(57)【要約】  本発明は組換え微生物、その製造方法及び補酵素Ｑ１０の生産における使用に関する。具体的には、本発明はグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を外因的に導入することによって、発酵法による補酵素Ｑ１０の生産、特に酸化型補酵素Ｑ１０の生産に適する組換え微生物を構築する方法を提供する。本発明の組換え微生物はストレスに強く、高浸透圧及び高酸化還元電位を含む過酷な環境に対する耐性に優れるため、補酵素Ｑ１０、特に酸化型補酵素Ｑ１０の収量を大幅に増やすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含む親菌株から、クローニングにより、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を取得する工程と、
ｂ．前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子をベクターに連結し、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築する工程と、
ｃ．前記組換えベクターを宿主細胞に導入することで、組換え微生物を得る工程と、
を含むことを特徴とする、組換え微生物の製造方法。
【請求項２】
前記工程ｂは、プロモーター入れ替えにより、前記組換えベクター上の前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターをノックアウトした後、異なる別のプロモーターを挿入し、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現をさらに調節することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物の製造方法。
【請求項３】
前記工程ｂにおいて、挿入するプロモーターは誘導型プロモーターであり、好ましくは浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢであり、
前記浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも７０個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５０個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列、最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の完全なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド配列から得られたものであり、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、好ましくは前記浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組換え微生物の製造方法。
【請求項４】
前記浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢは、細菌、好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、より好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から分離されたものであることを特徴とする、請求項３に記載の組換え微生物の製造方法。
【請求項５】
前記工程ｂのベクターは、ｐＢＲ３２２及びその誘導体、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４及びその誘導体、ＲＫ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、コスミドベクター及びその誘導体から選ばれたものであり、好ましくはｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
【請求項６】
前記工程ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるＤＮＡ配列に基づいてプライマーを設計し、前記親菌株から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法により、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を合成することを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
【請求項７】
前記工程ａにおける前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６００個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列、最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の完全なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド配列から得られたものであり、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、好ましくは前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
【請求項８】
前記親菌株は、細菌であり、好ましくはデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属で、より好ましくはデイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、デイノコッカス・デゼルティ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｓｅｒｔｉ）、デイノコッカス・ゴビエンシス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｂｉｅｎｓｉｓ）、デイノコッカス・プロテオリチクス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からなる群より選ばれたものであり、最も好ましくはデイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
【請求項９】
前記工程ｃの導入方法は、形質転換、形質導入、接合伝達及び電気穿孔から選ばれたものであり、前記宿主細胞は、細菌又は真菌から選ばれたものであり、好ましくはロドバクター属の細菌であり、より好ましくはロドバクター・スフェロイデスであり、
好ましくは、前記工程ｃは、工程ｂで得られた組換えベクターを大腸菌Ｓ１７−１コンピテントセルに形質転換した後、接合伝達により宿主細胞に導入することで、遺伝的に安定な組換え微生物を得ることを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の組換え微生物の製造方法。
【請求項１０】
請求項７に記載のグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子と、請求項３に記載の浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢとを含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項１１】
請求項７に記載の前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子と、請求項３に記載の浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢとを含むことを特徴とする、組換え微生物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により組換え微生物を製造し、前記組換え微生物を用いて補酵素Ｑ１０を生産することを含むことを特徴とする、補酵素Ｑ１０の生産方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により組換え微生物を作製し、前記組換え微生物を用いて酸化型補酵素Ｑ１０を生産することを含むことを特徴とする、酸化型補酵素Ｑ１０の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に属し、具体的には、組換え微生物及び補酵素Ｑ１０の生産におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ１０）は、ユビキノン、デセンキノンとも呼ばれ、化学名が２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−デカプレニルベンゾキノンである。キノン環の酸化還元特性及び側鎖の物理化学的特性に由来する生物活性を有する補酵素Ｑ１０は、細胞自体が産生する天然の抗酸化剤及び細胞代謝活性化剤であり、抗酸化、フリーラジカルの除去、身体の免疫力の向上、老化防止などの機能を備え、心臓病、癌、糖尿病、急性及び慢性肝炎、パーキンソン病などの様々な疾患の治療に広く使用されており、食品、化粧品及び老化防止製品にも多くの用途がある。
【０００３】
いままで、微生物発酵法は補酵素Ｑ１０の主な生産方法である。微生物発酵による補酵素Ｑ１０の生産は、製品の品質においても安全性においても大きな競争上の利点があり、大規模な工業生産に適する。一方、特に工業的な発酵環境では、微生物の成長や増殖において、様々な過酷な環境による外部からのストレスがしばしばある。例えば、発酵環境における浸透圧、ｐＨ、溶存酸素、栄養物質等の条件はある程度変動するものである。その影響により、微生物の成長はコントロールしにくいため、補酵素Ｑ１０の生産も不安定である。また、発酵環境による制限の関係で、工業生産において、バイオマスをさらに増やすことは困難である。そのため、補酵素Ｑ１０の収量をさらに向上させるために、過酷な環境に対する補酵素Ｑ１０生産菌の耐性を改善する必要がある。
【０００４】
開示された補酵素Ｑ１０発酵に関する技術の研究は主に、遺伝子工学の技術による補酵素Ｑ１０の生産レベルの改善、または菌の突然変異誘発処理や単一因子最適化調整実験による産物合成への影響の考察に焦点を当てている。また、発酵プロセスにおける主要なパラメータのオンライン制御により発酵プロセスを最適化することを報告した特許文献もある。これらの研究及び技術はある程度の効果はあるが、生産性を高めるための、過酷な環境に対する補酵素Ｑ１０生産菌の耐性改善は、根本的に解決していない。
【０００５】
例えば、特許文献１は、酸素消費速度（溶存酸素）と電気伝導率（栄養素補給速度）を調整することにより、補酵素Ｑ１０の発酵プロセスを制御することを提案している。特許文献２では、発酵中の菌体の形状に基づいてプロセスのパラメータを調整する。特許文献３では、ロドバクター・スフェロイデスを改変することにより、微生物の補酵素Ｑ１０合成能力を向上させる。これらのプロセスは、生産される補酵素Ｑ１０が酸化型補酵素Ｑ１０と還元型補酵素Ｑ１０の混合物であり、且つ還元型補酵素Ｑ１０の比率が比較的高い点で共通している。特に特許文献４に記載のプロセスでは、発酵終了後、微生物が生産した補酵素Ｑ１０における還元型補酵素Ｑ１０の含有量は７０％以上であった。
【０００６】
特許文献５には、酸化型補酵素Ｑ１０の発酵生産方法が開示されている。同特許では、Ｑ１０合成蓄積段階の後期で酸化還元電位ＯＲＰを調節することにより、菌株から高含有量の酸化型補酵素Ｑ１０を生産させ、酸化型補酵素Ｑ１０の含有量は９６％以上であったが、この方法では、高い酸化還元電位による生産菌株への酸化ストレスに起因する菌体内の代謝産物の蓄積、菌体の成長抑制等の問題を解決していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＣＮ１０５４２０４１７Ａ
【特許文献２】ＣＮ１０４５６１１５４Ａ
【特許文献３】ＣＮ１０３５０９７２９Ｂ
【特許文献４】ＵＳ７９１０３４０Ｂ２
【特許文献５】ＣＮ１０８０４８４９６Ａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した補酵素Ｑ１０の発酵プロセス、特に酸化型補酵素Ｑ１０の発酵プロセスにおける問題を解決し、過酷な環境に対する補酵素Ｑ１０生産菌の耐性を改善するために、本発明は、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を外因的に導入することにより、過酷な環境に対する補酵素Ｑ１０生産菌の耐性を改善した組換え微生物であって、発酵法による補酵素Ｑ１０の生産、特に酸化型補酵素Ｑ１０の生産に適する組換え微生物を構築する。
【０００９】
前記組換え微生物はストレスに強く、高浸透圧及び高酸化還元電位を含む過酷な環境に対する耐性に優れる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現により、補酵素Ｑ１０の発酵プロセスにおける微生物の上記特性を効果的に改善することができる。
【００１０】
グローバルレギュレーターｉｒｒＥは、生物体内のかかる重要な遺伝子を活性化するスイッチとして、ＤＮＡ損傷の修復と放射線ストレスからの保護のための経路において中心的な調節作用を発揮する。グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を外因的に導入することによって、浸透圧、酸化、放射線及び熱等の様々なストレスに対する微生物の耐性を改善することができ、菌の対数増殖期を延長し、バイオマスのさらなる蓄積を促進するとともに、発酵プロセスにおける菌の活発な成長および代謝活性を維持することにより、補酵素Ｑ１０の収量を高め、特に酸化型補酵素Ｑ１０の収量を高めることができる。
【００１１】
好ましくは、本発明は、プロモーター入れ替えにより、組換えベクター上のグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターをノックアウトした後、異なる別のプロモーターを挿入し、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現をさらに調節することができる。
【００１２】
插入されるプロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢであることが好ましい。このプロモーターは、初期の発現強度は低いが、浸透圧の上昇に伴って発現強度が強くなる。これにより、グローバルレギュレーターｉｒｒＥの発現量は浸透圧の上昇に伴って増加し、様々な強さのストレスに対する微生物の耐性は高くなる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は
ａ．グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含む親菌株から、クローニングにより、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を取得する工程と、
ｂ．前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子をベクターに連結し、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築する工程と、
ｃ．組換えベクターを宿主細胞に導入することで、組換え微生物を得る工程と、
を含む組換え微生物の製造方法を提供する。
【００１４】
上述した本発明の方法において、前記工程ｂは、プロモーター入れ替えにより、組換えベクター上のグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターをノックアウトした後、異なる別のプロモーターを挿入し、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現をさらに調節することを含む。
【００１５】
上述した本発明の方法において、前記工程ｂにおいて插入されるプロモーターとしては、誘導型プロモーター、好ましくは浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢを使用し、前記浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも７０個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５０個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列、最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の完全なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド配列から得られたものであり、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、好ましくは前記浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるヌクレオチド配列である。前記浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢは、細菌、好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、より好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から分離されたものである。
【００１６】
上述した本発明の方法において、前記工程ｂのベクターは、ｐＢＲ３２２及びその誘導体、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４及びその誘導体、ＲＫ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２、コスミドベクター及びその誘導体から選ばれたものであり、好ましくはｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２である。
【００１７】
上述した本発明の方法において、前記工程ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるＤＮＡ配列に基づいてプライマーを設計し、前記親菌株から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法により、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を合成することを含む。
上述した本発明の方法において、前記工程ａにおける前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６００個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列、最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の完全なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド配列から得られたものである。前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、好ましくは前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるヌクレオチド配列である。前記親菌株は細菌であり、好ましくはデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属で、より好ましくはデイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、デイノコッカス・デゼルティ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｓｅｒｔｉ）、デイノコッカス・ゴビエンシス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｂｉｅｎｓｉｓ）、デイノコッカス・プロテオリチクス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からなる群より選ばれたものであり、最も好ましくはデイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）である。
【００１８】
上述した本発明の方法において、前記工程ｃの導入方法は、形質転換、形質導入、接合伝達及び電気穿孔から選ばれたものであり、前記宿主細胞は、細菌又は真菌から選ばれたものであり、好ましくはロドバクター属の細菌であり、より好ましくはロドバクター・スフェロイデスである。好ましくは前記工程ｃは、工程ｂで得られた組換えベクターを大腸菌Ｓ１７−１コンピテントセルに形質転換した後、接合伝達により宿主細胞に導入することで、遺伝的に安定な組換え微生物を得ることを含む。
【００１９】
本発明はさらに、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子と、浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢとを少なくとも含む組換え微生物を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、前記方法により組換え微生物を製造し、前記組換え微生物を用いて補酵素Ｑ１０を生産することを含む補酵素Ｑ１０の生産方法を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、前記方法により組換え微生物を製造し、前記組換え微生物を用いて酸化型補酵素Ｑ１０を生産することを含む酸化型補酵素Ｑ１０の生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明者らは鋭意検討した結果、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の導入及びプロモーター入れ替えを行って構築された組換え微生物、特に組換えロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）はストレスに強く、高浸透圧及び高酸化還元電位を含む過酷な環境に対する耐性に優れ、菌の対数増殖期を延長し、バイオマスのさらなる蓄積を促進するとともに、発酵プロセスにおける菌の活発な成長および代謝活性を維持することができることを意外にも見出した。
【００２３】
また、従来の酸化型補酵素Ｑ１０の直接的な生産プロセスにおいて、発酵の後期では、細胞内に酸化型補酵素Ｑ１０が多く蓄積され、菌体自体が受ける酸化ストレスは強かった。本願の組換え微生物は、酸化ストレスに対する菌体の耐性を改善し、酸化型補酵素Ｑ１０の力価を著しく高めることができ、補酵素Ｑ１０の総量における酸化型補酵素Ｑ１０の比率の向上の観点から好適である。
【００２４】
さらに、本願は上記組換え微生物の構築において、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターをプロモーターｐｒｏＰＢに入れ替えた後、浸透圧の変化によりグローバルレギュレーターｉｒｒＥの発現を調節できることから、補酵素Ｑ１０生産菌のストレス耐性を段階的に高め、発酵プロセスの各段階における過酷な環境に対する菌体の耐性への要望に応えることができ、さらに補酵素Ｑ１０の生産、特に酸化型補酵素Ｑ１０の生産を促進できることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は元のプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２を示すものである。
【図２】図２は組換えプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−Ｇ−ｐｒｏＰＢ−ＩｒｒＥを示すものである。
【図３】図３はグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含み、浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢの入れ替えが行われていない組換え微生物のＲＳＰ−ＣＥの電気泳動像である。
【図４】図４はグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含み、且つ浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢの入れ替えが行われた組換え微生物のＲＳＰ−ＢＥの電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１．補酵素Ｑ１０を生産する微生物
本発明は、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を外因的に導入することにより、過酷な環境に対する補酵素Ｑ１０生産菌の耐性を改善し、発酵法による補酵素Ｑ１０の生産、特に酸化型補酵素Ｑ１０の生産に適する組換え微生物を構築する。
【００２７】
本発明のグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子は、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードするポリヌクレオチド分子から取得でき、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１００個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列を含む。好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも３００個、より好ましくは少なくとも６００個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列を含み、最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、デイノコッカス・ラディオデュランスから分離されたｉｒｒＥの完全なヌクレオチド配列を表す。
【００２８】
前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子は、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする長いポリヌクレオチド配列から取得してもよい。このようなポリヌクレオチドは、例えば細菌に由来してもよい。好ましくは、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から分離されたものであり、前記細菌としては、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、デイノコッカス・デゼルティ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｓｅｒｔｉ）、デイノコッカス・ゴビエンシス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｂｉｅｎｓｉｓ）、デイノコッカス・プロテオリチクス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）が挙げられる。
【００２９】
このようなポリヌクレオチドを長いポリヌクレオチド配列から取得する場合、このようなポリヌクレオチド配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１との相同性を確認することは可能である。この場合、好ましくは、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドを有する領域を選んで、別のポリヌクレオチドに由来する関連断片との比較を行う。ポリヌクレオチド配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から得られた関連断片とは、例えば同じヌクレオチドを６０個有すれば（１００個の連続ヌクレオチドを比較した結果）、相同性は６０％となる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド配列の一部はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも８０％の相同性を有し、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。相同性を確認するために、例えば、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド断片、好ましくは少なくとも３００個の連続ヌクレオチド断片、より好ましくは、少なくとも５００個連続ヌクレオチド断片を用いる。
【００３０】
ポリペプチドにおけるいくつかの断片は、生物学的機能上、必須のものであるが、他の領域では、アミノ酸の插入、欠失又は別のアミノ酸による置換が可能な領域もあり、また、入れ替えられるアミノ酸に近似するアミノ酸による置換が好ましいことは、当業者には知られている。
【００３１】
さらに、本発明は、高含有量の酸化型補酵素Ｑ１０の生産に適する微生物を提供することを目的とする。特許文献５は、発酵液のＯＲＰを制御することにより、微生物が生産する補酵素Ｑ１０における酸化型補酵素Ｑ１０の含有量を高める発酵方法を開示している。この公開特許は引用により本明細書に組み込まれる。
【００３２】
本発明者らは、適切な培養条件において、ストレスに強い微生物は、高含有量の酸化型補酵素Ｑ１０の直接的生産のさらなる最適化にも利用できることを見出した。
【００３３】
ここで、「直接的生産」、「直接的発酵」、「直接的転換」等の用語は、微生物が、化学的な転換工程をさらに介することなく、１つ以上の生物的な転換工程により、ある基質を特定の産物へ転換できることを意味する。その一例として、例えば、抽出された還元型補酵素Ｑ１０をさらに酸化して酸化型補酵素Ｑ１０とすることが挙げられる。
【００３４】
２．補酵素Ｑ１０を生産する組換え微生物の製造方法
本発明者らは、補酵素Ｑ１０を生産する微生物を遺伝子工学により改変することによって、補酵素Ｑ１０の生産を最適化する。
【００３５】
本発明の補酵素Ｑ１０を生産するための組換え微生物の製造は、
ａ．グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含む親菌株から、クローニングにより、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を取得する工程と、
ｂ．前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子をベクターに連結し、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築する工程と、
ｃ．ベクターを宿主細胞に導入するのに適する方法、例えば、形質転換、形質導入、接合伝達及び／又は電気穿孔により、前記宿主細胞が本発明の組換え微生物となるように、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含む組換え微生物を構築する工程と、
を含む。
【００３６】
前記工程ａにおいては、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含む菌株から、前記グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を取り出すとき、例えば、以下の例示的な方法を採用できる。
（ｉ）  当業界で公知の方法により、本明細書に開示するＤＮＡ配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ＰＣＲにより目的遺伝子を取得する。
（ｉｉ）  制限酵素を用いてゲノムをいくつかの断片に分割した後、標識核酸プローブを用いて、目的遺伝子を選び出す。
（ｉｉｉ）  当業界で公知の方法により、例えばＤＮＡシンセサイザーを用いて目的遺伝子を合成する。
【００３７】
所望の遺伝子を運ぶクローンが得られたら、当業界で公知の方法により標的遺伝子のヌクレオチド配列を測定することができる。
【００３８】
前記工程ｂにおいて、二本鎖ＤＮＡのクローニングでは、一連の宿主／クローニングベクターの組み合わせを用いてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉ内で本発明の遺伝子（つまりｉｒｒＥ遺伝子）を発現するための好適なベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉに一般的に適用される任意のベクターから選ぶことができ、例えばｐＢＲ３２２又はその誘導体（例えばｐＵＣ１８とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｉｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、  Ｃａｌｉｆ．、  ＵＳＡ））、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４及びその誘導体、並びに例えばＲＫ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２のような広範囲の宿主プラスミドからのベクターが挙げられる。ロドバクター・スフェロイデス内で本発明のヌクレオチド配列を発現するための好適なベクターは、ロドバクター・スフェロイデス及び好適なクローン生物（例えばＥ．ｃｏｌｉ）内で複製可能な任意のベクターから選ばれる。好適なベクターは、広範囲の宿主ベクターであり、例えば、コスミドベクター（例えばｐＶＫ１００）及びその誘導体、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２が挙げられる。当業界で公知の任意の方法、例えば、形質転換、形質導入、接合伝達又は電気穿孔により、宿主細胞及びベクターの性質を考慮した上で、このようなベクターを好適な宿主に移すことができる。
【００３９】
当業界で公知の方法を用いて、例えばプロモーター、リボソーム結合部位及び転写ターミネーターなどの宿主細胞内で操作可能な調節配列を含む適切なベクターに、本発明によるｉｒｒＥ遺伝子／ヌクレオチド配列を連結することにより、組換えベクターを作製することができる。
【００４０】
前記工程ｂにおいて、プロモーター入れ替えにより、組換えベクター上のグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターをノックアウトした後、異なる別のプロモーターを挿入し、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の発現をさらに調節してもよい。插入されるプロモーターとしては、構成型プロモーター又は誘導型プロモーターを使用でき、例えば、遺伝子の元のプロモーター、抗生剤耐性遺伝子のプロモーター、浸透圧調節型プロモーター、温度誘導型プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのβガラクトシダーゼ（ｌａｃ）、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃプロモーター、および宿主細胞内で機能できる任意のプロモーターが挙げられる。好ましくは、上記プロモーターは誘導型プロモーターで、特に浸透圧調節型プロモーターであり、より好ましくは浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢである。
【００４１】
前記浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢは、浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢのポリヌクレオチド分子から取得でき、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも７０個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも１００個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列を含み、より好ましくは少なくとも１５０個の連続ヌクレオチドからなる部分的なヌクレオチド配列を含む。最も好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、大腸菌から分離されるプロモーターｐｒｏＰＢの完全なヌクレオチド配列を表す。
【００４２】
前記浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢは、浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢを含む長いポリヌクレオチド配列から取得してもよい。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、細菌、好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、より好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から分離されるものが挙げられる。このようなポリヌクレオチドを長いポリヌクレオチド配列から取得する場合、このようなポリヌクレオチド配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２との相同性を確認することは可能である。ここで、相同性の定義は、前述したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相同性の定義と同様である。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド配列の一部は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも８０％の相同性を有し、より好ましくは、少なくとも９０％の相同性を有する。相同性を確認するために、例えば、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド断片、好ましくは、少なくとも２００個の連続ヌクレオチド断片を用いる。
【００４３】
発現のために、例えば、宿主細胞（本発明の組換え細胞を提供するためにコード配列が導入されるもの）内で操作可能なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列（例えば、ＡＧＧＡＧＧ等、宿主細胞内で操作可能な天然配列や合成配列を含む）及び転写ターミネーター（任意の天然配列や合成配列からなる逆反復構造）などの他の調節要素は、上記プロモーターと併用してもよい。
【００４４】
前記工程ｃにおいて、組換えベクターを含む組換え微生物を構築するために、例えば形質転換、形質導入、接合伝達、電気穿孔などの様々な遺伝子導入方法を使用できる。組換え細胞を構築するための方法は、分子生物学分野で公知の方法から選ぶことができ、例えば、従来の形質転換系は大腸菌に使用できる。形質導入系も大腸菌に使用でき、接合伝達系は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌に広く使用でき、例えば、大腸菌及びロドバクター・スフェロイデスに使用できる。ＣＮ１０３５０９８１６Ｂでは、例えば、液体培地中又は固体培地の表面上において接合が発生できる接合伝達法が開示された。接合伝達受容菌に選択マーカーを入れてもよく、例えば、カナマイシン耐性が通常選択される。天然の耐性も使用でき、例えば、ナリジクス酸に対する耐性をロドバクター・スフェロイデスに用いてもよい。
【００４５】
本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、好ましくは適切な宿主細胞内で機能できる組換えベクターに関する。
【００４６】
本発明において、当業界で補酵素Ｑ１０の生産に一般的に使用される微生物を用いることができ、例えば細菌、酵母、カビのいずれかに対して、当業界で公知の遺伝子工学技術の手段を施して本発明の上記組換え微生物を得ることができる。前記微生物としては、例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロモナス（Ａｇｒｏｍｏｎａｓ）属、ブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、シユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、リゾモナス（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ）属、ロドビウム（Ｒｈｏｄｏｂｉｕｍ）属、ロドプラネス（Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属等の微生物が挙げられ、好ましい種としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロモナス・オリゴトロフィカ（Ａｇｒｏｍｏｎａｓ  ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ブレブンジモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）、ロドシュードモナス・パルトリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドバクター・カプスレータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）等が挙げられ、さらに好ましくはロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）である。
【００４７】
したがって、本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを持つ宿主細胞に関する。遺伝子工学により改変されたこのような宿主細胞は、組換え宿主細胞又は組換え微生物と呼ばれる。
【００４８】
３．微生物発酵による補酵素Ｑ１０の生産
本発明の補酵素Ｑ１０を生産する微生物による発酵方法は、上記組換え微生物を用いて発酵生産を行うことを特徴とする。本発明の組換え微生物は、浸透圧、酸化、放射線及び熱等の様々なストレスに対する微生物の耐性を高めることができるため、従来の補酵素Ｑ１０の発酵方法に比較して、菌の対数増殖期を延長し、バイオマスのさらなる蓄積を促進するとともに、菌の活発な成長および代謝を維持することができ、補酵素Ｑ１０の力価を著しく向上させる。本発明の方法における組換え微生物を用いて補酵素Ｑ１０を生産する発酵プロセスの条件は特許文献１を参照してもよい。詳細な方法は以下のとおりである。
【００４９】
補酵素Ｑ１０を生産する菌株の発酵プロセスにおいて、酸素消費速度を３０〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈの範囲に維持しながら、電気伝導度を５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍの範囲に維持することにより、菌体の成長及び補酵素Ｑ１０の合成の開始及び蓄積を促進する。好ましくは、補酵素Ｑ１０を生産する菌株の発酵プロセスにおいて、酸素消費速度を３０〜９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈとする。好ましくは、補酵素Ｑ１０を生産する菌株の発酵プロセスにおいて、発酵液の電気伝導度を１０〜２０ｍｓ／ｃｍとする。
【００５０】
本発明の補酵素Ｑ１０の発酵生産方法において、前記酸素消費速度は撹拌速度および空気流量により調節し、前記電気伝導度は流加補充又は回分補充により調節する。ここで、流加補充又は回分補充の際に使用する補充液の組成は、補充液１リットルにつき、酵母粉末８〜１２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５〜１０ｇ、ＭｇＳＯ４  １〜２ｇ、ＮａＣｌ  ３〜６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ２〜４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２〜４ｇ、ＣａＣｌ２  １〜２ｇ、ビオチン０．０１３〜０．０２５ｇとし、ｐＨは７．０とし、補充培地の電気伝導度は１３．５〜２３ｍｓ／ｃｍとする。
【００５１】
本発明の補酵素Ｑ１０の発酵生産方法において、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＲＳＰ−ＢＥだけでなく、その物理的又は化学的な突然変異誘発方法により育種された菌株、又は遺伝子工学の方法により改変された菌株も使用できる。
【００５２】
本発明の方法によれば、補酵素Ｑ１０の力価は少なくとも１０００ｍｇ／Ｌで、好ましくは少なくとも２０００ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは少なくとも３０００ｍｇ／Ｌである。補酵素Ｑ１０の力価とは、発酵液の単位体積当たりの補酵素Ｑ１０の含有量を指す。
【００５３】
以上より、当業界の補酵素Ｑ１０の一般的な発酵方法を用いる場合でも、本発明の組換え微生物は、補酵素Ｑ１０の力価を向上させる上で大きな利点を持つことが分かる。したがって、本発明の組換え微生物は、当業界の補酵素Ｑ１０の一般的な発酵プロセスに適する。
【００５４】
４．微生物発酵による高含有量の酸化型補酵素Ｑ１０の生産
前述のように、従来の技術に比較して、本発明の組換え微生物は、酸化型補酵素Ｑ１０の収量をさらに改善できる点にも特徴づけている。
【００５５】
本発明の方法は、特定の組換え微生物を用いることにより、高浸透圧及び高酸化還元電位を含む過酷な環境に対する耐性を大幅に改善でき、酸化型補酵素Ｑ１０の発酵生産方法における高酸化還元電位による菌体への悪影響をなくすとともに、酸化ストレスによる菌体の補酵素Ｑ１０の生産に対する促進効果をさらに発揮させ、酸化型補酵素Ｑ１０の力価を高めることができる。本発明の方法における組換え微生物を用いて酸化型補酵素Ｑ１０を発酵生産する発酵プロセスの条件は、特許文献５を参照してもよい。詳細な方法は以下のとおりである。
【００５６】
酸化型補酵素Ｑ１０の発酵生産方法において、発酵プロセスにおける補酵素Ｑ１０の合成蓄積段階では発酵液のＯＲＰを制御し、好ましくは発酵プロセスにおける補酵素Ｑ１０の合成蓄積段階の中後期において発酵液のＯＲＰを制御し、より好ましくは発酵プロセスにおける補酵素Ｑ１０の合成蓄積段階の後期において発酵液のＯＲＰを制御する。生産菌株の発酵プロセスにおいて、発酵液の酸化還元電位ＯＲＰは−５０〜３００ｍＶとし、好ましくは発酵液の酸化還元電位ＯＲＰは５０〜２００ｍＶとする。
【００５７】
上述の発酵生産方法において、前記発酵プロセスでは、前記発酵液の電気伝導度は５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍとする。好ましくは、菌体の成長段階では、酸素消費速度は３０〜１５０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）の範囲とし、前記発酵液の電気伝導度は５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍの範囲とする。さらに好ましくは、補酵素Ｑ１０の合成蓄積段階では、酸素消費速度は６０〜１２０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）の範囲とし、前記発酵液の電気伝導度は８．０〜１５．０ｍｓ／ｃｍの範囲とする。
【００５８】
上述の発酵生産方法において、前記発酵液の溶存酸素の制御と、前記発酵液のｐＨの制御とのうちの少なくとも一方により発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを制御し、好ましくは前記発酵液の溶存酸素の制御と、前記発酵液のｐＨの制御とを併用する。
【００５９】
上述の発酵生産方法において、発酵タンクの単位体積当たりの撹拌動力の制御と、単位体積当たりの発酵液の空気吸気流量の制御と、発酵タンクの内圧の制御とのうちの少なくとも一方により前記発酵液中の溶存酸素を制御し、好ましくはこれらの２つ以上の併用により前記発酵液中の溶存酸素を制御する。
【００６０】
上述の発酵生産方法において、補酵素Ｑ１０の合成蓄積段階では、前記発酵タンクの単位体積当たりの撹拌動力は、好ましくは０．２５〜０．５０ｋｗ／ｍ３とし、前記単位体積当たりの発酵液の空気吸気流量は、好ましくは１．０〜１５．０ｖｖｍとし、及び／又は前記発酵タンクの内圧は、好ましくは０．０５〜０．３ＭＰａとする。より好ましくは、前記発酵タンクの単位体積当たりの撹拌動力は０．３０〜０．４０ｋｗ／ｍ３とし、前記単位体積当たりの発酵液の空気吸気流量は５．０〜８．０ｖｖｍとし、及び／又は前記発酵タンクの内圧は０．０８〜０．１５ＭＰａとする。
【００６１】
上述の発酵生産方法において、補酵素Ｑ１０の合成蓄積段階では、前記発酵液のｐＨを３．５〜６．０とすることにより、前記発酵液のｐＨを制御する。好ましくは、前記発酵液のｐＨを４．０〜５．０とすることにより、前記発酵液のｐＨを制御する。より好ましくは、酸の添加又は塩基の添加により、前記発酵液のｐＨを制御する。さらに好ましくは、前記酸又は前記塩基の段階的又は連続的な添加により、前記発酵液のｐＨを制御する。
【００６２】
上述の発酵生産方法において、前記酸は有機酸又は無機酸であり、及び／又は前記塩基は有機塩基又は無機塩基である。好ましくは、前記酸は、リン酸、塩酸、硫酸、乳酸、プロピオン酸、クエン酸及びシュウ酸のうちの１つ以上であり、及び／又は、好ましくは、前記塩基は、アンモニア水、水酸化ナトリウム及び液体アンモニアのうちの１つ以上である。より好ましくは、前記酸はリン酸、乳酸又はクエン酸であり、及び／又は、前記塩基はアンモニア水又は液体アンモニアである。
【００６３】
上述の発酵生産方法において、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＲＳＰ−ＢＥだけでなく、その物理的又は化学的な突然変異誘発方法により育種された菌株、又は遺伝子工学の方法により改変された菌株も使用できる。
【００６４】
上述の発酵生産方法において、前記補酵素Ｑ１０は高含有量の酸化型補酵素Ｑ１０であり、かつ、好ましくは、酸化型補酵素Ｑ１０の含有量は９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
【００６５】
上述の発酵生産方法において、前記酸化型補酵素Ｑ１０の力価は少なくとも１０００ｍｇ／Ｌであり、好ましくは少なくとも２０００ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは少なくとも３０００ｍｇ／Ｌである。酸化型補酵素Ｑ１０の力価とは、発酵液の単位体積当たりの酸化型補酵素Ｑ１０の含有量を指す。
【００６６】
上述の発酵生産方法により得られた酸化型補酵素Ｑ１０は、機能性栄養食品、特別な健康食品を含む種々の食品の製造に使用でき、さらに栄養サプリメント、栄養剤、動物用医薬品、飲料、飼料、化粧品、医薬品、薬剤及び予防薬の製造にも使用できる。
【００６７】
以下、図面及び実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
本願の実施例における組換え微生物の構築は以下の基本操作を含む。
【００６９】
本発明において、以下の培地を使用した。
斜面培地の組成（１００ｍｌ）は、酵母エキス  ０．８ｇ、ＦｅＳＯ４  ０．０１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１３ｇ、ＣｏＣｌ２  ０．００３ｇ、ＮａＣｌ  ０．２ｇ、ＭｎＳＯ４  ０．０００１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０２５ｇ、グルコース０．３ｇ、ビタミンＢ１  ０．１μｇ、ビタミンＫ  ０．１μｇ、ビタミンＡ  ０．１５μｇ、寒天粉１．５ｇであり、ｐＨを７．２とした。
シード液の組成（１００ｍｌ）は、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．２５ｇ、コーンスティープリカー  ０．０５ｇ、酵母エキス  ０．１４ｇ、ＮａＣｌ  ０．２ｇ、グルコース  ０．３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０５ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．１ｇ、ＦｅＳＯ４  ０．０１ｇ、ＣｏＣｌ２  ０．００３ｇ、ＭｎＳＯ４  ０．０００１ｇ、ＣａＣＯ３  ０．８ｇ、ビタミンＢ１  ０．１μｇ、ビタミンＫ  ０．１μｇ、ビタミンＡ  ０．１５μｇであり、ｐＨを７．２とした。
発酵液の組成（１００ｍｌ）は、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．３ｇ、ＮａＣｌ  ０．２８ｇ、グルコース  ４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１５ｇ、味の素  ０．３ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．６３ｇ、コーンスティープリカー  ０．４ｇ、ＦｅＳＯ４  ０．１２ｇ、ＣｏＣｌ２  ０．００５ｇ、ＣａＣＯ３  ０．６ｇ、ビタミンＢ１  ０．１μｇ、ビタミンＫ  ０．１μｇ、ビタミンＡ  ０．１５μｇであり、ｐＨを７．２とした。
【００７０】
力価の測定は以下のとおりである。
（試料の調製）
窒素ガス雰囲気下で、発酵液１ｍｌを１０ｍｌ遠心管に入れ、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ  １８０μｌを加えて、均一に混合し、３〜５ｍｉｎ静置した後、９２℃の水浴下で３０ｍｉｎ加熱した。上清を遠心除去し、浸出液（酢酸エチル：エタノール＝５：３）８ｍｌを加え、２時間の浸出を行い、逆相ＨＰＬＣで分析した。
【００７１】
（高速液体クロマトグラフィーの条件）
Ｃ１８カラム：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ
移動相：メタノール：イソプロパノール＝７５：２５（体積基準）
流量：１．００ｍｌ／ｍｉｎ
測定波長：２７５ｎｍ
注入量：４０μｌ
保持時間：１２ｍｉｎ
【００７２】
酸化型補酵素Ｑ１０の含有量測定は以下のとおりである。
（試料の調製）
窒素ガス雰囲気下で、発酵液１ｍｌを１０ｍｌ遠心管に入れ、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ  １８０μｌを加えて、均一に混合し、３〜５ｍｉｎ静置した後、９２℃の水浴下で３０ｍｉｎ加熱した。上清を遠心除去し、浸出液（酢酸エチル：エタノール＝５：３）８ｍｌを加え、２時間の浸出を行い、逆相ＨＰＬＣで分析した。
【００７３】
（高速液体クロマトグラフィーの条件）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ
移動相：メタノール／ｎ−ヘキサン＝８５：１５（体積基準）
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
測定波長：２７５ｎｍ
注入量：４０μｌ
保持時間：還元型補酵素Ｑ１０は１３．５ｍｉｎであり、酸化型補酵素Ｑ１０は２２．０ｍｉｎである。
【００７４】
バイオマスの測定は以下のとおりである。発酵液１０ｍｌを取って重量を測り、２ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を加えてｐＨを約４．０とし、８０℃で２０ｍｉｎ保温した後、上清を遠心除去し、水洗いして、上清を遠心除去し、６０℃で２０時間乾燥させて、重量を測り、発酵液１ｋｇ当たりの菌体の含有量を求めた。
【００７５】
残糖の測定は、当業界で公知の手段、例えばグルコース分析装置を用いる方法により行うことができる。溶存リンの測定は、当業界で公知の手段、例えばモリブデンブルー法により行うことができる。
【実施例１】
【００７６】
グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子の増幅と組換えベクターの構築
キットの取扱明細書に従って、デイノコッカス・ラディオデュランスのゲノムを抽出した（試薬は、上海生物工程有限公司製Ｅｚｕｐカラム用細菌ゲノムＤＮＡ抽出キットに由来するものである）。
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるＤＮＡ配列に基づき、Ｐｒｉｍｅｒ５プライマー設計ソフトにより設計して、上流プライマーｉｒｒＥ−Ｆ：５´−ｃｃｇＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧ−３´（下線部はＥｃｏＲＩ切断部位）  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、下流プライマーｉｒｒＥ−Ｒ：５´−ｃｇｃＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＧＴＣ−３´（下線部はＢａｍＨＩ切断部位）  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４を得た。
【００７８】
デイノコッカス・ラディオデュランスから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、高忠実度酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ（大連）より購入）、プライマーＳＥＱＩＤ  Ｎｏ．３及びＮｏ．４を用いて、ＰＣＲ法によりグローバルレギュレーターｉｒｒＥの遺伝子を合成し、以下の標準反応系を採用した。
【００７９】
【表１】
2021517806.tif 000002
【００８０】
増幅プロセスは、９８℃での１０秒の変性と、５５℃での１５秒のアニーリングと、７２℃での１分間の伸長とを含む処理を１サイクルとし、３０サイクル実施した。
【００８１】
ＰＣＲ産物を取り出して、キットの取扱明細書に従ってＰＣＲ精製を行い（試薬はＡｘｙｇｅｎ  ＰｒｅｐＰＣＲクリーニングキットに由来するもの）、ＰＣＲ精製産物を得た。
【００８２】
タカラバイオ社の下記エンドヌクレアーゼ標準系に従って酵素による切断を行った。
【００８３】
【表２】
2021517806.tif 000003
【００８４】
【表３】
2021517806.tif 000004
【００８５】
酵素による切断の産物を取り出して、キットの取扱明細書に従ってゲル回収を行い（試薬はＡｘｙｇｅｎ  ＰｒｅｐＤＮＡゲル回収キットに由来するもの）、遺伝子断片を回収した。
【００８６】
タカラバイオ社製Ｔ４リガーゼの取扱明細書に基づき、標準系に従って、ゲル回収により得られたｉｒｒＥ遺伝子５．５μｌ、ゲル回収により得られたプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２  ３μｌ、Ｔ４リガーゼ０．５μｌ、Ｔ４リガーゼＢＵＦＦＥＲ  １μｌを混合し、２２℃の水浴で６０分間つなぐことで、組換えプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−ｉｒｒＥを得た。
【実施例２】
【００８７】
浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢの入れ替え
ヒートショック法により組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−ｉｒｒＥを大腸菌ＢＬ２１コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ平板培地上で成長可能なコロニーを当該ＬＢ平板培地において連続培養して、遺伝的に安定な組換え大腸菌を得た。
【００８８】
キットの取扱明細書に従って、遺伝的に安定な組換え大腸菌のプラスミドを抽出した（試薬はＡｘｙＰｒｅｐプラスミドＤＮＡミニプレップ・キットに由来するものである）。
【００８９】
プライマーｉｒｒＥ−Ｆ及びｉｒｒＥ−Ｒを用いてＰＣＲ検証を行い、約１．０ｋｂの断片を得たことから、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子が組換え大腸菌に導入されたと確認できた。
【００９０】
上流プライマーｌａｃ−Ｆ：５´−ＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧ−３´（下線部は相同配列）  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５、下流プライマーｌａｃ−Ｒ：５´−ＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣ−３´（下線部は相同配列）  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６を設計した。
【００９１】
ＰＣＲ検証で確認された組換え大腸菌のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、タカラバイオ社（大連）製高忠実度酵素ｐｒｉｍｅＳＴＡＲ及び推奨系を使用し、下記標準反応系で、プライマーＳＥＱＩＤ  Ｎｏ．５及びＮｏ．６を用いてサーキュラーＰＣＲ法により増幅させた。
【００９２】
【表４】
2021517806.tif 000005
【００９３】
増幅プロセスは、９８℃での１０秒の変性と、５５℃での１５秒のアニーリングと、７２℃での６分間の伸長とを含む処理を１サイクルとし、２０サイクル実施した。
【００９４】
ＰＣＲ産物を取り出して、キットの取扱明細書に従ってＰＣＲ精製を行い（試薬はＡｘｙｇｅｎ  ＰｒｅｐＰＣＲクリーニングキットに由来するもの）、ＰＣＲ精製産物を得た。
【００９５】
ヒートショック法によりＰＣＲ精製産物を大腸菌ＢＬ２１コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ平板培地上で成長可能なコロニーを当該ＬＢ平板培地において連続培養して、遺伝的に安定な組換え大腸菌を得た。
【００９６】
キットの取扱明細書に従って、遺伝的に安定な組換え大腸菌のプラスミドを抽出することで（試薬はＡｘｙＰｒｅｐプラスミドＤＮＡミニプレップ・キットに由来するもの）、ｌａｃプロモーターがノックアウトされた組換えプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−Ｇ−ｉｒｒＥを得た。
【００９７】
上海生物工程公司によるプラスミドの配列決定検証により、ｌａｃプロモーターがノックアウトされたことを確認し、ｉｒｒＥ遺伝子配列が正確であることを確認した。キットの取扱明細書に従って、大腸菌のゲノムを抽出した（試薬は上海生物工程有限公司製Ｅｚｕｐカラム用細菌ゲノムＤＮＡ抽出キットに由来するものである）。
【００９８】
上流プライマーｐｒｏＰＢ−Ｆ：５´−ｃｃｇＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴ−３´（下線部はＸｈｏＩ切断部位）  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７、下流プライマーｐｒｏＰＢ−Ｒ：５´−ｃｃｃＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴＣＣＧＣＡＡＡＣＧ−３´（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ切断部位）  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８を設計した。
【００９９】
大腸菌から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、高忠実度酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ（大連）より購入）、プライマーＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８を用いて、下記標準反応系でＰＣＲ法によりグローバルレギュレーターｉｒｒＥの遺伝子を合成した。
【０１００】
【表５】
2021517806.tif 000006
【０１０１】
増幅プロセスは、９８℃での１０秒の変性と、５５℃での１５秒のアニーリングと、７２℃での１分間の伸長とを含む処理を１サイクルとし、３０サイクル実施した。
【０１０２】
ＰＣＲ産物を取り出して、キットの取扱明細書に従ってＰＣＲ精製を行い（試薬はＡｘｙｇｅｎ  ＰｒｅｐＰＣＲクリーニングキットに由来するもの）、ＰＣＲ精製産物を得た。
【０１０３】
タカラバイオ社の下記エンドヌクレアーゼ標準系に従って酵素による切断を行った。
【０１０４】
【表６】
2021517806.tif 000007
【０１０５】
【表７】
2021517806.tif 000008
【０１０６】
酵素による切断の産物を取り出して、キットの取扱明細書に従ってゲル回収を行い（試薬はＡｘｙｇｅｎ  ＰｒｅｐＤＮＡゲル回収キットに由来するもの）、遺伝子断片を回収した。
【０１０７】
タカラバイオ社製Ｔ４リガーゼの取扱明細書に基づき、標準系に従って、ゲル回収により得られたｐｒｏＰＢ配列５．５μｌ、ゲル回収により得られたプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−Ｇ−ｉｒｒＥ  ３μｌ、Ｔ４リガーゼ０．５μｌ、およびＴ４リガーゼＢＵＦＦＥＲ  １μｌを混合し、２２℃の水浴で６０分間つなぐことで、図２に示す組換えプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−Ｇ−ｐｒｏＰＢ−ｉｒｒＥを得た。
【実施例３】
【０１０８】
グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子と、浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢとを含む組換え微生物の構築
ヒートショック法により組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−Ｇ−ｐｒｏＰＢ−ｉｒｒを大腸菌Ｓ１７−１コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ平板培地上で成長可能なコロニーを当該ＬＢ平板培地において連続培養して、組換え大腸菌を得た。組換え大腸菌のゲノムを抽出し、プライマーｐｒｏＰＢ−Ｆ及びｉｒｒＥ−Ｒを用いてＰＣＲ検証を行った結果、約１．２ｋｂの断片を得たことから、ｐｒｏＰＢプロモーター及びグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子が組換え大腸菌に導入されたと確認できた。そして、上海生物工程公司によるプラスミドの配列決定検証により、配列がＮＣＢＩ上の配列に一致すると確認した。
【０１０９】
接合伝達により、組換え大腸菌の組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−Ｇ−ｐｒｏＰＢ−ｉｒｒＥをロドバクター・スフェロイデスに導入し、５０μｇ／ｍｌのナリジクス酸及びカナマイシンを含む平板培地上で成長可能なロドバクター・スフェロイデスを当該平板培地上で連続的に３代目まで継代して、遺伝的に安定な組換えロドバクター・スフェロイデスＲＳＰ−ＢＥを得た。
【０１１０】
組換えロドバクター・スフェロイデスのゲノムを抽出して、プライマーｐｒｏＰＢ−Ｆ及びｉｒｒＥ−Ｒを用いてＰＣＲ検証を行った結果、約１．２ｋｂの断片を得たことから、ｐｒｏＰＢプロモーター及びグローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子が組換えロドバクター・スフェロイデスＲＳＰ−ＢＥに導入されたと確認できた。
【０１１１】
上述した組換え微生物の構築において、組換えベクターを大腸菌Ｓ１７−１に形質転換する具体的な操作は以下のとおりである。
コンピテント大腸菌Ｓ１７−１を含むチューブを１０分間冰浴した後、組換えプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−Ｇ−ｐｒｏＰＢ−ｉｒｒＥを加え、さらに２０分間冰浴して、９０秒ヒートショックし、５分間冰浴して、６００μｌのＬＢ液体培地を加えた。３７℃で４５分間培養した後、５０００ｒｐｍで５分間遠心し、５００μｌの上清を除去して、残りの液を、カナマイシンを含む平板培地に塗布した。
【０１１２】
接合伝達の具体的な操作は以下のとおりである。
１０ｍｌの液体培地を含む試験管にロドバクター・スフェロイデスを播種し、３０℃、２００ｒｐｍで５０時間培養した。
【０１１３】
３２時間後、形質転換した大腸菌Ｓ１７−１の陽性クローンをＬＢ培養液に播種し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。１５時間後、大腸菌Ｓ１７−１を継代し、ＬＢ培地５ｍｌ毎に菌液１００μｌを加えるとともに、カナマイシン５μｌを加え、３７℃のシェーカーに置いて培養した。３〜４時間培養した後、ロドバクター・スフェロイデス菌液４ｍｌと大腸菌菌液２ｍｌを、２ｍｌ遠心管１本につき１ｍｌで分配し、５０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清をそれぞれ除去し、新鮮なＬＢ培地１ｍＬを加え、菌体を軽く再懸濁させ、５０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清をそれぞれ除去し、新鮮なＬＢ培地１ｍＬを加え、菌体を軽く再懸濁させた。ロドバクター・スフェロイデスと大腸菌の比率が１００：５０、１００：１００の比率となるように、菌液を均一に混合し、ＬＢ平板の中央にろ過膜（０．２２μｍ）を貼り付け、混合菌液をろ過膜の中心部に注ぎ、ＬＢ平板を穏やかに３２℃のインキュベーターに入れて一晩培養した。
【０１１４】
ろ過膜をピンセットで２ｍＬのＥＰ管に移し、５００μｌのＬＢ液体培地でろ過膜上の菌体を洗い流して分散させ、平板培地１枚につき菌液３５０μｌで分配して塗布した後、３２℃のインキュベーターに入れて７２時間培養した。
【０１１５】
接合伝達後、陽性クローンであるかを検査した。
【０１１６】
成長良好なコロニーを２つ〜５つ選んで４８〜６０時間培養し、継代してから、さらに２〜４時間培養した後、Ａｘｙｇｅｎプラスミド抽出キットの取扱明細書に記載の操作手順でプラスミドを抽出した。遠心管１本に、工程２で抽出したプラスミド３４μｌを入れ、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩをそれぞれ１μｌ加え、ＢＵＦＦＥＲ４μｌを加えた。３７℃の水浴に入れて酵素による切断を１．５時間行った。酵素による切断をした後、電気泳動で分析した結果、予想どおりに１．２ｋｂ付近にバンドが明確に見られた。ゲルを分割して回収した後、得られたＤＮＡ断片の配列決定検証により、陽性クローンであると確認した。
【０１１７】
上記方法により得られた菌株の微生物寄託を行った。この菌は、ロドバクター・スフェロイデスであって、ラテン名がＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓであり、ＲＳＰ−ＢＥ菌株と名付け、２０１８年６月１１日に中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ、北京市朝陽区北辰西路１号院３号中国科学院微生物研究所、郵便番号１００１０１）に寄託し、寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１５９２７である。
【実施例４】
【０１１８】
組換え微生物を用いる補酵素Ｑ１０の発酵生産
平板上で約７日培養した組換えロドバクター・スフェロイデスＲＳＰ−ＢＥのシングルコロニーを選んで、小試験管の斜面培地に移して培養し、培養済の斜面を滅菌水で洗浄し、菌濃度が細胞１０８〜１０９個／ｍｌである菌懸濁液とした。得られた菌懸濁液を２％の播種量でシード培地に播種してシード培養した。ここで、培地は１００ｍｌ、３２℃、回転速度１８０ｒｐｍとし、培養時間は２２〜２６時間とした。
【０１１９】
シード培養で得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１５９２７を１０％の播種量で１０Ｌの発酵タンクに播種した。播種量は当業界の一般の含有量、例えば、１〜３０％とすることができ、好ましくは２．５〜２０％、より好ましくは５〜１５％とする。必要に応じて播種量を調整してもよい。
【０１２０】
シード液は１０Ｌ発酵タンク内で発酵し始め、発酵温度は３１℃とし、タンク内圧は０．０３Ｍｐａとし、酸素供給は段階的制御の方針を採った。０〜２４時間の段階では、撹拌速度を５００ｒｐｍとし、空気流量を６Ｌ／ｍｉｎとし、菌体の成長に伴い、ＯＵＲは緩やかに安定して５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈになり、この段階では、菌体は指数増殖期で、酸素供給は成長を制限する要因となり、撹拌速度及び通気量を上げることにより酸素供給水準を改善した。２４〜３６時間の段階では、ＯＵＲを６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、３６〜６０時間の段階では、ＯＵＲを７０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持することで、菌体の成長を促進した。６０時間以降、この段階の菌体は徐々に安定期に入り、菌体の数は増加しなくなり、補酵素Ｑ１０は急速に合成して蓄積されるので、酸素供給を徐々に下げることで高い補酵素Ｑ１０生産速度を維持し、６０〜９０時間の段階では、ＯＵＲを９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、９０〜１００時間の段階は、ＯＵＲを８０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、１００時間以降はＯＵＲを６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持した。
【０１２１】
発酵プロセスにおける補充は次のように制御した。当業界で公知のように、発酵プロセスにおいて残糖及び溶存リンに応じてグルコース及びリン酸二水素カリウムを追加するほか、本発明では、電気伝導度が１５．０ｍｓ／ｃｍに低下した際に、培地の流加補充を行う。補充培地の組成は、補充液１リットルにつき、酵母粉末１２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １０ｇ、ＭｇＳＯ４  ２ｇ、ＮａＣｌ  ６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ４ｇ、ＣａＣｌ２  ２ｇ、ビオチン０．０２５ｇとし、ｐＨは７．０とし、培地の添加速度を制御することにより、電気伝導度を１５ｍｓ／ｃｍの範囲内とし、残糖を全過程にわたって２．０％に維持した。１１０時間経て発酵が終わった後、発酵液の一部を取って不活性ガス雰囲気下で抽出及び分析を行った結果、力価は３６３７ｍｇ／Ｌであり、バイオマスは１２５ｇ／ｋｇであった。
【実施例５】
【０１２２】
組換え微生物を使用する発酵による酸化型補酵素Ｑ１０の生産
平板上で約７日培養した組換えロドバクター・スフェロイデスＲＳＰ−ＢＥのシングルコロニーを選んで、小試験管の斜面培地に移して培養し、培養済の斜面を滅菌水で洗浄し、菌濃度が細胞１０８〜１０９個／ｍｌである菌懸濁液とした。得られた菌懸濁液を２％の播種量でシード培地に播種してシード培養した。ここで、培地は１００ｍｌ、３２℃、回転速度１８０ｒｐｍとし、培養時間は２２〜２６時間とした。
【０１２３】
シード培養で得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１５９２７を１０％の播種量で１０Ｌの発酵タンクに播種した。播種量は当業界の一般の含有量、例えば、１〜３０％とすることができ、好ましくは２．５〜２０％、より好ましくは５〜１５％とする。必要に応じて播種量を調整してもよい。
【０１２４】
シード液は１０Ｌの発酵タンク内で発酵し始め、発酵温度は３０℃とし、発酵タンクの単位体積の発酵液当たりの空気吸気流量は０．４ｖｖｍとし、単位体積当たりの撹拌動力は０．１ｋｗ／ｍ３とし、タンク圧は０．０２ＭＰａとし、酸素消費速度は５０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）とし、発酵液の電気伝導度は１２ｍｓ／ｃｍとし、ｐＨ値は約７．０とした。
【０１２５】
補充培地は、補充液１リットルにつき、酵母粉末１２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １０ｇ、ＭｇＳＯ４  ２ｇ、ＮａＣｌ  ６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ４ｇ、ＣａＣｌ２  ２ｇ、ビオチン０．０２５ｇを含み、ｐＨを７．０とした。
【０１２６】
１５時間後、酸素供給を増やし、発酵タンクの単位体積の発酵液当たりの空気吸気流量を０．６ｖｖｍとし、単位体積当たりの撹拌動力を０．２ｋｗ／ｍ３とし、タンク圧を０．０４ＭＰａとし、酸素消費速度を７０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に上げたからそのまま維持し、発酵液の電気伝導度を１２ｍｓ／ｃｍとし、ｐＨ値を７．０として、発酵を続け、この時の発酵は菌体の成長段階であった。
【０１２７】
２０時間後、増加酸素供給を再度増やし、発酵タンクの単位体積の発酵液当たりの空気吸気流量を０．８ｖｖｍとし、単位体積当たりの撹拌動力を０．２ｋｗ／ｍ３とし、タンク圧を０．０５ＭＰａとし、酸素消費速度を９０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に上げたからそのまま維持し、発酵液電気伝導度を１２ｍｓ／ｃｍとし、ｐＨ値を７．０として、発酵を続け、この時の発酵は菌体の成長段階であった。
【０１２８】
１０時間後、酸素消費速度を７０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）付近に維持し、発酵液の電気伝導度を１２ｍｓ／ｃｍとし、ｐＨを約６．０として、発酵を続け、この時の発酵は補酵素Ｑ１０の合成蓄積段階の前期であった。
【０１２９】
２０時間後、発酵力価の増加は平衡になり、発酵は補酵素Ｑ１０の合成蓄積段階の後期に入った。発酵タンクの単位体積の発酵液当たりの空気吸気流量を６．０ｖｖｍとし、単位体積当たりの撹拌動力を０．３ｋｗ／ｍ３とし、タンク圧を０．１ＭＰａとし、リン酸を連続的に添加することによって、約２時間でｐＨを約４．０に調節し、発酵液の電気伝導度を１２ｍｓ／ｃｍとして、発酵を続け、安定した発酵液のＯＲＰ値は１００〜２００ｍｖの範囲に維持された。
【０１３０】
１５時間後、発酵を停止し、発酵液の一部を取って不活性ガス雰囲気下で抽出及び分析を行った結果、力価は３５３３ｍｇ／Ｌで、酸化型補酵素Ｑ１０：還元型補酵素Ｑ１０は９９．３：０．７であり、バイオマスは１２３ｇ／ｋｇであった。
【０１３１】
比較例１
浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢ入れ替え無しの組換え微生物の構築
実施例１で構築した組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−ｉｒｒＥを、浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢの入れ替えを行わずに、実施例３と同様に大腸菌Ｓ１７−１コンピテントセルに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ培地上で２４時間培養し、組換え大腸菌を得た。組換え大腸菌のプラスミドを抽出し、プライマーｉｒｒＥ−Ｆ及びｉｒｒＥ−Ｒを用いてＰＣＲ検証を行い、約１．０ｋｂの断片を得たことから、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子が大腸菌Ｓ１７−１に導入されたと確認できた。
【０１３２】
得られた組換え大腸菌Ｓ１７−１の組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２−ｉｒｒＥを接合伝達によりロドバクター・スフェロイデスに導入し、ナリジクス酸及びカナマイシンを含む平板培地で培養し、組換えロドバクター・スフェロイデスＲＳＰ−ＣＥを得た。プライマーｉｒｒＥ−Ｆ及びｉｒｒＥ−Ｒを用いてＰＣＲ検証を行った結果、約１．０ｋｂの断片を得たことから、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子がロドバクター・スフェロイデスＲＳＰ−ＣＥに導入されたと確認できた。
【０１３３】
比較例２
補酵素Ｑ１０の発酵における組換え微生物の比較
実施例４の発酵方法と同様にロドバクター・スフェロイデスの元の菌株、組換えロドバクター・スフェロイデスＲＳＰ−ＢＥ及びＲＳＰ−ＣＥの発酵を行った。発酵結果を以下に示す。
【０１３４】
【表８】
2021517806.tif 000009
【０１３５】
比較例３
酸化型補酵素Ｑ１０の発酵における組換え微生物の比較
実施例５の発酵方法と同様にロドバクター・スフェロイデスの元の菌株、組換えロドバクター・スフェロイデスＲＳＰ−ＢＥ及びＲＳＰ−ＣＥの発酵を行った。発酵結果を以下に示す。
【０１３６】
【表９】
2021517806.tif 000010
【０１３７】
比較例３の結果によれば、発酵生産における高酸化還元電位による菌体への悪影響のため、ロドバクター・スフェロイデスの元の菌株の発酵を用いて得られた酸化型補酵素Ｑ１０の力価及び還元型補酵素Ｑ１０に対する比率は低かった。一方、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子はＤＮＡ損傷の修復と放射線ストレスからの保護の経路において中心的な調節作用を発揮するため、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を外因的に導入することによって、浸透圧、酸化、放射線及び熱等の様々なストレスに対する耐性を含む過酷な環境に対する微生物の耐性を改善することができ、菌の成長及び代謝活性並びにバイオマス向上の観点から好適であり、酸化型補酵素Ｑ１０の力価及び比率をある程度高めた。ただし、浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢの入れ替えは行わなかったので、組換えロドバクター・スフェロイデス菌株ＲＳＰ−ＣＥは、組換えロドバクター・スフェロイデス菌株ＲＳＰ−ＢＥに比較して、発酵液の測定で確認した力価が低かった。このように、浸透圧調節型プロモーターｐｒｏＰＢは、実際の発酵環境の条件変化に応じてｉｒｒＥの発現を効果的に調節することで、様々な強さのストレスに対する補酵素Ｑ１０生産菌の耐性を高めることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明にかかる発酵法で補酵素Ｑ１０を生産するための組換え微生物は、グローバルレギュレーターｉｒｒＥをコードする遺伝子を含むため、浸透圧、酸化、放射線及び熱等の様々なストレスに対する微生物の耐性を高めることができ、菌の対数増殖期を延長し、バイオマスのさらなる蓄積を促進するとともに、発酵プロセスにおける菌の活発な成長および代謝活性を維持することにより、補酵素Ｑ１０の収量を高め、特に酸化型補酵素Ｑ１０の収量を高めることができる。そのため、この遺伝子で構築された組換え微生物は、補酵素Ｑ１０の力価を高めることができ、特に酸化型補酵素Ｑ１０の含有量を著しく増加させることができる。したがって、本発明の方法で構築された組換え微生物は、補酵素Ｑ１０の工業的生産において広い用途がある。
【図１】
2021517806.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021517806.tif 000017
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