(57)【要約】  本発明は、幹細胞への導入能に優れていて、低い濃度でも幹細胞によく導入され得る組換えアデノウイルスおよびこれを含む幹細胞、遺伝子伝達用組成物、そして薬剤学的組成物に関し、本発明のアデノウイルスが導入された幹細胞は、体内残存能および腫瘍細胞に対する治療効果に優れ、抗癌剤として使用時に幹細胞の体内残存または肝毒性などの問題を誘発しなくて、特に全身投与用に有用であり、低い投与量でも優れた抗癌効果を有して、アデノウイルスを用いた抗癌剤として広く用いられる。
2021506267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子および配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルスを含有する抗癌用間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）。
【請求項２】
前記組換えアデノウイルスは、目的遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節配列をさらに含むものである、請求項１に記載の抗癌用間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項３】
前記遺伝子発現調節配列は、配列番号５のＡＦＰプロモーター配列または配列番号８のＴＥＲＴプロモーター配列を含むものである、請求項２に記載の抗癌用間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞は、０．０１ＭＯＩ超過〜１００ＭＯＩ未満濃度の目的遺伝子および配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルス；で５０時間以下で形質感染されたものである、請求項１に記載の抗癌用間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項５】
目的遺伝子および配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルスが導入された間葉系幹細胞を含む遺伝子伝達用組成物。
【請求項６】
前記組換えアデノウイルスは、目的遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節配列をさらに含むものである、請求項５に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項７】
前記組成物は、全身投与または局所投与用である、請求項５に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項８】
前記組成物は、０．０１ＭＯＩ超過〜１００ＭＯＩ未満濃度の目的遺伝子および配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルス；で５０時間以下で形質感染された間葉系幹細胞を含むものである、請求項５に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項９】
目的遺伝子および配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルスが導入された間葉系（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）を薬剤学的有効量で含む癌治療用薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記組換えアデノウイルスは、目的遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節配列をさらに含むものである、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、０．０１ＭＯＩ超過〜１００ＭＯＩ未満濃度の目的遺伝子および配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルス；で５０時間以下で形質感染された間葉系幹細胞を含むものである、請求項９に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１２】
血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブ（ｋｎｏｂ）を含む幹細胞導入能が改善された組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
前記血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブは、配列番号１の配列からなるものである、請求項１２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
前記組換えアデノウイルスは、目的遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節配列および目的遺伝子をさらに含むものである、請求項１２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１５】
前記組換えアデノウイルスは、５’から３’方向に（ａ）６コピー（ｃｏｐｙ）のＨＲＥ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）ドメイン配列；（ｂ）２コピーのＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）エンハンサーＡ配列、（ｃ）１コピーのＡＦＰプロモーターのエンハンサーＢ配列、および（ｄ）ＡＦＰプロモーター配列またはＴＥＲＴプロモーター配列を含む遺伝子発現調節配列；前記遺伝子発現調節配列に作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）目的遺伝子；および血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブ（ｋｎｏｂ）配列を含むものである、請求項１２に記載の組換えアデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌特異的遺伝子発現調節能および幹細胞導入能に優れた組換えアデノウイルスおよび前記組換えアデノウイルスが導入された幹細胞、そしてこれを用いた遺伝子伝達および癌特異的治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子伝達ベクターとしてアデノウイルスの様々な長所が浮かび上がるに伴い、癌遺伝子治療においてその使用頻度は着実に増加している傾向にある。癌を遺伝子療法で治療する場合、長期的かつ持続的な治療遺伝子の発現が必要でない長所がある。また、ベクターとして使用されるウイルスにより誘導される宿主の免疫反応が大きく問題にならないか、かえって利点として作用できるので、アデノウイルスは、癌治療用遺伝子伝達体として脚光を浴びている。特に、癌細胞内だけで増殖できる癌細胞（腫瘍）選択的殺傷アデノウイルスは、正常細胞には影響を与えず、癌細胞のみを選択的に死滅させることができて、次世代未来治療剤として注目を受けている。
【０００３】
しかしながら、遺伝子治療剤としてアデノウイルスを全身投与する場合、アデノウイルスが肝組織に蓄積されて毒性を誘発したり、血液中で作られる中和抗体に起因して体内維持時間が短くて、ターゲット腫瘍部位までアデノウイルスが伝達される効率が低下する短所がある。したがって、遺伝子治療でアデノウイルスの長所を維持しつつ、腫瘍部位への標的指向性および伝達効率を高めた遺伝子治療剤の開発が切実に要求されているのが現状である。
【０００４】
遺伝子治療剤の運搬体の一つとして間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）がある。ＭＳＣは、骨髄などの様々な組織から容易に分離することができ、体外で培養、増殖が容易である。また、体内投与時に損傷部位に移動して損傷した細胞を代替し、多様な成長因子およびサイトカインを分泌して、疾患の抑制および損傷部位の再生を促進させる効果がある。また、ＭＳＣは、腫瘍指向性（ｔｕｍｏｒ  ｔｒｏｐｉｓｍ）特性による腫瘍への移動能力を保有しており、共同刺激信号分子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）が発現しなくて、免疫拒否反応が低いか、ないため、全身投与が可能で、自己治療だけでなく、多くの患者を対象に同種治療が可能であるという長所もある。
【０００５】
したがって、このような免疫原性がなく、腫瘍標的能を有するＭＳＣを用いて多様な再生医学的幹細胞治療剤として開発しようとする努力が活発に行われている。そのうちの一つとして、間葉系幹細胞とアデノウイルス遺伝子治療剤を用いて細胞／遺伝子治療剤を開発しようとする試みがあったが、特定のレセプターが欠如した間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）にアデノウイルスが感染を起こさない問題点があって、現在までも間葉系幹細胞をアデノウイルスの運搬体として用いるのに困難が存在する。
【０００６】
さらに、遺伝子治療剤産業の発展のために自己由来方式でなく、多数の患者を対象にすることができる同種の治療に使用され得る治療剤の開発および品質の一貫性とコストを節減できる製造方法の開発に対する要求が持続している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、従来、全身投与が不可能で、幹細胞への導入効率が低いアデノウイルスの短所を改善し、体内注入後にターゲット部位までアデノウイルスを高効率で伝達させることができる方法について持続的に研究して、低い濃度でも幹細胞への導入能に優れ、癌特異的遺伝子発現調節能に優れたアデノウイルスおよび前記アデノウイルスが導入された幹細胞を開発し、前記幹細胞を用いる場合、全身投与が可能であり、癌に対する標的能に優れていて、肝毒性などの問題を起こすことなく、優れた癌細胞特異的殺傷効果を有することを確認して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブ（ｋｎｏｂ）を含む幹細胞導入能が改善された組換えアデノウイルスを提供する。
【０００９】
前記血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブは、配列番号１の配列からなるものでありうる。
【００１０】
前記組換えアデノウイルスは、目的遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節配列および目的遺伝子をさらに含むことができる。
【００１１】
具体的に、前記組換えアデノウイルスは、５’から３’方向に（ａ）６コピー（ｃｏｐｙ）のＨＲＥ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）ドメイン配列；（ｂ）２コピーのＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）エンハンサーＡ配列、（ｃ）１コピーのＡＦＰプロモーターのエンハンサーＢ配列、および（ｄ）ＡＦＰプロモーター配列を含む遺伝子発現調節配列；前記遺伝子発現調節配列に作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）目的遺伝子；および血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブ（ｋｎｏｂ）配列を含むものでありうる。
【００１２】
また、本発明は、前記組換えアデノウイルスを含有する間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）を提供する。
【００１３】
前記間葉系幹細胞は、目的遺伝子および配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルスを含有する抗癌用間葉系幹細胞でありうる。
【００１４】
前記組換えアデノウイルスは、目的遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節配列をさらに含むことができる。
【００１５】
前記遺伝子発現調節配列は、配列番号５のＡＦＰプロモーター配列または配列番号８のＴＥＲＴプロモーター配列を含むことができる。
【００１６】
前記間葉系幹細胞は、０．０１ＭＯＩ超過〜１００ＭＯＩ未満濃度の目的遺伝子および配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルス；で５０時間以下で形質感染されたものでありうる。
【００１７】
前記組成物は、全身投与または局所投与用である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の組換えアデノウイルスは、幹細胞への導入能および特異的遺伝子発現調節効果に優れていて、低い濃度でも幹細胞への導入が可能な特性を有する。特に、本発明のアデノウイルスを用いる場合、低い濃度でも幹細胞への感染に優れているので、アデノウイルスの導入過程で死滅する幹細胞の比率が低くて、遺伝子治療剤の製造効率を高めることができる長所がある。また、本発明のアデノウイルスが導入された幹細胞は、生存能および癌細胞殺傷能にさらに優れた長所があり、幹細胞に搭載されたアデノウイルスは、自らの増殖が可能で、遺伝子治療への適用時に治療効果を高めることができ、注入された幹細胞が体内に残存しなくて、副作用を誘発しないという長所がある。また、本発明のアデノウイルスを搭載した幹細胞およびこれを含む組成物は、他のアデノウイルス治療剤と比較して全身性投与にさらに適しており、肝毒性を起こすことなく、免疫反応を誘発しなくて、同種治療が可能であり、治療剤のコストを低減することができるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図１は、本発明の一実施例によって製造された組換えＡＦＰプロモーターによりルシフェラーゼの発現が調節されるプラスミドのプロモーター部位およびサイズを示す。
図２は、本発明の一実施例によって製造された組換えＡＦＰプロモーターの肝癌特異的活性を確認した結果を示すグラフである。
図３は、本発明の一実施例によって製造されたプロモーターが挿入された遺伝子の発現が調節されるアデノウイルスのシャトルベクターの構造を示す。
図４は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターが搭載された複製不能アデノウイルスの相同組換え過程および構造を示す。
図５は、本発明の一実施例によって変形ＡＦＰプロモーターにより遺伝子の発現が調節されるアデノウイルスを製作する過程を示す。
図６ａ、図６ｂ、図６ｃ、図６ｄ、図６ｅおよび図６ｆは、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターが搭載された組換えアデノウイルスの細胞株による遺伝子発現活性の有無および低酸素状態で遺伝子発現が増加することを確認した結果を示すグラフである。図６ａ〜図６ｄは、肝癌細胞株に対する実験結果、図６ｅは、正常細胞株、そして図６ｆは、肺癌細胞株（Ａ５４９）に対する結果を示す。
図７は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターを含むアデノウイルスの腫瘍組織でＧＦＰ発現程度を蛍光で確認した結果を示す。
図８は、変形されたＡＦＰプロモーターによりアデノウイルスの複製が調節される肝癌細胞特異的細胞殺傷アデノウイルスのシャトルベクターの構造を示す。
図９は、変形されたＡＦＰプロモーターによりアデノウイルスの複製が調節される肝癌細胞特異的細胞殺傷アデノウイルスの相同組換え過程および構造を示す。
図１０ａ、図１０ｂ、図１０ｃ、図１０ｄおよび図１０ｅは、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターが搭載された腫瘍殺傷アデノウイルスの細胞株の種類による殺傷効果を確認した結果を示すグラフである。図１０ａ、図１０ｂおよび図１０ｃは、肝癌細胞株で肝癌細胞特異的殺傷効果を示し、図１０ｄおよび図１０ｅは、正常細胞株で殺傷の有無を示し、正常条件（ｎｏｒｍｏｘｉａ）および低酸素条件（ｈｙｐｏｘｉａ）であるときのそれぞれの殺傷効果を意味する。
図１１は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターが搭載された組換えアデノウイルスの正常条件（ｎｏｒｍｏｘｉａ）および低酸素条件（ｈｙｐｏｘｉａ）であるときの複製能を確認した結果を示す。
図１２は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターが搭載された組換えアデノウイルスの正常酸素濃度（腫瘍の周辺部位；ｎｏｒｍｏｘｉａ、赤色ボックス）および低酸素濃度（腫瘍の中央部位；ｈｙｐｏｘｉａ、青色ボックス）での複製能をスフェロイド培養された肝癌組織（Ｈｅｐ３Ｂ  ｏｒｇａｎｏｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）で蛍光染色を通じて確認した結果を示す。
図１３は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターが搭載された組換えアデノウイルスの増殖能および抗腫瘍効果（細胞アポトーシス）を肝癌皮下モデル（ＡＦＰ＋Ｈｅｐ３Ｂ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ）で確認した結果を示す。
図１４は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターが搭載された組換えアデノウイルスの抗腫瘍効果を肝癌同所移植モデルで確認した結果を示す。
図１５は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的プロモーターが搭載された組換えアデノウイルスの抗腫瘍効果を確認した結果を示すグラフである。
図１６ａは、アデノウイルスタイプ３５ファイバー（Ｋ３５）を発現する複製不能アデノウイルスの製造方法を示す。
図１６ｂは、アデノウイルスのファイバーの末端にＲＧＤを発現する複製不能アデノウイルスの製造方法を示す。
図１６ｃは、アデノウイルスのファイバー（ｆｉｂｅｒ）変形による間葉系幹細胞への伝達効率（ｔｒａｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を確認した結果を示す。
図１７は、本発明の一実施例によって製造された組換えアデノウイルスのファイバー（ｆｉｂｅｒ）変形による遺伝子伝達効率を確認した結果を示す。
図１８は、本発明の一実施例によって製造された間葉系幹細胞に搭載された腫瘍殺傷アデノウイルスによる癌細胞殺傷能をＭＴＴアッセイにより確認した結果と間葉系幹細胞内ウイルス増殖能をＱ−ＰＣＲにより確認した結果を示すグラフである。
図１９は、本発明の一実施例によるヒト肝癌同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）モデルを構築する過程を示す。
図２０は、本発明の一実施例によって構築されたヒト肝癌同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）モデルで腫瘍の生成および成長を確認した発光（ルシフェラーゼ）イメージ写真である。
図２１は、本発明の一実施例によって製造されたアデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞の投与時に体内腫瘍組織への標的指向性およびアデノウイルスの増殖能を確認した結果を示す発光（ルシフェラーゼ、Ｌｕｃ）イメージ写真である。
図２２は、本発明の一実施例によって製造されたＭＳＣに遺伝子伝達可能な肝癌標的殺傷アデノウイルスの相同組換え過程および構造を示す。
図２３ａおよび図２３ｂは、本発明の一実施例によって製造されたＭＳＣに遺伝子伝達可能なＬｕｃ発現肝癌標的殺傷アデノウイルスの相同組換え過程および構造を示す。
図２４ａおよび図２４ｂは、本発明の一実施例によって製造されたアデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞でアデノウイルスのファイバー（ｆｉｂｅｒ）変形による遺伝子伝達効率を比較した結果を示す。図２４ｂは、本発明の一実施例によって製造されたアデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞で増殖してルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子の発現を効率的に誘導することを示す。
図２５は、本発明の一実施例による治療遺伝子を発現する幹細胞搭載用肝癌標的アデノウイルスの構造を示す。
図２６は、本発明の一実施例による治療遺伝子を発現する幹細胞搭載用ｓＬＲＰ６発現肝癌標的アデノウイルスの相同組換え過程および構造を示す。
図２７は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的殺傷アデノウイルスの細胞株（肝癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ１）および正常細胞（ＨＤＦ））の種類による殺傷効果を比較したグラフである。
図２８は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的殺傷アデノウイルスの間葉系幹細胞に対する殺傷能を確認した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は、間葉系幹細胞の細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を意味し、グラフの横軸は、間葉系幹細胞を感染させたアデノウイルス（Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６）の濃度を意味し、各処理群は、感染後の経過時間（２日、５日）を意味する。
図２９は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的殺傷アデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞内でアデノウイルスの増殖能を確認した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は、アデノウイルスの数（Ａｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｐｉｅｓ、ＶＰ／ｍｌ）を意味し、グラフの横軸は、間葉系幹細胞を感染させたアデノウイルス（Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６）の濃度を意味し、各処理群は、感染後の経過時間（２日および５日）を意味する。
図３０ａおよび図３０ｂは、本発明の一実施例によって製造された肝癌標的殺傷アデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞の抗腫瘍効果をｉｎ  ｖｉｖｏ状態で確認した結果を示す。
図３１は、本発明の一実施例によって製造された肝癌標的殺傷アデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞の抗腫瘍効果をｉｎ  ｖｉｖｏ状態で確認した結果を定量値で示したグラフである。
図３２は、本発明の一実施例によって製造された肝癌標的殺傷アデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞の抗腫瘍効果をｅｘ  ｖｉｖｏイメージで確認した結果を示す。
図３３ａおよび図３３ｂは、本発明の一実施例によって製造された肝癌標的殺傷アデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞の抗腫瘍効果を腫瘍の重さ（３３ａ）またはフラックス（ｆｌｕｘ）値（３３ｂ）の差異によって比較したグラフである。
図３４は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的殺傷アデノウイルスが搭載された間葉系幹細胞による生体内での肝数値の変化を確認した結果を示すグラフである。
図３５は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的殺傷アデノウイルス搭載幹細胞の全身投与時に生体内分布を確認した結果を示すグラフである。
図３６は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的殺傷アデノウイルス搭載幹細胞の肝癌の組織学的変化を確認した写真である。
図３７は、本発明の一実施例によって製造された肝癌特異的殺傷アデノウイルス搭載幹細胞の肝癌の組織学的変化を確認した写真である。
図３８ａ、図３８ｂ、図３８ｃおよび図３８ｄは、本発明の一実施例によるＷＮＴｉを発現するＨＣＣ−標的ｏＡｄの構造および特性を確認した結果である。図３８ａは、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉの構造を示し、図３８ｂは、Ｗｎｔ信号伝達経路と関連した遺伝子の発現を確認した結果であり、図３８ｃは、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉのＨＣＣ殺傷効果を示す結果であり、そして、図３８ｄは、低酸素の条件および正常酸素の条件でＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉのＨＣＣ殺傷能を示すグラフである。
図３９は、本発明の一実施例によるＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉが積載された間葉系幹細胞（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ）の癌細胞殺傷効果を確認したグラフである。未処理群（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）、ＭＳＣ単独処理群（ＭＳＣ）、ｎａｋｅｄ  Ａｄ処理群（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ）は、それぞれ対照群として一緒に実験された。
図４０は、本発明の一実施例によるＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉが積載された間葉系幹細胞（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ）の薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ）プロファイルを確認した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、間葉系幹細胞への遺伝子伝達能に優れ、低い濃度でも間葉系幹細に優れた導入能を有し、遺伝子発現調節能に優れた組換えアデノウイルスを搭載した間葉系幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）、本発明の間葉系幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）を含む遺伝子伝達用組成物、そして本発明の間葉系幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）を含む癌治療用組成物を提供する。
【００２１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２２】
ただし、本発明は、多様な変更を加えることができ、様々な形態を有することができるところ、以下で記述する特定の実施例および説明は、本発明の理解を助けるためのものに過ぎず、本発明を特定の開示形態に対して限定しようとするものではない。本発明の範囲は、本発明の思想および技術範囲に含まれるすべての変更、均等物ないし代替物を含むものと理解されなければならない。
【００２３】
本発明の一様態によれば、本発明は、配列番号１のファイバー（ｆｉｂｅｒ）配列を含む組換えアデノウイルスを含む。また、本発明は、前記組換えアデノウイルスが導入された間葉系幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）を提供する。
【００２４】
前記アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高いタイター、広範囲なターゲット細胞および優れた感染性のため、遺伝子伝達ベクターとして多く用いられている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐのＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）を含み、これは、ＤＮＡ複製およびパッケージングに必須のシースエレメントである。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、転写および宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードする。現在開発されたアデノウイルスのうち、Ｅ１領域が欠如した複製不能アデノウイルスが多く用いられている。一方、Ｅ３領域は、通常のアデノウイルスベクターで除去されて、外来遺伝子が挿入されるサイトを提供する（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３−５５１（１９８２）；およびＲｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０６６−１０７３（１９８９））。
【００２５】
本発明のアデノウイルスは、配列番号１のファイバー配列を含むことを特徴とする。従来、アデノウイルスは、遺伝子または細胞治療の伝達体として使用可能性が研究されてきたが、血液内で迅速に除去されたり、他の免疫反応を起こして、治療効率が減少する問題があった。これを解決するための方案として、間葉系幹細胞にアデノウイルスを搭載することが提案されたが、間葉系幹細胞内にアデノウイルスを導入する効率が非常に低く、アデノウイルスの導入率を高めるために高い濃度のアデノウイルスで感染させる場合、幹細胞の生存能が弱くなって、幹細胞が腫瘍部位に到達する前に死滅するなどの問題があるので、アデノウイルスを搭載した間葉系幹細胞を実際治療剤に使用するのに困難がある。
【００２６】
しかしながら、本発明の配列番号１のファイバーを含むようにアデノウイルスを組換えする場合、間葉系幹細胞への導入効率が顕著に優れており、低いウイルス濃度でも良好に導入できる特徴を有する。したがって、本発明は、従来の遺伝子治療で問題になったアデノウイルスの短所と間葉系幹細胞内への低い導入効率を解決したという点から、本発明は、非常に重要な特許性を有する。
【００２７】
本発明の一実施例において本発明のアデノウイルスを間葉系幹細胞に導入する場合、０．０２ＭＯＩでも間葉系幹細胞にベクターが良好に導入されたことを確認することができる（図１８）。また、他のベクターを用いる場合、１００ＭＯＩまたは５００ＭＯＩでもウイルスベクターの導入が良好に行われないが（図１７および図２４）、本発明の組換えアデノウイルスを用いる場合、５ＭＯＩでもベクターの導入が非常に良好に行われたことを確認することができた。
【００２８】
本発明のＡｄ搭載された間葉系幹細胞は、これを用いた抗癌効果および標的部位にＡｄ−搭載されたＭＳＣの到達効果を最適化するために、幹細胞内に導入（ｌｏａｄｉｎｇ）されるアデノウイルス（Ａｄ）の量を調節することができる。
【００２９】
具体的に、０．００１ＭＯＩ超過〜１００ＭＯＩ未満のアデノウイルスを用いて５０時間以下でＭＳＣを形質感染させることができる。好ましくは、０．０１ＭＯＩ〜１００ＭＯＩ以下で形質感染させることができる。より具体的には、５０ＭＯＩ以下、または０．０１ＭＯＩ超過〜５０ＭＯＩ以下、または２ＭＯＩ〜１０ＭＯＩ濃度の血清型３５のノブ（ｋｎｏｂ）を含むＡｄとともに５０時間以下で形質感染して、間葉系幹細胞アデノウイルスを導入させることができる。この場合、アデノウイルスの含量が非常に多くてＭＳＣ自らの生存率が低くなる問題点を解決しながらも、ＭＳＣでＡｄの増殖を最適化することができて、体内注入されたＭＳＣが目的部位に到達するとき、Ａｄの増殖によるさらに強力な抗癌効果を得ることができて、ウイルス増殖とＭＳＣ生存率が均衡を成す最適条件のＡｄが導入されたＭＳＣを製造することができる。
【００３０】
本発明のアデノウイルスは、遺伝子発現調節配列をさらに含むことができる。前記遺伝子発現調節配列は、従来、アデノウイルスに含まれ得るものであって、本発明の技術分野に知られたものであれば、制限なしに本発明に含まれる。
【００３１】
前記遺伝子発現調節配列は、Ｅ１Ａ遺伝子のプロモーター配列位置に挿入されて、Ｅ１Ａ遺伝子の発現を調節することができる。また、本発明の遺伝子発現調節配列−発現遺伝子カセットは、欠失されたＥ１領域（Ｅ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）および／またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、欠失されたＥ１領域に挿入される。また、本発明の遺伝子発現調節配列−発現遺伝子カセットは、欠失されたＥ４領域にも挿入され得る。本明細書でウイルスゲノム配列と関連して使用される用語「欠失」は、当該配列が完全に欠失されたものだけでなく、部分的に欠失されたものをも含む意味を有する。
【００３２】
具体的な一例として、本発明の遺伝子発現調節配列がＥ１Ａ遺伝子のアップストリームに位置する場合、すなわちＥ１Ａ遺伝子に本発明の遺伝子発現調節配列が作動的に連結された場合（ＨＲＥ−Ｅａ−Ｅｂ−ＡＦＰｍ−Ｅ１Ａ）、組換えアデノウイルスの複製が本発明の遺伝子発現調節配列により調節される。本発明の遺伝子発現調節配列が欠失されたＥ３遺伝子領域に位置する場合には、「遺伝子発現調節配列−目的遺伝子」発現カセット形態で欠失されたＥ３遺伝子領域に挿入され得る。本発明の遺伝子発現調節配列が欠失されたＥ４遺伝子領域に位置する場合には、「遺伝子発現調節配列−目的遺伝子」発現カセット形態で欠失されたＥ４遺伝子領域に挿入され得る。
【００３３】
組換えアデノウイルスに挿入される目的遺伝子は、プロモーター−目的遺伝子の発現カセットに挿入されることが好ましい。この場合、前記プロモーターとして、本発明の遺伝子発現調節配列（例：Ｅａ−Ｅｂ−ＡＦＰｍ、Ｅａ２−Ｅｂ−ＡＦＰｍまたはＨＲＥ６−Ｅａ２−Ｅｂ−ＡＦＰｍ）または通常のプロモーターを用いることができる。目的遺伝子に結合される通常のプロモーターは、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞で作動して目的遺伝子の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルスに由来したプロモーターおよび哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーターを含み、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオニンプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーター、癌細胞特異的プロモーター（例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｅ２ＦプロモーターおよびＡＦＰプロモーター）および組織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）を含むが、これに限定されるものではない。
【００３４】
目的遺伝子を発現させるための発現コンストラクトで目的遺伝子のダウンストリームにポリアデニル化配列が結合されていることが好ましい。前記ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンターミネーター（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６９８３−６９９８（１９８９）），ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５３８６−５３９３（１９９２）），ＨＩＶ−１  ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１８７０−  １８７６（１９９８）），β−グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４９：３９９−４０６（１９８７）），ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ  Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２１０４−２１１３（１９８５））またはポリオーマウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これに限定されるものではない。
【００３５】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッキングすることができるので、約２ｋｂを追加にパッケージングすることができる（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１７３３−１７３９（１９８７））。したがって、アデノウイルスに挿入される上述した外来配列は、アデノウイルスのゲノムに追加に結合させることもできる。
【００３６】
アデノウイルスにより運搬される外来遺伝子は、エピゾームと同じ方式で複製され、これより、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。したがって、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを用いた遺伝子治療が非常に安全なものと判断される。
【００３７】
本明細書で用語「Ｋ３５ファイバー（ｆｉｂｅｒ）」とは、アデノウイルス血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）３５のファイバータンパク質またはこれをコードする塩基配列を意味する。アデノウイルスは、カプシド（ｃａｐｓｉｄ）を有する７０〜９０ｎｍの外皮がないウイルスであって、前記カプシドは、３個の主な露出型構造タンパク質であるヘキソン（ｈｅｘｏｎ）、ファイバー（ｆｉｂｅｒ）、そしてペントン塩基（ｐｅｎｔｏｎ  ｂａｓｅ）から構成されるが、カプシドの各頂点であるペントン部位から突出したノブ（ｋｎｏｂ）形態のタンパク質をファイバーという。アデノウイルスは、前記ファイバータンパク質を通じて感染対象細胞などの受容体に結合する役割をし、血清型によって異なる感染および症状を示すものと知られている。
【００３８】
前記Ｋ３５ファイバー配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むことができ、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列からなるものでありうる。
【００３９】
本発明の一実施例において、目的遺伝子を伝達するアデノウイルスのファイバーをＫ３５で変形した結果、低い濃度のアデノウイルスでも間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への遺伝子導入が良好に行われることを確認した。また、アデノウイルスを間葉系幹細胞に導入させるために、あまり高い濃度のウイルスで感染させた間葉系幹細胞の場合、かえって間葉系幹細胞の死滅が起こるなど生存力が低くなったが、低い濃度のアデノウイルスで感染させた間葉系幹細胞の場合、アデノウイルス搭載後に間葉系幹細胞内でアデノウイルスの増殖が起こり、間葉系幹細胞の投与時にさらに優れた抗癌効果を有することを確認した。
【００４０】
一例として、本発明のアデノウイルスに含まれる遺伝子発現調節配列は、５’から３’方向に（ａ）ＨＲＥ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）ドメイン配列、（ｂ）ＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーターのエンハンサーＡ配列、（ｃ）ＡＦＰプロモーターのエンハンサーＢ配列、および（ｄ）ＡＦＰプロモーター配列を含む遺伝子発現調節配列；および前記遺伝子発現調節配列に作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）目的遺伝子をさらに含むことができる。
【００４１】
したがって、本発明のアデノウイルスは、５’から３’方向に（ａ）６コピー（ｃｏｐｙ）のＨＲＥ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）ドメイン配列；（ｂ）２コピーのＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）エンハンサーＡ配列、（ｃ）１コピーのＡＦＰプロモーターのエンハンサーＢ配列、および（ｄ）ＡＦＰプロモーター配列を含む遺伝子発現調節配列；前記遺伝子発現調節配列に作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）目的遺伝子；および血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブ（ｋｎｏｂ）配列を含むアデノウイルスでありうる。
【００４２】
他の一例として、本発明のアデノウイルスは、５ＭＭＴＥＲＴプロモーターを含む遺伝子発現調節配列および前記遺伝子発現調節配列に作動可能に連結された目的遺伝子を含むことができる。
【００４３】
前記遺伝子発現調節配列は、目的遺伝子が特定の条件だけで発現することができるように、発現を調節できる配列を意味する。
【００４４】
本明細書で用語「ＡＦＰプロモーター」は、卵黄嚢と胎児発生期の期間に肝で発現が高い血清タンパク質であるＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質の発現を促進するプロモーターを意味する。ＡＦＰタンパク質は、成人肝癌患者を除いては、ほとんど検出されないため、肝癌に対する有用な標識子として用いられ、個人ごとに血清内ＡＦＰの発現程度は、これらの発現を調節するエンハンサーの活性の差異によって非常に多様である。したがって、ＡＦＰプロモーターとエンハンサーの特定の組合せからなる発現調節配列を用いる場合、伝達しようとする目的／治療遺伝子が癌細胞特異的に発現するようにすることができる。前記ＡＦＰプロモーターの配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００４５】
本明細書で用語「ＨＲＥドメイン配列」は、低酸素−反応性エンハンサー配列を意味する。低酸素条件で細胞の特定遺伝子の発現が調節される（Ｂｕｎｎ  ａｎｄ  Ｐｏｙｔｏｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：８３９−８８５（１９９６）；Ｄａｃｈｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７４：５１２６−５１３２（１９９６）；Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｓｎｏｗ  Ｃｅｌｌ  ８９：９−１２（１９９７））。多くの腫瘍細胞は、不十分な血液供給を受けることになるが、これは、腫瘍細胞が一般的に血管を形成させる内皮細胞より早く成長するためであり、これは、腫瘍で低酸素状態を誘発することになる。多くの固形腫瘍内で引き起こされるこのような低酸素状態は、解糖酵素（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）や血管新生誘発前駆因子（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）のような生存因子の生産を引き起こすことによって、放射線治療や化学抗癌治療に抵抗性を有することになる。低酸素反応の主要な媒介者は、転写複合体ＨＩＦ（ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ）−１αであり、これは、多様な遺伝子の調節部位にあるＨＲＥと相互作用し、前記遺伝子は、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子、そして、エノラーゼ−１とＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のような糖分解酵素−コーディング遺伝子を含む。本発明は、このように低酸素条件で遺伝子の発現を調節し、ＨＩＦ−１αと相互作用する配列であるＨＲＥを用いることができる。本発明に前記ＨＲＥは、組換えアデノウイルスの腫瘍細胞選択性を大きく向上させることができると共に、アデノウイルスの増殖能を増加させる作用をする。
【００４６】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の遺伝子発現調節配列は、ＨＲＥ配列を含むことができ、好ましくはＨＲＥ配列による転写活性を向上させるために、ＨＲＥ反復配列を含むことができる。より好ましくは、本発明の遺伝子発現調節配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を１〜１０回反復、より好ましくは３〜８回反復、最も好ましくは５〜７回反復して含むことができる。一例として、６コピー（ｃｏｐｙ）のＨＲＥ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）ドメイン配列は、配列番号２の配列を含むことができる。
【００４７】
前記遺伝子発現調節配列は、伝達遺伝子の発現効率を向上させるために、配列番号３のエンハンサーＡの配列を含むことができ、前記エンハンサーＡの配列は、反復配列形態で含まれ得る。本発明の反復配列は、同じ配列が連続的に反復されることもでき（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ａｄｊａｃｅｎｔ）、またはプロモーターやエンハンサーの活性に影響を与えない範囲内で適切な長さのリンカーヌクレオチドを間に置いて不連続的に反復される（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｒｅｐｅａｔｅｄ）こともできる。
【００４８】
好ましくは、本発明の遺伝子発現調節配列に含まれるエンハンサーＡ配列は、配列番号３のヌクレオチド配列が１〜１０回反復された配列、より好ましくは２〜６回反復された配列、最も好ましくは３〜５回反復された配列でありうる。
【００４９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の遺伝子発現調節配列は、５’から３’方向にＨＲＥドメイン配列、エンハンサーＡ配列、エンハンサーＢ配列およびＡＦＰプロモーター配列を含む。また、好ましくは、前記ＨＲＥ配列は、６回反復され、前記エンハンサーＡ配列は、２回反復され得る。
【００５０】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、前記遺伝子発現調節配列に作動可能に連結された目的遺伝子をさらに含むことができる。
【００５１】
本明細書で用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または解読を調節することになる。本発明の遺伝子発現調節配列に作動的に連結された発現対象の遺伝子（目的遺伝子）の種類は、特に制限されない。
【００５２】
前記発現対象の遺伝子は、目的部位で遺伝子の機能を発現させようとする遺伝子という側面から、目的遺伝子とも言うことができ、前記目的遺伝子は、治療遺伝子でありうる。前記治療遺伝子は、本発明の明細書において治療学的トランス遺伝子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）という用語と言及され得る。本発明の明細書において用語「治療学的トランス遺伝子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、生体内で疾病または症状の改善または治療効果を示すヌクレオチド配列を意味する。前記治療学的トランス遺伝子は、一例として、癌細胞内で発現して治療学的効果を示すヌクレオチド配列でありうる。
【００５３】
前記目的遺伝子は、一例として腫瘍抑制因子遺伝子、自殺遺伝子、抗原性遺伝子、免疫増進遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子、抗−新生血管生成遺伝子、転移抑制遺伝子、抗体遺伝子、免疫調節遺伝子および本発明のベクターにより伝達され得るヌクレオチドから構成された群から選ばれるものでありうる。
【００５４】
本発明の明細書において用語「腫瘍抑制因子遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）」は、標的細胞内で発現して腫瘍表現型を抑制できたり細胞死滅を誘導できるヌクレオチド配列を意味する。本発明の実施に有用な腫瘍抑制因子遺伝子には、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９８７、３２９、６４２）、ＭＭＡＣ−１遺伝子、腺腫様ポリープコイルタンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（米国特許公報５，７８３，６６６号）、欠損された結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、染色体３ｐ２１．３に位置する鼻咽頭腫瘍抑制因子遺伝子（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９５：３０４２−３０４７（１９９８））、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ−２遺伝子およびＶＨＬ遺伝子が含まれる。
【００５５】
本発明で抗腫瘍アデノウイルスにより細胞内に運搬され得る外来遺伝子配列は、癌細胞の死滅を誘導し、究極的に腫瘍を退化させる癌治療遺伝子であって、腫瘍抑制遺伝子、免疫調節遺伝子［例：サイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子および共刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：Ｂ７．１とＢ７．２のようなＴ細胞活性に必要な補助分子）］、抗原性遺伝子、自殺遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、親−細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子が含まれ、これに限定されるものではない。
【００５６】
自殺遺伝子は、細胞が外部因子により殺傷されやすいように誘導する物質を発現したり細胞に毒性条件を誘発する核酸配列である。このような自殺遺伝子としてよく知られたものは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である（米国特許第５，６３１，２３６号および第５，６０１，８１８号）。ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）の投与により選択的な死滅に敏感である。腫瘍抑制遺伝子は、腫瘍の形成を抑制するポリペプチドを暗号化する遺伝子を示す。腫瘍抑制遺伝子は、哺乳動物で自然発生遺伝子であり、この遺伝子の欠失または不活性化は、腫瘍発生に必須前提であると信じられている。腫瘍抑制遺伝子の例としては、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＮＦ−１、Ｎ  Ｆ−２、ＭＴＳ１、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＶＨＬ、ｐ５３、Ｒｂ、ＭＭＡＣ−１、ＭＭＳＣ−２、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ、３２９：６４２（１９８７））、腺腫性ポリープ腸タンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ  ｐｒｏｔｅｉｎ；米国特許第５，７８３，６６６号）、染色体３ｐ２１．３に位置する鼻咽頭腫瘍抑制因子遺伝子（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：３０４２−３０４７（１９９８））、欠損された結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＴＳ１、ＣＤＫ４、ＶＨＬ、ｐ１１０Ｒｂ、ｐ１６およびｐ２１を含む腫瘍抑制遺伝子のＩＮＫ４系の一員およびその治療学的に有効な断片（例、ｐ５６Ｒｂ、ｐ９４Ｒｂなど）が含まれる。当業者は、前記例示された遺伝子の他に、その他知られた抗腫瘍遺伝子全部が本発明に使用され得ることを理解するだろう。
【００５７】
本発明の明細書で用語「抗原性遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）」は、標的細胞内で発現して免疫システムで認識できる細胞表面抗原性タンパク質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、ＨＥＲ−２、ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）およびｐ５３（Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．，国際特許出願公開ＷＯ９４／０２１６７号）が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするために、前記抗原性遺伝子をＭＨＣ第Ｉ型抗原に結合させることができる。
【００５８】
本発明の明細書で用語「細胞毒性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｇｅｎｅ）」は、細胞内で発現して毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュドモナス外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リシン毒素、ジフテリア毒素、ＣＤ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、Ｓｕｐｅｒ−ＣＤ（Ｓｕｐｅｒ−ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ＴＫ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）などをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００５９】
本発明の明細書で用語「細胞増殖抑制遺伝子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」細胞内で発現して細胞周期途中に細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン−従属性キナーゼ抑制因子をコードする遺伝子（例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８およびｐ１９）、成長中止特異性ホメオボックス（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ：ＧＡＸ）遺伝子（国際特許出願公開ＷＯ  ９７／１６４５９号およびＷＯ９６／３０３８５号）などがあるが、これに限定されるものではない。
【００６０】
本発明の明細書で用語「細胞死滅遺伝子（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」は、発現してプログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親−細胞死滅遺伝子の例には、ｐ５３、ＴＲＡＩＬ、ＭＤＡ−７（ＩＬ−２４）、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ（Ａｄ２およびＡｄ５に由来）またはアデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ（Ａｄに由来）、アデノウイルスＥ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子およびカスパーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【００６１】
本発明の明細書で用語「抗−新生血管生成遺伝子（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）」は、発現して、抗−新生血管生成因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗−新生血管生成因子には、バスタチン（ｖａｓｔａｔｉｎ）、アンギオスタチン、Ｔｉｅ２（ＰＮＡＳ，９５：８７９５−８００（１９９８））のような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子、エンドスタチン、ＶＥＧＦ  ｄｅｃｏｙタンパク質、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡなどが含まれる。
【００６２】
浸潤による転移を抑制する「転移抑制遺伝子」として、例えばＢＲＭＳ１、ＣＲＳＰ３、ＤＲＧ１、ＫＡＩ１、ＫＩＳＳ１、ＮＭ２３および多様なＴＩＭＰ（Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）を含む。
【００６３】
本発明の明細書において用語「抗体遺伝子（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｇｅｎｅ）」は、正常細胞とは異なって、癌細胞で優先的または独占的に発現する抗原に結合して癌細胞の細胞死滅を誘導できる特定の抗体を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗体遺伝子の例には、ａｎｔｉ−ＤＲ４／ＤＲ５、ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４、ａｎｔｉ−ＰＤ−１、ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１、ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ、ａｎｔｉ−ＶＥＧＦＲ、ａｎｔｉ−ｃＭｅｔ、ａｎｔｉ−Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ、ａｎｔｉ−Ｗｎｔ、ａｎｔｉ−Ｌｙ４９などをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００６４】
本発明の明細書で用語「免疫調節遺伝子（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ、ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ）」は、免疫関連因子の発現を調節するすべての遺伝子を意味するものであって、例えばサイトカイン（例、インターフェロン−アルファ、−ベータ、−デルタおよび−ガンマ）、インターロイキン（例、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２３）およびコロニー刺激因子（例、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）を暗号化する遺伝子、ケモカイングループ（単核球化学走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単核球化学走化性タンパク質２（ＭＣＰ−２）、単核球化学走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、単核球化学走化性タンパク質４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、マクロファージ炎症性タンパク質１γ（ＭＩＰ−１γ）、マクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰ−３α）、マクロファージ炎症性タンパク質３β（ＭＩＰ−３β）、ケモカイン（ＥＬＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質４（ＭＩＰ−４）、マクロファージ炎症性タンパク質５（ＭＩＰ−５）、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−イプシロン（ｐ５００）、胸腺活性化−調節されるケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、Ｉ−３０９、ヒトタンパク質ＨＣＣ−１／ＮＣＣ−２、ヒトタンパク質ＨＣＣ−３、マウスタンパク質Ｃ１０など）および補助刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：Ｂ７．１とＢ７．２のようなＴ細胞活性に必要な補助分子）などがある。
【００６５】
その他、本発明のベクターにより伝達され得るヌクレオチドは、ＣＤ４４ｖ３／６、ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＩＦＮ−γ、ＨＩＦ−１αｓｉＲＮＡ、ＩＤＯ２（ｉｄｏｌａｍｉｎｅ  ２、３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ２）ｓｉＲＮＡ、Ｗｎｔ  ｄｅｃｏｙタンパク質、ＶＥＧＦ  ｄｅｃｏｙタンパク質、ｃＭｅｔ  ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２６ａ）、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−５０６（ｆｏｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｑ１）、ｓｈＡｋｔ１、ｓｈＭＹＯ６、ＮＩＳ（ｓｏｄｉｕｍ−ｉｏｄｉｎｅ  ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ）、ＨＳＶ−ＴＫ、ＬＭＰ２Ａ／ＬＭＰ１、ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０、ＰＦ−４ｖａｒ／ＣＸＣＬ４Ｌ１、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ、ＣＤ  １４７をターゲッティングするヒト−マウスキメラ抗体（ｈｕｍａｎ−ｍｏｕｓｅｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｌｉｎ２８をターゲッティングするジンクフィンガータンパク質、ＶＥＧＦターゲッティング  ジンクフィンガータンパク質、ｃＭｅｔターゲッティングジンクフィンガータンパク質、Ｃａｓ  ９タンパク質とｇｕｉｄｉｎｇ  ＲＮＡ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ＴＲＡＩＬタンパク質、またはＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）コーディング遺伝子があり、本発明の治療学的トランス遺伝子は、これに限定されない。上述したｍｉＲ−９９ａは、ｍＴＯＲ、ＡＫＴ１およびＦＧＦＲ３をターゲッティングし、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐは、ＰＳＥＮ１遺伝子をターゲッティングする。
【００６６】
本発明の一具現例によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、カプシドタンパク質エンコーディングヌクレオチドに蛍光性タンパク質エンコーディングヌクレオチドをさらに含むことができる。この場合、挿入された細胞内アデノウイルスの位置追跡が容易な組換えアデノウイルスを提供することができる。
【００６７】
本発明によれば、アデノウイルスのカプシドを構成するタンパク質に蛍光標識子タンパク質を挿入する場合、リアルタイムでウイルスの経路および分布を追跡することができる。ウイルスの遺伝子内に標識遺伝子が挿入された場合、ＤＮＡがタンパク質に転換された後にタンパク質の発現が確認された反面、ＩＸタンパク質に標識タンパク質が結合されたウイルスの場合、ウイルスの感染経路に関係なく、ウイルスの感染初期からタンパク質の発現およびウイルスの位置追跡が可能である。したがって、本発明は、有用な非侵襲的分子映像ツールとして用いられる。
【００６８】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のカプシドタンパク質は、ｐＩＸでありうる。
【００６９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の蛍光性タンパク質は、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＹＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＲＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＢＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）よりなる群から選ばれる。
【００７０】
前記間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）は、成体幹細胞の一種であって、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞など多様な細胞に分化が可能であると報告されている。間葉系幹細胞は、遺伝子運搬体の一つとして多く研究されているが、特定のレセプターなどが欠如していて、アデノウイルスが感染を起こさないので、遺伝子伝達体として使用されるのに困難があった。
【００７１】
しかしながら、本発明の組換えアデノウイルスは、ファイバータンパク質の変形によって間葉系幹細胞への導入能が改善されて、体内の所望の部位に目的遺伝子を伝達する遺伝子伝達体として効果的に使用することができる。
【００７２】
間葉系幹細胞の場合、アデノウイルスの導入が難しくて、遺伝子治療剤として使用できる水準まで導入させるためには、多数のアデノウイルスが必要であった。しかしながら、このような場合、アデノウイルスによる間葉系幹細胞の生存能および特性が低下し、間葉系幹細胞の早い死滅を招く問題点があった。しかしながら、本発明の配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルスを用いて間葉系幹細胞に搭載する場合、低い濃度のＭＯＩでもアデノウイルスの導入が良好に行われ得ることを実験的に確認した。したがって、本発明の組換えアデノウイルスを搭載した幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）の場合、他の幹細胞と比較して高い生存能を有しており、搭載されたアデノウイルスが増殖できる培養体の役割をすると共に、それ自体で免疫原性を起こさない、遺伝子治療で優れた遺伝子伝達体として使用され得る。
【００７３】
本発明の一具体例において、前記幹細胞は、全身性投与または局部投与が可能なものでありうる。一例として、全身性投与は、静脈投与と腹腔内投与、肺腔投与、そして尿道内注入（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）でありうるが、これに限定されるものではない。従来、遺伝子治療でアデノウイルス自体を遺伝子伝達体として使用する場合、自らの免疫原性などによって体内注入後に目的部位に到達する前に消滅したり肝毒性を誘発する問題があった。しかしながら、本発明のアデノウイルス搭載幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）の場合、免疫反応が低いか、ないため、全身投与が可能であり、腫瘍細胞にターゲット性に優れていて、肝毒性を誘発しない効果があるという点から優れた特性を有する。
【００７４】
このような側面で、本発明の遺伝子伝達用組成物は、全身性投与用でありうる。従来、アデノウイルスベクターのみを遺伝子伝達体として使用する場合、全身投与が不可能であり、目的部位に到達する前に体内免疫細胞などによりアデノウイルスベクターが消失される遺伝子伝達の困難があったが、本願発明のアデノウイルスを搭載した幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）の場合、癌特異的な特性の他に、免疫反応が低いか、ないため、全身投与が可能であり、腫瘍細胞にターゲット性に優れており、肝毒性を誘発しない効果があるので、遺伝子伝達効率を顕著に高めることができる。
【００７５】
前記間葉系幹細胞は、骨髄などから分離することができ、患者自分または血液銀行のデータベースを用いて同種の間葉系幹細胞を使用することができる。したがって、本発明のアデノウイルス搭載幹細胞を遺伝子伝達体として用いる場合、自己治療だけでなく、同種の治療も可能であるので、遺伝子治療のコストをさらに低減することができる。
【００７６】
本発明の遺伝子発現調節配列および目的遺伝子を含むアデノウイルスを間葉系幹細胞内に導入する方法は、当業界に公知となった多様な方法を通じて実施され得る。具体的に、前記遺伝子導入は、当業界に公知となったウイルス感染方法により行われ得る。
【００７７】
本発明の遺伝子発現調節配列、目的遺伝子およびＫ３５ファイバーを含む組換えアデノウイルスは、上述した通りであり、記載の重複を避けるためにその記載を省略する。
【００７８】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、配列番号１の配列を含む組換えアデノウイルスが導入された間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）を含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００７９】
前記本発明の遺伝子伝達用組成物は、癌特異的遺伝子伝達用組成物でありうる。
【００８０】
本発明の一実施例によって、前記アデノウイルスに含まれた遺伝子発現調節配列は、肝癌細胞に特異的に遺伝子の発現が可能なプロモーターおよびエンハンサーに設計されたものであり得、さらに低酸素の条件で遺伝子発現に優れているようにＨＲＥドメイン配列を含むところ、本発明の具体的な実施例において、ＡＦＰ陽性肝癌細胞はもちろん、ＡＦＰ陰性肝癌細胞の全部で特異的に遺伝子発現が現れ、正常細胞には目的遺伝子が発現しないことを確認した。
【００８１】
本発明の他の一実施例によって、本発明は、癌腫の種類に区分なしに治療に使用され得る汎癌特異的癌細胞殺傷用アデノウイルス（ｐａｎ−ｃａｎｃｅｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｄ）を用いて、腫瘍組織で特異的に治療効果を有することを開示しているという点から、本発明の遺伝子伝達用組成物は、目的遺伝子の種類によって効果を異ならしめることができるので、癌の種類に制限されない。
【００８２】
本発明の組換えアデノウイルスおよび幹細胞について先立って記述された内容と重複を避けるためにその記載を省略し、上述した内容を準用することができる。
【００８３】
本発明のさらに他の様態において、本発明は、５’から３’方向に（ａ）ＨＲＥ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）ドメイン配列、（ｂ）ＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーターのエンハンサーＡ配列、（ｃ）ＡＦＰプロモーターのエンハンサーＢ配列、および（ｄ）ＡＦＰプロモーター配列を含む遺伝子発現調節配列；前記遺伝子発現調節配列に作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）治療遺伝子；そして血清型３５（Ｋ３５）ファイバー（ＦＩＢＥＲ）のノブ（ｋｎｏｂ）をコードする配列；を含む組換えアデノウイルスが導入された間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）を薬剤学的有効量で含む薬剤学的組成物を提供する。
【００８４】
前記薬剤学的組成物は、癌治療用でありうる。本発明において癌の種類は、本発明のアデノウイルスに挿入される治療遺伝子の種類およびプロモーターの種類などによって治療対象とする癌の種類が変わり得るので、前記癌の種類に制限を受けない。癌の具体的な例として、これに限定されるものではないが、胃癌、肺癌、肝癌、子宮頸癌、白血病、すい臓癌、小児固形癌、結腸癌、皮膚癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、腎臓癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫、前立腺癌、軟組織癌、甲状腺癌、上咽頭癌、食道癌、眼球癌、乳癌または胆管癌がある。
【００８５】
本発明において一例として汎癌（ｐａｎ  ｃａｎｃｅｒ）特異的腫瘍殺傷型（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスとしても効果を確認したところ、前記癌腫の種類に制限を受けなく、また、肝癌治療用遺伝子を挿入してその効果を確認したという点から肝癌治療用でありうる。
【００８６】
前記癌は、癌細胞または腫瘍組織でありうる。本発明の一実施例において、アデノウイルス搭載幹細胞は、ＡＦＰ陽性肝癌細胞およびＡＦＰ陰性肝癌細胞の全部で治療遺伝子の発現を通じて癌細胞殺傷能を示すことができるところ、肝癌細胞の表現型に関係なく、本発明のアデノウイルス搭載幹細胞を治療に用いることができる。
【００８７】
本発明のアデノウイルスを搭載した幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）を用いて癌を治療する場合、癌特異的に治療遺伝子の発現が可能で、他の正常細胞に影響を与えず、免疫反応が低いか、ないため、全身投与が可能であり、腫瘍細胞にターゲット性に優れ、肝毒性を誘発しない効果があるので、遺伝子伝達効率を顕著に高めることができる。また、体内注入後にアデノウイルスにより間葉系幹細胞自体が死滅するところ、間葉系幹細胞の体内残存による副作用の発生憂慮を解決することができる。
【００８８】
本明細書で用語「治療」は、疾患に関連した臨床的状況を抑制したり緩和して有利に変更するすべての行為を意味する。また、治療は、治療を受けない場合に予想される生存率と比較して増加した生存を意味する。前記治療は、治療的手段以外の予防的手段を同時に含むことができる。本発明では、治療は、一例として腫瘍細胞の死滅または殺傷を意味する。
【００８９】
本明細書において、「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、例えば、犬、猫、マウス、ヒトなどでありうる。
【００９０】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んで製剤化され得る。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を相当に刺激せず、投与成分の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。本発明における薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれら成分のうち１成分または１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液および静菌剤など他の通常の添加剤を添加して、組織または臓器に注入するのに適した注射剤の形態に剤形化することができる。また、等張性滅菌溶液、または場合によって滅菌水や生理食塩水を添加して注射可能な溶液になりうる乾燥製剤（特に凍結乾燥製剤）に剤形化することもできる。
【００９１】
また、好ましくは、本発明の組成物は、充填剤、賦形剤、崩解剤、結合剤および滑沢剤などをさらに含むことができる。また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供することができるように当業界に公知となった方法を使用して剤形化され得る。
【００９２】
本発明で用語「投与」は、いかなる適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与され得る。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与され得るが、これに制限されなく、好ましくは静脈内投与され得る。
【００９３】
本明細書で、「有効量」は、目的とする治療されるべき特定疾患の発病または進行を遅延したり全面的に中止させるのに必要な量を意味する。本発明において組成物は、薬学的有効量で投与され得る。適切な総１日使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医者によって決定され得るというのは、当業者に自明なことである。本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって異なる製剤が使用されるか否かを始めとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使用されるか、同時に使用される薬物を始めとする多様な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって相異に適用することが好ましい。
【００９４】
以下、本発明を製造例および実験例を通じて詳細に説明する。下記実施例および実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９５】
［準備例］実験の準備および実験方法
１．実験材料および準備
本発明の実験で使用された細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３（アデノウイルスＥ１領域を発現するヒト胚芽腎臓細胞株）、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞株）、ＡＦＰ−陽性ＨＣＣ（Ｈｅｐ３Ｂ）、ＡＦＰ−陰性ＨＣＣ（Ｈｅｐ１）は、別途の言及がないところ、ＡＴＣＣ（ＵＳＡ）から購入して使用した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、およびゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）で補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ変形されたＥａｇｌｅ’ｓ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で培養した。すべての細胞株は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターで保管された。健康な成人男性の寄贈者から骨髓吸引から分離したヒトＭＳＣをＰｈａｒｍｉｃｅｌｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（城南、韓国）から提供されて使用した。冷凍保管された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）ＭＳＣ細胞を解凍させて、研究に使用した。ＭＳＣは、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）およびゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）が含まれた低グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ変形されたＥａｇｌｅ’ｓ培地で３７℃、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターで培養された。
【００９６】
本発明で肝癌特異的にＷＮＴｉを発現するアデノウイルスに対する表記としてＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ＷＮＴｉまたはＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉを交換的に使用した。
【００９７】
２．統計分析
データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。統計的有意性は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ−ｔｅｓｔまたはＯｎｅ−ｗａｙ  Ａｎｏｖａ検定（ＳＰＳＳ  １３．０ソフトウェア，ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）により決定した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意なものと見なされた。
【００９８】
［実施例１］肝癌標的殺傷アデノウイルスの製作
試験例１−１．ＡＦＰプロモーターのエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）とサイレンサー（ｓｉｌｅｎｃｅｒ）部位を組換えした肝癌特異的プロモーターの製作
肝癌特異的アデノウイルスを開発するために、まず、肝癌患者において発現が高いＡＦＰタンパク質のプロモーター部位を組換えし、それぞれのプロモーター活性を比較した。
【００９９】
具体的に、５．１ＫｂのＡＦＰプロモーター部位が挿入されたｐｈＡＦＰ５．１からエンハンサーＡ（ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ａ，３６５  ｂｐ，配列番号３）、エンハンサーＢ（ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｂ，１９３ｂｐ，配列番号４）、ディスタルサイレンサー（ｄｉｓｔａｌ  ｓｉｌｅｎｃｅｒ，９０ｂｐ）、プロクサマルサイレンサー（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｉｌｅｎｃｅｒ，１５６ｂｐ）、ＡＦＰミニアルプロモーター（ＡＦＰ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，３００ｂｐ，配列番号５）部位をそれぞれＰＣＲで増幅してＤＮＡ断片を得て、標識遺伝子としてルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が挿入されたベクターであるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒにそれぞれの断片を順次に挿入して、変形されたＡＦＰプロモーターを製作した（図１）。
【０１００】
試験例１−２．ＡＦＰプロモーターのエンハンサーとサイレンサー部位を組換えした肝癌特異的プロモーターの活性の比較
前記試験例１−１で製作されたＡＦＰプロモーターによる組織特異的なルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の活性を確認するために、ＨＣＣ細胞株のうちＡＦＰ発現が高いＨｕｈ７、中間程度の発現水準を示すＨｅｐ３ＢとＨｅｐＧ２、ＡＦＰを発現しないＨｅｐ１、肝癌以外の他の組織の癌細胞に脳癌細胞株であるＵ３４３、肺癌細胞株であるＡ５４９、ヒト正常細胞株であるＢＪ、ＷＩ３８、ＣＢＨＥＬ、ＩＭＲ９０にそれぞれのＤＮＡを形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４８時間後に細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させて、ルシフェラーゼ活性分析（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を行った（図２）。
【０１０１】
図２に示されたように、ＡＦＰを発現するＨＣＣ細胞株であるＨｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２細胞株でルシフェラーゼ活性が高く現れ、ＡＦＰを発現しないｈｅｐ１および他の組織の癌細胞、正常細胞の全部でほとんどルシフェラーゼ活性が現れなかった。実験に用いられたプロモーターのうち２コピー（ｃｏｐｙ）のエンハンサーＡと１コピーのエンハンサーＢがミニアルプロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と結合されたａ２ｂｍに連結されたルシフェラーゼ活性が最も高く、前記プラスミドが肝癌で特異的に発現される組織特異性も有することを確認することができた。
【０１０２】
試験例１−３．変形されたＡＦＰプロモーターにより遺伝子の発現が調節されるアデノウイルスのシャトルベクターの製作
前記試験例１−２の多様な組換えプロモーターによりルシフェラーゼの発現が調節されるプラスミドを用いた実験（ルシフェラーゼ分析）結果で最も優れた遺伝子伝達効率を示すプロモーターであるａ２ｂｍとａ２ｂＳｍを選択し、これらの陰性対照群としてＡＦＰｍを用いて、それぞれ複製不能アデノウイルスの遺伝子に挿入してウイルスを製作した。
【０１０３】
複製不能アデノウイルスは、まず、アデノウイルスのＥ１シャトルベクターであるｐ△Ｅ１ｓｐ１ＡにＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素を用いてＧＦＰ遺伝子を挿入してｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／ＧＦＰシャトルベクターを製作した。製作されたベクターをＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで切った部位にＡＦＰｍプロモーターが挿入されたｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／ＡＦＰｍ／ＧＦＰ、ａ２ｂｍプロモーターが挿入されたｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／ａ２ｂｍ／ＧＦＰ、ａ２ｂＳｍプロモーターが挿入されたｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／ａ２ｂＳｍ／ＧＦＰベクターをそれぞれ製作した。また、低酸素状態でもウイルスの活性が阻害されないようにするために、血管新生因子であるＶＥＧＦのＨＲＥドメインを６コピー（ｃｏｐｙ）反復して、ＡＦＰプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の上位ＭｌｕＩ部位に挿入したｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／Ｈａ２ｂｍ／ＧＦＰとｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／Ｈａ２ｂＳｍ／ＧＦＰシャトルベクターを製作した（図３）。
【０１０４】
試験例１−４．変形されたＡＦＰプロモーターにより遺伝子の発現が調節されるアデノウイルスの製作
試験例１−３で製作された５種類のＥ１シャトルベクターをＸｍｎ  Ｉ制限酵素で切断して線形化させ、アデノウイルストータルベクターであるｄＥ１は、ＢｓｔＢ  Ｉ制限酵素で切断して線形化させた後、シャトルベクターとトータルベクターを共に大腸菌ＢＪ５１８３で相同組換えして、最終的にアデノウイルスＡＦＰｍ−ｄＥ１／ＧＦＰ、ａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰ、ａ２ｂＳｍ−ｄＥ１／ＧＦＰ、Ｈａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰとＨａ２ｂＳｍ−ｄＥ１／ＧＦＰを製作した（図４）。
【０１０５】
次に、前記試験例１−３で製作された５種類のプラスミドＤＮＡをＰａｃ  Ｉ制限酵素で切断して線形化させた後、アデノウイルス生産細胞株であるＨＥＫ２９３にリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いて形質転換してウイルスを生産した。生産されたアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞株に再感染させてＣｓＣｌ密度勾配（ＣｓＣｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）法でアデノウイルスを濃縮して純粋分離した後、限界希釈検定（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）とウイルスゲノム（ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ）の吸光度による光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ、Ｏ．Ｄ）でアデノウイルスの力価を決定した。
【０１０６】
試験例１−５．変形されたＡＦＰプロモーターによる肝癌特異的遺伝子発現調節の可否の確認
前記試験例１−１で製造された組換えＡＦＰプロモーター（ＡＦＰｍ，ａ２ｂｍ，ａ２ｂＳｍ，Ｈａ２ｂｍ，Ｈａ２ｂＳｍ）を含み、肝癌特異的に遺伝子の発現が調節されるアデノウイルスのＧＦＰ遺伝子の発現調節の可否を確認するために、ＡＦＰ発現水準が異なる肝癌細胞株（Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐ１）および他の組織の癌細胞株（Ａ５４９）、ヒト正常細胞株（ＨａＣａＴ）に複製不能アデノウイルス（ＡＦＰｍ−ｄＥ１／ＧＦＰ、ａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰ、ａ２ｂＳｍ−ｄＥ１／ＧＦＰ、Ｈａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰおよびＨａ２ｂＳｍ−ｄＥ１／ＧＦＰ）をそれぞれ感染させ、４８時間後にＦＡＣＳを用いてＧＦＰを発現する細胞の群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を確認した。また、低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）状態でのプロモーター活性を調べるための実験群は、それぞれのアデノウイルス感染後に低酸素（１％Ｏ２）条件で培養後、さらに、正常酸素濃度の条件で培養することを２サイクル（ｃｙｃｌｅ）反復した。その結果を図６ａ、図６ｂ、図６ｃ、図６ｄ、図６ｅおよび図６ｆに示した。
【０１０７】
図６ａ、図６ｂ、図６ｃ、図６ｄおよび図６ｆに示されたように、ＡＦＰ発現肝癌細胞株（Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ）でＨａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰによるＧＦＰ発現が最も高く、その次にＨａ２ｂＳｍ−ｄＥ１／ＧＦＰが高かった。また、ＡＦＰが陽性である肝癌細胞株（Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、またはＨｅｐ３Ｂ）だけでなく、ＡＦＰが発現しない肝癌細胞株（Ｈｅｐ１）と肺癌細胞株（Ａ５４９）においてもＨａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰおよびＨａ２ｂＳｍ−ｄＥ１／ＧＦＰは、低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件で正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉａ）の条件より発現量が増加することを確認することができた。反面、正常細胞（ＨａＣａＴ、図６ｅ）では、すべてのベクターでＧＦＰの発現量が非常に低いことを確認した。したがって、本発明によって製造されたプロモーターが癌特異的なプロモーターとして５種類の候補ウイルスのうちＨａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰが最も優れた癌特異的遺伝子発現ウイルスであることを確認し、以下、実験を実施した。
【０１０８】
試験例１−６．肝癌組織で変形されたＡＦＰプロモーターによる肝癌特異的遺伝子の発現調節の可否の確認
前記試験例１−４で製造されたアデノウイルスが癌組織内で肝癌特異的にＡＦＰプロモーターによる遺伝子発現を調節できるか否かを確認するために、肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂを用いて腫瘍を形成し、ａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰまたはＨａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰアデノウイルスを腫瘍内に注入して、ＧＦＰ発現の有無を蛍光で観察した。
【０１０９】
肝癌組織で変形されたＡＦＰプロモーターによる肝癌特異的遺伝子の発現調節の可否を確認するために、６週齢のヌードマウスの皮下に１ｘ１０７個のＨｅｐ３Ｂ細胞を注入して腫瘍を形成し、腫瘍の大きさが２００ｍｍ３程度になったとき、５ｘ１０９ＶＰのａ  ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰまたはＨａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰをそれぞれ二日間隔で３回腫瘍に直接注入した。３日後、腫瘍を摘出してパラフィンブロックを製作し、これを３μｍ厚さで切断してスライドに付着した後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）、１００％、９５％、８０％、７０％エタノール溶液に順に浸漬して、パラフィンを除去（ｄｅｐａｒａｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）した。これを０．５％ＮＰ４０溶液に浸漬して、組織の透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を高めた後、低酸素状態を標識する抗−ピモニダゾール（ａｎｔｉ−ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）抗体（ＨＰ１−１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）と４℃で一晩中（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）反応させて、低酸素部位（ｈｙｐｏｘｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）を赤色（Ｒｅｄ）で染色した。翌日、アレクサ５６８（ａｌｅｘａ  ５６８）が結合された二次抗体で常温で２時間ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）させ、ａｎｔｉ−ＧＦＰ抗体（ＭＡＢ３５８０，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）とさらに４℃で一晩中（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）反応させて、ＧＦＰタンパク質を緑色（Ｇｒｅｅｎ）で染色した。翌日、アレクサ４４８（ａｌｅｘａ  ４８８）が結合された二次抗体と常温で２時間反応させた後、ＤＡＰＩで染色（細胞核は青色（Ｂｌｕｅ）で染色）と蛍光専用マウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）溶液でマウンティングして、共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。
【０１１０】
図７に示されたように、腫瘍細胞内でＨＲＥが含まれていないプロモーターに比べてＨＲＥが含まれたプロモーターを搭載したアデノウイルス（Ｈａ２ｂｍ−ｄＥ１／ＧＦＰ）の遺伝子発現が高く、ＨＲＥの挿入で正常酸素部位だけでなく腫瘍内の低酸素部位でもＧＦＰの発現が維持されることを確認することができた。
【０１１１】
試験例１−７．変形されたＡＦＰプロモーターによりアデノウイルスの複製が調節される肝癌細胞特異的細胞殺傷アデノウイルスの製作
先立って複製不能アデノウイルスを用いて進行された研究結果に基づいて様々な種類のプロモーターのうち最も効率性と特異性が高いａ２ｂｍとＨａ２ｂｍプロモーターを選択して、肝癌細胞特異的細胞殺傷アデノウイルスを製作した。
【０１１２】
肝癌標的化アデノウイルス（ＨＣＣ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏＡｄ  ｖｅｃｔｏｒ）を製作するために、ｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／ａ２ｂＡＦＰｍとｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／Ｈａ２ｂＡＦＰｍベクターをＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで切った後、ａ２ｂｍとＨａ２ｂｍプロモーターをそれぞれＥ１Ｂ１９Ｄｋａが除去されて細胞殺傷能に優れたアデノウイルスシャトルベクターに挿入して、ｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／ａ２ｂＡＦＰｍ／ｄ１９とｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／Ｈａ２ｂＡＦＰｍ／ｄ１９シャトルベクターを製作した（図８）。
【０１１３】
次に、前記２種類のシャトルベクターと対照群であるｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ／ｄ１９シャトルベクターをＸｍｎＩ制限酵素で切断して線形化し、アデノウイルストータルベクターｄＥ１をＢｅｔＢ  Ｉ制限酵素で切断して線形化させた後、シャトルベクターとトータルベクターを共に大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させてＥ１相同組換えし、最終的に対照群ウイルスと２種類の肝癌特異的殺傷アデノウイルスであるｄ１９、ａ２ｂｍ−ｄ１９、またはＨａ２ｂｍ−ｄ１９を製作した（図９）。
【０１１４】
製作されたプラスミドＤＮＡをＰａｃＩ制限酵素で切断して線形化させた後、アデノウイルス生産細胞株であるＨＥＫ２９３にリポフェクタミンを用いて形質転換してウイルスを生産した。生産されたアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞株に再感染させてＣｓＣｌ濃度勾配法でアデノウイルスを濃縮して純粋分離した後、限界希釈検定とウイルスゲノムの吸光度による光学密度（Ｏ．Ｄ）でアデノウイルスの力価を決定した。
【０１１５】
試験例１−８．変形されたＡＦＰプロモーターにより複製が調節される肝癌特異的細胞殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能の確認
前記試験例１−７で製作されたアデノウイルスによる肝癌特異的細胞殺傷能を比較するために、多様な細胞株（Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｐ１、ＩＭＲ９０およびＭＲＣ５）にｄ１９、ａ２ｂｍ−ｄ１９、またはＨａ２ｂｍ−ｄ１９アデノウイルスをそれぞれ感染させた後、ＭＴＴ分析を行った。
【０１１６】
図１０ａ、図１０ｂ、図１０ｃ、図１０ｄおよび図１０ｅに示されたように、実験に用いられた癌細胞（Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｐｌ）と正常細胞（ＩＭＲ９０、ＭＲＣ５）の全部でｄ１９アデノウイルスの細胞殺傷能が高く現れることを確認した。しかしながら、ａ２ｂｍ−ｄ１９アデノウイルスを感染させた場合、細胞株のＡＦＰ発現程度が高い細胞だけで殺傷能を示し、特に正常細胞であるＩＭＲ９０とＭＲＣ５での細胞生存率は、何らの処理もしない細胞群とほぼ類似しているか、さらに高かった。また、ＨＲＥが追加に挿入されたＨａ２ｂｍ−ｄ１９アデノウイルスを感染させたとき、低酸素の条件でＡＦＰを発現する細胞の細胞殺傷能が顕著に増加した。特に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株では、強力な細胞殺傷能を有するｄ１９アデノウイルスと類似した水準の細胞殺傷能を示した。しかしながら、ＩＭＲ９０とＭＲＣ５のような正常細胞株では、ウイルスを処理しない実験群と類似した細胞生存率を示して、本発明の変形されたＡＦＰプロモーターを搭載したアデノウイルスが肝癌細胞に特異的に殺傷能を有することを確認することができた。ＡＦＰを発現しないＨｅｐ１細胞株の場合、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９アデノウイルスを感染させたとき、低酸素条件で細胞殺傷能が約６０％増加したことから見て、異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が高い肝癌組織内でＡＦＰを発現する癌細胞だけでなく、ＡＦＰを発現しない癌細胞をも除去することができて、さらに優れた癌細胞殺傷効果を有すると予想した。
【０１１７】
試験例１−９．変形されたＡＦＰプロモーターにより複製が調節される肝癌特異的細胞殺傷アデノウイルスのウイルス複製能の確認
本発明のアデノウイルスが低酸素状態で細胞殺傷能が顕著に増加した現象がウイルスの複製能の増加と関連があるかを確認するために、Ｈｅｐ３Ｂ肝癌細胞株とＡ５４９肺癌細胞株にａ２ｂｍ−ｄ１９またはＨａ２ｂｍ−ｄ１９アデノウイルスをそれぞれ感染させた後、細胞培養液と生きている細胞全部を回収してＨＥＫ２９３細胞株に再感染させて、限界希釈検定を行った。
【０１１８】
図１１に示されたように、肺癌細胞株では、ａ２ｂｍ−ｄ１９とＨａ２ｂｍ−ｄ１９アデノウイルスの複製能の差異がないが、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９アデノウイルスが感染したＨｅｐ３Ｂ細胞株において低酸素状態でもウイルスの複製が阻害されず、かえって正常酸素条件と比較したときとａ２ｂｍ−ｄ１９ウイルスが感染した細胞と比較したとき、４０倍以上複製が増加することを確認した。
【０１１９】
試験例１−１０．スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）内で肝癌特異的細胞殺傷アデノウイルスの複製能の検証
生体外で自然的に癌組織の内部に低酸素区域が形成されるようにするために、ヌードマウスに肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂを注入して形成された腫瘍を摘出して、スフェロイド培養（ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を行った。スフェロイド培養（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）時に二種類のアデノウイルスａ２ｂｍ−ｄ１９またはＨａ２ｂｍ−ｄ１９をそれぞれ感染させたスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）部分（ｓｅｃｔｉｏｎ）でアデウイルスの複製と関連したＥ１Ａタンパク質に対する抗体を用いた組織免疫染色法を行った。
【０１２０】
その結果、図１２に示されたように、ａ２ｂｍ−ｄ１９を感染させた組織では、ウイルスの接近が容易な正常酸素区域であると予想されるスフェロイドマージン（ｍａｒｇｉｎ）部分だけでＥ１Ａが観察された反面、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９を感染させた組織では、スフェロイドマージン（ｍａｒｇｉｎ）だけでなく、自然的に低酸素条件が形成されたと予想される組織の内部でもＥ１Ａタンパク質が観察された。これは、本発明の癌特異的細胞殺傷アデノウイルスであるＨａ２ｂｍ−ｄ１９が、生体外だけでなく、生体内の低酸素条件でも複製能が阻害されないことを示唆する。
【０１２１】
試験例１−１１．生体内肝癌特異的細胞殺傷アデノウイルスの複製能と細胞殺傷能の検証
生体外実験結果に基づいて生体内で肝癌特異的細胞殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能と複製能を検証するために、ヌードマウスの皮下にＨｅｐ３Ｂ細胞株を注入して形成された腫瘍にＰＢＳ、アデノウイルスａ２ｂｍ−ｄ１９またはアデノウイルスＨａ２ｂｍ−ｄ１９をそれぞれ投与した。これを用いて腫瘍組織内でアデノウイルスの複製と関連したＥ１Ａタンパク質の発現様相を調査し、ＴＵＮＥＬアッセイを通じて細胞殺傷程度を比較した。
【０１２２】
図１３に示されたように、アデノウイルスのＥ１Ａタンパク質に対する抗体を用いて免疫染色法を施行した結果、ＨＲＥが挿入されたＨａ２ｂｍ−ｄ１９を処理した実験群の場合、ａ２ｂｍ−ｄ１９を処理した実験群に比べて、Ｅ１Ａタンパク質の発現が顕著に増加したことを観察することができ、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９グループの腫瘍組織は、Ｅ１Ａが組織の広い範囲内に均一に分布していることを観察することができた。ＴＵＮＥＬアッセイ結果でも、Ｅ１Ａと同様に、ＨＲＥが搭載されたＨａ２ｂｍ−ｄ１９を処理した実験群でＴＵＮＥＬ染色陽性である細胞アポトーシスが進行された細胞が腫瘍組織内に均一に分布していることを観察することができた。これを通じて、腫瘍組織内の低酸素条件でもＨＲＥが含まれたＨａ２ｂｍ−ｄ１９の場合、ＨＲＥがないａ２ｂｍ−ｄ１９に比べてウイルス複製能の阻害なしに優れた細胞殺傷効果を示すことを確認することができた。
【０１２３】
試験例１−１２．同所移植モデルを用いた生体内肝癌特異的複製可能アデノウイルスの抗腫瘍効果の検証
動物実験は、６週齢の雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）をオリエント（Ｏｒｉｅｎｔ  Ｉｎｃ．，Ｋｏｒｅａ）から購入して施行した。動物飼育室の温度は２２±２℃、湿度は５５〜６０％に維持され、明暗循環が１２時間単位で調節されるようにし、放射線照射で滅菌した固形飼料（中央実験動物、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）と滅菌された給水を自由に摂取するようにした。
【０１２４】
実際腫瘍形成モデルに最も近い同所移植モデルを確立するために、６週齢雄性ヌードマウスの腹部皮下を切開して、２０μｌのＨＢＳＳで浮遊させた１ｘ１０６個のルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を安定的に発現するＨｅｐ３Ｂ細胞をマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）２０μｌと混ぜて左側肝葉に直接注入し、さらにシールした。細胞注入２週後、マウスから血液を採取して血清を分離した後、ＡＦＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いて血液内ＡＦＰ発現量を測定し、ＡＦＰ発現量が７００ｎｇ／ｍＬ以上のマウスを３グループに分けて実験に用いた。ＰＢＳまたは二種類のアデノウイルス（ａ２ｂｍ−ｄ１９、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９）を２．５ｘ１０１０ＶＰずつ二日間隔で３回尻尾を通じて静脈注射し、１週間間隔で２００ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を腹腔内投与した後、ＩＶＩＳ  １００（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇを実施した。イメージング（Ｉｍａｇｉｎｇ）を通じて得られた信号は、ＩＧＯＲ−ＰＲＯ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて定量分析した。ウイルス注入してから５週後に血液を採取して血清を分離して、血液内ＡＦＰ発現量をＥＬＩＳＡを用いて測定し、肝癌組織は、摘出して重さを測った後、パラフィンブロックで製作した。ＰＢＳ、ａ２ｂｍ−ｄ１９またはＨａ２ｂｍ−ｄ１９をそれぞれ静脈注射した後、一週間ごとに光学写真（ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて抗腫瘍効果を確認した。
【０１２５】
図１４および図１５に示されたように、アデノウイルスを注入して５週が経過した後、三つのグループ間の抗腫瘍効果が最も顕著な差異を示した。ａ２ｂｍ−ｄ１９ウイルスを投与したグループの場合、６匹の全部で腫瘍のサイズが持続的に大きく増加することを確認することができた。反面、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９を投与したグループの場合、多くのマウスで腫瘍の成長速度が鈍化することを確認することができ、結果的に、ウイルスを投与して５週が経過したとき、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９を投与したグループが、ａ２ｂｍ−ｄ１９を投与したグループに比べて腫瘍のサイズがさらに小さくなったことを確認した。腫瘍のサイズ変化を全体（ｔｏｔａｌ）フラックス（ｆｌｕｘ）数値を用いて定量化してみると、ウイルス投与５週後、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９を投与したグループは、ａ２ｂｍ−ｄ１９を投与したグループに比べて５倍低い数値を示した。これは、約８２％の腫瘍成長抑制効果を意味するものであって、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９の投与が、優れた抗腫瘍効果を有することを確認した。また、肝癌特異的細胞殺傷アデノウイルスによる抗腫瘍効果をイメージと同時に血清内ＡＦＰ発現量（ウイルス投与５週後）を比較してみると、全体フラックス（ｔｏｔａｌ  ｆｌｕｘ）数値と同様に、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９を投与したグループがａ２ｂｍ−ｄ１９を投与したグループに比べて５倍低い濃度のＡＦＰを発現した。
【０１２６】
［実施例２］肝癌標的殺傷アデノウイルス搭載用幹細胞の製作
試験例２−１．ＭＳＣへのアデノウイルスの流入効率の最適化
間葉系幹細胞（ＭＳＣ、パミセル株式会社）対象アデノウイルスの伝達効率（ｔｒａｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を確認するために、ＬａｃＺ遺伝子を発現するファイバー（ｆｉｂｅｒ）が互いに異なる３種類のウイルスであるｄＥ１／ＬａｃＺ、ｄＥｌ−ｋ３５／ＬａｃＺ、ｄＥｌ−ＲＧＤ／ＬａｃＺを用いて間葉系幹細胞（ＭＳＣ、パミセル株式会社）にそれぞれのウイルスを０〜２００ＭＯＩで感染させ、二日後にＸ−ｇａｌ染色を通じてＬａｃＺ発現を確認した。
【０１２７】
それぞれのファイバー変形アデノウイルスは、次の方法によって製造した。
【０１２８】
配列番号１のアデノウイルスタイプ３５（血清型３５）のファイバー配列を挿入したアデノウイルスシャトルベクターであるｐＳＫ５５４３−Ｋ３５をＧＦＰ遺伝子がアデノウイルスＥ１部位に挿入された複製不能アデノウイルスであるｄＥ１／ＧＦＰと相同組換えを通じてｄＥ１−３５／ＧＦＰウイルスを製作した（図１６ａ）。また、アデノウイルスファイバーの末端にＲＧＤを挿入したアデノウイルスシャトルベクターであるｐＳＫ５５４３−ＲＧＤをＧＦＰ遺伝子がアデノウイルスＥ１部位に挿入された複製不能アデノウイルスであるｄＥ１／ＧＦＰと相同組換えを通じてｄＥ１−ＲＧＤ／ＧＦＰウイルスを製作した（図１６ｂ）。製作されたアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞株に形質転換させて、大量増殖を通じてアデノウイルスを生産した。
【０１２９】
図１６ｃに示されたように、ｄＥｌ−ｋ３５／ＬａｃＺウイルスでＭＳＣを感染させた場合、最も高い遺伝子伝達効率を示した。
【０１３０】
また、ＡｄのＭＳＣに最適導入効率を最適化するために、異なるファイバー（ｆｉｂｅｒ）型を有するＧＦＰ−発現Ａｄ５を用いて形質導入効率を確認した：ｄＥ１／ＧＦＰ（野生型ファイバーを有するＡｄ５ベクター）、ｄＥｌ−ｋ３５／ＧＦＰ（Ａｄ血清型３５のファイバーノブ（ｋｎｏｂ）を有するキメラＡｄ５）、ｄＥｌ−ＲＧＤ／ＧＦＰ（ＡｄファイバーのＨＩループにＲＧＤモチーフを含むＡｄ５ベクター）、ｄＥ１−ｋ３Ｓ／ＧＦＰ（Ａｄ５の切断されたファイバーシャフト（ｓｈａｆｔ）およびＡｄ３のファイバーノブを含有するキメラＡｄ５）、ｄＥ１−ＶＳＶＧ（１２Ｌ）／ＧＦＰ、ｄＥ１−ＶＳＶＧ（１２Ｃ）／ＧＦＰおよびｄＥ１−ＶＳＶＧ（１２Ｒ）／ＧＦＰ。遺伝子の伝達前に、２４時間の間ＭＳＣを２４−ｗｅｌｌに５Х１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で接種した。前記ＭＳＣ細胞をそれぞれのＡｄで０、５、２０または１００ＭＯＩで処理し、３７℃で４８時間の間インキュベートした。ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１；Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で測定された。
【０１３１】
図１７に示されたように、すべてのＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）でｄＥ１／ＧＦＰおよびｄＥ１−ＲＧＤ／ＧＦＰは、ＭＳＣに形質導入効率は有意的に非常に低かった。ｄＥ１−ｋ３Ｓ／ＧＦＰの場合、用量依存的にさらに高いＧＦＰ発現水準を示したが、効率は、有意的に非常に低かった。しかしながら、ｄＥ１−ｋ３５／ＧＦＰの場合、ＭＳＣに非常に高い伝達効率を示した。これは、ＬａｃＺ発現結果と一致するものであった。特に配列番号１のＡｄ血清型３５のファイバーノブを有するアデノウイルスの場合、間葉系幹細胞に対して５ＭＯＩでも感染がよく起こるところ、間葉系幹細胞に搭載するためのアデノウイルスとして顕著に優れた効果を有することを確認した。以後、配列番号１のファイバー（ｆｉｂｅｒ）を含むウイルスベクターを用いて実験を実施した。
【０１３２】
２−２．ＭＳＣでのアデノウイルスによるＭＳＣの細胞殺傷能とウイルス複製能の検証
腫瘍殺傷アデノウイルス（Ｈ５ｃｍ  Ｔ−Ｒｄ１９−ｋ３５／Ｌｕｃ）を０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５または１ＭＯＩの力価でＭＳＣに感染させ、細胞殺傷能をＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）を通じて確認した。また、ＭＳＣで生成されるウイルス量を確認するために、Ｑ−ＰＣＲを通じてウイルス増殖能を確認した。
【０１３３】
Ｈ５ｃｍ  Ｔ−Ｒｄ１９は、下記のように製造した。
【０１３４】
６個のＨＲＥエンハンサー（配列番号６）を含み、５ＭＭＴＥＲＴプロモーターによりＥ１Ａ遺伝子の発現が調節されるアデノウイルスを製作するために、まず、アデノウイルス全体遺伝子を鋳型としてＲｂ７△１９／Ｅ１Ｂ５５部位をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で増幅して、所望の遺伝子部位を得た。センスプライマー（Ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）として５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧＴＡ−３’とアンチセンスプライマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）として５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＧＴＡＣＣＴＣＡＡＴＣＴＧ−３’を使用し、クローニング上の便宜のためにＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限酵素部位を挿入した。生成されたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ベクターに挿入し、本研究室で製造した５ＭＭＴＥＲＴプロモーターを含んでいるベクターをＣｌａＩとＥｃｏＲＩで切断した後、挿入した。最後に、６個のＨＲＥ配列を添加するために、ＸｈｏＩとＳａｌＩで切断して、先立って製作されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）／５ＭＭＴＥＲＴ／Ｒｂ７△１９ベクターに伝達した。このように製作されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）／ＨＲＥ６５ＭＭＴＥＲＴ／Ｒｂ７△１９から組換えしたエンハンサーとプロモーターをＥ１シャトルベクターであるｐΔＥ１ｓｐ１Ｂに挿入するためにＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切断して挿入した。前記の方法で製作されたＥ１シャトルベクターをＸｍｎＩ制限酵素で切断した後、ＢｓｔＢ制限酵素の処理により一本鎖になったアデノウイルスｄｌ３２４ＢｓｔＢと共に大腸菌ＢＪ５１８３に同時に形質転換させて、遺伝子相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を誘導した。ＢＪ５１８３で獲得した組換えしたプラスミドＤＮＡは、さらにＤＨ５α大腸菌に形質転換させてＤＮＡを増幅させた。ＤＨ５α大腸菌から相同組換えしたプラスミドＤＮＡを収得し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処理して、それぞれの組換えしたアデノウイルスゲノムを選別した。前記Ｈ５ｃｍＴ−Ｒｄ１９をバックボーンとするウイルスのｋｎｏｂ部分をｋ３５（配列番号１）配列に置換し、映像化を進めることができるように、Ｌｕｃ遺伝子を挿入して使用した。
【０１３５】
図１８に示されたように、汎癌特異的腫瘍殺傷アデノウイルスの感染時間、または濃度依存的に細胞殺傷能とウイルス増殖能が増加することを確認した。前記結果に基づいて、細胞治療剤の伝達体としてＭＳＣを用いる場合、細胞殺傷能を有するウイルスの増殖によってさらに高い癌細胞殺傷を誘導することができて、他の伝達体を用いる場合と比較してさらに優れた抗癌効果を有することを確認した。また、生体内注入後、一定時間以後には、アデノウイルスによりＭＳＣが除去されるところ、従来、ＭＳＣを細胞治療剤として使用する場合、生体内ＭＳＣの残存に対する憂慮を解消することかできることを確認した。したがって、本発明のＭＳＣ内にアデノウイルスを搭載した細胞治療剤は、ウイルスの生産量を増加させて抗癌作用を最大化することができ、ＭＳＣの副作用を最小化できる効果を有する。
【０１３６】
試験例２−３．ヒト肝癌同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）モデルの構築
実際腫瘍形成モデルに最も近い同所移植モデルを確立するために、６週齢雄性ヌードマウスの腹部皮下を切開し、２０μｌのＨＢＳＳで浮遊させた１ｘ１０６個のルシフェラーゼを安定的に発現するＨｅｐ３Ｂ細胞をマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）２０μｌと混ぜて左側肝葉に直接注入した（図１９）。細胞注入２週後、マウスから血液を採取して血清を分離した後、ＡＦＰ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて血液内ＡＦＰ発現量を測定し、ＡＦＰ発現量が３００ｎｇ／ｍｌ以上のマウスを実験に用いた。また、発光イメージ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）を通じて非侵襲的な方法でルシフェラーゼを発現する肝癌細胞株が投与されたヌードマウス内の腫瘍生成および変化をリアルタイムで観察した（図２０）。
【０１３７】
試験例２−４．腫瘍殺傷アデノウイルス搭載幹細胞による遺伝子治療剤の癌標的
肝癌同所移植モデルでＡｄ−ＭＳＣの腫瘍特異的ローカリゼーション（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）と肝癌選択的なアデノウイルスの複製を確認するために、まず、Ｈ５ｃｍ  Ｔ−Ｒｄ１９−ｋ３５／Ｌｕｃを０．２ＭＯＩ、０．５ＭＯＩおよび１ＭＯＩでＭＳＣにそれぞれ感染させた。２４時間後にそれぞれの間葉系幹細胞をマウス１匹当たり１Ｘ１０６ｃｅｌｌｓで肝癌同所移植モデル（ヌードマウス）に尻尾静脈を通じて投与した。また、対照群としてＰＢＳを肝癌同所移植モデルに尻尾静脈を通じて投与した。投与後２時間から２８日まで発光イメージ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）を通じてウイルスの移動と複製能をリアルタイムで観察した。
【０１３８】
図２１に示されたように、汎癌特異的腫瘍殺傷アデノウイルスを用いて０．５ＭＯＩおよび１ＭＯＩの濃度で感染したＡｄ−ＭＳＣを投与した処理群でＡｄ−ＭＳＣが成功裏に腫瘍部位に伝達され、投与後２８日目までもウイルスが存在し、治療効果を示すことを確認することができた。これは、本発明による腫瘍殺傷ウイルスは、ウイルスの複製が活発に行われて、腫瘍で長期間ウイルスが維持しつつ治療効果を示すことを示唆する。
【０１３９】
試験例２−５．幹細胞搭載用癌標的アデノウイルスの製作および生産
実施例１の肝癌特異的プロモーターの活性を比較する実験を通じてサイズが小さく、プロモーターの活性に優れたａ２ｂｍを選定し低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件でもウイルス複製が可能なＨＲＥが挿入されたＨａ２ｂｍを肝癌特異的プロモーターとして最終選定した。また、試験例２−１の結果に基づいてＭＳＣで遺伝子伝達効率に優れた配列番号１のファイバー（ｆｉｂｅｒ）を選定し、遺伝子伝達効率を確認するために、レポータ遺伝子であるＬｕｃを挿入して、最終Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／Ｌｕｃを候補物質として選定した。ウイルスを製作するために、まず、△Ｅ１ｓｐ１Ａ／Ｈａ２ｂｍ／ｄ１９シャトルベクターをＸｍｎ  Ｉで、ｄＥ１−ｋ３５トータルベクターをＢｓｔＢ  Ｉで線形化し、ＢＪ５１８３  Ｅ−ｃｏｌｉに形質転換させて、Ｅ１相同組換えを通じてＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５を製作した（図２２）。
【０１４０】
次に、ホタルルシフェラーゼを発現カセットをＡｄ  Ｅ３シャトルベクター（ｐＳＰ７２  Ｅ３）で連結させて、ｐＳＰ７２ΔＥ３／Ｌｕｃ  Ａｄ  Ｅ３シャトルベクターを製造した。ＷＮＴｉ−発現するＨＣＣ標的化ｏＡｄベクターを作るために、ＷＮＴｉをコードする配列をｐＣＡ１４−ｓＬＲＰ６Ｅ１Ｅ２［６０］からサブクローニングした後、ｐＳＰ７２ΔＥ３に連結させてｐＳＰ７２ΔＥ３／ＷＮＴｉ＿Ａｄ  Ｅ３シャトルベクターを生成した。Ａｄ  Ｅ３シャトルベクター（ｐＳＰ７２ΔＥ３／ＬｕｃおよびｐＳＰ７２ΔＥ３／ＷＮＴｉ）は、ＸｍｎＩを用いて線形化し、ＳｐｅＩで線形化されたＨＣＣ−ｏＡｄ（Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５）［４８］とともに大腸菌ＢＪ５１８３細胞で同時−形質転換して、相同組換えを通じて、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／Ｌｕｃ（ＨＣＣ−ｏＡｄ−Ｌｕｃ）またはＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ＷＮＴｉ（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ）をそれぞれ含有するプラスミドを製造した（図２３ａ）。同種組換えＡｄプラスミドをＰａｃＩで切断し、生産細胞株であるＨＥＫ２９３細胞にリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いて形質感染させて、ＨＣＣ−標的化ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＬｕｃおよびＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉを製造した（図２３ｂ）。ＨＥＫ２９３細胞でウイルス粒子が生成されれば、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＬｕｃおよびＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉをＡ５４９細胞で増殖させ、ＣｓＣｌ勾配遠心分離で精製した。２６０ｎｍ（ＯＤ２６０）で吸光度１（ＯＤ２６０＝１）であるとき、ＶＰの数は、１．１ｘ１０１２ＶＰ／ｍＬである光学密度測定値から計算された。精製されたウイルスを使用するまで−８０℃で保管した。
【０１４１】
試験例２−６．ＭＳＣでの幹細胞搭載用肝癌標的アデノウイルスの形質導入効率の比較
ＭＳＣに対する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの形質導入効率を確認するために、試験例２−１で製造したＧＦＰを発現するように設計されたアデノウイルスベクターを５００ＭＯＩで間葉系幹細胞に導入した後、２４時間後にＧＦＰ遺伝子発現程度を確認した。
【０１４２】
また、Ｌｕｃ遺伝子を発現する肝癌特異的殺傷アデノウイルスであるＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／Ｌｕｃ（ＨＣＣ−ｏＡｄ−Ｌｕｃ）を用いてＭＳＣにウイルスを０、５０、１００または２００ＭＯＩで感染させ、二日後（感染４８時間以後）にＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いて、ルシフェラーゼ信号を確認した。生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）信号強度は、関心領域から秒当たり獲得された光子（ｐｈｏｔｏｎ）（ｐ／ｓ）で得た。
【０１４３】
図２４に示されたように、ウイルスを感染させた場合、ｄＥ１−ｋ３５／ＧＦＰの場合にのみ、ＭＳＣに遺伝子導入が円滑に現れたことを確認し、５０、１００および２００ＭＯＩのｏＡｄでＭＳＣを形質転換させたとき、アデノウイルスの濃度に依存的にＬｕｃの発現が増加することを確認した（Ｐ＜０．００１）。このような結果は、本発明によるＡｄの場合、ＭＳＣに効率的に導入されて、転移遺伝子を発現することができることを確認するものである。
【０１４４】
試験例２−７．治療遺伝子を発現する幹細胞搭載用肝癌標的アデノウイルスの製作および生産
肝癌特異的プロモーターの活性を比較する実験を通じてサイズが小さく、プロモーターの活性に優れたａ２ｂｍを選定し、低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件でもウイルス複製が可能なＨＲＥが挿入されたＨａ２ｂｍをプロモーターとして最終選定して、肝癌特異的殺傷アデノウイルスを製作した。腫瘍細胞の殺傷能を増加させるために、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／ｗｎｔ信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を遮断できるｓＬＲＰ６遺伝子を発現するアデノウイルスを製作するために、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５トータルベクターＳｐｅ  Ｉで、ｐＳＰ７２ｄＥ３／ｓＬＲＰ６シャトルベクターをＸｍｎ  Ｉで線形化し、ＢＪ５１８３  Ｅ−ｃｏｌｉに形質転換させて、Ｅ３相同組換えを通じてＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６プラスミドを製作した（図２５および図２６）。
【０１４５】
製作されたプラスミドＤＮＡをＰａｃ  Ｉ制限酵素で切断して線形化させた後、アデノウイルス生産細胞株であるＨＥＫ２９３にリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いて形質転換してウイルスを生産した。生産されたアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞株に再感染させてＣｓＣｌ密度勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）方法でアデノウイルスを濃縮して純粋分離した後、限界希釈検定（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）とウイルスゲノム（ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ）の吸光度による光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ、Ｏ．Ｄ）でアデノウイルスの力価を決定した。
【０１４６】
試験例２−８．肝癌標的殺傷アデノウイルスの肝癌細胞および正常細胞に対する殺傷能の比較
肝癌特異的殺傷アデノウイルスＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６の肝癌細胞特異的な殺傷能を確認するために、０．１、０．５、２、１０および５０ＭＯＩでそれぞれ肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、そしてＨｅｐ１と正常細胞であるＨＤＦに感染させた後、７２時間経過したとき、ＭＴＴ分析（ａｓｓａｙ）を通じて細胞殺傷能を確認した。
【０１４７】
図２７に示されたように、肝癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、そしてＨｅｐ１で肝癌特異的殺傷アデノウイルスの濃度に応じて殺傷能が増加することを確認した。また、正常細胞であるＨＤＦでは、殺傷効果が現れていないことを確認することができた。これは、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６が正常細胞には殺傷効果を示さず、癌細胞のみに対して優れた標的能を有することを意味する。また、ＡＦＰ陽性（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７）の肝癌細胞だけでなく、ＡＦＰ陰性（Ｈｅｐ１）の肝癌細胞でも、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６が優れた癌細胞殺傷能を示し、これは、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６が多様な表現型の臨床肝癌患者での適用が可能な優れた治療能を有することを意味する。
【０１４８】
試験例２−９．ｏＡｄのＭＳＣに導入されている量（ｄｏｓｅ）の最適化
全身循環を通じて標的組織に到達する前に、細胞が早期に溶解することを予防するために、伝達体としてＭＳＣに導入されたｏＡｄの導入量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ）を最適化することは、非常に重要である。したがって、ＭＳＣに対するｏＡｄの最適導入量を評価した。
【０１４９】
ＭＳＣでの肝癌標的殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能を確認するために、肝癌特異的殺傷アデノウイルスＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６を０．５、１、２、５、１０、２０および５０ＭＯＩでそれぞれＭＳＣに感染させた後、２、５日目にＭＴＴ分析を進めて間葉系幹細胞の細胞生存率を比較した。
【０１５０】
図２８に示されたように、ＭＳＣの生存率は、すべてのローディング量で感染後５日目になる場合、２日目になる場合より有意的に低かった（ｐ＞０．００１）。ウイルス濃度の増加と時間の経過によって細胞殺傷能が増加することを確認することができた。これは、ＭＳＣが腫瘍標的をして癌組織に到達したとき、ウイルスによる細胞殺傷効果により腫瘍細胞だけでなくＭＳＣも生体内で除去され得るので、従来、ＭＳＣを細胞治療剤として使用する場合、生体内ＭＳＣの残存に対する憂慮を解消することができることを確認した。したがって、本発明のＭＳＣ内にアデノウイルスを搭載した細胞治療剤は、癌組織に移動する時間の間ＭＳＣ内で増殖する効果を通じてウイルスの含量が増加して抗癌作用を最大化することができ、癌組織に到達した後には、ＭＳＣを除去してＭＳＣが生体内残存することによって起こりうる副作用を最小化することができて、細胞治療剤の安全性を高める可能性を提示した。
【０１５１】
次に、ｏＡｄ−ローディングされたＭＳＣをさらに最適化するために、ＭＳＣでウイルス増殖水準を測定した。
【０１５２】
試験例２−１０．ＭＳＣでアデノウイルスの生成量の確認
ＭＳＣでの肝癌特異的殺傷アデノウイルスの生産量を確認するために、ＭＳＣに肝癌特異的殺傷アデノウイルスＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６を０．５、１、２、５、１０、２０、５０および１００ＭＯＩでそれぞれＭＳＣに感染させた後、２、５日目にＱＰＣＲを進めてウイルス生産量を比較した。
【０１５３】
図２９に示されたように、感染後２日目に０．５〜５ＭＯＩでウイルス量の１０−倍（ｆｏｌｄ）増加は、５０００倍（ｆｏｌｄ）さらに高い水準のウイルス生産を招いた。しかしながら、５〜５０ＭＯＩで類似した水準の増加は、約１．８倍（ｆｏｌｄ）の最小の増加だけを示した。ウイルス生産水準の増加が５ＭＯＩ以上のＭＯＩで安定した状態を示し、ＭＳＣ生存率で顕著な含量−依存的減少が同じウイルス含量範囲から観察されたので、ｏＡｄ−ローディングされたＭＳＣを製造するとき、ウイルス増殖とＭＳＣ生存率が均衡を成す最適条件として５ＭＯＩおよび２日感染で行った。
【０１５４】
試験例２−１１．肝癌標的殺傷アデノウイルス搭載幹細胞（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ）の抗腫瘍効果の検証
２−１１−１．ＷＮＴｉを発現するＨＣＣ−標的ターゲッティングｏＡｄの特性の確認
エンハンサー部位−変形されたＡＦＰプロモーター（Ｈａ２ｂｍ）を用いてＷＮＴｉを発現するＨＣＣ−特異的ｏＡｄ、すなわちＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ（図３８ａ）を製造した。
【０１５５】
本発明で製造されたＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉがＷｎｔ信号伝達経路を抑制できるかを評価するために、ＨＣＣ−ｏＡｄで感染したりＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉで感染したＨｅｐ３Ｂ細胞でウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を通じてＷｎｔおよびＷｎｔ信号伝達経路と関連した多様なダウンストリーム要素の発現程度を調査した。
【０１５６】
図３８ｂに示されたように、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ処理は、対照群ｏＡｄ（ＨＣＣ−ｏＡｄ）または陰性対照群（処理されないグループ）で感染した細胞よりＨｅｐ３Ｂ細胞で顕著に低い水準のＷｎｔ発現を誘導した。また、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ処理は、速い癌細胞増殖およびＥＭＴを促進するものと知られたβ−ｃａｔｅｎｉｎおよびｐ−ＭＥＫ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）のような多様なダウンストリーム要素の発現水準を有意に減少させた。また、間葉系マーカーであるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｄｈｅｒｉｎ）の発現水準は、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ感染Ｈｅｐ３Ｂ細胞で未処理細胞またはＨＣＣ−ｏＡｄ感染細胞でより顕著に高かった。このような結果は、ＨＣＣ細胞のＷｎｔ信号経路がＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉにより効果的に抑制されて、究極的にＥＭＴを防止することを示す。
【０１５７】
ＨＣＣ−標的ｏＡｄによるＷＮＴｉ発現がＨＣＣ細胞でｏＡｄの癌細胞殺傷効果を向上させるかを評価するために、ＡＦＰ−陽性ＨＣＣ細胞を臨床的に承認されたｏＡｄ（Ｈ１０１）、同族対照群ＨＣＣ−ｏＡｄまたはＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉで多様なＭＯＩで感染させた。図３８ｃに示されたように、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉは、ＡＦＰ−陽性Ｈｅｐ３Ｂ細胞のすべてのＭＯＩでＨ１０１または対照群ＨＣＣ−ｏＡｄと比較して容量依存的にそして顕著に優れた癌細胞殺傷効果を誘導した（Ｐ＜０．００１）。これは、ＷＮＴｉ発現が肝細胞癌腫（ＨＣＣ）特異的ｏＡｄの癌細胞殺傷効果を向上させることができることを意味する。ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉは、ＡＦＰ−陽性ＨＣＣ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）に対し１０ＭＯＩでＨ１０１または対照群ＨＣＣ−ｏＡｄより５．４６−倍または２．２９−倍さらに多い細胞毒性を示した。
【０１５８】
Ｈａ２ｂｍプロモーターが低酸素状態でＡｄ複製の低酸素症の媒介抑制を克服することが明らかになったので、Ｈａ２ｂｍプロモーターの制御下でＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉが低酸素状態よりさらに強力な癌細胞殺傷効果を誘導することができるか否かを評価した。図３８ｄに示されたように、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉは、低酸素および正常酸素環境の全部でＨＣＣ−ｏＡｄより癌細胞殺傷効果を増加させた。また、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉは、低酸素状態で正常酸素より１．２倍さらに高い癌細胞殺傷効能を示した（Ｐ＜０．００１）。このような結果は、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉがＡＦＰ陽性肝細胞癌で強力な細胞殺傷効果を導き出し、低酸素症によるウイルス複製の下向き調節を克服することができることを示唆する。
【０１５９】
２−１１−２．ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣの強力な肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）治療効果
ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣのＨＣＣに対する腫瘍殺傷能を評価するために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞とＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ（５ＭＯＩのウイルスで２日間感染したＭＳＣ）を細胞比率１：１にして共同培養した。
【０１６０】
図３９に示されたように、処理１日目から５日目まで正常酸素および低酸素条件の全部で未処理群とＭＳＣ投与群のＨｅｐ３Ｂ生存率に有意な差異がないので、ＭＳＣが癌細胞の成長に影響を及ぼさないことが分かる。対照的に、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉおよびＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ処理群は、正常酸素および低酸素条件の全部で処理後に３日および５日目に、未処理群またはＭＳＣ処理群と比較してＨｅｐ３Ｂ生存率を顕著に減少させたので、ｎａｋｅｄ  ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉとＭＳＣにロードされたＡｄ全部がＡＦＰ−陽性ＨＣＣ細胞殺傷能を有することを確認した。また、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉで処理されたりＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣで処理されたＨｅｐ３Ｂ細胞の全部は、処理１日目には、未処理群と類似した水準の生存力を示し、その後から癌細胞生存率がｏＡｄ−含む群により減少することは、増殖-媒介 細胞変性効果であることをさらに確認することである。また、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉとＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣは、Ｈａ２ｂｍプロモーターにより、治療３日目と５日目に正常酸素状態より低酸素条件でさらに高い癌細胞殺傷効果を示した。参考として、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣによる処理は、正常酸素状態または低酸素状態（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）で治療３日または５日目にＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉより有意的にさらに強力な肝細胞癌殺傷効果を誘発した。このような結果は、ＨＣＣ細胞にウイルスを伝達する間に、ＭＳＣでＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉの効率的なウイルス複製がｏＡｄの細胞死滅効果を向上させることができることを示す。
【０１６１】
２−１１−３．全身投与された肝癌標的殺傷アデノウイルス搭載幹細胞（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ）の抗腫瘍効果の検証
肝癌同所移植モデル（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ＨＣＣ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）で全身投与されたｏＡｄ−ローディングされたＭＳＣ（Ａｄ−ＭＳＣ）の治療効能を評価するために、ルシフェラーゼ発現同所Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍モデルマウスにＰＢＳ、ＭＳＣ（１ｘ１０６細胞）、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ（５ｘ１０８ＶＰｓ）またはＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ（５ｘ１０８ＶＰで１８時間の間感染した１ｘ１０６ＭＳＣ）を尻尾−静脈注射を通じて処理した。
【０１６２】
具体的に、肝癌細胞の移植後、８日目と１２日目にそれぞれ肝癌特異的殺傷アデノウイルスであるＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ（Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６）を５ＭＯＩでＭＳＣに感染させ、２４時間後に１Ｘ１０６のＭＳＣを肝癌同所移植モデル（ヌードマウス）に尾静脈を通じて投与した。対照群としてＰＢＳとウイルスを感染させない同量（１Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ）のＭＳＣ、またはＭＳＣに感染させた同量のＡｄ（５Ｘ１０８ＶＰ）を尻尾静脈で投与した。
【０１６３】
図３０ａおよび図３１に示されたように、対照群グループ（ＰＢＳ）では、急速な腫瘍の成長を観察することができたが、Ａｄ−ＭＳＣを投与したグループでは、腫瘍の成長が格別に抑制されることを観察することができた。図３０ａおよび図３０ｂに示されたように、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣの全身投与は、移植後に３５日（Ｐ＜０．０１）でＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉまたはＭＳＣ単独グループより顕著に高い抗腫瘍活性を示し、ＰＢＳ、ＭＳＣまたはＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉそれぞれに比べて４４．７倍、２４．０倍、または８．１倍以上の治療効果を示した。これは、また、同所腫瘍モデルマウスのｅｘ−ｖｉｖｏ写真でも確認することができるが、ＰＢＳ、ＭＳＣ、またはＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ処理された肝では、さらに大きい腫瘍が観察されたが、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ処理された肝では、顕著に小さいＨＣＣ腫瘍が観察された（図３２および図３３ａ）。このような傾向は、腫瘍を重さ測定により評価する場合にも、類似した結果が観察された（図３３ｂ）。参考として、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣは、腫瘍保有マウスの全身治療に頻繁に使用される既存のｏＡｄ用量範囲（〜２ｘ１０１０ＶＰ）より低い用量で投与されたが、依然として強力な抗腫瘍効果を示した。このような結果は、ＭＳＣ内にｏＡｄをローディングさせることが、全身投与されたウイルスの治療効能を大きく増加させると共に、投与量に関連した副作用を最小化することができることを示唆する。
【０１６４】
試験例２−１２．生体内での肝癌標的殺傷アデノウイルス搭載幹細胞による肝数値変化の観察
肝癌同所移植モデルでＡｄ−ＭＳＣの腫瘍治療効果による肝機能を確認するために、癌特異的殺傷アデノウイルスであるＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６を５ＭＯＩでＭＳＣに１８時間の間感染させ、前記Ａｄ搭載された間葉系幹細胞（１Ｘ１０６細胞）を肝癌同所移植モデル（ヌードマウス）に尾静脈を通じて投与した。対照群として、ＰＢＳ、２００μｌのウイルスを感染させない同量のＭＳＣ（１Ｘ１０６細胞）およびｎａｋｅｄ  Ａｄ（ＭＳＣに感染させない腫瘍殺傷アデノウイルスＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６、５ｘ１０８ＶＰ）をそれぞれ尻尾静脈で、９日および１３日に二回投与した。二回目に注入して３日後に、４グループのマウスで血液を採取して、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノ転移酵素（ＡＳＴ）の血清水準と、対照群として非−腫瘍正常マウスも共に評価して、肝毒性を測定した。具体的に、マウス血液０．５〜１ｍＬを採取した後、常温で２０〜３０分経過した後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を進める。血清である上澄み液を取って毒性検査機関に依頼して進めた。
【０１６５】
図３４に示されたように、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉで処理されたマウスは、最も高いＡＳＴ水準を示した（ＰＢＳ−処理されたグループより１．６倍さらに高い；Ｐ＜０．０５）。反対に、正常マウス群と関連して、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣで処理されたマウスでＡＳＴ水準の有意な増加を観察しなかった。かえって、ＡＳＴ水準が正常マウスと同等な水準に維持されることを確認することができる。これは、ＭＳＣ−媒介されたｏＡｄの腫瘍−特異的伝達が伝統的に全身投与されたＡｄと関連した肝の損傷と共にＨＣＣ腫瘍による肝損傷の問題も予防することができることを示す。
【０１６６】
試験例２−１３．生体内での肝癌標的殺傷アデノウイルス搭載幹細胞の全身投与による生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）の分析
Ｎａｋｅｄ  ｏＡｄは、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞および凝固因子との相互作用により静脈注射後に肝で迅速かつ非特異的に隔離されて、肝毒性および制限された抗腫瘍効果を起こす。したがって、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣが、ｏＡｄの腫瘍内蓄積を強化させ、肝細胞隔離を回避することができるか否かをさらに調査するために、全身投与されたＭＳＣ、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉまたはＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣの生体内分布プロファイルを分析した。
【０１６７】
同所移植モデルで腫瘍特異的殺傷アデノウイルスを搭載したＭＳＣを全身投与後に現れる生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を分析するために、Ｈｅｐ３Ｂ−Ｌｕｃ肝癌同所移植モデルを製作した後、ＰＢＳ、ＭＳＣ（１ｘ１０６細胞）、Ｈａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ，５ｘ１０８ＶＰ）、または５ｘ１０８ＶＰのＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６アデノウイルスで１８時間の間感染したＭＳＣ（Ａｄ−ＭＳＣ，１ｘ１０６細胞）を腫瘍移植後に９日および１３日にそれぞれ尻尾静脈内投与した。各群に二回目の投与をして２４時間後に、マウスを麻酔させて血液を採取した後、犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させ、肝癌組織、正常肝組織、胃、脾臓、肺、すい臓、心臓そして腎臓を摘出し、ＤＮＡを抽出した。具体的に、臓器を液体窒素を用いて凍結させた後、乳棒と乳鉢を用いて粉砕した。粉砕された臓器２０ｍｇを新しいチューブに入れ、臓器を溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて溶解（ｌｙｓｉｓ）させ、ＤＮＡを獲得した。前記ＤＮＡの濃度を極微量分光光度計（ｎａｎｏｄｒｏｐ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定し、この中で１００ｎｇのＤＮＡを用いてＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて各試料でウイルスゲノムの数を測定した。各試料でウイルスゲノムの数は、生体内肝癌特異的殺傷アデノウイルスの分布を定量的に検証した。
【０１６８】
図３５ａに示されたように、肝に吸収されたＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣは、ｎａｋｅｄ  ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉと比較して有意的に減少した（Ｐ＜０．００１）。また、重要なことは、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣがｎａｋｅｄ  ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉより４,８２４．２−倍高い腫瘍内蓄積を示したということである（Ｐ＜０．００１）。このような結果は、ＭＳＣが全身循環中に効果的にｏＡｄを保護することができ、ｏＡｄの本来の肝への方向性（ｈｅｐａｔｉｃ  ｔｒｏｐｉｓｍ）を減少させることによって、腫瘍へ向かうＭＳＣの特性に起因してウイルスの効率的な腫瘍内蓄積を誘導することを示す。また、このようなデータは、ＭＳＣ−媒介ｏＡｄの腫瘍内位置化は、低いウイルス用量でも全身循環する間に、ＭＳＣでそして腫瘍組織でウイルスの複製を許容することによって、強力な抗腫瘍効果を誘導することができることを示唆する。結果的に、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣの腫瘍と肝の比率は、ｎａｋｅｄ  ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉのものより６、４８０．８−倍さらに高く、これは、ＭＳＣ基盤の腫瘍殺傷Ａｄの伝達がウイルスの治療効率および安全性プロファイルを改善するための全身投与の障害物を克服して、その効果を向上させることができることを示す。
【０１６９】
試験例２−１４．生体内での肝癌標的殺傷アデノウイルス搭載幹細胞による肝癌組織学的変化の観察
肝癌同所移植モデルでＡｄ−ＭＳＣの腫瘍治療効果を組織学的に確認した。ｏＡｄを搭載したＭＳＣは、それぞれ肝癌特異的殺傷アデノウイルスであるＨａ２ｂｍ−ｄ１９−ｋ３５／ｓＬＲＰ６（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ）を５ＭＯＩで２４時間の間ＭＳＣに感染させて準備した。
【０１７０】
肝癌細胞を肝癌同所移植モデル（ヌードマウス）に移植して９日後および１３日後に１Ｘ１０６のＭＳＣを肝癌同所移植モデル（ヌードマウス）に尾静脈を通じて投与した（Ａｄ−ＭＳＣ処理群；ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ）。対照群としてＰＢＳ（ＰＢＳ処理群；ＰＢＳ）とウイルスを感染させない同量ＭＳＣ（ＭＳＣ；１Ｘ１０６ｃｅｌｌ）、またはＭＳＣに感染させない同量のＡｄ（５ｘ１０８ＶＰ）（Ａｄ処理群；ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ）を尻尾静脈で投与した（ｎ＝群当たり６匹）。
【０１７１】
最後の投与３日後に、ＰＢＳ、ＭＳＣ、Ａｄ、そしてＡｄ−ＭＳＣ群のグループのマウスから肝組織を確保した。肝組織は、１０％ホルマリンで固定され、パラフィンに埋めて、５μｍ厚さで切断された。スライドに付着した後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）、１００％、９５％、８０％、７０％エタノール溶液に順に浸漬してパラフィンを除去（ｄｅｐａｒａｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）し、Ｈ＆Ｅ染色（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ  ｓｔａｉｎ）とコラーゲン繊維質（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌｓ）を染色できるｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を進めた。次に、同じ組織でヒトＭＳＣの標識子であるＣＤ９０と細胞増殖程度を確認できるＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）抗体を用いて免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を進めた。組織スライドでキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）、１００％、９５％、８０％、７０％エタノール溶液に順に浸漬してパラフィンを除去（ｄｅｐａｒａｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）し、０．５％ＮＰ４０溶液に浸漬して組織の透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を高めた後、ＣＤ９０抗体（Ａｂｃａｍ，Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）またはＰＣＮＡ抗体（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と４℃で一晩中（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）反応させ、翌日、ＡＢＣ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｋｉｔ（ＣｈｅｍＭａｔｅ  ＤＡＫＯ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ｋｉｔ；ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて二次抗体反応を進めた後、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）で染色し、マウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）溶液でマウンティングして、組織顕微鏡で観察した。
【０１７２】
図３６に示されたように、対照群（ＰＢＳ）またはＭＳＣまたはＡｄ処理グループでは、肝組織内に広い範囲に分布した腫瘍を確認することができ、また、細胞外基質の主要成分として腫瘍組織の形成と成長を助けるコラーゲン繊維質（青色で染色）が癌組織の境界部分および癌組織内に広く分布したことを確認したが、Ａｄ−ＭＳＣ（ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ）を投与したグループでは、腫瘍組織およびコラーゲン繊維質が全く確認されず、正常な肝組織形態を維持していることを確認した。
【０１７３】
また、図３７に示されたように、ＭＳＣの標識子であるＣＤ９０の染色を通じてＭＳＣの存在有無を確認した結果、ＭＳＣで処理したマウスの肝組織でＣＤ９０は、陽性であり、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉまたはＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣで処理した肝組織でＣＤ９０は陰性であった。ＭＳＣのみを投与したグループだけでＭＳＣが肝組織に残存して長時間留まっていることは、遺伝子伝達を完了したＭＳＣは、それに搭載されたＡｄによりきれいに除去されたことを意味し、残存するＭＳＣによる副作用が現れる可能性を排除することができることを意味するという点から、本発明のＡｄ搭載された幹細胞は、治療剤として優れた特性を有するといえる。
【０１７４】
次に、細胞増殖程度を確認した結果、対照群（ＰＢＳ）とＭＳＣまたはＡｄ投与グループだけで癌細胞特有の過度な細胞増殖が起こることを確認したが、本発明のＡｄ−ＭＳＣを投与したグループでは、腫瘍細胞が観察されなかった。ＰＢＳ、ＭＳＣまたはＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ処理と比較してＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ処理は、増殖する細胞の水準を顕著に低減し、ＨＣＣ腫瘍の増殖を効果的に抑制して、強力な抗腫瘍効果を誘導することができることを確認した。
【０１７５】
試験例２−１５．ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣの向上した薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ）プロファイルの確認
ＨＣＣ腫瘍を全身投与方法を通じて効果的に治療するためには、標的腫瘍組織にｏＡｄ伝達のためにｏＡｄの血液保有時間を延長しなければならない。したがって、本発明では、ＨＣＣを標的なｏＡｄ−搭載ＭＳＣの血液内残存時間を延長させることができるか否かを評価した。
【０１７６】
マウスの血液でＡｄが除去される速度を評価するために、ｏＡｄ−処理されたマウスの全血試料を用いてリアルタイム定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を行った。５ｘ１０８ＶＰのｎａｋｅｄ  ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉまたは同量のＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣ（ＭＳＣに搭載されたＡｄの総数は、５ｘ１０８ＶＰ）を全身注入した後、５分、１０分、３０分、１時間、６時間、２４時間または４８時間目にマウスの眼窩静脈叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｕｓ）で全血１００μＬを採取した（ｎ＝３）。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して全血標本（ａｌｉｑｕｏｔ）からトータルＤＮＡを抽出した。Ａｄゲノムの数は、Ｑ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。試料は、３回分析され、実験結果は、ＳＤＳ  １９．１ソフトウェアパッケージ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で処理した。
【０１７７】
ｎａｋｅｄ  ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ（ＭＳＣに搭載されないＡｄ）は、血液から急速に除去された。対照的に、ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉ／ＭＳＣは、注射後１時間および２４時間目にｎａｋｅｄ  ＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉより血中濃度がそれぞれ１２−倍および３，２００−倍高く維持されたところ（Ｐ＜０．００１）、これは、全身循環中にＭＳＣがＨＣＣ−ｏＡｄ−ＷＮＴｉを効果的に保護することを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３ａ】
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【図３３ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３８ｃ】
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【図３８ｄ】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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