(57)【要約】血流中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するために使用され得るパピローマウイルスおよび改変ＳＶ４０に基づくプローブ、このようなプローブを製造するための方法、およびこのようなプローブを使用するための方法が開示される。一実施形態において、本明細書で開示されるプローブは、パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることによって、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの上記改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリによって、作製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するためのプローブであって、
ヒトまたはウシまたは他のパピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成されるキャプシドへとパッケージされた、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、プローブ。
【請求項２】
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子は、前記改変ＳＶ４０ウイルスの中でＳＶ４０ウイルス後期プロモーターの下流に挿入されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記ＳＶ４０ウイルスは、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項８】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し得るプローブをアセンブリするためのプロセスであって、
パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることを包含するか、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリを包含する、プロセス。
【請求項９】
前記共トランスフェクトすることは、ｐＳＶ−ＧＦＰおよびｐＨＰＶＬ１，２を２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトすることを包含する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記哺乳動物細胞は、２９３ＴＴ細胞である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記プローブは、マーカー遺伝子を含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１５】
ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記ＳＶ４０は、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１７】
患者において循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するための方法であって、
患者から血液を集める工程；
前記血液から有核細胞を単離する工程；
前記血液から単離した有核細胞、およびＣＴＣを検出するためのプローブを含む混合物を調製する工程であって、ここで前記プローブは、パピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成される改変キャプシドを有し、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、工程；ならびに
前記混合物中のＣＴＣを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記有核細胞は、ＰＢＭＣまたはＣＴＣを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＳＶ４０ウイルスは、（ｉ）ＳＶ４０の内因性開始コドンを排除する、（ｉｉ）４個の７２縦列反復エンハンサー配列をＳＶ４０に挿入する、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換する、（ｉｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換する、（ｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換する、および（ｖｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換する、
のうちの１または複数によって改変されている、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１８年２月１４日出願の米国仮出願第６２／６３０，５７０号（その全体において本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
政府の権益に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所の国立がん研究所によって与えられた１  Ｒ０１  ＣＡ１８７９２３−０１Ａ１および１  Ｒ０１  ＣＡ２０３８５２−０１の下で政府支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、血流中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するために使用され得るプローブ、およびこのようなプローブを使用してＣＴＣを検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発腫瘍または転移部位のいずれかから血流へと入った悪性腫瘍細胞である。ＣＴＣは、腫瘍増殖の比較的初期のステージで循環血液中に出現すると考えられている。ＣＴＣは、リキッドバイオプシーを経て容易に入手できることから、それらは、腫瘍学において、早期診断の可能性、化学療法有効性およびがんの予後の評価、ならびに個体特異的抗がん薬の選択を含む種々の適用にとって魅力的な供給源である。しかし、近年の集中的な研究にも拘わらず、血液中のＣＴＣの単離および／または検出のための効果的でかつ単純な方法は未だになく、予後不良をもたらしている。これは、比較的後期のステージまで明確で特有の臨床上の症状を生じないこともある内臓腫瘍（例えば、膵臓がんおよび肺がん）に特にあてはまる。いくつかの理由が、ＣＴＣの検出のための効率的方法がないということに寄与している。第１に、ＣＴＣは、全血球量のうちのごくわずかな部分であるに過ぎない。第２に、ＣＴＣは、これらが由来する腫瘍細胞と同様に、全ての悪性腫瘍細胞タイプの中で、特有の、十分に定義されたユニバーサルな表面マーカーを欠いている。第３に、多くのＣＴＣは上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受けており、これにより、悪性度と関連する表面マーカーの変化が生じ得ると考えられている。
【０００５】
現在、ＣＴＣの単離／同定ストラテジーには２つの大きな分類がある：１）特有の生体マーカー（すなわち、ＥｐＣＡＭ）の免疫学的認識に依拠する免疫ベースの捕捉／検出（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、および２）ＣＴＣの物理的特性を利用する技術である。各ストラテジーは、特有の欠点を有する。
【０００６】
第１の検出方法、免疫ベースの捕捉／検出（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）に関しては、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨＴＭは、免疫ベースの捕捉アプローチの例であり、ＣＴＣ検出に関してＦＤＡ承認を受けている唯一の方法である。その方法は、まず鉄ナノ粒子にコンジュゲートした抗ＥｐＣＡＭ抗体を通じてＣＴＣを結合させ、続いて、磁石で捕捉することによって全血中のＣＴＣを富化する。次いで、ＣＴＣは、以下によってさらに特徴づけられ、確認される：１）有核細胞を同定するためのＤＡＰＩ染色、２）上皮構造サイトケラチン（ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９）に関するさらなる抗体染色、ならびに３）ＣＴＣを循環白血球（ＷＢＣ）から区別する抗ＣＤ４５。これは、扱いづらくかつコストのかかる検出方法である。より重要なことには、この方法は、血液中の比較的小さな割合のＣＴＣを捕捉し得るに過ぎず、これは主に、腫瘍細胞および検出のために依拠する生体マーカーの不均一性に起因する。
【０００７】
第２の検出方法、ＣＴＣの物理的特性を利用することに関しては、物理的特性に基づくＣＴＣの単離は、ＣＴＣの比較的大きなサイズに主に依拠する。この原理に基づくいくつかの方法が報告されている。それらは、特定の孔サイズを有するフィルターベースの膜、富化ストラテジーにおいてＣＴＣのサイズおよび変形する能力の両方に依存する微小流体デバイス、ならびに密度遠心分離とサイズベースの濾過と統合したデバイスを使用することを含む。物理的特性に基づく単離の主な欠点のうちの１つは、多くの血球（例えば、単球／マクロファージ）が、サイズにおいて類似であるか、またはＣＴＣよりさらに大きく、そのため単離手順後にＣＴＣから分離されないことである。よって、物理的特性に基づく方法から単離されたＣＴＣは頻繁に、免疫染色またはＲＴ−ＰＣＲ分析（これは、扱いづらくかつコストがかかる）のいずれかによってさらに確認される必要がある。
【０００８】
従って、血液中のＣＴＣの単離および／または検出のための効果的かつ単純なデバイスおよび方法は、当該分野で必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本明細書で開示されるある種の実施形態の要旨は、以下でさらに記載される。この節が、読み手にある種の実施形態の簡潔な要旨を提供するために示されているに過ぎず、これらの説明が、本出願の範囲を限定するとは意図されないことが理解される。実際に、本開示は、本明細書で示されていないこともある種々の実施形態を含み得る。
【００１０】
血中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するためのプローブが、このようなプローブを製造するための方法、およびこのようなプローブを使用してＣＴＣを検出するための方法を含めて本明細書で開示される。一実施形態において、そのプローブは、ヒトまたはウシまたは他のパピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成されるキャプシドへとパッケージされた改変ＳＶ４０ウイルスを含み得る。そのプローブは、マーカー遺伝子を含み得、上記マーカー遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質が挙げられ得る。一実施形態において、上記ＳＶ４０ウイルスは、内因性開始コドンを排除することによるもの、４個の７２塩基対（ｂｐ）縦列反復エンハンサー配列を挿入することによるもの、ならびに／または野生型ＳＶ４０において、ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へ、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへ、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへ、および／もしくはヌクレオチド３２２をＧからＣへと置換することによるものを含む、少なくとも３つの方法で改変され得る。
【００１１】
一実施形態において、本明細書で開示されるプローブは、パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることによって、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの上記改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリによって、作製される。
【００１２】
別の実施形態において、本明細書で開示されるプローブは、血液中のＣＴＣを検出するために使用される。患者から血液が集められ、ＰＢＭＣおよびＣＴＣのような有核細胞がその血液から単離される。単離した有核細胞および本明細書で開示されるプローブを含む混合物が調製され得る。いったん混合されると、上記ＣＴＣは、その混合物中で検出され得る。
【００１３】
前述の要旨ならびに以下の詳細な説明は、添付の図面および配列表とともに読まれる場合によりよく理解される。例証目的のみのために、ある種の実施形態が図面の中で示される。しかし、本明細書で開示される発明の概念が図面に示される正確な配置および手段に限定されないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１Ａは、本明細書で開示される実施形態およびに配列番号１〜５の配列情報を従って、ＳＶ４０プローブ（ｐＳＶ−ＧＦＰ）の詳細な構成要素およびその構築のために導入される改変を図示する。改変のために使用されるシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ゲノム配列は、７７６野生株（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０２４００．１）に由来する。ラージＴおよびスモールＴ配列を、これらが合成される場合にヒト発現について最適化した。ＳＶ４０ゲノムに、以下を含むいくつかの変化を導入した：１）余分の４×７２塩基対（ｂｐ）縦列反復エンハンサー配列（配列番号１３）の挿入、２）配列番号１の６７１番、６７２番および６７７番のＣからＴへの、配列番号１の６９５番のＧからＣへのヌクレオチド変異、ならびに３）配列番号１において７０８番のヌクレオチド配列をＡからＣへと変異させて、元の開始コドンを欠失させる。ｐＳＶ−ＧＦＰにおけるＧＦＰ遺伝子は、他のマーカー遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）であってもよい。一実施形態において、そのルシフェラーゼ遺伝子は配列番号１０のものであり得る。これはＤｅｅｐ  Ｓｅａ  Ｓｈｒｉｍｐに由来し、「Ｓｌｕｃ」（分泌型ナノルシフェラーゼ）といわれるものであり、ヒト化によってならびにそれをＦｌａｇおよびＨＡタグと連結することによって改変されている。Ｓｌｕｃを選択する利点は、以下である：１）その配列は、一般に使用されるルシフェラーゼ遺伝子（例えば、ホタルおよびウミシイタケのＬｕｃ遺伝子）の配列より遙かに短く、これは、パピローマウイルスに由来するＶＬＰのパッケージング収容力が限られていることから重要である、２）Ｓｌｕｃは他のルシフェラーゼより顕著に安定であり、その結果、蓄積され検出を用意にし得る、および３）Ｓｌｕｃは本来的に分泌され、そのため検出をより容易にする。図１Ｂは、本明細書で開示される実施形態および配列番号６〜７の詳細な配列情報に従って、そのプローブをパッケージングするためのＨＰＶ１６  Ｌ１およびＬ２キャプシドを図示する。同じ改変ＳＶ４０プローブを、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）のＬ１およびＬ２タンパク質に由来するキャプシドの内部にも同じ効率でパッケージングできた（その詳細な配列情報は、配列番号８〜９）。
【図１−２】図１Ｃは、ｐＳＶ−ＧＦＰ（ＳＶ４０プローブ）がＨＰＶ  Ｌ１およびＬ２タンパク質に由来するキャプシド内部にパッケージングされた、アセンブリされた形態でのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏを図示する。
【００１５】
【図２】図２Ａは、本明細書で開示される実施形態および配列番号１１からの配列情報からの詳細な配列情報に従って、ｐｃＤＮＡ−ＧＦＰコントロール構築物（配列番号１１）を図示する。図２Ｂは、コントロールｐｃＤＮＡ−ＧＦＰがＨＰＶに由来するキャプシド内部にパッケージングされた、アセンブリされた形態でのコントロールｐｃＤＮＡ−ＧＦＰを図示する。
【００１６】
【図３−１】図３Ａは、本明細書で開示される実施形態に従って、コントロールｐｃＤＮＡ−ＧＦＰ構築物ではなくＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏによる悪性腫瘍細胞の特異的検出を図示する。図３Ｂは、本明細書で開示される実施形態に従って、ｐｃＤＮＡ−ＧＦＰコントロール構築物によるヒト肺がん細胞株（Ａ５４９および５８３８）の検出を図示する。
【図３−２】図３Ｃは、本明細書で開示される実施形態に従って、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏによるヒト肺がん細胞株（Ａ５４９および５８３８）の検出を図示する。
【００１７】
【図４】図４は、本明細書で開示される実施形態に従って、ｐｃＤＮＡ−ＧＦＰコントロール構築物に対するＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏによる悪性腫瘍細胞におけるプローブ増幅の定量的測定の比較を図示する。
【００１８】
【図５】図５は、本明細書で開示される実施形態に従って、ＰＢＭＣと混合したＡ５４９腫瘍細胞、ＰＢＭＣと混合したＡ１９４４腫瘍細胞、およびヒトＰＭＢＣ単独の（ＧＦＰ同定を通じた）ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏによる検出の比較を図示する。
【００１９】
【図６】図６は、本明細書で開示される実施形態に従って、２種の異なる腫瘍溶解性ＨＳＶベースのウイルスベクター（Ｂａｃｏ−１およびＦｕｓＯｎ−Ｈ２）による（しかし、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏによってではない）、ＰＢＭＣの非特異的検出の比較を図示する。
【００２０】
【図７】図７は、本明細書で開示される実施形態に従って、５×１０６  ＰＢＭＣを添加した単一腫瘍細胞を定量的に検出するにあたっての、ルシフェラーゼ含有ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏの能力を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本明細書で示される発明の概念が、それらの適用において、以下の説明で示されるかまたは図面の中で図示される構築の詳細または構成要素の配置に限定されないことが、理解されるべきである。本明細書で使用される表現法および用語法が説明目的に過ぎず、限定とみなされるべきではないことも理解されるべきである。
【００２２】
記載される特徴のうちのいずれか１つが、別個に、または他の特長と組み合わせて使用され得ることもさらに理解されるべきである。他の考案されたシステム、方法、特徴および利点は、図面および本明細書中の詳細な説明を試験する際に、当業者に明らかであるかまたは明らかになる。全てのこのようなさらなるシステム、方法、特徴、および利点は、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
【００２３】
血液中のＣＴＣを極めて高感度で正確に検出する単純な手順において使用され得る新規なユニバーサルプローブが、本明細書で開示される。本明細書で使用される場合、用語「ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏ」とは「ＣＴＣユニバーサルプローブ」を表し、２つの重要な構成要素を含む新規なプローブである。その第１の構成要素である、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）および／もしくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）もしくは他の種に由来するパピローマウイルスのＬ１およびＬ２タンパク質から形成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、そのプローブが他の血球ではなくＣＴＣに選択的に侵入することを可能にする。これにより、そのプローブは、血流中でＣＴＣを検出するための極めて高度の特異性を得る。その第２の構成要素である、マーカー遺伝子を含みＶＬＰにパッケージングされる本明細書で開示される改変ＳＶ４０ウイルスゲノムは、そのプローブが、腫瘍細胞内で大々的に増幅されることを可能にする。これにより、そのプローブは、血中で希にしか現れずかつ低濃度であるＣＴＣを検出するための高い感度を得る。専らＳＶ４０に基づくプローブに伴う大きな問題は、それらがＣＴＣに加えて他の血球（例えば、Ｔ細胞および単球）にも進入し得ることである。ＳＶ４０キャプシドをＨＰＶまたは他のパピローマウイルスから形成されるＶＬＰで置き換えることは、がん細胞の大部分が上皮起源のものであり、パピローマウイルスが専ら上皮細胞に感染するという事実を利用する。従って、この新規なプローブは、ＨＰＶ−ＶＬＰ媒介性進入の特異性およびＳＶ４０増幅によって提供される感度を併せ持つ。
【００２４】
健常ドナーから調製された単核細胞を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を有するＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏと混合する場合、単一のＧＦＰ陽性細胞は検出されない。健常ドナーから調製された同じ単核細胞をルシフェラーゼマーカー遺伝子を有するＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏと混合する場合、非常に低いバックグラウンドシグナルのみが高感度の機械で検出された。これらは、そのプローブの極度の特異性を証明する。なぜならそのプローブは、いかなる正常な血球をも検出しないからである。しかし、腫瘍細胞を添加した同じ単核細胞をこのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏと混合した場合、その腫瘍細胞は高い精度および感度で検出される。その同じ実験を、異なる組織起源のほぼ十数種の腫瘍細胞で反復し得、各場合において、その添加した腫瘍細胞はそのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏで容易に検出される。これは、そのプローブが、実質的に全ての腫瘍タイプを検出するためにユニバーサルに使用され得ることを証明する。タグ化膜タンパク質を有するＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、さらなる分析のためにＣＴＣを正確に集めることを可能にする。
【００２５】
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、ＣＴＣを簡便に信頼性高く検出するための特異的かつ高感度のプローブであり、これは、広範囲のがんタイプのより早期の診断、化学療法有効性およびがん予後のより良好な評価、ならびに個体特異的抗がん薬のより良好な選択をもたらし得る。
【００２６】
一実施形態において、そのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、改変ＳＶ４０ウイルスに基づく。これは、短期間内で非常に大きな増幅を受け得、検出における高感度を可能にする。
【００２７】
一実施形態において、プローブの選択性を増大させるために、そのＳＶ４０ウイルスは、元のキャプシドをウイルス様粒子で置き換えることによって改変され得る。例えば、そのキャプシドは、ヒトパピローマウイルス１６のＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質によって形成され得る。
【００２８】
一実施形態において、そのプローブは、ＳＶ４０ウイルスの改変によって調製され得、その結果、そのプローブは、検出を容易にするためにマーカー遺伝子を有する。例示に過ぎないが、そのマーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、またはタグ（例えば、ＨＡタグ）を含む膜タンパク質であり得る。そのマーカー遺伝子は、ＳＶ４０後期プロモーターの下流に挿入され、その結果、そのマーカーはそのウイルスとともに増幅し、ウイルスを検出可能にする。ＳＶ４０遺伝子の後期プロモーターも改変され得、マーカー遺伝子の増幅を増大させる。例えば、ＳＶ４０内因性開始コドンからの干渉は、野生型ＳＶ４０におけるヌクレオチド３３５のアデニン（Ａ）をシトシン（Ｃ）で置換する（配列番号１において７０８をＡからＣにするものとして示される）ことによって排除され得、これは、そのマーカー遺伝子の発現を促進する。なお別の実施形態において、配列番号１２にさらに示される７２塩基対エンハンサー配列（配列番号１の２５２〜３２３）はさらに４回反復され（配列番号１３）、２８８ｂｐのエンハンサーとして挿入され、後期プロモーターの活性を強化する。さらに、野生型ＳＶ４０において２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へ、２９９をＣからＴへ、および３０４をＣからＴへ（配列番号１において６７１、６７２および６７７をＣからＴにするものとして示される）とする一連のヌクレオチド置換も、後期プロモーターの活性を強化し得る。さらなる改変は、野生型ＳＶ４０において３２２番においてＧからＣへのヌクレオチド変異（配列番号１において６９５をＧからＣにするものとして示される）を含み得る。全てのこれらの改変は、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏの極めて高い検出感度を可能にするために重要である。
【００２９】
例示に過ぎないが、図１Ａ〜図１Ｃは、本明細書で記載されるＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏプローブの構築を図示する。そのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏ（図１Ｃ）は、ｐＳＶ−ＧＦＰ（図１Ａ）およびｐＨＰＶＬ１，２（図１Ｂ）を２９３ＴＴ細胞（これは、高レベルのＳＶ４０のラージＴおよびスモールＴ抗原を発現する１４）に共トランスフェクトすることによって形成され得る。他の哺乳動物細胞も、生成効率がわずかに低いとはいえ使用され得る。そのｐＳＶ−ＧＦＰは、ＨＰＶに由来するキャプシド内部にパッケージされる。４８〜７２時間後にその細胞は集められ、溶解緩衝液でまたは超音波処置を通じて溶解され得る。そのプローブは、細胞デブリを遠心沈殿させた後にその上清を採取することによって集められ得る。別の実施形態において、そのプローブは、ＧＥ  Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００カラムを通過させ、次いでＰＤ−１０カラムを通過させることによって、または他の精製手順によってさらに精製され得る。
【００３０】
なお別の実施形態において、そのプローブの力価は、その採取したプローブの連続希釈物と２９３ＴＴ細胞とをインキュベートすることによって力価測定され得、ここでＧＦＰ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって定量され得る。
【００３１】
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏプローブは、精製Ｌ１とｐＳＶ−ＧＦＰ構築物とを混合することによって、またはＬ１およびＬ２でトランスフェクトした２９３ＴＴ細胞から採取したＶＬＰとｐＳＶ−ＧＦＰ構築物とを混合することのいずれによっても、インビトロでアセンブリされ得る。
【００３２】
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏ  −  健常細胞からの腫瘍細胞の選択的検出
【００３３】
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、腫瘍細胞のみを検出する。例えば、２種の異なるヒト肺がん細胞株に由来する腫瘍細胞および健常血液に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、等量のＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏと混合し、２４〜７２時間インキュベートし得る。図３Ａに示されるように、蛍光顕微鏡下で撮影した写真は、ＧＦＰ陽性細胞が肺がん細胞株において広く検出されること、およびＧＦＰ陽性細胞がＰＢＭＣで検出されないことを示す。２８種の腫瘍細胞株（以下の表１で同定される）に由来する腫瘍細胞および３名の異なるドナーに由来するＰＢＭＣを使用する実施形態において、そのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、類似の結果を達成した。
表１．腫瘍細胞株
【表１】
2021513845.tif 000002
【００３４】
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏ  −  プローブ中のＴ抗原の存在の結果としての腫瘍細胞中での自己増幅
【００３５】
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、広く種々の悪性腫瘍細胞において自己増幅し得る。例えば、一実施形態において、コントロール構築物は、そのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏと同じＨＰＶキャプシド殻の中にパッケージされ得る。図２Ａ〜２Ｂに図示されるように、このコントロールは、強力な哺乳動物プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ−Ｐ）によって駆動されるＧＦＰ、およびＳＶ４０複製起点（Ｏｒｉ）およびプロモーターを含むｐｃＤＮＡ−ＧＦＰコントロール構築物（図２Ａ）を含み得る。そのコントロール構築物（図２Ｂ）は、ｐｃＤＮＡ−ＧＦＰコントロール構築物（図２Ａ）およびｐＨＰＶＬ１，２（図１Ｂ）を２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトすることによって形成され得る。そのｐｃＤＮＡ−ＧＦＰコントロール構築物は、ＨＰＶに由来するキャプシドの内部へとパッケージされる。そのｐｃＤＮＡ−ＧＦＰ単独では、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏ中に含まれ自己増幅に必要なＴ抗原１５を欠いている。
【００３６】
一実施形態において、２種のヒト肺がん細胞株（Ａ５４９および５８３８）は、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏまたはｐｃＤＮＡ−ＧＦＰ  コントロール構築物のいずれかとともにインキュベートされ得る。図３Ｂに示されるように、２４時間後および７２時間後にｐｃＤＮＡ−ＧＦＰを含むウェルにおいてＧＦＰは低く検出される。対照的に、図３Ｃに示されるように、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏを含むウェルにおいて高レベルのＧＦＰが存在し、これは、そのプローブの顕著な増幅を示す。当業者は、その高い増幅がＴ抗原の存在に起因することを理解する。
【００３７】
なお別の実施形態において、２９３ＴＴ細胞（これは、自己増殖に必要なＴ抗原を発現する）は、ｐｃＤＮＡ−ＧＦＰ構築物およびＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏの両方とともにインキュベートされ得る。例示に過ぎないが、図３Ｂは、ｐｃＤＮＡ−ＧＰＦおよび２９３ＴＴ細胞を有するウェルにおけるＧＦＰ発現の増大を示し、これはＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏおよび２９３ＴＴ細胞が代わりに使用される図３Ｃに認められるものに類似する。繰り返しになるが、当業者は、２９３ＴＴ細胞におけるｐｃＤＮＡ−ＧＦＰ構築物によるＧＦＰの増強された検出が、自己増幅を引き起こすＴ抗原の付加に起因することを理解する。
【００３８】
なお別の実施形態において、蛍光イルミネーターは、２９３ＴＴ細胞の添加ありでも添加なしでも、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏおよびｐｃＤＮＡ−ＧＦＰ構築物によるＧＦＰ発現を定量するために使用され得る（各インキュベーションに関して三連のウェル）。図４は、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏがＣＴＣに進入後におよそ８０倍自己増幅し得ること（つまり、検出感度の顕著な増強）を図示する。Ｔ抗原から生じる増幅の増大は、Ｔ抗原が自己増幅に必要であること、およびＴ抗原の発現を操作することによって自己増幅がさらに改善され得ることを含むことも明らかに示す。
【００３９】
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏ  −  広い範囲の腫瘍細胞の検出
【００４０】
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、広い範囲の腫瘍細胞を検出し得る。例示に過ぎないが、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏが希なＣＴＣを検出する能力を決定するために、５００万個のヒトＰＢＭＣを種々の数の腫瘍細胞と混合し得、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏとともにインキュベートし得る。図５に示されるように、ＣＴＣは、ＰＢＭＣ中のＣＴＣの濃度が１：５，０００，０００程度の低さである場合ですら、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏによって検出され得る。
【００４１】
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、ＣＴＣを極めて高感度で定量的に検出し得る。例示に過ぎないが、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏが希なＣＴＣを検出する能力を決定するために、５００万個のヒトＰＢＭＣを、種々の数の腫瘍細胞と混合し得、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏとともにインキュベートし得る。図７に示されるように、ＣＴＣは、ＰＢＭＣ中のＣＴＣの濃度が１：５，０００，０００程度の低さである場合ですら、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏによって定量的に検出され得る。
【００４２】
別の実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、種々の組織起源の悪性腫瘍細胞に由来するＣＴＣを検出し得る。例示に過ぎないが、ＰＢＭＣを４８タイプを超える腫瘍細胞と混合し得、その混合物中のそれらの全てをＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏで容易に検出し得る。例示に過ぎないが、図３Ａは、ｐｃＤＮＡ−ＧＦＰではなくＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏが、３種の異なる器官組織起源の腫瘍細胞（肺に由来するＨ１９４４およびＨ３５８、肝臓に由来するＨｕｈ−７、および前立腺に由来するＰＣ−３）を容易に検出し得ることを示す。従って、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、多くの異なる組織に由来するＣＴＣ（表１に列挙されるとおり）を検出するにあたってユニバーサルな能力を有する。
【００４３】
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏ  −  他のウイルスベースの検出方法との比較
【００４４】
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、他の検出器より高感度で血流中のＣＴＣを検出し得る。例えば、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によるＣＴＣの検出と比較される。ＨＳＶは、ＣＴＣを検出し得るが、正常血球（例えば、リンパ球、単球、および樹状細胞）にも感染し得、特異性の問題をもたらす１６〜２０。Ｂａｃｏ−１（ＨＳＶ−１に由来する）およびＦｕｓＯｎ−Ｈ２（ＨＳＶ−２に由来する）は、ＧＦＰ遺伝子を含む２１，２２。ヒトＰＢＭＣは、Ｂａｃｏ−１、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２、またはＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏのいずれかとインキュベートされ得る。図６は、インキュベーション後２４時間程度の期間での腫瘍溶解性ＨＳＶを含むウェルにおけるＧＦＰ検出、および７２時間のインキュベーション後のＧＦＰ検出の顕著な増大を図示する。比較において、ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏを含むウェルでは、７２時間後にＧＦＰ陽性細胞は検出されなかった。腫瘍溶解性ＨＳＶをＣＴＣの検出に使用した場合、それらは顕著な偽陽性診断を生じると思われる。さらに、ＨＳＶは、その細胞溶解性の性質に起因して短い時間量でＣＴＣを破壊し得、ＣＴＣの不正確な定量を引き起こし、ＣＴＣのその後の採取の可能性を排除する。
【００４５】
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、ＨＰＶ−１６が上皮細胞にのみ感染する能力２３に起因してＣＴＣに対して極めて高い特異性を有する。これは、臨床状況において、がん患者から血液が採血され、そこからＰＢＭＣが単離されるからである。ＰＢＭＣは上皮起源ではないので、それらはＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏが検出（すなわち、感染）できない（例えば、図３Ａに示されるとおり）。ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏによって検出され得る唯一の細胞は、ＰＢＭＣに含まれるＣＴＣのみである。
【００４６】
一実施形態において、がん患者の血液が集められる。血液からＰＢＭＣは分離され、そのＰＢＭＣは、本明細書で記載されるＣＴＣ−Ｕｎｉｐｒｏによる検出の前に種々の比で腫瘍細胞と混合される。次いで、ＣＴＣは、ＣＴＣ−Ｕｎｉｐｒｏを使用して検出され得る。そのＣＴＣ−Ｕｎｉｐｒｏは、例えば、緑色としてＣＴＣを示すことによって、それらを同定し得る（例えば、図５）。
【実施例】
【００４７】
細胞株およびＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏの構築のためのウイルス
２９３ＴＴ細胞株を、国立がん研究所から得た。肺がん細胞株Ａ５４９、Ｈ１９４４、５８３８およびＨ３５８、ならびにアフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。２９３ＴＴ細胞を、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、１００ユニット／ｍＬ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、１％  非必須アミノ酸、および１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を補充したＤＭＥＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｓｏｕｔｈ  Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）中で培養した。他の細胞を、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。全ての細胞を、５％  ＣＯ２を有する加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベースの腫瘍溶解性ウイルスＢａｃｏ−１およびＨＳＶ−２ベースのＦｕｓＯｎ−Ｈ２を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｕｓｔｏｎ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて最初から構築した。両方のウイルスはＧＦＰ遺伝子を含むので、それらの感染は、緑色の蛍光細胞またはプラークの出現によって容易に同定可能であり得る。それらを増幅させ、本明細書で記載されるようにＶｅｒｏ細胞で力価測定した。ＧＦＰの代わりにＬｕｃ遺伝子は、より正確な定量的測定を可能にし得る。タグ（例えば、ＨＡタグ）を含む膜タンパク質は、磁性ビーズにコンジュゲートした抗ＨＡ抗体の使用を通じて、ＣＴＣのその後の容易な採取を可能にし得る。
【００４８】
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏおよびコントロールベクターの調製および精製
構築ストラテジーの詳細は、図１Ａ〜図１Ｃに図示される。ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏは、２つの重要な構成要素を含む：特定のＣＴＣ診断プローブ（ｐＳＶ−ＧＦＰ）（図１Ａ）、およびプローブがＣＴＣに進入しその後の増幅および検出を可能にするパッケージングシステム（ｐＨＰＶ１，２）（図１Ｂ）。図１Ａに示されるように、そのｐＳＶ−ＧＦＰを、野生型（ｗｔ）ＳＶ４０ゲノムに基づいていくつかの改変とともにデザインした。最初に、そのＳＶ４０ゲノムに沿ってヌクレオチド（ｎｔ）３７１〜２５３２のＶＰ１〜３キャプシド遺伝子全体を欠失させ、ＧＦＰ遺伝子で置き換えた。その欠失させた領域は天然のポリＡシグナルを含むことから、合成ポリＡをそのＧＦＰ遺伝子の最後に挿入し戻した。ＧＦＰ発現を増強するために、３種の改変をＳＶ４０後期プロモーター領域に対して行った。第１に、７２塩基対反復のさらなる４コピーを天然の２１塩基対反復および２×７２塩基対反復の下流に付加して、その後期プロモーターを強化した。第２に、以下を含む一連の変異をその後期プロモーターに導入した：ヌクレオチド２９８、２９９、３０４においてＣからＴへ、およびヌクレオチド３２２においてＧからＣへ、ならびにヌクレオチド３３５においてＡからＣへ。そのパッケージング構築物であるｐＨＰＶＬ１，２を、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６の配列に基づいて、Ｌ１およびＬ２遺伝子の両方を合成することによって構築した。これら２種の遺伝子は、２Ａ配列によって分離される。
【００４９】
上述の改変を、ヒト細胞発現のためのコドン最適化を伴うＤＮＡ合成を通じて行い、その合成を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって行った。そのコントロールベクターは、ｐｃＤＮＡ−ＧＦＰに由来した（図１Ｃ）。そのコントロールベクターは、ＳＶ４０  Ｏｒｉ−Ｐ配列のコピーならびにＧＦＰカセット（そのマーカー遺伝子はＣＭＶプロモーターによって駆動された）を含んだ。ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏおよびそのコントロールベクターの生成のために、２９３ＴＴ細胞をトランスフェクションの１６時間前に１０ｃｍディッシュにプレーティングした。プラスミドｐＨＰＶＬ１，２をｐＳＶ−ＧＦＰまたはｐＣＤＮＡ−ＧＦＰのいずれかと混合し、次いで、その混合物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトした。これらの共トランスフェクションにより、ｐＨＡＶ１，２から発現したＬ１およびＬ２はウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成し、次いで、これは、そのプローブ（ｐＳＶ−ＧＦＰ）またはそのコントロールベクター（ｐｃＤＮＡ−ＧＦＰ）をパッケージし得る。そのトランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの４８時間後または７２時間後に採取した。細胞ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、その後、それらを懸濁し、溶解緩衝液：９．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  １００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および０．１％  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）および２５ｍＭ  ＮＨ４ＳＯ４（ｐＨ９）を補充したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解して、そのプローブを放出させた。その溶解物を３７℃において２４時間インキュベートしてＶＬＰを成熟させ、その後、５Ｍ  ＮａＣｌを添加して最終濃度８５０ｍＭにした。その溶解物を氷上で短時間冷却し、その後、それらを５，０００ｇにおいて５分間４℃で遠心分離した。その清澄化したプローブを、ＧＥ  Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００およびＤＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で製造業者のプロトコールに従ってさらに精製した。その精製したプローブについて、小さいアリコートを２９３ＴＴ細胞とともに４８時間インキュベートすることによって定量した。ＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）によって確認し、フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって定量した。
【００５０】
ヒトＰＢＭＣ調製
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から得られるバッフィーコートから調製した。そのバッフィーコートを等量のＰＢＳと混合し、その後、それらをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）に載せ、ブレーキを外して室温において８００ｇで３０分間の遠心分離を行った。ＰＢＭＣを血漿：Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ境界面にある層から集め、２％  ＦＢＳ−ＰＢＳで２回洗浄した。その細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で処理して赤血球を除去し、再び２％  ＦＢＳ−ＰＢＳで２回洗浄した。その精製したＰＢＭＣを実験のために直接使用した。
【００５１】
プローブによる腫瘍細胞検出
ＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏが腫瘍細胞の中で増幅する能力を試験するために、種々の組織起源の１〜２×１０５  腫瘍細胞を、１２ウェルプレートまたは２４ウェルプレートで一晩プレーティングした。次いで、２感染単位（ＩＵ）／細胞のＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏまたはコントロールベクターのいずれかとともに、各個々の実験に依存して２４〜９６時間にわたって、細胞をインキュベートした。次いで、細胞を蛍光顕微鏡下で分析した。臨床診断の状況を模倣するために、１０個または１００個のがん細胞を、１２ウェルプレートにおいてＲＰＭＩ１６４０  ＋  １０％  ＦＢＳ中で２×１０６  ＰＢＭＣと混合した。その混合した細胞またはＰＢＭＣ単独を、１×１０７  ＩＵのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏとともに３７℃で７２時間インキュベートした。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＰＢＭＣに感染する能力を試験するために、細胞を、Ｂａｃｏ−１またはＦｕｓＯｎ−Ｈ２のいずれかに１ｐｆｕで７２時間にわたって感染させた。
【００５２】
ＧＦＰ定量
がん細胞におけるプローブ強度を定量的に測定するために、記載の細胞を、２ＩＵのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏまたはそのコントロールベクターのいずれかとともにインキュベートした。その細胞を７２時間後に採取した。ＧＦＰの定量的測定を、ＧＦＰ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）で行った。簡潔には、その採取した細胞をアッセイ緩衝液で１０分間溶解した。その上清を遠心分離によって清澄化し、その後、それらを９６ウェルプレートへと移した。そのサンプルを蛍光マイクロプレートリーダー（ＶｉｃｔｏｒＴＭ  Ｘ４，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）で定量した。
【図１−１】
2021513845.tif 000003
【図１−２】
2021513845.tif 000004
【図２】
2021513845.tif 000005
【図３−１】
2021513845.tif 000006
【図３−２】
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【図４】
2021513845.tif 000008
【図５】
2021513845.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月12日(2020.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するためのプローブであって、
ヒトまたはウシまたは他のパピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成されるキャプシドへとパッケージされた、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、プローブ。
【請求項２】
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子は、前記改変ＳＶ４０ウイルスの中でＳＶ４０ウイルス後期プロモーターの下流に挿入されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記ＳＶ４０ウイルスは、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項８】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し得るプローブをアセンブリするためのプロセスであって、
パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることを包含するか、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリを包含する、プロセス。
【請求項９】
前記共トランスフェクトすることは、ｐＳＶ−ＧＦＰおよびｐＨＰＶＬ１，２を２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトすることを包含する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記哺乳動物細胞は、２９３ＴＴ細胞である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記プローブは、マーカー遺伝子を含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１５】
ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記ＳＶ４０は、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１７】
患者から集めた血液において循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するための方法であって、
前記血液から有核細胞を単離する工程；
前記血液から単離した有核細胞、およびＣＴＣを検出するためのプローブを含む混合物を調製する工程であって、ここで前記プローブは、パピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成される改変キャプシドを有し、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、工程；ならびに
前記混合物中のＣＴＣを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記有核細胞は、ＰＢＭＣまたはＣＴＣを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＳＶ４０ウイルスは、（ｉ）ＳＶ４０の内因性開始コドンを排除する、（ｉｉ）４個の７２縦列反復エンハンサー配列をＳＶ４０に挿入する、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換する、（ｉｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換する、（ｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換する、および（ｖｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換する、
のうちの１または複数によって改変されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するための組成物であって、
ヒトまたはウシまたは他のパピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成されるキャプシドへとパッケージされた、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
ＧＦＰ定量
がん細胞におけるプローブ強度を定量的に測定するために、記載の細胞を、２ＩＵのＣＴＣ−ＵｎｉＰｒｏまたはそのコントロールベクターのいずれかとともにインキュベートした。その細胞を７２時間後に採取した。ＧＦＰの定量的測定を、ＧＦＰ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）で行った。簡潔には、その採取した細胞をアッセイ緩衝液で１０分間溶解した。その上清を遠心分離によって清澄化し、その後、それらを９６ウェルプレートへと移した。そのサンプルを蛍光マイクロプレートリーダー（ＶｉｃｔｏｒＴＭ  Ｘ４，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）で定量した。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するためのプローブであって、
ヒトまたはウシまたは他のパピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成されるキャプシドへとパッケージされた、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、プローブ。
（項目２）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１に記載のプローブ。
（項目３）
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、項目２に記載のプローブ。
（項目４）
前記マーカー遺伝子は、前記改変ＳＶ４０ウイルスの中でＳＶ４０ウイルス後期プロモーターの下流に挿入されている、項目１に記載のプローブ。
（項目５）
前記ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目６）
前記ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目７）
前記ＳＶ４０ウイルスは、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目８）
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し得るプローブをアセンブリするためのプロセスであって、
パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることを包含するか、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリを包含する、プロセス。
（項目９）
前記共トランスフェクトすることは、ｐＳＶ−ＧＦＰおよびｐＨＰＶＬ１，２を２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトすることを包含する、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
前記哺乳動物細胞は、２９３ＴＴ細胞である、項目８に記載のプロセス。
（項目１１）
前記プローブは、マーカー遺伝子を含む、項目８に記載のプロセス。
（項目１２）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１１に記載のプロセス。
（項目１３）
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、項目１１に記載のプロセス。
（項目１４）
ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１５）
ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１６）
前記ＳＶ４０は、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１７）
患者において循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するための方法であって、
患者から血液を集める工程；
前記血液から有核細胞を単離する工程；
前記血液から単離した有核細胞、およびＣＴＣを検出するためのプローブを含む混合物を調製する工程であって、ここで前記プローブは、パピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成される改変キャプシドを有し、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、工程；ならびに
前記混合物中のＣＴＣを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
前記有核細胞は、ＰＢＭＣまたはＣＴＣを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記ＳＶ４０ウイルスは、（ｉ）ＳＶ４０の内因性開始コドンを排除する、（ｉｉ）４個の７２縦列反復エンハンサー配列をＳＶ４０に挿入する、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換する、（ｉｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換する、（ｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換する、および（ｖｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換する、
のうちの１または複数によって改変されている、項目１７に記載の方法。
【国際調査報告】
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