(57)【要約】  本発明は、核酸分子およびシングルドメイン抗体調製における核酸分子の応用を提供する。宿主動物の免疫グロブリン遺伝子又はその断片を含む前記核酸分子であって、宿主動物のＩｇＨ ５’−端エンハンサー、ＩｇＭのスイッチ領域（Ｓμ）およびＩｇＭ配列を含み、前記ＩｇＭ配列は、すべて宿主動物のＩｇＭ配列であり、ＩｇＭがＣＨ１配列（ＩｇＭ−ｄＣＨ１）を欠失し、ＩｇＧの発現調節エレメントが宿主動物に由来し、Ｓγ、ＴＭ１、ＴＭ２およびＰｏｌｙＡ等の配列を含み、ＩｇＧのＣγ配列（Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３）がヒトの配列（Ｉｇγ−ｄＣＨ１）に由来する。本発明は、トランスジェニック動物のＢ細胞の正常な発生を確保し、トランスジェニック動物で発現するのはヒトシングルドメイン抗体であり、後期における人工的な改変を減らすと共に抗体の医薬としての可能性を高められる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン遺伝子又はその断片を含む核酸分子であって、ＩｇＧ遺伝子（Ｉｇｙ）とＩｇＧスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎγ、Ｓγ）および／あるいはＩｇＭ遺伝子（ＩｇＨＣμ）とＩｇＭスイッチ領域（Ｓμ）を含み、ＩｇＭ遺伝子／ＩｇＧ遺伝子は、ＣＨ１機能を欠失することを特徴とする、核酸分子。
【請求項２】
前記Ｓμ、Ｓγ、ＩｇＨＣμは、宿主動物の配列である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＩｇＨＣμは、宿主動物ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４エクソンおよびその間の配列と、ＴＭ１、ＴＭ２、ｐｏｌｙＡシグナル等を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ＩｇＨＣμ構造は、図３−１に示されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記Ｉｇγは、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２、ＣＨ３エクソンおよびその間の配列と、ＴＭ１、ＴＭ２、ｐｏｌｙＡシグナルを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記ＴＭ１、ＴＭ２、ｐｏｌｙＡシグナルは、宿主動物の配列であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記Ｉｇγ構造は、図１−１に示されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
宿主動物のＩｇＨ重鎖の５’末端のエンハンサー（５’−Ｅｎｈａｎｃｅｒ）を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記Ｓγは、Ｓγ１、Ｓγ３、Ｓγ２ａおよび／あるいはＳγ２ｂであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記Ｓμのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２（２５５０）．．（４４５１）に示されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記エンハンサーのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２的（４３３）．．（１４４４）に示されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
ＩｇＧ遺伝子は、宿主動物／ヒトＩｇＧキメラエレメント又は完全ヒトＩｇＧ配列であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記Ｉｇγ配列は、ヒトＩｇγの単一又は複数のサブタイプと、宿主動物の各種Ｉｇγサブタイプの位置スイッチ領域（Ｓγ）を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
ヒトＩｇγサブタイプは、Ｉｇγ３、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２および／あるいは Ｉｇγ４を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
ヒト又は宿主動物ＩｇＨ重鎖の３’位置発現制御配列（Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ）を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
ヒトＩｇＨ重鎖Ｖ領域配列又は断片、ヒトＩｇＨ Ｄ領域配列又は断片およびヒトＩｇＨ Ｊ領域配列又は断片を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
その構造組成は、図６又は図７に示されることを特徴とする、請求項１〜１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１〜１７に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１８に記載のベクターを含むことを特徴とする、細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１８に記載のベクター又は請求項１９に記載の細胞に由来することを特徴とする、ヒト化抗体。
【請求項２１】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡのコード化、アミノ酸配列の発現、タンパク質、ベクター、ハイブリドーマ培養、細胞株、トランスジェニック動物および／あるいはヒト化抗体調製における請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１８に記載のベクター又は請求項１９に記載の細胞の応用。
【請求項２２】
以下の工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１８に記載のベクター又は請求項１９に記載の細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する方法。
（１）前記核酸分子を取得する工程
（２）前記核酸分子をベクターに構築する工程
（３）前記ベクターを宿主動物細胞又は胚に導入する工程
（４）前記ベクターを含む細胞を宿主動物の胚又は体細胞クローンに移植する工程
（５）ヘテロ接合、ホモ接合のトランスジェニック動物を繁殖する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野に属し、特に、核酸分子およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シングルドメイン抗体（Ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ−ｏｎｌｙ）は、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれ、免疫グロブリン重鎖抗体を指す。インタクトな抗体の質量（１５０〜１６０ｋＤａ）と比較すると、シングルドメイン抗体もはるかに小さく、５０ｋＤａ程度である。
【０００３】
シングルドメイン抗体は、自然界（ラクダ科動物とサメ）に存在している。最初のシングルドメイン抗体は、ラクダから分離され、特別なＶＨＨ配列が使用されている。シングルドメイン抗体を作製する別の方法は、トランスジェニック動物を利用することである。２００３年Ｎｇｕｙｅｎ氏ら、２００５年Ｚｏｕ氏らは、Ｉｇγ２ａのＣＨ１変異を利用してトランスジェニックベクターを構築し、シングルドメイン抗体をトランスジェニックマウスで高発現させ、２００７年Ｚｏｕ氏らは、マウス軽鎖（ＫａｐｐａとＬａｍｂｄａ鎖）がない場合において、マウスも自然にシングルドメイン抗体を産生させることができることを証明した。
【０００４】
シングルドメイン抗体の特徴は、分子量が小さく、いくつかの隠れたエピトープに結合するができることであり、シングルドメイン抗体は、一部の癌の治療および写真や画像の診断など、抗体の入手が困難な標的に特に適し、大腸菌による下痢および炎症性腸疾患および大腸癌などの消化管疾患を経口治療することができ、シングルドメイン抗体は、血液脳関門を通過でき、完全抗体と比べると大きな腫瘍内へ浸透しやすいため、脳腫瘍の治療のための医薬品や二重特異性抗体を開発することが可能である。抗体改変も容易で、製薬コストを削減できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、完全ヒトシングルドメイン抗体の調製に用いられ、後期段階での手作業による改変を減らすと共に抗体の医薬としての可能性を高めることができる核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では、上記目的を達成するために、次の技術的手段を講じた。
【０００７】
免疫グロブリン遺伝子又はその断片を含む核酸分子であって、ＩｇＧ遺伝子（Ｉｇｙ）とＩｇＧスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎγ、Ｓγ）および／あるいはＩｇＭ遺伝子（ＩｇＨＣμ）とＩｇＭスイッチ領域（Ｓμ）を含み、ＩｇＭ遺伝子／ＩｇＧ遺伝子は、ＣＨ１機能を欠失することを特徴とする。
【０００８】
さらに、前記Ｓμ、Ｓγ、ＩｇＨＣμは、宿主動物の配列である。
【０００９】
上記ＩｇＨＣμは、宿主動物ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４エクソンおよびその間の配列と、ＴＭ１、ＴＭ２、ｐｏｌｙＡシグナル等を含む。具体的に、前記ＩｇＨＣμ構造は、図３−１に示されている。
【００１０】
上記核酸分子は、宿主動物のＩｇＨ ５’末端のエンハンサー（５’−Ｅｎ）をさらに含む。前記エンハンサーは、スイッチ領域（Ｓμ又はＳγ）の５′末端に位置する。具体的に、その構造は図１および図３に示されている。ＩｇＨ ５’末端のエンハンサーは、ＩｇＨのＶＤＪ遺伝子断片の組換えおよび転写に関連しており、抗体の発現量および抗体サブタイプの形質転換を増加できる。ＩｇＭのＣＨ１配列は、完全に欠失するか、又はＣＨ１配列中に変異が発生してもよい。ＩｇＭの発現過程でＣＨ２、ＣＨ３とＣＨ４およびＴＭ１とＴＭ２等のみが使用される。
【００１１】
重鎖ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、ＴＭ１とＴＭ２等（ここで、ＣＨ１が欠失し、ＩｇＭ−ｄＣＨ１）の配列およびその５’エンハンサーと発現調節等の配列は、宿主動物の配列に由来する（図３の緑色に示されている）。ＩｇＨ ５’末端のエンハンサー（５’−Ｅｎ）、ＩｇＭのスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓμ）配列、ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４（エクソンＣＨ１とそれに続くイントロン配列を除去し、ＩｇＭ−ｄＣＨ１）およびＴＭ１、ＴＭ２とＰｏｌｙＡおよびその間のすべての配列は、宿主動物に由来し、宿主動物におけるＩｇＭの高発現およびＢ細胞発生を保証する。宿主動物がマウスの場合、マウスＩｇＨ ５’末端のエンハンサー（５’−Ｅｎ）、マウスＩｇＭのスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓμ）配列、マウスＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４（エクソンＣＨ１とそれに続くイントロン配列を除去し、ＩｇＭ−ｄＣＨ１）およびＴＭ１、ＴＭ２とＰｏｌｙＡおよびその間のすべての配列を使用し、マウスのＢ細胞発生および抗体成熟を保証する。
【００１２】
より詳しくは、前記ＩｇＨ ５’末端のエンハンサー、ＩｇＨ Ｃμのスイッチ領域（Ｓμ）およびＩｇＭ−ｄＣＨ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されている。
【００１３】
上記Ｉｇγは、ヒトＨｉｎｇｅ、ＣＨ２、ＣＨ３エクソンおよびその間の配列を含み得る。ＣＨ１配列が欠失又はＣＨ１配列の中に変異を有するＩｇＧは、Ｉｇγ−ｄＣＨ１と命名される。前記Ｉｇｙ−ｄＣＨ１発現調節配列は、宿主動物のスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓγ）配列および宿主動物の終結シグナル（ＰｏｌｙＡ）、ＴＭ１とＴＭ２等の配列を含む宿主動物の配列に由来する。例えば、マウスＩｇγ３、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２ａおよびＩｇｙ２ｂの発現調節エレメント等に由来する。具体的に前記Ｉｇｙエレメント構造は、図１−１に示されている。ヒトＨｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３エクソン配列は、マウスＩｇγ発現調節エレメント（Ｓγ、ＴＭ１、ＴＭ２およびＰｌｏｙＡ等）の制御下で発現されることができ、ＩｇＧの発現量および特異性をさらに高める。より詳しくは、前記マウス５’−Ｅｎ、Ｓγ１およびＩｇγ１−ｄＣＨ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１である。ヒトＩｇγ１のＨｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３がマウスＩｇγ１のＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３を置き換える配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３である。
【００１４】
上記Ｉｇγ配列は、ヒトＩｇγの各種サブタイプ、すなわち、Ｉｇγ３、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２および／あるいはＩｇγ４等を含み得、前記Ｉｇγ３、Ｉｇｙ１、Ｉｇｙ２および（又は）Ｉｇｙ４は、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３エクソンおよびその間の配列（エクソンＣＨ１とそれに続くイントロン配列を除去し、Ｉｇｙ−ｄＣＨ１）を含む。エクソン配列は、Ｉｇγの発現フレームワークを保証するため、宿主動物の発現調節エレメントの配列とマッチする。
【００１５】
上記Ｉｇγ−ｄＣＨ１の発現調節エレメントは、（マウスを例にする）マウスＩｇγ３、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２ａおよび／あるいはＩｇγ２ｂ等に由来し得る。
【００１６】
上記核酸分子は、ＩｇＨ ３’位置発現制御配列（Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ）をさらに含む。図２、図５、図６および図７に示すように、前記ＬＣＲは、宿主動物のＩｇＨ ３’位置発現制御（ＬＣＲ）配列である。
【００１７】
上記核酸分子は、ヒトＩｇＨ重鎖Ｖ領域配列又は断片、ヒトＩｇＨ Ｄ領域配列又は断片およびヒトＩｇＨ Ｊ領域配列又は断片を含む。重鎖のＶ領域、Ｄ領域およびＪ領域は、図６および図７に示すように、ヒトに由来する。
【００１８】
例えば、具体的に上記核酸分子は、複数（又はすべて）のヒト免疫グロブリン遺伝子の（ＩｇＨ）Ｖ領域、Ｄ領域およびＪ領域配列を含有し、マウス免疫グロブリン（ＩｇＨ）５’エンハンサー（５’−Ｅｎ）をリンクしてからマウスＩｇｙのスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓγ）配列をリンクし、次にヒトＩｇγのＨｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３配列およびマウスのＰｏｌｙＡ、ＴＭ１とＴＭ２配列をリンクさせ、最後にマウス重鎖ＩｇＨの３’位置発現制御（ＬＣＲ）配列（図６）をリンクさせる。トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＧ等のシングルドメイン抗体を発現する。
【００１９】
又は具体的に、上記核酸分子は、複数（又はすべて）のヒト免疫グロブリン遺伝子の（ＩｇＨ）Ｖ領域、Ｄ領域およびＪ領域配列を含有し、マウス免疫グロブリン（ＩｇＨ）５’エンハンサー（５’−Ｅｎ）、スイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓμ）配列とＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＰｏｌｙＡ、ＴＭ１とＴＭ２等の配列をリンクしてからマウスＩｇｙのスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓγ）配列をリンクし、次にヒトＩｇγのＨｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３配列およびマウスのＰｏｌｙＡ、ＴＭ１とＴＭ２配列をリンクさせ、最後にマウス重鎖ＩｇＨの３’位置発現制御（ＬＣＲ）配列（図７）をリンクさせる。トランスジェニックマウスは、マウスＩｇＭおよびヒトＩｇＧ等のシングルドメイン抗体を発現する。
【００２０】
上記ヒト免疫グロブリン遺伝子は、ヒト重鎖（ＩｇＨ）のＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域の一部又は全部を含み、ヒトＣμ領域列およびＣγ領域配列のＣＨ１配列の変異又は欠失も含む。上記マウス免疫グロブリン遺伝子は、マウスの重鎖の５’末端エンハンサー（５’−Ｅｎｈａｎｃｅｒ）配列、スイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、ＳμとＳγ）配列、終結シグナル（ＰｏｌｙＡ）、ＴＭ１とＴＭ２およびマウス重鎖ＩｇＨの３’位置発現制御（ＬＣＲ）等の配列を含む。
【００２１】
ベクターであって、上記核酸分子を含む。
【００２２】
上記核酸分子又はベクターを含む原核生物である。上記核酸分子又はベクターを含む細胞であって、これら核酸分子に由来するトランスジェニック動物の細胞のいずれかを含み、トランスジェニック動物に由来するリンパ球、ハイブリドーマ、抗体発現細胞等も含むが、これらに限定されない。
【００２３】
ヒト化抗体であって、上記核酸分子のいずれかを再配列およびコード化することにより作製され、上記核酸分子又は核酸分子トランスジェニック動物に由来するヒト化抗体のいずれかを含み、抗体タンパク質、ＤＮＡ・ｃＤＮＡ配列によってコードされる抗体、および更なる修飾、改変された抗体等を含むがこれらに限定されない。
【００２４】
上記核酸分子又はベクター、細胞又は抗体を含有するトランスジェニック動物であって、動物はブタ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリおよびヒツジ等の哺乳動物であり得る。
【００２５】
上記核酸分子、ベクター、細胞又は動物は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡのコード化、アミノ酸配列の発現、タンパク質、ベクター、ハイブリドーマ培養、細胞株、トランスジェニック動物において応用される。
【００２６】
特に、上記トランスジェニックベクターを動物ゲノムにトランスフェクトすることにより得られるトランスジェニック動物、又は宿主動物自体の免疫グロブリン遺伝子を欠失する動物とのハイブリッドの子孫、宿主動物自体の重鎖および軽鎖が不活性化され、ヒト抗体タンパク質のみを発現する遺伝子工学動物であり、抗原免疫を上記改変後のヒト免疫グロブリン遺伝子にトランスフェクトした動物によって完全ヒトシングルドメイン抗体を得る。
【００２７】
例えば上記の改変により、上記の核酸、ベクター、細胞またはトランスジェニック動物は、宿主動物のシングルドメインＩｇＭおよびヒトシングルドメインＩｇＧ抗体を発現することができる。
【００２８】
上記核酸分子又はベクターを用いてトランスジェニック動物を作製する方法は、以下の工程（１）〜（５）を含む。すなわち、
（１）前記核酸分子を取得する工程
（２）前記核酸分子をベクターに構築する工程
（３）前記ベクターを宿主動物細胞（幹細胞、誘導幹細胞および体細胞を含む）又は胚に導入する工程
（４）前記ベクターを含む細胞を宿主動物の胚（キメラ個体の作製）又は体細胞クローンに移植する工程
（５）ヘテロ接合、ホモ接合のトランスジェニック動物（宿主動物自体の免疫グロブリン遺伝子を欠失する動物との交配を含む）を繁殖する工程。
【００２９】
上記宿主動物とは、上記核酸分子を応用できるトランスジェニック動物、例えばブタ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリおよびヒツジ等の哺乳動物を指し、上記ベクターは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミドおよびＤＮＡ断片等を含む。上記ベクター導入方法は、エレクトロポレーション、ウイルス感染、脂質媒介導入およびマイクロインジェクションを含む。
【００３０】
ある（いくつか）具体的実施形態としてＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ１、ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ２、ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ３の上記核酸分子の配列は示されているとおりであるが、これは本発明の範囲を限定することを意図していない。当業者であれば、具体実施形態に基づいて、ヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドの削除、追加、置換など、非本質的な改善と調整することができる。
【００３１】
本発明の前記ＩｇＭ遺伝子は、ＣＨ１機能を欠失し、当業者が従来の方法を用いてＣＨ１機能を欠失させ、例えばＣＨ１配列の欠失又はＣＨ１配列の変異等であり、略してＩｇＭ−ｄＣＨ１と呼ばせてもよい。
【発明の効果】
【００３２】
１．本発明は、免疫グロブリン遺伝子ベクターのＣ領域のＣＨ１配列を変異又は欠失させて、シングルドメイン抗体トランスジェニック動物を作製し、シングルドメイン抗体を産生する。
２．本発明は、ヒト免疫グロブリン遺伝子又は断片によるヒトシングルドメイン抗体の産生を実現し、異なる抗原の刺激條件下で、親和性の高いシングルドメイン抗体を得ることができる。
３．本発明は、完全ヒトシングルドメイン抗体を直接取得し、後期における人工的な改変を減らすと共に抗体の医薬としての可能性を高められる。
４．本発明の利点は、次の通りであり、すなわち、トランスジェニック動物のＩｇＨトランスジェニックベクターにおいて、トランスジェニック宿主動物自体のＩｇＨ５’末端エンハンサー、スイッチ領域ＳμおよびＩｇＭ−ｄＣＨ１配列を用いてトランスジェニック動物のＢ細胞の正常な発生を確保し、トランスジェニック宿主動物自体のＩｇγスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓγ）配列およびトランスジェニック宿主動物自体のＩｇγ終結シグナル（ＰｏｌｙＡ）とＴＭ１、ＴＭ２配列を用いてヒトＩｇγ−ｄＣＨ１（ＩｇγのＨｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３等の配列のみ）の発現を制御する。これは、ＤＮＡの組換え、変異およびＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）のシグナル伝達に役に立ち、抗原の刺激下でヒトＩｇγを成熟させる。トランスジェニック動物のＩｇＨトランスジェニックエレメントにおいて、ヒトのＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域とγ配列を利用するため、トランスジェニック動物で発現するのはヒトシングルドメイン抗体（ＩｇＧ）であり、後期における人工的な改変を減らすと共に抗体の医薬としての可能性を高められる。
５．本発明の主な用途は、ヒト治療用シングルドメイン抗体の調製であり、具体的に（１）関連疾患、特に脳疾患および固形腫瘍の治療；（２）二重特異性抗体の調製；（３）ＣＡR−Ｔの調製である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Ｉｇｙの構造および構築を示す概念図。具体的に、マウスＩｇＨ ５’エンハンサー、マウス／ヒトＩｇγ１キメラ発現エレメント（マウスＳγ１、ＴＭ１、ＴＭ２およびＰｏｌｙＡ等の配列とヒトＨｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３配列）模式図である。相同組換え（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）技術およびカウンターセレクション組換え技術（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）により、ベクターをヒトＩｇＧ Ｃ領域５’エンハンサー、ＩｇＭおよびＩｇＤ的ＢＡＣ内にトランスフェクトする。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｐｕｒｏ）耐性遺伝子は、細菌および細胞において別々に選別できる。Ｌｏｘは、３４ｂｐのＤＮＡ配列である。
【図２】核酸分子のＩｇＧ Ｃ領域の構築を示す概念図：図１のＤＮＡ断片を相同組換え技術（ホモロジーアーム配列）によりマウスＩｇＨの３’−ＬＣＲにリンクする。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｐｕｒｏ）およびＺｅｏｃｉｎ（Ｚｅｏ）耐性遺伝子は、細菌と細胞内において別々に選別することができる。ＦｒｔおよびＬｏｘは３４ｂｐのＤＮＡ配列であり、Ｆｌｐｏ又はＣＲＥタンパク質又は発現プラスミドを通じて耐性遺伝子を除去でき、ＤＮＡ配列においてＦｒｔおよびＬｏｘの配列を１つだけ残す。
【図３】マウスＩｇＨ ５’エンハンサー、マウスＩｇＭ−ｄＣＨ１発現エレメント、すなわちマウスＩｇＨ ５’エンハンサー、Ｓμ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＴＭ１、ＴＭ２とＰｏｌｙＡ等の配列を構築する。相同組換え技術（ホモロジーアーム配列）により、ベクターをヒトＩｇＧ Ｃ領域５’エンハンサー、ＩｇＭおよびＩｇＤのＢＡＣ内にトランスフェクトする。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｐｕｒｏ）耐性遺伝子は、細菌と細胞内において別々に選別することができる。Ｌｏｘは、３４ｂｐのＤＮＡ配列である。
【図４】マウスとヒトＩｇｙ１−ｄＣＨ１キメラ発現調節エレメント構造を示す概念図：カウンターセレクション組換え技術（ホモロジーアーム配列）によりヒトＩｇｙのＨｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３配列をマウスＩｇｙのＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３配列に置き換える（緑色はマウスの配列、赤色がヒトの配列を示す）。
【図５】核酸分子のＩｇＧ−ｄＣＨ１ Ｃ領域の構築を示す概念図：図３および図４のＤＮＡ断片を相同組換え技術（ホモロジーアーム配列）によりマウスＩｇＨの３’−ＬＣＲにリンクする。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｐｕｒｏ）およびＺｅｏｃｉｎ（Ｚｅｏ）耐性遺伝子は、細菌と細胞内において別々に選別することができる。ＦｒｔおよびＬｏｘは３４ｂｐのＤＮＡ配列であり、Ｆｌｐｏ又はＣＲＥタンパク質又は発現プラスミドを通じて耐性遺伝子を除去でき、ＤＮＡ配列においてＦｒｔおよびＬｏｘの配列を１つだけ残す。
【図６】ＩｇＨトランスジェニック核酸分子（トランスジェニックマウスＨａ）構成要素の１つを示す図：ヒトＩｇＨ Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域を新しいＩｇＨ Ｃ領域（Ｉｇγ１−ｄＣＨ１）および３’−ＬＣＲとリンクし、ヒトシングルドメイン抗体発現核酸分子が形成される（赤色はヒトの配列、緑色がマウスの配列を示す）。
【図７】ＩｇＨトランスジェニック核酸分子（トランスジェニックマウスＨｂ）構成要素の１つを示す図：ヒトＩｇＨ Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域を新しいＩｇＨ Ｃ領域（Ｉｇγ１−ｄＣＨ１）および３’−ＬＣＲとリンクし、ヒトシングルドメイン抗体発現核酸分子が形成される（赤色はヒトの配列、緑色がマウスの配列を示す）。図１乃至図７は、は、トランス遺伝子の重要な遺伝子構造図である。
【図８】マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子ＩｇＨのＪ領域遺伝子ターゲティング：マウスＩｇＨのＪ領域はＪ１、Ｊ２、Ｊ３およびＪ４で構成され、遺伝子ターゲティング技術でＪ領域全体の配列を切り出される。Ｊ領域配列相同性を持たないマウスは、マウス由来Ｉｇ（ＩｇＭとＩｇＧ等を含む）を産生できない。
【図９】シングルドメインマウス（Ｈａ）のヒトＩｇＨＶ２−２６ＰＣＲ結果、４３３ｂｐ ＰＣＲ産物。
【図１０】シングルドメイン抗体トランスジェニックマウス（Ｈａ）血清中のヒトＩｇＧ Ｅｌｉｓａ結果。
【図１１】シングルドメインマウス（Ｈｂ）のヒトＩｇＨＶ２−２６ＰＣＲ結果、４３３ｂｐ ＰＣＲ産物。
【図１２】シングルドメイン抗体トランスジェニックマウス（Ｈｂ）血清中のヒトＩｇＧ Ｅｌｉｓａ結果。
【図１３】マウスＩｇＨＪ領域配列の遺伝子ターゲティング（遺伝子ターゲティング後のＪ領域ＰＣＲ産物のサイズは７３２ｂｐであり、通常のＪ領域ＰＣＲ産物のサイズが２４２２ｂｐである）。
【図１４】ＯＶＡとＨＥＬでマウスを免疫した後に得られた特異性および親和性の高いシングルドメイン抗体統計表。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、具体的実施例を参照しつつ本発明を説明する。ここで、以下の実施例は、本発明をさらに説明するためにのみ使用され、本発明の保護範囲を非限定的に解釈すると指摘される。当業者であれば、上記発明内容に基づいて本発明に対して非本質的な改善と調整を行うことができる。
【実施例】
【００３５】
改変されたヒト免疫グロブリン遺伝子重鎖ベクターをマウスにトランスフェクトし、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを免疫して、完全ヒトシングルドメイン抗体を得る。具体的な工程は次のとおりである。
【００３６】
１．免疫グロブリン遺伝子のベクターの構築
１）免疫グロブリン重鎖遺伝子の構築（図６）まずヒトＩｇｙ１のＣＨ１配列の改変：カウンターセレクション組換えおよび遺伝子合成技術により、ヒトＩｇγのＣＨ１配列を除去し、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３およびそのすべての配列の発現フレームワークを確保し、次にマウスＩｇＨ ５’末端エンハンサーを得てマウス５’エンハンサーおよびマウス／ヒトＩｇｙ１のキメラ発現エレメントを構築し、そして図１に示すように、相同組換えにより発現エレメントをヒトＩｇＨ Ｃ領域のＢＡＣ内に取り込む。マウス３’位置発現制御配列（ＬＣＲ）を得ると共に耐性遺伝子およびホモロジーアームを構築する。同時に図２に示すように、相同組換えにより２つの遺伝子断片を１つの高分子核酸に形成される。最後に図６に示すように、ヒトＩｇＨ Ｖ領域と図２の高分子核酸を免疫グロブリン重鎖遺伝子の遺伝子クラスターに形成される（緑色はマウスの配列、赤色がヒトの配列を示す）。順番通り免疫グロブリン重鎖遺伝子のヒトＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域、マウスＩｇＨ ５’−Ｅｎ、Ｓγ、ヒトＩｇｙ１−ｄＣＨ１およびマウスのＬＣＲが含まれる。マウスＩｇＨ ５’末端エンハンサー、Ｉｇγのスイッチ領域（Ｓγ）配列、ヒトＨｉｎｇｅ、ＣＨ２、ＣＨ３およびマウスのＴＭ１とＴＭ２配列およびその間の配列とＰｏｌｙＡシグナル配列等を用いてマウス／ヒトＩｇγ−ｄＣＨ１キメラ発現エレメントを形成する。ＬＣＲは、マウスＩｇＨ ３’位置発現制御配列である。
【００３７】
２）免疫グロブリン重鎖遺伝子の改変（図７）
まずマウスＩｇＭのＣＨ１配列の改変：カウンターセレクション組換え技術又はＤＮＡ合成技術により、ＩｇＭのＣＨ１配列を除去し、ＣＨ２、ＣＨ３とＣＨ４およびそのすべての配列の発現フレームワーク（図３）を確保し、同時にカウンターセレクション組換えにより、ヒトＩｇｙ１のＨｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３等の配列をマウスＩｇｙ１のＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３等の配列に置き換える（図４）。次にマウスＩｇＨ ３’位置発現制御配列（ＬＣＲ）を得ると共にＤＮＡ断片両端のホモロジーアームを構築し、相同組換えによりシングルドメイン核酸分子のＣ領域配列および３’−ＬＣＲを得る（図５）。さらに図７に示すように、相同組換え技術により、上記の改変されたＤＮＡ断片をヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子（Ｉｇ）含有ＹＡＣ又はＢＡＣベクターにトランスフェクトして、免疫グロブリン重鎖遺伝子の遺伝子クラスターを構築する（緑色はマウスの配列、赤色がヒトの配列を示す）。順番通り免疫グロブリン重鎖遺伝子ヒトＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域、マウスの５’−Ｅｎ、Ｓμ、ｍＩｇＭ−ｄＣＨ１およびＳγ、ヒトＩｇｙ−ｄＣＨ１およびマウスのＬＣＲ（図７）が含まれ、ここでｍＩｇＭ−ｄＣＨ１は、遺伝子改変（図３）を経、マウス由来ＩｇＨ ５’エンハンサー、スイッチ領域（Ｓμ）配列、ＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、ＴＭ１とＴＭ２配列およびその間の配列と関連ＰｏｌｙＡシグナル配列等がいずれもマウスの配列であり、ヒトＩｇγ−ｄＣＨ１は、遺伝子改変（図４）を経、マウスＩｇγのスイッチ領域（Ｓγ）配列、ヒトＩｇγのＨｉｎｇｅ、ＣＨ２、ＣＨ３およびマウスＩｇｙのＴＭ１とＴＭ２配列およびその間の配列と関連ＰｏｌｙＡシグナル配列等を用いてマウス／ヒトＩｇγ−ｄＣＨ１キメラ発現エレメントを形成する（図５）。ＬＣＲは、マウスＩｇＨ ３’位置発現制御配列である。
【００３８】
２、ヒトシングルドメイン抗体トランスジェニックマウスの育成
１）ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子導入マウスの育成
Ａ．ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子導入マウス（シングルドメインマウスＨａ）の育成
従来のトランスジェニック技術を利用して、工程１の１）において構築されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子のベクター（図６）をマウスにトランスフェクトする。ＰＣＲ測定およびＥＬＩＳＡ測定の二重標準により選別して得られたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子導入マウスは、シングルドメイン抗体マウス（Ｈａ）であった。
使用するＰＣＲ同定プライマーは、次の通りである。
ヒトＩｇＨＶ２−２６ＰＣＲ：
Ｆｏｒ：ＧＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧ
Ｒｅｖ：ＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣ
ＰＣＲ産物のサイズ：４３３ｂｐ
ＰＣＲ測定の結果を図９に示す。注：ヒトＩｇＨＶ２−２６トランスジェニックマウスのＤＮＡ ＰＣＲ結果は、陽性マウスには４３３ｂｐのＰＣＲバンドがある（１％ゲル電気泳動）
ヒトＩｇＶ３−１１ＰＣＲ：
Ｆｏｒ：ＴＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＧ
Ｒｅｖ：ＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣ
ＰＣＲ産物のサイズ：６８６ｂｐ
トランスジェニックマウスのＥｌｉｓａ測定：ＥＬＩＳＡの同定に使用される抗体は、一次抗体（包埋）Ａｂｃａｍ（ａｂ９７２２１）および二次抗体Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＡＰ１１３Ｐ）であり、健康な成人と健康なマウスの血清をコントロールとして使用した。
シングルドメイン抗体トランスジェニックマウスの血清中のヒトＩｇＧ Ｅｌｉｓａの結果は、図１０に示されている。注：シングルドメイン抗体トランスジェニックマウスの血清中のヒトＩｇＧ Ｅｌｉｓａ測定は、正常なマウスを陰性対照、ヒト血清を陽性対照として使用した。トランスジェニックマウス血清中に明らかなＩｇＧ発現があった。
【００３９】
Ｂ．ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子導入マウス（シングルドメインマウスＨｂ）の育成
従来のトランスジェニック技術を利用して、工程１の２）において構築されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子のベクター（図７）をマウスにトランスフェクトする。ＰＣＲ測定およびＥＬＩＳＡ測定の二重標準により選別して得られたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子導入マウスは、シングルドメイン抗体マウス（Ｈｂ）であった。
使用するＰＣＲ同定プライマーは、次の通りである。
ヒトＩｇＨＶ２−２６ＰＣＲ：
Ｆｏｒ：ＧＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧ
Ｒｅｖ：ＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣ
ＰＣＲ産物のサイズ：４３３ｂｐ
ＰＣＲ測定の結果を図１１に示す。注：ヒトＩｇＨＶ２−２６トランスジェニックマウスのＤＮＡ ＰＣＲ結果は、陽性マウスには４３３ｂｐのＰＣＲバンドがある（１％ゲル電気泳動）
ヒトＩｇＶ３−１１ＰＣＲ：
Ｆｏｒ：ＴＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＧ
Ｒｅｖ：ＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣ
ＰＣＲ産物のサイズ：６８６ｂｐ
トランスジェニックマウスのＥｌｉｓａ測定：ＥＬＩＳＡの同定に使用される抗体は、一次抗体（包埋）Ａｂｃａｍ（ａｂ９７２２１）および二次抗体Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＡＰ１１３Ｐ）であり、健康な成人と健康なマウスの血清をコントロールとして使用した。
シングルドメイン抗体トランスジェニックマウスの血清中のヒトＩｇＧ Ｅｌｉｓａの結果は、図１２に示されている。注：シングルドメイン抗体トランスジェニックマウスの血清中のヒトＩｇＧ Ｅｌｉｓａ測定は、正常なマウスを陰性対照、ヒト血清を陽性対照として使用した。トランスジェニックマウス血清中に明らかなＩｇＧ発現があった。
【００４０】
２）免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトマウスの育成（図８）
遺伝子ターゲティング技術により、免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトマウスを構築する。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子のＩｇＨ Ｊ領域を遺伝子ノックアウト部位として選択（ノックアウト部位および遺伝子ノックアウト効果は、図８を参照）選択して免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトマウスを得た。ＰＣＲ測定とＥＬＩＳＡ測定の二重標準の選別により、免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトマウスを得た。
使用するＰＣＲ同定プライマーは、次の通りである。
Ｆｏｒ：ＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＣ
Ｒｅｖ：ＴＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＡＣ
ＰＣＲ結果を図１３に示す。ＰＣＲ産物：Ｊ領域の遺伝子ターゲティング後のＰＣＲ産物のサイズは７３２ｂｐ、正常Ｊ領域のＰＣＲ産物のサイズが２４２２ｂｐであった。
ＥＬＩＳＡの同定に使用される抗体は、ｓｉｇｍａ（Ｍ８６４４）およびｓｉｇｍａ（Ａ８７８６）であり、健康な成人と健康なマウスの血清をコントロールとして使用した。
【００４１】
３）免疫グロブリンｋａｐｐａ軽鎖遺伝子ノックアウトマウスの育成（ＣＮ１０５４４１４５５Ａ参照）
【００４２】
４）ハイブリダイゼーションによりヒト化抗体トランスジェニックマウスを得る。
工程２のＨａ）又はＨｂ）をステップ２）、３）で得られたマウスと交配して繁殖し、ＰＣＲとＥＬＩＳＡの測定を経て、最後に高発現なヒトシングルドメインＩｇＧ抗体マウスを得るが、マウス免疫グロブリンＩｇＧを発現しなかった（又は低発現した）。
トランスジェニックマウス血清中のヒトＩｇＧ含有量のＥｌｉｓａ測定：
結果：正常マウス血清のＩｇＧ含有量：１〜３ｍｇ／ｍｌ
正常ヒト血清のＩｇＧ含有量：３．５〜１５ｍｇ／ｍｌ
トランスジェニックマウス（Ｈａ）血清中のヒトＩｇＧ含有量：０．００１〜０．３ｍｇ／ｍｌ
トランスジェニックマウス（Ｈｂ）血清中的ヒトＩｇＧ含有量：０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌ
（注：トランスジェニックマウスのヒトＩｇＧ遺伝子は、改変を経た後のＩｇＧであり、ＣＨ１およびそれに関連するイントロンが欠失（ＩｇＧ−ｄＣＨ１）するため、ＩｇＧの発現量が正常ヒトＩｇＧ含有量よりも少なかった。またトランスジェニックマウスが清浄で無菌の環境で飼育されていたため、その血清中のＩｇＧも少なくなる）
【００４３】
３．ヒトシングルドメイン抗体の取得
ヒトシングルドメイン抗体トランスジェニックマウスを免疫してＢ細胞を取得し、さらにファージディスプレイ技術と組み合わせて、治療用ヒトシングルドメイン抗体を取得するか、又は二重特異性抗体を調製する。
Ａ．ＯＶＡ免疫により得られたヒト化抗体トランスジェニックマウス
８週齢のマウスを選択して免疫化する。
【００４４】
初回の免疫：
（１）ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ７６４１）抗原をＰＢＳで希釈し、最終濃度を２ｍｇ／ｍｌとし、２０ｕｇのＣｐＧ（ＯＤＮ１８２６、ｔｌｒｌ−１８２６、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を加え、適量の水酸化アルミニウム（ｖａｃ−ａｌｕ−５０、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）も加えて水酸化アルミニウム濃度を１％にさせた。
（２）  （１）で調製した抗原０．７５ｍＬとＣＦＡアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ｆ５８８１）を１：１の割合で混合し、ＭＩＸＰＡＣＴＭシリンジで乳化し、各マウスに２００ｕｌ（０．２ｍｇ）を注射して皮下投与による免疫を行った。
２回目の免疫：
（１）免疫後２１日目に、２回目の免疫を行い、抗原をＰＢＳで希釈し、最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｕｇのＣｐＧを加え、適量の水酸化アルミニウムも加えて水酸化アルミニウム濃度を１％にさせた。
（２）  （１）で調製した抗原０．７５ｍＬとＩＦＡアジュバントを１：１の割合で混合し、ＭＩＸＰＡＣＴＭシリンジで乳化し、各マウスに２００ｕｌ（０．１ｍｇ）を注射して腹腔内投与による免疫を行った。
３回目の免疫：
（１）免疫後２１日目に、３回目の免疫を行い、抗原をＰＢＳで希釈し、最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｕｇのＣｐＧを加え、適量の水酸化アルミニウムも加えて水酸化アルミニウム濃度を１％にさせた。
（２）  （１）の方法で調製した抗原タンパク質を直接注射し、各マウスに２００ｕｌ（０．１ｍｇ）を注射して腹腔内投与による免疫を行った。
４回目の免疫：
（１）免疫後２１日目に、４回目の免疫を行い、抗原をＰＢＳで希釈し、最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｕｇのＣｐＧを加え、適量の水酸化アルミニウムも加えて水酸化アルミニウム濃度を１％にさせた。
（２）  （１）の方法で調製した抗原タンパク質を直接注射し、各マウスに２００ｕｌ（０．１ｍｇ）を注射して腹腔内投与による免疫を行った。
【００４５】
追加免疫：
４回目の免疫から２１日後、Ｅｌｉｓａ結果において要求を満たすマウスを追加免疫し、そして得られた脾臓のＢ細胞をハイブリドーマ融合、培養および選別した。
１）マウスイムノアッセイ
４回目の免疫から１０日後、マウスから血液を採取してＥＬＩＳＡ測定を行い、免疫前マウスをコントロールとして使用して、免疫後マウス血清中のマウスＩｇＧ含有量およびヒトＩｇＧ含有量をそれぞれ測定した。
マウス血清中のヒトＩｇＧの測定：９６ウェルプレートに抗原を包埋し、希釈後の免疫血清中の特異的な抗体含有量をｈＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１１３Ｐ））で測定した。
免疫後のヒト化抗体マウスのヒト化ＩｇＧの発現量は、比較的高い（血清希釈ａｔ １：８０００）、そのＥｌｉｓａ ＯＤ４５０＞１．０の免疫マウスをシングルドメイン抗体の調製に使用した。
２）シングルドメイン抗体の取得
マウスの脾臓Ｂ細胞を収集し、高発現の特異的な抗体Ｂ細胞を分離（ｈＩｇＧ＋ＣＤ１３８＋Ａｇ＋、ＦＡＣＳ分離等）し、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡファージディスプレイを作製して、特異性および親和性の高いシングルドメイン抗体（表１４に示すように、ＫＤは０．０３〜５．６ｎＭの範囲にある）。
【図１】
2021512650.tif 000003
【図２】
2021512650.tif 000004
【図３】
2021512650.tif 000005
【図４】
2021512650.tif 000006
【図５】
2021512650.tif 000007
【図６】
2021512650.tif 000008
【図７】
2021512650.tif 000009
【図８】
2021512650.tif 000010
【図９】
2021512650.tif 000011
【図１０】
2021512650.tif 000012
【図１１】
2021512650.tif 000013
【図１２】
2021512650.tif 000014
【図１３】
2021512650.tif 000015
【図１４】
2021512650.tif 000016
【配列表】
2021512650000001.app
【国際調査報告】
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2021512650.tif 000018
2021512650.tif 000019
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