(57)【要約】  本発明は、非応答性新生物微小環境を応答表現型に向けて少なくとも促進、駆動または誘導する方法を提供する。さらに詳細には、本発明は、チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物腫瘍の感受性を増強する方法を提供する。本発明はまた、腫瘍微小環境におけるＳＴＡＴＩ活性化および／またはＮＫ細胞の数の増加を測定することにより、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答の尤度を予測する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進するまたは増強するための方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するステップまたは前記細胞および／もしくは腫瘍を前記１つもしくは複数の感作剤に暴露してそれにより免疫チェックポイント阻害剤に対し前記細胞および／または腫瘍が感作されるようにするステップを含む、方法。
【請求項２】
免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進するまたは増強するための方法であって、
ａ．免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するステップ、または免疫チェックポイント阻害剤に対し腫瘍が感作されるようにする時間および／または治療量で、前記細胞および／もしくは腫瘍を前記１つもしくは複数の感作剤に暴露するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進するまたは増強するための方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するステップ、またはＮＫ細胞の数を増加させかつそれにより免疫チェックポイント阻害剤に対する前記新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強するために、前記細胞および／もしくは腫瘍を前記１つもしくは複数の感作剤に暴露するステップを含む、方法。
【請求項４】
免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進するまたは増強するための方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するステップ、または前記細胞および／または腫瘍によるＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を増加させそれにより免疫チェックポイント阻害剤に対する前記１つまたは複数の新生物細胞の感受性を促進または増強するために、前記細胞および／もしくは腫瘍を前記１つもしくは複数の感作剤に暴露するステップを含む、方法。
【請求項５】
免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進するまたは増強するための方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するステップ、またはＮＫ細胞によるＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を増加させそれにより免疫チェックポイント阻害剤に対する前記新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強するために、前記細胞および／もしくは腫瘍を前記１つもしくは複数の感作剤に暴露するステップを含む、方法。
【請求項６】
免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進するまたは増強するための方法であって、
ａ．１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である新生物細胞および／または腫瘍を同定するステップと、
ｂ．免疫治療前に少なくとも３日間または前記腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に対して少なくとも部分的に感作されるまで、治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤をステップ（ａ）で同定された新生物細胞および／もしくは腫瘍に投与するかまたは前記新生物細胞および／もしくは腫瘍を前記感作剤に暴露するステップ
を含む、方法。
【請求項７】
免疫チェックポイント感作剤が、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
免疫チェックポイント感作剤の組み合わせが、本方法で用いられ、前記組み合わせが、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、およびインターフェロンγまたはその機能性変異体を含む群から選択される少なくとも複数の同定された感作剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
免疫チェックポイント感作剤が、少なくともレチノイドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫チェックポイント感作剤が、少なくとも１つのレチノイドならびにＣＤ４０アゴニストおよび／または抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体のいずれか１つまたは複数を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
免疫チェックポイント感作剤が、ポリ（Ｉ：Ｃ）などの少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
免疫チェックポイント感作剤が、ポリ（Ｉ：Ｃ）などのインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、抗ＩＬ−１０抗体およびインターフェロンγまたはその機能性変異体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
免疫チェックポイント感作剤が、ポリ（Ｉ：Ｃ）などの少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、ならびに抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはアゴニストＣＤ４０抗体などのＣＤ４０アゴニストのいずれか１つまたは複数を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
免疫チェックポイント感作剤が、ポリ（Ｉ：Ｃ）などの少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、ならびに抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体のいずれか１つまたは両方を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
免疫チェックポイント感作剤が、アゴニストＣＤ４０抗体などの少なくともＣＤ４０アゴニストを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
本方法のステップ（ａ）での新生物細胞集団が、（ｉ）前記細胞を１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤に暴露し前記免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるこれらの細胞を同定することまたは（ｉｉ）細胞集団においてＳＴＡＴ１の活性を測定することであって前記ＳＴＡＴ１タンパク質の活性化の不在（核ＳＴＡＴ１またはリン酸化ＳＴＡＴ１について５０％未満の陽性細胞）が、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）の細胞集団の耐性のバイオマーカーとして現れる、測定することのいずれかにより選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）の細胞が、（ｉ）測定可能な量のＳＴＡＴ１バイオマーカーが細胞集団中で検出されるならびに／または（ｉｉ）測定可能な量のナチュラルキラー細胞が腫瘍細胞微小環境中で検出される後で免疫チェックポイント阻害剤に暴露される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたは複数のチェックポイント感作剤が悪性状態に対する免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の有効性を高めるために腫瘍または新生物細胞集団環境で免疫エフェクターＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１の量の十分な増加をもたらした時点で前記免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍を処置するための薬剤の製造における、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（オールトランスレチノイン酸など）および／またはインターフェロンγから選択される１つまたは複数の感作治療剤の使用であって、前記腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性である、使用。
【請求項２０】
腫瘍を感作するための薬剤の製造における、治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、前記腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であり、前記薬剤が、ＮＫ細胞（活性化ＳＴＡＴ１および／またはＩＦＮγを産生するＮＫ細胞など）の数を増加させならびに／または新生物細胞および／もしくは腫瘍細胞および／もしくはＮＫ細胞によるＩＦＮγおよび／もしくは活性化ＳＴＡＴ１の産生を増加させる、使用。
【請求項２１】
薬剤が、免疫治療の少なくとも３日前に免疫チェックポイント感作剤を、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与するための指示書を含む、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
悪性状態を有する患者または悪性状態を発現することが予測される患者を処置するための方法であって、
ａ．１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍または新生物細胞集団（複数可）を同定するステップと、
ｂ．前記腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に対して少なくとも部分的に感作されるまで免疫治療前に少なくとも３日間、治療有効量の１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤をステップ（ａ）で同定された腫瘍もしくは新生物細胞集団（複数可）に投与するかまたは前記腫瘍もしくは新生物細胞集団（複数可）を前記感作剤に暴露するステップ
を含む、方法。
【請求項２３】
本方法のステップ（ａ）での新生物細胞集団が、（ｉ）前記細胞を１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤に暴露することおよび前記免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるこれらの細胞を同定することまたは（ｉｉ）細胞集団においてＳＴＡＴ１の活性を測定することであってＳＴＡＴ１タンパク質の活性化の不在（核ＳＴＡＴ１またはリン酸化ＳＴＡＴ１について５０％未満の陽性細胞）が、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）での細胞集団の耐性のバイオマーカーとして現れる、測定することのいずれかにより選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）の細胞が、（ｉ）測定可能な量のＳＴＡＴ１バイオマーカーが細胞集団中で検出されるならびに／または（ｉｉ）測定可能な量のナチュラルキラー細胞が腫瘍細胞微小環境中で検出される後で免疫チェックポイント阻害剤に暴露される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
患者において、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性を促進または増強するための、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（オールトランスレチノイン酸など）ならびに／またはインターフェロンγから選択される１つまたは複数の感作治療剤の使用であって前記治療剤が、免疫治療の少なくとも３日前に１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与される、使用。
【請求項２６】
患者において腫瘍を処置するための薬剤の製造における、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（オールトランスレチノイン酸など）および／またはインターフェロンγから選択される１つまたは複数の治療剤の使用であって、前記腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性である、使用。
【請求項２７】
アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）、オールトランスレチノイン酸などのレチノイドおよび／またはインターフェロンγ、ならびに薬学的に許容される担体の１つまたは複数を含む免疫チェックポイント阻害剤に対し腫瘍を感作することにおける使用のための治療用組成物。
【請求項２８】
抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγまたは抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、オールトランスレチノイン酸などのレチノイドおよびインターフェロンγから選択される少なくとも２つの治療剤の治療有効量の組み合わせを含む、請求項２７に記載の治療用組成物。
【請求項２９】
抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγまたは抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、オールトランスレチノイン酸などのレチノイドおよびインターフェロンγから選択される少なくとも３つの治療剤の治療有効量の組み合わせを含む、請求項２７に記載の治療用組成物。
【請求項３０】
抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγまたは抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０およびインターフェロンγの治療有効量の組み合わせを含む免疫チェックポイント阻害剤に対し腫瘍を感作することにおける使用のための治療用組成物。
【請求項３１】
腫瘍または新生物細胞集団を処置するためのキットであって、
ａ）治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤、および
ｂ）免疫治療の少なくとも３日前に１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に前記免疫チェックポイント感作剤を投与するための指示書、
を含む、キット。
【請求項３２】
キットが、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫治療剤、ならびに１つまたは複数のチェックポイント感作剤が十分なエフェクター免疫細胞（例えば、ＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１を産生するＮＫ細胞）を腫瘍または新生物細胞集団環境に誘引した時点で前記薬剤（複数可）を前記腫瘍または新生物細胞集団に投与するための指示書を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測するための診断または方法であって、
ａ）細胞集団におけるＳＴＡＴ１活性化を測定するステップと、
ｂ）前記細胞集団が免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定するステップであって、前記バイオマーカーＳＴＡＴ１の活性化および／または局在化が、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する前記細胞の感受性を示す、ステップ
を含む、診断または方法。
【請求項３４】
免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測するための診断または方法であって、
ａ）腫瘍におけるナチュラルキラー細胞の存在を測定するステップと、
ｂ）前記腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定するステップであって、ナチュラルキラー細胞の活性化および／または存在が、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する細胞の感受性を示す、ステップ
を含む、診断または方法。
【請求項３５】
対象における新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位でならびに／または前記対象における前記新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境にＮＫ細胞を固定化するまたはＮＫ細胞の数を増加させるための方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による前記対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
例えば対象における新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位でならびに／または前記対象における前記新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境において、前記対象中のＮＫ細胞によりＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を誘導するまたは増加させる方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による前記対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
対象中の新生物細胞および／または腫瘍によりＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を誘導するまたは増加させる方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による前記対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チェックポイント阻害剤に応答しない新生物細胞および／または腫瘍を応答表現型に向けて促進、駆動または誘導する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または腫瘍の感受性を増強する方法を提供する。本発明はまた、特定の免疫治療に対する応答を予測する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
以下の背景技術の考察は、本発明の理解を促進することのみを意図している。考察は、本明細書に言及された材料はいずれも、先行技術ベースの一部であるか、または一部であったか、あるいは本願の特許請求の範囲の優先日時点で共通の一般知識の一部を形成することを了承または容認するものではない。
【０００３】
免疫チェックポイントは、免疫系を調節し、免疫系が細胞を無差別に攻撃するのを防ぐ自己寛容に関与する経路である。抑制性チェックポイント分子は、複数の癌型に対するその使用可能性により癌免疫治療の標的である。例えば、現在承認されているチェックポイント抑制剤は、ＣＴＬＡ４ならびにＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１を阻害する。抑制性チェックポイント分子を抑制／阻害する薬物、薬物候補または他の分子、例えば、モノクローナル抗体は、免疫チェックポイント抑制剤、またはより単純にチェックポイント抑制剤としばしば称される。免疫チェックポイントの抑制は、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）、または単純にチェックポイント阻害と称される。
【０００４】
免疫チェックポイントを標的とする抗体を用いた癌免疫治療は、過去数年間で顕著な結果を示した（Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ，Ｗ．Ｊ．ら、（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  ＤＲｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １０、５９１〜６００）。具体的には、免疫チェックポイントを標的とする抗体、例えば、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）および細胞傷害性Ｔ細胞関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）は、黒色腫、非小細胞肺癌およびいくつかの他の様々な癌型を含む、様々な癌型を有するいくらかの患者の生存を延長できる（Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．ら、２０１０）、New Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３、７１１〜７２３；Ｒｅｃｋ，Ｍ．ら（２０１６）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７５、１８２３〜１８３３；およびＷｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．ら（２０１３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９、１２２〜１３３）。しかし、このような免疫治療に対する応答は患者のサブセットにおいてのみ起こり、大部分の患者においては応答が起こらず、有益でない。例えば、いくらかの患者においては、時には数週間以内にすべての腫瘍が即時かつ完全に退縮するが（Ｐ．Ｂ．Ｃｈａｐｍａｎら、（２０１５）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７２、２０７３〜２０７４）、他の患者は、治療応答を全く経験しない（Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．ら、（２０１３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９、１２２〜１３３）。したがって、ＩＣＢによる処置は、多くの癌で生存率を改善するが、多くの患者は恩恵を受けず、いくつかの癌型は感受性および応答性が低いと思われる（Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，Ｏ．（２０１７）Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １８、９８１）。さらに、どの生物学的プロセスが有効な結果を決定するかは、完全には理解されていない（Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ，Ｗ．Ｊ．ら（２０１７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １６、２６４〜２７２）。この理解の欠如は、合理的な組み合わせ処置の開発を妨げる。
【０００５】
チェックポイントリガンドの発現（Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．ら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５１５、５６３〜５６７）、突然変異荷重（Ｍ．Ｙａｒｃｈｏａｎら（２０１７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７７、２５００〜２５０１）、ネオ抗原発現（Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ，Ｅ．Ｍ．ら（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０、２０７〜２１１）、インターフェロンシグネチャー（Ａｙｅｒｓ，Ｍ．ら（２０１７）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２７、２９３０〜２９４０）および炎症性腫瘍微小環境（Ｊｉ，Ｒ．Ｒ．ら（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ６１、１０１９〜１０３１）などの、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）に対する応答のいくつかの相関要因が報告されているが、決定的な予測バイオマーカーは同定されていない（Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ，Ｗ．Ｊ．ら（２０１７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  ＤＲｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １６、２６４〜２７２）。
【０００６】
より重要なことに、非応答性腫瘍微小環境を応答表現型に向けて操作できるか否か、操作できる場合、どのように操作するかについては不明であった。その結果、組み合わせ治療の臨床開発は、特定の細胞型または経路の調節に重点が置かれた，主として実験による開発であり、時にはわずかな前臨床データに基づくものであった（Ｆａｒｋｏｎａ，Ｓ．ら（２０１６）ＢＭＣ  Ｍｅｄ  １４，７３）。
【０００７】
世界中でＩＣＢに関わる２０００超の現在の臨床試験により（Ｊ．Ｔａｎｇら、（２０１８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １７、８５４〜８５５）、無益な処置および潜在的に重篤な副作用に暴露される患者を制限するために、好ましくは前臨床データに基づく、免疫治療用の組み合わせを優先することが明らかに必要とされている。理想的には、これは、治療前に腫瘍微小環境を好ましい表現型に薬理学的に変化させ、次いで、腫瘍状態をその後評価して、チェックポイント標的処置を進めるか否かを決定することを含む。このような戦略は、免疫治療用の組み合わせを優先して患者で臨床試験を行い、また実験および臨床診療において有効な患者の層別化を可能にする。
【０００８】
ＩＣＢに対する応答を予測するシグネチャーを定義する以前の試みは、おそらく生殖系列遺伝学、環境因子ならびに癌の多様な遺伝的および細胞構造の違いにより成功しなかった（Ｈｕｇｏ，Ｗ．ら（２０１７）Ｃｅｌｌ  １６８、５４２；およびＲｉａｚ，Ｎ．ら（２０１７）Ｃｅｌｌ  １７１、９３４〜９４９）。
【０００９】
興味深いことに、モノクローナル癌細胞株に由来する腫瘍を有する近交系マウス系統の高度に均一な設定においても、免疫チェックポイント阻害剤による免疫治療処置に対する応答は依然として二分する（Ｗ．Ｊ．Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓら（２０１７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １６、２６４〜２７２；Ｗ．Ｊ．Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓら（２０１５）Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５、１２２９８；Ｓ．Ｃｈｅｎら（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３、１４９〜１６０；Ｓ．Ｒ．Ｗｏｏら（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２、９１７〜９２７；Ｒ．Ｐ．Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒら（２００１）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４、８２３〜８３２；Ｍ．Ａ．Ｃｕｒｒａｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  （２０１０）１０７、４２７５〜４２８０；ならびにＪ．Ｆ．ＧｒｏｓｓおよびＭ．Ｎ．Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ、（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３、５）。図１ａも参照のこと。これは注目に値する。なぜなら、これらのマウスのゲノムは同一であり、かつ腫瘍はクローン細胞株由来であり、したがって自己および突然変異腫瘍拒絶抗原の違いを排除するからである。これらの実験において、マウスは同年齢および同性であり、制御された病原体フリー条件下で維持され、同一の処置を受けた。
【００１０】
不確実な背景に対して本発明が開発された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明に至る研究において、本発明者らは、ＩＣＢ剤による免疫治療に対する応答と相関する、ＩＣＢ剤による処置前の腫瘍などの新生物細胞の集団の微小環境のシグネチャーを同定しようとした。
【００１２】
本発明者らはまた、非応答性新生物細胞微小環境を、特定の免疫治療剤に対して応答表現型に変える方法を開発しようとした。詳細には、本発明者らは、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞集団および／または腫瘍の感受性を促進または増強する方法を開発しようとした。
【００１３】
本発明者らはまた、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞集団および／または腫瘍の感受性を促進または増強できる１つまたは複数の感作剤を含む治療用組成物を提供しようとした。
【００１４】
本発明者らはまた、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による免疫治療について、新生物細胞集団および／または腫瘍の免疫治療に対する応答を予測する診断方法を開発しようとした。
【００１５】
したがって、本発明は、免疫治療非応答性新生物細胞微小環境を、特定の免疫治療剤に対して応答表現型に向けて駆動しようとする非常に一般的な応用原理を提供する。この方法を用いて、新生物細胞集団および／または新生物腫瘍は、感作され、その表現型が変化し、免疫チェックポイント阻害剤に対して新生物細胞集団および／または新生物腫瘍を感受性またはより感受性にすることができる。さらに、この方法を用いて、エフェクター免疫細胞、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）および／または活性化転写１のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子（ＳＴＡＴ１）タンパク質を産生するナチュラルキラー細胞（ＮＫ）が標的とされ、固定化されるようになり、非応答性新生物細胞微小環境（例えば、腫瘍部位）に浸潤して、ＩＣＢ剤に対する新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強する。さらに、この方法を用いて、免疫エフェクター、例えば、活性化ＳＴＡＴ１およびＩＦＮγを、新生物細胞微小環境において（例えば、腫瘍部位で）増加させて、ＩＣＢ剤に対する非応答性新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強する。詳細には、本発明は、免疫治療に耐性の新生物細胞および／または腫瘍を感受性にすることができる１つまたは複数の感作剤を提供する。一例において、これは特にチェックポイント阻害抗体による処置に関する。
【００１６】
さらにまたはあるいは、本発明は、免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測する方法を供給する。詳細には、本発明者らは、本発明の方法により、新生物細胞が免疫治療前に成功裏に感作されたか否かを評価する方法を同定した。
【００１７】
一態様において、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露し、それにより、免疫チェックポイント阻害剤に対し細胞および／または腫瘍が感作されるようにすることを含む、方法に属する。
【００１８】
この態様の関連する実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、
ａ．免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、免疫チェックポイント阻害剤に対し腫瘍が感作されるようにする時間および／または治療量で、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露すること
を含む、方法が提供される。
【００１９】
一例において、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【００２０】
１つのこのような例において、ＣＤ４０アゴニストは、アゴニストＣＤ４０抗体またはＣＤ４０リガンドであり得る。１つの好ましい例において、ＣＤ４０アゴニストはアゴニストＣＤ４０抗体である。
【００２１】
別の例において、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドである。例えば、インターフェロンα／β受容体シグナル伝達の誘導因子は、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ（Ａ：Ｕ）、ポリＩＣＬＣ、ポリ：ポリＣ１２ＵおよびｓＯＤＮ−ｄｓＲＮＡからなる群から選択されるＴＬＲ３リガンドであり得る。好ましくは、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子は、ポリ（Ｉ：Ｃ）であるか、またはこれを含む。
【００２２】
別の例において、レチノイドは、トレチノイン、レチノール、レチナール、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチナート、アシトレチン、アダパレン、ベキサロテンおよび／またはタザロテンから選択される。好ましくは、レチノイドはトレチノインおよび／またはベキサロテンおよび／またはイソトレチノインである。より好ましくは、レチノイドはトレチノインである。
【００２３】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイドおよび／またはインターフェロンγを含む群から選択される。
【００２４】
好ましくは、感作剤は、免疫チェックポイント阻害剤の導入前に、新生物細胞および／または腫瘍に、免疫チェックポイント阻害剤（複数可）に対し細胞および／または腫瘍を感作するのに十分な時間投与される。あるいはまたはさらに、新生物細胞および／または腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤の導入前に、感作剤に、免疫チェックポイント阻害剤（複数可）に対し細胞および／または腫瘍を感作するのに十分な時間暴露される。本発明の１つの例示的な形態において、感作剤は、免疫治療前に、免疫チェックポイント剤に応答しない新生物細胞および／または腫瘍と少なくとも３日間接触させる。より詳細には、感作治療剤は、臨床基準の非毒性用量で、腫瘍と３日〜５週間接触するように製造される。本発明の別の形態において、感作剤は、免疫チェックポイント剤に応答しない新生物細胞および／または腫瘍と、転写１のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子（ＳＴＡＴ１）タンパク質を活性化する時間接触させる。
【００２５】
好ましくは、感作剤は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前に新生物細胞および／または腫瘍が感作されるのに十分な濃度または有効用量で、細胞または腫瘍に投与されるか、またはこれと接触される。とりわけ、この目的に有効な薬剤（複数可）の量は、用いられる薬剤のタイプ、ならびに状態のタイプ、状態の段階、対象の体重、対象の状態の重症度および投与方法を含む各症例の特定の要因に応じて異なる。理想的には、本方法で用いられる感作剤の濃度は、腫瘍細胞集団においてＳＴＡＴ１タンパク質を活性化するのに十分である。
【００２６】
本発明の第１の態様の一実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露して、ＮＫ細胞の数を増加させ、それにより免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強するステップを含む、方法が提供される。
【００２７】
好ましくは、本明細書にわたり記載される本発明の任意の広範な態様、実施形態、形態または実施例によれば、ＮＫ細胞は、ＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質を産生するＮＫ細胞である。
【００２８】
本明細書にわたり記載される本発明の任意の広範な態様、実施形態、形態または実施例によれば、活性化ＳＴＡＴ１タンパク質は、典型的にはリン酸化ＳＴＡＴ１タンパク質である。
【００２９】
１つの好ましい例において、本方法は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、ならびに／または新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境でＮＫ細胞の数を増加させる。
【００３０】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【００３１】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露して、細胞および／または腫瘍によるＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を増加させ、それにより免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞の感受性を促進または増強するステップを含む、方法が提供される。
【００３２】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【００３３】
本発明のこの第１の態様のさらに別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露して、ＮＫ細胞によるＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を増加させ、それにより免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強するステップを含む、方法が提供される。
【００３４】
１つの好ましい例において、ＮＫ細胞によるＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生の増加は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、ならびに／または新生物細胞および／もしくは腫瘍の微小環境において生じる。
【００３５】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【００３６】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、
ａ．１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である新生物細胞および／または腫瘍を同定するステップと、
ｂ．免疫治療前に少なくとも３日間、または腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に対して少なくとも部分的に感作されるまで、治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤を、ステップ（ａ）で同定された新生物細胞および／もしくは腫瘍に投与する、または前記新生物細胞および／もしくは腫瘍を前記感作剤に暴露するステップ
を含む、方法が提供される。
【００３７】
一例において、新生物細胞は、腫瘍中の新生物細胞である。
【００３８】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【００３９】
より好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される。
【００４０】
本方法の好ましい形態において、免疫チェックポイント感作剤の組み合わせが、本方法で用いられ、組み合わせは、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、およびインターフェロンγまたはその機能性変異体を含む群から選択される少なくとも複数の同定された感作剤である。
【００４１】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともレチノイド、例えば、トレチノインを含む。一例において、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともレチノイド、ならびにＣＤ４０アゴニストおよび／または抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体のいずれか１つまたは複数を含む。
【００４２】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。一例において、免疫チェックポイント感作剤は、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）、抗ＩＬ−１０抗体、およびインターフェロンγまたはその機能性変異体を含む。別の例において、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ならびに抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはＣＤ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ４０抗体のいずれか１つまたは複数を含む。１つのこのような例において、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ならびに抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体のいずれか１つまたは両方を含む。別の例において、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともＣＤ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ４０抗体を含む。
【００４３】
好ましくは、上記組み合わせは、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される、少なくとも複数の同定された感作剤である。理想的には、組み合わせは、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγの少なくとも３つの組み合わせ、またはＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγの抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、レチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸の組み合わせである。例えば、組み合わせは、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体であり得る。
【００４４】
免疫チェックポイント阻害剤による免疫チェックポイント阻害に対し腫瘍の新生物細胞の少なくとも５％の応答がある場合、腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤に対し部分的に感作される。
【００４５】
好ましくは、本方法のステップ（ａ）での新生物細胞集団は、（ｉ）細胞を１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤に暴露し、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるこれらの細胞を同定すること、または（ｉｉ）腫瘍もしくは免疫起源のものであり得る細胞集団においてＳＴＡＴ１の活性を測定することであって、ＳＴＡＴ１タンパク質の活性化の不在（これは、閾値５０％で、細胞集団における核ＳＴＡＴ１またはリン酸化ＳＴＡＴ１のいずれかにより測定され得る）が免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）での細胞集団の耐性のバイオマーカーとして現れる、測定すること、のいずれかにより選択される。一例において、核ＳＴＡＴ１について測定される５０％の閾値は、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）での細胞集団の耐性のバイオマーカーを呈する。別の例において、リン酸化ＳＴＡＴ１の測定の５％の閾値は、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）での細胞集団の耐性のバイオマーカーを呈する。
【００４６】
本方法の別の形態において、測定可能な量のＳＴＡＴ１バイオマーカーが細胞集団で検出される場合、ステップ（ｂ）の細胞は、免疫チェックポイント阻害剤に、十分な時間暴露されている。このような測定可能な量は、本明細書に記載されるように、核ＳＴＡＴ１試験においては好ましくは少なくとも４０％の応答であるが、より好ましく少なくとも５０％の応答であり、および／またはリン酸化ＳＴＡＴ１試験においては少なくとも５％の応答である。
【００４７】
本発明のこの好ましい形態において、ステップ（ｂ）での細胞集団は、ＳＴＡＴ１の活性化について周期的に（任意で、１時間ごと、または２、６、１２または２４時間ごとに）測定され、バイオマーカーＳＴＡＴ１の活性化および／または存在は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する細胞の感受性を示している。
【００４８】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性を促進または増強するための、１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、感作剤（複数可）が、免疫治療の少なくとも３日前に、治療有効量で、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与される、使用が提供される。
【００４９】
本発明の好ましい形態において、本方法はまた、１つまたは複数のチェックポイント感作剤が、悪性状態に対する免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の有効性を高めるために、十分なエフェクター免疫細胞（例えば、ＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１を産生するＮＫ細胞）を腫瘍または新生物細胞集団環境に誘引した時点で、免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップを含む。
【００５０】
別の好ましい形態において、本方法は、１つまたは複数のチェックポイント感作剤が、悪性状態に対する免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の有効性を高めるために、腫瘍または新生物細胞集団環境で免疫エフェクターＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１の量を十分に増加させた時点で、免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップを含む。例えば、ＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１は、ＮＫ細胞によりおよび／または腫瘍もしくは新生物細胞集団により産生される。
【００５１】
本発明によれば、本方法における使用のために選択される免疫チェックポイント阻害剤（複数可）は、抑制性Ｔ細胞分子ＣＴＬＡ−４を標的とするか、ならびに／またはプログラム死受容体（ＰＤ−１）および／もしくはＰＤ−リガンド（ＰＤ−Ｌ）経路、および／もしくはグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、および／もしくはリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ）３、ＣＤ１３４および／もしくはＯＸ４０としても知られる腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４、および／もしくは４１ＢＢ、および／もしくはＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有（ＴＩＭ）３を標的とする薬剤である。抑制性Ｔ細胞分子ＣＴＬＡ−４を標的とする薬剤の例は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブである。ＰＤ−１を標的とする薬剤の例は、ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、ニボルマブ、ＡＭＰ−２２４、ピジリズマブ、スパルタリズマブ、セミプリマブ、カムレリズマブ、チスレリズマブまたはペンブロリズマブである。ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬剤の例は、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブである。ＧＩＴＲを標的とする薬剤の例は、アンタゴニスト、例えば、ＴＲＸ５１８またはＭＫ４１６６である。ＬＡＧ３を標的とする薬剤の例は、ＢＭＳ−９８６０１６、ＢＩ７５４１１１、ＬＡＧ−５２５またはＲＥＧＮ−３７６７である。ＯＸ４０を標的とする薬剤の例は、ＢＭＳ９８６１７８、ＭＥＤＩ６４６９、ＧＳＫ３１７４９９８、ＰＦ−０４５１８６００である。ＴＩＭ３を標的とする薬剤の例は、ＬＹ３３２１３６７、ＭＢＧ４５３またはＴＳＲ−０２２である。４１ＢＢを標的とする薬剤の例は、ＰＦ−０５０８２５６６である。
【００５２】
第２の態様によれば、本発明は、腫瘍を感作する薬剤の製造における、治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、上記腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に耐性である、使用に属する。
【００５３】
関連する実施形態において、本発明は、腫瘍を感作する薬剤の製造における、治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、上記腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に耐性であり、上記薬剤がＮＫ細胞（例えば、活性化ＳＴＡＴ１および／またはＩＦＮγを産生するＮＫ細胞）の数を増加させるか、ならびに／または新生物細胞および／もしくは腫瘍細胞および／もしくはＮＫ細胞によるＩＦＮγおよび／もしくは活性化ＳＴＡＴ１の産生を増加させる、使用に属する。
【００５４】
好ましくは、薬剤は、免疫治療の少なくとも３日前に、免疫チェックポイント感作剤を、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与するための指示書を含む。
【００５５】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。より好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される。特に好ましい形態において、免疫チェックポイント感作剤の組み合わせが、本方法で用いられ、上記組み合わせは、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される、少なくとも複数の同定された感作剤である。理想的には、組み合わせは、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγ、または抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、レチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸もしくはＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγの少なくとも３つの組み合わせである。例えば、組み合わせは、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体であり得る。
【００５６】
第３の態様によれば、本発明は（１）悪性状態または（２）癌の外科手術切除後または（３）任意の他の形態の補助免疫治療前、治療中もしくは治療後のいずれかの患者を処置する方法であって、
ａ．１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍または新生物細胞集団（複数可）を同定するステップと、
ｂ．腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に対して少なくとも部分的に感作されるまで免疫治療前に少なくとも３日間、治療有効量の１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を、ステップ（ａ）で同定された腫瘍もしくは新生物細胞集団（複数可）に投与するか、または前記腫瘍もしくは新生物細胞集団（複数可）を上記感作剤に暴露するステップ
を含む、方法に属する。
【００５７】
本発明の第３の態様の好ましい形態において、本方法はまた、１つまたは複数のチェックポイント感作剤が、悪性状態に対する免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の有効性を高めるために、十分なエフェクター免疫細胞（例えば、ＩＦＮγ産生および／またはＳＴＡＴ１発現ＮＫ細胞）を腫瘍または新生物細胞集団環境に誘引した時点で、免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップを含む。
【００５８】
好ましくは、本方法のステップ（ａ）での腫瘍または新生物細胞集団（複数可）は、（ｉ）細胞を１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤に暴露し、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるこれらの細胞を同定すること、または（ｉｉ）腫瘍もしくは免疫起源のものであり得る細胞集団においてＳＴＡＴ１の活性を測定することであって、ＳＴＡＴ１タンパク質の活性化の不在が、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）での細胞集団の耐性のバイオマーカーとして現れる、測定することのいずれかにより選択される。
【００５９】
本方法の別の好ましい形態において、上記方法は、（ｉ）測定可能な量の活性化ＳＴＡＴ１および／もしくはＩＦＮγが細胞集団で検出された場合、ならびに／または（ｉｉ）測定可能な量のナチュラルキラー細胞（例えば、活性化ＳＴＡＴ１および／またはＩＦＮγを含有するＮＫ細胞）が腫瘍もしくは細胞集団細胞微小環境で検出された場合、ステップ（ｂ）の細胞を免疫チェックポイント阻害剤に暴露する追加のステップを含む。
【００６０】
本発明の第３の態様の一実施形態において、患者において免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性を促進または増強するための、１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、感作剤（複数可）が、免疫治療の少なくとも３日前に、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与される、使用が提供される。一例において、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、その場合にはさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時に投与され得る。例えば、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、その場合にはさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時にＩＣＢ治療継続期間中、例えば、最大少なくとも３か月、もしくは少なくとも６か月、もしくは少なくとも９か月、もしくは少なくとも１０か月、もしくは少なくとも１１か月、もしくは少なくとも１２か月、もしくは少なくとも１３か月、もしくは少なくとも１４か月、もしくは少なくとも１５か月、もしくは少なくとも１６か月、もしくは少なくとも１７か月、もしくは少なくとも１８か月、もしくは少なくとも１９か月、もしくは少なくとも２０か月、もしくは少なくとも２１か月、もしくは少なくとも２２か月、もしくは少なくとも２３か月、もしくは少なくとも２４か月、または２年超投与され得る。
【００６１】
第４の態様によれば、本発明は、腫瘍または新生物細胞集団を有する患者を処置する方法であって、免疫治療前に、腫瘍または新生物細胞集団を、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体の治療有効量の組み合わせで、免疫細胞、特にＩＦＮγを産生するＮＫ細胞を腫瘍に誘引するのに十分な時間処置し、免疫チェックポイント阻害に対し腫瘍を感作するステップを含む、方法に属する。本発明のこの態様の一形態において、組み合わせは、免疫治療前に腫瘍と少なくとも３日間接触させる。より詳細には、組み合わせは、免疫治療前に、臨床基準の非毒性用量で、腫瘍と３日〜５週間接触させる。
【００６２】
第５の態様によれば、本発明は、悪性状態での免疫チェックポイント阻害剤の有効性を高めるための、少なくとも１つの免疫チェックポイント感作剤（複数可）を含む感作治療剤に属する。好ましくは、感作組成物は、少なくとも複数の同定された薬剤の組み合わせである。好ましくは、組み合わせは、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドの少なくとも２つまたは少なくとも３つの組み合わせである。理想的には、組み合わせは、抗ＩＬ−１０抗体、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγ、または抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、もしくはレチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸およびインターフェロンγの少なくとも３つの組み合わせである。例えば、組み合わせは、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体であり得る。組成物ごとに、免疫治療剤が含まれ得、これは、感作治療用組成物の有効性が効果を有した時点で、感作治療用組成物の後に投与され得る。
【００６３】
本発明によれば、
ａ）治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤、および
ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、感作治療剤も提供される。
【００６４】
本発明による感作治療剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドの１つまたは複数を含み得る。一例において、感作治療剤は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸および／またはインターフェロンγを含み得る。例えば、感作治療剤は、単剤治療として提供され得る。好ましくは、感作治療剤は、腫瘍細胞を感作するその生物学的効果を発揮するように一緒に機能する治療剤の組み合わせとして提供される。
【００６５】
好ましくは、治療用の組み合わせでの感作剤の投与は、同時、順次または交互に行われる。一例において、同時投与は、感作剤および免疫チェックポイント阻害剤を本質的に同時に投与することを指す。同時共投与について、一連の処置も同時に行われ得る。例えば、単一の組み合わせ剤形の薬剤が患者に投与され得る。
【００６６】
一例において、治療用の組み合わせでの感作剤の投与は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時に行われる。例えば、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時にＩＣＢ治療継続期間中、例えば、最大で少なくとも３か月、もしくは少なくとも６か月、もしくは少なくとも９か月、もしくは少なくとも１０か月、もしくは少なくとも１１か月、もしくは少なくとも１２か月、もしくは少なくとも１３か月、もしくは少なくとも１４か月、もしくは少なくとも１５か月、もしくは少なくとも１６か月、もしくは少なくとも１７か月、もしくは少なくとも１８か月、もしくは少なくとも１９か月、もしくは少なくとも２０か月、もしくは少なくとも２１か月、もしくは少なくとも２２か月、もしくは少なくとも２３か月、もしくは少なくとも２４か月、または２年超投与され得る。
【００６７】
第６の態様によれば、本発明は、
腫瘍または新生物細胞集団を処置するためのキットであって、
ａ）治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤、および
ｂ）免疫治療の少なくとも３日前に、免疫チェックポイント感作剤を、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与するための指示書、
を含む、キットに属する。
【００６８】
好ましくは、キットはまた、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫治療剤、ならびに１つまたは複数のチェックポイント感作剤が十分なエフェクター免疫細胞（例えば、ＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１を産生するＮＫ細胞）を腫瘍または新生物細胞集団環境に誘引したら薬剤（複数可）を腫瘍または新生物細胞集団に投与するための指示書を含む。この効果は、腫瘍細胞感作を引き起こし、悪性状態に対する免疫チェックポイント阻害剤の有効性を高めるためである。
【００６９】
第７の態様によれば、本発明は、免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測する診断方法であって、
ａ）細胞集団におけるＳＴＡＴ１活性化を測定するステップと、
ｂ）腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定するステップであって、バイオマーカーＳＴＡＴ１の活性化および／または存在が、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を発現する腫瘍細胞を示す、ステップ
を含む、診断方法に属する。
【００７０】
第８の態様によれば、本発明は、免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測する診断方法であって、
ａ）腫瘍細胞集団におけるナチュラルキラー細胞の活性化および／または存在量を測定するステップと、
ｂ）腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定するステップであって、ナチュラルキラー細胞の活性化および／または存在が、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を発現する細胞を示す、ステップ
を含む、診断方法に属する。
【００７１】
さらなる態様によれば、本発明は、免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測する診断方法であって、
ａ）細胞集団におけるＳＴＡＴ１活性化および／またはＩＦＮγ産生を測定するステップと、
ｂ）腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定するステップであって、バイオマーカーＳＴＡＴ１の活性化および／または存在が、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を発現する腫瘍細胞を示す、ステップと
を含む、診断方法に属する。
【００７２】
好ましくは、ＳＴＡＴ１活性化および／またはＩＦＮγ産生を測定することは、ＳＴＡＴ１活性化および／またはＩＦＮγおよび／または新生物細胞集団および／または腫瘍を測定することを含む。
【００７３】
本発明の第９の態様によれば、対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、ならびに／または対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境に、ＮＫ細胞を固定化するか、またはＮＫ細胞の数を増加させる方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００７４】
好ましくは、１つまたは複数の感作剤は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、または新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境で対象に投与される。
【００７５】
好ましくは、ＮＫ細胞はＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質を産生する。
【００７６】
本発明の第１０の態様によれば、例えば、対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、ならびに／または対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境において、対象中のＮＫ細胞によりＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を誘導するか、または増加させる方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００７７】
好ましくは、１つまたは複数の感作剤は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、または新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境で対象に投与される。
【００７８】
本発明の第１１の態様において、対象中の新生物細胞および／または腫瘍によりＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を誘導するか、または増加させる方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００７９】
好ましくは、１つまたは複数の感作剤は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、または新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境で対象に投与される。
【００８０】
一例において、本方法は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による処置前に、１つまたは複数の感作剤を対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍に投与するか、または対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露することを含む。
【００８１】
一例において、本明細書に記載の本発明の任意の広範な態様、実施形態、形態または実施例によれば、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【００８２】
一例において、本明細書に記載の本発明の任意の態様、実施形態、形態または実施例によれば、新生物腫瘍は、悪性腫瘍または良性腫瘍である。
【００８３】
一例において、本明細書を通じて記載される本発明の任意の態様、実施形態、形態または実施例によれば、新生物細胞または細胞集団は、悪性または良性である。
【００８４】
１つの好ましい例において、新生物細胞または細胞集団は、黒色腫腫瘍、非小細胞肺癌腫瘍、メルケル細胞癌腫瘍、マイクロサテライト不安定性結腸直腸癌腫瘍、腎癌腫瘍および／または中皮腫癌腫瘍から選択される１つまたは複数の癌腫瘍細胞を含む。
【００８５】
カラー図面の参照
本出願は、カラーで作成された少なくとも１つの写真を含有する。カラー写真付きの本特許出願公報のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
本発明のさらなる特徴は、そのいくつかの非限定的な実施形態についての以下の説明においてより詳細に記載される。この説明は、本発明を例示する目的のみのために含まれる。これは、上記の本発明の広範な要約、開示または説明に対する制限として理解されるべきではない。説明は、以下の添付の図面を参照して作成される。
【００８７】
本発明のさらなる特徴は、そのいくつかの非限定的な実施形態についての以下の説明においてより詳細に記載される。この説明は、本発明を例示する目的のみのために含まれる。これは、上記の本発明の広範な概要、開示または説明に対する制限として理解されるべきではない。説明は、以下の添付の図面を参照して作成される。
【００８８】
【図１】ＩＣＢによる処置前の特徴的な遺伝子シグネチャーに関連する、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）に対して対称的であるが二分する応答を示すモノクローナル細胞株由来の腫瘍を有する、近交系マウス系統を示す。パネルＡは、Ｒｅｎｃａ腎臓癌細胞株を接種し、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの代表的な腫瘍増殖曲線；３つの独立した実験からプールされたデータ；ならびにＩＣＢ非応答者（赤線）、中間応答者（オレンジ線）および応答者（青線）を示すグラフ表示である。パネルＢおよびＣは、ＡＢ１（Ｂ）およびＲｅｎｃａ（Ｃ）腫瘍を左右対称に接種し、ＩＣＢ治療（抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１）で処置したマウスの代表的な増殖曲線；（ｎ＝１０）マウスごとに色分けされた２つの独立した実験からプールされたデータを示すグラフ表示である。パネルＤは、実施例１で概説される本発明の実験設計を示す図式表示である。パネルＥおよびＦは、応答性（ＲＳ）および非応答性（ＮＲ）ＡＢ１腫瘍（Ｅ）およびＲｅｎｃａ（Ｆ）腫瘍のＰＣＡクラスターを示す三次元グラフ表示である（１群あたりｎ＝１２）。パネルＧおよびＨは、応答性および非応答性腫瘍を明確に分離する上位の差次的発現遺伝子の教師なし階層的クラスタリングを示すグラフ表示である。ＡＢ１（Ｇ）については、１０３０７個の遺伝子（上位２００を図示）が、Ｒｅｎｃａ（Ｈ）については１２７個の遺伝子（すべて図示。図２も参照）が応答者対非応答者において差次的に発現された。パネルＩは、応答者におけるタンパク質レベルでのＰＤ−Ｌ１発現の増加のフローサイトメトリー検証である。
【図２】ＡＢ１およびＲｅｎｃａ腫瘍における上位８個のＨａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットの個々の遺伝子セット濃縮分析のグラフ表示を示す。ＡＢ１（パネルＡ）とＲｅｎｃａ（パネルＢ）の両方からの個々のランダムウォークグラフは、応答者におけるこれらのＨａｌｌｍａｒｋ遺伝子シグネチャーの強い関連性を示している。各グラフの右上隅で：ＮＥＳ＝正規化濃縮スコア、ＥＳ＝濃縮スコア、ＦＤＲ＝偽発見率ｑ−スコア。
【図３】チェックポイント阻害応答性腫瘍が、ＳＴＡＴ１により駆動される炎症性微小環境を示し、それにより重要な調節因子としてのＳＴＡＴ１による炎症性経路が、マウスモデルおよび患者のＩＣＢ応答性腫瘍において濃縮されることを示す。パネルＡは、応答性対非応答性ＡＢ１およびＲｅｎｃａ腫瘍における上位のＨａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットのＧＳＥＡ分析を示すグラフ表示である。パネルＢは、患者コホート（ｎ＝１９２）（Ｓ．Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８）からの応答性対非応答性腫瘍のＧＳＥＡ分析を示すグラフ表示である。パネルＣは、ＡＢ１およびＲｅｎｃａ腫瘍からのデータを合わせた、応答マウスにおいて濃縮されたカノニカル経路を示す創意工夫経路分析を示すグラフ表示である。パネルＤは、応答性腫瘍と非応答性腫瘍の間の差次的発現遺伝子を同定しモジュールごとの箱ひげ図として異なるｔ統計量をプロットすることにより、ＷＧＣＮＡを用いて同定された、処置応答に関連した共発現モジュールを示すグラフ表示である。棒線＝外れ値を含むＳＤ、および水平の破線はｐ＝０．０５に対応する。パネルＥはモジュール１の配線図の事前知識に基づくグラフの再構築図である。パネルＦは、ＳＴＡＴ１遺伝子セット（Ｍ．Ａ．Ｃａｒｅら（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ７、９６）を用いる、患者コホート（ｎ＝１９２）（Ｓ．Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８）からの応答性（ＣＲ）対非応答性（ＰＤ）腫瘍のＧＳＥＡ分析を示すグラフ表示である。パネルＧは、非応答性および応答性ＡＢ１腫瘍における代表的なｐＳＴＡＴ１免疫組織化学を示す写真表示である。パネルＨは、ｐＳＴＡＴ１の高いおよび低い、ＩＣＢにより処置された腫瘍の代表的な生存曲線のグラフ表示である（ｎ＝１０応答者（ＲＳ）、８非応答者（ＮＲ）；ログランク検定、*ｐ＜０．０５）。
【図４】応答性腫瘍と非応答性腫瘍の間で、ＡＢ１およびＲｅｎｃａ腫瘍内で動作する、高度に差次的に共発現される遺伝子の７個のモジュールを同定した、加重遺伝子相関ネットワーク分析のグラフ表示である。応答者と非応答者を比較するＤＥＳｅｑ２分析からのｐ値にオーバーレイしたネットワークモジュールは、どのモジュールが応答に関連しているかを明らかにした。結果は、モジュールの発現が、ＡＢ１およびＲｅｎｃａの応答者において別個にアップレギュレートされることを示している。７個のモジュールのうち５個が応答に有意に関連していることに反映されるように、ＡＢ１腫瘍（パネルＡ）は、非応答者と比較して応答者において圧倒的に大きな差次的発現を示した。Ｒｅｎｃａ腫瘍（パネルＢ）は、応答の駆動因子としてモジュール１（茶）を同定した。（箱ひげ図、ひげ１．５ＩＱＲ）（水平の破線はｐ＝０．０５に対応する）。
【図５】図５は、重複ＡＢ１／Ｒｅｎｃａにおける応答に関連するモジュール（モジュール１）のＲｅａｃｔｏｍｅおよびＫＥＧＧ経路濃縮を示すグラフ表示である。経路分析は、応答に関連するモジュールにおいてアップレギュレートされた遺伝子に反映される、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を含む免疫関連経路を明らかにする（水平の破線はｐ＝０．０５に対応する）。
【図６】応答性／非応答性ＡＢ１腫瘍の単一細胞分析を示すグラフ表示である。パネルＡは、ｔＳＮＥにより可視化された応答性および非応答性ＡＢ１腫瘍のトランスクリプトームを示す（１０７４３個の細胞）。細胞サブセットを、ＳｉｎｇｌｅＲを用いてアノテーションした。パネルＢは応答性および非応答性ＡＢ１腫瘍の細胞型にわたるＳＴＡＴ１発現のバイオリン図である。
【図７】ヒト患者コホートにおけるＳＴＡＴ１発現および応答との相関を示す。パネルＡは、抗ＰＤ−Ｌ１で処置した尿路上皮癌患者（Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら２０１８;ｎ＝２９８、応答データ）の応答者（ＣＲおよびＰＲ）および非応答者（ＳＤおよびＰＤ）におけるＳＴＡＴ１発現を示すグラフ表示である。パネルＢ、本発明者らはまた、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブで処置した黒色腫患者の第２のコホート（Ｒｉａｚら、２０１７）におけるＳＴＡＴ１シグネチャーを試験した。結果は、実施例２に記載されるようにＳＴＡＴ１遺伝子セットを用いて、抗ＰＤ−１で処置した黒色腫患者コホート（ｎ＝３３）からの応答性（ＣＲおよびＰＲ＝１０）対非応答性（ＰＤ＝２３）腫瘍のＧＳＥＡ分析である。パネルＣ、本発明者らは、リン酸化ＳＴＡＴ１が、マウスにおいて、およびヒト患者から先を見越して採取される利用可能な腫瘍組織の不在下で、ＩＣＢに対する応答に相関していることを同定したため、本発明者らは、ＳＴＡＴ１活性化シグネチャーが、応答に関連しているか否かを同定しようとした。すべての患者（ｎ＝３４８）を、ＳＴＡＴ１活性化のレベルに基づき２つの均等な群に分けた。高いＳＴＡＴ１活性化は、生物学的シグネチャーの分類アルゴリズム（実施例２の材料および方法を参照のこと）を用いてＳＴＡＴ１遺伝子セットにより定義されるように、放射線学的応答にかかわらず、全体的な生存の増加と相関していた。ＣＲ、完全応答；ＰＲ、部分応答；ＳＤ、安定した疾患；ＰＤ、進行性疾患。
【図８】ＡＢ１およびＲｅｎｃａ腫瘍で行われたＳＴＡＴ１免疫組織化学を示す。パネルＡは、非応答性（左）および応答性（右）Ｒｅｎｃａ腫瘍における全ＳＴＡＴ１の代表的な免疫組織化学染色を示す写真表示である。ＳＴＡＴ１は試料間の陽性細胞の割合におけるばらつきが小さいため、全ＳＴＡＴ１の染色は、ｐＳＴＡＴ１の染色より評価が困難であった。パネルＢは、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１で処置したＳＴＡＴ１陽性および陰性のＲｅｎｃａおよびＡＢ１担持マウスの生存曲線を概説している（ｎ＝９応答者、７非応答者、ログランク検定*ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、ＮＫ細胞が、マウスモデルおよび患者のＩＣＢ感受性腫瘍において濃縮され、ＩＣＢ治療に対する応答に必要とされることを示す。パネルＡは、応答性（ｎ＝６）および非応答性（ｎ＝９）ＡＢ１腫瘍、または応答性（ｎ＝７）および非応答性（ｎ＝１１）Ｒｅｎｃａ腫瘍担持マウスからの解離した腫瘍のフローサイトメトリー（１２００のマージイベント）から得られた結果のグラフ表示である。パネルＢは、応答性および非応答性ＡＢ１またはＲｅｎｃａ腫瘍（ｎ＝１２／群）からのＲＮＡｓｅｑデータのＣＩＢＥＲＳＯＲＴ分析である。パネルＣは、パネルＡに示される応答性および非応答性腫瘍におけるＮＫ細胞（ＣＤ３３５＋）の割合（％）を示すグラフ表示である。パネルＤは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ（多重比較のＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正によるマンホイットニーＵ検定）による全白血球の浸潤に対するＮＫ画分を示すグラフ表示である。パネルＥは、患者コホートからの腫瘍における活性化ＮＫ細胞画分（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ）を示す。ＣＲ、完全応答；ＰＲ、部分応答；ＳＤ、安定した疾患；ＰＤ、進行性疾患。（ｎ＝２９８、マンホイットニーＵ検定、棒＝標準偏差）。パネルＦおよびＧは、ＩＣＢの開始３日前に、ＮＫ枯渇抗体抗アシアロＧＭ１（ａＧＭ１）ありまたはなしで、ＩＣＢで処置したＡＢ１（Ｆ）またはＲｅｎｃａ担持マウス（Ｇ）の生存図である。マウスをＩＣＢで早く処置し（ＡＢ１は５日目、Ｒｅｎｃａは７日目）、応答減衰の調査を可能にした（ｎ＝１０マウス／群、２つの独立した実験からプールされたデータ、ログランク検定）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。
【図１０】抗ＣＴＬＡ４抗体／抗ＰＤ−Ｌ１抗体による処置前のＡＢ１およびＲｅｎｃａにおける応答者および非応答者の個々の試料のＣＩＢＥＲＳＯＲＴを示すグラフ表示である。ＡＢ１（パネルＡ）およびＲｅｎｃａ（パネルＢ）腫瘍全体の個々の試料の積層グラフを、ＲＮＡ配列決定データを用いてＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより分析した。２５個の細胞サブセットを、各試料内の白血球の相対的割合として識別した。２つのモデルは、細胞組成における明確な違いを実証した。さらに、応答群および非応答群内およびこれらの間の両方で、個々のマウス間のばらつきがあった。
【図１１】アテゾリズマブ処置患者コホートにおける全細胞集団のＣＩＢＥＲＳＯＲＴ積層グラフである。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ細胞サブセットを９つの重要なサブセットにまとめ、応答型ごとの積層グラフとしてプロットした（ＣＲ、完全応答；ＰＲ、部分応答；ＳＤ、安定した疾患；ＰＤ、進行性疾患）。ＮＫ細胞の増加を除き、いずれかの群の間で細胞集団間に有意差はなかった（図９参照）。
【図１２】ｐ−値およびｚ−スコアによるＡＢ１、Ｒｅｎｃａ腫瘍およびモジュール１（ＡＢ１とＲｅｎｃａとの組み合わせ）における差次的発現遺伝子の上流調節因子分析を示すグラフ表示である。ＡＢ１（パネルＡおよびＤ）ＵＲＡとＲｅｎｃａ（パネルＢおよびＥ）ＵＲＡの両方は、同様の目標出力をもたらした。モジュール１  ＵＲＡ（パネルＣおよびＦ）も同様の出力をもたらし、このモジュールが応答の中心であることを補強している。３つの分析すべては、ＩＦＮγおよびポリ（Ｉ：Ｃ）を上位の正の調節因子として、およびＩＬ−１０を上位の負の調節因子として同定した。図１３Ａに示されるｐ値による、およびｚスコアによるＤＥ遺伝子（ＡＢ１およびＲｅｎｃａ）の重複のＵＲＡ、（パネルＧ）（正の調節因子は赤、負の調節因子は青（ｚスコア）；破線＝ｐ＝０．０５）。
【図１３】ＩＣＢ治療に対する腫瘍の感作を促進または増強するための腫瘍微小環境の治療的調節を示す。パネルＡは、ＡＢ１およびＲｅｎｃａ腫瘍からの合わせたデータの上流調節因子分析（ＵＲＡ）のグラフ表示であり、ｐ値によりランク付けされる、応答に関連する遺伝子シグネチャーの上位の予測される調節因子を示している（赤は正の相関、青は負の相関である）。パネルＢは、患者コホート（ｎ＝１９２）（Ｓ．Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８）の応答者対非応答者における予測される調節因子のＵＲＡのグラフ表示である。パネルＣは、本発明で使用される非限定的な感作処置スケジュールを示す図式表示である。パネルＤ〜Ｇは、ＩＣＢ単独（ｎ＝１０／群のマウス；ＡＥ１７腫瘍担持マウスについては１５）またはビヒクル対照（ＰＢＳ）と比較して、腫瘍を応答阻害治療、次いでＩＣＢ（次いで、処置（抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１））に対して感作することが本発明者らにより予測された、薬剤（ＩＦＮγ、ポリ−Ｉ：Ｃ、抗ＩＬ−１０抗体）の組み合わせで３日間処置した、Ｒｅｎｃａ腎臓癌腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｄ）、ＡＢ１中皮腫腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｅ）、ＡＥ１７中皮腫腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｆ）およびＢ１６黒色腫腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｇ）の生存曲線である。パネルＨは、ＩＣＢ前に、単剤治療（抗ＩＬ−１０抗体またはポリ（Ｉ：Ｃ）またはＩＦＮγ）対３つの組み合わせで処置した、Ｒｅｎｃａ腫瘍担持マウスの生存曲線のグラフを示す。パネルＩは、ＩＣＢ前に、２つの薬剤による治療対３つの組み合わせで処置した、Ｒｅｎｃａ腫瘍担持マウスの生存曲線のグラフを示す（ｎ＝１０／群、５匹のマウス／群の２つの独立した実験；ＩＣＢのみの群と比較したログランク検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。パネルＪは、ＩＣＢ、次いで感作剤、例えば、３つの組み合わせ治療を試験する処置スケジュールを示すダイアグラムである。パネルＫは、Ｊに示すようにＩＣＢ、次いで、３つの組み合わせ治療で、またはパネルＣに示すように逆のスケジュールで処置した、Ｒｅｎｃａ担持マウスの生存曲線を示す（ｎ＝１０／群、５匹のマウス／群の２つの独立した実験）（ログランク検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。パネルＬは、ＣＤ４０アゴニスト抗体、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびＩＬ−１０で前処置し、次いで、ＩＣＢ処置（ＣＰＢ）として抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１で処置した、Ｒｅｎｃａ腫瘍担持マウスの生存曲線を示す。
【図１４】ＩＣＢとしてアテゾリズマブで処置した尿路上皮癌患者のコホートからのデータベースにおけるいくつかの負の調節因子のＵＲＡ分析を示し、いくつかの負の上流調節因子を同定する（破線＝ｐ＝０．０５）。
【図１５】３つの薬剤の組み合わせ（抗ＩＬ−１０抗体、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびＩＦＮγ）、次いで、ＩＣＢとして、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１処置で処置したＡＢ１腫瘍担持マウス対最初にＩＣＢで、次いで、同じ３つの組み合わせ（すなわち逆の処置スケジュール）で処置したＲｅｎｃａ腫瘍担持マウスの生存曲線。３つの組み合わせがＩＣＢに対し腫瘍を感作するか否かを決定するために、エフェクター応答を増強するのではなく、３つの組み合わせの後にＩＣＢが続くスケジュールを、ＩＣＢの後に３つの組み合わせが続くスケジュールと比較した。ＩＣＢ処置のみ、３つの組み合わせのみおよびＰＣＳビヒクル対照も分析した。各マウス群において、ｎ＝５／群（ログランク検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。
【図１６】ＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）を阻害する抗体ありまたはなしで、ポリ（Ｉ：Ｃ）（または対照としてＰＢＳ）で３日間前処置し、次いで抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１を含む免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）で処置したＡＥ１７中皮腫腫瘍担持マウスの腫瘍増殖曲線を示すグラフ表示である。ＩＣＢ前のポリ（Ｉ：Ｃ）による前処置は、ＩＣＢ単独と比較して腫瘍増殖を明らかに遅延させるが、これは、ＩＮＦＡＲ阻害により抑制され、ポリ（Ｉ：Ｃ）の腫瘍感作効果が、ＩＦＮα／βシグナル伝達の誘導により媒介されること、および腫瘍微小環境に対するポリ（Ｉ：Ｃ）の感作効果が、阻害（ＩＦＮＡＲ）により消失することを実証している。詳細には、このデータは、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導がまた、ＩＣＢに対する腫瘍の感受性を促進または増強することを実証している。ＩＣＢ処置は、「ＣＰＢ」としてグラフ上に示されている。
【図１７】ＩＦＮα、ポリ（Ｉ：Ｃ）またはＰＢＳ対照による前処置後のＡＥ１７腫瘍のフローサイトメトリー分析を示すグラフ表示である。ＡＥ１７中皮腫腫瘍担持マウスをポリ（Ｉ：Ｃ）または組換えＩＦＮα（またはＰＢＳ対照）で３日間腫瘍内前処置し、その後腫瘍を解離し、ＮＫマーカーＣＤ３３５、汎白血病マーカーＣＤ４５およびｐＳＴＡＴ１について染色した。結果は（ａ）全白血球のＮＫ細胞の割合、（ｂ）ｐＳＴＡＴ１＋白血球の割合および（ｃ）ｐＳＴＡＴ１＋ＮＫ細胞の割合を示している。これらの結果は、組換えＩＦＮαが、ＮＫ細胞の数（すなわち、ＮＫ細胞浸潤の増加）およびｐＳＴＡＴ１活性化（すなわち、ＳＴＡＴ１のリン酸化）の増加を少なくとも特徴とする、ポリ（Ｉ：Ｃ）に類似したＩＣＢ応答に関連するプロファイルを腫瘍の細胞微小環境において誘導することを示している。
【図１８】腫瘍微小環境の治療的調節が、ＩＣＢに対して腫瘍を感作することを示す。パネルＡ〜Ｄは、ＩＦＮγ、ポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０による処置後の、ＣＤ４５＋腫瘍浸潤白血球による、ＮＫ細胞画分（Ｂ）、ＳＴＡＴ１の活性化（Ｂ）、およびＩＦＮγ産生（Ｃ）、ならびにＣＤ４５−非白血球によるＰＤ−Ｌ１発現（Ｄ）を示すグラフ表示である（マンホイットニーＵ検定、棒＝標準偏差、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。パネルＥおよびＦは、腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ４５＋細胞）におけるＩＦＮγ発現（Ｅ）およびＳＴＡＴ１リン酸化（Ｆ）を示すグラフ表示である（マンホイットニーＵ検定）、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。パネルＧは、ＮＫ枯渇抗アシアロＧＭ１抗体ありまたはなしでの、感作、次いでＩＣＢを受けたＲｅｎｃａ担持マウスの生存曲線を示す（ｎ＝１０／群、ｎ＝５のＰＢＳ対照；ログランク検定、***ｐ＜０．００１）。パネルＨは、本発明に従い癌患者を処置するための例示的な二段階アプローチを概説する図式表示であり、ここで腫瘍プロファイリングは、ＩＣＢで最初に処置する、または１つもしくは複数の感作剤、例えば、先行の図において例示された薬剤の３つの組み合わせなどによる処置後にＩＣＢで処置するかの決定を可能にする。
【図１９】ＩＦＮγ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）＋抗ＩＬ−１０抗体による処置は、応答に関連する腫瘍微小環境を表現型模写する。予測される上流調節因子が、応答者表現型を誘導し得るか否かを決定するために、本発明者らは、処置した腫瘍をフローサイトメトリーにより分析した。大きな定着腫瘍をＩＦＮγ、ポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０で処置することは、前処置応答性腫瘍に類似の表現型をもたらした。（パネルＡ）処置は、応答性腫瘍に特有の、腫瘍を浸潤するＮＫ細胞の割合を増加させた（図９を参照のこと）。本発明者らは、単球の増加、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞および樹状細胞の減少も観察した（ｎ＝９／群、２つの個々の実験、Ｒｅｎｃａ）。（パネルＢ）ＣＤ４５＋白血球でのｐＳＴＡＴ１の増加（図１８Ｂ）に加えて、本発明者らは、処置後の非白血球（ＣＤ４５−、すなわち腫瘍細胞および間質）におけるｐＳＴＡＴ１発現の増加も観察した（マンホイットニーＵ検定）、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図２０】腫瘍中のＣＤ３３５＋細胞が、従来のＮＫ細胞であることを示す。腫瘍中のＣＤ３３５＋細胞の表現型を決定するために、本発明者らは生ＣＤ４５＋、ＣＤ３−ＴＣＲｂ−ＣＤ１９−ＣＤ３３５＋細胞のフローサイトメトリー分析を行った（パネルＡ）。ＣＤ３３５＋集団は主としてＮＫ細胞特異的マーカーＥｏｍｅｓおよびＣＤ４９ｂを発現した。細胞は、Ｔ−ｂｅｔも発現したが、ＩＬＣ３マーカーＲｏｒγｔ、ならびにＩＬＣ１マーカーＣＤ１２７およびＣＤ２００ｒを欠いていた（パネルＢ）。（Ａ）および（Ｂ）での図は、未処置（ｎ＝４）腫瘍と処置（ｎ＝５）腫瘍の両方の代表である。代表的な試料（黒のオープンヒストグラム）を、各マーカーの染色対照（灰色の網掛けヒストグラム）とオーバーレイする。
【図２１】漸増投与量（パネルＣ、Ｄ、Ｅ）で、４日目に３日早く開始して（パネルＣ、Ｄ、Ｅ）、または７日目に同時に開始して（パネルＦ）９日間投与されたトレチノインと組み合わせて７、９、１１日目に抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体（抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１）を用いる、（ＩＣＢ）抗体に対するチェックポイント阻害で処置したＡＢ１−ＨＡ腫瘍担持マウスの腫瘍増殖曲線のグラフ表示を提供する。有効性を、ＩＣＢ単独（パネルＢ）およびＰＢＳ対照（パネルＡ）と比較した。ＣＰＢ＝ＩＣＢ処置。結果は、ＩＣＢに対する応答が、レチノイド、例えば、トレチノインの投与により改善されたことを実証している。
【図２２】レチノイド、例えば、トレチノインによる前処置が、腫瘍におけるＳＴＡＴ１の活性化の増加を誘導することを示す。パネルＡおよびＢは、経口経管栄養を介してトレチノインで５日間処置したＣＴ２６結腸直腸癌担持マウスからの腫瘍でのホスホ−ＳＴＡＴ１の免疫組織化学染色を示す。パネルＣは、トレチノインでの腹腔内処置の３日後のＲｅｎｃａ腫瘍において、フローサイトメトリーにより測定された全腫瘍浸潤白血球の割合としての、ｐＳＴＡＴ１陽性ＭＨＣＩＩ＋細胞の数を示すグラフ表示である。グラフ図は、トレチノインによるマウスの処置後のＡＢ１腫瘍において、フローサイトメトリーにより測定された全腫瘍浸潤白血球の割合として、ｐＳＴＡＴ１陽性ＭＨＣＩＩ＋細胞の数を示す。
【図２３】トレチノインまたはビヒクル対照（ＰＢＳ）ありまたはなしで、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＩＣＢ治療）によるマウスの処置後のマウスにおけるＡＢ１−ＨＡ腫瘍の腫瘍増殖曲線である。トレチノインは、１０ｍｇ／ｋｇで、腫瘍接種後６日目に開始して（灰色の網掛け部分）９日間毎日腹腔内投与され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は２００μｇ／マウスで８、１０および１２日目に投与された。結果は、トレチノインおよびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を阻害する抗体による組み合わせ処置が、抗体単独の使用よりも効果的であることを実証している。
【図２４】ＩＣＢ（抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体＝グラフではＣＢＰと示されている）単独で（パネルＡ）、またはベキサロテンと組み合わせて（パネルＢ）、またはトレチノインと組み合わせて（パネルＣ）、またはイソトレチノインと組み合わせて(パネルＤ)処置されたマウスにおけるＲｅｎｃａ腎臓癌腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。パネルＥは、全処置群の生存曲線を示す。ＩＣＢ（抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−Ｌ抗体）は、１２、１４および１６日目に投与され、レチノイドは９日目から開始して６日間経口投与された（灰色の網掛け部分）。得られた結果は、様々なレチノイド化合物／薬物が、腫瘍をＩＣＢ治療に対し感作できることを実証している。
【図２５】実施例（実施例２の８を参照のこと）において使用するフローサイトメトリーゲーティング戦略の模式的グラフ表示を示す。
【図２６】実施例（実施例２の８を参照のこと）において使用するフローサイトメトリー法で用いられた抗体の表形式の表示である。
【図２７】実施例４において言及されるＲｅｎｃａ腫瘍とＡＢ１腫瘍の両方で差次的に発現されることが見出された１１８個の遺伝子のリストを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
本発明によれば、本発明者らは、１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤および好ましくはこれらの組み合わせが、エフェクター免疫細胞、特にＩＦＮγを産生するＮＫ細胞を腫瘍環境に誘引し、腫瘍細胞の感作を誘導し、悪性状態に対する免疫チェックポイント阻害剤の有効性を高めることを明らかにした。すなわち、腫瘍の細胞成分は、免疫チェックポイント感作剤により標的とされ、免疫エフェクター細胞が腫瘍微小環境内で刺激され得る。これが達成されると、腫瘍は免疫チェックポイント阻害剤に対して感作されるようになる。
【００９０】
便宜上、以下の第１項は、本明細書で使用する様々な用語の意味を概説する。続く第２項は、本発明の全般的説明を提供し、これは、考察される使用方法、薬剤の使用および薬剤の製造方法に関する。この説明の項は、本発明の様々な実施形態の特性、およびこれらがどのように用いられ得るかを実証する具体例により支持される。別段の記載のない限り、本明細書に記載の各実施例、実施形態および態様は、各およびすべての他の実施例、実施形態および態様に準用されるべきである。
【００９１】
１．定義
本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用する特定の用語および語句の意味を以下に示す。当技術分野における用語の使用と、本明細書に提供された用語の定義との間に明白な矛盾がある場合、本明細書に提供された定義が優先とされるものとする。
【００９２】
当業者は、本明細書に記載された本発明が、具体的に記載された以外の変更および修正に影響を受けやすいものであることを理解するであろう。本発明は、このような変更および修正すべてを含む。本発明はまた、本明細書に言及されるかまたは示されるステップ、特徴、製剤および化合物をすべて、個々にまたはまとめて含み、かつステップまたは特徴のいずれかおよびすべての組み合わせ、またはいずれか２つ以上を含む。
【００９３】
本文に引用される各文書、参考文献、特許出願または特許は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれ、本文の一部として読者により読まれ考察されるべきであることを意味する。本文に引用される文書、参考文献、特許文献または特許は、単に簡潔さのため、本文では繰り返されない。しかし、引用された材料またはその材料に含有される情報はいずれも、共通の一般知識であると理解されるべきではない。
【００９４】
本明細書または参照により本明細書に組み込まれる任意の文書で言及される任意の製品についての製造業者の指示書、説明書、製品仕様書および製品シートは、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施で用いられ得る。
【００９５】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態のいずれかにより、範囲に限定されるものではない。これらの実施形態は、例示目的のみを意図する。機能的に同等の製品、製剤および方法は、明らかに本明細書に記載の本発明の範囲内にある。
【００９６】
実施例中、または別段の指示がある場合以外では、本明細書で使用する成分の量または反応条件を示すすべての数字は、すべての場合において、用語「約」で修飾されるものと理解されるべきである。パーセンテージとの関連で用いられる場合、用語「約」は±１％を意味し得る。
【００９７】
本明細書に記載の本発明は、値（例えば、サイズ、濃度など）の１つまたは複数の範囲を含み得る。値の範囲は、範囲を定義する値、および範囲の境界を定義する値にすぐ隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果をもたらす範囲に近接する値を含む、範囲内のすべての値を含むと理解される。例えば、当業者は、範囲の上限または下限の１０％の変動は、完全に適当であり得、本発明に包含されると理解するであろう。より詳細には、範囲の上限または下限の変動は５％であるか、または当技術分野で一般に認識されるようにいずれか大きい方である。
【００９８】
本明細書において、別段の具体的な記載のない限り、単数形の使用は、複数形を含む。本出願において、別段の記載のない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれた（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は限定されない。
【００９９】
また、別段の具体的な記載のない限り、「要素」または「成分」などの用語は、１つの単位を含む要素および成分、ならびに１つ超の副次的単位を含む要素と成分の両方を包含する。
【０１００】
本明細書を通じて、語句「免疫チェックポイント阻害剤（複数可）」は、抑制性Ｔ細胞分子ＣＴＬＡ−４を標的とするか、ならびに／またはプログラム死受容体（ＰＤ−１）および／もしくはＰＤ−リガンド（ＰＤ−Ｌ）経路、および／もしくはグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、および／もしくはＬＡＧ３および／もしくはＯＸ４０、および／もしくは４１ＢＢ、および／もしくはＴＩＭ３を標的とする薬剤を含むが、これらに限定されない。抑制性Ｔ細胞分子ＣＴＬＡ−４を標的とする薬剤の例は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブである。ＰＤ−１を標的とする薬剤の例は、ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、ニボルマブ、ＡＭＰ−２２４、ピジリズマブ、スパルタリズマブ、セミプリマブ、カムレリズマブまたはペンブロリズマブである。ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬剤の例は、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブである。ＧＩＴＲを標的とする薬剤の例は、アンタゴニスト、例えば、ＴＲＸ５１８またはＭＫ４１６６である。ＬＡＧ３を標的とする薬剤の例は、ＢＭＳ−９８６０１６、ＢＩ７５４１１１、ＬＡＧ−５２５またはＲＥＧＮ−３７６７である。ＯＸ４０を標的とする薬剤の例は、ＢＭＳ９８６１７８、ＭＥＤＩ６４６９、ＧＳＫ３１７４９９８、ＰＦ−０４５１８６００である。ＴＩＭ３を標的とする薬剤の例は、ＬＹ３３２１３６７、ＭＢＧ４５３またはＴＳＲ−０２２である。４１ＢＢを標的とする薬剤の例は、ＰＦ−０５０８２５６６である。
【０１０１】
本明細書を通じて、語句「免疫チェックポイント感作剤（複数可）」は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドを含む群から選択される薬剤を含むが、これらに限定されない。例えば、免疫チェックポイント感作剤（複数可）は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含むが、これらに限定されない。好ましくは、語句は、免疫チェックポイント感作剤の組み合わせを意味し、上記組み合わせは、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される、少なくとも複数の同定された感作剤である。理想的には、組み合わせは、以下の薬剤：抗ＩＬ−１０抗体、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγ、または抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０もしくはレチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸およびインターフェロンγの少なくとも３つの組み合わせである。
【０１０２】
用語「ＣＤ４０アゴニスト」は、アゴニストＣＤ４０抗体またはＣＤ４０リガンドを包含するが、これらに限定されないと理解される。本発明における使用に好適なアゴニストＣＤ４０抗体の例としては、ダセツズマブ（ＳＧＮ−４０としても知られる、例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．製）、ＣＰ−８７０，８９３（例えば、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣｈｉＬｏｂ７／４（例えば、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ大学製）、ＡＢＢＶ−９２７（例えば、Ａｂｂｖｉｅ製）、ＡＰＸ００５Ｍ（例えば、Ａｐｅｘｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．製）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明における使用に好適な例示的なＣＤ４０リガンドとしては、組換えヒトＣＤ４０リガンド、例えば、ｒｈｕＣＤ４０Ｌ（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．製）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「抗ＩＬ−１０抗体」は、ＩＬ−１０受容体を標的とし、例えば、新生物細胞および／または新生物腫瘍において活性またはＩＬ−１０受容体をアンタゴナイズするか、および／または消失させる任意の抗体を含むと理解される。本発明における使用に好適な例示的な抗ＩＬ−１０抗体としては、ＭＫ−１９６６（例えば、Ｍｅｒｃｋ製）および／またはＢＴ−０６３（例えば、Ｂｉｏｔｅｓｔ製）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本明細書で使用する「インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子」は、細胞、例えば、新生物細胞および／または腫瘍細胞においてＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）の誘導および／または活性化などにより、ＩＦＮα／βシグナル伝達を誘導および／または増強できる、任意の化合物、薬物または組成物を含むと理解される。好適なインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子としては、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明における使用に好適なＴＬＲ３リガンドとしては、ポリ（Ｉ：Ｃ）（すなわち、ポリイノシン酸：ポリシチジン酸）；ポリ（Ａ：Ｕ）（すなわち、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸）；ポリ：ポリＣ１２Ｕ（すなわち、リンタトリモド）；ポリＩＣＬＣ（すなわち、４−アミノブチルカルバミン酸；［５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキシオキソラン−２−イル］メチルリン酸二水素；［３，４−ジヒドロキシ−５−（６−オキソ−３Ｈ−プリン−９−イル）オキソラン−２−イル］メチルリン酸二水素；２ヒドロキシ酢酸（カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン−ポリシチジル酸、およびポリ−Ｌ−リジン二本鎖ＲＮＡの合成複合体）；および／または「ｓＯＤＮ−ｄｓＲＮＡ」としても知られるホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドにコンジュゲートした合成ｄｓＲＮＡ（Ｍ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、（２０１５）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ、６ｐ．６２８０）が挙げられる。
【０１０５】
本明細書で使用する用語「インターフェロンγまたはその機能性変異体」は、例えば、新生物細胞、例えば、腫瘍細胞においてＳＴＡＴ１を活性化できる任意のＩＦＮγサイトカイン、例えば、ヒトＩＦＮγまたはその機能性変異体もしくはそのフラグメント、例えば、組換えヒトＩＦＮγサイトカインを含む。好適なヒトＩＦＮγ変異体としては、組換えヒトＩＦＮγ１ｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本発明における使用に好適なレチノイドは、トレチノイン（オールトランスレチノイン酸またはレチノイン酸としても知られる）、レチノール、レチナール、イソトレチノイン（１３−ｃｉｓ−レチノイン酸）、アリトレチノイン（９−ｃｉｓ−レチノイン酸）、エトレチナート、アシトレチン、アダパレン、ベキサロテン、タザロテンを含むが、これらに限定されない。好ましくは、レチノイドはトレチノインおよび／またはベキサロテンおよび／またはイソトレチノインを含む。例えば、レチノイドは、トレチノインおよび／またはベキサロテンおよび／またはイソトレチノインのいずれか２つ以上を含む。好ましくは、少なくともトレチノインは本発明で用いられる。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「新生物細胞」または「新生物細胞集団」は、異常なおよび／もしくは過剰な増殖、ならびに／または制御されない増殖を示す細胞または細胞集団を指すと理解される。例えば、新生物細胞または細胞集団は、正常な身体の周辺組織のものと協調せず、異常なおよび／または過剰な増殖挙動を誘導する元のトリガーが上記細胞または細胞集団から除去された場合でも、異常におよび／または過剰に増殖し続け得る。新生物細胞または細胞集団の異常なおよび／または過剰な増殖は、腫瘍などの細胞塊を形成し得ると理解される。また、新生物細胞または新生物細胞集団という用語は、悪性または良性の細胞または細胞集団を包含すると理解される。１つの好ましい例において、新生物細胞または新生物細胞集団は悪性であり、例えば、癌性腫瘍である。１つの特に好ましい例において、本明細書を通じて記載される任意の態様、実施形態、形態または実施例によれば、新生物細胞または細胞集団は、ＳＴＡＴ１タンパク質を活性化もしくはリン酸化でき、および／またはＩＦＮγサイトカインを産生できる。
【０１０８】
一例において、本明細書を通じて記載される本発明の任意の態様、実施形態、形態または実施例によれば、新生物細胞または細胞集団は、悪性または良性である。
【０１０９】
一例において、新生物細胞または細胞集団が悪性である場合、これは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、および骨肉腫、および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、胚芽腫、子宮内膜癌、食道癌、感覚神経芽腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼の癌、網膜芽細胞腫、卵管癌、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小児中枢神経系胚細胞腫瘍、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、腎臓（腎細胞）癌、ランゲルハンス細胞組織球症、咽頭癌、白血病、口唇および口腔癌、肝癌、肺癌（非小細胞および小細胞）、リンパ腫、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、転移性癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、ＮＵＴ遺伝子の変化に関連する正中管癌、口の癌、多発性内分泌線腫症、多発性骨髄腫または形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口唇および口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵癌、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌腫瘍、陰茎癌腫瘍、咽頭癌腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺腫瘍、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫腫瘍、原発性腹膜癌腫瘍、前立腺癌腫瘍、直腸癌腫瘍、腎細胞（腎臓）癌腫瘍、網膜芽細胞腫腫瘍、横紋筋肉腫腫瘍、唾液腺癌腫瘍、肉腫腫瘍、血管腫瘍、ユーイング肉腫腫瘍、カポジ肉腫腫瘍、軟部組織肉腫腫瘍、子宮肉腫腫瘍、セザリー症候群腫瘍、皮膚癌腫瘍、小細胞肺癌腫瘍、小腸癌腫瘍、皮膚腫瘍の扁平上皮癌、原発不明の扁平上皮頸部癌、転移性腫瘍、胃癌腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌腫瘍、鼻咽頭癌腫瘍、中咽頭癌腫瘍、下咽頭癌腫瘍、胸腺腫および胸腺癌腫瘍、甲状腺癌腫瘍、腎孟および尿管腫瘍の移行性細胞癌、尿管および腎孟腫瘍、移行性細胞癌、尿道癌腫瘍、子宮癌腫瘍、子宮内膜子宮肉腫、膣癌腫瘍、外陰癌腫瘍、ウィルムス腫瘍、小児腎臓腫瘍および／または中皮腫腫瘍から選択される１つまたは複数の癌腫瘍細胞を含み得る。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「新生物腫瘍」または「腫瘍」は、正常な身体の周辺組織（複数可）のものに対して、非協調的な異常なおよび／または過剰な増殖を示す細胞または組織の異常な塊を指すことが理解され、新生物細胞、ならびに間質および免疫細胞、例えば、リンパ球（例えば、ＮＪＫ細胞）、Ｔ細胞、樹状細胞を含むがこられに限定されない他の細胞を含む。本明細書を通じて記載される本発明の任意の態様、実施形態、形態または実施例によれば、新生物腫瘍または腫瘍は好ましくは、ＳＴＡＴ１タンパク質を活性化またはリン酸化でき、および／またはＩＦＮγサイトカインを産生できる新生物細胞を含む。また、本明細書で使用する「新生物腫瘍」または「腫瘍」は、良性または悪性であり得ると理解される。好ましくは、腫瘍は悪性腫瘍である。
【０１１１】
一例において、腫瘍は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）腫瘍、副腎皮質癌、肛門癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、および骨肉腫、および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、胚芽腫、子宮内膜癌、食道癌、感覚神経芽腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼の癌、網膜芽細胞腫、卵管癌、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小児中枢神経系胚細胞腫瘍、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、腎臓（腎細胞）癌、ランゲルハンス細胞組織球症、咽頭癌、白血病、口唇および口腔癌、肝癌、肺癌（非小細胞および小細胞）、リンパ腫、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、転移性癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、ＮＵＴ遺伝子の変化に関連する正中管癌、口の癌、多発性内分泌線腫症、多発性骨髄腫または形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口唇および口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵癌、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌腫瘍、陰茎癌腫瘍、咽頭癌腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺腫瘍、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫腫瘍、原発性腹膜癌腫瘍、前立腺癌腫瘍、直腸癌腫瘍、腎細胞（腎臓）癌腫瘍、網膜芽細胞腫腫瘍、横紋筋肉腫腫瘍、唾液腺癌腫瘍、肉腫腫瘍、血管腫瘍、ユーイング肉腫腫瘍、カポジ肉腫腫瘍、軟部組織肉腫腫瘍、子宮肉腫腫瘍、セザリー症候群腫瘍、皮膚癌腫瘍、小細胞肺癌腫瘍、小腸癌腫瘍、皮膚腫瘍の扁平上皮癌、原発不明の扁平上皮頸部癌、転移性腫瘍、胃癌腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌腫瘍、鼻咽頭癌腫瘍、中咽頭癌腫瘍、下咽頭癌腫瘍、胸腺腫および胸腺癌腫瘍、甲状腺癌腫瘍、腎孟および尿管腫瘍の移行性細胞癌、尿管および腎孟腫瘍、移行性細胞癌、尿道癌腫瘍、子宮癌腫瘍、子宮内膜子宮肉腫、膣癌腫瘍、外陰癌腫瘍、ウィルムス腫瘍、小児腎臓腫瘍および／または中皮腫腫瘍から選択される悪性腫瘍であり得る。
【０１１２】
例えば、腫瘍は黒色腫腫瘍、非小細胞肺癌腫瘍、メルケル細胞癌腫瘍、マイクロサテライト不安定性結腸直腸癌腫瘍、腎癌腫瘍、中皮腫腫瘍から選択される。
【０１１３】
新生物細胞、細胞集団および／または新生物腫瘍の微小環境に関して本明細書で使用する用語「微小環境」は、新生物細胞もしくは細胞集団、または新生物細胞もしくは細胞集団を含む腫瘍の塊の局所環境を指すと理解される。また、新生物細胞または細胞集団の微小環境は、細胞集団または腫瘍中の新生物細胞を含み、任意の間質細胞および任意の免疫細胞、例えば、リンパ球、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞および樹状細胞、ならびにサイトカイン、例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα）および増殖因子を含むが、これらに限定されない化学的エフェクターまたは免疫エフェクターも含み得ると理解される。また、新生物細胞または細胞集団の微小環境は、支持間質および血管系も含み得ると理解される。理想的には、新生物細胞または細胞集団の微小環境は、ＮＫ細胞、例えば、ＳＴＡＴ１およびＩＦＮγＮＫを産生するＮＫ細胞の浸潤に対し透過性である。
【０１１４】
本明細書を通じて、文脈上別段必要とされない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または変形物、例えば「        含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及された完全体または完全体の群の包含を意味するが、任意の他の完全体または完全体の群を排除するものではないと理解される。
【０１１５】
用語「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」はすべて、統計学的に有意な量の減少を全般的に意味するために本明細書において用いられる。しかし、誤解を防ぐために、「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、例えば、薬剤の不在下での、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％）、または少なくとも約６０％＞、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の減少を意味する。
【０１１６】
用語「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」はすべて、統計学的に有意な量の増加を全般的に意味するために本明細書において用いられる。誤解を防ぐために、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」は、例えば、薬剤の不在下での、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％）、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％の増加、または少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍〜１０倍もしくはそれより多い任意の増加を意味する。
【０１１７】
本明細書で使用する用語「投与する」は、所望の効果が得られるように、組成物を所望の部位に少なくとも部分的に局在させる方法または経路により対象内に組成物を配置することを指す。本明細書に記載の化合物または組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、経鼻、直腸内および局所（頬側および舌下を含む）投与を含む、経口または非経口経路を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られている任意の適当な経路により投与され得る。特定の実施形態において、化合物は、非経口投与、または標的部位への送達を可能にする他の方法により投与される。
【０１１８】
本明細書の文脈において、語句「有効量」、「治療有効量」または「有効用量（本明細書において互換的に用いられる）はその意味内に、所望の効果を提供するための本発明の化合物または組成物の十分であるが非毒性である量を含む。必要とされる化合物または組成物の正確な量は、所望の効果、処置される種、対象の年齢および全身状態、処置される状態の重症度、投与される薬剤または薬剤の組み合わせ、投与様式などの要因に応じて、対象によって異なる。したがって、正確な「有効量」を明記することはできない。しかし、所与のどの場合にも、当業者は、日常的な実験だけを用いて適当な有効量（用量）を決定できる。一般に、治療有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性、ならびに対象の医学的状態の重症度およびタイプ、他の医薬活性剤の投与により異なり得る。
【０１１９】
治療適用における使用への本明細書における言及は、ヒトおよび非ヒト、例えば、獣医学的適用に等しく適用できると理解されることに留意されるべきである。したがって、別段の記載のない限り、「患者」、「対象」または「個体」（本明細書において互換的に用いられる）への言及は、ヒト、または非ヒト、例えば、哺乳動物、鳥類、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類および齧歯類の種を含むがこられに限定されない、社会、経済または研究的に重要な任意の種の個体を意味すると理解される。より好ましくは、動物は哺乳動物種である。哺乳動物種は、望ましくはヒトもしくは非ヒト霊長類またはコンパニオンアニマル、例えば、家畜イヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはブタである。
【０１２０】
本明細書で使用される選択用語の他の定義は、本発明の詳細な説明中に見出され得、全体を通して適用され得る。別段の定義のない限り、本明細書で使用されるすべての他の科学および技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１２１】
以下で、本発明の特徴を以下の非限定的な説明および実施例を参照して考察する。
【０１２２】
２．具体的な好ましい実施形態
後続する実施例に示すように、本発明をもたらす研究において、本発明者らは、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）剤による免疫治療に対する感受性に関連した前処置腫瘍微小環境の同定に着手した。この趣旨で、本発明者らは、モノクローナル癌細胞株由来の腫瘍を有する近交系マウス系統の非常に均一な設定においても、ＩＣＢによる処置に対する応答が依然として二分するという事実を利用した。移植可能な腫瘍を有する近交系マウス系統であっても、免疫治療後に、二分する結果を示す（図１Ａを参照のこと）。これらのマウスのゲノムが名目上同一でありかつ腫瘍がクローン細胞株に由来し、腫瘍拒絶抗原の発現の違いがこれらの異なる応答を引き起こすという可能性を排除するので、当技術分野で観察されたこのような二分は驚くべきものであった。マウスは、同年齢および同性であり、制御された条件下で維持され、同一の処置を受けた。しかし、マウスの応答は著しく異なる。
【０１２３】
任意の理論または作用様式に拘束されずに、本発明者らは、動物間の結果の違いが、生殖系列に完全にコードされないＴ細胞レパートリーの違いに、または確率的免疫事象に関係する可能性があり得ると推論した。しかし、観察されたこの二分の原因にかかわらず、本発明者らは、クローン細胞株由来の移植可能な腫瘍を有する近交系マウス系統におけるＩＣＢに対する応答のこのような二分は、制御された背景での治療応答の微小環境調節における潜在的にわずかな違いを評価できると推論した。
【０１２４】
当技術分野で観察された二分のこの非常に均一な背景に対して、本発明者らは、ＩＣＢ剤による免疫治療処置の適用前に存在し、かつＩＣＢ剤に対する応答と相関する、腫瘍微小環境のシグネチャーを同定しようとした。本発明者らはまた、その情報を、例えば、非応答者を応答者にするために、ＩＣＢ剤による処置に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強するのに使用しようとした。
【０１２５】
これを実現するために、および後続する実施例において実証されるように、本発明者らは、例えば、２つの異なるマウス癌モデル由来の腫瘍からのフローサイトメトリーならびにバルクおよび単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータを用いて、ＩＣＢ前のマウスからの応答性および非応答性腫瘍の細胞組成および遺伝子発現プロファイルを比較し、応答に関連する重要な細胞および分子ネットワークをマッピングした。本発明者らにより得られた結果は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする免疫チェックポイント阻害抗体で処置した癌患者コホートを用いて得られた先の知見を（Ｎ．Ｒｉａｚら（２０１７）Ｃｅｌｌ  １７１、９３４〜９４９  ｅ９１５；およびＳ．Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８）補強／立証した。
【０１２６】
後続する実施例で示すように、本発明者らは、薬物、組換えタンパク質または抗体による治療標的の上流調節因子を優先し、実際に腫瘍微小環境を免疫チェックポイント阻害剤による免疫治療に対して非応答状態から応答状態に駆動できることを、驚くべきことに見出した。
【０１２７】
詳細には、本明細書に示すように、応答性腫瘍が、転写１のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子タンパク質（ＳＴＡＴ１）およびＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）のシグナル伝達のアップレギュレーション、およびインターロイキン１０（ＩＬ−１０）シグナル伝達のダウンレギュレーションと一致する、とりわけ炎症性遺伝子発現シグネチャーを特徴とすることが、驚くべきことに見出された。さらに、応答性腫瘍は、浸潤性の高いナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を有することが見出された。ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および／または抗ＩＬ−１０抗体の１つまたは複数を用いる、大きな定着腫瘍を有する様々なマウス系統の前処置は、ＩＦＮγを産生するＮＫ細胞を腫瘍に誘引することによりＩＣＢに対し腫瘍を感作し、その結果治癒率を増加させた。
【０１２８】
当業者は、本明細書において提供される結果がＩＣＢに対する応答を予測できる前処置細胞および分子腫瘍微小環境を同定し、これは治療的に達成され得ることを理解するであろう。本明細書において提供されるデータは、ＩＣＢ処置前の感作治療剤による処置が患者に有益であるか否かを確立するための患者管理に対するバイオマーカー駆動型アプローチを予想する。
【０１２９】
後続する実施例において実証されるように、本発明者らは、同じマウス癌モデル内のＩＣＢ応答性および非応答性腫瘍からの遺伝子発現データおよびフローサイトメトリーデータを比較することにより有効な結果に関連する免疫チェックポイント阻害剤（複数可）での処置前の新生物細胞微小環境を評価する試験設計を立案した。本発明者らはまた、腫瘍微小環境を応答表現型、すなわち、ＩＣＢ剤による処置の影響を受けやすい表現型に向けて治療的に促進または増強し、したがってＩＣＢに対する応答を増加させる方法を実証しようとした（実施例１を参照のこと）。
【０１３０】
後続する実施例３に示す結果は、免疫治療による処置前でも、ＩＣＢ剤による免疫治療に応答するであろう新生物細胞集団および腫瘍の微小環境を非応答者と区別できることを実証する。同様に、結果はまた、ＩＣＢ剤による免疫治療に対する応答者であることが予測される対象を非応答者と区別できることを実証する。また、免疫治療による処置前でも、新生物細胞集団もしくは腫瘍、または新生物細胞集団もしくは腫瘍を有する対象が、ＩＣＢ剤による免疫治療に応答するか否かを予測できる。
【０１３１】
後続する研究において実証されるように、ＳＴＡＴ１活性化は、ＩＣＢ応答に関連する腫瘍微小環境の駆動因子であり、ＩＣＢ免疫治療に応答する可能性が高い新生物細胞集団および／もしくは腫瘍、ならびに／またはこのような新生物細胞集団および／もしくは腫瘍を有する患者を同定するための潜在的バイオマーカーとして利用できる（例えば、実施例４を参照のこと）。また、本明細書において実証されるように、様々な動物モデル間および様々な癌腫瘍間の細胞腫瘍微小環境の違いにもかかわらず、１つまたは複数の感作剤を用いてＩＣＢ治療に対し腫瘍を応答性にすることができる（例えば、実施例５を参照のこと）。
【０１３２】
また、例えば、実施例５に示すように、ＮＫ細胞（例えば、ＩＦＮγおよび／またはＳＴＡＴ１を産生する活性化ＮＫ細胞 による腫瘍微小環境の浸潤は、ＩＣＢ治療に対する新生物細胞または腫瘍の感受性の促進または増強に寄与し得る。
【０１３３】
複数の異なるマウス腫瘍モデル、例えば、中皮腫、腎臓癌および黒色腫（それらは病理学的に完全に別個の癌である）のモデルを用いて、ＩＣＢ治療前に開始しかつＩＣＢ免疫治療中も継続され得る、ＩＣＢ剤に対する新生物細胞集団および／または腫瘍の著しい感作をもたらす、臨床的に利用可能な治療剤の適用も実証できた。例えば、実施例に示すように、１つまたは複数の感作剤、例えば、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択されるものによる前処置は、チェックポイント阻害治療に対して感作されるようになることができることが実証された（例えば、実施例６、７および９を参照のこと）。結果は、ＩＣＢに対する１つまたは複数の新生物細胞集団、例えば、腫瘍、の感受性の促進または増強が、腫瘍細胞微小環境における活性化ＮＫ細胞（例えば、ＩＦＮγサイトカインを分泌するもの）の浸潤およびＳＴＡＴ１リン酸化（ＳＴＡＴ１活性化）の増加を特徴とすることを示している（例えば、実施例７および８を参照のこと）。得られたデータは、１つまたは複数の感作剤、例えば、ＩＣＢに対する新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強する治療剤のような薬剤の２つ以上の使用の根拠を概説する。これは、腫瘍プロファイリングに基づき、ＩＣＢによる処置の決定が最初にまたは感作治療剤による前処置後に行われてよい、癌患者を処置するための二段階アプローチへの道を開く（例えば、実施例６〜９を参照のこと）。
【０１３４】
したがって、１つの広範な態様において、本発明は、特定の免疫治療剤の効果に対して細胞集団、例えば、新生物細胞集団および／または腫瘍を感作する方法に関する。特定の実施形態において、方法は、より具体的には、免疫チェックポイント阻害剤の効果に対して新生物細胞を感作することに関する。
【０１３５】
具体的には、本発明は、感作化合物の同定に依存し、感作化合物は、免疫チェックポイント阻害剤の前に投与された場合、例えば、腫瘍の細胞微小環境を変化させ、その環境中の細胞を、免疫チェックポイント阻害剤に対し耐性であることから、これらの薬剤に感受性であるように変化させることができる。
【０１３６】
一態様において、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露し、それにより、免疫チェックポイント阻害剤に対し細胞および／または腫瘍を感作させるステップを含む、方法に属する。
【０１３７】
本態様の関連実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、
ａ．免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、免疫チェックポイント阻害剤に対し腫瘍を感作させる時間および／または治療量で、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露するステップ
を含む、方法が提供される。
【０１３８】
一例において、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【０１３９】
１つのこのような例において、ＣＤ４０アゴニストは、アゴニストＣＤ４０抗体またはＣＤ４０リガンドであり得る。１つの好ましい例において、ＣＤ４０アゴニストは、アゴニストＣＤ４０抗体である。
【０１４０】
別の例において、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドである。例えば、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子は、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ（Ａ：Ｕ）、ポリＩＣＬＣ、ポリ：ポリＣ１２ＵおよびｓＯＤＮ−ｄｓＲＮＡからなる群から選択されるＴＬＲ３リガンドであり得る。好ましくは、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子は、ポリ（Ｉ：Ｃ）であるか、またはこれを含む。
【０１４１】
別の例において、レチノイドは、トレチノイン、レチノール、レチナール、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチナート、アシトレチン、アダパレン、ベキサロテンおよび／またはタザロテンから選択される。好ましくは、レチノイドはトレチノインおよび／またはベキサロテンおよび／またはイソトレチノインである。より好ましくは、レチノイドはトレチノインである。
【０１４２】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイドおよび／またはインターフェロンγを含む群から選択される。
【０１４３】
本方法の好ましい形態において、免疫チェックポイント感作剤の組み合わせが、本方法において用いられ、上記組み合わせは、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される、少なくとも複数の同定された感作剤である。理想的には、組み合わせは、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγの少なくとも３つの組み合わせ、またはＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγの抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、レチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸の組み合わせである。例えば、組み合わせは、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体であり得る。
【０１４４】
好ましくは、感作剤は、免疫チェックポイント阻害剤（複数可）に対し細胞および／または腫瘍を感作するために、免疫チェックポイント阻害剤の導入前に、十分な時間新生物細胞および／または腫瘍に投与される。あるいはまたはさらに、新生物細胞および／または腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤（複数可）に対し細胞および／または腫瘍を感作するために、免疫チェックポイント阻害剤の導入前に、十分な時間感作剤に暴露される。本発明の１つの例示的な形態において、感作剤は、免疫治療前に少なくとも３日間、免疫チェックポイント剤に応答しない新生物細胞および／または腫瘍と接触させられる。より詳細には、感作治療剤は、臨床基準の非毒性用量で、腫瘍と３日〜５週間接触させられる。本発明の別の形態において、感作剤は、転写１のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子（ＳＴＡＴ１）タンパク質を活性化する時間の間、免疫チェックポイント剤に応答しない新生物細胞および／または腫瘍と接触される。
【０１４５】
本発明の形態において、感作剤は、免疫治療前に少なくとも３日間免疫チェックポイント剤に応答しない腫瘍と接触される。より詳細には、感作治療剤は、臨床基準の非毒性用量で、腫瘍と３日〜５週間接触させられる。この目的のために、治療剤は、免疫治療前に、腫瘍に１、２、３、４または５週間または１週間の任意の部分（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５日）の間暴露され得る。当業者は、治療剤への暴露時間は、患者に用いられる薬剤の濃度に依存することを理解するであろう。理想的には、感作剤は、非毒性の生物学的に有効な量（すなわち、患者に有害でなく、処置される腫瘍を感作できる量）で患者に投与される。当業者は、用量が個々の薬剤各々に対する用量であることを把握している。
【０１４６】
本発明の別の形態において、治療有効量の感作剤は、ＳＴＡＴ１タンパク質を活性化する時間の間、免疫チェックポイント阻害剤に応答しない腫瘍と接触される。詳細には、本発明者らは、ＳＴＡＴ１の活性化が、炎症応答性微小環境の駆動因子であり、免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測する潜在的バイオマーカーとして利用できることを明らかにした。
【０１４７】
感作の別の手段として、測定可能な量の免疫エフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）が腫瘍または細胞集団微小環境で検出可能である場合、腫瘍または新生物細胞集団が感作される。
【０１４８】
好ましくは、感作剤は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前に新生物細胞および／または腫瘍を感作させるのに十分な濃度または有効用量で、細胞または腫瘍に投与されるか、またはこれらと接触される。とりわけ、この目的に有効な薬剤（複数可）の量は、用いられる薬剤のタイプ、ならびに状態のタイプ、状態のステージ、対象の体重、対象の状態の重症度および投与方法を含む、各症例の特定の要因に応じて異なる。理想的には、本方法で用いられる感作剤の濃度は、腫瘍細胞集団においてＳＴＡＴ１タンパク質を活性化するのに十分である。
【０１４９】
本発明の第１の態様の好ましい形態において、本方法はまた、１つまたは複数のチェックポイント感作剤が、十分なエフェクター免疫細胞（例えば、ＩＦＮγを産生するＮＫ細胞）を腫瘍または新生物細胞集団微小環境に誘引して、悪性状態に対する免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の有効性を高めたら免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップを含む。
【０１５０】
本発明によれば、本方法における使用のために選択される免疫チェックポイント阻害剤（複数可）は、抑制性Ｔ細胞分子ＣＴＬＡ−４を標的とするか、ならびに／またはプログラム死受容体（ＰＤ−１）および／もしくはＰＤ−リガンド（ＰＤ−Ｌ）経路および／もしくはグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）を標的とする薬剤である。本発明の非常に好ましい形態において、阻害される免疫チェックポイント経路は、以下の標的：ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ１リガンドおよび／またはＧＩＴＲおよび／またはＬＡＧ３および／またはＯＸ４０および／または４１ＢＢおよび／またはＴＩＭ３、の一つか複数（組み合わせ）に関連している。例えば、免疫治療剤は、（ａ）ＣＴＬＡ−４を標的とする薬剤、例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブから選択される。ＰＤ−１を標的とする薬剤の例は、ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、ニボルマブ、ＡＭＰ−２２４、ピジリズマブ、スパルタリズマブ、セミプリマブ、カムレリズマブまたはペンブロリズマブである。ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬剤の例はＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブである。ＧＩＴＲを標的とする薬剤の例は、アンタゴニスト、例えば、ＴＲＸ５１８またはＭＫ４１６６である。
【０１５１】
免疫チェックポイント阻害から恩恵を受ける患者の数を増加させるために、本発明の好ましい形態において、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＧＩＴＲ抗体が組み合わせられる。これらの製品の詳細、これらの標的およびこれらが主として用いられる癌型を以下の表１に示す。ＬＡＧ３を標的とする薬剤の例は、ＢＭＳ−９８６０１６、ＢＩ７５４１１１、ＬＡＧ−５２５またはＲＥＧＮ−３７６７である。ＯＸ４０を標的とする薬剤の例は、ＢＭＳ９８６１７８、ＭＥＤＩ６４６９、ＧＳＫ３１７４９９８、ＰＦ−０４５１８６００である。ＴＩＭ３を標的とする薬剤の例は、ＬＹ３３２１３６７、ＭＢＧ４５３またはＴＳＲ−０２２である。４１ＢＢを標的とする薬剤の例は、ＰＦ−０５０８２５６６である。本発明の特に好ましい形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、以下の表１において同定される薬剤の１つである。
【０１５２】
【表１】
2021518843.tif 000002
2021518843.tif 000003
【０１５３】
本発明の第１の態様の一実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露して、ＮＫ細胞の数を増加させ、それにより免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強するステップを含む、方法が提供される。
【０１５４】
好ましくは、本明細書を通じて記載される本発明の任意の広範な態様、実施形態、形態または実施例によれば、ＮＫ細胞は、ＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質を産生するＮＫ細胞である。
【０１５５】
本明細書を通じて記載される本発明の任意の広範な態様、実施形態、形態または実施例によれば、活性化ＳＴＡＴ１タンパク質は、典型的にはリン酸化ＳＴＡＴ１タンパク質である。
【０１５６】
１つの好ましい例において、方法は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、ならびに／または新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境中でＮＫ細胞の数を増加させる。
【０１５７】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【０１５８】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露して、細胞および／または腫瘍によるＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を増加させ、それにより免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の新生物細胞の感受性を促進または増強するステップを含む、方法が提供される。
【０１５９】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【０１６０】
本発明のこの第１の態様のさらに別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または新生物腫瘍の感受性を促進または増強する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の処置前に、１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を新生物細胞および／もしくは新生物腫瘍に投与するか、または細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露して、ＮＫ細胞によるＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を増加させ、それにより免疫チェックポイント阻害剤に対する新生物細胞および／または腫瘍の感受性を促進または増強するステップを含む、方法が提供される。
【０１６１】
１つの好ましい例において、ＮＫ細胞によるＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生の増加は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、ならびにまたは新生物細胞および／もしくは腫瘍の微小環境において生じる。
【０１６２】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【０１６３】
本発明の第１の態様の一実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する１つまたは複数の細胞集団の感受性を促進または増強する方法であって、
ａ．１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である新生物細胞集団を同定するステップと、
ｂ．免疫治療前に少なくとも３日間、または腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に対して少なくとも部分的に感作されるまで、治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤を、ステップ（ａ）で同定された腫瘍の新生物細胞に投与するか、または上記新生物細胞を前記感作剤に暴露するステップ
を含む、方法が提供される。
【０１６４】
一例において、新生物細胞は、腫瘍中の新生物細胞である。
【０１６５】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【０１６６】
より好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される。
【０１６７】
本方法の好ましい形態において、免疫チェックポイント感作剤の組み合わせが、本方法で用いられ、上記組み合わせは、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、およびインターフェロンγまたはその機能性変異体を含む群から選択される少なくとも複数の同定された感作剤である。
【０１６８】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともレチノイド、例えば、トレチノインを含む。一例において、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともレチノイド、ならびにＣＤ４０アゴニストおよび／または抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体のいずれか１つまたは複数を含む。
【０１６９】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。一例において、免疫チェックポイント感作剤は、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）、抗ＩＬ−１０抗体、およびインターフェロンγまたはその機能性変異体を含む。別の例において、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ならびに抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはＣＤ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ４０抗体のいずれか１つまたは複数を含む。１つのこのような例において、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともインターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ならびに抗ＩＬ−１０抗体および／またはインターフェロンγもしくはその機能性変異体のいずれか１つまたは両方を含む。別の例において、免疫チェックポイント感作剤は、少なくともＣＤ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ４０抗体を含む。
【０１７０】
好ましくは、上記組み合わせは、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される、少なくとも複数の同定された感作剤である。理想的には、組み合わせは、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγの少なくとも３つの組み合わせ、またはＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγの抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、レチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸の組み合わせである。例えば、組み合わせは、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体であり得る。
【０１７１】
免疫チェックポイント阻害剤による免疫チェックポイント阻害に対して腫瘍の新生物細胞の少なくとも５％の応答がある場合、腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤に対して部分的に感作される。より好ましくは、応答は、免疫チェックポイント阻害剤による免疫チェックポイント阻害に対して腫瘍中の新生物細胞の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の応答である。本発明に特に好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤による免疫チェックポイント阻害に対して腫瘍の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０％の応答がある。例えば、少なくとも４０％の腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤による免疫チェックポイント阻害に応答する場合、腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤に対し部分的に感作される。
【０１７２】
好ましくは、本方法のステップ（ａ）での新生物細胞集団は、（ｉ）細胞を１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤に暴露し、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるこれらの細胞を同定すること、または（ｉｉ）腫瘍もしくは免疫起源のものであり得る細胞集団においてＳＴＡＴ１の活性を測定することであって、ＳＴＡＴ１タンパク質の活性化の不在（これは、閾値５０％で、細胞集団における核ＳＴＡＴ１またはリン酸化ＳＴＡＴ１のいずれかにより測定され得る）が、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）での細胞集団の耐性のバイオマーカーとして現れる、測定すること、のいずれかにより選択される。一例において、核ＳＴＡＴ１の測定の５０％の閾値は、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）での細胞集団の耐性のバイオマーカーを呈する。別の例において、リン酸化ＳＴＡＴ１の測定の５％の閾値は、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）での細胞集団の耐性のバイオマーカーを呈する。
【０１７３】
別の手段として、測定可能な量のナチュラルキラー細胞が腫瘍微小環境で検出された場合、腫瘍または新生物細胞集団は、免疫チェックポイント阻害剤に対して少なくとも部分的に感作される。ナチュラルキラー細胞が感受性の尺度として用いられる場合、患者の腫瘍浸潤白血球細胞の約２％のナチュラルキラー細胞数は典型的には、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性の変化を反映する。より好ましくは、ナチュラルキラー細胞数は、患者の腫瘍浸潤白血球細胞の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０％でなくてはならない。望ましくは、腫瘍浸潤白血球細胞の少なくとも５〜１０％のナチュラルキラー細胞数は典型的には、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性の変化を反映する。
【０１７４】
本発明の別の形態において、測定可能な量のナチュラルキラー細胞は、前処置レベルに対するこのような細胞の増加に反映され得る。このような測定が、前処置レベルに対して行われる場合、腫瘍におけるナチュラルキラー細胞の前処置レベルと比較してナチュラルキラー細胞の約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５％の相対的増加は典型的には、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性の変化を反映する。
【０１７５】
本方法の別の形態において、測定可能な量のＳＴＡＴ１バイオマーカーが細胞集団で検出された場合、ステップ（ｂ）の細胞は、免疫チェックポイント阻害剤に、十分な時間暴露されている。このような測定可能な量は、本明細書に記載されるように、核ＳＴＡＴ１試験においては好ましくは少なくとも４０％の応答であるが、より好ましく少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％の応答、および／またはリン酸化ＳＴＡＴ１試験においては少なくとも５％の応答である。
【０１７６】
本発明のこの好ましい形態において、ステップ（ｂ）での細胞集団は、ＳＴＡＴ１の活性化について周期的に（任意で、１時間ごと、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８時間ごとに）測定され、バイオマーカーＳＴＡＴ１の活性化および／または存在は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する細胞の感受性を示している。
【０１７７】
本発明の第１の態様の別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍微小環境の感受性を促進または増強するための、１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、感作剤（複数可）が、免疫治療の少なくとも３日前に、治療有効量で、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与される、使用が提供される。
【０１７８】
本発明の好ましい形態において、本方法はまた、１つまたは複数のチェックポイント感作剤が、十分なエフェクター免疫細胞（例えば、ＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１を産生するＮＫ細胞）を腫瘍または新生物細胞集団環境に誘引して、悪性状態に対する免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の有効性を高めた時点で免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップを含む。
【０１７９】
別の好ましい形態において、本方法は、１つまたは複数のチェックポイント感作剤が、腫瘍または新生物細胞集団環境で免疫エフェクターＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１の量を十分に増加させ、悪性状態に対する免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の有効性を高めた時点で免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップを含む。例えば、ＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１は、ＮＫ細胞および／または腫瘍もしくは新生物細胞集団により産生される。
【０１８０】
本発明によれば、本方法における使用のために選択される免疫チェックポイント阻害剤（複数可）は、抑制性Ｔ細胞分子ＣＴＬＡ−４を標的とするか、ならびに／またはプログラム死受容体（ＰＤ−１）および／もしくはＰＤ−リガンド（ＰＤ−Ｌ）経路、および／もしくはグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、および／もしくはリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ）３、ＣＤ１３４および／もしくはＯＸ４０としても知られる腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４、および／もしくは４１ＢＢ、および／もしくはＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有（ＴＩＭ）３を標的とする薬剤である。抑制性Ｔ細胞分子ＣＴＬＡ−４を標的とする薬剤の例は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブである。ＰＤ−１を標的とする薬剤の例は、ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、ニボルマブ、ＡＭＰ−２２４、ピジリズマブ、スパルタリズマブ、セミプリマブ、カムレリズマブ、チスレリズマブまたはペンブロリズマブである。ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬剤の例は、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブである。ＧＩＴＲを標的とする薬剤の例は、アンタゴニスト、例えば、ＴＲＸ５１８またはＭＫ４１６６である。ＬＡＧ３を標的とする薬剤の例は、ＢＭＳ−９８６０１６、ＢＩ７５４１１１、ＬＡＧ−５２５またはＲＥＧＮ−３７６７である。ＯＸ４０を標的とする薬剤の例は、ＢＭＳ９８６１７８、ＭＥＤＩ６４６９、ＧＳＫ３１７４９９８、ＰＦ−０４５１８６００である。ＴＩＭ３を標的とする薬剤の例は、ＬＹ３３２１３６７、ＭＢＧ４５３またはＴＳＲ−０２２である。４１ＢＢを標的とする薬剤の例は、ＰＦ−０５０８２５６６である。
【０１８１】
第２の態様によれば、本発明は、腫瘍を感作する薬剤の製造における、治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、上記腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に耐性である、使用に属する。
【０１８２】
関連する実施形態において、本発明は、腫瘍を感作する薬剤の製造における、治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、上記腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に耐性であり、上記薬剤がＮＫ細胞（例えば、活性化ＳＴＡＴ１および／またはＩＦＮγを産生するＮＫ細胞）の数を増加させるか、ならびに／または新生物細胞および／もしくは腫瘍細胞および／もしくはＮＫ細胞によるＩＦＮγおよび／もしくは活性化ＳＴＡＴ１の産生を増加させる、使用に属する。
【０１８３】
好ましくは、薬剤は、免疫治療の少なくとも３日前に、免疫チェックポイント感作剤を、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与するための指示書を含む。
【０１８４】
好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。より好ましくは、免疫チェックポイント感作剤は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される。特に好ましい形態において、免疫チェックポイント感作剤の組み合わせが、本方法で用いられ、上記組み合わせは、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγを含む群から選択される、少なくとも複数の同定された感作剤である。理想的には、組み合わせは、抗ＩＬ−１０、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγ、または抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、レチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸もしくはＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγの少なくとも３つの組み合わせである。例えば、組み合わせは、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体であり得る。
【０１８５】
第３の態様によれば、本発明は（１）悪性状態または（２）癌の外科手術切除後または（３）任意の他の形態の補助免疫治療前、治療中もしくは治療後、のいずれかの患者を処置する方法であって、
ａ．１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍または新生物細胞集団（複数可）を同定するステップと、
ｂ．腫瘍が免疫チェックポイント阻害剤に対して少なくとも部分的に感作されるまで、免疫治療前に少なくとも３日間、治療有効量の１つもしくは複数の免疫チェックポイント感作剤を、ステップ（ａ）で同定された腫瘍もしくは新生物細胞集団（複数可）に投与するか、または上記腫瘍もしくは新生物細胞集団（複数可）を上記感作剤に暴露するステップ
を含む、方法に属する。
【０１８６】
本発明の第３の態様の好ましい形態において、本方法はまた、１つまたは複数のチェックポイント感作剤が、十分なエフェクター免疫細胞（例えば、ＩＦＮγおよび／またはＳＴＡＴ１を産生するＮＫ細胞）を腫瘍または新生物細胞集団環境に誘引して悪性状態に対する免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の有効性を高めた時点で免疫治療または免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップを含む。
【０１８７】
好ましくは、本方法のステップ（ａ）での腫瘍細胞集団は、（ｉ）細胞を１つもしくは複数の免疫チェックポイント阻害剤に暴露し、これらの細胞が免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定すること、または（ｉｉ）腫瘍もしくは免疫起源のものであり得る細胞集団においてＳＴＡＴ１の活性を測定することであって、ＳＴＡＴ１タンパク質の５０％の活性化の不在（例えば、核ＳＴＡＴ１試験またはリン酸化ＳＴＡＴ１試験による）が免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）の細胞集団の耐性のバイオマーカーとして現れる、測定すること、のいずれかにより同定される。別の例において、ＳＴＡＴ１タンパク質の５％のリン酸化の不在（リン酸化ＳＴＡＴ１試験）は、免疫チェックポイント阻害剤に対するステップ（ａ）の細胞集団の耐性のバイオマーカーとして現れる。
【０１８８】
本方法の別の好ましい形態において、上記方法は、（ｉ）ＳＴＡＴ１タンパク質の少なくとも５０％の活性化（例えば、核ＳＴＡＴ１試験またはリン酸化ＳＴＡＴ１試験による）が細胞集団で検出された場合、および／または（ｉｉ）測定可能な量のナチュラルキラー細胞が腫瘍微小環境で検出された場合、ステップ（ｂ）の細胞を免疫チェックポイント阻害剤に暴露する追加のステップを含む。
【０１８９】
本方法の別の好ましい形態において、上記方法は、（ｉ）ＳＴＡＴ１タンパク質の少なくとも５％の活性化（リン酸化ＳＴＡＴ１試験により測定）が細胞集団で検出された場合、および／または（ｉｉ）測定可能な量のナチュラルキラー細胞が腫瘍微小環境で検出された場合、ステップ（ｂ）の細胞を免疫チェックポイント阻害剤に暴露する追加のステップを含む。
【０１９０】
本発明の方法において、患者に投与される感作治療剤の量は、免疫チェックポイント剤に対し患者の新生物細胞を感作するのに十分な量である。とりわけ、この目的に有効な薬剤（複数可）の量は、用いられる薬剤のタイプ、ならびに状態のタイプ、状態のステージ、対象の体重、対象の状態の重症度および投与方法を含む各症例の特定の要因に応じて異なる。これらの量は、当業者により容易に決定され得る。
【０１９１】
本発明の第３の態様の一実施形態において、患者において、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性を促進または増強するための、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγから選択される１つまたは複数の感作治療剤の使用であって、感作治療剤が、免疫治療の少なくとも３日前に、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与される、使用が提供される。
【０１９２】
本方法の別の好ましい形態において、上記方法は、（ｉ）測定可能な量の活性化ＳＴＡＴ１および／もしくはＩＦＮγが細胞集団で検出された場合、ならびに／または（ｉｉ）測定可能な量のナチュラルキラー細胞（例えば、活性化ＳＴＡＴ１および／またはＩＦＮγを産生するＮＫ細胞）が腫瘍もしくは細胞集団細胞微小環境で検出された場合、ステップ（ｂ）の細胞を免疫チェックポイント阻害剤に暴露する追加のステップを含む。
【０１９３】
本発明の第３の態様の一実施形態において、患者において免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性を促進または増強するための、１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤の使用であって、感作剤（複数可）が、免疫治療の少なくとも３日前に、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与される、使用が提供される。一例において、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、その場合にはさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時に投与され得る。例えば、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、その場合にはさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時にＩＣＢ治療継続期間中、例えば、最大少なくとも３か月、もしくは少なくとも１０か月、もしくは少なくとも９か月、もしくは少なくとも１２か月、もしくは少なくとも１３か月、もしくは少なくとも１４か月、もしくは少なくとも１５か月、もしくは少なくとも１６か月、もしくは少なくとも１７か月、もしくは少なくとも１８か月、もしくは少なくとも１９か月、もしくは少なくとも２０か月、もしくは少なくとも２１か月、もしくは少なくとも２２か月、もしくは少なくとも２３か月、もしくは少なくとも２４か月、または２年超投与され得る。
【０１９４】
第４の態様によれば、本発明は、腫瘍または新生物細胞集団を有する患者を処置する方法であって、免疫治療前に、腫瘍または新生物細胞集団を、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体の治療有効量の組み合わせで、免疫細胞、特にＩＦＮγを産生するＮＫ細胞を腫瘍に誘引するのに十分な時間処置して、免疫チェックポイント阻害に対し腫瘍を感作するステップを含む、方法に属する。本発明のこの態様の一形態において、組み合わせは、免疫治療前に腫瘍と少なくとも３日間接触される。より詳細には、組み合わせは、免疫治療前に、臨床基準の非毒性用量で、腫瘍と３日〜５週間接触される。
【０１９５】
第５の態様によれば、本発明は、悪性状態での免疫チェックポイント阻害剤の有効性を高めるための少なくとも１つの免疫チェックポイント感作剤（複数可）を含む感作治療剤に属する。好ましくは、感作組成物は、少なくとも複数の同定された薬剤の組み合わせである。理想的には、組み合わせは、抗ＩＬ−１０抗体、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびインターフェロンγ、または抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、もしくはレチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸およびインターフェロンγの少なくとも３つの組み合わせである。例えば、組み合わせは、ＳＴＡＴ１活性化サイトカインＩＦＮγ、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０抗体であり得る。組成物ごとに、免疫治療剤が含まれ得、これは、感作治療用組成物の有効性に効果があった時点で、感作治療用組成物の後に投与され得る。
【０１９６】
本発明によれば、
ａ）治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤、および
ｂ）薬学的に許容される担体
を含む、感作治療剤も提供される。
【０１９７】
本発明による感作治療剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドの１つまたは複数を含み得る。一例において、感作治療剤は、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ＴＬＲ３リガンドポリ（Ｉ：Ｃ）、レチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸および／またはインターフェロンγを含み得る。例えば、感作治療剤は、単剤治療として提供され得る。好ましくは、感作治療剤は、腫瘍細胞を感作するその生物学的効果を発揮するように一緒に機能する治療剤の組み合わせとして提供される。
【０１９８】
本発明の治療剤は、本発明の組成物を製造するために様々な成分と組み合わせられ得る。このような組成物は、例えば、投与様式との適合性に対して選択される薬学的または生理学的に許容される製剤と混合して、治療有効量の化合物中に同定された治療剤の１つまたは複数を含み得る。
【０１９９】
本発明の薬剤はまた、医薬組成物を製造するために薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせられ得る。好適な担体および希釈剤としては、等張性生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合でない限り、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分も組成物に組み込まれ得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（１９９５、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）を参照のこと。
【０２００】
医薬組成物はまた、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着または浸透を変更、維持または保持するための製剤材料を含有し得る。好適な材料としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌剤；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤；単糖、二糖；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味料および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリぺプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存料（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ，ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール）；安定性向上剤（スクロースまたはソルビトール）；張度増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的補助薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
組成物における治療用途の最適な濃度は、例えば、意図される投与経路、送達形態および所望の投与量に応じて当業者により決定される。
【０２０２】
このような組成物は、本発明のペプチドの物理的状態、安定性、インビボ遊離速度、インビボクリアランス速度に影響を与え得る。さらに、医薬組成物の好ましい形態は、意図される投与様式および治療適用に依存する。
【０２０３】
本発明の一実施形態によれば、悪性状態に対し免疫チェックポイント阻害剤が有する応答を増強する、アゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ポリＩ：Ｃ、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγから選択される治療用組成物に属する。
【０２０４】
治療用の組み合わせにおける薬剤の投与は、同時、順次または交互に行われ得る。同時投与は、感作治療剤および免疫チェックポイント阻害剤を本質的に同時に投与することを指す。同時共投与について、一連の処置も同時に行われ得る。例えば、単一の組み合わせ剤形の薬剤が患者に投与され得る。
【０２０５】
一例において、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、その場合にさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時に投与され得る。例えば、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、その場合にさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時にＩＣＢ治療継続期間中、例えば、最大少なくとも３か月、もしくは少なくとも６か月、もしくは少なくとも９か月、もしくは少なくとも１０か月、もしくは少なくとも１１か月、もしくは少なくとも１２か月、もしくは少なくとも１３か月、もしくは少なくとも１４か月、もしくは少なくとも１５か月、もしくは少なくとも１６か月、もしくは少なくとも１７か月、もしくは少なくとも１８か月、もしくは少なくとも１９か月、もしくは少なくとも２０か月、もしくは少なくとも２１か月、もしくは少なくとも２２か月、もしくは少なくとも２３か月、もしくは少なくとも２４か月、または２年超投与され得る。
【０２０６】
本発明の組成物は、単位用量または複数回用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルで提供され得る。
【０２０７】
持続または制御送達製剤中に本発明のペプチドを含む製剤を含む、さらなる医薬組成物が、当業者には明らかであろう。様々な他の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体分解性微粒子または多孔質ビーズおよび蓄積注射を製剤化する技術も当技術分野で知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出について記載するＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。持続放出調製物のさらなる例としては、成形物品の形態で半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、エチレン酢酸ビニルまたはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を挙げることができる。持続放出組成物としてはまた、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかにより調製され得るリポソームが挙げられ得る。このような組成物は、ある治療剤の送達、次いで第２の放出のための手段を提供し得る。これを例示するために、本発明の治療剤が最初に患者に送達され、次いで時間差で免疫治療剤が送達され得る。
【０２０８】
治療的に用いられる治療用組成物の治療剤の有効量は、例えば、治療状況および目標に依存する。したがって、当業者は、処置に適した投与量レベルが、送達される分子、治療剤が用いられる適応症、投与経路およびサイズ（体重、体表または器官のサイズ）ならびに患者の状態（年齢および全体的な健康）に応じて異なることを理解するであろう。したがって、臨床医は、投与量の力価を測り、最適な治療効果を得るために投与経路を変更し得る。典型的な投与量は、上記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。他の実施形態において、投与量は、０．１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２０９】
投与の頻度は、用いられる治療剤および製剤の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで治療剤を投与する。したがって、治療剤は、単回用量として、または経時的に２回以上の用量（これは、同量の所望の分子を含有していてもよく、または含有していなくてもよい）として、または移植デバイスもしくはカテーテルを介する連続注入として投与され得る。適当な投与量のさらなる精緻化は、当業者により日常的に行われ、当業者が日常的に行う業務の範囲内である。適当な投与量は、適当な用量応答データの使用を介して確認できる。
【０２１０】
医薬組成物の投与経路は、経口、静脈内、冠内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内、腫瘍内または病巣内経路による注射を介する；持続放出系または移植物によるなどの公知の方法に従う。所望される場合、組成物はボーラス注射により、または注入により連続的に、または移植デバイスにより投与され得る。
【０２１１】
好ましくは、本発明の組成物は、病巣内、腫瘍内、筋膜上、関節内、皮内、筋肉内、眼窩内、腹腔内（特に、局在的な局所治療の場合）、脊髄内、胸骨内、血管内、静脈内、実質、腫瘍内または皮下を含むがこれらに限定されない、注射により送達される。
【０２１２】
非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療剤は、薬学的に許容されるビヒクル中に本発明の所望のペプチドを含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは無菌蒸留水であり、その中に活性剤が、無菌等張液として製剤化され、適切に保存される。さらに別の調製物は、蓄積注射として送達され得る製品の制御または持続放出をもたらす、注射可能なミクロスフェア、生体分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの薬剤を用いた所望の分子の製剤化を含み得る。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中での持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入に好適な他の手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０２１３】
一実施形態において、治療剤は、吸入用に製剤化され得る。例えば、ペプチドは、吸入用の乾燥粉末として製剤化され得る。治療用吸入液はまたエアロゾル送達用の噴霧剤を用いて製剤化され得る。さらに別の実施形態において、溶液は噴霧され得る。
【０２１４】
また、特定の治療剤が経口投与され得ることが企図される。例えば、治療剤は、バイオアベイラビリティが最大化され、プレシステミック分解が最小化される時点で胃腸管中で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、活性剤の吸収を促進するために含まれ得る。希釈剤、着香料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤および結合剤も用いられ得る。あるいは、治療剤は、錠剤の形態で非毒性の賦形剤と共に調製され得る。
【０２１５】
あるいはまたはさらに、組成物は、所望の分子が吸収または封入されている膜、スポンジまたは他の適当な材料の移植により局所投与され得る。移植デバイスが用いられる場合、デバイスはいずれかの公的な組織または器官に移植され得、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス、または継続投与によるものであり得る。
【０２１６】
場合によっては、エクスビボで本明細書の医薬組成物を使用することが所望され得る。このような場合、処置される対象から除去された細胞、組織または器官が治療剤に暴露され、その後上記細胞、組織および／または器官は次いで対象に移植し戻される。
【０２１７】
本発明によれば、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感作における使用のための治療用組成物であって、
ａ．治療有効量のアゴニストＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０、ＴＬＲ３リガンドポリＩ：Ｃ、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸）および／またはインターフェロンγの１つまたは複数、および
ｂ．薬学的に許容される担体
を含む、治療用組成物も提供される。
【０２１８】
好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感作における使用のための治療用組成物は、少なくとも複数の同定された薬剤の治療有効量の組み合わせから本質的になる。理想的には、組成物は、少なくとも抗ＩＬ−１０、ポリＩ：Ｃおよびインターフェロンγ、または抗ＣＤ４０、抗ＩＬ−１０、およびインターフェロンγの治療有効量の組み合わせからなる。
【０２１９】
治療用の組み合わせにおける薬剤の投与は、同時、順次または交互に行われ得る。同時投与は、治療剤および免疫チェックポイント阻害剤を本質的に同時に投与することを指す。同時共投与について、一連の処置も同時に行われ得る。例えば、単一の組み合わせ剤形の薬剤が患者に投与され得る。
【０２２０】
一例において、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、その場合にさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時に投与され得る。例えば、１つまたは複数の感作剤（複数可）は、その場合にさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時にＩＣＢ治療継続期間中、例えば、最大少なくとも３か月、もしくは少なくとも６か月、もしくは少なくとも９か月、もしくは少なくとも１０か月、もしくは少なくとも１１か月、もしくは少なくとも１２か月、もしくは少なくとも１３か月、もしくは少なくとも１４か月、もしくは少なくとも１５か月、もしくは少なくとも１６か月、もしくは少なくとも１７か月、もしくは少なくとも１８か月、もしくは少なくとも１９か月、もしくは少なくとも２０か月、もしくは少なくとも２１か月、もしくは少なくとも２２か月、もしくは少なくとも２３か月、もしくは少なくとも２４か月、または２年超投与され得る。
【０２２１】
第６の態様によれば、本発明は、
腫瘍または新生物細胞集団を処置するためのキットであって、
ａ）治療有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイント感作剤、および
ｂ）免疫治療の少なくとも３日前に、免疫チェックポイント感作剤を、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に耐性である腫瘍に投与するための指示書、
を含む、キットに属する。
【０２２２】
好ましくは、キットはまた、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫治療剤、ならびに１つまたは複数のチェックポイント感作剤が十分なエフェクター免疫細胞（例えば、ＩＦＮγを産生するＮＫ細胞）を腫瘍または新生物細胞集団環境に誘引したら薬剤（複数可）を腫瘍または新生物細胞集団に投与するための指示書を含む。この効果は、腫瘍細胞を感作させて、悪性状態に対する免疫チェックポイント阻害剤の有効性を高めるためである。
【０２２３】
第７の態様によれば、本発明は、免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測する診断方法であって、
ａ）腫瘍におけるＳＴＡＴ１活性化を測定するステップと、
ｂ）腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定するステップであって、バイオマーカーＳＴＡＴ１の活性化および／または局在化が、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を発現する細胞を示す、ステップ
を含む、診断方法に属する。
【０２２４】
望ましくは、ＳＴＡＴ１は、核ＳＴＡＴ１試験により測定されるか、またはリン酸化ＳＴＡＴ１試験が用いられる。これらの試験において、リン酸化ＳＴＡＴ１の少なくとも５０％の陽性染色または同定の尺度は、免疫チェックポイント阻害剤による免疫治療に対する腫瘍細胞集団の感作の指標として十分である。
【０２２５】
第８の態様によれば、本発明は、免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測する診断方法であって、
ａ）腫瘍におけるナチュラルキラー細胞の存在を測定するステップと、
ｂ）腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定するステップであって、ナチュラルキラー細胞の活性化および／または存在が、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を発現する細胞を示す、ステップ
を含む、診断方法に属する。
【０２２６】
ナチュラルキラー細胞が、感受性の尺度として用いられる場合、患者の腫瘍浸潤白血球細胞の約２％のナチュラルキラー細胞数は典型的には、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性の変化を反映する。より好ましくは、ナチュラルキラー細胞数は、患者の腫瘍浸潤白血球細胞の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０％でなくてはならず、典型的には、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性の変化を反映する。望ましくは、腫瘍浸潤白血球細胞の少なくとも５〜１０％のナチュラルキラー細胞数は典型的には、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性の変化を反映する。
【０２２７】
本発明の別の形態において、測定可能な量のナチュラルキラー細胞は、前処置レベルに対するこのような細胞の増加に反映され得る。このような測定が、前処置レベルに対して行われる場合、腫瘍におけるナチュラルキラー細胞の前処置レベルと比較して、ナチュラルキラー細胞の約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５％の相対的増加は典型的には、免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性の変化を反映する。
【０２２８】
さらなる態様によれば、本発明は免疫チェックポイント阻害に対する応答を予測する診断方法であって、
ａ）細胞集団におけるＳＴＡＴ１活性化および／またはＩＦＮγ産生を測定するステップと、
ｂ）腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤に耐性であるか否かを決定するステップであって、バイオマーカーＳＴＡＴ１の活性化および／または存在が、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を発現する腫瘍細胞を示す、ステップ
を含む、診断方法に属する。
【０２２９】
好ましくは、ＳＴＡＴ１活性化および／またはＩＦＮγ産生の測定は、ＳＴＡＴ１活性化および／またはＩＦＮγおよび／または新生物細胞集団および／または腫瘍を測定することを含む。
【０２３０】
本発明の第９の態様によれば、対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、ならびに／または対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境で、ＮＫ細胞を固定化するか、またはＮＫ細胞の数を増加させる方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【０２３１】
好ましくは、１つまたは複数の感作剤は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、または新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境で対象に投与される。
【０２３２】
好ましくは、ＮＫ細胞はＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質を産生する。
【０２３３】
本発明の第１０の態様によれば、例えば、対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、ならびに／または対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境において、対象中のＮＫ細胞によりＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を誘導するか、または増加させる方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【０２３４】
好ましくは、１つまたは複数の感作剤は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、または新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境で対象に投与される。
【０２３５】
本発明の第１１の態様において、対象中の新生物細胞および／または腫瘍によりＩＦＮγおよび／または活性化ＳＴＡＴ１タンパク質の産生を誘導するか、または増加させる方法であって、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による対象の処置前に、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体から選択される１つまたは複数の感作剤を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【０２３６】
好ましくは、１つまたは複数の感作剤は、新生物細胞および／もしくは腫瘍の部位で、または新生物細胞および／もしくは腫瘍の細胞微小環境で対象に投与される。
【０２３７】
一例において、本方法は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による処置前に、１つまたは複数の感作剤を対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍に投与するか、または対象中の新生物細胞および／もしくは腫瘍を１つもしくは複数の感作剤に暴露することを含む。
【０２３８】
一例において、本明細書に記載の本発明の任意の広範な態様、実施形態、形態または実施例によれば、免疫チェックポイント感作剤は、ＣＤ４０アゴニスト、抗ＩＬ−１０抗体、インターフェロンα／βシグナル伝達の誘導因子、インターフェロンγもしくはその機能性変異体および／またはレチノイドから選択される。
【０２３９】
一例において、本明細書に記載の本発明の任意の態様、実施形態、形態または実施例によれば、新生物腫瘍は、悪性腫瘍または良性腫瘍である。
【０２４０】
一例において、本明細書を通じて記載される本発明の任意の態様、実施形態、形態または実施例によれば、新生物細胞または細胞集団は、悪性または良性である。
【０２４１】
１つの好ましい例において、新生物細胞または細胞集団は、黒色腫腫瘍、非小細胞肺癌腫瘍、メルケル細胞癌腫瘍、マイクロサテライト不安定性結腸直腸癌腫瘍、腎癌腫瘍および／または中皮腫癌腫瘍から選択される１つまたは複数の癌腫瘍細胞を含む。
【０２４２】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために利用されるものであり、限定として解釈されるべきではない。
【０２４３】
実施例１：試験設計
後続する実施例に示す試験は、同じマウス癌モデル内のＩＣＢ応答性および非応答性腫瘍からの遺伝子発現データおよびフローサイトメトリーデータを比較することによる有効な結果に関連する、免疫チェックポイント阻害剤（複数可）での処置前の新生物細胞微小環境を定義しようとするものである。
【０２４４】
後続する実施例に示す試験はまた、腫瘍微小環境を応答表現型、すなわち、ＩＣＢ剤による処置の影響を受けやすい表現型に向けて治療的に促進または増強し、したがってＩＣＢに対する応答を増加させる方法を実証しようとするものでもある。
【０２４５】
腫瘍をマウスの両側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）移植することにより、ＩＣＢによる処置の１時間前に１つの腫瘍全体を除去し、次いで、残りの腫瘍をＩＣＢに対する応答についてモニターすることが可能であった。除去した腫瘍を、フローサイトメトリー、バルク全トランスクリプトームショットガン配列決定（バルクＲＮＡｓｅｑ）または単一細胞全トランスクリプトームショットガン配列決定（単一細胞ＲＮＡｓｅｑ）により分析し、ｉｎ  ｓｉｔｕで残存する、対応する腫瘍の結果に基づき、応答性または非応答性腫瘍として分類した。中間の応答（部分応答または再発）を示した腫瘍を分析から除外した。これらの実験を、ＡＢ１中皮腫およびＲｅｎｃａ腎細胞癌細胞株を用いて行った。
【０２４６】
マウスモデル特異的作用を排除するため、両方のモデルの応答性腫瘍と非応答性腫瘍の間で差次的に発現した遺伝子に注目した。Ｈａｒｔらにより開発された方法（Ｓ．Ｎ．Ｈａｒｔら（２０１３）Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｓｉｚｅ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２０、９７０〜９７８に詳述されている）を用いて、バルクＲＮＡｓｅｑ実験用の試料サイズを推定した。
【０２４７】
次いで、トランスクリプトームデータを用いて、標的とされ得る経路および調節因子を同定した。２人の患者コホートからの公的に入手可能なＲＮＡｓｅｑデータを用いて、知見を検証した（Ｎ．Ｒｉａｚら（２０１７）Ｃｅｌｌ  １７１、９３４〜９４９  ｅ９１５；およびＳ．Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８）。エンドポイントとして腫瘍増殖を用いたインビボ標的化試験を利用した。
【０２４８】
これらの試験を、ＡＢ１およびＲｅｎｃａ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスで行い、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの無関係の皮下ＡＥ１７中皮腫およびＢ１６黒色腫モデルで検証して、腫瘍モデルおよびマウス系統にわたってロバスト性を確立した。腫瘍が定着した後でマウスを無作為化し、その後腫瘍の除去および治療を行った。１名の研究者が処置を行い、処置割付について盲目である別の研究者が腫瘍を測定した。詳細な試料サイズの計算および統計的分析を以下の実施例２で概説する。
【０２４９】
実施例２：方法および材料
１．マウス
生後８〜１２週のＢＡＬＢ／ｃＡｒｃ、ＢＡＬＢ／ｃＪＡｕｓｂおよびＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスをすべての実験に使用した。マウスをＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｍｕｒｄｏｃｈ、ＷＡ、オーストラリア）またはＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｍｏｓｓ  Ｖａｌｅ、ＭＳＷ）から得、特定病原体フリーの条件下でＨａｒｒｙ  Ｐｅｒｋｉｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。マウスにラットおよびマウス用固形食（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｆｅｅｄｓ、Ｇｌｅｎ  Ｆｏｒｒｅｓｔ、オーストラリア）を給餌し、水は自由に摂取させた。ケージ（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ、イタリア）は濾過空気で個々に換気され、アスペンチップの寝具（Ｔａｐｖｅｉ、エストニア）を含有し、環境強化としてティッシュ、段ボール紙および木材ブロックが補給された。ケージを１４日ごとに交換した。マウスを２１〜２２℃、１２時間の明／暗サイクル（０６：００〜１８：００）で収容した。動物施設のセンチネルマウス（ｎ＝３）を、細菌および真菌、外寄生生物、内寄生生物、非病原性原虫ならびにウイルスの標準的パネルについて、毎月スクリーニングした（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。実験はすべて、Ｈａｒｒｙ  Ｐｅｒｋｉｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ医学研究動物倫理委員会（承認番号ＡＥ０７、ＡＥ０４７、ＡＥ０９１）により提供される機関ガイドラインに準拠して行われた。
【０２５０】
２．細胞培養
マウス中皮腫細胞株ＡＢ１およびＡＥ１７をＣｅｌｌ  Ｂａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａから得た。マウス腎皮質腺癌細胞株ＲｅｎｃａはＤｒ  Ｅ．ＳｏｔｏｍａｙｏｒおよびＤｒ  Ｆ．Ｃｈｅｎｇ（サウスフロリダ大学、Ｔａｍｐａ、ＦＬ）から寄贈されたが、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ；ＣＲＬ−２９４７）から得ることもできる。マウス黒色腫細胞株Ｂ１６をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ；ＣＲＬ−６４７５）から得た。細胞株を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００単位／ｍｌペニシリン（ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、オーストラリア）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｄａｖｉｄ  Ｂｕｌｌ  Ｌａｂｓ、Ｋｅｗｄａｌｅ、オーストラリア）および１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｕｌｇｒａｖｅ、オーストラリア）中で維持した。細胞を７０〜８０％に増殖させた後、継代培養し、３〜５回継代培養した後、接種した。細胞はマイコプラズマについてＰＣＲにより高頻度で試験され、陰性のままであった。細胞株を、ＭＨＣクラスＩ分子Ｈ２−Ｋｂ（Ｃ５７ＢＬ／６と一致）およびＨ２−Ｋｂ（ＢＡＬＢ／ｃと一致）について、ならびに線維芽細胞マーカーＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）（陰性）についてフローサイトメトリーにより、メソテリンについてＰＣＲ（ＡＢ１は陽性、Ｒｅｎｃａは陰性）により毎年検証した。
【０２５１】
３．インビボ処置
細胞株が７０〜８０％コンフルエントであった場合、細胞株を採取して、ＰＢＳで３回洗浄した。注射ごとに単一の２６Ｇ針を用いて１００μｌ中５×１０５細胞を下方右手側（ＲＨＳ）側腹部（単回腫瘍接種）または両側腹部（二重腫瘍接種）に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。腫瘍接種の約３〜５日後、腫瘍が蝕知可能になったら、マウスを無作為化した。主要エンドポイントの盲検評価を保証するために、処置割付に盲目である研究者が、カリパーを用いて腫瘍を１週間に少なくとも３回測定した。
【０２５２】
４．外科的実験
腫瘍接種の７日後（ＡＢ１）または１０日後（Ｒｅｎｃａ）、腫瘍が約９ｍｍ２であったら、マウスに１００μｌ中０．１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを皮下投与し（３０分前）、イソフルラン（２Ｌ／分の流速で１００％酸素中４％）を用いて麻酔した。ＲＨＳの腫瘍全体および対応する排出側鼠径リンパ節を外科的切除により除去し、ＲＮＡｓｅｑ用にＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア）中に、または単一細胞ＲＮＡｓｅｑもしくはフローサイトメトリー用に冷ＰＢＳ中にすぐに浸漬した。創傷をステープル（Ａｂｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オーストラリア）で封止した。マウスをリカバリー用の加熱ボックスに入れた。手術の１時間後、マウスに免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＢ）を投与した。除去した腫瘍の応答の指標として、残りの腫瘍を応答についてモニターした。腫瘍が完全に退行し、処置後最大で４週間腫瘍なしの状態であった場合、マウスを「応答者」として指定した。生理食塩水処置対照と同様に、腫瘍が処置開始から４週間以内に１００ｍｍ２に増殖した場合、マウスを「非応答者」として指定した。腫瘍増殖の遅延または部分的退行を有するマウスを、「中間応答者」として指定し、分析から除外した。内部の一貫性のために、実験は、マウスが二分する応答を示した場合のみ行われた。すなわち、いずれのケージにおいても、応答者の中に少なくとも１匹の非応答者が存在しなくてはならず、またその逆も然りである。
【０２５３】
５．インビボ免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）処置
抗ＰＤ−Ｌ１ハイブリドーマ（クローンＭＩＨ５（Ｂｉｏｃｅｒｏｓ、オランダ）および抗ＣＴＬＡ４ハイブリドーマ（クローン９Ｈ１０）（Ｂｉｏｃｅｒｏｓ、オランダ）を１％のＦＣＳおよびゲンタマイシンを含有するＩＭＤＭ中で培養した。精製された上清を使用して、アフィニティクロマトグラフィーを用いて抗体を精製した。抗体をＰＢＳ中で無菌で製剤化した。マウスに、１００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で組み合わせた１００μｇの抗ＣＴＬＡ４および１００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１の腹腔内（ｉ．ｐ．）用量を投与した。２〜４日後、マウスに１００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１の追加用量を投与した。ビヒクル対照にはＰＢＳを単独投与した。本発明者らによる先の実験において（Ｗ．Ｊ．Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓら（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ８、ｅ６１８９５）、対照ＩｇＧ対ＰＢＳの効果に何ら違いが見出されず、したがってビヒクル対照にはＰＢＳを単独投与した。ＩＣＢに対する好適なバックグラウンド応答率；応答が否定されるであろう実験については高く、応答率が改善されるであろう実験においては低い、を得るために、処置開始時間を腫瘍接種後に変更した。
【０２５４】
６．ＲＮＡ配列決定のための腫瘍の調製
バルクＲＮＡｓｅｑ、フローサイトメトリーおよび単一細胞ＲＮＡｓｅｑを、別個の実験からの腫瘍で行った。
【０２５５】
ＲＮＡｓｅｑのために、腫瘍全体およびリンパ節を外科的に切除し、周辺組織を除去し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア）にすぐに浸漬した。試料を４℃で２４時間貯蔵した後、上清を除去し、試料を−８０℃に移した。
【０２５６】
凍結した腫瘍を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒ（ＱＩＡｇｅｎ、オーストラリア）を用いてトリゾール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア）中で解離した。ＲＮＡを、クロロホルムを用いて抽出し、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（ＱＩＡｇｅｎ、オーストラリア）で精製した。ＲＮＡ試料の完全性を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）で確認した。ライブラリー調製および配列決定（５０ｂｐ、シングルエンド）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ標準プロトコルを用いて、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより行った。
【０２５７】
７．単一細胞ＲＮＡｓｅｑ
単一細胞ＲＮＡｓｅｑのために、腫瘍を採取し、冷ＰＢＳに浸漬し、メス刃で１〜２ｍｍ片に切断し、単一細胞プロファイリング用に処理されるまで、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）を用いて解離した。凍結保存した細胞を急速解凍し、ＰＢＳで希釈し、ペレットにした。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、４０μＭのフィルターに通して細胞塊を除去した。次いで、１試料あたり約５，０００個の細胞を１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒに充填して、クロム単一細胞３’ライブラリーを生成した。配列決定を、オーストラリア、メルボルンのＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより行った。
【０２５８】
一次解析を、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒソフトウェアスイートを用いて行った。生の配列決定データをデマルチプレックスし（Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ  ｖ２．１．１およびｂｃｌ２ｆａｓｔｑ  ｖ２．２０．０．４２２）、リードを参照に整列させ（ＧＲＣｍ３８、Ｅｎｓｅｍｂｌビルド８４）、遺伝子発現を、Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒカウントコマンドを用いて定量した。デフォルトパラメータを用いて、実際の細胞を含有するいくつかの液滴を廃棄した。したがって、予想細胞６０００ＦＬＡＧを使用して、これらの細胞を包含した。応答者および非応答者の試料を、Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ  Ａｇｇｒ関数を用いて組み合わせた。試料中のすべての細胞を、Ｄ．Ａｒａｎら（２０１８）ＢｉｏＲｘｉｖ、２８４６０４に記載されるようにＳｉｎｇｌｅＲソフトウェアパッケージでアノテーションした。
【０２５９】
８．フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために、腫瘍を採取し、冷ＰＢＳ中にすぐに浸漬し、メス刃で１〜２ｍｍ片に切断し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムを用いて解離した。Ｆｃブロック（抗ＣＤ１６／ＣＤ３２、ＢＤ）を氷上で１０分間使用した。Ｚｏｍｂｉｅ  ＵＶ生死判定試薬（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して生細胞を弁別した。細胞を、ＦｏｘＰ３  ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて透過処理および固定した後、抗体をＲＴで２０分間添加した。抗体の詳細については附表２を参照のこと。細胞を、獲得まで安定化固定液中で維持した。データをＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。
【０２６０】
細胞集団を単球（ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋／−、Ｌｙ６Ｃ＋、Ｆ４／８０−、ＣＤ１１ｃ−）；マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｃ＋／−、Ｌｙ６Ｃ−、Ｌｙ６Ｇ−）；未熟骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ−、Ｆ４／８０＋、Ｌｙ６Ｃ−、Ｌｙ６Ｇ−）；好中球／顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ＋、ＭＨＣ−、Ｌｙ６Ｃｉｎｔ、Ｆ４／８０−）；ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ８＋）；ＣＤ４ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３−）；Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋）；ＮＫ細胞（ＣＤ３３５＋、ＣＤ３−）；およびＢ細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ３−）と定義した。使用したゲーティング戦略については図２５を参照のこと。また、使用したフローサイトメトリー法における細胞検出で使用する抗体のリストについては図２６を参照のこと。
【０２６１】
ＩＮＦγの検出のために、細胞をブレフェルジンＡと３７℃で４時間インキュベートした。Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｉｎ６２０（ＢＤ）を使用して、死細胞を同定した。細胞を、抗体でＲＴにて２０分間表面染色した。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ）での透過処理後、細胞を、Ｐｅｒｍｗａｓｈ（ＰＢＳ／０．１％サポニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））中のＩＮＦγ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で３０分間氷上染色した。
【０２６２】
ホスホ−ＳＴＡＴ１の検出のために、解離した腫瘍を表面抗体で染色し、１．５％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、次いで、氷冷メタノールで４℃にて１０分間透過処理した。細胞を、ウサギ抗ｐＳＴＡＴ１抗体（Ｔｙｒ７０１）−ＰＥ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で室温（ＲＴ）にて３０分間染色した。
【０２６３】
細胞内ＮＫ／ＩＬＣマーカーの検出のために、細胞を、ＦｏｘＰ３緩衝液キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて透過処理した。
【０２６４】
９．ＩＣＢ感作薬投与スケジュール
前処置薬の投与を、ＡＢ１およびＲｅｎｃａについて１５日目、ＡＥ１７について１０日目またはＢ１６について８日目に開始した。
【０２６５】
ＩＦＮγ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、腫瘍部位に５０，０００単位で３日間毎日皮下投与した。
【０２６６】
ポリ−Ｉ：Ｃ（ＨＭＷ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、腫瘍部位に５０μｇで３日間毎日皮下投与した。
【０２６７】
抗ＩＬ−１０ハイブリドーマ（クローンＪＥＳ５．２Ａ５）を、１％のＦＣＳおよびゲンタマイシンを含有するＩＭＤＭ中で培養した。精製された上清を使用して、アフィニティクロマトグラフィーを用いて抗体を精製した。抗体を、ＰＢＳ中で無菌で製剤化した。抗ＩＬ−１０抗体を０．５ｍｇ／マウスで３日間毎日腹腔内投与した。
【０２６８】
マウスへのレチノイドの投与レジメンを、本実施例の１６にさらに詳細に記載する。
【０２６９】
ＩＣＢ剤を、例えば、生物学的効果を発揮するのに十分な時間を与えるために前処置薬スケジュールの３日後に投与した：ＡＢ１およびＲｅｎｃａについて２０日目、ＡＥ１７について１５日目、Ｂ１６について１３日目。ＩＣＢのみの群については、前処置薬の投与が他の群において開始されると同時に、投与を開始した。
【０２７０】
１０．ＮＫ細胞の枯渇
ＮＫ細胞の枯渇の影響を調査するために、ＩＣＢ抗体の投与タイミングを早め、それによりＩＣＢ抗体を、早めにすなわち５日目（ＡＢ１）または７日目（Ｒｅｎｃａ）に投与して、応答率に対する最大の影響を実証し、高いバックグラウンド応答率を得た。抗アシアロＧＭ１（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を５０μｌの生理食塩水中２０μｇで投与し、ＩＣＢ投与の３日前（すなわち、２日目（ＡＢ１）または４日目（Ｒｅｎｃａ））に静脈内に注射して、腫瘍微小環境に対して生物学的効果を発揮する時間を確保した。ＮＫ細胞の枯渇を、ＣＤ４５およびＣＤ３３５の抗体を用いて、末梢血のフローサイトメトリー分析により検証した。本発明者らは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＯＳおよびＫｉ６７の抗体も使用し、ＣＤ８またはＣＤ４Ｔ細胞の枯渇も、活性化細胞の数の減少もないことを見出した。
【０２７１】
１１．ＲＮＡ−ｓｅｑデータ解析
リードライブラリーを、ＦａｓｔＱＣ（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．（２０１０）ＦａｓｔＱＣ  Ａ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／からオンライン上で利用可能）（ｖ０．１１．３）を用いて品質評価し、ＨＩＳＡＴ２（ｖ２．０．４）（Ｋｉｍ，Ｄ．ら（２０１５）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １２、３５７〜３６０）を用いて転写と遺伝子レベルの両方でマウスゲノム（ｍｍ１１）にマッピングした。整列させたリードの遺伝子レベルの定量化（カウント）を、ＳｕｍｍｅｒｉｚｅＯｖｅｒｌａｐｓ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．ら（２０１３）ＰＬＯＳ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９、ｅ１００３１１８）を用いて行い、転写の発見および定量化にはＳｔｒｉｎｇｔｉｅ（ｖ１．３．０）（Ｐｅｒｔｅａ，Ｍ．ら（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３、２９０〜２９５）およびＢａｌｌｇｏｗｎ（Ｆｒａｚｅｅ，Ａ．Ｃ．ら（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３、２４３〜２４６）を用いた。
【０２７２】
主成分分析（ＰＣＡ）を行って、Ｒ（ｖ３．３．３）のｐｒｃｏｍｐ（）関数を用いてデータ内の変動の主な寄与を可視化した。遺伝子数データを、分散安定化変換（Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．およびＨｕｂｅｒ，Ｗ．（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１、Ｒ１０６）を用いてＰＣＡに変換した。試料にわたって上位１０００個の最も可変的な遺伝子（最大の中央値絶対偏差を有するもの）を、ＰＣＡ用に選択した。免疫治療非応答者と応答者の間で差次的に発現される遺伝子を、ＤＥＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．ら（２０１４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５、５５０）を用いて同定した。ｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎ,Ｙ．およびＨｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  （Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）５７、２８９〜３００）を用いて複数の比較について調整し、ｐ値＜０．０５を有意とみなした（Ｙ．ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＹ．Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（１９９５）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）５７、２８９〜３００）。
【０２７３】
差次的に発現される遺伝子を、関連する遺伝子発現データと共にＩｎｎａｔｅＤＢ（ｗｗｗ．ｉｎｎａｔｅｄｂ．ｃｏｍ）にアップロードした。アップロードされた遺伝子にマッピングする経路のリストを返し、経路分析に着手して、アップおよびダウンレギュレートされた遺伝子データセットにおいてどの経路が有意に過剰提示されたかを決定した。ＩｎｎａｔｅＤＢは３０００超の経路におけるＤＥ遺伝子の過剰提示について同時に試験し、ここから、ＫＥＧＧ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）およびＲｅａｃｔｏｍｅ（ｗｗｗ．ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ／）データベースについて考察した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）ＦＤＲ補正を適用して、複数の試験を補正した。
【０２７４】
加重遺伝子共発現ネットワーク分析（ＷＧＣＮＡ）アルゴリズム（Ｌａｎｇｆｅｌｄｅｒ，Ｐ．およびＨｏｒｖａｔｈ，Ｓ．（２００８）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ９、５５９〜５５９）を使用して、全試料にわたる署名付きネットワークを構築し、高度に相関する遺伝子発現パターンを有する遺伝子クラスター（モジュール）を同定した。ＷＧＣＮＡについてのデータを作成するために、本発明者らは：（ｉ）分散安定化変換を適用してデータを正規化し、（ｉｉ）低レベルで発現される遺伝子をフィルター除去し（１試料あたり少なくとも１０の数を有する遺伝子のみを保持した）、（ｉｉｉ）公式のＭＧＩ記号なしの遺伝子を除去し、（ｉｖ）ＤＣＧＬパッケージ（有意な閾値を０．０１に設定）（Ｙａｎｇ，Ｊら（２０１３））ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ８、ｅ７９７２９）内の分散に基づくｆｉｌｔｅｒ（）関数を適用することにより可変性の低い遺伝子を除去した。得られた６０２６個の遺伝子セットを、ネットワーク構築のインプットとして使用した。ＷＧＣＮＡにより同定された共発現遺伝子のネットワークモジュールを、モジュールごとにＤＥＳｅｑ２解析由来の−ｌｏｇ１０ｐ値をプロットすることにより、免疫治療の非応答者と応答者の間で差次的に発現される遺伝子の濃縮について試験した。差次的に発現される遺伝子のタンパク質間相互作用ネットワークを、Ｉｎｎａｔｅ  ＤＢネットワーク分析ツール（フィルターなし）、およびＮｅｔｗｏｒｋ  Ａｎａｌｙｓｔ（J. Xiaら、（２０１４）Nucleic Acids Res 42, W167-174）を用いて作成したネットワークを用いて、ＳＴＲＩＮＧインタラクトーム、信頼カットオフ９００（Ｄ．  Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋら（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４３、Ｄ４４７〜４５２）により作成した。モジュール相互作用のレンダリングを、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅソフトウェアを用いて行った。目的のネットワークモジュールおよび差次的発現遺伝子（発現の絶対倍率変化＞２を有するものを含むようにフィルターした）をまた、右側フィッシャーの正確確率検定および他のオプションのデフォルト設定を用いて、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙシステムで分析し（Ｋｒａｍｅｒ，Ａ．ら（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０，  ５２３〜５３０）、関連する上流転写調節因子を同定した。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。活性化ｚスコアも、下流標的に対するこれらの公知の効果と遺伝子発現において観察された変化とを比較することにより、各上流転写調節因子について計算した。活性化ｚスコア≧２または≦２を有するものを、各々「活性化」または「抑制」とみなした。
【０２７５】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴアルゴリズム（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．Ｍ．ら（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２、４５３）を使用して、各試料のトランスクリプトームプロファイルに基づき２５のマウス造血免疫細胞型の相対的割合を推定し、ここではＣｈｅｎらにより開発された５１１のマウス遺伝子シグネチャーを参照として使用した（Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら（２０１７）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ７、４０５０８）。本発明者らは、いくつかの関連する母集団を以下のように分解して、２５の細胞型を１２の主な集団に大まかに分類した：Ｂ細胞は記憶、ナイーブおよび形質細胞を含む；ＣＤ８  Ｔ細胞は記憶、ナイーブおよび活性化細胞を含む；ＣＤ４  Ｔ細胞は記憶、ナイーブ、濾胞性細胞、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞を含む；マクロファージはＭ０、Ｍ１およびＭ２表現型を含む；ＮＫ細胞は活性化および休止細胞を含む；ＤＣは活性化および未熟細胞を含む。分析前に、転写レベルデータを、Ｂａｌｌｇｏｗｎパッケージ（Ｆｒａｚｅｅ，Ａ．Ｃ．ら（２０１４）ｂｉｏＲｘｉｖ）を用いてライブラリーサイズおよび遺伝子の長さに正規化し、ミリオンマップリードあたりの転写物のキロベースあたりのフラグメント（ＦＫＰＭ）を得た。個々の転写物を、Ａｇｇｒｅｇａｔｅ（）関数を用いて平均ＦＰＫＭ値に基づく遺伝子レベルデータに分解した。最後に、データをフィルターにかけて、少なくとも８つの試料（最小の実験群サイズである）においてＦＰＫＭ値＞０．３を有する遺伝子を保持した。
【０２７６】
Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）ソフトウェア（Ａ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（２００７）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３、３２５１〜３２５３）を使用して、低いカウントをプレフィルタリングしながら正規化された遺伝子発現データの分析を行った。５０個のＭＳｉｇＤＢ  Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットを使用するＨａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットデータベース（Ａ．  Ｌｉｂｅｒｚｏｎら（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔ  １、４１７〜４２５）およびＳＴＡＴ１シグネチャーを使用した。ＳＴＡＴ１シグネチャーはＣａｒｅら（Ｍ．Ａ．Ｃａｒｅ，Ｄ．Ｒ．Ｗｅｓｔｈｅａｄ，Ｒ．Ｍ．Ｔｏｏｚｅ，（２０１５）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ７、９６）によるものであり、１１個のＤＬＢＣＬデータベース全体の遺伝子発現のスピアマン順位相関係数に基づき定義され、強力に相関する遺伝子（カットオフ中央値相関スコア＞０．６）を選択した。合計１０００の並べ替えを行った。他のデフォルトパラメータをすべて使用した。公称Ｐ値＜０．０５およびＦＤＲ＜０．２５で濃縮された遺伝子セットを有意とみなした。
【０２７７】
１２．ＳＴＡＴ１シグネチャー濃縮を有する患者の生存分析
生存分析のためにＳＴＡＴ１経路活性化を有する患者のサブセットを定義するために、本発明者らは、生物学的シグネチャーに基づく分類アルゴリズム（Ｆ．Ｒｅｙｎｉｅｒら
（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６、ｅ２４８２８）に密接に従った。Ｃａｒｅらからの先に定義されたＳＴＡＴ１遺伝子セット（Ｍ．Ａ．Ｃａｒｅ、Ｄ．Ｒ．Ｗｅｓｔｈｅａｄ、Ｒ．Ｍ．Ｔｏｏｚｅ、（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ７、９６）を使用し、Ｒデータパッケージ（Ｉｍｖｉｇｏｒ２１０ＣｏｒｅＢｉｏｌｏｇｉｅｓ）として利用可能なＩｍｖｉｇｏｒ２１０試験（Ｓ．Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８）からのＲＮＡｓｅｑデータを利用した。データセットは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アテゾリズマブで処置された３４８人の尿路上皮癌患者の遺伝子数データを含有する。患者を最良応答で分類した：２５人の完全応答者（ＣＲ）、４３人の部分応答者（ＰＲ）、６３人の安定した疾患（ＳＤ）および１６７人の進行者（ＰＤ）。５０人の患者は評価可能な疾患（ＮＥ）を有していなかった。このＲＮＡｓｅｑデータから、２つのプロトタイプベクターを、このＳＴＡＴ１遺伝子セットにおける遺伝子の中央発現値に基づき定義した：放射線学的完全応答者および部分応答者からの「応答者」プロトタイプおよび進行者試料に基づく「進行者」プロトタイプ。各患者について、ＳＴＡＴ１遺伝子セットの発現プロファイルを、２つのプロトタイプベクターと比較した。類似性をピアソン相関係数に基づき計算し、決定スコアを相関比に基づいて公式化した。この決定スコアを使用して、応答にかかわらずＩｍｖｉｇｏｒ２１０データセット中の全患者を分類した。決定スコア＞１はＳＴＡＴ１経路の高い活性化を示す。ログランク検定を用いて、生存分析を行い、この決定スコアに基づき患者を分類した。決定スコア＞１はＳＴＡＴ１経路の高い活性化を示す。カプラン・マイヤー生存曲線を構築した。
【０２７８】
１３．ＳＴＡＴ１およびｐＳＴＡＴ１の免疫組織化学
ＳＴＡＴ１およびｐＳＴＡＴ１の免疫組織化学染色のために、厚さ４μｍのスライドをホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックから切断した。その後、スライドを約５分間のキシレン２変化で脱パラフィンし、次いで１００％、９６％、７０％および４０％エタノールの変化および蒸留水で脱水した。次に、ＳＴＡＴ１染色のために、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた抗原賦活化を、圧力鍋（ＰＴ−モジュール、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉａｂｖｉｓｉｏｎ）を用いて１２１℃で約１０分間行った。ｐＳＴＡＴ１染色のために、スライドを電子レンジ内で１Ｍ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）中にて約１０分間サブボイリングした。スライドをＴＢＳＴですすぎ、蒸留水中の３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ）を用いて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。切片を再びＴＢＳＴで洗い、製造業者の説明書に従ってＰＢＳ中で希釈したヤギ血清（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）で阻害した。一次抗体、ＳＴＡＴ１またはｐＳＴＡＴ１（細胞シグナル伝達、希釈：各々１／８００および１／２００）を室温（ＲＴ）で６０分間インキュベートした。切片を洗浄し、二次抗体、ヤギ抗Ｒｂ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）をＲＴで約３０分間インキュベートした後、再び洗浄した。製造業者の説明書に従って、ベタゾイドＤＡＢクロモゲン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を調製した。クロモゲンを適用し、切片を茶色の発現についてモニターし、Ｈ２Ｏで反応を停止した。切片をヘマトキシリンで対比染色し、脱水した後、Ｐｅｒｔｅｘでカバースリップをマウントした。経験を有する病理医が、陽性腫瘍細胞の推定割合を割り当てることにより切片をスコア化した（陽性はｐＳＴＡＴ１について中程度または強い核染色として定義され、ＳＴＡＴ１については中程度または強い核および細胞質の陽性）が、処置の結果については盲目であった。
【０２７９】
１５．ＩＣＢに対して腫瘍細胞微小環境を感作するためのＩＦＮα／βシグナル伝達の誘導
ポリ−Ｉ：Ｃのプライミング効果の根底にある機構が、ＩＦＮα／β誘導により媒介されたか否かを試験するために（実施例６において考察される）、ＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）に対する阻害抗体を添加しながら、プライミング実験を繰り返した。Ｃ５７ＢＬ／６  ＡＥ１７中皮腫腫瘍担持マウスを、腫瘍部位に５０μｇのポリ−Ｉ：Ｃの３日間の皮下前処置ありまたはなしで（１７〜１９日目）、同時に開始するＩＦＮＡＲに対する阻害抗体ありまたはなしで（例えば、ＢｉＸｃｅｌｌから供給されるウサギモノクローナル抗体ＭＡＲ１−５Ａ３）（０．５ｍｇ腹腔内、３回／週）、腫瘍接種後２２日目にＣＰＢで処置した。
【０２８０】
組換えＩＦＮαがポリ−Ｉ：Ｃに類似する応答に関連する表現型を誘導する（すなわち、ＩＣＢに対して腫瘍細胞微小環境を感作する）可能性を検証するために、ＡＥ１７中皮腫腫瘍担持マウスを、ポリ−Ｉ：Ｃまたは組換えＩＦＮα（：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（またはＰＢＳ対照）で３日間腫瘍内前処置した。次いで、腫瘍を解離し、ＮＫマーカーＣＤ３３５、汎白血病マーカーＣＤ４５およびｐＳＴＡＴ１について染色し、フローサイトメトリーによる分析を行った。
【０２８１】
１６．レチノイドに対する腫瘍微小環境の感作
トレチノイン（オールトランスレチノイン酸）が、０．０００９５４のｐ値および２．５６５のｚスコアを有し応答に関連する遺伝子発現シグネチャーの上位の予測される上流調節因子の１つとして同定されたため、本発明者らは、トレチノインがチェックポイント阻害（ＩＣＢ）に対し腫瘍微小環境を感作する能力を試験しようとした。この目的のために、ＡＢ１−ＨＡ中皮腫腫瘍を有するマウスを、トレチノイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ありまたはなしで、既に記載したようにＩＣＢ（抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−Ｌ１抗体）で処置した。マウスへのトレチノインの投与は、ＩＣＢの３日前またはＩＣＢと同時のいずれかに開始した（６群）。トレチノインを３つの投与量；１０ｍｇ／ｋｇ（３群）、５ｍｇ／ｋｇ（４群）または１ｍｇ／ｋｇ（５群）で投与し、合計９日間投与した。
【０２８２】
トレチノインが、単一のＩＣＢ抗体のみと組み合わせて使用された場合にＩＣＢに対する腫瘍の感作を達成できるか否かを調査するために、ＡＢ１−ＨＡ腫瘍担持マウスを、トレチノイン１０ｍｇ／ｋｇで、６日目に開始して合計９日間腹腔内処置し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２００μｇ、腹腔内）を８、１０および１２日目に投与した。
【０２８３】
（ｉ）他のレチノイド化合物、すなわちトレチノイン以外も、ＩＣＢに対する腫瘍の感作によりチェックポイント阻害の有効性を高めるか否かを試験するため、（ｉｉ）様々な他の腫瘍モデルにおけるレチノイドの有用性を実証するため、および（ｉｉｉ）ＩＣＢに対する腫瘍の感作におけるレチノイドの使用が経口投与により達成できるか否かを試験するために、Ｒｅｎｃａ腎臓癌担持マウスを、経口経管栄養を介して９日目に開始して６日間毎日投与されるレチノイドと組み合わせて、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−Ｌ１抗体（抗ＣＴＬＡ４は１００μｇを１２日目に腹腔内投与；抗ＰＤ−Ｌ１は１００μｇを１２、１４、１６日目に腹腔内投与）によるＩＣＢ処置に暴露した。以下のレチノイドおよび投与量を使用した：ベキサロテン（Ｓａｐｈｉｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１００ｍｇ／ｋｇで投与した；トレチノインおよびイソトレチノイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をすべて１０ｍｇ／ｋｇで投与した。
【０２８４】
レチノイドが、腫瘍におけるＮＫ細胞、炎症性マーカーおよびｐＳＴＡＴ１陽性白血球の増加を特徴とするＩＣＢ応答に関連する表現型を誘導するか否かを試験するために、Ｒｅｎｃａ腎臓癌担持マウスを、経口トレチノイン（１０ｍｇ／ｋｇ）で１２日目に開始して５日間処置し、フローサイトメトリーのために腫瘍を１５日目に採取した。その後の実験において、ＡＢ１−ＨＡ中皮腫またはＣＴ２６結腸直腸癌腫瘍担持マウスを、トレチノイン１０ｍｇ／ｋｇで１０日目に開始して３日間腹腔内処置し、腫瘍をフローサイトメトリーおよび免疫組織化学のために１３日目に採取した。
【０２８５】
１７．統計
インビボマウス実験用の試料サイズ計算は、先の実験に基づき、対照処置（ＩＣＢ単独）での生存期間中央値が３５日であることが判明した（Ｗ．Ｊ．Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓら（２０１５）Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５、１２２９８）。比例ハザードモデルを用いて、実験対象に対して対照対象の真のハザード率（相対リスク）が５である場合、実験のおよび対照の生存曲線が確率（検出力）０．８と等しいとする帰無仮説を棄却できるように１０人の実験対象および１０人の対照対象を試験する必要があることが判明した。この帰無仮説のこの試験に関連するタイプＩエラー確率は、０．０５であった。バルクＲＮＡｓｅｑ実験の試料サイズを、Ｈａｒｔらにより開発された方法（Ｓ．Ｎ．Ｈａｒｔら（２０１３）Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２０、９７０〜９７８）を用いて推定した；例えば、試料サイズｎ＝１２および群内の変動係数０．３について、遺伝子発現における１．７倍変化を検出するための検出力は＞９０％であった。フローサイトメトリーおよびＣＩＢＥＲＳＯＲＴを用いる応答者および非応答者における集団頻度の違いを、平均でマン・ホイットニーのＵ検定を用いて決定した。
【０２８６】
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、腫瘍増殖を分析し、マン・ホイットニーのＵ検定を適用することにより群間の統計的有意差を決定した。ｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（Ｂ−Ｈ）法を用いて多重比較に対し調整した；ｐ値＜０．０５を有意とみなした。カプラン・マイヤー法を生存分析に使用し、ｐ値を、ログランク検定（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）を用いて計算した。
【０２８７】
実施例３：近交系マウス系統において増殖させたクローン癌細胞株由来の腫瘍は、２つの別個の遺伝子シグネチャーを示し、ＩＣＢに対する感受性を予測する。
本実施例は、免疫治療による処置前でも、ＩＣＢ剤による免疫治療に応答するであろう新生物細胞集団および腫瘍の微小環境を、非応答者と区別できることを実証する。同様に、本実施例はまた、ＩＣＢ剤による免疫治療に対する応答者であることが予測される対象を、非応答者と区別できることを実証する。したがって、本実施例はまた、新生物細胞集団もしくは腫瘍、または新生物細胞集団もしくは腫瘍を有する対象が、免疫治療による処置前でもＩＣＢ剤による免疫治療に応答するか否かを予測できることを実証する。
【０２８８】
ＩＣＢに対する応答を予測するシグネチャーを定義する先の試みは失敗に終わった。ＩＣＢに対する応答の決定的なマーカーが出現しなかった潜在的な理由は、患者間の宿主遺伝学、環境因子ならびに癌の遺伝的および細胞構造の違いを含め、数多く存在する。興味深いことに、移植可能腫瘍を有する近交系マウス系統でさえ、免疫治療後に二分する結果を示す（図１Ａを参照のこと）。これらのマウスのゲノムが名目上同一であり、かつ腫瘍がクローン細胞株に由来し、したがって腫瘍拒絶抗原の発現の違いがこれらの異なる応答をもたらした可能性を排除するので、これは驚くべきことである。これらの実験において、マウスは同年齢および同性であり、制御された病原体フリー条件下で維持され、同一の処置を受けた。しかし、マウスの応答は著しく異なった。任意の理論または任意の作用様式に拘束されずに、動物間での結果の違いが、生殖系列においてコードされないＴ細胞レパートリーの違い、（Ｍａｄｉ，Ａ．ら（２０１７）Ｅｌｉｆｅ  ６）または確率的免疫事象（Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３、２４０〜２４５）に関係した可能性がある。この二分の原因にかかわらず、本発明者らは、クローン細胞株由来の移植可能な腫瘍を有する近交系マウス系統で観察されたＩＣＢに対する応答のこの二分は、制御された背景での治療応答の微小環境調節における潜在的にわずかな違いを評価することを可能にすると推論した。
【０２８９】
制御された背景での治療応答の腫瘍微小環境調節の違いを評価するために、近交系マウス系統（ＢＡＬＢ／ｃＡｒｃ、ＢＡＬＢ／ｃＪＡｕｓｂおよびＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス、生後８〜１２週）に、ＡＢ１中皮腫細胞またはＲｅｎｃａ腎臓癌細胞のいずれかを左右対称に接種し、実施例２に示すように抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−Ｌ１抗体で処置した。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示すように、これは、対称的であるが二分する応答、すなわち、腫瘍が応答するか、または応答しないかのいずれかの結果をもたらした（図１Ｂ、図１Ｃ）。
【０２９０】
したがって、これらのマウスモデルは、腫瘍がｉｎ  ｓｉｔｕで残された場合、残りの対側腫瘍の運命をモニターすることにより、治療による腫瘍の運命を依然推測できると同時に、腫瘍を外科的に除去することにより、任意の時点で１つの腫瘍全体を生物学的に評価できた。これらのモデルを用いて、前処置腫瘍細胞微小環境を特徴付けた。１つの腫瘍は、ＩＣＢ剤、例えば、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する直前に、バルクＲＮＡｓｅｑ、フローサイトメトリーおよび単一細胞ＲＮＡｓｅｑを用いる詳細な分析のために外科的に処置した。残りの腫瘍は、ＩＣＢ剤、例えば、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の治療成績を決定するために評価された（図１Ｄ）。
【０２９１】
図１Ｅおよび図１Ｆに示すように、バルクＲＮＡｓｅｑデータの主成分分析（ＰＣＡ）の使用（実施例２に概説される）は、応答性および非応答性の新生物細胞集団、例えば、腫瘍が、両方のモデルにおいて、別個に集まったことを明らかにした。上位の差次的発現遺伝子の教師なし階層的クラスタリングは、応答性および非応答性腫瘍の明確な分離をもたらした（図１Ｇ、図１Ｈ）。
【０２９２】
したがって、図１に示す結果は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質を含むＩＣＢ剤に応答する腫瘍の細胞微小環境におけるタンパク質レベルでのいくつかの応答に関連する遺伝子のアップレギュレーションを確認し、これは、多くの異なる癌の臨床試験に従う（図１Ｉ)（Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．ら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５１５、５６３〜５６７；およびＲｅｃｋ，Ｍ．ら（２０１６）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７５、１８２３〜１８３３）。より具体的には、本明細書に提供される結果は、近交系マウスにおける未処置の表面上は同一の腫瘍が、遺伝子発現プロファイルにおいて驚くべき異質性を示し、免疫治療による処置前でも、新生物細胞集団および／または腫瘍、ならびに応答者になるであろう、このような新生物細胞集団および／または腫瘍を有する動物を、非応答者と区別できることを実証する。
【０２９３】
実施例４：ＩＣＢ応答性腫瘍は、ＳＴＡＴ１により駆動される炎症性微小環境を特徴とする。
本実施例は、ＳＴＡＴ１活性化が、ＩＣＢ応答に関連する腫瘍微小環境の駆動因子であり、新生物細胞集団および／もしくは腫瘍、ならびに／またはＩＣＢ免疫治療に応答する可能性が高い、このような新生物細胞集団および／もしくは腫瘍を有する患者を同定する潜在的バイオマーカーとして利用できることを実証する。
【０２９４】
本発明者らは、応答性および非応答性腫瘍において差次的に発現される遺伝子の生物学的関連性への洞察を得ることを目標とした。最初に、本発明者らは、ＡＢ１腫瘍は差次的に発現する遺伝子を１０，０００超個有したが、Ｒｅｎｃａ腫瘍では差次的に発現する遺伝子がわずか１２７個であるという、応答者と非応答者の間の差次的発現遺伝子の点から２つのモデル間の著しい違いに留意した。しかし、本発明者らはまた、Ｒｅｎｃａ腫瘍において差次的に発現された１２７個の遺伝子の大部分が、ＡＢ１で重複し（１１８個の遺伝子）、精密な応答に関連するシグネチャーをもたらすことに留意した。Ｒｅｎｃａ腫瘍とＡＢ１腫瘍の両方で差次的に発現されることが見出されたこれらの１１８個の遺伝子のリストを図２７に示す。
【０２９５】
応答者と非応答者の間の差次的発現遺伝子のこの精密な応答に関連するシグネチャーに関連する包括的な生物学的プロセスをさらに特徴付けるために、本発明者らは、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）（Ｌｉｂｅｒｚｏｎ，Ａ．ら（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔ  １、４１７〜４２５）を用いて８０個の「Ｈａｌｌｍａｒｋ」遺伝子セットの十分に特徴付けられ精選されたコレクションの分布を分析した（図３Ａおよび図２参照のこと）。図３Ａおよび図２に示すように、これは、両方のマウスモデルの応答性腫瘍において、炎症性応答、同種移植片拒絶、タイプＩおよびＩＩインターフェロン応答、ならびにＩＬ６−ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３シグナル伝達に関連する遺伝子の濃縮を明らかにした。次いで、本発明者らは、ＩＣＢ剤であるＰＤ−Ｌ１抗体アテゾリズマブで処置され、応答した尿路上皮癌患者のコホートからの前処置腫瘍生検から得られた公的に利用可能なデータセット（Ｓ．Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８）で８０個のＨａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットのＧＳＥＡを行った。これらの遺伝子セットはまた、図３Ｂに示すように、応答した前処置腫瘍生検において実際に濃縮され、それによりこの実験の知見の翻訳関連性を検証する。
【０２９６】
２つのモデルの共通の差次的発現遺伝子の経路分析は、応答性腫瘍において最も濃縮された経路として抗原提示およびＴｈ１型免疫応答を同定した（図３Ｃ参照）。これらのデータは、ヒト黒色腫患者での公表されたデータ（Ｍ．Ａｙｅｒｓら（２０１７）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２７、２９３０〜２９４０）と一致し、炎症性経路の活性化、特にＩＦＮ応答が、動物癌モデルおよび同様に患者において腫瘍をＩＣＢに対し感受性にさせることを示唆する。
【０２９７】
次に、加重遺伝子相関ネットワーク分析（ＷＧＣＮＡ）を、本質的にＰ．ＬａｎｇｆｅｌｄｅｒおよびＳ．Ｈｏｒｖａｔｈ（２００８）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ９、５５９に記載されているように使用して、ＩＣＢに対する応答性の根底にある分子ネットワークをマッピングした。これは、腫瘍内で動作する高度に共発現する遺伝子の７個のモジュールを同定し、そのうちの１つは、両方のモデルの応答性腫瘍において有意にアップレギュレートされた；図３Ｄおよび図４のモジュール１を参照のこと。この応答関連モジュールは、適応免疫、特にＮＫ細胞媒介性細胞傷害性、およびＩＦＮγ、ＰＤ−１シグナル伝達および共刺激に関与する遺伝子について濃縮された（図５参照）。本発明者らは、その後、実質的に（Ｊ．Ｘｉａら（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２、Ｗ１６７〜１７４）に記載されるようにＷＧＣＮＡネットワークアナリストを用いて、同じモジュール内の遺伝子間の相関パターンの全体的な強度に基づき、ＳＴＡＴ１をハブとして同定した仮想ネットワークをアセンブルした（図３Ｅを参照のこと）。この結果は、ＳＴＡＴ１が、応答に関連する炎症性モジュールにおいて最も関係がある遺伝子であることを実証した。ＴＲＡＮＳＦＡＣおよびＪＡＳＰＡＲを用いて、このモジュールにおける遺伝子プロモーターは、ＳＴＡＴ１結合部位について有意に濃縮されることが予測された（ｐ５．７ｅ−７；Ｚスコア２．１２）。
【０２９８】
これらの知見は、ＡＢ１腫瘍の単一細胞分析において実証され、これは応答性ＡＢ１細胞と非応答性ＡＢ１細胞の両方において高いＳＴＡＴ１遺伝子発現を同定した（図６を参照のこと）。さらに、非応答患者と比較したとき、アテゾリズマブで処置された尿路上皮癌患者（Ｓ．Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８）からの応答性腫瘍において、およびニボルマブで処置された黒色腫患者の第２のコホート（ｐ＝０．０４４）（Ｎ．Ｒｉａｚら（２０１７）Ｃｅｌｌ  １７１、９３４〜９４９  ｅ９１５）においてＳＴＡＴ１シグネチャーの有意（ｐ＝０．０１９）な濃縮があった；図３Ｆ、図７Ａおよび図７Ｂ参照。
【０２９９】
ＳＴＡＴ活性化が、核のトランスロケーションをもたらすため、本発明者らは、応答性および非応答性腫瘍において核ＳＴＡＴ１を免疫組織化学的に評価した。本発明者らは、核（すなわち、活性化の代わりとして）ＳＴＡＴ１の存在が、チェックポイント阻害に対する応答と相関していることを見出し、すべての応答マウスは、５０％超の核ＳＴＡＴ１陽性を示し、非応答マウスはいずれも示さなかった（図８）。
【０３００】
ＳＴＡＴ１はリン酸化を介して活性化され、これを免疫組織化学により評価できるため、全ＳＴＡＴ１およびリン酸化ＳＴＡＴ１の存在量を、本明細書に記載のマウスモデルで評価した。図３Ｇ、図３Ｈに示すように、本発明者らがリン酸化（すなわち、活性化）ＳＴＡＴ１に特異的な抗体を使用した場合、応答性腫瘍は、非応答性腫瘍よりも高い割合のリン酸化ＳＴＡＴ１陽性細胞を有したことを見出した。同様に、ヒト前処置試料におけるＳＴＡＴ１遺伝子シグネチャーの不在は、尿路上皮癌／アテゾリズマブ臨床データセットにおける無憎悪生存期間の減少に関連しており（図７Ｃを参照のこと）、これは抗ＰＤ１で処置した黒色腫患者における腫瘍ＳＴＡＴ１の活性化の予測値についての先の報告と一致する（Ｔｕｍｅｈら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５１５、５６８〜５７１）。
【０３０１】
総合すると、これらのデータは、ＳＴＡＴ１活性化が、ＩＣＢ応答に関連する腫瘍微小環境の駆動因子であり、応答する可能性が高い患者を同定するための潜在的バイオマーカーとして利用できることを示唆している。
【０３０２】
実施例５：耐性および感受性腫瘍の細胞分析は、ＩＣＢに対する応答の必要条件としてＮＫ細胞の存在を同定する。
本実施例は、モデル間で全く異なる細胞腫瘍微小環境が、ＩＣＢ治療に対し腫瘍を応答させるのに依然として貢献することを実証する。
【０３０３】
本実施例はさらに、前処置腫瘍ＮＫ細胞浸潤が、ＩＣＢ治療に対する腫瘍応答に必要であり得ることを実証する。
【０３０４】
本発明者らは、ＩＣＢ剤に応答する腫瘍において炎症性ＩＦＮ／ＳＴＡＴ１駆動環境に関連する遺伝子の増加（すなわち、濃縮）を観察し、「炎症性」腫瘍が、ＣＤ８  Ｔ細胞浸潤の増加を特徴とし得ることが以前に見出されたため（Ｐ．Ｃ．Ｔｕｍｅｈら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５１５、５６８〜５７１）、本発明者らは、応答性および非応答性腫瘍の免疫細胞浸潤を調査した。
【０３０５】
具体的には、フローサイトメトリーを、解離した腫瘍で使用し、データを、実質的にＡ．Ｍ．Ｎｅｗｍａｎら（２０１５）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２、４５３〜４５７に記載されるようにＣＩＢＥＲＳＯＲＴ分析を用いて比較した。この点において、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、遺伝子発現データから複合組織の細胞組成を特徴付けるためのデコンボリューションアプローチであり、本発明者らは、本明細書で得られる単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータに適用した。図９に示すように、ＡＢ１腫瘍は、主に骨髄性浸潤を特徴とするが、Ｒｅｎｃａ腫瘍における浸潤は主としてリンパ性であった（各々図９Ａおよび図９Ｂを参照のこと）。興味深いことに、細胞浸潤での著しい違いにもかかわらず、これらの腫瘍マウスモデルは、チェックポイント阻害に対し同様に応答する。ＣＤ８もしくはＣＤ４Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球細胞、または樹状細胞の浸潤に関して、応答性腫瘍と非応答性腫瘍の間で一貫した違いは観察されなかった（図９Ａ、図９Ｂおよび図１０を参照のこと）。しかし、両方の腫瘍マウスモデルでの応答性腫瘍中でＮＫ細胞の割合が高かった（言い換えれば、応答性腫瘍はより多くのＮＫ細胞を有する）；図９Ｃおよび図９Ｄを参照のこと。全白血球の割合は、フローサイトメトリーを用いて全腫瘍含有細胞のＣＤ４５＋細胞により測定すると、応答性腫瘍と非応答性腫瘍の間で著しく違わなかった（図１１を参照のこと）。全腫瘍細胞のＮＫ細胞の割合は、フローサイトメトリーを用いて全腫瘍含有細胞のＣＤ３３５＋／ＣＤ３−細胞により測定すると、有意（ｐ＜０．０００１）に増加した（図１１）。
【０３０６】
腫瘍ＮＫ細胞濃縮がヒトに関連し得るか否かを評価するために、本発明者らは、ＰＤ−１阻害抗体ニボルマブまたはペンブロリズマブで処置された黒色腫、頭頸部癌または肺癌患者の遺伝子発現データセット（Ｐｒａｔ，Ａ．ら（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７７、３５４０〜３５５０）を調べた。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を用いて、本発明者らは、ＮＫ特異的遺伝子セット（Ｂｅｚｍａｎ，Ｎ．Ａ．ら（２０１２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３、１０００〜１００９）が、これらの患者での応答と著しく関連していることを見出した（データは図示せず）。さらに、本発明者らは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ分析を使用して、ＩＣＢ治療として、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アテゾリズマブでの処置の前に得られた、尿路上皮癌患者コホートの別のヒト患者遺伝子発現データセット（Ｓ．  Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  ５５４、５４４〜５４８（２０１８））を調べ、応答患者は、マウスモデル（図９Ｃ）と同様に患者の腫瘍中のＮＫ細胞の数が著しく高いことを見出した（図９Ｅ、図１１）。したがって、これらの結果は、ヒトでもまた、活性化ＮＫ細胞に特異的な遺伝子セットが、ＩＣＢ治療に対する応答と著しく相関していることを実証する。
【０３０７】
前処置腫瘍微小環境のＮＫ細胞浸潤が、本明細書に記載の腫瘍マウスモデルにおける応答に必要であるか否かを試験するために、ＡＢ１腫瘍とＲｅｎｃａ腫瘍の両方においてＩＣＢ処置の３日前にＮＫ細胞を（抗アシアロＧＭ１の単回注射で）枯渇させ、これは著しく減少した応答をもたらした（図９Ｆおよび図９Ｇ）。これらのデータは、モデル間で全く異なる細胞腫瘍微小環境が、ＩＣＢに対する応答に依然として貢献することを実証する。さらに、データは、前処置腫瘍ＮＫ細胞浸潤がＩＣＢに対する応答に必要であることも実証する。
【０３０８】
実施例６：ＩＣＢに対し新生物細胞集団および／または腫瘍を感作するための、ＩＣＢ治療前に開始する処置レジメンの開発
本実施例は、ＩＣＢ治療前に開始し、ＩＣＢ免疫治療中も継続され得る、ＩＣＢ剤に対する新生物細胞集団および／または腫瘍の著しい感作をもたらす、臨床的に利用可能な治療剤の適用を実証する。
【０３０９】
治療的に標的とされ得る応答性腫瘍において濃縮される炎症性経路およびネットワークの高位の調節因子を同定するために、上流調節因子分析（ＵＲＡ）を、実質的にＫｒａｍｅｒ  Ａら（（２０１４）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０、５２３〜５３０））により記載されるように使用して、応答性腫瘍において濃縮される炎症性経路およびネットワークの高位の調節因子を同定した。ＵＲＡは、先の実験データに基づき、差次的に発現される遺伝子の発現レベルを調節することが知られる転写調節因子を同定する。ＡＢ１モデルとＲｅｎｃａモデルの間の差次的発現遺伝子および細胞浸潤の数の著しい違いにもかかわらず、ＩＣＢに対する応答に関連する調節因子は、非常に類似しており、ＡＢ１腫瘍モデルとＲｅｎｃａ腫瘍モデルの両方の上位の正の調節因子はＩＦＮγおよびＳＴＡＴ１であり、上位の負の調節因子はＩＬ−１０と同定された（図１３Ａおよび図１２を参照のこと）。したがって、モデル間の差次的発現遺伝子の数の著しい違いにもかかわらず、応答に関連する上流調節因子は非常に類似していた。次に、ＵＲＡを使用して、応答に関連する遺伝子共発現モジュールの潜在的な駆動因子を同定した。再び、ＩＦＮγおよびＳＴＡＴ１が上位の正の調節因子として同定され、ＩＬ−１０が上位の負の調節因子として同定された（データは図示せず）。重要なことに、患者コホート（Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１８；５５４（７６９３）：５４４〜５４８）は同様の結果を示した（図１３Ｂを参照のこと）。他の負の調節因子も、図１４に示すようにこの患者コホートにおいて同定された。
【０３１０】
応答に関連する調節因子シグネチャーを同定し、本発明者らは、ＩＣＢ前にこのシグネチャーを表現型模写することが予測されるこれらの調節因子を標的とすることにより、非応答性腫瘍を応答性腫瘍に変換できると推論した。この目的のために、本発明者らは、臨床的に容易に利用可能である（少なくとも第ＩＩ相臨床試験段階の）治療剤に注目し、したがって上位の正の調節因子の１つとして図１３Ａに示す結果においても実証され、かつＳＴＡＴ１を誘導することが知られる（Ｄｅｍｐｏｙａら（２０１２）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６、１２７６０〜１２７６９）、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０抗体、および／またはＴＬＲ３アゴニストポリ−Ｉ：Ｃの前処置スケジュールを選択した。この趣旨で、本発明者らは、わずか３日間の、短期のこれらの処置、次いで２日後にＩＣＢ治療を行った（図１３Ｃ）。上記のようにＡＢ１およびＲｅｎｃａモデルを使用することに加え、本発明者らは、ＡＥ１７中皮腫およびＢ１６黒色腫担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスも、両者がＩＣＢに比較的耐性であったため、使用した（Ｍｏｓｅｌｙら（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ５、２９〜４１）。例えば、いかなる場合でも、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０抗体およびポリ−Ｉ：Ｃで前処置されたマウスはＩＣＢ（すなわち、ＩＣＢ剤による治療）に対し感作され、応答率がＩＣＢ単独の０〜１０％から、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０抗体およびポリ−Ｉ：Ｃの組み合わせでは最大８０％へと大幅に増加した（図１３Ｄ〜Ｇ）。
【０３１１】
感作成績が、単一の薬物の効果であるのか、または３つの感作剤の組み合わせによるものであるのかを決定するために、マウスを、感作剤の１つを単独で、次いでＩＣＢで別個に前処置した。いずれの場合も、各感作剤を別個に使用した場合、ＩＣＢに対する腫瘍のいくらかの感作が認められた（図１３Ｈ）。さらに、ポリ−Ｉ：ＣとＩＦＮγとの組み合わせ、またはポリ−Ｉ：Ｃと抗ＩＬ−１０抗体との組み合わせによる前処置は、いくらかの腫瘍の感作をもたらし、ＩＣＢ治療単独（すなわち、感作剤による前処置なしで適用された場合のＩＣＢ剤）へのさらなる恩恵が観察された（図１３Ｉ）。さらに、３つの感作剤すべて、すなわち、ポリ−Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、および抗ＩＬ−１０抗体の組み合わせによる前処置は、ＩＣＢ治療に対して、すなわちＩＣＢ治療単独と比較して、腫瘍のさらに良好な感作をもたらした（図１３Ｈ）。
【０３１２】
さらに、Ｒｅｎｃａ腫瘍担持マウスをＣＤ４０アゴニスト抗体、ポリ−Ｉ：ＣおよびＩＬ−１０の組み合わせで前処置し、次いでＩＣＢ（抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ−Ｌ１）で処置した。結果を図１３Ｌに示す。これらの結果はまた、ＩＣＢに対する新生物細胞集団および／または腫瘍の感受性を促進または増強するさらなる薬剤としてのＣＤ４０のアゴニスト、例えば、ＣＤ４０抗体の使用を暗示する。
【０３１３】
次に、これらの感作剤の使用が、実際にＩＣＢ免疫治療に対する腫瘍の感受性を促進または増強するか否かをさらに確認するために、本発明者らはポリ−Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγおよび抗ＩＬ−１０抗体の３つの組み合わせを使用して、これについて試験した。この趣旨で、エフェクター応答を増強するのではなく、スケジューリングを変更し、ＩＣＢに対する腫瘍の応答について、３つの感作剤の組み合わせ、次いでＩＣＢを腫瘍に添加した場合（図１３Ｃ）と、ＩＣＢ、次いで３つの感作剤の組み合わせで処置した場合（図１３Ｊ）に観察された結果とを比較した。最初にチェックポイント阻害、次いで３つの組み合わせを投与した場合、応答率はＩＣＢ単独と同様であった。しかし、３つの組み合わせを先に投与した場合、対照と比較してＩＣＢの開始が実質的に遅延しても、腫瘍は、Ｒｅｎｃａ（図１３Ｋ）マウス腫瘍モデルとＡＢ１（図１５）マウス腫瘍モデルの両方において治療剤に対し感作されおよび応答した。
【０３１４】
したがって、これらの複数の腫瘍マウスモデル（ＡＢ１およびＡＥ１７中皮腫、Ｒｅｎｃａ腎臓癌およびＢ１６黒色腫）を用いて、本発明者らは、ポリ−Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγおよび抗ＩＬ−１０から選択されるものなどの１つまたは複数の感作剤で前処置されたマウスがチェックポイント阻害治療に対して感作されるようになり得ることを実証した。これらのデータは、１つまたは複数の感作剤、例えば、ＩＣＢに対する新生物細胞集団および／または腫瘍の感作を促進または増強する治療剤としてのこのような薬剤の２つ以上の使用の合理性を実証する。これは、腫瘍プロファイリングに基づき、ＩＣＢによる処置の決定が最初に行われてもよく、または感作治療剤による前処置後に行われてもよい、癌患者を処置するための二段階アプローチへの道を開く。
【０３１５】
実施例７：ＩＦＮαによる腫瘍の処置によるなど、ＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）の誘導／活性化によるなどのＩＦＮα／βシグナル伝達の誘導および／または増強もまたＩＣＢ治療に対する感受性を促進または増強する。
本実施例は、ＩＦＮα／βを誘導する任意の薬物の活性を活性化および／または増強できる、治療剤などの組成物、例えば、抗体が、例えば、腫瘍細胞微小環境におけるＮＫ細胞の数およびＳＴＡＴ１リン酸化の増加により、ＩＣＢに対する１つまたは複数の新生物細胞集団、例えば、腫瘍の感受性を誘導、促進または増強できることを実証する。
【０３１６】
ポリ−Ｉ：Ｃおよび任意のポリ−Ｉ：Ｃをベースとした感作剤の組み合わせの有用性を実証する、得られた上記の結果に基づき、本発明者らはポリ−Ｉ：Ｃ単独またはポリ−Ｉ：Ｃベースの組み合わせによる処置後のＩＣＢに対する腫瘍の感受性の誘導、促進または増強が、ＩＦＮα／β経路の誘導によるものであったと仮定した。
【０３１７】
これを試験するために、ＡＥ１７担持マウスを、ポリ（Ｉ：Ｃ）、次いでＩＣＢで前処置すると同時に、阻害抗体による共処置によりＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）を阻害した。実際に、ポリ（Ｉ：Ｃ）前処置の有益な効果は、ＩＦＮＡＲ阻害により抑制された（図１６）。言い換えれば、ポリ（Ｉ：Ｃ）がとりわけインターフェロンα／β経路の誘導を介して感受性を誘導、促進または増強するように作用し得るという本発明者らの推論に従って、本発明者らは、インターフェロンα／β受容体に対するポリ（Ｉ：Ｃ）による前処置の抗腫瘍効果を試験し、この効果が消失したことを観察した（図１６）。
【０３１８】
このデータに基づき、次いで本発明者らは、ＩＦＮα／βシグナル伝達の活性を活性化または増強できる主題の任意の化合物、薬物または組成物が、ＮＫ細胞の数およびＳＴＡＴ１リン酸化の増加を特徴とする、応答に関連する腫瘍微小環境環境を誘導、促進または増強できると推論した。したがって、次に、本発明者らは、ＩＦＮα／βシグナル伝達を誘導する他の治療用化合物または組成物が、ＩＣＢに対する新生物細胞集団、例えば、腫瘍の感受性を促進または増強できるか否かを確立しようとした。これを試験するために、本発明者らは、ＡＥ１７担持マウスをポリ（Ｉ：Ｃ）または組換えＩＦＮαで前処置し、腫瘍微小環境においてＮＫ細胞を誘引し、ＳＴＡＴ１を活性化するそれらの効果について試験した。本発明者らは、ＩＦＮαが実際に、ＮＫ浸潤およびＳＴＡＴ１リン酸化（すなわち、ｐＳＴＡＴ１活性化）の増加を特徴とする、腫瘍中の非常に類似したプロファイルを誘導することを見出した（図１７）。
【０３１９】
実施例８：感作処置は、腫瘍の細胞微小環境においてＮＫ細胞（ＮＫの浸潤の増強）およびＳＴＡＴ１の活性化／リン酸化の増加を特徴とする応答表現型を誘導する。
本実施例は、感作することが、腫瘍細胞微小環境においてＳＴＡＴ１のリン酸化（すなわち、ＳＴＡＴ１の活性化）を増加させ、またＮＫ細胞集団を増加させることを実証する。
【０３２０】
感作治療剤、例えば、先の実施例に記載の感作剤の組み合わせが、ＩＣＢに対する腫瘍の感受性を促進または増強する、応答に関連する表現型を誘導するか否かを試験するために、腫瘍を有するマウスをＩＦＮγ、ポリ（Ｉ：Ｃ）および抗ＩＬ−１０の組み合わせまたはビヒクル対照により前処置した３日後に、腫瘍をＳＴＡＴ１活性化およびＮＫ浸潤について試験した（図１８Ａ）。実際に、感作前処置は、ＣＤ３３５＋細胞の頻度を著しく増加させた（図１８Ａおよび図１９Ａ）ことが見出された。さらに、腫瘍に浸潤するホスホ−ＳＴＡＴ１陽性およびＩＦＮγ産生白血球が増加した（図１８Ｂ、ＣおよびＤ）。さらに、前処置は、ＰＤ−Ｌ１およびｐＳＴＡＴ１陽性腫瘍細胞を増加させた（図１８Ｄおよび図１９Ｂ）。前処置は、腫瘍における複数の白血球サブセットに由来するＩＦＮγ産生を増加させたが、これは、ＮＫ細胞集団のみで有意（ｐ＜０．００１）であり、他の細胞サブセットでは有意ではなかった（図１８Ｅ）。これはまた、ＳＴＡＴ１のリン酸化にも当てはまった（図１８Ｆ）。腫瘍におけるこれらのＣＤ３３５＋ＮＫ細胞のさらなる表現型特性評価は、これらが、従来のＮＫ細胞であり、組織常在性ＣＤ３３５＋ＩＬＣ１またはＩＬＣ３でないことを明らかにした（図２０）（Ｖｉｖｉｅｒら（２０１８）Ｃｅｌｌ  １７４、１０５４〜１０６６）。活性化マーカーＣＤ１１ｂおよびＫＬＲＧ１の高発現は、これらの従来のＮＫ細胞の活性化および最終分化状態を確認した（データは図示せず）。前処置の前にＮＫ細胞を枯渇させた場合、ＩＣＢに対する感作効果は完全に消失し（図１８Ｇ）、実際に、これが腫瘍微小環境における循環ＮＫ細胞の処置誘導性浸潤により媒介されたことを実証する。
【０３２１】
総合的に考えると、本明細書に提供されるデータは、浸潤ＮＫ細胞に支配される前処置腫瘍微小環境、およびＩＣＢに対し感受性であるＳＴＡＴ１活性化を特徴とする炎症性遺伝子発現シグネチャーを示し、このプロファイルが治療的に利用できることを実証する。これらのデータは、腫瘍プロファイリングにより、最初に（例えば、プロファイリングに基づき、腫瘍がＩＣＢに対して感受性であることが示された場合）、または代替的に１つまたは複数の感作治療剤／薬剤による前処置後に（例えば、腫瘍プロファイリングにより、腫瘍が、ＩＣＢに耐性であるか、または部分的に感受性であることが示された場合）のいずれかでＩＣＢによる処置について決定できる、癌患者を処置するための二段階アプローチへの道を開く（図１８Ｈ）。
【０３２２】
実施例９：レチノイドはＩＣＢに対し腫瘍細胞微小環境を感作する。
本実施例は、レチノイド（例えば、オールトランスレチノイン酸、ベキサロテンおよび／またはイソトレチノイン）が、ＩＣＢに対し腫瘍細胞微小環境を感作できることを実証する。
【０３２３】
トレチノイン（オールトランスレチノイン酸としても知られる）が、ｐ値０．０００９５４およびｚスコア２．５６５を有し応答に関連する遺伝子発現シグネチャーの上位の予測される上流調節因子の１つとして同定されたため、本発明者らは、全般的にレチノイド、より具体的には、単なる例としてトレチノインがチェックポイント阻害（ＩＣＢ）に対し腫瘍細胞微小環境を感作する能力を試験しようとした。
【０３２４】
図２１に示すように、ＡＢ１−ＨＡ中皮腫腫瘍を有するマウスを、トレチノインありまたはなしで、チェックポイント阻害（ＩＣＢ）抗体（抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体）で処置した。トレチノイン処置は、ＣＰＢの３日前（「事前トレチノイン」）またはＣＰＢと同時（「同日トレチノイン」）のいずれかで開始した。トレチノインを、図のように３つの投与量；１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇで投与した。ＣＰＢ抗体を、腫瘍接種後７、９、１１日目に投与し、トレチノインを、ＣＰＢの３日前（４日目）またはＣＰＢと同時（７日目に開始）のいずれかで開始して合計９日間毎日投与した（灰色の網掛け部分）。図２１に示す結果は、ＩＣＢ前にレチノイド、例えば、トレチノインなどで担癌マウスを処置することは、ＩＣＢに対する腫瘍の応答を用量依存的に改善したことを実証する。さらに、このデータは、ＩＣＢ前にレチノイド、例えば、トレチノインをマウスに投与することが、レチノイドをＩＣＢと同時に投与した場合と比較して、ＩＣＢの有効性を著しく改善したことを実証する。
【０３２５】
別の実験において、ＡＢ−１担持マウスをトレチノイン１０ｍｇ／ｋｇで５日間処置し、腫瘍を免疫組織化学のために採取した。図２２（パネルＡおよびＢ）に示すように、レチノイド、例えば、トレチノインは、チェックポイント阻害応答に関連する表現型を誘導し、免疫組織化学は、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍におけるレチノイド、例えば、トレチノインによる処置後の腫瘍におけるｐＳＴＡＴ１免疫細胞浸潤の斑点の増加により特徴付けられた。図２２に示すように、ｐＳＴＡＴ１陽性部分はトレチノイン処置群においては浸潤するが、ビヒクル対照においては浸潤しない。これらの知見は、フローサイトメトリーを用いてＲｅｎｃａ腎臓癌において実証され、腫瘍、特にＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞におけるｐＳＴＡＴ１陽性白血球の増加を示す（図２２Ａ）。
【０３２６】
レチノイドの感作の有益な効果は、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−Ｌ１に対する２つのＩＣＢ抗体の組み合わせによるＩＣＢ治療の使用に限定されなかった。これは、ＩＣＢとして（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を阻害する）抗ＰＤ−Ｌ１抗体単独（すなわち、抗ＣＴＬＡ４抗体の不在下）による処置でも有効性が増大したためである（図２３）。同様に、感作の有益な効果は、広範なクラスのレチノイド化合物に当てはまり、トレチノイン単独に限定されなかった。これは、感作効果が、ベキサロテンおよびイソトレチノインを含む他のレチノイドでも達成されたためであり（図２４）、これはＩＣＢ単独と比較して、ＩＣＢとの組み合わせ治療後の完全退縮率の増加を示した。
【０３２７】
要約すると、本実施例の結果は、レチノイド、例えば、トレチノイン、ベキサロテンおよびイソトレチノインが、ＩＣＢに対する腫瘍応答を用量依存的に改善でき、レチノイドがＩＣＢ前に対象に投与された場合、最も効果的であり、ＩＣＢと同時に投与された場合、あまり効果がないことを実証する（例えば、図２２を参照のこと）。
【０３２８】
レチノイド、例えば、トレチノイン、ベキサロテンおよびイソトレチノインはまた、レチノイドの投与後の腫瘍における増加されたｐＳＴＡＴ１免疫細胞浸潤により、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍を特徴とするチェックポイント阻害応答に関連する表現型を誘導できる（図２２Ａおよび２２Ｂ）。これらの知見は、フローサイトメトリーを用いてＲｅｎｃａ腎臓癌において実証され、腫瘍、特に、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞におけるｐＳＴＡＴ１陽性白血球の増加を示す（図２２Ｃ）。
【０３２９】
レチノイド、例えば、トレチノイン、ベキサロテンおよびイソトレチノインの有益な効果は、ＩＣＢ免疫治療のタイプに限定されなかった（図２３）。同様に、ＩＣＢに対する腫瘍の感作におけるレチノイドの有益な効果は、トレチノイン単独に限定されなかっただけでなく、ベキサロテンおよびイソトレチノインを含む、レチノイドクラスから他の薬物にまでおよび得る（図２４）。本実施例に概説される結果は、免疫チェックポイント阻害に対する１つまたは複数の新生物細胞の感受性を促進または増強する感作剤としての、レチノイド、例えば、オールトランスレチノイン酸／トレチノイン、ベキサロテンおよび／またはイソトレチノインの包含を支持する。本明細書に概説される結果は、ＳＴＡＴ１により駆動される炎症性遺伝子発現シグネチャー優位の前処置腫瘍微小環境がＩＣＢに対し感作すること、およびこのプロファイルが、例えば、上で既に概説された癌患者を処置する二段階アプローチ（腫瘍プロファイリングに基づき、ＩＣＢによる処置の決定が最初に行われてもよく、または感作治療剤による前処置後に行われてもよい）において、治療的に利用できることを実証する、先の実施例において概説される知見に対するさらなる支持を提供する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｈ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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