(57)【要約】【課題】標的タンパク質を安定して発現できる組換えウイルス、およびその使用を提供する。【解決手段】標的タンパク質を安定して発現できる組換えウイルスを生成するための方法が提供される。本発明の組換えウイルスは、免疫原性組成物またはワクチンの生産に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルスのゲノム中に発現カセットを含む組換えウイルスであって、発現カセットは、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および組換えウイルスの必須の遺伝子またはその機能的な断片である第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの上流に位置しており、前記第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルス中で活性な、前記必須の遺伝子またはその機能的な断片の唯一のコピーである、組換えウイルス。
【請求項２】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが、同じＯＲＦ内である、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項３】
第２のポリヌクレオチドが、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子である、請求項１または２に記載の組換えウイルス。
【請求項４】
第２のポリヌクレオチドが、外因性であり、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子が、サイレンシングされている、請求項１または２に記載の組換えウイルス。
【請求項５】
第１のポリヌクレオチドが、抗原性のポリペプチドまたは治療用ポリペプチドをコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項６】
抗原性のポリペプチドが、ＦＭＤＶ抗原、ＰＲＲＳＶ抗原、ＤＥＶ抗原、およびＰＲＶ抗原からなる群から選択され、好ましくはＦＭＤＶ抗原である、請求項５に記載の組換えウイルス。
【請求項７】
第１のポリヌクレオチドが、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項８】
組換えウイルスが、ヘルペスウイルス科、例えばウマアルファヘルペスウイルス１（ＥＨＶ−１）、ウマアルファヘルペスウイルス４（ＥＨＶ−４）、ならびに他のワリセロウイルス属、例えば仮性狂犬病ウイルス（ＰｒＶ）およびウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）、アデノウイルス科（ＡｄＶ）、例えばイヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス科、レンチウイルス科、例えばレトロウイルス、ならびにポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルス由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項９】
ウイルスが、ヘルペスウイルス科のメンバー、好ましくはアルファヘルペスウイルス属のメンバー、より好ましくはワリセロウイルス亜属のメンバー、最も好ましくはウマアルファヘルペスウイルス１（ＥＨＶ−１）のメンバーである、請求項８に記載の組換えウイルス。
【請求項１０】
組換えウイルスが、ＥＨＶ−１由来であり、第１のポリヌクレオチドが、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項１１】
必須の遺伝子が、キャプシドタンパク質、ＤＮＡ複製関連のタンパク質、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡレプリカーゼ、受容体結合タンパク質、およびＥｇｒｅｓｓ関連タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項１２】
組換えウイルスが、ＥＨＶ−１由来であり、第１のポリヌクレオチドが、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含み、必須の遺伝子が、ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子またはＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子である、請求項１１に記載の組換えウイルス。
【請求項１３】
第１のポリヌクレオチドが、リンカーを介して第２のポリヌクレオチドに連結されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項１４】
リンカーが、フレキシブルなリンカー、または２Ａ遺伝子であってもよく、好ましくは２Ａ遺伝子である、請求項１３に記載の組換えウイルス。
【請求項１５】
第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドに直接連結されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項１６】
発現カセットが、調節エレメント、例えばプロモーター、好ましくはＣＭＶ５プロモーターをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項１７】
発現カセットが、Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ４３コンストラクトまたはＰ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ５４コンストラクト、好ましくは、ＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ４３−ＢＧＨコンストラクトまたはＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ５４−ＢＧＨコンストラクト、より好ましくは、配列番号８で示されるＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ４３−ＢＧＨコンストラクトまたは配列番号９で示されるＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ５４−ＢＧＨコンストラクトを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスを調製するための方法であって、組換えウイルスのゲノム中に発現カセットを構築することを含み、発現カセットは、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および組換えウイルスの必須の遺伝子またはその機能的な断片である第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの上流に位置しており、前記第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルス中で活性な、前記必須の遺伝子またはその機能的な断片の唯一のコピーである、方法。
【請求項１９】
組換えウイルス内の目的のポリペプチドの発現安定性を増加させるための方法であって、組換えウイルスのゲノム中に発現カセットを構築することを含み、発現カセットは、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および組換えウイルスの必須の遺伝子またはその機能的な断片である第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの上流に位置しており、前記第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルス中で活性な、前記必須の遺伝子またはその機能的な断片の唯一のコピーである、方法。
【請求項２０】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが、同じＯＲＦ内である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第２のポリヌクレオチドが、組換えウイルスのゲノム中に天然に存在する必須の遺伝子である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２のポリヌクレオチドが、外因性であり、組換えウイルスのゲノム中に天然に存在する必須の遺伝子が、サイレンシングされている、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
第１のポリヌクレオチドが、抗原性のポリペプチドまたは治療用ポリペプチドをコードする、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
抗原性のポリペプチドが、ＦＭＤＶ抗原、ＰＲＲＳＶ抗原、ＤＥＶ抗原、およびＰＲＶ抗原からなる群から選択され、好ましくはＦＭＤＶ抗原である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第１のポリヌクレオチドが、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
組換えウイルスが、ヘルペスウイルス科、例えばウマアルファヘルペスウイルス１（ＥＨＶ−１）、ウマアルファヘルペスウイルス４（ＥＨＶ−４）、ならびに他のワリセロウイルス属、例えば仮性狂犬病ウイルス（ＰｒＶ）およびウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）、アデノウイルス科（ＡｄＶ）、例えばイヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス科、レンチウイルス科、例えばレトロウイルス、ならびにポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルス由来である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ウイルスが、ヘルペスウイルス科のメンバー、好ましくはアルファヘルペスウイルス属のメンバー、より好ましくはワリセロウイルス亜属のメンバー、最も好ましくはウマアルファヘルペスウイルス１（ＥＨＶ−１）のメンバーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
組換えウイルスが、ＥＨＶ−１由来であり、第１のポリヌクレオチドが、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
必須の遺伝子が、キャプシドタンパク質、ＤＮＡ複製関連のタンパク質、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡレプリカーゼ、受容体結合タンパク質、およびＥｇｒｅｓｓ関連タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
組換えウイルスが、ＥＨＶ−１由来であり、第１のポリヌクレオチドが、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含み、必須の遺伝子が、ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子またはＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１のポリヌクレオチドが、リンカーを介して第２のポリヌクレオチドに連結されている、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
リンカーが、フレキシブルなリンカー、または２Ａ遺伝子であってもよく、好ましくは２Ａ遺伝子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドに直接連結されている、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
発現カセットが、他の調節エレメント、例えばプロモーター、ポリＡなど、好ましくはプロモーター、より好ましくはＣＭＶ５プロモーターをさらに含む、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
発現カセットが、Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ４３コンストラクトまたはＰ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ５４コンストラクト、好ましくは、ＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ４３−ＢＧＨコンストラクトまたはＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ５４−ＢＧＨコンストラクト、好ましくは、配列番号８で示されるＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ４３−ＢＧＨコンストラクトまたは配列番号９で示されるＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ５４−ＢＧＨコンストラクトを含む、請求項１９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスを含む宿主細胞であって、好ましくは、宿主細胞は、真核宿主細胞株であり；より好ましくは、宿主細胞株は、哺乳類細胞株または昆虫細胞株であり；最も好ましくは、宿主細胞株は、ＲＫ１３細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＳＴ細胞株、ＡＩ−ＳＴ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１、ＭＤＣＫ細胞株、および／またはそれらの派生株である、宿主細胞。
【請求項３７】
請求項３６に記載の宿主細胞を調製する方法であって、以下：
ａ．宿主細胞株を、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスに感染させる工程、および
ｂ．感染細胞を、好適な条件下で培養する工程
を特徴とし、
ｃ．前記宿主細胞を回収する工程
を特徴としてもよい方法。
【請求項３８】
ａ．請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルス、および／または
ｂ．請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスによって発現された目的のポリペプチド
を含み、
ｂ．医薬的または獣医学的な許容できる担体または賦形剤
を含んでいてもよい免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチン組成物であって、好ましくは、前記担体は、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適である、組成物。
【請求項３９】
免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチン組成物を調製するための方法であって、以下：
ａ．請求項３６に記載の宿主細胞を、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスに感染させる工程、
ｂ．感染細胞を、好適な条件下で培養する工程、および
ｃ．感染細胞を回収する工程
を含み、
ｄ．工程ｃ）の回収物を精製する工程
を含んでいてもよく、
ｅ．前記回収物を、医薬的に許容される担体と混合する工程
を含んでいてもよい方法。
【請求項４０】
回収物が、感染細胞によって生産された組換えウイルスであるか、または回収物が、組換えウイルスによって発現された目的のポリペプチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
動物における病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を防止および／もしくは処置するための、または動物における病原体の感染を処置もしくは防止する方法で使用するための、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチン組成物の調製における請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスの使用であって、好ましくは、前記動物は、食物生産動物、例えばブタである、使用。
【請求項４２】
動物における病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を低減もしくは防止する方法で使用するための、または動物における病原体の感染を処置もしくは防止する方法で使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスまたは請求項３８に記載の免疫原性組成物、医薬組成物もしくはワクチン組成物であって、好ましくは、前記動物は、食物生産動物、例えばブタである、組換えウイルスまたは組成物。
【請求項４３】
動物、例えば食物生産動物、例えばブタまたはウシを、前記動物における病原体によって引き起こされる疾患に対して免疫化、処置または防止する方法であって、動物に、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスまたは請求項３８に記載の免疫原性組成物、医薬組成物もしくはワクチン組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項４４】
動物、好ましくは食物生産動物、例えばブタまたはウシに、動物における病原体に関連する疾患に対してワクチン接種をするための、および／または動物における病原体に関連する、またはそれによって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減させるためのキットであって、
ａ．前記動物に、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスまたは請求項３８に記載の免疫原性組成物、医薬組成物もしくはワクチン組成物を投与することが可能なディスペンサー；および
ｂ．請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えウイルスまたは請求項３８に記載の免疫原性組成物、医薬組成物もしくはワクチン組成物
を含み、
ｃ．指示リーフレット
を含んでいてもよいキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関し、特に標的タンパク質を安定して発現できる組換えウイルス、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）は、ピコルナウイルス科のアフトウイルス属に属するリボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスである（Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180）。直径約２５ｎｍの裸の正二十面体ウイルスとして、ＦＭＤＶは、正極性を有する約８５００ヌクレオチドからなる一本鎖ＲＮＡ分子を含有する。このＲＮＡ分子は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、これは、とりわけタンパク質Ｐ１としても公知のキャプシド前駆体を含有する単一のポリタンパク質をコードする。タンパク質Ｐ１は、そのアミノ末端でミリスチル化されている。成熟プロセス中、タンパク質Ｐ１は、プロテアーゼ３Ｃによって、ＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３として公知の３つのタンパク質に切断される（Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261）。ビリオン中で、タンパク質ＶＰ０は次いで、２つのタンパク質、ＶＰ４およびＶＰ２に切断される。タンパク質ＶＰ０がＶＰ４およびＶＰ２に変換されるメカニズム、および成熟ビリオン形成のメカニズムは、わかっていない。タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、約２６，０００Ｄａの分子量を有するが、タンパク質ＶＰ４は、それより小さく、約８，０００Ｄａである。
ＦＭＤが流行している地域では、ワクチン接種が、疾患を制御するための有効かつ主要な手段である。現在の商業的なＦＭＤＶに対するワクチンは、主として、不活性化された全ＦＭＤＶワクチンである。このようなワクチンの生産は、高度な封じ込め施設における大量の毒性ＦＭＤＶの増殖を必要とするが、これは、維持に費用がかかり、生きたＦＭＤＶを放出する潜在的なリスクを有する。加えて、一部の野外株は、浮遊ＢＨＫ細胞に適合させ、高い力価を達成することが難しい。全不活性化ワクチンの別の問題は、このようなワクチンは、特にブタにおいて、免疫応答を効果的に刺激できないことがあり、したがって定期的なブースター注射を必要とすることである。
【０００３】
新規のＦＭＤワクチンの１つは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベースのワクチンである。ＶＬＰは、前駆タンパク質Ｐ１−２Ａに由来するため、無傷のウイルス上に提示される免疫原性部位のレパートリー全体を含有し、動物においてビリオンと同等に免疫原性である。ＶＬＰは、核酸を欠失しており、感染性ではないため、ＶＬＰベースのワクチンは、動物における生産および使用の観点で高い安全性プロファイルを有する。ＦＭＤＶのＶＬＰは、異なる発現系およびベクターを使用して発現させることができ、サブユニットワクチンとして送達することができる（Luis L. Rodriguez and Marvin J. Grubman, Foot and mouth disease virus vaccines, Vaccine 27 (2009) D90-D94）。安全性および簡単な調製にもかかわらず、ＶＬＰベースのサブユニットワクチンは、疾患に対する長期にわたる免疫性をうまく誘導できないことがある。生ワクチンは、１または２回の投与で免疫性を付与できるが、それに対してＶＬＰベースのサブユニットワクチンは、特定された期間にわたり繰り返しの投与が必要になる可能性がある。
【０００４】
ＶＬＰベースの生きたベクターを用いたワクチンは、ＦＭＤＶ制御のための有望なワクチン候補として期待される。ＦＭＤＶ  ＶＬＰベースの生きたベクターを用いたワクチンを開発するために、ＶＬＰをコードする遺伝子を含有する組換えウイルスを構築すべきである。ＶＬＰをコードする遺伝子は、組換えウイルスの複製中にＶＬＰが発現され自動的に集合できるように、Ｐ１−２Ａ前駆遺伝子および３Ｃプロテアーゼ遺伝子で構成されるべきである。残念なことに、Ｐ１−２Ａ遺伝子は、組換えウイルス、例えばアデノウイルスの連続的な継代中に安定して維持できないことが見出され、それゆえに、ＶＬＰの収量およびワクチン効能に悪影響を与えると予想される。（L. Robinson, T. J. D. Knight-Jones, B. Charleston. Global Foot-and-Mouth Disease Research Update and Gap Analysis: 3 - Vaccines. Transboundary and Emerging Diseases (2016) P30-41）。
インビトロでのその連続的な継代中に、組換えウイルス中でＶＬＰをコードする遺伝子を安定して維持することを可能にする、ＶＬＰをコードする遺伝子を含有する組換えウイルスを開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
上述した技術的な問題の解決法は、説明と特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって達成され、その異なる態様の発明は、特許請求の範囲に従って実行される。
一般的に、本発明は、標的遺伝子の発現安定性を増加させるための、組換えウイルスおよび関連方法を提供する。
【０００６】
上述の組換えウイルスにおいて、標的遺伝子は、標的遺伝子と必須の遺伝子とが共発現できるように、組換えウイルスの必須の遺伝子に機能的に連結され、必須の遺伝子の上流に位置するように設計される。例えば、標的遺伝子は、同じＯＲＦ内で組換えウイルスの必須の遺伝子の上流に挿入でき、したがって標的遺伝子は、組換えウイルスが複製できる限り必須の遺伝子と共に安定して共発現されることになる。標的遺伝子発現がない、または標的遺伝子中に何らかのアウトオブフレーム突然変異がある組換えウイルスは、複製できないことになる。一実施形態において、組換えウイルスは、ヘルペスウイルス科由来であり、特にウマアルファヘルペスウイルス１（ＥＨＶ−１）由来である。一実施形態において、標的遺伝子は、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含む。本発明の説明の文脈中で、用語「標的遺伝子」および「第１のポリヌクレオチド」は、交換可能であり、用語「必須の遺伝子」および「第２のポリヌクレオチド」は、交換可能である。
【０００７】
上述の組換えウイルスを使用することによって、標的遺伝子は、それを含有する組換えウイルスによって安定して発現され得る。
本発明はまた、本発明の組換えウイルスを含む宿主細胞、およびその調製方法も提供する。
本発明はまた、本発明の組換えウイルスおよび／または本発明の組換えウイルスによって発現される目的のポリペプチドを含む、免疫原性組成物、医薬組成物、もしくはワクチン組成物、ならびにその調製方法も提供する。本発明はまた、免疫原性／医薬／ワクチン組成物の調製における本発明の組換えウイルスの使用も提供する。
本発明はまた、動物に、本発明の組換えウイルスまたは本発明の免疫原性／医薬／ワクチン組成物を投与することによる、動物におけるウイルスによって引き起こされる臨床徴候の処置および／または予防のための方法も提供する。
本発明はさらに、動物、例えばブタなどの食物生産動物を免疫化するための方法であって、このような動物に、本発明の組換えウイルスまたは本発明の免疫原性／医薬／ワクチン組成物を投与することを含む方法に関する。
【０００８】
以下の図面は、明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。これらの図面の１つまたは複数を、本明細書で示された具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、本発明をよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】必須の遺伝子のトランスロケーションの概念の図解である。Ａ：必須の遺伝子を欠失させ、標的遺伝子と共にトランスロケーションさせる；およびＢ：標的遺伝子はまた、元の位置の必須の遺伝子の上流に挿入されてもよい。
【図２】ＦＭＤＶ  Ｐ１２Ａ３Ｃカセットの設計を示す図である。
【図３】トランスファープラスミドの構築手順を例示する図である。標的遺伝子Ｐ１２Ａ３Ｃを合成し、ベクターｐＵＣ１９−ＣＭＶ５−ＯＲＦ１／３−リンカーにクローニングして、ｐＵＣ１９−ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃを得た。ＥＨＶ−１の必須の遺伝子ＯＲＦ４３またはＯＲＦ５４も合成し、ｐＵＣ１９−ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃにクローニングして、最終的なトランスファープラスミドを得て、これを使用して組換えＥＨＶ−１を生成した。
【図４】ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ４３−ＢＧＨのゲル電気泳動の結果を示す図である。トランスファープラスミドの制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩでの消化。消化後、約７ｋｂの標的断片が放出され、これを組換えに使用した。
【図５】遺伝子ＯＲＦ４３またはＯＲＦ５４をＥＨＶ−１ベクターから欠失させたところ、欠失突然変異ウイルスは、インビトロで複製できなかった。対照として、ＥＨＶ−１野生型は、容易に救出され、トランスフェクションの２日後によく増殖することができた。救出されたウイルスがＥＧＦＰ遺伝子を含有するため、プラークは緑色蛍光を示す。
【図６】ＯＲＦ４３遺伝子がトランスロケーションした組換えＥＨＶ−１の遺伝子構造を示す図である。ＯＲＦ４３遺伝子をその元の位置から欠失させ、ＦＭＤＶ  Ｐ１２Ａ３Ｃ遺伝子の下流にトランスロケーションさせた。
【図７】ＩＦＡによるＦＭＤＶタンパク質発現およびＥＨＶ−１  ＯＲＦ７１回復の確認を示す図である。ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３またはＯＲＦ５４がトランスロケーションした組換えウイルスは、トランスフェクション後に救出することができた。ＦＭＤＶ標的タンパク質の発現は、ＩＦＡによって確認された。ＥＨＶ−１ｇｐ２を染色したところ、ＥＨＶ−１プラークの存在が示された。
【図８】一連の組換えＥＨＶ−１を標準的な設計を用いて構築したが、標的タンパク質を安定して発現できないことを示す図である。（Ａ）二重のＩＦＡによって、陰性ＥＨＶ−１プラークが見出された；（Ｂ）陰性プラークのシーケンシングは、結果として下流の遺伝子のアウトオブフレーム突然変異を引き起こす単一のヌクレオチド酸欠失を含むランダムな遺伝学的変化を示した。
【図９】標的ＦＭＤＶタンパク質とＥＨＶ−１タンパク質の両方を発現できるプラークを示す代表的な二重のＩＦＡの結果の図解を示す図である。
【図１０】組換えウイルスの異なる継代レベルからのＦＭＤＶ  ＶＬＰの検出を示す図である。
【図１１】Ａ：標的遺伝子発現カセットおよびプライマーの位置の図解；Ｂ：組換えウイルスの異なる継代レベルからのＰＣＲ結果を示す図である。
【図１２】親のＥＨＶ−１と比較した組換えＥＨＶ−１のインビトロにおける一段階の増殖速度論を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、組換えウイルスのゲノム中に発現カセットを含む組換えウイルスであって、発現カセットは、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および組換えウイルスの必須の遺伝子またはその機能的な断片である第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの上流に位置しており、前記第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルス中で活性な、前記必須の遺伝子またはその機能的な断片の唯一のコピーである、組換えウイルスに関する。
本発明はまた、組換えウイルスを調製するための方法であって、組換えウイルスのゲノム中に発現カセットを構築することを含み、発現カセットは、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および組換えウイルスの必須の遺伝子またはその機能的な断片である第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの上流に位置しており、前記第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルス中で活性な、前記必須の遺伝子またはその機能的な断片の唯一のコピーである、方法にも関する。
【００１１】
本発明はさらに、組換えウイルス内の目的のポリペプチドの発現安定性を増加させるための方法であって、組換えウイルスのゲノム中に発現カセットを構築することを含み、発現カセットは、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および組換えウイルスの必須の遺伝子またはその機能的な断片である第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの上流に位置しており、前記第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルス中で活性な、前記必須の遺伝子またはその機能的な断片の唯一のコピーである、方法に関する。
【００１２】
本発明の組換えウイルスは、標的遺伝子と組換えウイルスの必須の遺伝子との共発現という新しい概念に基づいて構築される。標的遺伝子と組換えウイルスの必須の遺伝子との共発現は、標的タンパク質の安定な発現に有用であることが期待される。組換えウイルスの複製は、標的遺伝子の発現に依存し、順に標的遺伝子の発現を安定にすると予想される。組換えウイルスが標的遺伝子の発現を喪失しているか、または標的遺伝子中に何らかのアウトオブフレーム突然変異を有する場合、下流の必須の遺伝子は、どちらも機能的に発現されないと予想され、結果として組換えウイルスは、複製できないと予想される。すなわち、機能的に一緒に組み合わせることによって、標的遺伝子は、複製選択圧力下で安定して発現されると予想される。
【００１３】
標的遺伝子と組換えウイルスの必須の遺伝子との共発現は、標的遺伝子を必須の遺伝子に機能的に連結させることによって達成することができる。例示的な実施形態において、標的遺伝子および必須の遺伝子は、同じＯＲＦ内に位置するように設計することができる。したがって、一実施形態において、本発明の組換えウイルスの第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、同じＯＲＦ内である。
標的遺伝子の必須の遺伝子への機能的な連結を達成するための２つの例示的な選択肢がある。第１の選択肢は、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子（すなわち組換えウイルスのゲノム中に天然に存在する必須の遺伝子）を欠失させるかまたはサイレンシングし、標的遺伝子が必須の遺伝子に機能的に連結されるように、標的遺伝子の下流に外因的に導入される同じ必須の遺伝子を挿入することである。したがって、一実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、外因性であり、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子は、サイレンシングされている。第２の選択肢は、標的遺伝子が必須の遺伝子に機能的に連結されるように、ウイルスの内因性の必須の遺伝子の上流に標的遺伝子を挿入することである。したがって、一実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子である。
【００１４】
一実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子である。別の実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、外因性であり、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子は、サイレンシングされている。
一実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、抗原性のポリペプチドまたは治療用ポリペプチドをコードする。抗原性のポリペプチドは、例えば、ＦＭＤＶ抗原、ＰＲＲＳＶ抗原、ＤＥＶ抗原、およびＰＲＶ抗原からなる群から選択することができ、好ましくはＦＭＤＶ抗原である。一実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含む。一実施形態において、Ｐ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１によって示される。一実施形態において、２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２によって示される。一実施形態において、３Ｃ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３によって示される。一実施形態において、Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子カセットのヌクレオチド配列は、配列番号４によって示される。
【００１５】
一実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルスの必須の遺伝子またはその機能的な断片である。必須の遺伝子は、その複製にとって重要であると考えられる生物の遺伝子である。ウイルスに関して、必須の遺伝子としては、これらに限定されないが、キャプシドタンパク質、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡレプリカーゼなどをコードする遺伝子が挙げられる。一実施形態において、必須の遺伝子は、例えば、キャプシドタンパク質、ＤＮＡ複製関連のタンパク質、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡレプリカーゼ、受容体結合タンパク質、およびＥｇｒｅｓｓ関連タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。一実施形態において、必須の遺伝子は、ＥＨＶ−１のゲノム由来である。一実施形態において、必須の遺伝子は、ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子またはＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子である。一実施形態において、ＯＲＦ４３遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５によって示される。一実施形態において、ＯＲＦ５４遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６によって示される。
一実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、リンカーを介して第２のポリヌクレオチドに連結されている。一実施形態において、リンカーは、フレキシブルなリンカー、例えば（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー、または２Ａ遺伝子であってもよく、好ましくは２Ａ遺伝子である。一実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに直接連結されている。一実施形態において、発現カセットは、「第１のポリヌクレオチド−リンカー−第２のポリヌクレオチド」の構造により示されるコンストラクトを含む。
【００１６】
一実施形態において、組換えウイルスは、例えばヘルペスウイルス科、例えばウマアルファヘルペスウイルス１（ＥＨＶ−１）、ウマアルファヘルペスウイルス４（ＥＨＶ−４）およびウシアルファヘルペスウイルス１（ウシヘルペスウイルス１、ＢＨＶ−１）から選択されるウイルス由来である。一実施形態において、組換えウイルスは、ヘルペスウイルス科のメンバー、好ましくはアルファヘルペスウイルス属のメンバー、より好ましくはワリセロウイルス亜属のメンバーから選択されるウイルス由来であり、最も好ましくは前記組換えウイルスは、ウマアルファヘルペスウイルス１（ＥＨＶ−１）由来である。
【００１７】
一実施形態において、組換えウイルスは、ＥＨＶ−１由来であり、第１のポリヌクレオチドは、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含む。一実施形態において、Ｐ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１によって示される。一実施形態において、２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２によって示される。一実施形態において、３Ｃ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３によって示される。一実施形態において、Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子カセットのヌクレオチド配列は、配列番号４によって示される。一実施形態において、組換えウイルスは、ＥＨＶ−１由来であり、必須の遺伝子は、ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子またはＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子である。一実施形態において、ＯＲＦ４３遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５によって示される。一実施形態において、ＯＲＦ５４遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６によって示される。一実施形態において、組換えウイルスは、ＥＨＶ−１由来であり、必須の遺伝子は、ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子またはＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子であり、第１のポリヌクレオチドは、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含む。
【００１８】
一実施形態において、発現カセットは、例えば調節エレメント、例えばプロモーター、ターミネーターなどをさらに含む。一実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。一実施形態において、ターミネーターは、ポリＡ（ポリアデニル化）シグナルであり、好ましくはＢＧＨ（ウシ成長ホルモン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｇｒｏｕｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ））ポリＡシグナルである。一実施形態において、ＢＧＨポリＡシグナルのヌクレオチド配列は、配列番号７によって示される。
【００１９】
一実施形態において、発現カセットは、「プロモーター−第１のポリヌクレオチド−第２のポリヌクレオチド−ターミネーター」の構造により示されるコンストラクトを含む。一実施形態において、発現カセットは、「プロモーター−第１のポリヌクレオチド−リンカー−第２のポリヌクレオチド−ターミネーター」の構造により示されるコンストラクトを含む。一実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、好ましくはＣＭＶ５プロモーターである。一実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、標的遺伝子であり、ＦＭＤＶのＰ１遺伝子、２Ａ遺伝子および３Ｃ遺伝子を含むかまたはからなる。一実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、必須の遺伝子であり、ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子またはＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子である。一実施形態において、ターミネーターは、ＢＧＨである。一実施形態において、リンカーは、２Ａ遺伝子である。一実施形態において、発現カセットは、ＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ４３−ＢＧＨコンストラクトを含むかまたはからなる。一実施形態において、発現カセットは、ＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ５４−ＢＧＨコンストラクトを含むかまたはからなる。一実施形態において、ＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ４３−ＢＧＨコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号８を含むか、またはそれによって示される。一実施形態において、ＣＭＶ−Ｐ１−２Ａ−３Ｃ−２Ａ−ＯＲＦ５４−ＢＧＨコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号９を含むか、またはそれによって示される。
【００２０】
本発明はさらに、本発明の組換えウイルスを含む宿主細胞に関する。本発明の宿主細胞は、本発明による組換えウイルスの複製を許容することを特徴とする真核宿主細胞株を含む。一実施形態において、前記宿主細胞株は、哺乳類細胞株または昆虫細胞株であり、最も好ましくは、ＲＫ１３細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＳＴ細胞株、ＡＩ−ＳＴ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１、ＭＤＣＫ細胞株、および／またはそれらの派生株である。一実施形態において、宿主細胞株は、ＭＤＢＫ細胞株である。
本発明はさらに、宿主細胞を調製する方法であって、以下：ａ）．真核宿主細胞株を本発明の組換えウイルスに感染させる工程；およびｂ）．感染細胞を、好適な条件下で培養する工程を特徴とし、ｃ）．前記宿主細胞を回収する工程を特徴としてもよい方法に関する。
上記で列挙したような哺乳類宿主細胞株は、一般的に、イーグル塩類およびウシ胎児血清が補充された最小必須培地（ＭＥＭ）などの哺乳類細胞培養のための培地中に浸されたプラスチック組織培養容器中で培養される。哺乳類細胞株は、３７℃で、５％ＣＯ２が補充された通例の雰囲気およびおよそ８０％の湿度中で、インキュベーター中で維持される。昆虫細胞株は、昆虫細胞培養培地中に浸されたプラスチック組織培養容器中で培養され、２７℃で、通例の雰囲気中、インキュベーター中で維持される。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の組換えウイルスおよび／または本発明の組換えウイルスによって発現される目的のポリペプチドを含む、免疫原性組成物、医薬組成物、もしくはワクチン組成物に関する。一実施形態において、免疫原性／医薬／ワクチン組成物は、ａ）．本発明の組換えウイルス；および／またはｂ）．本発明の組換えウイルスによって発現される目的のポリペプチドを含み；ｃ）．医薬的または獣医学的な許容できる担体または賦形剤を含んでいてもよく、好ましくは、前記担体は、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適である。
本発明はさらに、免疫原性／医薬／ワクチン組成物を生産するための方法であって、以下：ａ）．本発明の宿主細胞株を、本発明の組換えウイルスに感染させる工程；ｂ）．感染細胞を、好適な条件下で培養する工程；およびｃ）．感染細胞を回収する工程を含み；ｄ）．工程ｃ）の回収物を精製する工程を含んでいてもよく；ｅ）．前記回収物を、医薬的に許容される担体と混合する工程を含む方法に関する。一実施形態において、回収物は、感染細胞によって生産された組換えウイルスであるか、または回収物は、組換えウイルスによって発現された目的のポリペプチドである。
本発明はさらに、免疫原性／医薬／ワクチン組成物の調製における本発明の組換えウイルスの使用に関する。一実施形態において、免疫原性／医薬／ワクチン組成物は、動物における病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を防止および／もしくは処置するために、または動物における病原体の感染を処置もしくは防止する方法で使用するために使用され、好ましくは、前記動物は、食物生産動物、例えばブタである。
本発明はさらに、動物における病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を低減もしくは防止する方法で使用するための、または動物における病原体の感染を処置もしくは防止する方法で使用するための、本発明の組換えウイルスまたは本発明の免疫原性／医薬／ワクチン組成物に関し、好ましくは、前記動物は、食物生産動物、例えばブタである。
【００２２】
本発明はさらに、動物、例えばブタなどの食物生産動物を免疫化するための方法であって、このような動物に、本発明の組換えウイルスまたは本発明の免疫原性／医薬／ワクチン組成物を投与することを含む方法に関する。
本発明はさらに、動物、例えばブタなどの食物生産動物を、前記動物における病原体によって引き起こされる臨床疾患に対して免疫化する方法であって、動物に、本発明の組換えウイルスまたは本発明の免疫原性／医薬／ワクチン組成物を投与する工程を含み、それによって、前記組換えウイルスまたは前記免疫原性／医薬／ワクチンは、感染の臨床徴候を引き起こさず、しかし前記病原体の病原性の形態に対して動物を免疫化する免疫応答を誘導することが可能である、方法に関する。
【００２３】
一実施形態において、免疫化は、獣群における特定のウイルス感染の発生率を低くすること、または特定のウイルス感染によって引き起こされるかまたはそれに関連する臨床徴候の重症度を低減することをもたらす。
さらに、その必要がある食物生産動物の、本明細書で提供される免疫原性組成物での免疫化は、食物生産動物のウイルス感染の防止をもたらす。さらにより好ましくは、免疫化は、前記ウイルス感染に対する有効な長期にわたる免疫応答をもたらす。その期間は、２カ月より長く、好ましくは３カ月より長く、より好ましくは４カ月より長く、より好ましくは５カ月より長く、より好ましくは６カ月より長く続くことが理解されると予想される。免疫化は、免疫化された全ての動物／対象で有効ではない可能性があることが理解されると予想される。しかしながら、この用語は、獣群の動物／対象のかなりの部分が効果的に免疫化されることを必要とする。
【００２４】
本発明はさらに、その必要がある動物、例えば食物生産動物におけるウイルスによって引き起こされる臨床徴候の処置または予防のための方法であって、動物に、治療有効量の本発明の組換えウイルスまたは本発明の免疫原性／医薬／ワクチン組成物を投与することを含む方法に関する。
好ましくは、臨床徴候は、処置または防止されていない（免疫化されていない）が、その後ウイルスに感染させた動物と比較して、少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％低減される。
一実施形態において、上述したような臨床徴候または疾患は、アフトウイルス属およびアルファヘルペスウイルス属のウイルスによって引き起こされる、好ましくはＦＭＤＶによって引き起こされる。
【００２５】
本発明はさらに、動物、好ましくは食物生産動物、例えばブタまたはウシに、動物における病原体に関連する疾患に対してワクチン接種をするための、および／または動物における病原体に関連する、またはそれによって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減させるためのキットに関する。本発明のキットは、ａ）．前記動物に、ワクチンを投与することが可能なディスペンサー；およびｂ）．本発明の免疫原性／医薬／ワクチン組成物を含み、ｃ）．指示リーフレットを含んでいてもよい。
【００２６】
一般的な定義
別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、出願時において本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は明確であるべきであるが、何らかの潜在的なあいまいさがある場合、本明細書で提供される定義が、いずれの辞書または外部の定義より優先される。さらに、文脈上別段の要求がなされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において、「または」の使用は、別段の指定がない限り「および／または」を意味する。さらに、用語「含むこと」、加えて「含む」および「含まれる」などの他の形態の使用は、非限定的である。本明細書で言及された全ての特許および公報は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２７】
本発明の実施は、別段の指定がない限り、当業界の技術の範囲内の、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学および免疫学の従来の技術を採用すると予想される。このような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Protein purification methods-a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照されたい。
【００２８】
また、本明細書において使用される用語は、単に本発明の特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解されるものとする。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかにそうではないことを指示しない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は、２種またはそれより多くの抗原の混合物を含み、「賦形剤（ａｎ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」への言及は、２種またはそれより多くの賦形剤の混合物を含み、他も同様である。
【００２９】
分子生物学の定義
用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ＲＮＡ配列」または「ＤＮＡ配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドならびにそれらの断片および部分、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、これらは、一本鎖または二本鎖であってもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表す。配列は、非コード配列、コード配列またはその両方の混合物であってもよい。本発明の核酸配列は、当業者周知の標準的な技術を使用して調製することができる。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」はまた、５種の生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成される核酸を含む場合もある。
【００３０】
用語「ポリペプチド」は、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体の生物学的に存在する短鎖である。本発明の文脈において、指定がない限り、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、交換可能である。
用語「目的のポリペプチド」は、目的の生成物をコードするあらゆる長さのポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを指す。具体的な態様において、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、外因性である。定義によれば、組換えウイルスに含有される全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子、およびそれによってコードされたそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、特にそれが異なる（ウイルス）種に由来する場合、「外因性」、「外因性配列」、「外因性遺伝子」、「外因性コード配列」または「導入遺伝子」と称される。具体的な態様において、目的のポリペプチドは、抗原性のポリペプチドまたは治療用ポリペプチドである。具体的な態様において、目的のポリペプチドは、ＦＭＤＶ抗原である。本発明の文脈において、指定がない限り、用語「目的のポリペプチド」および「標的タンパク質」は、交換可能である。
【００３１】
用語「ベクター」は、当業界において公知の通り、遺伝物質を宿主細胞に送るのに使用されるポリヌクレオチドコンストラクト、典型的には、プラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドであり得る。本明細書で使用されるベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで構成されていてもよいし、またはそれらを含有していてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、ＤＮＡで構成される。一部の実施形態において、ベクターは、感染性ウイルスである。このようなウイルスベクターは、細胞培養物中でも宿主動物中でもウイルスベクターの複製における機能を有さない外来遺伝子を有するように操作されたウイルスゲノムを含有する。具体的な態様において、ベクターは、単なる遺伝物質の伝達、宿主細胞もしくは生物のトランスフェクション、標的遺伝子の発現、ワクチン、例えばＤＮＡワクチンとしての使用、または遺伝子発現の目的などの様々な目的のために使用することができる。遺伝子発現は、遺伝子と呼ばれる具体的なポリヌクレオチド配列の指示に従った細胞におけるタンパク質の生合成のことを記述する用語である。具体的な態様において、ベクターは、「発現ベクター」であってもよく、これは、それが適切な環境中に存在する場合、ベクターによって運搬される１つまたは複数の遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を指示することが可能なベクターである。
【００３２】
ベクターおよび発現のためにベクター（または組換え体）を作製および／または使用するための方法は、以下で開示された方法であってもよいし、またはそれらに類似したものであってもよい：米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号、第５，３３８，６８３号、第５，４９４，８０７号、第４，７２２，８４８号、第５，９４２，２３５号、第５，３６４，７７３号、第５，７６２，９３８号、第５，７７０，２１２号、第５，９４２，２３５号、第３８２，４２５号、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１６７１６、ＷＯ９６／３９４９１、ＷＯ９５／３００１８；Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update," PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Ｓｍｉｔｈら、米国特許第４，７４５，０５１号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；EPA0 370 573；１９８６年１０月１６日に出願された米国特許出願第９２０，１９７号；欧州特許公報第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；米国特許第５，５９１，４３９号、第５，５５２，１４３号；ＷＯ９８／００１６６；両方とも１９９６年７月３日に出願された、許諾された米国特許出願第０８／６７５，５５６号、および０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ  ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；ならびに米国特許第５,５９１,６３９号、第５,５８９,４６６号、および第５,５８０,８５９号、加えて、ＷＯ９０/１１０９２、ＷＯ９３/１９１８３、ＷＯ９４/２１７９７、ＷＯ９５/１１３０７、ＷＯ９５/２０６６０；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, inter alia. See also WO 98/33510；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)；Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，���５０号；Fischbachet al. (Intracel)；ＷＯ９０／０１５４３；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)；Ｓｚｏｋａら、米国特許第４，３９４，４４８号（生きた細胞にＤＮＡを挿入する方法）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、米国特許第５，６７７，１７８号（細胞変性ウイルスの使用）；ならびに米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）；加えて本明細書において引用された他の文書。
【００３３】
用語「ウイルスベクター」は、その宿主細胞への侵入が、結果として具体的な生物学的活性、例えばベクターによって運搬される外来標的遺伝子の発現をもたらすことが可能になるような方法で組換えＤＮＡ技術によって操作された遺伝子改変されたウイルスのことを述べている。ウイルスベクターは、標的細胞、組織、または生物中で、複製能を有していてもよいし、または有していなくてもよい。ウイルスベクターは、あらゆる公知の生物のゲノム由来の配列を取り込んでいてもよい。その配列は、その天然型で取り込まれていてもよいし、または所望の活性を得るあらゆる方法で改変されていてもよい。例えば、その配列は、挿入、欠失または置換を含んでいてもよい。ウイルスベクターはまた、外因性ポリヌクレオチド配列のための挿入部位を取り込んでいてもよい。具体的な態様において、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス科であり、例えばＥＨＶ−１である。
ウイルスベクターの生成は、当業界において周知のあらゆる好適な遺伝子工学技術、例えば、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡシーケンシング、細胞培養でのトランスフェクションの標準的な技術など、例えばSambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)）またはK. MaramoroschおよびH. Koprowski（Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014)）に記載されたようなものを使用して達成することができる。
【００３４】
用語「組換えウイルス」は、ウイルスゲノムの人工操作、すなわち組換えＤＮＡ技術によって、そのゲノム中に外因性配列を含むウイルスのことを記述するために使用される。具体的な態様において、外因性抗原をコードする配列などの外因性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。具体的な態様において、組換えウイルスは、目的のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含有するウイルスとみなすことができる。具体的な態様において、組換えウイルスは、ヘルペスウイルス科、例えばＥＨＶ−１由来であり、標的遺伝子を含む。
組換えウイルスを調製するための組換えＤＮＡ技術は、当業者周知であり、通常、ウイルスゲノムの全長の相補的なＤＮＡコピー（感染性クローン）の構築を採用し、次いでこれは、ＤＮＡ組換えおよび操作方法によって改変することができる。
【００３５】
用語「機能的に連結された」または「作動可能に連結した」は、調節エレメントと遺伝子またはそのコード領域との接続を記述するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つまたは複数の調節エレメント、例えば、これらに限定されないが、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーの制御下に配置される。遺伝子またはコード領域は、調節エレメント「に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結した」または「に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結した」または「と作動可能に会合した」または「に機能的に連結した」と言われ、遺伝子またはコード領域が、調節エレメントによって制御されるかまたは影響を受けることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現を実行する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。
さらに、本発明の説明の文脈において、用語「機能的な連結」、「機能的に連結した」、「作動可能に連結した」または「作動可能に連結した」は、２つまたはそれより多くの核酸配列が、所望の方式での正しい形態および機能でそれらそれぞれの発現が許容されるように配置されていることを意味する。例えば、必須の遺伝子配列の転写または翻訳がポリヌクレオチドの正しい発現に依存する場合、ポリヌクレオチドは、必須の遺伝子配列に機能的に連結されている。
【００３６】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、翻訳開始シグナルまたは開始コドン、例えばＡＴＧまたはＡＵＧ、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に翻訳される可能性がある、所定の長さのＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかである核酸配列を指す。
「２つのポリヌクレオチドは、同じＯＲＦ内である」は、２つのポリヌクレオチドが同じ転写分子内であり、同じ翻訳開始シグナルまたは開始コドンおよび同じ終止コドンを共有していることを意味することを指す。具体的な態様において、標的遺伝子および必須の遺伝子は、同じ転写分子内であり、同じ翻訳開始シグナルまたは開始コドンおよび同じ終止コドンを共有する。
【００３７】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、核酸配列の転写および／または翻訳を指す。本発明の具体的な態様によれば、用語「発現」は、外因性核酸配列の転写および／または翻訳を指す。
用語「発現カセット」または「転写単位」は、転写しようとする１つまたは複数の遺伝子を含有する組換えウイルスのゲノム内の領域を定義する。具体的な態様において、発現カセットに含有される遺伝子は、組換えウイルスの標的遺伝子および内因性の必須の遺伝子であり得る。具体的な態様において、発現カセットに含有される遺伝子は、標的遺伝子および外因性の必須の遺伝子であり得る。転写された遺伝子に加えて、発現カセット内に含有される調節エレメントを含有するポリヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列は、互いに作動可能に連結されている。これらは、プロモーターから転写され、転写は、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルによって終結される。１つの具体的な態様において、これらは、１つの単一のプロモーターから転写される。結果として、異なる遺伝子が、少なくとも転写により連結される。１種より多くのタンパク質または生成物は、各転写単位（多シストロン性転写単位）から転写および発現させることができる。各転写単位は、単位内に含有される選択された配列のいずれかの転写および翻訳に必要な調節エレメントを含むと予想される。さらに各転写単位は、同一または異なる調節エレメントを含有していてもよい。例えば、各転写単位は、同じターミネーターを含有していてもよく、またはＩＲＥＳエレメントもしくはイントロンを、転写単位内の遺伝子の機能的な連結に使用することもできる。
【００３８】
用語「必須の遺伝子」は、生物の複製に必要不可欠な遺伝子を意味し、それゆえに生命の基礎とみなされる。必須の遺伝子の「機能的な断片」または「機能的な誘導体」という用語は、断片または誘導体でもなお必須の遺伝子の活性を実行することを意味する。ウイルスの場合、一段階または複数段階の増殖曲線のいずれかで、ある遺伝子の欠失が１０分の１を下回るウイルス力価の減少を引き起こす場合、その遺伝子も必須である（すなわち、細胞培養において役割を有する）とみなされる。必須の遺伝子のほとんどは、中枢代謝を維持する、ＤＮＡを複製する、遺伝子をタンパク質に翻訳する、基礎的な細胞構造を維持する、および細胞への、および細胞からの輸送プロセスを媒介するためのタンパク質をコードする。ウイルスの場合、また、被包されたビリオンの生産、アクチンテール形成、および細胞外のビリオン放出に関与する全ての遺伝子も必須とみなされる。２つの主要な戦略、すなわち、誘導された遺伝子欠失、およびトランスポゾンを使用するランダム変異誘発が、ゲノム全般に基づき必須の遺伝子を同定するために採用されてきた。第１のケースでは、個々の遺伝子（またはＯＲＦ）を、系統的な方式でゲノムから完全に欠失させる。トランスポゾン媒介変異誘発では、標的化された遺伝子を不活性化することを目的として、トランスポゾンが、ゲノム中の可能な限り多くの位置にランダムに挿入される。それでもなお生存または増殖が可能な挿入突然変異体は、必須の遺伝子中にない。（Zhang, R., 2009 & Gerdes, S., 2006）。
【００３９】
用語「内因性」は、本明細書で使用される場合、種において天然に存在するポリヌクレオチドまたはタンパク質を指す。必須の遺伝子は、「ウイルスの内因性の必須の遺伝子」であると言われ、これは、必須の遺伝子がウイルスのゲノム中に天然に存在することを意味する。具体的な態様において、標的遺伝子は、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子の上流に挿入され、それに機能的に連結されている。
用語「外因性」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはタンパク質が、外来の種に由来するかもしくはそれから生産されたものであることを指し、または同じ種由来の場合、その元の形態から操作されていることを指す。具体的な態様において、組換えウイルスの内因性の必須の遺伝子は、サイレンシングされており、同じ外因性の必須の遺伝子は、標的遺伝子の下流に挿入され、それに機能的に連結されている。
【００４０】
用語「コンストラクト」は、本明細書で使用される場合、組換え核酸、例えば人工的に生成したプラスミドを指す。
【００４１】
用語「調節エレメント」、「調節核酸」「発現制御エレメント」は、交換可能に使用され、特定の宿主生物における作動可能に連結したコード配列の発現に影響を与えることができる核酸分子を指す。これらの用語は、プロモーター、プロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基礎的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサー、および応答エレメントなどの、転写を促進または調節する全てのエレメントに広義に使用され、それらを網羅する。原核生物における例示的な調節エレメントとしては、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞で使用される調節エレメントとしては、これらに限定されないが、宿主細胞中でのコード配列の発現および／またはコードされたポリペプチドの生産をもたらす、および／またはそれらを調節する、転写および翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ピコルナウイルス２Ａ配列などを挙げることができる。
【００４２】
用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許容し、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列を意味する。典型的には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントはしばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターの例としては、これらに限定されないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、および動物、例えば哺乳動物（ウマ、ブタ、ウシおよびヒトを含む）、トリまたは昆虫由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑制性、および／または構成的プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、温度の変化などの培養条件における何らかの変化に応答して、それらの制御下におけるＤＮＡからの転写レベルの増加を開始させる（Ptashne, 2014）。当業者周知のプロモーターの例は、例えばＣＭＶ−５．ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ前初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーターである。
【００４３】
用語「エンハンサー」は、シスの位置でプロモーターの活性に作用して、このプロモーターに機能的に接続された遺伝子またはコード配列の転写を刺激するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターとは異なり、エンハンサーの作用は、位置および方向から独立しており、それゆえにそれらは、イントロン内で、またはコード領域内でさえも、転写単位の前または後に位置することができる。エンハンサーは、転写単位のすぐ隣の位置と、プロモーターから顕著に離れた位置のいずれに位置していてもよい。またエンハンサーは、プロモーターと物理的および機能的なオーバーラップを有することも考えられる。当業者であれば、様々な源由来の多数のエンハンサー（さらに、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに寄託されたもの、例えばＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）を認識していると予想され、これらは、独立したエレメントまたはポリヌクレオチド配列内にクローニングされたエレメント（例えばＡＴＣＣに寄託された、または商業的な源および個人的な源からの）として入手可能である。また多数のプロモーター配列は、頻繁に使用されるＣＭＶプロモーターなどのエンハンサー配列も含有する。ヒトＣＭＶエンハンサーは、これまでに同定されたなかでも最も強いエンハンサーの１つである。誘導性エンハンサーの一例は、メタロチオネインエンハンサーであり、これは、グルココルチコイドまたは重金属によって刺激され得る。
【００４４】
「転写調節エレメント」は通常、発現させる遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位、ならびにポリアデニル化シグナルを含む。
用語「転写開始部位」は、一次転写物、すなわちｍＲＮＡ前駆体に取り込まれる第１の核酸に対応するコンストラクト中の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしていてもよい。
【００４５】
「終結シグナル」または「ターミネーター」または「ポリアデニル化シグナル」または「ポリＡ」または「転写終結部位」または「転写終結エレメント」は、真核ｍＲＮＡの３’末端における特異的な部位を切断し、切断された３’末端に約１００〜２００個のアデニンヌクレオチド（ポリＡテール）の配列を転写後に取り込むことにより、ＲＮＡポリメラーゼの転写を終わらせるシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは、切断部位の上流に配列ＡＡＴＡＡＡの約１０〜３０ヌクレオチド、および下流に位置する配列を含む。ｔｋポリＡ、ＳＶ４０後期および初期ポリＡ、ＢＧＨポリＡ（例えば米国特許第５，１２２，４５８号に記載されている）またはハムスター成長ホルモンポリＡ（ＷＯ２０１００１０１０７）などの様々なポリアデニル化エレメントが公知である。
【００４６】
「翻訳調節エレメント」は、発現させるそれぞれ個々のポリペプチドにつき、翻訳開始部位（ＡＵＧ）、停止コドンおよびポリＡシグナルを含む。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が、一部のコンストラクトに含まれていてもよい。発現を最適化するために、発現させる核酸配列の５’および／または３’−非翻訳領域を除去する、付加する、または変更して、存在し得るあらゆる余分の不適切な代替翻訳開始コドン、または転写レベルもしくは翻訳レベルのいずれかで発現に干渉するかもしくは発現を低減する可能性がある他の配列を消去することが望ましい場合がある。翻訳を強化する、したがって発現を強化するために、開始コドンのすぐ上流に、コンセンサスリボソーム結合部位（コザック配列）を挿入することができる。このリボソーム結合部位周辺におけるＡ／Ｕ含量の増加はさらに、より効率的なリボソーム結合をもたらす。
【００４７】
用語「アウトオブフレーム突然変異」は、フレーミングエラーまたはリーディングフレームシフトとも称され、３で割り切れないＤＮＡ配列におけるヌクレオチド数のインデル（挿入または欠失）によって引き起こされる遺伝子突然変異を指す。ＯＲＦ内のアウトオブフレーム突然変異は、ＯＲＦ内の遺伝子の異常な発現を引き起こすと予想される。
用語「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子を「オフ」にし、それによってタンパク質生産の形態で、または他の発現形態でそれが発現されることを防止するプロセスである。遺伝子を無効にすることが、その遺伝子の目的を決定する極めて有効な方法であるため、遺伝子サイレンシングは重要な実験技術である。遺伝子は、様々な方法で、多くの様々なメカニズムの１つを介してサイレンシングすることができる。遺伝子サイレンシングはしばしば、遺伝子ノックアウトと同じとみなされる。すなわち、遺伝子がノックアウトされると、それらは生物のゲノムから完全に消去され、したがって発現は起こらない。本発明の文脈において、遺伝子サイレンシングはまた、遺伝子の残りの活性がその機能を達成するには不十分であるようなレベルに遺伝子発現を低減させることも含む。例えば、具体的な態様において、ウイルスの内因性の必須の遺伝子は、必須の遺伝子の残りの活性が、外因的に導入され標的遺伝子に機能的に連結されている必須の遺伝子の標的遺伝子による制御に影響を与えることができないようなレベルにサイレンシングされている。
「宿主細胞」は、組換えウイルスが複製できる細胞を指す。具体的な態様において、宿主細胞は、真核宿主細胞株であってもよく、好ましくは哺乳類細胞株または昆虫細胞株である。宿主細胞は、これらに限定されないが、ＲＫ１３細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＳＴ細胞株、ＡＩ−ＳＴ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１、ＭＤＣＫ細胞株、および／またはそれらの派生株を含む。
【００４８】
用語「安定な発現」または「発現安定性」は、本明細書で使用される場合、組換えウイルスが、外因性ポリヌクレオチドを損なうことも、または外因性ポリヌクレオチド中の何らかのアウトオブフレーム突然変異を伴うこともなく、その継代中に外因性ポリヌクレオチドを正確に発現することが可能であることを意味する。本発明の文脈において、外因性ポリヌクレオチドの安定な発現は、外因性ポリヌクレオチドを組換えウイルスの必須の遺伝子に機能的に連結させ、必須の遺伝子の上流に位置させることによって達成される。外因性ポリヌクレオチドを失っている、または外因性ポリヌクレオチド中の何らかのアウトオブフレーム突然変異を有する組換えウイルスは複製しないと予想され、したがって組換えウイルス培養液からなくなると予想される。したがって、培養液中に存在する優勢な組換えウイルスは、外因性ポリヌクレオチドと必須の遺伝子とを正確に共発現することが可能なものになる。
外因性ポリヌクレオチドの発現は、様々な方法によって、例えばＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロッティングによって、ラジオイムノアッセイによって、免疫沈降によって、タンパク質の生物学的活性をアッセイすることによって、またはタンパク質の免疫染色とそれに続くＦＡＣＳ分析によって決定することができる。具体的な態様において、外因性ポリヌクレオチドの発現は、ウェスタンブロッティングによって決定される。
【００４９】
ＥＨＶ−１の定義
「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルスベクター」は、ヘルペスウイルス目ヘルペスウイルス科の種を指す。
用語「ウマヘルペスウイルスベクター」または「ウマヘルペスウイルス」または「ＥＨＶ」は、ウマに影響を及ぼすヘルペスウイルス科のメンバーを意味する。これまで、ウマヘルペスウイルスの８つの異なる種が同定され、そのうち５つは、アルファヘルペスウイルス亜科（ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９）に属し、３つはガンマヘルペスウイルス亜科に属する。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy：2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)。
用語「ウマ科動物」または「ウマ科の」または「ウマ科」は、ウマ科であることを意味するか、またはウマ科に属することを意味し、その例としては、ウマ、ロバ、およびシマウマが挙げられ、好ましくはウマである。加えて、用語「ウマ科動物」または「ウマ科の」または「ウマ科」は、ウマ科のメンバーの交雑種（例えばラバ、ケッテイなど）も包含する。
【００５０】
用語「ＥＨＶ−１」は、ウマアルファヘルペスウイルス１を意味し、これは、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス属のワリセロウイルス亜属のメンバーである。ＥＨＶ−１の非限定的な参照配列は、例えば野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６６５７１３．１）またはＲａｃＨ（Hubert 1996）と予想される。具体的な態様において、組換えウイルスは、ヘルペスウイルス科由来であり、例えばＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４であり、好ましくはＥＨＶ−１である。
ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子は、カプソメア間の三重鎖の成分であるＶＰ２３として公知のキャプシドタンパク質をコードする（Elizabeth A. R. Telford, et al, Journal of General Virology, 1998, 79, 1197-1203）。一実施形態において、ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５によって示される。
ＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子は、ＤＮＡヘリカーゼ−プライマーゼ複合体の成分であるタンパク質をコードする（Elizabeth A. R. Telford, et al, Journal of General Virology, 1998, 79, 1197-1203）。一実施形態において、ＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６によって示される。
【００５１】
ＦＭＤＶの定義
「口蹄疫ウイルス」または「ＦＭＤＶ」は、ピコルナウイルス科アフトウイルス属の種を指す。
用語「Ｐ１タンパク質」または「タンパク質Ｐ１」は、４つのキャプシドタンパク質、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１を含有する前駆タンパク質を意味する。成熟プロセス中、タンパク質Ｐ１は、プロテアーゼ３ＣによってＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３として公知の３つのタンパク質に切断される。ビリオンにおいて、タンパク質ＶＰ０は次いで、２つのタンパク質、ＶＰ４およびＶＰ２に切断される。一実施形態において、Ｐ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１によって示される。
【００５２】
用語「２Ａペプチド」または「ペプチド２Ａ」は、自己切断ペプチドであり、数々のウイルス科で、最も知られているものとしてピコルナウイルス科のＦＭＤＶで、複数のポリペプチドを生産するために使用されている。ＦＭＤＶにおいて、２Ａペプチドは、Ｐ１−２Ａ前駆体のＣ末端に位置している。一実施形態において、２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２によって示される。
用語「プロテアーゼ３Ｃ」または「３Ｃプロテアーゼ」は、ピコルナウイルスに見出されるプロテアーゼおよびエンドペプチダーゼ酵素であって、非末端配列のペプチド結合を切断するものを意味する。３Ｃプロテアーゼは、Ｐ３前駆体中に位置し、Ｐ１前駆タンパク質をＶＰ０（ＶＰ４およびＶＰ２の前駆体）、ＶＰ３およびＶＰ１にプロセシングすることができる。一実施形態において、３Ｃ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３によって示される。
Ｐ１−２Ａ−３Ｃカセットは、２Ａペプチド遺伝子を含有する配列によって連結されたＰ１遺伝子および３Ｃ遺伝子を含有する単一のＯＲＦを意味する。一実施形態において、Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子カセットのヌクレオチド配列は、配列番号４によって示される。
【００５３】
ワクチンの定義
「免疫原性または免疫学的な組成物」は、細胞の宿主における免疫応答または組成物に対する抗体媒介性免疫応答を惹起する、少なくとも１つの抗原、またはその免疫原性部位を含む、物質の組成物を指す。
本明細書において使用される用語「抗原」は、当業界においてよく理解されており、免疫原性の物質、すなわち免疫原、加えて免疫学的な不応答、またはアネルギー、すなわち外来物質に対する体の防御機構による反応の欠如を誘発する物質を含む。用語「抗原」は、本明細書で使用される場合、全長タンパク質に加えて、エピトープを含有するかまたは含むそのペプチド断片を意味することが意図される。
【００５４】
用語「食物生産動物」は、ヒトの消費のために使用される動物、例えばブタ、ウシ、トリなどを意味し、好ましくは、食物生産動物は、ブタおよびウシを意味し、最も好ましくはブタを意味する。本発明の具体的な態様において、「食物生産動物」は、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタなどの双蹄獣であり、好ましくはブタである。
【００５５】
「免疫原性組成物」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される免疫応答を惹起する、ポリペプチドまたはタンパク質、例えばウイルス表面タンパク質などを指す場合がある。用語「免疫原性断片」または「免疫原性部位」は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって本明細書に記載される免疫応答を惹起する、タンパク質またはポリペプチドの断片または短縮化および／もしくは置換された形態を指す。一般的に、このような短縮化および／もしくは置換された形態、または断片は、全長タンパク質からの少なくとも６つの連続するアミノ酸を含むと予想される。このような断片は、当業界において周知の様々なエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、線状エピトープは、固体支持体上の膨大な数の、タンパク質分子の一部に対応するペプチドを同時に合成し、ペプチドを支持体に結合させたままでペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。このような技術は公知であり、当業界において説明されている。例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；およびGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715を参照されたい。同様に、コンフォメーショナルエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴などによりアミノ酸の空間的なコンフォメーションを決定することによって容易に同定される。上記のEpitope Mapping Protocolsを参照されたい。合成抗原は、定義内にも含まれているが、例えば、エピトープの端にあるポリエピトープ、および他の組換え抗原または合成的に誘導された抗原。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998を参照されたい。（これらの教示および内容は、全て参照により本明細書に組み入れられる。）
【００５６】
用語「ワクチン」は、本明細書で使用される場合、動物において免疫応答を誘導する少なくとも１種の免疫学的に活性な成分、および場合によっては、ただし必ずではないが、活性成分の免疫学的活性を強化する１つまたは複数の追加の成分を含む医薬組成物を指す。ワクチンは、加えて、医薬組成物に典型的なさらなる成分を含んでいてもよい。区別する目的で、ワクチンの免疫学的に活性な成分は、その元の形態で、またはいわゆる改変生ワクチン（ＭＬＶ）における弱毒化した粒子として、もしくはいわゆる不活化ワクチン（ＫＶ）における適切な方法によって不活性化された粒子としてのいずれかでの完全ウイルス粒子を含んでいてもよい。別の形態において、ワクチンの免疫学的に活性な成分は、生物の適切なエレメントを含んでいてもよく（サブユニットワクチン）、その場合、これらのエレメントは、粒子全体の破壊またはこのような粒子を含有する増殖培養、および任意に、それに続く所望の構造を得るための精製工程によって、または例えば細菌、昆虫、哺乳類、または他の種に基づく好適なシステムの使用による適切な操作、加えて、任意に、それに続く単離および精製手順を含む合成プロセスによって、または好適な医薬組成物を使用した遺伝物質の直接の取り込み（ポリヌクレオチドのワクチン接種）によるワクチンを必要とする動物における合成プロセスの誘導のいずれかによって生成される。ワクチンは、上述したエレメントのうち１つ、または同時に１つより多くを含んでいてもよい。本発明の具体的な態様で使用される場合、「ワクチン」は、組換えワクチンとも称される生ワクチンまたは生ウイルスを指す。本発明の別の具体的な態様において、「ワクチン」は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む不活性化または不活化ウイルスを指す。したがって、ワクチンは、サブユニットワクチンまたは不活化（ＫＶ）もしくは不活性化ワクチンであり得る。
【００５７】
「医薬組成物」は、それが投与される生物の、またはその生物中もしくはその上で生きる生物の、生理学的な、例えば免疫学的な機能を改変することが可能な１つまたは複数の成分から本質的になる。この用語は、これらに限定されないが、抗生物質または駆虫薬、加えて、特定の他の目的、例えばこれらに限定されないが、処理上の特性、滅菌、安定性、経腸または非経口経路、例えば経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、または他の好適な経路を介した組成物投与の実行可能性、投与後の耐性、または制御放出特性などを達成するのに一般的に使用される他の成分を含む。このような医薬組成物の１つの非限定的な例は、単に実証する目的で与えられる場合、以下のように調製することができる：感染細胞培養物の細胞培養上清を、安定剤（例えば、スペルミジンおよび／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合し、その後、混合物を凍結乾燥するか、または他の方法によって脱水する。次いで、ワクチン接種の前に、混合物を水性溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または非水性溶液（例えば、油乳濁液、アルミニウムベースのアジュバント）で再水和する。
【００５８】
「医薬的または獣医学的な許容できる担体」は、本明細書で使用される場合、様々な溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含む。一部の好ましい実施形態において、特に、凍結乾燥した免疫原性組成物を含む実施形態において、本発明で使用するための安定化剤としては、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定剤が挙げられる。
【００５９】
一部の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含有する。「アジュバント」としては、本明細書で使用される場合、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを挙げることができる。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィン油（欧州薬局方タイプ）；イソプレノイド油、例えばスクアランまたはスクアレン；アルケンのオリゴマー化、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化の結果生じる油；酸の、または直鎖状アルキル基を含有するアルコールのエステル、より特定すると植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプレート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプレート）またはプロピレングリコールジオレエート；分岐状脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルをベースとしたものでもよい。これらの油を乳化剤と組み合わせて使用して、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン界面活性剤であり、特に、ソルビタンのエステル、マンニドのエステル（例えばアンヒドロマンニトールオレエート）、グリコールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステルであり、これらは任意にエトキシ化されていてもよく、さらに、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にＰｌｕｒｏｎｉｃ製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., the theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)およびTodd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。例示的なアジュバントは、「Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach」、M. PowellおよびM. Newman編, Plenum Press, 1995の147頁に記載されたＳＰＴエマルジョン、およびこれと同じ本の１８３頁に記載されたエマルジョンＭＦ５９である。
【００６０】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、および無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されているアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた、米国特許第２，９０９，４６２号を参照してもよく、これは、少なくとも３個のヒドロキシル基、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化された化合物で架橋されたこのようなアクリル系ポリマーであって、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置き換えられているものを記載している。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和のラジカルは、それ自体が他の置換基、例えばメチルを含有していてもよい。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）；（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）という名称で販売される製品が、特に適切である。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋されている。次いで、そのなかでも、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐを挙げることができる。最も好ましくは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐの使用である。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーとしては、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）が挙げられ、これは、無水マレイン酸とエチレンとのコポリマーである。これらのポリマーを水中に溶解させると、酸溶液が生じ、これは、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物そのものが取り込まれているアジュバント溶液を得るために、好ましくは生理学的なｐＨに中和されることになる。
【００６１】
さらなる好適なアジュバントとしては、これらに限定されないが、他の多くのもののなかでも、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジンリピド−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の易熱性エンテロトキシン（組換えまたはそれ以外の方法で）、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４もしくはムラミールジペプチド、または天然に存在する、もしくは組換えサイトカインもしくはそれらの類似体、または内因性サイトカイン放出の刺激因子が挙げられる。
アジュバントは、１用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、好ましくは１用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、より好ましくは１用量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量、さらにより好ましくは１用量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量、最も好ましくは１用量当たり約１ｍｇの量で添加することができる。代替として、アジュバントは、最終産物の体積に対して、約０．０１〜５０％の濃度、好ましくは約２％〜３０％の濃度、より好ましくは約５％〜２５％の濃度、さらにより好ましくは約７％〜２２％の濃度、最も好ましくは１０％〜２０％の濃度であってもよい。
【００６２】
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを挙げることができる。等張剤としては、なかでも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、なかでも、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）のアルカリ塩が挙げられる。
「単離された」は、「人の手によって」その天然状態から変更されていることを意味し、すなわち、それが天然に存在する場合、その元の環境から変化または除去されている、またはその両方であることを意味する。例えば、この用語が本明細書で採用される場合、生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されていない」が、その天然状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されている」。
【００６３】
製剤
組成物が投与される対象は、好ましくは、これらに限定されないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、トリ（例えばニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットなどの動物であり、最も好ましくは、哺乳動物は、ブタである。
本発明の製剤は、有効な免疫化量の１種または複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効な免疫化量の１種または複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。製剤は、投与様式に合ったものであるべきである。
免疫原性組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有していてもよい。免疫原性組成物は、液状溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、または粉剤であり得る。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含んでいてもよい。
【００６４】
処置方法
好ましい投与経路としては、これらに限定されないが、鼻腔内、経口、皮内、および筋肉内が挙げられる。飲用水での、最も好ましくは単回用量での投与が望ましい。当業者であれば、本発明の組成物はまた、１つ、２つまたはそれより多くの用量で、加えて他の投与経路によっても投与できることを認識していると予想される。例えば、このような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内、皮内が挙げられ、本発明による組成物は、処置の所望の持続時間および有効性に応じて、１回または数回で、また間欠的に、例えば数日間、数週間または数カ月にわたり毎日、異なる投薬量で、例えば約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０（上記のウイルス力価を参照）で投与してもよい。
【００６５】
組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在していてもよい。パックは、例えば金属またはプラスチック箔を含んでいてもよく、例えばブリスターパックである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための、好ましくは哺乳動物、特にブタへの投与のための指示書が付属していてもよい。このようなコンテナーに、ヒト投与のための製造、使用または販売の政府機関による承認を反映する、医薬品または生物学的な製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態での通告が付随していてもよい。
【００６６】
配列の概要
本発明において、以下の配列を詳述し、ここに開示する：
配列番号１  Ｐ１遺伝子のヌクレオチド配列、
配列番号２  ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列、
配列番号３  ３Ｃ遺伝子のヌクレオチド配列、
配列番号４  Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列、
配列番号５  ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３遺伝子のヌクレオチド配列、
配列番号６  ＥＨＶ−１  ＯＲＦ５４遺伝子のヌクレオチド配列、
配列番号７  ＢＧＨポリＡシグナルのヌクレオチド配列、
配列番号８  ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ４３−ＢＧＨカセットのヌクレオチド配列、
配列番号９  ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ５４−ＢＧＨカセットのヌクレオチド配列、
配列番号１０  プライマー配列、および
配列番号１１  プライマー配列。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために記載される。以下に記載される実施例で開示された技術は、本発明の実施で十分機能することが発明者らによって発見された技術を表し、したがって、その実施について好ましい様式を構成するとみなすことができることを当業者は理解しているはずである。しかしながら、当業者は、本発明の開示の観点から、開示された具体的な実施形態に多くの変更を施すことができ、それでもなお本発明の本質および範囲から逸脱することなく同様の、または類似した結果が得られることを理解しているはずである。
研究において、何らかの例外が特記されない限り、全ての材料が商業的に入手可能であり、それらはＱＩＡＧＥＮ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒおよびＢＩＯ−ＲＡＤから購入した。
【００６８】
（実施例１）
ＦＭＤＶ抗原を安定して発現できる本発明の組換えＥＨＶ−１の構築
１．１  ＦＭＤＶ  Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子発現カセットの構築
ＦＭＤＶ  ＶＬＰを発現させるため、ＦＭＤＶ血清型Ｏ株（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＪＮ９９８０８５）由来の遺伝子発現カセットＰ１−２Ａ−３Ｃを設計した。この研究において、ＦＭＤＶ  Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子発現カセットは、Ｐ１遺伝子（配列番号１）、２Ａ遺伝子（配列番号２）および３Ｃ遺伝子（配列番号３）のヌクレオチド配列に基づき、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって化学合成された。研究で使用した合成Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子発現カセットのヌクレオチド配列は、配列番号４によって示される。Ｐ１−２Ａ−３Ｃカセットの設計を、図２に例示した。
【００６９】
１．２  トランスファープラスミドの構築
２工程のＲｅｄ媒介組換えのための相同なフランキング領域、カナマイシン耐性遺伝子、加えてプロモーターおよびＢＧＨポリＡシグナルを含有するトランスファーベクターｐＵＣ１９−ＣＭＶ５−ＯＲＦ１／３−リンカー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を、研究に使用した。
トランスファープラスミドを生成するために、Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子（配列番号４）を、ＯＲＦ１／３の部位でトランスファーベクターに挿入した。次いで、ＯＲＦ４３遺伝子（配列番号５）およびＯＲＦ５４遺伝子（配列番号６）を化学合成し、Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子（配列番号４）の下流にクローニングして、それぞれトランスファープラスミドｐＵＣ１９−ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ４３およびｐＵＣ１９−ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ５４を得た。トランスファープラスミドｐＵＣ１９−ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ４３の構築手順を、図３に例示した。
トランスファープラスミドを制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩ（ＮＥＢ）によって消化して、それぞれＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ４３−ＢＧＨ（配列番号８）およびＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ５４−ＢＧＨ（配列番号９）を含有する約７ｋｂの２つの断片を放出させ、これらを次いでゲル精製し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ゲル電気泳動によって確認した。さらなる組換えに、放出された断片を使用した。ＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ４３−ＢＧＨのゲル電気泳動結果を、図４に例示した。
【００７０】
１．３  ＥＨＶ−１ウイルスベクターの構築
この研究において、ＥＨＶ−１ワクチン株ＲａｃＨ（Patel, JR and Heldens, J, 2005）を、血清型ＯのＦＭＤＶ遺伝子Ｐ１２Ａ３Ｃを発現させるためのウイルスベクターとして使用した。ＲａｃＨ株は、天然宿主、すなわちウマにおけるその毒性を喪失させたものであり、それ以降、欧州と米国の両方で改変生ワクチン（ＭＬＶ）として使用されている（Patel, JR and Heldens, J, 2005）。ＲａｃＨウイルスゲノムを、ＯＲＦ７１遺伝子の大部分（ｇｐ２をコードする）をミニ−Ｆレプリコン配列で置き換えることによって細菌人工染色体（ＢＡＣ）として構築し、バクミドをｐＲａｃＨと名付けた（Rudolph and Osterrieder, 2002, Virology 293, 2002, 356-367；ＵＳ７４８２４４１Ｂ２）。
【００７１】
この研究において、必須の遺伝子ＯＲＦ４３遺伝子およびＯＲＦ５４遺伝子をそれぞれｐＲａｃＨから欠失させ、ＯＲＦ４３遺伝子が欠失したｐＲａｃＨ（図５においてＥＨＶ−１−ｄｅｌＯＲＦ４３Ｐ１として示される）およびＯＲＦ５４遺伝子が欠失したｐＲａｃＨ（図５においてＥＨＶ−１−ｄｅｌＯＲＦ５４Ｐ１として示される）を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析によって同定した。
ＥＨＶ−１−ｄｅｌＯＲＦ４３Ｐ１およびＥＨＶ−１−ｄｅｌＯＲＦ５４Ｐ１をＭＤＢＫ細胞にトランスフェクトすることによって、欠失突然変異体が細胞培養中に複製できないことが確認された。以下の図５に結果を示す。
【００７２】
１．４  本発明の組換えＥＨＶ−１の構築
本発明の組換えＥＨＶ−１を、２工程のＲｅｄ媒介組換え戦略を介して構築した（Tischer BK et al, BioTechniques 2006 (40), 191-197）。特に、工程１．２で得られたトランスファープラスミドを消化して、それぞれＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ４３−ＢＧＨ（配列番号８）およびＣＭＶ５−Ｐ１２Ａ３Ｃ２ＡＯＲＦ５４−ＢＧＨ（配列番号９）の断片を放出させた。２つの放出された断片を、それぞれＥＨＶ−１−ｄｅｌＯＲＦ４３Ｐ１およびＥＨＶ−１−ｄｅｌＯＲＦ５４Ｐ１を含有するＥ．ｃｏｌｉコンピテント細胞にエレクトロポレーションした。図６に、組換えウイルスの遺伝子構造を例示した。次いでクロラムフェニコールおよびカナマイシンの二重耐性ＬＢ寒天プレート上で組換えクローンを選択した。組換えバクミドＤＮＡを抽出し、ＰＣＲおよびＲＦＬＰ方法の両方によって分析した。Ｒｅｄ組換えの第２の工程において、１％アラビノースを使用して、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの発現を誘導し、カナマイシン遺伝子の上流におけるＩ−ＳｃｅＩ制限部位の切断を起こし、最終的にカナマイシンカセットを切り出した。
【００７３】
１．５  ウイルスの救出および精製
組換えＥＨＶ−１を救出するために、組換えバクミドＤＮＡを抽出し、リポフェクトアミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して６−ウェルプレート中のＭＤＢＫ細胞（Ｓｉｇｍａ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を毎日観察して、ＧＦＰ陽性および陰性プラークの両方の形成をチェックした。トランスフェクトされた細胞を、培養上清と共に凍結および融解を２回行い、遠心分離によって清澄化し、継代１と定義された組換えウイルスを後の分析のために−８０℃で貯蔵した。限界希釈またはプラーク精製を実行して、ＧＦＰ陰性組換えウイルスを分離し、そこでＥＧＦＰ遺伝子を含有するミニ−Ｆを除去し、分子内相同組換えメカニズムを介して失われたＯＲＦ７１を回復した。限界希釈の各ラウンドは、１継代として認識された。
【００７４】
（実施例２）
ＦＭＤＶタンパク質の発現および検出
２．１  ＩＦＡ、スクロース勾配遠心分離およびウェスタンブロット
ＦＭＤＶタンパク質の発現を確認するために、間接蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を、ＦＭＤＶ  ＶＰ１に対するモノクローナル抗体（Ｊｅｎｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号９１７２）を使用して実行した。ＭＤＢＫ細胞を感染させ、１．５％のメチルセルロース上に載せた。感染から３日後に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００によって透過化し、対応する抗体で染色した。ＦＭＤＶタンパク質の発現をＩＦＡによって確認した（図７）。
【００７５】
ウェスタンブロット分析のために、感染細胞のペレットを溶解させ、４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＮｕｐａｇｅ  １０×還元試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。８５℃で５分加熱した後、タンパク質をＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）に転写した。膜のブロッキングの後、膜を抗ＦＭＤＶ  ＶＰ１  ｍＡｂ（第１の抗体、Ｊｅｎｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に１時間インキュベートし、次いで洗浄した後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（第２の抗体、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）と共に１時間インキュベートした。膜にＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を適用した後、画像を現像した。
ＦＭＤＶ  ＶＬＰの形成を確認するために、感染細胞の培養物を遠心分離によって前もって清澄化し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５ｍＬ遠心分離フィルター（Ｍｅｒｋ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１００ＫＤａ）を使用した限外ろ過によって濃縮し、次いで、１０％〜６０％スクロース勾配超遠心分離に、１０℃で、５３，７２０ｇで２２時間適用した。スクロース勾配を、上から下に１４画分に分離した。各画分中のタンパク質を、上述したように抗ＦＭＤＶ  ＶＰ１  ｍＡｂを使用したウェスタンブロットによって分析した。
【００７６】
（実施例３）
ＦＭＤＶタンパク質発現の安定性の研究
３．１  ＦＭＤＶ  Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子は標準的な設計で安定して発現させることができない
ＥＨＶ−１ウイルスベクターにＦＭＤＶ  Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子を直接導入する標準的な設計を用いて、対照としての異なる組換えＥＨＶ−１（異なるプロモーターおよび挿入部位を有する）を構築した。以下の表に、異なる組換えＥＨＶ−１の遺伝学的安定性試験の結果を要約する。
【表１】
2021518152.tif 000002
二重のＩＦＡによって示された通り（図８Ａ）、標準的な設計を使用することによって、連続的な継代中に、ＦＭＤＶ  Ｐ１−２Ａ−３Ｃ遺伝子は安定した維持が可能ではなく、標的タンパク質発現を喪失する傾向があったことがわかる。またシーケンシング分析は、挿入物中にランダムな欠失があったことも示した（図８Ｂ）。
【００７７】
３．２  遺伝学的な安定性の問題を解決するための必須の遺伝子のトランスロケーション
本発明の組換えＥＨＶ−１によってＦＭＤＶタンパク質が安定して発現され得るかどうかを評価するために、本発明の組換えＥＨＶ−１を、０．０１のＭＯＩで、ＭＤＢＫ細胞で連続的に継代した。各継代の後、新しいＭＤＢＫ細胞単層を、適切に希釈した組換えウイルスに感染させ、１．５％メチルセルロースを上に載せた。感染から３日後、二重のＩＦＡを、抗ＦＭＤＶ  ＶＰ１  ｍＡｂおよびヤギ抗ＥＨＶ−１  ｐＡｂ（ＶＭＲＤ）の混合物を使用して実行した。個々のプラークを蛍光顕微鏡法下で検査した。ＦＭＤＶ  ＶＰ１およびＥＨＶ−１抗体の両方で染色されるプラークを陽性として認識し、一方でＥＨＶ−１染色のみを示すものは、陰性である。陽性プラーク率を計算し、異なる継代レベル間で比較した。図９に、代表的な二重のＩＦＡの結果を示す。
５回の継代毎に（Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１５およびＰ２０）、ウイルスＤＮＡを感染細胞から抽出し、全挿入物を、高忠実度Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ増幅した（フォワードプライマー：ｔａａｃａｃｃａｔｇｇｃａｇｇｃｃｔｇｔｔｇ（配列番号１０）、リバースプライマー：ｇａｇｃｇａｔｔｃｇｃａｃｃｔｃａｔｃｔｃｃ（配列番号１１））。次いでＰＣＲ産物をシーケンシングした。加えて、ＶＬＰの発現を、５回の継代毎にスクロース勾配遠心分離およびウェスタンブロットを使用して検出した（Rational Engineering of Recombinant Picornavirus Capsids to Produce Safe, Protective Vaccine Antigen. PLOS Pathogens.2013 Mar; 9(3):e1003255）。図１０に、組換えＥＨＶ−１の異なる継代レベルからのＦＭＤＶ  ＶＬＰの結果を示す。
【００７８】
全ＥＨＶ−１プラークのうちのＦＭＤＶタンパク質陽性プラークのパーセンテージを計算し、表２に示した。結果から明らかに、ＦＭＤＶタンパク質は、継代中、少なくともＰ２０まで安定して発現できることが示された。
【表２】
2021518152.tif 000003
５つの継代それぞれからのウイルスＤＮＡを組換えＥＨＶ−１から抽出し、ＰＣＲを使用して、全挿入物を増幅した。結果から、全挿入物は、断片長さの明白な差を生じることなく増幅できることが示され（図１１）、これは、連続的なウイルス継代中に遺伝学的変化が起こらなかったことを示す。ＰＣＲ産物もシーケンシングし、遺伝学的変化がないことが解明された。
【００７９】
（実施例４）
インビトロにおける組換えウイルスの増殖速度論
インビトロにおける組換えウイルスの増殖特性を評価するために、２４−ウェルプレート中のＭＤＢＫ細胞を、５のＭＯＩで親ウイルスおよび組換えウイルスに感染させた。３７℃で２時間接触させた後、細胞をクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄した。異なるタイムポイントで、培養上清を回収し、滴定した。
ＯＲＦ４３またはＯＲＦ５４がトランスロケーションした組換えウイルスの両方での一段階の増殖速度論を決定し、親ウイルスと比較した。図１２からわかるように、組換えウイルスは、親ウイルスと類似の増殖速度論を有し、感染後３６時間でピーク力価に到達することができるが、ピークが親ウイルスより約１ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ｍＬ低く、これは、外来タンパク質の発現はウイルスの増殖に影響を与えるはずなので、予測されたものであった。
【００８０】
上記の実験データから、（１）標準的な設計を用いた場合、ＦＭＤＶ標的タンパク質を安定して発現できなかったこと；（２）ＥＨＶ−１  ＯＲＦ４３またはＯＲＦ５４は、ＥＨＶ−１複製に必須の遺伝子であること；および（３）本発明のｒＥＨＶ−１／ＦＭＤコンストラクトは、親のＥＨＶ−１に匹敵する増殖能力を維持しながら安定性を顕著に改善して、標的タンパク質を発現できたことを決定することができる。
【００８１】
本明細書において開示された、および特許請求された組成物および方法の全ては、本発明の開示に照らして、余計な実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明の概念、本質および範囲から逸脱することなく、組成物および方法に、さらに本明細書に記載される方法の工程または一連の工程にバリエーションを適用できることが当業者には明らかであると予想される。より具体的には、同じまたは類似の結果を達成しながら、本明細書に記載される物質を化学的および生理学的の両方で関連する特定の物質で置き換えてもよいことが明らかであると予想される。このような全ての当業者に明白な類似の置き換えおよび改変は、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の本質、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2021518152000001.app
【国際調査報告】
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