(57)【要約】本発明は、がんを処置または予防するための細菌株を含む併用療法を提供する。【選択図】図７Ｂ
2021510688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のがんの処置または予防方法に使用するための治療用組み合わせであって、前記治療用組み合わせが、
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物、及び
（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬
を含む、前記治療用組み合わせ。
【請求項２】
前記組成物が、他の任意の種由来の細菌を含有しないか、または別の種由来の細菌を僅少な量もしくは生物学的に無関係な量のみ含む、請求項１に記載の治療用組み合わせ。
【請求項３】
前記治療用組み合わせが、肺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、肝癌、神経内分泌癌、または結腸がんの処置または予防方法に使用するためのものである、請求項１または２のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項４】
前記治療用組み合わせが、腫瘍サイズを低減させるか、腫瘍成長を低減させるか、転移を予防するか、または血管新生を予防する方法に使用するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項５】
前記細菌株が、配列番号２で表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項６】
前記組成物が経口投与のためのものであり、及び／またはＣＴＬＡ−４阻害薬が静脈内投与のためのものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項７】
前記組成物が、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項８】
前記細菌株が、凍結乾燥される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項９】
前記細菌株が、腸に部分的または全体的にコロニーを形成することが可能である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１０】
前記組成物が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの単一株を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１１】
前記組成物が、微生物コンソーシアムの一部として前記Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌株を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１２】
前記組成物が、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１３】
前記組成物が、食品またはワクチン組成物に含まれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１４】
前記ＣＴＬＡ−４阻害薬が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＲｅｂＭａｂ  ６００、ＡＧＥＮ１８８４、ＲｅｂＭａｂ  ６００、ＭＫ−１３０８、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１５】
前記組成物が、前記対象への前記ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前に、前記対象に投与される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１６】
前記組成物が、前記ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与の少なくとも１、２、３、または４週間前に、前記対象に投与される、請求項１５に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１７】
前記組成物が、前記対象への前記ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前に、及び／または少なくとも部分的に前記ＣＴＬＡ−４阻害薬の投与と並行して、前記対象に投与される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１８】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の前記細菌株及び前記ＣＴＬＡ−４阻害薬が、別々の組成物中に存在する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項１９】
前記対象が、ＣＴＬＡ−４阻害薬を単独で使用した事前処置に応答しなかった、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の治療用組み合わせ。
【請求項２０】
がんの処置または予防方法に使用するための、ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む第２の組成物と組み合わせて使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む第１の組成物であって、任意に、前記第１の組成物が、前記第２の組成物の最初の投与前に、及び／または前記第２の組成物の前記投与と並行して、投与される、前記第１の組成物。
【請求項２１】
がんの処置または予防方法に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む第２の組成物と組み合わせて使用するための、ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む第１の組成物であって、任意に、前記第１の組成物が、前記第２の組成物の前記投与と並行して投与される、前記第１の組成物。
【請求項２２】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株、好ましくは、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された株を含む組成物の投与を以前に受けたことがある対象のがんの処置または予防方法に使用するための、ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む組成物。
【請求項２３】
ＣＴＬＡ−４阻害薬を用いる処置を必要とすると診断された対象のがんの処置または予防方法に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株、好ましくは、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された株を含む、組成物。
【請求項２４】
がんの処置または予防を必要とする対象のがんの処置または予防方法であって、
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物を前記対象に投与すること、及び
（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を前記対象に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項２５】
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物、及び
（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む組成物
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんを処置（treat）または予防（prevent）するための併用療法（combination therapy）：がんを処置または予防するための細菌株を含む組成物及びＣＴＬＡ−４阻害薬の組み合わせの分野にある。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸は、子宮内では無菌であると考えられるが、出生直後は、多様の母体及び環境の微生物に曝される。その後、微生物のコロニー形成及び継承の動的な期間が生じ、これは、分娩様式、環境、食事、及び宿主の遺伝子型などの要因により影響を受け、これらの全ては、特に、生涯の間に、腸内微生物叢の組成に影響を与える。その後、微生物叢は、安定し、成体のようになる［１］。ヒト腸内細菌叢は、本質的に２つの主要な細菌分類、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓに属する５００〜１０００を超える異なるファイロタイプを含有する［２］。ヒト腸の細菌コロニー形成から生じる良好な共生関係は、多種多様な代謝、構造、保護、及び他の有益な機能をもたらしている。コロニー形成された腸の強化された代謝活動は、他の点では、難消化性の食物の構成成分が、宿主に重要な栄養源を提供する副産物の放出により分解されることを保証する。同様に、腸内微生物叢の免疫学的な重要性は、よく認識されており、共生細菌の導入後に、共生細菌の導入後に機能的に再構成された免疫系が悪化した無菌動物において例示される［３−５］。
【０００３】
微生物叢組成の劇的な変化は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸障害で証明されている。例えば、ＩＢＤ患者においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａ細菌のレベルが低減する一方、Ｅ．ｃｏｌｉの数が増加して、腸内の共生生物及び病原生物のバランスの変化を示唆する［６−９］。興味深いことに、この微生物腸内毒素症は、Ｔエフェクター細胞集団の不均衡とも関連する。
【０００４】
特定の細菌株が動物の腸に及ぼし得る潜在的な好ましい効果を認識して、種々の疾患の処置に使用される種々の株が、提案されている（例えば、［１０−１３］を参照のこと）。さらに、腸に直接関連しない種々の炎症性疾患及び自己免疫疾患の処置に使用される、大部分のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を含む特定の株が提案されている（概説については、［１４］及び［１５］を参照のこと）。しかし、異なる疾患及び異なる細菌株間の関係、ならびに腸への及び全身レベルで及び特定の任意のタイプの疾患への特定の細菌株の正確な効果は、十分に特徴付けられていない。例えば、特定のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種は、がんの発生に関与している［１６］。対照的に、がんの処置及び予防に使用されるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株はまた、開示されている［５４］。
【０００５】
がんの多様な性質に起因して、異なる患者群を処置するために、種々の処置モダリティが開発されている。効果的であることが証明されている１つの処置モダリティは、免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＩ）の使用である。ＩＣＩは、宿主の免疫細胞ががん細胞を攻撃するのを予防するがん細胞の能力を阻害する化合物である。ＩＣＩは、例えば、膜貫通型受容体プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤＣＤ１、ＰＤ−１、ＰＤ１、またはＣＤ２７９と呼ばれる）及びそのリガンドであるＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＬ１、またはＣＤ２７４と呼ばれる）間の相互作用に対して開発されている治療用抗体であってよい。
【０００６】
ＩＣＩを用いるがん患者の処置が、有効である時、長持ちし重要な臨床的効果をもたらし得るが、かなりのパーセンテージの、ＩＣＩ処置に応答しないか、または部分的にしか応答しない患者が依然として存在する。それ故、がんを予防及び処置するための新しく改善された処置モダリティ、特に、ＣＴＬＡ−４阻害薬処置の効果を改善し得る処置モダリティ、のための当該技術分野での要件が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、がんを処置及び予防する新規の併用療法に関する。特に、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株及びＣＴＬＡ−４阻害薬の連続的及び／または部分的な並行投与が、細菌株またはＣＴＬＡ−４阻害薬単独での処置よりも効果的ながんの処置をもたらす治療の改善に関する。
【０００８】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物は、以下の本明細書及び［５４］で提供されるように、一般に、治療に、特に、がんの処置または予防に、有効である。本発明はさらに、部分的に、ＣＴＬＡ−４阻害薬及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物の両方の投与時に、達成される予想外の効果に基づいている。本明細書で使用される場合、「本発明の組み合わせ」、「本発明の治療用組み合わせ（therapeutic combination）」及び「治療用組み合わせ」という用語は、互換的に使用されてもよく、（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬、の治療用組み合わせを指す。治療用組み合わせとの関連で「組み合わせ」という用語が、必ずしも同じ組成物中にあり、及び／または同時に投与される組み合わせの構成要素（ａ）及び（ｂ）を指さないことを理解すべきである。好ましい実施形態によれば、治療用組み合わせの（ａ）及び（ｂ）は、別々の組成物中にある。一部の実施形態によれば、対象のがんの処置または予防方法に使用される本発明の組み合わせが本明細書で提供される。一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせを対象に投与することを含む、対象のがんを処置または予防するための方法が本明細書で提供される。
【０００９】
一部の実施形態によれば、細菌組成物の投与は、治療用組み合わせとの関連で、細菌組成物を用いずに投与された免疫チェックポイント阻害薬を用いる処置に応答しないか、または不十分な応答を示すがん患者の処置を可能にする。一部の実施形態によれば、ＩＣＩ療法に応答しないか、またはＩＣＩ療法に対する部分応答者である患者は、ＩＣＩナイーブであり得る（すなわち、以前にＩＣＩ治療を受けたことがない）か、またはそれらは、ＩＣＩの以前の良好な投与後に不応答者もしくは部分応答者となっていることがある。
【００１０】
理論または機序に拘束されることを望むものではないが、この効果は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の効率を改善するメディエーターの調節によるもの、例えば、腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加または腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＦｏｘＰ３＋細胞の比の増加によるもの、であり得る。
【００１１】
一態様によれば、対象のがんの処置または予防方法に使用するための治療用組み合わせが本明細書で提供され、該治療用組み合わせは、
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物、及び
（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬、を含む。
【００１２】
一部の実施形態によれば、対象のがんの処置または予防方法に使用するためのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物が本明細書で提供され、該組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて使用される。
【００１３】
一部の実施形態によれば、対象のがんの処置または予防方法に使用するための、ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む第２の組成物と組み合わせて使用するためのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む第１の組成物が本明細書で提供され、任意に、該第１の組成物は、該第２の組成物の最初の投与前に、及び／または第２の組成物の投与と並行して、投与され、任意に、対象は、免疫チェックポイント阻害薬を単独で使用する事前処置に応答しなかった、該第１の組成物である。
【００１４】
別の態様によれば、がんの処置または予防を必要とする対象のがんの処置または予防方法（本明細書では「本発明の方法」とも呼ばれる）が本明細書で提供され、方法は、（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物を対象に投与すること；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を対象に投与すること、を含む。
【００１５】
別の態様によれば、（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物、及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む組成物を含むキットが本明細書で提供される。
【００１６】
一部の実施形態によれば、がんは、乳癌、肺癌、結腸癌（colon cancer）、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、肝癌、及び神経内分泌癌からなる群より選択される。一部の実施形態によれば、治療用組み合わせは、肺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、肝癌、神経内分泌癌、または結腸癌の処置または予防方法で使用するためのものである。一部の実施形態によれば、がんは、メラノーマ、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び頭頸部癌からなる群より選択される。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせまたは方法は、がんの処置において、腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の予防に使用するためのものである。一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせまたは方法は、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、転移の予防、または血管新生の予防のうちの少なくとも１つで使用するためのものである。
【００１７】
一部の実施形態によれば、「組成物」、「細菌組成物」、及び「本発明の組成物」という用語は、互換的に使用されてもよく、本発明の治療用組み合わせに含まれる組成物を指し、これは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む。一部の実施形態によれば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物は、他の任意の種由来の細菌を含有しないか、または別の種由来の細菌を僅少な量もしくは生物学的に無関係な量のみ含む。一部の実施形態によれば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの細菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株などのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの密接に関連する株はまた、治療用組み合わせの一部として使用されてもよい。好ましくは、細菌株は、配列番号１または２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。好ましくは、配列同一性は、配列番号２とのものである。好ましくは、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、配列番号２に表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。
【００１８】
従って、本発明の治療用組み合わせは、がんの処置または予防方法に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの細菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列と、任意に、配列番号２と少なくとも９５％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株を含む組成物を含んでもよい。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは、一部の実施形態では、組成物中の細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのものではないが、密接に関連する株である。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、経口投与用である。本発明の株の経口投与は、特に、本発明の治療用組み合わせの一部として投与される時、がんを処置するのに有効であり得る。また、経口投与は、患者及び開業医にとって便利であり、腸への送達及び／または腸の部分的もしくは全体的なコロニー形成を可能にする。一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせの一部として使用されるＣＴＬＡ−４阻害薬は、静脈内投与される。一部の実施形態によれば、治療用組み合わせの細菌組成物及びＣＴＬＡ−４阻害薬のそれぞれは、別々の組成物中に存在し、それぞれが、場合により、投与様式に適する担体及び／または賦形剤を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物中にある。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明の細菌組成物は、凍結乾燥されている細菌株を含む。凍結乾燥は、細菌の送達を可能にする安定した組成物を調製するための効果的且つ便利な技術である。一部の実施形態によれば、組成物中の細菌株は、腸に部分的または全体的にコロニー形成することが可能である。
【００２１】
特定の実施形態では、細菌組成物は、食品に含まれる。特定の実施形態では、細菌組成物は、ワクチンに含まれる。
【００２２】
一部の実施形態によれば、細菌組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの単一株を含む。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、微生物コンソーシアム（microbial consortium）の一部としてＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌株を含む。好ましくは、細菌組成物は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株を含む。
【００２３】
一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、イピリムマブである。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、イピリムマブ（Ipilimumab）、トレメリムマブ（tremelimumab）、ＲｅｂＭａｂ  ６００、ＡＧＥＮ１８８４、ＲｅｂＭａｂ  ６００、ＭＫ−１３０８、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２４】
本発明の方法の一部の実施形態によれば、細菌組成物は、対象へのＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前に、対象に投与される。本発明の方法の一部の実施形態によれば、細菌組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与の少なくとも１、２、３、または４週間前に、対象に投与される。本発明の方法との関連で、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与は、本発明の治療用組み合わせの一部としての最初の投与を指すことを理解すべきである。本発明の治療用組み合わせの投与前に、対象は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の投与中／投与前に投与される本発明の細菌組成物を用いずに、ＣＴＬＡ−４阻害薬が投与されていることがある。一部の実施形態によれば、少なくとも１、２、３、または４週間が、本発明の治療用組み合わせの投与及びＣＴＬＡ−４阻害薬単独または細菌組成物単独の事前投与間で経過した。
【００２５】
本発明の方法の一部の実施形態によれば、細菌組成物は、対象へのＣＴＬＡ−４阻害薬の投与と少なくとも部分的に並行して、対象に投与される。細菌組成物及びＣＴＬＡ−４阻害薬の投与時間との関連で、少なくとも部分的に並行した投与は、完全に（例えば、１２ヶ月にわたる両方の構成成分の投与）または部分的に（例えば、１２ヶ月の期間と完全にまたは部分的に重複し得る１２ヶ月にわたる１つ構成成分の投与及び８ヶ月にわたる第２の構成成分の投与）重複し得る投与を指す。両方の構成成分の並行投与は、両方の構成成分が、必ずしも、同じ投薬レジメンを使用して投与されないことを意味しないことを理解すべきである。本発明の方法の一部の実施形態によれば、細菌組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前に及び／または少なくとも部分的に該対象へのＣＴＬＡ−４阻害薬の投与と並行して、対象に投与される。特定の実施形態によれば、細菌組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与の少なくとも１、２、３、または４週間前に、対象に投与され、続いて、細菌組成物及びＣＴＬＡ−４阻害薬は、少なくとも２、４、または６週間に、少なくとも部分的に並行して投与される。
【００２６】
一部の実施形態によれば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種及びＣＴＬＡ−４阻害薬の細菌株は、別々の組成物中にあり、好ましくは、細菌組成物は、経口投与用に製剤化されるが、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、静脈内投与用に製剤化された製剤中に存在する。
【００２７】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、免疫チェックポイント阻害薬を単独で使用する事前処置に応答しなかった対象のがんを処置または予防するためのものである。本明細書で使用される場合、免疫チェックポイント阻害薬を用いる処置に応答しないＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準に従って、またはｉｒＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における免疫関連応答評価基準）に従って、応答しない対象を指す。
【００２８】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、対象のがんを処置または予防するためのものであり、ＣＴＬＡ−４阻害薬または細菌組成物は単独では、対象のがんの有効な処置または予防を提供することができない。一部の実施形態によれば、対象におけるがんの有効な処置は、対象のがんの完全または部分的寛解をもたらす程度までの、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、及び／または転移の予防のうちの少なくとも１つを含む。
【００２９】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、ＣＴＬＡ−４阻害薬または細菌組成物単独よりも高い程度に、腫瘍サイズの低減及び／または腫瘍成長の低減及び／または転移の予防及び／または血管新生の予防が可能である。
【００３０】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、好ましくは、ＣＴＬＡ−４阻害薬または細菌組成物を単独で用いる処置を使用して達成されるよりも短い時間枠で、対象のがんの完全寛解があるように、対象のがんを処置するためのものである。
【００３１】
本発明はまた、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株、好ましくは、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された株を含む組成物の投与を以前に受けたことがある対象のがんの処置または予防方法に使用するためのＣＴＬＡ−４阻害薬を含む組成物を提供する。
【００３２】
本発明はまた、ＣＴＬＡ−４阻害薬を用いる処置を必要とすると診断された対象のがんの処置または予防方法に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株、好ましくは、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された株を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】乳癌のマウスモデル−腫瘍体積。
【図１Ｂ】上のパネル：ＥＭＴ６腫瘍の壊死面積（未処置  ｎ＝６、ビヒクル  ｎ＝６、ＭＲｘ０５１８  ｎ＝８）。下のパネル：ＥＭＴ６腫瘍の分裂細胞のパーセンテージ。Ｐ＝０．０１９（未処置  ｎ＝４、カウントされた細胞の総数＝３７２０１、ビヒクル  ｎ＝６、カウントされた細胞の総数＝６４２９７、ＭＲｘ０５１８  ｎ＝６、カウントされた細胞の総数＝３３５３９）。
【図１Ｃ】乳癌のマウスモデル−浸潤性免疫細胞。散布図は、各処置群の個々の動物の種々の免疫マーカーの細胞数を表す。
【図１Ｄ】乳癌のマウスモデル−腫瘍溶解物におけるサイトカイン産生。列は、各処置群の総タンパク質の平均ｐｇ／ｍＬを表す。＊一元ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を使用した群間では、ｐ＜０．０５。
【図１Ｅ】乳癌のマウスモデル−血漿中のサイトカイン産生。列は、各処置群の平均ｐｇ／ｍＬを表す（＋／−ＳＥＭ）。
【図１Ｆ】ＣＤ８αに対する抗体で免疫標識される（下のパネル）及びＤＡＰＩで対比染色される（上のパネル）ビヒクル、ＭＲｘ０５１８、及びＣＴＬＡ−４で処置されたマウスの回腸凍結切片の代表的な画像。
【図１Ｇ】ビヒクル、ＭＲｘ０５１８、またはＣＴＬＡ−４で処置されたマウスの回腸陰窩領域から撮影された１視野当たり３を超えるＣＤ８α＋細胞を含む動物研究サブセットを定量するプロット。
【図２】肺癌のマウスモデル−腫瘍体積。
【図３Ａ】肝臓癌のマウスモデル−肝臓重量。
【図３Ｂ】腎臓癌のマウスモデル−腫瘍体積。
【図４Ａ】未成熟樹状細胞（細菌なし）におけるサイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）。
【図４Ｂ】ＬＰＳ添加後の未成熟樹状細胞におけるサイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）。
【図４Ｃ】ＭＲＸ５１８の添加後の未成熟樹状細胞におけるサイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）。
【図４Ｄ】ＭＲＸ５１８及びＬＰＳの添加後の未成熟樹状細胞におけるサイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）。
【図５Ａ】ＴＨＰ−１細胞におけるサイトカインレベル（細菌なし）。
【図５Ｂ】細菌沈降物の添加後のＴＨＰ−１細胞におけるサイトカインレベル。
【図５Ｃ】ＭＲＸ５１８を単独でまたはＬＰＳと組み合わせて添加した後のＴＨＰ−１細胞におけるサイトカインレベル。
【図６】種々の処置後の増殖ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを示す棒グラフ（ＮＣＤ−細胞分裂なし、１ＲＣＤ−１回の細胞分裂、２ＲＣＤ−２回の細胞分裂、３ＲＣＤ−３回の細胞分裂、４ＲＣＤ−４回の細胞分裂）。
【図７Ａ】以下の本明細書に記載の実施例６で使用される異なる群の処置スケジュールの概略図。
【図７Ｂ】ＥＭＴ−６細胞により形成された腫瘍を持つマウスの平均腫瘍体積。マウスは、未処置であるか、またはＹＣＦＡビヒクル（ビヒクル）、ＹＣＦＡ培地（ＭＲｘ５１８）中のＭＲｘ５１８細菌、抗ＰＤ１抗体及びＹＣＦＡ培地（抗ＰＤ１）、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びＹＣＦＡ培地（抗−ＣＴＬＡ−４）、ＭＲｘ５１８及び抗ＰＤ１抗体の組み合わせ、またはＭＲｘ５１８及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の組み合わせで処置された。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の開示
細菌株
本発明の組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む。実施例は、この種の細菌を含む治療用組み合わせが、がんの処置または予防に有用であることを実証する。
【００３５】
一部の実施形態によれば、対象のがんの処置または予防方法に使用するための治療用組み合わせが本明細書で提供され、該治療用組み合わせは、
（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物、及び
（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬、を含む。
【００３６】
一部の実施形態によれば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの細菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９５％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株を含む組成物は、本発明の治療用組み合わせ及び方法に使用されてもよい。特定の実施形態によれば、本発明はまた、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせたがんの処置または予防に使用するための、配列番号２と少なくとも９５％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物中の細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍではないが、密接に関連する株である。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである配列番号２と少なくとも９５％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株を含み、任意の他の細菌の属を含有しない。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである配列番号２と少なくとも９５％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株の単一株を含み、他の任意の細菌株または種を含有しない。
【００３８】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは、大部分がペアまたは短鎖の球菌細胞を形成する。それは非運動性であり、血液寒天または栄養寒天のコロニーは、円形で滑らかである。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍは、ランスフィールド分類のＤ抗血清と反応する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの種類株は、Ｆ８７／２７６＝ＰＢ２１＝ＡＴＣＣ  ４９５７３＝ＣＣＵＧ  １８６５８＝ＣＩＰ  １０３０１３＝ＪＣＭ  ８７２８＝ＬＭＧ  １３１２９＝ＮＢＲＣ  １００６７５＝ＮＣＩＭＢ  ７０２３１３（以前は、ＮＣＤＯ  ２３１３）＝ＮＣＴＣ  １２３５９である［１７］。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＡＦ０３９９００（本明細書では配列番号１として開示される）である。例示的なＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株は、［１７］に記載される。
【００３９】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌は、実施例で試験された。これは、本明細書ではＭＲＸ５１８株とも呼ばれる。ＭＲＸ５１８及びＭＲｘ０５１８への言及は、互換的に使用される。試験されたＭＲＸ５１８株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、配列番号２で提供される。ＭＲＸ５１８株は、「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ」として、２０１５年１１月１６日に、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、スコットランドアバディーンＡＢ２５  ２ＺＳ）により、国際寄託機関ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、スコットランドアバディーンＡＢ２１  ９ＹＡ）で寄託され、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８を割り当てられた。
【００４０】
ＭＲＸ５１８株のゲノムは、染色体及びプラスミドを含む。ＭＲＸ５１８株の染色体配列は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３に提供される。ＭＲＸ５１８株のプラスミド配列は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４で提供される。これらの配列は、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩプラットフォームを使用して生成された。
【００４１】
実施例で試験された株に密接に関連する細菌株もまた、本発明の治療用組み合わせにおいて、がんの処置または予防に有効であると予想される。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの細菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。好ましくは、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、配列番号１または２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。好ましくは、配列同一性は、配列番号２とのものである。好ましくは、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、配列番号２に表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。
【００４２】
受託番号４２４８８で寄託された細菌のバイオタイプである細菌株も、本発明の治療用組み合わせとの関連で、がんの処置または予防に有効であると予想される。バイオタイプは、生理学的及び生化学的特性が同じまたは非常に類似する密接に関連する株である。
【００４３】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌のバイオタイプであり、本発明の治療用組み合わせで使用するために適する株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌のための他のヌクレオチド配列を配列決定することにより同定されてもよい。例えば、実質的に全ゲノムが、配列決定されてもよく、本発明の治療用組み合わせに使用するためのバイオタイプ株は、全ゲノムの少なくとも８０％にわたって（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％にわたって、または全ゲノムにわたって）、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有してもよい。例えば、一部の実施形態では、バイオタイプ株は、ゲノムの少なくとも９８％にわたって、少なくとも９８％の配列同一性、またはゲノムの９９％にわたって少なくとも９９％の配列同一性を有する。バイオタイプ株の同定に使用するための他の好適な配列は、ｈｓｐ６０、またはＢＯＸ、ＥＲＩＣ、（ＧＴＧ）５、もしくはＲＥＰ、または［１８］などの反復配列を含んでもよい。バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌の対応する配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を有してもよい。一部の実施形態では、バイオタイプ株は、ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＭＲＸ５１８株の対応する配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し、配列番号２と少なくとも９９％同一（例えば、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％同一）である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、バイオタイプ株は、ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＭＲＸ５１８株の対応する配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する配列を有し、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせにするための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と配列同一性を有する染色体を有する。好ましい実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する染色体を有する。例えば、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の７０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の８０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の１００％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の７０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の８０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の１００％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の７０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の８０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９５％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９８％の同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の１００％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９９．５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９５％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９９．５％の同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の９８％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９９．５％の同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の１００％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する染色体を有してもよい。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを有する。好ましい実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有するプラスミドを有する。例えば、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の７０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の８０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の９０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の１００％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の７０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の８０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の９０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の１００％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の７０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の８０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の９０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有するか、またはＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４の１００％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有するプラスミドを有してもよい。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と配列同一性を有する染色体及びＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを有する。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、例えば、上記のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と配列同一性を有する染色体、及び、例えば、上記のように、配列番号１または２のいずれかと配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有し、好ましくは、配列番号２と少なくとも９９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有し、より好ましくは、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含み、任意に、上記のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含む。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、例えば、上記のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と配列同一性を有する染色体を有し、任意に、上記のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含む、がんの処置または予防に有効である。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせで使用するための細菌株は、例えば、上記のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と配列同一性を有する染色体、及び例えば、上記のように、配列番号１または２のいずれかと配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有し、任意に、上記のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、がんの処置または予防に有効である。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせで使用するための細菌株は、配列番号２で表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９９％、９９．５％、または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列（例えば、これは、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む）及びＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の少なくとも９０％にわたって、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する染色体を有し、任意に、上述のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、これは、がんの処置または予防に有効である。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、配列番号２で表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９９％、９９．５％、または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列（例えば、これは、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む）及びＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の少なくとも９８％にわたって（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％にわたって）、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性）を有する染色体を有し、任意に、上記のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、これは、がんの処置または予防に有効である。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであり、配列番号２で表される１６ｓ  ｒＲＮＡ配列と少なくとも９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列（例えば、これは、配列番号２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む）及びＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３の少なくとも９８％にわたって（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％にわたって）、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性（例えば、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性）を有する染色体を有し、任意に、上記のように、ＷＯ２０１７／０８５５２０の配列番号４と配列同一性を有するプラスミドを含み、これは、がんの処置または予防に有効である。
【００５３】
あるいは、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌のバイオタイプであり且つ本発明の治療用組み合わせでの使用に適する株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８寄託及び制限フラグメント分析及び／またはＰＣＲ分析を使用することにより、例えば、蛍光増幅フラグメント長多型（ＦＡＦＬＰ）及び反復ＤＮＡ因子（ｒｅｐ）−ＰＣＲフィンガープリント、またはタンパク質プロファイリング、または部分的な１６Ｓもしくは２３ｓ  ｒＤＮＡ配列決定を使用することにより、同定されてもよい。好ましい実施形態では、そのような技術は、他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株を同定するために使用されてもよい。
【００５４】
特定の実施形態では、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌のバイオタイプであり且つ本発明の治療用組み合わせでの使用に適する株は、増幅されたリボソームＤＮＡ制限分析（ＡＲＤＲＡ）で分析される時、例えば、Ｓａｕ３ＡＩ制限酵素を使用する時、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌と同じパターンを提供する株である（例示的方法及びガイダンスについては、例えば、［１９］を参照のこと）。あるいは、バイオタイプ株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌と同じ炭水化物発酵パターンを有する株として同定される。一部の実施形態では、炭水化物発酵パターンは、ＡＰＩ５０ＣＨＬパネル（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して決定される。一部の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用される細菌株は：好ましくは、ＡＰＩ５０ＣＨＬ分析（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ製のＡＰＩ５０ＣＨＬパネルを使用する）により決定される場合、
（ｉ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、サリシン、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトース、スクロース、Ｄ−トレハロース、ゲンチオビオース、Ｄ−タガトース、及びグルコン酸カリウムのうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または全て）の発酵について陽性であり；ならびに／または
（ｉｉ）Ｄ−マンニトール、メチル−αＤ−グリコピラノシド、Ｄ−ラクトース、デンプン、及びＬ−フコースのうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、もしくは全て）の発酵について中間である。
【００５５】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌のバイオタイプなどの、本発明の組成物及び方法において有用である他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株は、実施例に記載のアッセイを含む、任意の適切な方法または方策を使用して同定されてもよい。例えば、本発明の治療用組み合わせに使用するための株は、嫌気性ＹＣＦＡで培養すること及び／またはＩＩ型コラーゲン誘発関節炎モデルマウスに細菌を投与し、次に、サイトカインレベルを評価することにより同定されてもよい。特に、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された細菌と類似の成長パターン、代謝型、及び／または表面抗原を有する細菌株は、本発明の治療用組み合わせにおいて有用であり得る。有用な株は、ＮＣＩＭＢ４２４８８株と同等の免疫調節活性を有するであろう。特に、バイオタイプ株は、実施例に示される効果と同等のがん疾患モデルへの効果を誘発することになり、これは、実施例に記載される培養及び投与プロトコールを使用することにより同定されてもよい。一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせに使用され得るバイオタイプ株は、本発明の治療用組み合わせまたは方法で投与される時、実施例に示される同等のがん疾患モデルへの効果を誘発することが可能である株である。
【００５６】
一部の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用される細菌株は、好ましくは、炭水化物、アミノ酸、及び硝酸塩代謝のアッセイ、ならびに任意に、アルカリホスファターゼ活性のアッセイにより測定される場合、より好ましくは、Ｒａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａ分析（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ製のＲａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａシステムを使用する）により測定される場合、
（ｉ）マンノース発酵、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、アルギニンアリールアミダーゼ、フェニルアラニンアリールアミダーゼ、ピログルタミン酸アリールアミダーゼ、チロシンアリールアミダーゼ、ヒスチジンアリールアミダーゼ、及びセリンアリールアミダーゼのうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または全て）について陽性である；及び／または
（ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ−６−リン酸、β−グルコシダーゼ、及びＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼのうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つまたは全て）について中間である；及び／または
（ｉｉｉ）ラフィノース発酵、プロリンアリールアミダーゼ、ロイシルグリシンアリールアミダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、アラニンアリールアミダーゼ、グリシンアリールアミダーゼ、及びグルタミルグルタミン酸アリールアミダーゼのうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、または全て）について陰性である。
【００５７】
一部の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用される細菌株は、
（ｉ）炭水化物、アミノ酸、及び硝酸塩代謝のアッセイにより測定される場合、好ましくは、Ｒａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａ分析（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ製のＲａｐｉｄ  ＩＤ  ３２Ａシステムを使用する）により測定される場合、グリシンアリールアミダーゼ、ラフィノース発酵、プロリンアリールアミダーゼ、及びロイシンアリールアミダーゼのうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、もしくは４つ全て）について陰性である；ならびに／または
（ｉｉ）好ましくは、ＡＰＩ５０ＣＨＬ分析（好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ製のＡＰＩ５０ＣＨＬパネルを使用する）により測定される場合、Ｌ−フコースの発酵について中間陽性である。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用される細菌株は、細胞外ＡＴＰプロデューサー、ＡＴＰアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＡＫ１９０）を使用して測定される場合、例えば、６〜６．７ｎｇ／μｌ（例えば、６．１〜６．６ｎｇ／μｌまたは６．２〜６．５ｎｇ／μｌまたは６．３３±０．１０ｎｇ／μｌ）のＡＴＰを産生するものである。細菌の細胞外ＡＴＰは、Ｔ細胞受容体媒介性シグナル伝達の活性化（Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）、腸のＴｈ１７細胞分化の促進（Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）、及びＮＬＲＰ３インフラマソームによる前炎症誘発性メディエーターＩＬ−１βの分泌の誘導（Ｋａｒｍａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）を含む多面的効果を有し得る。従って、細胞外ＡＴＰプロデューサーである細菌株は、本発明の治療用組み合わせ及び方法との関連で、がんの処置または予防に有用である。
【００５９】
一部の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、以下の３つの遺伝子：可動因子タンパク質；キシロースＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼ構成成分；及びＦＩＧ００６３２３３３：仮想タンパク質のうちの１または２以上を含む。例えば、特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせに使用するための細菌株は、可動因子タンパク質及びキシロースＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼ構成成分；可動因子タンパク質及びＦＩＧ００６３２３３３：仮想タンパク質；キシロースＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼ構成成分及びＦＩＧ００６３２３３３：仮想タンパク質；または可動因子タンパク質、キシロースＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼ構成成分、及びＦＩＧ００６３２３３３：仮想タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００６０】
本発明の治療用組み合わせの特に好ましい株は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株である。これは、実施例で試験され且つ疾患を処置するのに有効であることが示される例示的なＭＲＸ５１８株である。本発明は、一部の実施形態によれば、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株の細胞またはその派生物（derivative）を含む、本発明の治療用組み合わせの一部としての細菌組成物を提供する。受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された株の派生物は、娘株（後代）またはオリジナル株から培養された（サブクローニングされた）株であってよい。
【００６１】
本発明の治療用組み合わせに含まれる組成物の株の派生物は、生物学的活性を除去することなく、例えば、遺伝子レベルで改変されてもよい。特に、本発明の治療用組み合わせの派生株は、治療的に活性である。派生株は、元のＮＣＩＭＢ４２４８８株と同等の免疫調節活性を有するであろう。特に、派生株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わされる時に、実施例に示される効果と同等のがん疾患モデルへの効果を誘発することになり、これは、実施例に記載の培養及び投与プロトコールを使用して同定されてもよい。ＮＣＩＭＢ４２４８８株の派生物は一般に、ＮＣＩＭＢ４２４８８株のバイオタイプであろう。
【００６２】
受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株の細胞への言及は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された株と同じ安全性及び治療有効性特性を有する任意の細胞を包含し、そのような細胞は、本発明の治療用組み合わせに包含される。従って、一部の実施形態では、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株の細胞への言及は、ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＭＲＸ５１８株のみを指し、ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されなかった細菌株を指さない。一部の実施形態では、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株の細胞への言及は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された株と同じ安全性及び治療有効性特性を有するが、ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託された株ではない細胞を指す。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明の組成物中の細菌株は、生存可能であり、腸に部分的または全体的にコロニー形成することが可能である。
【００６４】
がんの処置
好ましい実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、がんの処置または予防に使用するためのものである。実施例は、本発明の治療用組み合わせの投与が、腫瘍成長の低減をもたらし得ることを実証する。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせを用いる処置は、腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の低減をもたらす。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の低減に使用するためのものである。本発明の治療用組み合わせは、腫瘍のサイズまたは成長を低下させるために有効であり得る。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、固形腫瘍を有する患者に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、がんの処置における血管新生の低減または予防に使用するためのものである。本発明の治療用組み合わせは、血管新生において中心的役割を有する免疫または炎症性系に影響を与え得る。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、転移の予防に使用するためのものである。
【００６６】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、乳癌の処置または予防に使用するためのものである。実施例は、本発明の治療用組み合わせが、乳癌の処置に有効であり得ることを実証している。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、乳癌の処置における腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは、乳癌である。好ましい実施形態では、がんは、ＩＶ期乳癌である。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、肺癌の処置または予防に使用するためのものである。実施例は、本発明の治療用組み合わせが、肺癌の処置に有効であり得ることを実証している。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、肺癌の処置における腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは、肺癌である。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、肝臓癌の処置または予防に使用するためのものである。実施例は、本発明の治療用組み合わせが、肝臓癌の処置に有効であり得ることを実証している。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、肝臓癌の処置における腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは、肝癌（肝細胞癌）である。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、結腸癌の処置または予防に使用するためのものである。実施例は、本発明の治療用組み合わせが、結腸癌細胞に対して効果を有し且つ結腸癌の処置に有効であり得ることを実証する。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、結腸癌の処置における腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは、結腸直腸腺癌である。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、腎臓癌（本明細書では腎癌とも呼ばれる）の処置または予防に使用するためのものである。実施例は、本発明の治療用組み合わせが、腎癌細胞に対して効果を有し且つ腎臓癌の処置に有効であり得ることを実証する。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、腎癌の処置における腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは、腎細胞癌または移行上皮癌である。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、メラノーマの処置または予防に使用するためのものである。一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、メラノサイトに効果を有し、メラノーマを処置するのに有効であり得る。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、メラノーマの処置における腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。
【００７２】
一部の実施形態では、がんは、腸のものである。一部の実施形態では、がんは、腸ではない体の一部のものである。一部の実施形態では、がんは、腸の癌ではない。一部の実施形態では、がんは、結腸直腸癌ではない。一部の実施形態では、がんは、小腸の癌ではない。一部の実施形態では、処置または予防は、腸以外の部位で行われる。一部の実施形態では、処置または予防は、腸で起こり、腸以外の部位でも行われる。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、がん腫の処置または予防に使用するためのものである。実施例は、本発明の治療用組み合わせが、多種類のがん腫の処置に有効であり得ることを実証している。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、非免疫原性がんの処置または予防に使用するためのものである。実施例は、本発明の治療用組み合わせが、非免疫原性がんの処置に有効であり得ることを実証している。
【００７４】
がんに対する本発明の細菌組成物の治療効果は、本発明の治療用組み合わせとの関連で、前炎症性機序により媒介され得る。実施例２、４、及び５は、多数の前炎症性サイトカインの発現が、ＭＲＸ５１８の投与後に増加し得ることを実証する。炎症は、がん抑制効果を有し得［２０］、ＴＮＦαなどの前炎症性サイトカインは、がん治療法として研究されている［２１］。実施例に示されるＴＮＦなどの遺伝子の上方制御は、本発明の細菌組成物が、同様の機序を介してがんを処置するために有用であり得ることを示し得る。ＣＸＣＲ３リガンド（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０）及びＩＦＮγ誘導性遺伝子（ＩＬ−３２）の上方制御は、本発明の細菌組成物が、ＩＦＮγ型応答を誘発することを示し得る。ＩＦＮγは、殺腫瘍活性を刺激することができる強力なマクロファージ活性化因子であり［２２］、ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０は、例えば、抗がん効果も有する［２３〜２５］。従って、特定の実施形態では、本発明の細菌組成物は、本発明の治療用組み合わせと関連して使用される時、がんの処置における炎症の促進に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、本発明の治療用組み合わせとの関連で使用される時、がんの処置においてＴｈ１炎症を促進する際に使用するためのものである。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮγを産生し、強力な抗がん作用を有する［２０］。特定の実施形態では、本発明の組成物は、本発明の治療用組み合わせとの関連で使用される時、早期がん、例えば、転移していないがん、またはステージ０もしくはステージ１のがん、の処置に使用するためのものである。炎症を促進することは、初期のがんに対してより効果的であり得る［２０］。特定の実施形態では、本発明の組成物は、本発明の治療用組み合わせとの関連で使用される時、ＣＴＬＡ−４阻害薬の効果を増強するために、炎症の促進に使用するためのものである。特定の実施形態では、がんの処置または予防は、１または２以上のサイトカインの発現のレベルを増加させることを含む。例えば、特定の実施形態では、がんの処置または予防は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α、例えば、ＩＬ−１β及びＩＬ−６、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αのうちの１または２以上の、またはＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの３つ全ての発現のレベルを増加させることを含む。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αのいずれかの発現のレベルの増加は、がんの処置における有効性を示すことが知られる。
【００７５】
実施例４及び５は、本明細書に記載の細菌株がリポ多糖体（ＬＰＳ）と組み合わせて使用される時、ＩＬ−１βの相乗的増加が存在することを実証する。ＬＰＳは、前炎症性効果を誘発することが知られる。従って、特定の実施形態では、がんの処置または予防は、ＩＬ−１βを上方制御する薬剤と組み合わせて本明細書に記載の細菌株を使用することを含む。特定の実施形態では、がんの処置または予防は、ＬＰＳと組み合わせて本明細書に記載の細菌株を使用することを含む。従って、本発明の治療用組み合わせはさらに、ＩＬ−１βを上方制御する薬剤を含んでもよい。従って、本発明の細菌組成物はさらに、ＬＰＳを含んでもよい。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、以前に化学療法を受けている患者の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、化学療法処置を忍容されてなかった患者処置に使用するためのものである。本発明の治療用組み合わせは、特に、そのような患者に好適であり得る。他の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、免疫チェックポイント阻害薬を用いる事前処置に応答しなかったがん患者の処置に使用するためのものである。他の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、ＰＤ−１阻害薬を用いる事前処置に応答しなかったがん患者の処置に使用するためのものである。理論または機序に拘束されることを望まないが、本発明の細菌組成物が、ＣＴＬＡ−４阻害薬とは異なる機序を介して、対象の免疫系を刺激することが可能であり、それにより、免疫チェックポイント阻害薬に応答しない患者を処置する補足的な機序を提供すると考えられる。
【００７７】
一部の実施形態によれば、本発明の結果の治療用組み合わせを使用するがんの処置は、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準またはｉｒＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における免疫関連応答評価基準）基準で測定される場合、ＣＴＬＡ−４阻害薬を単独で使用するよりも効果的である。一部の実施形態によれば、本発明の結果の治療用組み合わせを使用するがんの処置は、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準またはｉｒＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における免疫関連応答評価基準）基準で測定される場合、細菌組成物を単独で使用するよりも効果的である。一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせを使用するがんの処置は、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準またはｉｒＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における免疫関連応答評価基準）基準で測定される場合、ＣＴＬＡ−４阻害薬を単独で、または細菌組成物を単独で用いる処置と比較して相乗的な臨床効果をもたらす。
【００７８】
一部の実施形態によれば、治療用組み合わせのＣＴＬＡ−４阻害薬は、抗体である。一部の実施形態によれば、治療用組み合わせのＣＴＬＡ−４阻害薬は、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体である。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、再発を予防するためのものである。細菌組成物は、本発明の治療用組み合わせとの関連で、長期投与に適し得る。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、がんの進行の予防に使用するためのものである。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、小細胞肺癌の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、扁平上皮癌の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、腺癌の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、腺腫瘍、カルチノイド腫瘍、または未分化がん腫の処置に使用するためのものである。
【００８０】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、肝芽腫、胆管癌、胆管細胞性嚢胞腺癌、またはウイルス感染に起因する肝臓癌の処置に使用するためのものである。
【００８１】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、浸潤性腺管癌、非浸潤性乳管癌、または浸潤性小葉癌の処置に使用するためのものである。
【００８２】
さらなる実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼内メラノーマ、網膜芽腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、小児視覚経路及び視床下部、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、咽頭癌、下垂体腺腫、形質細胞新生物、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌の処置または予防に使用するためのものである。
【００８３】
一部の実施形態によれば、治療用組み合わせは、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、膀胱癌、及び頭頸部癌からなる群より選択されるがんの処置または予防に使用するためのものである。
【００８４】
特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、追加の抗がん薬を含む。一部の実施形態によれば、追加の抗がん薬は、標的化抗体免疫療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス、または細胞増殖抑制薬から選択される。
【００８５】
投与様式
好ましくは、本発明の細菌組成物は、本発明の細菌株による腸への送達及び／または腸の部分的もしくは全体的なコロニー形成を可能にするために、胃腸管に投与されるべきである。一般に、本発明の細菌組成物は、経口投与されるが、それらは、直腸内、鼻腔内、または口腔もしくは舌下経路を介して投与されてもよい。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明の細菌組成物は、フォームとして、スプレーまたはゲルとして投与されてもよい。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明の細菌組成物は、直腸坐剤などの坐剤として、例えば、カカオ油（ココアバター）、合成硬質脂肪（例えば、サポシア（ｓｕｐｐｏｃｉｒｅ）、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ））、グリセロゼラチン、ポリエチレングリコール、または石鹸グリセリン組成物の形態で、投与されてもよい。
【００８８】
特定の実施形態では、本発明の細菌組成物は、経鼻胃管、口腔胃管、胃管、空腸瘻管（Ｊ管）、経皮内視鏡的胃瘻造設術（ＰＥＧ）などの管、または胃、空腸、及びその他の好適なアクセスポートへのアクセスを提供する胸壁ポートなどのポートを介して胃腸管に投与される。
【００８９】
本発明の細菌組成物は、１回投与されてもよく、または、それらは、処置レジメンの一部として連続して投与されてもよい。特定の実施形態では、本発明の細菌組成物は、毎日投与されるべきである。
【００９０】
本発明の特定の実施形態では、本発明による処置は、患者の腸内微生物叢の評価を伴う。処置は、本発明の細菌組成物の株を用いる送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成が達成されず、その結果、有効性が観察されない場合に、繰り返されてもよく、あるいは、処置は、送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成が成功して、有効性が観察される場合に、停止されてもよい。一部の実施形態によれば、本発明の細菌組成物は、本発明の治療用組み合わせのＣＴＬＡ−４阻害薬との最初の投与前に、対象に投与される。一部の実施形態によれば、対象の腸内微生物叢は、細菌組成物の投与後及びＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前に評価され、その結果、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、組成物中の細菌株の株を用いる送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成が達成された後にのみ、投与される。特定の実施形態では、本発明の治療用組み合わせは、子宮内及び／またはそれが生まれた後の子供でがんが発生する可能性を低減するために、妊娠した動物、例えば、ヒトなどの哺乳動物、に投与されてもよい。
【００９１】
本発明の治療用組み合わせは、がんと診断されている患者、またはがんのリスクがあると同定されている患者に投与されてもよい。治療用組み合わせはまた、健康な患者におけるがんの発生を予防する予防手段として投与されてもよい。
【００９２】
本発明の治療用組み合わせは、異常な腸内微生物叢を有すると同定されている患者に投与されてもよい。例えば、患者は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍによるコロニー形成が低減していても、存在しなくてもよい。
【００９３】
本発明の細菌組成物は、栄養補助食品などの食品として投与されてもよい。
【００９４】
一般に、本発明の治療用組み合わせは、ヒトの処置のためのものであるが、それらは、家禽、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、またはウサギなどの単胃哺乳動物を含む動物を処置するために使用されてもよい。本発明の治療用組み合わせは、動物の成長及び能力を増強するのに有用であり得る。細菌組成物が動物に投与される場合、経口強制飼養が使用されてもよい。
【００９５】
一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、静脈内投与される。一部の実施形態によれば、静脈内投与されるＣＴＬＡ−４阻害薬は、任意にさらに少なくとも１つの薬学的に適合性のある担体または賦形剤を含む組成物中にある。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、約１、２、３、または４週間毎に、好ましくは、３週間毎に、静脈内投与される。
【００９６】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせの細菌組成物及びＣＴＬＡ−４阻害薬は、異なる投与経路を使用して投与される。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、経口投与されるが、本発明の治療用組み合わせのＣＴＬＡ−４阻害薬は、異なる経路を使用して投与される。一部の実施形態によれば、治療用組み合わせのＣＴＬＡ−４阻害薬は、静脈内投与されるが、細菌組成物は、経口投与される。
【００９７】
一部の実施形態によれば、細菌組成物は、対象へのＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前に、対象に投与される。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、対象へのＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前に、対象に投与され、細菌組成物は、組成物中の細菌株の株を用いる送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成が達成されるまで、投与される。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、対象へのＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前に、対象に投与され、細菌組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害薬が以前にＩＣＩ処置に応答しなかったがん患者を処置することが可能であるように、バイオマーカーの十分な調節が起こるまで投与される。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与の少なくとも１、２、３、または４週間前に、対象に投与される。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与の約２週間前に、対象に投与される。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与の少なくとも１、２、３、または４週間前に、対象に投与され、ＣＴＬＡ−４阻害薬の投与と並行して対象に投与されない。
【００９８】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせにおける細菌組成物の最初の投与は、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与前にある。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬の最初の投与は、細菌組成物の投与の約１、２、３、４、５、６または７日以後に行われる。
【００９９】
本発明の方法及び治療用組み合わせの一部の実施形態によれば、細菌組成物は、対象へのＣＴＬＡ−４阻害薬の投与と少なくとも部分的に並行して対象に投与される。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、第１の期間に対象に投与され、続いて、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、第２の期間に対象に投与され、任意に、細菌組成物はさらに、該第２の期間の少なくとも一部の間に、任意に、第２の期間全体にわたって対象に投与される。特定の実施形態によれば、細菌組成物は、限定されないが、約２週間などの第１の期間に対象に投与され、続いて、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、限定されないが、約３週間などの第２の期間に対象に投与される。特定の実施形態によれば、細菌組成物は、限定されないが、約２週間などの第１の期間に対象に投与され、続いて、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、限定されないが、約３週間などの第２の期間に対象に投与され、細菌組成物はさらに、該第２の期間の少なくとも一部の間に、好ましくは、第２の期間全体にわたって対象に投与される。
【０１００】
一部の実施形態によれば、細菌組成物及びＣＴＬＡ−４阻害薬は、同じ頻度で投与されない。非限定例では、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、３週間毎に静脈内投与されるが、細菌組成物は、毎日または隔日で経口投与される。一部の実施形態によれば、細菌組成物は、第１の期間に対象に投与され、続いて、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、第２の期間に対象に投与され、任意に、細菌組成物はさらに、該第２の期間の少なくとも一部の間に対象に投与され、細菌組成物の投与の頻度は、第１の期間及び第２の期間において異なる。
【０１０１】
本発明の治療用組み合わせの細菌組成物
一般に、本発明の治療用組み合わせに含まれる組成物は細菌を含む。本発明の好ましい実施形態では、細菌組成物は、凍結乾燥形態で製剤化される。例えば、本発明の細菌組成物は、本発明の細菌株を含む、顆粒剤またはゼラチンカプセル剤、例えば、ハードゼラチンカプセル剤、を含んでもよい。
【０１０２】
好ましくは、本発明の細菌組成物は、凍結乾燥された細菌を含む。細菌の凍結乾燥は、確立された手順であり、関連するガイダンスは、例えば、参考文献［２６−２８］で利用可能である。
【０１０３】
あるいは、本発明の細菌組成物は、生きている活性な細菌培養物を含んでもよい。
【０１０４】
一部の実施形態では、本発明の細菌組成物中の細菌株は、不活化されておらず、例えば、熱不活化されていない。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物中の細菌株は、死滅しておらず、例えば、熱死滅していない。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物中の細菌株は、弱毒化されておらず、例えば、熱弱毒化されていない。例えば、一部の実施形態では、本発明の細菌組成物中の細菌株は、死滅、不活化、及び／または弱毒化されていない。例えば、一部の実施形態では、本発明の細菌組成物中の細菌株は、生きている。例えば、一部の実施形態では、本発明の細菌組成物中の細菌株は、生存可能である。例えば、一部の実施形態では、本発明の細菌組成物中の細菌株は、腸に部分的または全体的にコロニー形成することが可能である。例えば、一部の実施形態では、本発明の細菌組成物中の細菌株は、生存可能であり、腸に部分的または全体的にコロニー形成することが可能である。
【０１０５】
一部の実施形態では、細菌組成物は、生きている細菌株及び死滅している細菌株の混合物を含む。
【０１０６】
好ましい実施形態では、本発明の治療用組み合わせの細菌組成物は、細菌株の腸への送達を可能にするためにカプセル化される。カプセル化は、例えば、ｐＨの変化により引き起こされ得る圧力、酵素活性、または物理的崩壊などの化学的または物理的刺激で破裂することにより、標的位置に送達されるまで、細菌組成物を分解から保護する。任意の適切なカプセル化方法が使用されてもよい。例示的なカプセル化技術は、多孔質マトリックス内への閉じ込め、固体担体表面への付着または吸着、凝集または架橋剤による自己凝集、及び微孔性膜またはマイクロカプセルの裏側への機械的封じ込めを含む。本発明の組成物を調製するために有用であり得るカプセル化に関するガイダンスは、例えば、参考文献［２９］及び［３０］で入手可能である。
【０１０７】
細菌組成物は、経口投与されてもよく、錠剤、カプセル剤、または散剤の形態であってよい。カプセル化された製品は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍが嫌気性菌であるので好ましい。他の成分（例えば、ビタミンＣなど）は、送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成及びｉｎ  ｖｉｖｏでの生存を改善するために、脱酸素剤及びプレバイオティック基質として含まれてもよい。あるいは、本発明のプロバイオティック組成物は、乳もしくは乳清ベースの発酵乳製品などの食品もしくは栄養製品、または医薬品として経口投与されてもよい。
【０１０８】
細菌組成物は、プロバイオティクスとして製剤化されてもよい。
【０１０９】
本発明の細菌組成物は、治療有効量の本発明の細菌株を含む。細菌株の治療的有効量は、患者において有益な効果を発揮するのに十分である。細菌株の治療的有効量は、患者の腸への送達及び／または患者の腸の部分的もしくは全体的なコロニー形成をもたらすのに十分であってよい。
【０１１０】
細菌の好適な１日用量は、例えば、成人の場合、約１ｘ１０３〜約１ｘ１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）；例えば、約１ｘ１０７〜約１ｘ１０１０ＣＦＵ；別の例では、約１ｘ１０６〜約１ｘ１０１０ＣＦＵであってよい。
【０１１１】
特定の実施形態では、細菌組成物は、組成物の重量に対して約１ｘ１０６〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／ｇ；例えば、約１ｘ１０８〜約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇの量の細菌株を含有する。用量は、例えば、１ｇ、３ｇ、５ｇ、及び１０ｇであってよい。
【０１１２】
本発明の細菌組成物などのプロバイオティックは、任意に、少なくとも１つの好適なプレバイオティック化合物と組み合わされてもよい。プレバイオティック化合物は通常、上部消化管で分解または吸収されない、オリゴ糖または多糖などの非消化性炭水化物、または糖アルコールである。既知のプレバイオティクスは、イヌリン及びトランスガラクトオリゴ糖などの市販製品を含む。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明のプロバイオティック細菌組成物は、全重量組成物に対して約１〜約３０重量％（例えば、５〜２０重量％）の量のプレバイオティック化合物を含む。炭水化物は、フルクトオリゴ糖（またはＦＯＳ）、短鎖フルクトオリゴ糖、イヌリン、イソマルトオリゴ糖、ペクチン、キシロオリゴ糖（またはＸＯＳ）、キトサンオリゴ糖（またはＣＯＳ）、β−グルカン、アラビアガム変性及び耐性デンプン、ポリデキストロース、Ｄ−タガトース、アカシア繊維、イナゴマメ、オーツ麦、ならびに柑橘類繊維からなる群より選択されてもよい。一態様では、プレバイオティクスは、短鎖フルクトオリゴ糖（ＦＯＳｓ−ｃ．ｃとして以下の本明細書で示される単純な場合）；該ＦＯＳｓ−ｃ．ｃ．は、一般に、テンサイ糖の転化により得られ且つ３つのグルコース分子が結合するサッカロース分子を含む消化可能な炭水化物ではない。
【０１１４】
本発明の細菌組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体を含んでもよい。そのような好適な賦形剤の例は、参考文献［３１］に見出され得る。治療的使用のための許容される担体または希釈剤は、医薬分野で周知であり、例えば、参考文献［３２］で記載される。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図された投与経路及び標準的な薬務に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の好適な結合剤（複数可）、滑沢剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含んでもよい。好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水ラクトース、フリーフローラクトース、β−ラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールを含むが挙げられる。好適な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。医薬組成物中に、保存剤、安定剤、染料、さらには、香料が提供されてもよい。保存料の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁剤もまた使用されてもよい。
【０１１５】
本発明の細菌組成物は、食品として製剤化されてもよい。例えば、食品は、本発明の治療効果に加えて、栄養サプリメントなどの、栄養上の利点を提供してもよい。同様に、食品は、医薬組成物よりも一般的な食品により類似することにより、本発明の組成物の味を良くするように、または組成物を、消費するのにより魅力的にするように製剤化されてもよい。特定の実施形態では、本発明の組成物は、乳系製品として製剤化される。「乳系製品」という用語は、様々な脂肪含有量を有する任意の液体または半固体乳または乳清系製品を意味する。乳系製品は、例えば、牛乳、山羊乳、羊乳、脱脂乳、全乳、粉乳から再混合した乳、及びいかなる加工もない乳清、または加工製品、例えば、ヨーグルト、凝乳、カード、サワーミルク、サワーホールミルク、バターミルク、及び他のサワーミルク製品であり得る。別の重要な群は、例えば、乳清飲料、発酵乳、練乳、乳児または乳児用乳などの乳飲料；フレーバーミルク、アイスクリーム；お菓子などの乳含有食品を含む。
【０１１６】
特定の実施形態では、本発明の細菌組成物は、単一の細菌株または種を含有し、他の任意の細菌株または種を含有しない。そのような細菌組成物は、他の細菌株または種を僅少な量または生物学的に無関係な量のみ含んでもよい。そのような細菌組成物は、他の種の生物を実質的に含まない培養物であってよい。従って、一部の実施形態では、治療用組み合わせの細菌組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来の１または２以上の株を含み、他の任意の種由来の細菌を含有しないか、または別の種由来の細菌を僅少な量もしくは生物学的に無関係な量のみ含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、複数の細菌株または種を含む。例えば、一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、同じ種内由来の複数の株（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５株超）を含む、任意に、他の任意の種由来の細菌を含有しない。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、同じ種内由来の５０株未満（例えば、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、または３株未満）を含み、任意に、他の任意の種由来の細菌を含有しない。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、同じ種内由来の１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、６〜３０、６〜１５、１６〜２５、または３１〜５０株を含み、任意に、他の任意の種由来の細菌を含有しない。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、同じ種内由来の複数の種（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２３、２５、３０、３５、または４０種超）を含み、任意に、他の任意の属由来の細菌を含有しない。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、同じ属内由来の５０種未満（例えば、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、８、７、６、５、４、または３種未満）を含み、任意に、他の任意の属由来の細菌を含有しない。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、同じ属内由来の１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、６〜３０、６〜１５、１６〜２５、または３１〜５０種を含み、任意に、他の任意の属由来の細菌を含有しない。本発明の組み合わせに使用するための細菌組成物は、上述の任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１１８】
一部の実施形態では、細菌組成物は、微生物コンソーシアムを含む。例えば、一部の実施形態では、細菌組成物は、微生物コンソーシアムの一部として、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである、配列番号２と少なくとも９５％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株を含む。例えば、一部の実施形態では、細菌株は、それが腸内でｉｎ  ｖｉｖｏで共生し得る他の属由来の１または２以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、または２０）の他の細菌株と組み合わせて、細菌組成物中に存在する。例えば、一部の実施形態では、細菌組成物は、異なる属由来の細菌株と組み合わせて、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである、配列番号２と少なくとも９５％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する細菌株を含む。一部の実施形態では、微生物コンソーシアムは、単一の生物、例えば、ヒト、の糞便試料から得られた２つ以上の細菌株を含む。一部の実施形態では、微生物コンソーシアムは、自然界では一緒にみられない。例えば、一部の実施形態では、微生物コンソーシアムは、少なくとも２つの異なる生物の糞便試料から得られた細菌株を含む。一部の実施形態では、２つの異なる生物は、同じ種、例えば、２つの異なるヒト、例えば、２つの異なるヒト乳児に由来する。一部の実施形態では、２つの異なる生物は、幼児ヒト及び成人ヒトである。一部の実施形態では、２つの異なる生物は、ヒト及び非ヒト哺乳動物である。
【０１１９】
一部の実施形態では、本発明の細菌組成物はさらに、ＭＲＸ５１８株と同じ安全性及び治療有効性特性を有するが、ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託されたＭＲＸ５１８ではないか、またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍではない細菌株を含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、細菌組成物に使用するための細菌株は、ヒト乳児の糞便から得られる。細菌組成物が複数の細菌株を含む一部の実施形態では、細菌株全ては、ヒト乳幼児の糞便から得られるか、または他の細菌株は、存在する場合、僅少な量でのみ存在する。細菌は、ヒト乳児の糞便から得られ、細菌組成物に使用された後に、培養されていてもよい。
【０１２１】
上述のように、一部の実施形態では、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである、配列番号２と少なくとも９５％同一である１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１または２以上の細菌株は、本発明の細菌組成物中に治療活性剤（複数可）のみが存在する。一部の実施形態では、細菌組成物中の細菌株（複数可）は、組成物中唯一の治療活性剤（複数可）である。
【０１２２】
本発明による使用のための細菌組成物は、販売承認を必要としても、必要としなくてもよい。
【０１２３】
特定の実施形態では、本発明は、上記の細菌組成物を提供し、該細菌株は、凍結乾燥される。特定の実施形態では、本発明は、上記の細菌組成物を提供し、該細菌株は、噴霧乾燥される。特定の実施形態では、本発明は、上記の細菌組成物を提供し、細菌株は、凍結乾燥または噴霧乾燥され、それは、生きている。特定の実施形態では、本発明は、上記の細菌組成物を提供し、細菌株は、凍結乾燥または噴霧乾燥され、それは、生存可能である。特定の実施形態では、本発明は、上記の細菌組成物を提供し、細菌株は、凍結乾燥または噴霧乾燥され、それは、腸に部分的または全体的にコロニー形成することが可能である。特定の実施形態では、本発明は、上記の細菌組成物を提供し、細菌株は、凍結乾燥または噴霧乾燥され、それは、生存可能であり、腸に部分的または全体的にコロニー形成することが可能である。
【０１２４】
一部の場合では、凍結乾燥または噴霧乾燥された細菌株は、投与前に再構成される。一部の場合では、再構成は、本明細書に記載の希釈剤の使用によるものである。
【０１２５】
本発明の細菌組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。
【０１２６】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明に使用される細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、乳癌である。好ましい実施形態では、がんは、乳癌である。好ましい実施形態では、がんは、ＩＶ期乳癌である。
【０１２７】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明に使用される細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、肺癌である。好ましい実施形態では、がんは、肺癌である。
【０１２８】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明に使用される細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、肝臓癌である。好ましい実施形態では、がんは、肝癌（肝細胞癌）である。
【０１２９】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、結腸癌である。好ましい実施形態では、がんは、結腸直腸腺癌である。
【０１３０】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、がん腫である。
【０１３１】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、非免疫原性がんである。
【０１３２】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、腺癌、腺腫瘍、カルチノイド腫瘍、未分化型がん腫からなる群より選択される。
【０１３３】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、肝芽腫、胆管癌、胆管細胞嚢胞腺癌、またはウイルス感染に起因する肝臓癌からなる群より選択される。
【０１３４】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり；細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、浸潤性腺管癌、非浸潤性乳管癌、または浸潤性小葉癌からなる群より選択される。
【０１３５】
特定の実施形態では、細菌組成物は、本発明の細菌株；及び薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物であり、細菌株は、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて対象に投与される時に、障害を処置するのに十分な量のものであり；障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼内メラノーマ、網膜芽腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、小児視覚経路及び視床下部、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、咽頭癌、下垂体腺腫、形質細胞新生物、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌からなる群より選択される。
【０１３６】
特定の実施形態では、細菌組成物中の細菌株の量は、組成物の重量に対して１グラム当たり約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位である。
【０１３７】
特定の実施形態では、細菌組成物は、１ｇ、３ｇ、５ｇ、または１０ｇの用量で投与される。
【０１３８】
特定の実施形態では、細菌組成物は、経口、経直腸、皮下、経鼻、口内、及び舌下からなる群より選択される方法で投与される。
【０１３９】
特定の実施形態では、細菌組成物は、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、及びソルビトールからなる群より選択される担体を含む。
【０１４０】
特定の実施形態では、本発明は、エタノール、グリセロール、及び水からなる群より選択される希釈剤を含む細菌組成物を提供する。
【０１４１】
特定の実施形態では、細菌組成物は、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、フリーフローラクトース、β−ラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムからなる群より選択される賦形剤を含む。
【０１４２】
特定の実施形態では、細菌組成物はさらに、防腐剤、抗酸化剤、及び安定剤のうちの少なくとも１つを含む。
【０１４３】
特定の実施形態では、細菌組成物は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルからなる群より選択される保存剤を含む。
【０１４４】
特定の実施形態では、細菌組成物が約４℃または約２５℃で密閉容器に保存され且つ容器が５０％の相対湿度を有する雰囲気中に配置される時、細菌株の少なくとも８０％は、少なくとも約１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、１．５年、２年、２．５年、または３年の期間後に存続する。
【０１４５】
一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、密閉容器で提供される。一部の実施形態では、密封容器は、サッシェまたはボトルである。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、シリンジで提供される。
【０１４６】
細菌；組成物は、一部の実施形態では、医薬製剤として提供されてもよい。例えば、細菌組成物は、錠剤またはカプセル剤として提供されてもよい。一部の実施形態では、カプセルは、ゼラチンカプセル（「ジェルキャップ」）である。
【０１４７】
一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、経口投与される。一部の実施形態では、本発明の細菌組成物は、経口投与に適する医薬製剤に製剤化される。経口投与は、化合物が胃腸管に入るような嚥下、及び／または化合物が口から直接血流に入る口内、舌側、もしくは舌下投与を含んでもよい。
【０１４８】
経口投与に適する医薬製剤としては、固体プラグ、固体微粒子、錠剤などの半固体及び液体（多相または分散系を含む）；マルチもしくはナノ粒子、液剤（例えば、水溶液）、乳剤、または散剤を含有するソフトまたはハードカプセル剤；トローチ剤（液体入りを含む）；チュアブル錠；ジェル剤；高速分散剤形；フィルム剤；膣坐剤；スプレー剤；及び頬／粘膜付着性パッチが挙げられる。
【０１４９】
一部の実施形態では、医薬製剤は、腸溶性製剤、すなわち、経口投与による本発明の組成物の腸への送達に適する胃耐性製剤（例えば、胃のｐＨに耐性）である。腸溶性製剤は、細菌または組成物の別の構成成分が酸感受性であり、例えば、胃条件下で分解する傾向がある時、特に有用であり得る。
【０１５０】
一部の実施形態では、腸溶性製剤は、腸溶性コーティングを含む。一部の実施形態では、製剤は、腸溶性コーティングされた剤形である。例えば、製剤は、腸溶性コーティングされた錠剤または腸溶性コーティングされたカプセル剤などであってよい。腸溶性コーティングは、従来の腸溶性コーティング、例えば、経口送達用の錠剤、カプセル剤などのための従来のコーティングであってよい。製剤は、フィルムコーティング、例えば、腸溶性ポリマーの薄膜層、例えば、酸不溶性ポリマー、を含んでもよい。
【０１５１】
一部の実施形態では、腸溶性製剤は、腸溶性コーティングを必要とせずに、本質的に腸溶性、例えば、胃耐性である。従って、一部の実施形態では、製剤は、腸溶性コーティングを含まない腸溶性製剤である。一部の実施形態では、製剤は、サーモゲル材料から作製されたカプセル剤である。一部の実施形態では、サーモゲル材料は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）などのセルロース系材料である。一部の実施形態では、カプセル剤は、いかなるフィルム形成ポリマーも含有しないシェルを含む。一部の実施形態では、カプセル剤は、シェルを含み、シェルは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース含み、任意のフィルム形成ポリマーを含まない（例えば、［３３］を参照のこと）。一部の実施形態では、製剤は、本質的に腸溶性カプセル剤（例えば、カプスゲル製のＶｃａｐｓ（登録商標））である。
【０１５２】
一部の実施形態では、製剤は、ソフトカプセル剤である。ソフトカプセル剤は、例えば、グリセロール、ソルビトール、マルチトール、及びポリエチレングリコールなどの軟化剤の添加のために、カプセルシェル中に存在し得るカプセル剤であり、特定の弾性及び柔軟性を有する。ソフトカプセル剤は、例えば、ゼラチンまたはデンプンベースで製造することができる。ゼラチンベースのソフトカプセルは、種々のサプライヤーから市販される。例えば、経口または直腸などの投与方法に応じて、ソフトカプセル剤は、種々の形状を有することができ、それらは、例えば、円形、楕円形、長方形、または魚雷型とすることができる。ソフトカプセルは、例えば、シェラー加工、アコゲル加工、もしくは液滴などの従来の加工、またはブロー成形加工で製造することができる。
【０１５３】
培養方法
本発明に使用するための細菌株は、例えば、参考文献［３４−３６］に詳述される標準的な微生物学技術を使用して培養することができる。
【０１５４】
培養に使用するための固体または液体培地は、ＹＣＦＡ寒天またはＹＣＦＡ培地であってよい。ＹＣＦＡ培地は、（１００ｍｌ当たり、概算値）：カシトン（１．０ｇ）、酵母抽出物（０．２５ｇ）、ＮａＨＣＯ３（０．４ｇ）、システイン（０．１ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＮａＣｌ（０．０９ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．０９ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００９ｇ）、ＣａＣｌ２（０．００９ｇ）、レサズリン（０．１ｍｇ）、ヘミン（１ｍｇ）、ビオチン（１μｇ）、コバラミン（１μｇ）、ｐ−アミノ安息香酸（３μｇ）、葉酸（５μｇ）、及びピリドキサミン（１５μｇ）を含んでもよい。
【０１５５】
ワクチン組成物に使用するための細菌株
本発明の細菌組成物の細菌株が、ＣＴＬＡ−４阻害薬と組み合わせて投与される時に、がんの処置または予防に有用であることを、本発明者らは確認している。これは、本発明の細菌株が宿主の免疫系に及ぼす影響の結果である可能性が高い。特定の実施形態では、細菌株は、生存可能である。特定の実施形態では、細菌株は、腸に部分的または全体的にコロニー形成することが可能である。特定の実施形態では、細菌株は、生存可能であり、腸に部分的または全体的にコロニー形成することが可能である。他の特定の実施形態では、細菌株は、死滅、不活化、または弱毒化されてもよい。特定の実施形態では、細菌組成物は、皮下注射などの注射による投与のためのものである。
【０１５６】
ＣＴＬＡ−４阻害薬
本発明の治療的組み合わせは、少なくとも１つのＣＴＬＡ−４阻害薬を含む。上記のように、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、免疫チェックポイントを阻害し、それにより、身体の免疫系が、がん細胞を含む身体自体の細胞として認識される細胞を攻撃することが可能になる化合物である。
【０１５７】
既知のＣＴＬＡ−４阻害薬としては、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４またはＣＤ１５２）受容体を阻害する化合物が挙げられる。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、ＣＴＬＡ−４により媒介されるシグナル伝達を低減または阻害する薬剤である。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、ＣＴＬＡ−４により媒介されるシグナル伝達を低減または阻害することが可能な抗体、その抗原結合フラグメント、またはアンタゴニストである。
【０１５８】
一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。本発明において、ＣＴＬＡ−４阻害薬として有用な抗体または抗体フラグメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、非ヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントとすることができる。好ましい実施形態によれば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ−４に対して高い結合特異性を有する。
【０１５９】
一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１６０】
一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体は、商品名ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）で、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより市販されるイピリムマブである。
【０１６１】
「抗体」という用語は、リガンドのその受容体への結合の阻害、または受容体のリガンド誘導性シグナル伝達の阻害などの、所望の生物学的活性を示す任意の形態の抗体を指す。したがって、「抗体」は、最も広い意味で使用され、特に、モノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を網羅するが、これらに限定されない。一部の実施形態によれば、本発明で使用される抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、単離抗体である。
【０１６２】
本出願を通して互換的に使用される「抗体フラグメント」、「抗原結合フラグメント」、及び「抗体結合フラグメント」という用語は、通常、親抗体の抗原結合または可変領域の少なくとも一部（例えば、１または２以上のＣＤＲ）を含む抗原結合フラグメントを意味する。抗体フラグメントは、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する。通常、抗体フラグメントは、活性がモル基準で表される時、親結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、抗体フラグメントは、標的に対する親抗体の結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％以上を保持する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃ−Ｆｖが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【０１６４】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１つの軽鎖ならびにＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン、さらに、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン間の領域を含有する１つの重鎖の一部を含有し、その結果、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成するように、鎖間ジスルフィド結合を、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖間に形成することができる。
【０１６５】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン間に定常領域の一部を含有する２つの軽鎖及び２つの重鎖を含有し、その結果、鎖間ジスルフィド結合が、２つの重鎖間に形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの重鎖間のジスルフィド結合により結合している２つのＦａｂ’フラグメントからなる。
【０１６６】
「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むが、定常領域を欠く。
【０１６７】
「一本鎖Ｆｖ抗体」（または「ｓｃＦｖ抗体」）は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。
【０１６８】
「単離」抗体は、その自然環境の構成成分から分離及び／または回収されている抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ローリー法により決定される場合、抗体の９５重量％超まで、最も好ましくは、９９重量％超まで、精製される。
【０１６９】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。
【０１７０】
「キメラ」抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において対応する配列と同一または相同であるが、残りの鎖（複数可）が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において対応する配列と同一または相同である抗体、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを指す。
【０１７１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ、または所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト霊長類、の超可変領域由来の残基により置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含んでもよい。さらに抗体の性能を除去するために、これらの修飾がなされる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたはほぼ全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し且つＦＲ領域の全てまたはほぼ全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、通常、２つの可変ドメインのほぼ全てを含むであろう。任意に、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリンのもの、のうちの少なくとも一部を含むであろう。
【０１７２】
本明細書で使用される「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。
【０１７３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきでない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により作製されても、組み換えＤＮＡ法により作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【０１７４】
本明細書で使用される「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、２つの分子、すなわち、抗体及び抗原の間のランダムでない会合を指す。一部の実施形態によれば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗原結合ドメインを介して、＜１０”５Ｍの結合親和性（Ｋｄ）で抗原に特異的に結合する。あるいは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗原結合ドメインを介して、＜１０”６Ｍまたは＜１０”ＭのＫｄで抗原に結合し得る。Ｋｄは、本明細書で使用される場合、会合速度対解離速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して決定されてもよい。
【０１７５】
一部の実施形態によれば、治療用組み合わせのＣＴＬＡ−４阻害薬は、全身投与される。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、全身投与用に製剤化される。
【０１７６】
別の実施形態によれば、全身投与は、非経口経路を介するものである。一部の実施形態によれば、非経口投与用の本発明のＣＴＬＡ−４阻害薬の調製物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、または乳濁液を含み、それぞれは、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１７７】
一部の実施形態によれば、非経口投与は、静脈内、動脈内、血管壁への投与、筋肉内、腹腔内、皮内、硝子体内、経皮、または皮下投与である。上記の投与経路のそれぞれは、本発明の別々の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、治療用組み合わせのＣＴＬＡ−４阻害薬は、静脈内投与される。
【０１７８】
一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬の全身投与は、注射によるものである。注射による投与のために、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、水溶液中で、例えば、限定されないが、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩緩衝液を含む生理学的に適合性のある緩衝液中で、製剤化されてもよい。注射用の製剤は、単位剤形、例えば、アンプル中、または任意に、保存剤を含む複数回投与容器中で提供されてもよい。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために、好適な安定剤または活性成分の溶解度を増加させる薬剤を含有してもよい。
【０１７９】
一部の実施形態によれば、非経口投与は、ボーラス注射で実施される。他の実施形態によれば、非経口投与は、連続注入で実施される。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、制御放出システムで送達され、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式用に製剤化される。一実施形態では、ポンプが使用される。さらに別の実施形態では、制御放出システムは、治療標的の近くに配置することができ、それにより、全身投与の一部しか必要としない。
【０１８０】
治療用組み合わせ
一部の実施形態によれば、対象のがんの処置または予防方法に使用するための本発明の治療用組み合わせが本明細書で提供される。一部の実施形態によれば、対象のがんの処置方法に使用するための本発明の治療用組み合わせが本明細書で提供される。
【０１８１】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせを使用して処置または予防されるべきがんは、メラノーマ、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び頭頸部癌からなる群より選択される。一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせを使用して処置または予防されるべきがんは、乳癌、肺癌、結腸癌、及び肝臓癌からなる群より選択される。
【０１８２】
一部の実施形態によれば、がんの処置は、対象の腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の予防のうちの少なくとも１つに関する。一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせまたは方法は、がんに罹患した対象の腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、転移の予防、または血管新生の予防のうちの少なくとも１つに使用するためのものである。
【０１８３】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む。
【０１８４】
一部の実施形態によれば、治療用組み合わせの細菌組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ以外の他の任意の種由来の細菌を含有しないか、または別の種由来の細菌を僅少な量もしくは生物学的に無関係な量のみ含む。一部の実施形態によれば、治療用組み合わせの細菌組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の単一の株のみを含有し、他の任意の種由来の細菌を含有しないか、または別の種由来の細菌を僅少な量もしくは生物学的に無関係な量のみ含む。一部の実施形態によれば、治療用組み合わせの細菌組成物は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株を含む。一部の実施形態によれば、治療用組み合わせの細菌組成物は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の単一株を含み、他の任意の種由来の細菌を含有しないか、または別の種由来の細菌を僅少な量もしくは生物学的に無関係な量のみ含む。
【０１８５】
一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、場合により、少なくとも１つの薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を含む組成物中に存在する。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、抗体である。一部の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１８６】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、（ａ）組成物が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の単一株を含み、任意に、組成物が他の任意の種を含有しないか、または別の種由来の細菌を僅少な量もしくは生物学的に無関係な量のみ含むＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む。
【０１８７】
好ましくは、本発明の治療用組み合わせは、（ａ）受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む。一部の実施形態によれば、対象のがんの処置または予防方法に使用するための治療用組み合わせが本明細書で提供され、治療用組み合わせは、（ａ）受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物、及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む。
【０１８８】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、（ａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株を含む組成物；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬、を含み、任意に、阻害薬は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１８９】
一部の実施形態によれば、本発明の治療用組み合わせは、（ａ）任意に、組成物が他の任意の種及び／もしくは株由来の細菌を含有しないか、または別の種及び／もしくは株由来の細菌を僅少な量もしくは生物学的に無関係な量のみ含む、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の細菌株、任意に、受託番号ＮＣＩＭＢ４２４８８として寄託された株を含む組成物；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む。
【０１９０】
一部の実施形態によれば、本明細書で開示の治療用組み合わせのうちのいずれか１つを使用して対象のがんを処置及び／または予防するための方法が本明細書で提供される。一部の実施形態によれば、本発明は、対象のがんの処置及び／または予防に使用するための、本明細書で開示の治療用組み合わせのうちのいずれか１つを提供する。
【０１９１】
全般
本発明の実施は、別途指示のない限り、当業者の技能範囲内の化学、生化学、分子生物学、免疫学、及び薬理学の従来の方法を用いるであろう。そのような技術は、文献で完全に説明される。例えば、参考文献［３７］及び［３８〜４４］などを参照のこと。
【０１９２】
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘで排他的に構成されても、追加のものを含んでもよく、例えば、Ｘ＋Ｙである。
【０１９３】
数値ｘに関する「約」という用語は、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１９４】
「実質的に」という用語は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、「実質的に」という用語は、本発明の定義から省略されてもよい。
【０１９５】
２つのヌクレオチド配列間のパーセンテージ配列同一性への言及は、アラインされる時、ヌクレオチドのパーセンテージが、２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメント及びパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野で既知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献［４５］のセクション７．７．１８に記載されるもの、を使用して決定することができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティー１２及びギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２を有するアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムで決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献［４６］に開示される。
【０１９６】
具体的な記載のない限り、多数のステップを含むプロセスまたは方法は、方法の最初または最後に追加のステップを含んでも、追加の介在ステップを含んでもよい。さらに、適切であれば、ステップは、組み合わされても、省略されても、別の順序で実施されてもよい。
【０１９７】
本発明の種々の実施形態が本明細書に記載される。なお、各実施形態に明記される特徴は、さらなる実施形態を提供するために、他の明記される特徴と組み合わせ得ることが理解されるであろう。特に、好適な、代表的な、または好ましいと本明細書で強調された実施形態は、互いに組み合わされてもよい（それらが相互に排他的である時を除く）。
【０１９８】
発明を実施するための様式
実施例１−がんのマウスモデルにおける細菌接種の有効性
概要
この研究は、本発明による細菌株を含む組成物の有効性を４つの腫瘍モデルで試験した。
【０１９９】
材料
試験物質−細菌株＃ＭＲＸ５１８。
【０２００】
参照物質−抗ＣＴＬＡ−４抗体（クローン：９Ｈ１０、カタログ：ＢＥ０１３１、アイソタイプ：シリアンハムスターＩｇＧ１、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）。
【０２０１】
試験及び参照物質ビヒクル−細菌培地（酵母抽出物、カシトン、脂肪酸培地（ＹＣＦＡ））。マウスへの注射の毎日、抗体をＰＢＳで希釈した（参照：ＢＥ１４−５１６Ｆ、Ｌｏｎｚａ、フランス）。
【０２０２】
処置用量−細菌：２００μＬ中に２ｘ１０８。ａ−ＣＴＬＡ−４を１０ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊで注射した。マウスの最新の体重に応じて、１０ｍＬ／ｋｇ／ａｄｍの投与体積で抗ＣＴＬＡ−４を投与した（すなわち、２０ｇの体重のマウスの場合、２００μＬの試験物質が投与されることになる）。
【０２０３】
投与経路−カニューレを介した経口強制飼養（経口、ＰＯ）で細菌接種材料を投与した。カニューレを毎日除染した。抗ＣＴＬＡ−４をマウスの腹腔に注射した（腹腔内、ＩＰ）。
【０２０４】
細菌株の培養条件−細菌株の培養条件は以下の通りであった：
●（調製された１０ｍＬのＥ＆Ｏラボボトルから）Ｈｕｎｇａｔｅチューブに１０ｍＬのＹＣＦＡをピペットで移す
●シリンジ投入及び排出システムを使用して、チューブを密閉し、ＣＯ２でフラッシュする
●Ｈｕｎｇａｔｅチューブをオートクレーブする
●冷却した時、Ｈｕｎｇａｔｅチューブを１ｍＬのグリセロールストックで接種する
●静的な３７℃のインキュベーターに約１６時間定置する。
●次の日、１ｍＬのこの継代培養を取り、１０ｍＬのＹＣＦＡの接種し（再度予熱されたフラッシュフＨｕｎｇａｔｅチューブ、全て２回ずつ）
●３７℃の静置インキュベーターに５〜６時間定置する
【０２０５】
がん細胞株及び培養条件−
使用された細胞株は、下表に詳述される：
【表１】
2021510688.tif 000003
【０２０６】
過形成乳腺肺胞結節の移植後のＢＡＬＢ／ｃＣＲＧＬマウスで生じた移植可能なマウス乳癌から、ＥＭＴ−６細胞株を樹立した［４７］。
【０２０７】
原発性ルイス肺癌の移植に起因する腫瘍を有するＣ５７ＢＬマウスの肺から、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）細胞株を樹立した［４８］。
【０２０８】
Ｈｅｐａ  １−６細胞株は、Ｃ５７／Ｌマウスで生じたＢＷ７７５６マウス肝癌の派生物である［４９］。
【０２０９】
細胞培養条件−全ての細胞株を、加湿雰囲気（５％ＣＯ２、９５％の空気）中、３７℃で単層として成長させた。培地及び補助剤は、下表に示される。
【表２】
2021510688.tif 000004
【０２１０】
実験的使用のために、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中、トリプシン−ベルセン（参照：ＢＥ１７−１６１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）で５分間処理することにより、接着腫瘍細胞を培養フラスコから分離し、完全培地を添加することにより中和した。細胞を血球計でカウントした。その生存率は、０．２５％のトリパンブルー排除アッセイにより評価されるであろう。
【０２１１】
動物の使用−
体重及び年齢が一致する健康な雌Ｂａｌｂ／Ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスを、ＥＭＴ６及びＲＥＮＣＡモデル実験のためにＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手した。
【０２１２】
体重及び年齢が一致する健康な雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬｌ６Ｊ）マウスを、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）及びＨｅｐａ１−６モデル実験のためにＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手した。
【０２１３】
ＦＥＬＡＳＡガイドラインに従って、動物をＳＰＦの健康状態に維持し、フランス及び欧州の規制と実験動物のケア及び使用に関するＮＲＣガイドに従った動物舎及び実験手順を適用した［５０、５１］。制御された環境条件下：温度２２±２℃、湿度５５±１０％、光周期（１２時間明／１２時間暗）、ＨＥＰＡフィルター処理空気、再循環なしの１時間当たり１５回の換気で、動物を飼育室に保持した。記載されるように、床敷材料、食物と水、環境的及び社会的充実（群飼）を有する無菌で十分なスペースを有する動物のエンクロージャーを提供した：換気ラック内の９００ｃｍ２ケージ（参照ｇｒｅｅｎ、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）、Ｅｐｉｃｅａ床敷（ＳＡＦＥ）、１０ｋＧｙの照射食餌（Ａ０４−１０、ＳＡＦＥ）、免疫能力のある齧歯動物のための完全食−Ｒ／Ｍ−Ｈ押出物、水筒の水。
【０２１４】
実験設計及び処置
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
処置スケジュール−最初の投与の開始は、Ｄ０とみなされた。Ｄ０に、移植していないマウスを、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、フランスクテルノン）を使用して、個々の体重に従って、９／８匹ずつ群に無作為化した。Ｄ０に、マウスは、ビヒクル（培地）または細菌株を受けた。Ｄ１４に、下記のように、全てのマウスにＥＭＴ−６腫瘍細胞を移植した。Ｄ２４に、陽性対照群のマウスは、抗ＣＴＬＡ−４抗体処置を受けた。
【０２１５】
処置スケジュールは、下表にまとめられる：
【表３】
2021510688.tif 000005
【０２１６】
動物の監視を下記のように実施した。
【０２１７】
動物におけるＥＭＴ６腫瘍の誘導−Ｄ１４に、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中の１ｘ１０６のＥＭＴ−６細胞をマウスの右脇腹に皮下注射することにより、腫瘍を誘導した。
【０２１８】
安楽死−各マウスが下記のように人道的エンドポイントに達した時、または投与の開始の最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０２１９】
抗腫瘍活性、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）モデル
処置スケジュール−最初の投与の開始は、Ｄ０とみなされた。Ｄ０に、移植していないマウスを、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、フランスクテルノン）を使用して、個々の体重に従って、９／８匹ずつ７群に無作為化した。Ｄ０に、マウスは、ビヒクル（培地）または細菌株を受けるであろう。Ｄ１４に、下記のように、全てのマウスにＬＬ／２腫瘍細胞を移植した。Ｄ２７に、陽性対照群のマウスは、抗ＣＴＬＡ−４抗体処置を受けた。
【０２２０】
処置スケジュールは、下表にまとめられる：
【表４】
2021510688.tif 000006
【０２２１】
動物の監視を下記のように実施した。
【０２２２】
動物におけるＬＬ／２（ＬＬＣ１）腫瘍の誘導−Ｄ１４に、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中の１ｘ１０６のＬＬ／２（ＬＬＣ１）細胞をマウスの右脇腹に皮下注射することにより、腫瘍を誘導した。
【０２２３】
安楽死−各マウスが下記のように人道的エンドポイントに達した時、または投与の開始の最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０２２４】
抗腫瘍活性、Ｈｅｐａ１−６モデル
処置スケジュール−最初の投与の開始は、Ｄ０とみなされた。Ｄ０に、移植していないマウスを、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、フランスクテルノン）を使用して、個々の体重に従って、９匹ずつ７群に無作為化した。Ｄ０に、マウスは、ビヒクル（培地）または細菌株を受けた。Ｄ１４に、下記のように、全てのマウスにＨｅｐａ  １−６腫瘍細胞を移植した。Ｄ１６に、陽性対照群のマウスは、抗ＣＴＬＡ−４抗体処置を受けた。
【０２２５】
処置スケジュールは、下表にまとめられる：
【表５】
2021510688.tif 000007
【０２２６】
動物の監視を下記のように実施した。
【０２２７】
脾臓内注射による動物のＨｅｐａ  １−６腫瘍細胞の同所性誘導−Ｄ１４に、５０μＬのＲＰＭＩ  １６４０培地中の１００万（１ｘ１０６）のＨｅｐａ  １−６腫瘍細胞を、脾臓内注射でマウスに移植した。要約すると、小さな左肋骨下脇腹を切開し、脾臓を露出させた。脾臓を無菌ガーゼパッド上に露出させ、視覚的制御下で、２７ゲージの針で細胞懸濁液を注入した。細胞接種後、脾臓を摘出した。
【０２２８】
安楽死−以下のセクションに記載されるように、人道的なエンドポイントに達した時、または投与開始の最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０２２９】
安楽死時の腫瘍量の評価−終了時に、肝臓を採取して、重量を測定した。
【０２３０】
抗腫瘍活性、ＲＥＮＣＡモデル
処置スケジュール−最初の投与の開始は、Ｄ０とみなされた。Ｄ０に、移植していないマウスを、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、フランスクテルノン）を使用して、個々の体重に従って、マウス９匹ずつ群に無作為化した。Ｄ０に、マウスは、ビヒクル（培地）または細菌株（２００μＬ中の２ｘ１０８、ＰＯ）を投与した。Ｄ１４に、下記のように、全てのマウスに、ＳＣを下脇腹の腹面に注射したＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を移植した。腫瘍が５０〜７０ｍｍ３の体積に達した時に、抗ＣＴＬＡ−４（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）及び抗ＰＤＬ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、１０ｍｇ／ｋｇ）を用いる処置を開始した。
【０２３１】
処置スケジュールは、下表にまとめられる：
【表６】
2021510688.tif 000008
【０２３２】
動物の監視を下記のように実施した。
【０２３３】
ＳＣ注射による動物におけるＲＥＮＣＡ腫瘍細胞の同所性誘導−Ｄ１４に、５０μＬのＲＰＭＩ  １６４０培地中の１００万（１ｘ１０６）のＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を、ＳＣ注射によりマウスの下脇腹の腹面に移植した。
【０２３４】
安楽死−以下のセクションに記載されるように、人道的なエンドポイントに達した時、または投与開始の最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
【０２３５】
安楽死時の腫瘍量の評価−終了時に、腫瘍を採取し、その体積を評価した。
【０２３６】
動物監視
臨床監視−腫瘍の長さ及び幅をキャリパーで週に２回測定し、腫瘍の体積をこの式で推定した［５２］：
【数１】
2021510688.tif 000009
【０２３７】
人道的エンドポイント［５３］：痛みの徴候、苦痛または苦痛：痛みの姿勢、痛みの顔貌、行動；正常体重の１０％を超えているが、２０００ｍｍ３を超えない腫瘍；歩行または栄養を妨げる腫瘍；潰瘍性腫瘍または組織びらん；３日間連続して２０％の体重減少；体調不良、衰弱、悪液質、脱水；外部刺激に対する自発的応答の長期にわたる欠如；急速な呼吸困難、貧血、著しい出血；神経学的徴候：旋回、痙攣、麻痺；体温の持続的な低下；腹部膨満。
【０２３８】
麻酔−イソフルランガス麻酔を、全ての手順に使用した：手術または腫瘍接種、ｉ．ｖ．注射、採血。ケタミン及びキシラジン麻酔を定位固定外科手術に使用した。
【０２３９】
鎮痛−カルプロフェンまたはマルチモーダルカルプロフェン／ブプレノルフィン鎮痛プロトコールを外科手術の重症度に適合させた。全ての痛みを伴う手順に対して、非薬理学的ケアを提供した。さらに、主治医の推奨で、研究を妨げない薬理学的ケア（トピック処置）を提供した。
【０２４０】
ガス麻酔の過剰投薬（イソフルラン）、続いて、頸部脱臼または瀉血により、安楽死−動物の安楽死を実施した。
【０２４１】
結果
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
結果は、図１Ａに示される。本発明の細菌株を用いる処置は、両方の陰性対照と比較して腫瘍体積の明らかな低減をもたらした。予想されるように、陽性対照はまた、腫瘍体積の低減をもたらした。
【０２４２】
ＭＲｘ０５１８が同系腫瘍モデルでその治療効果を伝達する機序をさらに解明するために、同系ＥＭＴ６腫瘍モデル研究で、ｅｘ  ｖｉｖｏ分析を実施した。腫瘍体積が前臨床腫瘍学研究の主要な測定値であるが、腫瘍は多くの場合、壊死性コアと共に活発に分裂する腫瘍細胞からなる。ＭＲｘ０５１８処置がＥＭＴ６腫瘍内にみられる壊死の程度に影響したかどうかを調べるために、腫瘍の中腹部のパラフィン切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。マウスＥＭＴ６乳癌モデルのＭＲｘ０５１８処置は、腫瘍内の壊死の断面積を増加させる傾向を示した（図１Ｂ、上パネル）。ＭＲｘ０５１８処置が腫瘍内の分裂細胞に影響したかどうかを調査するために、ＥＭＴ６腫瘍内で分裂している細胞のパーセンテージを推定するために、腫瘍の中腹部のパラフィン切片をＤＡＰＩカウンター染色と共に増殖タンパク質Ｋｉ６７で染色した。マウスＥＭＴ６乳癌モデルのＭＲｘ０５１８処置により、腫瘍内にみられる分裂細胞のパーセンテージが大幅に減少した（図１Ｂ、下のパネル、Ｐ＝０．０１９）。
【０２４３】
免疫細胞集団
ＭＲｘ５１８細菌株が免疫系を制御して抗腫瘍効果を誘発する能力を有するという仮説を調査するために、腫瘍微小環境のさらなる調査を、腫瘍のフローサイトメトリーを介して実施した。異なる処置群から切除された腫瘍を細かく切断した。１つの破片をフローサイトメトリー分析にかけた。腫瘍内に存在するＴリンパ球の相対的パーセンテージを評価するために、以下のマーカーを使用した：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、及びＦｏｘＰ３。
【０２４４】
フローサイトメトリーデータは、腫瘍内のリンパ球の相対パーセンテージが、ビヒクルまたは対照動物とそれぞれ比較した場合、ＭＲｘ０５１８及び抗ＣＴＬＡ−４の両方で処置された群において、わずかに減少したことを示す（図１Ｃ）。同様に、ＣＤ４＋細胞の相対パーセンテージは、ＭＲｘ０５１８及び抗ＣＴＬＡ−４で処置された動物において、減少するようにみえた一方、ＣＤ８＋細胞の相対パーセンテージは、大きさが異なるが、両群で反対の傾向を示した。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の相対パーセンテージは、抗ＣＴＬＡ４処置群において、ＭＲｘ０５１８処置動物におけるわずかな減少と比較された時、低かったが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の相対パーセンテージの低減は、抗ＣＴＬＡ−４処置群においてのみ顕著であった。ＣＤ８＋／ＦｏｘＰ３＋比は、抗ＣＴＬＡ−４処置群において、ＭＲｘ０５１８動物よりも大きな増加を示した。本明細書で提示されるこれらのデータは、細胞数を低減させるか、または腫瘍組織における抑制活性を減弱させることにより、抗ＣＴＬＡ−４抗体が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を標的とするという仮説をサポートする一方、ＭＲｘ０５１８の異なる作用機序を示唆する。
【０２４５】
サイトカイン産生
追加の腫瘍片を、血漿試料と共に、総タンパク質抽出及びその後のサイトカイン分析に使用した。腫瘍微小環境におけるＩＬ−１０、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０、及びＩＦＮ−γのタンパク質レベルを、ＭａｇＰｉｘテクノロジーで分析した。ＩＬ−１７Ａ及びＧＭ−ＣＳＦが、検出レベルを下回っていたが、他のマーカーは全て、妥当なレベルで発現された（図１Ｄ）。ＩＦＮ−γについて、ビヒクル群及び抗ＣＴＬＡ−４群間に有意差が観察された。ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０免疫マーカーの産生は、対照処置と比較してＭＲｘ５１８で処置された後に低減したようにみえた。
【０２４６】
同じ動物の血漿中のサイトカインレベルも評価した。ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０、及びＩＦＮ−γのタンパク質レベルを、ＭａｇＰｉｘテクノロジーで分析した。全体として、腫瘍誘導前または研究終了時のいずれかで、動物の血漿中のサイトカイン産生は、ほとんど検出されなかった（図１Ｅ）。ＶＥＧＦ及びＣＸＣＬ１０は、かなりのレベルで検出されたが、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＣＸＣＬ１、及びＣＸＣＬ２は、低レベルで検出された。ＩＬ−２、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１７Ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０、及びＩＦＮ−γは、試料で検出されなかった。０日目に、ＭＲｘ０５１８は、ＩＬ−６の産生を有意に増加させた。ＭＲｘ０５１８はまた、ＩＬ−２３産生を増加させるようにみえた。２２日目に、ＶＥＧＦ及びＣＸＣＬ１０は、抗ＣＬＴＡ−４群で有意に下方制御された。免疫細胞集団に対し示された結果と同様に、ＭＲｘ５１８及びＣＴＬＡ−４間の腫瘍及び血漿中のサイトカイン産生の差は、それらのそれぞれが別個の潜在的に相補的な機序に作用することを示唆する。
【０２４７】
回腸におけるＣＤ８α陽性細胞の局在
回腸の１０μｍの凍結切片をクリオスタット（ＣＭ１９５０  Ｌｅｉｃａ）で切断し、ポリＬリジンスライドにピックアップした。次に、切片を１時間空気乾燥し、氷冷メタノールで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１０％のＢＳＡ、ｐＨ７．２でブロックした後、１次抗体（ラット抗マウスＣＤ８α抗体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に一晩インキュベートした。
【０２４８】
翌朝、スライドをＰＢＳ中で洗浄し、２次抗体：ヤギ抗ラット抗体Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、室温で１時間染色した。別の洗浄ステップの後、スライドを、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で対比染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に搭載した。水銀蒸気ランプ、適切なフィルター、及びｘ２０のアポクロマート対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ顕微鏡を使用して、スライドを調査及び画像化した。ビヒクル、ＭＲｘ０５１８、及び抗ＣＴＬ４動物のスライドから得られた画像の例が示される（図１Ｆ−上のパネル：ＤＡＰＩ染色、下のパネル：ＣＤ８α染色）。
【０２４９】
２０匹の動物由来の視野を試験し、手動の露出時間を使用して、画像化した。解析された動物及び視野の数は、下表に示される。
【表７】
2021510688.tif 000010
【０２５０】
画像を以下の通り点数化した：陽性細胞が３以下の視野を０と点数化する一方、３以上の細胞を含む視野を１と点数化した。この分析の結果が示される（図１Ｇ）。
【０２５１】
抗ＣＤ８αで染色された回腸凍結切片は、ビヒクル群と比較して、ＭＲｘ０５１８及び抗ＣＴＬＡ−４で処置された動物の陰窩領域組織に局在するＣＤ８α陽性細胞数をより多く示した。
【０２５２】
この観察は、免疫応答の一部として、感染または炎症性微小環境の場合に腸内に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞と一致する。
【０２５３】
抗腫瘍活性、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）モデル
結果は、図２に示される。本発明の細菌株を用いる処置は、両方の陰性対照と比較して腫瘍体積の明らかな低減をもたらした。
【０２５４】
抗腫瘍活性、Ｈｅｐａ１−６モデル
結果は、図３Ａに示される。未処置の陰性対照は、肝臓重量がこの群において他の群よりも低かったので、予想通りに現れない。しかし、ビヒクル陰性対照及び陽性対照群は双方共に、ビヒクル単独で処置されたマウスが抗ＣＴＬＡ４抗体で処置されたマウスよりも肝臓が大きく、ビヒクル陰性対照群では腫瘍量が大きいので、予想通りに現れる。本発明の細菌株を用いる処置は、ビヒクル陰性対照群のマウスに対する肝臓重量（従って、腫瘍量）の明らかな低減につながった。
【０２５５】
抗腫瘍活性、ＲＥＮＣＡモデル
結果は、図３Ｂに示される。ＭＲｘ０５１８単独療法を用いる処置は、ビヒクル処置群と比較して、試験／対照が５１％（１８日目）の腫瘍体積を低減させた。パクリタキセル及び抗ＣＴＬＡ−４＋抗ＰＤＬ−１は、未処置群及びビヒクル群の両方と比較して、Ｄ１８及びＤ２２で腫瘍サイズの（ほぼ）完全な低減を示した。
【０２５６】
ＭＲＸ５１８株ががんの処置または予防に、特に、乳癌、肺癌、腎臓癌、及び肝臓癌の腫瘍体積を低減させるのに有用であり得ることを、これらのデータは示す。
【０２５７】
実施例２−ＰＣＲ遺伝子分析
細菌ＭＲＸ５１８の純粋な培養を、ＰＣＲ遺伝子解析で研究した。実験には２つの群があった：１）ＭＲＸ５１８は、宿主の細菌の影響を調査するために、ヒト結腸細胞（ＣａＣｏ２）と共培養された、及び、２）ＭＲＸ５１８は、炎症環境における細菌の影響を模倣するためにＩＬ１で刺激されたＣａＣｏ２細胞上で共培養された。両方のシナリオにおける効果を、遺伝子発現解析で評価した。結果は、以下に示される：
【表８】
2021510688.tif 000011
2021510688.tif 000012
【０２５８】
これらのデータは、２つの遺伝子発現シグネチャーを示すようにみえる−前炎症性細胞の遊走に関連するＣＸＣＲ１／２リガンド（ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−８）、及びより具体的には、ＩＦＮ−γ誘導性であるＩＬ−３２によってもサポートされるＩＦＮ−γ型応答を表すＣＸＣＲ３リガンド（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０）。
【０２５９】
実施例３−安定性試験
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株を含有する本明細書に記載の組成物は、２５℃または４℃で密閉容器に保存され、容器は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の相対湿度を有する雰囲気中に静置される。１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、１．５年、２年、２．５年、または３年後に、標準プロトコールで決定されたコロニー形成単位で測定される場合、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の細菌株が残存するものとする。
【０２６０】
実施例４−ＭＲＸ５１８＋ＬＰＳと比較した、ＭＲＸ５１８で誘導された未成熟樹状細胞におけるサイトカイン産生
概要
この研究は、細菌株ＭＲＸ５１８単独の効果及びリポ多糖（ＬＰＳ）との組み合わせた未成熟樹状細胞でのサイトカイン産生への効果を試験した。
【０２６１】
単球集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された。その後、単球細胞は、未成熟樹状細胞に分化した。未成熟樹状細胞を２００，０００細胞／ウェルでプレーティングし、最終濃度１０７／ｍｌでＭＲＸ５１８とインキュベートし、任意に、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加した。陰性対照は、ＲＰＭＩ培地のみと共に細胞をインキュベートすることを含み、陽性対照は、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に細胞をインキュベートした。次に、細胞のサイトカイン含有量を分析した。
【０２６２】
結果
これらの実験の結果は、図４ａ〜ｄにみることができる。ＭＲＸ５１８を単独で添加すると、陰性対照と比較してサイトカインＩＬ−６及びＴＮＦ−αのレベルの大幅な増加がもたらされる（図４ａ及びｃ）。ＬＰＳ（陽性対照）を添加すると、陰性対照と比較してＩＬ−６及びＴＮＦ−αのレベルの増加がもたらされるが、ＩＬ−１βのレベルの増加はもたらされない（図４ｂ）。ＭＲＸ５１８及びＬＰＳの組み合わせは、産生されるＩＬ−１βのレベルの相乗的な増加をもたらす（図４ｄ）。
【０２６３】
結論
ＭＲＸ５１８は、未成熟樹状細胞において、より高いＩＬ−６及びＴＮＦ−αサイトカイン産生を誘導する能力を有する。ＬＰＳ及びＭＲＸ５１８の組み合わせは、未成熟樹状細胞において、サイトカインＩＬ−１βのレベルを増加させ得る。単独のＭＲＸ５１８またはＬＰＳと組み合わせたＭＲＸ５１８が、がんを抑制し得る炎症を促進する炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αを増加させ得ることを、これらのデータは示す。単独のＭＲＸ５１８または組み合わせたＭＲＸ５１８を用いる処置は、腫瘍の成長を制限し得るサイトカインを誘発し得る。
【０２６４】
実施例５−ＭＲＸ５１８＋ＬＰＳと比較した、ＭＲＸ５１８で誘導されたＴＨＰ−１細胞におけるサイトカイン産生
概要
この研究は、単球及びマクロファージのモデル細胞株であるＴＨＰ−１細胞におけるサイトカイン産生への、単独の細菌株ＭＲＸ５１８及びＬＰＳと組み合わせたＭＲＸ５１８の効果を試験した。
【０２６５】
ＴＨＦ−１細胞を、５ｎｇ／ｍＬのホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート（ＰＭＡ）でＭ０培地中に４８時間分化させた。続いて、これらの細胞を、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加してまたは添加せずに、最終濃度１０８／ｍｌのＭＲＸ５１８と共にインキュベートした。次に、細菌を洗い落とし、細胞を通常の成長条件下で２４時間インキュベートした。次に、細胞を遠沈し、得られる上清をサイトカイン含有量について分析した。
【０２６６】
結果
これらの実験の結果は、図５ａ〜ｃにみることができる。ＬＰＳなしでＭＲＸ５１８を添加すると、無細菌及び細菌沈降物対照と比較して、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αのサイトカインレベルの増加がもたらされる。ＬＰＳ及びＭＲＸ５１８を添加すると、サイトカインの産生の相乗的な増加がもたらされる。
【０２６７】
結論
ＭＲＸ５１８は、ＴＨＰ−１細胞におけるサイトカイン産生を誘導する能力を有し、これは、ＬＰＳの添加により相乗的に増加させることができる。単独のＭＲＸ５１８またはＬＰＳと組み合わせたＭＲＸ５１８が、がんを抑制し得る炎症を促進する炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αを増加させ得ることを、これらのデータは示す。単独のＭＲＸ５１８または組み合わせたＭＲＸ５１８を用いる処置は、腫瘍の成長を制限し得るサイトカインを誘発し得る。
【０２６８】
実施例６−ＭＲＸ５１８及びＰＤ−１阻害薬ＲＭＰ１−１４またはＣＴＬＡ−４阻害薬の治療用組み合わせの抗腫瘍活性
概要
この研究は、ＥＭＴ−６腫瘍細胞を有するマウスにおいて、ＭＲＸ５１８、ＰＤ−１阻害薬（ＲＭＰ１−１４）、ＣＴＬＡ−４阻害薬、及びＭＲＸ５１８とＰＤ−１阻害薬またはＣＴＬＡ−４阻害薬との治療用組み合わせの抗腫瘍活性を比較した。
【０２６９】
材料
試験及び参照物質−細菌株＃ＭＲＸ５１８；抗ＰＤ−１抗体（クローン：ＲＭＰ１−１４、カタログ：ＢＥ０１４６、アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）；抗ＣＴＬＡ４抗体（参照：ＢＥ０１３１、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ；クローン：９Ｈ１０；反応性：マウス；アイソタイプ：ハムスターＩｇＧ１；保存条件：＋４℃）。
【０２７０】
試験及び参照物質ビヒクル−ＭＲＸ５１８細菌は、細菌培地（酵母抽出物、カシトン、脂肪酸培地（ＹＣＦＡ））中で成長させ、−８０℃でグリセロールストックとして保管した。試験プロトコールに従って、動物に細菌を投与した。マウスへの注射の各日に、抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ−４抗体をＰＢＳ（参照：ＢＥ１４−５１６Ｆ、Ｌｏｎｚａ、フランス）で希釈した。
【０２７１】
処置用量−細菌：２００μＬ中に２ｘ１０８。抗ＰＤ１−１及び抗ＣＴＬＡ４抗体を、マウスの最新の体重に従って１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。
【０２７２】
投与経路−２００μＬ／ｉｎｊの体積で強制投与チューブを介した経口強制飼養（経口、ＰＯ）により、細菌組成物を投与した。抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を、マウスの腹腔内（腹腔内、ＩＰ）に、マウスの最新の個々の体重に合わせて１０ｍｌ／ｋｇの体積で注入した。
【０２７３】
がん細胞株及び培養条件−この研究で使用された細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州マナサス）から入手されたＥＭＴ−６細胞株である。過形成乳腺肺胞結節の移植後のＢＡＬＢ／ｃＣＲＧＬマウスで生じた移植可能なマウス乳癌から、ＥＭＴ−６細胞株を樹立した。
【０２７４】
腫瘍細胞を、加湿された雰囲気（５％のＣＯ２、９５％の空気）中、３７℃で単層として成長させた。培地は、１０％のウシ胎児血清（参照：３３０２、Ｌｏｎｚａ）が補充された２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ  １６４０（参照：ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｌｏｎｚａ、ベルギーベルビエ）であった。ＥＭＴ−６腫瘍細胞は、プラスチック製のフラスコに付着する。実験的使用のために、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中のトリプシン−ベルセン（参照：ＢＥ０２−００７Ｅ、Ｌｏｎｚａ）を用いる５分間の処置により、腫瘍細胞を培養フラスコから分離し、完全培地の添加により中和した。細胞をカウントし、生存率を０．２５％のトリパンブルー排除アッセイで評価した。
【０２７５】
動物の使用−１３０匹の５〜７週齢の健康な雌Ｂａｌｂ／Ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスを、ＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手し、ＦＥＬＡＳＡガイドラインに従って、ＳＰＦの健康状態に維持した。動物舎及び実験手順は、実験動物の管理及び使用に関するフランス及びヨーロッパの規制及びＮＲＣガイドに従って実現された。制御された環境条件：温度：２２±２℃、湿度５５±１０％、光周期（１２時間明／１２時間暗）、ＨＥＰＡフィルター処理空気、再循環なしの１時間当たり１５回の換気下で、動物を飼育室のケージ毎に３〜４匹保持した。記載されるように、床敷、餌及び水、環境的及び社会的充実（群飼）を備えた滅菌し十分なスペースを有する動物のエンクロージャーを提供した：トップフィルターポリカーボネートＥｕｒｏｓｔａｎｄａｒｄタイプＩＩＩまたはＩＶケージ、トウモロコシ穂軸の床敷（参照：ＬＡＢ  ＣＯＢ  １２、ＳＥＲＬＡＢ、フランス）、２５ｋＧｙの照射食餌（Ｓｓｎｉｆｆ（登録商標）Ｓｏｅｓｔ、ドイツ）、免疫適格齧歯動物用の完全食品−Ｒ／Ｍ−Ｈ押出物、滅菌、０．２μｍ水でろ過、及び環境的充実（ＳＩＺＺＬＥ−ｄｒｉ  ｋｒａｆｔ−Ｄ２０００４  ＳＥＲＬＡＢ、フランス）。動物は、ＲＦＩＤトランスポンダーで個別に識別され、各ケージは、特定のコードが与えられた。動物の処置は、バッチ２及び３の場合、１週間の順化後、またはバッチ１の場合、３週間の順化後に、開始した。
【０２７６】
実験設計及び処置
−１４日目（Ｄ−１４）に、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ、フランス）を使用して、移植していないマウス１３０匹を、個々の体重に応じて動物３０匹ずつ３群及び動物１０匹ずつ４群に無作為化した。マウスを、１処置群当たり動物１０匹ずつ３バッチに分けた（バッチ１：動物１０匹ずつ群１、群２、及び群３；バッチ２：動物１０匹ずつ群１、群２、及び群３、ならびにバッチ３：動物１０ずつ群１〜７）。研究の開始：Ｄ−１４またはＤ０からの種々の終了点を有する。
【０２７７】
終了時に、バッチ３は終了及びＦＡＣＳ分析スケジュールのために２のコホートに分けられ：これらを１日以上ずらした：Ｄ２４／Ｄ２５。従って、動物の全てのコホートは、１処置群当たり５匹の動物（ケージ１の動物４匹及びケージ２の動物１匹）を有していた。倫理基準に基づいて、腫瘍体積が１５００ｍｍ３を超えた場合、Ｄ２４及びＤ２５に死亡させるべき動物の選択は、ケージではなく腫瘍体積に基づく。実験設計は、図７Ａに示され、以下にまとめられる：
１）バッチ１（群１、群２、及び群３）は、Ｄ０に処置を開始し、Ｄ１４で間引きした（動物１０匹が群３〜１を形成する）。これらは、腫瘍細胞を受けず、ベースライン群を構成した。
２）バッチ２（群１、群２、及び群３）は、Ｄ−１４に処置を開始し、Ｄ７に間引いた（動物１０匹が群１〜３を形成する）。
３）バッチ３（群１〜７）は、Ｄ−１４に処置を開始し、Ｄ２４／２５に間引いた（動物１０匹が群１〜７を形成する）。抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４の処置は、Ｄ１０に開始した。
【０２７８】
０日目（Ｄ０）に、バッチ２及び３（それぞれ７日目及び２４／２５日目に終了）の全てのマウスに、２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中の１ｘ１０６のＥＭＴ−６細胞を右脇腹に皮下注射することにより、ＥＭＴ−６腫瘍細胞を移植した（Ｄ１４に死亡させたバッチ１の３０匹のマウスは、腫瘍注射を受けなかった）。マウスを以下の処置スケジュール群に従って処置した（ＴＷｘ２＝週２回）。
【表９】
2021510688.tif 000013
【０２７９】
次の試料は、実験全体で収集される。
１．糞便（バッチ３のみ）−研究中の３つの時点（Ｄ−１５、Ｄ−１、及びＤ２２）で、１群当たり８匹の同一のマウスから、糞便試料を採取した（マウス１匹当たり８０〜１００ｍｇまたは６〜７ペレットの同等物、しかし、少なくとも３の糞便ペレット）、−８０℃で急速凍結及び保存した。
２．血液−マウスの終了時（バッチ１の場合Ｄ１４、バッチ２の場合Ｄ７、及びバッチ３の場合Ｄ２５）に、深いガス麻酔下の週末手順で、心臓内の血液約１ｍＬを各動物からＥＤＴＡチューブに採取した。血液を遠心分離して、血漿を得、血漿を−８０℃で保存した。
３．腫瘍及び脾臓−全てのマウス由来の腫瘍（Ｄ及びＤ２４／Ｄ２５）ならびに脾臓（Ｄ７、Ｄ１４、及びＤ２４／Ｄ２５）を収集した。腫瘍試料中の腫瘍免疫浸潤細胞を、以下に記載されるように、ＦＡＣＳ分析で定量した。
４．腸間膜リンパ節−Ｄ７、Ｄ１４、及びＤ２４／Ｄ２５に、群毎且つ時点毎の全動物の腸間膜リンパ節を収集し、−８０℃で急速凍結した。
５．腸−安楽死時（Ｄ７、Ｄ１４、及びＤ２４／Ｄ２５）に、群毎且つタイミング毎の全マウス由来の腸のいくつかの切片を収集し、解剖した。盲腸内容物を同様に採取した。
【０２８０】
ＦＡＣＳ分析
腫瘍細胞の分析のために、群毎且つタイミング毎の全マウス由来の腫瘍を終了時に収集した（Ｄ７及びＤ２４／２５に）。全ての腫瘍をＨＢＳＳ培地に収集した。各収集試料由来の腫瘍免疫浸潤細胞を、ＦＡＣＳ分析で定量した。要約すると、収集試料を、機械的解離で処理し、１００μＬの染色緩衝液（ＰＢＳ、０．２％のＢＳＡ、０．０２％のＮａＮ３）で調製した。次に、各抗体に対し供給者により記載された手順に従って、選択されたマーカーに対する抗体を添加した。ＦｏｘＰ３を除く全抗体は、表面標識用のものであり、ＦｏｘＰ３は、細胞内標識用のものであった。ＦＡＣＳ分析に使用される抗体は、下表に列挙される：
パネル１：パネル  Ｔ細胞の生存率、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＰＤ１、Ｂ２２０
【表１０】
2021510688.tif 000014
2021510688.tif 000015
パネル２  腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）：生存率、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ２０６、ＭＨＣＩＩ
【表１１】
2021510688.tif 000016
2021510688.tif 000017
【０２８１】
混合物を暗所、室温で２０〜３０分間インキュベートし、洗浄し、２００μＬの染色緩衝液中に再懸濁した。全試料を氷上で保存し、ＦＡＣＳ分析まで遮光した。腫瘍試料も、対照アイソタイプ抗体で処理した。波長４０５、４８８、及び６３３ｎｍの３つの励起レーザーを備えたＣｙＦｌｏｗ（登録商標）ｓｐａｃｅフローサイトメーター（ＬＳＲ  ＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、染色された細胞を分析した。
【０２８２】
腸試料の分析のために、群毎且つタイミング毎の全マウスの小腸及び結腸を、終了時に収集した（Ｄ７、Ｄ１４、及びＤ２４／２５に）。全ての新鮮な組織を、ＨＢＳＳ培地に収集した。各収集試料由来の固有層の免疫細胞を、ＦＡＣＳ分析で定量した。試料を腫瘍試料として処理した。ＦＡＣＳ分析に使用される抗体は、上記のパネル１のもの及び下表に列挙されるものである（その後の試料のインキュベーション及び分析は、上記の通りであった）。
パネル３：腸のＤＣ：生存率、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ１０３
【表１２】
2021510688.tif 000018
2021510688.tif 000019
【０２８３】
脾臓試料の分析のために、群毎且つタイミング毎の全てのマウスの脾臓を終了時に（Ｄ７、Ｄ１４、及びＤ２４／２５に）収集した。全ての脾臓を完全ＲＰＭＩ培地（１０％のｄＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン１％、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び５５μＭの２−メルカプトエタノール）に収集した。各収集試料由来の腫瘍免疫浸潤細胞を、ＣＤ３及びＣＤ２８で７２時間刺激した後、ＦＡＣＳ分析で定量した。手順：脾細胞を、２つの刺激（ＣＤ３／ＣＤ２８、熱殺菌ＭＲｘ０５１８）及び１つの陰性対照のいずれかで培養した。ウェル毎に、加熱殺菌済みＭＲｘ０５１８及び脾細胞の比率は、１：１であった。２０μｌの加熱殺菌済みＭＲｘ０５１８試料に提供される１ｘ１０６の細菌細胞があった。上記のパネル１のマーカーに対する抗体を、各抗体の供給元が記載する手順に従って、各処置の細胞ペレットに添加した。上記のように、その後の試料のインキュベーション及び分析を実施した。
【０２８４】
動物監視
動物の生存率及び行動を毎日記録した。体重を週２回測定した。腫瘍の長さ及び幅を、キャリパーで週に２回測定し、腫瘍の体積を、以下の式で推定した：
【数２】
2021510688.tif 000020
【０２８５】
対照動物と比較した、処置動物の腫瘍体積に対する試験物質の効果に関して、処置の有効性を評価した。Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、フランスクテルノン）を使用して、抗腫瘍効果の以下の評価基準を決定した。
１．個別及び／または平均（または中央値）腫瘍体積。群１〜７の平均腫瘍体積は、図７Ｂに示される。
２．腫瘍倍加時間（ＤＴ）。
３．以下のように計算された、処置群対対照群の腫瘍体積中央値の比として定義される腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ％）（Ｄｘ＝測定日）：
【数３】
2021510688.tif 000021
最適値は、達成された最大の腫瘍成長阻害を反映する最小のＴ／Ｃ％比である。Ｔ／Ｃ％比の有効な基準は、ＮＣＩ規格によると、４２％以下である。
４．ＲＴＶが次の通りに計算される、試験群及び対照群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）曲線（ＤＸ＝測定日、ＤＲ＝無作為化日）：
【数４】
2021510688.tif 000022
５．体積Ｖ及びＶに到達する時間を計算する。体積Ｖは、実験データから導出される標的体積として定義され、腫瘍成長の対数期に選択される。各腫瘍について、標的体積Ｖに最も近い腫瘍体積が、腫瘍体積測定で選択される。この体積Ｖの値及び腫瘍がこの体積に到達する時間が記録される。各群について、腫瘍体積Ｖの平均及びこの体積に到達するまでの時間の平均が計算される。
【０２８６】
実施例７−ＣＤ８増殖評価
ＭＲＸ５１８及びＣＴＬＡ−４阻害薬の免疫刺激効果を調査するために、組み合わせたＭＲＸ５１８及び抗ＰＤ−１チェックポイント阻害薬Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＤ２７９のＣＤ８＋細胞増殖への影響のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価を行った。
【０２８７】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の冷凍保存、カタログ番号：７００２５）を液体窒素から取り出し、フラスコ中で一晩休ませた。９６ウェルプレートを、分裂促進性の組み合わせの半分として、ＣＤ３抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＣＤ３  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＯＫＴ３）、０．３μｇ／ｍｌ）でコーティングした。休止期間の後、ＰＢＭＣをカウントし、蛍光細胞トレーサー（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）遠赤細胞増殖キット）で染色した。
【０２８８】
このようにして、１０セットの細胞を調製した。それらのセットのうちの９つに、抗ＰＤ−１抗体を添加した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製、ＣＤ２７９（ＰＤ１）の純粋な機能グレード、１０μｇ／ｍｌ）。対照セットとして機能する追加のセットに、抗ＰＤ−１抗体を添加しなかった（下表では細胞セット１と呼ばれる）。次に、全ての細胞セットを１．５時間インキュベートした。
【０２８９】
インキュベーション期間の後、下表に示されるように、細菌試験構成成分を細胞セット３〜１０に添加した。
【表１３】
2021510688.tif 000023
＊ＭＲＸ５１８細胞の比率：ＰＢＭＣ細胞
＊＊鞭毛アセンブリーが破壊されるように設計されたＭＲＸ５１８の変異体を試験した。フラジェリンは、ＭＲＸ５１８の免疫刺激効果に寄与することが本発明者らにより理解される。
＊＊＊１：１の感染多重度（ＭＯＩ）の場合、上清で処置されるＰＢＭＣの数と同数の細菌から、上清を採取した。１０：１のＭＯＩの場合、高濃度の細菌培養物から、上清を採取したが、ＰＢＭＣに対する細菌の正確な数を測定しなかった。
【０２９０】
細菌試験構成成分を添加した後、ＣＤ２８抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＣＤ２８．２）、１μｇ／ｍｌ）を、分裂促進性の組み合わせの残りの半分として細胞セットのそれぞれに添加して、増殖を誘発した。次に、ＰＤＬ−１（Ｒ＆Ｄシステム、組み換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１  Ｆｃキメラ、１０μｇ／ｍｌ）を各細胞セットに添加した。
【０２９１】
次に、細胞セットを、５日間インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ２）。インキュベーション後、細胞を採取し、細胞トレーサーにより付与された細胞蛍光に従って、ＦＡＣＳで分析して、インキュベーション期間中に生じている細胞分裂の数を示した。分裂数（細胞分裂なし（ＮＣＤ）から４回の細胞分裂（４ＲＣＤ）まで）にグループ化された細胞のパーセンテージを示す結果は、図６に示される。
【０２９２】
配列表
配列番号１（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子−ＡＦ０３９９００）
１  ｔａａｔａｃａｔｇｃ  ａａｇｔｃｇａａｃｇ  ｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔ  ｃａｃｃｇｇａｇｃｔ  ｔｇｃｔｃｃａｃｃｇ  ａａａｇａａａａａｇ
６１  ａｇｔｇｇｃｇａａｃ  ｇｇｇｔｇａｇｔａａ  ｃａｃｇｔｇｇｇｔａ  ａｃｃｔｇｃｃｃａｔ  ｃａｇａａｇｇｇｇａ  ｔａａｃａｃｔｔｇｇ
１２１  ａａａｃａｇｇｔｇｃ  ｔａａｔａｃｃｇｔａ  ｔａａｃａｃｔａｔｔ  ｔｔｃｃｇｃａｔｇｇ  ａａｇａａａｇｔｔｇ  ａａａｇｇｃｇｃｔｔ
１８１  ｔｔｇｃｇｔｃａｃｔ  ｇａｔｇｇａｔｇｇａ  ｃｃｃｇｃｇｇｔｇｃ  ａｔｔａｇｃｔａｇｔ  ｔｇｇｔｇａｇｇｔａ  ａｃｇｇｃｔｃａｃｃ
２４１  ａａｇｇｃｃａｃｇａ  ｔｇｃａｔａｇｃｃｇ  ａｃｃｔｇａｇａｇｇ  ｇｔｇａｔｃｇｇｃｃ  ａｃａｃｔｇｇｇａｃ  ｔｇａｇａｃａｃｇｇ
３０１  ｃｃｃａｇａｃｔｃｃ  ｔａｃｇｇｇａｇｇｃ  ａｇｃａｇｔａｇｇｇ  ａａｔｃｔｔｃｇｇｃ  ａａｔｇｇａｃｇａａ  ａｇｔｃｔｇａｃｃｇ
３６１  ａｇｃａａｃｇｃｃｇ  ｃｇｔｇａｇｔｇａａ  ｇａａｇｇｔｔｔｔｃ  ｇｇａｔｃｇｔａａａ  ａｃｔｃｔｇｔｔｇｔ  ｔａｇａｇａａｇａａ
４２１  ｃａａｇｇａｔｇａｇ  ａｇｔａｇａａｃｇｔ  ｔｃａｔｃｃｃｔｔｇ  ａｃｇｇｔａｔｃｔａ  ａｃｃａｇａａａｇｃ  ｃａｃｇｇｃｔａａｃ
４８１  ｔａｃｇｔｇｃｃａｇ  ｃａｇｃｃｇｃｇｇｔ  ａａｔａｃｇｔａｇｇ  ｔｇｇｃａａｇｃｇｔ  ｔｇｔｃｃｇｇａｔｔ  ｔａｔｔｇｇｇｃｇｔ
５４１  ａａａｇｃｇａｇｃｇ  ｃａｇｇｃｇｇｔｔｔ  ｃｔｔａａｇｔｃｔｇ  ａｔｇｔｇａａａｇｃ  ｃｃｃｃｇｇｃｔｃａ  ａｃｃｇｇｇｇａｇｇ
６０１  ｇｔｃａｔｔｇｇａａ  ａｃｔｇｇｇａｇａｃ  ｔｔｇａｇｔｇｃａｇ  ａａｇａｇｇａｇａｇ  ｔｇｇａａｔｔｃｃａ  ｔｇｔｇｔａｇｃｇｇ
６６１  ｔｇａａａｔｇｃｇｔ  ａｇａｔａｔａｔｇｇ  ａｇｇａａｃａｃｃａ  ｇｔｇｇｃｇａａｇｇ  ｃｇｇｃｔｃｔｃｔｇ  ｇｔｃｔｇｔａａｃｔ
７２１  ｇａｃｇｃｔｇａｇｇ  ｃｔｃｇａａａｇｃｇ  ｔｇｇｇｇａｇｃｇａ  ａｃａｇｇａｔｔａｇ  ａｔａｃｃｃｔｇｇｔ  ａｇｔｃｃａｃｇｃｃ
７８１  ｇｔａａａｃｇａｔｇ  ａｇｔｇｃｔａａｇｔ  ｇｔｔｇｇａｇｇｇｔ  ｔｔｃｃｇｃｃｃｔｔ  ｃａｇｔｇｃｔｇｃａ  ｇｃａａａｃｇｃａｔ
８４１  ｔａａｇｃａｃｔｃｃ  ｇｃｃｔｇｇｇｇａｇ  ｔａｃｇａｃｃｇｃａ  ａｇｇｔｔｇａａａｃ  ｔｃａａａｇｇａａｔ  ｔｇａｃｇｇｇｇｇｃ
９０１  ｃｃｇｃａｃａａｇｃ  ｇｇｔｇｇａｇｃａｔ  ｇｔｇｇｔｔｔａａｔ  ｔｃｇａａｇｃａａｃ  ｇｃｇａａｇａａｃｃ  ｔｔａｃｃａｇｇｔｃ
９６１  ｔｔｇａｃａｔｃｃｔ  ｔｔｇａｃｃａｃｔｃ  ｔａｇａｇａｔａｇａ  ｇｃｔｔｃｃｃｃｔｔ  ｃｇｇｇｇｇｃａａａ  ｇｔｇａｃａｇｇｔｇ
１０２１  ｇｔｇｃａｔｇｇｔｔ  ｇｔｃｇｔｃａｇｃｔ  ｃｇｔｇｔｃｇｔｇａ  ｇａｔｇｔｔｇｇｇｔ  ｔａａｇｔｃｃｃｇｃ  ａａｃｇａｇｃｇｃａ
１０８１  ａｃｃｃｔｔａｔｔｇ  ｔｔａｇｔｔｇｃｃａ  ｔｃａｔｔｔａｇｔｔ  ｇｇｇｃａｃｔｃｔａ  ｇｃｇａｇａｃｔｇｃ  ｃｇｇｔｇａｃａａａ
１１４１  ｃｃｇｇａｇｇａａｇ  ｇｔｇｇｇｇａｔｇａ  ｃｇｔｃａａａｔｃａ  ｔｃａｔｇｃｃｃｃｔ  ｔａｔｇａｃｃｔｇｇ  ｇｃｔａｃａｃａｃｇ
１２０１  ｔｇｃｔａｃａａｔｇ  ｇｇａａｇｔａｃａａ  ｃｇａｇｔｔｇｃｇａ  ａｇｔｃｇｃｇａｇｇ  ｃｔａａｇｃｔａａｔ  ｃｔｃｔｔａａａｇｃ
１２６１  ｔｔｃｔｃｔｃａｇｔ  ｔｃｇｇａｔｔｇｔａ  ｇｇｃｔｇｃａａｃｔ  ｃｇｃｃｔａｃａｔｇ  ａａｇｃｃｇｇａａｔ  ｃｇｃｔａｇｔａａｔ
１３２１  ｃｇｃｇｇａｔｃａｇ  ｃａｃｇｃｃｇｃｇｇ  ｔｇａａｔａｃｇｔｔ  ｃｃｃｇｇｇｃｃｔｔ  ｇｔａｃａｃａｃｃｇ  ｃｃｃｇｔｃａｃａｃ
１３８１  ｃａｃｇａｇａｇｔｔ  ｔｇｔａａｃａｃｃｃ  ｇａａｇｔｃｇｇｔｇ  ａｇｇｔａａｃｃｔｔ  ｔｔｔｇｇａｇｃｃａ  ｇｃｃｇｃｃｔａａｇ
１４４１  ｇｔｇｇｇａｔａｇａ  ｔｇａｔｔｇｇｇｇｔ  ｇａａｇｔｃｇｔａａ  ｃａａｇｇｔａｇｃｃ  ｇｔａｔｃｇｇａａｇ  ｇｔｇｃｇｇｃｔｇｇ
１５０１  ａｔｃａｃｃ
【０２９３】
配列番号２（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株ＭＲＸ５１８に対するコンセンサス１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列）
ＴＧＣＴＡＴＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡＣＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＴＡＴＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＴＣＣＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＧＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＴＡＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＣＣＴＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴＧＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＴＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＣＧＡＧＧＣＴＡＡＧＣＴＡＡＴＣＴＣＴＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＣＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＧＴＧ
【０２９４】
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［３１］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４），Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ  Ｗａｄｅ  ａｎｄ  ＰＪ  Ｗｅｌｌｅｒ
［３２］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）
［３３］ＵＳ２０１６／００６７１８８
［３４］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１０）Ｒｏｎａｌｄ  Ａｔｌａｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．
［３５］Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（１９９６）Ｊｅｎｎｉｅ  Ｃ．Ｈｕｎｔｅｒ−Ｃｅｖｅｒａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ
［３６］Ｓｔｒｏｂｅｌ（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５８１：２４７−６１．
［３７］Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２．
［３８］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）．
［３９］Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
［４０］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
［４１］Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）．
［４２］Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）
［４３］Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）（２００２）Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）．
［４４］ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ  ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）
［４５］Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０
［４６］Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９．
［４７］Ｒｏｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７２）Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４９：７３５−４９．
［４８］Ｂｅｒｔｒａｍ  ａｎｄ  Ｊａｎｉｋ（１９８０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１１：６３−７３．
［４９］Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５１：１９−３８．
［５０］Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ  ｄｅ  ｌ’ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｅ，Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｎ°２０１０／６３  ＣＥＥ  ２２ｎｄ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１０，Ｄｅｃｒｅｔ  ｎ°２０１３−１１８  １ｓｔ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３．
［５１］Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ：Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ；２０１１
［５２］Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｈｅｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ（１９７０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ．５４：１４３−７４．
［５３］Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０２：１５５５−７７．
［５４］ＷＯ２０１７／０８５５２０
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図１Ｄ−３】
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【図１Ｅ−１】
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【図１Ｅ−２】
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【図１Ｅ−３】
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【図１Ｅ−４】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021510688.tif 000051
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