(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸分子である。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含むベクター、組成物、およびワクチンが開示される。ＢＯＲＩＳを発現する腫瘍を有する対象を治療する方法、およびＢＯＲＩＳを発現する腫瘍を予防する方法が開示される。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原が、開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０をコードする核酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜２０４０、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５〜２０４０の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５〜２０４０と少なくとも９５％同一である断片、および
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５〜２０４０と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号２の全長をコードする核酸配列、
（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および
（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項４】
（ａ）配列番号１、
（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、および
（ｄ）配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項５】
配列番号１に示される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項６】
薬剤として使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、核酸分子。
【請求項７】
がんの治療における薬剤として使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、核酸分子。
【請求項８】
薬剤の調製において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、核酸分子。
【請求項９】
がんの治療のための薬剤の前記調製において使用するための、請求項１〜５および８のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１１】
プラスミドまたはウイルスベクターを含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸分子を含む、組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１０または１１に記載の１つ以上のベクターを含む、組成物。
【請求項１５】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１６】
（ａ）配列番号２、
（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、
（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および
（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ワクチン。
【請求項１９】
請求項１０または１１に記載のベクターを含む、ワクチン。
【請求項２０】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１８または１９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２１】
アジュバントをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記アジュバントが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳである、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
ＢＯＲＩＳを発現するがん性細胞を有する対象を治療する方法であって、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のワクチンの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
投与が、エレクトロポレーションステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
投与が、前記対象の１つ以上の部位で行われる、請求項２６または２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＢＯＲＩＳを発現するがん性細胞に対して対象にワクチン接種する方法であって、体液性または細胞性免疫応答を誘導するのに有効な量の、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５９８，２７４号の優先権および利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列一覧
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列一覧を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１２月１１日に作成され、１０４４０９＿０００４４７＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、９，１７９バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、ＢＯＲＩＳ抗原およびそれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、かかるＢＯＲＩＳ抗原および／または核酸分子を含むワクチンに関する。本発明はさらに、免疫応答を誘導し、ＢＯＲＩＳを発現するがん細胞および／または腫瘍を有する対象を予防および／または治療するためにワクチンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんは、世界中で主要な死因の１つである。米国では、がんは、２番目に多い死因であり、４人に１人近くの死を占める。がんは、正常な細胞からがん性の細胞に形質転換した単一の細胞から発生する。かかる形質転換は、前がん性病変から悪性腫瘍へと進行する多段階のプロセスである場合が多い。老化、遺伝的寄与、ならびに物理的発がん物質（例えば、紫外線および電離放射線）、化学的発がん物質（例えば、アスベスト、タバコの煙の成分）、および生物学的発がん物質（例えば、特定のウイルス、細菌、寄生虫）などの外部物質への曝露を含む、複数の要因がこの進行に寄与する。
【０００５】
がんの予防、診断、および治療には、多くの異なる形態をとり得る。予防には、病因（例えば、特定の遺伝的バリアント）のスクリーニング、挙動の改変（例えば、喫煙、食事、および身体活動の量）、およびウイルスに対するワクチン接種（例えば、ヒト乳頭腫ウイルスＢ型肝炎ウイルスなど）が含まれる。治療には、化学療法、放射線療法、および腫瘍またはがん性組織の外科的切除を含み得る。多数の予防および治療法が利用可能であるにもかかわらず、かかる方法は、がんを効果的に予防および／または治療する上で限られた成功しか収めないことが多い。
【０００６】
ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）は、遺伝子制御に関与する１１個のジンクフィンガー因子である。ＣＴＣＦの１１個のジンクフィンガーは、様々なＤＮＡ標的部位と結合し、転写性リプレッサーとして機能する。インプリント部位（「ＢＯＲＩＳ」）またはＣＴＣＦ様（「ＣＴＣＦＬ」）の調節因子の同類は、ＣＴＣＦパラログであり、転写調節因子でもある。（Ｌｏｕｋｉｎｏｖ，Ｄ．Ｉ  ｅｔ  ａｌ．ＢＯＲＩＳ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｌｅ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ，ｓｈａｒｅｓ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  １１−ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈ  ＣＴＣＦ，ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｍａｒｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｏｍａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９，６８０６−６８１１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９２１２３６９９  （２００２））。ＣＴＣＦおよびＢＯＲＩＳは、正常な組織では相互に排他的な発現パターンを有するが、がん組織では共発現する。ＢＯＲＩＳ  ｍＲＮＡ発現は、非常に低いか、または正常な卵巣組織では検出不可能であるが、多くの上皮性卵巣がん（「ＥＯＣ」）細胞では高発現である。ＢＯＲＩＳの異常発現が、ＥＯＣ原発腫瘍の６７％で検出された。（Ｌｉｎｋ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＢＯＲＩＳ／ＣＴＣＦＬ  ｍＲＮＡ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３，６（２０１３））。
【０００７】
選択的スプライシングから生成される２３の異なるＢＯＲＩＳ  ｍＲＮＡアイソフォームがあり、各々が標準的なエクソン−イントロン接合部およびポリＡシグナルを有し、その特徴は、霊長類で保存されている。６つの異なるＢＯＲＩＳアイソフォームファミリー（ｓｆ１〜ｓｆ６）は、１７の異なるＢＯＲＩＳタンパク質をコードする。ＢＯＲＩＳのジンクフィンガードメインは、ＣＴＣＦのそれらと相同性を示し、しかしながら、２つのタンパク質間の異なる隣接領域は、ＤＮＡ結合の異なる機能的意義を示す。（Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ，Ｒ．＆  Ｌｏｂａｎｅｎｋｏｖ，Ｖ．ＣＴＣＦ  ｉｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ  １７，５２０−５２７（２００１）を参照されたい）。ＢＯＲＩＳアイソフォームｓｆ１は、正常な卵巣およびＥＯＣがん組織試料の間で最も異なって発現される。
【０００８】
がん、特にＥＯＣの治療および予防のためのワクチンは、興味深いものである。しかしながら、腫瘍細胞抗原を標的とする既存のワクチンは、インビボでの不十分な抗原発現により制限されている。したがって、当該技術分野では、がんを予防および／または治療し、がんに罹患している対象の死亡率を低減するための安全かつ効果的なワクチンおよびそれらの使用方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子が本明細書で提供される。
【００１０】
核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜２０４０、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５〜２０４０の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５〜２０４０と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５〜２０４０と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。
【００１１】
核酸分子は、（ａ）配列番号２の全長をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。
【００１２】
核酸分子は、（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。
【００１３】
核酸分子は、配列番号１に示される核酸配列を含む。
【００１４】
本明細書に記載される核酸分子は、薬剤として使用する。
【００１５】
本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療における薬剤として使用する。
【００１６】
本明細書に記載される核酸分子は、薬剤の調製において使用する。
【００１７】
本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療のための薬剤の調製において使用する。
【００１８】
ベクターは、本明細書に記載される核酸分子を含み、そのベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【００１９】
組成物は、本明細書に記載される１つ以上の核酸分子を含む。
【００２０】
本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体を含み、その組成物は、本明細書に記載される１つ以上のベクターを含み得る。
【００２１】
タンパク質は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
タンパク質は、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
ワクチンは、本明細書に記載される核酸分子を含む。
【００２５】
ワクチンは、本明細書に記載されるベクターを含む。
【００２６】
本明細書に記載されるワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み、このワクチンは、アジュバントをさらに含むことができ、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳであり得る。
【００２７】
ＢＯＲＩＳを発現するがん性細胞を有する対象を治療する方法は、本明細書に記載されるワクチンの治療有効量を投与することを含み、投与は、エレクトロポレーションステップを含むことができ、投与は、対象の１つ以上の部位で行われ得る。
【００２８】
ＢＯＲＩＳを発現するがん性細胞に対して対象にワクチン接種する方法は、体液性または細胞性免疫応答を誘導するのに有効な量の、本明細書に記載されるワクチンを投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
概要および以下の詳細な記載は、添付の図面と併せて読むとさらに理解される。本発明を例示する目的で、本発明の例示的な実施形態が図面に示されており、しかしながら、本発明は、開示される特定の方法、組成物、およびデバイスに限定されない。図面：
【図１】合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原アミノ酸配列の模式図を示す。アスタリスクは、１１個のジンクフィンガードメインおよび核局在化シグナルへの変異を示す。
【図２】ＢＯＲＩＳタンパク質の全体構造を示す。球は、天然のＢＯＲＩＳに対する変化を示す。
【図３】天然のジンクフィンガーおよび合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ジンクフィンガー構造の比較を示す。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ジンクフィンガーの構造は、ＤＮＡ結合を破壊する。
【図４】合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列挿入物を含むｐＧＸ１４４０の構築を示す。
【図５】フローサイトメトリーのゲーティング戦略を示す。
【図６】抗ヒトＢＯＲＩＳ抗体を用いる免疫ブロットで測定した、ｐＧＸ１４４０をトランスフェクトしたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞における合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原のインビトロ発現を示す。
【図７Ａ】合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の免疫原性を示す。雌のＣＢ６Ｆ１マウスは、指示された用量の合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原（ｐＧＸ１４４０、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空ベクター、ｎ＝４）で、３週間間隔で３回免疫された。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＩＦＮγ応答は、指定された用量のｐＧＸ１４４０でＥＬＩＳｐｏｔにより評価された。図７Ａは、個々の動物の応答を示し、図７Ｂは、群の応答を示す。ロ発現を示す。
【図７Ｂ】合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の免疫原性を示す。雌のＣＢ６Ｆ１マウスは、指示された用量の合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原（ｐＧＸ１４４０、ｎ＝８／群）、またはｐＧＸ０００１（空ベクター、ｎ＝４）で、３週間間隔で３回免疫された。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＩＦＮγ応答は、指定された用量のｐＧＸ１４４０でＥＬＩＳｐｏｔにより評価された。図７Ａは、個々の動物の応答を示し、図７Ｂは、群の応答を示す。
【図８Ａ】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度を示す。ｐＧＸ１４４０により誘導される細胞性免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞区画にあった。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、すべての用量群において未処理より有意に強い抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答の頻度を誘導した（図８Ａ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原により誘導された抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群において対照よりも有意に増加した（図８Ｂ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図８Ｃ）に、およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを（図８Ｄ）に示す。
【図８Ｂ】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度を示す。ｐＧＸ１４４０により誘導される細胞性免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞区画にあった。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、すべての用量群において未処理より有意に強い抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答の頻度を誘導した（図８Ａ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原により誘導された抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群において対照よりも有意に増加した（図８Ｂ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図８Ｃ）に、およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを（図８Ｄ）に示す。
【図８Ｃ】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度を示す。ｐＧＸ１４４０により誘導される細胞性免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞区画にあった。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、すべての用量群において未処理より有意に強い抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答の頻度を誘導した（図８Ａ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原により誘導された抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群において対照よりも有意に増加した（図８Ｂ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図８Ｃ）に、およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを（図８Ｄ）に示す。
【図８Ｄ】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度を示す。ｐＧＸ１４４０により誘導される細胞性免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞区画にあった。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、すべての用量群において未処理より有意に強い抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答の頻度を誘導した（図８Ａ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原により誘導された抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群において対照よりも有意に増加した（図８Ｂ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図８Ｃ）に、およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答のサイトカインプロファイルを（図８Ｄ）に示す。
【図９Ａ】合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的Ｔ細胞の細胞溶解能を示す。ｐＧＸ１４４０により誘導される細胞溶解性免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞区画にあった。抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群で増加した（図９Ａ）。同様に、抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群で増加した（図９Ｂ）。ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図９Ｃ）に、およびＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図９Ｄ）に示す。
【図９Ｂ】合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的Ｔ細胞の細胞溶解能を示す。ｐＧＸ１４４０により誘導される細胞溶解性免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞区画にあった。抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群で増加した（図９Ａ）。同様に、抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群で増加した（図９Ｂ）。ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図９Ｃ）に、およびＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図９Ｄ）に示す。
【図９Ｃ】合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的Ｔ細胞の細胞溶解能を示す。ｐＧＸ１４４０により誘導される細胞溶解性免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞区画にあった。抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群で増加した（図９Ａ）。同様に、抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群で増加した（図９Ｂ）。ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図９Ｃ）に、およびＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図９Ｄ）に示す。
【図９Ｄ】合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的Ｔ細胞の細胞溶解能を示す。ｐＧＸ１４４０により誘導される細胞溶解性免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞区画と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞区画にあった。抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群で増加した（図９Ａ）。同様に、抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群で増加した（図９Ｂ）。ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図９Ｃ）に、およびＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを（図９Ｄ）に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原を含むワクチンに関する。ＢＯＲＩＳは、多くの腫瘍で発現される。したがって、ワクチンは、ＢＯＲＩＳを発現する、がんまたはがんに基づく腫瘍の治療を提供する。
【００３１】
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、異なる種または種内の異なるアイソフォームからのＢＯＲＩＳの配列に由来するコンセンサスＢＯＲＩＳ抗原であり得、したがって、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は非天然である。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、１つ以上の変異をコンセンサス配列に導入して、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列を生成することにより、さらに改変することができる。変異は、天然ＢＯＲＩＳ配列の特定の機能ドメインを遮断または改変し、それにより機能ドメインの構造または機能を破壊または強化することができる。一実施形態において、変異は、コンセンサスＢＯＲＩＳ配列に導入されて、天然ＢＯＲＩＳのジンクフィンガードメインの各々を破壊する。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列の他の実施形態において、変異は、天然ＢＯＲＩＳの核局在化シグナル配列に導入される。他の実施形態において、変異は、コンセンサスＢＯＲＩＳ配列に導入され、各ジンクフィンガードメインおよび核局在化配列を破壊する。
【００３２】
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価の抗体応答を誘導し得、それにより、抗原を発現するがんまたは腫瘍に対して直接的もしくは反応性である免疫応答を誘導または誘発する。いくつかの実施形態において、誘導または誘発された免疫応答は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性免疫応答の両方であり得る。いくつかの実施形態において、誘導または誘発された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および／またはインターロイキン２（ＩＬ−２）の誘導または分泌を含むことができる。他の実施形態において、誘導または誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方調節する因子、抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生される可溶性因子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ−１、および免疫チェックポイント分子を上方調節する因子を低減または阻害することができる。
【００３３】
本発明のワクチンは、治療を必要とする対象のがんの特定の予防または治療のための特定のがん抗原の任意の組み合わせを提供することができる。
【００３４】
組換えがん抗原の核酸およびそのコードされるアミノ酸配列を設計するための１つの様式は、天然がん抗原の全体的なアミノ酸配列において特定のアミノ酸を変化させる変異を導入することによるものである。変異の導入は、がん抗原をあまり改変しないため、哺乳動物対象、好ましくはヒトまたはイヌ対象にわたり普遍的に適用することはできないが、結果として生じるアミノ酸配列は、免疫応答を生成するために、耐性を破壊するか、または外来抗原と見なされるように十分に変化する。別の様式は、それに対応する天然がん抗原と比較して、少なくとも８５％〜最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％〜最大９８％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９３％〜最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは、少なくとも９５％〜最大９８％の配列同一性を有するコンセンサス組換えがん抗原を作製することであり得る。いくつかの事例において、組換えがん抗原は、それに対応する天然がん抗原と比較して、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。天然がん抗原は、特定のがんまたはがん腫瘍に通常関連する抗原である。がん抗原に応じて、がん抗原のコンセンサス配列は、哺乳動物種全体、または種のサブタイプ内、またはウイルス株全体、または血清型にわたることができる。いくつかのがん抗原は、がん抗原の野生型アミノ酸配列と大きく異ならない。いくつかのがん抗原は、種にわたり多岐の核酸／アミノ酸配列を有し、コンセンサス配列を生成することができない。これらの事例において、組換えがん抗原は、耐性を破壊して生成し、それに対応する天然がん抗原と比較して、少なくとも８５％〜最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％〜最大９８％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９３％〜最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは、少なくとも９５％〜最大９８％の配列同一性を有する免疫応答が生成される。いくつかの事例において、組換えがん抗原は、それに対応する天然がん抗原と比較して、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。前述のアプローチを組み合わせて、最終的な組換えがん抗原が、上で考察された天然がん抗原アミノ酸配列との類似性パーセントを有するようにすることができる。
【００３５】
ワクチンは、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わせて、細胞性および体液性免疫応答の両方の刺激を増強することができる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１抗体を使用すると、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを防止する。全体として、免疫系により認識されるようにがん抗原を設計することは、腫瘍細胞による他の形態の免疫抑制を克服するのに役立ち、これらのワクチンは、抑制または阻害療法（抗ＰＤ−１および抗ＰＤＬ−１抗体療法など）と組み合わせて使用して、Ｔ細胞および／またはＢ細胞応答をさらに増強することができる。
【００３６】
ワクチンは、腫瘍フリー生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、および４５％で増加することができる。ワクチンは、免疫化後に、腫瘍質量を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％で低減することができる。このワクチンは、骨髄由来サプレッサー細胞から分泌されるサイトカインである単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の増加を防止および遮断することができる。ワクチンは、腫瘍生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％で増強することができる。
【００３７】
ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫応答を約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍で増強することができる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫応答を約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍で増強することができる。
【００３８】
ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象におけるＩＦＮ−γレベルと比較して、ワクチンを投与された対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベルを約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍で増強することができる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、ワクチンを投与されていない対象におけるＩＦＮ−γレベルと比較して、ワクチンを投与された対象におけるＩＦＮ−γレベルを約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍で増強することができる。
【００３９】
以下により詳細に記載されるように、ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下でより詳細に記載する。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／もしくは分化、Ｂ細胞提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達など、免疫系の任意の成分の抑制を防止する任意の核酸またはタンパク質である。以下でさらに詳細に記載するように、ワクチンは、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わせて、細胞性および体液性免疫応答の両方の刺激を増強することができる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１抗体を使用すると、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを防止する。
【００４０】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先される。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及したすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。
【００４１】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびそれらの変形の用語は、追加の行為または構造の可能性を排除しない、制限のない過渡的な句、用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」には、文脈から明確に指示されない限り、複数の参照が含まれる。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、「からなる」および「本質的にからなる」他の実施形態も企図する。
【００４２】
本明細書の数値範囲の列挙については、列挙された範囲の最小値および最大値と同じ程度の精度を有する各々の介在する値が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて７および８の数値が企図され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数値が、明示的に企図される。
【００４３】
本明細書で使用される「アジュバント」は、抗原の免疫原性を増強するために本明細書に記載されるワクチンに追加される任意の分子を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、および一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、およびそれらの誘導体を含む。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製された抗体、またはその任意の混合物であり得、それに由来する所望されるエピトープまたは配列に対して十分な結合特異性を示す。
【００４５】
「抗原」とは、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含む断片を含む、ＢＯＲＩＳ抗原アミノ酸配列を有するタンパク質、ならびに（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む、ＢＯＲＩＳ抗原アミノ酸配列を有するタンパク質、ならびに配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、ＢＯＲＩＳ抗原を指す。抗原は、他のタンパク質からのものなどのシグナルペプチドを任意で含み得る。
【００４６】
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される対象または哺乳動物の細胞における発現を指示することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節要素に作動可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。
【００４７】
核酸に関して本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、ワトソンクリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）または核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のフーグスティーン塩基対を意味することができる。
【００４８】
本明細書で使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」または「ＢＯＲＩＳコンセンサス配列」は、異なる生物または生物内の異なるアイソフォームからの同じ遺伝子に対する複数の配列のアラインメントの分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。
【００４９】
本明細書で使用される「定電流」は、同じ組織に送達される電気パルスの持続時間にわたって、組織または該組織を規定する細胞によって受け取られるまたは経験される電流を表す。電気パルスは、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスから送達される。本明細書で提供されるエレクトロポレーションデバイスは、好ましくは瞬間的なフィードバックを有するフィードバック要素を有するので、この電流は、電気パルスの寿命にわたって該組織内で一定のアンペア数のままである。フィードバック要素は、パルスの持続時間全体で組織（または細胞）の抵抗を測定し、エレクトロポレーションデバイスにその電気エネルギー出力を変化（例えば、電圧を増加）させることができるため、同じ組織の電流は電気パルス全体で（マイクロ秒のオーダーで）、またパルス間で一定のままである。いくつかの実施形態において、フィードバック要素は、コントローラを含む。
【００５０】
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」は、互換的に使用され得、かつ提供されたエレクトロポレーションデバイスの能動的応答を意味し得、これは、電極間の組織の電流を測定し、それに応じて電流を一定レベルに維持するために、ＥＰデバイスによって供給されるエネルギー出力を変更することを含む。この一定レベルは、パルス配列または電気治療の開始前にユーザによって事前設定される。フィードバックは、電気回路が、電極間の組織の電流を継続的にモニタリングし、そのモニタリングされた電流（または組織内の電流）を事前設定された電流と比較し、エネルギー出力調整を継続的に行って、モニタリングされた電流を事前設定レベルに維持するため、エレクトロポレーションデバイスのエレクトロポレーション構成要素、例えば、コントローラによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、瞬間的であり得る。
【００５１】
本明細書で使用される「分散電流」は、本明細書で記載されるエレクトロポレーションデバイスの様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、ここで、パターンは、エレクトロポレーションされている組織の任意の領域におけるエレクトロポレーション関連熱ストレスの発生を最小化、または好ましくは排除する。
【００５２】
本明細書で互換的に使用される「エレクトロポレーション」、「電気透過性」、または「動電学的増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微視的経路（細孔）を誘導する膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在により、プラスミドおよびベクター、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、水などの生体分子が細胞膜の一方の側からもう一方の側へと通過することができる。
【００５３】
核酸配列に関して本明細書で使用される「断片」は、本明細書で開示される抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することが可能なポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部分を意味する。断片は、以下に示すタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。断片は、追加された異種シグナルペプチドを除いて、以下に示される１つ以上の核酸配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。断片は、以下に示される１つ以上の核酸配列の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得、さらに任意で、異種シグナルペプチドをコードする配列を含み、同一性パーセントを計算する際に含める必要はない。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、断片は、以下に示される少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも２０ヌクレオチド以上、少なくとも３０ヌクレオチド以上、少なくとも４０ヌクレオチド以上、少なくとも５０ヌクレオチド以上、少なくとも６０ヌクレオチド以上、少なくとも７０ヌクレオチド以上、少なくとも８０ヌクレオチド以上、少なくとも９０ヌクレオチド以上、少なくとも１００ヌクレオチド以上、少なくとも１５０ヌクレオチド以上、少なくとも２００ヌクレオチド以上、少なくとも２５０ヌクレオチド以上、少なくとも３００ヌクレオチド以上、少なくとも３５０ヌクレオチド以上、少なくとも４００ヌクレオチド以上、少なくとも４５０ヌクレオチド以上、少なくとも５００ヌクレオチド以上、少なくとも５５０ヌクレオチド以上、少なくとも６００ヌクレオチド以上、少なくとも６５０ヌクレオチド以上、少なくとも７００ヌクレオチド以上、少なくとも７５０ヌクレオチド以上、少なくとも８００ヌクレオチド以上、少なくとも８５０ヌクレオチド以上、少なくとも９００ヌクレオチド以上、少なくとも９５０ヌクレオチド以上、少なくとも１０００ヌクレオチド以上、少なくとも１１００ヌクレオチド以上、少なくとも１２００ヌクレオチド以上、少なくとも１３００ヌクレオチド以上、少なくとも１４００ヌクレオチド以上、少なくとも１５００ヌクレオチド以上、少なくとも１６００ヌクレオチド以上、少なくとも１７００ヌクレオチド以上、少なくとも１８００ヌクレオチド以上、少なくとも１９００ヌクレオチド以上、または少なくとも２０００ヌクレオチド以上を含むことができる。
【００５５】
ポリペプチド配列に関する「断片」または「免疫原性断片」は、本明細書に開示される抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。断片は、以下の様々なアミノ酸配列の少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。コンセンサスタンパク質の断片は、追加された異種シグナルペプチドを除いて、コンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。断片は、以下に示される１つ以上のアミノ配列の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得、さらに任意で、異種シグナルペプチドを含み、同一性パーセントを計算する際に含める必要はない。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、コンセンサスタンパク質の断片は、本明細書に開示されるタンパク質配列の少なくとも２０アミノ酸以上、少なくとも３０アミノ酸以上、少なくとも４０アミノ酸以上、少なくとも５０アミノ酸以上、少なくとも６０アミノ酸以上、少なくとも７０アミノ酸以上、少なくとも８０アミノ酸以上、少なくとも９０アミノ酸以上、少なくとも１００アミノ酸以上、少なくとも１１０アミノ酸以上、少なくとも１２０アミノ酸以上、少なくとも１３０アミノ酸以上、少なくとも１４０アミノ酸以上、少なくとも１５０アミノ酸以上、少なくとも１６０アミノ酸以上、少なくとも１７０アミノ酸以上、少なくとも１８０アミノ酸以上、少なくとも２００アミノ酸以上、少なくとも２２０アミノ酸以上、少なくとも２４０アミノ酸以上、少なくとも２６０アミノ酸以上、少なくとも２８０アミノ酸以上、少なくとも３００アミノ酸以上、少なくとも３２０アミノ酸以上、少なくとも３６０アミノ酸以上、少なくとも３８０アミノ酸以上、少なくとも４００アミノ酸以上、少なくとも４２０アミノ酸以上、少なくとも４４０アミノ酸以上、少なくとも４６０アミノ酸以上、少なくとも４８０アミノ酸以上、少なくとも５００アミノ酸以上、少なくとも５２０アミノ酸以上、少なくとも５４０アミノ酸以上、少なくとも５６０アミノ酸以上、少なくとも５８０アミノ酸以上、少なくとも６００アミノ酸以上、少なくとも６２０アミノ酸以上、少なくとも６４０アミノ酸以上、または少なくとも６６０アミノ酸以上を含むことができる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される対象の細胞における発現を指示することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節要素に作動可能に連結された開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用する場合、「発現可能な形態」という用語は、対象の細胞に存在する場合に、コード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された必要な調節要素を含む遺伝子構築物を指す。
【００５８】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、ある程度の相補性を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）があり得る。完全に相補的な配列が、標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、機能的用語「実質的に相同な」を使用して言及される。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合に、本明細書で使用される「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズすることができるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合に、本明細書で使用される「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸鋳型配列にハイブリダイズすることができる（すなわち、その相補体である）プローブを指す。
【００５９】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で本明細書において使用される「同一の」または「同一性」は、配列が、特定の領域にわたって同じである特定の割合の残基を有することを意味する。割合は、２つの配列を最適に整列し、指定された領域にわたり２つの配列を比較し、一致した位置の数を得るために、両方の配列で同一の残基が発生する位置の数を決定し、一致した位置の数を指定された領域の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることで計算することができる。２つの配列の長さが異なる場合、またはアラインメントによって１つ以上の互い違いの末端が生成され、指定された比較領域に単一配列のみが含まれる場合、単一配列の残基は分母に含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等と見なすことができる。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用して実行することができる。
【００６０】
本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバック機構を考察するときに使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、事前設定された電流との比較が可能になる。
【００６１】
本明細書で使用される「免疫応答」は、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性、または体液性応答、またはその両方の形態であり得る。
【００６２】
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントは、所定の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。
【００６３】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであることができ、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、塩基の組み合わせは、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む。核酸は、化学合成法または組換え法によって得ることができる。
【００６４】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置することができる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターとプロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく対応することができる。
【００６５】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し得、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組み合わせであり得る。
【００６６】
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、細胞における核酸の発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写調節配列を含み得る。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対ほど離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的または差次的に遺伝子構成成分の発現を調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータ−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが含まれる。
【００６７】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書において互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端で連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を指向する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質が産生される細胞からその分泌を容易することが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、しばしば成熟タンパク質と称される、タンパク質の残りの部分から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端（すなわち、Ｎ末端）で連結される。
【００６８】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複雑な混合物などにおいて、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨで特異的配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）であり得る（標的配列は過剰で存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％は平衡で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブについては（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、そして長いプローブについては（例えば、約５０ヌクレオチド超）少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、正のシグナルは背景ハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳで洗浄。
【００６９】
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫化されることを望む、またはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットであり得る。
【００７０】
本明細書で使用される「実質的に相補的」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００７１】
本明細書で使用される「実質的に同一」は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または核酸に関して、第１の配列が第２の配列の補体と実質的に相補的であることを意味する。
【００７２】
本明細書で使用される「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、阻止する、または完全に排除することにより疾患から動物を保護することを意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の抑制は、疾患の誘導後であるが、その臨床的出現の前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の阻止は、疾患の臨床的出現後に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。
【００７３】
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその一部分の補体、（ｉｉｉ）参照核酸またはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味する。
【００７４】
ペプチドまたはポリペプチドに関して本明細書で使用される「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドを意味する。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似する特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、当該技術分野において典型的にわずかな変化を伴うと認識されている。これらのわずかな変化は、当該技術分野において理解されるように、一部、アミノ酸の疎水性親水性指数を考慮することによって同定され得る。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷を考慮することに基づく。類似する疎水性親水性指数のアミノ酸が置換され、尚もタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野において既知である。一態様では、±２の疎水性親水性指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈において、アミノ酸の親水性を考慮することにより、抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な手段である、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能となる。米国特許第４，５５４，１０１号、参照により本明細書に完全に組み込まれる。類似する親水性値を有するアミノ酸を置換することにより、当該技術分野において理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性親水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性により明らかにされるように、アミノ酸の相対類似性および特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【００７５】
バリアントは、完全な遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
【００７６】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種核酸配列を含有するか、それを含み得る。
【００７７】
ワクチン
本明細書で開示される合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードする核酸分子、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の断片をコードする核酸分子、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原のバリアントをコードする核酸分子、またはその組み合わせを含むワクチンが本明細書で提供される。ワクチンは、抗原に対する免疫応答を対象において生じさせることが可能であり得る。免疫応答は、治療的または予防的免疫応答であり得る。ワクチンは、以下により詳細に記載されるように、１つのベクターまたは複数のベクターを含み得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードする。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、または配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１、配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号１と少なくとも９５％同一である断片、または配列番号１と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原を含み、抗原は、配列番号２、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
【００７９】
ワクチンは、がん、例えば、ＢＯＲＩＳを発現するがんまたは腫瘍から保護するために使用することができる。ワクチンは、ＢＯＲＩＳを発現する腫瘍を予防および／または治療するために、それを必要とする対象において使用することができる。ワクチンは、ＢＯＲＩＳおよびＢＯＲＩＳを発現する腫瘍に対する細胞性および／または抗体応答を誘導することができる。
【００８０】
一実施形態において、ワクチンは、ＢＯＲＩＳを発現する卵巣がん細胞、詳細には、ＢＯＲＩＳを発現する上皮性卵巣がん細胞、詳細には、ＢＯＲＩＳを発現する漿液性卵巣がん細胞に対する細胞性および／または抗体応答を防御、防止および／または治療するために、または誘導するために使用することができる。
【００８１】
本明細書に記載されるがんワクチンの開発は、免疫系によって認識されず、腫瘍関連（「がん／精巣」、「Ｃ／Ｔ」）抗原であるがん抗原、例えば、ＢＯＲＩＳを同定することを含む。同定されたがん抗原は、免疫系により認識されるために、自己抗原から外来抗原に変更される。組換えがん抗原の核酸およびアミノ酸配列を自己から外来抗原に再設計すると、免疫系による抗原の耐性が破壊される。耐性を破壊するために、以下に記載するように、いくつかの再設計手段をがん抗原に適用することができる。
【００８２】
ワクチンの組換えがん抗原は、自己として認識されないため、耐性が破壊される。耐性を破壊することは、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価の抗体応答を誘導し、それにより、抗原を発現するがんまたは腫瘍に対して直接的もしくは反応性である免疫応答を誘導または誘発する。いくつかの実施形態において、誘導または誘発された免疫応答は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性免疫応答の両方であり得る。いくつかの実施形態において、誘導または誘発された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および／またはインターロイキン２（ＩＬ−２）の誘導または分泌を含むことができる。他の実施形態において、誘導または誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方調節する因子、抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生される可溶性因子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ−１、および免疫チェックポイント分子を上方調節する因子を低減または阻害することができる。
【００８３】
特定の実施形態において、ワクチンは、（１）ＣＤ８+および／もしくはＣＤ１０７ａ+（ＣＴＬ）などの細胞傷害性Ｔリンパ球を増加して、腫瘍細胞を攻撃して殺傷する、（２）Ｔヘルパー細胞応答を増加する、ならびに／または（３）ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＦＮ−α、または好ましくは前述のすべてを介した炎症応答を増加することにより、クリアランスを媒介するか、または腫瘍細胞の増殖を防止することができる。
【００８４】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号に開示されており、参照により本明細書に完全に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、それが染色体に組み込まれるのを阻害する要素または試薬をさらに含むことができる。
【００８５】
ワクチンは、がん抗原をコードするＲＮＡを含み得る。ＲＮＡワクチンは、細胞に導入することができる。
【００８６】
ワクチンは、弱毒生ワクチン、組換えベクターを使用して抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンであり得、例えば、これらに限定されないが、ワクチンは、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３  ６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、および同第６，５８９，５２９号に記載され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、核酸ワクチンは、分子アジュバントのコード配列をさらに含み得、いくつかの事例において、分子アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳであり得。いくつかの事例において、分子アジュバントは、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、抗プログラム死受容体１（ＰＤ−１）、および抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）を含む、チェックポイント阻害剤である。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳについてのコード配列は、１つ以上の抗原についてのコード配列を含む１つ以上の核酸分子に含まれ得る。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳについてのコード配列は、別個のプラスミドまたはベクターなどの別個の核酸分子に含まれ得る。
【００８８】
本発明のワクチンは、ワクチンのそれ自体が疾患または死亡を引き起こさないように安全である、疾患から保護する、中和抗体の誘導する、保護Ｔ細胞応答を誘導する、投与の簡易性、少ない副反応、生物学的安定性、低い用量あたりのコストを提供するなどの有効なワクチンに要求される特徴を有することができる。ワクチンは、以下で考察されるように、がん抗原をコードする核酸分子（複数可）を含むことにより、これらの特徴のいくつかまたはすべてを達成することができる。
【００８９】
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたワクチン
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下でより詳細に記載する。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／もしくは分化、Ｂ細胞提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達など、免疫系の任意の成分の抑制を防止する任意の核酸またはタンパク質である。
【００９０】
かかる阻害剤は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸はまた、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。小分子は、低分子量、例えば、８００ダルトン未満の酵素基質、タンパク質もしくは核酸により結合されたリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの調節因子として機能する、有機または無機化合物であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列であり得る。他の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００９２】
免疫チェックポイント分子
免疫チェックポイント分子は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸はまた、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。小分子は、低分子量、例えば、８００ダルトン未満の酵素基質、タンパク質もしくは核酸により結合されたリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの調節因子として機能する、有機または無機化合物であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００９３】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１
免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ−１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされる細胞表面タンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞に発現しているため、これらの細胞の運命および／または分化に寄与する。特に、ＰＤ−１は、Ｔ細胞調節因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーの１型膜タンパク質であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルを負に制御し、それにより免疫応答を負に調節する。ＰＤ−１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を負に調節することができるため、ＣＤ８媒介細胞傷害性を阻害し、腫瘍の成長を促進する。
【００９４】
ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２という２つのリガンドを有し、それは、Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ−Ｌ１は、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦ処理に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）で、かつＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達時にＴ細胞およびＢ細胞で上方調節される。ＰＤ−Ｌ１は、骨髄腫、肥満細胞腫、および黒色腫を含む多くの腫瘍細胞株で発現する。
【００９５】
抗免疫チェックポイント分子抗体
上述されるように、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体であり得る。抗体は、抗原（すなわち、上述される免疫チェックポイント分子）と結合または反応することができる。したがって、抗体は、抗免疫チェックポイント分子抗体または免疫チェックポイント分子抗体と考慮され得る。抗体は、含まれる核酸配列によりコードすることができる。
【００９６】
抗体は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含み得る。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、および／またはヒンジ領域を含むことができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含むことができる。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。
【００９８】
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットには、ＶＨ領域のうちの３つの超可変領域を含むことができる。重鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と示される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与することができる。
【００９９】
軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットには、ＶＬ領域のうちの３つの超可変領域を含むことができる。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と示される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与することができる。
【０１００】
抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得、ＣＤＲに対して支持を提供し、ＣＤＲの空間的な関係を相互に定義する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間にそれぞれ挿入される。ＣＤＲセットは、重または軽鎖Ｖ領域のうちの３つの超可変領域を含み得る。重または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、「ＣＤＲ３」と示される。したがって、抗原結合部位は、重および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含み得る。
【０１０１】
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含むことができる。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含むことができる。
【０１０２】
追加的に、タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片を生成し、その２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々、無傷の抗原結合部位を含む共有ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、Ｆ（ａｂ’）2断片を含むいくつかの断片を提供することができ、両方の抗原結合部位を含む。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含むことができる。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含むことができる。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含むことができる。
【０１０３】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望される抗原と結合する非ヒト種からの抗体であり得る。
【０１０４】
ＰＤ−１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ−１抗体（本明細書では「ＰＤ−１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ−１抗体は、ニボルマブであり得る。抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
【０１０５】
ＰＤ−Ｌ１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（本明細書では「ＰＤ−Ｌ１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
【０１０６】
抗原
上述されるように、ワクチンは、抗原または抗原をコードする核酸を含むことができる。抗原は、ＢＯＲＩＳ、その断片、そのバリアント、または断片およびそのバリアントの組み合わせであり得る。
【０１０７】
したがって、ワクチンは、ＢＯＲＩＳを発現するがんまたは腫瘍に罹患する対象を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、がんは、卵巣がんである。いくつかの実施形態において、卵巣がんは、上皮性卵巣がんである。卵巣がんは、漿液性上皮性卵巣がんであり得る。ワクチンはまた、対象においてかかる腫瘍の発生を防止するために、ＢＯＲＩＳを発現するがんまたは腫瘍を有する対象を治療するために使用することもできる。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、天然ＢＯＲＩＳ遺伝子とは異なり得、したがってＢＯＲＩＳ抗原を発現する腫瘍に対する療法または予防法を提供する。したがって、天然ＢＯＲＩＳ遺伝子とは異なる合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列（すなわち、変異または合成ＢＯＲＩＳ遺伝子または配列）が本明細書で提供される。
【０１０８】
天然ＢＯＲＩＳ遺伝子の転写産物は、様々なｍＲＮＡにプロセシングされる。特定のＢＯＲＩＳ  ｍＲＮＡアイソフォームは、例えば、がん細胞におけるそれらの発現に基づいて選択することができる。特定の実施形態において、ＢＯＲＩＳアイソフォームは、卵巣がん細胞におけるその発現に基づいて選択される。本明細書に記載される合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列は、選択的プロセシングを回避し、１つの完全長転写産物を生成し、エフェクターＴおよびＢ細胞応答のより強い誘導をもたらす。
【０１０９】
上述される異種配列を含む単離された核酸分子が提供される。上述される異種配列からなる単離された核酸分子が提供される。上述される異種配列を含む単離された核酸分子は、プラスミド、ウイルスベクター、および以下に記載されるような他の形態の核酸分子などのベクターに組み込まれ得る。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードする核酸配列が本明細書で提供される。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードするコード配列は、上述されるような配列を有する。
【０１１０】
上述される異種合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原アミノ酸配列を含むタンパク質分子が提供される。上述される異種合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原アミノ酸配列からなるタンパク質分子が提供される。上述される合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列を有するタンパク質およびポリペプチドが本明細書で提供される。タンパク質およびポリペプチドは、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原およびＢＯＲＩＳ免疫原と称され得る。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、ＢＯＲＩＳを発現する腫瘍に対する免疫応答を誘発することが可能である。
【０１１１】
一態様において、転写を増加するための低ＧＣ含有リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性およびコドンの最適化、ならびに可能な限り、シス作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の排除の１つ以上を含む、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原が転写および翻訳の改善を提供することが望ましい。
【０１１２】
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、２つ以上の種に由来するコンセンサス抗原（または免疫原）配列であり得る。一実施形態において、コンセンサス配列は、異なる種のＢＯＲＩＳアイソフォームから生成される。コンセンサス配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の同様のＤＮＡもしくはタンパク質配列データベースから収集されたＢＯＲＩＳ配列に由来する。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、発現を改善するためのコンセンサス配列および／または改変を含むことができる。改変には、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増強するためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）の追加、および／または合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の免疫原性を増強するための免疫グロブリンリーダー配列の追加が含まれる。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＢＯＲＩＳコンセンサス抗原は、血球凝集素（ＨＡ）タグを含むことができる。ＢＯＲＩＳコンセンサス抗原は、対応するコドン最適化合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原よりも強力で幅広い細胞性および／または体液性免疫応答を誘発するように設計することができる。
【０１１３】
コンセンサスＢＯＲＩＳ配列を変異させて、天然ＢＯＲＩＳの特定の構造および／または機能を破壊および／または増強して、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列を生成することができる。一実施形態において、変異は、ジンクフィンガー構造および機能を破壊するために、１１個のジンクフィンガードメインの各々に導入される。１つ以上の変異は、１つ以上のジンクフィンガーにおける亜鉛イオンを調整するアミノ酸の１つ以上の置換であり得る。亜鉛イオンを調整する１つ以上のアミノ酸は、ＣＣＨＨモチーフであり得る。したがって、いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、１つ以上のＣＣＨＨモチーフのうちの１、２、３、または４つすべてのアミノ酸を置き換えることができる。好ましい実施形態において、ＢＯＲＩＳ中の１１個のジンクフィンガー中のシステインは、ジンクフィンガー構造および結合を破壊するためにグリシンに変異される。（Ｓｔｏｌｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ＤＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３７２，１２２７−１２４５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．０７．０１７（２００７）を参照されたい）。
【０１１４】
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、例えば、発現時に核移行を破壊する核局在化シグナルを含む、例えば、天然局在化シグナル配列を破壊するための変異または欠失を含むことができる。例えば、核局在を防止するために、ＲＲＲＫをＲＫＲＫに置換することができる。特定の実施形態において、１１個のジンクフィンガードメインの各々および核局在化シグナル配列が破壊される。本明細書に記載される変異の１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを有する組換え合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原が、本開示の目的のために非自己抗原としての機能も同様に有することは、当業者により容易に理解され、これらのバリアントの各々は、本開示により企図される。
【０１１５】
好ましい実施形態において、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列は、配列番号１と９５．０％の同一性を共有する。この実施形態において、配列番号１の核酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。他の実施形態において、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原配列は、配列番号１と９５．０％以上の同一性、９５．２％以上の同一性、９５．４％以上の同一性、９５．６％以上の同一性、９５．８％以上の同一性、９６．０％以上の同一性、９６．２％以上の同一性、９６．４％以上の同一性、９６．６％以上の同一性、９６．８％以上の同一性、９７．０％以上の同一性、９７．２％以上の同一性、９７．４％以上の同一性、９７．６％以上の同一性、９７．８％以上の同一性、９８．０％以上の同一性、９８．２％以上の同一性、９８．４％以上の同一性、または９８．６％以上の同一性、９８．８％以上の同一性、９９．０％以上の同一性、９９．２％以上の同一性、９９．４％以上の同一性、９９．６％以上の同一性、９９．８％以上の同一性、または１００％の同一性を共有する。
【０１１６】
ベクター
ワクチンは、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含むことができる。例えば、１つ以上のベクターは、配列番号２のアミノ酸配列の全長をコードする核酸配列、配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、または配列番号２と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含むことができる。１つ以上のベクターは、配列番号２のアミノ酸１９〜６８０をコードする核酸配列、配列番号２のアミノ酸１９〜６８０の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、または配列番号２のアミノ酸１９〜６８０と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含むことができる。１つ以上のベクターは、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含む核酸配列を有することができる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【０１１７】
１つ以上のベクターは、発現構築物であり得、これは、一般的に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体によって生成される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として機能し、発現ベクター上で運ばれる遺伝子の効率的な転写につながる調節配列を含むように多くの場合設計されている。本発明のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質を発現する。
【０１１８】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローニングされた遺伝子との間の距離の調整、ならびに転写終結配列およびＰＴＩＳ（携帯型翻訳開始配列）の挿入などの発現シグナルを有し得る。
【０１１９】
ベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸であり得る。環状プラスミドおよび直鎖状核酸は、適切な対象細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指示することが可能である。ベクターは、抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを有することができ、終結シグナルに作動可能に連結され得る。ベクターはまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列、ならびにベクターおよびその断片をクローニングおよびサブクローニングするための配列を含むことができる。目的のヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下であり得、宿主細胞が、一部の特定の外部刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織または器官または発生段階に特異的であり得る。好ましい実施形態において、プラスミドベクターは、本明細書に記載されるｐＧＸ１４４０であり、配列番号１の核酸配列をさらに含む。
【０１２０】
ベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、抗原をコードする核酸を用いて細胞をトランスフェクトするのに有用であり得る。形質転換された宿主細胞は、抗原の発現が起こる条件下で培養および維持され得る。
【０１２１】
プラスミドは、合成の抗原に対する免疫応答を誘発することができるコンセンサス抗原、かかるタンパク質の断片、かかるタンパク質のバリアント、バリアントまたは融合タンパク質の断片をコードするコード配列を含む、上記に開示された様々な抗原の１つ以上をコードする核酸配列を含み得、これらは、コンセンサスタンパク質および／またはコンセンサスタンパク質の断片および／またはコンセンサスタンパク質のバリアントおよび／またはコンセンサスタンパク質のバリアントの断片の組み合わせで構成される。
【０１２２】
単一のプラスミドは、単一の抗原のコード配列、２つの抗原のコード配列、３つの抗原のコード配列、または４つの抗原のコード配列を含有し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態おいて、プラスミドは、ＣＣＲ２０を単独で、またはこれらのプラスミドの一部としてコードするコード配列をさらに含み得る。同様に、プラスミドは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８のコード配列をさらに含み得る。
【０１２４】
プラスミドは、コード配列の上流であり得る開始コドン、およびコード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含み得る。開始および終止コドンは、コード配列を伴うインフレームであり得る。
【０１２５】
プラスミドは、コード配列に作動可能に連結されるプロモーターも含み得る。コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからのプロモーターであり得る。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターでもあり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターでもあり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１７５７２７号に記載されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
プラスミドは、コード配列の下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１２７】
プラスミドは、コード配列の上流のエンハンサーも含み得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶからのものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、各々の内容は参照により完全に組み込まれる。
【０１２８】
プラスミドは、プラスミドを染色体外で維持し、細胞においてプラスミドの複数コピーを産生するために、哺乳類の複製起点も含み得る。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４またはｐＲＥＰ４であり得、エプスタインバールウイルスの複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み、組み込みなしで高コピーのエピソーム複製を生成し得る。プラスミドの骨格は、ｐＡ  Ｖ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
【０１２９】
プラスミドは、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現によく好適である場合がある調節配列も含み得る。コード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。
【０１３０】
コード配列は、Ｉｇリーダー配列も含み得る。リーダー配列は、コード配列の５’’であり得る。この配列によってコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ末端Ｉｇリーダー、続いてコンセンサス抗原タンパク質を含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
【０１３１】
プラスミドはｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであってもよく、これは昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、これはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。
【０１３２】
ベクターは、細胞ゲノムに組み込むことによって標的細胞を形質転換するか、または染色体外で存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）であり得る。
【０１３３】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１３４】
エレクトロポレーションにより対象に効率的に送達され、１つ以上の所望の抗原を発現することができる直鎖状核酸ワクチンまたは直鎖状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、任意のリン酸骨格を欠く任意の直鎖状ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、１つ以上の抗原をコードし得る。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含有し得る。抗原の発現はプロモーターにより制御され得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現に無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
【０１３５】
ＬＥＣは、局在化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、抗原を発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１３６】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
【０１３７】
ベクターは、プロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離された核酸の発現を制御することが可能な任意のプロモーターであり得る。かかるプロモーターは、本明細書に記載される抗原配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用性配列要素である。異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、ベクター内の転写開始からほぼ同じ距離に配置し得、それは、その自然な設定での転写開始部位からである。しかしながら、この距離の差異は、プロモーターの機能を喪失することなく調整され得る。
【０１３８】
プロモーターは、転写物、リボソーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な抗原およびシグナルをコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。
【０１３９】
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞において発現に有効であると示される別のプロモーターであり得る。
【０１４０】
ベクターは、機能的なスプライスドナーおよびアクセプター部位を有するエンハンサーおよびイントロンを含み得る。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含有し得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得てもよい。
【０１４１】
ベクターを調整する方法
本明細書で考察されるＤＮＡワクチンを含むベクターを調製する方法が本明細書で提供される。ベクターは、最終的なサブクローニングステップの後、当該技術分野で既知の方法を使用して、大規模発酵タンク内の細胞培養に播種するために使用され得る。
【０１４２】
ベクターは、ＥＰデバイスを用いて使用し、以下でより詳細に記載するように、既知のデバイスおよび技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願された同時係属中の米国仮出願米国特許第６０／９３９，７９２号に記載される最適化された製造技術を使用して製造される（米国特許公開第２００９／０００４７１６号を参照されたい）。いくつかの例において、これらの研究で使用されるＤＮＡベクターは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術はまた、２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に既知である様々なデバイスおよびプロトコルを含む、または組み込む。上記で参照された出願および特許、米国特許第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
ワクチンの賦形剤および他の成分
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクワレンおよびスクワレンなどのベシクル、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含むことができる。
【０１４４】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであり、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在し得る。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞などの界面活性剤も含み得、遺伝子構築物とともに投与されるヒアルロン酸も使用され得る。ＤＮＡベクターワクチンはまた、脂質、リポソームなどのトランスフェクション促進剤を含み得、ＤＮＡ−リポソーム混合物として、レシチンリポソームもしくは当該技術分野で既知の他のリポソーム（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含む。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。ワクチンにおけるトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１４５】
薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、代替のプラスミドまたはベクターにおいて発現されるか、またはワクチンにおいて上記のプラスミドまたはベクターと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１〜、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ，ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、欠失したシグナル配列をコードするシグナル配列またはコード配列を有し、任意選択でＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチド、もしくはＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を含むＩＬ−１５、およびそれらの機能断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、アジュバントは、ＣＣＬ−２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、またはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上の核酸分子であり得る。ＩＬ−１２構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号および対応する米国出願第０８／９５６，８６５号、ならびに２０１１年１２月１２日に出願された米国仮出願第６１／５６９６００号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号および対応する米国出願第１０／５６０，６５０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号および対応する米国出願第１２／１６０，７６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳＩ０／０４８８２７号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ｉＬ−２８構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号および対応する米国出願第１２／９３６，１９２に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第および０９／６２２４５２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、およびＭＥＣ構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号および対応する米国出願第１１／７１９，６４６号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および免疫調節剤の例は米国出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節剤の例は、米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１，  Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、  ＩＬ−２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードするものを含む。
【０１４８】
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願された米国第０２１，５７９号（参照により完全に組み込まれる）に説明される遺伝子ワクチン促進剤をさらに含み得る。
【０１４９】
ワクチンは、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で抗原をコードするベクターを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、約５ナノグラム〜約１０００マクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約１０ナノグラム〜約８００マクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約０．１〜約５００マクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約１〜約３５０マクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約０．１マクログラム〜約１０ミリグラム、約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムの抗原またはそれをコードするプラスミドを含有し得る。
【０１５０】
ワクチンは、使用される投与モードにより製剤化され得る。注射可能なワクチン薬学的組成物は、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含であり得る。等張製剤または溶液を使用することができる。等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。ワクチンは、血管収縮剤を含み得る。等張溶液は、リン酸緩衝食塩水を含み得る。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む安定剤は、製剤を長期間室温または周囲温度で安定させることができる。
【０１５１】
ワクチンの薬学的組成物
ワクチンは、薬学的組成物の形態であり得る。薬学的組成物は、ワクチンを含むことができる。薬学的組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）〜約１０ミリグラム（ｍｇ）のワクチンの核酸分子（複数可）を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約２５ｎｇ〜約５ｍｇのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５０ｎｇ〜約１ｍｇのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０マイクログラム〜約８０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５マイクログラム〜約６０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０ｎｇ〜約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５ｎｇ〜約４５マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇのワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムのワクチンの核酸分子（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ以上のワクチンの核酸分子（複数可）を含み得る。
【０１５３】
他の実施形態において、薬学的組成物は、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇ（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラム（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、最大１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子（複数可）を含み得る。
【０１５４】
薬学的組成物は、使用される投与モードにより製剤目的のための他の薬剤をさらに含み得る。薬学的組成物が注射可能な薬組成物である場合、それらは、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含である。等張製剤を使用することが好ましい。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としてはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。
【０１５５】
薬学的組成物は、上記の段落２で提供されるような薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、段落２で提供されるように、機能性分子、ビヒクル、アジュバント、担体、希釈剤、またはトランスフェクション促進剤を含むことができる。
【０１５６】
適応症
本明細書で提供されるワクチンおよびワクチンを含む薬学的組成物は、ＢＯＲＩＳを発現するがん細胞およびがんに基づく腫瘍の治療または予防に使用することができる。特に、本明細書で提供されるワクチンおよびワクチンを含む薬学的組成物は、卵巣がん、より詳細には上皮性卵巣がん、最も詳細には漿液性卵巣がんの治療または予防に使用することができる。
【０１５７】
ワクチン接種の方法
上述の薬学的製剤を使用して、がんを治療および／または予防するための方法が本明細書に提供される。対象におけるがんの治療および／または予防に上述の薬学的製剤を使用する方法も本明細書に記載される。対象にワクチン接種する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の薬学的製剤を、それを必要する対象に投与する方法も本明細書に記載される。集合的に本明細書に記載の薬学的製剤を使用する治療方法と称される本明細書に記載の方法は、治療的および／または予防的免疫応答を誘導するために、本明細書に記載される１つ以上のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含み得る。ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強するために対象に投与され得る。ワクチンの投与は、細胞において発現され、細胞の表面に送達されると、免疫系が、細胞性、液性、または細胞性および液性応答を認識し誘導する核酸分子としての本明細書に開示されるがん抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの投与は、本明細書で考察されるワクチンを対象に投与することにより、対象において、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を誘導または誘発するために使用され得る。
【０１５８】
ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節するために対象に投与され、それにより免疫応答を増強させることができる。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。哺乳動物にワクチンを投与し、それによりベクターを哺乳動物の細胞に導入すると、トランスフェクトされた細胞が本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上を発現および分泌する。これらの分泌されたタンパク質または合成抗原は、１つ以上のがん抗原に対して作られた抗体、および１つ以上のがん抗原に特異的に対するＴ細胞応答を含み得る免疫応答を開始する免疫系により異物として認識される。いくつかの例では、本明細書で考察されるワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、抗原刺激を受けた免疫系を有し、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を接種された場合、抗原刺激を受けた免疫系は、液性、細胞性、または細胞性および液性両方の免疫応答によるものかにかかわらず、本明細書に開示される後のがん抗原を迅速に除去することができる。
【０１５９】
ＤＮＡのワクチンの投与方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、その両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
ワクチンを哺乳動物に投与して、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、好ましくはヒト、ウシ、またはブタであり得る。ワクチンは同様に、免疫応答を誘発するために、非ヒト対象、例えば、ニワトリに投与され得る。
【０１６１】
ワクチンの用量は、経時的にキログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム〜１０ｍｇ（構成成分／ｋｇ体重／回）の活性構成成分であり得、２０マイクログラム〜１０ｍｇ構成成分／ｋｇ体重／回であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
【０１６２】
ワクチンにより免疫応答を生成する方法
ワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、哺乳動物または非哺乳動物対象において免疫応答を生成することができる。免疫応答は、本明細書に開示されるような１つ以上のがん抗原に指向される抗体および／またはキラーＴ細胞を生成することができる。そのような抗体およびＴ細胞が単離され得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態は、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を生成する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態は、上述のがん抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に対して対象に予防的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、がん抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に罹患している対象に治療的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。ワクチンの投与前に本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を発現するがんまたは腫瘍の診断は、日常的に行うことができる。
【０１６４】
ワクチンによるがん治療の方法
ワクチンは、哺乳動物またはそれを必要とする対象におけるＢＯＲＩＳを発現する癌または腫瘍（例えば、卵巣がん）に対して反応性または指向性である哺乳動物において免疫応答を生成または誘発するために使用され得る。誘発された免疫応答は、がんまたは腫瘍の成長を防止することができる。
【０１６５】
誘発された免疫応答は、がん性または腫瘍細胞の転移を防止および／または低減することができる。したがって、ワクチンは、ワクチンを投与された哺乳動物または対象におけるがんまたは腫瘍を治療および／または予防する方法で使用することができる。
【０１６６】
投与経路
ワクチンまたは薬学的組成物は、経口、非経口、舌下、経皮的、直腸に、経粘膜的、局所的、吸入により、頬側投与により、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内  くも膜下腔内、および／もしくは関節内、またはそれらの組み合わせにより投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学診療に従って適切に許容される製剤として投与することができる。獣医は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎｓ）」、またはエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法により投与され得る。
【０１６７】
ワクチンのベクターは、インビボエレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、ナノ粒子促進トランスフェクション（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ならびに組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、および組換えワクシニアなどの組換えベクターを伴うまたは伴わないＤＮＡ注射（ＤＮＡ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含む、いくつかの周知の技術により哺乳動物に投与され得る。１つ以上のがん抗原のワクチンがインビボエレクトロポレーションとともにＤＮＡ注射により投与され得る。
【０１６８】
ワクチンまたはワクチンを含む薬学的組成物は、エレクトロポレーションにより投与され得る。エレクトロポレーションによるワクチンの投与は、可逆性細孔を細胞膜において形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得るエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザによって入力される事前設定された電流と同等の定電流である。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーション構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。エレクトロポレーション構成要素は、コントローラ、電流波形発生装置、インピーダンステスター、波形ロガー、入力素子、ステータス報告要素、通信ポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーションデバイスの様々な要素のうちの１つ以上を含み、それらを組み込むことができる。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボエレクトロポレーションデバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して達成され得る。
【０１６９】
本発明のＤＮＡワクチンの投与を容易にし得るエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの投与を容易にするために使用することができる他のエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション法には、２００７年１０月１７日に出願された同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号で提供されるものが含まれ、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号に対する利益を主張し、これらはすべて、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを容易にするためのモジュール電極システムおよびそれらの使用を説明している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクタ、および電源を備え得る。オペレータは、支持構造に載置される複数の針電極を把持し、それらを身体もしくは植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次に、生体分子を、皮下針により選択された組織内に投与する。プログラム可能な定電流パルスコントローラを作動させ、定電流電気パルスを複数の針電極に適用する。適用された定電流電気パルスは、生体分子を、複数の電極間の細胞に導入するのを容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを効果的に容易にするために使用することができるエレクトロポレーションデバイスを説明している。エレクトロポレーションデバイスは、操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を備える。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御に基づいた一列の電極とパルスパラメータの入力との間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを作り出し、電流波形データの保存および取得を可能にする。エレクトロポレーションデバイスは、一連の針電極を有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および着脱可能なガイドディスクも備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１７２】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に説明される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく他の組織または臓器にも深く浸透させるのに適し得る。電極アレイの構成により、注射針は標的臓器にも完全に挿入され、注射は電極によって予め描かれた領域の標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に説明される電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【０１７３】
加えて、エレクトロポレーションデバイスおよびその使用を組み込むいくつかの実施形態において企図される、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載されるもののエレクトロポレーションデバイスがある。さらに、様々なデバイスのいずれかを使用したＤＮＡの投与に関係する２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注射する方法が注目された２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号に提供される主題を網羅する特許が、本明細書で企図される。上記の特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０１７４】
ワクチンを調整する方法
本明細書で考察される合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原をコードする核酸分子（複数可）を含むベクターを調製する方法が本明細書で提供される。ＤＮＡベクターは、哺乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップの後、当該技術分野で既知の方法を使用して、大規模発酵タンク内の細胞培養に播種するために使用され得る。
【０１７５】
本発明のＥＰデバイスで使用するためのＤＮＡベクターは、既知のデバイスおよび技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００７年５月２３日に出願された米国公開出願第２００９／０００４７１６号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例において、これらの研究で使用されるＤＮＡベクターは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術はまた、２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に既知である様々なデバイスおよびプロトコルを含む、または組み込む。上記に参照される出願および特許である、米国第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれが、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって図示される多くの態様を有する。
【実施例】
【０１７７】
本発明は、以下の実施例においてさらに図示される。これらの実施形態は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に実例として示されることを理解するべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を様々な使用および条件に適応させることができる。したがって、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０１７８】
実施例１−合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の生成
ヒトコンセンサスＢＯＲＩＳを生成するために、７個のＢＯＲＩＳ配列をＧｅｎＢａｎｋから収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）。選択したＢＯＲＩＳサブファミリー１配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＮＰ＿５４２１８５．２、ＸＰ＿００９４３５７２７．１、ＸＰ＿００４０６２４６５．１、ＸＰ＿００２８３０５０５．１、ＸＰ＿００３８０６２１２．１、ＸＰ＿０１１８３３５５０．１、およびＸＰ＿００３２５３０２３．１である。
【０１７９】
ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（バージョン１３．０．０．３５７）を使用して、コンセンサス配列を生成した。上記に列挙した７つの配列を、ＭｅｇＡｌｉｇｎにインポートし、ＣｌｕｓｔａｌＷの複数配列アラインメントプログラムを使用して整列した。結果のＢＯＲＩＳコンセンサス配列は、ヒト天然ＢＯＲＩＳと９８．６％の同一性を共有する。
【０１８０】
コンセンサスＢＯＲＩＳ配列の潜在性生物学的機能を消失するために、２２変異（１１個のジンクフィンガーの各々に２つの変異）を導入して、ジンクフィンガー構造およびＤＮＡ結合潜在性を破壊した。さらに、ＢＯＲＩＳは転写因子であるため、核局在化を防止するために１変異を導入した。これらの変異の導入の根拠を以下に記載した。
【０１８１】
ジンクフィンガー変異
ＣＴＣＦおよびＣＴＣＦＬ（ＢＯＲＩＳ）は、１１個のジンクフィンガードメイン（および同じＤＮＡ結合潜在性）をコードする同じエクソンを有するパラロガスな遺伝子である。コンセンサスＢＯＲＩＳ中の１１個のジンクフィンガーのシステインを、ジンクフィンガー構造および結合を破壊するためにグリシンに変異した。
【０１８２】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）変異
ＢＯＲＩＳは転写因子であるため、予測される核局在化シグナルを、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＮｕｃＰｒｅｄプログラムを使用して特定した（ｗｗｗ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／〜ｍａｃｃａｌｌｒ／ｎｕｃｐｒｅｄ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｉｎｇｌｅ．ｃｇｉ）。ＢＯＲＩＳにおいて予測される核局在化シグナルは、４つの連続した塩基性アミノ酸を含むクラス１モノパータイトＮＬＳの種類である。核局在化を防止するために、核局在化シグナルを、ＲＫＲＫからＲＲＲＫに変異した。
【０１８３】
コンセンサスＢＯＲＩＳ配列の生成、それに続くジンクフィンガーおよびＮＬＳ  ＤＮＡ配列内の変異の後、結果として得られる合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原タンパク質配列は、ヒト天然ＢＯＲＩＳタンパク質アイソフォーム「ｓｆ１」（すなわち、ＮＰ＿５４２１８５．２）と９５．２％の同一性を共有する。
【０１８４】
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ＤＮＡ配列が得られたら、より高いレベルの発現を得るために、上流のコザック配列およびＩｇＥリーダー配列をＮ末端に追加した。さらに、この遺伝子のコドン使用法は、ホモサピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合した。（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐ１２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，１４９７−１５０３（１９９８）、Ｄｅｍｌ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５，１０９９１−１１００１，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．２２．１０９９１−１１００１．２００１（２００１））。加えて、ＧＣ含有量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域、ならびに内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ−部位、リボソームエントリー部位などのｃｉｓ−作動配列モチーフを避けた、ＲＮＡ最適化も行った。（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｅａｓｔ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｃｌａｄｅ−Ａ  ｇｐ１６０  ｐｌａｓｍｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｔｒｏｎｇ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１４，１３４−１４６（２００３）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍ．，Ｎａｓｉｏｕｌａｓ，Ｇ．，Ｆｅｌｂｅｒ，Ｂ．Ｋ．＆  Ｐａｖｌａｋｉｓ，Ｇ．Ｎ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｌｌｏｗｓ  Ｒｅｖ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｇ  ａｎｄ  Ｇａｇ／ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１，４８９２−４９０３（１９９７））。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、サイトメガロウイルス前初期プロモーターの転写制御下に置かれた発現カセットを備えた独自の発現ベクターｐＧＸ０００１にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧＸ１４４０と命名し、完全長配列決定を行い、次に分析し、正しいことを確認した。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ＤＮＡ構築物の略図を図１に示す。本発明の合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ＤＮＡおよびタンパク質配列の特徴を以下の表２に要約する。
【表１】
2021506269.tif 000003
【表２】
2021506269.tif 000004
【０１８５】
実施例２−ｐＧＸ１４４０  ＢＯＲＩＳ発現ベクターの構築
ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）の制御下にあるｐＧＸ０００１（改変ｐＶＡＸ１発現ベクター）を骨格ベクターとして使用した。元のｐＶＡＸ１は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。
【０１８６】
改変を、ｐＧＸ０００１を作製するためにｐＶＡＸ１に導入し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なｐＶＡＸ１の報告された配列に基づいて特定した。これらの改変は以下に列挙されており、プラスミド増幅、ならびに抗原の転写および翻訳に関して問題は検出されていない。これまでのところ、ｐＧＸ０００１を骨格として使用するプラットフォーム内のプラスミド生成物のいずれのデータにおいても、ｐＧＸ０００１の配列内に変更は観察されていない。
【表２−１】
2021506269.tif 000005
塩基対２、３、および４は、ＣＭＶプロモーターの上流の骨格においてＡＣＴからＣＴＧに変更される。
【０１８７】
ｐＧＸ１４４０は、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原タンパク質をコードするＤＮＡプラスミドである。関連するｍＲＮＡの生成は、ヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動し、ウシ成長ホルモンの３’末端ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ）によって終結する。ｐＧＸ０００１骨格には、生産目的のためのカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）が含まれる。これらの要素は、真核細胞では機能しない。ｐＧＸ１４４０は、図４に示すように、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位の合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ＤＮＡ配列をｐＧＸ０００１にクローニングすることによって作製した。
【０１８８】
実施例３−合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原構築物の免疫原性
ヒトＢＯＲＩＳ、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原（ｐＧＸ１４４０）を標的とするように設計したワクチン構築物の免疫原性をマウスで評価した。構築物による抗原タンパク質の発現はまた、ウエスタンブロッティングによりインビトロで評価した。
材料および方法
【０１８９】
プラスミド
インビトロおよびインビボ試験では、プラスミド（１０ｍｇ）をｐＧＸ１４４０のＧｅｎＳｃｒｉｐｔから注文した（ロット番号Ｕ０６３８ＢＣ０４０Ｓ−３／Ｇ６１４２５）。１０ｍｇプラスミドストックの抗原配列を、サンガーシーケンスによって確認し、正確性を確認した。
【０１９０】
インビトロ抗原発現
ｐＧＸ１４４０による抗原タンパク質の発現を、ウエスタンブロッティングにより確認した。１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭ培地で維持されたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１３６）に、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎ  ８（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用してｐＧＸ１４４０またはｐＧＸ０００１（６μｇ／１０ｃｍ2ディッシュ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して溶解し、細胞溶解液を収集した。総タンパク質濃度を決定するためのＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に続いて、１５μｇの細胞溶解物を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で電気泳動し、次に抗ＢＯＲＩＳ（ＣＴＣＦＬ）モノクローナル抗体（ＡｂＣａｍ、クローン１２６７７８）を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ｓｃ−２００５）で、ＥＣＬウエスタンブロット分析システム（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して視覚化した。負荷対照として、抗β−アクチンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、クローン、Ｃ４）を使用して、ブロットのアクチン発現を再プローブした。
【０１９１】
動物および免疫化
雌の８週齢のＣＢ６Ｆ１マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。すべての動物を、ＢＴＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の温度制御された光サイクル施設に収容した。動物の世話は、国立衛生研究所および動物の世話および使用の提案（ＡＣＵＰ）のガイドラインに従って実施した（ＢＴＳ  ＡＣＵＰ  ＃１５−０９１）。マウスを表３に示すように５つの群に分けた。
【表３】
2021506269.tif 000006
【０１９２】
免疫した群のマウスを、ｐＧＸ０００１またはｐＧＸ１４４０の示された用量でワクチン接種した。簡単に言えば、プラスミドを注入用滅菌水（ＶｅｔＯｎｅ）で製剤化され、指示された用量が３０μＬの注入量で前脛骨筋に筋肉内注射により送達した。各筋肉内注射の直後に、３Ｐアレイを備えたＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００適応型定電流エレクトロポレーションデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用したエレクトロポレーション（ＥＰ）を行った。このデバイスは、５２ｍｓパルス幅の２つの０．１Ａパルスを、１秒の遅延で離して配信するように構成された。マウスは、３週間間隔で３回の免疫を受けた。最後の免疫から１週間後にマウスを犠牲にし、細胞性免疫読み取りのために脾臓を採取した。他の組織は収集しなかった。
【０１９３】
脾臓リンパ球単離
脾細胞を無菌的に単離し、５ｍＬのＲ１０培地（１０％ウシ胎児血清および１％抗生物質−抗真菌剤を添加したＲｏｓｅｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  １６４０）に入れた。脾臓細胞を、ストマッカーマシン（Ｓｅｗａｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用して脾臓を機械的に破壊することによって単離し、得られた生成物を、４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を使用して濾過した。得られた生成物を遠心分離し、ペレットを赤血球の溶解のためにＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）で５分間処理した。次に、脾臓細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、Ｒ１０培地に再懸濁し、すぐにさらなる分析に使用した。
【０１９４】
ＩＦＮγエリスポット
マウスＩＦＮγエリスポットアッセイ（ＭａｂＴｅｃｈ）を実施して、抗原特異的な細胞応答を評価した。簡単に言えば、抗マウスＩＦＮγ抗体でプレコートされた９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄し、完全培地（１０％ＦＢＳおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩ  １６４０）で、室温で２時間ブロックした。脾臓リンパ球を、Ｒ１０培地に再懸濁した（その後、ウェルあたり２×１０5細胞の入力細胞数で、３連で追加した）。ペプチドのセットが合成され（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、各々が合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原タンパク質配列全体を表す１１個のアミノ酸が重複する１５のアミノ酸残基を含む。これらのペプチドのセットをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、約２μｇ／ｍｌのペプチドの濃度で３つのペプチドプール（図７ＢのＰ１、Ｐ２、およびＰ３）にプールした。ペプチドプールは、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原に対応するペプチドを含んだ。５μｇ／ｍｌのコンカバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用し、完全培養培地を陰性対照として使用した。プレートを５％ＣＯ2大気のインキュベータ内で、３７℃で１８時間インキュベートした。次に、ビオチン化抗マウスＩＦＮγ検出抗体（ＭａｂＴｅｃｈ）を加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＬＰ抗体（ＭａｂＴｅｃｈ）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。スポット検出は、キットの製造元の指示（ＭａｂＴｅｃｈ）に従って完了した。プレート上のスポットは、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してカウントした。スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均数は、データ表示用に１×１０6脾臓細胞に調整した。
【０１９５】
ＩＦＮγエリスポットによる抗原特異的応答を、培地のみの対照におけるＳＦＵよりも大きい１×１０6脾臓細胞あたりのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数として報告した。
【０１９６】
フローサイトメトリー
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原によって誘導される細胞性免疫応答を、フローサイトメトリーによってさらに特徴付けした。簡単に言えば、ワクチン接種したおよび未処理マウスからの２×１０6脾臓細胞を、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、モネンシン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で６時間、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ペプチドで単離した直後に刺激した。ペプチドで刺激した後、脾臓細胞を遠沈し、マウスＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液のウェルあたり２０μＬに再懸濁した。Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋを、ＰＢＳで１：４０の初期希釈で使用し、４℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、残りの細胞外抗体（ＰＢＳ中）を１ウェルあたり３０μＬ加え、４℃で３０分間インキュベートする。細胞外染色液を追加すると、各ウェルの最終容量は５０μＬになり、１：１００の最終希釈のＦｃ  Ｂｌｏｃｋと適切な使用希釈の細胞外抗体で構成される。その後、細胞を生存能色素（Ｖｉｖｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、ならびにＡＰＣ−Ｃｙ７抗マウスＣＤ３ｅ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗マウスＣＤ４、およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の細胞外抗体で染色した。その後、細胞内サイトカインをＢＶ６０５抗マウスＩＦＮγ、ＡＰＣ−Ｒ７００抗マウスＩＬ−２、およびＰＥ抗マウスＴＮＦ−α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗体で染色した。ＩＣＳデータを、１０色ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析を完了した。フローサイトメトリーのゲーティング戦略を図５に示す。
【０１９７】
細胞がフローサイトメトリーによって抗原特異的と称されるためには、報告されたパラメーターの頻度は、培地のみの対照の頻度を超える必要がある。細胞が抗原特異的ＣＤ１０７ａを産生すると同定されるためには、ブールゲーティングによって同定されるＩＦＮγおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦαの抗原特異的産生が陽性であると同定されなければならない。
【０１９８】
統計分析
統計分析を、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２２（ＩＢＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して完了した。群間の分析を、ＡＮＯＶＡと事後のテューキーの検定（ＨＳＤ）を使用して実行し、複数の比較を調整した。分散の均一性を、多重比較の前にＦ統計を使用して確認した。すべての統計分析について、０．０５０のｐ値を有意と見なした。
【０１９９】
結果
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の発現
ｐＧＸ１４４０による合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の発現を、ウエスタンブロッティングにより確認した。簡単に言えば、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞にｐＧＸ１４４０またはｐＧＸ０００１（空のベクター、陰性対照）プラスミドをトランスフェクトした。細胞溶解物を、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の発現について抗ヒトＢＯＲＩＳ抗体（ＣＴＣＦＬ）でプローブした。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原の予想分子量（７６．７５ｋＤ）のタンパク質バンドを検出した（図６）。ＲＤ細胞株における低レベルの内因性ＢＯＲＩＳタンパク質発現が原因である可能性が最も高い陰性対照（ｐＧＸ０００１）で、かすかなバンドを検出した。抗β−アクチンのバンドを同様の強度で検出され、等量のタンパク質が各レーンに負荷されたことを示す。要約すると、ｐＧＸ１４４０がそれぞれの抗原タンパク質を発現することを見出した。
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ワクチン構築物の免疫原性
【０２００】
ＩＦＮγエリスポット
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原構築物の免疫原性を、ＩＦＮγエリスポットおよびフローサイトメトリー（ｎ＝８／群）によって４用量（１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、および５０μｇ）で評価した。陰性対照（ｎ＝４／群）として空のプラスミド骨格（ｐＧＸ０００１）を、マウスに免疫した。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原（ｐＧＸ１４４０）によるワクチン接種は、陰性対照のワクチン接種されたマウスと比較して、非常に強力な細胞性免疫応答を誘発した。エリスポットによって決定した合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＩＦＮγ産生の大きさは、用量非依存性であり（図７Ａおよび図７Ｂ）、２０および５０μｇ用量で同様の最大応答を達成した。詳細には、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＩＦＮγ  ＳＦＵは、それぞれ１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、５０μｇであり、１０，３１５±４，０９３、１３，７２５±６，１５１、８，６４５±２，３０４、および１３，６００±９，８９４であった。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４４０の１０μｇ（ｐ＝０．０２６）、２０μｇ（ｐ＝０．００２）、および５０μｇ（ｐ＝０．００３）用量では、未処理よりも有意に高かったが、３０μｇ用量（ｐ＝０．０７１）ではそうではなかった。ＩＦＮγ応答を表４に要約した。
【表４】
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【０２０１】
フローサイトメトリー
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、ＣＤ４+Ｔ細胞区画での応答と比較して、ＣＤ８+Ｔ細胞区画でより強力な応答を誘発した（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、１０μｇ（１．４１％±０．４４％）（ｐ＜０．００１）、２０μｇ（１．３６％±０．４２％）（ｐ＜０．００１）、３０μｇ（１．５０％±０．２２％）（ｐ＜０．００１）および５０μｇ（１．６２％±０．６６％）（ｐ＜０．００１）用量群で未処理（０．１１％±０．０６％）よりもはるかに強力な抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答の頻度を誘導した（図８Ａ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答も用量に依存せず、主にＩＦＮγ+ＩＬ−２+ＴＮＦα+、ＩＦＮγ+ＩＬ−２-ＴＮＦα+、またはＩＦＮγ+ＩＬ−２-ＴＮＦα-産生ＣＤ４+Ｔ細胞で構成された（図８Ｃ）。抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度は、表５でさら詳細に記載した。
【表５】
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【０２０２】
合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原により誘導された抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群において対照よりも有意に増加した（図８Ｂ）。詳細には、１０μｇ（１２．４５％±３．８６％）（ｐ＝０．００２）、２０μｇ（１５．６４％±５．６３％）（ｐ＜０．００１）、３０μｇ（１４．４９％±３．５８％）（ｐ＜０．００１）、および５０μｇ（１７．３４％±８．１７％）のｐＧＸ１４４０で免疫した群における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ応答の頻度は、未処理（０．１０％±０．０５％）と比較して有意により強固であった。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答も用量に依存せず、主にＩＦＮγ+ＩＬ−２-ＴＮＦα-およびＩＦＮγ+ＩＬ−２-ＴＮＦα+産生ＣＤ８+Ｔ細胞から構成された（図８Ｄ）。抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、表６でさら詳細に記載した。
【表６】
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【０２０３】
すべての用量の合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、未処理（０．０８％±０．０７％）よりも高い頻度でＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞を誘導したが、３０μｇおよび５０μｇのより高い用量のみが有意に強固であった。詳細には、抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．０９７）、２０μｇ（ｐ＝０．２５６）、３０μｇ（ｐ＝０．０１２）、および５０μｇ（ｐ＝０．０１０）のそれぞれの用量群において０．３７％±０．２３％、０．３０％±０．１５％、０．４９％±０．２０％、および０．５０％±０．３０％であった（図９Ａ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、用量群間にわたり類似しており、主にＩＦＮγ+ＩＬ−２+ＴＮＦα+、ＩＦＮγ+ＩＬ−２-ＴＮＦα+、ＩＦＮγ+ＩＬ−２-ＴＮＦα-細胞で構成された（図９Ｃ）。細胞溶解能を有する抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度を、表７でさらに詳細に記載する。
【表７】
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【０２０４】
抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の大きさと同様に、合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、未処理（０．０２％±０．０１％）と比較して、すべての群間でＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度に有意な変化を誘導した（図９Ｃ）。詳細には、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．００２）、２０μｇ（ｐ＜０．００１）、３０μｇ（ｐ＜０．００１）、および５０μｇ（ｐ＜０．００１）のそれぞれの用量群において１１．５２％±３．５０％、１４．４９％±５．２２％、１３．５７％±３．４５％、および１６．２４％±７．７４％であった（図９Ｂ）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、用量群にわたりで類似しており、主にＩＦＮγ+ＩＬ−２-ＴＮＦα-で構成され、いくつかのＩＦＮγ+ＩＬ−２-ＴＮＦα+細胞を有した（図９Ｄ）。細胞溶解能を有する抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度を、表８でさらに詳細に記載する。
【表８】
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【０２０５】
全体として、報告したデータのいずれも、免疫群間の応答に有意差はなかった（すなわち、１０μｇは５０μｇよりも有意に低くなかったなど）。合成コンセンサスＢＯＲＩＳ抗原は、未処理と比較して、抗原特異的ＣＤ４＋、ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋、およびＣＤ８＋、ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度を有意に増加させたが、応答の大きさは、ＣＤ８＋Ｔ細胞区画ではるかに強固であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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