(57)【要約】  細胞のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)遺伝子機能を回復させることができるアデノ随伴ウイルス(AAV)組成物が、本明細書で提供される。前記AAV組成物の使用方法、及び前記AAV組成物を作製するためのパッケージング系も、提供される。
2021512871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)遺伝子の突然変異を修正する方法であって、前記細胞に複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)で形質導入する工程を含み、AAVが、
(a)AAVカプシドと、
(b)修正ゲノムと
を含み、
前記修正ゲノムが、(i)PAH遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための編集エレメントと、(ii)前記標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの5'側の5'相同アームヌクレオチド配列と、(iii)前記標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの3'側の3'相同アームヌクレオチド配列とを含み、
前記細胞は、外因性ヌクレアーゼ、又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を同時形質導入も同時投与もせずに、形質導入される、方法。
【請求項２】
前記細胞が、肝細胞、腎細胞、又は脳、下垂体、副腎、膵臓、膀胱、胆嚢、結腸、小腸若しくは乳房における細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、哺乳動物対象の細胞であり、AAVが、前記対象の細胞への形質導入に有効な量で前記対象に投与される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
PAH遺伝子突然変異に関連する疾患又は障害に罹患している対象を処置する方法であって、
(a)AAVカプシドと、
(b)修正ゲノムと
を含む複製欠損AAVの有効量を、前記対象に投与するステップを含み、
前記修正ゲノムが、(i)PAH遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための編集エレメントと、(ii)前記標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの5'側の5'相同アームヌクレオチド配列と、(iii)前記標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの3'側の3'相同アームヌクレオチド配列とを含み、
外因性ヌクレアーゼ、又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、前記対象に同時投与されない、方法。
【請求項５】
前記疾患又は障害が、フェニルケトン尿症である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記対象がヒト対象である、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項７】
前記編集エレメントが、PAHコード配列の少なくとも一部分を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記編集エレメントが、PAHコード配列を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記PAHコード配列が、配列番号23に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項7又は8に記載の方法。
【請求項１０】
前記PAHコード配列が、配列番号24に記載の配列を含む、請求項7から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
PAHコード配列が、サイレント変化を有する、請求項7から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記PAHコード配列が、配列番号25、116、131、132、138、139、又は143に記載の配列を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記編集エレメントが、PAHイントロン挿入コード配列を含み、必要に応じて、前記PAHイントロン挿入コード配列が、PAHコード配列に挿入された非天然イントロンを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
前記非天然イントロンが、ヘモグロビンベータ遺伝子の第1のイントロンとマウス微小ウイルス(MVM)イントロンとからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記非天然イントロンが、配列番号28〜30、及び120〜130のうちのいずれか1つと少なくとも90%同一のヌクレオチド配列からなる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記非天然イントロンが、配列番号28〜30、及び120〜130のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記PAHイントロン挿入コード配列が、配列番号23に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項13から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記PAHイントロン挿入コード配列が、5'から3'に向かって、PAHコード配列の第1の部分と、イントロンと、PAHコード配列の第2の部分とを含み、前記第1の部分及び前記第2の部分が、共にスプライシングされると、完全PAHコード配列を形成する、請求項13から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記PAHコード配列が、配列番号24に記載の配列を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
PAHコード配列が、サイレント変化を有する、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記PAHコード配列が、配列番号25、116、131、132、138、139、又は143に記載の配列を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記PAHコード配列の前記第1の部分が、配列番号64若しくは65に記載のアミノ酸配列を含み、及び/又は前記PAHコード配列の前記第2の部分が、配列番号66若しくは67に記載のアミノ酸配列を含む、請求項18から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記PAHコード配列の前記第1の部分が、配列番号64又は65に記載のアミノ酸配列からなり、前記PAHコード配列の前記第2の部分が、配列番号66又は67に記載のアミノ酸配列からなる、請求項18から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記編集エレメントが、5'から3'に向かって、リボソームスキッピングエレメントと、前記PAHコード配列又は前記PAHイントロン挿入コード配列とを含む、請求項7から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記編集エレメントが、前記PAHコード配列又は前記PAHイントロン挿入コード配列の3'側にポリアデニル化配列を更に含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリアデニル化配列が、外因性ポリアデニル化配列であり、必要に応じて、前記外因性ポリアデニル化配列が、SV40ポリアデニル化配列である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記SV40ポリアデニル化配列が、配列番号31〜34からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドが、前記PAH遺伝子のエクソン内にある、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドが、前記PAH遺伝子のエクソン1内にある、請求項24から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記編集エレメントが、前記リボソームスキッピングエレメントの5'側にスプライスアクセプターを更に含む、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドが、前記PAH遺伝子のイントロン内にある、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドが、前記PAH遺伝子のイントロン1内にある、請求項30又は31に記載の方法。
【請求項３３】
前記編集エレメントが、配列番号35に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記5'相同アームヌクレオチド配列が、前記第1のゲノム領域と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記3'相同アームヌクレオチド配列が、前記第2のゲノム領域と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第1のゲノム領域が、第1の編集ウィンドウ内に位置し、前記第2のゲノム領域が、第2の編集ウィンドウ内に位置する、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第1の編集ウィンドウが、配列番号36又は45に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記第2の編集ウィンドウが、配列番号36又は45に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項36又は37に記載の方法。
【請求項３９】
前記第1の編集ウィンドウが、配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第2の編集ウィンドウが、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項36から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第1のゲノム領域が、配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第2のゲノム領域が、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記5'及び3'相同アームヌクレオチド配列の各々が、独立して、約100〜約2000ヌクレオチドの長さを有する、請求項1から41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記5'相同アームが、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68)、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及び/又は前記PAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するAを含む、請求項1から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記5'相同アームが、
(a)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG;
(b)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA;
(c)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA;
(d)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA;
(e)前記PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG;
(f)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC;
(g)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68);並びに/又は
(h)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するA
を含む、請求項1から43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記5'相同アームが、(c)及び(d)、(f)及び(g)、並びに/又は(b)及び(h)の修飾を含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記5'相同アームが、配列番号36〜44、111、115、及び142のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1から45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記3'相同アームが、配列番号45、112、117、144に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記修正ゲノムが、配列番号46〜54、113、118、134、136、及び145のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記修正ゲノムが、5'相同アームヌクレオチド配列の5'側に5'逆方向末端反復(5'ITR)ヌクレオチド配列を、及び3'相同アームヌクレオチド配列の3'側に3'逆方向末端反復(3'ITR)ヌクレオチド配列を更に含む、請求項1から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記5'ITRヌクレオチド配列が、配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3'ITRヌクレオチド配列が、配列番号19に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記5'ITRヌクレオチド配列が、配列番号20に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3'ITRヌクレオチド配列が、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項49に記載の方法。
【請求項５２】
前記5'ITRヌクレオチド配列が、配列番号26に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3'ITRヌクレオチド配列が、配列番号27に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項49に記載の方法。
【請求項５３】
前記修正ゲノムが、配列番号55〜63、114、119、135、137、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1から52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記修正ゲノムが、配列番号55〜63、114、119、135、137、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1から53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記AAVカプシドが、AAVクレードFカプシドタンパク質を含む、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cである、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含む、請求項57に記載の方法。
【請求項６０】
前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Dであり、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cである、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６４】
前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Tであり、配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸68に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Vであり、配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Lであり、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Dであり、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
(a)配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Tであり、及び配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、及び配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Yであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Lであり、及び配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであるか、
(e)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであるか、
(f)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであるか、
(g)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、
(h)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、又は
(i)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cである、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６８】
前記AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、前記標的遺伝子座への前記編集エレメントの組込み効率が、少なくとも1%である、請求項1から67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、前記標的遺伝子座への前記編集エレメントの組込みのアレル頻度が、少なくとも0.5%である、請求項1から68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)であって、AAVが、
(a)AAVカプシドと、
(b)修正ゲノムと
を含み、
前記修正ゲノムが、(i)PAH遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための編集エレメントと、(ii)前記標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの5'側の5'相同アームヌクレオチド配列と、(iii)前記標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの3'側の3'相同アームヌクレオチド配列とを含む、AAV。
【請求項７１】
前記編集エレメントが、PAHコード配列の少なくとも一部分を含む、請求項70に記載のAAV。
【請求項７２】
前記編集エレメントが、PAHコード配列を含む、請求項70又は71に記載のAAV。
【請求項７３】
前記PAHコード配列が、配列番号23に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項71又は72に記載のAAV。
【請求項７４】
前記PAHコード配列が、配列番号24に記載の配列を含む、請求項73に記載のAAV。
【請求項７５】
PAHコード配列が、サイレント変化を有する、請求項73に記載のAAV。
【請求項７６】
前記PAHコード配列が、配列番号25、116、131、132、138、139、又は143に記載の配列を含む、請求項75に記載のAAV。
【請求項７７】
前記編集エレメントが、PAHイントロン挿入コード配列を含み、必要に応じて、前記PAHイントロン挿入コード配列が、PAHコード配列に挿入された非天然イントロンを含む、請求項71に記載のAAV。
【請求項７８】
前記非天然イントロンが、ヘモグロビンベータ遺伝子の第1のイントロンとマウス微小ウイルス(MVM)イントロンとからなる群から選択される、請求項77に記載のAAV。
【請求項７９】
前記非天然イントロンが、配列番号28〜30、及び120〜130のうちのいずれか1つと少なくとも90%同一のヌクレオチド配列からなる、請求項78に記載のAAV。
【請求項８０】
前記非天然イントロンが、配列番号28〜30、及び120〜130のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる、請求項79に記載のAAV。
【請求項８１】
前記PAHイントロン挿入コード配列が、配列番号23に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項77から80のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項８２】
前記PAHイントロン挿入コード配列が、5'から3'に向かって、PAHコード配列の第1の部分と、イントロンと、PAHコード配列の第2の部分とを含み、前記第1部分と前記第2の部分が、共にスプライシングされると、完全PAHコード配列を形成する、請求項77から81のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項８３】
前記PAHコード配列が、配列番号24に記載の配列を含む、請求項82に記載のAAV。
【請求項８４】
前記PAHコード配列が、サイレント変化を有する、請求項82に記載のAAV。
【請求項８５】
前記PAHコード配列が、配列番号25、116、131、132、138、139、又は143に記載の配列を含む、請求項84に記載のAAV。
【請求項８６】
前記PAHコード配列の前記第1の部分が、配列番号64若しくは65に記載のアミノ酸配列を含み、及び/又は前記PAHコード配列の前記第2の部分が、配列番号66若しくは67に記載のアミノ酸配列を含む、請求項82から85のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項８７】
前記PAHコード配列の前記第1の部分が、配列番号64又は65に記載のアミノ酸配列からなり、前記PAHコード配列の前記第2の部分が、配列番号66又は67に記載のアミノ酸配列からなる、請求項82から86のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項８８】
前記編集エレメントが、5'から3'に向かって、リボソームスキッピングエレメントと、前記PAHコード配列又は前記PAHイントロン挿入コード配列とを含む、請求項71から87のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項８９】
前記編集エレメントが、前記PAHコード配列又は前記PAHイントロン挿入コード配列の3'側にポリアデニル化配列を更に含む、請求項88に記載のAAV。
【請求項９０】
前記ポリアデニル化配列が、外因性ポリアデニル化配列であり、必要に応じて、前記外因性ポリアデニル化配列が、SV40ポリアデニル化配列である、請求項89に記載のAAV。
【請求項９１】
前記SV40ポリアデニル化配列が、配列番号31〜34からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項90に記載のAAV。
【請求項９２】
前記標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドが、前記PAH遺伝子のエクソン内にある、請求項88から91のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項９３】
前記標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドが、前記PAH遺伝子のエクソン1内にある、請求項88から92のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項９４】
前記編集エレメントが、前記リボソームスキッピングエレメントの5'側にスプライスアクセプターを更に含む、請求項88から91のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項９５】
前記標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドが、前記PAH遺伝子のイントロン内にある、請求項94に記載のAAV。
【請求項９６】
前記標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドが、前記PAH遺伝子のイントロン1内にある、請求項94又は95に記載のAAV。
【請求項９７】
前記編集エレメントが、配列番号35に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項70から96のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項９８】
前記5'相同アームヌクレオチド配列が、前記第1のゲノム領域と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である、請求項70から97のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項９９】
前記3'相同アームヌクレオチド配列が、前記第2のゲノム領域と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である、請求項70から98のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１００】
前記第1のゲノム領域が、第1の編集ウィンドウ内に位置し、前記第2のゲノム領域が、第2の編集ウィンドウ内に位置する、請求項70から99のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１０１】
前記第1の編集ウィンドウが、配列番号36又は45に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項100に記載のAAV。
【請求項１０２】
前記第2の編集ウィンドウが、配列番号36又は45に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項100又は101に記載のAAV。
【請求項１０３】
前記第1の編集ウィンドウが、配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなり、前記第2の編集ウィンドウが、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項100から102のいずれか一項に記載AAV。
【請求項１０４】
前記第1のゲノム領域が、配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項70から103のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１０５】
前記第2のゲノム領域が、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項70から104のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１０６】
前記5'及び3'相同アームヌクレオチド配列の各々が、独立して、約100〜約2000ヌクレオチドの長さを有する、請求項70から105のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１０７】
前記5'相同アームが、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68)、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及び/又は前記PAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するAを含む、請求項70から106のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１０８】
前記5'相同アームが、
(a)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、前記PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG;
(b)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA;
(c)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA;
(d)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA;
(e)前記PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG;
(f)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC;
(g)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68);並びに/又は
(h)前記PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、前記PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及び前記PAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するA
を含む、請求項70から107のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１０９】
前記5'相同アームが、(c)及び(d)、(f)及び(g)、並びに/又は(b)及び(h)の修飾を含む、請求項108に記載のAAV。
【請求項１１０】
前記5'相同アームが、配列番号36〜44、111、115、及び142のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる、請求項70から109のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１１１】
前記3'相同アームが、配列番号45、112、117、144に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項70から110のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１１２】
前記修正ゲノムが、配列番号46〜54、113、118、134、136、及び145のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項70から111のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１１３】
前記修正ゲノムが、5'相同アームヌクレオチド配列の5'側に5'逆方向末端反復(5'ITR)ヌクレオチド配列を、及び3'相同アームヌクレオチド配列の3'側に3'逆方向末端反復(3'ITR)ヌクレオチド配列を更に含む、請求項70から112のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１１４】
前記5'ITRヌクレオチド配列が、配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3'ITRヌクレオチド配列が、配列番号19に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項113に記載のAAV。
【請求項１１５】
前記5'ITRヌクレオチド配列が、配列番号20に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3'ITRヌクレオチド配列が、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項113に記載のAAV。
【請求項１１６】
前記5'ITRヌクレオチド配列が、配列番号26に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3'ITRヌクレオチド配列が、配列番号27に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項113に記載のAAV。
【請求項１１７】
前記修正ゲノムが、配列番号55〜63、114、119、135、137、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項70から116のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１１８】
前記修正ゲノムが、配列番号55〜63、114、119、135、137、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる、請求項70から117のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１１９】
前記AAVカプシドが、AAVクレードFカプシドタンパク質を含む、請求項70から118のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１２０】
前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項70から119のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１２１】
配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、請求項120に記載のAAV。
【請求項１２２】
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cである、請求項121に記載のAAV。
【請求項１２３】
前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含む、請求項121に記載AAV。
【請求項１２４】
前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項70から123のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１２５】
配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Dであり、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、請求項124に記載のAAV。
【請求項１２６】
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cである、請求項125に記載のAAV。
【請求項１２７】
前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含む、請求項125に記載AAV。
【請求項１２８】
前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項70から127のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１２９】
配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Tであり、配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸68に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Vであり、配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Lであり、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Dであり、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、請求項128に記載のAAV。
【請求項１３０】
(a)配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Tであり、及び配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、及び配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Yであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Lであり、及び配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであるか、
(e)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gであるか、
(f)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであるか、
(g)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、
(h)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであるか、又は
(i)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cである、請求項129に記載のAAV。
【請求項１３１】
前記カプシドタンパク質が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含む、請求項129に記載AAV。
【請求項１３２】
前記AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、前記標的遺伝子座への前記編集エレメントの組込み効率が、少なくとも1%である、請求項70から131のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１３３】
前記AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、前記標的遺伝子座への前記編集エレメントの組込みのアレル頻度が、少なくとも0.5%である、請求項70から132のいずれか一項に記載のAAV。
【請求項１３４】
請求項70から133のいずれか一項に記載のAAVを含む、医薬組成物。
【請求項１３５】
複製欠損AAVの組換え調製のためのパッケージング系であって、
(a)1つ又は複数のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列と、
(b)請求項119から131のいずれか一項に記載の1つ又は複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列と、
(c)請求項70から118、132、及び133のいずれか一項に記載の修正ゲノムと
を含み、細胞内で前記修正ゲノムを前記カプシドに封入して前記AAVを形成するのに有効である、パッケージング系。
【請求項１３６】
前記Repヌクレオチド配列及び前記Capヌクレオチド配列を含む第1のベクターと、前記修正ゲノムを含む第2のベクターとを含む、請求項135に記載のパッケージング系。
【請求項１３７】
前記Repヌクレオチド配列が、AAV2 Repタンパク質をコードする、請求項135又は136に記載のパッケージング系。
【請求項１３８】
前記AAV2 Repタンパク質が、78/68又はRep 68/52である、請求項137に記載のパッケージング系。
【請求項１３９】
前記AAV2 Repタンパク質が、配列番号22のAAV2 Repアミノ酸配列に対して最小の配列同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含み、前記最小の配列同一性パーセントが、前記AAV2 Repタンパク質をコードするアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも70%である、請求項137又は138に記載のパッケージング系。
【請求項１４０】
第3のベクターを更に含み、前記第3のベクターが、ヘルパーウイルスベクターである、請求項136から139のいずれか一項に記載のパッケージング系。
【請求項１４１】
前記ヘルパーウイルスベクターが、独立した第3のベクターである、請求項140に記載のパッケージング系。
【請求項１４２】
前記ヘルパーウイルスベクターが、第1のベクターと一体になっている、請求項140に記載のパッケージング系。
【請求項１４３】
前記ヘルパーウイルスベクターが、第2のベクターと一体になっている、請求項140に記載のパッケージング系。
【請求項１４４】
前記第3のベクターが、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項140から143のいずれか一項に記載のパッケージング系。
【請求項１４５】
ヘルパーウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びサイトメガロウイルス(CMV)からなる群から選択される、請求項140から144のいずれか一項に記載のパッケージング系。
【請求項１４６】
前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、請求項145に記載のパッケージング系。
【請求項１４７】
アデノウイルスゲノムが、E1、E2、E4及びVAからなる群から選択される1つ又は複数のアデノウイルスRNA遺伝子を含む、請求項146に記載のパッケージング系。
【請求項１４８】
前記ヘルパーウイルスが、単純ヘルペスウイルス(HSV)である、請求項145に記載のパッケージング系。
【請求項１４９】
HSVゲノムが、UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及びUL30/UL42からなる群から選択されるHSV遺伝子のうちの1つ又は複数を含む、請求項148に記載のパッケージング系。
【請求項１５０】
前記第1のベクター及び前記第3のベクターが、第1のトランスフェクトプラスミドに含有される、請求項140から149のいずれか一項に記載のパッケージング系。
【請求項１５１】
前記第2のベクター及び前記第3のベクターのヌクレオチドが、第2のトランスフェクトプラスミドに含有される、請求項140から149のいずれか一項に記載のパッケージング系。
【請求項１５２】
前記第1のベクター及び前記第3のベクターのヌクレオチドが、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる、請求項140から149のいずれか一項に記載のパッケージング系。
【請求項１５３】
前記第2のベクター及び前記第3のベクターのヌクレオチドが、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる、請求項140から149のいずれか一項に記載のパッケージング系。
【請求項１５４】
複製欠損AAVの組換え調製のための方法であって、前記修正ゲノムを前記カプシドに封入して前記AAVを形成するのに有効な条件下で、請求項135から153のいずれか一項に記載のパッケージング系を細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2018年2月1日に出願した米国特許仮出願第62/625,149号、及び2018年5月16日に出願した米国特許仮出願第62/672,377号の優先権を主張するものであり、これらの米国特許仮出願の全内容は、これにより参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
電子的に提出する配列表への参照
ASCIIテキストファイル(名称:HMT-024PC_SeqList_ST25.txt;サイズ:367,287バイト;及び作成日:2019年1月30日)により電子的に提出する配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
フェニルケトン尿症(PKU)は、原因の大部分がフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)遺伝子の突然変異に起因する、常染色体劣性遺伝性障害である。PAH遺伝子は、多量体化時のL-フェニルアラニン(Phe)からL-チロシン(Tyr)へのヒドロキシル化を触媒する肝酵素をコードする。PAH活性の低下又は喪失は、フェニルアラニン蓄積、及びフェニルピルビン酸(フェニルケトンとしても公知)へのその変換につながる。フェニルアラニン代謝のこの異常は、ニューロン突然変異及びミエリン合成を損なわせ、その結果、精神遅滞、てんかん発作及び他の重篤な医学的問題が生じることになる。
【０００４】
現在、PKUには治療法がない。標準的なケアは、大量のフェニルアラニンを含有する食物を最小限に抑えることによる食事管理である。出生時からの低フェニルアラニンの粉ミルクでの食事管理により、この障害の神経学的影響の発生が予防される。しかし、低タンパク質食を摂っていても、小児は、やはり発達遅滞を患い、成人は、多くの場合、骨粗鬆症及びビタミン欠乏症にかかる。更に、生涯にわたる食療法の遵守は、特に就学年齢を超えると、困難である。
【０００５】
大型中性アミノ酸(LNAA)補給、補因子テトラヒドロビオプテリン療法、酵素補充療法及び遺伝子組換えプロバイオティクス療法をはじめとする、新たな処置戦略が、最近、浮上してきた。しかし、これらの戦略には欠点がある。LNAA補給は、低Phe食を遵守しない成人にしか適さない。補因子テトラヒドロビオプテリンは、一部の軽症型のPKUにしか使用することができない。PAHの代用品、例えばフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、の投与による酵素補充は、有効性を低下させる及び/又は副作用を引き起こす、免疫応答をもたらしうる。遺伝子組換えプロバイオティクス療法に関しては、PAL発現大腸菌(E. coli)の病原性が懸念されている。
【０００６】
遺伝子療法は、PKUを治療するまたとない機会を提供する。レンチウイルスベクターをはじめとするレトロウイルスベクターは、核酸を宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。しかし、これらのベクターは、ゲノムへのそれらの非標的化挿入のため、安全性の懸念を提起しうる。例えば、前記ベクターには、腫瘍抑制遺伝子を破壊すること又は癌遺伝子を活性化することによって悪性疾患を引き起こすリスクがある。実際、ガンマレトロウイルスベクターでCD34+骨髄前駆細胞に形質導入することによりX連鎖重症複合免疫不全(SCID)を処置する臨床試験では、10名のうち4名の患者が白血病を発症した(Hacein-Bey-Abinaら、J Clin Invest. (2008) 118(9):3132〜42頁)。
【０００７】
メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びクラスター化して規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し(CRISPR)技術等の、ヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術を使用して、PKU患者のPAH遺伝子の欠陥を修正することができるのではないかと、推測されてもいる。しかし、これらの技術の各々は、所期の標的部位に配列が類似しているヒトゲノム内の部位に対するオフターゲット突然変異の可能性のため、安全性の懸念を提起する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第7,790,154号
【特許文献２】米国特許第9,783,824号
【特許文献３】米国特許第9,623,120号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hacein-Bey-Abinaら、J Clin Invest. (2008) 118(9):3132〜42頁
【非特許文献２】Mauro及びChappell (2014) Trends Mol Med. 20(11):604〜13頁
【非特許文献３】Sibleyら、(2016) Nature Reviews Genetics、17、407〜21頁
【非特許文献４】Zhang (1998) Human Molecular Genetics、7(5):919〜32頁
【非特許文献５】Luら(2013) Molecular Therapy 21(5):954〜63頁
【非特許文献６】Luら(2017) Hum. Gene Ther. 28(1):125〜34頁
【非特許文献７】Sherryら、Nucleic Acids Res. 2001; 29(1):308〜11頁
【非特許文献８】Nucleic Acids Res. 2014; 42(データベース特集号):D986〜92
【非特許文献９】Nucleic Acids Res. 2014; 42(データベース特集号):D980〜D985
【非特許文献１０】Nucleic Acids Res. 2016; 44(データベース特集号):D67〜D72
【非特許文献１１】genome.ucsc.edu/encode/terms.html
【非特許文献１２】Nucleic Acids Res. 2018; 46(D1):D260〜D266
【非特許文献１３】Messeguerら、Bioinformatics 2002; 18(2):333〜334頁
【非特許文献１４】Farreら、Nucleic Acids Res. 2003; 31(13):3651〜3653頁
【非特許文献１５】Savyら、Human Gene Therapy Methods (2017) 28(5):277〜289頁
【非特許文献１６】Remington's Pharmaceutical Sciences、現行版、Mack Publishing社、Easton Pa. 18042、USA
【非特許文献１７】A. Gennaro (2000)「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、Lippincott, Williams, & Wilkins社
【非特許文献１８】Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Anselら、第7版、Lippincott, Williams, & Wilkins社
【非特許文献１９】Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbeら、第3版、Amer. Pharmaceutical Assoc.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、PKU患者のPAH遺伝子機能を効率的に且つ安全に回復させることができる、改善された遺伝子療法組成物及び方法が、当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
細胞のPAH遺伝子機能を回復させることができるアデノ随伴ウイルス(AAV)組成物、及びPAH遺伝子機能の低下に関連する疾患(例えば、PKU)を処置するために前記組成物を使用する方法が、本明細書で提供される。アデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージング系も提供される。
【００１２】
したがって、一態様では、本開示は、細胞内のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)遺伝子の突然変異を修正する方法であって、前記細胞に複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)で形質導入する工程を含み、AAVが、
(a)AAVカプシドと、
(b)修正ゲノムと
を含み、
前記修正ゲノムが、(i)PAH遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための編集エレメントと、(ii)前記標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの5'側の5'相同アームヌクレオチド配列と、(iii)前記標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの3'側の3'相同アームヌクレオチド配列とを含み、
前記細胞は、外因性ヌクレアーゼ、又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を同時形質導入も同時投与もせずに、形質導入される、方法を提供する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、細胞は、肝細胞、腎細胞、又は脳、下垂体、副腎、膵臓、膀胱、胆嚢、結腸、小腸若しくは乳房における細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物対象の細胞であり、AAVは、前記対象の細胞への形質導入に有効な量で前記対象に投与される。
【００１４】
別の態様では、本開示は、PAH遺伝子突然変異に関連する疾患又は障害に罹患している対象を処置する方法であって、
(a)AAVカプシドと、
(b)修正ゲノムと
を含む複製欠損アデノ随伴ウイルスの有効量を、前記対象に投与するステップを含み、
前記修正ゲノムが、(i)PAH遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための編集エレメントと、(ii)前記標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの5'側の5'相同アームヌクレオチド配列と、(iii)前記標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの3'側の3'相同アームヌクレオチド配列とを含み、
外因性ヌクレアーゼ、又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、前記対象に同時投与されない、方法を提供する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、疾患又は障害は、フェニルケトン尿症である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト対象である。
【００１６】
別の態様では、本開示は、複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)であって、AAVが、
(a)AAVカプシドと、
(b)修正ゲノムと
を含み、
前記修正ゲノムが、(i)PAH遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための編集エレメントと、(ii)前記標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの5'側の5'相同アームヌクレオチド配列と、(iii)前記標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの3'側の3'相同アームヌクレオチド配列とを含む、AAVを提供する。
【００１７】
以下の実施形態は、上述の態様の各々に当てはまる。
【００１８】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、PAHコード配列の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、PAHコード配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号23に記載のアミノ酸配列をコードする。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号24に記載の配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、サイレント変化を有する。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号25、116、131、132、138、139、又は143に記載の配列を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、PAHイントロン挿入コード配列を含み、必要に応じて、前記PAHイントロン挿入コード配列は、PAHコード配列に挿入された非天然イントロンを含む。ある特定の実施形態では、非天然イントロンは、ヘモグロビンベータ遺伝子の第1のイントロンとマウス微小ウイルス(MVM)イントロンとからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、非天然イントロンは、配列番号28〜30、及び120〜130のうちのいずれか1つと少なくとも90%同一のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、非天然イントロンは、配列番号28〜30、及び120〜130のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる。
【００２０】
ある特定の実施形態では、PAHイントロン挿入コード配列は、配列番号23に記載のアミノ酸配列をコードする。ある特定の実施形態では、PAHイントロン挿入コード配列は、5'から3'に向かって、PAHコード配列の第1の部分と、イントロンと、PAHコード配列の第2の部分とを含み、前記第1の部分と前記第2の部分は、共にスプライシングされると、完全PAHコード配列を形成する。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号24に記載の配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、サイレント変化を有する。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号25又は116に記載の配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列の第1の部分は、配列番号64若しくは65に記載のアミノ酸配列を含み、及び/又はPAHコード配列の第2の部分は、配列番号66若しくは67に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列の第1の部分は、配列番号64又は65に記載のアミノ酸配列からなり、PAHコード配列の第2の部分は、配列番号66又は67に記載のアミノ酸配列からなる。
【００２１】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、5'から3'に向かって、リボソームスキッピングエレメントと、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列とを含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列の3'側にポリアデニル化配列を更に含む。ある特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、外因性ポリアデニル化配列であり、必要に応じて、前記外因性ポリアデニル化配列は、SV40ポリアデニル化配列である。ある特定の実施形態では、SV40ポリアデニル化配列は、配列番号31〜34からなる群から選択されるヌクレオチド配列、及びそれに相補的な配列を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のエクソン内にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のエクソン1内にある。
【００２３】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、リボソームスキッピングエレメントの5'側にスプライスアクセプターを更に含む。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のイントロン内にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のイントロン1内にある。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号35に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、5'相同アームヌクレオチド配列は、第1のゲノム領域と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である。ある特定の実施形態では、3'相同アームヌクレオチド配列は、第2のゲノム領域と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である。
【００２５】
ある特定の実施形態では、第1のゲノム領域は、第1の編集ウィンドウ内に位置し、第2のゲノム領域は、第2の編集ウィンドウ内に位置する。ある特定の実施形態では、第1の編集ウィンドウは、配列番号36又は45に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第2の編集ウィンドウは、配列番号36又は45に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第1の編集ウィンドウは、配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなり、第2の編集ウィンドウは、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる。
【００２６】
ある特定の実施形態では、第1のゲノム領域は、配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第2のゲノム領域は、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる。
【００２７】
ある特定の実施形態では、5'及び3'相同アームヌクレオチド配列の各々は、独立して、約100〜約2000ヌクレオチド長を有する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68)、PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及び/又はPAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するAを含む。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、
(a)PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、及びPAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG;
(b)PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA、
(c)PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA;
(d)PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA;
(e)PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG;
(f)PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC;
(g)PAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68);並びに/又は
(h)PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するA
を含む。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、(c)及び(d)、(f)及び(g)、並びに/又は(b)及び(h)の修飾を含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、配列番号36〜44、111、115、及び142のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、配列番号45、112、117、144に記載のヌクレオチド配列からなる。
【００３０】
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号46〜54、113、118、134、136、及び145のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、5'相同アームヌクレオチド配列の5'側に5'逆方向末端反復(5'ITR)ヌクレオチド配列を、及び3'相同アームヌクレオチド配列の3'側に3'逆方向末端反復(3'ITR)ヌクレオチド配列を更に含む。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号19に対して少なくとも95%の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号20に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号26に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号27に対して少なくとも95%の配列同一性を有する。
【００３２】
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号55〜63、114、119、135、137、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号55〜63、114、119、135、137、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列からなる。
【００３３】
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、AAVクレードFカプシドタンパク質を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gである。ある特定の実施形態では、
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであるか、又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cである。
【００３５】
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Dであり、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gである。ある特定の実施形態では、
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであるか、又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cである。
【００３７】
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Tであり、配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸68に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Vであり、配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Lであり、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Dであり、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gである。ある特定の実施形態では、
(a)配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Tであり、及び配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Qであるか、
(b)配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、及び配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Yであるか、
(c)配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Kであるか、
(d)配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Lであり、及び配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Sであるか、
(e)配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであり、及び配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであるか、
(f)配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mであるか、
(g)配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであるか、
(h)配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、及び配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであるか、又は
(i)配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、及び配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cである。
【００３９】
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、標的遺伝子座への編集エレメントの組込み効率は、少なくとも1%である。ある特定の実施形態では、AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、標的遺伝子座への編集エレメントの組込みのアレル頻度は、少なくとも0.5%である。
【００４１】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示されるAAVを含む医薬組成物を提供する。
【００４２】
別の態様では、本開示は、AAVの組換え調製のためのパッケージング系であって、
(a)1つ又は複数のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列と、
(b)本明細書で開示される1つ又は複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列と、
(c)本明細書で開示される修正ゲノム又は移入ゲノムと
を含み、細胞内で前記修正ゲノム又は移入ゲノムを前記カプシドに封入して前記AAVを形成するのに有効である、パッケージング系を提供する。
【００４３】
ある特定の実施形態では、パッケージング系は、Repヌクレオチド配列及びCapヌクレオチド配列を含む第1のベクターと、修正ゲノムを含む第2のベクターとを含む。ある特定の実施形態では、Repヌクレオチド配列は、AAV2 Repタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、AAV2 Repタンパク質は、78/68又はRep 68/52である。ある特定の実施形態では、AAV2 Repタンパク質は、配列番号22のAAV2 Repアミノ酸配列に対して最小の配列同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含み、前記最小の配列同一性パーセントは、前記AAV2 Repタンパク質をコードするアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも70%である。
【００４４】
ある特定の実施形態では、パッケージング系は、第3のベクターを更に含み、前記第3のベクターは、ヘルパーウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、独立した第3のベクターである。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、第1のベクターと一体になっている。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、第2のベクターと一体になっている。ある特定の実施形態では、第3のベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００４５】
ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びサイトメガロウイルス(CMV)からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルスである。ある特定の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、E1、E2、E4及びVAからなる群から選択される1つ又は複数のアデノウイルスRNA遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、単純ヘルペスウイルス(HSV)である。ある特定の実施形態では、HSVゲノムは、UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及びUL30/UL42からなる群から選択されるHSV遺伝子のうちの1つ又は複数を含む。
【００４６】
ある特定の実施形態では、第1のベクター及び第3のベクターは、第1のトランスフェクトプラスミドに含有される。ある特定の実施形態では、第2のベクター及び第3のベクターのヌクレオチドは、第2のトランスフェクトプラスミドに含有される。ある特定の実施形態では、第1のベクター及び第3のベクターのヌクレオチドは、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる。ある特定の実施形態では、第2のベクター及び第3のベクターのヌクレオチドは、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる。
【００４７】
別の態様では、本開示は、AAVの組換え調製のための方法であって、修正ゲノム又は移入ゲノムをカプシドに封入してAAVを形成するのに有効な条件下で、本明細書に記載のパッケージング系を細胞に導入する工程を含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】pHMI-hPAH-hAC-008ベクターのマップである。
【図１Ｂ】pHMI-hPAH-h1C-007ベクターのマップである。
【図１Ｃ】pHMIA-hPAH-hI1C-032.1ベクターのマップである。
【図２】pCOH-WT-PAH (「WT PAH」)、pCOH-CO-PAH (「CO PAH pCOH」)及びpHMI-CO-PAH (「CO PAH pHMI」)ベクターからのヒトPAHの発現を示す、ウェスタンブロットの画像である。5×105個のHEK293細胞に1μgのベクターで形質導入した。細胞の溶解物をトランスフェクションの48時間後に収集した。ヒトPAHの発現を、ウェスタンブロットにより、抗PAH抗体(Sigma社製HPA031642)で検出した。抗GAPDH抗体(Millipore社製MAB 374)により検出したときのGAPDHタンパク質の量を、負荷対象として示した。
【図３Ａ】編集標的部位の線形増幅後のPAH cDNAカセット(「LAM-濃縮」)又はPCR増幅後のPAH cDNAカセット(「アンプリコン」)の定量化を示すグラフである。
【図３Ｂ】液滴デジタルPCR(ddPCR)によるpHMI-hPAH-hA-002ベクターの組込みの定量分析を示すグラフである。
【図４Ａ】pHMI-hPAH-mAC-006ベクターの設計、及びマウスゲノムへのその予想される組込みを示す。
【図４Ｂ】pHMI-hPAH-mAC-006ベクターにより編集されたアレルをPCRにより検出する方法を例示する略図である。プライマーの2種類のペアを設計した:第1のペアは、未編集のアレルから867bp DNAを増幅することができ(「対照PCR」)、第2のペアは、編集されたアレルから2459bp DNAを特異的に増幅することができた(「編集アレルPCR」)。
【図４Ｃ】図4Aで例示した通りの対照PCRからのPCR産物(「対照PCR」)及び図4Aで例示した通りの編集アレルPCRからのPCR産物(「編集PCR」)を示す、DNA電気泳動の画像である。AAVHSCカプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクターを、2匹の野生型新生仔マウスに、体重1kg当たりベクターゲノム2×1013個の用量で、尾静脈経由で静脈内注射した。肝臓試料を2週間後に採取した。食塩水処置マウスからの肝臓試料及び3T3マウス線維芽細胞の細胞試料を、編集アレルPCRの陰性対照として使用した。
【図５Ａ】編集されたアレルをddPCRにより定量化する方法を例示する略図である。プライマーの第1のペアは、pHMI-hPAH-mAC-006ベクター内の第1の配列を増幅するように設計し、第1のプローブ(「ベクタープローブ」)は、前記第1の配列とハイブリダイズするように設計した。プライマーの第2ペアは、ベクター付近のマウスゲノム上の第2の配列を増幅するように設計し、第2のプローブ(「遺伝子座プローブ」)は、前記第2の配列とハイブリダイズするように設計した。DNA試料を油滴に分配した。1滴の油滴がベクター粒子とゲノムDNA粒子とをランダムに含有する確率を有意に低下させる(p<0.001)ために、DNAの濃度を20μL当たり600pgに最適化した。ベクターがゲノムに組み込まれると、同じ液滴中のベクタープローブと遺伝子座プローブの二重陽性率は、上昇する。
【図５Ｂ】図5Aに記載の方法を使用して予想される結果を例示する略図である。この略図中の各々のドットは、単一の油滴を表す。ベクタープローブシグナルが陰性であるが遺伝子座プローブシグナルが陽性であるドットは、未編集のアレルを表し、これに対して、ベクタープローブシグナルが陽性であるが遺伝子座プローブシグナルが陽性であるドットは、編集されたアレルを表す。
【図５Ｃ】図5Aに記載の方法を使用してマウス肝臓から生成したデータを示すグラフである。AAVHSCカプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクターを、2匹の野生型新生仔マウスに、体重1kg当たりベクターゲノム2×1013個の用量で、尾静脈経由で静脈内注射した。肝臓試料を2週間後に採取した。1つの試料を、図5Aに記載の方法を使用して分析した。ベクタープローブと遺伝子座プローブの二重陽性ドットが検出された。
【図５Ｄ】食塩水で処置したマウスからの肝臓とpHMI-hPAH-mAC-006プラスミドとを含有する試料から生成したデータを示すグラフである。プローブ及び遺伝子座プローブ二重陽性の液滴は、ほとんど検出されなかった。これは、この試料が、有意に希釈されており、したがって、1滴の油滴がベクター粒子及びゲノムDNA粒子を含有する確率が極めて低いことを示唆する。
【図５Ｅ】図5Dのグラフ及び他の試料から生成したグラフについての定量化を示すグラフである。2匹の対照マウスは、肝臓におけるアレルのそれぞれ0%及び0.0395%が編集され、pHMI-hPAH-mAC-006ベクターで処置した2匹のマウスは、肝臓におけるアレルのそれぞれ2.504%及び2.783%が編集された。
【図６】pHMI-hPAH-mAC-006ベクターの投与後の肝臓におけるヒトPAHのmRNA発現を示すグラフである。RNAを抽出し、逆転写した。プライマーペア及びプローブを、編集されたアレルからのPAH発現を特異的に検出するように設計した。各PAH発現レベルは、内因性Hprtの発現レベルに正規化されたものである。
【図７Ａ】プライマーとプローブのセットを使用してddPCRにより測定して、ベクター及びマウスPAHゲノム遺伝子座コピー数を測定した、マウス血液試料におけるAAVHSCカプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの形質導入効率を示すグラフである。細胞1個当たりのベクターゲノムの数(「VG／細胞」)は、マウスPAHのゲノム遺伝子座のコピー数に対するベクターの数の比の測定値から算出したものである。
【図７Ｂ】プライマープローブセットを使用して多重化ddPCRにより測定して、マウスPAH遺伝子座及びヒトPAH遺伝子座へのAAVベクター(「ペイロード」)の組込みによって組み込まれたDNAの頻度を測定した、マウス血液試料における編集効率パーセンテージを示すグラフである。編集頻度は、別々の核酸分子内へのペイロードと標的DNAの共分配(co-partitioning)の予想確率を超える、単一の液滴内へのペイロードと標的DNA共分配の検出値に基づいて算出した。
【図７Ｃ】AAVHSCカプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの投与後のマウスにおけるベースラインに対する血清フェニルアラニンのパーセンテージレベルを示すグラフである。処置マウス及び対照動物(AAV投与を施さなかったマウス)における平均レベルをプロットしたものである。
【図７Ｄ】AAVHSCカプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクターを注射した個々のマウス各々における又はAAV投与を施さなかった対照マウス各々におけるベースラインに対する血清フェニルアラニンのパーセンテージレベルを示すグラフである。p値は、対照分布に対するANOVAにより算出した。
【図７Ｅ】ベースラインに対する血清フェニルアラニンのパーセンテージレベルと編集効率パーセンテージとの相関関係を示すグラフである。
【図７Ｆ】hPAH-mAC-006ベクター(中央パネル)、非組込み型Pah導入遺伝子ベクター(右側パネル)、又は食塩水対照(左側パネル)を注射したマウスの肝臓試料における、PAH配列を含むPah mRNA及び場合によりウイルスDNAのin situハイブリダイゼーションを示す一連の画像である。
【図８Ａ】hPAH-hAC-008ベクター及びhPAH-hAC-008-HBBベクターについてのAAVHSC15カプシドにパッケージングされた前記ベクターを投与したマウスにおけるヒト及びマウス肝細胞への形質導入効率であって、前記ベクターに特異的なプライマーとプローブのセットを使用してddPCRにより測定したときの前記形質導入効率を示すグラフである。y軸は、マウス又はヒト細胞のゲノムに対して相対的に測定したベクターの数を表す。
【図８Ｂ】未修飾又は修飾hPAH-hAC-008ベクターを投与したマウスからの肝臓試料における、サイレントコドン変化があるPAH配列を含むヒトPah mRNA及び場合によりウイルスDNAのin situハイブリダイゼーションを示す一連の写真である。プローブは、未修飾又は修飾hPAH-hAC-008ベクターにより編集された遺伝子座から転写されたmRNAのみを検出した。
【図８Ｃ】多重化ddPCRにより測定したときの、ヒト肝細胞を移植したマウスからのマウス及びヒト肝細胞におけるthe hPAH-hAC-008ベクターの編集効率パーセンテージを示すグラフである。図の左半分は、hPAH-hAC-008-HBBベクターで処置した動物の編集効率を指し、右側は、hPAH-hAC-008ベクターで処置した動物の編集効率を指す。p値は、ANOVAにより算出した。
【図９Ａ】マウスにおけるPAH遺伝子の編集効率を決定するために使用したアッセイの模式図を示す。
【図９Ｂ】pHMI-hPAH-mAC-006ベクター又は溶媒対照のどちらかを投与したマウスからの細胞におけるPAH遺伝子編集効率を示すグラフである。
【図１０Ａ】AAVHSC15カプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクター又は溶媒対照のどちらかの投与後のマウスにおけるベースラインに対する血清フェニルアラニンレベルの平均パーセンテージレベルを示すグラフである。
【図１０Ｂ】AAVHSC15カプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクター又は溶媒対照のどちらかの投与後のマウスにおけるベースラインに対する血清チロシンレベルの平均パーセンテージレベルを示すグラフである。
【図１０Ｃ】AAVHSC15カプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクター又は溶媒対照のどちらかを施したマウスにおける血清フェニルアラニンレベルと血清チロシンレベルの比を示すグラフである。
【図１１Ａ】pHMI-hPAH-mAC-006ベクター又は溶媒対照のどちらかを投与したマウスから得た細胞における平均PAH遺伝子編集効率及び形質導入効率を示すグラフである。
【図１１Ｂ】pHMI-hPAH-mAC-006ベクター(AAVHSC15-mPAH)及び又は溶媒対照のどちらかを投与したマウスから得た細胞に発現されたPAH mRNAの相対量であって、マウスGAPDHの発現レベルに正規化された前記相対量を示すグラフを示す。
【図１２Ａ】HuLivヒト化肝臓マウスモデルを示す模式図である。
【図１２Ｂ】AAVHSC15カプシドにパッケージングされたpHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターの投与の1週間後及び6週間後にマウスから得た細胞における平均PAH遺伝子編集効率を示す。
【図１３】AAVHSC15カプシドにパッケージングされたpHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターを投与したHuLivマウスから得た細胞における平均PAH遺伝子編集効率であって、ddPCR及び次世代シーケンシング(NGS)により測定したときの前記編集効率を示すグラフである。
【図１４】AAVHSC15にパッケージングされたpHMIK-hPAH-hI1C-032ベクター(hPAH-032)又はpHMI-hPAH-mAC-006ベクター(mPAH-006)のどちらかを静脈内投与したPAHノックアウトマウスモデル(PAHENU2)マウスの平均血清フェニルアラニンレベルを、対照マウスと比較して示すグラフである。
【図１５Ａ】ヒトPAH発現レベルと血清Pheレベルの間の関係を示すグラフである。
【図１５Ｂ】AAVHSC15にパッケージングされたpHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターで処置した2匹の異なるHuLivマウスにおけるヒトGAPDHに対するヒトPAHの発現を示すプロットである。
【図１６】AAVHSC15にパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクターで処置したHuLivマウスにおけるヒトPAH遺伝子発現(左側)及び前記ベクターで処置したPAHENU2マウスにおけるマウスPAH遺伝子発現(右側)を示すプロットである。
【図１７Ａ】pKITR-hPAH-mAC-006-HCRのベクターマップを示す。
【図１７Ｂ】pKITR-hPAH-hI1C-032-HCRのベクターマップを示す。
【図１７Ｃ】pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3のベクターマップを示す。
【図１７Ｄ】pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3のベクターマップを示す。
【図１７Ｅ】pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1のベクターマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本開示は、細胞のPAH遺伝子機能を回復させることができるアデノ随伴ウイルス(AAV)組成物を提供する。アデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージング系も提供される。
【００５０】
I.定義
本明細書で使用される場合、用語「複製欠損アデノ随伴ウイルス」は、Rep及びCap遺伝子を欠いているゲノムを含むAAVを指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「PAH遺伝子」は、PAH遺伝子のコード領域、エクソン、イントロン、5'UTR、3'UTR、及び転写調節領域を含むがこれらに限定されない、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)遺伝子を指す。ヒトPAH遺伝子は、Entrez Gene ID 5053により識別される。PAH mRNAの例示的ヌクレオチド配列は、配列番号24として提供される。PAHポリペプチドの例示的アミノ酸配列は、配列番号23として提供される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「PAH遺伝子の突然変異を修正すること」は、野生型PAHポリペプチドを発現することができるPAH遺伝子を作出するための、突然変異型PAH遺伝子の標的遺伝子座における1つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を指す。ある特定の実施形態では、「PAH遺伝子の突然変異を修正すること」は、野生型PAHポリペプチド又はその機能的等価物の少なくとも一部分をコードするヌクレオチド配列を、突然変異型PAH遺伝子に、前記野生型PAHポリペプチド又はその機能的等価物が突然変異型PAH遺伝子座から(例えば、外因性PAH遺伝子プロモーターの制御下で)発現されるように、挿入することを伴う。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「修正ゲノム」は、編集エレメント(例えば、1つ又は複数のヌクレオチド又はヌクレオチド間結合)を相同組換えによって標的遺伝子座に組み込んでPAH遺伝子の遺伝的欠陥を修正することができる、組換えAAVゲノムを指す。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ヒトPAH遺伝子内にある。5'相同アームと編集エレメントと3'相同アームとを含む修正ゲノムの部分が、標的遺伝子座(例えば、ヒトPAH遺伝子)に対してセンス方向で存在することもあり、又はアンチセンス方向で存在することもあることは、当業者には理解されるであろう。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「編集エレメント」は、標的遺伝子座に組み込まれたときに前記標的遺伝子座を修飾する、修正ゲノムの分部分を指す。編集エレメントは、標的遺伝子座における1つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を媒介することができる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「標的遺伝子座」は、編集エレメントにより修飾される、染色体の領域又はヌクレオチド間結合(例えば、ヒトPAH遺伝子の領域又はヌクレオチド間結合)を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「相同アーム」は、標的遺伝子座に隣接するゲノムと実質的に同一である編集エレメントの5'又は3'側に位置する修正ゲノムの一部分を指す。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ヒトPAH遺伝子内にあり、相同アームは、前記遺伝子座に隣接するゲノムと実質的に同一の配列を含む。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「クレードFカプシドタンパク質」は、本明細書における配列番号1のアミノ酸1〜736、138〜736、及び203〜736それぞれに記載のVP1、VP2、又はVP3アミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、AAV VP1、VP2、又はVP3カプシドタンパク質を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、2ヌクレオチド配列間又は2アミノ酸配列間の同一性は、アライメントしている同一ヌクレオチド又はアミノ酸の数をより長いヌクレオチド又はアミノ酸配列の完全長で割ることにより決定される。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「PAH遺伝子突然変異に関連する疾患又は障害」は、PAH遺伝子の変異に起因する、PAH遺伝子の変異により憎悪される、又はPAH遺伝子の変異と遺伝的に関連付けられる、任意の疾患又は障害を指す。ある特定の実施形態では、PAH遺伝子突然変異に関連する疾患又は障害は、フェニルケトン尿症(PKU)である。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「サイレント変化を有する(silently altered)」は、遺伝子のコード配列又はスタッファー挿入コード配列の変化であって、前記コード配列又はスタッファー挿入コード配列によりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列の変更を伴わない変化(例えば、ヌクレオチド置換によるもの)を指す。コドン変化は、当技術分野において公知の任意の方法(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Mauro及びChappell (2014) Trends Mol Med. 20(11):604〜13頁に記載されているような方法)により行うことができる。そのようなサイレント変化は、他の遺伝子の遺伝子座への又は標的遺伝子に対してパラロガスな偽遺伝の遺伝子座への修正ゲノムの組込みの尤度を低下させる点で有利である。そのようなサイレント変化はまた、編集エレメントと標的遺伝子の間の相同性を低下させることによって、相同アームではなく編集エレメントにより媒介される望ましくない組込みを低下させる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「コード配列」は、開始コドンで始まって終止コドンで終わる、ポリペプチドをコードする相補的DNA(cDNA)の部分を指す。遺伝子は、選択的スプライシング及び/又は選択的翻訳開始に起因して1つ又は複数のコード配列を有することがある。コード配列は、野生型であることもあり、又はサイレント変化を有することもある。例示的な野生型コード配列は、配列番号24に記載のものである。
【００６２】
本明細書で使用される場合、遺伝子の「イントロン挿入コード配列」という用語は、遺伝子のコード配列に挿入された1つ又は複数のイントロンを含むヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、イントロンのうちの少なくとも1つは、非天然イントロン、すなわち、遺伝子の天然イントロンとは異なる配列を有するものである。ある特定の実施形態では、イントロン挿入コード配列内のイントロンの全てが、非天然イントロンである。非天然イントロンは、異なる種からのイントロンの配列を有することもあり、又は同じ種からの異なる遺伝子内のイントロンの配列を有することもある。代替的に又は加えて、非天然イントロン配列の少なくとも一部分は、合成のものであることもある。非天然イントロン配列を、当技術分野において公知の任意のコンセンサススプライシングモチーフを導入することによりRNAスプライシングを媒介するように設計することができることは、当業者には理解されるであろう。例示的なコンセンサススプライシングモチーフは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Sibleyら、(2016) Nature Reviews Genetics、17、407〜21頁に提供されている。非天然イントロンの挿入は、スタッファー配列によってベクターを最適なサイズ(例えば、4.5〜4.8kb)に至るように調整することができるので、ベクターパッケージングの効率及びロバスト性を高めることができる。ある特定の実施形態では、イントロンのうちの少なくとも1つは、遺伝子の天然イントロンである。ある特定の実施形態では、イントロン挿入コード配列内のイントロンの全てが、遺伝子の天然イントロンである。非天然又は天然イントロンを、コード配列内の任意のヌクレオチド間結合に挿入することができる。ある特定の実施形態では、1つ又は複数の非天然又は天然イントロンは、効率的スプライシングを促進すると予想されるヌクレオチド間結合に挿入される(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Zhang (1998) Human Molecular Genetics、7(5):919〜32頁を参照されたい)。ある特定の実施形態では、1つ又は複数の非天然又は天然イントロンは、2つの外因性エクソンを連結するヌクレオチド間結合に挿入される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「リボソームスキッピングエレメント」は、1つのmRNA分子の翻訳からの2本のペプチド鎖の生成を引き起こすことができる短いペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメントは、X1X2EX3NPGP(式中、X1は、D又はGであり、X2は、V又はIであり、X3は、任意のアミノ酸である)(配列番号75)のコンセンサスモチーフを含むペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメントは、ゾセア・アセグナ(thosea-asigna)ウイルス2Aペプチド(T2A)、ブタテッショウイルス-1 2Aペプチド(P2A)、口蹄疫ウイルス2Aペプチド(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス2Aペプチド(E2A)、細胞質核多角体病ウイルス2Aペプチド(BmCPV 2A)、又はカイコ(B.mori)軟化病ウイルス2Aペプチド(BmIFV 2A)をコードする。T2Aペプチド及びP2Aペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号76及び77にそれぞれ記載のものである。T2Aエレメント及びP2Aエレメントの例示的なヌクレオチド配列は、配列番号78及び79にそれぞれ記載のものである。ある特定の実施形態では、リボソームスキッピングエレメントは、N末端にGly-Ser-Glyの配列を更に含むペプチドをコードし、必要に応じて、前記Gly-Ser-Glyの配列は、GGCAGCGGAのヌクレオチド配列によりコードされている。理論により拘束されることを望まないが、リボソームスキッピングエレメントは、第1のペプチド鎖の翻訳の終結及び第2のペプチド鎖の翻訳の再開によって、又はコードされているペプチドの固有のプロテアーゼ活性による、若しくは環境(例えば、サイトゾル)の別のプロテアーゼによる、リボソームスキッピングエレメントにコードされているペプチド配列内のペプチド結合の切断によって、機能すると仮定する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「リボソームスキッピングペプチド」は、リボソームスキッピングエレメントによりコードされるペプチドを指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「ポリアデニル化配列」は、RNAに転写されたときにポリアデニル化シグナル配列を構成する、DNA配列を指す。ポリアデニル化配列は、天然の(例えば、PAH遺伝子からの)ものであることもあり、又は外因性であることもある。外因性ポリアデニル化配列は、哺乳動物ポリアデニル化配列であることもあり、又はウイルスポリアデニル化配列(例えば、SV40ポリアデニル化配列)であることもある。
【００６６】
本開示では、PAH遺伝子内のヌクレオチド位置は、開始コドンの第1のヌクレオチドを基準にして指定される。開始コドンの第1のヌクレオチドが1位であり、開始コドンの第1のヌクレオチドの5'側のヌクレオチドは、負の番号を有し、開始コドンの第1のヌクレオチドの3'側のヌクレオチドは、正の番号を有する。本明細書で使用される場合、ヒトPAH遺伝子のヌクレオチド1は、NCBI参照配列NG_008690.1のヌクレオチド5,473であり、ヒトPAH遺伝子のヌクレオチド-1は、NCBI参照配列NG_008690.1のヌクレオチド5,472である。
【００６７】
本開示では、PAH遺伝子内のエクソン及びイントロンは、NCBI参照配列NG_008690.1のヌクレオチド5473である開始コドンの第1のヌクレオチドを包含するエクソンを基準にして指定される。開始コドンの第1のヌクレオチドを包含するエクソンは、エクソン1である。エクソン1の3'側のエクソンは、5'から3'に向かって、エクソン2、エクソン3等となる。エクソン1の3'側のイントロンは、5'から3'に向かって、イントロン1、イントロン2等となる。したがって、PAH遺伝子は、5'から3'に向かって、エクソン1、イントロン1、エクソン2、イントロン2、エクソン3等を含む。本明細書で使用される場合、ヒトPAH遺伝子のエクソン1は、NCBI参照配列NG_008690.1のヌクレオチド5001〜5532であり、ヒトPAH遺伝子のイントロン1は、NCBI参照配列NG_008690.1のヌクレオチド5533〜9704である。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「組込み」は、標的遺伝子座(例えば、PAH遺伝子のもの)への、修正ゲノムと前記標的遺伝子座の間の相同組換えによる、編集エレメントの導入を指す。編集エレメントの組込みは、標的遺伝子座(例えば、PAH遺伝子のもの)における1つ又は複数のヌクレオチドの置換、挿入及び/又は欠失を生じさせる結果となりうる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「標的遺伝子座への編集エレメントの組込み効率」は、標的遺伝子座への編集エレメントの組込みが起こった、形質導入集団中の細胞のパーセンテージを指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「標的遺伝子座への編集エレメントの組込みのアレル頻度」は、標的遺伝子座への編集エレメントの組込みが起こった形質導入細胞の集団中のアレルのパーセンテージを指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「標準的なAAV投与条件」は、肝細胞アブレーション後のマウスに埋め込まれたヒト幹細胞に対する形質導入であって、AAVが、実施例5のセクションbの方法によって与えられるように、体重1キログラム当たりベクターゲノム1×1013個の用量で静脈内投与される、形質導入を指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、対象へのAAVの投与の文脈での用語「有効量」は、所望の予防又は治療効果を達成するAAVの量を指す。
【００７３】
II.アデノ随伴ウイルス組成物
一態様では、PAH遺伝子機能の低下又は別様の欠陥がある細胞におけるPAH発現を回復させるのに有用な新規複製欠損AAV組成物が、本明細書で提供される。そのようなAAV組成物は、PAH遺伝子の突然変異を修正する効率又はPAH発現を回復させる効率が高く、そのような修正を助長するために外因性ヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ(TALEN)、又はRNA誘導型ヌクレアーゼ、例えばCas9)の作用による標的遺伝子座でのゲノムの切断を必要としない。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるAAV組成物は、外因性ヌクレアーゼも、外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列も、含まない。
【００７４】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるAAVは、AAVカプシドと、PAH遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための修正ゲノムとを含む。本明細書で開示されるAAV組成物に使用することができるAAVカプシドタンパク質としては、限定ではないが、クレードA AAV、クレードB AAV、クレードC AAV、クレードD AAV、クレードE AAV及びクレードF AAVの、AAVカプシドタンパク質及びその誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9又はAAVrh10のAAVカプシドタンパク質又はその誘導体である。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、AAVクレードFカプシドタンパク質を含む。
【００７５】
任意のAAVクレードFカプシドタンパク質又はその誘導体を、本明細書で開示されるAAV組成物に使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列と、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cである。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
例えば、ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Dであり、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列と、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rである。ある特定の実���形態では、配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cである。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
例えば、ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2のアミノ酸2に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Tであり、配列番号2のアミノ酸65に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸68に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Vであり、配列番号2のアミノ酸77に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸119に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Lであり、配列番号2のアミノ酸151に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸160に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Dであり、配列番号2のアミノ酸206に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、配列番号2のアミノ酸296に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Hであり、配列番号2のアミノ酸312に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Qであり、配列番号2のアミノ酸346に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Aであり、配列番号2のアミノ酸464に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Nであり、配列番号2のアミノ酸468に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Sであり、配列番号2のアミノ酸501に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸590に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸626に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、G若しくはYであり、配列番号2のアミノ酸681に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Mであり、配列番号2のアミノ酸687に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Kであり、配列番号2のアミノ酸706に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Cであり、又は、配列番号2のアミノ酸718に対応する前記カプシドタンパク質中のアミノ酸が、Gである、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列と、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸2に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Tであり、配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Qである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸65に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Yである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸77に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸690に対���するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Kである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸119に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Lであり、配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Sである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Gである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Hであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Nであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Mである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Aであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Iであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Rであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸は、Cである。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸203〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸138〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、又は17のアミノ酸1〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
【００７９】
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号8のアミノ酸203〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号8のアミノ酸138〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号8のアミノ酸1〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号8のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号8のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号8のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号8のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号8のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号8のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号8のアミノ酸203〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号8のアミノ酸138〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号8のアミノ酸1〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号11のアミノ酸203〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号11のアミノ酸138〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号11のアミノ酸1〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号11のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号11のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号11のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号11のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号11のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号11のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号11のアミノ酸203〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号11のアミノ酸138〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号11のアミノ酸1〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
【００８１】
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号13のアミノ酸203〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号13のアミノ酸138〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号13のアミノ酸1〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号13のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号13のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号13のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号13のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号13のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号13のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号13のアミノ酸203〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号13のアミノ酸138〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号13のアミノ酸1〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
【００８２】
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号16のアミノ酸203〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号16のアミノ酸138〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号16のアミノ酸1〜736の配列と少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号16のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号16のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号16のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号16のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号16のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号16のアミノ酸1〜736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質のうちの、2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号16のアミノ酸203〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、(b)配列番号16のアミノ酸138〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質、及び(c)配列番号16のアミノ酸1〜736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
【００８３】
本明細書で開示されるAAV組成物において有用な修正ゲノムは、一般に、(i)PAH遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための編集エレメントと、(ii)前記標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの5'側の5'相同アームヌクレオチド配列と、(iii)前記標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域に対して相同性を有する編集エレメントの3'側の3'相同アームヌクレオチド配列とを含み、前記5'相同アームと編集エレメントと前記3'相同アームとを含む前記修正ゲノムの部分は、PAH遺伝子座に対してセンス方向で存在することもあり、又はアンチセンス方向で存在することもある。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、5'相同アームヌクレオチド配列の5'側に5'逆方向末端反復(5'ITR)ヌクレオチド配列を、及び3'相同アームヌクレオチド配列の3'側に3'逆方向末端反復(3'ITR)ヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
本明細書で開示される修正ゲノムに使用される編集エレメントは、標的遺伝子座における1つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を媒介することができる。
【００８５】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に相同組換えにより正しく組み込まれたとき、編集エレメントは、PAHコード配列の少なくとも一部分を含むヌクレオチド配列を、突然変異型PAH遺伝子に、野生型PAHポリペプチド又はその機能的等価物が突然変異型PAH遺伝子座から発現されるように、挿入する。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、完全PAHコード配列(例えば、野生型PAHコード配列又はサイレント変化を有するPAHコード配列)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、PAHコード配列のヌクレオチド4〜1359を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、PAHイントロン挿入コード配列(例えば、野生型又はサイレント変化を有するPAHコード配列に挿入されたイントロンを含むもの)を含む。
【００８６】
ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、野生型PAHポリペプチド(例えば、配列番号23に記載のアミノ酸配列を有するもの)をコードする。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、野生型(例えば、配列番号24に記載のヌクレオチド配列を含むもの)である。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、野生型PAH遺伝子の対応するエクソンと100%未満(例えば、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%又は50%未満)同一であるようにサイレント変化を有する。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号25に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号116に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００８７】
ある特定の実施形態では、PAHイントロン挿入コード配列は、野生型PAHポリペプチド(例えば、配列番号23に記載のアミノ酸配列を有するもの)をコードする。ある特定の実施形態では、PAHイントロン挿入コード配列は、PAHコード配列に挿入された少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12)のイントロンを含む。イントロンは、PAH遺伝子の天然イントロン配列を含むこともあり、異なる種からのイントロン配列若しくは同じ種からの異なる遺伝子からのイントロン配列を含むこともあり、及び/又は合成イントロン配列を含むこともある。ある特定の実施形態では、非天然イントロンは、長さが最大100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1,500、又は2,000ヌクレオチドである。理論により拘束されることを望まないが、イントロンは、例えば、転写サイレンシングを低減させること及び核から細胞質へのmRNA核外輸送を増進させることにより、導入遺伝子発現を増加させることができると仮定する。合成イントロン配列を、当技術分野において(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Sibleyら、(2016) Nature Reviews Genetics、17、407〜21頁において)公知の任意のスプライシングモチーフを導入することにより、RNAスプライシングを媒介するように設計することができることは、当業者には理解されるであろう。例示的なイントロン配列は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられている、Luら(2013) Molecular Therapy 21(5):954〜63頁、及びLuら(2017) Hum. Gene Ther. 28(1):125〜34頁に提供されている。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、任意の種(例えば、ヒト、マウス、又はウサギ)におけるヘモグロビンベータ遺伝子の第1のイントロンを含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、ヒトHBB遺伝子の第1のイントロン(例えば、配列番号28と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むもの)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、マウスHBB遺伝子の第1のイントロン(例えば、配列番号29と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むもの)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン(例えば、配列番号30と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むもの)を含む。
【００８８】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号120と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、キメラMVMイントロン(本明細書ではChiMVMとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号121と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、SV40イントロンを含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号122と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、アデノウイルス・トリパータイトリーダー・イントロン(本明細書ではAdTPLとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号123と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、ミニβ-グロビンイントロン(本明細書ではMiniBGlobinとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号124と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、AdV/Igキメライントロン(本明細書ではAdVIgGとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、β-グロビンスプライスドナー領域とIgG重鎖スプライスアクセプター領域とを含むキメライントロンである、β-グロビンIg重鎖イントロン(本明細書ではBglobinIgとも呼ばれる)であって、例えば、配列番号125と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、前記β-グロビンIg重鎖イントロンを含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、野生型MVMイントロンのバリアントであるWu MVMイントロン(本明細書ではWu MVMとも呼ばれる)であって、例えば、配列番号126と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、前記Wu MVMイントロンを含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号127と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、HCR1エレメント(本明細書ではOptHCRとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号128と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、β-グロビンイントロン(本明細書ではBGlobinとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号129と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、第IX因子イントロン(本明細書ではtFIX又はFIXイントロンとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、例えば、配列番号130と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる、ch2BLoodイントロン(本明細書ではBloodEnhとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、PAHイントロン挿入コード配列は、野生型PAHポリペプチド(例えば、配列番号23に記載のアミノ酸配列を有するもの)をコードする。ある特定の実施形態では、PAHイントロン挿入コード配列は、共にスプライシングされると、完全PAHコード配列を形成する、PAHコード配列の部分を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、野生型(例えば、配列番号24に記載のヌクレオチド配列を含むもの)である。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、野生型PAH遺伝子の対応するエクソンと100%未満(例えば、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%又は50%未満)同一であるようなサイレント変化を有する。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号25に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号116に記載のヌクレオチド配列を含むか又はそのようなヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、イントロン挿入PAHコード配列は、配列番号116と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、配列番号116に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、イントロン挿入PAHコード配列は、配列番号80、81、82、131、132、又は143に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、イントロン挿入PAHコード配列は、配列番号80、81、82、131、132、又は143と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、イントロン挿入PAHコード配列は、配列番号80、81、82、131、132、又は143に記載のヌクレオチド配列からなる。
【００８９】
イントロンをPAHコード配列の任意の位置に挿入することができる。ある特定の実施形態では、イントロンは、2つの天然エクソンを連結するヌクレオチド間結合に対応する位置に挿入される。ある特定の実施形態では、イントロンは、天然のエクソン8とエクソン9を連結するヌクレオチド間結合に対応する位置に挿入される。ある特定の実施形態では、PAHイントロン挿入コード配列は、5'から3'に向かって、PAHコード配列の第1の部分と、イントロンと、PAHコード配列の第2の部分とを含み、前記第1の部分と前記第2の部分は、共にスプライシングされると、完全PAHコード配列(例えば、野生型PAHコード配列、又はサイレント変化を有するPAHコード配列)を形成する。ある特定の実施形態では、PAHコード配列の第1の部分は、配列番号64若しくは65に記載のアミノ酸配列を含み、及び/又はPAHコード配列の第2の部分は、配列番号66若しくは67に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、PAHコード配列の第1の部分は、配列番号64又は65に記載のアミノ酸配列からなり、PAHコード配列の第2の部分は、配列番号66又は67に記載のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、PAHコード配列の第1の部分は、配列番号65に記載のアミノ酸配列からなり、PAHコード配列の第2の部分は、配列番号67に記載のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、3'から5'に向かって、配列番号64に記載のヌクレオチド配列からなるPAHコード配列の第1の部分、又はそのサイレント変化を有するバリアント(例えば、配列番号65に記載のヌクレオチド配列からなるもの)と、イントロン(例えば、配列番号28、29、又は30に記載のヌクレオチド配列からなるもの)と、配列番号66に記載のヌクレオチド配列からなるPAHコード配列の第2の部分、又はそのサイレント変化を有するバリアント(例えば、配列番号66に記載のヌクレオチド配列からなるもの)とを含む。
【００９０】
ある特定の実施形態では、PAHコード配列は、修飾スプライスドナー部位を含む。ある特定の実施形態では、スプライスドナー部位修飾PAHコード配列は、配列番号138又は139に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、スプライスドナー部位修飾PAHコード配列は、配列番号138又は139と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、スプライスドナー部位修飾PAHコード配列は、配列番号138又は139に記載のヌクレオチド配列からなる。
【００９１】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列の3'側に転写ターミネーターを更に含む。ある特定の実施形態では、転写ターミネーターは、ポリアデニル化配列(例えば、外因性ポリアデニル化配列)を含む。ある特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31〜34からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又はそれに相補的な配列を含むもの)を含む。ある特定の実施形態では、SV40ポリアデニル化配列は、配列番号31に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、5'から3'に向かって、PAHコード配列(例えば、配列番号25に記載のヌクレオチド配列を含むもの)又はPAHイントロン挿入コード配列(例えば、配列番号80に記載のヌクレオチド配列を含むもの)と、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31に記載のヌクレオチド配列を含むもの)とを含む。
【００９２】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31に記載のヌクレオチド配列を含むもの)の5'側にIDカセットを更に含むことがある。IDカセットは、次世代シーケンシング実験を行うとき識別のために使用することができる配列を提供する。ある特定の実施形態では、IDカセットは、配列番号33に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、IDカセットは、配列番号33と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、IDカセットは、配列番号33に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、5'から3'に向かって、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列と、IDカセットと、SV40ポリアデニル化配列とを含む。
【００９３】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列の5'側にリボソームスキッピングエレメントを更に含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、5'から3'に向かって、リボソームスキッピングエレメントと、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列と、必要に応じて転写ターミネーター(例えば、ポリアデニル化配列)とを含む。ある特定の実施形態では、上述の編集エレメントを相同組換えによりPAH遺伝子のエクソンに組み込んで(例えば、標的遺伝子の5'側のヌクレオチドが、PAH遺伝子のエクソンに入り)、その結果、5'から3'に向かって、標的遺伝子座の5'側のPAH遺伝子の部分と、リボソームスキッピングエレメントと、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列と、転写ターミネーター(例えば、ポリアデニル化配列)とを含む、組換え配列であって、前記リボソームスキッピングエレメントが、標的遺伝子座の5'側のPAH遺伝子の部分、及び完全PAHコード配列と、インフレームであるような位置にある、前記組換え配列を生成することができる。この組換え配列の転写及び翻訳によって、コードされているリボソームスキッピングペプチドの5'部分に融合された、標的遺伝子座の5'側のPAH遺伝子の部分によりコードされているアミノ酸配列を含む、第1のポリペプチドと、PAHポリペプチドの完全アミノ酸配列に融合された、コードされているリボソームスキッピングペプチドの3'部分を含む、第2のポリペプチドとが、生成される。
【００９４】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のエクソン(例えば、エクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8、エクソン9、エクソン10、エクソン11、エクソン12、又はエクソン13)内にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子のエクソン(例えば、エクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8、エクソン9、エクソン10、エクソン11、エクソン12、又はエクソン13)内のヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子内の配列であり、この配列の5'末端は、PAH遺伝子のエクソン(例えば、エクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8、エクソン9、エクソン10、エクソン11、エクソン12、又はエクソン13)内にあるか、又はAchaete-scuteホモログ1(ASCL1)とPAHの間の遺伝子間領域内にあり、この配列の3'末端は、PAH遺伝子内の、又はPAHとインスリン様増殖因子1(IGF1)の間の遺伝子間領域内の、任意のヌクレオチドでありうる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のエクソン1、エクソン2、又はエクソン3内にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子のエクソン1、エクソン2、又はエクソン3内のヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子内の配列であり、この配列の5'末端は、PAH遺伝子のエクソン1、エクソン2、又はエクソン3内にあり、この配列の3'末端は、PAH遺伝子内の、又はPAHとIGF1の間の遺伝子間領域内の、任意のヌクレオチドでありうる。
【００９５】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、リボソームスキッピングエレメントの5'側にスプライスアクセプターを含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、5'から3'に向かって、スプライスアクセプターと、リボソームスキッピングエレメントと、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列と、必要に応じて転写ターミネーター(例えば、ポリアデニル化配列)とを含む。ある特定の実施形態では、上述の編集エレメントを相同組換えによりPAH遺伝子のイントロンに組み込んで(例えば、標的遺伝子の5'側のヌクレオチドが、PAH遺伝子のイントロンに入り)、その結果、5'から3'に向かって、イントロンの内因性スプライスドナー部位を含むが外因性スプライスアクセプターを含まない、標的遺伝子座の5'側のPAH遺伝子の部分と、スプライスアクセプターと、リボソームスキッピングエレメントと、PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列と、転写ターミネーター(例えば、ポリアデニル化配列)とを含む、組換え配列であって、前記リボソームスキッピングエレメントが、前記PAHコード配列又はPAHイントロン挿入コード配列、及び転写ターミネーター(例えば、ポリアデニル化配列)と、インフレームであるような、且つ、PAHの前記イントロンの内因性スプライスドナーへのスプライスアクセプターのスプライシングよって前記標的遺伝子座の5'側のPAH遺伝子の部分とインフレームにされるような、位置にある、前記組換え配列を生成することができる。この組換え配列の発現によって、コードされているリボソームスキッピングペプチドの5'部分に融合された、標的遺伝子座の5'側のPAH遺伝子の部分によりコードされているアミノ酸配列を含む、第1のポリペプチドと、コードされているリボソームスキッピングペプチドの3'部分に融合された、PAHポリペプチドの完全アミノ酸配列を含む、第2のポリペプチドとが、生成される。
【００９６】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のイントロン(例えば、イントロン1、イントロン2、イントロン3、イントロン4、イントロン5、イントロン6、イントロン7、イントロン8、イントロン9、イントロン10、イントロン11、又はイントロン12)内にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子のイントロン(例えば、イントロン1、イントロン2、イントロン3、イントロン4、イントロン5、イントロン6、イントロン7、イントロン8、イントロン9、イントロン10、イントロン11、又はイントロン12)内のヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子内の配列であり、この配列の5'末端は、PAH遺伝子のイントロン(例えば、イントロン1、イントロン2、イントロン3、イントロン4、イントロン5、イントロン6、イントロン7、イントロン8、イントロン9、イントロン10、イントロン11、又はイントロン12)内にあり、この配列の3'末端は、PAH遺伝子内の、又はPAHとIGF1の間の遺伝子間領域内の、任意のヌクレオチドでありうる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のイントロン1、イントロン2、又はイントロン3内にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子のイントロン1、イントロン2、又はイントロン3内のヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子内の配列であり、この配列の5'末端は、PAH遺伝子のイントロン1、イントロン2、又はイントロン3内にあり、この配列の3'末端は、PAH遺伝子内の、又はPAHとIGF1の間の遺伝子間領域内の、任意のヌクレオチドでありうる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側のヌクレオチドは、PAH遺伝子のイントロン1内にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、PAH遺伝子内の配列であり、この配列の5'末端は、PAH遺伝子のイントロン1内にあり、この配列の3'末端は、PAH遺伝子内の、又はPAHとIGF1の間の遺伝子間領域内の、任意のヌクレオチドでありうる。
【００９７】
本明細書で開示される編集エレメントのいずれか又は全ては、野生型PAH遺伝子に存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を更に含むことができる。そのような制限エンドヌクレアーゼ部位によって、標的遺伝子座に編集エレメントが組み込まれている細胞を、制限酵素断片長多型解析に基づいて、又は標的遺伝子座及びその隣接領域若しくはそれらから増幅された核酸についての核シーケンシング解析により、同定することができる。
【００９８】
本明細書で開示される編集エレメントのいずれか又は全ては、標的遺伝子座に組み込まれたときPAHポリペプチドの1つ又は複数のアミノ酸突然変異を引き起こす、1つ又は複数のヌクレオチド変化を含むことができる。ある特定の実施形態では、突然変異型PAHポリペプチドは、野生型PAHポリペプチドの機能的等価物であり、すなわち、野生型PAHポリペプチドのように機能することができる。ある特定の実施形態では、機能的に等価のPAHポリペプチドは、野生型PAHポリペプチドに見られない少なくとも1つの特性、例えば、PAHタンパク質(例えば、二量体若しくは四量体)を安定させる能力、又はタンパク質分解に抵抗する能力を、更に有する。
【００９９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントは、少なくとも0、1、2、10、100、200、500、1000、1500、2000、3000、4000、又は5000個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、1〜5000、1〜4500、1〜4000、1〜3000、1〜2000、1〜1000、1〜500、1〜200、1〜100、1〜50、若しくは1〜10個のヌクレオチドを含むか、又はそのような数のヌクレオチドからなる。
【０１００】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントは、PAHコード配列若しくはその一部分(例えば、完全ヒトPAHコード配列、若しくはヒトPAHコード配列のヌクレオチド4〜1359)、5'非翻訳領域(UTR)、3'UTR、プロモーター、スプライスドナー、スプライスアクセプター、非翻訳RNAをコードする配列、インスレーター、遺伝子、又はこれらの組合せを含むか、或いは前述のもの又は組合せからなる。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号35、83、又は84に記載の配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号35、83、又は84に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号35、83又は84に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号147、148、149、150、151、152、又は153に記載の配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号147、148、149、150、151、152、又は153に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号147、148、149、150、151、152、又は153に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１０２】
本明細書で開示される修正ゲノムに使用される相同アームを、ゲノム上のPAH遺伝子又は隣接する遺伝子の任意の領域に方向付けることができる。相同アームの正確な同一性及び位置決めは、編集エレメント及び/又は標的遺伝子座の同一性により決定される。
【０１０３】
本明細書で開示される修正ゲノムに利用される相同アームは、標的遺伝子座(例えば、PAH遺伝子内の標的遺伝子座)に隣接するゲノムと実質的に同一である。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%)のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、第1のゲノム領域に対して100%のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%)のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、第2のゲノム領域に対して100%のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同アームは、各々、標的遺伝子座(例えば、PAH遺伝子内の標的遺伝子座)に隣接する第1及び第2のゲノム領域とそれぞれ少なくとも約90%(例えば、少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%)同一である。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同アームは、各々、標的遺伝子座(例えば、PAH遺伝子内の標的遺伝子座)に隣接する第1及び第2のゲノム領域とそれぞれ100%同一である。ある特定の実施形態では、5'相同アーム及び/又は3'相同アームのヌクレオチドと、標的遺伝子座に隣接するゲノム内の対応する領域のヌクレオチドとの相違は、ヌクレオチド配列の非翻訳領域の相違を含むか、そのような相違から本質的になるか、又はそのような相違からなる。
【０１０４】
相同アームが、標的遺伝子座に隣接するゲノム配列と100%同一でなくても、相同組換えによるその標的遺伝子座への編集エレメントの組込みを媒介することができることは、当業者には理解されるであろう。例えば、相同アームは、ヒト集団内での1つ若しくは複数の遺伝的変異、及び/又は発現レベル若しくは特異性を向上させるように設計された1つ若しくは複数の修飾(例えば、ヌクレオチド置換、挿入若しくは欠失)を含みうる。ヒトの遺伝的変異は、遺伝性の変異と、標的ゲノムに固有のものであるデノボ変異の両方を含み、単純なヌクレオチド多型、挿入、欠失、再構成、反転、重複、微小反復(micro-repeat)及びこれらの組合せを包含する。そのような変異は、当技術分野において公知であり、例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられている、dnSNP (Sherryら、Nucleic Acids Res. 2001; 29(1):308〜11頁を参照されたい)、Database of Genomic Variants (Nucleic Acids Res. 2014; 42(データベース特集号):D986〜92を参照されたい)、ClinVar (Nucleic Acids Res. 2014; 42(データベース特集号):D980〜D985を参照されたい)、Genbank (Nucleic Acids Res. 2016; 44(データベース特集号):D67〜D72を参照されたい)、ENCODE (genome.ucsc.edu/encode/terms.html)、JASPAR (Nucleic Acids Res. 2018; 46(D1):D260〜D266を参照されたい)、及びPROMO (Messeguerら、Bioinformatics 2002; 18(2):333〜334頁; Farreら、Nucleic Acids Res. 2003; 31(13):3651〜3653頁を参照されたい)のデータベースで見つけることができる。相同アームが、標的遺伝子座に隣接するゲノム配列と100%同一でない状況で、前記相同アームと前記ゲノムの間の相同組換えによって、標的遺伝子座に隣接するゲノム配列を、使用される相同アームの配列とそのゲノムの配列が同一になるように変化させることができることは、当業者には更に理解されるであろう。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域は、第1の編集ウィンドウ内に位置し、前記第1の編集ウィンドウは、配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域は、第2の編集ウィンドウ内に位置し、前記第2の編集ウィンドウは、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域は、第1の編集ウィンドウ内に位置し、前記第1の編集ウィンドウは、配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなり、標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域は、第2の編集ウィンドウ内に位置し、前記第2の編集ウィンドウは、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、第1の編集ウィンドウと第2の編集ウィンドウは、異なる。ある特定の実施形態では、第1の編集ウィンドウは、第2の編集ウィンドウの5'側に位置する。ある特定の実施形態では、第1のゲノム領域は、第1のゲノム領域が位置する第1の編集ウィンドウの配列より短い配列からなる。ある特定の実施形態では、第1のゲノム領域は、第1のゲノム領域が位置する第1の編集ウィンドウの配列からなる。ある特定の実施形態では、第2のゲノム領域は、第2のゲノム領域が位置する第2の編集ウィンドウの配列より短い配列からなる。ある特定の実施形態では、第2のゲノム領域は、第2のゲノム領域が位置する第2の編集ウィンドウの配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域は、配列番号36に記載の配列を有する。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域は、配列番号45に記載の配列を有する。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の5'側の第1のゲノム領域、及び標的遺伝子座の3'側の第2のゲノム領域は、それぞれ、配列番号36に記載の配列及び配列番号45に記載の配列を有する。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、第1の編集ウィンドウと第2の編集ウィンドウは、同じである。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、編集ウィンドウ内のヌクレオチド間結合又はヌクレオチド配列であり、第1のゲノム領域は、標的遺伝子座の5'側の編集ウィンドウの第1の部分からなり、第2のゲノム領域は、標的遺伝子座の3'側の編集ウィンドウの第2の部分からなる。ある特定の実施形態では、編集ウィンドウの第1の部分は、編集ウィンドウの5'末端から標的遺伝子座の5'側に隣接するヌクレオチドまでの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集ウィンドウの第2の部分は、標的遺伝子座の3'側に隣接するヌクレオチドから編集ウィンドウの3'末端までの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集ウィンドウの第1の部分は、編集ウィンドウの5'末端から標的遺伝子座の5'側に隣接するヌクレオチドまでの配列からなり、編集ウィンドウの第2の部分は、標的遺伝子座の3'側に隣接するヌクレオチドから編集ウィンドウの3'末端までの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集ウィンドウは、配列番号36又は45に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、編集ウィンドウの第1及び第2の部分は、実質的に等しい長さを有する(例えば、短い方の部分の長さの、長い方の部分の長さに対する比は、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.96、0.97、0.98、又は0.99より大きい)。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、約50〜約4000ヌクレオチド(例えば、約100〜約3000、約200〜約2000、約500〜約1000ヌクレオチド)長を有する。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、約800ヌクレオチド長を有する。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、約100ヌクレオチド長を有する。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、約50〜約4000ヌクレオチド(例えば、約100〜約3000、約200〜約2000、約500〜約1000ヌクレオチド)長を有する。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、約800ヌクレオチド長を有する。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、約100ヌクレオチド長を有する。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同アームの各々は、独立して、約50〜約4000ヌクレオチド(例えば、約100〜約3000、約200〜約2000、約500〜約1000ヌクレオチド)長を有する。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同アームは、約800ヌクレオチドの長を有する。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、5'及び3'相同アームは、実質的に等しいヌクレオチド長を有する。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同アームは、非対称なヌクレオチド長を有する。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド長の非対称性は、最大90%の5'相同アームと3'相同アーム間の長さの差、例えば、最大80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、又は10%の長さの差により定義される。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68)、PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及び/又はPAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するAを含む。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、
(a)PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、及びPAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG;
(b)PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA;
(c)PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA;
(d)PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA;
(e)PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG;
(f)PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC;
(g)PAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68);並びに/又は
(h)PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するA
を含む。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、
(a)PAH遺伝子のヌクレオチド-2に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド4に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド6に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド7に対応するG、及びPAH遺伝子のヌクレオチド9に対応するG;
(b)PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA;
(c)PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA;
(d) PAH遺伝子のヌクレオチド-181に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-214に対応するG、PAH遺伝子のヌクレオチド-212に対応するC、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA;
(e)PAH遺伝子のヌクレオチド194に対応するG;
(f)PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC;
(g)PAH遺伝子のヌクレオチド-433に対応するC、PAH遺伝子のヌクレオチド-432に対応するC、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-394〜-388に対応するACGCTGTTCTTCGCC(配列番号68);及び/又は
(h)PAH遺伝子のヌクレオチド-467に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-465に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-341に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-339に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-225に対応するA、PAH遺伝子のヌクレオチド-211に対応するA、及びPAH遺伝子のヌクレオチド-203に対応するA
を含む。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、配列番号36に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%)のヌクレオチド配列同一性を有し、したがって、上記の位置のヌクレオチドのうちの1つ又は複数を必要に応じて含む。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、ヒト集団内での1つ又は複数の遺伝的変異を更に含む。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、配列番号36、37、38、39、40、41、42、43、又は44に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、配列番号36、37、38、39、40、41、42、43、又は44に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、3'相同アームは、配列番号45に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%)のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、ヒト集団内での1つ又は複数の遺伝的変異を更に含む。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、配列番号45に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、配列番号45に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、5'相同アーム及び3'相同アームは、各々、配列番号36及び45に記載のヌクレオチド配列に対してそれぞれ少なくとも約90%(例えば、少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%)のヌクレオチド配列同一性を有し、必要に応じて、前記5'相同アームは、上記の位置のヌクレオチドのうちの1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、5'相同アーム及び3'相同アームは、配列番号36及び45、37及び45、38及び45、39及び45、40及び45、41及び45、42及び45、43及び45、又は、44及び45に記載のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。ある特定の実施形態では、5'相同アーム及び3'相同アームは、配列番号36及び45、37及び45、38及び45、39及び45、40及び45、41及び45、42及び45、43及び45、又は、44及び45に記載のヌクレオチド配列からそれぞれなる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、配列番号69又は72に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、配列番号69又は72に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、配列番号70又は73に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、配列番号70又は73に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'相同アーム及び3'相同アームは、配列番号69及び70、又は72及び73に記載のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。ある特定の実施形態では、5'相同アーム及び3'相同アームは、配列番号69及び70、又は72及び73に記載のヌクレオチド配列からそれぞれなる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、5'相同アームは、配列番号111、115又は142に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、5'相同アームは、配列番号111、115又は142に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、配列番号112、117又は144に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3'相同アームは、配列番号112、117又は144に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'相同アーム及び3'相同アームは、配列番号111及び112、115及び117、又は142及び144に記載のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。ある特定の実施形態では、5'相同アーム及び3'相同アームは、配列番号111及び112、115及び117、又は142及び144に記載のヌクレオチド配列からそれぞれなる。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号46、47、48、49、50、51、52、53、54、85、86、113、118、134、136、又は145と少なくとも90%(例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%)同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号46、47、48、49、50、51、52、53、54、85、86、113、118、134、136、又は145に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号46、47、48、49、50、51、52、53、54、85、86、113、118、134、136、又は145に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される修正ゲノムは、5'相同アームヌクレオチド配列の5'側に5'逆方向末端反復(5'ITR)ヌクレオチド配列を、及び3'相同アームヌクレオチド配列の3'側に3'逆方向末端反復(3'ITR)ヌクレオチド配列を更に含む。任意のAAV血清型又はそのバリアントからのITR配列を、本明細書で開示される修正ゲノムに使用することができる。5'及び3'ITRは、同じ血清型のAAVからのものであることもあり、又は異なる血清型のAAVからのものであることもある。本明細書で開示される修正ゲノムにおける使用のための例示的なITRは、本明細書中の配列番号18〜21に記載のものである。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列及び3'ITRヌクレオチド配列は、互いに実質的に相補的である(例えば、5'又は3'ITR内の1、2、3、4又は5カ所のヌクレオチド位置におけるミスマッチを除いて、互いに相補的である)。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、5'ITR又は3'ITRは、AAV2からのものである。ある特定の実施形態では、5'ITRと3'ITRの両方が、AAV2からのものである。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号18に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、若しくは100%)の配列同一性を有し、又は3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号19に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、若しくは100%)の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号18に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、若しくは100%)の配列同一性を有し、及び3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号19に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、若しくは100%)の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号35に記載のヌクレオチド配列を有する編集エレメントと、配列番号18の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列と、配列番号19の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列とを含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号46〜54のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と、配列番号18の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列と、配列番号19の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列とを含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、5'から3'に向かって、配列番号18の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列と、配列番号46〜54のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と、配列番号19の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列とからなる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、5'ITR又は3'ITRは、AAV5からのものである。ある特定の実施形態では、5'ITRと3'ITRの両方が、AAV5からのものである。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号20に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、若しくは100%)の配列同一性を有し、又は3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号20に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、若しくは100%)の配列同一性を有し、及び3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号21に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、若しくは100%)の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号35に記載のヌクレオチド配列を有する編集エレメントと、配列番号20の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列と、配列番号21の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列とを含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号46〜54のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と、配列番号20の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列と、配列番号21の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列とを含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、5'から3'に向かって、配列番号20の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列と、配列番号46〜54のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列と、配列番号21の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列とからなる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列及び3'ITRヌクレオチド配列は、互いに実質的に相補的である(例えば、5'又は3'ITR内の1、2、3、4又は5カ所のヌクレオチド位置におけるミスマッチを除いて、互いに相補的である)。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、5'ITR又は3'ITRは、Repタンパク質による分解を低減させるように又は無くすように修飾される(「非分解性(non-resolvable) ITR」)。ある特定の実施形態では、非分解性ITRは、末端分解部位のヌクレオチド配列における挿入、欠失又は置換を含む。そのような修飾は、移入ゲノムが感染細胞において複製された後のAAVの自己相補的な二本鎖DNAゲノムの形成を可能にする。例示的な非分解性ITR配列は、当技術分野において公知である(例えば、それら全体が参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第7,790,154号及び同第9,783,824号において提供されているものを参照されたい)。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号26と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号26と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号26に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'ITRは、配列番号27と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号27と少なくとも95%、96%、97%、98%、3又は99%同一のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'ITRは、配列番号27に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号26に記載のヌクレオチド配列からなり、3'ITRは、配列番号27に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号26に記載のヌクレオチド配列からなり、3'ITRは、配列番号19に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、3'ITRには、野生型AAV2ゲノム配列に由来する追加のヌクレオチド配列が隣接している。ある特定の実施形態では、3'ITRには、野生型AAV2 ITRに隣接している野生型AAV2ゲノム配列に由来する追加の37bp配列が隣接している。例えば、Savyら、Human Gene Therapy Methods (2017) 28(5):277〜289頁を参照されたい(この参考文献は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれている)。ある特定の実施形態では、追加の37bp配列は、3'ITRの内側にある。ある特定の実施形態では、37bp配列は、配列番号140に記載の配列からなる。ある特定の実施形態では、3'ITRは、配列番号141と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3'ITRは、配列番号141に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3'ITRのヌクレオチド配列は、配列番号141と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'ITRのヌクレオチド配列は、配列番号141に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される修正ゲノムは、約0.5〜約8kb(例えば、約1〜約5、約2〜約5、約3〜約5、約4〜約5、約4.5〜約4.8、又は約4.7kb)の長さを有する。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、87、88、114、119、135、137、又は146と少なくとも90%(例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%)同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、87、88、114、119、135、137、又は146に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、87、88、114、119、135、137、又は146に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、複製欠損AAVは、(a)配列番号16のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメント:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同アーム(例えば、配列番号115の5'相同アーム)、スプライスアクセプター(例えば、配列番号14のスプライスアクセプター)、2Aエレメント(例えば、配列番号74の2Aエレメント)、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列(例えば、配列番号116のPAHコード配列)、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同アーム(例えば、配列番号117の3'相同アーム)、及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19の3'ITR)を含む、移入ゲノムとを含む; (b)配列番号16のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメント:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同アーム(例えば、配列番号115の5'相同アーム)、スプライスアクセプター(例えば、配列番号14のスプライスアクセプター)、2Aエレメント(例えば、配列番号74の2Aエレメント)、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列(例えば、配列番号116のPAHコード配列)、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同アーム(例えば、配列番号117の3'相同アーム)、及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19の3'ITR)を含む、移入ゲノムとを含む;並びに/又は(c)配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメント:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同アーム(例えば、配列番号115の5'相同アーム)、スプライスアクセプター(例えば、配列番号14のスプライスアクセプター)、2Aエレメント(例えば、配列番号74の2Aエレメント)、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列(例えば、配列番号116のPAHコード配列)、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同アーム(例えば、配列番号117の3'相同アーム)、及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19の3'ITR)を含む、移入ゲノムとを含む。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、複製欠損AAVは、(a)配列番号16のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、配列番号25、46〜63、113、114、116、118、119、134〜137、145、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む; (b)配列番号16のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、配列番号25、46〜63、113、114、116、118、119、134〜137、145、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む;  並びに/又は(c)配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、配列番号25、46〜63、113、114、116、118、119、134〜137、145、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む。
【０１２９】
本明細書で開示されるAAV組成物は、in vivoでもin vitroでも高効率で細胞内のPAH遺伝子を修正することができる点で、特に有利である。ある特定の実施形態では、AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、標的遺伝子座への編集エレメントの組込み効率は、少なくとも1%(例えば、少なくとも2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%)である。ある特定の実施形態では、AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、標的遺伝子座への編集エレメントの組込みのアレル効率は、少なくとも0.5%(例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%)である。
【０１３０】
PAH遺伝子の編集効率を判定する任意の方法を利用することができる。ある特定の実施形態では、個々の細胞は、形質導入細胞の集団から分離され、PAH遺伝子の遺伝子座に正しく組み込まれた編集エレメントの存在を同定することができるPCRプライマーを使用する単一細胞PCRに付される。そのような方法は、未修飾標的遺伝子座を選択的に増幅するPCRプライマーを使用する同細胞の単一細胞PCRを更に含むことができる。このような方法で、細胞の遺伝子型を決定することができる。例えば、細胞が、編集された標的遺伝子座と未修飾の標的遺伝子座の両方を有することを、単一細胞PCRが示した場合には、この細胞の編集されたPAH遺伝子はヘテロ接合性と考えられることになる。
【０１３１】
加えて又は代替的に、ある特定の実施形態では、編集されたPAHアレルのみを検出するプライマー及びプローブを使用して、線形増幅媒介PCR(LAM-PCR)、定量的PCR(qPCR)又はデジタル液滴PCR(ddPCR)を、形質導入細胞の集団から抽出したDNAに対して行うことができる。そのような方法は、試料中の全ゲノムの数及び未編集PAHアレルの数を決定するための追加のqPCR又はddPCRを(同じ反応又は別の反応どちらかで)更に含む。これらの数を使用して、標的遺伝子座への編集エレメントの組込みのアレル頻度を決定することができる。
【０１３２】
加えて又は代替的に、ある特定の実施形態では、PAH遺伝子座を、形質導入細胞の集団から抽出したDNAから、標的遺伝子座に隣接しているPAH遺伝子の領域と結合するプライマーを使用するPCRによるか又は修正ゲノム内の領域(例えば、前記遺伝子座に本来存在しない外因性配列を含む領域)に結合するプライマーを使用するLAM-PCRによるかのどちらかにより、増幅することができる。結果として得られたPCRアンプリコンを、単一分子次世代シーケンシング(NGS)手法を使用して個々にシーケンシングして、形質導入細胞の集団に存在する編集されたPAHアレルと未編集のPAHアレルの相対数を決定することができる。これらの数を使用して、標的遺伝子座への編集エレメントの組込みのアレル頻度を決定することができる。
【０１３３】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示のAAVを薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤、溶媒若しくは担体、又はこれらの組合せと共に含む、医薬組成物を提供する。「薬学的に許容される担体」は、組成物の活性成分と併せられたとき、前記成分が生物活性を保持できるようにし、意図せぬ免疫反応等の、問題を起こす生理的反応を引き起こさない、任意の材料を含む。薬学的に許容される担体は、水、リン酸緩衝食塩水、油/水型エマルジョン等のエマルジョン、及び湿潤剤を含む。そのような担体を含む組成物は、Remington's Pharmaceutical Sciences、現行版、Mack Publishing社、Easton Pa. 18042、USA; A. Gennaro (2000)「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、Lippincott, Williams, & Wilkins社; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Anselら、第7版、Lippincott, Williams, & Wilkins社;及びHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbeら、第3版、Amer. Pharmaceutical Assoc.に記載のもの等の、周知の従来的方法により製剤化される。
【０１３４】
III.使用方法
別の態様では、本開示は、PAH遺伝子の突然変異を修正するための及び細胞においてPAHポリペプチドを発現させるための方法を提供する。これらの方法は、一般に、本明細書で開示の複製欠損AAVで細胞に形質導入する工程を含む。そのよう方法は、PAH遺伝子の突然変異を修正する効率又はPAH発現を回復させる効率が高く、そのような修正を助長するために外因性ヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ(TALEN)、又はRNA誘導型ヌクレアーゼ、例えばCas9)の作用による標的遺伝子座でのゲノムの切断を必要としない。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、外因性ヌクレアーゼ、又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を同時形質導入も同時投与もせずに、本明細書で開示の複製欠損AAVで細胞に形質導入する工程を伴う。
【０１３５】
本明細書で開示される方法を、PAH遺伝子の突然変異を内在的に有する任意の細胞に適用することができる。PAHを活発に発現する細胞が特に興味深いことは、当業者には理解されるであろう。したがって、ある特定の実施形態では、方法は、肝臓、腎臓、脳、下垂体、副腎、膵臓、膀胱、胆嚢、結腸、小腸又は乳房における細胞に適用される。ある特定の実施形態では、方法は、肝細胞及び/又は腎細胞に適用される。
【０１３６】
本明細書で開示される方法を、研究のためにin vitroで行うことができ、又は治療のためにex vivo若しくはin vivoで行うことができる。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、形質導入される細胞は、哺乳動物対象の細胞であり、AAVは、前記対象の細胞への形質導入に有効な量で前記対象に投与される。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、PAH遺伝子突然変異に関連する疾患又は障害に罹患している対象を処置する方法であって、本明細書で開示の複製欠損AAVの有効量を前記対象に投与するステップを一般に含む前記方法を提供する。対象は、ヒト対象であることもあり、又はヒト肝臓細胞を有する齧歯動物対象(例えば、マウス)であることもある。適するマウス対象としては、限定ではないが、ヒト肝臓細胞(例えば、ヒト肝細胞)を生着させたマウスが挙げられる。PAH遺伝子突然変異に関連する任意の疾患又は障害を、本明細書で開示される方法を使用して処置することができる。適する疾患又は障害としては、限定ではないが、フェニルケトン尿症が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、外因性ヌクレアーゼ、又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を同時形質導入も同時投与もせずに、形質導入される。
【０１３８】
本明細書で開示される方法は、in vivoでもin vitroでも高効率で細胞内のPAH遺伝子を修正することができる点で、特に有利である。ある特定の実施形態では、AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、標的遺伝子座への編集エレメントの組込み効率は、少なくとも1%(例えば、少なくとも2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%)である。ある特定の実施形態では、AAVが、ヒト肝細胞を埋め込んだマウスに、標準的なAAV投与条件下、外因性ヌクレアーゼの非存在下で投与されたとき、標的遺伝子座への編集エレメントの組込みのアレル効率は、少なくとも0.5%(例えば、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%)である。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるAAV組成物での細胞に対する形質導入を、本明細書で提供されるように行うことができ、又は当業者に公知の任意の形質導入方法により行うことができる。ある特定の実施形態では、細胞とAAVとを、50,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、若しくは500,000の感染多重度(MOI)で、又は細胞に対する最適な形質導入をもたらす任意のMOIで、接触させることができる。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、上述の方法は、(a)配列番号16のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメント:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同アーム(例えば、配列番号115の5'相同アーム)、スプライスアクセプター(例えば、配列番号14のスプライスアクセプター)、2Aエレメント(例えば、配列番号74の2Aエレメント)、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列(例えば、配列番号116のPAHコード配列)、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同アーム(例えば、配列番号117の3'相同アーム)、及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19の3'ITR)を含む、移入ゲノムとを含む、(b)配列番号16のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメント:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同アーム(例えば、配列番号115の5'相同アーム)、スプライスアクセプター(例えば、配列番号14のスプライスアクセプター)、2Aエレメント(例えば、配列番号74の2Aエレメント)、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列(例えば、配列番号116のPAHコード配列)、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同アーム(例えば、配列番号117の3'相同アーム)、及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19の3'ITR)を含む、移入ゲノムとを含む、並びに/又は(c)配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメント:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同アーム(例えば、配列番号115の5'相同アーム)、スプライスアクセプター(例えば、配列番号14のスプライスアクセプター)、2Aエレメント(例えば、配列番号74の2Aエレメント)、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列(例えば、配列番号116のPAHコード配列)、SV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号31のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同アーム(例えば、配列番号117の3'相同アーム)、及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19の3'ITR)を含む、移入ゲノムとを含む、複製欠損AAVを利用する。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、上述の方法は、(a)配列番号16のアミノ酸203〜736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、配列番号25、46〜63、113、114、116、118、119、134〜137、145、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む、(b)配列番号16のアミノ酸138〜736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、配列番号25、46〜63、113、114、116、118、119、134〜137、145、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む、並びに/又は(c)配列番号16のアミノ酸のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質と、配列番号25、46〜63、113、114、116、118、119、134〜137、145、及び146のうちのいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む、複製欠損AAVを利用する。
【０１４２】
本明細書で開示されるAAV組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、局所又は皮内経路を限定ではないが含む、任意の適切な経路により、対象に投与することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、静脈内注射又は皮下注射による投与用に製剤化される。
【０１４３】
IV. AAVパッケージング系
別の態様では、本開示は、複製欠損AAVの組換え調製のためのパッケージング系を提供する。そのようなパッケージング系は、1つ又は複数のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列と、本明細書で開示の1つ又は複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列と、本明細書で開示の、PAH遺伝子の修正のための修正ゲノム又はPAH遺伝子の発現のための移入ゲノムとを一般に含み、このパッケージング系は、細胞内で前記修正ゲノムを前記カプシドに封入して前記AAVを形成するのに有効である。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、パッケージング系は、Repヌクレオチド配列及びCapヌクレオチド配列を含む第1のベクターと、修正ゲノム又は移入ゲノムを含む第2のベクターとを含む。本明細書に記載のパッケージング系の文脈で使用される場合、「ベクター」は、核酸を細胞に導入するための媒体(例えば、プラスミド、ウイルス、コスミド、人工染色体等)である、核酸分子を指す。
【０１４５】
任意のAAV Repタンパク質を、本明細書で開示されるパッケージング系に利用することができる。パッケージング系のある特定の実施形態では、Repヌクレオチド配列は、AAV2 Repタンパク質をコードする。適するAAV2 Repタンパク質としては、限定ではないが、Rep 78/68又はRep 68/52が挙げられる。パッケージング系のある特定の実施形態では、AAV2 Repタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号22のAAV2 Repアミノ酸配列に対して最小の配列同一性パーセントを有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記最小の配列同一性パーセントが、前記AAV2 Repタンパク質のアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)である、ヌクレオチド配列を含む。パッケージング系のある特定の実施形態では、AAV2 Repタンパク質は、配列番号22に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１４６】
パッケージング系のある特定の実施形態では、パッケージング系は、第3のベクター、例えば、ヘルパーウイルスベクターを更に含む。第3のベクターは、独立した第3のベクターであることもあり、第1のベクターと一体になっていることもあり、又は第2のベクターと一体になっていることもある。ある特定の実施形態では、第3のベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【０１４７】
パッケージング系のある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(単純ヘルペスウイルス(HSV)を含む)、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)、サイトメガロウイルス(CMV)、及びバキュロウイルスからなる群から選択される。ヘルペスウイルスがアデノウイルスである、パッケージング系のある特定の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、E1、E2、E4及びVAからなる群から選択される1つ又は複数のアデノウイルスRNA遺伝子を含む。ヘルパーウイルスがHSVである、パッケージング系のある特定の実施形態では、HSVゲノムは、UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及びUL30/UL42からなる群から選択されるHSV遺伝子のうちの1つ又は複数を含む。
【０１４８】
パッケージング系のある特定の実施形態では、第1、第2、及び/又は第3のベクターは、1つ又は複数のトランスフェクトプラスミドに含有される。ある特定の実施形態では、第1のベクター及び第3のベクターは、第1のトランスフェクトプラスミドに含有される。ある特定の実施形態では、第2のベクター及び第3のベクターは、第2のトランスフェクトプラスミドに含有される。
【０１４９】
パッケージング系のある特定の実施形態では、第1、第2、及び/又は第3のベクターは、1つ又は複数の組換えヘルパーウイルスに含有される。ある特定の実施形態では、第1のベクター及び第3のベクターは、組換えヘルパーウイルスに含有される。ある特定の実施形態では、第2のベクター及び第3のベクターは、組換えヘルパーウイルスに含有される。
【０１５０】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載のAAVの組換え調製のための方法であって、修正ゲノムをカプシドに封入して本明細書に記載のAAVを形成するのに有効な条件下で、記載のパッケージング系で細胞にトランスフェクト又は形質導入する工程を含む、前記方法を提供する。AAVの組換え調製のための例示的方法としては、一過性トランスフェクション(例えば、本明細書に記載の第1のベクターと第2のベクターと必要に応じて第3のベクターとを含有する、1つ又は複数のトランスフェクションプラスミドでの)、ウイルス感染(例えば、本明細書に記載の第1のベクターと第2のベクターと必要に応じて第3のベクターとを含有する、1つ又は複数の組換えヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)、ヘルペスウイルス(HSVを含む)、サイトメガロウイルス、又はバキュロウイルスでの)、及び安定した産生細胞株トランスフェクション又は感染(例えば、本明細書に記載の1つ若しくは複数のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列及び/又は1つ若しくは複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列を含有する、哺乳動物又は昆虫細胞等の、安定した産生細胞での、並びにトランスフェクトプラスミド又は組換えヘルパーウイルスの形態で送達される本明細書に記載の修正ゲノムでの)が挙げられる。
【実施例】
【０１５１】
V.実施例
本明細書で開示する組換えAAVベクターは、in vitro及びin vivoで高効率遺伝子編集を媒介する。以下の実施例は、AAVクレードFカプシド(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第9,623,120号で開示されているような、AAVHSC7、AAVHSC15又はAAVHSC17)でパッケージングすることができる修正ベクターを提供し、フェニルケトン尿症等のある特定のヒト疾患の際に突然変異するPAH遺伝子の発現の効率的回復を実証するものである。これらの実施例は、実例として提供するものであり、限定として提供するものではない。
【０１５２】
(実施例1)
PAH修正ベクターpHMI-hPAH-hAC-008
a)PAH修正ベクターpHMI-hPAH-hAC-008
PAH修正ベクターpHMI-hPAH-hAC-008は、図1Aに示されているように、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含む:5'ITRエレメント、5'相同アーム、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、標的組込み制限カセット(「TI RE」)、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。これらのエレメントの配列をTable 1(表1)に示す。5'相同アームは、ヒトPAH開始コドンから800ヌクレオチド上流の野生型ゲノム配列を含み、したがって、一部のPKU患者において観察されるようなPAH発現に影響を与える開始コドン及び/又は5'非翻訳領域(UTR)の変異を修正する能力を有する。3'相同アームは、開始コドンから800ヌクレオチド下流の野生型ゲノム配列を含む。ヒトゲノムへのPAH修正ベクターpHMI-hPAH-hAC-008の組込みは、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、及び標的組込み制限カセットをPAH開始コドン遺伝子座に挿入し(すなわち、PAH遺伝子のヌクレオチド1〜3を置換する)、それによって、PAH遺伝子の5'UTR、コード配列又は3'UTRの突然変異により損なわれた野生型PAHタンパク質の発現を回復させる。
【０１５３】
【表１】
2021512871.tif 000003
【０１５４】
b)PAH修正ベクターpHMI-hPAH-h1C-007
PAH修正ベクターpHMI-hPAH-h1C-007は、図1Bに示されているように、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含む:5'ITRエレメント、5'相同アーム、スプライスアクセプター、2Aエレメント、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、標的組込み制限カセット(「TI RE」)、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。これらのエレメントの配列をTable 2(表2)に示す。5'相同アームは、イントロン1内に位置する、ヒトPAHのヌクレオチド2128から800ヌクレオチド上流の野生型ゲノム配列を含む。3'相同アームは、ヒトPAHのヌクレオチド2127から800ヌクレオチド下流の野生型ゲノム配列を含む。ヒトゲノムへのPAH修正ベクターpHMI-hPAH-h1C-007の組込みは、プレmRNAへのPAH遺伝子座の転写を可能にし、このプレmRNAは、5'から3'に向かって次のエレメントを含む:外因性PAHのエクソン1、イントロン1のその5'スプライスドナーからヌクレオチド2127までの部分、ベクターpHMI-hPAH-h1C-007内のスプライスアクセプター、2Aエレメント、サイレント変化を有するPAHコード配列、及びSV40ポリアデニル化配列。このプレmRNAのスプライシングは、5'から3'に向かって次のエレメントを含むmRNAを生成する:外因性PAHのエクソン1、2Aエレメント(PAHエクソン1とインフレーム)、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列(2Aエレメントとインフレーム)、及びSV40ポリアデニル化配列。2Aエレメントは、2AペプチドのN末端部と融合した、エクソン1の末端で終わる切断型PAHペプチド、及び完全長PAHポリペプチドと融合した、2Aペプチドからのプロリンという、2つのポリペプチドの生成をもたらす。それ故、ベクターpHMI-hPAH-h1C-007の組込みは、PAH遺伝子のコード配列の又は3'UTRの突然変異により損なわれた野生型PAHタンパク質の発現を回復させることができる。
【０１５５】
【表２】
2021512871.tif 000004
【０１５６】
上記2つのベクターに採用したサイレント変化は、発現ベクターpCOH-WT-PAH、pCOH-CO-PAH及びpHMI-CO-PAHの比較により実証されるように、PAHタンパク質の発現を有意に向上させた。pCOH-WT-PAHベクターは、配列番号24に記載の野生型PAHコード配列に作動可能に連結されたCBAプロモーターを含む。pCOH-CO-PAH及びpHMI-CO-PAHベクターは、各々、配列番号25に記載のサイレント変化を有するヒトPAHコード配列に作動可能に連結されたCBAプロモーターを含む。pCOH-CO-PAH及びpHMI-CO-PAHベクターは、非常に類似していた。各ベクターを、PAHが天然に欠乏しているHEK 293細胞にトランスフェクトした。図2に示されているように、VG-GT-CO-PAH (「CO-hPAH」)は、VG-GT-PAH (「WT-hPAH」)より著しく高いヒトPAHの発現レベルを生じさせた。
【０１５７】
(実施例2)
PAH修正ベクターpHMIA-hPAH-hI1C-032.1及びそのバリアント
効率的な遺伝子編集を助長する相同アーム配列を同定するために、130の修正ベクターを設計し、それらのうちの70を、ヒト肝細胞癌細胞において試験した。pHMIA-hPAH-hI1C-032.1ベクターは、in vitroで最も高い編集効率を示した。この実施例は、このベクター及びそのバリアントの構造を提供する。
【０１５８】
a)PAH修正ベクターpHMIA-hPAH-hI1C-032.1
PAH修正修正ベクターpHMIA-hPAH-hI1C-032.1は、図1Cに示されているように、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含む:5'ITRエレメント、5'相同アーム、スプライスアクセプター、P2Aエレメント、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。これらのエレメントの配列をTable 3(表3)に示す。5'相同アームは、ヒトPAHのヌクレオチド-686〜274の野生型ゲノム配列を含み、その3'末端は、イントロン1内に位置する。3'相同アームは、ヒトPAHのヌクレオチド415〜1325の野生型ゲノム配列を含む。ヒトゲノムへのPAH修正ベクターpHMIA-hPAH-hI1C-032.1の組込みは、プレmRNAへのPAH遺伝子座の転写を可能にし、このプレmRNAは、5'から3'に向かって次のエレメントを含む:外因性PAHのエクソン1、イントロン1のその5'スプライスドナーからヌクレオチド274までの部分、ベクターpHMIA-hPAH-hI1C-032.1内のスプライスアクセプター、P2Aエレメント、サイレント変化を有するPAHコード配列、及びSV40ポリアデニル化配列。このプレmRNAのスプライシングは、5'から3'に向かって次のエレメントを含むmRNAを生成する:外因性PAHのエクソン1、P2Aエレメント(PAHエクソン1とインフレーム)、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列(P2Aエレメントとインフレーム)、及びSV40ポリアデニル化配列。P2Aエレメントは、P2AペプチドのN末端部と融合した、エクソン1の末端で終わる切断型PAHペプチド、及び完全長PAHポリペプチドと融合した、P2Aペプチドからのプロリンという、2つのポリペプチドの生成をもたらす。それ故、ベクターpHMIA-hPAH-hI1C-032.1の組込みは、PAH遺伝子のコード配列の又は3'UTRの突然変異により損なわれた野生型PAHタンパク質の発現を回復させることができる。
【０１５９】
【表３】
2021512871.tif 000005
【０１６０】
b)PAH修正ベクターpHMIA-hPAH-hI1C-032.1のバリアント
pHMIA-hPAH-hI1C-032.1ベクターの8つのバリアントを、PAH遺伝子座の発現を向上させるために設計した。pHMIA-hPAH-hI1C-032.2からpHMIA-hPAH-hI1C-032.9までの名称のこれらのバリアントは、5'相同アームのみがpHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。これらの異なるエレメントの配列をTable 4(表4)に示す。
【０１６１】
【表４】
2021512871.tif 000006
【０１６２】
pHMIA-hPAH-hI1C-032.2ベクターは、転写物へのリボソーム動員向上のためにコザック配列を最適化するように設計した。このベクターは、PAH遺伝子の-2、4、6、7及び9位にそれぞれヌクレオチドC、G、G、G及びGを有する点で、pHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。
【０１６３】
pHMIA-hPAH-hI1C-032.3ベクターは、発現を抑制する可能性がある、PAH遺伝子の5'UTRにおける単一の四重項を除去するように設計した。このベクターは、PAH遺伝子の-467及び-465位にそれぞれヌクレオチドA及びAを有する点で、pHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。
【０１６４】
pHMIA-hPAH-hI1C-032.4ベクターは、発現を増加させるためにサイクリックAMP応答エレメントを最適化するように設計した。このベクターは、PAH遺伝子の-181位にヌクレオチドAを有する点で、pHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。
【０１６５】
pHMIA-hPAH-hI1C-032.5ベクターは、発現を増加させるために2つのサイクリックAMP応答エレメントを最適化するように設計した。このベクターは、PAH遺伝子の-214、-212、-211及び-181位にそれぞれヌクレオチドG、C、A及びAを有する点で、pHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。
【０１６６】
pHMIA-hPAH-hI1C-032.6ベクターは、ヒトにおけるPAH発現の変化と相関関係がある、SNP rs1522295のマイナーアレルを組み入れるように設計した。このベクターは、PAH遺伝子の194位にヌクレオチドGを有する点で、pHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。
【０１６７】
pHMIA-hPAH-hI1C-032.7ベクターは、発現を増加させるために5'UTRにおけるグルココルチコイド結合部位を最適化するように設計した。このベクターは、PAH遺伝子の-433及び-432位にそれぞれヌクレオチドC及びCを有する点で、pHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。
【０１６８】
pHMIA-hPAH-hI1C-032.8ベクターは、発現向上のために2つのグルココルチコイド結合部位及び単一のAP2結合部位を修飾するように設計した。このベクターは、PAH遺伝子の-433及び-432位にそれぞれヌクレオチドC及びCを有する点、並びにPAH遺伝子の-394〜-388位にヌクレオチド配列ACGCTGTTCTTCGCC (配列番号68)を有する点で、pHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。
【０１６９】
pHMIA-hPAH-hI1C-032.9ベクターは、発現を抑制する可能性がある、5'UTRにおけるG-四重項を破壊するように設計した。このベクターは、PAH遺伝子のヌクレオチド位置-467、-465、-341、-339、-225、-211及び-203の各々にヌクレオチドAを有する点で、pHMIA-hPAH-hI1C-032.1と異なる。
【０１７０】
(実施例3)
in vitroヒトPAH遺伝子編集
この実施例は、前の実施例で説明したもの等のPAH修正ベクターを調査するためのin vitro法を提供する。
【０１７１】
PAHコード配列が野生型である(すなわち、サイレント変化を有さない)、pHMI-hPAH-hAC-008のバリアントである、PAH修正ベクターpHMI-hPAH-hA-002と、PAHコード配列が野生型である(すなわち、サイレント変化を有さない)、pHMI-hPAH-h1C-007のバリアントである、PAH修正ベクターpHMI-hPAH-h1-001とを、標的組込みの評定のために調査した。AAVHSC17に150,000のMOIでパッケージングされたpHMI-hPAH-hA-002ベクターを用いてK562細胞に形質導入した。細胞のゲノムDNAを48時間後に採取した。配列ccaaatcccaccagctcact(配列番号89)及びtcccatgaaactgaggtgtga(配列番号90)が相同アームの外側に各々位置する単一ビオチン化プライマーを別々に使用して、線形増幅によりDNA試料を増幅した。編集されたアレルと未編集のアレルの両方を偏りなく増幅した。増幅DNA試料をプールし、ストレプトアビジンプルダウンにより濃縮した。pHMI-hPAH-hA-002が組み込まれたアレルの数を、PAH_Genomic Set 1プライマー/プローブセットを使用してddPCRにより測定した。
【０１７２】
図3A、左側のパネル(「LAM-濃縮」)に示されているように、所望の組込みは、pHMI-hPAH-hA-002ベクターで形質導入した細胞からの試料(「R1 ATG」)では検出されたが、pHMI-hPAH-h1-001ベクターで形質導入した細胞からの試料(「R1 Intron」)でも、非形質導入細胞からの試料(「R1 WT」)でも検出されなかった。図3Aの右のパネル(「アンプリコン」)では、ベクター組込み量を、SV40_FAM Set 1プライマー/プローブセットを使用してddPCRにより測定した。陽性シグナルが、pHMI-hPAH-hA-002ベクターで形質導入した細胞(「T001 Frag」)とpHMI-hPAH-h1-001ベクターで形質導入した細胞(「T002 Frag」)の両方からの試料で観察され、これは、両方の細胞にベクターが組み込まれたことを示す。
【０１７３】
標的組込みを定量化するために、Table 6(表6)に示すような、プライマーとプローブの3つのセットを、ddPCRによる組込みの検出のために設計した。PAH_Genomic Set 1は、pHMI-hPAH-hA-002の標的組込み後に未編集のゲノム及び編集されたゲノムを検出した。SV40_FAM Set 1は、編集されたゲノム及び未編集のゲノムに存在する、SV40ポリアデニル化配列中の配列を検出した。PAH_HA Set 1は、編集されたゲノムと未編集のゲノムの両方には、組み込まれていないベクターにも存在する、相同アーム中の領域を検出した。
【０１７４】
DNA試料を油滴に分配した。1滴の油滴が2つのDNA分子(例えば、ベクター粒子及びゲノムDNA粒子)をランダムに含有する確率を有意に低下させる(p<0.001)ように、DNAの濃度を、20μL当たり600pgの濃度に最適化した。PAH_Genomic Set 1により同定されたDNAの量(Quantity_genome)は、未編集のゲノムと編集されたゲノムの総量を表した。SV40_FAM Set 1により同定されたDNAの量(Quantity_payload)は、編集されたのゲノムと組み込まれていないベクターの総量を表した。PAH_HA Set 1により同定されたDNAの量(Quantity_HA)は、未編集のゲノムと編集されたゲノムと組み込まれていないベクターの総量を表した。したがって、編集されたゲノムの量は、次の式により算出することができる:Quantity_genome +- Quantity_payload - Quantity_HA。正しく組み込まれたゲノムの割合は、Quantity_genomeで割った、編集されたゲノムの量として算出することができる。
【０１７５】
【表５】
2021512871.tif 000007
【０１７６】
図3Bに示されているように、上記プライマー/プローブセットにより測定したとき、pHMI-hPAH-hA-002ベクターが正しく組み込まれたゲノムのパーセンテージは、17.86%であった。pHMI-hPAH-hA-002ベクターで形質導入しなかった対照細胞では、組込みが検出されなかった。
【０１７７】
(実施例4)
マウス肝臓におけるin vivoでのPAH遺伝子編集
この実施例は、マウスPAH遺伝子を編集することができるPAH修正ベクターであって、マウス肝臓におけるそれらの編集効率を決定することができる前記PAH修正ベクターを調査するための動物モデルを提供する。
【０１７８】
a)野生型マウスにおけるマウスPAH遺伝子の編集
具体例で、ここで提供するのは、pHMI-hPAH-mAC-006ベクターを使用するマウスゲノムのin vivoでの編集である。pHMI-hPAH-mAC-006ベクターは、pHMI-hPAH-hAC-008ベクターに類似しているが、ヒトPAH遺伝子ではなくマウスPAH遺伝子を編集することができる(図4A)。具体的には、pHMI-hPAH-mAC-006は、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含んでいた:5'ITRエレメント、5'相同アーム、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、標的組込み制限カセット(「TI RE」)、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。これらのエレメントの配列をTable 6(表6)に示す。5'相同アームは、マウスPAH開始コドンの上流の且つマウスPAH開始コドンを含む、野生型ゲノム配列を含み、したがって、マウスPAH遺伝子の開始コドン及び/又は5'非翻訳領域(UTR)の突然変異を修正する能力があった。3'相同アームは、マウスPAHの開始コドンの下流に野生型ゲノム配列を含んでいた。マウスゲノムへのPAH修正ベクターpHMI-hPAH-mAC-006の組込みは、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、及び標的組込み制限カセットを、マウスPAH遺伝子の開始コドンに挿入する(すなわち、したがってマウスPAH遺伝子のヌクレオチド1〜3を置換する)ことによって、マウス細胞において野生型ヒトPAHタンパク質を発現させることができた。単独でのこのベクターは、プロモーター配列を含まなかったが、ゲノム組込みなしに独立したPAH発現を駆動することができた。
【０１７９】
【表６】
2021512871.tif 000008
【０１８０】
pHMI-hPAH-mAC-006ベクターをAAVHSC17カプシドにパッケージングし、2匹の野生型新生仔マウスに、体重1kg当たりベクターゲノム2×1013個の用量で、尾静脈経由で静脈内注射した。2匹の対照マウスには尾静脈経由で食塩水の注射を施した。肝臓試料を2週間後に採取した。
【０１８１】
マウスゲノムへのpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの組込みを検出するためのPCR法を開発した。図4Bに示されているように、プライマーの第1のペア(配列番号62及び63)を、未編集のアレルから867bp DNAを増幅するように設計し(「対照PCR」)、プライマーの第2のペア(配列番号64及び65)を、編集されたアレルから2459bp DNAを特異的に増幅するように設計した(「編集アレルPCR」)。図4Cに示されているように、食塩水で処置したマウスからの肝臓試料、及び3T3マウス線維芽細胞の細胞試料は、編集されたアレルに対応するPCR産物を生成しなかったが、その一方で、pHMI-hPAH-mAC-006ベクターを注射した2匹のマウスからの肝臓試料は、編集されたアレルに対応するPCR産物を生成した。4つの試料全てが、未編集のアレルに対応するPCR産物の同様のレベルを生じさせ、これは、これらの試料が、品質的に同等であることを示唆した。
【０１８２】
マウスゲノムへのpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの組込みを定量するためのddPCR法を開発した。Table 7(表7)に示す通りの、プライマーとプローブの2つのセットを、ddPCRによる組込みの検出のために設計した。mPAH_ATG_gDNA_FAM Set 1は、pHMI-hPAH-mAC-006の標的組込み後に未編集のゲノム及び編集されたゲノムを検出した。SV40_FAM Set 1は、編集されたゲノム及び未編集のゲノムに存在する、SV40ポリアデニル化配列中の配列を検出した(図5A)。
【０１８３】
DNA試料を油滴に分配した。1滴の油滴がベクター粒子とゲノムDNA粒子とをランダムに含有する確率を有意に低下させる(p<0.001)ように、DNAの濃度を20μL当たり600pgに最適化した(図5C及び5D)。ベクターがゲノムに組み込まれると、同じ液滴中のベクタープローブと遺伝子座プローブの二重陽性率が上昇する(図5B)。図5Eに示されているように、2匹の対照マウスは、肝臓におけるアレルのそれぞれ0%及び0.0395%が編集され、pHMI-hPAH-mAC-006ベクターで処置した2匹のマウスは、肝臓におけるアレルのそれぞれ2.504%及び2.783%が編集された。したがって、所与の条件下で肝臓におけるpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの総合組込み効率は、約2.6%であった。個々の細胞各々についての組込み効率は、全ての細胞にこのベクターで形質導入されるとは限らなかったので、より高いと予想される。
【０１８４】
【表７】
2021512871.tif 000009
【０１８５】
編集されたアレルから発現されたmRNAの相対量をddPCRにより決定した。SV40_FAM Set 1を使用して、編集されたアレルからのヒトPAH発現を特異的に検出した。各PAH発現レベルを内因性Hprtの発現レベルに正規化した。図6に示されているように、対照マウスは、ヒトPAHの発現を示さず、これは、プライマー及びプローブが内因性マウスPAHと交差反応しないことを示唆した。野生型レベルに対するPAH発現パーセントを、Hprtに対する内因性マウスPAHシグナルに対して正規化した、Hprtに対するヒトPAHシグナルに基づいて算出した。pHMI-hPAH-mAC-006ベクターで処置した2匹のマウスは、内因性マウスPAHレベルに対して、それぞれ、5.378%及び4.846%のmRNAレベルを有した。したがって、所与の条件下で肝臓におけるpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの総合mRNAレベルは、約5%であった。個々の細胞各々についてのmRNAレベルは、全ての細胞にこのベクターで形質導入されるとは限らなかったので、より高いと予想される。
【０１８６】
b) pahノックアウトマウスにおけるマウスPAH遺伝子の編集
1つの実験では、表現型修正に関するpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの効率を、PAHノックアウトマウスモデル(PAHENU2)を使用して決定した。手短に述べると、AAVHSC15カプシドにパッケージングされたhPAH-mAC-006ベクターを、これらのマウスに、体重1キログラム当たりベクターゲノム1.16×1014個の用量で、連続5日間、静脈内投与した。血清フェニルアラニン(Phe)を、5カ月間、週1回、質量分析により測定した。5カ月後、DNAを肝臓試料から抽出し、プライマーとプローブのセットを使用してddPCRにより細胞1個当たりのベクターゲノムの数を分析して、ベクター及びヒトPAHゲノム遺伝子座コピー数を測定した。
【０１８７】
プライマーとプローブのセットを使用してddPCRにより形質導入効率を(細胞1個当たりのベクターゲノムの数(「VG／細胞」)で測定して)決定して、ベクター、並びにマウス及びヒトPAHゲノム遺伝子座コピー数を測定した。プライマープローブセットを使用して多重化ddPCRにより編集頻度を測定して、マウスPAH遺伝子座及びヒトPAH遺伝子座に組み込まれたAAVベクター(「ペイロード」)から編集エレメントDNAの頻度を測定した。手短に述べると、単一DNA鎖を油滴に分配した。各液滴を、ペイロードの存在又は非存在と共にヒト又はマウスどちらかのPAH DNAの存在について、試験した。編集頻度は、別々の核酸分子内へのペイロードと標的DNAの共分配の予想確率を超える、単一の液滴内へのペイロードと標的DNAの共分配の検出値に基づいて、算出した。
【０１８８】
PAHノックアウトマウスは、血液中のフェニルアラニン(Phe)レベルが上昇した表現型を有した。表現型変化を調査するために、AAVベクターの投与後のPheの血清レベルを測定し、0時点のベースラインに対するパーセンテージレベルを算出し、パーセンテージレベルを、AAVベクターを施さなかった対照マウスと比較した。
【０１８９】
AAVHSC15カプシドにパッケージングされたhPAH-mAC-006ベクターを投与したマウスは、細胞1個当たりベクターゲノム約8〜18個の形質導入効率(図7A)、及びアレルの数に対して約4.4%の平均編集効率(図7B)を示した。この編集効率は、マウスの血清中のPheレベルを少なくとも5カ月間、約50%低下させるのに十分なPAHの発現レベルを裏付け(図7C及び図7D)、表現型変化は、この編集効率と相関した(図7E)。編集されたゲノム遺伝子座から、ペイロードとハイブリダイズした第1のプライマー及び右側相同アームの下流のゲノム配列とハイブリダイズした第2のプライマーを使用して増幅した、PCR産物の長さにより、Pah遺伝子座におけるベクターの正しい相同組換えを検証した(データを示さない)。
【０１９０】
相同組換えが、編集されたアレルに何らかのゲノム変化を導入するかどうかを決定するために、相同アームに対応するゲノム領域内のDNA配列をディープシーケンシング(Illumina社)により更に解析した。試料全てが、高品質配列リードを有し、全ての位置を、20,000リードを超える深度でシーケンシングした。挿入及び欠失(本明細書では以降、「インデル」)を、インデルクオリティーフィルター及びストランドバイアスフィルターを用いてSomatic Variant Callerにより同定した。具体的には、連続する10個のGを含む右側相同アーム内の領域は、対照動物においても、処置動物においても、約0.02〜0.05%の高いインデル率を示した。この遺伝子座はもちろん他の幾つかの遺伝子座でのインデルは、本物の変化についてのフィルターを通過しなかったので、さらなる解析から外した。Table 8(表8)に示すように、未処置対照動物は、0.002〜0.006%のインデル率を示した。処置動物1は、0.031%のインデル率を有し、処置動物2には、フィルターを通過したインデルが無く、処置動物3は、対照動物のものに類似したインデル率を有した。同定された全てのインデルは、非翻訳領域に位置した。
【０１９１】
【表８】
2021512871.tif 000010
【０１９２】
上記の結果は、ゲノムにPAHコード配列を挿入する修正ベクターを使用してPAH欠乏の表現型を逆転させることの実現可能性を実証した。
【０１９３】
in vivoでの形質導入後の個々のマウス肝細胞におけるヒトPAHの発現を検出するために、肝臓組織切片を用いて、上記のサイレントコドン変化を有するヒトPAH RNAの>1kbに特異的なプローブを使用してRNA in situハイブリダイゼーション(ISH)を行った(Advanced Cell Diagnostics社、Hayward、CA)。図7Fに示されているように、このプローブは、hPAH-mAC-006ベクターで形質導入したマウス肝細胞においてPAH配列を含むヒトPAH RNA及び場合によりウイルスDNAを検出したが、内因性マウスPah RNAと交差ハイブリダイズしなかった。同じサイレントコドン変化を有するヒトPah RNAの発現を駆動するCMVプロモーターを含む導入遺伝子構築物で形質導入したマウスの肝臓試料を陽性対照として使用した。
【０１９４】
c)PAH修正ベクターpHMI-hPAH-mAC-006
pHMI-hPAH-mAC-006ベクターは、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含んでいた:5'ITRエレメント、5'相同アーム、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。これらのエレメントの配列をTable 9(表9)に示す。
【０１９５】
【表９】
2021512871.tif 000011
【０１９６】
d)pHMI-hPAH-mAC-006を投与したマウスにおけるPAH遺伝子編集効率
図9Aは、pHMI-hPAH-mAC-006ベクターを施したマウスにおけるPAH遺伝子の編集効率を決定するために使用したアッセイの模式図を示す。ddPCR及びLAM-NGS(LAM-PCR、続いての次世代シーケンシング(NGS))を、本明細書で説明するように及び図9Aに示すように行った。図9Bは、pHMI-hPAH-mAC-006ベクター又は溶媒対照のどちらかを投与したマウスの細胞において決定したときのPAH遺伝子編集効率のグラフを示す。図9Bに示されているように、HMI-hPAH-mAC-006ベクターを投与したマウスにおけるPAH遺伝子編集効率は、アレルの数に対して約8%であると決定された。編集された領域においてエラーは検出されなかった。
【０１９７】
e)マウスモデルにおける高フェニルアラニン血症の持続的な表現型修正
1つの実験では、表現型修正に関するpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの効率を、PAHノックアウトマウスモデル(PAHENU2)を使用して決定した。pHMI-hPAH-mAC-006ベクターをAAVHSC15カプシドにパッケージングし、マウスに体重1キログラム当たりベクターゲノム1×1014個の用量で静脈内投与した。表現型変化を調査するために、AAVHSC15カプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクターの投与後のフェニルアラニン(Phe)及びチロシン(Tyr)の血清レベルを7週間より長い間、週1回測定し、0時点のベースラインに対するパーセンテージレベルを算出し、パーセンテージレベルを、溶媒対照を施した対照マウスと比較した。合計4匹のマウスに、AAVHSC15カプシドにパッケージングされたpHMI-hPAH-mAC-006ベクターを投与し、2匹のマウスには溶媒対照を投与した。図10に示されているように、Pheの血清レベルの有意な低下(図10A;*は、反復測定の二元配置ANOVAにより溶媒に対してp<0.0001を示す;反復測定の二元配置ANOVAにより時間に対してp<0.0001)及びTyrの血清レベルの有意な上昇(図10B;*は、反復測定の二元配置ANOVAにより溶媒に対してp<0.05を示す;反復測定の二元配置ANOVAにより時間に対してp<0.0003)が、ベクターを施したマウスにおいて観察された。図10Cは、ベクター又は溶媒対照を施したマウスにおける血清Pheと血清Tyr間の比を示す(*は、反復測定の二元配置ANOVAにより溶媒に対してp< 0.002を示す;反復測定の二元配置ANOVAにより時間に対してp<0.0004)。
【０１９８】
図11Aは、pHMI-hPAH-mAC-006ベクター又は溶媒対照のどちらかを投与したマウスから得た細胞についてのPAH遺伝子編集効率及び形質導入効率を示すグラフを示す。図11Aの左側のy軸は、編集効率のパーセンテージを示し、pHMI-hPAH-mAC-006ベクター(AAVHSC15-mPAH)を投与したマウスが、アレルの数に対して約5%の編集効率を有したことを示す。図11Aの右側のy軸は、細胞1個当たりのベクターゲノムの数を示し、pHMI-hPAH-mAC-006ベクター(AAVHSC15-mPAH)を投与したマウスが、細胞1個当たりベクターゲノム約140個という形質導入効率を有したことを示す。
【０１９９】
図11Bは、pHMI-hPAH-mAC-006ベクター(AAVHSC15-mPAH)又は溶媒対照のどちらかを投与したマウスから得た細胞についての発現されたPAH mRNAの相対量であって、マウスGAPDHの発現レベルに正規化した前記相対量を示すグラフを示す。示されているように、pHMI-hPAH-mAC-006ベクター(AAVHSC15-mPAH)を投与したマウスから得た細胞は、溶媒対照を投与したマウスと比較して、有意なヒトPAH mRNAレベルを有した(*は、両側マン・ホイットニー検定により溶媒に対してp<0.005を示す)。
【０２００】
(実施例5)
マウスモデルにおけるヒトPAH遺伝子のin vivoでの編集
この実施例は、マウスモデルにおけるヒトPAH遺伝子の編集に関して、前の実施例で説明したもの等の、PAH修正ベクターを調査するための動物モデルを提供する。
【０２０１】
a)マウスモデルにおけるヒト血液細胞中のヒトPAHの編集
手短に述べると、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスを、亜致死照射によって骨髄破壊し、このマウスにヒトCD34+造血幹細胞を移植した。12週間後、末梢血中のヒト及びマウスCD45+細胞の量をフローサイトメトリーにより同定することによって生着レベルを決定し、循環ヒトCD45+細胞を50%より多く有するマウスを選択した。AAVHSC17カプシドでパッケージングされたhPAH-hAC-008ベクターを、4群に均等に分けた12匹のそのようなマウスに静脈内投与した。マウスの第1及び第2の群には、体重1キログラム当たりベクターゲノム1.54×1013個の用量を施し、第3及び第4の群には、体重1キログラム当たりベクターゲノム2.1×1012個の用量を施した。注射の6週間後にマウスを安楽死させた。血液、骨髄及び脾臓組織の試料を採取し、ゲノムDNAを抽出した。
【０２０２】
プライマープローブセットを使用して多重化液滴デジタルPCR(ddPCR)によりマウス及びヒト細胞における編集頻度を測定して、マウスPAH遺伝子座及びヒトPAH遺伝子座へのAAVベクター(「ペイロード」)組込みによって組み込まれたDNAの頻度を測定した。手短に述べると、単一DNA鎖を油滴に分配した。各液滴を、ペイロードの存在又は非存在と共にヒト又はマウスどちらかのPAH DNAの存在について、試験した。編集頻度は、別々の核酸分子内へのペイロードと標的DNAの共分配の予想確率を超える、単一の液滴内へのペイロードと標的DNAの共分配の検出値に基づいて算出した。
【０２０３】
表10に示されているように、ヒト細胞の編集が骨髄試料において用量依存的に検出された。注目すべきことに、マウス細胞では編集が検出されなかったので、編集はヒトゲノムに特異的であった。
【０２０４】
【表１０】
2021512871.tif 000012
【０２０５】
図8Aは、AAVHSC15カプシドにパッケージングされたベクターを投与したマウスのヒト及びマウス肝細胞へのhPAH-hAC-008ベクター及びhPAH-hAC-008-HBBベクターの形質導入効率を示す。
【０２０６】
b)HBBイントロンを含むベクターを使用するマウスモデルにおけるヒト肝細胞中のヒトPAHの編集
hPAH-hAC-008ベクターは、いかなるイントロンもない完全ヒトPAHコード配列を含む。ヒトHBB遺伝子の第1のイントロン(配列番号28のヌクレオチド配列を有するもの)がヒトPAHコード配列のヌクレオチド912と913の間に付加されている修飾ベクターhPAH-hAC-008-HBBを、ベクターから転写されるRNA分子の核外輸送及び安定性を向上させるために生成した。ヌクレオチド912と913の間のヌクレオチド間結合は、天然PAH遺伝子のエクソン8とエクソン9の間のスプライシング部位に対応し、これは、コドンのサイレント変化により破壊されなかった。
【０２０７】
ベクターをAAVHSC15カプシドでパッケージングし、マウスに体重1キログラム当たりベクターゲノム1×1013個の用量で静脈内投与した。投与の6週間後、肝臓試料を採取し、サイレント変化を有するPAH配列を含むヒトPAH mRNAの及び場合によりウイルスDNAの局在を、in situハイブリダイゼーションにより調査した。図8Bに示されているように、HBBイントロンの付加は、mRNAの核外輸送を実質的に向上させた。この結果は、PAHコード配列へのイントロンの付加が、PAH遺伝子の発現レベルを増加させる可能性がありうること、及びこの特徴をPAH修正ベクターの設計に含めることができることを実証した。
【０２０８】
c)マウスモデルにおけるヒト肝細胞中のヒトPAHの編集
手短に述べると、FRG(登録商標)ノックアウトマウスと一般に呼ばれる、C57Bl/6バックグラウンドのFah-/- Rag2-/- Il2rg-/-マウスを、肝臓ヒト化のモデルとして使用した。このマウスは、免疫不全であり、チロシン分解酵素フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ(Fah)を欠いていた。マウス肝細胞のアブレーションを、保護薬2-(2-ニトロ-4-トリフルオロメチルベンゾイル)-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)の休薬により誘導した。次いで、マウスにヒト肝細胞を生着させ、ウロキナーゼ発現アデノウイルスを投与してヒト肝細胞の再増殖を増進させた。CuRx(商標)ニチシノン(20-0026)の適切なレジメン及びSMX/TMP抗生物質(20-0037)の予防的処置を用いて、動物の生涯にわたって生着を維持した。これらの動物は、平均体重22グラムであり、18〜24カ月の典型的な寿命を有した。
【０２０９】
hPAH-hAC-008又はhPAH-hAC-008-HBBベクターをAAVHSC15カプシドでパッケージングし、マウスに体重1キログラム当たりベクターゲノム1×1013個の用量で静脈内投与した。投与の6週間後、肝臓試料を採取し、ヒト及びマウス肝細胞を分離し、肝臓灌流後にMiltenyi社製autoMACSカラムを使用して精製した。DNAを抽出し、上に記載したのと同じddPCR法を使用して遺伝子編集の効率を測定した。
【０２１０】
図8Cに示されているように、全てのアレルのうちの編集されたアレルのパーセンテージとして測定した、ヒト肝細胞における編集効率パーセンテージは、hPAH-hAC-008ベクターで処理した動物では2.2%、及びhPAH-hAC-008-HBBベクターで処理した動物では4.3%であった。編集は、どちらの動物からのマウス肝細胞においても検出されなかった。どちらの動物からのマウス肝細胞においても編集の検出が欠如することは、マウス肝細胞に十分に形質導入された(図8A)ので、形質導入効率の不足に起因する可能性が低い。別の実験では、hPAH-hAC-008ベクターによるヒトゲノムの編集が、ヒトゲノムのアレルの数に対して2.131%の率で検出されたが、その一方で、この肝臓試料におけるマウスゲノムの編集は、マウスゲノムのアレルの数に対して0.05%の率で検出された。これらの結果は、hPAH-hAC-008ベクター又はその修飾バージョンによるPAH遺伝子のヒト特異的編集を示し、肝細胞における編集効率を調査するためのin vivoモデルを提供した。
【０２１１】
d)マウスモデルにおけるヒト肝細胞中のヒトPAHの編集
1つの実験では、FRG(登録商標)ノックアウトマウスと一般に呼ばれる(本明細書ではHuLivマウスとも呼ばれる)、C57Bl/6バックグラウンドのFah-/- Rag2-/- Il2rg-/-マウスを、上に記載したように、肝臓ヒト化のモデルとして使用した(図12Aを参照されたい)。
【０２１２】
pHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターは、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含んでいた:5'ITRエレメント、5'相同アーム、スプライシングアクセプター、2Aエレメント、サイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。これらのエレメントの配列はTable 11(表11)に記載される。
【０２１３】
【表１１】
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【０２１４】
pHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターをAAVHSC15カプシドでパッケージングし、マウスに体重1キログラム当たりベクターゲノム1×1014個の用量で静脈内投与した。AAVHSC15カプシドでパッケージングされたpHMIK-hPAH-hI1C-032を施した3匹のマウスから肝臓試料を採取し、ヒト及びマウス肝細胞を分離し、精製し、DNAを抽出した。上で説明したのと同じddPCR法を使用して、遺伝子編集の効率を測定した。
【０２１５】
ベクター投与の1週間及び6週間後に処置マウスから得た細胞中の全てのアレルのうちの編集されたアレルのパーセンテージを決定することにより、ヒト肝細胞におけるPAH遺伝子編集の持続性を測定した。図12Bに示されているように、ベクターの投与の1週間後にマウスから得た細胞では約4%のPAH遺伝子編集が測定され、ベクターの投与の6週間後にマウスから得た細胞では約7%の遺伝子編集が測定された。
【０２１６】
pHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターにより媒介されるゲノム編集は、HuLivマウスにおいてヒト肝細胞に特異的であることが判明した。図13に示されているように、ベクター投与の1週間後、PAH遺伝子編集(ddPCR及びNGSにより決定したとき)は、ヒトゲノムのアレルの数に対して約3%〜3.5%の率で検出されたが、その一方で、この肝臓試料におけるマウスゲノムの編集は、マウスゲノムのアレルの数に対して0%に近かった。ベクター投与後6週間の時点で、ヒトゲノムのアレルの数に対して約5%〜6.5%の率で編集が検出された。*は、マウスの値と比較してp<0.0025を示す。
【０２１７】
更に、pHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターは、非ヒト細胞では効果がないことが判明した。図14に示されているように、PAHノックアウトマウス(PAHENU2)マウスに、AAVHSC15カプシドでパッケージングされたpHMIK-hPAH-hI1C-032ベクター(hPAH-032)を、体重1キログラム当たりベクターゲノム1×1014個の用量で静脈内投与したとき、血清フェニルアラニンレベルは、対照を投与したマウスのものと、注射の3週間後まで同様であった。対照的に、pHMI-hPAH-mAC-006ベクター(mPAH-006)を投与したマウスは、早くも注射の1週間後に血清Pheレベルの低下を示した。
【０２１８】
図15Aは、ヒトPAH発現と血清Pheレベルとの関係を示す。示されているように、PAHENU2マウスにおいてpHMI-hPAH-mAC-006ベクターを使用する実験から収集したデータでは、10%のヒトPAH発現が、PAHENU2マウスにおける表現型を修正する。したがって、内因性レベルに対して10%のヒトPAH発現は、フェニルアラニン血症を修正するために必要なレベル(例えば、治療レベル)であると決定した。
【０２１９】
治療レベルの発現が、pHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターで検出された。pHMIK-hPAH-hI1C-032ベクター(hPAH-032)を体重1キログラム当たりベクターゲノム1×1014個の用量で投与したHuLivマウスにおいて、ヒト肝細胞におけるヒトPAHの発現をヒトGAPDHに対して相対的に測定した。図15Bに示されているように、ベクターで処置した2匹の異なるHuLivマウスにおいて2つの異なる発現プローブを使用してヒトPAHの発現を測定して、ヒトPAH発現はヒト肝細胞において10%より多いと決定した。ベクターを投与したHuLivマウスのヒト肝細胞におけるPAH遺伝子編集範囲は、13匹の異なるマウスにおいて3回の異なる実験にわたって約5%〜約11%であると測定された。
【０２２０】
pHMIK-hPAH-hI1C-032ベクターは、ヒトPAH遺伝子を標的とすることが判明し、HuLivマウスにおいて編集されたmRNAのレベルの修正をもたらした。表現型修正に必要なPAH mRNAレベルを、先ず、マウスモデルにおいて(PAHノックアウトマウスモデル(PAHENU2)を使用して)確立した。これを内因性レベルに対して約10%のPAH発現であると決定した(図15A)。図16に示されているように、GAPDH発現に対してヒトPAH遺伝子発現は、約44.9%であると決定し(左側)、GAPDH発現に対してマウスPAH遺伝子発現は、約39.7%であると決定した(右側)。
【０２２１】
(実施例6)
ヒトPAH修正ベクター
この実施例は、ヒトPAH修正ベクターpKITR-hPAH-mAC-006-HCR、pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR、pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3、pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3、及びpHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1を提供する。これらのベクターの模式図を、図17A、図17B、図17C、図17D、及び図17Eにそれぞれ示す。
【０２２２】
a) pKITR-hPAH-mAC-006-HCR、pKITR-hPAH-hI1C-032-HCR、及びpHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1
ベクターpKITR-hPAH-mAC-006-HCR及びpKITR-hPAH-hI1C-032-HCRは、HCRイントロンをPAHコード配列に挿入することにより生成した。ベクターpHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1は、HBB1イントロンをPAHコード配列に挿入することにより生成した。HCR及びHBB1イントロンは、ルシフェラーゼレポーターを使用して肝臓及び血液細胞株において高度な発現を示すイントロンを決定するイントロンスクリーニング実験において、それらの性能に基づいて選択した。スクリーニングに使用したイントロンをTable 12(表12)に示す。
【０２２３】
【表１２】
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【０２２４】
pKITR-hPAH-mAC-006-HCRは、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含んでいた:5'ITRエレメント、5'相同アーム、HCRイントロンが挿入されたサイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、標的組込み制限カセット(「TI RE」)、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。pKITR-hPAH-hI1C-032-HCRは、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含んでいた:5'ITRエレメント、5'相同アーム、スプライスアクセプター、2Aエレメント、HCRイントロンが挿入されたサイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。pHMIA2-hPAH-mAC-006-HBB1は、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含んでいた:5'ITRエレメント、5'相同アーム、HBBイントロンが挿入されたサイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、標的組込み制限カセット(「TI RE」)、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。これらのエレメントの配列をTable 13(表13)に示す。
【０２２５】
【表１３】
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【０２２６】
b) pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3及びpHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3
ベクターpKITR-hPAH-mAC-006-SD.3及びpHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3は、スプライスドナー部位を修飾することにより生成した。スプライスドナーは、図17C及び図17Dにそれぞれ示されているように修飾した。pKITR-hPAH-mAC-006-SD.3は、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含んでいた:5'ITRエレメント、5'相同アーム、スプライスドナーが修飾されたサイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、標的組込み制限カセット(「TI RE」)、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。pHMIA2-hPAH-hI1C-032-SD.3は、5'から3'に向かって次の遺伝子エレメントを含んでいた:5'ITRエレメント、5'相同アーム、スプライシングアクセプター、2Aエレメント、スプライスドナーが修飾されたサイレント変化を有するヒトPAHコード配列、SV40ポリアデニル化配列、3'相同アーム、及び3'ITRエレメント。これらのエレメントの配列をTable 14(表14)に示す。
【０２２７】
【表１４】
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【０２２８】
本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態により範囲が限定されることにならない。実際、記載するものに加えて本発明の様々な修飾形態が上述の説明及び添付の図から当業者に明らかになると予想される。そのような修飾形態は、添付の特許請求の範囲に記載の範囲に入るように意図されている。
【０２２９】
本明細書に引用した全ての参考文献(例えば、刊行物又は特許又は特許出願)は、個々の参考文献(例えば、刊行物又は特許又は特許出願)各々が、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれていると具体的に且つ個々に示されている場合と同程度に、それら全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられている。他の実施形態は、下記の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2021512871.tif 000023
【図４Ｂ】
2021512871.tif 000024
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2021512871.tif 000026
【図５Ｂ】
2021512871.tif 000027
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2021512871.tif 000029
【図５Ｅ】
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【図６】
2021512871.tif 000031
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2021512871.tif 000033
【図７Ｃ】
2021512871.tif 000034
【図７Ｄ】
2021512871.tif 000035
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2021512871.tif 000039
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
2021512871.tif 000041
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2021512871.tif 000049
【図１３】
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【図１４】
2021512871.tif 000051
【図１５Ａ】
2021512871.tif 000052
【図１５Ｂ】
2021512871.tif 000053
【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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