(57)【要約】  本発明は、患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)および患者にリンカーにより標的化部分に結合した小分子を投与することによる、癌を有する患者を処置する方法に関する。本発明はまたこのような方法で使用するための組成物にも関する。
2021512147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)；そして
iii)患者に該ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第二用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【請求項２】
化合物またはその薬学的に許容される塩が抗体ではなく、抗体フラグメントを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的化部分がペプチドエピトープを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌が葉酸受容体発現癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＲＳが減少または予防され、本方法が患者における腫瘍体積減少をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞が中央記憶／エフェクター記憶表現型を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ８：ＣＤ４比が約１：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣＲＳによる体重減少が減少するかまたは阻止される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
癌が腫瘍を含み、腫瘍の完全応答が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；そして
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含む)
を含む、方法。
【請求項１１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物が約１：５のＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞、約１：４のＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞、約１：３のＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞、約１：２のＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞および約１：１のＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞から選択される比でＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物が約１：１〜約１：５のＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞の比でＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１０００万のＣＡＲ  Ｔ細胞および約４０００万の非形質転換Ｔ細胞の混合物で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１,５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞および約３５００万の非形質転換Ｔ細胞の混合物で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＡＲ  Ｔ細胞が約２０００万のＣＡＲ  Ｔ細胞および約３０００万の非形質転換Ｔ細胞の混合物で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)；そして
iii)患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与すること
を含む、方法。
【請求項１７】
フォレートが投与され、フォレートが葉酸またはロイコボリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートが投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、薬剤が化合物またはその薬学的に許容される塩のＣＡＲ  Ｔ細胞結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
薬剤がフルオレセインアミン、ＦＩＴＣまたはフルオレセインナトリウムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が患者に投与され、ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤がＣＲＳグレードが３または４に達したとき投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は約１０ｎＭ／kg患者体重〜約２５００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される)、；そして
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１,５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である)
を含む、方法。
【請求項２４】
化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約１００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約５０ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約２０ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
化合物またはその薬学的に許容される塩が約２００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物を連続的に投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そしてiii)患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するために、該化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了すること
を含む、方法。
【請求項３０】
化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも１時間連続して投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも４時間連続して投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも６時間連続して投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
化合物またはその薬学的に許容される塩が週３回患者に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該患者に化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも第一用量および第二用量で投与され、ここで、該第一用量と該第二用量は異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い)；そして
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【請求項３５】
化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量、第二用量および第三用量が患者に投与され、ここで、該第一用量、該第二用量および該第三用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約７５０倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８００倍〜約１００００倍多い、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量、第二用量、第三用量および第四用量が患者に投与され、ここで、該第一用量、該第二用量、該第三用量および該第四用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約７５０倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８００倍〜約７５００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８０００〜約１５０００倍多い、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１０００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１００００倍多い、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第二用量を投与すること(ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約５０％低い)；そして
iii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【請求項３９】
化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約６０％低い、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約７０％低い、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約８０％低い、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９０％低い、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９５％低い、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は、標的化部分に指向されたＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の投与前に患者に投与される)、
ii)次いで、患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の一用量を投与すること、そして
iii)次いで、患者に該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【請求項４５】
癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は患者に週１回投与される)、および
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の下、２０１８年１月２２日に出願の米国仮出願番号６２／６２０,４１４、２０１８年１月２３日に出願の米国仮出願番号６２／６２０,７０６、２０１８年４月１１日に出願の米国仮出願番号６２／６５６,２３３、２０１８年８月２９日に出願の米国仮出願番号６２／７２４,１７１、２０１８年９月２４日に出願の米国仮出願番号６２／７３５,６２７および２０１８年９月２６日に出願の米国仮出願番号６２／７３６,７２７に基づく優先権を主張し、これら全てを引用により全体として本明細書に包含させる。
【０００２】
技術分野
本発明は、患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)および患者にリンカーにより標的化部分に結合した小分子を投与することによる、癌を有する患者を処置する方法に関する。本発明はまたこのような方法に使用するための組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
患者へのリンパ球(例えば、Ｔ細胞)の養子移入に基づく免疫療法は、癌および他の疾患の価値ある治療法である。免疫療法の発展における多くの重要な進歩は、リンパ球の養子移入に基づきなされている。多くのタイプの免疫療法の中で、開発中の最も有望な免疫療法の一つは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞(ＣＡＲ  Ｔ細胞)である。キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、特定の抗原、例えば、腫瘍抗原を標的とするよう設計された遺伝子改変受容体である。このターゲティングが、例えば、ＣＡＲ発現ＣＡＲ  Ｔ細胞が該特定の腫瘍抗原を介して腫瘍を標的とし、腫瘍細胞を殺害することができるように、腫瘍に対する細胞毒性をもたらし得る。
【０００４】
第一世代ＣＡＲは、腫瘍により発現される抗原を認識し、結合するための抗体由来の認識領域、例えば、一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域および活性化シグナル伝達ドメインからなり、例えば、Ｔ細胞のＣＤ３ζ鎖は、ＣＡＲにおけるＴ細胞活性化シグナルとして働き得る。ＣＡＲ  Ｔ細胞はインビトロで良い結果を示しているが、臨床治験で疾患(例えば、癌)排除の成功は限定的である。一つの問題は、インビボでＣＡＲ  Ｔ細胞集団の長期活性化および拡大が不可能なことである。
【０００５】
この問題に取り組むために、第二世代ＣＡＲでは、インビボでのＴ細胞の長期活性化を達成するために共刺激ドメイン(例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ２８またはＣＤ１３４)が包含されている。共刺激ドメイン付加は、ＣＡＲ含有Ｔ細胞のインビボ増殖および生存を増強し、初期臨床データは、このような構築物が癌などの疾患処置に有望な治療剤であることを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞治療は改善されているものの、幾つかの問題が残っている。まず、‘オフターゲット’毒性が、ＣＡＲ  Ｔ細胞により標的とされる抗原(例えば、腫瘍関連抗原)を発現する正常細胞に対して生じ得る。次に、ＣＡＲ  Ｔ細胞による迅速かつ非制御の罹患細胞(例えば、癌細胞)排除が、患者に致命的であり得る腫瘍溶解症候群またはサイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)と呼ばれる一連の代謝機能不全を誘発する、非制御ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化が見られ得る。腫瘍溶解症候群およびＣＲＳは、容易に制御できず、未制御に活性化されるＣＡＲ  Ｔ細胞の投与によりもたらされ得る。従って、ＣＡＲ  Ｔ細胞は癌などの疾患の処置におけるツールとして非常に有望であることが示されているが、オフターゲット毒性が低減され、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化がより厳密に制御されたさらなるＣＡＲ  Ｔ治療が必要でとされる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明者らは、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療に重要な進歩を提供する、オフターゲット毒性を低減し、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化をより厳密に制御する方法を発見した。ここに記載する種々の実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドが、癌とＣＡＲ発現ＣＡＲ  Ｔ細胞(ここで、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)の間のブリッジとして使用される。ブリッジは、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を、癌の治癒のために癌に指向させる。ある実施態様において、「小分子リガンド」は、例えば、フォレート(folate)、ＤＵＰＡ、ＮＫ−１Ｒリガンド、ＣＡＩＸリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＣＣＫ２Ｒリガンドであり得て、この各々は癌細胞に特異的に結合する小分子リガンドである(すなわち、これらリガンドの受容体は、正常組織に比して癌で多く発現される)。
【０００８】
ある実施態様において、「小分子リガンド」は、ＣＡＲ  Ｔ細胞により発現されるＣＡＲに結合する「標的化部分」に結合する。種々の実施態様において、「標的化部分」は、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)および／またはＮＨＳ−フルオレセインから選択され得る。
【０００９】
「標的化部分」は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現する遺伝子改変ＣＡＲの認識領域に結合する。従って、ＣＡＲの認識領域(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントの一本鎖可変領域(ｓｃＦｖ)、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｃ、(Ｆａｂ’)２フラグメントなど)は、「標的化部分」に指向される。それ故に、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドは、癌の治癒のためにＣＡＲ  Ｔ細胞を癌に指向させる、癌とＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の間のブリッジとして働く。
【００１０】
ある実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そしてiii)患者に該ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第二用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【００１１】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含む)を含む。
【００１２】
さらに他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)；そしてiii)患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与することを含む。
【００１３】
なお他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該患者に化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも第一用量および第二用量で投与され、ここで、該第一用量と該第二用量は異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【００１４】
他の説明的実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第二用量を投与すること(ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約５０％低い)；そしてiii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【００１５】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は約１０ｎＭ／kg患者体重〜約２５００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１,５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である)を含む。
【００１６】
なお他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物を連続的に投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そしてiii)患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するために、該化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了することを含む。
【００１７】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は患者に週１回投与される)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【００１８】
なお他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は、標的化部分を指向するＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の投与前に患者に投与される)、ii)次いで、患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の一用量を投与すること、そしてiii)次いで、患者に該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【００１９】
さらなる実施態様を、次に列挙する項によっても記載する。本出願の概要セクション、説明的実施態様の詳細な記載セクション、実施例セクションまたは特許請求の範囲に記載する適用できる実施態様の何れかと組み合わせた次の実施態様の何れもが考慮される。
【００２０】
１. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)；そして
iii)患者に該ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第二用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【００２１】
２. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；そして
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含む)
を含む、方法。
【００２２】
３. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)；そして
iii)患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与すること
を含む、方法。
【００２３】
４. ステップiiiがフォレートの投与を含む、項３の方法。
【００２４】
５. ステップiiiが葉酸またはロイコボリンの投与を含む、項３または４の方法。
【００２５】
６. ステップiiiがフォレートを含むコンジュゲートの投与を含む、項３の方法。
【００２６】
７. フォレートを含むコンジュゲートが１以上のアミノ酸に結合したフォレートを含む、項６の方法。
【００２７】
８. フォレートを含むコンジュゲートが式
【化１】
2021512147.tif 000003
を有する、項７の方法。
【００２８】
９. フォレートが式
【化２】
2021512147.tif 000004
〔式中、Ｘ１およびＹ１は各々独立してハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３およびＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは各々−(Ｒ６ａ)Ｃ＝、−Ｎ＝、−(Ｒ６ａ)Ｃ(Ｒ７ａ)−および−Ｎ(Ｒ４ａ)−からなる群から独立して選択される二価基であり；ＱはＣおよびＣＨからなる群から選択され；ＴはＳ、Ｏ、Ｎおよび−Ｃ＝Ｃ−からなる群から選択され；
Ｘ２およびＸ３は各々独立して酸素、硫黄、−Ｃ(Ｚ)−、−Ｃ(Ｚ)Ｏ−、−ＯＣ(Ｚ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)−、−ＯＣ(Ｚ)Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｏ−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ５ｂ)−、−Ｓ(Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−、−Ｎ(Ｒ４ａ)Ｓ(Ｏ)２−、−Ｃ(Ｒ６ｂ)(Ｒ７ｂ)−、−Ｎ(Ｃ≡ＣＨ)−、−Ｎ(ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ)−、Ｃ１−Ｃ１２アルキレンおよびＣ１−Ｃ１２アルキレンオキシからなる群から選択され、ここで、Ｚは酸素または硫黄であり；
Ｒ１は水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂおよびＲ７ｂは各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、Ｃ１−Ｃ１２アルキニル、(Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ)カルボニルおよび(Ｃ１−Ｃ１２アルキルアミノ)カルボニルからなる群から選択され；
Ｒ６およびＲ７は各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ６およびＲ７は一体となってカルボニル基を形成し；
Ｒ６ａおよびＲ７ａは各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ６ａおよびＲ７ａは一体となってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは各々独立して０または１であり；そして
＊はコンジュゲートの残りへの任意の共有結合を表す。〕
を有する、項３〜８の何れかの方法。
【００２９】
１０. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＥＣ２３１９および化合物またはその薬学的に許容される塩のＣＡＲ  Ｔ細胞結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤からなる群から選択される、項３の方法。
【００３０】
１１. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、薬剤がリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である、項１０の方法。
【００３１】
１２. リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤がダサチニブである、項１１の方法。
【００３２】
１３. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、薬剤がＰＩ３キナーゼ阻害剤である、項１０の方法。
【００３３】
１４. ＰＩ３キナーゼ阻害剤がＧＤＣ０９８０である、項１３の方法。
【００３４】
１５. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、薬剤がＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤である、項１０の方法。
【００３５】
１６. ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤がＢＭＳ−５０９７４４である、項１５の方法。
【００３６】
１７. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、化合物またはその薬学的に許容される塩のＣＡＲ  Ｔ細胞結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤である、項１０の方法。
【００３７】
１８. 薬剤がフルオレセインアミン、ＦＩＴＣまたはフルオレセインナトリウムである、項１７の方法。
【００３８】
１９. 薬剤がＦＩＴＣである、項１８の方法。
【００３９】
２０. 薬剤がフルオレセインナトリウムである、項１８の方法。
【００４０】
２１. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０１〜約３００μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４１】
２２. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約１００μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４２】
２３. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約９０μＭ／kgの患者体重用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４３】
２４. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約８０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４４】
２５. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約７０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４５】
２６. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約６０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４６】
２７. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約５０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４７】
２８. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約４０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４８】
２９. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約３０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００４９】
３０. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約２０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００５０】
３１. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約１０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００５１】
３２. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約８μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００５２】
３３. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約６μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【００５３】
３４. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が１回を超えて患者に投与される、項３〜３３の何れかの方法。
【００５４】
３５. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が化合物またはその薬学的に許容される塩の前および／または後に患者に投与される、項３〜３４の何れかの方法。
【００５５】
３６. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与が患者におけるサイトカインレベルを減少させる、項３〜３５の何れかの方法。
【００５６】
３７. サイトカインレベル減少が患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与した約３時間後までに起こる、項３６の方法。
【００５７】
３８. サイトカインレベル減少が患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与した約６時間後までに起こる、項３６の方法。
【００５８】
３９. サイトカインレベルの減少が、ほぼ未処置患者のサイトカインレベルまでの減少である、項３６〜３８の何れかの方法。
【００５９】
４０. 化合物またはその薬学的に許容される塩がフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与前および後に投与される、項３〜３９の何れかの方法。
【００６０】
４１. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与後、患者のサイトカインレベルが減少しても、患者の血中ＣＡＲ  Ｔ細胞数が増加する、項３〜４０の何れかの方法。
【００６１】
４２. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与後、処置患者のサイトカインレベルが減少しても、レスキュー剤で処置されていない患者に比して、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化が増強または維持される、項３〜４１の何れかの方法。
【００６２】
４３. 癌が腫瘍を含み、患者の腫瘍サイズがフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を患者に投与したとき増加しない、項３〜４２の何れかの方法。
【００６３】
４４. 腫瘍の完全応答が得られる、項４３の方法。
【００６４】
４５. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を、ＣＲＳグレードが１、２、３または４に達したとき患者に投与する、項３〜４４の何れかの方法。
【００６５】
４６. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を、ＣＲＳグレードが３または４に達したとき患者に投与する、項４５の方法。
【００６６】
４７. 肺浮腫が軽減される、項３〜４６の何れかの方法。
【００６７】
４８. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg患者体重〜約２５００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与され、ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１,５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞用量で投与される、項１〜４７の何れかの方法。
【００６８】
４９. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約１００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８の方法。
【００６９】
５０. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約５０ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８〜４９の何れかの方法。
【００７０】
５１. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約２０ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８〜５０の何れかの方法。
【００７１】
５２. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８の方法。
【００７２】
５３. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約２００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８の方法。
【００７３】
５４. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約４００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８の方法。
【００７４】
５５. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１,２５０万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である、項４８〜５４の何れかの方法。
【００７５】
５６. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約７００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である、項４８〜５５の何れかの方法。
【００７６】
５７. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である、項４８〜５６の何れかの方法。
【００７７】
５８. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約２００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である、項４８〜５７の何れかの方法。
【００７８】
５９. 患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するために、該化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了するステップをさらに含む、項１〜５８の何れかの方法。
【００７９】
６０. 化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも１時間連続して投与される、項１〜５９の何れかの方法。
【００８０】
６１. 化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも４時間連続して投与される、項１〜５９の何れかの方法。
【００８１】
６２. 化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも６時間連続して投与される、項１〜５９の何れかの方法。
【００８２】
６３. 化合物またはその薬学的に許容される塩が隔日で患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【００８３】
６４. 化合物またはその薬学的に許容される塩が週３回患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【００８４】
６５. 化合物またはその薬学的に許容される塩が週２回患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【００８５】
６６. 化合物またはその薬学的に許容される塩が週１回患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【００８６】
６７. 化合物またはその薬学的に許容される塩が、許容されない患者の体重減少、発熱、血圧低下または肺浮腫が生じるまで患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【００８７】
６８. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該患者に化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも第一用量および第二用量で投与され、ここで、該第一用量と該第二用量は異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い)；そして
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【００８８】
６９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量、第二用量および第三用量が患者に投与され、ここで、該第一用量、該第二用量および該第三用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約７５０倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８００倍〜約１００００倍多い、項６８の方法。
【００８９】
７０. 化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量、第二用量、第三用量および第四用量が患者に投与され、ここで、該第一用量、該第二用量、該第三用量および該第四用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約７５０倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８００倍〜約７５００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８０００〜約１５０００倍多い、項６８の方法。
【００９０】
７１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１０００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１００００倍多い、項７０の方法。
【００９１】
７２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量および第二用量が患者に投与され、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量および第二用量が異なり、第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い、項６８の方法。
【００９２】
７３. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第二用量を投与すること(ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約５０％低い)；そして
iii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向されたＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【００９３】
７４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約６０％低い、項７３の方法。
【００９４】
７５. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約７０％低い、項７３の方法。
【００９５】
７６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約８０％低い、項７３の方法。
【００９６】
７７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９０％低い、項７３の方法。
【００９７】
７８. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９５％低い、項７３の方法。
【００９８】
７９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９６％低い、項７３の方法。
【００９９】
８０. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９７％低い、項７３の方法。
【０１００】
８１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９８％低い、項７３の方法。
【０１０１】
８２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９９％低い、項７３の方法。
【０１０２】
８３. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９９.５％低い、項７３の方法。
【０１０３】
８４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０１０４】
８５. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約９００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０１０５】
８６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０１０６】
８７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０１０７】
８８. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０１０８】
８９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約２００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０１０９】
９０. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約４００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０１１０】
９１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約５００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０１１１】
９２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg患者体重である、項８４の方法。
【０１１２】
９３. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約４５０ｎＭ／kg患者体重である、項８５の方法。
【０１１３】
９４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約４００ｎＭ／kg患者体重である、項８６の方法。
【０１１４】
９５. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約３５０ｎＭ／kg患者体重である、項８７の方法。
【０１１５】
９６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重である、項８８の方法。
【０１１６】
９７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約１ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重である、項８９の方法。
【０１１７】
９８. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約２ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重である、項９０の方法。
【０１１８】
９９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約２ｎＭ／kg〜約２５０ｎＭ／kg患者体重である、項９１の方法。
【０１１９】
１００. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約５ｎＭ／kg〜約４０ｎＭ／kg患者体重である、項９２〜９９の何れかの方法。
【０１２０】
１０１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約４０ｎＭ／kg〜約１５０ｎＭ／kg患者体重である、項９２〜９９の何れかの方法。
【０１２１】
１０２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量を投与することをさらに含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量と同じである、項７３〜１０１の何れかの方法。
【０１２２】
１０３. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量を投与することをさらに含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量または化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量と同じである、項１０２の方法。
【０１２３】
１０４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量後に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の用量が、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量に関連した癌の増殖阻害を維持する、項７３〜１０３の何れかの方法。
【０１２４】
１０５. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約４０００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量で投与される、項７３〜１０４の何れかの方法。
【０１２５】
１０６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量後に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の用量が週１回投与される、項７３〜１０５の何れかの方法。
【０１２６】
１０７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の用量が週２回投与される、項７３〜１０５の何れかの方法。
【０１２７】
１０８. ＣＡＲがＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ３ζ活性化ドメインおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインをさらに含む、項１〜１０７の何れかの方法。
【０１２８】
１０９. Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントがｓｃＦｖフラグメントである、項１〜１０８の何れかの方法。
【０１２９】
１１０. ＣＡＲタンパク質配列が配列番号２に少なくとも約９０％同一性を有する、項１〜１０９の何れかの方法。
【０１３０】
１１１. ＣＡＲタンパク質配列が配列番号２に少なくとも約９５％同一性を有する、項１〜１０９の何れかの方法。
【０１３１】
１１２. ＣＡＲタンパク質配列が配列番号２に少なくとも約９８％同一性を有する、項１〜１０９の何れかの方法。
【０１３２】
１１３. ＣＡＲがフルオレセインに結合する、項１〜１１２の何れかの方法。
【０１３３】
１１４. ＣＡＲタンパク質配列が約５０までの保存的アミノ酸置換を有し、ＣＡＲがフルオレセインに結合する、項１〜１０９の何れかの方法。
【０１３４】
１１５. ＣＡＲが配列番号１に少なくとも約９０％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、項１〜１０９の何れかの方法。
【０１３５】
１１６. ＣＡＲが配列番号１に少なくとも約９５％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、項１〜１０９の何れかの方法。
【０１３６】
１１７. ＣＡＲが配列番号１に少なくとも約９８％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、項１〜１０９の何れかの方法。
【０１３７】
１１８. ＣＡＲがフルオレセインに結合する、項１１５〜１１７の何れかの方法。
【０１３８】
１１９. ＣＡＲが配列番号１を有するポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＡＲがフルオレセインに結合する、項１〜１１８の何れかの方法。
【０１３９】
１２０. ＣＡＲが配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによりコードされる、項１〜１１９の何れかの方法。
【０１４０】
１２１. リガンドがフォレート、ＤＵＰＡ、ＮＫ−１Ｒリガンド、ＣＡＩＸリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＣＣＫ２Ｒリガンドからなる群から選択される、項１〜１２０の何れかの方法。
【０１４１】
１２２. 標的化部分がフルオレセインまたはその薬学的に許容される塩である、項１〜１２１の何れかの方法。
【０１４２】
１２３. リンカーがポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロリン、親水性アミノ酸、糖、非天然ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ−１２７またはこれらの組み合わせを含む、項１〜１２２の何れかの方法。
【０１４３】
１２４. リンカーがＰＥＧを含む、項１〜１２３の何れかの方法。
【０１４４】
１２５. 化合物またはその薬学的に許容される塩が式
【化３】
2021512147.tif 000005
〔式中、Ｂは小分子リガンドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＴは標的化部分であり、ここで、Ｌは式
【化４】
2021512147.tif 000006
を有する構造を含み、ｎは０〜２００の整数である。〕
を有する、項１〜１２４の何れかの方法。
【０１４５】
１２６. 癌が肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頚部癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、子宮内膜癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、子宮内膜腫、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小細胞肺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、尿道癌、前立腺癌、慢性白血病、急性白血病、急性骨髄球性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱癌、バーキットリンパ腫、輸尿管癌、腎臓癌、腎臓細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫および食道胃接合部腺癌からなる群から選択される、項１〜１２５の何れかの方法。
【０１４６】
１２７. 癌が葉酸受容体発現癌である、項１〜１２６の何れかの方法。
【０１４７】
１２８. 癌が子宮内膜癌である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０１４８】
１２９. 癌が非小細胞肺癌である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０１４９】
１３０. 癌が卵巣癌である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０１５０】
１３１. 癌がトリプルネガティブ乳癌である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０１５１】
１３２. 癌が急性骨髄球性白血病である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０１５２】
１３３. 癌が葉酸受容体−βを発現する、項１３２の方法。
【０１５３】
１３４. 複数用量のＣＡＲ  Ｔ細胞組成物が投与される、項１〜１３３の何れかの方法。
【０１５４】
１３５. 少なくとも２用量のＣＡＲ  Ｔ細胞組成物が投与される、項１〜１３４の何れかの方法。
【０１５５】
１３６. 患者が化合物またはその薬学的に許容される塩投与前またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与前に造影される、項１〜１３５の何れかの方法。
【０１５６】
１３７. 化合物またはその薬学的に許容される塩が抗体ではなく、抗体フラグメントを含まない、項１〜１３６の何れかの方法。
【０１５７】
１３８. 標的化部分がペプチドエピトープを含まない、項１〜１３７の何れかの方法。
【０１５８】
１３９. 患者におけるオフターゲット毒性をもたらすサイトカイン放出が生じず、癌に対するＣＡＲ  Ｔ細胞毒性が生じる、項１〜１３８の何れかの方法。
【０１５９】
１４０. オフターゲット組織毒性が患者で生じず、癌に対するＣＡＲ  Ｔ細胞毒性が生じる、項１〜１３８の何れかの方法。
【０１６０】
１４１. 癌が腫瘍を含み、患者における腫瘍サイズが減少し、オフターゲット毒性が生じない、項１〜１３８の何れかの方法。
【０１６１】
１４２. ＣＲＳが減少または予防され、本方法が患者における腫瘍体積減少をもたらす、項１〜１４１の何れかの方法。
【０１６２】
１４３. ＣＲＳによる体重減少が減少するかまたは阻止される、項１〜１４２の何れかの方法。
【０１６３】
１４４. 患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を再投与することをさらに含む、項５９〜６７の何れかの方法。
【０１６４】
１４５. 化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の投与が、患者におけるＣＡＲ  Ｔ細胞活性化およびサイトカインレベル増加をもたらす、項１４４の方法。
【０１６５】
１４６. 癌が腫瘍を含み、腫瘍の完全応答が得られる、項１〜１４５の何れかの方法。
【０１６６】
１４７. ＣＡＲ  Ｔ細胞が中央記憶／エフェクター記憶表現型を有する、項１〜１４６の何れかの方法。
【０１６７】
１４８. ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ８：ＣＤ４比が約１：１である、項１〜１４７の何れかの方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１はＥ２構築物対４Ｍ５.３構築物を図式的に示し、Ｅ２構築物の地図を示す。
【０１６９】
【図２】図２は、ＥＣ１７固定用量および用量漸減スキーマを示す。
【０１７０】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＥＣ１７用量漸減および体重変化と共にＥ２−ＣＡＲ−Ｔ抗腫瘍活性(３０００万細胞)を示す。抗腫瘍活性はＮａＦＬレスキュー後維持されることが示されている。
【０１７１】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＥＣ１７用量漸減および体重変化と共に４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ抗腫瘍活性(３０００万細胞)を示す。４Ｍ５.３−ＣＡＲ−ＴはＥ２−ＣＡＲ−Ｔより低活性であったことが示されている。さらに、ＥＣ１７用量依存的抗腫瘍活性および体重減少が観察された。
【０１７２】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、固定ＥＣ１７投与レジメン(５００nmol／kg、ＳＩＷ)でＥ２−ＣＡＲ−Ｔ抗腫瘍活性(１０００万および２０００万細胞)および体重変化を示す。抗腫瘍活性はＮａＦＬレスキュー後維持されたことが示されている。
【０１７３】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、固定ＥＣ１７投与レジメン(５００nmol／kg、ＳＩＷ)で４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ抗腫瘍活性(１０００万および２０００万細胞)および体重変化を示す。４Ｍ５.３−ＣＡＲ−ＴはＥ２−ＣＡＲ−Ｔより低活性であったことが示されている。
【０１７４】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＮＳＧマウスへの注入前のＥ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型特徴づけを示す。
【０１７５】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、Ｅ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞および４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＧＦＰ＋４Ｍ５.３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む種々の調製物におけるＣＡＲ−Ｔ分化表現型の比較を示す。
【０１７６】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ＦＩＴＣへのＤＩＧ標識Ｅ２−ＩｇＧの結合を示す。
【０１７７】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＦＩＴＣ標識ＫＢ細胞上のＤＩＧ標識Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。
【０１７８】
【図１１】図１１は、正常ヒト臓器組織：副腎における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１７９】
【図１２】図１２は、正常ヒト臓器組織：骨髄における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８０】
【図１３】図１３は、正常ヒト臓器組織：乳房における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８１】
【図１４】図１４は、正常ヒト臓器組織：小脳組織における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８２】
【図１５】図１５は、正常ヒト臓器組織：子宮頸における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８３】
【図１６】図１６は、正常ヒト臓器組織：結腸における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８４】
【図１７】図１７は、正常ヒト臓器組織：食道における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８５】
【図１８】図１８は、正常ヒト臓器組織：眼における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８６】
【図１９】図１９は、正常ヒト臓器組織：心臓における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８７】
【図２０】図２０は、正常ヒト臓器組織：下垂体における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８８】
【図２１】図２１は、正常ヒト臓器組織：腎臓における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１８９】
【図２２】図２２は、正常ヒト臓器組織：喉頭における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９０】
【図２３】図２３は、正常ヒト臓器組織：脾臓における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９１】
【図２４】図２４は、正常ヒト臓器組織：肝臓における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９２】
【図２５】図２５は、正常ヒト臓器組織：肺における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９３】
【図２６】図２６は、正常ヒト臓器組織：リンパ節における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９４】
【図２７】図２７は、正常ヒト臓器組織：神経における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９５】
【図２８】図２８は、正常ヒト臓器組織：卵巣における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９６】
【図２９】図２９は、正常ヒト臓器組織：膵臓における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９７】
【図３０】図３０は、正常ヒト臓器組織：前立腺における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９８】
【図３１】図３１は、正常ヒト臓器組織：皮膚における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０１９９】
【図３２】図３２は、正常ヒト臓器組織：小腸における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０２００】
【図３３】図３３は、正常ヒト臓器組織：胃における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０２０１】
【図３４】図３４は、正常ヒト臓器組織：横紋筋における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０２０２】
【図３５】図３５は、正常ヒト臓器組織：精巣における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０２０３】
【図３６】図３６は、正常ヒト臓器組織：胸腺における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０２０４】
【図３７】図３７は、正常ヒト臓器組織：舌における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０２０５】
【図３８】図３８は、正常ヒト臓器組織：子宮における結合ＤＩＧ−Ｅ２抗体のＩＨＣ染色を示す。パネルＡ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない対照組織切片。
【０２０６】
【図３９】図３９は、種々の標的細胞との１日共培養におけるＴ細胞活性化を示すチャートである。１日共培養後活性化されたＥ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のパーセンテージ(ｙ軸)を、アッセイの時間での標的細胞のＦＲ発現レベルに対してグラフ化する(ｘ軸)。(▼)ＯＶ９０細胞；(◆)ＳＫＯＶ３細胞；(▲)ＩＧＲＯＶ１細胞；(■)ＨＯＳ−Ｆｒα細胞；(●)ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞。
【０２０７】
【図４０】図４０は、種々の条件下、５種の異なる細胞型(ＯＶ９０細胞；ＳＫＯＶ３細胞；ＩＧＲＯＶ１細胞；ＨＯＳ−Ｆｒα細胞；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞)との２日共培養における標的細胞アポトーシスを示すグラフである。各細胞型について、条件は次のとおりである：左バー標的細胞単独＋ＥＣ１７；中央バーＥＣ１７ＣＡＲ  Ｔ＋前処理なしの標的細胞共培養；右バーＣＡＲ  Ｔ＋ＥＣ１７前処理で処理した標的細胞。
【０２０８】
【図４１】図４１は５種の異なる細胞型(ＯＶ９０細胞；ＳＫＯＶ３細胞；ＩＧＲＯＶ１細胞；ＨＯＳ−Ｆｒα細胞；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞)における機能的葉酸受容体発現レベルを示すチャートである。
【０２０９】
【図４２】図４２は、腫瘍担持およびナイーブマウスの実験的タイムラインを示す模式図である。
【０２１０】
【図４３】図４３(左パネル)は、サイトカインＩＦＮ−γレベルがナイーブマウスおよび腫瘍担持マウス両者でＥＣ−１７依存的であり、ＩＦＮ−γ増加がＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスと比較してナイーブマウスではるかに低かったことを示すチャートである(２３倍低い)。図４３(右パネル)は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスでＣＡＲ−Ｔ拡大があり、ナイーブマウスで検出可能なＣＡＲ−Ｔ細胞拡大がないＦＡＣＳ分析を示すチャートである。
【０２１１】
【図４４】図４４(上部パネル)は、陽性対照細胞株Ｋ５６２−ＯＫＴ３との共培養における量的に類似レベルでの偽Ｔ細胞および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞からのサイトカイン(ＩＬ−２)産生を示すチャートである(左側のバーのペアであって、偽は左バーであり、抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞は右バーである)；Ｋ５６２とので偽または抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞によりサイトカインは産生されなかった(中央)；そして抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞はサイトカインＩＬ−２の分泌を誘発できた唯一の細胞であったが、ＥＣ−１７での前処理によってのみであった(右、ここで、抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞の結果のみ示す)。図４４(中央パネル)は、陽性対照細胞株Ｋ５６２−ＯＫＴ３との共培養における量的に類似レベルでの偽Ｔ細胞および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞からのサイトカイン(ＩＦＮ−γ)産生を示すチャートである(左側のバーのペアであって、偽は左バーであり、抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞は右バーである)；Ｋ５６２とので偽または抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞によりサイトカインは産生されなかった(中央)；そして抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞はサイトカインＩＦＮ−γの分泌を誘発できた唯一の細胞であったが、ＥＣ−１７での前処理によってのみであった(右、ここで、抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞の結果のみ示す)。図４４(下部パネル)は、陽性対照細胞株Ｋ５６２−ＯＫＴ３との共培養における量的に類似レベルでの偽Ｔ細胞および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞からのサイトカイン(ＴＮＦ−α)産生を示すチャートである(左側のバーのペアであって、偽は左バーであり、抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞は右バーである)；Ｋ５６２とので偽または抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞によりサイトカインは産生されなかった(中央)；そして抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞はサイトカインＴＮＦ−αの分泌を誘発できた唯一の細胞であったが、ＥＣ−１７での前処理によってのみであった(右、ここで、抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞の結果のみ示す)を示すチャートである。
【０２１２】
【図４５】図４５(左上)は、ＣＤ８＋偽Ｔ細胞および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞を陰性対照Ｋ５６２細胞と３０：１、１０：１、３：１または１：１の比で共培養したときのパーセンテージ溶解を示すチャートである。図４５(右上)は、ＣＤ８＋偽Ｔ細胞および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞をＫ５６２＋ＯＫＴ３  標的細胞と３０：１、１０：１、３：１または１：１の比で共培養したときのパーセンテージ溶解を示すチャートである。図４５(左下)は、ＣＤ８＋偽Ｔ細胞および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞を非標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と３０：１、１０：１、３：１または１：１の比で共培養したときのパーセンテージ溶解を示すチャートである。図４５(右下)は、ＣＤ８＋偽Ｔ細胞および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞をＥＣ１７標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と３０：１、１０：１、３：１または１：１の比で共培養したときのパーセンテージ溶解を示すチャートである。全チャートで、(ｘ)ＣＤ８＋偽Ｔ細胞；(○)抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞。
【０２１３】
【図４６】図４６(上部)は、ＦＩＴＣ−フォレートの化学構造を示す。図４６(下部)は、ＦＩＴＣ−フォレートの用量応答曲線を示すチャートである。
【０２１４】
【図４７】図４７(上部)は、ＦＩＴＣ−ＤＵＰＡの化学構造を示す。図４７(下部)は、ＦＩＴＣ−ＤＵＰＡの用量応答曲線を示すチャートである。
【０２１５】
【図４８】図４８(上部)は、ＦＩＴＣ−ＣＡ９の化学構造を示す。図４８(下部)は、ＦＩＴＣ−ＣＡ９の用量応答曲線を示すチャートである。
【０２１６】
【図４９】図４９(上部)は、ＦＩＴＣ−ＮＫ１Ｒの化学構造を示す。図４９(下部)は、ＦＩＴＣ−ＮＫ１Ｒの用量応答曲線を示すチャートである。
【０２１７】
【図５０】図５０は、インビボモデルで使用し、ブリッジの小分子リガンドに対応する受容体を発現する腫瘍細胞へのブリッジの結合(ＦＡＣＳ分析による)を示す。
【０２１８】
【図５１】図５１は、ＣＡＲ  Ｔ細胞による強力なＦＲ依存性腫瘍細胞殺滅のＥＣ１７誘導を示す。
【０２１９】
【図５２】図５２は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解性活性と腫瘍細胞の機能的ＦＲレベルの相関を示す。
【０２２０】
【図５３】図５３は、ＥＣ１７／ＦＲ依存性ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化および疲弊を示す。ＥＣ１７(１００nM、３７℃で３０分パルス)を併用せずまたは併用して前充填したＦＲ＋腫瘍細胞標的と共培養(Ｅ／Ｔ＝１：１)したＣＡＲ−Ｔ細胞で検出される早期(ＣＤ６９)、中期(ＣＤ１３７)および後期(ＰＤ１)Ｔ細胞活性化マーカーの発現を示す。最初の２つの白抜きバーは、標的細胞なしのＣＡＲ−Ｔおよび偽形質導入Ｔ細胞のみを示す。２〜４番目のパネルの上から下の注釈＝バーは左から右。
【０２２１】
【図５４】図５４は、ＥＣ１７／ＦＲ依存性ＣＡＲ  Ｔ細胞疲弊プロファイルを示す。１行目：０〜３日目標的細胞を伴わない培養でのＣＡＲ−Ｔ細胞の分化状態変化を表す着色パイチャート。最下行：ＥＣ１７(０.１または１０nM、３７℃で３０分パルス)を併用せずまたは併用して前充填したＦＲ＋(ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＴＨＰ−１ＦＲβ、ＨＯＳ−ＦＲα、ＫＢ)およびＦＲ−陰性(ＴＨＰ１−ＦＧ１２、ＨＯＳ−１４３ｂ)腫瘍細胞と３日間の共培養(Ｅ／Ｔ＝１：２)後のＣＡＲ−Ｔ細胞の分化状態を表す４セットの着色パイチャート。
【０２２２】
【図５５】図５５は、抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ(クローンＥ２)、完全長ＩｇＧ４スペーサー(Ｆｃ由来ヒンジ−ＣＨ２(Ｌ２３５Ｄ、Ｎ２９７Ｑ)−ＣＨ３)、ＣＤ２８ｔｍ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ細胞質活性化ドメインおよび上皮細胞増殖因子受容体の非機能的切断細胞表面ポリペプチド(ＥＧＦＲｔ)からなる完全ヒトＣＡＲ構築物を示す。下部：ＥＧＦＲｔソート(左パイチャート)ＣＡＲ−Ｔ細胞調製物および非ソート「臨床模写(clinical facsimile)」(右パイチャート)のフローサイトメトリーにより実施したＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞表現型検査の例。カラーキーは示すとおり。
【０２２３】
【図５６】図５６、パネルＡ：３７℃で２時間インキュベーション後のＦＲ＋標的細胞による３Ｈ−ＥＣ１７取り込みのＫｄ値(細胞当たりの結合分子数から計算)。パネルＢ：室温で２時間インキュベーション後のＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞による３Ｈ−ＥＣ１７取り込みのＫｄ値(約２４％ＥＧＦＲｔ＋、約９５：５  ＣＤ８／ＣＤ４比)(総細胞関連放射活性、ＤＰＭから計算)。
【０２２４】
【図５７】図５７(パネルＡおよびＢ)は、ＣＲＳ評価尺度ＨＯＳ−ＦＲα腫瘍担持マウスのフルオレセインナトリウムレスキューに適用したおよび実験条件を示す。レスキューしたおよびしていないＴ細胞由来サイトカインの変化が示される。ｐ値はスチューデントのｔ検定により計算した。
【０２２５】
【図５８】図５８は、３Ｈ−ＦＡ(葉酸)ベースの結合アッセイにより測定した腫瘍細胞の機能的ＦＲレベルを示す(１００nM、１時間、３７℃)。
【０２２６】
【図５９】図５９は、(パネルＡ)１：１  Ｅ／Ｔ(エフェクター／標的)比で２４時間、ＥＧＦＲｔソートＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養した５種のＦＲ(葉酸受容体)＋腫瘍細胞株の特異的溶解(％)における完全範囲ＥＣ１７用量応答を示す；(パネルＢ)最大溶解(％)およびＥＣ５０値は、１００nMまで適合させた用量−応答曲線から得た。
【０２２７】
【図６０】図６０は、ＣＡＲ−Ｔ細胞活性とＦＲレベルおよび腫瘍細胞の本来の感受性の相関を示す。パネルＡ：１０nM  ＥＣ１７存在下、１６時間および４８時間の共培養後の、ＦＲ＋(ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＫＢ、ＴＨＰ１−ＦＲβ、ＯＶ９０、ＨＯＳ−ＦＲα)およびＦＲ−陰性(ＨＯＳ−１４３ｂ)細胞株の種々のＥ／Ｔ比での特異的溶解(％)の反応速度論。パネルＢ：Ｅ／Ｔ比の線形目盛に対してプロットした標的細胞の特異的溶解(％)。高ＦＲ＋ＫＢ細胞は１６時間で早期抵抗を示し、ＦＲ−陰性ＨＯＳ−１４３ｂは応答しなかった。パネルＣ：ＫＢ細胞以外、片対数相関が１６時間の共培養での特異的溶解(％)と腫瘍細胞の機能的ＦＲレベルの間で構築された。パネルＤ：１０nM  ＥＣ１７と４４時間の共培養後のＣＡＲ−Ｔ細胞由来Ｔｈ１サイトカイン(ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α)のレベルと種々のＥ／Ｔ比の相関を示す３Ｄダイアグラム。パネルＥ：Ｌｏｇ１０スケールでＦＲ＋標的細胞のＦＲレベルに対してプロットしたＣＡＲ−Ｔ細胞由来Ｔｈ１サイトカインレベル。
【０２２８】
【図６１】図６１は、(パネルＡ)フローサイトメトリーにより確認した標的細胞のＥＣ１７充填状態を示す棒グラフであり、ＭＦＩとして示す(ＥＣ１７はＦＲ陰性細胞株で検出不可能であった)および(パネルＢ)図５４に記載のとおり２日間の共培養後のAnnexin V染色により検出した標的細胞アポトーシス(％)。
【０２２９】
【図６２】図６２は、インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の薬物動態および腫瘍取り込みを示す。パネルＡ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞注射および毎週ＥＣ１７投与(５００nmol／kg)と関連した動物採取スケジュールを示す実験レイアウトの概略図。計１５マウスが０日目に約４８０万のＥＧＦＲｔソートＣＡＲ−Ｔ細胞を受けた(３マウスは開始すべき大きな腫瘍を有した)。パネルＢ：左パネルは腫瘍体積測定および体重変化を示す；中央のプロットは、ＥＣ１７単回投与７日後の血中のＣＡＲ−Ｔ細胞拡大を示す；右棒グラフは、小さなおよび大きな腫瘍を有するマウスの循環ＣＤ４／ＣＤ８  ＣＡＲ−Ｔ細胞サブセットの分化プロファイルを示す。パネルＣ：腫瘍体積および体重変化の測定。パネルＤ：上部プロットは、血液(実線)対腫瘍(点線)のＣＡＲ−Ｔ細胞反応速度論を示す。下部棒グラフは、血中のＣＡＲ−Ｔ細胞表現型の変化を示す。パネルＥ：腫瘍浸潤ＣＡＲ−Ｔ細胞上の活性化マーカー(４−１ＢＢ、ＰＤ１)の表面発現における動態学的変化。
【０２３０】
【図６３】図６３は、抗腫瘍活性およびＣＲＳ毒性に対する食餌性フォレートの効果を示す。パネルＡ：試験中ＦＡ強化またはＦＡ欠損餌に維持した、大ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を異種移植され、ＣＡＲ−Ｔ細胞(約１０００万「臨床模写」)と５００nmol／kgのＥＣ１７  ＳＩＷで処置したＮＳＧマウスの腫瘍体積および体重変化の測定(ｎ＝５)。パネルＢ：それぞれ５２日目(ＦＡ欠損)および５９日目(ＦＡ強化)の試験の最後に測定した循環ＣＡＲ−Ｔ細胞(ヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋)を示す棒グラフ。パネルＣ：ＣＡＲ−Ｔ細胞のみ(ＥＣ１７無)処置ＦＡ欠損マウスで循環ＣＡＲ−Ｔ細胞がないことおよびＦＡ強化餌以外同一処置したマウスと比較してＦＡ欠損餌のＣＡＲ−Ｔ細胞とＥＣ１７で処置したマウスの循環ＣＡＲ−Ｔ細胞数増加を示す代表的フローサイトメトリードットプロット。パネルＤ：ＦＲ発現の消失は、ＦＡ強化動物で５９日目に採取し、フローサイトメトリーで分析した３つのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍中２つで検出された(後に定量的放射リガンド結合アッセイで確認、データは示していない)。
【発明を実施するための形態】
【０２３１】
定義
ここで使用する単数表現は、１以上を意味し得る。例えば、整数、分数およびパーセンテージを含む数値を参照してここで使用する「約」は、一般に当業者が記載される値と等しいと考える(例えば、同じ機能または結果を有する)、数値範囲(例えば、記載される値の±５％〜１０％)をいう。
【０２３２】
ここで使用する用語「処置」、「処置された」または「処置する」は、治療的処置および予防的または防止的処置の両者を含む。
【０２３３】
癌に関してここで使用する用語「改善」、「改善された」または「改善する」は、癌の症状軽減、腫瘍サイズ減少、腫瘍の完全なまたは部分的な除去(例えば、完全または部分応答)、疾患を安定させる、癌進行を阻止する(例えば、無進行生存)または医師が癌の治療的、予防的または防止的処置であると考える癌に対する他の何らかの効果を意味し得る。
【０２３４】
ここで使用する用語「投与」、「投与された」または「投与する」は、化合物もしくはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を患者に導入する全ての手段を意味し、経口、静脈内、筋肉内、皮下および経皮を含むが、これらに限定されない。
【０２３５】
ここで使用する用語「オフターゲット毒性」は、患者を処置する医師に受容され得ない臓器損傷または患者の体重減少または患者を処置する医師に受容され得ない患者に対する何らかの他の作用、例えば、Ｂ細胞形成不全、発熱、血圧低下または肺浮腫を意味する。
【０２３６】
ここで使用する用語「形質導入」および「トランスフェクト」は等しく使用され、これら用語は、ウイルス法および非ウイルス法を含む何らかの人工的方法により細胞に核酸を導入することを意味する。
【０２３７】
説明的実施態様の詳細な記載
ここに記載する種々の実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドは癌とＣＡＲ  Ｔ細胞(すなわち、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞)の間のブリッジとして使用され、ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分に指向する遺伝子改変ＣＡＲを含み、ここで、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む。ブリッジは、癌の改善のためにＣＡＲ  Ｔ細胞を癌に指向させる。ある実施態様において、「小分子リガンド」はフォレート、ＣＡＩＸリガンド、ＤＵＰＡ、ＮＫ−１Ｒリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＣＣＫ２Ｒリガンドであり得て、この各々は癌細胞型に特異的に結合する小分子リガンドである(すなわち、これらのリガンドの各々の受容体は、正常組織に比して癌で過発現される)。
【０２３８】
小分子リガンドに結合する「標的化部分」は、ＣＡＲ  Ｔ細胞により発現される遺伝子改変ＣＡＲの認識領域に結合し、ここで、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む。従って、ＣＡＲの認識領域(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体の一本鎖フラグメント可変領域(ｓｃＦｖ))は、「標的化部分」に指向される。それ故に、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドは癌とＣＡＲ  Ｔ細胞(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は遺伝子改変ＣＡＲを含む)の間のブリッジとして働き、癌の改善のためにＣＡＲ  Ｔ細胞を癌に指向させる。
【０２３９】
ブリッジは小有機分子であり、よって血流からのクリアランスは迅速に達成され得る(例えば、約２０分以下)。ある態様おいて、ＣＡＲ  Ｔ細胞応答(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む遺伝子改変ＣＡＲを含む)は、‘ブリッジ’の小分子リガンド部分の受容体を発現する癌細胞のみに標的化され得て、それにより正常組織へのオフターゲット毒性が低減される。さらに、この系は、１タイプのＣＡＲ  Ｔ細胞構築物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を、異なる‘ブリッジ’を使用することにより多くの癌を標的とするために使用できるため、‘普遍的’であり得る。実例として、ＣＡＲ  Ｔ細胞(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む遺伝子改変ＣＡＲを含む)により認識される標的化部分は、１タイプのＣＡＲ  Ｔ細胞の使用を可能とするよう一定のままであり得て、一方、癌に結合する小分子リガンドを、多くの癌のターゲティングを可能とするよう変え得る。
【０２４０】
本明細書に記載する種々の実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを「化合物」と称する。
【０２４１】
種々の実施態様において、用語「Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメント」は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体のフラグメント(例えば、ｓｃＦｖフラグメント)を含むＣＡＲをいう。Ｅ２抗フルオレセイン抗体は、例えば、Vaughan, et al., Nature Biotechnol. Vol. 14(3), pp. 309-314, 1996に記載され、引用により本明細書に包含させる。種々の実施態様において、ＣＡＲは、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ３ζ活性化ドメインおよび／または４−１ＢＢ共刺激ドメインまたはＥＧＦＲｔドメインなどの任意の他の適当なドメインをさらに含み得る。なお他の実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９.５％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ得る。他の説明的実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１を有するポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ得る。さらに他の態様において、ＣＡＲは配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによりコードされ得る。他の実施態様において、ＣＡＲタンパク質配列は、配列番号２に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有し得る。さらに他の実施態様において、ＣＡＲタンパク質配列は約５０までの保存的アミノ酸置換を有し得る。ここに記載する実施態様の何れにおいても、ＣＡＲがフルオレセインに結合する。
【０２４２】
ある実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そしてiii)患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第二用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【０２４３】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含む)を含む。
【０２４４】
さらに他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そして、iii)患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬物を投与することを含む。
【０２４５】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は約１０ｎＭ／kg患者体重〜約２５００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１,５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である)を含む。
【０２４６】
なお他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物を連続的に投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そしてiii)患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するために、該化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了することを含む。
【０２４７】
他の説明的態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該患者に化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも第一用量および第二用量で投与され、ここで、該第一用量と該第二用量は異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い)そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【０２４８】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は患者に週１回投与される)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【０２４９】
さらに他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第二用量を投与すること(ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約５０％低い)、そしてiii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の１用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【０２５０】
数実施態様を、次に列挙する項によって記載する。本出願の概要セクション、説明的実施態様の詳細な記載セクション、実施例セクションまたは特許請求の範囲に記載する適用できる実施態様の何れかと組み合わせた次の実施態様の何れも考慮される。
【０２５１】
１. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)；そして
iii)患者に該ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第二用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【０２５２】
２. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；そして
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含む)
を含む、方法。
【０２５３】
３. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)；そして
iii)患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与すること
を含む、方法。
【０２５４】
４. ステップiiiがフォレートの投与を含む、項３の方法。
【０２５５】
５. ステップiiiが葉酸またはロイコボリンの投与を含む、項３または４の方法。
【０２５６】
６. ステップiiiがフォレートを含むコンジュゲートの投与を含む、項３の方法。
【０２５７】
７. フォレートを含むコンジュゲートが１以上のアミノ酸に結合したフォレートを含む、項６の方法。
【０２５８】
８. フォレートを含むコンジュゲートが式
【化５】
2021512147.tif 000007
を有する、項７の方法。
【０２５９】
９. フォレートが式
【化６】
2021512147.tif 000008
〔式中、Ｘ１およびＹ１は各々独立してハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３およびＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは各々−(Ｒ６ａ)Ｃ＝、−Ｎ＝、−(Ｒ６ａ)Ｃ(Ｒ７ａ)−および−Ｎ(Ｒ４ａ)−からなる群から独立して選択される二価基であり；ＱはＣおよびＣＨからなる群から選択され；ＴはＳ、Ｏ、Ｎおよび−Ｃ＝Ｃ−からなる群から選択され；
Ｘ２およびＸ３は各々独立して酸素、硫黄、−Ｃ(Ｚ)−、−Ｃ(Ｚ)Ｏ−、−ＯＣ(Ｚ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)−、−ＯＣ(Ｚ)Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｏ−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ５ｂ)−、−Ｓ(Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−、−Ｎ(Ｒ４ａ)Ｓ(Ｏ)２−、−Ｃ(Ｒ６ｂ)(Ｒ７ｂ)−、−Ｎ(Ｃ≡ＣＨ)−、−Ｎ(ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ)−、Ｃ１−Ｃ１２アルキレンおよびＣ１−Ｃ１２アルキレンオキシからなる群から選択され、ここで、Ｚは酸素または硫黄であり；
Ｒ１は水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂおよびＲ７ｂは各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、Ｃ１−Ｃ１２アルキニル、(Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ)カルボニルおよび(Ｃ１−Ｃ１２アルキルアミノ)カルボニルからなる群から選択され；
Ｒ６およびＲ７は各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ６およびＲ７は一体となってカルボニル基を形成し；
Ｒ６ａおよびＲ７ａは各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ６ａおよびＲ７ａは一体となってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは各々独立して０または１であり；そして
＊はコンジュゲートの残りへの任意の共有結合を表す。〕
を有する、項３〜８の何れかの方法。
【０２６０】
１０. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＥＣ２３１９および化合物またはその薬学的に許容される塩のＣＡＲ  Ｔ細胞結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤からなる群から選択される、項３の方法。
【０２６１】
１１. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、薬剤がリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である、項１０の方法。
【０２６２】
１２. リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤がダサチニブである、項１１の方法。
【０２６３】
１３. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、薬剤がＰＩ３キナーゼ阻害剤である、項１０の方法。
【０２６４】
１４. ＰＩ３キナーゼ阻害剤がＧＤＣ０９８０である、項１３の方法。
【０２６５】
１５. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、薬剤がＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤である、項１０の方法。
【０２６６】
１６. ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤がＢＭＳ−５０９７４４である、項１５の方法。
【０２６７】
１７. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、化合物またはその薬学的に許容される塩のＣＡＲ  Ｔ細胞結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤である、項１０の方法。
【０２６８】
１８. 薬剤がフルオレセインアミン、ＦＩＴＣまたはフルオレセインナトリウムである、項１７の方法。
【０２６９】
１９. 薬剤がＦＩＴＣである、項１８の方法。
【０２７０】
２０. 薬剤がフルオレセインナトリウムである、項１８の方法。
【０２７１】
２１. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０１〜約３００μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２７２】
２２. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約１００μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２７３】
２３. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約９０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２７４】
２４. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約８０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２７５】
２５. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約７０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２７６】
２６. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約６０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２７７】
２７. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約５０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２７８】
２８. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約４０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２７９】
２９. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約３０μＭル／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２８０】
３０. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約２０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２８１】
３１. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約１０μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２８２】
３２. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約８μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２８３】
３３. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０６〜約６μＭ／kg患者体重の用量で投与される、項１７〜２０の何れかの方法。
【０２８４】
３４. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が１回を超えて患者に投与される、項３〜３３の何れかの方法。
【０２８５】
３５. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が化合物またはその薬学的に許容される塩の前および／または後に患者に投与される、項３〜３４の何れかの方法。
【０２８６】
３６. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与が患者におけるサイトカインレベルを減少させる、項３〜３５の何れかの方法。
【０２８７】
３７. サイトカインレベル減少が患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与した約３時間後までに起こる、項３６の方法。
【０２８８】
３８. サイトカインレベル減少が患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与した約６時間後までに起こる、項３６の方法。
【０２８９】
３９. サイトカインレベルの減少が、ほぼ未処置患者のサイトカインレベルまでの減少である、項３６〜３８の何れかの方法。
【０２９０】
４０. 化合物またはその薬学的に許容される塩がフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与前および後に投与される、項３〜３９の何れかの方法。
【０２９１】
４１. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与後、患者のサイトカインレベルが減少しても、患者の血中ＣＡＲ  Ｔ細胞数が増加する、項３〜４０の何れかの方法。
【０２９２】
４２. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与後、処置患者のサイトカインレベルが減少しても、レスキュー剤で処置されていない患者に比して、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化が増強または維持される、項３〜４１の何れかの方法。
【０２９３】
４３. 癌が腫瘍を含み、患者の腫瘍サイズがフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を患者に投与したとき増加しない、項３〜４２の何れかの方法。
【０２９４】
４４. 腫瘍の完全応答が得られる、項４３の方法。
【０２９５】
４５. フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を、ＣＲＳグレードが１、２、３または４に達したとき患者に投与する、項３〜４４の何れかの方法。
【０２９６】
４６. ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を、ＣＲＳグレードが３または４に達したとき患者に投与する、項４５の方法。
【０２９７】
４７. 肺浮腫が軽減される、項３〜４６の何れかの方法。
【０２９８】
４８. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg患者体重〜約２５００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与され、ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１,５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞用量で投与される、項１〜４７の何れかの方法。
【０２９９】
４９. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ナノモル／kg〜約１００ナノモル／患者体重kgの用量で投与される、項４８の方法。
【０３００】
５０. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約５０ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８〜４９の何れかの方法。
【０３０１】
５１. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約２０ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８〜５０の何れかの方法。
【０３０２】
５２. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約１０ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８の方法。
【０３０３】
５３. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約２００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８の方法。
【０３０４】
５４. 化合物またはその薬学的に許容される塩が約４００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される、項４８の方法。
【０３０５】
５５. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１,２５０万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である、項４８〜５４の何れかの方法。
【０３０６】
５６. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約７００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である、項４８〜５５の何れかの方法。
【０３０７】
５７. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である、項４８〜５６の何れかの方法。
【０３０８】
５８. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約２００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である、項４８〜５７の何れかの方法。
【０３０９】
５９. 患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するために、該化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了するステップをさらに含む、項１〜５８の何れかの方法。
【０３１０】
６０. 化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも１時間連続して投与される、項１〜５９の何れかの方法。
【０３１１】
６１. 化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも４時間連続して投与される、項１〜５９の何れかの方法。
【０３１２】
６２. 化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に少なくとも６時間連続して投与される、項１〜５９の何れかの方法。
【０３１３】
６３. 化合物またはその薬学的に許容される塩が隔日で患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【０３１４】
６４. 化合物またはその薬学的に許容される塩が週３回患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【０３１５】
６５. 化合物またはその薬学的に許容される塩が週２回患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【０３１６】
６６. 化合物またはその薬学的に許容される塩が週１回患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【０３１７】
６７. 化合物またはその薬学的に許容される塩が、許容されない患者の体重減少、発熱、血圧低下または肺浮腫が生じるまで患者に投与される、項１〜６２の何れかの方法。
【０３１８】
６８. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該患者に化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも第一用量および第二用量で投与され、ここで、該第一用量と該第二用量は異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い)；そして
ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【０３１９】
６９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量、第二用量および第三用量が患者に投与され、ここで、該第一用量、該第二用量および該第三用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約７５０倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８００倍〜約１００００倍多い、項６８の方法。
【０３２０】
７０. 化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量、第二用量、第三用量および第四用量が患者に投与され、ここで、該第一用量、該第二用量、該第三用量および該第四用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約７５０倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８００倍〜約７５００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８０００〜約１５０００倍多い、項６８の方法。
【０３２１】
７１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１０００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１００００倍多い、項７０の方法。
【０３２２】
７２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量および第二用量が患者に投与され、ここで、第一用量および第二用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い、項６８の方法。
【０３２３】
７３. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)；
ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第二用量を投与すること(ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約５０％低い)；そして
iii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)
を含む、方法。
【０３２４】
７４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約６０％低い、項７３の方法。
【０３２５】
７５. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約７０％低い、項７３の方法。
【０３２６】
７６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約８０％低い、項７３の方法。
【０３２７】
７７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９０％低い、項７３の方法。
【０３２８】
７８. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９５％低い、項７３の方法。
【０３２９】
７９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９６％低い、項７３の方法。
【０３３０】
８０. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９７％低い、項７３の方法。
【０３３１】
８１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９８％低い、項７３の方法。
【０３３２】
８２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９９％低い、項７３の方法。
【０３３３】
８３. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９９.５％低い、項７３の方法。
【０３３４】
８４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０３３５】
８５. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約９００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０３３６】
８６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０３３７】
８７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０３３８】
８８. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約１００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０３３９】
８９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約２００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０３４０】
９０. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約４００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０３４１】
９１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量が約５００ｎＭ／kg患者体重である、項７３〜８３の何れかの方法。
【０３４２】
９２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg患者体重である、項８４の方法。
【０３４３】
９３. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約４５０ｎＭ／kg患者体重である、項８５の方法。
【０３４４】
９４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約４００ｎＭ／kg患者体重である、項８６の方法。
【０３４５】
９５. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約３５０ｎＭ／kg患者体重である、項８７の方法。
【０３４６】
９６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約０.５ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重である、項８８の方法。
【０３４７】
９７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約１ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重である、項８９の方法。
【０３４８】
９８. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約２ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重である、項９０の方法。
【０３４９】
９９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約２ｎＭ／kg〜約２５０ｎＭ／kg患者体重である、項９１の方法。
【０３５０】
１００. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約５ｎＭ／kg〜約４０ｎＭ／kg患者体重である、項９２〜９９の何れかの方法。
【０３５１】
１０１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が約４０ｎＭ／kg〜約１５０ｎＭ／kg患者体重である、項９２〜９９の何れかの方法。
【０３５２】
１０２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量を投与することをさらに含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量と同じである、項７３〜１０１の何れかの方法。
【０３５３】
１０３. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量を投与することをさらに含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量または化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量と同じである、項１０２の方法。
【０３５４】
１０４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量後に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の用量が、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量に関連した癌の増殖阻害を維持する、項７３〜１０３の何れかの方法。
【０３５５】
１０５. ＣＡＲ  Ｔ細胞が約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約４０００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量で投与される、項７３〜１０４の何れかの方法。
【０３５６】
１０６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量後に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の用量が週１回投与される、項７３〜１０５の何れかの方法。
【０３５７】
１０７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の用量が週２回投与される、項７３〜１０５の何れかの方法。
【０３５８】
１０８. ＣＡＲがＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ３ζ活性化ドメインおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインをさらに含む、項１〜１０７の何れかの方法。
【０３５９】
１０９. Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントがｓｃＦｖフラグメントである、項１〜１０８の何れかの方法。
【０３６０】
１１０. ＣＡＲタンパク質配列が配列番号２に少なくとも約９０％同一性を有する、項１〜１０９の何れかの方法。
【０３６１】
１１１. ＣＡＲタンパク質配列が配列番号２に少なくとも約９５％同一性を有する、項１〜１０９の何れかの方法。
【０３６２】
１１２. ＣＡＲタンパク質配列が配列番号２に少なくとも約９８％同一性を有する、項１〜１０９の何れかの方法。
【０３６３】
１１３. ＣＡＲがフルオレセインに結合する、項１〜１１２の何れかの方法。
【０３６４】
１１４. ＣＡＲタンパク質配列が約５０までの保存的アミノ酸置換を有し、ＣＡＲがフルオレセインに結合する、項１〜１０９の何れかの方法。
【０３６５】
１１５. ＣＡＲが配列番号１に少なくとも約９０％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、項１〜１０９の何れかの方法。
【０３６６】
１１６. ＣＡＲが配列番号１に少なくとも約９５％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、項１〜１０９の何れかの方法。
【０３６７】
１１７. ＣＡＲが配列番号１に少なくとも約９８％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、項１〜１０９の何れかの方法。
【０３６８】
１１８. ＣＡＲがフルオレセインに結合する、項１１５〜１１７の何れかの方法。
【０３６９】
１１９. ＣＡＲが配列番号１を有するポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ＣＡＲがフルオレセインに結合する、項１〜１１８の何れかの方法。
【０３７０】
１２０. ＣＡＲが配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによりコードされる、項１〜１１９の何れかの方法。
【０３７１】
１２１. リガンドがフォレート、ＤＵＰＡ、ＮＫ−１Ｒリガンド、ＣＡＩＸリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＣＣＫ２Ｒリガンドからなる群から選択される、項１〜１２０の何れかの方法。
【０３７２】
１２２. 標的化部分がフルオレセインまたはその薬学的に許容される塩である、項１〜１２１の何れかの方法。
【０３７３】
１２３. リンカーがポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロリン、親水性アミノ酸、糖、非天然ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ−１２７またはこれらの組み合わせを含む、項１〜１２２の何れかの方法。
【０３７４】
１２４. リンカーがＰＥＧを含む、項１〜１２３の何れかの方法。
【０３７５】
１２５. 化合物またはその薬学的に許容される塩が式
【化７】
2021512147.tif 000009
〔式中、Ｂは小分子リガンドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＴは標的化部分であり、ここで、Ｌは式
【化８】
2021512147.tif 000010
を有する構造を含み、ｎは０〜２００の整数である。〕
を有する、項１〜１２４の何れかの方法。
【０３７６】
１２６. 癌が肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頚部癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、子宮内膜癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、子宮内膜腫、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小細胞肺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、尿道癌、前立腺癌、慢性白血病、急性白血病、急性骨髄球性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱癌、バーキットリンパ腫、輸尿管癌、腎臓癌、腎臓細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫および食道胃接合部腺癌からなる群から選択される、項１〜１２５の何れかの方法。
【０３７７】
１２７. 癌が葉酸受容体発現癌である、項１〜１２６の何れかの方法。
【０３７８】
１２８. 癌が子宮内膜癌である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０３７９】
１２９. 癌が非小細胞肺癌である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０３８０】
１３０. 癌が卵巣癌である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０３８１】
１３１. 癌がトリプルネガティブ乳癌である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０３８２】
１３２. 癌が急性骨髄球性白血病である、項１〜１２７の何れかの方法。
【０３８３】
１３３. 癌が葉酸受容体−βを発現する、項１３２の方法。
【０３８４】
１３４. 複数用量のＣＡＲ  Ｔ細胞組成物が投与される、項１〜１３３の何れかの方法。
【０３８５】
１３５. 少なくとも２用量のＣＡＲ  Ｔ細胞組成物が投与される、項１〜１３４の何れかの方法。
【０３８６】
１３６. 患者が化合物またはその薬学的に許容される塩投与前またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与前に造影される、項１〜１３５の何れかの方法。
【０３８７】
１３７. 化合物またはその薬学的に許容される塩が抗体ではなく、抗体フラグメントを含まない、項１〜１３６の何れかの方法。
【０３８８】
１３８. 標的化部分がペプチドエピトープを含まない、項１〜１３７の何れかの方法。
【０３８９】
１３９. 患者におけるオフターゲット毒性をもたらすサイトカイン放出が生じず、癌に対するＣＡＲ  Ｔ細胞毒性が生じる、項１〜１３８の何れかの方法。
【０３９０】
１４０. オフターゲット組織毒性が患者で生じず、癌に対するＣＡＲ  Ｔ細胞毒性が生じる、項１〜１３８の何れかの方法。
【０３９１】
１４１. 癌が腫瘍を含み、患者における腫瘍サイズが減少し、オフターゲット毒性が生じない、項１〜１３８の何れかの方法。
【０３９２】
１４２. ＣＲＳが減少または予防され、本方法が患者における腫瘍体積減少をもたらす、項１〜１４１の何れかの方法。
【０３９３】
１４３. ＣＲＳによる体重減少が減少するかまたは阻止される、項１〜１４２の何れかの方法。
【０３９４】
１４４. 患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を再投与することをさらに含む、項５９〜６７の何れかの方法。
【０３９５】
１４５. 化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の投与が、患者におけるＣＡＲ  Ｔ細胞活性化およびサイトカインレベル増加をもたらす、項１４４の方法。
【０３９６】
１４６. 癌が腫瘍を含み、腫瘍の完全応答が得られる、項１〜１４５の何れかの方法。
【０３９７】
１４７. ＣＡＲ  Ｔ細胞が中央記憶／エフェクター記憶表現型を有する、項１〜１４６の何れかの方法。
【０３９８】
１４８. ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ８：ＣＤ４比が約１：１である、項１〜１４７の何れかの方法。
【０３９９】
それ故に、ある実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第一用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そしてiii)患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の第二用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【０４００】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含む)を含む。
【０４０１】
さらに他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そして、iii)患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬物を投与することを含む。
【０４０２】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は約１０ｎＭ／kg患者体重〜約２５００ｎＭ／kg患者体重の用量で投与される)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は約１００万のＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１,５００万のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量である)を含む。
【０４０３】
なお他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物を連続的に投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そしてiii)患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するために、該化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了することを含む。
【０４０４】
他の説明的態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該患者に化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも第一用量および第二用量で投与され、ここで、該第一用量と該第二用量は異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い)そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【０４０５】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は患者に週１回投与される)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【０４０６】
さらに他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第二用量を投与すること(ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約５０％低い)そしてiii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の１用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を含む。
【０４０７】
従って、種々の実施態様は先の段落および上記項の一覧に記載され、この「説明的実施態様の詳細な記載」、概要セクション、実施例および特許請求の範囲に記載される全ての適用できる実施態様は、これら実施態様に適用される。
【０４０８】
ここで記載する「患者」はヒトであってよく、または、獣医適用の場合、患者は実験動物、農業用動物、家庭用動物または野生動物であり得る。種々の態様において、患者は齧歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスターなど)、ウサギ、サル、チンパンジーなどの実験動物、イヌ、ネコまたはウサギなどの家庭用動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの農業用動物またはクマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカまたはクジラなどの捕らわれた野生動物であり得る。
【０４０９】
種々の実施態様において、処置する癌は、癌腫、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、鼻咽頭癌、白血病、腺癌または骨髄腫から選択され得る。他の実施態様において、癌は肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頚部癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、子宮内膜癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、子宮内膜腫、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小細胞肺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、尿道癌、前立腺癌、慢性白血病、急性骨髄球性白血病を含む急性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱癌、バーキットリンパ腫、輸尿管癌、腎臓癌、腎臓細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫および食道胃接合部腺癌であり得る。
【０４１０】
これら実施態様のある態様において、癌は葉酸受容体発現癌である。他の実施態様において、癌は葉酸受容体α発現癌である。さらに他の実施態様において、癌は葉酸受容体β発現癌である。これら実施態様のある態様において、癌は子宮内膜癌で、非小細胞肺癌、卵巣癌またはトリプルネガティブ乳癌ある。他の実施態様において、処置される癌は腫瘍である。他の実施態様において、癌は悪性である。他の実施態様において、癌は急性骨髄球性白血病である。さらに他の実施態様において、癌は急性骨髄球性白血病であり、癌は葉酸受容体−βを発現する。なお他の実施態様において、癌は急性骨髄球性白血病であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞は中央記憶／エフェクター記憶表現型を有する。さらに他の実施態様において、ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ８：ＣＤ４比は約１：１、約１.２〜１比、約１〜１.２比、約１.３〜１比、約１〜１.３比、約１.４〜１比、約１〜１.４比、約１.５〜１比または約１〜１.５比である。癌が急性骨髄球性白血病または他の癌である他の実施態様において、腫瘍と結合するＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍と結合しないＣＡＲ  Ｔ細胞に比してＣＤ２５発現が増加し得る。
【０４１１】
ある実施態様において、「小分子リガンド」はフォレート、ＤＵＰＡ(ＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞および他の癌細胞型により結合されるリガンド)、ＮＫ−１Ｒリガンド(例えば、結腸および膵臓の癌にみられるリガンドであるＮＫ−１Ｒの受容体)、ＣＡＩＸリガンド(例えば、腎臓、卵巣、外陰および乳房の癌で見られるＣＡＩＸリガンドの受容体)、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼリガンド(例えば、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、星状細胞神経膠腫、黒色腫および白血病で過発現されるトランスペプチダーゼ)、ＮＫＧ２Ｄリガンド(例えば、肺、結腸、腎臓、前立腺の癌ならびにＴおよびＢ細胞リンパ腫で見られるＮＫＧ２Ｄリガンドの受容体)またはＣＣＫ２Ｒリガンド(とりわけ甲状腺、肺、膵臓、卵巣、脳、胃、消化器間質および結腸の癌に見られるＣＣＫ２Ｒリガンドの受容体)であってよく、この各々は癌細胞型に特異的に結合する小分子リガンドである(すなわち、これらのリガンドの各々の受容体は、正常組織に比して癌で過発現され得る)。
【０４１２】
ある実施態様において、小分子リガンドは約１０,０００ダルトン未満、約９０００ダルトン未満、約８,０００ダルトン未満、約７０００ダルトン未満、約６０００ダルトン未満、約５０００ダルトン未満、約４５００ダルトン未満、約４０００ダルトン未満、約３５００ダルトン未満、約３０００ダルトン未満、約２５００ダルトン未満、約２０００ダルトン未満、約１５００ダルトン未満、約１０００ダルトン未満または約５００ダルトン未満の質量を有し得る。他の実施態様において、小分子リガンドは約１〜約１０,０００ダルトン、約１〜約９０００ダルトン、約１〜約８,０００ダルトン、約１〜約７０００ダルトン、約１〜約６０００ダルトン、約１〜約５０００ダルトン、約１〜約４５００ダルトン、約１〜約４０００ダルトン、約１〜約３５００ダルトン、約１〜約３０００ダルトン、約１〜約２５００ダルトン、約１〜約２０００ダルトン、約１〜約１５００ダルトン、約１〜約１０００ダルトンまたは約１〜約５００ダルトンの質量を有し得る。
【０４１３】
ある実施態様において、ＤＵＰＡ誘導体は標的化部分に結合した小分子リガンドのリガンドであり得て、ＤＵＰＡ誘導体は、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１５／０５７８５２に記載される。
【０４１４】
ある実施態様において、「リンカーに結合した小分子リガンド」において小分子リガンドはフォレートである。種々の実施態様において、フォレートは葉酸、葉酸アナログまたは他の葉酸受容体結合分子であり得る。種々の実施態様において、使用し得る葉酸アナログは、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸および葉酸受容体結合プテリジン、例えばテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸およびそのデアザおよびジデアザアナログを含む。用語「デアザ」および「ジデアザ」アナログは、天然に存在する葉酸構造の１つまたは２つの窒素原子を置き換える炭素原子を有する、当分野で認識されるアナログをいう。例えば、デアザアナログは、１−デアザ、３−デアザ、５−デアザ、８−デアザおよび１０−デアザアナログを含む。ジデアザアナログは、例えば、１,５−ジデアザ、５,１０−ジデアザ、８,１０−ジデアザおよび５,８−ジデアザアナログを含む。前記葉酸アナログは、葉酸受容体に結合するその能力を反映して、慣用的に「フォレート」と称される。他の葉酸受容体結合アナログは、アミノプテリン、アメソプテリン(メトトレキサート)、Ｎ１０−メチル葉酸、２−デアミノ−ヒドロキシ葉酸、デアザアナログ、例えば１−デアザメソプテリンまたは３−デアザメソプテリンおよび３’,５’−ジクロロ−４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミン酸(ジクロロメトトレキサート)を含む。
【０４１５】
他の実施態様において、「リンカーに結合した小分子リガンド」と記載されている小分子リガンドは、式
【化９】
2021512147.tif 000011
〔式中、Ｘ１およびＹ１は各々独立してハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３およびＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは各々−(Ｒ６ａ)Ｃ＝、−Ｎ＝、−(Ｒ６ａ)Ｃ(Ｒ７ａ)−および−Ｎ(Ｒ４ａ)−からなる群から独立して選択される二価基であり；ＱはＣおよびＣＨからなる群から選択され；ＴはＳ、Ｏ、Ｎおよび−Ｃ＝Ｃ−からなる群から選択され；
Ｘ２およびＸ３は各々独立して酸素、硫黄、−Ｃ(Ｚ)−、−Ｃ(Ｚ)Ｏ−、−ＯＣ(Ｚ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)−、−ＯＣ(Ｚ)Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｏ−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ５ｂ)−、−Ｓ(Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−、−Ｎ(Ｒ４ａ)Ｓ(Ｏ)２−、−Ｃ(Ｒ６ｂ)(Ｒ７ｂ)−、−Ｎ(Ｃ≡ＣＨ)−、−Ｎ(ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ)−、Ｃ１−Ｃ１２アルキレンおよびＣ１−Ｃ１２アルキレンオキシからなる群から選択され、ここで、Ｚは酸素または硫黄であり；
Ｒ１は水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂおよびＲ７ｂは各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、Ｃ１−Ｃ１２アルキニル、(Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ)カルボニルおよび(Ｃ１−Ｃ１２アルキルアミノ)カルボニルからなる群から選択され；
Ｒ６およびＲ７は各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ６およびＲ７は一体となってカルボニル基を形成し；
Ｒ６ａおよびＲ７ａは各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ６ａおよびＲ７ａは一体となってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは各々独立して０または１であり；そして
＊はコンジュゲートの残りへの任意の共有結合を表す。〕
を有し得る。
【０４１６】
ある態様おいて、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含み、ＣＡＲ  Ｔ細胞により発現されるＣＡＲに結合する「標的化部分」は、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)およびＮＨＳ−フルオレセインから選択され得る。標的化部分の特性は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲにより、好ましくは特異性をもって認識され、結合されなければならないことかつ比較的低分子量を有することによってのみ限定される。種々の態様において、標的化部分の例は、小分子量有機分子を含むハプテンである。
【０４１７】
ある説明的実施態様において、標的化部分は次の例示的構造
【化１０】
2021512147.tif 000012
〔式中、Ｘは酸素、窒素または硫黄であり、ＸはリンカーＬに結合し；ＹはＯＲａ、ＮＲａ２またはＮＲａ３＋であり；そしてＹ’はＯ、ＮＲａまたはＮＲａ２＋であり；ここで、各Ｒは各場合Ｈ、フルオロ、スルホン酸、スルホネートおよびその塩などから独立して選択され；そしてＲａは水素またはアルキルである。〕
を有し得る。
【０４１８】
ある説明的態様において、リンカーはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロリン、親水性アミノ酸、糖、非天然ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ−１２７またはこれらの組み合わせを含み得る。
【０４１９】
他の説明的態様において、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩のリンカーは、直接結合であってよく(例えば、ＦＩＴＣのイソチオシアネート基と小分子リガンドの遊離アミン基の反応)または結合は、中間リンカーを介するものであり得る。ある実施態様において、存在するならば、中間リンカーは、二価リンカーなどの当分野で知られる任意の生体適合性リンカーであり得る。ある説明的実施態様において、二価リンカーは約１〜約３０炭素原子を含み得る。他の説明的実施態様において、二価リンカーは約２〜約２０炭素原子を含み得る。他の実施態様において、低分子量二価リンカー(すなわち、約３０〜約３００ダルトンの凡その分子量を有するもの)が用いられる。他の実施態様において、適するリンカー長は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０またはそれ以上の原子を有するリンカーを含むが、これらに限定されない。
【０４２０】
種々の実施態様において、標的化部分に結合した小分子リガンドは、式
【化１１】
2021512147.tif 000013
〔式中、Ｂは小分子リガンドであり、Ｌはリンカーであり、そしてＴは標的化部分であり、ここで、Ｌは式
【化１２】
2021512147.tif 000014
を有する構造を含み、ｎは０〜２００の整数である。〕
を有するものであり得る。他の実施態様において、ｎは０〜１５０、０〜１１０、０〜１００、０〜９０、０〜８０、０〜７０、０〜６０、０〜５０、０〜４０、０〜３０、０〜２０、０〜１５、０〜１４、０〜１３、０〜１２、０〜１１、０〜１０、０〜９、０〜８、０〜７、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、０〜１、１５〜１６、１５〜１７、１５〜１８、１５〜１９、１５〜２０、１５〜２１、１５〜２２、１５〜２３、１５〜２４、１５〜２５、１５〜２６、１５〜２７、１５〜２８、１５〜２９、１５〜３０、１５〜３１、１５〜３２、１５〜３３、１５〜３４、１５〜３５、１５〜３６、１５〜３７、１５〜３８、１５〜３９、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１１０、１５〜１２０、１５〜１３０、１５〜１４０、１５〜１５０の整数であってよくまたはｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０８、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０であり得る。
【０４２１】
他の実施態様において、リンカーは、１以上のスペーサーを含み得る二価リンカーであり得る。説明的スペーサーを次の表に示す。次に非限定的、説明的スペーサーを記載し、ここで、＊は小分子リガンドまたは標的化部分または他の二価リンカー部分への結合点を示す。
【表１】
2021512147.tif 000015
【０４２２】
他の実施態様において、標的化部分に結合した小分子リガンド(ブリッジ)は、次の構造の何れかを有し得る。
【化１３】
2021512147.tif 000016
【化１４】
2021512147.tif 000017
【化１５】
2021512147.tif 000018
【化１６】
2021512147.tif 000019
【０４２３】
他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩が抗体ではなく、抗体フラグメントを含まない。さらに他の実施態様において、標的化部分がペプチドエピトープを含まない。
【０４２４】
ある説明的実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンド(ブリッジ)は小分子リガンドに結合したフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)を含む。ある態様おいて、癌は小分子リガンドに対する受容体を過発現し得る。他の態様において、例えば、細胞毒性Ｔ細胞または他のタイプのＴ細胞を、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを発現するように形質転換し得る。この態様において、ＣＡＲはＦＩＴＣを標的にでき、小分子リガンドの癌への結合の結果として癌をＦＩＴＣ分子で装飾する。それ故に、正常、非標的細胞への毒性は回避され得る。この実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントＣＡＲ発現Ｔ細胞がＦＩＴＣに結合するとき、ＣＡＲ  Ｔ細胞は活性化され、癌が改善される。
【０４２５】
リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドの「薬学的に許容される塩」が考慮される。ここで使用する用語「薬学的に許容される塩」は、カウンターイオンが医薬で使用され得る塩をいう。種々の実施態様において、このような塩は、１)遊離塩基の親化合物と塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、(Ｄ)または(Ｌ)リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸などの有機酸の反応により得ることができる酸付加塩；または２)親化合物に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオンで置き換えられたときに形成される塩；またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基との配位を含むが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は当業者に周知であり、あらゆるこのような薬学的に許容される塩は、ここに記載する実施態様と関連して考慮される。
【０４２６】
種々の実施態様において、適当な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。説明的例は、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプチン酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびトリフルオロ酢酸塩塩を含む。
【０４２７】
種々の実施態様において、適当な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。説明的例は、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リシン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛塩を含む。酸および塩基のヘミ塩、例えば、ヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩も形成され得る。
【０４２８】
ある説明的態様において、ここに記載する化合物またはその薬学的塩は１以上のキラル中心を含んでよくまたは他の点で複数立体異性体として存在可能であり得る。従って、種々の実施態様は、純粋立体異性体ならびに立体異性体混合物、例えばエナンチオマー、ジアステレオマーおよびエナンチオマーまたはジアステレオマー富化混合物を含み得る。ある態様おいて、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩は幾何異性体として存在し得る。従って、種々の実施態様は純粋幾何異性体または幾何異性体混合物を含み得る。
【０４２９】
ある態様において、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩は、溶媒和されていない形態ならびに水和形態を含む溶媒和された形態で存在し得る。一般に、溶媒和された形態は溶媒和されていない形態と等価であり、本発明の範囲内に包含される。
【０４３０】
ここに記載する方法は、ブリッジの標的化部分(例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)およびＮＨＳ−フルオレセイン)を認識し、結合する、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作されたＴリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)も利用する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲは、１)特異性をもって標的化部分を認識し、結合する、認識領域(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体の一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域、Ｆａｂフラグメントなど)、２)Ｔリンパ球の増殖および生存を増強する共刺激ドメインおよび３)Ｔリンパ球活性化シグナルを産生する活性化シグナル伝達ドメインを含む３ドメインを含む。
【０４３１】
種々の態様において、非限定的例として、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)およびＮＨＳ−フルオレセインに結合する抗体のｓｃＦｖ領域が使用され得る。説明的非限定的実施態様において、ｓｃＦｖ領域は(ｉ)標的化部分と結合する当分野で知られるＥ２抗体および(iii)このような抗体のｓｃＦｖ領域由来の配列バリアント、例えば、由来するｓｃＦｖ領域のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有するｓｃＦｖ領域から調製し得る。
【０４３２】
ある態様おいて、共刺激ドメインは、ＣＡＲの標的化部分への結合により、細胞毒性Ｔリンパ球の増殖および生存を増強するために働く。適当な共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)受容体ファミリーメンバー、ＣＤ１３４  (ＯＸ４０)、受容体ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１５０、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ２７８(ＩＣＯＳ)のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、活性化Ｔ細胞に発現されるＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある説明的実施態様において、改変ＣＡＲの共刺激ドメインはＣＤ２８およびＣＤ１３７を含む。当業者は、バリアントがモデル化されたドメインと同じまたは類似する活性を有するとき、これら共刺激ドメインの配列バリアントが本発明に不利に影響することなく使用され得ることを理解する。種々の実施態様において、このようなバリアントは、由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有し得る。
【０４３３】
ある説明的実施態様において、活性化シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの標的化部分への結合により、Ｔリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)を活性化するために働く。種々の実施態様において、適当な活性化シグナル伝達ドメインはＴ細胞ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３デルタ受容体タンパク質、ｍｂｌ受容体タンパク質、Ｂ２９受容体タンパク質およびＦｃ受容体γを含む。当業者は、バリアントがモデル化されたドメインと同じまたは類似する活性を有するとき、これら活性化シグナル伝達ドメインの配列バリアントが使用され得ることを理解する。種々の実施態様において、バリアントは、由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有する。
【０４３４】
ある態様おいて、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲをコードする構築物は、遺伝子工学技術を使用して製造される。このような技術は、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)(引用により本明細書に包含させる)およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Labor(引用により本明細書に包含させる)に詳述される。
【０４３５】
例として、インフレームで認識領域、１以上の共刺激ドメインおよび活性化シグナル伝達ドメインを含み、５’から３’方向で結合される融合タンパク質をコードする、プラスミドまたはウイルス発現ベクター(例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、sleeping beautyおよびpiggyback(非ウイルス介在ＣＡＲ遺伝子送達系を含むトランスポゾン／トランスポザーゼ系))を調製し得る。他の実施態様において、他の配置が許容され、認識領域、活性化シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激ドメインを含む。ある実施態様において、融合タンパク質への認識領域の設置は、一般に細胞外部領域への提示が達成されるようなものである。ある実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲは、融合タンパク質の細胞表面への適切な排出を確実にするシグナルペプチド(例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド)、融合タンパク質が完全膜タンパク質として維持されることを確実にする膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメイン)および認識領域に柔軟性を与え、標的化部分への強い結合を可能にするヒンジドメイン(例えば、ＣＤ８αヒンジまたはＩｇＧ４ヒンジ)および任意の他の適当なドメインのようなさらなる要素を含み得る。
【０４３６】
発現されるＣＡＲがＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲ構築物の例の図が図１に示され、ここで、融合タンパク質配列は発現ベクターに取り込まれ、ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメント、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含み、共刺激ドメインはＣＤ１３７(４−１ＢＢ)であり、活性化シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζである。ＣＡＲはさらに適当なドメインを含み得る。ＣＡＲインサートの核酸配列の例は配列番号１として提供され、コードされるアミノ酸配列の例は配列番号２として提供される。ここで使用する「配列番号１」は、下線「ａｇｃ」コドンから始まり、下線「ｇｇｃ」コドンで終わる配列を意味する。長い配列のこの部分は、Ｔ細胞膜に挿入されたＣＡＲをコードする。長い配列の他の部分は、膜に挿入されたＣＡＲの一部ではなく、キメラ抗原受容体として機能する、シグナルペプチド、ＥＧＦＲｔドメインなどのコード配列をコードする。ここで使用する「配列番号２」は、下線「Ｓ」から始まり、下線「Ｇ」で終わる配列を意味する。長い配列のこの部分は、Ｔ細胞膜に挿入されたＣＡＲのアミノ酸配列である。長い配列の他の部分は、膜に挿入されたＣＡＲの一部ではなく、キメラ抗原受容体として機能する、シグナルペプチド、ＥＧＦＲｔドメインなどのアミノ酸配列を含む。さらに他の実施態様において、配列番号２は、ヒト化またはヒトアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。配列番号１および２は上記のとおりである。長い核酸配列の開始および停止コドンは下線を引き、長い配列は、ここに記載する方法において使用するＴ細胞の形質導入に使用できる配列の例である。
【０４３７】
配列番号１(Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントＣＡＲ核酸配列(インサート))
【化１７】
2021512147.tif 000020
【０４３８】
配列番号２(Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントＣＡＲアミノ酸配列(インサート))
【化１８】
2021512147.tif 000021
【０４３９】
ある実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲは、認識領域はＥ２抗フルオレセイン抗体の一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域である認識領域、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)である共刺激ドメインおよびＴ細胞ＣＤ３ζ鎖である活性化シグナル伝達ドメインを含む。他の実施態様において、ＣＡＲは何れかのさらなる適当なドメインをさらに含み得る。抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖと抗フルオレセインｓｃＦｖが等価の用語であることは当業者に周知である。
【０４４０】
種々の実施態様において、「Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメント」は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体のフラグメント(例えば、ｓｃＦｖフラグメント)を含むＣＡＲであり得る。Ｅ２抗フルオレセイン抗体は、例えば、引用により本明細書に包含させる、Vaughan, et al., Nature Biotechnol. Vol. 14(3), pp. 309-314, 1996に記載される。ある実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲは、約０.７nM〜約０.８nM、約０.７２nM〜約０.８nM、約０.７３nM〜約０.８nM、約０.７２nM〜約７.８nM、約０.７３〜約０.７７nMまたは約０.７５nMのフルオレセインに対する結合親和性を有し得る。
【０４４１】
種々の実施態様において、ＣＡＲは、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ３ζ活性化ドメインおよび／または４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび他の適当なドメインをさらに含み得る。なお他の実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９.５％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ得る。他の説明的実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１を有するポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ得る。さらに他の態様において、ＣＡＲは配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによりコードされ得る。他の実施態様において、ＣＡＲタンパク質配列は、配列番号２に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９.５％同一性を有し得る。さらに他の実施態様において、ＣＡＲタンパク質配列は約５０までの保存的アミノ酸置換を有し得る。ここに記載する実施態様の何れにおいても、ＣＡＲがフルオレセインに結合する。
【０４４２】
ある実施態様において、Ｔリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)は、Ｔリンパ球の集団をＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ構築物をコードする発現ベクターでトランスフェクトすることにより、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ構築物を発現するよう遺伝子改変され得る。Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＴリンパ球の形質導入集団を調製する適当な方法は当業者に周知であり、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)(引用により本明細書に包含させる)およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Labor(引用により本明細書に包含させる)に記載される。
【０４４３】
ある実施態様において、配列番号１の核酸を含むＣＡＲ  Ｔ細胞はここに記載のとおりに使用され得る。他の実施態様において、配列番号２のポリペプチドを含むＣＡＲ  Ｔ細胞はここに記載のとおりに使用され得る。他の説明的態様において、配列番号１を含み、キメラ抗原受容体をコードする核酸(例えば、単離核酸)を使用して、ここに記載するとおりに使用するためのＣＡＲ  Ｔ細胞を調製し得る。さらに他の実施態様において、配列番号２を含むキメラ抗原受容体ポリペプチドを使用して、ここに記載するとおりに使用するためのＣＡＲ  Ｔ細胞を調製し得る。他の実施態様において、配列番号１を含むベクターを使用して、ここに記載するとおりに使用するためのＣＡＲ  Ｔ細胞を調製し得る。他の態様において、配列番号１を含むレンチウイルスベクターを使用して、ここに記載するとおりに使用するためのＣＡＲ  Ｔ細胞を調製し得る。さらに他の実施態様において、配列番号２はヒト化またはヒトアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。
【０４４４】
これらの実施態様の各々において、配列番号と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有するバリアント核酸配列またはアミノ酸配列１が考慮される。他の実施態様において、核酸配列は、バリアント配列が配列番号２のポリペプチドをコードする限り、配列番号１と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有するバリアント核酸配列であり得る。他の実施態様において、核酸配列またはアミノ酸配列は、配列番号１に２００核酸の長さにわたり、または、配列番号２について、２００アミノ酸の長さにわたり少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有するバリアント核酸またはアミノ酸配列であり得る。ある実施態様において、配列間の％同一性または類似性決定は、例えば、ＧＡＰプログラム(Genetics Computer Group、ソフトウェア；現在Accelrysを経てhttp://www.accelrys.comから入手可能)を使用して実施でき、アラインメントは、例えば、ClustalWアルゴリズム(ＶＮＴＩソフトウェア、InforMax Inc.)を使用して実施できる。配列データベースを、目的の核酸またはアミノ酸配列を使用して検索し得る。データベース検索のためのアルゴリズムは、一般にＢＬＡＳＴソフトウェア(Altschul et al., 1990)に基づく。ある実施態様において、パーセント同一性を、核酸またはアミノ酸配列の完全長に沿って決定できる。
【０４４５】
また本発明の範囲内で、配列番号１により示される核酸と相補的な核酸を使用して、ここに記載するとおり使用するためのＣＡＲ  Ｔ細胞を調製し得て、配列番号１により示される核酸とハイブリダイズするものまたは高度にストリンジェントな条件下でその相補体とハイブリダイズするものが使用され得る。本発明によると「高度にストリンジェントな条件」は、６５℃で５×ＳＳＰＥおよび５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションおよび６５℃で０.５×ＳＳＰＥでの洗浄を意味する。高ストリンジェンシー、低ストリンジェンシーおよび中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)(引用により本明細書に包含させる)およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Labor(引用により本明細書に包含させる)に記載される。ある説明的態様において、ハイブリダイゼーションは核酸の完全長に沿って生じる。
【０４４６】
なお他の実施態様において、ここに記載する方法において使用するためのＣＡＲは、配列番号１に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９.５％同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ得る。他の説明的実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１を有するポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ得る。さらに他の態様において、ＣＡＲは配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによりコードされ得る。ここで使用する縮重バリアントは、何れか特定のアミノ酸を特定するために１を超えるコドンを有する遺伝コードをいう。各アミノ酸を特定する縮重バリアントコドンは当分野で周知である。さらに他の態様において、特定の原核生物または真核生物宿主細胞におけるポリペプチドの産生レベルを最適化するために、置換を行い得る(すなわち、コドン使用頻度バリアント)。
【０４４７】
他の実施態様において、ＣＡＲタンパク質配列は、配列番号２に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有し得る。さらに他の実施態様において、ＣＡＲタンパク質配列は約５０までの保存的アミノ酸置換を有し得る。ある実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲタンパク質配列は、最大約５の保存的アミノ酸置換、最大約１０の保存的アミノ酸置換、最大約１５の保存的アミノ酸置換、最大約２０の保存的アミノ酸置換、最大約２５の保存的アミノ酸置換、最大約３０の保存的アミノ酸置換、最大約３５の保存的アミノ酸置換、最大約４０の保存的アミノ酸置換、最大約４５の保存的アミノ酸置換、最大約５０の保存的アミノ酸置換、最大約５５の保存的アミノ酸置換、最大約６０の保存的アミノ酸置換、最大約６５の保存的アミノ酸置換、最大約７０の保存的アミノ酸置換または最大約７５の保存的アミノ酸置換を有し得る。当業者に周知のとおり、保存的アミノ酸置換によるポリペプチドの重要ではないアミノ酸の何れかの改変は、置き換わったアミノ酸の側鎖が、置き換えられたアミノ酸の側鎖と類似する結合および接点を形成することが可能であるため、そのポリペプチドの活性を有意に変えない。ここに記載する実施態様の何れにおいても、ＣＡＲはフルオレセインに結合する。
【０４４８】
ある説明的態様において、非保存的置換は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントポリペプチドのフルオレセイン結合活性に過度に影響しない限り、可能である。当分野で周知のとおり、アミノ酸の「保存的置換」またはポリペプチドの「保存的置換バリアント」は、１)ポリペプチドの二次構造；２)アミノ酸の電荷または疎水性；および３)側鎖のかさ高さまたはこれら特徴の何れか１以上を維持するアミノ酸置換である。ある実施態様において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸アナログとなし得る。実例として、周知の用語「親水性残基」はセリンまたはスレオニンに関する。「疎水性残基」はロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンなどをいう。「正電荷残基」はリシン、アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンに関する。「負電荷残基」はアスパラギン酸またはグルタミン酸をいう。「かさ高い側鎖」を有する残基はフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンなどをいう。保存的アミノ酸置換の例示的一覧を表１に示す。
【表２】
2021512147.tif 000022
【０４４９】
ある実施態様において、ここに記載する方法において使用するＴリンパ球(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の調製に使用する細胞毒性Ｔリンパ球または非形質転換Ｔ細胞)は自己細胞であり得るが、処置される患者が、患者の免疫系を破壊するために高用量化学療法または放射線療法を受けているときなど、異種細胞も使用し得る。ある実施態様において、同種異系(allogenic)細胞が使用され得る。
【０４５０】
ある態様おいて、Ｔリンパ球は、当分野で周知の手段により患者から得ることができる。例えば、Ｔ細胞(例えば、細胞毒性Ｔ細胞または非形質転換Ｔ細胞)は、患者から末梢血を採取し、血液をFicoll密度勾配遠心分離に付し、次いで、末梢血からＴ細胞集団を単離するための陰性Ｔ細胞単離キット(例えばEasySepTM T Cell Isolation Kit)を使用して得ることができる。ある説明的実施態様において、Ｔリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔ細胞または非形質転換Ｔ細胞)の集団は純粋である必要はなく、他のタイプのＴ細胞(例えば、細胞毒性Ｔ細胞の場合)、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびＢ細胞などの他の細胞を含んでよい。ある態様おいて、採取される集団は、選択細胞型を少なくとも約９０％、選択細胞型を少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％含み得る。
【０４５１】
ある実施態様において、Ｔリンパ球(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の調製に使用する細胞毒性Ｔ細胞)を得た後、細胞を、該細胞の活性化を促進する条件下で培養する。この実施態様において、培養条件は、細胞が、培養培地の成分に対する反応性の懸念なく、患者に投与され得るようなものであり得る。例えば、培養条件は、ウシ血清アルブミンなどのウシ血清製品を含み得ない。ある説明的態様において、活性化を、培養培地に既知アクティベーター、例えば、細胞毒性Ｔ細胞の場合抗ＣＤ３抗体を導入することにより達成し得る。他の適当なアクティベーターは抗ＣＤ２８抗体を含む。ある態様おいて、リンパ球の集団を、約１〜約４日間、活性化を促進する条件下で培養し得る。ある実施態様において、活性化の適切なレベルは、細胞サイズ、増殖率またはフローサイトメトリーにより決定される活性化マーカーにより決定され得る。
【０４５２】
ある説明的実施態様において、Ｔリンパ球(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の調製に使用した細胞毒性Ｔリンパ球)の集団が活性化を促進する条件下で培養された後、細胞は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲをコードする発現ベクターでトランスフェクトされ得る。種々の実施態様において使用する適当なベクターおよびトランスフェクト方法は上に記載される。ある態様おいて、トランスフェクト後、細胞を直ぐに患者に投与でき、または細胞を少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日またはそれ以上または約５〜約１２日、約６〜約１３日、約７〜約１４日または約８〜約１５日培養して、例えば、細胞をトランスフェクトから回復させる時間を与えてよい。ある態様おいて、適当な培養条件は、活性化を促進するために使用した薬剤を含むまたは含まない、細胞を活性化するために培養した条件に類似し得る。
【０４５３】
それ故に、上記のとおり、ある説明的態様において、ここに記載する処置方法は、さらに、１)自己または異種Ｔリンパ球(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の調製に使用した細胞毒性Ｔリンパ球)の集団を得て、２)該Ｔリンパ球を、細胞の活性化を促進する条件下で培養し、そして３)リンパ球をＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲをコードする発現ベクターでトランスフェクトして、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を形成することを含み得る。
【０４５４】
ある説明的実施態様において、細胞がトランスフェクトされ、活性化されているとき、ＣＡＲ  Ｔ細胞(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)を含む組成物を、非形質転換Ｔ細胞と併用してまたは併用せずに調製し、患者に投与し得る。ある実施態様において、ウシ血清などのあらゆる動物性製品を欠く培養培地を、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞および／または非形質転換Ｔ細胞の培養に使用し得る。他の実施態様において、一般に細菌、真菌およびマイコプラズマによる汚染を避けるために当業者により使用される組織培養条件が使用され得る。例示的実施態様において、患者に投与する前に、細胞(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞および／または非形質転換Ｔ細胞)をペレット化し、洗浄し、薬学的に許容される担体または希釈剤に再懸濁する。Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ発現Ｔリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)または非形質転換Ｔ細胞を含む組成物の例は、無菌２９０mOsm食塩水、不溶解性凍結培地(Plasma-Lyte A、デキストロース、塩化ナトリウム注射、ヒト血清アルブミンおよびＤＭＳＯ)、２％ヒト血清アルブミン添加０.９％ＮａＣｌまたは任意の他の無菌２９０mOsm不溶解性物質中に細胞を含む組成物を含む。あるいは、他の実施態様において、培養培地の特性によって、培養培地中のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞または非形質転換Ｔ細胞を組成物として投与でき、または投与前に濃縮し、培養培地に再懸濁し得る。種々の実施態様において、非形質転換Ｔ細胞を伴うまたは伴わないＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)を、非経腸投与、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内または髄腔内などの任意の適当な手段により、患者に投与し得る。
【０４５５】
ある態様おいて、患者に投与する組成物のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の総数および細胞の濃度は、使用するＴリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)のタイプ、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲの結合特異性、標的化部分および小分子リガンドの特性、癌の特性、患者における癌の位置、患者に組成物を投与するために使用する手段ならびに処置する患者の健康状態、年齢および体重を含む、多数の因子により変わる。種々の実施態様において、適当な形質導入されたＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、約０.１ml〜約２００mlおよび約０.１ml〜約１２５mlの体積を有するものを含む。
【０４５６】
種々の実施態様において、患者に投与される、形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)は、約１×１０５〜約１×１０１５または１×１０６〜約１×１０１５の形質導入されたＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を含み得る。種々の実施態様において約１×１０５〜約１×１０１０、約１×１０６〜約１×１０１０、約１×１０６〜約１×１０９、約１×１０６〜約１×１０８、約１×１０６〜約２×１０７、約１×１０６〜約３×１０７、約１×１０６〜約１.５×１０７、約１×１０６〜約１×１０７、約１×１０６〜約９×１０６、約１×１０６〜約８×１０６、約１×１０６〜約７×１０６、約１×１０６〜約６×１０６、約１×１０６〜約５×１０６、約１×１０６〜約４×１０６、約１×１０６〜約３×１０６、約１×１０６〜約２×１０６、約２×１０６〜約６×１０６、約２×１０６〜約５×１０６、約３×１０６〜約６×１０６、約４×１０６〜約６×１０６、約４×１０６〜約１×１０７、約１×１０６〜約１×１０７、約１×１０６〜約１.５×１０７、約１×１０６〜約２×１０７、約０.２×１０６〜約１×１０７、約０.２×１０６〜約１.５×１０７、約０.２×１０６〜約２×１０７または約５×１０６のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞が患者に投与され得る。ある態様おいて、ここに記載する何れの実施態様においても、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞が単回用量または複数用量で患者に投与され得る。この段落または本明細書に記載する何れの実施態様においても、ＣＡＲ  Ｔ細胞数は患者体重kg当たりであり得る。ここに記載する実施態様の何れにおいても、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞は、化合物またはその薬学的に許容される塩の前に投与され得る。理解されるとおり、ここに記載する方法の何れかのステップについてのｉ)、ii)そしてiii)などの指定は、特に断らない限り順番を示すものではない。
【０４５７】
ここに記載する種々の実施態様において、非形質転換Ｔ細胞もＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と共に投与でき、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞および非形質転換Ｔ細胞についてここに記載する量で投与され得る。ある態様おいて、ＣＡＲ  Ｔ細胞(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)と非形質転換Ｔ細胞の混合物を、一回または複数回投与でき、純粋なＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞およびＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物の用量の組み合わせを投与し得る(例えば、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を１用量、続いてＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を１以上の用量)。本開示から当業者には明らかであるとおり、ここで記載するＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の「混合物」は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞が、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲの発現に使用される構築物に曝されていない非形質転換Ｔ細胞と混合されることを意味する。
【０４５８】
他の実施態様において、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物における患者に投与されるＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、約１００万、約２００万、約３００万、約４００万、約５００万、約６００万、約７００万、約８００万、約９００万、約１０００万、約１１００万、約１２００万、約１２５０万、約１３００万、約１４００万および約１,５００万のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞からなる群から選択される。
【０４５９】
さらに他の説明的実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物が患者の血流に注射により投与され、患者の血流中のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の注射約４週間後、患者の血流中の患者の総Ｔ細胞の少なくとも５％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％または少なくとも１５％、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の注射約３週間後少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または５０％、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の注射約２週間後少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％または８０％またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の注射約１週間後少なくとも８５％、９０％または９５％である。
【０４６０】
ここに記載する実施態様において、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はあらゆる他の細胞型を伴わずＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を含んでよくまたは非形質転換Ｔ細胞を、患者にＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と組み合わせて投与し得る。ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物が複数回投与される実施態様について、任意の回がＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞またはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を含み得る。種々の実施態様において、非形質転換Ｔ細胞を、ここでＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞について記載した量で投与し得る。
【０４６１】
他の実施態様において、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の用量は、何れもＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を、約１：５のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞、約１：４のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞、約１：３のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞、約１：２のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞および約１：１のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞の比で含み得る。
【０４６２】
なお他の実施態様において、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の用量は、何れもＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と非形質転換Ｔ細胞の混合物を約１：１〜約１：５のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞対非形質転換Ｔ細胞で含んでよくまたはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物は、約１０００万のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と約４０００万の非形質転換Ｔ細胞、約１,５００万のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と約３５００万の非形質転換Ｔ細胞、約２０００万のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と約３０００万の非形質転換Ｔ細胞または約２５００万のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と約２５００万の非形質転換Ｔ細胞の混合物を含み得る。
【０４６３】
ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、組成物はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む)は、当分野で知られる何れかの適当な方法を使用して患者に投与され得る。ここで記載する用語「投与する」または「投与」は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮などを含むが、これらに限定されない、化合物またはその薬学的に許容される塩またはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを有するＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を患者に導入する全ての手段を含む。ある態様おいて、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩は、慣用の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび媒体を含む単位投与形態および／または製剤で投与され得る。
【０４６４】
ある態様おいて、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲ発現ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む)を、血流、筋肉内または内部臓器内に直接投与し得る。種々の実施態様において、このような非経腸投与のための適当な経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、腫瘍内、筋肉内および皮下送達を含む。ある実施態様において、非経腸投与の手段は、有針(マイクロニードルを含む)注射器、無針注射器および点滴法を含む。
【０４６５】
ある説明的態様において、非経腸製剤は、一般に塩、炭水化物および緩衝剤(好ましくは３〜９のｐＨの)などの担体または添加物を含み得る水溶液であるが、より好適には無菌非水溶液または無菌、発熱性物質除去水または無菌食塩水などの適当な媒体と組み合わせて使用される乾燥形態として製剤され得る。他の実施態様において、ここに記載する液体製剤の何れも、ここに記載する非経腸投与に適用され得る。非経腸製剤のための無菌凍結乾燥粉末を製造する凍結乾燥による無菌条件下の製剤は、当業者に周知の標準製薬技術を使用して、容易に達成され得る。ある実施態様において、非経腸製剤の製剤に使用する化合物またはその薬学的に許容される塩の溶解度を、溶解促進剤の取り込みなどの適切な製剤技術の使用により増加させ得る。
【０４６６】
患者に投与する化合物またはその薬学的に許容される塩の量は、処置する癌、化合物またはその薬学的に許容される塩の投与経路および組織分布により顕著に変わり得る。患者に投与すべき量は、体表面積、体重および医師の評価に基づき得る。種々の実施態様において、投与する量は、例えば、約０.０５mg〜約３０mg、０.０５mg〜約２５.０mg、約０.０５mg〜約２０.０mg、約０.０５mg〜約１５.０mg、約０.０５mg〜約１０.０mg、約０.０５mg〜約９.０mg、約０.０５mg〜約８.０mg、約０.０５mg〜約７.０mg、約０.０５mg〜約６.０mg、約０.０５mg〜約５.０mg、約０.０５mg〜約４.０mg、約０.０５mg〜約３.０mg、約０.０５mg〜約２.０mg、約０.０５mg〜約１.０mg、約０.０５mg〜約０.５mg、約０.０５mg〜約０.４mg、約０.０５mg〜約０.３mg、約０.０５mg〜約０.２mg、約０.０５mg〜約０.１mg、約.０１mg〜約２mg、約０.３mg〜約１０mg、約０.１mg〜約２０mgまたは約０.８〜約３mgの範囲であり得る。当業者は、用量が、上記因子に基づき、上記の種々の範囲内で変わり得て、医師の裁量により得ることを理解する。
【０４６７】
他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、約５０ｎＭ／kg〜約３０００ｎＭ／kg患者体重、約５０ｎＭ／kg〜約２０００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約、９００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約４００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約２００ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg〜約１００ｎＭ／kg、約１００ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg、約１００ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg、約１００ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg、約１００ｎＭ／kg〜約２０００ｎＭ／kg患者体重の範囲であり得る。他の実施態様において、用量は約１ｎＭ／kg、約５ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg、約２０ｎＭkg、約２５ｎＭ／kg、約３０ｎＭ／kg、約４０ｎＭ／kg、約５０ｎＭ／kg、約６０ｎＭ／kg、約７０ｎＭ／kg、約８０ｎＭ／kg、約９０ｎＭ／kg、約１００ｎＭ／kg、約１５０ｎＭ／kg、約２００ｎＭ／kg、約２５０ｎＭ／kg、約３００ｎＭ／kg、約３５０ｎＭ／kg、約４００ｎＭ／kg、約４５０ｎＭ／kg、約５００ｎＭ／kg、約６００ｎＭ／kg、約７００ｎＭ／kg、約８００ｎＭ／kg、約９００ｎＭ／kg、約１０００ｎＭ／kg、約２０００ｎＭ／kg、約２５００ｎＭ／kgまたは約３０００ｎＭ／kg患者体重であり得る。
【０４６８】
種々の他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、約１０ｎＭ／kg〜約１００００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約５０００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約３０００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約２５００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約２０００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約９００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約４００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約２００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約１５０ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約１００ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約９０ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約８０ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約７０ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約６０ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約５０ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約４０ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約３０ｎＭ／kg、約１０ｎＭ／kg〜約２０ｎＭ／kg、約２００ｎＭ／kg〜約９００ｎＭ／kg、約２００ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg、約２００ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg、約２００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg、約２００ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg、約２５０ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg、約３００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg、約３００ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kgまたは約４００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重の範囲であり得る。種々の他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、約１ｎＭ／kg〜約１００００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約５０００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約３０００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約２５００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約２０００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約９００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約４００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約２００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約１５０ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約１００ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約９０ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約８０ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約７０ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約６０ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約５０ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約４０ｎＭ／kg、約１ｎＭ／kg〜約３０ｎＭ／kgまたは約１ｎＭ／kg〜約２０ｎＭ／kgの範囲であり得て、さらに他の実施態様において、用量は、約０.１ｎＭ／kg、約０.２ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg、約０.４ｎＭkgまたは約０.５ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約９００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約８５０ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約４００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約２００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約１００ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約５０ｎＭ／kg、約０.１ｎＭ／kg〜約１０ｎＭ／kgまたは約０.１ｎＭ／kg〜約１ｎＭ／kgであり得る。他の実施態様において、用量は、約０.３ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg患者体重、約０.３ｎＭ／kg〜約９００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約８５０ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約４００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約２００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約１００ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約５０ｎＭ／kg、約０.３ｎＭ／kg〜約１０ｎＭ／kgまたは約０.３ｎＭ／kg〜約１ｎＭ／kg患者体重であり得る。これら実施態様において、「kg」は、患者のキログラムでの体重である。ある態様おいて、化合物またはその薬学的に許容される塩を、１回または複数回患者に投与し得る。
【０４６９】
他の実施態様において、約２０μg／kg患者体重〜約３mg／kg患者体重の化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に投与され得る。他の態様において、量は約０.２mg／kg患者体重および約０.４mg／kg患者体重であってよくまたは約５０μg／kg患者体重であり得る。ある態様おいて、化合物またはその薬学的に許容される塩を、１回または複数回患者に投与し得る。
【０４７０】
ある実施態様において、標的化部分(化合物)に結合した小分子リガンドを、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを有する)の前に患者に投与し得る。他の実施態様において、標的化部分(ブリッジ)に結合した小分子リガンドを、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを有する)と同時に、しかし、異なる製剤または同一製剤で患者に投与し得る。さらに他の実施態様において、標的化部分に結合した小分子リガンドを、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを有する)の後に患者に投与し得る。
【０４７１】
ある説明的態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを有するＣＡＲ  Ｔ細胞と標的化部分(ブリッジ)に結合した小分子を投与する間の間隔は、使用するＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞のタイプ、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを有するＣＡＲの結合特異性、標的化部分および小分子リガンドの特性、癌の特性、患者における癌の位置、患者にＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞および標的化部分に結合した小分子リガンドを投与するために使用する手段ならびに患者の健康状態、年齢および体重を含む因子により、広範に変わり得る。ある態様おいて、標的化部分に結合した小分子リガンドを、約３時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、２４時間、２７時間、３０時間、３３時間、３６時間、３９時間、４２時間、４５時間、４８または５１時間以内または約０.５日、１日、１.５日、２日、２.５日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上の日数以内などで、ＣＡＲ  Ｔ細胞の前または後に投与し得る。
【０４７２】
ある実施態様において、当分野で知られる何れかの適用できる投与スケジュールを、化合物またはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲを有するＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)の投与に使用し得る。例えば、１日１回投与(別標記ｑｄ)、１日２回投与(別標記ｂｉｄ)、１日３回投与(別標記ｔｉｄ)、週２回投与(別標記ＢＩＷ)、週３回投与(別標記ＴＩＷ)、週１回投与などが使用され得る。ある態様おいて、化合物またはその薬学的に許容される塩およびＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲを有するＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)の投与に選択される投与スケジュールは、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲを有するＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)の細胞毒性を制御し、そしてＣＲＳを制御するために、投与する化合物またはその薬学的に許容される塩の濃度およびＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の数を考慮し得る。
【０４７３】
ある実施態様において、患者におけるサイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)を予防または阻止する、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＡＲを含み、該ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む)、そして、iii)患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬物を投与することを含む。
【０４７４】
この方法実施態様において、患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬物を投与するステップを、患者におけるＣＲＳの予防または阻止に使用し得る。この実施態様において、フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬物の何れも、ここでは「レスキュー剤」と称し得る。ある実施態様において、葉酸のようなフォレートを、患者におけるＣＲＳの予防または阻止のために患者に投与し得る。この実施態様において、フォレートはブリッジ(すなわち、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド)と、腫瘍上のブリッジの受容体の相互作用を阻止し、腫瘍溶解を阻止し、患者におけるＣＲＳを予防または阻止する。
【０４７５】
他の実施態様において、レスキュー剤は、該レスキュー剤投与後、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間または約１０時間をかけてＣＲＳを低減し得る。例えば、ＣＲＳのグレードは減少し得る(例えば、グレード３からグレード２、グレード４からグレード３など)。
【０４７６】
評点方式の例を、左から右でグレード０、１、２、３、４および５である行１〜６により下に示す。
【表３】
2021512147.tif 000023
【０４７７】
ある実施態様において、ブリッジの腫瘍への結合の阻害剤として投与されるフォレートは、例えば、葉酸、葉酸アナログまたは他の葉酸受容体結合分子であり得る。種々の実施態様において、使用され得る葉酸アナログは、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸および葉酸受容体結合プテリジン、例えばテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸およびそのデアザおよびジデアザアナログを含む。用語「デアザ」および「ジデアザ」アナログは、天然に存在する葉酸構造の１つまたは２つの窒素原子を置き換える炭素原子を有する、当分野で認識されるアナログをいう。例えば、デアザアナログは、１−デアザ、３−デアザ、５−デアザ、８−デアザおよび１０−デアザアナログを含む。ジデアザアナログは、例えば、１,５−ジデアザ、５,１０−ジデアザ、８,１０−ジデアザおよび５,８−ジデアザアナログを含む。前記葉酸アナログは、葉酸受容体に結合するその能力を反映して、慣用的に「フォレート」と称される。他の葉酸受容体結合アナログは、アミノプテリン、アメソプテリン(メトトレキサート)、Ｎ１０−メチル葉酸、２−デアミノ−ヒドロキシ葉酸、デアザアナログ、例えば１−デアザメソプテリンまたは３−デアザメソプテリンおよび３’,５’−ジクロロ−４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミン酸(ジクロロメトトレキサート)を含む。
【０４７８】
他の実施態様において、ブリッジの腫瘍への結合の阻害剤として投与されるフォレートは、式
【化１９】
2021512147.tif 000024
〔式中、Ｘ１およびＹ１は各々独立してハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３およびＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは各々−(Ｒ６ａ)Ｃ＝、−Ｎ＝、−(Ｒ６ａ)Ｃ(Ｒ７ａ)−および−Ｎ(Ｒ４ａ)−からなる群から独立して選択される二価基であり；ＱはＣおよびＣＨからなる群から選択され；ＴはＳ、Ｏ、Ｎおよび−Ｃ＝Ｃ−からなる群から選択され；
Ｘ２およびＸ３は各々独立して酸素、硫黄、−Ｃ(Ｚ)−、−Ｃ(Ｚ)Ｏ−、−ＯＣ(Ｚ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)−、−ＯＣ(Ｚ)Ｎ(Ｒ４ｂ)−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｏ−、−Ｎ(Ｒ４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ５ｂ)−、−Ｓ(Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−、−Ｎ(Ｒ４ａ)Ｓ(Ｏ)２−、−Ｃ(Ｒ６ｂ)(Ｒ７ｂ)−、−Ｎ(Ｃ≡ＣＨ)−、−Ｎ(ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ)−、Ｃ１−Ｃ１２アルキレンおよびＣ１−Ｃ１２アルキレンオキシからなる群から選択され、ここで、Ｚは酸素または硫黄であり；
Ｒ１は水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂおよびＲ７ｂは各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、Ｃ１−Ｃ１２アルキニル、(Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ)カルボニルおよび(Ｃ１−Ｃ１２アルキルアミノ)カルボニルからなる群から選択され；
Ｒ６およびＲ７は各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ６およびＲ７は一体となってカルボニル基を形成し；
Ｒ６ａおよびＲ７ａは各々独立して水素、ハロ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルおよびＣ１−Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ６ａおよびＲ７ａは一体となってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは各々独立して０または１であり；そして
＊はコンジュゲートの残りへの任意の共有結合を表す。〕
を有する。
【０４７９】
さらに他の実施態様において、フォレートを含むコンジュゲートを、患者におけるサイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)を予防または阻止するために投与し得る。ＣＲＳは当分野で周知の用語であり、この症候群は、体重減少、高熱、肺浮腫および危険な血圧低下を含むが、これらに限定されない有害作用を患者に引き起こし得る。
【０４８０】
この実施態様において、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まず、それ故に、コンジュゲートは、腫瘍溶解を予防し、患者におけるＣＲＳを低減するように、ブリッジと腫瘍の相互作用を阻害する。この実施態様において、フォレートを含むコンジュゲートのフォレート部分は、標的化部分を含まない化学部分に関連して前段落に記載したフォレートの何れかを含み得る。ある態様おいて、フォレートを含むコンジュゲートは、標的化部分を含まない１以上のアミノ酸に結合したフォレートを含み得る。実例として、フォレートを含むコンジュゲートは、式
【化２０】
2021512147.tif 000025
を有し得る。
【０４８１】
この化合物は「ＥＣ９２３」とも称し得る。これら実施態様において、フォレートまたはフォレートを含むコンジュゲートを、ブリッジ(すなわち、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンド)に対してモル過剰で、例えば、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドに対してフォレートまたはフォレートを含むコンジュゲートが１０倍過剰、１００倍過剰、２００倍過剰、３００倍過剰、４００倍過剰、５００倍過剰、６００倍過剰、７００倍過剰、８００倍過剰、９００倍過剰、１０００倍過剰または１０,０００倍過剰で、患者に投与し得る。ブリッジと腫瘍の相互作用を阻害するのに必要な、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドの量に対するフォレートまたはフォレートを含むコンジュゲートの量は、当業者により決定され得る。
【０４８２】
他の実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害するレスキュー剤が、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化を阻害するためおよび患者におけるＣＲＳの阻止または予防のために、患者に投与され得る。ある態様おいて、薬剤は、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、ダサチニブ)、ＰＩ３キナーゼ阻害剤(例えば、ＧＤＣ０９８０)、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤(例えば、ＢＭＳ−５０９７４４)、)、ＪＡＫ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、トシリズマブ、ＳＩＰアゴニスト(例えば、シポニモドおよびオザニモド)およびブリッジへのＣＡＲ  Ｔ細胞結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤(例えば、フルオレセインアミン、ＦＩＴＣまたはフルオレセインナトリウム)からなる群から選択され得る。ＦＩＴＣ(すなわち、フルオレセイン)は、生理学的条件下または、例えば、生理学的ｐＨの緩衝液で、塩の形態(例えば、フルオレセインナトリウム)または塩ではない形態であることは、当業者に理解される。従って、ある実施態様において、フルオレセインを患者に投与するとき、塩形態(例えば、フルオレセインナトリウム)と塩ではない形態が平衡であり得る。他の実施態様において、ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害するレスキュー剤は、式
【化２１】
2021512147.tif 000026
の化合物であり得る。
【０４８３】
種々の実施態様において、レスキュー剤は、例えば、０.１ml、０.２ml、０.３ml、０.４ml、０.５ml、０.６ml、０.７ml、０.８ml、０.９ml、１ml、２ml、３ml、４ml、５ml、１０ml、１００mlまたは１０００mlを含む、適切な体積で、約.００１nM〜約１００mM、約.０１nM〜約１００mM、約１nM〜約１００mM、約１０nM〜約１００mM、約５０nM〜約１００mMまたは約１００nM〜約１００mMの濃度で投与され得る。他の実施態様において、レスキュー剤は、約.０１〜約３００μＭ／kg患者体重、約.０６〜約１００μＭ／kg患者体重、約.０６〜約９０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約８０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約７０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約６０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約５０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約４０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約３０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約２０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約１０μＭ／kg患者体重、約.０６〜約８μＭ／kg患者体重または約.０６〜約６μＭ／kg患者体重の用量で投与され得る。
【０４８４】
これら実施態様において、レスキュー剤を、化合物またはその薬学的に許容される塩(すなわち、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンド)に対してモル過剰で、例えば、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドに対してレスキュー剤が約１０倍過剰、約２０倍過剰、約３０倍過剰、約４０倍過剰、約５０倍過剰、約６０倍過剰、約７０倍過剰、約８０倍過剰、約９０倍過剰、約１００倍過剰、約２００倍過剰、約３００倍過剰、約４００倍過剰、約５００倍過剰、約６００倍過剰、約７００倍過剰、約８００倍過剰、約９００倍過剰、約１０００倍過剰または約１０,０００倍過剰で、患者に投与し得る。化合物またはその薬学的に許容される塩と腫瘍および／またはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の相互作用を阻害するのに必要なリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンド(ブリッジ)の量に対するレスキュー剤の量は、当業者により決定され得る。
【０４８５】
他の実施態様において、フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の１を超える用量を患者に投与し得る。
【０４８６】
ここに記載する‘レスキュー剤’の実施態様において、フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を、化合物またはその薬学的に許容される塩の前および／または後に患者に投与し得る。他の態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与の前および後に投与し得る。この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の投与は、患者におけるＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化をもたらし、サイトカインレベルを増加させ得る。
【０４８７】
他の実施態様において、フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与は、患者におけるサイトカインレベルの減少をもたらし得る。さらに他の実施態様において、サイトカインレベルの減少は、患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤投与後、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間または約８時間までに生じ得る。他の実施態様において、サイトカインレベルの減少は、ほぼ未処置患者のサイトカインレベルまでの減少である。
【０４８８】
他の説明的実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の数は、患者におけるサイトカインレベルが減少しても、フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与後、患者の血液中で増加し得る。他の説明的態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化は、処置患者におけるサイトカインレベルが減少しても、フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはレスキューＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与後、レスキュー剤で処置されていない患者と比較して、増強または維持され得る。なお他の実施態様において、癌は腫瘍を含み、患者における腫瘍サイズは、フォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害するレスキュー剤を患者に投与したとき増加しない。この実施態様において、腫瘍の完全応答が得られ得る。
【０４８９】
他の実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害するレスキュー剤を、ＣＲＳグレードが１、２、３または４に達したときまたはＣＲＳグレードが３または４に達したとき患者に投与する。他の態様において、レスキュー剤が投与されたとき、患者の肺浮腫が軽減される。
【０４９０】
ここに記載するある実施態様において、癌を処置する方法が提供され、該方法は、ｉ)患者に化合物を連続的に投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)を投与すること、そしてiii)患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するために、該化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了することを含む。
【０４９１】
この実施態様によって、用語「連続的」は、化合物またはその薬学的に許容される塩を、患者に、例えば、少なくとも１時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間または少なくとも２４時間投与することを意味し得、または１日１回、１日２回、１日３回、毎日、隔日、週１回、週２回、週３回または当業者により連続投与と見なされる何れかの他の適当なレジメンなどの日単位または週単位の投与のレジメンを意味し得る。他の態様において、用語「連続的」は、この段落に記載した実施態様の何れかの組み合わせを意味し得る。
【０４９２】
この方法の実施態様において、患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するための化合物またはその薬学的に許容される塩の「連続投与を終了」するステップは、例えば、数時間または数日の連続期間の投与後の投与中止または上記日単位または週単位レジメンなどの処置レジメンの中止を意味し得る。他の実施態様において、「連続投与を終了」するステップは、例えば、患者の許容されない体重減少が生じるまでまたは高熱、血圧低下もしくは肺浮腫などの何らかの他の許容されない副作用が生じるまでの投与を意味し得る。この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の「連続投与を終了」するステップは、化合物またはその薬学的に許容される塩での処置が単回処置であり、その後化合物またはその薬学的に許容される塩で処置しないことを意味しない。この方法の実施態様において、サイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)を「阻止または予防する」は、ＣＲＳの排除またはＣＲＳの症状の軽減または改善を意味する。
【０４９３】
化合物またはその薬学的に許容される塩の「連続投与を終了」する実施態様を含むある実施態様において、方法は、さらに、患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を再投与するステップiv)を含み得る。ある実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、例えば、週１回投与でき、１回分省かれ得る。他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、１日おき(すなわち、隔日)で投与でき、１回分以上(例えば、２回、３回、４回など)省かれ得る。他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を週２回で投与でき、１回分以上(例えば、２回、３回、４回など)省かれ得る。他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩は月曜日、火曜日および次の月曜日に投与でき、その後投与が２週間中止され、サイクルが反復される。他の実施態様において、上記レジメン実施態様の何れかを使用でき、１回分以上(例えば、２回、３回、４回など)省かれ得る。これら実施態様において、省いた投与は、患者におけるＣＲＳを予防または低減し得る。
【０４９４】
さらに他の説明的態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該患者に化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも第一用量および第二用量で投与され、ここで、該第一用量と該第二用量は異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約１５０００倍多い)そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)を投与することを含む。
【０４９５】
この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の用量を、患者におけるサイトカイン放出症候群を阻止または予防するために徐々に増加させ得る。例えば、化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量および第二用量が患者に投与され得て、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量および第二用量が異なり、第二用量が化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２０倍〜約１５０００倍多い、２倍〜約１５０００倍多い。他の実施態様において、第二用量またはその後の用量は、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約５倍、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約２０倍、約２倍〜約３０倍、約２倍〜約４０倍、約２倍〜約５０倍、約２倍〜約６０倍、約２倍〜約７０倍、約２倍〜約８０倍、約２倍〜約９０倍、約２倍〜約１００倍、約２倍〜約１５０００倍、約２倍〜約１００００倍、約５倍〜約９０００倍、約５倍〜約８０００倍、約５倍〜約７０００倍、約５倍〜約６０００倍、約５倍〜約５０００倍、約５倍〜約４０００倍、約５倍〜約３０００倍、約５倍〜約４０００倍、約５倍〜約３０００倍、約５倍〜約２０００倍、約５倍〜約１０００倍、約５倍〜約７５０倍、約２倍〜約７５０倍、約５倍〜約５００倍、約５倍〜約１００倍、約８００倍〜約１５０００倍、約８００倍〜約１００００倍、約８００倍〜約９０００倍、約８００倍〜約８０００倍、約８００倍〜約７０００倍、約８００倍〜約６０００倍、約８００倍〜約５０００倍、約８００倍〜約４０００倍、約８００倍〜約３０００倍、約８００倍〜約２０００倍、約８００倍〜約１０００倍、約８０００倍〜約１５０００倍、約８０００倍〜約１００００倍、約８０００倍〜約９０００倍、約１５０００倍、約１００００倍、約９０００倍、約８０００倍、約７０００倍、約６０００倍、約５０００倍、約４０００倍、約３０００倍、約２０００倍、約１０００倍、約５００倍、約４００倍、約３００倍、約２００倍、約１００倍、約９０倍、約８０倍、約７０倍、約６０倍、約５０倍、約４０倍、約３０倍、約２０倍、約１０倍、約５倍または約２倍多い。
【０４９６】
用量漸増方法の他の説明的実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量、第二用量および第三用量が患者に投与され得て、ここで、該第一用量、該第二用量および該第三用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約７５０倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８００倍〜約１００００倍多い。
【０４９７】
用量漸増方法の他の態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第一用量、第二用量、第三用量および第四用量が患者に投与され得て、ここで、該第一用量、該第二用量、該第三用量および該第四用量が異なり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約２倍〜約７５０倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８００倍〜約７５００倍多く、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約８０００〜約１５０００倍多い。
【０４９８】
なお他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量は化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１００倍多くてよく、化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量は化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１０００倍多くてよく、化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量は化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より約１００００倍多くてよい。例示的実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量は.０５ｎＭ／kgであり、第二用量は５ｎＭ／kgであり、第三用量は５０ｎＭ／kgであり、第四用量は５００ｎＭ／kgである。ここに記載する用量漸増実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一、第二、第三、第四および任意のその後の用量を複数回投与してよい(例えば、.０５ｎＭ／kgの第一用量が数回投与され、その後、漸増用量が投与される)。
【０４９９】
ここに記載する他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも第二用量を投与すること(ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量が該化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約５０％低い)そしてiii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の１用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)を含む。
【０５００】
この用量漸減実施態様の種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量は、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約６０％低い、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約７０％低い、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約８０％低い、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９０％低い、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９５％低い、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９６％低い、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９７％低い、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９８％低い、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９９％低いまたは化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量の量より少なくとも約９９.５％低いものであり得る。
【０５０１】
ここに記載する用量漸減実施態様の種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量は、約１００ｎＭ／kg〜約１０００ｎＭ／kg患者体重、約１００ｎＭ／kg〜約９００ｎＭ／kg患者体重、約１００ｎＭ／kg〜約８００ｎＭ／kg患者体重、約１００ｎＭ／kg〜約７００ｎＭ／kg患者体重、約１００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重、約２００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重、約４００ｎＭ／kg〜約６００ｎＭ／kg患者体重または約５００ｎＭ／kg患者体重であり得る。
【０５０２】
ここに記載する用量漸減実施態様の種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量は、約０.５ｎＭ／kg〜約５００ｎＭ／kg患者体重、約０.５ｎＭ／kg〜約４５０ｎＭ／kg患者体重、約０.５ｎＭ／kg〜約４００ｎＭ／kg患者体重、約０.５ｎＭ／kg〜約３５０ｎＭ／kg患者体重、約０.５ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重、約１ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重、約２ｎＭ／kg〜約３００ｎＭ／kg患者体重、約２ｎＭ／kg〜約２５０ｎＭ／kg患者体重、約５ｎＭ／kg〜約４０ｎＭ／kg患者体重または約４０ｎＭ／kg〜約１５０ｎＭ／kg患者体重であり得る。
【０５０３】
ここに記載する用量漸減実施態様のさらなる実施態様において、方法は化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量を投与することをさらに含んでよく、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量は化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量と同じである。他の実施態様において、方法は化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量を投与することをさらに含んでよく、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩の第四用量は第二用量またはその薬学的に許容される塩および化合物またはその薬学的に許容される塩の第三用量と同じである。さらに他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量後に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の用量は、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量に関連した癌の増殖阻害を維持し得る。
【０５０４】
ここに記載する用量漸減実施態様の他の実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞は、約１００万のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞〜約４０００万のＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の用量で投与され得る。なお他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量後に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の用量を、週１回または２回投与し得る。
【０５０５】
なおここに記載する用量漸減実施態様の他の実施態様において、方法は、患者にフォレート、標的化部分を含まないフォレートを含むコンジュゲートまたはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与するステップをさらに含み得る。他の実施態様において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を阻害する薬剤が患者に投与され、薬剤は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の化合物またはその薬学的に許容される塩の結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤であり、薬剤はフルオレセインアミン、フルオレセインナトリウムまたはフルオレセインである。さらに他の実施態様において、薬剤はフルオレセインナトリウムである。
【０５０６】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物の第一用量を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含み、該化合物またはその薬学的に許容される塩は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)の投与の少なくとも約１時間前に患者に投与される)、ii)次いで患者にＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の１用量を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)、そしてiii)次いで患者に該化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量を投与することを含む。この前処置実施態様の種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第一用量を、患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約２時間前、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約４時間前、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約８時間前、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約１２時間前、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約１６時間前、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約２０時間前またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約２４時間前に投与でき、それぞれの場合、ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０５０７】
この前処置実施態様の種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の第二用量を、患者に、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約２４時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約２０時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約１８時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約１６時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約１４時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約１２時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約１０時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約８時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約６時間後、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約４時間後またはＣＡＲ  Ｔ細胞組成物投与の少なくとも約２時間後までに投与でき、それぞれの場合、ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０５０８】
フォレートがリンカーにより標的化部分に結合したリガンドであるここに記載する実施態様の何れにおいても、患者に、ここに記載する方法で処置する前にフォレート欠乏食を処方してよくまたは患者は食事にフォレートを適用し得る。患者がフォレートを投与される実施態様において、用量は、例えば、約５０nＭ／kg〜約３０００nＭ／kg患者体重、約５０nＭ／kg〜約２０００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約１０００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約９００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約８００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約７００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約６００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約５００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約４００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約３００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約２００nＭ／kg、約５０nＭ／kg〜約１００nＭ／kg、約１００nＭ／kg〜約３００nＭ／kg、約１００nＭ／kg〜約５００nＭ／kg、約１００nＭ／kg〜約１０００nＭ／kg、約１００nＭ／kg〜約２０００nＭ／kg患者体重の範囲であり得る。他の実施態様において、用量は、約１００nＭ／kg、約１５０nＭ／kg、約２００nＭ／kg、約２５０nＭ／kg、約３００nＭ／kg、約３５０nＭ／kg、約４００nＭ／kg、約４５０nＭ／kg、約５００nＭ／kg、約６００nＭ／kg、約７００nＭ／kg、約８００nＭ／kg、約９００nＭ／kg、約１０００nＭ／kg、約２０００nＭ／kgまたは約３０００nＭ／kg患者体重であり得る。これら実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。ある態様おいて、フォレートを、例えば、連日、毎週、週２回、週３回またはフォレートの投与のための任意の適当なレジメンを使用して投与し得る。
【０５０９】
ここに記載する種々の実施態様において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後最長で約１０日間、最長で約１５日間、最長で約２０日間、最長で約２５日間、最長で約３０日間、最長で約３５日間、最長で約４０日間、最長で約４５日間、最長で約５０日間、最長で約５５日間、最長で約６０日間、最長で約６５日間、最長で約７０日間、最長で約７５日間または最長で約８０日間、循環ＣＡＲ  Ｔ細胞数が増加したままであり得る。
【０５１０】
ここに記載する種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の５０％効果濃度(ＥＣ５０)は、約１pM〜約２nM、約１pM〜約５nM、約１pM〜約１０nM、約１pM〜約２０nM、約１pM〜約３０nM、約１pM〜約４０nM、約１pM〜約５０nM、約１pM〜約６０nM、約１pM〜約７０nM、約１pM〜約８０nM、約１pM〜約９０nM、約１pM〜約１００nM、約１pM〜約２００nM、約１pM〜約３００nM、約１pM〜約４００nM、約１pM〜約５００nM、約１pM〜約６００nM、約１pM〜約７００nM、約１pM〜約８００nM、約１pM〜約９００nM、約１pM〜約１nM、約１pM〜約９００pM、約１pM〜約８００pM、約１pM〜約７００pM、約１pM〜約６００pM、約１pM〜約５００pM、約１pM〜約４００pM、約１pM〜約３００pM、約１pM〜約２００pM、約１pM〜約１００pM、約１pM〜約９０pM、約１pM〜約８０pM、約１pM〜約７０pM、約１pM〜約６０pM、約１pM〜約５０pM、約１pM〜約４０pM、約１pM〜約３０pM、約１pM〜約２０pM、約１pM〜約１０pMまたは約１pM〜約５pMであり得る。
【０５１１】
ここに記載する種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩のＣＡＲ  Ｔ細胞への結合のＫｄは約１nM〜約１００nM、約１nM〜約２００nM、約１nM〜約３００nM、約１nM〜約４００nM、約１nM〜約５００nM、約１nM〜約６００nM、約１nM〜約７００nM、約１nM〜約８００nM、約１nM〜約９００nM、約１００nM〜約５００nM、約１００nM〜約４００nM、約１００nM〜約３００nM、約１００nM〜約２００nM、約１００nM〜約１５０nMまたは約１３０nMであり得る。
【０５１２】
ここに記載する種々の説明的実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、患者に、まずＣＡＲ  Ｔ細胞の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日前または後またはＣＡＲ  Ｔ細胞の前または後の任意の適切な日に投与し得る。
【０５１３】
ここに記載する種々の実施態様において、ＥＧＦＲｔソートまたは非ソートＣＡＲ  Ｔ細胞が使用され得る。他の実施態様において、低分化プロファイルを有するＣＡＲ  Ｔ細胞の「臨床模写」バッチが使用され得る。他の実施態様において、ＣＡＲ  Ｔ細胞の「研究バッチ」が使用され得る。「臨床模写」バッチ(約３９％ＥＧＦＲｔ＋)は、約６６％ＴＳＣＭおよび約３２％ＴＣＭのＣＤ４＋サブセットおよび約９５％ＴＳＣＭおよび約３％ＴＣＭのＣＤ８サブセットを含み得る。研究バッチ(約２３％ＥＧＦＲｔ＋)は、約３２％ＴＳＣＭ、約５３％ＴＣＭ、約１１％ＴＥＭおよび約３.７％ＴＥＦＦのＣＤ４サブセットおよび約４４％ＴＳＣＭ、約０.２８％ＴＣＭ、約３.４％ＴＥＭおよび約５２％ＴＥＦＦのＣＤ８サブセットを含み得る。
【０５１４】
この前処置実施態様の種々のさらなる実施態様において、患者にオフターゲット毒性をもたらすサイトカイン放出は生じないが、癌へのＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の毒性は生じるまたはオフターゲット組織毒性は患者で生じないが、癌へのＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の毒性は生じるまたは癌は腫瘍を含み、腫瘍サイズは患者で減少するが、オフターゲット毒性は生じないまたは患者における腫瘍サイズの減少は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の投与前に、化合物またはその薬学的に許容される塩で予め処置されていない患者より大きい。当業者により理解されるとおり、「標的」は癌(例えば腫瘍)であり得る。
【０５１５】
他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)を含み、ここで、小分子リガンドはＰＳＭＡリガンドであり、標的化部分はＦＩＴＣである。この実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドは、式
【化２２】
2021512147.tif 000027
を有し得る。
【０５１６】
さらに他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、該化合物はリンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドを含む)、そしてii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)を含み、ここで、小分子リガンドはＣＡＩＸリガンドであり、標的化部分はＦＩＴＣである。この実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合された小分子リガンドは、式
【化２３】
2021512147.tif 000028
を有し得る。
【０５１７】
なお他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に第一化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、第一化合物またはその薬学的に許容される塩は、リンカーによりＦＩＴＣに結合したＰＳＭＡリガンドを含む)、ii)患者に第二化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、第二化合物またはその薬学的に許容される塩は、リンカーによりＦＩＴＣに結合したＣＡＩＸリガンドを含む)、そしてiii)患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与すること(ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物はＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、該ＣＡＲ  Ｔ細胞はＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含む)を含む。この実施態様において、第一化合物は式
【化２４】
2021512147.tif 000029
を有し得て、第二化合物は式
【化２５】
2021512147.tif 000030
を有し得る。
【０５１８】
ここに記載する方法のある実施態様において、癌は、患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する前または患者にＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を投与する前に造影され、ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含むＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。ある説明的実施態様において、造影はＰＥＴ造影により行う。他の説明的実施態様において造影はＭＲＩ造影またはＳＰＥＣＴ／ＣＴ造影により行う。造影方法は、当分野で知られる何れかの適当な造影方法であり得る。ある実施態様において、造影方法は、ここに記載するが、ここに記載する造影のタイプに適する造影剤に結合された小分子リガンドの使用を含み得る。
【０５１９】
ここに記載する実施態様の何れにおいても、患者にオフターゲット毒性をもたらすサイトカイン放出は、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の癌への毒性が生じても、生じ得ない。ここに記載する実施態様の何れにおいても、オフターゲット組織毒性は、患者において、Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の癌への毒性が生じても、生じ得ない。ここに記載する実施態様の何れにおいても、癌は腫瘍を含み得て、腫瘍サイズは、オフターゲット毒性が生じなくても、患者において減少され得る。ここに記載する実施態様の何れにおいても、ＣＲＳは減少または予防され得て、方法は、患者の腫瘍体積の減少をもたらし得る。ここに記載する実施態様の何れにおいても、ＣＲＳによる体重減少は減少または阻止され得る。ここに記載する実施態様の何れにおいても、癌は腫瘍を含み得て、腫瘍の完全応答が得られ得る。
【０５２０】
ここに記載する方法の他の実施態様において、ここに記載する方法の何れも単独で使用できまたはここに記載する方法の何れも任意の他の方法またはここに記載する方法と組み合わせて使用し得る。
【実施例】
【０５２１】
実施例１
ＥＣ１７用量漸減は治療関連毒性を低減し得る
ＥＣ１７用量漸減の効果を、ＣＡＲ−Ｔ治療の抗腫瘍活性および毒性(体重変化)で試験した。２種の異なる抗フルオレセインｓｃＦｖをＣＡＲ構築のために使用した(図１)。ＣＡＲの最初の構築物は次のドメインを含む：抗ＦＬ(ＦＩＴＣ−Ｅ２)ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ヒンジ(ＣＨ２(Ｌ２３５Ｄ、Ｎ２９７Ｑ)−ＣＨ３)−ＣＤ２８ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ。ＣＡＲの第二の構築物は次のドメインを含む：抗ＦＬ(ＦＩＴＣ−４Ｍ５.３)ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ヒンジ(ＣＨ２(Ｌ２３５Ｄ、Ｎ２９７Ｑ)−ＣＨ３)−ＣＤ２８ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ。各構築物のＣＡＲの核酸配列およびアミノ酸配列は、配列番号１〜４として示す。ヒトＴ細胞を単離し、活性化し、適切なＣＡＲ遺伝子を担持するレンチウイルスベクターで形質導入した。ＣＡＲ修飾されたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＡＲ修飾されたＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、別々にインビトロで約７日間培養した。ＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を、動物試験のためにｉ.ｖ.投与する前に１：１比で混合した。
【０５２２】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍(１５０〜２５０mm３)担持マウスを、Ｅ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞を評価するインビボ試験に使用した。実験の第一部で、１０００万または２０００万のＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与し、５００nＭ／kg  ＥＣ１７をＣＡＲ−Ｔ投与後２日目、９日目、１６日目、２３日目などに毎週ｉ.ｖ.投与した(図２Ａに示すとおり)。２０００万のＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスは、２回目のＥＣ１７後重度のＣＲＳを示し、６μmol／kg  フルオレセインナトリウム(ＮａＦＬ)でレスキューしなければならなかった。１０００万および２０００万のＣＡＲ−Ｔ群両者は３回目および４回目のＥＣ１７後重度のＣＲＳを示し、ＮａＦＬでレスキューしなければならなかった(図５Ａおよび５Ｂに示すとおり)。これら２群のいずれも、Ｅ２−ＣＡＲ−Ｔ治療中重度の体重減少(約２０％)を示し、１０００万または２０００万のＥ２  ＣＡＲ−Ｔ／ＥＣ１７  ５００nＭ／kg  ＳＩＷ治療が重度の毒性を有したことを示した。(２０００万のＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞単独は抗腫瘍活性も示したが(図５Ａ、白丸)、これは、短時間インビトロで培養した「若い」Ｔ細胞で一般にみられる同種ＨＬＡミスマッチＴＣＲが原因である可能性があった。)
【０５２３】
実験の第二部で、使用したＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞をインビトロで約２週間培養した。３０００万のＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与し、ＥＣ１７投与を漸減のために修飾した。図２Ｂに示すとおり、５００nＭ／kg  ＥＣ１７をＣＡＲ−Ｔ投与２日後に投与し、次いで低用量のＥＣ１７(５nＭ／kgまたは２０nＭ／kgまたは１００nＭ／kg)を毎週投与した(ＣＡＲ−Ｔ投与後９日目、１６日目、２３日目など)。図３Ａに示すとおり、全３つのＥＣ１７漸減群は完全応答に到達し、ブリッジ漸減用量がＣＡＲ−Ｔの抗腫瘍活性に影響しないことを示した。より重要なことに、これら３つのＥＣ１７漸減群いずれも、何ら重度ＣＲＳを示さなかった。図３Ｂに示すとおり、実験の第一部(１０００万または２０００万のＣＡＲ−Ｔ細胞)より多くのＣＡＲ−Ｔ細胞(３０００万)が投与されたが、全漸減群は、極めて軽度な体重減少を示した。これらのデータは、ブリッジ漸減(１高レベル負荷用量、続く維持用量の減少レベル)は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の良好な抗腫瘍活性を維持しながら、毒性が減少され得ることを示す。
【０５２４】
第二構築物４Ｍ５.３−ＣＡＲ(抗ＦＬ(ＦＩＴＣ−４Ｍ５.３)ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ヒンジ(ＣＨ２(Ｌ２３５Ｄ、Ｎ２９７Ｑ)−ＣＨ３)−ＣＤ２８ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ)も評価した。担持マウスＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍(１５０−２５０mm３)を、４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ細胞の評価のためにインビボ試験で使用した。実験の第一部で、１０００万または２０００万の４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与し、５００nmol／kg  ＥＣ１７をＣＡＲ−Ｔ投与後２日目、９日目、１６日目、２３日目などに毎週ｉ.ｖ.投与した(図２Ａに示すとおり)。１０００万または２０００万の４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスは、１回ＥＣ１７投与の後重度ＣＲＳまたは体重減少を示さなかったが(図６Ｂ)、腫瘍は全て減少し、最終的に消失した(図６Ａ)。２０００万のＣＡＲ−Ｔ細胞(上部線)は、１０００万のＣＡＲ−Ｔ細胞(中央の線)より良好な抗腫瘍活性を示した。
【０５２５】
実験の第二部で、使用した４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ細胞を、約２週間インビトロで培養した。３０００万の４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与し、ＥＣ１７投与を漸減のために修飾した。図２Ｂに示すとおり、５００nＭ／kg  ＥＣ１７をＣＡＲ−Ｔ投与２日後に投与し、次いで低用量のＥＣ１７(５nＭ／kgまたは２０nＭ／kgまたは１００nＭ／kg)を毎週投与した(ＣＡＲ−Ｔ投与後９日目、１６日目、２３日目など)。図４Ａに示すとおり、１００nＭ／kg  ＥＣ１７漸減群は最良抗腫瘍活性を示し、全腫瘍が治癒したが(下部線)、５ｎＭ／kg  ＥＣ１７群(上から２番目の線)も２０nＭ／kg  ＥＣ１７群(上から３番目の線)も、ＣＡＲ−Ｔ治療に対して完全応答を示さなかった。データは、ＣＡＲ−Ｔ活性が漸減に使用したＥＣ−１７用量で制御されることを示す。さらに、図４Ｂに示すとおり、３漸減群のマウスの体重減少もＥＣ１７用量依存的であった。１００nＭ／kg  ＥＣ１７用量漸減群は、５nＭ／ｋg  ＥＣ１７または２０nＭ／ｋg  ＥＣ１７の他の２群より大きな体重減少を示した。これらのデータは、ブリッジ漸減(１回の高レベル負荷用量、続く維持用量の減少レベル)がＣＡＲ−Ｔ治療の抗腫瘍活性および毒性両者を制御できることを示す。
【０５２６】
Ｅ２−ＣＡＲと４Ｍ５.３−ＣＡＲの唯一の差は、使用したｓｃＦｖ配列である。これら２種のＣＡＲを同じ条件で比較すると、１０００万のＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１０００万の４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ細胞より良好な抗腫瘍活性を有することが示され、ＥＣ１７用量漸減(５nＭ／kgまたは２０nＭ／kgまたは１００nＭ／kg)を試験したとき、３０００万のＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞も、３０００万の４Ｍ５.３−ＣＡＲ−Ｔ細胞より良好な抗腫瘍活性を示した。
【０５２７】
ここで使用する「配列番号４」は、下線「ｇａｃ」コドンから始まり、下線「ｇｇｃ」コドンで終わる配列を意味する。長い配列のこの部分は例示的４Ｍ５.３  ＣＡＲをコードする。ＣＡＲはＴ細胞膜に挿入される。長い配列の他の部分は、膜に挿入されるＣＡＲの一部ではなく、キメラ抗原受容体として機能するシグナルペプチド、ＥＧＦＲｔドメインなどのコード配列を含む。ここで使用する「配列番号３」は下線「Ｄ」から始まり、下線「Ｇ」で終わる配列を意味する。長い配列のこの部分は、Ｔ細胞膜に挿入されるＣＡＲのアミノ酸配列である。長い配列の他の部分は、膜に挿入されるＣＡＲの一部ではなく、キメラ抗原受容体として機能するシグナルペプチド、ＥＧＦＲｔドメインなどのアミノ酸配列を含む。さらに他の実施態様において、配列番号３はヒト化またはヒトアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。配列番号３および４は上記のとおりである。長い核酸配列の開始および停止コドンは下線を引き、長い配列は、４Ｍ５.３  ＣＡＲを調製するためにＴ細胞の形質導入に使用され得る例示的配列である。
【０５２８】
配列番号３[４Ｍ５.３−ＣＡＲアミノ酸配列(インサート)]
【化２６】
2021512147.tif 000031
【０５２９】
配列番号４[４Ｍ５.３−ＣＡＲ  ヌクレオチド酸配列(インサート)]
【化２７】
2021512147.tif 000032
【０５３０】
実施例２
ＮＳＧマウスへの注入前のＣＡＲ  Ｔ細胞分化表現型の特徴づけ
多色フローサイトメトリーを使用して、腫瘍担持マウスに注入すべきＣＡＲ  Ｔ細胞産物の表現型を確認した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットの分化状態を、図７Ａに示す表面マーカーの特定の組み合わせを使用して分析した。非ソートＥ２臨床模写ＣＡＲ  Ｔ細胞産物は、主に自己再生Ｔｓｃｍ／Ｔｃｍ表現型からなった(図７Ｂ)。図７Ｂにおいて、最も高いバーは「Ｔｓｃｍ」であり、低いバーは「Ｔｃｍ」である。図８Ａに示すＣＤ８：ＣＤ４比の差異に加えて、現在のＥ２臨床模写ＣＡＲ  Ｔ細胞は先にソートしたＥ２／４Ｍ５.３  ＣＡＲ−Ｔ細胞および早期ＧＦＰ＋４Ｍ５.３  ＣＡＲ  Ｔインビボ研究調製物と異なった(図８Ｂにパイチャートとして要約)。図８Ａにおいて、左から右の１０群で、バーは次を意味する  −  １−(高いバーＴｓｃｍ、低いバーＴｃｍ)、２−(高いバーＴｓｃｍ、低いバーＴｃｍ)、３−(高いバーＴｅｆｆ、低いバーＴｅｍ)、４−(高いバーＴｅｍ、低いバーＴｅｆｆ、最も低いバーＴｃｍ)、５−(高いバーＴｅｆｆ、低いバーＴｅｍ)、６−(高いバーＴｅｍ、低いバーＴｅｆｆ、最も低いバーＴｃｍ)、７−(高いバーＴｅｆｆ、低いバーＴｓｃｍ)、８−(高いバーＴｅｆｆ、低いバーＴｅｍ)、９−(高いバーＴｅｆｆ、低いバーＴｓｃｍ)、１０−(高いバーＴｅｆｆ、低いバーＴｓｍ、次に低いバーＴｅｍ、最も低いバーＴｃｍ)。従って、主にＴｓｃｍ／Ｔｃｍ表現型のＣＡＲ  Ｔ細胞は、より分化したＴｅｍ／Ｔｅｆｆ表現型を有する過去のＣＡＲ  Ｔ調製物と比較して、優れた抗腫瘍表現型を有することが期待された。同じ理由で、ｓＣＲＳは、同じＥＣ１７投与レジメンを仮定して、現在のＣＡＲ−Ｔ調製物では、先のＣＡＲ−Ｔ調製物より遅く生じる。
【０５３１】
凍結保存後のＣＡＲ  Ｔ細胞回復
凍結保存ＣＡＲ  Ｔ細胞を３７℃水浴で急速に解凍し、直ぐにＴ細胞回復培地(２％ヒトＡＢ血清添加グルタミン(Miltenyi Biotec #130-097-196)含有TexMACSTM培地)に入れ、５０Ｕ／mL組み換えヒトＩＬ−２を添加し、インビトロで約３〜５日間、Ｔ細胞回復のために培養した。
【０５３２】
フローサイトメトリー分析
ＣＡＲ  Ｔ細胞をインビトロ回復培地から採取し、４００ｇで５分間遠心分離してペレット化した。次いで、Ｔ細胞を、両抗マウスＦｃγIII／II受容体(ＣＤ１６／ＣＤ３２)ブロック[クローン２.４Ｇ２；BD Bioscience, catalog#553142、１：１００(ｖ／ｖ)希釈]および抗ヒトＦｃブロック[BD Biosciences, catalog #564220、１：５０(ｖ／ｖ)希釈]添加フローサイトメトリー染色溶液[１％ウシ血清アルブミン、５０mg／mL  ヒトＩｇＧ(Equitech Bio, cat#SLH56-0001)、リン酸緩衝化食塩水中０.９％ナトリウムアジド、ｐＨ＝７.４]に再懸濁した。表面マーカー染色を、次の蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣｅＦ７８０[クローンＨＩ１００、ThermoFisher #47-0458-42、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ−ｅＦ４５０[クローンＵＣＨＬ１、Thermofisher #48-0457-42、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＣＤ８α−ＰＥＣｙ７[クローンＲＰＡ−Ｔ８、BD Bioscience, catalog #557746、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＣＤ４−Ｐｅｒｃｐｅ７１０[クローンＳＫ３、ｅBioscience catalog #46-0047-42、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、ビオチニル化抗ヒトＥＧＦＲ(セツキシマブ；R&D Systems #FAB9577B-100、１：１０(ｖ／ｖ)、続いてＰＥコンジュゲート抗ビオチン(BioLegend #53-9895-82、１：４００(ｖ／ｖ))を、各サンプルに２０分間、暗所で氷上で添加することにより実施した。表面マーカー染色後、Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、３μMヨウ化プロピジウム含有冷ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーコレクションチューブに移した。フローサイトメトリーデータをGalliosフローサイトメーター(Beckman Coulter, Brea, CA)で集め、そこで最小２０,０００事象を集めて、データをKaluza v1.5ソフトウェアを使用して分析した。
【０５３３】
実施例３
Ｅ２抗ＦＩＴＣ抗体はあらゆるヒト正常組織と結合しない
Ｅ２抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ構築物のものと同じ可変フラグメント配列を有するＥ２抗ＦＩＴＣ  ＩｇＧ抗体を使用して、Ｅ２抗体がヒト正常組織と何かしらの結合をするか否か試験した。組み換えヒトＥ２抗ＦＩＴＣ  ＩｇＧ１ラムダ１をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、プロテインＡ親和性カラムを使用して精製した。抗体純度は、ＳＥＣ時間ＰＬＣ分析を使用して９８％を超えた。抗体を、Mix-N-Stain DIG抗体標識キット(Biotium)を使用して、ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)で標識した。ＦＩＴＣ固定化ビーズに対するＤＩＧ標識Ｅ２抗体の結合親和性をＦＡＣＳにより測定した。種々の濃度のＤＩＧ−Ｅ２  ＩｇＧを、ＦＩＴＣ固定化ビーズと、３０分間、室温でインキュベートした。洗浄後、モノクローナル抗ＤＩＧ  Ａｂを加え、ビーズと３０分間インキュベートした。ｅＦ６６０コンジュゲート抗マウス二次抗体を加え、洗浄したビーズとインキュベートした。洗浄したビーズを、ｅＦ６６０シグナルについて、ＦＡＣＳで分析した。ＰＥ固定化ビーズを陰性対照ビーズとして使用した。ｅＦ６６０の蛍光強度を、ＤＩＧ標識Ｅ２−ＩｇＧの添加濃度に対してプロットし、図９に示す。ＦＩＴＣに対するＤＩＧ標識Ｅ２抗体の結合親和性をＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して計算した。図９Ｂの挿入部分に示すとおり、Ｋｄは約０.６６nMであり、ＤＩＧ標識Ｅ２抗ＦＩＴＣ抗体がＦＩＴＣに高結合親和性を有し、ヒト正常組織とのＥ２結合に使用できることを示した。
【０５３４】
Ｅ２抗体のヒト組織への結合を試験するためのＩＨＣアッセイを開発した。ＦＩＴＣ標識ＫＢ細胞を伴う寒天ブロックのホルマリン固定、パラフィン包埋(ＦＦＥＰ)組織切片を陽性対照として使用し、非標識ＫＢ細胞のＦＦＰＥ組織切片を陰性対照として使用した。組織切片を脱パラフィン処理および再水和し、次いで、組織切片と抗原回収緩衝液(ｐＨ６.０)を９１℃で２４分間インキュベートして抗原を回収し、次いでＤＩＧ−Ｅ２抗体を再水和組織切片とインキュベートし、最後に抗ＤＩＧ  ＩＨＣ染色を実施した。簡潔には、モノクローナル抗ＤＩＧ抗体、続いて、ペルオキシダーゼ標識抗マウス二次抗体を加え、インキュベートした。図１０Ａに示すとおり、ＦＩＴＣ標識ＫＢ細胞は、陽性染色を示し、Ｅ２抗体がこれら標識ＫＢ細胞上のＦＩＴＣと結合することを示した。非標識ＫＢ細胞は、何ら染色を示さなかった(図１０Ｂ)。
【０５３５】
ＤＩＧ標識Ｅ２抗体をヒト複数臓器正常組織マイクロアレイ(FDA999, US Biomax, Inc)とインキュベートし、Ｅ２抗体のヒト正常組織への結合を、上記の条件と同じＩＨＣ法を使用して評価した。この複数臓器正常組織マイクロアレイは、副腎(図１１)、骨髄(図１２)、乳房(図１３)、小脳組織(図１４)、子宮頸(図１５)、結腸(図１６)、食道(図１７)、眼(図１８)、心臓(図１９)、下垂体(図２０)、腎臓(図２１)、喉頭(図２２)、肝臓(図２４)、肺(図２５)、リンパ節(図２６)、神経(図２７)、卵巣(図２８)、膵臓(図２９)、前立腺(図３０)、皮膚(図３１)、小腸(図３２)、脾臓(図２３)、胃(図３３)、横紋筋(図３４)、精巣(図３５)、胸腺(図３６)、舌(図３７)および子宮(図３８)を含む２８タイプの正常ヒト臓器を伴う９９コアを有する。少なくとも３名の正常ヒト個体から得た臓器がマイクロアレイパネルに包含された。図１１〜３８に示すとおり、陽性ＩＨＣ染色は、試験したこれら２８タイプの正常ヒト臓器で見られず、Ｅ２抗ＦＩＴＣ抗体は、正常ヒト臓器組織と何ら結合しないことが示された。一部形質細胞は、ＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートした試験切片およびＤＩＧ−Ｅ２抗体とプレインキュベートしていない陰性対照切片の両者で、一定レベルの染色強度を示し、この弱い染色が非特異的であったことを示した。
【０５３６】
結論として、Ｅ２抗ＦＩＴＣ抗体は、試験したヒト正常臓器組織と何ら結合せず、Ｅ２抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ細胞自体が、インビボであらゆるヒト正常組織に結合せず、攻撃しない。
【０５３７】
実施例４
ＦＩＴＣ−フォレートの合成
【化２８】
2021512147.tif 000033
フォレート−γ−エチレンジアミンを、テトラメチルグアニジンおよびジイソプロピルアミン存在下、無水ジメチルスルホキシド(ＤＭＦ)中で、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)異性体Ｉ(Sigma-Aldrich)とカップリングさせた。粗製生成物をＸｔｅｒｒａ  ＲＰ１８分取ＨＰＬＣカラム(Waters)に負荷し、９９％５mM  リン酸ナトリウム(移動相Ａ、ｐＨ７.４)および１％アセトニトリル(移動相Ｂ)で開始し、２０mL／分の流速で、１０分間で９０％Ａおよび１０％Ｂに達する勾配条件で溶出した。これらの条件下、ＦＩＴＣ−フォレート主ピークは、一般に２７〜５０分で溶出した。ＦＩＴＣ−フォレートフラクションの品質を、分析的逆相ＨＰＬＣとＵＶ検出器でモニターした。９８.０％を超える純度(ＬＣＭＳ)のフラクションを凍結乾燥して、最終ＦＩＴＣ−フォレート生成物を得た。当分野で知られるとおり、この構造を有する化合物はＥＣ１７とも称される。
【０５３８】
実施例５
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ１２−フォレートの合成
【化２９】
2021512147.tif 000034
汎用ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)Nova TagTM樹脂(０.２ｇ)をペプチド合成容器に加え、イソプロピルアルコール(ｉ−ＰｒＯＨ)(３×１０mL)およびジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、３×１０mL)で洗浄した。９−フルオレニルメトキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)脱保護を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×１０mL)を使用して実施した。カイザーテストを実施して、反応の進行を評価した。次いで、容器にＦｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸５−ｔｅｒｔ−ブチルエステル(Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−(Ｏ−ｔ−Ｂｕ)−ＯＨ)(２３.５mg)のＤＭＦ溶液、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ)(４当量)およびベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(ＰｙＢＯＰ)(２当量)を加えた。Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×１０mL)を使用して実施した。次いで、容器にＮ１０−ＴＦＡ−Ｐｔｅ−ＯＨ溶液(２２.５mg)、ＤＭＦ、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ(４当量)およびＰｙＢＯＰ(２当量)を加えた。アルゴンで２時間バブリングし、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ジクロロメタン(ＤＣＭ)中で樹脂を膨潤させた後、ＤＣＭ／トリフルオロエタン(ＴＦＥ)(１：１)中の１Ｍ  ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢＴ)溶液(２×３mL)を加えた。アルゴンで1時間バブリングし、溶媒を除去し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦ中で樹脂を膨潤させた後、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−(ＰＥＧ)１２−ＣＯＯＨ(４６.３mg)のＤＭＦ溶液、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ(４当量)およびＰｙＢＯＰ(２当量)を加えた。アルゴンで２時間バブリングし、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×１０mL)を使用して実施した。カイザーテストを実施して、反応の進行を評価した。容器にＦＩＴＣ(Life Technologies、２１.４mg)のＤＭＦ溶液およびｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ(４当量)を加え、次いでアルゴンで２時間バブリングし、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。次いで、容器に２％ＮＨ２ＮＨ２のＤＭＦ溶液(２×２mL)を加えた。最終化合物をＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン(ＴＩＳ)(９５：２.５：２.５)(開裂溶液)を使用して樹脂から開裂させ、減圧下に濃縮した。濃縮生成物をＥｔ２Ｏで沈殿させ、減圧下乾燥させた。粗製生成物を分取ＲＰ時間ＰＬＣ(移動相：Ａ＝１０mM  酢酸アンモニウムｐＨ＝７、Ｂ＝ＡＣＮ；方法：０％Ｂ〜３０％Ｂを３０分間、１３mL／分)を使用して精製した。純粋フラクションを集め、凍結乾燥して、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ１２−フォレートを得た。
【０５３９】
実施例６
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２０−フォレートの合成
【化３０】
2021512147.tif 000035
エチレンジアミン、ポリマー結合(２００〜４００メッシュ)樹脂(５０mg)をペプチド合成容器に加え、ＤＣＭ(３mL)、続いてＤＭＦ(３mL)で膨潤させた。次いで、容器にＤＭＦ中Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ２０−ＣＯＯＨ溶液(１３１mg、１.０当量)、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ(６.０当量)およびＰｙＢＯＰ(４.０当量)を入れた。アルゴンで６時間バブリングし、カップリング溶液を排水し、樹脂をＤＭＦ(３×１０mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×１０mL)で洗浄した。カイザーテストを実施して、反応の進行を評価した。Ｆｍｏｃ脱保護を、各アミノ酸カップリング前、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×１０mL)を使用して実施した。上記工程を繰り返して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ(７２mg、２.０当量)およびＴｆａ.プテロイン酸(４１mg、１.２当量)カップリングステップの反応を完了させた。樹脂を２％ヒドラジンのＤＭＦ溶液(３×１０mL)(５分)で洗浄してプテロイン酸のトリフルオロ−アセチル保護基を除去し、ｉ−ＰｒＯＨ(３×１０mL)、続いてＤＭＦ(３×１０mL)で洗浄した。樹脂をアルゴン下で３０分間乾燥させた。フォレート−ペプチドを開裂溶液を使用して樹脂から開裂した。１０mLの開裂混合物を導入し、アルゴンで１.５時間バブリングした。開裂混合物を新しいフラスコに注加した。樹脂をさらなる開裂混合物で３回洗浄した。合わせた混合物を少量(約５mL)まで減圧下濃縮し、エチルエーテルで沈殿させた。
沈殿を遠心分離により集め、エチルエーテル(３回)で洗浄し、高減圧下乾燥させた。乾燥フォレート−ＰＥＧ２０−ＥＤＡ(１.０当量)を、室温でＤＭＳＯおよびＤＩＰＥＡ中のＦＩＴＣ(５０mg、１.５当量)で処理した。反応の進行をＬＣＭＳによりモニターした。８時間後、出発物質は消費されて、生成物となった。粗製反応混合物を分取ＨＰＬＣ(移動相Ａ＝１０mM  酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；移動相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３mL／分で０％Ｂ〜３０％Ｂを３５分間)で精製し、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２０−フォレートを６０％収率で得た。
【０５４０】
実施例７
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ１０８−フォレートの合成
【化３１】
2021512147.tif 000036
エチレンジアミン、ポリマー結合(２００〜４００メッシュ)樹脂(５０mg)をペプチド合成容器に入れ、ＤＣＭ(３mL)、続いてＤＭＦ(３mL)で膨潤させた。次いで、容器にＤＭＦ中のＦｍｏｃ−ＰＥＧ３６−ＣＯＯＨ溶液(１６１mg、１.０当量)、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ(６.０当量)およびＰｙＢＯＰ(４.０当量)を入れた。アルゴンで６時間バブリングし、カップリング溶液を排水し、樹脂をＤＭＦ(３×１０mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×１０mL)で洗浄した。カイザーテストを実施して、反応の進行を評価した。Ｆｍｏｃ脱保護を、各アミノ酸カップリング前に、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×１０mL)を使用して実施した。上記工程を繰り返して、２×Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ３６−ＣＯＯＨ(１６１mg、１.０当量)、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ(７２mg、２.０当量)およびＴｆａ.プテロイン酸(４１.０mg、１.２当量)カップリングステップの反応を完了させた。最後に、樹脂を２％ヒドラジンのＤＭＦ溶液(３×１０mL)(５分)で洗浄してプテロイン酸のトリフルオロ−アセチル保護基を除去し、ｉ−ＰｒＯＨ(３×１０mL)、続いてＤＭＦ(３×１０mL)で洗浄した。樹脂をアルゴン下で３０分間乾燥させた。フォレート−ペプチドを開裂溶液を使用して樹脂から開裂した。１０mLの開裂混合物を導入し、アルゴンで１.５時間バブリングした。開裂混合物を新しいフラスコに注加した。樹脂をさらなる開裂溶液で３回洗浄した。合わせた混合物を少量(約５mL)まで減圧下濃縮し、エチルエーテルで沈殿させた。
沈殿を遠心分離により集め、エチルエーテル(３×)で洗浄し、高減圧下乾燥させた。乾燥フォレート−ＰＥＧ１０８−ＥＤＡ(１.０当量)を、室温でＤＭＳＯおよびＤＩＰＥＡ中のＦＩＴＣ(５０mg、１.５当量)で処理した。ＬＣＭＳにより反応進行をモニターした。１０時間後、出発物質は消費されて、生成物となった。粗製反応混合物を分取ＨＰＬＣ(移動相Ａ＝１０mM  酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；移動相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３mL／分で０％Ｂ〜３０％Ｂを３５分間)で精製し、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ１０８−フォレートを６４％収率で得た。
【０５４１】
実施例８
ＦＩＴＣ−ＤＵＰＡの合成
【化３２】
2021512147.tif 000037
ＤＵＰＡ−ＦＩＴＣを、次の固相法により合成した。万能Nova TagTM樹脂(５０mg、０.５３mM)をＤＣＭ(３mL)、続いてＤＭＦ(３mL)で膨潤させた。ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×３mL)を樹脂に加え、アルゴンで５分間バブリングした。樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびイソプロピルアルコール(ｉ−ＰｒＯＨ、３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦ中で樹脂を膨潤させた後、ＤＵＰＡ−(ＯｔＢｕ)−ＯＨ(１.５当量)、ＨＡＴＵ(２.５当量)およびｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ(４.０当量)のＤＭＦ溶液を加えた。アルゴンで２時間バブリングし、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。樹脂をＤＣＭで膨潤させた後、ＤＣＭ／ＴＦＥ(１：１)中１Ｍ  ＨＯＢｔ溶液(２×３mL)を加えた。アルゴンで1時間バブリングし、溶媒を除去し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦ中で樹脂を膨潤させた後、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ(２.５当量)、ＨＡＴＵ(２.５当量)およびＤＩＰＥＡ(４.０当量)のＤＭＦ溶液を加えた。アルゴンで２時間バブリングし、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。上記工程を、さらに２回のカップリングステップで繰り返し、８−アミノオクタン酸およびフルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンＢイソチオシアネートを付加した。最終化合物を開裂溶液を使用して樹脂から開裂し、減圧下に濃縮した。濃縮生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、減圧下乾燥させた。粗製生成物を分取ＲＰ時間ＰＬＣ[λ＝４８８nm；溶媒勾配：１％Ｂ〜８０％Ｂを２５分間、８０％Ｂ洗浄３０分間ラン；Ａ＝１０mM  ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ＝７；Ｂ＝アセトニトリル(ＡＣＮ)]を使用して精製した。ＡＣＮを減圧下除去し、精製フラクションを凍結乾燥して、ＦＩＴＣ−ＤＵＰＡを帯褐色−橙色固体として得た。ＲＰ時間ＰＬＣ：ｔＲ＝８.０分(Ａ＝１０mM  ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ＝７.０；Ｂ＝ＡＣＮ、溶媒勾配：１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂ洗浄１５分間ラン)。1H NMR (DMSO-d6/D2O): δ 0.98-1.27 (ms, 9H); 1.45 (b, 3H); 1.68-1.85 (ms, 11H); 2.03 (m, 8H); 2.6-3.44 (ms, 12H); 3.82 (b, 2H); 4.35 (m, 1H); 6.53 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.61 (dd, J=5.3, 3.5 Hz, 2H); 6.64 (s, 2H); 7.05 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.19 (m, 5H); 7.76 (d, J=8.0 Hz, 1H); 8.38 (s, 1H)。HRMS (ESI)(m/z): (Ｍ＋Ｈ)＋  Ｃ５１Ｈ５９Ｎ７Ｏ１５Ｓの計算値１０４０.３７１２、実測値１０４０.３７０２。ＵＶ／ｖｉｓ：λｍａｘ＝４９１nm。
【０５４２】
実施例９
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ１２−ＤＵＰＡの合成
【化３３】
2021512147.tif 000038
１,２−ジアミノエタントリチル樹脂(０.０２５ｇ)をペプチド合成容器に加え、ｉ−ＰｒＯＨ(３×１０mL)、続いてＤＭＦ(３×１０mL)で洗浄した。次いで、容器にＦｍｏｃ−ＮＨ−(ＰＥＧ)１２−ＣＯＯＨ(４２.８mg)のＤＭＦ溶液、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ(２.５当量)およびＰｙＢＯＰ(２.５当量)を加えた。得られた溶液をＡｒで１時間バブリングし、カップリング溶液を排水し、樹脂をＤＭＦ(３×１０mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×１０mL)で洗浄した。カイザーテストを実施して、反応の進行を評価した。Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×１０mL)を使用して実施した。この工程を、全カップリングステップが完了するまで繰り返した(２×１.５当量のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨおよび１.５当量の８−アミノオクタン酸および１.２当量のＤＵＰＡを、各カップリングステップの各々で使用した)。ＤＵＰＡカップリング後、樹脂をＤＭＦ(３×１０mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×１０mL)で洗浄し、減圧下乾燥させた。ペプチドを、開裂溶液を使用してペプチド合成容器中の樹脂から開裂した。１５mLの開裂溶液をペプチド合成容器に加え、反応物をＡｒ下、１５分間バブリングした。樹脂を、さらに２回の１０mL量の開裂溶液で、各５分間処理した。開裂混合物を約５mLに濃縮し、エチルエーテルで沈殿させた。沈殿を遠心分離により集め、エチルエーテル(３×)で洗浄し、高減圧下乾燥させ、粗物質を回収した。撹拌中の粗製ＤＵＰＡ−(ＰＥＧ)１２−ＥＤＡ(１０mg)およびＦＩＴＣ(５.６mg)のジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ、１mL)溶液に、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ(５当量)を室温で加え、アルゴン下６時間撹拌した。反応をＬＣＭＳでモニターし、分取ＨＰＬＣ(移動相：Ａ＝１０mM  酢酸アンモニウムｐＨ＝７、Ｂ＝ＡＣＮ；方法：０％Ｂ〜５０％Ｂを３０分間、１３mL／分)で精製した。精製フラクションを集め、凍結乾燥して、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ１２−ＤＵＰＡを得た。
【０５４３】
実施例１０
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ１１−ＮＫ１の合成
【化３４】
2021512147.tif 000039
撹拌中のＮＫ−１(０.０２ｇ、０.０４３３mmol、１.０当量)、Ｏ−(２−アミノエチル)−Ｏ’−[２−(Ｂｏｃ−アミノ)エチル]デカエチレングリコール(ＢｏｃＮＨ−ＰＥＧ１１−ＮＨ２)(Sigma、０.０３３６ｇ、０.０５２１mmol、１.２当量)、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(ＰｙＢＯＰ)(０.０２７ｇ、０.０５２１mmol、１.２当量)の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)(０.０７６mL、０.４３３８mmol、１０当量)をアルゴン下、室温で加えた。ＬＣＭＳにより反応進行をモニターし、分取ＲＰ時間ＰＬＣ(Waters、XBridgeTM Prep C18、５μm；１９×１００mmカラム、移動相Ａ＝２０mM  酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７、Ｂ＝アセトニトリル、勾配１０〜１００％Ｂを３０分間、１３mL／分、λ＝２２０nm、２５４nm)で精製した。純粋フラクションを集め、全有機溶媒を蒸発させ、サンプルを４８時間凍結乾燥させて、ＮＫ１−ＰＥＧ１１−ＮＨＢｏｃを得た。収量：４０.１３mg(９７％)。ＮＫ１−ＰＥＧ１１−ＮＨＢｏｃ(０.０１６５ｇ、０.０１５mmol)の乾燥ＤＣＭ溶液に、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ、２０当量)を加え、反応混合物を４時間、ｒ.ｔ.で撹拌した。過剰のＴＦＡを除去し、残存溶液を水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２(３×５mL)を使用して抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮した。得られた残留物を減圧下乾燥させ、さらに精製することなく次工程で使用した。撹拌中のＮＫ１−ＰＥＧ１１−ＮＨ２(０.００８ｇ、０.００８１mmol、１.０当量)、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)(Sigma、０.００３７ｇ、０.００９７mmol、１.２当量)の乾燥ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ、０.３mL)溶液を、ジイソプロピルエチルアミン(０.００２８mL、０.０１６２mmol、２.０当量)に、室温でアルゴン下加えた。ＬＣＭＳにより反応進行をモニターし、生成物を分取ＲＰ時間ＰＬＣ(Waters、XBridgeTM Prep C18、５μm；１９×１００mmカラム、移動相Ａ＝２０mM  酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７、Ｂ＝アセトニトリル、勾配１０〜１００％Ｂを３０分間、１３mL／分、λ＝２８０nm)で精製した。純粋フラクションを集め、全有機溶媒を蒸発させ、サンプルを４８時間凍結乾燥させて、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ１１−ＮＫ１を８.５４mg(７７％)収量で得た。
＊注：ＮＫ−１化合物を、文献に記載の方法により製造した塩基リガンドから出発して、２工程法で合成した。(参照：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES、出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／４４２２９；引用により本明細書に包含させる。)
【０５４４】
実施例１１
ＦＩＴＣ−ＰＥＧ２−ＣＡ９の合成
【化３５】
2021512147.tif 000040
ＣＡ９リガンド(５３.６mg)を、テフロン磁気攪拌棒を使用して５０mL丸底フラスコでＤＭＦ(２〜３mL)に溶解した。真空を利用して外気を除き、窒素ガスに置き換え、これを３サイクル行った。丸底フラスコを、一定窒素ガス下に維持した。フラスコに、２８.９mgのＮ−(３−ジメチルアミノプロピル)−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)、続いて２１.６mg  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(ＨＯＢｔ)および１８.９μLのＢｏｃ−ＰＥＧ２−ＮＨ２(Sigma Aldrich)を加えた。５.４μLのトリエチルアミン(ＴＥＡ)を加え、反応物を一夜撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣを使用して精製し、ＵＨＰＬＣ−ＭＳ(標的ｍ／ｚ  ８３１)で確認した。アセトニトリルを高真空回転蒸発により除去し、生成物を凍結乾燥した。化合物を１：１  ＴＦＡ：ＤＣＭと３０分間混合した。ＴＦＡ／ＤＣＭを高真空回転蒸発により除去し、続いて３０分間高真空に置いた。次いで、化合物をＤＭＦに溶解し、５モル当量のｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ、１６mgのフルオレセインイソチオシアネート(Life Technologies)と合わせ、１時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣで精製し、標的化合物をＵＨＰＬＣ−ＭＳ(標的ｍ／ｚ  １１２０)で確認した。サンプルを凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【０５４５】
実施例１２
ＦＩＴＣ−ＤＵＰＡ
【化３６】
2021512147.tif 000041
ＤＵＰＡ−ＦＩＴＣを、次の固相法により合成した。普遍的NovaTag樹脂(５０mg、０.５３mM)をジクロロメタン(ＤＣＭ)(３mL)、続いてジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、３mL)で膨潤させた。ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×３mL)を樹脂に加え、アルゴンで５分間バブリングした。樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびイソプロピルアルコール(ｉ−ＰｒＯＨ、３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦ中で樹脂を膨潤させた後、ＤＵＰＡ−(ＯｔＢｕ)−ＯＨ(１.５当量)、ＨＡＴＵ(２.５当量)およびＤＩＰＥＡ(４.０当量)のＤＭＦ溶液を加えた。アルゴンで２時間バブリングし、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。樹脂をＤＣＭで膨潤させた後、ＤＣＭ／トリフルオロエタン(ＴＦＥ)(１：１)中１Ｍ  ＨＯＢｔ溶液(２×３mL)を加えた。アルゴンで1時間バブリングし、溶媒を除去し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦ中で樹脂を膨潤させた後、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ(２.５当量)、ＨＡＴＵ(２.５当量)およびＤＩＰＥＡ(４.０当量)のＤＭＦ溶液を加えた。アルゴンで２時間バブリングし、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ−ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。上記工程を、さらに２回のカップリングステップで繰り返し、８−アミノオクタン酸およびフルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンＢイソチオシアネートを付加した。最終化合物を、樹脂からトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：カクテル(９５：２.５：２.５)を使用して開裂し、減圧下に濃縮した。濃縮生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、減圧下乾燥させた。粗製生成物を分取ＲＰ時間ＰＬＣ[λ＝４８８nm；溶媒勾配：１％Ｂ〜８０％Ｂを２５分間、８０％Ｂ洗浄３０分間ラン；Ａ＝１０mM  ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ＝７；Ｂ＝アセトニトリル(ＡＣＮ)]を使用して精製した。ＡＣＮを減圧下除去し、純粋フラクションを凍結乾燥して、ＤＵＰＡ−ＦＩＴＣを帯褐色−橙色固体として得た。ＲＰ時間ＰＬＣ：ｔＲ＝８.０分(Ａ＝１０mM  ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ＝７.０；Ｂ＝ＡＣＮ、溶媒勾配：１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂ洗浄１５分間ラン)。1H NMR (DMSO-d6/D2O): δ 0.98-1.27 (ms, 9H); 1.45 (b, 3H); 1.68-1.85 (ms, 11H); 2.03 (m, 8H); 2.6-3.44 (ms, 12H); 3.82 (b, 2H); 4.35 (m, 1H); 6.53 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.61 (dd, J=5.3, 3.5 Hz, 2H); 6.64 (s, 2H); 7.05 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.19 (m, 5H); 7.76 (d, J=8.0 Hz, 1H); 8.38 (s, 1H)。HRMS (ESI)(m/z): (Ｍ＋Ｈ)＋  Ｃ５１Ｈ５９Ｎ７Ｏ１５Ｓの計算値１０４０.３７１２、実測値１０４０.３７０２。ＵＶ／ｖｉｓ：λｍａｘ＝４９１nm。
【０５４６】
実施例１３
ＦＩＴＣ−ＣＡ９
【化３７】
2021512147.tif 000042
５０mL丸底フラスコで、ＣＡ９リガンド(５３.６mg、研究室で合成)を、テフロン磁気攪拌棒を使用して所望の量のＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)(２〜３mL)に溶解した。真空を利用して外気を除き、窒素ガスに置き換え、これを３サイクル行った。次いで、丸底フラスコを、一定窒素ガス下に維持した。フラスコに、２８.９mgのＮ−(３−ジメチルアミノプロピル)−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)、続いて２１.６mg  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(ＨＯＢｔ)および１８.９μLのＢｏｃ−ＰＥＧ２−ＮＨ２(Sigma Aldrichから購入)を加えた。５.４μLのトリエチルアミン(ＴＥＡ)を最後に加え、反応物を一夜撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣを使用して精製し、ＵＨＰＬＣ−ＭＳ(標的ｍ／ｚ  ８３１)で確認した。アセトニトリルを高真空回転蒸発により除去し、４８時間凍結乾燥機に入れた。Ｂｏｃ脱保護を、１：１  ＴＦＡ：ＤＣＭで３０分間行った。ＴＦＡ／ＤＣＭを高真空回転蒸発により除去し、続いて３０分間高真空に置いた。次いで、化合物をＤＭＦに溶解し、５モル当量のＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)と合わせた。１６mgのフルオレセインイソチオシアネート(Life Technologiesから購入)を溶液に加え、１時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣで精製し、標的化合物をＵＨＰＬＣ−ＭＳ(標的ｍ／ｚ  １１２０)で確認した。サンプルを４８時間凍結乾燥機に入れ、化合物を−２０℃で保存した。
【０５４７】
実施例１４
ＦＩＴＣ−ＮＫ１Ｒ
撹拌中のＮＫ−１(０.０２ｇ、０.０４３３mmol、１.０当量)、Ｏ−(２−アミノエチル)−Ｏ’−[２−(Ｂｏｃ−アミノ)エチル]デカエチレングリコール(ＢｏｃＮＨ−ＰＥＧ１１−ＮＨ２)(Sigma、０.０３３６ｇ、０.０５２１mmol、１.２当量)、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(ＰＹＢＯＰ)(０.０２７ｇ、０.０５２１mmol、１.２当量)の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)(０.０７６mL、０.４３３８mmol、１０当量)をアルゴン下、室温で加えた。ＬＣＭＳにより反応進行をモニターし、分取ＲＰ時間ＰＬＣ(Waters、XBridgeTM Prep C18、５μm；１９×１００mmカラム、移動相Ａ＝２０mM  酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７、Ｂ＝アセトニトリル、勾配１０〜１００％Ｂを３０分間、１３mL／分、λ＝２２０nm、２５４nm)で精製した。純粋フラクションを集め、全有機溶媒を蒸発させ、サンプルを４８時間凍結乾燥させて、ＮＫ１−ＰＥＧ１１−ＮＨＢｏｃを得た。収量：４０.１３mg(９７％)。ＮＫ１−ＰＥＧ１１−ＮＨＢｏｃ(０.０１６５ｇ、０.０１５mmol)の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液に、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ、２０当量)を加え、反応混合物を４時間、ｒ.ｔ.で撹拌した。過剰のＴＦＡを除去し、水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２(３×５mL)を使用して抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮した。得られた残留物を減圧下乾燥させ、さらに精製することなく次工程で使用した。撹拌中のＮＫ１−ＰＥＧ１１−ＮＨ２(０.００８ｇ、０.００８１mmol、１.０当量)、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)(Sigma、０.００３７ｇ、０.００９７mmol、１.２当量)の乾燥ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ、０.３mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(０.００２８mL、０.０１６２mmol、２.０当量)を、室温でアルゴン下加えた。ＬＣＭＳにより反応進行をモニターし、分取ＲＰ時間ＰＬＣ(Waters、XBridgeTM Prep C18、５μm；１９×１００mmカラム、移動相Ａ＝２０mM  酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７、Ｂ＝アセトニトリル、勾配１０〜１００％Ｂを３０分間、１３mL／分、λ＝２８０nm)で精製した。純粋フラクションを集め、全有機溶媒を蒸発させ、サンプルを４８時間凍結乾燥させて、ＮＫ１−ＰＥＧ１１−ＦＩＴＣ(５)を得た。収量：８.５４mg(７７％)。
ＮＫ−１化合物を、文献に記載の方法により製造した塩基リガンドから出発して、２工程法で合成した。(参照：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES、出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／４４２２９、引用により全体として本明細書に包含させる)。
【０５４８】
実施例１５
インビトロ共培養Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ活性化および標的細胞死アッセイ
Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｔ細胞増殖培地(TexMACS培地＋２％ヒトＡＢ血清＋５０Ｕ／mL組み換えヒトＩＬ−２)１ミリリットルあたり５０万〜２００万Ｔ細胞の細胞密度で凍結保存から解凍し、４日間回復させた。種々のレベルの表面葉酸受容体を発現する標的細胞も凍結保存から解凍し、増殖培地で回復させた(フォレート欠損ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで４日間)。
−１日目、１００,０００標的細胞を、１２ウェル組織培養プレートのウェルあたり２mlの増殖培地で播種し、標的細胞を付着および回復させた。０日目、ＥＣ１７ブリッジ分子を入れたウェルを１００nM  ＥＣ１７で、３０分間、組織培養インキュベーターで処理した。その後、全培地を洗い流し、フォレートとＥＣ１７がない新鮮増殖培地に置き換えた。ＥＣ１７インキュベーション中、Ｔ細胞を採取し、計数し、ＥＣ１７処理完了後、１００,０００  Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、１：１(Ｅ：Ｔ)比で計３mlの増殖培地の標的細胞の各ウェルに直接加え、１日および２日のそれぞれの期間、３７℃、５％ＣＯ２の標準組織培養加湿条件で培養した。１日共培養条件を標的細胞によるＥ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化のアッセイに使用し、２日インキュベーションを、標的細胞死のアッセイに使用した。
【０５４９】
種々のレベルの表面葉酸受容体を有する標的細胞と１日共培養後のＥ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性レベルを決定するために、浮遊細胞を残存付着細胞と共に採取し、５分０.２５％トリプシン消化を使用して組織培養プレートから剥離した細胞と共に保存した。保存した浮遊および付着細胞を、５分間の４００×重力遠心分離ステップでペレット化し、フローサイトメトリー染色溶液に再懸濁した。フローサイトメトリーによるＥ２  Ｔ細胞同定のための表面マーカー染色は、抗ヒトＥＧＦＲおよび抗ヒトＣＤ３を含み、フローサイトメトリーによるＣＡＲ  Ｔ細胞活性化の検出は、抗ヒトＣＤ１３７染色を使用した。Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＥＧＦＲ＋ＣＤ３＋として同定され、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞もＣＤ１３７を共発現した(フローサイトメトリー方法参照)。
２日共培養後の種々のレベルで表面葉酸受容体を発現する標的細胞のＥ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞殺滅の効率を決定するために、保存および付着細胞を、上記１日共培養アッセイと同じ方法でペレット化し、次いで、Ｅ２  ＣＡＲ  ＴマーカーＥＧＦＲおよびＣＤ３で染色し、次いで洗浄し、流動抗体染色サンプルをAlexa Fluor 647コンジュゲート組み換えAnnexin V(Invitrogen cat# A23204、提供された１×Annexin染色緩衝液中、１：５０希釈)と３μMヨウ化プロピジウムに再懸濁することにより、アポトーシスマーカーAnnexin Vで染色した。
【０５５０】
Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化は標的細胞のＥＣ１７染色に依存的である
Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化に必要な葉酸受容体のレベルを知るために、種々のレベルで表面葉酸受容体(ＦＲ)を発現する標的細胞との１日共培養を実施した(図３９)。１日共培養後活性化されたＥ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のパーセンテージをｙ軸にグラフ化し、アッセイ時点での標的細胞のＦＲ発現レベルをｘ軸にグラフ化する。重要なことに、ＦＲ発現レベルデータを、ＣＡＲ  Ｔ細胞により選択されたＦＲ高発現細胞の何らかの人為的な結果を回避するために、ＥＣ１７で処理したが、ＣＡＲ  Ｔ細胞不存在下に培養した同じ標的細胞を使用して実施したアッセイと同じ日に取得した。広範囲の葉酸受容体を発現する５標的細胞株中４つが、ＣＡＲ  Ｔ細胞を類似レベルまで活性化させた。興味深いことに、低ＦＲ発現細胞株ＯＶ９０(下向き三角)は、ＳＫＯＶ３細胞(菱形)の約５０％のＦＲを発現し、ＳＫＯＶ３細胞の約５０％のＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化した。これらのデータは、広範囲のＥＣ１７がＥ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を類似レベルまで活性化し、標的細胞に結合するＥＣ１７の一定の閾値が、Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の完全活性化に必要であることを示唆する。さらに、最適以下のＥ２  ＣＡＲ  Ｔ応答を与えるＦＲ発現の閾値があることも示唆される。
【０５５１】
Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞標的細胞殺滅
Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化も標的細胞の十分な殺滅に転換されるかを確認するために、２日共培養アッセイを行い、次いで、フローサイトメトリーにより標的細胞(ＥＧＦＲ−  ＣＤ３−)事象を観察し、アポトーシス表面マーカー、Annexin V染色で染色される標的細胞のパーセンテージを決定した。図４０で、各々３つの異なる条件下、２日間培養した同じ５つの標的細胞(ｘ軸に標識)を、３つの異なるバーとして示す。各群の最初のバーは、ＥＣ１７で処理したが、Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞非存在下で培養された標的細胞として、標的細胞アポトーシスの基底レベルを表す。各群の第二のバーは、標的細胞の先のＥＣ１７処理が全くないＣＡＲ  Ｔ＋標的細胞共培養を示し、各群の第三のバーは、ＣＡＲ  Ｔ  ＋ＥＣ１７前処理標的細胞を表す。ｙ軸は、アポトーシス性である標的細胞のパーセンテージ(Annexin V＋)を示す。これらのデータから、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化が、３種の最高葉酸受容体発現体(ＭＤＡＭＢ２３１、ＨＯＳ−ＦＲαおよびＩＧＲＯＶ１)で標的細胞殺滅に良好に転換されることが判明した。しかしながら、ＦＲ発現が４番目に低かったＳＫＯＶ３細胞(図３９、ｘ軸)について、類似するＥ２  ＣＡＲ  Ｔ活性化は類似する標的細胞死に転換されなかった(図４０)。ＳＫＯＶ  ３細胞におけるＣＡＲ  Ｔ細胞活性化と標的細胞アポトーシスのこの分離は、低葉酸受容体発現の機能ではないかもしれない可能性がある。先に記載のとおり、各癌細胞は、自身の抗アポトーシス機構を進化させている可能性があり、ＳＫＯＶ３細胞の程度の、しかし、異なる癌細胞株でのＦＲ発現レベルは、高いレベルでの標的細胞アポトーシスに十分であり得る。
まとめると、図３９および図４０のデータは、癌細胞へのＥＣ１７結合が細胞死に必要であることを示す。これらのデータは、さらに、標的細胞結合ＥＣ１７のある閾値未満で、表面結合ＥＣ１７とＥ２  ＣＡＲ  Ｔ活性化および殺滅の直線的相関が存在することをさらに示唆する。
【０５５２】
実施例１６
３Ｈ−葉酸結合アッセイ
全腫瘍細胞株を、一夜、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含む、無フォレートＲＰＭＩ培地に播種した。翌日、細胞を１５分間、氷上で１００nM  ３Ｈ−葉酸と、１０μM  冷葉酸を伴いまたは伴わずにインキュベートした。冷１×ＰＢＳで３回濯いだ後、細胞全体を溶解させ、総細胞関連放射活性をシンチレーションカウンターでカウントした。３Ｈ−葉酸のＦＲ特異的結合を、葉酸競合サンプルのカウントを減算し、３Ｈ−葉酸の比活性を使用して、細胞あたりの分子数として計算することにより決定した。
図４１は、これら細胞株におけるＦＲ発現がそれぞれ異なるレベルであることを示す。ＦＲレベルの順番は、ＩＧＲＯＶ１＞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＯＳ−ＦＲα＞ＯＶ９０、ＳＫＯＶ３である。
【０５５３】
実施例１７
皮下移植ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するおよび有しないＮＳＧマウスにおけるＥＣ１７／Ｅ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞治療
腫瘍移植
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を、５〜１０％ＦＢＳ含有フォレート欠損ＲＰＭＩ  １６４０で、３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気下増殖させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を、動物あたり２.５×１０６細胞で皮下接種した。６６匹のマウス中４２匹のみに接種し、残り２２匹のマウスは、無腫瘍のままとした。
【０５５４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞投与
ＥＧＦＲｔソート抗ＦＩＴＣ  Ｅ２  ｓｃＦｖ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｔ細胞凍結培地で凍結させた。凍結ＣＡＲ−Ｔ細胞のバイアルを直ぐに−８０℃で保存した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を３７℃で急速に解凍し、ＰＢＳで２回洗浄し、動物あたり１０００万の生存可能ＥＧＦＲｔ＋Ｅ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＣＤ４／ＣＤ８、約１：１)での動物への注射に使用した。Ｅ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞表現型のフローサイトメトリー分析のために、注入した日に少量を取った。
【０５５５】
ヒト／マウスサイトカイン分析
マウス血液サンプルを血漿用に処理し、使用するまで−２０℃で保存した。ヒトＴＨ１サイトカインパネル(Biolegend, Cat. No. 740009)およびヒト造血幹細胞サイトカインパネル(Biolegend, Cat. No. 740610)を、マウス血中のヒトサイトカインの検出に使用した。マウス１３−ｐｌｅｘ炎症性サイトカインパネル(Biolengend, No. 740150)を、マウスサイトカインの検出に使用した。全分析を、製造業者の指示に従い実施した。
【０５５６】
フローサイトメトリー分析
全血液細胞分析：予定した体積の全ＥＤＴＡ処理血液から血漿を取り、ＲＢＣをＲＢＣ溶解溶液で溶解した。次いで、白血球ペレットをフローサイトメトリー染色溶液(１％ウシ血清アルブミン、５０mg／mL  ヒトＩｇＧ(Equitech Bio、cat#SLH56-0001)、リン酸緩衝化食塩水中０.９％ナトリウムアジド、ｐＨ＝７.４)に再懸濁し、白血球表面マーカー染色を、次の抗体を使用して実施した：抗ヒトＣＤ４５[クローンＨＩ３０、eBioscience #47-0459-42、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＣＤ１３７[クローン４Ｂ４−１、BD Bioscience #564092、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＣＤ８α[クローンＲＰＡ−Ｔ８、BD Bioscience, catalog #557746、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＣＤ４[クローンＳＫ３、eBioscience catalog #46-0047-42、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＥＧＦＲ[R&D systems、クローンＨｕ１、catalog #FAB9577B、１：１０(ｖ／ｖ)]、抗ヒトＰＤ−１[BD Biosciences、クローンＥＨ１２.１、catalog#562511、１：２０(ｖ／ｖ)]、抗ヒトＬＡＧ−３[BD Biosciences、クローンＴ４７−５３０、catalog #565616、１：２０(ｖ／ｖ)]、抗ヒトＴＩＭ−３[BD Biosciences、クローン７Ｄ３、catalog #565558、１：２０(ｖ／ｖ)]、抗ヒトＣＤ３ε[BD Biosciences、クローンＳＫ７、catalog #557832、１：２０(ｖ／ｖ)]。白血球染色後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５３,０００個のCountBrightTMビーズ(Invitrogen catalog #C36950)を含む冷ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーコレクションチューブに移した。フローサイトメトリーデータをGalliosフローサイトメーター(Beckman Coulter, Brea, CA)で集めた。各血液サンプル中のＣＡＲ  Ｔ細胞の濃度決定は、Invitrogenの指示に従って計算した。ＣＡＲ  Ｔ細胞はヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋事象として同定され、容易に区別され、KaluzaTM フローサイトメトリーソフトウェアを使用してカウントした。次いで、各注入マウスの循環中のＣＡＲ  Ｔ細胞数を、分析した全血１００μLあたりのＣＡＲ  Ｔ細胞の総数としてグラフ化した。統計的有意を、対応のない両側スチューデントｔ検定を利用して決定し、有意をｐ＜０.０５と設定した。
【０５５７】
腫瘍および組織分析：固形腫瘍(１００〜１０００mm３)を採取し、秤量し、小片に刻み、次いで、２０mLの腫瘍消化カクテルを含む５０mLチューブに移した。酵素腫瘍消化カクテルは、抗生物質添加無血清およびフォレート欠損ＲＰＭＩ１６４０培地中、０.５mg／mL  コラゲナーゼIV(Sigma-Aldrich, Catalog# C5138)、０.５mg／mL  ヒアルロニダーゼ(Sigma-Aldrich, Catalog# H3506)および０.１mg／mL  ＤＮａｓｅ  Ｉ(Sigma-Aldrich, Catalog# DN25)からなった。腫瘍フラグメントを水平シェーカー上で１時間、３７℃で、３００rpmで消化させた。その後、腫瘍消化を４００×ｇで５分遠心分離し、腫瘍細胞ペレットを赤血球溶解ステップに付し、次いで冷リン酸塩緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)で洗浄し、最後に４０μmナイロン細胞濾過器で濾過した。
【０５５８】
インビボでのＥ２−ＣＡＲ−Ｔ表現型および増殖
血中のＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大および残留は、臨床治験でＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ治療に対する応答と相関することが報告されている。大量プールからの循環血液由来Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔが、本インビボモデルでＦＲ＋腫瘍のＥＣ１７指向攻撃に対してより大きな応答を可能とするとの推測は不合理的ではない。ＥＣ１７に対するＥ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の応答の指標として、全血１００μLあたりの循環Ｅ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞数を定量し、ＥＣ１７刺激を受けたコホート(コホート２、３、４および５)が、ＥＣ１７を受けなかったコホート(コホート１および６)と比較して、循環中、少なくとも１０倍を超えることを観察した。重要なことに、血液内の循環ＣＡＲ  Ｔ細胞のこの拡大は、抗原依存的様式でＣＡＲ  Ｔ細胞拡大と一致する。さらに、数が増えた循環ＣＡＲ  Ｔ細胞の残留性が、最長でＣＡＲ  Ｔ細胞注入５４日後であり、同様にＣＡＲ  Ｔ残留がＥＣ１７を受けなったコホート１および６と比較したとき、ＥＣ１７依存的(コホート２、３、４および５)であることも観察した。
【０５５９】
腫瘍対無腫瘍マウス
図４２に示すとおり、１０００万のＥ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、無腫瘍ナイーブＮＳＧマウスまたはＮＳＧＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスにｉ.ｖ.注射した。５００nmol／kg  ＥＣ１７を、ＣＡＲ−Ｔ注射後２日目および１０日目にｉ.ｖ.投与し、２回目のＥＣ１７投与２０時間後(１１日目)、臓器評価および血液分析のためにマウスを屠殺した。血漿サンプルを血液からすぐに単離し、サイトカイン分析まで−２０℃で保存した。ＣＡＲ−Ｔ注射後１２日目、上記のとおりＦＡＣＳ分析のために別のセットの動物を得た。
図４３に示すとおり、腫瘍担持マウスのサイトカイン産生はＥＣ１７依存性であった。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０を含むサイトカインのレベルは、全てＥＣ１７を用いた腫瘍担持マウスで、ＥＣ１７投与しないマウスに比して増加した。腫瘍がないナイーブマウスで、サイトカイン産生の上方制御が、またＥＣ１７を投与されたマウスで見られたか、無腫瘍マウスでの増加は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するマウスと比較して、はるかに低かった(例えばＩＦＮ−γについて２３倍低い)。
腫瘍担持マウスは、無腫瘍マウスより約２３倍高いＩＦＮ−γ産生を有した。無腫瘍マウス(約２か月間ＦＤ餌)は、ＥＣ１７  ＳＩＷ５００×２回後ある程度のサイトカイン産生を示したが、ＦＡＣＳで検出可能なＣＡＲ−Ｔ細胞拡大はなかった。
【０５６０】
実施例１８
ヒト化抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ  Ｅ２−ＣＡＲ構築物およびＣＡＲ修飾Ｔ細胞を使用する標的特異的活性がインビトロで示された
細胞株：全細胞株を、特に断らない限り、２mM  Ｌ−グルタミン(Cellgro)、２５mM  ＨＥＰＥＳ(Irvine Scientific)および１０％熱不活性化ＦＢＳ(Hyclone)添加ＲＰＭＩ  １６４０(Irvine Scientific)に維持した。Ｋ５６２標的細胞株はDr. Stanley Riddell(FHCRC)により恵与された。Ｋ５６２  ＯＫＴ３細胞株は、ＯＫＴ３導入遺伝子含有レンチウイルスでの形質導入により産生した。ＯＫＴ３は、ＣＤ３イプシロンを標的とする膜繋留型ｓｃＦｖである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はEndocyteから提供され、無フォレートＤＭＥＭで培養した。全細胞株は、University of Arizona Genetics CoreのＤＳＭＺデータベースにマッチしたSTR Profilingにより認証されている。
【０５６１】
細胞毒性およびサイトカイン分泌：４時間クロム放出アッセイを実施した。簡潔には、標的細胞を５１Ｃｒ(PerkinElmer)で一夜標識し、ＰＢＳで３回洗浄し、９６ウェルプレートでＲＰＭＩ中、トリプリケートで、５×１０３細胞／ウェルで、Ｔ細胞と種々のエフェクター対標的(Ｅ：Ｔ)比でインキュベートした。γ−カウンティングのために上清を採取し、特異的溶解を計算した。サイトカイン分泌について、５×１０５  Ｔ細胞を、標的細胞と２：１のＥ：Ｔ比で、９６ウェルプレートに２４時間トリプリケートで播種し、上清を、製造業社の指示に従い、Bio-Plexヒトサイトカインパネル(Bio-Rad)を使用するサイトメトリービーズアレイにより分析した。ＥＣ１７標識標的について、細胞を、暗所で室温で１時間、１００nM  ＥＣ１７のＰＢＳ溶液とインキュベートし、その後播種した。ＥＣ１７を使用したとき、細胞をアッセイ中無フォレートＲＰＭＩとインキュベートした。
【０５６２】
サイトカイン放出アッセイ：
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、２：１比のＴ細胞対標的で２４時間共培養し、次いで、上清をエフェクターサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの存在についてアッセイした。アッセイをトリプリケートで実施し、データを平均±ＳＥとして示す。図４４に示すとおり、偽および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞が、陽性対照細胞株Ｋ５６２−ＯＫＴ３との共培養に応答して、量的に類似したレベルのサイトカイン産生をすることを観察した。サイトカインは、Ｋ５６２との共培養で偽または抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞で酸性されなかった。サイトカイン放出は、ＥＣ１７の先のインキュベーションに依存的であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞のみが、ＥＣ１７標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対してサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌を誘発できる細胞であった。
【０５６３】
クロム放出アッセイ：
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、標的細胞と３０：１、１０：１、３：１または１：１比で共培養した。トリプリケートウェルのパーセンテージ溶解(平均±ＳＥ)を示す。図４５に示すとおり、抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞は陰性対照(Ｋ５６２)または非標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株に対して細胞毒性を示さなかった。しかしながら、偽形質導入および抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞は、陽性対照Ｋ５６２−ＯＫＴ３細胞株に対して類似するレベルの特異的溶解を誘発できた。さらに、ＥＣ１７標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、抗ＦＬＣＡＲ  Ｔ細胞により効率的に認識および溶解されたが、偽Ｔ細胞は、溶解させることができなかった。
【０５６４】
実施例１９
ＣＡＲ−Ｔ細胞のアダプター構造
図４６〜４９は、ＣＡＲ−Ｔ細胞実験で使用したブリッジの構造およびブリッジが指向する細胞タイプに対する、インビトロで決定したその親和性を示す(例えば、葉酸受容体発現癌細胞に対してフォレート−ＦＩＴＣ)。図５０は、インビボモデルで使用し、ブリッジの小分子リガンドに対応する受容体を発現する腫瘍細胞へのブリッジの結合を示す(ＦＡＣＳ分析による)。
【０５６５】
実施例２０〜３０  −  図５５〜６３参照
実施例２０
細胞株および試薬
特に断らない限り、全ＦＲ＋およびＦＲ陰性癌細胞株を、２.４μM  葉酸(ＦＡ)無添加(ＦＦＲＰＭＩ)または添加(ＲＰＭＩ)した、１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地(Gibco BRL)に維持した。ＫＢ(ＨｅＬａマーカーを有するＦＲα発現ヒト子宮頸癌)およびＣＨＯ−β(ヒトＦＲβをトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞)を、それぞれ、放射リガンド結合アッセイのＦＲαおよびＦＲβ源として使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ヒトトリプルネガティブ乳癌(ＴＮＢＣ)細胞株のＦＲαサブクローンを表す。ＡＭＬ試験で、ＦＲβ陽性(ＴＨＰ１−ＦＲβ)およびＦＲ陰性(ＴＨＰ１−ＦＧ１２)細胞株の緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)発現同質遺伝子対を提供した。両者は、急性単球性白血病を有する１歳男児にもともと由来した、小児ＡＭＬの研究に一般に使用される細胞モデルであるＴＨＰ−１(ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−２０２)から確立した。骨肉腫試験について、ＨＯＳ−ＦＲαを、ヒトＦＲαをコードするＦＯＬＲ１遺伝子を伴うＦＲ陰性ＨＯＳ−１４３ｂ(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ８３０３)のレンチウイルス形質導入により確立した。ＨＯＳ−１４３ｂは、もともと１３歳白人女児の原発腫瘍から確立され、ＮＳＧマウスで高度に腫瘍原性である。ＦＲ＋ＨＯＳ−ＦＲαｆＬｕｃおよびＦＲ陰性ＨＯＳ−１４３ｂｆＬｕｃのＧＦＰ発現生物発光対を、レンチウイルスホタルルシフェラーゼと形質導入した。
【０５６６】
LEGENDplexTMヒトサイトカインパネルをBioLegend(San Diego, CA)から購入した。乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)ベースのCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイキットをPromega(Madison, WI)から購入した。多色フローサイトメトリーに使用した市販の抗ヒト抗体は、Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA)からのＣＤ４５ＲＡ(クローンＨＩ１００)、ＣＤ４５ＲＯ(クローンＵＣＨＬ１)、ＣＤ４(クローンＳＫ３)およびＣＤ６９(クローンＦＮ５０)；BD Bioscience(San Jose, CA)からのＣＤ３ε(クローンＳＫ７)、ＣＤ８α(クローンＲＰＡ−Ｔ８)、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ(クローン４Ｂ４−１)、ＣＤ２５(クローンＭ−Ａ２５１)、ＰＤ−１(クローンＥＨ１２.１)、ＬＡＧ−３(クローンＴ４７−５３０)およびＴＩＭ−３(クローン７Ｄ３)；R&D Systems(Minneapolis, MN)からのビオチニル化抗ヒトＥＧＦＲ(セツキシマブ、クローンＨｕ１)；ならびにBioLegend(San Diego, CA)からのＦＲα(クローンＬＫ２６)であった。フルオロフォアコンジュゲート抗ビオチンもBioLegendから購入した。ＡＰＣコンジュゲート抗ＦＩＴＣマウスＩｇＧ２ａ／カッパ抗体(クローンNAWESLEE)、CountBrightTMビーズ(Invitrogen)、Annexin V染色緩衝液およびAlexaFluor-647コンジュゲートAnnexin VをThermo Fisher Scientificから購入した。腫瘍組織酵素消化のために、コラゲナーゼIV、ヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅ  Ｉは全でSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。
ＥＣ１７またはフォレート−ＦＩＴＣ[ＦＡ−(γ)−エチレンジアミン−ＦＩＴＣ]はEndocyteで合成した。３Ｈ−ＥＣ１７は、Moravek biochemicals(Brea, CA)から約０.９５２Ci／mmolの比活性で購入したか、またはEndocyteが、ＦＩＴＣとViTrax(Placentia, CA)から製造した３Ｈ−ＦＡ−(γ)−エチレンジアミンを、約１.２Ci／mmolの比活性でコンジュゲートすることにより製造した。３Ｈ−ＦＡも、ViTraxから５９Ci／mmolの比活性で購入した。ＣＲＳレスキューのために、フルオレセインナトリウム投与溶液を、Purdue Pharmacy(NDC 17478-250-25)から購入したAK-FLUOR(登録商標)２５％(フルオレセイン注射、ＵＳＰ)から希釈した。
【０５６７】
実施例２１
ヒト化ＣＡＲ構築物およびＣＡＲ修飾Ｔ細胞
先の試験は、ヒンジおよびＣＤ８αの膜貫通配列および４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、ＧＦＰ＋第二世代抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ(クローン４Ｍ５.３)ＣＡＲを使用した(すなわち、ＦＩＴＣ−４Ｍ５.３−ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ８αｔｍ−４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ)。人での最初の試験に転換するために、第二世代完全ヒトＦＩＴＣ特異的(クローンＥ２)ＣＡＲ構築物(ここではＥ２と称する)を開発した(図５５、上図)。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、図５５、下部パイチャートに示す。
ここに記載する構築物は、(１)完全ヒト抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ(クローンＥ２、Ｋｄ＝０.７５nM)、(２)ＣＤ２８膜貫通ドメインに融合したＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２(Ｌ２３５Ｄ、Ｎ２９７Ｑ)−ＣＨ３スペーサー、(３)第二世代４−１ＢＢ／ＣＤ３ζエンドドメインおよび(４)細胞表面ヒトＥＧＦＲｔタグからなるＦＩＴＣ特異的ＣＡＲ構築物である(図５５、上図)(配列番号１および２はそれぞれ核酸およびアミノ酸配列である)。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を産生するために、レンチウイルスを、ＣＡＲコードｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターと共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞で産生した。ドナーＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を免疫磁性選択により精製し、別々にまたは約５０：５０比で形質導入した。一般に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化１ラウンドのみ、続いて１または２ラウンドの急速インビトロ拡大を実施した。前臨床評価のために、ＥＧＦＲｔソートＣＤ４、ＣＤ８および非ソートＣＤ４／ＣＤ８  ＣＡＲ−Ｔ細胞の数バッチを使用した。全ＣＡＲ−Ｔ細胞調製物を、フローサイトメトリーによりＥＧＦＲｔ発現およびＣＤ４／ＣＤ８比を決定するために凍結保存前および解凍後分析した。表面マーカーの組み合わせを使用して、注入した日のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞サブセットの分化状態を分析し、ＴＮ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−ナイーブＴ細胞；ＴＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋幹細胞記憶Ｔ細胞；ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋中央記憶Ｔ細胞；ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ９５＋エフェクター記憶細胞；およびＴＥＦＦ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ９５＋エフェクターＴ細胞として定義した。下記前臨床試験のために、試験は２バッチのＥＧＦＲｔソート純粋ＣＤ４およびＣＤ８サブセット(約１：１比で混合後)および低分化プロファイルを有する「臨床模写」調製物を含む数バッチの非ソートの約１：１  ＥＧＦＲｔ＋ＣＤ４／ＣＤ８混合物を含んだ。
合成し、評価した一連の種々のＣＡＲ構築物に囲まれて、完全ヒト抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ(ＦＩＴＣ−Ｅ２)ＣＡＲを前臨床開発のために選択した(図５５)。この第二世代完全ヒトＣＡＲは、抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ(クローンＥ２)、ＦｃγＲへの結合を減らすためのＣＨ２領域(Ｌ２３５ＤおよびＮ２９７Ｑ)における二重変異を有するＩｇＧ４−Ｆｃスペーサー／ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＴ２Ａリボソームスキップ配列により細胞表面ＥＧＦＲｔタグに付加された４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなった(すなわち、ＦＩＴＣ−Ｅ２−ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍ−４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ)。前臨床治験のために、ＥＧＦＲｔソートおよび非ソートＥ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞両者を、約１：１  ＣＤ４／ＣＤ８比で調製し、Ｔ細胞サブタイプ表現型検査を、各インビボ実験のためにＣＡＲ  Ｔ細胞注入時点(０日目)で、フローサイトメトリーにより慣用的に実施した。ＥＧＦＲｔソートＣＡＲ−Ｔ細胞の典型的発現パターンは、約４２％ＴＳＣＭ、１０％ＴＣＭ、１２％ＴＥＭおよび３４％ＴＥＦＦでＣＤ４およびＣＤ８サブセット両者からなった(図５５、左側パイチャート)。ＥＧＦＲｔソートＣＡＲ−Ｔ細胞のみを共培養(図５３、５４、５６、５８、５９および６１)および薬物動態試験(図６２)に使用した。腫瘍治療について、低分化プロファイルを有する「臨床模写」バッチ(図５５、右側パイチャート)を使用し、この「臨床的バッチ」をＭＤＡ−ＭＢ−２３１試験(図６３)にも使用し、研究バッチをＴＨＰ１−ＦＲβおよびＨＯＳ−ＦＲα試験(図５７)に使用した。「臨床模写」バッチ(約３９％ＥＧＦＲｔ＋)は、約６６％ＴＳＣＭおよび約３２％ＴＣＭのＣＤ４＋サブセットならびに約９５％ＴＳＣＭおよび３％ＴＣＭのＣＤ８サブセットからまった。研究バッチ(約２３％ＥＧＦＲｔ＋)はより分化され、３２％ＴＳＣＭ、５３％ＴＣＭ、１１％ＴＥＭおよび３.７％ＴＥＦＦのＣＤ４サブセットならびに４４％ＴＳＣＭ、０.２８％ＴＣＭ、３.４％ＴＥＭおよび５２％ＴＥＦＦのＣＤ８サブセットからなった。
【０５６８】
実施例２２
ＥＣ１７  ＣＡＭの二特異的親和性
ＥＣ１７  ＣＡＭの二特異的親和性を、細胞ベースの放射性リガンド結合アッセイで３Ｈ−ＥＣ１７を使用して評価した。ＦＲ＋標的への結合のために、ＫＢおよびＣＨＯ−β細胞を、一夜、２４ウェル組織培養プレートに前播種し、ＦＦＲＰＭＩ中０.１nM、０.５nM、１nM、５nM、１０nM、２０nMおよび４０nMの３Ｈ−ＥＣ１７と、２時間、３７℃でインキュベートした。その後、細胞をリン酸塩緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)で濯ぎ、１％ドデシル硫酸ナトリウムで溶解した。全細胞ライセートを、標準Pierce BCAタンパク質アッセイにより放射活性レベルおよび細胞タンパク質含量を定量した。細胞あたりに結合した３Ｈ−ＥＣ１７分子数を計算して、それぞれＦＲα(ＫＢ)およびＦＲβ(ＣＨＯ−β)の解離定数(Ｋｄ)を決定した(図５６)。
【０５６９】
ＣＡＭ制御ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の主成分
ＣＡＲ−Ｔ細胞治療の基本成分は、シュード腫瘍抗原としてのＦＩＴＣ、高親和性ＥＣ１７  ＣＡＭ(ＣＡＭは、本明細書ではブリッジまたは「化合物」に等しい)および合理的に設計された抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲおよびＣＡＲ修飾Ｔ細胞を含む。ＥＣ１７は、免疫療法および光学造影目的で臨床で既に試験されている。その二特異的結合親和性を直接定量するため、３Ｈ−ＥＣ１７を合成し、放射性リガンド結合アッセイを、それぞれＦＲα＋およびＦＲβ＋標的細胞を表すＫＢおよびＣＨＯ−β細胞株ならびにエフェクター細胞を表す非ソートＥＧＦＲｔ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で実施した。標的に結合したとき、ＥＣ１７は、それぞれ１.７nMおよび０.８nMの低いＫｄ値でＦＲαおよびＦＲβ両者に類似する親和性を示した(図５６、パネルＡ)。非ソートＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞(約２４％ＥＧＦＲｔ＋、約９５：５  ＣＤ８／ＣＤ４比)への結合により、Ｋｄ値は約１３０nMと推定された(図５６、パネルＢ)。
【０５７０】
実施例２３
腫瘍モデル
全動物管理および使用はＮＩＨガイドラインに従い、かつPurdue University Animal Use and Care Committeeにより承認されたプロトコールに従った。雌４〜５週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ(ＮＳＧＴＭ)マウス(stock number: 005557)をThe Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)から購入した。特に指定しない限り、全動物を到着してから、試験の間中、ＦＡ欠損餌(TestDiet, St. Louis, MO)で飼育した。皮下異種移植を確立するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＯＳ−ＦＲαを、それぞれ動物あたり２.５×１０６細胞および１×１０６細胞で右脇腹領域に移植した。静脈内異種移植について、ＴＨＰ１−ＦＲβ細胞を、動物あたり５×１０６細胞で接種した。皮下腫瘍をカリパスで週２〜３回測定し、楕円式(長さ×幅２)／２を使用して計算した。試験設計に従ってまたは(ｉ)動物が体重の≧２０％を失ったまたは瀕死状態に近づいたとき、(ii)皮下腫瘍のサイズが≧１５００mm３に達したときまたは(iii)動物が腹部膨満および重度苦痛の徴候を示したとき(すなわち、ＴＨＰ１−ＦＲβ)、屠殺した。全動物用量(ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＥＣ１７、フルオレセインナトリウム)を静脈内で与えた。
【０５７１】
実施例２４
腫瘍治療
治療設定で、ＥＣ１７  ＣＡＭは、理論的にＣＡＲ−Ｔ細胞注射の前に与えても後に与えてもよい。ここに記載するとおり、腫瘍担持マウスにおけるヒトＴ細胞の観察期間を確保するため、ＥＣ１７の最初の投与を、ＣＡＲ−Ｔ細胞の２〜３.５日後与えた。非ソートＥ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞の２バッチ(２３％または３９％ＥＧＦＲｔ＋、１：１  ＣＤ４／ＣＤ８)をインビボ試験で使用した。各実験についての注入日(０日目)、凍結ＣＡＲ−Ｔ細胞を３７℃で急速に解凍し、ダルベッコ１×ＰＢＳ(ｐＨ７.４)で２回洗浄し、尾静脈に所望のＥＧＦＲｔ＋Ｅ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞用量で注射した。さらに、少量のＣＡＲ−Ｔ細胞を、フローサイトメトリーで、ＣＤ４対ＣＤ８比およびＣＡＲ−Ｔ細胞の分化状態について試験した。ＥＣ１７投与した最初の日、腫瘍担持動物を、腫瘍サイズまたは静脈内移植後(すなわち、ＴＨＰ１−ＦＲβ)の同じ日数により、群に割り当てた。
【０５７２】
実施例２５
毒性およびＣＲＳレスキュー
ＣＡＲ−Ｔ細胞用量およびＥＣ１７の投与方法によって、ＦＩＴＣ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を受ける腫瘍担持マウスは、重度ＣＲＳおよび種々の程度の体重減少を経験し得る。それ故に、ＣＲＳ評点方式(０〜５スケール)を開発して、ＣＲＳレスキューの良好なタイミングを可能にするために動物の巨視的形態学および社会行動から実験的にＣＲＳ毒性を評価した。グレード０および５はそれぞれ正常(ＣＲＳ無)または死亡(重度ＣＲＳのため)であり、グレード１、２および３〜４は、軽度、軽度から中程度および重度ＣＲＳ(図５７Ａ、表の記載)と見なされた。さらに、全ＥＣ１７用量を、可能性のあるＣＲＳ症状が夜間に発症するように、意図的に１日の終わりごろに与えた。各ＥＣ１７用量の直ぐ翌日、動物を採点し、フルオレセインナトリウム、葉酸およびロイコボリンなどのレスキュー剤を、ＣＲＳ毒性軽減のために使用した。この特定の場合において、高ＥＧＦＲｔ＋ＣＤ４／ＣＤ８比(約９３：７)のＥ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞のバッチを、ＨＯＳ−ＦＲα腫瘍担持マウスに、０日目に約２５０万のＣＤ８および約３３００万のＣＤ４の混合物として与えた(図５７Ａ、略図)。ＥＣ１７をそれぞれ５００nmol／kg、１００nmol／kgおよび５００nmol／kgで３日目、１０日目および１２日目に与えたとき、低ＣＲＳ(グレード１〜２)が４日目および１１日目に示され、一方高ＣＲＳ(グレード３)が１３日目に示された。重度ＣＲＳ毒性を軽減するために、フルオレセインナトリウムを１３日目の朝に約９６mg／kgで静脈内投与し、マウス血漿サンプルを、ＣＲＳ関連サイトカインの分析のために６時間後に集めた。
フルオレセインナトリウムでのＣＲＳレスキュー能を精査するために、ＣＲＳスコアリングシステムを開発し、これはＥＣ１７投与後重度ＣＲＳ(グレード３／４)の発症を捕捉できた(図５７Ａ)。３５００万の総ＣＡＲ−Ｔ細胞(９３：７  ＣＤ４／ＣＤ８)の極めて高用量により、ＨＯＳ−ＦＲα腫瘍担持マウスで急速ＣＲＳ発症した挑戦的により示されるとおり、ヒト等量用量(マウスで約９５mg／kg)での静脈内フルオレセインナトリウムは、ＣＡＲ−Ｔ細胞由来ヒトサイトカインの減少に極めて速く作用した(図５７Ｂ)。
【０５７３】
実施例２６
統計
統計分析を、コンピュータープログラムGraphPad Prism(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)を使用して実施した。データをスチューデントのｔ検定または１元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。適用可能であるならば、適切な複数比較後検定を使用して処置群にわたりさらに分析した。＊＝ｐ＜０.０５を、全試験で統計的有意と見なした。
【０５７４】
実施例２７
共培養実験
インビトロでＥＣ１７  ＣＡＭ作用を試験するために、純粋ＥＧＦＲｔソートＣＤ４およびＣＤ８  ＣＡＲ−Ｔ細胞を１：１比で混合し、適合偽形質導入Ｔ細胞を、実験設計当たり入れた。ＡＭＬおよび骨肉腫細胞株のＦＲ±同質遺伝子対以外、ＫＢ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＯＶ９０を、種々の組織学的腫瘍タイプおよびＦＲ発現レベルを表すために加えた。全ＦＲ＋標的細胞株を、直接３Ｈ−ＦＡ結合アッセイに付して、結合ＦＲ分子数／細胞を定量した(図５８；注釈上から下＝バー左から右)。共培養実験前に、凍結保存ＣＡＲ−Ｔ細胞を、Ｔ細胞培養培地で２〜３日間回復させた。全エフェクターおよび標的細胞をＦＦＲＰＭＩで前洗浄して、ＥＣ１７と競合し得るあらゆる外因性ＦＡを除いた。≦３日間の短期共培養試験を、何ら外因性サイトカインを添加することなくＦＦＲＰＭＩで実施した。
ＥＣ１７用量応答試験(図５９、パネルＡおよびＢ)のために、１０倍増分で０.１pM〜１００μM範囲のＥＣ１７存在下、ＦＲ＋細胞株(ＫＢ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＯＳ−ＦＲα、ＴＨＰ１−ＦＲβ、ＯＶ９０)を、エフェクター対標的(Ｅ／Ｔ)比１：１で、ＥＧＦＲｔソートＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養した。２４時間の共培養後、上清を採取して、腫瘍細胞殺滅を決定した。インビトロのＴ細胞活性化の反応速度論およびＦＲ相関(図６０、パネルＡ−Ｅ)を試験するために、１０nM  ＥＣ１７の連続存在下、種々のＥ／Ｔ比(１：２７、１：９、１：３、１：１、３：１)でＦＲ＋／細胞株の共培養を実施した。腫瘍細胞殺滅の速度(kinetics)を、１６時間および４８時間の共培養で追跡した。一方、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α測定のために、４４時間の共培養後上清の一部を採った。Promega’s CytoTox 96(登録商標)ＬＤＨアッセイキットを使用して、標的細胞殺滅を定量し、既定Ｅ／Ｔ比でＥＣ１７非存在下の基底レベルに対して標準化した特異的溶解(％)として表した。LEGENDplexTMヒトＴｈ１サイトカインパネル(BioLegend, San Diego, CA)を使用して、ＣＡＲ−Ｔ細胞由来サイトカインを決定した。
【０５７５】
ＦＲ＋腫瘍細胞標的存在下のＣＡＲ−Ｔ細胞活性化を試験するために(図５３)、共培養実験をまずＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＴＨＰ１−ＦＲβおよびＨＯＳ−ＦＲαで実施した。１００nM  ＥＣ１７を含む培地に３０分間暴露後、全標的細胞を洗浄し、次いで１：１  Ｅ／Ｔ比でＥＧＦＲｔソートＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞(１：１  ＣＤ４／ＣＤ８)または偽形質導入対照Ｔ細胞とインキュベートした。２４時間の共培養後、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)およびＰＤ−１の表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。Ｔ細胞疲弊試験について(図５４)、ＦＲ＋(ＫＢ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＯＳ−ＦＲαｆＬｕｃ、ＴＨＰ１−ＦＲβ)およびＦＲ陰性(ＨＯＳ−１４３ｂｆＬｕｃ、ＴＨＰ１−ＦＧ１２)腫瘍細胞株を標的として使用した。ここで、標的細胞を、０日目に、０.１nMおよび１０nMのＥＣ１７と３０分間、３７℃でインキュベートし、ＥＣ１７「前負荷」状態を、細胞表面ＥＣ１７を抗ＦＩＴＣ抗体で対比染色して評価した(図６１、パネルＡ)。３日後、共培養ＣＡＲ−Ｔ細胞のＰＤ−１、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３阻害剤受容体の表面発現を分析し、二重および三重陽性細胞の高頻度を疲弊表現型に近づくと考えた。本試験で使用した腫瘍細胞の倍加時間が種々であるため、標的細胞アポトーシス(％)を、２日間の共培養後Annexin V+で測定し、Ｔ細胞非存在下の同じ条件の標的細胞培養のアポトーシスの背景レベルで標準化した(図６１、パネルＢ)。
【０５７６】
機能的ＦＲ評価
これら機能的ＦＲ評価を、ここに記載する数例に適用できる。ＦＲα(ＨＯＳ−ＦＲα)およびＦＲβ(ＴＨＰ１−ＦＲβ)でトランスフェクトした小児癌細胞株以外、種々の組織検査およびＦＲ発現レベルの癌細胞株(図５８)が包含された。放射リガンド結合アッセイ(１００nM  ３Ｈ−ＦＡ、１時間、３７℃)により推定されるとおり、これらの細胞株の総利用可能ＦＲの順番は：９×１０４(ＯＶ９０、低ＦＲ発現卵巣癌細胞株)、１.９×１０５(ＴＨＰ１−ＦＲβ)、２.４×１０５(ＨＯＳ−ＦＲαｆＬｕｃ)、７×１０５(ＨＯＳ−ＦＲα)、２.１×１０６(ＭＤＡ−ＭＢ−２３１)および４.８×１０６(ＫＢ)ＦＡ分子／細胞であった。ＦＲ陰性対照としてまた包含させたのは、ＨＯＳ−１４３ｂ(ｆＬｕｃ)およびＴＨＰ１−ＦＧ１２親細胞株であった。それ故に、共培養ＦＲ＋癌細胞株の機能的ＦＲ発現の一般的ランキングは、ＫＢ＞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１＞ＨＯＳ−ＦＲα＞ＨＯＳ−ＦＲαｆＬｕｃ＞ＴＨＰ１−ＦＲβ(ＡＭＬ)＞ＯＶ９０であった。
【０５７７】
標的細胞溶解およびサイトカイン産生とＦＲレベルの相関
ＦＲ依存性を分析するために、５つのＦＲ＋(ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＫＢ、ＨＯＳ−ＦＲα、ＴＨＰ１−ＦＲβ、ＯＶ９０)および１つのＦＲ陰性(ＨＯＳ−１４３ｂ)細胞株を、１０nM  ＥＣ１７の連続存在下、種々のＥ／Ｔ比(１：２７、１：９、１：３、１：１および３：１)でＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養した。特異的溶解(％)を１６時間および４８時間の共培養後定量し、培養培地のＴｈ１サイトカイン(ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α)を４４時間の共培養後測定した。特異的溶解の発生(約１６時間)は種々の腫瘍で異なったが、特異的細胞溶解の増加が全ＦＲ＋癌細胞株で４８時間で観察された(図６０、パネルＡ)。一般に最低ＦＲ発現ＯＶ９０細胞で有意な活性を見るためには、長時間(４８時間)および高いＥ／Ｔ比(≧１：１)が必要であった(図６０、パネルＡ)。高ＦＲ発現ＫＢ細胞は極めてゆっくり応答し、有意な細胞死を引き起こすのに、また高いＥ／Ｔ比(≧１：３)および長い暴露時間が必要であった(図６０、パネルＢ、左側プロット)。十分なエフェクター細胞が存在するとき(≧１：１  Ｅ／Ｔ比)、全ＦＲ＋癌細胞は４８時間の共培養後応答した。顕著なことに、ＦＲ陰性ＨＯＳ−１４３ｂ細胞のみが本質的に無傷であった(図６０、パネルＢ、右側プロット)。
インビトロでＣＡＲ−Ｔ細胞活性とＦＲ発現の相関を確立するために、１６時間特異的溶解の値を、腫瘍細胞で見られた機能的ＦＲレベルに対してＥ／Ｔ比１：１でプロットした(図５８)。開始時に異常な抵抗をＫＢ細胞以外、ＦＲ発現と細胞溶解開始に強い片対数相関があり、０.９８のＲ値であった(図６０、パネルＣ)。同様に、ＦＲ陰性ＨＯＳ−１４３ｂ腫瘍細胞以外全て、Ｅ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞と１：１のＥ／Ｔ比で４４時間の共培養後、高レベルのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α産生を誘発した(図６０、パネルＤ)。Ｔｈ１サイトカイン産生について、片対数相関も、包含させた全細胞株で見られ、それぞれ、Ｒ値０.８８(ＩＦＮ−γ)、０.８９(ＩＬ−２)および０.８９(ＴＮＦ−α)であった(図６０、パネルＥ)。短期共培養で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＣＡＲ−Ｔ細胞による殺滅に最も感受性であるが、ＨＯＳ−ＦＲα骨肉腫およびＴＨＰ１−ＦＲα  ＡＭＬも、ＦＲレベル依存的様式で急速に応答することが見られた(図６０、パネルＣ)。
【０５７８】
インビトロでのエフェクター／標的細胞結合におけるＥＣ１７  ＣＡＭの高有効性
遊離形態の単価ＥＣ１７(すなわち１ＦＩＴＣ／ＦＡリガンド)は、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を自動的に活性化しなかった。ＣＡＲ−Ｔ細胞活性化の頑健性(robustness)を試験するため、５つのＦＲ＋細胞株(ＫＢ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＯＳ−ＦＲα、ＴＨＰ１−ＦＲβ、ＯＶ９０)を、広範囲の濃度のＥＣ１７(０.１pM〜１００μM)と、Ｅ／Ｔ比１：１で使用した(図５９、パネルＡおよびＢ)。特異的溶解(％)を、２４時間の共培養後PromegaのＬＤＨ細胞毒性アッセイキットで定量した。全細胞株で、ＥＣ１７依存性細胞溶解はベル型用量応答に従い、幾分広い濃度プラトー(約０.１nM〜１μM)であった(図５９、パネルＡ)。用量−応答曲線を、頂点(１００nMまで)に合わせたとき、半数効果濃度(ＥＣ５０)が、それぞれ、４.５pM(ＭＤＡ−ＭＢ−２３１)、５.３pM(ＫＢ)、１５pM(ＴＨＰ１−ＦＲβ)、３０pM(ＨＯＳ−ＦＲα)および４１８pM(ＯＶ９０)で得られた。しかしながら、各細胞株で得られた最大溶解は異なってランク付けされ、４５％(ＭＤＡ−ＭＢ−２３１)、２７％(ＴＨＰ１−ＦＲβ)、１８％(ＨＯＳ−ＦＲα)、１５％(ＯＶ９０)および１１％(ＫＢ)であった(図５９、パネルＢ)。低いＥＣ５０値は、一般にＥＣ１７が活性化Ｅ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＦＲ特異的標的細胞溶解の誘発に高度に強力であったことを示す。
【０５７９】
インビトロでのＥＣ１７／ＦＲ依存性ＣＡＲ−Ｔ細胞活性化および疲弊
抗原依存性ＣＡＲ−Ｔ細胞活性化を試験するため、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＴＨＰ１−ＦＲβおよびＨＯＳ−ＦＲα細胞を１００nM  ＥＣ１７で３０分間前負荷した。細胞を洗浄し、次いで１：１  Ｅ／Ｔ比で、ＥＧＦＲｔソートＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞(１：１  ＣＤ４／ＣＤ８)または偽形質導入対照Ｔ細胞とインキュベートした。２４時間の共培養後、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)およびＰＤ−１の表面発現を測定した(図５３)。ＥＣ１７前負荷ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＯＳ−ＦＲαは、本ＣＡＲ−Ｔ細胞の強力なアクティベーターであった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞より１１倍低いＦＲを発現するＴＨＰ１−ＦＲβ細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞活性化を誘発したが、低いレベルであった。重要なことに、偽対照Ｔ細胞は、これらの条件下活性化されなかった。あるＦＲ＋腫瘍タイプ(例えばＫＢ)は、ＥＣ１７指向ＣＡＲ  Ｔ細胞による殺滅に生来の抵抗を示し(図５６、５８、５９および６０)、ＥＣ１７  ＣＡＭ作用の機構としてＴ細胞活性化対疲弊を試験した。ＦＲ＋(ＫＢ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＯＳ−ＦＲαｆＬｕｃ、ＴＨＰ１−ＦＲβ)およびＦＲ陰性(ＨＯＳ−１４３ｂｆＬｕｃ、ＴＨＰ１−ＦＧ１２)腫瘍細胞株両者を、この目的で選択した。ＨＯＳ−ＦＲαｆＬｕｃは、その親ＨＯＳ−ＦＲαより約５.６倍低いレベルの機能的ＦＲを発現し、ＨＯＳ−１４３ｂｆＬｕｃはＨＯＳ−１４３ｂに類似してＦＲ陰性であった(図５９、パネルＡ)。ここで、ＥＣ１７前負荷(０.１nMまたは１０nM、３７℃で３０分パルス)していないまたはしたＦＲ＋およびＦＲ陰性腫瘍細胞を、ＥＧＦＲｔソートＣＡＲ−Ｔ細胞(１：１  ＣＤ４／ＣＤ８)と、Ｅ／Ｔ比１：２でインキュベートした(図５４および図６１、パネルＢ)。ＥＣ１７用量依存性前負荷を、０日目の、ＡＰＣコンジュゲート抗ＦＩＴＣ抗体(クローンNAWESLEE)での膜結合ＥＣ１７の対比染色により確認した(図６１、パネルＡ)。３日後、共培養ＣＡＲ−Ｔ細胞をＴ細胞活性化／疲弊マーカーＰＤ−１、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３の上方制御および共発現について測定した。標的細胞非存在下で、Ｅ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、培養で低グレード分化を受け、二重または三重陽性細胞は低頻度であった。興味深いことに、腫瘍細胞単独の存在(ＥＣ１７前負荷無)は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を種々の程度に「弛緩」させるように見えた。しかし、ＥＣ１７前負荷ＦＲ＋(ＦＲ陰性ではない)腫瘍細胞標的に遭遇したとき、Ｅ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、顕著な分化を受け、疲弊マーカーの共発現が増加した。三重および二重陽性細胞の頻度増加に基づき、より疲弊した表現型が、ＫＢ＞ＨＯＳ−ＦＲαｆＬｕｃ＞ＴＨＰ１−ＦＲβ＞ＭＤＡ−ＭＤ−２３１の順で共培養ＣＡＲ−Ｔ細胞で現れた。一方ＥＣ１７用量依存性アポトーシス(Annexin V+)は、２日目全ＦＲ＋腫瘍細胞株で見られ、高ＦＲ発現ＫＢ細胞はまた不均衡に低アポトーシスを示した(図６１、パネルＢ)。
【０５８０】
実施例２８
ＣＡＲ−Ｔ細胞拡大および腫瘍取り込みの反応速度論
インビボでＣＡＲ−Ｔ細胞拡大を試験するため、分析を、０日目に注射した約４８０万のＥＧＦＲｔソートＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞(１：１  ＣＤ４／ＣＤ８)を有する１５匹のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスで開始した(図６２、パネルＡ)。腫瘍サイズが２日目に平均約３５０±６０mm３に達したとき、６回まで５００nmol／kgで毎週投与のＥＣ１７を、２日目、９日目、１６日目、２３日目および３０日目に与えた。エキソビボ分析のために、３匹の動物を、計４回採取のために、次の９日目、１６日目、２３日目および３０日目のＥＣ１７投与前にとった。比較のため、同じＥＣ１７用量を、２日目に約４.４倍大きな腫瘍サイズ(約１５５５±７９mm３)を有した３匹のＣＡＲ−Ｔマウスに与えた。各採取について、新鮮血液および腫瘍サンプル(利用可能であれば)を、フローサイトメトリーによりヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在について分析した。さらに、循環におけるＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型変化(ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＥＭおよびＴＥＦＦ)および腫瘍浸潤ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化状態(すなわち、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＰＤ−１)を分析した。
【０５８１】
インビボでのＥＣ１７介在ＣＡＲ−Ｔ細胞拡大および腫瘍取り込み
インビボでのＥＣ１７とＣＡＲ−Ｔ細胞の動的相互作用を、３Ｈ−ＦＡベースの放射性リガンド結合アッセイを使用して１０３±１５pmol／mg膜タンパク質でＦＲ発現が最も高い腫瘍の一つであることが先に判明したＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍モデルを使用してさらに分析した。この試験で、ＣＡＲ−Ｔ細胞拡大の反応速度論を、約４８０万のＥＧＦＲｔソートＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けた腫瘍担持マウスで試験した(図６２、パネルＡ)。単回ＥＣ１７投与７日後(すなわち、試験９日目)、ヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋ＣＡＲ−Ｔ細胞をマウスの血中で検出し、大きな腫瘍を担持するマウスで循環している数が増えていた(図６２、パネルＢ)。インビボでの高い拡大傾向に加えて、これらの血液由来ＣＡＲ−Ｔ細胞は、大きな腫瘍を有するマウスで、より分化したプロファイルも示した(図６２、パネルＢ、２５０４±４４１mm３対４２２±１６mm３)。サイズが小さい腫瘍を有するマウスで試験を続け、計５回、５００nmol／kgで毎週ＥＣ１７投与を受けた。図６２、パネルＣに示すとおり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍は、２回目のＥＣ１７投与後応答し始めた。マウスは、ＥＣ１７投与後、特に３回目の投与後、軽度の体重減少を経験した。循環ＣＡＲ−Ｔ細胞が約１５日目でピークとなり、最大３０日持続するため(フローサイトメトリーによる最後の分析)、腫瘍浸潤ＣＡＲ−Ｔ細胞の一定増加が観察された(図６２、パネルＤ、上部プロット、点線)。さらに、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、９日目のＴＳＣＭ表現型優勢から、継続ＥＣ１７処置のその後の日でのより分化したプロファイルへと、血液における動的表現型変化を受けた(図６２、パネルＤ、下部棒グラフ)。従って、これらの腫瘍浸潤ＣＡＲ−Ｔ細胞は、活性化され、早期(ＣＤ１３７／４−１ＢＢ)および後期(ＰＤ−１)Ｔ細胞活性化マーカーを発現した(図６２、パネルＥ)。ＣＤ１３７／４−１ＢＢ発現は約９日目にピークとなり、一方ＰＤ−１発現は９日目以降も高いままであった。それ故に、ＥＣ１７  ＣＡＭ投与は、インビボで、頑強な抗腫瘍免疫をもたらすＣＡＲ−Ｔ細胞活性化、拡大および腫瘍取り込みを駆動する。
【０５８２】
実施例２９
エキソビボでのフローサイトメトリー
循環中のＣＡＲ−Ｔ細胞分析のために、予定した体積の全血から取った血漿を、エチレンジアミン四酢酸抗凝固剤を含むチューブに集めた。赤血球溶解後、白血球ペレットを、１％ウシ血清アルブミン、５０mg／mLヒトＩｇＧ(Equitech Bio)および０.９％ナトリウムアジドを含むフローサイトメトリー染色溶液に再懸濁した。サンプルを、ヒト白血球表面マーカー(ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ)およびビオチニル化抗ヒトＥＧＦＲ(セツキシマブ)、続いてフルオロフォアコンジュゲート抗ビオチン二次抗体で染色した。腫瘍浸潤ＣＡＲ−Ｔ細胞分析のため、予め秤量した新鮮腫瘍フラグメントを細かく切断し、１時間、３７℃で激しく振盪しながら、無血清ＦＦＲＰＭＩ中の０.５mg／mL  コラゲナーゼIV、０.５mg／mLヒアルロニダーゼおよび０.１mg／mL  ＤＮａｓｅ  Ｉからなる消化カクテルで酵素的に消化させた。その後、腫瘍細胞ペレットを赤血球溶解ステップに付し、冷ＰＢＳで洗浄し、４０μmナイロン細胞濾過器で濾過した。得られた単一細胞懸濁液をＥＧＦＲｔおよびヒト白血球マーカー、ＣＤ１３７／４−１ＢＢおよびＰＤ−１について染色した。最小２０,０００ヨウ化プロピジウム陰性生存細胞事象を、Galliosフローサイトメーターに集め、Kaluzaソフトウェア、version 2.1(Beckman Coulter, Brea, CA)で分析した。ＣＡＲ−陽性Ｔ細胞をマウス血液でヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋事象として同定し、血液体積あたりの絶対数を、各サンプルに加えた等しい数のCountBrightTMビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して計算した。腫瘍浸潤ＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋  ＣＡＲ−Ｔ細胞数を、分析した総生存可能腫瘍細胞の％として表した。
【０５８３】
実施例３０
腫瘍治療
高食餌性フォレートの効果を試験するために(図６３、パネルＡ〜Ｄ)、２セットのＮＳＧマウスを、到着時からＦＡ強化餌(４mg／kg、Envigo, Indianapolis, IN)またはＦＡ欠損餌(TestDiet, St. Louis, MO)で飼育した。０日目、両セットのマウスは、約１０００万の同じ「臨床模写」ＣＡＲ−Ｔ細胞を受け、続いてＥＣ１７は無いかまたは５００nmol／kgのＥＣ１７  ＳＩＷを３日目から開始した。ＥＣ１７投与１日目、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍サイズは、ＦＡ強化マウスで平均約５４９±１８４mm３(２８０〜９１８mm３)であり、ＦＡ欠損マウスで約５５９±１６５mm３(３５６〜９６１mm３)であった。
【０５８４】
ＣＲＳおよび抗腫瘍活性に対する高食餌性フォレートの効果
先に、ＦＡまたはＦＡリガンドの投与が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍担持マウスにおけるＣＲＳの重症度低減を助けたことが示された。食餌性フォレートの長期効果を試験するために、マウスを約７３日間既定餌で飼育し、腫瘍がＦＡ強化マウスで約５４９±１８４mm３(２８０〜９１８mm３)およびＦＡ欠損マウスで約５５９±１６５mm３(３５６〜９６１mm３)に達したとき、使用した(図６３、パネルＡ〜Ｄ)。全マウスは、０日目に約１０００万のＥ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞の同じ「臨床模写」を受け、ＥＣ１７処置コホートは、２日目(ＦＡ強化)または３日目(ＦＡ欠損)に開始する５００nmol／kgを８回毎週受けた。先に見られたとおり、ＥＣ１７の最初の全量投与は一般に安全であり、いずれの餌のマウスでも何らＣＲＳまたは体重減少を引き起こさなかった。事実、ＦＡ強化動物は、ＥＣ１７処置をとおしてＣＲＳの症状を示さなかったが、ＦＡ欠損動物は、グレード２〜３ＣＲＳおよび体重減少(最大約１１.４％)を、各その後のＥＣ１７投与で経験した(図６３、パネルＡ、下部パネル)。同じＥＣ１７処置期間で、ＦＡ強化餌マウス(５９日目０.０２７〜４.３×１０３／１００μL血液)と比較して、ＦＡ欠損餌マウス(５２日目１.６〜２０.４×１０４／１００μL血液)ではるかに高いＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋ＣＡＲ−Ｔ細胞レベルが見られた図６３、パネルＢ〜Ｃ)。重要なことに、ＥＣ１７処置されなかったＦＡ欠損動物でＣＡＲ−Ｔ細胞拡大は検出されなかった(図６３、パネルＣ)。
【０５８５】
先の試験より大きなＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍サイズで開始したため、この１０００万「臨床模写」ＣＡＲ−Ｔ細胞用量のアロ反応性による腫瘍退縮は明白ではなかった(図６３、パネルＡ、上部列)。ＦＡ強化マウスにおける対照腫瘍(ＥＣ１７無)は、ＦＡ欠損マウスにおける対照腫瘍と比較して、増殖反応速度が速いように見えた；しかし、全体として、ＥＣ１７を受けたＦＡ強化マウスで２／５治癒、２／５完全応答および１／５部分応答があった(図６３、パネルＡ、上部左図)。より頑強なインビボＴ細胞拡大がＦＡ欠損餌のマウスで見られ、５／５治癒をもたらしたが、これらの動物の健康状態は、各ＣＲＳエピソードで悪化した(図６３、パネルＡ、上右図)。
【０５８６】
酵素消化後のマウス腫瘍塊内のＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞を同定するために抗ヒトＥＧＦＲ(クローンＨｕ１)を使用して、ＥＣ１７処置継続にも関わらず再発を経験したＦＡ強化餌のマウスから採取した３腫瘍のＦＲαタンパク質発現(クローンＬＫ２６)を分析した。フローサイトメトリー検出で、最小腫瘍(２１mg)から単離したＥＧＦＲ＋癌細胞はＦＲαを発現したが、二つの大きな腫瘍(９０mgおよび３６３mg)から単離したＥＧＦＲ＋癌細胞は、ＦＲα発現を完全に失っていた(図６３、パネルＤ)。３Ｈ−ＦＡを用いる定量的放射リガンド結合アッセイを使用して、これらの腫瘍から得た組織ホモジネートの機能的ＦＲレベルを確認した(約２.１pmol／mg結合能に対して未処置動物からの腫瘍で約１０３pmol／mg)。それ故に、ＦＡ欠損は活性およびＣＲＳ毒性の増強に至り得るが、非生理学的ＦＡ摂取はＣＲＳを予防し、かつ継続した飲食による摂取は活性減少に至り得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５１−３】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６０−３】
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【図６１】
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【図６２−１】
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【図６２−２】
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【図６３−１】
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【図６３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021512147.tif 000114
2021512147.tif 000115