(57)【要約】本発明は、抗体媒介受容体シグナル伝達を増強するための組成物および方法を提供する。2021518411.tif 000048
2021518411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む操作されたポリペプチドであって、前記Ｆｃバリアントが、少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、残基位置２２８、２３４、２３５、２７０、３２２、３２９、３３１、３３３、３４５、４０９、４３０、４４０、またはそれらの組み合わせにおいて生じており、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、ポリペプチド。
【請求項２】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８の前記アミノ酸が、プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３４の前記アミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３５の前記アミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３４５のグルタミン酸（Ｅ）が、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４０９の前記アミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４３０のグルタミン酸（Ｅ）が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４４０のセリン（Ｓ）が、トリプトファン（Ｗ）で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２７０のアスパラギン酸（Ｄ）が、中性非極性アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２２のリジン（Ｋ）が、中性非極性アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２９のプロリン（Ｐ）が、中性非極性アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３１の前記アミノ酸が、中性非極性アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記中性非極性アミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む、請求項９、１０、１１、または１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３３のグルタミン酸（Ｅ）が、中性極性アミノ酸で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記中性極性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記アミノ酸置換が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３４５Ｋ、およびＥ４３０Ｇを含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記アミノ酸置換が、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ３４５Ｋ、Ｒ４０９Ｋ、およびＥ４３０Ｇを含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記アミノ酸置換が、Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、およびＰ３３１Ｇをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記アミノ酸置換が、Ｄ２７０ＡおよびＰ３３１Ｇをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記アミノ酸置換が、Ｄ２７０Ａ、Ｐ３３１Ｖ、およびＥ３３３Ｑをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記アミノ酸置換が、Ｐ３２９Ｖをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記アミノ酸置換が、Ｐ３３１Ｖをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換が、Ｐ３２９ＶおよびＰ３３１Ｖをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記アミノ酸置換が、Ｐ３２９Ｖおよび／またはＰ３３１Ｆをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、１つ以上のヒトＦｃ受容体に対して低減した親和性を示す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、増加した受容体クラスター化をさらに示す、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
減少した補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をさらに示す、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記抗体が、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
薬物、毒素、放射性標識、またはそれらの組み合わせにコンジュゲートされている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
Ｔ細胞上の阻害分子に特異的な抗体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
Ｔ細胞上の前記阻害分子が、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、またはＫＩＲを含む、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
Ｔ細胞上の刺激分子に特異的な抗体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
Ｔ細胞上の前記刺激分子が、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−ＢＢ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２８を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
ケモカイン受容体に特異的な抗体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記ケモカイン受容体が、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ４、またはＣＣＲ５を含む、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
腫瘍細胞上の腫瘍関連分子に特異的な抗体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
腫瘍細胞上の前記腫瘍関連分子が、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、抗原提示細胞分子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記抗原提示細胞分子が、ＰＤＬ１またはＰＤＬ２を含む、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
感染因子に特異的な抗体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記感染因子が、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群ウイルス（ＭＥＲＳ）、アルファウイルス、フラビウイルス、またはインフルエンザウイルスを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記アルファウイルスが、西部馬脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、またはチクングニアウイルス（ＣＨＫＶ）を含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記フラビウイルスが、蚊媒介性である、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記フラビウイルスが、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、デンジウイルス血清型１〜４、黄熱ウイルス、またはジカウイルスを含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記インフルエンザウイルスが、新興インフルエンザウイルスである、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記抗体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のターゲティングドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの組み合わせが、細胞外ドメインに組み込まれている、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に特異的な抗体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
ＣＣＲ４に特異的な抗体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
ＦｃバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む操作されたポリペプチドであって、前記Ｆｃバリアントが、配列番号４に対する少なくとも９０％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じている、ポリペプチド。
【請求項５２】
Ｘ１が、セリン（Ｓ）を含むアミノ酸置換である、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
Ｘ２が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
Ｘ３が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
Ｘ４が、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
Ｘ５が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
Ｘ６が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
Ｘ７が、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＦｃバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む操作されたポリペプチドであって、前記Ｆｃバリアントが、配列番号５に対する少なくとも９０％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じている、ポリペプチド。
【請求項６０】
Ｘ１が、セリン（Ｓ）を含むアミノ酸置換である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
Ｘ２が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
Ｘ３が、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
Ｘ４が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
Ｘ５が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
Ｘ６が、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
ＦｃバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む操作されたポリペプチドであって、前記Ｆｃバリアントが、配列番号６に対する少なくとも９０％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じている、ポリペプチド。
【請求項６７】
Ｘ１が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８のアミノ酸の置換であり、かつプロリン（Ｐ）を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
Ｘ２が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
Ｘ３が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
Ｘ４が、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
Ｘ５が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
Ｘ６が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
Ｘ７が、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、またはＸＤが、中性非極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である、請求項５１、５９、または６６に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
前記中性非極性アミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む、請求項７４に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
ＸＥが、中性極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である、請求項５１、５９、または６６に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
前記中性極性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む、請求項７６に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
表１Ｂに開示される可変領域アミノ酸配列と、表８Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４５）、表９Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４７）、表１０Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４９）、表１１Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５１）、表１２Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５３）、表１３Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５５）、表１４Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５７）、または表１５Ｂ（配列番号１８、１９、２４、２６、５９）に開示されるバリアントＦｃ領域アミノ酸配列と、を含む、組換えＧＩＴＲ抗体。
【請求項７９】
表１Ｂに開示される可変領域アミノ酸配列と、表８Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４５）、表９Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４７）、表１０Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４９）、表１１Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５１）、表１２Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５３）、表１３Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５５）、表１４Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５７）、または表１５Ｂ（配列番号１８、１９、２４、２６、５９）に開示されるバリアントＦｃ領域アミノ酸配列と、を含む、組換えＣＣＲ４抗体。
【請求項８０】
請求項７８に記載の組換えＧＩＴＲ抗体または請求項７９に記載の組換えＣＣＲ４抗体を対象に投与する工程を含む、Ｔ細胞免疫を増強する方法。
【請求項８１】
請求項７８に記載の組換えＧＩＴＲ抗体を対象に投与する工程を含む、対象における腫瘍を治療する方法。
【請求項８２】
請求項７９に記載の組換えＣＣＲ４抗体を対象に投与する工程を含む、ＣＣＬ２２／１７分泌腫瘍を治療する方法。
【請求項８３】
前記ＣＣＬ２２／１７分泌腫瘍が、血液系がんである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記血液系がんが、リンパ腫または白血病である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＣＣＬ２２／１７分泌腫瘍が、卵巣癌である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
リガンドを細胞に結合させる抗体に細胞を接触させる工程を含む、細胞の細胞シグナル伝達を増強する方法であって、前記抗体が、請求項１、５１、５９、もしくは６６に記載のポリペプチドまたは野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、前記Ｆｃバリアントが、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１、Ｅ３３３、Ｅ３４５、Ｅ４３０、および／またはＳ４４０においてアミノ酸置換を含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、方法。
【請求項８７】
前記置換が、Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３３１Ｇ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｆ、Ｅ３３３Ｑ、Ｅ４３０Ｇ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、Ｅ４３０Ｔ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｓ４４０Ｗ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
リガンドを細胞に結合させる抗体に細胞を接触させる工程を含む、細胞の受容体クラスター化を誘導する方法であって、前記抗体が、請求項１、５１、５９、もしくは６６に記載のポリペプチドまたは野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、前記Ｆｃバリアントが、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１、Ｅ３３３、Ｅ３４５、Ｅ４３０、および／またはＳ４４０においてアミノ酸置換を含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、方法。
【請求項８９】
前記置換が、Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３３１Ｇ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｆ、Ｅ３３３Ｑ、Ｅ４３０Ｇ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、Ｅ４３０Ｔ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｓ４４０Ｗ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
腫瘍が、固形腫瘍または液体腫瘍である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
リガンドを細胞に結合させる抗体に細胞を接触させる工程を含む、細胞のＣＤＣ活性を低減する方法であって、前記抗体が、請求項１、５１、５９、もしくは６６に記載のポリペプチドまたは野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、前記Ｆｃバリアントが、Ｄ２７０、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１、および／またはＥ３３３においてアミノ酸置換を含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／６４６，０５３号の優先権を主張し、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載され特許請求される本発明の日付の当業者に既知の最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、参照により本出願に組み込まれる。
【０００３】
本特許開示は、著作権保護の対象となる、材料を含む。著作権所有者は、米国特許商標局の特許ファイルまたは記録に表れているように、特許文書または特許開示のいずれかによってファクシミリ複製に異議はないが、それ以外では、何であれすべての著作権を留保する。
【０００４】
発明の分野
本発明は、一般に、強化された機能を有する治療抗体に関する。具体的には、本発明は、Ｆｃ領域のバリアントを含むポリペプチド、およびそれを含む抗体に関する。より具体的には、本発明は、ポリペプチドのＦｃ領域における１つ以上のアミノ酸置換の結果として変更されたエフェクター機能を有するＦｃ領域含有ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
モノクローナル抗体は、大きな治療可能性を有し、今日の医療ポートフォリオにおいて重要な役割を果たす。過去１０年間、製薬業界における重要な傾向は、がん、喘息、関節炎、および多発性硬化症などの多くの疾患の治療のための治療剤としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発であった。
【０００６】
抗体のＦｃ領域、すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインに及ぶ抗体の重鎖の末端、およびヒンジ領域の一部分は、可変性が制限されており、抗体が果たす生理学的役割への影響に関与している。抗体のＦｃ領域に起因するエフェクター機能は、抗体のクラスおよびサブクラスで異なり、Ｆｃ領域を介した細胞上の特定のＦｃ受容体（「ＦｃＲ」）への抗体の結合を含み、これは様々な生物学的応答を引き起こす。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアント、例えば、ヒトＩｇＧのＦｃにおけるＤ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３３１Ｖ、Ｅ３３３Ｑのうちの１つ以上と組み合わせて、アミノ酸置換Ｅ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａ；またはＥ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、Ｓ２２８Ｐ、およびＲ４０９Ｋを有するＦｃバリアントを含むポリペプチドを特徴とする。残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３（１９６９）７８−８５を参照されたい）。ポリペプチドは、低減したＣＤＣ活性に加えて、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有するポリペプチドと比較して、ヒトＦｃ受容体のうちの１つ以上に対する低減した親和性および／または増加した受容体クラスター化を示す。
【０００８】
本発明の一態様は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む操作されたポリペプチドに関する。一実施形態では、Ｆｃバリアントは、残基位置２２８、２３４、２３５、２７０、３２２、３２９、３３１、３３３、３４５、４０９、４３０、４４０、またはそれらの組み合わせにおいて１つのアミノ酸置換、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個の置換を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８のアミノ酸は、プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３４のアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３５のアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３４５のグルタミン酸（Ｅ）は、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４０９のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４３０のグルタミン酸（Ｅ）は、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４４０のセリン（Ｓ）は、トリプトファン（Ｗ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２７０のアスパラギン酸（Ｄ）は、中性非極性アミノ酸で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２２のリジン（Ｋ）は、中性非極性アミノ酸で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２９のプロリン（Ｐ）は、中性非極性アミノ酸で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３１のアミノ酸は、中性非極性アミノ酸で置換されている。一実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３３のグルタミン酸（Ｅ）は、中性極性アミノ酸で置換されている。一実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）である。一実施形態では、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３４５Ｋ、およびＥ４３０Ｇを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。一実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ３４５Ｋ、Ｒ４０９Ｋ、およびＥ４３０Ｇを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、およびＰ３３１Ｇをさら���含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｄ２７０ＡおよびＰ３３１Ｇをさらに含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｄ２７０Ａ、Ｐ３３１Ｖ、およびＥ３３３Ｑをさらに含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ｖをさらに含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３３１Ｖをさらに含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９ＶおよびＰ３３１Ｖをさらに含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ｖおよび／またはＰ３３１Ｆをさらに含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、ヒトＦｃ受容体のうちの１つ以上に対して低減した親和性を示す。他の実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、増加した受容体クラスター化をさらに示す。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、減少した補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をさらに示す。
【０００９】
本発明の態様は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む操作されたポリペプチドに関し、Ｆｃバリアントは、配列番号４に対する少なくとも９０％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じる。一実施形態では、Ｆｃバリアントは、配列番号４に対する少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｘ１は、セリン（Ｓ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ２は、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ３は、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ４は、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ５は、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ６は、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ７は、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、またはＸＤは、中性非極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。別の実施形態では、ＸＥは、中性極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む。
【００１０】
本発明の態様は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む操作されたポリペプチドに関し、Ｆｃバリアントは、配列番号５に対する少なくとも９０％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じる。一実施形態では、Ｆｃバリアントは、配列番号５に対する少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｘ１は、セリン（Ｓ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ２は、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ３は、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ４は、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ５は、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ６は、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、またはＸＤは、中性非極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。別の実施形態では、ＸＥは、中性極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む。
【００１１】
本発明の態様は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む操作されたポリペプチドに関し、Ｆｃバリアントは、配列番号６に対する少なくとも９０％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じる。一実施形態では、Ｆｃバリアントは、配列番号６に対する少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｘ１は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８のアミノ酸の置換であり、プロリン（Ｐ）を含む。一実施形態では、Ｘ２は、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ３は、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ４は、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ５は、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ６は、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｘ７は、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である。一実施形態では、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、またはＸＤは、中性非極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。別の実施形態では、ＸＥは、中性極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む。
【００１２】
ポリペプチドは、例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質である。抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を有することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２８などの免疫モジュレーターに特異的な抗体であり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ細胞上の阻害分子、例えば、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、またはＫＩＲに特異的な抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ細胞上の刺激分子、例えば、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−ＢＢ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２８に特異的な抗体である。他の実施形態では、ポリペプチドは、ケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ４、またはＣＣＲ５に特異的な抗体である。他の実施形態では、ポリペプチドは、腫瘍細胞上の腫瘍関連分子、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、抗原提示細胞分子、またはそれらの組み合わせに特異的な抗体である。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞分子は、ＰＤＬ１またはＰＤＬ２を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、感染因子に特異的な抗体である。さらなる実施形態では、感染因子は、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群ウイルス（ＭＥＲＳ）、アルファウイルス、フラビウイルス、またはインフルエンザウイルスを含む。例えば、アルファウイルスは、西部馬脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、またはチクングニアウイルス（ＣＨＫＶ）であり得る。例えば、フラビウイルスは、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、デンジウイルス血清型１〜４、黄熱病ウイルス、またはジカウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、フラビウイルスは、蚊媒介性である。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、新興インフルエンザウイルスである。他の実施形態では、抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のターゲティングドメインを含む。さらに他の実施形態では、ＩｇＧ  ＦｃのＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの組み合わせは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の細胞外ドメインに組み込まれる。任意に、ポリペプチドは、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＰＤＬ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ１、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ＴＩＧＩＴ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、インフルエンザまたはフラビウイルスに特異的な抗体である。
【００１３】
一実施形態では、ポリペプチドは、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に特異的な抗体である。一実施形態では、組換えＧＩＴＲ抗体は、表１Ｂに開示される可変領域アミノ酸配列と、表８Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４５）、表９Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４７）、表１０Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４９）、表１１Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５１）、表１２Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５３）、表１３Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５５）、表１４Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５７）、または表１５Ｂ（配列番号１８、１９、２４、２６、５９）に開示されるバリアントＦｃ領域アミノ酸配列と、を含む。
【００１４】
一実施形態では、ポリペプチドは、ＣＣＲ４に特異的な抗体である。一実施形態では、組換えＣＣＲ４抗体は、表１Ｂに開示される可変領域アミノ酸配列と、表８Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４５）、表９Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４７）、表１０Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、４９）、表１１Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５１）、表１２Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５３）、表１３Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５５）、表１４Ｂ（配列番号１８、１９、２２、２６、５７）、または表１５Ｂ（配列番号１８、１９、２４、２６、５９）に開示されるバリアントＦｃ領域アミノ酸配列と、を含む。
【００１５】
様々な態様では、ポリペプチドは、当該技術分野において実施されるように、薬物、毒素、放射性標識、またはそれらの組み合わせにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、毒素は、シュードモナス外毒素、リシン、ボツリヌス毒素、または当業者によって使用される他の毒素、例えば、（その全体が参照によって組み込まれる）Ｐｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．２０１６  Ｊｕｎ  １；４（２）．ｐｉｉ：Ｅ１２．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ４０２００１２）によって記載されるものであり得る。いくつかの実施形態では、放射性標識は、イットリウム−９０、レニウム−１８８、ルテチウム−１７７、ストロンチウム−８９、ラジウム−２２３などであり得る。いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲートは、モノメチルオーイスタチンＥ、または例えば、（その全体が参照によって組み込まれる）Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６  Ｍａｙ；３６  Ｓｕｐｐｌ  １：１００−７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０８７５−０１６−０２６５−６．Ｅｐｕｂ  ２０１６  Ｍａｒ  ２２）によって記載されるものであり得る。
【００１６】
また、本発明には、本発明によるポリペプチド、またはそれをコードする核酸を投与することによって、疾患に罹患した対象を治療する方法が含まれる。また、本発明には、本発明によるポリペプチドまたはそれをコードする核酸および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の組成物を対象に投与することによって、疾患に罹患した対象を治療する方法が含まれる。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞免疫を増強する方法を提供し、方法は、本明細書に記載される組換えＧＩＴＲ抗体または本明細書に記載される組換えＣＣＲ４抗体を対象に投与する工程を含む。一実施形態では、本発明は、対象における腫瘍を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載される組換えＧＩＴＲ抗体または本明細書に記載される組換えＣＣＲ４抗体を対象に投与する工程を含む。一実施形態では、本発明は、ＣＣＬ２２／１７分泌腫瘍を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載される組換えＧＩＴＲ抗体または本明細書に記載される組換えＣＣＲ４抗体を対象に投与する工程を含む。一実施形態では、ＣＣＬ２２／１７分泌腫瘍は、血液系がんである。一実施形態では、血液系がんは、リンパ腫または白血病である。一実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍または液体腫瘍である。一実施形態では、ＣＣＬ２２／１７分泌腫瘍は、卵巣癌である。いくつかの実施形態では、液体腫瘍は、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であり得る。一実施形態では、本発明は、対象における血液系がんを治療することを提供し、方法は、本明細書に記載される組換えＣＣＲ４抗体を対象に投与する工程を含む。一実施形態では、血液系がんは、リンパ腫または白血病である。
【００１８】
他の態様では、本発明は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む細胞上のリガンドに結合することができる抗体に細胞を接触させることによって、細胞シグナル伝達を増強するか、または細胞の受容体クラスター化を誘導する方法を提供する。他の態様では、本発明は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む細胞上のリガンドに結合することができる抗体に細胞を接触させることによって、細胞のＣＤＣ活性を低減する方法を提供する。Ｆｃバリアントは、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１、Ｅ３４５、Ｅ４３０、および／またはＳ４４０のアミノ酸置換などのアミノ酸置換を有し、残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。一実施形態では、変異は、Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３３１Ｇ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｆ、Ｅ３３３Ｑ、Ｅ４３０Ｇ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、Ｅ４３０Ｔ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｓ４４０Ｗのうちの１つ以上を含む。
【００１９】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施に使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によってその全体が明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。加えて、本明細書に記載される材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、それらによって包含されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】２９３Ｆ細胞から発現および精製された抗ＧＩＴＲ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。抗ＧＩＴＲ抗体Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ（レーン１）、Ｅ１−３Ｈ７安定化ＩｇＧ４（レーン２）、ＣＴＩ−１０安定化ＩｇＧ４（レーン３）、Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡヘキサマー（レーン４）、Ｅ１−３Ｈ７安定化ＩｇＧ４ヘキサマー（レーン５）、およびＥ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー（レーン６）をコードするｐＴＣＡＥプラスミドを、２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトさせる。細胞上清を、９６時間後に採取し、プロテインＡアフィニティー樹脂で精製した。約２ｕｇ（精製後ＯＤ２８０読み取りによって測定）の各精製抗体を４〜２０％ポリアクリルアミドゲルによって分析し、クーマシーブルー染色によって可視化した。レーン７は、対照ＣＴＩ−１０  ＩｇＧ１を既知の濃度で含有する。パネルＡ還元条件、パネルＢ非還元条件。データは、各抗体が発現および精製されたことを示す。
【図２】Ｐｒｏｍｅｇａによって作製され、我々のアッセイにおいて使用されるＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＮＦ−ｋＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイシステム内で、ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲＬ相互作用がＮＦ−ｋＢ経路を活性化することを示す図である。
【図３−１】ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＮＦ−ｋＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞は、表面に発現した受容体ＧＩＴＲとのルシフェラーゼ活性に基づくリガンドまたは抗体反応を生成するレポーター細胞である。システム対照として、パネルＡは、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）が、予想されるルシフェラーゼ活性を誘導したことを示し、パネルＢは、抗ＨＡ抗体が、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬで誘導されたルシフェラーゼ活性をさらに増強するというデータを示す（ＧＬＴＲＬはｃ末端ＨＡタグと融合していることに留意されたい）。
【図３−２】パネルＣは、我々の新たに発見された抗ＧＩＴＲ抗体Ｅ１−３Ｈ７−ｓＩｇＧ４が、ＧｉＴＲ／ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼを単独で誘導するか、または１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬで誘導されるルシフェラーゼ活性をさらに増強することができることを示し、これは市販の抗ＧＩＴＲ  Ａｂ対照、ＣＴＩ−１０、パネルＤの挙動とは異なる。
【図４−１】ヘキサマー化抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体は、ＧＩＴＲ／ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼ活性の媒介において増加した感度を有する。（Ａ）抗ＧＩＴＲ抗体Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１−ＬＡＬＡおよび対応するヘキサマー（Ｅ１−３Ｈ７−ＬＡＬＡ  Ｈｅｘ）は、ルシフェラーゼ活性をＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＮＦ−ｋＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞から用量依存的に誘導した。Ｅ１−３Ｈ７ヘキサマーは、ルシフェラーゼ誘導を抗体濃度において約１ｌｏｇ低い方にシフトすることができたことに留意されたい。（Ｂ）抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体は、ＧＩＴＲＬ誘導性ルシフェラーゼ活性をさらに増強する。もう一度、Ｅ１−３Ｈ７−ＬＡＬＡヘキサマーは、そのような誘導をはるかに低いＡｂ濃度で達成した。パネルＣおよびＤは、Ｅ１−３Ｈ７での同様の効果がＩｇＧ４およびその対応するｓＩｇＧ４ヘキサマーを安定させたことを示す。抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体は、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲリガンドの不在下（パネルＡおよびＣ）または存在下（パネルＢおよびＤ）で、５０００ｎｇ／ｍｌから２０．５８ｎｇ／ｍｌまでの３倍希釈で使用した。
【図４−２】図４−１の説明を参照のこと。
【図５−１】ヘキサマー化抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体は、ＧＩＴＲ／ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼ活性の媒介において増加した感度を有する。ルシフェラーゼ誘導の完全な範囲を確認するために、抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７−ＩｇＧ１  ＬＡＬＡまたはＩｇＧ４抗体濃度が、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲリガンドの不在下（パネルＡおよびＣ）または存在下（パネルＢおよびＤ）で、１５０００ｎｇ／ｍｌから６１．７３ｎｇ／ｍｌまでの３倍希釈で使用されたことを除いて、図４に示されるものと同様の実験であり、それらの対応するヘキサマー形式は、５０００ｎｇ／ｍｌから２０．５８ｎｇ／ｍｌまでのままであった。無関係なＩｇＧ対照は、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬによるルシフェラーゼ誘導のベースレベルに対する有意な効果を示さなかった。
【図５−２】図５−１の説明を参照のこと。
【図６−１】抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体のＩｇＧ１  Ｆｃ野生型、ＩｇＧ１  Ｆｃ  ＬＡＬＡ変異体、または安定化ＩｇＧ４ヘキサマーは、ＧＩＴＲ／ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼ活性の媒介において同様の活性を有する。抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７−ＩｇＧ１  ＷＴまたはＩｇＧ  １  ＬＡＬＡまたはｓＩｇＧ４ヘキサマー抗体濃度は、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲリガンドの不在下または存在下で、５０００ｎｇ／ｍｌから２０．５８ｎｇ／ｍｌまでの３倍希釈で使用したが、対照ＩｇＧ１は、１５０００ｎｇ／ｍｌから６１．７３ｎｇ／ｍｌまでの濃度を有する。パネルＡにおけるＥ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー結果は、パネルＢおよびＣまたはパネルＤおよびＥに提示されるものとは別の実験からのものであることに留意されたい。Ｘ軸およびＹ軸は、パネルＡ〜Ｅについて同じである。
【図６−２】図６−１の説明を参照のこと。
【図７】Ｐｒｏｍｅｇａからのレポーターシステムを用いたＡＤＣＣアッセイ。
【図８−１】ＩｇＧ１のＷＴおよびＬＡＬＡヘキサマー変異体のＦｃ領域の核酸およびアミノ酸配列。
【図８−２】図８−１の説明を参照のこと。
【図８−３】図８−１の説明を参照のこと。
【図８−４】図８−１の説明を参照のこと。
【図８−５】図８−１の説明を参照のこと。
【図９−１】安定化ヘキサマーＩｇＧ４のＦｃ領域の核酸およびアミノ酸配列。
【図９−２】図９−１の説明を参照のこと。
【図９−３】図９−１の説明を参照のこと。
【図１０】ＩｇＧ抗体の哺乳動物発現に使用することができるベクターのための発現ベクターマップ。
【図１１】ＩｇＧ抗体の哺乳動物発現に使用することができるベクターのための発現ベクターマップ。
【図１２−１】ＩｇＧ１の野生型Ｆｃ領域についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびＫａｂａｔのＥＵインデックスによる対応するアミノ酸残基番号である。
【図１２−２】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−３】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−４】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−５】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−６】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−７】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１３−１】ＩｇＧ２の野生型Ｆｃ領域についてのアミノ酸配列（配列番号２）およびＫａｂａｔのＥＵインデックスによる対応するアミノ酸残基番号である。
【図１３−２】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−３】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−４】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−５】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−６】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−７】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１４−１】ＩｇＧ４の野生型Ｆｃ領域についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびＫａｂａｔのＥＵインデックスによる対応するアミノ酸残基番号である。
【図１４−２】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−３】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−４】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−５】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−６】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−７】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１５】ＣＤＣ活性が、ｓＩｇＧ４モノマーを除き、すべての抗ＧＩＴＲ  Ａｂ構築物に残ることを示すグラフである。グラフは、細胞殺滅の量を定量化するために異なる試薬を使用した同様の実験を表す。左のグラフのアッセイは、培養中の生存細胞の数を決定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏシステムを使用するが、右のグラフのアッセイは、死細胞のみをカウントするＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏを使用する。
【図１６】減少した補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を生成するためにＬＡＬＡ−ヘキサマー構築物のＣＨ２領域に導入されたいくつかの変異のリボン構造の図である。図１６のパネルＡは、Ｃ１ｑ結合に関与しており、変異の標的とされるＣＨ２におけるその重要な残基を示す。パネルＢ〜Ｈは、各構築物において変異した残基（複数可）、および変異による予測される効果（複数可）を示す。パネルＩおよびＪは、２つのＣＬ融合体を示し、１つは抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖとの、もう１つはＧＦＰアナログｚｓＧｒｅｅｎとのものである。
【図１７−１】ＧＩＴＲ変異体のＳＤＳページゲル（非還元ゲル、還元ゲル（１０％ＢＭＥ））の写真画像である。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅをトランスフェクトし、採取およびプロテインＡコンジュゲートセファロースを介した精製前の５日間培養した。１ｕｇの各精製タンパク質を、Ｂｏｌｔ（商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓ  Ｇｅｌで泳動した。右のゲル中の試料は還元されておらず、左のゲルは１０％β−メルカプトエタノールで還元されている。レーン１．ラダー（Ｂｉｏｒａｄプレシジョンプラス）、レーン２．ｍＡｂ２−３  ＩｇＧ１  ＷＴモノマー、レーン３．ｍＡｂ２−３  ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー、レーン４．Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴモノマー、レーン５．Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー、レーン６．Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡモノマー、レーン７．Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡヘキサマー、レーン８．Ｍｔ  １、レーン９．Ｍｔ  ２、レーン１０．Ｍｔ  ３、レーン１１．ＰＶ、レーン１２．ＶＰ、レーン１３．ＶＶ、レーン１４．ａＰＤＬ１、およびレーン１５．ＰＦ（Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ）。
【図１７−２】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１８】ＧＩＴＲ＋細胞に結合する抗ＧＩＴＲ  Ａｂの結合曲線であり、結合について陽性の細胞％に関してフローサイトメトリーによって分析されている。試験されたＧＩＴＲヘキサマー変異体のキー：（ａ）Ｍｔ１：Ｄ２７０Ａ  Ｋ３２２Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｂ）Ｍｔ２：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｃ）Ｍｔ３：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑ、（ｄ）ＶＰ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｐ、（ｅ）ＰＶ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｖ、（ｆ）ＶＶ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｖ、および（ｇ）ＰＦ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ。
【図１９】ＧＩＴＲ＋細胞への抗ＧＩＴＲ  Ａｂ結合についての結合曲線であり、ＭＦＩ（平均蛍光強度）に関してフローサイトメトリーによって分析されている。試験されたＧＩＴＲヘキサマー変異体のキー：（ａ）Ｍｔ１：Ｄ２７０Ａ  Ｋ３２２Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｂ）Ｍｔ２：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｃ）Ｍｔ３：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑ、（ｄ）ＶＰ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｐ、（ｅ）ＰＶ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｖ、（ｆ）ＶＶ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｖ、および（ｇ）ＰＦ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ。
【図２０】ＣＤＣがＷｔおよびＬＡＬＡ構築物（ＲＬＵ）と比較して低減したことを示す変異体のＣＤＣの棒グラフを表す。試験された変異体のキー：（ａ）Ｍｔ１：Ｄ２７０Ａ  Ｋ３２２Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｂ）Ｍｔ２：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｃ）Ｍｔ３：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑ、（ｄ）ＶＰ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｐ、（ｅ）ＰＶ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｖ、（ｆ）ＶＶ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｖ、および（ｇ）ＰＦ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ。すべての抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、親Ｅ１−３Ｈ７抗ＧＩＴＲ抗体に由来する。
【図２１】ＣＤＣがＷｔおよびＬＡＬＡ構築物（殺滅％）と比較して低減したことを示す変異体のＣＤＣの棒グラフを表す。試験された変異体のキー：（ａ）Ｍｔ１：Ｄ２７０Ａ  Ｋ３２２Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｂ）Ｍｔ２：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｃ）Ｍｔ３：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑ、（ｄ）ＶＰ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｐ、（ｅ）ＰＶ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｖ、（ｆ）ＶＶ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｖ、および（ｇ）ＰＦ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ。すべての抗体は、親Ｅ１−３Ｈ７抗ＧＩＴＲ抗体からのものである。導入された変異は、元の抗体と比較してＣＤＣ活性の量を有意に低減する。
【図２２】ＧＩＴＲバイオアッセイ（ＲＬＵ）のグラフを示す。左のグラフは抗体のみであるが、右のグラフは各試料への１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬの添加を有する（左および右のグラフの結果は異なる日に行われた）。データは、ＣＤＣ活性を低減するために行われた変異が抗体のヘキサマー化に影響を与えないことを示す。モノマーと比較して、ヘキサマーのすべてが用量応答曲線で左への顕著なシフトを示す。
【図２３】ＧＩＴＲバイオアッセイにおける抗体および一定のＧＩＴＲＬによる誘導の倍率のグラフを示す。左のグラフは抗体のみであるが、右のグラフは各試料への１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬの添加を有する（異なる日に行われた実験間の比較）。データは、ＣＤＣ活性を低減するために行われた変異が抗体のヘキサマー化に影響を与えないことを示す。モノマーと比較して、ヘキサマーのすべてが用量応答曲線で左への顕著なシフトを示す。ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）と共刺激される場合、抗体は相加効果を有するが（図２２および２３）、市販のＧＴＩ−１０抗ＧＩＴＲ抗体はこれを有さない。
【図２４】ＧＩＴＲバイオアッセイにおいてＧＩＴＲＬに対して正規化された場合の抗体による誘導の倍率のグラフを示す。このグラフは、（１１１ｎｇ／ｍｌでの）ＧＩＴＲＬに対して誘導倍率を正規化することによって、抗体からＧＩＴＲＬの効果をデコンボリューションする。正規化された誘導倍率は、次のように計算される：試料のＲＬＵ／ＧＩＴＲＬ（１１１ｎｇ／ｍｌ）のみのＲＬＵ。生物活性アッセイのこの分析はまた、変異したヘキサマーが、モノマーと比較して用量応答曲線で左への顕著なシフトを有し続けることを示す。
【図２５】観察されたＡＤＣＣ活性のグラフを示す。グラフに列挙された変異体は、いかなる測定可能なＡＤＣＣ活性も有さない。陰性対照ＩｇＧは、特異的ＡＤＣＣ活性を示さなかった。
【図２６】本発明によって企図される変異体の要約である。
【図２７−１】ＩｇＧ３の野生型Ｆｃ領域についてのアミノ酸配列（配列番号６０）およびＫａｂａｔのＥＵインデックスによる対応するアミノ酸残基番号である。
【図２７−２】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−３】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−４】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−５】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−６】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−７】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２８】ＩｇＧ  Ｌｃ融合体の結合（％）を示すグラフである。ａＧＩＴＲ−ＰＤＬ１  Ｌｃ融合ＩｇＧを、ＰＤＬ１で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＧＩＴＲ＋細胞またはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（約７５〜８０％のトランスフェクション効率）と様々な濃度でインキュベートした。ＲＴで２５分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、融合抗体の結合をＰＤＬ１−ｓｃＦｖ融合体のＣ末端上のＨｉｓタグを通した抗Ｈｉｓ−ＰＥによって検出した。このグラフは、検出されたＰＥ陽性細胞％によって決定されるように、二重特異性ＩｇＧの各アームが独立してその標的に結合することができることを示す。
【図２９】ＩｇＧ  Ｌｃ融合体の結合（ＭＦＩ）を示すグラフである。ａＧＩＴＲ−ＰＤＬ１  Ｌｃ融合体を、ＰＤＬ１で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＧＩＴＲ＋細胞またはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（約７５〜８０％のトランスフェクション効率）と様々な濃度でインキュベートした。ＲＴで２５分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、融合抗体の結合をＰＤＬ１−ｓｃＦｖ融合体のＣ末端上のＨｉｓタグによって検出した。このグラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定されるように、二重特異性ＩｇＧの各アームが独立してその標的に結合することができることを示す。
【図３０】ＩｇＧ  Ｌｃ融合体の同時結合（％）を示すグラフである。１Ｅ６  ＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞を各試料に使用した。ａＧＩＴＲ  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｈｅｘ  Ｌｃ融合体（ａＰＤＬ１）を２倍段階希釈で加え、ＲＴで２５分間インキュベートした。試料を次いで洗浄し、１．５ｕｇのＰＤ−Ｌ  １−ｒｂＦｃを各チューブに加え、チューブを２５分間ＲＴでインキュベートした。別の洗浄後、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ（２ｕｇ／ｍｌ）を検出用のウェルに加えた。
【図３１】ＩｇＧ  Ｌｃ融合体の同時結合（ＭＦＩ）を示すグラフである。１Ｅ６  ＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞を各試料に使用した。ａＧＩＴＲ  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｈｅｘ  Ｌｅ融合体（ａＰＤＬ１）を２倍段階希釈で加え、ＲＴで２５分間インキュベートした。試料を次いで洗浄し、１．５ｕｇのＰＤ−Ｌ  １−ｒｂＦｃを各チューブに加え、チューブを２５分間ＲＴでインキュベートした。別の洗浄後、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ（２ｕｇ／ｍｌ）を検出用のウェルに加えた。
【図３２】ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＣＨ２のアミノ酸配列アラインメントを示す。ＩｇＧ４ヘキサマーからＣＤＣ活性を排除するためにＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ｍｕｔ３と同様にＩｇＧ４構築物において変異を行った。ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｍｕｔ３は、Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑである。ｓＩｇＧ４では、残基３３１はＳである。第１のＭｕｔ３アナログでは、Ｄ２７０ＡおよびＥ３３Ｑのみを変更し、これはＩｇＧ１およびＩｇＧ４において同一である。第２の構築物を作製するために、残基３３０および３３１も、Ｃ１ｑ結合ポケットの一部であるため、ＩｇＧ１  ＬＡＬＡと同一になるように変更した。
【図３３】ｓＩｇＧ４変異体のＣＤＣ活性（１時間）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
１つ以上の実施形態の詳細な説明が本明細書に提供される。しかしながら、本発明が、様々な形式で具現化され得ることが、理解される。したがって、本明細書に開示された特定の詳細は、限定として解釈されるべきではなく、特許請求の範囲の根拠として、および当業者に本発明を任意の適切な方法で用いるように教示するための代表的な根拠として解釈されるべきである。
【００２３】
Ｆｃ受容体は、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内のいくつかのシグナル伝達事象を媒介し得る細胞内ドメインを有することができる。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞を含む様々な免疫細胞において発現する。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を結合した抗原の部位に動員し、典型的には細胞内のシグナル伝達事象と、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、および細胞毒性攻撃などの重要なその後の免疫応答と、を引き起こす。
【００２４】
多くの状況では、免疫グロブリンのＦｃ領域によって媒介されるエフェクター機能の結合および刺激は、例えば、ＣＤ２０抗体について、非常に有益であるが、特定の例では、エフェクター機能を減少またはさらに排除することがより有利であり得る。
【００２５】
他の例では、例えば、広く発現した受容体とその同族リガンドとの相互作用を遮断することが目的である場合、すべての抗体エフェクター機能を減少または排除して、望ましくない毒性を低減することが有利であろう。
【００２６】
受容体クラスター化を増加させることによってシグナル伝達を増強することも有利であろう。
【００２７】
補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性を有意に減少させることも有利であろう。
【００２８】
ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣなどの大きく低下したエフェクター機能、ならびに増強した受容体細胞シグナル伝達および／または誘導受容体細胞クラスター化を有する抗体についての満たされていないニーズがある。したがって、本発明の目的は、導入された変異を有する免疫グロブリンのＦｃ領域のポリペプチドを合成および／または操作して、そのような効果を促進し、操作されたＦｃ領域を含む抗体を最終的に特定することであった。一実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるバリアントＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２バリアントＦｃ領域）を有するがん療法のために開発することができる。一実施形態では、補体活性を回避しながらヘキサマー化することができる抗体を生成することができる。別の実施形態では、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ））も回避しながら、ヘキサマー化することができる抗体を生成することができる。一実施形態では、抗体は、ＧＩＴＲに特異的である。一実施形態では、抗体は、ＣＣＲ４に特異的である。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＩｇＤまたはＩｇＥのＦｃ領域のバリアントヒンジ、ＣＨ１、および／またはＣＨ２ドメインを含むことができ、そのアミノ酸配列は、参照によってその全体が組み込まれる、ＷＯ  ２００７／１２１３５４に記載される。
【００２９】
本発明は、部分的に、抗体ヘキサマー化を促進することが知られる抗体のＦｃ領域における変異および増加した補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）もエフェクター細胞シグナル伝達を著しく増強する予期しない能力を有するという発見に基づいている。本発明の、抗体バリアントを含む、ポリペプチドバリアントはすべて、結合領域と、抗体ヘキサマー化を促進し、エフェクター機能を低減することが知られる１つ以上の変異（複数可）を含む免疫グロブリンの全長または部分Ｆｃドメインと、を含む。
【００３０】
配列番号１は、ＩｇＧ１の野生型Ｆｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８５７（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）、３３０アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸である。図１２は、配列番号１を、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されるアミノ酸残基と対応させる表である。
2021518411.tif 000003
【００３１】
配列番号４は、ＩｇＧ１のバリアントＦｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８５７（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）、３３０アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８でのアミノ酸の置換であり、プロリン（Ｐ）を含み、Ｘ２は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３４でのアミノ酸の置換であり、アラニン（Ａ）を含み、Ｘ３は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３５でのアミノ酸の置換であり、アラニン（Ａ）を含み、Ｘ４は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３４５でのアミノ酸の置換であり、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含み、Ｘ５は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４０９でのアミノ酸の置換であり、アルギニン（Ｒ）を含み、Ｘ６は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４３０でのアミノ酸の置換であり、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含み、Ｘ７は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４４０でのアミノ酸の置換であり、トリプトファン（Ｗ）を含む。さらなる実施形態では、ＸＡは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２７０でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＢは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２２でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＣは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２９でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＤは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３１でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＥは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３３でのアミノ酸の置換であり、中性極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、環構造を有さないアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ））である。いくつかの実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む。
2021518411.tif 000004
【００３２】
配列番号２は、ＩｇＧ２の野生型Ｆｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８５９（ＩＧＨＧ２＿ＨＵＭＡＮ）、３２６アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸である。図１３は、配列番号２を、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されるアミノ酸残基と対応させる表である。
2021518411.tif 000005
【００３３】
配列番号５は、ＩｇＧ２のバリアントＦｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８５９（ＩＧＨＧ２＿ＨＵＭＡＮ）、３２６アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８でのアミノ酸の置換であり、プロリン（Ｐ）を含み、Ｘ２は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３５でのアミノ酸の置換であり、アラニン（Ａ）を含み、Ｘ３は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３４５でのアミノ酸の置換であり、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含み、Ｘ４は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４０９でのアミノ酸の置換であり、アルギニン（Ｒ）を含み、Ｘ５は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４３０でのアミノ酸の置換であり、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含み、Ｘ６は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４４０でのアミノ酸の置換であり、トリプトファン（Ｗ）を含む。さらなる実施形態では、ＸＡは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２７０でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＢは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２２でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＣは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２９でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＤは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３１でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＥは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３３でのアミノ酸の置換であり、中性極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、環構造を有さないアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ））である。いくつかの実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む。
2021518411.tif 000006
【００３４】
配列番号３は、ＩｇＧ４の野生型Ｆｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８６１（ＩＧＨＧ４＿ＨＵＭＡＮ）、３２７アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸である。図１４は、配列番号３を、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されるアミノ酸残基と対応させる表である。
2021518411.tif 000007
【００３５】
配列番号６は、ＩｇＧ４のバリアントＦｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８６１（ＩＧＨＧ４＿ＨＵＭＡＮ）、３２７アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８でのアミノ酸の置換であり、プロリン（Ｐ）を含み、Ｘ２は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３４でのアミノ酸の置換であり、アラニン（Ａ）を含み、Ｘ３は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３５でのアミノ酸の置換であり、アラニン（Ａ）を含み、Ｘ４は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３４５でのアミノ酸の置換であり、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含み、Ｘ５は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４０９でのアミノ酸の置換であり、リジン（Ｋ）を含み、Ｘ６は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４３０でのアミノ酸の置換であり、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含み、Ｘ７は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４４０でのアミノ酸の置換であり、トリプトファン（Ｗ）を含む。さらなる実施形態では、ＸＡは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２７０でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＢは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２２でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＣは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２９でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＤは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３１でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＥは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３３でのアミノ酸の置換であり、中性極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、環構造を有さないアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ））である。いくつかの実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む。
2021518411.tif 000008
【００３６】
配列番号６０は、ＩｇＧ３の野生型Ｆｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８６０（ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ）、３７７アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸である。図２７は、配列番号６０を、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されるアミノ酸残基と対応させる表である。
2021518411.tif 000009
【００３７】
配列番号６１は、ＩｇＧ３のバリアントＦｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８６０（ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ）、３７７アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸残基を表し、Ｘ１は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８でのアミノ酸の置換であり、プロリン（Ｐ）を含み、Ｘ２は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３４でのアミノ酸の置換であり、アラニン（Ａ）を含み、Ｘ３は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３５でのアミノ酸の置換であり、アラニン（Ａ）を含み、Ｘ４は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３４５でのアミノ酸の置換であり、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含み、Ｘ５は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４０９でのアミノ酸の置換であり、アルギニン（Ｒ）を含み、Ｘ６は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４３０でのアミノ酸の置換であり、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含み、Ｘ７は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４４０でのアミノ酸の置換であり、トリプトファン（Ｗ）を含む。さらなる実施形態では、ＸＡは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２７０でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＢは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２２でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＣは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３２９でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＤは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３１でのアミノ酸の置換であり、中性非極性アミノ酸を含み、ＸＥは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３３でのアミノ酸の置換であり、中性極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、環構造を有さないアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ））である。いくつかの実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む。
2021518411.tif 000010
【００３８】
配列番号６２は、ＩｇＡ１の野生型Ｆｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８７６（ＩＧＨＡ１＿ＨＵＭＡＮ）、３５３アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸である。また、各々その全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ２００７／１２１３５４およびＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０：４８１６−２４を参照されたい。
2021518411.tif 000011
【００３９】
配列番号６３は、ＩｇＡ２の野生型Ｆｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８７７（ＩＧＨＡ２＿ＨＵＭＡＮ）、３４０アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸である。また、各々その全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ２００７／１２１３５４およびＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０：４８１６−２４を参照されたい。
2021518411.tif 000012
【００４０】
抗体ヘキサマー化を促進することができるＦｃ変異は、免疫グロブリンのＦｃ領域の約３４５〜４４０位のアミノ酸残基に対応するセグメントにおける１つ以上の変異（複数可）を含む。一実施形態では、抗体ヘキサマー化を促進することができるＦｃ変異は、ＩｇＧ１におけるＥ３４５〜Ｓ４４０に対応するセグメントにおける１つ以上の変異（複数可）を含む。そのような１つ以上の変異（複数可）はまた、アミノ酸残基位置３４５、４３０、および／または４４０のアミノ酸残基に対応する変異（例えば、ＩｇＧ１におけるＥ３４５、Ｅ４３０および／またはＳ４４０）を含み得る。いくつかの実施形態では、変異は、Ｅ４３０Ｇ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、Ｅ４３０Ｔ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、およびＳ４４０Ｗを含み得る。いくつかの実施形態では、変異は、Ｅ３４５ＫおよびＥ４３０Ｇを含む。これらの変異は、本発明の文脈において「ヘキサマー化増強変異」として知られる。
【００４１】
エフェクター機能を低減することができるＦｃ変異は、ＩｇＧ１におけるアミノ酸残基Ｌ２３４および／またはＬ２３５〜Ｓ４４０における１つ以上の変異（複数可）を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域におけるエフェクター機能変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む。ＩｇＧ４を安定させることができるＦｃ変異は、ＩｇＧ４におけるＳ２２８、Ｌ２３５、および／またはＲ４０９を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ＩｇＧ４を安定させることができるＦｃ変異は、ＩｇＧ４におけるＳ２２８ＰおよびＬ２３５ＥまたはＲ４０９Ｋを含む。（ＩｇＧサブクラスの構造およびエフェクター機能の一般的な議論については、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；５−５２０も参照されたい）。補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を低下させることができるＦｃ変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４における（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）２７０、３２２、３２９、３３１、３３３位にあるアミノ酸残基における１つ以上の変異（複数可）を含む。
【００４２】
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む操作されたポリペプチドであり、Ｆｃバリアントは、残基位置２２８、２３４、２３５、３４５、４０９、４３０、４４０、またはそれらの組み合わせでアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。さらなる実施形態では、Ｆｃバリアントは、残基位置２７０、３２２、３２９、３３１、３３３、またはそれらの組み合わせでアミノ酸置換をさらに含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。いくつかの実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、または７つのアミノ酸置換は、残基位置２２８、２３４、２３５、３４５、４０９、４３０、４４０で行われる。いくつかの実施形態では、少なくとも２、３、４、または５つのアミノ酸置換が、残基位置２７０、３２２、３２９、３３１、３３３で行われる。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２２８のアミノ酸は、プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３４のアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２３５のアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３４５のグルタミン酸（Ｅ）は、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４０９のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４３０のグルタミン酸（Ｅ）は、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置４４０のセリン（Ｓ）は、トリプトファン（Ｗ）で置換されている。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置２７０、３２２、３２９、および／または３３１のアミノ酸は、中性非極性アミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、中性非極性アミノ酸は、環構造を有さないアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ））である。一実施形態では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置３３３のアミノ酸は、中性極性アミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む。
【００４３】
本明細書および特許請求の範囲では、免疫グロブリン重鎖における残基の付番は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）におけるＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基付番を指す。
【００４４】
したがって、本発明は、結合領域と、１つ以上のヘキサマー化増強変異および１つ以上のエフェクター機能低減変異を有する免疫グロブリンの全長または部分Ｆｃドメインと、を有する、抗体バリアントを提供する。本発明の抗体バリアントは、野生型Ｆｃドメインを有する抗体と比較して、増強された受容体クラスター化およびまたはエフェクター細胞シグナル伝達を有する。
【００４５】
本明細書に記載される本発明は、バリアントＦｃドメインを含む抗体にさらに関する。一実施形態では、抗体は、バリアントＦｃドメインを含む抗ＧＩＴＲ抗体である。表１Ａ〜１Ｂは、それぞれ、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の、核酸配列（配列番号７〜８）およびアミノ酸配列（配列番号９〜１０）を提供する。一実施形態では、本明細書に記載されるバリアントＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体を操作するために、抗体の可変領域を移植することができる。
【００４６】
（表１Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７可変領域核酸配列
2021518411.tif 000013
【００４７】
（表１Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７可変領域アミノ酸配列
2021518411.tif 000014
【００４８】
以下の表１Ｃ．は、配列番号９〜１０に基づく抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖および軽鎖可変領域のフレームワークおよびＣＤＲの境界を示す。
【００４９】
（表１Ｃ）抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７アミノ酸配列
2021518411.tif 000015
【００５０】
一実施形態では、抗体は、バリアントＦｃドメインを含む抗ＣＣＲ４抗体である。表１Ｄ．は、抗ＣＣＲ４抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１〜１２）を提供する。一実施形態では、本明細書に記載されるバリアントＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体を操作するために、抗体の可変領域を移植することができる。
【００５１】
（表１Ｄ）抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３可変領域アミノ酸配列
（＝親和性成熟させたヒト化ｍＡｂ１５６７）
2021518411.tif 000016
【００５２】
以下の表１Ｅ．は、配列番号１１〜１２に基づく抗ＣＣＲ４抗体についての重鎖および軽鎖可変領域のフレームワークおよびＣＤＲの境界を示す。
【００５３】
（表１Ｅ）抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３アミノ酸配列
2021518411.tif 000017
【００５４】
表２Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖の定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１７）を提供する。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００５５】
（表２Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―野生型ＩｇＧ１モノマー（ＣＬを除いて、本明細書に記載の抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000018
【００５６】
一実施形態では、本明細書に記載される軽鎖のＦｃ領域を使用して、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のＦｃ領域を操作することができる。一実施形態では、軽鎖のＦｃ領域（ＣＬ（カッパ））は、配列番号４３の核酸配列を含む：
2021518411.tif 000019
一実施形態では、軽鎖のＦｃ領域（ＣＬ（カッパ））は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む：
2021518411.tif 000020
【００５７】
表２Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖の定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜２２）を提供する。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００５８】
（表２Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―野生型ＩｇＧ１モノマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）。ＣＨ２およびＣＨ３における太字残基は、例えば、異なるＩｇＧ１変異体を作製するために変異させることができる野生型残基（表３〜５における黄色で強調表示された残基）である。
2021518411.tif 000021
【００５９】
表３Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号２３）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００６０】
（表３Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体モノマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000022
【００６１】
表３Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号２４）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００６２】
（表３Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ変異体モノマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000023
【００６３】
表４Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号２５）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００６４】
（表４Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000024
【００６５】
表４Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号２６）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００６６】
（表４Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000025
【００６７】
表５Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号２７〜２８）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００６８】
（表５Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡヘキサマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000026
【００６９】
表５Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号２９〜３０）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００７０】
（表５Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡヘキサマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000027
【００７１】
表６Ａ．は、安定化ＩｇＧ４重鎖および軽鎖の定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号３１〜３５）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ４を安定させるために導入された変異である。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００７２】
（表６Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ｓＩｇＧ４モノマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000028
【００７３】
表６Ｂ．は、安定化ＩｇＧ４重鎖および軽鎖の定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号３６〜４０）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ４を安定させるために導入された変異である。太字／水色で強調表示された残基は、表７におけるｓＩｇＧ４ヘキサマーを作製するために変異させることができる野生型残基である。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００７４】
（表６Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ｓＩｇＧ４モノマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000029
【００７５】
表７Ａ．は、安定化ＩｇＧ４重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号３１〜３３、３５、および４１）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ４を安定させるために導入された変異である。太字残基は、表７におけるｓＩｇＧ４ヘキサマーを作製するために変異させることができる野生型残基である。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００７６】
（表７Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ｓＩｇＧ４ヘキサマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000030
【００７７】
表７Ｂ．は、安定化ＩｇＧ４重鎖および軽鎖の定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号３６〜４０）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ４を安定させるために導入された変異である。太字／水色で強調表示された残基は、表７におけるｓＩｇＧ４ヘキサマーを作製するために変異させることができる野生型残基である。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００７８】
（表７Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ｓＩｇＧ４ヘキサマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000031
【００７９】
表８Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１４、１７、２５、および４４）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００８０】
（表８Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ１
2021518411.tif 000032
【００８１】
表８Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜１９、２２、２６、および４５）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００８２】
（表８Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ１
2021518411.tif 000033
【００８３】
表９Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１４、１７、２５、および４６）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００８４】
（表９Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ２
2021518411.tif 000034
【００８５】
表９Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜１９、２２、２６、および４７）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００８６】
（表９Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ２
2021518411.tif 000035
【００８７】
表１０Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１４、１７、２５、および４８）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００８８】
（表１０Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ３
2021518411.tif 000036
【００８９】
表１０Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜１９、２２、２６、および４９）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００９０】
（表１０Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ３
2021518411.tif 000037
【００９１】
表１１Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１４、１７、２５、および５０）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００９２】
（表１１Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＶＰ
2021518411.tif 000038
【００９３】
表１１Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜１９、２２、２６、および５１）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００９４】
（表１１Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＶＰ
2021518411.tif 000039
【００９５】
表１２Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１４、１７、２５、および５２）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００９６】
（表１２Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＰＶ
2021518411.tif 000040
【００９７】
表１２Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜１９、２２、２６、および５３）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【００９８】
（表１２Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＰＶ
2021518411.tif 000041
【００９９】
表１３Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１４、１７、２５、および５４）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【０１００】
（表１３Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＰＦ
2021518411.tif 000042
【０１０１】
表１３Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜１９、２２、２６、および５５）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【０１０２】
（表１３Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＰＦ
2021518411.tif 000043
【０１０３】
表１４Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１４、１７、２５、および５６）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【０１０４】
（表１４Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＶＶ
2021518411.tif 000044
【０１０５】
表１４Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜１９、２２、２６、および５７）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。
【０１０６】
（表１４Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＶＶ
2021518411.tif 000045
【０１０７】
表１５Ａ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についての核酸配列（配列番号１３〜１４、２３、２５、および５８）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。一実施形態では、表１５Ａは、抗ＰＤＬ１などのｓｃＦｖとのインフレーム融合体を提供する。
【０１０８】
（表１５Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ−ａＰＤＬ１
2021518411.tif 000046
【０１０９】
表１５Ｂ．は、ＩｇＧ１重鎖および軽鎖のバリアント定常領域（Ｆｃ）についてのアミノ酸配列（配列番号１８〜１９、２４、２６、および５９）を提供する。黄色で強調表示された残基は、ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを作製するためにＦｃ領域に導入された変異を示す。例えば、本明細書に記載されるＦｃ領域は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のバリアントＦｃ領域を操作するために使用することができる。一実施形態では、表１５Ｂは、抗ＰＤＬ１などのｓｃＦｖとのインフレーム融合体を提供する。
【０１１０】
（表１５Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ−ａＰＤＬ１
2021518411.tif 000047
【０１１１】
１つ以上のヘキサマー化増強変異および１つ以上のエフェクター機能低減変異を有し、１つ以上のＣＤＣ活性低減変異をさらに有する抗体バリアントは、向上した治療可能性を有するであろう。特に、標的細胞表面への結合後にアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体は、増加した生物学的活性を有するであろう。理論によって縛られることなく、これは、細胞表面受容体クラスター化がそれらの生物学的機能に必要とされる場合に当てはまる。本発明の抗体バリアントの増強した受容体クラスター化および／またはエフェクター細胞シグナル伝達は、実際的な臨床的利益、例えば、治療効果を達成するためのヒトモノクローナル抗体の有効用量を低下すること、およびより低い親和性抗体を有する抗体を使用することにつながる。
【０１１２】
例えば、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体を用いた抗体誘導性クラスター化を通した受容体シグナル伝達の増強は、アゴニスト活性が望まれる細胞表面上の創薬可能な標的を活用するために使用することができる。一実施形態では、ケモカイン受容体は、ケモカイン受容体クラスター化を通してシグナル伝達能力を増強するために、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体を使用することによって、増加したアゴニスト活性が望まれる細胞表面上の創薬可能な標的として機能することができる。別の実施形態では、その受容体に結合しているので、サイトカイン、ホルモン、またはリガンドの依然として露出した領域を標的とすることによって、その受容体に結合しながら、サイトカイン、ホルモン、またはリガンドのアゴニストまたはアンタゴニスト活性を増強するために、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体を使用することができる。例えば、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体は、Ｔ細胞増殖を促進するためにＩＬ−２に向けられ得る。さらに他の実施形態では、アゴニスト活性を増加させることは、小分子薬物の標的として機能する、７回膜貫通ドメインに及ぶタンパク質（以下で議論されるＧタンパク質共役受容体など）を標的とすることによって、より広く活用することができる。
【０１１３】
本発明の一態様は、Ｗｎｔシグナル伝達受容体タンパク質の細胞表面受容体クラスター化を通したＷｎｔ経路の増強されたシグナル伝達に関する。例えば、Ｗｎｔタンパク質は、これらに限定されないが、細胞運命、細胞増殖、生存、および遊走の特定を含む、様々な発生プロセスを制御する、分泌されたシグナル伝達糖タンパク質の大きなファミリーに属する。よって、Ｗｎｔシグナル伝達は、初期胚発生および後期発生中の細胞運命決定および組織パターン化を制御する重要な発生シグナル伝達経路である。一実施形態では、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する（例えば、ｗｎｔタンパク質および／またはそれらのリガンドのクラスター化を誘導する）Ｗｎｔアゴニスト抗体（例えば、Ｒ−スポンジンファミリーのタンパク質メンバーに特異的またはＮｏｒｒｉｎに特異的な抗体）は、幹細胞の分化を誘導する（例えば、刺激する）ために使用することができる。
【０１１４】
本発明の別の態様は、一般に、これらの細胞表面分子の受容体クラスター化を通した、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型受容体の増強されたアゴニストおよび／またはアンタゴニストシグナル伝達に関する。Ｉ型受容体は、それぞれ、神経伝達物質であるアセチルコリンおよびＧＡＢＡの標的であるニコチン性受容体またはＧＡＢＡ作動性受容体である。ニコチン性受容体は、リガンドであるニコチンにも結合することができる。ＩＩ型受容体は、Ｇタンパク質共役受容体、セロトニン受容体、およびグルタミン酸受容体などの代謝型受容体である。これらの受容体のリガンドは、例えば、様々なホルモン（エピネフリン、グルカゴン、カルシトニン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ニューロキニン、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、カンナビノイド、オキシトシン）、および神経伝達物質（ドーパミン、セロトニン、および代謝型グルタミン酸など）を含む。ＩＩＩ型受容体は、例えば、受容体チロシンキナーゼおよび酵素結合受容体を含む。インスリン受容体は、リガンドインスリンに結合するＩＩＩ型表面分子である。他のＩＩＩ型受容体は、上皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、血管内皮成長因子受容体、線維芽細胞成長因子受容体、および結腸癌キナーゼ４を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体を使用する、Ｉ型、ＩＩ型、もしくはＩＩＩ型細胞表面分子および／またはそれらのリガンドの抗体媒介性クラスター化は、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト活性を増強するために使用することができる。例えば、ＰＣＳＫ９に特異的な、（例えば、タンパク質および／またはそれらのリガンドのクラスター化を誘導する）本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体は、Ｐｃｓｋ９に結合して、ＬＤＬ受容体への結合をより効率的に阻害することができる。
【０１１５】
例えば、７回膜貫通ドメイン（７−ＴＭＤ）表面受容体のシグナル伝達は、７−ＴＭＤタンパク質のクラスター化を通してシグナル伝達能力を高めるために、これらのタンパク質に特異的な、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体を使用することによって増幅することができる。いくつかの実施形態では、アンタゴニスト活性を増加させることも、小分子薬物の標的としても役立つ阻害性７−ＴＭＤタンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役受容体）を標的とすることによって活用することができる。例えば、７−ＴＭＤ細胞表面受容体阻害性シグナル伝達は、これらの標的とされた７−ＴＭＤ阻害タンパク質が、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有するアンタゴニスト抗体の存在により細胞表面でクラスター化されるので、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体を使用して増強することができる。よって、７−ＴＭＤ受容体および／またはそれらのリガンドの抗体媒介性クラスター化は、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を増強するために使用され得る。一実施形態では、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体を対象に投与することを使用して、片頭痛を治療するためにカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）リガンド／７−ＴＭＤ受容体相互作用を遮断することができる。
【０１１６】
さらなる実施形態では、抗体媒介性クラスター化（例えば、本明細書に記載されるＦｃバリアント領域を有する抗体を使用することによって受容体クラスター化を誘導すること）を使用して、低アビディティ抗体を明らかに高い親和性を有する抗体に変換することができる。これは結合活性およびその後の生物学的活性を高めるために使用することができる。
【０１１７】
したがって、本発明はまた、がん、自己免疫障害、炎症性障害、神経疾患、心血管疾患、感染性疾患を治療し、幹細胞系列経路を誘導する治療方法において、本発明の抗体バリアントを使用する方法を提供する。「治療する」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状、特徴、または臨床症状を部分的または完全に軽減、改善、向上、緩和、その発症を遅延、その進行を阻害、その重症度を低減、および／またはその発生率を低減することを指すことができる。治療は、疾患、障害、および／もしくは状態に関連する病理を発症するリスクを低下させる目的で、疾患、障害、および／もしくは状態の兆候を示さない対象（例えば、特定可能な疾患、障害、および／もしくは状態の前）、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の初期兆候のみを示す対象に実施することができる。いくつかの実施形態では、治療は、細胞シグナル伝達の増強または細胞の受容体クラスター化の誘導を含む。
【０１１８】
本発明の抗体バリアントは、目的の任意の標的に特異的であり得る。例えば、目的の標的は、（これに限定されないが）腫瘍関連表面抗原、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ−７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＡ−１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）（Ｐ５０１）、ＰＳＭＡ、生存およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、中皮、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、およびテネイシンＣ（ＴｎＣ  Ａ１）および線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）のＡ１ドメイン；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）などの系譜特異的もしくは組織特異的な抗原、エンドグリン、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ  １７）、またはウイルス特異表面抗原、例えば、ＨＩＶ特異抗原（ＨＩＶ  ｇｐ１２０など）；ＥＢＶ特異抗原、ＣＭＶ特異抗原、ＨＰＶ特異抗原、ラッセ（Ｌａｓｓｅ）ウイルス特異抗原、インフルエンザウイルス特異抗原、およびこれらの表面マーカーの任意の誘導体またはバリアントであり得る。
【０１１９】
（例えば、本明細書に開示されるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２からのバリアントＦｃ領域を有する）本明細書に記載される本発明の抗体バリアントは、目的の任意の標的、例えば、本明細書に記載されるタンパク質標的に特異的であり得る。一実施形態では、抗体は、Ｔ細胞上の阻害分子に特異的である。Ｔ細胞上の阻害分子の非限定的な例は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００５００９）、またはＣＤ２７９としても知られる）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインタンパク質を有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿７７６１６０））、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２としても知られる、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００５２０５）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００２２７７））、ＴＩＭ３（Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿１１６１７１）としても知られる）、およびＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ１（ＫＩＲ３ＤＬ１、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００１３０９０９７）としても知られる）を含む。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるＴ細胞上の阻害分子は、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１２０】
一実施形態では、抗体は、Ｔ細胞上の刺激分子に特異的である。Ｔ細胞上の刺激分子の非限定的な例は、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿６８３７００）、ＣＤ２７（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００１２３３）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦとしても知られる、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００３３１８）、４−１ＢＢ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）としても知られる、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００１５５２）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００００６５）、誘導性Ｔ細胞共刺激タンパク質（ＩＣＯＳ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０３６２２４）、ＣＤ３（デルタ鎖についてのＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号、ＮＰ＿０００７２３、イプシロン鎖についてのＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号、ＮＰ＿０００７２４、ガンマ鎖についてのＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号、ＮＰ＿００００６４）、およびＣＤ２８（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０）を含む。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるＴ細胞上の刺激分子は、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。別の実施形態では、ＣＤ３に特異的な抗体および／またはＣＤ２８に特異的な抗体を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞免疫療法などの細胞療法のための細胞のエクスビボ増殖のためのＴ細胞増殖を増強することができる。
【０１２１】
一実施形態では、抗体は、ケモカイン受容体に特異的である。ケモカイン受容体の非限定的な例は、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００５４９９）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０００５７０）、およびＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４、アイソフォームｃについてのＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号、ＮＰ＿００１３３４９８５）を含む。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるケモカイン受容体は、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１２２】
一実施形態では、抗体は、腫瘍細胞上の腫瘍関連分子に特異的である。腫瘍関連分子の非限定的な例は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡとしても知られる）、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００１１８３）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００１２０７）、および抗原提示細胞分子（ＰＤＬ１（プログラム細胞死リガンド１、ＣＤ２７４としても知られる、アイソフォームａについてのＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号、ＮＰ＿０５４８６２）またはＰＤ−Ｌ２（プログラム細胞死リガンド２（ＰＤＣＤ１ＬＧ２）、ＣＤ２７３としても知られる、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０７９５１５）など）を含む。一実施形態では、本発明の抗体によって認識される腫瘍関連分子は、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１２３】
一実施形態では、抗体は、感染因子に特異的である。感染因子の非限定的な例は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＳＡＲＳ／ＳＡＲＳ．ｈｔｍｌ参照、例えば、抗体が、ＳＡＲＳウイルスのＳ（スパイク）タンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿８２８８５１、その全体が参照によって組み込まれる、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；３３１：９９１−１００４にも記載されるゲノム）、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ（グループ１およびグループ２など）、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、またはインフルエンザＤウイルスに特異的である場合、例えば、抗体が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０４０９８０、またはＮＰ＿０５６６６０）またはインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０４０９８０またはＮＰ＿０５６６６３）に特異的である場合）、フラビウイルス、アルファウイルス、および中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫＬ５９３９９、例えば、抗体がＭＥＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨＸ７１９４６）のＳ（スパイク）タンパク質に特異的である場合）を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、新興インフルエンザウイルスである。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるＳＡＲＳウイルスは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＳＡＲＳ／ＳＡＲＳ．ｈｔｍｌまたは本明細書において提供されるアクセッション番号でアクセス可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるＭＥＲＳウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１２４】
アルファウイルスの非限定的な例は、西部馬脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿６４０３３０、例えば、ＢＦＮ３０６０株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５６４５３）、ＢＦＳ９３２株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＩＣ８１８６１）、ＡＧ８０−６４６株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＣＴ７５２８７））、東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿６３２０２１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪＰ１３６２４、例えば、ＦＬ９３−９３９株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＬ８４６８６））、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０４０８２２、例えば、ＴＣ−８３株（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＡＢ０２５１６））、およびチクングニアウイルス（ＣＨＫＶ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿６９０５８８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦＰ４３２４３）を含む。
【０１２５】
西部馬脳炎ウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝５７２４０＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるＷＥＥＶウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。東部馬脳炎ウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝８６８＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるＥＥＥＶウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。ベネズエラ馬脳炎ウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝２６８１＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるベネズエラ馬脳炎ウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。チクングニアウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝７２８＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるチクングニアウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１２６】
フラビウイルスの非限定的な例は、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０４１７２４、例えば、Ｋｅｒａｌａ株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＧＩ１６４６１）、デングウイルス血清型１−４（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０５９４３３（例えば、ＤＥＮＶ１  ＢＲ／ＳＪＲＰ／２８７／２０１１株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫＱ０００１１、ＤＥＮＶ１  ＢＲ／ＳＪＲＰ／４８４／２０１２株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫＱ０００１４）、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号、ＮＰ＿０５６７７６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦＵ６５９３４．１（例えば、デングウイルス２／Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ／Ｈａｉｔｉ−１／２０１６株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＯＥ２３００２）、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＹＰ＿００１６２１８４３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ９９４３７（例えば、デングウイルス３単離Ｊｅｄｄａｈ−２０１４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＩＨ１３９２５）、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０７３２８６（例えば、ＤＥＮＶ−４株Ｂｒ２６４ＲＲ／１０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥＸ９１７５４．１）、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｈｏｍｅ．ｓｐｇ？ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｆｌａｖｉ＿ｄｅｎｇｕｅ）も参照、黄熱ウイルス（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０４１７２６（例えば、ＢｅＡｎ７５４０３６（ＰＲ４４０８）株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＲＱ１９０２６）、ＤＡＫ  ＡＲ  Ｂ４９０株、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＹＰ＿００９３４４９６１、ＹＭＰ  ４８株、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＹＰ＿００９２５６１９２、Ｕｇａｎｄａ  Ｓ株、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＹＰ＿００９３４４９６８、Ｗｅｓｓｅｌｓｂｒｏｎ株、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＹＰ＿００２９２２０２０））、ジカウイルス（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＹＰ＿００９４２８５６８、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＹＰ＿００２７９０８８１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＶ３４１５１を有するＭＲ  ７６６株）、ポワッサンウイルス（ＰＯＷ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿６２００９９）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９７３２）、および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０５９４３４）を含む。いくつかの実施形態では、フラビウイルスは、蚊媒介性（例えば、デングウイルス血清型１〜４（ＤＥＮＶ１〜４）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）など）である。
【０１２７】
ウエストナイルウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝２６９４＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｆｌａｖｉで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるウエストナイルウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１２８】
デングウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝７３０−７３１−７３２−７３３−７３４−７３５−７３６−８４３−８４４−８４５−８４６−８４７−８４８−８４９−８５０＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｆｌａｖｉで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるデングウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１２９】
黄熱ウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝２７１３＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｆｌａｖｉで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識される黄熱ウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１３０】
ジカウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝２７２１＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｆｌａｖｉで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるジカウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１３１】
ポワッサンウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝２２８０＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｆｌａｖｉで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるポワッサンウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１３２】
セントルイス脳炎ウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝２５８８＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｆｌａｖｉで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるセントルイス脳炎ウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１３３】
日本脳炎ウイルスの様々な株についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝１６９５＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｆｌａｖｉで入手することができる。一実施形態では、本発明の抗体によって認識されるセントルイス脳炎ウイルスは、本明細書において提供されるアクセッション番号で入手可能なアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である。
【０１３４】
本発明による抗体バリアントの構築に有用な例示的な抗体は、例えば、その各々の内容が参照によってその全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ／２００５／０６０５２０、ＷＯ／２００６／０８９１４１、ＷＯ／２００７／０６５０２７、ＷＯ／２００９／０８６５１４、ＷＯ／２００９／０７９２５９、ＷＯ／２０１１／１５３３８０、ＷＯ／２０１４／０５５８９７、ＷＯ２０１５／１４３１９４、ＷＯ２０１５／１６４８６５、ＷＯ２０１３／１６６５００、およびＷＯ２０１４／１４４０６１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５４２０２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５４０１０、および６２／１４４，７２９において開示される抗体を含む。
【０１３５】
本発明の抗体およびその断片は、本明細書において表に記載されるものなどの核酸を使用して、合成、操作、および／または生成することができる。一実施形態では、核酸は、表１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ、１４Ａ、１５Ａにおいて開示されるヌクレオチドを含む配列、配列番号４３、またはそれらの組み合わせを有する。別の実施形態では、核酸は、表１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ、１４Ａ、１５Ａにおいて開示される核酸配列、配列番号４３、またはそれらの組み合わせに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する。本発明は、本明細書に具体的に開示される配列の部分およびバリアントを含むことが理解されるであろう。例えば、コドン最適化配列の形態を実施形態において使用することができる。
【０１３６】
本発明の抗体およびその断片はまた、本明細書において表に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用して、合成、操作、および／または生成することができる。一実施形態では、ポリペプチドは、表１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂ、１３Ｂ、１４Ｂ、１５Ｂにおいて開示される連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列、配列番号４３によってコードされるアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせを有する。別の実施形態では、ポリペプチドは、表１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂ、１３Ｂ、１４Ｂ、１５Ｂにおいて開示されるアミノ酸配列、配列番号４３によってコードされるアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
【０１３７】
コード配列は、例えば、複製または非複製アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、弱毒結核菌ベクター、カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）ベクター、ワクシニアまたは改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、別のポックスウイルスベクター、組換えポリオおよび他の腸内ウイルスベクター、サルモネラ種細菌ベクター、赤痢菌種細菌ベクター、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、またはタバコモザイクウイルスベクターに存在し得る。コード配列は、例えば、ＣＭＶプロモーターなどの活性プロモーターを有するＤＮＡプラスミドとして発現させることもできる。他の生ベクターも、本発明の配列を発現するために使用することができる。本発明の抗体の発現は、好ましくはヒト細胞における発現を最適化するコドンおよびプロモーターを使用して、抗体をコードする核酸のそれらの細胞への導入によって、対象自身の細胞において誘導することができる。
【０１３８】
本発明の実施形態は、本発明の抗体バリアントを発現する細胞（すなわち、ＣＡＲＴ）を含む。細胞は、がん療法のための抗体バリアントを発現することができる免疫細胞、またはＣＡＲをコードする発現ベクターを保有する細菌細胞などの細胞を含む、任意の種類のものであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」は、交換可能に使用され得る。これらのすべての用語には、それらの子孫も含まれ、これは、あらゆる後続世代である。計画的または偶発性の変異のために、すべての子孫が同一ではない可能性があることが理解されている。異種核酸配列を発現する状況において、「宿主細胞」は、ベクターを複製し、および／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することができる真核細胞を指す。宿主細胞はベクターのレシピエントとして使用でき、使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」されてもよく、これは、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。形質転換された細胞は、初代対象細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｃｅｌｌ）およびその子孫を含む。本明細書で使用される場合、「操作された」および「組換え」細胞または宿主細胞という用語は、例えば、ベクターなどの外因性核酸配列が導入された細胞を指すことができる。したがって、組換え細胞は、組換えによって導入された核酸を含まない自然発生細胞と区別できる。本発明の実施形態では、宿主細胞は、細胞毒性Ｔ細胞（ＴＣ、細胞毒性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはキラーＴ細胞としても知られる）を含む、Ｔ細胞であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞も本発明に包含される。
【０１３９】
いくつかのベクターは、原核細胞および真核細胞の両方において複製および／または発現されることを可能にする制御配列を使用し得る。当業者は、上記の宿主細胞のすべてをインキュベートしてそれらを維持し、ベクターの複製を可能にする条件をさらに理解するであろう。また、ベクターの大規模生産、ならびにベクターによってコードされる核酸およびそれらの同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの生産を可能にする技術および条件も理解され、知られている。
【０１４０】
細胞は、自家細胞、同系細胞、同種異系細胞、場合によっては異種細胞であってもよい。
【０１４１】
多くの状況において、改変ＣＴＬの存在後のその不在が関心対象であるかまたは他の事由の研究にて、細胞が腫瘍性化し、治療を終わらせることを望む場合に、改変ＣＴＬを殺傷できることを望む場合がある。この目的のために、誘導性自殺遺伝子などの制御された条件下で改変細胞を殺傷することができる特定の遺伝子産物の発現を提供することができる。
【０１４２】
本発明はさらに、１つ以上のポリペプチドを分泌するように改変されたＣＡＲＴを含む。ポリペプチドは、例えば、抗体またはサイトカインであり得る。例えば、抗体は、ＣＡＩＸ、ＧＩＴＲ、ＰＤＬ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、ＣＣＲ４またはＴＩＧＩＴに特異的であり得る。
【０１４３】
武装ＣＡＲＴは、標的とされる部位、例えば、腫瘍部位でポリペプチドを同時に分泌するという利点を有する。
【０１４４】
武装ＣＡＲＴは、細胞内シグナル伝達ドメインの後に目的のポリペプチドをコードする核酸を含めることで構築できる。好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインと目的のポリペプチドとの間に配置された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）がある。当業者は、複数のＩＲＥＳ配列をタンデムで使用することにより、２つ以上のポリペプチドを発現できることを理解することができる。
【０１４５】
操作されたポリペプチドを含む抗体は、タンパク質を単離および精製するための様々な周知の技法を使用して、例えば、細胞からまたは組換え系から精製され得る。例えば、その各々が、それらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００；Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，２００１における抗体精製方法を参照されたい。
【０１４６】
本明細書に記載される、抗体、断片、および抗体誘導体、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体は、対象における使用のためのものなどの組成物（例えば、薬学的組成物）として製剤化することができる。適切な組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、水性媒体）に溶解または分散された抗体または断片（またはその誘導体）を含むことができる。
【０１４７】
薬学的に許容される担体は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などを含むことができる。薬学的な活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。抗体と適合性である任意の従来の媒体または薬剤を使用することができる。補助的な活性剤も、組成物中に組み込むことができる。薬学的に許容される担体の非限定的な例は、これらに限定されないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、安息香酸メチル、安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油を含む、固体または液体の充填剤、希釈剤、および封入物質を含む。
【０１４８】
本発明の薬学的組成物は、無菌であり得、その意図された投与経路に適合するように製剤化することができる。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。
【０１４９】
例えば、注射可能な使用に適した薬学的組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与について、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＭ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性であるべきである。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールのような薬学的に許容されるポリオール、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールによって達成することができる。多くの場合、組成物において等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含めることが有用であり得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって達成することができる。
【０１５０】
無菌注射可能溶液は、必要量の抗体を、必要に応じて、本明細書に列挙される成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。概して、分散液は、抗体を、基本的な分散媒および本明細書に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。
【０１５１】
別の例として、経口組成物は一般に、不活性希釈剤または可食性担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、抗体は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。
【０１５２】
薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含有することができる：微結晶セルロース、トラガカンスガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロートなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味などの着香剤。
【０１５３】
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与について、浸透させる障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与について、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与について、活性化合物は、当該技術分野で一般に知られる軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１５４】
抗体または断片（またはそれらの誘導体）はまた、皮膚または粘膜への局所投与（例えば、直腸内または膣内投与）に適切な組成物として製剤化され得る。そのような組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲル、およびペーストの形態をとることができる。抗体または断片（またはそれらの誘導体）はまた、鼻腔内投与に適切な組成物として製剤化され得る。標準的な製剤技法を適切な組成物の調製に使用することができる。
【０１５５】
本発明の抗体および／または組成物は、対象に１回（例えば、単一の注射または沈着として）投与することができる。あるいは、投与は、それを必要とする対象に約２〜約２８日、または約７〜約１０日、または約７〜約１５日の期間にわたって１日１回または２回であり得る。対象に年に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回、またはそれらの組み合わせの期間わたって１日１回または２回投与することもできる。
【０１５６】
治療有効用量範囲は、抗体または断片（またはその誘導体）、ならびに製剤の性質および投与経路に依存し得る。最適な用量は、過度の実験なしに当業者によって決定することができ、活性成分の薬力学的特性ならびにその投与様式および経路；有効成分の投与時間；レシピエントの年齢、性別、健康、および体重；症状の性質および程度；同時治療の種類、治療の頻度、および望ましい効果；ならびに排出率などの既知の因子に応じて変動し得る。例えば、約０．１〜１０００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲における抗体の治療有効用量を使用することができる。好ましくは、約１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲における抗体の用量を使用することができる。
【０１５７】
本発明の抗体または核酸は、キットで提供することもできる。一実施形態では、キットは、（ａ）抗体を含有する組成物を含有する容器、および任意に（ｂ）情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載される方法および／または治療上の利益のための薬剤の使用に関する説明的、指導的、マーケティング、または他の資料であり得る。一実施形態では、キットは、疾患または状態に罹患した対象を治療するための第２の薬剤も含む。例えば、キットは、ポリペプチドを含む組成物を含有する第１の容器、および第２の薬剤を含む第２の容器を含む。
【０１５８】
キットの情報資料は、その形態において限定されない。一実施形態では、情報資料は、抗体の産生、抗体の分子量、濃度、有効期限、バッチまたは産生部位情報などについての情報を含むことができる。一実施形態では、情報資料は、対象を治療するために、ポリペプチドまたはそれをコードする核酸を、例えば、適切な用量、剤形、または投与方法（例えば、本明細書に記載される用量、剤形、または投与方法）で投与する方法に関する。情報は、様々な形式で提供することができ、印刷されたテキスト、コンピュータ読み取り可能な資料、ビデオ録音、もしくは音声録音、または実質的な資料へのリンクもしくはアドレスを提供する情報を含む。
【０１５９】
抗体またはそれをコードする核酸に加えて、キットにおける組成物は、溶媒もしくは緩衝液、安定剤、または保存剤などの他の成分を含むことができる。抗体または核酸は、任意の形態、例えば、好ましくは、実質的に純粋および／または無菌の、液体、乾燥、または凍結乾燥形態で提供することができる。液体溶液で提供される場合、液体溶液は、好ましくは水溶液である。乾燥形態として提供される場合、再構成は一般に、適切な溶媒の添加による。溶媒、例えば、無菌水または緩衝液は、任意にキットにおいて提供することができる。
【０１６０】
キットは、抗体、核酸、またはそれを含む組成物のための１つ以上の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、組成物および情報資料のための別個の容器、仕切り、または区画を含有する。例えば、組成物は、ボトル、バイアル、またはシリンジに含有することができ、情報資料は、プラスチックスリーブまたはパケットに含有することができる。他の実施形態では、キットの別個の要素は、単一の分割されていない容器内に含有される。例えば、組成物は、ラベルの形態でそれに添付された情報資料を有するボトル、バイアル、またはシリンジに含有される。いくつかの実施形態では、キットは、各々が抗体または核酸の１つ以上の単位剤形（例えば、本明細書に記載される剤形）を含有する、複数（例えば、パック）の個々の容器を含む。容器は、組み合わせ単位投与量、例えば、抗体および第２の薬剤の両方を、例えば、所望の比で含む単位を含むことができる。例えば、キットは、例えば、各々が単一の組み合わせ単位用量を含有する、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、ブリスターパック、または医療デバイスを含む。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、水分の変化または蒸発に対して不浸透性）、および／または光密性であり得る。キットは、任意に、組成物の投与に適したデバイス、例えば、シリンジまたは他の適切な送達デバイスを含む。デバイスは、予め装填されて提供され得るか、または空であるが、装填に適し得る。
【０１６１】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。特許請求の範囲および／または明細書において「備える」という用語とともに使用されるときの「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つ以上」の意味とも一致する。
【０１６２】
句「例えば」、「など」、「含む」などが本明細書で使用される場合は常に、他に明確に明記されない限り、句「限定することなく」が付随することが理解される。同様に、「一例」、「例示的」などは、非限定的であると理解される。
【０１６３】
用語「実質的に」は、意図した目的に悪影響を与えない記述語からの逸脱を可能にする。記述用語は、単語「実質的に」が明確に列挙されていなくても、用語「実質的に」によって修正されることが理解される。
【０１６４】
用語「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに「有している（ｈａｖｉｎｇ）」および「伴っている（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」（および同様に「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、および「伴う（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」）などは、交換可能に使用され、同じ意味を有している。具体的には、用語それぞれは、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、それ故、非限定用語（ｏｐｅｎ  ｔｅｒｍ）の意味「少なくとも以下の（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｔｈｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）」であると解釈され、追加の特徴、限定、態様などを除外しないとも解釈される。したがって、例えば、「工程ａ、ｂ、およびｃを伴うプロセス」は、プロセスが少なくとも工程ａ、ｂおよびｃを含むことを意味している。用語「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」が使用される場合は常に、そのような解釈が文脈において無意味でない限り、「１以上」と理解される。
【０１６５】
本明細書で使用される「約」という用語は、本明細書では、おおよそ、大まかに、およそ、またはその領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、それは、記載された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、用語「約」は、本明細書では、数値を、記載された値の上下に２０パーセントの変動（上下）で変更するために使用される。
【０１６６】
本明細書および特許請求の範囲では、免疫グロブリン重鎖における残基の付番は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）におけるＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基付番を指す。
【０１６７】
「親和性」は、例えば、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原またはＦｃ受容体）との間の非共有相互作用の合計の強さを指し得る。特に示されない限り、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体／Ｆｃ受容体または抗体および抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指すことができる。分子ＸのそのパートナーＹについての親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で知られる一般的な方法によって測定することができる。さらに、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ，Ｄａｎｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．”Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｏｕｒ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ  １２２（２０１７）を参照されたい。結合親和性を測定するための特定の例示的（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｖｅ）かつ例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）な実施形態は、以下に記載される。例えば、その各々がその全体において参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００３０５６２９６、Ｎｅｒｉ，Ｄａｒｉｏ，ｅｔ  ａｌ．”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ．”Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４．１２（１９９６）：４６５−４７０、Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．”Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｂｉａｃｏｒｅ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０１１．４０３−４１８、およびＫａｒｌｓｓｏｎ，Ｒｏｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．”Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４９．１（２００６）：１３６−１４７を参照されたい。
【０１６８】
「親和性成熟」抗体は、例えば、そのような変更を保有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）における１つ以上の変更を有する抗体であり得、そのような変更は、抗原についての抗体の親和性における改善をもたらし得る。
【０１６９】
「アミノ酸修飾」は、例えば、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列における変更であり得る。例示的な修飾は、アミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含む。本明細書における好ましいアミノ酸修飾は、置換である。例えば、Ｆｃ領域の、指定された位置での「アミノ酸修飾」は、指定された残基の置換もしくは欠失、または指定された残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指すことができる。挿入によって、「隣接する」指定された残基は、例えば、その１〜２つの残基内の挿入であり得る。挿入は、指定された残基へのＮ末端またはＣ末端であり得る。
【０１７０】
「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列における少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の、別の異なる「置換」アミノ酸残基での置換を指す。置換残基（複数可）は、「自然発生アミノ酸残基」（すなわち、遺伝暗号によってコードされる）であり、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、およびバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択され得る。一実施形態では、置換残基は、システインではない。１つ以上の非自然発生アミノ酸残基での置換は、本明細書におけるアミノ酸置換を指すこともできる。「非自然発生アミノ酸残基」は、例えば、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基（複数可）に共有結合することができる、上記の自然発生アミノ酸残基以外の残基であり得る。非自然発生アミノ酸残基の非限定的な例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２（１９９１）３０１−３３６）に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体が挙げられる。そのような非自然発生アミノ酸残基を生成するために、例えば、Ｎｏｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４（１９８９）１８２およびＥｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，上記）の手順を使用することができる。簡潔には、これらの手順は、サプレッサーｔＲＮＡを非自然発生アミノ酸残基で化学的に活性化すること、続いてＲＮＡのインビトロ転写および翻訳を含む。
【０１７１】
「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つのアミノ酸の組み込みを指すことができる。挿入は、通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、本明細書に記載される本発明は、より大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３〜約５またはさらに約１０までのアミノ酸残基の挿入を利用することができる。挿入された残基（複数可）は、上記のように自然または非自然発生であり得る。
【０１７２】
「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指すことができる。
【０１７３】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、それらが望ましい抗原結合活性を示す限り、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、および抗体断片を含む、様々な抗体構造を包含する。本発明の抗体は、本明細書に記載されるものから選択されるＦｃ配列を含むものを含む。例えば、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアント、例えば、アミノ酸置換Ｅ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａ；またはＥ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、Ｓ２２８Ｐ、およびＲ４０９Ｋを有するＦｃバリアントを含む。残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。本発明の実施形態では、インタクトな抗体、抗体誘導体、またはその断片（例えば、抗原結合断片）のいずれかを使用することができる。すなわち、例えば、インタクトな抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ミニボディ、または二重特異性全抗体を、細胞シグナル伝達を増強する、および／または受容体クラスター化を誘導するためなどの、本発明の態様において使用することができる。
【０１７４】
毒素は、本明細書に記載される抗体または抗体断片に結合することができる。そのような毒素は、放射性同位体、生物学的毒素、ホウ素化デンドリマー、および免疫リポソームを含み得る（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７４６：１２１−４１，２０１２））。毒素は、当該技術分野で周知の方法を使用して抗体または抗体断片にコンジュゲートさせることができる（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７４６：１２１−４１（２０１２））。本明細書に開示される抗体、またはその断片もしくは誘導体の組み合わせはまた、本発明の方法において使用され得る。
【０１７５】
本明細書で使用される「抗体バリアント」という用語は、例えば、野生型抗体と比較したアミノ酸配列における変更が、例えば、野生型抗体における特定のアミノ酸残基の変異によって導入された、抗体バリアントにおいて生じることを特徴とする、野生型抗体のバリアントを指す。例えば、抗体バリアントは、細胞シグナル伝達を増強する、および／または受容体クラスター化を誘導するＦｃ領域におけるアミノ酸置換を含み得る。そのような置換は、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１、Ｅ３３３、Ｅ３４５、Ｅ４３０、および／もしくはＳ４４０と組み合わせたＥ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａ；またはヒトＩｇＧのＦｃにおけるＤ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、Ｐ３３１、Ｅ３３３、Ｅ３４５、Ｅ４３０、および／もしくはＳ４４０と組み合わせたＥ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、Ｓ２２８Ｐ、およびＲ４０９Ｋなどの本明細書に記載されるものを含む。残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番される。
【０１７６】
本明細書で使用される「抗体エフェクター機能（複数可）」または「エフェクター機能」という用語は、ＩｇＧのＦｃエフェクタードメイン（複数可）（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域）によってもたらされる機能を指すことができる。そのような機能は、例えば、食作用もしくは溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体へのＦｃエフェクタードメイン（複数可）の結合によって、または補体系の成分へのＦｃエフェクタードメイン（複数可）の結合によってもたらされ得る。典型的なエフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣである。
【０１７７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子であり得る。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
参照抗体として「同じエピトープに結合する抗体」は、例えば、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体であり得、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原への抗体の結合を５０％以上を遮断する。本明細書では、例示的な競合アッセイが提供される。
【０１７９】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」および「ＡＤＣＣ」は、例えば、ＦｃＲを発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ，ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９（１９９１）４５７−４９２の４６４ページの表３に要約される。
【０１８０】
例えば、「抗体依存性細胞食作用」および「ＡＤＣＰ」は、抗体でコーティングされた細胞が、全体または部分のいずれかにおいて、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する食作用性免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球、および樹状細胞）によって内在化されるプロセスである。
【０１８１】
「結合ドメイン」は、例えば、別の分子に結合するポリペプチドの領域であり得る。ＦｃＲの場合、結合ドメインは、Ｆｃ領域の結合に関与するそのポリペプチド鎖の一部分（例えば、そのａ鎖）を含むことができる。１つの有用な結合ドメインは、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインである。
【０１８２】
例えば、Ｆｃ受容体への「結合」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイにおけるＦｃ受容体への抗体の結合であり得る（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【０１８３】
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイでは、Ｆｃ受容体が表面に結合され、変異が導入されたバリアント、例えば、抗体バリアントの結合が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。例えば、各々が参照によってそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｒｉｃｈ，Ｒｅｂｅｃｃａ  Ｌ．，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ．”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ．”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１．１（２０００）：５４−６１、およびＲｉｃｈ，Ｒｅｂｅｃｃａ  Ｌ．；Ｒｉｃｈ，Ｒｅｂｅｃｃａ  Ｌ．，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ．”Ｓｐｙｉｎｇ  ｏｎ  ＨＩＶ  ｗｉｔｈ  ＳＰＲ．”Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１．３（２００３）：１２４−１３３、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｊａｍｅｓ  Ｍ．”Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ｔｏｗａｒｄｓ  ａｎ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ５．５（２００１）：５７２−５７７、およびＤａｖｉｄ  Ｇ．Ｍｙｓｚｋａ．”ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｊ：ａ  ｎｅｗ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １４．４（２００１）：２２３−２２８を参照されたい。結合の親和性は、ｋａ（抗体／Ｆｃ受容体複合体からの抗体の会合についての速度定数）、ｋｄ（解離定数）、およびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）という用語によって定義することができる。あるいは、例えば、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルは、共鳴シグナル高さおよび解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較することができる。
【０１８４】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも称される）は、通常、約アミノ酸２３１〜約アミノ酸３４０に及ぶ。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接にペアリングされていないという点でユニークである。むしろ、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が挿入されている。炭水化物はドメイン間ペアリングの代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ると推測されている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１９８５）１６１−２０６）。一実施形態では、図８、９、１１、および２７は、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびＩｇＧ３のＣＨドメインを示す。
【０１８５】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインへのＣ末端残基のストレッチ（すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１〜約アミノ酸残基４４７）を含む。一実施形態では、図８、９、１１、および２７は、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびＩｇＧ３のＣＨドメインを示す。
【０１８６】
「がん」および「がん性」は、例えば、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または記述する。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、および様々なタイプの頭頸部癌を含む。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という表現は互換的に使用され、すべてのそのような指定は子孫を含む。よって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、移入の数に関係なく、それが由来する初代対象細胞および培養物を含む。計画的または偶発性の変異のために、すべての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一ではない場合があることも理解されている。元の形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。別個の指定が意図される場合、文脈から明らかであろう。
【０１８８】
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。例えば、各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．”ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５（２０１４）：５２０、およびＳｐｉｅｇｅｌｂｅｒｇ，Ｈａｎｓ  Ｌ．”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ１．”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．１９．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７４．２５９−２９４．を参照されたい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【０１８９】
例えば、本明細書で使用される「細胞毒性剤」は、細胞機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性剤は、これらに限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；その断片および／またはバリアントを含む、細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素；ならびに本明細書で論じられる様々な抗腫瘍剤または抗癌剤を含む。
【０１９０】
「補体依存性細胞毒性」またはＣＤＣは、例えば、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメイン（複数可）が一連の酵素反応を活性化して標的細胞膜における孔の形成をもたらす細胞死を誘導するためのメカニズムを指す。抗体でコーティングされた標的細胞上のものなどの抗原抗体複合体は、補体成分Ｃ１ｑに結合してこれを活性化し、次に補体カスケードを活性化して、標的細胞死を引き起こす。補体の活性化はまた、白血球上の補体受容体（例えば、ＣＲ３）を結合することによってＡＤＣＣを促進する標的細胞表面上の補体成分の沈着をもたらし得る。
【０１９１】
「障害」は、Ｆｃバリアントを含む抗体のような、ポリペプチドでの治療から利益を受けるであろう任意の状態であり得る。これは、哺乳動物を問題の障害にかかりやすくする病理学的状態を含む、慢性および急性障害または疾患を含む。一実施形態では、障害は、がんである。
【０１９２】
「エフェクター機能」は、例えば、抗体のアイソタイプで異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、ならびにＢ細胞活性化を含む。
【０１９３】
本明細書で使用される「低減したエフェクター機能」は、対照（例えば、野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチド）と比較して、例えば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのような、特定のエフェクター機能の少なくとも２０％の低減を指すことができ、本明細書で使用される「大きく低減したエフェクター機能」は、対照と比較して、例えば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのような、特定のエフェクター機能の少なくとも５０％の低減を指すことができる。
【０１９４】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療または予防結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。
【０１９５】
「Ｆｃ領域」は、例えば、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。用語は、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含むことができる。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。本明細書で特に指定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ付番システムによる。
【０１９６】
「バリアントＦｃ領域」は、本明細書に記載されるような少なくとも１つの「アミノ酸修飾」によって、「天然」または「野生型」配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域、例えば、約１〜約１０個のアミノ酸置換と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。一実施形態では、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性を保有、それと少なくとも約９０％の相同性を保有、それと少なくとも約９５％の相同性を保有、それと少なくとも約９６％の相同性を保有、それと少なくとも約９７％の相同性を保有、それと少なくとも約９８％の相同性を保有、またはそれと少なくとも約９９％の相同性を保有することができる。
【０１９７】
本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」は、Ｆｃドメインにおける修飾を含むポリペプチドを指す。本発明のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。よって、例えば、Ｐ３２９Ｇは、親Ｆｃポリペプチドに対して３２９位でのプロリンのグリシンでの置換を有するＦｃバリアントであり、付番は、ＥＵインデックスによる。野生型アミノ酸の同一性は、特定されていない場合があり、その場合、前述のバリアントは、Ｐ３２９Ｇと称される。本発明で議論されるすべての位置について、付番は、ＥＵインデックスによる。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔもしくはＥＵ付番スキームのようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す（参照によって全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３（１９６９）７８−８５）。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。置換は、自然発生アミノ酸および非自然発生アミノ酸を含むことができる。バリアントは、非天然アミノ酸を含み得る。例は、すべて全体が参照によって組み込まれる、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ  ９８／４８０３２、ＷＯ  ０３／０７３２３８、ＵＳ  ２００４／０２１４９８８  Ａ１、ＷＯ  ０５／３５７２７  Ａ２、ＷＯ  ０５／７４５２４  Ａ２、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４（２００２）９０２６−９０２７、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１（２００２）１１３５−１１３７、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＩＣＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９（２００２）１１０２０−１１０２４、およびＷａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｃｈｅｍ．（２００２）１−１０を含む。
【０１９８】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」は、Ｆｃ領域を含む、抗体またはイムノアドヘシン（本明細書の説明参照）などのポリペプチドを指す。
【０１９９】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。例示的なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。また、別の例示的なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、対立遺伝子バリアントおよびこれらの受容体の選択的スプライス形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（１９９７）２０３−２３４）における概説を参照されたい）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ，ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９（１９９１）４５７−４９２、Ｃａｐｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４（１９９４）２５−３４、およびｄｅ  Ｈａａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０−４１において概説される。将来的に特定されるものを含む、他のＦｃＲは、本明細書では「ＦｃＲ」という用語によって包含される。用語は、母体ＩｇＧの胎児への移入に関与する、新生児型受容体であるＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７およびＫｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４９）。
【０２００】
例えば、「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物からの分子、例えば、ポリペプチドであり得る。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲを含むが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドはまた、ＦｃγＲに対して相同であるＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）を含む（参照によって完全に組み込まれる、Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０（２００２）１２３−１３６）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ  Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。一実施形態では、「Ｆｃリガンド」は、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物からの分子、例えば、ポリペプチドであり得る。
【０２０１】
本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーは、アイソフォームＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、およびＦｃγＲＩＣを含む、Ｆｃ．γ．ＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩＡ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ−１およびＦｃγＲＩＩＢ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含む、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＢ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＢ−ＮＡ２を含む）を含む、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照によって完全に組み込まれる、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２（２００２）５７−６５）、ならびに未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプを含むが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む、任意の生物に由来し得る。マウスＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに未検出のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプを含むが、これらに限定されない。
【０２０２】
「ＦｃＲｎ」または「新生児型Ｆｃ受容体」は、例えば、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質であり得る。ＦｃＲｎは、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む、任意の生物に由来し得る。当該技術分野で知られるように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と称される、２つのポリペプチドを含む。軽鎖は、ベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書で特に示されない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。
【０２０３】
例えば、「野生型または親ポリペプチド」は、その後修飾されてバリアントを生成する未修飾ポリペプチドであり得る。野生型ポリペプチドは、自然発生ポリペプチド、または自然発生ポリペプチドのバリアントもしくは操作されたバージョンであり得る。野生型ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、「野生型免疫グロブリン」は、修飾されてバリアントを生成する未修飾免疫グロブリンポリペプチドを指し、「野生型抗体」は、修飾されてバリアント抗体を生成する未修飾抗体を指す。「野生型抗体」は、本明細書に記載されるように、既知の市販の組換え産生された抗体を含むことに留意されたい。
【０２０４】
「断片結晶化可能（Ｆｃ）ポリペプチド」は、エフェクター分子および細胞と相互作用する抗体分子の一部分である。それは免疫グロブリン重鎖のＣ末端部分を含む。
【０２０５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、例えば、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）における以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に出現する。
【０２０６】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」は、本明細書において互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【０２０７】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節などを含む。そのようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされるＦｃ領域を必要とし、例えば、本明細書に開示される様々なアッセイを使用して評価することができる。
【０２０８】
「ヒンジ領域」は一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６〜Ｐｒｏ２３０のアミノ酸のストレッチを指す（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１９８５）１６１−２０６）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列と整列され得る。
【０２０９】
Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、例えば、ヒンジ領域のすぐＣ末端の残基、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３〜２３９のストレッチに対応する。
【０２１０】
「相同性」とは、例えば、最大の相同性パーセントを達成するために、必要に応じて、配列を整列させ、ギャップを導入した後に同一であるアミノ酸配列バリアントにおける残基のパーセンテージを指す。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。そのようなコンピュータプログラムの１つは、１９９１年１２月１０日に米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．２０５５９にユーザー文書とともに提出された、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成された「Ａｌｉｇｎ  ２」である。
【０２１１】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」という用語は、互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これは、一次形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量において親細胞と完全に同一ではない場合があり得るが、変異を含有し得る。元の形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が本明細書に含まれる。
【０２１２】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【０２１３】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、および好中球を含み、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然供給源から、例えば、本明細書に記載されるような血液またはＰＢＭＣから単離され得る。
【０２１４】
「ヒト化」抗体は、例えば、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指すことができる。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことができ、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含むことができる。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。例えば、「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残部が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【０２１５】
本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、配列において超可変である、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然四本鎖抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、配列可変性が最も高く、および／または抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）で発生する（Ｃｈｏｔｈｉａ，ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１−９１７）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、およびＨ３の９５〜１０２で発生する（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、省略−ＣＤＲまたはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１〜３４、Ｌ２の５０〜５５、Ｌ３の８９〜９６、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜５８、およびＨ３の９５〜１０２で発生する（Ａｌｍａｇｒｏ，ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９−１６３３を参照されたい）。特に示されない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記に従って付番される。
【０２１６】
「免疫複合体」とは、少なくとも１つの標的分子および少なくとも１つの異種Ｆｃ領域含有ポリペプチドが互いに結合してより大きな分子量の複合体を形成するときに形成される比較的安定な構造を指す。免疫複合体の例は、抗原−抗体凝集体および標的分子−イムノアドヘシン凝集体である。本明細書で使用される「免疫複合体」という用語は、特に示されない限り、エクスビボ複合体（すなわち、それが自然に見出され得る形態または設定以外）を指す。しかしながら、例えば、哺乳動物における免疫複合体のクリアランスを評価するために、免疫複合体が哺乳動物に投与され得る。
【０２１７】
「イムノコンジュゲート」は、これに限定されないが、細胞毒性剤を含む、１つ以上の異種分子（複数可）にコンジュゲートされた抗体である。
【０２１８】
「個体」または「対象」は哺乳動物であり得る。哺乳動物には、家畜（例：牛、羊、猫、犬、馬）、霊長類（例：ヒトおよびサルなどの非人類霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例：マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、個体または対象はヒトである。
【０２１９】
「対象」または「患者」という用語は、本発明の態様を、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的で投与することができる任意の生物を指すことができる。本開示の化合物が投与され得る典型的な対象は、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトであろう。獣医用途には、例えば、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ｃｏｗ）、ブタなどのような家畜、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどのような家禽、ならびに飼育動物、特にイヌおよびネコのようなペットなどの、多種多様な対象が適しているであろう。診断または研究用途には、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、および近交系ブタなどのブタを含む、多種多様な哺乳動物が適切な対象であろう。「生体対象」という用語は、上記の対象または生きている別の生物を指す。「生体対象」という用語は、生体対象から切除された部分（例えば、肝臓または他の臓器）だけではなく、対象または生物全体を指す。
【実施例】
【０２２０】
実施例は、本発明のより完全な理解を促進するために以下に提供される。以下の実施例は、本発明を作製および実施する例示的な様式を例示する。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例に開示されている特定の実施形態に限定されず、代わりの方法を使用して同様の結果を得ることができるため、例示のみを目的としている。
【０２２１】
実施例１−ＡＤＣＣアッセイ
我々は、Ｐｒｏｍｅｇａからのレポーターシステムを用いたＡＤＣＣアッセイを行った。ＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞のプールを選別して、９９％超のＧＩＴＲ＋細胞の純度を有する細胞集団を達成した。細胞を１５ｋ細胞／ウェルで播種し、様々な濃度の異なるａＧＩＴＲ抗体とインキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞を５：１のＥ：Ｔ比で加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｉｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬を添加し、発光シグナルを、ＢＭＧ  ＰｏｌａｒＳｔａｒｔ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダーを用いて検出した。データは、ＩｇＧ１  ＷＴモノマーおよびヘキサマー構築物のみが予想通り顕著なＡＤＣＣ活性を示したことを示す。ヘキサマー化がＷＴ  ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣの規模を低下させるように見えることも興味深い。陰性対照ＩｇＧは、特定のＡＤＣＣ活性を示さなかった。
【０２２２】
実施例２−ＣＤＣ活性変異体としてのＦcバリアント
ＩｇＧ１におけるＰ３２９−Ｐ３３１モチーフは、Ｃ１ｑ側鎖間のポケットに適合するループを形成する［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５１（２０１２）６６−７２］。理論によって縛られることなく、プロリン（Ｐ）の側鎖リング構造は、Ｃ１ｑとのＦｃ相互作用に顕著に寄与する。理論によって縛られることなく、構造を変更し、プロリンの側鎖を変更することによって、本発明者らは、ループの側鎖とＣ１ｑ上の結合ポケットとの間に反発相互作用または立体衝突のいずれかを形成することができる。Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９、およびＰ３３１位のアミノ酸を使用して、本発明者らは、最終構築物のヘキサマー構造およびＡＤＣＣヌル機能を維持しながら、ＣＤＣ活性を排除するように単一、二重、および三重変異体を設計した。図１５は、本発明者らがＬＡＬＡ−ヘキサマー構築物のＣＨ２領域に導入したいくつかの変異の図である。
【０２２３】
本発明者らはまた、Ｃ１ｑ結合を遮断する代替方法の試験を調査した。抗体が細胞表面上でヘキサマー化する場合、それらはＣ１ｑ構築物がドッキングするための平らなディスクを形成する。理論によって縛られることなく、より巨視的なレベルでＣ１ｑ結合に立体的に干渉するように、第２の構築物を軽鎖定常領域（ＣＬ）にテザーすることができる。これを試験するために、本発明者らは、２つのＣＬ融合体を生成し、図１５のパネルＩおよびＪに示されるように、１つは抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖとの、もう１つはＧＦＰアナログｚｓＧｒｅｅｎとのものである。
【０２２４】
一実施形態では、点変異の分析は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片、グリコフォーム（Ｇ０Ｆ）２（ＰＤＢコード−１ｈ３ｘ）を使用して行った。点変異体は、ＣＯＯＴ（結晶学的オブジェクト指向ツール）において手動でモデル化した。
【０２２５】
実施例３−ＣＤＣ活性は、ｓＩｇＧ４モノマーを除き、すべての抗ＧＩＴＲ  Ａｂ構築物に残る
この実験における標的細胞（図１６）は、選別されたＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞であった。標的細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒについて５０，０００／ウェルおよびＣｙｔｏＴｏｘについて１０，０００細胞／ウェルで播種し、目的の抗体を、１０％ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ）の最終濃度での３倍段階希釈で加えた。すべての試料を三重に分析した。３７℃で１時間インキュベーション後、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（生細胞数）またはＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（死細胞数）試薬を添加し、プレートをＢＭＧ  ＰｏｌａｒＳｔａｒ  Ｏｍｅｇａで読み取った。細胞および１０％血清（抗体なし）の両方を含有するウェルを使用して、すべての試料を正規化した。
【０２２６】
実施例４−結合分析
ＦＡＣＳは、選別されたＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞を使用して行った。２００ｋ細胞／ウェルを、示されるように抗体の量を増加させながらインキュベートし、ＭＡＣＳバッファーで１回洗浄した後、２ｕｌ／ウェルのＦＩＴＣ標識抗ヒトＬｃラムダ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ３１６６０６）を含有するＭＡＣＳバッファーに再懸濁させた。ＭＡＣＳバッファーで洗浄した後、細胞をＦｏｒｔｅｓｓａ  ＨＴＳ  ＦＡＣＳマシンで読み取り、生細胞にゲートをかけ、ＦＩＴＣ＋パーセントおよびＭＦＩを計算してプロットした（それぞれ図１８および１９を参照されたい）。陰性対照ＩｇＧは、特定の結合活性を示さなかった。
【０２２７】
実施例５−ＣＤＣ活性分析
図２０および図２１における標的細胞は、選別されたＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞（選別後Ｐ２）であった。標的細胞を１０，０００細胞／ウェルで播種し、目的の抗体を１０％ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ）の最終濃度での３倍段階希釈で加えた。すべての試料を三重に分析した。３７℃で２時間インキュベーション後、ＰｒｏｍｅｇａのＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ試薬を加え、プレートをＢＭＧ  ＰｏｌａｒＳｔａｒ  Ｏｍｅｇａで読み取った。細胞および１０％血清（抗体なし）の両方を含有するウェルを使用して、すべての試料を正規化した。図２０に示される選択された変異は、元の抗体と比較してＣＤＣ活性を有意に低減する。陰性対照ＩｇＧ（ｍＡ２．３）は、特定のＣＤＣ活性を示さなかった。
【０２２８】
実施例６−ＧＩＴＲバイオアッセイ
ＰｒｏｍｅｇａのＧＩＴＲバイオアッセイレポーターアッセイを実験に使用した（図２２〜２４）。凍結および解凍ＧＩＴＲ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＧＩＴＲＬ（ＧＩＴＲリガンド）のみ、抗体のみ、または抗体＋１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬのいずれかと３７℃で６時間インキュベートした。ＰｒｏｍｅｇａのＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を次いで加え、発光をＰｏｌａｒｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａプレートリーダーで読み取った。図２２〜２３について未刺激細胞シグナルを差し引くことによって、値を正規化した。
【０２２９】
実施例７−ＡＤＣＣアッセイ
ＡＤＣＣは、ＰｒｏｍｅｇａＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して行った（図２５）。ＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞のプールを選別して、９９％超のＧＩＴＲ＋細胞の純度を有する細胞集団を達成した。細胞を１５ｋ細胞／ウェルで播種し、様々な濃度の異なるαＧＩＴＲ抗体とインキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞を５：１のＥ：Ｔ比で加え、プレートを３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｉｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬を添加し、発光シグナルを検出した。
【０２３０】
実施例８
図３３を参照すると、ＣＤＣは、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（生細胞アッセイ）を使用して行った。５０ｋ細胞を播種し、１０％ヒト血清（最終濃度）および様々な抗体と混合した。それらを３７℃で１または２時間インキュベートした後、ＲＴで３０分間平衡化させた。次いでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬を加え、平衡化後、プレートをＰｏｌａｒｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａで読み取った。
【０２３１】
データは、選択されたｓＩｇＧ４変異が、ｓＩｇＧ４  ｈｅｘ  ＷＴと比較してＣＤＣ活性を有意に増加させることを示す。
【０２３２】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していない。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内である。
【０２３３】
当業者であれば、ルーチンの実験以上のものを使用せずに、本明細書に具体的に記載された特定の物質および手順に対する多数の同等物を認識するであろう、または確認できるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の請求項によってカバーされる。
【図１】
2021518411.tif 000049
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２７−５】
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【図２７−６】
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【図２７−７】
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【図２８】
2021518411.tif 000111
【図２９】
2021518411.tif 000112
【図３０】
2021518411.tif 000113
【図３１】
2021518411.tif 000114
【図３２】
2021518411.tif 000115
【図３３】
2021518411.tif 000116
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月27日(2020.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
[本発明1001]
野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含む操作されたポリペプチドであって、前記Ｆｃバリアントが、少なくとも2つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、残基位置228、234、235、270、322、329、331、333、345、409、430、440、またはそれらの組み合わせにおいて生じており、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、ポリペプチド。
[本発明1002]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置228の前記アミノ酸が、プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置234の前記アミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1004]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置235の前記アミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1005]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置345のグルタミン酸（Ｅ）が、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1006]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置409の前記アミノ酸が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1007]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置430のグルタミン酸（Ｅ）が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1008]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置440のセリン（Ｓ）が、トリプトファン（Ｗ）で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1009]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置270のアスパラギン酸（Ｄ）が、中性非極性アミノ酸で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1010]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置322のリジン（Ｋ）が、中性非極性アミノ酸で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1011]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置329のプロリン（Ｐ）が、中性非極性アミノ酸で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1012]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置331の前記アミノ酸が、中性非極性アミノ酸で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1013]
前記中性非極性アミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む、本発明1009、1010、1011、または1012のポリペプチド。
[本発明1014]
ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置333のグルタミン酸（Ｅ）が、中性極性アミノ酸で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1015]
前記中性極性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）である、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1016]
前記アミノ酸置換が、Ｌ234Ａ、Ｌ235Ａ、Ｅ345Ｋ、およびＥ430Ｇを含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1017]
前記アミノ酸置換が、Ｓ228Ｐ、Ｅ345Ｋ、Ｒ409Ｋ、およびＥ430Ｇを含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1018]
前記アミノ酸置換が、Ｄ270Ａ、Ｋ322Ａ、およびＰ331Ｇをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1016または1017のポリペプチド。
[本発明1019]
前記アミノ酸置換が、Ｄ270ＡおよびＰ331Ｇをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1016または1017のポリペプチド。
[本発明1020]
前記アミノ酸置換が、Ｄ270Ａ、Ｐ331Ｖ、およびＥ333Ｑをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1016または1017のポリペプチド。
[本発明1021]
前記アミノ酸置換が、Ｐ329Ｖをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1016または1017のポリペプチド。
[本発明1022]
前記アミノ酸置換が、Ｐ331Ｖをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1016または1017のポリペプチド。
[本発明1023]
前記アミノ酸置換が、Ｐ329ＶおよびＰ331Ｖをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1016または1017のポリペプチド。
[本発明1024]
前記アミノ酸置換が、Ｐ329Ｖおよび／またはＰ331Ｆをさらに含み、前記アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、本発明1016または1017のポリペプチド。
[本発明1025]
前記野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、1つ以上のヒトＦｃ受容体に対して低減した親和性を示す、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1026]
前記野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、増加した受容体クラスター化をさらに示す、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1027]
減少した補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をさらに示す、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1028]
ヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、またはＩｇＧ4  Ｆｃ領域を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1029]
抗体またはＦｃ融合タンパク質である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1030]
前記抗体が、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である、本発明1029のポリペプチド。
[本発明1031]
薬物、毒素、放射性標識、またはそれらの組み合わせにコンジュゲートされている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1032]
Ｔ細胞上の阻害分子に特異的な抗体である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1033]
Ｔ細胞上の前記阻害分子が、ＰＤ1、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ4、Ｌａｇ3、Ｔｉｍ3、またはＫＩＲを含む、本発明1032のポリペプチド。
[本発明1034]
Ｔ細胞上の刺激分子に特異的な抗体である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1035]
Ｔ細胞上の前記刺激分子が、ＧＩＴＲ、ＣＤ27、ＯＸ40、4−ＢＢ、ＣＤ40Ｌ、ＩＣＯＳ、またはＣＤ28を含む、本発明1034のポリペプチド。
[本発明1036]
ケモカイン受容体に特異的な抗体である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1037]
前記ケモカイン受容体が、ＣＣＲ4、ＣＸＣＲ4、またはＣＣＲ5を含む、本発明1036のポリペプチド。
[本発明1038]
腫瘍細胞上の腫瘍関連分子に特異的な抗体である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1039]
腫瘍細胞上の前記腫瘍関連分子が、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、抗原提示細胞分子、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1038のポリペプチド。
[本発明1040]
前記抗原提示細胞分子が、ＰＤＬ1またはＰＤＬ2を含む、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1041]
感染因子に特異的な抗体である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1042]
前記感染因子が、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群ウイルス（ＭＥＲＳ）、アルファウイルス、フラビウイルス、またはインフルエンザウイルスを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1043]
前記アルファウイルスが、西部馬脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、またはチクングニアウイルス（ＣＨＫＶ）を含む、本発明1042のポリペプチド。
[本発明1044]
前記フラビウイルスが、蚊媒介性である、本発明1042のポリペプチド。
[本発明1045]
前記フラビウイルスが、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、デンジウイルス血清型1〜4、黄熱ウイルス、またはジカウイルスを含む、本発明1042のポリペプチド。
[本発明1046]
前記インフルエンザウイルスが、新興インフルエンザウイルスである、本発明1042のポリペプチド。
[本発明1047]
前記抗体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のターゲティングドメインを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1048]
ＣＨ1ドメイン、ヒンジ、ＣＨ2ドメイン、ＣＨ3ドメイン、またはそれらの組み合わせが、細胞外ドメインに組み込まれている、本発明1047のポリペプチド。
[本発明1049]
グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に特異的な抗体である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1050]
ＣＣＲ4に特異的な抗体である、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1051]
ＦｃバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む操作されたポリペプチドであって、前記Ｆｃバリアントが、配列番号4に対する少なくとも90％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換が、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じている、ポリペプチド。
[本発明1052]
Ｘ1が、セリン（Ｓ）を含むアミノ酸置換である、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1053]
Ｘ2が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1054]
Ｘ3が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1055]
Ｘ4が、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1056]
Ｘ5が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1057]
Ｘ6が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1058]
Ｘ7が、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である、本発明1051のポリペプチド。
[本発明1059]
ＦｃバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む操作されたポリペプチドであって、前記Ｆｃバリアントが、配列番号5に対する少なくとも90％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換が、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じている、ポリペプチド。
[本発明1060]
Ｘ1が、セリン（Ｓ）を含むアミノ酸置換である、本発明1059のポリペプチド。
[本発明1061]
Ｘ2が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、本発明1059のポリペプチド。
[本発明1062]
Ｘ3が、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である、本発明1059のポリペプチド。
[本発明1063]
Ｘ4が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である、本発明1059のポリペプチド。
[本発明1064]
Ｘ5が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である、本発明1059のポリペプチド。
[本発明1065]
Ｘ6が、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である、本発明1059のポリペプチド。
[本発明1066]
ＦｃバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む操作されたポリペプチドであって、前記Ｆｃバリアントが、配列番号6に対する少なくとも90％の同一性を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換が、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、ＸＤ、ＸＥ、またはそれらの組み合わせにおいて生じている、ポリペプチド。
[本発明1067]
Ｘ1が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる残基位置228のアミノ酸の置換であり、かつプロリン（Ｐ）を含む、本発明1066のポリペプチド。
[本発明1068]
Ｘ2が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、本発明1066のポリペプチド。
[本発明1069]
Ｘ3が、アラニン（Ａ）を含むアミノ酸置換である、本発明1066のポリペプチド。
[本発明1070]
Ｘ4が、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸置換である、本発明1066のポリペプチド。
[本発明1071]
Ｘ5が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸置換である、本発明1066のポリペプチド。
[本発明1072]
Ｘ6が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸置換である、本発明1066のポリペプチド。
[本発明1073]
Ｘ7が、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸置換である、本発明1066のポリペプチド。
[本発明1074]
ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ、またはＸＤが、中性非極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である、本発明1051、1059、または1066のポリペプチド。
[本発明1075]
前記中性非極性アミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を含む、本発明1074のポリペプチド。
[本発明1076]
ＸＥが、中性極性アミノ酸を含むアミノ酸置換である、本発明1051、1059、または1066のポリペプチド。
[本発明1077]
前記中性極性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）を含む、本発明1076のポリペプチド。
[本発明1078]
表1Ｂに開示される可変領域アミノ酸配列と、表8Ｂ（配列番号18、19、22、26、45）、表9Ｂ（配列番号18、19、22、26、47）、表10Ｂ（配列番号18、19、22、26、49）、表11Ｂ（配列番号18、19、22、26、51）、表12Ｂ（配列番号18、19、22、26、53）、表13Ｂ（配列番号18、19、22、26、55）、表14Ｂ（配列番号18、19、22、26、57）、または表15Ｂ（配列番号18、19、24、26、59）に開示されるバリアントＦｃ領域アミノ酸配列と、を含む、組換えＧＩＴＲ抗体。
[本発明1079]
表1Ｂに開示される可変領域アミノ酸配列と、表8Ｂ（配列番号18、19、22、26、45）、表9Ｂ（配列番号18、19、22、26、47）、表10Ｂ（配列番号18、19、22、26、49）、表11Ｂ（配列番号18、19、22、26、51）、表12Ｂ（配列番号18、19、22、26、53）、表13Ｂ（配列番号18、19、22、26、55）、表14Ｂ（配列番号18、19、22、26、57）、または表15Ｂ（配列番号18、19、24、26、59）に開示されるバリアントＦｃ領域アミノ酸配列と、を含む、組換えＣＣＲ4抗体。
[本発明1080]
本発明1078の組換えＧＩＴＲ抗体または本発明1079の組換えＣＣＲ4抗体を対象に投与する工程を含む、Ｔ細胞免疫を増強する方法。
[本発明1081]
本発明1078の組換えＧＩＴＲ抗体を対象に投与する工程を含む、対象における腫瘍を治療する方法。
[本発明1082]
本発明1079の組換えＣＣＲ4抗体を対象に投与する工程を含む、ＣＣＬ22／17分泌腫瘍を治療する方法。
[本発明1083]
前記ＣＣＬ22／17分泌腫瘍が、血液系がんである、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記血液系がんが、リンパ腫または白血病である、本発明1083の方法。
[本発明1085]
前記ＣＣＬ22／17分泌腫瘍が、卵巣癌である、本発明1082の方法。
[本発明1086]
リガンドを細胞に結合させる抗体に細胞を接触させる工程を含む、細胞の細胞シグナル伝達を増強する方法であって、前記抗体が、本発明1001、1051、1059、もしくは1066のポリペプチドまたは野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、前記Ｆｃバリアントが、Ｄ270、Ｋ322、Ｐ329、Ｐ331、Ｅ333、Ｅ345、Ｅ430、および／またはＳ440においてアミノ酸置換を含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、方法。
[本発明1087]
前記置換が、Ｄ270Ａ、Ｋ322Ａ、Ｐ329Ｖ、Ｐ331Ｇ、Ｐ331Ｖ、Ｐ331Ｆ、Ｅ333Ｑ、Ｅ430Ｇ、Ｅ430Ｓ、Ｅ430Ｆ、Ｅ430Ｔ、Ｅ345Ｋ、Ｅ345Ｑ、Ｅ345Ｒ、Ｅ345Ｙ、Ｓ440Ｗ、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1086の方法。
[本発明1088]
リガンドを細胞に結合させる抗体に細胞を接触させる工程を含む、細胞の受容体クラスター化を誘導する方法であって、前記抗体が、本発明1001、1051、1059、もしくは1066のポリペプチドまたは野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、前記Ｆｃバリアントが、Ｄ270、Ｋ322、Ｐ329、Ｐ331、Ｅ333、Ｅ345、Ｅ430、および／またはＳ440においてアミノ酸置換を含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、方法。
[本発明1089]
前記置換が、Ｄ270Ａ、Ｋ322Ａ、Ｐ329Ｖ、Ｐ331Ｇ、Ｐ331Ｖ、Ｐ331Ｆ、Ｅ333Ｑ、Ｅ430Ｇ、Ｅ430Ｓ、Ｅ430Ｆ、Ｅ430Ｔ、Ｅ345Ｋ、Ｅ345Ｑ、Ｅ345Ｒ、Ｅ345Ｙ、Ｓ440Ｗ、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1088の方法。
[本発明1090]
腫瘍が、固形腫瘍または液体腫瘍である、本発明1083の方法。
[本発明1091]
リガンドを細胞に結合させる抗体に細胞を接触させる工程を含む、細胞のＣＤＣ活性を低減する方法であって、前記抗体が、本発明1001、1051、1059、もしくは1066のポリペプチドまたは野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、前記Ｆｃバリアントが、Ｄ270、Ｌ234、Ｌ235、Ｋ322、Ｐ329、Ｐ331、および／またはＥ333においてアミノ酸置換を含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されている、方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、それらによって包含されるであろう。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【図１】２９３Ｆ細胞から発現および精製された抗ＧＩＴＲ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。抗ＧＩＴＲ抗体Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ（レーン１）、Ｅ１−３Ｈ７安定化ＩｇＧ４（レーン２）、ＣＴＩ−１０安定化ＩｇＧ４（レーン３）、Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡヘキサマー（レーン４）、Ｅ１−３Ｈ７安定化ＩｇＧ４ヘキサマー（レーン５）、およびＥ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー（レーン６）をコードするｐＴＣＡＥプラスミドを、２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトさせる。細胞上清を、９６時間後に採取し、プロテインＡアフィニティー樹脂で精製した。約２ｕｇ（精製後ＯＤ２８０読み取りによって測定）の各精製抗体を４〜２０％ポリアクリルアミドゲルによって分析し、クーマシーブルー染色によって可視化した。レーン７は、対照ＣＴＩ−１０  ＩｇＧ１を既知の濃度で含有する。パネルＡ還元条件、パネルＢ非還元条件。データは、各抗体が発現および精製されたことを示す。
【図２】Ｐｒｏｍｅｇａによって作製され、我々のアッセイにおいて使用されるＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＮＦ−ｋＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイシステム内で、ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲＬ相互作用がＮＦ−ｋＢ経路を活性化することを示す図である。
【図３−１】ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＮＦ−ｋＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞は、表面に発現した受容体ＧＩＴＲとのルシフェラーゼ活性に基づくリガンドまたは抗体反応を生成するレポーター細胞である。システム対照として、パネルＡは、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）が、予想されるルシフェラーゼ活性を誘導したことを示し、パネルＢは、抗ＨＡ抗体が、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬで誘導されたルシフェラーゼ活性をさらに増強するというデータを示す（ＧＬＴＲＬはｃ末端ＨＡタグと融合していることに留意されたい）。
【図３−２】パネルＣは、我々の新たに発見された抗ＧＩＴＲ抗体Ｅ１−３Ｈ７−ｓＩｇＧ４が、ＧｉＴＲ／ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼを単独で誘導するか、または１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬで誘導されるルシフェラーゼ活性をさらに増強することができることを示し、これは市販の抗ＧＩＴＲ  Ａｂ対照、ＣＴＩ−１０、パネルＤの挙動とは異なる。
【図４−１】ヘキサマー化抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体は、ＧＩＴＲ／ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼ活性の媒介において増加した感度を有する。（Ａ）抗ＧＩＴＲ抗体Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１−ＬＡＬＡおよび対応するヘキサマー（Ｅ１−３Ｈ７−ＬＡＬＡ  Ｈｅｘ）は、ルシフェラーゼ活性をＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＮＦ−ｋＢ−ｌｕｃ２Ｐ／ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞から用量依存的に誘導した。Ｅ１−３Ｈ７ヘキサマーは、ルシフェラーゼ誘導を抗体濃度において約１ｌｏｇ低い方にシフトすることができたことに留意されたい。（Ｂ）抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体は、ＧＩＴＲＬ誘導性ルシフェラーゼ活性をさらに増強する。もう一度、Ｅ１−３Ｈ７−ＬＡＬＡヘキサマーは、そのような誘導をはるかに低いＡｂ濃度で達成した。パネルＣおよびＤは、Ｅ１−３Ｈ７での同様の効果がＩｇＧ４およびその対応するｓＩｇＧ４ヘキサマーを安定させたことを示す。抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体は、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲリガンドの不在下（パネルＡおよびＣ）または存在下（パネルＢおよびＤ）で、５０００ｎｇ／ｍｌから２０．５８ｎｇ／ｍｌまでの３倍希釈で使用した。
【図４−２】図４−１の説明を参照のこと。
【図５−１】ヘキサマー化抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体は、ＧＩＴＲ／ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼ活性の媒介において増加した感度を有する。ルシフェラーゼ誘導の完全な範囲を確認するために、抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７−ＩｇＧ１  ＬＡＬＡまたはＩｇＧ４抗体濃度が、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲリガンドの不在下（パネルＡおよびＣ）または存在下（パネルＢおよびＤ）で、１５０００ｎｇ／ｍｌから６１．７３ｎｇ／ｍｌまでの３倍希釈で使用されたことを除いて、図４に示されるものと同様の実験であり、それらの対応するヘキサマー形式は、５０００ｎｇ／ｍｌから２０．５８ｎｇ／ｍｌまでのままであった。無関係なＩｇＧ対照は、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬによるルシフェラーゼ誘導のベースレベルに対する有意な効果を示さなかった。
【図５−２】図５−１の説明を参照のこと。
【図６−１】抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７抗体のＩｇＧ１  Ｆｃ野生型、ＩｇＧ１  Ｆｃ  ＬＡＬＡ変異体、または安定化ＩｇＧ４ヘキサマーは、ＧＩＴＲ／ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼ活性の媒介において同様の活性を有する。抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７−ＩｇＧ１  ＷＴまたはＩｇＧ  １  ＬＡＬＡまたはｓＩｇＧ４ヘキサマー抗体濃度は、１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲリガンドの不在下または存在下で、５０００ｎｇ／ｍｌから２０．５８ｎｇ／ｍｌまでの３倍希釈で使用したが、対照ＩｇＧ１は、１５０００ｎｇ／ｍｌから６１．７３ｎｇ／ｍｌまでの濃度を有する。パネルＡにおけるＥ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー結果は、パネルＢおよびＣまたはパネルＤおよびＥに提示されるものとは別の実験からのものであることに留意されたい。Ｘ軸およびＹ軸は、パネルＡ〜Ｅについて同じである。
【図６−２】図６−１の説明を参照のこと。
【図７】Ｐｒｏｍｅｇａからのレポーターシステムを用いたＡＤＣＣアッセイ。
【図８−１】ＩｇＧ１のＷＴおよびＬＡＬＡヘキサマー変異体のＦｃ領域の核酸およびアミノ酸配列。図８は、出現順にそれぞれ配列番号９２〜９５を開示する。
【図８−２】図８−１の説明を参照のこと。
【図８−３】図８−１の説明を参照のこと。
【図８−４】図８−１の説明を参照のこと。
【図８−５】図８−１の説明を参照のこと。
【図９−１】安定化ヘキサマーＩｇＧ４のＦｃ領域の核酸およびアミノ酸配列。図９は、出現順にそれぞれ配列番号９６〜９７を開示する。
【図９−２】図９−１の説明を参照のこと。
【図９−３】図９−１の説明を参照のこと。
【図１０】ＩｇＧ抗体の哺乳動物発現に使用することができるベクターのための発現ベクターマップ。
【図１１】ＩｇＧ抗体の哺乳動物発現に使用することができるベクターのための発現ベクターマップ。
【図１２−１】ＩｇＧ１の野生型Ｆｃ領域についてのアミノ酸配列（配列番号１）およびＫａｂａｔのＥＵインデックスによる対応するアミノ酸残基番号である。
【図１２−２】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−３】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−４】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−５】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−６】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−７】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１３−１】ＩｇＧ２の野生型Ｆｃ領域についてのアミノ酸配列（配列番号２）およびＫａｂａｔのＥＵインデックスによる対応するアミノ酸残基番号である。
【図１３−２】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−３】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−４】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−５】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−６】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−７】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１４−１】ＩｇＧ４の野生型Ｆｃ領域についてのアミノ酸配列（配列番号３）およびＫａｂａｔのＥＵインデックスによる対応するアミノ酸残基番号である。
【図１４−２】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−３】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−４】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−５】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−６】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１４−７】図１４−１の説明を参照のこと。
【図１５】ＣＤＣ活性が、ｓＩｇＧ４モノマーを除き、すべての抗ＧＩＴＲ  Ａｂ構築物に残ることを示すグラフである。グラフは、細胞殺滅の量を定量化するために異なる試薬を使用した同様の実験を表す。左のグラフのアッセイは、培養中の生存細胞の数を決定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏシステムを使用するが、右のグラフのアッセイは、死細胞のみをカウントするＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏを使用する。
【図１６】減少した補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を生成するためにＬＡＬＡ−ヘキサマー構築物のＣＨ２領域に導入されたいくつかの変異のリボン構造の図である。図１６のパネルＡは、Ｃ１ｑ結合に関与しており、変異の標的とされるＣＨ２におけるその重要な残基を示す。パネルＢ〜Ｈは、各構築物において変異した残基（複数可）、および変異による予測される効果（複数可）を示す。パネルＩおよびＪは、２つのＣＬ融合体を示し、１つは抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖとの、もう１つはＧＦＰアナログｚｓＧｒｅｅｎとのものである。
【図１７−１】ＧＩＴＲ変異体のＳＤＳページゲル（非還元ゲル、還元ゲル（１０％ＢＭＥ））の写真画像である。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅをトランスフェクトし、採取およびプロテインＡコンジュゲートセファロースを介した精製前の５日間培養した。１ｕｇの各精製タンパク質を、Ｂｏｌｔ（商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓ  Ｇｅｌで泳動した。右のゲル中の試料は還元されておらず、左のゲルは１０％β−メルカプトエタノールで還元されている。レーン１．ラダー（Ｂｉｏｒａｄプレシジョンプラス）、レーン２．ｍＡｂ２−３  ＩｇＧ１  ＷＴモノマー、レーン３．ｍＡｂ２−３  ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー、レーン４．Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴモノマー、レーン５．Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴヘキサマー、レーン６．Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡモノマー、レーン７．Ｅ１−３Ｈ７  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡヘキサマー、レーン８．Ｍｔ  １、レーン９．Ｍｔ  ２、レーン１０．Ｍｔ  ３、レーン１１．ＰＶ、レーン１２．ＶＰ、レーン１３．ＶＶ、レーン１４．ａＰＤＬ１、およびレーン１５．ＰＦ（Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ）。
【図１７−２】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１８】ＧＩＴＲ＋細胞に結合する抗ＧＩＴＲ  Ａｂの結合曲線であり、結合について陽性の細胞％に関してフローサイトメトリーによって分析されている。試験されたＧＩＴＲヘキサマー変異体のキー：（ａ）Ｍｔ１：Ｄ２７０Ａ  Ｋ３２２Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｂ）Ｍｔ２：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｃ）Ｍｔ３：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑ、（ｄ）ＶＰ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｐ、（ｅ）ＰＶ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｖ、（ｆ）ＶＶ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｖ、および（ｇ）ＰＦ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ。
【図１９】ＧＩＴＲ＋細胞への抗ＧＩＴＲ  Ａｂ結合についての結合曲線であり、ＭＦＩ（平均蛍光強度）に関してフローサイトメトリーによって分析されている。試験されたＧＩＴＲヘキサマー変異体のキー：（ａ）Ｍｔ１：Ｄ２７０Ａ  Ｋ３２２Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｂ）Ｍｔ２：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｃ）Ｍｔ３：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑ、（ｄ）ＶＰ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｐ、（ｅ）ＰＶ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｖ、（ｆ）ＶＶ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｖ、および（ｇ）ＰＦ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ。
【図２０】ＣＤＣがＷｔおよびＬＡＬＡ構築物（ＲＬＵ）と比較して低減したことを示す変異体のＣＤＣの棒グラフを表す。試験された変異体のキー：（ａ）Ｍｔ１：Ｄ２７０Ａ  Ｋ３２２Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｂ）Ｍｔ２：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｃ）Ｍｔ３：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑ、（ｄ）ＶＰ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｐ、（ｅ）ＰＶ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｖ、（ｆ）ＶＶ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｖ、および（ｇ）ＰＦ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ。すべての抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、親Ｅ１−３Ｈ７抗ＧＩＴＲ抗体に由来する。
【図２１】ＣＤＣがＷｔおよびＬＡＬＡ構築物（殺滅％）と比較して低減したことを示す変異体のＣＤＣの棒グラフを表す。試験された変異体のキー：（ａ）Ｍｔ１：Ｄ２７０Ａ  Ｋ３２２Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｂ）Ｍｔ２：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｇ、（ｃ）Ｍｔ３：Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑ、（ｄ）ＶＰ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｐ、（ｅ）ＰＶ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｖ、（ｆ）ＶＶ：Ｐ３２９Ｖ  Ｐ３３１Ｖ、および（ｇ）ＰＦ：Ｐ３２９Ｐ  Ｐ３３１Ｆ。すべての抗体は、親Ｅ１−３Ｈ７抗ＧＩＴＲ抗体からのものである。導入された変異は、元の抗体と比較してＣＤＣ活性の量を有意に低減する。
【図２２】ＧＩＴＲバイオアッセイ（ＲＬＵ）のグラフを示す。左のグラフは抗体のみであるが、右のグラフは各試料への１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬの添加を有する（左および右のグラフの結果は異なる日に行われた）。データは、ＣＤＣ活性を低減するために行われた変異が抗体のヘキサマー化に影響を与えないことを示す。モノマーと比較して、ヘキサマーのすべてが用量応答曲線で左への顕著なシフトを示す。
【図２３】ＧＩＴＲバイオアッセイにおける抗体および一定のＧＩＴＲＬによる誘導の倍率のグラフを示す。左のグラフは抗体のみであるが、右のグラフは各試料への１１１ｎｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬの添加を有する（異なる日に行われた実験間の比較）。データは、ＣＤＣ活性を低減するために行われた変異が抗体のヘキサマー化に影響を与えないことを示す。モノマーと比較して、ヘキサマーのすべてが用量応答曲線で左への顕著なシフトを示す。ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）と共刺激される場合、抗体は相加効果を有するが（図２２および２３）、市販のＧＴＩ−１０抗ＧＩＴＲ抗体はこれを有さない。
【図２４】ＧＩＴＲバイオアッセイにおいてＧＩＴＲＬに対して正規化された場合の抗体による誘導の倍率のグラフを示す。このグラフは、（１１１ｎｇ／ｍｌでの）ＧＩＴＲＬに対して誘導倍率を正規化することによって、抗体からＧＩＴＲＬの効果をデコンボリューションする。正規化された誘導倍率は、次のように計算される：試料のＲＬＵ／ＧＩＴＲＬ（１１１ｎｇ／ｍｌ）のみのＲＬＵ。生物活性アッセイのこの分析はまた、変異したヘキサマーが、モノマーと比較して用量応答曲線で左への顕著なシフトを有し続けることを示す。
【図２５】観察されたＡＤＣＣ活性のグラフを示す。グラフに列挙された変異体は、いかなる測定可能なＡＤＣＣ活性も有さない。陰性対照ＩｇＧは、特異的ＡＤＣＣ活性を示さなかった。
【図２６】本発明によって企図される変異体の要約である。
【図２７−１】ＩｇＧ３の野生型Ｆｃ領域についてのアミノ酸配列（配列番号６０）およびＫａｂａｔのＥＵインデックスによる対応するアミノ酸残基番号である。
【図２７−２】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−３】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−４】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−５】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−６】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２７−７】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２８】ＩｇＧ  Ｌｃ融合体の結合（％）を示すグラフである。ａＧＩＴＲ−ＰＤＬ１  Ｌｃ融合ＩｇＧを、ＰＤＬ１で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＧＩＴＲ＋細胞またはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（約７５〜８０％のトランスフェクション効率）と様々な濃度でインキュベートした。ＲＴで２５分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、融合抗体の結合をＰＤＬ１−ｓｃＦｖ融合体のＣ末端上のＨｉｓタグを通した抗Ｈｉｓ−ＰＥによって検出した。このグラフは、検出されたＰＥ陽性細胞％によって決定されるように、二重特異性ＩｇＧの各アームが独立してその標的に結合することができることを示す。
【図２９】ＩｇＧ  Ｌｃ融合体の結合（ＭＦＩ）を示すグラフである。ａＧＩＴＲ−ＰＤＬ１  Ｌｃ融合体を、ＰＤＬ１で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＧＩＴＲ＋細胞またはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（約７５〜８０％のトランスフェクション効率）と様々な濃度でインキュベートした。ＲＴで２５分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、融合抗体の結合をＰＤＬ１−ｓｃＦｖ融合体のＣ末端上のＨｉｓタグによって検出した。このグラフは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定されるように、二重特異性ＩｇＧの各アームが独立してその標的に結合することができることを示す。
【図３０】ＩｇＧ  Ｌｃ融合体の同時結合（％）を示すグラフである。１Ｅ６  ＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞を各試料に使用した。ａＧＩＴＲ  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｈｅｘ  Ｌｃ融合体（ａＰＤＬ１）を２倍段階希釈で加え、ＲＴで２５分間インキュベートした。試料を次いで洗浄し、１．５ｕｇのＰＤ−Ｌ  １−ｒｂＦｃを各チューブに加え、チューブを２５分間ＲＴでインキュベートした。別の洗浄後、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ（２ｕｇ／ｍｌ）を検出用のウェルに加えた。
【図３１】ＩｇＧ  Ｌｃ融合体の同時結合（ＭＦＩ）を示すグラフである。１Ｅ６  ＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞を各試料に使用した。ａＧＩＴＲ  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｈｅｘ  Ｌｅ融合体（ａＰＤＬ１）を２倍段階希釈で加え、ＲＴで２５分間インキュベートした。試料を次いで洗浄し、１．５ｕｇのＰＤ−Ｌ  １−ｒｂＦｃを各チューブに加え、チューブを２５分間ＲＴでインキュベートした。別の洗浄後、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ（２ｕｇ／ｍｌ）を検出用のウェルに加えた。
【図３２】ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＣＨ２のアミノ酸配列アラインメントを示す。ＩｇＧ４ヘキサマーからＣＤＣ活性を排除するためにＩｇＧ１ＬＡＬＡ  ｍｕｔ３と同様にＩｇＧ４構築物において変異を行った。ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  Ｍｕｔ３は、Ｄ２７０Ａ  Ｐ３３１Ｖ  Ｅ３３３Ｑである。ｓＩｇＧ４では、残基３３１はＳである。第１のＭｕｔ３アナログでは、Ｄ２７０ＡおよびＥ３３Ｑのみを変更し、これはＩｇＧ１およびＩｇＧ４において同一である。第２の構築物を作製するために、残基３３０および３３１も、Ｃ１ｑ結合ポケットの一部であるため、ＩｇＧ１  ＬＡＬＡと同一になるように変更した。図３２は、出現順にそれぞれ配列番号２０および３８を開示する。
【図３３】ｓＩｇＧ４変異体のＣＤＣ活性（１時間）を示すグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
配列番号９８は、ＩｇＧ３の野生型Ｆｃ領域のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１８６０（ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ）、３７７アミノ酸）を提供し、ＣＨ１ドメインは太字であり、ヒンジ領域は下線が引かれ、ＣＨ２ドメインはイタリック体であり、ＣＨ３ドメインは破線が引かれ、影付きのボックスは、本発明に従って置換され得るアミノ酸である。図２７は、配列番号６０を、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って付番されるアミノ酸残基と対応させる表である。
2021518411.tif 000117
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
（表１Ｃ）抗ＧＩＴＲ  Ｅ１−３Ｈ７アミノ酸配列
2021518411.tif 000118
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
（表１Ｅ）抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３アミノ酸配列
2021518411.tif 000119
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
一実施形態では、本明細書に記載される軽鎖のＦｃ領域を使用して、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＣＣＲ４抗体などの目的の抗体のＦｃ領域を操作することができる。一実施形態では、軽鎖のＦｃ領域（ＣＬ（カッパ））は、配列番号４３の核酸配列を含む：
2021518411.tif 000120
一実施形態では、軽鎖のＦｃ領域（ＣＬ（カッパ））は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む：
2021518411.tif 000121
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
（表７Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ｓＩｇＧ４ヘキサマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000122
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
（表７Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ｓＩｇＧ４ヘキサマー（ＣＬを除いて抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ２．３構築物と同じ）
2021518411.tif 000123
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
（表８Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ１
2021518411.tif 000124
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
（表８Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ１
2021518411.tif 000125
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
（表９Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ２
2021518411.tif 000126
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
（表９Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ２
2021518411.tif 000127
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
（表１０Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ３
2021518411.tif 000128
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
（表１０Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ  Ｍｔ３
2021518411.tif 000129
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
（表１１Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＶＰ
2021518411.tif 000130
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
（表１１Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＶＰ
2021518411.tif 000131
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
（表１２Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＰＶ
2021518411.tif 000132
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
（表１２Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＰＶ
2021518411.tif 000133
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
（表１３Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＰＦ
2021518411.tif 000134
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
（表１３Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＰＦ
2021518411.tif 000135
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
（表１４Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＶＶ
2021518411.tif 000136
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
（表１４Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ  ｈｅｘ−ＶＶ
2021518411.tif 000137
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
（表１５Ａ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域核酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ−ａＰＤＬ１
2021518411.tif 000138
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
（表１５Ｂ）Ａｂ＃Ｅ１−３Ｈ７定常領域アミノ酸配列―ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ−ａＰＤＬ１
2021518411.tif 000139
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
本発明の抗体およびその断片はまた、本明細書において表に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用して、合成、操作、および／または生成することができる。一実施形態では、ポリペプチドは、表１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂ、１３Ｂ、１４Ｂ、１５Ｂにおいて開示される連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列、配列番号６４によってコードされるアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせを有する。別の実施形態では、ポリペプチドは、表１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂ、１３Ｂ、１４Ｂ、１５Ｂにおいて開示されるアミノ酸配列、配列番号６４によってコードされるアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021518411000001.app
【国際調査報告】
2021518411.tif 000140
2021518411.tif 000141
2021518411.tif 000142
2021518411.tif 000143