(57)【要約】本発明は、血液を測定するためのマイクロ流体デバイスおよび方法を提供する。本発明のマイクロ流体デバイスは、流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポートと；該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路と；該マイクロ流体流路よりも小さな断面積を有しかつ圧力シンクと連通するように適合された、該マイクロ流体流路と流体連通している出口とを含む。マイクロ流体デバイスは、プライミング流体を圧力下でプライミング回路に適用したときに、出口に比べてマイクロ流体流路において層流に対する抵抗が低いことにより該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへと流れるように、マイクロ流体流路と流体連通している該プライミング回路をさらに含む。2021518552.tif 000003
2021518552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポート；
該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路；
該マイクロ流体流路よりも小さな断面積を有し、かつ圧力シンクと連通するように適合された、該マイクロ流体流路と流体連通している出口；ならびに
プライミング流体を圧力下でプライミング回路に適用したときに、該出口に比べて該マイクロ流体流路において層流に対する抵抗が低いことにより該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへと流れるように、該マイクロ流体流路と流体連通している該プライミング回路
を備える、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
出口が、
マイクロ流体流路と流体連通している出口チャネル；および
該出口チャネルと流体連通している出口ポート
を備える、請求項1記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
出口チャネルが、マイクロ流体回路の断面積の約60％未満である断面積を有する、請求項1記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
マイクロ流体流路、出口およびプライミング回路が、1つの場所で連結されている、請求項1記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
プライミング回路が、マイクロ流体流路から該プライミング回路内への流れに抵抗するように適合および構成された逆止弁を備える、請求項1記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
逆止弁が、複数のマイクロ流体流路と流体連通している1つの逆止弁である、請求項1記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
入口およびマイクロ流体流路のうちの少なくとも一方の内部にある乾燥した1つまたは複数の試薬
をさらに備える、請求項1記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポート、
該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路、ならびに
該マイクロ流体流路よりも小さな断面積を有し、かつ圧力シンクと連通するように適合された、該マイクロ流体流路と流体連通している出口
を各マイクロ流体回路が備える、複数のマイクロ流体回路と；
プライミング流体を圧力下でプライミング回路に適用したときに、該出口に比べて該マイクロ流体流路において層流に対する抵抗が低いことにより該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへと流れるように、該マイクロ流体流路のそれぞれと流体連通している該プライミング回路と
を備える、マイクロ流体デバイス。
【請求項９】
マイクロ流体流路が、空間的にコンパクトな感知領域へと収束する、請求項8記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
マイクロ流体流路がそれぞれ、入口ポートと空間的にコンパクトな感知領域との間で実質的に同一の圧力降下を有する、請求項9記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
マイクロ流体流路がそれぞれ、入口ポートと空間的にコンパクトな感知領域との間に実質的に同一の距離を有する、請求項9記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
複数の入口ポートが、1本の線上に配置されている、請求項8記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
複数の入口ポートが、マルチチャネルピペットに対応したポート間距離で、1本の線に沿って間隔を空けて配されている、請求項8記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
マイクロ流体回路のそれぞれが、
入口およびマイクロ流体流路のうちの少なくとも一方の内部にある乾燥した1つまたは複数の試薬
をさらに備える、請求項8記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
1つまたは複数の試薬が、複数のマイクロ流体回路の間で異なる、請求項14記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
請求項1〜7のいずれか一項記載のマイクロ流体デバイスのプライミング回路を通してプライミング流体を導入する工程；
入口ポートの1つまたは複数に血液をロードする工程；
血液をマイクロ流体流路内へ送り込むために該1つまたは複数の入口ポートに圧力供給源を適用する工程；および
マイクロ流体経路に沿った流れを画像化する工程
を含む、血液を測定するための方法。
【請求項１７】
血液を、1つまたは複数の試薬と事前混合する、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポート、ならびに
該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路
を各マイクロ流体回路が備える、複数のマイクロ流体回路であって、該マイクロ流体流路が2つずつ合流することを繰り返し行い1つの合流マイクロ流体流路を形成する、該複数のマイクロ流体回路と；
該1つの合流マイクロ流体流路と流体連通している出口チャネルと；
流体試料を収集するように適合および構成された、該出口チャネルと流体連通している出口ポートと；
プライミング流体を圧力下でプライミング回路に適用したときに、該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへ、および該出口チャネルを通って該出口ポートへと同時に流れるように、該合流マイクロ流体流路および該出口チャネルと1つの場所で流体連通している該プライミング回路と
を備える、マイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
1つの合流マイクロ流体流路および出口チャネルが、互いの10％以内の断面寸法を有する、請求項18記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
表面を有する基板；
該基板の該表面上に付着した接着性コーティング；
あるパターンで該接着性コーティングの一部分の上に直接付着した生化学コーティング；ならびに
以下：
開放境界を有する複数のマイクロ流体チャネルであって、各マイクロ流体チャネルが、
流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポート、
該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路
を備える、該複数のマイクロ流体チャネルと、
開放表面を有し、該複数のマイクロ流体チャネルと流体連通している出口チャネルと、
流体試料を収集するように適合および構成された、該出口チャネルと流体連通している出口ポートと、
開放表面を有するプライミング回路であって、プライミング流体を圧力下で該プライミング回路に適用したときに、該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへ、および該出口チャネルを通って該出口ポートへと同時に流れるように、該マイクロ流体チャネルおよび該出口チャネルと流体連通している、該プライミング回路と
を備える、チップ
を備え、
該マイクロ流体流路の少なくとも一部分が該生化学コーティングと重なるように、該チップが該接着性コーティング上に載置されており、かつ
該接着性コーティングが該チップを該基板に接合し、それによって該マイクロ流体チャネル、該出口チャネルおよび該プライミング回路の該開放表面が流体的に封止されている、
マイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
生化学コーティングが印刷によって接着性コーティング上に付着される、請求項20記載のマイクロ流体デバイスアセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年3月20日に出願された米国仮特許出願第62/645,525号に対する優先権の恩典を主張する。この出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号R01-HL-103419およびU01-HL-131053の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血液凝固、抗血小板療法、抗凝固療法、血友病の治療、手術による出血、外傷による出血および血小板機能のモニタリングは、診断学における非常に大きな（10億ドル超の）市場の基礎をなしている。人間の体内にある流動状態に類似した流動状態下で血液をモニタするためのデバイスまたはシステムは市場にはわずかしか存在せず、これらは有用性が限られているとともに、トロンビンおよびフィブリン生成を含む完全な凝固が欠如した状態でしか動作しない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の態様は、流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポートと；該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路と；該マイクロ流体流路よりも小さな断面積を有しかつ圧力シンクと連通するように適合された、該マイクロ流体流路と流体連通している出口と；プライミング流体を圧力下でプライミング回路に適用したときに、該出口に比べて該マイクロ流体流路において層流に対する抵抗が低いことにより該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへと流れるように、該マイクロ流体流路と流体連通している該プライミング回路とを含む、マイクロ流体デバイスを提供する。
【０００５】
いくつかの態様において、出口は、マイクロ流体流路と流体連通している出口チャネル；および該出口チャネルと流体連通している出口ポートを含む。いくつかの態様において、出口チャネルは、マイクロ流体回路の断面積の約60％未満である断面積を有する。
【０００６】
いくつかの態様において、マイクロ流体流路、出口およびプライミング回路は、1つの場所で連結されている。いくつかの態様において、プライミング回路は、マイクロ流体流路からプライミング回路内への流れに抵抗するように適合および構成された逆止弁を含む。いくつかの態様において、逆止弁は、複数のマイクロ流体流路と流体連通している1つの逆止弁である。いくつかの態様において、本発明のマイクロ流体デバイスは、入口およびマイクロ流体流路のうちの少なくとも一方の内部にある乾燥した1つまたは複数の試薬を追加的に含む。
【０００７】
本発明の別の局面はマイクロ流体デバイスを提供し、該マイクロ流体デバイスは、流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポート、該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路、ならびに該マイクロ流体流路よりも小さな断面積を有しかつ圧力シンクと連通するように適合された、該マイクロ流体流路と流体連通している出口を、各マイクロ流体回路が含む、複数のマイクロ流体回路と；プライミング流体を圧力下でプライミング回路に適用したときに、該出口に比べて該マイクロ流体流路において層流に対する抵抗が低いことにより該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへと流れるように、該マイクロ流体流路のそれぞれと流体連通している該プライミング回路とを含む。
【０００８】
いくつかの態様において、マイクロ流体流路は、空間的にコンパクトな感知領域へと収束する。
【０００９】
いくつかの態様において、マイクロ流体流路はそれぞれ、入口ポートと空間的にコンパクトな感知領域との間で実質的に同一の圧力降下を有する。いくつかの態様において、マイクロ流体流路はそれぞれ、入口ポートと空間的にコンパクトな感知領域との間に実質的に同一の距離を有する。
【００１０】
いくつかの態様において、複数の入口ポートは1本の線上に配置されている。いくつかの態様において、複数の入口ポートは、マルチチャネルピペットに対応したポート間距離で、1本の線に沿って間隔を空けて配されている。
【００１１】
いくつかの態様において、マイクロ流体回路のそれぞれは、入口およびマイクロ流体流路のうちの少なくとも一方の内部にある乾燥した1つまたは複数の試薬をさらに含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の試薬は複数のマイクロ流体回路の間で異なる。
【００１２】
本発明の別の局面は、血液を測定するための方法を提供する。本方法は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスのプライミング回路を通してプライミング流体を導入する工程；入口ポートの1つまたは複数に血液をロードする工程；血液をマイクロ流体流路内へ送り込むために該1つまたは複数の入口ポートに圧力供給源を適用する工程；および、マイクロ流体経路に沿った流れを画像化する工程を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、血液は1つまたは複数の試薬と事前混合される。
【００１４】
本発明の別の局面はマイクロ流体デバイスを提供し、該マイクロ流体デバイスは、流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポート、ならびに該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路を、各マイクロ流体回路が含む、複数のマイクロ流体回路であって、該マイクロ流体流路が2つずつ合流することを繰り返し行い1つの合流マイクロ流体流路を形成する、該複数のマイクロ流体回路と；該1つの合流マイクロ流体流路と流体連通している出口チャネルと；流体試料を収集するように適合および構成された、該出口チャネルと流体連通している出口ポートと；プライミング流体を圧力下でプライミング回路に適用したときに、該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへ、および該出口チャネルを通って該出口ポートへと同時に流れるように、該合流マイクロ流体流路および該出口チャネルと1つの場所で流体連通している該プライミング回路とを含む。いくつかの態様において、1つの合流マイクロ流体流路および出口チャネルは、互いの10％以内の断面寸法を有する。
【００１５】
本発明の別の局面はマイクロ流体デバイスを提供し、該マイクロ流体デバイスは、表面を有する基板；該基板の該表面上に付着した接着性コーティング；あるパターンで該接着性コーティングの一部分の上に直接付着した生化学コーティング；ならびに、以下：開放境界を有する複数のマイクロ流体チャネルであって、各マイクロ流体チャネルが、流体試料を受け入れるように適合および構成された入口ポート、該入口ポートと流体連通しているマイクロ流体流路を備える、該複数のマイクロ流体チャネルと、開放表面を有し、該複数のマイクロ流体チャネルと流体連通している出口チャネルと、流体試料を収集するように適合および構成された、該出口チャネルと流体連通している出口ポートと、開放表面を有するプライミング回路であって、プライミング流体を圧力下で該プライミング回路に適用したときに、該プライミング流体が該マイクロ流体流路を通って該入口ポートへ、および該出口チャネルを通って該出口ポートへと同時に流れるように、該マイクロ流体チャネルおよび該出口チャネルと流体連通している、該プライミング回路とを備える、チップ；を含み、該マイクロ流体流路の少なくとも一部分が該生化学コーティングと重なるように、該チップは該接着性コーティング上に載置されており、かつ該接着性コーティングは該チップを該基板に接合し、それによって該マイクロ流体チャネル、該出口チャネルおよび該プライミング回路の該開放表面が流体的に封止されている。
【００１６】
いくつかの態様において、生化学コーティングは印刷によって接着性コーティング上に付着される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の性質および所望の目的をより十分に理解するために、以下の詳細な説明が添付の図面と併せて参照されるが、添付の図面において、同様の参照文字はいくつかの図を通して対応する部分を指す。
【００１８】
【図１】本発明の一態様による、流動状態下で血液生物学をモニタするためのマイクロ流体デバイスを示す。
【図２】本発明の一態様による、流動状態下で血液生物学をモニタするためのマイクロ流体デバイスを示す。
【図３】本発明の一態様による、流動状態下で血液生物学をモニタするためのマイクロ流体デバイスを示す。
【図４】本発明の一態様による、流動状態下で血液生物学をモニタするためのマイクロ流体デバイスを示す。
【図５】本発明の一態様による、流動状態下で血液生物学をモニタするためのマイクロ流体デバイスを示す。
【図６】本発明の一態様によるマイクロ流体デバイスをプライミングし（図6A）、マイクロ流体デバイスのウェルに試料をロードし（図6B）、マイクロ流体デバイスに加圧して試料を感知ゾーンに通す（図6C）、段階的方法を示す。
【図７Ａ】本発明の一態様によるマイクロ流体デバイスを準備およびプライミングする段階的方法を示す。
【図７Ｂ】本発明の一態様によるマイクロ流体デバイスを準備およびプライミングする段階的方法を示す。
【図７Ｃ】本発明の一態様によるマイクロ流体デバイスを準備およびプライミングする段階的方法を示す。
【図７Ｄ】本発明の一態様によるマイクロ流体デバイスを準備およびプライミングする段階的方法を示す。
【図７Ｅ】本発明の一態様によるマイクロ流体デバイスを準備およびプライミングする段階的方法を示す。
【図８】各チャネルの表面の1つにコラーゲンが事前にパターン付けされた特定位置における経時的な蛍光血小板付着を示す、8個の反復チャネル位置の取得された蛍光画像のセットである。
【図９】8個の反復チャネルについての経時的な血小板付着の平均蛍光強度および標準偏差を報告するグラフである。
【図１０】マイクロ流体チャネルを形成するための追加の構成要素と基板との接着接合のために基板上に被覆された接着剤の上に直接パターン付けされた生化学成分を用いた、本発明の例示的な挟持型デバイスのアセンブリを示す。
【図１１】本発明の一態様による、流動状態下での血液生物学のモニタリングにおける使用のための、1つのプライミングチャネルを有する例示的なマイクロ流体デバイスを示す。
【図１２】プライマー流チャネルが入口流チャネルおよび出口流チャネルと交差する1つの場所の拡大図を示す。
【図１３】図13A〜13Cは、本発明の一態様による例示的なマイクロ流体デバイスを準備およびプライミングする段階的方法を示す。
【図１４】本発明の一態様による、マルチチャネルピペット操作に適した8個の試料入口ウェルを有する例示的なマイクロ流体デバイスを示す。
【図１５】本発明の一態様によるマイクロ流体デバイスと共に使用することができる例示的なカートリッジフレームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
本発明は、以下の定義を参照して最も明確に理解される。
【００２０】
本明細書において用いられる場合、文脈上別段の明確な規定がない限り、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は複数の言及対象を含む。
【００２１】
本明細書において用いられる場合、具体的に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、「約」なる用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均から2標準偏差以内として理解される。「約」は、記述された値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％または0.01％以内として理解されてもよい。文脈から別段明らかでない限り、本明細書において提供されるすべての数値は「約」なる用語によって修飾される。
【００２２】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる場合、「備える（comprise）」、「備える（comprising）」、「含有する（containing）」、「有する（having）」などの用語は、米国特許法においてこれらの用語に与えられた意味を有してもよく、「含む（include）」、「含む（including）」などを意味してもよい。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、具体的に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、「または（or）」なる用語は包含的であると理解される。
【００２４】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、1〜50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50（ならびに、文脈上別段の明確な規定がない限り、それらの分数）からなる群の任意の数字、数字の組み合わせまたは部分範囲を含んでいると理解される。
【００２５】
本明細書において用いられる場合、具体的に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、2つ（またはそれ以上）の値は、それらの値がその他の値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％または0.01％以内である場合に「実質的に同一である」と理解され得る。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明の局面は、流体（例えば、血液などの生物学的流体）を流動状態下でモニタするためのデバイスおよび方法を提供する。本発明の態様には、生物学的および血行力学的に関連した流動状態を生成することができる新規なマイクロ流体デバイスが含まれる。本発明のデバイスおよび方法は、出血リスク、血栓症リスクまたは線維素溶解リスクのアッセイにおいて、血小板機能、凝固機能、線維素溶解、線維素溶解抵抗性および薬物機能をモニタするのに適している。デバイスおよび方法はまた、炎症、免疫系活性化、線維素溶解抵抗性および線維素溶解をモニタするために用いることもできる。本発明は、腫瘍学、移植療法、外傷、心血管疾患の管理、血液学的疾患の管理、待機手術、外傷手術および血友病の管理の各分野において適用可能であり、血液、血液細胞および血漿の疾患の処置に役立つことができる。
【００２７】
マイクロ流体デバイス
ここで図1を参照すると、本発明の一態様は、入口ポート102と；該入口ポート102と流体連通しているマイクロ流体流路104と；該マイクロ流体流路104と流体連通している出口106と；プライミング流体を圧力下でプライミング回路108に適用したときに、該出口106に比べて該マイクロ流体流路104において層流に対する抵抗が低いことにより該プライミング流体が該マイクロ流体流路104を通って該入口ポート102へと流れるように、該マイクロ流体流路104と流体連通している該プライミング回路108とを含むマイクロ流体回路101を含む、マイクロ流体デバイス100を提供する。
【００２８】
出口106は、マイクロ流体流路よりも小さな断面積を有し得、かつ圧力シンクまたは大気圧と連通するように適合され得る。特定の態様において、出口106は、マイクロ流体流路104と流体連通している出口チャネル110；および該出口チャネル110と流体連通している出口ポート112を含む。好ましい態様において、出口チャネル110は、マイクロ流体流路104の断面積の約60％未満である断面積を有し得る。出口チャネル110は、マイクロ流体流路104の断面積とほぼ等しい断面積を有してもよい。出口チャネル110は、図11および図14に示されるような迂回形態または蛇行形態を有してもよい。
【００２９】
プライミング回路108はマイクロ流体流路104と同じ断面積を有し得るが、そうでなくてもよい。プライミング回路108はマイクロ流体流路104よりも大きなまたは小さな断面積を有し得る。空のチャネルおよび空気で満たされたチャネル内に液体を送達することを考えると、いくつかの態様、例えば図3に示される態様においては、プライミング回路108の断面積には関係なく、プライミング流体は、出口106に向かうより小さな断面の流入口に比べて、マイクロ流体流路104に向かうより大きな断面の入口の中へ優先的に流れると考えられる。別の態様、例えば図11および14に図示される態様においては、マイクロ流体流路104および出口106における流体抵抗はほぼ等しく、その結果、プライミング流体はマイクロ流体流路104と出口106のそれぞれに均等に流れ、流路104と出口106が同時にプライミングされる。特定の態様において、各マイクロ流体流路がプライミング回路を有する（例えば、図3）。他の態様において、マイクロ流体デバイス全体が、1つのプライミング回路によりプライミングされる（例えば、図11、12および14）。
【００３０】
いくつかの態様において、マイクロ流体流路104、出口106およびプライミング回路108は、1つの場所114で連結されている。
【００３１】
プライミング回路108は、特にプライミング回路108がプライミング流体で満たされている場合にマイクロ流体流路104からプライミング回路108内への流れに抵抗するように適合および構成された、逆止弁118を含み得る。図2を参照すると、逆止弁118は、複数のマイクロ流体流路104と流体連通している1つの逆止弁であり得る。いくつかの態様において、逆止弁118は、マイクロ流体デバイス100の外に設置され得、かつポンピング手段とプライミング経路入口108との間に設置され得る。
【００３２】
マイクロ流体流路104、出口106およびプライミング回路108は、（流体流の方向に軸方向に見た場合に）様々な断面プロフィールを有し得る。例えば、チャネル104、106、108は、円、楕円、三角形、四辺形、長方形、正方形、台形、平行四辺形、菱形、五角形、六角形、七角形、八角形、九角形、十角形、n角形などのうちの1つまたは複数に近似した断面プロフィールを有し得る。長方形および正方形のチャネルは例示的態様である。一態様において、マイクロ流体流路104は、高さが約40μm〜約100μm（例えば、約60μm）であり、幅が約80μm〜約300μmである。
【００３３】
次に図2を参照すると、マイクロ流体デバイス100は、複数のマイクロ流体回路101（例えば、2個、4個、8個、12個、およびマルチチャネルピペットに対応する他の個数）を含み得る。一例では、複数のマイクロ流体流路104は空間的にコンパクトな感知領域116へと収束し得る。例えば、図2を参照すると、マイクロ流体流路104が互いに短い距離をおいて平行に配列されるように感知領域116が配置され得る。
【００３４】
複数のマイクロ流体回路101を有する態様において、各マイクロ流体流路104は、入口ポート102と空間的にコンパクトな感知領域116との間で実質的に同一の圧力降下を有し得る。マイクロ流体流路104の断面積が実質的に均一である態様において、同一または実質的に同一の長さを有するマイクロ流体流路104が同一または実質的に同一の圧力降下を示すように、マイクロ流体流路104の長さにより圧力降下が規定される。一態様において、複数の入口ポート102は、1本の直線上に、それらの最近接の入口ポートから等距離離れるよう互いに位置合わせされ得る。そのような態様において、入口ポート102は、材料を入口ポート102に添加するためにマルチチャネルピペットを使用することができるように、1本の直線に沿って間隔を空けて配され得る。マイクロ流体流路104は次いで、空間的にコンパクトな感知領域116へと収束し得る。いくつかの態様、例えば図2に示される態様において、マイクロ流体流路104は、空間的にコンパクトな感知領域116により近い入口102を有するマイクロ流体流路104に関して均一な経路長をもたらすための適切な横方向区間120を任意で含む。
【００３５】
特定の態様において、入口102およびマイクロ流体流路104のうちの少なくとも一方は1つまたは複数の化学作用物質を含有し得る。化学作用物質は乾燥形態で存在し得る。化学作用物質は、血液試料と相互作用する試薬または化学反応物であり得る。複数のマイクロ流体回路101を有する態様において、マイクロ流体回路101の少なくとも一部は異なる化学作用物質、試薬または反応物を含有し得る。化学作用物質の例には、マトリックスタンパク質；酵素；ポリマー；小分子化合物；特に血小板、好中球、フィブリン、トロンビンを標識するための蛍光標識プローブ；キレート剤（EGTA、EDTA）；脱酸素剤（例えば、亜ジチオン酸塩、アスコルビン酸塩または亜硫酸塩）；血小板機能のモジュレータ（アスピリン、トロンボキサン受容体拮抗薬、α-2b/β-3を遮断するインテグリン拮抗薬、P2Y12阻害薬、P2Y1阻害薬、PAR1およびPAR4阻害薬）；ならびに凝固機能のモジュレータ（第XIIa因子、第XIa因子、第Xa因子、第IXa因子、第VIIIa因子、第VIIa因子、第Va因子、トロンビンまたは組織因子の阻害薬）が含まれ得る。感知領域116内の経路104の表面を被覆するための例示的な試薬には、線維性コラーゲン、フォン・ヴィレブランド因子（VWF）、脂質化組織因子（TF）、カオリン、シリカ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、および第XIIa因子アクチベータが含まれる。特定の態様において、化学作用物質は、血小板、トロンビン、フィブリン、RBC、白血球、酵素活性、血餅安定性、凝固速度、線維素溶解、線維素溶解抵抗性、ネトーシス（NETosis）、または薬物反応もしくは疾患進行を示す特定の生物学的プロセスのモニタリングを可能にする化合物であり得る。化学作用物質は、マイクロ流体流路104の少なくとも一区画の上に、特に感知領域116の場所をまたがって、パターン化され得る。いくつかの例において、マイクロ流体流路104の前記区画は、約100μm〜約1,000μmの長さである。
【００３６】
マイクロ流体デバイス100は、血液の貯蔵および輸送に適合されかつそれに対応した実質的に任意の材料から作製され得る。例示的な材料には、ポリマー材料（例えば、PDMS、PMMA、PTFE、PEEK、PE、エポキシ樹脂、熱硬化性ポリマー）、非晶質材料（例えば、ガラス）、結晶性材料（例えば、ケイ素、二酸化ケイ素）または金属材料（例えば、Al、Cu、Au、Ag、合金）が含まれる。デバイスの構成要素を製造するための適切なポリマーには、ガラス、環状オレフィンコポリマー（COC）、環状オレフィンポリマー（COP）、ポリカーボネート、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリスチレンなどが含まれる。
【００３７】
マイクロ流体デバイス100は、フォトリソグラフィ（例えば、UVフォトリソグラフィ）、微細加工、積層造形、レーザ切断、レーザアブレーション、ドリリング、成形、鋳造、化学蒸着、電子ビーム蒸着および反応性イオンエッチングを含むがこれらに限定されない、当技術分野において一般的な実質的に任意の手段によって製造され得る。マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体回路101の要素を含むチップ、および該チップを接合させる平坦な基板という、2つまたはそれ以上の部品から作製され得る。1つまたは複数のマイクロ流体流路104は、チップ上で、約10μm以下、約10μm〜約5000μmおよび／または約5000μm超の距離だけ離隔されていてもよい。チップと平坦な基板は、超音波溶接、接着剤（例えば、当技術分野において理解されている1つまたは複数の接着性コーティング）、真空接合、熱処理およびプラズマ処理から選択される方法によって結合され得る。接合プロセスは、入口102および／またはマイクロ流体流路104内、特に感知領域116の場所に存在する1つまたは複数の化学作用物質を崩壊させることも、妨害することも、破壊することもない方法であるべきである。
【００３８】
基板は、可撓性または剛性であってもよく、透明または不透明であってもよい。基板は、ポリマー材料（例えば、PDMS、PMMA、PTFE、PEEK、PE、エポキシ樹脂、熱硬化性ポリマー）、非晶質材料（例えば、ガラス）、結晶性材料（例えば、ケイ素、二酸化ケイ素）または金属材料（例えば、Al、Cu、Au、Ag、合金）を含み得る1つまたは複数の適切な材料から構築されてもよい。デバイスの構成要素を製造するための適切なポリマーには、ガラス、環状オレフィンコポリマー（COC）、環状オレフィンポリマー（COP）、ポリカーボネート、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリスチレンなどが含まれる。
【００３９】
生化学プリント基板
次に図10を参照すると、1つまたは複数の接着剤および／または接着性コーティング1004を1つまたは複数の生化学成分1006によって被覆してもよく、この生化学成分1006は例えば、1つまたは複数のポリマー、バイオポリマー、タンパク質、小分子、抗体、抗体断片、核酸、リポソーム、または他の細胞内成分を含み、これには、コラーゲン、線維性コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、フォン・ヴィレブランド因子（VWF）、脂質化組織因子（TF）、カオリン、シリカ、第XIIa因子アクチベータなどのうちの1つまたは複数を含有する混合物が含まれる。コーティングはプライミング流体および／または試料と相互作用するために可溶性であり得る。
【００４０】
生化学コーティング1006は、マイクロ流体デバイス1008と基板1002との間に挟持されるように接着性コーティング1004の上に直接付着させてもよく、マイクロ流体デバイス1008と基板1002は接着性コーティング1002によって流体的に封止される。生化学コーティング1006は、約0.1μm〜約25μmの厚さを有してもよい。マイクロ流体デバイスが試料をアッセイするための使用の前に組み立てられた後、生化学コーティング1006は乾燥しているか、半湿潤状態であるか（例えば、グリセロールなどの吸湿性媒体中で）、または湿潤している（例えば、1つもしくは複数の緩衝溶液中で）ことができる。
【００４１】
生化学コーティング1006は様々なパターンで適用され得、かつ様々な成分を含み得る。例えば、それぞれ異なる組成物を含む1つまたは複数のライン1010を適用することができる。そのようなライン1010は、マイクロ流体チャネル1012と共線的であり得るか、またはマイクロ流体チャネル1012に対して（例えば、直角に）傾斜し得る。傾斜した生化学コーティングライン1010は、有利には、基板1002とチャネルを画定するチップ1008との接続についての公差を緩和する。
【００４２】
図10の生化学コーティング1006は、マイクロ流体チップ1008との接続後に均一な厚さを有するように図示されているが、生化学コーティング1006および／または接着剤1004は、マイクロ流体チップ1008と接触している領域において縮むかまたは横方向に流れてもよい。
【００４３】
出願人は、マイクロ流体チャネル1012の側壁を越えて横方向に（例えば、チャネル1012間に）延びている傾斜した生化学コーティングであっても、マイクロ流体チャネル1012が、少なくとも典型的なマイクロ流体実験の間（例えば、少なくとも1分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも20分間、少なくとも30分間など）液密のままであるようなプロセスを発明した。
【００４４】
生化学コーティング1006は、噴霧、印刷（例えば、インクジェット技術を用いて）、ピペット操作、シルクスクリーン印刷、マスキングなどを含む様々な流体取扱技術を用いて適用することができる。
【００４５】
他のデバイスとの連結
マイクロ流体デバイス100は、1つまたは複数のマイクロ流体経路104に沿った画像データを収集できる画像化デバイスと連結することができる。画像化デバイスは、可視光カメラ、フォトダイオード、ダイオードアレイ検出器、紫外可視分光計、赤外線カメラ、赤外分光計から選択される少なくとも1つのデバイスを含み得る。
【００４６】
本発明のデバイスは、自動的に作動させることができ、かつロボット液体ディスペンサおよび自動感知装置に適合させることができる。マイクロ流体デバイス100は、情報を保存するため、ロボット構成要素を制御するため、印加される圧力を調節するため、画像化デバイスを作動させるため、および収集したデータを記録するためのコンピュータをさらに含み得る。
【００４７】
本発明のデバイスは、当技術分野において一般的なデバイスに比べて、いくつかの注目すべき恩恵を提供する。特に、本マイクロ流体デバイスは、3ヶ月超にわたって乾燥保管下で安定のままであるチップの上に組み込むことができる。加えて、本デバイスは、後述のように、広範な訓練なしにロードおよび操作することができる。したがって、本デバイスは臨床検査室への応用に特に有用である。
【００４８】
方法
本発明はさらに、本発明のマイクロ流体デバイスを用いて流体（例えば、血液、尿、唾液、水試料）を測定する方法を提供する。
【００４９】
本発明の方法は、ある体積のプライミング流体（例えば、水、生理食塩水など、アルブミンなどの追加のタンパク質を含有する生理食塩溶液、または当技術分野において理解されている1つもしくは複数のブロッキング緩衝液を含む他の適切な流体）を、マイクロ流体デバイス100のプライミング回路108を通して導入し、それによって1つまたは複数のマイクロ流体回路101をプライミングする工程を含む。マイクロ流体デバイスは、100μl以下、100〜200μl、200μl〜500μl、500μl〜1000μlなどを含む体積のプライミング流体によりプライミングされてもよい。次いで、1つまたは複数の試料（例えば、血液）を入口ポート102のうちの1つまたは複数にロードする。次いで、1つまたは複数のマイクロ流体経路104に沿った流れを画像化しながら、血液を1つまたは複数のマイクロ流体流路104内へ送り込むために1つまたは複数の入口ポート102に圧力供給源を適用する。逆止弁118により、および経路108内にあるプライミング流体の非圧縮性により、経路104を通って移動する試料はプライミング経路108には流入できない。
【００５０】
デバイスをプライミングするために、規定の体積のプライミング流体を導入することができる。あるいは、プライミング流体が入口102において視認できるようになるまでプライミング流体を導入することができる。
【００５１】
規定の体積の試料（例えば、50μl〜100μl、100μl〜200μl、200μl〜500μl、または1mL以下）を入口102にロードすることができる。あるいは、試料を視覚によって（例えば、目に見えるレベルまで入口102が満たされるまで）ロードすることができる。
【００５２】
画像化は、存在する場合は、複数のマイクロ流体経路104を同時に画像化することを可能にする空間的にコンパクトな感知領域116において行うことができる。プライミング工程は、血液試料を1つまたは複数の入口ポート102にロードする約1時間前までに行うことができる。例えば、技術者が、いくつかのデバイスに試料をロードする前にこれらのデバイスをプライミングすることができる。
【００５３】
マイクロ流体デバイスは、図15に示されるフレーム500内に設置されてもよく、フレーム500は、試料（例えば、血液）を収容するための1つまたは複数のトラフ502と、プライミング溶液を含む緩衝液を収容する1つまたは複数のウェル504と、流出流体を収集するための1つまたは複数の廃棄物トラップ508とを含む。デバイスがフレーム500のチップスロット506内に載置されているときに、デバイスにロードしてもよい。デバイスがフレーム内に載置されているときに、デバイスを画像化してもよい。
【００５４】
特定の態様において、試料を1つまたは複数の試薬と事前混合する。他の態様において、試料を、入口ポート102およびマイクロ流体流路104のうちの少なくとも一方の内部に存在する1つまたは複数の試薬と接触させる。さらに他の態様において、試料を、1つまたは複数の試薬と事前混合するとともに、マイクロ流体回路101内の試薬と接触させる。
【００５５】
試料は、シリンジまたはピペットを含むがこれらに限定されない、当技術分野において一般的な実質的に任意の手段によって、入口ポート102に添加することができる。本明細書の他の場所に記載されている、1本の線上に配列された入口ポート102を有する態様において、試料は、マルチチャネルピペットによって入口ポートに添加することができる。
【００５６】
圧力は、様々なデバイスを用いて適用することができる。例えば、マニフォールドを入口102の上方に押し付けるかまたはクランプ付けして、加圧することができる。特定の態様において、印加される圧力は、約10〜約10,000s-1または約10〜約2,000s-1の中心線壁せん断速度を確立するのに十分な圧力で維持される。印加される入口圧力は、約1mmHg〜約500mmHgの範囲の一定圧力で維持され得る。別の態様において、血液を入口からデバイスを横切って出口へと引くために、大気圧より低い一定圧力（負圧）を流出口地点に印加することができる。他の態様において、シリンジポンプによって食塩水緩衝液などの作動液を注入して、血液を入口から出口までデバイスを横切って一定流量で押し進めることができる。別の態様において、血液を一定流量で引き込むためにシリンジポンプをデバイスの出口に取り付けることができる。
【００５７】
特定の態様において、方法は、1つまたは複数のコンピュータ制御ロボットによって実行される自動化された方法であり得る。
【００５８】
試料は任意の動物に由来し得る。いくつかの例において、動物は哺乳動物であり、他の例において、動物はヒトである。
【実施例】
【００５９】
材料および方法
互いに接合される層を用いて、すべての入口、出口、プライミング経路、および感知領域内のコラーゲンパターン付き表面を備えたデバイスを構成することができる。図5に、構成要素から組み立てられたデバイスを示す。マイクロチャネルがPDMSなどのポリマー内に成形されており、このポリマーは、ポリマー内にチャネルを形成するための小さな形体がエッチングによりパターン形成されたウェーハ上で重合される。ウェーハは標準的なリソグラフィ技術によって得られ、この標準的なリソグラフィ技術では、マスクによってSU8などの感光性コーティング上に精密なパターンを露光することが可能であり、次いでこれをエッチングすることができる。ポリマーデバイスをウェーハから取り外して、入口圧力チャンバ、出口リザーバ、ならびにオフチッププライミング管および逆止弁と共に構成する。このデバイスを、流体デバイスの感知ゾーン内のパターン付き表面を提供する平坦基板と接合する。
【００６０】
図5にデバイスの使用が示されており、ここでは、プライミング流体が逆止弁を通して送達され、血液試料が8個の入口ウェルへと送達され、入口圧力チャンバが、圧力供給源に取り付けられた上蓋によって封止されている。図6Aにおいては、最初にデバイスを赤色色素プライミング液でプライミングし、次いで青色色素試験液で入口ウェルを満たし（図6B）、その後、圧力供給源を取り付けて（図6C）、青色色素試験液を駆動して8個の各経路に通すために10mmHgの圧力を印加し、それによって、青色色素試験液が各チャネルの入口から出口へと流れるにつれて赤色色素プライミング液が変位する。図13Aにおいては、最初に例示的なデバイスを緑色色素プライミング液でプライミングする。次いで、赤色／橙色色素試験液で入口ウェルを満たし（図13B）、赤色／橙色色素試験液が入口から出口チャネルへと流れるにつれて緑色色素プライミング液が試験液によって変位するが、一方で試験液がプライミング回路と混ざることはない（図13C）。
【００６１】
図7に、チップを作動させるためのプライミング工程が、デバイスへの手動でのプライミング流体の送達に関して示されており、ここでは、シリンジをプライミング入口に接続し（図7A）、逆止弁を通してプライミング流体をデバイス内へと送達するようにシリンジを手動で駆動し（図7B）、その結果、試験試料を送達する入口リザーバに対するプライミングを含めた、デバイスのプライミングが完了する（図7C）。これらの手動工程は、ロボット流体ディスペンサシステムに、またはシリンジプランジャの自動運動により駆動される事前取り付けプレフィルドシリンジに、容易に置き換えることができる。使用時にプライミング流体を使用することによって、デバイスを乾燥状態下で保管すること（図7D）、およびその後、血液などの個々の試験試料によるデバイスの使用に向けた準備において、プライミング流体（図7Eにおいては、赤色色素プライミング流体）でデバイスを完全にプライミングすることが可能である。
【００６２】
実施例1
血小板機能の試験において、血小板を標識するための蛍光抗体を血液試料に添加することができ、血液試料をプライミングされたデバイスに送達することができる。入口への圧力の印加によって、個々の試料が、デバイスの感知領域内のコラーゲン被覆ストリップを横切って駆動される。血小板がコラーゲン上に蓄積しているときに、個々のチャネルすべてを同時に画像化することができる（図8）。画像は、ビデオ速度（毎秒30フレーム）で、または1〜30秒毎に1フレームというより遅いサンプリング速度で取得することができる。画像処理によって、デバイスの感知領域内の個々の凝固ゾーンに対応する関心領域を画像内で規定することが可能である。規定されたこれらの関心領域において、標準的な画像解析技術を用いて蛍光強度を経時的に決定することができる。図9においては、個々の感知領域すべてを平均して、チップ動作の0〜600秒の凝固過程にわたる8個の特有の反復凝固イベントについての平均蛍光および蛍光の標準偏差を示している。
【００６３】
実施例2
いくつかの実験においては、血液を、トロンビンを阻害するためのd-フェニルアラニル-プロリル-アルギニルクロロメチルケトン（PPACK）および／または第Xa因子を阻害するためのアピキサバンで処理する。他の抗凝固薬には、ヘパリン、シトレート、ヒルジンなどが含まれ得る。血液を血小板標識でさらに処理し、コラーゲン上に潅流して、コラーゲンに対する血小板反応を評価する。この実験の変形形態においては、抗血小板剤の漸増用量を血液試料の一部に添加して、所与の抗血小板剤について用量反応および患者の薬物感受性を1つのデバイスを用いて明らかにすることができる。一般的な抗血小板剤には、アスピリン、インドメタシン、P2Y12阻害薬、プロスタサイクリン、プロスタサイクリン類似体、インテグリン拮抗薬などが含まれる。
【００６４】
いくつかの実験においては、血液を、第XIIa因子を阻害するためのトウモロコシトリプシン阻害物質で処理する。血液を血小板標識およびフィブリン標識（抗フィブリンまたは蛍光フィブリノゲン）およびトロンビン標識（1〜600nMという低用量の蛍光PPACKまたは血小板を標的指向するトロンビンセンサ）でさらに処理し、コラーゲン／TF表面上に潅流して、堅牢なトロンビン生成およびフィブリン重合の存在下でのコラーゲンに対する血小板反応を評価する。この実験の変形形態においては、抗血小板剤の漸増用量を血液試料の一部に添加して、所与の抗血小板剤について用量反応および患者の薬物感受性を1つのデバイスを用いて明らかにすることができる。一般的な抗血小板剤には、アスピリン、インドメタシン、P2Y12阻害薬、プロスタサイクリン、プロスタサイクリン類似体、インテグリン拮抗薬などが含まれる。この実験の変形形態においては、抗凝固剤の漸増用量を血液試料の一部に添加して、所与の抗凝固剤について用量反応および患者の薬物感受性を1つのデバイスを用いて明らかにすることができる。一般的な抗凝固剤には、第XIIa因子、第XIa因子、第Xa因子、第IXa因子、第VIIIa因子、第VIIa因子、第Va因子、第IIa因子（トロンビン）もしくは組織因子を標的とする抗凝固剤、TFPI、プロテインS、プロテインZ、活性化プロテインC、またはPAR1もしくはPAR4阻害薬が含まれるがこれらに限定されない。
【００６５】
いくつかの実験においては、血友病もしくは出血性障害であることが分かっている患者またはその疑いがある患者由来の血液を、血液凝固を促進する作用物質、例えば、凝固イベント中のトロンビンおよびフィブリンの産生を増強する作用物質、またはフォン・ヴィレブランド因子のような血小板粘着を増強する作用物質と共に、デバイスに適用することができる。
【００６６】
いくつかの実験においては、急性外傷に苦しんでいる患者由来の血液をデバイスに適用して、出血リスクの尺度としての、および輸液製品または薬理学的作用物質の選択の指針となるツールとしての、血小板機能、トロンビン生成速度、フィブリン重合速度を評価することができる。
【００６７】
いくつかの実験においては、一定時間の潅流および凝固の後、圧力降下が無いことによりマイクロチャネルを横切る流れが停止するように、入口の圧力を0 PSIGへ急激に下げることができる。この状況において、ADP、ATPおよびトロンボキサンなどの血小板から放出された産物は流れ場によって押し流されることはなく、むしろ、高いレベルまで蓄積して血小板収縮および全体的な血餅退縮を促進するが、これは画像解析によって容易に観察され、血餅の面積が時間とともに減少する。
【００６８】
いくつかの実験においては、一定時間の潅流および凝固の後、マイクロチャネルを横切る流れが増加して感知領域内の血餅に対するせん断力が増加するように、入口の圧力を1.5〜10倍に急激に上げることができる。この状況において、弱い血餅構造の指標としての血餅塞栓化が生じる可能性がある。塞栓化は画像解析によって容易に観察され、血餅関連の蛍光の低下によって示されるように血餅の質量が時間とともに減少する。この実験の変形形態においては、収縮を含む血小板機能、トロンビン生成、またはフィブリン重合のモジュレータをウェルの一部に添加して、全体的な血餅強度に対するこれらの経路の効果を理解することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2021518552.tif 000010
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
2021518552.tif 000023