(57)【要約】  本発明は、凝集する傾向の減少を示し、タンパク質の安定性及び収率を改善する、改変された黄色ブドウ球菌Hlaタンパク質を開示する。前記改変されたHlaタンパク質はまた、任意選択的に、グリコシル化部位コンセンサス配列を含有する。本発明はまた、改変されたHlaタンパク質及び抗原(例えば、黄色ブドウ球菌糖抗原)を含むコンジュゲートを開示し、抗原は、改変されたHlaタンパク質のアミノ酸残基に連結されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する改変されたHlaタンパク質であって、該アミノ酸配列が、配列番号1のH48位及びG122位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点で改変されており、前記置換がHからC及びGからCである、改変されたHlaタンパク質。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号1のH35位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点でさらに改変されている、請求項1に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項３】
H35位での前記アミノ酸置換がHからLである、請求項2に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項４】
アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択される1つ以上のコンセンサス配列を含むという点でさらに改変されており、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項５】
配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸(例えば、1〜7つのアミノ酸、例えば、1つのアミノ酸)が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列によって置換されている、請求項4に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項６】
D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131、S203、S239及びK273から選択される1つ以上のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項７】
D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている、請求項6に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項８】
D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置と置換されている、請求項7に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項９】
XがQ(グルタミン)であり、ZがR(アルギニン)である(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))、請求項4〜8のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１０】
配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、Hlaタンパク質の精製に有用であるペプチドタグをさらに含み、前記ペプチドタグが、任意選択的に、6つのヒスチジン残基又はHRリピート(例えば、HRHR(配列番号25)を含み、任意選択的に前記ペプチドタグが、アミノ酸配列のC末端に位置する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１２】
ペプチドタグが、N末端で1つ又は2つの追加のアミノ酸、例えば、GS(配列番号26)を含む、請求項11に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１３】
配列番号5、6、9若しくは10のいずれか1つのアミノ酸配列、又は配列番号5、6、9若しくは10のいずれか1つと少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一である配列を有する、請求項12に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１４】
アミノ酸配列が、Hlaタンパク質を宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムに指向することができるシグナル配列をさらに含み、任意選択的に、前記シグナル配列が、配列番号13〜21から選択され、任意選択的に、前記配列が、タンパク質のN末端にある、請求項1〜13のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１５】
タンパク質が、シグナル配列と配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列との間に1つ又は2つの追加のアミノ酸(例えば、S)を含み、任意選択的に、前記Hlaタンパク質が、配列番号5若しくは配列番号9のアミノ酸配列、又は配列番号5若しくは配列番号9と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１６】
タンパク質が、N末端で1つ又は2つの追加のアミノ酸(例えば、S)を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１７】
前記Hlaタンパク質が、配列番号6若しくは配列番号10のアミノ酸配列、又は配列番号6若しくは配列番号10と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項16に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１８】
改変されたHlaタンパク質がグリコシル化されている、請求項1〜17のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質を含むコンジュゲートであって、改変されたHlaタンパク質が、抗原、例えば、多糖又はオリゴ糖の抗原に連結されている、コンジュゲート。
【請求項２０】
改変されたHlaタンパク質が、任意選択的に、カルボジイミド化学、還元アミノ化(animation)、シアニル化化学(例えば、CDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロイルスクシンイミド化学からなる群から選択される化学コンジュゲーション法を用いて得られる化学的連結を介して、直接的に又はリンカーを介して、前記抗原に共有結合で連結されている、請求項19に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
バイオコンジュゲートである、請求項19に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
抗原が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファン(例えば、アスパラギン)から選択される、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸に連結されている、請求項19〜21のいずれか一項に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
【請求項２３】
抗原が、糖、任意選択的に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型5又は8の莢膜糖から任意選択的に選択される、細菌莢膜糖(例えば、黄色ブドウ球菌由来)である、請求項15〜17のいずれか一項に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
【請求項２４】
抗原が、黄色ブドウ球菌血清型5莢膜糖である、請求項23に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
【請求項２５】
請求項1〜17のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項25に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】
v)グリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の核酸、
vi)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
vii)請求項1〜17のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
viii)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞。
【請求項２８】
(a)ウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼ、及び(b)Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項27に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の遺伝子に対して異種であり、任意選択的に、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼが、エシェリキア属(Escherichia)種、シゲラ属(Shigella)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、キサントモナス属(Xhantomonas)種、サルモネラ属(Salmonella)種、エルシニア属(Yersinia)種、アエロモナス属(Aeromonas)種、フランシセラ属(Francisella)種、ヘリコバクター属(Helicobacter)種、プロテウス属(Proteus)種、ラクトコッカス属(Lactococcus)種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種、シュードモナス属(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)種、バチルス属(Bacillus)種、クロストリジウム属(Clostridium)種、リステリア属(Listeria)種、又はカンピロバクター属(Campylobacter)種由来であり、任意選択的にwecA(例えば、大腸菌由来のwecA)である、請求項28に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記ヘキソース単糖誘導体が、C-2位がアセトアミド基で修飾される任意の単糖、例えばN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)である、請求項27〜29のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌(E. coli)O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であるか、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、請求項27〜30のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapK、並びに任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO及び/又はcapPを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項27〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapK、並びに任意選択的に、緑膿菌(P. aeruginosa)O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB及び/又はwecCを含む、黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項27〜31のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)に由来し、任意選択的に前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニのpglBであり、任意選択的にカンピロバクター・ジェジュニのpglB遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれ、任意選択的に宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置き換えられており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子がカンピロバクター・ジェジュニpglBによって置き換えられている、請求項27〜33のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞が、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記莢膜多糖ポリメラーゼが、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、請求項27〜34のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記フリッパーゼが、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、請求項27〜35のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記宿主細胞が、単糖を修飾することができる酵素、任意選択的にエピメラーゼをさらに含み、任意選択的に、前記エピメラーゼが、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的に前記エピメラーゼが、大腸菌由来であり、任意選択的に大腸菌O157由来のZ3206又はgalEである、請求項27〜36のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
改変されたHlaタンパク質をコードする核酸が、宿主細胞中のプラスミドにある、請求項27〜37のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
大腸菌である、請求項27〜38のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
糖に連結された、改変されたHlaタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生産する方法であって、(i)タンパク質の生産に適した条件下で、請求項27〜39のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)バイオコンジュゲートを単離することを含む方法。
【請求項４１】
改変されたHlaタンパク質に連結された糖を含む、請求項40に記載の方法によって生産されるバイオコンジュゲート。
【請求項４２】
請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
【請求項４３】
改変されたHlaタンパク質又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、請求項42に記載の免疫原性組成物を作製する方法。
【請求項４４】
請求項42に記載の免疫原性組成物、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチン。
【請求項４５】
それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防するための方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４６】
黄色ブドウ球菌感染に対してヒト宿主を免疫化する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法。
【請求項４７】
対象における黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量又は予防有効量を投与することを含む方法。
【請求項４８】
黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変されたHlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４９】
黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変Hlaタンパク質、又は請求項19〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項41に記載のバイオコンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性組成物及びワクチン、それらの製造、並びに医薬におけるこのような組成物の使用の分野に関する。より具体的には、本発明は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の改変されたHlaタンパク質、及びワクチン抗原としてのその使用に関する。改変されたHlaは、それ自体で抗原として、また他の抗原、具体的には、糖抗原用の担体タンパク質としても使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は、菌血症、心内膜炎、肺炎、及び創傷感染などの侵襲性ヒト感染症の主要な原因である。黄色ブドウ球菌は、抗生物質耐性を急速に生じさせ、一般的に使用される抗生物質、例えば、メチシリン、及びさらには最終手段であるバンコマイシンの抗生物質に対して耐性である菌株が出現している。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は病院で流行しており、地域関連MRSA株は世界的に広がっており、世界的に大きな課題となっている。
【０００３】
したがって、ブドウ球菌性疾患を予防するためのワクチンが緊急に必要とされている。臨床試験では、莢膜多糖(CPS)コンジュゲート、個々のタンパク質抗原、及びリポテイコ酸に対するモノクローナル抗体(mAbs)などのいくつかのワクチンが試験されている。しかしながら、いずれも様々な開発段階では失敗しており、現在までのところ、黄色ブドウ球菌に対するワクチンは市販されていない。
【０００４】
液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘発する黄色ブドウ球菌ワクチンは、現在、評価段階にあり、両方のタンパク抗原、例えば、アルファ毒素(Hla)及びCPSは、多成分ワクチンに含めるために検討されている重要な抗原である。
【０００５】
黄色ブドウ球菌株の90%は、5型又は8型の莢膜多糖のいずれかを発現し、そのため、CP5及びCP8を含むワクチンは、循環する黄色ブドウ球菌株の大多数に対して防御する可能性がある。黄色ブドウ球菌莢膜多糖を含むワクチンは、ブドウ球菌に対する防御免疫応答を作り出すために使用されてきたが、CPS単独を含むワクチンは、十分に有効であることは証明されていない。シュードモナスエキソタンパク質A(StaphVAX-Nabi Biopharmaceuticals)にコンジュゲートされた黄色ブドウ球菌5型及び8型の莢膜多糖のコンジュゲートを含むワクチンが臨床試験において試験されており、PhI及びIIにおいて安全性及び有効性が実証されたが、国際公開第WO03/61558号に記載されているように、PhIIIでは必要とされる評価項目を達成することができなかった。
【０００６】
新しい糖鎖工学技術を用いて緑膿菌エキソタンパク質A(EPA)又は黄色ブドウ球菌Hlaにコンジュゲートした黄色ブドウ球菌CPSを含むワクチンをウサギ及びマウスで試験した(Wackerら、2014年、Journal of Infectious Diseases 209巻: 1551〜61頁)。CP-Hlaバイオコンジュゲートワクチンは、菌血症及び致死性肺炎からマウスを保護し、黄色ブドウ球菌タンパク質及び莢膜多糖のバイオコンジュゲートが黄色ブドウ球菌に対する有効なワクチンの有望な候補である可能性を実証した。
【０００７】
Hlaは毒素であり、したがって、ワクチン抗原として使用するために解毒が必要である。野生型Hlaの単量体はアセンブルして、六量体を形成し、これがヒト赤血球及び他の細胞の膜に脂質二重層を貫通する孔を形成し、細胞溶解をもたらす。Menzies and Kernodle (Menzies and Kernodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847)に記載されるように、Hlaの細胞溶解活性は、孔形成に関与するアミノ酸残基の突然変異によって減少し得る。このような突然変異体の1つ(HlaH35L)は、著しく減少した六量体形成を示し、溶血活性を持たず、マウスに対して無毒性であった。HlaH35Lは、それ以来、上記のバイオコンジュゲートワクチンを含む黄色ブドウ球菌感染に対する実験的ワクチンに使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、本発明者らは、六量体に加えて、Hlaがまたタンパク質の安定性及び収率に影響を与える高レベルの凝集体を形成することを見出した。減少した六量体形成を示す突然変異体、例えばHlaH35Lは、凝集体形成の問題の影響をなおも受けている。したがって、凝集が減少し、現在公知である解毒された突然変異体よりも高い収率で生成され得る安定なHlaタンパク質が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、改変されたHla(ブドウ球菌性溶血素A、α毒素としても公知である)タンパク質及び前記改変されたHlaのコンジュゲート(バイオコンジュゲートを含む)を提供する。
【００１０】
したがって、本発明の一態様において、配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する改変されたHlaタンパク質であって、該アミノ酸配列が、配列番号1のH48位及びG122位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点で改変されており、前記置換がそれぞれHからC及びGからCである、改変されたHlaタンパク質(例えば、配列番号2)が提供される。
【００１１】
前記改変されたHlaタンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号1のH35位(例えば、H35L)で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点でさらに改変され得る(例えば、配列番号3)。
【００１２】
前記改変されたHlaタンパク質は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含むようにさらに改変され得、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である(例えば、配列番号7)。ある実施形態では、前記改変されたHlaタンパク質は、以下の突然変異:H35L、H48C及びG122Cを含有する。したがって、配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたHlaタンパク質であって、アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含むという点で改変されており、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である、改変されたHlaタンパク質が提供される。例示的な配列は、配列番号7の配列である。
【００１３】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変されたHlaタンパク質に連結された、例えば共有結合で連結された、オリゴ糖又は多糖抗原を含むコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)が提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変されたHlaタンパク質又はバイオコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変されたHlaタンパク質又はバイオコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００１６】
本発明のさらなる態様によれば、
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞が提供される。
【００１７】
本発明のさらなる態様によれば、糖に連結された、改変されたHlaタンパク質を含む(又はそれからなる)バイオコンジュゲートを生産(生成)するプロセスが提供され、前記方法は、(i)タンパク質の生産に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養すること、及び(ii)前記宿主細胞によって生産されたバイオコンジュゲートを単離することを含む。
【００１８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明のプロセスによって生産されたバイオコンジュゲートが提供され、前記バイオコンジュゲートは、改変されたHlaタンパク質に連結された糖を含む。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む免疫原性組成物が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、改変されたHlaタンパク質又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、本発明の免疫原性組成物を作製する方法が提供される。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、それを必要とする対象におけるブドウ球菌感染、具体的には、黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防する方法が提供され、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートの治療有効量を前記対象に投与することを含む。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、ブドウ球菌感染、具体的には、黄色ブドウ球菌感染に対してヒト宿主を免疫化する方法が提供され、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、対象におけるブドウ球菌、具体的には、黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法が提供され、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートの治療有効量又は予防有効量を投与することを含む。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、ブドウ球菌感染、具体的には、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートが提供される。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、ブドウ球菌感染、具体的には、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬(薬剤)の製造における、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】担体タンパク質Hla(ヘモリシンA)に導入されたシステイン-システイン架橋を設計するための構造的根拠及び理論的解釈を示す図である。図1は、A)毒性孔形成Hla七量体(PDB識別子7AHL、Songら、1996年)、B)無毒性Hlaモノマー(PDB識別子4IDJ、Folettiら、2013年)、及びC)A)中の1つのモノマーの重ね合わせ(赤/淡灰色で強調)及びB中のモノマーの重ね合わせ(青/暗灰色で強調)の3D結晶構造を表す。システイン-システイン架橋部位のより広い領域は、楕円で示される。
【図１Ｂ−Ｃ】図１Ａの続きである。
【図２】結晶構造7AHL及び4IDJからの重ねられたHlaモデルの操作領域を示す図である。4つの異なる架橋Hla変異体を作出する、個々にシステイン残基に突然変異させた4対のアミノ酸の拡大図である。架橋されたアミノ酸残基対は、1)Y102-G126、2)G122-H48、3)N121-H48、4)G122-L52である。毒性形態のモデルは「T」として示され、非毒性形態は重ねられ、「NT」として示される。野生型残基は、棒表示で強調され、対応するアルファ炭素原子(C)の位置は各残基対について破線で結ばれている。各アミノ酸対のCα-Cα位置の距離は、オングストローム(Å)で示される:Y102C/G126C:7.52Å、G122C/H48C:6.23Å、N121C/H48C:6.60Å、G122C/L52C:7.04Åで示される。
【図３】架橋されたHla変異体のCP5-Hlaバイオコンジュゲート生成性及び安定性の増大を示す図である。図3は、CP5-Hlaバイオコンジュゲート生成のための架橋されたHla変異体の増大された安定性(減少した凝集体形成)及び生成性を示す。すべてのHla変異体は、131位(K131の置換)にグリコサイトを含んだ。キー:M=タンパクマーカー、C=非架橋変異体、SS1=Y102C-G126C、SS2=G122C-H48C、SS3=N121C-H48C、SS4=G122C-L52C、B=試料を装填前に煮沸した、NB=試料を装填前に煮沸しなかった。レーン1:PageRuler染色済みタンパク質マーカー。レーン2:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN570(HlaH35L)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸した。レーン3:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN570(HlaH35L)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸しなかった。レーン4:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN570(HlaH35L)、pGVXN72(空のPglBプラスミドベクター)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの非存在下で生成し、煮沸した。レーン5:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN570(HlaH35L)、pGVXN72(空のPglBプラスミドベクター)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの非存在下で生成し、煮沸しなかった。レーン6:空。レーン7:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN2178(HlaH35L-Y102C-G126C)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸した。レーン8:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN2178(HlaH35L-Y102C-G126C)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸しなかった。レーン9:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN2179(HlaH35L-H48C-G122C)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸した。レーン10:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN2179(HlaH35L-G122C-H48C)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸しなかった。レーン11:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN2180(HlaH35L-H48C-N121C)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸した。レーン12:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN2180(HlaH35L-H48C-N121C)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸しなかった。レーン13:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN2181(HlaH35L-L52C-G122C)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸した。レーン14:StGVXN1717[pGVXN393(cap5HIJK)、pGVXN2181(HlaH35L-L52C-G122C)、pGVXN1221(pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V)]由来のタンパク質試料。試料をPglBの存在下で生成し、煮沸しなかった。
【図４Ａ】動的光散乱(DLS)による凝集したu-Hla種の分析を示す図である。図4は、動的光散乱(DLS)による凝集したu-Hla(コンジュゲートされていないHla)種の分析を示す。A)は、凝集したHla(3試料)の平均サイズ分布プロファイルを示す。B)は、分析に使用された凝集したu-Hla種を示し、ピーク1は、約90mMのイミダゾールで溶出するIMAC由来である(楕円で示す)。C)は、モノマー又は七量体分子のいずれかの大まかな最大寸法をナノメートルで推定するために、プログラムPymolで行われた測定を示す。モノマー中の最長寸法は最大8ナノメートルである。七量体形態は、全方向に約10ナノメートルの最大寸法を有する。
【図４Ｂ】図４Ａの続きである。
【図４Ｃ】図４Ｂの続きである。
【図５Ａ】サイズ排除クロマトグラフィーにより検出された、SDS-PAGE中の煮沸していない試料からの非架橋の非グリコシル化(u-Hla)凝集体移動挙動と凝集体種との相関を示す図である。図5は、(A)サイズ排除クロマトグラフィー(クロマトグラフィーカラムからの吸光度読み出し及び溶出画分のSDS-PAGE)において大きな種として、及び(B)試料を煮沸していない場合のSDS-PAGEにおけるそれに応じて見かけのより高い分子量として泳動された凝集した非グリコシル化の非架橋Hlaの相関を示す(レーン4)。
【図５Ｂ】図５Ａの続きである。
【図６】固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)からの非架橋の非グリコシル化Hla変異体の溶出プロファイルを示す図である。図6は、抗His抗体を用いた各溶出画分のイムノブロット分析を伴う、非グリコシル化の非架橋Hlaの固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)の溶出プロファイルを示す。
【図７】固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)からの非架橋対架橋の非グリコシル化溶血素A変異体の溶出プロファイルを示す図である。図7は、図6からの非グリコシル化の非架橋Hlaからの固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)溶出プロファイルと、単量体と比較した凝集体形成の阻止(Y102C/G126C)、又はタンパク質収率の増加に関連する、単量体と比較した凝集体形成の強力な減少(G122C/H48C)を示す4つの非グリコシル化の架橋Hla変異体とのオーバーレイを示す。Y102-G126=架橋1、G122-H48=架橋2、N121-H48=架橋3、G122-L52=架橋4。
【図８】サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)からの非架橋対架橋の非グリコシル化溶血素A変異体の溶出プロファイルを示す図である。図8は、図6に示されるIMAC勾配溶出、及び図7に示される4つの架橋Hla変異体のモノマー種からのIMAC溶出物から得られた凝集体又はモノマーとして溶出された非グリコシル化の非架橋Hla変異体のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図９】カチオン交換クロマトグラフィーを用いたC末端タグを有するCP5-Hlaの高度に選択的な精製を示す図である。実施例6に記載される溶出画分からのタンパク質を4〜12%SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜上にブロットし、抗Hla抗体によって検出するか、又はゲルをSimplyBlue Safe染色で直接染色した。A:40μLの装填：レーン1:カラムに装填する前の試料からのタンパク質試料、レーン2:プールしたフロースルー画分のタンパク質試料、レーン3:プール洗浄画分からのタンパク質試料、レーン4〜9:溶出画分からのタンパク質試料、レーン10:PageRuler染色済みタンパク質マーカー。B:20μLの装填：レーン1:PageRuler染色済タンパク質マーカー、レーン2:カラムに装填する前の試料からのタンパク質試料、レーン3:プールしたフロースルー画分からのタンパク質試料、レーン4:プール洗浄画分からのタンパク質試料、レーン5〜10:溶出画分からのタンパク質試料。
【図１０】非タグ化CP5-Hlaバイオコンジュゲートのカチオン交換クロマトグラフィーの精製画分を示す図である。図9と同じ手順を非タグ化CP5-Hlaを用いて行った。ゲルA:20μLの装填：レーン1:PageRuler染色済みタンパク質マーカー、レーン2:カラムに装填する前の試料からのタンパク質試料、レーン3:プールしたフロースルー画分からのタンパク質試料、レーン4:プール洗浄画分からのタンパク質試料、レーン5-10:溶出画分からのタンパク質試料。ゲルB:40μLの装填：レーン1:PageRuler染色済みタンパク質マーカー、レーン2:カラムに装填する前の試料からのタンパク質試料、レーン3:プールしたフロースルー画分からのタンパク質試料、レーン4:プール洗浄画分からのタンパク質試料、レーン5〜10:溶出画分からのタンパク質試料。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
専門用語
担体タンパク質:コンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を作製するために抗原(例えば、糖抗原)に共有結合したタンパク質。担体タンパク質は、T細胞がコンジュゲートした抗原に対してT細胞性免疫を活性化する。
【００２８】
プロリン(プロ、P)とは別の任意のアミノ酸:アラニン(ala、A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、セリン(ser、S)、スレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、バリン(val、V)からなる群から選択されるアミノ酸を指す。
Hla:ブドウ球菌、具体的には、黄色ブドウ球菌由来のアルファ毒素としても公知であるヘモリシンA。
CP:莢膜多糖。
LPS:リポ多糖。
wzy:多糖重合を触媒する酵素をコードする多糖ポリメラーゼ遺伝子。コードされた酵素は、オリゴ糖単位を非還元末端に転移し、グリコシド結合を形成する。
waaL:膜結合酵素をコードするO抗原リガーゼ遺伝子。コードされた酵素は、ウンデカプレニル-二リン酸(UPP)結合O抗原をリピドAコアオリゴ糖に転移し、リポ多糖を形成する。
Und-PP:ウンデカプレニルピロリン酸。
Und-P:ウンデカプレニルリン酸。
還元末端:オリゴ糖又は多糖の還元末端は、グリコシド結合に関与せず、したがって開鎖型に変換することができる遊離アノマー炭素を有する単糖である。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「バイオコンジュゲート」とは、宿主細胞バックグラウンドで調製されたタンパク質(例えば、担体タンパク質)と抗原(例えば、糖)との間のコンジュゲートを指し、宿主細胞機構は、抗原をタンパク質に連結する(例えば、N連結する)。
【００３０】
本明細書で使用される場合、治療薬(例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン)を対象に投与する文脈において、用語「有効量」とは、予防効果及び/又は治療効果(複数可)を有する治療薬の量を指す。特定の実施形態では、「有効量」とは、以下の効果のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療薬の量を指す:(i)細菌感染又はそれに関連する症状の重症度を減少又は軽減する、(ii)細菌感染又はそれに関連する症状の持続時間を減少させる、(iii)細菌感染又はそれに関連する症状の進行を予防する、(iv)細菌感染又はそれに関連する症状の退行を引き起こし、(v)細菌感染症又はそれに関連する症状の発症又は発病を予防する、(vi)細菌感染又はそれに関連する症状の再発を予防する、(vii)細菌感染に関連する臓器不全を減少させる、(viii)細菌感染を有する対象の入院を減少させる、(ix)細菌感染を有する対象の入院期間を減少させる、(x)細菌感染を有する対象の生存を増加させる、(xi)対象における細菌感染を除去する、(xii)対象における細菌複製を阻害又は減少させる、及び/又は(xiii)別の治療薬の予防効果又は治療効果(複数可)を増大又は改善する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、動物、具体的には哺乳動物、例えば霊長類(例えば、ヒト)を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「ドナーオリゴ糖又は多糖」とは、オリゴ糖又は多糖がそれから誘導されるオリゴ糖又は多糖を指す。ドナーオリゴ糖及び多糖は、本明細書で使用される場合、第1のリピート単位の還元末端にヘキソース単糖(例えば、グルコース)を含む。ドナーオリゴ糖又は多糖という用語の使用は、オリゴ糖又は多糖がインサイチュで改変されることを示唆することを意味しない。むしろ、ドナーオリゴ糖又は多糖という用語の使用は、野生型の状態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、PglB)活性の弱い基質であるか、又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、例えば、PglB)活性の基質ではないオリゴ糖又は多糖を指すことを意味する。ドナーオリゴ糖又は多糖の例としては、黄色ブドウ球菌CP5及びCP8を含む細菌由来のものが挙げられる。当業者は、オリゴ糖又は多糖が、第1のリピート単位の還元末端にヘキソース単糖(例えば、グルコース)を含むかどうか、したがって、このようなオリゴ糖又は多糖が、本明細書に包含されるドナーオリゴ糖又は多糖であるかどうかを容易に決定することができる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「ヘキソース単糖誘導体」とは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性の基質となり得るヘキソース単糖の誘導体を指す。一般的に、ヘキソース単糖誘導体は、2位にアセトアミド基を含む単糖を含む。例示的なヘキソース単糖誘導体には、GlcNAc、HexNAc、デオキシHexNAc、又は2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソースが含まれる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリッドオリゴ糖又は多糖」とは、第1のリピート単位の還元末端にヘキソースを含まないが、代わりに第1のリピート単位の還元末端にヘキソース単糖誘導体を含む、操作されたオリゴ糖又は多糖を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、2つのアミノ酸又は核酸配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、整列された場合、そのアミノ酸又は塩基のパーセンテージは、2つの配列を比較する際に同じであることを意味する。このアラインメント及びパーセント相同性又は配列同一性は、当該技術分野において公知であるソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら、編集、1987年、Supplement 30)の7.7.18節に記載されているものを用いて決定することができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティが12であり、ギャップ拡張ペナルティが2であり、BLOSUMマトリックスが62であるアフィンギャップサーチを用いて、Smith-Waterman相同性サーチアルゴリズムによって決定される。Smith-Waterman相同性サーチアルゴリズムは、Smith & Waterman (1981年) Adv. Appl. Math. 2巻: 482〜489頁に開示されている。任意の具体的な配列(例えば、具体的な配列番号)に対する同一性パーセンテージは、理想的には、その配列の全長にわたって計算される。異なる長さの2つの配列間の配列同一性パーセンテージは、好ましくは、より長い配列長にわたって計算される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「免疫原性断片」は、その断片に特異的な宿主動物、例えばヒトにおいて、体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘発することができる、全体よりも小さい抗原の一部である。タンパク質の断片は、当該技術分野において公知である技術を用いて、例えば、組換え的に、タンパク質分解消化によって、又は化学合成によって生成することができる。ポリペプチドの内部断片又は末端断片は、ポリペプチドをコードする核酸の一端(末端断片について)又は両端(内部断片について)から1つ以上のヌクレオチドを除去することによって生じさせることができる。典型的には、断片は、全長配列の少なくとも10、20、30、40又は50個の連続したアミノ酸を含む。断片は、N末端及びC末端のいずれか又は両方から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40若しくは50個のアミノ酸を付加又は除去することによって容易に改変することができる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、又は親水性にほとんど影響ないか又は全く影響がなく、免疫原性の低下をもたらさないで、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを伴う。例えば、これらは、以下の基:バリン、グリシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、及びフェニルアラニン、チロシン内の置換であり得る。ポリペプチドの配列に対する保存的アミノ酸改変(及びコードするヌクレオチドに対する対応する改変)は、親ポリペプチドのものと類似する機能的及び化学的特徴を有するポリペプチドを生成し得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「欠失」は、タンパク質配列からの1つ以上のアミノ酸残基の除去である。典型的には、1〜6残基(例えば、1〜4残基)以下が、タンパク質分子内の任意の1つの部位で欠失される。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「挿入」は、タンパク質配列中の1つ以上の非天然アミノ酸残基の付加である。典型的には、約1〜6残基(例えば、1〜4残基)以下が、タンパク質分子内の任意の1つの部位に挿入される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「含む」は、指定された成分に加えて他の成分が存在し得ることを示し、一方、用語「からなる」は、他の成分が存在しないか、又は検出可能な量で存在しないことを示す。用語「含む」は、用語「からなる」を当然に含む。
【００４１】
タンパク質
配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含む(又はそれからなる)改変されたHlaタンパク質であって、該アミノ酸配列が、配列番号1のH48位及びG122位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点で改変されており、前記置換がそれぞれHからC及びGからC(例えば、H48C及びG122C、例えば、配列番号2又は配列番号3)である、改変されたHlaタンパク質が提供される。前記タンパク質は、さらに、アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含むという点でさらに改変され得、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸(例えば、配列番号7)である。これらの配列は、シグナル配列の付加、及び任意選択的に、本明細書に記載されるように、クローニング目的のためのN末端セリン及び/又はアラニンの挿入によって改変され得る。配列は、解毒突然変異、例えば、本明細書に記載される解毒突然変異のいずれか1つ又はすべてを含むようにさらに改変され得る。好ましい解毒突然変異は、配列番号1又は2のH35Lである。
【００４２】
ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列由来であり得、これは、免疫原性断片及び/又は配列番号1の変異体である。ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、全長配列の少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個の連続するアミノ酸残基を含む配列番号2又は3の免疫原性断片由来であり得、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。
【００４３】
ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列に由来し得、これは、1個以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変されている配列番号1の変異体である。アミノ酸置換は、保存的であるか又は非保存的であり得る。1つの態様では、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加又はそれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り、単一の変異体において組み合わせることができる。ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、1〜10個、5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、又は付加される変異体に由来することができる。例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号1〜3又は7のいずれか1つの変異体であるアミノ酸配列に由来することができ、この場合、N末端に1つ又は2つの追加アミノ酸、例えば、最初のN末端SA(例えば、配列番号6又は10)を有する。改変されたHlaタンパク質は、C末端に1つ以上の追加のアミノ酸、例えば、1、2、3、4、5、又は6個のアミノ酸を付加的に又は代替的に有することができる。このような追加のアミノ酸は、精製を補助するペプチドタグを含み得、例えば、GSHRHR(例えば、配列番号5、6、9及び10)を含み得る。
【００４４】
ある実施形態では、本発明は、B細胞エピトープ又はT細胞エピトープを含む断片及び/又は変異体を含む。このようなエピトープは、例えば、PSIPREDプログラム(David Jones、Brunel Bioinformatics Group、Dept. Biological Sciences、Brunel University、Uxbridge UB8 3PH、UKによる)、及びJameson及びWolf (CABIOS 4巻:181〜186頁[1988年])に記載される方法に基づいて計算される抗原性指標を用いて、2D構造予測の組み合わせを用いて予測することができる。
【００４５】
用語「改変されたHlaタンパク質」とは、Hla酸配列(例えば、配列番号2のHlaアミノ酸配列を有するか又は配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を有する)を指し、Hlaアミノ酸配列は、野生型成熟Hlaアミノ酸配列(例えば、配列番号1の野生型アミノ酸配列)であり得、これは、1つ以上のアミノ酸の付加、置換又は欠失(例えば、システインによる配列番号1のH48及びG122の置換、リジンによる配列番号1のH35の置換、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列(複数可)の付加(挿入)、又はD/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列による1つ以上のアミノ酸の置換による)によって改変されている。改変されたHlaタンパク質はまた、さらなる改変(付加、置換、欠失)、並びに1つ以上のコンセンサス配列(複数可)の付加又は置換を含み得る。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。N末端及び/又はC末端のさらなるアミノ酸は、クローニングを補助するために(例えば、存在する場合は、シグナル配列の後又はペプチドタグの前に)含まれ得る。ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、天然に存在しないHlaタンパク質であり得る。
【００４６】
本発明の実施形態では、改変されたHlaアミノ酸配列(例えば、配列番号2のアミノ酸配列、又は配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるHlaアミノ酸配列、例えば、配列番号3を有する)は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))コンセンサス配列によって置換されている。例えば、Hlaアミノ酸配列(例えば、配列番号3)における単一のアミノ酸は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))コンセンサス配列(例えば、配列番号7)で置き換えられ得る。あるいは、Hlaアミノ酸配列(例えば、配列番号2、又は配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるHlaアミノ酸配列)中の2、3、4、5、6又は7個のアミノ酸は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))コンセンサス配列で置き換えられ得る。
【００４７】
D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列の導入は、改変されたHlaタンパク質をグリコシル化し得る。したがって、本発明はまた、改変されたHlaタンパク質がグリコシル化された、本発明の改変されたHlaタンパク質を提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、Hlaアミノ酸配列の特定の領域、例えば、タンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。本発明のある態様では、コンセンサス配列(複数可)の位置は、改善されたグリコシル化、例えば、収率の増加を提供する。ある実施形態では、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))から選択されるコンセンサス配列(複数可)は、配列番号1のアミノ酸K131(例えば、配列番号7)に対応する位置で付加又は置換される。
【００４８】
ある実施形態では、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))から選択されるコンセンサス配列は、配列番号2の1つ以上のアミノ酸残基に対して若しくはアミノ酸残基K131に代えて、又は配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列中の同等の位置において(例えば、配列番号3のアミノ酸配列中の同等の位置において)付加又は置換されている。一態様では、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))コンセンサス配列は、配列番号1のアミノ酸K131に対して、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列(例えば、配列番号7)において付加又は置換されている。
【００４９】
当業者は、Hlaアミノ酸配列が配列番号2のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列である場合、「アミノ酸間」へのは、2つの配列間の配列同一性を最大化するために、この配列が配列番号1のアミノ酸配列と並べられた場合、定義された位置に対して同等である位置を指すことを理解する(配列アラインメントツールは、限定されないが、Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk) MUSCLE (www(.)ebi(.)ac(.)uk)、又はT-coffee (www(.)tcoffee(.)org)である)。一態様では、使用される配列アラインメントツールは、Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)である。
【００５０】
配列番号1の変異体及び/又は断片からのアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異された配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違を導くことができるが、しかしながら、突然変異された配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、したがって、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。
【００５１】
このようなグリコシル化部位の導入は、例えば、タンパク質の一次構造に新しいアミノ酸を付加する(すなわち、グリコシル化部位が全部又は一部に付加される)ことによって、又はグリコシル化部位を生じさせるためにタンパク質中の既存のアミノ酸を突然変異させること(すなわち、アミノ酸はタンパク質に付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように突然変異される)ことによって達成することができる。当業者は、タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であるアプローチ、例えば、タンパク質をコードする核酸配列の改変を含む組換えアプローチを用いて容易に改変し得ることを認識する。したがって、ある実施形態では、本発明は、配列番号1のH48及びG122に対応するアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるHlaアミノ酸配列における同等の位置がシステインで置換されており、グリコシル化部位が、配列番号1のHlaアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるHlaアミノ酸配列に組換え的に導入されている、アミノ酸配列を有する改変されたHlaタンパク質を提供する。したがって、ある実施形態では、本発明は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)であって、配列番号1のHlaアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるHlaアミノ酸配列に組換え的に導入されているコンセンサス配列(例えば、配列番号2又は3)を含むアミノ酸配列を有する、改変されたHlaタンパク質を提供する。本発明はまた、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)が、配列番号1のHlaアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるHlaアミノ酸配列に組換え的に導入される、改変されたHlaタンパク質(すなわち、改変された組換えHlaタンパク質)を調製する方法を提供する。ある種の実施形態では、古典的な5アミノ酸グリコシル化コンセンサス配列(D/E-X-N-Z-S/T)(配列番号11)は、より効率的なグリコシル化のためにリジン残基によって伸長され得(例えば、K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12))、したがって、挿入されたコンセンサス配列は、挿入されるべきか、又はアクセプタータンパク質アミノ酸を置き換える5、6、又は7個のアミノ酸をコードし得る。
【００５２】
一実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号2の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含み(又はそれらからなり)、前記アミノ酸配列は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列を含み、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である(例えば、K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)又はK-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))。ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号7のアミノ酸配列を含む(又はそれからなる)。ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、N末端セリン及び/又はアラニン(すなわち、N末端で付加されたS残基、例えば、配列番号6又は10)を有する配列番号1〜3又は7のいずれか1つのアミノ酸配列を含む(又はそれからなる)。
【００５３】
Hlaは毒素であるため、それをインビボで投与し得る前に、解毒する必要がある(すなわち、保護に適した投薬量で提供された場合、哺乳動物、例えば、ヒトに対して毒性を示さない)。本発明の改変されたHlaタンパク質は、(すなわち、突然変異により)遺伝的に解毒され得る。遺伝的に解毒された配列は、ヒトへの投与後に抗Hla防御及び/又は中和抗体を誘導する能力を保持しながら、望ましくない活性、例えば、毒性を減少させるために、ヒト赤血球及び他の細胞に対する脂質二重層貫通孔、膜透過、細胞溶解、及び細胞溶解活性を形成する能力を除去し得る。例えば、本明細書に記載されるように、Hlaタンパク質は、その免疫原性エピトープをなおも維持しながら、それが生物学的に不活性であるように改変され得る。
【００５４】
本発明の改変されたHlaタンパク質は、1つ以上の点突然変異によって遺伝的に解毒され得る。例えば、孔形成に関与する残基は、Hlaの溶菌活性に関係している。一態様では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、Menzies及びKernodle(Menzies and Kernodle (Menzies and Kernodle、1994年、Infect Immun 62巻、1843〜1847頁)に記載されるようなアミノ酸置換、例えば、H35、H48、H114及び/又はH259の別のアミノ酸、例えばリジンによる置換によって解毒され得る。例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列に関して(又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列における同等の位置で)、H35L、H114L又はH259Lから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み得る。好ましくは、改変されたHlaタンパク質は、置換H35L(例えば、配列番号3)を含む。
【００５５】
本明細書において言及されるアミノ酸番号は、配列番号1におけるアミノ酸に対応し、上記されるように、当業者は、アラインメントにより、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列における同等のアミノ酸位置を決定することができる。
【００５６】
改変されたHlaタンパク質は、ジスルフィド架橋を欠くHla、例えば、野生型若しくは解毒されたHla(例えば、Hla H35L、例えば、配列番号30)、又は他の架橋された突然変異体、例えば、Hla H35L/Y102C/G126C(配列番号27)、Hla H35L/N121C/H48C(配列番号28)、若しくはHla H35L/G122C/L52C(配列番号29)と比較して凝集する傾向の減少を示すことができる。例えば、本発明の適切な改変されたHlaタンパク質は、実施例に記載されるように、野生型Hla又はHlaH35Lより低い凝集を示すものであり得る(例えば、ウエスタンブロット上で検出可能であるか又はクロマトグラフィー技術、例えば、IMAC若しくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定可能である)。例えば、適切な改変されたHlaタンパク質は、野生型の、解毒された(例えば、HlaH35L)Hla又は他の架橋されたHlaの0%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、又は5%、約0%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%又は5%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%又は5%未満、<10%、<20%、<30%、<40%、<50%、<60%、<70%、<80%又は<90%の凝集レベル(本明細書に記載される方法のいずれかを用いて決定される)を示し得る。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又はIMACを使用する場合、モノマーHlaを表すピークは、野生型Hla若しくはHlaH35L若しくは他の架橋されたHlaより高くあり得、及び/又は凝集したHlaを表すピークは、低くあり得る。
【００５７】
改変されたHlaタンパク質は、ジスルフィド架橋を欠くHla、例えば、野生型若しくは解毒されたHla(例えば、Hla H35L、例えば、配列番号30)、又は他の架橋された突然変異体、例えば、Hla H35L/Y102C/G126C(配列番号27)、Hla H35L/N121C/H48C(配列番号28)、若しくはHla H35L/G122C/L52C(配列番号29)より高い全体的な収率で生成され得る。全体的な収率が大きくない場合、改変されたHlaタンパク質は、ジスルフィド架橋を欠くHla、例えば、野生型若しくは解毒されたHla(例えば、Hla H35L、例えば、配列番号30)、又は他の架橋された突然変異体、例えば、Hla H35L/Y102C/G126C(配列番号27)、Hla H35L/N121C/H48C(配列番号28)、若しくはHla H35L/G122C/L52C(配列番号29)よりHlaモノマーの高い収率で生成され得る。例えば、改変されたHlaタンパク質の収率は、野生型の、無毒化された(例えば、HlaH35L)Hla又は他の架橋されたHlaの収率と比較して、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、110%、120%、150%、200%若しくはそれ以上、又は約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、110%、120%、150%、200%若しくはそれ以上増加され得る。タンパク質収率は、下記のように決定され得る。
【００５８】
本発明の改変されたHlaタンパク質の溶血活性は、例えば、Menzies及びKernodle、1994年、Infect Immun 62巻、1843〜1847頁に記載された方法によってアッセイされ、特徴付けられ得る。インビトロ溶血試験を用いて、野生型Hlaに対する改変されたHlaタンパク質の溶血性(例えば、細胞溶解性)活性を測定することができる。溶血阻害アッセイを用いて、Hlaによる溶血を阻害する、本発明の改変されたHlaタンパク質に対して上昇させた抗血清の能力を測定し、(典型的には)抗(改変されたHla)抗血清を抗(野生型Hla)抗血清と比較することができる。例えば、本発明の適切な改変されたHlaタンパク質は、(例えば、インビトロ溶血アッセイを介して)野生型Hlaよりも低い溶血活性を示すものであり得る。例えば、適切な改変されたHlaタンパク質は、野生型Hlaの比活性の約(独立して以下の値の各々に言及される)0%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%又は10%未満の比活性(インビトロ溶血アッセイを用いて測定される)を有し得る。本発明の適切な改変されたHlaタンパク質はまた、宿主への投与後、宿主に野生型Hlaによる溶血を阻害する抗体を(例えば、溶血抑制アッセイを介して)生成させるものであり、免疫原性であり(例えば、wtHlaに対する抗体の生成を誘導し)、及び/又は防御性である(例えば、既に存在する感染による感染に対して宿主を防御する免疫応答を誘導するか又は既に存在する感染を制限する)ものであり得る。アッセイは、実施例に記載されるように使用することができる。
【００５９】
ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたHlaタンパク質の単離及び/又は同定を可能にするアミノ酸の配列をさらに含む。例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、したがって、タグ化された、改変されたHlaタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製において有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態では、タグは、ヘキサヒスチジンタグである。別の実施形態では、タグは、HRタグ、例えば、HRHRタグである。ある種の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、取り外し可能であり、例えば、タンパク質が精製された後に、もはや必要とされなくなった場合、例えば、化学剤によって又は酵素的手段によって除去される。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に6個のヒスチジン残基を含む。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に4つのHR残基(HRHR)を含む。ペプチドタグは、1つ、2つ又はそれ以上の追加アミノ酸残基、例えば、アラニン、セリン及び/又はグリシン残基、例えばGSを含み得るか、又はそれらに先行され得る。一態様では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号2又は配列番号3の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含み(又はそれらからなり)、前記アミノ酸配列は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)コンセンサス配列(例えば、K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)又はK-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))、並びにH35L、H48C及びG122Cから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換、及びアミノ酸配列のC末端でGSHRHRペプチドタグを含む。任意選択的に、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号5、6、9又は10と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６０】
ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムにHlaタンパク質を指向することができるシグナル配列を含む。特定の実施形態では、シグナル配列は、大腸菌フラジェリン(FlgI)[MIKFLSALILLLVTTAAQA(配列番号13)]由来である。他の実施形態では、シグナル配列は、大腸菌外膜ポーリンA(OmpA)[MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(配列番号14)]、大腸菌マルトース結合タンパク質(MalE)[MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(配列番号15)]、エルウィニア・カロトボランス(Erwinia carotovorans)ペクチン酸リアーゼ(PelB)[MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(配列番号16)]、易熱性大腸菌エンテロトキシンLTIIb[MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA(配列番号17)]、枯草菌(Bacillus subtilis)エンドキシラナーゼXynA[MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA(配列番号18)]、大腸菌DsbA[MKKIWLALAGLVLAFSASA(配列番号19)]、TolB[MKQALRVAFGFLILWASVLHA(配列番号20)]又はSipA[MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS(配列番号21)]由来である。ある実施形態では、シグナル配列は、配列番号13〜21と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。一態様では、シグナル配列は、大腸菌フラジェリンシグナル配列(FlgI)[MIKFLSALILLLVTTAAQA(配列番号13)]と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。シグナル配列を含む、例示的な改変されたHla配列は、配列番号4、5、8及び9である。
【００６１】
ある実施形態では、セリン及び/又はアラニン残基は、シグナル配列と成熟タンパク質、例えばSA又はS、好ましくはSの配列の開始の間に付加される。このような残基は、リーダー配列のより効率的な切断をもたらす利点を有する。
【００６２】
一態様では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号1の配列と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含み(又はそれらからなる)、前記アミノ酸配列は、アミノ酸置換G122からC、及びH48からC、及び任意選択的にさらにはH35からL、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)コンセンサス配列(X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である)(例えば、K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)又はK-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))、アミノ酸配列のC末端でHRHRタグ(配列番号25)、及び任意選択的にシグナル配列、好ましくはシグナル配列のN末端でFlgLシグナル配列(配列番号13)、任意選択的に続いてSAジペプチドを含む。ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号9又は配列番号10から選択されるアミノ酸配列と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、本発明は、配列番号7〜10から選択されるアミノ酸配列を有する改変されたHlaタンパク質を提供する。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、本発明の改変されたHlaタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。例えば、配列番号2〜10のいずれか1つと少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、改変されたHlaタンパク質をコードするポリヌクレオチド。このようなポリヌクレオチドを含むベクターは、本発明のさらなる態様である。
【００６４】
コンジュゲート
本発明はまた、本発明の改変されたHlaタンパク質を含む(又はそれからなる)コンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を提供し、改変されたHlaタンパク質は、例えば、抗原、好ましくは多糖又はオリゴ糖抗原に共有結合で連結されている。
【００６５】
ある実施形態では、コンジュゲートは、抗原、好ましくは多糖又はオリゴ糖抗原に共有結合で連結された、配列番号1〜10の配列と少なくとも97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する、本発明の改変されたHlaタンパク質を含む(又はそれからなる)コンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を含み、抗原は、改変されたHlaタンパク質のアミノ酸残基に(直接的に又はリンカーを介して)連結されている。
【００６６】
ある実施形態では、改変されたHlaタンパク質は、化学的コンジュゲーション法を用いて得ることができる化学的連結を介して、抗原に共有結合で連結されている(すなわち、コンジュゲートは、化学的コンジュゲーションによって生成される)。
【００６７】
ある実施形態では、化学的コンジュゲーション法は、カルボジイミド化学、還元アミノ化(animation)、シアニル化化学(例えば、CDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロイスクシンイミド化学からなる群から選択される。コンジュゲートは、米国特許出願公開第2007/10184072号(Hausdorff)、米国特許第4,365,170号(Jennings)及び米国特許第4,673,574号(Anderson)に記載される直接還元アミノ化法によって調製することができる。他の方法は、欧州特許出願公開第0161188号、欧州特許出願公開第208375号及び欧州特許出願公開第0477508号に記載されている。あるいは、コンジュゲーション法は、シアン酸エステルを形成するために、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)による糖の活性化に依存し得る。このようなコンジュゲートは、PCT出願公開第WO93/15760号、ユニフォームドサービス大学(Uniformed Services University)、並びに同第WO95/08348号及び同第WO96/29094号に記載されている。また、Chu C.ら、Infect. Immunity、1983年  245〜256頁を参照されたい。
【００６８】
一般的に、改変されたHlaタンパク質上の次のタイプの化学基をカップリング/コンジュゲーションに用いることができる。
A)カルボキシル(例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を介する)。一実施形態では、この基は、直接糖上のアミノ基に、又はカルボジイミド化学、例えばEDACを有するリンカー上のアミノ基に連結される。
B)アミノ基(例えば、リジンを介する)。一実施形態では、この基は、直接糖上のカルボキシル基に、又はカルボジイミド化学、例えばEDACを有するリンカー上のカルボキシル基に連結される。別の実施形態では、この基は、直接糖上の、CDAP若しくはCNBrで活性化されたヒドロキシル基に又はリンカー上のこのような基に、アルデヒド基を有する糖若しくはリンカーに、スクシンイミドエステル基を有する糖又はリンカーに結合される。
C)スルフィドリル(例えば、システインを介する)。一実施形態では、この基は、ブロモ若しくはクロロアセチル化された糖、又はマレイミド化学を有するリンカーに連結される。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
D)ヒドロキシル基(例えば、チロシンを介する)。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
E)イミダゾリル基(例えば、ヒスチジンを介する)。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化/修飾(改変)される。
F)グアニジル基(例えば、アルギニンを介する)。
G)インドリル基(例えば、トリプトファンを介する)。
【００６９】
糖については、一般的に、以下の基:OH、COOH又はNH2がカップリングに使用することができる。アルデヒド基、例えば、過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などが、異なる処置後に生じ得る。
【００７０】
直接的カップリングアプローチ:
糖-OH+CNBr又はCDAP----->シアン酸エステル+NH2-タンパク質---->コンジュゲート
糖-アルデヒド+NH2-タンパク質---->シッフ塩基+NaCNBH3---->コンジュゲート
糖-COOH+NH2-タンパク質+EDAC---->コンジュゲート
糖-NH2+COOH-タンパク質+EDAC---->コンジュゲート
スペーサー(リンカー)を介した間接的カップリングアプローチ:
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2----NH2---->糖----NH2+COOH-タンパク質+EDAC----->コンジュゲート
糖-OH+CNBr又はCDAP---->シアン酸エステル+NH2-----SH----->糖----SH+SH-タンパク質(露出したシステインを有する天然タンパク質、又は例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の修飾(改変)後に得られたタンパク質)-----糖-S-S-タンパク質
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2----SH------->糖----SH+マレイミド-タンパク質(アミノ基の修飾(改変))---->コンジュゲート
糖-OH+CNBr又はCDAP--->シアン酸エステル+NH2-----SH--->糖-SH+ハロアセチル化タンパク質---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2-----NH2--->糖------NH2+EDAC+COOH-タンパク質---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+SH-タンパク質(露出したシステインを有する天然タンパク質、又は例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の修飾(改変)後に得られたタンパク質)----->糖-S-S-タンパク質
糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+マレイミド-タンパク質(アミノ基の修飾(改変))---->コンジュゲート
糖-COOH+EDAC+NH2----SH--->糖-SH+ハロアセチル化タンパク質---->コンジュゲート
糖-アルデヒド+NH2-----NH2---->糖---NH2+EDAC+COOH-タンパク質---->コンジュゲート
注釈:前記のEDACの代わりに、任意の適切なカルボジイミドを使用することができる。
【００７１】
ある実施形態では、抗原は、改変されたHlaタンパク質に直接連結されている。
【００７２】
ある実施形態では、抗原は、リンカーを介して改変されたHlaタンパク質に結合される。任意選択的に、リンカーは、4〜12個の炭素原子を有するリンカー、二官能性リンカー、末端に1又は2個の反応性アミノ基を含有するリンカー、B-プロピオンアミド、ニトロフェニル-エチルアミン、ハロアシルハライド、6-アミノカプロン酸及びADHからなる群から選択される。したがって、活性化された糖は、改変されたHlaタンパク質上のアミノ基に直接又はスペーサー(リンカー)基を介してカップリングされ得る。例えば、スペーサーは、シスタミン又はシステアミンであり得、マレイミド活性化された、改変されたHlaタンパク質(例えば、GMBS(4-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いる)又はハロアセチル化された、改変されたHlaタンパク質(例えば、SIAB(スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノ安息香酸)、又はSIA(スクシンイミジルヨード酢酸)、又はSBAP(スクシンイミジル-3-(ブロモアセトアミド)プロピオン酸)を用いる)との反応後に得られるチオエーテル連結を介して、改変されたHlaにカップリンさせることができるチオール化された多糖を得ることができた。ある実施形態では、シアン酸エステル(任意選択的にCDAP化学によって作製される)は、ヘキサンジアミン又はADH(アジピン酸ジヒドラジド)とカップリングされ、アミノ誘導体化された糖は、カルボジイミド(例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC又はEDC))化学を用いて、改変されたHlaタンパク質上のカルボキシル基を介して、改変されたHlaタンパク質にコンジュゲートされる。このようなコンジュゲートは、PCT出願公開第WO93/15760号、ユニフォームドサービス大学(Uniformed Services University)、並びに同第WO95/08348号及び同第WO96/29094号に記載されている。
【００７３】
ある実施形態では、抗原が連結された、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸残基は、アスパラギン残基ではなく、この場合、コンジュゲートは、典型的には、化学的コンジュゲーションによって生成される。ある実施形態では、抗原が連結された、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸残基は、Ala、Arg、Asp、Cys、Gly、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、及びValからなる群から選択される。任意選択的に、アミノ酸は、末端アミン基を含有するアミノ酸、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、チロシン、ヒスチジン又はトリプトファンである。任意選択的に、抗原は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファンから選択される改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸に共有結合で連結されている。
【００７４】
ある実施形態では、抗原が連結された、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸残基は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列の一部ではない。ある実施形態では、抗原が連結された、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸残基は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列中のアスパラギン残基ではない。
【００７５】
あるいは、別の実施形態では、抗原は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファン(例えば、アスパラギン)から選択される、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸に連結されている。別の実施形態では、抗原が連結された、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸残基は、アスパラギン残基である。別の実施形態では、抗原が結合された、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸残基は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列の一部(例えば、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列中のアスパラギン)である。
【００７６】
多糖抗原
ある実施形態では、本発明のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)中の抗原の1つは、糖、例えば、細菌莢膜糖、細菌リポ多糖又は細菌オリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、細菌莢膜糖である。
【００７７】
糖は、黄色ブドウ球菌5型莢膜糖、黄色ブドウ球菌8型莢膜糖、髄膜炎菌(N. meningitidis)血清群A莢膜糖(MenA)、髄膜炎菌血清群C莢膜糖(MenC)、髄膜炎菌血清群Y莢膜糖(MenY)、N髄膜炎菌血清群W莢膜糖(MenW)、インフルエンザ菌(H. influenzae)b型莢膜糖(Hib)、B群連鎖球菌I群莢膜糖、B群連鎖球菌II群莢膜糖、B群連鎖球菌III群莢膜糖、B群連鎖球菌IV群莢膜糖、B型連鎖球菌V群莢膜糖、チフス菌(Salmonella typhi)由来のVi糖、髄膜炎菌LPS(例えば、L3及び/又はL2)、カタラーリス菌(M. catarrhalis)LPS、インフルエンザ菌LPS、赤痢菌(Shigella)O抗原、緑膿菌O抗原、大腸菌O抗原又は肺炎連鎖球菌莢膜多糖からなる群から選択され得る。
【００７８】
ある実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌由来の細菌莢膜糖である。黄色ブドウ球菌由来の細菌莢膜糖は、黄色ブドウ球菌血清型5又は8の莢膜糖から選択され得る。例えば、抗原は、血清型5由来の黄色ブドウ球菌莢膜糖であり得る。
【００７９】
本発明の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌由来の細菌莢膜糖のリピート単位である。本発明の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型5又は8由来の細菌莢膜糖のリピート単位を含む。
【００８０】
本発明の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型5由来の細菌莢膜糖のリピート単位を含む。本発明の実施形態では、抗原は、以下を含む:
【００８１】
【化１】
2021506311.tif 000002
「n」は、任意の整数であり、下記に記載されるように、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上である。
【００８２】
本発明の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型8由来の細菌莢膜糖のリピート単位を含む。本発明の実施形態では、抗原は、以下を含む:
【００８３】
【化２】
2021506311.tif 000003
「n」は、任意の整数であり、下記に記載されるように、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上である。
【００８４】
ある実施形態では、抗原は、多糖又はオリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、2個以上の単糖、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の単糖を含む。ある実施形態では、抗原は、20、15、12、10、9又は8個以下の単糖を含有するオリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10又は5個以下の単糖を含有するオリゴ糖である。
【００８５】
宿主細胞
本発明はまた、以下:
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
含む宿主細胞を提供する。
【００８６】
本発明のバイオコンジュゲートを生成するために使用することができる宿主細胞には、古細菌、原核生物宿主細胞、及び真核生物宿主細胞が含まれる。本発明のバイオコンジュゲートの生成に使用するための例示的な原核宿主細胞には、限定されないが、エシェリキア属(Escherichia)種、シゲラ属(Shigella)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、キサントモナス属(Xhantomonas)種、サルモネラ属(Salmonella)種、エルシニア属(Yersinia)種、ラクトコッカス属(Lactococcus)種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種、シュードモナス属(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)種、バチルス属(Bacillus)種、及びクロストリジウム属(Clostridium)種が挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。
【００８７】
ある実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートを生成するために使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば、1つ以上の担体タンパク質をコードする異種核酸、及び/又は1つ以上のタンパク質をコードする異種核酸、例えば、1つ以上のタンパク質をコードする遺伝子をコードする異種核酸を含むように操作される。特定の実施形態では、グリコシル化経路(例えば、原核生物及び/又は真核生物のグリコシル化経路)に関与するタンパク質をコードする異種核酸は、本発明の宿主細胞に導入され得る。このような核酸は、限定されないが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを含むタンパク質をコードし得る。異種核酸(例えば、担体タンパク質をコードする核酸、及び/又は他のタンパク質、例えば、グリコシル化に関与するタンパク質をコードする核酸)は、方法、例えば、エレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、天然の形質転換、ファージ形質導入、及びコンジュゲーションを用いて本発明の宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態では、異種核酸は、プラスミドを用いて本発明の宿主細胞に導入され、例えば、異種核酸は、プラスミド(例えば、発現ベクター)によって宿主細胞内で発現される。別の特定の実施形態では、異種核酸は、国際特許出願第PCT/EP2013/068737号(WO14/037585号として公開)に記載される挿入方法を用いて、本発明の宿主細胞に導入される。
【００８８】
したがって、本発明はまた、以下:
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸、及び
vi)フリッパーゼ(例えば、wxy)をコードする核酸
を含む宿主細胞を提供する。
【００８９】
ある実施形態では、さらなる改変は、本発明の宿主細胞に(例えば、組換え技術を用いて)を導入することができる。例えば、おそらく競合又は干渉するグリコシル化経路の一部を形成する(例えば、宿主細胞に組換え的に導入される、グリコシル化に関与する1つ以上の異種遺伝子と競合又は干渉する)タンパク質をコードする宿主細胞核酸(例えば、遺伝子)は、宿主細胞バックグラウンド(ゲノム)において、それらを不活性/機能不全にさせる方法で欠失又は改変され得る(すなわち、欠失/改変された宿主細胞核酸は、機能性タンパク質をコードしないか、又はタンパク質を全くコードしない)。ある実施形態では、核酸が本発明の宿主細胞のゲノムから欠失された場合、それらは、望ましい配列、例えば、糖タンパク質生成に有用である配列で置き換えられる。
【００９０】
宿主細胞において欠失され得る(及び、いくつかの場合では、他の所望の核酸配列と置き換えられ得る)例示的な遺伝子には、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子、例えば、waaL(例えば、Feldmanら、2005年、PNAS USA 102巻:3016〜3021頁を参照されたい)、リピドAコア生合成クラスター(waa)、ガラクトースクラスター(gal)、アラビノースクラスター(ara)、コラン酸クラスター(wc)、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール-ピロリン酸生合成遺伝子(例えば、uppS(ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ)、uppP(ウンデカプレニルジホスファターゼ))、Und-Pリサイクル遺伝子、ヌクレオチド活性化糖生合成に関与する代謝酵素、腸内細菌共通抗原クラスター、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原改変クラスターが含まれる。
【００９１】
このような改変された原核生物宿主細胞は、抗原、例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質に結合した糖抗原を含む生体コンジュゲートを生成することができる酵素をコードする核酸を含む。このような宿主細胞は、糖抗原の生成に特異的な核酸を自然に発現することができ、又は宿主細胞は、このような核酸を発現するように作製することができる。すなわち、ある種の実施形態では、前記核酸は、宿主細胞に対して異種である。ある種の実施形態では、糖抗原の生成に特異的な1つ以上の前記核酸は、宿主細胞に対して異種であり、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ある種の実施形態では、本発明の宿主細胞は、タンパク質のN-グリコシル化において活性な追加の酵素をコードする核酸を含み、例えば、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸及び/又は他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の核酸をさらに含む。
【００９２】
莢膜多糖遺伝子クラスターを含む核酸配列は、本発明の宿主細胞に挿入され得る。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞に挿入される莢膜多糖遺伝子クラスターは、大腸菌株、ブドウ球菌株(例えば、黄色ブドウ球菌)、連鎖球菌株(例えば、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌(S. pyrogenes)、S. アガラクティエ(S. agalacticae))、又はバークホルデリア菌株(例えば、鼻疽菌(B. mallei)、類鼻疽菌(B. pseudomallei)、バークホルデリア・タイランデンシス(B. thailandensis))由来の莢膜多糖遺伝子クラスターである。バイオコンジュゲートを生成することができるこのような宿主細胞を作製する方法の開示は、国際公開第WO06/119987号、同第WO09/104074号、同第WO11/62615号、同第WO11/138361号、同第WO14/57109号、同第WO14/72405号、及び同第WO16/20499号に見出される。
【００９３】
ある実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞中のプラスミドに改変されたHlaタンパク質をコードする核酸を含む。
【００９４】
グリコシル化機構
本発明の宿主細胞は、ハイブリッドオリゴ糖及び/又は多糖を生成することができる遺伝子機構(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、及び/又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ)をコードする核酸、並びに抗原を本発明の改変されたHlaタンパク質に連結することができる遺伝子機構を含み、及び/又は含むように改変することができる。
【００９５】
黄色ブドウ球菌莢膜多糖は、グラム陰性菌におけるO多糖合成のポリメラーゼ依存性経路と相同性を共有する保存された経路によって、細菌膜担体脂質のウンデカプレニルピロリン酸にアセンブルされる。O抗原のアセンブルは、DPドナーからウンデカプレニルリン酸に、糖リン酸が転移することによって開始される。脂質連結O抗原は、異なるグリコシルトランスフェラーゼの連続的な作用によって、内膜の細胞質側でアセンブルされる。次に、糖脂質は、ペリプラズム腔に反転され、重合される。O抗原リガーゼWaaLをオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBで置き換えることによって、重合したO抗原は、脂質Aコアというよりはむしろ、タンパク質担体に移すことができる。
【００９６】
グリコシルトランスフェラーゼ
本発明の宿主細胞は、オリゴ糖又は多糖のリピート単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。ある実施形態では、前記リピート単位は、還元末端にヘキソースを含まず、前記オリゴ糖又は多糖のリピート単位は、還元末端にヘキソースを含むドナーオリゴ糖又は多糖のリピート単位に由来する。
【００９７】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ヘキソース単糖誘導体をウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み得る。一態様では、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の遺伝子に対して異種である。前記グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属(Aeromonas)種、フランシセラ属(Francisella)種、ヘリコバクター属(Helicobacter)種、プロテウス属(Proteus)種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属(Listeria)種、又はカンピロバクター属(Campylobacter)種由来であり得る。特定の実施形態では、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、wecAであり、任意選択的に大腸菌由来のwecAである(wecAは、UDP-GlcNAcからGlcNAcをUndP上にアセンブルさせることができる)。ある実施形態では、ヘキソース単糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノトール、フコース及びマンノース(例えば、ガラクトース)からなる群から選択される。
【００９８】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み得る。特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、シゲラ・ボイディ(Shigella boyedii)由来のガラクトシルトランスフェラーゼ(wfeD)である。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)である。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である。ガルフトランスフェラーゼ、例えば、wfdK及びwbeYは、Galf(ガラクトフラノース)をUDP-Galfから-GlcNAc-P-P-ウンデカカプレニルに転移することができる。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である。
【００９９】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。
【０１００】
ある実施形態では、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ(wciP)、例えば、大腸菌O21由来のwciPを含む。
【０１０１】
一実施形態では、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1のリピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1のリピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、グルコシルトランスフェラーゼ(wciQ)、例えば、大腸菌O21由来のwciQを含む。
【０１０２】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8遺伝子クラスターから選択されるオリゴ糖又は多糖のリピート単位を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼを含む。特定の実施形態では、オリゴ糖又は多糖のリピート単位を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼは、黄色ブドウ球菌CP5遺伝子クラスター由来である。黄色ブドウ球菌CP5及びCP8は、緑膿菌O11抗原合成遺伝子と類似の構造を有し、そのため、これらの遺伝子を大腸菌単糖合成遺伝子と組み合わせて、リピート三糖単位からなるウンデカプレニルピロリン酸連結されたCP5又はCP8ポリマーを合成することができる。
【０１０３】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapKを含むCP5又はCP8糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む。任意選択的に、本発明の宿主細胞はまた、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO、capPを含む。あるいは、本発明の宿主細胞はまた緑膿菌O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB、wecCを含む。
【０１０４】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ及び/又はcapKを含むCP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む。任意選択的に、本発明の宿主細胞はまた、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO、capPを含む。あるいは、本発明の宿主細胞はまた、緑膿菌O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB、wecCを含む。
【０１０５】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼを含み、このグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。
【０１０６】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ
N-結合タンパク質のグリコシル化-標的タンパク質のポリペプチド鎖中のアスパラギン残基への炭水化物分子の付加-は、真核生物の小胞体で起こる翻訳後修飾の最も一般的なタイプである。このプロセスは、小胞体内の保存配列Asn-X-Ser/Thr(Xは、プロリンを除く任意のアミノ酸である)内の新生タンパク質のアスパラギン残基に、脂質担体(ドリコールリン酸)から予めアセンブルしたオリゴ糖の転移に関与する酵素オリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体(OST)によって達成される。
【０１０７】
細菌、食物媒介性病原体カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)はまた、それ自身のグリコシル化機構を有するという事実に起因して、そのタンパク質をN-グリコシル化し得ることが示されている(Wackerら、Science、2002年、298巻(5599号):1790〜3頁)。この反応に関与する機構は、「pgl」(タンパク質のグリコシル化に関して)と呼ばれるクラスターによってコードされる。
【０１０８】
C.ジェジュニのグリコシル化機構は、大腸菌に伝達され、大腸菌細胞によって発現される組換えタンパク質のグリコシル化を可能にする。従前の研究は、N-グリコシル化を行うことができる大腸菌株を生じさせる方法を実証している(例えば、Wackerら、Science、2002年、298巻(5599号):1790〜3頁; Nita-Lazarら、Glycobiology、2005年、15巻(4号):361〜7頁; Feldmanら、Proc Natl Acad Sci U S A、2005年、102巻(8号):3016〜21頁; Kowarikら、EMBO J. 2006年、25巻(9号):1957〜66頁; Wackerら、Proc Natl Acad Sci U S A、2006年、103巻(18号):7088〜93頁;国際特許出願公開第WO2003/074687号、同第WO2006/119987号、同第WO2009/104074号、同第WO/2011/06261号、及び同第WO2011/138361号を参照されたい)。最適化された特性を有するPglB突然変異体は、国際公開第WO2016/107818号に記載される。好ましい突然変異体は、実施例に記載されているように、PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669Vである。
【０１０９】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、N-グリコシル化コンセンサスモチーフ、例えばAsn-X-Ser(Thr)(Xは、Proを除く任意のアミノ酸であり得る)又はAsp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(X及びZは、Proを除く任意の天然アミノ酸から独立して選択される)を含む新生ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に、脂質結合されたオリゴ糖を転移させる(国際公開第WO2006/119987号を参照されたい)。例えば、国際公開第WO2003/074687号及び同第WO2006/119987号を参照されたい。これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞に対して天然であり得、又は上記される遺伝学的アプローチを用いて宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼはカンピロバクター由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。別の特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(すなわち、pglB、例えば、Wackerら、2002年, Science 298巻:1790〜1793頁、また、例えば、NCBI Gene ID: 3231775、UniProtアクセッション番号O86154を参照されたい)である。別の特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである(例えば、NCBI Gene ID: 7410986を参照されたい)。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする前記核酸配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１１２】
特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする前記核酸配列は、プラスミド媒介性である。
【０１１３】
別の特定の実施形態では、本明細書では、(i)黄色ブドウ球菌由来の莢膜多糖クラスターに由来するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記グリコシルトランスフェラーゼは前記宿主細胞のゲノムに組み込まれるグリコシルトランスフェラーゼ、(ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする核酸であって、前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸はプラスミド媒介性であり、及び/又は宿主細胞のゲノムに組み込まれる核酸、並びに(iii)本発明の改変されたHlaタンパク質であって、前記改変されたHlaタンパク質はプラスミド媒介性であるか又は宿主細胞のゲノムに組み込まれる改変されたHlaタンパク質を含む、改変された原核宿主細胞が提供される。また、(i)黄色ブドウ球菌由来の莢膜多糖クラスターに由来するグリコシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のゲノムに組み込み、(ii)プラスミド媒介性であり及び/又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする1つ以上の核酸を宿主細胞に組み込み、並びに(iii)プラスミド媒介性であるか又は宿主細胞のゲノムに組み込む本発明の改変されたHlaタンパク質を宿主細胞に組み込むことを含む、改変された原核宿主細胞を作製する方法も提供される。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸で置き換えられており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子がC.ジェジュニpglBで置き換えられているものである。
【０１１５】
ポリメラーゼ
ある実施形態では、ポリメラーゼ(例えば、wzy)は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、ポリメラーゼは宿主細胞に対して異種である)。ある実施形態では、ポリメラーゼは、細菌ポリメラーゼである。ある実施形態では、ポリメラーゼは、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)である。ある実施形態では、ポリメラーゼは、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)である。
【０１１６】
ある実施形態では、莢膜多糖生合成経路のポリメラーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。
【０１１７】
別の特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌莢膜多糖生合成経路のポリメラーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。
【０１１８】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞に導入されるポリメラーゼは、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8の莢膜多糖遺伝子クラスター由来のwzy遺伝子(cap5J/cap8I)である。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞に導入されるポリメラーゼは、CP5の莢膜多糖遺伝子クラスターからのwzy遺伝子(cap5J)である。
【０１１９】
別の特定の実施形態では、前記ポリメラーゼは、黄色ブドウ球菌莢膜多糖クラスターの一部として前記宿主細胞に組み込まれ(例えば、発現されるゲノム又はプラスミドに挿入され)、前記黄色ブドウ球菌莢膜多糖クラスターは、wzyポリメラーゼを含むように改変されている。
【０１２０】
特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌wzyポリメラーゼをコードする核酸配列は、本発明の宿主細胞に挿入されるか又は発現される。したがって、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌wzyポリメラーゼをさらに含むことができる。
【０１２１】
フリッパーゼ
ある実施形態では、フリッパーゼ(wzx又は相同体)は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、フリッパーゼは宿主細胞に対して異種である)。したがって、本発明の宿主細胞は、フリッパーゼをさらに含むことができる。ある実施形態では、フリッパーゼは、細菌フリッパーゼである。フリッパーゼは、野生型リピート単位、及び/又はそれらに対応する操作された(ハイブリッド)リピート単位を細胞質から宿主細胞(例えば、大腸菌)のペリプラズムに移行させる。したがって、本発明の宿主細胞は、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み得る。
【０１２２】
特定の実施形態では、莢膜多糖生合成経路のフリッパーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。
【０１２３】
別の特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌莢膜多糖生合成経路のフリッパーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。ある種の態様では、本発明の宿主細胞に導入されるフリッパーゼは、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8の莢膜多糖遺伝子クラスター由来のcapK遺伝子である。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞に導入されるフリッパーゼは、CP5の莢膜多糖遺伝子クラスター由来のcapK遺伝子である。
【０１２４】
本発明の宿主細胞に導入することができる他のフリッパーゼは、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来である(例えば、pglK)。
【０１２５】
単糖を修飾(改変)する酵素
アクセサリー酵素
ある実施形態では、1つ以上のアクセサリー酵素をコードする核酸は、本発明の宿主細胞に導入される。したがって、本発明の宿主細胞は、これらのアクセサリー酵素の1つ以上をさらに含み得る。1つ以上の補助酵素をコードするこのような核酸は、プラスミド媒介性であるか、又は本発明の宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。例示的なアクセサリー酵素には、限定されないが、エピメラーゼ、分枝、修飾(改変)(例えば、コリン、グリセリンリン酸、ピルビン酸を付加するため)、アミド化、鎖長調節、アセチル化、ホルミル化、重合化酵素が含まれる。
【０１２６】
ある種の実施形態では、単糖を修飾することができる酵素は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、単糖を修飾することができる酵素は、宿主細胞に対して異種である)。このような酵素には、例えば、エピメラーゼ及びラセマーゼが含まれる。したがって、本発明の宿主細胞は、エピメラーゼ及び/又はラセマーゼをさらに含み得る。
【０１２７】
ある実施形態では、エピメラーゼ及びラセマーゼは、細菌由来である。ある種の実施形態では、本発明の宿主細胞に導入されるエピメラーゼ及び/又はラセマーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来である。
【０１２８】
ある種の実施形態では、本発明の宿主細胞に挿入されるエピメラーゼは、国際特許出願公開第WO2011/062615号(その開示は全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されたエピメラーゼである。一実施形態では、エピメラーゼは、大腸菌株O157のZ3206遺伝子によってコードされるエピメラーゼである。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第WO2011/062615号、及びRushら、2009年、The Journal of Biological Chemistry 285巻:1671〜1680頁を参照されたい。別の実施形態では、エピメラーゼは、galE(UPD-ガラクトースエピメラーゼ)Z3206であり、galEは、GlcNAc-P-P-ウンデカプレニルをGalNAc-P-P-ウンデカプレニルに変換する。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、エピメラーゼをコードする核酸配列を含み、エピメラーゼをコードする前記核酸配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１２９】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ムターゼ、例えば、glf(UDP-ガラクトピラノースムターゼ)をさらに含む。
【０１３０】
ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、RcsA(CP合成の活性化因子)をさらに含む。RcsAは、大腸菌におけるコラン酸莢膜多糖の合成に必要な不安定な正の調節因子である。
【０１３１】
遺伝的バックグラウンド
本発明の宿主細胞を生じさせるために用いることができる例示的な宿主細胞には、限定されないが、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、及びクロストリジウム属種が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌である。
【０１３２】
ある実施形態では、宿主細胞の遺伝学的バックグラウンドは、例えば、1つ以上の遺伝子の欠失によって改変される。宿主細胞において欠失され得る(及び、いくつかの場合では、他の所望の核酸配列と置き換えられ得る)例示的な遺伝子は、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子、例えば、waaL(例えば、Feldmanら、2005年、PNAS USA 102巻:3016〜3021頁を参照されたい)、O抗原クラスター(rfb又はwb)、腸内細菌共通抗原クラスター(wec)、リピドAコア生合成クラスター(waa)、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原改変クラスターを含む。特定の実施形態では、waaL遺伝子、gtrA遺伝子、gtrB遺伝子、gtrS遺伝子、又はwecクラスター由来の遺伝子若しくは複数の遺伝子、又はrfb遺伝子クラスター由来の遺伝子若しくは複数の遺伝子のうちの1つ以上は、本発明の原核生物宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。一実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子、gtrA遺伝子、gtrB遺伝子、gtrS遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。別の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子及びgtrS遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。別の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子及びwecクラスター由来の遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。
【０１３３】
バイオコンジュゲート
本発明の宿主細胞は、糖抗原、例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質に連結された黄色ブドウ球菌糖抗原を含むバイオコンジュゲートを生成するために使用することができる。宿主細胞を用いてバイオコンジュゲートを生成する方法は、例えば、国際公開第WO2003/074687号、同第WO2006/119987号及び同第WO2011/138361号に記載されている。本明細書に記載されているように、バイオコンジュゲートは、それらが製造においてより少ない化学物質を必要とし、生じる最終生成物に関してより一貫性があるという点において、抗原-担体タンパク質の化学的コンジュゲートを上回る有利な特性を有する。
【０１３４】
ある実施形態では、本明細書では、黄色ブドウ球菌抗原に連結された、改変されたHlaタンパク質を含むバイオコンジュゲートが提供される。特定の実施形態では、前記黄色ブドウ球菌抗原は、莢膜糖(例えば、莢膜多糖)である。特定の実施形態では、本明細書では、本発明の改変されたHlaタンパク質と、黄色ブドウ球菌血清型CP5又はCP8の莢膜糖(例えば、莢膜多糖)から選択される抗原とを含むバイオコンジュゲートが提供される。特定の実施形態では、本明細書では、本発明の改変されたHlaタンパク質と、黄色ブドウ球菌血清型CP5の莢膜糖(例えば、莢膜多糖)由来の抗原とを含むバイオコンジュゲートが提供される。
【０１３５】
本発明のバイオコンジュゲートは、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、陽イオン交換、陰イオン交換、アフィニティー、及びサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度によって、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。例えば、Saraswatら、2013年、Biomed. Res. Int. ID#312709 (1〜18頁)を参照されたい。また、国際公開第WO2009/104074号に記載されている方法を参照されたい。さらに、精製を容易にするために、本明細書に記載されているか、又は当該技術分野において公知である異種ポリペプチド配列にバイオコンジュゲートを融合させることができる。例えば、陽イオン交換による精製のために、Hlaタンパク質は、ペプチドタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ又はHRHRタグ(配列番号25及び26)を組み込むことができる。具体的なバイオコンジュゲートを精製するために使用される実際の条件は、部分的には、合成戦略、並びに因子、例えば、バイオコンジュゲートの正味の電荷、疎水性、及び/又は親水性に依存し、当業者には明らかである。
【０１３６】
本発明のさらなる態様は、糖に連結された、改変されたHlaタンパク質を含む(又はそれからなる)バイオコンジュゲートを生成する方法であり、前記方法は、(i)タンパク質の生成に適した条件下で(及び任意選択的に糖の生成に適した条件下で)本発明の宿主細胞を培養すること、及び(ii)前記宿主細胞によって生成されたバイオコンジュゲートを単離することを含む。
【０１３７】
本発明のさらなる態様は、本発明のプロセスによって生成されたバイオコンジュゲートであり、前記バイオコンジュゲートは、改変されたHlaタンパク質に連結された糖を含む。
【０１３８】
分析方法
種々の方法を用いて、本発明のバイオコンジュゲートの構造組成及び糖鎖長を分析することができる。
【０１３９】
一実施形態では、ヒドラジン分解を用いてグリカンを分析することができる。第一に、多糖は、製造業者の指示に従ってヒドラジンとともにインキュベートすることにより、タンパク質担体から放出される(Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit、Oxfordshire、UK)。求核剤であるヒドラジンは、多糖と担体タンパク質との間のグリコシド結合を攻撃し、結合したグリカンの放出を可能にする。N-アセチル基はこの処理中に喪失し、再N-アセチル化によって再構成される必要がある。遊離グリカンをカーボンカラム上で精製し、続いて、還元末端でフルオロフォア2-アミノベンズアミドで標識する。Bigge JC、Patel TP、Bruce JA、Goulding PN、Charles SM、Parekh RB: Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem 1995年、230巻(2号):229〜238頁を参照されたい。RoyleらのHPLCプロトコールに従って、標識された多糖をGlycoSep-Nカラム(GL Sciences)上で分離する。Royle L、Mattu TS、Hart E、Langridge JI、Merry AH、Murphy N、Harvey DJ、Dwek RA、Rudd PM: An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins. Anal Biochem 2002年、304巻(1号):70〜90頁を参照されたい。得られた蛍光クロマトグラムは、多糖の長さ及びリピート単位の数を示す。構造情報は、個々のピークを回収し、続く、MS/MS分析を行うことによって収集することができる。これにより、単糖組成及びリピート単位の配列を確認することができ、さらに多糖組成の均一性を確認することができた。
【０１４０】
別の実施形態では、SDS-PAGE又はキャピラリーゲル電気泳動を用いて、グリカン及びバイオコンジュゲートを評価することができる。O抗原グリカンのポリマー長は、直線的にアセンブルされたリピート単位の数によって定義される。これは、典型的なラダー様パターンが、グリカンを構成する異なるリピート単位数の結果であることを意味する。したがって、SDS PAGE、又はサイズによって分離される他の技術において、互いに隣り合う2つのバンドは、1つのリピート単位だけ異なる。これらの個別の違いは、グリカンサイズに関して、糖タンパク質を分析する場合に利用される:グリコシル化されていない担体タンパク質と、異なるポリマー鎖長を有するバイオコンジュゲートは、それらの電気泳動移動度に従って分離される。バイオコンジュゲート上に存在する第1の検出可能なリピート単位数(n1)及び平均リピート単位数(naverage)を測定する。これらのパラメータは、バッチ間の一貫性又は多糖の安定性を示すために使用することができる。
【０１４１】
別の実施形態では、高質量MS及びサイズ排除HPLCを適用して、完全なバイオコンジュゲートのサイズを測定することができる。
【０１４２】
別の実施形態では、アントロン-硫酸アッセイを使用して、多糖の収率を測定することができる。Leyva A、Quintana A、Sanchez M、Rodriguez EN、Cremata J、Sanchez JC: Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization 2008年、36巻(2号):134〜141頁を参照されたい。別の実施形態では、メチルペントースアッセイを使用して、多糖の収率を測定することができる。例えば、Discheら、J Biol Chem. 1948年9月、175巻(2号):595〜603頁を参照されたい。
【０１４３】
グリコシル化部位の使用の変化
特定のタンパク質における部位の使用が、挿入された系とは対照的に、複数のプラスミド系において変化することを示すために、グリコシル化部位の使用を定量化する必要がある。そうする方法を以下に列挙する。
【０１４４】
グリコペプチドLC-MS/MS:バイオコンジュゲートをプロテアーゼ(複数可)で消化し、ペプチドを適切なクロマトグラフィー法(C18、親水性相互作用HPLC HILIC、GlycoSepNカラム、SE HPLC、AE HPLC)により分離し、異なるペプチドをMS/MSを用いて同定する。この方法は、化学的(スミス分解)又は酵素的方法により、以前の糖鎖を短縮するか又は短縮することなく、使用することができる。215〜280nmでのUV検出を用いてグリコペプチドピークを定量することにより、グリコシル化部位の使用を相対的に決定することができる。
【０１４５】
サイズ排除HPLC:より高いグリコシル化部位の使用は、SE HPLCカラムからのより早期の溶出時間によって反映される。
【０１４６】
均一性
バイオコンジュゲートの均一性(すなわち、結合した糖残基の均一性)は、グリカン長及び流体力学的半径を測定する方法を用いて評価することができる。
【０１４７】
分析方法
収量:タンパク質収量は、制御され、最適化された条件下でバイオリアクター中で増殖させた1リットルの細菌生成培養物から得られたタンパク質量として測定される。タンパク質量は、BC、Lowry、又はBradfordアッセイによって測定され得る。バイオコンジュゲートの収量、制御され、最適化された条件下でバイオリアクター中で増殖させた1リットルの細菌生成培養物から得られた炭水化物量として測定される。バイオコンジュゲートの精製後、炭水化物収量は、アントロンアッセイ又は炭水化物特異的抗血清を用いるELISAのいずれかによって直接測定することができる。タンパク質量(BCA、Lowry、又はBradfordアッセイで測定される)及び糖鎖長と構造を用いて、タンパク質1gあたりの理論的な炭水化物量を計算することにより、間接的な測定が可能である。さらに、収量はまた、揮発性緩衝液から糖タンパク質調製物を乾燥させ、天秤を用いて重量を測定することによって測定することができる。
【０１４８】
凝集体の形成。高MWの凝集体の形成は、ウエスタンブロット法、及びより定量的には、クロマトグラフィー技術、例えば、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)及びサイズ排除クロマトグラフィーによって評価することができる。凝集体は、ゲルの上部近くの高MWスミアとしてウエスタンブロット上で視認することができる。凝集体は、単量体Hlaに対応するピークとは異なる別個のピークとして、クロマトグラフィー溶出プロファイル上で視認され得る。
【０１４９】
モノマー収量:同様に、モノマー(又はモノマー対凝集体)の収量は、ウエスタンブロットにより、又はより正確には、クロマトグラフィー技術、例えば、IMAC及びサイズ排除クロマトグラフィーを介して評価することができる。ウエスタンブロット上の単量体Hlaに対応するバンドの強度、又はクロマトグラフィー溶出プロファイルの単量体Hlaに対応するピークのサイズ。
【０１５０】
均一性:均一性は、グリカンの長さと、おそらくグリコシル化部位の数の変動性を意味する。この目的のために、上記で列挙された方法を使用することができる。SE-HPLCは、流体力学的半径の測定を可能にする。担体中のグリコシル化部位の数が多いことにより、グリコシル化部位が少ない担体と比較して、流体力学的半径の変動が大きくなる。しかしながら、単一のグリカン鎖を分析した場合、長さがより制御されているため、それらはより均質である可能性がある。グリカン長は、ヒドラジン分解、SDS PAGE、及びCGEによって測定される。さらに、均一性はまた、ある種のグリコシル化部位の使用パターンがより広い/より狭い範囲に変化することを意味し得る。これらの因子は、グリコペプチドLC-MS/MSによって測定することができる。
【０１５１】
菌株の安定性及び再現性。選択圧の非存在下での細菌発酵中の菌株安定性は、生成培養細胞中の組換えDNAの有無を確認する直接法及び間接法によって測定される。培養体積の影響は、培養時間を長くすることによってシミュレートすることができ、これは世代時間を長くすることを意味する。発酵の世代が長ければ長いほど、組換えエレメントが失われる可能性が高くなる。組換えエレメントの欠失は、不安定性と考えられる。間接的な方法は、選択カセットと、組換えDNA、例えば、プラスミド中の抗生物質耐性カセットとの結合に依存する。生成培養細胞は、選択培地、例えば、抗生物質又は選択システムに関連する他の化学物質が補充されたLBプレート上に播種され、耐性コロニーは、それぞれの選択化学物質に関連する組換えDNAが陽性であるとみなす。複数のプラスミドシステムの場合、複数の抗生物質に対する耐性コロニーを計数し、3種類の耐性をすべて含有する細胞の割合を安定集団とみなす。あるいは、定量PCRを用いて、3つの組換えエレメントの組換えDNAの量を、選択の存在下、非存在下、及び発酵の異なる時点で測定することができる。したがって、組換えDNAの相対量及び絶対量を測定し、比較する。生成プロセスの再現性は、本出願に記載された方法により一貫性バッチを完全に分析することによって測定される。
【０１５２】
免疫原性組成物
本発明の改変されたHlaタンパク質及びコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)は、免疫原性組成物及びワクチンに含めるのに特に適している。本発明は、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
【０１５３】
また、本発明の改変されたHlaタンパク質又はコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、本発明の免疫原性組成物を作製する方法が提供される。
【０１５４】
免疫原性組成物は、本発明の改変されたHlaタンパク質又はコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)の免疫学的に有効な量、並びに任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、その量の個体への投与が、単回投薬又は一連の一部のいずれかとして、治療又は予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康状態及び身体状態、年齢、所望の防御の程度、ワクチンの処方、及び他の関連する因子に依存して変化する。その量は、日常的な試行を通じて判断することができる比較的幅広い範囲にあることが期待される。
【０１５５】
本発明がまた希釈剤、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどを含有し得る場合の免疫原性組成物。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質、ポリオールなどが存在し得る。
【０１５６】
本発明の改変されたHlaタンパク質又はコンジュゲート(又はバイオコンジュゲート)を含む免疫原性組成物は、医薬投与に使用するのに適した任意の追加の成分を含み得る。特定の実施態様では、本発明の免疫原性組成物は、一価の製剤である。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、多価製剤、例えば、二価、三価、及び四価の製剤である。例えば、多価製剤は、1を超える抗原、例えば、1を超えるコンジュゲートを含む。
【０１５７】
本発明の免疫原性組成物は、任意選択的に、さらなる抗原をさらに含む。このような追加の抗原の例は、黄色ブドウ球菌タンパク質又は莢膜多糖である。
【０１５８】
ワクチン
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチンを提供する。
【０１５９】
薬学的に許容される賦形剤及び担体は、当業者によって選択され得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤又は担体は、緩衝液、例えば、Tris(トリメタミン)、リン酸塩(例えば、リン酸ナトリウム)、酢酸塩、ホウ酸塩(例えば、ホウ酸ナトリウム)、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジン及びコハク酸塩(例えば、コハク酸ナトリウム)、適切には塩化ナトリウム、ヒスチジン、リン酸ナトリウム又はコハク酸ナトリウムを含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化マグネシウムを含むことができる。任意選択的に、薬学的に許容される賦形剤は、溶解性及び/又は安定性を安定化する少なくとも1つの成分を含有する。可溶化剤/安定化剤の例としては、洗剤、例えば、ラウレルサルコシン及び/又はポリソルベート(例えば、TWEEN(商標)80)が挙げられる。また、安定化剤の例には、ポロキサマー(例えば、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338及びポロキサマー407)が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート-80(TWEEN(商標)80)、ポリソルベート-60(TWEEN(商標)60)、ポリソルベート-40(TWEEN(商標)40)及びポリソルベート-20(TWEEN(商標)20)、又はポリオキシエチレンアルキルエーテル(適切にはポリソルベート-80)が含まれ得る。代替の可溶化剤/安定化剤には、アルギニン、及びガラス形成ポリオール(例えば、スクロース、トレハロースなど)が挙げられる。薬学的賦形剤は、保存剤、例えば、フェノール、2-フェノキシエタノール、又はチオマーサルであり得る。他の薬学的に許容される賦形剤としては、糖(例えば、ラクトース、スクロース)、及びタンパク質(例えば、ゼラチン及びアルブミン)が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、水、生理食塩水、水性デキストロース及びグリセロール溶液が挙げられる。多数の薬学的に許容される賦形剤及び担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、E. W. Martin、Mack Publishing Co. Easton、PA、第5版(975)に記載されている。
【０１６０】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、1つ以上の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液及び/又はスクロースリン酸グルタミン酸緩衝液をさらに含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、緩衝液を含まない。
【０１６１】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、1つ以上の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸カリウムアルミニウム)、又はこのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、塩を含まない。
【０１６２】
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、保存剤、例えば、水銀誘導体チメロサールをさらに含むことができる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、0.001%〜0.01%のチメロサールを含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、保存剤を含まない。
【０１６３】
本発明のワクチン又は免疫原性組成物はまた、典型的には、多用量フォーマットでパッケージされた場合、抗菌剤を含み得る。例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、2-フェノキシエタノールを含み得る。
【０１６４】
本発明のワクチン又は免疫原性組成物はまた、洗剤、例えば、ポリソルベート、例えばTWEEN(商標)80を含み得る。洗剤は、一般的に、低レベル、例えば<0.01%で存在するが、抗原製剤を安定化させるために、より高いレベル、例えば、最大10%のレベルが示唆されている。
【０１６５】
本発明の免疫原性組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。
【０１６６】
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、使用前に保存することができ、例えば、組成物は、(例えば、約-20℃又は約-70℃で)凍結保存することができ、冷蔵条件下(例えば、約4℃)で保存することができ、又は室温で保存することができる。
【０１６７】
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、溶液中に貯蔵するか又は凍結乾燥することができる。ある実施形態では、溶液は、糖、例えば、スクロース、トレハロース又はラクトースの存在下で凍結乾燥される。別の実施形態では、本発明のワクチンは、使用前に凍結乾燥され、即座に再構成される。
【０１６８】
ワクチン調製物は、一般的にVaccine Design (「The subunit and adjuvant approach」(Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995年) Plenum Press New York)に記載されている。リポソーム内のカプセル化は、Fullerton、米国特許第4,235,877号に記載されている。
【０１６９】
アジュバント
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバントを含むか又はアジュバントと組み合わせて投与される。本発明の免疫原性組成物又はワクチンと組み合わせて投与するためのアジュバントは、前記免疫原性組成物又はワクチンの投与前、同時、又は投与後に投与することができる。一部の実施形態では、用語「アジュバント」とは、本発明のワクチンの免疫原性組成物と組み合わせて又はその一部として投与された場合、バイオコンジュゲートに対する免疫応答を増強し、増大し、及び/又は強化するが、化合物が単独で投与された場合には、改変されたHlaタンパク質/コンジュゲート/バイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。一部の実施形態では、アジュバントは、改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせ、アレルギー又は他の有害反応を生成しない。
【０１７０】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバント化される。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって免疫応答を増大することができる。アジュバントの具体的な例としては、限定されないが、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(MPL)(英国特許GB2220211を参照されたい)、MF59(Novartis)、AS01(GlaxoSmithKline)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(TWEEN(商標)80、ICL Americas,Inc.)、イミダゾピリジン化合物(国際公開第WO2007/109812号として公開された国際出願第PCT/US2007/064857号を参照されたい)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開第WO2007/109813号として公開された国際出願第PCT/US2007/064858号を参照されたい)、及びサポニン、例えば、QS21などの(Kensilら、Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編集、Powell & Newman、Plenum Press、NY、1995年)、米国特許第5,057,540号を参照されたい)が含まれる。一部の実施形態では、アジュバントは、フロイントアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、水中油型エマルジョン(例えば、スクアレン又はピーナッツ油)であり、任意選択的に、免疫刺激剤、例えば、モノホスホリルリピドAと組み合わせる(Stouteら、N. Engl. J. Med. 336巻、86〜91頁(1997年)を参照されたい)。別のアジュバントは、CpGである(Bioworld Today、1998年11月15日)。
【０１７１】
本発明の一態様では、アジュバントは、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)又はリン酸アルミニウムである。
【０１７２】
本発明の別の態様では、アジュバントは、TH1又はTH2型の応答のいずれかの優先的な誘導因子であるように選択される。高レベルのTh1型サイトカインは、所定の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を好む傾向があり、一方、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導を好む傾向がある。Th1型とTh2型の免疫応答の区別は絶対的なものではないことを覚えておくことが重要である。実際には、個体は、主にTh1又は主にTh2であると記載される免疫応答を支持する。しかしながら、Mosmann及びCoffman(Mosmann, T.R.及びCoffman、R.L. (1989年) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology、7巻、145〜173頁)によってマウスCD4+ve T細胞クローンにおいて説明されているという点では、サイトカインファミリーを考慮することは、しばしば好都合である。伝統的に、Th1型の応答は、Tリンパ球によるINF-γ及びIL-2サイトカインの生成と関連している。Th1型の免疫応答の誘導にしばしば直接的に関連する他のサイトカイン、例えばIL-12は、T細胞によって生成されない。対照的に、Th2型の応答は、Il-4、IL-5、IL-6、IL-10の分泌と関連している。主としてTh1応答を促進する適切なアジュバント系としては、モノホスホリルリピドA又はその誘導体、具体的には3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)(その調製については、英国特許出願公開第2220211A号を参照されたい)、MPL、例えば、リポソーム、例えば、コレステロール及びDPOCを含むリポソーム中の3D-MPL及びサポニンQS21、並びにモノホスホリルリピドA、例えば、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAと、アルミニウム塩(例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)又は水中油型エマルジョンのいずれかとの組み合わせが挙げられる。このような組み合わせにおいて、抗原及び3D-MPLは、同じ粒子構造に含有され、抗原及び免疫刺激シグナルのより効率的な送達を可能にする。研究は、3D-MPLが、ミョウバン吸着した抗原の免疫原性をさらに増大させ得ることを示している[Thoelenら、Vaccine (1998年) 16巻:708〜14頁;欧州特許第689454-B1号]。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(国際公開第WO96/02555号)はまた、TH1応答の優先的な誘導因子であり、本発明における使用に適している。
【０１７３】
本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、アジュバント組成物(欧州特許出願公開第399843号、国際公開第WO95/17210号)として有用であることが示唆されているため、これらは水中油型エマルジョンを含有することができる。国際公開第WO95/17210号(2〜10%スクアレン、2〜10%アルファトコフェロール、及び0.3〜3%Tween 80を含む水中油型エマルジョン、並びに単独又はQS21及び/又は3D-MPLと組み合わせたそれらの使用を開示する)、国際公開第WO99/12565号(代謝可能な油、サポニン及びステロール及びMPLを含む水中油型エマルジョン組成物を開示する)、又は国際公開第WO99/11241号に記載される水中油型エマルジョンを使用することができる。さらに、国際公開第WO09/127676号及び同第WO09/127677号に開示される水中油型エマルジョンもまた適している。特定の実施形態では、免疫原性組成物又はワクチンは、サポニン、例えばQS21をさらに含む。免疫原性組成物又はワクチンはまた、水中油型エマルジョン及びトコフェロール(国際公開第WO95/17210号)を含み得る。
【０１７４】
投与方法
本発明の免疫原性組成物又はワクチンを使用して、前記免疫原性組成物又はワクチンを全身又は粘膜経路を介して投与することによって、感染に感受性の哺乳動物を保護又は治療することができる。これらの投与には、筋肉内(IM)、腹腔内、皮内(ID)若しくは皮下経路による注射、又は口腔/消化管、呼吸器、泌尿生殖器への粘膜投与が含まれ得る。例えば、鼻腔内(IN)投与は、肺炎又は中耳炎の治療に使用され得る(肺炎球菌の鼻咽頭保菌がより効果的に予防され、したがって、その初期段階での感染を減弱させることができるためである)。本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、単回用量として投与することができるが、それらの成分はまた、同時に又は異なる時間に、一緒に同時投与され得る(例えば、肺炎球菌多糖は、互いに対する免疫応答の最適な調整のために、別々に、同時に、又はワクチンのいずれかの細菌タンパク質成分の投与後の1〜2週間に投与することができる)。同時投与について、任意選択のTh1アジュバントは、異なる投与のいずれか又は全てに存在し得るが、しかしながら、本発明の1つの具体的な態様では、それは、免疫原性組成物又はワクチンの改変されたHlaタンパク質成分と組み合わせて存在する。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を使用することができる。例えば、多糖は、IM(又はID)に投与することができ、細菌タンパク質は、IN(又はID)に投与することができる。さらに、本発明のワクチンは、初回用量のためにIMで、及び追加免疫用量のためにINで投与することができる。
【０１７５】
一態様では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、筋肉内送達経路によって投与される。筋肉内投与は、大腿部又は上腕部に行うことができる。注射は、典型的には、針(例えば、皮下注射針)を介して行われるが、代わりに、無針注射が使用され得る。典型的な筋肉内用量は0.5mlである。
【０１７６】
別の態様では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、皮内投与によって投与される。ヒトの皮膚は、表皮を覆う角質層と呼ばれる外側の「角質」キューティクルを含む。この表皮の下には真皮と呼ばれる層があり、順番に皮下組織を覆う。皮内注射の従来の技術である「マントゥー法」は、皮膚を洗浄し、次に、片手で伸ばし、狭いゲージの針(26〜31ゲージ)のベベルを上向きにして、針を10〜15°の角度で挿入する工程を含む。針のベベルが挿入されると、針のバレルが下降し、皮膚の下でそれを持ち上げるわずかな圧力を与えながらさらに前進する。次に、液体は非常にゆっくりと注入され、それによって皮膚表面にブレブ又はバンプを形成し、続いて、針をゆっくりと引き抜く。
【０１７７】
より最近では、液体剤を皮膚の中又は全体に投与するように特別に設計されたデバイスが記載されており、例えば、国際公開第WO99/34850号及び欧州特許出願公開第1092444号に記載されたデバイス、また、例えば、国際公開第WO01/13977号、米国特許第5,480,381号、米国特許第5,599,302号、米国特許第5,334,144号、米国特許第5,993,412号、米国特許第5,649,912号、米国特許第5,569,189号、米国特許第5,704,911号、米国特許第5,383,851号、米国特許第5,893,397号、米国特許第5,466,220号、米国特許第5,339,163号、米国特許第5,312,335号、米国特許第5,503,627号、米国特許第5,064,413号、米国特許第5,520,639号、米国特許第4,596,556号、米国特許第4,790,824号、米国特許第4,941,880号、米国特許第4,940,460号、国際公開第WO97/37705号及び国際公開第WO97/13537号に記載されたジェット噴射デバイスが挙げられる。ワクチン調製物の皮内投与の別の方法には、従来の注射器及び針、又は固形ワクチンの弾道送達用に設計されたデバイス(国際公開第WO99/27961号)、又は経皮パッチ(国際公開第WO97/48440号、同第WO98/28037号)、又は皮膚表面に適用されるデバイス(経皮又は経皮送達、国際公開第WO98/20734号、同第WO98/28037号)が含まれ得る。
【０１７８】
別の態様では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、鼻腔内投与によって投与される。典型的には、免疫原性組成物又はワクチンは、例えば、肺に吸入されることなく、鼻咽頭領域に局所的に投与される。免疫原性組成物又はワクチン製剤を肺に入れることなく又は実質的に入れることなく、鼻咽頭領域に送達させる鼻腔内送達デバイスを使用することが望ましい。本発明によるワクチンの鼻腔内投与に適したデバイスは、スプレーデバイスである。適切な市販の鼻腔スプレーデバイスとしては、ACCUSPRAY(商標)(Becton Dickinson)が挙げられる。
【０１７９】
ある実施形態では、鼻腔内使用のためのスプレーデバイスは、デバイスの性能がユーザによって印加される圧力に依存しないデバイスである。これらのデバイスは、圧力閾値デバイスとして公知である。閾値圧力が印加された場合にだけ、ノズルから液体が放出される。これらのデバイスは、規則的な液滴サイズを有するスプレーを達成することを容易にする。本発明とともに使用するのに適した圧力閾値デバイスは、当該技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第WO91/13281号及び欧州特許出願公開第311863号及び同第516636号に記載されている。このようなデバイスは、Pfeiffer GmbHから市販されており、また、Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe、1999年9月にも記載されている。
【０１８０】
別の実施形態では、鼻腔内デバイスは、1〜200μm、例えば、10〜120μmの範囲の液滴(液体として水を使用して測定される)を生成する。10μm未満では吸入のリスクがあり、したがって、10μm未満では約5%以下の液滴を有することが望ましい。120μmを超える液滴は、より小さな液滴と同様に拡散せず、そのため、120μmを超える液滴の約5%以下を有することが望ましい。
【０１８１】
初回ワクチン接種後、対象は、適切な間隔で1回又は数回の追加免疫を受けることができる。
【０１８２】
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、前記免疫原性組成物又はワクチンを全身又は粘膜経路を介して投与することによって、感染に感受性である哺乳動物、例えばヒトを保護又は治療するために使用することができる。これらの投与には、筋肉内(IM)、腹腔内(IP)、皮内(ID)若しくは皮下(SC)経路を介した注射、又は口腔/消化管、呼吸器、泌尿生殖器への粘膜投与を介した注射が含まれ得る。本発明のワクチンは、単回用量として投与することができるが、それらの成分はまた、同時に又は異なる時間に、一緒に同時投与され得る(例えば、肺炎球菌糖コンジュゲートは、互いに対する免疫応答の最適な調整のために、別々に、同時に、又は本発明のいずれかの改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート、若しくはバイオコンジュゲートの投与後の1〜2週間に投与することができる)。同時投与について、任意選択のアジュバントは、異なる投与のいずれか又は全てに存在し得る。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を使用することができる。例えば、多糖コンジュゲートは、IM(又はID)に投与することができ、本発明の改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、IN(又はID)に投与することができる。さらに、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、初回用量のためにIMで、及び追加免疫用量のためにINで投与することができる。
【０１８３】
投薬量
各免疫原性組成物又はワクチン用量中のコンジュゲート抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意な副作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特定の免疫原が使用され、どのようにしてそれが提示されるかに依存して変化する。改変されたHlaタンパク質の含有量は、典型的には1〜100μg、適切には5〜50μgの範囲である。糖の含有量は、典型的には0.1〜10μg、適切には1〜5μgの範囲である。
【０１８４】
ヒトの使用に適した体積の用量は、一般的には0.25〜1.5mlであるが、皮膚への投与には0.05ml〜0.2mlの低い体積を用いることができる。一実施形態では、ヒト用量は0.5mlである。さらなる実施形態では、ヒト用量は、0.5mlよりも高く、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9又は1mlである。さらなる実施形態では、ヒト用量は、1ml〜1.5mlである。別の実施形態では、具体的には、免疫原性組成物が小児集団に対するものである場合、ヒト用量は、0.5ml未満、例えば0.25〜0.5mlであり得る。
【０１８５】
予防的及び治療的使用
本発明はまた、本発明の改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを対象に投与することを含む、対象の細菌感染を治療及び/又は予防する方法を提供する。改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、免疫原性組成物又はワクチンの形態であり得る。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、細菌による対象(例えば、ヒト対象)の感染の予防に使用される。本発明の改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを用いて治療及び/又は予防することができる細菌感染には、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種によって引き起こされるものが含まれる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)による感染を治療又は予防するために使用される。
【０１８６】
また、本明細書では、本発明の改変されたHlaタンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を対象に投与することを含む、細菌に対する対象における免疫応答を誘導する方法が提供される。一実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有する。別の実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有しない。本発明の改変されたHlaタンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを用いて、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種に対する免疫応答を誘導することができる。特定の実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを用いて、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)に対する免疫応答を誘導する。
【０１８７】
また、本明細書では、本発明の改変されたHlaタンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を対象に投与することを含む、細菌に対する対象におけるオプソニン食作用性抗体の生成を誘導する方法が提供される。一実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有する。別の実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有しない。本明細書に提供される本発明の改変されたHlaタンパク質、又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を用いて、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種に対するオプソニン食作用性抗体の生成を誘導することができる。特定の実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を使用して、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)に対するオプソニン食作用性抗体の生成を誘導する。
【０１８８】
例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、院内感染を含む黄色ブドウ球菌感染に対する予防に使用され得る。より具体的には、対象は、皮膚感染、肺炎、髄膜炎、骨髄炎心内膜炎、毒性ショック症候群、及び/又は敗血症から保護され得る。本発明はまた、対象の骨及び関節の黄色ブドウ球菌感染からの保護に有用である(したがって、限定されないが、骨髄炎、敗血症性関節炎、及び人工関節感染を含む障害の予防に有用である)。多くの場合、これらの疾患は、黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの形成と関連している場合がある。
【０１８９】
黄色ブドウ球菌は、種々の哺乳動物(ウシ、イヌ、ウマ、及びブタを含む)に感染するが、本発明で使用するための好ましい哺乳動物はヒトである。ヒトは、小児(例えば、幼児又は乳児)、10代の若者、又は成人であり得る。一部の実施形態では、ヒトは、人工骨若しくは関節を有し得、又は、選択的手術を待っている患者、具体的には、人工骨若しくは関節の意図されたレシピエント(例えば、術前整形外科手術患者)であり得る。しかしながら、ワクチンは、これらのグループにのみ適しておらず、より一般的にはヒト集団において使用され得る。
【０１９０】
本発明のワクチン調製物は、全身又は粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することによって、黄色ブドウ球菌感染に感受性のあるヒトを保護又は治療するために使用することができる。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内若しくは皮下経路を介した注射、又は口腔/消化管、呼吸器、泌尿生殖管への粘膜投与を介した注射が含まれる。
【０１９１】
ある実施形態では、本発明は、本発明の免疫原性組成物又はワクチン(小児用ワクチン)の治療有効量を投与することによって、乳児(本発明との関連では、0〜2歳として定義される)において免疫応答を誘発する改良された方法である。ある実施形態では、ワクチンは、小児用ワクチンである。
【０１９２】
ある実施形態では、本発明は、本発明の免疫原性組成物又はワクチンの治療有効量を投与することによって、高齢集団(本発明との関連では、患者は、年齢が50歳以上、典型的には55歳以上、より一般的には60歳以上である場合、高齢者とみなされる)において免疫応答を誘発する改良された方法である。ある実施形態では、ワクチンは、高齢者用のワクチンである。
【０１９３】
本発明は、それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染の治療又は予防のための方法であって、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンの治療有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１９４】
本発明は、本発明の改変されたHlaタンパク質、本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンの免疫防御用量を宿主に投与することを含む、ヒト宿主を黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化する方法を提供する。
【０１９５】
本発明は、対象において黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンの治療有効量又は予防有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０１９６】
本発明は、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンを提供する。
【０１９７】
本発明は、黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明の改変されたHlaタンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートの使用を提供する。
【０１９８】
黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患は、例えば、皮膚感染、肺炎、髄膜炎、対象の骨及び関節の黄色ブドウ球菌感染(例えば、敗血症性関節炎、人工関節感染又は骨髄炎)、心内膜炎、毒性ショック症候群、及び/又は敗血症であり得る。この疾患は、院内感染であり得る。
【０１９９】
本明細書中で引用される全ての参考文献又は特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２００】
本発明の態様は、以下の番号付けされた段落に要約される。
1.配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する改変されたHlaタンパク質であって、該アミノ酸配列が、配列番号1のH48位及びG122位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点で改変されており、前記置換がそれぞれHからC及びGからCである、改変されたHlaタンパク質。
2.アミノ酸配列が、配列番号1のH35位で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点でさらに改変されている、段落1に記載の改変されたHlaタンパク質。
3.H35位での前記アミノ酸置換がHからLである、段落2に記載の改変されたHlaタンパク質。
4.アミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択される1つ以上のコンセンサス配列(複数可)を含むという点でさらに改変されており、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である、段落1〜3のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
5.配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸(例えば、1〜7つのアミノ酸、例えば、1つのアミノ酸)が、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)又はK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)コンセンサス配列によって置換されている、段落4に記載の改変されたHlaタンパク質。
6.D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131、S203、S239及びK273から選択される1つ以上のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている、段落1〜5のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
7.D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置で付加され又はそれと置換されている、段落6に記載の改変されたHlaタンパク質。
8.D/E-X-N-Z-S/T(配列番号11)及びK-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号12)から選択されるコンセンサス配列が、配列番号1のK131のアミノ酸で、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置と置換されている、段落7に記載の改変されたHlaタンパク質。
9.XはQ(グルタミン)であり、ZはR(アルギニン)である(例えば、K-D-Q-N-R-T-K(配列番号23))、段落4〜8のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
10.配列番号3のアミノ酸配列、又は配列番号3の配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落1〜9のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
11.アミノ酸配列が、Hlaタンパク質の精製に有用であるペプチドタグをさらに含み、前記ペプチドタグが、任意選択的に、6つのヒスチジン残基又はHRリピート(例えば、HRHR(配列番号25)を含み、任意選択的に前記ペプチドタグが、アミノ酸配列のC末端に位置する、段落1〜10のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
12.ペプチドタグが、N末端で1つ又は2つの追加のアミノ酸、例えば、GS(配列番号26)を含む、段落11に記載の改変されたHlaタンパク質。
13.配列番号5、6、9若しくは10のいずれか一つのアミノ酸配列、又は配列番号5、6、9若しくは10のいずれか一つと少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一である配列を有する、段落12に記載の改変されたHlaタンパク質。
14.アミノ酸配列が、Hlaタンパク質を宿主細胞(例えば、細菌)のペリプラズムに指向することができるシグナル配列をさらに含み、任意選択的に、前記シグナル配列が、配列番号13〜21から選択され、任意選択的に、前記配列が、タンパク質のN末端にある、段落1〜13のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
15.タンパク質が、シグナル配列と配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列との間に1つ又は2つの追加のアミノ酸(例えば、S)を含み、任意選択的に、前記Hlaタンパク質が、配列番号5若しくは配列番号9のアミノ酸配列、又は配列番号5若しくは配列番号9と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落11に記載の改変されたHlaタンパク質。
16.タンパク質が、N末端で1つ又は2つの追加のアミノ酸(例えば、S)を含む、段落1〜13のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
17.前記Hlaタンパク質が、配列番号6若しくは配列番号10のアミノ酸配列、又は配列番号6若しくは配列番号10と少なくとも97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を有する、段落16に記載の改変されたHlaタンパク質。
18.改変されたHlaタンパク質はグリコシル化されている、段落1〜17のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質。
19.段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質を含むコンジュゲートであって、改変されたHlaタンパク質が、抗原、例えば、多糖又はオリゴ糖の抗原に連結されている、コンジュゲート。
20.改変されたHlaタンパク質が、任意選択的に、カルボジイミド化学、還元アミノ化(animation)、シアニル化化学(例えば、CDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロイルスクシンイミド化学からなる群から任意選択的に選択される化学的コンジュゲーション法を用いて得られる化学的連結を介して、直接的に又はリンカーを介して、前記抗原に共有結合で連結されている、段落19に記載のコンジュゲート。
21.バイオコンジュゲートである、段落19に記載のコンジュゲート。
22.抗原が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン又はトリプトファン(例えば、アスパラギン)から選択される、改変されたHlaタンパク質上のアミノ酸に連結されている、段落19〜21に記載の1つのコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
23.抗原が、糖、任意選択的に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)血清型5又は8の莢膜糖から任意選択的に選択される、細菌莢膜糖(例えば、黄色ブドウ球菌由来)である、段落15〜17のいずれか一つに記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
24.抗原が、黄色ブドウ球菌血清型5莢膜糖である、段落23に記載のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)。
25.段落1〜17のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
26.段落25に記載のポリヌクレオチドを含むベクター
27.i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)段落1〜17のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞。
28.(a)ウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルされたグリコシルトランスフェラーゼ、及び(b)Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落27に記載の宿主細胞。
29.Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1つ以上の遺伝子に対して異種であり、任意選択的に、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的にwecA(例えば、大腸菌由来のwecA)である、段落28に記載の宿主細胞。
30.前記ヘキソース単糖誘導体が、C-2位がアセトアミド基で修飾される任意の単糖、例えばN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)である、段落27〜29のいずれか一つに記載の宿主細胞。
31.Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)、若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であり、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、段落27〜30のいずれか一つに記載の宿主細胞。
32.黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ、及び/又はcapK、並びに任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO/又はcapPを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落27〜31のいずれか一つに記載の宿主細胞。
33.黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJ、及び/又はcapK、並びに任意選択的に緑膿菌O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzz及び/又はwzx、並びに大腸菌O16由来のwecB及び/又はwecCを含む黄色ブドウ球菌CP5糖のリピート単位を合成するのに十分なグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落27〜31のいずれか一つに記載の宿主細胞。
34.オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニに由来し、任意選択的に前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼはカンピロバクター・ジェジュニのpglBであり、任意選択的にカンピロバクター・ジェジュニのpglB遺伝子は宿主細胞ゲノムに組み込まれ、任意選択的に宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子は機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子は機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子はオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置き換えられており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子はカンピロバクター・ジェジュニpglBによって置き換えられている、段落27〜33のいずれか一つに記載の宿主細胞。
35.前記宿主細胞が、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸を含み、任意選択的に前記莢膜多糖ポリメラーゼは、黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、段落27〜34のいずれか一つに記載の宿主細胞。
36.前記宿主細胞が、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み、任意選択的に、前記フリッパーゼは黄色ブドウ球菌由来であり、任意選択的に黄色ブドウ球菌CP5又はCP8由来である、段落27〜35のいずれか一つに記載の宿主細胞。
37.前記宿主細胞が、単糖を修飾することができる酵素、任意選択的にエピメラーゼをさらに含み、任意選択的に、前記エピメラーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的に前記エピメラーゼは、大腸菌由来であり、任意選択的に大腸菌O157由来のZ3206又はgalEである、段落27〜36のいずれか一つに記載の宿主細胞。
38.改変されたHlaタンパク質をコードする核酸が、宿主細胞中のプラスミドにある、段落27〜37のいずれか一つに記載の宿主細胞。
39.大腸菌である、段落27〜38のいずれか一つに記載の宿主細胞。
40.糖に連結された、改変されたHlaタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成する方法であって、(i)タンパク質の生成に適した条件下で、段落27〜39のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)バイオコンジュゲートを単離することを含む方法。
41.改変されたHlaタンパク質に連結された糖を含む、段落40に記載の方法によって生成されるバイオコンジュゲート。
42.段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
43.改変されたHlaタンパク質又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、段落42に記載の免疫原性組成物を作製する方法。
44.段落42に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチン。
45.それを必要とする対象における黄色ブドウ球菌感染を治療又は予防する方法であって、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
46.ヒト宿主を黄色ブドウ球菌感染に対して免疫する方法であって、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法。
47.対象において黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートの治療有効量又は予防有効量を投与することを含む方法。
48.黄色ブドウ球菌感染により引き起こされる疾患の治療又は予防に使用するための、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲート。
49.黄色ブドウ球菌感染により引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、段落1〜18のいずれか一つに記載の改変されたHlaタンパク質、又は段落19〜24のいずれか一つに記載のコンジュゲート、又は段落41に記載のバイオコンジュゲートの使用。
【０２０１】
本発明をよりよく理解し得るために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲をいかなる方法でも限定するものと解釈されるべきではない。
【０２０２】
2021506311.tif 000004
2021506311.tif 000005
2021506311.tif 000006
2021506311.tif 000007
【実施例】
【０２０３】
[実施例1]
担体タンパク質Hla(ヘモリシンA)に導入されたシステイン-システイン架橋の設計
図1は、他の2つの天然アミノ酸残基を置き換えることによってシステインアミノ酸残基対を導入するための黄色ブドウ球菌担体タンパク質ヘモリシンA(Hla)の操作の構造的根拠及び理論的解釈を示す。図は、A)毒性孔形成Hla七量体(PDB識別子7AHL、Songら、1996年)、B)無毒性Hlaモノマー(PDB識別子4IDJ、Folettiら、2013年)、及びC)A)高輝度の1つのモノマー(赤色)及びB)高輝度のモノマー(青色)の重ね合わせのモデルを示すhttp://www.rcsb.org/に公開された3D結晶構造を表す。システイン-システイン架橋部位のより広い領域は、緑色の楕円で示される。操作の目的は、凝集を防ぐためにタンパク質を安定化させ、それによって収率を高め、タンパク質をさらに解毒することであった。タンパク質内の架橋部位の遺伝子座を選択し、非毒性モノマー(青色)からの立体構造変化が、七量体の構築に必要とされるベータ鎖伸長の阻害を介して毒性モノマー(赤色)を形成するのを防止した。
【０２０４】
図2は、システイン残基に個々に突然変異したアミノ酸対のクローズアップを1対ずつ示す。毒性形態のモデルを赤色で着色し、無毒性形態を重ね合わせて、青色で示す。野生型残基は、緑色の棒表示で強調され、対応するアルファ炭素原子(Cα)の位置は、残基対ごとに黒色の破線で結ばれている。各アミノ酸対のCα-Cα位置の距離は、オングストローム(Å)で示され、Y102C/G126C:7.52Å、G122C/H48C:6.23Å、N121C/H48C:6.60Å、G122C/L52C:7.04Åである。N121C/H48Cは公開されている(Kawate及びGouaux、2003年)。
【０２０５】
[実施例2]
架橋Hla変異体のCP5-Hlaバイオコンジュゲート生成性及び安定性の増大
CP5-Hlaバイオコンジュゲート生産のための架橋Hla変異体の安定性(凝集体形成の観点から)及び生産性を、非架橋Hlaのそれと比較した。StGVXN1717(W3110ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするpGVXN393、カンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするプラスミドPglBcuoN311V-K482R-D483H-A669V pGVXN1221、及び個々に黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35LをコードするプラスミドpGVXN570、又は架橋変異体HlaH35L-Y102C-G126CをコードするプラスミドpGVXN2178、HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2179、HlaH35L-H48C-N121CをコードするプラスミドpGVXN2180若しくはHlaH35L-L52C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2181(すべて、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヘキサヒスチジン(His6)親和性タグを有する)を用いて同時形質転換された。PglBをコードする遺伝子を欠く対照形質転換には、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)pGVXN393、PglBの空骨格ベクターpGVXN72(pEXT21、Dykxhoornら、Gene 177巻(1996年) 133〜136頁)と組み合わせた黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)pGVXN570が含まれた。
【０２０６】
細胞をTB培地中で増殖させ、組換え多糖を恒常的に発現させ、PglB及びHlaを光学濃度OD600nmが0.5〜1.0の範囲で誘導した。
【０２０７】
一晩の誘導後、細胞を回収し、CP5-Hlaバイオコンジュゲートは、1mg/mlリゾチームが補充された溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.5、1mM EDTA、20%スクロース)を用いてペリプラズム調製物によって抽出された。遠心分離後、上清からペリプラズムタンパク質を回収し、4〜12%SDS-PAGE上に装填し、ニトロセルロース膜上にブロットし、抗Hisタグ抗体により検出した。SDS-PAGEの各試料を分割し、98℃で10分間煮沸するか、又は装填前に煮沸しなかった。装填されたタンパク質は、細胞の光学濃度について標準化された。
【０２０８】
結果を図3に示す。すべての架橋変異体は、非架橋Hlaと比較して同等であるか又はそれより高いレベルのグリコシル化を示し、G122C/H48C変異体が最高レベルを示し、N121C/H48Cが続いた。加えて、非架橋Hlaは、煮沸していない試料においてより高い見かけの分子量シグナルとして見られる、ウエスタンブロット上で実質的な凝集体形成を示したが、一方、凝集体はいずれの架橋変異体についてブロット上では見えなかった。
【０２０９】
方法
大腸菌StGVXN1717(W3110ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするpGVXN393、カンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするプラスミドPglBN311V-K482R-D483H-A669V pGVXN1221、及び個々に黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)をコードするプラスミドpGVXN570、又は架橋変異体HlaH35L-Y102C-G126CをコードするプラスミドpGVXN2178、HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2179、HlaH35L-H48C-N121CをコードするプラスミドpGVXN2180若しくはHlaH35L-L52C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2181(すべて、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヘキサヒスチジン(His6)親和性タグを有する)を用いて同時形質転換された。PglBをコードする遺伝子を欠く対照形質転換には、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)pGVXN393、PglBの空骨格ベクターpGVXN72と組み合わせた黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)pGVXN570が含まれた。
【０２１０】
形質転換された細菌を、3種類の抗生物質テトラサイクリン[20μg/ml]、アンピシリン[100μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]が補充された選択寒天プレート上で一晩増殖させた。細胞をテトラサイクリン[20μg/ml]、アンピシリン[100μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]を含有する50mlのLysogenyブロス(LB)中に接種し、37℃、180rpmで一晩、三角フラスコ中で振とうした。翌日、0.4〜0.45%グリセロール(Sigma、49781)、10mM MgCl2、テトラサイクリン[20μg/ml]、スペクチノマイシン[80μg/ml]及びアンピシリン[100μg/ml]が補充された50mlのTerrificブロス(TB)培地の主要培養物を、600nmで0.1の光学濃度(OD600nm)の希釈液に接種し、平均OD600nmが0.9〜1.0になるまで180rpm、37℃で三角フラスコ中でインキュベートし、誘導した。培養物を37℃、180rpmで一晩振とうし、翌日、50 OD600nmを各培養物から回収した。細胞を4℃、4000rpmで15分間、エッペンドルフ遠心分離機で遠沈し、5mlの0.9%塩化ナトリウム(NaCl)で洗浄し、続いて、4000rpmで15分間、4℃でさらに遠心分離した。1mg/mlのリゾチームが補充された、1mlの溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.5、1mM EDTA、20%(w/v)スクロース)にペレットを再懸濁した。試料を回転ホイール上で20分間、4℃でインキュベートし、14000rpmで20分間、4℃で遠心分離により遠沈した。45μlの上清を回収し、15μlの4倍濃縮したLaemmli緩衝液中で、15分間、98℃で煮沸して、最終濃度62.5mM Tris-HCl pH 6.8、2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、5%(w/v)ベータ-メルカプトエタノール、10%(v/v)グリセロール、0.005%(w/v)ブロムフェノールブルーに到達させた。同一セットの試料をSDS-PAGEに装填する前に煮沸することなく準備した。OD600nmの1同等物からのタンパク質は、SDS-PAGE(Nu-PAGE、4〜12%Bis-Trisゲル、Life Technologies)によって、MOPS泳動緩衝液(50mM MOPS、50mM Tris塩基、0.1%SDS、1mM EDTA、pH7.7)を用いて、200ボルトで45分間分離された。次に、タンパク質は、iBLOTゲル転写スタック(Novex、Life Technologiesによる)を用いてニトロセルロース膜上に転写された。ニトロセルロースは、20分間、室温でPBST(10mMリン酸緩衝液  pH7.5、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム(Ambresco E703-500mlから購入)、0.1%(v/v)Tween)に溶解した10%(w/v)粉末ミルクでブロックされ、続いて、1%(w/v)粉末ミルクが補充されたPBST中の0.1μg/mlの一次マウス抗ペンタヒスチジン抗体(Qiagen、34660)を用い、膜を1時間、室温でインキュベートすることによりイムノブロット検出された。以下では、膜をPBSTで5分間、2回洗浄し、1%(w/v)粉末ミルクが補充されたPBST中の二次抗マウス多価西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体(Sigma、A0412)とともに1時間、室温でインキュベートした。膜をPBSTで5分間3回洗浄し、TBM(TMB1成分HRP膜基質、BioFX、TMBM-1000-01)の添加によりタンパク質バンドを可視化し、反応を脱イオン水で停止した。
【０２１１】
[実施例3]
SDS-PAGE中の非煮沸試料からの非架橋の非グリコシル化Hla(u-Hla)凝集体移動挙動とサイズ排除クロマトグラフィーにより検出された凝集体種との相関
この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより大きな種として、及びそれに対応して、試料が沸騰されてない場合に、SDS-PAGEにおいてより高い見かけの分子量として泳動する凝集された非グリコシル化の非架橋Hlaの相関を示す。結果を図5に示す。
【０２１２】
StGVXN2457(W3110  ΔwaaL、ΔrlmB-wecG、ΔaraBAD)は、エレクトロポレーションにより、131位にグリコシル化部位及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35LをコードするプラスミドpGVXN570を用いて形質転換された。
【０２１３】
細胞をTB培地中で増殖させ、Hlaは、0.66の光学濃度OD600nmで0.2%アラビノースを用いて誘導された。
【０２１４】
一晩の誘導の後、細胞を回収し、Hlaバイオコンジュゲートは、1mg/mlリゾチームが補充された溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH 8.5、1mM EDTA、20%スクロース)を用いてペリプラズム調製物によって抽出された。遠心分離後の上清からペリプラズムタンパク質を回収し、10mlのIMACレジン(Hypersel、Pall)上に装填し、勾配溶出によって溶出させた。大部分が単量体の非凝集種を含有する画分をプールし、さらにアニオン交換クロマトグラフィー(ANX Sepharose)により精製した。標的タンパク質は、非結合画分から回収されたが、一方、不純物はカラムへの結合を介して除去された。フロースルー画分を濃縮し、サイズ排除カラム(Superdex 200 10/300)に注入して、単分散Hlaから残存凝集種を分離した。すべての精製は、FPLCシステム(Aekta、Amersham Pharmacia)上で行われた。精製画分は、SimplyBlue Safe Stainで染色した4〜12%SDS-PAGEにより分析された。
【０２１５】
方法
大腸菌StGVXN2457(W3110  ΔwaaL、ΔrlmB-wecG、ΔaraBAD)は、エレクトロポレーションにより、131位にグリコシル化部位及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)をコードするプラスミドpGVXN570を用いて形質転換された。
【０２１６】
形質転換された細菌を、抗生物質アンピシリン[100μg/ml]が補充された選択LB(Lysogenyブロス)寒天プレート上で一晩増殖させた。細胞をアンピシリン[100μg/ml]を含有する100mlのLB中に接種し、37℃、180rpmで一晩、三角フラスコ中で振とうした。翌日、0.4〜0.45%グリセロール(Sigma、49781)、10mM MgCl2、及びアンピシリン[100μg/ml]が補充された2000mlのTerrificブロス(TB)培地の主要培養物を、600nmで0.1の光学濃度(OD600nm)の希釈液に接種し、180rpm、37℃で三角フラスコ中でインキュベートした。Hlaは、pBADプロモーターからの0.2%アラビノースを用いて、0.66の光学濃度OD600nmで誘導され、180rpm及び37℃で一晩振とうした。細胞を収穫し、4℃、5000rpmで20分間、遠沈し、200mlの0.9%塩化ナトリウムで洗浄し、4℃、5000rpmで20分間、再度遠沈した。OD600nmの8360同等物を、1mg/mlリゾチームが補充された167ml溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.5、1mM EDTA、20%(w/v)スクロース)に再懸濁した。試料を回転ホイール上で15分間、4℃でインキュベートし、8000rpmで30分間、4℃で遠心分離により遠沈し、上清を回収した。10mlのIMAC精製レジン(Hypersel、Pall)を、30mlの30mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールを用いて平衡化し、43mlの150mM Tris-HCl pH8.0、2500mM NaCl、25mMイミダゾール、4mM塩化マグネシウムが補充された上清とともに、40分間、室温でインキュベートした。レジンをXK16カラム(GE Healthcare)に充填し、ペリスタポンプ(Ismatec)を用いて、50mlの30mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールで洗浄した。以下では、カラムをFPLCシステム(Aekta、Amersham Pharmacia)に取り付け、タンパク質は、最大500mMのイミダゾール勾配で同じ緩衝条件で溶出された。45μlのクロマトグラフィー画分に、15μlの4倍濃縮したLaemmli緩衝液を補充し、最終濃度62.5mMのTris-HCl pH6.8、2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、5%(w/v)ベータ-メルカプトエタノール、10%(v/v)グリセロール、0.005%(w/v)ブロムフェノールブルーを得た。試料を95℃で15分間煮沸し、40μlを4〜12%のSDS-PAGE(Nu-PAGE、4〜12%Bis-Trisゲル、Life Technologies)によって、MOPS泳動緩衝液(50mM MOPS、50mM Tris塩基、0.1%SDS、1mM EDTA、pH7.7)を用いて、200ボルトで45分間分離した。タンパク質をSimplyBlue Safe Stainで可視化した。約90、190及び340mMのイミダゾールで3つの溶出ピークが観察された。約190mMのイミダゾール(第2のピーク、15ml)で溶出する5つの画分をプールし、10000rpmで30分、4℃で遠心分離し、上清を35mlの緩衝液A(10mM Tris-HCl pH7.5)で希釈して、2.69mS/cmの導電率に達した。タンパク質を25mlアニオン交換クロマトグラフィーカラム(ANXセファロース)上に装填し、50mlの緩衝液Aで洗浄し、タンパク質を緩衝液B(10mM Tris-HCl pH7.5、1M NaCl):3カラム体積(cv)から13%緩衝液B、5cvから16%緩衝液B、及び7cvから100%の緩衝液Bを用いた差次勾配により溶出した。すべての画分をSDS-PAGEにより分析し、上記のようにSimplyBlue Safe Stainで可視化した。標的タンパク質は、大部分が非結合画分中に検出され、プールされ、30キロダルトン分子量カットオフフィルター(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit)で500μlまで濃縮され、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Superdex 200 10/300、GE Healthcare)に注入され、凝集体を単量体担体タンパク質から分離した(図5A、吸光度読み取りを参照されたい)。画分をSDS-PAGEにより再度分析し、上記のようにSimplyBlue Safe Staで可視化した(図5A、SDS-PAGEゲル)。さらに、凝集種及び単量体種由来のタンパク質を、試料を煮沸させずにSDS-PAGE上で分析した。これにより、SDS-PAGE上の高分子量移動挙動と凝集種との明確な相関が確認された(図5B、レーン3中の非煮沸試料はゲルの頂部付近で非常に高いMWバンドを示す)。したがって、これは、高純度までタンパク質を精製する必要がなく、さらなる実験のために、非グリコシル化又はグリコシル化された担体タンパク質Hlaの均一性を分析するための迅速な読み出しを可能にする。
【０２１７】
[実施例4]
動的光散乱(DLS)による凝集u-Hla種の分析
凝集した非架橋u-Hla種を動的光散乱(DLS)により分析した。結果を図4に示す。4A)は、凝集Hlaの平均サイズ分布プロファイルを示す。4B)は、分析に使用した凝集u-Hla種を示し、ピーク1は、約90mMのイミダゾールで溶出するIMAC由来である。122.4nmの平均粒径を生じる3重測定の生データを表1に示す。
【０２１８】
【表１】
2021506311.tif 000008
【０２１９】
図4Cは、ナノメートル単位のモノマー分子又は七量体分子のいずれかの大まかな最大寸法を推定するために、プログラムPymolで行われた測定を示す。モノマー中の最長寸法は最大8nmであり、七量体形態は、全ての方向において約10nmの最大寸法を有する。
【０２２０】
StGVXN2457(W3110  ΔwaaL、ΔrlmB-wecG、ΔaraBAD)は、エレクトロポレーションにより、131位にグリコシル化部位及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35LをコードするプラスミドpGVXN570を用いて形質転換された。
【０２２１】
細胞をTB培地中で増殖させ、Hlaは、0.66の光学濃度OD600nmで0.2%アラビノースを用いて誘導された。
【０２２２】
一晩の誘導後、細胞を回収し、1mg/mlリゾチームが補充された溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.5、1mM EDTA、20%スクロース)を用いてペリプラズム調製物によってHlaバイオコンジュゲートを抽出した。遠心分離後、上清からペリプラズムタンパク質を回収し、10mlのIMACレジン(Hypersel、Pall)上に装填し、勾配溶出によって溶出した。
【０２２３】
方法
大腸菌StGVXN2457(W3110  ΔwaaL、ΔrlmB-wecG、ΔaraBAD)は、エレクトロポレーションにより、131位にグリコシル化部位及びC末端ヘキサヒスチジン親和性タグを有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)をコードするプラスミドpGVXN570を用いて形質転換された。
【０２２４】
形質転換された細菌を、抗生物質アンピシリン[100μg/ml]が補充された選択LB(Lysogenyブロス)寒天プレート上で一晩増殖させた。細胞をアンピシリン[100μg/ml]を含有する100mlのLB中に接種し、37℃、180rpmで一晩、三角フラスコ中で振とうした。翌日、0.4〜0.45%グリセロール(Sigma、49781)、10mM MgCl2、及びアンピシリン[100μg/ml]が補充された2000mlのTerrificブロス(TB)培地の主要培養物を、600nmで0.1の光学濃度(OD600nm)の希釈液に接種し、180rpm、37℃で三角フラスコ中でインキュベートした。Hlaは、pBADプロモーターからの0.2%アラビノースを用いて、0.66の光学濃度OD600nmで誘導され、180rpm及び37℃で一晩振とうした。細胞を収穫し、4℃、5000rpmで20分間、遠沈し、200mlの0.9%塩化ナトリウムで洗浄し、4℃、5000rpmで20分間、再度遠沈した。OD600nmの8360同等物を、1mg/mlリゾチームが補充された167ml溶解緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.5、1mM EDTA、20%(w/v)スクロース)に再懸濁した。試料を回転ホイール上で15分間、4℃でインキュベートし、8000rpmで30分間、4℃で遠心分離により遠沈し、上清を回収した。10mlのIMAC精製レジン(Hypersel、Pall)を、30mlの30mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールを用いて平衡化し、43mlの150mM Tris-HCl pH8.0、2500mM NaCl、25mMイミダゾール、4mM塩化マグネシウムが補充された上清とともに、40分間、室温でインキュベートした。レジンをXK16カラム(GE Healthcare)に充填し、ペリスタポンプ(Ismatec)を用いて、50mlの30mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、5mMイミダゾールで洗浄した。以下では、カラムをFPLCシステム(Aekta、Amersham Pharmacia)に取り付け、タンパク質は、最大500mMのイミダゾール勾配で同じ緩衝条件で溶出された。異なるイミダゾール濃度で3つのピークが観察された。サイズ排除クロマトグラフィー(実施例3、図5を参照されたい)から判断すると、約90mMのイミダゾールで最初のピークに溶出するこのHla種は凝集型であり、その画分を回収し、ダイナミック光散乱(DLS)により分析して、平均サイズ分布を得た。試料の3重測定は、70の蓄積時間を用いて0.9mg/mlで行われた。測定は、25℃でDelsa Nano C(Beckman Coulter)上で行われ、平均122.4ナノメートル(nm)の大きさが得られた。したがって、測定された平均粒子は10倍大きく、Hlaの凝集体である可能性が高いため、潜在的に七量体であり、毒性形態の形成は排除することができる。また、この方法ではタンパク質が小さすぎるため(約3×8nmの寸法)、いずれものシグナルをもたらさないHlaのモノマー形態を測定することを試みた。
【０２２５】
[実施例5]
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)からの非架橋対架橋の非グリコシル化ヘモリシンA変異体の溶出プロファイルの分析
非グリコシル化の非架橋Hlaの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)溶出プロファイルを、抗His抗体による各溶出画分のイムノブロット分析と比較し、標的タンパク質の不均一な溶出挙動を明らかにした。結果を図6に示す。
【０２２６】
次に、図7に示されるように、非グリコシル化の非架橋Hla、及び4つの非グリコシル化の架橋Hla変異体からの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)溶出プロファイルを比較した。これは、タンパク質収率の増加(G122C/H48C)と関連して、モノマーと比較して凝集体形成の阻害(Y102C/G126C)又は強い減少を示した。
【０２２７】
次に、図7に示されるIMAC勾配溶出から得られた凝集体又はモノマーとして溶出された非グリコシル化の非架橋Hla変異体、及び図7に示される4つの架橋Hla変異体のモノマー種からのIMAC溶出物をサイズ排除クロマトグラフィー分析に供した。結果を図8に示す。
【０２２８】
StGVXN1717(W3110  ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするプラスミドpGVXN393、カンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuoN311V-K482R-D483H-A669Vをコードする遺伝子を欠いた空のプラスミドベクターpGVXN72、及び黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35LをコードするプラスミドpGVXN570、架橋変異体HlaH35L-Y102C-G126CをコードするプラスミドpGVXN2178、HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2179、HlaH35L-H48C-N121CをコードするプラスミドpGVXN2180又はHlaH35L-L52C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2181(すべて、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヘキサヒスチジン(His6)親和性タグを有する)のうちの1つを用いて同時形質転換された。
【０２２９】
細胞をTB培地中で増殖させ、組換え多糖を恒常的に発現させた。Hlaを光学濃度OD600nmが0.5〜1.0の範囲で誘導した。
【０２３０】
一晩の誘導後、細胞を回収し、非グリコシル化Hlaタンパク質を浸透ショック法により抽出した。細胞を1mlの8.3mM Tris-HCl pH7.4、43.3mM NaCl、0.9mM KCl及び0.5ml再懸濁緩衝液(75%(w/v)スクロース、30mM EDTA、600mM Tris-HCl pH8.5)に再懸濁し、4℃で20分間回転させた。細胞をペレット化し、浸透ショック緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0)に再懸濁し、続いて、30分間、4℃でさらにインキュベートした。細胞を再度遠沈し、上清を1ml HisTrap FFカラムに装填し、タンパク質を勾配溶出によって溶出した。非架橋Hla変異体pGVXN570に由来する試料からの溶出画分を4〜12%SDS-PAGEに装填し、ニトロセルロース膜にブロットし、抗Hisタグ抗体によって検出した。
【０２３１】
方法
大腸菌StGVXN1717(W3110  ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするプラスミドpGVXN393、カンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuo N311V-K482R-D483H-A669Vをコードする遺伝子を欠いた空のプラスミドベクターpGVXN72、及び黄色ブドウ球担体タンパク質HlaH35L(ヘモリシンA)をコードするプラスミドpGVXN570、架橋変異体HlaH35L-Y102C-G126CをコードするプラスミドpGVXN2178、HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2179、HlaH35L-H48C-N121CをコードするプラスミドpGVXN2180又はHlaH35L-L52C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2181(すべて、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヘキサヒスチジン(His6)親和性タグを有する)のうちの1つを用いて同時形質転換された。
【０２３２】
形質転換された細菌を、3種類の抗生物質テトラサイクリン[20μg/ml]、アンピシリン[100μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]が補充された選択Lysogenyブロス(LB)寒天プレート上で一晩増殖させた。細胞をテトラサイクリン[20μg/ml]、アンピシリン[100μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]を含有する50mlのLysogenyブロス(LB)中に接種し、180rpm、37℃で一晩、三角フラスコ中で振とうした。翌日、0.4〜0.45%グリセロール(Sigma、49781)、10mM MgCl2、テトラサイクリン[20μg/ml]、アンピシリン[100μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]が補充された50mlのTerrificブロス(TB)培地の主要培養物を、600nmで0.1の光学濃度(OD600nm)の希釈液に接種し、平均OD600nmが0.9〜1.0になるまで180rpm、37℃で三角フラスコ中でインキュベートし、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG、Thermoscientific R0393)及びアラビノースで誘導し、180rpm、37℃で一晩振とうした。200 OD600nmを各試料から回収し、4℃、4000rpmで15分間遠沈し、細胞ペレットを20mlの0.9%NaClで洗浄し、再度4℃、4000rpmで15分間遠沈した。タンパク質を、1mlの8.3mM Tris-HCl pH7.4、43.3mM NaCl、0.9mM KCl及び0.5ml再懸濁緩衝液(75%スクロース、30mM EDTA、600mM Tris-HCl pH8.5)中に再懸濁することにより、浸透ショック法によって精製した。細胞懸濁液を回転ホイール上で4℃で20分間インキュベートし、9000rpmで30分間、4℃で遠心分離することによってペレット化し、1.5mlの浸透ショック緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0)に再懸濁した。懸濁液を4℃で30分間、回転させてインキュベートし、14000rpmで30分間、4℃で遠沈した。上清を回収し、塩化マグネシウム(MgCl2)及び5×結合緩衝液(150mM Tris-HCl pH8.0、2.5M NaCl、25mMイミダゾール)を補充して、最終濃度50mM MgCl2、及び30mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、5mM  イミダゾールのIMAC(固定化金属アフィニティークロマトグラフィー)結合条件に到達させた。1mlのHis Trap FFカラム(GE Healthcare)を、10mlの結合緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、5mM  イミダゾール)で平衡化し、試料をカラムに装填し、ペリスタポンプ(Ismatec)を用いて10mlの結合緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、5mM  イミダゾール)で洗浄した。以下では、カラムをFPLCシステム(Aekta、Amersham Pharmacia)に取り付け、10mlの30mM Tris-HCl、pH8.0、50mM NaCl、5mMイミダゾールで洗浄し、15ml中で5〜500mMのイミダゾールからの勾配により溶出した。非架橋Hla pGVXN570を用いて生成された試料からの45μlの各溶出画分に、62.5mM Tris-HCl pH6.8、2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、5%(w/v)ベータ-メルカプトエタノール、10%(v/v)グリセロール、0.005%(w/v)ブロムフェノールブルーの濃度に達するように、15μlの4×Laemmli緩衝液を補充し、15分間、98℃で煮沸した。各試料の30μlを、MOPS泳動緩衝液(50mM MOPS、50mM Tris塩基、0.1%SDS、1mM EDTA、pH7.7)を用いたSDS-PAGE(Nu-PAGE、4〜12%Bis-Trisゲル、Life Technologies)により、200V、45分間分析した。次に、タンパク質は、iBLOTゲル転写スタック(Novex、Life Technologiesによる)を用いてニトロセルロース膜上に転写された。ニトロセルロースは、20分間、室温でPBST(10mMリン酸緩衝液  pH7.5、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム(Ambresco E703-500mlから購入)、0.1%(v/v)Tween)に溶解した10%(w/v)粉末ミルクでブロックされ、続いて、1%(w/v)粉末ミルクが補充されたPBST中の0.1μg/mlの一次マウス抗ペンタヒスチジン抗体(Qiagen、34660)を用いて、1時間、室温で膜をインキュベートしてイムノブロット検出を行った。以下では、膜をPBSTで5分間2回洗浄し、1%(w/v)粉末ミルクが補充されたPBST中の二次抗マウス多価西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体(Sigma、A0412)とともに1時間、室温でインキュベートした。膜をPBSTで5分間、3回洗浄し、TBM(TMB1成分HRP膜基質、BioFX、TMBM-1000-01)の添加によりタンパク質バンドを可視化し、反応を脱イオン水で停止した。
【０２３３】
図7に示されるIMAC溶出液を、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によりさらに分析した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)Superdex 200 10/300カラム(GE Healthcare)は、FPLCシステム(Aekta、Amersham Pharmacia)上で1×TBS(Tris緩衝生理食塩水、Fisher Scientific)pH7.4を用いて0.5ml/分で平衡化された。非グリコシル化の架橋Hla変異体から回収された非グリコシル化の非架橋Hla及びモノマー種の凝集及びモノマー種由来の500μlのIMAC溶出ピークは、サイズ排除クロマトグラフィーSuperdex 200 10/300カラムに注入された。溶出プロファイルを280nmの吸収波長で記録し、図8に示されるように重ね合わせた。
【０２３４】
[実施例6]
陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたC末端HRHRタグを有するCP5-Hlaの高度に選択的な精製
図9に示すように、陽イオン交換レジンを用いてHRHR精製タグを有するCP5-Hlaバイオコンジュゲートの高度に選択的な精製工程を行った。精製タグを欠くCP5-Hlaを用いて得られた結果を図10に示す。StGVXN1717(W3110  ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするプラスミドpGVXN393、C末端ヒスチジン-アルギニン-ヒスチジン-アルギニンタグの有無にかかわらず、131位にグリコシル化部位を有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L-H48C-G122C pGVXN2533をコードするプラスミド、及びカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuo N311V-K482R-D483H-A669VをコードするプラスミドpGVXN1221を用いて同時形質転換された。
【０２３５】
細胞をTB培地中で増殖させ、組換え多糖を恒常的に発現させ、Hla及びPglBを0.74の光学濃度OD600nmで誘導した。
【０２３６】
一晩の誘導後、細胞を回収し、CP5-Hlaバイオコンジュゲートを浸透ショック法によりペリプラズムから放出した。細胞を8.3mM Tris-HCl pH7.4、43.3mM NaCl、0.9mM KCl及び再懸濁緩衝液(75%(w/v)スクロース、30mM EDTA、600mM Tris-HCl pH8.5)に再懸濁し、20分間、4℃で回転させた。細胞をペレット化し、浸透ショック緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0)に再懸濁し、続いて20分間、4℃でさらにインキュベートした。細胞を再度遠沈し、上清を1mlの陽イオン交換カラムに装填し、バイオコンジュゲートを勾配溶出によって回収した。溶出画分からのタンパク質を4〜12%のSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜上にブロットし、抗Hla抗体によって検出するか又はゲルをSimplyBlue Safe Stainで直接染色した。結果を図9(タグあり)及び図10(タグなし)に示す。
【０２３７】
方法
標識タンパク質について、大腸菌StGVXN1717(W3110  ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするプラスミドpGVXN393、131位にグリコシル化部位、及びC末端ヒスチジン-アルギニン-ヒスチジン-アルギニンタグを有する黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2533(ヘモリシンA)、並びにカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuo N311V-K482R-D483H-A669VをコードするプラスミドpGVXN1221を用いて同時形質転換された。
【０２３８】
形質転換された細菌を、0.4〜0.45%グリセロール(Sigma、49781)、2mM塩化マグネシウム、並びに3種類の抗生物質テトラサイクリン[20μg/ml]、カナマイシン[50μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]が補充された選択TB寒天プレート上で一晩増殖させた。細胞を10mM塩化マグネシウム、テトラサイクリン[20μg/ml]、カナマイシン[50μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]を含有する50mlのLysogenyブロス(LB)中に接種し、37℃、180rpmで一晩、三角フラスコ中で振とうした。翌日、0.4〜0.45%グリセロール(Sigma、49781)、10mM MgCl2、テトラサイクリン[20μg/ml]、カナマイシン[50μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]が補充された1000mlのTerrificブロス(TB)培地の主要培養物を、600nmで0.1の光学濃度(OD600nm)の希釈液に接種し、180rpm、37℃で三角フラスコ中でインキュベートした。組換え多糖を恒常的に発現させ、ヘモリシンAは、pBADプロモーターからアラビノースで誘導され、PglBは、OD600nmが0.74の光学濃度でイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導され、180rpm及び37℃で一晩振とうした。細胞を回収し、4℃、9000rpmで15分間遠沈し、110mlの0.9%塩化ナトリウムで洗浄し、OD600nmの1560同等物を浸透圧ショック法により抽出した。細胞を5mlの1/3×TBS(Tris緩衝生理食塩水、Fisher Scientific)及び2.5mlの再懸濁緩衝液(75%(w/v)スクロース、30mM EDTA、600mM Tris-HCl pH 8.5)に再懸濁し、20分間、4℃で回転させた。細胞をペレット化し、7.5mlの浸透ショック緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0)に再懸濁し、続いて30分間、4℃でさらにインキュベートした。細胞を遠心分離により再度遠沈し、上清を回収し、0.2μmフィルターで濾過した。2mlの濾液に5M塩化ナトリウム溶液を50mMの最終濃度になるまで添加し、1Mクエン酸を用いてpHを5.5に調整した。試料を14000rpm、4℃で、5分間の遠心分離により遠沈した。精製カラム(Proteus FliQ FPLCカラム、1ml、Generon)を1mlの陽イオン交換レジン(Nuvia HR-S、Biorad)で調製し、FPLCシステム(Aekta、Amersham Pharmacia)上で20mMクエン酸塩、50mM NaCl、pH5.5で平衡化した。試料を2mlのスーパーループで適用し、カラムを5mlの20mMクエン酸塩、50mMのNaCl、pH5.5で洗浄し、バイオコンジュゲートを20mMクエン酸塩、500mMのNaCl、pH5.5に勾配を適用して、10カラム体積で溶出した。回収されたフロースルー画分及び洗浄画分は500μlであり、溶出画分は350μlの体積であった。45μlのクロマトグラフィー画分に、15μlの4倍濃縮したLaemmli緩衝液を補充し、最終濃度62.5mMのTris-HCl pH6.8、2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、5%(w/v)ベータ-メルカプトエタノール、10%(v/v)グリセロール、0.005%(w/v)ブロムフェノールブルーを得た。試料を95℃で15分間、煮沸し、40μlは、200ボルトで45分間、MOPS泳動緩衝液(50mM MOPS、50mM Tris塩基、0.1%SDS、1mM EDTA、pH7.7)を用いて、4〜12%SDS-PAGE(Nu-PAGE、4〜12%Bis-Trisゲル、Life Technologies)により分離された。次に、タンパク質は、iBLOTゲル転写スタック(Novex、Life Technologiesによる)を用いてニトロセルロース膜上に転写された。ニトロセルロースは、20分間、室温でPBST(10mMリン酸緩衝液  pH7.5、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム(Ambresco E703-500mlから購入)、0.1%(v/v)Tween)に溶解した10%(w/v)粉末ミルクでブロックされ、続いて、PBST中の2.5μg/mlの一次ウサギ抗Hla抗体(ポリクローナル精製IgG、Glycovaxyn Nr 160)を用いて、1時間、室温でイムノブロット検出された。膜は、PBSTで2回洗浄され、PBST中の二次ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体(Biorad、170-6515)とともに1時間、室温でインキュベートされた。膜をPBSTで5分間、3回洗浄し、TBM(TMB1成分HRP膜基質)の添加によりタンパク質バンドを可視化し、反応を脱イオン水で停止した。
【０２３９】
煮沸した試料から、20μlを第2の4〜12%SDS-PAGEゲル(Nu-PAGE、4〜12%Bis-Trisゲル、Life Technologies)に装填し、タンパク質をMOPS泳動緩衝液(50mM MOPS、50mM Tris塩基、0.1% SDS、1mM EDTA、pH7.7)中で200ボルトで45分間分離した。ゲルを10mlのSimplyBlue SafeStain(Life Technologies)で連続して2回染色し、続いて脱イオン水を用いて脱色工程を行った。結果を図9に示す。
【０２４０】
タグ化されていないタンパク質について、大腸菌StGVXN1717(W3110ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、rmlB-wecG::Clm)は、エレクトロポレーションにより、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5(CPS5)をコードするプラスミドpGVXN393、131位にグリコシル化部位を有するが、C末端タグを有しない黄色ブドウ球菌担体タンパク質HlaH35L-H48C-G122CをコードするプラスミドpGVXN2438、及びカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuo N311V-K482R-D483H-A669VをコードするプラスミドpGVXN1221を用いて同時形質転換された。
【０２４１】
形質転換された細菌を、0.4〜0.45%グリセロール(Sigma、49781)、2mM塩化マグネシウム、並びに3種類の抗生物質テトラサイクリン[20μg/ml]、スペクチノマイシン[80μg/ml]及びアンピシリン[100μg/ml]が補充された選択TB寒天プレート上で一晩増殖させた。細胞を10mM塩化マグネシウム、テトラサイクリン[20μg/ml]、スペクチノマイシン[80μg/ml]及びアンピシリン[100μg/ml]を含有する50mlのLysogenyブロス(LB)中に接種し、37℃、180rpmで一晩、三角フラスコ中で振とうした。翌日、0.4〜0.45%グリセロール(Sigma、49781)、10mM MgCl2、テトラサイクリン[20μg/ml]、スペクチノマイシン[80μg/ml]及びアンピシリン[100μg/ml]が補充された1000mlのTerrificブロス(TB)培地の主要培養物を、600nmで0.1の光学濃度(OD600nm)の希釈液に接種し、180rpm、37℃で三角フラスコ中でインキュベートした。組換え多糖を恒常的に発現させ、ヘモリシンAは、pBADプロモーターから0.6%アラビノースで誘導され、PglBは、OD600nmが0.64の光学濃度で1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導され、180rpm及び37℃で一晩振とうした。細胞を回収し、4℃、9000rpmで15分間遠沈し、110mlの0.9%塩化ナトリウムで洗浄し、OD600nmの4200同等物を浸透圧ショック法により抽出した。細胞を14mlの1/3×TBS(Tris緩衝生理食塩水、Fisher Scientific)及び7mlの再懸濁緩衝液(75%(w/v)スクロース、30mM EDTA、600mM Tris-HCl pH 8.5)に再懸濁し、30分間、4℃で回転させた。細胞を8000rpmで30分間、4℃にて遠心分離によりペレット化し、21mlの浸透ショック緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0)に再懸濁し、続いて30分間、4℃でさらにインキュベートした。細胞を遠心分離により再度遠沈し、上清を回収し、0.2μmフィルターで濾過した。2mlの濾液に5M塩化ナトリウム溶液を50mMの最終濃度になるまで添加し、体積を4mlに調節することにより1Mクエン酸を用いてpHを5.5に設定した。試料を14000rpm、4℃で、5分間の遠心分離により遠沈した。精製カラム(Proteus FliQ FPLCカラム、1ml、Generon)を1mlの陽イオン交換レジン(Nuvia HR-S、Biorad)で調製し、FPLCシステム(Aekta、Amersham Pharmacia)上で20mMクエン酸塩、50mM NaCl、pH5.5で平衡化した。2mlの試料を2mlのスーパーループで適用し、カラムを5mlの20mMクエン酸塩、50mMのNaCl、pH5.5で洗浄し、バイオコンジュゲートを20mMクエン酸塩、500mMのNaCl、pH5.5に勾配を適用して、10カラム体積で溶出した。回収されたフロースルー画分及び洗浄画分は500μlであり、溶出画分は350μlの体積であった。45μlのクロマトグラフィー画分に、15μlの4倍濃縮したLaemmli緩衝液を補充し、最終濃度62.5mMのTris-HCl pH6.8、2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、5%(w/v)ベータ-メルカプトエタノール、10%(v/v)グリセロール、0.005%(w/v)ブロムフェノールブルーを得た。試料を95℃で15分間、煮沸した。その20μlは、図10)A)に示されるウエスタンブロットについて、200ボルトで45分間、MOPS泳動緩衝液(50mM MOPS、50mM Tris塩基、0.1%SDS、1mM EDTA、pH7.7)を用いて、4〜12%SDS-PAGE(Nu-PAGE、4〜12%Bis-Trisゲル、Life Technologies)により分離された。次に、タンパク質は、iBLOTゲル転写スタック(Novex、Life Technologiesによる)を用いてニトロセルロース膜上に転写された。ニトロセルロースは、20分間、室温でPBST(10mMリン酸緩衝液  pH7.5、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム(Ambresco E703-500mlから購入)、0.1%(v/v)Tween)に溶解した10%(w/v)粉末ミルクでブロックされ、続いて、PBST中の2.5μg/mlの一次ウサギ抗Hla抗体(ポリクローナル精製IgG、Glycovaxyn Nr 160)を用いて、1時間、室温でイムノブロット検出された。膜は、PBSTで2回洗浄され、PBST中の二次ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体(Biorad、170-6515)とともに1時間、室温でインキュベートされた。膜をPBSTで5分間、3回洗浄し、TBM(TMB1成分HRP膜基質)の添加によりタンパク質バンドを可視化し、反応を脱イオン水で停止した。
【０２４２】
煮沸した試料から、40μlをSimplyBlues染色用の第2の4〜12%SDS-PAGEゲル(Nu-PAGE、4〜12%Bis-Trisゲル、Life Technologies)に装填し、タンパク質をMOPSランニング緩衝液(50mM MOPS、50mM Tris塩基、0.1%SDS、1mM EDTA、pH7.7)中で、200ボルトで45分間分離した。ゲルを10mlのSimplyBlue SafeStain(Life Technologies)で連続2回染色し、続いて脱イオン水を用いて脱色工程を行った。結果を図10に示す。
【０２４３】
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際、本明細書に提供される主題の種々の変更は、記載されるものに加えて、前述の説明及び付随する図面から当業者に明らかになる。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることを意図している。
【０２４４】
種々の刊行物、特許及び特許出願が本明細書で引用され、それらの開示は、全体が参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
2021506311.tif 000009
【図１Ｂ−Ｃ】
2021506311.tif 000010
【図２】
2021506311.tif 000011
【図３】
2021506311.tif 000012
【図４Ａ】
2021506311.tif 000013
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2021506311.tif 000015
【図５Ａ】
2021506311.tif 000016
【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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