(57)【要約】  本発明は、チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、そのアナログ、またはチモシンβ４の誘導体を有効成分として含む、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための組成物に関する。本発明の、チモシンβ４、そのアイソフォーム、またはその誘導体を有効成分として含む、ムチン分泌を促進するための組成物は、杯細胞増殖を促進し、ムチン分泌量を増加させる。特に、ムチン分泌を促進するための組成物は、Ｍｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４およびＭｕｃ１６の発現を増加させる。したがって、本発明の杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための組成物は、杯細胞またはムチンが関与する疾患に対し優れた効果を有すると考えられる。
2021504349.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体を有効成分として含む、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための組成物。
【請求項２】
チモシンβ４が配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
チモシンβ４の誘導体が、変異したチモシンβ４Ｎ末端またはＣ末端を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
チモシンβ４またはそのアイソフォームもしくは誘導体の濃度が、０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
酢酸、クエン酸、その塩、または該塩の水和物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム二水和物、および塩化マグネシウム六水和物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体を有効成分として含む、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項８】
チモシンβ４が配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
チモシンβ４の誘導体が、変異したチモシンβ４Ｎ末端またはＣ末端を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
チモシンβ４またはそのアイソフォームもしくは誘導体の濃度が、０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
酢酸、クエン酸、その塩、または該塩の水和物をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム二水和物、および塩化マグネシウム六水和物をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ムチンが関与する疾患が、胃炎、胃潰瘍、腸炎、潰瘍性大腸炎またはドライアイである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれかに記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を処置する方法。
【請求項１５】
杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患が、胃炎、胃潰瘍、腸炎、潰瘍性大腸炎またはドライアイである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための、請求項１に記載される組成物の使用。
【請求項１７】
杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための医薬を製造するための、請求項１に記載される組成物の使用。
【請求項１８】
杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための、請求項７に記載される組成物の使用。
【請求項１９】
杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬を製造するための、請求項７に記載される組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための、チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体を有効成分として含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
杯細胞は、ムチン、例えばＭｕｃ５ＡＣを分泌する円柱上皮細胞である。杯細胞は主に、上皮、例えば小腸、大腸、気管支、結膜等の上皮に分布する。杯細胞はムチンを分泌して粘膜表面を潤し、それによって組織を機械的摩擦または化学的刺激から保護する。
【０００３】
一方、ムチンは、上皮組織、例えば胃腸管、肺、腎臓、卵巣、乳房、眼、鼻、膵臓等の上皮組織から分泌される糖タンパク質である。正常な生理学的条件下に、ムチンは上皮組織を保護するように働く。しかしながら、上皮組織からのムチン分泌が低下した場合には、例えば胃炎、胃潰瘍、腸炎、潰瘍性大腸炎、便秘等といった疾患が起こりうる。さらに、例えば眼および鼻といった器官の粘膜からのムチン分泌が低下した場合には、外的有害物質が身体に侵入し得、角膜炎、ドライアイ、鼻炎、気管支炎、肺炎等といった疾患を引き起こしうる。
【０００４】
チモシンβ４は、４１〜４３のアミノ酸からなる、等電点が５．１のタンパク質で、１９８１年に胸腺において最初に発見された。チモシンβ４は、１９９１年にRivaらによって、動物細胞中のアクチン捕捉分子として最初に同定された。その後、チモシンβ４は、免疫調節および神経内分泌にも関与することがわかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明者は、ムチン分泌を効果的に促進することのできる組成物についての研究を行った。その結果、本発明者は、チモシンβ４は、効果的に杯細胞を増殖させ、ムチン分泌も促進することを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一側面において、チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体を有効成分として含む、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための組成物が提供される。
【０００７】
本発明の他の一側面において、チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはその誘導体を有効成分として含む、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【０００８】
本発明の他の一側面において、組成物を対象に投与することを含む、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療する方法が提供される。
【０００９】
本発明の他の一側面において、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための組成物の使用が提供される。
【００１０】
本発明の他の一側面において、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための医薬を製造するための組成物の使用が提供される。
【００１１】
本発明の他の一側面において、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物の使用が提供される。
【００１２】
本発明の他の一側面において、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬を製造するための医薬組成物の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体を有効成分として含む、ムチン分泌を促進するための本発明の組成物は、杯細胞増殖を促進し、ムチン分泌を増加させる。特に、ムチン分泌を促進する組成物は、Ｍｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４およびＭＡＣ１６の発現を増加させる。したがって、本発明のムチン分泌を促進する組成物は、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患に対し優れた効果を示すと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、杯細胞増殖およびムチン分泌の促進に対するチモシンβ４の効果を確認するための、ドライアイ誘発マウスを用いる動物実験を示す図である。
【図２】図２は、杯細胞増殖促進に対するチモシンβ４の効果を調べるために、試験物質の点眼に付した正常マウスおよびドライアイ誘発マウスの眼球を採り、組織中の杯細胞を染色して撮影した写真である。
【図３】図３は、杯細胞増殖促進に対するチモシンβ４の効果を調べるために、試験物質の点眼に付した正常マウスおよびドライアイ誘発マウスの眼球を採り、組織中の杯細胞を染色した後、染色領域を定量化することによって得た結果を示す。
【図４】図４は、ムチン分泌促進に対するチモシンβ４の効果を調べるために、試験物質の点眼に付した正常マウスおよびドライアイ誘発マウスの眼球を採り、組織中のムチンを染色して撮影した写真である。
【図５】図５は、ムチン分泌促進に対するチモシンβ４の効果を調べるために、試験物質の点眼に付した正常マウスおよびドライアイ誘発マウスの眼球を採り、組織中のムチンを染色した後、染色領域を定量化することによって得た結果を示す。
【図６】図６は、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ１６およびＭｕｃ５ＡＣの発現増加に対するチモシンβ４の効果を調べるために、試験物質の点眼に付した正常マウスおよびドライアイ誘発マウスの眼球を採り、角膜において発現されたＭｕｃ１、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ１６およびＭｕｃ５ＡＣを免疫蛍光染色して撮影した写真である。
【図７】図７は、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ１６およびＭｕｃ５ＡＣの発現増加に対するチモシンβ４の効果を調べるために、試験物質の点眼に付した正常マウスおよびドライアイ誘発マウスの眼球を採り、結膜において発現されたＭｕｃ１、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ１６およびＭｕｃ５ＡＣを免疫蛍光染色して撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明を以下詳細に説明する。
本発明の一側面において、チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体を有効成分として含む、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための組成物が提供される。
【００１６】
本書において、用語「チモシンβ４」は、Ｔβ４とも表されるタンパク質であるが、胸腺から初めて単離され、さまざまな組織において確認されている４３アミノ酸からなる４．９ｋＤａのポリペプチドをさす。チモシンβ４は、インビトロで上皮細胞の遊走および分化の間にアップレギュレートされるタンパク質である。チモシンβ４の多くのアイソフォームが同定されており、それらアイソフォームは、チモシンβ４の既知のアミノ酸配列との少なくとも約７０％、約７５％または約８０％の同一性を有する。チモシンβ４は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質でありうる。
【００１７】
チモシンβ４誘導体は、変異したチモシンβ４Ｎ末端またはＣ末端を有しうる。チモシンβ４誘導体は、チモシンβ４の活性が維持される限りにおいて、チモシンβ４のＮ末端および／またはＣ末端における部分的なトランケーション、またはそれへの１またはそれ以上のアミノ酸の付加を有しうる。特に、チモシンβ４誘導体は、チモシンβ４のＮ末端への１または２アミノ酸の付加を有しうる。さらに、チモシンβ４誘導体は、チモシンβ４のＣ末端への１または２アミノ酸の付加を有しうる。
【００１８】
ここで、アミノ酸は、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパルテート、システイン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、トリプトファン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギンおよびスレオニンからなる群から選択される任意の１つまたは組み合わせでありうるが、それに限定されない。
【００１９】
チモシンβ４誘導体は、チモシンβ４のＮ末端に１〜３アミノ酸のトランケーションを有しうる。さらに、チモシンβ４誘導体は、チモシンβ４のＣ末端に１〜３アミノ酸のトランケーションを有しうる。
【００２０】
杯細胞増殖またはムチン分泌を促進する組成物におけるチモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）でありうる。
【００２１】
本書において、用語「杯細胞」とは、粘膜上皮ライニングに存在する粘液分泌細胞をさす。杯細胞は、ムチン、例えばＭｕｃ５ＡＣを分泌する円柱細胞である。さらに、杯細胞は主に、上皮、例えば小腸、大腸、気管支、結膜等の上皮に分布する。杯細胞はムチンを分泌して粘膜表面を潤し、それによって組織を機械的摩擦または化学的刺激から保護する。
【００２２】
上述のように、各組織の粘膜を保護するように機能する杯細胞に機能障害が起きると、上皮組織、例えば胃腸管、肺、腎臓、卵巣、膵臓、眼および鼻の上皮組織におけるムチン分泌が減少し、それによって疾患が起こりうる。杯細胞の機能障害によって引き起こされる疾患は、胃炎、胃潰瘍、腸炎、潰瘍性大腸炎またはドライアイでありうるが、それに限定されない。
【００２３】
組成物は、従来の方法にしたがって調製および使用されうる。適当な製剤は、硬もしくは軟カプセル、溶液、懸濁液、エマルジョン、注射剤、坐剤、眼科用製剤等を包含するが、それに限定されない。
【００２４】
組成物は、有機または無機の不活性担体を使用して適当な剤形に調製されうる。すなわち、製剤が硬カプセルである場合、組成物は、ラクトース、スクロース、デンプンもしくはその誘導体、またはタルク、炭酸カルシウム、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩を含みうる。さらに、製剤が軟カプセルである場合、組成物は、植物油、ワックス、脂肪、半固形または液体のポリオールを含みうる。さらに、製剤が溶液またはシロップ剤の形態である場合、組成物は、水、ポリオール、グリセロール、および／または植物油等を含みうる。
【００２５】
組成物は、担体に加えて、さらに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、甘味剤、着色剤、浸透圧調節剤、抗酸化剤等を含みうる。
【００２６】
組成物の製剤が眼科用製剤である場合、組成物は、酢酸およびクエン酸、その塩、または該塩の水和物をさらに含みうる。さらに、組成物は、クエン酸ナトリウム水和物または酢酸ナトリウム水和物をさらに含みうる。
【００２７】
クエン酸は、式Ｃ６Ｈ８Ｏ７を有する化合物である。さらに、クエン酸は、シトレートの形で使用されうる。シトレートは、クエン酸の誘導体であり、シトレートは例えば、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム水和物でありうる。クエン酸またはその塩は通常、ｐＨ変化を最小限にするための緩衝剤として用いられる。しかしながら、本発明において用いられるクエン酸またはその塩は、一般的に用いられるよりも多量に用いられるべきである。ここで、クエン酸またはその塩は、組成物全体中に０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）の量で含まれうる。さらに、クエン酸またはその塩は、組成物全体中に０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．２５％（ｗ／ｖ）の量、好ましくは組成物全体中に０．１％〜０．３％の量で含まれうる。
【００２８】
酢酸は、式ＣＨ３ＣＯＯＨを有する弱酸である。さらに、酢酸は、アセテートの形で用いられうる。例えば、アセテートは、酢酸ナトリウム水和物でありうる。ここで、酢酸またはその塩は、組成物全体中に０．０１％（ｗ／ｖ）〜１．５％（ｗ／ｖ）の量で含まれうる。さらに、酢酸またはその塩は、組成物全体中に０．１％（ｗ／ｖ）〜０．８％（ｗ／ｖ）の量、好ましくは組成物全体中に０．２％〜０．５％の量で含まれうる。
【００２９】
組成物は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム二水和物、および塩化マグネシウム六水和物をさらに含みうる。
【００３０】
さらに、塩化ナトリウムの濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）〜１．２％（ｗ／ｖ）であることができ、０．３％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）であることができる。好ましくは、塩化ナトリウムの濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）であることができる。さらに、塩化カリウムの濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．１５％（ｗ／ｖ）であることができ、０．０３％（ｗ／ｖ）〜０．１２％（ｗ／ｖ）であることができる。好ましくは、塩化カリウムの濃度は、０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．０９％（ｗ／ｖ）であることができる。さらに、塩化カルシウム二水和物の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．１２％（ｗ／ｖ）であることができ、０．０３％（ｗ／ｖ）〜０．０９％（ｗ／ｖ）であることができる。好ましくは、塩化カルシウム二水和物の濃度は、０．０３％（ｗ／ｖ）〜０．０６％（ｗ／ｖ）であることができる。さらに、塩化マグネシウム六水和物の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．１２％（ｗ／ｖ）であることができ、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）であることができる。
【００３１】
さらに、組成物は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含みうる。塩酸または水酸化ナトリウムは、組成物のｐＨを調節するのに適当な量で加えることができる。さらに、組成物のｐＨは６．５〜７．５であることができ、６．８〜７．２であることができる。好ましくは、組成物のｐＨは７．０であることができる。
【００３２】
本発明者は、杯細胞増殖およびムチン分泌の促進、ならびにムチンが関与する疾患の処置に対するチモシンβ４の効果を確認するために、ドライアイ誘発マウスを用いる実験を行った。
【００３３】
具体的には、ドライアイ誘発マウスを、チモシンβ４および他の試験薬剤それぞれによる点眼処置に１０日間付した。１０日後、各群のドライアイ誘発マウスを殺し、眼球を採り、組織免疫染色および分子生物学的分析を行った（図１）。その結果、チモシンβ４点眼処置に付したドライアイ誘発マウスにおいて杯細胞の数が増加したことが確認された（図２および３）。さらに、チモシンβ４点眼処置に付したドライアイ誘発マウスにおいてムチン分泌量が増加したことが確認された（図４および５）。さらに、チモシンβ４点眼処置に付したドライアイ誘発マウスにおいて、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ１６、およびＭｕｃ５ＡＣの発現レベルが上昇したことが確認された（図６および７）。
【００３４】
これらの結果から、チモシンβ４は杯細胞を増殖させ、ムチン分泌を促進すること、したがって、ムチンが関与する疾患の予防または治療に使用しうることが確認された。
【００３５】
本発明の他の一側面において、チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体を有効成分として含む、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
【００３６】
チモシンβ４、チモシンβ４アイソフォーム、そのアナログおよび誘導体は、前記に説明したとおりである。
【００３７】
本書において、用語「杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患」とは、上皮組織、例えば胃腸管、肺、腎臓、卵巣、膵臓、眼、鼻等の上皮組織からのムチン分泌の減少によって引き起こされる疾患をさす。杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患は、胃炎、胃潰瘍、腸炎、潰瘍性大腸炎、またはドライアイでありうるが、それに限定されない。
【００３８】
医薬組成物は、薬学的に許容しうる担体をさらに含みうる。用語「薬学的に許容しうる」とは、担体が実質的に生体を刺激せず、投与される活性物質の生物学的活性および性質を妨害しないことを意味する。
【００３９】
担体は、天然物または合成物でありうる。製剤は、それに応じたさまざまな担体、例えば希釈剤または賦形剤、例えば充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、および界面活性剤を用いて調製されうる。
【００４０】
例えば、経口投与用の固形製剤は、カプセル等を包含する。そのような固形製剤は、１つまたはそれ以上の化合物を、少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチン等と混合することによって調製されうる。さらに、単純な賦形剤のほか、例えばステアリン酸マグネシウムおよびタルクといった滑沢剤も使用されうる。経口投与用の液体製剤は、懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤等を包含する。液体製剤は、希釈剤としての水および流動パラフィンに加えて、さまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、香味剤および保存剤を含みうる。
【００４１】
非経口投与用の製剤は、無菌の水溶液、非水性の溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤、および坐剤を包含する。非水性の溶液および懸濁液には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、注射可能なエステル、例えばオレイン酸エチル等が使用されうる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン（Tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用されうる。医薬組成物は、それぞれ従来の方法にしたがって調製および使用されうる。適当な製剤は、硬または軟カプセル、溶液、懸濁液、エマルジョン、注射剤、坐剤、眼科用製剤等を包含するが、それに限定されない。
【００４２】
医薬組成物は、担体に加えて、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、甘味剤、着色剤、浸透圧調節剤、抗酸化剤等をさらに含みうる。
【００４３】
医薬組成物におけるチモシンβ、チモシンβ４アイソフォーム、またはそのアナログもしくは誘導体の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）でありうる。
【００４４】
医薬組成物が眼科用製剤の形態である場合、組成物は、酢酸およびクエン酸、その塩、または該塩の水和物をさらに含みうる。さらに、組成物は、クエン酸ナトリウム水和物または酢酸ナトリウム水和物をさらに含みうる。
【００４５】
クエン酸は、式Ｃ６Ｈ８Ｏ７を有する化合物である。さらに、クエン酸は、シトレートの形で使用されうる。シトレートは、クエン酸の誘導体であり、シトレートは例えば、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム水和物でありうる。クエン酸またはその塩は通常、ｐＨ変化を最小限にするための緩衝剤として用いられる。しかしながら、本発明において用いられるクエン酸またはその塩は、一般的に用いられるよりも多量に用いられるべきである。ここで、クエン酸またはその塩は、組成物全体中に０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）の量で含まれうる。さらに、クエン酸またはその塩は、組成物全体中に０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．２５％（ｗ／ｖ）の量、好ましくは組成物全体中に０．１％〜０．３％の量で含まれうる。
【００４６】
酢酸は、式ＣＨ３ＣＯＯＨを有する弱酸である。さらに、酢酸は、アセテートの形で用いられうる。例えば、アセテートは、酢酸ナトリウム水和物でありうる。ここで、酢酸またはその塩は、組成物全体中に０．０１％（ｗ／ｖ）〜１．５％（ｗ／ｖ）の量で含まれうる。さらに、酢酸またはその塩は、組成物全体中に０．１％（ｗ／ｖ）〜０．８％（ｗ／ｖ）の量、好ましくは組成物全体中に０．２％〜０．５％の量で含まれうる。
【００４７】
医薬組成物の製剤が眼科用製剤である場合、組成物は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム二水和物、および塩化マグネシウム六水和物をさらに含みうる。
【００４８】
さらに、塩化ナトリウムの濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）〜１．２％（ｗ／ｖ）であることができ、０．３％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）であることができる。好ましくは、塩化ナトリウムの濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）であることができる。さらに、塩化カリウムの濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．１５％（ｗ／ｖ）であることができ、０．０３％（ｗ／ｖ）〜０．１２％（ｗ／ｖ）であることができる。好ましくは、塩化カリウムの濃度は、０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．０９％（ｗ／ｖ）であることができる。さらに、塩化カルシウム二水和物の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．１２％（ｗ／ｖ）であることができ、０．０３％（ｗ／ｖ）〜０．０９％（ｗ／ｖ）であることができる。好ましくは、塩化カルシウム二水和物の濃度は、０．０３％（ｗ／ｖ）〜０．０６％（ｗ／ｖ）であることができる。さらに、塩化マグネシウム六水和物の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．１２％（ｗ／ｖ）であることができ、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）であることができる。
【００４９】
さらに、医薬組成物は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含みうる。塩酸または水酸化ナトリウムは、組成物のｐＨを調節するのに適当な量で加えることができる。さらに、組成物のｐＨは６．５〜７．５であることができ、６．８〜７．２であることができる。好ましくは、組成物のｐＨは７．０であることができる。
【００５０】
さらに、医薬組成物が眼科用製剤の形態である場合、組成物は、眼科学的に許容しうる非毒性の賦形剤または担体との混合によって調製されうる。例えば、後述のもの、特に、担体、安定剤、可溶化剤、緩衝剤、保存剤、浸透圧調節剤、増粘剤、および他の賦形剤が用いられうる。さらに、溶液は所望のｐＨに調節され使用されうる。
【００５１】
本発明にしたがって用いられうる担体は、典型的には、局所的または全身的投与に適するものであり、その例としては以下のものが挙げられる：水、水と水混和性溶媒、例えばＣ１−Ｃ７アルカノールとの混合物、植物油または鉱油、例えば０．５〜５重量％のヒドロキシエチルセルロース、オレイン酸エチル、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、および他の眼科用の非毒性水溶性ポリマー、例えばセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、アルカリ金属塩の形態のカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース、アクリレートまたはメタクリレート、例えばポリアクリル酸またはアクリル酸エチル、ポリアクリルアミド、天然物、例えばゼラチン、アルギネート、ペクチン、トラガカント、カラヤガム、キサンタンガム、カラギーナン、寒天、アラビアガム、デンプン誘導体、例えば酢酸デンプンおよびヒドロキシプロピルデンプン、ならびに他の合成物、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンオキシド、好ましくは架橋ポリアクリル酸、例えば中性のカーボポール、またはそのようなポリマーの混合物。担体の好ましい例としては、水、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、アルカリ金属塩の形態のカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、中性カーボポール、またはそれらの混合物が挙げられる。
【００５２】
安定剤の例は、チロキサポール、脂肪酸グリセロールポリ低級アルキレングリコールエーテル、脂肪酸ポリ低級アルキレングリコールエーテル、ポリエチレングリコール、グリセロールエーテル、またはそれら化合物の混合物を包含する。安定剤は典型的には、活性成分を溶解するのに十分な量で加えられる。
【００５３】
緩衝剤の例は、ボレート、水素カーボネート／カーボネート、グルコネート、ホスフェート、プロピオネート、およびトロメタミン（ＴＲＩＳ）緩衝剤を包含する。トロメタミンおよびボレート緩衝剤が好ましい。緩衝剤は、例えば、生理学的に許容しうるｐＨ範囲を確実にし維持する量で加えられる。ｐＨ範囲は典型的には、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８．２、より好ましくはｐＨ６．８〜８．１である。
【００５４】
保存剤の例は、第四級アンモニウム塩、例えばセトリミド、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゾキソニウム；チオサリチル酸のアルキル水銀塩、例えばチメロサール、硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、またはホウ酸フェニル水銀、パラベン、例えばフェニルパラベンまたはプロピルパラベン、アルコール、例えばクロロブタノール、ベンジルアルコール、またはフェニルエタノール、グアニジン誘導体、例えばクロルヘキシジンまたはポリヘキサメチレンビグアニド、またはソルビン酸を包含する。好ましい保存剤の例は、セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゾキソニウム、およびパラベンを包含する。保存剤は、細菌および真菌による使用中の二次的汚染を防止するのに十分な量で加えられうる。
【００５５】
本書に記載されるもののなかで、浸透圧調節剤は、対象生成物の浸透圧を生理学的等張（例えば０．９％食塩液）に調節するために用いられる。例えば、本発明のチモシンβ４を含む組成物に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、デキストロースおよび／またはマンニトールが加えられうる。浸透圧調節剤の量は、加えられる特定の物質の種類に応じてさまざまである。本発明の特定の組成物において、浸透圧調節剤は通常、最終的な組成物が眼科学的に許容しうる浸透圧、好ましくは１５０ｍＯｓｍ〜４５０ｍＯｓｍ、より好ましくは２５０ｍＯｓｍ〜３５０ｍＯｓｍを有するように加えられうる。好ましい浸透圧調節剤の例は、ナトリウム塩およびカリウム塩、特に塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを包含する。最も好ましい浸透圧調節剤は塩化ナトリウムである。
【００５６】
さらに、眼科用製剤において適正な粘度を維持するために、下記物質が使用されうるが、本発明はそれに限定されない：（ａ）単量体ポリオール、例えばチロキサポール、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール；（ｂ）重合体ポリオール、例えばポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００）；（ｃ）セルロース誘導体（セルロースをベースとするポリマー）、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース；（ｄ）デキストラン、例えばデキストラン７０；（ｅ）水溶性タンパク質、例えばゼラチン；（ｆ）ビニルポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン；（ｇ）他のポリマー、例えばポリソルベート８０、ポビドン；（ｈ）カルボマー、例えばカルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４１、カルボマー９４０およびカルボマー９７４Ｐ；ならびに（ｉ）多糖／グリコサミノグリカン、例えばヒアルロナン（ヒアルロン酸／ヒアルロネート）、コンドロイチン硫酸。さらに、担体（ビヒクル）の粘度を高めるように、本発明の組成物に少なくとも１つの増粘剤が加えられうる。
【００５７】
加えられる賦形剤の量および種類は、特定の必要性に応じて異なりうる。賦形剤は通常、約０．０００１重量％〜約９０重量％の範囲で用いられ得、眼科学的分野で当業者に一般に用いられる範囲の中で用いられうる。さらに、眼科用製剤は、３．５〜９、好ましくは４．５〜８、より好ましくは５．５〜７．８の範囲のｐＨを有しうる。
【００５８】
本発明の他の一側面において、医薬組成物を個体に投与することを含む、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を処置する方法が提供される。
【００５９】
特に、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を処理する方法は、チモシンβ４またはその誘導体を有効成分として含む医薬組成物の有効量を組織と接触させることを含む処置方法でありうる。直接投与の例として、本書に開示されるペプチド剤を含む、溶液、ローション、膏薬、ゲル、クリーム、ペースト、スプレー、懸濁液、分散液、ヒドロゲル、軟膏、油またはフォームを、組織と接触させるように直接適用することが挙げられる。
【００６０】
杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患は、前記に説明したとおりである。
【００６１】
さらに、組成物は、クエン酸またはその塩をさらに含みうる。さらに、組成物は、クエン酸および酢酸、またはその塩をさらに含みうる。ここで、チモシンβ４とクエン酸またはその塩は、前後して、または組み合わせて投与され得、１日当たり複数回に分割した適当な量で投与されうる。チモシンβ４とクエン酸またはその塩を組み合わせて同時に投与することが最も好ましい。
【００６２】
組成物のチモシンβ４含有量は、組成物全体の量に対して０．０１％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）、または０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）であり得、ここで、チモシンβ４の１日当たりの総用量は０．０８ｍｌ〜２．０ｍｌでありうる。チモシンβ４は、１日に１回または複数回、好ましくは１日当たり２〜５回投与されうる。さらに、クエン酸またはその塩の含有量は、組成物全体の量に対して０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）でありうるか、または組成物全体の量に対して０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜０．３％（ｗ／ｖ）でありうる。あるいは、クエン酸またはその塩は、１日当たりの総用量０．１ｍｌ〜４．０ｍｌで投与されうる。クエン酸またはその塩は、１日に１回または複数回、好ましくは１日当たり２〜５回投与されうる。
【００６３】
さらに、酢酸またはその塩が、チモシンβ４およびクエン酸またはその塩と前後して、または組み合わせて投与されうる。好ましくは、酢酸またはその塩は、チモシンβ４およびクエン酸またはその塩と同時に投与されうる。ここで、酢酸またはその塩の含有量は、組成物全体の量に対して０．０１％（ｗ／ｖ）〜１．５％（ｗ／ｖ）でありうるか、または組成物全体の量に対して０．１％（ｗ／ｖ）〜０．８％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）でありうる。あるいは、酢酸またはその塩は、１日当たりの総用量０．１５ｍｌ〜６．０ｍｌで投与されうる。酢酸またはその塩は、１日に１回または複数回、好ましくは１日当たり２〜５回投与されうる。
【００６４】
組成物の投与経路の例は、経口投与および非経口投与、例えば静脈内、皮内、皮下、鼻内（例えば吸入）、経皮（例えば局所適用）、粘膜および直腸投与を包含するが、それに限定されない。
【００６５】
本発明の他の一側面において、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進するための本発明の組成物の使用が提供される。
【００６６】
本発明の他の一側面において、杯細胞増殖またはムチン分泌を促進する医薬を製造するための本発明の組成物の使用が提供される。
【００６７】
本発明の他の一側面において、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物の使用が提供される。
【００６８】
本発明の他の一側面において、杯細胞が関与する、またはムチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬を製造するための医薬組成物の使用が提供される。
【実施例】
【００６９】
本発明の理解を助けるために、以下、実施例等によって本発明を詳細に説明する。しかしながら、実施例は、本発明にしたがって他のさまざまな形態に改変することができ、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものと解釈すべきではない。
【００７０】
実施例１．チモシンβ４を含む組成物（ＧＢＴ−２０１）の調製
計量した各試薬を下記表１に示す量となるように無菌注射用水に入れ、各試薬が完全に溶解するまで混合した。次いで、混合溶液にチモシンβ４（Bachem, USA, 配列番号１）を１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように加え、完全に溶解するまで混合した。上記混合プロセスの後に得られた溶液において、水酸化ナトリウムおよび塩酸を用いて酸性度を７．０に調節した。その後、上記調節プロセスに付した溶液を、０．２μｍのフィルターで濾過した。次いで、上記濾過プロセスに付した混合溶液を、低密度ポリエチレン容器に充填し、封止した。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
試験例１．ドライアイ誘発マウスの調製、および薬物の点眼
１２週齢またはそれ以上のＮＯＤ．Ｂ１０−Ｈ２ｂマウスを、湿度が４０％またはそれ以下の室内に１０日間維持した。マウスを室内に維持しながら、０．５ｍｇ／０．２ｍｌの濃度のスコポラミンヒドロブロミド（Sigma-Aldrich, SLBR8568V）を、１日４回（午前９時、午後１２時、午後３時および午後６時）、大腿に皮下注射した。１０日後、涙液分泌の体積、および角膜の滑らかさのスコアを測定し、涙液分泌体積が０．０６μｌまたはそれ以下、かつ、角膜の滑らかさのスコアが２またはそれ以下であるマウスだけを選択した。選択したマウスを、下記の表２に示すようにグループ分けした。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
表２に示すようにグループ分けした後、各群のマウスを各試験薬剤による１０日間の点眼処置に付した。各試験薬剤による点眼処置は、次のように行った：賦形剤：１日４回；ジクアス（Diquas）（Santen Pharmaceutical Co., Ltd., Japan）：１日６回；シードラ（Xiidra）（Shire plc, USA）：１日２回；およびＧＢＴ−２０１：１日２回または４回。１０日後に各群のマウスを殺し、眼球を採り、組織の免疫染色および分子生物学的分析を行った（図１）。
【００７５】
試験例２．杯細胞増殖促進に対するチモシンβ４の効果の確認
結膜におけるムチン分泌細胞である杯細胞の増殖をチモシンβ４が促進するかを調べるために、試験例１で犠牲にしたマウスから眼球を採り、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色によって評価した。各群の切片において、角膜または下結膜円蓋の０．１ｍｍ２の領域を調べた。
【００７６】
具体的には、試験例１で犠牲にしたマウスから眼球を採り、ホルマリン中で３日間固定されている眼および付属器を、ミクロトームで６μｍの切片に切断した。６μｍの厚さに切断した眼および付属器の切片を、ＰＡＳキット（Merck Chemicals International, USA）を用いて染色した。要すれば、各切片をパラフィン除去し、蒸留水で水和させた。水和した切片を蒸留水で洗い、その後、過ヨウ素酸で処理した。次いで、得られた切片をアルデヒドで処理することによって酸化し、シッフ試薬と１０分間反応させることによって赤紫色に染色した。切片をヘマトキシリンで対比染色し、その後、脱水および清浄化プロセスに付した。切片をマウント剤を用いてマウントした。マウントしたスライドにおいて、バーチャル顕微鏡（NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu Photonics K.K., Japan）を用いて写真撮影および組織分析を行った。
【００７７】
その結果、正常対照群とＤＳ Ｄ１０対照群の比較において、正常対照群と比較してＤＳ Ｄ１０対照群において杯細胞の数が少ないことが視覚的に確認された。一方、ＧＢＴ−２０１、ジクアスまたはシードラの点眼処置に付した群では、ＤＳ Ｄ１０対照群と比較して杯細胞の数が増加したことが視覚的に確認された（図２）。
【００７８】
特に、染色領域の定量化によって、次の結果が得られた。ＤＳ Ｄ１０対照群における杯細胞の数は、正常対照群における杯細胞の数と比較して約６５．９％少なかった（１６．４７６±１．７２２／０．１ｍｍ２に対して５．６１９±０．９１８細胞／０．１ｍｍ２）。一方、ＧＢＴ−２０１群における杯細胞の数は、ＤＳ Ｄ１０対照群における杯細胞の数と比較して約２倍〜２．４倍多かった（１１．１４３±０．４９５細胞／０．１ｍｍ２、１３．６１９±０．９１８細胞／０．１ｍｍ２に対して５．６１９±０．９１８細胞／０．１ｍｍ２）。さらに、ジクアスまたはシードラの点眼処置に付した群における杯細胞の数は、ＤＳ Ｄ１０対照群と比較して約１．１倍多かった（１１．２３８±０．４３６細胞／０．１ｍｍ２、６．０９５±１．０８２細胞／０．１ｍｍ２に対して５．９０５±１．１９０細胞／０．１ｍｍ２）。特に、４回のＧＢＴ−２０１点眼処置に付した群における杯細胞の数は、正常対照群における杯細胞のレベルに回復した（図３）。
【００７９】
試験例３．チモシンβ４点眼処置後のムチン分泌量の増加の確認
チモシンβ４が結膜においてムチン分泌量の増加をもたらすかを調べるために、試験例１で犠牲にしたマウスから眼球を採り、アルシアンブルー染色によって評価した。
【００８０】
具体的には、試験例１で犠牲にしたマウスから眼球を採り、ホルマリン中で３日間固定されている眼および付属器を、ミクロトームで６μｍの切片に切断した。６μｍの厚さに切断した眼および付属器の切片を、Alcian Blue pH 2.5 Stain Kit（Abcam Inc, Cambridge, MA）を用いて染色した。要すれば、各切片をパラフィン除去し、蒸留水で水和させた。水和した切片を蒸留水で洗い、酢酸溶液と３分間反応させることによって酸化し、その後、蒸留水で洗った。酸化した切片を、ムチンが青色に染色されるようにアルシアンブルー液中で１５分間反応させた。
【００８１】
次いで、対比染色のために、アルシアンブルーで染色した切片を蒸留水で２回洗い、その後、サフラニンＯ液を用いて対比染色した。次いで、切片を脱水および清浄化プロセスに付した。切片をマウント剤を用いてマウントした。マウントしたスライドにおいて、バーチャル顕微鏡（NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu Photonics K.K., Japan）を用いて写真撮影および組織分析を行った。
【００８２】
その結果、正常対照群とＤＳ Ｄ１０対照群の比較において、正常対照群と比較してＤＳ Ｄ１０対照群においてムチン分泌量が少ないことが視覚的に確認された。一方、ＧＢＴ−２０１、ジクアスまたはシードラの点眼処置に付した群では、ＤＳ Ｄ１０対照群と比較してムチン分泌量が増加したことが視覚的に確認された（図４）。
【００８３】
特に、染色領域の定量化によって、次の結果が得られた。ＤＳ Ｄ１０対照群におけるムチン分泌量は、正常対照群におけるムチン分泌量と比較して約６５．６％少なかった（１４．９５２±２．４６３細胞／０．１ｍｍ２に対して５．１４３±０．８５７細胞／０．１ｍｍ２）。一方、ＧＢＴ−２０１群におけるムチン分泌量は、ＤＳ Ｄ１０対照群におけるムチン分泌量と比較して約２．６倍多かった（１２．０９５±１．４３８細胞／０．１ｍｍ２、１３．１４３±１．０３０細胞／０．１ｍｍ２に対して５．１４３±０．８５７細胞／０．１ｍｍ２）。さらに、ジクアスまたはシードラの点眼処置に付した群におけるムチン分泌量は、ＤＳ Ｄ１０対照群と比較して、それぞれ約１．３倍または約１．５倍多かった（６．５７１±０．８５７細胞／０．１ｍｍ２、７．７１４±１．７１４細胞／０．１ｍｍ２に対して５．１４３±０．８５７細胞／０．１ｍｍ２）。特に、ＧＢＴ−２０１の点眼処置に付した２つの群におけるムチン分泌量は、正常対照群におけるムチン分泌量のレベルに回復した（図５）。
【００８４】
試験例４．チモシンβ４点眼処置後のＭｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４およびＭｕｃ１６の発現レベル増加の確認
【００８５】
チモシンβ４が結膜におけるＭｕｃ５ＡＣ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４およびＭｕｃ１６の発現レベル増加をもたらすかを調べるために、試験例１で犠牲にしたマウスから眼球を採り、免疫蛍光染色した。
【００８６】
具体的には、試験例１で犠牲にしたマウスから眼球を採り、ホルマリン中で３日間固定されている眼および付属器を、ミクロトームで６μｍの切片に切断した。６μｍの厚さに切断した角膜および結膜部分の眼の各切片を、ＰＢＳで再水和させ、次いで０．３％Triton X-100溶液に２０分間浸漬した。その後、切片をＰＢＳで３回洗い、次いで、非特異的染色を防ぐために３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液に１時間浸漬した。その後、抗Ｍｕｃ１抗体（1:250, Abcam Inc, Cambridge, MA）、抗Ｍｕｃ４抗体（1:250, Bioss Inc, Woburn, MA）、抗Ｍｕｃ５ＡＣ抗体（1:250, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA）、抗Ｍｕｃ１６抗体（1:250, Abbiotec Inc, San Diego, CA）による処理を行い、４℃の温度で一晩反応させた。翌日、切片をＰＢＳで３回洗った。Alexa Fluor（商標）488 ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（1:500; Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA）、またはAlexa Fluor（商標）555 ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（1:500; Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA）による処理を行い、室温で１時間反応させた。その後、切片をＰＢＳで３回洗い、ＤＡＰＩを含むマウント剤を用いてマウントした。マウントしたスライドにおいて、蛍光顕微鏡（Leica DM2500, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)）を用いて写真撮影を行った。
【００８７】
その結果、図６および７に示されるように、角膜および結膜上皮の表面層において、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ４およびＭｕｃ１６が赤色に染色された。正常対照群とＤＳ Ｄ１０対照群の比較において、正常対照群と比較してＤＳ Ｄ１０対照群においてＭｕｃ１、Ｍｕｃ４およびＭｕｃ１６発現レベルが低いことが視覚的に確認された。一方、ＧＢＴ−２０１の点眼処置に付した群では、ＤＳ Ｄ１０対照群と比較してＭｕｃ１、Ｍｕｃ４およびＭｕｃ１６発現レベルが顕著に高いことが視覚的に確認された。
【００８８】
さらに、図６および７に示されるように、角膜および結膜においてＭｕｃ５ＡＣが緑色に染色された。正常対照群とＤＳ Ｄ１０対照群の比較において、正常対照群と比較してＤＳ Ｄ１０対照群においてＭｕｃ５ＡＣ発現レベルが低いことが視覚的に確認された。一方、ＧＢＴ−２０１またはジクアスの点眼処置に付した群では、ＤＳ Ｄ１０対照群と比較してＭｕｃ５ＡＣ発現レベルが高いことが視覚的に確認された。特に、ＧＢＴ−２０１の点眼処置に付した群においてＧＢＴ−２０１発現レベルが顕著に高められた。
【図１】
2021504349.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021504349.tif 000009
【図６】
2021504349.tif 000010
【図７】
2021504349.tif 000011
【配列表】
2021504349000001.app
【国際調査報告】
2021504349.tif 000012
2021504349.tif 000013
2021504349.tif 000014
2021504349.tif 000015
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