくとも１個の置換をさらに含む。残基Ｔ３４０、Ｗ４５０および／またはＡ５１０に対する置換（複数可）は、触媒ポケットのサイズおよび形状の両方に対して影響を有する。残基Ｇ４１３、Ｈ４１６および／またはＥ４１８に対する置換（複数可）は、タンパク質ループ二次構造に影響を有する。残基Ａ５１０に対する置換は、触媒ポケットのサイズおよび形状の両方に対して影響を有する。
【００４４】
興味深いことに、本発明者らは、その改変体が、有利なことには、置換の組み合わせＬ１８１Ｆ＋Ａ２３７Ｖ＋Ｒ４８０Ｋおよび／またはＧ４１３Ｌ／Ｓ＋Ｈ４１６Ｄ＋Ｅ４１８Ａを含み得、これら置換は、本明細書中以降、定常変異として示され、それがタンパク質安定性に対して大きな影響を有することを発見した。
【００４５】
特定の実施形態において、その改変体は、以下から選択される２個のアミノ酸置換の組み合わせを含む：Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｅ４５７ＬおよびＣ３０２Ｇ＋Ｅ４５７Ｎ、好ましくはＣ３０２Ｒ＋Ｒ３３６ＬまたはＣ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ。
【００４６】
特定の実施形態において、その改変体は、以下から選択される３個のアミノ酸置換の組み合わせを含む：Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ａ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７ＬおよびＣ３０２Ｇ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎ、好ましくはＭ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ、Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７ＬおよびＣ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｎ。
【００４７】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＭ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ（ＤＳ１１）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００４８】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＭ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ（ＤＳ２９）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００４９】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＭ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ（ＤＳ１７３）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００５０】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＬ２６０Ｐ＋Ｃ３０２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ（ＤＳ６５９）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００５１】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＣ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ（ＤＳ８７４）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００５２】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＭ１９２Ｒ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ（ＤＳ２２６）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００５３】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＭ１９２Ｑ＋Ｃ３０２Ｇ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ（ＤＳ５５７）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００５４】
本発明はより詳細には、表１に列挙されるとおりの少なくとも１個の置換または置換の組み合わせを有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を有するＴｄＴの改変体を提供する。本発明の改変体は少なくとも、左列に列挙され「変動性の変異（Variable  Mutation）」と称されるアミノ酸置換もしくは機能的に等価な残基、および必要に応じて右列に列挙され「必要に応じた定常変異（Optional  Constant  Mutation）」と称される置換のうち、一方もしくは両方の組み合わせ、または機能的に等価な配列を含む。
【００５５】
【表１−１】
2021510074.tif 000002
【表１−２】
2021510074.tif 000003
【表１−３】
2021510074.tif 000004
【表１−４】
2021510074.tif 000005
【表１−５】
2021510074.tif 000006
【表１−６】
2021510074.tif 000007
【表１−７】
2021510074.tif 000008
【表１−８】
2021510074.tif 000009
【表１−９】
2021510074.tif 000010
【表１−１０】
2021510074.tif 000011
【表１−１１】
2021510074.tif 000012
【表１−１２】
2021510074.tif 000013
【表１−１３】
2021510074.tif 000014
【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
2021510074.tif 000017
【００５６】
特定の実施形態において、本発明の改変体は、配列番号２のアミノ酸配列（または機能的に等価な配列）および必要に応じてそのＣ末端またはＮ末端にさらなるアミノ酸フラグメントを含む。別の実施形態において、本発明の改変体は、配列番号１のアミノ酸配列（または機能的に等価な配列）および必要に応じてそのＣ末端またはＮ末端にさらなるアミノ酸フラグメントを含む。別の実施形態において、本発明の改変体は、配列番号２のアミノ酸配列（または機能的に等価な配列）のみからなる。より詳細には、特定の実施形態において、本発明の改変体は、ＢＲＴＣ様ドメイン（これは、配列番号１の残基１〜１２９に相当する）を欠く。
【００５７】
本発明の第２の局面によれば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体は、（ｉ）Ｍ１９２Ｒ／Ｑ、  Ｌ２６０Ｐ、  Ｃ３０２Ｇ／Ｒ、  Ｒ３３６Ｌ／Ｎ、  Ｄ３７９Ｖ、  Ｒ４５４Ｐ／ＮおよびＥ４５７Ｎ／Ｌ／Ｔ／Ｓから選択される少なくとも３個のアミノ酸置換、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここでその位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、（ｉｉ）テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、および（ｉｉｉ）その核酸フラグメントに改変ヌクレオチドを組み込み得る。
【００５８】
例えば、ＴｄＴの改変体は、以下から選択される置換の組み合わせを含む：Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、  Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７���、Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７ＮおよびＲ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ、または機能的に等価な残基（複数可）。
【００５９】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＲ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ（ＤＳ９２８）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００６０】
特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、置換の組み合わせＲ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎ（ＤＳ９５０）、または機能的に等価な残基を有する、配列番号２のアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を含む。
【００６１】
このような改変体は、Ｌ１８１、Ａ２３７、Ｌ２６０、Ｔ３４０、Ｇ４１３、Ｈ４１６、Ｅ４１８、Ｗ４５０、Ｒ４８０およびＡ５１０から選択される残基、または機能的に等価な残基（複数可）に相当する位置において少なくとも１個の置換をさらに含み得る。
【００６２】
上記で曝されるように、上記改変体はまた、定常変異の組み合わせＬ１８１Ｆ＋Ａ２３７Ｖ＋Ｒ４８０Ｋおよび／もしくはＧ４１３Ｌ／Ｓ＋Ｈ４１６Ｄ＋Ｅ４１８Ａ、または機能的に等価な残基（複数可）を含み得る。
【００６３】
さらなる局面によれば、本発明は、（ｉ）Ｍ１９２Ｒ、Ｍ１９２Ｑ、Ｌ２６０Ｐ、Ｒ３３６Ｌ、Ｒ３３６Ｎ、Ｄ３７９Ｖ、Ｒ４５４Ｐ、Ｒ４５４Ａ、Ｅ４５７Ｌ、Ｅ４５７Ｎから選択される少なくとも１個のアミノ酸置換、または機能的に等価な残基（複数可）を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここでその位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、（ｉｉ）テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、および（ｉｉｉ）その核酸フラグメントに改変ヌクレオチドを組み込み得る、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体を提供する。
【００６４】
別の局面において、本発明は、（ｉ）少なくとも、Ｍ１９２Ｒ＋Ｌ２６０Ｐ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｒ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｌ２６０Ｐ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｍ１９２Ｑ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ３３６Ｎ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｒ４５４Ａ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｌ２６０Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｒ４５４Ａ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ３３６Ｌ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｄ３７９Ｖ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｒ４５４Ａ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ３３６Ｎ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ｐ、Ｄ３７９Ｖ＋Ｒ４５４Ａ、Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｄ３７９Ｖ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｌ、Ｒ４５４Ｐ＋Ｅ４５７Ｎ、Ｒ４５４Ａ＋Ｅ４５７ＬおよびＲ４５４Ａ＋Ｅ４５７Ｎから選択される置換の組み合わせ、または機能的に等価な残基（複数可）を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含み、ここでその位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる、（ｉｉ）テンプレートなしに核酸フラグメントを合成し得る、および（ｉｉｉ）その核酸フラグメントに改変ヌクレオチドを組み込み得る、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の改変体を提供する。
【００６５】
従って、本発明の目的は、表２に列挙され、「変動性の変異」として列挙される任意の置換もしくは置換の組み合わせ、または機能的に等価な残基（複数可）、および必要に応じて定常変異Ｌ１８１Ｆ＋Ａ２３７Ｖ＋Ｒ４８０Ｋ、Ｇ４１３Ｌ／Ｓ＋Ｈ４１６Ｄ＋Ｅ４１８Ａのうちの一方または両方の組み合わせ、もしくは機能的に等価な残基（複数可）を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を有するＴｄＴ改変体を提供することである。
【００６６】
特定の実施形態によれば、その改変体は、表２に列挙されるとおりの少なくとも１個の置換または置換の組み合わせ、および必要に応じて１個またはこれより多くのさらなる変異を含む。
【００６７】
【表２−１】
2021510074.tif 000018
【表２−２】
2021510074.tif 000019
【表２−３】
2021510074.tif 000020
【表２−４】
2021510074.tif 000021
【表２−５】
2021510074.tif 000022
【表２−６】
2021510074.tif 000023
【表２−７】
2021510074.tif 000024
【表２−８】
2021510074.tif 000025
【００６８】
本発明によれば、ＴｄＴの改変体は、上記で記載される置換または置換の組み合わせ、および配列番号１と少なくとも８０％  同一性もしくは機能的に等価な配列、好ましくは配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％  同一性または機能的に等価な配列を有する。
【００６９】
本発明によれば、上記で開示されるとおりのＴｄＴの全ての改変体は、テンプレートなしで核酸フラグメントを合成し得、かつ改変ヌクレオチドをその核酸フラグメントへと組み込み得る。有利なことには、上記改変体は、配列番号１または配列番号２のＴｄＴと比較して、改変ヌクレオチド、好ましくは３’Ｏ−改変ヌクレオチドを、核酸フラグメントに組み込む増大した能力を有する。
【００７０】
上記の実施形態のうちのいくつかにおいて、３’Ｏ−改変ヌクレオシド三リン酸を組み込むことにおける改変体ＴｄＴの効率は、配列番号１の配列の野生型ＴｄＴの効率の少なくとも１１０％であり；他の実施形態においては、３’Ｏ−改変ヌクレオシド三リン酸を組み込むことにおける改変体ＴｄＴの効率は、配列番号１の配列の野生型ＴｄＴの効率の少なくとも１５０％である；他の実施形態においては、３’Ｏ−改変ヌクレオシド三リン酸を組み込むことにおける改変体ＴｄＴの効率は、配列番号１の配列の野生型ＴｄＴの効率の少なくとも少なくとも２００％である。
【００７１】
さらなる改変
１つの実施形態において、ＴｄＴの改変体は、そのＮ末端、Ｃ末端または両方の末端に任意のタイプのタグ化ペプチド（例えば、Ｈｉｓ−タグ配列）をさらに含む。上記タグ化ペプチドは、精製、同定、発現の増大、分泌性または触媒活性の増大のために使用され得る。このような種々のタグが、文献中に広範に記載され、従って、当業者に公知の全てのタグが、本発明によって網羅されることは、理解される。
【００７２】
本発明の改変体はまた、例えば、組換えポリメラーゼの精製における使用のための、そのタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端領域において１またはこれより多くの外因性もしくは異種の特徴を含み得る。
【００７３】
本発明の改変体は、配列番号３のＰｏｌμポリメラーゼ配列の残基Ｈ３６３〜Ｃ３９０（ここでその位置は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けられる）または機能的に等価な残基による、Ｃ３７８位〜Ｌ４０６位の間の残基（ここでその位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照することによって番号付けされる）または機能的に等価な残基の置換をさらに含み得る。
【００７４】
有利なことには、ＴｄＴの改変体は、その開示された置換（複数可）を有する、少なくとも、配列番号２のアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含む。特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、その開示された置換（複数可）を有する、配列番号２のアミノ酸配列（または機能的に等価な配列）のみで構成される。別の特定の実施形態において、ＴｄＴの改変体は、配列番号２においてその開示された置換（複数可）を有する、少なくとも、配列番号１のアミノ酸配列または機能的に等価な配列を含む。好ましくは、その改変体は、配列番号１の残基１〜１３０に相当するＢＲＴＣ様ドメインのうちの全てまたは一部を除いて、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または機能的に等価な配列を有する。
【００７５】
改変ヌクレオチド
本発明によれば、ＴｄＴの改変体は、改変ヌクレオチド、好ましくは改変３’Ｏ−ヌクレオチドおよびより好ましくは３’Ｏ−ブロックヌクレオチドを組み込み得る。
【００７６】
本発明の状況において、表現「改変ヌクレオチド」とは、その末端のうちの１つ：２’、３’、５’または塩基に少なくとも１個のさらなる基を有する３個のリン酸基に結合したヌクレオシド（すなわち、デオキシリボースまたはリボース糖分子に結合した塩基）を含む分子をいう。上記さらなる基は、いかなるホスホジエステル結合（３’Ｏ−改変、２’または２’Ｏ改変）の形成をも防止することによって、またはそのポリメラーゼが、その３’末端上でこのような改変ヌクレオチド（５’または塩基改変）を含む任意の核酸フラグメントに結合することを立体的に防止することによって、ヌクレオチドのさらなる付加をブロックする。さらには、上記さらなる基は、有利なことには、その基が特異的切断反応を通じて除去されることを可能にする可逆的性質を有する。
【００７７】
ヌクレオシドまたはヌクレオチド三リン酸としては、デオキシリボースを含むヌクレオチドの例については、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）またはデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）が挙げられる。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）またはウリジン三リン酸（ＵＴＰ）は、リボースを含むヌクレオチド三リン酸のさらなる例である。ヌクレオシドの他のタイプは、ヌクレオチド三リン酸を形成するために３個のリン酸に結合され得る（例えば、天然に存在する改変ヌクレオシドおよび人工ヌクレオシド）。
【００７８】
特定の実施形態において、その改変ヌクレオチドは、３’Ｏ−ブロックヌクレオチドであり、これは、さらなるヌクレオチド付加を防止するために、そのヌクレオチド三リン酸の３’末端に可逆的に結合した基を含む。上記基は、多様な化学的性質を有し得る（例えば、アジドメチル、アミノキシ、およびアリル）。
【００７９】
いくつかの実施形態において、その改変ヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基およびそこに共有結合した除去可能な３’−ＯＨブロッキング基を有するリボースまたはデオキシリボース糖部分を含む改変ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含み、その結果、その３’炭素原子は、以下の構造の基：
−Ｏ−Ｚ
を結合しており、
ここで−Ｚは、−Ｃ（Ｒ’）２−O−Ｒ”、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ”）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ”、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ”および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのうちのいずれかであり、ここで各Ｒ”は、除去可能な保護基であるか、その保護基の一部であり；各Ｒ’は独立して、ｉｓ  水素原子、アルキル、置換されたアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または連結基を通じて結合された検出可能な標識であり；ただし、いくつかの実施形態において、このような置換基は、１０個までの炭素原子および／または５個までの酸素もしくは窒素ヘテロ原子を有するか；または（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ”’）２のアルキリデン基を表し、ここで各Ｒ”’は、同じであっても異なっていてもよく、水素およびハロゲン原子を含む基ならびにアルキル基から選択されるが、ただしいくつかの実施形態において、各Ｒ’”のアルキルは、１〜３個の炭素原子を有し；ここでその分子が反応して、各Ｒ”がＨに交換される中間体を生じ得るか、あるいはＺは、−（Ｒ’）２−Ｆであり、そのＦは、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２、好ましくはＯＨに交換され、その中間体は、水性条件下で解離して、遊離３’−ＯＨを有する分子を生じる；ただしここでＺは、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ”であり、両方のＲ’基は、Ｈではない。ある種の実施形態において、その改変ヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換されたアルキルであるが、ただしこのようなアルキルまたは置換されたアルキルは、１〜１０個の炭素原子および０〜４個の酸素または窒素ヘテロ原子を有する。ある種の実施形態において、その改変ヌクレオチドまたはヌクレオシドの−Ｚは、式−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ３のものである。ある種の実施形態において、Ｚは、アジドメチル基である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、Ｚは、２００またはこれより小さい分子量を有するヘテロ原子ありまたはなしの切断可能な有機部分である。他の実施形態において、Ｚは、１００またはこれより小さい分子量を有するヘテロ原子ありまたはなしの切断可能な有機部分である。他の実施形態において、Ｚは、５０またはこれより小さい分子量を有するヘテロ原子ありまたはなしの切断可能な有機部分である。
【００８１】
さらに特定の実施形態において、「３’Ｏ改変ヌクレオチド」とは、３’末端に３’−Ｏ−メチル、３’−アジド、３’−Ｏ−アジドメチル、３’−Ｏ−アミノ、３’−アミノキシまたは３’−Ｏ−アリル基のいずれかを有するヌクレオチド三リン酸を指す。さらなる実施形態において、その３’−ブロックヌクレオチド三リン酸は、３’−Ｏ−アジドメチル、３’−アミノキシまたは３’−Ｏ−アリル基のいずれかによってブロックされる。他の実施形態において、「３’Ｏ改変ヌクレオチド」とは、３’末端にエステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ヒドロキシルアミン、ボレート、ニトレート、糖、ホスホルアミド、ホスホルアミデート、フェニルスルホネート（ｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｅｎａｔｅ）、スルフェート、スルホンまたはアミノ酸のいずれかを有するヌクレオチド三リン酸を指す。いくつかの実施形態において、前述の３’−Ｏ−ブロッキング基は、１００またはこれより小さい分子量を有する。
【００８２】
なお他の実施形態において、本発明の３’−Ｏ−ブロッキング基は、メチル、３’−Ｏ−（２−ニトロベンジル）、アリル、アミン、アジドメチル、ｔｅｒｔ−ブトキシエトキシ、またはプロパルギルを含む。
【００８３】
さらに特定の実施形態において、「３’Ｏ改変ヌクレオチド」とは、ＷＯ２０１６０３４８０７に記載されるもののようなターミネーターエフェクター改変基を有するヌクレオチド三リン酸を指す。
【００８４】
興味深いことに、本発明の改変体は、野生型ＴｄＴと比較した場合、改変ヌクレオチドに対して増大した親和性、およびそれによって、このような改変ヌクレオチドを、核酸合成の間に核酸配列の中に組み込む増大した能力を示す。より詳細には、本発明の改変体は、改変３’Ｏ−ヌクレオチド（およびより詳細には、３’Ｏ−ブロックヌクレオチド）を使用し、核酸配列の中に組み込むことができる。このことは、野生型ＴｄＴでは不可能である（Ｋｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．，  ２０１１，  １７：２９０３を参照のこと）。
【００８５】
特定の局面によれば、本発明は、核酸の酵素による合成プロセスにおいて改変ヌクレオチドで、特に、３’Ｏ−改変ヌクレオチド（例えば、３’Ｏ−ブロックヌクレオチド）で機能し得、長い核酸分子または核酸分子の誘導体を生成する能力を有するＴｄＴの改変体に関する。
【００８６】
核酸の酵素による合成
本発明の目的は、Ｙｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，  ＷＯ２０１５／１５９０２３；  Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５７：  １８２１−１８３２  （２０１８）；  Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ，  米国特許第５８０８０４５号に記載されるような、核酸の合成のために使用され得るＴｄＴの改変体を提供することである。より詳細には、本発明の目的は、改変ヌクレオチドを開始核酸鎖に付加するために適したＴｄＴの改変体を提供することである。次いで、そのブロッキング基は、改変ヌクレオチドの新たな付加を可能にするために除去され得る。
【００８７】
本発明によれば、本発明の改変体を使用することによって、付加および脱保護を含む連続サイクルを実行することが可能である。このプロセスは、従って、可逆的改変ヌクレオチドの付加およびそのブロッキング基のさらなる除去の多数のサイクルによって、開始核酸鎖の、規定された配列への制御された伸長を可能にする。
【００８８】
本発明は、任意の酵素による核酸合成プロセスにおいて、本発明に従う改変ＴｄＴの使用を企図する。
【００８９】
また、本発明の目的は、テンプレートなしで核酸分子を合成するためのプロセスであって、核酸プライマーと、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１個の３’Ｏ−改変ヌクレオチド、および本発明の改変体の両方とを接触させる工程を包含するプロセスを提供することである。
【００９０】
本発明は、酵素による核酸合成プロセスの概念を企図する。このようなプロセスにおいて、核酸分子は、いかなるテンプレート鎖の非存在下でも、デノボ合成される。よって、ヌクレオチドの規則正しい配列は、本発明の改変体の助けを借りて、開始核酸フラグメントにカップリングされる。定量的カップリングおよびより一般には、成長している核酸鎖への各ヌクレオチドの高カップリング効率は、非常に重要であることは、理解される。非ターミネーターヌクレオチド（例えば、天然のヌクレオチドまたは永久的に標識されたヌクレオチド）が、その合成された配列に対するいかなる制御をも許容せず、例えば、制御されないおよび望ましくないポリ付加を生じることはまた、理解される。
【００９１】
特定の実施形態によれば、その酵素による核酸合成プロセスは、
ａ．固体支持体に連結された核酸分子を提供する工程；
ｂ．以前の核酸分子と、可逆的ターミネーター改変ヌクレオチドおよび本発明に従うＴｄＴの改変体とを反応させる工程；
を包含する。
【００９２】
別の特定の実施形態によれば、その酵素による核酸プロセスは、
ａ．固体支持体に連結された核酸分子を提供する工程；
ｂ．可逆的改変ヌクレオチドおよび本発明に従うＴｄＴの改変体を添加する工程；
ｃ．その固体支持体からの１またはいくつかの試薬の第１の除去工程；
ｄ．その可逆的改変ヌクレオチドの可逆的部分を、さらなるその後の伸長のために、その可逆的部分を脱保護するために反応させる工程；
ｅ．その固体支持体からの１またはいくつかの試薬の第２の除去工程；
ｆ．必要に応じておよび最後に、その核酸分子をその固体支持体から切断する工程、
を包含する。
【００９３】
別の特定の実施形態によれば、その酵素による核酸プロセスは、以下の方法において細分されたサイクル：
ａ．  上記フラグメントの一方の末端へＸｉヌクレオチドを伸長させる段階であって、Ｘは、１〜５の間、好ましくは１〜３の間であることが可能であり、ｉは、そのサイクル数であり、ｎ＋Ｘｉのヌクレオチドを含むフラグメントを得ることを可能にし（第１段階として公知）であり、以下のステージを含む段階：
−  第１の支持体に、開始核酸フラグメントまたは伸長の過程にある核酸フラグメント（ｎ個のヌクレオチドを含む）の第１の末端を結合させる第１のステージ、
−  ＴｄＴの改変体に必要な試薬を添加するステージ、
−  ＴｄＴの改変体が上記核酸フラグメントの第２の末端にＸｉヌクレオチドを付加するステージであって、Ｘは、１〜５の間、好ましくは１〜３の間であり、ｉは、そのサイクル数であるステージ、
−  その反応媒体から望ましくない試薬を除去する必要に応じたステージ、
−  上記第１の支持体から、ｎ＋Ｘｉヌクレオチドを含む上記フラグメントを解離させるステージ、
−  ｎ＋Ｘｉヌクレオチドを含む上記フラグメントを移動させる第１のステージ、
ｂ．  ｎ＋Ｘｉヌクレオチドを含む正確な配列を有するフラグメントを精製する段階（第２段階として公知）であって、以下の連続するステージを含む段階：
−  第２の支持体に、ｎ＋Ｘｉヌクレオチドを含む上記フラグメントを、その第１段階の間に付加されたＸｉヌクレオチドを有するそれらの末端によって結合させる第２のステージ、
−  その第２の支持体に結合していなかったフラグメントを除去するステージ、
−  ｎ＋Ｘｉヌクレオチドを含む上記フラグメントを上記第２の支持体から解離させるステージ、
−  上記反応媒体から、望ましくない残留試薬を除去する必要に応じたステージ；
ｃ．  ｎ＋Ｘｉヌクレオチドを含む正確な配列を有するフラグメントを増幅する、好ましくは酵素により増幅する（例えば、ＰＣＲによって）必要に応じた段階（第３段階として公知）であって、以下の連続するステージを含む段階：
−  増幅に必要な試薬を添加するステージ、
−  ｎ＋Ｘｉヌクレオチドを含むフラグメントの乗算係数（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）Ｙｉによる乗算のステージ（必要に応じて、そのプロセスを可能にするサブステージから構成される）であって、ｉは、サイクル数であり、Ｙは１〜４×１０１０の間、好ましくは１〜１×１０９の間であることが可能であるステージ、
−  ｎ＋Ｘｉヌクレオチドを含むフラグメントを移動させるステージ、
を含み、各サイクルは、酵素による付加および酵素による増幅と適合性の反応媒体（例えば、水性媒体）中で行われ、その合成プロセスはまた、そのｉ回の伸長サイクルの全ての最後に、乗算係数Ｙｆによる、最終増幅するステージを含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）遊離３’−ヒドロキシルを有する開始フラグメントを提供する工程；（ｂ）その開始フラグメントまたは遊離３’−ヒドロキシルを有する伸長中間体を、本発明の改変体ＴｄＴと、３’−Ｏ−ブロックヌクレオシド三リン酸の存在下で、伸長条件下で反応させて、３’−Ｏ−ブロック伸長中間体を生成する工程；（ｃ）その伸長中間体を脱ブロックして、遊離３’−ヒドロキシルを有する伸長中間体を生成する工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を、そのポリヌクレオチドが合成されるまで反復する工程を包含する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）固体支持体に結合した開始フラグメントを提供する工程であって、そのイニシエーター（ｉｎｉａｔｏｒ）は、遊離３’−ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドである工程；（ｂ）その開始フラグメントまたは遊離３’−ヒドロキシルを有する伸長中間体と、本発明の改変体ＴｄＴとを、３’−Ｏ−ブロックヌクレオシド三リン酸の存在下で、伸長条件下で反応させて、３’−Ｏ−ブロック伸長中間体を生成する工程；（ｃ）その固体支持体を洗浄して、組み込まれていない３’−Ｏ−ブロックヌクレオシド三リン酸を除去する工程；（ｄ）その固体支持体を脱ブロック剤に曝すことによってその伸長中間体を脱ブロックして、遊離３’−ヒドロキシルを有する伸長中間体を生成する工程；ならびに（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）を、そのポリヌクレオチドが合成されるまで反復する工程を包含する。その方法は、その完成したポリヌクレオチドをその固体支持体から切断するさらなる工程を包含し得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、工程（ｂ）のＴｄＴ触媒付加反応に関しては、酵素条件は、３’−ヒドロキシルを保護する除去可能なブロッキング部分を有する約０．２０〜約２００μＭのヌクレオチドおよびその開始基質に由来する遊離かつ改変されていない約０．２０〜２００μＭの３’−ヒドロキシルを含み得る。いくつかの実施形態において、その反応緩衝液は、約１０〜約５００ｍＭ  カコジル酸カリウム緩衝液（６．５〜７．５の間のｐＨ）、および約０．０１〜約１０ｍＭの二価カチオン（例えば、ＣｏＣｌ２またはＭｎＣｌ２）を含む。他の緩衝液組成および構成要素は、本発明の特定の望ましい実施形態に適切であり得る。
【００９７】
本発明の状況において、表現「切断反応（ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）」とは、可逆的改変ヌクレオチドに対して先に記載されるさらなる基を切断し得る、物質の任意の作用または物理的条件を指す。当業者は、任意の先に列挙した基のための切断反応を決定し得る。
【００９８】
一実施形態において、その切断剤は、化学的切断剤である。代替の実施形態において、その切断剤は、酵素切断剤である。
【００９９】
切断剤の選択が、使用される３’−ヌクレオチドブロッキング基のタイプに依存することは、当業者によって理解される。例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、３’Ｏ−アジドメチル基を切断するために使用され得るか、パラジウム錯体は、３’Ｏ−アリル基を切断するために使用され得るか、または亜硝酸ナトリウムは、３’Ｏ−アミノ基を切断するために使用され得る。特定の実施形態において、その切断反応は、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体または亜硝酸ナトリウムが関わる。
【０１００】
特定の実施形態において、その切断反応は、さらなる構成要素（例えば、変性剤（例えば、尿素、塩化グアニジウム、ホルムアミドまたはベタイン））の存在下で行われる。さらなる実施形態において、その切断反応は、１種またはこれより多くの緩衝液を用いて行われる。緩衝液の選択が、その正確な反応機構に依存することは、当業者によって理解される。
【０１０１】
本発明は、定量的様式で、改変ヌクレオチドを組み込む能力を有するＴｄＴの改変体に関する。「定量的様式（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｗａｙ）」または「定量的反応」とは、完了に至る反応（すなわち、この場合、反応物は、生成物に完全に変換される）を意味する。定量的様式で可逆的改変ヌクレオチドを組み込むポリメラーゼは、利用可能なヌクレオチド全てを用いて核酸のあらゆるフラグメントを伸長することができ、長さｎの開始フラグメントの全てを長さｎ＋１のフラグメントへの変換をもたらすポリメラーゼである。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「開始フラグメント（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、遊離３’末端を有する短い、さらに伸長され得るオリゴヌクレオチド配列を指す。一実施形態において、その開始フラグメントは、ＤＮＡ開始フラグメントである。代替の実施形態において、その開始フラグメントは、ＲＮＡ開始フラグメントである。
【０１０３】
一実施形態において、その開始フラグメントは、３〜１００個の間、特に、３〜２０個の間のヌクレオチドを有する。
【０１０４】
一実施形態において、その開始フラグメントは１本鎖である。代替の実施形態において、その開始フラグメントは２本鎖である。
【０１０５】
一実施形態において、その開始フラグメントは、固体支持体に固定される。その開始フラグメントは、固体支持体に種々の方法で結合され得、そのフラグメントが受ける種々の酵素反応または合成反応の条件下で安定をもたらす。
【０１０６】
一実施形態において、その開始フラグメントは、可逆的相互作用部分（例えば、化学的に切断可能なリンカー）、抗体／免疫原性エピトープ、ビオチン／ビオチン結合タンパク質またはグルタチオン−ＧＳＴタグを介して、固体支持体に固定される。さらなる実施形態において、その開始フラグメントは、化学的に切断可能なリンカー（例えば、ジスルフィド、アリル、またはアジドでマスクされたヘミアミナールエーテルリンカー）を介して固体支持体に固定される。
【０１０７】
開始フラグメントにおいて、その固定された部分は、少なくとも１個の制限部位を含む。制限酵素および制限部位を使用して、特異的部位で核酸鎖を選択的に加水分解することは、文献中で記載されている。いずれの当業者も、開始フラグメント切断部位配列にマッチする適切な制限酵素を選択し得る。
【０１０８】
代替の実施形態において、その開始フラグメントは、少なくとも１個のウリジンを含む。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）での処理は、無塩基部位を生成する。無プリン／無ピリミジン（ＡＰ）部位エンドヌクレアーゼでの適切な基質に対する処理により、核酸鎖が得られる。
【０１０９】
核酸分子
また、本発明の目的は、本発明の改変体をコードする核酸分子を提供することである。本明細書で使用される場合、「核酸分子」とは、ヌクレオシドのポリマーを指す。一実施形態において、その核酸はＤＮＡである。代替の実施形態において、その核酸はＲＮＡである。代替の実施形態において、その核酸はＸＮＡである。
【０１１０】
先に列挙した核酸分子の各々が、ポリマー分子を構成するヌクレオチドの塩基上に改変を有し得ることは、当業者によって理解される。このような改変は、天然の改変（例えば、エピジェネティック改変）または天然でない改変（例えば、標識）であり得る。
【０１１１】
一実施形態において、核酸分子は、天然に存在するエピジェネティック改変（例えば、メチル化、ヒドロキシメチル化、ホルミル化または５−カルボキシル化）を有する、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＸＮＡである。
【０１１２】
一実施形態において、核酸分子は、天然に存在しない改変（例えば、蛍光タグ、蛍光標識、相互作用基）を有する、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＸＮＡである。
【０１１３】
一実施形態において、核酸分子は、以下より大きい長さを有するポリマー分子である：５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、６０００ヌクレオチド、７０００ヌクレオチド、８０００ヌクレオチド、９０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、２００００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、５００００ヌクレオチド、または１０００００ヌクレオチド。
【０１１４】
適用
核酸合成、オリゴヌクレオチド合成、プローブ合成、タグ化、核酸増幅、アプタマー、治療用核酸分子、創薬ターゲットおよび検証、疾患診断、代謝工学、データ格納、収穫物改良、ライブラリーデザイン、シーケンシングプール、核酸標識もしくは結合、または核酸分子が関わる任意の他の適用のために使用されるべきＴｄＴの改変体の使用が、本明細書で記載される。
【０１１５】
改変体ＴｄＴの生成
本発明の改変体は、公知の対照標準すなわち野生型ＴｄＴをコードするポリヌクレオチドを変異させ、次いで、これを従来の分子生物学技術を使用して発現させることによって、生成され得る。例えば、マウスＴｄＴ遺伝子（配列番号１）は、従来の分子生物学技術を使用して、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ，  １６４：  ４９−５３  （１９９５）；  Ｋｏｄｕｍａｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １０１：  １５５７３−１５５７８  （２００４）などによって記載されるプロトコールを使用して、合成フラグメントからアセンブリされ得るか、またはそれは、Ｂｏｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：  １９９−２０８  （１９９８）、もしくはＢｅｎｔｏｌｉｌａ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １４：  ４２２１−４２２９  （１９９５）などによって記載されるプロトコールを使用して、マウス細胞から直接クローニングされ得る。
【０１１６】
例えば、単離されたＴｄＴ遺伝子は、発現ベクター（例えば、ｐＥＴ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ））へと挿入されて、ベクターｐＣＴｄＴを与え得、このベクターは次いで、改変体ＴｄＴタンパク質を従来のプロトコールを使用して作製および発現するために使用され得る。正確な配列を有するベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉプロデューサー株において形質転換され得る。
【０１１７】
形質転換された株は、従来の技術を使用して培養されて、ペレットを形成し、そのペレットから、ＴｄＴタンパク質が抽出される。例えば、以前に調製したペレットを３０〜３７℃のウォーターバスの中で解凍する。いったん完全に解凍すると、ペレットを、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ  メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５％  グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼカクテルインヒビターの１００ｍＬのための１錠（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）から構成される溶解緩衝液中に再懸濁する。早過ぎる溶解および凝集物の残留を回避するために、再懸濁を注意深く行う。再懸濁した細胞を、完全な色の均一性が得られるまで数サイクルのフレンチプレスによって溶解する。使用される通常の圧力は、１４，０００ｐｓｉである。次いで、溶解物を１時間〜１時間３０分、１０，０００ｒｐｍにおいて遠心分離する。遠心分離物（centrifugate）を、０．２μｍフィルタに通して、カラム精製の前にいかなるデブリをも除去する。
【０１１８】
ＴｄＴタンパク質を、その遠心分離物から１工程アフィニティ手順で精製し得る。例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、そのポリメラーゼを結合させる。最初に、そのカラムを１５カラム容積の５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭ  イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で洗浄および平衡化している。平衡化した後に、ポリメラーゼをそのカラムに結合させる。次いで、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭ  イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）から構成される）を、１５カラム容積にわたってそのカラムに適用する。洗浄後、そのポリメラーゼを、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および０．５Ｍ  イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で溶離する。目的のポリメラーゼの最高濃度に相当する画分を集め、１つのサンプルにプールする。そのプールした画分を、透析緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、１００ｍＭ  ［ＮＨ４］２ＳＯ４）に対して透析する。その透析物を、その後、濃縮フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−３０，  Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の助けを借りて濃縮する。濃縮した酵素を、最終５０％  グリセロールを添加した小さなアリコートで分配し、次いで、それらアリコートを−２０℃で凍結し、長期間貯蔵した。その精製した酵素の５μＬの種々の画分を、ＳＤＳＰＡＧＥゲルで分析する。
【０１１９】
キット、酵素およびヌクレオチド組成物
本発明の特定の局面は、必要に応じて、開始フラグメント、１種またはこれより多くの可逆的ターミネーターヌクレオチド、さらなる酵素および切断反応において使用される試薬から選択される１種またはこれより多くの構成要素の任意の組み合わせとともに、本発明にまたは本発明の任意の特定の局面に従うＴｄＴの改変体を含む組成物およびＴｄＴの改変体を含むキットの使用に関する。上記キットは、酵素による核酸合成の方法において使用され得る。
【０１２０】
本発明は、適切な緩衝液および比率濃度（ｒａｔｉｏ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を有する混合物中の可逆的改変ヌクレオチドとともに、本発明にまたは本発明の任意の特定の局面に従うＴｄＴの改変体を含む組成物（composition  of  matter）を網羅する。
【実施例】
【０１２１】
実施例１  −  本発明に従うＴｄＴの改変体の生成、発現および精製
発現株生成
ＴｄＴマウス遺伝子を、［Ｂｏｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０，  １９９−２０８］に記載されるｐＥＴ２８プラスミドから生成した。配列番号４の配列（Ｔａｇ  ＴｄＴ）を、標準的な分子生物学技術を通じて、以下のプライマーを使用することによって増幅した：
【化１】
2021510074.tif 000026
次いで、その配列をプラスミドｐＥＴ３２骨格へとクローニングして、新たなｐＣＴｄＴプラスミドを得た。
【０１２２】
配列決定の後に、ｐＣＴｄＴを、市販のＥ．ｃｏｌｉ細胞ＢＬ２１（ＤＥ３，  Ｎｏｖａｇｅｎから）に形質転換した。カナマイシンを含むプレート上で成長しているコロニーを単離し、Ｅｃ−ＣＴｄＴと称した。
【０１２３】
ポリメラーゼ改変体生成
そのｐＣＴｄＴベクターを、出発ベクターとして使用する。１またはいくつかの点変異を含む特異的プライマーを、Ａｇｉｌｅｎｔオンラインソフトウェアから生成した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ：８０／ｐｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎＰｒｏｇｒａｍ．ｊｓｐ）。市販のキットＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、標的とした変異を含む所望の改変ポリメラーゼを生成した。実験手順は、供給者のプロトコールに従った。そのＤＳｉまたはＤＳｉ’改変体をコードする得られたプラスミドを、ｐＤＳｉまたはｐＤＳｉ’と称する（ここでｉは、表１または表２に示される改変体の番号である）。その異なるｐＤＳｉまたはｐＤＳｉ’ベクターの生成後に、それらの各々を配列決定した。正確な配列を有するベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉプロデューサー株（先に記載されるとおり）において形質転換した。カナマイシンＬＢ−アガープレート上で成長し得るコロニーを単離し、Ｅｃ−ＤＳｉまたはＥｃ−ＤＳｉ’と称する。
【０１２４】
発現
Ｅｃ−ＣＴｄＴおよびＥｃ−ＤＳｉまたはＥｃ−ＤＳｉ’株を使用して、適切な量のカナマイシンを補充した５０ｍＬのＬＢ培地を含む２５０ｍＬ  フラスコ（erlen）に接種した。３７℃で一晩成長させた後、適切な容積のこれら前培養物を使用して、カナマイシンを有する２Ｌ  ＬＢ培地を含む５Ｌ  フラスコに接種した。その５Ｌ培養物の初期ＯＤは、０．０１であるように選択する。そのフラスコを強力な撹拌下で３７℃に置き、その異なる培養物のＯＤを、定期的にチェックする。０．６〜０．９の間で構成されるＯＤに達した後に、各フラスコに、１ｍＬの１Ｍ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド，  Ｓｉｇｍａ）を添加することによって補充する。そのフラスコを、撹拌へと戻して３７℃の制御された温度の下に置く。一晩の発現後に、その細胞を、いくつかのペレットで採取する。その同じ改変体を発現するペレットをプールし、−２０℃で、最終的には数カ月間貯蔵する。
【０１２５】
抽出
以前に調製したペレットを、３０〜３７℃  ウォーターバス中で解凍する。いったん完全に解凍すると、ペレットを、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ  メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５％  グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼカクテルインヒビターの１００ｍＬのための１錠（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）から構成される溶解緩衝液中に再懸濁する。早過ぎる溶解および凝集物の残留を回避するために、再懸濁を注意深く行う。再懸濁した細胞を、完全な色の均一性が得られるまで数サイクルのフレンチプレスによって溶解する。使用される通常の圧力は、１４，０００ｐｓｉである。次いで、溶解物を１時間〜１時間３０分、１０，０００ｒｐｍにおいて遠心分離する。遠心分離物を、０．２μｍフィルタに通して、カラム精製の前にいかなるデブリをも除去する。
【０１２６】
精製
１工程アフィニティ手順を使用して、その生成し、抽出したポリメラーゼ酵素を精製する。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、そのポリメラーゼを結合させる。最初に、そのカラムを１５カラム容積の５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭ  イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で洗浄および平衡化している。平衡化した後に、ポリメラーゼをそのカラムに結合させる。次いで、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭ  イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）から構成される）を、１５カラム容積にわたってそのカラムに適用する。洗浄後、そのポリメラーゼを、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および０．５Ｍ  イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で溶離する。目的のポリメラーゼの最高濃度に相当する画分を集め、１つのサンプルにプールする。そのプールした画分を、透析緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ６．８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、１００ｍＭ  ［ＮＨ４］２ＳＯ４）に対して透析する。その透析物を、その後、濃縮フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−３０，  Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の助けを借りて濃縮する。濃縮した酵素を、最終５０％  グリセロールを添加した小さなアリコートで分配し、次いで、それらアリコートを−２０℃で凍結し、長期間貯蔵する。その精製した酵素の５μＬの種々の画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析する。
【０１２７】
結果を図１に示す。ゲルは、各ＴｄＴ（改変体および野生型の両方）に関して、カラム素通り（ＦＴ）および種々の画分Ｆ１〜Ｆ４（その溶離ピークに相当）を示す。分子量マーカー（Ｍ）もまた、そのゲルに載せた。図１は、本発明に従うＴｄＴの改変体は、ＴｄＴ野生型と比較して、高純度レベル（約９０％）および良好な発現を表すことを示す（カラムＦ２および／またはＦ３を参照のこと）。
【０１２８】
実施例２  −  蛍光プライマーでのＴｄＴの改変体の活性の評価
活性試験
実施例１に従って生成、発現および精製した表１からの改変体ＤＳ１１、ＤＳ２９、ＤＳ１７３、ＤＳ６５９、ＤＳ８７４の伸長成績を、以下のアッセイによって評価する。その結果は全て、互いとおよびその野生型ＴｄＴ酵素（配列番号１）とおよびいかなるポリメラーゼ酵素をも欠くコントロールチューブと比較する。
【０１２９】
【表３】
2021510074.tif 000027
【０１３０】
その活性緩衝液は、例えば、ＣｏＣｌ２を補充したＴｄＴ反応緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）を含む。使用したプライマーは、以下のとおりである：
【化２】
2021510074.tif 000028
【０１３１】
そのプライマーはまた、ＡＴＴＯ蛍光色素をその５’末端に有する。
【０１３２】
使用したヌクレオチド（表３においてｄＮＴＰとして注記される）は、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−トリホスフェート（ＯＮＨ２，  Ｆｉｒｅｂｉｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（例えば、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェートのような）である。
【０１３３】
試験した各種々の改変体につき、１本のチューブを反応に使用する。その試薬を、水から始めて、次いで、表３の順序でそのチューブに添加する。３７℃で３０分後、反応を、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって停止させる。
【０１３４】
分析
その分析は、ポリアクリルアミドゲル分析が関わっている。活性試験からのサンプルを、ポリアクリルアミド  １６％（ｂｉｏｒａｄ）変性ゲルによって分析する。ゲルを、ガラスプレートの内部にポリアクリルアミドを注ぎ、それを重合させることによって、その分析直前に作製する。そのガラスプレート内部のゲルを、電気泳動工程のためにＴＢＥ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を満たした適合するタンクに取り付ける。その分析されるべきサンプルを、そのゲルの頂部に載せる。５００〜２，０００Ｖの電圧を、そのゲルの頂部と底部との間に、３〜６時間室温において印加する。そのサンプル標的サイズに従って一旦移動したら、システムを取り外し、ゲル蛍光を、Ｔｙｐｈｏｏｎ機器（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してスキャンする。画像獲得の後に、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して、その改変ヌクレオチドの組み込みのパーセンテージを分析する。
【０１３５】
結果を図２に示す。ｘ軸上の各改変体に関して、伸長パーセンテージを、そのゲルに載せたＤＮＡの全量に対して、予測される伸長生成物の量として評価した。各実験を、三連で行った。そのバーの高さ（ｙ軸）は、それらの３回の実験の平均値に相当する。本発明に従う改変体は全て、そのｗｔ酵素と比較して、１０倍より高い活性の増大を示す。このことから、これら改変体で核酸合成技術を開発する可能性が確認される。
【０１３６】
実施例３  −  非標識プライマーでのＴｄＴの改変体の活性の評価
活性試験
実施例１に従って生成、発現および精製した表２からの改変体ＤＳ９２８およびＤＳ９５０の伸長成績を、以下のアッセイによって評価した。その結果は全て、以前の研究から得た参照改変体（配列番号９）とおよびいかなるポリメラーゼ酵素をも欠くコントロールチューブと比較した。
【０１３７】
【表４】
2021510074.tif 000029
【０１３８】
使用したプライマーは、以下である：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号８）。
【０１３９】
使用したヌクレオチド（表４においてｄＮＴＰとして注記される）は、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−トリホスフェート（ＯＮＨ２，  Ｆｉｒｅｂｉｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（例えば、３’−Ｏ−アミノ−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−トリホスフェートのような）であった。
【０１４０】
試験した各改変体につき、１本のチューブを反応に使用した。試薬を水から始めて、次いで、表４の順序でそのチューブに添加した。３７℃で３０分後、反応を、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって停止させた。
【０１４１】
分析
分析には、液体クロマトグラフィーおよび質量分析計検出および定量（ＬＣ／ＭＳ）を使用した。活性試験からのサンプルを、ＬＣ／ＭＳによって分析した。サンプルを、そのＬＣ／ＭＳ機器に載せ、標準的なオリゴヌクレオチド分離法を行った。データの獲得に続いて、デコンボリューションおよびスペクトル計算を行った。
【０１４２】
結果を図３に示す。そのスペクトルは、それぞれ、改変体ＤＳ９２８、ＤＳ９５０および対照標準の伸長分析に相当する。初期プライマー質量は、およそ６１１４であり、予測される伸長生成物質量は、およそ６４４７である（矢印で強調される）。シグナル強度（すなわち、そのピークの高さ）は、物質の量と直接的に相関し得る。改変体ＤＳ９２８、ＤＳ９５０の両方が、参照改変体と比較した場合に、出発プライマーの伸長において有意な改善を示す。これらの結果は、本発明に従う新たな改変体が、先行技術のＴｄＴを超える明白な改善をもたらすことを確認する。
【図１】
2021510074.tif 000030
【図２】
2021510074.tif 000031
【図３】
2021510074.tif 000032
【配列表】
2021510074000001.app
【国際調査報告】
2021510074.tif 000033
2021510074.tif 000034
2021510074.tif 000035