(57)【要約】【課題】単離されたＮＫ細胞の集団をプレ活性化し、拡大する方法が、本明細書中に提供される。【解決手段】プレ活性化され、拡大されたＮＫ細胞を投与することによって癌を処置するための方法が、さらに本明細書中に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を拡大するためのインビトロ方法であって、
（ａ）ＮＫ細胞の集団を得る工程；
（ｂ）該ＮＫ細胞の集団を、有効濃度のＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８を含むプレ活性化培養物中でプレ活性化して、プレ活性化されたＮＫ細胞を得る工程；および
（ｃ）該プレ活性化されたＮＫ細胞を、ＣＤ１３７リガンドを発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む拡大培養物中で拡大することにより、拡大されたＮＫ細胞を生成する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＮＫ細胞の集団が、臍帯血（ＣＢ）、末梢血（ＰＢ）、幹細胞または骨髄から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＫ細胞の集団が、ＣＢから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＢが、２単位以上の個々の臍帯血単位からプールされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＢが、３、４、５、６、７または８単位の個々の臍帯血単位からプールされる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＫ細胞の集団が、ＣＢ単核細胞（ＣＢＭＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＫ細胞の集団がさらに、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞と定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ａＡＰＣがさらに、膜結合型サイトカインを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜結合型サイトカインが、膜結合型ＩＬ−２１（ｍＩＬ−２１）または膜結合型ＩＬ−１５（ｍＩＬ−１５）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜結合型サイトカインが、ｍＩＬ−２１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ａＡＰＣが、内在性のＨＬＡクラスＩ、ＩＩまたはＣＤ１ｄ分子を本質的に発現しない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ａＡＰＣが、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ａＡＰＣがさらに、白血病細胞由来ａＡＰＣと定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記白血病細胞由来ａＡＰＣが、ＣＤ１３７リガンドおよび／またはｍＩＬ−２１を発現するように操作されたＫ５６２細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｋ５６２細胞が、ＣＤ１３７リガンドおよびｍＩＬ−２１を発現するように操作される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ａＡＰＣが、レトロウイルス導入によって操作されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ａＡＰＣが、照射される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記プレ活性化工程が、１０〜２０時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記プレ活性化工程が、１４〜１８時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記プレ活性化工程が、１６時間である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プレ活性化培養物が、ＩＬ−１８および／またはＩＬ−１５を１０〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プレ活性化培養物が、ＩＬ−１８および／またはＩＬ−１５を４０〜６０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プレ活性化培養物が、ＩＬ−１８および／またはＩｌ−１５を５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プレ活性化培養物が、ＩＬ−１２を０．１〜１５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記プレ活性化培養物が、ＩＬ−１２を１〜２０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記プレ活性化培養物が、ＩＬ−１２を１０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記プレ活性化されたＮＫ細胞を拡大前に洗浄する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
洗浄が、複数回行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
拡大が、５〜２０日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記拡大が、１２〜１６日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記拡大が、１４日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プレ活性化されたＮＫ細胞とａＡＰＣとが、前記拡大培養物中に３：１〜１：３の比で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記プレ活性化されたＮＫ細胞とａＡＰＣとが、前記拡大培養物中に１：２の比で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記拡大培養物が、ＩＬ−２をさらに含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＩＬ−２が、１０〜５００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＩＬ−２が、１００〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＩＬ−２が、２００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２が、組換えヒトＩＬ−２である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＩＬ−２が、前記拡大培養物に２〜３日ごとに補充される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ａＡＰＣが、少なくとも２度、前記拡大培養物に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、無血清培地中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮＫ細胞が、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するように操作される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＡＲが、ヒト化抗原結合ドメインを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、メソテリン、ＣＤ５、ＣＤ４７、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＣＤ９９、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＣＳ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＲＯＲ−１またはＢＣＭＡの抗原結合ドメインを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９またはＣＤ１２３の抗原結合ドメインを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＣＡＲが、ＩＬ−１５を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＣＡＲが、自殺遺伝子を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記自殺遺伝子が、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法に従って作製され、拡大されたＮＫ細胞の集団。
【請求項５１】
請求項５０に記載の拡大されたＮＫ細胞の集団および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項５２】
被験体における疾患または障害の処置において使用するための、有効量の請求項５０に記載の拡大されたＮＫ細胞を含む組成物。
【請求項５３】
前記疾患または障害が、癌、炎症、移植片対宿主病、移植片拒絶、自己免疫障害、免疫不全症、Ｂ細胞悪性疾患または感染症である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記癌が、白血病である、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記障害が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５７】
前記障害が、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息またはシェーグレン症候群である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５８】
被験体における疾患または障害を処置する方法であって、治療有効量の請求項５０に記載の拡大されたＮＫ細胞を該被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項５９】
前記疾患または障害が、癌、炎症、移植片対宿主病、移植片拒絶、自己免疫障害、免疫不全症、Ｂ細胞悪性疾患または感染症である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記癌が、白血病である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＮＫ細胞が、同種異系である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＮＫ細胞が、自家性である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
前記障害が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記障害が、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息またはシェーグレン症候群である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記被験体が、ヒトである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６７】
少なくとも１つの第２の治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記少なくとも１つの第２の治療薬が、治療有効量の抗癌剤、免疫調節剤または免疫抑制剤である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗癌剤が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法または免疫療法である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、またはケモカインもしくはインターロイキンの阻害剤である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
ＮＫ細胞および／または前記少なくとも１つの第２の治療薬が、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、領域性に、または直接注射もしくは灌流によって投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記第２の治療薬が、抗体である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体または三重特異性抗体である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗体が、リツキシマブである、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年２月２１日出願の米国特許仮出願第６２／６３３，５９２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、概して、医学および免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化および拡大の方法ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、有望な抗腫瘍エフェクターとして研究されてきたが、いくつかの障壁のせいで、その治療的な利用には制約があり、その障壁は主にそれらの細胞の数が少ないことに関することから、養子免疫療法に向けてエキソビボでの拡大が必要である。サイトカイン刺激は、腫瘍標的細胞に応答するＮＫ細胞の機能適格性を高めるための重要なシグナルを構成している。さらに、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２の組み合わせを用いた一晩のＮＫ細胞のプレ活性化は、再刺激の際に、サイトカイン産生が高まった長寿命のメモリーのようなＮＫ細胞を生成すると示された（Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２によってプレ活性化されたＮＫ細胞の活性を特徴付ける研究は、末梢血（ＰＢ）から直接単離されたＮＫ細胞をエキソビボ拡大なしに使用していたことから、臨床で使用するためには、十分な数を生成するために白血球搬出法などの複雑かつコストのかかる手順が必要であった。したがって、治療用途にとって十分な数の高度に機能的なプレ活性化されたＮＫ細胞を生成するストラテジーの改善について、満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、本開示のある特定の実施形態は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化および拡大ならびに細胞療法のためのその使用に関する方法および組成物を提供する。
【０００５】
第１の実施形態では、ＮＫ細胞を拡大するためのインビトロ方法が提供され、その方法は、ＮＫ細胞の集団を得る工程；そのＮＫ細胞の集団を、有効濃度のＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８を含むプレ活性化培養物中でプレ活性化して、プレ活性化されたＮＫ細胞を得る工程；およびそのプレ活性化されたＮＫ細胞を、ＣＤ１３７リガンドを発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む拡大培養物中で拡大することにより、拡大されたＮＫ細胞を生成する工程を含む。
【０００６】
いくつかの態様において、ＮＫ細胞の集団は、臍帯血（ＣＢ）、末梢血（ＰＢ）、幹細胞または骨髄から得られる。特定の態様において、幹細胞は、誘導多能性幹細胞である。具体的な態様において、単離されたＮＫ細胞の集団は、ＣＢ、例えば、プールされたＣＢから得られる。いくつかの態様において、ＣＢは、２単位以上（例えば、３、４、５、６、７、８単位またはそれ以上）の個々の臍帯血単位からプールされる。ある特定の態様において、単離されたＮＫ細胞の集団は、ＣＢ単核細胞（ＣＢＭＣ）である。いくつかの態様において、単離されたＮＫ細胞の集団はさらに、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞と定義される。
【０００７】
ある特定の態様において、ａＡＰＣはさらに、膜結合型サイトカインを発現する。いくつかの態様において、膜結合型サイトカインは、膜結合型ＩＬ−２１（ｍＩＬ−２１）または膜結合型ＩＬ−１５（ｍＩＬ−１５）である。いくつかの態様において、膜結合型サイトカインは、ｍＩＬ−２１である。いくつかの態様において、ａＡＰＣは、内在性のＨＬＡクラスＩ、ＩＩまたはＣＤ１ｄ分子を本質的に発現しない。ある特定の態様において、ａＡＰＣは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現する。いくつかの態様において、ａＡＰＣはさらに、白血病細胞由来ａＡＰＣと定義される。ある特定の態様において、白血病細胞由来ａＡＰＣはさらに、ＣＤ１３７リガンドおよび／またはｍＩＬ−２１を発現するように操作されたＫ５６２細胞と定義される。いくつかの態様において、Ｋ５６２細胞は、ＣＤ１３７リガンドおよびｍＩＬ−２１を発現するように操作される。ある特定の態様において、操作はさらに、レトロウイルス導入と定義される。特定の態様において、ａＡＰＣは、照射される。
【０００８】
いくつかの態様において、プレ活性化工程は、１０〜２０時間、例えば、１４〜１８時間（例えば、約１４、１５、１６、１７または１８時間）、特に約１６時間である。ある特定の態様において、プレ活性化培養物は、ＩＬ−１８および／またはＩＬ−１５を１０〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、４０〜６０ｎｇ／ｍＬ、特に約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。いくつかの態様において、プレ活性化培養物は、ＩＬ−１２を０．１〜１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、１〜２０ｎｇ／ｍＬ、特に約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【０００９】
ある特定の態様において、上記方法はさらに、プレ活性化されたＮＫ細胞を拡大前に洗浄する工程を含む。いくつかの態様において、洗浄は、複数回、例えば、２、３または４回行われる。
【００１０】
いくつかの態様において、拡大は、５〜２０日間、例えば、１２〜１６日間（例えば、１２、１３、１４、１５または１６日間）、特に約１４日間である。ある特定の態様において、プレ活性化されたＮＫ細胞とａＡＰＣとは、拡大培養物中に３：１〜１：３の比で存在する。具体的な態様において、プレ活性化されたＮＫ細胞とａＡＰＣとは、拡大培養物中に約１：２の比で存在する。
【００１１】
さらなる態様において、拡大培養物はさらに、ＩＬ−２を含む。いくつかの態様において、ＩＬ−２は、１０〜５００Ｕ／ｍＬ、例えば、１００〜３００Ｕ／ｍＬ、特に約２００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの態様において、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２は、組換えヒトＩＬ−２である。いくつかの態様において、ＩＬ−２は、拡大培養物に２〜３日ごとに補充される。いくつかの態様において、ａＡＰＣは、拡大培養物に少なくとも２度加えられる。いくつかの態様において、上記方法は、無血清培地中で行われる。
【００１２】
さらなる態様において、ＮＫ細胞は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するように操作される。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、メソテリン、ＣＤ５、ＣＤ４７、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＣＤ９９、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＣＳ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＲＯＲ−１またはＢＣＭＡの抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ヒト化抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＩＬ−１５を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、自殺遺伝子を含む。具体的な態様において、自殺遺伝子は、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９である。
【００１３】
さらなる実施形態は、上記実施形態（例えば、単離されたＮＫ細胞の集団を得ること；その単離されたＮＫ細胞の集団を、有効濃度のＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８を含むプレ活性化培養物中でプレ活性化して、プレ活性化されたＮＫ細胞を得ること；およびそのプレ活性化されたＮＫ細胞を、ＣＤ１３７リガンドを発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む拡大培養物中で拡大することにより、拡大されたＮＫ細胞を生成すること）に従って作製され、拡大されたＮＫ細胞の集団を提供する。上記実施形態の拡大されたＮＫ細胞の集団および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物も、本明細書中に提供される。
【００１４】
別の実施形態において、被験体における疾患または障害の処置において使用するための、有効量の、上記実施形態（例えば、単離されたＮＫ細胞の集団を得ること；その単離されたＮＫ細胞の集団を、有効濃度のＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８を含むプレ活性化培養物中でプレ活性化して、プレ活性化されたＮＫ細胞を得ること；そのプレ活性化されたＮＫ細胞を、ＣＤ１３７リガンドを発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む拡大培養物中で拡大することにより、拡大されたＮＫ細胞を生成すること）の拡大されたＮＫ細胞を含む組成物が提供される。
【００１５】
被験体における疾患または障害を処置する方法が、さらに本明細書中に提供され、その方法は、治療有効量の上記実施形態の拡大されたＮＫ細胞をその被験体に投与する工程を含む。
【００１６】
上記実施形態のいくつかの態様において、疾患または障害は、癌、炎症、移植片対宿主病、移植片拒絶、自己免疫障害、免疫不全症、Ｂ細胞悪性疾患または感染症である。いくつかの態様において、癌は、白血病である。ある特定の態様において、白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。
【００１７】
いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、同種異系である。他の態様において、ＮＫ細胞は、自家性である。ある特定の態様において、被験体は、ヒトである。
【００１８】
ある特定の態様において、障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。いくつかの態様において、障害は、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息またはシェーグレン症候群である。
【００１９】
いくつかの態様において、上記方法はさらに、少なくとも１つの第２の治療薬を投与する工程を含む。ある特定の態様において、少なくとも１つの第２の治療薬は、治療有効量の抗癌剤、免疫調節剤または免疫抑制剤である。いくつかの態様において、抗癌剤は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法または免疫療法である。具体的な態様において、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、またはケモカインもしくはインターロイキンの阻害剤である。
【００２０】
ある特定の態様において、ＮＫ細胞および／または少なくとも１つの第２の治療薬は、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、領域性に、または直接注射もしくは灌流によって投与される。
【００２１】
いくつかの態様において、第２の治療薬は、抗体である。特定の態様において、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。１つの具体的な態様において、抗体は、リツキシマブである。
【００２２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、当業者には、本発明の趣旨および範囲を超えない様々な変更および修正がこの詳細な説明から明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に例証として与えられることに注意するべきである。
【００２３】
以下の図面は、本明細書の一部を成し、本開示のある特定の態様をさらに示すために含められる。本開示は、本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、さらに良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、７日間拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞は、７日間拡大された（がプレ活性化されなかった）ＣＢ−ＮＫ細胞と比べて、Ｋ５６２標的による刺激に応答して、より多くのＩＦＮγおよびＴＮＦ−αを産生した。
【図１Ｂ】１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、１４日間拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞は、１４日間拡大された（がプレ活性化されなかった）ＣＢ−ＮＫ細胞と比べて、Ｋ５６２標的による刺激に応答して、より多くのＩＦＮγおよびＴＮＦ−αを産生した。
【図１Ｃ】１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、２１日間拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞は、２１日間拡大された（がプレ活性化されなかった）ＣＢ−ＮＫ細胞と比べて、Ｋ５６２標的による刺激に応答して、より多くのＩＦＮγおよびＴＮＦ−αを産生した。
【図１Ｄ】柱状グラフが、複数の独立した実験のデータを要約している。１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、７日間（７単位の異なるＣＢ単位）または１４日間（６単位の異なるＣＢ単位）拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞は、拡大されたがプレ活性化されなかったＮＫ細胞と比べて、Ｋ５６２標的に応答して、より多くのＩＦＮγおよびＴＮＦ−αを発現する。
【図１Ｅ】プレ活性化され、拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞は、拡大された（がプレ活性化されなかった）ＣＢ−ＮＫ細胞と比べて、Ｒａｊｉ標的による刺激に応答して、より多くのＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγおよびＴＮＦ−αを発現する。
【図１Ｆ】柱状グラフが、複数の独立した実験のデータを要約している。１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、１４日間拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞（４単位の異なるＣＢ単位）は、拡大されたがプレ活性化されなかったＮＫ細胞と比べて、Ｒａｊｉ標的に応答して、有意に多いＩＦＮγを発現する。
【００２５】
【図２Ａ】拡大後の７日目における、ＣＢ−ＮＫ細胞を用いたＫ５６２細胞に対する５１クロム放出アッセイ。１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、７日間拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞（７単位の異なるＣＢ単位）は、拡大されたがプレ活性化されなかったＮＫ細胞と比べて、有意により効率的にＫ５６２標的を殺滅する。
【図２Ｂ】拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞を用いたＲａｊｉ細胞に対する５１クロム放出アッセイ。１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、７日間拡大された（５単位の異なるＣＢ単位）または１４日間拡大された（３単位の異なるＣＢ単位）ＣＢ−ＮＫ細胞は、拡大されたがプレ活性化されなかったＮＫ細胞よりも効率的にＲａｊｉ標的を殺滅する。
【図２Ｃ】ＭＯＬＭ１４、ＭＯＬＭ１３およびＴＨＰ−１を含む急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株に対する、拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞の５１クロム放出アッセイ。１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞は、拡大されたがプレ活性化されなかったＮＫ細胞よりも効率的にＡＭＬ標的を殺滅する。
【００２６】
【図３】リツキシマブおよびＲａｊｉ標的細胞を用いた抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）実験は、１６時間プレ活性化され（ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５を用いて）、拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞が、コントロールと比べて、リツキシマブでコートされたＲａｊｉリンパ腫標的をより効率的に殺滅することを示している。５１クロム放出アッセイによって評価したとき、すべてのエフェクター−標的比において、プレ活性化＋拡大されたＮＫ（リツキシマブなし）、リツキシマブありまたはなしで拡大されたＮＫ。
【００２７】
【図４Ａ】ＣＤ１９に対するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するように形質導入され、プレ活性化＋拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞（ＣＢ−ＮＫ  ＣＡＲ１９）は、コントロールと比べて、すべてのエフェクター−標的比において、Ｒａｊｉ標的をより効率的に殺滅する。拡大されたＣＢ−ＮＫ  ＣＡＲ  ＣＤ１９、プレ活性化＋拡大されたが形質導入されなかったＮＫ細胞または拡大されたが形質導入されなかったＮＫ細胞。
【図４Ｂ】同様に、ＣＤ１２３に対するキメラ抗原レセプターを発現するように形質導入され、プレ活性化＋拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞（ＣＢ−ＮＫ  ＣＡＲ．ＣＤ１２３）は、５１Ｃｒ放出アッセイによって評価したとき、拡大されたＣＢ−ＮＫ  ＣＡＲ．ＣＤ１２３細胞と比べて、ＡＭＬ標的（ＭＯＬＭ１４）をより効率的に殺滅する。
【図４Ｃ】ＣＤ１２３に対するキメラ抗原レセプターを発現するように形質導入され、プレ活性化＋拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞（ＣＢ−ＮＫ  ＣＡＲ．ＣＤ１２３）は、ＭＯＬＭ１４標的に応答してＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγおよびＴＮＦ−αを発現する能力によって評価したとき、拡大されたＣＢ−ＮＫ  ＣＡＲ．ＣＤ１２３細胞と比べて、ＡＭＬ標的（ＭＯＬＭ１４）をより効率的に殺滅する。
【００２８】
【図５】１４日間培養した後のＣＢ−ＮＫ細胞の拡大倍率。プレ活性化工程は、ＮＫ細胞が拡大を起こす能力に悪影響を及ぼさなかった。実際に、培養の１４日後に、プレ活性化＋拡大されたＮＫ  ＣＢ−ＮＫ細胞に対する拡大倍率の中央値は、１５２０倍（１０８０〜１９２２という範囲）であり、コントロールの拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞のそれと等価だった。
【００２９】
【図６】プレ活性化されたが拡大されなかった、または拡大されたがプレ活性化されなかった、またはプレ活性化され、かつ拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞に対する、Ｋ５６２標的に応答した５１Ｃｒ放出アッセイによる細胞傷害性の比較。プレ活性化と拡大との２工程アプローチは、Ｋ５６２標的に応答して優れた細胞傷害性をもたらす。
【００３０】
【図７】プレ活性化されたが拡大されなかった、または拡大されたがプレ活性化されなかった、またはプレ活性化され、かつ拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞に対する、Ｋ５６２標的に応答したエフェクターサイトカイン産生（ＩＦＮγおよびＴＮＦ−α発現）の比較。プレ活性化と拡大との２工程アプローチは、Ｋ５６２標的に応答して優れたサイトカイン産生をもたらす。
【００３１】
【図８】ＮＫプレ活性化の後の拡大という順序とＮＫ拡大の後のプレ活性化という順序の、ＮＫ細胞の細胞傷害性に対する比較。まずプレ活性化した後、拡大するというアプローチは、腫瘍標的に対して優れた細胞傷害性をもたらした（５１Ｃｒ放出アッセイによって評価したとき）。
【００３２】
【図９】拡大のみ、プレ活性化の後の拡大、または拡大の後のプレ活性化の１３日後のＮＫ細胞数の定量。まずプレ活性化した後、拡大するというアプローチは、ＮＫ細胞の優れた数値的拡大をもたらした。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ＮＫ細胞は、悪性の血液疾患ならびに固形腫瘍を有する患者に対する細胞免疫療法の興味深い供給源として台頭しつつある。しかしながら、養子移入されたＮＫ細胞を用いたほとんどの研究が、注入された細胞の残存性が不十分であること、インビボでの拡大が不良であること、および抗腫瘍活性が期待外れであることによる制約がある。したがって、ＮＫ免疫療法の分野において克服すべき障壁は、養子治療の前にＮＫ細胞の抗腫瘍機能を高めるための、生物学主導のアプローチの必要性である。
【００３４】
したがって、ある特定の実施形態において、本開示は、臍帯血（ＣＢ−ＮＫ）、末梢血（ＰＢ−ＮＫ）または骨髄などからの、ＮＫ細胞の大規模な「特注でない」作製のための方法を提供する。例示的な方法では、単離されたＮＫ細胞を、サイトカインの組み合わせ（例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１８）を用いた短期間（例えば、約１６時間）のプレ活性化に供した後、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（膜結合型ＩＬ−２１およびＣＤ１３７リガンドを発現するＫ５６２フィーダー細胞）を用いた拡大に供し得る。この拡大は、外来性ＩＬ−２の存在下において行われ得る。
【００３５】
本研究は、本方法によって作製された、プレ活性化され、拡大されたＮＫ細胞が、白血病細胞株およびリンパ腫細胞株に対して高い抗腫瘍機能を示すことを示した。プレ活性化され、拡大されたＮＫ細胞は、高い抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）も示した。
【００３６】
上記ＮＫ細胞は、腫瘍標的に対するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）で遺伝的に改変されると、予備刺激なしで拡大されたＣＡＲ−ＮＫと比べて優れた殺滅およびサイトカイン産生をもたらし得る。
【００３７】
ＩＬ−１２、ＩＬ１５およびＩＬ−１８でプレ活性化された後、ａＡＰＣ（例えば、ｍＩＬ−２１およびＣＤ１３７リガンドを発現するＫ５６２細胞）を用いて拡大されたＮＫ細胞は、高度に強力な細胞生成物を提供し得る。したがって、様々な疾患を処置するために本ＮＫ細胞を使用する方法（例えば、癌を有する患者の免疫療法）が提供される。その処置方法は、さらなる治療薬（例えば、モノクローナル抗体、二重特異的抗体および三重特異的抗体）を含み得る。それらの抗体は、ＮＫ細胞上のＣＤ１６または他のレセプターに結合し得、細胞を標的に向け直し得るので、種々の腫瘍に対する応答を増大させる。
Ｉ．定義
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、特定の構成要素に関して「本質的に含まない」は、その特定の構成要素が、ある組成物中に意図的に処方されていないことおよび／または夾雑物としてしかもしくは微量でしか存在しないことを意味するために本明細書中で使用される。ゆえに、ある組成物の任意の意図されない混入に起因するその特定の構成要素の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは、０．０１％を下回る。その特定の構成要素の量が標準的な分析方法で検出できない組成物が最も好ましい。
【００３９】
本明細書中で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。請求項において使用されるとき、単語「ａ」または「ａｎ」は、単語「含む」とともに使用されるとき、１つまたは１つより多いことを意味し得る。
【００４０】
請求項における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すと明示的に示されない限り、または選択肢が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみのことを指す定義と「および／または」とを支持する。本明細書中で使用されるとき、「別の」は、少なくとも１つの第２のものまたはそれ以上のものを意味し得る。用語「約」、「実質的に」および「およそ」は、一般に、述べられる値プラスまたはマイナス５％を意味する。
【００４１】
用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、免疫系の特定のエフェクター細胞によって認識可能なペプチド−ＭＨＣ複合体の形態で１つ以上の抗原を提示することができ、それによって、提示される抗原に対する有効な細胞免疫応答を誘導することができる、細胞のクラスのことを指す。用語「ＡＰＣ」は、インタクトなホールセル（例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞および樹状細胞）、または抗原を提示することができる天然に存在するかもしくは合成の分子（例えば、ｙ２−ミクログロブリンと複合体化した精製ＭＨＣクラスＩ分子）を包含する。
【００４２】
「免疫障害」、「免疫関連障害」または「免疫介在性障害」とは、免疫応答が疾患の発生または進行において重要な役割を果たす障害のことを指す。免疫介在性障害としては、自己免疫障害、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、ならびに炎症性およびアレルギー性の状態が挙げられる。
【００４３】
「免疫応答」は、刺激に対する免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞または自然免疫細胞）の応答である。１つの実施形態において、その応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。
【００４４】
「自己免疫疾患」とは、免疫系が、正常な宿主の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対して免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答）を引き起こして組織に対して損傷を生じる疾患のことを指す。自己抗原は、宿主細胞に由来し得るか、または通常、粘膜表面にコロニー形成する微生物（共生生物として知られる）などの共生生物に由来し得る。
【００４５】
疾患もしくは状態を「処置する」またはそれらの処置とは、その疾患の徴候または症状を軽減する目的で１つ以上の薬物を患者に投与することを含み得るプロトコルの実行のことを指す。望ましい処置の効果としては、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態を軽減することまたは緩和すること、および緩解または予後の改善が挙げられる。軽減は、疾患または状態の徴候または症状が現れる前、ならびにそれらが現れた後に生じ得る。したがって、「処置する」または「処置」は、疾患もしくは望ましくない状態を「予防する」またはそれらの「予防」を含み得る。さらに、「処置する」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には、患者に対して限界効果だけをもたらすプロトコルを含む。
【００４６】
用語「治療効果」または「治療的に有効な」は、本願全体で使用されるとき、この状態の医学的処置に関して被験体の健康を増進するまたは向上させるもののことを指す。これには、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の処置は、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍の侵襲性の低下、癌の成長速度の低下、または転移の予防を含み得る。癌の処置とは、癌を有する被験体の生存時間の延長のことも指し得る。
【００４７】
「被験体」および「患者」とは、ヒトまたは非ヒト（例えば、霊長類、哺乳動物および脊椎動物）のことを指す。特定の実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００４８】
句「薬学的または薬理学的に許容され得る」とは、必要に応じてヒトなどの動物に投与されたとき、副作用、アレルギー反応または他の有害反応を引き起こさない分子実体および組成物のことを指す。抗体またはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らして、当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓが要求するような無菌性、発熱性、全般的な安全性および純度の基準を満たすべきであることが理解される。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」には、当業者に公知であり得るように、任意のおよびあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール溶液／水溶液、食塩水溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなど）、非水溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、補液および栄養補給剤、それらのそのような材料および組み合わせが含まれる。薬学的組成物中の様々な構成要素のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。
【００５０】
用語「ハプロタイピングまたは組織タイピング」とは、例えば、特定の被験体のリンパ球上にどのＨＬＡ遺伝子座（または複数の遺伝子座）が発現されているかを明らかにすることによる、被験体のハプロタイプまたは組織タイプを特定するために用いられる方法のことを指す。ＨＬＡ遺伝子は、６番染色体の短腕上の領域である主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に配置されており、細胞間相互作用、免疫応答、臓器移植、癌の発生、および疾患に対する感受性に関わる。移植において重要な遺伝子座は６つあり、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱと命名されている。各遺伝子座に、いくつかの異なる対立遺伝子のいずれかが存在し得る。
【００５１】
ハプロタイピングのために広く用いられている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＭＨＣ抗原をコードする遺伝子の公知のセグメントと被験体のＤＮＡを比較する。それらの遺伝子のこれらの領域の多様性が、被験体の組織タイプまたはハプロタイプを決定する。血清学的方法も、細胞表面上の血清学的に定義された抗原を検出するために用いられる。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ決定基は、公知の血清学的手法によって計測され得る。簡潔には、被験体由来の（新鮮末梢血から単離された）リンパ球を、公知のすべてのＨＬＡ抗原を認識する抗血清とともにインキュベートする。それらの細胞を、様々な種類の抗血清が入った微細ウェルを備えるトレーに広げる。それらの細胞を３０分間インキュベートした後、さらに６０分間、インキュベーションを補完する。リンパ球が、抗血清中の抗体によって認識される抗原を表面上に有する場合、そのリンパ球は溶解される。色素を加えることにより、細胞膜の透過性の変化および細胞死を示すことができる。溶解によって破壊された細胞のパターンは、組織学的不適合性の程度を示す。例えば、ＨＬＡ−Ａ３について試験されているある人物由来のリンパ球が、ＨＬＡ−Ａ３に対する抗血清を含むウェルにおいて破壊された場合、その検査は、この抗原群について陽性である。
ＩＩ．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
【００５２】
本開示のいくつかの実施形態は、癌免疫療法などのための、ＮＫ細胞の単離、活性化および拡大に関する。
【００５３】
ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、当該分野で周知の方法によって、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、未刺激の白血球搬出産物（ＰＢＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄または臍帯血から得られる。詳細には、ＮＫ細胞は、臍帯血（ＣＢ）、末梢血（ＰＢ）、骨髄または幹細胞から単離され得る。特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、プールされたＣＢから単離される。ＣＢは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の単位からプールされ得る。ＮＫ細胞は、自家性または同種異系であり得る。単離されたＮＫ細胞は、細胞療法を施される被験体とハプロタイプが一致し得る。ＮＫ細胞は、特異的な表面マーカー（例えば、ヒトではＣＤ１６、ＣＤ５６およびＣＤ８）によって検出され得る。
【００５４】
ある特定の態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞をエキソビボで拡大するという以前に報告された方法（Ｓｐａｎｈｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）によって単離される。この方法では、ＣＢ単核細胞が、フィコール密度勾配遠心分離によって単離される。その細胞培養物は、ＣＤ３を発現する任意の細胞が枯渇していることがあり、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞またはＮＫ細胞のパーセンテージを測定するために特徴付けられ得る。他の方法では、臍ＣＢを用いることにより、ＣＤ３４＋細胞の単離によってＮＫ細胞が得られる。
【００５５】
ＮＫ細胞のプレ活性化は、単離されたＮＫ細胞を１つ以上のサイトカインの存在下において培養することを含み得る。ＮＫ細胞は、ＩＬ−２、または共通ガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１など）で刺激され得る。特定の実施形態において、プレ活性化サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８であり得る。１つ以上のさらなるサイトカインが、プレ活性化工程のために使用され得る。そのプレ活性化は、短時間（例えば、５〜７２時間、例えば、１０〜５０時間、特に１０〜２０時間、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０時間、具体的には、約１６時間）であり得る。プレ活性化培養物は、ＩＬ−１８および／またはＩＬ−１５を１０〜１００ｎｇ／ｍＬ（例えば、４０〜６０ｎｇ／ｍＬ、特に、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５ｎｇ／ｍＬ、具体的には約５０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で含み得る。プレ活性化培養物は、ＩＬ−１２を０．１〜１５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ、特に１〜２０ｎｇ／ｍＬ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｎｇ／ｍＬ、具体的には約１０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で含み得る。
【００５６】
次いで、プレ活性化されたＮＫ細胞は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の存在下において拡大され得る。プレ活性化されたＮＫ細胞は、拡大前に、例えば、２、３、４または５回、具体的には３回洗浄され得る。ａＡＰＣは、ＣＤ１３７リガンドおよび／または膜結合型サイトカインを発現するように操作され得る。その膜結合型サイトカインは、膜結合型ＩＬ−２１（ｍＩＬ−２１）または膜結合型ＩＬ−１５（ｍＩＬ−１５）であり得る。特定の実施形態において、ａＡＰＣは、ＣＤ１３７リガンドおよびｍＩＬ−２１を発現するように操作される。ａＡＰＣは、癌細胞、例えば、白血病細胞に由来し得る。ａＡＰＣは、内在性のＨＬＡクラスＩ、ＩＩまたはＣＤ１ｄ分子を発現しないことがある。それらは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現し得る。特に、ａＡＰＣは、Ｋ５６２細胞、例えば、ＣＤ１３７リガンドおよびｍＩＬ−２１を発現するように操作されたＫ５６２細胞であり得る。ａＡＰＣは、照射され得る。操作は、レトロウイルス導入などの当該分野で公知の任意の方法による操作であり得る。拡大は、約２〜３０日間（例えば、３〜２０日間、特に１２〜１６日間、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９日間、具体的には約１４日間）であり得る。プレ活性化されたＮＫ細胞とａＡＰＣとは、約３：１〜１：３（例えば、２：１、１：１、１：２、具体的には約１：２）の比で存在し得る。拡大培養物はさらに、拡大を促進するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）を含み得る。ＩＬ−２は、約１０〜５００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００〜３００Ｕ／ｍＬ、特に約２００Ｕ／ｍＬ）の濃度で存在し得る。ＩＬ−２は、拡大培養物に２〜３日ごとなどに補充され得る。ａＡＰＣは、培養物に少なくとも２度（例えば、拡大の約７日後に）加えられ得る。
【００５７】
プレ活性化および／または拡大の工程において使用されるサイトカインは、組換えヒトサイトカインであり得る。
【００５８】
ＮＫ細胞は、拡大後、直ちに注入されてもよいし、凍結保存などによって保存されてもよい。ある特定の態様において、それらの細胞は、約１、２、３、４、５日以内に、数日間、数週間または数ヶ月間、エキソビボでバルク集団として増殖され得る。
【００５９】
活性化されたおよび／または拡大されたＮＫ細胞は、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方を活性化するＩ型サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））ならびに他のサイトカインおよびケモカインを分泌し得る。これらのサイトカインの計測は、ＮＫ細胞の活性化状態を判断するために使用され得る。さらに、ＮＫ細胞の活性化を判断するための当該分野で公知の他の方法を、本開示のＮＫ細胞の特徴付けのために使用してもよい。
Ａ．キメラ抗原レセプター
【００６０】
ある特定の実施形態において、本ＮＫ細胞は、キメラ抗原レセプターを発現するように遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、およびｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。
【００６１】
ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と無関係な細胞表面腫瘍関連抗原を認識し、１つ以上のシグナル伝達分子を用いて、殺滅、増殖およびサイトカイン産生のために、遺伝的に改変されたＮＫ細胞を活性化する（Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞を遺伝的に改変するための本明細書中に開示されるプラットフォーム技術は、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた、非ウイルス性の遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３−ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３−ζまたは他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）抗原認識ドメインを細胞表面とつなぐ種々の長さの細胞外ドメインを有するＣＡＲ、および場合によっては、（ｉｖ）ＣＡＲ＋ＮＫ細胞を確実かつ数値的に拡大することができるＫ５６２に由来する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を含む。
【００６２】
本開示の実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む抗原特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）ポリペプチド（免疫原性を低下させるようにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む）をコードする核酸を含む核酸の使用に関する。ある特定の実施形態において、そのＣＡＲは、１つ以上の抗原の間で共有される空間を含むエピトープを認識し得る。ある特定の実施形態において、その結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域および／またはその抗原結合フラグメントを含み得る。別の実施形態において、その特異性は、レセプターに結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。
【００６３】
ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を向上させるために用いられるヒト遺伝子であり得ることが企図される。具体的な実施形態において、本開示は、完全長ＣＡＲｃＤＮＡまたはコード領域を提供する。抗原結合領域または抗原結合ドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許第７，１０９，３０４号に記載されているもの）に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のフラグメントを含み得る。そのフラグメントは、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態において、そのフラグメントは、ヒト細胞における発現のためにヒトコドン使用頻度について最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。
【００６４】
配置は、多量体、例えば、ダイアボディまたはマルチマーであり得る。マルチマーは、たいてい、軽鎖および重鎖の可変部分が相互に対形成してダイアボディになることによって形成される。その構築物のヒンジ部分には、複数の選択肢があり、それらとしては、完全に削除されること、１番目のシステインが維持されること、セリンではなくプロリンに置換されること、１番目のシステインまで切断されることが挙げられる。Ｆｃ部分は、削除され得る。安定であるかつ／または二量体化する任意のタンパク質が、この目的にかない得る。Ｆｃドメインの１つ、例えば、ヒト免疫グロブリン由来のＣＨ２またはＣＨ３ドメインのいずれかが、使用され得る。二量体化を改善するように改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域が、使用され得る。他の態様では、単に免疫グロブリンのヒンジ部分またはＣＤ８αの一部が、使用され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ核酸は、他の共刺激レセプター（例えば、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン）をコードする配列を含む。他の共刺激レセプターとしては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３ζによって惹起される１次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激レセプターによって提供されるさらなるシグナルは、ＮＫ細胞の完全な活性化にとって重要であり、インビボでの残存性の改善および養子免疫療法の治療の成功の改善を助け得る。
【００６６】
キメラ抗原レセプターの細胞内シグナル伝達ドメインは、そのキメラ抗原レセプターが配置された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関わる。用語「エフェクター機能」とは、ＮＫ細胞などの分化細胞の特殊機能のことを指す。具体的な実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内レセプターシグナル伝達ドメインには、Ｔ細胞抗原レセプター複合体の細胞内レセプターシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３のゼータ鎖、また、ＦｃγＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２を単独でまたは例えばＣＤ３ゼータと一続きで）が含まれる。具体的な実施形態において、細胞内ドメイン（細胞質ドメインと称され得る）は、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ−２Ｒベータ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒアルファ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ４０の１つ以上の一部または全部を含む。いくつかの実施形態において、内在性のＴ細胞レセプター複合体の任意の部分が、細胞内ドメインにおいて使用される。いわゆる第３世代ＣＡＲは、例えば、相加効果または相乗効果のために共に融合された、少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有するので、１つまたは複数の細胞質ドメインを使用してもよい。
【００６７】
キメラ抗原レセプターのある特定の実施形態において、レセプターの抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称され得る）は、腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原には、Ｄｅｃｔｉｎ−１などのパターン認識レセプターによって認識される糖鎖抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上で発現される限り、任意の種類であってよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３および変異ｒａｓが挙げられる。さらなる例示的な抗原としては、ＣＤ９９、ＣＬＬ−１、ＣＤ４７、ＣＤ３３、ＣＳ１およびＢＣＭＡが挙げられる。
【００６８】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原の量が少ないとき、残存性を改善するために、サイトカインと共発現され得る。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ−１５と共発現され得る。
【００６９】
キメラレセプターをコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ起源、ｃＤＮＡ起源から得ることができるか、または合成され得るか（例えば、ＰＣＲを介して）、またはそれらの組み合わせであり得る。イントロンがｍＲＮＡを安定化することが見出されているので、ゲノムＤＮＡのサイズおよびイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化させるために内在性または外来性の非コード領域を使用することもさらに有益であり得る。
【００７０】
キメラ構築物は、裸のＤＮＡとしてまたは好適なベクターの形でＮＫ細胞に導入され得ることが企図される。裸のＤＮＡを使用してエレクトロポレーションによって細胞を安定にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。裸のＤＮＡとは、一般に、発現にとって適切な向きでプラスミド発現ベクターに含められる、キメラレセプターをコードするＤＮＡのことを指す。
【００７１】
あるいは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を使用することにより、キメラ構築物をＮＫ細胞に導入することができる。本発明の方法に従って使用するのに適したベクターは、ＮＫ細胞において非複製である。ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、細胞内で維持されるウイルスのコピー数は、その細胞の生存能を維持できるほど十分低く、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターである。
【００７２】
ＣＡＲは、自殺遺伝子（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９）を発現し得る。
【００７３】
ＣＡＲは、腫瘍抗原結合ドメインを含み得る。その腫瘍抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒアルファ、カッパー鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＶＥＧＦＲ２であり得るが、これらに限定されない。ＣＡＲは、ヒト化ｓｃＦｖ、例えば、ヒト化ＣＤ１９またはヒト化ＣＤ１２３を含み得る。例示的な腫瘍抗原としては、ＣＤ９９、ＣＬＬ−１、ＣＤ４７、ＣＤ３３、ＣＳ１またはＢＣＭＡが挙げられ得る。
Ｂ．抗原提示細胞
【００７４】
マクロファージ、Ｂリンパ球および樹状細胞をはじめとした抗原提示細胞は、特定の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の発現によって識別される。ＡＰＣは、抗原を内部移行し、その抗原の一部をＭＨＣ分子とともに細胞膜外膜上に再発現する。ＭＨＣは、複数の遺伝子座を伴う大きな遺伝子複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣと称される、２つの大きなクラスのＭＨＣ膜分子をコードする。Ｔヘルパーリンパ球は、一般に、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原を認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子と会合した抗原を認識する。ＭＨＣは、ヒトではＨＬＡ複合体と称され、マウスではＨ−２複合体と称される。
【００７５】
いくつかの場合において、ａＡＰＣは、上記実施形態の治療的組成物および細胞療法用製品の調製において有用である。抗原提示系の調製および使用に関する一般的ガイダンスについては、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号および同第６，７９０，６６２号；米国特許出願公開第２００９／００１７０００号および同第２００９／０００４１４２号；ならびに国際公開番号ＷＯ２００７／１０３００９を参照のこと。
【００７６】
ａＡＰＣ系は、少なくとも１つの外来性の補助分子を含み得る。任意の好適な数および組み合わせの補助分子が使用され得る。補助分子は、共刺激分子および接着分子などの補助分子から選択され得る。例示的な共刺激分子としては、ＣＤ８６、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、４１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７リガンド）およびＩＬ−２１が挙げられる。接着分子には、セレクチンなどの糖結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通型結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および例えば、細胞間の接触または細胞とマトリックスとの接触を促進する、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質が含まれ得る。例示的な接着分子としては、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ（例えば、ＩＣＡＭ−１）が挙げられる。共刺激分子および接着分子をはじめとした例示的な補助分子の選択、クローニング、調製および発現に有用な手法、方法および試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号に例証されている。
【００７７】
特定の実施形態において、ａＡＰＣは、レトロウイルスベクターなどによって、ＣＤ１３７リガンドを発現するように操作されている。それらのａＡＰＣはさらに、膜結合型サイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ−２１（ｍＩＬ−２１）または膜結合型ＩＬ−１５（ｍＩＬ−１５））を発現し得る。特定の態様において、それらのａＡＰＣは、ＣＤ１３７リガンドおよびｍＩＬ−２１を発現する。それらのａＡＰＣは、ＣＤ１３７およびｍＩＬ−２１を発現するように操作されたＫ５６２白血病細胞であり得る。それらのａＡＰＣは、所望の抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現するように開発され得る。必要に応じ、より多数のＮＫ細胞を作製するために、さらなる刺激サイクルを行うことができる。
ＩＩＩ．使用方法
【００７８】
本開示の実施形態は、免疫応答を誘発するＮＫ細胞集団を移入することによって内科疾患または障害を処置または予防するために本明細書中に提供されるＮＫ細胞を使用するための方法に関する。その方法は、被験体に治療有効量のプレ活性化され、拡大されたＮＫ細胞を投与することによって、その被験体における障害を処置または予防する工程を含む。本開示のある特定の実施形態では、免疫応答を誘発するＮＫ細胞集団を移入することによって、癌または感染症が処置される。ＮＫ細胞は、炎症促進性サイトカインの放出に起因して、補助的な免疫細胞の分化、活性化および／または悪性疾患部位への動員を促進することによって、抗炎症性の腫瘍微小環境を逆転させ得、適応免疫応答を高め得る。
【００７９】
本処置方法が有用な腫瘍としては、任意の悪性細胞タイプ、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍に見られるタイプが挙げられる。例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺および乳房からなる群より選択される器官の腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性疾患、白血病、リンパ腫、芽腫、ミエローマなどが挙げられる。本明細書中に提供される方法を用いて処置され得る癌のさらなる例としては、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（消化器癌および消化管間質癌を含む）、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々なタイプの頭頸部癌、ならびに黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
癌は、具体的には以下の組織型の癌であり得るが、これらに限定されない：新生物，悪性；癌腫；癌腫，未分化型；巨細胞および紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ，悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌・胆管癌の混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ内腺癌；腺癌，家族性大腸ポリポーシス；充実性癌；カルチノイド腫瘍，悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状・濾胞腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病，乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫，悪性；卵巣間質腫瘍，悪性；莢膜細胞腫，悪性；顆粒膜細胞腫，悪性；アンドロブラストーマ，悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍，悪性；脂質細胞腫瘍，悪性；傍神経節腫，悪性；乳房外傍神経節腫，悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒子黒色腫；末端黒子型黒色腫；結節性黒色腫；巨大色素性母斑内悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑，悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫，悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍，悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫，悪性；ブレンナー腫瘍，悪性；葉状腫瘍，悪性；滑膜肉腫；中皮腫，悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫，悪性；卵巣甲状腺腫，悪性；絨毛癌；中腎腫，悪性；血管肉腫；血管内皮腫，悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫，悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫，悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍，悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫，悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；松果体腫，悪性；脊索腫；神経膠腫，悪性；上衣腫；アストロサイトーマ；原形質性アストロサイトーマ；細線維性アストロサイトーマ；星芽腫；神経膠芽腫；乏突起膠腫；希突起芽腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節神経芽腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫，悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫，悪性；顆粒細胞腫，悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫，小リンパ球性；悪性リンパ腫，大細胞型，びまん性；悪性リンパ腫，濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非切れ込み細胞ＮＨＬ；巨大病変（ｂｕｌｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性���腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリーセル白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病。
【００８１】
特定の実施形態は、白血病を処置する方法に関する。白血病は、血液または骨髄の癌であり、血液細胞、通常は白血球細胞（白血球）の異常な増殖（分裂増殖による生成）を特徴とする。白血病は、血液新生物と呼ばれる広範囲な疾患群の一部である。白血病は、ある疾患範囲を網羅する広義語である。白血病は、臨床的および病理学的に、急性型と慢性型とに分けられる。
【００８２】
急性白血病は、未熟な血液細胞の急速な増殖を特徴とする。この密集によって、骨髄は健康な血液細胞を産生できなくなる。急性型の白血病は、小児および若年成人において生じ得る。実際に、急性型の白血病は、米国の小児では、他の任意のタイプの悪性疾患よりも一般的な死因である。急性白血病では、急速な進行および悪性細胞の蓄積、次いでそれが血流にあふれ出て、身体の他の器官に広がることから、速やかな処置が必要とされる。中枢神経系（ＣＮＳ）の関与は珍しいが、この疾患は、時として脳神経麻痺を起こし得る。慢性白血病は、比較的成熟しているがなおも異常な血液細胞の過剰な蓄積によって区別される。通常、数ヶ月から数年間かけて進行する間に、正常細胞よりもかなり速い速度で細胞が産生されて、血液中に多くの異常な白血球が生じる。慢性白血病は、たいていは高齢者に起きるが、理論的にはどの年齢群でも生じ得る。急性白血病は、直ちに処置しなければならないのに対して、慢性型は時折、治療の有効性が最大となるのを確実にするために、処置前にしばらくの間、監視される。
【００８３】
さらに、上記疾患は、リンパ球性またはリンパ芽球性（正常にはリンパ球を形成し続けるあるタイプの骨髄細胞に癌化が起こったことを示す）および骨髄性または骨髄球性（正常には赤血球、いくつかのタイプの白血球および血小板を形成し続けるあるタイプの骨髄細胞に癌化が起こったことを示す）に分類される（リンパ系細胞  対  骨髄性細胞を参照のこと）。
【００８４】
急性リンパ性白血病（急性リンパ芽球性白血病、すなわちＡＬＬとしても知られる）は、低年齢小児において最も一般的なタイプの白血病である。この疾患は、成人、特に、６５歳以上でも発症する。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、ほとんどの場合、５５歳を超える成人で発症する。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、時折、それより若い成人でも生じるが、小児で発症することはほとんどない。急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、すなわちＡＭＬとしても知られる）は、通常、小児よりも成人において生じる。このタイプの白血病は、以前は「急性非リンパ性白血病」と呼ばれていた。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、主に成人に生じる。非常に少数の小児も、この疾患を発症する。
【００８５】
リンパ腫は、リンパ球（脊椎動物の免疫系における白血球の１タイプ）から発生する癌のタイプである。リンパ腫には、多くのタイプが存在する。米国国立衛生研究所によると、リンパ腫は、米国における癌の全症例の約５パーセントを占め、特にホジキンリンパ腫は、米国における癌の全症例の１パーセント未満を占める。リンパ系は、身体の免疫系の一部であるので、ＨＩＶ感染またはある特定の薬物もしくは薬物療法などによって免疫系が弱った患者も、リンパ腫の発生率が高い。
【００８６】
本発明のある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、それを必要とする個体（例えば、癌または感染症を有する個体）に送達される。次いで、それらの細胞は、その個体の免疫系を亢進して、それぞれの癌細胞または病原性細胞を攻撃する。いくつかの場合では、個体は、ＮＫ細胞を１回以上提供される。個体が、ＮＫ細胞を２回以上提供される場合、投与間の時間は、その個体において伝播のための時間が経過するのに十分な時間であるべきであり、具体的な実施形態において、投与間の時間は、ｌ、２、３、４、５、６、７日またはそれ以上である。
【００８７】
プレ活性化され、拡大されるＮＫ細胞の起源は、任意の種類であってよいが、具体的な実施形態において、その細胞は、例えば、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞のバンクから得られる。治療効果にとって好適な用量は、好ましくは一連の投与サイクルにおいて、１用量あたり例えば少なくとも１０５または約１０５〜約１０１０細胞であり得る。例示的な投与レジメンは、０日目の少なくとも約１０５細胞から開始し、例えば、患者内用量漸増スキーム開始の数週間以内に約１０１０細胞という目標用量まで徐々に増加させるという用量漸増の１週間投与サイクルの４サイクルからなる。好適な投与様式としては、静脈内、皮下、腔内（例えば、レザバーアクセスデバイス）、腹腔内および腫瘤への直接注射が挙げられる。
【００８８】
本方法に従って作製されたＮＫ細胞には、実験用途および治療用途をはじめとした、多くの潜在的な用途がある。特に、そのような細胞集団は、望ましくないまたは不適当な免疫応答を抑制する際に極めて有用であることが想定される。そのような方法では、少数のＮＫ細胞を患者から取り出し、次いで、エキソビボで操作し、拡大した後、それを患者に再注入する。このように処置され得る疾患の例は、例えば、同種移植寛容のために、免疫活性の抑制が望ましい自己免疫疾患および自己免疫状態である。治療的な方法は、哺乳動物を準備する工程、その哺乳動物からＮＫ細胞を得る工程；上に記載された本方法の方法に従ってそのＮＫ細胞をエキソビボで拡大する工程；および拡大されたＮＫ細胞を処置される哺乳動物に投与する工程を含み得る。
【００８９】
本開示の薬学的組成物は、単独でまたは癌の処置に有用な他の確立された作用物質と組み合わせて使用され得る。単独で送達されるのか、他の作用物質と組み合わせて送達されるのかに関係なく、本開示の薬学的組成物は、様々な経路を介して、哺乳動物、特にヒトの身体の様々な部位に送達されることにより、特定の効果が達成され得る。当業者は、２つ以上の経路を投与に用いることができるが、特定の経路が、別の経路よりも即効性かつ効果的な反応を提供できることを認識するだろう。例えば、黒色腫の処置の場合、吸入よりも皮内送達が有利に使用され得る。局所送達または全身送達は、体腔への製剤の適用もしくは滴下注入、エアロゾルの吸入もしくはガス注入、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹膜、皮下もしくは皮内投与を含む非経口導入を含む投与によって達成され得る。
【００９０】
１つの実施形態において、被験体は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および自己免疫性睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスペート−皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（例えば、微小変化群、巣状糸球体硬化症または膜性腎症）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎または疱疹状皮膚炎脈管炎）、白斑、ならびにヴェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書中に開示される方法を用いて処置され得る自己免疫疾患のいくつかの例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。被験体は、喘息などのアレルギー性障害も有し得る。
【００９１】
なおも別の実施形態において、被験体は、臓器移植または幹細胞移植のレシピエントであり、拒絶を予防および／または処置するために、拡大されたＮＫ細胞が用いられる。特定の実施形態において、被験体は、移植片対宿主病を有するか、または移植片対宿主病を発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁ドナーまたは非血縁ドナーからの幹細胞を使用するかまたは含む任意の移植で起き得る合併症である。ＧＶＨＤには、急性と慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの徴候としては、手および足における赤みを帯びた発疹が挙げられ、それは、広がって、より重篤になることがあり、皮膚剥脱または水疱形成を伴う。急性ＧＶＨＤは、胃および腸にも影響することがあり、その場合、筋痙攣、悪心および下痢が現れる。皮膚および眼の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響していることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいてランク付けされる：ステージ／グレード１が軽度であり；ステージ／グレード４が重度である。慢性ＧＶＨＤは、移植の３ヶ月後またはそれ以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの症状と似ているが、さらに慢性ＧＶＨＤは、眼の粘液腺、口の唾液腺、ならびに胃の内壁および腸を滑らかにする腺にも影響することがある。本明細書中に開示される任意のＮＫ細胞の集団が利用され得る。移植される器官の例としては、実質臓器の移植（例えば、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺および／または心臓）または細胞移植（例えば、膵島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄、または造血性幹細胞もしくは他の幹細胞）が挙げられる。移植は、複合移植（例えば、顔面の組織）であり得る。ＮＫ細胞（例えば、免疫抑制性ＣＤ１９＋細胞）は、移植の前、移植と同時、または移植の後に、投与され得る。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、移植の前（例えば、移植の少なくとも１時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも１週間前、少なくとも２週間前、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前または少なくとも１ヶ月前）に投与される。１つの非限定的な具体例において、治療有効量のＮＫ細胞の投与は、移植の３〜５日前に行われる。
【００９２】
移植を受けている患者に投与されるＮＫ細胞は、投与前に、移植材料に特異的な抗原で感作され得る。この実施形態によると、その移植レシピエントは、その移植材料に対する免疫応答／炎症反応が低減し、したがって、移植された組織の拒絶の可能性が最小限に抑えられる。同様に、移植片対宿主病の処置に関しては、宿主に特異的な抗原でＮＫ細胞が感作され得る。この実施形態によると、そのレシピエントは、自己抗原に対する免疫応答／炎症反応が低減し得る。
【００９３】
さらなる実施形態では、被験体に治療有効量のＮＫ細胞を投与することによって、その被験体における炎症が処置または阻害される。したがって、その方法は、治療有効量のＮＫ細胞を被験体に投与して、炎症過程を阻害する工程を含む。炎症性障害の例としては、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節症、未分化型関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス感染症または慢性細菌感染症に起因する慢性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に開示される方法は、アレルギー性障害を処置するためにも使用され得る。
【００９４】
ＮＫ細胞の投与は、免疫抑制または炎症阻害が望まれるときはいつでも、例えば、疾患または炎症の最初の徴候または症状が現れたときに、利用できる。これらは、全般的なもの（例えば、疼痛、浮腫、体温上昇）であり得るか、または冒された器官の機能不全に関係する特異的な徴候もしくは症状であり得る。例えば、腎臓の移植片拒絶では、血清クレアチニンレベルの上昇があり得るのに対して、ＧＶＨＤでは、発疹があり得、喘息では、息切れおよび喘鳴があり得る。
【００９５】
ＮＫ細胞の投与は、目的の被験体における免疫介在性疾患の予防にも利用され得る。例えば、ＮＫ細胞は、移植レシピエントとなり得る被験体に移植前に投与され得る。別の例では、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞枯渇なしで同種異系骨髄移植を受ける被験体に投与される。さらなる例では、ＮＫ細胞は、糖尿病の家族歴を有する被験体に投与され得る。他の例では、ＮＫ細胞は、喘息の発作を予防するために、喘息を有する被験体に投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量のＮＫ細胞が、症状に先立って被験体に投与される。ＮＫ細胞の投与は、ＮＫ細胞を含まない他の治療を受けた患者と比べて、その後の免疫学的イベントもしくは症状（例えば、喘息の発作）の発生率もしくは重症度の低下、または患者の生存時間の改善をもたらす。
【００９６】
ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、第２の治療薬と組み合わせて投与される。例えば、第２の治療薬としては、Ｔ細胞、免疫調節剤、モノクローナル抗体または化学療法剤が挙げられ得る。非限定的な例において、免疫調節剤は、レナリドマイドであり、モノクローナル抗体は、リツキシマブ、オファツマブまたはルミリキシマブであり、化学療法剤は、フルダラビンまたはシクロホスファミドである。
【００９７】
本開示の組成物は、単位剤形で提供され得、ここで、各投与単位、例えば、注射剤は、所定の量のその組成物を単独でまたは他の活性な作用物質との適切な組み合わせで含む。単位剤形という用語は、本明細書中で使用されるとき、ヒトおよび動物被験体に対する単位投与量として適した物理的に不連続な単位のことを指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量として計算された所定の量の本開示の組成物を、単独でまたは他の活性な作用物質と組み合わせて、必要に応じて薬学的に許容され得る希釈剤、キャリアまたはビヒクルと併せて、含む。本開示の単位剤形についての仕様は、特定の被験体における、薬学的組成物に関連する特定の薬力学に依存する。
【００９８】
望ましくは、長期間の特異的な抗腫瘍応答が確立されて、腫瘍サイズが減少するか、またはそのような処置が無い場合に生じ得る腫瘍の成長もしくは再成長が無くなるように、単離され、導入された有効量のまたは十分な数のＮＫ細胞が、組成物中に存在し、被験体に導入される。望ましくは、被験体に再導入されるその量のＮＫ細胞は、他の点では同じ条件（ＮＫ細胞が存在しない）と比べて、腫瘍サイズを１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％減少させる。
【００９９】
したがって、投与されるＮＫ細胞の量は、投与経路を考慮するべきであり、十分な数のＮＫ細胞が所望の治療反応を達成するように導入されるような量であるべきである。さらに、本明細書中に記載される組成物に含められる活性な作用物質の各々の量（例えば、接触される各細胞あたりの量またはある特定の体重あたりの量）は、用途によって異なり得る。一般に、ＮＫ細胞の濃度は、望ましくは、処置される被験体において、少なくとも約１×１０６〜約１×１０９ＮＫ細胞、さらにより望ましくは、約１×１０７〜約５×１０８ＮＫ細胞を提供するのに十分であるべきであるが、それを超える量、例えば、５×１０８細胞を超える量、またはそれを下回る量、例えば、１×１０７細胞未満の量といった、任意の好適な量を利用できる。投与スケジュールは、確立された細胞ベースの治療に基づき得る（例えば、米国特許第４，６９０，９１５号を参照のこと）か、または代わりの持続注入ストラテジーを用いることもできる。
【０１００】
これらの値は、本方法を実施するために本開示の方法を最適化する際に実務家が利用するＮＫ細胞の範囲の一般的ガイダンスを提供する。そのような範囲の本明細書中の詳述は決して、特定の用途では保証され得る、それより多いまたは少ない量の構成要素の使用を排除しない。例えば、正確な用量およびスケジュールは、組成物が他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるか否かに応じて、または薬物動態、薬物処分および代謝の個体差に応じて、異なり得る。当業者は、特定の状況の緊急事態に応じて、任意の必要な調整を容易に行うことができる。
ＩＶ．キット
【０１０１】
いくつかの実施形態において、例えば、ＮＫ細胞を作製するための１つ以上の培地および構成要素を含み得るキットが提供される。そのような製剤は、ＮＫ細胞と組み合わせるのに適した形態で因子のカクテルを含み得る。試薬系は、必要に応じて、水性媒質中にまたは凍結乾燥された形態で、包装され得る。キットの容器手段としては、一般に、構成要素が配置され得る、好ましくは、適切に分注され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段が挙げられる。キットに２以上の構成要素が存在する場合、そのキットは一般に、追加の構成要素が別々に入れられ得る第２、第３または他のさらなる容器も含み得る。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、１つのバイアルに含められてもよい。キットの構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または構成要素が、乾燥粉末として提供されるとき、その粉末は、好適な溶媒を加えることによって再構成され得る。その溶媒は、別の容器手段に提供されてもよいことが想定される。また、キットは、通常、商業的販売のためにキットの構成要素を厳重に閉じ込めた状態で含めるための手段も含み得る。そのような容器としては、所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が挙げられ得る。キットは、使用のための指示書（例えば、印刷された形式または電子的な形式、例えば、デジタル形式）も含み得る。
【実施例】
【０１０２】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本発明の実施においてうまく機能すると本発明者が発見した手法であり、ゆえに、それらの手法は、実施するための好ましい形態を構成すると見なされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される具体的な実施形態では、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく多くの変更が行われ得、なおも同様または類似の結果が得られることを認識するはずである。
実施例１−ＮＫ細胞のプレ活性化および拡大
【０１０３】
臍帯血（ＣＢ）単核細胞（ＭＮＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離によって、新鮮なＣＢ単位から単離した。ＮＫ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で精製したＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、ｒｈＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）に加えてｒｈＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）を用いて１６時間プレ活性化し、３回洗浄して、サイトカインを除去した。次いで、プレ活性化されたＮＫ細胞を、無血清幹細胞完全成長培地（ＳＣＧＭ）中、組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，２００Ｕ／ｍＬ）の存在下において、膜結合型ＩＬ−２１およびＣＤ１３７リガンドを発現する照射された（１００Ｇｙ）Ｋ５６２ベースのフィーダー細胞で刺激した（２：１のフィーダー細胞：ＮＫ比）。ＩＬ−２を２〜３日ごとに補充した。７日後、ＮＫ細胞をフィーダーａＡＰＣ細胞で、同じ比を用いて再度刺激した。コントロールとして、精製されたＮＫ細胞を、プレ活性化工程なしで、照射された（１００Ｇｙ）フィーダー細胞（２：１のフィーダー細胞：ＮＫ比）および組換えヒトＩＬ−２を用いて拡大した（拡大されたＣＢ−ＮＫ；ＥｘｐＮＫ）。
【０１０４】
プレ活性化され、拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞（Ｐ＋Ｅ  ＮＫ）は、Ｋ５６２標的（図１Ａ〜Ｄ）、ＡＭＬおよびリンパ腫細胞株（図１Ｅ〜Ｆ）による刺激に応答して、より多くのＩＦＮ−ｇおよびＴＮＦ−αを産生し、刺激の７、１４および２１日後に５１クロム放出アッセイによって、ＥｘｐＣＢ−ＮＫ細胞と比べて、より大きな細胞傷害性をもたらした（図２Ａ〜Ｃ）ことから、プレ活性化後に高い殺滅特性が持続することが示唆された。
【０１０５】
腫瘍拘束性抗原に特異的な治療的なモノクローナル抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）と腫瘍標的との間の低親和性のタンパク質連結を提供する。したがって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）実験を、リツキシマブおよびＲａｊｉ標的細胞を用いて行ったところ、Ｐ＋Ｅ  ＮＫ細胞が、すべてのエフェクター−標的比において、コントロール（Ｅｘｐ  ＮＫ細胞）と比べて、リツキシマブでコートされたＲａｊｉリンパ腫標的の高い殺滅を示したことが観察された（図３）。
【０１０６】
プレ活性化は、種々の構築物を用いてキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）によって改変されたＮＫ細胞の殺滅能力を有意に高めることも実証された。ｉＣ９／ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５（図４Ａ）またはｉＣ９／ＣＡＲ．１２３／ＩＬ−１５（図４Ｂ〜Ｃ）を発現するようにレトロウイルスベクターで形質導入されたＰ＋Ｅ  ＮＫ  ＣＢ−ＮＫ細胞は、それぞれｉＣ９／ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５またはｉＣ９／ＣＡＲ．１２３／ＩＬ−１５を形質導入されたが活性化前にプレ活性化されなかったＣＢ−ＮＫ細胞と比べて、ＣＤ１９またはＣＤ１２３を発現している腫瘍に対して有意に高い細胞傷害性およびサイトカイン産生を示したことから、プレ活性化＋拡大に対するプロトコルが、高度に強力なＣＡＲ−ＮＫ細胞を生成するためにも適用できることが示唆された。
【０１０７】
プレ活性化工程は、ＮＫ細胞が拡大を起こす能力に悪影響を及ぼさなかった。実際に、培養の１４日後に、Ｐ＋Ｅ  ＮＫ  ＣＢ−ＮＫ細胞に対する拡大倍率の中央値は、１５２０倍（１０８０〜１９２２という範囲）であり、コントロールのＥｘｐ  ＣＢ−ＮＫ細胞のそれと等価だった（図５）。
【０１０８】
プレ活性化され、拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞は、プレ活性化されただけのＣＢ−ＮＫ細胞または拡大されただけのＣＢ−ＮＫ細胞と比べて、Ｋ５６２標的に対してより良い細胞傷害性を発揮したことがさらに観察された（図６）。さらに、プレ活性化され、拡大されたＣＢ−ＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞に対して高いサイトカイン産生を示した（図７）。
【０１０９】
拡大と活性化の順序が標的に対する細胞傷害活性をもたらしたかを判定するための研究を行った。プレ活性化の後の拡大は、拡大の後のプレ活性化と比べて、Ｒａｊｉ標的に対してより良い細胞傷害性を示したことが観察された（図８）。これは、ＮＫ細胞拡大の解析によって確かめられた。プレ活性化の後に拡大を行う方法は、拡大の後にプレ活性化を行う方法よりも良い増殖をもたらした（図９）。したがって、プレ活性化の後に拡大を行う本方法が、細胞傷害活性が高い多数のＮＫ細胞を提供した（図９）。
【０１１０】
本明細書中に開示されるおよび特許請求される方法のすべてが、本開示に鑑みて、過度の実験を行うことなく、実施および実行され得る。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法および方法の工程または工程の順序に変更が適用され得ることが当業者には明らかであろう。より詳細には、化学的かつ生理的に関係するある特定の作用物質が、本明細書中に記載される作用物質の代わりに用いられ得るが、同じまたは類似の結果が達成され得ることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換および修正のすべてが、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念を超えないとみなされる。
【０１１１】
文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に援用される。
国際公開番号 WO2007/103009
Leong et al., Biol Blood Marrow Transplant. 20(4):463-73, 2014.
Singh et al., Cancer Research, 71:3516-3527, 2011.
U.S. Patent No. 4,690,915
U.S. Patent No. 6,225,042
U.S. Patent No. 6,355,479
U.S. Patent No. 6,362,001 
U.S. Patent No. 6,410,319
U.S. Patent No. 6,790,662
U.S. Patent No. 7,109,304
U.S. Patent Publication No. 2009/0004142
U.S. Patent Publication No. 2009/0017000 
【図１Ａ】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｅ−２】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｃ−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図９−２】
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【国際調査報告】
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