(57)【要約】  本発明は、チャンバー内に流体の流れを構築することができるマイクロ流体デバイスを提供する。流体の流れはチャンバー内で混合して濃度勾配を形成する。チャンバーは細胞培養物を受け入れることができ、かつ細胞培養物を回収することができる。マイクロ流体デバイスは、チャンバーの光学的分析のための標準的な研究用顕微鏡と適合する。【選択図】図１
2021512619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体デバイスであって、
上面と底面を有し、その間に厚みがあり、そして複数のウェル並びに上面の中に埋め込みされたテストチャンバーを有し、前記ウェルの各々がマイクロチャネルによってテストチャンバーに流体的に接続している、第一層；および
上面と底面を有し、その間に厚みがあり、そして上面と底面の間に伸びている複数のウェル開口部を有する第二層
を含み、ここで前記第二層のウェル開口部の各々が、前記第一層のウェルの各々と整合するように、前記第二層を前記第一層の上面に取り付け可能である、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記第二層が
上面と下面の間に伸びているテストチャンバー開口部であって、第一層のテストチャンバーと一直線に整合されているテストチャンバー開口部；および
テストチャンバー開口部の周囲に外周を形成する、上面の中に埋め込まれたくぼみであって、第二層の底面にまで貫通して伸びるアパーチャーを含むくぼみ
を更に含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記アパーチャーが真空源に接続可能な第一層中のマイクロチャネルと一直線に整合される、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記第二層のくぼみとテストチャンバー開口部を覆うようにサイジングされたカバースリップを更に含む、請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
上面と底面を有し、その間に厚さがあり、上面と底面の間に伸びている複数のウェル開口部、および上面と底面の間に伸びている窓開口部を有する第三層を更に含み、ここで前記第三層のウェル開口部の各々が第二層のウェル開口部の各々と整合するように、第三層を第三層の上面に取り付けることができ、そして前記窓開口部が第二層のくぼみを取り囲んでいる、請求項２に記載のデバイス。
【請求項６】
前記第一層の底面に取り付けられた支持層を更に含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記第一層と第二層が、各層の上面と底面を通って伸びている少なくとも２つの整合用スロットを有し、ここで各整合用スロットはガイドロットを受け入れるようにサイジングされている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
第二層の整合用スロットをガイドロッドの上を通過させて第一層の整合用スロットの中にインサートすることで、第二層のウェル開口部の各々を第一層のウェル開口部の各々と整合するように、それらの整合用スロットが配置される、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
マイクロチャネル、テストチャンバーまたはその双方に接続された１つ以上の気泡トランプまたは脱泡弁を更に含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
濃度勾配を有する流体の流れを構築する方法であって、
少なくとも１つのウェル流入口と少なくとも１つのウェル流出口を少なくとも１つの埋め込み型マイクロチャネルによって流体的に接続されたテストチャンバー開口部を有する基板を含むマイクロ流体デバイスを提供する工程；
前記テストチャンバーをカバースリップで閉じる工程；
前記少なくとも１つのウェル流入口のそれぞれに少なくとも１つの流体源を取り付ける工程；
前記少なくとも１つのウェル流出口のそれぞれに少なくとも１つの真空源を取り付ける工程；および
少なくとも１つの真空源を使って負圧を適用し、密閉したテストチャンバーを通って少なくとも１つのウェル流入口のそれぞれから、少なくとも１つのウェル流出口の外へと、流体を引き出す工程
を含む方法。
【請求項１１】
細胞集団に１つ以上の剤の勾配を投与する方法であって、
テストチャンバーと複数のウェルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記複数のウェルが複数のマイクロチャネルによってテストチャンバーに流体的に接続されているマイクロ流体デバイスを提供する工程；
細胞集団により被覆された細胞培養基板を提供する工程；
少なくとも１つのウェルからテストチャンバーへと流体培地を流し、それによって前記細胞集団に前記１つ以上の剤の勾配を構築する工程
を含む方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の剤が、核酸分子、タンパク質、ペプチドおよび小分子から成る群より選択された少なくとも１つの剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞集団中の各細胞が暴露される前記１つ以上の剤の量が、テストチャンバー中の細胞の位置に応じて異なる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞中に表現型変化を生じさせる能力について１つ以上の剤の効果を評価する方法であって、
テストチャンバーと複数のウェルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記複数のウェルが複数のマイクロチャネルによりテストチャンバーに流体的に接続されているマイクロ流体デバイスを提供する工程；
細胞集団で被覆された細胞培養基板を提供する工程；
前記細胞培養基板を前記テストチャンバーと接触させる工程；
前記１つ以上の剤を含む流体培地を前記複数のウェルの少なくとも１つに投与する工程；および
前記流体培地を少なくとも１つのウェルからテストチャンバーへと流し、それにより前記細胞集団に前記１つ以上の剤の勾配を構築する工程
を含む方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の剤が、核酸分子、タンパク質、ペプチドおよび小分子から成る群より選択された少なくとも１つの剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の剤が、mRNA、lncRNA、マイクロRNA、hnRNA、全RNA、非コードRNA、siRNA、shRNAおよびアンチセンスRNAから成る群より選択されたRNA分子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記RNA分子がドナー細胞のものであり、ここでドナー細胞の指標である表現型の変化を表す１つ以上の細胞を同定することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記表現型の変化が、遺伝子発現、タンパク質発現、免疫学的マーカー、形態学、生理学、バイオ製品の合成、および膜脂質組成から成る群より選択された少なくとも１つの表現型特徴の変化を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞集団が、上皮細胞、星状細胞、神経細胞、線維芽細胞、真菌細胞、胚性線維芽細胞、ケラチン形成細胞、成体幹細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞から成る群より選択された細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、2018年２月７日出願の米国仮特許出願第62/627,346号の優先権を主張し、その全内容が参考により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流体デバイスは、数種類の化学種と生物種の分析のための小型化ハイスループット機能を有するプラットフォームを提供するツールとして働く。これらのデバイスは、核酸のqPCRと配列決定から細胞のトランスフェクション等にまで及ぶ用途で使用される。ある特定のマイクロ流体ベースのデバイスは、チャンバーまたは細胞の中に流体の所望の濃度勾配を構築することができる。しかしながら、現存のデバイスには、標準的な研究用顕微鏡と適合するものは記載されておらず、広範なRNA濃度を有する様々な微小環境において多数の細胞の効率的トランスフェクションが必要である、トランスクリプトームにより誘導される表現型のリモデリング（再構成）に適当であるものは記載されていない。
従って、改善された勾配を生み出すマイクロ流体デバイスが必要とされている。本発明はこのニーズに対処する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一態様では、本発明は、マイクロ流体デバイスであって、
上面と底面を有し、その間に厚みがあり、そして複数のウェルおよび上面の中に埋め込まれたテストチャンバーを有する第一層であって、前記ウェルの各々がマイクロチャネルによってテストチャンバーに流体的に接続している、第一層；および
上面と底面を有し、その間に厚みがあり、そして上面と底面の間に伸びる複数のウェル開口部を有する第二層
を含み、ここで前記第二層のウェル開口部の各々が、前記第一層のウェルと整合する（ぴったり位置が合う）ように、前記第二層を前記第一層の上面に取り付け可能である、マイクロ流体デバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一実施形態では、第二層が上面と底面の間に伸びるテストチャンバー開口部を更に含み、ここで該テストチャンバー開口部は第一層のテストチャンバーと一直線に整合され；第二層はテストチャンバー開口部の周囲に外周を形成する、上面の中に埋め込まれたくぼみ（indent）を含み、ここで前記くぼみは第二層の底面全体に広がるアパーチャー（開窓）を含む。一実施形態では、前記アパーチャーは、真空源に接続可能である第一層中のマイクロチャネルと整合される。一実施形態では、該デバイスは、第二層のくぼみとテストチャンバー開口部を覆うようにサイジングされたカバースリップを更に含む。一実施形態では、該デバイスは、上面と底面を有しその間に厚さがあり、上面と底面の間に広がる複数のウェル開口部、および上面と底面の間に広がる窓の開口部を含む第三層を更に含み、ここで前記第三層のウェル開口部の各々が第二層のウェル開口部の各々と整合するように、第三層を第二層の上面に取り付けることができる。
【０００５】
一実施形態では、該デバイスは、第一層の底面に取り付けられた支持層を更に含む。一実施形態では、第一層と第二層は、各層の上面と底面の間に伸びる少なくとも２つの整合用スロットを有し、その各々の整合用スロットは、ガイドロットを受け入れるようにサイジングされている。一実施形態では、整合用スロットは、第二層の整合用スロットをガイドロットの上を通過させて第一層の整合用スロットの中にインサートし、第二層の各ウェル開口部を第一層の各ウェルと整合するように配置される。一実施形態では、該デバイスは、マイクロチャネル、テストチャンバーまたはその双方に接続された１つ以上の気泡トラップまたは脱気弁を更に含む。
【０００６】
別の態様では、本発明は、濃度勾配を有する流体の流れを構築する方法であって、少なくとも１つのウェル流入口と少なくとも１つのウェル流出口を少なくとも１つの埋め込み型マイクロチャネルによって流体的に接続されたテストチャンバー開口部を有する基板を含むマイクロ流体デバイスを提供する工程；前記テストチャンバーをカバースリップで閉じる工程；前記少なくとも１つのウェル流入口のそれぞれに少なくとも１つの流体源を取り付ける工程；少なくとも１つのウェル流出口のそれぞれに少なくとも１つの真空源を取り付ける工程；そして少なくとも１つの真空源を使って負圧を適用し、密閉したテストチャンバーを通って少なくとも１つのウェル流入口のそれぞれから、そして少なくとも１つのウェル流出口の外に、流体を引き出す工程、を含む方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、細胞集団に１つ以上の剤の勾配を投与する方法であって、テストチャンバーと複数のウェルを含み、前記複数のウェルが複数のマイクロチャネルによってテストチャンバーに流体的に接続されているマイクロ流体デバイスを提供する工程；細胞集団により被覆された細胞培養基板を提供する工程；および少なくとも１つのウェルからテストチャンバーへと流体培地を流し、それによって細胞集団に前記１つ以上の剤の勾配を構築する工程、を含む方法を提供する。一実施形態では、細胞集団の中の各細胞が暴露される前記１つ以上の剤の量は、テストチャンバー中の細胞の位置に応じて異なる。
【０００８】
別の態様では、本発明は、細胞において表現型変化を引き起こす能力について１つ以上の剤の効果を評価する方法であって、テストチャンバーと複数のウェルとを含むマイクロ流体デバイスであって、前記複数のウェルが複数のマイクロチャネルによってテストチャンバーに流体的に接続されているマイクロ流体デバイスを提供する工程；複数の細胞で被覆された細胞培養基板を提供する工程；前記細胞培養基板を前記テストチャンバーと接触させる工程；前記少なくとも１つのウェルからテストチャンバーへ流体を流し、それにより細胞集団に前記１つ以上の剤の勾配を構築し、そして表現型に変化を示す１つ以上の細胞を同定する工程、を含む方法を提供する。
【０００９】
一実施形態では、１つ以上の剤は、核酸分子、タンパク質、ペプチドおよび小分子から成る群より選択された少なくとも１つの剤を含む。一実施形態では、前記１つ以上の剤は、mRNA、lncRNA、マイクロRNA、hnRNA、全RNA、非コードRNA、siRNA、shRNA、およびアンチセンスRNAから成る群より選択されたRNA分子を含む。一実施形態では、RNA分子はドナー細胞の示す表現型の変化を提示する１つ以上の細胞を同定することを含む。一実施形態では、表現型の変化は、遺伝子発現、タンパク質発現、免疫学的マーカー、形態学、生理学、バイオ製品の合成、および膜の脂質組成から成る群より選ばれた少なくとも１つの表現型の特徴の変化を含む。一実施形態では、細胞の集団は次の群：上皮細胞、星状細胞、神経細胞、線維芽細胞、心筋細胞、胚性線維芽細胞、ケラチン生成細胞、成体肝細胞、胎児肝細胞および人工多能性幹細胞から成る群より選択された細胞を含む。
【００１０】
本発明の例示的な実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、例示的なマイクロ流体デバイスを示す。
【００１２】
【図２】図２は、デバイスの様々な層を露出させた、例示的なマイクロ流体デバイスの分解図を示す。
【００１３】
【図３Ａ】図３Ａは、例示的なマイクロ流体デバイスのマイクロチャネル層を示す。
【００１４】
【図３Ｂ】図３Ｂは、脱気弁をさらに含む例示的なマイクロ流体デバイスの概略図を示す。
【００１５】
【図４】図４は、例示的なマイクロ流体デバイスのカバー層を示す。
【００１６】
【図５】図５は、例示的なマイクロ流体デバイスの上部支持層およびカバースリップを示す。
【００１７】
【図６Ａ】図６Ａは、例示的なマイクロ流体デバイスのレイアウトを示す。図６Ａは、２次元（２Ｄ）ディフューザーのマイクロチャネルの概略図を示す。この配置は、デバイス内での拡散によって生成される、様々な濃度での４つの同時テストに順応性を提供する。
【００１８】
【図６Ｂ】図６Ｂは、テスト中の例示的なマイクロ流体チャネルを示す。
【００１９】
【図７】図７は、カバースリップを固定するためのクランプ系を有する例示的なマイクロ流体デバイスを描写する。
【００２０】
【図８】図８は、本発明のマイクロ流体デバイスを使用する例示的方法の流れ図（フローチャート）である。
【００２１】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、本発明のマイクロ流体デバイスを使って流体濃度プロファイルをテストした結果を表す。図９Ａは、数値解法を検証するためおよびマイクロ流体デバイスの時間応答をモデル化するためのRNA濃度プロファイルのシミュレーションを表す。
【００２２】
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、本発明のマイクロ流体デバイスを使って流体濃度プロファイルをテストした結果を表す。図９Ｂは、実際のデバイスでの濃度プロファイルの予測を表す。
【００２３】
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、本発明のマイクロ流体デバイスを使って流体濃度プロファイルをテストした結果を表す。図９Ｃは、マイクロ流体デバイスにおける流体の実験的テスト実行を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、チャンバー内に流体の流れを構築することができるマイクロ流体デバイスを提供する。流体の流れは、チャンバー内で混合して濃度の勾配を形成する。チャンバーは、アクセス可能な細胞培養チャンバーで、分散した細胞や３Ｄ組織片の培養に適している。マイクロ流体デバイスは、チャンバーの光学分析用の標準的な研究用顕微鏡と適合性がある。
【００２５】
一態様では、本発明は、１つ以上の剤の勾配を細胞集団に投与する方法を提供する。例えば、特定の実施形態では、本発明は、細胞集団に対する１つ以上の剤の効果を調べるハイスループット法を提供し、それにより、各細胞は規定された濃度の１つ以上の剤に曝露される。例えば、本発明のデバイスは、細胞がセル内のその位置に基づいて１つ以上の剤の規定された濃度に曝されるように、１つ以上の薬剤の勾配を培養チャンバーに送達するために使用することができる培養チャンバーを含む。いくつかの実施形態では、デバイスを介して送達される薬剤の勾配により、各細胞を１つ以上の薬剤の同一性および量によって定義される薬剤の固有の処方箋（レシピ）に曝露することができる。例示的な薬剤には、核酸分子、DNA、RNA、ペプチド、タンパク質、小分子、色素、ホルモン、ビタミン、成長因子、幹細胞因子などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、細胞の集団における表現型の変化を評価する方法を提供する。例えば、一実施形態では、当該方法は、１つ以上の剤の勾配を細胞集団に投与すること、および投与された勾配に応答して集団の中のどの細胞がその表現型を変化させたかを決定することを含む。特定の実施形態では、当該方法は、１つ以上の核酸分子の勾配を細胞集団に投与することを含み、それにより、細胞集団の１つ以上の細胞を、同一性および濃度によって定義される核酸分子の固有の処方箋でトランスフェクトする。特定の実施形態では、方法は、投与された勾配に応答して集団の中のどの細胞が表現型の変化の特徴を示したかを決定し、それにより表現型変換に必要な剤の同一性および濃度の決定を可能にすることを含む。
【００２７】
定義
本発明の図と説明は、本発明の明確な理解のために、関連がある要素を例示するために簡略化されているが、明確化の目的上、当技術分野で通常見られる他の多くの要素を除外していることを理解されたい。当業者は、本発明の実施に際して、他の要素および／または工程が望ましくそして／または必要であることを認識するかもしれない。しかしながら、そのような要素および工程は当技術分野で十分知られており、また、それらは本発明のより良い理解を促すわけではないため、そのような要素および工程の説明は本明細書では提供されない。本明細書の開示は、当業者に知られているかかる要素と方法に対する、そのようなすべての変形および修正に向けられる。
【００２８】
他の箇所で定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語と科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法と材料を、本発明の実施または試験に使用することができるけれども、例示的な方法および材料が記載される。
【００２９】
本明細書で使用する場合、以下の各用語は、本項目に記載のそれと関連する意味を有する。
【００３０】
冠詞「a」および「an」は、本明細書では、冠詞の文法上の対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ある１つの要素（an element）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００３１】
本明細書中で用いる時の「約」という用語は、量、時間的期間などのような測定可能な数値を指す場合、指定された値からの±20％、±10％、±5％、±1％および±0.1％の変動を包含する（そのような変動が適切である場合）ことを意味する。
【００３２】
本開示の全体を通じて、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲とその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なすべきである。例えば、１〜６といった範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示された部分範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば１、２、2.7、３、４、５、5.3、６、更にはそれらの間のあらゆる全増分および部分増分を含むものと解釈すべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００３３】
マイクロ流体デバイス
ここで図１を参照する。例示的なマイクロ流体デバイス10が描写されている。デバイス10は、複数のウェル32を有する層状構造を含み、各ウェル32は、マイクロチャネル33によりテストチャンバー34に流体的に接続されている。層状構造の分解図が図２に示され、ここでデバイス10はマイクロチャネル30、カバー層40、上部支持層50、およびカバースリップ60を含む。種々の実施形態で、デバイス10は、デバイス10に構造的な支えを提供する実質的に平面でかつ硬質のシート材である下部支持層20、および、マイクロチャネル層のための固定プラットフォーム30を含む。幾つかの実施形態では、下部支持層20は、約70Ｄ〜80Ｄのショア硬度（Shore硬度）を有する。一実施形態では、下部支持層20は75Ｄのショア硬度を有する。
【００３４】
次に図３Ａを参照する。例示的なマイクロチャネル層30が描写されている。マイクロチャネル層30は、上面、底面およびその間に厚さを有する実質的に平面の形状を有する。マイクロチャネル層30は、約５〜15 cmの長さと幅、および約１〜10 mmの厚さなど、任意の適切な寸法を有することができる。マイクロチャネル層30は、複数のウェル32、テストチャンバー34および各ウェル32をテストチャンバー34と流体的に接続する、上面に埋封された複数のマイクロチャネル33を備える。ウェル32、テストチャンバー34、および複数のマイクロチャネル33は、任意の適切な寸法を有する。様々な実施形態では、ウェル32は、約0.5〜2.5 mmの直径と約0.5〜5 mmの深さを有することができ、テストチャンバー34は、約5〜20 mmの直径と約0.1〜0.5 mmの深さを有することができ、そして複数のマイクロチャネル33は約0.1〜0.5 mmの幅と深さを有する。図３Ａは、テストチャンバー34の周りに放射状に配置された８個のウェル32を示しているが、マイクロチャネル33が具備できるウェル32の穴数には制限がなく、かつウェル32とマイクロチャネル33の各々は任意の適当な立体配置で配置することができることは理解されたい。様々な実施形態において、マイクロチャネル33とテストチャンバー34は、流体の流れを誘導するまたはそれに影響を与える物理的特徴、例えば不均一な表面またはエッチングパターンや突起を更に含んでもよい。幾つかの実施形態では、マイクロチャネル33、テストチャンバー34、またはその双方は、１つ以上の気泡トラップ35に流体的に接続される（図３Ｂ）。いくつかの実施形態では、気泡トラップ35は、約50μL〜500μLの容積を有し、最大２バールの圧力を支えることができる小さな空間のポケットである。気泡トラップ35は、マイクロチャネル33と直列に、またはマイクロチャネル33もしくはテストチャンバー34に隣接して配置することができる。気泡トラップ35は、流体の流れにより充満されるように構成することができ、ここで流体の流れの中に発生したどんな気泡でも気泡トラップ35内に達するとすぐにトラップされるようになる。幾つかの実施形態では、気泡トラップ35は脱泡弁に流体的に接続され得る。幾つかの実施形態では、脱泡弁は液体の存在下では閉じられ、気体の存在下では開放されてガスポケットと気泡を放出させる。幾つかの実施形態では、脱泡弁を手動で開放したり閉じたりして、気泡トラップ35の中に捕獲されている気泡を放出させることができる。マイクロチャネル層30は、真空チャネル37に流体的に接続された少なくとも１つの真空ポート36を更に含み、真空チャネル37はテストチャンバー34の方に伸びているが、テストチャンバー34から流体的に分離（隔離）されている。幾つかの実施形態では、マイクロチャネル層30は、１つ以上の整合用（位置合わせ）スロット38を更に含む。１つ以上の整合用スロット38は、マイクロチャネル層30の上面に埋め込まれており、そしてガイドロッドまたはガイドワイヤ（図示せず）を受け入れて連続した層の１つ以上の整合用スロットとマイクロチャネル層30との整合を誘導することができる。
【００３５】
次に図４を参照すると、例示的なカバー層40が示されている。カバー層40は、上面、底面、およびその間に厚さを有する実質的に平面の形状を有する。カバー層40は、約5〜15 cmの長さと幅、および約0.1〜1 mmの厚さなど、任意の適切な寸法を有することができる。カバー層40は、中央に配置されたテストチャンバー開口部44の周囲に配置された複数のウェル開口部42を含む。ウェル開口部42およびテストチャンバー開口部44は、上面と底面との間のカバー層40の厚さを貫通して伸びている。くぼみ（indent）45は、カバー層40の上面内部に埋め込まれており、間にスペースを空けてテストチャンバー開口部44と境界を接し、リップ47を形成する。くぼみ45は、カバー層40の底面まで貫通して伸びている少なくとも１つのアパーチャー46をさらに含む。ウェル開口部42、テストチャンバー開口部44およびくぼみ45は、任意の適切な寸法を有することができる。様々な実施形態では、ウェル開口部42は約0.5〜2.5 mmの直径を有することができ、テストチャンバー開口部44は約5〜25 mmの直径を有することができ、くぼみ45は約0.1〜1 mmの深さを有することができ、そしてテストチャンバー開口部44から約0.5〜2.5 mmの距離だけ離れて位置することができる。特定の実施形態では、カバー層40の寸法とレイアウトは、マイクロチャネル層30の寸法とレイアウトを反映し、その結果、カバー層40とマイクロチャネル層30は同じ長さと幅を有し、ウェル32とウェル開口部42は同じ寸法と配置を有し、そしてテストチャンバー34とテストチャンバー開口部44は、同じ寸法と配置を有する。特定の実施形態では、カバー層40は、１つ以上の整合用スロット48をさらに含む。１つ以上の整合用スロット48は、上面から底面までカバー層40を貫通して伸び、ガイドロッドまたはガイドワイヤ（図示せず）を受け入れることができ、カバー層40とマイクロチャネル層30との整合を誘導する。
【００３６】
次に図５を参照すると、例示的な上部支持層50が示されている。上部支持層50は、上面、底面およびその間に厚さを有する実質的に平面の形状を有する。上部支持層50は、約5〜15 cmの長さと幅、および約0.5〜5 mmの厚さなど、任意の適切な寸法を有することができる。上部支持層50は、中央に配置された窓54の周囲に配置された複数のウェル開口部52を含む。ウェル開口部52および窓54は、上面と底面との間の上部支持層50の厚さを貫通して伸びる。ウェル開口部52および窓54は、任意の適切な寸法を有することができる。様々な実施形態では、ウェル開口部52は、約0.5から2.5 mmの間の直径を有することができ、窓54は、約5〜35 mmの長さと幅を有することができる。特定の実施形態において、上部支持層50の寸法とレイアウトは、マイクロチャネル層30とカバー層40の寸法とレイアウトを反映し、その結果、上部支持層50、マイクロチャネル層30およびカバー層40は、同じ長さと幅を有する。開口部52、ウェル開口部42およびウェル32は、同じ寸法と配置を有し、窓54は、テストチャンバー開口部44およびテストチャンバー34へのアクセスを提供する。特定の実施形態において、上部支持層50は、１つ以上の整合用スロット（図示せず）をさらに含む。１つ以上の整合用スロットは、上部支持層50の上面からその底面まで貫通して伸び、上部支持層50とマイクロチャネル層30とカバー層40との整合（位置合わせ）を誘導するガイドロッドまたはガイドワイヤを受け入れることができる。
【００３７】
図５にさらに示されているのは、例示的なカバースリップ60である。カバースリップ60は、実質的に平面の形状を有し、剛性材料から構成され得る。カバースリップ60は、約5〜35 mmの長さと幅など、任意の適切な寸法を有することができる。いくつかの実施形態では、カバースリップ60は、上部支持層50の窓54の内側にフィットするようにサイジングされる。いくつかの実施形態では、カバースリップ60は、テストチャンバー開口部44、リップ47およびくぼみ45の全体をカバーするようにサイジングされる。
【００３８】
マイクロチャネル層30、カバー層40、上部支持層50およびカバースリップ60は、一緒に積み重ねられて、図１に示されるマイクロ流体デバイス10を形成する。マイクロチャネル層30の上面に配置されたカバー層40は、複数のマイクロチャネル33、真空ポート36および真空チャネル37の少なくとも一部を密閉し、複数のウェル32、テストチャンバー34、アパーチャー46に隣接した真空チャネル37の部分への入口を保持する。カバー層40の上面に配置された上部支持層50は、複数のウェル開口部42およびウェル32、並びにテストチャンバー開口部44およびテストチャンバー34への開口部を保持する。上部支持層50の窓54の内部およびカバー層40の上に配置されたカバースリップ60は、テストチャンバー開口部44とくぼみ45の上にシールを形成する。本明細書の他の箇所で説明されるように、下部支持層20は、その構造的剛性を高めるためにマイクロチャネル層30の底面に取り付けられてもよい。
【００３９】
組み立てられたマイクロ流体デバイス10は、二つの流体的に分離されたマイクロ流体回路を形成する。第１のマイクロ流体回路は、真空ポート36、真空チャネル37、アパーチャー46、およびくぼみ45の間に流体接続を含む。外部真空源に接続可能な真空ポート36は、カバー層40の上にカバースリップ60を保持するために真空チャネル37とアパーチャー46を介してくぼみ45内に負圧を加えることができる。真空源は、約0.3〜0.9気圧の間の負圧を加えることでカバースリップ60を所定の位置に保持し、テストチャンバー34への開口部を閉じることができる。第２のマイクロ流体回路は、各ウェル32間の流体接続、各ウェル32に接続されたマイクロチャネル33、および所定の位置にカバースリップ60を有するテストチャンバー34を含む。１つ以上の流動性物質は、第１のウェル開口部52と第１のウェル開口部42を経由して第１のウェル32に入り、接続された第１のマイクロチャネル33を通って流れ、テストチャンバー34に入り、接続された第２のマイクロチャネル33を通過して出て、そして第２のウェル32から外に流れ出る。
【００４０】
１つ以上の流動性物質がテストチャンバ34を通過すると、１つ以上の流体の流れが互いに拡散して、流動性物質の勾配を形成することができる。いくつかの実施形態では、流動性物質の勾配は、例えば、その流動性物質の各々の流量を調節することにより、ウェル開口部52とマイクロチャネル33の異なるパターンを有するマイクロ流体デバイス10を提供することにより、テクスチャ加工したまたはパターン形成されたテストチャンバー34を提供することにより、等で調整することができる。勾配は、明視野可視化、蛍光顕微鏡、色素などを使用してモニタリングできる。
【００４１】
マイクロ流体デバイスの構成部品は、本明細書に記載される特定例に限定されないことを理解されたい。マイクロ流体デバイスの構成部品の様々な特徴は、任意の適切な構成およびバリエーションを受け入れることができる。例えば、図６Ａおよび図６Ｂでは、２つ以上のマイクロチャネル33は、一緒に組み合わされるか、または２つ以上のマイクロチャネル33に分割され得る。特定の実施形態では、ディフューザー領域70は、何重にも内部接続している２以上のマイクロチャネル33を含み、そのためその２以上のマイクロチャネル33の流体が互いに拡散して流体の勾配を形成し、ディフューザー領域70から２以上のマイクロチャネル33を通って下流へと流れ続けることができるようになる。別の例では、カバースリップ60は、図７に示されるように、外部クランプによって所定の場所に固定されてもよい。流体の流れは、正圧、負圧、または毛細管現象によって駆動されてもよい。
【００４２】
本発明のマイクロ流体デバイスの構成部品は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して製造することができる。製造方法は使用する材料によって異なり得る。例えば、実質的に金属を含む構成部品は、より大きな金属のブロックから圧延することができ、または溶融金属から鋳造することができる。同様に、実質的にプラスチックまたはポリマーを含む構成部品は、より大きなブロックから圧搾され、鋳造され、または射出成形されてもよい。適切な方法は、回路、電極、磁石、ダイオードなどを含む１つ以上の要素の組み込みを含むこともできる。１つ以上の要素は、磁場、電場（エレクトロポレーションの場合など）、熱源、冷却源、光源などを提供することで、デバイスに１つ以上の機能を追加することができる。
【００４３】
幾つかの実施形態では、構成部品は、例えば限定されないが、溶融堆積、立体リソグラフィー、焼結、デジタル光加工、レーザー部分溶融、電子ビーム溶融、および積層物体造形といった、当技術分野で一般的に使用される3D印刷または他の追加の製造技術を使用して作製され得る。構成部品は、組み立てを最小限にするために、個別に印刷されるか、または少なくとも部分的に一緒に印刷されてもよい。積層造形と適合できる任意の種類の材料を使用でき、例えばシリコンやABSをはじめとする種々のポリマー；アルミニウム、ステンレス鋼、チタンをはじめとする金属；セラミックや複合材料といった他の材料などを使用することができる。
【００４４】
特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの構成部品は、透明または半透明であることができる。マイクロ流体デバイスは、全体が透明であることができ、または全体が透明であるかもしくはある特定の部分だけが透明である構成部品を含むことができる。例えば、マイクロチャネル層30、カバー層40、上部支持層50およびカバースリップ60の一部分が、マイクロチャネル33を通過する１以上の流体の視覚化を可能にするために透明であることができる。マイクロ流体デバイスの透明部分は、フォトポレーション、発光アッセイ、光学走査など、特定の光学式技術もサポートすることができる。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明のマイクロ流体デバイスの構成部品は、１つ以上の積層、コーティングおよび表面処理を用いて改変することができる。積層、コーティングおよび表面処理は、分子または細胞の付着を強化するか、あるいは特定の表面の疎水性または親水性を変更することによって流体の流れを強化することができる。上記の積層、コーティングおよび表面処理は、スピンコーティング、ディップコーティング、化学的蒸着、化学的溶液堆積、物理的蒸着、液浴浸漬などを含む任意の適切な手段を使用して付着させるまたは施すことができる。積層、コーティングおよび表面処理は、任意の適切な厚さで沈着させるまたは施すことができる。
【００４６】
様々の実施形態では、１つ以上の表面処理は、生存細胞の付着と生存力を高めるために１種以上の細胞外マトリックス材料および／または天然型細胞外マトリックス材料のブレンド、例えば限定されないが、コラーゲン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ビキサパチン（VP12）、ヘパリンおよびケラタン硫酸、プロテオグルカン並びにその組み合わせ等を含むことができる。有益となりうる幾つかのコラーゲンには、限定されないが、I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、およびXIXがある。これらのタンパク質は、天然型および変性型を含むがこれらに限定されない任意の形態であり得る。様々な実施形態では、１つ以上の表面処理は、キチン、キトサン、アルギン酸、アルギン酸カルシウムやアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸塩といった、１つ以上の炭水化物を含むことができる。これらの材料は、植物生産物、ヒトまたは他の生物、または細胞から単離することができ、あるいは合成的に製造することができる。
【００４７】
マイクロ流体デバイスの使用方法
本発明は、また、マイクロ流体デバイスの使用方法に関する。図８を参照すると、本発明のマイクロ流体デバイスを使用する例示的方法100が示されている。方法100はステップ102で始まり、このステップでは、マイクロ流体デバイスであって、少なくとも１つの埋め込まれたマイクロチャネルによって少なくとも１つのウェル流入口と少なくとも１つのウェル流出口とに対して流体的に接続されたテストチャンバーを有する基板を含むマイクロ流体デバイスが提供される。ステップ104では、テストチャンバーの開口部がカバースリップで閉じられる。ステップ106では、少なくとも１つの流体源が、少なくとも１つのウェル流入口のそれぞれに取り付けられる。ステップ108では、少なくとも１つの真空源が、少なくとも１つのウェル流出口のそれぞれに取り付けられる。ステップ110では、少なくとも１つの真空源を使用して負圧が加えられ、その負圧によって少なくとも１つのウェル流入口のそれぞれから、密閉したテストチャンバーを通過して、少なくとも１つのウェル流出口の外へと液体を引き出す。
【００４８】
方法100は、テストチャンバー34の内側の試験サンプル（検体）の上に一定の濃度範囲で少なくとも１つの流体をハイスループットで流すことにおいて有用であり得る。試験サンプルの上に複数の流体を同時に流すことは、テストチャンバー34の内部に複数の流体の各々を互いに拡散させ、その結果、テストチャンバー34の内部に置かれた試験サンプルが流体の勾配に曝される。特定の実施形態では、試験サンプルがカバースリップ60上に固定されそしてテストチャンバー34中に反転され、その結果、テストチャンバー34をシールした時、カバースリップ60が試験サンプルをテストチャンバー34の中に吊り下げて浮遊（suspend）させる。試験サンプルは、カバースリップ60上で培養することにより、接着剤の使用により、またはスライスメッシュのようなサンプルホルダーの使用により、固定することができる。
【００４９】
一態様では、本発明は、目的の１つ以上の剤を細胞集団に送達する方法を提供する。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスは、該デバイスのテストチャンバー内の細胞集団に１つ以上の剤の勾配を送達するために使用される。例示的な剤としては、限定されないが、核酸分子、DNA、RNA、ペプチド、タンパク質、小分子、色素、ホルモン、ビタミン、成長因子、幹細胞因子などが挙げられる。
【００５０】
特定の実施形態では、デバイスの各ウェルは、マイクロチャネルを介してテストチャンバーに送達されるべき１つ以上の剤を含む流体を含む。特定の実施形態では、各ウェルからの流れは、各剤の勾配がテストチャンバー内で生成されるように制御される。各々の細胞は、テストチャンバー中のその細胞の位置によって定義されるような、特定量の各剤に曝露される。特定の実施形態では、勾配によって各細胞が特有の量の各剤に曝露されるようになり、それによって各細胞が可変量の薬剤を受け取る方法を構築する。当該デバイスは、従って、可変レベルの剤への細胞の曝露の効果を評価するためのハイスループット法を可能にする。
【００５１】
特定の実施形態では、方法は、デバイスの１つ以上のウェルに１つ以上の剤を含む溶液を配置することを含み、１つ以上の剤のそれぞれは、所望の初期濃度で存在する。特定の実施形態では、複数のウェルのそれぞれは、異なる剤を含む。特定の実施形態では、複数のウェルのそれぞれが同じ剤を含む。特定の実施形態では、複数のウェルの第１セットは第１の剤を含み、複数のウェルの第２セットは第２の剤を含む。それにより、本方法は、任意の組み合わせのウェルから任意の組み合わせの剤を送達することを可能にする。特定の実施形態では、ウェルは、同じまたは異なる初期濃度のいずれかで、複数の異なる剤を含有する。特定の実施形態では、当該方法は、１つ以上の剤の第１セットの勾配を投与すること、溶液を１つ以上の剤の第２セットで置き換えること、および１つ以上の剤の第２セットの勾配を投与することを含む。
【００５２】
特定の実施形態では、細胞集団は、１つ以上の剤に継続的または定期的に曝露される。例えば、特定の実施形態では、デバイスは、ウェルから数秒、数分、数時間または数日間にわたり連続的に流れるように構成される。一実施形態では、デバイスは、細胞が１つ以上の薬剤に定期的に暴露されるようにウェルからの流れが開始および停止される、定期的な流れのために構成される。例えば、特定の実施形態において、デバイスは、限定された期間の間の剤への曝露のために構成される。一実施形態では、該方法は、１時間あたり少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも10分間、または少なくとも30分間にわたり、薬剤を細胞に送達することを含む。一実施形態では、この方法は、１日あたり少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも10分間、少なくとも30分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも12時間、または少なくとも18時間にわたり細胞に薬剤を送達することを含む。
【００５３】
特定の実施形態では、方法は、送達された薬剤の効果を評価することを含む。例えば、細胞は、当技術分野で既知の任意の既知の方法論またはアッセイを使用して評価することができる。一実施形態では、方法は、蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、近赤外顕微鏡法、二光子顕微鏡法などを含むがこれらに限定されない顕微鏡法を使用した、テストチャンバー中の１つ以上の細胞の目視検査を含む。特定の実施形態において、当該方法は、免疫細胞化学、免疫組織化学、またはin situハイブリダイゼーションを実施して、テストチャンバーの細胞中の目的の生体分子（例えば、タンパク質、抗原、核酸配列）の存否または存在量を評価することを含む。特定の実施形態において、当該方法は、テストチャンバーの細胞の生存力または細胞毒性を評価することを含む。特定の実施形態では、当該方法は、機能的な細胞ベースのアッセイを実施して、テストチャンバーの細胞の生理学または病態生理学を評価することを含む。
【００５４】
特定の実施形態では、方法は、１つ以上の同定された細胞が勾配の投与中に曝露された薬剤の濃度または量を決定することを含む。例えば、特定の実施形態では、観察される特徴を示す１つ以上の細胞のチャンバー内の位置を使用して、細胞が曝露された各薬剤の量を決定することができる。薬剤の濃度は、フロー中のテストチャンバーの較正曲線および画像解析を使用して計算することができ、この場合、画像のピクセル強度は薬剤濃度と相関を示す。薬剤濃度は、コンピュータシミュレーションを使用するか、適切な境界条件で移流拡散方程式を解くことによっても計算することができる。従って、この方法は、観察された細胞特性に対する薬剤量の正確な相関を可能にする。
【００５５】
テストチャンバー内で培養した細胞集団は、任意の適当な細胞型のもの、例えば限定されないが、真核、原核または哺乳動物細胞であることができる。幾つかの実施形態では、細胞は幹細胞、例えば、限定されないが、真核幹細胞（ESC）、多能性幹細胞（PSC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、成体幹細胞、または間充織幹細胞（MSC）である。幾つかの実施形態では、細胞は哺乳動物由来、例えば、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、モルモット、ウマ等由来である。非哺乳類真核細胞としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、原生動物細胞、および糸状菌と非糸状菌を含む心筋細胞が挙げられる。細胞が原核細胞である場合、細胞は細菌細胞である、細胞は分化細胞および／または非分化細胞を含んでよい。細胞は始原細胞または幹細胞を含んでもよい。幾つかの実施形態では、細胞は組織特異的細胞、例えば哺乳動物組織特異的細胞、またはヒト組織特異的細胞である。典型的な哺乳動物細胞としては、限定されないが、上皮細胞、星状細胞、神経細胞、線維芽細胞、心筋細胞、胎児線維芽細胞、ケラチン生成細胞、成体幹細胞、胚幹細胞、および肝細胞が挙げられる。幾つかの実施形態では、細胞は表現型が柔軟な細胞である。表現型が柔軟な細胞は、本発明の方法の条件下での変化に応じて表現型が順応する細胞である。表現型が柔軟な細胞の非限定例としては、神経細胞、線維芽細胞、胎児線維芽細胞、成体幹細胞および胚幹細胞が挙げられる。
【００５６】
幾つかの実施形態では、細胞は分散細胞培養物を含む。幾つかの実施形態では、細胞は３Ｄ組織切片、例えば限定されないが、脳切片を含む。幾つかの実施形態では、細胞は初代細胞培養またはスライス培養の細胞である。
【００５７】
本発明の方法は、細胞過程を含む細胞に対して実施可能である。そのような細胞過程としては、限定されないが、活動電位、樹状突起、軸索、微絨毛、絨毛、不動毛、星状細胞系、などの電気的性質が含まれる。本明細書中で論じるように、本方法は、所望の量の核酸を１つ以上の局所部位に有利に導入できるようにし、生理学的量でのタンパク質の制御された限局性の生産を可能し、細胞に多遺伝子効果をもたらす。よって、本方法は、外来的に適用される剤（例えば核酸）が結合する細胞から始まる細胞過程を切断することを利用せずに、外来的に適用される剤の特異的な局在化を可能にする（Kacharmina他、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 97: 11545-11550）。
【００５８】
本発明は、１種以上の剤を細胞に導入して細胞内で表現型変換を生じさせる方法を提供する。例えば、特定の実施形態では、該方法は、本明細書に記載の方法とマイクロ流体デバイスを使用して、テストチャンバー内に１つ以上の剤の勾配（グラジエント）を導入する方法を提供する。特定の実施形態では、該方法は、テストチャンバー中の１種以上の細胞の表現型の変化を引き起こす１種以上の剤の素性（ID）と量を同定することを含む。表現型の相違は、種、組織型、分化の程度、薬物または病原体への暴露、異常状態、増殖条件等といった任意の相違であることができ、その相違は、遺伝子発現の差に起因することが知られているかまたはその疑いがある。
【００５９】
特定の実施形態では、１つ以上の剤は、例えば限定されないが、DNA、ssDNA、cDNA、RNA、mRNA、lncRNA、マイクロRNA、hnRNA、全RNA、非コードRNA、siRNA、shRNA、アンチセンスRNA等をはじめとする核酸分子を含む。
【００６０】
１つ以上の核酸分子は、異なる配列を有する２以上の核酸分子を含んでよい。幾つかの実施形態では、２以上の核酸分子は異なるポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸は非コードRNAまたは他の非コード核酸である。更に別の実施形態では、核酸はコード核酸と非コード核酸の混合物を含む。核酸はドナー細胞から得られてよく、化学的に合成されてもよく、あるいはその組み合わせであってよい。核酸を化学的に合成する方法は、本明細書中の他の箇所に開示され、それにはインビトロ（in vitro）転写が含まれ得る。
【００６１】
幾つかの実施形態では、１つ以上の剤はドナー細胞の１つ以上の剤を含む。例えば、一実施形態では、当該方法は、ドナー細胞の１つ以上の剤のいずれがおよびどれ程の量が、テストチャンバーの１以上の細胞に表現型の変化を生じさせてドナー細胞の１以上の表現型形質を提示するかを同定する方法を含む。ドナー細胞の表現型は、テストチャンバーの細胞の表現型とは異なっている。
【００６２】
特定の実施形態では、１つ以上の剤はドナー細胞のmRNAトランスクリプトームの１以上のmRNAを含む。特定の実施形態では、１つ以上の剤のいずれがmRNAトランスクリプトームを含む。mRNAトランスクリプトームは、３以上、５以上、10以上、20以上、40以上、50以上、75以上、100以上、200以上の異なるポリペプチドをコードするmRNAを含んでよい。例えば、特定の実施形態では、mRNAトランスクリプトームの１つ以上のmRNAは、当該デバイスの異なるウェル中に入れることができる。
【００６３】
本発明の方法での使用に適した核酸分子は、任意のサイズのものであることができる。本発明は、約30塩基、約50塩基、約75塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約300塩基、約500塩基、約750塩基、約1000塩基、約1500塩基、約2000塩基、約2500塩基または約3000塩基の長さの核酸分子をトランスフェクトすることを含む。特定の実施形態では、本発明は、異なるタンパク質をコードするRNAの混合物および異なる分子量のRNAの混合物を、時には光トランスフェクションにより、トランスフェクトすることを含む。幾つかの実施形態では、核酸は、ある範囲のmRNA転写物サイズを有しかつ約0.5 kb〜約5 kbの平均mRNA転写物サイズ、または別の実施形態では、約1 kb〜約3.5 kbの平均mRNA転写物サイズを有するmRNAトランスクリプトームである。
【００６４】
本発明の方法では、核酸が細胞中に移入され、受容細胞に表現型変換を開始させる。本明細書中で用いる場合、表現型変換は、遺伝子発現、タンパク質発現、免疫学的マーカー、形態学、生理学、バイオ製品（例えばドーパミン）の合成および膜脂質組成のうちの少なくとも１つの変化を含む。一実施形態では、そのような変化は、トランスフェクトクトされたRNAまたはDNAが得られる細胞と関連づけられるまたはそれを示す表現型を生じる。一実施形態では、細胞の表現型変換は、２以上の変化を含む。一実施形態では、表現型変換は生理学の変化を含む。別の実施形態では、表現型変換は、受容細胞の形態学の変化および生理学の変化を含む。表現型変換は、何百という遺伝子の発現の変化を伴うことができる。例えば、ドナー細胞と受容細胞の両方で休止している遺伝子の発現を、新規にアップレギュレート（上方制御）することができる。染色体リモデリングに関連する遺伝子、例えば染色体およびDNA代謝関連過程に関与する遺伝子は、表現型変換を有する細胞でアップレギュレートされ得る。遺伝子オントロジー（「GO」）データベース中の「BP」という注釈付きの遺伝子は、染色体リモデリングに関連すると考えられる（The Gene Ontology Consortium (2000) "Gene ontology: tool for the unification of biology," Nature Genet. 25: 25-29）。GOデータベースは、公表されている（例えばwww. geneontology.orgを参照）。幾つかの実施形態では、遺伝子発現プロファイリングに基づき、ドナー細胞に比較して受容細胞で異なって発現される遺伝子（例えば発現変動遺伝子）の少なくとも５％、幾つかの実施形態では約７％、10％、15％、また幾つかの実施形態では少なくとも約25％が、ドナー細胞で観察されるレベルに対比してそれらの発現が変化する。
【００６５】
細胞の表現型変換は、長期間に渡り安定に維持される。一実施形態では、表現型変換は少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、10日、11日、12日、13日、またはそれ以上の間安定でありかつ持続する。一実施形態では、表現型変換は少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間またはそれ以上の間安定である。別の実施形態では、表現型変換は少なくとも約１か月、２か月、３か月またはそれ以上の間安定である。幾つかの実施形態では、表現型変換は細胞の生存期間または細胞から誘導された培養物の生存期間の期間の間安定である。
【００６６】
別の非限定例では、所望の生理学的状態（例えば分化の間、異常状態、薬品、毒素、転写阻害剤または他の化合物での処理後）にある細胞の核酸発現プロファイル、および別の生理学的状態（例えば異常状態でない同一細胞型の分化前もしくは分化後、または薬品、毒素、転写阻害剤もしくは他の化合物での処理後）にある細胞の核酸発現プロファイルは、当業界で既知でありかつ本明細書中の他の箇所に開示されるRNA単離技術を使って得ることができる。それらのRNAのcDNAクローンは、異なる生理学的状態のRNA存在量の変化を反映して作製することができ、あるいは最初にRNAをcDNAに逆転写することなく該RNAを細胞中にトランスフェクトすることができる。それらのRNAは、異なる生理学的状態にある細胞の核酸発現プロファイルにより示される同じ比率と存在量に従って混合することができる。次いで、それらの核酸混合物を、本明細書に記載のトランスフェクション法と当業界で既知の方法を使って、細胞中にトランスフェクトする。本発明の方法は、細胞の局所トランスフェクションを可能にすることで、核酸混合物を細胞の特定の部分に局所的にトランスフェクトすることができ、あるいは任意の比率の細胞をトランスフェクトすることによって核酸混合物を細胞中に全体的にトランスフェクトすることができる。本発明の方法、および本明細書に記載の核酸の生理学的関連混合物を使って、核酸混合物が細胞内で発現されれば、その生理学的状態の表現型を細胞または細胞過程において複製することができるので、そのため当業者が細胞または細胞過程における表現型移行を観察できるようになる。
【００６７】
１つ以上の核酸分子は、任意の生理学的状態にある着目の任意細胞より得ることができる。ドナー細胞は任意の型の細胞であってよい。ドナー細胞は真核細胞または原核細胞であることができる。特定の実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞、例えば限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、モルモット、ウマの細胞などである。非哺乳動物真核細胞としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、原虫細胞、および糸状菌や非糸状菌を含む真菌細胞が挙げられる。細胞が原核細胞である時、細胞は細菌細胞である。核酸が得られる細胞の非限定例としては、肝細胞、星状細胞、心筋細胞、新生児心筋細胞、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、および神経細胞が挙げられる。着目の任意ドナー細胞由来のRNAを、本発明の方法において任意細胞、例えば線維芽細胞中にトランスフェクトすることができる。特定の実施形態では、ドナー細胞はテストチャンバーの細胞と同じ種のものである。ドナー細胞はテストチャンバーの細胞と同じ個体からであるか、または異なる個体からのものであることができる。ドナー細胞は、テストチャンバーの細胞と同じ胚層（例えば外胚葉）に由来する（例えば両方とも外胚葉に由来する）、または異なる胚層に由来する（例えば１つの細胞が外胚葉に由来しそして他方が内胚葉に由来する）ことができる。ドナー細胞は、テストチャンバーの細胞と同じ細胞型であるが、異なる分化段階にある、治療薬候補に曝露された、毒素もしくは病原体に曝露された、病気に冒された、細胞であることができる。また別の実施形態では、ドナー細胞は受容細胞であってよい。例えば、ドナー細胞からの核酸が第一の受容細胞に移入される。次いで第一の受容細胞からの核酸が続いて第二の受容細胞に移入される。一態様では、第一と第二の受容細胞が異なる生理学的状態にある。別の態様では、第一と第二の受容細胞が同じ細胞型である。本明細書中の他の箇所に記載の通り、細胞から得られたRNAを用いて細胞をトランスフェクトでき、または鋳型として用いてcDNAを作製することができる。該cDNAをインビトロ転写法に用いてRNAの一部または全部を増幅させることができ、次いでそれを本発明の方法に用いる。
【００６８】
非限定例として、ドナー細胞由来のRNAを、当業界で既知の技術および本明細書の他の箇所に開示の技術を使ってそのような細胞から単離することができる。mRNAトランスクリプトームを得るために、mRNAを単離するための種々の既知技術、例えば相補的ポリdT核酸を用いるmRNAの単離を使って、全RNAをプロセシングすることができ、次いでそれをビーズまたはカラムに結合させることができる。次いで得られた１つ以上のmRNAを、本明細書に開示される方法を使って１つ以上の細胞にトランスフェクトする。特定の実施形態では、テストチャンバーの１つ以上の細胞は、ドナー細胞から単離されたmRNAの混合物を発現し、そしてドナー細胞の１つ以上の表現型形質を複製する。
【００６９】
非限定例として、化合物、例えば薬物、ペプチド、サイトカイン、抗体、マイトジェン、毒素、転写阻害剤または当業界で既知の他の化合物で処理した細胞からのRNAを、本明細書中に開示される当業界で既知の方法を使って単離することができる。次いでその細胞からの１つ以上のmRNAを、本明細書に開示の方法を使って別の細胞型にトランスフェクトし、それによって化合物で処理した細胞の多遺伝子表現型を別の細胞に移行させ、それによって別の細胞型での該化合物の迅速でかつ特異的な決定を可能にすることができる。
【００７０】
本発明の別の非限定的実施形態では、異常細胞、例えば腫瘍細胞、細胞内病原体を担持している細胞、自己免疫疾患患者からの細胞等に由来するRNAを、異常細胞から単離することができる。その細胞由来のmRNAトランスクリプトームは、例えば、ポリdT単離技術を使って、全RNAから単離することができる。異常細胞からの１つ以上のmRNAを、本発明の方法を使って別の細胞中にトランスフェクトし、それによって異常細胞の多遺伝子表現型を別の細胞に移行して、相互に作用しあう核酸とその核酸によりコードされるタンパク質とが、細胞のその表現型において有する役割を表すより正確な概念図を提供することができる。
【００７１】
本発明の別の非限定的実施形態として、本発明の方法は治療薬の試験用に細胞を調製するために実施することができる。治療薬候補は、典型的には動物またはヒトでの評価の前に多数の異なる細胞型に対して試験される。それらの異なる細胞はしばしば、多様なシグナル伝達経路を有する細胞系である。経路の多様性は、薬物の機能並びに効能および／または副作用に関する試験と重複しかつ相殺することがあり、それによって候補薬の効果の評価のロバスト性（堅牢度）を低くしてしまう。従って、１つ以上の特定の二次メッセンジャー系経路をコードする核酸分子を着目の初代細胞または細胞系にトランスフェクトし、１つ以上の経路の存在および／または活性を富化した細胞を構築し、それによってそれらの経路は内因性経路よりも優位に立つだろう。従って核酸分子は、前記１つ以上の二次メッセンジャー系経路の種々の成分をコードする不均一の集合体（コレクション）である。その１つ以上の第二メッセンジャー系経路をコードする核酸分子をトランスフェクトさせなかった細胞に比較して、１つ以上の経路の存在および／または活性が高められる。次いで、１つ以上の特定の二次メッセンジャー系経路の発現が高められた細胞に提示される優先経路において、候補治療薬を効能および／または副作用について評価することができる。二次メッセンジャー系の非限定例としては、cAMP系；ホスホイノシトール系；アラキドン酸系；cGMP系；およびチロシンキナーゼ系が挙げられる。そのような限定された細胞系を使うことで、特定の経路に対する候補薬の効果の評価を改善できることが期待される。一実施形態では、特定経路の発現を減少させることによる内因性経路の活性調節も想定される。活性調節（モジュレーション）は、１つの経路の特定タンパク質をコードするmRNAに相当するsiRNAを細胞に導入することによって、特定の経路を阻害することにより達成することができる。そのような活性調節は、１つ以上の特定の二次メッセンジャー系経路をコードする核酸分子の導入と同時に実施することができ、あるいは１つ以上の別々のステップで実施することができる。
【００７２】
RNAの混合物のような核酸の混合物を細胞に導入する場合、その混合物の部分集団を細胞にトランスフェクトし、所定の遺伝子型を担当しているRNAのコアセットを決定することができる。非限定例として、一定の生理学的状態にある細胞から全RNAを単離し、そして全RNAのその集団からmRNAを単離する時、単離されたmRNAの特定の部分集団を細胞にトランスフェクトして、その表現型を担っているコアmRNAを確立することができる。mRNAの特定集団は、当業界で既知であり様々なデータベース、例えばGenBank（登録商標）（United States Department of Health and Human Services提供、メリーランド州ベテスダ）から入手可能である配列相同性データまたは他の特性を使って同定することができる。
【００７３】
あるいは、本発明の方法を使って細胞からmRNAを単離しそして細胞中にトランスフェクトし、そしてsiRNA、マイクロRNA、アンチセンス核酸またはリボザイム（これらをまとめて阻害性核酸と呼ぶ）を前記mRNAと同時にトランスフェクトし、mRNAのサイレンシングおよび／または阻害をもたらすことができる。mRNAのサイレンシングにより、当業者が例えば、多遺伝子表現型を担っているコアmRNAを同定できるようになる。加えて、本発明は、１つの生理学的状態にある細胞の核酸発現プロファイルを決定するステップを伴わずに或る表現型を別の細胞で複製できるようにする。RNAのような核酸は、特定の生理学的状態、例えば一定の分化状態または異常状態にある細胞から単離することができる。幾つかの実施形態では、続いてmRNAトランスクリプトームが単離される。本発明の方法を使って、RNAまたは該RNAのcDNAを細胞にトランスフェクトし、いったん核酸が発現されたら、そのトランスフェクト細胞において表現型を分析することができる。核酸は細胞からの全RNA、または該RNAの部分集団、例えばmRNAトランスクリプトームであることができる。
【００７４】
特定の実施形態では、テストチャンバーの細胞は、マイクロ流体デバイスによって投与される１種以上の核酸によりトランスフェクトされる。細胞は、例えば限定されないが、エレクトロポレーション、フォトポレーション、脂質媒介トランスフェクションなどをはじめとする当業界で既知の任意方法論を使ってトランスフェクトされ得る。例えば、ある特定の態様では、テストチャンバーは光トランスフェクション用の光源にまたはエレクトロポレーション用の電流源にアドレス可能である。
【００７５】
特定の実施形態では、テストチャンバーの１つ以上の細胞がその細胞上のいずれかに位置する１つ以上の部位においてレーザーで照射され、それによって一時的なポレーション孔を作出し、そこから１つ以上の投与された核酸が細胞に入ることができる。
【００７６】
核酸分子を細胞中に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈澱法、リポフェクション、粒子衝突法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション、光トランスフェクションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞の産生方法は当業界で周知である。例えば、Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, NY 2012)を参照されたい。
【００７７】
核酸分子を細胞に導入する生物学的方法には、DNAおよびRNAベクターの使用がある。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を例えばヒト細胞のような哺乳動物細胞中に挿入するために最も汎用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス等から誘導することができる。例えば、米国特許第5,350,674号および同第5,585,362号明細書を参照されたい。
【００７８】
核酸分子を細胞に導入する化学手段としては、コロイド状分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソームをはじめとする脂質ベースの系が挙げられる。生体外（in vitro）および生体内（in vivo）での送達ビヒクルとして使用される典型的コロイド系はリポソームである（例えば人工膜小胞）。
【００７９】
非ウイルス性送達システムを使用する場合、典型的な送達ビヒクルはリポソームである。核酸を宿主細胞に導入する（in vitro、ex vivoまたはin vivoで）ためには、脂質製剤の使用が想定される。別の態様では、核酸を脂質と会合させることができる。脂質と会合された核酸は、リポソームの水性内部液の中に封入され、リポソームの脂質二重層の中に散在され、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と結合する連結分子を介してリポソームに取り付けられ、リポソーム内に封じ込められ、リポソームと複合化され、脂質を含む溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と会合され、脂質中の懸濁液として含められ、またはミセルに包含されるかまたはミセルと複合化され、または他の方法で脂質と組み合わされる。脂質、脂質／DNAまたは脂質／発現ベクターと会合した組成物は、任意の特定の溶液状態の構造に限定されない。例えば、それらはミセルとして二重層構造で存在するか、または「崩壊性の（collapsed）」構造で存在することができる。それらは単純に溶液中に分散されてよく、それらはおそらくサイズまたは形状が均一でない凝集体を形成するであろう。脂質は天然型または合成型脂質であることができる脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に存在する脂肪小滴並びに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドといった化合物のクラスが挙げられる。
【００８０】
使用に適した脂質は、商業源より入手できる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）はミズーリ州セントルイスのSigma社より得ることができ；リン酸ジセチル（「DCP」）はK & K Laboratories社（ニューヨーク州プレインビュー）より入手でき、そしてコレステロール（「Cho」）はCalbiochem-Behring社より入手でき；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc.（アラバマ州バーミンガム）より入手できる。クロロホルム中またはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発されるので最適の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単層および多層脂質ビヒクルを包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重膜と内側の水性媒質を有する小胞構造を有するものとして特徴づけることができる。多層リポソームは、水性媒質により隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると自然に生じる。脂質成分は、密閉構造の形成前に自己再編成を受け、そして脂質二重層の間に水と溶けた溶質とを封じ込める（Ghosh他、1991 Glycobiology 5:505-10）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造を取ることができ、または単に脂質分子の不均一凝集体として存在してもよい。リポフェクタミン−核酸複合体も想定される。
【００８１】
本発明は、テストチャンバーの１つ以上の細胞の連続トランスフェクションを更に含むことができる。連続トランスフェクションは、本明細書では、細胞を第一の時点でトランスフェクトし、次いで第二の時点または後続の時点でトランスフェクトするというプロセスを指すために用いられる。一例として、細胞を１日目にトランスフェクトすることができ、その結果、１つ以上の核酸が細胞に導入される。それらの核酸は細胞の翻訳複合体によって発現されるかまたはサイレントのままであり、あるいは本明細書の他の箇所に開示されるように阻害性核酸を使って阻害することができる。２日目に、同じ細胞を再びトランスフェクトし、１つ以上の同一または別個の核酸を同一細胞中にトランスフェクトすることができる。しかしながら、本発明は１日間隔を空けたトランスフェクションに限定されない。第一の時点と第二の時点の間に数分、数時間、数日、数週間または数か月間をあけて連続トランスフェクションが起こってもよい。ただし、トランスフェクションは同一細胞に起こることを前提とする。よって、本発明の連続トランスフェクション法は、細胞の寿命（生存期間）によってのみ限定される。連続トランスフェクションの別の非限定例は、１日目の第一トランスフェクション、その48時間後（３日目）の第二トランスフェクション、および第一トランスフェクションの７日後の第三トランスフェクションを含む。連続トランスフェクションの条件は同一であっても異なってもよい。トランスフェクションの手法を変更することができ、そして／またはトランスフェクション工程でトランスフェクトされる部位の数が複数のトランスフェクション間で異なることができる。例えば、第二および後続のトランスフェクションは、第一トランスフェクションに用いられるレーザー出力に比較して減少させたレーザー出力を使って実施することができる。
【００８２】
本発明の連続トランスフェクションは、他の中でも特に、細胞内の一時的遺伝子発現を分析すること、長期の発生過程の多遺伝子効果を分析すること、および細胞の生存期間の過程に渡って遺伝子型と表現型との関係を調べることにおいて有用である。
【００８３】
トランスフェクトした核酸の発現の効果を評価するため、本発明の方法に従ってトランスフェクトした細胞を、当業界で既知の方法を使って調査することができる。評価は、例えば、表現型変化、mRNA発現、タンパク質発現、および機能的アッセイから構成され得る。そのような分析の例としては、限定されないが、細胞形態学、免疫学的マーカーの存否、RT-PCR、発現プロファイリング、mRNA存在量測定、特定タンパク質の免疫細胞化学分析（ICC）、細胞生存度、および細胞特異的活性、例えば、細胞分裂−減数分裂および電気生理学が挙げられる。
【００８４】
場合により、本発明の方法は、トランスフェクト細胞において転写を阻害すること、それにより内因性および外因性mRNAの発現とそれによりコードされるタンパク質の発現との間の競合を抑制することを更に含む。転写は外因性物質、例えば、転写を阻害する阻害性核酸または阻害性化合物、例えば５，６−ジクロロ−１−β−D−リボフラノシルベンズイミダゾール（DRB）、プロテアーゼ、またはSP100030（Huang他、2001、Br. J. Pharmacol., 134: 1029-1036）の添加によって阻害することができる。受容細胞の転写を阻害するのに有用な別の剤としては、限定されないが、α−アマニチン、トリコスタチンＡ（TSA；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）、チューブリン解重合剤およびアクチン解重合剤が挙げられる。特定の実施形態では、テストチャンバー中の１つ以上の細胞は、トランスフェクション前に１つ以上の転写阻害剤と接触される。幾つかの実施形態では、細胞はトランスフェクション前に約30分〜約80時間、または約30分〜約60時間、または約６時間〜約48時間接触させられる。
【００８５】
本発明の方法に有用な核酸は、様々な核酸、例えば様々な種類のRNA（mRNA、siRNA、miRNA、hnRNA、tRNA、全RNA、その組み合わせなど）並びにDNAを含むことができる。細胞からRNAを単離し、短鎖ポリヌクレオチドを合成し、DNA挿入断片を含むベクターを作製する方法、並びに細胞中に光トランスフェクトするために核酸を取得する他の方法は、当業界で周知であり、例えば、RNA単離、cDNA合成、インビトロ転写等が挙げられる。
【００８６】
本発明の核酸組成物は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、または種々の組み合わせのハイブリッドのいずれであるかに関係なく、天然源から単離することができ、または試験管内（in vitro）で合成することができる。核酸の操作技術はSambrook他（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, New York）およびAusubel他（1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）に一般的に記載されており、これらは参考により本明細書中に組み込まれる。本発明の方法での使用に適する核酸は、核酸類似体も含む。そのような類似体の例としては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖鎖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖鎖間（「骨格」）結合が挙げられる。加えて、モルホリノ骨格構造を有する核酸（米国特許第5,034,506号）またはポリアミド骨格構造を有する核酸（Nielsen他、1991, Science 254: 1497）も使用可能である。
【００８７】
本発明の方法は、DNA、RNA、mRNAから逆転写されたcDNA、そのcDNAから転写されたRNA、cDNAから増幅されたDNA、増幅されたDNAから転写されたRNAなどをはじめとする様々な核酸の使用を含み得る。本発明は更に、一本鎖および二本鎖RNAおよびDNA分子を使用することを更に含む。細胞または細胞過程（例えば樹状突起）の核酸を導入しそして翻訳する方法において、目的の任意コード配列を使用することができる。当業者は、本開示の内容を楯に用意するとき、細胞過程の多数の性質、関連により更に、付着させた細胞の多数の性質が、本発明の方法によって影響を受けることがあることを理解するだろう。
【００８８】
本発明の一実施形態では、細胞中にトランスフェクトされた核酸は、生物学的サンプル（検体）から単離された全mRNAの全部または一部である。用語「生物学的サンプル」は、本明細書中で用いる場合、生物体または生物体の構成成分（例えば臓器、組織または細胞）から得られたサンプルを指す。サンプルは任意の生物学的組織または流体であることができる。核酸（ゲノムDNAまたはmRNAのいずれか）は、当業者に既知の多数の方法のいずれかに従って該サンプルから単離することができる。
【００８９】
全mRNAを単離する方法は当業者に周知である。例えば、核酸の単離および精製方法は、Laboratory Techniques in Biochemstry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. の第３章、Theory and Nucleic Acid Preparation, P.Tijssen編、Elsevier、N.Y. (1993）、およびLaboratory Techniques in Biochemstry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I.の第３章、Theory and Nucleic Acid Preparation、P.Tijssen編、Elsevier、N.Y. (1993）に一般的に記載されている。
【００９０】
一実施形態では、全核酸は、例えば、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出法を使って所定の試料から単離され、そしてオリゴdTカラムクロマトグラフィーによりまたは(dT)n磁気ビーズを使うことによりポリA+ mRNAが単離される。市販の製品、例えばTRIzol（登録商標）およびMicro-FastTrackTM（InvitrogenTM、カリフォルニア州カールスバーグ）は、生物学的サンプルから核酸を抽出するのに有用である。
【００９１】
mRNAは細胞または細胞過程に直接、局所的にトランスフェクトすることができ、またはサンプルmRNAを逆転写酵素、オリゴdTを含むプロモーターおよびファージT7プロモーターをコードする配列を用いて逆転写し、一本鎖DNA鋳型を提供することができる。DNAポリメラーゼを使って第二鎖DNAを重合する。二本鎖cDNAの合成後、T7 RNAポリメラーゼを添加し、cDNA鋳型からRNAを転写する。各単一のcDNA鋳型からの連続転写反応は、増幅したRNAをもたらす。in virto重合方法は当業者に周知である（例えば、Sambrook, 前掲；Van Gelder他、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1663-1667参照）。更に、Eberwine他（1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3010-3014）は、in vitro転写による２回の増幅反応を用いるプロトコルを提供しており、そのプロトコルは元の出発物質の106倍超の増幅を達成する。
【００９２】
本発明は更に、細胞または細胞過程中へのトランスフェクションのためにin vitro転写を使用することを含む。in vitro転写は、核酸（DNA）セグメントを両方向で転写することによりdsRNAを生産することを含む。例えば、HiScribeTM RNAi転写キット（New England Biolabs社、マサチューセッツ州Ipswich）は、ベクターと、どちらかの側がT7プロモーターによって隣接される位置で該ベクター中にクローニングされる、核酸セグメントのdsRNAを産生する方法を提供する。前記dsRNAに対する２本の相補鎖のT7転写用に、別々の鋳型が作製される。それらの鋳型はT7 RNAポリメラーゼの添加によりin vitroで転写され、そしてdsRNAが産生される。PCRおよび／または他のRNAポリメラーゼ（例えばT3またはSP6ポリメラーゼ）を使った同様な方法も使用でき、それらは当業界で知られている。
【００９３】
本発明は更に、トランスフェクションのための化学合成核酸の使用を更に含む。プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは、Beaucage（1981, Tetrahedron Letts., 22:1859-1862）により最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、Needham-VanDevanter他（1984, Nucleic Acids Res., 12:6159-6168）に記載の通りに、自動合成装置を使って化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、Pearson（1983, J. Chrom., 255:137-149）に記載された未変性アクリルアミドゲル電気泳動によりまたはアニオン交換HPLCにより行われる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxamの化学分解法（1980, Grossman & Moldave編、Methods in Enzymology, Academic Press, New York, 65:499-560）を使って確かめることができる。
【００９４】
本発明は更に、トランスフェクションを介した細胞または細胞過程を局所的にトランスフェクトする方法におけるDNAの使用を含み得る。DNAはベクター中に含まれていてもよい。本発明は、プロモーター／調節配列を含む核酸に、該核酸がその核酸によりコードされるタンパク質の発現を指令することができるように作動可能に連結されたタンパク質をコードする単離されたDNAを含む。よって、本発明は、例えばSambrook他（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）およびAusubel他（1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）に記載されたもののような細胞内での外因性DNAの同時発現を伴う、外因性DNAを細胞中に導入するための発現ベクターと方法を包含する。
【００９５】
本明細書中に開示された通りにトランスフェクトした細胞または細胞過程でのタンパク質発現は、ベクターが導入される細胞での該タンパク質の発現を指令する働きをするプロモーター／調節配列に作動可能に連結された所望の核酸（タグを含むまたは含まない）を含むプラスミドまたは他のタイプのベクターを作製することによって達成することができる。遺伝子の構成的発現を駆動するのに有用な多数のプロモーター／調節配列が当業界で入手可能であり、そして例えば限定されないが、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー配列、SV40初期プロモーター、並びにラウス肉腫ウイルスプロモーター等が含まれる。更に、タンパク質をコードする核酸の誘導性および組織特異的発現は、誘導性または組織特異的プロモーター／調節配列の制御下にタンパク質をコードする核酸を配置することにより達成することができる。この目的に有用である組織特異的または誘導性プロモーター／調節配列の例としては、限定されないが、MMTV LTR誘導性プロモーター、およびSV40後期エンハンサー／プロモーターが挙げられる。加えて、金属、糖質コルチコイド等といった誘導物質に応答して誘導される当業界で周知のプロモーターも、本発明に想定される。よって、本発明は、既知であっても未知であってもよい任意の作動可能に連結された所望のタンパク質の発現を指令することができる、任意のプロモーター／調節配列の使用を含むことが理解されよう。
【００９６】
任意の特定のプラスミドベクターまたは他のDNAベクターの選択は、本発明の限定要素でなく、広範囲の多様なベクターが当業界で周知である。更に、特定のプロモーター／調節配列を選択すること、そして所望のポリペプチドをコードするDNA配列にそれらのプロモーター／調節配列を作動可能に連結することは、当業者の技術の十分範囲内である。そのような技術は当業界で周知であり、例えば、Sambrook他 (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) およびAusubel他 (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)中に記載されている。
【００９７】
タンパク質をコードする核酸は、様々なプラスミドベクター中にクローニングすることができる。しかしながら、本発明はプラスミドまたは任意の特定ベクターに限定されるものと解釈してはならない。代わりに、本発明は、当業界で容易に入手可能なおよび／または周知である広範囲の多様なベクターを包含すると解釈すべきである。
【００９８】
本発明は更に、アンチセンス核酸、siRNAまたはmiRNAのような阻害性核酸を細胞中に局所的にトランスフェクトすることを更に含む。siRNAポリヌクレオチドは、RNA活性を妨害するRNA核酸分子であり、その作用は一般に転写後遺伝子サイレンシング機構を介して起こると考えられる。siRNAポリヌクレオチドは、二本鎖RNA（dsRNA）を含み得るが、そのように限定するつもりはなく、一本鎖RNAを含んでもよい（例えば、Martinez他、2002, Cell 110:563-74参照）。本発明に含まれるsiRNAポリヌクレオチドは、他の天然型、組み換え型または合成の一本鎖もしくは二本鎖ヌクレオチドポリマー（リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはその両方の組み合わせ）および／または本明細書中に提供されるようなヌクレオチド類似体（例えばオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド等、典型的には５′→３′ホスホジエステル結合で）を含んでよい。従って、相補的ヌクレオチド塩基対合の十分確立された理論を前提とすると、siRNAポリヌクレオチドの転写を指令することができるDNA配列として本明細書中に開示されるある一定の典型的配列は、対応するRNA配列およびそれらの相補体もまた記載していると意図される。
【００９９】
siRNAは、鋳型として、RNAポリメラーゼプロモーター用のプロモーターを含むDNA（ゲノム、cDNAまたは合成）を使って転写させることができる。例えば、プロモーターは、U6プロモーターまたはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターであることができる。あるいは、siRNAは合成的に誘導されたRNA分子であってもよい。ある種の実施形態では、siRNAポリヌクレオチドは、平滑末端を有することができる。ある別の実施形態では、siRNAポリヌクレオチドの少なくとも一方の鎖が、siRNAポリヌクレオチドの一方の鎖の３′末端に「突出している（overhang）」（すなわち、反対側の鎖の相補的塩基と塩基対合しない）少なくとも１つのヌクレオチド、そして幾つかの実施形態では、２つのヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態では、siRNAポリヌクレオチド二本鎖の各鎖が３′末端に２ヌクレオチドの突出部を有する。この２ヌクレオチドの突出部は、チミジンジヌクレオチド（TT）であることができるが、別の塩基、例えばTCジヌクレオチドもしくはTGジヌクレオチド、または他の別のジヌクレオチドを含んでもよい。突出ジヌクレオチドは、干渉のターゲットとされるポリヌクレオチドの配列の５′末端の２個のヌクレオチドに対して相補的であってもよい。siRNAポリヌクレオチドの３′末端の詳解については、例えばWO 01/75164を参照されたい。
【０１００】
幾つかの実施形態では、siRNAポリヌクレオチドは、約18〜30ヌクレオチド塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドを含む。ある特定の例では、siRNAポリヌクレオチドは、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、または約27塩基対を含み、そして別の実施形態では、約19、約20、約21、約22もしくは約23塩基対、または約27塩基対を含む。本発明に有用なsiRNAポリヌクレオチドは、特定の配列から１、２、３または４ヌクレオチドが異なる（例えば転移またはトランスバージョン(塩基転換)といったヌクレオチド置換により）ことにより可変性を示すポリヌクレオチド配列を含んでもよい。それらの相違は、分子の長さに依存して、二本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖かアンチセンス鎖かのいずれに位置するかに依存して、特定のsiRNAポリヌクレオチド配列の任意のヌクレオチド位置で起こり得る。ヌクレオチドの相違は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の上に存在してよく、置換ヌクレオチドが典型的に水素結合でそれと塩基対合を形成するであろう相補的ヌクレオチドは、必ずしもそれに対応して置換されなくてもよい。幾つかの実施形態では、siRNAポリヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列に関して相同である。
【０１０１】
siRNAポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、特定の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド断片（例えば約18〜30ヌクレオチド）を含む一本鎖ポリヌクレオチドおよび、典型的にはスペーサー配列により隔てられている、それの逆方向相補体から誘導することができる。そのような一定の実施形態によれば、スペーサーの開裂は、一本鎖オリゴヌクレオチド断片とその逆方向相補体を提供するが、ここでそれらは場合により、一方の鎖もしくは両方の鎖の３′末端および／または５′末端からの１個、２個、３個またはそれ以上のヌクレオチドの付加もしくは削除をもたらし得る追加のプロセシング段階を伴って、互いにアニールして本発明の二本鎖siRNAポリヌクレオチドを形成することができる。特定の実施形態では、スペーサーは、該スペーサーの開裂前に、そして場合により、一方の鎖もしくは両方の鎖の３′末端および／または５′末端から１個、２個、３個、４個またはそれ以上のヌクレオチドの付加または削除をもたらしうる後続のプロセシング段階の前には、該断片とその逆方向相補体とがアニールして二本鎖構造（例えばヘアピンポリヌクレオチド）を形成できるような長さのものである。従って、スペーサー配列は、二本鎖核酸中にアニールさせるとsiRNAポリヌクレオチドをもたらす、２つの相補的ポリヌクレオチド配列領域の間に配置される、本明細書中に提供されるような任意のポリヌクレオチド配列であることができる。
【０１０２】
本発明方法は、更に、核酸を細胞中に導入する方法を含む。該方法は核酸分子の存在下で細胞をトランスフェクトすることを含み、ここでマイクロ流体デバイスを使って核酸分子が流体培地中で細胞に送達され、それにより細胞膜の一方の側から他方の側へと細胞膜を貫通して核酸を移行させることが可能である。流体培地は、細胞の生存力と核酸分子の安定性を支持するために緩衝能とpHを有する任意の培地を含むことができる。考えられる培地としては、限定されないが、イーグル基本培地（BME）、BGJb培地、ブリンスターBMOC-3培地、CMRL培地、CO2非依存性培地、ダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM)、F-10栄養培地、F-12栄養培地、グラスゴー最少必須培地、グレース昆虫細胞培地、改変MEM、IPL-41昆虫培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、レイボビッツL-15培地、McCoy 5A培地(改変)、MCDB 131培地、199培地、NCTC-109培地、最少必須培地(MEM)、改変イーグル培地(MEM)、Opti-MEM（登録商標）I 還元血清培地、RPMI培地1640、シュナイダーのショウジョウバエ培地、ウェイマウスMB 752/1培地、トリス、トリス-EDTA (TE) 細胞培養培地、ウィリアム培地E、人工髄液(aCSF)、リンゲル液などが挙げられる。本発明は、緩衝塩溶液、例えば限定されないが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)、イーグル平衡塩類溶液、ハンクス液、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)の使用を更に含み得る。
【０１０３】
細胞に入る核酸分子の数は、流体培地中の初期核酸濃度、核酸分子のサイズ、流体培地の流速、入口と出口の位置、およびテストチャンバー内の細胞の位置により影響を受ける。光トランスフェクションでは、細胞に入る核酸分子の数は、レーザー強度、例えば各レーザーパルスの長さ、送出されるレーザーパルスの数により影響を受ける。本明細書の教示に基づけば、当業者は、細胞に入る核酸の概算の数をコントロールするためにトランスフェクション工程のパラメータを容易に調整することができる。
【０１０４】
一実施形態では、細胞は、浴中で約１〜約150μg/mL、または約10〜約100μg/mL、または約10〜約50μg/mLで核酸分子を含む流体培地に曝露される。
【０１０５】
本発明は更に、トランスフェクションによって核酸を細胞または組織に導入する別法の使用を含む。本発明に含まれる方法としては、例えば、かん流、ピコスピリッツ法、マイクロインジェクション等が挙げられる。かん流方法には、限定されないが、ポンプを使って核酸分子を含む流体培地を細胞または組織に移動させることが含まれる。本発明のかん流法に用いられる流体培地には、本明細書中の他の場所に開示されたもの、例えば核酸と細胞、組織または動物の安定性を支持および維持する緩衝溶液などが含まれる。本発明の一実施形態では、流体培地としては、イーグル基本培地（BME）、BGJb培地、ブリンスターBMOC-3培地、CMRL培地、CO2非依存性培地、ダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM)、F-10栄養培地、F-12栄養培地、グラスゴー最少必須培地、グレース昆虫細胞培地、改変MEM、IPL-41昆虫培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、レイボビッツL-15培地、マコイ5A培地(改変)、MCDB 131培地、199培地、NCTC-109培地、最少必須培地(MEM)、改変イーグル培地(MEM)、Opti-MEM（登録商標）I還元血清培地、RPMI培地1640、シュナイダーのショウジョウバエ培地、ウェイマウスMB 752/1培地、ウィリアム培地E、人工髄液(aCSF)、リンゲル溶液などが挙げられる。本発明は、緩衝塩溶液、例えば限定されないが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)、イーグル平衡塩類溶液、ハンクス液、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)などの使用を更に含み得る。
【０１０６】
本発明は、核酸を細胞、臓器または組織に導入するために光トランスフェクションと協働してピコスプリッツ法を使用することを更に含む。ピコスプリッツ法は、核酸のような化合物を細胞、組織または動物に送達させるために圧力デバイスを用いて電気パルスを使用することを含む。ピコスプリッツ法は当業界で既知であり、例えば、Herberholz他、2002、J. Neuroscience, 22: 9078-9085中に記載されている。ピコスプリッツ装置は、例えば、World Precision Instruments社（フロリダ州サラソタ）より入手可能である。
【０１０７】
別の実施形態では、２以上の異なるポリペプチドをコードする核酸による細胞のトランスフェクションは、マイクロインジェクションにより達成される。
【０１０８】
光トランスフェクションを使用する場合、該方法は、細胞にレーザーを照射して光トランスフェクトし、細胞を局所的にトランスフェクトすることを含む。細胞膜、または植物細胞、真菌細胞、および細胞壁を含む他の細胞の場合には、レーザーが細胞膜または細胞壁と接触すると、細胞膜または細胞壁が穿孔され、RNAおよび／またはDNAのような外来分子を拡散させて細胞の中に入れるようにする。哺乳動物細胞膜の流動性は、その後の穿孔の閉塞を促す。本発明に適応するレーザーとしては、限定されないが、488 nmで操作する連続波アルゴンイオンレーザー（Schneckenburger他、2002、J. Biomed. Opt., 7: 410-416；Palumbo他、 1996, J. Photochem. Photobiol. B-Biol., 36: 41-46)、355 nm（Shirahata他、2001, J. Invest. Med., 49: 184-190）、532 nm (Soughayer他、2000, Anal. Chem., 72: 1342-1347）および1064 nm（Mohanty他、2003, Biotechnol. Lett. 25: 895-899）で操作する、パルス動作および高周波数変換型（pulsed and upconverted）Nd:YAG レーザー、並びにフェント秒チタン−サファイアレーザー（Tirlapur他、2002, Plant J. 31: 365-374；Tirlapur他、2002, Nature 418: 290-291；Zeira他、2003, Mol. Therapy 8: 342-350）が挙げられる。幾つかの実施形態では、405 nmのチタン−サファイアレーザー（PicoQuant GmbH, ドイツ国ベルリン）を用いて細胞を光トランスフェクトする。しかしながら、本発明は、チタン−サファイアレーザーに限定されず、約10-19 m3の局所焦点体積を送出する能力を有する任意のレーザーを包含する。
【０１０９】
入射レーザー光線のコントロールは、様々な装置を使ってレーザーの焦点と出力を制御し、更にはレーザーの照準を合わせることにより達成される。レーザーの出力はレーザーの焦点合わせは、レーザーと細胞の間に置いた、顕微鏡レンズなどのレンズを通して入射レーザー光を通過させることにより達成される。レーザーの出力は、レーザーの方に向かう電圧と電流を調整することによりそして減光フィルターまたはポッケルセルの使用を通してコントロールされる。レーザーへの細胞の暴露は、一眼レフ（SLR）カメラシャッターなどのシャッターを通しておよび／または電気的に制御されるポッケルセルを用いてコントロールされる。
【０１１０】
レーザーの照準は、顕微鏡レンズを通して、そしてレーザー源と細胞の間に置かれた誘電ミラーおよびステアリングミラー並びにAOD（防音光偏向器）を用いて達成される。本発明の実施に有用な顕微鏡としては、例えば限定されないが、共焦点顕微鏡、多光子励起蛍光顕微鏡、光学顕微鏡等が挙げられる。当該方法は、光ファイバーを使ってレーザーを遠隔領域またはアクセス困難な領域に伝送することを目指すことを更に含む。非限定例として、光ファイバーは生存動物の腸、神経系または心胸郭細胞を光トランスフェクトするために用いられる。更に、本発明は、動物において多重光ファイバーを使って細胞または細胞集団を光トランスフェクトすることを含む。光ファイバーは当業界で周知であり、例えば米国特許第3,711,262号および同第6,973,245号明細書に記載されている。
【０１１１】
10ミリ秒間に１ミリワット未満の出力を有するレーザー光線は、細胞を穿孔するのに十分である（Paterson他, 2005, Optics Express, 13: 595-600)。幾つかの実施形態では、レーザーは、レンズの背側アパーチャーのところで約1200 MWm-2 の電力密度および約30〜55 mWの総出力を有する。更に、トランスフェクションに最大表面積を提供するために、レーザー光線は約2 mmのビーム直径を有する高度に円形(dx＝dy)であるべきである。
【０１１２】
レーザーの開始出力は、標的細胞に対して付随の病理学的作用を与えることなく、出力を光トランスフェクションに必要なミリワット領域に減弱させるために、様々なフィルター、例えば減光（ND）フィルターの使用を通して弱められる。光線はf＝100 mmの望遠鏡の使用により拡大され、そしてa×100 対物レンズ (N.A.＝1.25)を装備した光学顕微鏡または油浸顕微鏡などの顕微鏡にさし向けられる。レーザー源と顕微鏡の間のSLRシャッターが露光時間の制御を可能にする。約40 msの露光時間が、付随の損傷を伴わずに細胞を穿孔する（ポレートする）のに十分であるが、このパラメータは、露光時間を増加または減少させるために変更することができる。
【０１１３】
標的細胞は、顕微鏡の試料台を操作することによりそして／または誘電ミラーとステアリングミラー並びにAODを使うことにより、適切な位置に配置され、焦点を合わせられる。それにより光線の焦点が細胞の核に対してでなく細胞膜に合わせられる。細胞過程、例えば樹状突起を穿孔する場合、光線の焦点は細胞過程の上に直接合わせられる。
【０１１４】
代表的な光トランスフェクションプロトコルは、少なくとも２つを含み、細胞の３回の連続光トランスフェクション工程を含み得る。ある実施形態では、最初の光トランスフェクション工程はチタン−サファイアレーザーを使って約35 mWで行われ、その後の光トランスフェクション工程は30 mW未満のような低出力で行われる。一実施形態では、各光トランスフェクション工程は、レーザーが多数のランダム部位で細胞を照射することを必要とする。工程あたりの照射部位の数は、レーザーの強度、照射部位に生じる穿孔の直径、mRNAトランスクリプトーム中の転写産物の平均サイズ、およびブラウン運動を使った穿孔を通した個々の転写産物のモデル化輸送を考慮することにより決定される。最初の光トランスフェクション工程の後、ドナー細胞に特異的な増殖培地に細胞を移すことができる。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、細胞は好結果のトランスフェクションを示すマーカーを含む核酸を用いてトランスフェクトされる。そのようなマーカーは当業界で既知であり、例えば、抗生物質耐性および蛍光タンパク質を含む。好結果のトランスフェクションは、検出可能な分子を核酸溶液に添加することにより追跡することができる。そのような分子は当業界で周知である。幾つかの実施形態では、分子は受容細胞に対して非毒性である。それの非限定例としては、ルシフェラーゼイエローおよびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステルが挙げられる。局所的にトランスフェクトされた核酸の発現は、マーカーの存在と活性または細胞の表現型に従って分析される。
【実施例】
【０１１６】
〔実施例〕
本発明は、以下の実施例への参照により更により詳細に説明される。これらの実施例は例示目的のみで与えられ、特に断らない限り限定を意図するものではない。よって、本発明は、下記の実施例に限定すると解釈してはならず、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈すべきである。
【０１１７】
更に説明しなくても、当業者は、前述の記載と下記の典型的実施例を用いて、本発明の化合物を製造および使用することができ、また特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。従って、下記の実施例は、本発明の例示的な実施形態を具体的に指摘しており、本開示の残余部分を決して限定するものであると解釈してはならない。
【０１１８】
実施例１：ハイスループットのトランスクリプトーム誘導表現型リモデリング（TIPeR）
細胞型はそれらのトランスクリプトームに基づいて識別可能であるが、細胞型を定義するのに役立つRNAの発現に一定の範囲が存在する。これは、細胞内でトランス遺伝子の発現を行うときに問題を引き起こす。その理由は、トランス遺伝子の発現が、各々のトランスフェクト細胞において異なるトランスクリプトーム背景の上に起こると予想されるからである。よって、理論的には、多数の細胞を実験用RNAプールでトランスフェクトする際に使用する個々のトランスフェクトRNAの存在量を系統的に変更することが重要であるだろう。そのような実験スキームは、トランスフェクトされたRNAが宿主細胞トランスクリプトームと相互作用して定量可能な機能的読み出し情報を生じることから、それらの細胞の同定を可能にするだろう。下記の試験は、トランスクリプトーム誘導表現型リモデリング（TIPeR）用途のために特別に開発された、新規ハイスループットマイクロ流体デバイスを提供する。このデバイスは、分散された形と生存切片中の両方の多数の細胞を、多数の異なる量のRNAによって効率的にトランスフェクトさせることが可能である。手短に言えば、このマイクロ流体デバイスは、精巧にコントロールされた流れ（低レイノルド数で）および標的宿主細胞への化学種の拡散に頼っている（図６Ａ）。RNAの拡散は、多数の細胞とRNAが該デバイスの内側で同時に試験することができるように、流体の流量と幾何学の組み合わせを使って、時間的および空間的の両方でコントロールされる（図６Ｂ）。このマイクロ流体TIPeRデバイスは、実験と細胞インキュベーションをはじめとして完全に自動化することができる。それは研究者が定義した濃度の範囲を超える幾つかの化学種を分析するためにマルチプレックス化することもできる。該デバイスは、そのような光トランスフェクションに光アドレス可能となるように工作されている。エレクトロポレーションはトランスフェクションモードとして実装することもできる。
【０１１９】
図６Ａの概略図は、チャネル、混成配置、および中央テストチャンバーを含むマイクロ流体デバイスを示す。マイクロチャネルは幅と深さが約200μmであり、そしてテストチャンバーは約2 cm平方であり、深さが200μmである。図６Ａの概略図は、12個の流入口と６個の流出口を示しており；注入口の連続ペアの各々は、ユーザーが決定した濃度の溶液に分析種を混合するためのディフューザーによって連結される。これらの溶液は最終的に、TIPeRでテストするための細胞を含むテストチャンバーに供給される。中央のリザーバーまたはテストチャンバーは、使用を容易にするために標準カバースリップまたはスライスメッシュと可逆的にインターフェース接続するように構成され、そして標準的な実験用顕微鏡と適合する。
【０１２０】
マイクロチャネルとテストチャンバー内に閉じ込められた気泡は、マイクロ流体デバイスの機能を変更する恐れがある。これらの気泡は、流体内に溶け込んだ気体から注入シリンジまたはウェルの壁面上に形成され、フローの間にマイクロ流体デバイスに入り、マイクロチャネルおよびテストチャンバー内に閉じ込められる可能性がある。これにより実験時間が増えることになり、操作上の不具合を引き起こし得る。気泡はまた、流れパターンや液体の混合を変化させることによって実験結果に影響を与える可能性があり、細胞膜に剪断応力を誘発することによって細胞を損傷する恐れがある。この問題を克服するために、脱泡弁または気泡トラップをマイクロチャネルとテストチャンバーに組み込んで、気泡をろ過により除去できる。弁またはトラップは、マイクロ流体デバイスを通して５時間以上流体を流した実験においてデバイスの信頼性を向上させることが観察された。気泡トラップは、内部容積が非常に小さくて済み（例えば、約50μL〜500μLまたは約115μL）、広範囲の流体圧力（例えば最大約2 bar）で動作する。小さい内部容積により、気泡トラップを最初に満たすために大量の注入流体を供給する必要性が回避される。
【０１２１】
図示されている実施形態の設計は、カバースリップ上またはスライスメッシュ内で最大12種の異なるRNAを同時にテストすることができる。テストチャンバーは、数千の細胞を様々な種および様々な濃度に曝露することができる。RNA濃度とチャンバーを通過する流量によって決定される濃度において12種のRNAを細胞にトランスフェクションすると、これらの12種のRNAは、その濃度を該デバイスによって操作することができる12種の異なるRNAによって置き換えることができ、続いてそれを細胞中へ光トランスフェクションすることができる。レーザーエネルギーとパルスパターンを適切に選択すると、個々の細胞に対して多数回の光トランスフェクションを実行しても、明らかな悪影響がない。
【０１２２】
図９Ａ〜図９Ｃに示す実験に加えて、テストチャンバー内のRNAの空間分布を決定するために、計算流体力学（CFD）シミュレーションが実装され、それによりチャンバー内の任意の場所にある12種のRNA全てについてのRNA濃度を決定することができる。このようにして、細胞の化学環境を詳細に予測することができる。図６Ｂおよび図９Ｃは、概略図に基づいた最初の原型並びに２つの異なる流体（赤色及び緑色色素）の拡散と混合パターンを示す。実験の時間スケールは、化学種の拡散速度によって設定されるが、それは流速と系のサイズによりコントロールされる。図６Ｂと図９Ｃに示される色素の赤色および緑色の線条は、異なる化学種の流れと混合をコントロールする能力を証明し、それは様々な濃度でのRNAの迅速なマルチプレックス化を可能にする。
【０１２３】
マイクロ流体デバイスの最初の原型は、従来の製造技術を使用して製造された。高精度（〜1μm）を有するコンピュータ数値制御（CNC）機械は、マイクロ流体デバイスを製造するのに約100μmの寸法を有する複雑な機能をロバストに製作することができる。多軸機械加工技術を利用して、漏れを防ぎ、非常に信頼性の高い流体注入を提供する、フィッティングを有する内蔵型サイドポートを構築する。マルチプレックス化の拡大のために、本格的な三次元（3D）マイクロ流体デバイスだけでなく、入れ子のミキサーやディフューザーをはじめとする追加のミクロ機能を追加することも可能である。同様にガス透過性である軟質材料（例えばPDMS）の層がデバイスの構成の中に導入されているものは、該デバイスを、トランスフェクション工程後の細胞モニタリング用のインキュベーターとして働くことができるようにする。図９Ａは、空間的および時間的に制御されたRNA濃度を取得するための概念を、RNAの適用および除去の流体力学を示すために混合せずに所定の試験形状においてテストした、コンピュータ計算流体力学法を使った数値シミュレーションを示す。ポートを連続方式でオン／オフすることにより、複雑なトポロジー機能を有する濃度パターンが作成される。結果は、ユーザーが所定の化学種の濃度の大きさと長さスケール（サイズ）並びに所定の形状において勾配（グラジェント）をコントロールすることができることを明らかに示す。次に、実験的形状が導入され、所定の化学種の流れ、混合および拡散が混合を伴ってシュミレートされる（図９Ｂ）。数値シュミレーションは、デバイス原型に従った濃度プロファイルの完全な進化を示す。流入口の流れがグリッド付きディフューザーの中で合流すると、混合が起こり、異なるレベルに分かれた後、下流の勾配チャンバーに入る。混合チャンバー内の高、中および低濃度の３本のバンドは、トランスフェクション暴露に必要なRNAレベルを表す。
【０１２４】
次に、数値シュミレーション結果を同様な条件下での実験と比較した（図９Ｃ）。数値予測は、図９Ｃに示したマイクロ流体実験の主な特徴を捉えているように見える。入口に２種の色素（RNA種を表す）を注入し、そしてそれらがテストチャンバー中へどのように流れていき、混合し、拡散するかを観察することによる、実験を行った。結果は、マルチプレックス化に必要な所望の濃度バンドを示している。言い換えれば、該デバイスは、所望の空間的濃度プロファイルを生成することができる。数値と実験的な流れパターンは非常によく似ており、ハイスループットなトランスフェクションに必要な、バンド状になったRNA濃度プロファイルを示す。シミュレーションプロファイルによる流れプロファイルの偏差は、おそらく実験とシミュレーションとの間の拡散係数の不一致、細胞サンプルを担持する円形カバースリップの追加、およびチャネル内に閉じ込められた小気泡により引き起こされると考えられる。直交方向に同様なRNA勾配を構築することは、１回の実験でテストすることができるRNA数を倍増させるだろう。
【０１２５】
流体注入口を使用し、別個のカルシウムインジケーターX-Rhod-1とFluo-4の２つの勾配を持つ生存神経細胞をロードすることができる。これを行うと、それらのフルオロフォアの分布は、予想どおり勾配に依存する形で、サイトゾルに分散され濃縮される。次のステップは、刺激剤とは異なる位置に配置されかつ異なる量の２種のカルシウムインジケーターがロードされている、細胞間のCa++応答を評価するために細胞を刺激することである。
【０１２６】
さらなる研究は、チャンバー内にユーザー定義の濃度で多数のRNAをチャンバー中に流し、細胞をトランスフェクトし、そしてトランスフェクトされたRNAの翻訳と機能を評価することである。マイクロ流体チャンバー中の任意細胞における個々のRNA濃度は、流量と初期RNA濃度に基づいて決定することができる。細胞中に拡散することのできる各RNAの量は、レーザー照射パラメータに基づいて決定することができる。RNAトランスフェクションの結果を測定することと、導入されたRNAの量を知ることにより、導入されるRNAと、それらの存在量と、結果として起こる細胞変化とを、直接相関させることができる。この多遺伝子機能的ゲノミクス解析は、ハイスループットTIPeRアッセイである。これは、分散培養液中の細胞に対して実施できるが、チャンバー中に切片を配置し、そして組織上にRNAを流すことにより、生存組織片の細胞に対しても実施することができる。RNA濃度の決定には、組織への追加の拡散成分が必要であるだろうが、これをモデル化してアルゴリズム（COMSOL）に組み込むことが可能である。TIPeRデバイスに注入するためのRNAのIDを迅速に変更できるようにするために、チャンバーに取り付けられた専用システムは、容積式注入システムと互換性のあるRNAカプセルを使用するだろう。これらのカプセルは少量容器（50マイクロリットルから1 mLまで）であり、汚染物質を混入することなく、専用の容積式ポンプに嵌め込むことができる。各カプセルスロットは独立して作動し、デバイスの対応する流入口に流れ込む。RNA種を含むカプセルは、細胞のローディングを完全にカスタマイズするために混合および整合させることができ、最小限のダウンタイム（休止時間）で容易に入れ替え可能であるだろう。
【０１２７】
複数の細胞にトランスフェクトされる複数のRNAの量をすべて異なる濃度で操作し決定できることにより、RNA集団の機能のハイスループット表現型解析が可能になる。
【０１２８】
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明を特定の実施形態を参照して開示してきたが、本発明の他の実施形態および変形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような実施形態および同等の変形を含むと解釈されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【国際調査報告】
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