(57)【要約】  ウイルス感染状態を決定するためのデジタルホログラフィック顕微鏡  細胞サンプルにおける少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を提供するものであって、デジタルホログラフィック顕微鏡によって細胞サンプルのホログラフィック情報（304）を受け取ること、および該ホログラフィック情報から、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態（306）を決定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタルホログラフィック顕微鏡によって得られた細胞サンプルのホログラフィック情報（304）を受け取ること、および該ホログラフィック情報から、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態（306）を決定することを含む、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を提供する方法であって、該感染状態（306）は該ホログラフィック情報から導出される細胞の１以上の測定された細胞のパラメータ（308）を含む細胞のパラメータデータ（312）から決定されるものであって、該１以上の測定された細胞のパラメータ（以下、MCPともいう）（308）は、表１のMCPのサブセットを含むものであり、該サブセットは、グループ（a）位相テクスチャ（F40〜F51）、（b）屈折ピーク（F20、F33〜F37）、（c）形態（F2〜F19、F70〜72）の少なくとも１つからの１以上のMCPを含む、方法。
【請求項２】
サブセットが、F45 (ID 位相相関特性)、F44(ID 位相コントラスト特性) 、F48 (ID 位相歪度特性) 、F47(ID 位相均一性特性) 、F43 (ID 位相平均均一性特性) 、F51(ID 位相均一性特性)から選択される１以上の（グループ（a））MCPを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サブセットが、F20 (ID 等価ピーク直径特性) 、F33 (ID ピーク領域特性) 、F34(ID ピーク領域正規化特性) 、F36(ID ピーク高さ特性) 、F37 (ID ピーク高さ正規化特性) から選択される１以上の（グループ（b））MCPを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サブセットが、F8 (ID 等価細胞直径特性) 、F17 (ID 半径平均特性) 、F8(ID 等価直径) 、F3 (ID 細胞領域特性) 、F18 (ID 半径分散特性) 、F6 (ID 伸長特性) 、F4 (ID真円度特性)から選択される１以上の（グループ（c））MCPを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サブセットが、光学高さ(F24〜F32、F38〜F39)、任意でF27 (ID 光学高さ平均特性)、F32(ID 光学ボリューム特性) 、F38 (ID 光学高さ標準偏差特性) 、F39 (ID ミクロン単位の光学高さの標準偏差特性)から選択される、１以上の（グループ（d））MCPをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サブセットが、
F45 (ID位相相関特性)および F44 (ID位相コントラスト特性)、
または
F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID 位相コントラスト特性)、およびF48 (ID位相歪度特性) 、
または
F45 (ID 位相相関特性)、F44 (ID 位相コントラスト特性)、F48(ID 位相歪度特性) 、および F20 (ID等価ピーク直径特性)、 
または
F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID位相コントラスト特性)、F48(ID位相歪度特性) 、F20 (ID等価ピーク直径特性)、および(F33 (ID ピーク領域特性)もしくはF34 (ID ピーク領域正規化特性))、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞のパラメータデータ（312）は、
−  ある細胞のMCPと同じ細胞の別の異なるMCPの少なくとも１つの比率、
−  MCPの細胞サンプルにおける２以上の細胞間の変動の指標、
を含む、少なくとも１つの細胞の１以上のMCPから決定された１以上の導出パラメータをさらに含む、請求項１または６に記載の方法。
【請求項８】
決定は、既知のウイルス感染状態および測定された細胞のパラメータの細胞のトレーニングセットを使用してトレーニングされた予測モデルを使用することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
予測モデルは、ニューラルネットワーク法、ランダムフォレストツリーまたはディープラーニング法を含む機械学習法を使用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルは、任意でバイオリアクターからのものである、流動的な細胞の懸濁液であり、および、ウイルス状態はリアルタイムで提供される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態は、ウイルス感染の有無の表示、感染の確率、感染の程度、感染の段階、ウイルスの量の１以上を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を含むレポートを出力することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
リモート処理センターで実行される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
−  請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行するように構成されたコンピューティングデバイス、および
−  デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）
を含む、システム。
【請求項１５】
DHMは、少なくとも部分的にコヒーレント光を発する光源、干渉計、およびイメージセンサーを備える、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行するように構成されたコンピューティングデバイスであって、前記コンピューティングデバイスは、
−  デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）によって取得された細胞サンプル中の少なくとも１つの細胞のホログラフィック情報を受け取り、および
−  該ホログラフィック情報から、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を決定する、
ように構成されている、コンピューティングデバイス。
【請求項１７】
コンピューティングデバイスまたはシステムによって実行されたときにコンピューティングデバイスまたはシステムに請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行させる命令を有するコンピュータプログラム。
【請求項１８】
請求項１７のコンピュータプログラムが格納されたコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）から得られたホログラフィック情報（holographic information）を使用して細胞サンプルにおける少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性ウイルス性疾患の決定は、いくつかの異なる技術を使用して達成することができる。
【０００３】
プラークアッセイ技術は、ウイルスの定量化に有用であり、単層の細胞がウイルスに感染すると、感染した細胞が溶解する。その後、周囲の細胞が感染し、最終的には単層のより広い領域が明らかになる。プラークとして知られる領域は、ウイルス感染を測定するために数えることができる。しかしながら、ウイルス検出は溶解段階でのみ決定されるため、検出するのは遅い。
【０００４】
他の方法では、抗体などの高分子プローブを使用して、またはPCRなどの核酸増幅技術を使用して細胞を分析することを含む。PCRまたは抗体プローブの使用には多くの時間と労力が必要とされるが、ウイルス感染を迅速に特定することが重要である。また、抗体は細胞膜上の抗原マーカーの同定を必要とするため、細胞型、抗原提示、およびウイルス感染に応じて異なる抗体が必要になる可能性がある。適切な抗原マーカーを特定する作業は、時間のかかるプロセスである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
さまざまな種類の細胞型や感染ウイルスに適用でき、タンパク質または核酸の疾患マーカーを特定する必要がない、細胞サンプル中の細胞のウイルス状態を決定するための迅速で柔軟な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書で提供されるものは、デジタルホログラフィック顕微鏡によって得られた細胞サンプルのホログラフィック情報（304）を受け取ること、および該ホログラフィック情報から、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態（306）を決定することを含む、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を提供する方法であって、該感染状態（306）は該ホログラフィック情報から導出される細胞の１以上の測定された細胞のパラメータ（308）を含む細胞のパラメータデータ（312）から決定されるものであって、該１以上の測定された細胞のパラメータ、MCP（308）は、表１のMCPのサブセットを含むものであり、該サブセットは、グループ（a）位相テクスチャ（F40〜F51）、（b）屈折ピーク（F20、F33〜F37）、（c）形態（F2〜F19、F70〜72）の少なくとも１つからの１以上のMCPを含む。
【０００７】
サブセットには、F45 (ID 位相相関特性)、F44 (ID 位相コントラスト特性) 、F48 (ID 位相歪度特性) 、F47(ID位相均一性特性) 、F43 (ID 位相平均均一性特性) 、F51 (ID 位相均一性特性)から選択される１以上の（グループ（a））MCPを含んでよい。
【０００８】
サブセットには、F20 (ID 等価ピーク直径特性) 、F33 (ID ピーク領域特性) 、F34(IDピーク領域正規化特性) 、F36 (ID ピーク高さ特性) 、F37 (ID ピーク高さ正規化特性) から選択される１以上の（グループ（b））MCPを含んでよい。
【０００９】
サブセットには、F8 (ID 等価細胞直径特性) 、F17 (ID 半径平均特性) 、F8(ID等価直径) 、F3 (ID 細胞領域特性) 、F18 (ID 半径分散特性) 、F6 (ID 伸長特性) 、F4 (ID真円度特性)から選択される１以上の（グループ（c））MCPを含んでよい。
【００１０】
サブセットには、光学高さ(F24〜F32、F38〜F39)、任意でF27 (ID 光学高さ平均特性)、F32(ID 光学ボリューム特性) 、F38 (ID 光学高さ標準偏差特性) 、F39 (ID ミクロン単位の光学高さの標準偏差特性)から選択される、１以上の（グループ（d））MCPをさらに含んでよい。
【００１１】
サブセットには、
F45 (ID位相相関特性)および F44 (ID位相コントラスト特性)、
または
F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID 位相コントラスト特性)、およびF48 (ID位相歪度特性) 、
または
F45 (ID 位相相関特性)、F44 (ID 位相コントラスト特性)、F48 (ID 位相歪度特性) 、および F20 (ID等価ピーク直径特性)、 
または
F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID位相コントラスト特性)、F48 (ID位相歪度特性) 、F20 (ID等価ピーク直径特性)、および(F33 (ID ピーク領域特性)もしくはF34 (ID ピーク領域正規化特性))を含んでよい。
【００１２】
本明細書で提供すされるものは、デジタルホログラフィック顕微鏡で取得した細胞サンプルのホログラフィック情報（304）を受け取ること、および該ホログラフィック情報から、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態（306）を決定することを含む、細胞サンプル中の少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を提供する方法である。
【００１３】
感染状態（306）は該ホログラフィック情報から導出される細胞の１以上の測定された細胞のパラメータ（308）を含む細胞のパラメータデータ（312）から決定されてもよい。
【００１４】
１以上の測定された細胞のパラメータ（308）は表１の１以上のパラメータを含んでもよい。
【００１５】
細胞のパラメータデータ（312）は、
−  細胞の測定された細胞のパラメータと同じ細胞の別の異なる測定された細胞のパラメータの少なくとも１つの比率、
−  測定された細胞のパラメータの細胞サンプルにおける２以上の細胞間の変動の指標、
を含む、少なくとも１つの細胞の１以上の測定された細胞のパラメータから決定された１以上の導出パラメータをさらに含んでもよい。
【００１６】
該決定は、既知のウイルス感染状態および測定された細胞のパラメータの細胞のトレーニングセットを使用してトレーニングされた予測モデルを使用することを含んでもよい。
【００１７】
該予測モデルは、ニューラルネットワーク法、ランダムフォレストツリーまたはディープラーニング法などの機械学習法を使用してもよい。
【００１８】
サンプルは、静的なまたは流動的な細胞懸濁液、または付着細胞培養物であってもよい。
【００１９】
少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態は、ウイルス感染の有無の表示、感染の確率、感染の程度、感染の段階、ウイルスの量の１以上を含む。
【００２０】
本発明の方法は、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を含むレポートを出力することをさらに含んでもよい。
【００２１】
本発明の方法は、リモート処理センターで実行してもよい。
【００２２】
本明細書でさらに提供されるのは、
−  本明細書で説明する方法を実行するように構成されたコンピューティングデバイス
−  デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）
を含む、システムである。
【００２３】
DHMは、少なくとも部分的にコヒーレント光を発する光源、干渉計、およびイメージセンサーを備えてよい。
【００２４】
本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に記載される方法を実行するように構成されたコンピューティングデバイスであって、
−  デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）によって取得された細胞サンプル中の少なくとも１つの細胞のホログラフィック情報を受け取ること、および
−  該ホログラフィック情報から、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を決定すること、
に構成されたコンピューティングデバイスである。
【００２５】
本明細書でさらに提供されるのは、 コンピューティングデバイスまたはシステムによって実行されたときにコンピューティングデバイスまたはシステムに本明細書に記載の方法を実行させる命令を有するコンピュータプログラムである。
【００２６】
本明細書でさらに提供されるのは、コンピュータプログラムが格納されたコンピュータ可読媒体である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、分析のためにサンプルがポンプで送られるバイオリアクターである容器（vessel）に接続されたDHMの配置を示す。
【図２】図２は、容器用の取り外し可能なポンプアセンブリの配置を示す。
【図３】図３は、DHM用の取り外し可能な導管を示している。
【図４】図４は、付着細胞培養のホログラフィック情報を取得するのに適したDHMを示す。
【図５】図５および図６は、本発明の方法の異なる態様を示すフローチャートである。
【図６】図５および図６は、本発明の方法の異なる態様を示すフローチャートである。
【図７】図７は、機械学習プロトコルを示すフローチャート。
【図８】図８は、バイオリアクター内のバッチ１細胞のウイルス量、TCD、VCDおよび細胞生存率を示すグラフである。
【図９】図９は、バイオリアクター内のバッチ２細胞のウイルス量、TCD、VCDおよび細胞生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の本方法、システム、デバイスおよび製品を説明する前に、本発明は、説明した特定の方法、システム、デバイスおよび製品または組み合わせに限定されず、もちろん、そのような方法、システム、デバイス、製品、および組み合わせは異なる場合があることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書で使用される用語は限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００２９】
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、単数および複数の指示対象の両方を含む。
【００３０】
本明細書で使用される「備える」、「含む」および「を備える」という用語は、「含有すること」、「含有する」または「包含している」、「包含する」と同義であり、包括的または制限のないものであり、追加の非引用の構成物、要素、または方法の工程を除外するものではない。本明細書で使用される「含む」、「備える」および「を備える」という用語は、「からなる」、「だけを含む」、および「だけからなる」という用語を含むことが理解されよう。
【００３１】
端点による数値範囲の記載には、それぞれの範囲内に含まれるすべての数および分数、ならびに記載された端点が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、パラメータ、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合、+ /-10％以下、好ましくは+ /-5％以下、より好ましくは+ /-1％以下、さらにより好ましくは+ /-0.1％以下、の変動、およびそのような変動が開示された発明で実行するのに適切である限り、特定の値を包含することを意味する。修飾語句「約」または「およそ」が指す値自体も、具体的かつ好ましくは開示されていることを理解されたい。
【００３３】
一方、要素の群の１以上または少なくとも１つの要素などの「１以上」または「少なくとも１つ」という用語は、それ以上の例示により、それ自体が明らかであり、この用語は、とりわけ、前記要素のいずれか１つ、または例えば前記要素のいずれかの≧３、≧４、≧５、≧６または≧７などの前記要素およびすべての上記要素までのいずれか２つ以上への言及を包含する。
【００３４】
本明細書で引用されるすべての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特に、本明細書で具体的に言及されるすべての文献の教示は、参照により組み込まれる。
【００３５】
別段の定義がない限り、技術用語および科学用語を含む、本発明の開示に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。さらなるガイダンスによって、本発明の教示をよりよく理解するために用語の定義が含まれる。
【００３６】
以下の段落では、本発明の異なる態様がより詳細に明示される。そのように明示された各態様は、反対に明確に示されない限り、他の任意の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示されている他の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
【００３７】
本明細書全体を通して「一つの実施形態」または「実施態様」への言及は、実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所での「一実施形態では」または「実施態様では」という語句の出現は、必ずしもすべて同じ実施形態を指すとは限らないが、そうであってもよい。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つまたは複数の実施形態において、この開示から当業者には明らかであろうように、任意の適切な方法で組み合わせることができる。また、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの他の特徴を含まないが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、当業者によって理解されるように、本発明の範囲内にあり、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲では、請求される実施形態のいずれも、任意の組み合わせで使用することができる。
【００３８】
本発明の本明細書の記載において、本明細書の一部を形成し、本発明を実施することができる特定の実施形態のみを例として示す添付図面を参照する。各要素に添えられた括弧付きまたは太字の参照番号は、単に例として要素を例示するものであり、それによって、各要素を限定することは意図されていない。本発明の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造的または論理的な変更を行うことができることを理解されたい。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で解釈されるべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【００３９】
本明細書では、デジタルホログラフィック顕微鏡法（ＤＨＭ）によって得られた前記細胞サンプルからホログラフィック情報を受け取り、ホログラフィック情報から細胞サンプルの少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を決定することを含む、細胞サンプル中の少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態に関する情報を提供する方法が記載される。
【００４０】
該ホログラフィック情報は、サンプル中の各細胞についてウイルス感染状態を決定することができる、サンプル中の各細胞について１以上の測定された細胞のパラメータを含む細胞のパラメータデータを決定するために使用されてもよい。
【００４１】
ウイルス状態は「リアルタイム」で提供される。「リアルタイム」とは、状態が定期的に更新されることで（例えば、1〜5回／分）、サンプル中の細胞がインキュベートされたときのウイルス負荷の変化を反映する。サンプルは流動的な懸濁液であってよい。サンプルは、バイオリアクターからポンプで送られ、バイオリアクターに戻される流動的な懸濁液であってよい。
【００４２】
細胞サンプルは、１つまたは複数の細胞を含む。１つまたは複数の細胞は、生物由来の細胞を含む生物に由来するものであってよい。生物は、例えば、動物、昆虫、酵母、または細菌であってよい。１つまたは複数の細胞は、動物、好ましくは哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、サルに由来してもよい。１つまたは複数の細胞は、ヒトに由来してもよい。細胞サンプル中の１つまたは複数の細胞は標識されていてもいなくてもよく、他の箇所で言及されるように、ウイルス状態をホログラフィックに決定するために標識する必要はない。
【００４３】
細胞サンプルは、液体中に懸濁状態の１つまたは複数の細胞を含有する液体懸濁液を含んでよい。細胞が懸濁されている液体は、細胞サンプルの性質（例えば、体液、血液、排泄物、バイオリアクターなど）に依存する可能性があることが理解される。
【００４４】
細胞サンプルは、DHMイメージセンサーに関連して静的（非流動的）液体懸濁液として提供されてもよい。細胞サンプルは、DHMイメージセンサーに関連する液体懸濁液のフロー（flow）として提供されてもよく、例えば、容器からポンプで送られ、任意で容器に戻されてもよい。フロー（flow）のホログラフィック情報を取得することで、ウイルス感染状態を標識なしでリアルタイムに測定できる。他のウイルス検出技術は、サンプルのフローを監視するのに十分高速または正確ではない場合があり、高分子プローブに依存する技術は大量のプローブを消費し、標識された細胞を容器に戻すことができない。本明細書で使用される容器（vessel）という用語は、対象の分析対象となる細胞が存在する液体を保持および／または誘導することができる容器または運河システムを指す。このように、容器という用語には、リアクター、インキュベーター、コンテナ、バイオリアクター、発酵反応器、給水配管または配管、水路システム、浄水反応器、醸造反応器、マイクロリアクターなどが含まれる。
【００４５】
細胞サンプルは、DHM光源から放射された光が通過できるように十分に透明でなければならない。DHMが依存する干渉プロセスに大きな影響を与えないように、光の散乱を十分に減らす必要がある。細胞密度は、細胞が広範囲に重なり合わないようなものであり、例えば、光は観察のボリューム（volume of observation）を通過し、イメージセンサー上の入射光子は、ボリューム内のすべての細胞の統合から生じる。
【００４６】
流動的なサンプルと組み合わせたDHMの例示的な要素が、例えば、図１〜３に示される。DHM(100)、リアクター(50)、チューブアセンブリ(160)によって取り外し可能なポンプアセンブリ(120)に接続されたDHM取り外し可能な導管（カートリッジとしても知られる）(150)を備えるシステムが図１に示される。DHM(100)は、サンプルフローの通過のための取り外し可能な導管(150)を受け入れるように構成されたドッキング要素(102)を備えることができ、このドッキング要素(102)は、ホログラフィック情報を取得するための、DHMイメージセンサーおよび／またはDHM光源に関連する取り外し可能な導管の透明部品（152、図３）を配置するように構成される。透明部品(152)は、DHM光源によって放出された光の通過のために構成される。取り外し可能な導管（ＤＣ）(150)は、液体懸濁液の流入のためのＤＣ入口(154)、およびその流出のためのＤＣ出口(156)を有する。
【００４７】
取り外し可能な導管(150)は、近位端(10)および遠位端(20)を有する少なくとも１つのチューブ(160)を備えるチューブアセンブリ(160)を使用して、容器(50)に流体接続されるかまたは接続可能である。「遠位」または「遠位の」および「近位」または「近位の」という用語は、DHMに向かう（近位）またはDHMから離れる（遠位）ことを意味すると理解される。したがって、「近位」または「近位の」は、DHMに向かっており、したがって、例えば、容器から離れていることを意味する。逆に、「遠位」または「遠位の」は、DHMから遠ざかっており、たとえば 、容器から遠ざかっていることを意味する。チューブアセンブリ(160)の近位端は、取り外し可能な導管(150)に接続されてもよい。チューブアセンブリ(160)の遠位端は、流体を容器(50)からチューブアセンブリ(160)を介して取り外し可能な導管(150)に向けて引き込みかつ送り出すように構成された取り外し可能なポンプアセンブリ(120)に接続されてもよい。
【００４８】
取り外し可能なポンプアセンブリ(120)（図２）は、流体誘導部(122)を備えてもよく、流体誘導部(122)は、チューブアセンブリ(160)の流出管の遠位端(20)に接続されているか、または接続可能なサンプル出口(124)、および容器(50)の内容物と接触するかまたは接触可能であるサンプル入口(126)を有する１以上の導管の配置である。サンプル入口(126)は、典型的には、サンプル入口(126)をサンプル出口(124)から分離し、それらを接続する流体誘導部(122)に含まれる突出要素(128)の端部に配置される。突出要素(128)の長さは、容器(50)のサイズおよびその中の液体の高さに応じて決定することができる。流体誘導部(122)はまた、例えばトルクの適用によって作動されると、サンプル入口(126)からサンプル出口(124)への液体の流れを誘導する流れ誘導機構(130)を備えて配置される。流れ誘導機構(130)は、サンプルのタイプおよび必要とされる圧力に従って決定されてもよく、当業者は、例えば、容積式ポンプまたは速度ポンプに見られるものなどの様々なメカニズムから選択することができる。流体誘導部(122)は、流れ誘導機構に力（例えば、トルク）を供給するための取り外し可能なアクチュエータ(140)に取り付けるための継手(132)を備えてもよい。取り外し可能なアクチュエータ(140)は、電気モーターを備えてもよい。容器（50）からのサンプルは、取り外し可能な導管(150)のDC入口（154）に接続されたチューブアセンブリ(160)の流出チューブを通って、サンプル入口(126)からサンプル出口(124)に誘導された流れの下で流れる。
【００４９】
流体誘導部(122)は、チューブアセンブリ(160)のリターンフローチューブの遠位端(20)に接続されるか、または接続可能であり、およびサンプル戻り出口（136）を備えた流体誘導部(122)に流体接続するサンプル戻り入口(134)をさらに備えてもよい。サンプル戻り出口（136）は、典型的には、サンプル戻り入口(134)とは異なる位置で前述の突出要素(128)上に配置されてよい。取り外し可能な導管(150)から（ＤＣ出口(156)から）戻るサンプルは、チューブアセンブリ(160)のリターンフローチューブを通って、流体誘導部のサンプル戻り入口(134)に流れ込み、サンプル戻り出口（136）から容器（50）に流れる。流体誘導部(122)は使い捨てであってよい。流体誘導部(122)は、好ましくは、剛性材料から形成される。取り外し可能な導管、取り外し可能なポンプアセンブリフローシステム、および容器とDHMでの使用に適したチューブの例は、WO 2014/044823およびUS 2017/0205222に記載されている。
【００５０】
DHM−取り外し可能導管（カートリッジとも呼ぶ）(150)、取り外し可能なポンプアセンブリ(120)、およびチューブアセンブリ(160)は、好ましくは取り外し可能なアクチュエータ(140)なしで、無菌の使い捨てキットとして提供されてもよい。
【００５１】
サンプルは、ガラスまたはプラスチック容器、または顕微鏡スライドに組み込まれた支持基板上の細胞を含んでよい。適切な容器には、マルチプレートウェル、Tフラスコが含まれる。支持基板は、DHMの前側焦点面が細胞サンプル内に自動的に入るように決定され、各サンプルのためにDHMの焦点を再度合わせる必要はない。DHMは、必要な形態で（例えば、顕微鏡スライドまたは容器として）支持基板を受け入れるように構成されたサンプルホルダーを備えることができる。サンプルホルダーは、支持基板の異なる領域を取得できるように移動可能（例えば、置換可能および／または回転可能）であってよい。図４において、例示的なDHM (100)は、その上に容器が置かれるステージ(104)である静止サンプルホルダーと、例えばサンプルからイメージセンサーへのまたは光源から放射された光の通過のための窓(106)とを備えて描かれている。
【００５２】
支持基質は付着細胞培養で使用され、該細胞は適切な培地で培養され、典型的には単層で、付着し、支持基質上に広がる。付着細胞培養は、足場依存性である特定の動物（例えば、哺乳類）細胞を増殖させるために使用される。細胞サンプルは、DHM光源から放射された光が通過できるように十分に透明でなければならない。DHMが依存する干渉プロセスに大きな影響を与えないように、光の散乱を十分に減らす必要がある。細胞密度は、細胞が広範囲に重複しないようなもの、例えば、光が観察のボリュームを通過し、イメージセンサーへの入射光子は、ボリューム内のすべての細胞の統合から生じることが理解される。
【００５３】
本方法は、様々なウイルス感染の検出に適している。ウイルスは、DNAウイルスまたはRNAウイルスであってよい。ウイルスは、例えば、これらに限定されないが、エプスタインバーウイルス、インフルエンザウイルス、B型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトTリンパ増殖性ウイルス1型（HTLV-I）、C型肝炎ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ AAV）、レンチウイルスまたはバキュロウイルスのいずれであってよい。
【００５４】
ホログラフィック情報とは、一般に位相と振幅の情報である情報を指し、細胞サンプルからデジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）を介して取得できる。特に、前記ホロフラフィック情報は、DHMによって取得されたデジタルホログラム、デジタルホログラムから導出された強度イメージ、デジタルホログラムから導出された定量的位相コントラストイメージ、またはこれらの組み合わせを含んでよい。強度イメージおよび定量的位相コントラストイメージは、ホログラム再構成によるデジタルホログラムから取得されてよい。
【００５５】
次に、イメージ（通常は定量的位相コントラストイメージ）は個々の細胞を背景から区別するためにセグメント化されており、それによりホログラフィックイメージから複数のセグメント化されたイメージを生成する。セグメント化のプロセスは、例えば、流域処理、クラスタリングベースのイメージ閾値、およびニューラルネットワークの使用から、当技術分野で知られている。マイヤーのフラッディングアルゴリズム（Meyer's flooding algorithm）や最適スパニングフォレストアルゴリズム（optimal spanning forest algorithms）（流域カット）を含む、流域処理にはさまざまなアルゴリズムが存在する。クラスターベースのイメージのしきい値処理には、大津の方法（Otsu's method）を使用してもよい。ホログラフィック情報は、セグメント化されたイメージを含んでよい。次に、測定された細胞のパラメータが、イメージセグメント内の個々の細胞に対して決定される。
【００５６】
細胞のパラメータデータは以下を含む： 
−  細胞の１以上の測定された細胞のパラメータ（MCP）（下記表１参照）、および／または
−  １以上の測定された細胞のパラメータから決定された１以上の導出パラメータ、例えば、同じ細胞の２以上のMCPの変換、または２以上の異なる細胞の１以上の同じMCPの変換。
【００５７】
導出パラメータは以下を含んでよい：
−細胞の測定された細胞パラメータと同じ細胞の別の（異なる）測定された細胞パラメータの少なくとも１つの比率。その比率は、表１の（F1）〜（F73）の他のいずれか、および（F1）〜（F73）のいずれかとしてよい。
−測定された細胞のパラメータの細胞サンプルにおける２以上の細胞間の変動の指標。例えば、導出パラメータ（核サイズの変動）はF70から決定でき、１または複数の視野に存在する細胞の核容積の標準偏差である。別の導出パラメータ（核ボリュームの変動性）はF71から導出される可能性があり、分析されたすべての核ボリュームの統計的分布の変動性である。
【００５８】
細胞のパラメータデータから、サンプル中の細胞のウイルス感染状態に関する情報を決定することができる。細胞のパラメータデータが、測定された細胞のパラメータの細胞サンプル内の２以上の細胞間の変動（例えば、核サイズ変動、核ボリューム変動）の指標を含む場合、ウイルス感染状態は、細胞サンプル内の２以上の細胞と見なされてもよい。
【００５９】
ホログラフィック情報は、細胞サンプル内の個々の細胞の１以上の測定された細胞のパラメータ（MCP）を決定するために使用してもよい。MCPは、細胞または細胞の構成要素（例えば、核のサイズ、細胞の内部構造の光学的高さなど）に対して測定されるパラメータである；例えば、限定されるものではないが、ホログラフィック情報からの細胞質の光学的高さ、光学的核の高さなど。表１に、細胞のMCPの例（F1〜F73）をリストする。
【表１】
2021518563.tif 000002
2021518563.tif 000003
2021518563.tif 000004
2021518563.tif 000005
2021518563.tif 000006
2021518563.tif 000007
【００６０】
表１：ホログラフィック情報から決定される細胞の測定された細胞のパラメータ（MCP）。「No.」は本明細書においてMCPを識別するために使用されるコードを指し、「ID」は、MCPに標識付けるための標準ソフトウェアで使用される属性名を指し、「カテゴリー」はMCPのクラスを指し、「グループ」は、MCPのより洗練された分類を指し、そして 「説明」は測定情報を提供する。
【００６１】
絶対的な数が光学的高さを示すために使用されるときはいつでも、文脈が他に指示しない限り、比例定数は真空中の光の速度である。さらに、特に明記しない限り、本明細書では、光学的高さは液体媒体の光学的高さを参照して表現され、この場合、光が構造体（例えば、細胞質、核、核小体）を高さ方向に横断するのにかかる時間と、光が液体媒体内で同じ距離を横断するのにかかる時間の差に比例する。一般的に、光学的高さは、屈折率に実際の物理的高さを掛けて得られた結果として定義できる。
【００６２】
MCPは、典型的には、細胞全体の特性（例えば、表面、真円度）または細胞の構成要素の特性（例えば、核のサイズ、細胞の内部構造のいずれかの光学的高さ、例えば、これらに限定されないが、細胞質の光学高さ、核の光学高さ）であってよい。MCPが細胞成分の特性である場合、細胞の成分のイメージが最初に分離され、次にMCPがその分離されたイメージで決定される。当業者は、例えば、Rafael C. GonzalezおよびRichard E. Woodsによるデジタルイメージ処理（第４版）(ISBN-13: 978-0133356724)で述べられているように、例えばイメージ処理の原理を使用して、また、Open CV（Open Source Computer Vision）などのプログラミング関数のライブラリを使用して、ホログラフィックイメージを処理してMCPに到達する方法を知っている。
【００６３】
表１の１以上、またはすべてのMCPを、ウイルス感染状態を決定するために使用してもよい。表１のMCPのサブセットは、ウイルス感染状態を決定するために使用してもよい。  機械学習アルゴリズムは、細胞型と感染ウイルスに応じてMCPのサブセットを決定する場合がある。
表１に示されるとおり、MCPは、強度テクスチャ、形態、屈折ピーク、強度、光学高さ、屈折ピーク、位相テクスチャ、強度テクスチャ、蛍光、光学などの異なるグループに分類できる。
グループ位相テクスチャ(F40〜F51)は、細胞内の光学密度または位相シフトの変動の測定値であるMCPを含む。細胞を通過する光の位相は、細胞内の局所密度によって異なる。細胞内の密度が高い領域ほど、位相シフトが大きくなる。
グループ屈折ピーク(F20、F33〜F37)は、細胞によって屈折した光の測定値であるMCPを含む。特に、細胞によって屈折された光は、円錐ビームとして現れ、屈折ピークは、このビームの幾何学的特性に関係する。
グループ形態(F2〜F19、F70〜72)は、細胞の幾何学的特性（例えば、半径、直径など）の測定値であるMCPを含む。
グループ光学高さ(F24〜F32、F38〜F39)は、入射光の方向における、対象の厚さの測定値であるMCPを含む。
【００６４】
MCPのサブセットは、グループ(a) 位相テクスチャ(F40〜F51)、(b) 屈折ピーク(F20、F33〜F37)、(c) 形態(F2〜F19、F70〜72)、(d) 光学高さ(F24〜F32、F38〜F39)、の少なくとも１つにおいて１以上のMCPを含んでよい。
MCPのサブセットは、グループ(a) 位相テクスチャ(F40〜F51)、(b) 屈折ピーク(F20、F33〜F37)、(c) 形態(F2〜F19、F70〜72)の少なくとも１つにおいて１以上のMCPを含んでよい。
MCPのサブセットは、グループ(a) 位相テクスチャ(F40〜F51)、(b) 屈折ピーク(F20、F33〜F37)、(c) 形態(F2〜F19、F70〜72)の少なくとも１つにおいて１以上のMCPを含んでよく、およびさらに(d) 光学高さ(F24〜F32、F38〜F39)、任意でF27 (ID光学高さ平均特性)、F32 (ID光学ボリューム特性)、F38 (ID光学高さ標準偏差特性)、F39 (ID光学高さ標準偏差ミクロン特性)から選択される１以上のMCPを含んでよい。
MCPのサブセットは、グループ(a) 位相テクスチャ(F40〜F51)および(b) 屈折ピーク(F20、F33〜F37)の少なくとも１つにおいて１以上のMCPを含んでよい。
MCPのサブセットは、少なくともグループ(a) 位相テクスチャ(F40〜F51)の１以上のMCPを含んでよい。
【００６５】
グループ（a）から（d）のMCPは、表１に示すように設定してもよく、または、少なくとも次のセクションで説明するMCPを少なくとも含めてよい。
【００６６】
MCPのサブセットは、グループ(a) 位相テクスチャ(F40〜F51)の１以上のMCPを含んでよい。
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID位相コントラスト特性)、F48 (ID位相歪度特性)、F47 (ID位相均一性特性)、F43 (ID P位相平均均一性特性)、および F51 (ID位相均一性特性)から選択されるグループ(a) 位相テクスチャの１以上のMCPを含んでよい。 
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性) を含んでよい。
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性) およびF44 (ID位相コントラスト特性)を含んでよい。
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性) 、F44 (ID位相コントラスト特性) およびF48 (ID位相歪度特性)を含んでよい。
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID位相コントラスト特性)、F48 (ID位相歪度特性)、F47 (ID位相均一性特性)、F43 (ID P位相平均均一性特性)、および F51 (ID位相均一性特性)の全てのMCPを含んでよい。 
【００６７】
MCPのサブセットは、グループ(b)屈折ピーク(F20、F33〜F37)の１以上のMCPを含んでよい。
MCPのサブセットは、F20 (ID等価ピーク直径特性)、F33 (ID ピーク面積特性)、F34 (ID ピーク面積正規化特性)、F36 (ID ピーク高さ特性)、およびF37 (ID ピーク高さ正規化特性)から選択されるグループ(b)屈折ピークの１以上のMCPを含んでよい。
F33 (ID ピーク面積特性)とF34 (ID ピーク面積正規化特性)は関連しており、どちらか一方を使用できることに留意されたい。F36 (ID ピーク高さ特性)とF37 (ID ピーク高さ正規化特性)は関連しており、どちらか一方を使用できることに留意されたい。
MCPのサブセットは、F20 (ID等価ピーク直径特性)を含んでよい。
MCPのサブセットは、F20 (ID等価ピーク直径特性)、F33 (ID ピーク面積特性)かF34 (ID ピーク面積正規化特性)のいずれか、F36 (ID ピーク高さ特性)かF37 (ID ピーク高さ正規化特性)のいずれか、の全てを含んでよい。
【００６８】
MCPのサブセットは、グループ(c) 形態(F2〜F19、F70〜72)の１以上のMCPを含んでよい。
MCPのサブセットは、F8 (ID等価細胞直径特性)、F17 (ID半径平均特性)、F8 (ID 等価直径) もしくはF3 (ID細胞面積特性)、F18 (ID半径分散特性)、F6 (ID伸長特性)、およびF4 (ID真円度特性)から選択されるグループ(c) 形態の１以上のMCPを含んでよい。
F8 (ID等価細胞直径特性)とF17 (ID半径平均特性)は関連しており、どちらか一方を使用できることに留意されたい。F8 (ID等価細胞直径特性)とF3 (ID細胞面積特性)は関連しており、どちらか一方を使用できることに留意されたい。F18 (ID半径分散特性)とF6 (ID伸長特性)は関連しており、どちらか一方を使用できることに留意されたい。
MCPのサブセットは、F8 (ID等価細胞直径特性)またはF17 (ID半径平均特性)を含んでよい。
MCPのサブセットは、F8 (ID等価細胞直径特性)またはF17 (ID半径平均特性)またはF3 (ID細胞面積特性)を含んでよい。
MCPのサブセットは、F8 (ID等価細胞直径特性)またはF17 (ID半径平均特性)またはF3 (ID細胞面積特性)および（F18 (ID半径分散特性)もしくはF6 (ID伸長特性)）およびF4 (ID真円度特性)を含んでよい。
MCPのサブセットは、グループ(d) 光学高さ(F24〜F32、F38〜F39)の１以上のMCPを含んでよい。
MCPのサブセットは、F27 (ID光学高さ平均特性)、F32 (ID光学ボリューム特性)、F38 (ID光学高さ標準偏差特性)、およびF39 (ID光学高さ標準偏差ミクロン特性)から選択されるグループ(d) 光学高さの１以上のMCPを含んでよい。
F27 (ID光学高さ平均特性)とF32 (ID光学ボリューム特性)は関連しており、どちらか一方を使用できることに留意されたい。F38 (ID光学高さ標準偏差特性)とF39 (ID光学高さ標準偏差ミクロン特性)は関連しており、どちらか一方を使用できることに留意されたい。
MCPのサブセットは、F27 (ID光学高さ平均特性)またはF32 (ID光学ボリューム特性)を含んでよい。
MCPのサブセットは、F27 (ID光学高さ平均特性)またはF32 (ID光学ボリューム特性)およびF38 (ID光学高さ標準偏差特性)またはF39 (ID光学高さ標準偏差ミクロン特性)を含んでよい。
【００６９】
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性)を含んでよい。
【００７０】
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性)およびF44 (ID位相コントラスト特性)を含んでよい。
【００７１】
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID位相コントラスト特性)、およびF48 (ID位相歪度特性)の２以上、好ましくは全てを含んでよい。
【００７２】
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID位相コントラスト特性)、F48 (ID位相歪度特性)およびF20 (ID等価ピーク直径特性)の３以上、好ましくは全てを含んでよい。
【００７３】
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID位相コントラスト特性)、F48 (ID位相歪度特性)、F20 (ID等価ピーク直径特性)、および(F33 (ID ピーク面積特性)もしくはF34 (ID ピーク面積正規化特性))の４以上、好ましくは全てを含んでよい。
【００７４】
MCPのサブセットは、F45 (ID位相相関特性)、F44 (ID位相コントラスト特性)、F48(ID位相歪度特性)、F20 (ID等価ピーク直径特性)、(F33 (ID ピーク面積特性)もしくはF34 (ID ピーク面積正規化特性))、(F36(ID ピーク高さ特性)もしくはF37 (ID ピーク高さ正規化特性))、F47 (ID位相エントロピー特性)、(F17 (ID半径平均特性)もしくはF8 (ID等価細胞直径特性))、(F3 (ID細胞面積特性)もしくはF8 (ID等価直径))、F43 (ID位相平均均一性特性)、(F32 (ID光学ボリューム特性)もしくはF27 (ID光学高さ平均特性))、(F18 (ID半径分散特性)もしくはF6 (ID伸長特性))、F4 (ID真円度特性)、F27 (ID光学高さ平均特性)、(F38 (ID光学高さ標準偏差特性)もしくはF39 (ID光学高さ標準偏差ミクロン特性))、F51 (ID位相均一性特性) の２、３、４、または５以上、好ましくは全てを含んでよい。
【００７５】
各MCPは等しい重み付けを持ってよく、または細胞タイプと感染ウイルスに応じて、１以上の測定された細胞のパラメータに重み係数（weight factor）が適用されてよい。機械学習アルゴリズムが重み付けを決定してもよい。
【００７６】
デジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)は、サンプルをレイヤーごとにスキャンする必要なく、サンプルまたは物体の３次元情報の記録を可能にする技術である。この点に関し、DHMは、取得速度の点で共焦点顕微鏡より優れた技術である。DHMにおいて、ホログラフィック表現は、CCDやCMOSなどのイメージセンサーによって記録される。ホログラフィック表現は、その後、コンピュータで格納または処理することができる。
【００７７】
ホログラフィック表現、またはホログラムを作成するために、従来はコヒーレントな光源を使用してサンプルが照明されていた。光源は、レーザーによって提供されてもよい。最も基本的な設定では、光源からの光は、物体光（object beam）と参照光（reference beam）の２つのビームに分割される。物体光は光学システムを介してサンプルに送られ、サンプルと相互作用し、これにより、物体の光学特性と3D形状に応じて、光の位相と振幅が変化する。そして、サンプルで反射または透過した物体光は、（たとえば、ミラーおよび／またはビームスプリッタのセットによって）参照光と干渉するように作成され、干渉パターンがデジタルで記録される。物体光と参照光の振幅が同等の場合、ホログラムはより正確になるため、参照光に吸収要素を導入して、その振幅を物体光のレベルまで減少させることができるが、参照光の位相を変更することはなく、せいぜい全体的に位相を変更するだけであり、すなわち、どのように参照光が吸収要素を通過するか場所および方法に依存しない。記録される干渉パターンには、物体の光学特性と3D形状に依存する位相と振幅の変化に関する情報が含まれる。
【００７８】
ホログラムを作成する別の方法は、インラインホログラフィック技術を使用することである。インラインDHMは従来のDHMに似ているが、少なくともビームスプリッタやその他の外部光学要素によってビームを分割しない。インラインDHM は、粒子の密度が高すぎない溶液、例えば、流体中の細胞を見るために使用されることが最も好ましい。これにより、少なくとも部分的にコヒーレントな光の一部は、粒子（参照光）と相互作用することなくサンプルを通過し、粒子（物体光）と相互作用した光と干渉し、デジタルで記録され処理される干渉パターンを生じる。インラインDHMは透過モードで使用され、コヒーレンス長が比較的長い光を必要とし、サンプルが厚すぎるか密度が高い場合は使用できない。
【００７９】
ディファレンシャルDHM(DDHM)と呼ばれる別のDHM技術が欧州特許EP 1 631 788で開示されている。DDHMは、従来の意味で参照光と物体光を利用しないという点で他の手法とは異なる。好ましい設定のDDHMでは、サンプルは、反射モードまたは透過モードで使用するために少なくとも部分的にコヒーレントな光を出力する光源によって照射される。反射されたまたは透過されたサンプルビームは、対物レンズを介して送られてよく、その後、ビームスプリッタによって２つに分割され、微分干渉計、例えば、マイケルソン（Michelson）またはマッハ−ツェンダー（Mach-Zehnder）型の異なる経路に沿って送られる。経路の１つには、ビーム曲げ要素または傾斜機構、例えば、透明なくさび（wedge）または回折格子が挿入される。次に、２つのビームが集束レンズの焦点面で互いに干渉し、この焦点面の干渉パターンがCCDまたはCMOSなどのイメージセンサーによってデジタルで記録される。干渉パターンは、デジタル記憶媒体に格納してよい。これにより、ビーム曲げ要素により、２つのビームは制御された方法でわずかにシフトされ、干渉パターンはシフトの量に依存する。次に、ビーム曲げ要素を回転させ、シフト量を変更する。新しい干渉パターンも記録される。これは、Ｎ回行うことができ、これらのＮ個の干渉パターンから、集束レンズの焦点面における位相の勾配（または空間微分）を近似的に計算することができる。これは位相ステッピング法と呼ばれるが、フーリエ変換データ処理技術など、位相勾配を取得する他の方法も知られている。位相の勾配を積分して、位相を位置の関数として与えることができる。位置の関数としての光の振幅は、N個の記録された干渉パターンの振幅の加重平均の可能性があるが、必ずしもそうである必要はない。このように位相と振幅がわかっているため、直接ホログラフィック法と同じ情報が得られ（参照と物体光を使用）、その後の物体の3D再構成を実行できる。
【００８０】
光源は、空間的および時間的に部分的にコヒーレントな光を放出してよい。光源は、相関性の高いレーザー光を放出する可能性がある。空間的および時間的に部分的にコヒーレントな光は、例えば、発光ダイオード（LED）によって生成されてもよい。LEDはレーザーよりも安価で、既知の波長を中心とするスペクトルを持つ光を生成し、空間的および時間的に部分的にコヒーレントであり、すなわち、レーザー光ほどコヒーレントではないが、扱うアプリケーションに必要な品質のホログラフィックイメージを生成するのに十分なコヒーレントである。LEDは多くの異なる波長に対応できるという利点もあり、サイズが非常に小さく、必要に応じて簡単に使用または交換できる。したがって、ホログラフィックイメージを得るために空間的および時間的に部分的にコヒーレントな光を使用することができる方法およびシステムを提供することは、そのような方法を実施するためのより費用効果の高いデバイスにつながる。
【００８１】
診断設定でのDHMの使用には多くの利点があり、本発明のような設定で実装するのに理想的な技術になる。明視野イメージの他に、位相シフトイメージも作成される。位相シフトイメージはDHMに固有であり、光学距離に関する定量化可能な情報を提供する。反射DHMでは、位相シフトイメージは物体のトポグラフィー画像を形成する。
【００８２】
物体イメージは、所与の焦点距離で計算される。しかしながら、記録されたホログラムには必要な物体波面情報がすべて含まれているため、再構成アルゴリズムの焦点距離パラメータを変更することにより、任意の焦点面で物体を計算することができる。実際に、ホログラムには、完全なイメージスタックを計算するために必要なすべての情報が含まれている。物体波面が複数の角度から記録されるDHMシステムでは、物体の光学特性を完全に特徴付けて、物体の断層イメージを作成することが可能である。
【００８３】
DHMシステムに必要なコンポーネントは、レーザーダイオードやイメージセンサーなどの安価な光学部品や半導体コンポーネントである。DHMの自動焦点機能と組み合わせた低コンポーネントコストにより、非常に低コストでDHMシステムを製造することが可能になる。それでも、DHMのコストは、大量のリアクターを監視するため高すぎる可能性がある。このため、本発明は、１つのDHMおよび流体サンプルを複数のリアクターからDHMに導くことができる、好ましくは戻すことができる、１組の電気流体回路を備えるシステムを提供する。これにより、複数のリアクターを監視するのに必要なDHMは１つだけになり、全体のコストを削減できる。
【００８４】
一般的に、DHMは、レーザーまたはLEDなどのコヒーレント光または少なくとも部分的にコヒーレントな光を放射する光源、ミラーおよび／またはビームスプリッタのセットを備えることができる干渉計、およびCCDまたはCMOSなどのイメージセンサー、 および、プロセッサおよびコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ソリッドステートドライブ、フラッシュカード、または磁気記録デバイス）を備える。DHMは、１または複数のレンズ、ミラー、プリズム、減衰器などのさらなる光学コンポーネントも備えてよい。DHMは、メインフレーム、ＰＣ、ＰＬＣなどの論理デバイスなどの処理手段を備えてもよく、またはこれらに接続してもよい。DHMは、観察するサンプルの性質に応じて、透過モードおよび／または反射モードで機能することができる。DHMは、従来のDHM、インラインDHM、ディファレンシャルDHM、または別の種類のDHMであってよい。
【００８５】
図５に示されるとおり、本発明の方法(300)は、細胞サンプル(302)のホログラフィック情報(304)を使用して、ウイルス感染状態(306)を決定する。ウイルス感染と相関する細胞のパラメータデータのパターンが識別される。特に、本方法では、細胞のウイルス感染の予測数学モデル（330）を使用してもよく、図６のスキーム(310)に例示されるように、予測モデルへの入力は、細胞サンプル（304）のホログラフィック情報から得られた各細胞の測定された細胞のパラメータ（308）から導出された細胞のパラメータデータ（212）を含み、出力はウイルス感染状態（306）である。
【００８６】
予測モデル(330)は、細胞のトレーニングセット(322)を使用してトレーニングされる機械学習(328)方法（例えば、ニューラルネットワークまたはランダムフォレストツリー、ディープラーニング）を使用して作成されてもよく、ウイルス感染状態(324)および細胞のパラメータデータ(326)は、図７のスキーム(320)に例示されているように、各細胞について知られている。ウイルス感染状態は、例えば、任意で標識される抗体を使用して、またはPCRなどの核酸増幅技術を使用して決定することができる。機械学習（たとえば、ニューラルネットワークまたはランダムフォレストツリー、ディープラーニング）を使用した予測モデルの作成は、例えばen.wikipedia.org/wiki/Machine_learningからも当業者に知られており、例えば、当業者に知られているPattern Recognition and Machine Learning, 2006, Christopher M.Bishop, Springer. Deep learningを含む様々な刊行物にも記載されている。ディープラーニングは、例えばen.wikipedia.org/wiki/Deep_learning,a dnからも当業者に知られており、例えば、当業者に知られているDeep Learning, 2016, Ian Goodfellow, Yoshua Bengio and AaronCourvilleを含む様々な刊行物にも記載されている。
ガイダンスとして、簡単なモデルを作成する手順を説明する。細胞のトレーニングセットは、ウイルス感染細胞と非ウイルス感染細胞を含む。DHMによって測定された細胞のトレーニングセット内の個々の細胞について測定された細胞のパラメータが取得される。測定された細胞のパラメータおよび任意で導出されたパラメータを含む細胞のパラメータデータは、学習アルゴリズムに提供される。機械学習法は、ホログラフィック情報、特に細胞のパラメータデータに基づいて、ウイルス感染細胞と非ウイルス感染細胞を識別する方法を学習し、それによって予測モデルを作成する。機械学習の方法は、監視されている場合と監視されていない場合がある。混同行列（confusion matrix）により、エラー率を決定できる。
【００８７】
サンプル中の少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態には、感染の有無（はい／いいえ）、感染の確率（割合）、感染の程度、感染の段階、アポトーシスの状態、キャプシドの含量（capsid content）が含まれる。ウイルス感染状態は、ウイルスの種類を示してもよい。サンプル中の少なくとも２つの細胞のウイルス感染状態は、サンプル中の複数の細胞のウイルス感染状態を統計的に処理することによって決定することができる。
【００８８】
本方法は、細胞サンプルを提供する工程を含んでよい。
本方法は、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態に関するレポートを出力または提供する工程を含んでよい。
【００８９】
本明細書に記載の方法を実行するように構成されたコンピューティングデバイスがさらに提供される。
【００９０】
コンピューティングデバイスは、本発明の方法を実行するように構成された回路を含んでよい。典型的には、回路は、コンピュータプロセッサおよびメモリを含む。コンピューティングデバイスは、クラウドコンピューティングデバイス、または前述の回路を含む他のデバイスとして、１または複数の接続されたコンピュータに実装されてよい。
【００９１】
コンピューティングデバイスは、以下の１または複数を含む入力データを受け取ることができる：
−  細胞サンプルのホログラフィック情報であって、以下の１または複数を含んでよい：
−  DHMが取得したデジタルホログラム、
−  デジタルホログラムから導出された強度イメージ、
−  デジタルホログラムから導出された定量的な位相コントラストイメージ、
−  定量的位相コントラストイメージおよび／または強度イメージから導出された複数のセグメント化イメージ、
−  細胞のパラメータデータであって、以下を含む：
−  細胞の１以上の測定された細胞のパラメータ、および／または
−  １または複数の細胞の１または複数の測定された細胞のパラメータから導出された１または複数の導出パラメータ。
入力データは、例えば、インターネットまたはデータストレージメディア経由で送信され、電子的に受信されてよい。コンピューティングデバイスは、DHMから離れた場所、例えば、別の施設、町、都市、国などにあってよい。
【００９２】
コンピューティングデバイスは、次のように構成されてよい：
−  デジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)によって取得された細胞サンプル内の少なくとも１つの細胞のホログラフィック情報を受け取ること、および
−  ホログラフィック情報から、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を決定すること。
【００９３】
コンピューティングデバイスは、さらに次のように構成されてよい：
−  少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を出力すること。
【００９４】
コンピューティングデバイスは、ホログラフィック情報から、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態が決定される細胞サンプル中の細胞の１または複数の測定されたパラメータを含む細胞のパラメータデータを決定するようにさらに構成されてよい。
【００９５】
コンピューティングデバイスはさらに、細胞のパラメータデータを予測モデルに入力し、少なくとも１つの細胞のウイルス感染状態を予測モデルから出力するように構成されてよい。
【００９６】
コンピューティングデバイスまたはシステムによって実行されたときにコンピューティングデバイスまたはシステムに本明細書に記載の方法を実行させる命令を有するコンピュータプログラムまたはコンピュータプログラム製品がさらに提供される。
【００９７】
コンピュータプログラムまたはコンピュータプログラム製品が格納されているコンピュータ可読媒体がさらに提供される。
【００９８】
コンピュータプログラムまたはコンピュータプログラム製品を表すデータストリームがさらに提供される。
【００９９】
リモート処理センターは、以下の１または複数を含む入力データを受け取ることができる：
−  細胞サンプルのホログラフィック情報であって、以下の１または複数を含んでよい：
−  DHMが取得したデジタルホログラム、
−  デジタルホログラムから導出された強度イメージ、
−  デジタルホログラムから導出された定量的な位相コントラストイメージ、
−  定量的位相コントラストイメージおよび／または強度イメージから導出された複数のセグメント化イメージ、
−  細胞のパラメータデータであって、以下を含む：
−  細胞の１以上の測定された細胞のパラメータ（以下参照）、および／または
−  細胞の測定された細胞のパラメータおよび別の（異なる）測定された細胞のパラメータの少なくとも１つの比率、
−  測定された細胞のパラメータの細胞サンプルにおける２以上の細胞間の変動（variation）の指標。
【０１００】
入力データは、例えば、インターネット経由またはデータストレージメディア経由で送信され、電子的に受け取ってよい。リモート処理センターは、DHMから離れた場所、例えば、別の施設、町、都市、国などにあってよい。リモート処理センターは、典型的には、プロセッサおよびメモリを有するコンピュータ、例えば、サーバーを含む。リモート処理センターは、クラウドベースのコンピューティング設備として実装されてよい。リモート処理センターは、入力データを保存してよい。リモート処理センターは、入力データを処理することができ、特に決定工程を実行してよい。リモート処理センターは、予測モデルにアクセスしてよい。リモート処理センターは、細胞またはサンプルのウイルス感染状態に関する情報を含む出力データを送信してよい。出力データは、細胞および／またはサンプルのウイルス感染状態に関する情報を含むレポートを含んでよい。
【０１０１】
本明細書に記載されるようなコンピューティングデバイスを備えるシステムが提供され得る。該システムは、DHMをさらに含んでよい。DHMは、本明細書で説明されるDHMであってよい。該DHMは、少なくとも部分的にコヒーレントな光を発する光源、干渉計、およびイメージセンサーを含む。DHMは、サンプルフローの通過のための取り外し可能な導管を受け入れるように構成された、本明細書に記載されるようなドッキング要素(102)を備えてよい。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
バキュロウイルスに感染したSF9細胞のサンプル。 各サンプルのホログラフィックデータは、ウイルスへの曝露後異なる時点で収集された。ホログラフィックデータを分析して、細胞を分離し、各細胞またはクラスターをイベントとして登録した。分離された細胞を分析して、個々の細胞またはクラスターの測定された細胞のパラメータ(MCP)を得た。各サンプルの各細胞について、表１のMCPが取得された。
【０１０３】
MCPの以下の基準に従って、データセットの品質を向上させるためにフィルタリングが適用された：細胞直径＞15（保持）−破片／小細胞を除去；細胞直径＜30（保持）−クラスターを削除；ピーク高＞3（保持）−生存率の高い細胞のみ保持；最高の深さ特性＜5（保持）−フォーカスがある細胞のみ保持。
【０１０４】
機械学習では、フィルタリングされたデータの75％が機械学習アルゴリズムに適用され、分類器をトレーニングしてランダムフォレストツリー（RFT）を取得した。深さ10の木を20本使用した。フィルタリングされたデータの残りの25％でトレーニングされたアルゴリズムを使用すると、誤って予測された感染細胞の率は低く、真の予測された健常細胞の率は高くなった。RFTは、表２に従って、測定された各細胞のパラメータの識別力をランク付けした。
【０１０５】
【表２】
2021518563.tif 000008
2021518563.tif 000009
【０１０６】
表２．実施例２の上位20MCPの識別力のランキング。
【０１０７】
実施例２
本発明の方法を使用して、バイオリアクターからの流動懸濁液中の細胞のウイルス負荷をリアルタイムで監視した。SF9細胞の２つの異なるバッチを液体培地のバイオリアクターで培養した。細胞のウイルス負荷は、本発明の方法を使用して、DHMによるリアルタイムイメージを得るために光の通過のための透明な部分を有するフローセル（flow cell）を介してバイオリアクターから懸濁細胞をポンピングすることにより監視された。細胞はバイオリアクターに戻された。同時に監視されたのは、総細胞密度（TCD）、生存細胞密度（VCD）、および生存率だった。約90時間（矢印B）で、バキュロウイルスのアリコートをバイオリアクターに導入した。本発明の方法は、ウイルス負荷の指数関数的増加を検出した（図８（バッチ１）および図９（バッチ２）を参照）。
【０１０８】
図面の用語
Sample  サンプル
Holographic information  ホログラフィック情報
Viral infection status  ウイルス感染状態
Measured cellular parameters  測定された細胞のパラメータ
Cellular parameter data  細胞のパラメータデータ
Predictive model  予測モデル
Viral infection status per cell or cells  細胞あたりのウイルス感染状態
Training set of cells  細胞のトレーニングセット
Known viral infection status  既知のウイルス感染状態
Known cellular parameter data  既知の細胞のパラメータデータ
Machine learner  機械学習を行うもの
Predictive model  予測モデル
Density  密度
cells/ml  細胞／ｍｌ
Virus load  ウイルス負荷
Viability  生存率
Time (h)  時間（時）
【図１】
2021518563.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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