(57)【要約】  本明細書に開示されるものは、子癇前症のリスクおよび治療を決定するための方法および装置である。方法および装置は、ポリペプチドバイオマーカー(例えば、表１、表３および表４に記載されているもの)を用いる。さらに、子癇前症のリスクを予測するのに有用な複数のポリペプチドバイオマーカーを含むパネルが提供される。
2021512315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の対象者における子癇前症のリスクを評価する方法であって、以下の工程：
(ａ)妊娠中の対象者からの血液サンプルからマイクロ粒子を多く含む画分を調製する工程；
(ｂ)該画分中の１以上のマイクロ粒子関連タンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定する工程であって、該１以上のタンパク質バイオマーカーが、
(ｉ)表１のタンパク質バイオマーカー；
(ｉｉ)以下のセット：Ａ２Ｎ０Ｕ６、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡ、Ｑ９６ＴＢ４、Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｉ４、Ｑ５ＮＶ８２、Ｅ３ＵＶＱ２、Ｅ９ＰＱＧ４、Ｌ０Ｒ６Ｎ９、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＭＢＬ２、Ｂ２Ｒ８１５、Ｄ６ＭＪＤ１、ＺＡ２Ｇ、Ａ０Ａ０２４Ｒ９Ｉ２、ＴＰＣ１１１、ＣＯ５、Ａ０Ａ０２４Ｒ３Ｚ１、Ａ８Ｋ００８、Ｂ２Ｒ４Ｃ５、Ｂ４Ｅ１Ｄ８、ＧＰ１１２、Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｈ９のタンパク質バイオマーカー；および
(ｉｉｉ)以下のセット：ＧＰ１ＢＡ、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＨ、ＪＰＨ１、ＣＯ５、ＨＥＰ２、ＴＰＣ１１、ＭＢＬ２、ＡＡＣＴ、ＤＹＨ３、ＴＳＰ１、ＣＡＰＳ１、ＡＰＯＤ、ＬＣＡＴのタンパク質バイオマーカー、
から選択される；および
(ｃ)該測定値に基づいて子癇前症のリスクを評価する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
アップレギュレーションされたバイオマーカーの増加量またはダウンレギュレーションされたバイオマーカーの減少量が、子癇前症のリスク増加を示している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
表１のタンパク質バイオマーカーから選択される複数のタンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１つ以上のタンパク質バイオマーカーが、表１：グループ１、グループ２またはグループ３から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
１以上のタンパク質バイオマーカーが、免疫機能、細胞シグナル伝達、血管新生、アポトーシス、マトリックス付着、細胞機能、タンパク質代謝、イオン輸送および未知の機能から選択される複数の生物学的機能の各々から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
バイオマーカーが、０Ａ０７５Ｂ６Ｉ５＿ＨＵＭＡＮ、Ａ２ＭＹＤ２＿ＨＵＭＡＮ、ＡＬ２ＳＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲ１３Ｂ＿ＨＵＭＡＮ、Ｂ３ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＢＡＩ１＿ＨＵＭＡＮ、ＢＲＷＤ３＿ＨＵＭＡＮ、Ｃ６Ｋ６Ｈ８＿ＨＵＭＡＮ、ＣＩ０４０＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＬＸ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＬＸ２＿ＨＵＭＡＮ、Ｅ５ＲＧ７４＿ＨＵＭＡＮ、Ｅ９ＰＮＷ５＿ＨＵＭＡＮ、ＨＶ３０１＿ＨＵＭＡＮ、Ｉ６Ｙ０Ｂ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｊ３ＫＰＪ３＿ＨＵＭＡＮ、ＬＡＣ７＿ＨＵＭＡＮ、ＬＩＰＡ２＿ＨＵＭＡＮ、ＬＶ１０４＿ＨＵＭＡＮ、ＬＶ１０９＿ＨＵＭＡＮ、Ｑ６８Ｄ１３＿ＨＵＭＡＮ、Ｑ９ＵＬ８８＿ＨＵＭＡＮ、ＳＣＲＩＢ＿ＨＵＭＡＮおよびＴＴＣ３７＿ＨＵＭＡＮから選択される、重度の子癇前症のリスクを決定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ａ２Ｎ０Ｕ６、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡ、Ｑ９６ＴＢ４、Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｉ４、Ｑ５ＮＶ８２、Ｅ３ＵＶＱ２、Ｅ９ＰＱＧ４、Ｌ０Ｒ６Ｎ９、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＭＢＬ２、Ｂ２Ｒ８１５、Ｄ６ＭＪＤ１、ＺＡ２Ｇ、Ａ０Ａ０２４Ｒ９Ｉ２、ＴＰＣ１１、ＣＯ５、Ａ０Ａ０２４Ｒ３Ｚ１、Ａ８Ｋ００８、Ｂ２Ｒ４Ｃ５、Ｂ４Ｅ１Ｄ８、ＧＰ１１２およびＡ０Ａ０７５Ｂ６Ｈ９から選択される複数のタンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＧＰ１ＢＡ、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＨ、ＪＰＨ１、ＣＯ５、ＨＥＰ２、ＴＰＣ１１、ＭＢＬ２、ＡＡＣＴ、ＤＹＨ３、ＴＳＰ１、ＣＡＰＳ１、ＡＰＯＤおよびＬＣＡＴから選択される複数のタンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
バイオマーカーが、パネル１〜２９(図３)、パネル１〜５６(図４Ａ〜４Ｂ)およびパネル１〜２４(図５)から選択されるバイオマーカーのパネルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
パネルが、１０、９、８、７、６、５、４または３以下のタンパク質バイオマーカーを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
バイオマーカーが、パネル１〜２９(図３)、パネル１〜５６(図４Ａ〜４Ｂ)およびパネル１〜２４(図５)から選択されるバイオマーカーのパネルからなる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
バイオマーカーが、Ａ２Ｎ０Ｕ６、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡおよびＱ９６ＴＢ４から選択される５、４、３または２つのバイオマーカー包含しているバイオマーカーのパネルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
バイオマーカーが、Ａ２Ｎ０Ｕ６、ならびにＡ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡおよびＱ９６ＴＢ４の少なくとも１、２、３または４つを包含しているバイオマーカーのパネルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
バイオマーカーが、ＧＰ１ＢＡ、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２およびＡＰＯＨから選択される６、５、４、３または２つのバイオマーカーを包含しているバイオマーカーのパネルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
バイオマーカーが、ＧＰ１ＢＡ、ならびにＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２およびＡＰＯＨから選択される少なくとも１、２、３、４または５つのバイオマーカーを包含するバイオマーカーのパネルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
サンプルが、妊娠第１三半期または妊娠第２三半期の間の妊娠中の対象者から採取される、請求項１〜１５いずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが、妊娠１０〜１２週目の間の妊娠中の対象者から採取される、請求項７記載の方法。
【請求項１８】
妊娠中の対象者が、プリミグラビダ、マルチグラビダ、プライミパラスまたはマルチミパラスである、請求項１〜１７いずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
妊娠中の対象者が、単胎妊娠または多胎妊娠である、請求項１〜１８いずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
妊娠中の対象者が、子癇前症の無症候者(例えば、高血圧ではないか、または蛋白尿ではない)である、請求項１〜１９いずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
妊娠中の対象者が、子癇前症の既往歴がない、請求項１〜２０いずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
妊娠中の対象者が、子癇前症のリスク因子を有していない、請求項１〜２１いずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
妊娠中の対象者が、慢性高血圧症である、請求項１〜２２いずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
血液サンプルが、血漿または血清である、請求項１〜２３いずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
マイクロ粒子を多く含む画分が、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて調製される、請求項１〜２４いずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
サイズ排除クロマトグラフィーが、水による溶出を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
サイズ排除クロマトグラフィーが、アガロース固相および水性液相を用いて行われる、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
調製工程が、限外ろ過または逆相クロマトグラフィーを使用することをさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
調製工程が、サイズ排除クロマトグラフィー後に尿素を用いる変性、ジチオスレイトールを用いた還元、ヨードアセタミンを用いるアルキル化およびトリプシンを用いる消化をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
マイクロ粒子が、胎盤由来のエクソソソームまたは血管内皮由来のエクソソームを多く含むようにさらに精製される、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
定量的測定値を決定する工程が、質量分析法を含む、請求項１〜３０いずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
定量的測定値の決定が、液体クロマトグラフィー／質量分析(ＬＣ／ＭＳ)を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
質量分析が、液体クロマトグラフィー／トリプル四重極質量分析法を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
質量分析が、多重反応モニタリングを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
質量分析が多重反応モニタリングを含んでおり、液体クロマトグラフィーがアセトニトリルを含む溶媒を用いて行われ、および／または決定が、タンパク質バイオマーカーに保持時間指標を割り当てることを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
質量分析が多重反応モニタリングを含んでおり、方法が、質量分析計に導入する前に、１以上の安定同位体標準ペプチドをサンプルに加えること、該検出が、質量分析計のコリジョンセルによって生成された１以上の安定同位体標準ペプチドの娘イオンを検出することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
定量的測定値を決定する工程が、タンパク質バイオマーカーのサロゲートペプチドの定量的測定値を決定することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
質量分析が、各サロゲートペプチドに対応する１つ以上の安定同位体標識標準ペプチド(ＳＩＳペプチド)を定量することを含む、請求項３６の方法。
【請求項３９】
タンパク質バイオマーカーに対応する１以上の安定な重同位体置換標準物を、マイクロ粒子を多く含む画分に加えることを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
定量的測定値を決定する工程が、１つ以上の捕捉試薬をサンプルと接触させて、各捕捉試薬がタンパク質バイオマーカーの１つに特異的に結合させる工程、およびこのタンパク質バイオマーカーにおける捕捉試薬との結合を検出する工程を含む、請求項１〜３０いずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
イムノアッセイを行うことを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
免疫測定が、酵素免疫測定(ＥＩＡ)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)およびラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)からなる群から選択される、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
評価工程とは、分類ルールを実行して、子癇前症のリスクが存在する対象者を分類することを含み、ここで該分類ルールの実行により、少なくとも０.０５未満のｐ値を有する子癇前症または満期産との間の相関を生じる、請求項１〜４２いずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
評価工程とは、分類ルールを実行して、子癇前症のリスクが存在する対象者を分類することを含み、ここで該分類ルールの実行により、受信機動作特性(ＲＯＣ)曲線が作成され、該ＲＯＣ曲線が、少なくとも０.６、少なくとも０.７、少なくとも０.８または少なくとも０.９の曲線下面積(ＡＵＣ)を有している、請求項１〜４３いずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
分類ルールが対象を分類する場合の値が、母体年齢、母体の肥満指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜４４いずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
分類ルールが、カットオフ、線形回帰[例えば、多変数線形回帰(ＭＬＲ)、部分最小二乗(ＰＬＳ)回帰、主成分回帰(ＰＣＲ)]、二値決定木(例えば、ＣＡＲＴ−分類木および回帰木などの再帰的分割処理)、バックプロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析(例えば、ベイズ分類またはフィッシャー分析)、ロジスティック分類器およびサポートベクター分類器(例えば、サポートベクターマシン)を用いる、請求項１〜４５いずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
分類ルールが、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の感度、特異度、正の予測値または負の予測値を有するように構成されている、請求項１〜４６いずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
子癇前症の高いリスクを評価する工程には、タンパク質バイオマーカー(アップレギュレートされている場合)が閾値レベルを上回るか、または(ダウンレギュレートされている場合)閾値レベルを下回るかを決定する工程を含む、請求項１〜４７いずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
閾値レベルが、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも２００人のコントロール対象者から決定されたタンパク質の中心傾向の測定値(例えば、平均値、中央値またはモード)からの少なくとも１、少なくとも２または少なくとも３のｚスコアのレベルを示す、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
評価工程が、パネル内の各タンパク質の測定値をコントロール標準物と比較することを含む、請求項１〜４９いずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
妊娠中の対象者の子癇前症のリスクを医療従事者に伝達することをさらに含む、請求項１〜５０いずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
(ｄ)画分中の早産に関する１以上のマイクロ粒子関連タンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定する工程；および
(ｅ)該測定値に基づいて早産のリスクを評価する工程、
をさらに含む、請求項１〜５１いずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
妊娠中の対象者に対する子癇前症のリスクを減少させる方法、および／または子癇前症の新生児合併症を減少させる方法であって、該方法は以下の工程：
(ａ)請求項１〜５０いずれか１項記載の方法に従って、妊娠中の対象者の子癇前症のリスクを評価する工程；および
(ｂ)子癇前症のリスクを減少させ、および／又は子癇前症の新生児合併症を減少させるのに有効な治療剤を対象者に投与する工程、
を特徴とする、方法。
【請求項５４】
治療剤が、アスピリン(例えば、低用量アスピリン)、コルチコステロイドまたは高血圧を減少させるための薬剤からなる群から選択される、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
治療される子癇前症が、遅発型または軽症型、高血圧型または早発型または重症型である、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
当該方法により、子癇前症のリスクが高いと判定された妊娠対象に、子癇前症のリスクを減少させるため、または子癇前症の新生児合併症を減少させるために有効な治療剤を投与することを含む、方法。
【請求項５７】
パネル１〜２９(図３)、パネル１〜５６(図４Ａ〜４Ｂ)およびパネル１〜２４(図５)から選択されるタンパク質バイオマーカーのパネルの内のいずれか１つのコントロールの標準物と比較して、定量的測定値が変化している妊娠対象に、子癇前症のリスクを減少させるように設計された治療剤の有効量を投与する、方法。
【請求項５８】
表１、表３または表４のタンパク質バイオマーカーから選択される、複数の実質的に純粋なタンパク質バイオマーカーまたはサロゲートバイオマーカーを含む、パネル。
【請求項５９】
サロゲートバイオマーカーの各々と対をなす安定同位体標準ペプチドをさらに含む、請求項５７記載のパネル。
【請求項６０】
１以上の容器を含むキットであって、各容器は、１以上の複数の各安定同位体標準物を含んでおり、各安定同位体標準物が、パネル１〜２９(図３)、パネル１〜５６(図４Ａ〜４Ｂ)およびパネル１〜２４(図５)から選択されるバイオマーカーのパネルからのバイオマーカーに対するサロゲートペプチドに対応している、キット。
【請求項６１】
本明細書に記載の方法により生成された分類ルールを実行するためのコードを含む、有形で非一過性形態のコンピューター可読媒体。
【請求項６２】
(ｉ)プロセッサ；および
(ｉｉ)プロセッサに接続されたメモリを含んでいる、
(ａ)コンピューターを含むシステムであって、
該メモリが、
(１)分画中の１つ以上のタンパク質バイオマーカーの定量的測定を示す値を含む対象者からのサンプルの試験データ：該タンパク質バイオマーカーが、表１、表３および表４のタンパク質バイオマーカーから選択される；
(２)測定値を含む値に基づいて、対象者を早産のリスクがあると分類する分類ルール：該分類ルールは、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９５％の感度を有するように構成されている；および
(３)試験データに対して分類ルールを実行するためのコンピューター実行可能命令、
を含むモジュールを格納している、
システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本願は、３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９(ｅ)の定めにより、米国仮特許出願第６２／６２４,６２６号(２０１８年１月３１日出願)および第６２／６４１,１３５号(２０１８年３月９日出願)に基づく優先権を主張する。その全体を引用により本明細書に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
子癇前症(ＰＥ)は、高血圧(高血圧)および蛋白尿(尿中の蛋白質)を特徴とする妊婦の症状であり、子癇や痙攣へと至る可能性がある。子癇前症は、一般的に、妊娠中期から後期、出産後６週までの間に発症するが、２０週よりも早い時期または第１三半期に発症することもある。一般的には、最初の妊娠で発症し、ＰＥを経験した女性はその後の妊娠でも同じ症状になる可能性が高い。
【０００３】
ＰＥは、世界で毎年８,３７０,０００人の女性が罹患していると推定されており、母体、胎児および新生児の罹患率および死亡率に関する主要原因である。ＰＥは、新生児の罹患率と死亡率の約７％〜９％を占めている。米国では、２０万人の妊婦が罹患していると報告されており、約１００億ドルの医療費を要すると推定されている。費用の大部分(約８０％)は、早期発症型ＰＥ(例えば、妊娠３５週以前に発症したＰＥ)に関連がある。発展途上国では、子癇前症は、妊産婦死亡率の約４０〜６０％を占める。
【０００４】
子癇前症は、症状もなく発症する場合もある。高血圧は、血圧が正常であった女性であっても、徐々に、または突然発症することがある。その他の症状としては、主に顔や手の突然のむくみ、突然の体重増加、頭痛、視力の変化(時には点滅する光が見える)、倦怠感、息切れ、嘔吐、尿量の減少、血液中の血小板の減少などが挙げられる。ＰＥの合併症を発症する女性もいるが、その症状には、胎児の発育制限、早産(ＰＴＤ)、胎盤剥離、ＨＥＬＬＰ症候群、子癇症、その他の臓器障害(例えば、肝臓および腎臓)、心血管疾患などが挙げられる。子宮内発育制限(ＩＵＧＲ)や妊娠誘発性高血圧症(ＰＩＨ)などの他の合併症を発症する女性もいる。
【０００５】
ＰＥは、時には何の症状もなく、突然発症して、子癇、痙攣、臓器不全などの重篤かつ即時性の合併症を引き起こす可能性があり、誘発するか、または外科的に分娩を行わない限り、胎児と母体の健康が脅かされる。
【０００６】
ＰＥの原因は不明である。一般的に、肥満、糖尿病、ループス、免疫障害、複数の胎児を妊娠している女性や妊娠前の高血圧、腎臓病のある女性は、子癇前症のリスクが高い可能性がある。その他のリスク因子としては、年齢、新しい父子関係などが挙げられる。母親または姉妹がＰＥであった女性も、ＰＥのリスクが高い。
【０００７】
ＰＥは、母体と胎児の健康に長期的な影響をもたらし得る。ＰＥに罹患していた女性は、晩年に高血圧や母体の冠動脈疾患のリスクが高い可能性がある。早産に繋がるＰＥに罹患していた女性は、ＰＥを発症せずに妊娠した女性に比べて、心血管疾患による死亡率が高い。胎児が発育低下状態で出産された幼児や早産で生まれた幼児は、心血管疾患、高血圧糖尿病または精神疾患および神経発達障害(例えば、注意欠陥障害など)を、人生後半に発症する傾向がある。自閉症スペクトラム障害などの発達障害を持つ子供の中では、妊娠中にＰＥを持つ母親の元で生まれた可能性は２倍以上であるとも報告されている。
【０００８】
現在、ＰＥの診断には、高血圧と蛋白尿の両方の陽性所見が必要である。
【０００９】
ＰＥの治療法として考え得る方法には、血圧低下薬、コルチコステロイド、抗痙攣薬、入院、また最終的には分娩が挙げられる。
【００１０】
(図面の簡単な説明)
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する添付の図面は、明細書と共に実施形態を例示的に説明するものであり、これらの実施形態およびその他の実施形態を実施および使用することを可能にするのにさらに役立つことは、当業者には理解されよう。本発明は、以下の図面を用いてより具体的に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例２および３に関連し、かつ図３、４Ａ、４Ｂおよび５に関連する子癇前症に関連するタンパク質を同定するための概略的かつ統計学的ワークフローを示す。
【図２】図２は、子癇前症のリスクが高いバイオマーカーが関連している生物学的機能を示している。これは、図１の統計学的ワークフローを適用して同定したバイオマーカーを表す。
【図３】図３は、ＳＴＲＩＮＧタンパク質データベースに対してキュレーション前の内部モデル生成からの子癇前症に対する２９のバイオマーカーパネルを示している。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ＳＴＲＩＮＧタンパク質データベースに対してキュレーション前のサンプルの試験セットのモデル生成からの子癇前症についての５６のバイオマーカーパネルを示している。
【図５】図５は、ＳＴＲＩＮＧタンパク質データベースに対するキュレーション後の子癇前症のタンパク質バイオマーカーの２４のパネルを示す。
【００１２】
(要旨)
本明細書で提供される一つの局面は、妊娠中の対象者における子癇前症のリスクを評価するための方法であり、以下の工程を含む方法である：(ａ)妊娠中の対象者の血液サンプルからマイクロ粒子を多く含む画分を調製する工程；(ｂ)画分中の１以上のマイクロ粒子関連タンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定する工程、ここで該１以上のバイオマーカーは、下記のものから選択される；(ｉ)表１のタンパク質バイオマーカー；(ｉｉ)下記セットのタンパク質バイオマーカー：Ａ２Ｎ０Ｕ６、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡ、Ｑ９６ＴＢ４、Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｉ４、Ｑ５ＮＶ８２、Ｅ３ＵＶＱ２、Ｅ９ＰＱＧ４、Ｌ０Ｒ６Ｎ９、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＭＢＬ２、Ｂ２Ｒ８１５、Ｄ６ＭＪＤ１、ＺＡ２Ｇ、Ａ０Ａ０２４Ｒ９Ｉ２、ＴＰＣ１１、ＣＯ５、Ａ０Ａ０２４Ｒ３Ｚ１、Ａ８Ｋ００８、Ｂ２Ｒ４Ｃ５、Ｂ４Ｅ１Ｄ８、ＧＰ１１２、Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｈ９；および(ｉｉｉ)下記セットのタンパク質バイオマーカー：ＧＰ１ＢＡ、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＨ、ＪＰＨ１、ＣＯ５、ＨＥＰ２、ＴＰＣ１１、ＭＢＬ２、ＡＡＣＴ、ＤＹＨ３、ＴＳＰ１、ＣＡＰＳ１、ＡＰＯＤ、ＬＣＡＴ；ならびに(ｃ)測定値に基づいて子癇前症のリスクを評価する工程。一実施形態では、アップレギュレートされたバイオマーカー量の増加またはダウンレギュレートされたバイオマーカー量の減少は、子癇前症の高いリスクを示す。別の実施形態において、この方法は、表１のタンパク質バイオマーカーから選択された複数のタンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定することを含む。別の実施形態において、１以上のタンパク質バイオマーカーは、表１：グループ１、グループ２またはグループ３から選択される。別の実施形態において、１以上のタンパク質バイオマーカーは、免疫機能、細胞シグナル伝達、血管新生、アポトーシス、マトリックス付着、細胞機能、タンパク質代謝、イオン輸送および未知の機能から選択される複数の生物学的機能各々から選択される。別の実施形態において、該方法は、子癇前症の重症化リスクを決定することを含み、該バイオマーカー(１つ)またはバイオマーカー(複数)は、０Ａ０７５Ｂ６Ｉ５＿ＨＵＭＡＮ、Ａ２ＭＹＤ２＿ＨＵＭＡＮ、ＡＬ２ＳＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲ１３Ｂ＿ＨＵＭＡＮ、Ｂ３ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＢＡＩ１＿ＨＵＭＡＮ、ＢＲＷＤ３＿ＨＵＭＡＮ、Ｃ６Ｋ６Ｈ８＿ＨＵＭＡＮ、ＣＩ０４０＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＬＸ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＬＸ２＿ＨＵＭＡＮ、Ｅ５ＲＧ７４＿ＨＵＭＡＮ、Ｅ９ＰＮＷ５＿ＨＵＭＡＮ、ＨＶ３０１＿ＨＵＭＡＮ、Ｉ６Ｙ０Ｂ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｊ３ＫＰＪ３＿ＨＵＭＡＮ、ＬＡＣ７＿ＨＵＭＡＮ、ＬＩＰＡ２＿ＨＵＭＡＮ、ＬＶ１０４＿ＨＵＭＡＮ、ＬＶ１０９＿ＨＵＭＡＮ、Ｑ６８Ｄ１３＿ＨＵＭＡＮ、Ｑ９ＵＬ８８＿ＨＵＭＡＮ、ＳＣＲＩＢ＿ＨＵＭＡＮおよびＴＴＣ３７＿ＨＵＭＡＮから選択される。別の実施形態において、該方法は、Ａ２Ｎ０Ｕ６、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡ、Ｑ９６ＴＢ４、Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｉ４、Ｑ５ＮＶ８２、Ｅ３ＵＶＱ２、Ｅ９ＰＱＧ４、Ｌ０Ｒ６Ｎ９、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＭＢＬ２、Ｂ２Ｒ８１５、Ｄ６ＭＪＤ１、ＺＡ２Ｇ、Ａ０Ａ０２４Ｒ��Ｉ２、ＴＰＣ１１、ＣＯ５、Ａ０Ａ０２４Ｒ３Ｚ１、Ａ８Ｋ００８、Ｂ２Ｒ４Ｃ５、Ｂ４Ｅ１Ｄ８、ＧＰ１１２およびＡ０Ａ０７５Ｂ６Ｈ９から選択される複数のタンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定することを含む。別の実施形態において、該方法は、ＧＰ１ＢＡ、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＨ、ＪＰＨ１、ＣＯ５、ＨＥＰ２、ＴＰＣ１１、ＭＢＬ２、ＡＡＣＴ、ＤＹＨ３、ＴＳＰ１、ＣＡＰＳ１、ＡＰＯＤおよびＬＣＡＴから選択される複数のタンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定することを含む。別の実施形態において、該バイオマーカーは、パネル１〜２９(図３)、パネル１〜５６(図４Ａ〜４Ｂ)およびパネル１〜２４(図５)から選択されるバイオマーカーパネルを含む。別の実施形態において、該パネルは、１０、９、８、７、６、５、４または３ついずれかを超えないタンパク質バイオマーカーを含む。別の実施形態において、該バイオマーカーは、パネル１〜２９(図３)、パネル１〜５６(図４Ａ〜４Ｂ)およびパネル１〜２４(図５)から選択されるバイオマーカーパネルから構成される。別の実施形態において、該バイオマーカーは、Ａ２Ｎ０Ｕ６、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡおよびＱ９６ＴＢ４から選択される５、４、３または２のバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを含む。別の実施形態において、該バイオマーカーは、Ａ２Ｎ０Ｕ６と、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡおよびＱ９６ＴＢ４の内の少なくとも１、２、３または４つを含むバイオマーカーのパネルを含む。別の実施形態において、該バイオマーカーは、ＧＰ１ＢＡ、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２およびＡＰＯＨから選択される６、５、４、３または２つのバイオマーカーを含むバイオマーカーのパネルを含む。別の実施形態において、バイオマーカーは、ＧＰ１ＢＡと、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２およびＡＰＯＨの内の少なくとも１、２、３、４または５つを含むバイオマーカーのパネルを含む。別の実施形態において、サンプルは、妊娠第１三半期または第２三半期の間に妊娠中の対象者から採取される。別の実施形態において、サンプルは、妊娠１０〜１２週目の間の妊娠対象者から採取される。別の実施形態において、妊娠対象者は、プリミグラビダ、マルチグラビダ、プライミパラスまたはマルチミパラスである。別の実施形態において、妊娠対象者は、単胎妊娠または多胎妊娠である。別の実施形態において、妊娠対象者は、子癇前症に対して無症状である(例えば、高血圧ではないか、または蛋白尿を有していない)。別の実施形態において、妊娠対象者は、子癇前症の既往歴がない。別の実施形態において、妊娠対象者は、子癇前症のリスク因子を有さない。別の実施形態において、妊娠対象者は、慢性の高血圧症である。別の実施形態において、血液サンプルは、血漿または血清である。別の実施形態において、マイクロ粒子を多く含む画分は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて調製される。別の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、水による溶出を含む。別の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、アガロース固相および水性液相を用いて行われる。別の実施形態において、調製工程は、さらに限外ろ過または逆相クロマトグラフィーを使用することを含む。別の実施形態において、調製工程は、さらに、尿素を用いた変性、ジチオスレイトールを用いた還元、ヨードアセタミンを用いたアルキル化およびサイズ排除クロマトグラフィー後のトリプシン消化を含む。別の実施形態において、マイクロ粒子は、胎盤由来のエクソソームまたは血管内皮由来のエクソームを多く含むようにさらに精製される。別の実施形態において、定量的測定値の決定には、質量分析が含まれる。別の実施形態において、定量的測定値の決定には、液体クロマトグラフィー／質量分析(ＬＣ／ＭＳ)が含まれる。別の実施形態において、質量分析には、液体クロマトグラフィー/トリプル四重極質量分析が含まれる。別の実施形態において、質量分析は、多重反応モニタリングを含む。別の実施形態において、質量分析は、多重反応モニタリングを含み、液体クロマトグラフィーは、アセトニトリルを含む溶媒を用いて行い、その決定は、タンパク質に保持時間指標(indexed retention time)を割り当てる工程を含む。別の実施形態において、質量分析は、多重反応モニタリングを含み、この方法は、１または複数の安定同位体標準ペプチドを試料に加えた後、質量分析計に導入することを含み、検出は、質量分析計中のコリジョンセルで生成された安定同位体標準ペプチドの１または複数の娘イオンを検出することを含む。別の実施形態において、定量的測定値を決定する工程とは、タンパク質バイオマーカーのサロゲートペプチドの定量的測定値を決定することを含む。別の実施形態において、質量分析は、１以上の安定同位体標識された標準ペプチドを定量することを含む。別の実施形態において、ＭＲＭは、前記タンパク質バイオマーカーに対応する１以上の安定な重同位体で置換された標準ペプチドを、マイクロ粒子を多く含む画分に加えることを含む。別の実施形態において、定量的測定値を決定する工程とは、１以上の捕捉試薬(各捕捉試薬は、タンパク質バイオマーカーの１つに特異的に結合する)をサンプルと接触させて、タンパク質バイオマーカー中の捕捉試薬間の結合を検出することを含む。別の実施形態において、定量は、免疫測定を行うことを含む。別の実施形態において、免疫測定は、酵素免疫測定(ＥＩＡ)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)およびラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)からなる群から選択される。別の実施形態において、評価工程とは、分類ルールを実行することを含み、この分類ルールにより、子癇前症のリスクを有する対象者が分類され、その分類ルールの実行により、少なくとも０.０５未満のｐ値と子癇前症または満期産との間の相関関係が構築される。別の実施形態において、評価工程とは、分類ルールを実行することを含み、この分類ルールにより、子癇前症のリスクがある対象者が分類され、ここで分類ルールの実行により、受信機動作特性(ＲＯＣ)曲線が作成され、ＲＯＣ曲線は、少なくとも０.６、少なくとも０.７、少なくとも０.８または少なくとも０.９の曲線下面積(ＡＵＣ)を有する。別の実施形態において、対象を分類する分類ルールは、以下の少なくとも１つをさらに含む：母体年齢、母体の肥満指数、初産婦および妊娠中の喫煙。別の実施形態において、���類ルールは、カットオフ値、線形回帰[例えば、多変数線形回帰(ＭＬＲ)、部分最小二乗(ＰＬＳ)回帰、主成分回帰(ＰＣＲ)、二値決定木(例えば、ＣＡＲＴ−分類木および回帰木などの再帰的分割処理)、バックプロパゲーションネットワークなどの人工ニューラルネットワーク、判別分析(例えば、ベイズ分類またはフィッシャー分析)、ロジスティック分類およびサポートベクター分類(例えば、サポートベクターマシン)などを用いる。別の実施形態において、分類ルールは、感度、特異度、正の予測値または負の予測値が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％であるように決められている。別の実施形態において、子癇前症のリスク増加を評価する工程とは、タンパク質バイオマーカーが、閾値レベルを上回るか(アップレギュレートされている場合)、または閾値レベルを下回っているか(ダウンレギュレートされている場合)を決定することを含む。別の実施形態において、閾値レベルは、少なくとも５０人、少なくとも１００人または少なくとも２００人のコントロール対象者から決定されたタンパク質の中心傾向(例えば、平均値、中央値またはモード)の測定値からの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのｚスコアを表す。別の実施形態において、評価は、パネル中の各タンパク質の測定値をコントロールの標準物と比較することを含む。別の実施形態において、該方法は、妊娠対象者の子癇前症のリスクを、医療従事者に伝達することを含む。別の実施形態において、該方法は、(ｄ)分画中の早産に対する１または複数のマイクロ粒子関連タンパク質バイオマーカーの定量的測定値を決定する工程；および(ｅ)測定値に基づいて早産のリスクを評価する工程をさらに含む。
【００１３】
本明細書に提供される別の局面において、妊娠中の対象者に対する子癇前症のリスクを減少させる方法、および／または子癇前症の新生児合併症を減少させる方法であって、該方法は、ａ)本明細書に記載の方法に従って、妊娠対象者に対する子癇前症のリスクを評価する工程；および(ｂ)子癇前症のリスクおよび／または子癇前症の新生児の合併症を減少させるのに有効な治療剤を対象に投与する工程を含む。別の実施形態において、治療剤とは、アスピリン(例えば、低用量アスピリン)、コルチコステロイドまたは血圧低下薬からなる群から選択される。別の実施形態において、治療される子癇前症は、遅発型または軽症型、高血圧型あるいは早発型または重症型である。
【００１４】
本明細書に提供される別の局面において、本明細書に記載の方法により子癇前症のリスクが増大していると判定された妊娠対象に、子癇前症のリスク低下または子癇前症の新生児合併症低下のために有効な治療剤を投与することを含む方法である。
【００１５】
本明細書に提供される別の局面において、パネル１〜２９(図３)、パネル１〜５６(図４Ａ〜４Ｂ)およびパネル１〜２４(図５)から選択されるタンパク質バイオマーカーパネルのいずれか１つのコントロール標準物と比較した場合に変化した定量測定値を示す妊娠対象に、子癇前症のリスクを減少させるように設計された治療剤の有効量を投与する方法である。
【００１６】
本明細書で提供される別の局面において、表１、表３または表４のタンパク質バイオマーカーから選択される複数の実質的に純粋なタンパク質バイオマーカーまたはサロゲートバイオマーカーを含むパネルである。一つの実施形態において、パネルは、サロゲートバイオマーカーの各々と対を為す安定同位体標準ペプチドをさらに含む。
【００１７】
本明細書で提供される別の局面では、１以上の容器を含むキットであって、各容器は、複数の安定同位体標準のうちの１以上を含んでおり、各安定同位体標準は、パネル１〜２９(図３)、パネル１〜５６(図４Ａ〜４Ｂ)およびパネル１〜２４(図５)から選択されるバイオマーカーパネル由来のバイオマーカーのためのサロゲートペプチドに対応している。
【００１８】
別の局面では、本明細書に提供されるものは、本明細書に記載された方法によって構築された分類ルールを実行するためのコードを含む有形で非一過性形態のコンピューター可読媒体である。
【００１９】
本明細書で提供される別の側面では、(ｉ)プロセッサと(ｉｉ)該プロセッサに接続されたメモリを含む(ａ)コンピューターシステムが提供される；該メモリには、(１)対象者由来サンプルの試験データ、例えば分画物中の１以上のタンパク質バイオマーカーの定量測定値であって、該タンパク質バイオマーカーは、表１、表３および表４のタンパク質バイオマーカーから選択される；(２)該測定値を含む値に基づいて、対象者を早産のリスクが有ると分類する分類ルールであって、該分類ルールは、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９５％の感度を有するように作成される；および(３)試験データに対して分類ルールを実行するためのコンピューター実行可能命令を含むモジュールが格納されている。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
Ｉ．イントロダクション
本明細書に開示されているのは、子癇前症を発症するリスクの決定および子癇前症の治療に有用な方法、システムおよび物品である。これには、子癇前症の早期発見(症状が顕在しておらず、検出するためには通常の閾値以下である期間での決定)および子癇前症を発症するリスクの決定が含まれる。これらのうちの特定のものは、妊婦の血液由来のマイクロ粒子を多く含む画分中に見出される子癇前症バイオマーカーの検出に関連している。かかるバイオマーカーを、表１、表４、表５に示す。
【００２１】
ＩＩ．対象者
子癇前症を予測および治療するための対象者は、妊娠しているヒトの女性である。いくつかの実施形態において、妊婦とは、妊娠第１三半期(例えば、妊娠第１〜１２週)、第２三半期(例えば、妊娠第１３〜２８週)または第３三半期(例えば、妊娠第２９〜３７週)の妊娠中の女性である。いくつかの実施形態において、妊婦とは、妊娠初期(例えば、妊娠８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週または２０週から、ただし妊娠２１週よりも早い；２０週、１９週、１８週、１７週、１６週、１５週、１４週、１３週、１２週、１１週、１１週、１０週または９週から、ただし妊娠８週よりも遅い)である。いくつかの実施形態において、妊婦とは、妊娠８〜１５週の間、例えば１０〜１２週、８〜１２週または１０〜１５週の女性である。いくつかの実施形態において、妊婦は、妊娠中期(例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０から、ただし妊娠３１週よりも早い；３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２または２１から、ただし妊娠２０週よりも遅く)である。いくつかの実施形態において、妊婦は、妊娠後期(例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７から、ただし妊娠３８週よりも早い；３７、３６、３５、３４、３３、３２または３１から、ただし妊娠３０週よりも遅い)である。いくつかの実施形態において、妊婦とは、妊娠１７週未満、１６週未満、１５週未満、１４週未満または１３週未満である(２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９から、ただし妊娠８週よりも遅い)。妊娠段階は、妊娠中の対象者の最後の正常な月経期間の初日から算出することができる。
【００２２】
本明細書に記載の方法の妊娠対象者は、初産婦(以前に分娩経験無い、本明細書では互換的にヌリパラスまたはパリティ＝０として示す)または経産婦(以前に少なくとも１人妊娠２０週目までに分娩経験有、本明細書では互換的にパリティ＞０、パリティ＞１として示される)、プリミグラビダ(最初の妊娠)またはマルチグラビダ(２人以上の妊娠)を含む１以上のクラスに属することができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、妊娠しているヒトの対象は無症状者である。いくつかの実施形態において、対象者は、例えば、高血圧、尿中タンパク質、子癇前症の家族歴、腎疾患、結合組織の疾患、肥満、母体の高齢または医学的補助による妊娠などの子癇前症のリスク因子を有していてもよい。
【００２４】
ＩＩＩ．サンプル調製
本開示の方法で使用するためのサンプルは、妊娠中の対象から得られる生物学的サンプルである。ある実施形態では、サンプルは、前記妊娠段階で採取される。いくつかの実施形態において、サンプルは、血液、唾液、涙、汗、鼻分泌物、尿、羊水または子宮頸管膣液サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは血液サンプルであり、ある実施形態では血清または血漿である。いくつかの実施形態において、サンプルは、凍結保存されている(例えば、−２０℃または−８０℃)。
【００２５】
用語「マイクロ粒子」とは、約５０〜約５０００ｎｍの流体力学的直径を有する細胞外微小胞または脂質ラフトタンパク質凝集体を指す。このように、用語「マイクロ粒子」とは、エクソソーム(約５０〜約１００ｎｍ)、マイクロベシクル(約１００〜約３００ｎｍ)、エクトソーム(約５０〜約１０００ｎｍ)、アポトーシス体(約５０〜約５０００ｎｍ)および同じサイズの脂質−タンパク質凝集体が包含される。
【００２６】
用語「マイクロ粒子関連タンパク質」は、哺乳類(例えば、ヒト)被験体からのマイクロ粒子を多く含むサンプル中の検出可能なタンパク質またはそのフラグメントを指す。このような「マイクロ粒子関連タンパク質」という用語は、検出時にマイクロ粒子と物理的に結合しているタンパク質またはその断片に限定されない。
【００２７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、特に指定されない限り、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含むアミノ酸のポリマーを指す。
【００２８】
値について、本細書で使用されるような「約」という用語は、その値の９０％〜１１００％を指す。例えば、約１００００ｎｍの直径は、９００ｎｍ〜１１０００ｎｍの範囲内の直径である。
【００２９】
子癇前症のためのバイオマーカーは、マイクロ粒子から得ることができる。マイクロ粒子は、サイズ排除クロマトグラフィーにより血液(例えば、血清または血漿)から単離され得る。溶出バッファーは、例えば、ＰＢＳのような緩衝液、非緩衝液、水または脱イオン水であってもよい。高分子量画分を回収して、マイクロ粒子を多く含むサンプルを得ることができる。次いで、該マイクロ粒子を多く含むサンプル中のタンパク質を抽出して、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で消化し、複数のペプチドを含む消化されたサンプルを得る。消化されたサンプルは、サンプルのプロテオミクスプロファイルを取得するために、分析の前にペプチドの精製／濃縮工程(例えば、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法により)を行う。いくつかの実施形態において、精製／濃縮工程には、逆相クロマトグラフィー(例えば、０.２μＬのＣ１８樹脂を有するＺＩＰＴＩＰピペットチップ(Millipore Corporation, Billerica, MA)が挙げられる。
【００３０】
ある実施形態において、エクソソソームとは、胎盤由来のエクソソームまたは内皮由来のエクソソームである。かかるエキソソームは、これらの起源細胞の表面マーカーに対して、抗体などの捕捉物質を用いて単離され得る。例えば、胎盤由来のエクソソームは、ＣＤ３４、ＣＤ４４または白血病阻止因子(ＬＩＦ)に対する抗体を用いて単離され得る。内皮由来のエクソソームは、ＩＣＡＭまたはＶＣＡＭに対する抗体を用いて単離することができる。
【００３１】
本明細書に提供されるものは、実質的に純粋な形態の１以上の子癇前バイオマーカーを含む物質の組成物である。バイオマーカーは、容器内で混合されてもよく、または物理的に分離されてもよい(例えば、異なるアドレス可能な位置にて固体支持体と結合することにより)。本明細書で使用されるように、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの化学物質は、組成物中でその種の化学物質が優勢である場合に「実質的に純粋」である。これは、組成物中に同種の化学物質が５０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９５％以上を示す化学物質が含まれる場合である。化学物質は、組成物中で同種の化学物質が９８％以上、９９％以上、９９.５％以上、９９.９％以上または９９.９９％以上を表す場合、「本質的に純粋」である。本質的に純粋である化学物質もまた、実質的に純粋である。
【００３２】
ＩＶ．バイオマーカーの検出
Ａ．バイオマーカー
本明細書で用いる用語「バイオマーカー」とは、２つの症状の間に統計的に有意な差を示す存在、形態または量を有する生体分子を指す。従って、バイオマーカーは、単独で、または組み合わせにて、対象者を複数のグループの１つに分類するのに有用である。バイオマーカーは、天然に存在するものであってもよいし、天然に存在しないものであってもよい。例えば、バイオマーカーは、天然に存在するタンパク質または天然に存在しないタンパク質の断片であってもよい。タンパク質のフラグメントは、タンパク質のプロキシペプチドまたはサロゲートペプチドとして、または単独のバイオマーカーとして機能することができる。
【００３３】
本明細書において提供されるのは、子癇前症のリスクに関するポリペプチドバイオマーカーである。子癇前症に対するバイオマーカーは、表１、表３および表４に示されている。子癇前症のリスクについてのバイオマーカーパネルは、図３、図４Ａ、図４Ｂならびに図５に示されている。
【００３４】
バイオマーカーは、妊婦から採取したサンプル(例えば、血液)から単離したマイクロ粒子からのタンパク質に関するデ・ノボ・シーケンシングを用いて検出することができる。タンパク質は、質量分析、例えばシングルまたはダブル(ＭＳ／ＭＳ)質量分析により、配列決定され得る。親タンパク質および親タンパク質のペプチドフラグメントの両方が、子癇前症のバイオマーカーとして有用である。別段の記載がない限り、名称があるタンパク質バイオマーカーは、例えばタンパク質フラグメントなどのサロゲートによる検出を包含する。
【００３５】
質量分析法により検出されたタンパク質(例えば、ペプチド)を、コントロールと比較して、アップレギュレーションされているか(量が増加している)、またはダウンレギュレーションされている(量が減少している)タンパク質を特定するために分析する。統計学的有意差がある発現を示すタンパク質は、親タンパク質を同定するためにさらに分析される。かかるタンパク質は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔなどのタンパク質データベースで同定することができる。
【００３６】
ある実施形態では、バイオマーカーは、ペプチドバイオマーカーとペプチドの安定同位体標準物とが対になっている組成物中に含まれ得る。そのような組成物は、多重反応モニタリング質量分析における検出に有用である。
【００３７】
質量分析の目的のために、タンパク質は、例えば、多重反応モニタリング(ＭＲＭ)において、そのままで、または断片化により検出され得る。この場合、タンパク質は、分析の前にタンパク質分解により断片化され得る。タンパク質分解による断片化には、化学的断片化および酵素的断片化の両方が含まれる。化学的断片化には、例えば、シアノゲンブロマイドを用いる処理が含まれる。酵素的断片化には、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、ＡｒｇＣ、ＧｌｕＣ、ＬｙｓＮおよびＡｓｐＮなどのプロテアーゼによる消化が含まれる。これらのタンパク質断片または質量分析で生成されたそれらの断片化形態の検出は、完全タンパク質のサロゲートとして機能し得る。
【００３８】
１．初期解析により同定されたバイオマーカー
ミクロソーム関連タンパク質の初期統計解析により、表１のバイオマーカーが同定された。表１は、バイオマーカーの識別力の相対順位(「ランク」)(１、２または３)を示しており、そのバイオマーカーが、ＰＥの重度の症例を分類する際に機能するかどうか(「極端な表現型にも見いだされている」)、タンパク質バイオマーカーのフルネーム、症例とコントロールのバイオマーカー量の比率および示差発現のｐ値を示している。比率に関しては、比率が１より大きい場合は、そのマーカーがＰＥではアップレギュレートされていることを示し、比率が１より小さい場合は、そのバイオマーカーがＰＥではダウンレギュレートされていることを示している。重度の子癇前症(重症な子癇前症とも呼ばれる)は、頭痛、視朦、強い光への不耐性、疲労感、吐き気/嘔吐、排尿量の減少、右上腹部の痛み、息切れおよびアザになり易い傾向のうちの１以上を特徴とする。
【００３９】
子癇前症の予測に使用されるバイオマーカーは、下記の表１の全バイオマーカーから選択された１種類以上のバイオマーカーであってもよいし、表１のバイオマーカーの任意のランクグループから選択された１以上のバイオマーカーであってもよい。選択されるバイオマーカーは、全てがアップレギュレーションされていてもよいし、全てがダウンレギュレーションされていてもよいし、アップレギュレーションされたバイオマーカーとダウンレギュレーションされたバイオマーカーの両方を組み合わせたものであってもよい。
【００４０】
ある実施形態では、バイオマーカーは後記から選択される：０Ａ０７５Ｂ６Ｉ５＿ＨＵＭＡＮ、Ａ２ＭＹＤ２＿ＨＵＭＡＮ、ＡＬ２ＳＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲ１３Ｂ＿ＨＵＭＡＮ、Ｂ３ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＢＡＩ１＿ＨＵＭＡＮ、ＢＲＷＤ３＿ＨＵＭＡＮ、Ｃ６Ｋ６Ｈ８＿ＨＵＭＡＮ、ＣＩ０４０＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＬＸ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＰＬＸ２＿ＨＵＭＡＮ、Ｅ５ＲＧ７４＿ＨＵＭＡＮ、Ｅ９ＰＮＷ５＿ＨＵＭＡＮ、ＨＶ３０１＿ＨＵＭＡＮ、Ｉ６Ｙ０Ｂ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｊ３ＫＰＪ３＿ＨＵＭＡＮ、ＬＡＣ７＿ＨＵＭＡＮ、ＬＩＰＡ２＿ＨＵＭＡＮ、ＬＶ１０４＿ＨＵＭＡＮ、ＬＶ１０９＿ＨＵＭＡＮ、Ｑ６８Ｄ１３＿ＨＵＭＡＮ、Ｑ９ＵＬ８８＿ＨＵＭＡＮ、ＳＣＲＩＢ＿ＨＵＭＡＮおよびＴＴＣ３７＿ＨＵＭＡＮ。このようなバイオマーカーは、子癇前症の重症型と関連し得る。
【００４１】
図２は、子癇前症の高リスクに対するバイオマーカーと生物学的機能に関連があることを示す。これらの生物学的機能には、免疫機能、細胞シグナル伝達、血管新生、アポトーシス、マトリックス付着、細胞機能、タンパク質代謝およびイオン輸送が含まれる。生物学的機能が未知のタンパク質についてのバイオマーカーもまた示されている。ある実施形態では、複数の異なる生物学的機能からの少なくとも１つのバイオマーカー(例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７または少なくとも８つ)の夫々を測定することができる。これは、同様に、生物学的機能が未知のタンパク質の少なくともバイオマーカーを測定することを含むことができる。
【００４２】
２．機械学習により同定されたバイオマーカー
ＨＲＡＭ質量分析で作成されたデータに機械学習を使用することで、表３および表４に示すようにその他の優れたパフォーマンスを持つバイオマーカーが発見された。これらのバイオマーカーを使用したパネルを、図３ならびに図４Ａおよび４Ｂに示す。別の実施形態において、タンパク質バイオマーカーは、Ａ２Ｎ０Ｕ６、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡ、Ｑ９６ＴＢ４、Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｉ４、Ｑ５ＮＶ８２、Ｅ３ＵＶＱ２、Ｅ９ＰＱＧ４、Ｌ０Ｒ６Ｎ９、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＭＢＬ２、Ｂ２Ｒ８１５、Ｄ６ＭＪＤ１、ＺＡ２Ｇ、Ａ０Ａ０２４Ｒ９Ｉ２、ＴＰＣ１１、ＣＯ５、Ａ０Ａ０２４Ｒ３Ｚ１、Ａ８Ｋ００８、Ｂ２Ｒ４Ｃ５、Ｂ４Ｅ１Ｄ８、ＧＰ１１２およびＡ０Ａ０７５Ｂ６Ｈ９から選択された１、２、３、４、５、６またはそれ以上のバイオマーカーでもよい。あるいは、パネルは、このグループから選択された６、５、４、３または２つ以下のバイオマーカーを含むことができる。
【００４３】
本明細書に記載の方法において有用なタンパク質バイオマーカーは、バイオマーカーパネルを含む。バイオマーカーパネルは、図３のパネル１〜２９から選択されるパネルからのタンパク質を含むことができる。すなわち、パネルは、図３のパネル１〜２９から選択されたパネルからのバイオマーカーおよび他のバイオマーカーをさらに含むことができる。別の実施形態において、バイオマーカーパネルは、図３のパネル１〜２９から選択されたバイオマーカーパネルから構成され得る。すなわち、このパネルは、指定されたパネルにおいて同定されたバイオマーカーのみを含む。
【００４４】
バイオマーカーの別のパネルは、図４Ａ〜４Ｂのパネル１〜５６から選択されたパネルからのタンパク質バイオマーカーを含むパネルを含む。別の実施形態において、パネルは、図４Ａ〜４Ｂのパネル１〜５６のパネルからのタンパク質バイオマーカーから選択される。
【００４５】
他の実施形態において、バイオマーカーは、Ａ２Ｎ０Ｕ６、Ａ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡおよびＱ９６ＴＢ４から選択される、５、４、３または２つのバイオマーカーを含む。
【００４６】
別の実施形態において、バイオマーカーは、Ａ２Ｎ０Ｕ６、ならびにＡ０Ａ０２４Ｒ８Ｄ８、Ｂ２Ｒ６Ｌ０、ＧＰ１ＢＡおよびＱ９６ＴＢ４の内の少なくとも１、２、３または４つを含むバイオマーカーのパネルを含む。
【００４７】
３．キュレーション後に同定したバイオマーカー
前記機械学習操作で同定されたバイオマーカーには、ＳＴＲＩＮＧタンパク質データベースに対するキュレーションを行った。ＳＴＲＩＮＧデータベースに含まれていないか、またはデータベース内の他のタンパク質との相互作用が４以下であることが確認されたタンパク質は削除した。残っているタンパク質は、既知の生物学的機能を有する。残っているタンパク質に関連するデータを、機械学習の対象とした。最良のパフォーマンスを示すタンパク質バイオマーカーを同定し、表５および表６に示した。これらのタンパク質バイオマーカーを含む最良のパフォーマンスのパネルを、図５に示す。
【００４８】
従って、別の実施形態において、子癇前症のリスクを決定するためのタンパク質バイオマーカーは、ＧＰ１ＢＡ、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＨ、ＪＰＨ１、ＣＯ５、ＨＥＰ２、ＴＰＣ１１、ＭＢＬ２、ＡＡＣＴ、ＤＹＨ３、ＴＳＰ１、ＣＡＰＳ１、ＡＰＯＤおよびＬＣＡＴからなる群から選択される１、２、３、４、５、６以上のバイオマーカーであってもよい。あるいは、パネルは、このグループから選択された６、５、４、３、または２つ以下のバイオマーカーを含むことができる。
【００４９】
バイオマーカーパネルは、図５のパネル１〜２４から選択されるパネルからのタンパク質を含むことができる。別の実施形態において、パネルは、図５のパネル１〜２４から選択されるパネルからのタンパク質バイオマーカーを含む。
【００５０】
他の実施形態では、バイオマーカーは、ＧＰ１ＢＡ、ＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２およびＡＰＯＨから選択される６、５、４、３または２のバイオマーカーを含むパネルを含む。
【００５１】
他の実施形態では、バイオマーカーは、ＧＰ１ＢＡ、ならびにＶＴＮＣ、Ｃ１ＲＬ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＣ２およびＡＰＯＨから選択される少なくとも１、２、３、４または５を含むバイオマーカーのパネルを含む。
【００５２】
４．検出方法
バイオマーカーは、当該技術分野で知られている任意の方法によって検出および定量することができる。この方法には、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、質量分析、電気泳動および表面プラズモン共鳴が含まれるが、これに限定するものではない。
【００５３】
バイオマーカーの検出は、インタクトなタンパク質の検出またはフラグメントなどの該タンパク質サロゲートの検出を含む。
【００５４】
免疫測定法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、サンドイッチアッセイおよびウェスタンブロット、免疫沈降法、免疫組織化学法、免疫蛍光法、抗体マイクロアレイ、ドットブロット法、ＦＡＣＳ法などが挙げられる。
【００５５】
クロマトグラフィー法としては、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー／ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー(例えば、ＨＰＬＣなど)が挙げられる。
【００５６】
５．質量分析
いくつかの実施形態において、マイクロ粒子関連タンパク質レベルの検出(例えば、存在を検出することを含む)は、液体クロマトグラフィー／質量分析(ＬＣＭＳ)に基づくプロテオミクス分析を用いて達成される。例示的な実施形態において、該方法は、サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィーに供して、高分子量画分を収集して(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより)、マイクロ粒子濃縮サンプルを得ることを含む。その後、このマイクロ粒子を多く含む試料を破砕し(例えば、カオトロピック剤、変性剤、還元剤および／またはアルキル化剤を使用して)、放出された内容物を、タンパク質分解の対象とする。複数のペプチドを含む破砕されたエキソソーム調製物は、質量分析によるペプチド分析の前に、本明細書に記載されたタンデムカラムシステムを用いて処理され、サンプルのプロテオミクスプロファイルが提供される。本明細書に開示した方法は、従前の方法に関連するタンパク質の濃縮／精製、緩衝液交換および液体クロマトグラフィーの工程を必要としない。
【００５７】
試料中のタンパク質は、質量分析法によって検出することができる。質量分析計は、典型的には、分析対象物をイオン化するためのイオン源と、質量を決定するための１以上の質量分析計を含む。質量分析計は、タンデム質量分析計で一緒に使用することができる。イオン化の方法としては、特に、エレクトロスプレー法またはレーザー脱離法が挙げられる。質量分析装置には、四重極、イオントラップ、飛行時間測定装置および磁気セクターまたは電気セクター測定装置が含まれる。ある実施形態では、質量分析計は、ある質量のイオンを選択するための第１の質量分析計と、選択されたイオンを分析するための第２の質量分析計を使用するタンデム質量分析計(例えば、「ＭＳ-ＭＳ」)である。タンデム質量分析計の一例は、トリプル四重極装置であり、第１および第３の四重極が質量フィルタとして機能し、中間の四重極がコリジョンセルとして機能する。質量分析はまた、液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーなどのアップストリーム分離技術と結合することができる。従って、例えば、タンデム質量分析と結合された液体クロマトグラフィーは、「ＬＣ-ＭＳ-ＭＳ」と呼ばれ得る。
【００５８】
本明細書に記載された分析に有用な質量分析計には、ThermoFisher Scientific社のAltis(商標登録)四重極、Quantis(商標登録)四重極、Quantiva(商標登録)またはFortis(商標登録)トリプル四重極およびPerkin Elmer社のQSight(商標登録)トリプル四重極LC/MS/MSが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
一般に、ペプチドの質量に関する正確な情報、また好ましくは、選択されたペプチドの断片化および／または(部分的な)アミノ酸配列に関する正確な情報を提供することができるあらゆる質量分析(ＭＳ)技術(例えば、タンデム質量分析、ＭＳ／ＭＳ；またはポストソース分解、ＴＯＦＭＳ)を、本明細書に開示された方法および組成物に使用することができる。適切なペプチドＭＳおよびＭＳ／ＭＳ技術およびシステムは、当技術分野で知られており(例えば、Methods in Molecular Biology, vol.146:"Mass Spectrometry of Proteins and Peptides", by Chapman, ed., Humana Press 2000; Kassel & Biemann (1990) Anal. Chem. 62:1691-1695；Methods Enzymol 193. 455-79；またはMethods in Enzymology, vol.402: "Biological Mass Spectrometry", by Burlingame, ed. Academic Press 2005を参照のこと)、本明細書に開示された方法を実施する際に使用することができる。従って、いくつかの実施形態において、当該方法は、１以上のペプチドを測定するために定量的ＭＳを実行する工程を含む。そのような定量的方法は、自動化形式(Villanueva, et al., Nature Protocols (2006) 1(2):880-891)または半自動化形式で実施され得る。ある実施形態では、ＭＳは、液体クロマトグラフィー装置(ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ)またはガスクロマトグラフィー装置(ＧＣ−ＭＳまたはＧＣ−ＭＳ／ＭＳ)と連結して操作することができる。
【００６０】
選択反応モニタリングは、第１の質量分析器で目的のポリペプチド(前駆体)を選択し、コリジョンセルでポリペプチドを生成物断片へと断片化し、その１以上の断片を第２の質量分析器で検出する質量分析法である。前駆体と生成物イオンのペアは、ＳＲＭ「トランジション」と呼ばれる。この方法は、一般的には、トリプル四重極装置で行われる。ポリペプチドの複数のフラグメントを分析する場合、この方法は多重反応モニタリング質量分析法(「ＭＲＭ−ＭＳ」)と呼ばれる。
【００６１】
通常、タンパク質のサンプルは、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で消化し、ペプチド断片を生成する。これらのペプチドの幾つかの重同位体標識アナログを、同位体標準物として合成される。これらの標準物は、安定同位体標準物または「ＳＩＳ」と呼ばれる。ＳＩＳペプチドを、プロテアーゼ処理したサンプルと混合する。混合物は、トリプル四重極質量分析にかける。ＳＩＳ標準物と標的ペプチドの娘イオンに対応するペプチドを、時間領域または質量領域のいずれかで高精度で検出する。通常、親イオンの存在を明確に識別するために複数の娘イオンが用いられ、通常、最も多く存在する娘イオンの１つを定量に用いる。ＳＩＳペプチドは、オーダーメイドで合成することも、また例えばThermoFisher(Waltham, MA)またはBiognosys(Zurich, Switzerland)のような供給者から市販のキットとして購入することもできる。
【００６２】
本明細書で用いる用語「多重反応モニタリング(ＭＲＭ)」または「選択反応モニタリング(ＳＲＭ)」は、特に、少量の分析物を定量するのに有用なＭＳに基づく定量法を指す。ＳＲＭ実験では、予め規定された前駆体イオンとそのフラグメントのうちの１以上が、トリプル四重極装置の２つの質量フィルタにより選択され、正確に定量するために経時的にモニタリングされる。複数のＳＲＭ前駆体イオンとフラグメントイオンのペアは、異なる前駆体／フラグメントのペア間で迅速に切り替わる(toggling)ことで、そのクロマトグラフィーの時間スケールで同じ実験において測定され、ＭＲＭ実験を行うことができる。ターゲットとする分析物(例えば、ペプチドまたは化学物質、ステロイド、ホルモンなどの低分子)の保持時間と一連のトランジション(前駆体／フラグメントイオン対)を組み合わせることにより、確定的なアッセイを構築できる。一回のＬＣ−ＭＳ実験において多数の分析物を、定量することができる。ＭＲＭまたはＳＲＭにおける用語「計画された(Scheduled)」または「ダイナミック(dynamic)」とは、該アッセイのバリエーションを示し、ここで該特定の分析物についてのトランジションは、予測される保持時間辺りの時間ウィンドウにおいてのみ得られ、一回のＬＣ−ＭＳ実験において検出かつ定量され得る分析物の数を顕著に増加させ、また保持時間は分析物の物理的性質に依存する特性であるので試験の選択性に寄与する。１つの分析物は、１以上のトランジションによりモニターされることも可能である。最終的に、該アッセイは、目的の分析物(例えば、分析物のペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチド)に対応する標準物を包含するが、安定同位体を含むことによって異なる標準物を含むことができる。安定同位体標準物(ＳＩＳ)を、正確なレベルでアッセイに組み込み、対応する未知の分析物を定量するために使用できる。特異性の更なるレベルは、未知の分析物とその対応するＳＩＳの共溶出およびそれらのトランジション特性(例えば、分析物の２つのトランジションレベルの比率とその対応するＳＩＳの２つのトランジション比率の類似性)によってもたらされる。
【００６３】
従って、ＭＲＭ-ＭＳによるタンパク質標的の検出は、一般的には、ペプチドフラグメントが比較される安定同位体標準ペプチドの検出を介して、タンパク質の１以上のペプチドフラグメントの検出を含む。一般的に、ＳＩＳはそれ自体、元の消化されたフラグメントと同様に、コリジョンセル内で断片化され、これらのフラグメントの１以上が質量分析計によって検出される。
【００６４】
バイオマーカーペプチド分析に適した質量分析アッセイ、装置およびシステムには、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ)ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦポストソースディケイ(ＰＳＤ)；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ；表面増強レーザー脱離／イオン飛行時間型質量分析(ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ)ＭＳ；エレクトロスプレーイオン化質量分析(ＥＳＩ−ＭＳ)；ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＥＳＩ−ＭＳ／(ＭＳ)ｎ(ｎはゼロより大きい整数)；ＥＳＩ ３Ｄまたは線形(２Ｄ)イオントラップＭＳ;ＥＳＩトリプル四重極ＭＳ；ＥＳＩ四重極直交ＴＯＦ(Ｑ−ＴＯＦ)；ＥＳＩフーリエ変換ＭＳ系；シリコン上の脱離／イオン化(ＤＩＯＳ)；二次イオン質量分析(ＳＩＭＳ)；大気圧化学イオン化質量分析(ＡＰＣＩ−ＭＳ)；ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＡＰＣＩ−(ＭＳ)ｎ；イオン移動度分析(ＩＭＳ)；誘導結合プラズマ質量分析(ＩＣＰ−ＭＳ)大気圧光イオン化質量分析(ＡＰＰＩ−ＭＳ)；ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ；およびＡＰＰＩ−(ＭＳ)ｎを含み得るが、これに限定するものではない。タンデムＭＳ(ＭＳ／ＭＳ)配置におけるペプチドイオンの断片化は、例えば、衝突誘起解離(ＣＩＤ)などの当分野で既知の技術を用いて達成することができる。本明細書に記載されている通り、質量分析によるバイオマーカーの検出および定量は、特に、Kuhnら(2004)のProteomics 4:1175-1186に記載されるような多重反応モニタリング(ＭＲＭ)を含み得る。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析中に計画された多重反応モニタリング(Scheduled multiple-reaction-monitoring, ＭＲＭ)モード取得により、ペプチド定量の感度および精度が向上する。Anderson and Hunter (2006)Mol. Cell. Proteomics 5(4):573-588)。質量分析に基づくアッセイは、例えば、本明細書に記載されたタンデムカラムシステムなどの上流のペプチドまたはタンパク質の分離または分画方法と有利に組み合わせることができる。
【００６５】
Ｖ．子癇前症のリスクを評価する方法
本明細書で使用される「子癇前症のリスクの増加」という表現は、妊娠中の対象者が、所望により１以上の人口統計学的またはリスク因子を共有する集団と比較して、同じ妊娠段階にある対象者の一般集団よりも子癇前症を発症する可能性が高いことを示す。リスク因子には、例えば、年齢、過去の妊娠の状態／結果、高血圧、尿中タンパク質、人種／民族、病歴、過去の妊娠歴、喫煙／薬物歴などが挙げられる。例えば、妊娠１０〜１２週目の女性が、妊娠１０〜１２週目の女性の一般集団またはコントロール集団と比較して、子癇前症を発症するリスクが高いことを試験により示してもよい。
【００６６】
子癇前症のリスクを評価する方法、例えば、妊娠しているヒト女性を、子癇前症のリスクが増加している女性として分類する方法が、本明細書において提供される。該方法は、表１の１以上のバイオマーカーの定量的測定値を決定すること、そして該測定値を子癇前症のリスクと相関させることを含み得る。例えば、この決定には、２、３、４、５、６またはそれ以上、あるいは２、３、４、５、６以下のバイオマーカーを使用することができる。一般に、アップレギュレーションされたバイオマーカーの相対的に増加した量の測定値またはダウンレギュレーションされたバイオマーカーの相対的に減少した量の測定値は、子癇前症のリスクの増加と相関している。あるいは、決定は、非線形および／または超次元的な方法を用い得る分類アルゴリズムに基づいて行われる。
【００６７】
ある実施形態において、バイオマーカーは、(ｉ)ＰＥ、遅発型／軽症のＰＥと(ｉｉ)ＰＥ／高血圧型、早発型／重症のＰＥのように、ＰＥのサブグループの間を区別するために使用される。
【００６８】
ある実施形態において、当該方法は、子宮動脈ドップラー超音波検査を行うこと、または母体の血圧を測定することをさらに含む。
【００６９】
子癇前症のリスクを評価する方法は、本明細書に開示した少なくとも１つのバイオマーカーの少なくとも１つの定量的測定値を含めた情報に基づいて、対象を子癇前症のリスクが増加していると分類することを含むことができる。
【００７０】
分類には、統計解析および／または機械学習によって決定される分類アルゴリズムまたはモデルを用いることができる。
【００７１】
Ｂ．統計学的分析
典型的に、分析は、統計的に有意な結果を提供するために十分に多いサンプル数の統計学的分析を含む。この目的のために、当技術分野において既知のあらゆる統計的手法が使用され得る。かかる方法またはツールには、限定されないが、相関、ピアソン相関、スピアマン相関、カイ二乗、平均を比較する(例えば、対応あるＴ検定、独立Ｔ検定、ＡＮＯＶＡ)回帰分析(例えば、単純回帰、多変数線形回帰、線形回帰、非線形回帰、ロジスティック回帰、多項式回帰、工程ワイズ回帰、リッジ回帰、ラッソ回帰、エラスティックネット回帰)またはノンパラメトリック分析(例えば、ウィルコクソン順位和検定、ウィルコクソン符号順位検定、符号検定)が含まれる。このようなツールは、ＭＡＴＬＡＢ、ＪＭＰ統計ソフトウェア、ＳＡＳなどの市販の統計パッケージに含まれている。かかる方法は、特定のバイオマーカープロファイルを特定の状態に分類するために使用できるモデルまたは分類値を作成する。
【００７２】
統計分析は、オペレーターが行ってもよく、また機械学習により行わせてもよい。
【００７３】
Ｃ．機械学習
様々なタイプの分類アルゴリズムが当該目的に適しており、例えば、線形および非線形モデル(例えば、ＣＡＲＴ−分類木および回帰木のようなプロセス)、バックプロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析(例えば、ベイズ分類またはフィッシャー分析)、ロジスティック分類器およびサポートベクター分類器(例えば、サポートベクターマシン)などが挙げられる。カットオフ値のような特定の分類値(classifiers)は、人による審査により実行され得る。多変量分類などの他の分類値は、分類アルゴリズムを実行するためにコンピューターが必要とされ得る。
【００７４】
分類アルゴリズム(モデルとも呼ばれる)は、１つグループまたは別のグループに分類された対象者から得られたバイオマーカー測定値のデータセットの分析を実行する機械学習アルゴリズムを含む、数学的分析によって作成され得る。上記の分類アルゴリズムのタイプを作成するものを含む、多くの機械学習アルゴリズムが当技術分野で公知である。
【００７５】
診断検査は、感度(真の陽性である陽性として分類された割合)および特異度(真の陰性である陰性として分類された割合)によって特徴づけられる。診断検査の相対感度および特異度は、トレード・オフ(感度が高いほど特異度が低く、一方で特異性が高いほど感度が低くなることを意味し得る)を伴う可能性がある。これらの相対値は、受信機動作特性(ＲＯＣ)曲線上に表示することができる。バイオマーカーなどの一連の変数の診断力は、ＲＯＣ曲線の曲線下面積(ＡＵＣ)に反映される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、当該分類基準は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の感度を有する。当該分類値は、少なくとも０.６、少なくとも０.７、少なくとも０.８、少なくとも０.９または少なくとも０.９５のＡＵＣを有する。
【００７７】
分類は、バイオマーカーが選択されたカットオフレベルの上または下にある測定値に基づいて為され得る。ある実施形態では、カットオフ値は、複数の陽性および陰性の基準サンプル、例えば、各タイプの少なくとも１０、２０、５０、１００または２００サンプルのバイオマーカーレベルを測定することによって得られる。カットオフ値は、陰性サンプルにおける平均値、中央値またはモードなどの中心傾向の測定値に関して確立することができる。この中心傾向の測定値からの偏差は、カットオフを設定するために使用することができる。例えば、カットオフ値は、分散または標準偏差に基づいて設定することができる。例えば、カットオフ値は、Ｚスコア、即ち正常サンプルの平均値を超える標準偏差の数、例えば、１標準偏差、２標準偏差、３標準偏差または４標準偏差に基づいて設定することができる。例えば、カットオフ値は、診断テストが少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９.５％または９９.９％の感度、特異度および／または陽性予測値を有するように選択することができる。
【００７８】
数値的には、子癇前症についてのリスク増加は、１.０を超える、好ましくは１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.１、２.２、２.３、２.４、２.５、２.６、２.７、２.８、２.９または３.０を超えるオッズ比と関連している。
【００７９】
他の実施形態において、本明細書でさらに提供されるものは、子癇前症バイオマーカーの測定に使用されるものと同じマイクロ粒子を多く含む画分から得る早産についてのバイオマーカーの測定および早産のリスクを予測するためのそれらの使用である。早産についてのバイオマーカーは、例えば、米国公開第２０１５−０３５５１８８８号(「早産についてのバイオマーカー」)および国際出願ＷＯ２０１７／０９６４０５号(「早産のリスクを層別化するための循環マイクロ粒子の使用」)に記載されている。
【００８０】
ＶＩ．子癇前症のリスクがある対象者の治療方法
子癇前症に罹患しているか、またはそのリスクが増大している妊娠中の対象者を治療する方法には、子癇前症の治療に有用な治療剤の投与が含まれる。これには、例えば、血圧上昇を治療するための薬剤の投与、アスピリン(例えば、低用量アスピリン、例えば８０ｍｇ)などの薬剤の投与、スタチンの投与、および子癇前症の症状に対する集中モニタリングを特徴とする。また、補体活性化の標的阻害薬の投与も含まれる。
【００８１】
ＶＩＩ．キット
別の実施形態において、本明細書は、サンプル中の子癇前症のリスク増加についてのバイオマーカーを検出するのに有用な試薬のキットを提供する。タンパク質バイオマーカーを検出することができる試薬には、抗体が含まれるが、これらに限定するものではない。またタンパク質バイオマーカーを検出することができる抗体は、一般的に、検出可能な反応を触媒して、各試薬とそれらの標的との結合を提示することができるフルオロフォアまたは酵素のような分子と直接または間接的に結合される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、キットは、血漿からのマイクロ粒子を多く含むサンプルの迅速な調製のために、低容量(例えば、１ｍｌ、３ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ)の垂直カラム中の高分子量ゲル濾過組成物を含むサンプル処理用材(例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥのようなアガロース)をさらに含む。例えば、マイクロ粒子を多く含むサンプルは、凍結およびさらなる処理のための分析施設への輸送の前の準備段階で、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより調製され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、キットは、子癇前症のリスクを評価するための指示書をさらに含む。本明細書で用いる用語「指示書」とは、対象者からのサンプル中の目的のタンパク質(複数可)の存在を検出するための(発現レベルを判定することを含むキットに含まれる試薬の使用に関する指示を意味する。目的のタンパク質は、子癇前症に関する１以上のバイオマーカーを含み得る。いくつかの実施形態において、指示書は、体外診断用製品を表示する際に米国食品医薬品局(ＦＤＡ)によって要求される使用目的に関する記述をさらに含む。ＦＤＡは、体外診断薬を医療機器として分類し、５１０(ｋ)の申請にて承認されることを要求している。５１０(ｋ)の申請に必要な情報には以下のものが含まれる：１)体外診断用製品名(機器の商品名または商標名、一般名または通常名、および分類名を含む)；２)製品の使用目的；３)該当する場合、５１０（ｋ）の申請書を提出した所有者または事業者の施設登録番号；ＦＤ＆Ｃ法のセクション５１３に該当する場合にはインビトロ診断製品のクラス、既知の場合は適切なパネル、または所有者もしくは事業者が、その機器がかかるセクションに分類されていないと判断した場合は、その決定条件および体外診断製品がそのように分類されていないと判断するための根拠；４）適用可能な場所に、体外診断用製品を記述するのに十分な要求される添付文書および製品広告、その使用用途、ならびに使用説明書(写真または製品図面を含む);５）その機器が、米国における商品流通において同等タイプの他の体外診断用製品と類似していること、および／または異なることを示す文書、該文書をサポートするデータの添付；６)実質的等価性判定の基礎となる安全性および有効性データの５１０(ｋ)概要；または実質的等価性に関するＦＤＡの承認を支持する該５１０（ｋ）安全性および有効性情報が、書面による請求から３０日以内に利用可能となる旨の書面；７）提出者が、彼らが知る限り、上市前報告書で提出された全てのデータおよび情報が真実かつ正確であり、重大な事実が省略されていない事を宣誓する書面；ならびに８）ＦＤＡが実質的等価との判断を下すのに必要な体外診断用製品に関するさらなる情報。
【００８４】
別の実施形態において、キットは、ペプチドバイオマーカー、例えば、バイオマーカータンパク質のプロテアーゼ(例えば、トリプシン)消化により生成されたペプチドに対応する１種以上の安定同位体標準(ＳＩＳ)ペプチドを含む容器からなる。別の実施形態において、ＳＩＳペプチドの大部分または全てが、バイオマーカーペプチドに対応する。別の実施形態において、キットは、ＳＩＳペプチドが対応するバイオマーカーペプチドをさらに含む。
【００８５】
ＶＩＩＩ．システム
また本明細書は、プロセッサおよびメモリからなるコンピューターを含むシステムも提供する。コンピューターは、サンプルから測定された１以上のバイオマーカーの定量的測定値をメモリに受信するように構成できる。メモリは、実行されると、子癇前症のリスクまたは子癇前症のリスクではないとしてサンプルを分類するコンピューター可読命令を包含できる。このコンピューターシステムは、通信インターフェースの助けを借りてコンピューターネットワークと連結させて作動させ得る。ネットワークは、インターネット、インターネットおよび／またはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／またはエクストラネットであり得る。場合に依り、ネットワークは、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワークは、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にする１以上のコンピューターサーバを含むことが可能である。システムには、高速伝送ネットワークなどの通信ネットワークを介して第２のコンピューターと接続された第１のコンピューターを含むことができ、例えばデジタル加入者線(ＤＳＬ)、ケーブルモデム、光ファイバー、ワイヤレス、衛星およびブロードバンド・オーバー・パワーライン(ＢＰＬ)が挙げられるが、これらに限定されない。従って、サンプルを子癇前症のリスクが増加しているか、または増加していないかの分類を提供する結果は、送信コンピューターから、医療従事者のオフィスなどの遠隔受信コンピューターまたはスマートフォンなどのモバイルデバイスに送信することができる。
【実施例】
【００８６】
略語：ＡＵＣ(曲線下面積)；ＣＩ(信頼区間)；ＣＭＰ(循環マイクロ粒子)；ＦＤＲ(偽発見率)；ＬＣ(液体クロマトグラフィー)；ＬＭＰ(最終月経期)；ＭＲＭ(多重反応モニタリング)；ＭＳ(質量分析)；ＲＯＣ(受信機動作特性)；ＳＥＣ(サイズ排除クロマトグラフィー)。
【００８７】
イントロ：子癇前症(ＰＥ)の病態生理に関する標準見解は、妊娠第１三半期終了時に絨毛細胞の浸潤／機能の異常とされている。本研究では、循環マイクロ粒子(ＣＭＰ)タンパク質の固有パターンにより、この妊娠年齢でＰＥを発症する女性を識別できることを示す；これらのパターンは、母体全体および子宮胎盤レベルで固有かつ初期の機能不全と関連がある。
【００８８】
対象：循環マイクロ粒子(ＣＭＰ)は、殆どの種類の細胞から分泌されるナノサイズの脂質二重層粒子であり、細胞間のコミュニケーションと挙動両方の強力なメディエーターとしての評価が高まっている。これまでの研究は、子癇前症と診断された女性の間で循環ＣＭＰ濃度の上昇を関連付けている。子癇前症は、第１三半期末に母体の子宮生理および全身的生理との間に異常な絨毛細胞の相互作用を特徴とするため、ＣＭＰ関連タンパク質の解析により、血中の循環タンパク質よりも多くの情報が得られると期待されている。妊娠１２週間中央値で採取されたＣＭＰ関連タンパク質のパターンは、子癇前症を発症する女性と合併症を伴わない妊娠の女性との間では異なると考えられる。
【００８９】
デザイン：単胎妊娠のマッチドケースコントロール研究を実施した。確認バイアスおよび潜在的なバッチ処理の影響を最小限に抑えるために、サンプルを、実施された研究中の出生コホートにおいてＥＤＴＡ血漿サンプルを前向き研究で収集し、かつ保存(−８０℃)されたサンプルから無作為に選択した。
【００９０】
実施例１：妊娠１０〜１２週の間に得られたサンプル中の循環エキソソーム／マイクロ粒子バイオマーカーの単離
本実施例は、血液(例えば、血漿および／または血清)サンプルを使用するＰＥ患者に関するレトロスペクティブ研究を記述する。この研究は、凍結した母体血漿サンプルから検出されたプロテオミクスバイオマーカーのコホート内症例対照分析である。全てのサンプルは、ＩＲＢ承認のプロトコルに基づいて集められ、全ての患者は研究目的について同意をしている。サンプル収集のための包含基準には、２つの時点：妊娠１０週(±２週)および妊娠２４週(±２週)での単胎妊娠の正常かつ健康な無症状女性からのサンプル提供が含まれる。貯蔵庫に保管されている合計１５０の非同定盲検血漿サンプル(２つの時点の７５人の対象者、今回の妊娠でＰＥを経験した２５人の対象者およびコントロールとして妊娠中の正常で健康な５０人の対象者)を、一晩かけてドライアイス上で分析室に運び、−８０℃で保存した。
【００９１】
方法：
１０〜１２週の間に血漿サンプルを前向き研究で採取した２５症例の単胎妊娠の産科転帰を、ＰＥ＜３５週について治験責任医師により検証した。これらを、５０症例の合併症を伴わない単胎満期産に一致させた。コントロール群は、サンプル採取時の妊娠年齢(±２週)を一致させた。これらの検体からのＣＭＰをサイズ排除クロマトグラフィーで分離して、ＨＲＡＭ質量分析法に基づくグローバルプロテオームプロファイリングを用いて分析した。ペプチドおよびタンパク質を同定し、定量した後、得られたＡＵＣ比を用いて、症例とコントロールとの間の発現の差を決定した。同定したタンパク質を、重要な経路／相互作用を特定するために、タンパク質複合体展開を行った。生物学的関連性は、遺伝子オントゲニー(ＧＯ)用語を用いて調べた。
【００９２】
サンプル調製：
最適なサンプル前処理および質量分析計分析との互換性のために、緩衝液およびワークフローを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを使用する。別のサンプル前処理方法は、他の分析アプローチのために最適化されたバッファー/ワークフローの変更と組み合わせてもよく；または異なる組織または器官(例えば、胎盤由来のエクソソソームまたは血管内皮由来のエクソソーム)に由来するエクソソームを下位選択するように設計された新しい富化手段と組み合わせてもよい。
【００９３】
マイクロ粒子を、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)によって富化して、水(ＲＮＡｓｅ不含、ＤＮＡｓｅ不含、蒸留水)を用いてイソクラティック溶出を行う。簡単に説明すると、ＰＤ−１０カラム(ＧＥヘルスケアライフサイエンス)を、ＡＢＴ(フロリダ州マイアミ)からの２％アガロースビーズスタンダード(孔サイズ５０〜１５０μｍ)(１０ｍＬ)で充填して、洗浄し、使用前に最低２４時間から３日以内にて４℃で保存する。使用当日、カラムを再度洗浄し、解凍した血漿サンプル１ｍＬをカラムに重層する。つまり、血漿サンプルは、ＳＥＣの前にろ過、希釈、処理をしない。
【００９４】
循環マイクロ粒子は、カラムのボイドボリューム中に捕捉され、高含量のタンパク質ピークから一部分離された。２００ｕｇの総タンパク質(ＢＣＡにより決定)を含む各臨床検体からプールされたＣＭＰカラム画分の１つのアリコートを、さらなる分析のために使用する。
【００９５】
より具体的には、サイズ排除クロマトグラフィーによりＣＭＰの単離を行った。データは、ＨＲＡＭ質量分析法(「高分解能・高精度質量分析法」)に基づくグローバルプロテオームプロファイリングを用いて分析した。エクソソソームタンパク質をトリプシンで消化した後、ThermoFisher Scientific社製のOrbitrap Fusion(登録商標) Lumos(登録商標)Tribrid(登録商標)質量分析計を用いて分析した。高質量分解能システムは、エクソソソーム由来混合物のような複合混合物の分析に特に有用である。この方法は、ペプチドや他の分子の非常に複雑なバックグラウンドにおいて、低濃度のペプチドを検出しようとする場合に有用である。
【００９６】
実施例２．子癇前症を発症する妊娠１０〜１２週の間の循環エキソソーム／マイクロ粒子中のタンパク質の示差発現
本実施例から、妊娠１０〜１２週の間での循環マイクロ粒子(ＣＭＰ)タンパク質の固有パターンはＰＥを発症する女性を識別することが示された；これらのパターンは、母体の全身レベルおよび子宮胎盤レベルでの固有かつ初期の機能不全と関連している。
【００９７】
結果：
症例とコントロール群では、平均年齢(３２ｖｓ.３１；ｐ＝０.５０)、非白人率(４４ｖｓ.５４；ｐ＝０.３８)および無胎児率(２４ｖｓ.２８；ｐ＝０.７９)で相違はなかったが、慢性高血圧(１２ｖｓ.０；ｐ＝０.０１)およびＰＥ歴(２８ｖｓ.６；ｐ＝０.０１)で相違した。非標的化分析では、１０〜１２週目に両サンプルセットに６００を超える固有のタンパク質が確認された。ＦＤＲは０.１であり、５１個のタンパク質が症例とコントロール群において発現に差が見られた。
【００９８】
子癇前症のバイオマーカーを表１に示す。
【００９９】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【０１００】
関連する生物学的機能を表２に記載する。
【０１０１】
表２：妊娠１０〜１２週目に示差的に発現した循環エクソソーム／マイクロ粒子に関連する生物学的機能
【表８】
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【０１０２】
考察：
本研究では、妊娠１０〜１２週目でのＣＭＰ関連タンパク質バイオマーカーの候補セットを同定し、妊娠してＰＥを発症した場合の発現量に差があることを示した。既知のタンパク質の機能は、様々な新規プロセスが関与する生物学的説得性を示している。
【０１０３】
同定されたタンパク質バイオマーカーは、例えば、凝固、免疫調節および補体系に関連する相互関連性の全身的な生物学的ネットワークや、細胞死／分化、形態形成などの局所的な組織や細胞のプロセスなどの重要な生理学的および発生過程に関与している可能性がある。子癇前症に関与することが知られているか、または知られていない、現在までに知られていないプロセスまたはこれらのプロセス間の関係を同定することができる。これらの必須プロセスの機能は、部分的に、様々な細胞や組織間のＣＭＰ相互作用により媒介されている可能性がある。このアプローチの生物学的および臨床的な意義は、子癇前症や他の産科疾患および症状におけるタンパク質調節障害の非侵襲的検出とモニタリングにある。さらに、タンパク質バイオマーカーの定量レベル(マイクロ粒子ベースの試験)から得られる分類値モデルは、ＰＥのリスクを層別化し、治療を含む様々な治療的介入を用いてリスクのあるグループを治療するために利用され得る。
【０１０４】
実施例３：子癇前症のリスクについてのバイオマーカーおよびバイオマーカーのパネル
ＣＭＰ関連タンパク質を分類するためのパイプラインを作成した。同定されたペプチドおよびタンパク質のリストを、既知のタンパク質相互作用についてＳＴＲＩＮＧデータベースに提供した(string-db.org)。相互作用が５件以上記録されているタンパク質は保持した。ブロックランダム化を使用して、データを、トレーニングセットと試験セットに分けた。トレーニングセット内では、アンサンブル特徴量選択を使用して、コントロール群と比較して、子癇前症と有意にかつ一貫して関連がある最も情報量の多い個々のタンパク質のサブセットを作成した。次に、ロジスティック回帰モデルを用いた５分割交差検証を用いて、このサブセットから抽出された全ての可能な多変量モデルの情報を調べた。次に、交差検証を行った候補モデルの中で最もパフォーマンスが良かったものを試験セットに対して実行し、独立したデータでのパフォーマンスを確認した。タンパク質の機能は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースを参照して決定した。
【０１０５】
予測モデルの生成に用いられる機械学習法は、「アンサンブル特徴量選択」、「ロジスティック回帰」、「順列分析」などのいくつかの側面を含む。
【０１０６】
上位候補のＣＭＰ関連タンパク質の分子機能は、例えば凝固・血小板活性化、細胞接着(細胞間および細胞マトリックス間)、遊走性および走化性、細胞増殖、細胞分化および形態形成、血管新生、脂肪細胞脂質代謝、リポ蛋白質代謝、リポ蛋白質リパーゼ活性、コレステロール生合成、細胞内組織の細胞下位構造(特にサルコプラズマおよび小胞体)、カルシウム放出およびシグナル伝達、補体活性化および膜攻撃複合体アセンブリ、自然免疫応答、エンドペプチダーゼ阻害、微小管ベースの毛様体運動および精子運動、小胞体ストレス、および神経伝達物質および神経ペプチドのエキソサイトーシスなどの様々な重要な細胞および血液に基づく生物学的機能と関連していた。
【０１０７】
図１は、子癇前症のリスクについてのバイオマーカーおよびバイオマーカーのパネルを同定するための概略的なワークフローを示す。ワークフローには、以下の操作が含まれる：研究のためのサンプルを提供するが、この場合７５個のオリジナルサンプルのうち、７３個が研究のために選択され、そのうちの２３個は子癇前症の対象者由来のサンプルであり、５０個はコントロールである。サンプルを、５８サンプルのトレーニングセットと１５サンプルの試験セットに分けた。
【０１０８】
初期の機械学習分析
トレーニングセットの各サンプル中のタンパク質の定量的測定値が決定された。これらの測定値を機械学習で分析し、子癇前症のリスクを予測するモデルを開発した。３〜５種類のタンパク質バイオマーカーのパネルを含む、最もパフォーマンスが高いモデルが選択された。５分割交差検証を使用した。パフォーマンスは、曲線下面積(ＡＵＣ)の関数である。この第１ラウンドの内部試験で最もパフォーマンスの高かったモデルを図３に示す。タンパク質は、様々な公的に利用可能なタンパク質データベース(例えば、SwissProt)いずれかにおけるタンパク質名、遺伝子名またはアクセッション番号により同定される。
【０１０９】
これらのタンパク質についての更なる識別情報を、表３に示す。
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【０１１０】
その後、得られたモデルを、サンプルの試験セットからのデータに対して検証した。この検証工程で、最もパフォーマンスが高いモデルを、図４Ａおよび図４Ｂに示す。
【０１１１】
この検証工程で最もパフォーマンスが高いモデルにおけるタンパク質の出現頻度を、以下の表４に示す。
【表１３】
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【表１４】
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【０１１２】
次に、先のモデル構築工程で同定されたタンパク質を、ＳＴＲＩＮＧタンパク質データベースと比較した(string-db.org)。(ｉ)そのデータベースに存在しており、(ｉｉ)データベース内の少なくとも４つのタンパク質とネットワークがあるタンパク質を、さらなる研究のために選択した(図１−「ＳＴＲＩＮＧデータベースにおいてアノテーションがなく、ネットワーク内で＞４エッジであるタンパク質／ペプチドの排除)
【０１１３】
選択されたタンパク質を使用した新しいモデルが作成され、曲線下面積で測定された最高のパフォーマンスを持つバイオマーカーパネルが選択された。これらのモデルを図５に示す(パネル１〜２４)。
【０１１４】
下記の表５は、子癇前症についてのタンパク質バイオマーカーを提供し、これらのバイオマーカーが機械学習によって作成されたバイオマーカーパネルに出現した頻度を示す。
【表１５】
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【０１１５】
以下の表６は、表５に示したタンパク質バイオマーカーの情報を示す。
【表１６】
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【表１７】
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【０１１６】
本明細書で使用されているとおり、特に断りのない限り、以下の意味が適用される。単語「し得る」は、強制的な意味(即ち、ねばならないという意味)ではなく、許容的な意味(すなわち、可能性があるという意味)で使用される。「含む」、「含んでいる」、「包含する」などの語は、含むことを意味するがこれらに限定されないという意味である。単数形の冠詞「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」は、複数形を含む。従って、例えば、単数形の「要素」とは、「１以上」のような１以上の要素に対する他の用語および語句の使用にかかわらず、２つ以上の要素の組み合わせを含む。用語「または」は、特に断りのない限り、非排他的、即ち「および」と「または」の両方を包含する。修飾句とその後に続く用語「のいずれか」とは、修飾句に続く各メンバーを修飾することを意味する。したがって、例えば、「少なくとも１、２または３のいずれか」というフレーズは、「少なくとも１、少なくとも２、または少なくとも３」を意味する。「本質的に構成されている」という表現は、請求された組み合わせの基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない、引用される要素および他の要素を包含することを意味する。
【０１１７】
本明細書および図面は、本発明を開示された特定の形態に限定することを意図したものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲によって定義されるような、本発明の精神および範囲内の全ての改変、等価物および別の実施形態をカバーすることを意図していると理解されるべきである。本発明の様々な側面の更なる改変および別の実施形態は、本明細書を見た当業者であれば理解できるであろう。従って、本明細書および図面は、例示的なものとしてのみ解釈されるべきであり、本発明を実施するための一般的な態様を当技術に熟練した者に教示することを目的としている。本明細書に示され、記載されている本発明の形態は、実施形態の一例として理解されるべきである。要素および材料は、本明細書に図示および記載されたものを置き換えてもよく、部分およびプロセスは、逆にしても、または省略してもよく、本発明の特定の特徴を単独で利用してもよく、これらの全ては、本明細書の記載を見れば当分野の熟練の技術者には理解されるであろう。以下の特許請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された要素に変更を為すことができる。本明細書で使用される見出しは、構成目的のためだけのものであり、本明細書の範囲を限定するために使用されることを意図するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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