(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、合成コンセンサスサバイビン抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸分子である。合成コンセンサスサバイビン抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含むベクター、組成物、およびワクチンが開示される。サバイビンを発現する腫瘍を有する対象を治療する方法、およびサバイビンを発現する腫瘍を予防する方法が開示される。合成コンセンサスサバイビン抗原が開示される。【選択図】図１
2021506265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９をコードする核酸配列、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２をコードする核酸配列、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｆ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｈ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｉ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｊ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｋ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、および
（ｌ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜４２３、
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５〜６３６、
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５〜４２３の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｄ）配列番号３のヌクレオチド５５〜６３６の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｅ）配列番号１のヌクレオチド５５〜４２３と少なくとも９５％同一である断片、
（ｆ）配列番号３のヌクレオチド５５〜６３６と少なくとも９５％同一である断片、
（ｇ）配列番号１のヌクレオチド５５〜４２３と少なくとも９５％同一である核酸配列の少なくとも９０％を含む断片、および
（ｈ）配列番号３のヌクレオチド５５〜６３６と少なくとも９５％同一である核酸配列の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、
（ｂ）配列番号４をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号８をコードする核酸配列、
（ｄ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｅ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｆ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｇ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｈ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｉ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｊ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｋ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、および
（ｌ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項４】
（ａ）配列番号１、
（ｂ）配列番号３、
（ｃ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｄ）配列番号３の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｅ）配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、
（ｆ）配列番号３と少なくとも９５％同一である断片、
（ｇ）配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、および
（ｈ）配列番号３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項５】
配列番号１に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項６】
配列番号３に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
薬剤として使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
がんの治療における薬剤として使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
薬剤の調製に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、請求項１〜６および９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１２】
プラスミドまたはウイルスベクターを含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸分子を含む、組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される担体を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１１または１２に示される１つ以上のベクターを含む、組成物。
【請求項１６】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０、
（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｆ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｋ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｌ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１７】
（ａ）配列番号２、
（ｂ）配列番号４、
（ｃ）配列番号８、
（ｄ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｅ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｆ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｇ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｋ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、および
（ｌ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１９】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項２０】
配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ワクチン。
【請求項２２】
請求項１１または１２に記載のベクターを含む、ワクチン。
【請求項２３】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２４】
アジュバントをさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記アジュバントが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳである、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
サバイビンを発現するがん性細胞を有する対象を治療する方法であって、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のワクチンの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
投与が、エレクトロポレーションステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
投与が、前記対象の１つ以上の部位で行われる、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
サバイビンを発現するがん性細胞に対して対象にワクチン接種する方法であって、体液性または細胞性免疫応答を誘導するのに有効な量の、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５９８，２６７号の優先権および利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１２月１３日に作成され、１０４４０９＿０００４４８＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、８，７９７バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、サバイビン抗原およびそれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、かかるサバイビン抗原および／または核酸分子を含むワクチンに関する。本発明はさらに、免疫応答を誘導し、サバイビンを発現するがん細胞および／または腫瘍を有する対象を予防および／または治療するためにワクチンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんは、世界中で主要な死因の１つである。米国では、がんは、２番目に多い死因であり、４人に１人近くの死を占める。がんは、正常な細胞からがん性の細胞に形質転換した単一の細胞から発生する。かかる形質転換は、前がん性病変から悪性腫瘍へと進行する多段階のプロセスである場合が多い。老化、遺伝的寄与、ならびに物理的発がん物質（例えば、紫外線および電離放射線）、化学的発がん物質（例えば、アスベスト、タバコの煙の成分）、および生物学的発がん物質（例えば、特定のウイルス、細菌、寄生虫）などの外部物質への曝露を含む、複数の要因がこの進行に寄与する。
【０００５】
がんの予防、診断、および治療は、多くの異なる形態をとり得る。予防には、素因（例えば、特定の遺伝的バリアント）のスクリーニング、挙動の改変（例えば、喫煙、食事、および身体活動の量）、およびウイルスに対するワクチン接種（例えば、ヒト乳頭腫ウイルスＢ型肝炎ウイルスなど）が含まれる。治療には、化学療法、放射線療法、および腫瘍またはがん性組織の外科的切除を含み得る。多数の予防および治療法が利用可能であるにもかかわらず、かかる方法は、がんを効果的に予防および／または治療する上で限られた成功しか収めないことが多い。
【０００６】
サバイビンは、バキュロウイルスアポトーシス阻害因子反復配列含有タンパク質５（ＢＩＲＣ５）としても知られており、カスパーゼ機能を遮断し、それによりプログラムされた細胞死を防ぐアポトーシス阻害剤である。アポトーシスにおけるその役割に加えて、サバイビンは、有糸分裂において本質的に、進化的に保存された役割を明確に有する。（Ｌｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｙ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９６，５８０−５８４，ｄｏｉ：１０．１０３８／２５１４１（１９９８））。サバイビンの過剰発現は、腫瘍細胞の増殖、進行、血管新生、治療抵抗性、予後不良と関連する。健康な細胞および組織では、サバイビン発現は、存在しないか、または低レベルで存在するかのいずれかである。しかしながら、サバイビンは、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーであり、ＩＡＰ遺伝子は、様々ながん細胞および原発性腫瘍生検で高発現する。ＩＡＰの中で、サバイビンは、腫瘍および胎児組織で最も劇的な過剰発現を示す。卵巣がんの複数の研究では、サバイビン発現について陽性であると検査された患者試料の数は、７４〜９２％に及んだ。（Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．，Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｏｔｓｏｎｉｓ，Ｇ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．＆Ｓａｎｔｏｉａｎｎｉ，Ｒ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｍｏｄｅｒｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ  １６，５７４−５８３，ｄｏｉ：１０．１０９７／０１．ＭＰ．０００００７３８６８．３１２９７．Ｂ０（２００３）、Ｆｅｌｉｓｉａｋ−Ｇｏｌａｂｅｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔａｘａｎｅ−ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，２０，ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５７−２２１５−４−２０（２０１１）を参照されたい）。腫瘍形成へのサバイビンの寄与は、様々な腫瘍での発現および過剰発現のその制限されたパターンと組み合わせて、がん免疫療法の興味を引く標的となっている。
【０００７】
サバイビンは、ＩＡＰファミリーの最小メンバーである。それは、１４２アミノ酸からなる１６．３ｋＤのタンパク質であり、単一のＢＩＲリピートの存在を特徴とする。また、そのタンパク質構造は、カルボキシル末端のＲＩＮＧフィンガードメインを欠損する。（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｄｕａｎ，Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ７，３１４−３２３，ｄｏｉ：１０．７１５０／ｊｃａ．１３３３２  （２０１６））。いくつかのサバイビンアイソフォームが同定されており、サバイビンアイソフォーム１が主要な転写産物である。サバイビンは、胎児の発育中に発現するが、完全に分化した組織では発現しない。しかしながらそれは、多くのがん細胞で高発現される。したがって、サバイビンは、がんの治療のための潜在的な標的抗原である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
がん、特に上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）の治療および予防のためのワクチンは、興味深いものである。しかしながら、腫瘍細胞抗原を標的とする既存のワクチンは、インビボでの不十分な抗原発現により制限されている。したがって、当該技術分野では、がんを予防および／または治療し、がんに罹患している対象の死亡率を低減するための安全かつ効果的なワクチンおよびそれらの使用方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２をコードする核酸配列、（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｅ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｆ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｇ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｈ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｉ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｊ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｋ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、および（ｌ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子が本明細書に提供される。
【００１０】
核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜４２３、（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５〜６３６、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５〜４２３の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｄ）配列番号３のヌクレオチド５５〜６３６の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号１のヌクレオチド５５〜４２３と少なくとも９５％同一である断片、（ｆ）配列番号３のヌクレオチド５５〜６３６と少なくとも９５％同一である断片、（ｇ）配列番号１のヌクレオチド５５〜４２３と少なくとも９５％同一である核酸配列の少なくとも９０％を含む断片、および（ｈ）配列番号３のヌクレオチド５５〜６３６と少なくとも９５％同一である核酸配列の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。
【００１１】
核酸分子は、（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号８をコードする核酸配列、（ｄ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｅ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｆ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｇ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｈ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｉ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｊ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｋ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、および（ｌ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。
【００１２】
核酸分子は、（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号３、（ｃ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｄ）配列番号３の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、（ｆ）配列番号３と少なくとも９５％同一である断片、（ｇ）配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、および（ｈ）配列番号３と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。
【００１３】
核酸分子は、配列番号１に示される核酸配列を含む。
【００１４】
核酸分子は、配列番号３に示される核酸配列を含む。
【００１５】
本明細書に記載される核酸分子は、薬剤として使用する。
【００１６】
本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療における薬剤として使用する。
【００１７】
本明細書に記載される核酸分子は、薬剤の調製において使用する。
【００１８】
本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療のための薬剤の調製において使用する。
【００１９】
ベクターは、本明細書に記載される核酸分子を含む。
【００２０】
ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターを含む。
【００２１】
組成物は、本明細書に記載される１つ以上の核酸分子を含む。
【００２２】
本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
【００２３】
本明細書に記載される組成物は、本明細書に記載される１つ以上のベクターを含む。
【００２４】
タンパク質は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２、（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｉ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｊ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、および（ｌ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
タンパク質は、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号４、（ｃ）配列番号８、（ｄ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｉ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｊ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、および（ｌ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
タンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
タンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
ワクチンは、本明細書に記載される核酸分子を含む。
【００３０】
ワクチンは、本明細書に記載されるベクターを含む。
【００３１】
本明細書に記載されるワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【００３２】
本明細書に記載されるワクチンは、アジュバントをさらに含む。
【００３３】
本明細書に記載されるワクチンは、アジュバントが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳである。
【００３４】
サバイビンを発現するがん性細胞を有する対象を治療する方法は、本明細書に記載されるワクチンの治療有効量を投与することを含む。
【００３５】
本明細書に記載される方法は、投与が、エレクトロポレーションステップを含む。
【００３６】
本明細書に記載される方法は、対象の１つ以上の部位で行われる。
【００３７】
サバイビンを発現するがん性細胞に対して対象にワクチン接種する方法は、体液性または細胞性免疫応答を誘導するのに有効な量の、本明細書に記載されるワクチンを投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
概要および以下の詳細な記載は、添付の図面と併せて読むとさらに理解される。本発明を例示する目的で、本発明の例示的な実施形態が図面に示されており、しかしながら、本発明は、開示される特定の方法、組成物、およびデバイスに限定されない。図面：
【図１】合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１の略図を示す。アスタリスクは、抗アポトーシス活性を消失するために必須の変異を示す。
【図２】合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１モノマーＡ（左）およびモノマーＢ（右）の全体構造を示す。天然サバイビンに対する変化は、球で示す。
【図３】合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３の略図を示す。アスタリスクは、抗アポトーシス活性を消失するために必須の変異を示す。右（３’）の濃い灰色の領域は、切断型サバイビンアイソフォーム３（Ｔ３）領域を表す。
【図４】合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１を含むｐＧＸ１４２８の構造を示す。
【図５】合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３を含むｐＧＸ１４２９の構造を示す。
【図６】免疫ブロットにより、ｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９をそれぞれトランスフェクトしたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞における合成コンセンサスサバイビン抗原１および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３タンパク質の発現を示す。予想された分子量のタンパク質バンドを、ｐＧＸ１４２８（１７．５ｋＤ）およびｐＧＸ１４２９（２５．３ｋＤ）で検出した。β−アクチンを負荷対照として使用した。
【図７Ａ−Ｃ】合成コンセンサスサバイビン抗原１および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３の免疫原性を示す。雌のＣＢ６Ｆ１は、指示された用量のサバイビン１（ｐＧＸ１４２８）（図７Ａ〜７Ｄ）、サバイビン１Ｔ３  ｐＧＸ１４２９（Ｅ〜Ｈ）（ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空ベクター）（ｎ＝４）で、３週間間隔で３回免疫された。図７Ａ：指示された用量のｐＧＸ１４２８におけるＥＬＩＳｐｏｔによるサバイビン１特異的ＩＦＮγ応答。図７Ｂ：サバイビン１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答。図７Ｃ．サバイビン１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【図７Ｄ−Ｆ】図７Ｄ：指示された用量のｐＧＸ１４２９におけるＥＬＩＳｐｏｔによるサバイビン１Ｔ３特異的ＩＦＮγ応答。図７Ｅ：サバイビン１Ｔ３特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答。図７Ｆ：サバイビン１Ｔ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【図７Ｇ】図７Ｇ：サバイビン１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイル。
【図７Ｈ】図７Ｈ：サバイビン１Ｔ３特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイル。
【図８】フローサイトメトリーのゲーティング戦略を示す。
【図９】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度を示す。ｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９により誘導される細胞性免疫応答は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞区画にあった。
【図１０Ａ】サバイビン特異的Ｔ細胞の細胞溶解能を示す。サバイビン１およびサバイビン１Ｔ３により誘導される抗原特異的Ｔ細胞の細胞溶解能。図１０Ａ：サバイビン１特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ：サバイビン１Ｔ３特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度。
【図１０Ｃ】図１０Ｃ：ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイル。
【図１０Ｄ】図１０Ｄ：サバイビン１特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度。
【図１０Ｅ】図１０Ｅ：サバイビン１Ｔ３特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度。
【図１０Ｆ】図１０Ｆ：ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイル。
【図１１Ａ】サバイビンＩＦＮ−γ応答のエピトープマッピングを示す。サバイビン１およびサバイビン１Ｔ３により誘導されるＩＦＮγ応答の幅。図１１Ａ：５０μｇのｐＧＸ１４２８、ｐＧＸ１４２９、またはｐＧＸ０００１による処理後のサバイビン１ペプチドプール。
【図１１Ｂ】図１１Ｂ：５０μｇのｐＧＸ１４２９またはｐＧＸ０００１による処理後のサバイビンＴ３ペプチドプール。破線のボックスで示されるマトリックスプールの位置とｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９との配列比較。
【図１１Ｃ】図１１Ｃ：ｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９の配列比較。赤色のテキストのアミノ酸は、マトリックスマッピングにより同定されたエピトープを示す。下線が引かれたテキストは、合成コンセンサスサバイビン抗原に追加される配列部分を表す：Ｎ末端は、ＩｇＥＬＳおよびＲＧＲＫＲＲＳフリン切断部位を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄ：サバイビン１およびサバイビンＴ３マトリックスのデザイン。応答を誘発したペプチドは、破線のボックスで示される。
【図１２】合成コンセンサスサバイビン１Ｔ３を含む本開示の実施形態を使用して免疫化された個々の非ヒト霊長類からのサバイビン特異的ＩＦＮγ  ＳＦＵ／１０6  ＰＢＭＣを示す。
【図１３】低用量のＩＬ−１２（０．０４ｍｇ）を伴う合成コンセンサスサバイビン１Ｔ３を含む本開示の実施形態を使用して免疫化された個々の非ヒト霊長類からのサバイビン特異的ＩＦＮγ  ＳＦＵ／１０6  ＰＢＭＣを示す。
【図１４】高用量のＩＬ−１２（０．２０ｍｇ）を伴う合成コンセンサスサバイビン１Ｔ３を含む本開示の実施形態を使用して免疫化された個々の非ヒト霊長類からのサバイビン特異的ＩＦＮγ  ＳＦＵ／１０6  ＰＢＭＣを示す。
【図１５Ａ】ＮＨＰ研究の個々の動物の結果を示し、合成コンセンサスサバイビン１構築物および合成コンセンサスサバイビン１Ｔ３構築物による免疫化の比較をさらに示す。図１５Ａは、群１の動物の結果を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、群２の動物の結果を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、群３の動物の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、合成コンセンサスサバイビン抗原を含むワクチンに関する。サバイビンは、多くの腫瘍で発現される。したがって、ワクチンは、サバイビンを発現する、がんまたはがんに基づく腫瘍の治療を提供する。
【００４０】
合成コンセンサスサバイビン抗原は、異なる種または種内の異なるアイソフォームからのサバイビンの配列に由来するコンセンサスサバイビン抗原であり得、したがって、合成コンセンサスサバイビン抗原は非天然である。コンセンサスサバイビン抗原は、１つ以上の変異をコンセンサス配列に導入して、合成コンセンサス配列を生成することにより、さらに改変することができる。変異は、天然サバイビン配列の特定の機能ドメインを遮断または改変し、それにより機能ドメインの構造または機能を破壊または強化することができる。いくつかの実施形態では、合成コンセンサスサバイビン抗原配列に追加の配列を追加して、新しい構造または機能を導入する。例えば、合成コンセンサスサバイビン抗原配列は、フリン切断部位を有し得る。合成コンセンサスサバイビン抗原配列には、最終的なタンパク質生成物の細胞外輸送を増強するための追加の局在化シグナルを含み得る。追加の局在化シグナルは、ＩｇＥＬＳまたは他の細胞輸送配列であり得る。
【００４１】
合成コンセンサスサバイビン抗原は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価の抗体応答を誘導し得、それにより、抗原を発現するがんまたは腫瘍に対して直接的もしくは反応性である免疫応答を誘導または誘発する。いくつかの実施形態では、誘導または誘発された免疫応答は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性免疫応答の両方であり得る。いくつかの実施形態では、誘導または誘発された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および／またはインターロイキン２（ＩＬ−２）の誘導または分泌を含むことができる。他の実施形態では、誘導または誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生される可溶性因子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ−１、および免疫チェックポイント分子を上方制御する因子を低減または阻害することができる。
【００４２】
本発明のワクチンは、治療を必要とする対象のがんの特定の予防または治療のための特定のがん抗原の任意の組み合わせを提供することができる。
【００４３】
組換えがん抗原の核酸およびそのコードされるアミノ酸配列を設計するための１つの様式は、天然がん抗原の全体的なアミノ酸配列において特定のアミノ酸を変化させる変異を導入することによるものである。変異の導入は、がん抗原をあまり改変しないため、哺乳動物対象、好ましくはヒトまたはイヌ対象にわたり普遍的に適用することはできないが、結果として生じるアミノ酸配列は、免疫応答を生成するために、寛容性を破壊するか、または外来抗原と見なされるように十分に変化する。別の様式は、それに対応する天然がん抗原と比較して、少なくとも８５％〜最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％〜最大９８％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９３％〜最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは、少なくとも９５％〜最大９８％の配列同一性を有するコンセンサス組換えがん抗原を作製することであり得る。いくつかの事例において、組換えがん抗原は、それに対応する天然がん抗原と比較して、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。天然がん抗原は、特定のがんまたはがん腫瘍に通常関連する抗原である。がん抗原に応じて、がん抗原のコンセンサス配列は、哺乳動物種全体、または種のサブタイプ内、またはウイルス株全体、または血清型にわたることができる。いくつかのがん抗原は、がん抗原の野生型アミノ酸配列と大きく異ならない。いくつかのがん抗原は、種にわたり多岐の核酸／アミノ酸配列を有し、コンセンサス配列を生成することができない。これらの事例において、組換えがん抗原は、耐性を破壊して生成し、それに対応する天然がん抗原と比較して、少なくとも８５％〜最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％〜最大９８％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９３％〜最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは、少なくとも９５％〜最大９８％の配列同一性を有する免疫応答が生成される。いくつかの事例において、組換えがん抗原は、それに対応する天然がん抗原と比較して、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。前述のアプローチを組み合わせて、最終的な組換えがん抗原が、上で考察された天然がん抗原アミノ酸配列との類似性パーセントを有するようにすることができる。
【００４４】
ワクチンは、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わせて、細胞性および体液性免疫応答の両方の刺激を増強することができる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１抗体を使用すると、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを防止する。全体として、免疫系により認識されるようにがん抗原を設計することは、腫瘍細胞による他の形態の免疫抑制を克服するのに役立ち、これらのワクチンは、抑制または阻害療法（抗ＰＤ−１および抗ＰＤＬ−１抗体療法など）と組み合わせて使用して、Ｔ細胞および／またはＢ細胞応答をさらに増強することができる。
【００４５】
ワクチンは、腫瘍フリー生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、および４５％で増加することができる。ワクチンは、免疫化後に、腫瘍質量を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％で低減することができる。ワクチンは、骨髄由来サプレッサー細胞から分泌されるサイトカインである単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の増加を防止および遮断することができる。ワクチンは、腫瘍生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％で増強することができる。
【００４６】
ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫応答を約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍で増強することができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫応答を約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍で増強することができる。
【００４７】
ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象におけるＩＦＮ−γレベルと比較して、ワクチンを投与された対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベルを約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍で増強することができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象におけるＩＦＮ−γレベルと比較して、ワクチンを投与された対象におけるＩＦＮ−γレベルを約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍で増強することができる。
【００４８】
以下により詳細に記載されるように、ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下により詳細に記載される。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／もしくは分化、Ｂ細胞提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達など、免疫系の任意の成分の抑制を防止する任意の核酸またはタンパク質である。以下でさらに詳細に記載するように、ワクチンは、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わせて、細胞性および体液性免疫応答の両方の刺激を増強することができる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１抗体を使用すると、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを防止する。
【００４９】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先される。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及したすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。
【００５０】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびそれらの変形の用語は、追加の行為または構造の可能性を排除しない、制限のない過渡的な句、用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」には、文脈から明確に指示されない限り、複数の参照が含まれる。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、「からなる」および「本質的にからなる」他の実施形態も企図する。
【００５１】
本明細書の数値範囲の列挙については、列挙された範囲の最小値および最大値と同じ程度の精度を有する各々の介在する値が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて７および８の数値が企図され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数値が、明示的に企図される。
【００５２】
本明細書で使用される「アジュバント」は、抗原の免疫原性を増強するために本明細書に記載されるワクチンに追加される任意の分子を意味する。
【００５３】
本明細書で使用される「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、および一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、およびそれらの誘導体を含む。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製された抗体、またはその任意の混合物であり得、それに由来する所望されるエピトープまたは配列に対して十分な結合特異性を示す。
【００５４】
「抗原」は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０、（ｃ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２、（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるタンパク質、（ｈ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質、（ｉ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一のタンパク質、（ｊ）配列番号２のアミノ酸１９〜１５９と少なくとも９５％同一であるタンパク質の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４のアミノ酸１９〜２１０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の少なくとも９０％を含む断片、および（ｌ）配列番号８のアミノ酸１９〜２３２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の少なくとも９０％を含む断片を含む合成コンセンサスサバイビン抗原アミノ酸配列を有するタンパク質を指す。「抗原」はまた、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号４、（ｃ）配列番号８、（ｄ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質、（ｈ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質、（ｉ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質、（ｊ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、および（ｌ）配列番号８と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む合成コンセンサスサバイビン抗原アミノ酸配列を有するタンパク質も指す。抗原は、他のタンパク質からのものなどのシグナルペプチドを任意で含み得る。
【００５５】
本明細書で使用される「コード化配列」または「コード化核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード化配列は、核酸が投与される対象または哺乳動物の細胞における発現を指示することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御要素に作動可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。
【００５６】
核酸に関して本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、ワトソンクリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）または核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のフーグスティーン塩基対を意味することができる。
【００５７】
本明細書で使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、異なる生物または生物内の異なるアイソフォームからの同じ遺伝子に対する複数の配列のアラインメントの分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。
【００５８】
本明細書で使用される「定電流」は、同じ組織に送達される電気パルスの持続時間にわたって、組織または該組織を規定する細胞によって受け取られるまたは経験される電流を表す。電気パルスは、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスから送達される。本明細書で提供されるエレクトロポレーションデバイスは、好ましくは瞬間的なフィードバックを有するフィードバック要素を有するので、この電流は、電気パルスの寿命にわたって該組織内で一定のアンペア数のままである。フィードバック要素は、パルスの持続時間全体で組織（または細胞）の抵抗を測定し、エレクトロポレーションデバイスにその電気エネルギー出力を変化（例えば、電圧を増加）させることができるため、同じ組織の電流は電気パルス全体で（マイクロ秒のオーダーで）、またパルス間で一定のままである。いくつかの実施形態では、フィードバック要素は、コントローラを含む。
【００５９】
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」は、互換的に使用され得、かつ提供されたエレクトロポレーションデバイスの能動的応答を意味し得、これは、電極間の組織の電流を測定し、それに応じて電流を一定レベルに維持するために、ＥＰデバイスによって供給されるエネルギー出力を変更することを含む。この一定レベルは、パルス配列または電気治療の開始前にユーザによって事前設定される。フィードバックは、電気回路が、電極間の組織の電流を継続的にモニタリングし、そのモニタリングされた電流（または組織内の電流）を事前設定された電流と比較し、エネルギー出力調整を継続的に行って、モニタリングされた電流を事前設定レベルに維持するため、エレクトロポレーションデバイスのエレクトロポレーション構成要素、例えば、コントローラによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、瞬間的であり得る。
【００６０】
本明細書で使用される「分散電流」は、本明細書で記載されるエレクトロポレーションデバイスの様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、ここで、パターンは、エレクトロポレーションされている組織の任意の領域におけるエレクトロポレーション関連熱ストレスの発生を最小化、または好ましくは排除する。
【００６１】
本明細書で互換的に使用される「エレクトロポレーション」、「電気透過性」、または「動電学的増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微視的経路（細孔）を誘導する膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在により、プラスミドおよびベクター、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、水などの生体分子が細胞膜の一方の側からもう一方の側へと通過することができる。
【００６２】
核酸配列に関して本明細書で使用される「断片」は、本明細書で開示される抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することが可能なポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部分を意味する。断片は、以下に示すタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。断片は、追加された異種シグナルペプチドを除いて、以下に示される１つ以上の核酸配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。断片は、以下に示される１つ以上の核酸配列の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得、さらに任意で、異種シグナルペプチドをコードする配列を含み、同一性パーセントを計算する際に含める必要はない。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、断片は、以下に示される少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも２０ヌクレオチド以上、少なくとも３０ヌクレオチド以上、少なくとも４０ヌクレオチド以上、少なくとも５０ヌクレオチド以上、少なくとも６０ヌクレオチド以上、少なくとも７０ヌクレオチド以上、少なくとも８０ヌクレオチド以上、少なくとも９０ヌクレオチド以上、少なくとも１００ヌクレオチド以上、少なくとも１５０ヌクレオチド以上、少なくとも２００ヌクレオチド以上、少なくとも２５０ヌクレオチド以上、少なくとも３００ヌクレオチド以上、少なくとも３５０ヌクレオチド以上、少なくとも４００ヌクレオチド以上、少なくとも４５０ヌクレオチド以上、少なくとも５００ヌクレオチド以上、少なくとも５５０ヌクレオチド以上、少なくとも６００ヌクレオチド以上、または少なくとも６５０ヌクレオチド以上を含み得る。
【００６４】
ポリペプチド配列に関する「断片」または「免疫原性断片」は、本明細書に開示される抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。断片は、以下の様々なアミノ酸配列の少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。コンセンサスタンパク質の断片は、追加された異種シグナルペプチドを除いて、コンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。断片は、以下に示される１つ以上のアミノ配列の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得、さらに任意で、異種シグナルペプチドを含み、同一性パーセントを計算する際に含める必要はない。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、コンセンサスタンパク質の断片は、本明細書に開示されるタンパク質配列の少なくとも２０アミノ酸以上、少なくとも３０アミノ酸以上、少なくとも４０アミノ酸以上、少なくとも５０アミノ酸以上、少なくとも６０アミノ酸以上、少なくとも７０アミノ酸以上、少なくとも８０アミノ酸以上、少なくとも９０アミノ酸以上、少なくとも１００アミノ酸以上、少なくとも１１０アミノ酸以上、少なくとも１２０アミノ酸以上、少なくとも１３０アミノ酸以上、少なくとも１４０アミノ酸以上、少なくとも１５０アミノ酸以上、少なくとも１６０アミノ酸以上、少なくとも１７０アミノ酸以上、少なくとも１８０アミノ酸以上、少なくとも２００アミノ酸以上、または少なくとも２２０アミノ酸以上を含むことができる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード化配列は、核酸分子が投与される対象の細胞における発現を指示することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節要素に作動可能に連結された開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用する場合、「発現可能な形態」という用語は、対象の細胞に存在する場合に、コード化配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード化配列に機能的に連結された必要な制御性要素を含む遺伝子構築物を指す。
【００６７】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、ある程度の相補性を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）があり得る。完全に相補的な配列が、標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、機能的用語「実質的に相同な」を使用して言及される。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合に、本明細書で使用される「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズすることができるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合に、本明細書で使用される「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸鋳型配列にハイブリダイズすることができる（すなわち、その相補体である）プローブを指す。
【００６８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で本明細書において使用される「同一の」または「同一性」は、配列が、特定の領域にわたって同じである特定の割合の残基を有することを意味する。割合は、２つの配列を最適に整列し、指定された領域にわたり２つの配列を比較し、一致した位置の数を得るために、両方の配列で同一の残基が発生する位置の数を決定し、一致した位置の数を指定された領域の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることで計算することができる。２つの配列の長さが異なる場合、またはアラインメントによって１つ以上の互い違いの末端が生成され、指定された比較領域に単一配列のみが含まれる場合、単一配列の残基は分母に含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等と見なすことができる。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用して実行することができる。
【００６９】
本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバック機構を考察するときに使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、事前設定された電流との比較が可能になる。
【００７０】
本明細書で使用される「免疫応答」は、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性、または体液性応答、またはその両方の形態であり得る。
【００７１】
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントは、所定の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。
【００７２】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであることができ、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、塩基の組み合わせは、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む。核酸は、化学合成法または組換え法によって得ることができる。
【００７３】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’下流）に配置することができる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターとプロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく対応することができる。
【００７４】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し得、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組み合わせであり得る。
【００７５】
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、細胞における核酸の発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対ほど離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的または差次的に遺伝子構成成分の発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータ−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが含まれる。
【００７６】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書において互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端で連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を指向する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質が産生される細胞からその分泌を容易することが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、しばしば成熟タンパク質と称される、タンパク質の残りの部分から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端（すなわち、Ｎ末端）で連結される。
【００７７】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複雑な混合物などにおいて、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨで特異的配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）であり得る（標的配列は過剰で存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％は平衡で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブについては（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、そして長いプローブについては（例えば、約５０ヌクレオチド超）少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、正のシグナルは背景ハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳで洗浄。
【００７８】
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫化されることを望む、またはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットであり得る。
【００７９】
本明細書で使用される「実質的に相補的」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００８０】
本明細書で使用される「実質的に同一」は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または核酸に関して、第１の配列が第２の配列の補体と実質的に相補的であることを意味する。
【００８１】
本明細書で使用される「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、阻止する、または完全に排除することにより疾患から動物を保護することを意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の抑制は、疾患の誘導後であるが、その臨床的出現の前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の阻止は、疾患の臨床的出現後に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。
【００８２】
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその一部分の補体、（ｉｉｉ）参照核酸またはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味する。
【００８３】
ペプチドまたはポリペプチドに関して本明細書で使用される「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドを意味する。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似する特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、当該技術分野において典型的にわずかな変化を伴うと認識されている。これらのわずかな変化は、当該技術分野において理解されるように、一部、アミノ酸の疎水性親水性指数を考慮することによって同定され得る。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷を考慮することに基づく。類似する疎水性親水性指数のアミノ酸が置換され、尚もタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野において既知である。一態様では、±２の疎水性親水性指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈において、アミノ酸の親水性を考慮することにより、抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な手段である、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能となる。米国特許第４，５５４，１０１号、参照により本明細書に完全に組み込まれる。類似する親水性値を有するアミノ酸を置換することにより、当該技術分野において理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性親水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性により明らかにされるように、アミノ酸の相対類似性および特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【００８４】
バリアントは、完全な遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
【００８５】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種核酸配列を含有するか、またはそれを含み得る。
【００８６】
ワクチン
本明細書で開示される合成コンセンサスサバイビン抗原、抗原をコードする核酸分子、抗原の断片をコードする核酸分子、抗原のバリアントをコードする核酸分子、またはそれらの組み合わせをコードする核酸分子を含むワクチンが本明細書で提供される。ワクチンは、抗原に対する免疫応答を対象において生じさせることが可能であり得る。免疫応答は、治療的または予防的免疫応答であり得る。ワクチンは、以下により詳細に記載されるように、１つのベクターまたは複数のベクターを含み得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、合成コンセンサスサバイビン抗原をコードする。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号３をコードする核酸配列、配列番号３の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号３と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、または配列番号３と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、または配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号４をコードする核酸配列、配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、または配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２、配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号２と少なくとも９５％同一である断片、または配列番号２と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、合成コンセンサスサバイビン抗原を含み、抗原は、配列番号３、配列番号３の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、合成コンセンサスサバイビン抗原を含み、抗原は、配列番号４、配列番号４の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
【００９１】
ワクチンは、がん、例えば、サバイビンを発現するがんまたは腫瘍から保護するために使用することができる。ワクチンは、サバイビンを発現する腫瘍を予防および／または治療するために、それを必要とする対象において使用することができる。ワクチンは、サバイビンおよびサバイビンを発現する腫瘍に対する細胞性および／または抗体応答を誘導することができる。
【００９２】
一実施形態では、ワクチンは、サバイビンを発現する卵巣がん細胞、詳細には、サバイビンを発現する上皮性卵巣がん細胞、詳細には、サバイビンを発現する漿液性卵巣がん細胞に対する細胞性および／または抗体応答を防御、防止および／または治療するために、または誘導するために使用することができる。
【００９３】
本明細書に記載されるがんワクチンの開発は、免疫系によって認識されず、腫瘍関連（「がん／精巣」、「Ｃ／Ｔ」）抗原であるがん抗原、例えば、サバイビンを同定することを含む。同定されたがん抗原は、免疫系により認識されるために、自己抗原から外来抗原に変更される。組換えがん抗原の核酸およびアミノ酸配列を自己から外来抗原に再設計すると、免疫系による抗原の耐性が破壊される。寛容性を破壊するために、以下に記載されるように、いくつかの再設計手段ががん抗原に適用され得る。
【００９４】
ワクチンの組換えがん抗原は、自己として認識されないため、寛容性が破壊される。寛容性を破壊することは、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価の抗体応答を誘導し、それにより、抗原を発現するがんまたは腫瘍に対して直接的もしくは反応性である免疫応答を誘導または誘発する。いくつかの実施形態では、誘導または誘発された免疫応答は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性免疫応答の両方であり得る。いくつかの実施形態では、誘導または誘発された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および／またはインターロイキン２（ＩＬ−２）の誘導または分泌を含むことができる。他の実施形態では、誘導または誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生される可溶性因子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ−１、および免疫チェックポイント分子を上方制御する因子を低減または阻害することができる。
【００９５】
特定の実施形態では、ワクチンは、（１）ＣＤ８+および／もしくはＣＤ１０７ａ+（ＣＴＬ）などの細胞傷害性Ｔリンパ球を増加して、腫瘍細胞を攻撃して殺傷する、（２）Ｔヘルパー細胞応答を増加する、ならびに／または（３）ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＦＮ−α、または好ましくは前述のすべてを介した炎症応答を増加することにより、クリアランスを媒介するか、または腫瘍細胞の増殖を防止することができる。
【００９６】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号に開示されており、参照により本明細書に完全に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、それが染色体に組み込まれるのを阻害する要素または試薬をさらに含むことができる。
【００９７】
ワクチンは、がん抗原をコードするＲＮＡを含み得る。ＲＮＡワクチンは、細胞に導入することができる。
【００９８】
ワクチンは、弱毒生ワクチン、組換えベクターを使用して抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンであり得、例えば、これらに限定されないが、ワクチンは、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、および同第６，５８９，５２９号に記載され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、分子アジュバントのコード化配列をさらに含み得、いくつかの事例では、分子アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳであり得、いくつかの事例では、分子アジュバントは、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、抗プログラム死受容体１（ＰＤ−１）、および抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）を含む、チェックポイント阻害剤である。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳについてのコード化配列は、１つ以上の抗原についてのコード配列を含む１つ以上の核酸分子に含まれ得る。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳについてのコード化配列は、１つ以上の別個のプラスミドまたはベクターなどの１つ以上の別個の核酸分子に含まれ得、核酸ワクチンと組み合わせて投与される。
【０１００】
本発明のワクチンは、ワクチンのそれ自体が疾患または死亡を引き起こさないように安全である、疾患から保護する、中和抗体の誘導する、保護Ｔ細胞応答を誘導する、投与の簡易性、少ない副反応、生物学的安定性、低い用量あたりのコストを提供するなどの有効なワクチンに要求される特徴を有することができる。ワクチンは、以下で考察されるように、がん抗原をコードする核酸分子（複数可）を含むことにより、これらの特徴のいくつかまたはすべてを達成することができる。
【０１０１】
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたワクチン
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下により詳細に記載される。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／もしくは分化、Ｂ細胞提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達など、免疫系の任意の成分の抑制を防止する任意の核酸またはタンパク質である。
【０１０２】
かかる阻害剤は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸はまた、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。小分子は、低分子量、例えば、８００ダルトン未満の酵素基質、タンパク質もしくは核酸により結合されたリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの調節因子として機能する、有機または無機化合物であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列であり得る。他の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１０４】
免疫チェックポイント分子
免疫チェックポイント分子は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸はまた、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。小分子は、低分子量、例えば、８００ダルトン未満の酵素基質、タンパク質もしくは核酸により結合されたリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの制御因子として機能する、有機または無機化合物であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１０５】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１
免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ−１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされる細胞表面タンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞に発現しているため、これらの細胞の運命および／または分化に寄与する。特に、ＰＤ−１は、Ｔ細胞制御因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーの１型膜タンパク質であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルを負に制御し、それにより免疫応答を負に制御する。ＰＤ−１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を負に制御することができるため、ＣＤ８媒介細胞傷害性を阻害し、腫瘍の成長を促進する。
【０１０６】
ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２という２つのリガンドを有し、それは、Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ−Ｌ１は、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦ処理に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）で、かつＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達時にＴ細胞およびＢ細胞で上方制御される。ＰＤ−Ｌ１は、骨髄腫、肥満細胞腫、および黒色腫を含む多くの腫瘍細胞株で発現する。
【０１０７】
抗免疫チェックポイント分子抗体
上述されるように、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体であり得る。抗体は、抗原（すなわち、上述される免疫チェックポイント分子）と結合または反応することができる。したがって、抗体は、抗免疫チェックポイント分子抗体または免疫チェックポイント分子抗体と考慮され得る。抗体は、含まれる核酸配列によりコードすることができる。
【０１０８】
抗体は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含み得る。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、および／またはヒンジ領域を含むことができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含むことができる。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。
【０１１０】
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域のうちの３つの超可変領域を含むことができる。重鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と示される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与することができる。
【０１１１】
軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットには、ＶＬ領域のうちの３つの超可変領域を含むことができる。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と示される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与することができる。
【０１１２】
抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得、ＣＤＲに対して支持を提供し、ＣＤＲの空間的な関係を相互に定義する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間にそれぞれ挿入される。ＣＤＲセットは、重または軽鎖Ｖ領域のうちの３つの超可変領域を含み得る。重または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、「ＣＤＲ３」と示される。したがって、抗原結合部位は、重および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含み得る。
【０１１３】
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含むことができる。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含むことができる。
【０１１４】
追加的に、タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片を生成し、その２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々、無傷の抗原結合部位を含む共有ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、Ｆ（ａｂ’）2断片を含むいくつかの断片を提供することができ、両方の抗原結合部位を含む。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含むことができる。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含むことができる。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含むことができる。
【０１１５】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望される抗原と結合する非ヒト種からの抗体であり得る。
【０１１６】
ＰＤ−１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ−１抗体（本明細書では「ＰＤ−１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ−１抗体は、ニボルマブであり得る。抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
【０１１７】
ＰＤ−Ｌ１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（本明細書では「ＰＤ−Ｌ１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
【０１１８】
抗原
上述されるように、ワクチンは、抗原または抗原をコードする核酸を含むことができる。抗原は、サバイビン、その断片、そのバリアント、または断片およびそのバリアントの組み合わせであり得る。
【０１１９】
したがって、ワクチンは、サバイビンを発現するがんまたは腫瘍に罹患する対象を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、がんは、卵巣がんである。いくつかの実施形態では、卵巣がんは、上皮性卵巣がんである。卵巣がんは、漿液性上皮性卵巣がんであり得る。ワクチンはまた、対象においてかかる腫瘍の発生を防止するために、サバイビンを発現するがんまたは腫瘍を有する対象を治療するために使用することもできる。合成コンセンサスサバイビン抗原は、天然サバイビン遺伝子とは異なり得、したがって合成コンセンサスサバイビン抗原を発現する腫瘍に対する療法または予防を提供する。したがって、天然サバイビン遺伝子とは異なる合成コンセンサスサバイビン抗原配列（すなわち、変異または合成サバイビン遺伝子または配列）が本明細書で提供される。
【０１２０】
天然サバイビン遺伝子の転写産物は、様々なｍＲＮＡにプロセシングされる。特定のサバイビンｍＲＮＡアイソフォームは、例えば、がん細胞におけるそれらの発現に基づいて選択することができる。特定の実施形態において、サバイビンアイソフォームは、卵巣がん細胞におけるその発現に基づいて選択される。本明細書に記載される合成コンセンサスサバイビン抗原配列は、選択的プロセシングを回避し、１つの完全長転写産物を生成し、エフェクターＴおよびＢ細胞応答のより強い誘導をもたらす。
【０１２１】
上述される異種配列を含む単離された核酸分子が提供される。上述される異種配列からなる単離された核酸分子が提供される。上述される異種配列を含む単離された核酸分子は、プラスミド、ウイルスベクター、および以下に記載されるような他の形態の核酸分子などのベクターに組み込まれ得る。合成コンセンサスサバイビン抗原をコードする核酸配列が本明細書で提供される。合成コンセンサスサバイビン抗原をコードするコード配列は、上述されるような配列を有する。
【０１２２】
上述される異種アミノ酸配列を含むタンパク質分子が提供される。上述される異種アミノ酸配列からなるタンパク質分子が提供される。上述される配列を有するタンパク質およびポリペプチドが本明細書に提供される。タンパク質およびポリペプチドは、合成コンセンサスサバイビン抗原およびサバイビン免疫原と称され得る。合成コンセンサスサバイビン抗原は、サバイビンを発現する腫瘍に対する免疫応答を誘発することが可能である。
【０１２３】
一態様では、転写を増加するための低ＧＣ含有リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性およびコドンの最適化、ならびに可能な限り、シス作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の排除の１つ以上を含む、合成コンセンサスサバイビン抗原が転写および翻訳の改善を提供することが望ましい。
【０１２４】
合成コンセンサスサバイビン抗原は、２つ以上の種、アイソフォーム、またはバリアントに由来するコンセンサス抗原（または免疫原）配列であり得る。一実施形態では、コンセンサス配列は、異なる種のサバイビンアイソフォームから生成される。コンセンサス配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の同様のＤＮＡもしくはタンパク質配列データベースから収集されたサバイビン配列に由来する。いくつかの実施形態では、コンセンサス抗原は、第２のアイソフォームの一部と組み合わされた第１のアイソフォームの一部を含むことができ、第２のアイソフォームの一部は、例えば、第１のアイソフォームの任意の一部と非相同である。合成コンセンサスサバイビン抗原は、発現を改善するためのコンセンサス配列および／または改変を含むことができる。改変には、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増強するためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）の追加、および／または合成コンセンサスサバイビン抗原の免疫原性を増強するための免疫グロブリンリーダー配列の追加が含まれる。合成コンセンサスサバイビン抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、合成コンセンサスサバイビン抗原は、局在化シグナル配列、例えば、翻訳時に核局在化を破壊するための核局在化シグナルに対する変異または欠失を含むことができる。いくつかの実施形態では、サバイビンコンセンサス抗原は、血球凝集素（ＨＡ）タグを含むことができる。サバイビンコンセンサス抗原は、対応する非コドン最適化サバイビン抗原よりも強力で幅広い細胞性および／または体液性免疫応答を誘発するように設計できる。
【０１２５】
コンセンサスサバイビン配列を変異させて、天然サバイビンの特定の構造および／または機能を破壊および／または増強して、合成コンセンサスサバイビン抗原配列を生成することができる。一実施形態では、サバイビンの抗アポトーシス活性を消失するために変異が導入される。特定の実施形態では、Ｔ３４Ａ、Ｔ４８Ａ、およびＣ８４Ａ変異は、コンセンサスサバイビンアイソフォーム１配列に導入されて、抗アポトーシス機能を消失する。（Ｍｕｃｈｍｏｒｅ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｏｆ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ６，１７３−１８２（２０００）；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｂｙ  ｐ３４ｃｄｃ２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９７，１３１０３−１３１０７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２４０３９０６９７  （２０００）；Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｒ．Ｍ．，Ｃｏｌｎａｇｈｉ，Ｒ．＆Ｗｈｅａｔｌｅｙ，Ｓ．Ｐ．Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ４８  ｉｎ  ｔｈｅ  ＢＩＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＫ２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，Ｔｅｘ．）１０，５３８−５４８（２０１１）を参照されたい）。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、合成コンセンサスサバイビン抗原配列は、１つのアイソフォーム、例えば、優勢なサバイビンアイソフォームから生成され得るか、またはコンセンサス配列は、第１のアイソフォームの一部および第２のアイソフォームの一部の組み合わせ、もしくは第２のアイソフォームの切断型部分を含むことができる。一実施形態では、合成コンセンサス配列は、サバイビンアイソフォーム１（サバイビン１）に由来する。別の実施形態では、合成コンセンサス配列は、サバイビンアイソフォーム３（サバイビン３）に由来する。一実施形態では、合成コンセンサスサバイビン抗原３配列は、サバイビン３（サバイビン３Ｔ）の切断型部分である。一実施形態では、合成コンセンサス配列は、サバイビン１およびサバイビンＴ３、またはサバイビン１Ｔ３の組み合わせである。
【０１２７】
好ましい実施形態では、合成コンセンサスサバイビン抗原配列は、配列番号１または配列番号３と９５．０％以上の同一性を共有する。この実施形態では、配列番号１または配列番号３の核酸配列は、それぞれ、配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、合成コンセンサスサバイビン抗原配列は、配列番号１または配列番号３と９５．０％以上の同一性、９５．２％以上の同一性、９５．４％以上の同一性、９５．６％以上の同一性、９５．８％以上の同一性、９６．０％以上の同一性、９６．２％以上の同一性、９６．４％以上の同一性、９６．６％以上の同一性、９６．８％以上の同一性、９７．０％以上の同一性、９７．２％以上の同一性、９７．４％以上の同一性、９７．６％以上の同一性、９７．８％以上の同一性、９８．０％以上の同一性、９８．２％以上の同一性、９８．４％以上の同一性、または９８．６％以上の同一性、９８．８％以上の同一性、９９．０％以上の同一性、９９．２％以上の同一性、９９．４％以上の同一性、９９．６％以上の同一性、９９．８％以上の同一性、または１００％の同一性を共有する。
【０１２８】
ベクター
ワクチンは、合成コンセンサスサバイビン抗原をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含むことができる。１つ以上のベクターは、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含む核酸配列を有することができる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【０１２９】
１つ以上のベクターは、発現構築物であり得、これは、一般的に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体によって生成される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として機能し、発現ベクター上で運ばれる遺伝子の効率的な転写につながる制御性配列を含むように多くの場合設計されている。本発明のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質を発現する。
【０１３０】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローニングされた遺伝子との間の距離の調整、ならびに転写終結配列およびＰＴＩＳ（携帯型翻訳開始配列）の挿入などの発現シグナルを有し得る。
【０１３１】
ベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸であり得る。環状プラスミドおよび直鎖状核酸は、適切な対象細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指示することが可能である。ベクターは、抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを有することができ、終結シグナルに作動可能に連結され得る。ベクターはまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列、ならびにベクターおよびその断片をクローニングおよびサブクローニングするための配列を含むことができる。目的のヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下であり得、宿主細胞が、一部の特定の外部刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織または器官または発生段階に特異的であり得る。好ましい実施形態では、プラスミドベクターは、本明細書に記載されるｐＧＸ１４２８であり、さらに配列番号１の核酸配列を含み、または本明細書に記載されるｐＧＸ１４２９、さらに配列番号３の核酸配列を含む。
【０１３２】
ベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、抗原をコードする核酸を用いて細胞をトランスフェクトするのに有用であり得る。形質転換された宿主細胞は、抗原の発現が起こる条件下で培養および維持され得る。
【０１３３】
プラスミドは、合成の抗原に対する免疫応答を誘発することができるコンセンサス抗原、かかるタンパク質の断片、かかるタンパク質のバリアント、バリアントまたは融合タンパク質の断片をコードするコード配列を含む、上記に開示された様々な抗原の１つ以上をコードする核酸配列を含み得、これらは、コンセンサスタンパク質および／またはコンセンサスタンパク質の断片および／またはコンセンサスタンパク質のバリアントおよび／またはコンセンサスタンパク質のバリアントの断片の組み合わせで構成される。
【０１３４】
単一のプラスミドは、単一の抗原のコード配列、２つの抗原のコード配列、３つの抗原のコード配列、または４つの抗原のコード配列を含有し得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、プラスミドは、ＣＣＲ２０を単独で、またはこれらのプラスミドの一部としてコードするコード配列をさらに含み得る。同様に、プラスミドは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８のコード配列をさらに含み得る。
【０１３６】
プラスミドは、コード配列の上流であり得る開始コドン、およびコード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含み得る。開始および終止コドンは、コード配列を伴うインフレームであり得る。
【０１３７】
プラスミドは、コード配列に作動可能に連結されるプロモーターも含み得る。コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからのプロモーターであり得る。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターでもあり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターでもあり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１７５７２７号に記載されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
プラスミドは、コード化配列の下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１３９】
プラスミドは、コード配列の上流のエンハンサーも含み得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶからのものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、各々の内容は参照により完全に組み込まれる。
【０１４０】
プラスミドは、プラスミドを染色体外で維持し、細胞においてプラスミドの複数コピーを産生するために、哺乳類の複製起点も含み得る。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４またはｐＲＥＰ４であり得、エプスタインバールウイルスの複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み、組み込みなしで高コピーのエピソーム複製を生成し得る。プラスミドの骨格は、ｐＡ  Ｖ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
【０１４１】
プラスミドは、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に好適であり得る制御性配列も含み得る。コード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。
【０１４２】
コード化配列は、Ｉｇリーダー配列も含み得る。リーダー配列は、コード配列の５’であり得る。この配列によってコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ末端Ｉｇリーダー、続いてコンセンサス抗原タンパク質を含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
【０１４３】
プラスミドはｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであってもよく、これは昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、これはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。
【０１４４】
ベクターは、細胞ゲノムに組み込むことによって標的細胞を形質転換するか、または染色体外で存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）であり得る。
【０１４５】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１４６】
エレクトロポレーションにより対象に効率的に送達され、１つ以上の所望の抗原を発現することができる直鎖状核酸ワクチンまたは直鎖状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、任意のリン酸骨格を欠く任意の直鎖状ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、１つ以上の抗原をコードし得る。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含有し得る。抗原の発現はプロモーターにより制御され得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現に無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
【０１４７】
ＬＥＣは、局在化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、抗原を発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１４８】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
【０１４９】
ベクターは、プロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離された核酸の発現を制御することが可能な任意のプロモーターであり得る。かかるプロモーターは、本明細書に記載される抗原配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用性配列要素である。異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、ベクター内の転写開始からほぼ同じ距離に配置し得、それは、その自然な設定での転写開始部位からである。しかしながら、この距離の差異は、プロモーターの機能を喪失することなく調整され得る。
【０１５０】
プロモーターは、転写物、リボソーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な抗原およびシグナルをコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。
【０１５１】
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞において発現に有効であると示される別のプロモーターであり得る。
【０１５２】
ベクターは、機能的なスプライスドナーおよびアクセプター部位を有するエンハンサーおよびイントロンを含み得る。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含有し得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得てもよい。
【０１５３】
ベクターを調製する方法
本明細書で論じられる合成コンセンサスサバイビン抗原をコードする核酸分子を含むベクターを調製する方法が本明細書で提供される。ベクターは、最終的なサブクローニングステップの後、当該技術分野で既知の方法を使用して、大規模発酵タンク内の細胞培養に播種するために使用され得る。
【０１５４】
ベクターは、ＥＰデバイスを用いて使用し、以下でより詳細に記載するように、既知のデバイスおよび技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願された米国仮出願米国特許第６０／９３９，７９２号に記載される最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される（米国特許公開第２００９／０００４７１６号を参照されたい）。いくつかの例では、これらの研究で使用されるＤＮＡベクターは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術はまた、２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に既知である様々なデバイスおよびプロトコルを含む、または組み込む。上記で参照された出願および特許、米国特許第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
ワクチンの賦形剤および他の成分
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクワレンおよびスクワレンなどのベシクル、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含むことができる。
【０１５６】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであり、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在し得る。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞などの界面活性剤も含み得、遺伝子構築物とともに投与されるヒアルロン酸も使用され得る。ＤＮＡベクターワクチンはまた、脂質、リポソームなどのトランスフェクション促進剤を含み得、ＤＮＡ−リポソーム混合物として、レシチンリポソームもしくは当該技術分野で既知の他のリポソーム（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含む。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。ワクチンにおけるトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１５７】
薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、代替のベクターにおいて発現されるか、またはワクチンにおいて上記のベクターと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１〜、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ，ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、欠失したシグナル配列をコードするシグナル配列またはコード配列を有し、任意選択でＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチド、もしくはＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を含むＩＬ−１５、およびそれらの機能断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＣＣＬ−２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、またはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上の核酸分子であり得る。ＩＬ−１２構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号および対応する米国出願第０８／９５６，８６５号、ならびに２０１１年１２月１２日に出願された米国仮出願第６１／５６９６００号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号および対応する米国出願第１０／５６０，６５０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号および対応する米国出願第１２／１６０，７６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳＩ０／０４８８２７号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ｉＬ−２８構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号および対応する米国出願第１２／９３６，１９２に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、およびＭＥＣ構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号および対応する米国出願第１１／７１９，６４６号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および免疫調節剤の例は米国出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節剤の例は、米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１，Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、ＩＬ−２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードするものを含む。
【０１６０】
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願された米国第０２１，５７９号（参照により完全に組み込まれる）に説明される遺伝子ワクチン促進剤をさらに含み得る。
【０１６１】
ワクチンは、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量でプラスミドを含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるワクチンは、約５ナノグラム〜約１０００マクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約１０ナノグラム〜約８００マクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約０．１〜約５００マクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約１〜約３５０マクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約０．１マクログラム〜約１０ミリグラム、約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムの抗原またはそれをコードするプラスミドを含有し得る。
【０１６２】
ワクチンは、使用される投与モードにより製剤化され得る。注射可能なワクチン薬学的組成物は、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含であり得る。等張製剤または溶液を使用することができる。等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。ワクチンは、血管収縮剤を含み得る。等張溶液は、リン酸緩衝食塩水を含み得る。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む安定剤は、製剤を長期間室温または周囲温度で安定させることができる。
【０１６３】
ワクチンの薬学的組成物
ワクチンは、薬学的組成物の形態であり得る。薬学的組成物は、ワクチンを含むことができる。薬学的組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）〜約１０ミリグラム（ｍｇ）のワクチンの核酸分子（複数可）を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明による薬学的組成物は、約２５ｎｇ〜約５ｍｇのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約５０ｎｇ〜約１ｍｇのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約２０マイクログラム〜約８０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約２５マイクログラム〜約６０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約３０ｎｇ〜約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約３５ｎｇ〜約４５マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明による薬学的組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ以上のワクチンの核酸分子（複数可）を含み得る。
【０１６５】
他の実施形態では、薬学的組成物は、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇ（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、最大１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラム（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、最大１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子（複数可）を含み得る。
【０１６６】
薬学的組成物は、使用される投与モードにより製剤目的のための他の薬剤をさらに含み得る。薬学的組成物が注射可能な薬組成物である場合、それらは、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含である。等張製剤を使用することが好ましい。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としてはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。
【０１６７】
薬学的組成物は、上記の段落２で提供されるような薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、段落２で提供されるように、機能性分子、ビヒクル、アジュバント、担体、希釈剤、またはトランスフェクション促進剤を含むことができる。
【０１６８】
適応症
本明細書で提供されるワクチンおよびワクチンを含む薬学的組成物は、サバイビンを発現するがん細胞およびがんに基づく腫瘍の治療または予防に使用することができる。特に、本明細書で提供されるワクチンおよびワクチンを含む薬学的組成物は、卵巣がん、より詳細には上皮性卵巣がん、最も詳細には漿液性卵巣がんの治療または予防に使用することができる。
【０１６９】
ワクチン接種の方法
上述の薬学的製剤を使用して、がんを治療および／または予防するための方法が本明細書に提供される。対象におけるがんの治療および／または予防に上述の薬学的製剤を使用する方法も本明細書に記載される。対象にワクチン接種する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の薬学的製剤を、それを必要する対象に投与する方法も本明細書に記載される。集合的に本明細書に記載の薬学的製剤を使用する治療方法と称される本明細書に記載の方法は、治療的および／または予防的免疫応答を誘導するために、本明細書に記載される１つ以上のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含み得る。ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強するために対象に投与され得る。ワクチンの投与は、細胞において発現され、細胞の表面に送達されると、免疫系が、細胞性、液性、または細胞性および液性応答を認識し誘導する核酸分子としての本明細書に開示されるがん抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの投与は、本明細書で論じられるワクチンを対象に投与することにより、対象において、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を誘導または誘発するために使用され得る。
【０１７０】
ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節するために対象に投与され、それにより免疫応答を増強させることができる。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。哺乳動物にワクチンを投与し、それによりベクターを哺乳動物の細胞に導入すると、トランスフェクトされた細胞が本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上を発現および分泌する。これらの分泌されたタンパク質または合成抗原は、１つ以上のがん抗原に対して作られた抗体、および１つ以上のがん抗原に特異的に対するＴ細胞応答を含み得る免疫応答を開始する免疫系により異物として認識される。いくつかの例では、本明細書で論じられるワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、抗原刺激を受けた免疫系を有し、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を接種された場合、抗原刺激を受けた免疫系は、液性、細胞性、または細胞性および液性両方の免疫応答によるものかにかかわらず、本明細書に開示される後のがん抗原を迅速に除去することができる。
【０１７１】
ＤＮＡのワクチンの投与方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、その両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
ワクチンを哺乳動物に投与して、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、好ましくはヒト、ウシ、またはブタであり得る。ワクチンは同様に、免疫応答を誘発するために、非ヒト対象、例えば、ニワトリに投与され得る。
【０１７３】
ワクチンの用量は、経時的にキログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム〜１０ｍｇ（構成成分／ｋｇ体重／回）の活性構成成分であり得、２０マイクログラム〜１０ｍｇ構成成分／ｋｇ体重／回であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
【０１７４】
ワクチンにより免疫応答を生成する方法
ワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、哺乳動物または非哺乳動物対象において免疫応答を生成することができる。免疫応答は、本明細書に開示されるような１つ以上のがん抗原に指向される抗体および／またはキラーＴ細胞を生成することができる。そのような抗体およびＴ細胞が単離され得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態は、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を生成する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態は、上述のがん抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に対して対象に予防的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、がん抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に罹患している対象に治療的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。ワクチンの投与前に本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を発現するがんまたは腫瘍の診断は、日常的に行うことができる。
【０１７６】
ワクチンによるがん治療の方法
ワクチンは、哺乳動物またはそれを必要とする対象におけるサバイビンを発現するがんまたは腫瘍（例えば、卵巣がん）に対して反応性または指向性である哺乳動物において免疫応答を生成または誘発するために使用され得る。誘発された免疫応答は、がんまたは腫瘍の成長を防止することができる。
【０１７７】
誘発された免疫応答は、がん性または腫瘍細胞の転移を防止および／または低減することができる。したがって、ワクチンは、ワクチンを投与された哺乳動物または対象におけるがんまたは腫瘍を治療および／または予防する方法で使用することができる。
【０１７８】
投与経路
ワクチンまたは薬学的組成物は、経口、非経口、舌下、経皮的、直腸に、経粘膜的、局所的、吸入により、頬側投与により、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および／もしくは関節内、またはそれらの組み合わせにより投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学診療に従って適切に許容される製剤として投与することができる。獣医は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎｓ）」、またはエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法により投与され得る。
【０１７９】
ワクチンのベクターは、インビボエレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、ナノ粒子促進トランスフェクション（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ならびに組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、および組換えワクシニアなどの組換えベクターを伴うまたは伴わないＤＮＡ注射（ＤＮＡ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含む、いくつかの周知の技術により哺乳動物に投与され得る。１つ以上のがん抗原のワクチンがインビボエレクトロポレーションとともにＤＮＡ注射により投与され得る。
【０１８０】
ワクチンまたはワクチンを含む薬学的組成物は、エレクトロポレーションにより投与され得る。エレクトロポレーションによるワクチンの投与は、可逆性細孔を細胞膜において形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得るエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザによって入力される事前設定された電流と同等の定電流である。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーション構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。エレクトロポレーション構成要素は、コントローラ、電流波形発生装置、インピーダンステスター、波形ロガー、入力素子、ステータス報告要素、通信ポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーションデバイスの様々な要素のうちの１つ以上を含み、それらを組み込むことができる。エレクトロポレーションは、ベクターによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボエレクトロポレーションデバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して達成され得る。
【０１８１】
本発明のＤＮＡワクチンの投与を容易にし得るエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの投与を容易にするために使用することができる他のエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション法には、２００７年１０月１７日に出願された同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号で提供されるものが含まれ、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号に対する利益を主張し、これらはすべて、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを容易にするためのモジュール電極システムおよびそれらの使用を説明している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクタ、および電源を備え得る。オペレータは、支持構造に載置される複数の針電極を把持し、それらを身体もしくは植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次に、生体分子を、皮下針により選択された組織内に投与する。プログラム可能な定電流パルスコントローラを作動させ、定電流電気パルスを複数の針電極に適用する。適用された定電流電気パルスは、生体分子を、複数の電極間の細胞に導入するのを容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを効果的に容易にするために使用することができるエレクトロポレーションデバイスを説明している。エレクトロポレーションデバイスは、操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を備える。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御に基づいた一列の電極とパルスパラメータの入力との間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを作り出し、電流波形データの保存および取得を可能にする。エレクトロポレーションデバイスは、一連の針電極を有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および着脱可能なガイドディスクも備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１８４】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に説明される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく他の組織または臓器にも深く浸透させるのに適し得る。電極アレイの構成により、注射針は標的臓器にも完全に挿入され、注射は電極によって予め描かれた領域の標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に説明される電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【０１８５】
加えて、エレクトロポレーションデバイスおよびその使用を組み込むいくつかの実施形態において企図される、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載されるもののエレクトロポレーションデバイスがある。さらに、様々なデバイスのいずれかを使用したＤＮＡの投与に関係する２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注射する方法が注目された２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号に提供される主題を網羅する特許が、本明細書で企図される。上記の特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０１８６】
本明細書で論じられる合成コンセンサスサバイビン抗原をコードする核酸分子（複数可）を含むベクターを調製する方法が本明細書で提供される。ベクターは、哺乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップの後、当該技術分野で既知の方法を使用して、大規模発酵タンク内の細胞培養に播種するために使用され得る。
【０１８７】
本発明のＥＰデバイスで使用するためのＤＮＡベクターは、既知のデバイスおよび技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００７年５月２３日に出願された米国公開出願第２００９／０００４７１６号に記載されている最適化された製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究で使用されるＤＮＡベクターは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術はまた、２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に既知である様々なデバイスおよびプロトコルを含む、または組み込む。上記で参照された出願および特許、米国特許第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１８８】
本発明は、以下の実施例においてさらに図示される。これらの実施形態は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に実例として示されることを理解するべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を様々な使用および条件に適応させることができる。したがって、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０１８９】
実施例１−コンセンサスサバイビンアイソフォーム１の生成
２９個のサバイビンアイソフォーム１配列をＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）から収集した。選択したサバイビンアイソフォーム１配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＮＰ＿００１１２５７２７．１、３ＵＩＧ，１Ｆ３Ｈ、ＢＡＣ２２７４８．２、ＮＰ＿００１１５９．２、ＣＡＧ４６５４０．１、ＢＡＤ９７１４８．１、ＸＰ＿００２７４８８４１．１、ＸＰ＿００３８１８３２２．１、ＮＰ＿００１２５３１１０．１、ＸＰ＿０１１８１０７１８．１、ＸＰ＿０１１８３２６９０．１、ＸＰ＿００１０８３１８３．１、ＸＰ＿００３７８６１３４．１、ＸＰ＿０１２５１６８０１．１、ＸＰ＿００７９５７８００．１、ＸＰ＿００１９１５４３５．１、ＸＰ＿００８５２３１０２．１、ＡＡＴ３７５０４．１、ＸＰ＿００４４３２８８３．１、ＸＰ＿００３４１７２７７．１、ＸＰ＿００４３７４１６７．１、ＮＰ＿９９９３０６．１、ＸＰ＿００２９１８４２１．１、ＮＰ＿００１００３３４８．１、ＮＰ＿００１００９２８０．１、ＸＰ＿００４７４８８５９．１、ＮＰ＿００１００１８５５．２、およびＡＡＵ８９２７５．１である。
【０１９０】
ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（バージョン１３．０．０．３５７）を使用して、コンセンサス配列を生成した。上に列記される２９個の配列をＭｅｇＡｌｉｇｎに取り込み、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントプログラムを使用してアライメントした。得られたコンセンサスサバイビンアイソフォーム１配列は、天然ヒトサバイビンアイソフォーム１と９７．２〜９７．９％の相同性を共有する。得られたコンセンサスサバイビンアイソフォーム１タンパク質の潜在的な生物学的機能を消失するために、３つの変異を導入し、サバイビンの抗アポトーシス活性を消失した。３つの変異は、Ｔ３４Ａ、Ｔ４８Ａ、およびＣ８４Ａである。さらに、より高いレベルの発現を得るために、上流のコザック配列およびＩｇＥリーダー配列をＮ末端に追加した。さらに、この遺伝子のコドン使用法は、ホモサピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合した。（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐ１２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，１４９７−１５０３（１９９８）、Ｄｅｍｌ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５，１０９９１−１１００１，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．２２．１０９９１−１１００１．２００１（２００１））。加えて、ＧＣ含有量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域、ならびに内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ−部位、リボソームエントリー部位などのｃｉｓ−作動配列モチーフを避けた、ＲＮＡ最適化も行った。結果として、合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１タンパク質は、ヒト天然サバイビンアイソフォーム１タンパク質と９５．１〜９５．８％の同一性を共有する。合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
【０１９１】
合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、サイトメガロウイルス前初期プロモーターの転写制御下に置かれた発現カセットを備えた独自の発現ベクターｐＧＸ０００１にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧＸ１４２８と命名した。完全長配列決定を行い、次に分析し、正しいことを確認した。合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１構築物の略図を図１に示す。合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１の全体構造を図２に示す。
【表１】
2021506265.tif 000003
【表２】
2021506265.tif 000004
【０１９２】
実施例２−コンセンサスサバイビンアイソフォーム１Ｔ３の生成
ヒトコンセンサスサバイビンアイソフォーム３を生成するために、８個のサバイビンアイソフォーム３配列をＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）から収集した。選択したサバイビンアイソフォーム３配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＮＰ＿００１０１２２７０．１、ＸＰ＿００８９６９７９０．１、ＸＰ＿００８０１１２７５．１、ＸＰ＿００９１８９６１４．１、ＸＰ＿０１１８９７６５３．１、ＸＰ＿０１１８１０６４２．１、ＸＰ＿０１１８４４３１５．１、およびＸＰ＿０１１７１８３５５．１である。
【０１９３】
ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（バージョン１３．０．０．３５７）を使用して、コンセンサス配列を生成した。上に列記される８個の配列をＭｅｇＡｌｉｇｎに取り込み、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントプログラムを使用してアライメントした。下等動物の６個のこれらの配列は、ヒト配列には存在しない余剰な１１アミノ酸残基がそのＣ末端に含まれた。これらの余剰な残基は、コンセンサスヒトサバイビンアイソフォーム３を生成する際に取り除かれ、ヒトでのオフターゲット免疫応答の誘発を防止する。ヒトコンセンサスサバイビンアイソフォーム３を生成した後、サバイビンアイソフォーム１および３の間の同一のアミノ酸配列が、コンセンサスサバイビンアイソフォーム３から除去された。切断型コンセンサスサバイビンアイソフォーム３配列（サバイビン抗原Ｔ３）は、天然ヒトサバイビンアイソフォームＴ３配列と９６．８％の配列相同性を共有する。サバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３免疫原は、サバイビン抗原１（上述される）およびサバイビン抗原Ｔ３の間にフューリン開裂部位を追加することにより生成した。
【０１９４】
コンセンサス合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３  ＤＮＡ配列が得られたら、より高いレベルの発現を得るために、上流のコザック配列およびＩｇＥリーダー配列をＮ末端に追加した。（Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  Ｔｈ１−ｔｙｐｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｉｓｏｌａｔｅ（ＷＮＶ−ＮＹ１９９９）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８４，８０９−８１６，ｄｏｉ：１０．１０８６／３２３３９５（２００１））．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｇｅｎｅ  ｗａｓ  ａｄａｐｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ  ｏｆ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｅｎｅｓ（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐ１２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，１４９７−１５０３（１９９８）、Ｄｅｍｌ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５，１０９９１−１１００１，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．２２．１０９９１−１１００１．２００１（２００１））。加えて、ＧＣ含有量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域、ならびに内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ−部位、リボソームエントリー部位などのｃｉｓ−作動配列モチーフを１１、１２で避けた、ＲＮＡ最適化も行った。合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、サイトメガロウイルス前初期プロモーターの転写制御下に置かれた発現カセットを備えた発現ベクターｐＧＸ０００１にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧＸ１４２９と命名した。完全長配列決定を行い、次に分析し、正しいことを確認した。表１に示すように、合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３のヌクレオチド配列を配列番号３に示す。表１に示すように、合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３のアミノ酸配列を配列番号８に示す。合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３構築物の略図を図３に示す。合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３構築物の特徴を表３に示す。    
【表３】
2021506265.tif 000005
【０１９５】
実施例３−ｐＧＸ  サバイビン発現ベクターの構築
ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）の制御下にあるｐＧＸ０００１（改変ｐＶＡＸ１発現ベクター）を骨格ベクターとして使用した。元のｐＶＡＸ１は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。
【０１９６】
改変を、ｐＧＸ０００１を作製するためにｐＶＡＸ１に導入し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なｐＶＡＸ１の報告された配列に基づいて特定した。これらの改変は以下に列挙されており、プラスミド増幅、ならびに抗原の転写および翻訳に関して問題は検出されていない。これまでのところ、ｐＧＸ０００１を骨格として使用するプラットフォーム内のプラスミド生成物のいずれのデータにおいても、ｐＧＸ０００１の配列内に変更は観察されていない。
【表４−１】
2021506265.tif 000006
塩基対２、３、および４は、ＣＭＶプロモーターの上流の骨格においてＡＣＴからＣＴＧに変更される。
【０１９７】
ｐＧＸ１４２８は、合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１（サバイビン抗原１）タンパク質をコードするＤＮＡプラスミドである。関連するｍＲＮＡ産生はヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ０００１骨格には、生産目的のためのカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）が含まれる。これらの要素は、真核細胞では機能しない。ｐＧＸ１４２８は、図４に示すように、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位の合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１（サバイビン抗原１）ＤＮＡ配列をｐＧＸ０００１にクローニングすることによって作製した。
【０１９８】
ｐＧＸ１４２９は、合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３（サバイビン抗原１Ｔ３）タンパク質をコードするＤＮＡプラスミドである。関連するｍＲＮＡ産生はヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ０００１骨格には、生産目的のためのカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）が含まれる。これらの要素は、真核細胞では機能しない。ｐＧＸ１４２９は、図５に示すように、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位の合成コンセンサスサバイビン抗原アイソフォーム１Ｔ３（サバイビン抗原１Ｔ３）ＤＮＡ配列をｐＧＸ０００１にクローニングすることによって作製した。
【０１９９】
実施例４−合成コンセンサスサバイビン抗原構築物の免疫原性
ヒトサバイビン、合成コンセンサスサバイビン抗原１（ｐＧＸ１４２８）、および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（ｐＧＸ１４２９）を標的とするように設計したワクチン構築物の免疫原性をマウスで評価した。各構築物による抗原タンパク質の発現はまた、ウエスタンブロッティングによりインビトロで評価した。
【０２００】
材料および方法
プラスミド
合成コンセンサスサバイビン抗原１（ｐＧＸ１４２８）および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（ｐＧＸ１４２９）は、本書に記載されるように設計した。インビトロおよびインビボ研究では、プラスミド（１０ｍｇ）をｐＧＸ１４２８（ロット＃７８６１１４Ｓ−１／Ｇ５２２３８）およびｐＧＸ１４２９（ロット＃７８６１１４Ｓ−２／Ｇ５２２３９）の両方をＧｅｎＳｃｒｉｐｔから注文した。１０ｍｇプラスミドストックの抗原配列を、サンガーシーケンスによって確認した。
【０２０１】
インビトロ抗原発現
ｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９による抗原タンパク質の発現を、ウエスタンブロッティングにより確認した。図６に示すように、１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭ培地で維持されたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１３６）に、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎ  ８（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用してｐＧＸ１４２８、ｐＧＸ１４２９、またはｐＧＸ０００１（６μｇ／１０ｃｍ2ディッシュ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して溶解し、細胞溶解液を収集した。総タンパク質濃度を決定するためのＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に続いて、１５μｇの細胞溶解液を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で電気泳動した。検出をヒトサバイビン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、クローンＤ８、ｓｃ−１７７７９）のアミノ酸１〜１４２に対するモノクローナル抗体を用いて実施し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ｓｃ−２００５）で、ＥＣＬウエスタンブロット分析システム（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して視覚化した。負荷対照として、抗β−アクチンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、クローン、Ｃ４、ｓｃ−４７７７８  ＨＲＰ）を使用して、ブロットのアクチン発現を再プローブした。
【０２０２】
動物および免疫化
雌の８週齢のＣＢ６Ｆ１マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。すべての動物を、ＢＴＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の温度制御された光サイクル施設に収容した。動物の世話は、国立衛生研究所および動物の世話および使用の提案（ＡＣＵＰ）のガイドラインに従って実施した（ＢＴＳ  ＡＣＵＰ  ＃１５−０９１）。マウスを表４に示すように９つの群に分けた。    
【表４−２】
2021506265.tif 000007
【０２０３】
免疫した群のマウスを、ＳＯＰ  Ｒ２０−００３１４７ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３Ｐマウス治療に従って、ｐＧＸ０００１、ｐＧＸ１４２８、またはｐＧＸ１４２９の示された用量でワクチン接種した。簡単に言えば、プラスミドを注入用滅菌水（ＶｅｔＯｎｅ）で製剤化され、指示された用量が３０μＬの注入量で前脛骨筋に筋肉内注射により送達した。各筋肉内注入の直後に、３Ｐアレイを有するＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用するエレクトロポレーション（ＥＰ）が続いた。このデバイスは、５２ｍｓパルス幅の２つの０．１Ａｍｐパルスを、１秒の遅延で離して配信するように構成された。マウスは、３週間間隔で３回の免疫を受けた。最後の免疫から１週間後にマウスを犠牲にし、細胞性免疫読み取りのために脾臓を採取した。他の組織は収集しなかった。
【０２０４】
脾臓リンパ球単離
脾細胞を無菌的に単離し、５ｍＬのＲ１０培地（１０％ウシ胎児血清および１％抗生物質−抗真菌剤を添加したＲｏｓｅｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  １６４０）に入れた。脾臓細胞を、ストマッカーマシン（Ｓｅｗａｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用して脾臓を機械的に破壊することによって単離し、得られた生成物を、４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を使用して濾過した。得られた産物を遠心分離し、ＲＢＣの溶解のためにペレットをＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）で５分間処理した。次に、脾細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、Ｒ１０培地に再懸濁し、すぐにさらなる分析に使用した。
【０２０５】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ
マウスＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、抗原特異的細胞応答を評価するために、ＭａｂＴｅｃｈのキット（ＭａｂＴｅｃｈ、＃３３２１−４ＡＰＷ−１０）を使用しで実施した。簡潔に、抗マウスＩＦＮγ抗体（ｍＡｂ  ＡＮ１８）で予めコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳ中で洗浄し、完全培養培地培地（１０％のＦＢＳおよび抗生物質で補充されたＲＰＭＩ  １６４０）で、室温で２時間遮断した。脾臓リンパ球を、Ｒ１０培地に再懸濁した（その後、ウェルあたり２×１０５細胞の入力細胞数で、３連で追加した。ペプチドのセットが合成され（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、各々が合成コンセンサスサバイビン抗原１全体および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３タンパク質配列を表す１１個のアミノ酸が重複する１５個のアミノ酸残基を含む。ペプチドのこれらのセットをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、約２μｇ／ｍｌのペプチドの濃度で２つのペプチドプールにプールした。第１のペプチドプールは、合成コンセンサスサバイビン抗原１抗原タンパク質に対応するペプチドを含み、第２のペプチドプールは、合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３抗原タンパク質に対応するペプチドを含む。５μｇ／ｍｌのコンカバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用し、完全培養培地を陰性対照として使用した。プレートを、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベータ中で、３７℃で１８時間インキュベートした。次に、ビオチン化抗マウスＩＦＮγ検出抗体（ＭａｂＴｅｃｈ  ｍＡｂ  Ｒ４−６Ａ２）を加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＬＰ（ＭａｂＴｅｃｈ）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。スポットの検出は、キットの製造元の指示（ＭａｂＴｅｃｈ）に従って、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を使用して完了した。プレート上のスポットは、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してカウントした。スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均数は、データ表示用に１×１０6脾細胞に調整した。
【０２０６】
図７Ａ〜図７Ｈでは、ＩＦＮγエリスポットによる抗原特異的応答を、培地のみの対照におけるＳＦＵよりも大きい１×１０6脾細胞あたりのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数として報告した。
【０２０７】
フローサイトメトリー
合成コンセンサスサバイビン抗原１および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３により誘導された細胞性免疫応答は、フローサイトメトリーによりさらに特徴付けされた。簡単に言えば、ワクチン接種したおよび未処理マウスからの２×１０6脾細胞を、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、モネンシン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローン１Ｄ４Ｂ）の存在下で６時間、各群に応じて合成コンセンサスサバイビン抗原１およびサバイビン１Ｔ３ペプチドで単離した直後に刺激した。ペプチドで刺激した後、脾細胞を遠沈し、マウスＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液のウェルあたり２０μＬに再懸濁した。Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋを、ＰＢＳで１：４０の初期希釈で使用し、４℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、残りの細胞外抗体（ＰＢＳ中）を１ウェルあたり３０μＬ加え、４℃で３０分間インキュベートする。細胞外染色液を追加すると、各ウェルの最終容量は５０μＬになり、１：１００の最終希釈のＦｃ  Ｂｌｏｃｋと適切な使用希釈の細胞外抗体で構成される。次いで、細胞を、生存率染色（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ）（Ｖｉｖｉｄ  Ｖ４５０，Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）および以下の抗体：ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗マウスＣＤ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＲＭ４−５）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン６３−６．７）で染色した。細胞を固定し、４℃で２０分間透過処理した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５４７１４）。細胞内染色は、その後、以下の抗体：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗マウスＣＤ３ｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１４５−２Ｃ１１）、ＢＶ６０５抗マウスＩＦＮγ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＸＭＧ１．２）、ＡＰＣ−Ｒ７００抗マウスＩＬ−２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＪＥｓ６−５Ｈ４）、およびＰＥ抗マウスＴＮＦ−α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＭＰ６−ＸＴ２２）で完了した。１０色ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＩＣＳデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を完了した。フローサイトメトリーのゲーティング戦略を図８に示す。
【０２０８】
細胞がフローサイトメトリーによって抗原特異的と称されるためには、報告されたパラメータの頻度は、培地のみの対照の頻度を超える必要がある。細胞が抗原特異的ＣＤ１０７ａを産生すると同定されるためには、ブールゲーティングによって同定されるＩＦＮγおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦαの抗原特異的産生が陽性であると同定されなければならない。
【０２０９】
統計分析
統計分析を、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２２（ＩＢＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して完了した。群間の分析を、ＡＮＯＶＡと事後のテューキーの検定（ＨＳＤ）を使用して実行し、複数の比較を調整した。分散の均一性を、多重比較の前にＦ統計を使用して確認した。すべての統計分析について、０．０５０のｐ値を有意と見なした。
【０２１０】
結果
合成コンセンサスサバイビン抗原タンパク質の発現
ヒトサバイビン、合成コンセンサスサバイビン抗原１（ｐＧＸ１４２８）、および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（ｐＧＸ１４２９）を標的とするように２つの構築物を設計した。ｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９による合成コンセンサスサバイビン抗原１および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３抗原タンパク質の発現を、それぞれウエスタンブロッティングにより確認した。簡単に言えば、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞にｐＧＸ１４２８，ｐＧＸ１４２９、またはｐＧＸ０００１（空のベクター、陰性対照）プラスミドをトランスフェクトした。細胞溶解物を、合成コンセンサスサバイビン抗原タンパク質および抗ヒトサバイビン抗体（ＢＩＲＣ５）の発現についてプローブした。合成コンセンサスサバイビン抗原１（１７．５ｋＤ）および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（２５．３  ｋＤ）の予想分子量のタンパク質バンドを検出した（図６）。ＲＤ細胞株における低レベルの内因性サバイビンタンパク質発現が原因である可能性が最も高い陰性対照（ｐＧＸ０００１）で、かすかなバンドを検出した。抗β−アクチンのバンドを同様の強度で検出され、等量のタンパク質が各レーンに負荷されたことを示す。要約すると、ｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９は、それらのそれぞれの抗原タンパク質を発現することが分かった。
【０２１１】
合成コンセンサスサバイビン抗原ワクチン構築物の免疫原性
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ
２つの合成コンセンサスサバイビン抗原構築物の免疫原性を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔおよびフローサイトメトリー（ｎ＝８／群）によって４用量（１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、および５０μｇ）で評価した。陰性対照（ｎ＝４／群）として空ベクター骨格（ｐＧＸ０００１）を、マウスに免疫した。合成コンセンサスサバイビン抗原でのワクチン接種は、陰性対照ワクチン接種されたマウスと比較して有意なＩＦＮγ応答をもたらした。しかしながら、合成コンセンサスサバイビン抗原１（図１０Ａ）によって誘導されたＩＦＮγ産生において用量依存的な増加についての証拠は最小限であり、最大応答は、最低用量で達成されたことを示唆する。詳細には、合成コンセンサスサバイビン抗原１  ＩＦＮγ  ＳＦＵは、それぞれ１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、および５０μｇで、１，０８２±５７４、１，１８６±７４７、１，１３５±６４７、および８４８±３５０であった。合成コンセンサスサバイビン抗原１  ＩＦＮγ応答は、１０μｇ（ｐ＝０．０３１）、２０μｇ（ｐ＝０．０１５）、および３０μｇ（ｐ＝０．０２１）用量のｐＧＸ１４２８で、未処理（２±３）よりも有意に大きかったが、５０μｇ（ｐ＝０．１３４）用量ではそうではなかった。合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３によるワクチン接種は、有意なＩＦＮγ応答をもたらし、用量レベルの増加に伴う用量依存的な増加についてのいくつかの証拠有した（図１０Ｄ）。サバイビン１Ｔ３  ＩＦＮγ  ＳＦＵは、それぞれ１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、および５０μｇで、５１６±１５６、８１２±５３４、１，０１６±６５４、および８１８±３３９であった。合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３  ＩＦＮγ応答は、２０μｇ（ｐ＝０．０３９）、３０μｇ（ｐ＝０．００６）、および５０μｇ（ｐ＝０．０３７）用量のｐＧＸ１４２９で、未処理（５±６）よりも有意に大きかったが、１０μｇ（ｐ＝０．３３７）用量ではそうではなかった。ＩＦＮγ応答を表５に要約した。
【表５】
2021506265.tif 000008
【０２１２】
フローサイトメトリー
合成コンセンサスサバイビン抗原１および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３の両方は、ＣＤ８＋Ｔ細胞区画での応答と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞区画でより強力な応答を誘発した（図９）。合成コンセンサスサバイビン抗原１は、２０μｇ（１．０８％±０．６５％）（ｐ＝０．０２４）および５０μｇ（１．２１％±０．７３％）（ｐ＝０．００９）用量群において未処理（０．０３％±０．０５％）よりも有意に強固である抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の頻度を誘導したが、１０μｇ（０．８６％±０．３１％）（ｐ＝０．１０５）または３０μｇ（０．８２％±０．４６％）（ｐ＝０．１３４）用量群ではそうではなかった（図７Ｂ）。合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３は、２０μｇ  （１．０２％±０．５９％）（ｐ＝０．０１０）、３０μｇ（１．０８％±０．４７％）（ｐ＝０．００６）、および５０μｇ（１．１３％±０．４４％）（ｐ＝０．００４）用量群において未処理（０．０５％±０．０５％）よりも有意に強固である抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の頻度を誘導したが、１０μｇ（０．６２％±０．３５％）（ｐ＝０．２４８）用量群ではそうではなかった（図７Ｅ）。合成コンセンサスサバイビン抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、両方の構築物について、用量群全体で同様であり、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２  ＋ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋、またはＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−細胞で構成された（図７Ｇ、図７Ｈ）。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は、表６でさら詳細に記載した。
【表６】
2021506265.tif 000009
【０２１３】
合成コンセンサスサバイビン抗原１により誘導された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度に有意差はなかった（ｐ＝０．１１７）（図７Ｃ）。サバイビン１Ｔ３は、用量群の群間で抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意に高い頻度を誘導した（ｐ＝０．０４３）。１０μｇ（０．１５％±０．０９％）（ｐ＝０．９１９）、２０μｇ（０．２７％±０．２１％）（ｐ＝０．２７４）、または３０μｇ（０．２５％±０．１４％）（ｐ＝０．３７７）のｐＧＸ１４２９で免疫した群における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ応答の頻度は、未処理（０．０７％±０．０１％）と比較して統計的有意性に接近しなかった。サバイビン１Ｔ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、５０μｇのｐＧＸ１４２９で免疫した群において統計的有意性（０．３６％±０．２１％）（ｐ＝０．０５１）に接近した（図７Ｆ）。合成コンセンサスサバイビン抗原１および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３の両方は、大きさおよび表現型において同様のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋であった（図７Ｇ、図７Ｈ）。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、表７でさら詳細に記載した。
【表７】
2021506265.tif 000010
【０２１４】
合成コンセンサスサバイビン抗原１（図１０Ａ）および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（図１０Ｂ）により誘導されたおよそ２５％のサイトカイン陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ１０７ａについても陽性であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞を介した細胞溶解機能の可能性を示している。合成コンセンサスサバイビン抗原１のすべての用量は、未処理（０．０１％±０．０１％）よりも有意に高いＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度を誘導した。詳細には、抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．０１３）、２０μｇ（ｐ＜０．００１）、３０μｇ（ｐ＝０．０５０）、および５０  μｇ（ｐ＜０．００１）用量群のそれぞれにおいて、０．２５％±０．０８％、０．３６％±０．１１％、０．２１％±０．１５％、および０．３８％±０．１３％であった（図１０Ａ）。合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３は、１０μｇ用量群（０．１８％±．０．０９％）（ｐ＝０．１４７）を除くすべての群で、未処理（０．０１±０．０１）よりも有意に高いＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度を誘導した。抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、２０μｇ（ｐ＝０．０３０）、３０  μｇ（ｐ＝０．０１０）、および５０μｇ（ｐ＝０．００４）用量群のそれぞれにおいて、０．２４％±０．１２％、０．２７％±０．１２％、および０．２９％±０．１６％であった（図１０Ｂ）。細胞溶解能を有する抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度を、表８でさらに詳細に記載する。
【表８】
2021506265.tif 000011
【０２１５】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きさと同様に、合成コンセンサスサバイビン抗原１は、すべての群間でＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度に有意な変化を誘導しなかった（ｐ＝０．１０１）（図１０Ｃ）。合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３は、すべての用量群間でＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度に有意な変化を誘導した（ｐ＝０．０３４）（図１０Ｄ）。抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、５０μｇのｐＧＸ１４２９（０．２８％±０．２２％）で免疫した群で未処理（０．０３±０．０１）よりも有意に増加した（ｐ＝０．０２６）が、１０μｇ（０．１１％±０．０８％）（ｐ＝０．８１３）、２０μｇ（０．１６％±０．１１％）（ｐ＝０．４５０）、３０μｇ（０．１６％±０．０７％）（ｐ＝０．４２４）の合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３で免疫した群ではそうではなかった。合成コンセンサスサバイビン抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、用量群間にわたり、両方の構築物で類似しており、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−細胞で構成された（図１０Ｅ、図１０Ｆ）。細胞溶解能を有する抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度を、表９でさらに詳細に記載する。
【表９】
2021506265.tif 000012
合成コンセンサスサバイビン抗原構築物により誘導されるＩＦＮγ応答の幅
【０２１６】
ｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９により誘導されたサバイビンに対するＩＦＮγ応答の幅を、ペプチドマトリックスプールアプローチを使用したエピトープマッピングにより調査した（図１１Ａ〜１１Ｄ）。最高用量のｐＧＸ１４２８（ｎ＝８）（図１１Ａ）またはｐＧＸ１４２９（ｎ＝８）（図１１Ｂ）で免疫したマウスからプールした脾臓リンパ球を調査した。
【０２１７】
以下の合成コンセンサスサバイビン抗原１エピトープは、ｐＧＸ１４２８およびｐＧＸ１４２９の両方に存在した：
ＬＰＰＡＷＱＬＦＬＫＤＨＲＩＳＴＦＫＮ（配列番号５）（マトリックスプール１、２、３、４、および７）
ＬＫＬＤＲＥＲＡＫＮＫＩＡＫＥＴＮＮＫ（配列番号６）（マトリックスプール１、２、３、４、および１１）
ｐＧＸ１４２９に存在する合成コンセンサスサバイビン抗原Ｔ３エピトープ：
ＥＷＬＨＨＦＱＧＬＦＰ（配列番号７）（マトリックスプール３、４、および７）
【０２１８】
合成コンセンサスサバイビン抗原１および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３により誘導される細胞性免疫応答の合計の大きさは類似していたが、合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３の合成コンセンサスサバイビン抗原１（ｐＧＸ１４２８）領域に対する合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（ｐＧＸ１４２９）領域により誘発される応答は、合成コンセンサスサバイビン抗原１構築物（ｐＧＸ１４２８）により誘導される応答の約半分の大きさであった。マトリックスアプローチを使用したＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによるエピトープマッピングにより、両方の合成コンセンサスサバイビン抗原構築物が合成コンセンサスサバイビン抗原１抗原の同じエピトープに対する応答を生成することが明らかになったが、これらのエピトープに対する合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３により駆動される応答は、大きさが低くなった。合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３抗原のＴ３領域に固有のエピトープが存在することも確認した。
【０２１９】
合成コンセンサスサバイビン抗原１（ｐＧＸ１４２８）および合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（ｐＧＸ１４２９）により誘導される細胞性免疫応答の合計の大きさは類似していたが、合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３抗原の合成コンセンサスサバイビン抗原１領域に対する合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（ｐＧＸ１４２９）領域により誘発される応答は、合成コンセンサスサバイビン抗原１構築物（ｐＧＸ１４２８）により誘導される応答の約半分の大きさであった。マトリックスアプローチを使用したＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによるエピトープマッピングにより、両方の合成コンセンサスサバイビン抗原構築物が合成コンセンサスサバイビン抗原１抗原と同じエピトープに対する応答を生成することが明らかになったが、これらのエピトープに対する合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３により駆動される応答は、大きさが低くなった。このアプローチを使用して、合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３抗原のＴ３領域に固有のエピトープが存在することも確認した。合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３はまた、未処理と比較して、抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度を有意に増加させた一方、合成コンセンサスサバイビン抗原１は、マウスの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を有意に増加しなかった。合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（ｐＧＸ１４２９）を、マウスのｐＧＸ１４２８と比較したサバイビンに対する細胞性免疫応答の幅をさらに拡大するその可能性に基づいて、一価の非ヒト霊長類研究に移行するために選択した。
【０２２０】
実施例５−合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３（ｐＧＸ１４２９）を使用した非ヒト霊長類研究
合成コンセンサスサバイビン１Ｔ３の可能性を、単独、ならびに低用量および高用量のＩＬ−１２と組み合わせて調査するために、１８匹の成体のアカゲザルを、各固有のＮＨＰ  ＩＤ番号により識別し、６匹の３つの群に分けて、以下のようにｐＧＸ１４２９で免疫した。６匹の動物を３．０ｍｇのｐＧＸ１４２９で、６匹を３．０ｍｇのｐＧＸ１４２９に加えてアジュバントとして０．０４ｍｇのｐＧＸ６００６（ｏｐｔ  ｒｈ  ＩＬ−１２）で、６匹を３．０ｍｇのｐＧＸ１４２９に加えてアジュバントとして０．２０ｍｇのｐＧＸ６００６（ｏｐｔ  ｒｈ  ＩＬ−１２）で免疫し、ＳＳＣにおいて１．０ｍＬの注入量で製剤化した。免疫化注入は、第０、４、８、および１２週目に施した。すべての免疫化を、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００  ５Ｐ−ＩＭ  ＥＰデバイスを用いて、滅菌ＷＦＩにおいて製剤化された１ｍｌの注入量で、反対側の四肢に交互に筋肉内に実施した。ＥＰ条件は以下のとおりである：ＯｐＢｌｏｃｋ  ００７０−ＩＭ、０．５Ａｍｐ、３パルス、５２ミリ秒、パルス間０．２秒。サバイビン免疫原性を、第２、６、１０、および１４週目に評価した。サバイビン特異的ＩＦＮ−ガンマ応答を図１２および１３に示す。天然アカゲザルサバイビンおよびｐＧＸ１４２９の間の相同性を表１０に示す。図１３および１４に示すように、合成コンセンサスサバイビン抗原１Ｔ３に加えてアジュバントとして０．２０ｍｇのＩＬ−１２を免疫した動物では、サバイビン特異的応答の増加を観察した。
【０２２１】
ＰＢＭＣ単離
非ヒト霊長類全血を、抗凝固剤およびゲルバリアを含むクエン酸ナトリウム細胞調製チューブ（ＣＰＴ  ＣＰＴのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に収集した。一晩輸送する前に、ＰＭＢＣを分離および濃縮するために、採取後すぐ（２時間以内）に全血を遠心分離する。赤血球および好中球をチューブの底に沈殿し、ゲルバリアにより所定の位置に保持した。血漿およびリンパ球は、ゲルバリアの上に残存する。各ＣＰＴは、約８ｍＬの血液を保持でき、室温で輸送される。回転したＣＰＴチューブをＰＢＭＣ単離用に処理した。塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）緩衝液で赤血球を溶解した後、生細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｏｕｎｔｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントし、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびβメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁した。本明細書に記載されるアッセイが完了したら、残りのＰＢＭＣをクライオバイアル内の凍結培地（Ｓｅｒａｄｉｇｍからの９０％ＦＢＳ中のＳｉｇｍａからの１０％ＤＭＳＯ）で凍結させ、液体窒素中で長期間保存した。
【０２２２】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ
ワクチンにより誘導される抗原特異的細胞応答を評価するために、キット（ＭａｂＴｅｃｈ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔＰｒｏ、＃３４２１Ｍ−２ＡＰＷ−１０）を使用して、サルＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、各時点で単離したＰＭＢＣで実施した。簡単に言えば、抗サルＩＦＮγ抗体（ｍＡｂ  ＭＴ１２６Ｌ）で予めコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄し、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびβメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ  １６４０）で、室温で２時間遮断した。ＮＨＰ  ＰＢＭＣを、Ｒ１０培地に再懸濁した（その後、ウェルあたり２×１０5細胞の入力細胞数で、３連で追加した）。ペプチドのセットが合成され（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、各々が合成コンセンサスタンパク質配列全体を表す１１個のアミノ酸が重複する１５のアミノ酸残基を含む。これらのペプチドのセットをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、約２μｇ／ｍＬの各それぞれのペプチドの濃度でプールにプールした。すべての抗原特異的なプールしたペプチドを、１：１００希釈で使用し、ＰＢＭＣと組み合わせると、各ウェルで最終希釈が１：２００となる。各抗原タンパク質のサイズの変動により、サバイビンの２つのペプチドプールが得られた。
【０２２３】
抗ＣＤ３（ｍＡｂ  ＣＤ−２  Ｍａｂｔｅｃｈ）および／またはＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）とイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）とを陽性対照として使用した。完全なＲ１０培養培地を陰性対照として使用した。プレートを、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベータ中で、３７℃で約１８時間インキュベートした。細胞を除去し、ＡＬＰ複合抗サルＩＦＮγ検出抗体（ＭａｂＴｅｃｈ  Ａｂ  ７−Ｂ６−１−ＡＬＰ）を追加した後、プレートを室温で２時間インキュベートした。次に、キットの製造元の指示（ＭａｂＴｅｃｈ）に従って、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液を使用してサンドイッチ免疫酵素アッセイを展開した。青黒色の沈殿物がスポットとして形成され、個々のＩＦＮγ産生細胞が明らかになる。次に、スポットを、ＣＴＬＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）分析機器およびソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりスキャンおよびカウントして、訓練されたオペレータにより品質管理される。ＩＦＮγ応答を、培地のみの対照におけるＳＦＵよりも大きい１ｘ１０6  ＰＢＭＣに対するスポット形成単位（ＳＦＵ）として報告した。
【表１０】
2021506265.tif 000013
【表１１】
2021506265.tif 000014
【０２２４】
群１、２、および３は、以下を受けた：
・群１−３．０ｍｇのｐＧＸ１４２９（合成コンセンサスサバイビン１Ｔ３）。ＳＳＣにおいて１．０ｍＬの注入量、ＩＭで製剤化した。
・群２−３．０ｍｇのｐＧＸ１４２９（合成コンセンサスサバイビン１Ｔ３）＋０．０４  ｐＧＸ６００６（ｏｐｔ．ｒＩＬ−１２）。ＳＳＣにおいて１．０ｍＬの注入量、ＩＭで製剤化した。
・群３−３．０ｍｇのｐＧＸ１４２９（合成コンセンサスサバイビン１Ｔ３）＋０．２０  ｐＧＸ６００６（ｏｐｔ．ｒＩＬ−１２）。ＳＳＣにおいて１．０ｍＬの注入量、ＩＭで製剤化した。
【０２２５】
すべての群は、以下のスケジュールに従って免疫した：
・免疫化１（第０週目）
・免疫化２（第４週目）
・免疫化３（第８週目）
・免疫化４（第１２週目）
・免疫化５（任意）
【０２２６】
結果
サバイビン特異的ＩＦＮγ応答を、群１〜３のそれぞれについて図１２〜１４に示した。結果は、用量後２週間の各時点での応答を示す。全体として、すべての群および個々の動物は、予め採血されたベースラインと比較して、用量４の２週間後の試験終了までに応答の増加を有した。より高用量のＩＬ−１２（０．２ｍｇ）を追加すると、サバイビン単独またはサバイビン＋０．０４ｍｇのＩＬ−１２と比較して、各時点でより一貫した応答が得られた。ＰＤ２初期のより高い応答は、サバイビン＋０．２ｍｇのＩＬ−１２でも認められた。
【０２２７】
表１２〜１４に示すように、免疫化により測定された生理学的パラメータのいずれにも差異は存在しなかった。ＲＢＣ、ＨＣＴ、好中球、リンパ球、単球、好酸球で有意差は認められなかった（結果は示されていない）。これらの値は、この種、性、および同様の実験手順を受けている年齢の動物について予想された範囲内であった。記載された正常範囲からのいかなる変動も散発的な性質のものであり、一方の性のみに存在し、用量レベルまたはタイミングとは関係しない。
【表１２】
2021506265.tif 000015
【表１３】
2021506265.tif 000016
【表１４】
2021506265.tif 000017
【０２２８】
すべての群について、研究の過程にわたり体重に著しい変化はなかった（データは示していない）。
【０２２９】
全体的な結果は、単独で投与した合成コンセンサスサバイビンが、ＮＨＰの１００％において免疫応答を誘導できることを示す。ＩＬ−１２アジュバントの追加により、合成コンセンサスサバイビンで認められた応答が向上し、より早く、より大きな応答ＰＤ２が得られたが、より高い用量のＩＬ−１２を用いた場合のみであった。
【０２３０】
前述の詳細な説明および付随する実施例は一例にすぎず、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されないことが理解される。
【０２３１】
本開示の実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者には明らかであろう。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含む、本開示の実施形態に対するそのような変更および修正は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
2021506265.tif 000018
【図２】
2021506265.tif 000019
【図３】
2021506265.tif 000020
【図４】
2021506265.tif 000021
【図５】
2021506265.tif 000022
【図６】
2021506265.tif 000023
【図７Ａ−Ｃ】
2021506265.tif 000024
【図７Ｄ−Ｆ】
2021506265.tif 000025
【図７Ｇ】
2021506265.tif 000026
【図７Ｈ】
2021506265.tif 000027
【図８】
2021506265.tif 000028
【図９】
2021506265.tif 000029
【図１０Ａ】
2021506265.tif 000030
【図１０Ｂ】
2021506265.tif 000031
【図１０Ｃ】
2021506265.tif 000032
【図１０Ｄ】
2021506265.tif 000033
【図１０Ｅ】
2021506265.tif 000034
【図１０Ｆ】
2021506265.tif 000035
【図１１Ａ】
2021506265.tif 000036
【図１１Ｂ】
2021506265.tif 000037
【図１１Ｃ】
2021506265.tif 000038
【図１１Ｄ】
2021506265.tif 000039
【図１２】
2021506265.tif 000040
【図１３】
2021506265.tif 000041
【図１４】
2021506265.tif 000042
【図１５Ａ】
2021506265.tif 000043
【図１５Ｂ】
2021506265.tif 000044
【図１５Ｃ】
2021506265.tif 000045
【配列表】
2021506265000001.app
【国際調査報告】
2021506265.tif 000046
2021506265.tif 000047
2021506265.tif 000048