(57)【要約】  本発明は、人工的に設計された３本のポリペプチド鎖を含む新規な三本鎖抗体を提供し、この新規な三本鎖抗体において、第１重鎖可変ドメインを含む第１ポリペプチド鎖、前記第１重鎖可変ドメインと対を形成して第１抗原結合部位を形成する第１軽鎖可変ドメインを含む第２ポリペプチド鎖、および第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位とを含む第３ポリペプチド鎖を含む。本発明は、前記三本鎖抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞、前記三本鎖抗体を含む免疫複合体及び前記三本鎖抗体又はその免疫複合体を含む医薬組成物、並びに疾患の免疫治療、予防及び／又は診断における前記三本鎖抗体の使用をさらに提供する。
2021507720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１重鎖可変ドメインを含む第１ポリペプチド鎖、前記第１重鎖可変ドメインと対を形成して第１抗原結合部位を形成する第１軽鎖可変ドメインを含む第２ポリペプチド鎖、および第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位とを含む第３ポリペプチド鎖を含む、三本鎖抗体。
【請求項２】
前記第１ポリペプチド鎖が前記第１重鎖可変ドメインと免疫グロブリンＣＨ１ドメインとを含み、前記第２ポリペプチド鎖が前記第１軽鎖可変ドメインと免疫グロブリンＣＬドメインとを含む、請求項１に記載の三本鎖抗体。
【請求項３】
前記第３ポリペプチド鎖が、前記第２単一ドメイン抗原結合部位と前記第３単一ドメイン抗原結合部位との間に接続ペプチドを有するかまたは有さず、
好ましくは、前記第３ポリペプチド鎖が免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含まない、請求項１または２に記載の三本鎖抗体。
【請求項４】
前記第２単一ドメイン抗原結合部位および前記第３単一ドメイン抗原結合部位が、独立して重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、天然に軽鎖が欠如した抗体の重鎖可変ドメイン（例えば、ラクダ科の種に天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン）、魚類における新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリン（例えば、サメの血清中に天然に存在するＩｇＮＡＲ）におけるＶＨ様単一ドメイン、および組換え単一ドメイン抗原結合部位（例えば、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、またはヒト化ラクダ科抗体重鎖可変ドメイン）から選択され、例えば、前記第２単一ドメイン抗原結合部位および前記第３単一ドメイン抗原結合部位は、ラクダ科の種に天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメインおよびヒト化ラクダ科抗体重鎖可変ドメイン（略して「ＶＨＨ」と称される）から選択され、それによって、前記第２単一ドメイン抗原結合部位および前記第３単一ドメイン抗原結合部位は、それぞれ第１ＶＨＨおよび第２ＶＨＨであり、前記第１ＶＨＨおよび前記第２ＶＨＨは同一または異なる配列を有し、同一または異なる抗原エピトープに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項５】
前記第１ポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端までに、前記第１重鎖可変ドメイン、前記免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、前記第２ポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端までに、前記第１軽鎖可変ドメインおよび前記免疫グロブリンＣＬドメインを含み、前記第３ポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端までに、前記第２単一ドメイン抗原結合部位、前記第３単一ドメイン抗原結合部位およびＦｃドメインを含み、好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項６】
前記第１ポリペプチド鎖および前記第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインが、いずれも免疫グロブリンの定常部分のヒンジ領域を含み、前記第１ポリペプチド鎖および前記第３ポリペプチド鎖が、前記ヒンジ領域においてジスルフィド結合を介して互いに安定的に会合し、例えば、前記三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖および第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインは、いずれも「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域を含み、それによって、前記第１ポリペプチド鎖および前記第３ポリペプチド鎖は、前記ヒンジ領域においてアミノ酸残基の間に形成されるジスルフィド結合を介して安定的に会合し、
好ましくは、前記第１ポリペプチド鎖および前記第３ポリペプチド鎖は、それぞれそれらのＦｃドメインにおいてＹ３４９ＣとＳ３５４ＣまたはＳ３５４ＣとＹ３４９Ｃ（Ｋａｂａｔの「ＥＵ番号」に従う）とをさらに含み、それによって、前記第１ポリペプチド鎖および前記第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域で鎖間ジスルフィド結合をさらに形成する、請求項５に記載の三本鎖抗体。
【請求項７】
前記第１ポリペプチド鎖および／または前記第３ポリペプチド鎖が、Ｆｃドメインに、ＬＡＬＡ突然変異等の抗体エフェクター機能に影響を与える突然変異を含む、請求項５または６に記載の三本鎖抗体。
【請求項８】
前記第１ポリペプチド鎖および前記第３ポリペプチド鎖が、Ｆｃドメインに、それぞれ突起または空洞を含み、またはその逆に、前記第１ポリペプチド鎖のＦｃドメインの前記突起または空洞が、前記第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインの前記空洞または突起に位置し得、したがって前記第１ポリペプチド鎖および前記第３ポリペプチド鎖が、互いに安定な「ノブ−イン−ホール（knob-in-hole）」会合を形成する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインのそれぞれが、突起または空洞を含み、またはその逆に、前記ＣＨ１ドメインの前記突起または空洞が、前記ＣＬドメインの前記空洞または突起に位置し得、したがって前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖が、互いに安定な「ノブ−イン−ホール（knob-in-hole）」会合を形成する、請求項２〜８のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項１０】
前記第１抗原結合部位、前記第２抗原結合部位および前記第３抗原結合部位が、同一または異なる抗原上のエピトープに結合し、
例えば、前記第１抗原結合部位が第１抗原のエピトープに結合し、前記第２抗原結合部位および前記第３抗原結合部位が、第２抗原上の同一または異なるエピトープに結合し、それによって、前記三本鎖抗体が、前記第１抗原および前記第２抗原に対する二重特異性抗体となり、
前記第１抗原結合部位が第１抗原のエピトープに結合し、前記第２抗原結合部位および前記第３抗原結合部位が、それぞれ第２抗原のエピトープおよび第３抗原のエピトープに結合し、それによって、前記三本鎖抗体が三重特異性抗体となる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項１１】
前記接続ペプチドがグリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基を含み、例えば、ＧＧＧＧＳリピート、好ましくは４個のＧＧＧＧＳリピートを含む、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項１２】
前記抗原が、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、リガンド、細胞表面受容体またはそれらの断片である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項１３】
前記抗原が、腫瘍関連抗原、免疫チェックポイント分子、免疫系における共刺激分子、ならびにそれらのリガンドおよび／または受容体から選択される、請求項１２に記載の三本鎖抗体。
【請求項１４】
前記抗原が、ＣＤ４７、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）から選択される、請求項１３に記載の三本鎖抗体。
【請求項１５】
前記三本鎖抗体が抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体であり、その３つの抗原結合部位がそれぞれＣＤ４７および／またはＰＤ−Ｌ１分子に結合し、
例えば、前記三本鎖抗体が、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上に、ＶＨ１／ＶＬ１対を含み、ＣＤ４７に特異的に結合する第１抗原結合部位、および前記第３ポリペプチド鎖上に、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第１ＶＨＨおよび第２ＶＨＨを含み、または、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上に、ＶＨ１／ＶＬ１対を含み、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第１抗原結合部位、および前記第３ポリペプチド鎖上に、ＣＤ４７に特異的に結合する第１ＶＨＨおよび第２ＶＨＨを含み、
好ましくは、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上に、ＣＤ４７に特異的に結合し、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位が、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ−２９３４１から誘導されるＧＳＩＥＨＹＹＷＳ（配列番号３）に示されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）に示されるＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲＧＫＴＧＳＡＡ（配列番号５）に示されるＶＨ  ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号１０）に示されるＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１１）に示されるＶＬ  ＣＤＲ２およびＱＱＴＶＳＦＰＩＴ（配列番号１２）に示されるＶＬ  ＣＤＲ３、または前記６個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換または欠失）を有する配列を含み、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する前記第２および第３単一ドメイン抗原結合部位が、配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２および配列番号１９に示されるＣＤＲ３、または前記３個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換または欠失）を有する配列を含み、
より好ましくは、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合し、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位が、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ−２９３４１から誘導される配列番号２／９の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、または前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第２および第３単一ドメイン抗原結合部位が、配列番号１５および／または配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはこれらと実質的に同一（例えば、少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一）の配列を含み、
最も好ましくは、前記三本鎖抗体が、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、および配列番号１４または配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、または前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一）の配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項１６】
前記三本鎖抗体が抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体であり、その３つの抗原結合部位が４−１ＢＢおよび／またはＰＤ−Ｌ１分子に結合し、
例えば、前記三本鎖抗体が、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上に、ＶＨ１／ＶＬ１対を含み、４−１ＢＢに特異的に結合する第１抗原結合部位、および前記第３ポリペプチド鎖上に、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第１ＶＨＨおよび第２ＶＨＨを含み、または、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上に、ＶＨ１／ＶＬ１対を含み、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第１抗原結合部位、および前記第３ポリペプチド鎖上に、４−１ＢＢに特異的に結合する第１ＶＨＨおよび第２ＶＨＨを含み、
好ましくは、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上に、４−１ＢＢに特異的に結合し、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位が、配列番号２６／２８から誘導される対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる６個すべての重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および軽鎖ＣＤＲ、または前記６個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換または欠失）を有する配列を含み、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する前記第２および第３単一ドメイン抗原結合部位が、配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２および配列番号１９に示されるＣＤＲ３、または前記３個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換または欠失）を有する配列を含み、
より好ましくは、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合し、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位が、配列番号２６／２８から誘導される対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、または前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される前記第２および第３単一ドメイン抗原結合部位が、配列番号１５および／または配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはこれらと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一）の配列を含み、
最も好ましくは、前記三本鎖抗体が、配列番号２５に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号２７に示される第２ポリペプチド鎖、および配列番号１４または配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、または前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一）の配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項１７】
前記三本鎖抗体が抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体であり、その３つの抗原結合部位がＬＡＧ−３および／またはＰＤ−Ｌ１分子に結合し、
例えば、前記三本鎖抗体が、前記第１ポリペプチド鎖および第２ポリペプチド鎖上に、ＶＨ１／ＶＬ１対を含み、ＬＡＧ−３に特異的に結合する第１抗原結合部位、および前記第３ポリペプチド鎖上に、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第１ＶＨＨおよび第２ＶＨＨを含み、または、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上に、ＶＨ１／ＶＬ１対を含み、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第１抗原結合部位、および前記第３ポリペプチド鎖上に、ＬＡＧ−３に特異的に結合する第１ＶＨＨおよび第２ＶＨＨを含み、
好ましくは、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上に、ＬＡＧ−３に特異的に結合し、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位が、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３から誘導されるＧＳＩＹＳＥＳＹＹＷＧ（配列番号３１）に示されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＳＩＶＹＳＧＹＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）に示されるＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲＶＲＴＷＤＡＡＦＤＩ（配列番号３３）に示されるＶＨ  ＣＤＲ３、ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３６）に示されるＶＬ  ＣＤＲ１、ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号３７）に示されるＶＬ  ＣＤＲ２およびＱＱＶＬＥＬＰＰＷＴ（配列番号３８）に示されるＶＬ  ＣＤＲ３、または前記６個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換または欠失）を有する配列を含み、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する前記第２および第３単一ドメイン抗原結合部位が、配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２および配列番号１９に示されるＣＤＲ３、または前記３個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換または欠失）を有する配列を含み、
より好ましくは、前記第１ポリペプチド鎖および前記第２ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合し、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位が、配列番号３０／３５から誘導される対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、または前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する前記第２および第３単一ドメイン抗原結合部位が、配列番号１５および／または配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはこれらと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一）の配列を含み、
最も好ましくは、前記三本鎖抗体が、配列番号２９に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号３４に示される第２ポリペプチド鎖、および配列番号１４または配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、または前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一）の配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の三本鎖抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖、第２ポリペプチド鎖および／または第３ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖、第２ポリペプチド鎖および／または第３ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター、好ましくは発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞であって、例えば、前記宿主細胞が哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞であり、前記宿主細胞が原核細胞、好ましくは大腸菌細胞である、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の三本鎖抗体を製造する方法であって、（ｉ）前記三本鎖抗体の発現に適した条件下で請求項２０に記載の宿主細胞を培養すること、および（ｉｉ）前記宿主細胞または前記培地から前記三本鎖抗体を回収すること、を含む製造方法。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の三本鎖抗体および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
少なくとも１種の他の有効成分をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
対象における疾患の治療および／または予防のための医薬、または疾患の診断ツールとしての請求項１〜１７のいずれか一項に記載の三本鎖抗体、または請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用であって、前記対象が、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである、使用。
【請求項２５】
自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症または敗血症）、または腫瘍の治療および／または予防、または診断に用いられる請求項２４に記載の使用であって、例えば、前記腫瘍が固形腫瘍、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫等の骨髄腫）および転移性病巣から選択される、使用。
【請求項２６】
必要な対象における造血幹細胞移植に用いられる、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体的には、免疫学及び抗体工学の分野に関する。具体的には、本発明は人工的に設計された新規な三本鎖抗体、前記三本鎖抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞、前記三本鎖抗体を含む免疫複合体及び前記三本鎖抗体又はその免疫複合体を含む医薬組成物、並びに疾患の免疫治療、予防及び／又は診断における前記三本鎖抗体の使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
抗体分子は、対応する抗原と標的特異的に結合することができ、各種の疾患（例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患など）の重要な治療剤、予防剤及び／又は診断剤となりつつある。しかしながら、臨床利用において、１つだけの標的に対する単一特異性抗体には限界がある。患者が単一特異性抗体による治療を受けると、薬剤耐性が生じたり、不応答者になったりすることがある。がんや他のさまざまな疾患を研究することによって、複数種のシグナル伝達経路が疾患の発症及び発展に関与する場合が多く、単一標的による免疫療法が多くの疾患に対しては通常の治療作用を果たすのに不十分であることが分かった。
【０００３】
多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が異なる抗原に特異的に結合できるので、一方の抗原が特定の免疫細胞にあり、他方の抗原が疾患細胞にある場合、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は特定の免疫細胞を疾患細胞にリダイレクトすることで、疾患細胞に対する免疫細胞による殺滅作用を強化できる。また、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、２種以上の異なる媒体に同時に作用するシグナル伝達経路として設計してもよい。これらの利点のため、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の幅広い応用の将来性が期待できる。
【０００４】
抗体工学により複数の多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の形態を形成することができており、そしてこれらの疾患に対する適用性も研究されている。現在、市販品として承認された２種の二重特異性抗体製品は、それぞれＭｉｃｒｏｍｅｔ社及びＡｍｇｅｎ社により開発されたＢｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ、及びＴｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ社により開発されたＣａｔｕｍａｘｏｍａｂである。Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂは最初に米国で市販品として承認されたＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）と前駆Ｂ急性リンパ芽球性白血病リンパ腫（ＡＬＬ）を治療するための分子量約５５ＫＤａの一本鎖二重特異性抗体であり、それぞれＣＤ１９分子及びＣＤ３分子に対する２種の一本鎖Ｆｖ分子が可動性リンカーを介して融合してなり、ほぼ全てのＢ細胞リンパ腫において発現されるＣＤ１９及びＴ細胞において発現されるＣＤ３を用いて、Ｔ細胞と標的細胞（腫瘍細胞）を緊密に結合させ、Ｔ細胞によりパーフォリンとテロメラーゼをシナプス間隙へ放出して、腫瘍細胞による一連の化学反応を引き起こすことで、腫瘍細胞を殺滅する（Nagorsen D.及びBaeuerle P.A., Immunomodulatory therapy of cancer with T cell-engaging BiTE antibody blinatumomab, Exp Cell Res, 2011, 317:1255-1260）。Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂは、それぞれ親マウスＩｇＧ２ａアイソタイプとラットＩｇＧ２ｂアイソタイプに由来の２つの半抗体からなるキメラであり、そのうち、それぞれの半抗体には１本の軽鎖と１本の重鎖を含み、抗ＣＤ３ラットＩｇＧ２ｂ半抗体はＴ細胞認識用、抗腫瘍細胞表面抗原ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）のマウスＩｇＧ２ａ半抗体は腫瘍細胞認識用である（Chelius D et al., Structural and functional characterization of the trifunctional antibody catumaxomab, MAbs, 2010, 2:309-319）。Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標））は２００９年４月にヨーロッパにてＥｐＣＡＭ陽性の上皮性転移性腫瘍により引き起こされる悪性腹水治療用の許可を取った。
【０００５】
多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、構成部分及び構築方式によって複数の種類に分けられる。例えば、多重特異性抗体構造の左右対称性によって、対称構造と非対称構造に分けられ、多重特異性抗体のＩｇＧのＦｃ領域の有無によって、完全な抗体と抗体断片に分けられ、多重特異性抗体における抗原結合部位の数によって、二価、三価、四価又はそれ以上の多価抗体などに分けられる。
【０００６】
それぞれの多重特異性抗体の設計にはそれなりの利点及び欠点があり、例えば、Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を組換えることで大規模で培養して製造できるが、凝集物が形成されやすく、インビボ半減期が極めて短く、実際に使用するときに連続輸液用装置が必要であり、Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂは製造プロセスが複雑であり、そしてマウス異種抗体が人体で免疫原性の問題を引き起こしやすい。加えて、四本鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）様多重特異性抗体における非関連重鎖と軽鎖のペアリングの傾向がないことにより抗原結合活性部位が存在しないこと及び／又は他の機能のない、好ましくない副産物が形成されることが、抗体の臨床的な量産や治療用途において課題となっている（Klein, C. et al., Progress in overcoming the chain association issue in bispecific heterodimeric IgG antibodies, mAbs, 2012, 4:653-663）。理論的には、２本の重鎖は４種の異なる組み合わせ方式で会合でき、且つこれら重鎖のうちのそれぞれは軽鎖とランダムに会合して、２４（＝合計１６）種類の鎖の組み合わせを生成できる。以上の１６種類の理論的に可能な組み合わせのうち、実際には、１０種類の組み合わせが発見されているが、１種の組み合わせだけは所望の機能性多重特異性抗体に対応する。複雑混合物から所望の１種の多重特異性抗体を分離しにくいこと、及び理論的には、最大で１２．５％という本質による不良率のため、細胞発現系において四本鎖Ｉｇ様多重特異性抗体を生成するのが困難である。
【０００７】
本発明の新規抗体の形態は上記弊害を解決できる。本発明は、新しい多重特異性抗体の形態を提供し、前記抗体の形態では、各鎖同士の正確なカップリング又はペアリングにより増大する収率で容易に生成でき、インビトロの培養細胞で発現されやすく、複雑な製造プロセスが必要とされない。加えて、本発明の多重特異性抗体の形態は、該多重特異性抗体中の各抗原結合部位とそれらに対応する異なるエピトープとの結合親和力を保持でき、且つ異なるエピトープに結合する場合に互いに立体障害による干渉がなく、ドラッガブルである。さらに、本発明の多重特異性抗体の形態は、物理的及び生物学的に安定的であり、このため、該抗体には、より良好な生産性及び将来性が期待できる。
【発明の概要】
【０００８】
本出願は、抗体工学方法で構築される３本のポリペプチド鎖を含む新規三本鎖抗体を開示する。前記三本鎖抗体は、高親和力及び高特異性で１種又はそれ以上の抗原と結合する、好ましくは、２種以上の抗原と結合することができる。本発明は、前記三本鎖抗体をコードする核酸分子、前記三本鎖抗体を産生するための発現ベクター、宿主細胞及び方法をさらに提供する。本発明は、本発明の前記三本鎖抗体を含む免疫複合体及び前記三本鎖抗体又はその免疫複合体を含む医薬組成物をさらに提供する。本出願で開示された三本鎖抗体は、単独で、又は他の医薬品や他の治療方式と組み合わせて、例えば自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）、腫瘍などの疾患を治療、予防及び／又は診断することができる。
【０００９】
このため、一様態では、本発明は、以下の１つ又はそれ以上の特性を有する三本鎖抗体を提供する。
（ａ）高親和力、例えば少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは約１０８Ｍ−１、より好ましくは約１０９Ｍ−１又はそれよりも高い親和力定数で１種又はそれ以上の抗原と特異的結合する。
（ｂ）インビトロの培養細胞で発現されやすく、且つ３本の鎖同士が正確にカップリング又はペアリングをする。
（ｃ）良好な物理的安定性を有し、特に良好な長期熱安定性を有し、且つ長期間にわたって生物学的活性を保持できる。及び
（ｄ）１種又はそれ以上の抗原と特異的結合すると、各抗原が関与するシグナル伝達経路に対する作用によって生物学的機能を発揮させる。
【００１０】
本発明の三本鎖抗体は、少なくとも三価抗体（即ち、少なくとも３つの抗原結合部位を有する）である。一実施形態では、前記三本鎖抗体は、（１＋２形態）の三価抗体であり、その第１ポリペプチド鎖が第１重鎖可変ドメインを含み、第２ポリペプチド鎖が第１軽鎖可変ドメインを含み、前記第１重鎖可変ドメインと第１軽鎖可変ドメインがペアリングをして（以下、略してＶＨ１／ＶＬ１対と称される）第１抗原結合部位を形成し、且つ第３ポリペプチド鎖が第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位を含む。
【００１１】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体に含まれる１つの抗原結合部位は第１抗原をターゲットとし、別の２つの結合部位はそれぞれ第２抗原の同じ又は異なるエピトープをターゲットとする。一実施形態では、本発明の三本鎖抗体に含まれる３つの抗原結合部位は３種の異なる抗原をターゲットとする。一実施形態では、本発明の三本鎖抗体に含まれる３つの抗原結合部位は同じ抗原をターゲットとする。
【００１２】
一実施形態では、本発明は３本のポリペプチド鎖を含む三本鎖抗体を提供し、この三本鎖抗体では、第１ポリペプチド鎖が第１重鎖可変ドメインと免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含み、第２ポリペプチド鎖が第１軽鎖可変ドメインと免疫グロブリンＣＬドメインを含み、前記第１重鎖可変ドメインと第１軽鎖可変ドメインがペアリングをして第１抗原結合部位を形成し、且つ第３ポリペプチド鎖が第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位を含み、前記第３ポリペプチド鎖の第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがあり又は接続ペプチドがない。
【００１３】
一実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖の第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位との間には、グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）残基を含む接続ペプチド、例えば、１−７個のＧＧＧＧＳリピートを含む接続ペプチド、好ましくは、４個のＧＧＧＧＳリピートを含む接続ペプチドがある。
【００１４】
一好適実施形態では、本発明の三本鎖抗体では、前記第３ポリペプチド鎖は、免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含まず、前記第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位は、それぞれ天然の軽鎖欠如抗体の重鎖可変ドメイン（例えばラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）物種に天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン）、魚類のうち新規抗原受容体（new antigen receptor, NAR）と呼ばれる免疫グロブリン（例えばサメの血清に天然に存在するＩｇＮＡＲ）における単一ドメインの抗原結合部位、及びこれらから誘導される組換え単一ドメイン抗原結合部位から選択される。天然の軽鎖欠如重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメインは、本出願では、四本鎖免疫グロブリンの通常のＶＨ領域と区別するために、ＶＨＨと呼ばれる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の物種（例えばラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、リャマやグアナコ）で産生する抗体から誘導されて得る。ラクダ科以外の物種も天然の軽鎖欠如重鎖抗体を産生でき、このようなＶＨＨも本発明の範囲内である。
【００１５】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の前記第３ポリペプチド鎖では、前記第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位は、それぞれ第１ＶＨＨと第２ＶＨＨであり、前記第１ＶＨＨと第２ＶＨＨの配列が同じであるか、又は異なり、且つ同じ又は異なる抗原に結合するか、又は同じ抗原上の異なる抗原エピトープに結合する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、下記の３本のポリペプチド鎖を含む三本鎖抗体を提供し、この三本鎖抗体では、第１ポリペプチド鎖がＮ末端からＣ末端まで第１重鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン及びＦｃドメインを含み、第２ポリペプチド鎖がＮ末端からＣ末端まで第１軽鎖可変ドメインと免疫グロブリンＣＬドメインを含み、且つ第３ポリペプチド鎖がＮ末端からＣ末端まで第２単一ドメイン抗原結合部位、第３単一ドメイン抗原結合部位及びＦｃドメインを含み、好ましくは、前記免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４免疫グロブリン、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。
【００１７】
本発明に係る３本のポリペプチド鎖を含む三本鎖抗体では、発明者はまた三本鎖抗体構造を安定化させるとともに各鎖同士の正確なカップリング又はペアリングに有利なアミノ酸残基を設計している。例えば、三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインには、「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域を含み、それによって、前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、互いに前記ヒンジ領域でのアミノ酸残基の間に形成されるジスルフィド結合を介して安定的に会合する。一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、それぞれのＦｃドメインにおいて、それぞれＹ３４９ＣとＳ３５４Ｃを含むか、又はそれぞれＳ３５４ＣとＹ３４９Ｃを含み（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD (1991)のＥＵ索引に従って番号を付け、以下、「ＥＵ番号」という）、それによって、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域でさらに鎖間のジスルフィド結合を形成することで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖との正確なペアリングを安定化させる。
【００１８】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインには、抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸突然変異を含む。一特定実施形態では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施形態では、前記アミノ酸突然変異は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに存在し、例えば、前記三本鎖抗体は、第１ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖の第２３４位と第２３５位（ＥＵ番号）でのアミノ酸置換を含む。一特定実施形態では、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａである（以下、「ＬＡＬＡ突然変異」という）。
【００１９】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のそれぞれのＦｃドメインには、突起（「ノブ（knob）」）又は空洞（「ホール（hole）」）を含み、且つ第１ポリペプチド鎖のＦｃドメインにおける前記突起又は空洞は、それぞれ第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインにおける前記空洞又は突起に置いてもよく、それによって、前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、互いに「ノブ−イン−ホール（knob-in-hole）」のように安定的に会合する。一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、一方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、且つ前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、他方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号）を含む。それによって、一方の鎖の突起を他方の鎖の空洞に置くことで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖が正確にペアリングをすることができる。
【００２０】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインのそれぞれには、突起又は空洞を含み、且つＣＨ１ドメインの前記突起又は空洞をそれぞれＣＬドメインの前記空洞又は突起に置くことで、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖が互いに「ノブ−イン−ホール」のように安定的に会合し得る。
【００２１】
本発明の三本鎖抗体の第１抗原結合部位、第２抗原結合部位及び第３抗原結合部位は、同じ抗原又は異なる抗原上のエピトープに結合し得る。例えば、前記第１抗原結合部位は、第１抗原のエピトープに結合され、前記第２抗原結合部位及び第３抗原結合部位は、第２抗原上の同じ又は異なるエピトープに結合され、それによって、前記三本鎖抗体は第１抗原と第２抗原に対する二重特異性抗体となる。前記第１抗原結合部位が第１抗原のエピトープに結合され、前記第２抗原結合部位及び第３抗原結合部位がそれぞれ第２抗原のエピトープと第３抗原のエピトープに結合される場合、前記三本鎖抗体は三重特異性抗体となる。本発明の三本鎖抗体が特異的に結合する抗原のタイプについては特に制限がなく、抗原は、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、リガンド、細胞表面受容体又はその断片であってもよい。
【００２２】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体が特異的に結合する抗原は、腫瘍関連抗原、免疫チェックポイント分子、免疫系における共刺激分子、及びこれら分子のリガンド及び／又は受容体、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）から選択される。
【００２３】
本発明では、下記複数の三本鎖二重特異性抗体が例示される。
ｉ）一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体であり、前記抗体は、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは約１０８Ｍ−１、より好ましくは約１０９Ｍ−１又はそれよりも高い親和力定数で、腫瘍細胞表面のＣＤ４７に結合することで、ＣＤ４７とマクロファージ表面のＳＩＲＰαとの結合を遮断して、腫瘍組織浸潤領域のマクロファージによる腫瘍細胞への貪食作用を促進することができ、さらに、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは約１０８Ｍ−１、より好ましくは約１０９Ｍ−１又はそれよりも高い親和力定数で腫瘍細胞表面のＰＤ−Ｌ１に結合することで、Ｔ細胞上のＰＤ−１と腫瘍細胞表面のＰＤ−Ｌ１との結合を抑制して、Ｔ細胞の活性化を誘導して抗腫瘍作用を発揮させることができる。
【００２４】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。
【００２５】
一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ−２９３４１から誘導されるＧＳＩＥＨＹＹＷＳ（配列番号３）に示されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）に示されるＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲＧＫＴＧＳＡＡ（配列番号５）に示されるＶＨ  ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号１０）に示されるＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１１）に示されるＶＬ  ＣＤＲ２及びＱＱＴＶＳＦＰＩＴ（配列番号１２）に示されるＶＬ  ＣＤＲ３、又は、前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。別の実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ−２９３４１から誘導される配列番号２／９の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列とは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【００２６】
一実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２、及び配列番号１９に示されるＣＤＲ３、又は前記３つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。別の実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１５及び／又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００２８】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００２９】
ｉｉ）一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体であり、前記抗体は、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは約１０８Ｍ−１、より好ましくは約１０９Ｍ−１又はそれよりも高い親和力定数でＴ細胞表面の４−１ＢＢに結合することで、４−１ＢＢ／４−１ＢＢリガンドの共刺激シグナル伝達経路を活性化させ、Ｔ細胞の活性化、増殖及び抗アポトーシスを誘導し、さらに、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは約１０８Ｍ−１、より好ましくは約１０９Ｍ−１又はそれよりも高い親和力定数で腫瘍細胞表面のＰＤ−Ｌ１に結合することで、Ｔ細胞上のＰＤ−１と腫瘍細胞表面のＰＤ−Ｌ１の結合を抑制して、Ｔ細胞の活性化を誘導して抗腫瘍作用を発揮させることができる。
【００３０】
一実施形態では、本発明の抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。
【００３１】
一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗４−１ＢＢ抗体ＢＭＳ−６６３５１３から誘導される配列番号２６／２８の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる合計６個の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と軽鎖ＣＤＲ、又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗４−１ＢＢ抗体ＢＭＳ−６６３５１３から誘導される配列番号２６／２８の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列とは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【００３２】
一実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２、及び配列番号１９に示されるＣＤＲ３、又は前記３つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。別の実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１５及び／又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００３３】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号２５に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号２７に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号２５に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号２７に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００３５】
ｉｉｉ）一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体であり、前記抗体は、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは約１０８Ｍ−１、より好ましくは約１０９Ｍ−１又はそれよりも高い親和力定数でＴ細胞表面のＬＡＧ−３に結合することで、Ｔ細胞中のＬＡＧ−３抑制性シグナル伝達経路を抑制し、それによって、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を回復してＴｒｅｇ集団を減少させ、さらに、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは約１０８Ｍ−１、より好ましくは約１０９Ｍ−１又はそれよりも高い親和力定数で腫瘍細胞表面のＰＤ−Ｌ１に結合することで、Ｔ細胞上のＰＤ−１と腫瘍細胞表面のＰＤ−Ｌ１との結合を抑制して、Ｔ細胞の活性化を誘導して抗腫瘍作用を発揮させることができる。
【００３６】
一実施形態では、本発明の抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。
【００３７】
一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３から誘導されるＧＳＩＹＳＥＳＹＹＷＧ（配列番号３１）に示されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＳＩＶＹＳＧＹＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）に示されるＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲＶＲＴＷＤＡＡＦＤＩ（配列番号３３）に示されるＶＨ  ＣＤＲ３、ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３６）に示されるＶＬ  ＣＤＲ１、ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号３７）に示されるＶＬ  ＣＤＲ２及びＱＱＶＬＥＬＰＰＷＴ（配列番号３８）に示されるＶＬ  ＣＤＲ３、又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３から誘導される配列番号３０／３５の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列とは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【００３８】
一実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２、及び配列番号１９に示されるＣＤＲ３、又は前記３つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。別の実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１５及び／又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００３９】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号２９に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号３４に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００４０】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号２９に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号３４に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【００４１】
第２態様では、本発明は、本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖、第２ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４２】
第３態様では、本発明は、本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖、第２ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。
【００４３】
第４態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。例えば、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞であり、前記宿主細胞は、原核細胞、好ましくは大腸菌細胞である。
【００４４】
第５態様では、本発明は、本発明の三本鎖抗体を産生する方法を提供し、前記方法は、前記三本鎖抗体の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ（ｉ）と、前記宿主細胞又は前記培地から前記三本鎖抗体を回収するステップ（ｉｉ）と、を含む。
【００４５】
第６態様では、本発明は、本発明の三本鎖抗体を含む免疫複合体及び前記三本鎖抗体又はその免疫複合体を含む医薬組成物を提供する。本出願で開示された三本鎖抗体は、単独で、又は他の医薬品や他の治療方式と組み合わせて、例えば自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）、腫瘍などの疾患を治療、予防及び／又は診断することができる。
【００４６】
第７態様では、本発明は、本発明の三本鎖抗体、免疫複合体及び医薬組成物の用途を提供し、対象において疾患を治療及び／又は予防するための医薬品又は疾患のための診断ツールとして用いられるか、又はニーズを持つ対象の造血幹細胞移植に用いられる。好ましくは、前記対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。一実施形態では、前記疾患は、自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）、腫瘍である。
【００４７】
特に断らない限り、本出願に使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本出願に記載の全ての刊行物、特許出願、特許や他の参照文献は引用により全体として組み込まれる。加えて、本出願に記載の材料、方法及び例は、説明的なものであり、制限することを意図しない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本明細書及び図面、添付した特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
以下の図面を参照しながら閲覧すると、以下詳細に説明する本発明の好適実施形態をよく理解できる。本発明を説明するために、図には、現在の好適実施形態が示されている。しかしながら、本発明が図示した実施形態の特定の配置や手段に制限されていないと認識すべきである。
【図１】図１Ａ−１Ｃは、本発明の三本鎖抗体の構造を例示する。図１Ａは、本発明の三本鎖抗体の一例を例示し、この三本鎖抗体では、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖がペアリングをして第１抗原結合部位を形成し、第３ポリペプチド鎖が第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位を含み、且つ第３ポリペプチド鎖の第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位との間には、可動性リンカーがある。図１Ｂは、本発明の別の三本鎖抗体を例示し、この三本鎖抗体では、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖がペアリングをして第１抗原結合部位を形成し、第３ポリペプチド鎖が第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位を含み、且つ第３ポリペプチド鎖の第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位との間には、可動性リンカーがない。図１Ｃは、本発明の三本鎖抗体の各ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端までの構造を示し、点線矢印により示される第３ポリペプチド鎖中の可動性リンカーは、必要に応じて（例えば、特異的に結合するエピトープとの親和力、立体障害の状況）本発明の三本鎖抗体では、有してもよく、有さなくてもよい。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれサイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatgraphy;ＳＥＣ）を用いて検出された、本発明で調製される２種の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬの純度を示す。
【図３】図３は、動力学的測定法により得られる、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ、及び対照となる抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ  ２９３４１の動力学結合曲線、並びにｋｏｎ、ｋｄｉｓ及びＫＤデータを示す。
【図４】図４Ａは、ＦＡＣＳにより検出された、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ、及び対照となる抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体と、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞との結合を示す。図４Ｂは、ＦＡＣＳにより検出された、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ、及び陽性対照となる抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ  ２９３４１、陰性対照となるＩｇＧ１抗体と、ＣＤ４７を過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞との結合を示す。図中、横軸が抗体濃度を示し、縦軸が平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図５】図５は、ＰＥＧ沈殿法により測定された、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ、及び陽性対照となる抗体ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ、アダリムマブとも呼ばれ、抗ＴＮＦαヒト化モノクローナル抗体である）の物理的安定性及び可溶性を示す。
【図６】図６は、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬの長期熱安定性を示す。４０℃で、前記抗体を０、１、３、７、１０、２０、３０日間放置した後、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより抗体純度が測定される。
【図７】図７Ａは、０日目及び４０℃で３０日間放置した場合の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬのそれぞれと、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞との結合を示す。図７Ｂは、０日目及び４０℃で３０日間放置した場合の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬのそれぞれと、ＣＤ４７を過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞との結合を示す。横軸が抗体濃度を示し、縦軸が平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図８】図８は、ＭＯＡ法により検出された、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ、及び陽性対照となる抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体、陰性対照となるＩｇＧ１抗体による、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路に対する影響を示す。
【図９】図９は、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ、及び陽性対照となる抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ  ２９３４１の、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を促進する能力を示す。
【図１０】図１０は、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ、抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９（ＵＳ２０１５／０１８３８７４Ａ１に記載の「５Ｆ９」抗体に対応）及びＩｇＧ１対照抗体による、赤血球凝集への影響を示す。
【図１１】図１１は、腫瘍細胞とヒト赤血球の共インキュベーションにおいて、腫瘍細胞の表面に選択的に結合される抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬの割合を示す。
【図１２】図１２がＳＥＣにより検出された、本発明で調製された抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４の純度を示す。
【図１３】図１３Ａは、ＦＡＣＳにより検出された、抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４、及び陽性対照となる抗４−１ＢＢ抗体ＢＭＳ−６６３５１３と、４−１ＢＢを過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞との結合を示す。図１３Ｂは、ＦＡＣＳにより検出された、抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４、及び陽性対照となる抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体と、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞との結合を示す。図中、横軸が抗体濃度を示し、縦軸が平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図１４】図１４は、ＳＥＣにより検出された、本発明で調製された抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬの純度を示す。
【図１５】図１５Ａは、ＦＡＣＳにより検出された、抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬ、及び陽性対照となる抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体と、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞との結合を示す。図１５Ｂは、ＦＡＣＳにより検出された、抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬ、及び陽性対照となる抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３と、ＬＡＧ−３を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞との結合を示す。図中、横軸が抗体濃度を示し、縦軸が平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図１６】図１６は、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３、抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３＋抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体、ＩｇＧ４対照抗体と比較した場合の、抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬの、Ｔ細胞に対するインビトロ活性化作用を示す。
【図１７】図１７は、ｈ−ＩｇＧと比較した場合の、抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ  ２９３４１、抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体と抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ  ２９３４１の併用、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣの、Ｒａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１／ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍抑制活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
Ｉ．定義
用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より５％小さく上限として記載数値より５％大きい範囲における数値を含むことを意味する。
【００５０】
本出願に使用される場合、用語「含む」又は「含み」とは、前記要素、整数又はステップを含むが、他の要素、整数又はステップを排除しないことを意味する。
【００５１】
用語「抗体」は、本出願では、最も広い意味で使用されており、抗原結合部位を含むタンパク質を意味し、各種構造の天然抗体及び人工抗体を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、三本鎖抗体、完全な抗体及び抗体断片を含むが、これらに制限されない。
【００５２】
用語「全抗体」、「全長抗体」、「完全抗体」及び「完全な抗体」のいずれも、本出願では、ジスルフィド結合を介して互いに接続される少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質を交換可能に指す。各本の重鎖は、重鎖可変領域（本出願では、略してＶＨと称される）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各本の軽鎖は、軽鎖可変領域（本出願では、略してＶＬと称される）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、さらに分けられると、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）、とその間に挿入されているより保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ））がある。各々のＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシル末端へは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、複数種のエフェクター機能を示している。
【００５３】
「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインでは、配列において超可変であり且つ構造上に形成された所定のループ（「超可変ループ」）及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖及び軽鎖のＣＤＲは、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ−末端から順次番号を付けられる。抗体重鎖可変ドメイン内のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３と呼ばれ、一方、抗体軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３と呼ばれる。１つの特定の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各ＣＤＲにおけるアミノ酸配列の境界は、公知の各種の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１種又はその組み合わせにより正確に決定できる。前記割り当てシステムの例は、抗体の三次元的構造とＣＤＲリングのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883, Al-Lazikani et al., 「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)）、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, U.S. Department of Health and Human Services,National Institutes of Health (1987)）、ＡｂＭ（University of Bath）、Ｃｏｎｔａｃｔ（University College London)、国際的ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（www.imgt.cines.fr/にて利用可能）、大量の晶体構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（affinity propagation clustering）に基づくＮｏｒｔｈ  ＣＤＲ定義を含む。
【００５４】
ただし、異なる割り当てシステムから得られた同一抗体の可変領域のＣＤＲの境界には、差異がある可能性があることを認識すべきである。即ち、異なる割り当てシステムで定義された同一抗体の可変領域のＣＤＲ配列には違いがある。したがって、本発明で定義された具体的なＣＤＲ配列により抗体が限定される場合、前記抗体の範囲には、可変領域配列が前記した具体的なＣＤＲ配列を含むが、異なる手段（例えば、異なる割り当てシステムのルール又は組み合わせ）が使用されることにより、かかるＣＤＲ境界が本発明で定義された具体的なＣＤＲ境界と異なるような抗体も含まれる。
【００５５】
異なる特異性（即ち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体には、異なるＣＤＲがある。しかしながら、抗体によってＣＤＲに違いがあるものの、ＣＤＲ内において抗原結合に直接関与するアミノ酸位置の数量が限定的である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ及びＮｏｒｔｈ方法のうちの少なくとも２種を用いて、最小重複領域を決定し、それによって抗原結合用の「最小結合単位」を提供することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であってもよい。当業者にとって自明なように、抗体の構造及びタンパク質の折りたたみによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基が特定され得る。したがって、本発明では、本出願に記載の任意のＣＤＲの変異体も考えられる。例えば、１つのＣＤＲの変異体では、最小結合単位のアミノ酸残基は一定に維持できるが、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａで定義される残りのＣＤＲ残基は保存的アミノ酸残基により置換されてもよい。
【００５６】
用語「抗原結合断片」は、完全な抗体又は完全抗体のアミノ酸残基の数よりも少ない完全な抗体又は完全抗体の一部又は１つの断片であり、抗原に結合し又は完全な抗体（即ち、抗原結合断片が由来する完全な抗体）と競争的に抗原に結合し得る。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術、又は酵素又は化学的手段により完全な抗体を切断することによって調製することができる。抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むが、これらに制限されない。前記Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であり、例えば、Ｆａｂ断片はパパインで完全抗体を消化することにより得られ得る。加えて、ペプシンを用いてヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で完全抗体を消化して産生したＦ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’の二量体となり、二価の抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、中性条件でヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊することにより還元でき、したがってＦ（ａｂ’）２二量体がＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、基本的にヒンジ領域を有するＦａｂ断片である（抗体断片の他のより詳細な説明については、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）参照）。前記Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームＶＬとＶＨドメインからなる。また、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬとＶＨが独立した遺伝子でコードされるものの、組換え法によれば、この２つのドメインを１本の蛋白鎖として、産生し得る合成接続ペプチドによりこれらを接続することができ、前記１本の蛋白鎖では、ＶＬ領域とＶＨ領域がペアリングをして一本鎖Ｆｖとなる。前記抗体断片は化学方法、組換えＤＮＡ方法又は蛋白酵素消化法により得られる。
【００５７】
用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」は、通常、単一の可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、魚類ＩｇＮＡＲから誘導されるＶＨ様単一ドメイン（ｖ−ＮＡＲ））が抗原結合を付与できるような抗体を指す。即ち、該単一の可変ドメインは、別の可変ドメインと相互作用して標的抗原を認識する必要がない。単一ドメイン抗体の実例には、ラクダ科（アメリカラクダ及びラクダ）及び軟骨魚（例えばコモリザメ）に由来する単一ドメイン抗体（ＷＯ２００５／０３５５７２）が含まれる。
【００５８】
用語「ラクダ化ヒトＶＨドメイン」は、ラクダ科ＶＨＨ由来の主要エレメントをヒトＶＨドメインに導入することにより、ヒトＶＨドメインがＶＬドメインとペアリングをして標的抗原を認識する必要がなくなるようにすることを意味し、ラクダ化ヒトＶＨドメインは、単独で抗原へ結合特異性を付与できる。
【００５９】
本出願に使用される用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、抗体分子のうち抗原に実際に結合される領域であり、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなるＶＨ／ＶＬ対、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲからのＶＨ様単一ドメイン（ｖ−ＮＡＲ）、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化したラクダ科の抗体重鎖可変ドメインを含む。本発明の実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、少なくとも３つの抗原結合部位を含み、例えば、一番目の抗原結合部位（「第１抗原結合部位」ともいう）、二番目の抗原結合部位（「第２抗原結合部位」ともいう）、三番目の抗原結合部位（「第３抗原結合部位」ともいう）を含む。
【００６０】
用語「単一ドメイン抗原結合部位」は、単一の可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲからのｖ−ＮＡＲ、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化したラクダ科の抗体重鎖可変ドメイン、及びこれらの組換え単一ドメイン）をもって抗原に実際に結合される抗体分子の領域である。本発明の一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、それぞれ「第２単一ドメイン抗原結合部位」と「第３単一ドメイン抗原結合部位」と呼ばれる２つの単一ドメイン抗原結合部位を含む。  
【００６１】
本出願に示される用語「単一特異性」抗体とは、１つ又は複数の結合部位を有する抗体であり、前記部位のそれぞれは、同じ抗原の同じエピトープに結合する。
【００６２】
本出願に示される用語「多重特異性」抗体とは、少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体であり、前記少なくとも２つの抗原結合部位のうち、それぞれの抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープに結合する。本出願による抗体は、通常、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対して結合特異性を有する抗体である。一実施形態では、本出願は、第１抗原及び第２抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体を提供する。
【００６３】
用語「免疫グロブリン分子」とは、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧ類免疫グロブリンは、ジスルフィド結合を介して結合される２本の軽鎖と２本の重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各本の免疫グロブリン重鎖は、重鎖可変ドメインとも呼ばれる１つの重鎖可変領域（ＶＨ）を有し、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）がこの重鎖可変領域（ＶＨ）に続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各本の免疫グロブリンの軽鎖は、軽鎖可変ドメインとも呼ばれる１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、１つの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）がこの軽鎖可変領域（ＶＬ）に続く。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのカテゴリの１つに属し、そのうち、一部のカテゴリは、さらに、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）とα２（ＩｇＡ２）などのサブクラスに分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、κ及びλと呼ばれる２つのタイプの１つに分類され得る。免疫グロブリンは、基本的には、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続される２つのＦａｂ分子と１つのＦｃドメインとからなる。
【００６４】
用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、本出願では、免疫グロブリン重鎖の、少なくとも一部の定常領域を含むＣ末端領域を定義する。該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。天然の免疫グロブリン「Ｆｃドメイン」は、２つ又は３つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインを含み、必要に応じてＣＨ４ドメインも含む。例えば、天然抗体では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ類抗体に由来する２本の重鎖の第２及び第３定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）を含むか、又は、ＩｇＭ及びＩｇＥ類抗体に由来する２本の重鎖の第２、第３及び第４定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン）を含む。本出願では、特に断らない限り、Ｆｃ領域又は重鎖定常領域中のアミノ酸残基の番号は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interes, 第５版, Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD, 1991に記載のＥＵ番号システム（ＥＵ索引ともいう）に従って番号を付けられる。
【００６５】
用語「エフェクター機能」は、免疫グロブリンアイソタイプの変化に伴う免疫グロブリンＦｃ領域に起因する生物学的活性である。免疫グロブリンのエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合作用、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、免疫複合体が介在した抗原提示細胞による抗原の取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレート及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００６６】
用語「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域又はその一部を変化、置換又は交換することで、抗原結合部位が異なる又は変化したタイプ、エフェクター機能及び／又は物種の定常領域又はキメラ抗体に新しい性能を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、医薬品）などに接続される、又は（ｂ）可変領域又はその一部を、異なる又は変化した抗原特異性を有する可変領域で、変化、置換又は交換した抗体分子である。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンからの定常領域に変更することで修飾できる。ヒト定常領域に変更したため、該キメラ抗体は、抗原認識についての特異性を保持するとともに、元のマウス抗体に比べて、ヒトで低下した抗原性を有する。
【００６７】
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）の抗原特異性反応性を保留するとともに、治療薬としてヒトに投与する場合の免疫原性が低い抗体である。ヒト化抗体は、例えば、非ヒト抗原結合部位を保留するとともに、抗体の残りの部分をこれらに対応するヒトの部分（即ち、定常領域及び可変領域のうち結合に関与しない部分がヒト抗体の対応する部分である）に変更することにより実現される。例えばPadlan, Anatomy of the antibody molecule, Mol. Immun.,1994, 31:169-217を参照できる。ヒト抗体工学技術の別の例としては、ＵＳ５，７６６，８８６で開示されたＸｏｍａ技術が含まれるが、これに制限されない。
【００６８】
用語「…価」抗体とは、抗体分子に存在する抗原結合部位の数を意味する。「二価」、「三価」及び「四価」抗体とは、抗体分子にそれぞれ２つの抗原結合部位、３つの結合部位及び４つの結合部位が存在することを意味する。一実施形態では、本出願で報道された二重特異性抗体は「三価」のものである。
【００６９】
用語「可動性リンカー」又は「接続ペプチド」は、アミノ酸からなる接続ペプチド、例えば単独で又は組み合わせて使用するグリシン及び／又はセリン残基であり、抗体の各可変ドメインを接続することに用いられる。一実施形態では、可動性リンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含むＧｌｙ／Ｓｅｒ接続ペプチドであり、ここで、ｎは１又はそれ以上の正の整数であり、例えば、ｎは１−７のうちの正の整数である。一実施形態では、前記可動性リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２０）である。ＷＯ２０１２／１３８４７５に記載の接続ペプチドも本発明の範囲に含まれ、引用により本出願に組み込まれる。
【００７０】
本出願に示される用語「結合」又は「特異性結合」とは、結合作用が選択的に抗原に対して行われ、且つ好ましくない又は非特異的な相互作用と区別できる。特定抗原に対する抗原結合部位の結合能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）又は本分野で公知となる一般的な結合測定法により測定され得る。
【００７１】
「親和力」又は「結合親和力」とは、結合対のメンバー間の相互作用を反映するた固有の結合親和力である。その作用対象Ｙに対する分子Ｘの親和力は、通常、解離定数（ＫＤ）により表されることができ、解離定数は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｄｉｓとｋｏｎ）との割合である。親和力は、本分野で公知となる常法により測定できる。親和力を測定する具体的な方法の１つは、本出願に記載のＦｏｒｔｅＢｉｏ動力学的測定法である。
【００７２】
用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子のことである。このような免疫応答は、抗体の産生又は特異性免疫細胞の活性化に係り、又は両方に係る可能性がある。当業者が理解できるように、タンパク質又はペプチドを含み、ほぼ全ての大分子は抗原として利用できる。加えて、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから誘導され得る。本出願のいくつかの実施形態では、第１抗原、第２抗原、第３抗原は、３種の異なる抗原である。
【００７３】
用語「腫瘍関連抗原」又は「がん抗原」は、正常な細胞に比べて、好ましくはがん細胞の表面で完全に又は断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現させる分子（通常、タンパク質、炭水化物又は脂質）を交換可能に意味し、そして、前記分子は、がん細胞に対する薬剤の優先ターゲティングに利用できる。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、正常な細胞よりも腫瘍細胞で過剰発現させた、例えば、正常な細胞よりも１倍過剰発現させた、２倍過剰発現させた、３倍過剰発現させた又はそれ以上の倍数過剰発現させた細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞において不適に合成される細胞表面分子、例えば、正常な細胞において発現させた分子に対して欠失、添加又は突然変異が生じた分子である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面だけから完全に発現させ又は断片として発現させ、且つ正常な細胞の表面上に合成又は発現はしない。従来技術では、例えば、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、インターロイキン１１受容体α（ＩＬ−１１Ｒａ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）、ＣＤ７２、ＣＤ４７など、多数の腫瘍関連抗原が開示されている。
【００７４】
用語「免疫チェックポイント」とは、免疫系に存在する抑制性シグナル分子であり、末梢組織中の免疫反応の持続性及び強度を調節することにより組織の損傷を回避し、自体の抗原に対する耐性の維持に関与する（Pardoll DM., The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer, 2012, 12(4):252-264）。研究したところ、腫瘍細胞がインビボの免疫系から回避して、増殖が制御不能になる理由の１つは、免疫チェックポイントの抑制性シグナル伝達経路を使用してＴリンパ球の活性を抑制し、Ｔリンパ球が腫瘍に対して効果的に殺傷効果を発揮できないようにすることである（Yao S, Zhu Y及びChen L., Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation. Nat Rev Drug Discov, 2013, 12(2):130-146）。免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）及びＬＡＧ−３を含むが、これらに制限されない。これら免疫チェックポイント分子は免疫細胞を直接抑制する。免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３は、Ｔ細胞機能を調節（例えば、相乗的に調節）して腫瘍免疫回避を促進することができる。
【００７５】
用語「共刺激分子」とは、共刺激リガンドに特異的に結合してＴ細胞の共刺激反応（例えば、増殖が挙げられるが、それに制限されない）を介在するＴ細胞上の対応する結合作用対象である。共刺激分子は、抗原受容体又はそのリガンド以外の、有効免疫応答に寄与する細胞表面分子である。共刺激分子は、ＭＨＣＩ類分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）、ＣＤ２７及びＣＤ２８を含むが、それらに制限されない。いくつかの実施形態では、「共刺激分子」は、４−１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／又はＣＤ２８である。
【００７６】
用語「サイトカイン」は、細胞集団から放出されて、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質の通称である。このようなサイトカインの例には、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン（ＩＬ）例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５；腫瘍壊死因子例えばＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β；及びＬＩＦ、ｋｉｔリガンド（ＫＬ）及びγ−インターフェロンを含む他のポリペプチド性サイトカインがある。本出願に使用される用語であるサイトカインは、天然由来又は組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的活性を有する同等物を含み、この同等物には、人工合成による小分子実体、及びその薬学的に許容される誘導体及び塩が含まれる。
【００７７】
「免疫複合体」は、１つ又は複数の異種分子（細胞傷害剤を含むが、それに制限されない）と抱合する抗体である。
【００７８】
本出願に示される用語「細胞傷害剤」は、細胞機能を抑制又は阻止する、及び／又は細胞の死亡又は破壊を引き起こす物質である。細胞傷害剤は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法薬又は医薬品（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンブラスチン類アルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ゾルビシン又は他のインターカレーター）；成長阻害剤；酵素及びその断片例えば核酸分解酵素；抗生物質；細菌由来、真菌由来、植物由来又は動物由来の小分子毒素又は酵素活性毒素（その断片及び／又は変異体を含む）などの毒素；及び以下で開示された各種の抗腫瘍剤又は抗がん剤を含むが、それらに制限されない。
【００７９】
アミノ酸配列の「同一性百分率（％）」とは、候補配列と本明細書に示される具体的なアミノ酸配列とを比較し、且つ必要に応じて最大の配列同一性百分率を実現するために空位置を導入し、いずれの保存的置換も配列同一性の一部としない場合、本明細書に示される具体的なアミノ酸配列のアミノ酸残基と一致するアミノ酸残基の候補配列における百分率である。
【００８０】
ポリペプチド配列の場合、「保存的修飾」には、ポリペプチド配列に対する置換、欠失又は添加が含まれ、それにより、あるアミノ酸は、化学的に類似したアミノ酸に置換される。機能的に類似したアミノ酸の保存的置換表の提供は、本分野で公知となることである。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子に対しては、付加的なものであり、またそれらを排除することがない。以下は、互いに保存的置換となる８組のアミノ酸である。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。いくつかの実施形態では、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しく影響することがない又は結合特徴を変えないアミノ酸修飾である。
【００８１】
用語「Ｎ末端」は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を指しており、用語「Ｃ末端」は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を指している。
【００８２】
用語「宿主細胞」は、既に外因性ポリヌクレオチドが導入された細胞であり、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換された細胞」を含み、「形質転換体」と「形質転換された細胞」には、初代から形質転換された細胞及びこれらから誘導される子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の三本鎖抗体を産生できる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞は、培養される細胞を含むとともに、遺伝子組換え動物、遺伝子組換え植物又は培養される植物組織又は動物組織の内部の細胞を含む。
【００８３】
用語「発現ベクター」は、組換えポリヌクレオチドを含むベクターであり、発現させるべきヌクレオチド配列に効果的に接続される発現制御配列を含む。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現用の別のエレメントは、宿主細胞により提供されるか、又はインビトロ発現系にあってもよい。発現ベクターは、本分野で公知となる全てのものを含み、これらには、組換えポリヌクレオチドに組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、裸又はリポソームに含まれる）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
【００８４】
用語「対象」又は「対象」は、交換可能に使用され、哺乳動物のことを指す。哺乳動物は、家畜化された動物（例えば、乳牛、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどのヒト以外の霊長類）、ウサギとげっ歯類（例えば、マウスやラット）を含むが、これらに制限されない。特に、対象はヒトである。
【００８５】
用語「治療」とは、治療中の対象の疾患の自然過程を変えようとする臨床的介入である。期待される治療効果は、疾患の発症又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接又は間接的な病理学的結果の減少、転移防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は寛解、及び予後の緩和又は改善を含むが、これらに制限されない。いくつかの実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、疾患の発展又は疾患の進行を遅延させることに用いられる。
【００８６】
用語「抗腫瘍作用」は、多種の手段により示される生物学的効果であり、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少又は生存する腫瘍細胞の減少を含むが、これらに制限されない。用語「腫瘍」及び「がん」は、本出願では、交換可能に使用され、固形腫瘍と液性腫瘍を含む。
【００８７】
用語「がん」及び「がん性」は、通常、細胞の生長が調節不能になることを特徴とする哺乳動物の生理障害を指す又は説明する。がんの例には、がん、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫や白血病又はリンパ系悪性腫瘍が含まれるが、それらに制限されない。このようながんのより具体的な例には、扁平上皮がん（例えば、上皮系扁平上皮がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がん及び消化管間質がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿道がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、及びファコマトーシス（phakomatoses）、水腫（脳腫瘍に関連するものなど）及びメーグス（Ｍｅｉｇｓ）症候群に関連する異常な血管増殖、脳腫瘍及び脳がん、ならびに頭頸部がん、及び関連する転移がんが含まれるが、それらに制限されない。ある実施形態では、本発明の抗体による治療に適したがんには、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、肝がん、胃がん又は結腸がんが含まれ、これらがんの転移がんが含まれる。
【００８８】
用語「腫瘍」は、悪性か良性かを問わず、全ての腫瘍性（neoplastic）の細胞の成長及び増殖、全ての前がん（pre-cancerous）及びがん性の細胞や組織を含む。用語「がん」、「がん性」及び「腫瘍」は、本出願で言及された場合、相互に排他的ではない。
【００８９】
用語「感染性疾患」は、例えばウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染又は真菌感染を含む、病原体により引き起こされる疾患である。
【００９０】
ＩＩ．本発明の三本鎖抗体
本発明は、複数種の疾患の免疫治療、予防及び／又は診断に用いられる新規三本鎖抗体を提供する。本発明の三本鎖抗体は、少なくとも３つの抗原結合部位を含み、単一特異性抗体又は多重特異性（例えば二重特異性）抗体として機能でき、好ましくは、多重特異性（例えば二重特異性）抗体として機能できる。
【００９１】
複数本のポリペプチド鎖を有する単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性）抗体を産生する場合は、通常、好ましくない鎖間のミスマッチ、抗体親和力の低下、安定性低下などの問題が生じる。本出願で構築される三本鎖抗体は、これらよく発生する問題を回避できる。
【００９２】
本出願で構築される三本鎖抗体プラットフォームは、３本のポリペプチド鎖を含む三本鎖抗体であり、この三本鎖抗体では、第１ポリペプチド鎖が第１重鎖可変ドメインを含み、第２ポリペプチド鎖が第１軽鎖可変ドメインを含み、前記第１重鎖可変ドメインと第１軽鎖可変ドメインがペアリングをして（ＶＨ１／ＶＬ１対）第１抗原結合部位を形成し、且つ第３ポリペプチド鎖が第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位を含む。
【００９３】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第３ポリペプチド鎖中の第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがない。
【００９４】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第３ポリペプチド鎖中の第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがある。前記接続ペプチドのタイプについては特に制限がない。実施形態では、前記接続ペプチドは、１〜１００個、特に１〜５０個、より特に１〜２０個のアミノ酸長のアミノ酸配列を有するペプチドである。いくつかの実施形態では、前記接続ペプチドは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン且つｘ＝１−４のうちのいずれかの整数、ｎ＝１−７のうちのいずれかの整数、及びｍ＝０−３のうちのいずれかの整数である。一特定実施形態では、前記接続ペプチドは、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２０）である。
【００９５】
本発明の三本鎖抗体の第３ポリペプチド鎖中の単一ドメイン抗原結合部位は、高親和力で標的抗原のエピトープに特異的に結合できる単一の可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲからのｖ−ＮＡＲ、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化したラクダ科の抗体重鎖可変ドメイン、及びこれらの組換え単一ドメインである。一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第３ポリペプチド鎖中の２つの単一ドメイン抗原結合部位は、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン及び／又はヒト化したラクダ科の抗体重鎖可変ドメインである。
【００９６】
従来技術では、ラクダ科の物種（例えばラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、リャマやグアナコ）から得られた抗体タンパク質の大きさ、構造及びヒト対象に対する抗原性のキャラクタリゼーションがすでに完成されている。自然界では、ラクダ科哺乳動物ファミリーに由来する一部のＩｇＧ抗体は、軽鎖が欠如しており、それにより、構造的には、他の動物に由来する、２本の重鎖と２本の軽鎖を有する一般的な四鎖抗体の構造と異なる。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公布したＷＯ９４／０４６７８）を参照する。
【００９７】
標的抗原に対する高親和力を有するラクダ科の重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（該領域はＶＨＨとも呼ばれる）は遺伝子工学方法により得られ得る。１９９８年６月２日により授権された米国特許番号５，７５９，８０８を参照できる。他の非ヒト抗体断片と同様に、ラクダ科ＶＨＨのアミノ酸配列は、組換えにより変化して、ヒト配列により類似した配列となることができ、即ち、「ヒト化」が可能であり、それによってヒトに対するラクダ科ＶＨＨの抗原性が低減できる。また、ラクダ科ＶＨＨから誘導される主要エレメントをヒトＶＨドメインに移すことで、ラクダ化ヒトＶＨドメインを得ることもできる。本発明の一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第３ポリペプチド鎖中の単一ドメイン抗原結合部位は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するヒト化ＶＨＨである。
【００９８】
ＶＨＨは、分子量がヒトＩｇＧ分子の分子量の十分の一であり、そして物理的直径がわずか数ナノメートルである。ＶＨＨ自体は極めて高い熱安定性を有し、極端なｐＨやタンパク質の酵素分解消化に対して安定的であり、そして抗原性が低く、したがって、前記構造が本発明の三本鎖抗体の安定性、ヒト対象に対する低抗原性に寄与する。
【００９９】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体において、第１ポリペプチド鎖が第１重鎖可変ドメインと免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含み、第２ポリペプチド鎖が第１軽鎖可変ドメインと免疫グロブリンＣＬドメインを含み、且つ第３ポリペプチド鎖が第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位を含む。ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメインの由来免疫グロブリンのクラス、サブクラス、タイプ及びサブタイプについては特に制限がない。好ましくは、前記ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメインは、全てヒト免疫グロブリンの対応する部分に由来するか、又はこの部分とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を有する。
【０１００】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、インビボ半減期を延長させる成分をさらに含む。タンパク質のインビボ半減期に影響し得る要素が多い。例えば、腎臓によるろ過、肝臓での代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解や免疫原性反応（例えば、抗体のタンパク質の中和作用及びマクロファージや樹状細胞による取り込み）が挙げられる。本発明の三本鎖抗体の半減期を延長するために多種の手段が用いられる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の化学的接続、ポリシアル酸（ＰＳＡ）化、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）化、アルブミン、免疫グロブリンＦｃのカップリングなどが挙げられる。
【０１０１】
抗体をペグ化するために、一般には、この三本鎖抗体とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）例えばＰＥＧの活性エステル又はアルデヒド誘導体とを、そのうちの１つ又は複数のＰＥＧ基がこの三本鎖抗体に接続されるような条件で反応させる。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似した反応性水溶高分子）とのアシル化反応又はアルキル化反応により実施され得る。本出願に使用される用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質の誘導体化に用いられる任意の形態のＰＥＧ、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドを含む。いくつかの実施形態では、ペグ化の対象となる抗体は非グリコシル化の抗体である。抗体の生物学的活性の損失を最小限にする直鎖又は分岐ＰＥＧを用いて誘導体化する。ＰＥＧ分子と抗体が正確に抱合するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法により抱合の度合いを厳密に監視することができる。未反応ＰＥＧは、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧ抱合体と分離することができる。ＰＥＧから誘導される抗体の結合活性は当業者に公知の方法でテストできる。タンパク質のペグ化方法は本分野で公知するものであり、本発明の抗体に適用できる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．によるＥＰ０１５４３１６を参照する。
【０１０２】
ポリシアル酸化は、天然重合体であるポリシアル酸（ＰＳＡ）を用いて治療用ペプチド及びタンパク質の有効寿命を延ばし、その安定性を改善するための別の技術である。ＰＳＡはシアル酸（ある種の糖）の重合体である。タンパク質及び治療用ペプチド医薬品の送達に用いられる場合、ポリシアル酸は保護のための微小環境を抱合体に提供する。それにより、循環における治療用タンパク質の有効寿命を延ばすとともに、治療用タンパク質を免疫系による認識から保護する。
【０１０３】
抗体のヒドロキシエチルスターチ（「ＨＥＳ」）化も抗体の循環半減期を延ばし、生物学的活性を向上させることができる。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを変えることにより、広いタイプのＨＥＳ免疫複合体を調製することができる。
【０１０４】
また、ＩｇＧ定常ドメイン又は免疫グロブリンＦｃドメインを本発明の三本鎖抗体に導入することで、長くなったインビボ半減期を有する抗体を産生することができる。例えば、国際公開番号ＷＯ９８／２３２８９、国際公開番号ＷＯ９７／３４６３１及び米国特許番号６２７７３７５を参照する。
【０１０５】
さらに、本発明の三本鎖抗体は、アルブミン（例えば、人血清アルブミン；ＨＳＡ）と抱合することで抗体をインビボでより安定的にするか、又はより長いインビボ半減期を付与することができる。これら技術は本分野で公知するものであり、例えば、国際公開番号ＷＯ０１／７７１３７、及びヨーロッパ特許番号ＥＰ４１３，６２２を参照する。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、本発明の抗体のインビボ半減期を延ばすためにＦｃ領域を含む。
【０１０７】
別の特定実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインには、それぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域、及び／又はそれぞれＹ３４９ＣとＳ３５４Ｃ（Ｋａｂａｔによる「ＥＵ番号」）を含み、それにより、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域で鎖間ジスルフィド結合を形成し、それは本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖の正確なペアリングにも寄与する。
【０１０８】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、「ノブ−イン−ホール」技術（例えばJohn B. B. Ridgway et al., ‘Knobs-into-holes’ engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Engineering, 1996. 9(7): p.617-21; Shane Atwell et al., Stable heterodimers form remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J. Mol. Biol, 1997. 270:p.26-35参照）を使用しており、該技術は、本発明の三本鎖抗体の異なる鎖の間でインターフェースを変えることで、本発明の三本鎖抗体の各本の鎖を正確に会合させる。通常、該技術では、一方の鎖のインターフェースに「突起」を導入し、そのペアリング対象となる他方の鎖のインターフェースに対応する「空洞空洞」を導入して、突起が空洞空洞に配置できるようにする。好ましい１つのインターフェースは、一方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインとそのペアリング対象となる他方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインと、を含む。一方の鎖に由来の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインのインターフェースの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）に置き換えることで突起を構築し得る。大きなアミノ酸側鎖を小さな側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）に置き換えることにより、ペアリング対象となる他方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインのインターフェースで、突起と同じ又は類似した大きさを有する補償用空洞空洞が構築される。好ましい別のインターフェースは、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインを含み、ここで前記のように突起−空洞空洞の相互作用を形成させることができる。
【０１０９】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体に対する結合親和力の修飾を含む。一実施形態では、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体である。一実施形態では、前記Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。一実施形態では、前記修飾は、本発明の三本鎖抗体のエフェクター機能を低減させる。一特定実施形態では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施形態では、前記修飾は、前記免疫グロブリン分子のＦｃ領域内、特にそのＣＨ２領域内にある。一実施形態では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の第３２９位（ＥＵ番号）でのアミノ酸置換を含む。一特定実施形態では、前記アミノ酸置換はＰ３２９Ｇである。一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、免疫グロブリン重鎖の第２３４位と第２３５位（ＥＵ番号）でのアミノ酸置換を含む。一特定実施形態では、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ突然変異）である（Armour KL et al., Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol, 1999. 29(8):2613-24）。一実施形態では、本発明の三本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖の第２３４位、第２３５位及び第３２９位（ＥＵ番号）でのアミノ酸置換を含む。一特定実施形態では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖中のアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号）を含む。
【０１１０】
図１Ａにおける模式図に示されるように、本発明の例示的な三本鎖抗体は三価三本鎖抗体であり、この三価三本鎖抗体では第ポリペプチド鎖中の第１重鎖可変ドメインと第２ポリペプチド鎖中の第１軽鎖可変ドメインがペアリングして第１抗原結合部位を形成し、第３ポリペプチド鎖が第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位を含み、且つ前記第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがある。
【０１１１】
図１Ｂにおける模式図に示されるように、本発明の例示的な三本鎖抗体は三価三本鎖抗体であり、この三価三本鎖抗体では第ポリペプチド鎖中の第１重鎖可変ドメインと第２ポリペプチド鎖中の第１軽鎖可変ドメインがペアリングして第１抗原結合部位を形成し、第３ポリペプチド鎖が第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位を含み、且つ前記第２単一ドメイン抗原結合部位と第３単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがない。
【０１１２】
ｉ）一実施形態では、三本鎖抗体は抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
【０１１３】
ＰＤ−Ｌ１（表面抗原分類２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）とも呼ばれる）は、４０ｋＤａ  Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、活性化したＴ細胞に存在するその受容体ＰＤ−１と結合して、Ｔ細胞の活性化をダウンレギュレートする（Latchman et al., 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al., 2002 Eur J Immunol 32:634-43）。ヒト肺がん、卵巣がん、結腸がんや多数の骨髄腫など、多くのがんでＰＤ−Ｌ１発現が認められ、且つＰＤ−Ｌ１発現はがんの予後不良に繋がる場合が多い（Iwai et al. (2002) PNAS 99:12293-7; Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53; Okazaki et al. (2007) Intern.Immun.19:813-24; Thompson et al. (2006) Cancer Res. 66:3381-5）。ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用を抑制することによりいくつかの腫瘍患者において免疫抑制を逆転することが提案されている。
【０１１４】
エフ・ホフマン・ラ・ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社により研究・開発された抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ドイツのメルク・アンド・カンパニー社（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）及び米国のファイザー社（Ｐｆｉｚｅｒ）が協力して開発した抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｖｅｌｕｍａｂ、アストラゼネカ社により研究・開発されたＤｕｒｖａｌｕｍａｂは一部の腫瘍患者に対して治療効果を示す。他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖と軽鎖の可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４の配列番号２０及び２１に示されている）及びＷＯ２００７／００５８７４に開示された抗ＰＤ−Ｌ１抗体などが含まれる。
【０１１５】
ＣＤ４７は最初にインテグリン関連タンパク質（integrin-associated protein、ＩＡＰ）であると認められ（Brown E.J. et al., Integrin-associated protein (CD47) and its ligands, Trends Cell Biol., 2001,11 (3):130-135）、細胞表面に発現させた腫瘍関連抗原である。ＣＤ４７は、主にマクロファージ及び樹状細胞が発現させた、そのリガンドとしての細胞表面免疫グロブリンＳＩＲＰαと互いに作用して、一連のカスケード反応を産生し、それにより、ＣＤ４７を発現させた細胞に対するマクロファージ及び樹状細胞の取り込み及び貪食作用が抑制される。
【０１１６】
正常な組織では、一般的にＣＤ４７発現が存在し、例えば、ＣＤ４７は活性のある赤血球の表面で発現されている。ＣＤ４７の機能の一部は、活性のある赤血球を貪食作用から保護することである（Oldenborg P. A. et al., Role of CD47 as a marker of self on red blood cells, Science, 2000, 288(5473):2051-2054）。加えて、腫瘍には、ＣＤ４７の過剰発現が観察された。発現させたＣＤ４７はマクロファージの表面におけるＳＩＲＰαに結合されて、「食べないでください」というシグナルを放出し、それにより腫瘍組織浸潤領域のマクロファージの、腫瘍細胞に対する貪食作用を抑制する。次に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による腫瘍細胞の取り込みの減少は、Ｔ細胞の活性化の低下を間接的に引き起こし、加えて、ナイーブＴ細胞におけるＣＤ４７は活性化して、免疫抑制の制御性Ｔ細胞Ｔｒｅｇｓの形成を促進するとともに、Ｔｈ１エフェクター細胞の形成を抑制する（Avice M.N.et al., CD47 ligation selectively inhibits the development of human naive T cells into Th1 effectors, J. Immunol., 2000年10月, 165 (8):4624-4631）。
【０１１７】
現在、複数の抗ＣＤ４７抗体が報告されており、例えば米国特許ＵＳ２０１５／０１８３８７４Ａ１には、Ｂ６Ｈ１２から誘導されるヒトＩｇＧ１型キメラモノクローナル抗体及びＣＤＲ移植によるヒト化Ｂ６Ｈ１２抗体が報告されている。中国特許出願番号ＣＮ２０１７１０７５９８２８．９には、ＣＤ４７に特異的に結合可能なモノクローナル抗体「ＡＤＩ−２９３４１」が報告されている。
【０１１８】
本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、少なくともＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を同時にターゲットする抗体であり、且つ３つの抗原結合部位はそれぞれＣＤ４７及び／又はＰＤ−Ｌ１分子に結合される。前記のとおり、ＣＤ４７はがん細胞で過剰発現されているが、多数の正常な組織でのＣＤ４７の発現により、ＣＤ４７だけをターゲットとする抗体は、通常、正常な血液系における細胞に非特異的に結合されて、抗原シンク（antigen sink）の現象をもたらす。本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＣＤ４７及び腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１を同時にターゲットし、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１との特異的結合により、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の、腫瘍細胞に対する選択的結合が促進され、多数の正常な組織で発現させたＣＤ４７との結合が回避され、それにより、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、貪食作用を強化するとともに、副作用を減少させることができる。
【０１１９】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４７に特異的に結合される第２単一ドメイン抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４７に特異的に結合される第３単一ドメイン抗原結合部位を含む。一実施形態では、前記三本鎖抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。別の実施形態では、前記三本鎖抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。
【０１２０】
前記ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位に関しては、「ＶＨ１／ＶＬ１対」は従来技術で報告された抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、上記で挙げられた抗ＰＤ−Ｌ１抗体）及び将来研究・開発される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかのＶＨ１／ＶＬ１対から誘導される６個のＣＤＲ、又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含み、又は従来技術で報告された抗ＣＤ４７抗体（例えば、上記で挙げられた抗ＣＤ４７抗体）及び将来研究・開発される抗ＣＤ４７抗体のいずれかのＶＨ１／ＶＬ１対から誘導されるの６個のＣＤＲ又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。
【０１２１】
前記ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４７に特異的に結合される単一ドメイン抗原結合部位に関しては、ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４７に特異的に結合される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の血清からの、天然に軽鎖を含まず２本の重鎖だけからなるラクダ抗体の重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来のＶＨ様単一ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化したラクダ科の抗体重鎖可変ドメインを含む。
【０１２２】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位を含み、前記ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、ＰＤ−Ｌ１上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合される。
【０１２３】
一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ−２９３４１から誘導されるＧＳＩＥＨＹＹＷＳ（配列番号３）に示されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）に示されるＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲＧＫＴＧＳＡＡ（配列番号５）に示されるＶＨ  ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号１０）に示されるＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１１）に示されるＶＬ  ＣＤＲ２及びＱＱＴＶＳＦＰＩＴ（配列番号１２）に示されるＶＬ  ＣＤＲ３、又は、前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。
【０１２４】
一実施形態では、前記第ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＣＤ４７に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ−２９３４１から誘導される配列番号２／９の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列とは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【０１２５】
一実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２、及び配列番号１９に示されるＣＤＲ３、又は前記３つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。別の実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１５及び／又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１２６】
本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖中の免疫グロブリンの重鎖定常領域のタイプについては特に制限がなく、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はこの領域とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列である。より好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はこの領域とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列である。
【０１２７】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）に使用される重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）用の重鎖定常領域を含む。例えば、三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインには、それぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域、及び／又はそれぞれＹ３４９ＣとＳ３５４Ｃを含み（Ｋａｂａｔの「ＥＵ番号」に従う）、それによって、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域で鎖間ジスルフィド結合を形成することで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖との正確なペアリングを安定化させる。
【０１２８】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインには、抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸突然変異を含む。一特定実施形態では、前記アミノ酸置換は、ＬＡＬＡ突然変異である。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖は、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域又はヒトλ軽鎖定常領域を含む。一実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列に含まれる。
【０１３０】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のそれぞれのＦｃドメインには、「ノブ−イン−ホール」の安定的な会合が含まれる。一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、一方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、且つ前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、他方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号）を含む。それによって、一方の鎖の突起を他方の鎖の空洞に置くことで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖が正確にペアリングをすることができる。
【０１３１】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインのそれぞれには、突起又は空洞を含み、且つＣＨ１ドメインの前記突起又は空洞をそれぞれＣＬドメインの前記空洞又は突起に置くことができるため、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖も互いに「ノブ−イン−ホール」のように安定的に会合し得る。
【０１３２】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１３４】
本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＰＤ−Ｌ１とＣＤ４７タンパク質に同時に結合でき、且つ親抗体の親和力定数を維持するので、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路及びＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を遮断できる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路及びＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路に関連する疾患は、各種の血液疾患や固形腫瘍であり、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、リンパ腫、乳がん、胃がん、肺がん、食道がん、腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膵臓がん、膀胱がん、神経膠腫、黒色腫や他の固形腫瘍を含むが、これらに制限されない。また、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路を遮断することによりＮＯＤマウス系におけるヒト幹細胞移植（ＷＯ２００９／０４６５４１）を促進することができ、したがって、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ヒト幹細胞移植に利用できるという潜在的な利点もある。
【０１３６】
中国特許番号ＺＬ２０１０８００６４４２６．３には、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路を遮断する四価ＣＤ４７−抗体定常領域融合タンパク質が、ＳＩＲＰα＋細胞が介在した自己免疫疾患や炎症性疾患、例えば、アレルギー性喘息又は潰瘍性結腸炎を治療、予防又は診断できることが開示されている。これら疾患には、急性または慢性炎症性疾患、アレルギー反応やアレルギー性疾患、自己免疫疾患、局所虚血性疾患、重度の感染症や、細胞又は組織又は器官移植物の拒絶例えば非ヒト組織移植物（異種移植片）が含まれ、したがって、本発明の三本鎖抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、これら疾患の治療、予防又は診断においても役割を果たすことが期待できる。
【０１３７】
ｉｉ）一実施形態では、三本鎖抗体は、抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
【０１３８】
ＰＤ−Ｌ１は、免疫チェックポイント抑制分子である。腫瘍細胞で発現させたＰＤ−Ｌ１は、Ｔリンパ球におけるＰＤ−１に結合されることでＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を活性化させ、それによりＴリンパ球の活性が抑制されて、Ｔリンパ球が腫瘍に対する殺滅効果を効果的に発揮できなくなり、それは、腫瘍細胞がインビボ免疫系から回避して制御不能に増殖できる原因の１つである（Yao S,Zhu Y及びChen L., Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation. Nat Rev Drug Discov, 2013, 12(2):130-146）。
【０１３９】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９とも呼ばれる）は、活性化Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で発現させた活性化誘導共刺激受容体であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーの１つである。４−１ＢＢは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２で提供されるようなアミノ酸配列、又は非ヒト物種例えばマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿などに由来の等同のアミノ酸配列を有する。Ｔ細胞では、４−１ＢＢライゲーション（４−１ＢＢ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）はシグナルカスケードを誘発し、その結果、抗アポトーシス分子のアップレギュレーション、サイトカインの分泌及びエフェクター機能の強化が発生する。細胞傷害毒性が低下した機能障害のあるＴ細胞では、４−１ＢＢライゲーションは、エフェクター機能回復という効果的な能力を示す（Li SY, Liu Y. Immunotherapy of melanoma with the immune costimulatory monoclonal antibodies targeting CD137. Clin Pharmacol, 2013, 5 (Suppl 1):47-53）。ＮＫ細胞では、４−１ＢＢシグナル伝達は抗体依存性細胞介在性細胞傷害を向上できる。
【０１４０】
４−１ＢＢシグナル伝達をがん免疫療法に用いるために、４−１ＢＢに対するアゴニストモノクローナル抗体が研究開発されている（Ye Q, Song DG, Poussin M, Yamamoto T, Best A,Li C et al., CD137 accurately identifies and enriches for naturally occurring tumor-reactive T cells in tumor. Clin Cancer Res, 2014, 20(1):44-55）。多種の誘発性腫瘍モデル及び自然発生腫瘍モデルの前臨床結果から明らかなように、アゴニスト抗体が４−１ＢＢをターゲットとすることにより、腫瘍の除去及び長期にわたる抗腫瘍免疫性を実現できる。ＷＯ２００４０１０９４７Ａ２は、ヒト４−１ＢＢを結合しており、ヒト４−１ＢＢリガンドへのヒト４−１ＢＢの結合を可能にするヒト化抗４−１ＢＢモノクローナル抗体を開示する。
【０１４１】
ＷＯ２０１６／０６１１４２では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子と４−１ＢＢ受容体標的剤（例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ−１３７）を介したシグナル伝達を刺激する抗体、例えば、ＰＦ−２５６６を刺激する）を併用することが一般には言及されている。
【０１４２】
腫瘍免疫の場合、複数の標的をターゲットとする治療プロトコールが互いに相乗的に作用することができるため、腫瘍の免疫回避防止に有利である。現在腫瘍免疫の異なる標的をターゲットとする抗体の併用も臨床試験に入った。しかし、併用には、２つの独立した抗体製品を注射するか、又は１回に２種の異なる抗体の複合製剤を注射する必要がある。２回注射する場合は、投与量及びタイムスケジュールの柔軟性が許容されるが、患者のノンコンプライアンスや疼痛を引き起こす。また、複合製剤は、投与量の点である種の柔軟性を提供する可能性がある反面、通常、溶液において２種の抗体を許容でき、化学・物理的安定性のある調製条件が実現されにくく、それは、２種の抗体の分子特徴が異なるからである。さらに、併用及び複合製剤という２種の異なる抗体による療法は、患者及び／又は支払人にとって、追加費用を引き起こす恐れがあり、したがって、腫瘍を治療するための代替免疫療法が必要であり、且つ好ましくは、このような代替免疫療法は二重特異性抗体に関わる。
【０１４３】
本発明の抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、少なくとも４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１を同時にターゲットとする抗体であり、且つ３つの抗原結合部位はそれぞれ４−１ＢＢ及び／又はＰＤ−Ｌ１分子に結合され、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を遮断するとともに、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の４−１ＢＢ／４−１ＢＢリガンドシグナル伝達経路を活性化することができる。一実施形態では、前記三本鎖抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１又は４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１又は４−１ＢＢに特異的に結合される第２単一ドメイン抗原結合部位とＰＤ−Ｌ１又は４−１ＢＢに特異的に結合される第３単一ドメイン抗原結合部位を含む。一実施形態では、前記三本鎖抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。別の実施形態では、前記三本鎖抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。
【０１４４】
前記ＰＤ−Ｌ１又は４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位に関しては、「ＶＨ１／ＶＬ１対」は従来技術で報告された抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、上記で挙げられた抗ＰＤ−Ｌ１抗体）及び将来研究・開発される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかのＶＨ１／ＶＬ１対から誘導される６個のＣＤＲ又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含み、又は従来技術で報告された抗４−１ＢＢ抗体（例えば、上記で挙げられた抗４−１ＢＢ抗体）及び将来研究・開発される抗４−１ＢＢ抗体のいずれかのＶＨ１／ＶＬ１対から誘導される６個のＣＤＲ又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。
【０１４５】
前記ＰＤ−Ｌ１又は４−１ＢＢに特異的に結合される単一ドメイン抗原結合部位に関しては、ＰＤ−Ｌ１又は４−１ＢＢに特異的に結合される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の血清からの、天然に軽鎖を含まず２本の重鎖だけからなるラクダ抗体の重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来のＶＨ様単一ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化したラクダ科の抗体重鎖可変ドメインを含む。
【０１４６】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位を含み、前記ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、ＰＤ−Ｌ１上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合される。
【０１４７】
一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗４−１ＢＢ抗体ＢＭＳ−６６３５１３から誘導される配列番号２６／２８の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる合計６個の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と軽鎖ＣＤＲ、又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。
【０１４８】
一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、４−１ＢＢに特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗４−１ＢＢ抗体ＢＭＳ−６６３５１３から誘導される配列番号２６／２８の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列とは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【０１４９】
一実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２、及び配列番号１９に示されるＣＤＲ３、又は前記３つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。別の実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１５及び／又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１５０】
本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖中の免疫グロブリンの重鎖定常領域のタイプについては特に制限がなく、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はこの領域とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列である。より好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はこの領域とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列である。
【０１５１】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）に使用される重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）用の重鎖定常領域を含む。例えば、三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインには、それぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域、及び／又はそれぞれＹ３４９ＣとＳ３５４Ｃを含み（Ｋａｂａｔの「ＥＵ番号」に従う）、それによって、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域で鎖間ジスルフィド結合を形成することで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖との正確なペアリングを安定化させる。
【０１５２】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインには、抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸突然変異を含む。一特定実施形態では、前記アミノ酸置換は、ＬＡＬＡ突然変異である。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖は、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域又はヒトλ軽鎖定常領域を含む。一実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列に含まれる。
【０１５４】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のそれぞれのＦｃドメインには、「ノブ−イン−ホール」の安定的な会合が含まれる。一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、一方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、且つ前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、他方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号）を含む。それによって、一方の鎖の突起を他方の鎖の空洞に置くことで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖が正確にペアリングをすることができる。
【０１５５】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン和ＣＬドメインのそれぞれには、突起又は空洞を含み、且つＣＨ１ドメインの前記突起又は空洞をそれぞれＣＬドメインの前記空洞又は突起に置くことができるため、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖も互いに「ノブ−イン−ホール」のように安定的に会合し得る。
【０１５６】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号２５に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号２７に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１５７】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号２５に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号２７に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１５８】
本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＰＤ−Ｌ１と４−１ＢＢタンパク質に同時に結合でき、且つ親抗体の親和力定数を維持するので、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を遮断するとともに、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の４−１ＢＢ／４−１ＢＢリガンドのシグナル伝達経路を活性化することができる。本発明の三本鎖抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、前記シグナル伝達経路に関連する疾患の治療、予防又は診断に用いられ得る。
【０１５９】
ｉｉｉ）一実施形態では、三本鎖抗体は、抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
【０１６０】
本実施形態は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を遮断し、ＬＡＧ−３シグナル伝達経路に作用する抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体に関する。
【０１６１】
ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子−３、ＣＤ２２３とも呼ばれる）は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞で発現させる細胞表面分子であり、免疫抑制活性を有する細胞枯渇マーカーであり、前記細胞表面分子がＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇に作用することが示されている。
【０１６２】
主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）は、ＬＡＧ−３のリガンドであり、またＬＡＧ−３の他のリガンド（例えばＬ−セレクチン及びガレクチン−３）も決定されている（Anderson A. C. et al., Lag-3, tim-3, and TIGIT: Co-inhibitory receptors with specialized functions in immune regulation, Immunity, 2016, 44(5):989-1004; Kouo T.et al., Galectin-3 shapes antitumor immune responses by suppressing CD8+ T cells via LAG-3 and inhibiting expansion of plasmacytoid dendritic cells, Cancer Immunol Res. 2015 April; 3(4):412-423）。
【０１６３】
がんでは、ＬＡＧ−３を発現させた制御性Ｔ細胞（Regulatory T cells, Tregs）は、強化された抗腫瘍抑制活性を有し、一方、ＬＡＧ−３を発現させた細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、増殖速度が低下し、エフェクターサイトカインを産生する（Scurr M.et al., Highly prevalent colorectal cancer-infiltrating LAP+ Foxp3- T cells exhibit more potent immunosuppressive activity than Foxp3+ regulatory T cells, Mucosal Immunol. 2014, 7(2):428-439）。メタロプロテイナーゼにより切断されて細胞の微小環境に分泌されるＬＡＧ−３のスプライス変異体は、抗原提示細胞におけるＭＨＣ−ＩＩに結合されると、免疫活性化作用を有する（Casati C.et al., Soluble human LAG-3 molecule amplifies the in vitro generation of type 1 tumor-specific immunity, Clinical Cancer Research. American Association for Cancer Research; 2006, 66(8):4450-4460）。
【０１６４】
黒色腫、結腸がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、白血病、頭頸部がんの患者では、ＬＡＧ−３＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が報告されている（Demeure C.E.et al., T Lymphocytes infiltrating various tumour types express the MHC class II ligand lymphocyte activation gene-3 (LAG-3): role of LAG-3/MHC class II interactions in cell-cell contacts, Eur. J. Cancer, 2001, 37(13):1709-1718）。多数のがんマウスモデルでは、抗体によるＬＡＧ−３遮断によりＣＤ８＋エフェクターＴ細胞が回復し、Ｔｒｅｇ集団が減少する。
【０１６５】
本発明者は、ＬＡＧ−３シグナル伝達経路を抑制するモノクローナル抗体である抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３を開示しており、この抗体は、配列番号３０／３５の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列を有する。
【０１６６】
本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、少なくともＬＡＧ−３とＰＤ−Ｌ１を同時にターゲットとする抗体であり、且つ３つの抗原結合部位はそれぞれＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１分子に結合される。一実施形態では、前記三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１又はＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１又はＬＡＧ−３に特異的に結合される第２単一ドメイン抗原結合部位とＰＤ−Ｌ１又はＬＡＧ−３に特異的に結合される第３単一ドメイン抗原結合部位を含む。一実施形態では、前記三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。別の実施形態では、前記三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位、及び第３ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合される第１ＶＨＨと第２ＶＨＨを含む。
【０１６７】
前記ＰＤ−Ｌ１又はＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位に関しては、「ＶＨ１／ＶＬ１対」は従来技術で報告された抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、上記で挙げられた抗ＰＤ−Ｌ１抗体）及び将来研究・開発される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかのＶＨ１／ＶＬ１対から誘導される６個のＣＤＲ又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含み、又は従来技術で報告された抗ＬＡＧ−３抗体（例えば、上記で挙げられた抗ＬＡＧ−３抗体）及び将来研究・開発される抗ＬＡＧ−３抗体のいずれかのＶＨ１／ＶＬ１対から誘導される６個のＣＤＲ又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。
【０１６８】
前記ＰＤ−Ｌ１又はＬＡＧ−３に特異的に結合される単一ドメイン抗原結合部位に関しては、ＰＤ−Ｌ１又はＬＡＧ−３に特異的に結合される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の血清からの、天然に軽鎖を含まず２本の重鎖だけからなるラクダ抗体の重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来のＶＨ様単一ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化したラクダ科の抗体重鎖可変ドメインを含む。
【０１６９】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位及び第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位を含み、前記ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、ＰＤ−Ｌ１上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合される。
【０１７０】
一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３から誘導されるＧＳＩＹＳＥＳＹＹＷＧ（配列番号３１）に示されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＳＩＶＹＳＧＹＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）に示されるＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲＶＲＴＷＤＡＡＦＤＩ（配列番号３３）に示されるＶＨ  ＣＤＲ３、ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３６）に示されるＶＬ  ＣＤＲ１、ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号３７）に示されるＶＬ  ＣＤＲ２及びＱＱＶＬＥＬＰＰＷＴ（配列番号３８）に示されるＶＬ  ＣＤＲ３、又は前記６個のＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖上の、ＬＡＧ−３に特異的に結合され、ＶＨ１／ＶＬ１対を含む第１抗原結合部位は、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３から誘導される配列番号３０／３５の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列とは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【０１７１】
一実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１７に示されるＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＣＤＲ２、及び配列番号１９に示されるＣＤＲ３、又は前記３つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。別の実施形態では、前記第３ポリペプチド鎖上の、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合される単一ドメイン第２及び第３抗原結合部位は、いずれも配列番号１５及び／又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１７２】
本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖中の免疫グロブリンの重鎖定常領域のタイプについては特に制限がなく、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はこの領域とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列である。より好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はこの領域とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列である。
【０１７３】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）に使用される重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）用の重鎖定常領域を含む。例えば、三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインには、それぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域、及び／又はそれぞれＹ３４９ＣとＳ３５４Ｃを含み（Ｋａｂａｔの「ＥＵ番号」に従う）、それによって、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域で鎖間ジスルフィド結合を形成することで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖との正確なペアリングを安定化させる。
【０１７４】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインには、抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸突然変異を含む。一特定実施形態では、前記アミノ酸置換は、ＬＡＬＡ突然変異である。
【０１７５】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖は、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域又はヒトλ軽鎖定常領域を含む。一実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又はこれら配列とは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列に含まれる。
【０１７６】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のそれぞれのＦｃドメインには、「ノブ−イン−ホール」の安定的な会合が含まれる。一実施形態では、前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、一方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、且つ前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、他方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号）を含む。それによって、一方の鎖の突起を他方の鎖の空洞に置くことで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖が正確にペアリングをすることができる。
【０１７７】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインのそれぞれには、突起又は空洞を含み、且つＣＨ１ドメインの前記突起又は空洞をそれぞれＣＬドメインの前記空洞又は突起に置くことができるため、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖も互いに「ノブ−イン−ホール」のように安定的に会合し得る。
【０１７８】
一実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号２９に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号３４に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、配列番号２９に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号３４に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列のいずれかとは実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同じである）配列を含む。
【０１８０】
本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＰＤ−Ｌ１とＬＡＧ−３タンパク質に同時に結合でき、且つ親抗体の親和力定数を維持するので、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路及びＬＡＧ−３シグナル伝達経路を遮断できる。本発明の三本鎖抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、前記シグナル伝達経路に関連する疾患の治療、予防又は診断に用いられ得る。
【０１８１】
ＩＩＩ．本発明の三本鎖抗体変異体
いくつかの実施形態では、本出願で例示される二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体が提案される。例えば、二重特異性抗体の結合親和力及び／又は他の生物学的特性を改善するためである。二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること又はペプチド合成により二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体を調製することができる。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失及び／又は前記アミノ酸配列への残基の挿入及び／又は前記アミノ酸配列における残基の置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを発生させることにより最終構築体を得ることができ、前記最終構築体が所望の特徴、例えば抗原結合作用を有すればよい。
【０１８２】
表１には、「保存的置換」のタイトルに保存的置換が示される。表１には、「例示的置換」のタイトルに示され、且つアミノ酸側鎖のカテゴリを参照しながら下記のようにより明らかな変化をさらに説明する。アミノ酸置換を目標抗体に導入し、且つ産物に対して、所望の活性、例えば、保留／改善した抗原結合作用又は低下した免疫原性を選別することができる。
【０１８３】
【表１】
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アミノ酸は、一般的な側鎖の特性に応じてグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ；Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ；Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）アルカリ性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これら分類のうちの１つのメンバーを別の分類のメンバーにする。
【０１８４】
ＩＶ．免疫複合体
本発明の三本鎖抗体は、異種タンパク質又はポリペプチドへの組換え融合又は化学的に抱合共有結合性抱合と非共有結合（性抱合）することで融合タンパク質を産生し得る。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが抗体に融合又は抱合する方法は、本分野で公知するものである。例えば、米国特許番号５，３３６，６０３、５，６２２，９２９及びＥＰ３６７，１６６を参照する。
【０１８５】
また、本発明の三本鎖抗体は、精製を促進するために標識された配列（例えばペプチド）に融合し得る。好ましい実施形態では、標識されたアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）などにより標識が提供され、これらのうちの多くが市販品として入手できる。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６:８２１−８２４に記載のとおり、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の精製に便利を提供する。精製用の他のペプチド標識は、ヘマグルチニン（「ＨＡ」）標識を含むが、それに制限されない。インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３７:７６７）及び「ｆｌａｇ」標識に対応する。
【０１８６】
他の実施形態では、本発明の三本鎖抗体は診断剤又は検出可能な薬剤と抱合する。このような抗体は、臨床検査方法の一部（例えば特定療法の効能を確認する）として、疾患又は病気の発作、形成、進行及び／又は重篤性を監視又は予測することができる。このような診断及び検出は、抗体と検出可能な物質とを結合することにより実施でき、前記検出可能な物質は、複数種の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、及びさまざまな陽電子放出断層撮影法で使用される陽電子放出性金属及び非放射性の常磁性金属イオンを含み、前記酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含むが、それらに制限されない。前記補欠分子族としては、例えば、ストレプトアビジン／ビオチンやアビジン／ビオチンを含むが、それらに制限されない。前記蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンを含むが、それらに制限されない。前記発光物質としては、ルミノールを含むが、それらに制限されない。前記生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、フルオレセインやイクオリンを含むが、それらに制限されない。前記放射性物質としては、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ及び１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ及び１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、弗素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｔｉｎを含むが、それらに制限されない。
【０１８７】
本発明は、治療用部分と抱合する三本鎖抗体の用途をさらに含む。三本鎖抗体は、治療用部分、例えば細胞毒素（例えば細胞成長阻害剤又は細胞殺滅剤）、治療剤又は放射性金属イオン、例えばαエミッターに抱合し得る。用語「細胞毒素」又は「細胞傷害剤」は、細胞へ害を与える任意の物質を含む。
【０１８８】
また、三本鎖抗体は、所定の生物学的反応を調節する治療用部分又は医薬品部分とも抱合できる。治療用部分又は医薬品部分は、伝統的な化学療法薬に制限されると解釈すべきではない。例えば、医薬品部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド又はポリペプチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、毒素例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質例えば腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤、又は生物学的応答調節物質例えばリンホカインを含み得る。
【０１８９】
また、抗体は治療用部分に抱合できる。例えば放射性金属イオン、例えば２１３Ｂｉなどのα−エミッター、又は放射金属イオン（１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むが、これらに制限されない）をポリペプチドに抱合させる大環状キレート剤に抱合できる。いくつかの実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に付着できる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。このようなリンカー分子は、本分野で公知するものであり、且つＤｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（１０）:２４８３−９０に記載されており、前記文献のそれぞれは、引用により全体として組み込まれる。
【０１９０】
治療用部分と抗体を抱合させるための技術は周知するものであり、例えばＡrnon et al., 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」 （Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (編), 243-256ページ (Alan R. Liss, Inc. 1985)から抜粋）を参照できる。
【０１９１】
抗体は、固相支持物に接続されてもよく、前記支持物は、特に免疫測定法又は標的抗原の精製に利用できる。このような固相支持物は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンを含むが、それらに制限されない。
【０１９２】
Ｖ．本発明の三本鎖抗体の製造及び精製
本発明の三本鎖抗体は、例えば固相ペプチド合成（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換えにより製造できる。組換えて製造するために、前記三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド、第２ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド及び／又は第３ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを分離して、１つ又は複数のベクターに挿入することにより、さらに宿主細胞でクローン及び／又は発現させる。常法によれば、前記ポリヌクレオチドを容易に分離してシーケンシングすることができる。一実施形態では、本発明の１種又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。
【０１９３】
当業者が公知する方法で発現ベクターを構築することができる。発現ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージ又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに制限されない。
【０１９４】
本発明の１種又はそれ以上のポリヌクレオチドを含む発現用の発現ベクターを調製すると、発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクション又は導入できる。この目的を達成させるためには、多数の技術が利用でき、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、パーティクルガン、リポソームに基づくトランスフェクションや他の一般的な技術である。
【０１９５】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの１種又はそれ以上を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本出願に示される用語「宿主細胞」とは、エンジニアリングにより本発明の三本鎖抗体を産生し得る任意の細胞系を指す。コピー及び本発明の三本鎖抗体の発現のサポートに適した宿主細胞は本分野で公知するものである。必要に応じて、このような細胞は、特定発現ベクターを用いてトランスフェクション又は形質導入することができ、且つベクターを含有する細胞を大量に培養して大規模発酵槽において接種して、臨床用途に十分な量の本発明の三本鎖抗体を得ることができる。適切な宿主細胞には、原核微生物例えば大腸菌、真核微生物例えば糸状真菌又は酵母、又は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの各種の真核細胞が含まれる。懸濁培養に適した哺乳動物細胞系が利用可能である。有用な哺乳動物宿主細胞系の例には、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（ＨＥＫ２９３又は２９３Ｆ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、骨髄腫細胞株例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３やＳｐ２／０などが含まれる。タンパク質の産生に適した哺乳動物宿主細胞系の概要については、例えばＹａｚａｋｉ及びＷｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），２５５−２６８ページ（２００３）を参照する。一好適実施形態では、前記宿主細胞はＣＨＯ、ＨＥＫ２９３又はＮＳＯ細胞である。
【０１９６】
本分野では、これら宿主細胞系で外来遺伝子を発現させる標準技術が公知するものである。一実施形態では、本発明の三本鎖抗体を産生する方法を提供し、前記方法は、前記三本鎖抗体の発現に適した条件で、前記三本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む本出願に提供される宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から前記三本鎖抗体を回収することを含む。
【０１９７】
本出願に記載のように調製される三本鎖抗体は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど、既知の従来技術により精製できる。特定のタンパク質を精製するための実際の条件は、また、正味の電荷、疎水性、親水性などの因素にも依存し、これらは、当業者にとって公知するものである。
【０１９８】
本発明の三本鎖抗体の純度は、多数の公知分析方法のうちのいずれかにより決定でき、前記公知分析方法には、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどが含まれる。本出願による三本鎖抗体の物理／化学的特性及び／又は生物学的活性は、本分野で公知するさまざまな測定法により、同定、選別又は特性評価することができる。
【０１９９】
ＶＩ．医薬組成物及びキット
別の態様では、本発明は、組成物、例えば、医薬組成物を提供し、前記組成物は、薬学的に許容される担体と配合し得る本出願の前記三本鎖抗体を含む。本出願に使用される「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性のある任意の溶剤、分散媒体、等張剤や吸収遅延剤などを含む。本発明の医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与又は表皮投与（例えば、注射又は輸注による）に適している。
【０２００】
本出願では、本出願の前記三本鎖抗体と１種又はそれ以上の治療剤とを組み合わせた組成物をさらに開示し、前記治療剤は、以下のカテゴリ（ｉ）−（ｉｉｉ）のうちの１つ、２つ又は全てのカテゴリから選択される。（ｉ）抗原提示（例えば、腫瘍抗原提示）を強化させる医薬品；（ｉｉ）エフェクター細胞反応（例えば、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞活性化及び／又は動員）を強化させる医薬品；又は（ｉｉｉ）免疫抑制を減少させる医薬品。
【０２０１】
本発明の組成物は、多数の形態としてもよい。これら形態には、例えば液体、半固体及び固体の剤型、例えば液体溶液剤（例えば、注射用溶液剤や輸注可能溶液剤）、分散体剤又は懸濁剤、リポソーム剤や坐剤が含まれる。好ましい形態は、期待される投与モード及び治療用途によるものである。一般的な好ましい組成物は、注射可能溶液剤や輸注可能溶液剤の形態とされる。好ましい投与モードは、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内）注射である。一好適実施形態では、三本鎖抗体は静脈内輸注又は注射により投与される。別の好適実施形態では、三本鎖抗体は筋肉内、腹腔内又は皮下注射により投与される。
【０２０２】
本出願に使用される単語「非経口投与」及び「非経口方式投与」とは、経腸投与や局所投与を除いた投与モードのことであり、通常、注射により投与され、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、経気管、皮下注射や輸注を含むが、これらに制限されない。
【０２０３】
治療用組成物は、一般には、無菌のものであり、且つ製造や保管条件下で安定的なものである。組成物を溶液、マイクロエマルション、分散体、リポソーム又は凍結乾燥の形態に調製することができる。活性化合物（即ち三本鎖抗体）を所望の量で適切な溶剤に加え、次にろ過消毒を行い、無菌注射可能溶液剤とすることができる。通常、前記活性化合物を無菌溶媒に混入することで分散体を調製し、前記無菌溶媒には、基礎分散媒体と他の成分が含まれる。レシチンなどのコーティング剤が利用可能である。分散体の場合、界面活性剤を用いて溶液剤の適切な流動性を維持できる。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアレートやゼラチンを組成物に含ませることにより注射可能組成物の吸収期間を延長させることができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明の三本鎖抗体を経口投与することができ、例えば不活性希釈剤又は食用可能な担体とともに経口投与する。本発明の三本鎖抗体は、ハード又はソフトゼラチンカプセルに封入されたり、錠剤に圧縮されたり、そのまま対象の食べ物に加えられたりすることができる。経口投与により治療する場合、前記化合物は、賦形剤とともに混入し、且つ摂取可能な錠剤、頬錠、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅ）、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハ剤（ｗａｆｅｒ）などの形態で使用され得る。本発明の三本鎖抗体を非経口投与法により投与するためには、前記三本鎖抗体をその不活化を防止する材料でコーティングするか、又はこの材料とともに投与する必要がある場合がある。治療用組成物は、本分野で公知する医療デバイスを用いて投与することもできる。
【０２０５】
本発明の医薬組成物は、「治療的有効量」又は「予防的有効量」の本発明記載の三本鎖抗体を含み得る。「治療的有効量」とは、必要な期間に亘って必要な用量で所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。治療的有効量は、病状、個人の年齢、性別や体重などのさまざまな要因によって異なる。治療的有効量は、治療の有益な効果よりも毒性又は害が少ない任意の量である。「治療的有効量」は、未治療の対象に対しては、好ましくは、測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍成長率）を少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、よりさらに好ましくは、少なくとも約８０％抑制する。測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍体積）を抑制する本発明の三本鎖抗体の能力は、ヒト腫瘍における効能を示す動物モデルシステムで評価することができる。
【０２０６】
「予防的有効量」は、必要な期間に亘って必要な用量で所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。通常、予防的用量は、疾患の早期の前又は比較的に初期の段階で対象に使用されるため、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【０２０７】
本出願の前記三本鎖抗体を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、例えば、使用説明書；他の試薬、例えばマーカー又は結合用試薬；薬学的に許容されるベクター；及び対象への投与のためのデバイス又は他の材料を含む、１つ又はそれ以上の他の要素を含み得る。
【０２０８】
ＶＩＩ．三本鎖抗体の用途
本出願で開示される三本鎖抗体は、インビトロ及びインビボ診断用途、ならびに治療的及び予防的用途を有する。例えば、これらの分子は、インビトロ又はエキソビボの培養細胞、又は対象、例えばヒト対象に投与して、がん、自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）などの様々な抗原関連疾患を治療、予防及び／又は診断することができる。
【０２０９】
一態様では、本発明は、血清、精液、尿又は組織生検サンプル（例えば、過剰増殖性又はがん性病巣由来）などの生体サンプル中の関連抗原の存在をインビトロ又はインビボで検出する診断方法を提供する。この診断方法には、（ｉ）相互作用の発生が認められる条件において、サンプル（及び必要に応じて、対照サンプル）を本出願に記載の三本鎖抗体と接触させるか、又は対象に前記三本鎖抗体を投与することと、（ｉｉ）前記三本鎖抗体とサンプル（及び必要に応じて、対照サンプル）との複合物の形成を検出することとを含む。複合物の形成は、関連する抗原の存在を示し、本出願の前記治療及び／又は予防の適合性又は必要性を示すことができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、治療前、例えば、治療を開始する前、又は治療間隔がある場合、再度治療の前に関連する抗原を検出する。使用可能な検出方法には、免疫組織化学、免疫細胞化学、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）又はインビボイメージング技術が含まれる。一般には、インビトロ及びインビボの検出方法で使用される三本鎖抗体は、結合又は非結合コンジュゲートの検出を容易にするために、検出可能な物質で直接又は間接的に標識される。適切な検出可能な物質には、様々な生物活性酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、常磁性（例えば、核磁気共鳴活性）物質、及び放射性物質が含まれる。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、関連抗原のレベル及び／又は分布をインビボで決定し、例えば、検出可能な物質で標識された本発明の三本鎖抗体を、非侵襲的方式により（例えば、適切なイメージング技術（例えば、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）を用いて走査する）検出する。一実施形態では、例えば、検出用ＰＥＴ試薬（例えば、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ））を用いて、検出可能な方式で標識された本発明の三本鎖抗体は、関連抗原のレベル及び／又は分布をインビボで測定する。
【０２１２】
一実施形態では、本発明は、本出願の前記三本鎖抗体及び使用説明書を含む診断キットを提供する。
【０２１３】
別の態様では、本発明は、三本鎖抗体を用いて、免疫応答を調節する必要がある対象の疾患をインビボで治療又は予防し、それにより、がん性腫瘍、自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）などの関連疾患の発症又は再発を抑制又は減少する。本発明の三本鎖抗体は単独で使用できる。あるいは、三本鎖抗体は、他のがん治療剤／予防剤と組み合わせて投与することができる。本発明の三本鎖抗体を１種又はそれ以上の他の医薬品と組み合わせて投与する場合、この組み合わせは、任意の順番で投与してもよく、同時に投与してもよい。
【０２１４】
したがって、一実施形態では、本発明は、対象の免疫応答を調節する方法を提供し、前記方法は、本出願の前記三本鎖抗体を治療的有効量で対象へ投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の疾患の発症又は再発を防止する方法を提供し、前記方法は、本出願の前記三本鎖抗体を予防的有効量で対象へ投与することを含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、三本鎖抗体を用いて治療及び／又は予防するがんには、固形腫瘍、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、例えば多発性骨髄腫）及び転移性病巣が含まれるが、これらに制限されない。一実施形態では、がんは固形腫瘍である。固形腫瘍の例には、悪性腫瘍、例えば、複数の臓器系の肉腫やがん、例えば肺、乳房、卵巣、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、肛門、性器及び尿生殖路（例えば、腎臓、膀胱上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（例えば、脳、神経細胞やグリア細胞）、頭頸、皮膚（例えば、黒色腫）、鼻咽頭（例えば、分化型又は未分化型の転移性又は局所再発性鼻咽頭がん）や膵臓に浸潤するがん；及び腺がん、例えば、悪性腫瘍例えば結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝がん、非小細胞肺がん、小腸がんや食道がんが含まれる。がんは、早期、中期又は進行期にあるがん又は転移性がんであってもよい。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、乳がん、結腸がん、食道がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、肝がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、頭頸部腫瘍、胃がん、血液悪性疾患（例えば、リンパ腫）から選択される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、三本鎖抗体を用いて治療及び／又は予防する感染性疾患には、現在のところ有効なワクチンがない病原体、又は一般的なワクチンが完全に効かない病原体が含まれる。ＨＩＶ、（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）肝炎、インフルエンザ、疱疹、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、マラリア、リーシュマニア（Leishmania）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が含まれるが、これらに制限されない。本発明で例示される三本鎖抗体によるＰＤ−Ｌ１遮断作用は、特に感染が発展するに伴い、変異抗原が生じる病原体（例えばＨＩＶ）により引き起こされる感染に有用である。これら変異抗原は、抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体が投与されると、外来抗原とみなされ、それにより、本発明で例示される三本鎖抗体は、負のシグナルにより抑制されない強烈なＴ細胞反応をＰＤ−Ｌ１を介して活性化させることができる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明の三本鎖抗体を用いて炎症性や自己免疫性疾患及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、を治療及び／又は予防することで免疫系をダウンレギュレートする。本発明の三本鎖抗体を投与することで治療及び／又は予防し得る自己免疫性疾患の例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、限局性回腸炎、エリテマトーデス、潰瘍性結腸炎、ぶどう膜炎などが含まれるが、これらに制限されない。本発明の三本鎖抗体を投与することで治療及び／又は予防し得る炎症性疾患の例には、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、アレルギー性疾患、敗血症性ショック、肺線維症、関節炎やウイルスや細菌の慢性感染による慢性炎症が含まれるが、これらに制限されない。
【０２１９】
本発明をより理解するために、以下の実施例を説明する。これは、本発明の特許範囲を限定することを意図しておらず、決して何らかの不適な方式でこのように解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２２０】
実施例１．抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の構築、発現、精製、性質同定及び薬効試験
実施例１．１．抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の構築
本実施例では、２種の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が構築され、それぞれ（１）構造模式図が図１Ａに示される二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣと、（２）構造模式図が図１Ｂに示される二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬと命名される。
【０２２１】
図１Ａの構造模式図から分かるように、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣは、３本のポリペプチド鎖からなり、ペプチド鎖＃１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ２９３４１から誘導され配列番号２に示されるＶＨアミノ酸配列、前記ＶＨアミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号６に示されるＣＨ１アミノ酸配列、及び前記ＣＨ１アミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号７に示されるＦｃ領域アミノ酸配列が含まれる。ペプチド鎖＃２は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ２９３４１から誘導され配列番号９に示されるＶＬアミノ酸配列、及び前記ＶＬアミノ酸配列のＣ末端にあって配列番号１３に示されるヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列が含まれる。且つ、ペプチド鎖＃３は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、配列番号１６に示される第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列及び第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列、前記第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列と第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列との間にある配列番号２０に示される接続ペプチドアミノ酸配列、及び前記第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号２１に示されるＦｃ領域アミノ酸配列が含まれる。
【０２２２】
図１Ｂの構造模式図から分かるように、Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬも３本のポリペプチド鎖からなり、ペプチド鎖＃１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ペプチド鎖＃２は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、且つ、ペプチド鎖＃３は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有し、前記ペプチド鎖＃３には、配列番号１６に示される第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列及び第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列（前記第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列と第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列との間には、接続ペプチドがない）、及び前記第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列のＣ末端にあってＩｇＧ１から誘導され配列番号２１に示されるＦｃ領域アミノ酸配列が含まれる。
【０２２３】
抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬの３本の鎖を以下のように構築する。ＣＤ４７抗体ＡＤＩ−２９３４１のＶＨ  Ｃ末端をヒトＩｇＧ１の定常領域のＮ末端に接続してペプチド鎖＃１を得て、ここで、Ｆｃ領域は、本発明の抗体のエフェクター機能を弱めるためにＬＡＬＡ突然変異を含み、且つペプチド鎖＃３に安定的に会合するために「ノブ−イン−ホール」突然変異を含む。ペプチド鎖＃２は、ＡＤＩ−２９３４１のＶＬ及びヒトκ軽鎖定常領域から誘導される。ペプチド鎖＃３は、直列接続されている第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨ及び第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨを含み、前記２つの抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨの間には、接続ペプチドがなく（二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬの場合）又は２０個のアミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４の可動性リンカーで接続し（二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣの場合）、第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨのＣ末端をＩｇＧ１から誘導されるＦｃ領域アミノ酸配列のＮ末端に接続してペプチド鎖＃３を得て、ここで、Ｆｃ領域は、本発明の抗体のエフェクター機能を弱めるためにＬＡＬＡ突然変異を含み、且つペプチド鎖＃１に安定的に会合するために「ノブ−イン−ホール」突然変異を含む。
【０２２４】
実施例１．２．抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の発現及び精製
本実施例では、実施例１．１で構築された抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬのそれぞれの３本の鎖をコードするヌクレオチド配列を全てポリクローナル部位により市販の真核発現ベクターｐＴＴ５に接続し、真核細胞で発現させて精製し、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬを得た。具体的な操作は以下のとおりである。
【０２２５】
二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬの上記のそれぞれの３本の鎖をコードするヌクレオチド配列の合成を蘇州金唯智生物科技有限公司（Genewiz）に依頼した。合成した３本の鎖をコードするヌクレオチド配列のそれぞれを制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ（New England Biolabs）及びＮｏｔＩ（New England Biolabs）で切断し、次に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）の作用により、それぞれを、同様にＸｂａＩ及びＮｏｔＩを同時に用いて切断されたベクターｐＴＴ５に接続し、前記３本鎖をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む組換えベクターを３つ得た。
【０２２６】
前記３つの組換えベクターは、シーケンシングによって正確であると検証されると、後続の発現に用いられた。
【０２２７】
ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）をＥｘｐｉ２９３細胞培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）において継代培養した。トランスフェクショの前日に細胞培養物を遠心分離し細胞沈殿物を得てから、新鮮なＥｘｐｉ２９３細胞培養液で細胞を懸濁させ、細胞密度を１×１０６個の細胞／ｍｌに調整した。ＨＥＫ２９３細胞を培養し続け、トランスフェクション当日の培養物中の細胞密度を約２×１０６個の細胞／ｍｌにした。ＨＥＫ２９３細胞懸濁液の最終体積の１／１０に相当するＦ１７培地（Ｇｉｂｃｏ社製、製品カタログ番号Ａ１３８３５−０１）をトランスフェクション緩衝液とした。ペプチド鎖＃１、ペプチド鎖＃２又はペプチド鎖＃３をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む、モル比１：１：１の上記調製された組換えプラスミド１０μｇを毎１ｍｌのトランスフェクション緩衝液に加えて、均一に混合し、次にポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ））（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：２３９６６）３０ｕｇを加えて、均一に混合し、室温で１０分間インキュベートした後、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物をＨＥＫ２９３細胞懸濁液に軽く注入した。軽く均一に混合し、８％ＣＯ２に入れて、３６．５℃で一晩培養した。
【０２２８】
一晩培養した後、トランスフェクション後の培養物の体積の１／５０の濃度２００ｇ／ＬのＦＥＥＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ６７８４−１００Ｇ）及びトランスフェクション後の培養物の体積の１／５０の濃度２００ｇ／Ｌのグルコース溶液を培養フラスコに補充し、軽く均一に混合し、８％ＣＯ２に入れて、３６．５℃で培養し続けた。２０時間後、ＶＰＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１４０−０５０）を最終濃度が２ｍＭ／Ｌとなるまで加えた。７日目まで又は細胞活性≦６０％となるまで連続的に培養した後、培養物を収集して、７５００回転／分で３０分間遠心分離し、細胞の上澄みを、ＳＡＲＴＯＰＯＲＥ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号：５４４１３０７Ｈ４）でろ過した後、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてアフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【０２２９】
具体的なアフィニティークロマトグラフィーによる精製操作のステップは、以下のとおりである。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号：１７−５４３８−０３）アフィニティークロマトグラフィーカラムを採用し、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステム内に配置した。０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いてＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィーカラムが装備されたＡＫＴＡｐｕｒｅシステムから、一晩かけてエンドトキシンを除去した後、カラムの体積の５倍の結合緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ｐＨ７．２）でシステムを洗浄して、カラムを平衡化した。上記ろ過後の細胞上澄みをカラムに通した。カラムの体積の５〜１０倍の結合緩衝液で再度平衡化し、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステムに備える紫外線検出装置を用いてＵＶ基線が直線となるまで監視した。次に、溶出緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム  １００ｍＭ、ｐＨ３．５）を用いて抗体を溶出し、紫外線吸収値に基づいてサンプルを収集した。収集液の毎１ｍｌに中和緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２Ｍ）８０μｌを加えて中和し、さらなるイオン交換クロマトグラフィーに備えた。
【０２３０】
具体的なイオン交換クロマトグラフィーによる精製操作のステップは、以下のとおりである。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号：１０２４５６０５）イオン交換クロマトグラフィーカラムを採用し、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステム内に配置した。０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬイオン交換クロマトグラフィーカラムが装備されたＡＫＴＡｐｕｒｅシステムから、一晩かけてエンドトキシンを除去した。次に、蒸留水でシステム及びカラムを洗浄した。カラムの体積の５−１０倍のローディング緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム  １００ｍＭ、ｐＨ５．０）で、コンダクタンス及びｐＨが安定的になるまで、カラムを平衡化した。得たサンプルを容れた中和緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２Ｍ）に対して緩衝液交換を行い、つまりローディング緩衝液に交換した後、ローディングを行い、カラムの体積の５倍のローディング緩衝液で再度平衡化した。溶出緩衝液２（クエン酸＋クエン酸ナトリウム  １００ｍＭ，、ＮａＣｌ  １Ｍ、ｐＨ５．０）の含量が０−１００％である勾配で線形溶出を行い、合計２０個のカラム体積分溶出し、紫外線吸収値に基づいてサンプルを収集した。
【０２３１】
サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography；ＳＥＣ）を利用して、収集した各レベルのサブチューブ中のサンプルの純度を検出した。ＳＥＣ結果に基づいて純度が９５％より大きいレベルのサブチューブ中のサンプルを併せた。図２Ａ及び図２Ｂに示されるＳＥＣ結果のように、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣの純度は９７．７６％であり、Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬの純度は９７．８６％であった。
【０２３２】
精製後の二重特異性抗体溶液を１５ｍｌ限外濾過遠心分離管により４５００回転／分で３０分間遠心分離した。ＰＢＳを使用してタンパク質を希釈した後、４５００回転／分で３０分間遠心し続け、この操作を２回繰り返し、それにより緩衝液を交換した。緩衝液が交換された抗体を併せて、抗体の濃度を測定した。
【０２３３】
実施例１．３．抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の解離定数の測定
Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いて動力学的測定法により本発明の上記２種の例示的な抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬがＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１に結合されたときの平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。文献に報告された方法（Estep,P et al., High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013, 5(2):p.270-278）に従ってＦｏｒｔｅＢｉｏ親和力を測定した。簡単に言えば、実験開始の半時間前に、ＡＨＣセンサ（Ｐａｌｌ、カタログ番号：１５０６０９１）をＳＤ緩衝液（ＰＢＳ  １×、ＢＳＡ  ０．１％、ツイーン２０  ０．０５％）に浸漬して室温で平衡化した。黒色ポリスチレン製のハーフボリュームの９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルのそれぞれに、ＳＤ緩衝液１００μｌを空白対照（背景控除用）として加え、１００ｎＭ精製された二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ、Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ  １００μｌ及び抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体（ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９５８８４）、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ２９３４１  １００μｌを対照として加え、ＳＤ緩衝液において希釈して、抗原としての−ｒｈＰＤＬ１（１００ｎＭ）とｈＣＤ４７（１００ｎＭ）（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の溶液１００μｌを加えた。抗ヒトＩｇＧ  ＦｃバイオセンサＡＨＣを、それぞれ前記抗体溶液を含むウェルに没入し、室温で６００秒間浸漬してローディングした。次に、センサをＳＤ緩衝液において基線となるまで洗浄し、次に１００ｕｌの抗原溶液を含むウェルに没入し、抗体と抗原の会合を監視した。次にセンサをＳＤ緩衝液１００ｕｌを含むウェルに移して、抗体の解離を監視した。回転数は４００回転／分、温度は３０℃であった。Ｏｃｔｅｔ分析ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、背景補正された会合曲線と解離曲線をフィッティングして、会合（ｋｏｎ）と解離（ｋｄｉｓ）速度定数を生成し、次に、これらを平衡解離定数（ＫＤ）の計算に用いた。表２、表３及び図３には、抗体のｋｏｎ、ｋｄｉｓ及びＫＤデータが示されている。
【０２３４】
【表２】
2021507720.tif 000004
【０２３５】
【表３】
2021507720.tif 000005
【０２３６】
以上のデータから分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬは溶液中のＰＤ−Ｌ１とＣＤ４７タンパク質に同時に結合でき、且つ親抗体の親和力定数を維持できた。
【０２３７】
実施例１．４．本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体と、ＣＤ４７又はＰＤ−Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞との結合の分析
本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ及びＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬと、ＣＤ４７又はＰＤ−Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞との結合をＦＡＣＳにより計測した。
【０２３８】
簡単に言えば、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ａ２９１３３）を用いて、マーカーの取扱説明書に従って下記操作を実施した。ポリクローナル部位ＭＣＳにクローンされたヒトＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を有するｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をチャイニーズハムスター卵巣がん細胞（ＣＨＯ−Ｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションさせ、ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｓ−ＰＤ−Ｌ１細胞）を産生した。ＣＨＯ−Ｓ−ＰＤ−Ｌ１細胞を計数して、細胞培地を用いて１×１０６個の細胞／ｍｌとなるまで希釈し、１００μｌ／ウェルでＵ底９６ウェルプレートに加えた。遠心分離機にて４００ｇで５分間遠心分離して、細胞培地を除去した。階段希釈した本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ、Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ  １００μｌ及び対照であるヒト化Ｎｂ−Ｆｃのそれぞれを、Ｕ型プレートに加え、細胞を再懸濁させ、氷上に３０分間静置した。４００ｇで５分間遠心分離して、上澄みを除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。４００ｇで５分間遠心分離して、ＰＢＳを除去した。１：２００で希釈したＰＥに抱合した抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μｌを各ウェルに加えて、遮光下、氷上に３０分間インキュベートした。４００ｇで５分間遠心分離して、上澄みを除去した。ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合のＰＥに抱合した抗ヒトＦｃ抗体を取り除いた。ＰＢＳ  １００μｌで細胞を再懸濁させ、抗体と細胞の結合をＦＡＣＳにより検出した。結果は図４Ａに示される。
【０２３９】
図４Ａから分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬは、いずれも細胞表面で発現させたＰＤ−Ｌ１に結合され、且つ親抗体の結合ＥＣ５０を維持できた。
【０２４０】
同様に、ポリクローナル部位ＭＣＳににクローンされたヒトＣＤ４７  ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を有するｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をチャイニーズハムスター卵巣がん細胞（ＣＨＯ−Ｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションさせることによって、ヒトＣＤ４７を過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞（ＣＨＯ−Ｓ−ＣＤ４７細胞）を産生した。
【０２４１】
ＣＨＯ−ＣＤ４７に対してＦＡＣＳ検出を実施するにあたって、使用される細胞が異なり、ＡＤＩ２９３４１抗体が陽性対照抗体として、ＩｇＧ１が陰性対照抗体として使用されること以外、残りの実験操作は上記ＣＨＯ−Ｓ−ＰＤ−Ｌ１細胞のＦＡＣＳ検出と同様であった。本出願に使用されるＩｇＧ１陰性対照は、配列番号２３に示される重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と、配列番号２４に示される軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列と、を有する。
【０２４２】
結果は図４Ｂに示される。図４Ｂから分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬは、いずれも細胞表面で発現させたＣＤ４７に結合され、且つ親抗体の結合ＥＣ５０を維持できた。
【０２４３】
実施例１．５．本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の可溶性の検出
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、極性非イオン性沈殿剤であった。ＰＥＧ沈殿法（Li li et al., Application of a PEG precipitation method for solubility screening: A tool for developing high protein concentration formulations. Protein Science, 2013. 22:p.1118-23）により、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のさまざまな濃度のＰＥＧでの溶解状況を検出した。
【０２４４】
本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ溶液をそれぞれ５ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮させた。９６ウェル細胞培養プレートに４０μｌ／ウェルで前記二重特異性抗体を加えた。ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）を陽性対照とした。９６ウェル細胞培養プレートの左から右への第１〜１１縦列に、それぞれ３０％ＰＥＧ６０００（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：８１２５５−２５０Ｇ）２６．７μｌ、４０μｌ、４６．７μｌ、５３．３μｌ、６０μｌ、６６．７μｌ、７３．３μｌ、８０μｌ、８６．７μｌ、９３．３μｌ、１００μｌを加えた。１ウェルごとに、ＰＢＳを総体積が２００μｌとなるまで補充し、それにより、各ウェル中の抗体の最終濃度を全て１ｍｇ／ｍｌとし、且つ、９６ウェル細胞培養プレートの左から右への第１〜１１縦列中のＰＥＧ濃度勾配をそれぞれ４％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％とした。室温で１時間放置した。ＯＤ５００ｎｍでの吸光度を測定した。実験結果は図５に示される。
【０２４５】
図５から分かるように、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣは、ヒュミラに類似した可溶性を有する。
【０２４６】
実施例１．６  本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の熱安定性の検出
示差走査蛍光測定法（differential scanning fluorimetry；ＤＳＦ）は、タンパク質マップにおける蛍光の変化過程に基づいてタンパク質の構造安定性に関する情報を提供し、タンパク質の立体配置の変化を検出して、タンパク質の融解温度（Ｔｍ）を取得できる。本実施例では、本発明抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のＴｍ値がＤＳＦ法により測定された。
【０２４７】
本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ溶液をそれぞれＰＢＳ溶液で１ｍｇ／ｍｌまでに希釈した。
【０２４８】
ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ｓ６６５０）４μｌにＰＢＳ  １９６μｌを加えて、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎを５０倍希釈した。
【０２４９】
９６ウェルＰＣＲプレート（Ｎｕｎｃ）に上記濃度１ｍｇ／ｍｌの二重特異性抗体５０μｌを加え、さらに上記５０倍希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎを１０μｌ加え、次に水４０μｌを加えた。７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｍｒｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に入れて検出した。システムの温度が１分間あたり０．５℃上昇するように設定すると、蛍光曲線の絶対値にピークが現れたときに対応する温度は、該タンパク質のＴｍであった。
【０２５０】
実験結果は下記表４に示される。本発明の二重特異性抗体は、３つのＴｍ値があり、且ついずれも>５５ｏＣであり、したがって、良好な熱安定性を有した。
【０２５１】
【表４】
2021507720.tif 000006
【０２５２】
さらに、本発明の二重特異性抗体を４０℃で１０、２０、３０日間放置した後、その純度及び生物学的活性の変化を研究し、抗体の長期熱安定性を評価した。具体的には、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬ溶液をそれぞれＰＢＳにおいて５ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮させ、次に、２００μｌ／管でＥＰ管に分注し、遮光下、４０℃で放置した。
【０２５３】
０、１、３、７、１０、２０、３０日目に、それぞれ管を１つ取り出して、それについて、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより４０℃で放置した本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の純度を測定した。実験結果は、図６に示される。本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、４０℃で３０日間と長く放置しても、高い抗体純度を有した。
【０２５４】
加えて、上記実施例１．４のように、０日目及び３０日目の本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体とＣＤ４７又はＰＤ−Ｌ１を発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞との結合活性を検出した。実験結果は、図７Ａ及び７Ｂに示される。
【０２５５】
図６、図７Ａ及び７Ｂから分かるように、本発明の二重特異性抗体は、良好な長期熱安定性を有し、且つ生物学的活性を保持した。
【０２５６】
実施例１．７．ＭＯＡ法に基づく本発明の二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１活性の検出
抗体を調べる際にその作用メカニズム（mechanisms of action；ＭＯＡ）の把握及び生物学的活性を基礎にする観点から、本実施例では、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｂｉｏａｓｓａｙ，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、を用いて本発明の二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１生物学的活性を研究した。
【０２５７】
Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｂｉｏａｓｓａｙは、生物学に関連するＭＯＡに基づく測定法であり、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断し得る抗体の効力及び安定性を測定した。該測定法は、２種の遺伝子組み換え細胞株からなる。
・ＰＤ−１エフェクター細胞：ヒトＰＤ−１を安定的に発現させるとともに、活性化Ｔ細胞核内因子（nuclear factor of activated T cells；ＮＦＡＴ）によってルシフェラーゼを誘導発現させたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞。
・ＰＤ−Ｌ１  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞：ヒトＰＤ−Ｌ１を安定的に発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、及び対応するＴＣＲを抗原非依存的に活性化させる細胞表面タンパク質。
【０２５８】
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合は、ＮＦＡＴ下流シグナルの形質導入を遮断することにより、ルシフェラーゼの発現を抑制することができ、ＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体が加えられると、この遮断効果が逆になり、ルシフェラーゼが発現され、蛍光シグナルが検出される。該検出法は、感度、特異性、正確性が全て良好であり、且つ安定性に優れている。
【０２５９】
メーカーの製品取扱説明書に従って検出を行った。ＭＯＡ法を実施する前の１−２日に、ＰＤ−Ｌ１  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を継代培養した。培養上澄みを捨てて、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を洗浄した。適量のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を入れて、３７℃／５％  ＣＯ２で３〜５分間消化した。次に、トリプシンの体積の４倍の培地を加えて、細胞を５０ｍｌ遠心分離管に移して計数した。所望の体積の細胞を取り出して、２３０ｇで１０分間遠心分離した。ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を加えて、細胞を４×１０５個の細胞／ｍｌとなるまで再懸濁させた。１００μｌ／ウェルで細胞懸濁液を９６ウェル白色細胞培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ）に加えて、ＰＢＳ溶液を２００μｌ／ウェルとなるように補充した。細胞を３７℃／５％  ＣＯ２のインキュベータにおいて一晩培養した。
【０２６０】
同様に、ＭＯＡ法を実施する前の１−２日に、ＰＤ−１エフェクター細胞を継代培養した。計数後、所望の体積の細胞を取り出して、１７０ｇで５分間遠心分離した。テスト緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１％ＦＢＳ）を用いて細胞を１．２５×１０６個の細胞／ｍｌとなるように再懸濁させた。
【０２６１】
９５μｌ／ウェルのＰＤ−Ｌ１  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上澄みを捨てた。次に、各試験抗体、対照となる抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体、ＩｇＧ１陰性対照をそれぞれ４０μｌ加えた。上記調製したＰＤ−１エフェクター細胞４０μｌを検出プレートのウェルに加えた。３７℃／５％  ＣＯ２のインキュベータにおいて６時間培養した。
【０２６２】
Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を融解して、Ｂｉｏ−ＧｌｏＴＭ基質を加えて、均一に混合した。得られたＢｉｏ−ＧｌｏＴＭ試薬を８０μｌ／ウェルで上記６時間培養した検出プレートのウェルに加えた。室温で５〜１０分間放置し、蛍光シグナル値を読み取った。
【０２６３】
結果は図８に示されるように、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用によるＮＦＡＴシグナル経路への抑制作用を解消でき、且つその活性が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体を単独で使用する場合よりも優れた。
【０２６４】
実施例１．８．マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を促進する本発明の二重特異性抗体の能力の検出
フローサイトメトリーに基づく測定法で、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を促進する本発明の抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣとＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬの能力を測定した。
【０２６５】
ヒトドナーから採取した新鮮な血液に対して密度勾配遠心分離を行い、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（米国Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社製）による取扱説明書の手段により、分離したＰＢＭＣから、ＣＤ１４陽性の単核細胞を精製した。簡単に言えば、１０ｎｇ／ｍＬ顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えて７日間連続して接着培養し、ここで、５日目に２０ｎｇ／ｍＬインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）を加えて１時間刺激し、次に１００ｎｇ／ｍＬリポ多糖（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ）を加えて４８時間刺激し、末梢血単核細胞中の前駆細胞をマクロファージに誘導分化させた。
【０２６６】
ヒトＰＤ−Ｌ１を、エレクトロポレーションにより腫瘍細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣから購入）に導入して、標的腫瘍細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ−ＰＤ−Ｌ１を構築した。標的腫瘍細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ−ＰＤ−Ｌ１を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｃ３４５５４）の取扱説明書に従って、蛍光染料であるカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester、ＣＦＳＥ）を用いて、蛍光標識した。標識した腫瘍細胞を上記誘導分化済みのマクロファージと４：１の細胞数の割合で共培養し、同時に、異なる濃度の試験抗体を加えて３７℃で３時間インキュベートした。次に、細胞を少なくとも２回洗浄して、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＡＰＣ）で標識されたＣＤ１４抗体（ＢＤから購入）を加え、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにおいて氷上（遮光）に３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで少なくとも２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。貪食される細胞集団は、生細胞のうち、ＣＤ１４陽性であり且つ蛍光染料ＣＦＳＥも陽性である細胞集団である。実験結果は図９に示される。
【０２６７】
図９から分かるように、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を共発現させた標的細胞に対するマクロファージの貪食作用の発揮を誘導でき、その誘導活性が抗ＣＤ４７モノクローナル抗体と類似した。
【０２６８】
実施例１．９  本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体による赤血球凝集活性促進の検出
従来技術によれば、ほとんどの抗ＣＤ４７抗体には、赤血球凝集を促進するという副作用があることが知られており、したがって、これら抗ＣＤ４７抗体の治療用途が制限されてしまう。このため、発明者は、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の赤血球凝集作用をさらに研究した。具体的な検出方法は、以下のとおりである。
【０２６９】
新鮮なヒト血液を収集して、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ヒト赤血球懸濁液を調製し、ヒト赤血球と試験抗体（最高濃度６０ｕｇ／ｍｌ、三倍階段希釈、合計１１個の希釈後濃度を得る）とを３７°Ｃで２−６時間インキュベートし、該反応は、９６ウェル丸底プレートに行われた。反応終了後、写真を撮って結果を判断した。結果の判定基準としては、赤血球がウェルの底部に沈下し、網状に敷くと、赤血球凝集反応が発生しており（図１０のＨｕ５Ｆ９（ＵＳ２０１５／０１８３８７４Ａ１の「５Ｆ９」抗体）の結果参照）、赤血球が凝集反応を発生しない場合、赤血球が点状でウェルの底部に沈下する（図１０のＩｇＧ１対照参照）。
【０２７０】
以上の測定法のように行われる実験には、血球凝集反応の結果は図１０に示される。本発明の抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣは、赤血球凝集活性が極めて低く、赤血球凝集に対する促進活性が、対照群Ｈｕ５Ｆ９よりも明らかに低下した。以上から分かるように、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、明らかに低下した赤血球凝集作用を有し、したがって、臨床治療には、副作用が明らかに低下し、多種のがんの治療に広く利用できた。
【０２７１】
実施例１．１０  腫瘍細胞に対する本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の選択的結合活性の研究
人間の体内の正常赤血球の表面にＣＤ４７タンパク質が発現されており、ほとんどの抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は、正常赤血球に結合され、それは、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の副作用の主因の１つである。本実施例では、腫瘍細胞とヒト赤血球を共インキュベートし、本発明の二重特異性抗体の腫瘍細胞に対する選択的結合の性質を検出した。具体的な実験過程は、以下のとおりである。
【０２７２】
ヒトドナーから新鮮な血液５０ｍｌを採取して、その体積の２．５倍のＰＢＳ溶液を添加し、次にＦｉＣｏｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ）１２．５ｍｌに軽く加え、４本の管に分け、４００ｇで３０分間遠心分離して、ゼロの減速度で遠心分離を停止した。上層の血清及びＰＢＭＣを除去して、最下層の赤血球を得た。
【０２７３】
腫瘍細胞Ｈ２９２（ＡＴＣＣ）を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｃ３４５５４）の取扱説明書に従って、蛍光染料ＣＦＳＥを用いて蛍光標識した。標識した腫瘍細胞と上記分離したヒト赤血球とを、１：２０の細胞数の割合で共培養し、同時に、異なる濃度の試験抗体を加えて４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで少なくとも２回洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識されたヒトＦｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、カタログ番号：４０９３０６）を加え、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにおいて氷上（遮光）で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで少なくとも２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２７４】
表５及び図１１に示される実験結果のように、１．１１１ｎＭ〜０．０４１ｎＭの抗体濃度では、本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ及びＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬは、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体ＡＤＩ−２９３４１よりも、腫瘍細胞（０．１２ｎＭでは、Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ及びＫｈ２ＮＦ−ＰＣ−ＮＬは、それぞれ８８．５１％及び８３．２４％がＨ２９２細胞表面に結合され、ＡＤＩ−２９３４１は、５．７４％だけがＨ２９２細胞表面に結合される）に結合されやすい。
【０２７５】
【表５】
2021507720.tif 000007
【０２７６】
実施例１．１１  本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のインビボ抗腫瘍作用
本実施例では、Ｒａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに接種することで担がんマウスを作成し、本発明のＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍作用を測定した。
【０２７７】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス：
雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（４２−６２日齢）は、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入される。ＳＰＦグレードであり、１００匹であり、品質検査機関は、北京維通利華実験動物技術有限公司であり、証明書番号はＮＯ．１１４００７００２８４９７８である。前記マウスを入手後、７日間馴化し、次に研究を開始した。
【０２７８】
細胞の培養及びマウスへの接種：
ポリクローナル部位ＭＣＳにクローンされたヒトＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を有するｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＡＴＣＣから購入されたＲａｊｉ宿主細胞にトランスフェクションさせ、圧力スクリーニングによりヒトＰＤ−Ｌ１を安定的に発現させたＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞）を得た。Ｒａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞を通常継代培養し、後続のマウスのインビボ実験に用いた。
【０２７９】
培養したＲａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞を遠心分離して収集し、１×ＰＢＳで細胞を分散させ、細胞密度１０×１０６個／ｍｌのＲａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞とＭａｔｒｉｇｅｌゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：３５６２３１）とを１：１で混合し、細胞密度５×１０６個／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍｌをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右腹部の領域に皮下接種して、Ｒａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１胆がんマウスモデルを作成した。
【０２８０】
胆がんマウスの群分け及び投与：
腫瘍細胞を接種してから８日間後、各マウスの胆がん体積を検出して、胆がん体積が５０．５６ｍｍ３〜１１５．３９ｍｍ３範囲内にあるマウスを選択し、胆がん体積の大きさに応じてジグザグ配置で群分けを行い（１群６匹マウス）、投与量及び投与方式は表６に示される。ｈ−ＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏから購入、ロット番号：１６０３０８−０２、規格１ｇ／本、ＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌに調製）を陰性対照とした。具体的には、それぞれＲａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞に接種してから８、１０、１２、１４、１６、１８、２０日目に投与し、１週間にマウスの腫瘍体積及びマウスの体重を２−３回監視し、測定した。３３日間後、監視を停止した。接種３３日目後、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、計算式は、以下のとおりである。ＴＧＩ％＝１００％＊（ｈ−ＩｇＧ対照群の腫瘍体積-治療群の腫瘍体積）／（ｈ−ＩｇＧ対照群の腫瘍体積-ｈ−ＩｇＧ対照群の投与前の腫瘍体積）。ｈ−ＩｇＧ対照群の投与前の腫瘍平均体積は、８０．８６ｍｍ３である。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大縦軸（Ｌ）と最大横軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積を下記式Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。
【０２８１】
【表６】
2021507720.tif 000008
【０２８２】
腫瘍抑制率の結果は、図１７及び表７に示される。つまり、接種してからの３３日目、ｈ−ＩｇＧに比べて、ＡＤＩ−２９３４１  ０．１ｍｇ／ｋｇ単剤の腫瘍抑制率は８８％であり、ＡＤＩ−２９３４１  ０．１ｍｇ／ｋｇとヒト化Ｎｂ−Ｆｃ  ０．１ｍｇ／ｋｇの併用薬の腫瘍抑制率は１０７％であり、抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣ  ０．１７ｍｇ／ｋｇの腫瘍抑制率は１１１％であり、その腫瘍抑制効果は、いずれもヒト化Ｎｂ−Ｆｃ  ０．１ｍｇ／ｋｇの１０％の腫瘍抑制率よりも明らかに優れており、且つ抗ＣＤ４７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＣは、最適な腫瘍抑制効果を有した。マウスの体重の検出結果として、各群のマウスの体重には、有意差がなかった。
【０２８３】
【表７】
2021507720.tif 000009
【０２８４】
実施例２．抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の構築、発現、精製及び性質同定
実施例２．１．抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の構築
本実施例では、抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が構築され、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４と命名される。その構造模式図が図１Ａに示される。
【０２８５】
図１Ａの構造模式図から分かるように、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４は、３本のポリペプチド鎖からなり、ペプチド鎖＃１は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、抗４−１ＢＢ抗体ＢＭＳ−６６３５１３から誘導され配列番号２６に示されるＶＨアミノ酸配列、前記ＶＨアミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号６に示されるＣＨ１アミノ酸配列、及び前記ＣＨ１アミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号７に示されるＦｃ領域アミノ酸配列が含まれる。ペプチド鎖＃２は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、抗４−１ＢＢ抗体ＢＭＳ−６６３５１３から誘導され配列番号２８に示されるＶＬアミノ酸配列、及び前記ＶＬアミノ酸配列のＣ末端にあって配列番号１３に示されるヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列が含まれる。且つ、ペプチド鎖＃３は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、配列番号１６に示される第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列及び第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列、前記第１−抗ＰＤ-Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列と第２抗ＰＤ-Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列の間にある配列番号２０に示される接続ペプチドアミノ酸配列、及び前記第２抗ＰＤＬ１  ＶＨＨアミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号２１に示されるＦｃ領域アミノ酸配列が含まれる。
【０２８６】
抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４の３本の鎖を以下のように構築した。４−１ＢＢ抗体ＢＭＳ−６６３５１３のＶＨ  Ｃ末端をヒトＩｇＧ１の定常領域のＮ末端に接続してペプチド鎖＃１を得て、ここで、Ｆｃ領域は、本発明の抗体のエフェクター機能を弱めるためにＬＡＬＡ突然変異を含み、且つペプチド鎖＃３に安定的に会合するために「ノブ−イン−ホール」突然変異を含む。ペプチド鎖＃２は、ＢＭＳ−６６３５１３のＶＬ及びヒトκ軽鎖定常領域から誘導される。ペプチド鎖＃３は、直列接続されている第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨ及び第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨを含み、前記２つの抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨの間には、２０個のアミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４の可能性リンカーで接続し、第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨのＣ末端をＩｇＧ１から誘導されるＦｃ領域アミノ酸配列のＮ末端に接続してペプチド鎖＃３を得て、ここで、Ｆｃ領域は、本発明の抗体のエフェクター機能を弱めるためにＬＡＬＡ突然変異を含み、且つペプチド鎖＃１に安定的に会合するために「ノブ−イン−ホール」突然変異を含む。
【０２８７】
実施例２．２．抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の発現及び精製
本実施例では、実施例２．１で構築された抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４のそれぞれの３本の鎖をコードするヌクレオチド配列を全てポリクローナル部位により真核発現ベクターｐＴＴ５（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ； Ｍｏｎｔｒｅａｌ、カナダ）に接続し、真核細胞で発現させて精製し、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４を得た。
【０２８８】
プラスミドのトランスフェクション、抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４の発現及び精製の操作は、上記実施例１．２と同様であった。二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４のＳＥＣ結果は、図１２に示され、純度は９８．４２％であった。
【０２８９】
実施例２．３．本発明の抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体と、４−１ＢＢ又はＰＤ−Ｌ１を発現させたＣＨＯ細胞との結合の分析
基本的に上記実施例１．４のように、本発明の抗４−１ＢＢ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４と、４−１ＢＢ又はＰＤ−Ｌ１を発現させたＣＨＯ細胞との結合をＦＡＣＳにより計測した。簡単に言えば、ＣＨＯ−Ｓ−ＰＤ−Ｌ１細胞を計数して、細胞培地を用いて１×１０６個の細胞／ｍｌとなるまで希釈し、Ｕ底９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで加えた。遠心分離機にて４００ｇで５分間遠心分離して、細胞培地を除去した。階段希釈した本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４、及び対照であるヒト化Ｎｂ−Ｆｃ１００μｌをそれぞれＵ型プレートに加えて細胞を再懸濁させ、氷上に３０分間静置した。４００ｇで５分間遠心分離して、上澄みを除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。４００ｇで５分間遠心分離して、ＰＢＳを除去した。１：２００で希釈したＰＥに抱合した抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μｌを各ウェルに加えて、遮光下、氷上に３０分間インキュベートした。４００ｇで５分間遠心分離して、上澄みを除去した。ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合のＰＥに抱合した抗ヒトＦｃ抗体を取り除いた。ＰＢＳ  １００μｌで細胞を再懸濁させ、抗体と細胞の結合をＦＡＣＳにより検出した。結果は図１３Ｂに示される。
【０２９０】
図１３Ｂから分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４は、細胞表面で発現させたＰＤ−Ｌ１に結合でき、且つ結合能力が親抗体に類似した。
【０２９１】
同様に、ポリクローナル部位ＭＣＳにクローンされたヒト４−１ＢＢ  ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を有するｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をチャイニーズハムスター卵巣がん細胞（ＣＨＯ−Ｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションさせることによって、ヒト４−１ＢＢを過剰発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞（ＣＨＯ−Ｓ−４−１ＢＢ細胞）を産生した。ＣＨＯ−Ｓ−４−１ＢＢに対してＦＡＣＳ検出を実施するにあたって、使用される細胞が異なり、使用される抗体対照がＢＭＳ−６６３５１３抗体であること以外、残りの実験操作は、上記ＣＨＯ−Ｓ−ＰＤ−Ｌ１細胞のＦＡＣＳ検出と同様であった。結果は図１３Ａに示される。
【０２９２】
図１３Ａから分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−Ｐ４は、細胞表面で発現させた４−１ＢＢに結合でき、且つ結合能力が親抗体に類似した。
【０２９３】
実施例３．抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の構築、発現、精製及び性質同定
実施例３．１．抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の構築
本実施例では、抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が構築され、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬと命名される。その構造模式図が図１Ｂに示される。
【０２９４】
図１Ｂの構造模式図から分かるように、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬは、３本のポリペプチド鎖からなり、ペプチド鎖＃１は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３から誘導され配列番号３０に示されるＶＨアミノ酸配列、前記ＶＨアミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号６に示されるＣＨ１アミノ酸配列、及び前記ＣＨ１アミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号７に示されるＦｃ領域アミノ酸配列が含まれる。ペプチド鎖＃２は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３から誘導され配列番号３５に示されるＶＬアミノ酸配列、及び前記ＶＬアミノ酸配列のＣ末端にあって配列番号１３に示されるヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列が含まれる。且つペプチド鎖＃３は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列には、配列番号１６に示される第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列及び第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列、前記第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列と第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列の間に接続ペプチドアミノ酸配列がなく、及び前記第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨアミノ酸配列のＣ末端にあってヒトＩｇＧ１から誘導され配列番号２１に示されるＦｃ領域アミノ酸配列が含まれる。
【０２９５】
本発明の抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬの３本の鎖を以下のように構築した。ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３のＶＨ  Ｃ末端をヒトＩｇＧ１の定常領域のＮ末端に接続してペプチド鎖＃１を得て、ここで、Ｆｃ領域は、本発明の抗体のエフェクター機能を弱めるためにＬＡＬＡ突然変異を含み、且つペプチド鎖＃３に安定的に会合するために「ノブ−イン−ホール」突然変異を含む。ペプチド鎖＃２は、ＡＤＩ−３１８５３のＶＬ及びヒトκ軽鎖定常領域から誘導される。ペプチド鎖＃３は、直列接続されている第１抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨ及び第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨを含み、前記２つの抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨの間には、接続ペプチドがなく、第２抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨＨのＣ末端をＩｇＧ１から誘導されるＦｃ領域アミノ酸配列のＮ末端に接続してペプチド鎖＃３を得て、ここで、Ｆｃ領域は、本発明の抗体のエフェクター機能を弱めるためにＬＡＬＡ突然変異を含み、且つペプチド鎖＃１に安定的に会合するために「ノブ−イン−ホール」突然変異を含む。
【０２９６】
実施例３．２．抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の発現及び精製
本実施例では、実施例３．１で構築された抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬのそれぞれの３本の鎖をコードするヌクレオチド配列を全てポリクローナル部位により真核発現ベクターｐＴＴ５（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；  Ｍｏｎｔｒｅａｌ、カナダ）に接続し、真核細胞で発現させて精製し、二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬを得た。
【０２９７】
プラスミドのトランスフェクション、抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬの発現及び精製の操作は、上記実施例１．２と同様であった。二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬのＳＥＣ結果は、図１４に示され、純度は９７．８４％であった。
【０２９８】
実施例３．３．本発明の抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体と、ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１を発現させた細胞との結合の分析
基本的に上記実施例１．４のように、本発明の抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬと、ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１を発現させた細胞との結合をＦＡＣＳにより計測した。簡単に言えば、ＣＨＯ−Ｓ−ＰＤ−Ｌ１細胞を計数して、細胞培地を用いて１×１０６個の細胞／ｍｌとなるまで希釈し、Ｕ底９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで加えた。遠心分離機にて４００ｇで５分間遠心分離して、細胞培地を除去した。階段希釈した本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬ、及び対照である抗ＰＤ−Ｌ１ヒト化Ｎｂ−Ｆｃ抗体１００μｌをそれぞれＵ型プレートに加えて細胞を再懸濁させ、氷上に３０分間静置した。４００ｇで５分間遠心分離して、上澄みを除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。４００ｇで５分間遠心分離して、ＰＢＳを除去した。１：２００で希釈したＰＥに抱合した抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μｌを各ウェルに加えて、遮光下、氷上に３０分間インキュベートした。４００ｇで５分間遠心分離して、上澄みを除去した。ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合のＰＥに抱合した抗ヒトＦｃ抗体を取り除いた。ＰＢＳ  １００μｌで細胞を再懸濁させ、抗体と細胞の結合をＦＡＣＳにより検出した。結果は図１５Ａに示される。
【０２９９】
図１５Ａから分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬは、細胞表面で発現させたＰＤ−Ｌ１に結合でき、且つ結合能力が親抗体に類似した。
【０３００】
ポリクローナル部位ＭＣＳクローンされたぶヒトＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を有するｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションさせることによって、ヒトＬＡＧ−３を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞（２９３−ＬＡＧ−３細胞）を産生した。
【０３０１】
同様に、２９３−ＬＡＧ−３細胞に対してＦＡＣＳ検出を実施するにあたって、使用される細胞が異なり、使用される抗体対照が抗ＬＡＧ−３抗体ＡＤＩ−３１８５３であること以外、残りの実験操作は、上記ＣＨＯ−Ｓ−ＰＤ−Ｌ１細胞のＦＡＣＳ検出と同様であった。結果は図１５Ｂに示される。
【０３０２】
図１５Ｂから分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ−ＰＬは、細胞表面で発現させたＬＡＧ−３に結合でき、且つ結合能力が親抗体に類似した。
【０３０３】
実施例３．４  本発明の抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異抗体のヒトＴ細胞に対する活性化実験
本実施例では、混合リンパ球実験によって本発明の抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異抗体のヒトＴ細胞に対する活性化作用を検出し、具体的な実験過程は以下のとおりである。
【０３０４】
ヒトドナーから新鮮な血液５０ｍｌを採取して、その体積の２．５倍のＰＢＳ溶液を添加し、次にＦｉＣｏｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ）１２．５ｍｌに軽く加え、４本の管に分け、４００ｇで３０分間遠心分離して、ゼロの減速度で遠心分離を停止した。中間の白色バンドを吸い取ってＰＢＳに移し、ＰＢＳで２回洗浄し、分離したＰＢＭＣを得た。
【０３０５】
分離したＰＢＭＣ細胞５０ｍｌにＴ細胞培地Ｘ−ＶＩＶＯ１５（ＬＯＮＺＡ）５ｍｌを加え、インキュベータにおいて３７℃、６％  ＣＯ２で２時間接着培養し、懸濁細胞液を吸い取り、ＣＤ４＋細胞分離に用いた。また、懸濁細胞液を吸い取った後に残った細胞に対しては、３ｍｌの樹状細胞（ＤＣ）培地（Ｘ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ）９９％、ヒトＡＢ血清（Ａｃｃｅｓｓ）１％、ＨＥＰＥＳ  １０ ｍＭ、β−Ｍｅ  ５０μＭ、ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０００Ｕ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０００Ｕ／ｍｌ）を加えて、２日間培養後、ＤＣ培地３ｍｌを添加し、５日目まで培養すると、ｒＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ） （１０００ Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ） （５ ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１０ ｎｇ／ｍｌ）及び１ μＭ ＰＧＥ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加して２日間培養し、分離したＤＣ細胞を得て、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に使用されるＤＣ細胞とした。
【０３０６】
Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１３４６Ｄ）の取扱説明書に従って、ＣＤ４＋細胞分離を実施した。簡単に言えば、上記ＰＢＭＣを２時間静置して培養した後、吸い取った懸濁細胞液を２０ｍｌ遠心分離管に入れて、２００ｇで１０分間遠心分離し、細胞沈殿物に分離液５００μｌ、ＡＢ型血清１００μｌ、キットに備える精製抗体１００μｌを加えて、４℃で２０分間インキュベートし、分離液を用いて１回洗浄し、次にビーズ緩衝液を５００μｌ加えて１５分間インキュベートし、磁場によりビーズを除去し、Ｔ細胞培地で１回洗浄し、培地８ｍｌを用いて細胞を再懸濁させ、得たＣＤ４＋細胞を３７℃、６％ ＣＯ２で培養した。
【０３０７】
１×１０７個のＣＤ４＋細胞を４ｍｌ Ｘ−ＶＩＶＯ １５培地（ＬＯＮＺＡ）において再懸濁させ、１：１でＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、３日間培養し、ＣＤ４＋細胞に対してビーズによる刺激を施した。
【０３０８】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を以下のように実施した。９６ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ）において、上記分離したＤＣ細胞とビーズで刺激されたＣＤ４＋細胞と、を混合し、１ウェルごとに体積２００μｌ、ＤＣ細胞１００００個、ＣＤ４＋細胞１０００００個とし、階段希釈した抗体と１ ｎＭ ＳＥＥ（Ｔｏｘｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を加えて、本機関で自作したＩｇＧ４抗体を陰性対照として、３日間混合培養し、ＩＬ２キット（Ｃｉｓｂｉｏ社製）を用いてＩＬ２濃度を検出した。前記ＩｇＧ４対照抗体は、配列番号３９に示される重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と、配列番号４０に示される軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列と、を有する。
【０３０９】
図１６に示される実験結果のように、本発明の二重特異性抗体は、Ｔ細胞をインビトロで活性化することができ、その活性化効果は、抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＬＡＧ−３抗体が単独で使用される場合よりも高かった。Ｔ細胞に対する本発明の二重特異性抗体のインビトロ活性化作用は、抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＬＡＧ−３抗体を併用する場合の作用に類似した。
【０３１０】
本発明の目的を説明するために、いくつかの代表的な実施形態及び詳細を示したが、当業者にとって明らかなように、発明の主題の範囲を逸脱することなくこれらに対してさまざまな変化や修正を行うことができる。この観点からは、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲だけにより限定される。
【図１】
2021507720.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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