(57)【要約】本開示は概して、非天然トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合部位を含み、インビボで網状赤血球を実質的に減少させないが、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する結合性を維持している、Ｆｃポリペプチド二量体に関する。本開示はまた、Ｆｃポリペプチドの一方が、ＴｆＲに特異的に結合する非天然部位と、ＴｆＲに結合した時にＦｃγＲの結合を低減させる、該ＴｆＲ結合部位を含むＦｃポリペプチドにおける改変（複数可）とを含み、ここで、他方のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合部位を含まないがＦｃγＲへの結合性を維持している、Ｆｃポリペプチド二量体にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＴｆＲに特異的に結合し、
（ｂ）Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合することが可能であり、かつ
（ｃ）インビボで網状赤血球を実質的に減少させない
、改変Ｆｃポリペプチド二量体、またはその二量体フラグメント。
【請求項２】
（ａ）（ｉ）ＴｆＲ結合部位と、（ｉｉ）ＴｆＲに結合した場合にＦｃγＲ結合を低減する１つ以上のアミノ酸改変とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲ結合を低減するいかなる改変も含まない第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体、またはその二量体フラグメント。
【請求項３】
前記ＴｆＲ結合部位が、改変ＣＨ３ドメインを含む、請求項１または２に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインに由来する、請求項３に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ＥＵ番号付けに従って、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位、及び４２１位からなるアミノ酸位置のセットにおいて５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含む、請求項３または４に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３８０位、３９１位、３９２位、及び４１５位を含む位置に１個、２個、３個、または４個の置換を更に含む、請求項５に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７】
前記改変ＣＨ３ドメインが、４１４位、４２４位、及び４２６位を含む位置に１個、２個、または３個の置換を更に含む、請求項５または６に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項８】
ＴｆＲのアピカルドメインに結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項９】
トランスフェリンのＴｆＲへの結合を阻害することなくＴｆＲに結合する、請求項８に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項１０】
ＴｆＲのアミノ酸２０８を含むエピトープに結合する、請求項８または９に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項１１】
前記改変ＣＨ３ドメインが３８８位にＴｒｐを含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項１２】
前記改変ＣＨ３ドメインが４２１位に芳香族アミノ酸を含む、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項１３】
前記４２１位の芳香族アミノ酸がＴｒｐまたはＰｈｅである、請求項１２に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項１４】
前記改変ＣＨ３ドメインが、以下から選択される少なくとも１つの位置を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体：
３８４位がＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ、３８６位がＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ、３８７位がＶａｌ、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ、４１３位がＧｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ、４１６位がＴｈｒ、または酸性アミノ酸、及び、４２１位がＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＰｈｅ。
【請求項１５】
前記改変ＣＨ３ドメインが、以下から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの位置を含む、請求項１４に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体：
３８４位がＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ、３８６位がＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ、３８７位がＶａｌ、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ、４１３位がＧｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ、４１６位がＴｈｒ、または酸性アミノ酸、及び、４２１位がＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＰｈｅ。
【請求項１６】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３８４位にＬｅｕまたはＭｅｔを、３８６位にＬｅｕ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏを、３８７位にＶａｌを、３８８位にＴｒｐを、３８９位にＶａｌまたはＡｌａを、４１３位にＰｒｏを、４１６位にＴｈｒを、及び／あるいは４２１位にＴｒｐを含む、請求項５〜１５のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項１７】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３９１位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅを更に含む、請求項１６に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項１８】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎを更に含む、請求項１６または１７に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項１９】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３９２位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを更に含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項２０】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３８０位にＴｒｐを、及び／または３９２位にＧｌｎを更に含む、請求項１６または１７に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項２１】
前記改変ＣＨ３ドメインが、以下から選択される１つ、２つ、または３つの位置を更に含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体：
４１４位がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏ、４２４位がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ、及び４２６位がＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙ。
【請求項２２】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３８４位にＴｙｒを、３８６位にＴｈｒを、３８７位にＧｌｕまたはＶａｌを、３８８位にＴｒｐを、３８９位にＳｅｒを、４１３位にＳｅｒまたはＴｈｒを、４１６位にＧｌｕを、及び／あるいは４２１位にＰｈｅを含む、請求項５〜１５のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項２３】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎを更に含む、請求項２２に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項２４】
前記改変ＣＨ３ドメインが、４１５位にＧｌｕを更に含む、請求項２２または２３に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項２５】
前記改変ＣＨ３ドメインが、３８０位にＴｒｐを、及び／または４１５位にＧｌｕを更に含む、請求項２２に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項２６】
前記改変ＣＨ３ドメインが３９０位にＡｓｎを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項２７】
前記改変ＣＨ３ドメインが、以下の置換のうちの１つ以上を含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体：
３８０位にＴｒｐ、３８６位にＴｈｒ、３８８位にＴｒｐ、３８９位にＶａｌ、４１３位にＳｅｒまたはＴｈｒ、４１５位にＧｌｕ、及び／あるいは４２１位にＰｈｅ。
【請求項２８】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、及び６４〜１２７のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する、請求項５〜２７のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項２９】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２８に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項３０】
パーセント同一性がＥＵ番号付けに従って３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位、及び４２１位のセットを含まないことを条件として、前記改変ＣＨ３ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性を有する、請求項５〜２７のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項３１】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、及び１２５〜１２７のうちのいずれか１つのアミノ酸１５４〜１６０及び／または１８３〜１９１を含む、請求項５〜３０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項３２】
前記改変ＣＨ３ドメインが、以下から選択される少なくとも１つの位置を含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体：
３８０位がＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ、３８４位がＴｙｒまたはＰｈｅ、３８６位がＴｈｒ、３８７位がＧｌｕ、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ、３９０位がＳｅｒまたはＡｓｎ、４１３位がＴｈｒまたはＳｅｒ、４１５位がＧｌｕまたはＳｅｒ、４１６位がＧｌｕ、及び４２１位がＰｈｅ。
【請求項３３】
前記改変ＣＨ３ドメインが、以下から選択される、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、または１１個の位置を含む、請求項３２に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体：
３８０位がＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ、３８４位がＴｙｒまたはＰｈｅ、３８６位がＴｈｒ、３８７位がＧｌｕ、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ、３９０位がＳｅｒまたはＡｓｎ、４１３位がＴｈｒまたはＳｅｒ、４１５位がＧｌｕまたはＳｅｒ、４１６位がＧｌｕ、及び４２１位がＰｈｅ。
【請求項３４】
前記改変ＣＨ３ドメインが、以下の１１個の位置を含む、請求項３３に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体：
３８０位がＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ、３８４位がＴｙｒまたはＰｈｅ、３８６位がＴｈｒ、３８７位がＧｌｕ、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ、３９０位がＳｅｒまたはＡｓｎ、４１３位がＴｈｒまたはＳｅｒ、４１５位がＧｌｕまたはＳｅｒ、４１６位がＧｌｕ、及び４２１位がＰｈｅ。
【請求項３５】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、及び６４〜１２７のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３３または３４に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項３６】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３５に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項３７】
ＥＵ番号付けスキームに従って３８０位、３８４位、３８６位、３８４位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４２１位、４２４位、及び４２６位に対応する位置のうちの少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個における残基が、欠失も置換もされていない、請求項３５に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項３８】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８〜６１及び１３１〜１７３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項３に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項３９】
前記改変ＣＨ３ドメインが、ＥＵ番号付けスキームに従って（ｉ）３６６位にＴｒｐを、または（ｉｉ）３６６位にＳｅｒを、３６８位にＡｌａを、及び４０７位にＶａｌを更に含む、請求項５〜３７のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４０】
前記対応する未改変のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、請求項５〜３９のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４１】
ＴｆＲと結合した時にＦｃγＲの結合を低減する前記アミノ酸改変が、ＥＵ番号付けスキームに従って２３４位及び２３５位のＡｌａを含む、請求項２〜４０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４２】
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、血清中半減期を増大させるアミノ酸改変を含む、請求項２〜４１のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４３】
血清中半減期を増大させる前記アミノ酸改変が、ＥＵ番号付けスキームに従って、（ｉ）４２８位のＬｅｕ及び４３４位のＳｅｒ、あるいは（ｉｉ）４３４位のＳｅｒまたはＡｌａを含む、請求項４２に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４４】
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが更にＦａｂに融合されている、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４５】
ＥＵ番号付けスキームに従って、前記第１のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、前記第２のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む、請求項２〜４４のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４６】
ＥＵ番号付けスキームに従って、前記第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む、請求項２〜４４のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４７】
（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４８】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８、１９０、２０２、２１４、２２６、２３８、２５２、２８６、２９８、及び３１０のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項４７に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項４９】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７の配列を含む、請求項４７または４８に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５０】
（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５１】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３、３３０、３３７、３４４、３５１、３５８、３６５、３７２、３７９、及び３８６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項５０に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５２】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７の配列を含む、請求項５０または５１に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５３】
（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５４】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８、１９０、２０２、２１４、２２６、２３８、２５２、２８６、２９８、及び３１０のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項５３に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５５】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０７の配列を含む、請求項５３または５４に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５６】
（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５７】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３、３３０、３３７、３４４、３５１、３５８、３６５、３７２、３７９、及び３８６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項５６に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５８】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０７の配列を含む、請求項５６または５７に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項５９】
（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６０】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４、１９６、２０８、２２０、２３２、２４４、２８０、２９２、３０４、及び３１６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項５９に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６１】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９１の配列を含む、請求項５９または６０に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６２】
（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６３】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、３３３、３４０、３４７、３５４、３６１、３６８、３７５、３８２、及び３８９のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項６２に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６４】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９１の配列を含む、請求項６２または６３に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６５】
（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６６】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４、１９６、２０８、２２０、２３２、２４４、２８０、２９２、３０４、及び３１６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項６５に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６７】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０４の配列を含む、請求項６５または６６に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６８】
（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項６９】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、３３３、３４０、３４７、３５４、３６１、３６８、３７５、３８２、及び３８９のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項６８に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７０】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０４の配列を含む、請求項６８または６９に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７１】
網状赤血球を実質的に減少させない、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７２】
前記改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に減少する網状赤血球の量が、コントロールの投与後に減少する網状赤血球の量よりも少ない、請求項７１に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７３】
前記改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に減少する網状赤血球の量が、コントロールの投与後に減少する網状赤血球の量の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、３％、２％、または１％よりも少ない、請求項７２に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７４】
前記改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に残留する網状赤血球の量が、コントロールの投与後に残留する網状赤血球の量よりも多い、請求項７１に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７５】
前記改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に残留する網状赤血球の量が、コントロールの投与後に残留する網状赤血球の量よりも少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％多い、請求項７４に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７６】
骨髄中の網状赤血球を実質的に減少させない、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７７】
前記改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に骨髄中で減少する網状赤血球の量が、コントロールの投与後に骨髄中で減少する網状赤血球の量よりも少ない、請求項７６に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７８】
前記改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に骨髄中で減少する網状赤血球の量が、コントロールの投与後に骨髄中で減少する網状赤血球の量の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、３％、２％、または１％よりも少ない、請求項７７に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項７９】
前記改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に骨髄中に残留する網状赤血球の量が、コントロールの投与後に骨髄中に残留する網状赤血球の量よりも多い、請求項７６に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項８０】
前記改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に骨髄中に残留する網状赤血球の量が、コントロールの投与後に骨髄中に残留する網状赤血球の量よりも少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％多い、請求項７９に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項８１】
前記コントロールが、完全なエフェクター機能を有する対応するＴｆＲ結合Ｆｃ二量体であり、及び／またはＦｃγＲの結合を低減する変異を含まない、請求項７２〜７５及び請求項７７〜８０のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体。
【請求項８２】
（ａ）抗原に結合することが可能な抗体可変領域、またはその抗原結合フラグメントと、
（ｂ）（ｉ）ＴｆＲ結合部位と、ＴｆＲに結合した時にＦｃγＲの結合を低減する１つ以上のアミノ酸改変とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｉｉ）ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない第２のＦｃポリペプチドと
を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体と
を含む、ＢＢＢを通過して能動的に輸送されることが可能なＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項８３】
ＴｆＲと結合した時にＦｃγＲの結合を低減する前記アミノ酸改変が、ＥＵ番号付けスキームに従って２３４位及び２３５位のＡｌａを含む、請求項８２に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項８４】
前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、血清中半減期を増大させるアミノ酸改変を含む、請求項８２または８３に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項８５】
血清中半減期を増大させる前記アミノ酸改変が、ＥＵ番号付けスキームに従って、（ｉ）４２８位のＬｅｕ及び４３４位のＳｅｒ、あるいは（ｉｉ）４３４位のＳｅｒまたはＡｌａを含む、請求項８４に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項８６】
前記抗体可変領域配列がＦａｂドメインを含む、請求項８２〜８５のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項８７】
前記抗体可変領域配列が、２個の抗体可変領域重鎖及び２個の抗体可変領域軽鎖、またはそれらのそれぞれのフラグメントを含む、請求項８２〜８６のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項８８】
請求項１〜８１のいずれか１項に記載の前記改変Ｆｃポリペプチド二量体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項８９】
請求項８２〜８７のいずれか１項に記載の前記Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項９０】
内皮を通過して組成物をトランスサイトーシスするための方法であって、前記内皮を、請求項１〜８１のいずれか１項に記載の改変Ｆｃポリペプチド二量体を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項９１】
内皮を通過して組成物をトランスサイトーシスするための方法であって、前記内皮を、請求項８２〜８７のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項９２】
前記内皮がＢＢＢである、請求項９０または９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月１０日出願の米国特許仮出願第６２／６１５，９１４号、２０１８年２月１５日出願の米国特許仮出願第６２／６３１，２８１号、２０１８年６月８日出願の米国特許仮出願第６２／６８２，６３９号、及び、２０１８年８月２２日出願の米国特許仮出願第６２／７２１，２７５号に基づく優先権を主張するものであり、当該各出願の開示内容をあらゆる目的でそれらの全容にわたって本明細書に参照により援用するものである。
【０００２】
分野
本開示は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合し、少なくとも１つのエフェクター機能活性（例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ））を誘導することができるが、網状赤血球の大きな減少をもたらさない改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＴｆＲは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する治療薬の受容体介在型トランスサイトーシスの標的として提唱されている。ＴｆＲは、ＢＢＢを形成する内皮細胞で発現するが、ＴｆＲは網状赤血球を含む他の種類の細胞でも発現する。これまでの研究により、抗ＴｆＲ抗体は循環中から網状赤血球を減少させ得ることが示されている。
【０００４】
網状赤血球の減少はエフェクター機能活性により媒介されるため、この毒性はエフェクター機能を低減または消失させる改変を行うことによって克服することができる。しかしながら、このアプローチは、エフェクター機能が望ましい、または求められる治療薬の使用を妨げる。
【０００５】
したがって、網状赤血球の減少を引き起こさないエフェクター機能陽性の治療薬を脳に送達するための手段があれば有用であると考えられる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ＴｆＲに結合するように改変されたＦｃポリペプチドを開発した。これらのＦｃポリペプチドは、ＢＢＢにおけるＴｆＲへの結合を通じて受容体介在型トランスサイトーシスによって脳内に能動的に輸送されることが可能である。Ｆｃポリペプチドは、免疫細胞のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）との結合を通じてＡＤＣＣを含むエフェクター機能活性を誘導することが可能であるため、また、ＴｆＲは網状赤血球上で発現されるため、これらのポリペプチドによる網状赤血球及びＦｃγＲへの同時結合は網状赤血球の減少につながり得る。エフェクター機能は、Ｆｃポリペプチドに変異を導入することによって低減または消失させることができるが、これは特定の治療用途では望ましくない。
【０００７】
本開示は、ＴｆＲに結合し、ＢＢＢを通過し、エフェクター機能活性を保持するが、網状赤血球の減少を含む顕著なＴｆＲ依存性毒性を引き起こさない改変Ｆｃポリペプチド二量体の開発に基づくものである。かかる二量体は、本明細書に記載されるようにして操作することができる。
【０００８】
一態様では、本開示は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位を含み、（ｂ）Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合することが可能であり、かつ（ｃ）インビボで網状赤血球を実質的に減少させない、改変Ｆｃポリペプチド二量体、またはその二量体フラグメントに関する。
【０００９】
一態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）ＴｆＲ結合部位と、（ｉｉ）例えば、ＴｆＲに結合した時にＦｃγＲ結合を低減する１つ以上のアミノ酸改変（例えば、ＴｆＲに結合しない場合、ＦｃγＲ結合の低減が限定されるか、または低減されない）とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲ結合を低減させるいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む、改変Ｆｃポリペプチド二量体、またはその二量体フラグメントに関する。
【００１０】
この態様のいくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合部位は、改変ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインに由来する。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＥＵ番号付けに従って、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位、及び４２１位を含むアミノ酸位置のセットにおいて５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含む。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３８０位、３９１位、３９２位、及び４１５位を含む位置に１個、２個、３個、または４個の置換を更に含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは４１４位、４２４位、及び４２６位を含む位置に１個、２個、または３個の置換を更に含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲのアピカルドメインに結合する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、トランスフェリンのＴｆＲへの結合を阻害することなくＴｆＲに結合する。特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲのアミノ酸２０８を含むエピトープに結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３８８位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、４２１位に芳香族アミノ酸を含む。特定の実施形態では、４２１位の芳香族アミノ酸はＴｒｐまたはＰｈｅである。
【００１４】
この態様のいくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、以下から選択される少なくとも１つの位置を含む：３８４位がＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ、３８６位がＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ、３８７位がＶａｌ、Ｐｒｏ、またはアミノ酸、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ、４１３位がＧｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ、４１６位がＴｈｒ、またはアミノ酸、及び、４２１位がＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＰｈｅ。
【００１５】
この態様のいくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、以下から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの位置を含む：３８４位がＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ、３８６位がＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ、３８７位がＶａｌ、Ｐｒｏ、またはアミノ酸、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ、４１３位がＧｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ、４１６位がＴｈｒ、またはアミノ酸、及び、４２１位がＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＰｈｅ。
【００１６】
この態様のいくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、３８４位にＬｅｕまたはＭｅｔを、３８６位にＬｅｕ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏを、３８７位にＶａｌを、３８８位にＴｒｐを、３８９位にＶａｌまたはＡｌａを、４１３位にＰｒｏを、４１６位にＴｈｒを、及び／あるいは４２１位にＴｒｐを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３９１位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３９２位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３８０位にＴｒｐを、及び／または３９２位にＧｌｎを更に含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは以下から選択される１つ、２つ、または３つの位置を更に含む：４１４位がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏ、４２４位がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ、及び４２６位がＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙ。
【００１９】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３８４位にＴｙｒを、３８６位にＴｈｒを、３８７位にＧｌｕまたはＶａｌを、３８８位にＴｒｐを、３８９位にＳｅｒを、４１３位にＳｅｒまたはＴｈｒを、４１６位にＧｌｕを、かつ／あるいは４２１位にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、４１５位にＧｌｕを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３８０位にＴｒｐを、及び／または４１５位にＧｌｕを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、３９０位にＡｓｎを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、以下の置換のうちの１つ以上を含む。すなわち、３８０位にＴｒｐ、３８６位にＴｈｒ、３８８位にＴｒｐ、３８９位にＶａｌ、４１３位にＳｅｒまたはＴｈｒ、４１５位にＧｌｕ、及び／あるいは４２１位にＰｈｅ。
【００２１】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９及び６４〜１２７のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、パーセント同一性がＥＵ番号付けに従って３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位、及び４２１位のセットを含まないことを条件として、改変ＣＨ３ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９及び１２５〜１２７のうちのいずれか１つのアミノ酸１５４〜１６０及び／または１８３〜１９１を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、以下から選択される少なくとも１つの位置を含む：３８０位がＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ、３８４位がＴｙｒまたはＰｈｅ、３８６位がＴｈｒ、３８７位がＧｌｕ、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ、３９０位がＳｅｒまたはＡｓｎ、４１３位がＴｈｒまたはＳｅｒ、４１５位がＧｌｕまたはＳｅｒ、４１６位がＧｌｕ、及び４２１位がＰｈｅ。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、以下から選択される、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個の位置を含む：３８０位がＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ、３８４位がＴｙｒまたはＰｈｅ、３８６位がＴｈｒ、３８７位がＧｌｕ、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ、３９０位がＳｅｒまたはＡｓｎ、４１３位がＴｈｒまたはＳｅｒ、４１５位がＧｌｕまたはＳｅｒ、４１６位がＧｌｕ、及び４２１位がＰｈｅ。
【００２５】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、以下の１１個の位置を含む：３８０位がＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ、３８４位がＴｙｒまたはＰｈｅ、３８６位がＴｈｒ、３８７位がＧｌｕ、３８８位がＴｒｐ、３８９位がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ、３９０位がＳｅｒまたはＡｓｎ、４１３位がＴｈｒまたはＳｅｒ、４１５位がＧｌｕまたはＳｅｒ、４１６位がＧｌｕ、及び４２１位がＰｈｅ。
【００２６】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９及び６４〜１２７のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＥＵ番号付けスキームに従って３８０位、３８４位、３８６位、３８４位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４２１位、４２４位、及び４２６位に対応する位置のうちの少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個における残基は、欠失も置換もされていない。
【００２８】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８〜６１及び１３１〜１７３のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００２９】
この態様のいくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＥＵ番号付けスキームに従って（ｉ）３６６位にＴｒｐを、または（ｉｉ）３６６位にＳｅｒを、３６８位にＡｌａを、及び４０７位にＶａｌを更に含む。
【００３０】
この態様のいくつかの実施形態では、対応する未改変のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。
【００３１】
この態様のいくつかの実施形態では、例えば、ＴｆＲと結合した時にＦｃγＲの結合を低減するアミノ酸改変は、ＥＵ番号付けスキームに従って２３４位及び２３５位にＡｌａを含む。この態様のいくつかの実施形態では、例えば、ＴｆＲと結合した時にＦｃγＲの結合を低減するアミノ酸改変は、ＥＵ番号付けスキームに従って３２９位にＧｌｙを更に含む。
【００３２】
この態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血清中安定性（例えば、血清中半減期）を増大させるアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、血清中安定性（例えば、血清中半減期）を増大させるアミノ酸改変は、ＥＵ番号付けスキームに従って、２５２位のＴｙｒ、２５４位のＴｈｒ、及び２５６位のＧｌｕを含む。いくつかの実施形態では、血清中安定性（例えば、血清中半減期）を増大させるアミノ酸改変は、ＥＵ番号付けスキームに従って、（ｉ）４２８位のＬｅｕ及び４３４位のＳｅｒ、あるいは（ｉｉ）４３４位のＳｅｒまたはＡｌａを含む。
【００３３】
この態様のいくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体はＦａｂと更に融合される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｆａｂと更に融合される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＥＵ番号付けスキームに従って、第１のＦｃポリペプチドはノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＦｃポリペプチドはホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。いくつかの実施形態では、ＥＵ番号付けスキームに従って、第１のＦｃポリペプチドはホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃポリペプチドはノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む。
【００３５】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８、１９０、２０２、２１４、２２６、２３８、２３８、２５２、２８６、２９８、及び３１０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７の配列を含む。
【００３６】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９、１９１、２０３、２１５、２２７、２３９、２７５、２８７、２９９、及び３１１のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７の配列を含む。
【００３７】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１、１９３、２０５、２１７、２２９、２４１、２７７、２８９、３０１、及び３１３のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７の配列を含む。
【００３８】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３、３３０、３３７、３４４、３５１、３５８、３６５、３７２、３７９、及び３８６のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７の配列を含む。
【００３９】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２、１９４、２０６、２１８、２３０、２４２、２７８、２９０、３０２、及び３１４のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７の配列を含む。
【００４０】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４、３３１、３３８、３４５、３５２、３５９、３６６、３７３、３８０、及び３８７のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９７の配列を含む。
【００４１】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８、１９０、２０２、２１４、２２６、２３８、２５２、２８６、２９８、及び３１０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４００の配列を含む。
【００４２】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８、１９０、２０２、２１４、２２６、２３８、２５２、２８６、２９８、及び３１０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０７の配列を含む。
【００４３】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９、１９１、２０３、２１５、２２７、２３９、２７５、２８７、２９９、及び３１１のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４００の配列を含む。
【００４４】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９、１９１、２０３、２１５、２２７、２３９、２７５、２８７、２９９、及び３１１のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０７の配列を含む。
【００４５】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１、１９３、２０５、２１７、２２９、２４１、２７７、２８９、３０１、及び３１３のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４００の配列を含む。
【００４６】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３、３３０、３３７、３４４、３５１、３５８、３６５、３７２、３７９、及び３８６のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０７の配列を含む。
【００４７】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２、１９４、２０６、２１８、２３０、２４２、２７８、２９０、３０２、及び３１４のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４００の配列を含む。
【００４８】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４、３３１、３３８、３４５、３５２、３５９、３６６、３７３、３８０、及び３８７のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０７の配列を含む。
【００４９】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４、１９６、２０８、２２０、２３２、２４４、２８０、２９２、３０４、及び３１６のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９１の配列を含む。
【００５０】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５、１９７、２０９、２２１、２３３、２４５、２８１、２９３、３０５、及び３１７のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９１の配列を含む。
【００５１】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７、１９９、２１１、２２３、２３５、２４７、２８３、２９５、３０７、及び３１９のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９１の配列を含む。
【００５２】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、３３３、３４０、３４７、３５４、３６１、３６８、３７５、３８２、及び３８９のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９１の配列を含む。
【００５３】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８、２００、２１２、２２４、２３６、２４８、２８４、２９６、３０８、及び３２０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９１の配列を含む。
【００５４】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、３３４、３４１、３４８、３５５、３６２、３６９、３７６、３８３、及び３９０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９１の配列を含む。
【００５５】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４、１９６、２０８、２２０、２３２、２４４、２８０、２９２、３０４、及び３１６のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９４の配列を含む。
【００５６】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４、１９６、２０８、２２０、２３２、２４４、２８０、２９２、３０４、及び３１６のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０４の配列を含む。
【００５７】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５、１９７、２０９、２２１、２３３、２４５、２８１、２９３、３０５、及び３１７のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９４の配列を含む。
【００５８】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５、１９７、２０９、２２１、２３３、２４５、２８１、２９３、３０５、及び３１７のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０４の配列を含む。
【００５９】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７、１９９、２１１、２２３、２３５、２４７、２８３、２９５、３０７、及び３１９のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９４の配列を含む。
【００６０】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、３３３、３４０、３４７、３５４、３６１、３６８、３７５、３８２、及び３８９のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０４の配列を含む。
【００６１】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８、２００、２１２、２２４、２３６、２４８、２８４、２９６、３０８、及び３２０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９４の配列を含む。
【００６２】
別の態様において、本開示は、（ａ）ＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体に関する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、３３４、３４１、３４８、３５５、３６２、３６９、３７６、３８３、及び３９０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０４の配列を含む。
【００６３】
本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド二量体のいずれの態様においても、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、網状赤血球（例えば、循環網状赤血球）を実質的に減少させない。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に減少する網状赤血球の量は、コントロールの投与後に減少する網状赤血球の量よりも少ない。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に減少する網状赤血球の量は、コントロールの投与後に減少する網状赤血球の量の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、３％、２％、または１％よりも少ない。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に残留する網状赤血球の量は、コントロールの投与後に残留する網状赤血球の量よりも多い。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に残留する網状赤血球の量は、コントロールの投与後に残留する網状赤血球の量よりも少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％多い。
【００６４】
本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド二量体のいずれの態様においても、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、骨髄中の網状赤血球を実質的に減少させない。改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に骨髄中で減少する網状赤血球の量は、コントロールの投与後に骨髄中で減少する網状赤血球の量よりも少ない。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に骨髄中で減少する網状赤血球の量は、コントロールの投与後に骨髄中で減少する網状赤血球の量の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、３％、２％、または１％よりも少ない。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に骨髄中に残留する網状赤血球の量は、コントロールの投与後に骨髄中に残留する網状赤血球の量よりも多い。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体の投与後に骨髄中に残留する網状赤血球の量は、コントロールの投与後に骨髄中に残留する網状赤血球の量よりも少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％多い。
【００６５】
いくつかの実施形態では、コントロールは、完全なエフェクター機能を有し、及び／またはＦｃγＲの結合を低減する変異を含まない、対応するＴｆＲ結合Ｆｃ二量体（すなわち、上記に述べた改変Ｆｃポリペプチド二量体と同じＴｆＲへの結合をもたらす同じ変異を有する）である。
【００６６】
別の態様において、本開示は、
（ａ）抗原に結合することが可能な抗体可変領域、またはその抗原結合フラグメントと、
（ｂ）（ｉ）ＴｆＲ結合部位と、例えば、ＴｆＲに結合した時にＦｃγＲ結合を低減する１つ以上のアミノ酸改変（ただし、例えば、ＴｆＲに結合しない場合、ＦｃγＲ結合の低減は限定されるか、または低減されない）とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１のＦｃポリペプチドと、
（ｉｉ）ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲ結合を低減させるいかなる改変も含まない第２のＦｃポリペプチドと
を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体と
を含む、ＢＢＢを通過して能動的に輸送されることが可能なＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質を特徴とする。
【００６７】
この態様のいくつかの実施形態では、例えば、ＴｆＲと結合した時にＦｃγＲの結合を低減するアミノ酸改変は、ＥＵ番号付けスキームに従って２３４位及び２３５位にＡｌａを含む。特定の実施形態では、例えば、ＴｆＲと結合した時にＦｃγＲの結合を低減するアミノ酸改変は、ＥＵ番号付けスキームに従って３２９位にＧｌｙを更に含む。
【００６８】
この態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血清中安定性（例えば、血清中半減期）を増大させるアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、血清中安定性（例えば、血清中半減期）を増大させるアミノ酸改変は、ＥＵ番号付けスキームに従って、２５２位のＴｙｒ、２５４位のＴｈｒ、及び２５６位のＧｌｕを含む。いくつかの実施形態では、血清中安定性（例えば、血清中半減期）を増大させるアミノ酸改変は、ＥＵ番号付けスキームに従って、（ｉ）４２８位のＬｅｕ及び４３４位のＳｅｒ、あるいは（ｉｉ）４３４位のＳｅｒまたはＡｌａを含む。
【００６９】
この態様のいくつかの実施形態では、抗体可変領域配列は、Ｆａｂドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体可変領域配列は、２個の抗体可変領域重鎖及び２個の抗体可変領域軽鎖、またはそれらのそれぞれのフラグメントを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＦｃポリペプチドまたはＦｃポリペプチド二量体は、フコース欠損であるかまたは低フコース化されている（例えば、本明細書に記載されるように）。
【００７１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド二量体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【００７２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【００７３】
別の態様では、本開示は、内皮を通過して組成物をトランスサイトーシスするための方法であって、内皮を、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド二量体を含む組成物と接触させることを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、内皮はＢＢＢである。
【００７４】
別の態様では、本開示は、内皮を通過して組成物をトランスサイトーシスするための方法であって、内皮を、本明細書に記載されるＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質を含む組成物と接触させることを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、内皮はＢＢＢである。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体がＦＣγＲの結合を低減するように二量体の両方のＦｃポリペプチド上のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異（ＥＵ番号付けスキームを基準として番号付けされる）により改変された抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体が、ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウスにおいて血液中（Ａ）及び骨髄（Ｂ）の網状赤血球を減少させなかったことを示すグラフである。
【図２Ａ】ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲ結合部位に対してシス形態のＬＡＬＡ変異を有する（「シスＬＡＬＡ」）抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体が、ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウスにおいて、２５ｍｇ／ｋｇで血液中の網状赤血球を減少させなかったのに対して、Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲ結合部位に対してトランスのＬＡＬＡ変異を有する、抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合され、同様に改変されたＦｃポリペプチド二量体は、血液中の網状赤血球を減少させたことを示すグラフである。
【図２Ｂ】ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲ結合部位に対してシス形態のＬＡＬＡ変異を有する（「シスＬＡＬＡ」）抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体が、ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウスにおいて、２５ｍｇ／ｋｇで骨髄の網状赤血球を減少させなかったのに対して、Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲ結合部位に対してトランスのＬＡＬＡ変異を有する、抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合され、同様に改変されたＦｃポリペプチド二量体は、骨髄の網状赤血球を減少させたことを示すグラフである。
【図２Ｃ】ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲ結合部位に対してシス形態のＬＡＬＡ変異を有する（「シスＬＡＬＡ」）抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体が、ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウスにおいて、５０ｍｇ／ｋｇで血液中の網状赤血球を減少させなかったのに対して、Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲ結合部位に対してトランスのＬＡＬＡ変異を有する、抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合され、同様に改変されたＦｃポリペプチド二量体は、血液中の網状赤血球を減少させたことを示すグラフである。
【図２Ｄ】ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲ結合部位に対してシス形態のＬＡＬＡ変異を有する（「シスＬＡＬＡ」）抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体が、ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウスにおいて、５０ｍｇ／ｋｇで骨髄の網状赤血球を減少させなかったのに対して、Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲ結合部位に対してトランスのＬＡＬＡ変異を有する、抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合され、同様に改変されたＦｃポリペプチド二量体は、骨髄の網状赤血球を減少させたことを示すグラフである。
【図３Ａ】抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたシスＬＡＬＡ改変Ｆｃポリペプチド二量体（ＣＨ３Ｃ．３５．２１）及び両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有する改変ＦｃポリペプチドがＴｆＲ介在型ＡＤＣＣを誘導しなかったのに対して、ＴｆＲ結合部位を有するがＬＡＬＡ変異は有さないｈＩｇＧ１は内因性ＴｆＲを発現するＲａｍｏｓ細胞でＡＤＣＣを誘導したことを示すグラフである。
【図３Ｂ】抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたシスＬＡＬＡ改変Ｆｃポリペプチド二量体（ＣＨ３Ｃ．３５．２３）及び両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有する改変ＦｃポリペプチドがＴｆＲ介在型ＡＤＣＣを誘導しなかったのに対して、ＴｆＲ結合部位を有するがＬＡＬＡ変異は有さないｈＩｇＧ１は内因性ＴｆＲを発現するＲａｍｏｓ細胞でＡＤＣＣを誘導したことを示すグラフである。
【図４】ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体（ＣＨ３Ｃ．３５．２１）がＣＨＯ−ｈＴｆＲ細胞においてＴｆＲ介在型補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有さなかったのに対して、抗ＴｆＲコントロール抗体Ａｂ２０４はＣＤＣを誘導したことを示すグラフである。
【図５】抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたシスＬＡＬＡ改変Ｆｃポリペプチド二量体が、野生型ｈＩｇＧ１によってＴｆＲ結合ポリペプチドでみられるものと同様のｐＳｙｋタンパク質レベルを初代ヒトミクログリア細胞で誘導したのに対して、抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合された、両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有する改変Ｆｃポリペプチド二量体はｐＳｙｋを誘導しなかったことを示すグラフである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を含むｈＩｇＧ１が、抗ｍＣＤ２０抗体、及びＴｆＲ結合部位とｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位とを有するｈＩｇＧ１と同様、ＡＤＣＣを誘発したことを示す（図６Ａ）グラフである。同様に、シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体及びｈＣＤ２０のＦａｂ結合部位を含むｈＩｇＧ１が、抗ｈＣＤ２０、及びＴｆＲ結合部位とｈＣＤ２０のＦａｂ結合部位とを含むｈＩｇＧ１と同程度にＦａｂ媒介型ＣＤＣを誘発したことを示す（図６Ｂ）グラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を含むｈＩｇＧ１が、抗ｍＣＤ２０抗体、及びＴｆＲ結合部位とｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位とを有するｈＩｇＧ１と同様、安定したＢ細胞の減少を誘発したことを示すグラフである(Ａ及びＢ)。これらの結果は、シスＬＡＬＡ改変Ｆｃポリペプチド二量体がそのＦｃ機能を保持し、インビボでＦａｂ介在型エフェクター機能を有することを示すものである。
【図８Ａ】シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体を含むＴｆＲ結合部位を有する抗Ａβ（ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４）で処理したマウスが、Ａβプラークに対して安定したミクログリアの動員を誘発し（Ａ：ミクログリアの重複を含むプラーク領域の割合（％）、Ｂ：コントロールＩｇＧに対して正規化された同じデータ）、サイズが３０〜１２５μｍ２のプラークを減少させた（Ｃ）ことを示すグラフである。これらの結果は、シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体を有する抗Ａβが、ミクログリアの動員に対する安定したエフェクター機能、及び抗Ａβと同様のＡβプラークをある程度減少させる能力を維持していることを示すものである。
【図８Ｂ】シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体を含むＴｆＲ結合部位を有する抗Ａβ（ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４）で処理したマウスが、Ａβプラークに対して安定したミクログリアの動員を誘発し（Ａ：ミクログリアの重複を含むプラーク領域の割合（％）、Ｂ：コントロールＩｇＧに対して正規化された同じデータ）、サイズが３０〜１２５μｍ２のプラークを減少させた（Ｃ）ことを示すグラフである。これらの結果は、シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体を有する抗Ａβが、ミクログリアの動員に対する安定したエフェクター機能、及び抗Ａβと同様のＡβプラークをある程度減少させる能力を維持していることを示すものである。
【図８Ｃ】シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体を含むＴｆＲ結合部位を有する抗Ａβ（ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４）で処理したマウスが、Ａβプラークに対して安定したミクログリアの動員を誘発し（Ａ：ミクログリアの重複を含むプラーク領域の割合（％）、Ｂ：コントロールＩｇＧに対して正規化された同じデータ）、サイズが３０〜１２５μｍ２のプラークを減少させた（Ｃ）ことを示すグラフである。これらの結果は、シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体を有する抗Ａβが、ミクログリアの動員に対する安定したエフェクター機能、及び抗Ａβと同様のＡβプラークをある程度減少させる能力を維持していることを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
詳細な説明
Ｉ．序論
ＴｆＲ結合部位を含む改変Ｆｃポリペプチド二量体はＢＢＢを通過することができるだけでなく、ＢＢＢを通過して治療薬を輸送することができる。本明細書に記載されるように、網状赤血球もＴｆＲを発現することから、これらのＦｃポリペプチド二量体は、エフェクター機能を低減させるように操作されなければ、インビボで網状赤血球も減少させ得る。網状赤血球の減少は、Ｆｃポリペプチド二量体のＦｃポリペプチドのエフェクター機能をなくすような改変、すなわち、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）の結合をなくすかまたは低減するような改変（例えば、ＥＵ番号付けスキームを基準として番号付けした場合のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換）を導入することによって回避することが可能である。しかしながら、このアプローチは、分子のＦａｂ部分がその標的に結合する際にエフェクター機能が望ましい場合（例えば、治療標的タンパク質）では不利となる。
【００７７】
本開示は、エフェクター機能を維持するが、網状赤血球の実質的な減少をもたらさない改変Ｆｃポリペプチド二量体を提供するものである。これらの改変Ｆｃポリペプチド二量体を、本明細書では、「エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体」とも称する。いくつかの実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体の２個のＦｃポリペプチドの一方のみ（両方のＦｃポリペプチドではなく）を、エフェクター機能を低減させ、かつＴｆＲに結合するように改変する。改変Ｆｃポリペプチド二量体のもう一方のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合部位も含まず、エフェクター機能を低減するいかなる改変も含まないが、エフェクター機能を高める変異は含んでもよい。２個のＦｃポリペプチドの一方のみがＴｆＲ結合部位とＴｆＲに結合した時にＦｃγＲの結合を低減する改変との両方を含み、他方のＦｃポリペプチドはＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まないようなエフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体のことを、シス形態を有すると言う。本明細書に記載されるように、シス形態を有するこれらの改変Ｆｃポリペプチド二量体を、網状赤血球に対するそれらの作用について試験した。これらの実験によって、改変Ｆｃポリペプチド二量体を形成する２個のポリペプチドの一方のみに、ＴｆＲ結合部位及びＴｆＲに結合した時のＦｃγＲの結合を低減する変異の両方を導入することにより、ＴｆＲへの結合時のエフェクター機能を低減し、それにより網状赤血球を大きく減少させることなくＴｆＲへの結合を生じさせることが可能であることが示された。
【００７８】
本明細書に詳細に記載されるように、ＦａｂがＴｆＲではなくその標的に結合する場合にエフェクター機能（例えばＡＤＣＣ及びＣＤＣ）が維持され得るかどうかを調べるために、異なる形態を有する改変Ｆｃポリペプチド二量体を治療標的（例えばＣＤ２０）に対してターゲティングされたＦａｂに融合した。以下に詳細に記載されるように、（ａ）例えばＴｆＲに結合した時にＦｃγＲの結合を低減するような改変と、（ｂ）改変Ｆｃポリペプチド二量体においてＴｆＲへの結合を生じるような改変との特定の構成は、Ｆｃポリペプチド二量体がＦａｂに融合された場合に、エフェクター機能（例えばＡＤＣＣまたＣＤＣ）を依然維持しているが網状赤血球は減少させないようなＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体を生じることができる。このアプローチは、エフェクター機能を維持しながら、ＴｆＲが介在するＢＢＢを通過する輸送の使用を可能とする。
【００７９】
したがって、本開示は、ＴｆＲに結合し、ＴｆＲに結合する場合のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）は低減されているが、Ｆｃポリペプチド二量体が治療用Ｆａｂと融合され、Ｆａｂの標的抗原と結合する場合には依然としてエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）を維持しているような改変Ｆｃポリペプチド二量体にその一部において関連する。
【００８０】
ＩＩ．定義
本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、内容によってそうでない旨が明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド」と言った場合、２つ以上のそのような分子を含み得る、といった具合である。
【００８１】
本明細書で使用するところの「約」及び「およそ」なる用語は、数値または範囲において特定される量を修飾して用いられる場合、その数値、及び例えば±２０％、±１０％、または±５％といった、当業者には周知のその値からの妥当な偏差が、記載される値の想定される意味の範囲内にあることを示す。
【００８２】
本明細書で使用するところの「Ｆｃポリペプチド」なる用語は、構造ドメインとしてＩｇフォールドを特徴とする、天然に存在する免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドのＣ末端領域のことを指す。Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域配列を含み、ヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。一般に、Ｆｃポリペプチドは可変領域を含まない。
【００８３】
「改変Ｆｃポリペプチド」とは、野生型の免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較して少なくとも１つの変異、例えば置換、欠失、または挿入を有するが、天然のＦｃポリペプチドの全体のＩｇフォールドまたは構造を保持しているＦｃポリペプチドのことを指す。
【００８４】
本明細書で使用するところの「Ｆｃポリペプチド二量体」とは、２個のＦｃポリペプチドからなる二量体を指す。いくつかの実施形態ではＦｃポリペプチド二量体は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）に結合することができる。Ｆｃポリペプチド二量体において、２個のＦｃポリペプチドは２個のＣＨ３抗体の定常ドメイン間の相互作用によって二量体化する。いくつかの実施形態では、２個のＦｃポリペプチドは、２個の二量体化するＦｃドメイン単量体のヒンジ領域間に形成される１つ以上のジスルフィド結合を介しても二量体化することができる。Ｆｃポリペプチド二量体は、野生型Ｆｃポリペプチド二量体または改変Ｆｃポリペプチド二量体であってよい。野生型Ｆｃポリペプチド二量体は、２個の野生型Ｆｃポリペプチドの二量体化によって形成される。Ｆｃポリペプチド二量体はヘテロ二量体であってもホモ二量体であってもよい。
【００８５】
本明細書で使用するところの「改変Ｆｃポリペプチド二量体」なる用語は、少なくとも１つの改変Ｆｃポリペプチドを含むＦｃポリペプチド二量体を指す。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、２個の改変Ｆｃポリペプチドを含む。改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ホモ二量体（すなわち、２個の同じ改変Ｆｃポリペプチドを含む）またはヘテロ二量体（すなわち、２個のＦｃポリペプチドの少なくとも一方が改変Ｆｃポリペプチドであるような２個の異なるＦｃポリペプチドを含む）であってよい。
【００８６】
本明細書で使用するところの「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」とは、トランスフェリン受容体タンパク質１のことを指す。ヒトトランスフェリン受容体１のポリペプチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３に記載されている。他の種由来のトランスフェリン受容体タンパク質１の配列も知られている（例えば、チンパンジー（アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１）、アカゲザル（ＮＰ＿００１２４４２３２．１）、イヌ（ＮＰ＿００１００３１１１．１）、ウシ（ＮＰ＿００１１９３５０６．１）、マウス（ＮＰ＿０３５７６８．１）、ラット（ＮＰ＿０７３２０３．１）、及びニワトリ（ＮＰ＿９９０５８７．１））。「トランスフェリン受容体」なる用語には、トランスフェリン受容体タンパク質１の染色体座の遺伝子によってコードされる例示的な参照配列（例えばヒト配列）の対立遺伝子変異体も包含される。完全長のＴｆＲタンパク質は、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外ドメインを含んでいる。細胞外ドメインは、プロテアーゼ様ドメイン、螺旋状ドメイン、及びアピカルドメインの３つのドメインによって特徴付けられる。ヒトトランスフェリン受容体１のアピカルドメイン配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に記載されている。
【００８７】
本明細書で使用するところの「Ｆｃγ受容体」または「ＦｃγＲ」なる用語は、受容体が認識した抗体のタイプに基づいて分類される１つのタイプのＦｃ受容体を指す。ＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のいくつかのメンバーが含まれ、これらは異なる分子構造のために異なる抗体親和性を有している。ＦｃγＲは、ＩｇＧクラスの抗体のＦｃ部分に結合し、オプソニン化された微生物の食作用を誘導するうえで極めて重要である。ＦｃγＲは、免疫系の細胞の細胞表面にみられる。ＦｃγＲは、免疫系のエフェクター機能を誘発する役割を果たし、抗体のＦｃ部分が受容体に結合することで活性化される。ＦｃγＲは、例えば、感染細胞または侵入病原体に結合した抗体に結合する、食細胞または細胞傷害性細胞を刺激して抗体介在型食作用またはＡＤＣＣにより微生物または感染細胞を破壊するといった、免疫機能に介在する。
【００８８】
本明細書で使用するところの「ＦｃγＲの結合を低減する」なる用語は、改変ＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインに変異を有し、該変異が、ＦｃγＲに対する該改変Ｆｃポリペプチドの親和性を、ＦｃγＲの結合を低減する変異を有していないＦｃポリペプチド（例えば、野生型Ｆｃポリペプチド二量体）の親和性と比較して０．０１％〜９０％（例えば、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％）低下させる、改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体を指す。ＦｃγＲの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム）を用いて測定することができる。あるいは、ＦｃγＲの結合は、例えば、本明細書に記載されるもののようなＡＤＣＣアッセイ（例えば、細胞傷害性のインビボまたはインビトロアッセイ）などの機能的アッセイを用いて測定することもできる。ＦｃγＲの結合の低減は、改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体がＴｆＲに結合した時に測定することができる。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲに結合した場合のＦｃγＲの結合が低減するが、ＴｆＲに結合していない場合には低減は限定的である（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、３％、２％、または１％未満の低減）かまたは低減されない。
【００８９】
本明細書に更に記載されるように、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲ結合部位及びＴｆＲに結合した時にＦｃγＲの結合を低減する変異の両方を有する第１のＦｃポリペプチドと、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減する改変も有さない第２のＦｃポリペプチドと、を含むことができる。したがって、ＴｆＲとの結合の際、得られた第１及び第２のＦｃポリペプチドを有する非対称的なＦｃポリペプチド二量体は、全体として低下したＦｃγＲに対する親和性を有することができる。これに対して、ＴｆＲに結合しない場合には、ＦｃγＲの結合の低減は限定的（例えば、上記のように）であるか、または低減されない。
【００９０】
「ＦｃＲｎ」なる用語は、新生児Ｆｃ受容体のことを指す。ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎとの結合によって、Ｆｃポリペプチドのクリアランスは低下し、血清中半減期が長くなる。ヒトＦｃＲｎタンパク質は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質に似た約５０ｋＤａのサイズのタンパク質と、約１５ｋＤａのサイズのβ２マイクログロブリンとからなるヘテロ二量体である。
【００９１】
本明細書で使用するところの「ＦｃＲｎ結合部位」とは、ＦｃＲｎに結合するＦｃポリペプチドの領域のことを指す。ヒトＩｇＧでは、ＦｃＲｎ結合部位は、ＥＵ番号付けスキームを用いて番号付けした場合に、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、及びＹ４３６を含む。これらの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２１〜２６位、１９８位、及び２０３〜２０６位に相当する。
【００９２】
本明細書で使用するところの「天然ＦｃＲｎ結合部位」とは、ＦｃＲｎと結合し、ＦｃＲｎに結合する天然に存在するＦｃポリペプチドの領域と同じアミノ酸配列を有するＦｃポリペプチドの領域のことを指す。
【００９３】
本明細書で使用するところの「インビボで網状赤血球を実質的に減少させない」なる用語は、本明細書に記載されるエフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体、またはエフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体を含む本明細書に記載されるＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質によって引き起こされる網状赤血球の減少（例えば、骨髄網状赤血球または循環網状赤血球の減少）が、コントロール、例えば、完全なエフェクター機能を有し、及び／またはＦｃγＲの結合を低減する変異を含まない対応するＴｆＲ結合Ｆｃ二量体、または完全なエフェクター機能を有し、及び／またはＦｃγＲの結合を低減する変異を含まない対応するＴｆＲ結合Ｆｃ二量体を含む抗体によって引き起こされる網状赤血球の減少（例えば、骨髄網状赤血球または循環網状赤血球の減少）よりも少ない（例えば、その減少の８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、３％、２％、または１％よりも少ない）ことを意味する。
【００９４】
「インビボで網状赤血球を実質的に減少させない」なる用語はまた、本明細書に記載されるエフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体、またはエフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体を含む本明細書に記載されるＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質を投与した後に残存する網状赤血球（例えば、骨髄または循環中に残存する網状赤血球）の量または割合（％）が、コントロール（例えば、完全なエフェクター機能を有し、及び／またはＦｃγＲの結合を低減する変異を含まない対応するＴｆＲ結合Ｆｃ二量体、または完全なエフェクター機能を有し、及び／またはＦｃγＲの結合を低減する変異を含まない対応するＴｆＲ結合Ｆｃ二量体を含む抗体によって引き起こされる網状赤血球）を投与した後に残存する網状赤血球（例えば、骨髄または循環中に残存する網状赤血球）の量または割合（％）よりも多い（例えば、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％多い）ことを意味する。
【００９５】
網状赤血球の減少（例えば、骨髄または循環中の網状赤血球の減少）の量もしくは割合（％）、または残存する網状赤血球（例えば、骨髄または循環中に残存する網状赤血球）の量もしくは割合（％）は、マウスＴｆＲをヒトアピカルドメイン／マウスキメラＴｆＲタンパク質で置換するように操作されたヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウス（例えば、ヒトＴｆＲアピカルドメインノックインマウス (「ｈＴｆＲアピカルノックインマウス」）において、またはカニクイザルなどの非ヒト霊長類において、測定することができる。測定は、改変Ｆｃ二量体またはコントロールを、（例えば、ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩマウスに）例えば２５〜５０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与することにより行うことができ、循環網状赤血球は、本明細書に記載されるようなＡｄｖｉａ  １２０  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して細胞化学反応により投与２４時間後に測定することができる。骨髄網状赤血球は、ＦＡＣＳ分取を用いて本明細書に記載されるようなＴｅｒ１１９＋、ｈＣＤ７１高の集団、及びＦＳＣ低集団を決定することにより測定することができる。
【００９６】
本明細書で使用するところの「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」なる用語は、免疫グロブリンの定常領域ドメインポリペプチドのことを指す。ＩｇＧ抗体との関連において、ＣＨ３ドメインポリペプチドとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に約３４１位〜約４４７位のアミノ酸のセグメントのことを指し、ＣＨ２ドメインポリペプチドとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に約２３１位〜約３４０位のアミノ酸のセグメントのことを指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）番号付けスキームによって番号付けすることもでき、その場合、ＩＭＧＴ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃｈａｒｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ（ＩＭＧＴウェブサイト）に従えば、ＣＨ２ドメインの番号付けは１〜１１０であり、ＣＨ３ドメインの番号付けは１〜１０７である。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。ＩｇＧ抗体との関連において、Ｆｃ領域とは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に、約２３１位〜約４４７位までのアミノ酸のセグメントのことを指す。本明細書で使用するところの「Ｆｃ領域」なる用語は、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部も含み得る。例示的なヒンジ領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２に記載されている。
【００９７】
「可変領域」なる用語は、生殖細胞系列の可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、または連結（Ｊ）遺伝子から誘導され（定常（Ｃμ及びＣδ）遺伝子セグメントからは誘導されない）、抗体に抗原と結合するためのその特異性を与える抗体重鎖または軽鎖内のドメインのことを指す。一般的に抗体可変領域は、３個の超可変「相補性決定領域」を間に挟んだ４個の保存された「フレームワーク」領域を含む。
【００９８】
ＣＨ３及びＣＨ２ドメインに関して「野生型」、「天然」、及び「天然に存在する」なる用語は、本明細書では、天然に存在する配列を有するドメインのことを指して用いられる。
【００９９】
本明細書で使用するところの突然変異体ポリペプチドまたは突然変異体ポリヌクレオチドに関して「突然変異体」なる用語は、「変異体」と互換的に用いられる。所定の野生型ＣＨ３またはＣＨ２ドメイン参照配列に関して、変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体を含むことができる。「天然に存在しない」ＣＨ３またはＣＨ２ドメインとは、自然界で細胞内に存在せず、天然ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの遺伝子改変（例えば、遺伝子操作技術または突然変異誘発法を用いた）によって生成される変異体または突然変異体ドメインのことを指す。「変異体」は、野生型に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むあらゆるドメインを含む。突然変異は、置換、挿入、及び欠失を含み得る。
【０１００】
「アミノ酸」なる用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体のことを指す。
【０１０１】
天然に存在するアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされるもの、及び、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンなどの後で修飾されたアミノ酸である。「アミノ酸類似体」とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど）のことを指す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物のことを指す。
【０１０２】
天然に存在するα−アミノ酸としては、これらに限定されるものではないが、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。天然に存在するα−アミノ酸の立体異性体としては、これらに限定されるものではないが、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｄ−システイン（Ｄ−Ｃｙｓ）、Ｄ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−ヒスチジン（Ｄ−Ｈｉｓ）、Ｄ−イソロイシン（Ｄ−Ｉｌｅ）、Ｄ−アルギニン（Ｄ−Ａｒｇ）、Ｄ−リシン（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ｄ−ロイシン（Ｄ−Ｌｅｕ）、Ｄ−メチオニン（Ｄ−Ｍｅｔ）、Ｄ−アスパラギン（Ｄ−Ａｓｎ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−Ｐｒｏ）、Ｄ−グルタミン（Ｄ−Ｇｌｎ）、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）、Ｄ−スレオニン（Ｄ−Ｔｈｒ）、Ｄ−バリン（Ｄ−Ｖａｌ）、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）、Ｄ−チロシン（Ｄ−Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０３】
本明細書では、アミノ酸は、それらの一般的に知られる３文字記号によるか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字記号で呼称される。
【０１０４】
「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、本明細書では一本鎖のアミノ酸残基のポリマーを呼称するうえで互換的に使用される。かかる用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣体であるようなアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、全体がＬ−アミノ酸を含んでもよく、全体がＤ−アミノ酸を含んでもよく、またはＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含んでもよい。
【０１０５】
本明細書で使用するところのタンパク質とは、ポリペプチド、または一本鎖ポリペプチドの二量体（すなわち２個）もしくは多量体（すなわち３個以上）のことを指す。タンパク質の一本鎖ポリペプチド同士は、例えばジスルフィド結合のような共有結合、または非共有結合性相互作用によって結合することができる。
【０１０６】
「保存的置換」、「保存的変異」、または「保存的に改変された変異体」なる用語は、あるアミノ酸の、類似の特性を有するものとして分類され得る別のアミノ酸による置換を生じる変化のことを指す。このようにして定義される保存的アミノ酸のグループのカテゴリーの例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リシンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）、及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含む「荷電／極性基」；Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）、及び（ヒスチジンまたはＨ）を含む「芳香族基」；ならびに、Ｇｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（スレオニンまたはＴ）、及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含む「脂肪族基」を挙げることができる。各グループ内にサブグループを特定することもできる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓを含む「正に荷電したサブグループ」、Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む「負に荷電したサブグループ」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎを含む「極性サブグループ」を含むサブグループに更に分割することができる。別の例では、芳香族または環状基を、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐを含む「窒素環サブグループ」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒを含む「フェニルサブグループ」を含むサブグループに更に分割することができる。更に別の例では、脂肪族基を、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、及びＡｌａを含む「脂肪族非極性サブグループ」、ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓを含む「脂肪族弱極性サブグループ」などのサブグループに更に分割することができる。保存的変異のカテゴリーの例としては、上記のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、これらに限定されるものではないが、正電荷を維持できるようにＬｙｓをＡｒｇに、またはその逆；負電荷を維持できるようにＧｌｕをＡｓｐに、またはその逆；遊離−ＯＨを維持できるようにＳｅｒをＴｈｒに、またはその逆；遊離−ＮＨ２を維持できるようにＧｌｎをＡｓｎに、またはその逆が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば活性部位において疎水性アミノ酸を天然に存在する疎水性アミノ酸に置換することで疎水性が保たれる。
【０１０７】
２個以上のポリペプチド配列との関連で「同一」または「同一性」なる用語は、配列比較アルゴリズムを用いて、またはマニュアルアラインメント及び目視による検査により測定した場合に比較ウインドウ、または指定された領域にわたって最大の一致となるように比較及びアラインした場合に特定の領域にわたって同じであるか、または例えば、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％もしくはそれ以上一致しているアミノ酸残基の特定の割合（％）を有する２個以上の配列またはサブ配列のことを指す。
【０１０８】
ポリペプチドの配列比較では、一般的に１つのアミノ酸配列が、候補配列を比較する参照配列の役割を果たす。例えば、視覚的アラインメントまたは既知のアルゴリズムを用いた公開されているソフトウェアを使用するなど、当業者に利用可能な様々な方法を用いてアラインメントを行って最大のアラインメントを得ることができる。かかるプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。最大のアラインメントを得るためにアラインメントで用いられるパラメータは、当業者によって決めることができる。本出願の目的におけるポリペプチド配列の配列比較では、デフォルトのパラメータを用いて２個のタンパク質配列をアラインするためのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの標準タンパク質ＢＬＡＳＴを用いる。
【０１０９】
あるポリペプチド配列中の所定のアミノ酸残基を特定することとの関連で使用される場合、「〜に対応する」、「〜を基準として決められる」、または「〜を基準として番号付けされる」なる用語は、所定のアミノ酸配列を特定の参照配列と最大限アラインして比較した場合にその参照配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、あるポリペプチド中のアミノ酸残基は、その残基が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と最適にアラインされた場合にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中のそのアミノ酸とアラインする際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の領域中のアミノ酸に「対応する」。参照配列とアラインされるポリペプチドは、参照配列と同じ長さである必要はない。
【０１１０】
本明細書に記載される改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドについて言う場合、標的、例えばＴｆＲまたはＦｃγＲに「特異的に結合する」または「選択的に結合する」なる用語は、そのポリペプチドが、構造的に異なる標的と結合するよりも強いアフィニティー、より強いアビディティー、及び／またはより長い時間で標的と結合する結合反応のことを指す。典型的な実施形態では、ポリペプチドは、同じ親和性アッセイ条件下でアッセイした場合に無関係の標的と比較して特定の標的、例えばＴｆＲまたはＦｃγＲに対して少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、またはそれよりも高い親和性を有する。本明細書で使用するところの特定の標的（例えば、ＴｆＲまたはＦｃγＲ）「〜に対する特異的結合」、「〜に特異的に結合する」、または「〜に対して特異的である」なる用語は、例えば、結合する標的に対する平衡解離定数ＫＤが例えば、１０−４Ｍ以下、例えば、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍである分子によって示されうる。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ３ドメインポリペプチドは、種間で保存されている（例えば、種間で構造的に保存されている）、例えば、非ヒト霊長類とヒトとの間で保存されている（例えば、非ヒト霊長類とヒトとの間で構造的に保存されている）ＴｆＲのエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトＴｆＲだけに結合することができる。
【０１１１】
本明細書で使用するところの「結合親和性」とは、２個の分子間、例えばポリペプチドの１個の結合部位とポリペプチドが結合する標的、例えばＴｆＲとの間の非共有結合相互作用の強さのことを指す。したがって、例えば、この用語は、特に示されないかまたは文脈から明らかでない限り、ポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用のことを指す場合がある。結合親和性は、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度定数（ｋａ、時間−１Ｍ−１）で割ったもののことを指す平衡解離定数（ＫＤ）を測定することにより定量化することができる。ＫＤは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などのカイネティック排除アッセイ；及びバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを使用）を使用して、複合体形成及び解離の速度論を測定することによって求めることができる。本明細書で使用するところの「結合親和性」には、ポリペプチドとその標的と間の１：１の相互作用を反映したもののように正式な結合親和性だけでなく、強い結合を反映し得るＫＤが計算された見かけ上の親和性も含まれる。
【０１１２】
ＩＩＩ．ＴＦＲ結合ＦＣポリペプチド
このセクションでは、トランスフェリン受容体に結合し、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送されることが可能な改変Ｆｃポリペプチドの作製について述べる。
【０１１３】
ＣＨ３  ＴｆＲ結合ポリペプチド
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧのＣＨ３ドメインのような改変されたヒトＩｇのＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、いずれのＩｇＧのサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものであってもよい。ＩｇＧ抗体との関連において、ＣＨ３ドメインとは、ＥＵ番号付けスキームにしたがって番号付けした場合に、約３４１位〜約４４７位までのアミノ酸のセグメントのことを指す。ＴｆＲ結合のための対応するアミノ酸位置のセットを特定する目的でのＣＨ３ドメイン内の位置は、特に指定されない限り、ＥＵ番号付けスキーム、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１１〜２１７を基準として決められる。置換もまた、ＥＵ番号付けスキームまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決められ、すなわち、あるアミノ酸は、ＥＵ番号付けスキームまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の対応する位置のアミノ酸に対して置換であるとみなされる。
【０１１４】
上記に述べたように、改変することができるＣＨ３ドメインの残基のセットは、本明細書ではＥＵ番号付けスキームまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けされる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインなどの任意のＣＨ３ドメインが、ＥＵ番号付けスキームまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の記載される位置の残基に対応する１つ以上の残基のセットにおいて改変（例えばアミノ酸置換）を有することができる。ＥＵ番号付けスキームまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の任意の特定の位置に対応するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の配列のそれぞれの位置は容易に決定することができる。
【０１１５】
当業者には、例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどの他の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ３ドメインを、本明細書に記載されるアミノ酸位置に対応するこれらのドメイン内のアミノ酸を特定することにより同様に改変することができる点は理解される。改変は、例えば、非ヒト霊長類、サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ニワトリなどの他の種に由来する免疫グロブリンからの対応するドメインに行うこともできる。
【０１１６】
一実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインのポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインと、完全長のヒトＴｆＲ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）の２０８位を含むエピトープにおいて結合するが、この位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に記載されるヒトＴｆＲのアピカルドメイン配列の１１位に対応している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１は、ヒトＴｆＲ−１の単一タンパク質配列Ｐ０２７８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）のアミノ酸１９８〜３７８に対応している。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインと、完全長のヒトＴｆＲ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）の１５８、１８８、１９９、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、及び／または２９４位を含むエピトープにおいて結合する。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、受容体に対するトランスフェリンの結合をブロックまたは他の形で阻害することなくＴｆＲに結合しうる。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、約５０％未満（例えば、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、約２０％未満（例えば、約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満）阻害される。このような結合特異性を示す例示的なＣＨ３ドメインポリペプチドとしては、ＥＵ番号付けスキームに従って３８０、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１５、４１６、及び４２１位にアミノ酸置換を有するポリペプチドが挙げられる。
【０１１７】
ＣＨ３の、ＴｆＲと結合するセット：３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＥＵ番号付けスキームに従って３８０位、３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１５位、４１６位、及び４２１位を含むアミノ酸位置のセット（セットＣＨ３Ｃ）に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個の置換を含む。これらの位置に導入することができる例示的な置換を表３に示す。更なる置換を表４に示す。いくつかの実施形態では、３８８及び／または４２１位のアミノ酸は芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒ）である。いくつかの実施形態では、３８８位のアミノ酸はＴｒｐである。いくつかの実施形態では、３８８位のアミノ酸はＧｌｙである。いくつかの実施形態では、４２１位の芳香族アミノ酸はＴｒｐまたはＰｈｅである。
【０１１８】
特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個の位置を含む：３８０位のＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＧｌｎ、３８４位のＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＶａｌ、３８６位のＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＰｈｅ、３８７位のＶａｌ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、または酸性アミノ酸、３８８位のＴｒｐ、３８９位の脂肪族アミノ酸、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｓｎ、３９０位のＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはＴｈｒ、４１３位の酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓ、４１５位のＧｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、またはＡｒｇ、４１６位のＴｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、または酸性アミノ酸、及び／あるいは、４２１位の芳香族アミノ酸、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＥＵ番号付けスキームに従って以下のような置換を有する少なくとも１つの位置を含む。すなわち、３８４位にＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ；３８６位にＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ；３８７位にＶａｌ、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸；３８８位に芳香族アミノ酸、例えばＴｒｐまたはＧｌｙ（例えばＴｒｐ）；３８９位にＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ；４１３位に酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ；４１６位にＴｈｒまたは酸性アミノ酸；または４２１位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＰｈｅ。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、上記のセットの中の位置の１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換を、例えば、同じ電荷グループ、疎水性グループ、側鎖環構造グループ（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズグループ、及び／あるいは極性または非極性グループの中の、アミノ酸を含む。したがって、例えば、Ｉｌｅが３８４位、３８６位、及び／または４１３位に存在してよい。いくつかの実施形態では、３８７位、４１３位、及び４１６位のうちの１つ、２つ、またはそれぞれにおける酸性アミノ酸はＧｌｕである。他の実施形態では、３８７位、４１３位、及び４１６位のうちの１つ、２つ、またはそれぞれにおける酸性アミノ酸はＡｓｐである。いくつかの実施形態では、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、４１３、４１６、及び４２１位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つすべてがこのパラグラフで指定されるアミノ酸置換を有する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、セットＣＨ３Ｃに改変を有するＣＨ３ドメインポリペプチドは、３９０位に天然のＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３９０位にＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３８０、３９１、３９２、及び４１５を含む位置に１個、２個、３個、または４個の置換を更に含む。いくつかの実施形態では、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎが存在してよい。いくつかの実施形態では、３９１位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅが存在してよい。いくつかの実施形態では、３９２位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓが存在してよい。いくつかの実施形態では、４１５位にＧｌｕが存在してよい。
【０１２１】
特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは以下から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の位置を含む：３８０位にＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ；３８４位にＴｙｒまたはＰｈｅ；３８６位にＴｈｒ；３８７位にＧｌｕ；３８８位にＴｒｐ；３８９位にＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ；３９０位にＳｅｒまたはＡｓｎ；４１３位にＴｈｒまたはＳｅｒ；４１５位にＧｌｕまたはＳｅｒ；４１６位にＧｌｕ；及び／あるいは４２１位にＰｈｅ。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは以下の１１個の位置のすべてを含む：３８０位にＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ；３８４位にＴｙｒまたはＰｈｅ；３８６位にＴｈｒ；３８７位にＧｌｕ；３８８位にＴｒｐ；３８９位にＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ；３９０位にＳｅｒまたはＡｓｎ；４１３位にＴｈｒまたはＳｅｒ；４１５位にＧｌｕまたはＳｅｒ；４１６位にＧｌｕ；及び／あるいは４２１位にＰｈｅ。
【０１２２】
特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３８４位にＬｅｕまたはＭｅｔを、３８６位にＬｅｕ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏを、３８７位にＶａｌを、３８８位にＴｒｐを、３８９位にＶａｌまたはＡｌａを、４１３位にＰｒｏを、４１６位にＴｈｒを、及び／あるいは４２１位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３９１位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎを、及び／あるいは３９２位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを更に含む。いくつかの実施形態では、３８０位にＴｒｐが存在し、及び／または３９２位にＧｌｎが存在する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３８０位にＴｒｐを有さない。
【０１２３】
他の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３８４位にＴｙｒを、３８６位にＴｈｒを、３８７位にＧｌｕまたはＶａｌを、３８８位にＴｒｐを、３８９位にＳｅｒを、４１３位にＳｅｒまたはＴｈｒを、４１６位にＧｌｕを、及び／あるいは４２１位にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３９０位に天然のＡｓｎを含む。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎを、及び／あるいは４１５位にＧｌｕを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、３８０位にＴｒｐを、及び／または４１５位にＧｌｕを更に含む。
【０１２４】
更なる実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは以下から選択される１つ、２つ、または３つの位置を更に含む：４１４位がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏ、４２４位がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ、及び４２６位がＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙ。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、以下の置換のうちの１つ以上を含む：３８０位にＴｒｐ、３８６位にＴｈｒ、３８８位にＴｒｐ、３８９位にＶａｌ、４１３位にＳｅｒまたはＴｈｒ、４１５位にＧｌｕ、及び／あるいは４２１位にＰｈｅ。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つのアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、かかる改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つのアミノ酸１５４〜１６０及び／または１８３〜１９１を含む。いくつかの実施形態では、かかる改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つのアミノ酸１５０〜１６０及び／または１８３〜１９１を含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つのアミノ酸１５０〜１６０及び／または１８３〜１９６を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、パーセント同一性がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１５４位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１８３位、１８６位、及び１９１位のセット（ＥＵ番号付けスキームに従って３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位、及び４２１位）を含まないことを条件として、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１１〜２１７と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸１５４〜１６０及び／またアミノ酸１８３〜１９１を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの１５０位、１５４位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１８３位、１８４位、１８５位、１８６位、１９１位、１９４位、及び１９６位に対応する位置（ＥＵ番号付けスキームに従って３８０位、３８４位、３８６位、３８４位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４２１位、４２４位、及び４２６位）の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個が欠失も置換もされていないという条件で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、また、以下の位置のうちの少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個を含む：３８０位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ；３８４位にＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ；３８６位にＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ；３８７位にＶａｌ、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸；３８８位に芳香族アミノ酸、例えばＴｒｐ；３８９位にＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ；３９０位にＳｅｒまたはＡｓｎ；３９１位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅ；３９２位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓ；４１３位に酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ；４１４位にＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；４１５位にＧｌｕまたはＳｅｒ；４１６位にＴｈｒまたは酸性アミノ酸；４２１位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅ；４２４位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓ；及び、４２６位にＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙ。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８〜５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８〜５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、配列中の１個または２個のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８〜５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、配列中の３個のアミノ酸が置換されている。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、配列中の１個または２個のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、配列中の３個または４個のアミノ酸が置換されている。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１〜１６７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１〜１６７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、配列中の１個または２個のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１〜１６７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、配列中の３個のアミノ酸が置換されている。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、６０、及び１６８〜１７３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、６０、及び１６８〜１７３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、配列中の１個または２個のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、６０、及び１６８〜１７３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、配列中の３個または４個のアミノ酸が置換されている。
【０１３４】
更なる実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つのアミノ酸１５７〜１９４、アミノ酸１５３〜１９４、またはアミノ酸１５３〜１９９を含む。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つのアミノ酸１５７〜１９４と、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つのアミノ酸１５３〜１９４と、またはアミノ酸１５３〜１９９と少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つを含む。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つと少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。
【０１３６】
ＦｃＲｎ結合部位
ＢＢＢを通過して輸送されることが可能な本明細書に記載されるポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合部位を更に有してもよい。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、改変Ｆｃポリペプチドまたはそのフラグメント内にある。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、天然のＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、天然のＦｃＲｎ結合部位のアミノ酸配列に対するアミノ酸の変化を含まない。いくつかの実施形態では、天然のＦｃＲｎ結合部位は、ＩｇＧ結合部位、例えばヒトＩｇＧ結合部位である。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ＦｃＲｎとの結合を変化させる改変を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、例えば置換などの変異を有する１つ以上のアミノ酸残基を有し、かかる変異（複数可）は血清中半減期を増大させるか、または血清中半減期を実質的に減少させない（すなわち、同じ条件下でアッセイした場合に変異位置に野生型残基を有する対応するタンパク質と比較して血清中半減期を２５％以下だけ減少させる）。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、２１〜２６位、１９８位、及び２０３〜２０６位で置換された１つ以上のアミノ酸残基を有し、ただし、各位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決められる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、改変ポリペプチドの血清中半減期を増大させる、天然ヒトＩｇＧ配列に対する１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異、例えば置換を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決めた場合の１４〜２７位、４９〜５４位、７７〜８７位、１５３〜１６０位、及び１９８〜２０５位のうちの１つ以上に導入する（これらの位置は、ＥＵ番号付けを用いた場合の２４４〜２５７位、２７９〜２８４位、３０７〜３１７位、３８３〜３９０位、及び４２８〜４３５位に相当する）。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決めた場合の２１位、２２位、２４位、２５位、２６位、７７位、７８位、７９位、８１位、８２位、８４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５９位、１９８位、２０３位、２０４位、または２０６位に１つ以上の変異を導入する（これらの位置は、ＥＵ番号付けを用いた場合の２５１位、２５２位、２５４位、２５５位、２５６位、３０７位、３０８位、３０９位、３１１位、３１２位、３１４位、３８５位、３８６位、３８７位、３８９位、４２８位、４３３位、４３４位、または４３６位に相当する）。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決めた場合の２２位、２４位、及び２５位のうちの１つ、２つ、または３つに変異を導入する（これらの位置は、ＥＵ番号付けを用いた場合の２５２位、２５４位、及び２５６位に相当する）。いくつかの実施形態では、変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｍ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅを更に含む。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決めた場合の１９８位及び２０４位の１つまたは２つに変異を導入する（これらの位置は、ＥＵ番号付けを用いた場合の４２８位及び４３４位に相当する）。いくつかの実施形態では、変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ１９８Ｌ及びＮ２０４Ｓである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドは、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わずに変異Ｎ２０４Ｓを更に含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従った場合のＴ３０７、Ｅ３８０、及びＮ４３４位の１つ、２つ、または３つすべてに置換を含む（これらの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ７７、Ｅ１５０、及びＮ２０４に相当する）。いくつかの実施形態では、変異は、Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＴ７７Ｑ及びＮ２０４Ａ）である。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＴ７７Ａ、Ｅ１５０Ａ、及びＮ２０４Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｔ２５０位及びＭ４２８位に置換を含む（これらの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ２０及びＭ１９８に相当する）。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、変異Ｔ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８Ｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：���のＴ２０Ｑ及びＭ１９８Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｍ４２８位及びＮ４３４位に置換を含む（これらの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ１９８及びＮ２０４に相当する）。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む（これらの位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ１９８Ｌ及びＮ２０４Ｓに相当する）。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａの置換を含む（これらの置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＮ２０４ＳまたはＮ２０４Ａに相当する）。
【０１４０】
ＩＶ．エフェクター機能またはＦｃγＲの結合を低減する変異
ＴｆＲに結合し、ＢＢＢを通過する輸送を開始する本明細書で提供されるＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる更なる変異を含むこともできる。本明細書に記載されるように、ＴｆＲ結合部位と、ＦｃγＲの結合を低減する変異の両方をＦｃポリペプチド二量体の同じＦｃポリペプチドに導入することにより、ＴｆＲに結合した時のエフェクター機能を低下させ、網状赤血球を大きく減少させることなくＴｆＲとの結合をもたらす一方で、Ｆｃポリペプチド二量体が治療用Ｆａｂに融合されてＦａｂの標的抗原に結合する場合にはエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）を依然維持することが可能であった。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃポリペプチドはエフェクター機能（すなわち、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞で発現されたＦｃ受容体に結合した時に特定の生物学的機能を誘導する能力）を有する。エフェクター細胞としては、これらに限定されるものではないが、単核球、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び細胞傷害性Ｔ細胞が挙げられる。
【０１４２】
エフェクター機能の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｃ１ｑ結合及びＣＤＣ、Ｆｃ受容体との結合、ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の発現低下、及びＢ細胞活性化が挙げられる。エフェクター機能は抗体クラスによって異なりうる。例えば、天然のヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞上に存在する適当なＦｃ受容体に結合した時にＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘発することができ、天然のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫細胞上に存在する適当なＦｃ受容体に結合した時にＡＤＣＰ機能を誘発することができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＴｆＲ結合部位を有するＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低減する、すなわち、ＴｆＲと結合した時のエフェクター機能を低減するような更なる改変を有することができる。ＴｆＲと結合した時のＦｃポリペプチド二量体のエフェクター機能が低減されることは、網状赤血球も細胞表面にＴｆＲを有していることから網状赤血球の減少の低減につながるため、望ましい。本明細書で詳細に記載されるように、シス形態を有するＦｃポリペプチド二量体、すなわち、Ｆｃポリペプチド二量体の同じＦｃポリペプチド上にＴｆＲ結合部位とエフェクター機能を低下させる変異の両方を有するＦｃポリペプチド二量体は、網状赤血球を大きく減少させることなくＴｆＲへの結合を示す一方で、Ｆｃポリペプチド二量体が治療用Ｆａｂに融合され、Ｆａｂの標的抗原に結合する場合に依然としてエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）を維持する。Ｆｃポリペプチド二量体が、Ｆａｂの標的抗原に結合された治療用Ｆａｂに融合される場合にエフェクター機能を有することは、例えば、がん治療（例えば、脳腫瘍の治療）において望ましい。
【０１４４】
エフェクター機能を調節する例示的なＦｃポリペプチド変異としては、これらに限定されるものではないが、ＣＨ２ドメイン内の置換、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の４位及び５位（ＥＵ番号付けスキームに従って２３４及び２３５位）に対応する位置における置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメイン内の置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の４位及び５位にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメイン内の置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の４位及び５位にＡｌａ、ならびに９９位にＧｌｙを含む。
【０１４５】
エフェクター機能を調節する更なるＦｃポリペプチド変異としては、これらに限定されるものではないが、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９位のうちの１つ以上の置換を含む（ＥＵ番号付けスキームでは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に８、３５、３９、４０、６７、９７、及び９９位に相当する）。例示的な置換（ＥＵ番号付けスキームで番号付けした場合）には以下のものが含まれる。すなわち、３２９位は、プロリンがグリシンもしくはアルギニンまたはＦｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成されるＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を壊すだけの充分な大きさを有するアミノ酸残基に置換された変異を有することができる。更なる例示的な置換としては、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３３１Ｓが挙げられる。複数の置換が存在してもよく、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａ、ならびにヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つ以上のアミノ酸置換（例えば、ＥＵ番号付けスキームにしたがって、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位の置換）を有することができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＡＤＣＣを増大または減少させる１つ以上のアミノ酸置換を有してもよく、あるいはＣ１ｑ結合及び／またはＣＤＣを変化させる変異を有してもよい。
【０１４７】
具体的な実施形態では、ＴｆＲ結合部位を有するＦｃポリペプチドを、エフェクター機能を低減する、すなわち、ＦｃγＲの結合を低減するように改変することができる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合部位を有するＦｃポリペプチドは、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付けスキーム、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の４位及び５位に対応する）を含むことができる。他の実施形態では、ＴｆＲ結合部位を有するＦｃポリペプチドは、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付けスキーム、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の４位、５位及び９９位に対応する）を含むことができる。
【０１４８】
Ｖ．エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体
特定の態様では、本開示は、ＴｆＲに結合し、ＴｆＲに結合する場合のＦｃγＲの結合が低減されるが、ＴｆＲに結合しない場合にはＦｃγＲの結合の低減が限定的であるかまたは低減されないように改変されたエフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体を提供する。これらの改変Ｆｃポリペプチド二量体を治療用Ｆａｂに融合することでＦａｂをＢＢＢを通過して輸送することができる。これらの改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲに結合した時のエフェクター機能が低減されることが示されている。改変Ｆｃポリペプチド二量体がＦａｂに融合される場合、Ｆｃポリペプチド二量体は、Ｆａｂがその標的（例えば、がん細胞上の標的）に結合した時のエフェクター機能を維持する。このように、本明細書に記載されるエフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、網状赤血球（やはり細胞表面にＴｆＲを有する）を大きく減少させることなくＦａｂをＢＢＢを通過して輸送することができ、また、Ｆａｂがその標的に結合した時に脳内の細胞外凝集体（例えば、プラーク）または特定の疾患細胞（例えば、がん細胞）に狙いを絞って破壊することができるエフェクター機能を示すことによりその治療目的を果たすことができる。
【０１４９】
本明細書に記載されるエフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体はシス形態を有するが、これは、Ｆｃポリペプチド二量体のＦｃポリペプチドの一方のみ（両方ではない）が、ＴｆＲ結合部位、及びＴｆＲに結合した時のＦｃγＲの結合を低減する改変を有するように改変されていることを意味する。Ｆｃポリペプチド二量体のもう一方のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合部位も、ＦｃγＲの結合を実質的に低減する改変も含まない。改変Ｆｃポリペプチド二量体のトランス形態は、２個のＦｃポリペプチドの一方がＴｆＲ結合部位を含み、他方のＦｃポリペプチドが例えばＴｆＲに結合した時にＦｃγＲの結合を低減する改変を含むＦｃポリペプチド二量体を指す。本明細書で示されるように、トランス形態ではなくシス形態を有する改変Ｆｃポリペプチド二量体は、血液及び骨髄中の網状赤血球を減少させることができる（例えば、図２Ａ〜２Ｄを参照）。
【０１５０】
一実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５１】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５２】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５３】
一実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５４】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５５】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５６】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５７】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５８】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１５９】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６０】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６１】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６２】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６３】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６４】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６５】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６６】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６７】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６８】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１６９】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７０】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７１】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７２】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７３】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７４】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７５】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７６】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７７】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７８】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１７９】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、アミノ酸改変Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅとを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１８０】
別の実施形態では、エフェクター機能陽性のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合するＴｆＲ結合部位と、ＥＵ番号付けスキームに従ってアミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓとを含む、第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ＥＵ番号付けスキームに従ってノブ変異Ｔ３６６Ｗと、Ｍ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないアミノ酸改変Ｎ４３４Ｓを含み、ＴｆＲ結合部位もＦｃγＲの結合を低減するいかなる改変も含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含む。
【０１８１】
ＶＩ．エフェクター機能またはＦｃγＲの結合の測定
Ｆｃポリペプチド二量体とＦｃγＲとの間の結合親和性、結合速度論、及び交差反応性を分析するための方法は当該技術分野では周知のものである。これらの方法としては、これらに限定されるものではないが、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、速度論的排除アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分取法（ＦＡＣＳ）、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））、及びウェスタンブロット分析が挙げられる。いくつかの実施形態では、結合親和性及び／または交差反応性を調べるためにＥＬＩＳＡが用いられる。ＥＬＩＳＡアッセイを行うための方法は当該技術分野では周知のものである。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるために速度論的排除アッセイが用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるためにバイオレイヤー干渉法が用いられる。
【０１８２】
ＡＤＣＣは、抗体が病原性または腫瘍原性の標的細胞の表面の抗原に結合して、例えば末梢血単核球などのエフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞）によって破壊するためにこれらを特定する免疫反応の１つのタイプである。ＦｃγＲを有するエフェクター細胞は、標的細胞に結合した抗体のＦｃ領域を認識して結合する。したがって、抗体は、標的細胞殺傷に対する特異性を与える。ＣＤＣは、古典的補体経路の開始成分であるＣ１ｑが標的に結合した抗体のＦｃ領域に結合することで開始する。ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性は、標準的なインビボまたはインビトロの細胞殺傷のアッセイで測定することができる。ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を測定するための方法は、当該技術分野で利用可能である。いくつかの実施形態では、かかる方法は、標的細胞を５１Ｃｒなどの放射性物質、またはカルセイン−ＡＭなどの蛍光色素で標識することを含み得る。標識した細胞を抗体及びエフェクター細胞とインキュベートし、ＡＤＣＣ及びＣＤＣによる標的細胞の殺傷を放射能または蛍光の放射によって検出することができる。
【０１８３】
ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を測定するための他のアッセイとしては、例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイが挙げられる。細胞膜が何らかの形で破壊または損傷されると、細胞質中の可溶性であるが安定な酵素であるＬＤＨが周辺の細胞外空間に放出される。培地中のこの酵素の存在を細胞死マーカーとして利用することができる。次いで、培地中の生細胞及び死細胞の相対量を、比色定量または蛍光定量ＬＤＨ細胞傷害性アッセイを用いて放出されたＬＤＨの量を測定することにより定量することができる。
【０１８４】
ＶＩＩ．改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含むＦｃ領域内の更なる変異
ＴｆＲに結合してＢＢＢを通過する輸送を開始するように改変された、本明細書で提供されるＦｃポリペプチドは、例えば、血清中安定性または血清中半減期を増大させるため、エフェクター機能を調節するため、グリコシル化に影響を及ぼすため、ヒトにおける免疫原性を低下させるため、及び／または、Ｆｃポリペプチドのノブ・アンド・ホール型のヘテロ二量化を可能とするための更なる変異を含んでもよい。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチド）と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【０１８６】
本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドは、例えば、グリコシル化に影響を及ぼすため、血清中半減期を増大させるため、またはＣＨ３ドメインについては、改変ＣＨ３ドメインを構成するポリペプチドのノブ・アンド・ホール型のヘテロ二量化を可能とするためなど、指定されたアミノ酸のセットの外側に導入される他の変異を有してもよい。一般的に、この方法では、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を、第２のポリペプチドの界面に対応した穴（「ホール」）を導入することで、突起が穴の中に位置してヘテロ二量体の形成を促し、ホモ二量体の形成を妨げることができる。突起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換することによって形成される。突起と同じ、または似通った大きさの相補的な穴が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）に置換することによって第２のポリペプチドの界面に形成される。このような更なる変異は、ＴｆＲに対する改変ＣＨ３ドメインの結合に負の影響を及ぼさないポリペプチド内の位置に導入される。
【０１８７】
二量体化のためのノブ・アンド・ホール型のアプローチの例示的な一実施形態では、二量体化しようとする第１のＦｃポリペプチドサブユニットの、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１３６位に対応する位置が、天然のスレオニンの代わりにトリプトファンを有し、二量体の第２のＦｃポリペプチドサブユニットが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１７７位に対応する位置に天然のチロシンの代わりにバリンを有する。Ｆｃポリペプチドの第２のサブユニットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１３６位に対応する位置の天然のスレオニンがセリンに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１３８位に対応する位置の天然のロイシンがアラニンに置換される置換を更に含んでもよい。
【０１８８】
本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドは、ヘテロ二量体化のための他の改変（例えば、自然に帯電しているＣＨ３−ＣＨ３界面内の接触残基の静電的操作、または疎水性パッチ改変など）を有するように操作することもできる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、血清中半減期を増大させるための改変を導入することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２２位に対応する位置にＴｙｒを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２４位に対応する位置にＴｈｒを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２６位に対応する位置にＧｌｕを含むＣＨ２ドメインを含む。あるいは、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合にＭ１９８Ｌ及びＮ２０４Ｓの置換を含んでもよい。あるいは、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合にＮ２０４ＳまたはＮ２０４Ａの置換を含んでもよい。
【０１９０】
更なる変異を含む例示的なＦｃポリペプチド
本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、及び／または血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）を含む更なる変異を含むことができる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列を有する改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異を有するように改変することができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列を有する改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異、及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変することができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列を有する改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するように改変することができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列を有する改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するように改変することができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列を有する改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異を有するように改変することができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列を有する改変Ｆｃポリペプチドはホール変異、及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列を有する改変Ｆｃポリペプチドはホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するように改変することができる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ、あるいは（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、６４〜１２７、及び２６８〜２７４（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６８、９４、１０７〜１０９、１１９、及び２６８〜２７０）のうちのいずれか１つの配列を有する改変Ｆｃポリペプチドはホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するように改変することができる。
【０１９９】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７の配列を有する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８または１７９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８または１７９の配列を有する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０の配列を有する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２の配列を有する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１または１８２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１または１８２の配列を有する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３または３２４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３または３２４の配列を有する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３の配列を有する。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４または１８５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４または１８５の配列を有する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６の配列を有する。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５の配列を有する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７または１８８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７または１８８の配列を有する。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６または３２７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６または３２７の配列を有する。
【０２１１】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９の配列を有する。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０または１９１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０または１９１の配列を有する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２の配列を有する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９の配列を有する。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３または１９４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３または１９４の配列を有する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０または３３１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０または３３１の配列を有する。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５の配列を有する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６または１９７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６または１９７の配列を有する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８の配列を有する。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３２の配列を有する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９または２００の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９または２００の配列を有する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３３または３３４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３３または３３４の配列を有する。
【０２２３】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１の配列を有する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２または２０３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２または２０３の配列を有する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０４の配列を有する。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３６の配列を有する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５または２０６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５または２０６の配列を有する。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３７または３３８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３７または３３８の配列を有する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７の配列を有する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８または２０９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８または２０９の配列を有する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０の配列を有する。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３９の配列を有する。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１または２１２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１または２１２の配列を有する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４０または３４１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４０または３４１の配列を有する。
【０２３５】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１３の配列を有する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１４または２１５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１４または２１５の配列を有する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１６の配列を有する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４３の配列を有する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７または２１８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７または２１８の配列を有する。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４または３４５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４または３４５の配列を有する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９の配列を有する。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２０または２２１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２０または２２１の配列を有する。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２の配列を有する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４６の配列を有する。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３または２２４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３または２２４の配列を有する。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７または３４８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７または３４８の配列を有する。
【０２４７】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５の配列を有する。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６または２２７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６または２２７の配列を有する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２８の配列を有する。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５０の配列を有する。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９または２３０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９または２３０の配列を有する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１または３５２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１または３５２の配列を有する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１の配列を有する。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２または２３３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２または２３３の配列を有する。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３４の配列を有する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を有する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５または２３６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５または２３６の配列を有する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４または３５５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４または３５５の配列を有する。
【０２５９】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７の配列を有する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８または２３９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８または２３９の配列を有する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４０の配列を有する。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５７の配列を有する。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１または２４２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１または２４２の配列を有する。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５８または３５９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５８または３５９の配列を有する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４３の配列を有する。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４４または２４５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４４または２４５の配列を有する。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４６の配列を有する。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０の配列を有する。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４７または２４８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４７または２４８の配列を有する。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６１または３６２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６１または３６２の配列を有する。
【０２７１】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５０の配列を有する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５２または２７５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５２または２７５の配列を有する。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６の配列を有する。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６４の配列を有する。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７または２７８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７または２７８の配列を有する。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６５または３６６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６５または３６６の配列を有する。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７９の配列を有する。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０または２８１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０または２８１の配列を有する。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８２の配列を有する。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６７の配列を有する。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３または２８４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３または２８４の配列を有する。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６８または３６９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６８または３６９の配列を有する。
【０２８３】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５の配列を有する。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６または２８７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６または２８７の配列を有する。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８の配列を有する。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７１の配列を有する。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９または２９０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９または２９０の配列を有する。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７２または３７３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７２または３７３の配列を有する。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１の配列を有する。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９２または２９３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９２または２９３の配列を有する。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４の配列を有する。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７４の配列を有する。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５または２９６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５または２９６の配列を有する。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７５または３７６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７５または３７６の配列を有する。
【０２９５】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７の配列を有する。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８または２９９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８または２９９の配列を有する。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００の配列を有する。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７８の配列を有する。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１または３０２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１または３０２の配列を有する。
【０３００】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７９または３８０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７９または３８０の配列を有する。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３の配列を有する。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４または３０５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４または３０５の配列を有する。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６の配列を有する。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８１の配列を有する。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０７または３０８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０７または３０８の配列を有する。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８２または３８３の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８２または３８３の配列を有する。
【０３０７】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９の配列を有する。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０または３１１の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０または３１１の配列を有する。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２の配列を有する。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８５の配列を有する。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３または３１４の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３または３１４の配列を有する。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８６または３８７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８６または３８７の配列を有する。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５の配列を有する。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６または３１７の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６または３１７の配列を有する。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８の配列を有する。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８８の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８８の配列を有する。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２２Ｙ、Ｓ２４Ｔ、及びＴ２６Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９または３２０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９または３２０の配列を有する。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３６Ｓ、Ｌ１３８Ａ、及びＹ１７７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ４Ａ、Ｌ５Ａ、及び／またはＰ９９Ｇ（例えば、Ｌ４Ａ及びＬ５Ａ））、血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ１９８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０４Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８９または３９０の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清中安定性または血清中半減期を増大させる変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８９または３９０の配列を有する。
【０３１９】
ＶＩＩＩ．ＴｆＲ結合タンパク質のフォーマット
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＴｆＲ結合ポリペプチドは、タンパク質二量体のサブユニットである。いくつかの実施形態では、二量体はヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、二量体はホモ二量体である。いくつかの実施形態では、二量体は、ＴｆＲ受容体に結合する１個のＦｃポリペプチドを含む（すなわちＴｆＲ受容体との結合について一価である）。いくつかの実施形態では、二量体は、ＴｆＲ受容体に結合する第２のポリペプチドを含む。第２のポリペプチドは二価のホモ二量体タンパク質を与えるように同じ改変Ｆｃポリペプチドを含んでもよく、または本明細書に記載される第２の改変Ｆｃポリペプチドが第２のＴｆＲ受容体結合部位を与えてもよい。
【０３２０】
本明細書に記載されるＴｆＲ体結合ポリペプチド及びポリペプチドを含む二量体または多量体タンパク質は、例えば、ポリペプチドのフォーマットに基づいた、広範囲の結合親和性を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドは、１ｐＭ〜１０μＭの範囲のＴｆＲに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、親和性は一価のフォーマットで測定することができる。他の実施形態では、親和性は、例えば、改変Ｆｃポリペプチドを含むタンパク質二量体として、二価のフォーマットで測定することができる。
【０３２１】
ＴｆＲに対する結合を分析するために結合親和性、結合速度論、及び交差反応性を分析するための方法は当該技術分野では周知のものである。これらの方法としては、これらに限定されるものではないが、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、速度論的排除アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））、及びウェスタンブロット分析が挙げられる。いくつかの実施形態では、結合親和性及び／または交差反応性を調べるためにＥＬＩＳＡが用いられる。ＥＬＩＳＡアッセイを行うための方法は当該技術分野では周知のものであり、下記実施例のセクションでも述べる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるために速度論的排除アッセイが用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるためにバイオレイヤー干渉法が用いられる。ＴｆＲ結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合もこれらのタイプのアッセイを用いて評価することができる。ＦｃＲｎ結合は、通常は酸性条件下、例えばｐＨ約５〜約６でアッセイされる。
【０３２２】
ＩＸ．ＴｆＲ結合タンパク質結合体
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに結合してＢＢＢを通過する輸送を開始する改変ポリペプチドは、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドを含み、部分的または完全なヒンジ領域を更に含む。ヒンジ領域は、いずれの免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプからのものであってもよい。例示的な免疫グロブリンのヒンジの１つとして、ＩｇＧ１のヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１のヒンジのアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２））などのＩｇＧヒンジ領域がある。更なる実施形態では、ヒンジまたは部分的なヒンジ領域を含んでもよいポリペプチドを、別の部分、例えば免疫グロブリンの可変領域と更に融合することにより、ＴｆＲ結合ポリペプチド−可変領域融合ポリペプチドが作製される。可変領域は、対象となる任意の抗原、例えば治療用の神経学的標的、または診断用の神経学的標的と結合することができる。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチド（例えば、改変Ｆｃポリペプチド）は、リンカーを介して可変領域と融合される。上記のパラグラフに示したように、ＴｆＲ結合ポリペプチド（例えば改変Ｆｃポリペプチド）は、ヒンジ領域によって可変領域と融合することができる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチド（例えば、改変Ｆｃポリペプチド）は、ペプチドリンカーによって可変領域と融合することができる。ペプチドリンカーは、可変領域とＴｆＲ結合ポリペプチドとの互いに対する回転を可能とするように構成することができ、及び／またはプロテアーゼによる消化に対して耐性を有するものである。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのアミノ酸を含む柔軟なリンカーであってよい。かかるリンカーは、周知のパラメータを用いて設計することができる。例えば、リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリピートのような繰り返し配列を有することができる。
【０３２４】
可変領域は、任意の抗体フォーマット、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖのフォーマットとすることができる。いくつかの実施形態では、抗体可変領域配列は、２個の抗体可変領域重鎖及び２個の抗体可変領域軽鎖、またはそれらのそれぞれのフラグメントを含む。
【０３２５】
ＴｆＲ結合ポリペプチド（例えば、改変Ｆｃポリペプチド）は、対象となる抗原を標的化する免疫グロブリン可変領域以外のポリペプチドと融合することもできる。いくつかの実施形態では、かかるポリペプチドは、例えば上記に述べた柔軟なリンカーのようなペプチドリンカーを用いてＴｆＲ結合ポリペプチドと融合される。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＴｆＲ結合ポリペプチドを発現している細胞を標的化するのに望ましい、例えば治療用ポリペプチドなどのポリペプチドと融合することができる。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＢＢＢを通過して輸送するための生物学的活性を有するポリペプチド、例えば、可溶性タンパク質、例えば、受容体の細胞外ドメインもしくは成長因子、サイトカイン、または酵素と融合される。
【０３２７】
尚も他の実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、タンパク質の精製に有用なペプチドまたはタンパク質、例えば、ポリヒスチジン、エピトープタグ、例えばＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ヘマグルチニンタグなど、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合することができる。場合により、ＴｆＲ結合ポリペプチドと融合されたペプチドまたはタンパク質は、第Ｘａ因子またはトロンビンの切断部位のようなプロテアーゼ切断部位を含むことができる。特定の実施形態では、連結は中枢神経系に存在する酵素によって切断可能なものである。
【０３２８】
ポリペプチド以外の物質をＴｆＲ結合ポリペプチドに結合することもできる。かかる物質としては、細胞傷害性剤、造影剤、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、または化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、物質は、治療用または造影用の化合物である。いくつかの実施形態では、物質は小分子、例えば、１０００Ｄａ未満、７５０Ｄａ未満、または５００Ｄａ未満である。
【０３２９】
物質は、ポリペプチドまたは非ポリペプチドのいずれであっても、ＴｆＲ結合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端領域に結合するか、または、物質がＴｆＲ結合ポリペプチドのＴｆＲに対する結合を妨げない限り、ポリペプチドの任意の領域に結合することができる。
【０３３０】
異なる実施形態において、周知の化学架橋試薬及びプロトコールを用いて結合体を作製することができる。例えば、当業者には周知の、ポリペプチドを対象となる物質と架橋するうえで有用な多くの化学架橋剤が存在する。例えば、架橋剤は、分子を段階的に連結するために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質を結合するためのより特異的な連結方法の設計を可能とし、それにより、ホモタンパク質ポリマーのような不要な副反応の発生を低減するものである。
【０３３１】
対象となる物質は、細胞傷害性剤など、または化学的部分を含む治療剤であってよい。いくつかの実施形態では、物質は、ペプチドまたは小分子治療剤もしくは造影剤であってよい。
【０３３２】
Ｘ．エフェクター機能を高める方法
特定の用途では、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体にエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）を高める改変を導入することが望ましい。エフェクター機能を高める１つの方法は、低フコース化またはフコース欠損させた改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体を生成することを含む。
【０３３３】
フコース欠損改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体を生成するための１つのアプローチは、２−フルオロフコース（２−ＦＦ）のようなフコース類似体を使用することである。フコース類似体は、フコースをタンパク質に取り込むためにフコース転移酵素によって必要とされる基質であるＧＤＰ−フコースのアベイラビリティーを低下または低減することができる。
【０３３４】
商業的製造に広く使用されている、フコース欠損改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体を生成するための代替的なアプローチは、改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体の発現にα−１，６フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）ノックアウト細胞株を用いることである。適当なＦＵＴ８ノックアウト細胞株の非限定的な例として、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓより販売されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＦＵＴ８ノックアウト細胞株がある。更に、Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００４）８８：９０１−９０８；参照により本明細書にその全容を援用する）に記載されるように、ＦＵＴ８低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用してＣＨＯ細胞株をフコース欠損タンパク質の製造用に変換することができる（例えば、ＦＵＴ８  ｓｉＲＮＡの構成的発現により）。
【０３３５】
ＸＩ．核酸、ベクター、及び宿主細胞
本明細書に記載される改変ＴｆＲ結合ポリペプチドは、通常は組換え法を用いて調製される。したがって、本発明は、本明細書に記載される改変Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む単離核酸、及び該ポリペプチドをコードする核酸を複製し、及び／または該ポリペプチドを発現させるために使用される核酸が導入された宿主細胞を提供するものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えばヒト細胞である。
【０３３６】
別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは核酸コンストラクト内に含まれる。いくつかの実施形態では、コンストラクトは複製可能なベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージミド、酵母染色体ベクター、及び非エピソーム性の哺乳動物ベクターから選択される。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現コンストラクト内の１つ以上の調節ヌクレオチド配列と機能的に連結される。一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトは、表面発現ライブラリーとしての使用に適合される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、酵母での表面発現に適合される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ファージでの表面発現に適合される。別の一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトは、ミリグラムまたはグラム量でのポリペプチドの単離を可能とする系でのポリペプチドの発現に適合される。いくつかの実施形態では、系は哺乳動物細胞発現系である。いくつかの実施形態では、系は酵母細胞発現系である。
【０３３９】
組換えポリペプチドを製造するための発現ビヒクルとしては、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。例えば、適当なベクターとしては以下の種類のプラスミド、すなわち、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及び、大腸菌などの原核生物で発現させるためのｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、及びｐＨｙｇ由来ベクターは、真核生物のトランスフェクションに適した哺乳動物用発現ベクターの例である。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）などのウイルスの誘導体、またはエプスタイン・バー・ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、及びｐ２０５）を真核生物におけるポリペプチドの一過性発現に使用することもできる。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合もある。そのようなバキュロウイルス発現系としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクターが挙げられる。更なる発現系としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び他のウイルス発現系が挙げられる。
【０３４０】
ベクターは、任意の適当な宿主細胞に形質転換することができる。いくつかの実施形態では、例えば細菌または酵母細胞のような宿主細胞を表面発現ライブラリーとしての使用に適合させることができる。一部の細胞では、ベクターは宿主細胞内で発現されて比較的大量のポリペプチドを発現する。そのような宿主細胞としては、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び原核細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０細胞、Ｙ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞である。
【０３４１】
ＴｆＲ結合ポリペプチドをコードした発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドの発現を生じさせるような適当な条件下で培養することができる。ポリペプチドは、細胞の混合物及びポリペプチドを含有する培地から分泌させ、単離することができる。あるいは、ポリペプチドを細胞質中、または膜画分中に保持し、細胞を回収、溶解して、所望の方法によってポリペプチドを単離してもよい。
【実施例】
【０３４２】
ＸＩＩ．実施例
以下の実施例は、本開示の具体的な実施形態を示すために含まれるものである。当業者によれば、以下の実施例に開示される技術は、本開示を実施するうえで効果的に機能する技術を代表するものであり、したがって、その実施の具体的な態様を構成するものとみなし得る点は認識されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮することで、開示される具体的な実施形態に多くの変更を行うことが可能であり、それでもなお、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または同等の結果を得ることができる点は認識されるはずである。
【０３４３】
実施例１  ＴｆＲ結合ポリペプチドの作製
ＴｆＲに結合するＦｃポリペプチドを、ＣＨ３領域内の特定の位置としてコンビナトリアルライブラリーを用い、これらのライブラリーをヒトＴｆＲに対する結合について選択することにより作製した。初期のＴｆＲ結合配列のアフィニティー成熟により、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６の配列を有するＦｃポリペプチドなどの特異的なＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドが同定された。ヘテロ二量体のＦｃポリペプチド二量体を含むＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体を、以下の３種類のポリペプチドをそれぞれ１：１：２の比で同時発現させることによって構築した。得られた四量体のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質をＢＡＣＥ１−３Ｃ．３５．２１と称する。
【０３４４】
（１）Ｆａｂ領域、ヒンジ領域、及び改変Ｆｃポリペプチドがこの順序で直列に互いに融合された重鎖。Ｆａｂ領域は、ＢＡＣＥ１結合抗体の重鎖可変領域を含む。ヒンジ領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２の配列を有する。ＦｃポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５０の配列を有し、「ノブ」変異（ＥＵ番号付けスキームに従ってＴ３６６Ｗ）及びＴｆＲ結合変異を含む。
【０３４５】
（２）この順序で直列に互いに融合されたＦａｂ領域、ヒンジ領域、及び改変Ｆｃポリペプチドを含む重鎖。Ｆａｂ領域は、ＢＡＣＥ１結合抗体の重鎖可変領域を含む。ヒンジ領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２の配列を有する。ＦｃポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５１の配列を有し、「ホール」変異（ＥＵ番号付けスキームに従ってＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）を含む。
【０３４６】
（３）ＢＡＣＥ１結合抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖。
【０３４７】
上記３種類のポリペプチドを発現するための遺伝子をコードしたＤＮＡを、発現ベクターにクローニングし、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にそれぞれ１：１：２の比でトランスフェクトした。５〜７日後、細胞を回収し、得られたポリペプチドをプロテインＡで精製した後、当業者には周知の方法を用いてＨＩＣを行った。得られたポリペプチドを質量分析によって分析して、ホモ二量体のＦｃポリペプチド二量体（すなわち、どちらも「ノブ」変異を有する２個のＦｃポリペプチドを有するＦｃポリペプチド二量体、またはどちらも「ホール」変異を有する２個のＦｃポリペプチドを有するＦｃポリペプチド二量体）を有する融合タンパク質が精製後に存在していないことを確認した。更なる四量体ポリペプチドを同様にして作製した。
【０３４８】
実施例２  ヒトアピカルドメインのノックインマウスの作製（ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウス）
ノックイン／ノックアウトマウスの作製方法は文献に公開されており、当業者には周知のものである。要約すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いてマウスＴｆｒｃ遺伝子内でヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現するＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩマウスを作製し、得られたキメラＴｆＲを内因性プロモーターの制御下でインビボで発現させた。本明細書にその全容を参照により援用するところの国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１８３０２号に記載されるように、Ｃ５７Ｂｌ６マウスを使用して単一細胞胚に前核マイクロインジェクションした後、偽妊娠雌に胚移植することにより、ヒトアピカルＴｆＲマウス系統のノックインを作製した。具体的には、Ｃａｓ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６４及び２６５の配列を有するシングルガイドＲＮＡ、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７を有するドナーＤＮＡを胚に導入する。ドナーＤＮＡは、ヒトアピカルドメインのコーディング配列（マウスで発現させるためにコドン最適化したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６）を含むものとした。アピカルドメインのコーディング配列は、左側（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７のヌクレオチド１〜８１７）と右側のホモロジーアーム（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７のヌクレオチド１５２３〜２３２９）とによって挟まれたものとした。このように、アピカルドメインが４番目のマウスエクソンの後に挿入され、３’末端に９番目のエクソンが直接隣接するようにドナー配列を設計した。胚を移植した雌の子孫からのファウンダー雄を野生型の雌と交配してＦ１ヘテロ接合体マウスを作出した。次に、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスの交配によってホモ接合体マウスを作出した。
【０３４９】
実施例３  両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドはマウスにおける網状赤血球の減少を防止する
ＴｆＲに結合する抗体は、マウスに投与されると循環網状赤血球及び骨髄網状赤血球の両方を減少させることが示されている（例えば、Ｃｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，５：１８３ｒａ５７，１−１２，２０１３を参照）。実施例１に記載されるＢＡＣＥ１−３Ｃ．３５．２１に類似したＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体を作製した。この、Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体を「ＢＡＣＥ１−３Ｃ．３５．２１２ＸＬＡＬＡ」と称し、以下を含む。（１）ＢＡＣＥ１結合抗体の重鎖可変領域を有するＦａｂ領域と、ヒンジ領域と、「ノブ」変異（ＥＵ番号付けスキームに従ってＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を低減する変異（ＥＵ番号付けスキームに従ってＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）、及びＴｆＲ結合変異を有する改変Ｆｃポリペプチドと、を有する重鎖（ヒンジ領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５２（ノブ及びＬＡＬＡ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１）に融合された抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂ領域）；（２）ＢＡＣＥ１結合抗体の重鎖可変領域を有するＦａｂ領域と、ヒンジ領域と、「ホール」変異（ＥＵ番号付けスキームに従ってＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）及びエフェクター機能を低減する変異（ＥＵ番号付けスキームに従ってＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）を有する改変Ｆｃポリペプチド（ヒンジ領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３（ホール変異及びＬＡＬＡ変異を有するヒトＦｃ配列）に融合された抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂ領域）；及び（３）ＢＡＣＥ１結合抗体の軽鎖可変領域をそれぞれ含む２本の軽鎖。
【０３５０】
Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質をインビボで評価するためにホモ接合体のヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウスを作製した。要約すると、これらのマウスを操作してマウスＴｆＲをヒトアピカルドメイン／マウスキメラＴｆＲタンパク質で置換した（実施例２を参照）。これらのマウスに、ＢＡＣＥ１−Ｆｃ二量体２ＸＬＡＬＡＰＧ（両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異及びＰ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けスキームに従う）を有するＦｃ二量体に融合された抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂ）、またはＢＡＣＥ１−３Ｃ．３５．２１２ＸＬＡＬＡを２５ｍｇ／ｋｇで投与した。循環及び骨髄網状赤血球をそれぞれ、ＣＢＣ及びＦＡＣＳ分析により投与の２４時間後に評価した。骨髄網状赤血球は、Ｔｅｒ１１９＋、ｈＣＤ７１高、及びＦＳＣ低集団として同定された。上記の実験と一致して、ＢＡＣＥ１−３Ｃ．３５．２１２ＸＬＡＬＡと称されるＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体は、非ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体と同様、インビボで網状赤血球の減少を誘導しなかった（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０３５１】
実施例４  非対称なＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドの設計
ＴｆＲは、骨髄中及び循環中の両方に存在する未成熟赤血球である網状赤血球で高度に発現する。完全なエフェクター機能を有するＴｆＲ抗体は、血中及び骨髄中の両方の網状赤血球を急速に減少させ得ることがこれまでに示されている。したがって、網状赤血球の減少は、ＴｆＲを用いた抗体治療における主要な安全性の問題である。しかしながら、ＴｆＲを用いた抗体のエフェクター機能の完全な除去は、特定の場合において、Ｆａｂの結合時にエフェクター機能が誘発されるが、治療用Ｆａｂに融合された操作されたＴｆＲ結合Ｆｃ領域のＴｆＲへの結合時にはエフェクター機能が誘発されないことが望ましいことから、適当な解決策とは言えない。ＥＵ番号付けスキームに従ったＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）のようなＦｃ変異は、Ｆｃポリペプチド二量体へのＦｃγＲの結合を減少させることから、Ｆｃポリペプチド二量体の両方のＦｃポリペプチドにかかる変異を有する、Ｆａｂに融合された操作されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲの結合または標的へのＦａｂの結合のいずれによってもエフェクター機能を誘発することはできない。
【０３５２】
Ｆａｂがその標的に結合する場合にはエフェクター機能を誘発することができるが、ＴｆＲ結合部位がＴｆＲに結合する場合にはエフェクター機能を誘発することができない、治療用Ｆａｂに融合された操作されたＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体が望ましい。このため、２個のＦｃポリペプチドの一方（他方ではなく）がＴｆＲへの結合時にＦｃγＲの結合を減少させる変異を有するようなＦｃポリペプチド二量体が開発された。一方または両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有するか、またはどちらのＦｃポリペプチドにもＬＡＬＡ変異を有さない、ＢＡＣＥ１、ヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）、またはマウスＣＤ２０（ｍＣＤ２０）のいずれかに結合する抗原結合Ｆａｂ領域に融合された一連のＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド二量体を下記表１及び２に記載されるようにして作製した。表１は、２本の重鎖のそれぞれのＦｃ領域内の変異を示す。表１に示されるすべての変異体において、重鎖１は、Ｆｃ領域内にＴｆＲ結合部位及びノブ変異Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ番号付けスキームに従う）を含み、重鎖２は、Ｆｃ領域内にホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付けスキームに従う）を含む。変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２１はＦｃ領域内に更なる変異体を含まず、変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２１２ｘＬＡＬＡは、重鎖１及び２の両方のＦｃ領域内にＬＡＬＡ変異を含み、変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２１シスＬＡＬＡは、ＴｆＲ結合部位を含む方と同じＦｃ領域内にＬＡＬＡ変異を含み（シスＬＡＬＡまたはシス形態）、変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２１トランスＬＡＬＡは、ＴｆＲ結合部位を含まない方のＦｃ領域内にＬＡＬＡ変異を含む（トランスＬＡＬＡまたはトランス形態）。同じことが、変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２３、変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２３２ｘＬＡＬＡ、変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２３シスＬＡＬＡ、及び変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２３トランスＬＡＬＡに当てはまる。
【０３５３】
表２は、各Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体の重鎖及び軽鎖のそれぞれの配列番号を示す。例えば、ＢＡＣＥ１−３Ｃ．３５．２１２ｘＬＡＬＡは、表１に示される変異体ｚｚ−３Ｃ．３５．２１２ｘＬＡＬＡと、ＢＡＣＥ１をターゲティングするＦａｂ領域とを含む。
【０３５４】
（表１）Ｆｃポリペプチド内のエフェクター機能変異
2021510162.tif 000002
【０３５５】
（表２）Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体の配列番号
2021510162.tif 000003
2021510162.tif 000004
2021510162.tif 000005
【０３５６】
実施例５  シス形態を有するＴｆＲ結合はマウスにおける網状赤血球の減少を減弱する
シス形態またはトランス形態を有するＦｃポリペプチド二量体のどちらが網状赤血球の減少を減弱させることができるかを判定するため、本発明者らは、ホモ接合体のヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩ）マウスを、これらのＦｃポリペプチド、及び対応する野生型ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）で処理し、これらの動物の末梢血及び骨髄の両方からの網状赤血球を分析した。循環網状赤血球を、Ａｄｖｉａ  １２０  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して末梢血から定量した。要約すると、細胞をＡＤＶＩＡ  ａｕｔｏＲＥＴＩＣ試薬で染色し、網状赤血球をＲＮＡ含量及び吸光度差に基づいて同定した。骨髄網状赤血球については、骨髄細胞を各動物の大腿骨から採取し、Ｆｃブロッカー（抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２）でブロックし、抗ｍＴｅｒ１１９及び抗ｈＣＤ７１で染色し、蛍光活性化細胞分取法（ＦＡＣＳ）により分析した。網状赤血球をＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェアを使用して、ｍＴｅｒ１１９＋、ｈＣＤ７１高、及びＦＳＣ低集団としてゲーティングした。分析の結果、シス形態（すなわち、一方のみのＦｃポリペプチドがＴｆＲ結合部位及びＬＡＬＡ変異の両方を含み、他方のＦｃポリペプチドはＴｆＲ結合部位もＬＡＬＡ変異も含まない）を有するＦｃポリペプチド二量体は、野生型ｈＩｇＧコントロール及びトランス形態（すなわち、一方のＦｃポリペプチドがＴｆＲ結合部位を含み、他方のＦｃポリペプチドがＬＡＬＡ変異を含む）を有するＦｃポリペプチド二量体でみられた網状赤血球の減少を血中及び骨髄中の両方で低減した。驚くべきことに、シス形態を有するＦｃポリペプチドは２５ｍｇ／ｋｇでは、エフェクター機能を有するＴｆＲ結合ポリペプチドで通常みられる主要な安全性の問題を生じていない（図２Ａ及び２Ｂ）。更に、この系に、ＴｆＲ親和性の低いＴｆＲ結合ポリペプチドを使用して、５０ｍｇ／ｋｇの高用量でストレスをかけた。シス形態は、血中網状赤血球の減少を部分的に減弱したが、臨床上の安全性をより反映した骨髄網状赤血球の減少には影響しなかった（図２Ｃ及び２Ｄ）。これに対して、トランス形態を有するＦｃポリペプチド二量体は、血中及び骨髄網状赤血球を野生型ＩｇＧコントロールと同程度に減少させた。これらの結果は、シス形態を有するＦｃポリペプチド二量体は、インビボで網状赤血球の減少を低減することができることを示すものである。
【０３５７】
実施例６  シス形態を有するＴｆＲ結合はインビトロでＴｆＲ介在型ＡＤＣＣ活性を減弱する
シス形態を有するＦｃポリペプチド二量体によるインビボの網状赤血球の減少がみられないのはそれがＴｆＲ介在型ＡＤＣＣを誘発できないことによるものであると示された。ヒトＴｆＲを高レベルで発現するＲａｍｏｓ細胞をインビトロＡＤＣＣアッセイで標的細胞として使用した。標的細胞を１０，０００細胞／ウェルで播種し、（１）ＴｆＲ結合部位を有するｈＩｇＧ１、（２）両方のＦｃポリペプチドにＴｆＲ結合部位及びＬＡＬＡ変異を有するｈＩｇＧ１、及び（３）シス形態を有するＦｃポリペプチド二量体を有するｈＩｇＧ１で、３０分間オプソニン化した。エフェクターナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をヒト末梢血から単離し、ＩＬ−２１（２０ｎｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートし、２５：１のエフェクター：標的細胞の比（２５０，０００細胞／ウェル）で標的細胞と４時間インキュベートした。細胞傷害性をＬＤＨ発現によって評価し、ポリペプチドを含まないコントロールに対して正規化し、標的細胞中の最大溶解率（％）として計算した。エフェクター免疫細胞（この場合、ナチュラルキラー細胞）はＦｃγＲを発現するため、野生型ＩｇＧ１のＦｃ部分はＦｃγＲに結合し、ＡＤＣＣ応答を誘発する。実際、ＴｆＲ結合部位を有するｈＩｇＧ１が強いＡＤＣＣ反応を誘発したのに対して、両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有するｈＩｇＧ１、及びシス形態を有するＦｃポリペプチド二量体を有するｈＩｇＧ１はいずれもＡＤＣＣ反応を誘発しなかった。このデータは、インビボの網状赤血球のデータと一致していた。すなわち、シス形態を有するＦｃポリペプチド二量体、ならびに、両方のＦｃポリペプチドに（２つの異なるＴｆＲ親和性で（図３Ａ： ＣＨ３Ｃ．３５．２１、図３Ｂ：ＣＨ３Ｃ．３５．２３））ＴｆＲ結合部位及びＬＡＬＡ変異を有するＦｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲ介在型ＡＤＣＣを妨げ、これにより網状赤血球の減少を低減させた。
【０３５８】
実施例７  ＴｆＲ結合ポリペプチドは、ＴｆＲ介在型インビトロＣＤＣ活性を妨げる
ＴｆＲに結合する抗体によるインビボの網状赤血球の減少には、ＴｆＲ介在型ＣＤＣ活性も寄与していると考えられる。興味深い点として、ＴｆＲに結合するＦｃポリペプチド二量体は、ＣＤＣを誘発することはできず、これはおそらくは、補体応答を誘発するポリペプチド六量体を立体的に形成することができないことによる。ＴｆＲを過剰発現するように操作したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＴｆＲ）を無血清培地中、２００，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を（１）コントロールｈＩｇＧ１、（２）Ａｂ２０４（抗ＴｆＲ陽性コントロール抗体）、及び（３）ＴｆＲ結合部位を有するｈＩｇＧ１で、３０分間オプソニン化した。５０μＬの希釈したウサギ幼体血清を各ウェルに加え、細胞を４時間インキュベートした。細胞傷害性をＬＤＨ発現によって評価し、ポリペプチドを含まないコントロールに対して正規化し、標的細胞中の最大溶解率（％）として計算した。実際、抗ＴｆＲ  Ａｂ２０４がＣＨＯ−ｈＴｆＲ細胞にＣＤＣを誘導できなかったのに対して、Ｆｃ領域にＴｆＲ結合部位を有するｈＩｇＧ１はＣＤＣに影響を及ぼさなかった（図４）。
【０３５９】
実施例８  シス形態を有するＴｆＲ結合ポリペプチドは、初代ヒトミクログリアのｐＳｙｋ活性を刺激する
改変Ｆｃポリペプチド二量体は、初代ヒトミクログリア細胞を用いて、ＦｃγＲ誘導リン酸化脾臓チロシンキナーゼ（ｐＳＹＫ）によって測定される機能性Ｆｃを有することが確認されている。エフェクター免疫細胞上のＦｃγＲは、通常、抗体のＦｃ領域に結合して自然免疫で重要な多くの反応を誘発する。これらの反応の１つにＳｙｋチロシンキナーゼシグナル伝達経路があり、食作用、サイトカイン放出、及びＡＤＣＣなどの免疫細胞活性化に重要な役割を担っている（ＤｅＦｒａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．， Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１９９７，１８６（７）：１０２７−３９）。免疫細胞のＦｃγＲが免疫複合体に結合すると、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ｉｍｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）により、Ｓｙｋキナーゼが動員されてＳｒｃファミリーのキナーゼによってリン酸化され、これにより、下流のシグナル伝達経路が免疫細胞の活性化を誘発する（Ｈｉｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００４，２７９：３２３０８−１５）。このため、ｐＳｙｋは、ＦｃγＲ誘導型免疫細胞活性化のリードアウトとして用いられる。ヒト胚組織由来の混合グリア培養から得られたミクログリア細胞を回収し、ＴｆＲ結合ポリペプチドと結合した際のｐＳｙｋ活性を評価するために用いた。次いで、ミクログリアをＴｆＲ結合ポリペプチドでコートした９６ウェルプレートに加え、３７℃で１０分間インキュベートし、溶解し、ｐＳｙｋサンドウィッチイムノアッセイを用いてｐＳｙｋのレベルを定量した。シスＬＡＬＡ変異は、ＴｆＲ介在型ＡＤＣＣを誘発しなかったものの、野生型ＩｇＧペプチドと同様、ヒトミクログリア細胞にｐＳｙｋ応答を誘発することができた（ＬＡＬＡ変異コントロールから約３倍の増加、図５）。この結果は、シス形態を有する改変Ｆｃポリペプチド二量体がそのＦｃ機能を保持し、エフェクター機能を有し得ることを示すものである。
【０３６０】
実施例９  シス形態を有するＴｆＲ結合ポリペプチドは、標的細胞にＦａｂ介在型ＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘発する
ｐＳＹＫ活性の誘導以外に、シス形態を有するＴｆＲ結合ポリペプチドがＦａｂ介在型のＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘発する能力を評価した。マウスＣＤ２０（Ａ２０細胞株）を発現する標的細胞を使用してＦａｂ介在型ＡＤＣＣを評価した。実施例８に記載したＴｆＲ介在型ＡＤＣＣと同様、標的細胞を１０，０００細胞／ウェルで播種し、オプソニン化し、２５：１のエフェクター：標的細胞の比でＮＫ細胞とインキュベートし、ＬＤＨ発現により細胞傷害性について評価した。標的細胞を、（１）コントロールｈＩｇＧ、（２）抗ｍＣＤ２０抗体、（３）ＴｆＲ結合部位及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を含むｈＩｇＧ１（ＣＨ３Ｃ．３５．２１  ｈＩｇＧ１：α−ｍＣＤ２０（ＷＴ））、ならびに（４）シス形態及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１（ＣＨ３Ｃ．３５．２１  ｈＩｇＧ１：α−ｍＣＤ２０（シスＬＡＬＡ））でオプソニン化した。標的細胞はヒトＴｆＲを発現しないため、Ｆａｂ結合のみを評価するようにアッセイを設計する。ｐＳＹＫ活性の誘導と一致して、シス形態及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１は、抗ｍＣＤ２０抗体、及びＴｆＲ結合部位とｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位とを有するｈＩｇＧ１と同様、ＡＤＣＣを誘発した（図６Ａ）。
【０３６１】
ＡＤＣＣ以外にＣＤＣの評価も行った。Ｒａｊｉ細胞は、抗ｈＣＤ２０介在型ＣＤＣにおいて感受性を有することがこれまでに示されており、したがって、Ｒａｊｉ細胞を標的細胞として使用してＴｆＲ結合部位及びｈＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するｈＩｇＧ１を評価した。Ｒａｊｉ細胞を、無血清培地中に２００，０００細胞／ウェルで播種し、（１）コントロールｈＩｇＧ、（２）抗ｈＣＤ２０抗体、（３）ＴｆＲ結合部位及びｈＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するｈＩｇＧ１（ＣＨ３Ｃ．３５．２１  ｈＩｇＧ１：α−ｈＣＤ２０（ＷＴ））、ならびに（４）シス形態及びｈＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１（ＣＨ３Ｃ．３５．２１  ｈＩｇＧ１：α−ｈＣＤ２０（シスＬＡＬＡ））で３０分間、オプソニン化した。５０μＬの希釈したウサギ幼体血清を各ウェルに加え、細胞を４時間インキュベートした。細胞傷害性をＬＤＨ発現によって評価し、ポリペプチドを含まないコントロールに対して正規化し、標的細胞中の最大溶解率（％）として計算した。Ｆａｂ介在型ＡＤＣＣと同様、シス形態及びｈＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１は、抗ｈＣＤ２０、及びＴｆＲ結合部位とｈＣＤ２０のＦａｂ結合部位とを含むｈＩｇＧ１と同程度にＣＤＣを誘発した（図６Ｂ）。以上を併せると、これらの機能性インビトロ細胞傷害性アッセイは、シス形態を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１は、Ｆａｂ介在型エフェクター機能を誘発するｈＩｇＧ１の能力を妨げないことを示している。
【０３６２】
実施例１０  シス形態及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するＴｆＲ結合ポリペプチドは、インビトロでエフェクター機能を誘発する
インビボの安全性分析で示されたように、シス形態を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１は、ＴｆＲに結合した時の網状赤血球の減少を低減した。次に、本発明者らは、この形態が、治療反応の誘導に不可欠であるＦａｂ介在型エフェクター機能をインビボで誘発するかどうかを試験した。ｍＣＤ２０に対する抗体はインビボで末梢血及び脾臓のＢ細胞を著しく減少させることがこれまでに証明されていることから、Ｆａｂ介在型エフェクター機能を評価するために用いられている。シス形態及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１が血中及び脾臓Ｂ細胞を減少させる能力を、野生型（ＷＴ）マウスで評価し、抗ｍＣＤ２０抗体、及びＴｆＲ結合部位及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を含むｈＩｇＧ１で観察された反応と比較した。ＷＴマウスを、２５ｍｇ／ｋｇの（１）コントロールＩｇＧ、（２）抗ｍＣＤ２０抗体、（３）ＴｆＲ結合部位及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を含むｈＩｇＧ１（ＣＨ３Ｃ．３５．２１  ｈＩｇＧ１：α−ｍＣＤ２０（ＷＴ））、（４）ＴｆＲ結合部位を含み、両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有し、ｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を含むｈＩｇＧ１（ＣＨ３Ｃ．３５．２１  ｈＩｇＧ１：α−ｍＣＤ２０（ＬＡＬＡ））、ならびに（５）シス形態及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１（ＣＨ３Ｃ．３５．２１  ｈＩｇＧ１：α−ｍＣＤ２０（シスＬＡＬＡ））で処理した。成熟した末梢血Ｂ細胞及び脾臓Ｂ細胞をそれぞれ１日目及び５日目に評価した。要約すると、末梢血及び脾臓を採取した。末梢血及び脾臓細胞からの細胞をＡＣＫ溶解バッファーで処理し、Ｆｃブロッカーとインキュベートし、抗Ｂ２２０及び抗ＩｇＭで染色した。成熟Ｂ細胞は、ＦＡＣＳ分析により、Ｂ２２０高ＩｇＭ高集団として同定された。Ｆａｂ媒介性インビトロＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイと一致して、シス形態及びｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位を有するＦｃポリペプチド二量体を含むｈＩｇＧ１は、抗ｍＣＤ２０抗体、及びＴｆＲ結合部位とｍＣＤ２０のＦａｂ結合部位とを有するｈＩｇＧ１と同様、安定的なＢ細胞の減少を誘発した（図７Ａ及び７Ｂ）。これらの結果は、シス形態を有する改変Ｆｃポリペプチド二量体がそのＦｃ機能を保持し、インビボでＦａｂ介在型エフェクター機能を有することを示すものである。
【０３６３】
実施例１１  ＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチド
本実施例では、ＴｆＲへの結合性を与え、ＢＢＢを通過するためのＦｃポリペプチドの改変について記載する。
【０３６４】
特に断らない限り、本セクションにおけるアミノ酸残基の位置は、ヒトＩｇＧ１の野生型Ｆｃ領域についてのＥＵ番号付けに基づいて番号付けされる。
【０３６５】
３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位、及び４２１位に改変を含むＦｃポリペプチド（ＣＨ３Ｃクローン）の作製及び特性評価
３８４位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、４１３位、４１６位、及び４２１位のアミノ酸位置を含む位置に改変が導入されたＦｃ領域を含む酵母ライブラリーを以下に述べるようにして作製した。ＴｆＲに結合する例示的なクローンを表３及び４に示す。
【０３６６】
更に２ラウンドの分取の後、単一のクローンをシークエンシングし、４つの固有の配列を特定した。これらの配列は、３８８位に保存的Ｔｒｐを有し、いずれも４２１位に芳香族残基（すなわち、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓ）を有していた。他の位置では高い多様性がみられた。
【０３６７】
ライブラリーから選択した４種類のクローンを、ＣＨＯまたは２９３細胞でＦａｂフラグメントとのＦｃ融合体として発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した後、ＥＬＩＳＡによりホロＴｆの存在下または非存在下でヒトＴｆＲに対する結合についてスクリーニングした。各クローンはいずれもヒトＴｆＲに結合し、結合は過剰量（５μＭ）のホロＴｆの添加によって影響されなかった。各クローンをヒトＴｆＲを内因性に発現する２９３Ｆ細胞に対する結合についても試験した。各クローンは２９３Ｆ細胞に結合したものの、全体的な結合は高親和性のポジティブコントロールと比較して大幅に弱かった。
【０３６８】
次に、試験クローンとしてクローンＣＨ３Ｃ．３を使用して各クローンがＴｆＲ発現細胞に内在化するかどうかについて試験を行った。接着性ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルで約８０％コンフルエンスにまで増殖させ、培地を除去し、以下の各試料、すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．３、抗ＴｆＲベンチマークポジティブコントロール抗体（Ａｂ２０４）、抗ＢＡＣＥ１ベンチマークネガティブコントロール抗体（Ａｂ１０７）、及びヒトＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈより入手したもの）を１μＭの濃度で加えた。細胞を３７℃及び８％ＣＯ２濃度で３０分間インキュベートした後、洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００で透過処理し、抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体で染色した。更なる洗浄後、細胞をハイコンテント蛍光顕微鏡（すなわちＯｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ（登録商標）システム）下でイメージングし、細胞当たりの蛍光斑の数を定量した。１μＭでは、クローンＣＨ３Ｃ．３は、抗ＴｆＲポジティブコントロールと同様の内在化の傾向を示したが、ネガティブコントロールは内在化を示さなかった。
【０３６９】
クローンの更なる操作
ＤＮＡオリゴを作製して最初の４つのヒットのそれぞれに基づいてソフト変異誘発を導入するソフトランダム化アプローチを用いてヒトＴｆＲに対する初期のヒットの親和性を高めるために更なるライブラリーを作製した。ＴｆＲに結合する更なるクローンを特定し、選択した。選択されたクローンは２つの大きな配列グループに分類された。グループ１のクローン（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１８、ＣＨ３Ｃ．２１、ＣＨ３Ｃ．２５、及びＣＨ３Ｃ．３４）は、３８４位に半保存的Ｌｅｕを、３８６位にＬｅｕまたはＨｉｓを、３８７及び３８９位にそれぞれ保存的及び半保存的Ｖａｌを、４１３、４１６、及び４２１位にそれぞれ半保存的Ｐ−Ｔ−Ｗモチーフを有していた。グループ２のクローンは、３８４位に保存的Ｔｙｒを、３８６〜３９０位にモチーフＴＸＷＳＸを、４１３、４１６、及び４２１位にそれぞれ保存的モチーフＳ／Ｔ−Ｅ−Ｆを有していた。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５を、それぞれの配列グループの代表的な配列として更なる実験で使用した。
【０３７０】
エピトープマッピング
操作されたＦｃ領域がＴｆＲのアピカルドメインに結合するかを調べるため、ＴｆＲアピカルドメインをファージの表面で発現させた。アピカルドメインを適切に折り畳ませてディスプレイさせるには、ループのうちの１つを切り詰め、配列の順序を環状に並べ替える必要がある。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ファージＥＬＩＳＡプレートに従った。要約すると、１％ＰＢＳＡによる洗浄及びブロッキング後、ファージディスプレイの各希釈液を加え、室温で１時間インキュベートした。次いで各プレートを洗浄し、抗Ｍ１３−ＨＲＰを加え、更なる洗浄後、各プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４でクエンチした。このアッセイではクローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５の両方ともアピカルドメインに結合した。
【０３７１】
パラトープマッピング
Ｆｃドメイン内のどの残基がＴｆＲへの結合に最も重要であるかを理解するため、各変異体のＴｆＲ結合レジスター内の１個の位置を野生型に復帰変異させた一連の変異体クローンＣＨ３Ｃ．１８及びクローンＣＨ３Ｃ．３５のＦｃ領域を作製した。得られた変異体を組換えによりＦａｂ−Ｆｃ融合体として発現させ、ヒトまたはカニクイザルＴｆＲに対する結合について試験した クローンＣＨ３Ｃ．３５では、３８８及び４２１位は結合に重要であり、これらのいずれかの野生型への復帰変異はヒトＴｆＲに対する結合を完全に消失させた。
【０３７２】
成熟クローンの結合の特性分析
上記に述べたようにして、精製したＦａｂ−Ｆｃ融合変異体と、プレートにコーティングしたヒトまたはカニクイザルＴｆＲとの結合ＥＬＩＳＡを行った。クローンＣＨ３Ｃ．１８成熟ライブラリーからの変異体であるクローンＣＨ３Ｃ．３．２−１、クローンＣＨ３Ｃ．３．２−５、及びクローンＣＨ３Ｃ．３．２−１９がヒト及びカニクイザルＴｆＲと概ね等しいＥＣ５０値で結合したのに対して、親クローンのＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５は、カニクイザルＴｆＲに対してヒトＴｆＲに１０倍よりも高い結合を示した。
【０３７３】
次に、改変Ｆｃポリペプチドがヒト及びサルの細胞内に内在化するかについて試験を行った。上記に述べたプロトコールを用い、ヒトＨＥＫ２９３細胞及びアカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞への内在化を試験した。ヒト及びカニクイザルＴｆＲに対して同様に結合した変異体であるクローンＣＨ３Ｃ．３．２−５及びＣＨ３Ｃ．３．２−１９は、クローンＣＨ３Ｃ．３５と比較して有意に改善されたＬＬＣ−ＭＫ２への内在化を示した。
【０３７４】
更なるクローンの操作
更なる親和性成熟クローンであるＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５に対する更なる操作では、直接的相互作用、第２水和殻相互作用、または構造的安定化によって結合を向上させた位置にさらなる変異を加えた。これは、「ＮＮＫウォーク」または「ＮＮＫパッチ」ライブラリーの作製、及びこれらのライブラリーからの選択を行うことによって行った。ＮＮＫウォークライブラリーでは、パラトープの近傍の残基に１つずつＮＮＫ変異を導入することを行った。ＦｃγＲＩに結合したＦｃ（ＰＤＢ  ＩＤ：４Ｗ４Ｏ）の構造をみることにより、元の改変位置の近くの４４個の残基が試験の候補として特定された。詳細には、以下の残基、すなわち、Ｋ２４８、Ｒ２５５、Ｑ３４２、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｑ３４７、Ｔ３５９、Ｋ３６０、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｋ３７０、Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８５、Ｙ３９１、Ｋ３９２、Ｔ３９３、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｓ４０３、Ｋ４０９、Ｌ４１０、Ｔ４１１、Ｖ４１２、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｑ４１８、Ｑ４１９、Ｇ４２０、Ｖ４２２、Ｆ４２３、Ｓ４２４、Ｓ４２６、Ｑ４３８、Ｓ４４０、Ｓ４４２、Ｌ４４３、Ｓ４４４、Ｐ４４５８、Ｇ４４６、及びＫ４４７をＮＮＫ突然変異誘発の標的とした。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を用いてこれらの４４種類のシングルポイントＮＮＫライブラリーを作製し、他の酵母ライブラリーについて上記に述べたように各産物をプールして電気穿孔法により酵母に導入した。
【０３７５】
これらのミニライブラリー（それぞれ１個の位置を変異させ、２０種類の変異体を生じる）の組み合わせによって小さいライブラリーが作製され、このライブラリーを、酵母表面ディスプレイを用いてより高い親和性の結合を生じる位置について選択した。ＴｆＲアピカルドメインタンパク質を用い、上記に述べたようにして選択を行った。３ラウンドの分取の後、濃縮された酵母ライブラリーからのクローンをシークエンシングしたところ、特定の点突然変異がアピカルドメインタンパク質に対する結合を有意に改善させるいくつかの「ホットスポット」位置が特定された。クローンＣＨ３Ｃ．３５では、これらの変異として、Ｅ３８０（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎに変異させた）及びＳ４１５（Ｇｌｕに変異させた）が含まれた。クローンＣＨ３Ｃ．３５の単一変異体及び複合変異体の配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２３、６４〜６９、及び１２５〜１２７に示す。クローンＣＨ３Ｃ．１８では、これらの変異には、Ｅ３８０（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕに変異させた）及びＫ３９２（Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓに変異させた）が含まれた。クローンＣＨ３Ｃ．１８の単一変異体の配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０〜７５に示す。
【０３７６】
クローンＣＨ３Ｃ．３５の親和性を改善するための更なる成熟ライブラリー
ＮＮＫウォークライブラリーから変異の組み合わせを特定する一方でこれらの周辺にいくつかの更なる位置を追加するための更なるライブラリーを、上記の酵母ライブラリーについて述べたようにして作製した。このライブラリーでは、ＹｘＴＥＷＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１４）及びＴｘｘＥｘｘｘｘＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１５）モチーフを一定に保ち、以下の６つの位置、すなわちＥ３８０、Ｋ３９２、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｓ４２４、及びＳ４２６を完全にランダム化した。位置Ｅ３８０及びＳ４１５は、これらの位置がＮＮＫウォークライブラリーにおいて「ホットスポット」であったことから含めた。位置Ｋ３９２、Ｓ４２４、及びＳ４２６は、これらの位置が結合領域の位置を決定しうるコアの部分を構成することから含め、Ｋ４１４は、４１５位に隣接していることから選択した。
【０３７７】
このライブラリーを、上記に述べたようにして、カニクイザルＴｆＲのアピカルドメインのみによって分取した。５ラウンドの後に濃縮されたプールをシークエンシングし、特定された固有のクローンの改変領域の配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６〜９３に示す。
【０３７８】
次のライブラリーを、主要な結合パラトープ内の許容される多様性を更に調べるために設計した。元の位置（３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６、及び４２１）のそれぞれ、ならびに２個のホットスポット（３８０及び４１５）をＮＮＫコドンで個々にランダム化することにより、酵母で一連の単一位置飽和突然変異誘発ライブラリーを作製した。更に、それぞれの位置を個々に野生型残基に復帰変異させ、これらの個々のクローンを酵母上にディスプレイさせた。３８０、３８９、３９０、及び４１５位は、野生型残基に復帰変異させた際にＴｆＲに対する相当の結合を維持した唯一の位置であった点が着目された（４１３位の野生型への復帰変異で若干の残留はあるものの大幅に低減した結合が認められた）。
【０３７９】
単一位置のＮＮＫライブラリーを、ヒトＴｆＲアピカルドメインに対して３ラウンドで分取して、結合したもののうち、上位の約５％を回収し、次いで少なくとも１６種類のクローンを各ライブラリーからシークエンシングした。これらの結果は、クローンＣＨ３Ｃ．３５と関連して、各位置でどのアミノ酸がヒトＴｆＲに対する結合を大きく低下させることなく許容されうるかを示している。以下に要約を示す。
３８０位：Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ；
３８４位：ＴｙｒまたはＰｈｅ；
３８６位：Ｔｈｒのみ；
３８７位：Ｇｌｕのみ；
３８８位：Ｔｒｐのみ；
３８９位：Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＶａｌ（野生型のＡｓｎ残基は若干の結合を維持するようにみえたが、その後のライブラリー分取ではそのようにみえなかった）；
３９０位：ＳｅｒまたはＡｓｎ；
４１３位：ＴｈｒまたはＳｅｒ；
４１５位：ＧｌｕまたはＳｅｒ；
４１６位：Ｇｌｕのみ；及び
４２１位：Ｐｈｅのみ。
【０３８０】
上記の残基は、１個の変化として、または組み合わせでクローンＣＨ３Ｃ．３５内に置換された場合にＴｆＲアピカルドメインに対する結合を維持するパラトープの多様性を表す。これらの位置に変異を有するクローンには、表４に示されるものが含まれ、これらのクローンのＣＨ３ドメインの配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５〜６９、９２、９４〜１２４、及び２６８〜２７４に示す。
【０３８１】
実施例１２  方法
ファージディスプレイライブラリーの作製
野生型ヒトＦｃ配列）をコードする鋳型ＤＮＡを合成し、ファージミドベクターに組み込んだ。ファージミドベクターは、ｏｍｐＡまたはｐｅｌＢリーダー配列、ｃ−Ｍｙｃ及び６ｘＨｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２１）エピトープタグに融合されたＦｃインサート、ならびにアンバー終止コドンに続くＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩを含むものであった。
【０３８２】
改変を行うための所望の位置に「ＮＮＫ」三重コドンを含むプライマーを作製した（ただし、Ｎは任意のＤＮＡ塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）であり、ＫはＧまたはＴである）。あるいは、「ソフト」ランダム化用のプライマーを用い、７０％が野生型塩基に一致し、１０％ずつが他の３つの塩基に一致した塩基のミックスをそれぞれのランダム化位置に使用した。ランダム化の各領域に相当するＦｃ領域のフラグメントのＰＣＲ増幅を行ってから、ＳｆｉＩ制限部位を含んだエンドプライマーを用いてアセンブルした後、ＳｆｉＩで消化してファージミドベクターにライゲートすることにより、ライブラリーを作製した。あるいは、Ｋｕｎｋｅｌ法による突然変異誘発を行うためのプライマーを使用した。Ｋｕｎｋｅｌ産物のライゲート産物をＴＧ１株のエレクトロコンピテントな大腸菌細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）より入手したもの）に形質転換した。回復後の大腸菌細胞にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させ、一晩増殖させた後、ライブラリーファージを５％ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させ、１５％グリセロールを含むＰＢＳ溶液に再懸濁し、使用時まで凍結した。一般的なライブラリーサイズは、形質転換体約１０９〜約１０１１個の範囲であった。ｐＩＩＩ融合ＦｃとｐＩＩＩに結合されていない可溶性Ｆｃとの対合によってファージ上にＦｃ二量体をディスプレイさせた（後者はｐＩＩＩの手前のアンバー終止コドンのために生成される）。
【０３８３】
酵母ディスプレイライブラリーの作製
野生型ヒトＦｃ配列をコードする鋳型ＤＮＡを合成し、酵母ディスプレイベクターに組み込んだ。ＣＨ２及びＣＨ３ライブラリーについて、ＦｃポリペプチドをＡｇａ２ｐ細胞壁タンパク質上にディスプレイさせた。いずれのベクターも、Ｋｅｘ２切断配列を有するプレプロリーダーペプチド、及びＦｃの末端に融合されたｃ−Ｍｙｃエピトープタグを含んでいた。
【０３８４】
フラグメントの増幅をそのベクターについて相同末端を有するプライマーを用いて行った点以外は、ファージライブラリーについて述べたのと同様の方法を用いて酵母ディスプレイライブラリーをアセンブルした。新たに調製したエレクトロコンピテントな酵母（すなわちＥＢＹ１００株）に直線化したベクター及びアセンブルしたライブラリーインサートを電気穿孔法により導入した。電気穿孔法は当業者には周知のものであろう。選択的ＳＤ−ＣＡＡ培地中での回復後、酵母をコンフルエンスにまで増殖させ、２回分割した後、ＳＧ−ＣＡＡ培地に移すことによってタンパク質発現を誘導した。一般的なライブラリーサイズは、形質転換体約１０７〜約１０９個の範囲であった。Ｆｃの二量体が、隣接してディスプレイされたＦｃ単量体の対合によって形成された。
【０３８５】
ファージ選択の一般的方法
ファージ法は、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ，２００１）より採用した。更なるプロトコールの詳細は、この参照文献より入手することができる。
【０３８６】
プレート分取法
ヒトＴｆＲ標的をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）マイクロタイタープレート（通常、１〜１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を２００μＬ）に４℃で一晩コーティングした。特に断らない限り、すべての結合は室温で行った。ファージライブラリーを各ウェルに加え、一晩インキュベートして結合を行った。マイクロタイターウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳでよく洗い、各ウェルを酸（通常、５００ｍＭ  ＫＣｌ、または１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７を含む５０ｍＭ  ＨＣｌ）と３０分間インキュベートとすることにより結合したファージを溶出した。溶出されたファージを１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で中和し、ＴＧ１細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだ２ＹＴ培地中、３７℃で一晩増殖させた。標的の入ったウェルから溶出されたファージの力価を、標的の入っていないウェルから回収されたファージの力価と比較して濃縮度を評価した。次に結合の際のインキュベーション時間を短縮し、洗浄時間及び洗浄の回数を増やすことによって選択のストリンジェンシーを高めた。
【０３８７】
ビーズ分取法
抗原を、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）より入手したもの）を用いて遊離アミンを介してビオチン化した。ビオチン化反応には、３〜５倍モル過剰のビオチン試薬をＰＢＳ中で用いた。反応をＴｒｉｓで停止した後、ＰＢＳ中に重点的に透析した。ビオチン化された抗原をストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより入手したＭ２８０ストレプトアビジンビーズ）上に固定した。ファージディスプレイライブラリーを、抗原をコーティングしたビーズと室温で１時間インキュベートした。この後、結合しなかったファージを除去し、ビーズをＰＢＳＴで洗浄した。結合したファージを、５００ｍＭ  ＫＣｌ（または０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７）を含む５０ｍＭ  ＨＣｌと３０分間インキュベートすることにより溶出した後、プレート分取について上記に述べたように中和して、増殖させた。
【０３８８】
３〜５ラウンドのパニングを行った後、ファージ上で、または大腸菌のペリプラズム中に可溶性のＦｃを発現させることにより単一のクローンをスクリーニングした。かかる発現法は、当業者には周知のものであろう。個々のファージ上清またはペリプラズム抽出物を、抗原またはネガティブコントロールをコーティングし、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに曝露した後、ペリプラズム抽出物についてはＨＲＰ結合ヤギ抗Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈより入手したもの）を用いて、またはファージについては抗Ｍ１３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出し、次いでＴＭＢ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより入手したもの）で発色させた。ＯＤ４５０値がバックグラウンドの約５倍よりも大きいウェルを陽性クローンとみなしてシークエンシングし、その後、一部のクローンを可溶性Ｆｃフラグメントとして発現させるか、またはＦａｂフラグメントと融合させた。
【０３８９】
酵母選択の一般的方法
ビーズ分取（磁気細胞分離（ＭＡＣＳ））法
Ａｃｋｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２５（３），７７４に記載されるのと同様にしてＭＡＣＳ及びＦＡＣＳ選択を行った。ストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより販売されるＭ−２８０ストレプトアビジンビーズ）を、ビオチン化抗原で標識し、酵母とインキュベートした（通常５〜１０ｘのライブラリー多様性）。結合しなかった酵母を除去し、ビーズを洗浄し、結合した酵母を選択培地中で増殖させ、後の選択のラウンド用に誘導した。
【０３９０】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）法
酵母を抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で標識して発現及びビオチン化抗原（分取ラウンドに応じて濃度が変化する）を監視した。一部の実験では、抗原をストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と予め混合して相互作用のアビディティーを高めた。他の実験では、結合後のビオチン化抗原を検出し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で洗浄した。結合を有するシングレットの酵母をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩ細胞分取装置を使用して分取した。分取した酵母を選択培地中で増殖させた後、後の選択ラウンド用に誘導した。
【０３９１】
濃縮された酵母集団が得られた後、酵母をＳＤ−ＣＡＡアガープレートに播種し、シングルコロニーを増殖させ、発現を誘導した後、上記に述べたようにして標識して標的に結合する傾向を決定した。次いで、陽性のシングルクローンを抗原の結合についてシークエンシングした後、一部のクローンを可溶性のＦｃフラグメントとして発現させるか、またはＦａｂフラグメントと融合させた。
【０３９２】
スクリーニングの一般的方法
ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
クローンをパニングの結果産物から選択し、９６ウェルディープウェルプレートの個々のウェル中で増殖させた。各クローンに自己誘導培地（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより入手したもの）を用いてペリプラズムでの発現を誘導するか、またはファージ上に個々のＦｃ変異体をファージディスプレイするためにヘルパーファージを感染させた。培地を一晩増殖させ、遠心して大腸菌をペレット化した。ファージＥＬＩＳＡでは、ファージを含む上清を直接使用した。ペリプラズムでの発現では、ペレットを２０％スクロースに再懸濁した後、水で４：１に希釈し、４℃で１時間振盪した。プレートを遠心して固形物をペレット化し、上清をＥＬＩＳＡに使用した。
【０３９３】
ＥＬＩＳＡプレートに抗原をコーティングし（通常、０．５ｍｇ／ｍｌで一晩）、次いで１％ＢＳＡでブロッキングした後、ファージまたはペリプラズム抽出物を加えた。１時間のインキュベーションを行い、非結合タンパク質を洗い流した後、ＨＲＰ結合二次抗体（すなわち、可溶性ＦｃまたはファージディスプレイＦｃに対してそれぞれ抗Ｆｃまたは抗Ｍ１３）を加え、３０分間インキュベートした。各プレートを再び洗浄した後、ＴＭＢ試薬で発色させ、２Ｎの硫酸でクエンチした。プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））を用いて４５０ｎｍの吸光度を定量し、適用可能な場合にはＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線をプロットした。試験したクローンの吸光度シグナルをネガティブコントロール（Ｆｃを欠いているファージまたはペリプラズム抽出物）と比較した。一部のアッセイでは、可溶性のトランスフェリンまたは他の競合物質を結合ステップの間に、通常は大幅なモル過剰量（１０倍過剰超）で加える。
【０３９４】
フローサイトメトリーによるスクリーニング
Ｆｃ変異体ポリペプチド（ファージ上で、ペリプラズム抽出物中で、またはＦａｂフラグメントとの可溶性の融合体として発現させたもの）を、９６ウェルＶ底プレート中で細胞に加え（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中、ウェル当たり約１００，０００細胞）、４℃で１時間インキュベートした。この後、各プレートを遠心し、培地を除去してから細胞をＰＢＳＡで１回洗浄した。二次抗体（通常、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより入手したもの））を含むＰＢＳＡ中に細胞を再懸濁した。３０分後、プレートを遠心し、培地を除去し、細胞をＰＢＳＡで１〜２回洗浄した後、プレートをフローサイトメーター（すなわち、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーター）で読み取った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して各条件について蛍光の中央値を計算し、結合曲線をＰｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。
【０３９５】
実施例１３  ＣＨ３Ｃ．１８変異体の構築
本実施例では、ＣＨ３Ｃ．１８変異体のライブラリーの構築について述べる。
【０３９６】
単一のクローンを単離し、０．２％グルコースを一晩添加したＳＧ−ＣＡＡ培地中で一晩増殖させてＣＨ３Ｃ．１８変異体の表面での発現を誘導した。各クローンについて、２００万個の細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）中で３回洗浄した。細胞をビオチン化した標的として２５０ｎＭのヒトＴｆＲ、２５０ｎＭのカニクイザルＴｆＲ、または２５０ｎＭの無関連のビオチン化タンパク質により１時間、４℃で振盪しながら染色した後、同じバッファーで２回洗浄した。細胞をニュートラアビジン−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）で３０分間、４℃で染色した後、再び２回洗浄した。発現を、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を抗ニワトリＡｌｅｘｆｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）二次抗体と共に用いて測定した。細胞を再懸濁し、ＡＦ６４７及びＡＦ４８８の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩで測定した。各集団のＴｆＲ結合集団についてＭＦＩを計算し、ヒトＴｆＲ、カニクイザルＴｆＲ、またはコントロールとの結合と共にプロットした。
【０３９７】
表５は、ＣＨ３Ｃ．１８変異体のライブラリーを示す。各列は、各位置に示されるアミノ酸置換を有する変異体を表し、残りの位置のアミノ酸はＣＨ３Ｃ．１８のものと同じである。表５に示される各位置は、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けされたものである。
【０３９８】
（表５）ＣＨ３Ｃ．１８変異体
2021510162.tif 000006
【０３９９】
実施例１４  シス形態を有し、かつ、アミロイドベータ（Ａβ）に効果的に結合し、ＢＢＢを通過し、安定したエフェクター機能を誘発するＦａｂを有するＴｆＲ結合ポリペプチドは、ミクログリアをＡβプラークに動員し、Ａβプラークマウスモデルにおいてプラークを減少させる
シス形態を有するＴｆＲ結合ポリペプチドを、治療上関連する疾患モデルにおいて用いることができることの更なる根拠を与えるため、本発明者らは、Ａβプラーク沈着マウスモデルにおいてＡβに結合するＦａｂを有する、シス形態を有するＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドの評価を行った。詳細には、これらのポリペプチドを、Ａβプラークにミクログリアを動員する能力について評価した。要約すると、動物（生後３．５ヶ月）を以下の各群で、０、３、６、及び９日目に５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内処理した。すなわち、１）コントロールＩｇＧで処理したＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩマウス（ｎ＝６）、２）コントロールＩｇＧで処理した５ＸＦＡＤ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩマウス（ｎ＝１１）、３）抗Ａβ（α−Ａβ）で処理した５ＸＦＡＤ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩマウス（ｎ＝１２）、４）シス形態及びＡβ  Ｆａｂ結合部位を有するＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドで処理した５ＸＦＡＤ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩマウス（ｎ＝１２）、ならびに５）両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドで処理した５ＸＦＡＤ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕＫＩマウス（ｎ＝１２）。表６に、各Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体の重鎖及び軽鎖のそれぞれのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯを示す。
【０４００】
（表６）Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合体の配列番号
2021510162.tif 000007
【０４０１】
１２日目にマウスに灌流し、脳を採取して免疫組織化学用に４０μｍで矢状切片化した。動物１匹につき２個の脳切片（切片１：正中線から約３ｍｍ外側、切片２：正中線）をＩＨＣ分析用に選択した。自由に浮遊する切片を、ブロッキング溶液（０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ中、５％ロバ血清）中、室温で２時間、次いで一次抗体（抗ＣＤ６８、抗ヒトＡβ）と４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片を３回、１５分間洗浄し、蛍光標識した二次抗体と室温で２時間、ＤＡＰＩ溶液中で２０分間インキュベートした後、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ中で３回洗浄した。各切片を、スライドグラスに乗せ、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ａｎｔｉｆａｄｅマウンティング媒質を用いてカバーグラスをかけた。スライドグラスをＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃａｎ．Ｚ１スライドスキャナーを倍率２０倍で使用してイメージングし、Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮソフトウェアのカスタムマクロ及び画像処理マクロを使用して処理した。具体的には、画像を分析して拡張されたプラーク領域（サイズ毎）、プラーク／ＣＤ６８マイクログリア重複領域、拡張されたＣＤ６８＋マイクログリア領域、カウント、及びピクセル強度の総和（サイズ毎、９〜１４μｍ２、１４〜３３μｍ２、３３〜７５μｍ２、及び７５〜３３３３μｍ２）、ならびにプラークの形態、面積、カウント、及びピクセル強度の総和（稠密度＜０．７を不規則、＞０．７を円形として不規則なプラークから円形のプラークを分離する；サイズにより分離する（３０〜１２５μｍ２、１２５〜２５０μｍ２、２５０〜５００μｍ２、及び５００〜３３００μｍ２））を測定した。
【０４０２】
これらの実験から、シスＬＡＬＡ  Ｆｃポリペプチド二量体を含むＴｆＲ結合部位を有する抗Ａβで処理した５ＸＦＡＤ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスは、Ａβプラークに対する安定したマイクログリアの動員を誘発し（マイクログリアマーカーＣＤ６８とＡβマーカーの共局在化により測定される）、サイズが３０〜１２５μｍ２である小さなプラークを抗Ａβと同様の形で低減した（図８Ａ〜８Ｃ）。重要な点として、これらの作用は、両方のＦｃポリペプチドにＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合部位を有する抗Ａβでは観察されず、この疾患の実例におけるエフェクター機能の必要性と一貫している。全体として、これらのデータは、本明細書の他のインビトロ及びインビボデータと共に、シスＬＡＬＡ形態及び関連するＦａｂ結合部位を有するＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドのプラットフォーム骨格は、網状赤血球の安全性を緩和できるばかりでなく、関連する疾患モデルにおいて標的が介在するエフェクター機能を誘発する（すなわち、脳内のマイクログリアの関与）ことの強い証拠を与えるものである。
【０４０３】
本明細書に述べられる実施例及び実施形態はあくまで例示的な目的のものに過ぎず、これらを考慮することで様々な改変または変更が当業者に示唆され、かかる改変及び変更は本出願の趣旨及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものである点は理解されよう。本明細書に引用される配列アクセッション番号の配列をここに参照によって援用する。
【０４０４】
別段の定義がなされないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。
【０４０５】
本明細書に例示的に記載される発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の１乃至複数の要素、１乃至複数の限定がない状態で適当に実施することができる。したがって、例えば、「備える」、「含む」、「含有する」といった用語は、拡張的かつ限定なく読まれるべきである。更に、本明細書で用いられる用語及び表現は、限定のための用語としてではなく、説明のための用語として用いられ、かかる用語及び表現の使用においては、示され、記載される特徴のあらゆる均等物またはその部分を除外する意図はなく、むしろ、特許請求される発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識されよう。
【０４０６】
不一致がある場合、表（例えば、表３及び４）に記載される各クローンのアミノ酸置換が、配列表に記載される配列中にみられるアミノ酸に優先してそのクローンのレジスター位置におけるアミノ酸置換を決定する。
【０４０７】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、恰もそれらが個々に援用されているものと同様にして、それらの全容を参照により明示的に援用するものである。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。
【０４０８】
（表３）ＣＨ３Ｃレジスターの位置及び変異
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【０４０９】
（表４）更なるＣＨ３Ｃレジスターの位置及び変異
2021510162.tif 000009
【０４１０】
非公式な配列表
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【図１】
2021510162.tif 000048
【図２Ａ】
2021510162.tif 000049
【図２Ｂ】
2021510162.tif 000050
【図２Ｃ】
2021510162.tif 000051
【図２Ｄ】
2021510162.tif 000052
【図３Ａ】
2021510162.tif 000053
【図３Ｂ】
2021510162.tif 000054
【図４】
2021510162.tif 000055
【図５】
2021510162.tif 000056
【図６】
2021510162.tif 000057
【図７】
2021510162.tif 000058
【図８Ａ】
2021510162.tif 000059
【図８Ｂ】
2021510162.tif 000060
【図８Ｃ】
2021510162.tif 000061
【配列表】
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【国際調査報告】
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