(57)【要約】  間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高い患者の同定を可能にするように生存ＭＳＣを使用する方法が記載される。本方法は、前記患者由来の試料をインビトロで生存ＭＳＣと接触させるステップと、試料がインビトロで生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスを起こすように誘導することができるかどうかを判定するステップ、又はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のレベルの上昇を検出するステップとを含む。試料が前記アポトーシスを誘導する能力、及び／又はＰＧＥ２のレベルの上昇は、前記患者の前記免疫抑制治療に対する応答性及び／又は回復への適合性を示す。また、同種免疫疾患若しくは自己免疫疾患などの免疫介在性疾患若しくは状態の治療において使用するための、又は移植された臓器の拒絶反応を予防若しくは治療するための、又は組織修復を刺激する再生医療におけるアポトーシス性ＭＳＣが提供される。また、アポトーシス性ＭＳＣを含む医薬組成物を調製する方法も記載され、特許請求される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高い患者を同定する方法であって、前記患者由来の試料が、インビトロで生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスを起こすように誘導することができるかどうかを判定するステップを含み、前記試料が前記アポトーシスを誘導する能力が、前記免疫抑制治療に対する前記患者の応答性を表す、前記方法。
【請求項２】
試料がＭＳＣにおいてアポトーシスを引き起こす能力が、前記試料を生存ＭＳＣとインキュベートし、その後、インキュベート物中のアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出することによって判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料に添加されたＭＳＣの少なくとも１１％がインキュベーション後にアポトーシス性であるという所見が、免疫抑制治療に対する患者の応答性を表す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料がＭＳＣにおいてアポトーシスを引き起こす能力が、前記試料を生存ＭＳＣとインキュベートし、インキュベート物又はそこから得られた上清中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のレベルを検出し、前記レベルを免疫抑制治療に対する患者の応答性と関連付けることにより判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
４０００ｐｇ／ｍｌを超えるＰＧＥ２のレベルが、免疫抑制治療に対する患者の応答性を表す、請求項５に記載の方法。
【請求項６】
ＰＧＥ２のレベルが、定量的ＥＬＩＳＡを使用して判定される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
生存ＭＳＣを使用する免疫抑制治療に対して応答性であると判定された患者がＭＳＣによる治療を施され、前記免疫抑制治療に非応答性であると判定された患者がアポトーシス性ＭＳＣによる治療を施される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
インビトロで生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する方法であって、インビトロで前記生存ＭＳＣを患者由来の生体試料と接触させるステップと、インビトロでの前記生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在、又は前記試料中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のレベルの上昇のいずれかを検出するステップとを含み、インビトロでの前記生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在又はＰＧＥ２のレベルの上昇が、生存ＭＳＣを使用する免疫抑制治療に対する前記患者の応答性を表す、前記方法。
【請求項９】
インビトロでの生存ＭＳＣの複数の試料を、複数の患者における異なる患者由来の生体試料と接触させるステップと、インビトロでの生存ＭＳＣの各試料におけるアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出するステップとをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
その又は各々の接触させるステップが、生体試料を生存ＭＳＣとインキュベートするステップを含み、その又は各々の検出するステップが、インキュベート物中のアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出するステップ及び／又はその効力を判定するステップを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
試料との接触後にインビトロでの生存ＭＳＣの少なくとも１１％がアポトーシス性である、又は上清中のプロスタグランジンＥ２のレベルが４０００ｐｇ／ｍｌを超えるという所見が、免疫抑制治療に対する患者の応答性を表す、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
インビトロでの生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在及び／又はＰＧＥ２のレベルの上昇が検出される場合、患者が生存ＭＳＣにより治療され、インビトロでの生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在が検出されない場合、前記患者がアポトーシス性ＭＳＣにより治療される、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
試料が、血液又は血清試料である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
アポトーシス性ＭＳＣの存在が共焦点顕微鏡法又はフローサイトメトリーによって判定される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＭＳＣ免疫抑制治療による治療のために患者を層別化する方法であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法を実施するステップと、生存ＭＳＣによる治療のために、生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高い患者を同定するステップと、アポトーシス性ＭＳＣによる治療のために、前記免疫抑制治療に対して応答する可能性が低い患者を同定するステップとを含む、前記方法。
【請求項１６】
組織損傷から回復する対象の適合性を同定する方法であって、前記対象由来の試料が、インビトロで生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスを起こすように誘導することができるかどうかを判定するステップ、及び／又はＰＧＥ２のレベルの上昇を検出するステップを含み、前記試料が前記アポトーシスを誘導する能力、又はＰＧＥ２のレベルの上昇の存在が前記患者の回復する能力を表す、前記方法。
【請求項１７】
それを必要とする患者に免疫抑制効果を生じさせる方法であって、前記患者が生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高いかどうかを、前記患者由来の生体試料と接触させて、インビトロでの生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスの存在を検出することにより判定するステップと、インビトロでの前記生存ＭＳＣにおいてアポトーシスの存在が検出される場合に、前記患者に有効量の生存ＭＳＣを投与するステップと、インビトロでの前記生存ＭＳＣにおいてアポトーシスの存在が検出されない場合に、前記患者に有効量のアポトーシス性ＭＳＣを投与するステップとを含む、方法。
【請求項１８】
患者が、免疫介在性疾患若しくは状態に罹患しているか、又は組織修復を刺激する再生医療を必要とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
移植された臓器の拒絶反応の予防若しくは治療のためのものであるか、又は疾患又は状態が同種免疫疾患若しくは自己免疫疾患である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
疾患が移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、関節リウマチ、強直性脊椎炎又は乾癬性関節炎などの関節炎、及び急性呼吸窮迫症候群である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
患者における治療の有効性が、ＭＳＣを投与した後に前記患者から採取された試料中の食細胞又はＩＤＯの存在を検出することによってモニターされる、請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法を実施するために必要とされる構成要素を含むキット。
【請求項２３】
免疫介在性疾患若しくは状態の治療において、又は組織修復を刺激する再生医療において使用するためのアポトーシス性ＭＳＣ。
【請求項２４】
請求項７、１２、１５、１７〜２０のいずれかに記載の方法において使用するためのアポトーシス性ＭＳＣ。
【請求項２５】
移植された臓器の拒絶反応の予防若しくは治療のためのものであるか、又は疾患が同種免疫疾患若しくは自己免疫疾患である、請求項２３又は２４に記載のアポトーシス性ＭＳＣ。
【請求項２６】
疾患が移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、関節リウマチ、強直性脊椎炎又は乾癬性関節炎などの関節炎、及び急性呼吸窮迫症候群である、請求項２５に記載のアポトーシス性ＭＳＣ。
【請求項２７】
免疫抑制治療において使用するためのアポトーシス性ＭＳＣを産生する方法であって、少なくとも３０％のＭＳＣがアポトーシス性である細胞培養物を形成するのに十分な２４時間未満の期間内、生存ＭＳＣを薬学的に許容されるアポトーシス誘導剤とインキュベートするステップを含む、前記方法。
【請求項２８】
薬学的に許容されるアポトーシス誘導剤が生物学的薬剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的薬剤がセリンプロテアーゼ及び／又は抗ＦＡＳ抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
セリンプロテアーゼがヒトグランザイムＢ（ＧｒＢ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
薬学的に許容されるアポトーシス誘導剤がＧｒＢと抗ＦＡＳ抗体の組合せを含む、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
請求項２７〜３１のいずれかに記載の方法を使用して得ることができるアポトーシス性ＭＳＣ。
【請求項３３】
免疫抑制治療において使用するための請求項３２に記載のアポトーシス性ＭＳＣ。
【請求項３４】
自殺遺伝子、特にカスパーゼ９又はカスパーゼ３などのカスパーゼ誘導遺伝子の形態であってもよい、自殺メカニズムを含む、請求項３２又は３３に記載のアポトーシス性ＭＳＣ。
【請求項３５】
請求項３１〜３３のいずれかに記載のアポトーシス性ＭＳＣを含む医薬組成物。
【請求項３６】
生存ＭＳＣをさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
それを必要とする患者に免疫抑制効果を生じさせる方法であって、前記患者に有効量のアポトーシス性ＭＳＣを投与する、前記方法。
【請求項３８】
患者が免疫介在性疾患若しくは状態に罹患しているか、又は組織修復を刺激する再生医療を必要とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
移植された臓器の拒絶反応の予防若しくは治療のためのものであるか、又は疾患若しくは状態が同種免疫疾患若しくは自己免疫疾患である、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
疾患が移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、関節リウマチ、強直性脊椎炎又は乾癬性関節炎などの関節炎、及び急性呼吸窮迫症候群である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
患者における治療の有効性が、ＭＳＣを投与した後に前記患者から採取された試料中の食細胞又はＩＤＯの存在を検出することによってモニターされる、請求項３７〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
患者における回復への適合性及び／又は免疫抑制治療に対する応答性を判定するためのバイオマーカーとしてのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の使用及び／又はアポトーシス性ＭＳＣの使用。
【請求項４３】
患者由来の試料中のアポトーシス性ＭＳＣの存在及び量の検出並びに／又はＰＧＥ２のレベルの上昇の検出を含む、請求項４２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生存（live）間葉系間質細胞（ＭＳＣ，mesenchymal stromal cell）を使用する免疫抑制治療に対して応答することができる患者を同定する方法、並びに応答患者及び非応答患者に利用可能な治療の選択肢、並びにこの方法で使用するための薬剤を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性障害は、世界中の公共医療サービスに重い負担をかける。生物学的製剤はプラスの影響をもたらしたが、それらは治癒的ではなく、実質的な毒性と関係している。細胞ベースの免疫調節は、臨床環境で得られた有望な結果により支持される新たに出現した好機である。間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、おそらくその中で最も有望なものである。複数の研究で、ＭＳＣが炎症を調節し、その結果、残存している宿主組織修復活性を促進することにより組織恒常性を制御することが示されている。ＭＳＣ介在性免疫抑制は、事実、免疫細胞のいかなる型にも影響を及ぼし、産生される標的細胞とのいかなる組織適合性も必要としない。したがって、そのような特性及びそれらの多用途性は、免疫介在性障害の治療にＭＳＣを利用する機会に多くの関心を引き寄せた。ＭＳＣが移植片対宿主病（ＧｖＨＤ，graft-versus-host disease）に有益な効果があるという実証実験は既に存在する。ＧｖＨＤは、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ，haemopoietic stem cell transplantation）を受けている患者のおよそ４０％に影響を及ぼす致命的になり得る合併症である。症例の約１０〜２０％で起こる、疾患がステロイドに応答しない場合、患者は通常死亡する。初期フェーズII研究では、重度ステロイド難治性ＧｖＨＤ患者の約半数が、ＭＳＣ注入後に臨床応答を示すことが報告されている。また、ＭＳＣ治療が移植臓器の拒絶反応を調節し、多発性硬化症などの自己免疫疾患、クローン病、ある種の関節炎、及び急性呼吸窮迫症候群などの重度の急性炎症状態の改善に順調に使用することができるという初期のエビデンスもある。
【０００３】
しかし、記載されている臨床結果は不定であり、有効性の証明は決定的ではない。これは、最も有効な細胞調製物を選択するための基準を提供することができる効力アッセイの不足に起因しているが、したがって、ＭＳＣ治療効果を支える機序への限られた理解がこの方向へのいかなる進歩も妨げてきた。別の一面は、患者の選択である。前臨床研究によって強く裏付けられた利用可能なデータは、ＭＳＣ注入についての適切なタイミングの選択が、多くは細胞調製物に関係なく、臨床的有効性にとって基本であることを示している。タイミングは、必ずしも疾患の重症度に関連しているとは思われず、むしろ疾患の炎症性特徴に関連しているようである。実際、ＭＳＣは構成的に免疫抑制的ではないが、しかし、それらの特性を「ライセンス」する炎症性環境に曝露された後にだけＭＳＣは免疫抑制的である。疾患においてＭＳＣ治療活性を誘発する分子的合図（molecular cues）のパターンは未解決な課題のままであり、適切に対処されれば、どの患者がＭＳＣ治療の恩恵を受ける可能性がより高いかを同定する可能性を有する。動物モデル及びインビトロでのシステムからのこれまでの唯一のエビデンスは、ＭＳＣ「ライセンス化」におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ，interferon-γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α，tumour necrosis factor-α）、及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β，interleukin-1β）の役割を示唆しているが、これらの分子はいずれも臨床環境においては確認されていない。したがって、おそらくは、ＭＳＣ治療において最も緊急性のある、満たされていないニーズは、どの患者が治療に応答する可能性がより高いかを理解することである。ＭＳＣ応答者に関連したサインを同定することにより、患者の層別化を知らせ、高性能の臨床試験を設計し、既に有望なＭＳＣベースの治療戦略を最終的に最大限にすることができる。
【０００４】
ＭＳＣ治療の分野において最も困惑する観察の１つは、注入されたほとんどの細胞が、注入後ほぼすぐに肺に一時的に存在した後、数時間以内に検出不能になることである。現在の知識ではこのパラドックスの説明を提供することはできず、そのため、その有用性を最大限にするために、ＭＳＣ治療活性の基礎をなす機序をよりよく理解することが望まれる。
【０００５】
本出願人らはこの点で著しい進歩があったので、患者を選択することができ、すべての患者に対する治療の選択肢を特定し、拡大することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願人らは、ＭＳＣが、細胞毒性機能を有する活性化免疫細胞を保有するレシピエントに注射された場合、それらはアポトーシス細胞死を速やかに起こすことを観察した。この細胞死は、健康なレシピエント、又は炎症が細胞毒性細胞を含有しないレシピエントにおいては生じない。逆説的に、本治療効果は、細胞毒性細胞を含有し、注入されたＭＳＣを死滅させるレシピエントにおいてのみ提供することができる。この明白なパラドックスを説明する機序は、主としてインドールアミンデオキシダーゼ（ＩＤＯ，indoleamine deoxidase）によって達成される免疫抑制活性をレシピエントにおいて誘発する能力を有するのが特にアポトーシス性（apoptotic）ＭＳＣであるということである。
【０００７】
この発見は、したがって、患者の層別化についての明瞭な根拠を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高い患者を同定する方法であって、前記患者由来の試料が、インビトロで生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスを起こすように誘導することができるかどうかを判定するステップを含み、試料が前記アポトーシスを誘導する能力が、前記免疫抑制治療に対する前記患者の応答性を表す、方法が提供される。
【０００９】
本発明の方法における使用に適した患者試料は、免疫細胞、例えば末梢血単核細胞を含有する試料である。したがって、適切な試料は血液又は血清試料であるが、他の試料、例えば、生検試料又は脳脊髄液（ＣＳＦ，cerebrospinal fluid）試料を使用することもできる。必要な場合には、試料は、使用前に播種して免疫細胞を濃縮させてもよい。
【００１０】
本発明の第１の態様の方法の特定の実施形態では、試料がＭＳＣにおいてアポトーシスを引き起こす能力は、前記試料を生存ＭＳＣとインキュベートし、その後、インキュベート物中のアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出することによって判定される。適切には、添加されるＭＳＣの少なくとも１１％、任意に１２．５％がインキュベーション後にアポトーシス性になる場合、患者は生存ＭＳＣを使用する治療に対して「応答性」であると見なされる。特定の実施形態では、「応答性」宿主を示すＭＳＣアポトーシス性の閾値は、１１．５％、又は１２．５％、又は１３．５％である。
【００１１】
アッセイで使用されるＰＢＭＣなどの患者の細胞の数は、因子によって、例えば、試料のサイズ及び検出の方法によって変わる。しかし、典型的には、インキュベーションで一緒に混合される免疫細胞：ＭＳＣの比は、１：１〜６０：１、例えば２：１〜４０：１の範囲である。これらのＭＳＣは、適切には、任意の健康なドナー又は供給源に由来するものである。
【００１２】
インキュベーションは、適切には、有効な結果を判定するのに十分な期間実施されるが、重篤な疾患状態の場合であっても、治療の選択肢を迅速に探索するのに十分な速さで実施される。典型的には、これは、１〜２４時間、又は２〜２４時間、例えば１〜６時間、又は１〜５時間、又は２〜６時間、特に３〜５時間、例えば約４時間の範囲である。
【００１３】
インキュベート物中のアポトーシス性ＭＳＣの存在及び量は、任意の適切なアッセイ又は方法によって判定することができる。そのような方法としては、共焦点顕微鏡、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、他の抗体ベースの検出方法、ＤＮＡ増幅及び／又は検出、例えばポリメラーゼ連鎖反応、イムノアッセイ法、例えばＥＬＩＳＡ又は免疫酵素アッセイ又は代謝アッセイを挙げることができる。そのような方法を使用した検出を可能にするアポトーシス細胞の適切な標識化は、アネキシンＶ結合又はカスパーゼ活性に基づいていてもよい。顕微鏡法は染色を含んでいてもよく、例えば、ミトコンドリア又はＤＮＡに対する染色は、活性ミトコンドリアが破壊される初期アポトーシス、又はＤＮＡ断片化が起こる後期アポトーシスをそれぞれ検出することができる。
【００１４】
しかし、本出願人らは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２，prostaglandin E2）が、ＭＳＣと物理的接触をした後に患者のＰＢＭＣによって誘導される分子マーカーであること、及びこの活性が、ＰＢＭＣがＭＳＣアポトーシスを誘導する能力と相関することを今回明らかにした。特に、ＭＳＣは、カスパーゼ依存的方式で患者のＰＢＭＣと接触した際に、高レベルのＰＧＥ２を分泌するように誘導するものと思われる。その結果、ＰＧＥ２のレベルは、例えば市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、独立したオペレーターによって、より簡単に及び客観的に測定することができるので、これは、インビトロでのＭＳＣにおけるアポトーシスを誘導する患者の能力を検出する便利な方法を提供する。
【００１５】
したがって、本発明の特定の実施形態では、試料がＭＳＣにおいてアポトーシスを引き起こす能力は、前記試料を生存ＭＳＣとインキュベートし、インキュベート物又はそこから得られた上清中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のレベルを検出し、レベルを前記免疫抑制治療に対する前記患者の応答性と関連付けることにより判定される。以下に示すように、４０００ｐｇ／ｍｌを超えるインキュベート物由来の上清中のＰＧＥ２のレベルは、一般に、生存ＭＳＣを使用する免疫抑制治療に対する前記患者の応答性を表す。これらのレベルは、任意の従来の方法、例えばイムノアッセイ法を使用して判定することができるが、特に便利な方法は、定量的ＥＬＩＳＡの使用を含む。様々なキットがこの目的のために市販されている。
【００１６】
本発明の方法を使用することによって、ＭＳＣ治療に対して応答する可能性が最も高い患者を同定することができる。その結果、これらの患者は最も適切な治療を施される可能性があり、治療がより好結果となるという現実的期待がある。
【００１７】
本発明の方法は、ＭＳＣ治療に対する「応答者」及び「非応答者」を正確に同定することができる高感度試験を提供する。トライアルでは１００％の感度を、臨床試験では９２％の感度を達成することが示された。さらに、治療された患者の９０％で臨床応答が見出されたので、本試験は高い特異度を有する。
【００１８】
本方法は、インビトロでＭＳＣを使用する手段を提供する。したがって、第２の態様では、本発明は、インビトロで生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する方法であって、インビトロで生存ＭＳＣを患者由来の生体試料と接触させるステップと、インビトロでの生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出するステップ、又は混合物中のＰＧＥ２のレベルの上昇を検出するステップのいずれかとを含み、インビトロでの生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣ又はＰＧＥ２のレベルの上昇の存在が、生存ＭＳＣを使用する免疫抑制治療に対する患者の応答性を表す、方法を提供する。
【００１９】
第２の態様の方法は、インビトロで生存ＭＳＣの複数の試料を使用して適切に実施され、その各々は、複数の患者における異なる患者由来の生体試料と接触され、インビトロでの生存ＭＳＣの各試料におけるアポトーシス性ＭＳＣの、又はＰＧＥ２のレベルの上昇の存在が検出される。このように、応答者及び非応答者を同定することができ、また適切に効力のあるＭＳＣを同定することができる。
【００２０】
したがって、本発明の第２の態様の方法はまた、アポトーシスを起こす、及び／又はＰＧＥ２を産生するように最も良好に誘導することができる適切に効力のあるＭＳＣの同定を可能にし、それにより本発明の方法を効力アッセイとしても使用可能にする。効力アッセイは、異なる供給源由来のＭＳＣがアポトーシスを起こす感度の多様性を示すことが示されたので、特に有利である（図１９を参照）。さらに、効力の異なるＭＳＣの複数の試料又はバッチを得ることにより、品質管理を支援し、バッチ間での一貫性の判定を可能にする。
【００２１】
各実例において、接触させるステップは、生体試料を生存ＭＳＣとインキュベートするステップを適切に含み、検出するステップは、インキュベート物中のアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出するステップ、又はインキュベート物の上清中のＰＧＥ２レベルの上昇を検出するステップを適切に含む。適切な試料、検出レベルなどは、本発明の第１の態様において使用されるものと同様である。
【００２２】
以下で述べるように、ＭＳＣがこの場合に効果的であるという原理の証拠があるので、本出願人らは移植片対宿主病（ＧｖＨＤ，Graft-versus-Host Disease）モデルを使用して、ＭＳＣ活性の基礎をなす機序を調査した。ＧｖＨＤマウス内に保有される活性化細胞毒性細胞は、注入されたＭＳＣにおいて広範囲なインビボでのカスパーゼ活性化を迅速に誘導することが証明されている。ＭＳＣレシピエントにおける活性化細胞毒性細胞の存在は、ＭＳＣアポトーシスを誘導するために必要であり、結果として、ＭＳＣ免疫抑制効果を誘発するために必要である。
【００２３】
これらの所見は、注入されたＭＳＣの迅速なクリアランスを説明するだけでなく、それらの消失を免疫調節活性と機序的に一致させる。細胞毒性細胞活性、ＭＳＣアポトーシス及び免疫抑制の間のリンクは、ＭＳＣに対する高レベルの細胞毒性活性と臨床応答とのＧｖＨＤ患者における相関によって確認される。したがって、ＭＳＣのレシピエント介在型死滅は、患者の層別化のための第１の機序をベースとしたバイオマーカーと見なすことができる。
【００２４】
際立ったことに、以下に記載するように、エクスビボで生成されたアポトーシス性ＭＳＣは、食細胞に由来するインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ，indoleamine 2,3-dioxygenase）活性に依存する効力のある免疫抑制効果を示し、レシピエントにおける細胞毒性細胞の必要性を回避することも見出された。その結果、ＭＳＣに応答性でない患者は、代わりにアポトーシス性ＭＳＣで治療され得る。
【００２５】
さらに、この所見は、必要に応じて、ＭＳＣ又はアポトーシス性ＭＳＣで治療した後の患者の応答を確認する手段を提供する。特に、患者の応答は、食細胞及び／又はＩＤＯの存在について試料、例えば血液又は血清試料を分析することにより測定することができ、治療が作用しているかどうかを示すバイオマーカーとして機能する。
【００２６】
食作用についての適切なアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、食作用は、血清若しくはＩｇＧを使用してオプソニン化された赤血球などの細胞基質、ザイモサンなどの酵母粒子、又は金属ビーズなどの他の粒子の貪食を測定することによりアッセイすることができる。試料は基質と一緒にインキュベートして、貪食が起こるようにする。この後、食細胞は、食細胞に対する抗体染色（例えば、抗ＣＤ１４抗体又は抗ＣＤ１６抗体）の後に細胞蛍光測定アッセイを使用して画像化され、細胞質内部の基質／粒子の存在が検出される。或いは、いかなる遊離基質も除去され、試料の食細胞を溶解させて、貪食された基質を検出のために放出させる機能アッセイを実施することができる。
【００２７】
或いは、ＩＤＯは治療の有効性のための便利なバイオマーカーとして作用する。これは、例えばBraun et al. Blood, 2005, 106(7): 2375-2381によって記載されているように、ＲＮＡの検出、ＩＤＯタンパク質検出を含む様々な従来の方法を使用して、例えばＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイ技術を使用して、又は酵素活性についてアッセイすることにより判定することができる。さらなる方法は、クロマトグラフィーによるキヌレニン経路代謝産物の生化学的定量を含む。インビボでのＩＤＯ活性はまた、Bosnyak et al, 2015, Neuro Oncol 17(9): 1284-1292によって記載されているように、トリプトファントレーサーを用いた陽電子放出断層撮影で画像化することができる。
【００２８】
したがって、本発明の第１又は第２の態様の方法を使用し、生存ＭＳＣを使用する免疫抑制治療に応答性であると判定された患者は、ＭＳＣで治療することができる。しかしさらに、前記免疫抑制治療に非応答性であると判定された患者は、アポトーシス性ＭＳＣで治療することができる。その後、治療に対する患者の応答は、上記のように、食細胞又はＩＤＯを検出することによりモニターすることができる。
【００２９】
したがって、本発明の第３の態様は、ＭＳＣ免疫抑制治療による治療のために患者を層別化する方法であって、本発明の第１及び／又は第２の態様による方法を実施するステップと、生存ＭＳＣによる治療のために生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高い患者を同定するステップと、アポトーシス性ＭＳＣによる治療のために前記免疫抑制治療に対して応答する可能性が低い患者を同定するステップとを含む、方法を提供する。
【００３０】
また、本発明の第１及び／又は第２の態様の方法は、他のタイプの患者又は対象、例えば、怪我をした患者又は他の炎症状態に罹患している患者を層別化するために使用することもできる。図２０は、他の炎症状態における間質細胞に対する細胞毒性細胞の存在を示す。
【００３１】
また本発明の方法は、ＭＳＣ注入とは無関係に、患者が炎症を調節する能力を定量化するアッセイとして使用することができる。図２１は、ＭＳＣに属している細胞型の、皮膚由来の線維芽細胞も活性化細胞毒性細胞によって死滅され得ることを示す。これは、損傷後に頻繁に起こる事象である、組織における細胞毒性細胞の形成が、間質細胞がアポトーシスを起こすように誘導し、抗炎症活性、及び結果として組織修復を開始し得ることを示唆している。したがって、損傷後に産生される細胞毒性細胞がアポトーシスを誘導し、組織再生の促進に必要な免疫調節を開始することができるとすれば、本発明の方法によるバイオマーカーの検出は、したがって、再生への適合性を検出するために使用することができる。
【００３２】
本発明によれば、したがって、組織損傷から回復する対象の適合性を同定する方法であって、前記対象由来の試料が、インビトロで生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスを起こすように誘導することができるかどうかを判定するステップ、及び／又はＰＧＥ２のレベルの上昇を検出するステップを含み、試料が前記アポトーシスを誘導する能力、又はＰＧＥ２のレベルの上昇の存在が前記患者の回復する能力を表す、方法が提供される。
【００３３】
組織損傷から回復する能力は、アポトーシス性ＭＳＣの存在及び量を検出することにより、並びに／又は上記の任意の適切なアッセイ若しくは方法に従ってインキュベート物中のＰＧＥ２のレベルの上昇を検出することによって定量化することができる。本発明の方法を使用することにより、組織損傷から回復する可能性が最も高い対象、すなわち比較的高レベルのＭＳＣキラー細胞を有する対象を同定することができる。反対に、組織損傷から回復する見込みが低い対象を同定し、組織回復を促進する最も適切な治療を施すことができる。
【００３４】
アポトーシス性ＭＳＣ（ＡｐｏＭＳＣ，Apoptotic MSC）は、以前より、心筋梗塞などの疾患（Thum et al. 2005 JACC Volume 46, Issue 10, 15 November 2005, Pages 1799-1802）又は敗血症若しくは敗血症により誘発された肺、腎臓若しくは肝臓の損傷（Chang et al., J Transl Med 2012, 10:244；Chang et al, Am J Transl Res 2014, 6:439；Chen et al, J Pineal Res 2014, 57:16）の治療に使用されてきた。細胞は、多くの場合、メラトニンと結合し、これらの状況において生存ＭＳＣよりも良好な効果を示し得る。しかし、異なる患者集団において効果が異なるという指摘は以前にはなかった。
【００３５】
アポトーシス性ＭＳＣの産生は比較的複雑な手順であり、さらなる複雑性が産生及び保管において要求され、ＭＳＣより見劣りする生成物となっている。本発明の第３の態様の層別化方法を使用する特定の利点は、ＭＳＣ治療に優先してＡｐｏＭＳＣ治療から最も恩恵を受ける患者を同定することができることである。
【００３６】
さらに、ＭＳＣが作動する機序を判定すること、並びにアポトーシスの必要性及び免疫疾患の治療におけるＡｐｏＭＳＣの使用の恩恵を明らかにすることにより、本出願人らは、これらの細胞を広範囲の免疫疾患の治療において使用することができることを明らかにした。上記のように、アポトーシス細胞は、敗血症において潜在的に有用であることが示された。これは、免疫成分を有している可能性はあるが、感染症などの外部刺激に対する極めて制御不能な炎症反応を特徴とする疾患である。ＭＳＣの作用機序を理解することにより、本出願人らは、ＡｐｏＭＳＣを使用して治療することができる疾患の範囲を、主要原因が宿主免疫系に固有の問題である同種免疫疾患（ＧｖｈＤ又は固形臓器移植など）、自己免疫疾患を含むように拡大した。加えて、機序を明らかにすることにより、ＡｐｏＭＳＣが急性呼吸窮迫症候群を含む敗血症以外の極めて制御不能な炎症状態に影響を及ぼし得ると推定することができる。
【００３７】
本出願人らは、この研究の結果、アポトーシス性ＭＳＣが上記で挙げた疾患又は状態の治療において有用であることを見出した。これらは、移植臓器、例えば、移植された肝臓又は腎臓又は心臓の拒絶を防止又は治療するための移植片対宿主病；並びに多発性硬化症及び他の神経変性障害のような自己免疫疾患、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、ある種の関節炎（関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎など）、及び急性呼吸窮迫症候群を含む。さらに、アポトーシス性ＭＳＣは、組織修復を刺激することにより、再生医療における治療効果を得ることができる。
【００３８】
この場合、ＡｐｏＭＳＣの存在が応答患者に対して非応答患者と同様の影響を及ぼし得るため、患者の層別化は必要ではない場合がある。しかし、生存ＭＳＣの使用は応答者の患者に利点を有する可能性、及び層別化が依然として有益である可能性もある。
【００３９】
さらに、ＡｐｏＭＳＣは、低酸素の使用若しくは無血清培地の培養への使用を含む方法により、又は過酸化水素の使用により、既に調製されている。これらの条件は、壊死細胞を含む不良及び／又は不均質な品質の細胞をもたらし、このことは、それらが臨床適用には許容され得ないことを意味する。特に壊死細胞の存在は、炎症を阻害するのではなく炎症を促進する可能性があり、そのため、これらの細胞は免疫疾患を治療するのではなく悪化させる可能性がある。
【００４０】
国際公開第２０１７／０５１４２１号パンフレットは、少なくとも３日間の長期間にわたり培養物に添加される低レベルのアポトーシス誘導剤を添加することにより、生存ＭＳＣの増殖を増強する方法を記載している。得られた組成物はアポトーシス細胞を含有し得るが、これらは「浮遊」細胞であり、標的コロニーの一部ではないことが見出された。治療は生存ＭＳＣの数を増加させ、及び／又は得られたコロニー形成単位のサイズを変化させた。
【００４１】
本出願人らは、ＡｐｏＭＳＣを、それらを治療的に使用することができる方法で調製することができる方法を開発した。
【００４２】
特に、アポトーシス性ＭＳＣは、ＭＳＣの少なくとも３０％がアポトーシス性である細胞培養物を形成するのに十分な２４時間未満の期間内、生存ＭＳＣを薬学的に許容されるアポトーシス誘導剤とインキュベートするステップを含む方法による免疫抑制治療において使用するために産生される。特定の実施形態では、本方法は、細胞培養物中に存在するＭＳＣの少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、７０％、又は８０％をアポトーシス性になるようにする。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「細胞培養物」という表現は、従来の培養プレート又はウェル上で見出すことができるような増殖培養物を意味する。
【００４４】
細胞でアポトーシスを誘導する薬剤は当技術分野では公知であり、化学的薬剤及び生物学的薬剤が挙げられる。本発明の第４の態様による薬学的に許容される薬剤は、調製物が臨床的適用又は薬学的適用において直接的に使用されることを可能にする。特定の実施形態では、薬学的に許容されるアポトーシス誘導剤は、薬学的に許容される生物学的薬剤である。そのような薬剤の例としては、セリンプロテアーゼ及び／又は抗ＦＡＳ抗体、並びにＵＶと組み合わせてアポトーシスを誘導することができるソラレンを挙げることができる。特に有用なセリンプロテアーゼは、ヒトグランザイムＢ（ＧｒＢ，Granzyme B）であり、これはＧｒＢ及び抗Ｆａｓ抗体と組み合わせて適切に使用される。他の薬剤としては、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ，TNF-related apoptosis-inducing ligand）、及び標的細胞においてアポトーシスを誘導するように免疫系によって使用される任意の他の分子が挙げられる。
【００４５】
アポトーシス誘導剤は、所望のレベルのアポトーシスを誘導するのに十分な期間、生存ＭＳＣと適切にインキュベートされる。これは、使用される薬剤の性質及び細胞の容量などの因子に応じて変わるが、典型的には、１５分〜２５時間の範囲、例えば約１８時間である。この時間の後、細胞は壊死化し、したがって、上で論じた理由により、免疫疾患の治療における治療適用にもはや適さなくなる。またこれは、ＡｐｏＭＳＣがその生成の２４時間以内に、適切には１時間以内に、特に生成後に直接又は直ちに適切に使用されることも意味する。
【００４６】
薬剤の濃度も同様の因子に応じて変わるが、１ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、例えば５〜２０μｇ／ｍｌ、例えば約１０μｇ／ｍｌの濃度がほとんどの場合に適切であり得る。使用される薬剤が抗Ｆａｓ抗体又は（ＦＡＳＬ）である場合、いくつかの実施形態では、濃度は１００ｎｇ／ｍｌ超である。
【００４７】
この方法を使用して得ることができるアポトーシス性ＭＳＣを含む組成物は、治療、特に免疫抑制治療において有用である。
【００４８】
この文脈において、上記のアポトーシス性ＭＳＣを、薬学的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供することができる。適切な担体は当技術分野においては周知であり、液体担体、例えば水又は生理食塩水が挙げられる。特定の担体は投与方式に依存するが、典型的には、これは注射又は注入によって、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．，intravenous）、腹腔内（ｉ．ｐ．，intraperitoneal）、筋肉内（ｉ．ｍ．，intramuscular）、臓器内又は皮下（ｓ．ｃ，subcutaneous）注射又は注入による。特定の実施形態では、組成物は、腹腔内（ｉ．ｐ．）若しくは皮下（ｓ．ｃ）、又は静脈内（ｉ．ｖ．）により投与される。
【００４９】
組成物はいくつかの生存ＭＳＣをさらに含有していてもよい。これらの生細胞は、「応答者」の患者の場合には治療効果に寄与するが、非応答者の患者の場合にはあまり有用ではないか又は効果がない可能性がある。しかし、それらは有害ではなく、それらの存在は、投与前にアポトーシス細胞を生存ＭＳＣから単離する必要性を回避する。
【００５０】
組成物中のＭＳＣは、自殺遺伝子を組み込むように遺伝子操作されて、それらのインビボでのアポトーシスをより良好に調節することができる。これは、患者のＭＳＣキラーの存在とは無関係に、操作されたＭＳＣが、自然に化学誘引される炎症部位に輸送された場合にのみ、インビボでアポトーシスを起こすように誘導される選択的アプローチを提供する。抗ＦａｓＬアプローチと比較すると、このようなアプローチは、組織損傷及び炎症の部位でアポトーシスをインビボで選択的に実行することができるという利点を有する。
【００５１】
したがって、本発明によれば、上記のように、アポトーシス性ＭＳＣ及び／又は生存ＭＳＣを含む組成物が提供され、ＭＳＣは自殺メカニズムを含む。自殺メカニズムは、自殺遺伝子、特にカスパーゼ誘導性遺伝子、例えばカスパーゼ９又はカスパーゼ３を含み得る。
【００５２】
組成物は、ＭＳＣの増殖のサポートに使用される培養培地の要素をさらに含んでいてもよく、それらは薬学的に許容される。そのような培地は当技術分野では公知であり、以下に例示されている。
【００５３】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする患者に免疫抑制効果を生じさせる方法であって、前記患者に有効量のアポトーシス性ＭＳＣを投与するステップを含む、方法を提供する。本方法は、予備ステップとして、前記患者由来の試料が、インビトロでの生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスを起こすように誘導することができるかどうかを検出することにより、前記患者が生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高いかどうかを判定するステップと、試料がそうである場合には、前記患者に有効量の生存ＭＳＣを投与するステップと、前記試料が前記アポトーシスを誘導しない場合には、前記患者に有効量のアポトーシス性ＭＳＣを投与するステップとを含むことができる。
【００５４】
免疫抑制が必要とされ得、この方法を使用して治療され得る状態又は疾患は、上で示した疾患及び状態を含む。これらは、移植臓器、例えば、移植された肝臓又は腎臓又は心臓の拒絶を防止又は治療する移植片対宿主病、並びに多発性硬化症及び他の神経変性障害のような自己免疫疾患、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、ある種の関節炎（慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎など）を含む。最後に、アポトーシス性ＭＳＣは、組織修復を刺激することにより、再生医療において治療利益をもたらすことができる。
【００５５】
また、上で論じたように、患者における治療の有効性は、ＭＳＣの投与後に、例えば、ＭＳＣ又はＡｐｏＭＳＣの投与後１時間〜３日間の期間の後に患者から採取された試料、例えば血液又は血清試料中の食細胞又はＩＤＯの存在を検出することによってモニターすることができる。
【００５６】
必要な場合には、上記の方法の１又は２以上を実施するためのキットを提供することができ、これらは、場合によっては、本発明のさらなる態様を形成し得る。キットは、例えば、上記のような色素若しくは染色剤又は標識などのアポトーシス性ＭＳＣを検出するための手段、及び／又は上記の生物学的薬剤などの薬学的に許容される方法でアポトーシス性ＭＳＣを形成するための手段、及び／又は患者をモニターするステップで食細胞若しくはＩＤＯをアッセイするための手段を含んでいてもよい。
【００５７】
したがって、要約すると、本出願人らは、この分野における複数の未解決の問題を説明する重要な機序を明らかにすることにより、ＭＳＣ治療の議論の的になっているトピックを解明することができた。情報の最初の際立つ部分は、生着の欠如にもかかわらず、ＭＳＣが治療上有効であるというこれまでのパラドックスに対する解決を提供する。本出願人らは、ＭＳＣが細胞毒性細胞の存在下で注入後、広範囲のカスパーゼ活性化及びアポトーシスを起こすこと、並びにこれがそれらの免疫抑制機能の要件であることを証明した。他のレシピエント依存性応答は、インビトロでのＭＳＣ溶解及びインビボでのＭＳＣクリアランスを介在すると説明されているが、これは、注入後の免疫抑制の送達におけるインビボでのＭＳＣアポトーシスを助ける役割の最初の示唆である。さらに、複数の研究により免疫応答を調節するアポトーシス細胞の能力が報告されているが、本出願人らは、インビボでの自然に存在する細胞死が免疫抑制を駆動することを示した。
【００５８】
ＭＳＣアポトーシスは、レシピエントマウスにおいてＧｖＨＤも介在するレシピエント細胞毒性細胞に含有される細胞毒性顆粒を必要とし、それにより影響を受ける（以下の図１、Ａ及びＢ、図２、Ｃ及びＤ）。重要なことには、ＭＳＣに対する細胞毒性活性はまた、ＧｖＨＤ患者のＰＢＭＣにおいても検出することができ、臨床応答を予測する。高い細胞毒性を示す患者はＭＳＣに応答するが、細胞毒性活性が低い又は非存在の患者はＭＳＣ注入後に改善しない（図３、Ａ及びＢ）。したがって、レシピエントがアポトーシス性ＭＳＣを産生する能力は治療的有効性の要件であると考えられ、ＭＳＣ注入のための患者を層別化する可能性のあるバイオマーカーとして使用するのに適している。
【００５９】
細胞毒性細胞によるＭＳＣ認識は抗原特異的ではなく、ＨＬＡ関与も必要とせずアロ反応性拒絶の結果でもないので、したがって、第三者ＭＳＣを使用する現在の実施を支持する。ＭＳＣは活性化された細胞毒性細胞と物理的に接触してアポトーシスを起こさなければならないが、免疫学的シナプスは必要ではない。
【００６０】
本明細書で報告されているデータは、ＭＳＣエフェクター機能を調整及び判定するＭＳＣレシピエントの重要な役割を強調するＭＳＣ治療へのアプローチを示唆している。レシピエントの細胞毒性細胞が注入されたＭＳＣにおいてアポトーシスの開始に必要とされるだけでなく、食細胞も、アポトーシス性ＭＳＣを貪食し、ＩＤＯを産生することにより、最終的にＭＳＣ免疫抑制活性を送達する。同様の機序は、インビトロで生成された異なる系統のアポトーシス細胞が、他の全身性自己免疫疾患におけるＧｖＨＤ及びマクロファージＩＤＯ産生の免疫調節をどのように誘導するかを説明するために記載されている。またこれは、制御性Ｔ細胞及びマクロファージのようなレシピエントの免疫寛容ネットワークを刺激すると記載したＭＳＣの能力と一致している。
【００６１】
レシピエントマクロファージの枯渇又はＩＤＯ活性の阻害はまた、生存ＭＳＣの治療活性も損ない、それにより、インビボでのＭＳＣアポトーシスを免疫抑制とリンクさせる。任意の特定の食細胞集団（マクロファージ又は樹状細胞）がａｐｏＭＳＣの貪食に選択的に関与しているということは、それらがインビボでそのような活性を提示するという理由からありそうにない。
【００６２】
本発明の影響のうちの１つは、ＭＳＣが治療免疫抑制にとって必要な出発点を維持しつつも、患者に由来する細胞がそのような免疫抑制の送達において重要な役割を果たすことである。したがって、最も臨床的に有効なＭＳＣ亜集団を同定することを目的とした取り組み、並びにそのような選択を検証する効力アッセイは無益であると判明する可能性がある。この概念を支持するさらなる証拠は、エクスビボで生成されたａｐｏＭＳＣの投与によりＴｈ２炎症モデルにおける細胞毒性細胞の要件を回避することができること（図６Ｄ）、及びそのａｐｏＭＳＣがＧｖＨＤエフェクター細胞の増殖／浸潤を抑制するのに有効であり得ることである。興味深いことに、ａｐｏＭＳＣはｉ．ｐ．投与された場合にのみ、ＧｖＨＤモデルで主として有効であった（図７、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。貪食されているにもかかわらず、ｉ．ｖ．注射されたａｐｏＭＳＣはＩＤＯ産生を誘導せず（図７、Ｊ及びＫ）、したがって、ＭＳＣアポトーシスが起こる部位は、おそらくは食細胞の亜集団との連動により、免疫抑制機能に影響を及ぼし得ることを示唆している。
【００６３】
本発明は、ＭＳＣ治療におけるパラダイムシフトを表しており、それにより、それらのアポトーシスの消滅は、ＭＳＣによって発揮される免疫抑制のエフェクター機序における重要なステップである。本発明のさらなる影響は、この機序を支える原理がＭＳＣに対する臨床応答を予測し、したがって、ＭＳＣ治療に対してＧｖＨＤ患者を層別化するために使用することができるということである。
【００６４】
本明細書に記載されている患者の層別化は、患者が、ＡｐｏＭＳＣではなく、場合によりＭＳＣであり得る、利用可能な最も有効な治療を受けることを保証するのに役立つ可能性がある。
【００６５】
本発明は、次世代の臨床試験が、最良のＭＳＣ集団を選択することから、応答する可能性が最も高い患者を選択することに向けて移行すべきであることを示している。さらに、ａｐｏＭＳＣがＭＳＣに抵抗性の患者に有効であり得るという所見は、ＭＳＣの製造において新しい手段への道を開く。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
ここで本発明を、以下に要約している添付の図面を参照して、例として詳細に説明する。
【００６７】
【図１】ＭＳＣが免疫抑制の送達に影響を及ぼすことなく注入後にインビボでアポトーシスを起こすことを示す図である。Ａ：ｌｕｃ−ＭＳＣを、移植後３日目のナイーブマウス、ＢＭマウス及びＧｖＨＤマウスにｉ．ｖ．注射した。次いで、すべての動物にＤＥＶＤ−アミノルシフェリンを用いてｉ．ｐ．注射し、１時間後に画像化した。Ｎ：３回の独立した実験から群分けされた、群当たり６匹のマウス。白色の線は、最終画像で集められた複数の写真を分割している。Ｂ：ＴＬＳを図１Ａのマウスの画像から測定し、平均値±ＳＤとして示した。Ｃ、Ｄ：ＧｖＨＤマウス（黒色の丸）及びＭＳＣ注射の４日後のＭＳＣで治療したＧｖＨＤマウス（黒色の四角）の脾臓（Ｃ）及び肺（Ｄ）におけるＧｖＨＤエフェクター細胞（ＣＤ８＋Ｖβ８．３＋）の浸潤。Ｎ：４回の独立した実験から群分けされた、１５匹（ＧｖＨＤ）及び１３匹（ＧｖＨＤ＋ＭＳＣ）のマウス；平均値±ＳＤを示している。Ｂにおける統計：Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元ＡＮＯＶＡ。＊＊：ｐ＜．０１、＊＊＊：ｐ＜．００１、ｎｓ：有意でない。Ｃ及びＤ：独立ｔ検定。＊＊：ｐ＜．０１。
【図２】ＭＳＣアポトーシスが免疫抑制に不可欠であり、レシピエントにおいて機能的に活性化された細胞毒性細胞を必要とすることを示す図である。Ａ：ナイーブＣ５７ＢＬ／６雄性マウス、ＢＭマウス又はＧｖＨＤマウス由来の肺細胞懸濁液中のＣＤ８＋Ｖβ８．３＋細胞のパーセンテージをリンパ球集団で分析した。平均値±ＳＤを示している。Ｎ：３回の独立した実験から群分けした、１２匹（ＧｖＨＤ）、３匹（ＢＭ）及び３匹（ナイーブ）のマウス。Ｂ：ＣＤ８＋細胞を、移植の７日後に、雌性のナイーブＭｈマウス（灰色の棒）又はＧｖＨＤマウス（白色の棒）の肺及び脾臓から選別し、それらがインビトロでＭＳＣアポトーシスを誘導する能力について試験した。結果は、３回の独立した実験におけるアネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−  ＭＳＣ（平均値±ＳＤ）（Ｎ＝群当たり１０匹）を示し、黒色の棒は、対照として使用したＭＳＣ培養単独でのアポトーシスのレベルを表している（Ｎ：３）。Ｃ：ｌｕｃ−ＭＳＣを、移植の３日後に、ＧｖＨＤ（Ｎ＝７）マウス及びＧｖＨＤＰｅｒｆ−／−（Ｎ＝７）マウスにおける３回の独立した実験で注入した。１時間後、マウスにＤＥＶＤ−アミノルシフェリンを注射し、画像化した。白色の線は、最終画像で集められた複数の写真を分割している。Ｄ：ＴＬＳを図２Ｃから得、平均値±ＳＤとして表した。Ｅ、Ｆ：未治療のＧｖＨＤＰｅｒｆ−／−（Ｎ＝１６）マウス及びＭＳＣで治療したＧｖＨＤＰｅｒｆ−／−（Ｎ＝１７）マウスの脾臓（Ｅ）及び肺（Ｆ）におけるエフェクターＧｖＨＤ細胞（ＣＤ８＋Ｖβ８．３＋）の浸潤（４回の独立した実験の平均値±ＳＤ）。Ａ及びＢにおける統計：Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元ＡＮＯＶＡ。＊：ｐ＜．０５；＊＊＊：ｐ＜．００１。Ｄ、Ｅ及びＦ：独立ｔ検定。＊＊＊：ｐ＜．００１。ｎｓ：有意でない。
【図３】ＭＳＣに対する細胞毒性が、ＧｖＨＤ患者におけるＭＳＣに対する臨床応答を予測することを示す図である。Ａ、Ｂ：ＭＳＣを投与された健康な対照（ＨＣ，healthy control）又はＧｖＨＤの患者から２４時間後に得たＰＢＭＣを、２４ウェルプレートで、２０／１のＰＢＭＣ／ＭＳＣ比のＭＳＣと４時間インキュベートした。アポトーシスのレベルをＭＳＣで測定し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ／７−ＡＡＤのレベルを評価した。（Ａ）ＨＣ、臨床応答者（Ｒ，responder）及び非応答者（ＮＲ，non-responder）に対する代表的なプロット。（Ｂ）アポトーシスのレベルを、ＨＣ（丸、Ｎ＝５）、Ｒ（三角；Ｎ＝５）、及びＮＲ（四角；Ｎ＝１２）の間で比較した。統計：一元ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定。＊＊＊：ｐ＜．０００１。ｎｓ：有意でない。
【図４】ＭＳＣアポトーシスが、活性化されたＣＤ８＋及びＣＤ５６＋細胞毒性細胞によって介在され、バイスタンダー効果の結果であることを示す図である。Ａ：健康なドナー由来のＰＢＭＣは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，phytohemagglutinin）を使用して活性化するか（ＰＨＡ−ａＰＢＭＣ）、又はＭＬＲを使用して活性化した（ＭＬＲ−ａＰＢＭＣ）。休止時（明灰色の棒）、ＰＨＡａＰＢＭＣ（黒色の棒）又はＭＬＲ−ａＰＢＭＣ（暗灰色の棒）を、４時間、示した比のＭＳＣとインキュベートした。ＮＤ：実施なし。Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ：ＭＬＲ−ａＰＢＭＣ又はＰＨＡ−ａＰＢＭＣを、汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）（Ｂ）、ＧｒＢ阻害剤Ｚ−ＡＡＤ−ＣＭＫ（３００μＭ）、パーフォリン阻害剤エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）（４ｍＭ）（Ｅ）、中和濃度のＦＡＳ−Ｌ  ｍＡｂ抗ＣＤ１７８（Ｆ）、又は漸増する用量（１０〜７５μＭ）のＰＫＣζ−ＰＳ（Ｉ）の存在下又は非存在下でＭＳＣと培養した。Ｈ：ＭＬＲ−ａＰＢＭＣを、ＭＳＣと直接接触で培養したか、又はtranswell（登録商標）により分離した。Ｃ、Ｄ：ＭＬＲ−ａＰＢＭＣは、分画せずに、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋細胞に対してポジティブ選択して（Ｃ）、又はＣＤ５６＋、ＣＤ８＋、若しくはその両方を枯渇させて（Ｄ）使用した。Ｇ：抗ＨＬＡ−Ａ−Ｂ−Ｃ抗体又は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の中和用量の存在下又は非存在下での自己（黒色の棒）又は同種（灰色の棒）ＰＨＡ−ａＰＢＭＣと培養した後のＭＳＣにおけるアポトーシス。Ｂ〜Ｉ：ＰＢＭＣ／ＭＳＣ比は、２０／１であった。結果は、３回又は６回（Ｈ）の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。統計：Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元ＡＮＯＶＡ。＊：ｐ＜０．５。＊＊：ｐ＜．０１。＊＊＊：ｐ＜．００１。ｎｓ：有意でない。
【図５】ＭＳＣアポトーシスが、同族の標的の抗原特異的細胞毒性細胞の認識に干渉しないことを示す図である。Ａ：２０／１の４Ｄ８：Ｔ２比の４Ｄ８細胞と培養した後のＴ２細胞におけるアポトーシス。示されているところで、漸増濃度の（コールド標的として使用した）ＭＳＣを添加した。アポトーシス性Ｔ２細胞は、アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋細胞として同定された。Ｂ：ＮＫ細胞と培養したＫ５６２におけるアポトーシス（２０／１のＮＫ：Ｋ５６２比）。示されているところで、漸増濃度の（コールド標的として使用した）ＭＳＣを添加した。Ｃ：４Ｄ８細胞と培養したＭＳＣにおけるアポトーシス（２０／１の４Ｄ８：ＭＳＣ比）。示されているところで、漸増濃度の（コールド標的として使用した）Ｔ２細胞を添加した。Ｄ：２０／１のＮＫ：ＭＳＣ比でＮＫ細胞と培養したＭＳＣにおけるアポトーシス。示されているところで、漸増濃度の（コールド標的として使用した）Ｋ５６２を添加した。すべての実験において、ＭＳＣ、Ｔ２又はＫ５６２細胞のアポトーシスのレベルは、フローサイトメトリーにより４時間の共培養後に評価した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの統計：独立ｔ検定。＊：ｐ＜．０５。ｎｓ：有意でない。
【図６】アポトーシス性ＭＳＣが、細胞毒性細胞の非存在下で、Ｔｈ２型の炎症モデルにおいてインビボで免疫抑制を機能させることを示す図である。Ａ：ｌｕｃ−ＭＳＣを、最後の感作の１時間後に、ナイーブ（Ｎ＝３）マウス及びＯＶＡ＋ＭＳＣ（Ｎ＝６）マウスに注射した。１時間後、マウスにＤＥＶＤ−アミノルシフェリンを投与し、３回の独立した実験で画像化した。白色の線は、最終画像で集められた複数の写真を分割している。Ｂ：ＴＬＳを、図６Ａから測定した（平均値±ＳＤ）。Ｃ：ＭＳＣ注入の１８時間後、好酸球浸潤を、ナイーブマウス（Ｎ＝３）、ＭＳＣを注入したナイーブマウス（Ｎ＝３）、ＯＶＡマウス（Ｎ＝６）及びＯＶＡ＋ＭＳＣマウス（Ｎ＝６）のＢＡＬで２回の独立した実験において評価し、平均値±ＳＤを示している。Ｄ：ＡｐｏＭＳＣで治療したＯＶＡ感作マウスのＢＡＬにおける好酸球浸潤（平均値±ＳＤ）。群は次の通りであった：ＡｐｏＭＳＣなしのＯＶＡ（Ｎ＝６）、１ｘ１０６個のＡｐｏＭＳＣで治療したＯＶＡ（Ｎ＝７）；及び１ｘ１０６個（Ｎ＝２）のＡｐｏＭＳＣを投与するナイーブマウス。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。Ｂの統計：独立ｔ検定。ｎｓ：有意でない。Ｃ及びＤの統計：一元ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定。＊：ｐ＜．０５。ｎｓ：有意でない。
【図７】ＡｐｏＭＳＣがＧｖＨＤで免疫抑制活性を発揮し、ＩＤＯ産生を誘導するレシピエント貪食細胞により貪食されることを示す図である。Ａ〜Ｄ：ＧｖＨＤエフェクター細胞の浸潤を、ＧｖＨＤマウス（黒色の丸）及びＡｐｏＭＳＣで治療したＧｖＨＤマウス（黒色の四角）の脾臓（Ａ、Ｃ）及び肺（Ｂ、Ｄ）で評価した。ＡｐｏＭＳＣに、ｉ．ｐ．注入（ＧｖＨＤマウス  Ｎ＝１０、ＧｖＨＤ＋ＡｐｏＭＳＣマウス  Ｎ＝８）（Ａ、Ｂ）、又はｉ．ｖ．注入（ＧｖＨＤマウス  Ｎ＝９、ＧｖＨＤ＋ＡｐｏＭＳＣマウス  Ｎ＝７）（Ｃ、Ｄ）した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。統計：独立ｔ検定。＊：ｐ＜．０５；＊＊：ｐ＜．０１。ｎｓ：有意でない。Ｅ〜Ｋ：ＭＳＣをCellTrace（商標）Violetを使用して標識し、ＧｒＢ／ＦＡＳ−Ｌ（それぞれ、５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）を使用してアポトーシス誘導に供した。ＡｐｏＭＳＣを、移植３日後のＧｖＨＤマウスにｉ．ｐ．注射（Ｅ、Ｆ及びＪ）又はｉ．ｖ．注射（Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＫ）した。２時間後、動物を安楽死させ、腸間膜リンパ節（Ｅ、Ｆ及びＪ）又は肺（Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＫ）を採取した。ＡｐｏＭＳＣを貪食する細胞は、ＣＤ１１ｂ＋（Ｅ）、ＣＤ１１ｃ＋（Ｆ）、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＣＤ１１ｃｉｎｔ（Ｇ）、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ−（Ｈ）及びＣＤ１１ｂｈｉｇｈＣＤ１１ｃ−（Ｉ）亜集団内のＶｉｏｌｅｔ＋細胞として同定された。対応する亜集団は、Ｖｉｏｌｅｔ標識したＡｐｏＭＳＣを投与されていないＧｖＨＤマウスにおいてゲートをかけた。Ｊ及びＫ：ＩＤＯ発現を、CellTrace（商標）Violetに対して陽性である（ａｐｏＭＳＣを貪食する）ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ１１ｂ＋（Ｊ）又はＣＤ１１ｂｈｉｇｈＣＤ１１ｃｉｎｔ、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ−及びＣＤ１１ｂｈｉｇｈＣＤ１１ｃ−（Ｋ）細胞で評価し、ＡｐｏＭＳＣを投与されていないＧｖＨＤマウスの対応する集団と比較した。データは、２回の独立した実験において３匹のマウスから得られた同様の結果を表している。
【図８】レシピエント食細胞及びＩＤＯ産生がＧｖＨＤにおけるＭＳＣ免疫抑制活性に必要であることを示す図である。Ａ、Ｂ：ＧｖＨＤマウスを、移植の１０分後、リポソームクロドロネートで治療した。示されているところで、ＭＳＣを３日後に注入した。脾臓（Ａ）又は肺（Ｂ）におけるＧｖＨＤエフェクター細胞（ＣＤ８＋Ｖβ８．３＋）の浸潤を、さらに４日後に脾臓及び肺で定量化した。平均値±ＳＤを、群当たりＮ：１２匹（ＧｖＨＤ）及び１０匹（ＧｖＨＤ＋ＭＳＣ）のマウスで、３回の独立した実験を群分けして得た。Ｃ、Ｄ：ＧｖＨＤエフェクター細胞浸潤を、ＩＤＯ阻害剤１−ＤＭＴで処理したＧｖＨＤマウスの脾臓（Ｃ）及び肺（Ｄ）で調べた。処理したマウスに、移植の３日後にＭＳＣを注入した（Ｎ＝１１）。対照は、ＭＳＣを投与しなかったＧｖＨＤマウスで構成した（Ｎ＝９）。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤで示している。統計：独立ｔ検定。＊：ｐ＜．０５；＊＊：ｐ＜．０１。ｎｓ：有意でない。
【図９】ＭＳＣが、注入後のマウスの肺で追跡することができることを示す図である。Ａ：致死量照射したＣ５７ＢＬ／６雄性マウスに、骨髄（ＢＭ，bone marrow）、及びＭｈマウス（ＣＤ８＋Ｖβ８．３＋）から精製したＣＤ８＋細胞を伴って又は伴わずに、雌性同系ドナーに由来するＣＤ４＋−精製細胞を移植した（それぞれ、ＧｖＨＤ群及びＢＭ群）。移植後＋３日目に、ｌｕｃ−ＭＳＣを注入し、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンのｉ．ｐ．注射後のカスパーゼ３活性化を分析するために、１時間後にマウスを画像化した。移植後＋７日目に、マウスを安楽死させ、肺及び脾臓におけるＧｖＨＤエフェクター細胞（ＣＤ８＋Ｖβ８．３＋）の浸潤をフローサイトメトリーにより分析した。Ｂ：ＭＳＣを注入したマウスのすべての群の肺におけるｌｕｃ−ＭＳＣの存在を確認するために、図１Ａで画像化した同じマウスにＤ−ルシフェリンを注射した。白色の線は、最終画像で集められた複数の写真を分割している。Ｃ：ＴＬＳを、図９Ｂのマウスの画像から測定し、平均値±ＳＤとして示した。統計：Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を使用する、一元ＡＮＯＶＡ。ｎｓ：有意でない。
【図１０】ヒトＭＳＣ免疫抑制は、マウスのサイトカインによって「ライセンス」されないことを示す図である。Ａ：示したように、ヒトＭＳＣを、系列希釈単独で一晩、又はｈＩＦＮ−γ／ｈＴＮＦ−α（各２０ｎｇ／ｍｌ）若しくはｍＩＦＮ−γ／ｍＴＮＦ−α（各２０ｎｇ／ｍｌ）若しくはＰＨＡ−ａＰＢＭＣから得られた上清の存在下で７２時間、又はＣｏｎＡで活性化したｍＳｐｌ（ＣｏｎＡ−ａＳｐｌ）の存在下で７２時間、播種した。次いで、ＭＳＣを、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル色素で標識したＣｏｎＡ−刺激ｍＳｐｌの増殖を阻害する能力について試験した。増殖は、７２時間後にフローサイトメトリーにより判定した。曲線は、対応するＭＳＣ／ｍＳｐｌ比に対する阻害パーセントをプロットすることにより得た。Ｂ、Ｃ：示したように、未処理の又はｈＩＦＮ−γ／ｈＴＮＦ−α（各２０ｎｇ／ｍｌ）に曝露したヒトＭＳＣを一晩播種し、次いでｍＳｐｌ増殖を１：１０のＭＳＣ／ｍＳｐｌ比で抑制する能力を試験した。ヒストグラムプロット（Ｂ）は３回の独立した実験を表しており、棒（Ｃ）は３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。統計：一元ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定。＊＊＊：ｐ＜．００１。ｎｓ：有意でない。Ｄ：ヒトＭＳＣを、単独で、又はｈＩＦＮ−γ／ｈＴＮＦ−α（各２０ｎｇ／ｍｌ）、ｍＩＦＮ−γ／ｍＴＮＦ−α（各２０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＨＡ−ａＰＢＭＣ若しくはＣｏｎＡ−ａＳｐｌから得た上清の存在下でインキュベートした。２４時間後、ＩＤＯ、ＴＳＧ６及びＰＴＳＧ２の発現をリアルタイムＰＣＲで評価し、未処理のＭＳＣと比較した相対発現として算出した。３回の独立した実験の代表的な結果を示している。
【図１１】ＭＳＣアポトーシスが、非抗原特異的方法で細胞毒性細胞によって活性化されることを示す図である。Ａ：ナイーブ雌性Ｍｈマウスから単離されたＣＤ８＋細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで３日間刺激し、２０／１のＭｈ  Ｔ細胞：ＭＳＣ比でＭＳＣと培養した。４時間後、アポトーシスのレベルをＭＳＣでアネキシンＶ／７ＡＡＤ染色により評価した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。統計：Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用した、一元ＡＮＯＶＡ。＊＊＊：ｐ＜．００１。Ｂ：ＭＳＣを注入したマウスのすべての群の肺におけるｌｕｃ−ＭＳＣの存在を確認するために、図２Ｃで画像化した同じマウスにＤ−ルシフェリンを注射した。白色の線は、最終画像で集められた複数の写真を分割している。Ｃ：ＴＬＳを、図１１Ｂのマウスの画像から測定し、平均値±ＳＤとして示した。統計：独立ｔ検定。ｎｓ：有意でない。
【図１２】ＭＳＣに対する細胞毒性はＰＢＭＣドナーの中で異なるが、ＧｖＨＤ患者におけるＣＤ８＋又はＣＤ５６＋のパーセンテージには依存しないことを示す図である。Ａ：２名の異なるＧｖＨＤ患者（患者１及び患者２）から得たＰＢＭＣを、２名の異なるドナー由来のＭＳＣ（ＭＳＣ１及びＭＳＣ２）に対する細胞障害活性について試験した。Ｂ：４つの異なるＭＬＲ応答者／刺激剤組合せ（ＭＬＲ１、ＭＬＲ２、ＭＬＲ３、ＭＬＲ４）由来のＰＢＭＣでインキュベーションした後に異なるドナーから得たＭＳＣ（ＭＳＣ１、ＭＳＣ２及びＭＳＣ３）におけるアポトーシス。Ａ及びＢにおいて、アポトーシスのレベルを、共培養の４時間後、フローサイトメトリーにより評価した。Ｃ、Ｄ：１１名のＧｖＨＤ患者（Ｒ：３、ＮＲ：８）から得たＰＢＭＣを、ＣＤ８＋（Ｃ）及びＣＤ５６＋（Ｄ）細胞のパーセンテージについて分析した。統計：独立ｔ検定。ｎｓ：有意でない。
【図１３】ＭＳＣの死滅はカスパーゼ３によって介在され、ＧｒＢ及びパーフォリンにより実施されることを示す図である。Ａ：ＰＨＡ−ａＰＢＭＣは、ＰＢＭＣ／ＭＳＣ比を漸増するＭＳＣとインキュベートした。ＭＳＣアポトーシスを、フローサイトメトリーにより異なる時点でのアネキシンＶ／７−ＡＡＤによって評価した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。Ｂ、Ｃ：ＭＳＣをｐＥＣＦＰ−ＤＥＶＤＲ−Ｖｅｎｕｓベクター（ＦＲＥＴ−ＭＳＣ）でトランスフェクトし、ｐＥＣＦＰとＶｅｎｕｓ−ＹＦＰ  ＦＲＥＴとの間のＦＲＥＴをフローサイトメトリーにより調べ、ＣＡｆを算出した。ＦＲＥＴ−ＭＳＣは、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（５０μＭ）（Ｂ）、ＧｒＢ阻害剤Ｚ−ＡＡＤ−ＣＭＫ（３００μＭ）又はパーフォリン阻害剤ＥＧＴＡ（４ｍＭ）（Ｃ）の存在下で、単独で、ＰＨＡ−ａＰＢＭＣ若しくはＰＨＡａＰＢＭＣと培養した。５回（Ｂ）又は３回（Ｃ）の独立した実験の結果を示している。ＰＢＭＣが存在する場合、ＰＢＭＣ：ＭＳＣの比は４０／１であった。統計：一元ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定。＊＊：ｐ＞．０１。＊＊＊：ｐ＞．００１。ｎｓ：有意でない。Ｄ：ＭＬＲ−ａＰＢＭＣをＭＳＣ（比率２０／１）と培養し、アポトーシスを４時間後にフローサイトメトリーにより評価した。示されているところで、ＴＮＦ−α阻害剤のエタネルセプト又はｍＡｂ抗ＴＲＡＩＬを１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌで使用した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。
【図１４】注入されたＭＳＣは、Ｔｈ２型肺炎のマウスの肺で画像化することができることを示す図である。Ａ：Ｂａｌｂ／Ｃマウスを０日目及び７日目にＯＶＡでｉ．ｐ．免疫化し、続いて１４日目、１５日目及び１６日目にエアロゾルによりＯＶＡで感作させた（ＯＶＡ群）。実験群は、最後の感作の１時間後に、ＭＳＣで治療した（ＯＶＡ＋ＭＳＣ）。ｌｕｃ−ＭＳＣを使用した場合、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンのｉ．ｐ．注射後のカスパーゼ３活性化を分析するために、マウスを注入後１時間で画像化した。治療から１８時間後、ＢＡＬにおける好酸球浸潤を評価した。Ｂ〜Ｅ：ナイーブ（棒付き）（Ｎ＝３）マウス及びＯＶＡ−感作（黒色の棒）（Ｎ＝３）マウスのＢＡＬ（Ｂ、Ｃ）及び肺（Ｄ、Ｅ）における異なる細胞型のパーセンテージ（Ｂ、Ｄ）及び絶対数（Ｃ、Ｅ）。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表している。ＯＶＡ感作マウスにおいて、分析を、最後のエアロゾル感作の１時間後に実施した。Ｆ：ＭＳＣを注入したマウスのすべての群の肺におけるｌｕｃ−ＭＳＣの存在を確認するために、図６Ａで画像化した同じマウスにＤ−ルシフェリンを注射した。白色の線は、最終画像で集められた複数の写真を分割している。Ｇ：ＴＬＳを、図１４Ｆのマウスの画像から測定し、平均値±ＳＤとして示した。統計：独立ｔ検定。ｎｓ：有意でない。
【図１５】（Ａ）様々な濃度のＦａｓＬ（抗Ｆａｓ抗体）を使用して得たＡｐｏＭＳＣのパーセンテージ、及び（Ｂ）様々な期間に対する様々な濃度のＦａｓＬ（抗Ｆａｓ抗体）を使用して得たＡｐｏＭＳＣのパーセンテージを示す一連のグラフである。
【図１６】炎症性腸疾患（ＩＢＤ，inflammatory bowel disease）に罹患している患者由来のＰＢＭＣがどのようにエクスビボでＭＳＣアポトーシスを誘導するかを示すグラフである。ＩＢＤ患者（ＩＢＤ、ｎ＝８２）又は健康な対照（ＨＣ、ｎ＝８）由来のＰＢＭＣは、２０：１のＰＢＭＣ：ＭＳＣ比でＭＳＣと４時間共培養し、アポトーシスをフローサイトメトリーによるアネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色によって評価した。統計：独立ｔ検定。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１７】ＩＢＤ患者がＭＳＣにおいてＰＧＥ２上方制御をどのように誘導し、アネキシンＶ＋  ＭＳＣの割合と相関するかについて示す一連のグラフである。（Ａ）ＭＳＣ（５ｘ１０４個）及び患者ＰＢＭＣ（１ｘ１０６個）を２４時間共培養し、次いで上清を回収し、ＰＧＥ２をＥＬＩＳＡにより測定した。細胞は未処理のままにするか、又は汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（５０μＭ）で前処理した。統計：対応のあるｔ検定。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）上清中のアネキシンＶ＋  ＭＳＣレベルとＰＧＥ２レベルの相関関係。
【図１８】患者のＰＢＭＣがＭＳＣを誘導してアポトーシスを起こす能力が、ＧｖＨＤにおけるＭＳＣ注入に対する臨床応答を予測することを示す一連のグラフである。ステロイド抵抗性ＧｖＨＤの影響を受けた３２名の患者を、静脈内ＭＳＣで治療した（１〜３ｘ１０６個の細胞／Ｋｇ）（Ａ）。治療前、それらの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ，peripheral blood mononuclear cell）をＭＳＣと４時間インキュベートし、ＭＳＣアポトーシスをアネキシンＶ染色により評価した。グラフは、応答者及び非応答者におけるアネキシンＶ＋  ＭＳＣの割合を報告している（Ｂ）。ＲＯＣは、患者ＰＢＭＣによる１１．５％ＭＳＣ死滅（アネキシンＶ＋  ＭＳＣ）に従って算出した（Ｃ）。応答者及び非応答者におけるＭＳＣ後の患者の全生存。調査した可能性のある因子の中で、細胞毒性（１１．５％の閾値）は、多変量解析において臨床応答に影響を及ぼす唯一の因子であった。
【図１９】アポトーシスを起こす様々な感度を示す異なる供給源由来のＭＳＣを示す図である。骨髄（ＢＭ）又は臍帯（ＵＣ，umbilical cord）から単離されたＭＳＣの異なるバッチを、健康な個人由来のＰＨＡ活性化ＰＢＭＣとインキュベートした。４時間後、ＭＳＣをアポトーシスについて評価した（アネキシンＶ＋７−ＡＡＤ−）。
【図２０】他の炎症状態の患者由来のＰＢＭＣが抗ＭＳＣ細胞毒性細胞を保有することを示す図である。ＰＢＭＣは、活性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者又は肝移植（Ｌｔｘ，liver transplantation）を受けた患者から新たに単離し、ＦＡＣＳ分析の４時間前に骨髄に由来するＭＳＣ（２０：１比）と共培養した。独立ｔ検定による統計の分析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２１】皮膚線維芽細胞もまた、細胞毒性細胞に曝露された場合、アポトーシスを起こしやすいことを示す図である。健康なドナーから単離したＰＢＭＣを３日間ＰＨＡで活性化し、次いで、異なる比で皮膚線維芽細胞と共培養した。アネキシンＶ＋７ＡＡＤ−細胞として同定されたアポトーシス細胞を、４時間後にＦＡＣＳ分析により定量化した。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
詳細な説明
項目
本発明をここで以下の項目を参照して説明する：
【００６９】
１．生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高い患者を同定する方法であって、前記患者由来の試料が、インビトロで生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスを起こすように誘導することができるかどうかを判定するステップを含み、試料が前記アポトーシスを誘導する能力が、前記免疫抑制治療に対する前記患者の応答性を表す、方法。
【００７０】
２．試料がＭＳＣにおいてアポトーシスを引き起こす能力が、前記試料を生存ＭＳＣとインキュベートし、その後、インキュベート物中のアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出することによって判定される、項目１に記載の方法。
【００７１】
３．試料に添加されたＭＳＣの少なくとも１１％がインキュベーション後にアポトーシス性であるという所見が、前記免疫抑制治療に対する前記患者の応答性を表す、項目１又は２に記載の方法。
【００７２】
４．試料がＭＳＣにおいてアポトーシスを引き起こす能力が、前記試料を生存ＭＳＣとインキュベートし、インキュベート物又はそこから得られた上清中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のレベルを検出し、レベルを前記免疫抑制治療に対する前記患者の応答性と関連付けることにより判定される、項目１に記載の方法。
【００７３】
５．４０００ｐｇ／ｍｌを超えるＰＧＥ２のレベルが、前記免疫抑制治療に対する前記患者の応答性を表す、項目５に記載の方法。
【００７４】
６．ＰＧＥ２のレベルが定量的ＥＬＩＳＡを使用して判定される、項目４又は項目５に記載の方法。
【００７５】
７．生存ＭＳＣを使用する免疫抑制治療に応答性であると判定された患者がＭＳＣによる治療を施され、前記免疫抑制治療に非応答性であると判定された患者がアポトーシス性ＭＳＣによる治療を施される、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
【００７６】
８．インビトロで生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する方法であって、インビトロで生存ＭＳＣを患者由来の生体試料と接触させるステップと、インビトロでの生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在、又は試料中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のレベルの上昇のいずれかを検出するステップとを含み、インビトロでの生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在又はＰＧＥ２のレベルの上昇が、生存ＭＳＣを使用する免疫抑制治療に対する患者の応答性を表す、方法。
【００７７】
９．インビトロでの生存ＭＳＣの複数の試料を複数の患者における異なる患者由来の生体試料と接触させるステップと、インビトロでの生存ＭＳＣの各試料におけるアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出するステップとをさらに含む、項目８に記載の方法。
【００７８】
１０．その又は各々の接触させるステップが、生体試料を生存ＭＳＣとインキュベートするステップを含み、その又は各々の検出するステップが、インキュベート物中のアポトーシス性ＭＳＣの存在を検出するステップ及び／又はその効力を判定するステップを含む、項目８又は９に記載の方法。
【００７９】
１１．試料との接触後にインビトロでの生存ＭＳＣの少なくとも１１％がアポトーシス性である、又は上清中のプロスタグランジンＥ２のレベルが４０００ｐｇ／ｍｌを超えるという所見が、免疫抑制治療に対する患者の応答性を表す、項目８〜１０のいずれかに記載の方法。
【００８０】
１２．インビトロでの生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在及び／又はＰＧＥ２のレベルの上昇が検出される場合、患者が生存ＭＳＣで治療され、インビトロでの生存ＭＳＣにおけるアポトーシス性ＭＳＣの存在が検出されない場合、患者がアポトーシス性ＭＳＣで治療される、項目８〜１１のいずれかに記載の方法。
【００８１】
１３．試料が血液又は血清試料である、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
【００８２】
１４．アポトーシス性ＭＳＣの存在が共焦点顕微鏡法又はフローサイトメトリーによって判定される、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
【００８３】
１５．ＭＳＣ免疫抑制治療による治療のために患者を層別化する方法であって、項目１〜１４のいずれかに記載の方法を実施するステップと、生存ＭＳＣによる治療のために生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高い患者を同定するステップと、アポトーシス性ＭＳＣによる治療のために前記免疫抑制治療に対して応答する可能性が低い患者を同定するステップとを含む、方法。
【００８４】
１６．組織損傷から回復する対象の適合性を同定する方法であって、前記対象由来の試料が、インビトロで生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスを起こすように誘導することができるかどうかを判定するステップ、及び／又はＰＧＥ２のレベルの上昇を検出するステップを含み、試料が前記アポトーシスを誘導する能力、又はＰＧＥ２のレベルの上昇の存在が前記患者の回復する能力を表す、方法。
【００８５】
１７．それを必要とする患者に免疫抑制効果を生じさせる方法であって、前記患者が生存間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を使用する免疫抑制治療に対して応答する可能性が高いかどうかを、患者由来の生体試料と接触させて、インビトロでの生存ＭＳＣにおいて少なくともいくらかのアポトーシスの存在を検出することにより判定するステップと、インビトロでの生存ＭＳＣにおいてアポトーシスの存在が検出される場合に、患者に有効量の生存ＭＳＣを投与するステップと、インビトロでの生存ＭＳＣにおいてアポトーシスの存在が検出されない場合に、患者に有効量のアポトーシス性ＭＳＣを投与するステップとを含む、方法。
【００８６】
１８．患者が免疫介在性疾患若しくは状態に罹患しているか、又は組織修復を刺激する再生医療を必要とする、項目１７に記載の方法。
【００８７】
１９．移植された臓器の拒絶反応の予防若しくは治療のためのものであるか、又は疾患又は状態が同種免疫疾患若しくは自己免疫疾患である、項目１７又は項目１８に記載の方法。
【００８８】
２０．疾患が移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、関節リウマチ、強直性脊椎炎又は乾癬性関節炎などの関節炎、及び急性呼吸窮迫症候群である、項目１９に記載の方法。
【００８９】
２１．患者における治療の有効性が、ＭＳＣを投与した後に患者から採取された試料中の食細胞又はＩＤＯの存在を検出することによってモニターされる、項目１５〜２０のいずれかに記載の方法。
【００９０】
２２．項目１〜１２のいずれかに記載の方法を実施するために必要とされる構成要素を含むキット。
【００９１】
２３．免疫介在性疾患若しくは状態の治療において、又は組織修復を刺激する再生医療において使用するためのアポトーシス性ＭＳＣ。
【００９２】
２４．項目７、１２、１５、１７〜２０のいずれかに記載の方法において使用するためのアポトーシス性ＭＳＣ。
【００９３】
２５．移植された臓器の拒絶反応の予防若しくは治療のためのものであるか、又は疾患又は状態が同種免疫疾患若しくは自己免疫疾患である、項目２３又は２４に記載のアポトーシス性ＭＳＣ。
【００９４】
２６．疾患が移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、関節リウマチ、強直性脊椎炎又は乾癬性関節炎などの関節炎、及び急性呼吸窮迫症候群である、項目２５に記載のアポトーシス性ＭＳＣ。
【００９５】
２７．免疫抑制治療において使用するためのアポトーシス性ＭＳＣを産生する方法であって、少なくとも３０％のＭＳＣがアポトーシス性である細胞培養物を形成するのに十分な２４時間未満の期間内、生存ＭＳＣを薬学的に許容されるアポトーシス誘導剤とインキュベートするステップを含む、方法。
【００９６】
２８．薬学的に許容されるアポトーシス誘導剤が生物学的薬剤である、項目２７に記載の方法。
【００９７】
２９．前記生物学的薬剤がセリンプロテアーゼ及び／又は抗ＦＡＳ抗体である、項目２８に記載の方法。
【００９８】
３０．前記セリンプロテアーゼがヒトグランザイムＢ（ＧｒＢ）である、項目２９に記載の方法。
【００９９】
３１．薬学的に許容されるアポトーシス誘導剤がＧｒＢと抗Ｆａｓ抗体の組合せを含む、項目２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【０１００】
３２．項目２７〜３１のいずれかに記載の方法を使用して得ることができるアポトーシス性ＭＳＣ。
【０１０１】
３３．免疫抑制治療において使用するための、項目３２に記載のアポトーシス性ＭＳＣ。
【０１０２】
３４．自殺遺伝子、特にカスパーゼ９又はカスパーゼ３などのカスパーゼ誘導遺伝子の形態であってもよい、自殺メカニズムを含む、項目３２又は３３に記載のアポトーシス性ＭＳＣ。
【０１０３】
３５．項目３１〜３３のいずれかに記載のアポトーシス性ＭＳＣを含む医薬組成物。
【０１０４】
３６．生存ＭＳＣをさらに含む、項目３５に記載の組成物。
【０１０５】
３７．それを必要とする患者に免疫抑制効果を生じさせる方法であって、前記患者に有効量のアポトーシス性ＭＳＣを投与する、方法。
【０１０６】
３８．患者が免疫介在性疾患若しくは状態に罹患しているか、又は組織修復を刺激する再生医療を必要とする、項目３７に記載の方法。
【０１０７】
３９．移植された臓器の拒絶反応の予防若しくは治療のためのものであるか、又は疾患又は状態が同種免疫疾患若しくは自己免疫疾患である、項目３７又は項目３８に記載の方法。
【０１０８】
４０．疾患が移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、関節リウマチ、強直性脊椎炎又は乾癬性関節炎などの関節炎、及び急性呼吸窮迫症候群である、項目３９に記載の方法。
【０１０９】
４１．患者における治療の有効性が、ＭＳＣを投与した後に患者から採取された試料中の食細胞又はＩＤＯの存在を検出することによってモニターされる、項目３７〜４０のいずれかに記載の方法。
【０１１０】
４２．患者における回復への適合性及び／又は免疫抑制治療に対する応答性を判定するためのバイオマーカーとしてのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の使用及び／又はアポトーシス性ＭＳＣの使用。
【０１１１】
４３．前記患者由来の試料中のアポトーシス性ＭＳＣの存在及び量の検出並びに／又はＰＧＥ２のレベルの上昇の検出を含む、項目４２に記載の使用。
［実施例］
【実施例１】
【０１１２】
ＭＳＣは、レシピエントＧｖＨＤ動物においてアポトーシスを起こす
ＭＳＣが注射後に速やかに排除される機序を説明するため、本出願人らは、ＭＳＣがＧｖＨＤのマウスモデルにおいてアポトーシスを起こすという仮説を検証した。
【０１１３】
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）マウスは、Harlan Laboratories社（Bicester、英国）から購入した。Ｍｈ（Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンド、ＣＤ８＋Ｔｇ、Ｈ−２ｂ、ＣＤ４５．２＋、Ｈ−２Ｄｂ−制限）マウスは、Ｈ−Ｄｂの文脈で提示される雄性抗原ＵＴＹに特異的なＴ細胞受容体のトランスジェニックであり、自家飼育した。すべてのマウスを６〜１２週齢で使用した。
【０１１４】
急性ＧｖＨＤは既に開示されているように誘導した（T. Toubai et al. Blood, 119, 3844-3853 (2012)）。簡潔に説明すると、致死線量照射（１１Ｇｙ）後に、レシピエントＣ５７ＢＬ／６雄性マウスに、ＧｖＨＤエフェクター（図９Ａ）としての雌性Ｍｈマウスから雄性ＨＹ抗原Ｕｔｙ（Ｍａｔａｈａｒｉ、Ｍｈ）に特異的なＴ細胞受容体のトランスジェニック１ｘ１０６個の精製ＣＤ８＋細胞、５ｘ１０６個の未分画骨髄（ＢＭ）及び雌性同系ドナー（Ｃ５７ＢＬ／６野生型ドナー）由来の２ｘ１０６個の精製ポリクローナルＣＤ４＋細胞を移植した。対照群はＢＭ及び精製されたＣＤ４＋細胞のみを受けた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、磁気ビーズ（Miltenyi Biotec Ltd社、Bisley、英国）を使用してポジティブ選択によって得た。
【０１１５】
生存ＭＳＣ（１ｘ１０６個）を移植から＋３日目にｉ．ｖ．注射し、一方、ａｐｏＭＳＣ（１ｘ１０６個）は移植から＋１日目、＋３日目及び＋６日目にｉ．ｖ．投与又はｉ．ｐ．投与した。別段の指定がない限り、動物は＋７日目に分析のため安楽死させた。ＧｖＨＤエフェクター細胞の浸潤はフローサイトメトリーにより評価し、パーセンテージは、細胞の物理的特性に基づき、リンパ球ゲート内の細胞の割合として表した。
【０１１６】
このモデルにおいて、ＧｖＨＤ（ＣＤ８＋Ｖβ８．３＋）を達成するＴ細胞の拡大を正確に数えることができる。
【０１１７】
インビボでのＭＳＣカスパーゼ活性化は、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ＋，luciferase）の発現用のｐＧＬ３−コントロールベクターでトランスフェクトされたＭＳＣ（ｌｕｃ−ＭＳＣ）を使用して評価した。カスパーゼ活性化は、ＤＥＶＤ−アミノルシフェリンを使用し、ルシフェラーゼ活性として測定した。このシステムでは、ＤＥＶＤがカスパーゼ３の活性化の際に切断され、アミノルシフェリンが放出され、次にこれがＭＳＣにおいて発現されるホタルルシフェラーゼによって代謝され得るので、放出された光に基づき、カスパーゼ３活性化を定量化することができる。Ｌｕｃ−ＭＳＣを、ＣＤ８＋  Ｍｈ  Ｔ細胞を有するＢＭ移植のレシピエント（ＧｖＨＤ群）に注入し、１時間後にカスパーゼ活性を総発光シグナル（ＴＬＳ，total luminescence signal）として測定した。対照マウスは、ナイーブの雄性（ナイーブ群）と、照射され、トランスジェニックＴ細胞なしでＣＤ４＋及びＢＭ細胞を受けたマウスの群（ＢＭ群）で構成して、活性化された細胞毒性Ｔ細胞の非存在下でのＭＳＣ注入の状態を再現した（図９Ａ）。高カスパーゼ活性は、ＧｖＨＤマウスに注入されたＭＳＣにおいてのみ観察された（図１、Ａ及びＢ）。対照Ｄ−ルシフェリン（ホタルルシフェラーゼ基質）を使用した場合、すべての動物の肺から高シグナルを検出することができ（図９、Ｂ及びＣ）、したがって、カスパーゼ活性が検出できなかった場合にもｌｕｃ−ＭＳＣが肺で追跡できることが確認される。
【０１１８】
ＭＳＣが注入後にアポトーシスを起こすという証拠は、ＭＳＣが依然として抗原駆動型Ｔ細胞の増殖を抑制できるかどうかという疑問を生じさせた。したがって、それらの免疫抑制効果を、ＭＳＣ治療又は未治療のＧｖＨＤマウスにおけるＣＤ８＋Ｖβ８．３＋  Ｍｈ  Ｔ細胞（ＧｖＨＤエフェクター細胞）を数えることにより分析した。ＭＳＣは、ＧｖＨＤエフェクター細胞浸潤を脾臓及び肺の両方で有意に低減させた（図１、Ｃ及びＤ）。これらの結果は、注入後のＭＳＣアポトーシスの存在にもかかわらず（図１、Ａ及びＢ）、ＭＳＣ免疫抑制が依然として生じていることを示している。
【０１１９】
観察された免疫抑制活性がレシピエントの炎症性サイトカインの結果であり得る可能性は、本発明者らの異種の組合せでは、マウスの炎症性サイトカインが対応するヒト受容体と交差反応せず、ヒトＭＳＣの免疫抑制分子を活性化しないが、ＧｖＨＤを介在するマウスエフェクター細胞を増殖する能力は保持することから除外することができる。したがって、ヒトＭＳＣは、ヒトサイトカインによって事前活性化されない限り、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ，concanavalin-A）誘導性のマウス脾細胞（ｍＳｐｌ，murine splenocytes）の増殖を阻害することはできなかった（図１０、Ａ、Ｂ及びＣ）。さらに、ヒトＭＳＣのマウス炎症性サイトカインへの曝露は、ＩＤＯ、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６，TNF-stimulated gene 6 protein）、又はプロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ−２（ＰＴＳＧ２，prostaglandin-endoperoxide synthase-2）を上方制御せず、ヒトＭＳＣの主要なエフェクターがインビトロでの免疫抑制を介在すると考えられた（図１０Ｄ）。
【実施例２】
【０１２０】
インビボでのＭＳＣアポトーシスは、活性化されたレシピエントＧｖＨＤエフェクター細胞に依存する
本発明者らの結果は、ＭＳＣが注入後に速やかにアポトーシスを起こし、レシピエントにおける移植されたＭＳＣの迅速なクリアランスについての長い間探求されてきた説明がもたらされたことを示している。ナイーブマウス及びＢＭマウスにおけるインビボでのＭＳＣアポトーシスが非存在であることは、ＭＳＣアポトーシスがＧｖＨＤマウスにおいてのみ検出されることから、ＭＳＣアポトーシスがヒトＭＳＣの異種認識の結果ではないことを明白に証明している。本発明者らが、ＭＳＣアポトーシスが発生するマウスの肺においてＧｖＨＤエフェクター細胞浸潤（ＣＤ８＋Ｖβ８．３＋）を数えた場合、本発明者らは、ナイーブではなくＢＭマウスのＧｖＨＤの肺のみが、多量のＣＤ８＋Ｖβ８．３＋細胞を含有しており（図２Ａ）、したがって、ＭＳＣにおけるカスパーゼ活性化とＧｖＨＤエフェクター細胞の存在との相関が確認されることを見出した。
【０１２１】
ＧｖＨＤエフェクター細胞がＭＳＣアポトーシスの原因であったという仮説を試験するため、ＭＳＣを、ＧｖＨＤ（インビボで活性化）マウス又はナイーブＭｈ（インビボ休止時）マウスの肺又は脾臓から精製したＣＤ８＋  Ｔ細胞と培養した。活性化されたが休止していないＭｈ  ＣＤ８＋細胞は、ＭＳＣアポトーシスを誘導した（図２Ｂ）。死滅活性の誘導における抗原特異性の欠如のさらなるサポートにおいて、高レベルの細胞毒性は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによってインビトロで刺激されたナイーブＭｈ  ＣＤ８＋細胞により誘導され得る（図１１Ａ）。
【０１２２】
ＭＳＣアポトーシスの誘導における細胞毒性細胞の要件とその結果としての免疫抑制を、欠損細胞毒性ＧｖＨＤエフェクター細胞（ＧｖＨＤＰｅｒｆ−／−群）のドナーとして、Ｍｈ／パーフォリンノックアウトマウス（Ｍｈ／Ｐｅｒｆ−／−）を使用して評価した。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｐｒｆ１ｔｍ１Ｓｄｚ／Ｊ（パーフォリン−／−）マウスは、J Jackson研究所から購入し、Ｍａｔａｈａｒｉ  Ｒａｇ２−／−マウスと交配させ、得られた子孫を２世代交雑させて、Ｍｈ  Ｒａｇ２−／−．Ｐｅｒｆ  ＫＯ  Ｆ３マウスを得た。
【０１２３】
Ｌｕｃ−ＭＳＣを、Ｍｈ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与したＧｖＨＤＰｅｒｆ−／−マウス又は対照ＧｖＨＤマウスに注入した。マウスを１時間後に画像化し、カスパーゼ活性化を前述のように測定した。本発明者らは、ＧｖＨＤ対照と比較して、ＧｖＨＤＰｅｒｆ−／−マウスにおいて顕著に低いカスパーゼ活性を観察した（図２、Ｃ及びＤ）。対照Ｄ−ルシフェリンを使用した場合、すべての動物の肺において高シグナルが検出され（図１１、Ｂ及びＣ）、したがって、カスパーゼ活性が検出できなかった場合であっても、ｌｕｃ−ＭＳＣが肺に存在することが確認された。重要なことには、ＭＳＣが投与されたマウスの脾臓及び肺におけるＧｖＨＤエフェクター細胞の浸潤は、ＭＳＣが投与されたＧｖＨＤＰｅｒｆ−／−では減少しなかった（図２、Ｅ及びＦ）。本発明者らは、ＭＳＣアポトーシスが免疫抑制にとっては不可欠であり、レシピエントにおいて機能的に活性化された細胞毒性細胞が必要であると結論付ける。
【実施例３】
【０１２４】
ＭＳＣに対する細胞毒性活性は、ＧｖＨＤ患者におけるＭＳＣに対する臨床応答を予測するバイオマーカーである
これらの所見に基づいて、本発明者らは、レシピエントにおける細胞毒性細胞の存在がＭＳＣ治療活性を予測することができると推論した。
【０１２５】
重度ステロイド抵抗性グレード３〜４のＧｖＨＤの患者１６名（平均年齢４０．５歳（範囲：１０〜６９歳））は、何年にもわたり様々な病院にてＭＳＣで治療を受けた。ＭＳＣは、（規則（ＥＣ）第１３９４／２００７に従い）人道的使用のために投与された。患者は、造血幹細胞移植の前に、骨髄破壊的移植前治療又は強度軽減移植前治療を受けていた。すべての患者は、シクロスポリンと組み合わせたメトトレキサートの３又は４用量によるＧｖＨＤ予防を受けた。アレムツズマブ又はＡＴＧによるＴ細胞の枯渇を、UK centerで移植されたすべての成人患者において実施した。研究に含まれた１６名の患者のうち、１３名は造血幹細胞移植後に、残りの３名はＤＬＩ後にＧｖＨＤを発症した。１２名の患者は、急性ＧｖＨＤにより、３名の患者は遅発性急性ＧｖＨＤにより、１名の患者は慢性ＧｖＨＤにより影響を受けた。ＧｖＨＤの診断は組織学的基準で行い、ＧｖＨＤは標準的な基準に従ってステージ分類した。患者は、次の場合、ステロイド抵抗性であると考えられた：（ａ）ａＧＶＨＤの患者が６日後に高用量のメチルプレドニゾロンに応答しなかった場合；（ｂ）ｃＧＶＨＤの患者が、ミコフェノールミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ，Mycophenol Mycophenolate Mofetil）及びシクロスポリンを１週間及び４週間加えた上で、２〜４週間後に高用量ステロイドに応答しなかった場合。ＭＳＣに対する臨床応答は、ＭＳＣ注入の１週間後に評価し、ＧｖＨＤによる影響を受けた少なくとも１つの臓器で少なくとも５０％の改善として定義した。患者の特徴を以下の表１に要約している。
【０１２６】
ＭＳＣに対する臨床応答は、前述のようにＧｖＨＤにより影響を受けた少なくとも１つの臓器で少なくとも５０％の改善によって定義した。５名の患者が臨床応答を得た。
【０１２７】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＭＳＣ注入の前の２４時間以内に新たに回収し、４時間細胞毒性アッセイにおいてエクスビボでＭＳＣアポトーシスを誘導するその能力について直接試験した（以下を参照）。１名の患者に２用量のＭＳＣを投与し、細胞毒性アッセイを各用量の前に独立し実施した。ＭＳＣは、注入に使用した同じドナー（Ｎ＝８）から、又は異なるドナー（Ｎ＝９）から供給された。アッセイ及び細胞蛍光測定分析を実施する時点で、オペレーターは患者の臨床の詳細については知らされなかった。健康なドナー（Ｎ＝５）由来のＰＢＭＣを対照として使用した。
【０１２８】
全体として、ＧｖＨＤ患者由来のＰＢＭＣは、対照ＰＢＭＣで検出されたものよりも高いＭＳＣに対する平均細胞毒性活性を示したが、有意差には達しなかった（平均値±ＳＤは、それぞれ、１０．６３±８．７６％及び３．８２±２．５０％；ｐ＝．１０）。しかし、ＭＳＣに対する臨床応答者と非応答者の間の細胞毒性のレベルは顕著に異なり、アポトーシス性ＭＳＣの割合（アネキシンＶ＋／７ＡＡＤ−）は４倍の差異を示した（図３、Ａ及びＢ）。受信者動作特性曲線を使用して算出した応答者と非応答者の間のアポトーシス性ＭＳＣの弁別閾値は、１４．８５％のカットオフが最も高い感度及び特異度のある臨床応答を予測できることを明らかにした。細胞毒性のレベルは、ＭＳＣ調製物中で変わらなかったが、その理由は、本発明者らが無関係なドナーから得られた別の調製物と比較して、注入に使用したＭＳＣに対して患者のＰＢＭＣを試験した場合、アポトーシス誘導における差は検出されなかったからである（図１２Ａ）。さらに特定のＭＳＣ調製物と関連性のないことをさらに確認するために、本発明者らは、４つの異なる混合リンパ球反応（ＭＬＲ，mixed lymphocyte reaction）の組合せによって死滅される異なる無関係なドナーから供給されたＭＳＣの感受性を評価した。アポトーシス性ＭＳＣの割合は、同じＭＬＲが試験された場合、異なるＭＳＣ調製物の間で類似していた。反対に、同じＭＳＣに対する細胞毒性活性は、異なるＭＬＲの間で異なっていた（図１２、Ｂ）。
【０１２９】
最後に、本発明者らは、応答者と非応答者のＰＢＭＣの平均頻度が類似していたことから、異なる割合のＣＤ８＋とＣＤ５６＋細胞が異なる細胞毒性活性を説明することができる可能性を除外した（図１２、Ｃ及びＤ）。したがって、本発明者らは、レシピエントにおける活性化細胞毒性細胞の存在によりＭＳＣ治療活性が予測されると結論付ける。
【実施例４】
【０１３０】
細胞毒性細胞によって誘導されるＭＳＣアポプトーシスはバイスタンダー効果の結果である
ＭＳＣにおけるアポトーシスを駆動する機序を定義するため、本発明者らはエフェクター細胞としてインビトロ活性化ＰＢＭＣを使用した。本発明者らは、休止ではなく活性化されたＰＢＭＣがＭＳＣにおいて広範囲な初期アポトーシス（アネキシンＶ＋／７ＡＡＤ−）を誘導し（図４Ａ）、これは４時間でピークに達し、２４時間までに後期アポトーシス（アネキシンＶ＋／７ＡＡＤ＋）に向けてシフトした（図１３、Ａ）ことを見出した。本発明者らのインビボ観察と一致して（図１、Ａ及びＢ）、活性化されたＰＢＭＣのみが９０分にピークを有するＭＳＣにおけるカスパーゼ活性化を誘導し、これは汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫにより完全に抑止された（図４Ｂ及び図１３Ｂ）。
【０１３１】
ＭＳＣにおけるアポトーシスを誘導する細胞を同定するため、本発明者らは、活性化ＰＢＭＣの中で選択的濃縮及び枯渇実験を実施した。本発明者らは、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ，natural killer）集団及びＣＤ８＋集団が、ＭＳＣアポトーシスの開始に関与する唯一の細胞であることを見出した（図４、Ｃ及びＤ）。活性化細胞毒性細胞により誘導されるＭＳＣアポトーシスを介在する機序を特徴付けるため、本発明者らは、カスパーゼ３活性化に関与する潜在的因子を検討した。グランザイムＢ（ＧｒＢ）又はパーフォリンのいずれかの阻害は、ＭＳＣを死滅させ（図４Ｅ）、カスパーゼ３を活性化する（図１３Ｃ）活性化ＰＢＭＣの能力を完全に消失させた。また本発明者らは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α，Tumor Necrosis Factor-α）又はＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ，TNF-related apoptosis-inducing ligand）が、非常に高濃度のそれぞれの阻害剤の存在下でさえ阻害されなかった場合（図１３Ｄ）ではなく、ＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ、ＦａｓＬ又はＡＰＯ−１Ｌとしても公知である）が中和された場合に（図４Ｆ）、ＰＢＭＣ介在性の細胞毒性の低下を観察した。
【０１３２】
次いで、本発明者らは、ＭＳＣ細胞毒性細胞相互作用の性質を調べた。本発明者らは、アポプトーシスが抗ＨＬＡクラスＩ又は抗ＨＬＡクラスIIの中和抗体の存在によって影響を受けなかったことを観察した。一貫して、自己由来ＭＳＣ又は同種ＭＳＣに対する活性化ＰＢＭＣの細胞毒性活性に差異はなかった（図４Ｇ）。しかし、ＰＢＭＣはアポトーシスの誘導にＭＳＣとの物理的接触を必要としたが（図４Ｈ）、微小管形成中心の分極化を阻害することによる免疫シナプス形成の遮断（図４Ｉ）は効果がなかった。これらの結果は、活性化細胞毒性細胞によるＭＳＣ死滅が、免疫シナプスに関与していないバイスタンダー効果であることを証明している。
【実施例５】
【０１３３】
ＭＳＣアポトーシスは細胞毒性細胞の特定の標的の認識の妨げにならない。
細胞毒性細胞によって誘導されるＭＳＣアポトーシスはＭＨＣに依存せず、抗原特異的ではないと判定されたので、本発明者らは、ＭＳＣが抗原特異的認識と競合し、アンタゴナイズすることによりその免疫抑制効果を発揮し得るかどうかを探求した。ＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローン（４Ｄ８）又はＩＬ２活性化ポリクローナルＣＤ５６＋精製ＮＫ細胞を、それぞれ、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドパルスＴ２又はＫ５６２細胞に対するエフェクター細胞として使用した。実験の２つの異なるセットを実施した。第１のセットにおいて、４Ｄ８細胞又はＮＫ細胞を、コールド標的として使用される数が漸増するＭＳＣの存在下で、推定上の（感受性）標的細胞の定数に対して試験した。代替条件は、感受性標的と見なされる定数のＭＳＣの存在下で、現在コールド標的として使用されている、数が漸増する推定上の標的細胞で構成した。ペプチドパルスＴ２細胞の死滅はＭＳＣの存在によって影響を受けなかったので、ＭＳＣは抗原特異的Ｔ細胞細胞毒性と競合しなかった（図５Ａ）。同じ結果がＮＫ細胞を使用して得られた（図５Ｂ）。反対に、推定上の標的細胞の存在は、両システムで用量依存的にＭＳＣ死滅を著しく低減した（図５、Ｃ及びＤ）。本発明者らのデータは、ＭＳＣ死滅が同種抗原の主要な認識を妨げないことを示している。
【実施例６】
【０１３４】
アポトーシス性ＭＳＣはＴｈ２型炎症モデルで免疫抑制的である
本発明者らのデータは、ＭＳＣ死滅が同種抗原の主要認識を妨げないので、アポトーシスの誘導が免疫抑制活性に顕著に関与しているに違いないことを示唆している。
【０１３５】
したがって、記載されているＧｖＨＤモデルにおいては、レシピエント細胞毒性細胞によって生じるＭＳＣアポトーシスが免疫抑制に必要である。したがって、本発明者らは、この原因となる関係が非細胞毒性Ｔｈ２型炎症に関連する別の疾患モデルで有効であるかどうかを探求した。本発明者らは、図１４Ａにまとめたオボアルブミン（ＯＶＡ，ovalbumin）誘導性アレルギー性気道炎症のモデルを選択した。
【０１３６】
ＯＶＡ誘導性気道炎症は、既に記載されているように誘導した（Y. Riffo-Vasquez et al., 2012, Am J. Respir. Cell Mol Biol 47, 245-252）。簡単に説明すると、雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Harlan Laboratories社、Bicester、英国）に、３０μｇの鶏卵アルブミン（ＯＶＡタイプＶ）（Sigma-Aldrich Company Ltd社、Dorset、英国）を０日目及び７日目に腹腔内注射した。対照には、媒体（水酸化アルミニウム）のみを投与した。１４日目、１５日目、及び１６日目に、動物にＯＶＡ（３％）のエアロゾル溶液で２５分間感作させた。ＭＳＣ又はＡｐｏＭＳＣを、最後の感作の１時間後に注射した。さらに１８時間後、マウスを最終的に麻酔し、露出させた気管にカニューレ挿入し、滅菌生理食塩水の３つのアリコートを肺に注入した。洗浄液中の細胞の総数を数えた。鑑別細胞数については、サイトスピン調製物をＤｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ（DADE Behring社、ドイツ）で染色し、標準の形態学的基準を使用して細胞を数えた。
【０１３７】
細胞毒性免疫細胞がこの条件の誘導に関連付けられたが、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ，bronchoalveolar lavage）及び肺組織に浸潤しているＣＤ８＋及びＮＫ１．１＋細胞は、ＭＳＣが注入された場合、最後の感作の１時間後に２％未満であった（図１４、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）。ＭＳＣ死滅の非存在を確認するため、マウスにｌｕｃ−ＭＳＣを投与して、注入後のカスパーゼの活性化を評価し、１時間後に画像化した。カスパーゼ活性化は、いずれのマウスにおいても検出されなかった（図６、Ａ及びＢ）。
【０１３８】
高シグナルを、対照Ｄ−ルシフェリンを投与したすべての動物において検出することができた（図１４、Ｆ及びＧ）。ＢＡＬにおける好酸球浸潤を定量化することにより評価した治療活性は、ＭＳＣ治療マウスと未治療マウスとの間に差異を示さなかった（図６Ｃ）。まとめると、これらの結果は、このモデルにおいても、ＭＳＣ免疫抑制がＭＳＣアポトーシスを介在するレシピエント細胞毒性細胞の存在に依存していることを示している。
【０１３９】
したがって、本発明者らは、インビトロで産生されたアポトーシス性ＭＳＣ（ａｐｏＭＳＣ，apoptotic MSC）が細胞毒性細胞の必要性を回避し、好酸球浸潤を改善することができるかどうかを試験することに決めた。
【０１４０】
有意な（３０％を超える）数のアポトーシス細胞を含有する細胞培養物下の条件を調べた。ＭＳＣを、１５分〜２４時間の様々な時間、９６ウェル丸底プレートに１ウェル当たり５ｘ１０５個の細胞の濃度で、合成ヒトＧｒＢ（５μｇ／ｍｌ）（Enzo Life Sciences社、Exeter、英国）の存在下において、様々な濃度の抗ＦＡＳヒト（活性化、クローンＣＨ１１）と播種した。その後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、アネキシンＶ染色を使用してフローサイトメトリーにより判定した。結果を図９にまとめている。
【０１４１】
これに続き、ＡｐｏＭＳＣを試験用に、合成ヒトＧｒＢ（５μｇ／ｍｌ）（Enzo Life Sciences社、Exeter、英国）及び抗−ＦＡＳヒト（活性化、クローンＣＨ１１）（１０μｇ／ｍｌ）（Merk Millipore社、Watford、英国）の存在下において、２４時間完全なＲＰＭＩで、９６ウェル丸底プレートに１ウェル当たり５ｘ１０５個の細胞を播種することにより得た。ＧｒＢ及びＦａｓＬの濃度は、少なくとも８０％のＭＳＣアポトーシスを生じるように選択した。
【０１４２】
ａｐｏＭＳＣがレシピエントマウスに投与された場合に、ＢＡＬにおける好酸球浸潤の有意な減少が観察された（図６Ｄ）。
【実施例７】
【０１４３】
ＧｖＨＤに注入されたアポトーシス性ＭＳＣは免疫抑制性であり、レシピエント食細胞においてＩＤＯ産生を誘導する
本発明者らは、引き続き、ａｐｏＭＳＣがＧｖＨＤモデルにおいても免疫抑制性であり得るかどうかを調べた。ＡｐｏＭＳＣを静脈内（ｉ．ｖ．）投与又は腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、ＣＤ８＋Ｖβ８．３＋  Ｍｈ  Ｔ細胞の浸潤を評価し、未治療のＧｖＨＤマウスと比較した。ＡｐｏＭＳＣは、脾臓及び肺の両方でＧｖＨＤエフェクター細胞浸潤を有意に減少させたが、これはｉ．ｐ．注入されたＡｐｏＭＳＣで治療したマウスにおいてのみ観察することができた（図７、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。動物への照射された胸腺細胞の注射がレシピエントのマクロファージによる食作用及びＩＤＯの誘導をもたらすことが報告されている。
【０１４４】
したがって、本発明者らは、ａｐｏＭＳＣがレシピエント食細胞によるインビボでのエフェロサイトーシスを誘導し、ＩＤＯ産生を誘導することによって同じ運命をたどるかどうかを試験した。この目的のため、標識したａｐｏＭＳＣを注射後のレシピエント食細胞において追跡した。
【０１４５】
詳細には、最初にＭＳＣを、CellTrace（商標）Violet標識化（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）を使用して５μＭの終末濃度で標識し、次いで上記のように、２４時間、合成ヒトＧｒＢ（５μｇ／ｍｌ）及び抗ＦＡＳヒト（１０μｇ／ｍｌ）を使用してアポトーシス性にした（ＡｐｏＭＳＣ）。次いで、１０ｘ１０６個の標識化ａｐｏＭＳＣをｉ．ｐ．注射又はｉ．ｖ．注射し、注射後２時間でマウスを安楽死させた。脾臓、肺、気管周囲、傍気管、心膜、腸間膜、門脈周囲及び腹腔リンパ節を回収し、フローサイトメトリーにより分析した。CellTrace（商標）Violetの陽性率は、食細胞のＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｃ＋にゲートをかけた亜集団におけるＡｐｏＭＳＣ貪食の測定値として評価した。次いで、CellTrace（商標）Violetに対して陽性の細胞をＩＤＯのそれらの発現について評価した。
【０１４６】
ｉ．ｐ．投与の後、ａｐｏＭＳＣは、大部分が腹膜流入領域リンパ節（図７、Ｅ）においてＣＤ１１ｂ＋（図７、Ｅ）及びＣＤ１１ｃ＋（図７、Ｆ）食細胞内で同定されたが、肺及び脾臓において探索した場合には存在しなかった。ｉ．ｖ．経路を使用した場合、調べた複数の食細胞集団の中で、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＣＤ１１ｃｉｎｔ、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＣＤ１１ｃ−、及びＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋が肺におけるａｐｏＭＳＣ貪食として検出された（それぞれ、図７、Ｇ、Ｈ及びＩ）。ｉ．ｖ．群及びｉ．ｐ．群の両方でのＡｐｏＭＳＣを貪食する食細胞におけるＩＤＯ発現の分析からは、ｉ．ｐ．群の食細胞だけがＩＤＯ発現を未治療のＧｖＨＤマウスにおけるそれらの発現と比較して有意に高いレベルで増加させることができることが明らかにされた（図７、Ｊ及びＫ）。これらの所見は、ａｐｏＭＳＣの免疫抑制効果が重要なエフェクター機序としてレシピエント食細胞及びＩＤＯに関与していることを強く示唆している。
【実施例８】
【０１４７】
レシピエントに由来するＩＤＯ産生食細胞はＧｖＨＤにおけるＭＳＣ免疫抑制に不可欠である
ＭＳＣ免疫抑制活性におけるレシピエントに由来する食細胞及びレシピエント産生のＩＤＯの重要性を直接試験するため、本発明者らは、ＭＳＣ治療前にＧｖＨＤマウスにおいて食細胞を枯渇させ、ＩＤＯ活性を阻害し、ＧｖＨＤエフェクターの増殖に対する生存ＭＳＣの影響を評価した。食細胞を枯渇させるために、リポソームクロドロネート（１ｍｇ）をＭＳＣ注射の７２時間前にマウスに投与した。この処理により、ＭＳＣがＭｈ  Ｔ細胞浸潤を抑制する能力が劇的に損なわれた（図８、Ａ及びＢ）。
【０１４８】
最後に、動物を安楽死させるまで、ＭＳＣ注射の６日前に開始して飲料水中のＩＤＯ阻害剤１−メチル−Ｄ−トリプトファン（１−ＤＭＴ，1-methyl-D-tryptophan）（２ｍｇ／ｍｌ）を投与した。この場合においてもまた、Ｍｈ  Ｔ細胞浸潤に対するＭＳＣの有益な効果は、対照と比較して、１−ＤＭＴを投与したマウスにおいて大幅に低下した（図８、Ｃ及びＤ）。したがって、本発明者らは、ＭＳＣの免疫抑制効果にレシピエントの食細胞又はＩＤＯ産生の存在が必要であると結論付ける。
【実施例９】
【０１４９】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者（ＩＢＤ、ｎ＝８２）又は健康な対照（ＨＣ、ｎ＝８）由来のＰＢＭＣを、ＭＳＣと４時間、２０：１のＰＢＭＣ：ＭＳＣ比で共培養し、アポトーシスをフローサイトメトリーによるアネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色により評価した。結果を図１６に示す。
【０１５０】
ＩＢＤに罹患している患者に高キラー及び低キラーのコホートがあることは明らかである。ＧｖＨＤ患者において観察されたものと同様に、１３％のカットオフは、患者の２つのコホートを識別するようである。
【０１５１】
差異の分子学的基礎のさらなる調査を実施した。
【０１５２】
特に、ＭＳＣ（５ｘ１０４）及び患者ＰＢＭＣ（１ｘ１０６）は、汎カスパーゼ阻害剤、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（５０μΜ）を添加して又は添加せずに、２４時間共培養した。上清を回収し、ＰＧＥ２レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１７に示す。
【０１５３】
これらの結果は、患者のＰＢＭＣとの物理的接触の後、ＭＳＣが高レベルのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を分泌するように誘導されることを示している。培養物へのカスパーゼ阻害剤の添加がＰＧＥ２レベルを大幅に低下させるので、ＰＧＥ２の誘導はカスパーゼに完全に依存する（図１７Ａ）。したがって、これは、活性が、ＰＢＭＣがＭＳＣアポトーシスを誘導する能力と相関していることを示している。レベルは、それらの試料におけるアネキシンＶ＋細胞の誘導と良好な相関を示した（図１７Ｂを参照）。
【０１５４】
したがって、ＰＧＥ２は、アネキシンＶ＋細胞検出の代わりとして使用することができるＭＳＣに対するＰＢＭＣのアポトーシス誘導活性の良好なマーカーを提供する。このマーカーは、例えば簡単なＥＬＩＳＡ法を使用して、独立したオペレーターによって、より簡単及び客観的に測定することができるという利点を有する。
【０１５５】
材料及び方法
この研究の目的は、ＭＳＣが注入後にアポトーシスを起こすかどうかを実証し、レシピエントに由来する免疫寛容原性の免疫応答の開始でＭＳＣアポトーシスが果たす役割を試験することであった。
【０１５６】
レシピエントにおけるＭｈ  ＣＤ８＋細胞の増殖及び活性化によって介在される疾患であるＧｖＨＤのマウスモデルを、次の３つの重要な理由で選択した：ドナーとレシピエントの間のわずかなミスマッチを反復する；ＧｖＨＤに影響を及ぼすＴ細胞を正確に数えることができる；ＭＳＣがＧｖＨＤの治療に有効であるという原理の証明がある。さらに、ヒトＭＳＣを、ＭＳＣ免疫調節機能に対するレシピエントサイトカインの交絡影響を回避するために使用した。このシステムにおいては、マウスの炎症性サイトカインは対応するヒト受容体と交差反応せず、ヒトＭＳＣにおける免疫抑制分子を活性化しないが、ＧｖＨＤを介在するマウスエフェクター細胞を増殖させる能力は保持している。食細胞の枯渇及びＩＤＯ産生の阻害は、ＭＳＣアポトーシス依存性免疫抑制の送達におけるこれらの因子の要件を評価する機能喪失の実験と理解された。
【０１５７】
オボアルブミン（ＯＶＡ）誘導性アレルギー性気道炎症のマウスモデルを使用して、ＭＳＣ免疫抑制の送達における細胞毒性細胞とＭＳＣアポトーシスの間の因果関係がＴｈ２型炎症に関連する疾患において有効であるかどうかを評価した。
【０１５８】
無作為化方法は使用しなかった。すべての実験において、動物を対照群又は実験群に無作為に割り当てた。盲検化手法は採用しなかった。試料のサイズを事前判定するために統計的手法は使用せず、それはアッセイ感度及び異なる動物モデルによるこれまでの経験においてのみ推定した。別段の定めがない限り、３回の独立した実験の反復を実施した。
【０１５９】
ＧｖＨＤ患者におけるＭＳＣに対する細胞毒性細胞の存在がＭＳＣ治療活性を予測することができることを実証するため、ＧｖＨＤ患者から試料を回収し、ＭＳＣ注入前の２４時間以内に細胞毒性アッセイでＭＳＣアポトーシスを誘導するそれらの能力を試験した。アッセイ及び細胞蛍光分析の実施時点で、オペレーターは患者の臨床の詳細の詳細については知らされなかった。すべての患者はステロイド抵抗性ＧｖＨＤの影響を受けており、人道的使用のためにＭＳＣが投与された。健康なドナー由来のＰＢＭＣを対照として使用した。すべての試料は、地域倫理委員会の要件に従ってインフォームドコンセントを得た後に回収した。
【０１６０】
ＭＳＣ調製物
臨床グレードのＢＭに由来するヒトＭＳＣを、健康なドナーの腸骨稜から回収されたＢＭ吸引液から産生した。簡単に説明すると、２ｍｌのＢＭ吸引液を、１００μｌの防腐剤なしのヘパリンを入れたチューブに回収した。細胞を、アルファ改変イーグル培地（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）、保存料なしのヘパリン（１ＵＩ／ｍｌ）（Wockhardt UK Limited社、Wrexham、英国）及び５％の血小板可溶化物を使用することにより１０〜２５００万／６３６ｃｍ２の密度で２４時間以内に播種し、次いで、３７℃及び５％ＣＯ２雰囲気で３日間インキュベートした。非接着性細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）を使用して廃棄した。細胞コンフルエンスが９０〜１００％に達したら、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン、０．５γｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ）（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）で分離させ、５０００個の細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。ＭＳＣを継代２回ですべてのインビボ実験に使用したが、インビトロの実験にはそれらは継代８回で使用した。後者の場合、本発明者らは、異なる継代間でのアポトーシス感受性の点でいかなる相違も観察しなかった。放出基準は、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３については陽性（８０％を超える）に基づき、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ４５については陰性（２％未満）に基づいた。
【０１６１】
マウス及び疾患モデル
無作為化方法は使用しなかった。すべての実験において、動物を対照群又は実験群に無作為に割り当てた。盲検化手法は採用しなかった。
【０１６２】
細胞調製物及び培地
培養は、GlutaMAX（商標）、HEPES（２５ｍＭ）、ペニシリン５０００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０００μｇ／ｍｌ（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）、ウシ胎児血清１０％（Labtech.com社、Uckfield、英国）を含有する完全ＲＰＭＩ  １６４０培地で実施した。
【０１６３】
健康なドナー由来のヒト末梢血試料は、白血球コーン（leukocyte cones）としてNational Blood Service（Colindale、英国）から調達した。ＧｖＨＤ患者由来の試料は、ＭＳＣ注射前の２４時間以内に回収した。ＰＢＭＣは、Histopaque-1077（Sigma-Aldrich Company Ltd社、Dorset、英国）で密度勾配分離によって単離した。ｍＳｐｌはセルストレーナー（BD Falcon社、Oxford、英国）によって単離し、一方、肺は小片へ切断し、コラゲナーゼタイプIV（２５０Ｕ／ｍｌ）（Lorne Laboratories社、Reading、英国）、ウシ膵臓由来のDNAse I（２５０Ｕ／ｍｌ）（Merk Millipor社、Watford、英国）、及びウシ胎児血清６．２５％と３７℃で１時間インキュベートした。
【０１６４】
ＭＳＣの画像診断
Ｌｕｃ−ＭＳＣに、エレクトロポレーション（Gene Pulser Xcell，BioRad社、Kidlington、英国）を使用して、Ｌｕｃ＋の発現用のＳＶ４０プロモーターを含有するｐＧＬ３コントロールベクター（Promega社、Southampton、英国）を、又はpECFPDEVDR-Venus（Addgene社、Teddington、英国）をトランスフェクトした。細胞を全容量２５０μｌの緩衝液に懸濁し、１０μｇのＤＮＡを使用して２５０ボルト及び９５０Ｆで０．４ｃｍのギャップキュベットにエレクトロポレーションした。pECFP-DEVDR-Venusを使用した場合、ドナーフルオロフォアｐＥＣＦＰ及び受容体Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰは、カスパーゼ３の活性型によって認識され切断されるフレキシブルリンカーＤＥＶＤＲを介して結合された。このシステムにおいて、カスパーゼ３の活性は、ｐＥＣＦＰとＶｅｎｕｓ−ＹＦＰ間のフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ，Forster Resonance Energy Transfer）の分析によってモニターすることができる。カスパーゼ３が活性でない場合、フレキシブルリンカーＤＥＶＤＲはインタクトなままであり、ｐＥＣＦＰからのエネルギー移動はＹＦＰシグナルを放出させる。逆に、カスパーゼ３の活性化が存在下では、ＤＥＶＤＲは切断され、したがって、エネルギー移動は失われ、ｐＥＣＦＰシグナルは増加する。
【０１６５】
共焦点画像診断については、pECFP-DEVDR-VenusトランスフェクトＭＳＣを、３０ｍｍｘ１０ｍｍの皿（Corning社、Flintshire、英国）に１ｘ１０５個の細胞の濃度で完全ＲＰＭＩに播種し、一晩接着させた。翌日、ＰＨＡ−ａＰＢＭＣを４０／１のＰＢＭＣ：ＭＳＣ比で添加した。示されているところで、汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（５０μＭ）、パーフォリン阻害剤ＥＧＴＡ（４ｍＭ）、ＧｒＢ阻害剤Ｚ−ＡＡＤ−ＣＭＫ（３００μＭ）を使用した。
【０１６６】
生細胞の画像化は、Leica TCS SP5 II共焦点顕微鏡を使用して、４８８ｎｍ及び４０７ｎｍのレーザーにより、１８０分間３分毎に得た。画像を、ソフトウェア「Ｒ」及びEBImageパッケージを使用して処理し分析した。インビボでの画像化は、ＧｖＨＤモデルでの移植の３日後、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス、ＢＭマウス又はＧｖＨＤマウスに１ｘ１０６個のｌｕｃ−ＭＳＣをｉ．ｖ．注射して実施した。気道炎症モデルにおいては、ｌｕｃ−ＭＳＣを、最後のＯＶＡ感作の１時間後、ナイーブＢａｌｂ／Ｃ又はＯＶＡ処理マウスにｉ．ｖ．注射した。さらに１時間後、マウスをイソフルラン（１．５％イソフルオラン、９８．５％Ｏｘｉｙｇｅｎ）で麻酔をかけ、３ｍｇのVivoGlo（商標）Casp 3/7基質Z-DEVDアミノルシフェリン（Promega社、Southampton、英国）をｉ．ｐ．注射し、IVIS（登録商標）Lumina III（PerkinElmer社、Waltham、米国）システムを合計５分間に使用して画像化した。画像をソフトウェア「Ｒ」及びEBImageパッケージを使用して分析し、平均ＴＬＳを得た。トランスフェクトされたＭＳＣの存在の確認は、マウスにVivoGlo（商標）ルシフェリン（Promega社、Southampton、英国）を注射して得た。
【０１６７】
ヒトＰＢＭＣ及びマウスＣＤ８＋細胞の事前活性化
ＰＨＡ−ａＰＢＭＣを、７２時間、最終容量２ｍｌの完全ＲＰＭＩ中のＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）（Sigma-Aldrich Company Ltd社、Dorset、英国）の存在下で、２４ウェルプレートに５ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣを播種することにより得た。ＭＬＲ−ａＰＢＭＣを、一方向ＭＬＲを使用して得、１名のドナー由来のＰＢＭＣ（刺激剤）を照射し（３０Ｇｙ）、無関係なドナーのＰＢＭＣ（応答剤）と１／１の刺激剤：応答剤比で完全培地において０．７５ｘ１０６個の細胞／ｃｍ２の密度で共培養した。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。ＮＫ細胞を、健康なドナーＰＢＭＣ由来のＣＤ５６＋細胞（Miltenyi Biotec Ltd社、Bisley、英国）をポジティブ選択することにより精製し、組換えヒトＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で活性化した。ＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローン（クローン４Ｄ８）は、Vincenzo Cerundolo教授（Institute of Molecular Medicine、Oxford university、英国）の厚意により供給された。クローンを、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（０．０５ｍＭ）（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）、組換えヒトＩＬ−２（４００Ｕ／ｍｌ）（Peprotec EC Ltd社、London、英国）及びＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）（Sigma-Aldrich Company Ltd社、Dorset、英国）を含む完全ＲＰＭＩ  １６４０で増殖させた。
【０１６８】
Ｍｈ  ＣＤ８＋は、以下のプロトコルを使用して刺激した：５ｘ１０６個の精製ＣＤ８＋  Ｍｈ細胞を、最終容量２ｍｌの完全ＲＰＭＩ中、ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズ（Dynabeads（登録商標））（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）の存在下で、２４ウェルプレートに播種し、７２時間インキュベートした。
【０１６９】
免疫抑制アッセイ
ヒトＭＳＣの連続希釈液を平底９６ウェルプレートに播種し、１００μｌの完全ＲＰＭＩで一晩接着させた。示されているところで、ＭＳＣ培養物をヒトインターフェロン−γ（ｈＩＦＮ−γ，human Interferon-γ）及びヒトＴＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α，human TNF-α）、マウスＩＦＮ−γ（ｍＩＦＮ−γ，murine IFN-γ）及びマウスＴＮＦ−α（ｍＴＮＦ−α，murine TNF-α）（各２０ｎｇ／ｍｌ）（すべてのサイトカインはPeprotec EC Ltd社、London、英国から得た）、ＰＨＡ−ａＰＢＭＣ又はＣｏｎＡ−ａＳｐｌ由来の上清に曝露した。翌日、５ｘ１０５個のＢａｌｂ／Ｃ  ｍＳｐｌをカルボキシフルオレスセインジアセテートスクシンイミジルエステル染料（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）で標識し、漸増するＭＳＣ／ｍＳｐｌ比でＭＳＣを播種した。培養対照は、ＣｏｎＡの存在下で（陽性対照）又はＣｏｎＡの非存在下で（陰性対照）、ＭＳＣなしで播種したｍＳｐｌで構成した。次いで、ｍＳｐｌの増殖は７２時間後にフローサイトメトリーにより評価し、各ＭＳＣ／ｍＳｐｌ希釈で得られた増殖を陽性対照培養で得られたものと比較したパーセンテージとして表した。結果は阻害のパーセンテージとして表した。
【０１７０】
細胞毒性アッセイ
１ｘ１０５個のＭＳＣを５００μｌの全容量で一晩培養した。翌日、事前活性化した免疫細胞を、異なる濃度（２．５〜４０／１のエフェクター：ＭＳＣ比）で播種した。次いで、ＭＳＣアポトーシスをフローサイトメトリー又は共焦点顕微鏡分析を使用して異なる時点で試験した。最終的に、アッセイは、ほとんどの場合、４時間実施した。フローサイトメトリーで、ＭＳＣはＣＤ４５−細胞であると同定された。
【０１７１】
クローン４Ｄ８の抗原特異的細胞毒性活性を、１時間、０．１μＭの濃度でＮＹ−ＥＳＯ−１抗原（エピトープＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）によりパルスしたＴ２細胞を使用して試験した。競合アッセイにおいて、Ｔ２細胞（Hans Stauss、University College Londonから）及びＫ５６２細胞（Junia Melo、Imperial College Londonから）を、CellTrace（商標）Violet標識によってエフェクター細胞と識別した。トレーサー濃度を、Ｔ２（１μＭ）細胞及びＫ５６２（２．５μＭ）細胞に対して最適化した。細胞株を、使用前にマイコプラズマ汚染に関して試験した。
【０１７２】
フローサイトメトリーを使用した場合、アポトーシスのレベルは、ＰＥアネキシンＶアポトーシス検出キット（BD Biosciences社、Oxford、英国）を使用して評価した。特に明示のない限り、アポトーシス細胞は、アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−細胞であると同定された。
【０１７３】
阻害剤
示されているところで、培養に、汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（フローサイトメトリー実験では１０μＭ又は生細胞共焦点実験では５０μＭ）（R&D System社、Oxon、英国）、パーフォリン阻害剤ＥＧＴＡ（４ｍＭ）（Sigma-Aldrich Company Ltd社、Dorset、英国）、ＧｒＢ阻害剤Ｚ−ＡＡＤ−ＣＭＫ（３００μＭ）（Merk Millipor社、Watford、英国）、ＨＬＡ−ＤＲに対する中和抗体（クローンＬ２４３）（５０μｇ／ｍｌ）、ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（クローンＷ６／３２）（１００μｇ／ｍｌ）（BD Biosciences社、Oxford、英国）、ＴＮＦ−αアンタゴニストエタネルセプト（Enbrel（登録商標））（１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）（Amgen社、Cambridge、英国）を補充した。各試薬は、エフェクターキラー細胞との培養の１時間前に、ＭＳＣとインキュベートした。すべての場合において、対応する阻害剤の濃度を、細胞毒性アッセイの期間中維持した。
【０１７４】
中和抗ＣＤ１７８抗体（クローンＮＯＫ−１）（１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）（BD Biosciences社、Oxford、英国）、抗ＴＲＡＩＬ抗体（クローン２Ｅ２）（１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）（Enzo Life Sciences社、Exeter、英国）、ＭＹＲプロテインキナーゼ−Ｃζ偽基質（ＰＫＣζ−ＰＳ）（１０μＭ、２５μＭ又は７５μＭ）（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）及びエタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）を、ＭＳＣと培養する前に２時間エフェクターキラー細胞とインキュベートした。すべての場合において、対応する阻害剤の濃度を、細胞毒性アッセイの期間中維持した。
【０１７５】
フローサイトメトリー
以下のマウス分子に特異的な抗体を使用した：抗ＣＤ４５抗体（ＦＩＴＣ、クローン３０−Ｆ１１）（eBiosciences Ltd社、Hatfield、英国）、抗Ｖβ８．３抗体（ＦＩＴＣ、クローン１Ｂ３．３）、抗ＣＤ８抗体（ＡＰＣ、クローン５３−６．７）、抗ＣＤ４抗体（ＰＥ、クローンＨ１２９．１９）、抗ＣＤ１９抗体（ＡＰＣ−Ｈ７、クローン１Ｄ３）、抗ＮＫ１．１抗体（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、クローンＰＫ１３６）（BD Biosciences社、Oxford、英国）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、クローンＭ１／７０）、抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＡＰＣ−Ｃｙ７、クローンｎ４１８）、抗Ｉｄｏ１抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ６４７、クローン２ｅ２）（BioLegend社、London、英国）。ヒト特異的分子については、以下の抗体を使用した：抗ＣＤ４５抗体（ＦＩＴＣ、クローン２Ｄ１）、抗ＣＤ８抗体（ＡＰＣ、クローンＳＫ１）、抗ＣＤ４抗体（ＰＥ、クローンＳＫ３）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、クローンＭ１／７０）、抗ＣＤ５６抗体（ＦＩＴＣ、クローンＨＣＤ５６）（BD Biosciences社、Oxford、英国）。すべての試料を、ソフトウェアFACS Divaを使用するBD FACS Canto IIを使用して得、Flow-joソフトウェアで分析した。ＦＲＥＴ及びカスパーゼ活性（ＣＡｆ，Caspase activity）は、既に記載されている（He et al. Am J. Pathol 164, 1901-1913 (2004)）のフローサイトメトリーにより評価した。
【０１７６】
リアルタイム定量ＰＣＲ
ＭＳＣ  ＲＮＡを、TRIzol（登録商標）（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）可溶化物から得、RNeasy Mini Kit（Qiagen社、Manchester、英国）を使用して抽出した。リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ，Real Time quantitative PCR）を、TaqMan（登録商標）RNA-to-CT（商標）1-Step Kit使用説明書（ThermoFisher Scientific社、Paisley、英国）に従って、１反応当たり２０ｎｇのＲＮＡテンプレートを使用して実施した。アッセイを、TaqManプライマー（すべてThermoFisher Scientific社、Paisley、英国から購入）を使用して、StepOnePlus  ＲＴ  ＰＣＲシステムサーマルサイクラー（Applied Biosystem社、英国）で２連で実施した。使用したヒトプライマーは以下の通りであった：ＩＤＯ２（Ｈｓ０１５８９３７３＿ｍ１）、ＴＳＧ６（Ｈｓ０１１１３６０２＿ｍ１）及びＰＴＳＧ２（Ｈｓ００１５３１３３＿ｍ１）並びにハウスキーピング遺伝子としてのＨＰＲＴ１（Ｈｓ０２８００６９５＿ｍ１）。次いで、データをStepOne（商標）ソフトウェアバージョン２．１を使用して分析し、相対的定量化は、基準としての未治療ＭＳＣを考慮してΔΔＣｔ方法で得た。
【０１７７】
統計
結果は、平均値±ＳＤとして表した。独立ステューデントｔ検定を実施して、２つの平均値を比較した。一元ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、３又は４以上の平均値を比較した。５％未満の帰無仮説の可能性（ｐ＞．０５、両側）を、統計的に有意であると考えた。試料サイズを事前判定するために統計的手法は使用せず、それはアッセイ感度及び異なる動物モデルによるこれまでの経験においてのみ推定した。
【０１７８】
【表１】
2021510805.tif 000002
2021510805.tif 000003
【図１】
2021510805.tif 000004
【図２−１】
2021510805.tif 000005
【図２−２】
2021510805.tif 000006
【図３−１】
2021510805.tif 000007
【図３−２】
2021510805.tif 000008
【図４−１】
2021510805.tif 000009
【図４−２】
2021510805.tif 000010
【図５】
2021510805.tif 000011
【図６】
2021510805.tif 000012
【図７−１】
2021510805.tif 000013
【図７−２】
2021510805.tif 000014
【図７−３】
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【図８】
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【図９】
2021510805.tif 000017
【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
2021510805.tif 000020
【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
2021510805.tif 000023
【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
2021510805.tif 000027
【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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2021510805.tif 000035
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