(57)【要約】  本発明は、遺伝子操作された微生物ならびにエチレングリコールおよびエチレングリコールの前駆体の生物学的生産のための方法を提供する。特に、本発明の微生物は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、オキサロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびグリシンうちの１つ以上を介して、エチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する。本発明はさらに、エチレングリコールまたはポリエチレンテレフタレートなどのエチレングリコールのポリマーを含む組成物を提供する。【選択図】図１
2021506247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガス状基質からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成できる遺伝子操作された微生物。
【請求項２】
前記微生物が、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、オキサロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびグリシンからなる群から選択される１つ以上の中間体を介してエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記微生物が、
ａ．オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、
ｂ．グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素、
ｃ．イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる異種酵素、および
ｄ．グリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素、のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
ａ．オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる前記異種酵素が、クエン酸［Ｓｉ］−シンターゼ［２．３．３．１］、ＡＴＰクエン酸シンターゼ［２．３．３．８］またはクエン酸（Ｒｅ）−シンターゼ［２．３．３．３］であり、
ｂ．グリシンをグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、アラニン−グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、セリン−グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４５］、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］、グリシン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ［２．６．１．３５］、グリシントランスアミナーゼ［２．６．１．４］、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１０］、アラニンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、またはグリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．２．１］であり、
ｃ．イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、イソクエン酸リアーゼ［４．１．３．１］であり、かつ／または
ｄ．グリコール酸をグリコールアルデヒドに変換できる前記異種酵素が、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２１］、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２２］、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２４］、２，５−ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ［１．２．１．２６］、アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．３／４／５］、ベタイン−アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．８］、またはアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ［１．２．７．５］である、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
前記異種酵素のうちの１つ以上が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、およびＺｅａからなる群から選択される属に由来する、請求項３に記載の微生物。
【請求項６】
前記異種酵素のうちの１つ以上が、前記微生物における発現のためにコドン最適化されている、請求項３に記載の微生物。
【請求項７】
前記微生物は、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換できる酵素、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、ピルビン酸をリンゴ酸に変換できる酵素、ピルビン酸をホスフェノールピルビン酸に変換できる酵素、オキサロ酢酸をシトリル−ＣｏＡに変換できる酵素、シトリル−ＣｏＡをクエン酸に変換できる酵素、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換きる酵素、ホスホエノールピルビン酸を２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換できる酵素、２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換できる酵素、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホノオキシピルビン酸に変換できる酵素、３−ホスホノオキシピルビン酸を３−ホスホ−Ｌ−セリンに変換できる酵素、３−ホスホ−Ｌ−セリンをセリンに変換できる酵素、セリンをグリシンに変換できる酵素、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、Ｄ−グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、リンゴ酸をグリオキシル酸に変換できる酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換できる酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３に記載の微生物。
【請求項８】
前記微生物が、
ａ．前記オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、
ｂ．前記グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素および／または
ｃ．前記グリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素、を過剰発現する、請求項３に記載の微生物。
【請求項９】
前記微生物が、
ａ．前記ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、
ｂ．前記クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、
ｃ．前記ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、
ｄ．前記セリンをグリシンに変換できる酵素、
ｅ．前記５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、
ｆ．前記グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、および／または
ｇ．前記グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、を過剰発現する、請求項７に記載の微生物。
【請求項１０】
前記微生物が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上に破壊的変異を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項１１】
前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである、請求項１に記載の微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する、請求項１に記載の微生物。
【請求項１３】
前記微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される親細菌に由来する、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
前記微生物が、天然または異種のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項１５】
前記エチレングリコールの前駆体がグリオキシル酸またはグリコール酸である、請求項１に記載の微生物。
【請求項１６】
前記ガス状基質の存在下、栄養培地中で請求項１に記載の微生物を培養し、それによって前記微生物がエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成することを含む、エチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体の生成方法。
【請求項１７】
前記ガス状基質が、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記エチレングリコールの前駆体がグリオキシル酸またはグリコール酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記栄養培地からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を分離することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物がエタノール、２，３−ブタンジオール、およびコハク酸うちの１つ以上をさらに生成する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本発明は、遺伝子操作された微生物と、微生物発酵による、具体的には、ガス状基質の微生物発酵によるにエチレングリコールおよびエチレングリコール前駆体の生産のための方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
モノエチレングリコール（ＭＥＧ）としても知られるエチレングリコールの現在の市場価値は３３０億ドルを超え、多種多様な産業、医療、消費者製品の重要な構成要素である。エチレングリコールは現在、大量のエネルギーと水を必要とし、多くの望ましくない副産物を生成し、石油化学原料に依存する化学触媒プロセスを使用して生産されている。持続可能な材料の需要は、サトウキビ由来のエタノールからのエチレングリコールの触媒的な生産など、いくつかの技術進歩をもたらしている。
【０００３】
エチレングリコール前駆体も商業的に価値がある。例えば、グリコール酸はスキンケア、パーソナルケア、染色、日焼け、および洗浄剤として使用される。グリオキシル酸は、バニリン、農薬、抗生物質、アラントイン、および錯化剤の中間体である。
【０００４】
しかしながら、エチレングリコールを生物学的に生産できる微生物は知られておらず、エチレングリコールの生産への完全な生物学的経路は十分に確立されていない。糖からのエチレングリコールへのいくつかの生物学的経路が文献に記載されている。例えば、Ａｌｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ，１４：１２７，２０１５は、Ｅ．ｃｏｌｉでの（Ｄ）−キシロースからのエチレングリコールの生成を実証したが、高収量を達成するには好気性条件が必要であることに着目した。同様に、Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ，３４：８０−８７，２０１６では、Ｅ．ｃｏｌｉでのペントースからのエチレングリコール生成を達成した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのペントースからのエチレングリコール生成に関するいくつかの研究も行われているが、一貫性のない結果が示されている。例えば、Ｕｒａｎｕｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ，５１：２０−３１，２０１８を参照されたい。
【０００５】
ガス発酵は、産業廃棄ガス、合成ガス、化学薬品や燃料に改質されたメタンなど、すぐに入手できる低コストのＣ１原料を幅広く使用するための経路を提供する。ガス発酵代謝は糖発酵代謝とは大きく異なるので、上記の経路の使用は、これらの経路がエネルギーネガティブプロセスである糖新生を介してガスから糖前駆体を生成する必要があるため、実用的ではない。今日まで、ガス状基質からエチレングリコールを製造する方法は得られていない。
【０００６】
Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ，４１：１７３−１８１，２０１７は、探索的演習で、ケモインフォマティクスツールを使用してＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉａで合成ガスからエチレングリコールを生成するための数百の仮説的な経路を予測した。しかしながら、経路の多くは熱力学的または他の制約のために実行不可能であるため、当業者でさえこれらの経路をガス発酵生物に組み込むことは不可能である。例えば、Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．には、ほぼ２，０００の酸素または酸素ラジカルに依存する反応が含まれており、厳密な嫌気性システムでは実行できない。既知の反応を有するＩｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．による唯一確認された仮説の経路は、中間体として糖新生またはエタノールを必要とする。したがって、ガス状基質から高収量のエチレングリコールおよびエチレングリコール前駆体を生成することができる、有効な、エネルギー的に好ましい組換え生成システムが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明が従来技術に勝る特定の利点および進歩を提供するのは、上記の背景においてである。
【０００８】
本明細書に開示される本発明は、特定の利点または機能に限定されないが、本発明は、ガス状基質からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成できる遺伝子操作された微生物を提供する。
【０００９】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様において、微生物は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、オキサロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびグリシンからなる群から選択される１つ以上の中間体を介してエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する。
【００１０】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる異種酵素、およびグリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素のうちの１つ以上を含む。
【００１１】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様において、オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる前記異種酵素が、クエン酸［Ｓｉ］−シンターゼ［２．３．３．１］、ＡＴＰクエン酸シンターゼ［２．３．３．８］またはクエン酸（Ｒｅ）−シンターゼ［２．３．３．３］であり、グリシンをグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、アラニン−グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、セリン−グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４５］、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］、グリシン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ［２．６．１．３５］、グリシントランスアミナーゼ［２．６．１．４］、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１０］、アラニンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、またはグリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．２．１］であり、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、イソクエン酸リアーゼ［４．１．３．１］であり、かつ／またはグリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる前記異種酵素が、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２１］、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２２］、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２４］、２，５−ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ［１．２．１．２６］、アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．３／４／５］、ベタイン−アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．８］、またはアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ［１．２．７．５］である。
【００１２】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、異種酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、およびＺｅａからなる群から選択される属に由来する。
【００１３】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、異種酵素のうちの１つ以上は、微生物における発現のためにコドン最適化されている。
【００１４】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換できる酵素、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、ピルビン酸をリンゴ酸に変換できる酵素、ピルビン酸をホスフェノールピルビン酸に変換できる酵素、オキサロ酢酸をシトリル−ＣｏＡに変換できる酵素、シトリル−ＣｏＡをクエン酸に変換できる酵素、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換きる酵素、ホスホエノールピルビン酸を２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換できる酵素、２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換できる酵素、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホノオキシピルビン酸に変換できる酵素、３−ホスホノオキシピルビン酸を３−ホスホ−Ｌ−セリンに変換できる酵素、３−ホスホ−Ｌ−セリンをセリンに変換できる酵素、セリンをグリシンに変換できる酵素、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、Ｄ−グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、リンゴ酸をグリオキシル酸に変換できる酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換できる酵素、かつ／またはグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、のうちの１つ以上をさらに含む。
【００１５】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素、および／またはグリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素を過剰発現する。
【００１６】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様において、微生物は、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、クエン酸をアコニット酸に、アコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、セリンをグリシンに変換できる酵素、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素および／またはグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、を過剰発現する。
【００１７】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素の破壊的変異を含む。
【００１８】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである。
【００１９】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する。
【００２０】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される親細菌に由来する。
【００２１】
本明細書に開示されている微生物のいくつかの態様では、微生物は、天然または異種のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む。
【００２２】
本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、エチレングリコールの前駆体としてグリオキシル酸またはグリコール酸を生成する。
【００２３】
本発明はさらに、本明細書に開示される微生物を栄養培地中および基質の存在下で培養することを含み、それにより微生物はエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する、エチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する方法を提供する。
【００２４】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、基質は、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２のうちの１つ以上を含む。
【００２５】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、基質の少なくとも一部は、産業廃棄ガス、産業オフガス、または合成ガスである。
【００２６】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、微生物は、エチレングリコールの前駆体としてグリオキシル酸またはグリコール酸を生成する。
【００２７】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、方法は、栄養培地からエチレングリコールまたはエチレングリコール前駆体を分離することをさらに含む。
【００２８】
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、微生物は、エタノール、２，３−ブタンジオール、およびコハク酸のうちの１つ以上をさらに生成する。
【００２９】
本発明はさらに、本明細書に記載されている方法によって生成されたエチレングリコールを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、組成物は、不凍液、防腐剤、脱水剤、または掘削流体である。
【００３０】
本発明はさらに、本明細書に記載されている方法により生成されたエチレングリコールを含むポリマーを提供する。いくつかの態様では、ポリマーはホモポリマーまたはコポリマーである。いくつかの態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコールまたはポリエチレンテレフタレートである。
【００３１】
本発明はさらに、本明細書に記載されるポリマーを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物は、繊維、樹脂、フィルム、またはプラスチックである。
【００３２】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲とともに以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。特許請求の範囲の範囲が、その中の記述によって定義され、本明細書に記載された特徴および利点の具体的な議論によって定義されないことに留意されたい。
【００３３】
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号で示されている以下の図面と併せて読むと最もよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２を含むガス状基質からのエチレングリコール、グリコール酸、グリオキシル酸の生成の経路を示す模式図である。
【図２Ａ】実施例１〜４で使用したプラスミドのマップである。図２Ａは、実施例１に記載される発現シャトルベクター、ｐＩＰＬ１２のマップである。
【図２Ｂ】実施例１〜４で使用したプラスミドのマップである。図２Ｂは、実施例１に記載される、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓクエン酸シンターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉイソクエン酸リアーゼ、およびＧ．ｏｘｙｄａｎｓグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＭＥＧ０４２のマップである。
【図２Ｃ】実施例１〜４で使用したプラスミドのマップである。図２Ｃは、実施例２に記載される、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＭＥＧ０５８のマップである。
【図２Ｄ】実施例１〜４で使用したプラスミドのマップである。図２Ｄは、実施例３に記載される、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびＧ．ｏｘｙｄａｎｓアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＭＥＧ０５９のマップである。
【図２Ｅ】実施例１〜４で使用したプラスミドのマップである。図２Ｅは、実施例４に記載される、Ｃ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ  ｃｌａｓｓ  ＶアミノトランスフェラーゼおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＭＥＧ０６１のマップである。
【図３Ａ】ｐＭＥＧ０４２を発現するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（クローン１〜３）または空のベクターを含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（陰性対照）のバイオマスレベル（ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を示す。
【図３Ｂ】陰性対照（空ベクター）と比較する、独立栄養的に増殖し、発現ベクターｐＭＥＧ０４２を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、エチレングリコールを示す。
【図３Ｃ】独立栄養的に成長し、発現ベクターｐＭＥＧ０４２を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、グリコール酸を示す。実施例１を参照されたい。
【図４Ａ】ｐＭＥＧ０５８を発現するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（クローン１〜２）または空のベクターを含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（陰性対照）のバイオマスレベル（ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を示す。
【図４Ｂ】陰性対照（空ベクター）と比較する、独立栄養的に増殖し、発現ベクターｐＭＥＧ０５８を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、エチレングリコールを示す。実施例２を参照されたい。
【図５Ａ】ｐＭＥＧ０５９を発現するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（クローン１〜３）または空のベクターを含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（陰性対照）のバイオマスレベル（ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を示す。
【図５Ｂ】陰性対照（空ベクター）と比較する、独立栄養的に増殖し、発現ベクターｐＭＥＧ０５９を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、エチレングリコールを示す。実施例３を参照されたい。
【図６Ａ】ｐＭＥＧ０６１を発現するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（クローン１）または空のベクターを含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（陰性対照）のバイオマスレベル（ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を示す。
【図６Ｂ】陰性対照（空ベクター）と比較する、独立栄養的に増殖し、発現ベクターｐＭＥＧ０６１を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、エチレングリコールを示す。実施例４を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、エチレングリコールの生物学的生産のための微生物を提供する。「微生物」は、微小な生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は細菌である。
【００３６】
微生物に関して使用される場合の「非自然発生型」という用語は、参照種の野生型株を含む参照種の自然発生型の株には見られない少なくとも１つの遺伝子改変を微生物が有することを意味するように意図される。非自然発生型の微生物は、典型的には、実験室または研究施設で開発される。本発明の微生物は、非自然発生型である。
【００３７】
「遺伝子改変」、「遺伝子変化」、または「遺伝子操作」という用語は、広範には、人間の手による微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子修飾された」、「遺伝子改変された」、または「遺伝子操作された」という用語は、そのような遺伝子修飾、遺伝子改変、または遺伝子操作を含む微生物を指す。これらの用語は、実験室で生成された微生物と自然発生の微生物を区別するために使用され得る。遺伝子改変の方法は、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモータの挿入または欠失、核酸変異、改変遺伝子発現または不活性化、酵素操作、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリング、およびコドン最適化を含む。本発明の微生物は、遺伝子操作されている。
【００３８】
「組換え」は、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子改変、操作、または組換えの生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異なる株または種など、複数の源から誘導される遺伝物質を含有するか、またはそれによってコードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本発明の微生物は一般に組換えである。
【００３９】
「野生型」は、変異体または変異形とは区別されるように天然に存在する、生物、株、遺伝子、または特性の典型的な形態を指す。
【００４０】
「内在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在または発現する核酸またはタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態では、内在性遺伝子の発現は、外因性プロモータ等の外因性調節エレメントによって制御され得る。
【００４１】
「外因性」は、本発明の微生物の外側から生じる核酸またはタンパク質を指す。例えば、外因性遺伝子または酵素は、本発明の微生物に人工的または組換え的に作成され、導入または発現され得る。外因性遺伝子または酵素は、異種微生物から単離され、本発明の微生物に導入または発現され得る。外因性核酸は、本発明の微生物のゲノムに組み込まれるように、または本発明の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態にとどまるように適合され得る。
【００４２】
「異種」は、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物に存在しない核酸またはタンパク質を指す。例えば、異種遺伝子または酵素は、異なる株または種に由来し、本発明の微生物に導入または発現され得る。異種遺伝子または酵素は、それが異なる株または種で発生する形態で本発明の微生物で導入または発現させることができる。あるいは、異種遺伝子または酵素は、例えば、本発明の微生物における発現のためにコドン最適化することによって、または酵素活性の方向を逆転させるため、または基質特異性を変更するためなど、機能を変更するように操作することによって、何らかの方法で修飾することができる。
【００４３】
特に、本明細書に記載される微生物で発現される異種核酸またはタンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、Ｚｅａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｈｏｍｏ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ｂｏｓ、ｇａｌｌｕｓ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ａｍｂｌｙｒｈｙｎｃｈｕｓ、ｒａｔｔｕｓ、ｍｕｓ、ｓｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｋｕｒｔｈｉａ、Ｌｅｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｏｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓａｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ、またはＳｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来であってよい。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得て、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組織化の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識構成要素との接合により、さらに修飾され得る。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へ）転写される過程、および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳される過程を指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。
【００４６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割り込まれていてもよい。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素との接合などの任意の他の操作により、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を含む。
【００４７】
「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的活性を指す。したがって、酵素活性を「増加させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増加させること、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を増加させることを含む。同様に、酵素活性を「減少させること」は、酵素の活性を減少させること、酵素の量を減少させること、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を減少させることを含む。
【００４８】
「変異した」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物において修飾されている核酸またはタンパク質を指す。一実施形態において、変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施形態では、変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよい。
【００４９】
「親微生物」は、本発明の微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在する微生物（即ち、野生型微生物）または以前に修飾されたことのある微生物（即ち、変異体または組換え微生物）であり得る。本発明の微生物は、親微生物において発現または過剰発現されていなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるように修飾され得る。同様に、本発明の微生物は、親微生物が含有しなかった１つ以上の遺伝子を含有するように修飾され得る。本発明の微生物は、また、親微生物において発現した１つ以上の酵素を発現しないか、またはより少ない量を発現するように修飾され得る。
【００５０】
本発明の微生物は、本質的に任意の親微生物に由来し得る。一実施形態では、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群から選択される親微生物に由来し得る。他の実施形態では、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する。好ましい実施形態において、親細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉである。好ましい実施形態において、親微生物は、２０１０年６月７日にドイツ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβ  ７Ｂに位置するＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）に、ブダペスト条約の条項下で２０１０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を付与されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＺ１５６１である。この株については、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００１４４号に記載されており、ＷＯ２０１２／０１５３１７として公開されている。
【００５１】
「〜由来する」という用語は、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から修飾または適合されて、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成することを示す。そのような修飾または適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換を含む。一般に、本発明の微生物は、親微生物に由来する。一実施形態では、本発明の親微生物は、クロストリジウムオートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウムユングダーリー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、またはクロストリジウムラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）に由来する。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、クロストリジウムオートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）ＬＺ１５６１に由来する。
【００５２】
本発明の微生物は、機能特徴に基づいてさらに分類され得る。例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性細菌、アセトゲン、エタノロゲン、カルボキシド栄養生物、および／もしくはメタン資化性菌であり得るか、またはそれらから誘導され得る。
【００５３】
【表１】
2021506247.tif 000003
【００５４】
「Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ」は、例えば、Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８に記載されている炭素固定のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を指す。「Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物」は、予想通り、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む微生物を指す。多くの場合、本発明の微生物は天然のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含有する。本明細書では、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、天然の未修飾のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路であってもよく、またはＣＯ、ＣＯ２、および／もしくはＨ２をアセチル−ＣｏＡに変換するように依然として機能する限り、ある程度の遺伝子修飾（例えば、過剰発現、異種発現、遺伝子欠損など）を有するＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路であってもよい。
【００５５】
「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯおよびＣＯ２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。多くの場合、本発明の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるＣ１固定微生物に由来する。
【００５６】
「嫌気性細菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性細菌は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を示し得るか、または死滅し得る。しかし、一部の嫌気性菌は、「微小酸素（ｍｉｃｒｏｏｘｉｃ）状態」と呼ばれることもある低レベルの酸素（例えば、０．０００００１〜５％の酸素）に耐えることができる。多くの場合、本発明の微生物は嫌気性菌である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定される嫌気性菌に由来する。
【００５７】
「アセトゲン」は、エネルギー節約のため、およびアセテート等のアセチル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡ由来生成物の合成のためのその主要機構としてＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。特に、アセトゲンは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を、（１）ＣＯ２からのアセチル−ＣｏＡの還元合成のための機構、（２）最終電子を受容する、エネルギー節約プロセス、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のための機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。天然に存在する全てのアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、および非メタン資化性である。多くの場合、本発明の微生物はアセトゲンである。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるアセトゲンに由来する。
【００５８】
「エタノロゲン」は、エタノールを生成する、または生成することができる微生物である。多くの場合、本発明の微生物はエタノロゲンである。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるエタノロゲンに由来する。
【００５９】
「独立栄養生物」は、有機炭素の不在下で増殖することができる微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。多くの場合、本発明の微生物は独立栄養生物である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定される独立栄養生物に由来する。
【００６０】
「カルボキシド栄養生物」は、炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてＣＯを利用することができる微生物である。多くの場合、本発明の微生物はカルボキシド栄養生物である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるカルボキシド栄養生物に由来する。
【００６１】
「メタン資化性菌」は、炭素とエネルギーの唯一の供給源としてメタンを利用することが可能な微生物である。特定の実施形態では、本発明の微生物は、メタン資化性菌であるか、またはメタン資化性菌から誘導される。他の実施形態では、本発明の微生物は、メタン資化性菌ではないか、メタン資化性菌から誘導されない。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ種、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターから得られる。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって初めて報告され、かつ特徴付けられた。
【００６３】
これらの３つの種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー節約および発酵代謝のモードを有する。さらに、これらの種は、９９％を超えて同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生し、約２２〜３０ｍｏｌ％の含有量でＤＮＡ  Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態およびサイズを有し（０．５〜０．７×３〜５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり（３０〜３７℃で最適に増殖する）、約４〜７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５〜６の最適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。重要なことに、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄養性増殖を示し、主要な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を生成し、特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸を生成する。
【００６４】
しかしながら、これら３つの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。これらの種は、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらに、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列において違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的構成および数は、全ての種において同じであることが分かっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）。
【００６５】
したがって、要約すると、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの特性の多くは、その種に特有なのではなく、むしろＣ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーのこのクラスターの一般的な特性である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有しない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る。
【００６６】
本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株または変異体から得ることもできる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの単離物および突然変異体には、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、およびＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）（ＷＯ２０１２／０１５３１７）が含まれる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの単離物および突然変異体には、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ  ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８，８１９）、およびＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が含まれる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの単離物および突然変異体には、ＰＩ  １（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）が含まれる。
【００６７】
しかしながら、上記のように、本発明の微生物はまた、本質的に任意の親微生物、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群から選択される親微生物に由来し得る。
【００６８】
本発明は、エチレングリコール、グリオキシル酸、およびグリコール酸を生成できる微生物、ならびに本発明の微生物を基質の存在下で培養し、それによって微生物がエチレングリコールを生成することを含む、エチレングリコール、グリオキシル酸、およびグリコール酸を生成する方法を提供する。
【００６９】
本発明の微生物はアセチル−ＣｏＡ、例えば、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によって生成されるアセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素を含むことができる。この酵素は、ピルビン酸シンターゼ（ＰＦＯＲ）［１．２．７．１］またはＡＴＰ：ピルビン酸、オルトリン酸ホスホトランスフェラーゼ［１．２．７．１］であり得る。いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。
【００７０】
本発明の微生物は、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２）酵素を含むことができる。この酵素はピルビン酸：二酸化炭素リガーゼ［ＡＤＰ形成］［６．４．１．１］であり得る。いくつかの実施形態では、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施形態では、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する酵素が過剰発現される。
【００７１】
本発明の微生物は、オキサロ酢酸をシトリル−ＣｏＡに変換する（図１の反応３）酵素を含むことができる。この酵素はシトリル−ＣｏＡリアーゼ［４．１．３．３４］であり得る。いくつかの実施形態では、オキサロ酢酸をシトリル−ＣｏＡに変換する酵素は、内在性酵素である。
【００７２】
本発明の微生物は、シトリル−ＣｏＡをクエン酸に変換する（図１の反応４）酵素を含むことができる。この酵素は、クエン酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ［２．８．３．１０］であり得る。いくつかの実施形態では、シトリル−ＣｏＡをクエン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。
【００７３】
本発明の微生物は、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する（図１の反応５）酵素を含むことができる。この酵素は、クエン酸［Ｓｉ］−シンターゼ［２．３．３．１］、ＡＴＰクエン酸シンターゼ［２．３．３．８］、またはクエン酸（Ｒｅ）−シンターゼ［２．３．３．３］であってよい。いくつかの実施形態では、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。他の実施形態では、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵素は、異種酵素である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ１  ［ＥＣ  ２．３．３．１６］を含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のクエン酸（Ｒｅ）−シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種属由来のクエン酸（Ｓｉ）−シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ２を含む。いくつかの実施形態では、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵素が過剰発現される。
【００７４】
本発明の微生物は、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換する（図１の反応６）酵素を含むことができる。この酵素は、アコニット酸ヒドラターゼ［４．２．１．３］であり得る。いくつかの実施形態では、クエン酸をアコニット酸に、アコニット酸をイソクエン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施形態では、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換する酵素が過剰発現される。
【００７５】
本発明の微生物は、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応７）酵素を含むことができる。この酵素はイソクエン酸リアーゼ［４．１．３．１］であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｚ．ｍａｙｓ由来のイソクエン酸リアーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号１２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼを含む。いくつかの実施形態では、
【００７６】
本発明の微生物は、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素を含むことができる。この酵素は、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．２９］、グリオキシル酸レダクターゼ［１．１．１．２６／７９］、またはグリコール酸デヒドロゲナーゼ［１．１．９９．１４］であリ得る。いくつかの実施形態では、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施形態では、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する酵素が過剰発現される。
【００７７】
本発明の微生物は、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素を含むことができる。この酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２１］、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２２］、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２４］、２，５−ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ［１．２．１．２６］、アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．３／４／５］、ベタイン−アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．８］、またはアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ［１．２．７．５］であり得る。いくつかの実施形態では、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、内在性酵素である。他の実施形態では、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、異種酵素である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号５０に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のγ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、微生物が配列番号５２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号５１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号５４に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＮＡＤＰ−依存コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼＩを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号５６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号５５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ／グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物がそれぞれ、配列番号５８または配列番号６０で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号５７または配列番号５９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼＡを含む。グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素の追加の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＷＰ＿００３２０２０９８、ＷＰ＿００３１８２５６７、ＡＣＴ３９０４４、ＡＣＴ３９０７４、ＷＰ＿０４１１１２００５、およびＡＣＴ４０１７０に見出すことができる。いくつかの実施形態では、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素が過剰発現される。
【００７８】
本発明の微生物は、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素を含んでいてもよい。この酵素は、ラクトアルデヒドレダクターゼ［１．１．１．７７］、アルコールデヒドロゲナーゼ［１．１．１．１］、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）［１．１．１．２］、グリセロールデヒドロゲナーゼ［１．１．１．７２］、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．８］、またはアルデヒドレダクターゼ［１．１．１．２１］であり得る。いくつかの実施形態では、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施形態では、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する内在性酵素が過剰発現される。他の実施形態では、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する酵素は、異種酵素である。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号６２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ由来のラクトアルデヒドレダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号６４に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ由来のラクトアルデヒドレダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号６６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のラクトアルデヒドレダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号６８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のラクトアルデヒドレダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する異種酵素が過剰発現される。
【００７９】
本発明の微生物は、ピルビン酸をリンゴ酸に変換する（図１の反応１１）を含むことができる。この酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．３７］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（オキサロ酢酸脱炭酸）［１．１．１．３８］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（脱炭酸）［１．１．１．３９］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（オキサロ酢酸脱炭酸）（ＮＡＤＰ＋）［１．１．１．４０］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）［１．１．１．８２］、Ｄ−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（脱炭酸）［１．１．１．８３］、ジメチルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．８４］、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．８５］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］［１．１．１．２９９］、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（キノン）［１．１．５．４］であり得る。いくつかの実施形態では、ピルビン酸をリンゴ酸に変換する酵素は、内在性酵素である。他の実施形態では、ピルビン酸をリンゴ酸に変換する酵素は、異種酵素である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号２４に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、微生物が配列番号２６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号２５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のＮＡＤ依存リンゴ酸酵素を含む。
【００８０】
本発明の微生物は、リンゴ酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応１２）酵素を含むことができる。この酵素は、リンゴ酸シンターゼ［２．３．３．９］またはイソクエン酸リアーゼ［４．１．３．１］であり得る。いくつかの実施形態では、リンゴ酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、異種酵素である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物がそれぞれ配列番号２８または配列番号３４に示されるアミノ酸をコードする配列番号２７または配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ種属からのリンゴ酸シンターゼＧを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物がそれぞれ配列番号３０または配列番号３６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号２９または配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のリンゴ酸シンターゼＧを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号３２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号３１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のリンゴ酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号３８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ由来のリンゴ酸シンターゼＧを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号４０に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号３９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍ由来のリンゴ酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号４２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのリンゴ酸シンターゼＧを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号４４に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のリンゴ酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、微生物が配列番号４６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のリンゴ酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号４８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４７に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来のリンゴ酸シンターゼを含む。
【００８１】
本発明の微生物は、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素を含むことができる。この酵素は、ピルビン酸キナーゼ［２．７．１．４０］、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ［２．７．９．１］、またはピルビン酸水ジキナーゼ［２．７．９．２］であり得る。いくつかの実施形態では、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。
【００８２】
本発明の微生物は、ホスホエノールピルビン酸を２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換する（図１の反応１４）酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ［４．２．１．１１］であり得る。いくつかの実施形態では、ホスホエノールピルビン酸を２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。
【００８３】
本発明の微生物は、２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換する（図１の反応１５）酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホグリセリン酸ムターゼ［５．４．２．１１／１２］であり得る。いくつかの実施形態では、２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。
【００８４】
本発明の微生物は、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホノオキシピルビン酸に変換する（図１の反応１６）酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．９５］であり得る。いくつかの実施形態では、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホノオキシピルビン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。
【００８５】
本発明の微生物は、３−ホスホノオキシピルビン酸を３−ホスホ−Ｌ−セリンに変換（図１の反応１７）する酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホセリントランスアミナーゼ［２．６．１．５２］であり得る。いくつかの実施形態では、３−ホスホノオキシピルビン酸を３−ホスホ−Ｌ−セリンに変換する酵素は、内在性酵素である。
【００８６】
本発明の微生物は３−ホスホ−Ｌ−セリンをセリンに変換する（図１の反応１８）酵素を含むことができる。この酵素はホスホセリンホスファターゼ［３．１．３．３］であり得る。いくつかの実施形態では、３−ホスホ−Ｌ−セリンをセリンに変換する酵素は、内在性酵素である。
【００８７】
本発明の微生物はセリンをグリシンに変換する（図１の反応１９）酵素を含むことができる。この酵素はグリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ［２．１．２．１］であり得る。いくつかの実施形態では、セリンをグリシンに変換する酵素は内在性酵素である。いくつかの実施形態では、セリンをグリシンに変換する酵素が過剰発現される。
【００８８】
本発明の微生物は、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素（図１の反応２０）を含むことができる。この酵素は、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ／トランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ／トランスアミナーゼ［２．６．１．４５］、セリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ／トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］、グリシン−オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼ／トランスアミナーゼ［２．６．１．３５］、グリシントランスアミナーゼ［２．６．１．４］、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１０］、アラニンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、またはグリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．２．１］であり得る。いくつかの実施形態では、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素は、内在性酵素である。他の実施形態では、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素は、異種酵素である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｈ．ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ由来のセリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号１６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｔ．Ｔｅｐｉｄａｒｉｕｓ由来のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が、配列番号２０に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ由来のクラスＶアミノトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号２２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ由来のセリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素が過剰発現される。
【００８９】
本発明の微生物はセリンをヒドロキシピルビン酸に変換する（図１の反応２１）酵素を含むことができる。この酵素は、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］、セリン−グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４５］、アラニンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ［１．４．１．５］、セリン２−デヒドロゲナーゼ［１．４．１．７］、アラニントランスアミナーゼ［２．６．１．２］、グルタミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．１５］、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ［２．６．１．２１］、アラニン−グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、またはセリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］であり得る。いくつかの実施形態では、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。他の実施形態では、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換する酵素は、異種酵素である。セリンをヒドロキシピルビン酸に変換することができる酵素の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＷＰ＿００９９８９３１１およびＮＰ＿５１１０６２．１に見出すことができる。いくつかの実施形態では、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換する酵素が過剰発現される。
【００９０】
本発明の微生物は、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応２２）酵素を含むことができる。この酵素は、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ［４．１．１．４０］またはピルビン酸デカルボキシラーゼ［４．１．１．１］であり得る。この酵素は、他のデカルボキシラーゼでもよい［４．１．１．−］。いくつかの実施形態では、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、異種酵素である。ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換できる酵素の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＣＧ２８８６６、ＳＶＦ９８９５３、ＰＡ００９６、ＣＡＡ５４５２２、ＫＲＵ１３４６０、およびＫＬＡ２６３５６に見出すことができる。
【００９１】
本発明の微生物はＤ−グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換する（図１の反応２３）酵素を含むことができる。この酵素は、グリオキシル酸レダクターゼ［ＥＣ１．１．１．２６］、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．２９］、またはヒドロキシピルビン酸レダクターゼ［ＥＣ１．１．１．８１］であり得る。いくつかの実施形態では、Ｄ−グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換する酵素は、異種酵素である。Ｄ−グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＳＵＫ１６８４１、ＲＰＫ２２６１８、ＫＰＡ０２２４０、ＡＧＷ９０７６２、ＣＡＣ１１９８７、Ｑ９ＣＡ９０、およびＱ９ＵＢＱ７に見出すことができる。
【００９２】
本発明の微生物は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換する（図１の反応２４）複合体の酵素を含むことができる。５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の還元的分岐における補因子であり、アセチル−ＣｏＡの生成における足場として機能する。この複合体は、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．４．２］、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ［１．８．１．４］、およびアミノメチルトランスフェラーゼ（グリシンシンターゼ）［２．１．２．１０］を含むグリシン開裂系であり得る。いくつかの実施形態では、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換する複合体の酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施形態では、グリシン開裂系の酵素が過剰発現される。
【００９３】
本発明の微生物は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２５）酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＡＴＰ）［４．１．１．４９］または（ＧＴＰ）［４．１．１．３２］であり得る。いくつかの実施形態では、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する酵素は、内在性酵素である。他の実施形態では、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する酵素は、異種酵素である。いくつかの実施形態では、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する酵素が過剰発現される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２）酵素、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する（図１の反応５）酵素、クエン酸をアコニット酸に、アコニット酸をイソクエン酸に変換する（図１の反応６）酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応７）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、エチレングリコールを生成する。非限定的な例において、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵素は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ（配列番号１〜２）であり得る。非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１〜１２）であり得る。非限定的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５〜５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７〜５８）であり得る。図１に示すように、反応２、５、６、８、９、および１０を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。例えば、実施例１および図３Ｂを参照されたい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素、ホスホエノールピルビン酸を２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換する（図１の反応１４）酵素、２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換する（図１の反応１５）酵素、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホノオキシピルビン酸に変換する（図１の反応１６）酵素、３−ホスホノオキシピルビン酸を３−ホスホ−Ｌ−セリンに変換する（図１の反応１７）酵素、３−ホスホ−Ｌ−セリンをセリンに変換する（図１の反応１８）酵素、セリンをグリシンに変換する（図１の反応１９）酵素、グリシンをグリオキシル酸に変換する（図１の反応２０）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物はエチレングリコールを生成する。非限定的な例において、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（配列番号１５〜１６）またはＣ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ由来のクラスＶアミノトランスフェラーゼ（配列番号１９〜２０）であり得る。非限定的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５〜５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７〜５８）であり得る。図１に示すように、ステップ１９、２０、８、９、および１０の反応を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。例えば、実施例２〜４および図４Ｂ、５Ｂ、および６Ｂを参照されたい。
【００９６】
いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２）酵素、オキサロ酢酸をシトリル−ＣｏＡに変換する（図１の反応３）酵素、シトリル−ＣｏＡをクエン酸に変換する（図１の反応４）酵素、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換する（図１の反応６）酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応７）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、エチレングリコールを生成する。非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１〜１２）であり得る。非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１〜１２）であり得る。非限定的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５〜５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７〜５８）であり得る。図１に示すように、反応２、６、８、９、および１０を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素、ピルビン酸をリンゴ酸に変換する（図１の反応１１）酵素、リンゴ酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応１２）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、エチレングリコールを生成する。非限定的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５〜５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７〜５８）であり得る。図１に示すように、ステップ８、９、および１０の反応を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換する（図１の反応２４）酵素、グリシンをグリオキシル酸に変換する（図１の反応２０）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、の複合体を含む微生物は、エチレングリコールを生成する。非限定的な例において、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（配列番号１５〜１６）またはＣ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ由来のクラスＶアミノトランスフェラーゼ（配列番号１９〜２０）であり得る。非限定的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５〜５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７〜５８）であり得る。ステップ８、９、１０、２０、および２４の反応を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２５）酵素、オキサロ酢酸をシトリル−ＣｏＡに変換する（図１の反応３）酵素、シトリル−ＣｏＡをクエン酸に変換する（図１の反応４）酵素、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換する（図１の反応６）酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応７）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、エチレングリコールを生成する。非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１〜１２）であり得る。非限定的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５〜５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７〜５８）であり得る。図１に示すように、反応２、６、８、９、１０、および２５を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２５）酵素、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する（図１の反応５）酵素、クエン酸をアコニット酸に、アコニット酸をイソクエン酸に変換する（図１の反応６）酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応７）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、エチレングリコールを生成する。非限定的な例において、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵素は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ（配列番号１〜２）であり得る。非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１〜１２）であり得る。非限定的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５〜５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７〜５８）であり得る。図１に示すように、反応５、６、８、９、１０、および２５を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素、ホスホエノールピルビン酸を２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換する（図１の反応１４）酵素、２−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸に変換する酵素（図１の反応１５）、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を３−ホスホノオキシピルビン酸に変換する（図１の反応１６）酵素、３−ホスホノオキシピルビン酸を３−ホスホ−Ｌ−セリンに変換する（図１の反応１７）酵素、３−ホスホ−Ｌ−セリンをセリンに変換する（図１の反応１８）酵素、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換する（図１の反応２１）酵素、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応２２）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物はエチレングリコールを生成する。グリコアルデヒドからエチレングリコールへの変換を触媒する酵素は過剰発現可能である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、Ｄ−グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換する（図１の反応２３）酵素、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応２２）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素は、エチレングリコールを生成する。グリコアルデヒドからエチレングリコールへの変換を触媒する酵素は過剰発現可能である。
【０１０３】
本発明の酵素は、本発明の微生物における発現のために最適化されたコドンであり得る。「コドン最適化」は、特定の株または種における核酸の最適化または改善された翻訳のための、遺伝子等の核酸の変異を指す。コドン最適化により、翻訳速度の高速化または翻訳精度の向上がもたらされ得る。好ましい実施形態では、本発明の遺伝子は、本発明の微生物における発現のために最適化されたコドンである。コドン最適化は基礎となる遺伝子配列を指すが、コドン最適化はしばしば翻訳の改善をもたらし、したがって酵素発現の改善をもたらす。したがって、本発明の酵素はまた、コドンが最適化されていると説明することもできる。
【０１０４】
本発明の酵素のうちの１つ以上は、過剰発現され得る。「過剰発現した」とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物における核酸またはタンパク質の発現の増加を指す。過剰発現は、遺伝子コピー数、遺伝子転写速度、遺伝子翻訳速度、または酵素分解速度の変更を含む、当該技術分野において既知の任意の手段によって達成することができる。上記のように、図１の反応２、５、６、８、９、１０、１９、２０、２４、または２５を触媒する１つ以上の酵素が過剰発現され得る。
【０１０５】
本発明の酵素は破壊的変異を含み得る。「破壊的変異」は、遺伝子または酵素の発現または活性を低下または排除する（すなわち、「破壊する」）変異を指す。破壊的変異は、遺伝子または酵素を、部分的に不活性化し得るか、完全に不活性化し得るか、または欠失し得る。破壊的変異は、ノックアウト（ＫＯ）変異であり得る。破壊的変異は、酵素によって生成される生成物の生合成を低減、防止、または阻害する任意の変異であり得る。破壊的変異は、例えば、酵素をコードする遺伝子における変異、酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節エレメントにおける変異、酵素の活性を低下または阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、または酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）もしくはタンパク質の導入を含み得る。破壊的変異は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して導入されてもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．４１］に破壊的変異を含む。イソクエン酸デヒドロゲナーゼはイソクエン酸を２−オキソグルタル酸に変換する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠失などによるイソクエン酸デヒドロゲナーゼの破壊により、イソクエン酸のレベルが増加する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．２９］に破壊的変異を含む。グリセリン酸デヒドロゲナーゼはグリオキシル酸をグリコール酸に変換する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠失などによるグリセリン酸デヒドロゲナーゼの破壊により、グリオキシル酸のレベルが増加する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、グリコール酸デヒドロゲナーゼ  ［１．１．９９．１４］に破壊的変異を含む。グリコール酸デヒドロゲナーゼはグリオキシル酸をグリコール酸に変換する。グリコール酸デヒドロゲナーゼの欠失などによるグリコール酸デヒドロゲナーゼの破壊により、グリオキシル酸のレベルが増加する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ［１．２．７．５］に破壊的変異を含む。アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼは、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する。アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼの欠失などによるアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼの破壊により、グリコール酸のレベルが増加する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．３／１．２．３．４／１．２．３．５］に破壊的変異を含む。アルデヒドデヒドロゲナーゼはグリコール酸をグリコアルデヒドに変換する。アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠失などによるアルデヒドデヒドロゲナーゼの破壊により、グリコール酸のレベルが増加する。
【０１１１】
破壊的変異の導入は、本発明の微生物が誘導される親微生物と比較して、標的生成物を生成しないかもしくは実質的に標的生成物を生成しないか、または低減された量の標的生成物を生成する、本発明の微生物をもたらす。例えば、本発明の微生物は、標的生成物を生成しないか、または親微生物よりも、少なくとも約１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％少ない標的生成物を生成し得る。例えば、本発明の微生物は、約０．００１、０．０１、０．１０、０．３０、０．５０、または１．０ｇ／Ｌ未満の標的生成物を生成することができる。
【０１１２】
例示的な配列および酵素の供給源は、本明細書において提供されるが、本発明は、これらの配列と供給源に限定されるものではなく−それはまた、変異体を包含する。「変異体」という用語は、核酸およびタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸およびタンパク質の配列等の、参照核酸およびタンパク質の配列とは異なる、核酸およびタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を実行する変異体核酸またはタンパク質を使用して実施され得る。例えば、変異体タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を実行するか、または実質的に同じ反応に触媒作用を及ぼし得る。変異体遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードし得る。変異体プロモータは、参照プロモータと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有し得る。
【０１１３】
このような核酸またはタンパク質は、本明細書において「機能的に同等な変異体」と呼ばれ得る。例として、核酸の機能的に同等な変異体には、対立遺伝子変異体、遺伝子の断片、突然変異遺伝子、多型等が含まれ得る。他の微生物からの相同遺伝子も、機能的に同等な変異体の例である。これらとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの種の相同遺伝子が挙げられ、それらの詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイトで公開されており入手可能である。機能的に同等な変異形としてはまた、特定の微生物のコドン最適化の結果として配列が変化している核酸が挙げられる。核酸の機能的に同等な変異体は、好ましくは、参照核酸と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超える核酸配列同一性（相同性割合）を有する。タンパク質の機能的に同等な変異体は、好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超えるアミノ酸同一性（相同性割合）を有する。変異体核酸またはタンパク質の機能的同等性は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して評価され得る。
【０１１４】
核酸は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本発明の微生物に送達され得る。例えば、核酸は裸の核酸として送達されてもよく、リポソーム等の１つ以上の薬剤とともに配合されてもよい。核酸は、必要に応じて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある特定の実施形態では、制限阻害剤を使用してもよい。追加のベクターには、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、および人工染色体が含まれ得る。好ましい実施形態では、核酸は、プラスミドを使用して本発明の微生物に送達される。例として、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的または自然の能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または接合によって達成され得る。活性制限酵素系を有するある特定の実施形態では、核酸を微生物に導入する前に核酸をメチル化する必要があり得る。
【０１１５】
さらに、特定の核酸の発現を増加または制御するために、プロモータ等の調節エレメントを含むように核酸を設計してもよい。プロモータは、構成的プロモータまたは誘導性プロモータであり得る。理想的には、プロモータは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路プロモータ、フェレドキシンプロモータ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモータ、Ｒｎｆ複合オペロンプロモータ、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモータ、またはホスホトランスアセチラーゼ／アセテートキナーゼオペロンプロモータである。
【０１１６】
「基質」は、本発明の微生物のための炭素源および／またはエネルギー源を指す。多くの場合、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＣＨ４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子等の他の非炭素成分をさらに含み得る。しかしながら、他の実施形態では、基質は、糖、デンプン、繊維、リグニン、セルロース、またはヘミセルロースまたはそれらの組み合わせなどの炭水化物であってもよい。例えば、炭水化物は、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロース、キシロース、またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。一部の実施形態では、基質は（Ｄ）−キシロースを含まない（Ａｌｋｉｍ，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ，１４：１２７，２０１５）。いくつかの実施形態では、基質はキシロースなどのペントースを含まない（Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ，３４：８０−８７，２０１６）。いくつかの実施形態では、基質は、ガス状基質および炭水化物基質の両方を含み得る（混合栄養発酵）。
【０１１７】
ガス状基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｏｌ％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。ガス状基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０ｍｏｌ％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、ガス状基質は、約４０〜７０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、製鋼または高炉ガス）、約２０〜３０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、塩基性酸素転炉ガス）、または約１５〜４５ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態では、ガス状基質は、約１〜１０または１〜２０ｍｏｌ％のＣＯなどの比較的低量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は、典型的には、ガス状基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。いくつかの実施形態では、ガス状基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない（１ｍｏｌ％未満）。
【０１１８】
ガス状基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、ガス状基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０ｍｏｌ％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態では、ガス状基質は、約６０、７０、８０、または９０ｍｏｌ％のＨ２など、比較的多量のＨ２を含み得る。さらなる実施形態では、ガス状基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない（１ｍｏｌ％未満）。
【０１１９】
ガス状基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、ガス状基質は、約１〜８０または１〜３０ｍｏｌ％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、ガス状基質は、約２０、１５、１０、または５ｍｏｌ％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、ガス状基質は、ＣＯ２を含まないか、または実質的に含まない（１ｍｏｌ％未満）。
【０１２０】
ガス状基質は、代替形態で提供することもできる。例えば、ガス状基質は、液体に溶解され得るか、または固体支持体上に吸着され得る。
【０１２１】
ガス状基質および／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副産物として、または何らかの他の源から得られる、廃ガスまたはオフガスであってもよい。ある特定の実施形態では、産業過程は、製鋼所製造等の鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、ガス状基質および／またはＣ１炭素源は、任意の従来の方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
【０１２２】
ガス状基質および／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガスなどの、合成ガスであってもよい。別の実施形態では、合成ガスは、都市固形廃棄物または産業固形廃棄物のガス化から得られてもよい。
【０１２３】
ガス状基質の組成は、反応の効率および／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵過程の効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子等のいかなる望ましくない不純物も除去すること、および／または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【０１２４】
特定の実施形態において、発酵は、糖、デンプン、繊維、リグニン、セルロース、またはヘミセルロースなどの炭水化物基質の不在下で実施される。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、以下に示すように、ＣＯおよびＨ２からエチレングリコール（ＭＥＧ）への全体的なエネルギー論は、グルコースからエチレングリコールへのエネルギー論よりも好ましく、ＣＯおよびＨ２の、より負のギブス自由エネルギー、ΔｒＧ´ｍ値は、エチレングリコールへのより大きな推進力を示している。基質としてのグルコースとＣＯの比較のための全体的な反応デルタＧの計算を、生物学的システムにおける経路または経路の個々のステップの全体的な実現可能性を評価するための標準的な方法である、ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／）を使用して実行した（Ｆｌａｍｈｏｌｚ，Ｅ．Ｎｏｏｒ，Ａ．Ｂａｒ−Ｅｖｅｎ，Ｒ．Ｍｉｌｏ（２０１２）ｅＱｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ−ｔｈｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０：Ｄ７７０−５；Ｎｏｏｒ，Ａ．Ｂａｒ−Ｅｖｅｎ，Ａ．Ｆｌａｍｈｏｌｚ，Ｙ．Ｌｕｂｌｉｎｇ，Ｄ．Ｄａｖｉｄｉ，Ｒ．Ｍｉｌｏ（２０１２）Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｏｐｅｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｃｏｖｅｒａｇｅＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８：２０３７−２０４４；Ｎｏｏｒ，Ｈ．Ｓ．Ｈａｒａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ，Ｒ．Ｍｉｌｏ，Ｒ．Ｍ．Ｔ．Ｆｌｅｍｉｎｇ（２０１３）Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｉｂｂｓ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ９（７）：ｅ１００３０９８；Ｎｏｏｒ，Ａ．Ｂａｒ−Ｅｖｅｎ，Ａ．Ｆｌａｍｈｏｌｚ，Ｅ．Ｒｅｚｎｉｋ，Ｗ．Ｌｉｅｂｅｒｍｅｉｓｔｅｒ，Ｒ．Ｍｉｌｏ（２０１４）Ｐａｔｈｗａｙ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １０（２）：ｅ１００３４８３）。計算は次のとおりである。
【０１２６】
グルコース（ａｑ）＋３ＮＡＤＨ（ａｑ）
2021506247.tif 000004
３ＭＥＧ（ａｑ）＋３ＮＡＤ＋（ａｑ）ΔｒＧ´ｍ−１０４ｋＪ／ｍｏｌ
【０１２７】
６ＣＯ（ａｑ）＋３Ｈ２（ａｑ）＋６ＮＡＤＨ（ａｑ）
2021506247.tif 000005
３ＭＥＧ（ａｑ）＋６ＮＡＤ＋（ａｑ）ΔｒＧ´ｍ−１９２ｋＪ／ｍｏｌ
【０１２８】
生理学的状態：
【０１２９】
グルコース（ａｑ）＋３ＮＡＤＨ（ａｑ）
2021506247.tif 000006
３ＭＥＧ（ａｑ）＋３ＮＡＤ＋（ａｑ）ΔｒＧ´ｍ−７０ｋＪ／ｍｏｌ
【０１３０】
６ＣＯ（ａｑ）＋３Ｈ２（ａｑ）＋６ＮＡＤＨ（ａｑ）
2021506247.tif 000007
３ＭＥＧ（ａｑ）＋６ＮＡＤ＋（ａｑ）ΔｒＧ´ｍ−２９５ｋＪ／ｍｏｌ
【０１３１】
エチレングリコール、グリオキシル酸、および／またはグリコール酸に加えて、本発明の微生物は、１つ以上の副産物を生成するために培養されてもよい。例えば、本発明の微生物は、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０およびＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２およびＷＯ２０１６／０９４３３４）、ラクテート（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６１５２）、１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、コリスメート由来生成物（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、３−ヒドロキシブチレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、および１，３−ブタンジオール（ＷＯ２０１７／００６６４９８）を生成することができるか、または生成するように操作することができる。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、エチレングリコールに加えて、エタノール、２，３−ブタンジオール、および／またはコハク酸も生成する。特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が生成物と見なされ得る。
【０１３２】
「天然生成物」は、遺伝子組換えされていない微生物によって生成される生成物である。例えば、エタノール、アセテート、および２，３−ブタンジオールは、クロストリジウムオートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウムユングダーリー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびクロストリジウムラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）の天然生成物である。「非天然生成物」は、遺伝子組換えされた微生物によって生成されるが、遺伝子組換えされた微生物が由来する遺伝子組換えされていない微生物によって生成されない生成物である。エチレングリコールは、自然界に存在する微生物によって生成されることは知られていないため、すべての微生物の非天然生成物である。
【０１３３】
「選択性」は、微生物によって生成される全発酵生成物の生成に対する標的生成物の生成の比率を指す。本発明の微生物は、特定の選択性で、または最小の選択性で生成物を生成するように操作され得る。一実施形態では、標的生成物は、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、または７５％を占める。一実施形態では、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも１０％を占め、その結果エチレングリコールは、本発明の微生物が少なくとも１０％のエチレングリコールに対する選択性を有する。一実施形態では、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも３０％を占め、その結果エチレングリコールは、本発明の微生物が少なくとも３０％のエチレングリコールに対する選択性を有する。
【０１３４】
典型的には、培養は、バイオリアクタ中で実行される。「バイオリアクタ」という用語は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他のデバイス等の１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器および第２の培養／発酵反応器を含み得る。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供され得る。本明細書で使用する場合、「培養」および「発酵」という用語は、同じ意味で使用される。これらの用語は、培養／発酵過程の増殖期および生成物生合成期の両方を包含する。
【０１３５】
培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、および／または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において周知である。
【０１３６】
培養／発酵は、望ましくは、エチレングリコールの生成のために適切な条件下で実施されるべきである。必要に応じて、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮する反応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流量、液体流量、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限されないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。特に、基質の導入速度は、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを確実にするように制御されてもよい。
【０１３７】
上昇した圧力でバイオリアクタを操作することにより、気相から液相へのガス物質移動の速度を速めることができる。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を実施することが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な容積を示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの容積、およびその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に削減することができる。これはさらに、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流量で除算したものとして定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力に維持されるときに減少され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を行うことが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ所望の保持時間を達成することがバイオリアクタの必要な体積をさらに示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。
【０１３８】
特定の実施形態において、発酵は、光の不在下で、または光合成微生物のエネルギー要求を満たすには不十分な量の光の存在下で行われる。特定の実施形態において、本発明の微生物は、非光合成微生物である。
【０１３９】
本発明の方法は、発酵ブロスからエチレングリコールを分離することをさらに含み得る。エチレングリコールは、例えば、蒸留、模擬移動床プロセス、膜処理、蒸発、パーベーパレーション、ガスストリッピング、相分離、イオン交換、または、例えば液−液抽出を含む抽出発酵を含む、当技術分野で既知の任意の方法または方法の組み合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製することができる。一実施形態では、エチレングリコールは、逆浸透および／またはパーベーパレーションを使用して発酵ブロスから濃縮することができる（ＵＳ５，５５２，０２３）。蒸留により水を除去し、次いで、（高比率のエチレングリコールを含有する）底部を、蒸留または真空蒸留を使用して回収して、高純度エチレングリコール流を生成することができる。あるいは、逆浸透および／またはパーベーパレーションによる濃縮の有無にかかわらず、エチレングリコールは、アルデヒドとの反応蒸留（Ａｔｕｌ，Ｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｓｃｉ，５９：２８８１−２８９０，２００４）または炭化水素を使用する共沸蒸留（ＵＳ２，２１８，２３４）によってさらに精製できる。別のアプローチでは、エチレングリコールを水溶液から活性炭またはポリマー吸収剤に補足させ（逆浸透および／またはパーベーパレーションありまたはなしで）、低沸点有機溶媒を使用して回収できる（Ｃｈｉｎｎ，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｌｓ，Ｓｕｇａｒｓ，ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ＯＨ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｌｕｔｅ−Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｂｌｅ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｎｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，１９９９）。次に、エチレングリコールを蒸留により有機溶媒から回収することができる。特定の実施形態では、エチレングリコールは、発酵ブロスの一部分をバイオリアクタから連続除去し、微生物細胞をブロスから分離し（濾過により簡便に）、かつエチレングリコールをブロスから回収することによって、発酵ブロスから回収される。アルコールや酸などの副産物も、ブロスから分離または精製することができる。アルコールは、例えば、蒸留によって回収され得る。酸は、例えば、活性炭上での吸着によって回収され得る。特定の実施形態では、分離された微生物細胞をバイオリアクタに戻すことができる。標的生成物が取り出された後に残っている無細胞透過液も、好ましくは、全体または部分的にバイオリアクタに戻される。追加の栄養素（ビタミンＢなど）が、無細胞透過液に添加されて、培地を補充した後に、バイオリアクタに戻され得る。
【０１４０】
水性媒体からのジオールの回収は、いくつかの方法で実証されている。疑似移動床（ＳＭＢ）技術は、エタノールと関連する含酸素化合物の水性混合物から２，３−ブタエンジオールを回収するために使用されている（米国特許第８，６５８．８４５号）。反応性分離は、効果的なジオール回収のためにも実証されている。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの回収は、ジオール含有流とアルデヒドとの反応、ジオールの分別および再生、濃縮されたジオール流を回収するための最終分別によって行われる。例えば、米国特許第７，９５１，９８０号を参照されたい。
【０１４１】
本発明は、微生物によって、および本明細書に記載の方法に従って生成されたエチレングリコールを含む組成物を提供する。例えば、エチレングリコールを含む組成物は、不凍液、防腐剤、脱水剤、または掘削流体であり得る。
【０１４２】
本発明はまた、微生物によって、および本明細書に記載される方法に従って生成されたエチレングリコールを含むポリマーを提供する。このようなポリマーは、例えば、ポリエチレングリコールなどのホモポリマーまたはポリエチレンテレフタレートなどのコポリマーであり得る。これらのポリマーの合成方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｈｅｒｚｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．，１１６（４）：２１７０−２２４３（２０１６）およびＸｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄ  Ｅｎｇ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．５４（２２）：５８６２−５８６９（２０１５）を参照されたい。
【０１４３】
本発明はさらに、微生物によって、および本明細書に記載される方法に従って生成されるエチレングリコールを含むポリマーを含む組成物を提供する。例えば、組成物は、繊維、樹脂、フィルム、またはプラスチックであり得る。
【実施例】
【０１４４】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【０１４５】
実施例１：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣＯおよび／またはＣＯ２とＨ２からのエチレングリコールの生成のための、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓクエン酸シンターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉイソクエン酸リアーゼ、およびＧ．ｏｘｙｄａｎｓグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む異種発現ベクターの構築
【０１４６】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ；配列番号１〜２）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（ｉｃｌ；配列番号１１〜１２）、およびＧ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ１；配列番号５５〜５６）をコードする遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためにコドンに適合され（ｃｏｄｏｎ−ａｄａｐｔｅｄ）、合成された。適応遺伝子は、標準のＢｓａＩゴールデンゲートクローニングキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、発現シャトルベクターｐＩＰＬ１２にクローニングされた。ｐＩＰＬ１２は、Ｅ．ｃｏｌｉとＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの両方の複製起点を含み、複製して両方の種で維持できるようにし、また  ｐＩＰＬ１２は、ほとんどのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａでも機能する。ｐＩＰＬ１２はさらに、ポジティブ選択のためにエリスロマイシン／クラリスロマイシン耐性を付与する２３Ｓ  ｒＲＮＡ（アデニン（２０５８）−Ｎ（６））−メチルトランスフェラーゼＥｒｍ（Ｂ）、大腸菌からの接合伝達のためのＴｒａＪ、異種遺伝子の発現のためのプロモータを含む。図２Ａを参照されたい。ｃｉｔＺ、ｉｃｌ、およびａｌｄＡ１をｐＩＰＬ１２にクローニングしたときに作成された発現ベクターを、本明細書ではｐＭＥＧ０４２と呼ぶ（図２Ｂ）。
【０１４７】
【表２】
2021506247.tif 000008
【０１４８】
ｐＭＥＧ０４２構築物は、接合によりＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質転換された。発現ベクターは、標準的な熱ショック形質転換を使用して、接合体ドナー株であるＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１＋Ｒ７０２（ＣＡ４３４）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）（ドナー）に最初に導入された。ドナー細胞を３７℃で１時間ＳＯＣ培地で回収した後、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンおよび５００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンを含むＬＢ培地プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンと５００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンを含む５ｍＬのＬＢアリコートにいくつかのドナーコロニーを接種し、３７℃で約４時間、または培養液が目に見えて密度が高くなるまで、まだ静止期に入っていない状態で培養した。１．５ｍＬのドナー培養物を４０００ｒｐｍおよび２０〜２５℃で２分間の遠心分離によって収集し、上清を廃棄した。ドナー細胞を５００μＬの滅菌ＰＢＳ緩衝液に穏やかに再懸濁し、４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＰＢＳ上清を廃棄した。
【０１４９】
ペレットを嫌気性チャンバーに導入し、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ培養（レシピエント）の指数関数期の後期に２００μＬで穏やかに再懸濁した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ１００６１およびＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１の派生物）は、ＤＳＭＺ（Ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。菌株は、標準的な嫌気性技術（Ｈｕｎｇａｔｅ  １９６９；Ｗｏｌｆｅ  １９７１）を使用して、ｐＨ５．６でＰＥＴＣ培地（米国特許第９，７３８，８７５号を参照）中、３７℃で増殖させた。
【０１５０】
接合混合物（ドナー細胞とレシピエント細胞の混合物）をＰＥＴＣ−ＭＥＳ＋フルクトース寒天プレートにスポットし、放置して乾燥させた。スポットが、もはや目に見えて濡れなくなったときに、プレートを、圧力ジャーに導入し、合成ガス（５０％ＣＯ、１０％Ｎ２、３０％ＣＯ２、１０％Ｈ２）で２５〜３０ｐｓｉに加圧し、３７℃で約２４時間インキュベートした。次に、１０μＬの白金耳を使用して穏やかに掻き取ることにより、接合混合物をプレートから取り出した。取り出した混合物を２００〜３００μＬのＰＥＴＣ培地に懸濁した。接合混合物の１００μＬアリコートを、５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを補充したＰＥＴＣ培地寒天プレートにプレーティングし、プラスミドを担持する形質転換体を選択した。
【０１５１】
ｐＭＥＧ０４２プラスミドを担持するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの３つの異なるコロニーを５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含む２ｍＬのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地に接種し、５０％ＣＯ、１０％Ｎ２、３０％ＣＯ２、１０％Ｈ２とともにおよび１００ｒｐｍのオービタル振とうを用いて３日間、３７℃で独立栄養的に増殖させた。培養物を、血清ボトル内で５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含む１０ｍＬのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地でＯＤ６００が０．０５になるように希釈し、５０％ＣＯ、１０％Ｎ２、３０％ＣＯ２、１０％Ｈ２および１００ｒｐｍのオービタル振とうを用いて３７℃で独立栄養的に最大２０日間増殖させ、毎日サンプリングしてバイオマスと代謝産物を測定した（図３Ａおよび３Ｂ）。エチレングリコールの生成を、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を使用して測定し、他の代謝産物を、下記のように高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定した。
【０１５２】
エチレングリコール濃度は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＶＦ−ＷＡＸｍｓカラム（１５ｍ×０．２５μｍ×０．２５μｍ）およびＲＳＨオートサンプラーを装備したＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＩＳＱ  ＬＴ  ＧＣＭＳで測定した。２００μＬのブロスを２００μＬのメタノールで希釈して試料を調製した。試料をボルテックスした後、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、２００μＬの上澄みをインサート付きガラスバイアルに移した。１．０μＬの注入、５対１のスプリット比、２４０℃の注入口温度を使用して、試料を分析のためにオートサンプラーに移した。クロマトグラフィーは、８０℃、０．５分保持、１０℃／分で１５０℃まで昇温、２５℃／分で２２０℃まで昇温、３分最終保持のオーブンプログラムを使用して、実行した。カラムの流量は４．０ｍＬ／分で、０．５分間保持した後、キャリアガスとしてヘリウムを使用して、１００ｍｌ／分／分の速度で１．５ｍｌ／分に低下させた。ＭＳイオン源は、トランスファーラインを２４０℃に設定して２６０℃に維持した。定量は、３３．０ｍ／ｚを定量ピークとして、３１．０＋６２．０ｍ／ｚを確認ピークとして使用して、線形外部標準キャリブレーションを使用して行った。
【０１５３】
エタノール、アセテート、２，３−ブタンジオール、グリオキシル酸、およびグリコール酸の濃度は、屈折率（ＲＩ）検出を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣのＨＰＬＣにより３５℃で測定した。試料は、８０℃で５分間加熱した後、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して調製し、上清を分析のためにガラスバイアルに移した。分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ（商標）ＲＯＡ−有機酸Ｈ＋（８％）カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ×８μｍ）への１０μＬ注入で、０．７ｍＬ／分および３５℃で、アイソクラティック条件下、５ｍＭ硫酸移動相を使用して行われた。  
【０１５４】
独立栄養増殖の約３日後、エチレングリコール前駆体のグリコール酸が観察され、１０日後、エチレングリコールの生成が観察された（図３Ｂ）。
【０１５５】
実施例２：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２からのエチレングリコールの生成のためのＳ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む異種発現ベクターの構築。
【０１５６】
Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ｐｕｃＧ；配列番号１５〜１６）およびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｑ８ｒ１−９６由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ１；配列番号５７〜５８）をコードする遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためコドンに適合され、合成された。コドンに適合した遺伝子をｐＩＰＬ１２（図２Ａ）にクローニングし、得られた発現ベクター、ｐＭＥＧ０５８を、実施例１に記載されているように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに導入した。図２Ｃを参照されたい。
【０１５７】
【表３】
2021506247.tif 000009
【０１５８】
実施例１に記載されるように、ｐＭＥＧ０５８プラスミドを担持するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの２つの異なるコロニーを、５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含む２ｍＬのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地に接種し、独立栄養的に増殖させた。図４Ａを参照されたい。独立栄養増殖の約３日後、グリコール酸が観察され、８日後、エチレングリコールの生成が観察された（図４Ｂ）。
【０１５９】
実施例３：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２からのエチレングリコールの生成のための、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびＧ．ｏｘｙｄａｎｓグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む異種発現ベクターの構築
【０１６０】
Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ｐｕｃＧ；配列番号１５〜１６）およびＧ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ１；配列番号５５〜５６）をコードする遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためにコドンに適合され、合成された。コドンに適合した遺伝子をｐＩＰＬ１２（図２Ａ）にクローニングし、得られた発現ベクター、ｐＭＥＧ０５９を、実施例１に記載されているように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに導入した。図２Ｄを参照されたい。
【０１６１】
【表４】
2021506247.tif 000010
【０１６２】
実施例１に記載されるように、ｐＭＥＧ０５９プラスミドを担持するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの２つの異なるコロニーを、５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含む２ｍＬのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地に接種し、独立栄養的に増殖させた。図５Ａを参照されたい。独立栄養増殖の約３日後、グリコール酸が観察され、１０日後、エチレングリコールの生成が観察された（図５Ｂ）。
【０１６３】
実施例４：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２からのエチレングリコールの生成のためのアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む異種発現ベクターの構築。
【０１６４】
Ｃ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ由来のクラスＶアミノトランスフェラーゼ（ＳｇＡ；配列番号１９、２０）およびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｑ８ｒ１−９６由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ１；配列番号５７〜５８）をコードする遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためコドンに適合され、合成された。コドンに適合した遺伝子をｐＩＰＬ１２（図２Ａ）にクローニングし、得られた発現ベクター、ｐＭＥＧ０６１を、実施例１に記載されているように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに導入した。図２Ｅを参照されたい。
【０１６５】
【表５】
2021506247.tif 000011
【０１６６】
実施例１に記載されるように、ｐＭＥＧ０６１プラスミドを担持するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの３つの異なるコロニーを、５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含む２ｍＬのＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地に接種し、独立栄養的に増殖させた。図６Ａを参照されたい。独立栄養増殖の約３日後、グリコール酸が観察され、１６日後、エチレングリコールの生成が観察された（図６Ｂ）。
【０１６７】
実施例５：エチレングリコールへのさまざまなルートの最大収量のモデリング
Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ，１８：３０２０−３０２８，２０１６に記載されているようなＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムスケールの代謝モデルを利用して、エチレングリコールへの異なるルートの最大収量を予測した。異種代謝反応を野生型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍモデル構造に追加して、非天然化合物生成経路の組み込みを示した。本明細書に記載の実験作業に使用されるモデルは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに基づくが、代謝の類似性を考慮すると、結果は、他のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物にも当てはまると期待することは当然であり得る。
【０１６８】
エチレングリコールの生成は、ｃｏｂｒａｐｙバージョン０．８．２（Ｅｂｒａｈｉｍ．，ＣＯＢＲＡｐｙ：ＣＯｎｓｔｒａｉｎｔｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐｙｔｈｏｎ，ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ，７：７４，２０１３）を使用し、ソルバーインターフェイスとしてｏｐｔｌａｎｇバージョン１．２．３（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏｐｔｌａｎｇ：Ａｎ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ｆｏｒ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，２，ｄｏｉ：１０．２１１０５／ｊｏｓｓ．００１３９，２０１７）を、最適化ソルバーとしてＧｕｒｏｂｉ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒバージョン７．０．２を使用する、制約ベースの計算モデリング技術フラックスバランス分析（ＦＢＡ）および代謝調整の線形最小化（ＬＭＯＭＡ）を使用してシミュレートされた（Ｍａｉａ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｏｎ−ＧＥＣＣＯ´１７，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＡＣＭ  Ｐｒｅｓｓ，１６６１−１６６８，２０１７）。
【０１６９】
モデル化により、実施例１〜４で本明細書に記載された経路により、０．３７ｍｏｌのエチレングリコール／ｍｏｌＣＯの予測収量が明らかになった。これは、糖新生を必要とし、予測される最高の収量が、約０．１８ｍｏｌのエチレングリコール／ｍｏｌ  ＣＯに相当する、約０．４４ｇのエチレングリコール／ｇ  ＣＯであることが見出された、Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ，４１：１７３−１８１，２０１７によって記述された仮説的経路による予測収量の２倍以上である。
【０１７０】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の先行技術への言及は、その先行技術が任意の国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【０１７１】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有すること」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。「から本質的になる」という用語は、組成物、プロセス、または方法の範囲を、特定の材料もしくは工程、または組成物、プロセス、もしくは方法の基本的かつ新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。選択詞の使用（例えば「または」）は、選択詞の一方、両方、またはこれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の指示がない限り、指示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
【０１７２】
本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各個々の値を個々に言及する省略法としての役割を果たすことを単に意図し、各個々の値は、あたかも本明細書に個々に列挙されたかのように、本明細書中に組み込まれる。例えば、任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、整数範囲、サイズ範囲、または厚さ範囲は、別段の指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１０分の１、および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
【０１７３】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる例または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく解明することを単に意図し、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０１７４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、好ましい実施形態の全ての考えられる変化形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈と明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
【図１】
2021506247.tif 000012
【図２Ａ】
2021506247.tif 000013
【図２Ｂ】
2021506247.tif 000014
【図２Ｃ】
2021506247.tif 000015
【図２Ｄ】
2021506247.tif 000016
【図２Ｅ】
2021506247.tif 000017
【図３Ａ】
2021506247.tif 000018
【図３Ｂ】
2021506247.tif 000019
【図３Ｃ】
2021506247.tif 000020
【図４Ａ】
2021506247.tif 000021
【図４Ｂ】
2021506247.tif 000022
【図５Ａ】
2021506247.tif 000023
【図５Ｂ】
2021506247.tif 000024
【図６Ａ】
2021506247.tif 000025
【図６Ｂ】
2021506247.tif 000026
【配列表】
2021506247000001.app
【国際調査報告】
2021506247.tif 000027
2021506247.tif 000028