(57)【要約】本発明は、抗カンナビジオール抗体、およびこれらの抗体を生理活性カンナビジオールの検出および定量のために使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
2021506273.tif 000015
の構造を有するカンナビジオールに結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
式I（2-(6-イソプロペニル-3-メチル-2-シクロヘキセン-1-イル)-5-ペンチル-1,3-ベンゼンジオール）のΔ2-異性体に結合する、請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体がIgG抗体である、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記その結合断片が、単一重鎖可変（VH）ドメイン、単一軽鎖可変（VL）ドメイン、およびFab断片からなる群より選択される、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体が単鎖抗体を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体が重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1と比較して1または2個のアミノ酸残基改変を含有するSEQ ID NO:1の改変アミノ酸配列を含む、相補性決定領域1（H-CDR1）；
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2と比較して1、2、3、または4個のアミノ酸残基改変を含有するSEQ ID NO:2の改変アミノ酸配列を含む、相補性決定領域2（H-CDR2）；および
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:3と比較して1、2、または3個のアミノ酸残基改変を含有するSEQ ID NO:3の改変アミノ酸配列を含む、相補性決定領域3（H-CDR3）
を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）を含む、請求項7記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記VHがSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、請求項8記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体が軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4と比較して1または2個のアミノ酸残基改変を含有するSEQ ID NO:4の改変アミノ酸配列を含む、相補性決定領域1（L-CDR1）；
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:5と比較して1または2個のアミノ酸残基改変を含有するSEQ ID NO:5の改変アミノ酸配列を含む、相補性決定領域2（L-CDR2）；および
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:6と比較して1、2、または3個のアミノ酸残基改変を含むSEQ ID NO:6の改変アミノ酸配列を含む、相補性決定領域3（L-CDR3）
を含有する、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む、請求項10記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記VLがSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む、請求項11記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体が
SEQ ID NO:1のH-CDR1、SEQ ID NO:2のH-CDR2、およびSEQ ID NO:3のH-CDR3を含むVH；および
SEQ ID NO:4のL-CDR1、SEQ ID NO:5のL-CDR2、およびSEQ ID NO:6のL-CDR3を含むVL
を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体が、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVH、およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有するVLを含む、請求項13記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
請求項7〜14のいずれか一項記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項１６】
請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項16記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項17記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
試料中のカンナビジオールを検出する方法であって、
該試料を請求項1記載の抗体または抗原結合断片と接触させる工程；および
該試料中にカンナビジオールが存在する場合、該カンナビジオールに結合している抗体またはその抗原結合断片を検出する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
カンナビジオールの生理活性を決定する方法であって、
既知量のカンナビジオールを含有する試料を提供する工程；
該試料を請求項1記載の抗体または抗原結合断片と接触させる工程；
該試料中の該カンナビジオールに結合している抗体またはその抗原結合断片を検出する工程；
該カンナビジオールに結合している検出された抗体またはその抗原結合断片の量を測定する工程；および
前記測定に基づいて試料中のカンナビジオールの生理活性を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、検出可能な標識を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
請求項1記載の抗体または抗原結合断片を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2017年12月15日に提出された米国仮特許出願第62/599,501号の優先権の利益を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗カンナビジオール抗体、およびこれらの抗体を生理活性カンナビジオールの検出および定量のために使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
2-(6-イソプロペニル-3-メチル-2-シクロヘキセン-1-イル)-5-ペンチル-1,3-ベンゼンジオールという化学名を有するカンナビジオール（「CBD」）は、精神活性の無い植物性カンナビノイドであり、近年、薬効性がテトラヒドロカンナビノール（THC）よりも高いことが見出された。乱用に伴う危険性への懸念から、1930年代および1940年代には、米国およびその他多くの国において、マリファナおよびその成分の医薬用途が禁止されていた。その後、再びカンナビノイド類が治療上有用な化合物とみなされるまでに数十年かかった。しかし、現在もなお、米国におけるその使用は、例えば、関節炎、糖尿病、アルコール中毒、多発性硬化症、慢性疼痛、精神分裂症、外傷後窮迫症候群、抑うつ症、感染症、てんかん、および他の精神疾患、等を含む広い範囲の容態に対する治療的有用性が見込まれているにもかかわらず、厳しく制限されている。また、いくつかのグループは、カンナビジオールの抗がん特性について積極的に研究を進めている。
【０００４】
2-(6-イソプロペニル-3-メチル-2-シクロヘキセン-1-イル)-5-ペンチル-1,3-ベンゼンジオールには７つの二重結合異性体が存在する。これらのうち1つのみ、即ち「Δ2-異性体」が天然に存在し、その他6つの異性体は、合成CBDを製造した際、または天然イソ型が変性した際に形成される。カンナビジオールは、2型カンナビノイド受容体（CB2）に対するリガンドであり、その治療的性質の多くは、この受容体への結合を介するものである。異なるイソ型のCBDは、異なる親和性でCB2受容体に結合し、多様な活性レベルを発揮する。任意のCBD含有治療薬の使用において、その生理活性（即ち該CBD分子の同源のCB2受容体に対する結合親和性）の知識は欠かせない。現在まで、CBDの生理活性の正確な定量に適した薬剤および方法は存在していない。本発明は、当技術分野における上記および他の欠陥の克服に関する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の第一の局面は、式I：
2021506273.tif 000002
の構造を有するカンナビジオールに結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０００６】
本発明の別の局面は、本明細書に記載の抗カンナビジオール抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【０００７】
本発明の別の局面は、本明細書に記載の抗カンナビジオール抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０００８】
本発明の別の局面は、試料中のカンナビジオールの検出方法に関する。この方法は、試料を本明細書に記載の抗CBD抗体または抗原結合断片と接触させる工程、および、試料中にカンナビジオールが存在する場合、該カンナビジオールに結合している抗体またはその抗原結合断片を検出する工程、を含む。
【０００９】
本発明の別の局面は、カンナビジオールの生理活性を決定する方法に関する。この方法は、既知量のカンナビジオールを含有する試料を提供する工程、および、試料を本明細書に記載の抗CBD抗体または抗原結合断片と接触させる工程、を含む。該方法は、更に、試料中の該カンナビジオールに結合している抗体またはその抗原結合断片を検出する工程、該カンナビジオールに結合している検出された抗体またはその抗原結合断片の量を測定する工程、および、該測定に基づいて試料中のカンナビジオールの生理活性を決定する工程、を含む。
【００１０】
本発明の別の局面は、本明細書に記載の抗カンナビジオール抗体を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の多様な態様による、カンナビジオール−抗体−複合体（CAC）の向流免疫電気泳動像を示す。
【図２】図2A〜2Eは、本発明の抗カンナビジオール抗体を用いた、カンナビジオールの生理活性の定量的評価を示す。抗カンナビジオール抗体はフルオレセインと結合しており、フルオレセイン強度の定量化を用いて、試料中のカンナビジオールが発揮する最大活性に対する百分率を計算する。最大活性は、カンナビジオールの純粋なΔ2-異性体サンプルが発揮する活性である。図2Aの試料は最大活性の38％、図2Bの試料は最大活性の18％、図2Cの試料は最大活性の63％、図2Dの試料は最大活性の52％、および、図2Eの試料は最大活性の76％を示す。
【図３】カンナビジオールのエピトープ決定基、および、それらエピトープ決定基への選択的な結合に重要な抗CBD抗体のアミノ酸残基を示す。
【図４】カンナビス原料の生理活性を示す。花が最も高い生理活性をもたらすという非常に標準的なパターンが明らかとなった。CBD原料aは、超遠心分離法から得られた。CBD原料b、c、d、およびeは、冷溶媒抽出によって得られた。最も統計学的に保守的な概算値を示すために、上記の標準誤差は、トリミングが施されていない平均値から得た。
【図５】H.クリヤ（H. Kriya）およびカンナビス原料の生理活性を示す。いずれの器官においてもH.クリヤとカンナビスの間に有意な差は見られなかった。
【図６】ImmunAGおよびカンナビスに基づくCBD製品の比較を示す。H.クリヤに基づくImmunAGは、カンナビスに基づく市販品と比較して、全ての試料にわたり高い生理活性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本開示の第一の局面は、式I：
2021506273.tif 000003
の構造を有するカンナビジオール（IUPAC名：2-[(1R,6R)-3-メチル-6-プロプ-1-エン-2-イルシクロヘキサ-2-エン-1-イル]-5-ペンチルベンゼン-1,3-ジオール）に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００１３】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の結合活性、即ちカンナビジオールへの結合、を示す限りは、具体的にはモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む。
【００１４】
本明細書において使用される「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から同定、分離、および／または回収された抗体を意味する。本明細書に記載の抗体を含む組成物は、例えば、細胞培養液をはじめとする人工的な環境から、抗体の重量パーセントとして60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるまで単離精製される。
【００１５】
一態様において、本開示の抗体は、免疫グロブリン（Ig）分子であり、ジスルフィド結合によって連結された四本のポリペプチド鎖、即ち二本の重（H）鎖および二本の軽（L）鎖、を含む。哺乳動物由来のIg重鎖としては、α、δ、ε、γ、およびμ、の5種類が知られており、重鎖の種類により抗体のクラス（アイソタイプ）が定義される。本開示の抗体は、任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、およびIgA）、およびサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）であり得る。重鎖は、定常領域（CH）および可変領域（VH）、の二領域を含みうる。同一種における同一アイソタイプの天然に存在する全ての抗体の定常領域は、互いに高い相同性を有する。重鎖と同様に、軽鎖も一つの定常ドメイン（CL）および一つの可変ドメイン（VL）からなり得る。哺乳類では、2種類の免疫グロブリン軽鎖、即ち、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）、が存在する。抗体固有の結合性または抗原結合特異性は、可変（V）領域により決定される。特に、相補性決定領域(CDR)としても知られる、軽鎖の可変領域（VL）および重鎖の可変領域（VH）のそれぞれに3つ含まれる可変ループは、抗原結合特異性を担う。本発明の抗体のこれらの領域を以下に更に具体的に説明する。
【００１６】
本開示の抗体断片は、抗原結合領域を含む分子、または、全長抗体の抗原結合ドメインであるが、全長抗体ではなく、例えば、VH領域、VL領域、または両領域の組み合わせである。一態様において、抗体断片は、1つ、2つまたは3つの軽鎖可変ドメインCDRを含有する一本鎖ポリペプチドを含む。別の態様において、抗体断片は、1つ、2つまたは3つの重鎖可変領域CDRを含有する一本鎖ポリペプチドを含む。別の態様において、本開示の抗体断片は、単一ドメイン抗体（ナノボディとも称される）であり、例えば、全長抗体の1つの重鎖可変領域ドメインまたは1つの軽鎖可変領域ドメインを含む、アミノ酸約110個の長さを持つペプチド鎖である。別の態様において、抗体断片は、断片抗原結合（F(ab)）断片、または、F(ab’)2断片である。
【００１７】
本開示の抗体および抗体断片は、Ig分子において必須であるエピトープに結合する特徴を保持する、開示された抗体の変異体、変種、もしくは誘導体、またはその断片も包含する。例えば、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物由来（VHHドメイン）または軟骨魚由来（V-NAR）の可変ドメインから派生させることもでき、単独であっても、Fcドメインと融合されていてもよい。別の態様において、抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域が共に融合して形成する一本鎖可変ドメイン抗体（scFv）、または、Fc部分を有する一本鎖可変ドメイン（即ち、scFv-Fcであり、例えば、ミニボディ）を含む。別の態様において、抗体断片は、2つのscFvをタンデムに連結する（即ち、タンデムscFv）、または、これらが二量体化してダイアボディを形成することにより工学的に作製することができる2価または二価の一本鎖可変断片である。また別の態様において、抗体は、タンデムに、または、トリアボディを形成するよう3量体を形作るように3つのscFvを共に連結させることで、工学的に作製した、3価の一本鎖可変断片である。別の態様において、抗体は、テトラボディ一本鎖可変断片である。別の態様において、抗体は、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムFdセグメント（VH-CH1-VH-CH1）を含む抗体である「直鎖抗体」である（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zapata et. al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)を参照のこと）。
【００１８】
本明細書において開示される抗体および抗体断片は、その結合ドメインが一価、二価、または三価であってよく、結合ドメインは、その設計により結合特異性が単一特異性、二重特異性、または三重特異性であり得る。
【００１９】
上記のとおり、抗体のVHおよびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と名付けられている高頻度可変性の領域に細分される。CDRには、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、各V遺伝子ファミリーにおいて保存性が比較的高い領域が点在する。これらFR領域は特定のものであり、抗体の結合能の大部分を担うCDRにおける接触アミノ酸残基を適切な空間配置に置くものである。各VHおよびVLは3個のCDRおよび4個のFRから構成されている。これらは、アミノ末端からカルボキシ末端への次の順番で配置されている：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
【００２０】
重鎖および軽鎖の各可変領域には3個のCDRがあり、各可変領域に対してCDR1、CDR2およびCDR3と命名されている（即ち、軽鎖可変領域のL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3、および重鎖可変領域のH-CDR1、H-CDR2、およびH-CDR3）。用語「CDRセット」は、抗原へ結合可能な1つの可変領域に存在する3つのCDRからなる群を意味する。これらのCDRの厳密な境界に対して、異なるシステム毎に異なった定義がなされてきた。Kabat記載のシステム（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)and(1991))は、抗体の任意の可変領域に適用できる明確な残基ナンバリングシステムを提供するだけでなく、3個のCDRを規定する正確な残基境界も示している。
【００２１】
一態様において、本明細書に記載の抗体またはその結合断片は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および軽鎖それぞれのアミノ酸配列の一部分は、特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体における対応する配列に相同的であるが、各鎖の残りのセグメントは別の種またはクラスの抗体における対応する配列に相同的である、抗体である。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物の単一種に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部分は、別の種に由来する抗体における配列に相同的である。たとえば、可変領域は、非ヒト宿主生物からの容易に入手可能なハイブリドーマまたはＢ細胞を用いた現在公知の供給源に由来することができ、それが、たとえばヒト細胞調製物等に由来する定常領域と組み合わされる。キメラ抗体の作製方法は、当技術分野において周知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., “Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)を参照のこと。
【００２２】
別の態様において、抗体またはその結合断片は、CDR移植抗体である。「CDR移植抗体」とは、単一種の重鎖および軽鎖の可変領域配列を含む抗体であり、その一つ以上のCDR領域が別の種のCDR領域に置換されている抗体である。例えば、一態様において、CDR移植抗体は、ヒトまたはヒト化重鎖および軽鎖可変領域を含み、これらの領域中の一つ以上のCDRは、一つ以上の別の種由来のCDR、例えばマウスCDR、に置換されている。
【００２３】
別の態様において、抗体またはその結合断片は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域、および、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含む抗体またはその変種、誘導体、類似体または部分である。CDRに関連して、本明細書で使用される用語「実質的」は、非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有するCDRを意味する。同様に、FRに関連して、用語「実質的」は、ヒトFRのアミノ酸配列と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有するFRを意味する。ヒト化抗体は、少なくとも1つの、そして典型的には2つの可変ドメイン（Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv）の実質的にすべてを含んでなるが、その場合、CDR領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリン（即ち、ドナー抗体）のCDR領域に相当し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンのフレームワーク配列（即ち、アクセプター抗体）のフレームワーク領域に相当する。
【００２４】
抗体のヒト化法は、当技術分野において周知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Almagro and Fransson、“Humanization of Antibodies,” Frontiers in Bioscience 13:1619-1633 (2008)；Carterら、米国特許第6,054,297号；Almagroら、米国特許第8,343,489号および米国特許出願第US20100261620号を参照のこと。ヒトまたはヒト化フレームワーク配列は、既知の構造、即ち固定されたフレームワーク配列、ドナー抗体のフレームワーク配列との配列同一性（例えば、CDRが由来する抗体）、即ちベストフィットフレームワーク配列、またはこれら両方の手法の組み合わせ、に基づいて選択可能である。ヒトフレームワーク配列を選択する為に選ばれた方法に関わらず、該配列は、成熟型フレームワーク配列、生殖細胞遺伝子配列、またはコンセンサスフレームワーク配列より選択可能である。適合性があるヒトフレームワーク配列とは、抗体の正しいフォールディング、および、結合ドメインの形成を確実にするために、ドナー抗体（即ちCDRが由来する抗体）配列のフレームワーク配列に、長さおよび配列の両方が似ている配列である。
【００２５】
一態様において、本開示のヒト化抗体のヒト化フレームワーク配列は、コンセンサスフレームワーク配列を含む。コンセンサスフレームワーク配列は、コンセンサス免疫グロブリン配列由来であり、関連する免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も頻繁に出現するアミノ酸（又はヌクレオチド）によって形成された配列を指す（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WINNAKER, “From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology” (1987)；Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；およびPresta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照のこと）。免疫グロブリンのファミリーにおいては、コンセンサス配列中の各位置は、ファミリー中の該位置において最も頻繁に出現するアミノ酸残基によって占有される。2個のアミノ酸が同じ頻度で出現する場合、どちらをコンセンサス配列に含めてもよい。
【００２６】
別の態様において、本明細書に開示されるヒト化抗体またはその結合断片は、固定フレームワーク領域を含む。当技術分野において公知のヒト重鎖および軽鎖FR配列は、当技術分野において公知の手法（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)を参照のこと）を用いて、非ヒト抗体をヒト化するための重鎖および軽鎖「アクセプター」フレームワーク配列（または単に「アクセプター」配列）として使用可能である。一態様において、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、V-baseまたはInternational ImMunoGeneTics(登録商標)（IMGT（登録商標））情報システム等の一般的に利用可能なデータベースに掲載されたフレームワーク配列から選択される。
【００２７】
本明細書に記載のヒト化抗体またはその結合断片は、免疫グロブリンの定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域、の少なくとも一部も含み得る。一態様において、本明細書において開示されるヒト化抗体は、軽鎖、ならびに、少なくとも重鎖の可変ドメインを含む。更に、ヒト化抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含み得る。別の態様において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含む。別の態様において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含む。別の態様において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン、および／または、重鎖のヒト化可変ドメインのみを含む。
【００２８】
一態様において、本明細書に記載の抗体およびその結合断片は、ヒト抗体である。当技術分野において公知のヒト抗体作製方法は、本開示に従った使用に適している。例えば、内因性免疫グロブリンを生産することなく、免疫化に基づいてヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能な遺伝子導入動物（例えば、マウス）が生成されてもよい。例えば、キメラの生殖細胞系列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（JH）遺伝子のホモ接合型欠失が、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすと記載されている。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイを該生殖細胞系列変異マウスに導入すると、抗原チャレンジを経てヒト抗体の産生をもたらす。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Jakobovits et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993)；Lonbergら、米国特許第5,545,806号；Lonbergら、米国特許第5,569,825号；およびSuraniら、米国特許第5,545,807を参照のこと。
【００２９】
本明細書に記載の抗体およびその結合断片は、上記のとおり、ヒト抗体またはヒト化抗体（完全または部分的ヒト化）であってよい。また、抗体およびその結合断片は、動物抗体、例えば限定されないが、トリ（例えば、カモまたはガチョウ）、サメ、クジラまたは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジーなど）を含む哺乳動物であってよい。
【００３０】
抗体作製の方法、特にモノクローナル抗体の作製は、本明細書に記載の方法をはじめとする当技術分野において周知の方法を用いて実施し得る（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、MONOCLONAL ANTIBODIES - PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATIONS (Mary A. Ritter and Heather M. Ladyman eds., 1995）。この工程では一般に、関心対象の抗原（すなわち、2-(6-イソプロペニル-3-メチル-2-シクロヘキセン-1-イル)-5-ペンチル-1,3-ベンゼンジオール）で予めインビボまたはインビトロで免疫化した動物の脾臓から免疫細胞（リンパ球）を採取する。
【００３１】
次いで、抗体分泌リンパ球を、細胞培養で無制限に複製することができる骨髄腫または形質転換細胞と融合させることにより、不死の免疫グロブリン分泌細胞系が作製される。細胞培養で無限に複製することが可能な哺乳動物骨髄腫細胞をはじめとする融合パートナーとの融合は、標準的な周知の技術によって、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）をはじめとする融合剤を用いることによって達成される（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Milstein and Kohler, “Derivation of Specific Antibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion,” Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)）。不死細胞系は、マウス由来であってよいが、他の哺乳動物種の細胞に由来するものであってもよく、特定の栄養素を用いるのに必要な酵素が欠損しており、速く増殖することが可能で、融合能に優れるよう選択する。得られた融合細胞またはハイブリドーマを培養し、生じたコロニーを所望のモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングする。このような抗体を産生するコロニーをクローン化し、インビボまたはインビトロで増殖させて大量の抗体を産生させる。
【００３２】
本発明に従って、本明細書に記載の抗CBD抗体を産生するハイブリドーマは、NAYAM BJ9003.236ハイブリドーマと呼ばれる。このハイブリドーマによって生産された抗体は、本明細書において更に詳しく記載されるSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、本明細書において更に詳しく記載されるSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３３】
別の態様において、モノクローナル抗体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、McCafferty et al., “Phage Antibodies: Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains,” Nature 348:552-554 (1990)に記載された技術を用いて作成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Clackson et al., “Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries,” Nature 352:624-628 (1991)；およびMarks et al., “By-Passing Immunization. Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage,” J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)にはそれぞれ、ファージライブラリーを用いたマウスおよびヒト抗体の単離が記載されている。続いて発行された文献には、チェインシャッフリングによる高親和性（nM範囲）ヒト抗体の生産（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Marks et al., BioTechnology 10:779-783 (1992)）、並びに極めて大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Waterhouse, et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))が記載されている。このように、これらの技術は、モノクローナル抗体単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替技術である。
【００３４】
あるいは、モノクローナル抗体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cabillyら、米国特許第4,816,567に記載されるような組換えDNA法を使用して作製され得る。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増殖するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するRT-PCRによって、単離される。重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、次いで、好適な発現ベクター中へクローニングされ、これらが、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（E. coli）細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中へトランスフェクトされると、モノクローナル抗体が宿主細胞によって作製される。
【００３５】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、代替の抗体を作製するために、組換えDNA技術を使用してさらに修飾され得る。例えば、マウスモノクローナル抗体の、軽鎖および重鎖の定常ドメインは、キメラ抗体を作製するために、ヒト抗体のそれらの領域で置換され得る。あるいは、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインは、融合抗体を作製するために、非免疫グロブリンポリペプチドで置換され得る。他の態様において、定常領域は、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を作製するために、切断または除去される。さらに、可変領域の部位特異的または高密度突然変異誘発が、モノクローナル抗体の特異性および親和性を最適化するために、使用され得る。
【００３６】
一態様において、本明細書に記載の抗カンナビジオール抗体またはその結合断片は、重鎖可変領域を含む。重鎖可変領域は、SEQ ID NO:1（Asn-Phe-Tyr-Glu-Met-Trp）のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1を改変したアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（H-CDR1）を含み、該改変配列は、SEQ ID NO:1と比較して1個または2個のアミノ酸残基の改変を含有する。更に、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:2
2021506273.tif 000004
のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2を改変したアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（H-CDR2）を含み、該改変配列は、SEQ ID NO:2と比較して1、2、3、または4個のアミノ酸残基の改変を含有する。更に、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:3（Ile-Tyr-Try-Cys-Ala-Arg-Asp-Lys）のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:3を改変したアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（H-CDR3）を含み、該改変配列は、SEQ ID NO:3と比較して1、2、または3個のアミノ酸残基の改変を含有する。
【００３７】
本明細書に記載の抗体またはその結合断片は、代わりに、または、更に、軽鎖可変領域を含みうる。軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:4（Asp-Leu-Ser-Gln-Tyr-Leu-Phe）のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4を改変したアミノ酸配列を有する相補性決定領域1（L-CDR1）を含み、該改変配列は、SEQ ID NO:4と比較して1個または2個のアミノ酸残基の改変を含有する。更に、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:5（Arg-Val-Ser-Arg-Leu-Thr-His）のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:5を改変したアミノ酸配列を有する相補性決定領域2（L-CDR2）を含み、該改変配列は、SEQ ID NO:5と比較して1個または2個のアミノ酸残基の改変を含有する。更に、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:6（Gln-Gln-Ser-Arg-Leu-Ile-Pro-Asn-Thr）のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:6を改変したアミノ酸配列を有する相補性決定領域3（L-CDR3）を含み、該改変配列は、SEQ ID NO:6と比較して1個、2個、または3個のアミノ酸残基の改変を含有する。
【００３８】
本明細書に記載の抗CBD抗体の重鎖CDR配列および／または軽鎖CDR配列に対する適切なアミノ酸改変としては、例えば、保存的置換あるいは機能的に同等なアミノ酸残基への置換であり、本明細書に記載のCDR配列と類似した、または、それより高められた結合特性を有する変種CDR配列をもたらす改変、が含まれる。保存的置換は、アミノ酸側鎖の関連するアミノ酸ファミリー内で生じる置換である。遺伝子がコードするアミノ酸は、4つのファミリーに分けることができる：(1)酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；(2)塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；(3)非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；および(4)非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として両方に分類されることがある。あるいは、アミノ酸のレパートリーは以下のように分類されうる：(1)酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；(2)塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；(3)脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、セリンおよびスレオニンは任意で別個に脂肪族-水酸基として分類される；(4)芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；(5)アミド（アスパラギン、グルタミン）；ならびに(6)含硫（システインおよびメチオニン）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Stryer (ed.), Biochemistry, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981）。本明細書に記載の重鎖CDR配列および軽鎖CDR配列に対して非保存的置換を施すこともできる。非保存的置換は、CDRの結合特性を改善または高めるために、CDRの一つ以上のアミノ酸残基を、それとは異なるクラスの一つ以上のアミノ酸残基に置換することを含む。
【００３９】
本明細書に記載の抗CBD抗体の重鎖可変領域CDRおよび／または軽鎖可変領域CDRのアミノ酸配列は、更に、CBD結合性を変えない一つ以上の中性アミノ酸の内部挿入または内部欠失を含み得る。一態様において、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有するH-CDR3は、更に、CBD結合性を変えない一つ以上の中性アミノ酸の内部挿入または内部欠失を含む。別の態様において、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するL-CDR1は、更に、CBD結合性を変えない一つ以上の中性アミノ酸の内部挿入または内部欠失を含む。
【００４０】
本開示の一態様において、該抗CBD抗体またはその結合断片は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するH-CDR1；SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するH-CDR2；およびSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有するH-CDR3、を持つ重鎖可変領域を含む。前記CDR領域を含む例示的な重鎖可変領域は、下記SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する。SEQ ID NO:7の可変重鎖のCDR領域を下線で示し、隣接するフレームワーク領域（即ち、FR1〜FR4）を太字で示した。
2021506273.tif 000005
【００４１】
本開示の一態様において、抗CBD抗体またはその結合断片は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するL-CDR1；SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するL-CDR2；およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するL-CDR3、を持つ軽鎖可変領域を含む。
前記CDR領域を含む例示的な軽鎖可変領域は、下記SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する。SEQ ID NO:8の可変軽鎖のCDR領域を下線で示し、フレームワーク領域（即ち、FR1〜FR4）を太字で示した。
2021506273.tif 000006
【００４２】
一態様において、本明細書に記載の抗CBD抗体またはその結合断片は、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および／または、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、を含む。
【００４３】
別の態様において、該抗体またはその結合断片は、SEQ ID NO:7と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94%、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をもつ重鎖可変領域、および／または、SEQ ID NO:8と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94%、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をもつ軽鎖可変領域、を含む。
【００４４】
別の態様において、抗体またはその結合断片は、下記SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。SEQ ID NO:1、2、および3のCDRを下線で示した。
2021506273.tif 000007
【００４５】
別の態様において、抗体またはその結合断片は、下記SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。SEQ ID NO:4、5、および6の軽鎖CDRを下線で示した。
2021506273.tif 000008
【００４６】
一態様において、本明細書に記載の抗CBD抗体またはその結合断片は、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する重鎖、および／または、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する軽鎖、を含む。
【００４７】
別の態様において、抗体またはその結合断片は、SEQ ID NO:9と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94%、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をもつ重鎖、および／または、SEQ ID NO:10と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94% 、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をもつ軽鎖、を含む。
【００４８】
抗体「特異性」とは、CBDの特定の一つまたは複数のエピトープに対する、本明細書に記載の抗体またはその結合部分の選択的認識を意味する。用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合すること、ないしは他の方法で分子と相互作用することが可能な任意の決定基を含む。エピトープ決定基は一般的に、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖等の、化学的に活性な表面分子の群からなり、かつ一般的には、特異的な三次元構造特徴および特異的な荷電特徴を有する。図3は、CBDのエピトープ決定基を示し、CBDのこれらのエピトープに対する結合において重要な抗CBD抗体のCDR領域内のアミノ酸残基を特定している。具体的には、重鎖CDR1のアミノ酸残基34（SEQ ID NO:7）、H-CDR2のアミノ酸残基52および56（SEQ ID NO:7）、H-CDR3のアミノ酸残基102（SEQ ID NO:7）、および、軽鎖CDR3のアミノ酸残基96（SEQ ID NO:8）は、抗体のCBDへの結合に重要である。
【００４９】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、CBDと特異的に結合する。本明細書に記載の抗体またはその結合断片は、最高の親和性で、CBDの天然に存在するイソ型である2-(6-イソプロペニル-3-メチル-2-シクロヘキセン-1-イル)-5-ペンチル-1,3-ベンゼンジオールと結合する。本明細書に記載の抗体またはその結合断片は、CBDの他のイソ型とも結合するが、その結合は、CBDのΔ2-異性体との結合と比較して低い親和性を示す。本明細書に使用される「特異的に結合する」とは、抗体がその抗原に結合することを意味し、任意のタンパク質同士に起こり得る低レベルな非特異的結合を除外することを意図しない。抗体は、適切なエピトープを含むいかなるタンパク質または分子とも交差反応が可能なため、本明細書に使用される「特異的に結合する」とは、抗体が、本明細書に記載の分子以外の任意のタンパク質または分子と結合しないことを示唆せず、それを意図しない。
【００５０】
本開示の別の局面は、本明細書に記載の抗CBD抗体、即ちSEQ ID NO:1のH-CDR1、SEQ ID NO:2のH-CDR2、およびSEQ ID NO:3のH-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:4のL-CDR1、SEQ ID NO:5のL-CDR2、およびSEQ ID NO:6のL-CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体と、CBDへの結合について競合する、抗体またはその結合部分に関する。本開示のこの局面では、該抗体またはその結合部位は、CBDのΔ2-異性体との結合について競合する。
【００５１】
本開示のこの局面では、本明細書において詳細に記載されている抗CBD抗体とCBDへの結合について競合する抗体またはその結合部分を特定するために、バイオレイヤー干渉法（BLI）等の競合的結合アッセイを用いることが可能である。当技術分野において公知の他の競合的結合アッセイも、本開示のこの局面に従って、競合的結合を示す抗体を特定するために利用可能である。
【００５２】
本開示の別の局面は、本明細書に記載の抗体またはその結合断片をコードする一つ以上の単離されたポリヌクレオチドに関する。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の全部または少なくとも一部をコードする。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する重鎖の全部または少なくとも一部をコードする。別の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の全部または少なくとも一部をコードする。別の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する軽鎖の全部または少なくとも一部をコードする。別の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7、8、9、および10の全部または一部の組み合わせをコードする。
【００５３】
本明細書に記載の核酸分子は、本明細書に記載の抗体またはその結合断片を、インビトロ転写／翻訳するために使用する直鎖DNA配列、および、真核生物、原核生物、又はフィラメントファージで発現、分泌、および／または提示することに適合したベクターを含む、単離されたポリヌクレオチド、発現ベクターの一部、または直鎖DNA配列の一部を含む。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成等の化学合成により生成することができ、完全な一本鎖または二本鎖分子に集合される場合がある。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、PCRに続く日常的なクローニングなどの他の手法によって産生され得る。所与の公知の配列のポリヌクレオチドを産生または入手するための手法は、当技術分野において周知である。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターまたはエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、RepAの結合を促進するシス配列、等のような少なくとも一つの非コード配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列は、RepA、FcまたはpIXもしくはpIIIなどのバクテリオファージ外殻タンパク質などのタンパク質、シグナル配列、融合タンパク質パートナーの精製または検出を促進するために、例えば、ヒスチジンタグまたはHAタグなどのマーカーまたはタグ配列をコードする、追加的なアミノ酸をコードする追加的な配列も含み得る。
【００５６】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むベクターに関する。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクターまたは任意の手段による所与の生物もしくは遺伝背景への本明細書に記載のポリヌクレオチドの導入に適した任意の他のベクターであり得る。
【００５７】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の抗体またはその結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む、1つ以上の発現ベクターに関する。本明細書に記載の抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン、Fab断片、または全長鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列、翻訳開始配列、3'非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列、および転写終結配列と組み合わされ、1つ以上の発現ベクター構築体が形成される。
【００５８】
この態様に基づいて、抗CBD抗体またはその結合部分をコードする発現ベクター構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする核酸を含み得る。重鎖ポリペプチドは、重鎖可変（VH）領域、および／または、少なくとも1つの重鎖定常（CH）領域を含み得る。少なくとも1つの重鎖定常領域は、重鎖定常領域1（CH1）、重鎖定常領域2（CH2）、および重鎖定常領域3（CH3）、および／またはヒンジ領域を含み得る。幾つかの態様において、該重鎖ポリペプチドは、VH領域およびCH1領域を含み得る。他の態様において、重鎖ポリペプチドは、VH領域、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含み得る。
【００５９】
該発現構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする核酸配列を含み得る。軽鎖ポリペプチドは、軽鎖可変（VL）領域、および／または、軽鎖定常（CL）領域を含み得る。
【００６０】
発現構築物は、典型的には、抗体またはその結合断片の発現の駆動に適したプロモーター配列を含む。適したプロモーター配列としては、制限されることなく、伸長因子1アルファプロモーター（EF1a）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1プロモーター（PGK）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（CMV）、キメラ肝臓特異的プロモーター（LSP）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（CAG）、テトラサイクリン反応性プロモーター（TRE）、トランスサイレチンプロモーター（TTR）、シミアンウイルス40プロモーター（SV40）、およびCK6プロモーターが含まれる。その他、当技術分野において公知である、哺乳類細胞内での遺伝子発現の駆動に適切なプロモーターも、本明細書に記載の発現構築物への組み入れに適している。
【００６１】
発現構築物は、更に、リンカー配列をコードし得る。リンカー配列は、発現構築物の1つ以上の構成成分（コードされている抗体の重鎖および軽鎖構成成分）を空間的に分離および／または繋ぐアミノ酸配列をコードし得る。
【００６２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞である。本明細書に記載の抗体およびその結合断片は、当技術分野において周知の細胞株、混合細胞株、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団により任意に産生され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク（1987-2001）；Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989）；HarlowとLane、Antibodies, a Laboratory Manual、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989）；Colliganら編、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク（1994-2001）；Colliganら、Current Protocols in Protein Science、John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク（1997-2001）を参照のこと）。
【００６３】
発現のために選択された宿主細胞は、哺乳類、例えば、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HeG2、SP2/0、HeLa、骨髄腫、またはリンパ腫、の細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、またはそれらのいずれかの誘導体、不死化もしくは形質転換細胞であり得る。あるいは、該宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することが不可能な種または生物、例えば、BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)、および天然もしくは改変大腸菌種、クレブシエラ種（Klebsiella spp.）、又はシュードモナス種（Pseudomonas spp.）の菌株のいずれかなどの原核細胞または生物、から選択され得る。
【００６４】
本明細書に記載の抗体は、上記の単離されたポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞を用いる、任意のさまざまな手法により調製され得る。一般的に、抗体は、細胞培養技術により産生することができ、従来技術を介したモノクローナル抗体の産生、または組換え抗体であり得る抗体の産生を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主に抗体遺伝子、重鎖および／または軽鎖をトランスフェクトすることによるものが挙げられる。組換え発現ベクターの調製、宿主細胞への遺伝子導入、形質転換体の選択、宿主細胞の培養、培養液からの抗体回収には、標準的な分子生物学的手法が使用される。宿主細胞への遺伝子導入は、原核または真核宿主細胞への外来DNA導入に一般的に使用されるさまざまな手法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、DEAE-デキストラン導入など、を用いて実施され得る。原核または真核宿主細胞のいずれにおいても、本明細書に記載の抗体を発現することは可能であるが、真核細胞中での抗体発現が好ましい場合もあれば、哺乳類宿主細胞中での発現が好ましい場合もある。なぜなら、このような真核細胞（特に哺乳類細胞）は、原核細胞よりも、集合し、正しく折りたたまれ免疫学的に活性な抗体を分泌しやすいからである。
【００６５】
上記のとおり、本発明の組換え抗体を発現させるための例示的なの哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220 (1980)に記載されているdhfr-CHO細胞を含む）を含む。その他の適切な哺乳類宿主細胞としては、制限されることなく、NS0骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における抗体の発現または、より好ましくは、宿主細胞を増殖させる培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより抗体が産生される。
【００６６】
宿主細胞は、Fab断片またはscFv分子などの機能的抗体断片の作製にも使用可能である。上記の手順に関する多様性は、本開示の範囲内に含まれることが理解される。例えば、宿主細胞に、本明細書に記載の抗体の軽鎖および／または重鎖の機能的断片をコードするDNAを遺伝子導入することが望ましい場合がある。組換えDNA技術は、関心対象の抗原への結合に不要な軽鎖および重鎖の片方または両方をコードするDNAの全部または一部を除去するためにも使用され得る。このような切り詰めたDNA分子から発現された分子も、本明細書に記載の抗体に含まれる。
【００６７】
抗体および抗体結合断片は、限定するわけではないが、プロテインA精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法により、組換え細胞培養から回収し、精製される。高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）も精製に使用することができる。精製中のタンパク質分解を阻害するために、蛋白分解酵素阻害剤を使用してもよい。関心対象の抗体に適した精製方法は、細胞培養における発現に際して抗体の特徴が変化することを考慮した変更を必要とし得ることを当業者は認識するであろう。
【００６８】
本発明の別の局面は、試料中のカンナビジオールを検出する方法に関する。この方法は、本明細書に記載のカンナビジオールに結合する抗体または抗原結合断片と試料を接触させる工程、および、試料中にカンナビジオールが存在する場合、カンナビジオールに結合している抗体またはその抗原結合断片（即ち抗CBD抗体-CBD複合体）を検出する工程を含む。
【００６９】
試料中のCBDの検出に関係する本明細書に記載の方法は、検出可能に標識された本明細書に記載の抗CBD抗体の使用を伴う。従って、一態様において、本明細書に記載の抗CBD抗体は、検出可能な標識と対になっていてもよい。適切な検出可能な標識は、当技術分野において周知であり、検出可能なタグ（例えば、ポリ-ヒスチジン（His6-）タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST-）タグ、またはマルトース結合タンパク質（MBP-）タグ）；放射性標識（例えば、炭素（14C）またはリン（32P））；蛍光標識（例えば、ヒドロキシクマリン、スクシンイミジルエステル、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、ヒドラジド、パシフィックブルー、マレイミド、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、NBD、NBD-X、R-フィコエリスリン（PE）、PE-Cy5コンジュゲート（Cychrome、R670、Tri-Color、Quantum Red）、PE-Cy7コンジュゲート、Red 613、PE-テキサスレッド、PerCP、ペリジニンクロロフィルタンパク質、TruRed（PerCP-Cy5.5コンジュゲート）、FluorX、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、BODIPY-FL、TRITC、X-ローダミン（XRITC）、リサミンローダミンB、テキサスレッド、アロフィコシアニン（APC）、APC-Cy7コンジュゲート、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5またはCy7）；発光標識（例えば、ルミノール）；生物発光標識（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン）；または酵素標識（例えば、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ 、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、セイヨウワサビワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（たとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ）を含む。あるいは、CBD抗体は、検出可能な標識に結合されていてもよく、例えば、検出可能なラベルを含む二次抗体に結合されていてもよい。
【００７０】
試料中のカンナビジオールに結合している抗CBD抗体を検出するための検出アッセイは、当技術分野において周知であり、例えば、免疫沈降、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）、または蛍光標識細胞分取（FACS）を含む。
【００７１】
本発明の別の局面は、カンナビジオールの生理活性を決定する方法に関する。この方法は、既知量のカンナビジオールを含む試料を提供する工程、および本明細書に記載のカンナビジオールに結合する抗体または抗原結合断片と試料を接触させる工程、を含む。該方法は更に、試料中の該カンナビジオールに結合している抗体またはその抗原結合断片を検出する工程；該カンナビジオールに結合している検出された抗体またはその抗原結合断片の量を測定する工程；および、該測定に基づいて試料中のカンナビジオールの生理活性を決定する工程、を含む。
【００７２】
上述のとおり、CBDはCB2受容体に結合し、任意のCBD含有試料（例えば、植物抽出物）におけるCBDの生理活性は、その受容体に対するCBDの結合親和性により測定される。本発明の抗CBD抗体は、CB2受容体を刺激し、CBDのその受容体に対する結合親和性をインビトロで測定することを可能にする代替剤として機能する。該抗体は、天然の自然な形のCBD（即ち、2-(6-イソプロペニル-3-メチル-2-シクロヘキセン-1-イル)-5-ペンチル-1,3-ベンゼンジオール）に最も強く結合する。CBD分子の溶媒抽出、加熱、高速剪断、CBDが抽出される元となる植物の種類および植物の部分、等、全てが抗体−CBD結合に影響する。従って、CBDを含有する任意の組成物中のCBD生理活性は、本明細書に記載の抗CBD抗体と組成物中のCBDとの間の結合親和性を測定し、それをCBDの天然イソ型と抗CBD抗体との間の結合親和性と比較することにより、容易に決定できる。試料中のCBDの生理活性は、最大活性に対する割合（％）、即ち、CBDの天然イソ型と比較した活性の割合（％）、として表される。
【００７３】
適切な検出可能な標識を伴う抗CBD抗体とCBDの複合体を検出するアッセイおよび方法は、上述のとおりである。定量的な結合親和性評価に適した他のアッセイとしては、限定するわけではないが、放射性結合アッセイ、非放射性結合アッセイ（例えば、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ、または表面プラズモン共鳴法）、固相リガンド結合アッセイ、液相リガンド結合アッセイ（例えば、免疫沈降）が挙げられる。
【００７４】
本発明の別の局面は、本明細書に記載の抗カンナビジオール抗体を含むキットに関する。一態様において、該キットは、試料中のCBD生理活性を測定するために有用な、少なくとも１つの本明細書に記載の発明された抗体または抗原結合断片を含む、材料および構成成分の集合体である。
【００７５】
発明されたキットを構成する成分の正確な性質は、その使用目的次第である。使用説明書は、キットに含まれていてもよい。「使用説明書」は、典型的には、キットの構成成分を使用して所望の成果を遂げる、例えば、生理活性を有するCBDの検査またはCBDを定量するために使用される手法を説明する明確な表現を含む。任意で、キットには他の有用な構成成分、例えば、基質、注射器、アプリケーター、ピペット用もしくは測定用の道具、または当業者に容易に認識されるその他の有用な試薬も含まれていてもよい。
【００７６】
キットに集められた材料または構成成分は、その操作性および有用性が保存される、任意の便利で適切な方法により保管された形で、実践者に提供できる。例えば、構成成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥した形であり得；これらは室温、冷蔵または冷凍された温度で提供可能である。構成成分は、典型的に、適切な梱包材に含まれる。本明細書で用いられているように、「梱包材」とは、キットの内容物を収納するために用いる1つ以上の物理構造、例えば、発明された構成物等、を意味する。梱包材は、好ましくは無菌であり、不純物を含まない環境を提供するために、周知の方法により作成される。キットに使用された梱包材は、習慣的にアッセイに用いられるものである。本明細書で用いられている用語「パッケージ」は、個々のキット構成成分を保持することが可能な、適切な固体マトリックスまたは材料、例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、等を意味する。従って、例えば、パッケージは、本明細書に記載のCBDに特異的に結合する精製された抗体を適切な量含むために用いられるガラス製バイアルであり得る。一般的に、梱包材は、内容物および／またはキットの目的および／またはその構成成分を示す外部ラベルを有する。
【００７７】
本発明の様々な態様は、上記の詳細な説明に記載されている。これらの記載は、上記の態様を直接説明するが、当業者は、本明細書に記載され示される特定の態様に対して、変更および／または変化を思いついてもよいことが理解される。本明細書の範囲に含まれる任意のそのような変更や変化も、そこに含めることが意図される。特に明記されない限り、本明細書および特許請求の範囲における言葉および語句が、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられることは、発明者の意図するところである。
【実施例】
【００７８】
本発明の説明をするため、以下に実施例を挙げる。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途または動作原理に限定することを意図したものではない。
【００７９】
実施例1：抗カンナビジオール抗体の作製
カンナビジオール（2-[(1R,6R)-6-イソプロペニル-3-メチルシクロヘキサ-2-エン-1-イル]-5-ペンチルベンゼン-1,3-ジオール）は、1）エルサレム・ヘブライ大学（イスラエル・レホヴォト）、および2）ImmunAG, LP（インド・ゴア州）より入手した。
【００８０】
ステップ１：5％カンナビジオールをカプロン酸（C5H11COOH）に溶解し、その溶液をBALB/Lacマウスに注射した。0.2mLを27〜28mmゲージの注射針で外側尾静脈に注射した。1日おきに14日間注射を繰り返し、合計7回注射を行った。
【００８１】
ステップ2：各注射後にインビボ電気穿孔が行われ、これにより免疫応答が著しく増強された。これは、電界強度2500 V/cm、パルス周波数0.3Hz、パルス長100μ秒で80パルス送出することで実施された。
【００８２】
ステップ3：カンナビジオールで免疫されたマウスの脾臓細胞を単離した。モノクローナル抗体の作製は、骨髄腫細胞を、カンナビジオールで免疫した脾臓細胞と融合した、融合「脾細胞」の作成を伴う細胞培養により行った。B細胞と骨髄腫細胞の融合は、電気融合法により行った。BTX Harvard Apparatus（米国、マサチューセッツ州、ホリストン）社製の細胞融合に応用するBTX ECM 2001 Electrofusion発電機を融合に用いた。2つの細胞は、高周波の交流電場を用いた誘電泳動により融合された。いったん細胞を寄せ集めた後、パルス電圧を加えた。パルス電圧により、細胞膜が透過された後、2つの細胞の膜は組み合わさり融合した。この後、交流電圧を短時間で再度加え、この工程を安定化させた。最終結果として、混合された細胞質および細胞膜は完全に融合した。その後に細胞内で2つの核が融合し、その結果として「異核共存体」細胞が産生した。
【００８３】
ステップ4：融合細胞は、HAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地中でおよそ10日から14日間保温した。アミノプテリンは核酸合成経路を阻害し、いかなる未融合の骨髄腫細胞も死滅させた。B細胞−骨髄腫ハイブリッドのみが生き延びる。これらの細胞は、抗体を生産し（B細胞の性質）、不死化されている（骨髄腫細胞の性質）。保温した培地は、次に、各ウェルが1個の細胞のみを含むように希釈し、マルチウェルプレートに加えた。
【００８４】
ステップ5：次の段階として、適切な特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマのみを特定して選択する、迅速な一次スクリーニング手法であるELISAを行った。液体試料中におけるカンナビノールの存在は、固相酵素免疫測定法（EIA）を用いて検出した。試料由来のカンナビジオールは、表面に結合した。次に、保温した培地中で生産された抗体がカンナビジオールに結合できるよう、抗体を表面上に加えた。
【００８５】
この抗体は、チトクロームP450酵素（CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、およびCYP3A5の全てが働くことが確認された）と結合させ、最終ステップは、チトクロームP450基質（例えば、ペンタレノラクトン）を含有する物質の添加であった。続く反応により、基質の色が検出可能に変化した。
【００８６】
ステップ6：所望の抗体を産生したB細胞をクローニングし、多数の同一の娘クローンを作製した。インターロイキン6を含有する追加培養液を用いて、ハイブリドーマコロニーを樹立した。RPMI-1640培養液（抗生物質およびウシ胎仔血清を含有）において細胞はよく増殖し、多数の抗体を産生した。ハイブリドーマの増殖に使用した、より小さいマルチウェルプレートは、より大きな組織培養フラスコに交換した。培養上清より46μg/mLから72μg/mLのカンナビジオールモノクローナル抗体が得られ、これを使用するまで-20℃以下で保存した。
【００８７】
実施例2：免疫電気泳動法によるCBDの生理活性の分析
免疫電気泳動法を用いてカンナビジオール−抗体−複合体（「CAC」）を検査した。この手順にはいくつかの異なる種類があり、その全てがCACを必要とする。
【００８８】
好ましい媒体は、高pH（8.6程度）で緩衝された、厚さ約1mmの1％アガロースゲル板である。水平な冷却板を備えた電気泳動装置が最も有効であるとみられる。
【００８９】
図1は、向流免疫電気泳動法を用いたCACの分離および同定を示す。これは免疫拡散法と類似しているが、それに追加して、アガロース媒体に電場をかける。カンナビジオールと抗原は、それぞれのウェルからより速く、互いに向かって泳動し、線を形成するように沈降し、これにより結合が示される。
【００９０】
実施例3：免疫蛍光法によるCBDの生理活性の分析
この実験のために、本明細書に記載の抗CBD抗体は、蛍光分子であるフルオレセインで標識された。図2は、様々なCBD含有試料におけるCBDに結合している蛍光標識された抗CBD抗体を示す。結合した抗CBD抗体のフルオレセイン標識の発光強度を測定し、同量のCBDΔ2異性体に結合しているフルオレセイン標識抗CBD抗体の発光強度と比較することで、CBDの生理活性が定量される。
【００９１】
実施例4〜7の材料および方法
CHO細胞および膜の調製：これらは、ヒトCB2受容体をコードするcDNAを用いて安定にトランスフェクトされている。CB2遺伝子導入細胞は、[3H]-CP55940、[3H]-WIN55212-2または[35S]-GTPγS（Bmax＝72.5pmol／タンパク質mg）との結合アッセイに使用された。アッセイに使用したクローンは、Greenら（1998）により記載されたsPAPレポーターアッセイに使用されたものと同一である。細胞は、DMEM（f-12HAM）中、37℃および5％CO2で、2mmのグルタミン、ジェネテシン（600μg／mL）およびハイグロマイシン（300μg／mL）と共に維持された。受容体の過剰発現は、天然の膜に存在する受容体とは通常関連していないエフェクター機構の活性化を引き起こす可能性があるため（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Kenakin, “Agonist-receptor Efficacy II: Agonist Trafficking of Receptor Signals,” Trends in Pharmacological Sciences 16(7):232-238 (1995)）、アッセイは、結合アッセイに使用した細胞よりも少ないCB2受容体を発現する細胞を用いて実施した。CHO細胞を50mMトリス緩衝液（pH7.4）および0.32Mショ糖に懸濁し、Ultra-Turrexホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを50mMトリス緩衝液（pH7.4）で希釈し、50,000×gで1時間遠心分離することにより、膜を単離した。
【００９２】
CHO−CB2結合：[3H]-CP55940および[3H]-WIN55212-2の結合は、濾過の手順を用いて測定した。これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Compton et al., “Cannabinoid Structure-activity Relationships: Correlation of Receptor Binding and In Vivo Activities” Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 265(1):218-226 (1993)に記載された方法を改変したものである。結合アッセイは、[3H]-CP55940または[3H]-WIN55212-2、1mM MgCl2、1mM EDTA、2mg／mLウシ血清アルブミン（BSA）、および50mMトリス緩衝液を用い、全アッセイ量を500μLとして実施した。結合は、細胞膜の添加によって開始した（タンパク質20〜30μg）。アッセイは30℃で90分間実施し、その後、氷冷洗浄緩衝液（50mMトリス緩衝液、1mg/mL BSA）を添加し、12ウェルサンプリングマニホールド（Brandel Cell Harvester）および洗浄緩衝液中に4℃で24時間浸漬させたWhatman GF/Bガラスファイバーフィルタを使用して減圧濾過することにより、終了させた。各反応チューブを、4mLという一定分量の緩衝液で3回洗浄した。フィルタを、60分間オーブン乾燥し、次いで5mLのシンチレーション流体（Ultima Gold XR, Packard）中に置いた。液体シンチレーション分光分析によって放射能を定量した。特異的結合は、1μMの基準カンナビジオールが存在し、また存在しない状態で生じた結合の差として定義された。タンパク質アッセイは、Bio-Rad Dc kitを使用して実施した。非標識および放射標識されたカンナビジオールをそれぞれ50μL添加し、その後、アッセイ緩衝液（BSAを10mg／mLで含有する50mMトリス緩衝液）で希釈した。置換アッセイに使用された[3H]-CP55940または[3H]-WIN55212-2の濃度は、0.5nMであった。特異的結合部位からの放射リガンドの50％置換（IC50値）をもたらすカンナビジオールの濃度は、GraphPad Prism（GraphPad Software、米国、San Diego）を使用して計算した。競合結合曲線は、ゼロに制限した特異的結合部位から放射リガンドを置き換える為の最低値でフィットさせた。解離定数（Ki）値は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Yung-Chi et. al., “Relationship Between the Inhibition Constant (Ki) and the Concentration of Inhibitor Which Causes 50 Percent Inhibition (I50) of an Enzyme Reaction” Biochemical Pharmacology 22(23): 3099-3108 (1973)の方程式、および表1に示した[3H]-CP55940および[3H]-WIN55212-2の解離定数値を使用して計算した。
【００９３】
（表1）Ki値は、CB2細胞膜内の[3H]-CP55940に関しては0.8nMのKD値、CB2細胞膜内の[3H]-WIN55212-2に関しては2.1nMのKd値を用い、Cheng & Prusoffの方程式（n＝3または4）を使用して計算した。
2021506273.tif 000009
【００９４】
抗CBD抗体の産生および結合：基準CBDはアヴィデケル植物の花より抽出された。5％基準CBDをカプロン酸（C5H11COOH）に溶解し、この溶液を0.2mL、27-28mmゲージの注射針でBALB/Lacマウスの外側尾静脈に注射した。1日おきに14日間注射を繰り返し、合計7回注射を行った。各注射後に、電界強度2500 V/cm、パルス周波数0.3Hz、パルス長100μ秒で80パルス送出するインビボ電気穿孔を実施した。カンナビジオール免疫後、マウスの脾臓細胞を抽出し、単離した。これらと骨髄腫細胞を、BTX Harvard Apparatus（米国、マサチューセッツ州、ホリストン）社製のBTX ECM 2001 Electrofusion Generatorを使用して誘電泳動法により融合した。融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（それぞれ、0.1 mM、0.4μM、および0.016 mMの濃度）培地中で10日から14日間保温し、その結果、B細胞−骨髄腫ハイブリッドのみが生き延びた。各プレートが1個の細胞を含むよう限界希釈を行った後、純粋なCBD分子に対してより高い結合を示す抗体を生産したハイブリドーマを選別するためにELISA法を使用した。この抗体は、チトクロームP450酵素と結合させた。チトクロームP450の基質としてペンタレノラクトンを使用した。カンナビジオール−抗体−複合体（CAC）のモル重量の増加により測定された、最も高い結合親和性を示す抗体を生産するハイブリドーマは、インターロイキン6を含有する追加培養液を用いてクローニングした。
【００９５】
クローニングしたハイブリドーマは、抗生物質およびウシ胎仔血清を含有したRPMI-1640培養液中で増殖した。A／G精製を用いてハイブリドーマからモノクローナル抗体を抽出した。培養上清は、46〜72μg/mLのカンナビジオールモノクローナル抗体（MCA）を含有していた。この抗体は、使用するまで-20℃以下で保存した。各試料の結合を測定するために、蛍光標識ELISAを用いた。CACのモル重量を金を基準とした対照CACのモル重量で除することで、結合親和性の値を得た。
【００９６】
超遠心によるCBDの抽出：植物組織（花由来）を超音波により分画した。果肉と原形質を遠心分離した。原形質画分を、分析用超遠心分離によりさらに分画し研究することにより、CBDの沈降係数を得た。臭化ナトリウムおよび塩化セシウムを使用した調製用の等密度勾配遠心分離（130,000 RPMまで）を行うことにより、精製されたCBD試料を回収した。これは商業的に現実的な処理ではないものの、生理活性試験を実施するのに十分なmg数のCBDがこれにより提供された。
【００９７】
溶媒によるCBDの抽出：溶媒を用いた手順では、乾燥植物体を20℃程度でエタノール抽出、続いて塩化メチレン抽出に供し、非カルボキシル化カンナビノイドをカルボキシル化カンナビノイドから分離した。
【００９８】
CBDの単離および分析：各画分は、下記の方法を用いて同定した：CHCl3によるシリカゲルからの溶出； C6H6-MeOH-AcOH（88％：10％：2％）によるシリカゲルからの溶出（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mechoulam et al., “A New Tetrahydrocannabinolic Acid,” Tetrahedron Letters 10(28):2339-2341 (1969)；Korte et al., “Chemical Classification of Plants.  XXVI. Hashish Constituents by Thin-Layer Chromatography,” Journal of Chromatography 13(1):90-98 (1964)）；カンナビノイド標準品。CBDを単離し、同定した後、定性分析にFast Blue B Salt 色素を使用した。次に、トリメチルシリル化後、カンナビノイドを、OV225（50'のSCOTカラム）またはOV17（クロモソルブW上に2％、5'のカラム）を使用したGLCにより分析した。酸性カンナビノイドの概算は、ピリジン中の加熱による脱炭酸後に行った。
【００９９】
蛍光標識ELISAを用いて、試料の生理活性を測定した。
【０１００】
実施例4：新規の有効かつ大規模に実現可能なCBD生理活性検査
高純度の天然に存在するCBD分子は、2014年にイスラエルのティックーン・オラムより得られたアヴィデケル植物から、音波による分画および超遠心分離法により抽出された。組換えヒトCB2を発現するCHO細胞の膜画分を使用し、この標準試料に対して[3H]-CP55940置換アッセイを実施した。更に、この標準試料に対して、本明細書に記載のMCAの結合を検査した。その結果得られた置換および結合値は、26個のCBD試料（Natural Hemp Solutions、ジョージア州、アトランタより入手）の比較対象とする標準品として使用された。
【０１０１】
26個の試料について、CHO−CB2結合とMCA結合との相関関係を調査した。MCA結合がCHO−CB2と相関する場合、それを代わりに用いて、より速く、より効率的な検査が可能となる。
【０１０２】
26個のCBDサンプルのCB2結合値とCAC結合値に対してRを使用して、ピアソン相関分析を実施した。組換えヒトCB2および最高の親和性を示すMCAの両方に対する結合親和性は、高純度CBD分子が示す結合親和性と比較した割合として、表2に記載されている。ピアソン相関分析を使用することで、これらは相関性が高いことが明らかとなった（ピアソン関数＝0.97）。従って、MCAを使用することで、CBDの生理活性を高精度で予測することができる。
【０１０３】
（表2）26個のCBD産生植物試料における、MCAに対する結合親和性と、CB2複合体に対する結合親和性。これらは高い相関性を示す（r＝0.97）。
2021506273.tif 000010
【０１０４】
好結果の大規模に実現可能なCBD生理活性検査が確認された。生理活性値は、単離可能な最も純粋なCBD分子のCHO−CB2への結合と比較とした場合の0〜1の割合で表される。数値が低いほど、生理活性が低いことを示す。CBD分子が0.5未満の生理活性値を有する場合、生理活性値が1の分子の半分の強さのCBD−CB2結合が見られると予想される。ある分子の有する生理活性の観測値が0.2の場合、生理活性が1の分子の五分の一の強度の結合親和性が予想される。この検査は、植物の広範囲における様々な部分での生理活性分子の分布を明らかにするものである。
【０１０５】
実施例5：植物器官に応じたカンナビスCBD生理活性
カンナビス植物の様々な器官においてCBDの収率が異なることは、栽培者には周知であり、花での産出量が最も高い（主に雌株に存在する分泌毛の先端は、相当量のカンナビノイドを有する樹脂腺を含む。葉におけるこれらの腺の数は少ない（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zuardi, “Cannabidiol: From an Inactive Cannabinoid to a Drug with Wide Spectrum of Action,” Revista Brasileira de Psiquiatria 30(3);271-280 (2008)））。しかしながら、様々な器官より抽出されたCBDの生理活性は、これまで研究されてこなかった。
【０１０６】
実施例1において確認された生理活性検査を用いて、米国、インド、中国、およびチェコ共和国から入手したカンナビスの異なる48種の栽培品種の4領域を検討した。花、葉柄、頂芽／葉、および柄は、別々に検査した。音波による分画および超遠心分離法の組み合わせを花に使用することで、精製された試料を得た。また、冷溶媒抽出を用いることで、花、葉柄、頂芽／葉、および柄からCBDを得た。
【０１０７】
植物器官を唯一の要素とし、生理活性に関して、1x5分散解析（ANOVA）および適切な事後の比較を実施した。生理活性の平均値および標準誤差をプロットした。
【０１０８】
ルビーン検定により、器官の間に不等分散性の分散が示された（F(4,235)＝6.05、p＜0.001）。そのようなものとして、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wilcox, Introduction to Robust Estimation & Hypothesis Testing、第三版、Elsevier、オランダ、アムステルダム、（2012）に記載されるロバストANOVAが実施された。その結果、遠心分離により抽出された花CBDの生理活性（M＝0.96、SD＝0.02）、花から溶媒抽出されたCBDの生理活性（M＝0.86、SD＝0.04）、葉柄から溶媒抽出されたCBDの生理活性（M＝0.54、SD＝0.03）、頂芽／葉から溶媒抽出されたCBDの生理活性（M＝0.4、SD＝0.04）、および柄から溶媒抽出されたCBDの生理活性（M＝0.19, SD＝0.02）の間に有意な差が見いだされた。F(4, 70.38)＝9885.21、p＜0.001。(20%トリム平均は、上記のとおり)。
【０１０９】
ロバスト事後比較（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mair et al., “Robust Statistical Methods in R Using the WRS2 Package,” Technical Report Harvard University (2016)）から、CBDの源である各カテゴリー間の有意差が明らかにされた。（各比較のpsihat値、およびそれに関連する信頼区間に関しては、表3を参照のこと。）
【０１１０】
（表3）生理活性のロバストな一元配置ANOVA事後比較のpsihat値および対応する信頼区間の値（カギ括弧内）。各事後比較のpsihat値は、20％トリム平均を用いて得た。対応する95％信頼区間値はカギ括弧内に示した。全ての関連するp値は、＜0.001である。
2021506273.tif 000011
要約すると、各植物の莢において最も高いCBD生理活性が見出され、葉柄、頂芽／葉、柄の順に生理活性が低くなった（図4参照のこと）。各植物から得られた個々の生理活性スコアを表4に示す。
【０１１１】
(表4)カンナビスの48種の栽培品種、およびそれらの植物器官に応じた関連する生理活性レベル
2021506273.tif 000012
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【０１１２】
これらの結果は、抽出方法による違いを示した。音波による分画および超遠心分離法の組み合わせから、最高の生理活性を有するCBDが作製された。音波による分画および超遠心分離抽出法は、大きな労働力と多くの器具を必要とする実験室法であり、大規模製造には不向きである。対照的に、エタノール溶媒抽出は、少量の生理活性の低下を引き起こすが、これは大規模に実現可能であり、比較的安価に実施できる。それゆえに、これは、商業的なCBDの製造としては、はるかに一般的な手法である。
【０１１３】
結果は、エタノール抽出に供された植物器官の間に、標準的なCBD生理活性パターンを示している。花が最も高い生理活性を有するCBD分子を産生し、その活性は、柄より抽出されたCBDの5倍のレベルであった。生理活性の高いCBDを生産するためには、花のみを使用するべきである。商用CBD供給者が植物の茎および樹皮に由来する生物由来資源を混合した後に抽出を行っている場合、その産物は低い生理活性を有するであろう。
【０１１４】
実施例6：CBDの新規非カンナビス植物原料の持つ生理活性の検証
CBDを産生するフムルス属由来の植物を使用し、フムルス・クリヤ（Humulus Kriya）と呼ばれる新規植物を開発した。これはTHCを産生せず、GRASと考えられる植物の科に由来し（FDA、タイトル21、第3巻、セクション182.2-CAS 8060-28-4）、インド食品安全基準局（FSSAI）により「食品原料成分」として認定されている。これは付則表に分類されるものではない。実施例5と同様の方法を使用して、H.クリヤの様々な部位の生理活性プロファイルを検証した。
【０１１５】
ImmunAG, LLP（インド）より提供された6つのH.クリヤ植物、および31個のImmunAG油性抽出物試料から、試料を作製した。
【０１１６】
ウェルチのtを用いて、5つの群全てのH.クリヤのCBD生理活性を、カンナビス試料のそれと比較した。各植物について得られたそれぞれの生理活性スコアを表5に示した。
【０１１７】
（表5）6つのImmunAG試料、およびその植物器官ごとの関連する生理活性レベル
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【０１１８】
遠心分離されたH.クリヤ由来の莢CBD（M＝0.95、SD＝0.01）は、カンナビス試料と比較して、生理活性に差が無いことが示された、t(8.6594)＝1.74、p＝0.12。溶媒抽出された莢CBD（M＝0.86、SD＝0.06）は、差が無いことが示された、t(5.3803)＝0.007、p＝0.99。溶媒抽出された葉柄CBD（M＝0.54、SD＝0.01）は、差が無いことが示された、t(14.123)＝0.373、p＝0.715。溶媒抽出された葉CBD（M＝0.41、SD＝0.04）は、差が無いことが示された、t(6.164)＝-1.0212、p＝0.346。溶媒抽出された茎CBD（M＝0.20、SD＝0.01）は、差が無いことが示された、t(7.322)＝-1.143、p＝0.289。H.クリヤは、検査したカンナビス品種と同等のCBD生理活性プロファイルを有すると見られる。比較を図5に示した。
【０１１９】
植物の様々な部分より抽出したCBDに関して、H.クリヤとカンナビスで同等のCBD生理活性が見られた。CBD研究において、H.クリヤは、カンナビスの代わりとして利用可能と見られる。H.クリヤ由来のCBDにはTHCによる汚染の危険性が無く、インド食品安全基準局により食品原料成分として認証されている。
【０１２０】
実施例7：商業的に入手可能なCBD製品の生理活性の検討
市販のCBD試料の生理活性が検討されたことはない。市販のカンナビスに基づく製品から得られた結果を、過去二年間に渡って分析した。これらの試料は、販売業者（Natural Hemp Solutions、Centuria Foods、BSPG、Isodiol、Hammer Enterprises、等）より直接または第三者を経由して送付された。個々の販売業者における生理活性結果は公表されていないが、全ての販売業者における生理活性結果を総合したものは、匿名で発表されている。
【０１２１】
CBD以外の大麻類似分子は多数存在する。非麻／カンナビス原料由来の公表されている二つのCBD供給源は、酵母およびフムルスである。酵母からCBD試料を抽出することはできなかった。H.クリヤ（ImmunAG）より抽出したCBDの生理活性を検査し、市販のカンナビス製品と比較した。
【０１２２】
市販試料の最小生理活性は0.11であり、最大生理活性は0.41であった。ImmunAGの最小生理活性は0.72であり、最大生理活性は0.98であった。両方のクラスの製品の生理活性スコアを図6に示した。
【０１２３】
ImmunAGのCBD生理活性（M＝0.88、SD＝0.06）を、市場の製品のもの（M＝0.23、SD＝0.07）と比較した場合、ウェルチのtから、生理活性に有意な差が見られた、t(41.288)＝53.41、p＜0.001。
【０１２４】
市販のCBDの生理活性は低く、その値は、生理活性が比較的低い器官（柄、茎、樹皮、および葉）の値と一致した。供給業者は、嵩を増やし、規制に適合させるために、柄、茎、および葉の多い生物由来資源を使用した可能性がある。注意点としては、生理活性の低いCBDは、望まれる強い免疫細胞シグナルを生じさせない可能性がある。市販のCBDの生理活性には大きなばらつきがあり、最小値は0.11であり、最大値は0.41であった。最高値の市販試料は、最低値の試料の約4倍の効力を有していた。無検査のままの場合、生理活性の低いCBDは、医療用途や研究において混乱を生じ易くさせ、間違った結果がもたらされるであろう。
【０１２５】
ImmunAG試料は0.72から0.98の範囲であり、最も低いImmunAG生理活性は、最も高い市販のカンナビスに基づくCBDの生理活性よりも高かった。ImmunAGはH.クリヤの花のみから作製されているため、これは驚くべきことではない。監査から、注意深く制御された処理条件も、ImmunAGが有意に高い生理活性を維持することを可能にしたことが明らかになった。
【０１２６】
実施例4〜7の考察
モノクローナル抗体を用いたCBD生理活性の検査は実行可能であることが明らかになった。異なる植物器官より抽出されたCBDは異なる生理活性を有することが見出され、花が最も高い生理活性を有し、柄／茎が最も低い生理活性を有していた。カンナビスと類似の生理活性プロファイルを有する非カンナビスCBD産生植物であるH.クリヤを評価した。市販されている麻／カンナビスに基づくCBD製品は、低い生理活性を有することが見出された。H.クリヤから作製された市販のCBD製品が、最も高い生理活性を有することが見出された。
【０１２７】
CBD−CB2相互作用は、広範囲にわたる免疫学的効果の原因となっている。研究された試料は、幅広く異なる生理活性レベルを有していた。歴史的研究結果は、複数の生理活性レベルにより、人知れず混乱させられてきた可能性がある。医学研究を目的としてCBDを用いる科学的研究は、最高の生理活性レベルを有する製品を使用するよう努力するべきである。
【０１２８】
本明細書において好ましい態様を詳細に記述して説明したが、本発明の精神から逸脱しない様々な改変、付加、置換等を行うことができ、したがって、これらは、下記の特許請求の範囲内に定義される本発明の範囲内であると見なされることは当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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