(57)【要約】  組換えタンパク質を精製する方法であって、ｉ）該組換えタンパク質を含む溶液を用意する工程；ｉｉ）該溶液へアルキルグリコシドを添加する工程；およびｉｉｉ）該組換えタンパク質を精製する工程を含む前記方法。アルキルグリコシドの添加によって、プロセス関連不純物の排除が改善される。本発明の精製された組換えタンパク質は、低レベルの宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、およびウイルス混入を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えポリペプチドを精製する方法であって、
ｉ）該組換えポリペプチドを含む溶液を用意する工程；
ｉｉ）該溶液へアルキルグリコシドを添加する工程；および
ｉｉｉ）該溶液に対してクロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
アルキルグリコシドは、追加的に、クロマトグラフィー工程の洗浄バッファーに含まれるか；別法として、アルキルグリコシドは、工程ｉｉ）において該溶液に添加されず、クロマトグラフィー工程の洗浄バッファーにだけ含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉｉ）は、溶液中の宿主細胞ＤＮＡおよび／もしくは宿主細胞タンパク質からの組換えポリペプチドの分離、ならびに／または溶液中の他のタンパク質不純物からの組換えポリペプチドの分離をもたらす、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉｉｉ）は、溶液へアルキルグリコシドを添加しない同じ方法と比較して、溶液中の宿主細胞ＤＮＡおよび／または宿主細胞タンパク質からの組換えポリペプチドの分離を改善する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィーは、イムノアフィニティークロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または金属キレートクロマトグラフィーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
クロマトグラフィーはイムノアフィニティークロマトグラフィーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
イオン交換クロマトグラフィー工程は、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、該溶液に対して実行される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、工程（ｉｉｉ）の後に、溶液に対して実行される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
マルチモードクロマトグラフィー工程は、工程（ｉｉｉ）の後に、溶液に対して実行される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
イオン交換クロマトグラフィー工程は、疎水性相互作用またはマルチモードクロマトグラフィー工程の後に、溶液に対して実行される、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞ＤＮＡおよび／または宿主細胞タンパク質から組換えポリペプチドを分離するためのものであり、
ａ）該組換えポリペプチドを含む溶液を用意する工程；
ｂ）該溶液に対してイオン交換クロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程；
ｃ）該溶液へアルキルグリコシドを添加する工程；
ｄ）該該溶液に対してイムノアフィニティークロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程；
ｅ）該溶液に対して疎水性相互作用またはマルチモードクロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程；および
ｆ）該溶液に対してさらにイオン交換クロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
イオン交換クロマトグラフィーは陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項５、７、１０、または１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
５０００ｐｇ／ｍｌ未満であるレベルの宿主細胞ＤＮＡ混入を含む溶液を提供し；かつ／または、アルキルグリコシドを使用しないことを除いてもしくはＴＮＢＰ／ＰＳ８０のような従来のＳ／Ｄ処理を使用することを除いて前記方法に同一である参照方法と比較した場合、１．５分の１以下、好ましくは、２分の１以下、５分の１以下、１０分の１以下、２０分の１以下、５０分の１以下、１００分の１以下、１５０分の１以下、もしくは２００分の１以下に低減したレベルの宿主細胞ＤＮＡ混入を含む組換えポリペプチドの溶液を提供する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
５０００ｎｇ／ｍｌ未満である宿主細胞ＤＮＡの混入のレベルを含む溶液を提供し；かつ／または、アルキルグリコシドを使用しないことを除いてもしくはＴＮＢＰ／ＰＳ８０のような従来のＳ／Ｄ処理を使用することを除いて前記方法に同一である参照方法と比較した場合、１．５分の１以下、好ましくは、２分の１以下、２．５分の１以下、３分の１以下、もしくは３．５分の１以下に低減したレベルの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入を含む組換えポリペプチドの溶液を提供する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｉｉ）は、溶液をインキュベートすることをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
溶液中に存在し得る１つまたはそれ以上のウイルスを不活化する方法であって、該溶液へアルキルグリコシドを添加し、該溶液をインキュベートする工程を含む前記方法。
【請求項１７】
溶液は、ｉ）組換えポリペプチドを含む溶液、またはｉｉ）血漿由来物質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
インキュベーションは、２０分から５時間の間で行われる、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
インキュベーションは、室温または４℃から１０℃の間で行われる、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
インキュベーション前のアルキルグリコシドの最終濃度は、該アルキルグリコシドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超えている、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
インキュベーションは撹拌なしで行われる、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドは、遺伝子組換えにより該ポリペプチドを産生する細胞株由来のものである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドは、血液凝固タンパク質、アルブミン、免疫グロブリン、または融合タンパク質である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉ）における溶液は、０．１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの間の宿主細胞ＤＮＡ、および／または５０μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの間の宿主細胞タンパク質を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
アルキルグリコシドは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドであるか、またはｎ−デシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、およびｎ−デシル−ベータ−Ｄ−マルトシドからなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
溶液は、工程（ｉｉｉ）および任意の追加の精製工程の後にウイルスの濾過の工程によりさらに処理される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
溶液は、工程（ｉｉｉ）および任意の追加の精製工程の後に限外濾過および／またはダイアフィルトレーションの１つまたはそれ以上の工程によりさらに処理される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
精製された組換えポリペプチドは、医薬組成物を作製するために薬学的に許容される担体と混合される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
アルキルグリコシドは任意の有機溶媒なしに添加され、かつ／またはアルキルグリコシドは事前に有機溶媒と混合することなく添加される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
組換えポリペプチドおよびアルキルグリコシドを含む溶液であって、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の工程（ｉｉ）から得られる前記溶液。
【請求項３１】
精製された組換えポリペプチドを含む溶液であって、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法によって得られる前記溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えにより発現されるポリペプチド、特に、薬学的用途のためのこれらのポリペプチドの精製の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換えにより発現されるポリペプチドの大規模で経済的な精製は、バイオテクノロジー産業にとってますます重要な問題となっている。これらのポリペプチドは、一般に、当該ポリペプチドの遺伝子を含有する組換えプラスミドを挿入して目的のポリペプチドを生産するように操作された哺乳動物、酵母、または細菌のいずれかの細胞株を使用して、細胞培養物によって産生される。所望のポリペプチドを、例えば宿主細胞ＤＮＡおよびタンパク質などの細胞成分から、ヒトの治療用物質として使用するために十分な純度へ分離するには、難しい課題がある。使用される精製技術は、理想的には、スケーラブルで、効率的で、費用効果が高く、信頼性の高いものであり、最終生成物の任意の純度要件を満たすものとなる。現行の精製技術には、通常、複数のクロマトグラフ分離法が必要となる。典型的な方法は、次の工程：沈殿、限外濾過、ダイアフィルトレーション、イムノアフィニティーおよびアフィニティクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、ならびにサイズ排除クロマトグラフィーのうちの、すべてまたは少なくとも一部を含む可能性がある。
【０００３】
特に哺乳動物細胞株を用いる組換え技術を使用して製造されたポリペプチドは、健康に有害な病原性ウイルスなどのウイルスで汚染されている恐れもある。該ポリペプチドを個体に投与するのであれば、あらゆる混入するウイルス活性を排除することが重要である。現在、例えば、湿式もしくは乾式熱不活化、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）不活化、ｐＨ不活化、化学的不活化、および／または紫外線／ガンマ照射不活化を含む、病原性ウイルスを不活化する多様な方法がある。重要なヒト病原体のほぼすべては、溶媒および界面活性剤によって膜破壊の影響を受けるベロープウイルスであるため、これらの方法のうち、Ｓ／Ｄ不活化が、おそらく最も広く使用される殺ウイルス方法である。Ｓ／Ｄ不活化方法において、有機溶媒および界面活性剤は、精製されているポリペプチドを含む液体と混合され、インキュベートされる。溶媒は、界面活性剤と、ウイルスを封入する脂質膜との間の集合を促進する環境を創出し、界面活性剤は、この脂質膜中の分子間の相互作用を破壊する。一旦、破壊されると、エンベロープウイルスは、もはや細胞に結合し、感染し、複製することができない。無傷の脂質膜が、このような活性に必須であるためである。世界保健機関（ＷＨＯ）のガイドラインに従って使用される典型的な条件は、０．３％リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）および１％ポリソルベート８０（ＰＳ８０、別名ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエートまたはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）の２４℃で最低６時間のインキュベーション、または０．３％ＴＮＢＰおよび１％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）の２４℃で最低４時間のインキュベーションである（非特許文献１を参照されたい）。
【０００４】
Ｓ／Ｄ処理は、エンベロープウイルスを不活化する標準技術になっているものの、その使用には幾つかの弱点がある。製造の間に加えられるＳ／Ｄ混合物は、最終生成物を生成する前に実質的に取り除かれなければならない。例えば、ＴＮＢＰは、使用される濃度では健康への危険性があり、したがって、製造過程および最終製品において、健康上および安全上の問題となるものである。さらに、従来使用されているＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００などの界面活性剤は、深刻な環境上の脅威をもたらしており、使用を中止しなければならない。またこのウイルス不活化工程の組込みによって、プロセシング時間が増大し、生成物収率が１０％も低減し（非特許文献２を参照されたい）、この組込みにはインキュベーションの間に混合物を撹拌する装置が必要となる。これらの問題を最少化または排除するために、より単純でより効率的なウイルス不活化手順が提案されている。一般的な選択肢には、例えば非特許文献２、３、および４の中で提案されているように、脂肪酸のカプリル酸（オクタン酸）の使用が含まれる。さらなる選択肢が、非特許文献５および特許文献１に記載されている。特に特許文献１では、より環境に適合性があると示唆される様々な界面活性剤が試験されている。ウイルス不活化に対する、様々な界面活性剤を使用する効果は一様ではない。さらに、特定の界面活性剤がウイルスを不活化することができる可能性があるものの、さらなる精製過程へのその効果は、例えばＤＮＡまたは宿主細胞タンパク質低減に関して、予測することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／０７３６３３
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＷＨＯテクニカルレポート、添付書類４、「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｖｉｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｔｏ  ａｓｓｕｒｅ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、シリーズ第９２４号、１５１〜２２４頁、（２００４）
【非特許文献２】Ｋｏｒｎｅｙｅｖａら、（２００２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．３０（２）：１５３〜６２頁
【非特許文献３】Ｌｅｂｉｎｇら、（２００３）Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．８４（３）：１９３〜２０１頁
【非特許文献４】Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、（２００３）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．  ３１（３）：２１３〜２１頁
【非特許文献５】Ｂｏｓｌｅｙら、（２００８）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ．  ２（６）：９０４〜７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、さらに改善された、遺伝子組換えにより発現させたポリペプチドを精製する方法、特に、ＤＮＡおよびタンパク質混入の低減を達成し、病原性ウイルスを不活化する方法が必要である。
【０００８】
本発明の開示
本発明は、アルキルグリコシドを組換えポリペプチドに添加する精製方法に基づくものである。発明者らは、アルキルグリコシド、および特にｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドが、精製工程の間、例えば、精製工程に先立ち供給物質に添加されると、方法関連不純物の排除を改善し得ることを明らかにした。例えば、発明者らは、クロマトグラフィー精製工程の供給流にアルキルグリコシドが存在することによって、ＴＮＢＰ／ＰＳ８０のような代替薬剤または対照緩衝液の使用と比較して、溶出段階における宿主細胞ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質レベルが有意に低減し得ることを発見した。さらに、アルキルグリコシドは、撹拌せずに短期間しか存在しない場合でも、効率的にウイルスを不活化することができ、これによってプロセス時間およびコストの削減が可能となる。該方法は、この効率的なウイルス不活化を保持しながら、広範囲の方法パラメーター下で実行することができる。ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドに加え、発明者らは、ｎ−デシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、およびｎ−デシル−ベータ−Ｄ−マルトシドが、本発明における使用に特に効果的なアルキルグリコシドであることを明らかにした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、組換えポリペプチドを精製する方法であって、
ｉ）該組換えポリペプチドを含む溶液を用意する工程；
ｉｉ）該溶液へアルキルグリコシドを添加する工程；および
ｉｉｉ）該組換えポリペプチドを精製する工程
を含む前記方法を提供する。
【００１０】
組換えポリペプチドは、典型的には、測定可能な量の宿主細胞ＤＮＡおよび／または宿主細胞タンパク質をさらに含む溶液中に含まれることとなる。これらの実施形態において、本発明は、宿主細胞ＤＮＡおよび／または宿主細胞タンパク質から組換えポリペプチドを分離する方法を提供し、ここでは、工程（ｉｉｉ）によってこの分離がもたらされる。溶液へのアルキルグリコシドの添加によって、アルキルグリコシドを用いない同じ方法と比較してこの分離を改善することができ、例えば、少なくとも１０％（特に少なくとも２０％）分離を改善する。発明者らは、工程（ｉｉｉ）が溶液に対するクロマトグラフィーの工程を実行することによって行われると、特に効果的な分離が達成可能であることを明らかにした。クロマトグラフィーは、任意の好適なクロマトグラフィー、例えば、イムノアフィニティー、アフィニティ、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモード、サイズ排除、または金属キレートクロマトグラフィーから選択してもよい。後述の本発明を実施するための形態では、発明者らは、特にイムノアフィニティークロマトグラフィーの工程を用いている。疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーもまた、特に有効である。
【００１１】
組換えポリペプチドを含む溶液に添加されたアルキルグリコシドは、好ましくは、０．１から１０００ｍＭの間（例えば、１から５００ｍＭ、３から４００ｍＭ、５から２００ｍＭ、１０から１００ｍＭ、２０から９０ｍＭの間）のこのような溶液の濃度を有してもよく、通常、約２５〜８０ｍＭである。
【００１２】
工程（ｉｉｉ）が、溶液に対してクロマトグラフィーの工程を実行することによって行われる場合、アルキルグリコシドをクロマトグラフィー工程の洗浄緩衝液中に追加的に含めてもよい。他の実施形態において、クロマトグラフィー工程の洗浄緩衝液中にアルキルグリコシドを含める工程を、別個の工程として、工程（ｉｉ）の実行に対する代替として用いてもよい。これらの実施形態において、本発明は、したがって、組換えポリペプチドを精製する方法であって、ｉ）該組換えポリペプチドを含む溶液を用意する工程；およびｉｉｉ）アルキルグリコシドがクロマトグラフィー工程の洗浄緩衝液中に含まれる、該溶液に対する該クロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程を含む前記方法を提供する。クロマトグラフィー洗浄緩衝液中にアルキルグリコシドを含むことによって、宿主細胞ＤＮＡレベルおよび／もしくは宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルならびに／または他のタンパク質不純物を、アルキルグリコシドを含まない対応する洗浄緩衝液を使用する参照方法と比較してさらに低減させることが可能である。
【００１３】
さらなる精製工程を、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前または工程（ｉｉｉ）の後のどちらかで方法に含めてもよい。精製工程は、典型的にはクロマトグラフィーの工程である。クロマトグラフィーは、任意の好適なクロマトグラフィー、例えば、イムノアフィニティー、アフィニティ、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモード、サイズ排除、または金属キレートクロマトグラフィーから選択してもよい。
【００１４】
例えば、１つまたはそれ以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を方法に含めてもよい。典型的には、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、特に工程（ｉｉｉ）がイムノアフィニティークロマトグラフィー工程である場合、工程（ｉｉｉ）の後に溶液に対して実行される。同様に、１つまたはそれ以上のイオン交換クロマトグラフィー工程を方法に含めてもよい。典型的には、イオン交換クロマトグラフィー工程は、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、溶液に対して実行される。イオン交換クロマトグラフィー工程もまた、特に工程（ｉｉｉ）がイムノアフィニティークロマトグラフィー工程である場合、工程（ｉｉｉ）の後に溶液に対して行ってもよい。この実施形態において、典型的には、（前述のように）イムノアフィニティークロマトグラフィー工程の後に、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程が続き、その次に、イオン交換クロマトグラフィー工程が続く。
【００１５】
例えば、発明者らは、組換えポリペプチドを宿主細胞ＤＮＡおよび／または宿主細胞タンパク質から分離する特に効果的な方法は、ａ）該組換えポリペプチドを含む溶液を用意する工程；ｂ）該溶液に対してイオン交換クロマトグラフィーの工程を実行することによって、該組換えポリペプチドを精製する工程；ｃ）該溶液へアルキルグリコシドを添加する工程；ｄ）該溶液に対してイムノアフィニティークロマトグラフィーの工程を実行することによって、該組換えポリペプチドを精製する工程；ｅ）該溶液に対して疎水性相互作用またはマルチモードクロマトグラフィーの工程を実行することによって、該組換えポリペプチドを精製する工程；およびｆ）該溶液に対してさらなるイオン交換クロマトグラフィーの工程を実行することによって、該組換えポリペプチドを精製する工程を含むことを明らかにした。
【００１６】
したがって、本発明は、溶液中の組換えポリペプチドを精製する方法において、溶液へのアルキルグリコシドの添加からなる改善を提供する。該添加によって、該方法後の宿主細胞ＤＮＡおよび／またはタンパク質混入を低減させることができる。追加的にまたは代替的に、該添加によって、効率的なウイルス不活化が可能となる。さらに、該方法により得られる組換えポリペプチドの収率は、改善し得る。
【００１７】
本発明はまた、組換えポリペプチドを含む溶液への添加剤としてのアルキルグリコシドの使用を提供する。該使用によって、次の組換えポリペプチド精製の後の宿主細胞ＤＮＡおよび／またはタンパク質混入が低減し得る。追加的にまたは代替的に、該使用によって、効率的なウイルス不活化が可能となる。
【００１８】
本発明の方法は、５０００ｐｇ／ｍｌ未満（例えば、≦４０００ｐｇ／ｍｌ、≦３０００ｐｇ／ｍｌ、≦２５００ｐｇ／ｍｌ、≦２０００ｐｇ／ｍｌ、≦１５００ｐｇ／ｍｌ、≦１０００ｐｇ／ｍｌ、≦５００ｐｇ／ｍｌ、≦２００ｐｇ／ｍｌ、≦１００ｐｇ／ｍｌ、≦５０ｐｇ／ｍｌなど）であるレベルの宿主細胞ＤＮＡ混入を含む組換えポリペプチドの溶液を提供することができる。典型的には、宿主細胞ＤＮＡ混入のレベルは、５００ｐｇ／ｍｌ未満、特に２００ｐｇ／ｍｌ未満である。
【００１９】
本発明の方法は、アルキルグリコシドを使用しないということを除いてまたはＴＮＢＰ／ＰＳ８０のような従来のＳ／Ｄ処理を使用するということを除いて本発明の方法に同一である参照方法と比較した場合、１．５分の１以下、好ましくは、２分の１以下、５分の１以下、１０分の１以下、２０分の１以下、５０分の１以下、１００分の１以下、１５０分の１以下、または２００分の１以下に低減したレベルの宿主細胞ＤＮＡ混入を含む組換えポリペプチドの溶液を提供することができる。
【００２０】
本発明の方法は、好ましくは工程ｉｉｉ）による組換えポリペプチドの精製後に、好ましくは工程ｉｉｉ）によって、組換えポリペプチドの精製の前の宿主細胞ＤＮＡ混入のレベルと比較した場合に１０分の１以下、好ましくは、１００分の１以下、１０００分の１以下、１０，０００分の１以下、１５，０００分の１以下、２０，０００分の１以下、または２５，０００分の１以下に低減したレベルの宿主細胞ＤＮＡ混入を含む組換えポリペプチドの溶液を提供することができる。このような低減は、工程（ｉｉｉ）が例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー工程である場合にみられる。
【００２１】
本発明の方法は、５０００ｎｇ／ｍｌ未満（例えば、≦４０００ｎｇ／ｍｌ、≦３５００ｎｇ／ｍｌ、≦３０００ｎｇ／ｍｌ、≦２５００ｎｇ／ｍｌ、≦２０００ｎｇ／ｍｌ、≦１８００ｎｇ／ｍｌ、≦１５００ｎｇ／ｍｌ、≦１０００ｎｇ／ｍｌなど）であるレベルの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入を含む組換えポリペプチドの溶液を提供することができる。典型的には、宿主細胞タンパク質混入のレベルは、５０００ｎｇ／ｍｌ未満、特に３０００ｎｇ／ｍｌ未満である。
【００２２】
本発明の方法は、アルキルグリコシドを使用しないということを除いてまたはＴＮＢＰ／ＰＳ８０のような従来のＳ／Ｄ処理を使用するということを除いて本発明の方法に同一である参照方法と比較した場合、１．５分の１以下、好ましくは、２分の１以下、２．５分の１以下、３分の１以下、または３．５分の１以下に低減したレベルの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入を含む、組換えポリペプチドの溶液を提供することができる。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは工程ｉｉｉ）による組換えポリペプチドの精製後に、好ましくは工程ｉｉｉ）による組換えポリペプチドの精製の前の宿主細胞タンパク質混入のレベルと比較した場合、１０分の１以下、好ましくは、１００分の１以下、２００分の１以下、３００分の１以下、４００分の１以下、５００分の１以下、７００分の１以下、８００分の１以下、９００分の１以下、または１，０００分の１以下に低減したレベルの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入を含む、組換えポリペプチドの溶液を提供することもできる。このような低減は、工程（ｉｉｉ）が例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー工程である場合にみられる。
【００２４】
具体的には、本発明の方法は、（ａ）宿主細胞ＤＮＡ混入のレベルが（前述のように）５０００ｐｇ／ｍｌ未満であり、（ｂ）宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入のレベルが（前述のように）５０００ｎｇ／ｍｌ未満である、組換えポリペプチドの溶液を提供することができる。
【００２５】
本発明の方法は、アルキルグリコシドを使用しないということを除いてまたはＴＮＢＰ／ＰＳ８０のような従来のＳ／Ｄ処理を使用するということを除いて本発明の方法に同一である参照方法によって得られた組換えポリペプチドの収率と比較した場合、得られた組換えポリペプチドの収率が少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または少なくとも２の倍率で改善されている、組換えポリペプチドの溶液を提供することができる。
【００２６】
本明細書において言及された１つまたはそれ以上の方法による組換えポリペプチドの溶液は、好ましくは、本明細書に記載されたような組換えポリペプチドの精製の結果として、具体的には、工程ｉｉｉ）による精製の結果として提供される。別法としてまたは追加として、アルキルグリコシドは、クロマトグラフィー工程の洗浄緩衝液中に含めてもよい。
【００２７】
本発明はまた、組換えポリペプチドおよびアルキルグリコシドを含む溶液、具体的には、本発明の方法工程（ｉｉ）から得られたまたは得ることができる溶液を提供する。
【００２８】
本発明はまた、精製された組換えポリペプチドを含む溶液、特に、本発明の方法から得られたまたは得ることが可能な溶液を提供する。溶液には、アルキルグリコシドの残量が含有されていてもよい。アルキルグリコシドの量は、例えば、質量分析法を用いる場合、検出限界未満であり得る。例えば、アルキルグリコシドの量は、１．５μｇ／ｍｌ未満（または４０ｎｇ／精製組換えポリペプチドｍｇ未満）であり得る。アルキルグリコシドの量は、特に、１０ｎｇ／精製組換えポリペプチドｍｇ未満であり得る。
【００２９】
本発明はまた、５０００ｐｇ／ｍｌ未満（例えば、≦４０００ｐｇ／ｍｌ、≦３０００ｐｇ／ｍｌ、≦２５００ｐｇ／ｍｌ、≦２０００ｐｇ／ｍｌ、≦１５００ｐｇ／ｍｌ、≦１０００ｐｇ／ｍｌ、≦５００ｐｇ／ｍｌ、≦２００ｐｇ／ｍｌ、≦１００ｐｇ／ｍｌ、≦５０ｐｇ／ｍｌなど）であるレベルの宿主細胞ＤＮＡ混入を含む、組換えポリペプチドを含む溶液を提供する。典型的には、宿主細胞ＤＮＡ混入のレベルは、５００ｐｇ／ｍｌ未満、特に２００ｐｇ／ｍｌ未満である。
【００３０】
本発明はまた、５０００ｎｇ／ｍｌ未満（例えば、≦４０００ｎｇ／ｍｌ、≦３５００ｎｇ／ｍｌ、≦３０００ｎｇ／ｍｌ、≦２５００ｎｇ／ｍｌ、≦２０００ｎｇ／ｍｌ、≦１８００ｎｇ／ｍｌ、≦１５００ｎｇ／ｍｌ、≦１０００ｎｇ／ｍｌなど）であるレベルの宿主細胞タンパク質混入を含む、組換えポリペプチドを含む溶液を提供する。典型的には、宿主細胞タンパク質混入のレベルは、５０００ｎｇ／ｍｌ未満、特に３０００ｎｇ／ｍｌ未満である。
【００３１】
本発明はまた、（ａ）宿主細胞ＤＮＡ混入のレベルが（前述のように）５０００ｐｇ／ｍｌ未満であり；（ｂ）宿主細胞タンパク質混入のレベルが（前述のように）５０００ｎｇ／ｍｌ未満である、組換えポリペプチドを含む溶液を提供する。
【００３２】
本発明はまた、アルキルグリコシドをＴＮＢＰなどの任意の有機溶媒なしで添加する、組換えポリペプチドを含む溶液への添加剤としての該アルキルグリコシドの使用を提供する。本文脈における有機溶媒は、例えば、任意の炭素ベースの溶媒であり得る。本発明によれば、アルキルグリコシドを、水以外または緩衝水溶液以外の溶媒などと事前に混合することなく提供してもよい。
【００３３】
本発明はまた、本明細書に記載されたようなクロマトグラフィー工程用の洗浄緩衝液への添加剤としてのアルキルグリコシドの使用を提供する。
【００３４】
本発明はまた、添加剤としてアルキルグリコシドを含むことによってクロマトグラフィー工程において使用される、洗浄緩衝液を提供する。洗浄緩衝液は、好ましくは、本発明による組換えポリペプチドを精製する方法において適用できるように構成される。
【００３５】
アルキルグリコシドは、０．１から１０００ｍＭの間（例えば、０．２から５００ｍＭ、０．５から３００ｍＭ、１から２００ｍＭ、１．５から１００ｍＭ、２から８０ｍＭの間）のこのような洗浄緩衝液の濃度を有していてもよく、通常、約１０〜１００ｍＭである。
【００３６】
よって、本発明の好ましい実施形態によれば、組換えポリペプチドを含む溶液を、用意し、必要に応じて、インキュベートしてもよく、該溶液は、クロマトグラフィーカラムに投入するのに使用され、溶出前に、該カラムは、アルキルグリコシドを含有する洗浄緩衝液で洗浄される。洗浄緩衝液におけるアルキルグリコシド最終濃度は、典型的には、０．１から１０００ｍＭの間（例えば、０．２から５００ｍＭ、０．５から３００ｍＭ、１から２００ｍＭ、１．５から１００ｍＭ、２から８０ｍＭの間）であり、通常、約１０〜１００ｍＭである。発明者らは、この場合、該濃度はまた、アルキルグリコシドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満であってもよいことを明らかにした。この洗浄手順を用いて、アルキルグリコシドを含まない対応する洗浄緩衝液を用いる参照方法と比較して、宿主細胞ＤＮＡおよび／もしくはＨＣＰならびに／または他のタンパク質不純物を、５分の１未満に、１０分の１未満に、２５分の１未満に、５０分の１未満に、またはさらに１００分の１未満に低減させることができた。そのようなタンパク質不純物の１００分の１未満への低減は、下記の実施例３において実証されている。タンパク質不純物は、例えば、目的の組換えポリペプチドの１つまたはそれ以上の断片、目的の組換えポリペプチドのプロペプチド、任意の同時発現されたタンパク質などであり得る。
【００３７】
本発明の別の態様において、発明者らは、アルキルグリコシドが、ウイルス不活化のために使用された場合、特に有利な効果を有することを明らかにした。エンベロープウイルスはアルキルグリコシドに感受性があり、低温で使用された場合、ＴＮＢＰ／ＰＳ８０などの代替薬剤と比較して、アルキルグリコシドは、不活化能の損失の問題がほとんどないまたは全くない。それらは、撹拌を伴わず、例えば振盪を伴わなくても使用することができる。この目的のための例示的なアルキルグリコシドは、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、およびｎ−デシル−ベータ−Ｄ−マルトシドであり、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドが特に効果的である。
【００３８】
本発明のこのさらなる態様を、組換えポリペプチドを精製する本発明の方法を用いて適用してもよい。例えば、当該方法の工程ｉｉ）（すなわち、組換えポリペプチドを含む溶液へアルキルグリコシドを添加する工程）は、溶液をインキュベートすることをさらに含んでもよい。インキュベーションによって、溶液中に存在し得る１つまたはそれ以上のウイルスの不活化がもたらされる。インキュベーションは、後述のように行うことができる。ウイルスは、典型的には、自然環境から溶液に入り込むかまたは溶液を作製した材料中に存在した混入ウイルスとなる。溶液中のウイルスの有無はわからない可能性があるため、本発明を使用して、溶液中に存在し得る１つまたはそれ以上のウイルスを不活化することによって、ウイルス混入のリスクを低減させることができる。ウイルスが溶液中に存在する場合、インキュベーションによって、これらのウイルスのうちの１つまたはそれ以上を不活化することができる。
【００３９】
別法として、本発明のこの態様を、独立型の方法として適用してもよい。このようにして、本発明は、組換えポリペプチドを含む溶液へアルキルグリコシドを添加し、該溶液をインキュベートする工程を含む、該溶液中に存在し得る１つまたはそれ以上のウイルスを不活化する方法を提供する。１つまたはそれ以上のウイルスは、典型的には、エンベロープウイルスである。インキュベーションは、任意の好適な長さの時間、典型的には、効果的なウイルス低減を達成するのにかかるような長さの時間で行ってもよい。達成されたウイルス減少率（ｌｏｇ１０）は、例えば、少なくとも４であってもよい。典型的な実施形態において、インキュベーションは、１分から２４時間の間で、２分から１２時間の間で、好ましくは１０分から５時間の間で行われ、通常、約３０分間以上である。インキュベーションは好都合に室温で行われるが、より低い温度、例えば、≦２０℃、また４から１０℃の間でも、良好な結果を得ることができる。タンパク質が温度に影響を受けやすいのであれば、これらのより低い温度は特に好都合である。インキュベーション前のアルキルグリコシドの最終濃度は、典型的には、０．１から１０００ｍＭの間（例えば、１から５００ｍＭ、３から４００ｍＭ、５から２００ｍＭ、１０から１００ｍＭ、２０から９０ｍＭの間）であり、通常、約２５〜８０ｍＭである。発明者らは、アルキルグリコシドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える濃度が特にウイルス不活化に対して有効であることを明らかにした。典型的には、該濃度は、このＣＭＣの１．５、２、３、または４倍となる。
【００４０】
１つまたはそれ以上のウイルスを不活化するこの方法は、組換えポリペプチドを含む溶液に関して上記で説明されてきた。しかしながら、当業者であれば、該方法を、任意の好適な供給物質、特に（ヒト）血漿由来物質などに適用することができることを理解するであろう。血漿由来物質は、特にウイルスの混入が起こりやすい。したがって、より一般的な態様において、本発明は、溶液へアルキルグリコシドを添加し、溶液をインキュベートする工程を含む、溶液中に存在し得る１つまたはそれ以上のウイルスを不活化する方法を提供する。溶液は、特に生物学的組成物から、例えば、全血、赤血球濃厚液、血小板濃厚液、白血球濃厚液（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）、血球タンパク質（ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、血漿、多血小板血漿、血漿濃厚液（ｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）、血漿の任意の分画からの沈殿物、血漿の任意の分画からの上清、血漿タンパク質画分、精製されたまたは部分的に精製された血液タンパク質または他の成分、血清、精液、哺乳動物の初乳、乳汁、唾液、胎盤抽出物、寒冷沈降物、寒冷上清、細胞ライセート、哺乳動物細胞培養物または培養培地、発酵の生成物、腹水、血球中に存在するタンパク質、および正常または形質転換細胞によって細胞培養物中で産生された生成物（例えば、組換えＤＮＡまたはモノクローナル抗体技術を介して）などから得てもよい。
【００４１】
好ましい実施形態によれば、アルキルグリコシドは、特に本明細書に記載された１つまたはそれ以上の方法において、１つまたはそれ以上のエンベロープウイルスを不活化するために使用される。ここで、該１つまたはそれ以上のウイルスは、好ましくは、ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＢＶＤＶ（ウシウイルス性下痢症ウイルス）、ＰＲＶ（仮性狂犬病ウイルス）、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）、およびＶＡＣＶ（ワクシニアウイルス）からなる群から選択される。
【００４２】
組換えポリペプチド
「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために使用される。ポリマーは直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾型アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって遮断されていてもよい。該用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、硫酸化、または標識成分もしくは半減期を延ばす成分との結合などその他の操作もしくは改変などの天然にまたは介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。該用語にはまた、例えば、アミノ酸の１つまたはそれ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、および当技術分野で既知のその他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、別々のポリペプチドのマルチマーの形態であってもよい。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、目的の任意のポリペプチドであり、特に、混入ウイルス活性の排除が望まれるものであってもよい。本発明のポリペプチドは、好ましくは、水溶性ポリペプチドであってもよく、特に膜に挿入されているポリペプチドではなない。
【００４４】
ポリペプチドは、治療目的の任意のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、特に、抗体、血液タンパク質、酵素、受容体、ホルモン、制御因子、抗原、サイトカイン、およびその他の目的のポリペプチドを含む群から選択することができる。例えば、ポリペプチドは、モノクローナル抗体、それらのドメイン、このような抗体もしくはそれらのドメインの二量体もしくはオリゴマー、重特異性抗体、単鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）、またはキメラ型ポリペプチドであってもよい。
【００４５】
ポリペプチドはまた、特に血液タンパク質、例えば、血液凝固タンパク質、アルブミン、または免疫グロブリンであってもよい。血液タンパク質の非限定的な例としては、ＡＤＡＭＴＳ−１３、α１−抗プラスミン、α２−抗プラスミン、アンチトロンビンＩＩＩ、腫瘍由来凝固促進因子（ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）、エリスロポエチン、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ヘパリンコファクターＩＩ、高分子量キニノーゲン、免疫グロブリン、プラスミノーゲン、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−２、プレカリクレイン、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、タンパク質Ｚ関連プロテアーゼインヒビター、組織因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、またはフォン・ウィルブランド因子が挙げられる。ポリペプチドは、それらの融合タンパク質であってもよい。
【００４６】
ポリペプチドはまた、天然ポリペプチドの変異体、例えば、上記のポリペプチドのうちの１つの変異体であってもよい。変異体は、前記天然ポリペプチドの断片を含んでいてもよい。発明者らは、フォン・ウィルブランド因子融合タンパク質の組換え変異体を精製する本発明の方法を独自に開発した。変異体の一般的な種類は参考文献７に記載されており、この文書からの「Ｄ’Ｄ３−ＦＰ」変異体（文書では配列番号２と表記されている）が、発明者らが下記の本発明を実施するための形態において用いた代表的なポリペプチドである。
【００４７】
ポリペプチドは、異種のアミノ酸配列に融合させてもよい。前記異種のアミノ酸配列は、免疫グロブリン定常部および例えばＦｃ断片などのそれらの部分、トランスフェリンおよびそれらの断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮとして既知である水力学的容量が大きい溶媒和されたランダム鎖、ホモアミノ酸反復（ｈｏｍｏ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｅａｔ）（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理的条件下でアルブミンまたは免疫グロブリン定常部に結合できるポリペプチド、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含むかまたはそれらからなる。好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは、アルブミンまたはＦｃ断片に、特にアルブミンに融合させる。
【００４８】
ポリペプチドは、別法としてまたは追加として、さらなる部分に結合させてもよい。前記部分は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖またはアルブミン結合ペプチド、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４９】
「組換えポリペプチド」という用語は、本明細書において、遺伝子組換えにより発現されたポリペプチドを指すために使用される。具体的には、該ポリペプチドは、該ポリペプチドを発現するために遺伝子操作されたトランスジェニック生物から得られたか、または遺伝子組換えにより該ポリペプチドを産生する細胞株から得られたものである。生物の非限定的な例としては、鳥、ならびに例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ロバ、雌ウシ、霊長類、およびヒトなどの哺乳動物が挙げられる。トランスジェニック生物の非限定的な例としては、ポリペプチドを発現するために遺伝子操作された生物が挙げられる。トランスジェニック生物からのポリペプチドは、当技術分野で既知の常法を用いて、体液、組織もしくは器官抽出物、または生物由来のその他の供給源から得てもよい。しかしながら、より典型的には、原核生物および／または真核生物発現系を使用して、遺伝子組換えによりポリペプチドを発現させる。発現系は、限定はしないが、誘導発現、非誘導発現、構成的発現、組織特異的発現、細胞特異的発現、ウイルス媒介発現、安定的に組み込まれた発現、および一過的発現を含む、様々な特性のいずれかを含み得る。このような発現系の作製および使用方法は、当技術分野では既知である。
【００５０】
一般的には、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターにクローニングされる。原核生物発現ベクターは、典型的には、複製開始点、好適なプロモーター、および／またはエンハンサーエレメントを含み、リボソーム結合、ポリアデニル化、転写終結に必要な部位、ならびに非転写５’フランキング配列およびその他の非転写遺伝要素もまた含む。例示的な原核生物ベクターとしては、例えばバクテリオファージＴ７プロモーターのようなプロモーターを用いる、ｐＥＴおよびｐＲＳＥＴが挙げられる。真核生物発現ベクターは、典型的には、複製開始点、好適なプロモーター、および／またはエンハンサーエレメントを含み、リボソーム結合、ポリアデニル化、スプライシング、転写終結に必要な部位、ならびに非転写５’フランキング配列およびその他の非転写遺伝要素もまた含む。例示的な酵母ベクターとしては、例えばＡＯＸ１、ＡＵＧ１、ＧＡＰ、およびＧＡＬＬなどのプロモーターを用いる、ｐＡＯ、ｐＭＥＴ、ｐＰＩＣ、ｐＰＩＣＺ、およびｐＹＥＳが挙げられる。例示的な昆虫ベクターとしては、例えばＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐｌＥ２、ｇｐ６４、およびｐｏｌｈのようなプロモーターを用いる、ｐＡｃ５、ｐＢＡＣ、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＭＴが挙げられる。例示的な哺乳動物ベクターとしては、例えばベータ−カゼイン、ベータ−ラクトグロブリン、乳清酸性プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、レトロウイルス由来ＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−１などのプロモーターを用いる、ｐＢＰＶ、ｐＣＭＶ、ｐＣＭＶＴＮＴ、ｐＤＮＡ、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＭＳＧ、ｐＯＧ４４、ＰＱＢＩ２５、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＳＥＣＴａｇ、ｐＳＥＣＴａｇ２、ｐＳＧ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＵＣＩＧ−ＭＥＴ、ｐＶＡＸ１、ｐＷＬｎｅｏ、およびｐＸＴ１が挙げられる。選択マーカーとしては、アンピシリン、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、カナマイシン、ネオマイシン、およびテトラサイクリンが挙げられる。好適な発現ベクターが、当技術分野において既知であり、市販されている。
【００５１】
適合性のあるベクターを発現することができる細胞には、原核細胞、真核細胞、ならびに原核および真核細胞由来の細胞株が含まれる。原核細胞株の非限定的な例としては、例えば、大腸菌、バチルス・スブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バクテロイデス・フラジリス、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ディフィシル、カウロバクター・クレセンタス、ラクトコッカス・ラクティス、メチロバクテリウム・キストロクエンス、ナイセリア・メニンギルルス、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・フルオレッセンス、およびサルモネラ・ティフィムリウム由来のものが挙げられる。酵母株の非限定的な例としては、例えば、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・アングスタ、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロマイセス・セレビシエ、およびヤロウィア・リポリティカ由来のものが挙げられる。植物細胞および植物由来の細胞株には、例えば、トウモロコシのような単子葉植物の種、ならびにシロイヌナズナ、コムギ、イボウキクサ、およびコウキクサのような双子葉植物の種からの細胞が含まれる。昆虫細胞および昆虫由来細胞株には、例えば、ヨトウガ、イラクサギンウワバ、キイロショウジョウバエ、およびタバコスズメガからの細胞が含まれる。昆虫細胞株の非限定的な例としては、Ｈｉｇｈ−５、Ｋｃ、シュナイダーのショウジョウバエ株２（Ｓ２）、ＳＦ９、およびＳＦ２１細胞株が挙げられる。哺乳動物細胞および哺乳動物細胞由来細胞株には、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類、およびヒトからの細胞が含まれる。哺乳動物細胞株の非限定的な例としては、１Ａ３、３Ｔ３、６Ｅ６、１０Ｔ１／２、ＡＰＲＴ、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、ＢＥ（２）−Ｃ、ＢＨＫ、ＢＴ、Ｃ６、Ｃ１２７、ＣＨＯ、ＣＨＰ３、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＰＡＥ、ＥＳＫ−４、ＦＢ２、ＧＨ１、ＧＨ３、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３、ＨｅｐＧ２、ＨＬ−６０、ＩＭＲ−３２、Ｌ２、ＬＬＣ−ＰＫ１、Ｌ−Ｍ、ＭＣＦ−７、ＮＢ４、ＮＢＬ−６、ＮＣＴＣ、Ｎｅｕｒｏ２Ａ、ＮＩＥ−１  １５、ＮＧ１０８−１５、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＫ１５、ＳＢＡＣ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＴ、ＳＷ−１３、およびＶＶ−１細胞株が挙げられる。細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓおよび／またはＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから得てもよい。
【００５２】
組換えポリペプチドは、典型的には、宿主細胞ＤＮＡおよび／または宿主細胞タンパク質（ほとんどの場合、典型的には両方）を含む溶液中に含まれることとなる。自然界ではポリペプチドは水性環境において生じるため、溶液は、典型的には水溶液である。宿主細胞ＤＮＡおよび／または宿主細胞タンパク質は、遺伝子組換えによりポリペプチドを発現したトランスジェニック生物または細胞株由来の溶液中に存在する。ポリペプチドが細胞株によって発現された場合、溶液は、細胞株培養物からの培養培地を含んでいてもよい。組換えポリペプチドは、後に続く精製のための特定の媒体に移されていてもよい。
【００５３】
典型的には、工程（ｉ）における該組換えポリペプチドを含む溶液中の宿主細胞ＤＮＡの量は、０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの間であり、例えば、０．１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの間である。同様に、工程（ｉ）における宿主細胞タンパク質の量は、典型的には、５μｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの間であり、例えば、５０μｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌの間である。上記で論じたように、該溶液が０．０１から１００μｇ／ｍｌの間の宿主細胞ＤＮＡ（前述のように、例えば、少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ）および５μｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの間の宿主細胞タンパク質（前述のように、例えば、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ）を有するように、これらの混入種の両方が存在することが一般的である。
【００５４】
アルキルグリコシドの添加前の精製工程
上記で論じたように、本方法において、さらなる精製工程を、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前または工程（ｉｉｉ）の後のいずれかにおいて含めてもよい。いずれのさらなる精製工程も、典型的には、クロマトグラフィーの工程である。クロマトグラフィーは、任意の好適なクロマトグラフィー、例えば、イムノアフィニティー、アフィニティ、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモード、サイズ排除、または金属キレートクロマトグラフィーから選択してもよい。
【００５５】
例えば、イオン交換クロマトグラフィー工程を、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、溶液に対して実行してもよい。このアプローチの一例は、後述の本発明を実施するための形態において示す。発明者らは、例えばＰｏｒｏｓ（商標）ＸＱクロマトグラフィーマトリックスを用いる、（後述のような）陰イオン交換クロマトグラフィーは、特に、この工程に好適であることを明らかにした。
【００５６】
本発明は、典型的には、イオン交換クロマトグラフィーとして陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、負に荷電した分子が、正に荷電した固形支持体に引き寄せられる。正に荷電した固形支持体は、当業者に既知の任意の手段によって調製することができ、通常、正に荷電した機能的リガンドを固形支持体上へ共有結合させることが必要となる。好適な正に荷電した機能的リガンドは常に、溶液から分離したいポリペプチドによって決まる。好適な陰イオン交換樹脂の例には、機能的第四級アミン基（Ｑ）および／もしくは第三級アミン基（ＤＥＡＥ）、またはジエチルアミノプロピル基（ＡＮＸ）を含むものがある。市販の陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスとして、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＤＥＡＥセルロース、Ｐｏｒｏｓ（商標）ＰＩ２０、ＰＩ５０、ＨＱ１０、ＨＱ２０、ＨＱ５０、Ｄ５０、ＸＱ、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭｏｎｏＱ（商標）、ＭｉｎｉＱ（商標）、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｑおよび３０Ｑ、Ｑ、ＤＥＡＥならびにＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商標）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（商標）、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）、ならびにＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＷＰ  ＰＥＩ（商標）、ＷＰ  ＤＥＡＭ（商標）、ＷＰ  ＱＵＡＴ（商標）、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ（商標）ＤＥＡＥおよびＨｙｄｒｏｃｅｌｌ（商標）ＱＡ、ＢｉｏｒａｄからのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ＤＥＡＥ、ならびにＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（商標）Ｑ、ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（商標）ＤＥＡＥ、Ｑ  ＨｙｐｅｒＺ（商標）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（商標）ＭおよびＬＳ（商標）ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ（商標）ＬＳ  ＤＥＡＥ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ（商標）ＬＳ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ（商標）Ｍ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ（商標）Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ  Ａｎｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ、ならびにＤＯＷＥＸ（商標）ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ  Ｅ  ７７、弱塩基陰イオン、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｍｅ（商標）Ａ２００、Ａ５００、Ｑ５００、およびＱ８００、ＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ３  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＤＥＡＥ、およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＤＭＡＥ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、ＤＯＷＥＸ（商標）弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、Ｄｉａｉｏｎ（商標）弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、Ｄｕｏｌｉｔｅ（商標）、ＴｏｓｏｈからのＴＳＫ（商標）ｇｅｌ  ＱならびにＤＥＡＥ  ５Ｐおよび５ＰＷ−ＨＲ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、６５０Ｍ、および６５０Ｃ３、ＱＡＥ−２６−５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ−６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ならびにＷｈａｔｍａｎからのＱＡ５２（商標）、ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５１（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＤＥ５３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ（商標）Ｄ、およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ（商標）Ｑが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００５７】
必要に応じて、陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの代わりに、陰イオン交換クロマトグラフィー膜を使用することができる。市販の陰イオン交換膜としては、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＩｎｔｅｒｃｅｐｔ（商標）Ｑメンブレンが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００５８】
陰イオン交換クロマトグラフィーに代わる手段として、幾つかの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用することが可能な場合もある。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、正に荷電した分子は負に荷電した固形支持体に引き寄せられる。例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩、およびその他下記のような、陽イオン交換マトリックスを形成するのに好適な固相に結合された任意の負に荷電したリガンドを使用することができる。市販の陽イオン交換マトリックスとしては、例えば、スルホン酸塩をベースとする基（例えば、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭｏｎｏＳ（登録商標）、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｓおよび３０Ｓ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＳＰ−６５０ＳおよびＳＰ−６５０Ｍ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｓ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｓ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（登録商標）ＭおよびＬＳ  ＳＰ、ならびにＳｐｈｅｒｏｄｅｘ（登録商標）ＬＳ  ＳＰ）；スルホエチルをベースとする基（例えば、ＥＭＤ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＥ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＰＯＲＯＳ（登録商標）（Ｓ−１０およびＳ−２０））；スルホプロピルをベースとする基（例えば、ＴｏｓｏｈからのＴＳＫ  Ｇｅｌ（登録商標）ＳＰ  ５ＰＷおよびＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ−２０およびＨＳ  ５０）；スルホイソブチルをベースとする基（例えば、ＥＭＤ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３）；スルホキシエチルをベースとする基（例えば、ＷｈａｔｍａｎからのＳＥ５２、ＳＥ５３、およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ（商標）Ｓ）、カルボキシメチルをベースとする基（例えば、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＣＭ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ＣＭ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＬＳ  ＣＭ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｃ５００およびＣ２００、ＷｈａｔｍａｎからのＣＭ５２、ＣＭ３２、ＣＭ２３、およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ（商標）Ｃ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＣＭ−６５０Ｓ、ＣＭ−６５０Ｍ、およびＣＭ−６５０Ｃ）；スルホン酸およびカルボン酸をベースとする基（例えば、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（登録商標）Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｓｕｌｆｏｎ）；カルボン酸をベースとする基（例えば、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＷＰ  ＣＢＸ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ（登録商標）ＭＡＣ−３、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ、およびＤｉａｉｏｎ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ならびにＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−）；スルホン酸をベースとする基（例えば、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＳＰ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ａｃｉｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（登録商標）Ｓ、ＷＰ  Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓメンブレン、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ、およびＤｉａｉｏｎ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）；ならびにオルトリン酸をベースとする基（例えば、ＷｈａｔｍａｎからのＰＩ  １）を有するものが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００５９】
必要に応じて、陽イオン交換マトリックスの代わりに、陽イオン交換膜、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用することができる。
【００６０】
別法として、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、イムノアフィニティークロマトグラフィー工程を、溶液に対して実行してもよい。
【００６１】
イムノアフィニティークロマトグラフィーは、抗原−抗体相互作用の高い特異性を利用して、ポリペプチドを分離し、精製する。本発明におけるイムノアフィニティークロマトグラフィー工程は、典型的には、固形支持体上に固定化された抗体または抗体断片を必要とし、そこに組換えポリペプチドを含む溶液を通過させ、固定化された抗体に特異的なポリペプチドを捕捉するものである。非特異的タンパク質およびペプチドは洗い流され、次いで抗原が溶出される。他の実施形態において、例えば、組換えポリペプチドそれ自体が抗体である場合、当該抗体の特異的抗原をカラムにカップリングさせることができ、抗体の溶液をカラムに通す。
【００６２】
抗体（またはその他の実施形態においては抗原）を、アミンまたはスルフヒドリル残基を介して活性化された固形支持体への抗体または抗原の化学的カップリングを含む数多くの技術によって、固形支持体へ固定化することができる。様々な異なるカップリング化学反応を使用した、様々な市販の商用活性化アガロースがある。別の技術では、抗体を捕捉し、固定化する、プロテインＡまたはＧなどの抗体結合タンパク質で被覆された固形支持体を使用する。次いで、抗体は、化学的クロスリンカーの助剤を用いて共有結合により樹脂に連結される。
【００６３】
本発明において、イムノアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、宿主細胞タンパク質をさらに低減させることができる。この工程によって、多くの場合、ポリペプチドの良好な収率、例えば約６０〜９０％が維持される。該方法では、典型的には、イムノアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用する。カラムへの投入量は、例えばＵＶ吸収によって、溶液中の組換えポリペプチド濃度に基づき算出することができる。幾つかの実施形態において、溶液は、イムノアフィニティークロマトグラフィー工程の前に、例えば、エデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）またはクエン酸ナトリウムを添加して調整される。
【００６４】
別法として、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、アフィニティクロマトグラフィー工程を、溶液に対して実行してもよい。
【００６５】
アフィニティクロマトグラフィーは、固定化されたリガンドとその結合相手との間の特異的結合相互作用に基づく分離方法である。例としては、抗体／抗原、酵素／基質、および酵素／阻害剤相互作用が挙げられる。精製の程度は、相互作用の特異性に応じて高くなり得、その結果、アフィニティクロマトグラフィーが精製ストラテジーにおける唯一の工程であり得ることもある。
【００６６】
アフィニティクロマトグラフィーは、大まかに２つのアプローチに分けることができる。第１のアプローチは、結合部位として、目的のポリペプチド上のアミノ酸の天然構造または配列を使用する。アフィニティクロマトグラフィー物質の例としては、プロテインＡまたはタンパク質Ｇで誘導体化された物質が挙げられる。その他の選択肢には、ポリペプチドへ十分に強く結合できるようにさせ、アフィニティ樹脂において結合剤として作用し得る、特異的に開発された結合剤（ペプチド、修飾型ペプチド、核酸、合成化合物など）が含まれる。第２の方法は、目的のポリペプチド中へ操作された、通常「タグ」と呼ばれる特別なアミノ酸配列への結合を必要とするものである。多数の様々なタグが利用可能である。最も一般的に使用されるタンパク質タグのうちの２つは、ＩＭＡＣ樹脂に存在するようなある種の金属含有錯体に結合するポリヒスチジンタグ、およびＧＳＴ媒体
にみられるグルタチオンに結合するグルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列である。
【００６７】
アフィニティクロマトグラフィー物質の具体的な例としては、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（Ｍｅｒｃｋ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ、ＶＩＩＩ  Ｓｅｌｅｃｔ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｐｔｏ  Ｈｅｐａｒｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｔｏｓｏｈ）、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ、またはその他の  ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｂｌｕｅ  ＳＡ、およびＡｌｂｕｐｕｒｅ（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ）が挙げられる。さらに、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｍｅｒｃｋ、またはＡｖｉｔｉｄｅなどの会社による特注のアフィニティ樹脂を使用することができる。アフィニティクロマトグラフィー物質は、アフィニティクロマトグラフィーカラムの形態で用いてもよい。他の実施形態において、アフィニティクロマトグラフィー物質は、アフィニティクロマトグラフィー膜の形態で使用される。
【００６８】
アルキルグリコシド
「アルキルグリコシド」という用語は、当技術分野において既知であるように、本明細書において、何らかの疎水性アルキルへの結合によって連結されている任意の糖を概して指すために使用される。疎水性アルキル鎖と親水性サッカライドとの間の連結には、中でも特に、グリコシド、エステル、チオグリコシド、チオエステル、エーテル、アミド、もしくはウレイド結合または連結を挙げることができる。本発明における糖の典型的な選択肢としては、グルコース（グルコピラノシドとして）およびマルトースが挙げられる。疎水性アルキルの典型的な選択肢としては、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、およびｎ−ドテシル基が挙げられる。連結は、具体的には、グリコシド連結であり、特に、ベータグリコシド連結（例えば、ベータ−Ｄグリコシド連結）であり得る。発明者らは、具体的には、糖はグルコースであり、疎水性アルキルはｎ−オクチル基であり、連結はベータ−Ｄグリコシド結合であるアルキルグリコシドを使用した。発明者らが使用したその他の個々の組合せとしては、：グルコース、ｎ−デシル基、およびベータ−Ｄグリコシド結合；マルトース、ｎ−オクチル基、およびベータ−Ｄグリコシド結合；マルトース、ｎ−ドテシル基、およびベータ−Ｄグリコシド結合；グルコース、ｎ−ドテシル基、およびベータ−Ｄグリコシド結合；ならびにマルトース、ｎ−デシル基、およびベータ−Ｄグリコシド結合が含まれる。
【００６９】
本発明において使用することができるアルキルグリコシドの一般構造は、Ｒ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−Ｒ［式中、Ｒは、例えば、ＣＨ３、シクロへキシル（Ｃ６Ｈ１１）、または別のアルキル鎖、およびそれらの異性体であってもよく、ｘは、典型的には５から１３の間、特に７から１１の間であり、Ｒ１は、糖、典型的にはグルコースまたはマルトースである］である。好ましくは、本発明において使用されるアルキルグリコシドは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである（すなわち、Ｒ１はグルコース、ＲはＣＨ３であり、ｘは７である）。ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドは好都合な物理化学的および毒性学的特性を有する穏やかな界面活性剤であるため、発明者らは、これを好ましい選択肢であると考えている。発明者らが使用したその他のアルキルグリコシドには、ｎ−デシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（すなわち、Ｒ１はグルコースであり、ＲはＣＨ３であり、ｘは９である）、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−マルトシド（すなわち、Ｒ１はマルトースであり、ＲはＣＨ３であり、ｘは７である）、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−マルトシド（すなわち、Ｒ１はマルトースであり、ＲはＣＨ３であり、ｘは１１である）、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（すなわち、Ｒ１はグルコースであり、ＲはＣＨ３であり、ｘは１１である）、およびｎ−デシル−ベータ−Ｄ−マルトシド（すなわち、Ｒ１はマルトースであり、ＲはＣＨ３であり、ｘは９である）が含まれる。
【００７０】
例示的な代替アルキルグリコシドとしては、Ｒ１がグルコースであり、ＲがＣＨ３であり、ｘが：５（ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド）；６（ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）；または８（ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）であるものが挙げられる。グルコピラノシドは、グルコシドと呼ばれることもある。
【００７１】
例示的なアルキルグリコシドとして、Ｒ１がマルトースであり、ＲがＣＨ３であり、ｘが：５（ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド）；８（ｎ−ノニル−β−Ｄ−マルトシド）；１０（ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド）；１２（ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトシド）；１３（ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド）、または１５（ｎ−ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド）であるものがさらに挙げられる。マルトシドは、マルトピラノシドと呼ばれることもある。
【００７２】
例示的なアルキルグリコシドとして、Ｒ１がグルコースであり、ｘが３であり、Ｒがシクロへキシル（３−シクロへキシル−ｌ−プロピル−β−Ｄ−グルコシド）であるもの、およびＲ１がマルトースであり、ｘが４であり、Ｒがシクロへキシル（４−シクロへキシル−ｌ−ブチル−β−Ｄ−マルトシド）であるものがさらに挙げられる。
【００７３】
当業者であれば、これらのようなアルキルグリコシドの化学的合成によって、化合物は、完全に均質に調製されるのではなく、不均質な混合物として得られる可能性があることを理解するであろう。したがって、使用されている特定のアルキルグリコシドへの本明細書での言及は、少なくとも不均質な混合物の成分の大半は当該アルキルグリコシドであることを意味している。
【００７４】
組換えポリペプチドを含む溶液へのアルキルグリコシドの添加
組換えポリペプチドを含む溶液は、上記のようなアルキルグリコシドで処理される。特定の実施形態において、アルキルグリコシドは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。この処理は、該溶液を、所期の最終濃度の例えば１０倍のアルキルグリコシドの保存液と混合することによって簡便になし得る。溶媒／界面活性剤、例えばＴＮＢＰ／ＰＳ８０による処理とは異なり、アルキルグリコシドは、水溶液で用意することができ、追加の溶媒、特にＴＮＢＰのような有機溶媒は必要としない。アルキルグリコシドがｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである場合、２００から１０００ｍＭの間の濃度を有する保存液を使用するのが便利である。組換えポリペプチドを含む溶液がクロマトグラフィー工程からの溶出物であれば、必要に応じて、次いで、アルキルグリコシドの添加に先立ち、該溶液をさらに溶出緩衝液で希釈してもよい。
【００７５】
アルキルグリコシドの最終濃度は、典型的には、０．１から１０００ｍＭの間（例えば、１から５００ｍＭ、３から４００ｍＭ、５から２００ｍＭ、１０から１００ｍＭ、２０から９０ｍＭの間）である。ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの場合、最終濃度は、通常、約２５〜８０ｍＭである。当業者であれば、その他のアルキルグリコシドの好適な濃度を特定することができるはずである。最適濃度は、そのような濃度の範囲を試験することによって特定してもよい。発明者らは、特にウイルス不活化のためには、アルキルグリコシドの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える濃度が有効であることを明らかにした。典型的には、該濃度は、このＣＭＣの１．５、２、３、または４倍となる。
【００７６】
アルキルグリコシドの添加後、混合物を、好ましくはホモジナイズして、確実に十分に混合する。このホモジナイゼーションは、典型的には、２から１０分間行う。
【００７７】
混合物は、典型的には、濾過されるが（例えば、０．４５／０．２μｍフィルター孔径を使用して）、これは、アルキルグリコシド処理からウイルスを保護する可能性のある粒子を確実に除去するため、好都合である。発明者らは、この工程によって、ポリペプチドの良好な収率、例えば、約９０〜１００％が維持されることを明らかにした。
【００７８】
前述のように、混合物をインキュベートしてウイルスを不活化させてもよい。インキュベーションは、任意の好適な長さの時間、典型的には、効果的なウイルス低減を達成するのにかかるような長さの時間で行ってもよい。達成されたウイルス減少率（ｌｏｇ１０）は、例えば少なくとも４であり得る。典型的な実施形態において、インキュベーションは、１分から２４時間の間で、２分から１２時間の間で、好ましくは、１０分から５時間の間で行われ、通常、約３０分以上である。インキュベーションは室温で好都合に行われるが、より低い温度でも、例えば、≦２０℃、また４℃から１０℃の間でも良好な結果を得ることができる。タンパク質が温度に影響を受けやすいのであれば、これらのより低い温度は特に好都合である。組換えポリペプチドを変性させる可能性がある温度で混合物をインキュベートしないように注意すべきである（活性を保持したい場合）。インキュベーションの間、さらに撹拌する必要はないが、必要に応じて、これを行ってもよい。
【００７９】
インキュベーション後、溶液は、場合により、さらなる使用までの保管のために、例えば−２０℃未満に、またはより好ましくは−６５℃未満で凍結することができる。理想的には、組換えポリペプチドを保存するために、冷凍はできるだけ急速に行い、冷凍期間はできるだけ短くする。
【００８０】
組換えタンパク質を精製する工程
上記で論じたように、工程（ｉｉｉ）における組換えポリペプチドの精製は、典型的には、溶液に対するクロマトグラフィーの工程を実行することによって行われる。クロマトグラフィーは、任意の好適なクロマトグラフィー、例えば、イムノアフィニティー、アフィニティ、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモード、サイズ排除、または金属キレートクロマトグラフィーから選択してもよい。
【００８１】
クロマトグラフィーの工程は、特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーの工程であり得る。別法として、工程（ｉｉｉ）として実行することができるクロマトグラフィー工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程またはイオン交換クロマトグラフィー工程である。さらに、さらなる精製工程を、工程（ｉｉｉ）の後、方法に含めてもよい。例えば、１つまたはそれ以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を、方法に含めてもよい。一実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、例えば、工程（ｉｉｉ）がイムノアフィニティークロマトグラフィー工程である場合、工程（ｉｉｉ）の後に溶液に対して実行される。同様に、１つまたはそれ以上のイオン交換クロマトグラフィー工程を、方法に含めてもよい。典型的には、イオン交換クロマトグラフィー工程は、特に工程（ｉｉｉ）がイムノアフィニティーまたはアフィニティクロマトグラフィー工程である場合、工程（ｉｉｉ）の後に溶液に対して実行される。好ましい実施形態において、典型的には、（前述のように）イムノアフィニティークロマトグラフィー工程の後に、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程が続き、その次に、イオン交換クロマトグラフィー工程が続く。
【００８２】
工程のその他の順序もまた可能である。例えば、第１の実施形態において、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、陽イオン交換クロマトグラフィー工程が溶液に対して実行され、次いで、工程（ｉｉｉ）はイムノアフィニティークロマトグラフィー工程であり、この工程の後に疎水性相互作用クロマトグラフィー工程が続き、その次に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程が続く。第２の実施形態において、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、イムノアフィニティークロマトグラフィー工程が溶液に対して実行され、次いで、工程（ｉｉｉ）は陰イオン交換クロマトグラフィー工程であり、この工程の後に陽イオン交換クロマトグラフィー工程が続く。３番の実施形態において、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、イムノアフィニティークロマトグラフィー工程が溶液に対して実行され、次いで、工程（ｉｉｉ）は疎水性相互作用クロマトグラフィー工程であり、この工程の後に陰イオン交換クロマトグラフィー工程が続く。第４の実施形態において、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、陽イオン交換クロマトグラフィー工程が溶液に対して実行され、次いで、工程（ｉｉｉ）は疎水性相互作用クロマトグラフィー工程であり、この工程の後に陰イオン交換クロマトグラフィー工程が続く。その他の順序は、当業者には明らかであり、目的の組換えポリペプチドに応じて最適化することができる。イオン交換クロマトグラフィーの方法は上述している。本発明は、典型的には、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用するが（例えば、工程（ｉｉｉ）のために、および／または工程（ｉｉｉ）の後にイオン交換クロマトグラフィーが用いられる場合）、幾つかの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーが好適であることもある。陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する一例は、下記の本発明を実施するための形態において示す。発明者らは、工程（ｉｉｉ）の後の陰イオン交換クロマトグラフィーは、特に有効であることを明らかにした。
【００８３】
イムノアフィニティークロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィーの方法は、同様に上述している。マルチモード、サイズ、金属キレート、および疎水性相互作用クロマトグラフィーは、後述する。
【００８４】
工程ｉｉｉ）は、場合により、例えば、組換えポリペプチドを精製する工程の前に、該組換えポリペプチドを含む溶液を改変することを含んでいてもよい。改変は、溶液導電率を改変すること、および／または１つもしくはそれ以上の添加剤を含むことを必要とすることもある。添加剤は、例えばキレート剤、例えばＤＴＡであってもよい。改変は、溶液の希釈またはその他の調整を必要とすることもある。
【００８５】
マルチモードクロマトグラフィー
マルチモードまたは混合モードクロマトグラフィーは、相互作用の複数のモード：イオン交換、ヒドロキシアパタイト、アフィニティ、サイズ排除、および疎水性相互作用が可能なリガンドで機能化されている媒体支持体に基づくものである。これらの分離方法を組み合わせる能力によって、ポリペプチド精製方法における選択性が高められる。特に、ヒドロキシアパタイト（静電的およびカルシウム配位化合物）に基づく、または疎水性イオン交換リガンドに基づく、様々なクロマトグラフィー要素を合わせもつ混合モード媒体が多数市販されている。
【００８６】
マルチモードクロマトグラフィー物質の具体的な例としては、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  Ｉｍｐ  Ｒｅｓ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＡｃｔ、およびＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから）；Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＮＨ２−７５０Ｆ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）；Ｎｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅ（ＢｉｏＲａｄ）、ならびにＨＥＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＣＭＭ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｐａｌｌ）が挙げられる。
【００８７】
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ゲルに通す濾過によって、分子の大きさに基づきそれらを分離するものである。ゲルは、特定の粒径分布を含有する球状のビーズからなる。分離は、異なる大きさの分子がマトリックス内で選択されるかまたは細孔から排除されて起こる。低分子は細孔の中へ拡散し、カラムを通過するそれらの流れは大きさに基づき遅くなり、一方、大分子は、細孔に入り込むことなくカラムの空隙容量に溶出される。その結果、分子は、カラムを通過しながらそれらの大きさに基づいて分かれ、分子量が徐々に低くなる順で溶出される。
【００８８】
操作条件およびゲルの選択は、用途および所望の分離度によって決まる。ＳＥＣによって行われる一般的な２種類の分離法は、分画および脱塩（または緩衝液交換）である。分画は、ゲルマトリックス内において異なる分子量の分子を分離することを必要とする。ゲルの分画範囲は、目的の分子を包含するように選択する。脱塩は、試料を脱塩するためにＳＥＣの使用を必要とする。目的の分子は空隙容量に溶出され、一方、より小さい分子はゲル細孔に保持される。所望の分離を得るためには、ゲルは、目的の分子より著しく小さい排除限界を有するべきである。
【００８９】
サイズ排除クロマトグラフィー物質の具体的な例としては、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐポリアクリルアミド媒体が挙げられる。
【００９０】
金属キレートクロマトグラフィー
金属キレートクロマトグラフィーは、ヒスチジンタグ付きタンパク質の精製に有効であり、また、その他の露出したヒスチジン、システイン、およびトリプトファン残基を有するタンパク質を精製するためにも使用することができる。固定化アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂が、ポリペプチドを精製するために使用される。Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、またはＦｅ３＋のような使用する金属イオンによって高い選択的親和性を達成することができる。標的ポリペプチドの樹脂への結合強度は、主として使用する金属イオンおよび緩衝液のｐＨによって影響を受ける。結合したタンパク質は、イミダゾールによる競合溶出、またはｐＨを下げることによって溶出することができる。
【００９１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、一般的に、タンパク質凝集物およびその他の方法関連不純物を除去するために実行される。該分離法を実行する場合、例えばバッチ精製技術またはカラムを使用して、試料混合物をＨＩＣ物質と接触させる。ＨＩＣ精製に先立ち、例えば混合物をプレカラムに通すことによって、カオトロピック剤またはきわめて疎水性の物質を除去することが望ましい場合もある。
【００９２】
例えば、バッチ精製の関連において、ＨＩＣ物質は、望ましい平衡化緩衝液中で調製されるか、または望ましい平衡化緩衝液に対して平衡化される。ＨＩＣ物質のスラリーが得られる。組換えポリペプチドを含む溶液を該スラリーと接触させて、分離したいポリペプチドをＨＩＣ物質に吸着させる。例えばスラリーを沈殿させ、上清を取り除くことによって、ＨＩＣ物質に結合しない不純物を含む溶液をスラリーから分離する。スラリーは、１つまたはそれ以上の洗浄ステップにかけることができる。必要に応じて、スラリーをより低い導電率の溶液と接触させて、ＨＩＣ物質に結合したポリペプチドを脱着させることができる。結合したポリペプチドを溶出するために、塩濃度を低下することができる。
【００９３】
イオン交換クロマトグラフィーがポリペプチドの電荷に頼ってポリペプチドを分離するのに対し、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ポリペプチドの疎水性特性を利用する。ポリペプチド上の疎水基が、カラム上の疎水基と相互作用する。疎水性が大きいポリペプチドほど、カラムと強く相互作用することになる。このように、ＨＩＣ工程によって、例えば宿主細胞由来不純物、および場合により生成物関連不純物が除去される。
【００９４】
ＨＩＣカラムへのポリペプチドの吸着は、高い塩濃度によって容易となるが、実際の濃度は、ポリペプチドおよび選択された特定のＨＩＣリガンドの性質に応じて広範囲にわたり様々であり得る。ＨＩＣカラムは、通常、疎水性リガンド（例えば、アルキルまたはアリール基）が結合されているベースマトリックス（例えば、架橋アガロースまたは合成共重合体物質）を含む。好適なＨＩＣカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム）を含む。多くのＨＩＣカラムが市販されている。例としては、低または高置換のＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムまたはＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗもしくはＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＰｒｏｐｙｌまたはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ＭｅｔｈｙｌまたはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＷＰ  Ｈｌ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、フェニル、またはブチルカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、ＰＡ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００９５】
ＨＩＣを使用する一例は、下後述の本発明を実施するための形態において示す。発明者らは、工程（ｉｉｉ）の後の、例えばＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＨＩＣクロマトグラフィーは、特に有効であることを明らかにした。
【００９６】
組換えポリペプチドを含む溶液のさらなる処理
溶液を、工程（ｉｉｉ）の後のさらなる処理および上述のような任意の追加の精製工程にかけてもよい。
【００９７】
例えば、ウイルス濾過の工程を実行してもよい。本発明のある態様において、前工程からの組換えポリペプチドを含む溶液は、無傷のウイルスを含むウイルス粒子が存在する場合、その除去のための濾過にかけられる。好適なフィルターの非限定的な例としては、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルター、またはＡｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＬｔｄからのＰｌａｎｏｖａ  ２０Ｎフィルターがある。その他のウイルス用フィルターが、この濾過工程において用いることができ、当業者には公知である。ある実施形態において、濾過処理の後、フィルターハウジングに保持された組換えポリペプチドを除去するために、例えば前工程で使用した溶出緩衝液を用いてフィルターを洗浄する。
【００９８】
限外濾過および／またはダイアフィルトレーションのうちの１つまたはそれ以上の工程もまた、組換えポリペプチドを精製するのに使用してもよい。これらの工程によって、組換えポリペプチドを濃縮し、かつ／またはその緩衝液を交換することができる。典型的には、１つまたはそれ以上の限外濾過および／またはダイアフィルトレーション工程は、上記のウイルス濾過工程の後に実行される。
【００９９】
限外濾過は、参考文献８および９に詳述されている。１つの濾過方法は、参考文献１０に記載されているようなタンジェンシャルフロー濾過である。限外濾過は、一般的に、０．１μｍ未満の孔径を有するフィルターを使用する濾過を意味すると考えられている。そのような小さい孔径を有するフィルターを使用することによって、フィルターを通過する試料緩衝液が浸透することよって試料の体積は減少するが、組換えポリペプチドはフィルターに保持される。
【０１００】
ダイアフィルトレーションは、塩、糖、および非水溶媒を除去し、交換するために、結合種から遊離物を分離するために、低分子量物質を除去するために、かつ／またはイオンおよび／もしくはｐＨ環境の急速な変化を引き起こすために、限外濾過膜を使用する方法である。微小溶質（Ｍｉｃｒｏｓｏｌｕｔｅ）は、限外濾過されている溶液に、限外濾過速度とほぼ等しい速度で溶媒を加えることによって、最も効率的に除去される。これによって、一定の体積で溶液から微細種を洗い流し、保持されたポリペプチドを効果的に精製する。本発明のある実施形態において、ダイアフィルトレーション工程は、組換えポリペプチドから不純物を除去するためだけでなく、場合により、さらなる精製工程の前に、本発明の方法に関連して使用される様々な緩衝液を交換するために用いられる。
【０１０１】
医薬組成物および方法
本発明の医薬組成物は、精製された本発明の組換えポリペプチドを、当技術分野において一般的に使用される任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（これらすべては本明細書において「担体」と呼ぶ）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、およびその他の多種多様な添加剤と混合することによって、凍結乾燥した調合物または水溶液として保管用に調製することができる（参考文献１１を参照されたい）。そのような添加剤は、用いる用量および濃度でにおいて、レシピエントに対して非毒性でなければならない。
【０１０２】
本発明の医薬組成物はまた、本発明の精製された組換えポリペプチドに加えて、第２の治療薬も含有することができる。
【０１０３】
該組成物は、様々な剤形で調製してもよい。例えば、該組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製してもよい。注射に先立ち液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適した固形剤を調製することもできる。該組成物は、例えば軟膏、クリーム、または散剤として、局所投与用に調製してもよい。該組成物は、例えば錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤として（場合により味を付けて）、経口投与用に調製してもよい。該組成物は、例えば、細粉または噴霧剤を使用して吸入剤として、経肺投与用に調製してもよい。該組成物は、座薬またはペッサリーとして調製してもよい。該組成物は、例えば点滴剤として、噴霧剤として、または散剤として、経鼻、経耳、または目への投与用に調製してもよい［例えば、１２］。
【０１０４】
医薬組成物は、典型的には、無菌である。好ましくは、パイロジェンフリーである。
【０１０５】
多くの実施形態において、該組成物は、例えばｐＨ６からｐＨ８の間、一般的には約ｐＨ７で緩衝化される。該組成物は、水性であってもよく、または凍結乾燥されていてもよい。
【０１０６】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する送達機器を提供する。該機器は、例えば、シリンジまたは吸入器であってもよい。
【０１０７】
調剤化してしまえば、本発明の組成物は、対象に直接投与することができる。処置されるべき対象は、動物であり得、特に、ヒト対象を処置することができる。
【０１０８】
概括
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなっていてもよく、または例えばＸ＋Ｙのように、さらに何かを含んでいてもよい。
【０１０９】
数値ｘに関して「約」という用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１１０】
「実質的に」という単語は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まない場合もある。必要ならば、「実質的に」という単語は、本発明の定義から省いてもよい。
【０１１１】
本発明が複数の連続する工程を含む方法を提供する場合、工程は、示した順、すなわち、番号順またはアルファベット順で行われる。ただし、当業者であれば、工程の順序は変更できる一方で、なお有効な結果が得られることを理解するであろう。本発明はまた、総数がより少ない工程を含む方法も提供し得る。例えば、組換えタンパク質を含む溶液が、該溶液に対してイオン交換クロマトグラフィーの工程を実行することによって既に精製されていれば、この工程は、本発明の方法から省くことができる。同様に、組換えポリペプチドを含む溶液へアルキルグリコシドを添加する工程を行って工程（ｉｉｉ）用に準備された物質を得ることができるが、工程（ｉｉｉ）を実行する必要はない。前処置された物質は、次の精製のための中間生成物として有用であり、後の使用のために、例えば、一般にイムノアフィニティークロマトグラフィーまたはクロマトグラフィーのために使用し、保管し、運び出すことなどができるため、本発明の範囲内となるために工程（ｉｉｉ）を実行する必要があるわけではない。これらの様々な工程は、様々な場所で（例えば様々な国で）、様々な人によって、様々な回数で実行することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ＯＧ／ＴＮＢＰによるＭｕＬＶ不活化およびＯＧのみによるＭｕＬＶ不活化を示す図である：白三角は、撹拌下で２１℃での２００ｍＭ  ＯＧ＋０．３％ＴＮＢＰを含む４．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＭｕＬＶ不活化を示し、白四角は、撹拌なしで６℃での２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＭｕＬＶ不活化を示す。
【図２】ＯＧ／ＴＮＢＰによるＢＶＤＶ不活化およびＯＧのみによるＢＶＤＶ不活化を示す図である：白三角は、撹拌下で２１℃での２００ｍＭ  ＯＧ＋０．３％ＴＮＢＰを含む４．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＢＶＤＶ不活化を示し、白四角は、撹拌なしで６℃での２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＢＶＤＶ不活化を示す。
【図３】ＯＧ／ＴＮＢＰによるＰＲＶ不活化およびＯＧのみによるＰＲＶ不活化を示す図である：白三角は、撹拌して２１℃での２００ｍＭ  ＯＧ＋０．３％ＴＮＢＰを含む４．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白四角は、撹拌なしで６℃での２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示す。
【図４】撹拌してまたは撹拌なしのいずれかでの６℃でのＯＧによるＰＲＶ不活化を示す図である：白三角は、撹拌下で６℃での２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白四角は、撹拌なしで６℃での２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白菱形は、撹拌なしで６℃での２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示す。
【図５】撹拌して５〜６℃での様々な濃度のＯＧによるＰＲＶ不活化を示す図である：白四角は、撹拌下で５〜６℃での１５ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白菱形は、撹拌下で５〜６℃での２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白三角は、撹拌下で５〜６℃での３０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示す。
【図６】１８〜１９℃での様々な濃度のＯＧによるＰＲＶ不活化を示す図である：白三角は、撹拌下で２１．５℃での１０ｍＭ  ＯＧを含む４．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白四角は、撹拌下で１８℃での２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白菱形は、撹拌下で１８℃での３０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白丸は、撹拌下で１８℃での４０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、黒菱形は、撹拌下で１９℃での６０ｍＭ  ＯＧを含む１３．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、黒三角は、撹拌下、１８℃での、７日間暗所で保管した２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、黒四角は、撹拌下、１８℃での、７日間明所で保管した２０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、黒丸は、撹拌下、１８℃での、７日間暗所で保管した１０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示す。
【図７】１８または５〜６℃での同じｍＭ濃度のＯＧによるＰＲＶ不活化を示す図である：白三角は、撹拌下で１８℃での３０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白四角は、撹拌下で５〜６℃での３０ｍＭ  ＯＧを含む８．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示す。
【図８】様々なアルキルグリコシドのＰＲＶ不活化能を示す図である：白四角は、６０ｍＭ  ＯＧの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰ中でのＰＲＶ不活化を示し、白三角は、６０ｍＭ  ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシドの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白菱形は、６０ｍＭ  ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、黒四角は、６０ｍＭ  ｎ−ドテシル−β−Ｄ−マルトシドの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、黒三角は、６０ｍＭ  ｎ−ドテシル−β−Ｄ−グルコピラノシドの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、黒菱形は、６０ｍＭ  ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシドの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示す。
【図９】より低い濃度（それらのＣＭＣ値の約２倍）のｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、およびｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドのＰＲＶ不活化能を示す図である：白三角は、５ｍＭ  ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白四角は、４０ｍＭ  ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示し、白菱形は、５ｍＭ  ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシドの１１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおけるＰＲＶ不活化を示す。
【図１０】ａ）ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＧ）、ポリソルベート８０、およびリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＰＳ８０／ＴＮＢＰ）、または緩衝液対照による処理後、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって得られた、アルブミン融合タンパク質（ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ）の試料中の残留宿主細胞タンパク質濃度を比較する図；ならびにｂ）ＰＳ８０／ＴＮＢＰ（白のバー）または緩衝液対照（斜線のバー）処理と比較した、ＯＧまたはＤＧを工程ｉｉ）で使用した場合の宿主細胞タンパク質排除の相対的な改善（ＨＣＰ排除の改善倍率）を示す図である。
【図１１】ａ）ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）、ポリソルベート８０、およびリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＰＳ８０／ＴＮＢＰ）、または緩衝液対照による処理後、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって得られた、アルブミン融合タンパク質（ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ）の試料における残留宿主細胞ＤＮＡ濃度を比較する図；ならびにｂ）ＰＳ８０／ＴＮＢＰ（透明なバー）または緩衝液対照（縞のバー）処理と比較した、ＯＧを使用した場合の宿主細胞ＤＮＡ排除の相対的な改善（宿主細胞ＤＮＡ排除の改善倍率）を示す図である。
【図１２】ＯＧと比較した、ＳＤ処理によるＶＳＶ不活化を示す図である：黒三角は、２４．５℃での１０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおける４０ｍＭ  ＯＧによるＶＳＶ不活化を示し、白四角は、２６．５℃での１０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおける１％ＰＳ８０＋０．３％ＴＮＢＰによるＶＳＶ不活化を示す。
【図１３】ＯＧと比較した、ＳＤ処理によるワクシニアウイルス不活化を示す図である：黒三角は、２４．５℃での１０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおける４０ｍＭ  ＯＧによるワクシニアウイルス不活化を示し、白四角は、２６．５℃での１０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰにおける１％ＰＳ８０＋０．３％ＴＮＢＰによるワクシニアウイルス不活化を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１１３】
ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドと、溶媒／界面活性剤混合物、および対照としての緩衝液との比較
概要
組換えＤ’Ｄ３−ＦＰ（参考文献７）の、ポリソルベート８０とリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＰＳ８０／ＴＮＢＰ）との典型的な溶媒／界面活性剤混合物による処理を、アルキルグリコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）による処理と比較した。初期実験で、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰは、アルキルグリコシドによる処理に対して依然として安定していることが示された。さらに重要なことには、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）の非存在下でも、アルキルグリコシドによって、３つのモデルウイルスの迅速な不活化が観察された。ウイルス不活化は、撹拌してまたはせずに、５℃という低い温度で、１時間以内に完了した。この効率的な手順では、効率的なウイルス不活化をもたらす予想外に広範囲のプロセスパラメーターを用いることができた（ＯＧのために試験した範囲は、４〜２５℃、３０分以内（典型的には、１２０分間追跡した）、２０ｍＭ以上の濃度であった）。予想外に、その次のクロマトグラフィー精製工程の供給流中にアルキルグリコシドが存在することによって、溶出段階において、ＰＳ８０／ＴＮＢＰまたは対照緩衝液の使用と比較して有意に低い宿主細胞ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質レベルが得られた。
【０１１４】
方法および結果
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰは、組換えＤＮＡ技術によって生成したフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）タンパク質のＦＶＩＩＩ結合部位を含有する。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ  ｃＤＮＡ配列を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へトランスフェクトし、ポリペプチドを発現させ、記載した調査を行った。様々な代表的なウイルスモデルを用いてアルキルグリコシド工程のウイルス不活化能を評価する実験室での研究を行った。関連のウイルスとしてのレトロウイルスＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）の使用は、ＣＨＯ細胞が内在性レトロウイルス様粒子を含有することが知られているため、特にＣＨＯ細胞由来生成物に関連したものである。一般的にＳ／Ｄ処理に対してより安定なフラビウイルスＢＶＤＶ（ウシウイルス性下痢症ウイルス）およびヘルペスウイルスＰＲＶ（仮性狂犬病ウイルス）を、アルキルグリコシド処理の広範なウイルス不活化能を実証するウイルス評価研究において使用した。
【０１１５】
検討したすべての試料のウイルス力価は、試料を生成した後、直ちに終末点希釈法を用いて測定し、参考文献１３に示されているようなスピアマン−ケルバー法によって算出した。
【０１１６】
これらのＯＧ研究では、ウイルス不活化に関する曝露条件を試験するために、２つのプロセス制御パラメーター：１）２０ｍＭのＯＧ界面活性剤濃度；および２）６℃±１℃の温度を選択した。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ中間産物の試料（約１４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）を適切に希釈し、または未希釈で使用し、検討するウイルスを注入して、所望の界面活性剤濃度を得た。
【０１１７】
界面活性剤の添加前（無処理）、および界面活性剤の添加後の様々な時点で、試料を採取した。試料は、反応を止め、ウイルス測定で試料を非毒性するために細胞培養培地で１：１００に希釈することによって、直ちに測定した。
【０１１８】
以下の減少率が得られた（すべてのウイルスについて、本試験システムによってのみ、特に検出限界および使用したウイルス注入量によってのみ限定されたものである）：
【０１１９】
【表１】
2021506875.tif 000002
【０１２０】
図１〜３（それぞれ、表２〜４）におけるウイルス保持対照の結果は、インキュベーション期間を通して、ウイルス安定性試料で有意な減少がなかったことを示しており、これは、示された減少は、アルキルグリコシド界面活性剤処理の作用によることを裏づけるものである。さらに、これらの図から、ウイルス不活化が非常に迅速であったことが実証され、すべての場合において、４ｌｏｇを超えたウイルス不活化が観察された。２０ｍＭのＯＧ界面活性剤濃度によって、ＭｕＬＶおよびＢＶＤＶは、６℃±１℃の温度で、最初の調査時点である１５分までに完全に不活化されたのに対し、ＰＲＶの完全な不活化には、６０分かかった。
【０１２１】
【表２】
2021506875.tif 000003
【０１２２】
【表３】
2021506875.tif 000004
【０１２３】
【表４】
2021506875.tif 000005
【０１２４】
より耐性のあるエンベロープウイルスであるＰＲＶを用いたさらなるロバスト性研究で、以下のパラメーターが検討された：
・タンパク質濃度の変化は、ＰＲＶ不活化に影響しなかった（図３、表４）。
・６℃での２０ｍＭ  ＯＧインキュベーション中の撹拌によって、ＰＲＶ不活化は若干速まった（図４、表５）。それにもかかわらず、ＰＲＶは、ＯＧインキュベーション中、全く撹拌しない２０ｍＭ  ＯＧ処理によって、完全に確実に不活化された。
・６℃でＯＧ濃度を１５ｍＭ（ＣＭＣ以下）まで下げることによって、有意なＰＲＶ不活化は得られなかった（図５、表６）。
・同様の観察を、２１℃で１０ｍＭ  ＯＧで行った（図６、表７）。ＯＧ濃度を３０ｍＭ以上に上げることによって、ＰＲＶ不活化は速まった。さらに、ＯＧ保存液を７日間（暗所で）保管することによる不活化能への影響はなかった。
・３０ｍＭ  ＯＧでは、インキュベーション温度を６℃から１８℃に上げた場合、ＰＲＶ不活化は速まらなかった（図７、表８）。この他の数種の６０ｍＭのアルキルグリコシドによって、ＰＲＶはきわめて速く完全に不活化された（図８、表９）。特に、低量のアルキルグリコシド（ＣＭＣの約２倍）によって、ＰＲＶはきわめて速く完全に不活化された（図９、表１０ａ）。
【０１２５】
【表５】
2021506875.tif 000006
【０１２６】
【表６】
2021506875.tif 000007
【０１２７】
【表７】
2021506875.tif 000008
【０１２８】
【表８】
2021506875.tif 000009
【０１２９】
【表９】
2021506875.tif 000010
【０１３０】
【表１０】
2021506875.tif 000011
【０１３１】
評価したすべてのロバスト性条件下で、ウイルス不活化の速度論は、標準条件と同様であった。全体として、ＯＧ処理工程は、効果的でロバストなものであることと、特に関連のレトロウイルスＭｕＬＶを含むエンベロープウイルスを不活化する高い能力を有することとが明らかにされた。またその他のアルキルグリコシドについても、関連のウイルスを効果的に不活化するそれらの能力を明らかにすることができた。
【０１３２】
さらに、ＳＤ不活化に対して最も耐性のあるエンベロープウイルスであるワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）［１４］、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いたロバスト性研究を行った。ＶＳＶについて図１２（表１０ｂ）に示した結果およびＶＡＣＶについて図１３（表１０ｃ）に示した結果は、ＯＧによるウイルス不活化が、ＳＤ（１％ＰＳ８０＋０．３％ＴＮＢＰ）と比較してはるかに速いことを実証した。４時間の期間を通して、特にＯＧだけがきわめて速くＶＡＣＶを完全に不活化し、ＳＤは効果的にＶＡＣＶを不活化することができなかった（図１３）。
【０１３３】
【表１１】
2021506875.tif 000012
【０１３４】
【表１２】
2021506875.tif 000013
【０１３５】
結論
観察された迅速な不活化速度論から、ＯＧおよびその他のアルキル−グリコシドが、効果的に確実にエンベロープウイルスを不活化することが示された。
【０１３６】
イムノアフィニティークロマトグラフィー（ＩＡＣ）実験
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰは、ＩＡＣ樹脂にかける前に、ＯＧまたはＰＳ８０／ＴＮＢＰで処理した。この目的のために、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ試料を、ＯＧ保存液（６００ｍＭ）で希釈して、６０ｍＭ  ＯＧを含むウイルス不活化溶液を作出した。対照実験では、ＰＳ８０／ＴＮＢＰ保存液（３％ＰＳ８０／０．９％ＴＮＢＰ）を添加して、１％ＰＳ８０、０．３％ＴＮＢＰの最終濃度とした。次いで、溶液を濾過し、室温で２時間インキュベートした。その後、表１１に従ってＩＡＣ実験を行った。クロマトグラフィーについては、イムノアフィニティー樹脂ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトアルブミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。使用したクロマトグラフィー装置は、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。
【０１３７】
【表１３】
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【０１３８】
ＰＳ８０／ＴＮＢＰ処理によって、前溶出（工程５）画分中で６０％のｒＤ’Ｄ３−ＦＰが有意に損失し、溶出画分中に４０％のｒＤ’Ｄ３−ＦＰしか認められなかった。対照的に、ＯＧ処理では、はるかに高い収率が得られ、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰの８３％が溶出画分に存在した。溶出画分における宿主細胞ＤＮＡ排除（１８０ｐｇ／ｍＬ）は、ＯＧによる精製工程を経ることにより１７００倍となった。より高い濃度の宿主細胞ＤＮＡを含む様々な供給原料のｒＤ’Ｄ３−ＦＰロットをＯＧと共にインキュベートしたこの他の実施例において、イムノアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出物中の宿主細胞ＤＮＡ含量は、同等であり、約２５，０００の精製倍率となった。ＰＳ８０／ＴＮＢＰ処理と比較して、ＯＧ処理では、７．４倍優れた宿主細胞ＤＮＡ排除が得られた。ＯＧ処理された試料について、この工程を経ることによる、正規化した宿主細胞タンパク質排除は１２７０倍であり、溶出物において１１７ｐｐｍとなった（ＰＳ８０／ＴＮＢＰ処理と比較して１．９倍良い）。界面活性剤または溶媒／界面活性剤処理後、溶出画分間での同じｒＤ’Ｄ３−ＦＰ濃度でのより良好な比較可能性を実現するために、実験の第２の設定では、供給物質をＰＳ８０／ＴＮＢＰ処理した場合において、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰを２画分へ分割されることを避けるために、工程５（表１１）をプロトコールから省略した。
【０１３９】
イムノアフィニティークロマトグラフィー（ＩＡＣ）実験（前溶出工程５を含まない）
ｒＤ’Ｄ３−ＦＰを、６０ｍＭ  ＯＧもしくは表１２に明記したようなその他のアルキルグリコシド、１％ＰＳ  ８０、０．３％ＴＮＢＰ、または緩衝液対照（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４）で処理した。次いで、溶液を濾過し、室温で２時間インキュベートした。
【０１４０】
【表１４】
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【０１４１】
インキュベーションの２時間後、ウイルスが不活化された試料を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトアルブミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムにかけた。使用したクロマトグラフィー装置は、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。クロマトグラフィープロトコールは、表１１に記載しており、工程５は、実験のこの設定では、ＰＳ８０／ＴＮＢＰ処理画分における収率損失を回避するために省略した。
【０１４２】
すべての処理選択肢で、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ  ＤＮＡ）およびタンパク質（ＨＣＰ）を分析した溶出画分において、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰの同等の収率およびタンパク質濃度が得られた（表１３、図１０ａおよび１１ａ）。
【０１４３】
【表１５】
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【０１４４】
宿主細胞ＤＮＡについての結果は、６０ｍＭ  ＯＧを使用した場合を除く試料はすべて、緩衝液対照と比較して同等かまたはわずかに悪いものであった。６０ｍＭ  ＯＧの使用によって、緩衝液対照の１２６分の１およびＰＳ８０／ＴＮＢＰ対照の２１４分の１である著しく低い宿主細胞ＤＮＡ含量の溶出試料が得られた（図１１ｂ）。この具体例では、宿主細胞ＤＮＡは、約２０００分の１まで除去された（タンパク質含量に対して正規化したＤＮＡレベル）。
【０１４５】
同様に、緩衝液対照処理と比較して、ＯＧ処理では、宿主細胞タンパク質のレベルで３．５倍優れた低減がもたらされた。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰ含量に対して正規化したところ、精製工程を経ることによりＨＣＰは７２５分の１に低減していた。ＰＳ８０／ＴＮＢＰを使用した場合、ＯＧと比較して、ＨＣＰ排除は３２％低下した（表１３、図１０ｂ）。その他の試験したアルキルグリコシドの中では、６０ｍＭのＤＧおよびＯＭだけが、緩衝液対照と比較してＨＣＰ排除を改善した。ＯＭでは効果は小さかったのに対し（１．７倍）、ＤＧでは、１４．６倍の改善がみられた。５ｍＭ  ＤＧでは、溶出物中のＨＣＰ含量が緩衝液対照と同等であったため、この効果は強く濃度依存性であった。
【０１４６】
まとめると、次のクロマトグラフィー工程に先立ち、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰをＯＧとインキュベーションすることによって、緩衝液またはＰＳ８０／ＴＮＢＰ対照と比較して、宿主細胞ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質に関して有意により純粋な溶出試料が得られる。ＯＧ処理はまた、ＰＳ８０／ＴＮＢＰ処理では有意な損失をもたらした追加の洗浄工程の使用も可能にする（表１、工程５）。
【実施例２】
【０１４７】
様々なアルキルグリコシドのウイルス不活化能
概要
実施例１に記載した実験室研究と同様の研究をさらに行って、ＯＧに加えて、アルキルグリコシドのウイルス不活化能を評価した。ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドテシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、およびｎ−デシル−ベータ−Ｄ−マルトシドは、すべて、効果的であり（図８）、より低い濃度でも（それらのＣＭＣ値の約２倍、図９）効果的であることが認められた。
【０１４８】
本発明は実施例によってのみ説明されているが、本発明の範囲および趣旨において変更を行うことができることが理解されるであろう。
【実施例３】
【０１４９】
ＯＧを含有する洗浄工程の使用による、プロセス関連不純物の低減
概要
さらなる研究を行って、クロマトグラフィー装置において洗浄剤としてアルキルグリコシドを使用することを評価し、プロセス関連不純物、特にタンパク質不純物の排除への効果を検討した。本実施例では、バイオリアクタープロセスから回収したｒＤ’Ｄ３−ＦＰの細胞フリーの物質を、陰イオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ＸＱ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にかけた。ｒＤ’Ｄ３−ＦＰは、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）プロペプチドと一緒に発現される。このフォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）プロペプチドは、細胞中で切り離されるがｒＤ’Ｄ３−ＦＰと共に細胞上清へ分泌されるため、産物と同等のレベルで存在する。よって、このタンパク質不純物のレベルを低減することが重要である。クロマトグラフィープロトコールを改変し、ＯＧを洗浄緩衝液のうちの１つに添加した。
【０１５０】
方法および結果
陰イオン交換クロマトグラフィーの精製の詳細は、表１４でみることができる。２つの実験を行った。選択１では、工程５（洗浄工程２）をＯＧなしで実行し、選択２では、６０ｍＭ  ＯＧを洗浄緩衝液中に追加的に含めた。
【０１５１】
【表１６】
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【０１５２】
洗浄工程におけるＯＧの添加によって、主要なタンパク質不純物であるＶＷＦプロペプチドの含量は有意に低減した（表１５を参照されたい）。
【０１５３】
【表１７】
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【０１５４】
ＯＧを添加しなかった場合、ＶＷＦプロペプチドは、ｒＤ’Ｄ３−ＦＰから全く分離しなかった。６０ｍＭ  ＯＧを洗浄工程２へ添加した場合、溶出物中のＶＷＦプロペプチド濃度は、ほぼ１５０分の１に低減した。洗浄工程２におけるＯＧの存在は、これらの実験における唯一の変動要素であるため、タンパク質不純物排除の改善は、これに起因すると考えることができる。
【０１５５】
参考文献
[１] WHO Technical Report, Annex 4 Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products Series No. 924, p 151- 224, (2004).
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[３] Lebing et al. (2003) Vox Sang. 84(3):193-201.
[４] Johnston et al. (2003) Biologicals. 31(3):213-21).
[５] Bosley et al. (2008) Proteomics Clin Appl. 2(6):904-7.
[６] WO 2015/073633
[７] WO 2016/188907
[８] Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996).
[９] Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9).
[１０] Millipore catalogue entitled "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96).
[１１] Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980).
[１２] Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:455-467.
[１３] Groener et al. (2012) Transfusion 52: 2104-2112
[１４] Roberts (2000) Biologicals 28: 29-32.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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