(57)【要約】  本発明は、哺乳動物におけるライノウイルス感染の治療または予防における使用のためのヒドロキシ安息香酸のエステル誘導体を提供し、Ｒは、Ｃ１−１０アルキル基を表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は独立して、−Ｈまたは−ＯＨを表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、−ＯＨである。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるライノウイルス感染の治療または予防における使用のための式Ｉの化合物であって、
【化１】
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式中、
Ｒが、Ｃ１−１０アルキル基を表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５が独立して、−Ｈまたは−ＯＨを表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つが、−ＯＨである、化合物。
【請求項２】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項３】
前記感染が、上気道に存在する、請求項１または２に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
前記感染が、普通感冒である、請求項３に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
前記ライノウイルスが、ヒトライノウイルスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
前記ライノウイルスが、Ａ型である、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
前記ライノウイルスが、ヒトライノウイルス血清型ＨＲＶ−Ａ１、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ａ７、ＨＲＶ−Ａ８、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ１０、ＨＲＶ−Ａ１１、ＨＲＶ−Ａ１２、ＨＲＶ−Ａ１３、ＨＲＶ−Ａ１５、ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ１８、ＨＲＶ−Ａ１９、ＨＲＶ−Ａ２０、ＨＲＶ−Ａ２１、ＨＲＶ−Ａ２２、ＨＲＶ−Ａ２３、ＨＲＶ−Ａ２４、ＨＲＶ−Ａ２５、ＨＲＶ−Ａ２８、ＨＲＶ−Ａ２９、ＨＲＶ−Ａ３０、ＨＲＶ−Ａ３１、ＨＲＶ−Ａ３２、ＨＲＶ−Ａ３３、ＨＲＶ−Ａ３４、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ３９、ＨＲＶ−Ａ４０、ＨＲＶ−Ａ４１、ＨＲＶ−Ａ４３、ＨＲＶ−Ａ４４、ＨＲＶ−Ａ４５、ＨＲＶ−Ａ４６、ＨＲＶ−Ａ４７、ＨＲＶ−Ａ４９、ＨＲＶ−Ａ５０、ＨＲＶ−Ａ５１、ＨＲＶ−Ａ５３、ＨＲＶ−Ａ５４、ＨＲＶ−Ａ５５、ＨＲＶ−Ａ５６、ＨＲＶ−Ａ５７、ＨＲＶ−Ａ５８、ＨＲＶ−Ａ５９、ＨＲＶ−Ａ６０、ＨＲＶ−Ａ６１、ＨＲＶ−Ａ６２、ＨＲＶ−Ａ６３、ＨＲＶ−Ａ６４、ＨＲＶ−Ａ６５、ＨＲＶ−Ａ６６、ＨＲＶ−Ａ６７、ＨＲＶ−Ａ６８、ＨＲＶ−Ａ７１、ＨＲＶ−Ａ７３、ＨＲＶ−Ａ７４、ＨＲＶ−Ａ７５、ＨＲＶ−Ａ７６、ＨＲＶ−Ａ７７、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ８０、ＨＲＶ−Ａ８１、ＨＲＶ−Ａ８２、ＨＲＶ−Ａ８５、ＨＲＶ−Ａ８８、ＨＲＶ−Ａ８９、ＨＲＶ−Ａ９０、ＨＲＶ−Ａ９４、ＨＲＶ−Ａ９５、ＨＲＶ−Ａ９６、ＨＲＶ−Ａ９８、ＨＲＶ−Ａ１００、ＨＲＶ−Ａ１０１、ＨＲＶ−Ａ１０２、およびＨＲＶ−Ａ１０３からなる群から選択される、請求項６に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
前記ライノウイルスが、Ｂ型である、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
前記ライノウイルスが、ヒトライノウイルス血清型ＨＲＶ−Ｂ３、ＨＲＶ−Ｂ４、ＨＲＶ−Ｂ５、ＨＲＶ−Ｂ６、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ｂ１７、ＨＲＶ−Ｂ２６、ＨＲＶ−Ｂ２７、ＨＲＶ−Ｂ３５、ＨＲＶ−Ｂ３７、ＨＲＶ−Ｂ４２、ＨＲＶ−Ｂ４８、ＨＲＶ−Ｂ５２、ＨＲＶ−Ｂ６９、ＨＲＶ−Ｂ７０、ＨＲＶ−Ｂ７２、ＨＲＶ−Ｂ７９、ＨＲＶ−Ｂ８３、ＨＲＶ−Ｂ８４、ＨＲＶ−Ｂ８６、ＨＲＶ−Ｂ９１、ＨＲＶ−Ｂ９２、ＨＲＶ−Ｂ９３、ＨＲＶ−Ｂ９７、およびＨＲＶ−Ｂ９９からなる群から選択される、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
前記ライノウイルスが、Ｃ型である、請求項５に記載の使用のための化合物。
前記ライノウイルスが、ヒトライノウイルス血清型ＨＲＶ−Ｃ１、ＨＲＶ−Ｃ２、ＨＲＶ−Ｃ３、ＨＲＶ−Ｃ４、ＨＲＶ−Ｃ５、ＨＲＶ−Ｃ６、ＨＲＶ−Ｃ７、ＨＲＶ−Ｃ８、ＨＲＶ−Ｃ９、ＨＲＶ−Ｃ１０、ＨＲＶ−Ｃ１１、ＨＲＶ−Ｃ１２、ＨＲＶ−Ｃ１３、ＨＲＶ−Ｃ１４、ＨＲＶ−Ｃ１５、ＨＲＶ−Ｃ１６、ＨＲＶ−Ｃ１７、ＨＲＶ−Ｃ１８、ＨＲＶ−Ｃ１９、ＨＲＶ−Ｃ２０、ＨＲＶ−Ｃ２１、ＨＲＶ−Ｃ２２、ＨＲＶ−Ｃ２３、ＨＲＶ−Ｃ２４、ＨＲＶ−Ｃ２５、ＨＲＶ−Ｃ２６、ＨＲＶ−Ｃ２７、ＨＲＶ−Ｃ２８、ＨＲＶ−Ｃ２９、ＨＲＶ−Ｃ３０、ＨＲＶ−Ｃ３１、ＨＲＶ−Ｃ３２、ＨＲＶ−Ｃ３３、ＨＲＶ−Ｃ３４、ＨＲＶ−Ｃ３５、ＨＲＶ−Ｃ３６、ＨＲＶ−Ｃ３７、ＨＲＶ−Ｃ３８，ＨＲＶ−Ｃ３９、ＨＲＶ−Ｃ４０、ＨＲＶ−Ｃ４１、ＨＲＶ−Ｃ４２、ＨＲＶ−Ｃ４３、ＨＲＶ−Ｃ４４、ＨＲＶ−Ｃ４５、ＨＲＶ−Ｃ４６、ＨＲＶ−Ｃ４７、ＨＲＶ−Ｃ４８、ＨＲＶ−Ｃ４９、ＨＲＶ−Ｃ５０、およびＨＲＶ−Ｃ５１からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
Ｒが、非置換アルキル基を表す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
Ｒが、Ｃ１−８アルキル基、例えば、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−５アルキル基、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−３アルキル基、Ｃ１−２アルキル基、またはＣ１アルキル基を表す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
Ｒが、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基を表す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
Ｒが、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３を表し、式中、「ｎ」が０〜３の整数である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
Ｒが、−（ＣＨ２）２ＣＨ３を表す、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、モノヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、例えば、２−ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸）、３−ヒドロキシ安息香酸、または４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルである、請求項１６に記載の使用のための化合物。
【請求項１８】
前記化合物が、ジヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、例えば、２，３−ヒドロキシ安息香酸、２，４−ヒドロキシ安息香酸、２，５−ヒドロキシ安息香酸、または２，６−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、トリヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、例えば、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸（没食子酸）または２，４，６−トリヒドロキシ安息香酸（フロログルシノールカルボン酸）のアルキルエステルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２０】
前記化合物が、テトラヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２１】
前記化合物が、ペンタヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２２】
前記化合物が、安息香酸４−ヒドロキシプロピルエステル（プロパギン、プロピルパラベン、Ｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート）である、請求項１７に記載の使用のための化合物。
【化２】
2021513514.tif 000017
【請求項２３】
前記化合物が、口および／または咽頭の粘膜への送達に好適な形態で提供される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２４】
前記化合物が、口内スプレー、鼻内スプレー、ロゼンジ、トローチ、チューインガム、または液体で提供される、請求項２３に記載の使用のための化合物。
【請求項２５】
前記化合物が、口内スプレーで提供される、請求項２４に記載の使用のための化合物。
【請求項２６】
前記化合物が、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドと組み合わせて使用するためのものである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２７】
プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択される、請求項２６に記載の使用のための化合物。
【請求項２８】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼである、請求項２７に記載の使用のための化合物。
【請求項２９】
前記プロテアーゼが、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である、請求項２７または２８に記載の使用のための化合物。
【請求項３０】
プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、低温適応性である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、自然発生的である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、海洋セリンプロテアーゼである、請求項３１に記載の使用のための化合物。
【請求項３３】
前記海洋セリンプロテアーゼが、タラ、スケトウダラ、サケ、またはオキアミから入手可能である、請求項３２に記載の使用のための化合物。
【請求項３４】
前記海洋セリンプロテアーゼが、タイセイヨウダラから入手可能である、請求項３３に記載の使用のための化合物。
【請求項３５】
前記海洋セリンプロテアーゼが、トリプシンである、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＩ、トリプシンＸ、またはトリプシンＺＴである、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３７】
前記トリプシンの活性が、前記ポリペプチドの１Ｕ／ｍｇ〜１Ｕ／ｇ、例えば、前記ポリペプチドの５０Ｕ／ｍｇ〜５００Ｕ／ｍｇの範囲である、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、非自然発生的である、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記プロテアーゼ活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むか、またはそれからなる、請求項２７〜３８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３９に記載の使用のための化合物。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２による前記アミノ酸配列のフラグメントを含むか、またはそれからなる、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項４２】
前記フラグメントが、配列番号１〜１２のいずれか１つの少なくとも１５連続アミノ酸、例えば、配列番号１〜１２のいずれか１つの少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０連続アミノ酸を含むか、またはそれからなる、請求項４１に記載の使用のための化合物。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つによる前記アミノ酸配列の変異体を含むか、またはそれからなる、請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項４４】
前記変異体が、非自然発生的な変異体である、請求項４３に記載の使用のための化合物。
【請求項４５】
前記変異体が、配列番号１〜１２のいずれか１つによる前記アミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも５０％の同一性、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４３または４４に記載の使用のための化合物。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、融合タンパク質を含むか、またはそれからなる、請求項２７〜４５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項４７】
前記ポリペプチド、またはそのフラグメント、変異体、融合体、もしくは誘導体が、修飾または誘導体化されている１つ以上のアミノ酸を含む、請求項２７〜４６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項４８】
前記１つ以上のアミノ酸が、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、および／またはアルキル化によって修飾または誘導体化される、請求項４７に記載の使用のための化合物。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、１５０〜２５０アミノ酸長、例えば、２００〜２５０、２１０〜２４０、２２０〜２３０、または２２０〜２２５アミノ酸長である、請求項２７〜４８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが、直鎖状である、請求項２７〜４９のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、組換えポリペプチドである、請求項２７〜５０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５２】
前記化合物が、１つ以上の追加の活性剤と組み合わせて使用するためのものである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５３】
前記追加の活性剤が、抗菌剤（抗生物質、抗ウイルス剤、および抗真菌剤を含む）、抗炎症剤（ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤を含む）、ならびに防腐剤からなる群から選択される、請求項５２に記載の使用のための化合物。
【請求項５４】
前記１つ以上の抗菌剤が、ペニシリン、セファロスポリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、モノバクタム、カルバペネム、およびマクロライドからなる群から選択される抗生物質である、請求項５３に記載の使用のための化合物。
【請求項５５】
哺乳動物におけるライノウイルス感染の前記治療または予防のための薬剤の調製における、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５６】
前記化合物が、安息香酸４−ヒドロキシプロピルエステルである、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記薬剤が、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含む、請求項５５または５６に記載の使用。
【請求項５８】
プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記トリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むか、またはそれからなる、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記ポリペプチドが、タイセイヨウダラ由来のトリプシン、例えば、トリプシンＩまたはトリプシンＺＴである、請求項５７または５８に記載の使用。
【請求項６０】
哺乳動物におけるライノウイルス感染の前記治療または予防のための方法であって、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の治療有効量の化合物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
前記化合物が、安息香酸４−ヒドロキシプロピルエステルである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記薬剤が、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記トリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むか、またはそれからなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリペプチドが、タイセイヨウダラ由来のトリプシン、例えば、トリプシンＩまたはトリプシンＺＴである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
説明および実施例を参照して実質的に本明細書に記載されている使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物におけるライノウイルス感染の治療または予防における使用のための化合物に関する。具体的には、本発明は、哺乳動物におけるライノウイルス感染の治療または予防における使用のためのヒドロキシ安息香酸のエステル誘導体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ライノウイルスは、ヒトで最も一般的なウイルス感染因子であり、普通感冒の主な原因である。ライノウイルス感染は、鼻の中に見られる温度である、３３〜３５℃（９１〜９５°Ｆ）の温度で増殖する。
【０００３】
ライノウイルスは、７２００〜８５００ヌクレオチド長の一本鎖のプラスセンスＲＮＡゲノムを有する。ゲノムの５’末端にはウイルスにコードされたタンパク質があり、哺乳動物のｍＲＮＡと同様に、３’ポリＡテールがある。構造タンパク質は、ゲノムの５’領域にコードされ、非構造タンパク質は３’末端にコードされる。これは、全てのピコルナウイルスについて同じである。ウイルス粒子自体は、非エンベロープであり、二十面体の構造をしている。
【０００４】
ウイルスタンパク質は、単一の長いポリペプチドと翻訳され、構造および非構造ウイルスタンパク質に開裂される。
【０００５】
ヒトライノウイルスは、４つのウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４を含有するカプシドから構成される。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、タンパク質カプシドの主要な部分を形成する。はるかに小さいＶＰ４タンパク質は、より拡張された構造を有し、カプシドとＲＮＡゲノムとの間の境界にある。二十面体として組み立てられたこれらのタンパク質の各々の６０コピーが存在する。抗体は、ＶＰ１〜ＶＰ３の外部領域にあるエピトープによる感染に対する主要な防御である。
【０００６】
ライノウイルス感染の有効な治療は、依然として非常に限定されている。没食子酸（ヒドロキシル置換安息香酸）が、抗ヒトライノウイルス活性を呈する可能性があるという事例報告がある（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２４（９）：１２９２−６参照）。しかしながら、この研究は、それ以上継続されていないようである。
【０００７】
この背景に対して、本発明は、ライノウイルス感染を治療および予防するための新規かつ有効な化合物を提供することを追及する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１の態様は、式Ｉの、哺乳動物におけるライノウイルス感染の治療または予防における使用のためのヒドロキシ安息香酸のエステル誘導体を提供し、
【化１】
2021513514.tif 000003
式中、
Ｒは、Ｃ１−１０アルキル基を表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は独立して、−Ｈまたは−ＯＨを表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、−ＯＨである。
【０００９】
「ライノウイルス感染」には、哺乳動物が、ウイルスのピコルナウイルス科のエンテロウイルス属にあるライノウイルスの集団に感染している、またはそうでなければそれを保有していることが含まれる。
【００１０】
ヒトライノウイルスの主要な侵入経路は、上気道（口および鼻）である。ライノウイルスＡおよびＢは、呼吸上皮細胞のＣＤ５４（分化クラスター５４）受容体としても知られるＩＣＡＭ−１（細胞間接着分子１）に結合するが、ライノウイルスＣは、カドヘリン関連ファミリーメンバー３（ＣＤＨＲ３）を使用して細胞侵入を仲介する。ウイルスが複製および拡散すると、感染した細胞は、ケモカインおよびサイトカインとして知られる苦痛信号を放出する（次に、炎症性メディエータを活性化する）。細胞溶解は、上気道上皮で発生する。感染は急速に発生し、ウイルスは気道に進入してから１５分以内に表面の受容体に付着する。高リスクの人には、子供および高齢者が含まれる。感染後２日以内に、５０％以上の人が症状を経験する。潜伏期間が２０時間未満の症例は約５％だけであり、その一方で、潜伏期間が４日半を超える症例は５％であると予想される。
【００１１】
ヒトライノウイルスは、３２℃（８９°Ｆ）で優先的に増殖し、注目すべきは、平均的なヒトの体温３７℃（９８°Ｆ）より低温であるため、ウイルスは、呼吸気流量が（より低温の）体外環境と継続的に接触する上気道に感染する傾向がある。
【００１２】
したがって、一実施形態では、ライノウイルス感染は、普通感冒である。
【００１３】
代替的に、ライノウイルス感染は、喘息または慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）に関連付けられ得る（すなわち、それを有する対象に存在し得る）。
【００１４】
「治療」には、ライノウイルス感染の症状の緩和の一部または全体が含まれる。このような治療には、体内のライノウイルス集団の根絶、または増殖遅延が含まれ得る。
【００１５】
「予防」には、哺乳動物で発症するライノウイルス感染のリスクの低減が含まれる。しかしながら、このような予防が絶対的ではない可能性があり、すなわち、全てのこのような対象がライノウイルス感染を発症することを予防しない可能性があることが理解されるであろう。したがって、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および「予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、互換的に使用され得る。
【００１６】
一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００１７】
代替的な実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物である。したがって、本発明の化合物は、獣医学的設定、例えば、飼育動物および／または家畜（イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどを含む）におけるライノウイルス感染の治療または予防に使用され得る。好ましい実施形態では、哺乳動物は、イヌである。
【００１８】
一実施形態では、ライノウイルス感染は、上気道および／または下気道の感染である。代替的にまたは追加的に、ライノウイルス感染は、胃腸管に存在し得る。
【００１９】
「上気道」には、口、鼻、副鼻腔、中耳、喉、喉頭、および気管が含まれる。
【００２０】
「下気道」には、気管支（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｔｕｂｅ）（気管支（ｂｒｏｎｃｈｉ））および肺（気管支（ｂｒｏｎｃｈｉ）、細気管支、および肺胞）、ならびに肺の間質組織が含まれる。
【００２１】
「胃腸管」とは、口、食道、胃、および腸を含む、口から肛門までの管を意味する。
【００２２】
一実施形態では、ライノウイルスは、ヒトライノウイルスである。
【００２３】
したがって、ライノウイルスは、例えば、ヒトライノウイルス血清型ＨＲＶ−Ａ１、ＨＲＶ−Ａ２、ＨＲＶ−Ａ７、ＨＲＶ−Ａ８、ＨＲＶ−Ａ９、ＨＲＶ−Ａ１０、ＨＲＶ−Ａ１１、ＨＲＶ−Ａ１２、ＨＲＶ−Ａ１３、ＨＲＶ−Ａ１５、ＨＲＶ−Ａ１６、ＨＲＶ−Ａ１８、ＨＲＶ−Ａ１９、ＨＲＶ−Ａ２０、ＨＲＶ−Ａ２１、ＨＲＶ−Ａ２２、ＨＲＶ−Ａ２３、ＨＲＶ−Ａ２４、ＨＲＶ−Ａ２５、ＨＲＶ−Ａ２８、ＨＲＶ−Ａ２９、ＨＲＶ−Ａ３０、ＨＲＶ−Ａ３１、ＨＲＶ−Ａ３２、ＨＲＶ−Ａ３３、ＨＲＶ−Ａ３４、ＨＲＶ−Ａ３６、ＨＲＶ−Ａ３８、ＨＲＶ−Ａ３９、ＨＲＶ−Ａ４０、ＨＲＶ−Ａ４１、ＨＲＶ−Ａ４３、ＨＲＶ−Ａ４４、ＨＲＶ−Ａ４５、ＨＲＶ−Ａ４６、ＨＲＶ−Ａ４７、ＨＲＶ−Ａ４９、ＨＲＶ−Ａ５０、ＨＲＶ−Ａ５１、ＨＲＶ−Ａ５３、ＨＲＶ−Ａ５４、ＨＲＶ−Ａ５５、ＨＲＶ−Ａ５６、ＨＲＶ−Ａ５７、ＨＲＶ−Ａ５８、ＨＲＶ−Ａ５９、ＨＲＶ−Ａ６０、ＨＲＶ−Ａ６１、ＨＲＶ−Ａ６２、ＨＲＶ−Ａ６３、ＨＲＶ−Ａ６４、ＨＲＶ−Ａ６５、ＨＲＶ−Ａ６６、ＨＲＶ−Ａ６７、ＨＲＶ−Ａ６８、ＨＲＶ−Ａ７１、ＨＲＶ−Ａ７３、ＨＲＶ−Ａ７４、ＨＲＶ−Ａ７５、ＨＲＶ−Ａ７６、ＨＲＶ−Ａ７７、ＨＲＶ−Ａ７８、ＨＲＶ−Ａ８０、ＨＲＶ−Ａ８１、ＨＲＶ−Ａ８２、ＨＲＶ−Ａ８５、ＨＲＶ−Ａ８８、ＨＲＶ−Ａ８９、ＨＲＶ−Ａ９０、ＨＲＶ−Ａ９４、ＨＲＶ−Ａ９５、ＨＲＶ−Ａ９６、ＨＲＶ−Ａ９８、ＨＲＶ−Ａ１００、ＨＲＶ−Ａ１０１、ＨＲＶ−Ａ１０２、およびＨＲＶ−Ａ１０３からなる群から選択されるヒトＡ型ライノウイルスであり得る。
【００２４】
代替的に、ライノウイルスは、例えば、ヒトライノウイルス血清型ＨＲＶ−Ｂ３、ＨＲＶ−Ｂ４、ＨＲＶ−Ｂ５、ＨＲＶ−Ｂ６、ＨＲＶ−Ｂ１４、ＨＲＶ−Ｂ１７、ＨＲＶ−Ｂ２６、ＨＲＶ−Ｂ２７、ＨＲＶ−Ｂ３５、ＨＲＶ−Ｂ３７、ＨＲＶ−Ｂ４２、ＨＲＶ−Ｂ４８、ＨＲＶ−Ｂ５２、ＨＲＶ−Ｂ６９、ＨＲＶ−Ｂ７０、ＨＲＶ−Ｂ７２、ＨＲＶ−Ｂ７９、ＨＲＶ−Ｂ８３、ＨＲＶ−Ｂ８４、ＨＲＶ−Ｂ８６、ＨＲＶ−Ｂ９１、ＨＲＶ−Ｂ９２、ＨＲＶ−Ｂ９３、ＨＲＶ−Ｂ９７、およびＨＲＶ−Ｂ９９からなる群から選択されるヒトＢ型ライノウイルスであり得る。
【００２５】
さらなる代替では、ライノウイルスは、例えば、ヒトライノウイルス血清型ＨＲＶ−Ｃ１、ＨＲＶ−Ｃ２、ＨＲＶ−Ｃ３、ＨＲＶ−Ｃ４、ＨＲＶ−Ｃ５、ＨＲＶ−Ｃ６、ＨＲＶ−Ｃ７、ＨＲＶ−Ｃ８、ＨＲＶ−Ｃ９、ＨＲＶ−Ｃ１０、ＨＲＶ−Ｃ１１、ＨＲＶ−Ｃ１２、ＨＲＶ−Ｃ１３、ＨＲＶ−Ｃ１４、ＨＲＶ−Ｃ１５、ＨＲＶ−Ｃ１６、ＨＲＶ−Ｃ１７、ＨＲＶ−Ｃ１８、ＨＲＶ−Ｃ１９、ＨＲＶ−Ｃ２０、ＨＲＶ−Ｃ２１、ＨＲＶ−Ｃ２２、ＨＲＶ−Ｃ２３、ＨＲＶ−Ｃ２４、ＨＲＶ−Ｃ２５、ＨＲＶ−Ｃ２６、ＨＲＶ−Ｃ２７、ＨＲＶ−Ｃ２８、ＨＲＶ−Ｃ２９、ＨＲＶ−Ｃ３０、ＨＲＶ−Ｃ３１、ＨＲＶ−Ｃ３２、ＨＲＶ−Ｃ３３、ＨＲＶ−Ｃ３４、ＨＲＶ−Ｃ３５、ＨＲＶ−Ｃ３６、ＨＲＶ−Ｃ３７、ＨＲＶ−Ｃ３８，ＨＲＶ−Ｃ３９、ＨＲＶ−Ｃ４０、ＨＲＶ−Ｃ４１、ＨＲＶ−Ｃ４２、ＨＲＶ−Ｃ４３、ＨＲＶ−Ｃ４４、ＨＲＶ−Ｃ４５、ＨＲＶ−Ｃ４６、ＨＲＶ−Ｃ４７、ＨＲＶ−Ｃ４８、ＨＲＶ−Ｃ４９、ＨＲＶ−Ｃ５０、およびＨＲＶ−Ｃ５１からなる群から選択されるヒトＣ型ライノウイルスであり得る。
【００２６】
好ましい一実施形態では、ライノウイルスは、ライノウイルス１６型（ＲＶ−１６）である。
【００２７】
本発明は、保存料として一般的に使用される安息香酸エステル、具体的には、ヒドロキシ安息香酸の低級アルキルエステルが、ライノウイルスに対して抗ウイルス効果を呈することが可能であるという予想外の発見に由来する。
【００２８】
エステル官能基内の低級アルキル部分Ｒは、Ｃ１−２０アルキル基である。
【００２９】
「低級アルキル」という用語は、直鎖状または分枝状、環式または非環式のＣ１−Ｃ２０アルキル含むことが意図され、これは、酸素によって中断され得る（好ましくは５個以上の酸素原子が各アルキル鎖中に存在する）。
【００３０】
一実施形態では、Ｒは、非置換Ｃ１−Ｃ２０アルキル基を表す。
【００３１】
したがって、Ｒは、Ｃ１−８アルキル基、例えば、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−５アルキル基、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−３アルキル基、Ｃ１−２アルキル基、またはＣ１アルキル基を表し得る。
【００３２】
例えば、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基を表し得る。
【００３３】
有利には、Ｒは、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３を表し、式中「ｎ」は、０〜３の整数である。例えば、Ｒは、−（ＣＨ２）２ＣＨ３を表し得る。
【００３４】
アルキルエステル官能基に加えて、本発明で使用するための安息香酸誘導体は、その中のベンゼン環に結合した少なくとも１つのヒドロキシル部分も含む。
【００３５】
したがって、化合物は、モノヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、例えば、２−ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸）、３−ヒドロキシ安息香酸、または４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルであり得る。例えば、好ましい一実施形態では、化合物は、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルである。
【００３６】
代替的に、化合物は、ジヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、例えば、２，３−ヒドロキシ安息香酸、２，４−ヒドロキシ安息香酸、２，５−ヒドロキシ安息香酸、または２，６−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルであり得る。
【００３７】
さらなる代替的な実施形態では、化合物は、トリヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、例えば、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸（没食子酸）または２，４，６−トリヒドロキシ安息香酸（フロログルシノールカルボン酸）のアルキルエステルである。
【００３８】
さらに代替的な実施形態では、化合物は、テトラヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルである。
【００３９】
さらに代替的な実施形態では、化合物は、ペンタヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルである。
【００４０】
特に好ましい実施形態では、化合物は、安息香酸４−ヒドロキシプロピルエステル（プロパギン、プロピルパラベン、Ｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート）である。
【化２】
2021513514.tif 000004
【００４１】
便宜的には、本発明の第１の態様の化合物は、口および／または咽頭の粘膜への送達に好適な形態で、例えば、口内スプレー、鼻内スプレー、ロゼンジ、トローチ、チューインガム、または液体で提供される。
【００４２】
好ましい一実施形態では、化合物は、口内スプレーとして提供される。
【００４３】
本発明の化合物を他の活性剤と組み合わせて、同じ組成物／製剤内で組み合わせて、または別々に投与して使用してもよいことが、当業者には理解されるだろう。
【００４４】
したがって、一実施形態では、化合物は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドと組み合わせて使用するためのものである。
【００４５】
「プロテアーゼ活性」には、哺乳動物（例えば、ヒト）の体内において生体内でタンパク質分解に触媒作用を及ぼすことが可能である任意のポリペプチドが含まれる。したがって、セリンプロテアーゼ（トリプシン／キモトリプシンなど）、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、任意の種類のプロテアーゼが本発明で利用され得る。
【００４６】
例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択され得る。
【００４７】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、セリンプロテアーゼである。「セリンプロテアーゼ」には、タンパク質中のペプチド結合を開裂することが可能な自然発生的および非自然発生的の両方の触媒ポリペプチドが含まれ、セリンは、ポリペプチドの活性部位で求核性アミノ酸として機能する（ＥＣ番号３．４．２１に従って定義されるように）。セリンプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼ活性（すなわち、トリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼ）、またはサブチリシン様プロテアーゼ活性を有し得る。
【００４８】
したがって、一実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である。
【００４９】
したがって、本発明のポリペプチドは、トリプシン活性を呈し得る。「トリプシン活性」とは、ポリペプチドがトリプシン酵素（ＥＣ３，４，２１，４）または関連ペプチダーゼ（キモトリプシン酵素、ＥＣ３，４，２１，１など）のペプチダーゼ活性を呈することを意味する。例えば、プロテアーゼは、真核生物または原核生物起源の自然発生的なトリプシン、またはこのようなトリプシンの変異型であり得る。
【００５０】
本発明の一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、低温適応性であり、すなわち、ポリペプチドは好冷性である。「低温適応性」とは、ポリペプチドが低温環境からの生物に由来し、したがって低温で機能するように適応されていることを意味する。例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、２５℃または３７℃などのより高い温度よりも１５℃でより長い期間、プロテアーゼ活性を呈し得る（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ：Ｐａｒｔ  Ｂ−Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５５（２）：１８６−１９４を参照（その開示は参照により組み込まれる））（２１）。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、自然発生的または非自然発生的であってもよい。
【００５２】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、自然発生的なプロテアーゼのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、真核生物または原核生物起源のいずれかの、自然発生的なトリプシンのアミノ酸配列からなり得る。
【００５３】
一実施形態では、ポリペプチドは、海洋セリンプロテアーゼである。海洋セリンプロテアーゼは、例えば、タラ、スケトウダラ、サケ、またはオキアミから入手可能であり得る。海洋プロテアーゼの他の可能な供給源として、ナマズ、コダラ、ホキ、メルルーサ、レッドフィッシュ、ラフィー、ティラピア、ホワイティング、およびチリシーバスが挙げられる。具体的には、タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）、タイセイヨウおよびタイヘイヨウサケ（例えば、Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒおよびＯｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓの種）、ならびにアラスカスケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ  ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ）由来のトリプシンなどの低温適応性トリプシンが含まれる。例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下に列記されるように、配列番号１のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５４】
好ましい実施形態では、海洋セリンプロテアーゼは、タイセイヨウダラから入手可能である。
【００５５】
自然発生的なセリンプロテアーゼは、供給源の生物（例えば、タイセイヨウダラ）から精製され得るか、または組換え発現され得る。
【００５６】
したがって、本発明のこのような自然発生的なセリンプロテアーゼポリペプチドを、それらが自然界に見られるものとは異なる形態で提供しなければならないことが、当業者によって理解されるであろう。例えば、本発明のポリペプチドは、自然発生的な真核生物のトリプシンのアミノ酸配列からなり得るが、それが自然に発現されるため、タンパク質上に存在するグリコシル化部分を欠いている。
【００５７】
好ましい実施形態では、海洋セリンプロテアーゼは、トリプシン、例えば、トリプシンＩ、トリプシンＸ、トリプシンＹ、またはトリプシンＺＴである（例えば、以下を参照）。
【００５８】
トリプシンの３つの主要なアイソザイムは、元々タイセイヨウダラから特徴付けられ、トリプシンＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと指定された（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０：８５−９４を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。例えば、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＩは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＯ９０３９７で定義されている（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５５（２），１８６−１９４を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。その後、タイセイヨウダラによって産生されたトリプシンはさらに特徴付けられ、今ではトリプシンＩ、トリプシンＺＴ、トリプシンＸ、およびトリプシンＹを含む多数の異なるアイソフォームが特徴付けられている（以下を参照）。
【００５９】
加えて、タイセイヨウダラは、キモトリプシンＡおよびＢと指定されたキモトリプシンの２つの主要なアイソザイムを発現する（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ＆Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９９１，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ  ９９８：３２７−３３５を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ５５２４２．１を参照されたい。
【００６０】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）由来のトリプシンＩのアミノ酸配列、すなわち、配列番号１または配列番号２、
ＩＶＧＧＹＥＣＴＫＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＲＩＥＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＹＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＮＮＤＩＭＬＩＫＬＳＫＰＡＴＬＮＱＹＶＱＰＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＧＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＡＤＧＤＫＬＱＣＬＳＬＰＩＬＳＨＡＤＣＡＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＨＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＮＹ
［配列番号１］
ＩＶＧＧＹＥＣＴＫＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＶＬＲＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＹＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＮＮＤＩＭＬＩＫＬＴＫＰＡＴＬＮＱＹＶＨＡＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＡＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＡＤＧＤＫＬＱＣＬＳＬＰＩＬＳＨＡＤＣＡＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＨＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＮＹ
［配列番号２］
あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持する、配列番号１または２のそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むか、またはそれからなる。
【００６１】
トリプシンＩのさらなる詳細は、Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７（３）：１０９１−７およびＳｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５５（２），１８６−１９４に見られる（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６２】
代替的に、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）由来のトリプシンＺＴアイソフォームのアミノ酸配列、例えば、配列番号３〜７を含み得るか、またはそれからなり得る（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａ  ＡＢに対するＷＯ２０１７／０１７０１２を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【００６３】
配列番号３は、以下に提示されるＺＴ−アイソフォーム、ＺＴ−１〜ＺＴ−４のコンセンサス配列である。
ＩＸ１ＧＧＸ２Ｘ３ＣＥＰＸ４ＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＸ５ＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＸ６ＶＸ７ＣＸ８ＡＸ９ＹＰＧＭＩＳＰＲＭＸ１０ＣＸ１１ＧＸ１２ＭＤＧＧＲＤＸ１３ＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＸ１４ＧＣＡＸ１５ＰＮＸ１６ＰＧＶＹＶＫＶＹＥＸ１７ＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号３］
ここで、
Ｘ１は、ＩおよびＶから選択され、
Ｘ２は、ＱおよびＨから選択され、
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ４は、ＲおよびＮから選択され、
Ｘ５は、Ｌであり、
Ｘ６は、ＴおよびＰから選択され、
Ｘ７は、ＤおよびＡから選択され、
Ｘ８は、ＥおよびＱから選択され、
Ｘ９は、ＡおよびＳから選択され、
Ｘ１０は、ＶおよびＭから選択され、
Ｘ１１は、ＡおよびＶから選択され、
Ｘ１２は、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ１３は、ＡおよびＶから選択され、
Ｘ１４は、ＱおよびＲから選択され、
Ｘ１５は、ＬおよびＥから選択され、
Ｘ１６は、ＹおよびＳから選択され、
Ｘ１７は、ＹおよびＦから選択される。
タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−１アイソフォーム：
ＩＶＧＧＨＥＣＥＰＮＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＰＶＡＣＱＡＳＹＰＧＭＩＳＰＲＭＭＣＶＧＦＭＤＧＧＲＤＶＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＲＧＣＡＥＰＮＳＰＧＶＹＶＫＶＹＥＦＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号４］
タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−２アイソフォーム：
ＩＶＧＧＨＥＣＥＰＮＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号５］
タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−３アイソフォーム：
ＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＰＶＡＣＱＡＳＹＰＧＭＩＳＰＲＭＭＣＶＧＦＭＤＧＧＲＤＶＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＲＧＣＡＥＰＮＳＰＧＶＹＶＫＶＹＥＦＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号６］
タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−４アイソフォーム：
ＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号７］
【００６４】
ポリペプチドが、任意選択でトリプシンＩ、Ｘ、および／またはＹと組み合わせて、上記のトリプシンＺＴアイソフォームのうちの１つ以上の混合物として存在し得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【００６５】
代替的に、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＸのアミノ酸配列、例えば、配列番号８〜１１を含み得るか、またはそれからなり得る（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１８６５（１）：１１−１９を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
タイセイヨウダラトリプシンＸ：
ＩＶＧＧＹＥＣＴＲＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＶＬＲＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＦＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＤＮＤＩＭＬＩＫＬＴＥＰＡＴＬＮＱＹＶＨＡＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＡＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＤＤＧＤＫＬＱＣＬＮＬＰＩＬＳＨＡＤＣＡＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＮＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＳＹ
［配列番号８］
タイセイヨウダラトリプシンＸ−１：
ＩＶＧＧＹＥＣＴＲＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＲＩＥＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＦＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＤＮＤＩＭＬＩＫＬＳＥＰＡＴＬＮＱＹＶＱＰＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＧＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＤＤＧＤＫＬＱＣＬＮＬＰＩＬＳＨＡＤＣＡＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＮＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＳＹ
［配列番号９］
タイセイヨウダラトリプシンＸ−２：
ＩＶＧＧＹＥＣＴＲＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＲＩＥＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＦＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＤＮＤＩＭＬＩＫＬＳＫＰＡＴＬＮＱＹＶＱＴＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＧＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＤＤＧＤＫＬＱＣＬＮＬＰＩＬＳＨＡＤＣＳＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＮＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＳＹ
［配列番号１０］
タイセイヨウダラトリプシンＸ−３：
ＩＶＧＧＹＥＣＴＲＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＲＩＥＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＦＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＤＮＤＩＭＬＩＫＬＳＥＰＡＴＬＮＱＹＶＱＴＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＧＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＤＤＧＤＫＬＱＣＬＮＬＰＩＬＳＨＡＤＣＳＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＮＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＳＹ
［配列番号１１］
【００６６】
代替的に、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＹのアミノ酸配列、例えば、配列番号１２を含み得るか、またはそれからなり得る（Ｐａｌｓｄｏｔｔｉｒ＆Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ，２００８，ＦｏｏｄＣｈｅｍ．１１１（２）：４０８−１４を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【００６７】
タイセイヨウダラトリプシンＹ：
ＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＱＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号１２］
【００６８】
したがって、例示的な実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。このようなポリペプチドは、例えば、Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０：８５−９４に記載されているように、タイセイヨウダラから精製され得る（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６９】
本発明の好適で例示的なポリペプチド、およびそれらの産生方法は、欧州特許第１  ２０２  ７４３  Ｂ号にも記載されている（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）（７）。
【００７０】
多くのプロテアーゼと同様に、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＩは、開裂されて成熟した活性トリプシンを生成するプロペプチド（または「活性化」）配列を含む、不活性前駆体またはチモーゲンとして産生される。トリプシンの最初の発現産物は、発現後に除去されるシグナル配列も含む。
【００７１】
シグナル配列を含む、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＩのチモーゲン配列が、配列番号１３として以下に示される（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｐ１６０４９−１に対応する）。
【表Ｓ１】
2021513514.tif 000005
ここで、
シグナルペプチド＝アミノ酸１〜１３（下線）
プロペプチド＝アミノ酸１４〜１９（太字斜体）
成熟トリプシン＝アミノ酸２０〜２４１
【００７２】
シグナル配列を含む、配列番号２に対応するタイセイヨウダラ由来の変異体トリプシンＩのチモーゲン配列が、配列番号１４として以下に示される（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｐ１６０４９−１に対応する）。
【表Ｓ２】
2021513514.tif 000006
ここで、
シグナルペプチド＝アミノ酸１〜１３（下線）
プロペプチド＝アミノ酸１４〜１９（太字斜体）
成熟トリプシン＝アミノ酸２０〜２４１
【００７３】
シグナル配列を含む、配列番号８に対応する変異体トリプシンＸのチモーゲン配列が、配列番号１５として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９１０４１．２に対応する）。
【表Ｓ３】
2021513514.tif 000007
（ここで、シグナル配列およびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００７４】
シグナル配列を含む、配列番号９に対応する変異体トリプシンＸ−１のチモーゲン配列が、配列番号１６として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＯＸ１５７６９．１に対応する）。
【表Ｓ４】
2021513514.tif 000008
（ここで、シグナル配列およびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００７５】
シグナル配列を含む、配列番号１０に対応する変異体トリプシンＸ−２のチモーゲン配列が、配列番号１７として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＯＸ１５７７０．１に対応する）。
【表Ｓ５】
2021513514.tif 000009
（ここで、シグナル配列およびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００７６】
シグナル配列を含む、配列番号１１に対応する変異体トリプシンＸ−３のチモーゲン配列が、配列番号１８として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＯＸ１５７７１．１に対応する）。
【表Ｓ６】
2021513514.tif 000010
（ここで、シグナル配列およびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００７７】
シグナル配列を含む、配列番号１２に対応する変異体トリプシンＹのチモーゲン配列が、配列番号１９として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ３０５６３．１に対応する）。
【表Ｓ７】
2021513514.tif 000011
（ここで、シグナル配列およびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００７８】
配列番号３〜７によって表されるトリプシンＺＴアイソフォームは、これらのトリプシンの活性変異体、すなわち、トリプシンのＮ末端の開裂によって活性化された変異体を表す。これらのトリプシンは、幽門垂／膵臓（魚の膵臓組織）で発現されるタンパク質であり、細胞外への分泌および酵素を不活性化に維持することに重要である多くのアミノ酸が、Ｎ末端上にある。
【００７９】
例えば、全長トリプシンＺＴアイソフォームはまた、本明細書において以下のように開示される：
非開裂タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−１アイソフォーム：
ＭＩＧＬＡＬＬＭＬＬＧＡＡＡＡＡＶＰＲＤＶＧＫＩＶＧＧＨＥＣＥＰＮＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＰＶＡＣＱＡＳＹＰＧＭＩＳＰＲＭＭＣＶＧＦＭＤＧＧＲＤＶＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＲＧＣＡＥＰＮＳＰＧＶＹＶＫＶＹＥＦＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号２０］
非開裂タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−２アイソフォーム：
ＭＩＧＬＡＬＬＭＬＬＧＡＡＡＡＡＶＰＲＤＶＧＫＩＶＧＧＨＥＣＥＰＮＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号２１］
非開裂タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−３アイソフォーム：
ＭＩＧＬＡＬＬＭＬＬＧＡＡＡＡＶＰＲＥＤＧＲＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＰＶＡＣＱＡＳＹＰＧＭＩＳＰＲＭＭＣＶＧＦＭＤＧＧＲＤＶＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＲＧＣＡＥＰＮＳＰＧＶＹＶＫＶＹＥＦＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号２２］
非開裂タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−４アイソフォーム：
ＭＩＧＬＡＬＬＭＬＬＧＡＡＡＡＶＰＲＥＤＧＲＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号２３］
【００８０】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語には、標準の２０の遺伝的にコードされたアミノ酸およびそれらの対応する「Ｄ」型（天然の「Ｌ」型と比較して）の立体異性体、オメガ−アミノ酸、および他の自然発生的なアミノ酸、非従来型アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、ならびに化学的に誘導体化されたアミノ酸が含まれる（以下を参照）。
【００８１】
「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」など、アミノ酸が具体的に列挙されている場合、この用語は、特に明記しない限り、Ｌ−アラニンおよびＤ−アラニンの両方を指す。所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドに好適な構成成分であり得る。示されるペプチドについて、各コードされたアミノ酸残基は、適切な場合、従来型アミノ酸の慣用名に対応する一文字表記によって表される。
【００８２】
慣例に従って、本明細書に開示されるアミノ酸配列は、Ｎ−末端からＣ−末端の方向で提供される。
【００８３】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むか、またはそれからなる。
【００８４】
当業者は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、上記のアミノ酸配列の１つ、例えば、配列番号１〜１２のそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含み得るか、またはそれからなり得るが、ただし、前述のフラグメント、変異体、誘導体、または融合物が、前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を（少なくとも部分的に）保持することを条件とすることを理解するであろう。
【００８５】
トリプシン活性は、当該技術分野で周知の方法を使用して決定され得る。例えば、トリプシンアッセイキットは、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ（カタログ番号ａｂ１０２５３１を参照）および他の供給元から市販されている。一実施形態では、トリプシン活性は、基質としてＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｃｂｚ−ＧＰＲ−ｐＮＡ）を使用して測定される（ＥＰ１，２０２，７４３  ＢおよびＳｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１５５（２）：１８６−９４を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【００８６】
典型的には、プロテアーゼポリペプチドは、少なくとも１Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも１０Ｕ／ｍｇ、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、少なくとも２００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも５００Ｕ／ｍｇのポリペプチドの比活性を有する。本明細書で使用される場合、「Ｕ」は、酵素単位を意味する（１Ｕは、１分当たりの１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量である）。
【００８７】
一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１によるアミノ酸配列のフラグメントを含むか、またはそれからなり、フラグメントはプロテアーゼ活性を呈する。
【００８８】
したがって、ポリペプチドが配列番号１〜１２のいずれか１つによるアミノ酸配列を含む場合、ポリペプチドは、そのＮ−および／またはＣ−末端に、配列番号１〜１２のものを超える追加のアミノ酸を含み得る。同様に、ポリペプチドが配列番号１〜１２によるアミノ酸配列のフラグメント、変異体、または誘導体を含む場合、それは、そのＮ−および／またはＣ−末端に追加のアミノ酸を含み得る。
【００８９】
代替的に、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１〜１２などのそのような野生型トリプシンのフラグメントに対応し得るが、ただし、前述のフラグメントが、それが由来する自然発生的なトリプシンタンパク質のトリプシン活性を（少なくとも部分的に）保持することを条件とする。したがって、ポリペプチドは、配列番号１〜１２の少なくとも１０連続アミノ酸、例えば、配列番号１〜１２のいずれか１つの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０連続アミノ酸を含み得か、またはそれからなり得る。
【００９０】
例えば、フラグメントは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸残基６１〜７７を含み得るか、またはそれからなり得る。代替的にまたは追加的に、フラグメントは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸残基２２５〜２４１を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００９１】
本発明のポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つによるアミノ酸配列（またはそのフラグメント）の変異体を代替的に含み得るか、またはそれからなり得ることが、当業者によって理解されるであろう。このような変異体は、非自然発生的な変異体であり得る。
【００９２】
ポリペプチドの「変異体」には、保存的または非保存的のいずれかの挿入、欠失、および置換が含まれる。具体的には、このような変化が前述のポリペプチドのトリプシン活性を少なくとも部分的に保持するポリペプチドの変異体が含まれる。
【００９３】
このような変異体は、組換えポリヌクレオチドを使用した、当該技術分野で周知のタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を使用して作製され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照（これは参照により本明細書に組み込まれる））（８）。
【００９４】
一実施形態では、変異体は、配列番号１〜１２のいずれか１つによるアミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも５０％の同一性、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９５】
２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定され得、同一性パーセントが、その配列が最適にアライメントされたポリペプチドに関して計算されることが理解されるであろう。
【００９６】
代替的に、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用して実施してもよい（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載される（これは参照により本明細書に組み込まれる）（９））。
【００９７】
使用されるパラメータは、以下の通りであってもよい。
高速ペアワイズアライメントパラメータ：Ｋタプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング方法：ｘパーセント。
【００９８】
複数のアライメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップ延長ペナルティ；０．０５である。
【００９９】
スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【０１００】
代替的に、局所配列アライメントを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムが使用されてもよい。
【０１０１】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸位置：
Ｅ２１、Ｈ２５、Ｈ２９、Ｖ４７、Ｋ４９、Ｄ５０、Ｌ６３、Ｈ７１、Ｈ７２、Ｒ７４、Ｎ７６、Ｔ７９、Ｙ８２、Ｓ８５、Ｓ８７、Ｓ８９、Ｎ９８、Ｉ９９、Ｖ１２１、Ｍ１３５、Ｖ１３８、Ｍ１４５、Ｖ１４８、Ｄ１５０、Ｋ１５４、Ｌ１６０、Ｍ１７５、Ｓ１７９、Ａ１８３、Ｌ１８５、Ｖ２１２、Ｙ２１７、Ｐ２２５、Ａ２２９、Ｖ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３８、Ｎ２４０、Ｙ２４１、および／またはＭ２４２からなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸を含む配列番号１または２の変異体、
またはプロテアーゼ活性を呈するそのフラグメントである（アミノ酸配列および番号付けは、タンパク質データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従い、配列番号１または２の最初のイソロイシンは位置Ｉ−１６として番号付けされる）。
【０１０２】
したがって、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、
Ｅ２１Ｔ、Ｈ２５Ｙ、Ｈ２９（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４７Ｉ、Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ、Ｌ６３Ｉ、Ｈ７１Ｄ、Ｈ７２Ｎ、Ｒ７４（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７６（Ｔ／Ｌ）、Ｔ７９（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８２Ｆ、Ｓ８５Ａ、Ｓ８７（Ｋ／Ｒ）、Ｓ８９Ｒ、Ｎ９８Ｔ、Ｉ９９Ｌ、Ｖ１２１Ｉ、Ｍ１３５Ｑ、Ｖ１３８Ｉ、Ｍ１４５（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４８Ｇ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１６０（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７５（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７９Ｎ、Ａ１８３Ｖ、Ｌ１８５Ｇ、Ｖ２１２Ｉ、Ｙ２１７（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２５Ｙ、Ａ２２９Ｖ、Ｖ２３３Ｎ、Ｌ２３４Ｙ、Ｖ２３８Ｉ、Ｎ２４０Ｓ、Ｙ２４１Ｎ、および／またはＭ２４２Ｉからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含む配列番号１または２の変異体、
またはプロテアーゼ活性を呈するそのフラグメントであり得る。
【０１０３】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、表１における以下の定義された変異のうちの１つ（またはそれらの組み合わせ）を有する配列番号１または２のアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
【表１】
2021513514.tif 000012
【０１０４】
同様に、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下の定義された変異（またはそれらの組み合わせ）のうちの１つを有する配列番号１または２のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る：
（ａ）Ｈ２５Ｎ、Ｎ７６Ｔ
（ｂ）Ｈ２５Ｎ、Ｈ２９Ｙ
（ｃ）Ｈ２５Ｎ、Ｍ１３５Ｑ
（ｄ）Ｈ２９Ｙ、Ｔ７９Ｎ、Ｍ１３５Ｑ
（ｅ）Ｉ９９Ｌ、Ｖ１２１Ｉ、Ｌ１６０Ｉ、Ｙ２１７Ｈ
（ｆ）Ｖ１２１Ｉ、Ｌ１６０Ｉ
（ｇ）Ｈ７２Ｎ、Ｒ７４Ｅ、Ｓ８７Ｋ
（ｈ）Ｈ２５Ｎ、Ｍ１３５Ｑ、Ｙ２１７Ｈ
（ｉ）Ｔ７９Ｎ、Ｖ１２１Ｉ、Ｖ２１２Ｉ
（ｊ）Ｈ２９Ｙ、Ｎ７６Ｔ、Ｉ９９Ｌ、Ｍ１３５Ｑ
（ｋ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ、Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ、Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ
（ｌ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ、Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ、Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ
（ｍ）Ｈ２５Ｎ、Ｎ７６Ｔ、Ｓ８７Ｋ、Ｋ１５４Ｔ
（ｎ）Ｈ２５Ｑ
（ｏ）Ｈ２５Ｄ
（ｐ）Ｈ２５Ｓ
（ｑ）Ｋ２４Ｅ、Ｈ２５Ｎ
（ｒ）Ｙ９７Ｎ
（ｓ）Ｎ１００Ｄ
（ｔ）Ａ１２０Ｓ、Ａ１２２Ｓ
（ｕ）Ｍ１３５Ｅ
（ｖ）Ｖ２０４Ｑ、Ａ１２２Ｓ
（ｗ）Ｔ７９Ｄ
（ｘ）Ｒ７４Ｄ
（ｙ）Ｋ４９Ｅ
（ｚ）Ｋ４９Ｓ，Ｄ５０Ｑ
（ａａ）Ｄ５０Ｑ
（ｂｂ）Ｑ１７８Ｄ
（ｃｃ）Ｓ８７Ｒ
【０１０５】
好ましい一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、位置２５にヒスチジンを含まない、配列番号１または２のアミノ酸配列の変異体である。
【０１０６】
例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３（Ｈ２５Ｎ変異を含む；以下の配列の囲みを参照）のアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る：
【表Ｓ８】
2021513514.tif 000013
【０１０７】
代替的な好ましい実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、位置１６０にリジンを含まない、配列番号１または２のアミノ酸配列の変異体である。
【０１０８】
例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４（Ｌ１６０Ｉ変異を含む；以下の配列の囲みを参照）のアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る：
【表Ｓ９】
2021513514.tif 000014
【０１０９】
上記で同定された変異（タイセイヨウダラのトリプシンＩのアミノ酸配列、配列番号１または２の参照により定義される）を、他の種由来のトリプシンで作製してもよいことが、当業者により理解されるであろう。例えば、配列番号３および４で強調表示されている特定の変異（それぞれＨ２５ＮおよびＬ１６０Ｉ）は、アラスカスケトウダラ由来のトリプシンで作製され得る（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ７０４７６．３を参照し、ここで、活性トリプシンのアミノ酸配列が、Ｈ２５がＢＡＨ７０４７６．３のＨ２９などに対応するように、位置Ｉ２０から開始する）。
【０１１０】
本発明の第１の態様のさらなる実施形態では、ポリペプチドは、融合タンパク質を含むか、またはそれからなる。
【０１１１】
ポリペプチドの「融合物」には、任意の他のポリペプチドに融合したプロテアーゼ活性を有するポリペプチドに対応するアミノ酸配列（配列番号１〜１２などまたはそのフラグメントもしくは変異体）が含まれる。例えば、前述のポリペプチドは、前述のポリペプチドの精製を容易にするために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはタンパク質Ａなどのポリペプチドに融合され得る。このような融合物の例は、当業者に周知である。同様に、前述のポリペプチドは、Ｈｉｓ６などのオリゴ−ヒスチジンタグ、または周知のＭｙｃタグエピトープなどの抗体によって認識されるエピトープに融合され得る。前述のポリペプチドの任意の変異体または誘導体への融合物もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０１１２】
融合物は、本発明の前述のポリペプチドに望ましい特徴を与えるさらなる部分を含んでもよく、例えば、その部分は、治療効果を増大または延長するのに有用であり得る。例えば、一実施形態では、融合物は、ヒト血清アルブミンまたは類似のタンパク質を含む。
【０１１３】
代替的に、融合部分は、当業者に周知のように、例えば、ビオチン部分、放射性部分、蛍光部分、例えば、小フルオロフォアまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）フルオロフォアであってもよい。その部分は、当業者に既知のように、免疫原性タグ、例えば、Ｍｙｃタグであってもよく、または当業者に既知のように、ポリペプチドの細胞取り込みを促進することが可能である親油性分子またはポリペプチドドメインであってもよい。
【０１１４】
本発明の第１の態様のさらなる実施形態では、ポリペプチド、またはそのフラグメント、変異体、融合物、もしくは誘導体は、修飾または誘導体化されている１つ以上のアミノ酸を含むか、またはそれからなる。
【０１１５】
１つ以上のアミノ酸の化学的誘導体は、官能性側基との反応によって達成され得る。このような誘導体化分子には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成した分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて塩、メチル、およびエチルエステル、または他の種類のエステルおよびヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。化学的誘導体として、２０の標準アミノ酸の自然発生的なアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよく、５−ヒドロキシリジンでリジンを置換してもよく、３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してもよく、ホモセリンでセリンを、オルニチンでリジンを置換してもよい。誘導体には、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加または欠失を含有するペプチドも含まれる。他に含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる）、および同様の末端修飾である。
【０１１６】
ペプチド模倣化合物も有用であり得ることが当業者によってさらに理解されるであろう。したがって、「ポリペプチド」には、配列番号１〜１２のいずれかのポリペプチドの抗炎症性活性を有するペプチド模倣化合物が含まれる。「ペプチド模倣物」という用語は、治療薬としての特定のペプチドの配座および望ましい特徴を模倣する化合物を指す。
【０１１７】
例えば、本発明で使用するポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって接合されている分子だけでなく、ペプチド結合が逆転されている分子も含む。このようなレトロ−インベルソペプチド模倣物は、例えば、Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されているものなど、当該技術分野で既知の方法を使用して作製され得る（これは参照により本明細書に組み込まれる）（１０）。この手法は、側鎖の配向ではなく、主鎖を伴う変化を含む疑似ペプチドを作製することを含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかに耐性がある。代替的に、本発明のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が従来のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ２ＮＨ）−結合によって結合されているペプチド模倣化合物であってもよい。
【０１１８】
さらなる代替では、ペプチド結合は、完全に省かれてもよいが、ただし、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用されるということを条件とし、リンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有することが有利であり得る。
【０１１９】
ポリペプチドが、Ｎ−またはＣ−末端で便宜的にブロックされて、エキソタンパク質分解消化に対する感受性の低減を助け得ることが理解されるであろう。
【０１２０】
ポリペプチドを修飾するために、Ｄ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸などの様々な非コードまたは修飾アミノ酸も使用されている。加えて、推定される生物活性配座は、環化などの共有結合修飾によって、またはラクタムもしくは他の種類の架橋の組み込みによって安定化され得、例えば、Ｖｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：２６３６およびＴｈｏｒｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１１：１６６を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）（１１、１２）。
【０１２１】
しかしながら、好ましい一実施形態では、ポリペプチドは、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、および／またはアルキル化によって修飾または誘導体化された１つ以上のアミノ酸を含む。
【０１２２】
ポリペプチドが、任意の好適な長さであり得ることが、当業者によって理解されるであろう。好ましくは、ポリペプチドは、１０〜３０アミノ酸長、例えば、１０〜２０、１２〜１８、１２〜１６、または１５〜２０アミノ酸長である。代替的に、ポリペプチドは、１５０〜２５０アミノ酸長、例えば、２００〜２５０、２１０〜２４０、２２０〜２３０、または２２０〜２２５アミノ酸長であってもよい。
【０１２３】
一実施形態では、ポリペプチドは、直鎖状である。
【０１２４】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、組換えポリペプチドである。
【０１２５】
本発明のポリペプチド、ならびにそれを産生するための核酸分子、ベクター、および宿主細胞は、当該技術分野で周知の方法を使用して作製され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照（その文書内の関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる））（８）。
【０１２６】
トリプシンなどのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを産生するための組換え方法は、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａに対するＷＯ２０１５／１５０７９９に開示されており、その開示は参照により組み込まれる。
【０１２７】
代替的に、ポリペプチドは、液相および固相合成（例えば、ｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成およびＢＯＰ−ＳＰＰＳ）などの既知の手段によって合成されてもよい。
【０１２８】
本発明が、上述のポリペプチドの薬学的に許容される酸または塩基付加塩も含むことが、当業者によって理解されるであろう。本発明において有用な上述の塩基化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために使用される酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩、例えば、とりわけ、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３ナフトエート）］塩を形成するものである。
【０１２９】
薬学的に許容される塩基付加塩はまた、ポリペプチドの薬学的に許容される塩形態を産生するために使用され得る。本来酸性である本化合物の薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、このような化合物と非毒性の塩基塩を形成するものである。このような非毒性の塩基塩として、とりわけ、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウムおよびナトリウム）ならびにアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）などの薬理学的に許容されるカチオン、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例えば、Ｎ−メチルグルカミン−（メグルミン）、ならびに低級アルカノールアンモニウムおよび薬学的に許容される有機アミンの他の塩基塩由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
ポリペプチドが、保存のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成され得ることがさらに理解されるであろう。任意の好適な凍結乾燥方法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）および／または再構成技術が用いられ得る。凍結乾燥および再構成が、様々な程度の活性損失をもたらす可能性があり、補償するために使用レベルを上方に調整する必要があり得ることが、当業者によって理解されるであろう。好ましくは、凍結乾燥（フリーズドライ）ポリペプチドは、再水和した場合にその活性（凍結乾燥前）の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を損失する。
【０１３１】
本発明の化合物は、典型的には、ポリペプチドが薬学的に許容される緩衝液、希釈剤、担体、補助剤、または賦形剤と共に製剤化される治療用組成物の形態で提供される。ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ＥＧＴＡ、またはグルタチオンなどのキレート剤を含む追加の化合物が、組成物に含まれ得る。抗ウイルス用／治療用組成物は、十分に貯蔵安定性があり、かつヒトおよび動物への投与に好適である、当該技術分野で既知の方法で調製され得る。治療用組成物は、例えば、フリーズドライ、噴霧乾燥、噴霧冷却を通して、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用を通して凍結乾燥され得る。
【０１３２】
「薬学的に許容される」とは、本発明の化合物のトリプシン活性の有効性を低下させない非毒性材料を意味する。このような薬学的に許容される緩衝液、担体、または賦形剤は、当該技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）およびｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００）を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））（１３、１４）。
【０１３３】
「緩衝液」という用語は、ｐＨを安定化する目的で酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味することを意図している。緩衝液の例として、トリズマ、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、ヘペス、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、およびＴＥＳが挙げられる。
【０１３４】
「希釈剤」という用語は、治療用調製物中のペプチドを希釈する目的を有する水性または非水性溶液を意味することを意図している。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油（ベニバナ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、もしくはゴマ油など）のうちの１つ以上であり得る。
【０１３５】
「補助剤」という用語は、本発明のポリペプチドの生物学的効果を増大させるために製剤に添加される任意の化合物を意味することを意図している。補助剤は、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および異なるアシル組成物の酢酸塩を含むがこれらに限定されない、異なるアニオンを有する亜鉛、銅、または銀塩のうちの１つ以上であり得る。補助剤はまた、カチオン性ポリマー、例えば、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、カチオン性合成ポリマー、例えば、ポリ（ビニルイミダゾール）、ならびにカチオン性ポリペプチド、例えば、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、およびこれらのアミノ酸を含有するペプチドであり得る。
【０１３６】
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質、およびミネラルのうちの１つ以上であり得る。炭水化物の例として、例えば、凍結乾燥を容易にするために組成物に添加される、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、およびシクロデキストリンが挙げられる。ポリマーの例は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、ならびにポリビニルピロリドンであり、全て分子量が異なり、これらは例えば、粘度制御のため、生体接着を達成するため、または化学分解およびタンパク質分解から脂質を保護するために、組成物に添加される。脂質の例は、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、および糖脂質（全てアシル鎖長および飽和が異なる）、卵レシチン、大豆レシチン、水素添加卵および大豆レシチンであり、これらは、ポリマーと同様の理由で組成物に添加される。ミネラルの例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、これらは、液体蓄積の低減または有利な顔料特性などの利点を得るために組成物に添加される。
【０１３７】
一実施形態では、化合物は、塩化カルシウムなどの安定剤と共に提供されてもよい。
【０１３８】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチド剤の送達に好適なことが当該技術分野で既知の任意の種類の治療用組成物に製剤化されてもよい。
【０１３９】
一実施形態では、化合物は、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールもしくは油（ベニバナ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、もしくはゴマ油など）、トラガカントガム、および／または様々な緩衝液中に単純に溶解され得る。
【０１４０】
さらなる実施形態では、本発明の化合物は、リポソームの形態であってもよく、ポリペプチドは、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層、および液晶として凝集形態で存在する、脂質などの両親媒性剤と組み合わされる。リポソーム製剤に好適な脂質として、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な脂質は、血流循環時間を延長するために極性頭部基のポリ（エチレングリコール）によって修飾された上記の脂質も含む。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、ＵＳ４，２３５，８７１に見られ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
本発明の治療用化合物はまた、生分解性ミクロスフェアの形態であり得る。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）、またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）などの脂肪族ポリエステル、およびポリ無水物は、ミクロスフェアの産生において生分解性ポリマーとして広く使用されている。このようなミクロスフェアの調製は、ＵＳ５，８５１，４５１およびＥＰ０  ２１３  ３０３に見られ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
さらなる実施形態では、本発明の化合物は、ポリマーゲルの形態で提供され、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、およびポリビニルピロリドンなどのポリマーは、ペプチドを含有する溶液の増粘に使用される。ポリマーは、ゼラチンまたはコラーゲンも含み得る。
【０１４３】
本発明の化合物が、ポリペプチドの作用を増強するためのイオンおよび規定のｐＨを含み得ることが理解されるであろう。追加として、組成物は、滅菌などの従来の治療操作に供されてもよく、かつ／または保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、充填剤などの従来の補助剤を含有してもよい。
【０１４４】
好ましい一実施形態では、化合物は、ＥＤＴＡ、キシリトール、ソルビトール、プロピレングリコール、およびグリセロールのうちの１つ以上と共に、トリスまたはリン酸緩衝液中に製剤化される。
【０１４５】
本発明による化合物およびその治療用組成物は、当業者に既知の任意の好適な経路を介して投与され得る。したがって、可能な投与経路として、経口、口腔、非経口（静脈内、皮下、および筋肉内）、局所、眼、鼻、肺、非経口、膣、および直腸が含まれる。また、インプラントからの投与も可能である。
【０１４６】
好ましい一実施形態では、治療用組成物は、中咽頭への送達に好適な形態で局所投与される。例えば、ポリペプチドは、口内スプレー、ロゼンジ、トローチ、錠剤、シロップ、またはチューインガムとして製剤化され得る。
【０１４７】
代替的な実施形態では、治療用組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、脳室内、関節内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、もしくは皮下に投与されるか、または注入技術によって投与され得る。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態で便宜的に使用される。水溶液は、必要に応じて好適に緩衝化されるべきである（好ましくは３〜９のｐＨに）。滅菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。
【０１４８】
非経口投与に好適な製剤として、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の無菌注射液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提示されてもよく、使用直前に、例えば、注射用水などの滅菌液体担体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０１４９】
治療用組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効な」は、所与の条件および投与レジメンに対して治療効果を提供する量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルに関連して所望の治療効果をもたらすように計算された、活性材料の所定の量である。さらに、宿主の活性、機能、および応答の臨床的に有意な欠損を低減させ、最も好ましくは予防するために十分な量を意味することが意図される。代替的に、治療有効量は、宿主の臨床的に有意な状態を改善させるために十分である。当業者によって理解されるように、化合物の量は、その特異的活性に応じて変動し得る。好適な投与量は、必要とされる希釈剤に関連して、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の化合物の製造のための方法および使用において、治療有効量の活性構成成分が提供される。治療有効量は、当該技術分野において周知であるように、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、通常の技能を有する医療または獣医学従事者によって決定され得る。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位または複数のより小さい用量単位の形態における単回投与によって、または特定の間隔での細分用量の複数回投与によって実施され得る。代替的に、用量は、長期間にわたる連続注入として提供されてもよい。
【０１５０】
本発明の例示的な治療用組成物について、以下の実施例において説明する。
【０１５１】
一実施形態では、ポリペプチドは、中咽頭への送達を容易にするように構成され得る、送達デバイス、例えば、スプレー容器で提供され得る。
【０１５２】
一実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上の追加の活性剤と組み合わせて使用するためのものである。
【０１５３】
例えば、追加の活性剤は、抗菌剤（抗生物質、抗ウイルス剤、および抗真菌剤を含む）、抗炎症剤（ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤を含む）、ならびに防腐剤からなる群から選択され得る。
【０１５４】
一実施形態では、活性剤は、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、モノバクタム、カルバペネム、およびマクロライドからなる群から選択される１つ以上の抗菌剤である。
【０１５５】
例えば、抗生物質は、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、アジスロマイシン、カルベニシリン、カルバペネム、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ダラシン、ダルホプリスチン、ダプトマイシン、ドキシシクリン、エンロフロキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルオロキノロン、ゲンタマイシン、マルボフロキサシン、メロペネム、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ナフシリン、オフロキサシン、オキサシリン、ペニシリン、キヌプリスチン、リファンピン、スルファジアジン銀、スルファメトキサゾール、テイコプラニン、テトラサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、バンコマイシン、バシトラシン、およびポリミキシンＢ、またはそれらの混合物からなる群から選択され得る。
【０１５６】
一実施形態では、追加の抗生物質は、局所または経口投与用であり得る。
【０１５７】
本発明の第２の関連する態様は、哺乳動物におけるライノウイルス感染の治療または予防のための薬剤の調製における、本発明の第１の態様による化合物の使用を提供する。
【０１５８】
有利には、化合物は、安息香酸４−ヒドロキシプロピルエステルである。
【０１５９】
一実施形態では、薬剤は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含む。プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸配列、あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含み得るか、またはそれからなり得る。例えば、ポリペプチドは、タイセイヨウダラ由来のトリプシン、例えば、トリプシンＩまたはトリプシンＺＴであり得る。
【０１６０】
本発明の関連する第３の態様は、本発明の第１の態様による化合物の治療有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物におけるライノウイルス感染の治療または予防のための方法を提供する。
【０１６１】
有利には、化合物は、安息香酸４−ヒドロキシプロピルエステルである。
【０１６２】
一実施形態では、この方法は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを投与することをさらに含む。
【０１６３】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１または２のアミノ酸配列、あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含み得るか、またはそれからなり得る。例えば、ポリペプチドは、タイセイヨウダラ由来のトリプシン、例えば、トリプシンＩまたはトリプシンＺＴであり得る。
【０１６４】
本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータの選好およびオプションは、文脈がそうでないことを示さない限り、本発明の他の全ての態様、特徴、およびパラメータのありとあらゆる選好およびオプションと組み合わせて開示されたと見なされるべきである。例えば、一実施形態では、本発明は、ヒトにおけるコロナウイルス感染の治療における使用のための、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
【０１６５】
本明細書内の明らかに以前に発行された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が、先端技術の一部であるか、または一般共通の知識であると認識されるべきではない。
【０１６６】
請求項および／または本明細書において「含む」という用語と組み合わせて使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。
【０１６７】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、上記の説明と併せて考慮した場合、よりよく認識および理解されるであろう。しかしながら、上記の説明は、本発明の様々な実施形態およびその多くの特定の詳細を示しているが、限定ではなく例示として与えられていることを理解されたい。本発明の趣旨から逸脱することなく、本発明の範囲内で多くの置換、修正、追加、および／または再配置が行われてもよく、本発明は、このような置換、修正、追加、および／または再配置を全て含む。
【０１６８】
ここで、本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例について説明する。
【０１６９】
本明細書内の明らかに以前に発行された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が、先端技術の一部であるか、または一般共通の知識であると認識されるべきではない。
【０１７０】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例について、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】アッセイプロトコルの概略図
【図２】ライノウイルスＲＶ１６力価に対する安息香酸４−ヒドロキシプロピルエステル（「プラセボ」）およびＰＢＳ陰性対照（「ＰＢＳ」）による前処理のみの効果。
【図３】ライノウイルスＲＶ１６力価に対する安息香酸４−ヒドロキシプロピルエステル（「プラセボ」）およびＰＢＳ陰性対照（「ＰＢＳ」）による前処理および後処理の組み合わせの効果。
【実施例】
【０１７２】
材料および方法
【表２】
2021513514.tif 000015
【０１７３】
アッセイプロトコル
●ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞をウェル当たり１．７ｘ１０５細胞で１２個のウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ培地中で２４時間増殖させた
●次に、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地に入れた
●プラセボを１０ｍＬのユニバーサルチューブ内に噴霧し、これを使用して、２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地中で１／２、１／５、および１／１０の希釈を産生した。
●リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４を比較（陰性対照）として使用し、同様に希釈した。
●ウェル当たり１ｍＬを各ウェルに添加し、９０分間培養した（前処理）
●試験製剤またはＰＢＳを含有する上清を除去し、次に、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を１ＲＶ１６のＭＯＩにより室温で１時間、振とうしながら感染させた。
●ＲＶ１６を、２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地中で３回洗い流した
●次に、前処理では、２％ＦＣＳ含有培地を１ウェル当たり１ｍＬ添加した。
●前処理および後処理では、試験製剤およびＰＢＳ対照を上記のように新たに希釈し、ウェル当たり１ｍＬを添加した。
●細胞を４８時間培養し、次に、上清を−２０℃で凍結した。
●上清を解凍し、１０倍に段階希釈して、標準の実験室プロトコルを使用して、８回の複製でＨｅＬａ細胞の滴定に使用した。感染後４日目に全てのプレートを読み取った
●図１参照
【０１７４】
結果
●ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞は、試験製剤およびＰＢＳ対照による前処理後、または前処理および後処理の後に、どの希釈でも明らかな有害な効果を呈さなかった
●前処理のみでは、ＲＶ１６力価に効果がなかったように見えた（図２参照）
●前処理および後処理では、１／２希釈の試験製剤ではＲＶ１６力価が９８．５％低減した（図３参照）
●１／５希釈の試験製剤では、ＲＶ１６力価が６８％低減した
●１／１０希釈の試験製剤では、効果が見られなかった。
【０１７５】
結論
●データは、試験製剤がライノウイルスの複製を阻害することを示している。
【図１】
2021513514.tif 000018
【図２】
2021513514.tif 000019
【図３】
2021513514.tif 000020
【配列表】
2021513514000001.app
【国際調査報告】
2021513514.tif 000021
2021513514.tif 000022
2021513514.tif 000023