(57)【要約】  本発明の分野は、プレバイオティック組成物の分野である。  特に、本発明は、ガラクトグルコマンナンを含むプレバイオティック組成物に関し、その製造方法にも関する。  本発明は、腸内細菌叢の細菌中の短鎖脂肪酸の製造を増やすためのこのプレバイオティック組成物の使用にも向けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１から５０の、好ましくは１から３５の重合度を有するガラクトグルコマンナンを含み、
組成物の総質量に対して０．１質量％以上、好ましくは４質量％以上、さらにより好ましくは６質量％以上のアセチル濃度を有することを特徴とする、プレバイオティック組成物。
【請求項２】
リグノセルロース物質に由来することを特徴とする、請求項１に記載のプレバイオティック組成物。
【請求項３】
一つ又は複数のタイプの木材、好ましくは一つ又は複数の樹脂のタイプの木材に由来することを特徴とする、請求項１又は２に記載のプレバイオティック組成物。
【請求項４】
前記ガラクトグルコマンナンの濃度が前記組成物の総質量に対して２０質量％以上であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のプレバイオティック組成物。
【請求項５】
リグニンを含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のプレバイオティック組成物。
【請求項６】
腸内細菌叢の細菌中での短鎖脂肪酸の生産を促進することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のプレバイオティック組成物。
【請求項７】
ａ）水又は蒸気の存在下で熱処理によってリグノセルロース物質を自動加水分解する工程と；
ｂ）工程ａ）で得られたリグノセルロース物質の加水分解物を精製する工程と、を含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のプレバイオティック組成物を製造する方法。
【請求項８】
自動加水分解の工程ａ）は１００から２３０℃、好ましくは１５０から１８０℃の温度で、２０分間から１０時間、好ましくは３０分間から２時間行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）は、活性炭を用いた処理の段階及び／或いはナノろ過又は限外ろ過の段階及び／或いは溶媒中での沈殿の段階を含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）は、一つ又は複数のタイプの木材、好ましくは一つ又は複数の樹脂のタイプの木材の自動加水分解の工程であることを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
腸内細菌叢の細菌によって短鎖脂肪酸の製造を増やすための、請求項１から６のいずれか一項に記載のプレバイオティック組成物の使用。
【請求項１２】
治療上の使用のための、請求項１から６のいずれか一項に記載のプレバイオティック組成物。
【請求項１３】
肝臓の炎症性疾患、腸の慢性炎症性疾患、全身性慢性炎症状態、又は代謝不均衡の予防及び／又は治療における使用のための、請求項１から６のいずれか一項に記載のプレバイオティック組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、プレバイオティック組成物の分野である。
【０００２】
特に、本発明は、ガラクトグルコマンナンを含むプレバイオティック組成物に関し、それの製造方法にも関する。
【０００３】
本発明は、腸内細菌叢の細菌による短鎖脂肪酸の製造を増やすためのこのプレバイオティック組成物の使用も目的としている。
【背景技術】
【０００４】
プレバイオティクスは、腸内細菌叢の微生物の増殖又は活性を促進する栄養素である。特に、それらは胃腸の細菌叢に存在する有益な細菌の増殖を補助する。
【０００５】
欧州において、最も一般的に用いられるプレバイオティクスは、チコリーの根から製造されるフルクトオリゴ糖（fructo-oligosaccharides、FOS）である。これらのプレバイオティクスの製造は、食糧資源及び耕地の使用を要する。したがって、現在の製造は制限されており、食糧資源の製造と直接競合する。加えて、耕地の表面積は絶えず減少している。したがって、食糧の製造と競合せず、耕地を保存するために非食糧資源に由来するプレバイオティクスを提案することは魅力的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
目的
これらの状況において、本発明は少なくとも一つの以下に述べる目的を満たすことを目標とする。
【０００７】
本発明の必須の目的の一つは、非食糧資源に由来するプレバイオティック組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の必須の目的の一つは、利用可能で豊富な資源に由来するプレバイオティック組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の必須の目的は、別のプレバイオティック組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の必須の目的の一つは、安価なプレバイオティックを提供することである。
【００１１】
本発明の別の必須の目的は、細菌叢の増殖の促進に関して効果的であるプレバイオティック組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の必須の目的は、細菌叢による短鎖脂肪酸の選択的合成の導入に関して効果的であるプレバイオティック組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の必須の目的の一つは、予防の及び／又は治療の目的を有するプレバイオティック組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の別の必須の目的は、容易に及び経済的に実施され得るプレバイオティック組成物の合成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
全部又は一部のこれらの目的は、１から５０の重合度を有するガラクトグルコマンナンを含み、組成物の総質量に対して０．１質量％以上のアセチル濃度（acetyl level）を有するプレバイオティック組成物に関する本発明によって達成される。本組成物は、リグノセルロース物質から、特に、木材ヘミセルロースから製造され得る。
【００１６】
製紙工業は、セルロース繊維を抽出し、その結果として紙パルプを生産するために木材を使用する。標準の方法によると、セルロースは高温アルカリ法（クラフトプロセス）によって木材から抽出される。ヘミセルロース及びリグニン分解生成物及び本方法により生じる他の副生成物は、「黒液」と呼ばれる排水中に集められる。
【００１７】
本発明者らが、クラフトプロセスの前に木材に適用される自動加水分解の工程により木材から抽出されたヘミセルロースが、プレバイオティック組成物の製造に使用され得ることを見出したことは、称賛に値する。
【００１８】
その結果、効果的なプレバイオティック組成物の製造のために、リグノセルロース物質、及び、したがって非食糧資源を使用することが可能となる。
【００１９】
本発明は、ａ）水又は蒸気の存在下で熱処理によってリグノセルロース物質を自動加水分解する工程と、ｂ）工程ａ）で得られたリグノセルロース物質の加水分解物を精製する工程と、を含むプレバイオティック組成物を製造する方法にも関する。
【００２０】
本方法は、製紙プロセス、及び、特に多くの国に存在するセルロース製造工場に組み込まれ得るため、効果的かつ経済的である。さらに、本方法によって、今まではほとんど回収されず、回収可能性が低かった資源が回収され得る。
【００２１】
本方法の別の態様は、腸内細菌叢の細菌による短鎖脂肪酸の製造を増やすためのプレバイオティック組成物の使用である。
【００２２】
最後に、本方法は、治療上の使用のための、特に、肝臓の炎症性疾患（非アルコール性肝臓脂肪症、肝線維症）、腸の慢性炎症性疾患（クローン病、炎症性大腸炎）、全身性慢性炎症状態、及び代謝不均衡（インスリン耐性、脂質異常症）の予防又は治療のための、プレバイオティック組成物にも関する。
【００２３】
定義
「プレバイオティック組成物」は、例えば、腸内細菌叢の微生物の増殖又は活性に対して有益な効果を有する組成物を意味すると理解される。
【００２４】
「ガラクトグルコマンナン」は、例えば、マンノース単位、グルコース単位及びガラクトース単位を含むオリゴ糖を意味すると理解される。これらのオリゴ糖は一般的に、不規則に散在したグルコース単位と一緒にβ−（１−４）グリコシド結合で結合しているマンノースの主鎖、及び、時々側鎖中でα−（１−６）グリコシド結合で結合しているガラクトースを含む。グルコース／マンノース／ガラクトースの割合は、次の割合１／１．５から４．５／０から１で種類によって変化する。Ｃ２及びＣ３の位置のヒドロキシル基は、アセチル基によって部分的に置換され得る。ガラクトグルコマンナン鎖の構造の比限定的な例を、以下に提供する（Fengel, D and Wegener, G. (1983) Wood: chemistry, ultrastructure, reactions. Walter de Gruyter, NY）。
【００２５】
【化１】
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【００２６】
「短鎖脂肪酸」は、例えば、１から６個の炭素原子を含む炭素鎖を有する脂肪酸を意味すると理解される。以下は、短鎖脂肪酸の例として挙げられ得る：ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸及びイソ吉草酸。
【００２７】
「リグノセルロース物質」は、例えば、主にセルロース、ヘミセルロース、リグニン、並びにポリフェノール及びテルペノイド等の抽出物から構成される植物の細胞壁の主成分を意味すると理解される。
【００２８】
「重合度（ＤＰ）」は、ポリマー鎖の長さを定義する。本開示において、これらの用語はオリゴ糖鎖又は多糖鎖を構成する糖の単量体単位の数を指定する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１による、様々なプレバイオティック組成物及びフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の対照組成物の重合度を示す。
【図２Ａ】実施例２による、Ｅ．コリ（E. coli）からのＡＴＰ生成物の曲線を時間の関数として表す。
【図２Ｂ】実施例２による、Ｂ．アドレセンティス（B. adolescentis）からのＡＴＰ生成物の曲線を時間の関数として表す。
【図２Ｃ】実施例２による、Ａ．ムシニフィラ（A. muciniphila）からのＡＴＰ生成物の曲線を時間の関数として表す。
【図２Ｄ】実施例２による、Ｌ．サリバリウス（L. salivarius）からのＡＴＰ生成物の曲線を時間の関数として表す。
【図３】実施例３による、マウスの盲腸からの細菌の分布を、それらの門に従って示す（ｇｐ  コントロール（gp control）＝対照マウスの平均、ｇｐ  へミセル（gp hemicell）＝本発明によるプレバイオティック組成物を与えられたマウスの平均）。
【図４】実施例３による、マウスの盲腸の中の短鎖脂肪酸の量を示す（ａ＝酢酸、ｂ＝酪酸、ｃ＝プロピオン酸、ｄ＝ギ酸、ｇｐ  コントロール＝対照マウス、ｇｐ  へミセル＝プレバイオティック組成物を与えられたマウス）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
＜プレバイオティック組成物＞
【００３１】
本発明はまず、１から５０の、好ましくは１から３５の重合度を有するガラクトグルコマンナンを含み、組成物の総質量に対して０．１質量％以上、好ましくは４質量％以上、さらにより好ましくは６質量％以上のアセチル濃度を有するプレバイオティック組成物に関する。
【００３２】
一実施形態によると、ガラクトグルコマンナンの重合度は、１から２０又は１から１５である。
【００３３】
組成物のアセチル濃度は、プレバイオティック組成物の総質量に対する質量によって表される。このアセチル濃度は、プレバイオティック組成物の酸加水分解の前後の酢酸濃度の差を計算することによって測定され得る。この加水分解は、例えば３％硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液によって１時間１２０℃で行われ得る。アセチル濃度は０．１から５０％、２から２５％、４から１５％、又はさらには６から１０％であり得る。アセチルは主にアセチル化ガラクトグルコマンナンに由来する。
【００３４】
プレバイオティック組成物は、リグノセルロース物質、好ましくは木材に由来する。リグノセルロース物質は、樹脂木材、落葉性木材、再生木材、再生紙及びボード紙、及びこれらの混合物の中から選択され得る。
【００３５】
一実施形態によると、プレバイオティック組成物は一つ又は複数のタイプの木材、好ましくは一つ又は複数の樹脂のタイプの木材に由来する。
【００３６】
一実施形態によると、プレバイオティック組成物はリグノセルロース物質に含まれているヘミセルロースに由来する。好ましくは、プレバイオティック組成物は木材に含まれているヘミセルロースに由来する。
【００３７】
プレバイオティック組成物は、組成物の総質量に対して少なくとも２０質量％のガラクトグルコマンナンを含んでもよい。一実施形態によると、プレバイオティック組成物は、少なくとも３０質量％、少なくとも４０質量％、少なくとも５０質量％、少なくとも６０質量％、少なくとも７０質量％、又は少なくとも７５質量％のガラクトグルコマンナンを含む。一実施形態によると、プレバイオティック組成物は、２０から１００質量％、５０から９９質量％、又は７５から９８質量％のガラクトグルコマンナンを含む。
【００３８】
本発明の特定の一実施形態によると、プレバイオティック組成物は、リグニンも含む。組成物は、組成物の総質量に対して２０質量％以下のリグニンを含んでもよい。一実施形態によると、組成物は、０．１から２０質量％、又は０．２から５質量％のリグニンを含む。
【００３９】
一実施形態によると、組成物はキシラン（xylane）、例えば、組成物の総質量に対して０．１から３５質量％のキシレンも含む。
【００４０】
好ましい一実施形態によると、リグノセルロース物質に由来するプレバイオティック組成物は、１から３５の重合度及び４から１５％、好ましくは６から１０％のアセチル濃度を有するガラクトグルコマンナンを含む。
【００４１】
組成物はまた、芳香族化合物等の他の化合物を含んでもよい。
【００４２】
プレバイオティック組成物は、腸内細菌叢からの微生物の増殖及び／又は活性に対する際立った促進効果を有する。特に、この組成物は、腸内細菌叢からの有益な細菌の増殖を促進する。さらに、ほとんどのアセチル化されたガラクトグルコマンナンは、アセチル化されていないガラクトグルコマンナンよりも後に細菌によって消費される。そのように、ガラクトグルコマンナンが高いアセチル濃度を有する組成物は、あまりアセチル化されてない又はアセチル化されていないガラクトグルコマンナンの場合よりも長い時間にわたって細菌の増殖を改善することに役立つ。
【００４３】
この組成物は、腸内細菌叢の細菌中で短鎖脂肪酸の製造を促進するため、別の有益な効果を有する。特に、この組成物は、腸内細菌叢の細菌によって酢酸、プロピオン酸、及び酪酸の製造を促進する。
【００４４】
＜プレバイオティック組成物を製造する方法＞
【００４５】
本発明は、ａ）水又は蒸気の存在下で熱処理によってリグノセルロース物質を自動加水分解する工程と；ｂ）工程ａ）で得られたリグノセルロース物質の加水分解物を精製する工程と、を含むプレバイオティック組成物を製造する方法にも関する。
【００４６】
自動加水分解の工程ａ）は、１００から２３０℃、好ましくは１５０から１８０℃の温度及び２０分間から１０時間、好ましくは３０分間から２時間で実行されてもよい。好ましい一実施形態によると、工程ａ）は、一つ又は複数のタイプの木材、好ましくは一つ又は複数の樹脂のタイプの木材の自動加水分解の工程である。この場合においては、この工程ａ）の後、リグノセルロース物質の加水分解物は、ガラクトグルコマンナンを含む木材からのヘミセルロースを含むという結果となる。
【００４７】
好ましい一実施形態によると、工程ａ）は、閉じられて加圧された反応器中で行われる。反応器内の圧力は、選択された温度によって変わる水の飽和蒸気圧に相当する。一実施形態によると、リグノセルロース物質は削りくずの形状である。
【００４８】
リグノセルロース物質の加水分解物を精製する工程ｂ）は、いくつかの段階を含んでもよい。
【００４９】
好ましい一実施形態によると、工程ｂ）は、活性炭を用いた処理の段階及び／或いはナノろ過又は限外ろ過の段階及び／或いは溶媒中での沈殿の段階を含む。
【００５０】
工程ｂ）はまた、加水分解物から不溶性の粒子を取り除くための、遠心分離及び／又は精密ろ過の工程を含んでもよい。
【００５１】
本方法の一実施形態によると、工程ｂ）は活性炭を用いた処理の段階及びナノろ過又は限外ろ過の段階を含む。
【００５２】
本方法の別の実施形態によると、工程ｂ）は活性炭を用いた処理の段階及び溶媒中での沈殿の段階を含む。
【００５３】
本方法の別の実施形態によると、工程ｂ）はナノろ過又は限外ろ過の段階及び溶媒中での沈殿の段階を含む。
【００５４】
本方法の別の実施形態によると、工程ｂ）は活性炭を用いた処理の段階、ナノろ過又は限外ろ過の段階、及び溶媒中での沈殿の段階を含む。
【００５５】
様々な精製段階が、任意の順番で実行され得る。
【００５６】
ナノろ過又は限外ろ過の段階は、決められた分画の基準値で膜を通して加水分解物をろ過する工程を含む。
【００５７】
一実施形態によると、膜の分画の基準値は０．２ｋＤａから３０ｋＤａの間に含まれる。例えば、分画の基準値は、０．２ｋＤａ、０．５ｋＤａ、１ｋＤａ、５ｋＤａ、８ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、又は３０ｋＤａであり得る。当業者は、ガラクトグルコマンナンの望ましい重合度によって、分画の基準値を選ぶことができる。
【００５８】
ナノろ過又は限外ろ過のいくつかの段階を組み合わせることもできる。
【００５９】
溶媒中での沈殿の段階は、有機溶媒、有機溶媒の混合物、又は有機溶媒及び水の混合物で実行され得る。
【００６０】
一実施形態によると、溶媒中での沈殿の段階は、アセトン、エタノール、アセトン及びメタノールの混合物、又はエタノール及び水の混合物で実行される。
【００６１】
本方法の特定の一実施形態によると、本方法は、工程ａ）によってもたらされる加水分解物、又は工程ｂ）によってもたらされるプレバイオティック組成物の酵素処理の工程も含む。本工程は、一つ又はいくつかの酵素によって、例えば、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アセチルエステラーゼ、又はグルクロニダーゼのファミリーからの一つ又はいくつかの酵素によって実行され得る。
【００６２】
本工程は、オリゴ糖及び／又は多糖のサイズを小さくするために使用され得る。それは、遊離ヒドロキシル基をアセチル化することによって、又は、既に存在するアセチル基を分解することによって、ガラクトグルコマンナンのアセチル濃度を調節するためにも使用され得る。
【００６３】
例えば、ガラクトグルコマンナンの酵素的部分脱アセチル化の工程によってプレバイオティック組成物のアセチル濃度を減らすことができる。
【００６４】
本方法は、上述の方法によって得られ得るプレバイオティック組成物にも関する。
【００６５】
＜プレバイオティック組成物の使用＞
【００６６】
本発明は、腸内細菌叢の細菌によって短鎖脂肪酸の製造を増やすための本発明によるプレバイオティック組成物の使用にも関する。
【００６７】
一実施形態によると、短鎖脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸及びこれらの混合物の中から選択される。
【００６８】
本発明の目的は、予防及び／又は治癒的（curative）治療における使用のための本発明によるプレバイオティック組成物でもある。本発明によるプレバイオティック組成物は、腸内細菌叢中の微生物の増殖及び／又は活性に対する有益な効果を有するので、それは特定の病気の治療及び／又は予防において使用され得る。
【００６９】
本発明の目的は、肝臓の炎症性疾患（非アルコール性肝臓脂肪症、肝線維症）、腸の慢性炎症性疾患（クローン病、炎症性大腸炎）、全身性慢性炎症状態、又は代謝不均衡（インスリン耐性、脂質異常症）の予防及び／又は治療における使用のための本方法によるプレバイオティック組成物でもある。
【実施例】
【００７０】
＜実施例１：プレバイオティック組成物の調製＞
【００７１】
ａ）木材加水分解物
【００７２】
本研究で使用される木材は、樹脂の削りくず（スコッチパイン（Scotch pine）、クロマツ（black pine）、アレッポマツ（Aleppo pine）、ダグラスファー（Douglas fir）及びスプルース（spruce））の混合物である。
【００７３】
木材の削りくず及び蒸留水を、３の水／木材の割合（１００ｇのキルン乾燥材（kiln-dried wood）に対して３００ｍＬの水）で反応器に入れた。続いて、混合物を閉じられた反応器の中で１時間１７０℃に加熱した。室温まで冷却した後、リグノセルロース物質の自動加水分解物（ＡｕｔｏＨ）をもたらした。
【００７４】
ｂ）加水分解物の精製
【００７５】
様々な精製を試験した。
・活性炭を用いた処理の後、アセトン：メタノール混合物を用いて沈殿（ＰＰ  Ａｃｅｔ）。
・活性炭を用いた処理の後、エタノール：水混合物を用いて沈殿（ＰＰ  ｅｔｈ）。
・限外ろ過の後、活性炭を用いて処理（ＡｕｔｏＨ  ＵＣ）。
【００７６】
（ＰＰ  Ａｃｅｔ）
加水分解物を活性炭（１０ｇ／Ｌ）を用いて処理する。この工程の後に、アセトン：エタノール（９：１）の混合物を用いた２つの連続する沈殿、続いてプレバイオティック組成物の凍結乾燥が続く。
【００７７】
（ＰＰ  ｅｔｈ）
加水分解物を活性炭（１０ｇ／Ｌ）を用いて処理する。この工程の後に、エタノール：水（９：１）の混合物を用いた２つの連続する沈殿、続いてプレバイオティック組成物の凍結乾燥が続く。
【００７８】
（ＡｕｔｏＨ  ＵＣ）
加水分解物を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｓｔｉｒｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いることによって、０．５ｋＤａの分画の基準値の膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、再生セルロース）上でろ過する。その後、加水分解物を活性炭（４０ｇ／Ｌ）を用いて処理する。その後、プレバイオティック組成物を凍結乾燥する。
【００７９】
ｃ）様々なプレバイオティック組成物の分析
【００８０】
モノマーを、高速アニオン交換クロマトグラフィー（High-Performance Anion-Exchange Chromatography）によってパルスアンペロメトリック検出で数値化した（ＣａｒｂｏＰａｃ（商標）  ＰＡ１０  カラムを有するＨＰＡＥ−ＰＡＤ  Ｄｉｏｎｅｘ（商標）  ＩＣＳ−５０００；２５℃）。画分及び最初の自動加水分解物中のオリゴマー濃度を、酸加水分解後の単糖の濃度の増加より計算した（１２０℃／１時間、３％Ｈ２ＳＯ４）。
【００８１】
（ＡｕｔｏＨ）
０．２８：１のアラビノキシラン（arabinoxylane）：ガラクトグルコマンナンの割合及び全炭水化物に対して２８．７％のモノマーを有する、５７．６％のオリゴマー／加水分解物の総乾燥質量。したがって、ガラクトグルコマンナンの濃度は、組成物の総質量に対して４５質量％である。
【００８２】
（ＰＰ  ａｃｅｔ）
【００８３】
０．１８：１のアラビノキシラン：ガラクトグルコマンナンの割合及び全炭水化物に対して５．７％のモノマーを有する、９１．６％のオリゴマー／プレバイオティック組成物の総乾燥質量。したがって、ガラクトグルコマンナンの濃度は、組成物の総質量に対して７７．６質量％である。
【００８４】
（ＰＰ  ｅｔｈ）
０．０７：１のアラビノキシラン：ガラクトグルコマンナンの割合及び全炭水化物に対して０．６％のモノマーを有する、９４．５％のオリゴマー／プレバイオティック組成物の総乾燥質量。したがって、ガラクトグルコマンナンの濃度は、組成物の総質量に対して８８．３質量％である。
【００８５】
（ＡｕｔｏＨ  ＵＣ）
０．２０：１のアラビノキシラン：ガラクトグルコマンナンの割合及び全炭水化物に対して０．６％のモノマーを有する、９８．９％のオリゴマー／プレバイオティック組成物の総乾燥質量。したがって、ガラクトグルコマンナンの濃度は、組成物の総質量に対して８２．４質量％である。
【００８６】
分解生成物（フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、ギ酸及びさらに酢酸）をＨＰＬＣによって定量化した。精製された加水分解物は、もはやフルフラール、ＨＭＦ、ギ酸又は酢酸を含んでいない。
【００８７】
可溶化ヘミセルロースに存在するアセチル基の量を、酸加水分解（１２０℃／１時間、３％Ｈ２ＳＯ４）の前後の酢酸濃度の差を計算することによって測定した。精製されていない自動加水分解物に対して、アセチル濃度は約４％である。精製されたプレバイオティック組成物のＰＰ  ａｃｅｔ及びＰＰ  ｅｔｈに対して、アセチル濃度はそれぞれ８．３及び８．９％である。
【００８８】
オリゴ糖及び多糖の重合度を、マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）技術及びＧＰＣ  ＭＡＬＳ（ゲル浸透クロマトグラフィー−多角度レーザー散乱）によって測定した。図１は、様々なプレバイオティック組成物のオリゴ糖及び多糖の重合度を示す。
【００８９】
＜実施例２：細菌の増殖での様々なプレバイオティック組成物の試験＞
【００９０】
接着性侵襲性大腸菌（Adherent-invasive Escherichia coli（ＡＩＥＣ））ＬＦ８２及びビフィドバクテリウムアドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）ＣＦＰＬ１５，１９６を、リール（Ｌｉｌｌｅ、フランス）の薬学部門でヒト糞便から分離した。アッカーマンシアムシニフィラ（Akkermansia muciniphila、ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−８３５（商標））を、ＡＴＣＣから購入した。ラクトバシラスサリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＣＩＰ１０３，１４０を、パスツールコレクション研究所（Institut Pasteur Collection）から購入した。全ての培養を、１０％Ｈ２、５％ＣＯ２及び８５％Ｎ２（Anaerogaz、Linde）で構成される嫌気性雰囲気下で、デキストロースが無い脱酸素化ソイブロス（ＴＳＷＤ、Triptic soy without dextrose、Becton-Dickinson）を含む培地中で実行した。ＴＳＷＤに、１％（Ｗ／Ｖ）の実施例１による様々なプレバイオティック組成物を添加した。ＰＰ  ｅｔｈ組成物も、３％（Ｗ／Ｖ）で試験した。
【００９１】
陰性対照は、ＴＳＷＤのみを含んでいた。陽性対照は、４（２から９）の平均重合度を有するプレバイオティックフルクトオリゴ糖を１％の濃度で（ＦＯＳ  Ｐ９５、ＢＥＮＥＯ−Ｏｒａｆｔｉ、ベルギー）又はＴＳＷＤに添加した１％グルコースで構成されていた。
【００９２】
ａ）ＡＴＰの量の測定
【００９３】
細胞内のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の産生量を測定した。
【００９４】
図２Ａから２Ｄは、様々な細菌によって産生されたＡＴＰの量を示す。これらの結果は、本発明による組成物がＢ．アドレセンティス（B. adolescentis）、Ａ．ムシニフィラ（A muciniphila）及びＬ．サリバリウス（L salivarius）等の胃腸の細菌叢からの有益な細菌の増殖を補助するため、本発明による組成物は間違いなくプレバイオティック組成物であることを示す。さらに、大腸菌（E.coli）ＬＦ８２等の胃腸の細菌叢からの有害な細菌の増殖は補助しない。
【００９５】
ｂ）短鎖脂肪酸の量の測定
【００９６】
短鎖脂肪酸を、液液抽出によって細菌試料の上清から抽出し、その後ＨＰＬＣ−ＵＶによって分析する。
【００９７】
結果は、本発明によるプレバイオティック組成物は、ギ酸、酢酸、及びプロピオン酸を含む短鎖脂肪酸の製造を促進することを示す。
【００９８】
ｃ）アセチル化度の影響
【００９９】
細菌を培養している培地を、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって様々な反応時間で分析する。これらの分析の結果は、アセチル化されていないガラクトグルコマンナンは培養の初期から細菌によって最初に消費されることを示す。ほとんどアセチル化されたガラクトグルコマンナンは、より遅くに細菌によって消費される。これは、細菌における増殖の影響がＦＯＳ対照と比べてより長く得られる理由を説明する。
【０１００】
＜実施例３：プレバイオティック組成物のマウスによるインビボ試験＞
【０１０１】
実施例１によるエタノールで沈殿した画分（ＰＰ  ｅｔｈ）を用いたマウスの経管栄養及び１６Ｓ  ｒＲＮＡの分析。
【０１０２】
この実験はグルノーブル倫理委員会及びフランス政府によって審査され、認可された（ＡＰＡＦＩＳ  番号  8502-2016122009J36117）。動物は、Plateforme de Haute Technologie Animale、グルノーブル・アルプ大学で、確認番号C385l610006の下で飼育した。メスのマウスＣ５７ＢＬ／６Ｎ（生後５週間）をJanvier SA（Le Genest-Saint-Isle、フランス）から購入し、木材と水を制限なく利用できる状態でケージにつき４匹のマウスのグループで飼育した。マウスにＡ０４の対照食（ＳＡＦＥ、Villemoisson-sur-Orge、フランス）を一週間与えた。次に、８匹の対照マウスにＡ０４を３週間与え、一方で、他の８匹のマウスにプレバイオティック組成物（ＰＰ  ｅｔｈ）を加えたＡ０４を、マウスにつき０．３ｇ／日の割合で、水に溶かして与えた。それをするために、エタノールから沈殿した凍結乾燥した画分を水に溶かして８６ｇ／Ｌとし、０．２μｍ膜を通してろ過した。餌のボトル（１００ｍＬ）を２日から３日ごとに変えて、新たに調製した溶液と交換した。実験期間の最後に、マウスをイソフルランで安楽死させた。盲腸及び結腸を切除するために腹部中央の切開を行った。盲腸内容物を採取し、すぐに液体窒素中で凍結した。盲腸内容物の一部を、２００μＬのＰＢＳを用いて４０ｍｇの盲腸濃度となるように均一化によって調製した。糞便の懸濁液を、４℃で２０分間３５０００ｇで遠心分離し、上清を回収してろ過（０．２２μｍ）によって滅菌した。
【０１０３】
ａ）１６Ｓ  ｒＲＮＡの分析
【０１０４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ（及びＲＮＡの抽出物）の分析を、Vaiomer（Vaiomer SA、ラベージュ、フランス）に業務委託した。この分析によってもたらされるデータは、細菌の存在度データだけでなく、豊かさ（試料中の固有の細菌分類群の数）を意味するアルファダイバーシティでもある。
【０１０５】
図３は、盲腸中の様々な細菌の種類の分布を示す。これらの結果は、本発明によるプレバイオティック組成物を与えられたマウスは、プレバイオティック組成物を与えられなかったマウスに比べて異なった細菌の種類の分布を有したことを示す。
【０１０６】
特に、本発明によるプレバイオティック組成物を与えられたマウスは、より大きい割合の胃腸の細菌叢に存在する有益な細菌を有し、より低い割合の胃腸の細菌叢に存在する有害な細菌を有した。
【０１０７】
ｂ）短鎖脂肪酸の量の測定
【０１０８】
短鎖脂肪酸を、実施例２ｂからのプロトコルによる盲腸内容物中で分析した。
【０１０９】
図４は、盲腸中に含まれる短鎖脂肪酸の量を示す。これらの図は、本発明によるプレバイオティック組成物を与えられたマウスは、プレバイオティック組成物を与えられなかったマウスに比べてより多くの短鎖脂肪酸、特に、より多くの酢酸及び、より多くのプロピオン酸を産生したことを示す。
【０１１０】
＜実施例４：オリゴ糖のサイズへの酵素加水分解の影響＞
【０１１１】
実施例１（ＡｕｔｏＨ）に示すように調製された木材加水分解物を、マンナナーゼ（オリゴ糖のグラム当たりで３５ｍｇ／ｇの酵素）及びセルラーゼ（オリゴ糖のグラム当たりで５００及び３０００ＥＧＵ／ｇ）を用いることによる酵素加水分解に供した。ＧＰＣ  ＭＡＬＳによって測定した平均分子量（Ｍｗ）は、以下の結果を示した：
最初の加水分解物中のオリゴ糖のＭｗ：２．３ｋＤａ
マンナナーゼによる処理後のオリゴ糖のＭｗ：１．７ｋＤａ
それぞれ５００及び３０００ＥＧＵ／ｇのセルラーゼによる処理後のオリゴ糖のＭｗ：それぞれ１．７及び１．０ｋＤａ
【０１１２】
これらの結果は、酵素処理によって加水分解物中に含まれるオリゴ糖のサイズを減らすことができることを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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