(57)【要約】  本開示は、特に肝実質細胞でのＧＹＳ２発現を低減させるために有用なオリゴヌクレオチド、組成物、及び方法に関する。また、ＧＹＳ２発現を低減させるための本開示のオリゴヌクレオチドは、二本鎖であってもよく又は一本鎖であってもよく、ヌクレアーゼに対するより強力な耐性及びより低い免疫原性等の特徴の向上のために修飾されていてもよいまた、ＧＹＳ２発現を低減させるための本開示のオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞等の特定の細胞又は臓器を標的とするための標的指向性リガンドを含んでいてもよく、糖原病（例えば、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸ）及び関連状態を治療するために使用することができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号４１７〜４６６、５７５〜５８０、５８６〜５９８、及び６２０〜６２７のいずれか１つに示される配列を含むアンチセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号３８５〜４１６、５６９〜５７４、５８１〜５８５、及び６１２〜６１９のいずれか１つに示される配列を含むセンス鎖を更に含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖が、配列番号４１７〜４６６、５７５〜５８０、５８６〜５９８、及び６２０〜６２７のいずれか１つに示される配列からなる、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記センス鎖が、配列番号３８５〜４１６、５６９〜５７４、５８１〜５８５、及び６１２〜６１９のいずれか１つに示される配列からなる、請求項２又は３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号５９９〜６０８のいずれか１つに示されるＧＹＳ２の標的配列との相補性領域を有し、前記相補性領域が、少なくとも１５連続ヌクレオチド長である、オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記相補性領域が、前記ＧＹＳ２の標的配列と完全に相補的である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖が、１９〜２７ヌクレオチド長である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記アンチセンス鎖が、２１〜２７ヌクレオチド長である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記センス鎖が、１５〜４０ヌクレオチド長であり、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、請求項２〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記センス鎖が、１９〜４０ヌクレオチド長である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記二重鎖領域が、少なくとも１９ヌクレオチド長である、請求項９又は１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記二重鎖領域が、少なくとも２１ヌクレオチド長である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
ＧＹＳ２との前記相補性領域が、少なくとも１９連続ヌクレオチド長である、請求項５〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ＧＹＳ２との前記相補性領域が、少なくとも２１連続ヌクレオチド長である、請求項５〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記センス鎖が、配列番号３８５〜４１６、５６９〜５７４、５８１〜５８５、及び６１２〜６１９のいずれか１つに示される配列を含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記アンチセンス鎖が、配列番号４１７〜４６６、５７５〜５８０、５８６〜５９８、及び６２０〜６２７のいずれか１つに示される配列を含む、請求項５〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記センス鎖が、配列番号３８５〜４１６、５６９〜５７４、５８１〜５８５、及び６１２〜６１９のいずれか１つに示される配列からなる、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記アンチセンス鎖が、配列番号４１７〜４６６、５７５〜５８０、５８６〜５９８、及び６２０〜６２７のいずれか１つに示される配列からなる、請求項５〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記センス鎖が、その３’−末端に、Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループを含み、式中、Ｓ1が、Ｓ2と相補的であり、Ｌが、Ｓ1とＳ2との間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成する、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖が、２１〜２７ヌクレオチド長であり、ＧＹＳ２との相補性領域を有し、
前記センス鎖が、その３’末端に、Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループを含み、式中、Ｓ1がＳ2と相補的であり、Ｌが、Ｓ1とＳ2との間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成し、
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、少なくとも１９ヌクレオチド長の二重鎖構造を形成するが、共有結合で連結されていない、オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記相補性領域が、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡの少なくとも１９個の連続ヌクレオチドと完全に相補的である、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
Ｌが、テトラループである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
Ｌが、４ヌクレオチド長である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
Ｌが、ＧＡＡＡとして示される配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記アンチセンス鎖が、２７ヌクレオチド長であり、前記センス鎖が、２５ヌクレオチド長である、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、２５ヌクレオチド長の二重鎖領域を形成する、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記アンチセンス鎖に２ヌクレオチド長の３’−突出配列を更に含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
各々が２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
１９〜２１ヌクレオチド長の範囲の二重鎖構造を含む、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
１又は複数ヌクレオチド長の３’−突出配列を含み、前記３’−突出配列が、前記アンチセンス鎖、前記センス鎖、又は前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖に存在する、請求項２８又は２９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
２ヌクレオチド長の３’−突出配列を含み、前記３’−突出配列が、前記アンチセンス鎖に存在し、前記センス鎖が、２１ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチド長であり、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、２１ヌクレオチド長の二重鎖を形成する、請求項２８又は２９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−修飾を含む、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記２’−修飾が、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、全て修飾されている、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記アンチセンス鎖の５’−ヌクレオチドの糖の４’−炭素が、ホスフェート類似体を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ホスフェート類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
各標的指向性リガンドが、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
各標的指向性リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記ＧａｌＮａｃ部分が、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記ステム−ループのＬの最大で４個のヌクレオチドが、各々一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記標的指向性リガンドが、アプタマーを含む、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む、組成物。
【請求項４７】
オリゴヌクレオチドを対象に送達するための方法であって、請求項４６に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４８】
対象における糖原病の１つ又は複数の症状を減少させるための方法であって、請求項４６に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４９】
肝腫大、肝小結節形成、肝毒性、肝線維症、肝細胞増殖、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び／又は肝細胞癌を減少又は予防するための方法であって、請求項４６に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５０】
ＡＳＴ、ＡＬＴ、及びＡＬＰからなる群から選択される１つ又は複数の酵素のレベルが減少する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象が、糖原病に罹患している、請求項４９又は請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記糖原病が、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸからなる群から選択される、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、１５〜５０ヌクレオチド長のセンス鎖及び１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、前記センス鎖が、配列番号３８５〜４１６、５６９〜５７４、５８１〜５８５、及び６１２〜６１９のいずれか１つに示される配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号４１７〜４６６、５７５〜５８０、５８６〜５９８、及び６２０〜６２７から選択される相補的配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、表４に示される表の行から選択される１対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年３月２日に出願された米国特許仮出願第６２／６３７５７４号、発明の名称「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＨＩＢＩＴＩＮＧ  ＧＹＳ２  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものである。この文献の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、オリゴヌクレオチド及びそれらの使用、特に糖原病及び関連状態の治療に関する使用に関する。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、ファイル名がＤ０８００．７００１４ＷＯ００−ＳＥＱ．ｔｘｔであり、２０１９年２月１５日に作成され、サイズが１３２キロバイトのファイルとして提供されている。電子形式の配列表の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
グリコーゲンは、グルコースを貯蔵するために身体が使用する複合糖である。身体が機能するためにより多くのグルコースを必要とする場合、通常、細胞プロセスで使用するために、貯蔵されたグリコーゲンを分解する。幾つかの酵素が、グルコースをグリコーゲンとして貯蔵し（グリコーゲン合成）、グリコーゲンをグルコースへと分解する（グリコーゲン分解）ために使用されるプロセスに参加する。こうした酵素の１つ又は複数が阻害されると、影響を受けた細胞（例えば、肝臓細胞及び／又は筋肉細胞）でのグリコーゲン貯蔵不足、グリコーゲン蓄積、又は構造が異常なグリコーゲンの形成が観察され得る糖原病がもたらされる場合がある。グリコーゲン貯蔵又は分解の障害が生じると、影響を受けたものは、これらに限定されないが、肝腫大、肝毒性の増加（例えば、より高いレベルのＡＳＴ、ＡＬＴ、及び／又はＡＬＰ）、肝線維症、肝臓での脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び／又は肝細胞癌を含む幾つかの症状を被る場合がある。例示的な糖原病の非限定的なセットとしては、以下のものを挙げることができる：ＧＳＤＩ（例えば、ＧＳＤＩａ）、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸ。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の態様は、対象の糖原病（例えば、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、又はＧＳＤＩＸ等のグリコーゲン分解又は貯蔵に影響を及ぼす疾患又は障害）を治療するためのオリゴヌクレオチド及び関連方法に関する。一部の実施形態では、対象のＧＹＳ２発現を選択的に阻害するための強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発された。一部の実施形態では、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝実質細胞での全体的なＧＹＳ２活性を低減し、それにより、肝腫大、肝毒性（例えば、ＡＳＴ、ＡＬＴ、及び／又はＡＬＰのレベル）、肝線維症、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び／又は肝細胞癌を減少又は予防するために有用である。一部の実施形態では、そのようなオリゴヌクレオチドに基づく手法（例えば、実施例１を参照）を使用して特に標的とし易い、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡの重要な領域（ホットスポットと呼ばれる）を、本明細書で特定した。
本開示の一態様は、ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７のいずれか１つに示されている配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号４１７〜４６６、５７５〜５８０、５８６〜５９８、６２０〜６２７のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列を含むセンス鎖を更に含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号３８５〜４１６、５６９〜５７４、５８１〜５８５、６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなる。
【０００５】
本開示の一態様は、ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５９９〜６０８のいずれか１つに示されている、ＧＹＳ２の標的配列との相補性領域を有する。一部の実施形態では、相補性領域は、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２連続ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、相補性領域は、ＧＹＳ２の標的配列に完全に相補的である。一部の実施形態では、ＧＹＳ２の相補性領域は、少なくとも１９連続ヌクレオチド長である。
【０００６】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１９〜２７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１〜２７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５〜４０ヌクレオチド長のセンス鎖であって、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成するセンス鎖を更に含む。一部の実施形態では、センス鎖は、１９〜４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２７ヌクレオチド長であり、センス鎖は、２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、二重鎖領域は、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、２５ヌクレオチド長の二重鎖領域を形成する。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々が２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１９〜２１ヌクレオチド長の範囲である二重鎖構造を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１又は複数ヌクレオチド長の３’−突出配列を含み、３’−突出配列は、アンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２ヌクレオチド長のアンチセンス鎖に３’−突出配列を更に含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは２ヌクレオチド長の３’−突出配列を含み、３’−突出配列はアンチセンス鎖に存在し、センス鎖は２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長であり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長の二重鎖を形成する。
【０００７】
一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７のいずれか１つに示されている配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７のいずれか１つに示されている配列からなる。
【０００８】
一部の実施形態では、センス鎖は、Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されているステム−ループをその３’末端に含み、式中Ｓ1は、Ｓ2に相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成する。
本開示の別の態様は、ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、２１〜２７ヌクレオチド長であり、ＧＹＳ２との相補性領域を有し、センス鎖は、Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループをその３’末端に含み、式中Ｓ1は、Ｓ2に相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成し、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、少なくとも１９ヌクレオチド長の二重鎖構造を形成するが、共有結合では連結されていない、オリゴヌクレオチドを提供する（例えば、図３を参照）。一部の実施形態では、相補性領域は、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡの少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１個の連続ヌクレオチドに完全に相補的である。一部の実施形態では、Ｌは、テトラループである。一部の実施形態では、Ｌは、４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、Ｌは、ＧＡＡＡとして示される配列を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−修飾を含む。一部の実施形態では、２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、全て修飾されている。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の５’−ヌクレオチドの糖の４’−炭素は、ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。一部の実施形態では、ＧａｌＮａｃ部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である。一部の実施形態では、ステム−ループのＬの最大で４個のヌクレオチドが、各々一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、アプタマーを含む。
本開示の別の態様は、本開示のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物を提供する。本開示の別の態様は、本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、上記方法は、肝腫大、肝小結節形成、肝毒性（例えば、ＡＳＴ、ＡＬＴ、及び／又はＡＬＰのレベル）、肝線維症、肝細胞増殖、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び／又は肝細胞癌のレベル減少又は予防をもたらす。本開示の別の態様は、糖原病又は糖原病の１つ若しくは複数の症状を治療するための方法を提供する。例示的な糖原病の非限定的セットとしては、ＧＳＤＩ（例えば、ＧＳＤＩａ）、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸを挙げることができる。
【００１０】
本開示の別の態様は、ＧＹＳ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、１５〜４０ヌクレオチド長のセンス鎖及び１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、センス鎖は、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７から選択される相補的配列を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表４に示されている表の行から選択される１対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。
【００１１】
本明細書に組み込まれており、本明細書の一部分を構成する添付の図面は、ある実施形態を図示するものであり、記載されている説明と共に、本明細書で開示されている組成物及び方法のある態様の非限定的な例を提供する役目を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＨＥＫ−２９３細胞で２６４個のＧＹＳ２コンジュゲートをスクリーニングした後に残存したＧＹＳ２  ｍＲＮＡのパーセンテージを示すグラフである。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿０２１９５７．３のヌクレオチド位置が、Ｘ軸に示されている。
【図１Ｂ】ＨＥＫ−２９３細胞で２６４個のＧＹＳ２コンジュゲートをスクリーニングした後に残存したＧＹＳ２  ｍＲＮＡのパーセンテージを示すグラフである。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿０２１９５７．３のヌクレオチド位置が、Ｘ軸に示されている。
【図２Ａ】ＨＥＫ−２９３細胞で２つ又は３つの異なる濃度（０．１ｎＭ及び１．０ｎＭ、又は０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１．０ｎＭ）にて７１個のＧＹＳ２オリゴヌクレオチドをＧＹＳ２オリゴヌクレオチドスクリーニングした後に残存したｍＲＮＡのパーセンテージを示す１セットのグラフである。
【図２Ｂ】ＨＥＫ−２９３細胞で２つ又は３つの異なる濃度（０．１ｎＭ及び１．０ｎＭ、又は０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１．０ｎＭ）にて７１個のＧＹＳ２オリゴヌクレオチドをＧＹＳ２オリゴヌクレオチドスクリーニングした後に残存したｍＲＮＡのパーセンテージを示す１セットのグラフである。
【図３】４つのＧａｌＮＡｃ部分（菱形）にコンジュゲートされているニック付きテトラループ構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチドの非限定的な例を示す模式図である。
【図４】１つ又は２つの異なる修飾パターンの異なる塩基配列のＧＹＳ２オリゴヌクレオチドを使用して、ＨＥＫ−２９３細胞でスクリーニングした結果を示すグラフである。Ｘ軸には、評価したオリゴヌクレオチドが標的とするセンス鎖の３’末端が列挙されている。左側には、陰性対照配列（ＮＣ１）、未トランスフェクト細胞、及び疑似トランスフェクト細胞が、対照として示されている。
【図５】ニックテトラループ構造の塩基配列が異なるＧＹＳ２オリゴヌクレオチドを使用してサル肝実質細胞でスクリーニングした結果を示すグラフである。同じ修飾パターンを使用した。オリゴヌクレオチドは、３つの異なる濃度（０．１μＭ、０．３μＭ、及び１．０μＭ）で試験した。左側には、未トランスフェクト細胞が対照として示されている。
【図６Ａ】ＨＥＫ−２９３細胞での用量反応曲線スクリーニングから選択されたＧＹＳ２オリゴヌクレオチドのＩＣ50結果を示す一連のグラフである。
【図６Ｂ】ＨＥＫ−２９３細胞での用量反応曲線スクリーニングから選択されたＧＹＳ２オリゴヌクレオチドのＩＣ50結果を示す一連のグラフである。
【図７】ニック付きテトラループ構造のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＧＹＳ２オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。８つの異なるオリゴヌクレオチド配列を試験した。オリゴヌクレオチドを、０．５ｍｇ／ｋｇにて、ヒトＧＹＳ２を発現するマウスに皮下投与した。データは、ＰＢＳ対照に対して正規化された、投与後４日目に残存したＧＹＳ２  ｍＲＮＡの量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一部の態様によると、本開示は、糖原病（例えば、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸ）又は糖原病の１つ若しくは複数の症状を治療するための、細胞、特に肝臓細胞（例えば、肝実質細胞）でのＧＹＳ２発現低減に効果的な、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。従って、関連態様では、本開示は、糖原病（例えば、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸ）又は糖原病の１つ若しくは複数の症状を治療するための方法であって、肝臓でのＧＹＳ２遺伝子発現を選択的に低減することを含む方法を提供する。ある実施形態では、本明細書で提供されるＧＹＳ２標的指向性オリゴヌクレオチドは、標的組織の選択された細胞（例えば、肝臓肝実質細胞）に送達して、対象の糖原病（例えば、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸ）又は糖原病の１つ若しくは複数の症状を治療するように設計されている。
【００１４】
用語の定義の説明を含む本開示の更なる態様が下記に提供されている。
Ｉ．定義
投与：本明細書で使用される場合、用語「投与する」又は「投与」は、物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を、薬理学的に有用な様式で（例えば、対象の状態を治療するために）対象に提供することを意味する。
およそ：本明細書で使用される場合、１つ又は複数の目的の値に適用される用語「およそ」又は「約」は、表記されている参照値と同様である値を指す。ある実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別様の記述がない限り又は別様に状況から明白でない限り（そのような数値が、可能な値の１００％を超えてしまう場合を除く）、表記されている参照値のいずれかの方向に（より大きな又は未満）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれよりも小さな値内に入る値の範囲を指す。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）：本明細書で使用される場合、用語「アシアロ糖タンパク質受容体」又は「ＡＳＧＰＲ」は、大きな４８ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ−１）及び小さな４０ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ−２）により形成される二分Ｃ型レクチン（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ）を指す。ＡＳＧＰＲは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む循環性糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を有する。
【００１５】
相補的：本明細書で使用される場合、用語「相補的」は、ヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にするヌクレオチド（例えば、一本鎖核酸鎖の向かい合う核酸又は向かい合う領域の２つのヌクレオチド）間の構造的関係性を指す。例えば、向かい合う核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的な一方の核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより共に塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、相補的ヌクレオチドは、ワトソン−クリック様式の、又は安定的二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式の塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載のような、相補性領域を形成するように互いに相補的なヌクレオチド配列を有していてもよい。
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２’位に水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、ホスフェート基、若しくは塩基に修飾を含むか又は糖、ホスフェート基、若しくは塩基の置換を含む、２’位以外の原子の１つ又は複数の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
【００１６】
二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「二本鎖オリゴヌクレオチド」は、実質的に二重鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に別々の核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に連結されている核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、フォールディングして（例えば、ヘアピンにより）互いに塩基対を形成するヌクレオチドの相補的逆平行配列を提供する一本鎖核酸鎖で形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重鎖である２つの共有結合的に別々の核酸鎖を含む。しかしながら、一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二重鎖であり、例えば一方の又は両方の末端に突出を有する２つの共有結合的に別々の核酸鎖を含む。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であり、従って、内部ミスマッチ又は末端ミスマッチを含んでいてもよい１つ又は複数のミスマッチを有していてもよいヌクレオチドの逆平行配列を含む。
【００１７】
二重鎖：本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関する用語「二重鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合により形成される構造を指す。
賦形剤：本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、例えば、所望の稠度又は安定化効果を提供又は寄与するように組成物に含まれていてもよい非治療剤を指す。
糖原病：本明細書で使用される場合、用語「糖原病」、「ＧＳＤ」、又は「糖原病（複数）」は、グリコーゲン合成、グリコーゲン分解、及び／又はグルコース分解（解糖）に影響を及ぼす酵素欠損により引き起こされる代謝障害を指す。ＧＳＤ  ０、ＧＳＤ  Ｉ（ＧＳＤ１又はフォンギールケ病としても知られている；例えば、ＧＳＤＩａ）、ＧＳＤ  ＩＩ（ポンペ病又は酸性マルターゼ欠乏症としても知られている）、ＧＳＤ  ＩＩＩ（ＧＳＤ３、コリ病、又はフォーブズ病としても知られている）、ＧＳＤ  ＩＶ（ＧＳＤ４又はアンダーセン病）、ＧＳＤ  Ｖ（マッカードル病としても知られている）、ＧＳＤ  ＶＩ（ＧＳＤ６又はハース病としても知られている）、ＧＳＤ  ＶＩＩ（ＧＳＤ７又は垂井病としても知られている）、ＧＳＤ  ＶＩＩＩ、及びＧＳＤ  ＩＸ（ＧＳＤ９としても知られている）を含む種々のタイプの糖原病が特徴付けられている。一部の実施形態では、糖原病を有する個体は、これらに限定されないが、肝腫大、肝毒性の増加（例えば、より高いレベルのＡＳＴ、ＡＬＴ、及び／又はＡＬＰ）、肝線維症、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び／又は肝細胞癌を含む、幾つかの症状を呈する。
【００１８】
ＧＹＳ２：本明細書で使用される場合、用語「ＧＹＳ２」又は「グリコーゲン合成酵素２」は、肝臓グリコーゲン合成酵素遺伝子を指す。この遺伝子は、グリコーゲンの合成における律速段階（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｓｔｅｍ）（つまり、ＵＤＰ−グルコースからグリコーゲン分子の末端枝へのグルコース分子の移転）を触媒するタンパク質である肝臓グリコーゲン合成酵素をコードする。ＧＹＳ２は、肝臓細胞、例えば肝実質細胞で発現される。ＧＹＳ２の相同体は、ヒト、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類種等を含む一連の種にわたって保存されている（例えば、ＮＣＢＩ  ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：５６５８０を参照）。ヒトでは、ＧＹＳ２は、複数の転写物、つまり、各々が異なるアイソフォームをコードするＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２１９５７．３（配列番号６０９）、ＸＭ＿００６７１９０６３．３、及びＸＭ＿０１７０１９２４５．１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６８７７６．２、ＸＰ＿００６７１９１２６．１（アイソフォームＸ１）及びＸＰ＿０１６８７４７３４．１（アイソフォームＸ２）にそれぞれ示されている複数の転写物をコードする。例示的なサル（アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ））転写物配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿００１０９８５７８．２（配列番号６１０）に示されている。例示的なマウス転写物は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１４５５７２．２（配列番号６１１）に示されている。
【００１９】
肝実質細胞：本明細書で使用される場合、用語「肝実質細胞」又は「肝実質細胞（複数）」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。こうした細胞は、肝臓質量のおよそ７０〜８５％を占め、血清アルブミン、フィブリノーゲン、及びプロトロンビン群の凝固因子（第３因子及び第４因子を除く）を製造する。肝実質細胞系細胞のマーカーとしては、これらに限定されないが、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミンシンテターゼ（Ｇｌｕｌ）、肝実質細胞核内因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝実質細胞核内因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）を挙げることができる。成熟肝実質細胞のマーカーとしては、これらに限定されないが、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ（Ｆａｈ）、グルコース６−ホスフェート（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２−２Ｆ８を挙げることができる。例えば、Ｈｕｃｈら（２０１３年）、Ｎａｔｕｒｅ、４９４巻（７４３６号）：２４７〜２５０頁を参照されたい。この文献の肝実質細胞マーカーに関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
ループ：本明細書で使用される場合、用語「ループ」は、互いに十分に相補的な核酸の２つの逆平行領域によりフランキングされる核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の非対合領域を指し、非対合領域をフランキングする２つの逆平行領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下で（例えば、リン酸緩衝液中で、細胞中で）ハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成する。
修飾ヌクレオチド間連結：本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド間連結」は、リン酸ジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間連結と比較して、１つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチド間連結を指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは非天然連結である。典型的には、修飾ヌクレオチド間連結は、修飾ヌクレオチド間連結が存在する核酸に１つ又は複数の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは非天然ヌクレオチドである。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／又はホスフェート基に１つ又は複数の化学的修飾を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドにコンジュゲートされた１つ又は複数の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ又は複数の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース環の２’位に２’−Ｏ−メチル置換又は２’−Ｆ置換を含む。
【００２１】
ニック付きテトラループ構造：「ニック付きテトラループ構造」は、別々のセンス鎖（パッセンジャー鎖）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖）が存在することにより特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造であって、センス鎖は、２つの鎖が二重鎖を形成するようにアンチセンス鎖との相補性領域を有し、鎖の少なくとも一方、一般にはセンス鎖は、二重鎖から伸長し、伸長は、テトラループ及びテトラループに隣接するステム領域を形成する２つの自己相補的配列を含み、テトラループは、少なくとも一方の鎖の自己相補的配列により形成される隣接ステム領域を安定させるように構成されている構造である。
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、１００ヌクレオチド長未満の短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／又は例えば修飾リボヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもよく又は二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有していてもよく又は有していなくともよい。１セットの非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ、ｄｉｃｅｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、又は一本鎖ｓｉＲＮＡであってもよい。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
突出：本明細書で使用される場合、用語「突出」は、１つの鎖又は領域がそれと二重鎖を形成する相補的鎖の末端を越えて伸長する１つの鎖又は領域から生じる末端非塩基対合ヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、突出は、二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の二重鎖領域から伸長する１つ又は複数の非対合ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、突出は、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖にある３’突出又は５’突出である。
ホスフェート類似体：本明細書で使用される場合、用語「ホスフェート類似体」は、ホスフェート基の静電気特性及び／又は立体特性を模倣する化学部分を指す。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、酵素的に除去され易いことが多い５’−ホスフェートの代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置されている。一部の実施形態では、５’ホスフェート類似体は、ホスファターゼ耐性連結を含む。ホスフェート類似体の例としては、５’メチレンホスホネート（５’−ＭＰ）及び５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）等の５’ホスホネートが挙げられる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチドの糖の４’−炭素位置にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ばれる）。４’−ホスフェート類似体の例は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’−炭素に）又はその類似体に結合されているオキシメチルホスホネートである。例えば、２０１７年９月１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９号、２０１６年９月２日に出願された米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号明細書、及び２０１６年９月１２日に出願された第６２／３９３，４０１号明細書を参照されたい。これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの５’末端には、他の修飾が開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号；米国特許第８，９２７，５１３号明細書；及びＰｒａｋａｓｈら（２０１５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、４３巻（６号）：２９９３〜３０１１頁を参照、これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２３】
発現の低減：本明細書で使用される場合、遺伝子の「発現の低減」という用語は、遺伝子によりコードされるＲＮＡ転写物若しくはタンパク質の量の減少、及び／又は適切な参照細胞若しくは参照対象と比較した細胞若しくは対象の遺伝子の活性の量の減少を指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で細胞を処理する行為は、二本鎖オリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、ＲＮＡ転写物、タンパク質、及び／又は酵素活性（例えば、ＧＹＳ２遺伝子によりコードされる）の量の減少をもたらすことができる。同様に、「発現を低減する」は、本明細書で使用される場合、遺伝子（例えば、ＧＹＳ２）の発現の低減をもたらす行為を指す。
【００２４】
相補性領域：本明細書で使用される場合、用語「相補性領域」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、例えば、リン酸緩衝液中、細胞中等で、ヌクレオチドの２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にするために、ヌクレオチドの逆平行配列（例えば、ｍＲＮＡ内の標的ヌクレオチド配列）と十分に相補的である核酸（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）のヌクレオチドの配列を指す。相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその部分内に存在する標的ヌクレオチド配列）と完全に相補的であってもよい。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列と完全に相補的である相補性領域は、ｍＲＮＡの対応する配列と一切のミスマッチ又はギャップ無しで相補的であるヌクレオチドの連続配列を有する。或いは、相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその部分に存在するヌクレオチド配列）と部分的に相補的であってもよい。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列と部分的に相補的である相補性領域は、相補性領域が適切なハイブリダイゼーション条件下でｍＲＮＡと依然としてハイブリダイズ可能である限り、ｍＲＮＡの対応する配列と相補的であるが、ｍＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ又は複数のミスマッチ又はギャップ（例えば、１つ、２つ、３つ、又はそれよりも多くのミスマッチ又はギャップ）を含むヌクレオチドの連続配列を有する。
【００２５】
リボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオチド」は、その２’位にヒドロキシル基を含むリボースをそのペントース糖として有するヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドは、リボース、ホスフェート基、若しくは塩基に修飾を含むか又はリボース、ホスフェート基、若しくは塩基の置換を含む、２’位以外の原子の１つ又は複数の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドである。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部分は、標的ｍＲＮＡの切断に際してアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより使用される、二本鎖オリゴヌクレオチド、又は（ｂ）単一のアンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖（又はそのアンチセンス鎖の一部分）は、標的ｍＲＮＡの切断に際してＡｇｏ２エンドヌクレアーゼにより使用される、一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
鎖：本明細書で使用される場合、用語「鎖」は、ヌクレオチド間連結（例えば、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結）を介して共に連結されているヌクレオチドの単一の連続配列を指す。一部の実施形態では、鎖は、２つの遊離末端、例えば、５’−末端及び３’−末端を有する。
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。用語「個体」又は「患者」は、「対象」と同義的に使用される場合がある。
合成：本明細書で使用される場合、用語「合成」は、人為的に合成されたか（例えば、機械（例えば、固相核酸合成機）を使用して）、又はそうでなければ通常その分子を産生する天然供給源（例えば、細胞又は生物）に由来しない核酸又は他の分子を指す。
【００２６】
標的指向性リガンド：本明細書で使用される場合、用語「標的指向性リガンド」は、目的の組織又は細胞の同種分子（例えば、受容体）と選択的に結合し、他方の物質を目的の組織又は細胞へと標的化するために別の物質にコンジュゲート可能である分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質）を指す。例えば、一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドを目的の特定の組織又は細胞へと標的化するためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、細胞表面受容体と選択的に結合する。従って、一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされると、細胞の表面に発現されている受容体との選択的結合により、並びにオリゴヌクレオチド、標的指向性リガンド、及び受容体を含む複合体の細胞によるエンドソーム内部移行により、特定の細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にする。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドが細胞中で標的指向性リガンドから放出されるように、細胞内部移行後に又は細胞内部移行中に切断されるリンカーを介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。
【００２７】
テトラループ：本明細書で使用される場合、用語「テトラループ」は、ヌクレオチドのフランキング配列のハイブリダイゼーションにより形成される隣接二重鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、無作為に選択されたヌクレオチドの配列からなる同等の長さの１セットのループから平均して予想される隣接ステム二重鎖のＴmよりも高い隣接ステム二重鎖の融解温度（Ｔm）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ4中で、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、又は少なくとも７５℃の融解温度を、少なくとも２塩基対長の二重鎖を含むヘアピンに付与することができる。一部の実施形態では、テトラループは、スタッキング相互作用により隣接ステム二重鎖中の塩基対を安定させることができる。加えて、テトラループのヌクレオチド間の相互作用としては、これらに限定されないが、非ワトソン−クリック型塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が挙げられる（Ｃｈｅｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０年８月１６日；３４６巻（６２８５号）：６８０〜２頁；Ｈｅｕｓ及びＰａｒｄｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年７月１２日；２５３巻（５０１６号）：１９１〜４頁）。一部の実施形態では、テトラループは、３〜６個のヌクレオチドを含むか又はからなり、典型的には４〜５個のヌクレオチドである。ある実施形態では、テトラループは、修飾されていてもよく又はされていなくともよい（例えば、標的指向性部分にコンジュゲートされていてもよく又はされていなくともよい）３、４、５、又は６個のヌクレオチドを含むか又はからなる。一実施形態では、テトラループは、４個のヌクレオチドからなる。任意のヌクレオチドをテトラループに使用することができ、Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻：３０２１〜３０３０頁に記載の、そのようなヌクレオチドの標準ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ記号を使用することができる。例えば、文字「Ｎ」は、その位置には任意の塩基が存在してもよいことを意味するために使用することができ、文字「Ｒ」は、その位置にはＡ（アデニン）又はＧ（グアニン）が存在してもよいことを示すために使用することができ、「Ｂ」は、その位置にはＣ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、又はＴ（チミン）が存在してもよいことを示すために使用することができる。テトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０年１１月；８７巻（２１号）：８４６７〜７１頁；Ａｎｔａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１年１１月１１日；１９巻（２１号）：５９０１〜５頁）。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテ��ラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、Ｎａｋａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１巻（４８号）、１４２８１〜１４２９２頁、２００２年。ＳＨＩＮＪＩら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  第７８巻；２号；７３１頁（２０００年）を参照されたい。これらの文献は、それらの関連開示について参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、テトラループは、ニック付きテトラループ構造内に含まれている。
【００２８】
治療する：本明細書で使用される場合、用語「治療する」は、既存の状態（例えば、疾患、障害）と比べて対象の健康及び／又は安寧を向上させるために、又は状態の発生の可能性を予防若しくは減少させるために、例えば、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）を対象に投与することにより、それを必要とする対象に療治を提供する行為を指す。一部の実施形態では、治療は、対象が経験している状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、又は寄与要因の頻度又は重症度を低減させることを含む。
【００２９】
ＩＩ．オリゴヌクレオチドに基づく阻害剤
ｉ．  ＧＹＳ２標的指向性オリゴヌクレオチド
本明細書では、異なる種（ヒト及びアカゲザル、（例えば、実施例１を参照））のｍＲＮＡを含むＧＹＳ２  ｍＲＮＡの調査、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験により、強力なオリゴヌクレオチドが特定された。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、ＧＹＳ２活性を低減させることにより、及び結果的に肝腫大、肝毒性（例えば、ＡＳＴ、ＡＬＴ、及び／又はＡＬＰのレベルにより示される）、肝線維症、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び／又は肝細胞癌を減少又は予防することにより、糖原病（例えば、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸ）又は糖原病の１つ若しくは複数の症状を有する対象の治療利益を達成することができる。例えば、本明細書では、表４に提供されている表にも配置されているような（例えば、配列番号１に示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号１９３に示されている配列を含むアンチセンス鎖）、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなるセンス鎖、及び配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７から選択される相補的配列を含むか又はからなるアンチセンス鎖を有する強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが提供される。
【００３０】
配列は、本明細書に記載のような複数の異なるオリゴヌクレオチド構造（又は形式）に入れることができる。
一部の実施形態では、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡのある領域は、他の領域よりもオリゴヌクレオチドに基づく阻害を起こし易いため、標的化のホットスポットであることが発見された。一部の実施形態では、ＧＹＳ２のホットスポット領域は、配列番号５９９〜６０８のいずれか１つに示されている配列からなる。ＧＹＳ２  ｍＲＮＡのこうした領域は、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡ発現を阻害するための本明細書で考察されているオリゴヌクレオチドを使用して標的とすることができる。
【００３１】
従って、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、細胞中のｍＲＮＡを標的としその発現を阻害するための、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡ（例えば、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡのホットスポット内）との相補性領域を有するように設計されている。相補性領域は、一般に、オリゴヌクレオチド（又はその鎖）が、その発現を阻害することを可能にするためにＧＹＳ２  ｍＲＮＡにアニーリングするのに好適な長さ及び塩基内容である。
【００３２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡのホットスポット領域内にマッピングされる配列を含む、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９に示されている配列と少なくとも部分的に相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９に示されている配列と完全に相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。一部の実施形態では、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９に示されている配列の連続ヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の長さ全体にわたる。一部の実施形態では、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列の連続ヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の長さ全体の部分にわたる（例えば、アンチセンス鎖の３’末端の２個のヌクレオチドを除いて）。一部の実施形態では、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９に示されている配列のヌクレオチド１〜１９にわたる連続したひと続きのヌクレオチドと少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。
【００３３】
一部の実施形態では、相補性領域は、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１２〜３０（例えば、１２〜３０、１２〜２２、１５〜２５、１７〜２１、１８〜２７、１９〜２７、又は１５〜３０）ヌクレオチド長の範囲である、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡとの相補性領域を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡとの相補性領域を有する。
【００３４】
一部の実施形態では、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡとの相補性領域は、ＧＹＳ２  ｍＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ又は複数のミスマッチを有してもよい。オリゴヌクレオチドにある相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＧＹＳ２  ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持する限り、最大１つ、最大２つ、最大３つ、最大４つ等のミスマッチを有してもよい。或いは、オリゴヌクレオチドの相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＧＹＳ２  ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力を維持する限り、１つ以下、２つ以下、３つ以下、又は４つ以下のミスマッチを有してもよい。一部の実施形態では、相補性領域に１つよりも多くのミスマッチが存在する場合、それらは、オリゴヌクレオチドが適切なハイブリダイゼーション条件下でＧＹＳ２  ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力を維持する限り、連続的に（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれよりも多くが連続して）配置されていてもよく、又は相補性領域の全体にわたって点在していてもよい。
更に、一部の実施形態では、本明細書に提供されている二本鎖オリゴヌクレオチドは、表４に提供されている表に配置されているような（例えば、配列番号１に示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号１９３に示されている配列を含むアンチセンス鎖）、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列を有するセンス鎖、並びに配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７から選択される相補的配列を有するアンチセンス鎖を含むか又はからなる。
【００３５】
ｉｉ．オリゴヌクレオチド構造
本開示の方法でＧＹＳ２  ｍＲＮＡを標的とするのに有用なオリゴヌクレオチドには、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ等を含む様々な構造が存在する。本明細書又は他所に記載の構造はいずれも、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号５９９〜６０８に示されているもの等のＧＹＳ２のホットスポット配列、或いはそれぞれ、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、若しくは６１２〜６１９に示されているか又は配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、若しくは６２０〜６２７に示されている配列を含むか又はからなるセンス鎖又はアンチセンス鎖）を組み込むか又は標的とするためのフレームワークとして使用することができる。ＧＹＳ２発現を標的とするための二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉ経路により）は、一般に、互いに二重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されていない。しかしながら、一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されている。
【００３６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の配列は、両方とも１７〜４０ヌクレオチド長の範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドに組み込まれていてもよく、又はそうしたオリゴヌクレオチドを使用して標的化することができる。一部の実施形態では、それらのセンス鎖の３’伸長内にテトラループ構造、及びそのアンチセンス鎖の３’末端に２個の末端突出ヌクレオチドを有する、そのような配列が組み込まれているオリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、２個の末端突出ヌクレオチドは、ＧＧである。典型的には、アンチセンス鎖の２個の末端ＧＧヌクレオチドの一方又は両方は、標的と相補的であるかそうではない。
【００３７】
一部の実施形態では、両方とも２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する、そのような配列が組み込まれているオリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、１又は２ヌクレオチド長である３’突出が、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に提供されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２３個ヌクレオチドのガイド鎖及び２１個ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有し、パッセンジャー鎖の３’−末端及びガイド鎖の５’−末端は平滑末端を形成し、ガイド鎖は２個ヌクレオチドの３’突出を有する。
一部の実施形態では、ＧＹＳ２発現を低減するための二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす。例えば、各鎖が、１〜５個ヌクレオチドの少なくとも１つの３’突出を有する１９〜２５個ヌクレオチドのサイズを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号明細書を参照）。ダイサーによりプロセシングされて活性ＲＮＡｉ産物を生成するより長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号明細書を参照）。更なる研究により、鎖の一方が熱力学的に安定なテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも一方の鎖の少なくとも一方の末端が二重鎖標的指向性領域を越えて伸長している伸長二本鎖オリゴヌクレオチドがもたらされた（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号明細書及び第８，９２７，７０５号明細書並びに国際公開第２０１００３３２２５号を参照。これらの文献は、それらのオリゴヌクレオチドの開示について参照により本明細書に組み込まれる）。そのような構造としては、一本鎖伸長（分子の一方又は両方の側の）並びに二本鎖伸長を挙げることができる。
【００３８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の３’末端に突出（例えば、１、２、又は３ヌクレオチド長の）を有していてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡｓ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスである２１個ヌクレオチドのガイド鎖、及び相補的パッセンジャー鎖を含んでいてもよく、両鎖はアニーリングして、１９ｂｐ二重鎖、及びいずれかの又は両方の３’末端に２個ヌクレオチドの突出を形成する。例えば、米国特許第９０１２１３８号明細書、米国特許第９０１２６２１号明細書、及び米国特許第９１９３７５３号明細書を参照されたい。これらの文献の各々の内容は、それらの関連開示について本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス−センス二重鎖を越えて伸長する領域を含む３６個ヌクレオチドのセンス鎖を有し、伸長領域は、ステムが６塩基対の二重鎖であり、テトラループが４個のヌクレオチドを有するステム−テトラループ構造を有する。一部の実施形態では、ステム−テトラループは、Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示され、式中、Ｓ1は二重鎖を形成するようにＳ2と相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間にテトラループを形成する。
こうした実施形態にあるものでは、テトラループヌクレオチドの３個又は４個は各々、一価ＧａｌＮａｃリガンドにコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２５個ヌクレオチドのセンス鎖、及びダイサー酵素による作用を受けると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖がもたらされる２７個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。
【００３９】
本明細書で開示されている組成物及び方法で使用するための他のオリゴヌクレオチド設計としては、以下のものが挙げられる：１６量体ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（編）、Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年を参照）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ又はそれよりも短いステムを有する；例えば、Ｍｏｏｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０年；６２９巻：１４１〜１５８頁を参照）、平滑末端ｓｉＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ長の；例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ及びＢａｋｅｒ、ＲＮＡ  １２巻、１６３〜１７６頁（２００６年）を参照）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ。例えば、Ｓｕｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６巻、１３７９〜１３８２頁（２００８年）を参照）、非対称短鎖二重鎖ｓｉＲＮＡ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｓｈｏｒｔｅｒ−ｄｕｐｌｅｘ  ｓｉＲＮＡ）（例えば、Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９年４月；１７巻（４号）：７２５〜３２頁を参照）、フォーク型ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５５７巻、１〜３号；２００４年１月、１９３〜１９８頁を参照）、一本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０巻、１０６３頁（２０１２年））、ダンベル型環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９巻：１５１０８〜１５１０９頁（２００７年）を参照）、及び低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉｓｉＲＮＡ；例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７年９月；３５巻（１７号）：５８８６〜５８９７頁を参照）。上述の参考文献の各々は、その中の関連開示についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＧＹＳ２の発現を低減又は阻害するために一部の実施形態で使用することができるオリゴヌクレオチド構造の更なる非限定的な例は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖ｓｉＲＮＡである（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．、２００２年、２１巻（１７号）：４６７１〜４６７９頁を参照；また米国特許出願公開第２００９００９９１１５号明細書を参照）。
【００４０】
ａ．アンチセンス鎖
一部の実施形態では、ＧＹＳ２を標的とするための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなるアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１９３〜３８４、４１７〜４６６、５１８〜５６８、５７５〜５８０、５８６〜５９８、又は６２０〜６２７のいずれか１つに示されている配列の少なくとも１２個（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３個）の連続ヌクレオチドを含むか又はからなるアンチセンス鎖を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、最大で４０ヌクレオチド長（例えば、最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２７、最大で２５、最大で２１、最大で１９、最大で１７、又は最大で１２ヌクレオチド長）のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、又は少なくとも３８ヌクレオチド長）のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２〜４０（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２２、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０、又は３２〜４０）ヌクレオチド長の範囲のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を有してもよい。
【００４２】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる場合がある。例えば、アンチセンス鎖が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と係合し、アルゴノートタンパク質に結合するか、又は１つ若しくは複数の類似因子と係合若しくは結合し、標的遺伝子のサイレンシングを指図する場合、それをガイド鎖と呼ぶことができる。一部の実施形態では、ガイド鎖と相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる場合がある。
【００４３】
ｂ．センス鎖
一部の実施形態では、ＧＹＳ２を標的とするための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されているセンス鎖配列を含むか又はからなる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１９２、３８５〜４１６、４６７〜５１７、５６９〜５７４、５８１〜５８５、又は６１２〜６１９のいずれか１つに示されている配列の少なくとも１２個（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３個）の連続ヌクレオチドを含むか又はからなるセンス鎖を有する。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、最大で４０ヌクレオチド長（例えば、最大で４０、最大で３６、最大で３０、最大で２７、最大で２５、最大で２１、最大で１９、最大で１７、又は最大で１２ヌクレオチド長）のセンス鎖（又はパッセンジャー鎖）を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３６、又は少なくとも３８ヌクレオチド長）のセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２〜４０（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２１、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０、又は３２〜４０）ヌクレオチド長の範囲のセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド長のセンス鎖を有してもよい。
【００４４】
一部の実施形態では、センス鎖は、その３’−末端にステム−ループ構造を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、その５’−末端にステム−ループ構造を含む。一部の実施形態では、ステムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４塩基対長の二重鎖である。一部の実施形態では、ステム−ループは、分解（例えば、酵素的分解）に対するより良好な保護を分子に提供し、標的細胞へと送達するための標的指向性特徴を促進する。例えば、一部の実施形態では、ループは、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に実質的に影響を及ぼさずに修飾を行うことができる追加のヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、本明細書には、センス鎖が（例えば、その３’−末端に）Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ1は、Ｓ2と相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間に最大で１０ヌクレオチド長（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長）のループを形成するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００４５】
一部の実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）は、テトラループである（例えば、ニック付きテトラループ構造内の）。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組合せを含んでいてもよい。典型的には、テトラループは、４〜５個のヌクレオチドを有する。
【００４６】
ｃ．二重鎖の長さ
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、少なくとも１２（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１）ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長（例えば、１２〜３０、１２〜２７、１２〜２２、１５〜２５、１８〜３０、１８〜２２、１８〜２５、１８〜２７、１８〜３０、１９〜３０、又は２１〜３０ヌクレオチド長）の範囲である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の長さ全体にはわたっていない。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの長さ全体にわたる。ある実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の長さ全体にわたる。
【００４７】
ｄ．オリゴヌクレオチド末端
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のいずれかに、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に、３’−突出が存在する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、一方の５’末端が、他方の５’末端と比較して熱力学的により不安定である。一部の実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の３’末端に突出を含む非対称オリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’突出は、１〜８ヌクレオチド長（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８ヌクレオチド長）である。
典型的には、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に２個ヌクレオチドの突出を有する。しかしながら、他の突出が可能である。一部の実施形態では、突出は、１〜６個ヌクレオチド、任意選択で１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６個ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、若しくは６個ヌクレオチドの長さを含む３’突出である。しかしながら、一部の実施形態では、突出は、１〜６個ヌクレオチド、任意選択で１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６個ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、若しくは６個ヌクレオチドの長さを含む５’突出である。
【００４８】
一部の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端の１つ又は複数の（例えば、２、３、４個の）末端ヌクレオチドは修飾されている。例えば、一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１個又は２個の末端ヌクレオチドは修飾されている。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドは修飾されており、例えば２’−修飾、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１個又は２個の末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１個又は２個のヌクレオチドは、標的と相補的でない。一部の実施形態では、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端及び／又は３’末端は、逆向きキャップヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｃａｐ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を有する。
【００４９】
ｅ．ミスマッチ
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間には１つ又は複数の（例えば、１、２、３、又は４つの）ミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つよりも多くのミスマッチが存在する場合、それらは、連続的に配置されていてもよく（例えば、２つ、３つ、又はそれより多くが連続して）、又は相補性領域の全体にわたって点在していてもよい。一部の実施形態では、センス鎖の３’−末端は、１つ又は複数のミスマッチを含む。一実施形態では、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’−末端のセグメントの塩基ミスマッチ又は不安定化は、恐らくはダイサーによるプロセシングを促進することにより、ＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力を向上させた。
【００５０】
ｉｉｉ．一本鎖オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、本明細書に記載されている、ＧＹＳ２発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。そのような構造としては、これらに限定されないが、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを挙げることができる。最近の努力により、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉら（２０１６年５月）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２４巻（５号）、９４６〜９５５頁を参照）。しかしながら、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に記載して、特定の核酸の標的とされているセグメントの逆相補体を含み、（例えば、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）として）細胞でのその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介性切断を誘導するように、又は（例えば、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）として）細胞での標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように好適に修飾されている核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本開示で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関するその開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５６７，５８７号明細書に示されているものを含む、当該技術で公知の任意の好適な様式で修飾することができる（例えば、長さ、核酸塩基（ピリミジン、プリン）の糖部分、及び核酸塩基のヘテロ環部分の変更を含む）。更に、アンチセンス分子は、特定の標的遺伝子の発現を低減させるために、数十年にわたって使用されている（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、５７巻：８１〜１０５頁を参照）。
【００５１】
ｉｖ．オリゴヌクレオチド修飾
オリゴヌクレオチドは、種々の方法で修飾して、特異性、安定性、送達、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解からの耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布、及び細胞取り込み、及び治療使用又は研究使用に関連する他の特徴を向上又は制御することができる。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００９年、３７巻、２８６７〜２８８１頁；Ｂｒａｍｓｅｎ及びＫｊｅｍｓ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３巻（２０１２年）：１〜２２頁）を参照されたい。従って、一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の好適な修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又はホスフェート基に修飾を有する。
【００５２】
オリゴヌクレオチドの修飾の数及びそうしたヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を及ぼす場合がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、それらを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又は類似の担体にコンジュゲートすることにより又は包含させることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰ又は類似の担体により保護されていない場合（例えば、「ネイキッド送達」）、そのヌクレオチドの少なくとも一部を修飾することが有利であり得る。従って、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれかのある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾されている。ある実施形態では、ヌクレオチドの半分よりも多くが修飾されている。ある実施形態では、ヌクレオチドの半分未満が修飾されている。典型的には、ネイキッド送達の場合、全てのヌクレオチドは、そのヌクレオチドの糖基の２’位が修飾されている。こうした修飾は、可逆的であってもよく又は不可逆的であってもよい。典型的には、２’位置修飾は、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル等である。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素的分解からの保護、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に所望の細胞を標的とする能力、及び／又は熱力学的安定性）をもたらすのに十分な数及びタイプの修飾ヌクレオチドを有する。
【００５３】
ａ．糖修飾
一部の実施形態では、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ばれる）としては、例えば、糖の２’、３’、４’、及び／又は５’炭素位置に１つ又は複数の修飾が生じる修飾デオキシリボース又はリボース部分が挙げられる。また、一部の実施形態では、修飾糖は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎら（１９９８年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４巻、３６０７〜３６３０頁を参照）、アンロックド核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄら（２０１３年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２巻、ｅ１０３頁を参照）、及びブリッジ核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａ（２００２年）、Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１６５３〜１６５９頁を参照）に提示されているもの等の非天然代替炭素構造を含んでいてもよい。Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｓｎｅａｄら、Ｉｍａｎｉｓｈｉ、及びＯｂｉｋａは、糖修飾に関するそれらの開示について参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
一部の実施形態では、糖のヌクレオチド修飾は、２’−修飾を含む。ある実施形態では、２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、又は２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸であってもよい。典型的には、修飾は、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、又は２’−Ｏ−メトキシエチルである。しかしながら、オリゴヌクレオチドに使用するために開発された種々様々な２’位修飾を、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドに使用することができる。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００９年、３７巻、２８６７〜２８８１頁を参照されたい。一部の実施形態では、糖の修飾は、糖環の１つ又は複数の炭素の修飾を含んでいてもよい、糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’−炭素と１’−炭素又は４’−炭素との間の連結を含んでいてもよい。例えば、連結は、エチレン架橋又はメチレン架橋を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−炭素と３’−炭素との結合を欠如する非環式糖を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。
【００５５】
一部の実施形態では、末端３’−末端基（例えば、３’−ヒドロキシル）は、ホスフェート基、或いは例えば、リンカー、アダプター、若しくは標識を付着させるために、又はオリゴヌクレオチドを別の核酸と直接ライゲーションさせるために使用することができる他の基である。
【００５６】
ｂ．  ５’末端ホスフェート
オリゴヌクレオチドの５’−末端ホスフェート基は、アルゴノート２との相互作用を増強してもよく又は一部の場合では増強する。しかしながら、５’−ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素による分解に感受性であってもよく、それによりｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの生物学的利用能を制限することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドとしては、そのような分解に耐性である５’ホスフェートの類似体が挙げられる。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートであってもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然５’−ホスフェート基の静電気的及び立体的特性を模倣する化学部分（「ホスフェート模倣体」）に付着されている（例えば、Ｐｒａｋａｓｈら（２０１５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５年３月３１日；４３巻（６号）：２９９３〜３０１１頁を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。５’末端に付着させることができるホスフェート模倣体が数多く開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号明細書を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。オリゴヌクレオチドの５’末端のための他の修飾が開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。ある実施形態では、ヒドロキシル基が、オリゴヌクレオチドの５’末端に付着されている。
【００５７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’−炭素位置にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ばれる）。例えば、２０１７年９月１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９号、２０１６年９月２日に出願された、４’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅと題する米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号明細書、及び２０１６年９月１２日に出願された、４’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅと題する第６２／３９３，４０１号明細書を参照されたい。これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチドに４’−ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’−炭素に）又はその類似体に結合されているオキシメチルホスホネートである。他の実施形態では、４’−ホスフェート類似体は、チオメチル基の硫黄原子又はアミノメチル基の窒素原子が糖部分又はその類似体の４’−炭素に結合されているチオメチルホスホネート又はアミノメチルホスホネートである。ある実施形態では、４’−ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネートである。一部の実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＨ）2又は−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＲ）2により表わされ、式中、Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ3、アルキル基、ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、ＣＨ2ＯＣＯＣ（ＣＨ3）3、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3、又は保護基から選択される。ある実施形態では、アルキル基はＣＨ2ＣＨ3である。より典型的には、Ｒは、独立してＨ、ＣＨ3、又はＣＨ2ＣＨ3から選択される。
【００５８】
ｃ．修飾ヌクレオシド間連結
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間連結を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ホスフェート修飾又は置換は、少なくとも１つの（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの）修飾ヌクレオチド間連結を含むオリゴヌクレオチドをもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１〜１０個の（例えば、１〜１０、２〜８、４〜６、３〜１０、５〜１０、１〜５、１〜３、又は１〜２個の）修飾ヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の修飾ヌクレオチド間連結を含む。
【００５９】
修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロジチオエート連結、ホスホロチオエート連結、ホスホトリエステル連結、チオノアルキルホスホネート連結、チオノアルキルホスホトリエステル連結、ホスホラミダイト連結、ホスホネート連結、又はボラノホスフェート連結であってもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。
【００６０】
ｄ．塩基修飾
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾核酸塩基を有する。一部の実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に連結されている。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含んでいない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかしながら、ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含んでいない（脱塩基）。
一部の実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の１’位に、又は二重鎖に存在する場合、二重鎖の構造を実質的に変更することなく１つよりも多くのタイプの塩基の反対側に配置することができるヌクレオチド糖部分置換の等価位置に位置するヘテロ環式部分である。一部の実施形態では、標的核酸と完全に相補的な参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸と形成される二重鎖よりも低いＴmを有する、標的核酸との二重鎖を形成する。しかしながら、一部の実施形態では、ユニバーサル塩基が、単一のミスマッチを生成するように塩基と置き換えられている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される二重鎖よりも高いＴmを有する、標的核酸との二重鎖を形成する。
【００６１】
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、及び／又は１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙらの米国特許願公開第２００７０２５４３６２号明細書；Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔら、Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５年１１月１１日；２３巻（２１号）：４３６３〜７０頁；Ｌｏａｋｅｓら、３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５年７月１１日；２３巻（１３号）：２３６１〜６頁；Ｌｏａｋｅｓ及びＢｒｏｗｎ、５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４年１０月１１日；２２巻（２０号）：４０３９〜４３頁。上述の文献の各々は、塩基修飾に関するそれらの開示について、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６２】
ｅ．可逆的修飾
ある修飾をなして、標的細胞に到達する前のｉｎ  ｖｉｖｏ環境からオリゴヌクレオチドを保護することができるが、それらは、標的細胞のサイトゾルに到達するとオリゴヌクレオチドの効力又は活性を低減させる場合がある。分子が細胞の外部で望ましい特性を維持するように可逆的修飾をなすことができ、その後可逆的修飾は、細胞のサイトゾル環境に進入すると除去される。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用により、又は細胞内部の化学条件により（例えば、細胞内グルタチオンによる還元により）除去することができる。
一部の実施形態では、可逆的に修飾されたヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間ジホスフェート連結により創出される負電荷を遮蔽し、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を向上させるように、環式ジスルフィド部分で化学的に修飾されている。元々はＴｒａｖｅｒｓａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．社に帰属する米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号明細書（「Ｔｒａｖｅｒｓａ」）、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｌｔｄ．社の国際公開第２０１５／１８８１９７号（「Ｓｏｌｓｔｉｃｅ」）、Ｍｅａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、３２巻：１２５６〜１２６３頁（「Ｍｅａｄｅ」）、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ社の国際公開第２０１４／０８８９２０号を参照されたい。これらの文献の各々は、そのような修飾の開示について参照により組み込まれる。ヌクレオチド間ジホスフェート連結のこの可逆的修飾は、サイトゾルの還元環境（例えば、グルタチオン）により細胞内で切断されるように設計されている。より初期の例としては、細胞内部で切断可能であることが報告された中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３年、１２５巻：９４０〜９５０頁）。
【００６３】
一部の実施形態では、そのような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ及び他の過酷な環境条件（例えば、ｐＨ）に曝されることになるｉｎ  ｖｉｖｏ投与中（例えば、血液及び／又は細胞のリソソーム／エンドソームコンパートメントを通過中）の保護を可能にする。グルタチオンのレベルが細胞外空間と比較してより高い細胞のサイトゾルへと放出されると、修飾は、元に戻り、その結果としてオリゴヌクレオチドが切断される。可逆的なグルタチオン感受性部分を使用すると、不可逆的化学修飾を使用する場合に利用可能な選択肢と比較して、立体的により大きな化学基を目的のオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。これは、そうしたより大きな化学基は、サイトゾルで除去されることになるため、細胞のサイトゾル内部のオリゴヌクレオチドの生物学的活性を妨害するはずがないからである。結果として、そうしたより大きな化学基を組み込んで、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び低免疫原性等の種々の利点をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに付与することができる。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分の構造を組み込んで、その放出の動力学を修飾することができる。
一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の２’炭素に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’−末端ヌクレオチドである場合、糖の５’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’−末端ヌクレオチドである場合、糖の３’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、２０１６年８月２３日に出願され、国際公開第２０１８／０３９３６４号として２０１８年３月１日に公開された、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆと題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４８２３９号を参照されたい。これらの文献の内容は、その関連開示について参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
ｖ．標的指向性リガンド
一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを、１つ若しくは複数の細胞又は１つ若しくは複数の臓器に標的化することが望ましい場合がある。そのような戦略は、他の臓器における望ましくない効果の回避を支援することができるか、又はオリゴヌクレオチドにとって利益とならない可能性がある細胞、組織、若しくは臓器へのオリゴヌクレオチドの過度の喪失を回避することができる。従って、一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞、又は臓器の標的化を容易にするように、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされているヌクレオチドを含む。
【００６５】
標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質若しくはタンパク質の一部分（例えば、抗体又は抗体断片）、又は脂質を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的指向性リガンドはアプタマーである。例えば、標的指向性リガンドは、腫瘍血管系又は神経膠腫細胞を標的とするために使用されるＲＧＤペプチド、腫瘍血管系若しくはストーマ、トランスフェリン、ラクトフェリンを標的とするためのＣＲＥＫＡペプチド、又はＣＮＳ血管系で発現されるトランスフェリン受容体を標的とするためのアプタマー、又は神経膠腫細胞上のＥＧＦＲを標的とするための抗ＥＧＦＲ抗体であってもよい。ある実施形態では、標的指向性リガンドは、１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ部分である。
【００６６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個又は複数個の（例えば、１、２、３、４、５、又は６個の）ヌクレオチドは各々、別々の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの２〜４個のヌクレオチドは各々、別々の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、標的指向性リガンドが歯ブラシの毛部分に相似し、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに相似するように、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の２〜４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端の２〜４個ヌクレオチドの突出又は伸長部分にコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端又は３’末端のいずれかにステム−ループを含んでいてもよく、ステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドは、例えば２０１６年６月２３日に公開された国際公開第２０１６／１００４０１号に記載のような標的指向性リガンドに個々にコンジュゲートされていてもよい。この文献の関連内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＧＹＳ２の発現を低減するオリゴヌクレオチドを、対象の肝臓の肝実質細胞へと標的化することが望ましい。任意の好適な肝実質細胞指向性部分をこの目的に使用することができる。
ＧａｌＮＡｃは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む循環性糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を有するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する高親和性リガンドである。ＧａｌＮＡｃ部分を本開示のオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションすることにより（間接的又は直接的のいずれかで）、そうしたオリゴヌクレオチドを、そうした肝実質細胞上に発現されるＡＳＧＰＲへと標的化することができる。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価ＧａｌＮＡｃに直接的に又は間接的にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つよりも多くの一価ＧａｌＮＡｃに直接的に又は間接的にコンジュゲートされている（つまり、２つ、３つ、又は４つの一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされており、典型的には３つ又は４つの一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている）。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の二価ＧａｌＮＡｃ、三価ＧａｌＮＡｃ、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。
【００６８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個又は複数個の（例えば、１、２、３、４、５、又は６個の）ヌクレオチドは各々、ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）の２〜４個のヌクレオチドは各々、別々のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛部分に相似し、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに相似するように、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の２〜４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端の２〜４個ヌクレオチドの突出又は伸長部分にコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端又は３’末端のいずれかにステム−ループを含んでいてもよく、ステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドは、個々にＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされている。例えば、各ＧａｌＮＡｃ部分が１個のヌクレオチドにコンジュゲートされる場合、４つのＧａｌＮＡｃ部分が、センス鎖のテトラループのヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。
【００６９】
適切な方法又は化学（例えば、クリック化学）を使用して、標的指向性リガンドをヌクレオチドに連結することができる。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、アセタールに基づくリンカーを使用して、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドにコンジュゲートされている。アセタールに基づくリンカーは、例えば、２０１６年６月２３日に公開された国際公開第２０１６１００４０１号Ａ１に開示されている。そのようなリンカーに関するこの文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、リンカーは不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、かなり安定である。一部の実施形態では、二重鎖伸長部分（最大で３、４、５、又は６塩基対長）が、標的指向性リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）と二本鎖オリゴヌクレオチドとの間に提供されている。
【００７０】
ＩＩＩ．  製剤
オリゴヌクレオチドの使用を容易にするための種々の製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑えるか、送達及び／若しくは取り込みを容易にするか、又は製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象又は細胞環境に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書には、ＧＹＳ２の発現を低減させるオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド）を含む組成物が提供される。そのような組成物は、標的細胞の直近環境に又は全身性のいずれかで対象に投与されると、十分な割合のオリゴヌクレオチドが細胞に進入して、ＧＹＳ２発現を低減するように好適に製剤化することができる。様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを使用して、本明細書で開示されているＧＹＳ２を低減するためのオリゴヌクレオチドを送達することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩溶液等の緩衝溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドで製剤化される。一部の実施形態では、ネイキッドオリゴヌクレオチド又はそれらのコンジュゲートは、水又は水溶液（例えば、ｐＨ調整剤を有する水）で製剤化される。一部の実施形態では、ネイキッドオリゴヌクレオチド又はそれらのコンジュゲートは、塩基性緩衝水溶液（例えば、ＰＢＳ）で製剤化される。
【００７１】
カチオン性脂質を有するオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）等のカチオン性脂質を使用することができる。好適な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社、ボールダー、コロラド州）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）が挙げられ、これらは全て製造業者の使用説明書に従って使用することができる。
従って、一部の実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、若しくはナノ粒子を含むか、又はそうでなければそれを必要とする対象の細胞、組織、臓器、若しくは体内に投与するために製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０１３年を参照）。
【００７２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている製剤は、賦形剤を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、組成物に、安定性の向上、吸収の向上、溶解性の向上、及び／又は活性成分の治療増強を付与する。一部の実施形態では、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、又は水酸化ナトリウム）又はビヒクル（例えば、緩衝溶液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、又は鉱物油）である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その保管寿命を延長するために凍結乾燥され、その後使用（例えば対象への投与）前に溶液にされる。従って、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つを含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はポリビニルピロリドン）、又は崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、フィコール、又はゼラチン）であってもよい。
一部の実施形態では、医薬組成物は、その意図されている投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、径粘膜、及び直腸内投与が挙げられる。典型的には、投与経路は、静脈内又は皮下である。
【００７３】
注射使用に好適な医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散物、及び無菌注射溶液又は分散物の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。静脈内投与又は皮下投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、パーシッパニー、ニュージャージー州）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいだろう。無菌注射溶液は、必要とされる量のオリゴヌクレオチドを、上記に列挙されている成分の１つ又は組合せを有する選択された溶媒に組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することにより調製することができる。
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１％又はそれよりも多くの治療剤（例えば、ＧＹＳ２発現を低減するためのオリゴヌクレオチド）を含んでいてもよいが、活性成分のパーセンテージは、全組成物の質量又は容積の約１％〜約８０％又はそれよりも大きくてもよい。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品保管寿命等の要因、並びに他の薬学的考慮要因が、そのような医薬製剤を調製する当業者により企図されることになり、従って様々な投薬量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
幾つかの実施形態は、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的送達に関するが、他の組織標的化も企図される。
【００７４】
ＩＶ．使用の方法
ｉ．細胞におけるＧＹＳ２発現の低減
一部の実施形態では、細胞でのＧＹＳ２の発現を低減させるための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。本明細書で提供される方法は、任意の適切な細胞タイプに有用である。一部の実施形態では、細胞は、ＧＹＳ２（例えば、肝実質細胞又は脂肪細胞等の肝臓細胞）を発現する任意の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、対象から得られたものであり、細胞が実質的にその天然表現型特性を維持するように、継代の回数が限定的であってもよい初代細胞である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏであってもよく又はｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい（つまり、培養中の細胞に、又は細胞が存在する生物に送達することができる）。具体的な実施形態では、肝実質細胞においてのみ又は主に肝実質細胞においてＧＹＳ２の発現を低減させるための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。
【００７５】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含む溶液を注射すること、オリゴヌクレオチドで覆われている粒子で衝撃すること、オリゴヌクレオチドを含む溶液を細胞又は生物と接触させること、又はオリゴヌクレオチドの存在下で細胞膜をエレクトロポレーションすることを含む、適切な核酸送達方法を使用して導入することができる。脂質媒介性担体輸送、化学媒介性輸送、及びリン酸カルシウム等のカチオン性リポソームトランスフェクション等の、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための他の適切な方法を使用することができる。
阻害の結果は、細胞又は対象の１つ又は複数の特性を評価するための適切なアッセイにより、又はＧＹＳ２発現（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を示す分子を評価する生化学的技法により確認することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドが、ＧＹＳ２の発現レベルを低減する程度は、発現レベル（例えば、ＧＹＳ２のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベル）を適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていないか又は陰性対照が送達されている細胞又は細胞集団でのＧＹＳ２発現のレベル）と比較することにより評価される。一部の実施形態では、ＧＹＳ２発現の適切な対照レベルは、対照レベルを毎回測定しなくともよいように、所定のレベル又は値であってもよい。所定のレベル又は値は、様々な形態をとることができる。一部の実施形態では、所定のレベル又は値は、中央値又は平均値等の、単一のカットオフ値であってもよい。
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているオリゴヌクレオチドの投与は、細胞でのＧＹＳ２発現レベルの低減をもたらす。一部の実施形態では、ＧＹＳ２発現レベルの低減は、ＧＹＳ２の適切な対照レベルと比較して、１％若しくはそれよりも低い、５％若しくはそれよりも低い、１０％若しくはそれよりも低い、１５％若しくはそれよりも低い、２０％若しくはそれよりも低い、２５％若しくはそれよりも低い、３０％若しくはそれよりも低い、３５％若しくはそれよりも低い、４０％若しくはそれよりも低い、４５％若しくはそれよりも低い、５０％若しくはそれよりも低い、５５％若しくはそれよりも低い、６０％若しくはそれよりも低い、７０％若しくはそれよりも低い、８０％若しくはそれよりも低い、又は９０％若しくはそれよりも低い低減であってもよい。適切な対照レベルは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞又は細胞集団でのＧＹＳ２発現レベルであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法による、細胞へのオリゴヌクレオチド送達の効果は、有限期間後に評価される。例えば、ＧＹＳ２のレベルは、オリゴヌクレオチドを細胞内に導入した少なくとも８時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後に、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は１４日後に、細胞で分析することができる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞でオリゴヌクレオチド（例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖）を発現するように遺伝子操作されている導入遺伝子の形態で送達される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示されている任意のオリゴヌクレオチドを発現するように遺伝子操作されている導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、又は単純ヘルペスウイルス）又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミド又は合成ｍＲＮＡ）を使用して送達してもよい。一部の実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接注射してもよい。
【００７７】
ｉｉ．治療方法
本開示の態様は、対象の糖原病を治療するためにＧＹＳ２発現を低減するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象に本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を投与することを含んでいてもよい。そのような治療は、例えば、肝腫大、肝毒性（例えば、より低いか又は減少されたレベルのＡＳＴ、ＡＬＴ、及び／又はＡＬＰ）、肝線維症、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び／又は肝細胞癌を減少又は予防するために使用することができる。また、そのような治療、例えば、以下のもの：ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸからなるリストから選択される糖原病と関連する１つ又は複数の症状を治療又は予防するために、又はそのような糖原病の１つ又は複数の症状を治療又は予防するために使用することができる。本開示は、糖原病（例えば、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸ）並びに／又は糖原病（例えば、ＧＳＤＩａ、ＧＳＤＩＩＩ、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶＩ、及びＧＳＤＩＸ）に関連する症状若しくは状態のリスクのある（又は罹りやすい）対象を治療するための予防的及び治療的方法を両方とも提供する。
【００７８】
ある態様では、本開示は、対象に治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド又はそれをコードするベクター若しくは導入遺伝子）を投与することにより、本明細書に記載されている疾患、障害、症状、又は状態を対象において予防するための方法を提供する。一部の実施形態では、治療しようとする対象は、例えば、肝臓におけるＧＹＳ２タンパク質の量の低減から治療的に利益を得ることになる対象である。
本明細書に記載の方法は、典型的には、有効量の、すなわち望ましい治療結果をもたらすことが可能な量のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。治療的に許容される量は、疾患又は障害を治療することが可能な量であってもよい。任意の１つの対象にとって適切な投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間及び経路、全体的な健康、並びに同時に投与されている他の薬物を含むある要因に依存することになる。
一部の実施形態では、対象には、本明細書で開示されている組成物のいずれか１つが、経腸的に（例えば、経口的に、経胃栄養チューブにより、十二指腸栄養チューブにより、胃瘻により、又は直腸的に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射又は注入、動脈内注射又は注入、筋肉内注射）、局所的に（例えば、上皮に、吸入により、目薬により、又は粘膜を介して）、又は標的臓器（例えば、対象の肝臓）への直接注射により投与される。典型的には、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、静脈内に又は皮下に投与される。
【００７９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ）の範囲の用量で投与される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の、又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。
非限定的なセットの例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、典型的には、１年に１回、１年に２回、四半期毎に（３か月毎に１回）、２か月に１回（２か月毎に１回）、毎月、又は毎週投与されるだろう。
一部の実施形態では、治療しようとする対象は、ヒト（例えば、ヒト対象）又は非ヒト霊長類又は他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコ等の飼育動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリ等の家畜；並びにマウス、ラット、モルモット、及びハムスター等の動物が挙げられる。
【実施例】
【００８０】
実施例１：ヒト及びマウス細胞に基づくアッセイを使用したＧＹＳ２オリゴヌクレオチド阻害剤の開発
ヒト及びマウスに基づくアッセイを使用して、ＧＹＳ２発現を阻害するための候補オリゴヌクレオチドを開発した。まず、コンピューターに基づくアルゴリズムを使用して、ＧＹＳ２を阻害するための候補オリゴヌクレオチド配列（２５〜２７量体）を生成した。その後、細胞に基づくアッセイ及びＰＣＲアッセイを使用して、候補オリゴヌクレオチドを、ＧＹＳ２発現を低減させるそれらの能力について評価した。
コンピューターに基づくアルゴリズムにより、ヒトＧＹＳ２  ｍＲＮＡ（配列番号６０９、表１）に相補的だったオリゴヌクレオチドがもたらされた。それらのある配列は、アカゲザルＧＹＳ２  ｍＲＮＡ（配列番号６１０、表１）にも相補的だった。
【表１】
2021517826.tif 000003
【００８１】
アルゴリズムにより提供されたオリゴヌクレオチドのうち、２６４個のオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−２９３細胞に基づくアッセイでの実験評価の候補として選択した。このアッセイでは、安定してＧＹＳ２を発現するＨＥＫ−２９３ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−ＧＹＳ２細胞と呼ばれる）を、オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクション後ある期間にわたって細胞を維持し、その後、残存ＧＹＳ２  ｍＲＮＡのレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。２つのｑＰＣＲアッセイ、３’アッセイ及び５’アッセイを使用して、それぞれＨＥＸプローブ及びＦＡＭプローブにより測定されるｍＲＮＡレベルを決定した。２６４個のオリゴヌクレオチドを用いたＨＥＫ−２９３細胞に基づくアッセイの結果は、図１Ａ及び１Ｂに示されている。残存ｍＲＮＡパーセントが、３’アッセイ（円形）及び５’アッセイ（菱形）の各々について示されている。負対照と比較して残存ｍＲＮＡのパーセンテージが最も低いオリゴヌクレオチドを、ヒットとみなした。ヒトゲノムとの相補性が低いオリゴヌクレオチドを陰性対照として使用した。
【００８２】
これらのオリゴヌクレオチドの活性及び位置に基づき、ヒトＧＹＳ２  ｍＲＮＡのホットスポットを画定した。ホットスポットは、いずれかのアッセイにおいて対照と比較して３５％以下だったｍＲＮＡレベルをもたらした少なくとも２つのオリゴヌクレオチドと関連するヒトＧＹＳ２  ｍＲＮＡ配列の伸長として特定した。従って、以下のホットスポットがヒトＧＹＳ２  ｍＲＮＡ配列内で特定された：５７９〜６１８、６９１〜７３８、１０８９〜１１２５、１１７５〜１２１１、１４３１〜１４８６、２３４１〜２３８３、２４９７〜２５４３、２６６０〜２６９８、２８０８〜２８５１、及び３０１４〜３０５０。
ホットスポットの配列は表２に概説されている。
【表２】
2021517826.tif 000004
【００８３】
用量応答分析
初期のＨＥＫ−２９３細胞に基づくアッセイで評価した２６４個のオリゴヌクレオチドのうち、７１個の特に活性だったオリゴヌクレオチドを、ＧＹＳ２レベルをノックダウンするそれらの能力に基づいてヒットとして選択し、二次スクリーニングに供した。
この二次スクリーニングでは、候補オリゴヌクレオチドを、一次スクリーニングと同じだが、２つ又は３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０３ｎＭ）でのアッセイを使用して試験した（図２Ａ及び２Ｂ）。標的ｍＲＮＡレベルを、一般に、試料にわたって安定的発現参照を提供するハウスキーピング遺伝子であるスプライシング因子アルギニン／セリンリッチ９（ＳＦＲＳ９）に基づいて正規化して、図２Ａ及び２Ｂに示されているｍＲＮＡパーセントを生成した。図２Ａ及び２Ｂの各々における試験したオリゴヌクレオチドは、陰性対照配列（ＮＣ１）及び擬似トランスフェクションと比較して示されている。７１個のオリゴヌクレオチドは全て、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの組合せを含む、Ｍ１と表記されている同じ修飾パターンを有していた。試験した７１個のオリゴヌクレオチドの配列は、表３に提供されている。
【表３】
2021517826.tif 000005
Ｈｓ：ヒト、及びＲｍ：アカゲザル。センス配列番号及びアンチセンス配列番号の欄には、ハイブリダイズして各オリゴヌクレオチドになるセンス鎖及び対応するアンチセンス鎖がそれぞれの順番で提供されている。例えば、配列番号１のセンス鎖は配列番号１９３のアンチセンス鎖とハイブリダイズする。
この段階で、試験に由来する最も強力な配列の３６個を、更なる分析のために選択した。選択した配列を、ニック付きテトラループ構造形式（２２量体ガイド鎖を有する３６量体パッセンジャー鎖）に変換した。基本的なテトラループ構造は、図３を参照されたい。その後、こうしたオリゴヌクレオチドを以前と同様に試験し、ＨｅｐＧ２細胞においてＧＹＳ２  ｍＲＮＡ発現を低減するその能力について３つの濃度にて各オリゴヌクレオチドを評価した。
【００８４】
図４は、ニック付きテトラループ構造を有する異なる塩基配列で製作されており、各々が１つ又は２つの異なる修飾パターンを有するように構成されているオリゴヌクレオチドのデータを示す。Ｘ軸には、評価したオリゴヌクレオチドが標的とするセンス鎖の３’末端が列挙されている。標的ｍＲＮＡレベルを、上記に記載のように正規化して、図４に示されているｍＲＮＡパーセントを生成した。試験したオリゴヌクレオチドは、陰性対照配列（ＮＣ１）及び擬似トランスフェクションと比較して示されている。
【００８５】
あるテトラループ修飾オリゴヌクレオチドを、各化合物について同じ修飾パターンを使用して０．１μＭ、０．３μＭ、及び１．０μＭにてサル肝実質細胞において更に試験した（図５）。図５の試験したオリゴヌクレオチドは、未トランスフェクト細胞と比較して示されている。各化合物の最大半量阻害濃度（ＩＣ50）を決定するために、あるオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−２９３細胞での完全用量応答曲線を使用して更に試験した（図６Ａ及び６Ｂを参照）。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｖｏマウススクリーニング
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のデータを評価して、マウス肝実質細胞でのＧＹＳ２発現低減活性を維持しつつ、送達特性を向上させることになるテトラループ及び修飾パターンを特定した。その後、この分析に基づいて、選択したオリゴヌクレオチドをＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした。４つのＧａｌＮＡｃ部分を、センス鎖のテトラループのヌクレオチドにコンジュゲートした。クリックリンカーを使用してコンジュゲーションを実施した。使用したＧａｌＮＡｃは、下記に示されている通りだった。
【化１】
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Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトサミン（ＣＡＳ＃：１４１３１−６０−３）
【００８７】
ニック付きテトラループ構造を有する様々な修飾パターンを有する１８個の異なる塩基配列の合計６５個の強力なＧａｌＮＡｃコンジュゲートＧＹＳ２オリゴヌクレオチドを試験した選択したＧＹＳ２オリゴヌクレオチド配列は、ヒトｍＲＮＡ配列及びサルｍＲＮＡ配列に対して活性だったが、マウスＧｙｓ２には活性ではなかった。ヒトＧＹＳ２発現プラスミドを０．５〜５ｍｇ／ｋｇで水圧注入することにより、ヒトＧＹＳ２  ｍＲＮＡを一過性に発現するＣＤ−１マウスに、ＧＹＳ２オリゴヌクレオチドを皮下投与した。マウスを、投与後４日目に安楽死させた。肝臓試料を得、ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ｑＰＣＲによりＧＹＳ２  ｍＲＮＡレベルを評価した。こうした測定に基づいて、ＰＢＳ対照ｍＲＮＡと比較したＧＹＳ２  ｍＲＮＡパーセントを決定した。
６５個の試験したコンジュゲートから、８つの最も強力な塩基配列を特定し、ヒトＧＹＳ２  ｍＲＮＡを一過性に発現するＣＤ−１マウスに０．５ｍｇ／ｋｇで皮下注射することにより、各々を同じ修飾パターンで試験した。マウスを、投与後４日目に安楽死させた。肝臓試料を得、ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ｑＰＣＲによりＧＹＳ２  ｍＲＮＡレベルを評価した。こうした測定に基づいて、ＰＢＳ対照ｍＲＮＡと比較したＧＹＳ２  ｍＲＮＡパーセントを決定した。それらは図７に示されている。
【００８８】
物質及び方法
トランスフェクション
最初のスクリーニングのため、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（商標）を使用して、効率的なトランスフェクションのためにオリゴヌクレオチドを複合体化した。オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉＭＡＸ、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭを、室温で２０分間一緒にインキュベートし、その後このミックスの５０μＬを、トランスフェクション前にプレートの各ウェルに添加した。活性継代細胞のフラスコから培地を吸引し、トリプシンの存在下で３〜５分間３７℃で細胞をインキュベートした。細胞がフラスコにもはや接着しなくなった後、細胞増殖培地（ペニシリン及びストレプトマイシンを欠如する）を添加してトリプシンを中和し、細胞を懸濁した。１０μＬのアリコートを取り出し、血球計算器で計数して、１ミリリットル当たりを基準にして細胞を定量化した。細胞を、１０，０００又は２５，０００細胞／ウェルで、各ウェルの培地（例えば、１００μＬの培地）に接種した。希釈した細胞懸濁物を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中にオリゴヌクレオチドを既に含んでいた９６ウェルトランスフェクションプレートに添加した。その後、トランスフェクションプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、各ウェルから培地を吸引した。細胞を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲＮＡ単離キットの溶解緩衝液を使用して溶解した。溶解緩衝液を、各ウェルに添加した。その後、溶解した細胞を、ＲＮＡ単離のためにＣｏｒｂｅｔｔ  ＸｔｒａｃｔｏｒＧＥＮＥ（ＱＩＡｘｔｒａｃｔｏｒ社）に移したか、又は−８０℃で保管した。
後のスクリーニング及び実験、例えば二次スクリーニングのために、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡｘを使用して、オリゴヌクレオチドをリバーストランスフェクションのために複合体化した。複合体は、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中でＲＮＡｉＭＡＸ及びｓｉＲＮＡを１５分間混合することにより製作した。トランスフェクション混合物を、多ウェルプレートに移し、細胞懸濁物をウェルに添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、その後Ｐｒｏｍｅｇａ  ＳＶ９６キットの溶解緩衝液を使用して溶解した。真空マニホールドにてＳＶ９６プレートを使用してＲＮＡを精製した。その後、４マイクロリットルの精製ＲＮＡを、６５℃で５分間加熱し、４℃に冷却した。その後、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ逆転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した１０マイクロリットル反応中での逆転写のためにＲＮＡを使用した。その後、ｃＤＮＡを無ヌクレアーゼ水で５０μＬに希釈し、多重化５’−エンドヌクレアーゼアッセイ及びＳＳｏＦａｓｔ  ｑＰＣＲマスターミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）による定量ＰＣＲに使用した。
【００８９】
ｃＤＮＡ合成
Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｘ−ｔｒａｃｔｏｒ  Ｇｅｎｅ（商標）（ＱＩＡｘｔｒａｃｔｏｒ社）を使用して、組織培養中の哺乳動物細胞からＲＮＡを単離した。改変ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩプロトコールを使用して、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。単離したＲＮＡ（およそ５ｎｇ／μＬ）を６５℃に５分間加熱し、ｄＮＰ、ランダム六量体、オリゴｄＴ、及び水と共にインキュベートした。混合物を１５秒間冷却した。水、５×第一鎖緩衝液、ＤＴＴ、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（商標）（ＲＮＡ阻害剤）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴａｓｅからなる「酵素ミックス」を混合物に添加した。内容物を、サーモサイクラーを使用して４２℃に１時間、その後７０℃に１５分間加熱し、その後４℃に冷却した。その後、得られたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ（登録商標）に基づくｑＰＣＲに供した。１反応当たり２つの５’エンドヌクレアーゼアッセイを含むように、ｑＰＣＲ反応を多重化した。
【００９０】
ｑＰＣＲアッセイ
ＳＹＢＲ（登録商標）に基づくｑＰＣＲを使用して、プライマーセットをまずスクリーニングした。融解曲線並びに「マイナスＲＴ」対照を評価することにより、アッセイ特異性を検証した。ＨｅＬａ細胞及びＨｅｐａ１−６細胞に由来するｃＤＮＡ鋳型の希釈物（１反応当たり２０ｎｇから０．０２ｎｇまでの１０倍系列希釈）を使用して、それぞれヒト（Ｈｓ）アッセイ及びマウス（Ｍｍ）アッセイを試験した。ｑＰＣＲアッセイを３８４ウェルプレートにセットアップし、ＭｉｃｒｏＡｍｐフィルムで覆い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の７９００ＨＴで実施した。試薬濃度及びサイクル条件は、以下のものを含んでいた：２×ＳＹＢＲミックス、１０μＭフォワードプライマー、１０μＭリバースプライマー、ＤＤ  Ｈ2Ｏ、及びｃＤＮＡ鋳型。これらで総容積を１０μＬにした。
【００９１】
クローニング
単一融解曲線を示したＰＣＲアンプリコンを、製造業者の使用説明書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙベクターキットにライゲーションした。製造業者のプロトコールに従って、ＪＭ１０９高効率細胞を、新たにライゲーションしたベクターで形質転換した。その後、アンピシリンを含むＬＢプレートに細胞をプレーティングし、コロニー増殖のために３７℃で一晩インキュベートした。
【００９２】
ＰＣＲスクリーニング及びプラスミドミニプレップ
ＰＣＲを使用して、ライゲーションされた目的のアンプリコンを含むベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコロニーを特定した。インサートをフランキングするベクター特異的プライマーをＰＣＲ反応に使用した。その後、ＰＣＲ産物を全て１％アガロースゲルに流し、染色後にトランスイルミネーターで画像化した。ゲルを質的に評価して、どのプラスミドが、予想サイズのライゲーションされたアンプリコンを含むと考えられるかを決定した（およそ３００ｂｐ。アンプリコン、及び使用されたプライマーに特異的なフランキングベクター配列を含む）。
その後、ＰＣＲスクリーニングにより形質転換体であることが確認されたコロニーを、アンピシリンを有する２ｍＬのＬＢ培地からなる培養中で、３７℃にて振盪しながら一晩インキュベートした。その後、大腸菌細胞を溶解し、Ｐｒｏｍｅｇａ社のミニプレップキットを使用して目的のプラスミドを単離した。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によりプラスミド濃度を決定した。
【００９３】
プラスミド配列決定及び定量化
精製したプラスミドを、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーター配列決定キットを使用して配列決定した。ベクター特異的プライマーであるＴ７を使用して、インサート全体にわたるリード長を得た。以下の試薬を配列決定反応に使用した：水、５×配列決定緩衝液、ＢｉｇＤｙｅターミネーターミックス、Ｔ７プライマー、及びプラスミド（１００ｎｇ／μＬ）。これらで１０μＬの容積にした。混合物を９６℃で１分間保持し、その後９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で１分１５秒間の１５サイクル；９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で１分３０秒間の５サイクル；及び９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で２分間の５サイクルに供した。その後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のキャピラリー電気泳動シーケンサーを使用して、ダイターミネーション反応物を配列決定した。
その後、配列が検証されたプラスミドを定量化した。プラスミドを、単一の切断制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化した。線形性は、アガロースゲル電気泳動法を使用して確認した。プラスミド希釈物は全て、ポリプロピレンバイアルに対するプラスミドの非特異的結合を低減させるために、１ｍＬ緩衝液当たり１００μｇのｔＲＮＡを有するＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）で製作した。
その後、線形化されたプラスミドを、１μＬ当たり１，０００，０００から０１コピーまで系列希釈し、ｑＰＣＲに供した。アッセイ効率を算出し、効率が９０〜１１０％の範囲だった場合、アッセイを許容可能とみなした。
【００９４】
多重化アッセイ
各標的について、ｍＲＮＡレベルを、２つの５’ヌクレアーゼアッセイで定量化した。基本的に、幾つかのアッセイを各標的についてスクリーニングする。選択された２つのアッセイは、良好な効率、低検出限界、及び目的の遺伝子（ＧＯＩ）の幅広い５’−＞３’網羅範囲の組合せを示した。異なるフルオロフォアをそれぞれのプローブに使用した場合は、１つのＧＯＩに対する両アッセイを１つの反応に組み合わせることができた。従って、それらが同じｑＰＣＲ中に混合されていたか又は「多重化」されていた場合、アッセイ検証の最終工程は、選択されたアッセイの効率を決定することだった。
１０倍希釈物で両アッセイを行うための線形化プラスミドを一緒にして、ｑＰＣＲを実施した。各アッセイの効率を、上記に記載のように決定した。許容される効率割合は、９０〜１１０％だった。線形化プラスミド標準物質を使用して多重化反応を検証する間に、ｃＤＮＡを鋳型として使用して、目的の標的のＣq値も評価した。ヒト標的又はマウス標的には、それぞれ、ＨｅＬａ  ｃＤＮＡ及びＨｅｐａ１−６  ｃＤＮＡを使用した。この場合、ｃＤＮＡは、未トランスフェクト細胞からＣｏｒｂｅｔｔ（水中約５ｎｇ／μｌ）で単離したＲＮＡに由来した。このように、この試料ｃＤＮＡの観察されたＣq値は、９６ウェルプレートトランスフェクションの予想Ｃq値を代表するものだった。Ｃq値が３０よりも大きかった場合、目的の遺伝子がより高い発現レベルを示す他の細胞株を探した。各ヒト株及びマウス株からＣｏｒｂｅｔｔでのハイスループット法により単離された全ＲＮＡのライブラリーを生成し、それを使用して、標的発現の許容可能なレベルについてスクリーニングした。
【００９５】
オリゴヌクレオチド命名法の説明
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは全て、ＳＮ1−ＡＳＮ2−ＭＮ3のいずれかとして表記される。以下の表記法が適用される：
・Ｎ1：センス鎖配列の配列識別子番号
・Ｎ2：アンチセンス鎖配列の配列識別子番号
・Ｎ3：修飾パターンの参照番号であり、各番号は、オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオチドのパターンを表わす。
例えば、Ｓ２７−ＡＳ２１９−Ｍ１は、配列番号２７により示されるセンス配列、配列番号２１９により示されるアンチセンス配列を有し、Ｍ１として特定されている修飾パターンを有するように構成されているオリゴヌクレオチドを表す。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２２】
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【表４−２３】
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【表４−２４】
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【００９６】
本明細書にて適切に例示的に記載されている本開示は、本明細書で具体的に開示されていない任意の１つ若しくは複数の要素、１つ若しくは複数の限定の非存在下で実施することができる。従って、例えば、本明細書中の各出現において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、説明のために使用されており、限定のためではない。そのような用語及び表現の使用において、図示及び説明されている特徴又はそれら部分のいかなる均等物も除外する意図はなく、特許請求されている本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されているが、当業者であれば、本明細書に開示されている概念の任意選択の特徴、改変、及び変異を実施することができ、そのような改変及び変異は、本明細書及び添付の特許請求の範囲により画定されている本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
加えて、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュ群又は選択肢の他のグループ化として記載されている場合、当業者であれば、本発明はそれにより、マーカッシュ群又は他の群の任意の個々のメンバー又はメンバーの部分群としても記載されていることを認識するだろう。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は他の核酸の構造を説明する際に、配列表に示されている配列を参照することができることを認識されるべきである。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチド又は他の核酸は、指定の配列と比較して、１つ若しくは複数の代替ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ相当物又はＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相当物）、及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド、及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド間連結、及び／又は１つ若しくは複数の他の修飾を有していてもよいが、指定の配列と本質的に同じ又は同様の相補性特性を維持する。
【００９７】
本発明の説明の状況における（特に以下の特許請求の範囲の状況における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の指示物の使用は、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別様の記載のない限り、非限定的用語として解釈されるものとする（つまり、「含むが、それに限定されない」ことを意味する）。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書に別様の指定がない限り、その範囲内に入る各個別の値を個々に参照するための簡略的方法としての役割を果たすことが意図されているに過ぎず、各個別の値は、それが個々に本明細書に記載されているかの如く、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的文言（例えば、「等」）の使用は、本発明をより良好に説明することが意図されているに過ぎず、別様に特許請求されていない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の文言が、任意の特許請求されていない要素を、本発明の実施に不可欠であるものとして示していると解釈されるべきでない。
【００９８】
本発明の実施形態が本明細書に記載されている。そうした実施形態の変異は、当業者であれば、上述の説明を読むと明白になる場合がある。
【００９９】
本発明者らは、当業者がそのような変異を必要に応じて使用することを予想しており、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されているものとは別様に実施されることになることを意図している。従って、本発明は、準拠法により許容される、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載されている主題の改変及び均等物を全て含む。更に、それらの全ての考え得る変異における上記に記載の要素の任意の組合せは、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。当業者であれば、日常的なものを超える実験作業を使用することなく、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態の多数の均等物を認識することになるか又は確認することができるだろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｂ−３】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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