(57)【要約】  【解決手段】  本明細書に開示されるのは、膵臓細胞を、単離された膵島から誘導された機能的なインスリン産生ＣＤ１３３／Ｋｉ−６７陽性活性化膵島増殖細胞（ＡＩＰＣｓ）に分化させ、活性剤を含む培地を用いて、インビトロ培養において、誘導されたＡＩＰＣｓを展開させるための組成物および方法である。また、本明細書には、インビボ治療のための哺乳動物への移植のための、特にＩ型糖尿病を含む膵疾患のためのＡＩＰＣの使用も開示される。  【選択図】    図１１
2021528083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化膵島増殖細胞（ＡＩＰＣ）集団を生成する方法であって、
前記ＡＩＰＣ集団を得るために、基底培地及び有効量の活性剤を含む細胞培養培地を使って膵島の集団をインビトロで培養する工程を含み、
前記ＡＩＰＣ集団の少なくとも６０％は、ＣＤ１３３細胞マーカーおよびＫｉ−６７細胞マーカーからなり、
前記ＡＩＰＣ集団の少なくとも６０％は、インスリン産生することが可能であり、および
前記活性剤は、配列ＩＤ番号：１〜４のいずれか１つと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記膵島の集団は、約１０〜約１０，０００個の膵島を含む、方法。
【請求項３】
請求項１〜２いずれか１項記載の方法において、前記培養は、約２日〜約１０日の期間で行われる、方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項記載の方法において、前記ＡＩＰＣ集団の少なくとも約８０％は、インスリン、ＣＤ１３３、およびＫｉ−６７に陽性である、方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項記載の方法において、前記ポリペプチドは、少なくとも、配列ＩＤ番号：１記載のアミノ酸配列に対して９５％の配列同一性、配列ＩＤ番号：１記載のアミノ酸配列に対して９８％の配列同一性、配列ＩＤ番号：１記載のアミノ酸配列に対して９９％の配列同一性、配列ＩＤ番号：１記載のアミノ酸配列、配列ＩＤ番号：２記載のアミノ酸配列に対して９５％の配列同一性、配列ＩＤ番号：２記載のアミノ酸配列に対して９８％の配列同一性、配列ＩＤ番号：２記載のアミノ酸配列に対して９９％の配列同一性、配列ＩＤ番号：２記載のアミノ酸配列、配列ＩＤ番号：３記載のアミノ酸配列に対して９５％の配列同一性、配列ＩＤ番号：３記載のアミノ酸配列に対して９８％の配列同一性、配列ＩＤ番号：３記載のアミノ酸配列に対して９９％の配列同一性、配列ＩＤ番号：３記載のアミノ酸配列、配列ＩＤ番号：４記載のアミノ酸配列に対して９５％の配列同一性、配列ＩＤ番号：４記載のアミノ酸配列に対して９８％の配列同一性、配列ＩＤ番号：４記載のアミノ酸配列に対して９９％の配列同一性、または配列ＩＤ番号：４記載のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項記載の方法において、前記細胞培養培地は、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの濃度で活性剤を含む、方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項記載の方法において、前記細胞培養培地は、約５μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬの濃度で活性剤を含む、方法。
【請求項８】
活性化膵島増殖細胞（ＡＩＰＣ）集団を含む組成物であって、前記ＡＩＰＣ集団の６０％は、ＣＤ１３３細胞マーカーおよびＫｉ−６７細胞マーカーで構成され、
前記ＡＩＰＣ集団の少なくとも６０％は、インスリン産生することが可能である、組成物。
【請求項９】
請求項８記載の組成物において、前記ＡＩＰＣ集団は、直列通過可能であり、培養中に６０日以上生存可能なままである、組成物。
【請求項１０】
請求項８〜９いずれか１項記載の方法であって、１またはそれ以上の緩衝液、１またはそれ以上の薬学的に許容される担体、または１またはそれ以上の薬学的に許容される添加剤をさらに含む、組成物。
【請求項１１】
工程によって得られた活性化膵島増殖細胞（ＡＩＰＣ）集団を含む組成物であって、
前記ＡＩＰＣ集団を得るために、基底培地および有効量の活性剤を含む細胞培養培地を使って、単離された膵臓細胞集団をインビトロで培養する工程を含み、
前記ＡＩＰＣ集団の少なくとも３０％は、ＣＤ１３３細胞マーカーおよびＫｉ−６７細胞マーカーからなり、
前記ＡＩＰＣ集団の少なくとも６０％がインスリン産生することが可能であり、
前記活性剤は、配列ＩＤ番号：１〜４のいずれか１つと少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１２記載の組成物において、前記ＡＩＰＣ集団は、直列通過可能であり、培養中に少なくとも６０日間生存可能なままである、組成物。
【請求項１３】
請求項１２〜１３いずれか１項記載の組成物において、前記膵島の集団は、約１０〜約１０，０００個の膵島を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１２〜１４いずれか１項記載の組成物において、前記培養する工程は、約２日〜約１０日の期間にわたって行われる、組成物。
【請求項１５】
請求項１２〜１５のいずれか１項記載の組成物において、前記ＡＩＰＣ集団の少なくとも約８０％がインスリン、ＣＤ１３３、およびＫｉ−６７に対して陽性である、組成物。
【請求項１６】
請求項１２〜１６のいずれか１項記載の組成物であって、前記ポリペプチドは、少なくとも、配列ＩＤ番号：１記載のアミノ酸配列に対して９５％の配列同一性、配列ＩＤ番号：１記載のアミノ酸配列に対して９８％の配列同一性、配列ＩＤ番号：１記載のアミノ酸配列に対して９９％の配列同一性、配列ＩＤ番号：１記載のアミノ酸配列、配列ＩＤ番号：２記載のアミノ酸配列に対して９５％の配列同一性、配列ＩＤ番号：２記載のアミノ酸配列に対して９８％の配列同一性、配列ＩＤ番号：２記載のアミノ酸配列に対して９９％の配列同一性、配列ＩＤ番号：２記載のアミノ酸配列、配列ＩＤ番号：３記載のアミノ酸配列に対して９５％の配列同一性、配列ＩＤ番号：３記載のアミノ酸配列に対して９８％の配列同一性、配列ＩＤ番号：３記載のアミノ酸配列に対して９９％の配列同一性、配列ＩＤ番号：３記載のアミノ酸配列、配列ＩＤ番号：４記載のアミノ酸配列に対して９５％の配列同一性、配列ＩＤ番号：４記載のアミノ酸配列に対して９８％の配列同一性、配列ＩＤ番号：４記載のアミノ酸配列に対して９９％の配列同一性、または配列ＩＤ番号：４記載のアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１２〜１７のいずれか１項記載の組成物において、前記細胞培養培地は、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、または約５μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬの濃度で活性剤を構成する、組成物。
【請求項１８】
Ｉ型糖尿病の治療に使用するための、請求項８〜１７のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６８９，７８０号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、高血糖によって定義される代謝性疾患であるが、神経、血管、目、腎臓、心臓などを含む体のシステムの多くに深刻な損傷をもたらす。いくつかの研究では、世界で４億人以上の糖尿病患者がいると推定されており、糖尿病の罹患率および有病率は世界中、特に米国、中国、インドで増加している。
【０００３】
糖尿病には複数の亜種がありますが、主に２つのタイプが優勢である。１型糖尿病では、インスリンを産生する膵島β細胞が失われるため、膵臓はインスリンをほとんど、あるいは全く産生しない。２型糖尿病では、このようなインスリンを産生する膵島β細胞は存在するが、インスリン抵抗性があるため、産生されるインスリンの量や効果が少なくなる。このように、変異型にかかわらず、糖尿病は膵島細胞の機能障害として特徴づけることができる。
【０００４】
糖尿病と膵島生物学の研究は、膵島細胞を培養して増殖させることができないことにより、これまでの研究は著しく制限されてきた。現在、膵島クラスターまたは細胞は、約３週間の培養でしか維持できず、基本的には劣化状態にあり、膵島細胞の長期的な研究を妨げるものである。膵島を培養し、増殖させることができないということはまた、細胞が糖尿病の潜在的な治療法である膵島細胞補充療法の能力を制限する。
【０００５】
糖尿病における創薬および細胞移植療法のための細胞源を提供するためにβ細胞を生成するための現在の標準的な技術は、以下の２つである：ｉ）遺伝的再プログラミングおよび／または分化因子および多重成熟因子への曝露による、または胚性幹細胞をβ様細胞に分化させることによる、誘導多能性幹細胞（ｉＰＣ）細胞などの非β島細胞または線維芽細胞の分化；および（ｉｉｉ）治療分子の使用による成熟β細胞の増殖の誘導である。現在のアプローチの主な欠点は、遺伝子操作、分化の効率、およびβ細胞増殖を誘発するために使用される化学物質の潜在的なオフターゲット効果に関連する。さらに、ほとんどのアプローチは、長時間の培養を必要とし、多大な操作工程／時間を必要とし、これは微生物汚染のリスクを増大させ、生産コストに多大な影響を与え、最終的には臨床翻訳に影響を与える。
【０００６】
これは、糖尿病における創薬や細胞移植治療のための前例のない細胞源を提供すると考えられているため、以前にグループは、インビトロで幹細胞からインスリンを産生する膵β細胞を生成することを試みてきた。２００９年には、成人の膵島β細胞と同様の成熟したインスリン産生細胞に分化するために、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）とヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の両方を用いて、インスリンを産生する膵β細胞を作製する戦略をＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌に発表した。これらのｉＰＳ細胞を生成するために、体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｐ５３に対する短いヘアピンＲＮＡを含む（およびこれらに限定されない）複数の因子にさらされることによってエピソームリプログラミングを受けなければならず、確立するために数週間かかる多段階の情事である。最終段階で分化したヒトＥＳ細胞は、グルコース刺激に応答して、成体ヒト膵島に近い形でＣ−ペプチドを分泌した。さらに、誘導されたインスリン産生細胞内で、Ｃ−ペプチド、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１の共発現がｉｎ  ｖｉｔｒｏで初めて観察された。これらの細胞を生成するために、複数の試薬／因子が使用され、プロトコルは、細胞を生成するために２〜３週間の多段階分化プロトコルが必要である。
【０００７】
２０１４年、Ｐａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ．  ａｌ，（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１５９：Ｉｓｓｕｅ  ２，ｐ．４２８−４３９，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ９，２０１４）は、１０８個以上のｈＰＳＣおよびその後に分化した細胞型を生成することができるスケーラブルな懸濁液ベースの培養系を用いて、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からインビトロでβ細胞を生成した。彼らのプロトコルは４〜５週間かかり、γセクレターゼ阻害ばかりでなく、ｗｎｔ、アクチビン、ヘッジホッグ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸によるシグナル伝達を含む多数の経路におけるシグナル伝達に影響を与える因子を使用した逐次培養ステップのユニークな組み合わせを含む。
【０００８】
一方、２０１５年にカリフォルニア州のグループは、特定の成長因子および化学化合物と組み合わせてエピソームリプログラミング因子を採用することにより、ヒト線維芽細胞を内胚葉細胞運命に変換した（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１０００８０）。これらの細胞は、インビトロで機能的な膵β様細胞への分化および成熟を促進する化学化合物を用いて、さらに分化させた。しかしながら、これらの細胞は、その厳しい操作により、インビボに移植する際に細胞をデバイスに封入する必要があること、血糖を適切に調節するために必要な膵島内のすべての細胞を生成することができないこと、および移植後７週間以内に催奇形腫が形成されることなどの理由から、主にβ細胞置換の源を提供するには至っていない。
【０００９】
成熟ベータ細胞の増殖の誘導は、以前に、二重特異性チロシン調節キナーゼ１Ａ（ＤＹＲＫ１Ａ）の低分子阻害剤の使用によって達成される（Ｗａｎｇ，ｅｔ．Ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２０１９；２９：６３８−６５）。ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤の使用は、β細胞において１．５％〜３％の増殖指数をもたらす。より最近、成熟ベータ細胞の増殖を促進するために、Ｗａｎｇらは、ＤＹＲＫ１Ａとトランスフォーミング成長因子ベータスーパーファミリー（ＴＧＦｂＳＦ）／ＳＭＡＤシグナリングの薬理学的阻害を組み合わせることにより、ヒトベータ細胞増殖における顕著なさらなる相乗的増加（平均ラベリング指数、５％〜８％、および１５％〜１８％と高い）、およびマウスおよびヒトベータ細胞数の両方の増加を生成する。成熟ベータ細胞の増殖を誘導するために、全膵島を使用し、膵島の外に細胞を発生させない。細胞は動員されず、膵島構造内に留まる。膵島から細胞を放出するために、膵島は、１００％ＦＢＳの同量の添加によって中和された０．０５％トリプシンを使用して解離された。この研究は有望と思われるが、観察された増殖のレベルは、糖尿病の治療などの治療に使用するための生存可能なインスリン産生細胞の供給源を生成するのに必要な数のインスリン産生細胞を生成するのに十分ではない。
【００１０】
糖尿病における細胞療法または移植のための源として善意のβ細胞を生成するために使用される現在の標準的な技術のいずれも、集中的であり、複数の工程、無数の因子を必要とし、そして所望の細胞を生成するために何週間もの時間を必要とする。細胞ベースの治療法は、既存の医薬品では十分に対処できないＩ型糖尿病などの疾患を治療し、その経過を変化させることが期待できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に記載の組成物および方法は、前述の方法の問題点を克服する。本明細書に開示されているのは、活性化膵島増殖細胞（ＡＩＰＣ）集団およびそれを調製するための方法である。ＡＩＰＣ集団は、インスリンを産生し、細胞ベースの治療における使用のための需要を満たすために膵島の集団の拡大を可能にすることができる。
【００１２】
本明細書に記載の方法は、単離された膵島を、インスリンを産生し、ＣＤ１３３細胞マーカーおよびＫｉ−６７マーカーの両方を有する、本明細書で「トリプル陽性」膵島として同定される一定の割合の膵島（本明細書にさらに記載）を有するＡＩＰＣ集団に分化させるための迅速な手段を提供する。いわゆる「トリプル陽性」膵島は、グルコース応答性であり、適切な刺激に応答してインスリンおよびグルカゴンの両方を分泌する。
【００１３】
前記ＡＩＰＣの代表的な培養物は、ブダペスト条約の条件の下でＡＴＣＣ［Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ＿＿＿＿＿］に寄託される。
【００１４】
また、本明細書に開示されるのは、グルコース刺激に応答してインスリンを産生することができる健康な膵島を回復させるために、ＡＩＰＣ集団の有効量を哺乳動物、例えばヒトに投与することからなる治療方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本明細書にさらに記載されているように、ＩＭＧ（≒３μｇ／ｍＬ）を含む細胞培養培地で処理した培養マウス島の顕微鏡写真を示す（表２参照）単独で基底培地（表３参照）で培養した培養マウス膵島と比較して、本明細書に記載される。処置後２４時間以内に、処置された膵島は、クラスター化が少なくなり、膵島細胞は積極的にクラスターから離れて移動するように見えた。コントロール膵島は、クラスター化した形態を維持し、細胞移動の最小限の証拠を示した。７２時間まで培養すると、処理した膵島はその形態の大部分を失い、インスリン産生ＣＤ１３３陽性、Ｋｉ−６７陽性の増殖膵島細胞のコロニーを確立し始めた。（実施例１を参照）
【図２】図２は、未処理の対照膵島と比較して、ＩＭＧ（≒３μｇ／ｍＬ）を含む細胞培養物で処理した培養ヒト膵島の顕微鏡写真を示す。マウス膵島（図１に示す）で見られるように、活性剤を含む細胞培養物で処理した培養ヒト膵島は、膵島からの膵島細胞の遊走（２日目）およびインスリン産生ＣＤ１３３陽性、Ｋｉ−６７陽性の増殖膵島細胞のコロニーへの遊走膵島細胞の拡大（７日目）の同じ傾向を示した。（実施例２参照）
【図３】図３は、３日目および１０日目における対照細胞集団（未処置のマウス島細胞）と処置された細胞集団の、ヨウ化プロピジウムおよびアクリジンオレンジ染色後のＦＡＣによって決定された細胞の生存率を比較した棒グラフである；両方の集団（対照／未処置および処置された細胞）は、３日目および１０日目に８０％以上の細胞生存率を示した。（実施例１を参照）
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、単離されたヒト膵島との培養後の活性剤を含む培地の効果の表形式の結果を示す棒グラフを示す。ＩＭＧ（約１０μｇ／ｍＬ）を含む培地で培養されたヒト膵島は、ＣｙＱＵＡＮＴ細胞増殖アッセイ（細胞のＤＮＡ含有量を測定）によって決定されるように、コントロール（未処理のヒト膵島）と比較して膵島細胞の数が増加した。アッセイは膵島のプレーティング３日後に実施し、細胞増殖を決定するために、１０日後に培地で細胞を培養した後、トリパンブルー排除による細胞計数を行った。細胞測定の両方の手段（細胞増殖および細胞計数）は、活性剤からなる培地で培養したヒト膵島由来の膵島細胞の数の著しい増加を示し、具体的には、ＩＭＧで処理した後の９，５０００細胞に対して、未処理の対照では６，４０００細胞（図４Ａ）、ＩＭＧで処理した後の約２，５００，０００細胞に対して、未処理の対照では約５００，０００細胞未満であった（図４Ｂ）。
【図５】図５は、単離された非ネイティブ島を活性剤からなる培養液（ＩＭＧ）で処理することによって生成されたＡＩＰＣｓが、５日以内に少なくとも２世代の子孫を超えて拡大することが可能であることを示す。ＡＩＰＣをカルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標登録）ＣＦＳＥ細胞増殖キットを用いて活性剤を含む培地で処理した５日後に分析した。このキットは、インビトロおよびインビボでの細胞の標識に使用され、フローサイトメトリーによる色素希釈を使用して多世代を追跡する。５日以内に、２世代のＡＩＰＣが観察された。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、活性剤（ＩＭＧ）からなる培地中で培養された単離された膵島が、対照膵島と比較して、インスリン、ＣＤ１３３およびＫｉ−６７陽性細胞表現型からなる細胞集団（ＡＩＰＣ）への膵島の拡大を促進することを示す。具体的には、活性剤からなる培地で培養した単離膵島の少なくとも６０％および７０％以上（平均）が、ＣＤ１３３／Ｋｉ−６７／インスリン陽性（６１．４７％）であるＡＩＰＣｓを生成したのに対し（ＦＩＧ．６Ｂを参照）、対照細胞はＣＤ１３３／Ｋｉ−６７／インスリン陽性（実質的に０％）として対照細胞集団の５％未満を示したのに対し（図６Ａを参照）、対照細胞はＣＤ１３３／Ｋｉ−６７／インスリン陽性（実質的に０％）として対照細胞集団の５％未満を示した。培養されたＡＩＰＣは、ＣＤ１３３（体細胞前駆細胞のマーカー）、Ｋｉ−６７（増殖に関連する核タンパク質）、およびＦＡＣを利用した細胞内インスリン発現について評価された。実施例１および２を参照）。
【図７】図７は、活性剤からなる培地で処理した後の単離ヒト膵島に由来するＡＩＰＣが、グルコース刺激後にインスリンを分泌することを示す。ＡＩＰＣｓを静的培養グルコース刺激分泌アッセイ（実施例２を参照）に供した。誘導されたＡＩＰＣｓは、β細胞機能のための媒体からのインスリン分泌を評価するために、５つの刺激条件を受けた。ＡＩＰＣｓをいずれかで３０分間インキュベートした：（１）グルコース２．８ｍＭ（コントロールベースライン）；（２）グルコース１６．７ｍＭ（インスリンの刺激）；（３）グルコース１６．７ｍＭ＋１００μＭ  ＩＢＭＸ（すなわち、３−イソブチル−１−メチル−キサンチン、インスリンのための最大刺激）；（４）グルコース１．７ｍＭ＋１μＭエピネフリン（グルカゴンのための刺激）；（５）グルコース５．６ｍＭ＋２０ｍＭ  ＫＣｌ（インスリンおよびグルカゴンのための追加の刺激）。アッセイの後、培地を−２０℃で保存し、インスリンの標準的なＥＬＩＳＡ分析を行った。その結果、グループ１のための１１μＩＵ／ｍＬインスリン／百万個の細胞；グループ２のための５７μＩＵ／ｍＬインスリン／百万個の細胞；２２１μＩＵ／ｍＬのインスリン／百万個の細胞をグループ３に、６μＩＵ／ｍＬのインスリン／百万個の細胞をグループ４に、２２μＩＵ／ｍＬのインスリン／百万個の細胞をグループ５であった。
【図８】図８は、活性剤からなる培養液で処理した後の単離ヒト膵島に由来するＡＩＰＣが、グルコース刺激後にグルカゴンを分泌することを示す。ＡＩＰＣｓを静的培養グルコース刺激分泌アッセイ（実施例２を参照）に供した。誘導されたＡＩＰＣは、α細胞機能のための媒体からのグルカゴン分泌を評価するために、５回の刺激条件を受けた。ＡＩＰＣｓをいずれかで３０分間インキュベートした：（１）グルコース２．８ｍＭ（コントロールベースライン）；（２）グルコース１６．７ｍＭ（インスリンのための刺激）；（３）グルコース１６．７ｍＭ＋１００ｐＭ  ＩＢＭＸ（インスリンのための最大刺激）；（４）グルコース１．７ｍＭ＋１ｐＭエピネフリン（グルカゴンのための刺激）；（５）グルコース５．６ｍＭ＋２０ｍＭ  ＫＣＩ（インスリンおよびグルカゴンのための追加の刺激）のいずれかで３０分間インキュベートした。アッセイの後、培地を−２０℃で保存し、グルカゴンの標準的なＥＬＩＳＡ分析を行った結果、グルカゴンの分泌量は、第１群では３２ｐｇグルカゴン／百万個の細胞、第２群では３０ｐｇ／百万個の細胞、第３群では５２ｐｇ／百万個の細胞、第４群では９８ｐｇ／百万個の細胞、第５群では７５ｐｇ／百万個の細胞であった。
【図９】図９は、その時点で、派生ＡＩＰＣｓは、ＡＩＰＣｓが膵島に似た二次構造を生成し始めることの兆候を示した後、培養中の２０日で派生ＡＩＰＣｓの明視野顕微鏡を示す（顕微鏡で見ることができ、染色時に）。テストされたときに、これらの膵島のような構造は、ジチゾン（ＤＴＺ）陽性であることが決定された、デノボ膵島の仮説的なベータ細胞を表す。ＤＴＺは、膵島のβ細胞に存在する亜鉛イオンと結合し、膵島を赤く染色する（色の結果は未提示）。
【図１０】図１０Ａは、活性剤（ＩＭＧ）からなる培地での６０日後の処理におけるＦＡＣｓマーカープロフィールおよび誘導ＡＩＰＣの形態を示す。ＡＩＰＣのプロファイルを、培養６０日後に（実施例２に記載のフローサイトメトリーを利用して）評価し、細胞型のパーセンテージ（％）としてのマーカーを評価した。マーカープロファイルは以下の通りであった（細胞のパーセンテージとして）：インスリン陽性／Ｋｉ−６７陽性／ＣＤ１３３陽性は、全細胞集団の６１．４７％として示された。約１０％の細胞はマーカープロファイルが陰性であった。さらに、本明細書に記載された方法に従って増殖させた誘導ＡＩＰＣは、培養中の６０日以上にわたって、そのマーカープロファイル（ＣＤ１３３／Ｋｉ−６７／インスリン"トリプル"陽性表現型）および細胞形態を維持した（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。
【図１１】図１１は、ＡＩＰＣがｉｎ  ｖｉｖｏで生存可能なままであり、高血糖マウスモデル（実施例４参照）において血糖値の低下を引き起こすことを示す。４日前のＡＩＰＣｓ注入Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６；Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６）を７５ｍｇ／ｋｇの濃度でＳＴＺにて処理した。動物の空腹時ＢＧ値が２００ｍｇ／ｄＬ以上であった０日目に、各ＳＴＺ処理高血糖マウスに、約４００万匹のマウスＡＩＰＣからなる細胞懸濁液を注入した。トマトレッドマウスから単離された）。各ＳＴＺ処理マウスの空腹時血糖値を週２回測定した；２８日目に２匹の動物を犠牲にし、ＡＩＰＣの投与後４２日目に２匹の動物を犠牲にした。４６日目には残りの２匹のＳＴＺ処理動物には、約１００００万個の細胞を追加で（それぞれ尾静脈経由で）注射し、７０日目に犠牲にした。ＡＩＰＣの注射を受けたすべてのＳＴＺ処理動物は、血糖値の改善を示し、ＡＩＰＣの投与前の３００〜５００ｍｇ／ｄＬから、５０日目までにＡＩＰＣの投与後に約２００ｍｇ／ｄＬまで低下した。
【図１２】図１２は、犠牲にされた動物（実施例４）の組織学的分析を示し、ＳＴＺ処理された動物の膵臓にドナーのトマトレッドＡＩＰＣｓが表示され、膵臓への血流を介して尾部注入されたＡＩＰＣｓの移動／帰化を示唆する。ＡＩＰＣは、より長い時間の間、より高い濃度で存在しているようである。
【図１３】図１３は、７０日目（実施例４）に犠牲になったＡＩＰＣｓを注入したマウスの免疫組織学的分析を示しており、トマトレッドとＫｉ−６７の両方に対して「二重陽性」である膵臓内の領域が表示され、膵臓に帰化したＡＩＰＣｓが分裂し、増殖することができることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書に記載されているのは、膵島を含む一次細胞分離株の、マーカーＣＤ１３３（幹細胞のマーカー）およびＫｉ−６７（活性増のマーカー）、およびインスリン分泌に陽性の細胞を含む内分泌前駆細胞集団への増殖、拡大および分化を促進するための組成物および方法である。組成物は、基質培地および活性剤からなる培地からなり、活性剤は、例えば、配列ＩＤ番号：１に準拠した単離ポリペプチドまたはその活性断片からなる。あるいは、活性剤は、例えば、配列ＩＤ番号：２〜４に従って単離されたポリペプチドから構成されても良い。方法は、膵島細胞の分化を促進するための培地の使用、および膵島を構成する単離された初代細胞からＣＤ１３３１およびＫｉ−６７に陽性のマーカープロファイルを有する内分泌前駆細胞の集団を増殖させる工程を含む。
【００１７】
本明細書に記載される内分泌前駆細胞集団（ＡＩＰＣ、ＡＩＰＣｓ、またはＡＩＰＣ集団と称される）は、内分泌前駆細胞集団が、ａ）哺乳動物由来である；ｂ）ＣＤ１３３細胞マーカーに陽性である；ｃ）Ｋｉ６７細胞マーカーに陽性である；ｄ）刺激に応答してインスリンを産生する、ｅ）膵島を構成する単離された初代細胞を、例えば配列ＩＤ番号：１〜４に従ったアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントからなる活性剤を含む培養補助剤で処理することによって生成されたものである。
【００１８】
更なる方法は、本明細書に記載の方法によって産生された内分泌前駆細胞集団を、細胞移植もしくは移植のために、または膵臓の様々な障害もしくは疾患を治療するために有用な組織を工学的に構築するための使用を含む。
【００１９】
以下の用語は、本開示において、本発明の異なる側面を説明するために使用される。これらの用語は、説明のみを目的として使用され、本発明の任意の側面の範囲を限定することを意図していない。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「活性剤」とは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドフラグメント、またはその類似体、およびそれらの任意の改変体を意味し、配列ＩＤ番号：０１、配列ＩＤ番号：２〜４は、配列ＩＤ番号：１のフラグメントを表す。また、配列ＩＤ番号：２〜４に従ったアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドフラグメント、またはその類似体、およびそれらの改変体を含む。
【００２１】
本明細書で使用されるように、用語ＡＩＰＣ、ＡＩＰＣｓ、またはＡＩＰＣ集団は、本明細書に記載の方法に従って生成された非ネイティブ由来の内分泌（膵臓）前駆細胞集団を指し、ここで、細胞集団は、細胞マーカーＣＤ１３３およびＫｉ６７に対して陽性であり、刺激に応答してインスリンを産生する。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「増殖」という用語は、細胞を生きた状態で維持することを意味し、細胞の増殖および／または分化を含むが、これらに限定されない。用語「増殖」とは、細胞分裂の結果として培養物中に存在する細胞の数が増加することを意味する。
【００２３】
本明細書で使用される「培養」、「培養された」または「培養している」とは、環境（例えば宿主哺乳類）から細胞を除去または単離し、インビトロでの好ましい人工環境でのその後の増殖を意味する。
【００２４】
用語「拡張された」は、結果として得られる細胞集団が、ＩＭＧを含む培地組成物中での膵島のｅｘ  ｖｉｖｏ培養に由来することを意味することが意図される。「拡張された」という用語は、細胞由来のいかなるメカニズムまたは理論によって解釈されたり、制限されたりするものではなく、培養中に新規に発生した細胞を含むことができる。
【００２５】
「膵臓細胞」という用語は、膵臓に通常見られる細胞を含み、膵島細胞、例えば、グルカゴン合成α細胞、インスリン産生β細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書に記載の方法によって培養された膵島細胞から増殖された由来のＡＩＰＣは、とりわけ、インスリンの産生、および糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病を含む）を治療するための被験体への移植のために有用である。膵臓細胞集団は、一般に、本明細書に記載の方法を用いて膵臓細胞から生成されたＡＩＰＣを区別するために使用される細胞マーカーであるＫｉ−６７に対して３％以下の陽性である。
【００２６】
本明細書で使用される「標的部位」という用語は、治療または補充を必要とするレシピエント宿主（哺乳動物、好ましくはヒト）の領域を指す。標的部位は、特定の器官内の単一の領域であってもよいし、宿主内の複数の領域であってもよい。いくつかの実施形態では、補充または補充は、膵臓を標的とするか否かにかかわらず、膵臓組織などの正常組織と同じ生理学的応答をもたらす。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「治療」、「治療」または「治療」という用語、および他の文法的等価物は、疾患または状態の症状を緩和する、悪化させる、または改善する、追加の症状を予防する、改善する、または症状の基礎となる代謝原因を防止すること、疾患または状態を阻害すること、例えば、疾患または状態の発生を阻止すること、疾患または状態を緩和すること、疾患または状態の退行を引き起こすこと、疾患または状態によって引き起こされた状態を緩和すること、または疾患または状態の症状を停止すること、および予防すること。用語はさらに、治療上の有益性および／または予防上の有益性を達成することを含む。治療上の利益とは、治療されている基礎疾患の根絶または改善を意味する。また、治療上の有益性は、患者が基礎疾患にまだ悩まされている可能性があるにもかかわらず、患者において改善が観察されるような、基礎疾患に関連する生理学的症状の１つまたは複数の根絶または改善によって達成される。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「治療上有効な量」または「有効量」とは、記載された効果を達成するのに十分な量を指す。疾患を治療するための治療上有効な量とは、患者または患者集団において臨床的に関連するエンドポイントを達成することが可能な活性物質の量である。非限定的な例として、ＡＩＰＣｓを含む組成物の有効量の投与は、高血糖症に苦しむ患者などの高血糖症の対象者を、約１００〜１２５ｍｇ／ｄＬ（５．６〜６．９ｍｍｏｌ／Ｌ）〜約１５０ｍｇ／ｄＬ未満の正常な血糖値範囲に減少させるために、約４００〜約１，４００万細胞／キログラム、または２億細胞よりも大きい量である。注射または輸液用組成物として製剤化されたＡＩＰＣの適切な用量は、治療される対象および治療されるべき状態の重症度に依存する。本明細書に開示された実施例は、部分的にはマウスモデルで実施され、細胞培養実験は哺乳類（ヒトまたはマウス）細胞を利用した。アロメトリックスケーリングなどのスケーリング方法を使用して本明細書に開示されるようなＡＩＰＣを含む組成物を成人ヒトに投与するための適切で例示的な用量範囲を予測する。投与量のスケーリングは経験的アプローチであり、当技術分野ではよく特徴付けられ、理解される。このアプローチは、種間の解剖学的、生理学的、および生化学的プロセスにいくつかの固有の特徴があることを前提としており、薬物動態／生理学的時間の可能な違いは、そのようなものとして、スケーリングによって説明される。一例として、限定する意図はないが、文献によると、ヒトの膵臓には６０万から２００万個の膵島があり、正常なヒトの膵臓には約６億個の膵島細胞があり、その半分はβ細胞である。したがって、このスケールに基づいて、４００万ＡＩＰＣ／ｋｇの投与量は、正常なヒト膵臓のβ細胞を十分に置換すると予想される。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「配列同一性」という用語は、配列間の同一性または類似性の観点から表される２つ以上のアミノ酸配列間の同一性を指す。配列同一性は、パーセンテージ同一性の観点から測定することができ、パーセンテージが高いほど、配列の同一性が高い。パーセンテージ同一性は、配列の全長にわたって計算される。アミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法でアラインメントした場合、比較的高い配列同一性を有する。この相同性は、より遠縁な種（例えば、ヒトおよび線虫の配列）と比較して、より近縁な種（例えば、ヒトおよびマウスの配列）に由来する場合に、より顕著である。
【００３０】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られる。様々なプログラムやアラインメントアルゴリズムが記載される。
Ｓｍｉｔｈ  &  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  &  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  &  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  &  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ，７３：２３７４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  &  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，１９９２；ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４．Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０，ｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｄｅｔａｉｌｅｄ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｍａｙ  ｂｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０），ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，ＵＳ）ａｎｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ．
【００３１】
活性剤は、２９３アミノ酸ペプチドからなるポリペプチド、米国特許出願第１５／８１１，０６０号に記載されるペプチドフラグメントのようなそのフラグメント、またはそれらの組み合わせであっても良く、前記ポリペプチドまたはフラグメントの配列は、以下に示す（２９３）アミノ酸配列の一部と少なくとも５０％の相同性を有し、配列ＩＤ番号：１〜４として指定される。
【表１】
2021528083.tif 000003
2021528083.tif 000004
【００３２】
活性剤のアミノ酸残基は、翻訳後に修飾されていても良いし、他の機能性分子基または非機能性分子基と共役していても良い。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．７（７）：２２８６−２２９５，２０１１，ヒトリボソームタンパク質Ｓ２（例えば、配列ＩＤ番号：１）の一般的に拮抗的なシトルリン化およびメチル化を記載する。当然のことながら、そのような修飾アミノ酸残基は、アミノ酸配列に含まれ、本明細書に記載の活性剤の範囲内である。
【００３３】
例えば、配列ＩＤ番号：１〜４に従ったポリペプチドおよび／またはポリペプチド断片は、細菌、酵母、または合成手段での生産など、タンパク質生産のための当技術で知られる条件下で、または米国特許出願第１５／８１１，０６０号に記載されるような条件下で生産することができる。
【００３４】
第１の態様は、膵島の集団のＡＩＰＣ集団への成長、増殖および分化を刺激するのに有用な組成物に関するものであり、前記組成物は、基質培地と有効量の活性剤とを含む培地を含み、前記活性剤は、配列ＩＤ番号：１〜４（表１に記載）の１つまたは複数に従ったアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその活性フラグメントを含む。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列ＩＤ番号０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％を有する。または配列ＩＤ番号：１に記載のアミノ酸配列と９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、ポリペプチドは、配列ＩＤ番号：２〜４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％の配列同一性を有する。配列ＩＤ番号：２〜４のいずれかに記載されたアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００３５】
第２の態様は、基質培地と有効量の活性剤からなる細胞培養培地を用いて膵島の集団をインビトロで培養することからなる、ＡＩＰＣ集団を生成するための方法に関する。組成物は、一定量のグルコースに曝露されたときにグルコースを分泌する能力など、グルコースに対する組成物の応答性を決定するために分析されても良い。ＡＩＰＣ集団の特徴は、適切な刺激に曝露されたときにグルカゴンを分泌する能力に関連する。
【００３６】
第３の態様は、活性化膵島増殖細胞（ＡＩＰＣ）集団を有する組成物に関するものであり、ＡＩＰＣ集団の６０％はＣＤ１３３細胞マーカーおよびＫｉ−６７細胞マーカーを含み、ＡＩＰＣ集団の少なくとも６０％がインスリン産生能を有することを特徴とする。
【００３７】
第５の態様は、基底培地と有効量の活性剤からなる細胞培養培地を用いて膵島の集団をインビトロで培養する工程を含む方法によって得られる活性化膵島増殖細胞（ＡＩＰＣ）集団からなる組成物に関する。
【００３８】
第６の態様は、基底培地と有効量の活性剤からなる細胞培養培地を用いて膵島の集団をインビトロで培養してＡＩＰＣ集団を得る工程と、ＡＩＰＣ集団をＣＤ１３３、Ｋｉ−６７およびインスリンに選択的な１つまたは複数の細胞マーカーについてスクリーニングする工程と、およびスクリーニングによりＣＤ１３３／Ｋｉ−６７陽性およびインスリン産生と同定されたＡＩＰＣ集団を培養細胞集団から採取する工程とを含むＡＩＰＣ集団の作製方法に関するものである。ＡＩＰＣ集団を生成する方法は、ＡＩＰＣ集団を適当な培地上にプレーティングし、細胞を基底培地と有効量の活性剤からなる培地で処理して培養ＡＩＰＣ集団を得る工程と、ＣＤ１３３／Ｋｉ−６７陽性細胞およびインスリン産生細胞の培養ＡＩＰＣ集団の適当な割合が増殖するまで培養ＡＩＰＣを通過させる工程とをさらに含んでも良い。さらに、ＣＤ１３３３＋／Ｋｉ−６７＋／インスリン＋（「トリプル陽性」）膵島細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）への送達または移植のためにパッケージ化され、製剤化され、またはカプセル化されても良い。
【００３９】
第７の態様は、活性化された膵島増殖細胞（「ＡＩＰＣ」）集団を拡大および増殖させるための方法であり、この方法は、培養されたＡＩＰＣ集団を酵素的に剥離して剥離されたＡＩＰＣ集団を得る工程と、剥離されたＡＩＰＣ集団からなる組成物を培養プレートに再移植する工程と、および基底培地および活性剤からなる培養培地からなる細胞培養培地を培養する工程とを含む。前記ＡＩＰＣの増殖・増殖には、好適なプロテアーゼ、例えばトリプシンを用いることができる。分離した後、前記ＡＩＰＣを、ペレットを形成するのに十分な回転速度（例えば、１００００ｒｐｍ）および持続時間（例えば、７分間）で遠心分離しても良い。分離されたＡＩＰＣを、例えば、約１００００細胞／ｃｍ２の適当な細胞密度で再プレーティングすることが好ましいかもしれない。ＡＩＰＣ集団、剥離されたＡＩＰＣ等を含むＡＩＰＣの興味深い特徴は、少なくとも１００日間のアイソレーション後の生存性である。
【００４０】
第８の態様は、インビボ治療のために、特に１またはそれ以上の膵臓疾患、特にＩ型糖尿病の治療のために、哺乳動物に投与または移植するためのパッケージ化またはカプセル化された製剤の形態の活性化膵島増殖細胞（「ＡＩＰＣ」）集団に関する。ＡＩＰＣ集団は、送達溶液として、または送達車両に包装され、投与が全身的、局所的、または標的部位への投与であるか否かに関わらず、移植、注射、または輸液で投与されても良い。
【００４１】
第９の態様は、膵臓疾患が高血糖症またはＩ型糖尿病である場合に、哺乳動物において膵臓疾患を治療する方法に関するものであり、この方法は、以下を含む：哺乳動物種の膵島の集団を、基底培地および有効量の活性剤からなる培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して、ＡＩＰＣ集団を得る工程を含む。一実施形態では、ＡＩＰＣ集団は、インスリン産生ＣＤ１３３／Ｋｉ−６７陽性細胞からなる。別の実施形態では、膵臓疾患を治療する方法は、グルコースに対するＡＩＰＣ集団の応答を測定する工程をさらに含む。さらに別の実施形態では、膵疾患を治療する方法は、ＡＩＰＣ集団を拡大および増殖させる工程と、およびＡＩＰＣ集団を構成する組成物（例えば、インスリン産生性ＣＤ１３３／Ｋｉ−６７陽性細胞集団など）を哺乳動物に移植し、標的部位に組成物を送達する工程を含み、それにより膵疾患の治療を提供することができる。一実施形態では、組成物は、水溶液、懸濁液、カプセル化、マイクロカプセル化、および／またはカプセル化された、または半固形製剤として送達されても良く、前記組成物は、注射、輸液、卵管または腹膜パウチのうちの１またはそれ以上を介して哺乳動物に送達されても良い。外科的移植、または哺乳動物の標的部位へのデバイスの一部として組成物をパッケージングすることにより、組成物を移植することができる。
【００４２】
本発明の別の態様において、活性化膵島増殖細胞（ＡＩＰＣ）集団からなる組成物は、さらに、緩衝液、薬学的に許容される担体、または薬学的に許容される添加剤のうちの１またはそれ以上を含む。
【００４３】
本明細書に記載の細胞培養システムは、少なくとも最初に、膵島の集団；細胞培養増殖基質；および基質および有効量の活性剤からなる培養液を含み、前記活性剤は、例えば、配列ＩＤ番号：１〜４に従うポリペプチド、またはそのフラグメントを含み、前記ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、例えば配列ＩＤ番号：１に従うポリペプチドと、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する。例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有する。
［実施例］
【００４４】
以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、本明細書で主張される主題に関して限定するものではない。本明細書に記載され、定義されている他の活性剤、例えば、配列ＩＤ番号：２〜４が使用され得ることを理解した上で、本明細書において配列ＩＤ番号：１として同定される特定の活性剤を参照するために「ＩＭＧ」という用語が使用される。用語ＩＭＧおよびその量の使用は、活性剤の特定の用量または濃度を意味するものではない。実施例では、添加物／サプリメントの濃度、および活性剤の培地は表２に記載されており、対照培地は表３に記載される。
【００４５】
培養条件
実施例で実施した細胞培養は、標準的なＣＯ２（５％）条件下において３７℃でインキュベートした；培養（細胞のメッキ、細胞の分割）は、垂直層流フード中で標準的な無菌技術および条件の下で、およびそれを使用して実施した。別段の記載がない限り、ＡＩＰＣは表に記載された培地で培養した。ＡＩＰＣは、培養中に約７０〜８０％のコンフルエントに達したときに分割された。
【００４６】
分割技術は、培養プレートからの上清の除去を含んだ（上清は保存された）。プレートはその後、２−５ｍｌ＿ＰＢＳで洗浄した（洗浄は保存された）。ＡＩＰＣは、細胞が剥離するまで、約３〜５分間、３７℃でトリプシンの存在下で細胞をインキュベートすることにより、トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なような）の約３〜５ｍｌ＿を用いて剥離した。その後、プレートをＰＢＳで２回目の洗浄を行う。トリプシン化された細胞、および保存されたＰＢＳ洗浄物および収集された細胞培養上清を、次に、１００００ｒｐｍ、４℃で７分間遠心分離した。得られた上清をデカンテーションし、ペレットを２ｍｌ＿ＰＢＳに再懸濁し、再遠心した。その後、上清を除去し、ペレットをＩＭＧを含む培養液に再懸濁し、〜１００００細胞／ｃｍ２の細胞密度で再懸濁した。
【表２】
2021528083.tif 000005
【表３】
2021528083.tif 000006
【実施例１】
【００４７】
一つの例示的な研究において、３００匹のマウス膵島を、生後８〜１０週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙまたはＣｈａｒｌｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手可能なものなど）の膵臓から単離した。単離された膵島は、１０％子牛胎児血清、２ｍｍｏｌ  Ｌ−グルタミン、抗生物質、および濃度約３．０μｇ／ｍＬを含むＩＭＧを含む添加物を添加したＣＭＲＬ培地（もともとはＣｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって開発され、現在はＭｅｄｉａｔｅｃｈから入手可能）を含む培地で培養された。処理した細胞を横に並べて増殖させ、ＩＭＧを含まない基底培地で成長させた同一の細胞であった対照細胞と比較した。２４時間以内に、ＩＭＧを含む細胞培養培地で培養された細胞は、１０倍の倍率の顕微鏡による目視検査に基づいて、クラスター化が少なくなり、培養された膵島細胞は活発に細胞クラスターから離れて移動しているように見えることが観察された（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅソフトウェアを備えたＬｕｍｅｎｅｒａカメラを備えたＬｅｉｃａ  Ｌｉｇｈｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用）。一方、対照膵島細胞はクラスター化した形態を維持し、細胞移動の最小限の証拠を示したことが観察された。処理の３日後、ＩＭＧを含む培地で培養した膵島細胞は、培養中に自由浮遊細胞と付着細胞の両方を示した。自由浮遊細胞は、アクリジンオレンジ（ＡＯ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって決定されるように３０％の生存率であった。ＡＯは、生きている細胞と死んだ細胞の両方に浸透することができるインターカレート色素であり、ＰＩは、フローサイトメトリー分析における非生存細胞の排除のための細胞不透過性蛍光溶液である。ＰＩは、塩基対間のインターカレートにより二本鎖ＤＮＡに結合するが、無傷の形質膜を持つ細胞からは排除される。付着した細胞は８５％の生存可能な細胞であった。対照的に、対照の膵島細胞培養では、膵島クラスターは９０％以上の細胞生存率で測定されるように健康に見えたが、自由浮遊細胞や付着細胞の兆候を示さなかった。１０日目までに、ＩＭＧを含む培地で培養した膵島細胞は、膵島細胞クラスターの低い割合を示し、培養中に残っている識別可能な自由浮遊細胞がなく、付着細胞はコロニーを形成しているように見えたことが示された。ＩＭＧを含む培地で培養した膵島細胞の全細胞生存率は９０％以上であった。コントロール細胞は遊走や付着を示さないままであったが、膵島クラスター細胞の生存率は約９０％に留まった。培養２５日目に、処理したものと対照（未処理）の両方の膵島細胞を固定し、ＣＤ１３３（体性前駆細胞のマーカー）とインスリンを染色した。免疫組織染色の結果、ＩＭＧを含む細胞培養培地で処理した膵島細胞は、少なくとも７５％のインスリン陽性であった。さらに、ＩＭＧで処理した膵島細胞は少なくとも７０％のＣＤ１３３陽性であり、約６０％以上の膵島細胞がＣＤ１３３とインスリンの両方に陽性であった（"ダブル陽性"とみなす）。対照的に、対照細胞では、９０％がインスリン陽性であったが、ＣＤ１３３マーカーが陽性であったのは、細胞集団の５％未満であった。同様に、細胞集団の５％未満では、ＣＤ１３��マーカーおよびインスリンの両方に二重陽性であることが判明した。
【００４８】
この結果は、本明細書に記載された細胞培養系および培地が、膵島細胞の活性化および膵島外への移動を誘導する効果を有することを示す。これらの細胞は、ＣＤ１３３／インスリン「二重陽性」細胞集団のコロニーを形成し、このコロニーは、活性化されたβ細胞前駆体を表わすものであり、損傷した膵島を再生するための方法および治療法に使用される可能性がある。
【実施例２】
【００４９】
別の例示的な研究では、ヒト膵島が利用された。Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＨＩＲ）（商標登録）などのヒト膵臓は、臓器提供者の膵臓から処理された一次ヒト膵臓であり、Ｐｒｏｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから市販される。一般に、ヒト膵島の個体数は、３％未満のＫｉ−６７陽性であり、健康な膵島は、刺激に応答して約５０％のインスリン産生を行う。本実施例では、ＣＭＲＬ  １０６６培地、１０％子牛胎児血清、１０％ヒト血清、２ｍｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、抗生物質、およびＩＭＧを含む培地中で、約１０個の膵島を約１０．０ｐｇ／ｍＬの濃度で培養した。ＩＭＧを含む培地で培養した膵島を、ＩＭＧなしの（単独の）ＣＭＲＬ  １０６６培地で培養した対照細胞と比較した。処理したヒト膵島および未処理のヒト膵島を３７℃で５日間培養し、次にＣｙＱＵＡＮＴ細胞増殖アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なようなもの）を行った。５日以内に、ＩＭＧを含む培地で培養したヒト膵島は、対照群の約１．５倍の細胞数を有することが示された。コントロールでは６３６３細胞／ｍＬ、ＩＭＧで培養した膵島では９４６９細胞／ｍＬであった（ｐ＜０．００１）。ＩＭＧを含む培地で培養したヒト膵島は、ムラニー膵島（実施例１）で顕微鏡で見られたのと同じ傾向を示し、具体的には、膵島はサイズが小さくなり、組織構造が小さくなり、時間の経過とともに、膵島細胞は積極的にクラスターから離れて移動するように見えた。
【実施例３】
【００５０】
別途、ヒト膵島（３，０００〜１０，０００）を、コントロール培地または１０％子牛胎児血清、１０％ヒト血清、２ｍｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、抗生物質、およびＩＭＧを１０．０μｇ／ｍＬの濃度で補充したＣＭＲＬ  １０６６培地を含む培地で、タイプＩコラーゲン（ラット尾からのコラーゲン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ３８６７）および内皮細胞接着因子（ＥＣＡＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｅ９７６５）を含む接着因子混合物（ＡＦＭ）でコーティングしたプレート上で培養した。ＥＣＡＦとコラーゲンの様々な比率が使用されてもよく、ＥＣＡＦに対するコラーゲンの５０／５０の比率を含む。ＡＦＭの薄い層（３〜１０ｍＬの間）を適用し、３０分間設定した後、余分なＡＦＭを除去し、プレートは、フード内で４５分間乾燥させることができた。使用前にプレートをＰＢＳで洗浄し、潜在的な汚染物質を除去した。培養した膵島をＡＦＭ処理フラスコ（プレートを使用しても良い）中で、培地または対照培地のいずれかで２〜５日間培養した。
【００５１】
コントロール膵島（ＩＭＧを含まない標準的なＣＭＲＬ培地で培養）は、それらのクラスタ化された形態を維持することが示され、明視野顕微鏡を使用して見られる結果に基づき、細胞の移動の証拠を示さなかった。膵島の培養物ＩＭＧを含む培地で培養したか、標準培地で培養したかにかかわらず）を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメトリー装置を用いた蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により、ＣＤ１３３およびＫｉ−６７（増殖に関連する核内タンパク質）の発現、ならびに細胞内インスリンの発現についてアッセイした。培養された細胞は、最初にＣＤ１３３発現のために標識され、次いで、製造業者の指示に従って、ＦＯＸＰ３固定化／浸透化緩衝液を用いて細胞を固定および浸透化し、そしてそれぞれ、Ｋｉ−６７および細胞内インスリンのための共役フルオロメトリー抗体で染色された。次いで、ＦＯＸＰ３固定化／パーマビライゼーションおよび共役フルオロメトリー抗体で染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。ＩＭＧを含む培地で培養したヒト膵島細胞は、ＣＤ１３３、Ｋｉ−６７およびインスリン（トリプル陽性）、具体的には、インスリン、ＣＤ１３３およびＫｉ−６７に対して８０％以上の陽性を示し、対照細胞はインスリンに対して７５％以上の陽性を示し、ＣＤ１３３およびＫｉ−６７に対して約１０〜１５％の陽性を示した。
【００５２】
培養膵島のグルコース応答性を試験するために、ＡＩＰＣを静的培養グルコース刺激分泌アッセイに供した。約１×１０６細胞／ウェルを６ウェルディッシュにプレートし、β細胞機能のための培地からのインスリン分泌、およびα細胞機能のためのグルカゴンを評価するために５つの刺激条件を受けた。細胞は、以下のいずれかで３０分間インキュベートし、（１）２．８ｍＭの生理学的濃度のグルコースを添加したＫＲＥＢの緩衝液（コントロールベースライン）；（２）グルコース１６．７ｍＭ（インスリンの刺激）；（３）グルコース１６．７ｍＭ＋１００ｍＭ  ＩＢＭＸインスリンのための最大刺激）；（４）グルコース１．７ｍＭ＋１ｍＭエピネフリン（グルカゴンのための刺激）；（５）グルコース５．６ｍＭ＋２０ｍＭ  ＫＣＩ（インスリンおよびグルカゴンのための追加の刺激）。アッセイ後、培地を−２０℃で保存し、インスリンとグルカゴンの標準的なＥＬＩＳＡ分析を行った。図７および図８に示すように、ＩＭＧからなる細胞培養培地で培養した膵島は、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌することが示された。
【実施例４】
【００５３】
ＡＩＰＣｓがｉｎ  ｖｉｖｏで生存可能であるかどうかを決定し、高血糖症の治療および血糖コントロールのための方法としてＡＩＰＣｓを検証するために、６匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、在庫番号０００６６４）を、インスリン産生細胞の破壊およびマウスにおける１型糖尿病表現型の生成のために使用される化学物質であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（７５ｍｇ／ｋｇ）で処理した。ＳＴＺ処理した動物（ｎ＝６）が２００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を示したら（ＳＴＺ処理後４日目）、ＳＴＺ処理したマウスは、尾静脈注射によって、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の水性懸濁液またはＰＢＳの３００ｐＬ中の約４００万ＡＩＰＣからなる細胞性懸濁液を投与した。本研究で使用したＡＩＰＣは、堅牢なｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ蛍光を発現する細胞を有するＴｏｍａｔｏ−Ｒｅｄマウス（Ｊａｃｋｏｎｓｏｎ  Ｌａｂｓ、株番号００７５７６）から単離した。
【００５４】
細胞懸濁液用のＡＩＰＣｓを生成するために、以前に発表された方法（Ｂｅｒｔｅｒａ ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１２；２０１２：８５６３８６、２０１２  Ｄｅｃ  ９）に従って、５型コラゲナーゼ消化（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）により、Ｔｏｍａｔｏ−Ｒｅｄマウスからマウス膵島を単離した。簡潔に言うと、犠牲になった直後に２〜３ｍＬのコールドコラゲナーゼ溶液（１．９５ｍｇ／ｍｌのＨａｎｋ'ｓｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ））を総胆管を介して膵臓に注入した。完全に膨らんだ膵臓を取り出し、組織培養フラスコ中で３７℃で２０分間インキュベートした後、５秒間振盪して組織を分解した。消化された組織を０．２％ＢＳＡを補充した冷たいＨＢＳＳで洗浄し、膵島をＦｉｃｏｌｌ勾配で精製した。手摘みした膵島を、標準的なＣＯ２（５％）条件下で３７℃で培養培地（表２）で培養した。Ｔ−７５組織培養プレートを、本明細書に開示のように使用する前にＡＦＭ（ＥＣＡＦおよびコラーゲンタイプＩ）で前処理した。約３００〜５００個の小島は、培養培地（表２）でＴ−７５あたりにメッキした。小島は、細胞が外に移行しながらプレートに付着し始めたのはプレーティング後２４時間と早く、７２時間までにほとんどの小島は細胞が外に移行しながら付着した；そして約７〜１０日目に、ＡＩＰＣはコンフルエンシーであった。１４日目までに、ＡＩＰＣｓは、シリアルパセッシングを受けた。培養したＡＩＰＣｓを回収し、ＳＴＺ処理マウスに注射した。
【００５５】
ＳＴＺ処理マウスの空腹時血糖値は、以下の通りである。の投与を週２回測定した；２匹の動物（Ｍ２およびＭ６）を２８日目に犠牲にし、２匹の動物（Ｍ３およびＭ５）を４２日目のＡＩＰＣ注射後に犠牲にした。４６日目に、残りの２匹の動物（Ｍ１およびＭ４）を、尾静脈注射を介して、懸濁液（ＰＢＳ）中の追加の１，０００万細胞／３００ｐｌ＿を投与し、研究の７０日目に犠牲にした。
【００５６】
結果は、ＳＴＺで処理したＡＩＰＣを注射したマウスは空腹時血糖値の減少を示し、それは時間の経過とともに減少したことを示した。最後の２匹の動物（合計約１，４００万個のＡＩＰＣの２回の注射を受けたＳＴＺ処理マウス）は、５３日目までに正常な血糖値（２００ｍｇ／ｄＬ以下の血糖値）を示した（図１１参照）。さらに、組織学的および免疫学的尾静脈からＳＴＺ処理マウスに注入されたＡＩＰＣｓは膵臓にホーミングし、膵臓に移植され、膵臓に移植された後も増殖を続けることが組織学的染色と顕微鏡分析によって示された（結果は図１２と１３に提示）。
【００５７】
犠牲にした動物の組織学的分析は、ＳＴＺ処理した動物の膵臓にドナーのトマトレッドＡＩＰＣを表示し、尾静脈注入されたＡＩＰＣの膵臓への移動／帰化を示唆した（図１２参照）。ＡＩＰＣは、より長い時間帯でより高い濃度で存在しているようである。尾静脈注射を介してＡＩＰＣｓを受け取ったＳＴＺ処理マウスの免疫組織学的分析は、その後７０日目に犠牲にし、（マーカーの組織学的染色に基づいて）トマトレッドとＫｉ−６７の両方に二重陽性であった膵臓組織内の領域を示し、注入されたＡＩＰＣｓは、それらが継続的な細胞分裂と増殖することができる膵臓に帰化したことを示す（図１３参照）。
【００５８】
本明細書に記載の方法は、基底培地および活性剤を含む細胞培養培地中で単離された膵島を培養する工程を含む。培地は、膵島細胞の生存能力の低下を引き起こす証拠を示さず、膵島の解離および膵島細胞の膵島内核からの動員を促進するという直接的な証拠を示した。このようにして得られた培養された膵島細胞の拡大は、培養液で処理された場合、数日以内に示される。活性剤からなる細胞培養培地中で増殖した結果として生じる細胞は、インスリン発現、ＣＤ１３３およびＫｉ−６７に陽性であり、本明細書に記載された方法および培地を用いて暫定的に生成された新規なＡＩＰＣ細胞集団を表す。活性剤からなる培地を用いて単離された膵島を培養することによって生成されたＡＩＰＣは、１８世代以上にわたって連続的にパッシングされ、単離後少なくとも１００日間は生存可能な状態を維持することが示された。
【００５９】
本明細書の方法に従って生成された由来の活性化膵島増殖細胞集団は、培養中のＣＤ１３３＋／Ｋｉ−６７＋細胞の少なくとも３０％；または培養中のＣＤ１３３＋／Ｋｉ−６７＋細胞の少なくとも３５％；または培養中のＣＤ１３３＋／Ｋｉ−６７＋細胞の少なくとも４０％；または培養中のＣＤ１３３＋／Ｋｉ−６７＋細胞の少なくとも４５％；または培養中のＣＤ１３３＋／Ｋｉ−６７＋細胞の少なくとも５０％からなる。または培養中のＣＤ１３３＋／Ｋｉ−６７＋細胞の少なくとも６０％；または培養中のＣＤ１３３＋／ＫＬｕ＿３ＡＡ醢−６７＋細胞の少なくとも７０％；または培養中のＣＤ１３３＋／ＫＬｕ＿３ＡＡ醢−６７＋細胞の少なくとも８０％；または培養中のＣＤ１３３＋／Ｋｉ−６７＋細胞の少なくとも８５％、または培養中のＣＤ１３３＋／Ｋｉ−６７＋細胞の少なくとも９０％；そしてここで、由来の活性化膵島増殖細胞の少なくとも６０％がまたインスリン産生細胞である。
【００６０】
インビトロで生成された膵島細胞のカプセル化および哺乳動物への移植は、当技術分野において以前に特徴づけられている（例えば、Ａｌｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔ．Ｏｒｇａｎｓ  ３０：３８２−３８６、および米国特許６，７０３，０１７Ｂ１、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）−および本明細書に開示された方法に従って生成されたＡＩＰＣに適するだろう。好ましくは、カプセル化剤は低刺激性であり、標的組織内に容易かつ安定的に位置し、移植された細胞組成物に追加の保護を提供して、移植されたＩＰＰＣを保護し、破壊から防ぐことができる。
【００６１】
前述の本発明は、理解を明確にする目的で、図示および例示の方法でいくつかの詳細に記載されてきたが、特定の変更および修正が、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは、当業者には明らかだろう。上述した側面および様々な実施形態のいずれかに関連して記載された特徴が、異なる実施形態の間で互換的に適用され得ることは、当技術に熟練した者には明らかだろう。
【００６２】
上述の本発明の側面および種々の実施形態は、本発明の種々の特徴を例示するための例示である。本願で言及されたすべての刊行物および特許出願は、本発明が適用される当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれる場合と同様の範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
本明細書の明細書および特許請求の範囲全体を通して、「を含む」および「含有する」という語およびそれらの変形は、「含むが、これに限定されない」という意味であり、他の部位、添加物、成分、または工程を除外することを意図していない（および除外しない）。本明細書の明細書および特許請求の範囲全体を通して、文脈上別段の要求がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈が別段の要求をしない限り、単数形だけでなく複数形も考慮するものと理解される。
【００６４】
本発明の特定の側面、実施形態または例に関連して記載された特徴、特徴、化合物、化学的部位または基は、それと相容れない場合を除き、本明細書に記載された任意の他の側面、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書に開示される特徴のすべて（添付の請求項、要旨および図面を含む）、および／またはそのように開示されている任意の方法またはプロセスのすべての工程は、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、前述の任意の実施形態の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書に開示された特徴の任意の新規な１つまたは任意の新規な組み合わせ（任意の添付の特許請求の範囲、要旨および図面を含む）、またはそのように開示された任意の方法またはプロセスの工程の任意の新規な１つまたは任意の新規な組み合わせにも及ぶ。
【００６５】
本明細書に開示された情報は、例えば、２０１７年１１月１３日に出願された米国特許出願第１５／８１１，０６０号、２０１９年１月９日に出願されたＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５００４９号、および米国２０１８年６月２５日に出願された仮特許出願第６２／６８９，７８０号を含み、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に組み込まれる用語および／または表現は、本明細書に開示された用語および／または表現と矛盾する範囲で、本明細書に開示された情報が支配する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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