(57)【要約】  少なくとも１つの受容体Ｂ７ｈのリガンドを含む新規抗腫瘍剤であって、Ｂ７ｈ受容体のリガンドは生体適合性マイクロ担体またはナノ担体に搭載され、受容体Ｂ７ｈに結合して受容体Ｂ７ｈ活性をトリガすることが可能である、新規抗腫瘍剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する対象の治療に使用するための受容体Ｂ７ｈのリガンドであって、前記受容体Ｂ７ｈの前記リガンドは、生体適合性マイクロ担体またはナノ担体の中または上に搭載され、前記受容体Ｂ７ｈの前記リガンドは前記受容体Ｂ７ｈに結合して前記受容体Ｂ７ｈの活性をトリガすることが可能である、受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項２】
前記リガンドは、
ａ）配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＣＯＳタンパク質またはその一部、
ｂ）配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＣＯＳ細胞外ドメインまたはその一部、および、
ｃ）配列ＩＤ番号１、２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質ａ）およびｂ）のいずれか１つの相同体またはその一部
から選択される、請求項１に記載の受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項３】
前記リガンドは高グリコシル化される、またはマンノース残基に結合される、請求項１または２に記載の受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項４】
生体適合性マイクロ担体またはナノ担体の中または上に搭載された前記リガンドは注射、注入によって投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項５】
前記リガンドは安定化分子に融合または結合される、請求項１から４のいずれか一項に記載の受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項６】
前記安定化分子はヒトＦｃ抗体ドメイン、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリ−Ｌ−リシンシトライミド、スチレン無水マレイン酸およびポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドから選択される、請求項５に記載の受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項７】
前記リガンドは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項８】
前記生体適合性マイクロ担体またはナノ担体は、マイクロ粒子またはナノ粒子、マイクロカプセルまたはナノカプセル、マイクロベシクルまたはナノベシクル、マイクロバブルまたはナノバブル、ナノエマルジョン、ナノ懸濁物、ナノハイドロゲル、ミセル、デンドリマー、量子ドット、リポソームおよび炭素誘導体から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項９】
前記マイクロ粒子またはナノ粒子は、シクロデキストリンポリマー、ラクチド−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）、キトサン、アルギン酸塩、澱粉、アルギン酸塩、コラーゲン、アルブミン、シリカ、または金属からできている、請求項８に記載の受容体Ｂ７ｈのリガンド。
【請求項１０】
生体適合性マイクロ担体またはナノ担体の中または上に搭載される少なくとも１つの受容体Ｂ７ｈのリガンドと、腫瘍の治療に使用される薬学的に許容されるビヒクルとを備える医薬組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの受容体Ｂ７ｈのリガンドは、
ａ）配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＣＯＳタンパク質またはその一部、
ｂ）配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＣＯＳ細胞外ドメインまたはその一部、および、
ｃ）配列ＩＤ番号１、２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質ａ）およびｂ）のいずれか１つの相同体またはその一部
から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記リガンドは安定化分子に融合または結合される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記リガンドは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記生体適合性マイクロ担体またはナノ担体は、マイクロ粒子またはナノ粒子、マイクロカプセルまたはナノカプセル、マイクロベシクルまたはナノベシクル、マイクロバブルまたはナノバブル、ナノエマルジョン、ナノ懸濁物、ナノハイドロゲル、ミセル、デンドリマー、量子ドット、リポソームおよび炭素誘導体から選択される、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
腫瘍の治療に有用な医薬活性物質のスクリーニングの標的としての受容体Ｂ７ｈの使用であって、前記医薬活性物質は受容体Ｂ７ｈに結合し、受容体Ｂ７ｈ活性をトリガし、オステオポンチン活性を阻害する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、少なくとも１つの受容体Ｂ７ｈのリガンドを含む新規抗腫瘍治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＣＯＳは、Ｈ４１，２として本発明者によって記載されるＴ細胞共刺激分子である。後に、ＨｕｔｌｏｆｆがＣＤ２８ファミリーに属する分子としてＩＣＯＳをクローニングし、ＩＣＯＳおよびＨ４は同一の分子であることが示された３，４。ＩＣＯＳの際立った特徴は、活性化Ｔ細胞における選択的発現であるが、近年、樹状細胞（ＤＣ）においても検出された５。ＩＣＯＳ受容体は、ＤＣ、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞（ＥＣ）、上皮細胞、および線維芽細胞など、いくつかの種類の細胞によって発現されるＩＣＯＳＬ（またはＢ７ｈ）である６。ＩＣＯＳ／Ｂ７ｈ相互作用は、リンパ器官におけるＴ細胞活性化を調節し、炎症部位におけるＴ細胞機能を制御する。それは、制御性Ｔ細胞、ＴＨ１７、および卵胞Ｔヘルパー細胞の分化および胚中心の発生をサポートし、その欠乏は分類不能型免疫不全症を引き起こす７−１１。
【０００３】
Ｂ７ｈの他の名称は、誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド（ＩＣＯＳＬまたはＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７関連タンパク質１（Ｂ７ＲＰ−１またはＢ７ＲＰ１）Ｂ７ホモログ２（Ｂ７−Ｈ２）、Ｂ７様タンパク質ＧＬ５０、ＧＬ５０、ＫＩＡＡ０６５３、ＬＩＣＯＳ、ＣＤ２７５である。Ｂ７ｈ：ＩＣＯＳの相互作用は、Ｂ７ｈ発現細胞の応答を調節する双方向シグナルをトリガする。マウスＤＣにおいて、このＢ７ｈ媒介「逆シグナル伝達」はＩＬ−６分泌を増大させる１２。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＢ７ｈトリガの効果を評価するために、本発明者は、ＩｇＧ１のＦｃ部分と、ＩＣＯＳの細胞外部分の２分子とから成るＩＣＯＳの二価可溶形態（ＩＣＯＳ−Ｆｃ）を生産した。ＩＣＯＳ−Ｆｃは二価であるため、Ｂ７ｈを架橋し、アゴニスト効果を発揮し、Ｂ７ｈ発現細胞におけるＢ７ｈシグナル伝達をトリガする。ヒト細胞において、ＩＣＯＳ−ＦｃによるＢ７ｈトリガの以下の効果が示された。ｉ）ＥＣおよび腫瘍細胞株において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける接着性および遊走を阻害する１３，１４。ｉｉ）腫瘍細胞株において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験的肺転移の進行を阻害する１４。ｉｉｉ）ＤＣにおいて、ＩＬ−２３の分泌を増大させることによって、サイトカイン分泌を調節し（抗腫瘍応答に伴うＴＨ１７分化をサポートし）、抗原のクロスプレゼンテーションを促進し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける接着性および遊走を阻害する１５。ｉｖ）破骨細胞（ＯＣ）において、単球からの分化、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける骨吸収能、および、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスにおける骨粗鬆症の進行を阻害する１６。ｖ）Ｂ７ｈトリガは、ＥＣにおけるＥＲＫおよびｐ３８の脱リン酸化、腫瘍細胞におけるＦＡＫの脱リン酸化、ならびに、ＤＣおよび腫瘍細胞におけるβ−Ｐｉｘの下方調節を誘導する１３−１５。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の目的は、受容体Ｂ７ｈの少なくとも１つのリガンドを含む新規抗腫瘍治療剤を提供することである。ここで、受容体Ｂ７ｈのリガンドは、受容体Ｂ７ｈに特異的に結合し、受容体Ｂ７ｈ活性をトリガすることが可能である。
【０００５】
本発明によれば、上記目的は、後述の特許請求の範囲において具体的に記載された主題によって達成され、特許請求の範囲は本開示の不可欠な部分を形成するものとして理解される。
【０００６】
本発明は、腫瘍を有する対象の治療における使用のための受容体Ｂ７ｈのリガンドを提供する。ここで、受容体Ｂ７ｈのリガンドは、生体適合性マイクロ担体またはナノ担体の中または上に搭載され、受容体Ｂ７ｈのリガンドは、受容体Ｂ７ｈに結合して受容体Ｂ７ｈ活性をトリガすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
ここで、添付の図面を参照しながら、単に説明を目的とした非限定的な例として本発明を詳細に記載する。
【図１】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖に対する異なる形態のＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。触知可能な皮下Ｂ１６腫瘍を有するマウスを、ＰＢＳ、ＣＤＮＳ（ナノ粒子）単独、ＩＣＯＳ−Ｆｃ、または、ＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＣＤＮＳで４日ごとに処理した。第１処理の１６日後に腫瘍増殖を評価した。各処理は、実験あたり５匹のマウスを伴う。＊＊互いの条件に対してｐ＜０．０５
【図２】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍血管新生に対するＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。ＰＢＳ、ＣＤＮＳ単独、または、ＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＣＤＮＳで処理されたマウスの腫瘍組織断面の抗ＣＤ３１の免疫蛍光染色を示す。スライドは、ＡｂウサギαマウスＣＤ３１および二次抗体、または、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８が結合されたαウサギＣＤ３１のいずれかで染色した。３つの独立の実験の代表的な画像を示す。棒グラフはこれらの実験の累積的結果を腫瘍微小血管密度（ＴＤＭ）として示す。＊＊互いの条件に対してｐ＜０．０５。
【図３】ｅｘ−ｖｉｖｏにおけるＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３に対するＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。腫瘍からの侵入細胞を採取し、リアルタイムＰＣＲ解析に使用した。データは対照マウスにおける発現について正規化した（対照発現ＰＢＳ群を１００％に設定、＊ｐ＜０．０５）。
【図４】ＩＣＯＳ欠乏Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖に対する異なる形態のＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。触知可能な皮下Ｂ１６腫瘍を有するマウスを、ＣＤＮＳ単独、または、ＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＣＤＮＳで４日ごとに処理した。（Ａ）第１処理の８日後に腫瘍増殖を評価した。各処理は８匹のマウスを伴う。＊＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）リアルタイムＰＣＲ解析によって分析された腫瘍侵入リンパ球におけるＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３の発現を示す。データはＣＤＮＳ対照における発現について正規化した。ＣＤＮＳで処理されたマウスにおけるそれぞれの値からの♯ｐ＜０．０５。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ１６−Ｆ１０細胞の生存率に対する異なる形態のＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。滴定量（０．５〜５μｇ／ｍｌ）の遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃ、または空のＣＤＮＳ、またはＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの存在下または非存在下において培養した後に、ＭＴＴによってＢ１６−Ｆ１０細胞の細胞生存性を評価した。それらの試薬の非存在下で培養された細胞において検出された生存率の阻害率（％）として結果を示す。
【図６】ＯＰＮとＢ７ｈとの相互作用を検出する２つの手法の結果を示す。（左）滴定量の可溶Ｂ７ｈ−Ｆｃ（灰色の線）と、ＥＬＩＳＡプレートで被覆された固定量のオステオポンチン（ＯＰＮ）との相互作用を示す。黒色の線は、Ｂ７ｈ結合についてのＩＣＯＳとＯＰＮとの間の競合を評価するための、５μｇ／ｍｌの可溶ＩＣＯＳ−Ｆｃの存在下における同一の実験を示す。破線は、滴定量の可溶ＩＣＯＳ−ＦｃのＯＰＮ被覆プレートに対する結合が無いことを示す。（右）ウエスタンブロットは、ＯＰＮと共にインキュベートされた（第１レーン）、または、インキュベートされなかった（第２レーン）セファロース結合ｂａｉｔタンパク質としてＢ７ｈ−Ｆｃが使用されたプルダウンアッセイを示す。第３レーンはＯＰＮ陽性対照である。膜は抗ＯＰＮポリクローナル抗体によってブロットされた。
【図７】ＯＰＮ機能におけるＢ７ｈの役割を示す。（Ａ〜Ｂ）ＯＰＮまたはＦＣＳによって高レベル（Ａ）および低レベル（Ｂ）のＢ７ｈを発現する腫瘍細胞株において誘導される細胞遊走を示す。＊＊未処理細胞とは顕著に異なる。（Ｃ）ＯＰＮに対する遊走応答が、Ｂ７ｈでトランスフェクトした（Ｂ７ｈｈｉｇｈ）Ａ２０５８細胞において戻っている。＊＊トランスフェクトされていない細胞（Ｂ７ｈｌｏｗ）とは顕著に異なる。（Ｄ）ＯＰＮに対する遊走応答は、Ｂ７ｈがサイレンシングされた（Ｂ７ｈｌｏｗ）ＨＵＶＥＣにおいて抑制される。＊＊サイレンシングされていない細胞（Ｂ７ｈｈｉｇｈ）とは顕著に異なる。水平の点線は、未処理細胞の基礎的な遊走に対応し、１００％に設定される。
【図８】ＯＰＮ誘導細管形成、ならびに腫瘍細胞の遊走および接着におけるＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。（Ａ）ＯＰＮまたはＶＥＧＦのいずれかによって誘導されるＨＵＶＥＣ細管形成に対するＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。ＮＴ：ＯＰＮおよびＶＥＧＦ無しの基礎の管形成。＊＊ＩＣＯＳ−Ｆｃで処理された対応する細胞とは顕著に異なる。（Ｂ〜Ｃ）高レベルのＢ７ｈを発現する２つのヒトメラノーマ細胞株（すなわちＭ１４およびＪＲ８）のＨＵＶＥＣへの遊走（Ｂ）および接着（Ｃ）に対するＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。＊＊：未処理細胞に対してｐ＜０．０５、§§：ＯＰＮ処理細胞に対してｐ＜０．０５。
【図９】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ１６−Ｆ１０細胞の生存、および、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖に対するＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。（Ａ）滴定量（０．５〜５μｇ／ｍｌ）の遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃ、または空のＰＬＧＡ  ＮＰまたはＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ  ＮＰの存在下または非存在下において培養した後に、ＭＴＴによってＢ１６−Ｆ１０細胞の細胞生存性を評価した。それらの試薬の非存在下で培養された細胞において検出された生存率の阻害率（％）として結果を示す。（Ｂ）触知可能な皮下Ｂ１６腫瘍を有するマウスを、ＰＢＳ、ＰＬＧＡ（ナノ粒子）単独、ＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃで４日ごとに処理した。第１処理の１６日後に腫瘍増殖を評価した。各処理は、実験あたり５匹のマウスを伴う。＊または＊＊互いの条件に対してｐ＜０．０５。
【図１０】ヒト膠芽腫細胞を脳に注射された無胸腺マウスの生存におけるＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。移植の７日後から７日ごとにＰＬＧＡ単独（ブランク）（１００μｌ）またはヒトＩＣＯＳ−Ｆｃ（１００μｌ）を搭載したＰＬＧＡで腹腔内において処理された、ＭＤ１３担癌無胸腺マウスのカプラン・マイヤー解析を示す。ＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＰＬＧＡの処理により、担癌マウスの生存が顕著に延長された（免疫に欠陥があるマウスにおけるブランク対ＩＣＯＳ−Ｆｃ、すべての群でｎ＝６、Ｐ＝０．００５９１、ログランク検定）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下の説明では、実施形態の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が示される。実施形態は、具体的な詳細のうちの１または複数を省いても、または他の方法、成分、材料等を用いても実施可能である。他の例では、実施形態の態様を不明瞭にすることを避けるために、周知の構造、素材、または動作は、詳細に示されず、記載されてもいない。
【０００９】
本明細書の随所において「一実施形態」または「ある実施形態」について言及された場合、このことは、その実施形態に関連して説明されている特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。故に、本明細書の随所において現れる「一実施形態」または「１つの実施形態」という文言は、必ずしもすべてが同一の実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１または複数の実施形態において、任意の好適な態様で組み合わされてよい。
【００１０】
本明細書に提供される見出しは、便宜上のものにすぎず、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。
【００１１】
本開示は、受容体Ｂ７ｈ活性をトリガする能力を有する少なくとも１つの受容体Ｂ７ｈのリガンドを含む新規抗腫瘍治療剤に関する。
【００１２】
一実施形態によれば、本発明は、腫瘍を有する対象の治療における使用のための受容体Ｂ７ｈのリガンドを提供する。ここで、受容体Ｂ７ｈのリガンドは、生体適合性マイクロ担体またはナノ担体の中または上に搭載され、Ｂ７ｈ受容体のリガンドは、受容体Ｂ７ｈに結合して受容体Ｂ７ｈ活性をトリガすることが可能であり、任意で、オステオポンチン活性を阻害する。
【００１３】
好適な実施形態において、受容体Ｂ７ｈのリガンドは、ａ）配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＣＯＳタンパク質またはその一部、ｂ）配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＣＯＳ細胞外ドメインまたはその一部、および、ｃ）配列ＩＤ番号１、２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質ａ）およびｂ）のいずれか１つの相同体またはその一部から選択される。
【００１４】
なお更なる好適な実施形態において、Ｂ７ｈ受容体のリガンドは、配列ＩＤ番号３に記載されるようなアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明の一実施形態において、生体適合性マイクロ担体またはナノ担体の中または上に搭載される受容体Ｂ７ｈのリガンドは、注射または注入によって投与される。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「受容体Ｂ７ｈのリガンド」という表現は、配列ＩＤ番号１に記載されるようなアミノ酸配列を有するヒト野性型リガンドＩＣＯＳだけでなく、（例えば、配列ＩＤ番号２に記載されるようなアミノ酸配列を有する）その一部も含む。ただし、その一部は、受容体Ｂ７ｈに結合し、活性をトリガし、任意でオステオポンチン活性を阻害する能力を有するものとする。
【００１７】
本発明において有用である受容体Ｂ７ｈの他のリガンドは、受容体Ｂ７ｈに特異的に結合可能な（すなわち高親和性の）モノクローナル抗体を含む。ただし、そのモノクローナル抗体は、Ｂ７ｈ受容体に対してアゴニスト活性を有する、すなわち、受容体Ｂ７ｈ活性をトリガすることが可能であり、任意で、オステオポンチンに対して拮抗活性を有する、すなわち、オステオポンチン活性を阻害可能であるものとする。
【００１８】
「ヒトＩＣＯＳの相同体またはその一部」という表現は、配列ＩＤ番号１および２のいずれか１つ、またはその一部に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは９８％の同一性を有するタンパク質を意味する。ただし、その相同体は、受容体Ｂ７ｈに結合し、その活性をトリガし、任意で、オステオポンチン活性を阻害する能力を有するものとする。
【００１９】
受容体活性をトリガする能力が、例えばＳｅｅｄ  Ｂにおいて示されるような細胞表面上で発現される対象の受容体を架橋する能力を示唆することは一般常識である。 "Ｍａｋｉｎｇ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ"，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  １９９４  Ｎｏｖ；１（３）：１２５−９，  ａｎｄ    Ａ，  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  Ｊ．  "Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ"，  Ｃｅｌｌ．  １９９０  Ａｐｒ  ２０；６１（２）：２０３−１２。そのような一般常識から、受容体Ｂ７ｈのリガンドは、抗腫瘍効果を発揮するために少なくとも二量体の形態である必要があるということが分かる。受容体Ｂ７ｈ活性をトリガ可能な少なくとも二量体の形態であるリガンドの例は、とりわけ、二価または多価ＩＣＯＳ−Ｆｃコンストラクト、抗Ｂ７ｈ受容体抗体、結合された少なくとも２つのＩＣＯＳ分子を含む有機／無機、天然／合成スキャフォールド、および、複数のＩＣＯＳ分子の化学的または遺伝子的架橋によって取得されるＩＣＯＳ多量体によって代表される。多量体化は、金属イオンまたは小分子ベースのアセンブリ、タンパク質（ペプチド）相互作用ベースのアセンブリ、共有結合タンパク質アセンブリ、機能性タンパク質とタンパク質構成ブロックとの遺伝子融合によって達成され得る。多量体化は、デンドリマー、デンドロン、デンドロナイズドポリマー、多分岐ポリマー、およびポリマーブラシの使用によって達成され得る。スキャフォールドは、有機ポリマー（ショ糖、スクアレン、またはソラネソールに由来するものなど）、および、表面に複数のＩＣＯＳ分子を露出する有機または無機固体ナノ／マイクロ粒子を含み得る。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、安定化分子に融合または結合される受容体Ｂ７ｈのリガンドを提供する。
【００２１】
受容体Ｂ７ｈリガンドに結合できる安定化分子に関して、そのような分子は当技術分野において広く知られているので、本明細書において詳細な説明は不要である。安定化分子の例として、ヒトＦｃ抗体ドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはそれらの誘導体、ポリ−Ｌ−リシンシトライミド（リシンまたはカルバミン酸エチルスペーサーを介する）、スチレン無水マレイン酸およびポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドが挙げられる。
【００２２】
受容体Ｂ７ｈリガンド上に存在するアミノ基に結合可能なＰＥＧ誘導体はとりわけ、エポキシドＰＥＧ、アルデヒドＰＥＧ、ニトロフェニルカーボネートＰＥＧ、スクシンイミジルエステルＰＥＧである。Ｂ７ｈ受容体リガンド上に存在するチオール基に結合可能なＰＥＧ誘導体はとりわけ、オーソピリジルジスルフィド（ｏｒｔｈｏｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）ＰＥＧである。Ｂ７ｈ受容体リガンド上に存在するヒドロキシル基に結合可能なＰＥＧ誘導体はとりわけ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはヒドロキシベンゾトリアゾールで活性化されたＰＥＧ−ＣＯＯＨである。他のＰＥＧ誘導体は、ｐＨ依存加水分解のＰＥＧポリアセタールおよびＰＥＧデキストリン（ポリマーマスキング−アンマスキングタンパク質治療（ｐｏｌｙｍｅｒ−ｍａｓｋｉｎｇ−ｕｎｍａｓｋｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、ＰＵＭＰＴ）によって代表される。
【００２３】
Ｂ７ｈ受容体リガンドの治療部位すなわち腫瘍への送達を増大させるべく、受容体Ｂ７ｈリガンドは高グリコシル化してもよく、または、マンノース残基に結合されてよい。
【００２４】
高グリコシル化は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの化学反応または部位特異的突然変異誘発法のいずれかによって行われてよく、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかのタンパク質グリコシル化をもたらす。Ｎ結合型グリコシル化においては、糖鎖は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのアスパラギンに結合され、ここで、Ｘは、プロリン以外のアミノ酸を表わす。ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、高グリコシル化に頻繁に使用される。高分子量のＰＳＡが、低分子量の薬剤およびペプチドの送達に好適である一方、より低分子量のＰＳＡが、粒子状薬剤送達システムに加え、巨大タンパク質に用いられてよい。
【００２５】
マンノース残基へのコンジュゲートは、マンノース受容体へのコンジュゲートの結合を利用し、マンノース受容体は、クッパー細胞、マクロファージ、肺胞、単球由来の樹状細胞並びに血管およびリンパ内皮細胞のサブセット上で発現されると報告されている。マンノシル化タンパク質は、マンノース特異的レクチン、すなわち、マンノース受容体およびＭＢＰによって認識されてよい。
【００２６】
生体適合性担体（異なる程度の生分解性を有し得る）に関して、担体は粒子、カプセル、ベシクル、バブルから選択され、その各々は、ミクロンまたはナノメートルのオーダーの寸法を有する。他の好適な担体は、ナノエマルジョン、ナノ懸濁物、ナノハイドロゲル、ミセル、デンドリマー、量子ドット、リポソームまたは炭素誘導体（例えばカーボンナノチューブ）によって代表される。マイクロ、ナノ粒子は、ポリマー、金属（例えば金）、シリカ、または脂質シェルを有する合成ポリマーコアからできていてよい。金属粒子は磁気も有し得る。これらすべての担体は、薬剤の送達についての薬学分野において広く知られているので、本明細書において詳細な記載は不要である。受容体Ｂ７ｈリガンド／担体システムの抗腫瘍活性は、担体の特定の種類に関連せず、受容体Ｂ７ｈリガンドとナノ／マイクロ担体との会合がマイクロ、ナノプラットフォーム製剤を作り、２つの成分は協働する。Ｂ７ｈ受容体リガンドをマイクロ／ナノキャリアの中または上に搭載することは、治療有効性および臨床への応用に重要である。担体および受容体Ｂ７ｈのリガンドは、抗腫瘍活性に等しく寄与し、それらの相乗効果は有効な抗癌治療に必須である。加えて、Ｂ７ｈ受容体リガンド／担体システムは、下に記載するように、抗腫瘍活性を高めるために重要である。受容体Ｂ７ｈリガンドを担体中に組み込むことにより、活性分子の容器を作り、その全身曝露を最小化し、腫瘍組織への蓄積および放出、ならびに、非特異的送達の回避を可能にする。実際、受容体Ｂ７ｈリガンドをマイクロ／ナノキャリアに組み込むことにより、受動的および能動的標的化手法を利用する、癌細胞に送達するための部位特異的標的化システムの開発が可能になる。
【００２７】
好適な実施形態において、担体は、シクロデキストリンポリマー、ラクチド−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）、キトサン、アルギン酸塩、澱粉、アルギン酸塩、コラーゲン、アルブミン、シリカ、金属からできたマイクロ粒子またはナノ粒子によって代表される。好ましくは、担体は、シクロデキストリンポリマーまたはラクチド−グリコール酸共重合体からできているマイクロ粒子またはナノ粒子によって代表される。
【００２８】
更なる実施形態において、本発明は、生体適合性マイクロ担体またはナノ担体の中または上に搭載された受容体Ｂ７ｈの少なくとも１つのリガンドを含む医薬組成物、および、腫瘍の治療における使用のための薬学的に許容されるビヒクルに関する。
【００２９】
好適な実施形態において、医薬組成物に含まれる少なくとも１つの受容体Ｂ７ｈのリガンドは、ａ）配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＣＯＳタンパク質またはその一部、ｂ）配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩＣＯＳ細胞外ドメインまたはその一部、および、ｃ）配列ＩＤ番号１、２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質ａ）およびｂ）のいずれか１つの相同体またはその一部から選択される。
【００３０】
さらに好適な実施形態において、医薬組成物に含まれる受容体Ｂ７ｈの少なくとも１つのリガンドは、配列ＩＤ番号３に記載されるようなアミノ酸配列を含む。
【００３１】
好適な実施形態において、医薬組成物に含まれる受容体Ｂ７ｈの少なくとも１つのリガンドは、安定化分子に融合または結合される。
【００３２】
本開示はまた、腫瘍の処理に有用な医薬活性物質のスクリーニングの標的としての受容体Ｂ７ｈの使用であって、医薬活性物質は受容体Ｂ７ｈに結合し、受容体Ｂ７ｈ活性をトリガし、オステオポンチン活性を阻害する、使用に関する。
【００３３】
以前のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける研究では、ＩＣＯＳ−ＦｃによるＢ７ｈトリガは、ＤＣ、ＥＣおよびいくつかの腫瘍細胞株の遊走および接着を阻害することが示された。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏの研究では、ＩＣＯＳ−Ｆｃが、尾静脈に注射されたＢ７ｈ陽性腫瘍細胞の肺への転移を阻害することが示された。ヒトＢ７ｈ陽性新生細胞をマウスの尾静脈に注射し、これらのマウスをヒトおよびマウスＩＣＯＳ−Ｆｃ（種特異的である）の両方で処理することにより、本発明者は、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移のＩＣＯＳ−Ｆｃ媒介阻害は、腫瘍細胞および宿主細胞の両方に対する効果を伴うことを示した。ＩＣＯＳ−Ｆｃを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ処理により、同系のマウスの尾静脈にＢ１６メラノーマ細胞を注射しても、実験的な肺への転移の進行が阻害された。さらに、本発明者は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスの尾静脈に注射されたヒトＣＦ−ＰＡＣ１細胞株の異種移植モデルを使用して、転移の最適な阻害には、ヒトおよびマウスＩＣＯＳ−Ｆｃの両方による同時処理が必要であることを発見した。これらのデータは、ＩＣＯＳ−Ｆｃが、ヒト腫瘍細胞およびマウス環境の両方に作用することにより、転移性播種に対して阻害効果を発揮することを示す１４。
【００３４】
腫瘍増殖は実際、新生細胞増殖およびアポトーシス、組織侵入、接着および遊走、血管新生、血管内および血管外など、いくつかの別個のプロセスを伴う。したがって、新生細胞接着、遊走、血管内および血管外に作用する抗転移薬剤（いわゆる「転移安定化（ｍｉｇｒａｓｔａｔｉｃ）」剤）は、腫瘍増殖に対して有効でなく、「転移安定化」剤の潜在的な臨床妥当性は現在、大いに疑問視されている１７，１８。実際、発明者の以前の実験では、ｉｎ  ｖｉｖｏ１３，１４またはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれにおいても、樹立原発腫瘍の増殖に対するＩＣＯＳ−Ｆｃのいかなる効果も検出されなかった。これらのネガティブな結果は、ＩＣＯＳ−Ｆｃのいくつかの用量および送達経路（経静脈、腹腔内および腫瘍周辺への注射）、ならびに、腫瘍発現Ｂ７ｈのいくつかの実験モデル（移植可能Ｂ１６黒色腫およびＰＣ３前立腺癌腫およびＢａｌｂ／ｎｅｕＴ自発性乳癌）を試験することによってｉｎ  ｖｉｖｏで得られた。実際、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において、Ｂ７ｈを発現するいくつかの腫瘍細胞株の増殖およびアポトーシスに対してＩＣＯＳ−Ｆｃのいかなる効果も検出されなかった１４。さらに、ＩＣＯＳ−Ｆｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの血管内皮細胞増殖および血管新生アッセイに対して、いかなる効果も示さなかった１４。結論として、以前の研究によって検出されたＩＣＯＳ−Ｆｃの抗腫瘍効果のみが、抗転移効果であり、一方、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍増殖、腫瘍細胞増殖およびアポトーシス、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏの血管新生に対する効果は検出されなかった。
【００３５】
本発明者は次に、生体適合性ナノ粒子に封入されたＩＣＯＳ−Ｆｃの抗腫瘍活性を試験した。
【００３６】
発明者は、移植可能腫瘍のＢ１６黒色腫モデルを使用して、シクロデキストリンポリマーナノスポンジ（ＣＤＮＳ）に封入されたＩＣＯＳ−Ｆｃが、樹立腫瘍塊の増殖を低減し、その血管新生を低減する有力な抗腫瘍活性を示すことを意図せずに発見した。これらの効果はＩＣＯＳ欠乏マウスにおいても検出可能であった。このことは、それらはＢ７ｈと内因性ＩＣＯＳとの間の相互作用に対するＩＣＯＳ−Ｆｃの拮抗効果のみに起因するものではなかったことを示す。その効果は、ナノ粒子の種類および腫瘍の種類に依存しなかった。なぜなら、ラクチド−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子に搭載されたヒトＩＣＯＳ−Ｆｃおよび膠芽腫の異種モデルを使用して、同様の抗腫瘍効果が検出されたからである。
【００３７】
抗癌応答におけるＢ７ｈの関与の別の態様において、本発明者は、Ｂ７ｈが、細胞外基質のタンパク質および可溶性サイトカインのいずれかとして作用できるオステオポンチン（ＯＰＮ）にも結合することを発見した。ＯＰＮは、マクロファージ、ＤＣ、骨芽細胞およびＴ細胞を含むいくつかの細胞の種類によって分泌される。ＯＰＮは、骨再形成、マクロファージ応答、細胞遊走および接着、炎症、ＴＨ１およびＴＨ１７細胞分化のサポートなど、いくつかの機能を媒介する。腫瘍の生態において、腫瘍細胞によって生じたＯＰＮおよび腫瘍微小環境は、腫瘍増殖、遊走、転移性播種および血管新生の促進において重要な役割を担う。ＯＰＮは、インテグリンおよびＣＤ４４などいくつかの受容体と相互作用し、異なる受容体に結合し異なる機能を発揮するＮ末端（ＯＰＮ−Ｎ）およびＣ末端（ＯＰＮ−Ｃ）部分におけるトロンビンによって切断される。いくつかのインテグリンに結合するＲＧＤドメインは、トロンビン切断時に露出されるα４β１インテグリンの２つの他の結合部位に近いＯＰＮ−Ｎに位置する。ＣＤ４４結合部位はＯＰＮ−Ｃに位置する１９。本発明者は、腫瘍細胞株およびＥＣのＯＰＮ誘導遊走応答にＢ７ｈ発現が必要であること、この効果がＩＣＯＳ−Ｆｃによって阻害されることを意図せずに発見した。次に、ＩＣＯＳによって結合される部位とは異なるＢ７ｈの結合部位を使用して、ＯＰＮがＢ７ｈに直接結合することが発見された。これらのデータは、ＩＣＯＳによるＢ７ｈトリガが、いくつかの化学誘引によって誘導される細胞遊走を阻害し、一方、ＯＰＮによるトリガが細胞遊走を誘導し、ＩＣＯＳによって発揮される効果が優性であるシナリオを示す。したがって、任意の特定の理論に制限されることなく、本発明者は、腫瘍増殖、遊走、転移性播種および血管新生を促進するＯＰＮ効果を阻害することによっても、ＩＣＯＳ−Ｆｃがその抗腫瘍効果を発揮すると考える理由を有する。
【００３８】
腫瘍の治療における使用のためのＢ７ｈ受容体リガンドの送達のための担体に関して、本発明者は、担体の性質が、Ｂ７ｈ受容体リガンドが抗腫瘍活性に対して発揮する能力にいかなる効果も有しないことを確認した。
【００３９】
マイクロ、ナノ粒子は、シクロデキストリン（ＣＤ）ポリマーナノスポンジ（ＣＤＮＳ）、ラクチド−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）、キトサン、アルギン酸塩、澱粉、デキストラン、コラーゲン、アルブミン、シリカ、金属（例えば金）からできていてよい。細網内皮系による認識および摂取を阻害すべく、並びに循環時間を延長すべく、リポソームは、また、ＰＥＧで表面修飾されてよい。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕで、感熱性ヒドロゲルは、温度変化に応答して、ゾル−ゲル相転移を経る。
【００４０】
ＣＤは、６から１００より多くのグルコース単位を含む環状α−１，４グルカンである。それらはＣＤグルカノトランスフェラーゼによって分解される澱粉の分子内グリコシル基転移反応の結果としての天然産物である。当該酵素産物は一般に、それぞれ６、７および８個のグルコース単位を含むα、β、γ−ＣＤの混合物である。それらは、幅広いゲスト分子による分子封入の能力に起因して、超分子化学において重要な役割を担い、薬学分野、生物医療科学およびバイオテクノロジーにおいて高い関心を持たれている。それらはトーラス型のリング構造を提示し、内部の疎水性キャビティおよび外部の親水性部位を有する。ＮＳは、ＣＤキャビティの存在、および、結晶またはアモルファス構造、球状形状、膨張特性を有する架橋ネットワークのナノチャネルに起因するナノ多孔性不溶性ナノ粒子（ＮＰ）を形成し得る２０−２４。
【００４１】
シクロデキストリン−ナノスポンジ（ＣＤＮＳ）は、幅広い疎水性分子を収容可能な包接錯体を形成できる。水溶液において、疎水性ＣＤキャビティは、「弱い力」（エネルギー的に不利）によって結合される水分子によって占められる。内部キャビティのサイズに起因して、１または２つの疎水性ゲスト分子は、１、２、またはさらには３個のＣＤによって捕捉され得る。ＣＤＮＳは、球状の形状を有する、結晶またはアモルファスのいずれかである多孔性不溶性ＮＰを形成できる。ポリマーメッシュの極性および寸法は、架橋の種類および程度を変動させることによって容易に調節できる。ＣＤＮＳは、異なる種類の親油性または親水性分子を組み込むことができ、それらは、表面上で様々なリガンドを結合することによって、部位特異的な標的化のために官能化することができる。それらは安全で生分解性であり、細胞培養に対して無視できるほどの毒性を示し、マウスに注射するときに忍容性が良好である。水溶性が低い分子の水溶性を改善し、分解性物質を保護し、持続的放出を獲得することを達成するために、ＮＳ構造を調節することによって、捕捉された分子の放出を調整できる。
【００４２】
乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ＮＰは、いくつかの薬剤の効力および生物学的利用可能性を増大させる、もっとも特性評価されたＮＰであり、その使用は、いくつかの治療適用についてアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認されている。ポリマーラクチド−グリコリド比、分子量および結晶プロファイルの調節は、捕捉された分子の分解速度およびその後の放出を数日から最大１年に長引かせることを可能にする。
【００４３】
本明細書において、本発明者は、ＩＣＯＳ−Ｆｃが、生体適合性ナノ粒子に封入されたときのみ、樹立原発腫瘍の増殖を顕著に阻害し、一方、遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃは効果を有しないことを示す（図１）。このことは、薬剤担体としてＣＤＮＳまたはＰＬＧＡナノ粒子のいずれかを使用し、マウス腫瘍モデル（メラノーマ）（図１）またはヒト／マウス腫瘍異種移植モデル（膠芽腫）（図９）のいずれかを使用して、免疫原性が強い周辺腫瘍（メラノーマ）および免疫原性が弱いＣＮＳ腫瘍（膠芽腫）の両方において検出された。さらに、ＩＣＯＳ−Ｆｃは、免疫応答性マウス（メラノーマ）（図１）だけでなく、無胸腺マウス（膠芽腫）（図９）およびＩＣＯＳ−ＫＯマウス（メラノーマ）（図４）においても有効であった。これらのデータは、ＩＣＯＳ−Ｆｃ効果が、Ｂ７ｈとＴ細胞（または他の細胞の種類）で発現される内因性ＩＣＯＳとの間の相互作用をブロッキングすることに起因しないことを示す。抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂを使用するこのブロッキングは、抗腫瘍免疫応答を阻害する制御性Ｔ細胞の発生を抑制することを示した。
【００４４】
いずれの理論に制限されることなく、本発明者は、抗腫瘍活性を発揮するための担体（ナノ粒子）へのＩＣＯＳ−Ｆｃの搭載は、おそらく血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果によって、ＩＣＯＳ−Ｆｃを腫瘍塊に運ぶ担体の能力に起因し得ると考える理由を有する。ＥＰＲ、または、腫瘍への標的化を増大させる生体分子に結合された担体など、腫瘍への薬剤送達を増大させる他の機構のいずれかを通じて作用する様々な種類の担体によって、同じ効果が発揮され得る。さらに、モノクローナル抗体など、Ｂ７ｈをトリガできる他の分子によって、ＩＣＯＳ−Ｆｃの同じ効果が発揮され得る。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（図８）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（図２）のＩＣＯＳ−Ｆｃの抗血管新生活性によって示唆されるように、Ｂ７ｈトリガの抗腫瘍活性は、腫瘍血管新生に対するＩＣＯＳ−Ｆｃ効果に部分的に起因し得る。以前のデータは、ＩＣＯＳ−Ｆｃによって発揮される抗血管新生効果をいずれも検出しなかったので１４、この発見は新規である。さらに、膠芽腫異種移植モデルにおけるヒトＩＣＯＳ−Ｆｃの効果は、ＩＣＯＳ−Ｆｃが腫瘍細胞に対して直接的な効果も発揮することを示す。なぜなら、ヒトＩＣＯＳ−Ｆｃは、宿主細胞によって発現されるマウスＢ７ｈと相互作用しないからである。腫瘍細胞生存性に対する、ＮＰに封入されたＩＣＯＳ−Ｆｃの直接的な効果を支持するものとして、発明者は、ＣＤＮＳに封入された高用量のＩＣＯＳ−Ｆｃはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢ１６−Ｆ１０細胞に対して細胞毒性効果を発揮し、一方、空のＣＤＮＳおよび遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃは効果が無かったことを示す（図５）。１つの可能性として、この相違は、細胞内受容体Ｂ７ｈとのＩＣＯＳ−Ｆｃの相互作用を増大させるであろうＩＣＯＳ−Ｆｃ細胞インターナリゼーションを増大させるＮＰの能力に起因し得る。
【００４６】
重要な点として、Ｂ７ｈはまた、腫瘍増殖、遊走、および転移に関与する重要な分子であるＯＰＮに結合し（図６）、Ｂ７ｈ／ＯＰＮの相互作用はこれらのＯＰＮ活性に関与すること（図７）が初めて示された。Ｂ７ｈ／ＯＰＮの相互作用は、ＩＣＯＳ／Ｂ７ｈ相互作用とは異なる結合部位を伴い（図６）、ＩＣＯＳ−Ｆｃは、ＯＰＮによって媒介されるいくつかの腫瘍促進活性に対して強い負の優性効果を示す（図８）。これらのデータは、腫瘍増殖のＩＣＯＳ−Ｆｃ阻害活性は、Ｂ７ｈと、Ｔ細胞上で発現する内因性ＩＣＯＳとの間の相互作用のブロッキングに限定されないことを確認するものである。
【００４７】
発明者が実行した実験を考慮すると、ＩＣＯＳ−Ｆｃは、単剤療法または他の抗悪性腫瘍療法との併用療法のいずれにおいても使用できる抗悪性腫瘍薬剤である。ＩＣＯＳ−Ｆｃは、Ｂ７ｈをトリガし、ＯＰＮ活性を阻害することによって作用する。これらは、内因性ＩＣＯＳ／Ｂ７ｈ相互作用を阻害する効果への実質的に追加的な効果である。
【００４８】
［結果］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖におけるＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果
触知可能な皮下Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを静脈内注射によって、マウスＩＣＯＳ−Ｆｃ、またはＩＣＯＳ−Ｆｃ／ＣＤＮＳもしくは空のＣＤＮＳ、または対照として同一の体積（各々１００μｇ）のＰＢＳのいずれかで４日ごとに処理し、腫瘍増殖を４日ごとに監視した。結果は、ＣＤＮＳに搭載されたＩＣＯＳ−Ｆｃ（ＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ）は、マウスにおけるメラノーマ細胞の増殖を実質的に阻害し、一方、遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃは効果が無かったことを示した（図１）。
【００４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍血管新生におけるＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果
腫瘍血管新生に対するＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を評価するべく、Ｂ１６−Ｆ１０細胞を用いて取得された腫瘍におけるＣＤ３１の発現を評価した。結果は、ＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ処理によって、対照マウス（ＰＢＳ）または空のＣＤＮＳで処理したマウスと比較して血管形成が低減したことを示した（図２）。
【００５０】
ｅｘ−ｖｉｖｏでの免疫応答に対するＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果
当該処理が免疫応答を調節するかどうかを評価するべく、腫瘍から侵入リンパ球を取得し、ＩＬ−１７ＡおよびＲＯＲγｔ（マーキングＴＨ１７細胞）、ＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３（マーキング制御性Ｔ細胞）のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって評価した。なぜなら、ＩＣＯＳはＴＨ１７および制御性Ｔ細胞の分化において重要な役割を有するからである。結果は、ＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ処理により、対照マウスにおいて検出されたレベルと比較して、Ｆｏｘｐ３およびＩＬ−１０の発現が顕著に減少し、一方、遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃおよび空のＣＤＮＳは効果が無かったことを示した。対照的に、ＲｏＲγｔおよびＩＬ１７Ａの発現において顕著な相違は検出されなかった（図３）。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖におけるＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果は、内因性ＩＣＯＳの存在に依存しない。
【００５２】
ＩＣＯＳ−Ｆｃ抗腫瘍効果がＢ７ｈと内因性ＩＣＯＳとの相互作用の阻害にどの程度依存するかを評価するべく、ＩＣＯＳ欠乏マウスにおけるＢ１６腫瘍増殖に対するＣＤＳＮ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を評価した。結果は、ＩＣＯＳ欠乏マウスにおけるＢ１６腫瘍の増殖をＩＣＯＳ−Ｆｃが有効に阻害したことを示した（図４のＡ）。腫瘍増殖に対する効果は、組織から抽出されたｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ解析によって検出されたように、ＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３の発現の減少を伴った（図４のＢ）。これらのデータは、ＩＣＯＳ−Ｆｃ効果がＢ７ｈのトリガに依存し、内因性ＩＣＯＳへのＢ７ｈ結合の拮抗作用に依存しないことを示す。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞に対するＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの細胞毒性効果  ＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ、または空のＣＤＮＳ、または遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃの滴定量（０．５、１、２、５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でインキュベートされたＢ１６−Ｆ１０細胞に対してＭＴＴアッセイを実行することによって、ＣＤＮＳ調製および遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃの細胞毒性を評価した。結果は、ＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃのみによって発揮され、空のＣＤＮＳまたは遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃによって発揮されなかった、非常に高い用量での細胞毒性（２および５μｇ／ｍｌで３０％の阻害）を検出した（図５）。
【００５４】
Ｂ７ｈはＩＣＯＳだけでなくＯＰＮにも結合する  発明者は、組み換えＢ７ｈ−ＦｃおよびヒスチジンタグＯＰＮまたはＢ７ｈ（Ｂ７ｈ−ｈｉｓ）を使用して、ＯＰＮがＢ７ｈに結合するという仮説を試験するために２つの手法を使用した（図６）。Ａ）ＥＬＩＳＡ。ＯＰＮ（またはＢ７ｈ−ｈｉｓ）をＥＬＩＳＡプレート上に吸着させ、次に、滴定量のＢ７ｈ−Ｆｃ（またはＯＰＮ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、抗ＩｇＧ１ｍＡｂ（またはポリクローナル抗ＯＰＮ  Ａｂ）を用いて結合を評価した。結果は、ＯＰＮに対するＢ７ｈの濃度依存的な結合を示した。さらに、ＯＰＮ／Ｂ７ｈ結合は、ＩＣＯＳ−Ｆｃによって阻害されないことを示した。このことは、ＯＰＮおよびＩＣＯＳ−ＦｃはＢ７ｈの異なる部位に結合することを示す。ＩＣＯＳ−ＦｃはＯＰＮに対していかなる結合も示さなかった。Ｂ）プルダウン。セファロースタンパク質Ａによって捕捉されるｂａｉｔタンパク質としてＢ７ｈ−Ｆｃを使用し、ＯＰＮと共に１時間インキュベートした。洗浄後、タンパク質を樹脂から溶出し、抗ＯＰＮポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。結果は、ＯＰＮとＢ７ｈとの間の会合を示した。
【００５５】
ＯＰＮによるＢ７ｈのトリガは腫瘍細胞株およびＥＣの遊走を促進する  ＯＰＮは、高レベルのＢ７ｈを発現する腫瘍細胞株（Ｂ７ｈｈｉｇｈ）の遊走を誘導するが、低レベルのＢ７ｈを発現する腫瘍細胞株（Ｂ７ｈｌｏｗ）の遊走を誘導しない。一方、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）によって遊走が誘導されるとき、相違は見られなかった（図７のＡ〜Ｂ）。Ｂ７ｈｌｏｗ腫瘍細胞において、ＯＰＮへの遊走応答は、Ｂ７ｈ発現を強化するＢ７ｈトランスフェクションによって戻される。一方、Ｂ７ｈｈｉｇｈ  ＨＵＶＥＣにおいて、それはＢ７ｈのｓｈＲＮＡ媒介サイレンシングによって阻害される（図６のＣ−Ｄ）。その効果は特異的である。なぜなら、Ｂ７ｈ発現の調節は、腫瘍細胞においてＦＢＳによって、および、ＨＵＶＥＣにおいてＶＥＧＦによって誘導される遊走に影響しないからである。
【００５６】
ＩＣＯＳ−Ｆｃは、ＯＰＮ誘導遊走および細管形成の優性阻害を発揮する  ＨＵＶＥＣにおいて、ＩＣＯＳ−Ｆｃ処理により、ＯＰＮによって誘導される細管形成が阻害されるが、ＶＥＧＦによって誘導される細管形成は阻害されない（図８のＡ）。
【００５７】
高レベルのＢ７ｈを発現する腫瘍細胞株において、ＩＣＯＳ−Ｆｃ処理は、ＯＰＮによって誘導されるＨＵＶＥＣへの細胞遊走および接着を阻害する（図８のＢ）。
【００５８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖におけるＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果
滴定量（０．５、１、２、５μｇ／ｍｌ）の空のＰＬＧＡまたはＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ  ＮＰと共にインキュベートされたＢ１６−Ｆ１０細胞に対してＭＴＴアッセイを実行することによって、ＰＬＧＡ調製の細胞毒性を評価した。いくらかの毒性が、非常に高い用量のみでＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ  ＮＰによって発揮されたが、空のＰＬＧＡ  ＮＰまたは遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃによって発揮されなかった（図９のＡ）。
【００５９】
触知可能な皮下Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを腹腔内投与によって、ＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃまたは空のＰＬＧＡ（各々１００μｇ）または対照として同一の体積のＰＢＳのいずれかを４日ごとに処理し、腫瘍増殖を４日ごとに監視した。結果は、ＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ処理により、両方の対照処理と比較して、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖が有効に阻害されることを示した（図９のＢ）。
【００６０】
ヒト神経芽細胞腫細胞（ＭＤ１３）の脳への移植の１週間後に、脳にヒト膠芽腫を有する無胸腺マウスを、ヒトＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＰＬＧＡまたは空のＰＬＧＡで処理した。ＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ処理により、担癌マウスの生存の中間値が顕著に延長された（図１０）。ＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ処理により、空のＰＬＧＡで処理されたマウスと比較して、腫瘍形成が低減された。Ｔ細胞欠乏マウスにおいてＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を評価したので、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖におけるＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果は、内因性ＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在に依存しない。
【００６１】
［材料および方法］
ＩＣＯＳおよびＩＣＯＳ−Ｆｃのクローニングおよび生産  ヒトＩＣＯＳまたはマウスＩＣＯＳの細胞外部分が、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）プラスミド（ｃｏｄ．Ｖ８７０−２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の修飾された真核細胞発現ベクターにクローニングされ、Ｄｉ  Ｎｉｒｏ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２５によってｐミニボディ（ｐＭＢ−ＳＶ５）として報告された（ＰｕｂＭｅｄ  ＩＤ：１７６７８５２５）。このベクターは、元のものとは、次の点が異なる。すなわち、真核細胞における翻訳の開始に必要なＫｏｚａｋ配列（５'ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ３'−配列ＩＤ番号：１１）、培養上清中のタンパク質の放出を可能にすべく導入された分泌リーダー配列（５'ＧＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＡ３'−配列ＩＤ番号：１２）、タンパク質発現レベルを増大させるためのミニイントロン配列（５'ＧＧＴＡＡＧＧＧＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＡＴＣＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧ３'−配列ＩＤ番号：１３）。生成されるタンパク質を標的化するためのタグ配列が、導入された。これは、シミアンウイルス−５（ＳＶ５タグ）（５'  ＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＴＡＧＴＡＣＴ  ３'−配列ＩＤ番号：１４）に由来し、タンパク質のモノクローナル抗体認識に有用である。このベクターは、目的の断片を、配列ＩＤ番号５および９にそれぞれ記載のヌクレオチド配列を有する、免疫グロブリンＩｇＧ１（Ｆｃ）ドメインのヒトまたはマウスの定常断片のコード配列を持つフレームへのクローニングを可能にした。
【００６２】
ヒトＩＣＯＳ−Ｆｃコンストラクト（配列ＩＤ番号：３）を生成するため、ヒトＩＣＯＳの細胞外部分をコードするヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：４）が、特異的プライマーであるＩＣＯＳフォワードＢｓｓｈＩＩプライマー（５'  ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＣ  ３'−配列ＩＤ番号：１５、米国テキサス州ウッドランズにあるＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）およびＩＣＯＳリバースＮｈｅＩプライマー（５'  ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＡＧＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣ  ３'−配列ＩＤ番号：１６、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）で増幅された。増幅断片は、ＢｓｓＨＩＩ（ｃｏｄ．Ｒ０１９９Ｓ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチにあるＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｉｎｃ，）酵素、および、ＮｈｅＩ（ｃｏｄ．Ｒ０１３１Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｉｎｃ，）酵素で切断された。ヒトＦｃドメインのコード配列と共に、ダブルダイジェスト断片を上記のｐＭＢ−ＳＶ５プラスミドにクローニングした（ヒトＦｃドメインは、配列ＩＤ番号５に記載される配列を有する）。ヌクレオチド配列をシーケンシングによって決定した。ｈｕＩＣＯＳ−ｈｕＦｃをコードするベクターを発現するヌクレオチド配列は配列ＩＤ番号６に記載される。
【００６３】
マウスＩＣＯＳ−Ｆｃコンストラクト（配列ＩＤ番号７）を生成するために、マウスＩＣＯＳ（配列ＩＤ番号８）の細胞外部分をコードするヌクレオチド配列を特異的プライマーであるＩＣＯＳマウスフォワードＢｓｓｈＩＩプライマー（５'ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＧ'３−配列ＩＤ番号１７、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）およびＩＣＯＳマウスリバースＮｈｅＩプライマー（５'ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＣ３'−配列ＩＤ番号１８、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）で増幅した。増幅断片は、ＢｓｓＨＩＩ（ｃｏｄ．Ｒ０１９９Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｉｎｃ，、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）酵素、および、ＮｈｅＩ（ｃｏｄ．Ｒ０１３１Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｉｎｃ，）酵素で切断された。このクローニングで使用されたベクターは、マウスＦｃドメインのコード配列を持つｐＭＢ−ＳＶ５であった（マウスＦｃドメインは配列ＩＤ番号９に記載された配列を有する）。ダブルダイジェストされた断片は、上記のｐＭＢ−ＳＶ５プラスミドにクローニングされた。ヌクレオチド配列が、シーケンシングによって決定された。ｍｓＩＣＯＳ−ｍｓＦｃをコードする発現ベクターのヌクレオチド配列は配列ＩＤ番号１０に記載される。
【００６４】
プラスミドＤＮＡが、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ細胞細菌（大腸菌；ｃｏｄ．Ｃ４０４０−０３、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド）に形質転換された。得られたコロニーは、特異的プライマーであるＰハイグロセンス（５'  ＣＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧ  ３'−配列ＩＤ番号：１９、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）、および、Ｐハイグロアンチセンス（５'  ＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧ  ３'−配列ＩＤ番号：２０、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）を用いてスクリーニングされ、コンストラクトが、シーケンシングによって確認された。最後に、プラスミドＤＮＡが、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（ｃｏｄ．１６４４７１００、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、チャイニーズハムスターオヴァリアン−サスペンション（ｏｖａｒｉａｎ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）細胞株（ＣＨＯ−ｓ）（ｃｏｄ．Ｒ８／００−０７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、トランスフェクションされた。ベクター内のハイグロマイシン耐性の存在のおかげで、安定したクローンが得られた。この目的のために、クローンは、トランスフェクションされた細胞の完全選択を可能にする濃度０．２ｍｇ／ｍｌでのハイグロマイシン−Ｂ（ｃｏｄ．１０６８７−０１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の選択の下、増殖された。細胞は、無血清のＩＭＤＭ培地（ｃｏｄ．ＢＥ１２−９１５Ｆ０１、Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）で増殖され、無血清培養上清が、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ｃｏｄ．１７−０６１８−０１、米国ニュージャージー州ピスカタウェイタウンシップにあるＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、精製された。
【００６５】
ＣＤＮＳおよびＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの調製
構成ブロックとしてβシクロデキストリンを含む、カーボネートブリッジで架橋されたカーボネートＮＳ（ＣＤＮＳ、コードＣ４７６７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を以前に報告されたように調製した２０，２１。簡潔には、ある量の無水ＣＤを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、ｃｏｄｅ  ２２７０５６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）に溶解し、９０℃で少なくとも５時間、カルボニルジイミダゾール（ｃｏｄｅ  １１５５３３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）と反応させた。反応が終わると、過剰なカルボニルジイミダゾール（コード１１５５３３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を破壊するために、過剰な水を追加し、ろ過によって固体が回収され、水で精製した。次に、固体をすり鉢で粉砕し、エタノール（コード５１９７６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてソックスレー抽出し、残った反応副産物を除去した。反応は、過剰モルの架橋剤（例えば、シクロデキストリン：架橋剤が１：４）を使用して実行した。精製後、乾燥させたＮＳを２５℃で保存した。β−ＣＤＮＳをピロメリト酸二無水物（コード４１２２８７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）で架橋し、幾分球状の形態、および、可溶性が低い物質に対する非常に高い可溶化力を有する固体粒子を形成するカルボン酸末端のナノ多孔性材料（βＮＳ−Ｐｙｒｏ）を形成した。βＰｙｒｏ−ＮＳを獲得するべく、ピロメリト酸二無水物（コード４１２２８７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を無水シクロデキストリンに追加した。合成は、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、コードＤ１４３５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）において室温で２４時間実行した。アンモニアの存在下で、１：８のモル比で、ＣＤＮＳおよびピロメリト酸二無水物（コード４１２２８７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を架橋することによって、モルβＮＳ−Ｐｙｒｏを調製した。生物学的実験のために、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ機器（ＩＫＡ、ドイツ）を３分間使用して、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、乾燥させた調製物を０．９％ＮａＣｌ（コードＳ７６５３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）溶液中に分散させた。すべての試薬は分析用グレードであった。
【００６６】
ＮＰの構造をラマン分光法およびイメージング方法によって調査した。透過型電子顕微鏡によるデータは、形成されたＮＰは、５０〜１００ｎｍの範囲である、平均８１±９ｎｍのサイズを有する、ほぼ球状の形態を有することを示した。本結果は、ＮＳ−Ｐｙｒｏ  ＮＰは炎症効果が無く、メラノーマ細胞株に対していかなる副作用も有しなかったことを実証した。発明者は次に、これらのβＮＳ−Ｐｙｒｏ  ＮＰ  ＩＣＯＳ−Ｆｃに封入した。凍結乾燥させたβＮＳ−Ｐｙｒｏの測定した量を、３％  ｗ／ｖのＮａＣｌ（コードＳ７６５３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）およびＰＥＧ４００（ポリエチレングリコール４００、コード２０２３９８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を含むｐＨ６．０の水溶液において撹拌することによって分散させ、ＩＣＯＳ−Ｆｃを含む等張ナノ懸濁物水溶液を得た。
【００６７】
ＰＬＧＡ−ナノ粒子（ＮＰ）生産
変形された２溶媒蒸発法２６によってＰＬＧＡナノ粒子を調製した。簡潔には、６０ｍｇのＰＬＧＡ６５：３５結晶（ｃｏｄ．Ｐ２０６６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を１ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）（ｃｏｄ．２７０９９７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）に室温で溶解した。５０μｌのＰＢＳをＰＬＧＡに追加し、溶液を１分間にわたって超音波処理した。相分離を維持するべく、１％  ＰＶＡ（ｃｏｄ．Ｐ８１３６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）水溶液の５ボリュームを、得られたエマルジョンに慎重に追加した。さらに２分間の超音波処理を実行して、最終エマルジョンを得た。ＤＣＭを除去するべく、ドラフトチャンバーの下で一晩にわたって最終エマルジョンを蒸発させた。７０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離することによって、得られたナノ粒子を蒸留水で７回洗浄し、０．９％のＮａＣｌに再懸濁し、４℃で保管した。調製の第１段階中に、ＤＣＭに溶解されたＰＬＧＡ溶液にＩＣＯＳ−Ｆｃ（１ｍｇを凍結乾燥し、次に、５０μｌのＰＢＳすなわちリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した）を追加することによって上記のようにＩＣＯＳ−Ｆｃを含むナノ粒子を生産した。ＩＣＯＳ−Ｆｃの放出は、ナノ粒子を３７℃のＰＢＳに放置することによって評価した。放出されたタンパク質は、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。
【００６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
メスの５〜７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野性型ｃｏｄ．０００６６４−Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＩＣＯＳ−／−ｃｏｄ．００４８５９−Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｉｃｏｓｔｍ１Ｍａｋ／Ｊのいずれか、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国マサチューセッツ州ウィルミントン）にＢ１６−Ｆ１０細胞（１０５個の細胞／マウス、ｃｏｄ．ＣＲＬ−６４７５、ＡＴＴＣ、米国バージニア州マナッサ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が触知可能になった１０日後、経静脈（ｉ．ｖ．）注射により、マウスＩＣＯＳ−Ｆｃ、ＣＤＮＳに搭載されたＩＣＯＳ−Ｆｃ（ＩＣＯＳ−Ｆｃ／ＣＤＮＳ）、または空のＣＤＮＳのいずれか（各々１００μｇ）、または対照として同一の体積のＰＢＳを４日ごとにマウスに処理した。ノギスを用いて４日ごとに腫瘍サイズを測定し、３週間後にマウスを犠牲にした。他の実験において、ＰＬＧＡに搭載されたＩＣＯＳ−Ｆｃ（ＩＣＯＳ−Ｆｃ／ＰＬＧＡ）または空のＰＬＧＡ  ＮＰのいずれか（各々１００μｇ）、または対照として同一の体積のＰＢＳでマウスを処理することによって、同一の処理プロトコールが適用された。
【００６９】
他の実験において、無胸腺マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ、系統コード１９４、Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ）の右の線条体に、幹様腫瘍細胞に対応する、Ｂ７ｈ（処理群あたりｎ＝６）を発現する、新しく切除されたグリオーマ腫瘍に由来する細胞培養から取得された１×１０４個の解離されたヒト膠芽腫腫瘍球状細胞（間葉表現型）を定位的に注射した２７。腫瘍曝露の７日後、ＩＣＯＳ−Ｆｃまたは空のＰＬＧＡを含む１００μｌのＰＬＧＡナノ粒子をマウスに腹腔内注射した。脳腫瘍を有する動物において神経病理学な兆候が進行したとき、マウスを安楽死させた。腫瘍球状細胞を得るべく、新たに切除されたグリオーマ腫瘍サンプルを解離させ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｃｏｄ．３１３３１−０２８、Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ、米国ウォルサム）を含み、Ｂ２７  ＭＡＣＳ（登録商標）ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ（登録商標）−２１（以前はＭＡＣＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｂ２７  ＰＬＵＳ  ｃｏｄ．１３０−０９３−５６６  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）およびヘパリン（２．５μｇ／ｍｌ、ｃｏｄ．Ｈ３１４９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）が添加された合成培地において樹立細胞を培養した。増殖を強化し、幹細胞の特性を維持するべく、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、ｃｏｄ．１００−１８Ｂ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、英国ロンドン）および上皮成長因子（ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、ｃｏｄ．ＡＦ−１００−１５、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、英国ロンドン）を週に２回、スフィアカルチャーに追加した２７。マウスは、保険科学省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の動物施設の中で、病原体のない状態で育てられ、大学倫理委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に従い、扱われた。本研究は、東ピエモンテ大学の動物実験に関する生物倫理委員会およびイタリア保健省の承認を受けた（Ｐｒｏｔ．  Ｎｏ．  ４７７／２０１６−ＰＲ）。
【００７０】
リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
侵入細胞は腫瘍から取得された。ＩＬ−１７ＡおよびＲＯＲγｔ（マーキングＴＨ１７細胞）、ＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３（マーキング制御性Ｔ細胞）のｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲを介して評価した。次に、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ｃｏｄ．１５５９６０２６、Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ、米国ウォルサム）を使用して全ＲＮＡを単離した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｃｏｄ．２０５３１１、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）を使用してＲＮＡを逆転写した。その発現を遺伝子発現アッセイ（ｃｏｄ．４４５３３２０、Ａｓｓａｙ−ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）によって評価した。ｃＤＮＡ量を正規化するためにＧＵＳＢ遺伝子を使用した。１μｌ希釈ｃＤＮＡ、５μｌ  ＴａｑＭａｎ汎用ＰＣＲマスターミックス（ｃｏｄ．４３６９０１６  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）、０．５μｌのＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む最終体積１０μｌの各サンプルについて、ＣＦＸ９６システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してリアルタイムＰＣＲを２連で実行した。以下のアッセイが使用された：ＧＵＳＢ、Ｍｍ０１１９７６９８＿ｍ１；ＩＬ−１７Ａ、Ｍｍ００４３９６１８＿ｍ１；ＲＯＲγｔ、Ｍｍ０１２６１０２２＿ｍ１；ＩＬ−１０、Ｍｍ０１２８８３８６＿ｍ１；Ｆｏｘｐ３、Ｍｍ００４７５１６２＿ｍ１。サーマルサイクラーパラメータは、９５℃で１０分間であり、その後、９５℃で１５秒、６０℃で１分間の４０サイクルを行った。結果はデルタ−デルタＣＴ法を用いて分析した。
【００７１】
抗ＣＤ３１免疫蛍光
切除の直後に、腫瘍サンプルをＯＣＴ化合物（ｃｏｄ．０５−９８０１  Ｋｉｌｌｉｋ、Ｂｉｏｐｔｉｃａ  Ｍｉｌａｎｏ  ＳｐＡ）に埋め込み、急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。クリオスタット（厚さ５〜６μｍ）を用いて腫瘍組織を切断し、ＰＢＳに希釈した４％パラホルムアルデヒド（ｃｏｄ．Ｐ６１４８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、室温で５分間処理して、ガラススライド上にサンプルを固定した。次に、一次抗体が結合し得る非特異的部位をブロッキングするべく、ＰＢＳにおいてサンプルを５％ヤギ正常血清（ＮＧＳ  ｃｏｄ．ＤＹ００５  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネアポリス）で１時間ブロッキングした。ＣＤ３１発現を検出するために、一次抗体ウサギ抗ＣＤ３１（ｃｏｄ．ａｂ２８３６４希釈１：５０Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）と共にスライドを室温で２時間インキュベートした。使用される二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８が結合した抗ウサギＩｇ（ｃｏｄ．Ａ−１１００８、Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ）であり、１：４００に希釈した。次に、蛍光色素である０．５ｍｇ／ｍｌの４，６−アミジノ−２−フェニルインドール−ジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ、ｃｏｄ．Ｄ８４１７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で切片を５分間染色して細胞核を着色し、次に、Ｐｒｏｌｏｎｇ退色防止封入剤（Ｓｌｏｗ  Ｆａｄｅ  ＡｎｔｉＦＡＤＥ  Ｋｉｔ、ｃｏｄ．Ｓ２８２８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して切片を封入した。次に、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、イタリア）によって切片を観察し、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ−ｉｍａｇｉｎｇ  ５．０（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、バージョン５．０、米国メリーランド州ベセスダ）で解析した。
【００７２】
細胞遊走アッセイ
Ｂｏｙｄｅｎチャンバ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）遊走アッセイにおいて、メラノーマ細胞（Ａ２０５８、ｃｏｄ．ＣＲＬ−１１１４７、ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサ；Ｍ１４、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿１３９５；ＪＲ８、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿５７８０；ＰＣＦ−２）を、ＯＰＮ（１０μｇ／ｍｌ  ｃｏｄ．１４３３−ＯＰ−０５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネアポリス）またはＩＣＯＳ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を有する、または有しないＲＰＭＩ−１６４０（ｃｏｄ．ＢＥ１２−７０２Ｆ／１２、Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）無血清培地において、５０μｇ／ｍｌマトリゲル被覆フィルタ（ｃｏｄ．８．２ｍｍ直径、０．３μｍまたは０．５μｍ口径；Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．；ＢＩＯＭＡＰ  ｓｎｃ，、イタリア、ミラノ；Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ｃｏｄ．Ｌ００３９７５  Ｒｉｆ．Ｃａｔ  ３５４２３０、ＳＡＣＣＯ  ｓ．ｒ．ｌ．、ＣＯＭＯ、イタリア）の頂端側上に播種した。２０％  ＦＣＳ（ｃｏｄ．１０２７０１０６、Ｇｉｂｃｏ、米国メリーランド州ゲイザースバーグ）を含む培地を正の化学誘引物質刺激として基底外側チャンバに置いた。５％のＣＯ２の下で３７℃でチャンバをインキュベートした。２０時間後、頂端側の細胞をＱチップで拭き取った。フィルタの底部の細胞をクリスタルバイオレット（ｃｏｄ．６１１３５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）で染色し、倒立顕微鏡（倍率４０Ｘ）を用いて、すべてカウントした（４重フィルタ）。データは、未処理細胞について測定された対照の遊走に対する、処理細胞の遊走の割合として示される。
【００７３】
細胞接着アッセイ
完全培地Ｍ２００（ｃｏｄ．Ｍ２００５００、Ｇｉｂｃｏ、米国メリーランド州ゲイザースバーグ）中で、ＨＵＶＥＣを２４ウェルプレート（ｃｏｄ．ＥＴ３０２４、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、イタリア、ミラノ）においてコンフルエンスとなるように増殖させ、次に、ＯＰＮ（１０μｇ／ｍｌ、ｃｏｄ．１４３３−ＯＰ−０５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネアポリス）またはＩＣＯＳ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、または処理せず、新鮮な培地で２回洗浄し、メラノーマ細胞（５×１０４個の細胞／ウェル；Ａ２０５８、ｃｏｄ．ＣＲＬ−１１１４７、ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサ；Ｍ１４、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿１３９５；ＪＲ８、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿５７８０；ＰＣＦ−２）と共に１時間インキュベートした。接着アッセイにおけるインキュベーション後、Ｍ２００培地で３回洗浄することによって非接着細胞を除去した。各ウェルの中心を蛍光画像解析によって解析した。接着細胞は、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ−ｉｍａｇｉｎｇ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ベセスダ、メリーランド州、バージョン５．０）によってカウントした。データは、未処理細胞について測定された対照の接着に対する、処理細胞の接着の割合として示される。
【００７４】
管形成アッセイ
管形成アッセイ２８では、ＨＵＶＥＣ（２．５×１０４／ウェル）をＭ２００（ｃｏｄ．Ｍ２００５００、Ｇｉｂｃｏ、米国メリーランド州ゲイザースバーグ）無血清培地において培養し、ＯＰＮ（１０μｇ／ｍｌ、ｃｏｄ．１４３３−ＯＰ−０５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネアポリス）の存在下において、以前に１５０μｌの増殖因子低減マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｄ．  Ｌ００３９７５  Ｒｉｆ．  Ｃａｔ  ３５４２３０，  ＳＡＣＣＯ  ｓ．ｒ．ｌ．，  ＣＯＭＯ）で被覆された４８ウェルプレート（ｃｏｄ．ＥＴ３０４８、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、イタリア、ミラノ）またはＶＥＧＦ−αを有する対照培地（１０ｎｇ／ｍｌ、ｃｏｄ．２９３−ＶＥ−０１０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネアポリス）上に播種した。培養の６時間後に、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ、イタリア、ミラノ；倍率１０倍）を使用して、ＨＵＶＥＣによって形成される毛管様構造の形態を解析し、デジタルカメラ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、イタリア、ミラノ）を用いて撮影した。管形成を解析し、（両方の端に枝分かれがある）管の数をイメージングシステム（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏ−ｉｍａｇｉｎｇ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、バージョン５．０、ベセスダ、米国メリーランド州）でカウントした。３つのウェルにおける管の合計数をカウントすることによって管形成を評価した（ｎ＝５）。
【００７５】
プルダウンアッセイ
１０μｇのｒｈＢ７ｈ２−Ｆｃ（ｃｏｄ．１６５−Ｂ７−１００，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネソタ州ミネアポリス）およびｒｈＯＰＮ（ｃｏｄ．１４３３−ＯＰ−０５０／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネソタ州ミネアポリス）をＰＢＳにおいてホイール上で室温で１時間にわたって混ぜ、次に、セファロースタンパク質Ｇ（ｃｏｄ．１７−０６１８−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用してＢ７ｈを沈殿させ、タンパク質を解離するために２０％のβ−メルカプトエタノール（ｃｏｄ．Ｍ−３１４８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を含むサンプル緩衝液を使用し、ウエスタンブロットを実行した。抗ＯＰＮポリクローナル抗体（ｃｏｄ．ＭＡＢ１４３３１−ＳＰ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネソタ州ミネアポリス）を使用して膜上のＯＰＮを検出した。
【００７６】
Ｂ７ｈサイレンシングおよびトランスフェクション
Ｂ７ｈサイレンシング実験のために、ＨＵＶＥＣ細胞（１．５＊１０＾５個の細胞）を完全培地ＩＭＤＭ（ｃｏｄ．ＢＥ１２−９１５Ｆ０１、Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）において６ウェルプレート（ｃｏｄ．ＥＴ３００６、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、イタリア、ミラノ）に播種して２４時間放置した。細胞をサイレンシングするために、２つの異なるエクソンにマッピングされた２つの異なるｓｉＲＮＡダイレクトＢ７ｈ（オリゴ１：ＩＣＯＳＬＧＨＳＳ１７７３１８  （５'−ＣＡＧＣＡＧＣＣＵＵＣＧＡＧＣＵＧＡＵＡＣＵＣＡＧ−３'−配列ＩＤ番号２１および５'−ＣＵＧＡＧＵＡＵＣＡＧＣＵＣＧＡＡＧＧＣＵＧＣＵＧ−３' −配列ＩＤ番号２２）およびオリゴ２：ＩＣＯＳＬＧＨＳＳ１１８５６５（５'−ＧＧＣＣＣＡＡＣＧＵＧＵＡＣＵＧＧＡＵＣＡＡＵＡＡ−３'−配列ＩＤ番号２３および５'−ＵＵＡＵＵＧＡＵＣＣＡＧＵＡＣＡＣＧＵＵＧＧＧＣＣ−３'−配列ＩＤ番号２４）Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド）と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ｃｏｄ．１３７７８０３０、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用した。Ｂ７ｈトランスフェクション実験のために、完全培地ＲＰＭＩ−１６４０（ｃｏｄ．ＢＥ１２−７０２Ｆ／１２、Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）において、Ａ２０５８細胞（１０＾６個の細胞、ｃｏｄ．ＣＲＬ−１１１４７、ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサ）を１０ｃｍ２のプレート（ｃｏｄ．ＥＴ２１００、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、イタリア、ミラノ）に播種した。細胞をトランスフェクトするために、１０μｇのＤＮＡおよび１０μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（ｃｏｄ．Ｌ３０００００１、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用した。２４または４８時間後、サイレンシングまたはトランスフェクションされた細胞を遊走実験に使用した。
【００７７】
ＥＬＩＳＡアッセイ
８０ｎｍのｒｈＯＰＮ（＃１４３３−ＯＰ−０５０／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネソタ州ミネアポリス）をＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底ＥＬＩＳＡプレート（ｃｏｄ．Ｍ９４１０−１ＣＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）上に吸着させ、次に、８０ｎｍのｒｈＩＣＯＳ−Ｆｃの存在下または非存在下で滴定量のＢ７ｈ−Ｆｃ（ｃｏｄ．１６５−Ｂ７−１００、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、米国ミネソタ州ミネアポリス）と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０２５％  Ｔｒｙｔｏｎ（ｃｏｄ．Ｔ８７８７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を用いて洗浄した後に、ＨＲＰが結合された抗ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂ（ｃｏｄ．  Ｐ０２１４，Ｄａｋｏ、米国カリフォルニア州サンタクララ）を追加して１時間放置し、次に、ＴＭＢ基質（ｃｏｄ．Ｔ４４４４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を使用し、Ｈ２ＳＯ４  ２Ｎ（ｃｏｄ．３３９７４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）で２分後に反応を停止させ、Ｖｉｃｔｏｒ−Ｘ１プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【００７８】
細胞生存性アッセイ
Ｂ１６−Ｆ１０細胞をＲＰＭＩ−１６４０完全培地において１×１０３個の細胞／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。２４時間後に培地を除去し、滴定量（０．５〜５μｇ／ｍｌ）のＣＤＮＳまたはＰＬＧＡ  ＮＰを含む培地において、細胞を４８時間インキュベートした。インキュベーションの７２時間後、２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５カルボキサニリド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）分子内塩試薬（０．５ｍｇ／ｍｌ）を追加して３７℃で４時間放置することによって生存細胞を評価した。次に、ＭＴＴ溶液を廃棄し、１００μｌのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してホルマザン結晶を可溶化した。マイクロプレート分光光度計において５７０ｎｍの吸光度を測定した（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。以下の式を用いて細胞生存性を算出した。
細胞生存性＝サンプルの吸光度／対照の吸光度×１００（ｎ＝５）
【００７９】
データ解析
統計的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してマン・ホイットニーのＵ検定を使用して実行した。データは、平均値±標準誤差として表現され、統計的有意性はｐ＜０．０５（マン・ホイットニーのＵ検定）で設定された。
参考文献
1. Redoglia V, Dianzani U, Rojo JM, Portoles P, Bragardo M, Wolff H, Buonfiglio D, Bonissoni S, Janeway CA. Characterization of H4: a mouse T lymphocyte activation molecule functionally associated with the CD3/T cell receptor. Eur J Immunol 1996;26:2781-9. 
2. Buonfiglio D, Bragardo M, Bonissoni S, Redoglia V, Cauda R, Zupo S, Burgio VL, Wolff H, Franssila K, Gaidano G, Carbone A, Janeway CA Jr, Dianzani U. Characterization of a novel human surface molecule selectively expressed by mature thymocytes, activated T cells and subsets of T cell lymphomas. Eur J Immunol 1999;29:2863-74.
3. Hutloff, A, AM Dittrich, KC Beier, B Eljaschewitsch, R Kraft, I Anagnostopoulos, and R. Kroczek. ICOS is an inducible T cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28. Nature 1999;397:263-266.
4. Buonfiglio D, Bragardo M, Redoglia V, Vaschetto R, Bottarel F, Bonissoni S, R. Bensi T, Mezzatesta C, Janeway CA, Dianzani U. The T cell activation molecule H4 and the CD28-like molecule ICOS are identical. Eur J Immunol 2000;30:3463-7.
5. Hedl M, Lahiri A, Ning K, Cho JH, Abraham C. Pattern recognition receptor signaling in human dendritic cells is enhanced by ICOS ligand and modulated by the Crohn's disease ICOSLG risk allele. Immunity 2014;40:734-465. 
6. Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol 2003; 2:116-26.
7. Nurieva RI. Regulation of immune and autoimmune responses by ICOS-B7h interaction. Clin Immunol 2005;115:19-25.
8. Bauquet AT, Jin H, Paterson AM, Mitsdoerffer M, Ho IC, Sharpe AH, Kuchroo VK. The costimulatory molecule ICOS regulates the expression of c-Maf and IL-21 in the development of follicular T helper cells and TH-17 cells. Nat Immunol 2009;10:167-75.
9. Yong PF, Salzer U, Grimbacher B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol Rev 2009; 229:101-13.
10. Mesturini R, Nicola S, Chiocchetti A, Bernardone IS, Castelli L, Bensi T, Ferretti M, Comi C, Dong C, Rojo JM, Yagi J, Dianzani U. ICOS cooperates with CD28, IL-2, and IFN-gamma and modulates activation of human naive CD4+ T cells. Eur J Immunol 2006;36:2601-12.
11. Mesturini R, Gigliotti CL, Orilieri E, Cappellano G, Soluri MF, Boggio E, Woldetsadik A, Dianzani C, Sblattero D, Chiocchetti A, Yagi J, Rojo JM, Dianzani U. Differential induction of IL-17, IL-10, and IL-9 in human T helper cells by B7h and B7.1. Cytokine 2013;64:322-30.
12.Tang, G., Q. Qin, P. Zhang, G. Wang, M. Liu, Q. Ding, Y. Qin, and Q. Shen. Reverse signaling using an inducible costimulator to enhance immunogenic function of dendritic cells. Cell Mol Life Sci 2008;66:3067-3080.
13. Dianzani C, Minelli R, Mesturini R, Chiocchetti A, Barrera G, Boscolo S, Sarasso C, Gigliotti CL, Sblattero D, Yagi J, Rojo JM, Fantozzi R, Dianzani U. B7h triggering inhibits umbilical vascular endothelial cell adhesiveness to tumor cell lines and polymorphonuclear cells. J Immunol 2010;185: 3970-3979.
14. Dianzani C, Minelli R, Gigliotti CL, Occhipinti S, Giovarelli M, Conti L, Boggio E, Shivakumar Y, Baldanzi G, Malacarne V, Orilieri E, Cappellano G,Fantozzi R, Sblattero D, Yagi J, Rojo JM, Chiocchetti A, Dianzani U. B7h triggering inhibits the migration of tumor cell lines. J Immunol 2014;192:4921-31.
15. Occhipinti S, Dianzani C, Chiocchetti A, Boggio E, Clemente N, Gigliotti CL, Soluri MF, Minelli R, Fantozzi R, Yagi J, Rojo JM, Sblattero D, Giovarelli M, Dianzani U. Triggering of B7h by the inducible costimulator modulates maturation and migration of monocyte-derived dendritic cells. J Immunol 2013;190: 1125-1134.
16. Gigliotti CL, Boggio E, Clemente N, Shivakumar Y, Toth E, Sblattero D, D'Amelio P, Isaia GC, Dianzani C, Yagi J, Rojo JM, Chiocchetti A, Boldorini R, Bosetti M, Dianzani U. ICOS-Ligand Triggering Impairs Osteoclast Differentiation and Function In Vitro and In Vivo. J Immunol 2016; 97:3905-3916.
17. Gandalovicova A, Rosel D, Fernandes M, Vesely P, Heneberg P, Cermak V, Petruzelka L, Kumar S, Sanz-Moreno V, Brabek J. Migrastatics-Anti-metastatic and Anti-invasion Drugs: Promises and Challenges. Trends Cancer 2017; 3:391-406.
18. Steeg PS. Targeting metastasis. Nat Rev Cancer 2016;16:201-18.
19. Morimoto J, Kon S, Matsui Y, Uede T. Osteopontin; as a target molecule for the treatment of inflammatory diseases. Curr Drug Targets 2010;11:494-505.
20. Swaminathan S, Pastero L, Serpe L, Trotta F, Vavia P, Aquilano D, Trotta M, Zara G, Cavalli R. Cyclodextrin-based nanosponges encapsulating camptothecin: physicochemical characterization, stability and cytotoxicity. Eur J Pharm Biopharm. 2010;74:193-201.
21. Trotta F, Zanetti M, Cavalli R. Cyclodextrin-based nanosponges as drug carriers. J. Org. Chem. 2012;8:2091-2099. 
22. Szejtl J. Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry. Chem. Rev. 1998;98:1743-1754.
23. Swaminathan S, Cavalli R, Trotta F. Cyclodextrin-based nanosponges: a versatile platform for cancer nanotherapeutics development. Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2016;8:579-601.
24. Trotta F, Dianzani C, Caldera F, Mognetti B, Cavalli R. The application of nanosponges to cancer drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 2014;11:931-941.
25. Di Niro R, Ziller F, Florian F, Crovella S, Stebel M, Bestagno M, Burrone O, Bradbury AR, Secco P, Marzari R, Sblattero D. Construction of miniantibodies for  the in vivo study of human autoimmune diseases in animal models. BMC Biotechnol.  2007 Aug 1;7:46. 
26. Zhou X, Liu B, Yu X, Zha X, Zhang X, Wang X, Jin Y, Wu Y, Chen Y, Shan Y, Chen Y, Liu J, Kong W, Shen J. Controlled release of PEI/DNA complexes from PLGA microspheres as a potent delivery system to enhance immune response to HIV vaccine DNA prime/MVA boost regime. Eur J Pharm Biopharm 2008;68:589-95.
27. Kim SH, Ezhilarasan R, Phillips E, Gallego-Perez D, Sparks A, Taylor D, Ladner K, Furuta T, Sabit H, Chhipa R, Cho JH, Mohyeldin A, Beck S, Kurozumi K, Kuroiwa T, Iwata R, Asai A, Kim J, Sulman EP, Cheng SY, Lee LJ, Nakada M, Guttridge D, DasGupta B, Goidts V, Bhat KP, Nakano I. Serine/Threonine Kinase MLK4 Determines Mesenchymal Identity in Glioma Stem Cells in an NF-kappaB-dependent Manner. Cancer Cell, 2016. 29(2):201-13.
28. DeCicco-Skinner KL, Henry GH, Cataisson C, Tabib T, Gwilliam JC, Watson NJ, Bullwinkle EM, Falkenburg L, O'Neill RC, Morin A, Wiest JS. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. 2014 Sep 1;(91):e51312.
【００８０】
【図１】
2021513505.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2021513505000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月7日(2020.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
ここで、添付の図面を参照しながら、単に説明を目的とした非限定的な例として本発明を詳細に記載する。
【図１】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖に対する異なる形態のＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。触知可能な皮下Ｂ１６腫瘍を有するマウスを、ＰＢＳ、ＣＤＮＳ（ナノ粒子）単独、ＩＣＯＳ−Ｆｃ、または、ＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＣＤＮＳで４日ごとに処理した。第１処理の１６日後に腫瘍増殖を評価した。各処理は、実験あたり５匹のマウスを伴う。＊＊互いの条件に対してｐ＜０．０５
【図２】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍血管新生に対するＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。ＰＢＳ、ＣＤＮＳ単独、または、ＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＣＤＮＳで処理されたマウスの腫瘍組織断面の抗ＣＤ３１の免疫蛍光染色を示す。スライドは、ＡｂウサギαマウスＣＤ３１および、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８が結合されたαウサギ二次抗体で染色した。３つの独立の実験の代表的な画像を示す。棒グラフはこれらの実験の累積的結果を腫瘍微小血管密度（ＴＤＭ）として示す。＊＊互いの条件に対してｐ＜０．０５。
【図３】ｅｘ−ｖｉｖｏにおけるＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３に対するＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。腫瘍からの侵入細胞を採取し、リアルタイムＰＣＲ解析に使用した。データは対照マウスにおける発現について正規化した（対照発現ＰＢＳ群を１００％に設定、＊ｐ＜０．０５）。
【図４】ＩＣＯＳ欠乏Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖に対する異なる形態のＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。触知可能な皮下Ｂ１６腫瘍を有するマウスを、ＣＤＮＳ単独、または、ＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＣＤＮＳで４日ごとに処理した。（Ａ）第１処理の８日後に腫瘍増殖を評価した。各処理は８匹のマウスを伴う。＊＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）リアルタイムＰＣＲ解析によって分析された腫瘍侵入リンパ球におけるＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３の発現を示す。データはＣＤＮＳ対照における発現について正規化した。ＣＤＮＳで処理されたマウスにおけるそれぞれの値からの♯ｐ＜０．０５。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ１６−Ｆ１０細胞の生存率に対する異なる形態のＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。滴定量（０．５〜５μｇ／ｍｌ）の遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃ、または空のＣＤＮＳ、またはＣＤＮＳ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの存在下または非存在下において培養した後に、ＭＴＴによってＢ１６−Ｆ１０細胞の細胞生存性を評価した。それらの試薬の非存在下で培養された細胞において検出された生存率の阻害率（％）として結果を示す。
【図６】ＯＰＮとＢ７ｈとの相互作用を検出する２つの手法の結果を示す。（左）滴定量の可溶Ｂ７ｈ−Ｆｃ（灰色の線）と、ＥＬＩＳＡプレートで被覆された固定量のオステオポンチン（ＯＰＮ）との相互作用を示す。黒色の線は、Ｂ７ｈ結合についてのＩＣＯＳとＯＰＮとの間の競合を評価するための、５μｇ／ｍｌの可溶ＩＣＯＳ−Ｆｃの存在下における同一の実験を示す。破線は、滴定量の可溶ＩＣＯＳ−ＦｃのＯＰＮ被覆プレートに対する結合が無いことを示す。（右）ウエスタンブロットは、ＯＰＮと共にインキュベートされた（第１レーン）、または、インキュベートされなかった（第２レーン）セファロース結合ｂａｉｔタンパク質としてＢ７ｈ−Ｆｃが使用されたプルダウンアッセイを示す。第３レーンはＯＰＮ陽性対照である。膜は抗ＯＰＮポリクローナル抗体によってブロットされた。
【図７】ＯＰＮ機能におけるＢ７ｈの役割を示す。（Ａ〜Ｂ）ＯＰＮまたはＦＣＳによって高レベル（Ａ）および低レベル（Ｂ）のＢ７ｈを発現する腫瘍細胞株において誘導される細胞遊走を示す。＊＊未処理細胞とは顕著に異なる。（Ｃ）ＯＰＮに対する遊走応答が、Ｂ７ｈでトランスフェクトした（Ｂ７ｈｈｉｇｈ）Ａ２０５８細胞において戻っている。＊＊トランスフェクトされていない細胞（Ｂ７ｈｌｏｗ）とは顕著に異なる。（Ｄ）ＯＰＮに対する遊走応答は、Ｂ７ｈがサイレンシングされた（Ｂ７ｈｌｏｗ）ＨＵＶＥＣにおいて抑制される。＊＊サイレンシングされていない細胞（Ｂ７ｈｈｉｇｈ）とは顕著に異なる。水平の点線は、未処理細胞の基礎的な遊走に対応し、１００％に設定される。
【図８】ＯＰＮ誘導細管形成、ならびに腫瘍細胞の遊走および接着におけるＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。（Ａ）ＯＰＮまたはＶＥＧＦのいずれかによって誘導されるＨＵＶＥＣ細管形成に対するＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。ＮＴ：ＯＰＮおよびＶＥＧＦ無しの基礎の管形成。＊＊ＩＣＯＳ−Ｆｃで処理された対応する細胞とは顕著に異なる。（Ｂ〜Ｃ）高レベルのＢ７ｈを発現する２つのヒトメラノーマ細胞株（すなわちＭ１４およびＪＲ８）のＨＵＶＥＣへの遊走（Ｂ）および接着（Ｃ）に対するＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。＊＊：未処理細胞に対してｐ＜０．０５、§§：ＯＰＮ処理細胞に対してｐ＜０．０５。
【図９】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ１６−Ｆ１０細胞の生存、および、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖に対するＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。（Ａ）滴定量（０．５〜５μｇ／ｍｌ）の遊離ＩＣＯＳ−Ｆｃ、または空のＰＬＧＡ  ＮＰまたはＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃ  ＮＰの存在下または非存在下において培養した後に、ＭＴＴによってＢ１６−Ｆ１０細胞の細胞生存性を評価した。それらの試薬の非存在下で培養された細胞において検出された生存率の阻害率（％）として結果を示す。（Ｂ）触知可能な皮下Ｂ１６腫瘍を有するマウスを、ＰＢＳ、ＰＬＧＡ（ナノ粒子）単独、ＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃで４日ごとに処理した。第１処理の１６日後に腫瘍増殖を評価した。各処理は、実験あたり５匹のマウスを伴う。＊または＊＊互いの条件に対してｐ＜０．０５。
【図１０】ヒト膠芽腫細胞を脳に注射された無胸腺マウスの生存におけるＰＬＧＡ／ＩＣＯＳ−Ｆｃの効果を示す。移植の７日後から７日ごとにＰＬＧＡ単独（ブランク）（１００μｌ）またはヒトＩＣＯＳ−Ｆｃ（１００μｌ）を搭載したＰＬＧＡで腹腔内において処理された、ＭＤ１３担癌無胸腺マウスのカプラン・マイヤー解析を示す。ＩＣＯＳ−Ｆｃを搭載したＰＬＧＡの処理により、担癌マウスの生存が顕著に延長された（免疫に欠陥があるマウスにおけるブランク対ＩＣＯＳ−Ｆｃ、すべての群でｎ＝６、Ｐ＝０．００５９１、ログランク検定）。
【国際調査報告】
2021513505.tif 000012
2021513505.tif 000013
2021513505.tif 000014