(57)【要約】  本発明は、粒子、好ましくは循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のマイクロ流体選別、分離及び／又は操作に関する。本発明の一側面が提供する流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための装置は、（ａ）前記流体懸濁液を導入するための少なくとも１つの入口；（ｂ）所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも１つの出口；並びに（ｃ）前記少なくとも１つの入口及び前記少なくとも１つの出口と流体連通し、それらの中間にあるチャネルであって、メインチャネルの一部が湾曲して少なくとも１つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されている、チャネルを含み、前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷はそれぞれ半円弧セグメントを形成し、前記流体懸濁液は、前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと前記湾曲ユニットを通って移動する。
2021506263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための装置であって、
（ａ）前記流体懸濁液を導入するための少なくとも１つの入口；
（ｂ）所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも１つの出口；並びに
（ｃ）前記少なくとも１つの入口及び前記少なくとも１つの出口と流体連通し、それらの中間にあるチャネルであって、前記チャネルの一部が湾曲して少なくとも１つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されている、チャネル
を含み、
前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷はそれぞれ半円弧セグメントを形成し、前記流体懸濁液は、前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと前記湾曲ユニットを通って移動する
装置。
【請求項２】
前記谷の半円弧セグメントの直径が、前記山の半円弧セグメントの直径以上である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記谷の半円弧部分の直径が２００μｍ〜１２００μｍである、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記チャネルが複数の湾曲ユニットを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記複数の湾曲ユニットが直線方向に配置される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記複数の湾曲ユニットが１０〜４０個の湾曲ユニットを含む、請求項４又は５に記載の装置。
【請求項７】
前記少なくとも１つの出口が、第１、第２及び第３の出口である３つの出口をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記第１、第２及び第３の出口の幅が異なる、請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記第１、第２及び第３の出口の幅が、それぞれ３０〜８０μｍ、４０〜５５μｍ及び３０〜８０μｍである、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記メインチャネルが長方形の断面輪郭を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記メインチャネルが２０〜１２５μｍの幅及び５〜４０μｍの高さを有する、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記入口及び前記少なくとも１つの出口のそれぞれがリザーバをさらに含み、前記リザーバの直径が１．５ｍｍである、請求項１〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
前記山の半円弧セグメントの直径が６００〜８００μｍであり、前記面の半円弧セグメントの直径が２００〜３５０μｍであり、前記リップの半円弧セグメントの直径が２００〜３５０μｍであり、前記谷の半円弧セグメントの直径が６００μｍ〜１２００μｍである、請求項１〜１１のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作する方法であって、
（ａ）前記流体懸濁液を導入するための少なくとも１つの入口を提供すること；
（ｂ）所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも１つの出口を提供すること；
（ｃ）前記少なくとも１つの入口及び前記少なくとも１つの出口と流体連通し、それらの中間にあるメインチャネルであって、前記メインチャネルの一部が湾曲して少なくとも１つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されており、前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷がそれぞれ半円弧セグメントを形成する、メインチャネル；並びに
（ｄ）前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと、前記湾曲ユニットを通って前記流体懸濁液をポンプで送ること
を含む方法。
【請求項１５】
前記谷の半円弧セグメントの直径が前記山の半円弧セグメントの直径以上である前記湾曲ユニットを通って、前記流体懸濁液をポンプで送ることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
直線方向に配置される複数の湾曲ユニットを通って前記流体懸濁液をポンプで送ることをさらに含み、前記複数の湾曲ユニットが、１０〜４０個の湾曲ユニットを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記流体懸濁液を４０μＬ／分〜２００μＬ／分の流速でポンプで送ることをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
前記山の半円弧セグメントの直径が６００〜８００μｍであり、前記面の半円弧セグメントの直径が２００〜３５０μｍであり、前記リップの半円弧セグメントの直径が２００〜３５０μｍであり、前記谷の半円弧セグメントの直径が６００μｍ〜１２００μｍである、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
第１、第２及び第３の出口である３つの出口で前記流体懸濁液を排出することをさらに含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の出口で約３μｍ〜１０μｍのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出し、前記第２の出口で約１５μｍのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出し、前記第３の出口で約３μｍのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記流体懸濁液が全血サンプルであり、前記方法は前記サンプルから、がん細胞を分離し、又は前記流体懸濁液サンプルから異なるタイプの血球を分離し、又はサブマイクロン小胞とエキソソームを分離する、請求項１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
約３００ｎｍのサイズを有する粒子を、約１００ｎｍのサイズを有する粒子から分離する、請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための装置又は方法であって、実施例のいずれか又は添付図面のいずれかを参照して本明細書に実質的に記載されている装置又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体工学の分野に関する。特に、本発明は、粒子のマイクロ流体選別、分離及び／又は操作に関する。より詳細には、本発明は、シースレス慣性粒子集束及び細胞選別のための、受動流体力を利用する慣性マイクロ流体工学に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細な生物粒子（細胞や病原菌など）の選別は、生物学的分析や医療診断で重要な役割を果たす。例えば、ヒト血球から循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ、ＣＴＣ）を分離し、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）や造血幹細胞（ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＨＳＣ）などのさまざまな幹細胞の種類を選別することは、臨床分析や生物学的研究において重要視されている。高いスループットは、現在の細胞選別技術を実用的な生物医学用途に実行可能にするための主要な制約の１つである。
【０００３】
実用的な生物医学分析では、通常、患者の生の生体サンプル１〜１０ｍＬを処理する必要がある。感度と選択性を向上させるために、実際の生物医学分析の前にサンプルの精製が一般的に必要である。したがって、全体のターンアラウンドタイムを最小限に抑えるために、サンプルを非常に高いスループットで（〜ｍＬ／ｍｉｎ）で精製することが強く望まれている。現在の細胞選別技術は、多大な労力（遠心分離）又は高価な機器（蛍光活性化細胞選別）を必要としている。
【０００４】
マイクロスケールでの細胞の正確な操作と分離は、生物学的研究に不可欠な有効化技術であり、生物工学及び製薬産業においても非常に商業的な可能性を秘めている。過去２０年間で、さまざまなマイクロ流体細胞選別技術が開発され、能動的方法と受動的方法に分類できる。従来の能動的方法は、一般に外部音響1、2、3、4、5、電気6、7、8、9、10及び磁場11、12、13を適用し、非常に正確な細胞分離の卓越した能力を備えている。しかし、実際の用途での能動的細胞分離法の広範な利用は、複雑な装置の製造と組立て、比較的低いスループット（特に非常に少量の生体粒子を分離するために、数ｍＬ程度の大量のサンプルを処理する必要がある場合）によって妨げられる。受動的細胞分離法には、主にサイズベースの精密ろ過14、15、決定論的横置換法（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＤＬＤ）16、17、18、及び慣性集束が含まれる。１９６１年までさかのぼると、ＳｅｇｒｅとＳｉｌｂｅｒｂｅｒｇ19は、２つの対向する慣性揚力のバランスから生じる、層流領域における、円筒状パイプに沿って粒子が自発的に環状パターンを形成すること（チューブラピンチ効果）を最初に観察した。決定論的平衡位置へのこの横方向の移行は、慣性集束現象として知られている。この受動的な粒子集束現象は、流体の流れが中間レイノルズ数領域（〜１＜Ｒｅ＜〜１００）にあるときの慣性揚力の結果である。近年、ミクロンサイズの粒子（通常は１ミクロンを超える）の慣性集束は、非常に高い流速（〜ｍＬ／ｍｉｎ）で動作しているマイクロ流体装置でも達成できることがわかった。効果的な慣性集束のための高流速の要件は、実際の生物医学用途で必要とされる高スループットのサンプル処理も可能にする。慣性集束は、２００７以来、マイクロ流体工学における強力な正確な細胞操作技術の１つとして登場し20、その後、その高スループット、低エネルギー消費、シンプルな装置構造、及び易しい製造手順、並びに既存のマイクロ流体チップと組み合わせて機能コンポーネントとして機能することの容易さのおかげで、マイクロ流体工学研究分野で徐々に大きな注目を集めている21、22、23。
【０００５】
慣性集束は、サイズ選択的な操作がチャネルジオメトリーに大きく依存する、受動的マイクロ流体操作技術である。慣性集束を実証するために、ストレート24、25、26、27、湾曲／蛇行28、29、30、31、非対称湾曲32、29、33、スパイラル34、35、27、36、及び収縮／拡張37、38、39、40を含むさまざまなチャネルジオメトリー設計が採用されており、その中で各チャネル設計は異なる慣性集束挙動を示す21。曲線又は膨張収縮機能を備えたマイクロ流体チャネルは、メイン流れ方向に垂直なディーン二次流れを生成できる。ディーン流れの生成は、中央領域と壁付近の領域での連続フローの慣性の不一致（通常はチャネルの断面に沿うディーン渦の逆回転）に起因する。したがって、ディーンの二次流れは、ディーン抗力（Ｄｅａｎ  ｄｒａｇ  ｆｏｒｃｅ）を生み出し、ディーン抗力は、慣性揚力のバランスをとるために使用できるため、粒子の平衡位置を制御する融通性を提供する41。特に、ディーン抗力と慣性揚力は粒子サイズに応じて非常に際立って変化し、これにより、連続流で粒子を選別するために、異なるサイズの粒子の微分平衡位置を区別できる42。ディーン二次流れは、サンプル収集の便宜のために必要な平衡位置の数を減らすためにも役立つ。
【０００６】
多能性のマイクロ流体操作法として、慣性集束は、複数の用途（例えば、ほんの数例を挙げると、フローサイトメトリーにおけるシースレス配列43、30、サイズ依存性細胞分離36、44、45、変形能依存性細胞分離46、希少細胞分離34、32、40、47、細菌分離26、血小板分離29、血漿抽出48及び溶液交換40、49）に適用されている。とりわけ、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受けて循環系に侵入する、原発腫瘍（又は転移後の腫瘍）から脱落した悪性がん細胞である。ＣＴＣは腫瘍転移の前提条件と見なされており、ＣＴＣを捕捉して分析する能力が、がんの早期診断とがん転移の体系的な研究が可能になる。ただし、ＣＴＣは血流では非常に希少であり（つまり、１ｍＬの全血サンプルに数十のＣＴＣが含まれる50）、そのため、ＣＴＣ選別技術は、実用的な研究及び臨床的要求のための高スループット、純度、及び捕捉率の要件を満たす必要がある。慣性集束にはサンプルを高スループットで処理する能力があるため、高スループットの慣性選別又は濃縮技術の開発への関心が高まっている。例えば、スパイラルチャネルは、希少細胞の単離51、52、35（ＣＴＣなど）、特定の細胞型の分離36、44、27、単一細胞のカプセル化53など、慣性細胞の集束と選別に広く研究及び適用されている設計である。Ｍａｊｉｄ  Ｅｂｒａｈｉｍｉ  Ｗａｒｋｉａｎｉらは、シースフローと組み合わせたスパイラル慣性装置を使用して、リゾ化血液サンプルにスパイクされたがん細胞の少なくとも８５％の回復率を達成し54、シースフローを有する傾斜スパイラルチャネルにより、全血にスパイクされたがん細胞の８０％以上の回復率を達成した51。Ｊｉａｓｈｕ  Ｓｕｎらはダブルスパイラルマイクロチャネルにより、全血にスパイクされたがん細胞の８８．５％の回復率を得た35。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このようならせん慣性装置は、ディーン二次流れが弱いため、小さな細菌を効果的に集束させることができない。そのため、それらは血球濃縮に使用できるが、血液サンプルから細菌を分離して除去するために使用することはできない。生体適合性ポリマーを添加した粘弾性流体を使用する我々の設計では、臨床サンプルからサブミクロン粒子の弾性慣性集束と選別を実現できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、シースレス慣性粒子集束及び細胞選別のための一連の逆波状チャネル構造を有する新規のチャネル設計が考案された。「逆」とは、本発明の実施形態による湾曲ユニットにおけるディーン二次流れの逆転を意味する。様々な実施形態では、単一の波状チャネルユニットは、チャネルの断面に沿って周期的に逆転ディーン二次流れを生成する４つの半円形セグメントからなる。慣性揚力とディーン抗力とのバランスにより、フロースルー粒子と細胞のサイズにもよるが、決定論的な平衡集束位置が得られる。６種の蛍光ミクロ粒子（１５μｍ、１０μｍ、７μｍ、５μｍ、３μｍ、１μｍ）を使用して、サイズ依存性慣性集束挙動を研究した。急回転サブユニットを備えた我々の斬新な設計は、血小板の平均サイズである３μｍという小さな粒子を効果的に集束させることができ、シースフローを使用せずに全血からがん細胞を選別することを可能にした。最適化されたチャネル設計により、シースフローを使用せずに、希釈された全血サンプルにスパイクされたＭＣＦ−７乳がん細胞のサイズベースの選別が実証された。単一の選別プロセスにより、元の混合物から８９．７２％のＭＣＦ−７細胞を回収し、優れた細胞生存力でＭＣＦ−７細胞を元の純度の５．３％から６８．９％に濃縮することができた。
【０００９】
さらに、４種の異なるサイズの蛍光サブミクロンスフェア（１μｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、１００ｎｍ）を使用して、さまざまな条件下での粘弾性流体内の集束挙動を研究した。純度が８８％を超え、回収率が７６％を超える、サブミクロンのエキソソームのシンプルで高いスループット、かつラベルフリーの選別が実現できた。
【００１０】
本明細書における、明確に先に公開された文献の提示及び検討は、必ずしも、その文献が最新技術の一部であるか、又は一般的な一般知識であることを承認するものとは限らない。
【００１１】
本明細書で言及される文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
本発明は、〜ｍＬ／分の程度の流速での高いスループットの細胞選別のための一連の新しい慣性マイクロ流体装置を提供する。特に、本発明は、慣性揚力と二次ディーン流れからの抗力との間のバランスを利用する。サイズに大きく依存するフロースルー細胞の微分平衡位置により、高いスループットのサイズベースの細胞選別が可能になる。二次ディーン流れは、周期的な回転チャネル構造によって生成される。サブミクロンの粒子集束では、生体適合性ポリマーを添加して粘弾性流体を導入することにより、波状チャネルは、従来の直線チャネルと比較して、垂直方向と水平方向の両方でチャネル中心線領域に向けて粒子の集束を促進するより大きな弾性力を生成できる。これらの回転構造の異なるジオメトリー設計により、平衡位置が変化する。これは、特定の細胞選別用途がこれらの周期的な回転チャネル構造の独自の設計を必要とすることを意味する。この一連の新しい慣性マイクロ流体装置は、１〜１０ｍＬの容量の複雑な生体サンプル、例えば全血サンプル中の循環腫瘍細胞、エキソソーム及び病原体のような希少細胞集団の高いスループット及び高忠実度の選別に適用できる大きな可能性がある。
【００１３】
本発明の一側面は、流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための装置を提供し、この装置は、（ａ）前記流体懸濁液を導入するための少なくとも１つの入口；（ｂ）所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも１つの出口；並びに（ｃ）前記少なくとも１つの入口及び前記少なくとも１つの出口と流体連通し、それらの中間にあるチャネルであって、メインチャネルの一部が湾曲して少なくとも１つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されている、チャネルを含み、前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷はそれぞれ半円弧セグメントを形成し、前記流体懸濁液は、前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと前記湾曲ユニットを通って移動する。
【００１４】
有利には、本発明の装置は、３μｍという小さな粒子を効果的に集束させることができ、かつ半径パラメータを変更することで調整可能な粒子分離を容易に達成することができる、少なくとも１つの急回転サブユニットを有する。また、粘弾性力を導入することにより、サブミクロンの粒子集束を実現できる。「湾曲」とは、メインチャネルのあらゆる曲がりを含むことを意味する。例えば、チャネルは、ジグザグ構成、半円構成、Ｏ形状構成、スプリング／スパイラル形状構成などを形成するように曲げられてもよい。
【００１５】
様々な実施形態において、本発明の湾曲ユニットは連続波に似ており、湾曲ユニットの曲率は、既存の技術のスパイラルチャネルと比較してはるかに小さな曲率半径を有するように設計できる。このようなスパイラルチャネルは、徐々に増加する曲率半径を持っている。したがって、湾曲ユニットによって形成されるこれらの周期的な回転チャネル構造は、スパイラルチャネルよりもはるかに強力な二次ディーン流れを生成でき、１μｍ以下の粒子の集束を可能にする（スパイラルチャネルでは１μｍの粒子の集束は困難である）。粒子の大部分は４μｍ未満であるため、１μｍ以下の粒子を効果的に操作する能力は、細菌の選別にとって非常に重要である。直線チャネルは、そのような小さな粒子サイズでは純粋な慣性力で（すなわち、ディーン抗力を導入せずに）細菌の集束を達成することはできない。湾曲ユニットは、本発明の教示に従って半径パラメータを変更することにより、３μｍ程度の小さな粒子を効果的に集束させ、調整可能な粒子分離を容易に達成することができる。
【００１６】
様々な実施形態では、前記谷の半円弧セグメントの直径が、前記山の半円弧セグメントの直径以上である。
【００１７】
様々な実施形態では、前記メインチャネルが複数の湾曲ユニットを含む。
【００１８】
様々な実施形態では、前記複数の湾曲ユニットは直線方向に配置される。１つのチャネルでサンプルを０．１〜１ｍＬ／ｍｉｎの速度で処理できるが、実用的な用途での高いスループットの細胞選別には、チャネルの並列化がなお必要である。チャネルの並列化、すなわち、複数のチャネルを並行して運転することは、スパイラルマイクロ流体装置では実現が困難である。本発明では、そのような複数の湾曲ユニットを直線方向に配列又は配置することができ、スパイラルチャネルと比較してチャネルの並行化の実施がより簡単である。
【００１９】
様々な実施形態では、前記複数の湾曲ユニットが１０〜４０個の湾曲ユニットを含む。
【００２０】
様々な実施形態では、装置が複数の出口を含む。例えば、装置は３つの出口、すなわち第１、第２及び第３の出口を含むことができ、各出口は、流体懸濁液サンプル内の異なるサイズ又はタイプの粒子を排出する。
【００２１】
様々な実施形態では、前記第１、第２及び第３の出口の幅が異なる。第１、第２及び第３の出口の幅は、それぞれ３０〜８０μｍ、４０〜５５μｍ及び３０〜８０μｍであり得る。幅は、操作されている標的／粒子に応じて調整できる。
【００２２】
様々な実施形態では、メインチャネルは長方形の断面輪郭を有する。一例では、メインチャネルの幅は２０〜１２５μｍ、高さは５〜４０μｍである。
【００２３】
様々な実施形態では、前記入口及び前記少なくとも１つの出口のそれぞれが、前記流体懸濁液及び懸濁液中の選別された粒子のためのリザーバをさらに含む。一例では、前記リザーバの直径が１．５ｍｍである。
【００２４】
様々な実施形態では、前記山の半円弧セグメントの直径が６００〜８００μｍであり、前記面の半円弧セグメントの直径が２００〜３５０μｍであり、前記リップの半円弧セグメントの直径が２００〜３５０μｍであり、前記谷の半円弧セグメントの直径が６００μｍ〜１２００μｍである。
【００２５】
慣性による選別は受動的な技術であり、集束、選別、又は操作の効率は、チャネルのジオメトリー、特定の寸法、及び操作のフロー条件に大きく依存することに注意すべきである。さまざまな細胞選別用途の場合、チャネルのジオメトリーと寸法は、非常に慎重な設計が必要であり、それは確実に特許性を有する。したがって、以下で詳細に説明するように、本発明の湾曲ユニットのジオメトリー及び設計構成の選択は、任意のものではない。
【００２６】
本発明の別の側面は、流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作する方法を提供し、この方法は、（ａ）前記流体懸濁液を導入するための少なくとも１つの入口を提供すること；（ｂ）所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも１つの出口を提供すること；（ｃ）前記少なくとも１つの入口及び前記少なくとも１つの出口と流体連通し、それらの中間にあるメインチャネルであって、前記メインチャネルの一部が湾曲して少なくとも１つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されており、前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷がそれぞれ半円弧セグメントを形成する、メインチャネル；並びに（ｄ）前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと、前記湾曲ユニットを通って前記流体懸濁液をポンプで送ることを含む。
【００２７】
様々な実施形態では、前記方法は、前記谷の半円弧セグメントの直径が前記山の半円弧セグメントの直径以上である前記湾曲ユニットを通って、前記流体懸濁液をポンプで送ることをさらに含む。
【００２８】
様々な実施形態では、前記方法は、直線方向に配置される複数の湾曲ユニットを通って前記流体懸濁液をポンプで送ることをさらに含み、前記複数の湾曲ユニットが、１０〜４０個の湾曲ユニットを含む。
【００２９】
様々な実施形態では、前記方法は、前記流体懸濁液を４０μＬ／分〜２００μＬ／分の流速でポンプで送ることをさらに含む。
【００３０】
様々な実施形態では、前記方法は、前記山の半円弧セグメントの直径が６００〜８００μｍであり、前記面の半円弧セグメントの直径が２００〜３５０μｍであり、前記リップの半円弧セグメントの直径が２００〜３５０μｍであり、前記谷の半円弧セグメントの直径が６００μｍ〜１２００μｍである波状湾曲ユニットを通って、前記流体懸濁液をポンプで送ることを含む。
【００３１】
様々な実施形態では、前記方法は、第１、第２及び第３の出口である３つの出口で前記流体懸濁液を排出することをさらに含む。
【００３２】
様々な実施形態では、前記方法は、前記第１の出口で約３μｍ〜１０μｍのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出し、前記第２の出口で約１５μｍのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出し、前記第３の出口で約３μｍのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出することをさらに含む。
【００３３】
様々な実施形態では、前記流体懸濁液が全血サンプルであり、前記方法は前記サンプルから、がん細胞を分離し、又は前記流体懸濁液サンプルから異なるタイプの血球を分離し、又はサブマイクロン小胞とエキソソームを分離する。
【００３４】
様々な実施形態では、前記方法は約３００ｎｍ（以上）のサイズを有する粒子を、約１００ｎｍのサイズを有する粒子から分離する。
【発明の効果】
【００３５】
有利に、本発明は、生物学的研究及び臨床診断における、希少細胞集団の高いスループット及び高忠実度の選別に適用できる大きな可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本発明が完全に理解され、容易に実施できるように、非限定的な例として、本発明の好ましい実施形態のみを説明し、説明は添付の例示の図を参照して行う。
【００３７】
【図１】一連の逆波状チャネルユニットを有する、慣性集束用の３つの異なるチャネル設計である。（ａ）代表的な慣性選別マイクロ流体装置の写真である。マイクロチャネルへの青色染料の注入は、チャネル設計の視覚化に資する。スケールバーは１ｃｍである。（ｂ）単一の混合インプットにおける３つの異なるサイズの微粒子（３μｍ：青、１０μｍ：赤及び１５μｍ：緑）の慣性集束挙動の概略図である。（ｃ）各パターンの詳細な幾何学的パラメータである。パターン１〜３は、上部の半円（外側と内側の両方の半円）と下部の内側の半円の同じ幾何学的パラメータを共有し、下部の外側の半円は２００μｍずつ増加する。すべてのチャネル設計の幅は１２５μｍ、高さは４０μｍである。
【図２】３つのチャネル設計における異なる断面でのディーン二次流れの数値シミュレーションである。（ａ）単一の波状チャネルユニットに沿ったディーン流れを視覚化するために選択された４つの断面Ａ〜Ｄである。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、上部外側半円、下部内側半円、上部内側半円、及び下部外側半円の曲率半径である。（ｂ）チャネル断面に沿った典型的なディーン二次流れ（２つの対称的な逆回転渦）である。（ｃ）３つのチャネル設計の４つの断面Ａ〜Ｄに沿った速度プロファイルのシミュレーションである。左側はすべてチャネルの外壁を示す。色のレベルは、ディーンの流速の大きさを表す。（ｄ）３つのチャネルパターンの断面Ｄにおける速度プロファイルの拡大スケールである。
【図３ａ】３つのチャネル設計（ａ：パターン１；ｂ：パターン２；ｃ：パターン３）で慣性集束を受けた６種の異なるサイズの粒子（１５μｍ、１０μｍ、７μｍ、５μｍ、３μｍ及び１μｍ）の蛍光顕微鏡画像である。Ｉ欄及びＩＩ欄は、それぞれ上流及び中流における粒子軌道を示す。ＩＩＩ〜ＶＩ欄はそれぞれ、Ｒｅc＝１０（流速：４９．４１μＬ／ｍｉｎ）、２０（流速：９８．８３μＬ／ｍｉｎ）、３０（流速：１４８．２５μＬ／ｍｉｎ）、及び４０（流速：１９７．６０μＬ／ｍｉｎ）における下流の粒子軌道を示す。
【図３ｂ】３つのチャネル設計（ａ：パターン１；ｂ：パターン２；ｃ：パターン３）で慣性集束を受けた６種の異なるサイズの粒子（１５μｍ、１０μｍ、７μｍ、５μｍ、３μｍ及び１μｍ）の蛍光顕微鏡画像である。Ｉ欄及びＩＩ欄は、それぞれ上流及び中流における粒子軌道を示す。ＩＩＩ〜ＶＩ欄はそれぞれ、Ｒｅc＝１０（流速：４９．４１μＬ／ｍｉｎ）、２０（流速：９８．８３μＬ／ｍｉｎ）、３０（流速：１４８．２５μＬ／ｍｉｎ）、及び４０（流速：１９７．６０μＬ／ｍｉｎ）における下流の粒子軌道を示す。
【図３ｃ】３つのチャネル設計（ａ：パターン１；ｂ：パターン２；ｃ：パターン３）で慣性集束を受けた６種の異なるサイズの粒子（１５μｍ、１０μｍ、７μｍ、５μｍ、３μｍ及び１μｍ）の蛍光顕微鏡画像である。Ｉ欄及びＩＩ欄は、それぞれ上流及び中流における粒子軌道を示す。ＩＩＩ〜ＶＩ欄はそれぞれ、Ｒｅc＝１０（流速：４９．４１μＬ／ｍｉｎ）、２０（流速：９８．８３μＬ／ｍｉｎ）、３０（流速：１４８．２５μＬ／ｍｉｎ）、及び４０（流速：１９７．６０μＬ／ｍｉｎ）における下流の粒子軌道を示す。
【図３ｄ】３つのチャネル設計における下流の６種の粒子の集束位置の比較である。横座標と縦座標は、それぞれチャネルのレイノルズ数Ｒｅcとチャネル幅を表す。
【図４】パターン３選別装置を使用した、３種の異なるサイズの粒子の分離である。（ａ）単一の混合インプットにおける３種の異なるサイズの微粒子（３μｍ、１０μｍ、１５μｍ）の分離の概略実験セットアップである。（ｂ）三叉出口での３種の粒子の蛍光ストリークである。１０μｍ（赤色蛍光）及び１５μｍ粒子（緑色蛍光）は、それぞれアウトプット１及び２で収集された。３μｍ粒子（青色蛍光）がアウトプット１と３の両方で収集された。流速は１９７．６０μＬ／ｍｉｎ（Ｒｅc＝４０）であった。スケールバーは１２５μｍである。
【図５】パターン３選別装置での全血からのがん細胞の分離である。（ａ）混合物中の個別細胞の顕微鏡画像である。２つの黄色の矢印は、周囲の血球に比べてはるかに大きい２つの個別のＭＣＦ−７細胞を示す。スケールバーは１００μｍである。（ｂ）希釈（１００倍）全血からのがん細胞の分離を示す模式図であり、図中、がん細胞、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）の予想集束位置が示される。（ｃ）三叉出口での集束がん細胞の蛍光画像である。がん細胞は緑の線に沿って集束され（アウトプット２から排出）、ＲＢＣは薄暗い赤の線に沿って集束された（アウトプット１から排出）。スケールバーは１２５μｍである。（ｄ）明視野モードで高速カメラによってキャプチャされた他の血球からの個々のＭＣＦ−７細胞の分離プロセス（視野は（ｃ）に示される破線枠である）。矢印は、対応する時点でのＭＣＦ−７の位置を示す。スケールバーは１２５μｍである。
【図６】予混合及び選別されたサンプルの顕微鏡画像とフローサイトメトリーの結果である。（ａ〜ｄ）慣性選別装置を介してインプットからアウトプットまでの、がん細胞と混合された希釈全血の蛍光画像（パターン３）である。ＭＣＦ−７は緑色の蛍光で示される。スケールバーは１００μｍである。（ｅ）アウトプット２から収集されたＭＣＦ−７細胞は培養され、増殖することができたことを示す。（ｆ）フローサイトメトリー分析によって得られた、３つのアウトプットでの慣性選別装置によるＭＣＦ−７細胞の回収率である。（ｇ）３つのアウトプットと入口における、慣性選別装置によるＭＣＦ−７細胞の純度である。
【図７】不均一な細胞サンプル中の単一の標的細胞のための波状マイクロチャネル構造を備えた慣性選別技術の概略図である：（Ｉ）ミクロンサイズの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の単離；（ＩＩ）サブミクロンエキソソームの単離。
【図８】粘弾性流体内のさまざまなＰＥＯ濃度を有する、４種の異なるサイズのサブミクロンスフェア（１μｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、１００ｎｍ）の波状チャネルに沿った弾性慣性集束を示す蛍光顕微鏡画像である。画像は、マイクロチャネルの下流の三叉アウトプットセクションの近くの１つのユニットを示す。すべての実験は、レイノルズ数Ｒｅc＝３０（流速：４４．９０μＬ／ｍｉｎ）で同じ条件で行われた。（Ｉ）〜（Ｖ）欄は、０．０８ｗｔ％〜０．１６ｗｔ％の相対ＰＥＯ濃度を表す。
【図９】粘弾性流体を有する波状チャネルを使用した、サイズの異なる２種の１００ｎｍ（青）及び３００ｎｍ（ピンク）粒子分離のＮＴＡ結果である。（ａ）選別前の１００ｎｍ及び３００ｎｍ粒子の混合サンプルの正規化された分布である。（ｂ）副アウトプットから収集されたサンプルの正規化された分布である。（ｃ）中間アウトプットから収集されたサンプルの正規化された分布である。（ｄ）中間アウトプットと副アウトプットの両方から収集されたサンプルのＮＴＡ結果から計算された回収率である。
【図１０】粘弾性流体を有する波状チャネルを使用して、ＭＣＦ−７培地中のエキソソーム及びより大きなＥＶの分離のＮＴＡ結果である。（ａ）選別前のエキソソームとより大きなＥＶの混合物の正規化された分布である。（ｂ）副アウトプットから収集されたサンプルの正規化された分布である。（ｃ）中間アウトプットから収集されたサンプルの正規化された分布である。（ａ）〜（ｃ）の濃度は５×１０8粒子／ｍＬである。（ｄ）中間アウトプットと副アウトプットの両方から収集されたサンプルのＮＴＡ結果から計算されたエキソソーム及びより大きなＥＶの回収率である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明では、シースレス慣性粒子集束及び細胞選別のための、新規の幾何学的チャネル設計、非対称逆波状マイクロチャネルが考案されている。台形44、円、半円、三角55などの複数の断面形状が研究されてきたが、単純な製造プロセスであることから、典型的な長方形断面設計が選択された。３つのチャネルパターン設計における６種の蛍光ミクロンサイズの粒子（１５μｍ、１０μｍ、７μｍ、５μｍ、３μｍ及び１μｍ）の慣性集束挙動が実験的に調べられた。効果的な慣性集束のための最小粒子サイズは、１〜３μｍであることがわかった。これらの実験的研究に基づいて、全血サンプルのがん細胞の分離の要件を満たすために最適化されたチャネル設計が特定された。この新しい装置設計の応用の可能性を実証するために、乳がん細胞でスパイクした希釈全血サンプルを使用して、臨床ＣＴＣサンプルを擬態し、慣性マイクロ流体装置の選別性能をテストした。１つの単一の選別プロセスで、８９％以上のがん細胞を回収し、がん細胞の純度を１３倍に高めることができた。以前の慣性選別装置と比較して、極急回転サブユニットを備えた現在の新規設計は、３μｍもの小さな細胞に効果的に集束でき、したがってシースフローを使用せず、がん細胞から３種の主要な血球タイプ（すなわち、赤血球、白血球、及び血小板）を効果的に分離することができる。さらに、反復波状のユニットが直線方向に配列されているため、大量のサンプルを処理するためのマルチチャネルの水平（２Ｄ）及び垂直（３Ｄ）の並列化が容易になる。さらに、４種の異なるサイズの蛍光サブミクロンスフェア（１μｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、１００ｎｍ）を使用して、さまざまな条件下での粘弾性流体内の集束挙動を研究した。純度が８８％を超え、回収率が７６％を超える、エキソソームのシンプルで高いスループット、かつラベルフリーの選別が実現できた。この開発された弾性慣性エキソソーム選別技術は、さまざまなエキソソーム関連の生物学的研究、臨床及び製薬用途で有望なプラットフォームを提供する可能性がある。
【００３９】
図１は、流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための慣性装置５の実施形態を示す。図１を参照すると、装置５は、流体懸濁液を受け入れ又は導入するための入口１０と、チャネル１５と、出口２０を含む。これにより、流体懸濁液は、入口１０からチャネル１５を通って移動し、出口２０を介して装置５から出る。
【００４０】
「流体懸濁液」とは、選別、分離又は操作されることが望まれる粒子の懸濁液を含むあらゆる流体を含むことを意味する。粒子は生物学的物質又はその他のものであり得る。様々な実施形態では、以下で詳細に説明するように、流体懸濁液は、血液成分を含む血液サンプルであってよい。
【００４１】
この図は、両端に配置された入口１０及び出口２０、並びに入口１０及び出口２０と流体連通し、それらの中間にあるチャネル１５を示す。出口２０は、選別／分離／操作された粒子を排出するように適合されている。様々な実施形態では、出口２０は、１つより多く含むことができる。例えば、図５ｂは、３つの出口２０ａ、２０ｂ及び２０ｃを示す。各出口は、特定のサイズの粒子を選別するように適合される。装置５が選別を達成する手段は、チャネル１５の一部を湾曲させて、少なくとも１つの湾曲ユニット２５を形成することである。図１ｂは、本発明の実施形態による湾曲ユニット２５の分解図を示す。
【００４２】
湾曲ユニット２５は、山３０、谷４０上で湾曲するリップ３５、及び面４５を有する波の輪郭を形成するように成形されており、湾曲ユニット２５の山３０、リップ３５、面４５及び谷４０はそれぞれ半円弧セグメントを形成する。図１ｂ及び２ａに示される矢印は、湾曲ユニット２５を通る、すなわち、山３０の半円弧セグメントから谷４０の半円弧セグメントへの流体懸濁液の移動方向を示す。
【００４３】
「半円弧セグメント」とは、あらゆる曲線を含むことを意味する。様々な実施形態では、円の一部を形成できる任意の曲線を含むことも意味する。そのようなセグメントには、割線又は弦によって円の残りの部分から「カットオフ」される円の領域が含まれる。本発明の文脈では、あらゆる曲線は、入口１０と出口２０との間に配置される湾曲チャネル１５にあたり得る。本発明の非限定的な特定の実施形態では、半円弧セグメントは、直径線に沿って円全体を切断することによって形成される半円であり得る。
【００４４】
湾曲ユニット２５は、より詳細に説明され得る。図に見られるように、湾曲ユニット２５の波輪郭は、波輪郭の山３０（上部外側半円）及び面４５（上部内側半円）によってそれぞれ表される上部半円、並びに波輪郭のリップ３５（下部内側半円）及び谷４０（下部外側半円）によってそれぞれ表される下部半円を有することができる。上部と下部の半円は、架空の水平軸を中心に互いに向かい合っている。
【００４５】
コンセプトと動作原理
固体粒子が中間レイノルズ数領域（〜１００＞Ｒｅ＞〜１）で境界付き直線チャネルに沿って流れている場合、メイン流れ方向に沿って粒子に作用する粘性抗力に加えて、メイン流れに対して垂直に、粒子に作用する４つのタイプの慣性揚力がある22：ｉ）粒子のすべり回転によるマグヌス力（Ｍａｇｎｕｓ  ｆｏｒｃｅ）；ｉｉ）粒子の滑り剪断によるサフマン力（Ｓａｆｆｍａｎ  ｆｏｒｃｅ）；ｉｉｉ）流体速度プロファイルの曲率に起因する、剪断勾配によって引き起こされる揚力（粒子から壁に指向する）、及びｉｖ）粒子と壁の間の相互作用に起因する、壁によって引き起こされる揚力（壁から粒子を押し離す）。これらの力の中で、マグヌス力とサフマン力は通常、他の２つの揚力と比較してはるかに小さく、通常、マイクロ流体選別用途では無視できる。後者の２つの慣性揚力のバランスにより、ＳｅｇｒｅとＳｉｌｂｅｒｂｅｒｇ19によって観察された円筒状パイプに沿ったチューブラピンチ効果が生じる。Ａｓｍｏｌｏｖ氏のモデル56、42によると、２つの主要な揚力からなる正味慣性揚力は、次のように表すことができる。
中心付近：
【数１】
2021506263.tif 000003
壁付近：
【数２】
2021506263.tif 000004
式中、ｆLは揚力係数を指し、レイノルズ数Ｒｅ＜１００の場合は通常０．５20となり、ρf、Ｕ及びａはそれぞれ流体密度、流体速度及び粒子径を指す。ここでのＨは水力直径として定義され、長方形のチャネルでは２ｗｈ／（ｗ＋ｈ）として計算され、ここで、ｗはチャネル幅を指し、ｈは断面のチャネル高さを指す。
【００４６】
定常状態の非圧縮性ナビエストークス方程式（Ｎａｖｉｅｒ−Ｓｔｏｋｅｓ  ｅｑｕａｔｉｏｎｓ）（式３）及び連続方程式（式４）を使用して、マイクロチャネル内の流体の流れを表す。式３の左側の項は、急回転でディーン二次流れを生成する流体の慣性である。
【数３】
2021506263.tif 000005
【数４】
2021506263.tif 000006
流体に作用する慣性力と粘性力の関係を定量化するために、チャネルレイノルズ数Ｒｅcは次のように定義される。
【数５】
2021506263.tif 000007
式中、Ｕmは最大流速、μは流動粘度である。「ｕ→」（ｕの上に右矢印）は流体速度ベクトル、ρは流体圧力である。
【００４７】
中間レイノルズ数領域での曲率誘起ディーン流れなどの二次側方流動の導入により、粒子の平衡位置の制御性が向上する21。中央と壁付近の領域での連続流に対する側方遠心力の不一致と質量の保存により、湾曲チャネルの断面に沿って２つの逆回転ディーン渦が生成されることが可能である。無次元ディーン数Ｄｅは、ディーン流動強度を描くために使用される41、57。
【数６】
2021506263.tif 000008
式中、Ｒは曲率半径を表す。ディーン流れの大きさは、Ｕ2mに比例し、すなわち、
【数７】
2021506263.tif 000009
ディーン流れは、メイン流れ方向に対して垂直な粒子を引き寄せる。ディーン抗力は、次のように定義できる。
【数８】
2021506263.tif 000010
ディーン抗力には線形サイズスケーリングがあり、これは正味慣性揚力のサイズスケーリングとは異なる。したがって、ディーン抗力と正味慣性揚力の同時効果により、サイズの異なる粒子の平衡位置が微分され、連続フローでサイズベースの慣性選別が可能になる。
【００４８】
慣性選別装置の設計を導くために、特定のチャネルジオメトリーの以前の研究で２つの経験的パラメータが見つかった。まず、慣性集束を成功させるために、ａ／Ｈ＞０．０７が一般的に推奨される20。別の経験的パラメータＲfは、慣性揚力とディーン抗力の比であり、以下のように定義される23：
【数９】
2021506263.tif 000011
Ｒf＞〜０．０８の場合、慣性揚力がディーン抗力よりも支配的であることを意味する。逆に、Ｒf＜〜０．０８の場合、粒子の動きは慣性揚力ではなくディーン流れによって支配される。また、Ｒfの値が小さすぎると、決定論的な粒子集束ではなく、カオス的な粒子の動きが生成される。
【００４９】
非ニュートン粘弾性流体の場合、粒子に生成される追加の弾性力は、粒子の平衡集束位置にも影響を与える。ワイセンベルク数（Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇ  ｎｕｍｂｅｒ）Ｗｉは、流体の粘弾性効果を測定するために使用される58、59、60。
【数１０】
2021506263.tif 000012
ここで、λは流体の緩和時間を表し、「Υ・」（Υの上に点）はチャネル断面全体の流体せん断速度を表す。粘弾性流体を流れる粒子は、第１及び第２の垂直応力の影響を受ける61、62。Ｎ1＝τ11−τ22はメイン流れ方向に沿った張力を示し63、Ｎ2＝τ22−τ33はチャネルの断面に沿って二次流れを及ぼし64、ここで、τ11、τ22、τ33は、それぞれ流れ、速度勾配、回転方向を表す。ほとんどの粘弾性解では、Ｎ1の大きさがＮ2よりはるかに大きいため、Ｎ2は無視できる65,66。そのため、より小さいせん断速度領域を指向する粒子に加えられる弾性力は、以下のように表すことができる67、68、69。
【数１１】
2021506263.tif 000013
ここで、ＣEは無次元の弾性揚力係数を指す。
【００５０】
図１は、下部の外側の半円形の半径が、これらのチャネルジオメトリーにおいて集束する慣性粒子にどのように影響するかを理解するための３つの異なるチャネルパターンを示す。パターン１〜３は、同じ上部半円形設計と異なる下部外側半円形設定を持ち、ここで、パターン１はユニットパターンの中心に対して幾何学的に対称であり、パターン２と３はある程度の幾何学的非対称性を示す。３つのチャネル設計はすべて１つの入口設計を使用しており、メインチャネルの幅は１２５μｍ、高さは４０μｍであり、アスペクト比の低い設計（ＡＲ＝ｈ／ｗ＝０．３２）である。３つの出口分岐の幅は、それぞれ８０μｍ、４５μｍ、８０μｍである。入口及び出口リザーバの直径は１．５ｍｍである。図１ａは、連続逆波状チャネル構造を持つ代表的なマイクロ流体チャネルを示す。ここで、入口でランダムに分布した粒子は、チャネルを出るときに、粒子サイズに基づいて決定論的に、微分の細いストリークに集束されることができる（図１ｂ）。これらのパターン設計の詳細な幾何学的パラメータを図１ｃに示す。
【実施例】
【００５１】
材料及び方法
［装置の製作］
３つの異なるマイクロチャネルを、標準のポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ、ＰＤＭＳ）ソフトリソグラフィープロセスを使用して製造した。ＰＤＭＳキャスティングのマスターモールドは、シリコンウェーハ上にＳＵ−８（ＳＵ−８  ２０２５、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、ニュートン、マサチューセッツ州、米国）で製造した。ＰＤＭＳマイクロチャネル層と超音波洗浄ガラススライドを空気プラズマ（ＨａｒｒｉｃｋプラズマＰＤＣ−３２Ｇ、イサカ、ニューヨーク、米国）で処理して、表面にヒドロキシル官能基を生成した。次に、処理された表面を接触させて、閉じたマイクロチャネルを形成した。
【００５２】
［数値モデリング］
有限要素法（ｆｉｎｉｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ、ＦＥＭ）ベースの数値シミュレーションを、ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ  ５．０層流モジュールを使用して定常状態試験（ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ  ｓｔｕｄｙ）で行った（ｗｗｗ．ｃｏｍｓｏｌ．ｃｏｍ）。このモデルは、実験と同じジオメトリー寸法と入口流速を持つ３つの逆波状チャネルユニットで構成されている。非圧縮性ナビエストークス方程式（式３）と連続方程式（式４）は、マイクロチャネル内の流体運動をシミュレーションする支配方程式であり、ディーン二次流れが慣性粒子の集束にどのように影響するかを理解するのに役立つ。入口と出口以外の境界は非スリップ状態とした。流速１９７．６０μＬ／ｍｉｎ（チャネルレイノルズ数Ｒｅc＝４０に相当）での入口速度が計算され、最大ディーン流速も得られた。
【００５３】
［細胞培養］
ＭＣＦ−７乳がん細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＢ−７２）から購入し、１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）を補充した（成長因子と抗生物質を提供するため）ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で培養した。この培地は、細菌の成長を防ぐため、ペニシリンとストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を含む。加湿インキュベーター内において、単層が８０〜９０％のコンフルエントに達したときに細胞を２〜３日ごとに継代培養し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2に維持した。次に、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でトリプシン処理した。
【００５４】
［サンプル前処理］
蛍光ポリスチレンミクロスフェア（１５μｍ、１０μｍ、７μｍ、５μｍ、３μｍ及び１μｍ）を、追加の変更なく購入した（Ｍａｇｓｐｈｅｒｅ、米国）。これらの蛍光ポリスチレン粒子はすべて、０．６％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を含む脱イオン（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ、ＤＩ）水で希釈して、粒子の凝集とチャネル壁への付着を回避した。以下の実験で使用される典型的な粒子濃度は約６×１０6粒子／ｍＬであった。１５μｍ、１０μｍ、３μｍの粒子をＤＩ水に懸濁した混合物（０．６％Ｆ１２７を含む）を使用して、連続フローでのサイズベースの粒子選別を実証した。がん細胞（ＭＣＦ−７）をＳＹＴＯ  ９蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で染色し、希釈された全血（最終濃度は約５×１０7細胞／ｍＬ）と混合した。この細胞混合物は、上記波状慣性集束装置を使用して、血球からのＭＣＦ−７がん細胞のサイズベースの選別を実証するために使用された。
【００５５】
蛍光ポリスチレンミクロスフェア（１μｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、１００ｎｍ）を、追加の変更なく購入した（Ｍａｇｓｐｈｅｒｅ、米国）。これらの蛍光ポリスチレン粒子はすべて、０．６％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＤＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で希釈して、粒子の凝集とチャネル壁への付着を回避した。この実験で使用される典型的な粒子濃度は約６×１０7粒子／ｍＬであった。ＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）溶液は、ＰＥＯ（Ｍw＝６００ＫＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）の粉末をＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に０．０８ｗｔ％、０．１０ｗｔ％、０．１２ｗｔ％、０．１４ｗｔ％及び０．１６ｗｔ％の濃度で溶解することで作成した。ＰＥＯ粉末をＤＰＢＳに加えた後、均一な溶液特性を維持するために、溶液は一晩の穏やかな拡販を要した。ＰＥＯを水溶液に添加すると、流体は非ニュートン流体になる。これを行うことにより、追加の力を使用して、流体内のサブミクロン粒子を操作できる。
【００５６】
細胞外小胞は、約４８時間〜７２時間（細胞コンフルエントは約８５％に達する）の細胞増殖後にＭＣＦ−７細胞培養培地から収集した。次に、細胞外小胞を含む細胞培養上清を、示差遠心分離手順にかけた。最初に、５００×ｇの速度で５分間の遠心分離を使用して、かさばるアポトーシス及び死細胞の破片を除去した。続いて、残りの無傷の細胞、及びより大きなＥＶの一部を、２０００×ｇ及び１２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより除去した。なお、タンパク質含有物の変性を防ぐために、すべての遠心分離ステップは４℃で行われた。培地を最後に膜濾過（ポアサイズ：０．８μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）で処理して、不要な破片を取り除いた。実験で使用される典型的な小胞濃度は約５×１０8粒子／ｍＬであった。
【００５７】
［実験セットアップ］
使用済み装置内の残留粒子や気泡による相互コンタミネーションや考えられる詰まりを回避するために、個々の実験は新しいマイクロチャネル装置を使用して行われた。各実験について、シリンジポンプを使用して、４９．４１μＬ／ｍｉｎから１９７．６０μＬ／ｍｉｎ（１０〜４０のＲｅcに相当）の流速で、調製した水性サンプルをマイクロチャネルに連続的に注入した。これらの蛍光マイクロ粒子の軌跡は、ＣＣＤカメラを使用して倒立顕微鏡（オリンパス、ＣＫＸ５３、日本）で記録し、慣性集束挙動をキャプチャした。三叉出口での単一細胞の動きは、細胞分離プロセスを視覚化するために高速カメラ（ＦＡＳＴＣＡＭ  Ｍｉｎｉ  ＵＸ１００、ＰＨＯＴＲＯＮ、日本）を使用してキャプチャした。慣性選別の前後のサンプルの細胞含有量を、市販のフローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州、米国）で分析して、選別性能を評価した。エキソソーム単離実験では、選別の前後のサンプルの媒体内容物を、市販のＮＴＡ、ナノ粒子追跡分析システム（ＺｅｔａＶｉｅｗ、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｔｒｉｘ、ドイツ）で分析してサイズ分布を取得し、選別性能を評価した。すべてのサンプルは、正確な結果を得るためにＮＴＡ測定用にＤＰＢＳで約５×１０6の濃度に希釈され、すべての測定は２２℃で行われた。すべてのデータはＺｅｔａＶｉｅｗ（ｗｗｗ．ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｍｅｔｒｉｘ．ｄｅ）を通じて収集し、ＺｅｔａＶｉｅｗ  Ａｎａｌｙｚｅで分析した。
【００５８】
結果と考察
［３つのチャネル設計での流体の流れのシミュレーション］
図２ａで定義されている４つの断面Ａ〜Ｄに沿った速度プロファイルを調査することが特に興味深いため、３つの異なるチャネル設計での流体の流れが最初にシミュレーションした。すべてのシミュレーションは、１９７．６０μＬ／ｍｉｎ（Ｒｅc＝４０）の流速で行われた。図２ｂは、チャネル断面の１つに沿った代表的なフロープロファイルを示す。左側と右側は、それぞれチャネルの外壁（曲率半径が大きい）と内壁（曲率半径が小さい）である。流体が回転チャネルを流れるとき、流体の慣性は中間チャネルレイノルズ数領域（〜１００＞Ｒｅc＞〜１）で重要になる。チャネルの中央領域では、メイン流れ方向に沿って速く移動する流体は、断面方向に沿って外壁に向かって移動する傾向がある。閉じたチャネル内の流体質量を保存するために、上壁と下壁の近くでゆっくり動く流体は、内壁に向かって移動する傾向があり、ディーン二次流れと呼ばれるメイン流れ方向に垂直な２つの対称的な逆回転渦を生成する。
【００５９】
【表１】
2021506263.tif 000014
【００６０】
図２ｃの最初の欄は、単一の波状チャネルユニットの中心に対して幾何学的に対称になるように設計されたチャネルパターン１の４つの断面に沿ったディーン二次流れを示している。流体が断面Ａを流れると、断面に沿って比較的弱いディーン二次流れが発生し始める。図２ｃにおける外壁は常にチャネル断面の左側にある。断面ＡからＢに向かって、流体は上部外側の半円から下部内側の半円に流れ、その間、曲率半径は徐々に減少する。ディーン流れの大きさがＲに反比例するので、ディーン二次流れは、断面Ａと比較して、断面Ｂではるかに顕著になる。ＡからＢまで、外壁は同じチャネル側に沿っていることに留意すべきである。断面ＢからＣに向かって、流体は下部内側半円から上部内側半円に流れ、最も急な流れの回転を受ける。２つの断面の曲率半径は同じであるものの、ディーン二次流れは、断面Ｂと比較して、断面Ｃでさらに強くなる。これは、ＡからＢへの曲率半径の変化とＢからＣへの曲率半径の変化が異なるため、ＢとＣでの流れの発達にかなりの違いが生じることを考慮すると、直感的に理解できる。４つの断面における最大ディーン流れ速度を表１に列挙し、定量的に比較すると、ＢとＣの間でディーン流れ強度に〜２７％の相対差があることがわかる。特に、この逆波状チャネル設計により、ＡからＢへの外壁は、同じチャネル側に沿ってＢからＣへの内壁に反転する。これは、断面に沿ったディーン二次流れの方向が、断面ＢからＣに反転することを意味する。断面ＣからＤにかけて、曲率半径は徐々に増加し、内壁は同じチャネル側に沿ったままである。その結果、ディーン二次流れは、上部内側の半円から下部外側の半円に流れるときに弱くなる。要約すると、一つの波状チャネルユニットに沿って、ディーン二次流れの強度は弱かったり強かったりし、内側の半円に最も強いディーン渦があり、当該一つの波状チャネルユニットを離れると再び弱くなる。さらに、ディーン二次流れの方向は、一つの波状チャネルユニットを通じて１回反転する。チャネルパターン１はユニットの中心に対して幾何学的に対称であるが、周期的に反転するディーン二次流れの強度は、特に２つの内側の半円に沿って、ある程度の非対称を示す。
【００６１】
チャネルパターン１とは異なり、パターン２と３は、下部の外側の半円の曲率半径をそれぞれ１００μｍと２００μｍ増加させることにより、ある程度の幾何学的非対称性を導入している。全体的に、４つの断面Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄでのディーン流れは、同様の速度プロファイルを示す。表１は、３つのチャネルパターン設計における異なる断面での最大ディーン流速を定量的に比較している。断面Ａ、Ｂ、Ｃにおける３つの設計の最大速度の相対差は、約５％未満である。前述のように、断面ＢとＣの間の最大ディーン流速の相対差は、パターン１で約２７％である。この相対差は、パターン２と３の両方で〜２７％のままであることがわかっており、ＢからＣへの一貫した流れの非対称性を示す。導入された幾何学的非対称性は主に下部外側半円の曲率半径を変化させるため、パターン１と２の間、及びパターン１と３の間における、断面Ｄでの最大速度の相対差はそれぞれ〜２３％と〜３８％であることがわかった。断面Ｄでのディーン流れの違いを明確に視覚化するために、図２ｄの黒い破線枠内に示すように、流速のスケールを拡大した。明らかに、断面Ｄでのディーン渦の強度は、パターン１からパターン３へと減少する。断面Ｄのディーン渦は断面Ｃのディーン渦に比べて約７〜１０倍弱いことから、下部外側半円の曲率半径の変化は、一つの波状チャネルユニット内における、ディーン二次流れの微調整と考えることができる。
【００６２】
［３つのチャネル設計におけるサイズに依存する慣性集束］
３つの異なるチャネル設計における異なるサイズのミクロスフェア（１５μｍ、１０μｍ、７μｍ、５μｍ、３μｍ及び１μｍ）の慣性集束挙動を調査した。これらのミクロスフェアは蛍光性であるため、非常に高い流速でも粒子の軌跡を明確に視覚化できる。図３ａ〜３ｃは、３つのチャネル設計における、さまざまな流速での異なるサイズの粒子の蛍光ストリーク画像を示している。４つの異なる流速４９．４１μＬ／ｍｉｎ、９８．８３μＬ／ｍｉｎ、１４８．２５μＬ／ｍｉｎ、及び１９７．６０μＬ／ｍｉｎ（それぞれチャネルレイノルズ数Ｒｅc＝１０、２０、３０及び４０に相当）を選択して、慣性集束挙動を研究した。
【００６３】
チャネルの上流でのチャネルパターン１（図３ａ）の慣性集束挙動を詳しく見ると（図３ａのＩ欄に示す最初の波状チャネルユニット）、６種の異なるサイズの蛍光粒子は非常によく似た挙動を示し、明らかな慣性集束効果なしにチャネル断面全体を完全に占有した。慣性集束が定常状態（Ｒｅc＝４０）に達していない中流（図３ａのＩＩ欄）では、１５μｍと１０μｍの粒子がチャネルの中心線に沿って集束する傾向を示した。７μｍ、５μｍ、及び３μｍの粒子は、チャネルの２つの側壁の近くに２つのストリークを形成する傾向があった。最小の１μｍは、慣性集束の傾向を示さなかった。下流（図３ａのＩＩＩ欄からＶＩ欄に示す最後の波状チャネルユニット）でも、異なるサイズの粒子を収集するための三叉出口もあり、これらの粒子は異なるＲｅcで定常状態の慣性集束に達している。１５μｍのミクロスフェアは、Ｒｅc＝１０でも、チャネルの中心線領域に沿って１つの単一ストリークを形成するように集束された。中央領域付近の慣性揚力はＵ2とａ4に比例するため、１５μｍのミクロスフェアは他の粒子サイズよりも慣性集束を達成するのが簡単であった（ａ／Ｈ＝０．３５４＞０．０７）。慣性揚力とディーン抗力の役割を評価するためのもう１つの重要なパラメータは、Ｒf＝０．３５４である。以下では、さまざまな粒子のすべてのＲf値は、内側の半円の外壁に沿った曲率半径を使用して計算した（Ｒ＝１７５μｍ）。Ｒf＝０．３５４＞０．０８は、慣性揚力がディーン抗力よりも支配的であることを意味し、その結果、１５μｍ粒子の平衡集束位置は、直線チャネルに沿った慣性集束と同様に、ほぼ中心線に沿ったままで、ＡＲ＝ｈ／ｗ＝０．３２であった。Ｒｅc＝１０及び２０では、１５μｍのミクロスフェアは最終的に予想どおり中央の出口に流れ込んだ。一方、Ｒｅc＝３０及び４０では、集束された１５μｍのミクロスフェアが上部出口に流れ込み、その平衡集束位置が上部出口に向かってわずかにシフトしたことを示している。流速が増加するにつれて、ディーン抗力は１５μｍミクロスフェアの慣性揚力よりも速く増加したと推測される。ディーン抗力は慣性揚力に比べて弱いものの、平衡集束位置が中心線から少し離すようにシフトされる。
【００６４】
１０μｍのミクロスフェア（ａ／Ｈ＝０．１６５＞０．０７、Ｒf＝０．１５７＞０．０８）も、慣性揚力が集束挙動を支配する単一ストリークに集束した。さらに、比較的弱いディーン抗力でも、その平衡集束位置を上にシフトさせ、１０μｍのミクロスフェアが上部出口に流れ込んだ。一方、７μｍのミクロスフェアの慣性集束挙動は、流速によって変化した。ａ／Ｈ＝０．１１５＞０．０７は、効果的に集束されることを意味する。Ｒf＝０．０７７は経験値０．０８に非常に近く、７μｍのミクロスフェアにおいて慣性揚力がディーン抗力に匹敵するようになったことを示す。Ｒｅc＝１０及び２０では、７μｍのミクロスフェアが側壁の近くの２つのストリークに集束され、ディーン抗力が慣性揚力よりもわずかに優勢であった。ディーン二次流れは周期的な波状チャネルユニットに沿って周期的に逆転するため、ディーン抗力は粒子を２つの側壁に向かって引き寄せる傾向があった。ディーン抗力と慣性揚力、特に壁誘導揚力のバランスにより、側壁近くに平衡位置が生じた。ただし、Ｒｅc＝３０及び４０では、７μｍのミクロスフェアが中心線からシフトされた１つのストリークに集中し、慣性揚力がディーン抗力よりもわずかに支配的であることを明らかにしている。７μｍは、慣性揚力とディーン抗力が等しく重要になるしきい値サイズであるか、又はそれに非常に近いと推測される。２つの力は、流速がわずかに異なっても変化するため、７μｍのミクロスフェアの集束挙動は、単一ストリーク集束（中心線からシフト）と２つのストリーク集束（側壁近く）の間で簡単に切り替えることができる。５μｍのミクロスフェアの２つの重要なパラメータは、ａ／Ｈ＝０．０８３＞０．０７とＲf＝０．０３９＜０．０８である。したがって、５μｍのミクロスフェアはディーン抗力に支配され、２つの側壁の近くに２つのストリークが形成された。３μｍのミクロスフェアの場合、ａ／Ｈ＝０．０４９＜０．０７（Ｒf＝０．０１４＜０．０８）であるが、側壁近くの２つのストリークに効果的に集束していた。なお、この効果的な慣性集束のための経験的パラメータａ／Ｈ＝０．０７は、別チャネル設計から得られたものであり、このしきい値は、異なるチャネル設計の場合、０．０７からわずかに逸脱することがある。１μｍのミクロスフェアの場合、２つの重要なパラメータはａ／Ｈ＝０．０１６＜０．０７及びＲf＝０．００２＜０．０８であるため、明確な慣性集束を達成できなかった。
【００６５】
図３ｂと３ｃは、チャネルパターン２と３での６種の異なるサイズの粒子の慣性集束挙動をそれぞれ示す。全体的に、３つのチャネル設計における慣性粒子集束は非常に似た傾向に従うが、下部外側の半円に導入された幾何学的非対称性により、３つの設計間にわずかな違いが生じた。図３ｄは、３つのチャネル内の異なる粒子の集束位置と集束ストリークの幅のより明確な比較を示す。１５μｍのミクロスフェアの場合、Ｒｅcが１０から４０に増加すると、パターン１では集束ストリークが６４〜８０．５μｍから７３．３７〜８９．８７μｍにシフトし；パターン２では６３〜７９．５μｍから６９．２５〜８５．７５μｍにシフトし、パターン３では６３〜７８μｍから６４．５〜７９．５μｍにシフトした。パターン３は下部外側半円の曲率半径が最大であるため、生成されたディーン二次流れはわずかに弱くなり、これも表１に示されている。したがって、１５μｍのミクロスフェアは、他の２つのパターンと比較して、パターン３の中心線の近くに好適に集束される。１０μｍの粒子の場合、Ｒｅc＝１０に完全には集束されなかった。Ｒｅcが１０から４０に増加すると、パターン１では集束ストリーク７３．３〜９９．５μｍから８３．５〜９６．８μｍにシフトし；パターン２では６３．５〜８６．５μｍから８３．２〜９６．５μｍにシフトし、パターン３では８１．５〜９７．８μｍから８７．５〜９７．５μｍにシフトした。したがって、パターン３は、１０μｍの粒子と１５μｍの粒子の集束ストリークの間の端から端までの距離が最も大きかった（少なくとも８μｍ）ため、１０μｍの粒子から１５μｍの粒子を分離するのに最適な設計であった。図３ｃは、パターン３が、４つのＲｅc値すべてにおいて、１５μｍと１０μｍの粒子がそれぞれ中央の出口と上部の出口に流れ込んだ唯一の設計であることも示している。７μｍの粒子の場合、前述のように、パターン１で２つのストリーク集束（Ｒｅc＝１０及び２０）から単一のストリーク集束（Ｒｅc＝３０及び４０）にシフトした。パターン２及び３ではディーン二次流れが弱まったため、７μｍ粒子はＲｅc＝１０及び２０ではあまり効果的に集束されなかった。しかし、パターン２と３においてはＲｅc＝３０及び４０では単一ストリーク集束を形成した。３つのパターンにおいて、Ｒｅc＝３０及び４０では７μｍの粒子の集束ストリークはほぼ同じで、断面に沿って９９．８〜１０７．８μｍを占めていた。残りの３種の粒子（５μｍ、３μｍ、及び１μｍ）は、３つのチャネルパターンで非常によく似た挙動をした。Ｒｅc＞＝２０の場合、５μｍの粒子は２つのストリーク集束を形成し、断面の１０１．８〜１０８．８μｍ（上部ストリーク）と２１．２〜２９．３μｍ（下部ストリーク）を占めていた。同様に、Ｒｅc＞＝２０の場合、３μｍの粒子は２つのストリーク集束を形成し、９４．８〜１０８．８μｍ（上のストリーク）と２２〜３０．８μｍ（下のストリーク）を占めていた。１μｍの粒子は、３つのチャネルパターンすべてにおいて効果的に集束できなかった。
【００６６】
［サイズベースの慣性粒子選別］
３つの異なるパターンでサイズが異なる個々の粒子の慣性集束挙動がわかったため、チャネルパターン３は、複数の粒子サイズの粒子混合物の選別を実証するために選択された。高いスループットを達成するために、以下のすべての選別実験で、１９７．６０μＬ／ｍｉｎ（Ｒｅc＝４０）の流速を選択した。図４ａは、１５μｍ（緑）、１０μｍ（赤）、及び３μｍ（青）の蛍光マイクロ粒子を含む粒子混合物の選別の概略実験セットアップを示す。インプット粒子混合物は、アウトプット１、２、及び３によって収集された３つの亜集団に選別された。図４ｂは、一連の波状チャネルユニットを流れた後の、三叉出口での３種の粒子の差動集束を示す。これらの蛍光ストリークは、１５μｍ（緑）の粒子が主にメインチャネルの中心線に沿って集束し、アウトプット２に収集されることを明確に示している。１０μｍ（赤）の粒子は、メインチャネルの上端近くの狭いストリークに集束され、アウトプット１に収集された。個々の粒子の慣性集束に関する以前の研究では、１５μｍと１０μｍの粒子の集束ストリークの間の端から端までの距離は約８〜１０μｍであった。この粒子分離実験では、１５μｍと１０μｍの粒子の集束ストリーク間の距離が約３０μｍに拡大され、粒子の選別が大幅に促進された。１５μｍと１０μｍの粒子間の分離距離の拡大は、比較的高濃度での粒子間相互作用力に起因する可能性がある。大きい１５μｍの粒子がチャネルの中央領域をすぐに占めると、これらの大きい粒子は小さい粒子をはじく傾向があった。最小の３μｍ（青）の粒子は、メインチャネルの上端と下端に近い２つの細い縞に集束され、それに応じてアウトプット１と３の両方に収集された。
【００６７】
［サイズベースの慣性細胞選別］
希少細胞選別における潜在的な臨床適応性を証明するため、パターン３の慣性選別装置を使用して、乳がん細胞でスパイクされた希釈全血サンプルの分離をした。全血サンプルを、無細胞ＰＢＳバッファーを使用して１００倍に希釈し、最終濃度は５０００万細胞／ｍＬであった。混合細胞サンプルには、フローサイトメトリー分析の蛍光シグナルによる評価では、〜５％の蛍光染色された乳がん細胞（ＭＣＦ−７、直径約１９〜２４μｍ）が含まれていた。細胞混合物の残りの細胞集団は、主に赤血球（ＲＢＣ、直径約６〜８μｍ）、血小板（直径約３μｍ）及び白血球（ＷＢＣ、直径約１０〜１５μｍ）であった。図５ａは、混合細胞サンプルの顕微鏡画像を示す。この図では、個々のＭＣＦ−７細胞が他の血液細胞と比較してはるかに大きくなっている。高いスループットを達成するために、１９７．６０μＬ／ｍｉｎ（Ｒｅc＝４０）の流速が実行された。図３の個々の粒子の慣性集束の研究によると、ＭＣＦ−７細胞はアウトプット２に収集され、大部分のＷＢＣ及びＲＢＣはアウトプット１に収集され、血小板はアウトプット１と３の両方に収集されることが予想された（図５ｂに示すように）。
【００６８】
三叉出口での異なる細胞集団の予想される収集は、図５ｃと５ｄに示す選別実験を通じて確認された。図５ｃは、三叉出口での２つの主要な集束ストリークを示す。高速の流速での生きているがん細胞の比較的弱い蛍光のために、その集束位置を表すために薄緑色のストリークのみが視覚化できた。高密度の赤血球（比較的少量の白血球と血小板も含む）でも、蛍光標識なしでも薄い赤い線を形成した（サイズが小さく密度が低いため、チャネルの下端近くの血小板の集束ストリークは観察できなかった）。明らかに、一連の波状チャネルユニットを流れた後の完全な慣性集束では、乳がん細胞はメインチャネルの中心線に沿って集中し、ＲＢＣ、ＷＢＣ、血小板から大きな分離距離を示した。図５ｄは、高速カメラでキャプチャされた他の血球からの個々のＭＣＦ−７細胞の分離プロセスも示している。この場合、血球の大部分はアウトプット１に流れ込み、より大きなＭＣＦ−７細胞（白い矢印で示される）がアウトプット２に流れ込んだ。
【００６９】
元の細胞混合物と３つのアウトプットから収集された選別されたサンプルは、フローサイトメーターを使用して、少なくとも１０，０００細胞をカウントすることで分析した。図６ａ〜６ｄは、元の細胞混合物とアウトプットから収集された３つのサンプルの顕微鏡画像を示す。インプットサンプルは、全血球に対して５．３％のプリセット比率で蛍光染色されたＭＣＦ−７細胞を含んでいた。慣性選別の後、図６ｃの濃い緑色の蛍光スポットで示されるように、ほぼすべてのＭＣＦ−７細胞がアウトプット２に収集された。アウトプット１は、ラベル付けされていない血球の大部分を収集し（図６ｂ）、アウトプット３には血球のごく一部のみが収集された（図６ｄ）。選別性能を定量的に評価するために、各アウトプットにおけるＭＣＦ−７細胞の回収率（式１２）とＭＣＦ−７細胞の純度（式１３）を定義する。
回収率＝各アウトプットにおけるがん細胞数／インプットにおけるがん細胞数  （１２）
純度＝各アウトプット又はインプットにおけるがん細胞数／各アウトプット又はインプットにおける総細胞数  （１３）
【００７０】
単一の選別プロセスの後、図６ｆに示すように、元のインプットサンプルから８９．７２％のＭＣＦ−７細胞を回収できた。高細胞濃度での不可避な細胞間相互作用により、アウトプット１と３でそれぞれ３．５６％と２．１８％の回復率で示されるように、ＭＣＦ−７細胞のごく一部もアウトプット１と３から収集された。図６ｇは、単一の選別プロセス後の３つの収集されたアウトプットサンプルのＭＣＦ−７細胞の純度を示す。アウトプット２（分離されたＭＣＦ−７細胞）の平均純度は６８．９％で、元の純度の５．３％から１３倍に濃縮された。アウトプット２から収集されたＭＣＦ−７細胞の生存力が調査された。図６ｅは、選別されたＭＣＦ−７細胞が増殖できたことを示しており、慣性選別プロセス後の優れた細胞生存力を示している。
【００７１】
上記に加えて液体生検は、外科的生検に代わるその単純で非侵襲的な特性により、臨床診断及び予後検査（この中で循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とエキソソームは研究者にとって非常に魅力的である）において有望なルーチン試験として浮上していることにも注意すべきである。エキソソームが期待の星になる理由：（Ｉ）転移性がんからの包括的な情報：エキソソーム（ほとんどすべての細胞から分泌される小さな膜小胞（３０〜２００ｎｍ）は、タンパク質、マイクロＲＮＡ及びＤＮＡとしての重要な情報を含み、実際の液体生検における疾患の診断及び予後検査と密接に関連している。（ＩＩ）豊富な量：患者の末梢血に存在するまれな量のＣＴＣ（１ｍＬあたり１０〜１００ＣＴＣ）と比較して、エキソソームは、末梢血だけでなく唾液、尿、滑液などにも現れる高濃度の優位性を持っており、臨床サンプル取得のためのより便利な基盤がある。ただし、従来のエキソソーム単離方法は、通常、超小サイズのエキソソームのため、高純度、高いスループット、低コスト、省力、時間節約のプロセスで結果を達成するのは困難であった。
【００７２】
本発明は、本発明の慣性装置を利用して、ミクロンレベルの粒子径（粒子＞２μｍ）の不均一な細胞サンプルから希少ＣＴＣコレクションの選別／分離／操作を達成することを示した（図７（Ｉ）に示される）。
【００７３】
さらに、本発明は、大きな小胞からの、サブミクロンの直径（あるいは＜２μｍの粒子）を有するエキソソーム収集を実現した（図７（ＩＩ）に示される）。エキソソームを得るために、粘弾性流体を組み合わせた一連の逆波状チャネル構造が、慣性サブミクロン／ナノスケール粒子の集束及び選別について提示された。波状チャネルによって生成された、マイクロ流体の定期的に逆転されるディーン二次流れは、直線チャネルと比較して粒子の集束を促進できる。より大きな細胞外小胞は、弾性揚力によって支配され、チャネルの中心線領域に沿って集束される。より小さなエキソソームが２つのチャネル側壁近くの領域に残るため、エキソソームの分離は成功した。
【００７４】
［さまざまなサブミクロン粒子に対するＰＥＯ濃度の影響］
単一の入口を持つ波状チャネル内のさまざまなＰＥＯ濃度下での４つのサブミクロン粒子（１μｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、１００ｎｍ）の弾性慣性集束挙動を調査した。図８は、ＰＥＯ濃度が０．０８ｗｔ％から０．１６ｗｔ％に増加したとき、三叉出口での粒子集束挙動を示す。１μｍ粒子は、ＰＥＯ濃度が０．０８ｗｔ％と低くても効果的な集束を実現でき、ＰＥＯ濃度が０．１６ｗｔ％に増加しても同様の集束挙動を維持できる。５００ｎｍの粒子は、ＰＥＯ濃度が０．０８ｗｔ％になると集束傾向を示し始め、ＰＥＯ濃度が増加するにつれてより良好な集束を示す。式１１に示されているように、弾性揚力はｄ3に比例し、これは、１μｍ粒子に作用する弾性揚力が、同じＰＥＯ濃度下で５００ｎｍ粒子に作用する力の約８倍であることを意味する。前述のように、Ｎ1＝２ηpλΥ・2のＯｌｄｒｏｙｄ−Ｂモデルでは、ＰＥＯ溶液の緩和時間λはｃ0.65とともに増加し（ｃはＰＥＯ濃度を表す）、ηpはｃとともに増加し、Υ・は低濃度のＰＥＯ溶液で定数とみなすことができ70、つまりｃを増加させると、弾性揚力が向上し、中心線領域に向かってさらに粒子が移動することになる71。３００ｎｍの粒子は、０．０８ｗｔ％と０．１０ｗｔ％のＰＥＯ濃度では明確な集束挙動を示さず、ＰＥＯ濃度が０．１４ｗｔ％より高くなると徐々に効果的な集束を達成する。１００ｎｍの粒子は、ＰＥＯ濃度が０．０８ｗｔ％から０．１６ｗｔ％に増加した場合でも、明確な集束を示さなかった。
【００７５】
［サブミクロン粒子のサイズベースの慣性選別］
さまざまな条件下での粘弾性流体内の波状チャネル内のサブミクロン粒子の弾性慣性集束挙動がわかったため、０．１６ｗｔ％のＰＥＯ濃度は、３００ｎｍと１００ｎｍの粒子混合物のサイズベースの選別を実証するために選択された。基本的に、１００ｎｍと３００ｎｍの粒子は、それぞれエキソソームとより大きなＥＶを擬態するために使用された。粒子混合物のサイズベースの選別の概略的な実験セットアップを図７（ＩＩ）に示す。ここで、粒子サンプルとシースフローの流速はそれぞれ２５μＬ／ｍｉｎ（１５００μＬ／ｈに相当）及び１５０μＬ／ｍｉｎ（９０００μＬ／ｈに相当）であった。シースフローの助けにより、粒子の混合物はメインチャネルに入るときに側壁の近くに制限され、３００ｎｍの粒子は徐々に中央領域に移動し、一連の逆波状チャネルユニットを通過した後、チャネルの中心線に沿って狭いストリークを形成した。前述のように、横方向の移動、すなわち弾性慣性集束は、弾性揚力によって支配され、ディーン流れによって促進される。図８から観察されるように、１００ｎｍの粒子は集束挙動を示さず、これらは主な流体の流れに従うだけであり、シースフローによってチャネル壁の近くに限定されることを意味する。その結果、１００ｎｍの粒子が側面の出口から収集され、３００ｎｍの粒子が中央の出口から収集されて、３００ｎｍの粒子から１００ｎｍの分離が達成された。収集された２つのサンプルはＮＴＡ測定によって分析された。これに基づいて、図９に示すように、１回の選別プロセスの後、１００ｎｍの粒子の収集は、９５％を超える純度と８７．９％を超える回収率を達成できる。選別実験は、同じ条件で３回個別に繰り返された。
【００７６】
［エキソソームのサイズベースの慣性選別］
エキソソーム関連の生物学的研究及び臨床応用のためのこの新しい弾性慣性選別技術の可能性を実証するため、ＭＣＦ−７培養液中のエキソソームとより大きなＥＶを分離するためのこの技術の使用が検討された。選別条件は、前節での１００ｎｍ及び３００ｎｍ粒子の選別とまったく同じである。３００ｎｍ粒子の挙動と同様に、より大きなＥＶは徐々に中央領域に移動し、これらの繰り返し逆波状チャネルユニットを流れた後、チャネルの中心線に沿って集束したままで、最終的に中央の出口から収集された。３０〜２００ｎｍのサイズの小さいエキソソームは、側壁の近くに残り、２つの側面の出口から収集された。収集された２つのサンプルは、ＮＴＡ分析によって評価された。図１０ａは、正規化後のＭＣＦ−７培地からのエキソソーム（３０〜２００ｎｍ）とより大きなＥＶ（３００〜８００ｎｍ）の混合分布を示す。エキソソーム濃度は、より大きなＥＶのほぼ３．５倍であった。図１０ｂと１０ｃは、それぞれ選別手順後のエキソソームとより大きなＥＶの分布を表しており、前の粒子分離の結果と非常によく一致している。図１０ｄに示すように、最初のエキソソーム濃度が５×１０8粒子／ｍＬであるところ、１つの単一の選別プロセスで、８８％を超える純度と７６％を超える回収率を示すエキソソームの高いスループットのサイズベースの選別が成功に実証された。選別実験は、同じ条件で３回個別に繰り返された。
【００７７】
結論
以上より、主な流れの方向に垂直に周期的に反転するディーン二次流れを生成する一連の逆波状チャネル構造を備えた新しい慣性集束及び選別装置が提示される。２つの慣性効果、すなわち慣性揚力とディーン二次流れのバランスにより、チャネルをわたるサイズに依存した粒子の集束が生成される。幾何学的非対称度の異なる３つのチャネル設計における６種の粒子サイズ（１５μｍ、１０μｍ、７μｍ、５μｍ、３μｍ及び１μｍ）の慣性集束挙動が研究された。１５μｍと１０μｍの粒子について、慣性揚力がディーン抗力よりも優勢である場合、それらは単一ストリーク集束を形成することがわかった。ただし、１５μｍと１０μｍの粒子では力の支配の程度が異なるため、依然として粒子の集束位置が異なる。粒子サイズが小さくなるにつれて、２つの力は７μｍの粒子につき同等になり、異なる流速で単一ストリーク集束から２つのストリーク集束への切り替わりが可能である。５μｍと３μｍの粒子について、ディーン抗力が慣性揚力よりも支配的になる場合、それらは２つの側壁近くの２つの細いストリークに集束された。チャネルパターン３の装置を使用して、１０μｍ及び３μｍの粒子からの１５μｍの粒子の分離を実証した。効果的な慣性集束の最小粒子サイズは、チャネルパターン３で１μｍ〜３μｍであるため、シースフローを使用しない、希釈全血サンプルからのＭＣＦ−７がん細胞の分離も実証された。単一の選別プロセスで、元の混合物からＭＣＦ−７細胞の８９．７２％の回収率を達成でき、ＭＣＦ−７細胞の純度が５．３％から６８．９％に大幅に増加したことがわかった。選別されたＭＣＦ−７細胞は優れた生存力を示し、増殖することができた。４種の異なるサイズの蛍光サブミクロン粒子（１μｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、及び１００ｎｍ）を使用して、さまざまな条件下での粘弾性流体内の集束挙動を研究した。最適化されたパラメータの組み合わせにより、本発明は、純度が８８％を超え、回収率が７６％を超える、エキソソームの高いスループット（１分あたり数十マイクロリットル、１時間あたり数千マイクロリットル）、かつラベルフリーのサイズ依存性選別を実証した。これらの繰り返し波状チャネルユニットの線形配列により、マルチチャネルの水平（２Ｄ）及び垂直（３Ｄ）並列化が容易になり、実用的な生物医学用途での高いスループットでの細胞選別の大きな可能性を提供する。
【００７８】
既存の方法に対する主な利点／改良点は、本発明の慣性マイクロ流体装置が、そのサイズに基づいて高いスループット及び高忠実度の細胞選別のための非常に低コストの基盤を提供することである。このシステムでパワー作動を必要とする唯一の要素は、高流速でのサンプル導入用のポンプである。慣性マイクロ流体装置のコストは、複雑なアクチュエータを備えた従来のマイクロ流体装置よりはるかに低いため、これらの慣性装置は、相互コンタミネーションを回避するために、１回限りの使用に提供できる。
【００７９】
以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、設計又は構造の詳細に多くの変更又は修正を加えることができることが理解される。
【００８０】
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【図１】
2021506263.tif 000015
【図２】
2021506263.tif 000016
【図３ａ】
2021506263.tif 000017
【図３ｂ】
2021506263.tif 000018
【図３ｃ】
2021506263.tif 000019
【図３ｄ】
2021506263.tif 000020
【図４】
2021506263.tif 000021
【図５】
2021506263.tif 000022
【図６】
2021506263.tif 000023
【図７】
2021506263.tif 000024
【図８】
2021506263.tif 000025
【図９】
2021506263.tif 000026
【図１０】
2021506263.tif 000027
【国際調査報告】
2021506263.tif 000028
2021506263.tif 000029
2021506263.tif 000030
2021506263.tif 000031
2021506263.tif 000032