(57)【要約】  標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質が、提供される。このドメインは、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ−１）酵素ドメイン、またはオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素ドメインなどの酵素ドメインであり得る。そのような融合標的結合タンパク質を含む細胞（例えば、融合標的結合タンパク質を発現する細胞）、およびそのような融合標的結合タンパク質をコードする核酸もまた、提供される。本発明はまた、標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質を提供する。医薬組成物、医学的使用、および治療方法が開示され、そのすべては、これらの融合標的結合タンパク質、細胞、または核酸を使用する。タンパク質、細胞、核酸および医薬組成物は、神経芽腫または急性骨髄性白血病などのがんの予防および／または治療に使用され得る。
2021507716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質。
【請求項２】
アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進する前記ドメインが、酵素ドメインを含む、請求項１に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項３】
前記酵素ドメインが、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、ＡＳＬドメイン、ＯＣＤ１ドメイン、ＡｒｇＧドメイン、ＡｒｇＨドメイン、およびＡｒｇＦドメインからなる群から選択される、請求項２に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項４】
前記ＡＳＳ−１ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項５】
前記ＯＴＣドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３または請求項４に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項６】
前記ＡＳＬドメインが、配列番号３０によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項３から５のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項７】
前記ＯＤＣ１ドメインが、配列番号３１によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項３から６のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項８】
前記ＡｒｇＧドメインが、配列番号３２によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項３から７のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項９】
前記ＡｒｇＨドメインが、配列番号３３によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項３から８のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＡｒｇＦドメインが、配列番号３４によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項３から９のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１１】
標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質。
【請求項１２】
トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進する前記ドメインが、酵素ドメインを含む、請求項１１に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１３】
前記酵素ドメインが、ＴＲＰ５ドメインおよびＩＤＯドメインからなる群から選択される、請求項１１または請求項１２に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＴＲＰ５ドメインが、配列番号３５によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１５】
前記ＩＤＯドメインが、配列番号３６によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１６】
前記標的結合部分が、ＧＤ２標的結合部分、ＣＤ３３標的結合部分、メソセリン標的結合部分、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＧＤ２標的結合部分が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１８】
前記ＣＤ３３標的結合部分が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項１９】
前記メソセリン標的結合部分が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２１】
前記細胞内シグナル伝達領域が、４−１ＢＢシグナル伝達領域、ＯＸ−４０シグナル伝達領域、ＣＤ２８シグナル伝達領域、ＩＣＯＳシグナル伝達領域、およびＣＤ３  ζシグナル伝達領域からなる群から選択される領域を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２２】
前記細胞内シグナル伝達領域が、４−１ＢＢシグナル伝達領域を含む、請求項２１に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２３】
前記４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２１または請求項２２に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２４】
前記細胞内シグナル伝達領域が、ＣＤ３  ζドメインを含む、請求項２４から２３のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＣＤ３  ζドメインが、配列番号１１または配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２６】
４−１ＢＢドメインおよびＣＤ３  ζドメインの両方を含む、請求項２１から２５のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２７】
配列番号１２〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２８】
医薬としての使用のための、前記請求項のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質。
【請求項２９】
がんの予防または治療における使用のための、請求項２８に記載の使用のための融合標的結合タンパク質。
【請求項３０】
標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質を含む細胞。
【請求項３１】
前記融合標的結合タンパク質が、請求項１から１０、または１６から２７のいずれか１項に記載される融合標的結合タンパク質である、、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質を含む細胞。
【請求項３３】
前記融合標的結合タンパク質が、請求項１１から２７のいずれか１項に記載される融合標的結合タンパク質である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
医薬としての使用のための、請求項３０から３３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３５】
がんの予防または治療における使用のための、請求項３４に記載の使用のための細胞。
【請求項３６】
標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３７】
前記融合標的結合タンパク質が、請求項１から１０、または１６から２７のいずれか１項に記載される融合標的結合タンパク質である、請求項３６に記載の核酸。
【請求項３８】
配列番号３８、配列番号３９、または配列番号３７のＤＮＡ配列を含む、請求項３６または請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項４０】
前記融合標的結合タンパク質が、請求項１１から２７のいずれか１項に記載される融合標的結合タンパク質である、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
医薬としての使用のための、請求項３６から４０のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４２】
がんの予防または治療における使用のための、請求項４１に記載の使用のための核酸。
【請求項４３】
請求項１から３０のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質、および／または請求項３０から３５のいずれか１項に記載の細胞、および／または請求項３６から４２のいずれか１項に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項４４】
医薬としての使用のための、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
がんの予防または治療における使用のための、請求項４４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４６】
それを必要とする対象における状態を治療する方法であって、前記対象に請求項１から２９のいずれか１項に記載の融合標的結合タンパク質を提供することを含む方法。
【請求項４７】
前記融合標的結合タンパク質が、請求項３７から４３のいずれか１項に記載の核酸配列の細胞発現によって提供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
それを必要とする対象における状態を治療する方法であって、前記対象に請求項３０から３５のいずれか１項に記載の細胞を提供することを含む方法。
【請求項４９】
それを必要とする対象における状態を治療する方法であって、前記対象に請求項３６から４２のいずれか１項に記載の核酸を提供することを含む方法。
【請求項５０】
がんの治療における、請求項４６から４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ウイルス感染症の治療における、請求項４６から５０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合標的結合タンパク質、およびそのようなタンパク質を含む細胞に関する。本発明はまた、融合標的結合タンパク質をコードする核酸に関する。本発明は、医薬組成物、医学的使用、および治療方法に関し、そのすべては、開示される融合標的結合タンパク質、細胞、または核酸を使用する。
【背景技術】
【０００２】
標的結合能を有する融合タンパク質は、いくつかの治療適用に使用されている。特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞が、がんの治療に使用されている。しかし、下にさらに述べるように、かなりの臨床的有望さを示しているにもかかわらず、そのような処置は、普遍的に有効なわけではなかった。
【０００３】
前臨床試験および臨床試験におけるＣＡＲ−Ｔの失敗
成人がんおよび小児がんの両方に対する細胞傷害性化学療法の進歩にかかわらず、いくつかの主ながんサブタイプは、まだ極めて予後不良であることが明らかである。免疫療法は、悪性がん細胞を直接標的化することに対する代替的アプローチを提供し、標準的なアプローチの正常細胞への毒性副作用を回避する。
【０００４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）は、腫瘍細胞上の表面抗原を特異的に認識するように典型的には抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）により操作された、患者由来自己Ｔ細胞である。化学療法抵抗性の再発小児Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病の患者であって、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用して急速で持続的な寛解を生じた患者において、ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して小児がんをうまく治療する原理証明が確立されている。固形腫瘍において、最も一般的な小児固形がんである神経芽腫は、好まれるモデルであり、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に対する固形腫瘍の応答への情報を大いに与えることが分かった。前臨床試験により、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）抗原を認識するＣＡＲ  Ｔ細胞が、神経芽腫細胞を殺滅する強力な新しい方法に相当し得ることが指し示されている。神経芽腫は、固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の開発にとってのパラダイムとなったものの、前臨床モデルおよび初期相臨床試験で限られた抗腫瘍有効性だけが見られている。第１世代の抗ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存続できず、最小の抗腫瘍効果を有した。第２世代の抗ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインを有する）は、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ存続性を有し、中等度の腫瘍退縮をもたらしたが、神経芽腫の存在下で機能的に消耗する。ヒトにおいて、抗ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の研究は、多数のこれらの細胞の注入にもかかわらず、数週間以内にＣＡＲ  Ｔ細胞数が低いまたは検出不能になり、活動性疾患を有する患者の大多数が完全寛解を達成しなかったという重要な観察を行った。重要なことに、ＣＡＲ  Ｔ細胞の低レベルの存続性を有した患者は、より長い生存期間を有した。これらの結果は、残留神経芽腫の腫瘍上に大きな標的抗原負荷が存在するにもかかわらず、局所および全身の腫瘍微小環境がＣＡＲ−Ｔ細胞の存続性を損なうことを示唆している。
【０００５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、および人間において限られた数の他の固形腫瘍に対して検査されている。それぞれの場合で、これらの悪性腫瘍に対する結果は、ＡＬＬにおいて抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞について見られた素晴らしいデータを再現できなかった。
【０００６】
急性骨髄性白血病
急性骨髄性白血病は、最もよく見られる成人急性白血病であり、２番目によく見られる小児白血病である。発生率は年齢と共に増加し、高い危険性または再発性疾患を有する患者について、予後は極めて不良であり、造血幹細胞移植にもかかわらず成人における生存期間は＜１２カ月である。高齢患者または共存症を有する患者について、標準的な化学療法レジメンは、耐容性不良であり、至適以下の治療、および治癒の達成不能に至る。ＡＭＬに対して有効な新薬はほとんど開発されておらず、それゆえに免疫療法薬は、別のアプローチの可能性を与える。ＣＤ３３は、ＡＭＬ芽球上にほぼ例外なく発現され、免疫毒素に基づく治療法についての有効な標的であることが判明した（ゲムツズマブオゾガマイシン）。抗ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＭＬ芽球に対して細胞傷害性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで白血病の重荷を根絶する。これを基に、抗ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の第Ｉ相臨床試験が中国で開始された（ＮＣＴ０１８６４９０２およびＮＣＴ０２９５８３９７）。化学療法難治性ＡＭＬの１人の患者からの報告は、骨髄ＡＭＬ芽球の低減を示した。これらの結果は、抗ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞が有効であり得るという原理証明を提供する。しかし、血液中および骨髄中の両方で測定可能なＣＡＲ−Ｔ細胞が残っているにもかかわらず、疾患は、ＣＡＲ注入の９週間後までに再発した。この結果は、白血病の微小環境によりＣＡＲ−Ｔ細胞が不活性にされたことを示唆している（回避のメカニズムとしてＡＭＬ芽球上のＣＤ３３が消失したという証拠はない）。
【０００７】
中皮腫、卵巣がんおよび膵臓がん
成人においてほぼ例外なく予後不良のアスベスト関連腫瘍である中皮腫は、細胞表面糖タンパク質メソセリンを発現する。メソセリンはまた、卵巣腺がん、肺腺がん、および膵臓がんなどの上皮がん上に発現される。メソセリンは、ＳＳ１Ｐなどの免疫毒素による受動免疫療法のための有効で選択的な標的であることが実証されており、ＣＡＲ  Ｔ技術における開発のためにそれが選択されることにつながる。マウスモデルにおいて、抗メソセリンＣＡＲ−Ｔ細胞は、明白で存続性の抗腫瘍活性を実際に示す。抗メソセリンＣＡＲ−Ｔ細胞はまた、これらの腫瘍を有する患者にも投与されており、それぞれの場合で限定的な応答（ＰＲ、ＳＤ）が検出されたものの、腫瘍は進行した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の存続性は、極めて不良であり、初めの投与または繰り返し投与のわずか数日以内で細胞が検出不能になった。ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍内に、したがって標的抗原に近接して置かれた場合であっても、応答は弱いままであり、これは、Ｔ細胞の機能を低減する強い免疫抑制微小環境を示唆している。
【０００８】
膠芽腫
膠芽腫は、成人および小児の両方の最も壊滅的な脳腫瘍の１つであり、患者は、集中的な化学療法および放射線療法に基づくレジメンにもかかわらず、急速な疾患進行および治療の失敗をしばしば経験する。膠芽腫は、上皮成長因子受容体の変異体、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現し、免疫療法によって標的化することができる腫瘍特異抗原を提供する。ＥＧＦＲｖＩＩＩはまた、進行結腸直腸がんの約３分の１に発現され得る。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＩ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、同所マウス異種移植片における膠芽腫の疾患制御を実際に示した。しかし、すべての場合で、脳を含むすべての器官において検出可能なレベルのＣＡＲ−Ｔ細胞があるにもかかわらず、腫瘍は成長し続け、マウスの死亡をもたらす。やはり、このデータは、ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍の微小環境によって不活性化されることを示唆している。この理論的根拠に基づく第Ｉ相試験が、現在進行中である（ＮＣＴ０２８４４０６２、ＮＣＴ０２６６４３６３）。
【０００９】
アルギニンおよび免疫抑制微小環境
アルギニンは、健康な組織によって細胞生存性、増殖およびタンパク質合成を含むいくつかの細胞過程のために必要とされる準必須アミノ酸である。全身アルギニンレベルは、主として食事摂取によって維持され、より少ない度合いで、「腸−腎軸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｒｅｎａｌ  ａｘｉｓ）」中における前駆体からの合成によって維持される。細胞レベルで、アルギニンは、陽イオンアミノ酸（ＣＡＴ；ＳＬＣ７Ａ）ファミリーの輸送体を経由して細胞外液から搬入され、尿素回路に入る。炎症、妊娠、およびがんなどの高い需要の条件で、アルギニンレベルは局所組織微小環境中および全身で不足してくる可能性がある。一部の組織および細胞は、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ１）およびオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）の発現により前駆体からアルギニンを再合成することによって自らを防御することができる。これらの酵素のうち少なくとも一方の発現を欠く細胞は、細胞外アルギニンの搬入に依存し、これは、アルギニン栄養要求として知られる状況である。
【００１０】
以前の研究は、腫瘍部位でのアルギナーゼ阻害がｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＲ  Ｔ細胞活性が不十分である問題に取り組むのに有益であり得ることを示唆した。
【発明の概要】
【００１１】
第１の態様では、本発明は、標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質を提供する。簡潔にするために、本発明の様々な態様および実施形態による融合標的結合タンパク質は、本明細書において「本発明のタンパク質」と称される。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質を含む細胞を提供する。細胞は、融合標的結合タンパク質を発現する場合がある。
【００１３】
第３の態様では、本発明は、標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明の第３の態様による核酸が発現されて、本発明の第１の態様による融合標的結合タンパク質または本発明の第２の態様による細胞を生じる場合があることが理解されよう。
【００１４】
第４の態様では、本発明は、標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質を提供する。
【００１５】
第５の態様では、本発明は、標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質を含む細胞を提供する。細胞は、融合標的結合タンパク質を発現する場合がある。
【００１６】
第６の態様では、本発明は、標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとを含む融合標的結合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明の第６の態様による核酸が発現されて、本発明の第４の態様による融合標的結合タンパク質または本発明の第５の態様による細胞を生じる場合があることが理解されよう。
【００１７】
第７の態様では、本発明は、本発明の第１、第２、第４もしくは第５の態様による融合標的結合タンパク質もしくは細胞、または本発明の第３もしくは第６の態様による核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
第８の態様では、本発明は、医薬としての使用のための本発明の第１または第４の態様による融合標的結合タンパク質を提供する。
【００１９】
第９の態様では、本発明は、医薬としての使用のための本発明の第２または第５の態様による細胞を提供する。
【００２０】
第１０の態様では、本発明は、医薬としての使用のための第３または第６の態様による核酸を提供する。
【００２１】
第１１の態様では、本発明は、医薬としての使用のための本発明の第７の態様による医薬組成物を提供する。
【００２２】
第１２の態様では、本発明は、そのような予防および／または治療を必要とする対象における疾患を予防および／または治療する方法であって、対象に、本発明の融合標的結合タンパク質を提供することを含む方法を提供する。融合標的結合タンパク質は、本発明の第１、第４、または第１１の態様による場合がある。本発明のタンパク質は、本発明の第２または第５の態様の細胞などの、本発明の細胞の一部として提供される場合がある。
【００２３】
本明細書の他の箇所にさらに述べるように、本発明の融合標的結合タンパク質、細胞、核酸、および医薬組成物は、がん、ウイルス感染症などの感染症、および自己免疫疾患からなる群から選択される１つまたは複数の障害の予防および／または治療に使用される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】融合標的結合タンパク質含有ウイルスの力価の最適化を図示する。Ａ欄は、ＡＭＰＨＯ  Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞上清中のレトロウイルス粒子の濃度が７２時間にわたり増加したことを示す。Ｂ欄は、融合標的結合タンパク質Ｔ細胞の形質導入効率をｔＣＤ３４のフローサイトメトリー検出によって評価したことを示す。ＡＭＰＨＯ細胞株上清を使用してＰＢＭＣの形質導入効率に差は見られなかった。
【図２】アルギニン経路の酵素が形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞中で実際に活性を示すことを示す。Ａ欄は、フローサイトメトリーを使用してｔＣＤ３４の発現を測定することによって評価された高純度でタンパク質−酵素構築物を産生できることを示す。Ｂ欄は、形質導入細胞におけるＡＳＳ−１およびＯＴＣの発現増加を図示する。Ｃ欄は、形質導入細胞におけるアルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインがその機能を果たす能力を図示する。Ｄ欄は、オルニチンの（ＯＴＣによる）シトルリンへの細胞異化研究の結果を示す。ＯＴＣ酵素ドメインを含有する融合標的結合タンパク質を発現している細胞（「ＧＤ２−ＯＴＣ」）、またはＡＳＳ−１およびＯＴＣ酵素ドメインの両方を含有する融合標的結合タンパク質を発現している細胞（「ＧＤ２−ＡＳＳ−ＯＴＣ」）によって産生されたシトルリンの量を評価し、ＯＴＣ酵素ドメインなしの対照構築物を発現している細胞（「ＧＤ２」）、またはＡＳＳ−１酵素ドメインを含有する融合標的結合タンパク質を発現している細胞（「ＧＤ２−ＡＳＳ」）と比較した。Ｅ欄は、マウスにおける腫瘍微小環境中のアルギニン前駆体、アルギニノコハク酸塩の合成を促進するドメイン（ＡＳＳ−１）を含む構築物を形質導入された融合標的結合タンパク質Ｔ細胞の存続性を示す。Ｆ欄は、ＯＴＣドメインを含む融合標的結合タンパク質Ｔ細胞（ＧＤ２−ＯＴＣ）が、ＯＴＣドメインを含む融合標的結合タンパク質を有さないＴ細胞（ＧＤ２のみ）と比較して有意に高い存続性を示したことを示す。
【図３】アルギニン経路の酵素をヒトドナー細胞からのＰＢＭＣ中に形質導入できることを図示する。Ａ欄は、フローサイトメトリーを使用してｔＣＤ３４の発現を測定することによって、ＰＢＭＣ中で融合標的結合タンパク質−酵素構築物を高純度で産生できることを示す。Ｂ欄は、形質導入細胞におけるＡＳＳ−１およびＯＴＣの発現増加を示す。Ｃ欄は、アルギニンまたはアルギニン前駆体の酵素合成を促進する酵素ドメインを含む構築物も含有する融合標的結合タンパク質Ｔ細胞における共抑制受容体ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、およびＰＤ−１の発現に差がなかったことを示す。Ｄ欄は、ｔＣＤ３４のフローサイトメトリーによって検出されたときの、７日増大の間に測定された、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインを含む構築物を形質導入されたＰＢＭＣの存続性を示す。
【図４】ＡＳＳ−１およびＯＴＣ酵素ドメインが低アルギニン腫瘍条件で有意な代謝および増殖上の利点を付与することを示す。Ａ欄は、ＡＳＳ−１酵素ドメインを含む融合標的結合タンパク質Ｔ細胞（ＧＤ２−ＡＳＳ）およびＯＴＣ酵素ドメインを含む融合標的結合タンパク質Ｔ細胞ＧＤ２−ＯＴＣ）が、正常アルギニン培地条件および７５％アルギニン枯渇培地条件で培養された場合に、培養上清のＥＬＩＳＡによって検出されたシトルリン代謝を高めることを示す。Ｂ欄は、対照タンパク質を発現しているＴ細胞（ＡＳＳ−１もＯＴＣも有さない「ＧＤ２−ＢＢ」）による溶解と比べて評価するとき、本発明の融合標的結合タンパク質を発現しているＴ細胞（ＡＳＳ−１ドメイン（「ＧＤ２−ＡＳＳ」）、またはＯＴＣドメイン（「ＧＤ２−ＯＴＣ」）を含む）による神経芽腫細胞株および骨髄性白血病細胞株の特異的細胞溶解を図示する。Ｃ欄は、ＡＳＳ−１またはＯＴＣ酵素ドメインを含む融合標的結合タンパク質Ｔ細胞が、対照（酵素を有さないＧＤ２）と比較して低アルギニン条件で増殖の有意なレスキューを示したことを示す。グラフに示した条件は、正常アルギニン（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）、神経芽腫由来の低アルギニン上清（Ｌａｎ−１  ＴＣＭ）、または７５％アルギニン枯渇培地である。
【図５】改変融合標的結合タンパク質Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで高い抗腫瘍活性を有し、非ＧＤ２融合標的結合タンパク質Ｔ細胞に応用できることを示す。Ａ欄は、ＧＤ２＋腫瘍細胞を移植され、ＡＳＳ−１ドメインを含む融合標的結合タンパク質Ｔ細胞（ＧＤ２−ＡＳＳ）および有さない融合標的結合タンパク質Ｔ細胞（ＧＤ２のみ）を投与されたＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスの相対腫瘍体積を示す。相対腫瘍成長を経時的に測定した。Ｂ欄は、ＧＤ２−ＡＳＳ−１融合標的結合タンパク質Ｔ細胞およびＧＤ２のみの融合標的結合タンパク質Ｔ細胞を投与後のマウスの生存率を示す。Ｃ欄は、５０％〜７５％  ＡＭＬ細胞株の馴化培地（低アルギニン）または７５％アルギニン枯渇培地中のＣＤ３３およびＣＤ３３−ＡＳＳ−１融合標的結合タンパク質Ｔ細胞の生存能を図示する。
【図６】ｉｎ  ｖｉｖｏでのアルギニン枯渇条件における本発明の細胞の存続性増加を示す。静脈内投与された５×１０６個の抗ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ  Ｊｕｒｋａｔ細胞（対照細胞）、またはＧＤ２標的部分およびＡＳＳ−１ドメインを含む本発明のタンパク質を発現しているＪｕｒｋａｔ細胞（ＧＤ２−ＡＳＳ）、またはＧＤ２標的部分およびＯＴＣドメインを含む本発明のタンパク質を発現している細胞（ＧＤ２−ＯＴＣ）が移植されたＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスで実証した。ＧＤ２−ＡＳＳ−１  ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＧＤ２−ＯＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、改変ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ構築物を含む対照細胞と比較して有意に高い存続性を示した。
【図７】様々な標的結合部分を含むヒトドナーからのＰＢＭＣ内にアルギニン経路の酵素を形質導入できることを示す。ウエスタンブロットは、対照と比較して本発明のタンパク質を形質導入されたＰＢＭＣ細胞においてＡＳＳ−１およびＯＴＣの発現が増加していることを示す（Ａ欄）。Ｂ欄は、フローサイトメトリーによって評価されたＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、およびＰＤ−１の発現を示す。
【図８】Ｋ５６２白血病細胞の存在下において異なるエフェクター対標的比で４時間培養された、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインのいずれかと組み合わせてＣＤ３３標的化ドメインを発現しているＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞破壊活性を示す。本発明のタンパク質を含む細胞は、細胞破壊活性を維持する。
【図９】抗ＧＤ２、抗ＣＤ３３、抗メソセリン、または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化部分のいずれかをＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインのいずれかと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現しているＣＡＲ  Ｔ細胞が、対照細胞と比較して低アルギニン腫瘍条件で有意な代謝および増殖上の利点を付与することを示す。同じ結合ドメイン（すなわち、抗ＧＤ２、抗ＣＤ３３、抗メソセリン、または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を共有するが、酵素ドメインを欠如する未改変ＣＡＲ−Ｔ細胞を、本発明のタンパク質を発現している対照ＣＡＲ  Ｔ細胞として使用した。
【図１０】腫瘍馴化培地（ＴＣＭ）中で培養された、ＧＤ２結合部分をＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインのいずれかと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、有意な代謝および増殖上の利点を付与することを示す（Ａ欄）。Ｂ欄は、腫瘍馴化培地（ＴＣＭ）中で培養された、ＣＤ３３結合部分をＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインのいずれかと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞も、有意な代謝および増殖上の利点を付与することを示す。
【図１１】ＡＳＳ−１ドメインを含む本発明のタンパク質を発現しているＣＡＲ−Ｔ細胞（抗ＣＤ３３−ＡＳＳ−１ＣＡＲ−Ｔ細胞）が担白血病マウスの骨髄からのＡＭＬの排除を有意に高めることを示す。このデータは、ＮＯＧ−ＳＣＩＤマウス中に移植されたＨＬ−６０急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の排除に関係する。
【図１２】Ａ欄は、ＧＤ２結合部分およびＡＳＳ−１ドメインを含む本発明のタンパク質を発現している細胞により治療された神経芽腫異種移植マウスの脾臓内の本発明の細胞の存続性増加を図示する。本発明の細胞の、抗原刺激に応答して増殖する能力の改善をＢ欄に示す。
【図１３】Ａ欄は、ＣＤ３３結合部分と、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインのうちの１つとを含む本発明のタンパク質を発現している細胞により治療されたＡＭＬ異種移植マウスの脾臓内の本発明の細胞の存続性増加を図示する。本発明の細胞の、抗原刺激に応答して増殖する能力の改善をＢ欄に示す。
【図１４】本発明の細胞の好結果のレンチウイルス産生に使用されている、本発明の核酸を含む構築物の詳細を述べる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、アルギニンもしくはアルギニン前駆体の合成を促進するドメイン（および／またはトリプトファンもしくはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメイン）を組み込んでいる融合標的結合タンパク質を発現している細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで有意な利点を表すという本発明者の認識に基づく。特に、本発明者らは、多くの先行技術のＣＡＲに基づく治療法の失敗の一因となったと本発明者らが考える腫瘍微小環境に関連する免疫抑制効果を、そのようなタンパク質を発現している細胞が克服できることを見出した。
【００２６】
本発明のタンパク質を発現している細胞によって表される特定の利点のうちの１つは、腫瘍微小環境におけるそれらの増加した存続性および増殖である。この微小環境は、さもなければ先行技術のＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を劇的に下げる可能性があることが公知である。
【００２７】
さらに、本発明のタンパク質を発現している細胞は、免疫抑制腫瘍微小環境の条件で増殖する、改善された能力を表す。ＣＡＲを発現している細胞の増殖は、通常、アルギニン枯渇条件により劇的に阻害される。
【００２８】
これらの利点の両方は、本発明のタンパク質を発現している細胞の数が増加される、改善された治療を可能にし、これらの細胞は、腫瘍部位に長期の滞留期間を有し、したがってがん細胞の改善された殺滅を可能にする。この点で、本発明のタンパク質および細胞に関して行われた改変は、それらが（細胞傷害作用によってであろうと、特異的細胞溶解によってであろうと）がん細胞を殺滅する能力をあまり減らさないことに留意することが重要である。
【００２９】
したがって、本発明のタンパク質および細胞は、先行技術のＣＡＲに基づく治療法と比較して、改善された治療剤を提供すると認識されるであろう。本明細書に記載される本発明の様々な態様および実施形態は、これらの改善から生じるか、またはこれらの改善に寄与する。
【００３０】
本発明の理解のために、以下の定義を参照して、これからさらに説明する。簡潔にするために、以下の段落は、本発明のタンパク質だけに関連する特定の実施形態を指す場合があるが、文脈による別段の要求がある場合を除き、本発明のタンパク質に関連して参照される実施形態は、本明細書に開示される本発明のその他の態様のうちのいずれにも採用され得ることが理解されよう。
【００３１】
融合標的結合タンパク質
融合標的結合タンパク質は、本発明のタンパク質が発現される細胞の所望の生物学的性質に付与すべき所望の特異性を可能にする人工融合タンパク質である。簡潔にするために、それらもまた、本開示において「タンパク質」または「本発明のタンパク質」と称される。本発明に関連してそれぞれ提供することができる異なる種類の細胞および所望の生物学的性質は、本明細書の他の箇所にさらに述べられる。典型的には、融合標的結合タンパク質およびそのようなタンパク質を発現している細胞の医学的使用の状況で、疾患に関連する細胞（がん細胞または感染細胞など）に対して標的化された細胞破壊活性は、必要とされる治療的有用性を付与する。
【００３２】
本発明のタンパク質は、少なくとも標的結合部分と、細胞内シグナル伝達領域と、アルギニンもしくはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインおよび／またはトリプトファンもしくはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとを含む。これらの用語は、本明細書内の他の箇所に定義される。当業者は、そのようなタンパク質がまた、様々な他の随意のドメインまたは領域を組み込んでいる場合があることを認識しているであろう。
【００３３】
融合標的結合タンパク質の異なる部（標的結合部分、細胞内シグナル伝達領域、ならびにアルギニンもしくはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインおよび／またはトリプトファンもしくはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメイン）は、２つ以上の異なる「供給源」に由来する場合がある。したがって、異なる部は、タンパク質などの２つ以上の天然分子に由来する場合がある。追加的に、異なる部は、本来の界または種が異なるという点で、異なる供給源に由来する場合がある。
【００３４】
本発明の文脈で特に関心がもたれる融合標的結合タンパク質のクラスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質である。ＣＡＲは、抗体またはそのフラグメントを利用して、結合特異性を付与し、細胞内シグナル伝達領域を利用して、必要とされる特異的生物学的活性を決定する。様々な異なる世代のＣＡＲが公知であり、本開示の文脈による別段の要求がないかぎり、これらの異なる世代のそれぞれが、本発明の融合標的結合タンパク質の適切な例に相当する。
【００３５】
疑問を残さないように述べると、本発明のタンパク質はまた、アルギニンもしくはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインおよび／またはトリプトファンもしくはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインを含むように改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を包含すると考えられる場合がある。そのような実施形態では、標的結合部分は、受容体のＴＣＲ  α鎖およびＴＣＲ  β鎖により提供される場合がある。標的結合部分と、アルギニンもしくはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインおよび／またはトリプトファンもしくはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインとは、異なる供給源由来であるので、そのような改変ＴＣＲは、本発明の目的では、キメラである。
【００３６】
本発明のタンパク質は、典型的には、膜貫通部、ＣＨ２ＣＨ３スペーサー部、ＣＤ８ヒンジ部、およびＣＤ８ａシグナル伝達部からなる群からの１つまたは複数を含む追加的な部をさらに含む。
【００３７】
本発明の例示的なタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２〜２３に示す。これらの配列のうちのいずれかを含む、またはそれらからなる分子が、本発明の第１の態様によるタンパク質に相当することが理解されよう。配列番号１２〜２３に示されるタンパク質のうちのいずれかが、本発明の医学的使用、治療方法、または医薬組成物に利用され得る。
【００３８】
本発明の例示的なタンパク質の配列のフラグメントまたは変異体
本明細書は、いくつかの例示的なタンパク質および核酸配列を含有する。融合標的結合タンパク質およびそれらをコードする核酸と同様に、これらは、標的結合部分、細胞内シグナル伝達領域、および酵素ドメインの配列を含む。
【００３９】
文脈による別段の要求がある場合を除き、本発明の範囲は、本明細書に示される特定の例示的な配列に限定されるべきではないことが理解されよう。特に、熟練の読者は、例示的な配列のフラグメントまたは変異体であっても、例示的な配列によって付与される必要な活性を提供できる場合があることを認識しているであろう。例示的な配列のそのような適切なフラグメントまたは変異体は、本発明の様々な態様および実施形態に利用される場合がある。
【００４０】
したがって、本明細書における例示的なアミノ酸または核酸配列への参照は、文脈による別段の要求がある場合を除き、例示的な配列の機能的フラグメントまたは変異体も包含すると考えるべきである。例えば、適切なフラグメントは、関連する例示的な配列の完全長の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。実際に、適切な変異体は、例示的な配列の完全長の少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含む場合がある。
【００４１】
適切な変異体は、関連する例示的な配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を共有する場合がある。実際に、適切な変異体は、関連する例示的な配列と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有する場合がある。
【００４２】
フラグメントまたは変異体が「機能的」であることは、実施例に記載されたアッセイを含む当業者に公知のアッセイに関連して実験的に評価される場合がある。
【００４３】
アルギニンまたはアルギニン前駆体
本発明は、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインを含む融合標的結合タンパク質に関する。
【００４４】
アルギニン（多くの場合に「Ａｒｇ」または「Ｒ」と略される）は準必須アミノ酸である。これは、１７４．２ｇ／ｍｏｌ−１の分子量を有し、２−アミノ−５−グアニジノペンタン酸と称される場合もある。
【００４５】
本開示に関連して、アルギニン前駆体への言及は、代謝性アルギニンが搬入される、異化される、または再循環される一連の化学反応であるアルギニン経路に関連して解釈されるべきである。したがって、アルギニンの前駆体は、本目的のために、直接的または間接的のいずれかでアルギニンに変換される任意の化合物を包含すると考えられる場合がある。
【００４６】
アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメイン
本発明のタンパク質は、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインを含む。ドメインがこの機能を果たす能力、いわばアルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進する能力は、任意の適切な手段またはアッセイによって検討される場合がある。
【００４７】
当業者は、適切な手段またはアッセイが、合成を促進すべき化合物、例えばアルギニンまたはアルギニン前駆体に関連して選択される場合があることを、認識しているであろう。単なる例示として、ドメインが必要な合成を促進する能力が評価される適切なアッセイは、本発明の例示的な細胞の特徴づけと関係して実施例にさらに記載される。
【００４８】
適切には、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインは、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進することができる酵素ドメインであり得る。そのような実施形態では、酵素ドメインは、完全長酵素ドメイン、またはドメインが必要な活性を表すかぎり、そのようなドメインのフラグメントもしくは変異体を含む場合がある。
【００４９】
適切な実施形態では、合成が促進されるアルギニン前駆体は、アルギノコハク酸塩である。そのような実施形態では、そのような合成を促進するドメインは、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ−１）酵素ドメイン、およびアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡｒｇＧ）ドメインから選択される場合がある。適切には、そのような合成を促進するドメインは、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ−１）酵素ドメインである。
【００５０】
適切な実施形態では、合成が促進されるアルギニン前駆体はアルギノコハク酸塩である。アルギニノコハク酸リアーゼなどによるアルギニノコハク酸塩の触媒は、アルギニンを生じる。そのような実施形態では、そのような合成を促進するドメインは、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）酵素ドメイン、およびアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡｒｇＨ）酵素ドメインから選択される場合がある。
【００５１】
適切な実施形態では、合成が促進されるアルギニン前駆体はシトルリンである。そのような実施形態では、そのような合成を促進するドメインは、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素ドメイン、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ１）、およびオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）酵素ドメインから選択される場合がある。適切には、そのような合成を促進するドメインは、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素ドメインである。
【００５２】
したがって、適切な実施形態では、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインは、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、ＡＳＬドメイン、ＯＣＤ１ドメイン、ＡｒｇＧドメイン、ＡｒｇＨドメイン、およびＡｒｇＦドメインからなる群から選択される酵素ドメインを含む。ドメインは、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインから選択される場合がある。
【００５３】
適切には、本発明によるタンパク質は、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進する複数のドメインを含む場合がある。適切には、そのような複数は、複数の酵素ドメインを含む場合がある。この複数は、個別の酵素ドメインの１つよりも多いコピー、および／または複数の酵素ドメインの組み合わせを含む場合がある。例えば、本発明によるタンパク質は、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、ＡＳＬドメイン、ＯＣＤ１ドメイン、ＡｒｇＧドメイン、ＡｒｇＨドメイン、およびＡｒｇＦドメインからなる群から選択される酵素ドメインの組み合わせを含む場合がある。単なる例示として、本発明のタンパク質は、ＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインの両方を含む場合がある。
【００５４】
アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進する適切な酵素ドメインは、ヒト酵素ドメインであり得る。そのような実施形態では、これは、ＡＳＳ−１、ＯＴＣ、ＡＳＬまたはＯＤＣ１であり得る。
【００５５】
アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進する適切な酵素ドメインは、天然酵素ドメインであり得る。あるいは、アルギニンまたはアルギニン前駆体の合成を促進する適切な酵素ドメインは、天然ドメインの合成活性を再現することができる、天然酵素ドメインのフラグメントまたは誘導体であり得る。そのようなフラグメントまたは誘導体は、天然ドメインの５０％以上、天然ドメインの６０％以上、天然ドメインの７０％以上、天然ドメインの８０％以上、天然ドメインの９０％以上、または天然ドメインの９５％以上である合成活性を有する場合がある。実際に、適切なフラグメントまたは誘導体は、それが由来する天然ドメインよりも大きい合成活性を有する場合があり、つまり、これは、天然ドメインの合成活性の１００％以上を有する場合がある。
【００５６】
本開示のために、アルギニン前駆体の合成を促進する適切な酵素ドメインのさらなる詳細を下に述べる。
【００５７】
ＡＳＳ−１酵素ドメイン
本発明のタンパク質中の組込みに適したＡＳＳ−１酵素ドメインの一例を配列番号１に示す。
【００５８】
あるいは、配列番号１に示される配列のフラグメントまたは誘導体が、本発明のタンパク質中の組込みに適したＡＳＳ−１酵素ドメインとして使用される場合がある。
【００５９】
本発明のタンパク質にＡＳＳ−１活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態において使用される場合がある。ＡＳＳ−１活性は、本開示の実施例の項に記載されるアッセイによって評価される場合がある。
【００６０】
適切なレベルのＡＳＳ−１活性が、配列番号１によって付与される活性と等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＡＳＳ−１活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【００６１】
配列番号１に示されるＡＳＳ−１酵素ドメインの適切なフラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸残基の１つを除くすべて、配列番号１に示されるアミノ酸残基の２つを除くすべて、配列番号１に示されるアミノ酸残基の３つを除くすべて、配列番号１に示されるアミノ酸残基の４つを除くすべて、配列番号１に示されるアミノ酸残基の５つを除くすべて、配列番号１に示されるアミノ酸残基の６つを除くすべて、配列番号１に示されるアミノ酸残基の７つを除くすべて、配列番号１に示されるアミノ酸残基の８つを除くすべて、配列番号１に示されるアミノ酸残基の９つを除くすべて、または配列番号１に示されるアミノ酸残基の１０個を除くすべてを含む場合がある。
【００６２】
単なる例示として、配列番号１に示される配列の適切な変異体は、配列番号１、または上に定義されるような配列番号１のフラグメントと少なくとも７５％の同一性を共有する場合がある。適切な変異体は、配列番号１もしくはそのフラグメントと少なくとも８０％の同一性、配列番号１もしくはそのフラグメントと少なくとも８５％の同一性、配列番号１もしくはそのフラグメントと少なくとも９０％の同一性、配列番号１もしくはそのフラグメントと少なくとも９５％の同一性、配列番号１もしくはそのフラグメントと少なくとも９６％の同一性、配列番号１もしくはそのフラグメントと少なくとも９７％の同一性、配列番号１もしくはそのフラグメントと少なくとも９８％の同一性、または配列番号１もしくはそのフラグメントと少なくとも９９％の同一性を共有する場合がある。本発明のＣＡＲ中の組込みに適するために、そのような変異体は、上述のようなＡＳＳ−１の合成活性を保持するべきである。
【００６３】
適切なＡＳＳ−１酵素ドメインは、配列番号１のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも５０％を提供する場合がある。適切には、それは、配列番号１のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を提供する場合がある。適切には、それは、配列番号１のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも１００％さえ提供する場合がある。
【００６４】
実際に、適切なＡＳＳ−１ドメインは、配列番号１のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも１１０％を提供する場合がある。適切には、それは、配列番号１のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％を提供する場合がある。適切には、それは、配列番号１のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも２００％さえ提供する場合がある。
【００６５】
ＯＴＣ酵素ドメイン
本発明のタンパク質中の組込みに適したＯＴＣ酵素ドメインの一例を配列番号２に示す。
【００６６】
あるいは、配列番号２に示される配列のフラグメントまたは誘導体は、本発明のタンパク質中の組込みに適したＯＴＣ酵素ドメインとして使用される場合がある。
【００６７】
本発明のタンパク質にＯＴＣ活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態に使用される場合がある。ＯＴＣ活性は、本開示の実施例の項に記載されるアッセイによって評価される場合がある。
【００６８】
適切なレベルのＯＴＣ活性は、配列番号２によって付与される活性と等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＯＴＣ活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【００６９】
配列番号２に示されるＯＴＣ酵素ドメインの適切なフラグメントは、配列番号２に示されるアミノ酸残基の１つを除くすべて、配列番号２に示されるアミノ酸残基の２つを除くすべて、配列番号２に示されるアミノ酸残基の３つを除くすべて、配列番号２に示されるアミノ酸残基の４つを除くすべて、配列番号２に示されるアミノ酸残基の５つを除くすべて、配列番号２に示されるアミノ酸残基の６つを除くすべて、配列番号２に示されるアミノ酸残基の７つを除くすべて、配列番号２に示されるアミノ酸残基の８つを除くすべて、配列番号２に示されるアミノ酸残基の９つを除くすべて、または配列番号２に示されるアミノ酸残基の１０個を除くすべてを含む場合がある。
【００７０】
単なる例示として、配列番号２に示される適切な変異体は、配列番号２、または上に定義されるような配列番号２のフラグメントと少なくとも７５％の同一性を共有する場合がある。適切な変異体は、配列番号２もしくはそのフラグメントと少なくとも８０％の同一性、配列番号２もしくはそのフラグメントと少なくとも８５％の同一性、配列番号２もしくはそのフラグメントと少なくとも９０％の同一性、配列番号２もしくはそのフラグメントと少なくとも９５％の同一性、配列番号２もしくはそのフラグメントと少なくとも９６％の同一性、配列番号２もしくはそのフラグメントと少なくとも９７％の同一性、配列番号２もしくはそのフラグメントと少なくとも９８％の同一性、または配列番号２もしくはそのフラグメントと少なくとも９９％の同一性を共有する場合がある。本発明のＣＡＲ中の組込みに適するために、そのような変異体は、上述のようなＯＴＣの合成活性を保持するべきである。
【００７１】
適切なＯＴＣ酵素ドメインは、配列番号２のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも５０％を提供する場合がある。適切には、それは、配列番号２のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の活性を提供する場合がある。適切には、配列番号２のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも１００％さえ提供する場合がある。
【００７２】
実際に、適切なＯＴＣドメインは、配列番号２のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも１１０％を提供する場合がある。適切には、それは、配列番号２のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％を提供する場合がある。適切には、それは、配列番号２のドメインによって提供されるものの活性の少なくとも２００％さえ提供する場合がある。
【００７３】
アルギノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）酵素ドメイン
本発明のタンパク質中の組込みに適したＡＳＬ酵素ドメインの一例は、配列番号３０に示される核酸配列によってコードされる。
【００７４】
あるいは、配列番号３０に示される配列のフラグメントまたは誘導体を使用して、本発明のタンパク質中の組込みに適したＡＳＬ酵素ドメインをコードさせてもよい。
【００７５】
本発明のタンパク質にＡＳＬ活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態に使用される場合がある。
【００７６】
適切なレベルのＡＳＬ活性は、配列番号３０によってコードされるタンパク質によって付与されるものと等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＡＳＬ活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【００７７】
オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ１）酵素ドメイン
本発明のタンパク質中の組込みに適したＯＤＣ１酵素ドメインの一例は、配列番号３１に示される核酸配列によってコードされる。
【００７８】
あるいは、配列番号３１に示される配列のフラグメントまたは誘導体を使用して、本発明のタンパク質中の組込みに適したＯＤＣ１酵素ドメインをコードさせてもよい。
【００７９】
本発明のタンパク質にＯＤＣ１活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態に使用される場合がある。
【００８０】
適切なレベルのＯＤＣ１活性は、配列番号３１によってコードされるタンパク質によって付与されるものと等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＯＤＣ１活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【００８１】
アルギノコハク酸シンテターゼ（ＡｒｇＧ）酵素ドメイン
本発明のＣＡＲ中の組込みに適したＡｒｇＧ酵素ドメインの一例は、配列番号３２に示される核酸配列によってコードされる。
【００８２】
あるいは、配列番号３２に示される配列のフラグメントまたは誘導体を使用して、本発明のタンパク質中の組込みに適したＡｒｇＧ酵素ドメインをコードさせてもよい。
【００８３】
本発明のタンパク質にＡｒｇＧ活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態に使用される場合がある。
【００８４】
適切なレベルのＡｒｇＧ活性は、配列番号３２によってコードされるタンパク質によって付与されるものと等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＡｒｇＧ活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【００８５】
アルギノコハク酸リアーゼ（ＡｒｇＨ）酵素ドメイン
本発明のタンパク質中の組込みに適したＡｒｇＨ酵素ドメインの一例は、配列番号３３に示される核酸配列によってコードされる。
【００８６】
あるいは、配列番号３３に示される配列のフラグメントまたは誘導体を使用して、本発明のタンパク質中の組込みに適したＡｒｇＨ酵素ドメインをコードさせてもよい。
【００８７】
本発明のタンパク質にＡｒｇＨ活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態に使用される場合がある。
【００８８】
適切なレベルのＡｒｇＨ活性は、配列番号３３によってコードされるタンパク質によって付与されるものと等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＡｒｇＨ活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【００８９】
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）酵素ドメイン
本発明のタンパク質中の組込みに適したＡｒｇＦ酵素ドメインの一例は、配列番号３４に示される核酸配列によってコードされる。
【００９０】
あるいは、配列番号３４に示される配列のフラグメントまたは誘導体を使用して、本発明のタンパク質中の組込みに適したＡｒｇＦ酵素ドメインをコードさせてもよい。
【００９１】
本発明のタンパク質にＡｒｇＦ活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態に使用される場合がある。
【００９２】
適切なレベルのＡｒｇＦ活性は、配列番号３４によってコードされるタンパク質によって付与されるものと等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＡｒｇＦ活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【００９３】
トリプトファンまたはトリプトファン前駆体
本発明は、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインを含むタンパク質に関する。
【００９４】
トリプトファン（多くの場合に「Ｔｒｐ」または「Ｗ」と略される）は、非極性アミノ酸である。これは、２０４．２ｇ／ｍｏｌ−１の分子量を有し、２−アミノ−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパン酸と称される場合もある。
【００９５】
本発明の目的では、「トリプトファン前駆体」は、トリプトファン産生カスケードにおいてトリプトファンに先行する任意の化合物であると考えられる場合がある。
【００９６】
トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメイン
本発明のタンパク質は、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインを含む。ドメインがこの機能を果たす能力、いわばトリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進する能力は、任意の適切な手段またはアッセイによって検討される場合がある。
【００９７】
当業者は、適切な手段またはアッセイが、合成を促進すべき化合物、例えばトリプトファンまたはトリプトファン前駆体に関連して選択される場合があることを認識しているであろう。単なる例示として、ドメインが必要な合成を促進する能力が評価される適切なアッセイは、本発明の例示的な細胞の特徴づけと関係して実施例にさらに記載される。
【００９８】
適切には、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進するドメインは、トリプトファンまたはトリプトファン前駆体の合成を促進することができる酵素ドメインであり得る。そのような実施形態では、酵素ドメインは、完全長酵素ドメイン、またはドメインが必要な活性を表すかぎり、そのようなドメインのフラグメントもしくは変異体を含む場合がある。
【００９９】
適切な実施形態では、合成が促進されるトリプトファン前駆体は、インドールグリセロールリン酸塩である。そのような実施形態では、そのような合成を促進するドメインは、トリプトファンシンテターゼ（ＴＲＰ５）酵素ドメインであり得る。
【０１００】
適切な実施形態では、トリプトファンの合成が促進される。そのような実施形態では、そのような合成を促進するドメインは、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）酵素ドメインであり得る。
【０１０１】
トリプトファンシンテターゼ（ＴＲＰ５）酵素ドメイン
本発明のタンパク質中の組込みに適したＴＲＰ５酵素ドメインの一例は、配列番号３５に示される核酸配列によってコードされる。
【０１０２】
あるいは、配列番号３５に示される配列のフラグメントまたは誘導体を使用して、本発明のタンパク質中の組込みに適したＴＲＰ５酵素ドメインをコードさせてもよい。本発明のタンパク質にＴＲＰ５活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態に使用される場合がある。
【０１０３】
適切なレベルのＴＲＰ５活性は、配列番号３５によってコードされるタンパク質によって付与されるものと等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＴＲＰ５活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【０１０４】
インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）酵素ドメイン
本発明のタンパク質中の組込みに適したＩＤＯ酵素ドメインの一例は、配列番号３６に示される核酸配列によってコードされる。
【０１０５】
あるいは、配列番号３６に示される配列のフラグメントまたは誘導体を使用して、本発明のタンパク質中の組込みに適したＩＤＯ酵素ドメインをコードさせてもよい。
【０１０６】
本発明のタンパク質にＩＤＯ活性を付与する任意の酵素ドメインが、そのような実施形態に使用される場合がある。
【０１０７】
適切なレベルのＩＤＯ活性は、配列番号３６によってコードされるタンパク質によって付与されるものと等価な場合がある。あるいは、より低いまたはより高いレベルのＩＤＯ活性を付与する酵素ドメインがなお有益な場合がある。
【０１０８】
標的結合部分
本発明のタンパク質は、標的結合部分を含む。標的結合部分は、タンパク質の結合特異性、およびそれゆえに標的結合部分によって認識される標的分子がその上に見出される、細胞などの標的構造に対する本発明のタンパク質を発現している細胞の細胞破壊活性の特異性を付与する。
【０１０９】
特に、標的結合部分は、本発明の細胞の治療的有用性を補強する、それらの細胞の生物学的活性（例えば、細胞破壊活性または活性化に応答した細胞増殖）の特異性を付与する。文脈による別段の要求がある場合を除き、本開示における特異的結合への言及は、結合が起こるべき環境中で標的結合部分が可能性のあるパートナー同士を識別する能力を指すものとして解釈される場合がある。他の潜在的標的が存在する場合に１つの特定の標的分子と相互作用する標的結合部分は、それが相互作用する標的分子と「特異的に結合する」と言われる。一部の実施形態では、特異的結合は、標的結合部分とその標的分子との間の会合の程度を検出または決定することによって評価され、一部の実施形態では、特異的結合は、結合部分−標的分子複合体の解離の程度を検出または決定することによって評価され、一部の実施形態では、特異的結合は、標的結合部分がその標的分子と別の実体との間で代替的相互作用を競合する能力を検出または決定することによって評価される。一部の実施形態では、特異的結合は、そのような検出または決定を一連の濃度にわたり行うことによって評価される。適切な実施形態では、特異的結合は、同族標的と非同族標的との間の結合親和性における差を決定することによって評価される。例えば、特異的な標的結合部分は、非同族標的に対する結合親和性の約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはより大きい結合親和性を同族標的分子に対して有する場合がある。
【０１１０】
本開示に関連して、「特異性」は、特定の標的結合部分がその標的分子の結合パートナーを他の潜在的結合パートナーと識別する能力の尺度である。
【０１１１】
適切な標的結合部分は、任意の所望の標的分子に向けられる場合がある。標的結合部分は、本発明のタンパク質を発現している細胞の細胞破壊活性を向けることが望まれる標的によって独占的にまたは多く発現される標的分子に向けられる場合がある。例えば、標的結合部分は、疾患に関連する標的分子に向けられる場合がある。適切には、標的結合部分は、がんまたは感染症に関連する標的分子に向けられる場合がある。
【０１１２】
適切な実施形態では、標的結合部分は、ＧＤ２標的結合部分、ＣＤ３３標的結合部分、メソセリン標的結合部分、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分からなる群から選択される。
【０１１３】
そのような標的結合部分の例は、配列番号３〜６に示される。フラグメントまたは変異体（例えば、例示的な配列と１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いアミノ酸残基が異なる）が、標的分子と結合する能力を保持するかぎり、フラグメントまたは変異体が代替的な標的結合部分として使用され得ることが理解されよう。
【０１１４】
限定されることなく、適切な標的結合部分は、抗体、またはそのフラグメント（ｓｃＦｖなど）もしくは誘導体、ＴＣＲ、例えばＴＣＲ  α鎖またはＴＣＲ  β鎖、およびアプタマーからなる群から選択される場合がある。
【０１１５】
ＧＤ２標的結合部分
ＧＤ２標的結合部分は、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）に結合することができる部分であり、ガングリオシドＧＤ２と称される場合もある。ＧＤ２標的結合部分を含む本発明のタンパク質は、ＧＤ２分子を含む標的、例えばＧＤ２を発現している細胞に対する本発明のタンパク質を発現している細胞の細胞破壊活性を発揮することが望まれる状況における使用に適している。
【０１１６】
ＧＤ２は、神経芽腫、骨肉腫および黒色腫を含む神経外胚葉起源のがんによって発現される。したがって、ＧＤ２標的結合部分を含む本発明のタンパク質（ＣＡＲなど）は、任意のそのようながん、特に神経芽腫の予防および／または治療のための医学的使用に本発明のタンパク質を利用することが望まれる状況における使用に適していることが理解されよう。
【０１１７】
本発明によるタンパク質中の組込みに適したＧＤ２標的結合部分は、抗ＧＤ２抗体、例えば抗ＧＤ２モノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメントもしくは誘導体であり得る。例えば、ＧＤ２標的結合部分は、抗ＧＤ２  ｓｃＦｖ抗体フラグメントであり得る。単なる例示として、ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む適切なＧＤ２標的化ドメインは、配列番号３に示される。
【０１１８】
配列番号３に示されるｓｃＦｖ抗体フラグメントはまた、ＵＳ９，４９３，７４０Ｂ２に記載されるように１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖと称される。それは、ＵＳ９，７７７，０６８Ｂ２に開示されるｃｈ１４．１８抗体に由来し、他のｃｈ１４．１８抗体フラグメントまたは変異体が本発明のタンパク質においてＧＤ２標的結合部分として使用され得ることが理解されよう。
【０１１９】
あるいは、適切なＧＤ２標的結合部分は、抗ＧＤ２アプタマー、またはそのフラグメントもしくは誘導体からなる群から選択される場合がある。
【０１２０】
適切には、ＧＤ２標的結合部分は、ＧＤ２に特異的に結合することができる。
【０１２１】
ＣＤ３３標的結合部分
ＣＤ３３標的結合部分は、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ−３としても知られる）に結合することができる部分である。ＣＤ３３は、膜貫通タンパク質である。ＣＤ３３標的結合部分を含む本発明のタンパク質は、ＣＤ３３分子を含む標的、例えばＣＤ３３を発現している細胞に対して、本発明のタンパク質を発現している細胞の生物学的活性を発揮することが望まれる状況における使用に適している。
【０１２２】
ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞によって発現される。したがって、ＣＤ３３標的結合部分を含む本発明のタンパク質は、ＡＭＬの予防および／または治療のための医学的使用に本発明のタンパク質を利用することが望まれる状況における使用に適していることが理解されよう。
【０１２３】
本発明によるタンパク質中の組込みに適したＣＤ３３標的結合部分は、抗ＣＤ３３抗体、例えば抗ＣＤ３３モノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメントもしくは誘導体であり得る。例えば、ＣＤ３３標的結合部分は、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖ抗体フラグメントであり得る。単なる例示として、ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む適切なＣＤ３３標的化ドメインは、配列番号４に示される。
【０１２４】
配列番号４に示されるｓｃＦｖ抗体フラグメントは、ヒト化ｍｙ９６クローンモノクローナル抗体に由来する。ｍｙ９６抗体の詳細は、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５  Ａｕｇ；；２９（８）：１６３７−４７に示され、配列番号４のｓｃＦｖフラグメントの詳細は、ＵＳ２０１６００９６８９２Ａ１（そこで、このｓｃＦｖは配列番号１４７として開示されている）に示される。他のｍｙ９６抗体フラグメントまたは変異体が、本発明のタンパク質におけるＣＤ３３標的結合部分として使用される場合があることが理解されよう。
【０１２５】
あるいは、適切なＣＤ３３標的結合部分は、抗ＣＤ３３アプタマー、またはそのフラグメントもしくは誘導体からなる群から選択される場合がある。
【０１２６】
適切には、ＣＤ３３標的結合部分は、ＣＤ３３に特異的に結合することができる。
【０１２７】
メソセリン標的結合部分
メソセリン標的結合部分は、メソセリンに結合することができる部分である。メソセリンは、ＭＳＬＮの産物の４０ｋＤａタンパク質である。メソセリン標的結合部分を含む本発明のタンパク質は、メソセリン分子を含む標的、例えばメソセリンを発現している細胞に対して、本発明のタンパク質を発現している細胞の生物学的活性を発揮することが望まれる状況における使用に適している。
【０１２８】
メソセリンは、いくつかの異なる種類のがん細胞によって発現される。メソセリンを発現しているがんには、例えば、上皮がん、例えば、卵巣がん、肺腺がん、および膵臓がんが含まれる。したがって、メソセリン標的結合部分を含む本発明のタンパク質は、任意のメソセリン発現がんの予防および／または治療のための医学的使用に本発明のタンパク質を利用することが望まれる状況における使用に適していることが理解されよう。
【０１２９】
本発明によるタンパク質中の組込みに適したメソセリン標的結合部分は、抗メソセリン抗体、例えば抗メソセリンモノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメントもしくは誘導体であり得る。例えば、メソセリン標的結合部分は、抗メソセリンｓｃＦｖ抗体フラグメントであり得る。単なる例示として、ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む適切なメソセリン標的化ドメインは、配列番号５に示される。
【０１３０】
配列番号５に示されるｓｃＦｖ抗体フラグメントは、ＳＳ１抗体に由来する。この抗体、およびそれに由来するｓｃＦＶの詳細は、ＷＯ２０１５／０９０２３０Ａ（そこで、マウスＳＳ１  ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号２７９に提供される）に示される。他のＳＳ１抗体フラグメントまたは変異体が本発明のタンパク質におけるメソセリン標的結合部分として使用される場合があることが理解されよう。
【０１３１】
あるいは、適切なメソセリン標的結合部分は、抗メソセリンアプタマー、またはそのフラグメントもしくは誘導体からなる群から選択される場合がある。
【０１３２】
適切には、ＧＤ２標的結合部分は、ＧＤ２に特異的に結合することができる。
【０１３３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分
ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分は、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に結合することができる部分である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分を含む本発明のタンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子を含む標的、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩを発現している細胞に対して、本発明のタンパク質を発現している細胞の生物学的活性を発揮することが望まれる状況における使用に適している。
【０１３４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、上皮起源の一連のがんによって発現される。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分を含む本発明のタンパク質は、ＥＧＦＲを発現しているがん、例えば膠芽腫、および結腸直腸がんの予防および／または治療のための医学的使用に本発明のタンパク質を利用することが望まれる状況における使用に適していることが理解されよう。特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分を含む本発明のタンパク質は、膠芽腫の予防および／または治療における使用に適している。
【０１３５】
本発明によるタンパク質中の組込みに適したＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、例えば抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体、またはその抗原結合性フラグメントもしくは誘導体であり得る。例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ抗体フラグメントであり得る。単なる例示として、ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む適切なＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化ドメインは、配列番号６に示される。
【０１３６】
配列番号６に示されるｓｃＦｖ抗体フラグメントは、ＷＯ２０１２／１３８４７５Ａ１（そこで、１３９抗体のヒトｓｃＦＶが配列番号５に示され、ｓｃＦｖを組み込んでいるＣＡＲ構築物は、配列番号１１として示される）に開示される１３９抗体に由来する。他の１３９抗体フラグメントまたは変異体が本発明のタンパク質におけるメソセリン標的結合部分として使用される場合があることが理解されよう。
【０１３７】
代替的なＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分は、ＭＲ１抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に由来する場合がある。そのようなＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分の一例は、配列番号４１のＤＮＡ配列によってコードされるｓｃＦｖ（ＭＲ１に由来する）である。この代替的なＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分は、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４に示される本発明の例示的なタンパク質に組み込まれている。本発明のこれらの例示的なタンパク質は、実施例に記載される研究に利用された。
【０１３８】
あるいは、適切なＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩアプタマー、またはそのフラグメントもしくは誘導体からなる群から選択される場合がある。
【０１３９】
適切には、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合することができる。
【０１４０】
細胞内シグナル伝達領域
本発明のタンパク質は、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達領域を含む。細胞内シグナル伝達領域は、標的分子への標的結合部分の結合を、タンパク質を発現している細胞の他の生物学的活性と共役させるために役立つ。特に、適切な細胞内シグナル伝達領域は、標的結合部分のその標的分子への結合を、細胞の細胞破壊活性の活性化および／または細胞が活性化に応答して増殖する能力と共役させる場合がある。
【０１４１】
実施例に示すように、適切な細胞内シグナル伝達領域は、標的分子の標的結合部分への結合に応答して細胞傷害活性または特異的細胞溶解活性を活性化する場合がある。代替的または追加的に、適切な細胞内シグナル伝達領域は、標的分子の標的結合部分への結合に応答して活性化誘導細胞増殖を推進する場合がある。
【０１４２】
適切な実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は、４−１ＢＢシグナル伝達領域、ＯＸ−４０シグナル伝達領域、ＣＤ２８シグナル伝達領域、ＩＣＯＳシグナル伝達領域、およびＣＤ３  ζシグナル伝達領域からなる群から選択される領域を含む。
【０１４３】
本発明によるタンパク質は、複数の細胞内シグナル伝達領域を含む場合があることが理解されよう。適切には、複数は、個別の細胞内シグナル伝達領域の１つよりも多いコピーを含む場合がある。例えば、本発明のタンパク質は、４−１ＢＢシグナル伝達領域、ＯＸ−４０シグナル伝達領域、ＣＤ２８シグナル伝達領域、ＩＣＯＳシグナル伝達領域、およびＣＤ３  ζシグナル伝達領域のうちの１つの複数のコピー、または複数を含む場合がある。
【０１４４】
追加的または代替的に、本発明のタンパク質は、複数の細胞内シグナル伝達領域の組み合わせを含む場合がある。例えば、本発明によるタンパク質は、４−１ＢＢシグナル伝達領域、ＯＸ−４０シグナル伝達領域、ＣＤ２８シグナル伝達領域、ＩＣＯＳシグナル伝達領域、およびＣＤ３  ζシグナル伝達領域からなる群から選択される細胞内シグナル伝達領域の組み合わせを含む場合がある。単なる例示として、本発明のタンパク質は、４−１ＢＢシグナル伝達領域およびＣＤ３  ζシグナル伝達領域の両方を含む場合がある。
【０１４５】
適切な４−１ＢＢシグナル伝達領域は、そのようなシグナル伝達領域を含むタンパク質を発現している細胞に十分な共刺激シグナル伝達を提供して、細胞の活性化、および／もしくは細胞の機能、例えば細胞によるサイトカイン放出、および／もしくは細胞による細胞傷害性、ならびに／または細胞の増殖および／もしくは存続性のうちの少なくとも１つを促進することができるものである。この存続性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの存続性であり得る。存続性は、特に、免疫抑制腫瘍微小環境の条件、またはこの微小環境を再現する条件における細胞の存続性であり得る。一例として、サイトカインの放出は、ＩＦＮ−ガンマ、および／またはＴＮＦα、および／またはＩＬ２からなる群からの１つまたは複数のサイトカインを含む場合がある。
【０１４６】
適切には、４−１ＢＢシグナル伝達領域は、４−１ＢＢの完全長配列を含む場合がある。あるいは、４−１ＢＢシグナル伝達領域は、完全長配列の切断型および／または改変型を含む場合がある。単なる例示として、適切な４−１ＢＢシグナル伝達領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはこの配列の一部を含む場合がある。適切には、本発明のタンパク質中の組込みのための４−１ＢＢシグナル伝達領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる場合がある。
【０１４７】
適切な実施形態では、ＯＸ−４０シグナル伝達領域は、そのようなシグナル伝達領域を含むタンパク質を発現している細胞に十分な共刺激シグナル伝達を提供して、細胞の活性化、および／または細胞の機能、および／または細胞の存続性のうちの少なくとも１つを促進することができるものである。この存続性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの存続性であり得る。存続性は、特に、免疫抑制腫瘍微小環境の条件、またはこの微小環境を再現する条件における細胞の存続性であり得る。
【０１４８】
適切には、ＯＸ−４０シグナル伝達領域は、ＯＸ−４０の完全長配列を含む場合がある。あるいは、ＯＸ−４０シグナル伝達領域は、完全長配列の切断型および／または改変型を含む場合がある。単なる例示として、適切なＯＸ−４０シグナル伝達領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはこの配列の一部を含む場合がある。適切には、本発明のタンパク質中の組込みのための４−１  ＯＸ−４０  ＢＢシグナル伝達領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる場合がある。
【０１４９】
適切なＣＤ２８シグナル伝達領域は、そのようなシグナル伝達領域を含むタンパク質を発現している細胞に十分な共刺激シグナル伝達を提供して、細胞の活性化、および／または細胞の機能（、および／または細胞の存続性のうちの少なくとも１つを促進することができるものである。この存続性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの存続性であり得る。存続性は、特に、免疫抑制腫瘍微小環境の条件、またはこの微小環境を再現する条件における細胞の存続性であり得る。
【０１５０】
適切には、ＣＤ２８シグナル伝達領域は、ＣＤ２８の完全長配列を含む場合がある。あるいは、ＣＤ２８シグナル伝達領域は、完全長配列の切断型および／または改変型を含む場合がある。単なる例示として、適切なＣＤ２８シグナル伝達領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列またはこの配列の一部を含む場合がある。適切には、本発明のタンパク質中の組込みのためのＣＤ２８シグナル伝達領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる場合がある。
【０１５１】
ＩＣＯＳシグナル伝達領域は、そのようなシグナル伝達領域を含むタンパク質を発現している細胞に十分な共刺激シグナル伝達を提供して、細胞の活性化、ならびに／または細胞によるサイトカイン放出および／もしくは細胞の細胞傷害性などの細胞の機能、ならびに／または細胞の増殖および／もしくは存続性のうちの少なくとも１つを促進することができるものである。この存続性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの存続性であり得る。存続性は、特に、免疫抑制腫瘍微小環境の条件、またはこの微小環境を再現する条件における細胞の存続性であり得る。
【０１５２】
適切には、ＩＣＯＳシグナル伝達領域は、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８としても知られる）の完全長配列を含む場合がある。あるいは、ＩＣＯＳシグナル伝達領域は、完全長配列の切断型および／または改変型を含む場合がある。単なる例示として、適切なＩＣＯＳシグナル伝達領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはこの配列の一部を含む場合がある。適切には、本発明のタンパク質中の組込みのためのＩＣＯＳシグナル伝達領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる場合がある。ＩＣＯＳの切断型または改変型は、完全長ＩＣＯＳタンパク質の残基１８０〜１８３に見られるＹＭＦＭモチーフを少なくとも含む場合がある。
【０１５３】
適切なＣＤ３  ζシグナル伝達領域は、Ｔ細胞内の機能的応答（例えば、サイトカイン放出（例えば、インターフェロン−ガンマ、ＴＮＦａおよび／またはＩＬ２）、細胞傷害性および／または増殖）を活性化できるものである。
【０１５４】
適切には、ＣＤ３  ζシグナル伝達領域は、ＣＤ３  ζの完全長配列を含む場合がある。あるいは、ＣＤ３  ζシグナル伝達領域は、完全長配列の切断型および／または改変型を含む場合がある。単なる例示として、適切なＣＤ３  ζシグナル伝達領域は、配列番号１１もしくは配列番号４０に示されるアミノ酸配列、またはこれらの配列の一部を含む場合がある。適切には、本発明のタンパク質中の組込みのためのＣＤ３  ζシグナル伝達領域は、配列番号１１または配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる場合がある。
【０１５５】
ＧＤ２を標的化する本発明のタンパク質
ＧＤ２を標的化する本発明のタンパク質は、ＧＤ２標的化部分を、適切な細胞内シグナル伝達領域（４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達領域およびＣＤ３  ζ細胞内シグナル伝達領域など）と組み合わせて含む場合がある。タンパク質は、ＡＳＳ−１ドメイン、および／またはＯＴＣドメイン、および／またはＡＳＬドメイン、および／またはＯＣＤ１ドメイン、および／またはＡｒｇＧドメイン、および／またはＡｒｇＨドメイン、および／またはＡｒｇＦドメインをさらに含む場合がある。適切には、タンパク質は、ＡＳＳ−１ドメイン、および／またはＯＴＣドメインを含む場合がある。
【０１５６】
本発明者らは、ＧＤ２標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質が、それらの治療的有用性を実際に示すいくつかの性質に関して特に有用であることを見出した。
【０１５７】
例えば本発明者らは、ＧＤ２標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、先行技術において公知のＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して類似のまたは改善された生存能を表すことを見出した。
【０１５８】
有利なことには、本発明者らは、ＧＤ２標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、類似の対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して増加した存続性を実際に示すことができることを見出した。ＧＤ２標的化部分をＡＳＳ−１ドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、対照細胞と比較して特に有利な増加した増加した存続性を実際に示す。
【０１５９】
本発明者らはまた、ＧＤ２標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、腫瘍微小環境を表す条件（実験的アルギニン枯渇条件など）において対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して増加した増殖を実際に示すことができることを見出した。
【０１６０】
特に、ＧＤ２標的化部分をＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、アルギニン枯渇条件などの、腫瘍微小環境を表す条件において対照細胞と比較して増加した増殖を実際に示すことができる。驚くことに、ＧＤ２標的化部分をＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、アルギニン枯渇条件などの、腫瘍微小環境を表す条件において対照細胞と比較して増殖にさらにいっそう大きい増加を実際に示すことができる。
【０１６１】
実施例に示すように、ＧＤ２標的化部分をＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、アルギニン枯渇条件などの、腫瘍微小環境の条件において対照細胞と比較して増殖に５倍の増加を実際に示すことができる。
【０１６２】
さらにいっそう驚くことに、ＧＤ２標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、アルギニン枯渇条件などの腫瘍微小環境の条件において対照細胞と比較して増殖に１０倍の増加を実際に示すことができる。
【０１６３】
本発明者らは、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせてＧＤ２標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、がん細胞に関して細胞破壊活性を実際に示すことを見出した。単なる例示として、本発明者らによって、ＧＤ２標的化部分をＡＳＳ−１ドメインまたはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、先行技術において公知のＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞と類似の特異的細胞破壊活性を実際に示すことができることが実証された。
【０１６４】
有利なことには、ＡＳＳ−１ドメインまたはＯＴＣドメインと組み合わせてＧＤ２標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、増加した存続性および増殖に加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏがんモデルにおいてレシピエントの生存期間を改善する細胞破壊活性を実際に示すことができる。
【０１６５】
これらの利点は、本明細書の実施例の項にさらに述べられる。
【０１６６】
ＧＤ２を標的化する本発明の例示的なタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１２〜１４に示される。本発明は、これらの特異的タンパク質を包含するだけでなく、これらの例示的なタンパク質の生物学的活性（特に細胞破壊活性およびタンパク質結合に応答して増殖を促進する能力）を共有するこれらのタンパク質の変異体も包含すると考えるべきである。そのような変異体は、配列番号１２〜１４のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を共有する場合がある。適切には、そのような変異体は、配列番号１２〜１４のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する場合がある。
【０１６７】
メソセリンを標的化する本発明のタンパク質
メソセリンを標的化する本発明のタンパク質は、適切な細胞内シグナル伝達領域（４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達領域およびＣＤ３  ζ細胞内シグナル伝達領域など）と組み合わせて抗メソセリンＳＳ１抗体由来のメソセリン標的化部分を含む場合がある。タンパク質は、ＡＳＳ−１ドメイン、および／またはＯＴＣドメイン、および／またはＡＳＬドメイン、および／またはＯＣＤ１ドメイン、および／またはＡｒｇＧドメイン、および／またはＡｒｇＨドメイン、および／またはＡｒｇＦドメインをさらに含む場合がある。適切には、タンパク質は、ＡＳＳ−１ドメイン、および／またはＯＴＣドメインを含む場合がある。
【０１６８】
本発明者らは、メソセリン標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質が、それらの治療的有用性を実際に示すいくつかの性質に関して特に有用であることを見出した。
【０１６９】
例えば本発明者らは、メソセリン標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、先行技術において公知のメソセリンＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して類似のまたは改善された生存能を表すことを見出した。
【０１７０】
有利なことには、本発明者らは、メソセリン標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、腫瘍微小環境を表す条件（実験的アルギニン枯渇条件など）において対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して増加した増殖を実際に示すことができることを見出した。
【０１７１】
メソセリン標的化部分をＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、アルギニン枯渇条件などの、腫瘍微小環境を表す条件において対照細胞と比較して特に増加した増殖を実際に示す。実施例に例示するように、増殖におけるこの特定の増加が、それ自体にＯＴＣドメインを含む、またはＡＳＳ−１ドメインを有する、本発明のタンパク質によって実際に示される。メソセリン標的化部分をＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、腫瘍微小環境に見られる条件を再現している条件において対照細胞と比較して増殖に約４倍の増加を実際に示すことを分かることができる。
【０１７２】
実施例に示すように、ＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインと組み合わせてメソセリン標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、アルギニン枯渇条件などの腫瘍微小環境の条件において対照細胞と比較して増殖に３倍よりも大きい増加を実際に示すことができる。
【０１７３】
これらの利点は、本明細書の実施例の項にさらに述べられる。
【０１７４】
メソセリンを標的化する本発明の例示的なタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５〜１７に示す。本発明は、これらの特異的タンパク質を包含するだけでなく、これらの例示的なタンパク質の生物学的活性（特に細胞破壊活性およびタンパク質結合に応答して増殖を促進する能力）を共有するこれらのタンパク質の変異体を包含すると考えるべきである。そのような変異体は、配列番号１５〜１７のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を共有する場合がある。適切には、そのような変異体は、配列番号１５〜１７のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する場合がある。
【０１７５】
ＣＤ３３を標的化する本発明のタンパク質
ＣＤ３３を標的化する本発明のタンパク質は、抗ＣＤ３３  ｍｙ９６抗体に由来するＣＤ３３標的化部分を、適切な細胞内シグナル伝達領域（４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達領域およびＣＤ３  ζ細胞内シグナル伝達領域など）と組み合わせて含む場合がある。タンパク質は、ＡＳＳ−１ドメイン、および／またはＯＴＣドメインＡＳＳ−１ドメイン、および／またはＯＴＣドメイン、および／またはＡＳＬドメイン、および／またはＯＣＤ１ドメイン、および／またはＡｒｇＧドメイン、および／またはＡｒｇＨドメイン、および／またはＡｒｇＦドメインをさらに含む場合がある。適切には、タンパク質は、ＡＳＳ−１ドメイン、および／またはＯＴＣドメインを含む場合がある。
【０１７６】
ＣＤ３３標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質は、それらの治療的有用性を実際に示すいくつかの性質に関して特に有用である。
【０１７７】
例えば本発明者らは、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、先行技術において公知のＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して類似のまたは改善された生存能を表すことを見出した。
【０１７８】
有利なことには、本発明者らは、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、類似の対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して増加した存続性を実際に示すことができることを見出した。ＡＳＳ−１ドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、対照細胞と比較して特に有利な増加した存続性を実際に示す。
【０１７９】
本発明者らはまた、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、腫瘍微小環境を表す条件（実験的アルギニン枯渇条件など）において対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して増加した増殖を実際に示すことができることを見出した。
【０１８０】
ＯＴＣドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、アルギニン枯渇条件などの、腫瘍微小環境を表す条件において対照細胞と比較して有意に増加した増殖を実際に示す。本発明者らはまた、ＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、腫瘍微小環境を表す条件において対照細胞と比較して増殖にさらにいっそう大きい増加を実際に示すことを見出した。
【０１８１】
実施例に示すように、ＯＴＣドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、腫瘍微小環境を表す条件において対照細胞と比較して増殖に５倍よりも大きい増加を実際に示す。さらにいっそう有益なことに、ＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインの両方と組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、同じ条件下の対照細胞と比較して増殖に約６倍の増加を実際に示す。
【０１８２】
本発明者らは、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、先行技術において公知のＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞と類似する、がん細胞に関する細胞破壊活性を実際に示すことを見出した。
【０１８３】
有利なことには、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせてＣＤ３３標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞は、増加した存続性および増殖に加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏがんモデルにおいてレシピエントの生存期間を改善する細胞破壊活性を実際に示すことができる。
【０１８４】
これらの利点は、本明細書の実施例の項にさらに述べられる。
【０１８５】
ＣＤ３３を標的化する本発明の例示的なタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１８〜２０に示される。本発明は、これらの特異的タンパク質を包含するだけでなく、これらの例示的なタンパク質の生物学的活性（特に、細胞破壊活性およびタンパク質結合に応答して増殖を促進する能力）を共有する、これらのタンパク質の変異体も包含すると考えるべきである。そのような変異体は、配列番号１８〜２０のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を共有する場合がある。適切には、そのような変異体は、配列番号１８〜２０のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する場合がある。
【０１８６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的化する本発明のタンパク質
ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的化する本発明のタンパク質は、適切な細胞内シグナル伝達領域（４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達領域およびＣＤ３  ζ細胞内シグナル伝達領域など）と組み合わせて抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  １３９抗体に由来するＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化部分を含む場合がある。タンパク質は、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメイン、および／またはＡＳＬドメイン、および／またはＯＣＤ１ドメイン、および／またはＡｒｇＧドメイン、および／またはＡｒｇＨドメイン、および／またはＡｒｇＦドメインをさらに含む場合がある。特に、タンパク質は、ＡＳＳ−１ドメイン、および／またはＯＴＣドメインを含む場合がある。
【０１８７】
本発明者らの結果は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化部分をＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、先行技術において公知のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して類似のまたは改善された生存能を表すことを実証している。
【０１８８】
本発明者らは、ＡＳＳ−１ドメインと組み合わせてＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現している細胞が、腫瘍微小環境を表す条件（実験的アルギニン枯渇条件など）において対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して増加した増殖を実際に示すことを見出した。ＡＳＳ−１ドメインと組み合わせてＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化部分を含む本発明のタンパク質を発現しているそのような細胞は、そのような条件において対照細胞と比較して増殖に２倍よりも大きい増加を実際に示す。
【０１８９】
これらの利点は、本明細書の実施例の項にさらに述べられる。
【０１９０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的化する本発明の例示的なタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２１〜２３に示される。本発明は、これらの特異的タンパク質を包含するだけでなく、生物学的活性（特に、細胞破壊活性およびタンパク質結合に応答して増殖を促進する能力）を共有するこれらのタンパク質の変異体も包含すると考えるべきである。そのような変異体は、配列番号２１〜２３のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を共有する場合がある。適切には、そのような変異体は、配列番号２１〜２３のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する場合がある。
【０１９１】
本発明のタンパク質をコードする核酸
本発明の第３の態様は、本発明のタンパク質をコードする核酸を提供する。タンパク質は、本明細書に記載される本発明の態様または実施形態のうちのいずれかによる場合がある。
【０１９２】
適切には、本発明による核酸は、ＤＮＡを含む。適切な実施形態では、本発明の核酸は、ＲＮＡを含む。適切な核酸は、本質的にＤＮＡからなる場合があるか、本質的にＲＮＡからなる場合があるか、またはＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせを含む場合があることが理解されよう。
【０１９３】
本発明のタンパク質をコードする核酸の例は、配列番号３７〜３９に示される。これらの核酸配列は、本明細書に以下のように示される例示的なタンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
【０１９４】
【表１】
2021507716.tif 000003
【０１９５】
コドンの縮重は、本発明の単一の所与のタンパク質をコードする本発明の核酸配列に注目すべき差があり得ることを意味することが理解されよう。
【０１９６】
単なる例示として、本発明の適切な核酸は、配列番号３７〜３９に示される本発明の例示的な核酸のうちの１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する場合がある。本発明の適切な核酸は、配列番号３７〜３９に示される本発明の例示的な核酸のうちの１つと少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または９９％以上の配列同一性でさえ共有する場合がある。
【０１９７】
メソセリンを標的化する本発明のタンパク質をコードする核酸配列は、標的結合部分をコードするそれらの核酸配列の一部分が配列番号２８の核酸配列により置換されている場合を除き、配列番号３７、３８、または３９のうちのいずれかの核酸配列と同じ場合がある。
【０１９８】
ＣＤ３３を標的化する本発明のタンパク質をコードする核酸配列は、標的結合部分をコードするそれらの核酸配列の一部分が配列番号２７の核酸配列により置換されている場合を除き、配列番号３７、３８、または３９のうちのいずれかの核酸配列と同じ場合がある。
【０１９９】
ＥＧＦＲｖＩＩを標的化する本発明のタンパク質をコードする核酸配列は、標的結合部分をコードするそれらの核酸配列の一部分が配列番号２９の核酸配列により置換されている場合を除き、配列番号３７、３８、または３９のうちのいずれかの核酸配列と同じ場合がある。
【０２００】
本発明のタンパク質をコードする核酸は、ベクターの形で提供される場合がある。適切には、ベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンであり得る。レトロウイルスアプローチおよびレンチウイルスアプローチの両方が、本発明の細胞の産生にうまく使用されている。
【０２０１】
本発明の細胞のうまいレンチウイルス産生に使用されている構築物の詳細を図１４に示す。これらの構築物は、本発明の核酸のさらなる例を提供する。
【０２０２】
本発明の細胞
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様によるタンパク質を含む細胞を提供する。細胞は、タンパク質を発現する場合がある。タンパク質は、本明細書に記載される本発明の第１の態様の実施形態のうちのいずれかによる場合がある。
【０２０３】
適切には、本発明の第２の態様に従う細胞は、細胞媒介性細胞応答を発揮することができる細胞であり得る。適切な細胞は、例えば細胞傷害作用によって、または特異的細胞溶解を誘導することによって、細胞破壊活性を発揮することができる場合がある。追加的に、適切な細胞は、その対応する標的分子へのタンパク質の結合に応答して増殖することができる場合がある。適切には、本発明の第２の態様による細胞は、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される場合がある。
【０２０４】
適切には、Ｔ細胞は、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、ガンマデルタＴ細胞（ｇｄ  Ｔ細胞）、アルファベータＴ細胞（ａｂ  Ｔ細胞）、エフェクターＴ細胞、およびメモリーＴ細胞からなる群から選択される場合がある。
【０２０５】
適切には、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋リンパ球、およびＣＤ８＋リンパ球からなる群から選択される場合がある。
【０２０６】
細胞は、疾患の予防および／または治療を必要とする対象からのものであり得る。細胞は、そのような対象からの試料から採取される場合がある。
【０２０７】
あるいは、細胞は、健康なドナー対象（本開示の目的で、本発明のタンパク質または細胞で治療すべき疾患に苦しめられていない対象と考えられる）からのものであり得る。
【０２０８】
適切な細胞はまた、細胞株の細胞を含む場合があることが理解されよう。
【０２０９】
ヒト細胞の収集のための標準的な技術および本発明のタンパク質などのタンパク質によるそれらの形質転換は、当業者に周知である。ヒトＴ細胞のレトロウイルス形質導入のための好ましい技術、形質導入効率の決定、および磁気活性化細胞選別による形質導入されたＴ細胞の選別は、さらに実施例に記載される。
【０２１０】
本発明の細胞の生物学的活性
本発明のタンパク質を含む本発明の細胞は、疾患の予防および／または治療などの適用に有益ないくつかの活性を表す。
【０２１１】
これらの生物学的活性は、細胞破壊活性（本発明の細胞が治療効果を発揮することができる手段を表す）および増殖などの活性（例えば、活性化に応答したもの）および本発明の細胞がそれらの治療効果を先行技術のＣＡＲ発現細胞の場合よりも長く発揮できるようにするｉｎ  ｖｉｖｏ存続性に関連して、さらに考慮される場合がある。
【０２１２】
これらのそれぞれの生物学的活性は、下にさらに記載される。本発明のタンパク質および細胞により与えられる利点が主としてこれらの生物学的活性の組み合わせの結果として生じることが理解されよう。
【０２１３】
本発明の細胞の生物学的活性は、適切なコンパレーター細胞を基準として決定される場合がある。適切なコンパレーター細胞の例には、タンパク質を形質導入されていない本発明の細胞と同じ種類の細胞、またはアルギニンもしくはアルギニン前駆体の合成を促進するドメインを含まないタンパク質を形質導入された本発明の細胞と同じ種類の細胞が含まれる。
【０２１４】
本発明の細胞の細胞破壊活性
本発明の目的では、細胞破壊活性は、本発明の細胞（例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞）が他の細胞を殺滅する任意の活性を包含すると考えるべきである。例として、他の細胞の殺滅は、本発明の細胞の細胞傷害作用によって、または本発明の細胞により媒介される特異的細胞溶解によって達成される場合がある。
【０２１５】
本発明の細胞は、本発明のタンパク質の標的結合部分が結合する標的分子を含む標的構造に関してそれらの細胞破壊活性を発揮する。
【０２１６】
好ましくは、本発明の細胞の細胞破壊活性によって殺滅される細胞は、疾患に関連する細胞である。適切には、疾患に関連する細胞は、がん細胞、または感染細胞であり得る。
【０２１７】
実施例に示すように、本発明者らは、本発明の細胞（本発明のタンパク質を含む）が、本発明のタンパク質の標的結合部分が結合する標的分子を発現している細胞に特異的に向けられた細胞破壊活性を表すことを実証した。本発明の細胞に関して観察される細胞破壊活性の度合いは、先行技術に記載されたタンパク質発現細胞の活性と広く一致する。しかし、本発明の細胞によって表される、この維持された細胞破壊活性と、改善された増殖および／または存続性との組み合わせは、先行技術の細胞に関して言及されていない利点を付与する。
【０２１８】
当業者は、本発明の細胞、または適切なコンパレーター細胞の細胞傷害活性であろうと、特異的細胞溶解であろうと、細胞破壊活性が評価される場合がある多くの適切なアッセイを認識しているであろう。単なる例示として、適切なアッセイが実施例に記載され、実施例でそれらのアッセイが本発明の例示的な細胞の特徴づけに使用される。
【０２１９】
熟練の読者は、実施例に示される情報を考慮する上で、本発明の細胞が、本明細書に記載されるような疾患の予防および／または治療における治療的使用にそれらの細胞を十分適合させる細胞破壊活性を表すことを認識しているであろう。
【０２２０】
本発明の細胞の存続性
治療効果を発揮している細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ存続性、特に対象内の存続性は、疾患の効果的な予防および／または治療に重要である。以前に言及されたように、神経芽腫などの腫瘍周辺の微小環境は、特にＣＡＲ  Ｔ細胞などの治療用細胞に有害である。この微小環境の効果、および治療用細胞がその中で存続できないことは、多くの先行技術の治療に関して観察される失敗の顕著な一因となったと考えられる。
【０２２１】
本発明のタンパク質を含む本発明の細胞は、腫瘍微小環境において増加した存続性を表す。実施例で実際に示される、この増加したｉｎ  ｖｉｖｏ存続性は、本発明の細胞の治療効果を延長することができるメカニズムに相当し、それで、それらの治療的有用性は、先行技術の細胞と比較して増加した。
【０２２２】
本発明の細胞または適切なコンパレーター細胞の存続性は、実験的にいくつかの異なる方法で評価される場合がある。単なる例示として、細胞存続性は、本来投与された細胞であって、所与の期間の後にレシピエント内で生存を維持する細胞の率を基準として定義される場合がある。経過した時間が各細胞集団についてほぼ同じであるかぎり、任意の所与の期間の後に２つ以上の細胞集団（本発明の細胞の集団および適切なコンパレーター細胞の集団など）の間で有用な比較が行われ得ることが理解されよう。とは言うものの、本発明者らは、例えば実施例に示すように５×１０６個の本発明の細胞が移植されたＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスの場合、細胞の投与の１７日後に行われた比較がそのような計算にうってつけであることを見出した。目的となる特定の実験モデルに関連して他の時点が利用され得ること、および細胞における存続性を測定する他の方法が当業者に公知であることが、理解されよう。
【０２２３】
設定期間の後で存続している本発明の細胞の比率は、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも５％高い場合がある。実際に、存続している本発明の細胞の比率は、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高い場合がある。設定期間の後で存続している本発明の細胞の比率は、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも１００％以上高い場合がある。
【０２２４】
設定期間の後で存続している本発明の細胞の比率は、本来投与された本発明の細胞の総数の最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大３５％、最大４０％、最大４５％、最大５０％、最大５５％、最大６０％、最大６５％、最大７０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、最大９５％、または最大１００％でさえある場合がある。
【０２２５】
本発明の細胞は、適切なコンパレーター細胞よりも長い期間レシピエント中に存続する場合がある。本発明の細胞は、適切なコンパレーター細胞よりも最大５％長くレシピエント中に存続する場合がある。本発明の細胞は、適切なコンパレーター細胞よりも最大１０％長く、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大３５％、最大４０％、最大４５％、最大５０％、最大５５％、最大６０％、最大６５％、最大７０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、最大９５％、または最大１００％さえ長くレシピエント中に存続する場合がある。
【０２２６】
本発明の細胞などの細胞の存続性が評価され得る別の方法は、細胞がレシピエント中で生存を維持する時間の長さを基準とする。適切には、本発明のタンパク質を含む本発明の細胞は、レシピエント中で少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間、少なくとも５０日間、少なくとも５５日間、少なくとも６０日間、少なくとも６５日間、少なくとも７０日間、少なくとも７５日間、少なくとも８０日間、少なくとも８５日間、少なくとも９０日間、少なくとも９５日間、または少なくとも１００日間以上、生存を維持する場合がある。適切には、本発明のタンパク質を含む本発明の細胞は、レシピエント中で少なくとも１５０日間、少なくとも２００日間、少なくとも２５０日間、少なくとも３００日間、または少なくとも３５０日間以上、生存を維持する場合がある。適切には、本発明のタンパク質を含む本発明の細胞は、レシピエント中で少なくとも６カ月間、少なくとも９カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも１５カ月間、少なくとも１８カ月間、少なくとも２１カ月間、少なくとも２４カ月間またはより長く生存を維持する場合がある。適切には、本発明のタンパク質を含む本発明の細胞は、レシピエント中で少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、少なくとも６年間、少なくとも７年間、少なくとも８年間、少なくとも９年間または少なくとも１０年間以上生存を維持する場合がある。適切には、本発明のタンパク質を含む本発明の細胞は、レシピエント中で少なくとも１０年間、少なくとも１５年間、少なくとも２０年間、少なくとも２５年間、少なくとも３０年間、少なくとも３５年間、少なくとも４０年間、少なくとも４５年間、少なくとも５０年間またはより長く生存を維持する場合がある。
【０２２７】
本発明の細胞の増殖
対応する標的分子へのタンパク質の結合を介する本発明の細胞の活性化は、細胞増殖を誘導する。これは、治療活性を発揮することができる増加した数の細胞の産生を可能にする。しかし、そのような細胞増殖は、通常、腫瘍微小環境中で阻害され、これは、先行技術において開示されたＣＡＲ  Ｔ細胞治療の失敗の一因となった。
【０２２８】
本発明の細胞は、先行技術のＣＡＲ  Ｔ細胞に関して観察されたものと比較して、アルギニン枯渇腫瘍微小環境内で顕著に改善された増殖能を表す。細胞増殖は、本発明の細胞集団の増大を招き、それらは次に腫瘍微小環境内でそれらの治療的細胞破壊活性を発揮することができるので、このことは、高度に有利である。
【０２２９】
本発明の細胞などの細胞の増殖は、いくつかの方法で実験的に評価される場合がある。単なる例示として、細胞増殖は、腫瘍微小環境を再現する条件で評価される場合がある。そのような条件は、例えば腫瘍細胞を用いて馴化することによりアルギニンに関して枯渇された培地の使用を伴う場合がある。そのような条件では、本発明の細胞は、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも１０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも１５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも２０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも２５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも３０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも３５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも４０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも４５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも５０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも５５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも６０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも６５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも７０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも７５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも８０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも８５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも９０％高い、または適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも９５％高い増殖速度を表す場合がある。実際に、本発明の細胞は、同じ実験条件において適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも１００％以上高い増殖速度を表す場合がある。
【０２３０】
あるいは、細胞増殖は、投与から設定期間後にレシピエント中に存在する細胞数を基準として、同じ条件で存在するコンパレーター細胞数と比較して評価される場合がある。所与の時間の後でレシピエント中に存在する本発明の細胞の数は、本発明の細胞とコンパレーター細胞との両方がおよそ等量で投与される場合、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも１０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも１５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも２０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも２５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも３０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも３５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも４０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも４５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも５０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも５５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも６０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも６５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも７０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも７５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも８０％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも８５％高い、適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも９０％高い、または適切なコンパレーター細胞よりも少なくとも９５％高い場合がある。
【０２３１】
医学的使用および治療方法
特にそのようなタンパク質を発現する本発明の第２の態様の細胞の形態の、本発明のタンパク質は、医学的使用、つまり、疾患の予防および／または治療における医薬としての使用にうってつけである。そのような医学的使用は、本発明の第５、第６、および第７の態様の主題である。
【０２３２】
疾患の予防は、対象がまだ疾患を発生していないが、将来的に疾患を発生する危険性があると同定された場合に必要なことがある。適切には、そのような同定は、対象もしくはその家族の臨床歴、その家族の対象の遺伝子検査の結果、または公知の病原体への曝露された危険性などの詳細に基づく場合がある。がんの場合、予防は、前悪性疾患の症状または特徴を表している対象の場合に望ましい可能性がある。
【０２３３】
疾患の治療は、対象がすでに疾患を発生したと同定された後で必要になる場合がある。同定の時点での疾患の発症期は、症候性または無症候性の場合がある。そのような同定は、対象の臨床評価、対象によって提示される症状、または対象によって提供される試料（例えば、悪性腫瘍、感染病原体、または他の病的指標の存在の同定を可能にする生検、血液試料等）の分析に基づく場合がある。
【０２３４】
本発明の第８の態様は、そのような予防および／または治療を必要とする対象において疾患を予防および／または治療する方法であって、対象に本発明のタンパク質を提供することを含む方法に関する。本発明のタンパク質は、治療有効量で提供される。そのような治療有効量は、本発明のタンパク質を１回提供することによって、または本発明のタンパク質を複数回提供することで累積により、達成される場合がある。
【０２３５】
本発明のタンパク質は、適宜、直接的または間接的に対象に提供される場合がある。直接提供によって、特にタンパク質を発現している細胞の形態での、タンパク質の対象への投与が意味される。間接的提供によって、本発明のタンパク質を発現するように対象を誘導することが意味される。本発明のタンパク質が、本発明の第１の態様によるタンパク質をコードする本発明の第３の態様の核酸の投与により対象に間接的に提供され得ることが理解されよう。
【０２３６】
タンパク質を発現している細胞は、がん、自己免疫疾患および感染によって引き起こされる疾患、例えばウイルス感染症を含む広範囲の疾患の予防または治療に使用される場合があることが理解されよう。適切には、そのような疾患は、本発明のタンパク質、細胞、核酸、または医薬組成物を利用する治療方法の医学的使用によって予防および／または治療される場合がある。
【０２３７】
がんの予防および／または治療
特に、本発明のタンパク質、細胞、核酸、または医薬組成物は、がんの予防および／または治療に有用な場合がある。本発明の細胞がアルギニン枯渇腫瘍微小環境中で機能する、存続するおよび増殖できることが特に有利であることが、これらの適用に含まれる。
【０２３８】
本発明のタンパク質、細胞、核酸、または医薬組成物を利用する治療方法の医学的使用によって予防および／または治療される得るがんの適切な例には、神経芽腫、中皮腫、卵巣がん、乳がん、結腸がん、髄芽腫、膵臓がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病、膠芽腫、骨肉腫、および黒色腫からなる群から選択されるものが含まれる。
【０２３９】
医薬組成物および製剤
本発明はまた、本発明のタンパク質、細胞、または核酸を含む組成物も提供する。特に本発明は、所与の用量またはその分割量での投与のための、本発明のタンパク質、細胞、または核酸を含む単位用量形態の組成物などの、医薬組成物および製剤を提供する。医薬組成物および製剤は、一般的に、１つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加的な治療剤を含む。
【０２４０】
「医薬製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせるような形態の調製物であって、製剤が投与されるであろう対象に許容できないほど有毒な追加的な構成成分を含有しない調製物を指す。
【０２４１】
「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の、対象に対して無毒な、医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存剤が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０２４２】
一部の実施形態では、担体の選択は、一部、本発明の特定のタンパク質、細胞、もしくは核酸によって、および／または投与方法によって決定される。したがって、多種多様な適切な製剤がある。例えば、医薬組成物は、保存剤を含有することができる。適切な保存剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、およびベンザルコニウム塩化物が含まれる場合がある。一部の態様では、２種以上の保存剤の混合物が使用される。保存剤またはその混合物は、典型的には総組成物の約０．０００１〜約２重量％の量で存在する。担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）によって記載されている。薬学的に許容される担体は、一般的に、採用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、それらには、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウム塩化物；ベンゼトニウム塩化物；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０２４３】
緩衝剤は、本発明の組成物の一部の実施形態に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩が含まれる。一部の態様では、２種以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の約０．００１〜約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製するための方法が、公知である。例示的な方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ  ｅｄ．（Ｍａｙ  １，２００５）により詳細に記載されている。
【０２４４】
製剤は、水溶液を含むことができる。製剤または組成物はまた、本発明のタンパク質、細胞、または核酸により処置されている特定の適応、疾患、または状態に有用な１つよりも多い活性成分、好ましくは本発明のタンパク質、細胞、または核酸に相補的な活性を有するものを含有する場合があり、その際、それぞれの活性は相互に有害な影響を及ぼさない。そのような活性成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせて適宜存在する。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および／またはビンクリスチンなどの他の医薬活性剤または医薬活性薬をさらに含む。
【０２４５】
医薬組成物は、一部の実施形態では、本発明のＣＡＲ、細胞、または核酸を、治療有効量または予防有効量などの、疾患または状態を治療または予防するために有効な量で含有する。治療または予防有効性は、一部の実施形態では、処置された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。所望の投薬量は、本発明のタンパク質、細胞、もしくは核酸の単回ボーラス投与によって、タンパク質、細胞、もしくは核酸の多回ボーラス投与によって、またはタンパク質、細胞、もしくは核酸の連続注入投与によって送達することができる。
【０２４６】
組成物は、標準的な投与技術、製剤、および／または装置を使用して投与される場合がある。細胞の投与は、自己由来または異種由来であり得る。例えば、免疫応答細胞または前駆細胞を、１つの対象から得、同じ対象または異なる適合性の対象に投与することができる。末梢血由来免疫応答細胞またはそれらの子孫（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られたもの）は、カテーテル投与を含む局所注射、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与により投与することができる。治療用組成物（例えば、遺伝子修飾免疫応答細胞を含有する医薬組成物）を投与する場合、それは、一般的に、単位投薬量の注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルション）で製剤化されるであろう。
【０２４７】
製剤には、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔、舌下、または坐剤投与のためのものが含まれる。一部の実施形態では、細胞集団は、非経口投与される。本明細書に使用される「非経口」という用語には、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、および腹腔内投与が含まれる。一部の実施形態では、細胞は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達を用いて対象に投与される。
【０２４８】
一部の実施形態における組成物は、一部の態様では選択されたｐＨに緩衝され得る、無菌液体調製物、例えば、等張な水溶液、懸濁液、エマルション、分散物、または粘性組成物として提供される。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製が容易である。追加的に、液体組成物は、特に注射により投与することが幾分より好都合である。他方で粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供する適切な粘性範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る担体を含み得る。
【０２４９】
無菌注射液は、例えば、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等の適切な担体、希釈剤、または賦形剤と混合した、溶媒中に本発明のタンパク質、細胞、または核酸を組み込むことによって調製することができる。組成物は、投与経路および望まれる調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化もしくは増粘添加剤、保存剤、香味剤、および／または着色剤などの補助物質を含有することができる。一部の態様では、適切な調製物を調製するために、標準的な教科書を調べてもよい。
【０２５０】
抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌性を高める様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって確実にすることができる。注射可能な医薬剤形の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【０２５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用すべき製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。
【０２５２】
用量および投薬レジメン
用量のサイズまたは量
本発明のタンパク質、細胞、または核酸は、第１の用量および場合により後続の用量の中に提供される場合がある。一部の実施形態では、第１または後続の用量は、本発明のいくつかのタンパク質、細胞、または核酸を対象の体重１キログラムあたり約１０５〜約１０６個のそのような細胞、および／または約１０５個以下または約１０６個以下であるいくつかのそのような細胞の範囲で含有する。例えば、一部の実施形態では、第１の用量または後続の用量は、対象の体重１キログラムあたり１×１０５個もしくは約１×１０５個未満もしくは以下、２×１０５個もしくは約２×１０５個未満もしくは以下、５×１０５個もしくは約５×１０５個未満もしくは以下、または１×１０６個もしくは約１×１０６個未満もしくは以下のそのような細胞を含む。一部の実施形態では、第１の用量は、対象の体重１キログラムあたり１×１０５個もしくは約１×１０５個、２×１０５個もしくは約２×１０５個、５×１０５個もしくは約５×１０５個、または１×１０６個もしくは約１×１０６個のそのような細胞、あるいは前記値のうちの任意の２つの間の範囲内の値を含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、例えば、対象がヒトの場合、第１または後続の用量は、約１×１０未満の本発明の総タンパク質、細胞、または核酸、例えば、約１×１０６〜１×１０８個の範囲のそのような細胞、例えば２×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、もしくは１×１０８個もしくは合計のそのような細胞、または前記値のうちの任意の２つの間の範囲のものを含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、第１または後続の用量は、対象の１ｍ２あたり約１×１０８未満の本発明の総タンパク質、細胞、または核酸、例えば、対象の１ｍ２あたり約１×１０６〜１×１０８個のそのような細胞の範囲、例えば対象の１ｍあたり２×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、または１×１０８個のそのような細胞、または前記値のうちの任意の２つの間の範囲のものを含有する。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、第１の用量または後続の用量中の本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数は、対象の体重１キログラムあたり約１×１０６の本発明のそのようなタンパク質、細胞、または核酸よりも大きく、例えば、体重１キログラムあたり２×１０６、３×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、１×１０９、もしくは１×１０１０のそのような細胞および／または対象の１ｍ２もしくは合計あたり１×１０８、もしくは１×１０９、１×１０１０、もしくは前記値のうちの任意の２つの間の範囲のそのような細胞である。
【０２５６】
一部の実施形態では、後続の用量で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数は、本明細書における実施形態のうちのいずれかにおける第１の用量で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数と同じであるかまたは類似しており、例えば、対象の体重１キログラムあたり１×１０５もしくは約１×１０５、２×１０５もしくは約２×１０５、５×１０５もしくは約５×１０５、または１×１０６もしくは約１×１０６未満もしくは以下のそのような細胞である。一部の実施形態では、後続の用量は、対象の体重１キログラムあたり１×１０５もしくは約１×１０５、２×１０５もしくは約２×１０５、５×１０５もしくは約５×１０５、または１×１０６もしくは約１×１０６のそのような細胞、または前記値のうちの任意２つの間の範囲内の値を含有する。一部の実施形態では、そのような値は、本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数を指す。一部の態様では、後続の用量は、第１の用量よりも大きい。例えば、一部の実施形態では、後続の用量は、対象の体重１キログラムあたり約１×１０６よりも大きい本発明のタンパク質、細胞、または核酸、例えば対象の体重１キログラムあたり約３×１０６、５×１０６、１×１０７、１×１０８、または１×１０９のそのような細胞を含有する。一部の実施形態では、後続の用量の量またはサイズは、疾病負担もしくはその指標、および／または疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状を低減するために十分である。一部の実施形態では、第２（または他の後続）の用量は、対象の生存期間を改善するために、例えば、対象の生存期間、無再発生存期間、または無イベント生存期間を少なくとも６カ月、または少なくとも１、２、３、４、もしくは５年誘導するために有効なサイズである。一部の実施形態では、投与される本発明のタンパク質、細胞、もしくは核酸の数および／または後続の用量で対象の体重あたり投与されるそのような細胞の数は、第１の用量で投与される数よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍以上大きい。一部の実施形態では、疾病負担、腫瘍サイズ、腫瘍体積、腫瘍質量、および／または腫瘍負荷もしくはかさは、第１の用量または第２（もしくは他の後続）の用量の投与の直前と比較して、後続の用量の後に少なくとも５０、６０、７０、８０、９０％もしくはそれよりも大きく、または少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０％もしくはそれよりも大きく低減される。
【０２５７】
他の実施形態では、後続の用量中で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数は、第１の用量中で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数よりも小さい。
【０２５８】
一部の実施形態では、第１の用量の後で複数の後続の用量が投与され、その結果、第２（または他の後続）の用量の投与後に１つまたは複数の追加的な用量が投与される。一部の態様では、１つまたは複数の追加的な後続の用量（すなわち、第３、第４、第５など）中で対象に投与される細胞の数は、第１の用量、第２の用量、および／または他の後続の用量と同じであるか、または類似している。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な用量は、事前の用量よりも大きい。
【０２５９】
一部の態様では、第１の用量および／または後続の用量のサイズは、事前の治療、例えば化学療法に対する対象の応答、対象における疾病負担、例えば腫瘍負荷、かさ、サイズ、もしくは転移の程度、度合い、もしくは種類、ステージ、および／または対象が毒性アウトカム、例えば、ＣＲＳ、マクロファージ活性化症候群、腫瘍溶解症候群、神経毒性を発生する可能性もしくは発生率、ならびに／または投与されている細胞および／もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答などの１つまたは複数の基準に基づき決定される。
【０２６０】
一部の態様では、第１および／または後続の用量のサイズは、対象における疾患または状態負担によって決定される。例えば、一部の態様では、第１の用量中で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数は、第１の用量の投与直前の対象に存在する腫瘍負担に基づき決定される。一部の実施形態では、第１および／または後続の用量のサイズは、疾病負担と逆相関する。一部の態様では、大きい疾病負担の状況の場合のように、対象は、小さい数の本発明のタンパク質、細胞、または核酸、例えば対象の体重１キログラムあたり約１×１０６未満の本発明のタンパク質、細胞、または核酸が投与される。他の実施形態では、より低い疾病負担の状況の場合のように、対象は、より大きい数の本発明のタンパク質、細胞、または核酸、例えば対象の体重１キログラムあたり約１×１０６よりも大きい本発明のタンパク質、細胞、または核酸が投与される。
【０２６１】
一部の態様では、後続の用量中で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数は、第１の用量の投与後の対象に存在する腫瘍負担に基づき決定される。一部の実施形態では、例えば第１の用量が疾病負担を減少させたか、または特定の閾量もしくはレベル、例えば、それを超えると毒性アウトカムの増加した危険性がある量もしくはレベルよりも下に減少させた場合、後続の用量は大きく、例えば体重１キログラムあたり１×１０６の本発明のタンパク質、細胞、もしくは核酸よりも大きく、かつ／または第１の用量よりも大きい。他の態様では、第１の用量が、腫瘍負担をわずかな度合いで低減した場合、または第１の用量が腫瘍負担に検出可能な低減をもたらさなかった場合、後続の用量中で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数は小さく、例えば約１×１０６未満であり、例えば、第１の用量と同じまたはそれよりも小さい。
【０２６２】
一部の実施形態では、第１の用量中で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数は、他の方法で、例えば、免疫応答が発生する前に本発明のタンパク質、細胞、または核酸を投与するなどのために細胞の大きい単回用量が投与される方法のような他の方法で投与される本発明のタンパク質、細胞、または核酸の数よりも小さい。したがって、一部の実施形態では、方法は、より大きい用量の投与を伴う他の方法と比較して、毒性または毒性アウトカムを低減する。
【０２６３】
一部の実施形態では、第１の用量は、毒性もしくは毒性アウトカム、例えばサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、重度のＣＲＳ（ｓＣＲＳ）、マクロファージ活性化症候群、腫瘍溶解症候群、少なくともセ氏３８度もしくは約３８度で３日間以上の発熱および少なくとも２０ｍｇ／ｄＬもしくは約２０ｍｇ／ｄＬのＣＲＰの血漿レベル、ならびに／または神経毒性を引き起こさない、またはそれらの可能性を低減する量の本発明のタンパク質、細胞、または核酸を含む。一部の態様では、第１の用量中で投与される細胞の数は、細胞の投与後に対象がＣＲＳ、ｓＣＲＳ、および／またはＣＲＳ関連アウトカムなどの毒性または毒性アウトカムを表す可能性に基づいて決定される。例えば、一部の実施形態では、対象における毒性アウトカムの発生の可能性は、腫瘍負担に基づき予測される。一部の実施形態では、方法は、用量の投与前に毒性アウトカムおよび／または疾病負担を検出または評価することを含む。
【０２６４】
一部の実施形態では、第２（または他の後続）の用量は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、マクロファージ活性化症候群、または腫瘍溶解症候群、または神経毒性を発生する臨床的危険性が、最初の投与の後で存在しないか、または終わったか、または収まった時点で、例えば臨界ウィンドウ（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｗｉｎｄｏｗ）が過ぎてから投与され、臨界ウィンドウを過ぎると、例えば特定の疾患または状態を有する対象の６０、７０、８０、９０、または９５％においてそのような事象は一般的に収まってしまい、かつ／または起こる可能性が低い。
【０２６５】
用量のタイミング
一部の態様では、第２または後続の用量のタイミングは、第１の用量の開始から後続の用量の開始までとして測定される。他の実施形態では、後続の用量のタイミングは、第１の用量の完了から、または、例えば用量が１日よりも長くかけて、例えば２日かけてもしくは３日かけて投与される本明細書に記載される分割投薬の状況で、第１の用量の投与の中央値の日から測定される。
【０２６６】
一部の実施形態では、第１の用量と異なる本発明のタンパク質、細胞、または核酸の後続の用量が投与されるかどうかは、第１の用量の本発明のタンパク質、細胞、または核酸に対する対象における免疫応答または検出可能な免疫応答の存在または程度に基づき決定される。一部の態様では、第１の用量の細胞と異なる受容体を発現している細胞を含有する後続の用量が、検出可能な宿主適応免疫応答、またはある特定のレベル、ステージ、もしくは程度を確立するようになったか、もしくはそれに到達するようになった免疫応答を有する対象に投与されるであろう。
【０２６７】
一部の実施形態では、第２（または他の後続）の用量は、本発明のタンパク質、細胞、または核酸の第２の投与が宿主免疫系により排除される可能性があるか、またはそれが予測される時点に投与される。免疫応答を発生する可能性は、本明細書に記載される第１の用量の投与後に対象における受容体特異的免疫応答を測定することによって決定される場合がある。
【０２６８】
例えば、一部の実施形態では、対象を第１（または他の事前）の用量の後で、第２（または他の後続）の用量の前に検査して、免疫応答が第１の用量の後で対象において検出可能であるかどうかが決定される場合がある。いくつかのそのような実施形態では、第１の用量に対する免疫応答の検出は、第２の用量を投与する必要性を誘発する場合がある。
【０２６９】
一部の態様では、対象からの試料を検査して、第１の用量または事前の用量の後の対象において曝露に低下があるか、または所望の曝露よりも低い低下があるかどうか、例えば、本明細書に記載される細胞のある特定の数または濃度よりも小さい低下があるかどうかが決定される場合がある。一部のそのような態様では、細胞への対象の曝露における低下の検出は、第２の用量を投与する必要性を誘発する場合がある。
【０２７０】
一部の実施形態では、後続の用量は、対象における疾患または状態が第１の用量または事前の用量に応答した疾病負担における低減の後に再発していない時点で投与される。一部の実施形態では、疾病負担の低減は、対象またはその液体もしくは器官もしくは組織における疾患細胞の負荷または数、腫瘍の質量もしくは体積、または転移の程度もしくは度合いなどの１つまたは複数の要因における軽減によって指し示される。そのような要因は、初めの治療または投与に応答した、要因における低減の後で、続いて要因が増加する場合、再発したと見なされる。
【０２７１】
一部の実施形態では、第２の用量は、疾患が再発した時点で投与される。一部の実施形態では、再発は、１つまたは１つもしくは複数の要因、あるいは一般的に疾病負担におけるものである。一部の態様では、後続の用量は、対象、疾病負担、またはその要因が、第１の投与または事前の投与の後で測定または到達された最低ポイントと比べて再発したが、依然として第１の用量直前の時点と比較して低い時点で投与される。一部の実施形態では、対象は、疾病負担またはそれを示す要因が変化していない時点で、例えば疾病負担における増加が防止された時点で、後続の用量が投与される。
【０２７２】
一部の実施形態では、後続の用量は、宿主適応免疫応答が検出される、確立されることになった、またはある特定のレベル、程度、もしくはステージに到達した時点で投与される。一部の態様では、後続の用量は、対象における記憶免疫応答の発生後に投与される。
【０２７３】
一部の態様では、第１の用量の投与と後続の用量の投与の間の時間は、約２８〜約３５日、約２９〜約３５日であるか、または約３５日よりも長い。一部の実施形態では、第２の用量の投与は、第１の用量の投与の約２８日後よりも長い時点である。一部の態様では、第１の用量と後続の用量との間の時間は、約２８日である。
【０２７４】
一部の実施形態では、追加的な１つまたは複数の用量、例えば後続の用量は、第２の用量の投与後に投与される。一部の態様では、追加的な１つまたは複数の用量は、事前の用量の投与の少なくとも約２８日後に投与される。一部の実施形態では、用量は、事前の用量の約２８日後未満に投与されない。
【０２７５】
一部の実施形態では、例えば１つまたは複数の連続する用量が対象に投与される場合、連続する用量は、約７、約１４、約１５、約２１、約２７、または約２８日の間隔を空けられる場合がある。一部の態様では、連続する用量は、事前の用量の２１日後に投与される。一部の実施形態では、連続する用量は、事前の用量の投与後、１４日と２８日との間に投与される。
【０２７６】
実施形態のうちのいずれかでは、一部の場合における方法は、第１または事前の用量および後続の用量の投与を含み、他の場合では、第１または事前の用量を以前に受けた対象への後続の用量の投与を含むが、第１または事前の用量自体の投与を含まない。したがって、一部の場合における方法は、例えば本発明のタンパク質、細胞、または核酸の用量を事前に受けた対象に後続の地固め用量を投与することによる、地固め治療の投与を伴う。
【０２７７】
一部の実施形態では、疾病負担、腫瘍サイズ、腫瘍体積、腫瘍質量、および／または腫瘍の負荷もしくはかさは、第１もしくは事前の用量または第２もしくは後続の用量の投与の直前と比較して、後続の用量の後に少なくとも５０、６０、７０、８０、９０％もしくはそれよりも大きく、または少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０％もしくはそれよりも大きく低減される。
【０２７８】
本発明のタンパク質を発現している細胞の産生
当業者は、本発明の核酸などの核酸が、タンパク質を発現している形質導入細胞の産生に使用され得る適切な方法を認識しているであろう。そのような方法は、本発明のタンパク質を発現する本発明の細胞の産生に使用される場合がある。
【０２７９】
単なる例示として、本発明の細胞の産生に使用され得る適切なプロトコールが、下記の実施例にさらに記載される。
【０２８０】
本発明のタンパク質を発現している細胞の産生のための方法の他の例は、当業者に明らかであろう。非限定的に、これらは、本発明の核酸がウイルスまたはナノ粒子などの手段により細胞に導入される方法を含む。
【実施例】
【０２８１】
さらに下述するように、例示的なＣＡＲを参照して本発明のタンパク質を検討した。
【０２８２】
１  ＣＡＲ含有ウイルス力価の最適化。
本発明者らは、図１ａに示すＡＭＰＨＯ  Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞の上清中でレトロウイルス粒子の濃度が７２時間にわたり増加することを示した。
【０２８３】
ｔＣＤ３４のフローサイトメトリー検出によってＣＡＲ−Ｔ細胞の形質導入効率を評価した。図１ｂに示すように、２４時間または７２時間目に収集されたＡＭＰＨＯ細胞株上清を使用して、ＰＢＭＣの形質導入効率に差がないことが分かった。
【０２８４】
２  アルギニン経路酵素は形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞において活性を実際に示す。
本発明者らは、不死化ヒトＴリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）株におけるアルギニン経路酵素の役割を検討した。本研究の結果を図２に示す。
【０２８５】
Ｊｕｒｋａｔ細胞にアルギニン経路酵素を含む融合標的結合タンパク質構築物、または対照ＣＡＲ−Ｔ構築物を形質導入した。実験目的で本発明の細胞および対照細胞の両方に形質導入して、ＧＤ２結合部分を含むタンパク質を発現させた。フローサイトメトリーを使用してｔＣＤ３４の発現を測定することによって、産生されたタンパク質−酵素構築物の純度を評価した。図２ａに示すように、結果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてタンパク質−酵素構築物を高純度で産生できることを示している。
【０２８６】
図２ｂに示すように、形質導入細胞におけるＡＳＳ−１およびＯＴＣの発現に増加があった（Ｊｕｒｋａｔは、初代ＰＢＭＣと比較して高いバックグラウンドＡＳＳ−１発現を有することに注意）。
【０２８７】
本発明者らは、形質導入細胞におけるアルギニンの合成を促進するドメインがそれらの機能を果たす能力を検討した。
【０２８８】
ＡＳＳ−１によるシトルリンのアルギノコハク酸塩への異化を評価し、対照構築物（ＡＳＳ−１ドメインなし、ＧＤ２−ＣＡＲ）、ＯＴＣドメインを含有する融合標的結合タンパク質（ＧＤ２−ＯＴＣ）およびＡＳＳ−１ドメインとＯＴＣドメインとの両方を含有する融合標的結合タンパク質（ＧＤ２−ＡＳＳ−ＯＴＣ）と比較した。ＡＳＳ−１酵素がシトルリンをアルギニノコハク酸塩に直接異化する活性についての比色アッセイでＧＤ２−ＡＳＳ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞の溶解物を検査した。アルギニンの合成を促進するＡＳＳ−１ドメインを含有する融合標的結合タンパク質は、ＧＤ２−ＡＳＳ−１融合標的結合タンパク質が、対照融合標的結合タンパク質構築物を含有する細胞よりも有意に高いＡＳＳ−１活性を有することを実証した。図２ｃに示す。
【０２８９】
ＯＴＣによるオルニチンのシトルリンへの異化を評価し、ＯＴＣドメインを有さない対照構築物（ＧＤ２のみ）、ＡＳＳ−１ドメインを含有する融合標的結合タンパク質（ＧＤ２−ＡＳＳ）およびＡＳＳ−１とＯＴＣドメインとの両方を含有する融合標的結合タンパク質（ＧＤ２−ＡＳＳ−ＯＴＣ）と比較した。ＧＤ２−ＯＴＣ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞の溶解物を、ＯＴＣ酵素がオルニチンを直接シトルリンに異化する活性について比色アッセイで検査した。図２ｄに示すように、ＯＴＣドメインを含有する融合標的結合タンパク質（ＧＤ２−ＯＴＣ）ならびにＡＳＳ−１およびＯＴＣドメイン構築物を含有する融合標的結合タンパク質（ＧＤ２−ＡＳＳ−ＯＴＣ）は、対照ＣＡＲ構築物を含有する細胞よりも有意に高いＯＴＣ活性を有した。
【０２９０】
本発明者らは、腫瘍微小環境におけるアルギニンの合成を促進するドメインを含む構築物を形質導入された融合標的結合タンパク質Ｔ細胞の存続性を検討した。
【０２９１】
ＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスに５×１０６個の融合標的結合タンパク質Ｔ細胞を移植した。組換えＰＥＧ−アルギナーゼを１週間に２回投与して、再現性のある低アルギニン微小環境を作り出した（アルギニンＥＬＩＳＡで確認）。マウスを屠殺し、血液中の融合標的結合タンパク質Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。図２ｅに示すように、ＡＳＳ−１ドメイン（ＧＤ２−ＡＳＳ）を含む融合標的結合タンパク質Ｔ細胞は、ＡＳＳ−１ドメインを有さない融合標的結合タンパク質（ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞）と比較して有意に高い存続性を示した。
【０２９２】
図２ｆに示すように、ＯＴＣドメインを含む融合標的結合タンパク質Ｔ細胞（ＧＤ２−ＯＴＣ）は、ＯＴＣドメインを含む融合標的結合タンパク質を有さないＴ細胞（ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞）と比較して有意に高い存続性を示した。
【０２９３】
３  アルギニン経路酵素は、ヒトドナーからのＰＢＭＣに形質導入することができる。
本発明者らは、ヒトドナー細胞からのＰＢＭＣにおけるアルギニン経路酵素の役割を検討した）。本研究の結果を図３に示す。
【０２９４】
ＰＢＭＣに、アルギニン経路酵素を含む融合標的結合タンパク質構築物を形質導入した。フローサイトメトリーを使用してｔＣＤ３４の発現を測定することによって、産生されたＣＡＲ酵素構築物の純度を評価した。図３ａに示すように、結果は、融合標的結合タンパク質酵素構築物をＰＢＭＣ中に高純度で産生できることを示している。
【０２９５】
図３ｂに示すように、形質導入細胞中でＡＳＳ−１の発現に増加があり、ＯＴＣが増加する。
【０２９６】
本発明者らは、アルギニンの合成を促進するドメインを含む構築物もまた含有するＣＡＲ−Ｔ細胞において共抑制受容体ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、およびＰＤ−１の発現に差がなかったことを見出した。
【０２９７】
ｔＣＤ３４のフローサイトメトリーによって検出されるように、アルギニンの合成を促進するドメインを含む構築物を形質導入されたＰＢＭＣの存続性を７日の増大の間に測定した。ＧＤ２−ＡＳＳ−１構築物は、ＧＤ２のみの構築物と類似の存続性を実際に示した。図３ｄに示すように、ＧＤ２−ＯＴＣ構築物およびＧＤ２−ＡＳＳ−ＯＴＣ構築物は、徐々に維持されなくなった。抗原が存在しない正常アルギニン条件でこれらの実験を行った。本発明者らは、低アルギニン条件および抗原の存在下で生存期間の利点が見られる場合があるという仮説を立てる。ｉｎ  ｖｉｖｏで起こっている任意の細胞減少は、細胞が体内で生存する時間を反映する投与間隔で、患者に本発明の細胞の繰り返し投与によって克服され得る。
【０２９８】
４  ＡＳＳ−１およびＯＴＣは、低アルギニン腫瘍条件で有意な代謝および増殖上の利点を付与する
正常アルギニン（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）、ＬＡＮ−１神経芽腫馴化上清、および７５％アルギニン枯渇培地条件で培養された場合に、アルギニンの合成を促進するドメインを含む融合標的結合タンパク質Ｔ細胞、（ＧＤ２−ＡＳＳおよびＧＤ２−ＯＴＣ）がシトルリン代謝を高める能力を、培養上清のＥＬＩＳＡによって検出した。図４ａに示すように、腫瘍由来低アルギニン条件で、ＧＤ２−ＡＳＳ−１融合標的結合タンパク質およびＧＤ２−ＯＴＣ融合標的結合タンパク質は、対照（アルギニンの合成を促進するドメインを有さない、ＧＤ２のみ）と比較して、酵素の発現および活性化と一致してシトルリン代謝を有意に上方調節した。
【０２９９】
神経芽腫細胞株および骨髄性白血病細胞株に対するＡＳＳ−１ドメインを含む融合標的結合タンパク質（「ＧＤ２−ＡＳＳ−ＢＢ」）およびＯＴＣドメインを含む融合標的結合タンパク質（「ＧＤ２−ＯＴＣ−ＢＢ」）の融合標的結合タンパク質Ｔ細胞の特異的細胞溶解を、対照（ＧＤ２のみ：「ＧＤ２−ＢＢ」）と比べて評価した。融合標的結合タンパク質Ｔ細胞をクロム標識ＧＤ２＋  ＬＡＮ−１神経芽腫細胞の存在下で異なるエフェクター対標的比で４時間培養した。本発明者らの事前のデータと一致して、すべてのＣＡＲ−Ｔ細胞構築物は、神経芽腫細胞を効果的に特異的に殺滅する（３５〜４５％）。ＡＳＳ−１またはＯＴＣを添加しても細胞傷害性の損失は見られない。この細胞破壊活性の特異性は、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞（対照であろうと、本発明の細胞であろうと）による骨髄性白血病細胞株（ＧＤ２−Ｋ５６２）の殺滅はわずかであった（＜５％の特異的溶解）という事実によって実証された。図４ｂに示す。
【０３００】
アルギニンの合成を促進するドメイン（ＡＳＳ−１またはＯＴＣ）を含むＣＡＲ  Ｔ細胞は、低アルギニン条件で増殖の有意なレスキューを示した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を正常アルギニン（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）、神経芽腫由来低アルギニン上清、または７５％アルギニン枯渇培地中で培養した。９６時間後にＴ細胞の増殖をトリチウム標識チミジンの取込みによって測定した。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、本発明者らの事前の知見と一致して、低アルギニン条件でＴ細胞増殖における低減を示す。図４ｃに示すように、ＡＳＳ−１ドメインを含む構築物を形質移入された細胞（ＧＤ２−ＡＳＳ）およびＯＴＣドメインを含む構築物を形質移入された細胞（ＧＤ２−ＯＴＣ）は、対照（ＧＤ２−ＣＡＲ）と比較してこれらの条件で増殖の有意なレスキューを示した。
【０３０１】
５  改変ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで高い抗腫瘍活性を有し、非ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞に適用することができる
ＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスにＧＤ２＋腫瘍細胞を移植した。尾静脈注射を介してＡＳＳ−１ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞（ＧＤ２−ＡＳＳ）および有さないＣＡＲ−Ｔ細胞（ＧＤ２−ＣＡＲ）を投与した。相対腫瘍成長を経時的に測定した。図５ａに示すように、ＧＤ２−ＡＳＳ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与は、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して腫瘍成長における低減をもたらした。
【０３０２】
図５ｂに示すように、ＧＤ２−ＡＳＳ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与はまた、マウスの生存期間の改善ももたらした。この図に示す結果は、本発明の細胞の細胞破壊活性（およびしたがって治療活性）だけでなく、それらの改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ存続性も例証している。それは、この治療活性が対照細胞よりも長期間にわたり観察されるからである。
【０３０３】
ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ３３−ＡＳＳ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存能を評価した。ＣＤ３３−ＡＳＳ−１  ＣＡＲをＡＭＬ細胞株馴化培地（低アルギニン）または５０〜７５％アルギニン枯渇培地中で培養した。ＣＤ３３−ＡＳＳ−１  ＣＡＲは、ＣＤ３３  ＣＡＲと比較して低アルギニン条件で有意に高い生存能を示した。これを例証している結果を図５ｃに示す。
【０３０４】
６  ｉｎ  ｖｉｖｏアルギニン枯渇条件における本発明の細胞の増加した存続性。
静脈内投与された、５×１０６個の抗ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ  Ｊｕｒｋａｔ細胞（対照細胞）、またはＧＤ２標的部分およびＡＳＳ−１ドメインを含む本発明のタンパク質を発現しているＪｕｒｋａｔ細胞（ＧＤ２−ＡＳＳ）、またはＧＤ２標的部分およびＯＴＣドメインを含む本発明のタンパク質を発現している細胞（ＧＤ２−ＯＴＣ）を移植されたＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスにおいて本発明の細胞の改善された存続性が実証された。再現性のある低アルギニン微小環境を生み出す（そして、腫瘍微小環境を再現する）ために、マウスに組換えＰＥＧ−アルギナーゼを１週間に２回投与した。ＥＬＩＳＡによって低アルギニン条件を確認した（データは示さず）。１７日後にマウスを屠殺し、血液中のＣＡＲ−Ｔ細胞の率（対照であろうと本発明の細胞であろうと）をフローサイトメトリーによって測定した。ＧＤ２−ＡＳＳ−１  ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＧＤ２−ＯＴＣ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、未改変ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ構築物を含む対照細胞と比較して有意に高い存続性を示した。これらの結果を図６に示す。
【０３０５】
７  様々な標的結合部分を含む、ヒトドナーからのＰＢＭＣにアルギニン経路酵素を形質導入することができる。
ヒトドナーからのＰＢＭＣ（特にＴ細胞）に、ＡＳＳ−１ドメインおよび／またはＯＴＣドメインを、ＧＤ２、ＣＤ３３、メソセリン、またはＥＧＦＲｖＩＩＩからなるリストから選択される標的結合部分と組み合わせて含む本発明のタンパク質を形質導入した。ウエスタンブロットにより、対照細胞（各ウエスタンブロットの左側のカラム）と比較して本発明のタンパク質を形質導入された細胞においてＡＳＳ−１およびＯＴＣの発現が増加していることが示される。これを図７ａに示す。
【０３０６】
ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、およびＰＤ−１（がんの治療に潜在的に重要な共抑制受容体）の発現もまた、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインを含む本発明のタンパク質を発現している形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるフローサイトメトリーによって評価した。抗ＧＤ２、抗ＣＤ３３、抗ＭＥＳＯ、および抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の例を図７のＢ欄に示す。
【０３０７】
８  ＣＤ３３標的化ドメインを発現している細胞の細胞破壊活性
ＣＤ３３標的化ドメインをＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメインまたはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインのいずれかと組み合わせて含む本発明のタンパク質の発現によって、本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞を産生した。ＣＡＲ  Ｔ細胞をＫ５６２白血病細胞の存在下にて異なるエフェクター対標的比で４時間培養した。すべてのＣＡＲ−Ｔ細胞構築物は、特異的に白血病細胞を効果的に殺滅する（７０〜９０％）。図８に示すように、本発明のタンパク質によるＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の形質導入は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性に有害な影響を及ぼさない。実施例の残りに示すように、本発明のタンパク質を含む細胞が、増加した存続性および増殖も実際に示す一方で、細胞破壊活性を維持する能力は、それらの治療的有用性を例証している。
【０３０８】
９    酵素の改変は低アルギニン腫瘍条件で有意な代謝および増殖上の利点を付与する。
細胞に形質導入して、
・  ＧＤ２結合ドメインおよびＡＳＳ−１ドメインを含むタンパク質
・  ＧＤ２結合ドメインおよびＯＴＣドメインを含むタンパク質
・  ＧＤ２結合ドメインと、ＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインの両方とを含むタンパク質
・  ＣＤ３３結合ドメインおよびＡＳＳ−１ドメインを含むタンパク質
・  ＣＤ３３結合ドメインおよびＯＴＣドメインを含むタンパク質
・  ＣＤ３３結合ドメインと、ＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインの両方とを含むタンパク質
・  メソセリン結合ドメインおよびＡＳＳ−１ドメインを含むタンパク質
・  メソセリン結合ドメインおよびＯＴＣドメインを含むタンパク質
・  メソセリン結合ドメインと、ＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインの両方とを含むタンパク質
・  ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインおよびＡＳＳ−１ドメインを含むタンパク質
・  ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインおよびＯＴＣドメインを含むタンパク質
・  ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインと、ＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインの両方とを含むタンパク質
の本発明のタンパク質のうちの１つを発現させた。
【０３０９】
それらを低アルギニン条件（７５％アルギニン枯渇完全培地）で培養した。同じ結合ドメイン（すなわち抗ＧＤ２、抗ＣＤ３３、抗メソセリン、または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を共有するが、酵素ドメインを欠如している未改変ＣＡＲ−Ｔ細胞を対照として使用した。９６時間後にフローサイトメトリーによってすべての細胞の増殖を測定した。
【０３１０】
抗ＧＤ２細胞の場合、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメインまたはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインの付加は、未改変対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を有意に高めた。実際に、ＧＤ２−ＯＴＣ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＤ２のみの対照細胞と比較して増殖に５倍の増加を実際に示す。追加的に、ＧＤ２−ＡＳＳ／ＯＴＣ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＤ２のみのＣＡＲ  Ｔ細胞対照と比較して増殖に１０倍の増加を実際に示す。図９Ａ欄に示す。
【０３１１】
抗ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメインまたはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインの付加は、未改変対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を有意に高めた。ＣＤ３３−ＯＴＣ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ３３のみの対照細胞と比較して増殖に約５倍の増加を実際に示す。追加的に、ＣＤ３３−ＡＳＳ／ＯＴＣ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＤ２のみのＣＡＲ  Ｔ細胞対照と比較して増殖に６倍の増加を実際に示す。図９Ｂ欄に示す。
【０３１２】
抗メソセリンＣＡＲ−Ｔ細胞について、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメインまたはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインの付加は、未改変対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を有意に高めた。メソセリン−ＯＴＣ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ３３のみの対照細胞と比較して増殖に約４倍の増加を実際に示す。追加的に、メソセリン−ＡＳＳ／ＯＴＣ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、メソセリンのみのＣＡＲ  Ｔ細胞対照と比較して増殖に約３．５倍の増加を実際に示す。図９Ｃ欄に示す。
【０３１３】
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ−Ｔ細胞において、ＡＳＳ−１ドメインの付加は、未改変対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して増殖を約２．５倍有意に高めた。図９Ｄ欄に示す。
【０３１４】
１０  酵素の改変は、腫瘍馴化培地（ＴＣＭ）中に有意な代謝および増殖上の利点を付与する。
ＧＤ２結合部分をＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインのいずれかと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞を、神経芽腫馴化培地中で培養した。そのような培地は、腫瘍細胞の作用が原因で低アルギニン条件を有する。酵素ドメインを有さない抗ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞を対照細胞として使用した。
【０３１５】
培養細胞の増殖を９６時間後にフローサイトメトリーによって測定した。ＡＳＳ−１ドメインを含む本発明のタンパク質の追加は、図１０Ａ欄に示すように、未改変対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を有意に高めた。
【０３１６】
ＣＤ３３結合部分をＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインのいずれかと組み合わせて含む本発明のタンパク質を発現している細胞を、白血病腫瘍馴化培地（低レベルのアルギニンも含有する）中で培養した。この場合、酵素ドメインを有さない抗ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を対照細胞として使用し、細胞増殖を９６時間後に（再度）フローサイトメトリーによって測定した。
【０３１７】
ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメインまたはＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインを含む本発明のタンパク質の追加は、未改変対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を有意に高めた。ＯＴＣドメインを含むＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、増殖に約４倍の増加を実際に示す。ＡＳＳ−１およびＯＴＣドメインを含むＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、未改変対照ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して増殖に約３．５倍の増加を実際に示す。これらの結果を図１０Ｂ欄に示す。
【０３１８】
１１  酵素の改変はｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有意に高める
ＨＬ−６０急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞をＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスに移植した。担白血病マウスを、ＣＤ３３結合部分と、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインのいずれかとを含む、本発明のタンパク質を発現している細胞で治療した。酵素ドメイン（未改変ＣＡＲ−Ｔ細胞）を欠如する抗ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を対照として使用した。本発明の細胞または対照細胞を５×１０６個の細胞の用量で静脈内投与した。
【０３１９】
図１１に示すように、ＡＳＳ−１ドメインを含む本発明のタンパク質を発現しているＣＡＲ−Ｔ細胞（抗ＣＤ３３−ＡＳＳ−１  ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、対照ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して骨髄からのＡＭＬ排除を有意に高めた。
【０３２０】
１２  ＧＤ２  ＣＡＲＴ  Ｔ細胞の酵素改変はｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有意に高める
神経芽腫異種移植片マウスを、ＧＤ２結合部分およびＡＳＳ−１ドメインを含む本発明のタンパク質を発現している細胞で治療した。対照動物は、ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＡＳＳ−１ドメインなし）、またはＣＡＲ−Ｔ治療なしのいずれかを受けた。すべての動物の脾臓を採取し、フローサイトメトリーによって特徴づけられる白血球を抽出した。結果を図１２のＡ欄に示し、細胞数が対照細胞と比較して本発明の細胞について顕著に増加したことを例証する。これは、本発明の細胞（ＡＳＳ−１ドメインを含む本発明のタンパク質を発現している）が、対照と比較して治療されたマウスの脾臓中で改善された存続性を有することを指し示す。
【０３２１】
抽出された白血球を、神経芽腫標的細胞（ＩＭＲ３２細胞株または腫瘍細胞）ともｅｘ  ｖｉｖｏで共培養して、レシピエント中で存続した本発明の細胞が、抗原刺激に応答して増大を起こす能力を検討した。結果を図１２のＢ欄に示す。本発明の細胞の数が対照よりも有意に高いと分かることができる。これは、本発明の存続細胞が、抗原刺激に応答して、対照よりも大きい増殖能力を保持することを指し示す。
【０３２２】
１３  ＣＤ３３  ＣＡＲＴ  Ｔ細胞の酵素の改変はｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有意に高める
ＣＤ３３結合部分と、ＡＳＳ−１ドメイン、ＯＴＣドメイン、またはＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインのうちの１つとを含む本発明のタンパク質を発現している細胞でＡＭＬ異種移植マウスを治療した。対照群は、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞（酵素ドメインなし、「−酵素」として示す）、またはＣＡＲ−Ｔ治療なしのいずれかを受けた。すべての動物の脾臓を採取し、抽出された白血病をフローサイトメトリーによって特徴づけた。図１３のＡ欄に示す結果は、対照細胞と比較して本発明の細胞について細胞数が顕著に増加したことを例証している。これは、本発明の細胞がまた、ＡＭＬの状況で治療されたマウスの脾臓において（対照と比較して）改善された存続性を有することを指し示す。
【０３２３】
抽出された白血球を、また、ＡＭＬ標的細胞と共にｅｘ  ｖｉｖｏで共培養して、レシピエント中で存続した本発明の細胞が抗原刺激に応答して増大を起こす能力を検討した。結果を図１３のＢ欄に示す。本発明の細胞の数は、特に、ＡＳＳ−１ドメインを有する本発明のタンパク質を発現している細胞の場合、対照よりも有意に大きい。これらの結果は、レシピエント内で存続した本発明の細胞が、抗原刺激に応答して、対照細胞よりも大きい増殖能を保持することを指し示す。
【０３２４】
本発明の細胞の産生のためのプロトコール
本発明の細胞は、レトロウイルスおよびレンチウイルス形質導入アプローチによってうまく産生された。本発明の細胞のレトロウイルス産生のための例示的なプロトコールの詳細を下述する。
【０３２５】
ヒトＴ細胞のレトロウイルス形質導入
以下は、本発明の核酸の形質移入による本発明の細胞の産生のためのプロトコールを提供するものである。
【０３２６】
−２日目：Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞を解凍する
夕方に、−８０からＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞（ヒト細胞の形質導入のためのレトロウイルスパッケージング細胞株）を入手し、培養する。１０％  ＦＣＳ、１％  Ｌ−グルタミン（抗生物質なし）を有するＤＭＥＭ中でＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞を成長させる。Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞を集密に到達させてはならない。典型的には、２〜３×１０６個のＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞を各Ｔ１５０フラスコ中の培地３０ｍｌ中に入れる。０日目に約３０〜４０×１０６個のＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞を有するべきである。
【０３２７】
１日目：Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞をセットアップする
ＴｒｙＬＥを使用してＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞をトリプシン処理し、１０％  ＦＣＳおよび１％  Ｌ−グルタミンを有する３０ｍｌのＤＭＥＭ（抗生物質なし）（Ｔ１５０フラスコについての体積、適宜増減する）中に細胞８×１０６個／フラスコでＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞をセットアップする。細胞を一晩インキュベートする（３７℃／５％ＣＯ２）。
【０３２８】
２日目：Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞の形質移入
Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞は、形質移入の日に５０〜８０％集密であるべきである。次に、以下の方法によって細胞に形質移入するべきである（Ｔ１５０フラスコについて、異なるフラスコを使用する場合は適宜増減する）。
【０３２９】
１．  ｐｈｏｅｎｉｘ細胞の各Ｔ１５０フラスコについて、１２μｇのプラスミドＤＮＡ（すなわちＣＡＲプラスミド）＋１２μｇのｐＣｌ  ａｍｐｈｏプラスミドを１５ｍｌ容ｆａｌｃｏｎ中に入れ、ピペットでそっと混合しながらＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で１８００μｌに調整する。別の１５ｍｌ容ｆａｌｃｏｎに１６８０μｌのＯｐｔｉＭＥＭを加え、１２０μｌのＦｕｇｅｎｅ  ６形質移入試薬（市販）を加え、Ｆｕｇｅｎｅがチューブの側壁にへばり付かずにＯｐｔｉＭＥＭに直接入ることを確実にし、ピペットでそっと混合する。次に、１８００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ／ｆｕｇｅｎｅミックスを、プラスミドＤＮＡが入ったチューブに加え、ピペットでそっと混合する。室温で４５分間インキュベートする。これにより、ｆｕｇｅｎｅは、負荷電したＰｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞膜を通してＤＮＡを輸送させる中性荷電を有するＤＮＡと複合体を形成可能になる。
２．  Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｎｏ細胞上の培地を、１０％ＦＣＳおよびグルタミンを有する９ｍｌの新鮮ＤＭＥＭに非常にそっと交換し、次に直ちに細胞上にＤＮＡ／ｆｕｇｅｎｅ複合体またはＯｐｔｉＭＥＭ（模擬対照用）を重層する。プレートの東西南北の移動によってそっと混合する。
３．  細胞を２４時間インキュベートする（３７℃／５％ＣＯ２）。
【０３３０】
２日目：Ｔ細胞の活性化
Ｔ細胞は、活性化後４８時間中に増大しないので、典型的には、形質導入に必要なだけの数（または細胞が死滅する場合は、より多く）のＴ細胞を活性化させる。
【０３３１】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を使用する方法：
１．  新鮮白血球尖形管にリンパ球を調製する（ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）。
２．  細胞を計数し、Ｔ細胞培地（１％ヒト血清、１０％  ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ、Ｌ−グルタミンＲＰＭＩ）中に入れて１×１０６／ｍｌで培養する。典型的には、Ｔ１５０フラスコ１つあたり２００ｍｌ。
３．  ３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）を添加し、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８  ｍＡＢ（＃ＭＡＢ３４２−ＳＰ、Ｒ＆Ｄ）を添加する。
４．  ３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
【０３３２】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８  ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用する方法：
１．  新しい尖形管にリンパ球を調製する。細胞を計数し、ＰＢＭＣの５０％がＣＤ３＋  Ｔ細胞であると仮定する。
２．  １５ｍｌ容ｆａｌｃｏｎ中に１ｍｌの５％ヒト血清、ＰＢＳあたり１０×１０６個のＣＤ３＋  Ｔ細胞で細胞を再懸濁する。
３．  １つのＣＤ３＋細胞あたり２つのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８を加える。ｄｙｎａｂｅａｄｓを洗浄し：ビーズのバイアルを３０秒間ボルテックス撹拌する。ビーズの必要な体積を取り出し、１５ｍｌ容ｆａｌｃｏｎ中に入れる。１ｍｌの無菌ＰＢＳを添加し、ピペットで十分に混合する。ｄｙｎａｂｅａｄマグネット上にｆａｌｃｏｎを置く。ｄｙｎａｂｅａｄｓはｆａｌｃｏｎの端部にへばり付く。ビーズを乱さずに上清を慎重に取り除く。ｆａｌｃｏｎをマグネットから外し、洗浄ステップを繰り返す。少量のＰＢＳ中のＴ細胞にｄｙｎａｂｅａｄｓを添加する。
４．  Ｔ細胞をタンブラー上にて室温で少なくとも１時間インキュベートする。Ｔ細胞は、このステップの間にｄｙｎａｂｅａｄｓと結合し、同時にＣＤ３＋  Ｔ細胞の選択および活性化が可能になる。
５．  ｄｙｎａｂｅａｄマグネット上に細胞を置いて、未結合の細胞を除去する。細胞を計数し、ＩＬ−２  ３００Ｕ／ｍｌを有するＴ細胞培地（１％  ヒト血清、１０％  ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ、Ｌ−グルタミン  ＲＰＭＩ）中に１×１０６個／ｍｌで培養する。
６．  ３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
【０３３３】
３日目：Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ培地を交換する
Ｐｈｏｅｎｉｘ  ａｍｐｈｏ細胞は、今やプラスミドＤＮＡを含有するレトロウイルスを産生しているので、細胞／上清を扱う場合にこれを考慮する。ＴＣフード内部にオートクレーブ用バッグを入れ、レトロウイルス（細胞／上清）が夾雑する何らかのプラスチックもその中に入れる。作業が終わったら、オートクレーブ用バッグを密封し、オートクレーブ用金属容器に入れる。いかなる廃液も廃棄物ポットに入れ、密封する。レトロウイルスが夾雑する廃棄物を取り出して、できるだけ早く洗浄する。
【０３３４】
Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞上の培地を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（抗生物質なし）の新鮮な２１ｍｌ／フラスコ（Ｔ１５０フラスコについての体積、適宜増減する）によってそっと置き換える。細胞をさらに２４時間インキュベートする。
【０３３５】
４日目：ヒトＴ細胞の形質導入
１．  ２ｍｌのレトロネクチン（３０μｇ／ｍｌ）（＃Ｔ１００Ｂ、Ｔａｋａｒａ  ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）組換えヒトフィブロネクチンフラグメント）を６ウェルプレート（非組織培養処理）のウェルの必要数のそれぞれに添加し、室温で３時間インキュベートする（前日にセットアップし、冷蔵庫内で一晩コーティングすることもできる）。実験に模擬形質移入対照用のウェルを含めることを忘れないこと。培養プレートをレトロネクチン中でコーティングしてＴ細胞とウイルス粒子とを共局在させて、細胞の効率的な形質導入を可能にする。
２．  レトロネクチンを除去し（これは、なくなるまで再利用できる）、ウェルを２．５ｍｌの無菌ＰＢＳ／２％  ＢＳＡ／ウェルで３０分間ブロッキングする。ブロッキング溶液を除去し、ウェルを２．５ｍｌの無菌ＰＢＳで２回洗浄する（ウイルスを添加する用意ができるまで最終ＰＢＳ洗浄液をウェルに入れたままにする）。
３．  いくらかのＴ細胞培地を予め加温する。
４．  スピンフェクション（ｓｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）用の遠心分離機を空のバケットと共に３１６０ｒｐｍ／２０００ｇにて３２℃で６０分間回転させることによって予め加温する。スピンフェクションの準備ができたら、これを中断することができる。
５．  Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞からレトロウイルス含有培養上清を採取し、遠沈する（１５００ｒｐｍで５分間）。レトロウイルス上清を新しいチューブに移す。０．４５μｍフィルターを使用してレトロウイルスを濾過して、夾雑しているＰｈｏｅｎｉｘ  ａｍｐｈｏ細胞を除去する人もいるが、これは、レトロウイルスの力価を減少させる可能性がある。必要ならば、ドライアイス／エタノールのスラリー上でウイルスを急速凍結し、−８０℃で保存することができるが、凍結解凍の度に力価は半減する。
６．  スピンフェクション：２ｍｌ／ウェルのウイルス上清（または模擬上清）をレトロネクチンでコーティングされたウェルに添加し、３１６０ｒｐｍ／２０００ｇにて３２℃で２時間遠心分離する。
７．  この遠心分離が終わる４５分前に、形質導入予定のＴ細胞を調製する。Ｔ細胞を採取し、計数する。Ｔ細胞をＴ細胞培地＋ＩＬ２（１００Ｕ／ｍｌ）中に１×１０６個で再懸濁し、１５〜２０分間インキュベートして（３７℃／５％ＣＯ２）、遠心分離から細胞を回収できるようにする。
８．  ウイルスの遠心分離が完了したら、上清を取り除き、ウェルをＰＢＳ（２．５ｍｌ／ウェル）で１回洗浄する。
９．  ウイルス／レトロネクチンでコーティングされたプレートからＰＢＳを除去し、形質導入予定のＴ細胞を添加する（２ｍｌ／ウェル）。東西南北に揺らすことによって細胞がプレート上に均一に分布していることを確実にする。プレートを１３００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
１０．  プレートをインキュベーター中に入れる（３７℃／５％ＣＯ２）。
【０３３６】
５日目：形質導入Ｔ細胞に補給する
別の６ｍｌのＴ細胞培地＋ＩＬ２（１００ＩＵ／ｍｌ）をＴ細胞の各ウェルに添加し、インキュベーターに戻す（３７℃／５％ＣＯ２）。
【０３３７】
ＣＡＲの形質導入効率の決定
細胞に形質導入して本発明の細胞を産生するための方法の効率は、以下の手順を使用して決定され得る。
【０３３８】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の形質導入効率をスピンフェクションの４日後に決定する。模擬およびＣＡＲ  Ｔ細胞のウェルから試料を採り、
１．  ＦＡＣｓ緩衝液（１０％  ＦＣＳ、ＰＢＳ）で１回洗浄する
２．  ５０μｌのＦＡＣｓ緩衝液中、ＣＤ３４−ＡＰＣ（１μｌ／試料）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ（２μｌ／試料）およびＣＤ８−ＰＥ（１μｌ／試料）で染色する
３．  氷上で２０分間インキュベートする
４．  ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄する
５．  ２００μｌのＦＡＣｓ緩衝液中に細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ）によって分析する
のように染色する。
【０３３９】
ＣＤ３４磁気細胞選別による本発明の細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞など）の選別
ＣＡＲ−形質導入細胞（Ｔ細胞など）を
１．  Ｔ細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠沈し、上清を捨てる。
２．  細胞を１０ｍｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てる。
３．  細胞を３００μｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、１００μｌのＦｃＲブロッキング剤および１００μｌのＣＤ３４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １３０−０４６−７０２）を添加する。これらの量は、最大１０８個の細胞に適しており、それよりも多い場合は、適宜スケールアップする。
４．  よく混合し、冷蔵庫（２〜８℃）内で３０分間インキュベートする。
５．  ５０ｍｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てる。
６．  ５００μｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液中に細胞を再懸濁し、５００μｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液で予めすすいでおいたＭＳカラムに細胞懸濁液を負荷する。
７．  自然流下により細胞液を滴らせ、５００μｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液でカラムを３回洗浄する。
８．  カラムを磁石から外し、１ｍｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液を流し、細胞を無菌チューブ内に集める。
９．  選別されたＣＡＲ  Ｔ細胞を遠心分離し、１×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞／ｍｌの濃度で通常のＴ細胞培地（１％  ヒト血清、１０％  ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ、Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２、ＲＰＭＩ  １６４０）中に再懸濁する。
１０．  翌日にＣＤ３４表面抗体染色によってＣＡＲ  Ｔ細胞の純度をチェックする。
のように選別する。
【０３４０】
アルギノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ−１）またはアルギノコハク酸シンテターゼ（ＡｒｇＧ）酵素活性を決定するためのアッセイ  −  Ｌ−シトルリン枯渇
１．  ５×１０６個の細胞／試料をペレットにする（十分な細胞がある場合、追加で基質なし対照のために５×１０６個の細胞をペレットにする）。
２．  ２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘは、５０ｍｌチューブに入れて分子研究室にて４℃で保存する）中に再懸濁し、時々ボルテックス撹拌しながら氷上で２０分間インキュベートする。
３．  試料を１３，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離して、細胞デブリをペレットにする。
４．  ２０μｌの細胞溶解液を新しいエッペンドルフに入れ、氷上に保つ。
５．  各試料について新しいエッペンドルフを採用し、１０μｌのＬ−シトルリン（４ｍＭ、ｐＨ７．５）、１０μｌのＬ−アスパラギン酸（４ｍＭ、ｐＨ７．５）、１０μｌのＭｇＣｌ２（６ｍＭ）、１０μｌのＡＴＰ（４ｍＭ、ｐＨ７．５）、４０μｌのトリス−ＨＣｌ（２０ｍＭ）および２０μｌの細胞溶解液を添加する。
６．  酵素なし対照について、細胞溶解液の代わりに２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。
７．  基質なし対照を行う場合、ＡＳＳ−１基質もＡｒｇＧ基質も添加しない、すなわちＬ−シトルリンおよびＬ−アスパラギン酸を添加しない。その代わりに、トリス−ＨＣｌ（２０ｍＭ）で１００μｌの最終体積に調整する。
８．  試料を３７℃で１．５時間インキュベートする。ＡＳＳ−１またはＡｒｇＧ酵素反応が起こる。
９．  ４ｍＭ  Ｌ−シトルリン溶液の１：４希釈を行うことにより１ｍＭ  Ｌ−シトルリン溶液を作ることによってＬ−シトルリン標準を作る。エッペンドルフに１０、２０、３０、５０、８０および１００μｌのＬ−シトルリン（１ｍＭ）を添加し、各標準を無菌蒸留水で１００μｌに調整する。これにより、０、１０、２０、３０、５０、８０および１００ｎＭのＬ−シトルリン濃度が作られる。ブランク対照を含める。
１０．  各標準に１０μｌのＬ−アスパラギン酸（４ｍＭ、ｐＨ７．５）、１０μｌのＭｇＣｌ２（６ｍＭ）、１０μｌのＡＴＰ（４ｍＭ、ｐＨ７．５）および２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。ＡＳＳ−１またはＡｒｇＧ酵素活性試料内のＬ−シトルリン濃度をより正確に決定するために、ＡＳＳ−１またはＡｒｇＧ酵素試薬を標準に添加する。
１１．  ３７℃で１．５時間後に、各試料および標準に８０μｌの停止溶液（リン酸と硫酸とのそれぞれ３：１の混合物）および２０μｌの３％  ２，３ブタンジオンモノオキシム（ひどい悪臭のため、無菌蒸留水を用いてヒュームフード中で当日新たに作る）を添加する。
１２．  ボルテックス撹拌およびパルス遠心分離によってチューブを混合する。すべての試料および標準を９５℃で３０分間インキュベートする。２，３ブタンジオンモノオキシムがＬ−シトルリンと９５℃の酸性条件で反応するにつれて黄／橙色が出現する。
１３．  チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、何らかのデブリをペレットにする。２つ組で、５０μｌの上清を９６ウェル平底プレートのウェルに添加する。
１４．  マイクロプレート吸光度リーダを使用して４９０ｎｍで吸光度を読み取る。
【０３４１】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）またはオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）酵素活性アッセイを決定するためのアッセイ  −  Ｌ−シトルリンの産生
１．  ５×１０６個の細胞／試料をペレットにする（十分な細胞がある場合、追加で基質なし対照用に５×１０６個の細胞をペレットにする）。
２．  ２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘは５０ｍｌチューブに入れて分子研究室にて４℃で保存する）中に再懸濁し、時々ボルテックス撹拌しながら氷上で２０分間インキュベートする。
３．  試料を１３，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離して、細胞デブリをペレットにする。
４．  ２０μｌの細胞溶解液を新しいエッペンドルフ内に入れ、氷上に保つ。
５．  各試料のために新しいエッペンドルフを採用し、２５μＬのＬ−オルニチン（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、２５μｌのトリエタノールアミン（ボトルから直接ピペッティングする、溶液は非常に粘稠であるので、ゆっくりとピペッティングする）、２５μＬの新鮮調製カルバミルリン酸（１５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、および１０ｕｌのＳＤＷを添加する。
６．  次に、各チューブに２０ｕｌの細胞溶解液を添加する。酵素なし対照について、細胞溶解液の代わりに２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。
７．  基質なし対照を行う場合、ＯＴＣもＡｒｇＦ基質も添加しない、すなわちＬ−オルニチンおよびカルバミルリン酸を添加しない。その代わりにＳＤＷで１００μｌの最終体積に調整する。
８．  試料を３７℃で１．５時間インキュベートする。ＯＴＣまたはＡｒｇＦ酵素反応が起こる。
９．  ４ｍＭ  Ｌ−シトルリン溶液（ＡＳＳ−１酵素活性アッセイのために使用した−２０中の原液）の１：４希釈を行うことによって１ｍＭ  Ｌ−シトルリン溶液を作ることによってＬ−シトルリン標準を作る。エッペンドルフに１０、２０、３０、５０、８０および１００μｌのＬ−シトルリン（１ｍＭ）を添加し、各標準を無菌蒸留水で１００μｌに調整する。これにより、０、１０、２０、３０、５０、８０および１００ｎＭのＬ−シトルリン濃度が作られる。ブランク対照を含める。
１０．  各標準に２５μＬのＬ−オルニチン（５０ｍＭ）、２５μｌのトリエタノールアミン、２５μＬの新鮮調製カルバミルリン酸（１５０ｍＭ）および２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。ＯＴＣまたはＡｒｇＦ酵素活性試料内のＬ−シトルリン濃度をより正確に決定するためにＯＴＣ酵素試薬を標準に添加する。
１１．  ３７℃で１．５時間後に、各試料および標準に８０μｌの停止溶液（リン酸と硫酸とのそれぞれ３：１の混合物）および２０μｌの３％  ２，３ブタンジオンモノオキシム（ひどい悪臭のため、無菌蒸留水を用いてヒュームフード中で当日新たに作る）を添加する。
１２．  ボルテックス撹拌およびパルス遠心分離によってチューブを混合する。すべての試料および標準を９５℃で３０分間インキュベートする。２，３ブタンジオンモノオキシムがＬ−シトルリンと９５℃の酸性条件で反応するにつれ、黄／橙色が出現する。
１３．  チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、何らかのデブリをペレットにする。２つ組で、５０μｌの上清を９６ウェル平底プレートのウェルに添加する。
１４．  マイクロプレート吸光度リーダを使用して４９０ｎｍの吸光度を読み取る。
【０３４２】
アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）または（ＡｒｇＨ）酵素活性アッセイを決定するためのアッセイ  −  Ｌ−フマル酸塩産生またはアルギニン産生
１．  ５×１０６個の細胞／試料をペレットにする（十分な細胞がある場合、追加で基質なし対照用に５×１０６個の細胞をペレットにする）。
２．  ２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘは５０ｍｌチューブに入れて分子研究室にて４℃で保存する）中に再懸濁し、時々ボルテックス撹拌しながら氷上で２０分間インキュベートする。
３．  試料を１３，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離して、細胞デブリをペレットにする。
４．  ２０μｌの細胞溶解液を新しいエッペンドルフ中に入れ、氷上に保つ。
５．  各試料のために新しいエッペンドルフを採用し、２５μＬのＬ−アルギニノコハク酸（１１．７ｍＭ）、および５５μｌのＰＢＳを添加する。
６．  次に、２０ｕｌの細胞溶解液を各チューブに添加する。酵素なし対照用に、細胞溶解液の代わりに２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。
７．  基質なし対照を行う場合、ＡＳＬ基質もＡｒｇＨ基質も添加しない、すなわちＬ−アルギニノコハク酸を添加しない。その代わりに、ＳＤＷで１００μｌの最終体積に調整する。
８．  試料を３７℃で１．５時間インキュベートする。ＡＳＬまたはＡｒｇＨ酵素反応が起こる。
９．  ４ｍＭ  Ｌ−フマル酸塩溶液の１：４希釈を行うことにより１ｍＭ  Ｌ−フマル酸塩溶液を作ることによってＬ−フマル酸塩標準を作る。エッペンドルフに１０、２０、３０、５０、８０および１００μｌのＬ−フマル酸塩（１ｍＭ）を添加し、各標準を無菌蒸留水で１００μｌに調整する。これにより、０、１０、２０、３０、５０、８０および１００ｎＭのＬ−フマル酸塩濃度が作られる。ブランク対照を含める。
１０．  各標準に２５μＬのＬ−アルギニノコハク酸（１１．７ｍＭ）、および２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。ＡＳＬまたはＡｒｇＨ酵素活性試料内のＬ−フマル酸塩濃度をより正確に決定するために、ＡＳＬ酵素試薬を標準に添加する。
１１．  ３７℃で１．５時間後、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して何らかのデブリをペレットにする。２つ組で、５０μｌの上清を９６ウェル平底プレートのウェルに添加する。
１２．  マイクロプレート吸光度リーダを使用して２４００ｎｍの吸光度を読み取る。
１３．  ＨＰＬＣまたはアルギニンＥＬＩＳＡを製造業者の説明書により使用して、上記ステップ１１でアルギニン産生も測定することができる。細胞上清濃度の測定のために、細胞溶解液の代わりに１００ｕｌの細胞上清を使用して、上記プロトコールを相応に改変することができる。
【０３４３】
トリプトファンシンターゼ（Ｔｒｐ５）酵素活性アッセイを決定するためのアッセイ  −  インドール枯渇またはトリプトファン産生
１．  ５×１０６個の細胞／試料をペレットにする（十分な細胞がある場合、追加で基質なし対照のために５×１０６個の細胞をペレットにする）。
２．  ２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘは５０ｍｌチューブに入れて分子研究室にて４℃で保存する）中に再懸濁し、時々ボルテックス撹拌しながら氷上で２０分間インキュベートする。
３．  試料を１３，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離して、細胞デブリをペレットにする。
４．  ２０μｌの細胞溶解液を新しいエッペンドルフ内に入れ、氷上に保つ。
５．  各試料のために新しいエッペンドルフを採用し、８０μｌのインドール溶液（０．００５Ｍ）、４００μｌのＤＬ−セリン溶液（０．２Ｍ）、１００μｌのピリドキサールリン酸溶液、２０μｌのグルタチオン（０．０５Ｍ）、および１２０μｌのリン酸塩緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ７．８）、２６０μｌの水を添加する。
６．  次に、２０ｕｌの細胞溶解液を各チューブに添加する。酵素なし対照用に、細胞溶解液の代わりに２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。
７．  基質なし対照を行う場合、Ｔｒｐ５基質を添加しない、すなわちインドールおよびセリン溶液を添加しない。その代わりにＳＤＷで１０００μｌの最終体積に調整する。
８．  試料を３７℃で１．５時間インキュベートする。Ｔｒｐ５酵素反応が起こる。
９．  ４ｍＭ  Ｌ−フマル酸塩溶液の１：４希釈を行うことによって１ｍＭインドール溶液を作ることによってインドール標準を作る。エッペンドルフに１０、２０、３０、５０、８０および１００μｌのインドール（１ｍＭ）を添加し、各標準を無菌蒸留水で１０００μｌに調整する。これにより、０、１０、２０、３０、５０、８０および１００ｎＭのインドール濃度が作られる。ブランク対照を含める。各標準に２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。
１０．  ３７℃で１．５時間後、２００μｌの５％  ＮａＯＨを添加する。４ｍｌのトルエンを各チューブに添加し、遠心分離して溶液を２層に分離させる。
１１．  別の試験チューブにトルエン層を１ｍｌまでピペッティングする。４ｍｌのエタノールおよび２ｍｌのｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液を添加する（３６ｇを５００ｍｌのエタノール中に溶解する。１８０ｍｌの濃Ｈｃｌを添加する。冷めてから、エタノールで体積を１Ｌにするように調製する）。色変化を６０分間起こさせる。
１２．  マイクロプレート吸光度リーダを使用して５５０ｎｍの吸光度を読み取る。
１３．  ＨＰＬＣまたはトリプトファンＥＬＩＳＡを製造業者の説明書により使用して、上記ステップ１０でトリプトファンの産生も測定することができる。細胞上清濃度の測定のために、細胞溶解液の代わりに１００ｕｌの細胞上清を使用して上記プロトコールを相応に改変することができる。
【０３４４】
インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）酵素活性アッセイを決定するためのアッセイ  −  キヌレニン産生
１．  ５×１０６個の細胞／試料をペレットにする（十分な細胞がある場合、追加で基質なし対照用に５×１０６個の細胞をペレットにする）。
２．  ２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘは５０ｍｌチューブに入れて分子研究室にて４℃で保存する）中に再懸濁し、時々ボルテックス撹拌しながら氷上で２０分間インキュベートする。
３．  試料を１３，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離して、細胞デブリをペレットにする。
４．  ２０μｌの細胞溶解液を新しいエッペンドルフ内に入れ、氷上に保つ。
５．  各試料のために新しいエッペンドルフを採用し、５０□ｌのトリクロロ酢酸（３０％）を細胞溶解液に添加する。ボルテックス撹拌し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
６．  上清を集め、等体積のエールリッヒ試薬（１００ｍｇのＰ−ジメチルベンズアルデヒド、５ｍｌの酢酸）に添加する。
７．  ４ｍＭキヌレニン溶液の１：４希釈を行うことにより１ｍＭキヌレニン溶液を作ることによってキヌレニン標準を作る。エッペンドルフに１０、２０、３０、５０、８０および１００μｌのキヌレニン（１ｍＭ）を添加し、各標準を無菌蒸留水で１０００μｌに調整する。これにより、０、１０、２０、３０、５０、８０および１００ｎＭのキヌレニン濃度が作られる。ブランク対照を含める。各標準に２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤を添加する。
８．  マイクロプレート吸光度リーダを使用して４９２ｎｍの吸光度を読み取る。
９．  ＨＰＬＣまたはキヌレニンＥＬＩＳＡを製造業者の説明書により使用して、上記ステップ４でキヌレニン産生も測定することができる。細胞上清濃度の測定のために、細胞溶解液の代わりに１００ｕｌの細胞上清を使用して上記プロトコールを相応に改変することができる。
【０３４５】
オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ１）酵素活性アッセイを決定するためのアッセイ  −  ポリアミン産生
１．  ５×１０６個の細胞／試料をペレットにする（十分な細胞がある場合、追加で基質なし対照用に５×１０６個の細胞をペレットにする）。
２．  ２０μｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋プロテアーゼ阻害剤（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘは５０ｍｌチューブに入れて分子研究室にて４℃で保存する）中に再懸濁し、時々ボルテックス撹拌しながら氷上で２０分間インキュベートする。
３．  試料を１３，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離して、細胞デブリをペレットにする。
４．  ２０μｌの細胞溶解液を新しいエッペンドルフ内に入れ、氷上に保つ。
５．  ＨＰＬＣまたはポリアミンＥＬＩＳＡを製造業者の説明書により使用して、ポリアミンの産生を測定する。細胞上清濃度の測定のために、細胞溶解液の代わりに１００ｕｌの細胞上清を使用して、上記プロトコールを相応に改変することができる。
【０３４６】
配列情報
配列番号１  例示的なＡＳＳ−１酵素ドメインのアミノ酸配列
MSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK
配列番号２  例示的なＯＴＣ酵素ドメインのアミノ酸配列
MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号３  例示的なＧＤ２標的結合部分のアミノ酸配列
DILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSS
配列番号４  例示的なＣＤ３３標的結合部分のアミノ酸配列
GSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS
配列番号５  例示的なメソセリン標的結合部分のアミノ酸配列
MQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGVGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPLTFGAGTKLEIK
配列番号６  例示的なＥＧＦＲＶＩＩＩ標的結合部分のアミノ酸配列
QVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDY
配列番号７  例示的な４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達領域のアミノ酸配列
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号８  例示的なＯＸ−４０細胞内シグナル伝達領域のアミノ酸配列
RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
配列番号９  膜貫通ドメインを有する例示的なＣＤ２８細胞内シグナル伝達領域のアミノ酸配列
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号１０  例示的なＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達領域のアミノ酸配列
CWLTKKKYS SSVHDPNGEY MFMRAVNTAK KSRLTDVTL 
（完全長タンパク質の残基１６２〜１９９を含むＩＣＯＳの細胞質部。モチーフＹＭＦＭ（完全長タンパク質の残基１８０〜１８３）は、特に関連性があり、本発明のタンパク質における使用に適したＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達領域中に保持されるべきである）
配列番号１１  例示的なＣＤ３  ζ細胞内シグナル伝達領域のアミノ酸配列
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１２  本発明の例示的なタンパク質ＧＤ２  ＡＳＳ＋ＯＴＣのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号１３  本発明の例示的なタンパク質ＧＤ２  ＡＳＳ１のアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK
配列番号１４  本発明の例示的なタンパク質ＧＤ２  ＯＴＣのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号１５  本発明の例示的なタンパク質メソセリンＡＳＳ１＋ＯＴＣのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPMQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGVGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPLTFGAGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号１６  本発明の例示的なタンパク質メソセリンＡＳＳのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPMQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGVGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPLTFGAGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK
配列番号１７  本発明の例示的なタンパク質メソセリンＯＴＣのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPMQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGVGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPLTFGAGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号１８  本発明の例示的なタンパク質ＣＤ３３  ＡＳＳ＋ＯＴＣのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号１９  本発明の例示的なタンパク質ＣＤ３３  ＡＳＳ１のアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK
配列番号２０  本発明の例示的なタンパク質ＣＤ３３  ＯＴＣのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号２１  本発明の例示的なタンパク質ＥＧＦＲ  ＡＳＳ１＋ＯＴＣのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALEQKLISEEDLAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号２２  本発明の例示的なタンパク質ＥＧＦＲ  ＡＳＳ１のアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALEQKLISEEDLAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK
配列番号２３  本発明の例示的なタンパク質ＥＧＦＲ  ＯＴＣのアミノ酸配列
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALEQKLISEEDLAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号２４  ＡＳＳ１をコードするＤＮＡ配列
atgtccagcaaaggctccgtggttctggcctacagtggcggcctggacacctcgtgcatcctcgtgtggctgaaggaacaaggctatgacgtcattgcctatctggccaacattggccagaaggaagacttcgaggaagccaggaagaaggcactgaaActtggggccaaaaaggtgttcattgaggatgtcagcagggagtttgtggaggagttcatctggccggccatccagtccagcgcactgtatgaggaccgctacctcctgggcacctctcttgccaggccctgcatcgcccgcaaacaagtggaaatcgcccagcgggagggggccaagtatgtgtcccacggcgccacaggaaaggggaacgatcaggtccggtttgagctcagctgctactcactggccccccagataaaggtcattgctccctggaggatgcctgaattctacaaccggttcaagggccgcaatgacctgatggagtacgcaaagcaacacgggattcccatcccggtcactcccaagaacccgtggagcatggatgagaacctcatgcacatcagctacgaggctggaatcctggagaaccccaagaaccaagcgcctccaggtctctacacgaagacccaggacccagccaaagcccccaacacccctgacattctcgagatcgagttcaaaaaaggggtccctgtgaaggtgaccaacgtcaaggatggcaccacccaccagacctccttggagctcttcatgtacctgaacgaagtcgcgggcaagcatggcgtgggccgtattgacatcgtggagaaccgcttcattggaatgaagtcccgaggtatctacgagaccccagcaggcaccatcctttaccatgctcatttagacatcgaggccttcaccatggaccgggaagtgcgcaaaatcaaacaaggcctgggcttgaaatttgctgagctggtgtataccggtttctggcacagccctgagtgtgaatttgtccgccactgcatcgccaagtcccaggagcgagtggaagggaaagtgcaggtgtccgtcctcaagggccaggtgtacatcctcggccgggagtccccactgtctctctacaatgaggagctggtgagcatgaacgtgcagggtgattatgagccaactgatgccaccgggttcatcaacatcaattccctcaggctgaaggaatatcatcgtctccagagcaaggtcactgccaaa
配列番号２５  ＯＴＣをコードするＤＮＡ配列
Atgctgtttaatctgaggatcctgttaaacaatgcagcttttagaaatggtcacaacttcatggttcgaaattttcggtgtggacaaccactacaaaataaagtgcagctgaagggccgtgaccttctcactctaaaaaactttaccggagaagaaattaaatatatgctatggctatcagcagatctgaaatttaggataaaacagaaaggagagtatttgcctttattgcaagggaagtccttaggcatgatttttgagaaaagaagtactcgaacaagattgtctacagaaacaggcttagcacttctgggaggacatccttgttttcttaccacacaagatattcatttgggtgtgaatgaaagtctcacggacacggcccgtgtattgtctagcatggcagatgcagtattggctcgagtgtataaacaatcagatttggacaccctggctaaagaagcatccatcccaattatcaatgggctgtcagatttgtaccatcctatccagatcctggctgattacctcacgctccaggaacactatagctctctgaaaggtcttaccctcagctggatcggggatgggaacaatatcctgcactccatcatgatgagcgcagcgaaattcggaatgcaccttcaggcagctactccaaagggttatgagccggatgctagtgtaaccaagttggcagagcagtatgccaaagagaatggtaccaagctgttgctgacaaatgatccattggaagcagcgcatggaggcaatgtattaattacagacacttggataagcatgggacaagaagaggagaagaaaaagcggctccaggctttccaaggttaccaggttacaatgaagactgctaaagttgctgcctctgactggacatttttacactgcttgcccagaaagccagaagaagtggatgatgaagtcttttattctcctcgatcactagtgttcccagaggcagaaaacagaaagtggacaatcatggctgtcatggtgtccctgctgacagattactcacctcagctccagaagcctaaattt
配列番号２６  ＧＤ２  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列
GATATTCTGCTCACACAGACCCCACTCTCCCTGCCCGTGTCACTCGGGGATCAGGCTAGCATTTCTTGCCGCTCATCTCAGTCTCTGGTCCACCGGAATGGGAACACATACCTCCATTGGTACCTCCAGAAACCTGGACAGAGCCCTAAACTGCTCATCCACAAAGTCTCAAATCGGTTCTCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGGACCGACTTCACACTGAAAATCTCACGAGTGGAGGCTGAGGATCTCGGCGTCTACTTCTGTAGTCAGAGTACCCACGTCCCACCCCTCACCTTTGGCGCTGGAACAAAACTGGAGCTGAAACGAGCCGATGCTGCTCCTACCGTGTCCATCTTTCCTGGCTCCGGGGGAGGCGGGAGCGGAGGCGAAGTGAAACTCCAGCAGTCTGGCCCTTCTCTCGTGGAACCTGGCGCTTCTGTGATGATCTCCTGTAAGGCCTCTGGATCTTCCTTTACCGGCTACAACATGAACTGGGTCCGGCAGAACATTGGCAAATCCCTGGAATGGATTGGCGCCATCGATCCTTACTACGGCGGCACATCATACAATCAGAAATTCAAGGGGCGAGCAACACTCACTGTCGACAAATCTTCATCCACCGCCTACATGCACCTGAAATCTCTCACATCCGAGGATAGTGCTGTCTACTACTGTGTCTCTGGCATGGAATACTGGGGACAGGGAACTTCTGTCACCGTGTCTAGTGCCAAAACCACACCTCCCTCCGTGTACGGACGAGTCACTGTCTCATCT
配列番号２７  ＣＤ３３  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列
Ggatccaacatcatgctgacccagagccctagcagcctggccgtgtctgccggcgagaaagtgaccatgagctgcaagagcagccagagcgtgttcttcagcagctcccagaagaactacctagcctggtatcagcagatcccaggccagagccctaagctgctgatctactgggccagcaccagagaaagcggcgtgcccgatagattcaccggaagcggttctggcaccgacttcaccctgacaatcagcagcgtgcagagcgaggacctggccatctactactgccaccagtacctgagcagccggacctttggcggaggcaccaagctggaaatcaagagaggcggcggaggctcaggcggaggcggatctagtggcggaggatctcaggtgcagctgcagcagccaggcgccgaggtcgtgaaacctggcgcctctgtgaagatgtcctgcaaggccagcggctacaccttcaccagctactacatccactggatcaagcagacccctggacagggcctggaatgggtgggagtgatctaccccggcaacgacgacatcagctacaaccagaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacaagtctagcaccaccgcctacatgcagctgtccagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgccagagaagtgcggctgcggtacttcgatgtgtggggagccggcaccaccgtgaccgtgtcatct
配列番号２８  メソセリンｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列
Atgcaggtacaactgcagcagtctgggcctgagctggagaagcctggcgcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggacttattactccttacaatggtgcttctagctacaaccagaagttcaggggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggacctcctcagtctgacatctgaagactctgcagtctatttctgtgcaagggggggttacgacgggaggggttttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtgtaggcggttcaggcggcggtggctctggcggtggcggatcggacatcgagctcactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtcccaggtcgcttcagtggcagtgggtctggaaactcttactctctcacaatcagcagcgtggaggctgaagatgatgcaacttattactgccagcagtggagtggttaccctctcacgttcggtgctgggacaaagttggaaataaaa
配列番号２９  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列
CaggtacaactccagcagtctgggggaggcttagtgaagcctggagcgtctctgaaactctcctgtgtaacctctggattcactttcagaaaatttggcatgtcttgggttcgccagactagtgacaagaggctggaatgggtcgcaTccattagtactggcggttataacacgtactattcagacaatgtaaagggccgattcaccatctccagagagaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagtagtctgaagtctgaggacacggccttgtattactgtacaagaGgctattctagtacctcttatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaagtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatcgagctcactcagtctccagcatccctgtccGtggctacaggagaaaaagtcactatcagatgcatgaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccagcagaagccaggggaaccccctaagttccttatttcagaaggcaatactcttcggccgggagtcccatcccGattttccagcagtggcactggcacagattttgtttttacaattgaaaacacactctcggaagatgttggagattactactgtttgcaaagctttaacgtgcctcttacattcggtgatggcaccaagcttgaaaaagctctagagcagaaactgatctcggaagaagatctggcgaagccc
配列番号３０  ＡＳＬをコードするＤＮＡ配列
GACGCCATCCCGGCCAGAAAAGCCCTGGCCAGTGGCGGGCGCGACACTATCCGTGCGGCCAGGCGGAGGTGAGTGCGCGGCGGCCGGATGGGCGGGACGGGCGTGGAGGACGCCGAGCACCGTGGCGCGCGCTCACGTCCGCGTCCCCAAGGGCTGCGCTCCCTCAAGCGCAGTGCCCAGAACTCGGAGCCAGCCCGGCCCGGGGGACCCTGCTGGCCAAGGAGGTCGTCAGTCCGGTCTTGTCTTCCAGACCCGGAGGACCGAAGCTTCCGGACGACGAGGAACCGCCCAACATGGCCTCGGAGGTGAGTGGGACCTCGGGGACTCCGGTCCTCCTAGCCTCCAAAGGAGAGAGTGGGGGCGCCAGACCTGCCTCGGGCCACCCTGCTGGGAATCGCCCTCCAGGAAGCAATTTTGAAAATTACCTAGGAAGCCTGCACCCCCAGCCCTCCCGGGCGCATCATCTGGAGCCCAGCAGTCACCTTTACCAGGACTCACCAGTATCCGCAGGCAGCCCTTGTGGCAAACCCACCAACCCACACTACTAGGGGTAGAGTGGCTCTGCCCTCACCTCACAGTGATGCCTGCCTGGCCAGGAAAAGTGGCTCCCAAGCCTTCAGCCTTCCAACTCTTCCTTCCTTCTTACCACGTGTCCTCCTGTCAGGTCCCACCCCACACCACATCCCTTCTCCTGCTAGAGCAATTGTCCCTGTTTATAGAATAAAGCTCAGCCCCTAAGTGTTCTTGTCCTTGACTGTGGCATGTGGAAAGAGCCAGGAAAAAGGGGACGTCGCCTCGTGGCTCCAGCAACCCTGGTGCCTGGTCCCTTCCTGTCTCACTGGACCCTGCCTCTTAGGGTCAGTGGCTCCTGGCCTCTCCTCCTGACCACTGAGATGCTGGATTCCCAGGCAGAGGTTTTCCTTCCTTGGGCCATAGTTGATTTATCTGGCAATGGGGGTAATAATAGCTGTCGGCCTCACTCTGTAAGGCACTAGATTATGAGGCCATTGCTTTGGACCCTTCAGGTGAGAGGGGCTGTTCGCCTGATGCTTGATGAAGGGAACTCCGGGAAGCAGGAGGTCTGGGTTCCAGGCCCTTTTGGCCTTCATTAGCTAGCAATTCACTTCCTCTTTCTCAATGCCCTGCAAGCTCAGTGCCCTGCAAGCTTCTGGGTCATGGCAGGGGGGTAGGGCCTGGACTTTGGAGCCAAACAGACTTGGTTTCTGTACCAGTCACTTGAGCCCTTTAAACCTCTTTCCTCATTTGTGAAATAGGGGTAATATTGCCCACCTCATAAAAGGCCGTAATAACATATGTGAAATCCCTAGCA
CAGGGCTGAGCAACAGTAGGTGCTCAATAAATGGTGGCTAACCACAACAATACTGATATTTCTACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGAGGACTGCTGAAGCCCAGGAATTCCAGACCAGCCAGGGCAATGTAATGAGACCCTGTCTCTACAAAAAGATTTTGAAAATTACCCAGGTGTGGTGGCGTACACCTGTAGTCTCACAGGAGGCGGAGGCATGAGGATTGCTTGAGCCCAGGAGTTTGAGACTGCAGTGAGCATGATCTCACCACTGCACTCCAGCCCAGGCAACAGAGTGAGATCCAGTTTCAAAAAAATAAAAATAAAAAAACCTGGCAGGCATGGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGTCGAGGTGGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATGCAAAAATTAGCTGGGTGTAGTGGTGGGTGCCTGTAGTCCCAGCTATTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACTCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAAGCAAGACTCCACCTCAAAAAAAGAAAAAAAACCCACAAGTCCCAAAACCAAAACTGGTATTTCCCATGTACATTCGACCTTAACTGTTGCTCATTCAACCCAGCCCAACTCAGTGCCCCATCCCCTGGCCCTGAAGAGACCATTCTGGCCCAGATGTGTCCTGGCTTGGAGTAGCACCTTCTGCTACCACACTAGGCCTCCACTCTCCTCAGTGCCCAAGGGGAGGCACCTCACTCTGATCTCCCTGTGGGGTCCTCTTATGCCTGCCAGTAAGGATAGGAGTTTGGTTCTAGAGCAGAGTGGTCTGGCTTCCAACAAGCCCAGTGTTCTAGGTGACCTCAGGTTGCCCCAGGCCTTCCTGTAGGTTGGCACTAATTGGTTTGGCTGCAGCTCCACTTATTAAGTAGTTATTTTTATTACTAACAACCTAGGCAGGGTGGCCCAGGAGCCCGCTGGGGGAGGCGGTGCCAGGCTCCTGGCTGAGGGGCAGGCTGGCCCCAATTCTGACTGGCTGGCTCCAGTGATCAGGACCAGGGCCCCACGTGGTGCTTTGCTGGAGATCTAGGCTTGGTGGGGCAGCTGTGGGGTAAGGGGCAGGACCAGCTCAAAGATGGGGTGGGGGCGGAGGCTGCCTCTGCAGGGCAGAGTCCTTTGGCAGTCGGGACTGTTGGGCATAGAGGAGTCAGCTCACAGCTCAGGGCCAGAGCACTGGAGAGGTCTCTGGGGTGCATACAGGAACCAGGAGTGGAGCTGAAGCATGTCCTATCCCCTGCCAGCCCTCCCTTAGTAACAGCTGGCATTTCTCGAGTCCTTCCTGAGCACCAGGCACCGTGTTATGTATGCAATTTGCAAATATTATCTGATTAAATGCTCACAATAAGGCTATCAGAGAGGTACTATTATTATCCTTATCTTATTATTATTATTATTATTATTTTTAAGAAGGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAAGCTGGAGTACAATGGCGCCATCTCTGCTCACCGCAACCTCTACCTCCAGGATTCAAGTGATTCTCCTGCTTCAGACTCCCAAGTGGCTGGGACTACAGCTTCCTGCCACCGCGCCTGGCTAATGTTTATATTTTTAGTACAGATGAGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGATCTCGAACTCCTGACCTCAAGCGATCCACCTGCCTGGGCCTCCCAACCCTGAGGGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTGAGACAGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACGATCTCAGCTCACTGCAAGCTCCGCCTCCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGCGCCCAACACCCCCATGCCTGGCTAATTTTTTTGTGTGTGTTTTCAGTAGAGACGGAGTTTCACCATGTTAGCCAGGATGGTCTCCATCTCCTGACCTCGTGATCTGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTATAGGTGTGAGCCACCACGCCCAGCCCCTGAGGTTTAATAATAGGTGCCAGGCCAGGTGGTTAATAGAAGTCTGGGGCATTGTAGGGGGACAGAGGAGGATATATGTCCCCATTGGCCATTGTAGACTCCCTTCCACAAAAAGGACGTCAGTGAAGTGACATGCCCACCTCTACCCCACCCTCCTCCCAGTCCTGGGCACTAGGGCTGCTCCCCAGGTGTTCTGTACCCCCTCCCCACTCTGTCCCATGCCCTGGCCTCTGCCCTCTTTCAAAACATAGATGTGGCTGGCGCCTAGGCTCATGCCTATAATCTCAGCACTTTGGGAAGCTGAGGCTGGAGGACAGCTTGAGCCCAGGAATTCAAGACCAGCCTGGGCAACATAGTGAGACCCTGTCTCTACCAATTATTTTATTTTATTTTATTTTGTTCATTTATTTATTTATTTTGAGACAGAGTTTTGCTCTGTCACCTAGGCTGGAGTGCAGTGGCGTGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTAAGTAGCTGGAACTACAGGCGAGTGCCACCACGCCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACCAGGTTTCACCATGTTGACCAGGATGGTCTCTGTCTCCTGACCTCATGATCCACCCACCTTAGCCTTCCAAAATGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCACTCCCAGTCCTATAAAATTTTAAAAAAATGTCTGGGTGTGGTGGCGCATGCTTGTAGTCCCAACTATTGGGGAGGCTGAGGCAAGAGGATTGGTTGAGACCAGGAGTTTGAGGCTGCAGTGAGCTATGATGGTGCCACCGCACTCCAACCTGGGTAACAAAGTGAGACCCTGTGTCTAAAAAAGAATTTAAAGGCCGGGTGTGGTGGCTCACACCCGTAATCCCAGGACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCAGATCACGAGGTCAGATTAAGACCATCCTGGCTAACAAGGTGAAACCACGTCTCTACTGAAAAAAAAAAATACAAAAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGGGCACCTGTAGTC
CCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAATCTGGGAGGTGGAGCTTGCAGTGAGCCAAGATCCTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAAAGAGAGACTCCATCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTAAAAAAGATTTTTTTAATGAACAAAACAGGCTCGGCACAGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAAGCACTTCGGGATGCCAAGGTCAGGGGATCACCTGAGATCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGACCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATATAAAACTCAGCCAGGTGTGGTGGCACACGCCTGAAATTCCAGCTACTCGGG
AGGCTGAGGCAGGAAAATTGGCTTGAAGCCGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTGCACTCCAGCCTAGGCAACAGAGTGAGACTCTATCTCAAAGAAAACGAACAAAACATAGATGCCTACATACCATTCCTCTGCCCTTGGCTCCTGGGGAGTAAGGGATCACCCAGTGACCTCCTAGAAGGCCAGTGACAATGGGGGGTGTCAGGGTGCTTTTCAGAGCCAAGGGAGTGGTAGGAATTGGGATCTTAGTCCAGCTCCAAGCTGTGAGGGAGAGAGTTGCAGGGCACTTAAGCTTGGTGGAGACCCTCAAGGCCTCTTTGCCTGTCCCTGCAGCAAAGGTTCTGGACACCAGAGCCAAGTCCAGAAGCCCTGGTGGAACAGGGGTGAAAAGCATAGGTTCTGACTTCAGACTGCTGGGCCGCAGCCCTGGCTATCCCACCCCAGGTGAGAGCAGGCTGCTCTGTGCCTCAGTTTCCCCATCTTCATAGTGGAATTGTATTGGTGCCTACCCAGAGGGTTGTGTCAACAATTAGGATGGCACCTAGCACCTTGGTCAGTGGTGGGAAAGGTTCCAGAAGTTCTGCTGTGGTCCCAGGGGTGTCTCAGGCCCTGCCATCATCTCCTTGGAGGGGTGCCATGTGGTGGGAAAGAACCCCAACTTCAAGGCCACACACAGTGGCTCATGCCTGTAATCCTAGCACTTTCAGAGGCCAAGATGGGAGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAATGATACAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCACGTGCCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGTCTGAGGCAGGAGAATCTCTTGAACCTGGGAGGCAGAGTTTGCAGTGAGCTGAGATGGCACCACTGTACTCCAGCCTGGCCGACAAAGTGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAACCCAAACTTTTGGTGTTCAGCCATGTTCCCATGCTCACTCCCAGGGTGGTGACTCTGGGAAGGTCTCAGCCTCCTTGTCTGCCCAGTTAGAATGATCTGATGCCCCTGCTACCATCAGACTTGATAAGTTTCCCAAAGACTCTTTGCAAGAAGCACTGTTCTGGAGGGTGGAGGAGAGACTAATTGTTCTTGCTCTCCTGGCCAGAGTGGGAAGCTTTGGGGTGGCCGGTTTGTGGGTGCAGTGGACCCCATCATGGAGAAGTTCAACGCGTCCATTGCCTACGACCGGCACCTTTGGGAGGTGGATGTTCAAGGCAGCAAAGCCTACAGCAGGGGCCTGGAGAAGGCAGGGCTCCTCACCAAGGCCGAGATGGACCAGATACTCCATGGCCTAGACAAGGTACTTGCCGTGGCCCAAGCCCCACCCAAGGCCCCTTCCCTGTGGCCCCAGGCTCCCACCAAATCCCTGAGCAAACAGTGCAGTGTTGCCCATCTGTGGTTTCACATTGAACTAATTATATACTCAAGTGCTGTTTAACTGTGTGCCTTGATGACTGCCTCTCTCCATCCTTTAATGACCCCTGTGGCCCACATGGCTCATGGGTAAAGGTGTGCTGGGCCTGAGATGCCCCCTCCCAGGGTGCGCTTCCAGGACTCAGCTCCTGGGCAGGGACAGTCAGTCACCAGGGATAGGGTGGGACCAAGGCAGGGGCTCTCTTGGCTGCTGATGCCTGCTCACCTGACCCCGGCATTGCTGCTACCCACTACAGGTGGCTGAGGAGTGGGCCCAGGGCACCTTCAAACTGAACTCCAATGATGAGGACATCCACACAGCCAATGAGCGCCGCCTGAAGGTACGACCCCTGGAGCCCCACCGCTTTCCTTGCCTCCCCTCTCCACCTTGCCCAGGGCCACTTTGAGCATTAGCACCATTCTGTTTACTTCGCCATTGGCAGACAGCATGTGAGACCTCAGGACATGAGCCAGGCACCCTGGCTCATGCCTATAATCCTAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGAGGATTGCTTGAGACCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATAATGAGGTCCCACAGCTACAAAAATTAAAAAAAGAAAAGAAAAAAAGAACAGGCCTCAGCAGAAATGGCGAGAGATTTGGGGAGGACCCGGAGCCCTGGGGTATGGAGGTAGGTTGGCAGGGCTGATGAGGAAAACTGCCCTGCCTGGGTTGACTCCTCTGGGGGTATAGACCGTGACCCTGGGTCTCCCTTCACCTCCAGGAGCTCATTGGTGCAACGGCAGGGAAGCTGCACACGGGACGGAGCCGGAATGACCAGGTGCTTTAGCCCCTCCACCCCCTGCTCCGTGTTGTCCCAACCTTGAGGAGCCCAGGGGGCAGTTAGAGTTCTGCAGCGGTCCTGGCTCCTCAGGGAAGCAACACATCGGCCTCCCTGAGCACCATCTCCTCCTTGCACAGGTGGTCACAGACCTCAGGCTGTGGATGCGGCAGACCTGCTCCACGCTCTCGGGCCTCCTCTGGGAGCTCATTAGGACCATGGTGGATCGGGCAGAGGCGTGAGTCCTACAGGGACACCCAGGGGGCAGACAGAGGTGTGATGGAAGCCTGAACAGGAGACCTAGGGGGCAGGGGTGAACAGCGTGGGGGTGCCAGGCCCTGGGGGACAGGGGCATCCCAGAACTCCAGGATCGAGGCAGAGCAGCCAGGAGTGGGCCATTTCCTGCAGGCCCCAATACTCCCATGCCAGTCTAGCTCAGCAGGCAGAGAAGACTAACCCTTCGTGGGGCTGGGTGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCTCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGGAAAACTCTGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGGCAATGTGGTGGTGTGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGCCTGAGGCAGAAGAACTGCTTGAACCCGGGAGGAGGAGGTTGCAATGAGCCGAGATCGCGCCATTGCACTCCAGCCTGGGCTACAGAGCGAGACTCCTGTCTCAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGAAAACTCACCATTTGCAGATTTGAAGGCAGGAAGCTAAGCCAAGCACAGCTAGCTTGGCTGTGCCTGGAGCAGCCAGAGTCACTCCCCACACTGCCTGTCCCCCAGATCCCCCATCCTAAGCTTCGCCTCCCCATCCAGCCCATCTGGCAAAAGACAGAGCCAAAGGCTGCCTCCTGCTGGCCTCATTTCAGGCTTTGGCTTCTGGGACCTGGTGTCTTTGGGACTGGATTTGTTCCTTGCAGACCTGGACGAAGAGCTGCTGAGAAGTCTCCATGTGTTGTCAGAGACCCCTCCTCTTCCTCAACTCCCTGTGACCCCTGTTGTGCAGACTTGGGGGAAAACAAGGGCACAAGAATTGTCACCCAGCAGGTGGTGTGGGGCTGCTAGGAGGAACAGGGAGTGTCTGCTACTGAGTTCAGGGTTTCTTTAATTTTTTGTTGTTGTTGTTTGTTGTTGTTTTTTTTTTTTTGAGACAGGGTTTTGCTCTGTCACCTAGTCTGGAGTGTAGTGGCGCTATCTGAGCTAACTGCAAACTCTGCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTAGTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGAGATTACAGGTGTGCACCACCATGTCCAGCTAATTTTTGTATTTTTTTCAGTAGAGATGGGTTTTGCCATGTTGACCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGAGCTCAGGTGATCTGCCCGCGTCGGCCTGCCAAAGTGCTAGGATTACACCCATAAGCCACTGCGCTCAGCTTAATTTTTAAATTTTTAACTTTTTAAATTGTCTTTAGAGATGAGATCCTGCTCTGTCACCTAGGCTGGAGTGCAATGGCTTGGTAATAGCTCACTGCAGTCTCAAACTCCTGGACTCAAATGATCCTCCCACCTCAGCTTTCTGAGTAGCTAGGACCACAGGTGTGCACCACCTGTGAGACAGAGTCTTGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGTGATCTCCACTCACTGCAACCTCTGCCTCCCAGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGT
AGCTGGGAGTACAGGTGCCCACCACCACGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTAGCCAGGATGGTCTCAATCTCCCGACCTCATGATCCACCCACCTCGGACTCTCAAAGTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCCACCGTGCCCAGCCGCGAATTCTTTAAATTTTTTGTAGAAACAGGGTCTCACTATGTGGCTCAGGCTGGTCTCAAACTCCCGGCCTTAAGTGATCCTTCCCTCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTAAAGACTTGAGCCACCGTGCCTGGCCTTGAGTACAGAATTTCTTCATGGGGTGATGAAAATGTTCTAAAATTGGTTGTGGTGATGGTTGTACAGTAAAGTGTAAACTTTAAATGAGTAAATTGTGAATGATATCTCAGTAAAGCTGGTTTATTTAAAACAACAGGCCAGGTGCTGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGAAGGCTGAGGCGGGTGAATCACCTGAGGTCAAGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACACAAAATTAGCTGGGTGTGATGGTGGGCACCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGGCAGGAGAATCTCTTGGACCTGGGAGGTGGAGGTTGTAGTGAGCCGAGATCACGCCACTGCATTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCGAAACTCTTTCTCAAAAACAACAACAACAAAAAAACAGGCCAGGTATGGTGGCTCATATCTGTAATCCCAGCCCTTTGGGAGGCCAAGGCAGGAGGACTGCCTGAAACCAGGAGTTTCAGACCACTCTGGGCAACATAGCAAGACCCCATCTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGGCTGAAGTGCAATGGTGCAATCTCAACTCACTGCAAGCTCTGCCTCCTGGGTTCATGCCATTCTCCTGCCTCAGCCCTCCTGAGTAGCTGGAACTACAGGCGCCCACCACTACGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTATAGATGGGGTTTCACCGTGTTAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTTGTGATCTGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGTTACCGCGCCTGGCCACAAGACCCCATCTTTACAAAAAACTAAAAATTAGCTGGGCATGGTGGCATGTCCCTTTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACAGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAGATCGAGGCAGCAGTGAGCTATGATCATGCCACTGCACTCCAGTCTGGGCAACAGAACGAGACCTTGTCTCTAAAAATAAAAACAAAACAAAACAACAAGAAAACAGGACCATCACTCACAGCACCTCTGCCTCTGCCCTGCCTACTTGAATGAGGTGCAGGGCATCTCACCTGCTCAGAGCAGCCCTTGAATGAGCCCCAGCTATTTCTAGGGTCCTCAAACGAAACCTCCCACGGCCAAGTCATACCCAACATGGGCCTCCTCCCCTATTCTGGCCCCTGCTCGGAGATGCTGAGTGACAGAGGCTGGACTTGGGGTGTTTCTGGCAAAGCCTCACTGCAGGAAGCCCCACAGCTCAGGCCCAGTCCTTGGTTCACACGGTCCCACTTCCAGCTTCTTTTGCCCTTAAGACTGATTTGTCCCTGGGAGATCACCAGATCCCTCATTCAGGTGGAGTGCTGCAGCGTGACACTTTTTCCAGGGGTGACCCAGGCCTGCAGGGTTCCAGTGTCACAGGCAGGCCTTGCATGAGCCTCCACCCGAGCTTCTGCTCCTCCTCTCCCACAGGGAACGTGATGTTCTCTTCCCGGGGTACACCCATTTGCAGAGGGCCCAGCCCATCCGCTGGAGCCACTGGATTCTGAGGTGAGCCAGGTGAGGTGCAGGGGCTGTGCTAGAGGGGAGGACCCCGGCTGCCCTGACCCTCCTGCCCCTGGCTTCCCACAGCCACGCCGTGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGATCAATGTCCTGCCCCTGGGGAGGTGGGTGAGGCTCCAGTGCCCCGAGGGCCTGGTGGGGGTGGCTGCTGCATAGCCTTAGGGATTGACAGAGCTGGGAAGTGCAGAGTGGGACAGAAAACCGCCTTATCTGCTCAGCGGGGGACTCTGCATGGAGCCCCAGCTCTCGCTAAGGTGACGACCAAGCCATTGAATGTGTCTGAGCAGGGCCAGAGCCCTCCAGCAAGGCTCCTGGCAAGCCCAGCCTGCTGCCCTCAGCCTGACATGTGGGAACATGTGTCAGGAGACAAGTGTCCTGCACCCAGGGTGACTTAGTGCTTGGGGACAAGTGTTTTGTGGACACTTGGGGACAAGTATTCTGTACCCAAGGAGACTGGGCCAGGGAAGAGGCTAAGCGCCAGGTGGTTGCCCTGGCAACCAGGACTTGGTTCTCTGTGTGTGCGTTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCAGGGCTGCCTGCCAGGAGCCCTGGTCACCATGAATCCCTGTCCCTGCAGTGGGGCCATTGCAGGCAATCCCCTGGGTGTGGACCGAGAGCTGCTCCGAGCAGGTGAGACGTCCTGCCCCTCCTCCCCAGGGAGAATCACCCTCAGCACCCGCCAAGACCTGCAGACACACCTGAAACCAGAGGGCAGGGGCCTGTGGCTCCTGGTGAAACCTTCATTCATTGCCTATGGGCACTGAGGTCATCAAGTTCAGGGGTCACTCATGGCAGGGATGCCTGGTACTGAGAGACTCAGGGCTCCTGCCTCCCTCCTGGGACTGTGCAAAAGATCCCTCCCCCCAGCTGTTGCCCCACCCTGATCAGGGGAGGGGGCTGGGCAACCTAGTTGGGGGAGAGGGGGCCACTCCCTGTCCTCCAGCTTAGCCCTGCTTCCTCCCACCCCCCCAGAACTCAACTTTGGGGCCATCACTCTCAACAGCATGGATGCCACTAGTGAGCGGGACTTTGTGGGTGAGTCCTGGGGAGCCAGTCCCCTGCCCTGTGCCTCACTTTAGTCCTTCAGCCCAGCTTCTCTCCAGTTTCCTCCCACACCTCCACGGACAGGCTGGTTGTGGTGATATTGTACACTGAAGTATAAACCTTAAATGGGTAAAGTGGGTGGGGCATGGTGGTTCACCATGCCCAGCACTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAGAATACAAAATTTAGCTGGGTGTGTGGTGGCAGGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGTTCTGAGGCCAGAGAATCACTTGAACCCAGGAGGCGGAGGCTGCAGTGAGCCAAGATCACGCCAGTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCGAAACTCCATCTCAAAAAATAAAATAAAATAAAATAAAAATAAATAGGCCAGGCATGGTGGCTCACGCCCGTAATCCTAGCACTTTGGGAGTCCGAGGCAGGTGGATCACATGAGGTCAGGAGTTTAAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAGCACAAAAATTAGCTGGGCATGGTGGTGCATGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTAAGGAAGGAGATTCGCTGGAACCTGGGAGGTAGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATTGTGCCACTGTACTCCAGCCTGTGCATTGGGAGCGAGACTCCATCTCAATAAATAAATAAATAAATAAATGGATAAATTGTATGTGAGTGATAACTCAGTAAAGCTGGTTTATTTAAAACAACAACAATAACAAAAAACACGCTAGGTGCAATGGCTTACGTTTGTAATCCTAGCACTTTGGGAGGCCAAAGCAGAAGGATTGCTTGAGCCCACAAGTTTCAGAACAGCTTGGGCGACATAGCACGACCCCATCTTTGCGAAAAATGAAAATTTAGCCGGGTCCCCCCACCGCCTAACCTCCTCCTGCCCCCTGTATGGTCAGGCTGGGTGGGGATGGGAGAGGCCTGGTGACTGGGAACCTTTTCTCCCAGCCGAGTTCCTGTTCTGGGCTTCGCTGTGCATGACCCATCTCAGCAGGATGGCCGAGGACCTCATCCTCTACTGCACCAAGGAATTCAGCTTCGTGCAGCTCTCAGATGCCTACAGGTAAGCCCTGAACTGCCACCTCCATCTGCCGCTGCCGGCCTCTGTATCCCCCGCCGCCCGCGGACGTGGCTGCCTTCCTCCCCGTCCCACCCCTCCGCCAGACCTGGCCATTGCGGCGCTGGACCAGCCAAGGGTCCAGCCCCTTCAGCGCCAGCACCTCTGTCCCCAGCACGGGAAGCAGCCTGATGCCCCAGAAGAAAAACCCCGACAGTTTGGAGCTGATCCGGAGCAAGGCTGGGCGTGTGTTTGGGCGGGTGAGCAAGGCAGGGGGAGGGGCGGGGCCTCTGGGCTGATGGTGGGTGGCCAGGGGGGCAGGATCCCGGGTCCAGCCCCTGTGCCTCCCTCTTCCCGCAGTGTGCCGGGCTCCTGATGACCCTCAAGGGACTTCCCAGCACCTACAACAAAGACTTACAGGTGCGAGGCCGGGGGAGGCCTGGCTAGTACGTGCCAGTTCTCAGGGCTCTGGCACACTCAGGCAGGGCCCCACCCCGGGATTGCCATACATCCTCCCATCCTGTGCACACAGCTCCATCCGTGGCTGCCCTTGAACTCTCTGCCCTTCCTTTGTTGGGGTATTGAGTGTTCTTCCCATGGAAGGCAGTGGGGATGCCTCAGTGGGGGGGTGGGGCTGTGGGGACCCTGGGTGCCAGGGGGCTGCTAGGCCCTCACCTCCTGCCATGTGCCTCCCAGGAGGACAAGGAAGCTGTGTTTGAAGTGTCAGACACTATGAGTGCCGTGCTCCAGGTGGCCACTGGCGTCATCTCTACGCTGCAGGCAAGACATCACCCCCCTGCTTCTCCTCCCCTAGGTCCCAGGCACTGGGGTGGGCATGCGGGGAGGGTGGCCTTGGGAGGAGGTGAGGTGGGGCTGGAGGACCTGGGGCAGGGAAGGAGAGGTGTGCTCGCTCCTGCTCCTGGGGAACAGGGAAAGGACAGAAACTGCTGCCATGCAGTGGAAGTAGATGAGACTCAGGGGGCCTGGGGCCTGTCAAATGGCCTGACCAGAACTCTTTAAAAAAAGAAAATCTAAACAAAAGGCCAGGTGCAGTGGCTCATGCCTGGAATCTCACACTTTGGGAGGCCGAGGCAGATGGAGCACTTGAGGTCAGGGGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGCGTAACCACGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAGGCGTGATGGCCCACACCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCGGAGGCAGAAGAATAGCTTGAACCCAGGAGATGGAAGTTGTAGTGAGCCAAGATCATGCCGCTGCACTCCAGCCTGGACCACAGAGTAAAACTCCATCTACAAATATATAAATTAAATTAAATTAAATTAAATATCTTTAAAAAACATTTTTTAGAGACAGGGTCACTCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCGGTCGTAGCTCACTGCAGCCTCAAACTCTTGGGCTCAAGTGATCTTCCCACCTCAGTCTCCAGAGTAGCTGGGACTACAAACATGCGCCACCACGCCTGGCTAATTTTTTTATTTTTTGTAGAGACAGGGTCTCCCTATGTTTCCCAGGCTGGTCTCAAATTCCTGGCCCCAAGCCATCCTCCCACCTTGGTCTCCCAAGGTGCTGGGATTATAGGCATGAGCCACTTTGCCTGGCTGATTTCTTTTAAAATCAATTATTATGGGAAATTTATGTATATAACAGCTAGAGAATGCATAATGAACCCTATGTACCGACACCCAGCTTCAATGATAATCAACTCACGGACATCCTGGCTCCAGCTGTCTTTACCCACAGCTCTCTCCCACTCCCTTACCCCCTTATTTTGAAGCAAATTCCCATCATCACATCATTTCATTCCTAAATAGTTCAGGATATGTCTTGAAATCAGTGTTTCTTGGCTGGGTGCAGAGCCTCATGCCTGTAATCCCATCAATTTGCGAGACTAAGGTGGGCAGATCACTCGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGCGAAACCCCGTCTTTACTAAAAATATAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGTACACGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCGGGAGATGGAGACTGCAGTGAGCAGAGATCACGCCACTGCGCTCCAGCCTGTGTGACAGTGCAAGACTCCATCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCAGTGTTTCTGGAGGCTAGTCCCCCAACTAGCAGCACCAGCATCACCTCAGAAGTCCTGAGAAATGTGATGTGAGGCCCCACTCCAGATGGCTGAATCAGAGACTCTGGGGGTGCTCCCCAGCAATTTGTATTTTTCTTAGTAAATTCTCCAGTGGCTAGGCCTGGTGGCTCATGCTTGTAATCCCAGCACTTTGAGAAGCTGAGGCAGGAGAAGCGCTTGAGCCCAGGAGTTCAAAACCAGCCTGAGCAACATAGCGAGACCTTGTCTGTAAAATTAAAAAAATTAAATTAGCCAGTCGTGATGGCGTGTACCTGTGGTCCCAGCCACTTAGGAGACTGATGTGGGAGGATCCCTTGAGCCCAGGAGCTCAAGGATGCAGAGAGCCAGGATTGTGCCATTGCACTCCAACATGGGCGACCCTGTCTCAAAAAAGCCCAAAACAACAACAACAAATTAGCTAGGCACGGTGGTGTGCATGGCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCTGGAAGATCCCTTGAGTCCAGGCTGCAGAGGGCTATAATGGCCACTGCACTCCAGCCTGGACAACAGAGCAAGACCCTGTCTCCTAAAACAGAAAACAAATCCTCCAGGAACATCTGATGCATGCTGAAGATAAGGACTCTTTGAAAACATAAAGGCCAGTAAAACATACAGGCCAGTAAGTGTTCATAGCACATGTAAATATTATCGATAATTATGAGAAGATGGTTCAAGTTGAGAGTGAGACAGAGCCGAGTGGGTAAGAGAGTATCTGCCCAAGGCAGGGATGTCCTGGCAGAGGGGCAGGTCCTGGGCCTGGCAGCTTCAGATCCCAGGGTCCCCAGGGCTCACCACTCGCCCACCTGTGCCCCCAGATTCACCAAGAGAACATGGGACAGGCTCTCAGCCCCGACATGCTGGCCACTGACCTTGCCTATTACCTGGTCCGCAAAGGGGTAAGTGTGTAGCAGCCAGGGGGAGGGTGAGGAGATGGGGTGCCCCCCCCAGAGGGTGGGGGAGCTCAGGAATGGGTGCAAGCGGCCCAGCCTGGTGGCTCACCCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAAGCCGAGGTGGGCGGGTCACTTGAGGCCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGTCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTTTTGATGTAAAAATACAACAATTAGCTGGGTGTGGTGGCACACTCCTGTAATCCCAGTTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGATTGAACTGGGAGGTGGAGTTTGCGGTGAGGTGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCGAGACTTTGTGTCAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAGGGGGTGCAGGCAATGGAGGCAGATCAGGGCATGGAGAAACCTGCCTCAGCGCCATCTTCCTCCCTGGCACCCAGATGCCATTCCGCCAGGCCCACGAGGCCTCCGGGAAAGCTGTGTTCATGGCCGAGACCAAGGGGGTCGCCCTCAACCAGCTGTCACTGCAGGAGCTGCAGACCATCAGGTACGGCCCATCCCCTTCCCCATGCTGCCTCCTAGGAAGTGAGCCTGGGTGCCTGGAGCCCAGGGTGGCCTGGCGCCCTGGCCCACCTCTTCCTCTCTCCCCAGCCCCCTGTTCTCGGGCGACGTGATCTGCGTGTGGGACTACGGGCACAGTGTGGAGCAGTATGGTGCCCTGGGCGGCACTGCGCGCTCCAGCGTCGACTGGCAGATCCGCCAGGTGCGGGCGCTACTGCAGGCACAGCAGGCCTAGGTCCTCCCACACCTGCCCCCTAATAAAGTGGGCGCGAGAGGAGGCTGCTGTGTGTTTCCTGCCCCAGCCTGGCTCCCTCGTTGCTGGGCTTTCGGGGCTGGCCAGTGGGGACAGTCAGGGACTGGAGAGGCAGGGCAGGGTGGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGAAGGGCAAGGTGCGAGGATGCTTGAGGCCAGGAGTTTGACACAGCCTGGGCAACACAGGGAGACCCCCATCTCTACTCAATAATAAAACAAATAGCCTGGCGTGGTGGCCCATGCATATAGTCCCAGCTACTTGTAAGGCTGAGGTGAGAGGACACTTGTGCCCAGGAGTGGAGGCTGCAGTGAGCTATGATCACGCCACTGCATTCCAGCCTGGATAACAGAGTGAGAACCTATCTCTAAAAATAAATAAATAAACGAAAAATAAA
配列番号３１  ＯＤＣ１をコードするＤＮＡ配列
GAAGCCGGGGGCGGGGGCCACGCGTGGGGCAGGCGGTGCTCGGCTCGGCTGACGTCGGCCCGCCGGCGCC
CCACCAGCTCCGCGCGGGCCCGGGTTGGCCACCGCCGGGCCCCCGCCCCTCCCCCGGCGGTGTCCCGGCC
GGAACCGATCGTGGCTGGTTTGAGCTGGTGCGTCTCCATGGCGACCCGCCGGTGCTATAAGTAGGGAGCG
GCGTGCCGTGGGGCTTTGTCAGTCCCTCCTGTAGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCCGCCCCTCTGCCAGCA
GCTCCGGCGCCACCTCGGGCCGGCGTCTCCGGCGGGCGGGAGCCAGGCGCTGACGGGCGCGGCGGGGGCG
GCCGAGCGCTCCTGCGGCTGCGACTCAGGCTCCGGCGTCTGCGCTTCCCCATGGGGCTGGCCTGCGGCGC
CTGGGCGCTCTGAGGTGAGGGACTCCCCGGCCGCGGAGGAAGGGAGGGAGCGAGGGCGGGAGCCGGGGCG
GGCTGCGGGCCCCGGGCCCCGGGCACGTGTGCGGCGCGCCTCGCCGGCCTGCGGAGACACGTGGTCGCCG
AGCGGGCCACGACCTTGAGGCGCCGCTTCCTCCCGGCCCGGGGTTCTCCCGCGGCTGGATAAGGGTGATC
CGGGCGCCTCGTTCTGCCCCCGTCTTCACAGCTCGGGGCTGGAGGGGCCTAGGGGAGACCCACCCGGAGA
CCCTGCGGCCCCGCGCCGGCCTCTTTCCCAACCCTTCGGCGGCCGCGCGCTGGCCGGGGAGCCGTTGGGG
AGGCCCTGGCGGCCGCGCAGCAGGTGCAGGGGCGCAGAGCCCGGGCTCGCCTTGGTACAGACGAGCGGGC
CCCGGCCTTGGCGCCTTCAGTTTCCTTCCAGTTTTTATTTTCGCTGTGTCTACAGAGCAGATGACACCAA
TTTGGAAACCCGCGAGAGTGGGTAGAGCTAAGATAGTCTTGCTGTAGTAGCTGTGATATTAGATGCTCGG
CCATGACTTAGAGGTGTTTATTTAAGGACTGTGAATGACTCGGTGATTTCGGAAAAGCTTGGCTTAGATG
AACGGACATACACAGGGGAGACAGCCCTAAGGTTTGCAGAAAAGGCTGATTGTGCTGTTTGCGAAGTCGA
AATAATTGGTGAAAGTGTAGAAGGCAGAACCTCTCAGGAATGTCTGGGGAGGACAAAGAATGTGTTGGCT
GACTTTGTTTAAACATAAAATTGGGCAGACTTTAATTGATTTGTGAAATTTTTTTCAAAGTTTGTTTGAA
TTAGCCCCTATCTCTTCTAACATTATCCTCTTGTGCTAATTGATTGACCATTTTAAATAACTTAGCTGTT
ACAGAAAGACCGAAAGGTGTTCTTCAGTAAAATATATTCAAGTAAGTTACTTAAGTAACGCCTTAAAAGA
TACAGAAAAGCAAAAAAGTATTGGCGTATTAAAAAGAAATCAAAACTTTCCAAGTTTAGGCCTGAACATT
GCCTTAAAAATATTTAATAAGGCCTCAAATGACCCAGTCCGAGACTGCATGAGCCTATTTATTATTAAAT
TGTAAATATTCTTCATATAAACAAAAATATATAACCATGTCTGTAACAAAAATGGTTTTGCTAGCGTTGT
TACTCTCTTCCCTTCTCCGAGGGGTGATTTAGGCAACTTCGGAGGTTGACAATGCCAAGCAGTCACAATA
GATAGAGCTTTAAAGCAAATTCTATGCATGGGTTTGGATTTATGACAGGCCCGTCACCCTGGGCCTGTCA
TAGTACCCCATGCCAGAGCAAACTGTGTCCCCGAACCATTGCCTGGCCTCTGTGCCCGTAGGCTGCTGGC
ACTGAAGTGGGTTGCACAGTGGAAAAGAAGAAAGCTCTACCTGGCAGAAATTTTTAAAGGTTAAAATAAA
TAATTTTAAGAAAGCTGGTTCACAAGGTGCCACATTTGATGAAAGCAAAATACAGTGGCTTTTATTGTTA
CTAGAGTGATGTTCTTGCTTGTTTTTCTTTTTTGGTGAAGTTAGCCCCAAATTATTCTCATAGCTAAGCA
AATACGAGAGTGACTGTAAGGACAGTTGGCATTCCCGGAATTGCTAAACTTGGTAGGCAACGCTGGTTTA
AGAATACTGAGTTCTAGCCGGGCGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAACACTTTGGGAGGCTGAGGCAG
GCGGATCACCTGAGGTCGGGAGTTGGAGACCAGCCTGACTAACATGGAGAAACGCCATCTCCACTAAAAA
TATAAAATTAGCCAGGCCCCGGGTGTGGTGGCACATGCCGGTAATCCCAGCTACTCGGGAGACTGAGGCA
GGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGAGGTGAGCCGAGATCATGCCATTGCACTCCAGCCTGG
GCAACAAGAGTAAAACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAATACTGAATTCTGATCAGGTAACAGCAAC
TGTAATACAATGTGATAAGTTGACTTGAAGATTACAGTTTTTAAGAAGTATATACCCAGCTAATACATGA
AAATTAACTCGTAAAATCTCAAATGCTCCAGACATTTCCATGATGCCTGTTGGTCAGTAAAAATCATTCT
AAGACTTAGTGGAAGTAGGAAATGTTTGTATGGCTGTGTATAAAGGCTATAATGTAATCCCAGCACTTTG
GAAGACCGAGGCGGGTGGATCACCTGGGGTCAGGAGTTTGAGACCCACCTGGACAACGTGGTGAAATCCT
GTCTCTACTAAAAACACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCAGGCGCCTGTAATCCCAGCTGCTGGGGAGG
CTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATTGCACCGCTGCACTC
CAGCCTGGGTGACAGCGTGAGACTCTGTCTCAAAAAAAATAAAAAAGTCTATAATGCTATTTTAAGTTTC
TAAGGAACTGAAACTGCTCTGAAATAAATCAGACCATTATAAGACTTTTTTCCATATCAGTGAGCTAAGT
GCAGATAAGCTTCTGAAACTTGCATGCTAGATTTTTTTGGTACAAATATTTGAAATGCTTAGTGTGCTGC
CTTGGAAAAACCTGGTATTTTTTGTTGTGTCCTTATACTGCCAAGGTTTATGGAATCATGTACCTTATGC
CTAGTAATAATTAGGATGACCAGGCCAGTGAGTGGTTCATATCCGGGGCATGATTAGCTCTGCGTGTGCT
CAGCCAGTGCCCCATCTTCAACTCGATGTGTTCCTAAGGTAGACAGCAAATTCCCTATTTTATTTCTCAG
ATTGTCACTGCTGTTCCAAGGGCACACGCAGAGGGATTTGGAATTCCTGGAGAGTTGCCTTTGTGAGAAG
CTGGAAATATTTCTTTCAATTCCATCTCTTAGTTTTCCATGTAAGTATTCAGTTTACATTTATGTTGCAG
GTTAATCTTAAGAATTGTATTGCTAAGGCTTCTAAGTGAATTTCTCCACTCTATTTGCATTTTGTTGCAT
TTCAGAGGAACATCAAGAAATCATGAACAACTTTGGTAATGAAGAGTTTGACTGCCACTTCCTCGATGAA
GGTTTTACTGCCAAGGACATTCTGGACCAGAAAATTAATGAAGTTTCTTCTTCTGTAAGTATATGAGGCC
CATGCTGGCAGTGCAGCTGAGAGTGCCAGGCAAGTGGAAAACTTTGGCAAGGTCTAAGGAAGAGCAATGA
GGCTTACATGTCTTGTTATGGAATGTAGAAATTAATTCACTGGTGGTAAATTAATAGTGATAATGGTGAT
ACTCATATCAGTGGCTAGACTCAAAAGAGCAGGATTCATTGTGACTGATGGGAATGAAGGTCGCTGGCTA
TTGGTGTGGTGTGTGGTGAGGCTGCTAGTGAGTCACCTGTGACCACTCTTGTTTCAGGATGATAAGGATG
CCTTCTATGTGGCAGACCTGGGAGACATTCTAAAGAAACATCTGAGGTGGTTAAAAGCTCTCCCTCGTGT
CACCCCCTTTTATGCAGTCAAATGTAATGATAGCAAAGCCATCGTGAAGACCCTTGCTGCTACCGGGACA
GGATTTGACTGTGCTAGCAAGGTAAGCGATAGCAGCAGGCCTCAAAAGCGTTGTATAAAATGGGCCTGGT
ATTCCCCACGAGGCAGATACAAGTTGTGTTTTTTGGGCAATAAATGCTCACTAAAGGCAAATGGGGCGGG
GGGGTACATGACAACTTCCCATGCTTTTCTGTTTATTCCACGTGTTAAGCCACATATGGATAGCATGACA
CCACTCTTCTTTTTCAGACTGAAATACAGTTGGTGCAGAGTCTGGGGGTGCCTCCAGAGAGGATTATCTA
TGCAAATCCTTGTAAACAAGTATCTCAAATTAAGTATGCTGCTAATAATGGAGTCCAGATGATGACTTTT
GATAGTGAAGTTGAGTTGATGAAAGTTGCCAGAGCACATCCCAAAGCAAAGTGAGTTATTCCCCCATCTG
AGGGCAAGATCGGGAGCATAAGATATGTGGATTCTTATCAAACAAACTTAAATTTCTGATTATTATATTT
CTATACTTTAGTAGAAAGTAGTTGAAACCCCCATTGAGTCATGAAGCCTGGGACTCAAACTACAGAATAT
ATCAGCGACAGTATTTAGAACAGGATTGTTTTTATTTTAATTGTGGCTATAAGTGAACATCTATCATGAG
ACATTTGCTGCACTTTCCTTGCTTGTAGGTTGGTTTTGCGGATTGCCACTGATGATTCCAAAGCAGTCTG
TCGTCTCAGTGTGAAATTCGGTGCCACGCTCAGAACCAGCAGGCTCCTTTTGGAACGGGCGAAAGAGCTA
AATATCGATGTTGTTGGTGTCAGGTGAGATTTTGGTGGGATAGCTAGAGGTCAAGACATTGAACAGTTTG
AGTTTTACAGGCTTTCTCCTAGTGTTTGCTATTATTTTAAGAAATACTAAGACACAGTGTCTCGTCTCTT
TATTTTACCCCAGCTTCCATGTAGGAAGCGGCTGTACCGATCCTGAGACCTTCGTGCAGGCAATCTCTGA
TGCCCGCTGTGTTTTTGACATGGGGGTGAGTATACGTGACCCTGTTAGGGAAGGGCGGGACACAACTGAC
AATAACTAGTCTTAATTCTAGAGTTAACTTTTTATGGCAGTTGGTTCTGTATTACATGGGTTTCAGCCTA
TCTGCTGCATACATTTTTGTTATTAGCTGTGGATCTGGCTGACTTATTTTCTTGATTCTAGGCTGAGGTT
GGTTTCAGCATGTATCTGCTTGATATTGGCGGTGGCTTTCCTGGATCTGAGGATGTGAAACTTAAATTTG
AAGAGGTAATTTAGAACAAAACTGTAATACTCAGTAGCCGTTCTAATAAATTCCTTTTTGGAATATTTCA
AAATTTAAGTGTCTTAACTAATACCACAATGGGCTGAAGTGTCTTGGTGTGATATTTTGAGTGATTTCTT
TGTGCTGTCTGACATTACACTTGATACCATTTGGTTTTCTAAAGTGTGAATCAGCTTTCCCAGAAGTCTT
GGATAATTGGTTACATTGGAAATCATGGCTCACACCTGTAATCCAGCACTTGGGGAGGCCAAGGTGGTAG
GATCACTTGAGCCCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGGCAACACAGTGAGACCCCATCTCTACAAAAAAAAT
TTTAAAATTAGCCTGGTGTGGTGGCGGGCACCTGTAATCCCAGCTACTTGGAAGGCTGAGGTGGGAGGAT
CACTTGAGCCCAGGAGGTTGAGGCTGCAGTGAGCCATGATCATGCCACTGCACTCAGCCTGGGCTACAGA
GTGAGACCCTGTCTCAAAAAAAAAAAAGAAAAAGCATGTTGCTGTGGGCTTCCTAGAGAATATGCTGACT
GTAGCACATCATCACCCCAAATGTGCTTTGCTAGACCTATGCTTCCTCTCCTTAAAATACTTGAAATGTT
TAGTCACTTAGGAAGTTAAGCCATTATATTGGTGCTTGAATTTATAAAATATATCCACATGGTTTGTTAA
AATCATGACGTAGGCAGAATAGGATTTTTATCCTGTTGGCATGTATTTGTTAAAATGTTTTGACATCTTG
ATGCCTTCCTAGGTAGTAGTTAGTTGCGTACTGTTCTTTGATAAAAATCATACCCATAACATCCTAAAGG
AGATAGGGTGCCTGGAGGGGAATGAAAACGAGCCACCTGGGATATGTAGCCTGGTTTTCAGGGAGATGTT
GATGTTTTTTTGCTTTTGTTACTTTAATGATAAACCTGTCTGTTGATGCCTGGTCTCATGATGTCATGTC
ACAAGGCCCTGTGATGTTACTCCCCCATGTGAATTTCCCACAATGAAGGCTGCTCTTTCTTTTCTGTTTC
ACTCTCTTAGATCACCGGCGTAATCAACCCAGCGTTGGACAAATACTTTCCGTCAGACTCTGGAGTGAGA
ATCATAGCTGAGCCCGGCAGATACTATGTTGCATCAGCTTTCACGCTTGCAGTTAATATCATTGCCAAGA
AAATTGTATTAAAGGAACAGACGGGCTCTGATGGTATGTATAAAGGACGAATCACTTCATGTATAACTGA
AAGCTGATGCAAAAAGTCATTAAGATTGTTGATCTGCCTTTCTAGACGAAGATGAGTCGAGTGAGCAGAC
CTTTATGTATTATGTGAATGATGGCGTCTATGGATCATTTAATTGCATACTCTATGACCACGCACATGTA
AAGCCCCTTCTGCAAAAGGTAATTTCTGAGCATACTGTATAAAACAATTAAGAGGACTGGTCACAACACG
TGTAATTAAGTAGTACTTCCTCTCTCCGTCTCTTTATATAGAGACCTAAACCAGATGAGAAGTATTATTC
ATCCAGCATATGGGGACCAACATGTGATGGCCTCGATCGGATTGTTGAGCGCTGTGACCTGCCTGAAATG
CATGTGGGTGATTGGATGCTCTTTGAAAACATGGGCGCTTACACTGTTGCTGCTGCCTCTACGTTCAATG
GCTTCCAGAGGCCGACGATCTACTATGTGATGTCAGGGCCTGCGTGGTAAGTAAGCCATGCATGTTGATG
GTGCTGCCAAGAATAGGCACCTTCTTGGATGTGTGCTTCTTGTCTAGACGAATAAGAAATTGTCTTGCCT
AAGATTAAATATATATGGATATTTTTCCTAAGAAAAGTTTTAGAAAAGACTGATGAGTGTATTTCTATGT
AATTGGAATATATTTAAGTTCATGCCATGTGTCTTGTGGTTTCCTTATTACCAAAACGGTGACTGAAGAA
ACGCTTGCTTTAGAAATACATTGAATTGGCCAGGTGTGCTGGCTCACACCTGAAATCACAACACATTGGG
AGGCCAAGGCAGAAGGATCACTTGAGCCCAGGAGTTCGAGCCTGGGCAACATAGTGAGACCCTGTCTCTA
CAAAAAATTAAAAAATTAGTTGGCCATGGTAGTGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTGCTTGGCTAAGGTGAGA
GGTTTGCTTGAGCCTGGGAGGTTGAGGCTGCGGTGAGCTATGATAGCACCATTGTATTCCAGCCTGAGTA
ACAGAGAAAGACCCTGTCTCAGAAAAAAAAAAAATACATTGAATTGTTTCCTGATGGGAAGTAAATACTC
TCATGCCCAGTTAGGAGTGAGTCAGGGTTTTTAATATGCCACTTTTTCTTTCTCAGGCAACTCATGCAGC
AATTCCAGAACCCCGACTTCCCACCCGAAGTAGAGGAACAGGATGCCAGCACCCTGCCTGTGTCTTGTGC
CTGGGAGAGTGGGATGAAACGCCACAGAGCAGCCTGTGCTTCGGCTAGTATTAATGTGTAGATAGCACTC
TGGTAGCTGTTAACTGCAAGTTTAGCTTGAATTAAGGGATTTGGGGGGACCATGTAACTTAATTACTGCT
AGTTTTGAAATGTCTTTGTAAGAGTAGGGTCGCCATGATGCAGCCATATGGAAGACTAGGATATGGGTCA
CACTTATCTGTGTTCCTATGGAAACTATTTGAATATTTGTTTTATATGGATTTTTATTCACTCTTCAGAC
ACGCTACTCAAGAGTGCCCCTCAGCTGCTGAACAAGCATTTGTAGCTTGTACAATGGCAGAATGGGCCAA
AAGCTTAGTGTTGTGACCTGTTTTTAAAATAAAGTATCTTGAAATAATTAGGCATTGGGACGTT
配列番号３２  ＡｒｇＧをコードするＤＮＡ配列
＞ＮＣ＿０００９１３．３：３３１８６３７−３３１９９８０大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株、完全ゲノム
ATGACGACGATTCTCAAGCATCTCCCGGTAGGTCAACGTATTGGTATCGCTTTTTCTGGCGGTCTGGACA
CCAGTGCCGCACTGCTGTGGATGCGACAAAAGGGAGCGGTTCCTTATGCATATACTGCAAACCTGGGCCA
GCCAGACGAAGAGGATTATGATGCGATCCCTCGTCGTGCCATGGAATACGGCGCGGAGAACGCACGTCTG
ATCGACTGCCGCAAACAACTGGTGGCCGAAGGTATTGCCGCTATTCAGTGTGGCGCATTTCATAACACCA
CCGGCGGCCTGACCTATTTCAACACGACGCCGCTGGGCCGCGCCGTGACTGGTACCATGCTGGTTGCTGC
GATGAAAGAAGATGGCGTGAATATCTGGGGTGACGGTAGCACCTACAAAGGAAACGATATCGAACGTTTC
TATCGTTATGGTCTGCTGACCAATGCTGAACTGCAGATTTACAAACCGTGGCTTGATACTGACTTTATTGATGAACTGGGCGGCCGTCATGAGATGTCTGAATTTATGATTGCCTGCGGTTTCGACTACAAAATGTCTGT
CGAAAAAGCCTACTCCACAGACTCCAACATGCTTGGTGCAACGCATGAAGCGAAGGATCTGGAATACCTC
AACTCCAGCGTCAAAATCGTCAACCCGATTATGGGCGTGAAATTCTGGGATGAGAGCGTGAAGATCCCGG
CAGAAGAAGTCACAGTACGCTTTGAACAAGGTCATCCGGTGGCGCTGAACGGTAAAACCTTTAGCGACGA
CGTAGAAATGATGCTGGAAGCTAACCGCATCGGCGGTCGTCACGGCCTGGGCATGAGCGACCAGATTGAA
AACCGTATCATCGAAGCGAAAAGCCGTGGTATTTACGAAGCTCCGGGGATGGCACTGCTGCACATTGCGT
ATGAACGCCTGTTGACCGGTATTCACAACGAAGACACCATTGAGCAGTATCACGCGCATGGTCGTCAGTT
GGGCCGTCTGCTGTACCAGGGGCGTTGGTTTGACTCCCAGGCGCTGATGCTGCGTGACTCTCTGCAACGC
TGGGTTGCCAGCCAGATCACTGGTGAAGTTACCCTGGAGCTGCGCCGTGGGAACGATTATTCAATCCTGA
ATACCGTCTCAGAGAACCTGACCTACAAGCCAGAGCGTCTGACGATGGAAAAAGGCGACTCGGTGTTCTC
GCCAGATGATCGTATTGGTCAATTGACCATGCGTAACCTGGATATCACTGATACCCGCGAGAAACTTTTC
GGTTATGCCAAAACTGGCCTGCTTTCCTCCTCTGCCGCTTCAGGCGTGCCGCAGGTGGAGAATCTGGAAA
ACAAAGGCCAGTAA
配列番号３３  ＡｒｇＨをコードするＤＮＡ配列
＞ＮＣ＿０００９１３．３：４１５６８５０−４１５８２２３大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株、完全ゲノム
ATGGCACTTTGGGGCGGGCGTTTTACCCAGGCAGCAGATCAACGGTTCAAACAATTCAACGACTCACTGCGCTTTGATTACCGTCTGGCGGAGCAGGATATTGTTGGCTCTGTGGCCTGGTCCAAAGCCCTGGTCACGGTAGGCGTGTTAACCGCAGAAGAGCAGGCGCAACTGGAAGAGGCGCTGAACGTGTTGCTGGAAGATGTTCGCGCCAGGCCACAACAAATCCTTGAAAGCGACGCCGAAGATATCCATAGCTGGGTGGAAGGCAAACTGATCGACAAAGTGGGCCAGTTAGGCAAAAAGCTGCATACCGGGCGTAGCCGTAATGATCAGGTAGCGACTGACCTGAAACTGTGGTGCAAAGATACCGTTAGCGAGTTACTGACGGCTAACCGGCAGCTGCAATCGGCGCTGGTGGAAACCGCACAAAACAATCAGGACGCGGTAATGCCAGGTTACACTCACCTGCAACGCGCCCAGCCGGTGACGTTCGCGCACTGGTGCCTGGCCTATGTTGAGATGCTGGCGCGTGATGAAAGCCGTTTGCAGGATGCGCTTAAGCGTCTGGATGTCAGCCCGCTAGGCTGTGGCGCGCTGGCGGGAACGGCCTATGAAATCGACCGTGAACAGTTAGCAGGCTGGCTGGGCTTTGCTTCGGCGACCCGTAACAGTCTCGACAGCGTTTCTGACCGTGACCATGTGTTGGAACTGCTTTCTGCTGCCGCTATCGGCATGGTGCATCTGTCGCGTTTTGCTGAAGATCTGATTTTCTTTAACACCGGCGAAGCGGGGTTTGTGGAGCTTTCTGACCGCGTGACTTCCGGTTCATCATTAATGCCGCAGAAGAAAAACCCGGATGCGCTGGAGCTGATTCGCGGTAAATGCGGCCGGGTGCAGGGGGCGTTAACCGGCATGATGATGACGCTGAAAGGTTTGCCGCTGGCTTACAACAAAGATATGCAGGAAGACAAAGAAGGTCTGTTCGACGCGCTCGATACCTGGCTGGACTGCCTGCATATGGCGGCGCTGGTGCTGGACGGCATTCAGGTGAAACGTCCACGTTGCCAGGAAGCGGCTCAGCAGGGTTACGCCAACGCCACCGAACTGGCGGATTATCTGGTGGCGAAAGGCGTACCGTTCCGCGAGGCGCACCATATTGTTGGTGAAGCGGTGGTGGAAGCCATTCGTCAGGGCAAACCGCTGGAAGATCTGCCGCTCAGTGAGTTGCAGAAATTCAGTCAGGTGATTGACGAAGATGTCTATCCGATTCTGTCGCTGCAATCGTGCCTCGACAAGCGTGCGGCAAAAGGCGGCGTCTCACCGCAGCAGGTGGCGCAGGCGATTGCTTTTGCGCAGGCTCGGTTAGGGTAA
配列番号３４  ＡｒｇＦをコードするＤＮＡ配列
＞ＮＣ＿０００９１３．３：ｃ２９０３０５−２８９３０１大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株、完全ゲノム
ATGTCCGATTTATACAAAAAACACTTTCTGAAACTGCTCGACTTTACCCCTGCACAGTTCACTTCTCTGCTGACCCTTGCCGCACAGCTCAAAGCCGATAAAAAAAATGGCAAGGAAGTACAGAAGCTTACCGGTAAAAACATCGCGCTCATCTTCGAAAAAGACTCGACTCGTACCCGTTGCTCTTTCGAAGTTGCCGCATTTGACCAGGGCGCGCGCGTTACCTATTTAGGGCCGAGCGGCAGCCAGATTGGGCATAAAGAGTCAATTAAGGACACCGCGCGGGTTCTCGGGCGGATGTATGACGGCATTCAGTATCGCGGTCACGGCCAGGAAGTGGTCGAAACGCT
GGCGCAGTATGCGGGCGTGCCGGTGTGGAACGGGCTGACCAACGAGTTCCACCCGACCCAGCTGCTGGCGGACCTGATGACCATGCAGGAGCACCTGCCGGGCAAGGCGTTTAACGAGATGACGCTGGTCTACGCGGGCGATGCGCGCAACAACATGGGCAACTCGATGCTGGAAGCGGCGGCGCTGACCGGGCTGGATCTGCGCCTGTTGGCCCCGAAAGCCTGCTGGCCGGAAGAGAGCCTGGTGGCGGAGTGCAGCGCGCTGGCGGAGAAGCACGGCGGGAAAATTACTCTGACGGAAGACGTGGCGGCAGGCGTTAAGGGCGCGGACTTTATCTATACCGACGTGTGGGTGTCGATGGGCGAGGCCAAAGAGAAGTGGGCAGAGCGGATTGCGCTGCTGCGCGGGTATCAGGTGAACGCGCAGATGATGGCGCTGACCGACAACCCGAACGTGAAGTTCCTGCACTGTCTGCCGGCGTTCCATGACGACCAGACTACGCTCGGCAAGCAGATGGCGAAGGAGTTCGATCTGCACGGCGGGATGGAGGTGACGGACGAGGTGTTTGAGTCGGCGGCGAGCATCGTGTTCGACCAGGCGGAAAACCGGATGCATACGATTAAGGCGGTGATGATGGCAACGCTTGGGGAGTGA
配列番号３５  Ｔｒｐ５をコードするＤＮＡ配列
＞ＮＣ＿００１１３９．９：ｃ４４８５３５−４４６４１２出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８ｃ染色体ＶＩＩ、完全配列
ATGTCAGAACAACTCAGACAAACATTTGCTAACGCTAAAAAAGAAAACAGGAACGCCTTGGTCACATTTATGACCGCAGGTTACCCAACAGTCAAAGACACTGTCCCTATTCTCAAGGGTTTCCAGGATGGTGGTGTAGATATCATCGAATTGGGTATGCCCTTCTCTGATCCAATTGCAGATGGTCCTACAATTCAATTATCTAATACTGTGGCTTTGCAAAACGGTGTTACCTTGCCTCAAACTCTAGAAATGGTCTCCCAAGCTAGAAATGAAGGTGTTACCGTACCCATAATCCTAATGGGTTACTATAACCCTATTCTAAACTACGGTGAAGAAAGATTTATTCAGGACGCTGCCAAGGCTGGTGCTAATGGTTTTATCATCGTCGATTTGCCACCAGAGGAGGCGTTGAAGGTCAGAAACTACATCAATGATAATGGTTTGAGCCTGATCCCACTAGTGGCTCCTTCTACCACCGACGAAAGATTGGAATTACTATCGCATATTGCCGATTCGTTTGTCTACGTTGTGTCTAGAATGGGTACTACTGGTGTTCAAAGTTCTGTGGCCAGTGATTTGGATGAACTCATCTCTAGAGTCAGAAAGTACACCAAGGATACTCCTTTGGCCGTTGGGTTTGGTGTCTCTACCAGAGAACATTTCCAATCAGTTGGTAGTGTTGCTGACGGTGTAGTGATTGGTTCCAAAATCGTCACATTATGTGGAGATGCTCCAGAGGGCAAAAGGTACGACGTTGCTAAGGAATATGTACAGGGAATTCTAAATGGTGCTAAGCATAAGGTTCTGTCCAAGGACGAATTCTTTGCCTTTCAAAAAGAGTCCTTGAAGTCCGCAAACGTTAAGAAGGAAATACTGGACGAATTTGATGAAAATCACAAGCACCCAATTAGATTTGGGGACTTTGGTGGTCAGTATGTCCCAGAAGCTCTTCATGCATGTCTAAGAGAGTTGGAAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCGCCGATCCCACATTCTGGGAAGACTTCAAATCCTTGTATTCTTATATTGGCCGTCCTTCTTCACTACACAAAGCTGAGAGATTAACTGAGCATTGTCAAGGTGCTCAAATCTGGTTGAAGAGAGAAGATCTTAACCACACGGGATCTCACAAGATCAACAATGCTTTAGCACAAGTTCTTCTAGCTAAAAGATTAGGCAAGAAGAACGTTATTGCTGAAACCGGTGCTGGTCAACACGGTGTTGCCACTGCCACTGCATGTGCTAAATTTGGCTTAACCTGTACTGTGTTCATGGGTGCAGAAGATGTTCGTCGCCAAGCTTTAAACGTCTTCAGAATGAGAATTCTCGGTGCTAAAGTAATTGCTGTTACTAATGGTACAAAGACTCTAAGAGACGCTACTTCAGAGGCATTCAGATTTTGGGTTACTAACTTGAAAACTACTTACTACGTCGTCGGTTCTGCCATTGGTCCTCACCCATATCCAACTTTGGTTAGAACTTTCCAAAGTGTCATTGGTAAAGAAACCAAGGAACAGTTTGCTGCCATGAACAATGGTAAATTACCTGACGCAGTTGTTGCATGTGTTGGGGGTGGTTCCAACTCTACAGGTATGTTTTCACCATTCGAGCATGATACTTCCGTTAAGTTATTGGGTGTGGAAGCCGGTGGTGATGGTGTAGATACAAAGTTCCACTCTGCTACTCTAACTGCCGGTAGACCTGGTGTCTTCCATGGTGTCAAGACTTATGTCTTGCAAGATAGTGATGGTCAAGTCCATGATACTCATTCTGTTTCTGCTGGGTTAGACTACCCAGGTGTCGGTCCAGAATTGGCATATTGGAAATCTACTGGCCGTGCTCAATTCATTGCAGCTACTGACGCTCAGGCTCTGCTTGGCTTTAAATTATTATCTCAATTAGAAGGTATTATTCCCGCTTTGGAATCTTCTCATGCTGTTTATGGCGCTTGCGAATTGGCTAAGACGATGAAGCCTGATCAACATTTGGTTATCAATATTTCTGGTAGAGGTGATAAAGATGTCCAAAGTGTCGCTGAAGTCTTGCCGAAATTAGGTCCAAAGATAGGTTGGGATTTGAGATTCGAAGAAGACCCATCTGCCTAA
配列番号３６  ＩＤＯをコードするＤＮＡ配列
＞ＮＣ＿００１１３９．９：ｃ４４８５３５−４４６４１２出芽酵母Ｓ２８８ｃ染色体ＶＩＩ、完全配列
＞ＮＣ＿００１１３９．９：ｃ４４８５３５−４４６４１２出芽酵母Ｓ２８８ｃ染色体ＶＩＩ、完全配列
ATGTCAGAACAACTCAGACAAACATTTGCTAACGCTAAAAAAGAAAACAGGAACGCCTTGGTCACATTTATGACCGCAGGTTACCCAACAGTCAAAGACACTGTCCCTATTCTCAAGGGTTTCCAGGATGGTGGTGTAGATATCATCGAATTGGGTATGCCCTTCTCTGATCCAATTGCAGATGGTCCTACAATTCAATTATCTAATACTGTGGCTTTGCAAAACGGTGTTACCTTGCCTCAAACTCTAGAAATGGTCTCCCAAGCTAGAAATGAAGGTGTTACCGTACCCATAATCCTAATGGGTTACTATAACCCTATTCTAAACTACGGTGAAGAAAGATTTATTCAGGACGCTGCCAAGGCTGGTGCTAATGGTTTTATCATCGTCGATTTGCCACCAGAGGAGGCGTTGAAGGTCAGAAACTACATCAATGATAATGGTTTGAGCCTGATCCCACTAGTGGCTCCTTCTACCACCGACGAAAGATTGGAATTACTATCGCATATTGCCGATTCGTTTGTCTACGTTGTGTCTAGAATGGGTACTACTGGTGTTCAAAGTTCTGTGGCCAGTGATTTGGATGAACTCATCTCTAGAGTCAGAAAGTACACCAAGGATACTCCTTTGGCCGTTGGGTTTGGTGTCTCTACCAGAGAACATTTCCAATCAGTTGGTAGTGTTGCTGACGGTGTAGTGATTGGTTCCAAAATCGTCACATTATGTGGAGATGCTCCAGAGGGCAAAAGGTACGACGTTGCTAAGGAATATGTACAGGGAATTCTAAATGGTGCTAAGCATAAGGTTCTGTCCAAGGACGAATTCTTTGCCTTTCAAAAAGAGTCCTTGAAGTCCGCAAACGTTAAGAAGGAAATACTGGACGAATTTGATGAAAATCACAAGCACCCAA
TTAGATTTGGGGACTTTGGTGGTCAGTATGTCCCAGAAGCTCTTCATGCATGTCTAAGAGAGTTGGAAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCGCCGATCCCACATTCTGGGAAGACTTCAAATCCTTGTATTCTTATATTGGCCGTCCTTCTTCACTACACAAAGCTGAGAGATTAACTGAGCATTGTCAAGGTGCTCAAATCTGGTTGAAGAGAGAAGATCTTAACCACACGGGATCTCACAAGATCAACAATGCTTTAGCACAAGTTCTTCTAGCTAAAAGATTAGGCAAGAAGAACGTTATTGCTGAAACCGGTGCTGGTCAACACGGTGTTGCCACTGCCACTGCATGTGCTAAATTTGGCTTAACCTGTACTGTGTTCATGGGTGCAGAAGATGTTCGTCGCCAAGCTTTAAACGTCTTCAGAATGAGAATTCTCGGTGCTAAAGTAATTGCTGTTACTAATGGTACAAAGACTCTAAGAGACGCTACTTCAGAGGCATTCAGATTTTGGGTTACTAACTTGAAAACTACTTACTACGTCGTCGGTTCTGCCATTGGTCCTCACCCATATCCAACTTTGGTTAGAACTTTCCAAAGTGTCATTGGTAAAGAAACCAAGGAACAGTTTGCTGCCATGAACAATGGTAAATTACCTGACGCAGTTGTTGCATGTGTTGGGGGTGGTTCCAACTCTACAGGTATGTTTTCACCATTCGAGCATGATACTTCCGTTAAGTTATTGGGTGTGGAAGCCGGTGGTGATGGTGTAGATACAAAGTTCCACTCTGCTACTCTAACTGCCGGTAGACCTGGTGTCTTCCATGGTGTCAAGACTTATGTCTTGCAAGATAGTGATGGTCAAGTCCATGATACTCATTCTGTTTCTGCTGGGTTAGACTACCCAGGTGTCGGTCCAGAATTGGCATATTGGAAATCTACTGGCCGTGCTCAATTCATTGCAGCTACTGACGCTCAGGCTCTGCTTGGCTTTAAATTATTATCTCAATTAGAAGGTATTATTCCCGCTTTGGAATCTTCTCATGCTGTTTATGGCGCTTGCGAATTGGCTAAGACGATGAAGCCTGATCAACATTTGGTTATCAATATTTCTGGTAGAGGTGATAAAGATGTCCAAAGTGTCGCTGAAGTCTTGCCGAAATTAGGTCCAAAGATAGGTTGGGATTTGAGATTCGAAGAAGACCCATCTGCCTAA
配列番号３７  ＭＰ７１ベクターを有さない例示的なＣＡＲ  ＧＤ２  ＡＳＳ１＋ＯＴＣをコードするＤＮＡ配列
ATGCCTCGCGGCTGGACAGCCCTGTGCCTGCTGTCTCTGCTGCCATCCGGCTTCATGAGCCTGGATAATAACGGCACAGCCACCCCAGAGCTGCCTACACAGGGCACCTTCAGCAATGTGTCCACAAACGTGAGCTATCAGGAGACCACAACCCCTTCTACCCTGGGATCCACAAGCCTGCACCCCGTGTCTCAGCACGGCAACGAAGCCACCACCAACATCACCGAGACCACAGTGAAGTTTACCTCCACCTCTGTGATTACCTCTGTGTACGGAAATACAAACTCCAGCGTGCAGTCTCAGACATCTGTGATCTCCACAGTGTTTACAACACCTGCCAATGTGTCCACCCCAGAGACAACCCTGAAGCCCAGCCTGTCTCCTGGAAATGTGTCCGATCTGTCTACCACCTCCACCAGCCTGGCCACCTCTCCCACCAAGCCCTATACCTCCTCTTCTCCCATCCTGAGCGATATCAAAGCCGAGATCAAATGCAGCGGGATTCGGGAAGTGAAACTGACACAGGGCATCTGCCTGGAACAGAATAAGACATCCAGCTGCGCCGAGTTTAAGAAAGATAGAGGAGAGGGACTGGCCAGGGTGCTGTGTGGCGAAGAGCAGGCCGACGCCGATGCCGGCGCCCAGGTGTGTTCCCTGCTGCTGGCCCAGTCTGAGGTGCGCCCCCAGTGCCTGCTGCTGGTGCTGGCCAATCGGACAGAAATTAGCAGCAAGCTGCAGCTGATGAAAAAACACCAGAGCGATCTGAAAAAGCTGGGCATCCTGGACTTTACCGAGCAGGACGTGGCCTCTCACCAGAGCTACAGCCAGAAAACACTGATCGCCCTGGTGACCAGCGGAGCCCTGCTGGCCGTGCTGGGCATCACCGGATATTTCCTGATGAATAGGCGCAGCTGGAGCCCCACCGGCGAACGGCTGGAGCTGGAGCCTGTCGACCGAGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGTCCAACCCCGGGCCAGGGAATATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGATATTCTGCTCACACAGACCCCACTCTCCCTGCCCGTGTCACTCGGGGATCAGGCTAGCATTTCTTGCCGCTCATCTCAGTCTCTGGTCCACCGGAATGGGAACACATACCTCCATTGGTACCTCCAGAAACCTGGACAGAGCCCTAAACTGCTCATCCACAAAGTCTCAAATCGGTTCTCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGGACCGACTTCACACTGAAAATCTCACGAGTGGAGGCTGAGGATCTCGGCGTCTACTTCTGTAGTCAGAGTACCCACGTCCCACCCCTCACCTTTGGCGCTGGAACAAAACTGGAGCTGAAACGAGCCGATGCTGCTCCTACCGTGTCCATCTTTCCTGGCTCCGGGGGAGGCGGGAGCGGAGGCGAAGTGAAACTCCAGCAGTCTGGCCCTTCTCTCGTGGAACCTGGCGCTTCTGTGATGATCTCCTGTAAGGCCTCTGGATCTTCCTTTACCGGCTACAACATGAACTGGGTCCGGCAGAACATTGGCAAATCCCTGGAATGGATTGGCGCCATCGATCCTTACTACGGCGGCACATCATACAATCAGAAATTCAAGGGGCGAGCAACACTCACTGTCGACAAATCTTCATCCACCGCCTACATGCACCTGAAATCTCTCACATCCGAGGATAGTGCTGTCTACTACTGTGTCTCTGGCATGGAATACTGGGGACAGGGAACTTCTGTCACCGTGTCTAGTGCCAAAACCACACCTCCCTCCGTGTACGGACGAGTCACTGTCTCATCTGCTGAACCAAAATCCTGTGACAAAACACACACATGCCCACCTTGTCCTGCCCCTGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTCTTTCTGTTTCCCCCCAAACCCAAGGATACACTCATGATTTCTAGGACCCCCGAAGTCACTTGTGTCGTGGTCGATGTGTCTCACGAGGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGAGTCGAGGTCCACAATGCCAAAACAAAACCCCGGGAGGAACAGTACAATAGCACCTACCGAGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGTAAAGTGAGTAACAAGGCTCTCCCCGCTCCTATTGAAAAAACCATCTCAAAAGCAAAAGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCCTCACGGGACGAACTCACCAAAAATCAGGTGTCCCTCACTTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCTGTGGAATGGGAGTCAAATGGGCAGCCCGAAAACAACTACAAAACAACCCCCCCTGTGCTCGATTCCGATGGCTCTTTTTTCCTGTACTCCAAACTCACCGTGGACAAATCACGCTGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAATCATTACACCCAGAAATCCCTCTCACTCTCACCCGGCAAAAAGGACCCTAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAAAACCCTGGCCCCATGTCCAGCAAAGGCTCCGTGGTTCTGGCCTACAGTGGCGGCCTGGACACCTCGTGCATCCTCGTGTGGCTGAAGGAACAAGGCTATGACGTCATTGCCTATCTGGCCAACATTGGCCAGAAGGAAGACTTCGAGGAAGCCAGGAAGAAGGCACTGAAACTTGGGGCCAAAAAGGTGTTCATTGAGGATGTCAGCAGGGAGTTTGTGGAGGAGTTCATCTGGCCGGCCATCCAGTCCAGCGCACTGTATGAGGACCGCTACCTCCTGGGCACCTCTCTTGCCAGGCCCTGCATCGCCCGCAAACAAGTGGAAATCGCCCAGCGGGAGGGGGCCAAGTATGTGTCCCACGGCGCCACAGGAAAGGGGAACGATCAGGTCCGGTTTGAGCTCAGCTGCTACTCACTGGCCCCCCAGATAAAGGTCATTGCTCCCTGGAGGATGCCTGAATTCTACAACCGGTTCAAGGGCCGCAATGACCTGATGGAGTACGCAAAGCAACACGGGATTCCCATCCCGGTCACTCCCAAGAACCCGTGGAGCATGGATGAGAACCTCATGCACATCAGCTACGAGGCTGGAATCCTGGAGAACCCCAAGAACCAAGCGCCTCCAGGTCTCTACACGAAGACCCAGGACCCAGCCAAAGCCCCCAACACCCCTGACATTCTCGAGATCGAGTTCAAAAAAGGGGTCCCTGTGAAGGTGACCAACGTCAAGGATGGCACCACCCACCAGACCTCCTTGGAGCTCTTCATGTACCTGAACGAAGTCGCGGGCAAGCATGGCGTGGGCCGTATTGACATCGTGGAGAACCGCTTCATTGGAATGAAGTCCCGAGGTATCTACGAGACCCCAGCAGGCACCATCCTTTACCATGCTCATTTAGACATCGAGGCCTTCACCATGGACCGGGAAGTGCGCAAAATCAAACAAGGCCTGGGCTTGAAATTTGCTGAGCTGGTGTATACCGGTTTCTGGCACAGCCCTGAGTGTGAATTTGTCCGCCACTGCATCGCCAAGTCCCAGGAGCGAGTGGAAGGGAAAGTGCAGGTGTCCGTCCTCAAGGGCCAGGTGTACATCCTCGGCCGGGAGTCCCCACTGTCTCTCTACAATGAGGAGCTGGTGAGCATGAACGTGCAGGGTGATTATGAGCCAACTGATGCCACCGGGTTCATCAACATCAATTCCCTCAGGCTGAAGGAATATCATCGTCTCCAGAGCAAGGTCACTGCCAAAGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGCTGTTTAATCTGAGGATCCTGTTAAACAATGCAGCTTTTAGAAATGGTCACAACTTCATGGTTCGAAATTTTCGGTGTGGACAACCACTACAAAATAAAGTGCAGCTGAAGGGCCGTGACCTTCTCACTCTAAAAAACTTTACCGGAGAAGAAATTAAATATATGCTATGGCTATCAGCAGATCTGAAATTTAGGATAAAACAGAAAGGAGAGTATTTGCCTTTATTGCAAGGGAAGTCCTTAGGCATGATTTTTGAGAAAAGAAGTACTCGAACAAGATTGTCTACAGAAACAGGCTTAGCACTTCTGGGAGGACATCCTTGTTTTCTTACCACACAAGATATTCATTTGGGTGTGAATGAAAGTCTCACGGACACGGCCCGTGTATTGTCTAGCATGGCAGATGCAGTATTGGCTCGAGTGTATAAACAATCAGATTTGGACACCCTGGCTAAAGAAGCATCCATCCCAATTATCAATGGGCTGTCAGATTTGTACCATCCTATCCAGATCCTGGCTGATTACCTCACGCTCCAGGAACACTATAGCTCTCTGAAAGGTCTTACCCTCAGCTGGATCGGGGATGGGAACAATATCCTGCACTCCATCATGATGAGCGCAGCGAAATTCGGAATGCACCTTCAGGCAGCTACTCCAAAGGGTTATGAGCCGGATGCTAGTGTAACCAAGTTGGCAGAGCAGTATGCCAAAGAGAATGGTACCAAGCTGTTGCTGACAAATGATCCATTGGAAGCAGCGCATGGAGGCAATGTATTAATTACAGACACTTGGATAAGCATGGGACAAGAAGAGGAGAAGAAAAAGCGGCTCCAGGCTTTCCAAGGTTACCAGGTTACAATGAAGACTGCTAAAGTTGCTGCCTCTGACTGGACATTTTTACACTGCTTGCCCAGAAAGCCAGAAGAAGTGGATGATGAAGTCTTTTATTCTCCTCGATCACTAGTGTTCCCAGAGGCAGAAAACAGAAAGTGGACAATCATGGCTGTCATGGTGTCCCTGCTGACAGATTACTCACCTCAGCTCCAGAAGCCTAAATTTTAA
配列番号３８  ＭＰ７１ベクターを有さないＧＤ２  ＡＳＳ１の例示的なＣＡＲをコードするＤＮＡ配列
ATGCCTCGCGGCTGGACAGCCCTGTGCCTGCTGTCTCTGCTGCCATCCGGCTTCATGAGCCTGGATAATAACGGCACAGCCACCCCAGAGCTGCCTACACAGGGCACCTTCAGCAATGTGTCCACAAACGTGAGCTATCAGGAGACCACAACCCCTTCTACCCTGGGATCCACAAGCCTGCACCCCGTGTCTCAGCACGGCAACGAAGCCACCACCAACATCACCGAGACCACAGTGAAGTTTACCTCCACCTCTGTGATTACCTCTGTGTACGGAAATACAAACTCCAGCGTGCAGTCTCAGACATCTGTGATCTCCACAGTGTTTACAACACCTGCCAATGTGTCCACCCCAGAGACAACCCTGAAGCCCAGCCTGTCTCCTGGAAATGTGTCCGATCTGTCTACCACCTCCACCAGCCTGGCCACCTCTCCCACCAAGCCCTATACCTCCTCTTCTCCCATCCTGAGCGATATCAAAGCCGAGATCAAATGCAGCGGGATTCGGGAAGTGAAACTGACACAGGGCATCTGCCTGGAACAGAATAAGACATCCAGCTGCGCCGAGTTTAAGAAAGATAGAGGAGAGGGACTGGCCAGGGTGCTGTGTGGCGAAGAGCAGGCCGACGCCGATGCCGGCGCCCAGGTGTGTTCCCTGCTGCTGGCCCAGTCTGAGGTGCGCCCCCAGTGCCTGCTGCTGGTGCTGGCCAATCGGACAGAAATTAGCAGCAAGCTGCAGCTGATGAAAAAACACCAGAGCGATCTGAAAAAGCTGGGCATCCTGGACTTTACCGAGCAGGACGTGGCCTCTCACCAGAGCTACAGCCAGAAAACACTGATCGCCCTGGTGACCAGCGGAGCCCTGCTGGCCGTGCTGGGCATCACCGGATATTTCCTGATGAATAGGCGCAGCTGGAGCCCCACCGGCGAACGGCTGGAGCTGGAGCCTGTCGACCGAGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGTCCAACCCCGGGCCAGGGAATATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGATATTCTGCTCACACAGACCCCACTCTCCCTGCCCGTGTCACTCGGGGATCAGGCTAGCATTTCTTGCCGCTCATCTCAGTCTCTGGTCCACCGGAATGGGAACACATACCTCCATTGGTACCTCCAGAAACCTGGACAGAGCCCTAAACTGCTCATCCACAAAGTCTCAAATCGGTTCTCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGGACCGACTTCACACTGAAAATCTCACGAGTGGAGGCTGAGGATCTCGGCGTCTACTTCTGTAGTCAGAGTACCCACGTCCCACCCCTCACCTTTGGCGCTGGAACAAAACTGGAGCTGAAACGAGCCGATGCTGCTCCTACCGTGTCCATCTTTCCTGGCTCCGGGGGAGGCGGGAGCGGAGGCGAAGTGAAACTCCAGCAGTCTGGCCCTTCTCTCGTGGAACCTGGCGCTTCTGTGATGATCTCCTGTAAGGCCTCTGGATCTTCCTTTACCGGCTACAACATGAACTGGGTCCGGCAGAACATTGGCAAATCCCTGGAATGGATTGGCGCCATCGATCCTTACTACGGCGGCACATCATACAATCAGAAATTCAAGGGGCGAGCAACACTCACTGTCGACAAATCTTCATCCACCGCCTACATGCACCTGAAATCTCTCACATCCGAGGATAGTGCTGTCTACTACTGTGTCTCTGGCATGGAATACTGGGGACAGGGAACTTCTGTCACCGTGTCTAGTGCCAAAACCACACCTCCCTCCGTGTACGGACGAGTCACTGTCTCATCTGCTGAACCAAAATCCTGTGACAAAACACACACATGCCCACCTTGTCCTGCCCCTGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTCTTTCTGTTTCCCCCCAAACCCAAGGATACACTCATGATTTCTAGGACCCCCGAAGTCACTTGTGTCGTGGTCGATGTGTCTCACGAGGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGAGTCGAGGTCCACAATGCCAAAACAAAACCCCGGGAGGAACAGTACAATAGCACCTACCGAGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGTAAAGTGAGTAACAAGGCTCTCCCCGCTCCTATTGAAAAAACCATCTCAAAAGCAAAAGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCCTCACGGGACGAACTCACCAAAAATCAGGTGTCCCTCACTTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCTGTGGAATGGGAGTCAAATGGGCAGCCCGAAAACAACTACAAAACAACCCCCCCTGTGCTCGATTCCGATGGCTCTTTTTTCCTGTACTCCAAACTCACCGTGGACAAATCACGCTGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAATCATTACACCCAGAAATCCCTCTCACTCTCACCCGGCAAAAAGGACCCTAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAAAACCCTGGCCCCATGTCCAGCAAAGGCTCCGTGGTTCTGGCCTACAGTGGCGGCCTGGACACCTCGTGCATCCTCGTGTGGCTGAAGGAACAAGGCTATGACGTCATTGCCTATCTGGCCAACATTGGCCAGAAGGAAGACTTCGAGGAAGCCAGGAAGAAGGCACTGAAACTTGGGGCCAAAAAGGTGTTCATTGAGGATGTCAGCAGGGAGTTTGTGGAGGAGTTCATCTGGCCGGCCATCCAGTCCAGCGCACTGTATGAGGACCGCTACCTCCTGGGCACCTCTCTTGCCAGGCCCTGCATCGCCCGCAAACAAGTGGAAATCGCCCAGCGGGAGGGGGCCAAGTATGTGTCCCACGGCGCCACAGGAAAGGGGAACGATCAGGTCCGGTTTGAGCTCAGCTGCTACTCACTGGCCCCCCAGATAAAGGTCATTGCTCCCTGGAGGATGCCTGAATTCTACAACCGGTTCAAGGGCCGCAATGACCTGATGGAGTACGCAAAGCAACACGGGATTCCCATCCCGGTCACTCCCAAGAACCCGTGGAGCATGGATGAGAACCTCATGCACATCAGCTACGAGGCTGGAATCCTGGAGAACCCCAAGAACCAAGCGCCTCCAGGTCTCTACACGAAGACCCAGGACCCAGCCAAAGCCCCCAACACCCCTGACATTCTCGAGATCGAGTTCAAAAAAGGGGTCCCTGTGAAGGTGACCAACGTCAAGGATGGCACCACCCACCAGACCTCCTTGGAGCTCTTCATGTACCTGAACGAAGTCGCGGGCAAGCATGGCGTGGGCCGTATTGACATCGTGGAGAACCGCTTCATTGGAATGAAGTCCCGAGGTATCTACGAGACCCCAGCAGGCACCATCCTTTACCATGCTCATTTAGACATCGAGGCCTTCACCATGGACCGGGAAGTGCGCAAAATCAAACAAGGCCTGGGCTTGAAATTTGCTGAGCTGGTGTATACCGGTTTCTGGCACAGCCCTGAGTGTGAATTTGTCCGCCACTGCATCGCCAAGTCCCAGGAGCGAGTGGAAGGGAAAGTGCAGGTGTCCGTCCTCAAGGGCCAGGTGTACATCCTCGGCCGGGAGTCCCCACTGTCTCTCTACAATGAGGAGCTGGTGAGCATGAACGTGCAGGGTGATTATGAGCCAACTGATGCCACCGGGTTCATCAACATCAATTCCCTCAGGCTGAAGGAATATCATCGTCTCCAGAGCAAGGTCACTGCCAAATAA
配列番号３９  ＭＰ７１ベクターを有さないＧＤ２  ＯＴＣの例示的なＣＡＲをコードするＤＮＡ配列
ATGCCTCGCGGCTGGACAGCCCTGTGCCTGCTGTCTCTGCTGCCATCCGGCTTCATGAGCCTGGATAATAACGGCACAGCCACCCCAGAGCTGCCTACACAGGGCACCTTCAGCAATGTGTCCACAAACGTGAGCTATCAGGAGACCACAACCCCTTCTACCCTGGGATCCACAAGCCTGCACCCCGTGTCTCAGCACGGCAACGAAGCCACCACCAACATCACCGAGACCACAGTGAAGTTTACCTCCACCTCTGTGATTACCTCTGTGTACGGAAATACAAACTCCAGCGTGCAGTCTCAGACATCTGTGATCTCCACAGTGTTTACAACACCTGCCAATGTGTCCACCCCAGAGACAACCCTGAAGCCCAGCCTGTCTCCTGGAAATGTGTCCGATCTGTCTACCACCTCCACCAGCCTGGCCACCTCTCCCACCAAGCCCTATACCTCCTCTTCTCCCATCCTGAGCGATATCAAAGCCGAGATCAAATGCAGCGGGATTCGGGAAGTGAAACTGACACAGGGCATCTGCCTGGAACAGAATAAGACATCCAGCTGCGCCGAGTTTAAGAAAGATAGAGGAGAGGGACTGGCCAGGGTGCTGTGTGGCGAAGAGCAGGCCGACGCCGATGCCGGCGCCCAGGTGTGTTCCCTGCTGCTGGCCCAGTCTGAGGTGCGCCCCCAGTGCCTGCTGCTGGTGCTGGCCAATCGGACAGAAATTAGCAGCAAGCTGCAGCTGATGAAAAAACACCAGAGCGATCTGAAAAAGCTGGGCATCCTGGACTTTACCGAGCAGGACGTGGCCTCTCACCAGAGCTACAGCCAGAAAACACTGATCGCCCTGGTGACCAGCGGAGCCCTGCTGGCCGTGCTGGGCATCACCGGATATTTCCTGATGAATAGGCGCAGCTGGAGCCCCACCGGCGAACGGCTGGAGCTGGAGCCTGTCGACCGAGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGTCCAACCCCGGGCCAGGGAATATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGATATTCTGCTCACACAGACCCCACTCTCCCTGCCCGTGTCACTCGGGGATCAGGCTAGCATTTCTTGCCGCTCATCTCAGTCTCTGGTCCACCGGAATGGGAACACATACCTCCATTGGTACCTCCAGAAACCTGGACAGAGCCCTAAACTGCTCATCCACAAAGTCTCAAATCGGTTCTCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGGACCGACTTCACACTGAAAATCTCACGAGTGGAGGCTGAGGATCTCGGCGTCTACTTCTGTAGTCAGAGTACCCACGTCCCACCCCTCACCTTTGGCGCTGGAACAAAACTGGAGCTGAAACGAGCCGATGCTGCTCCTACCGTGTCCATCTTTCCTGGCTCCGGGGGAGGCGGGAGCGGAGGCGAAGTGAAACTCCAGCAGTCTGGCCCTTCTCTCGTGGAACCTGGCGCTTCTGTGATGATCTCCTGTAAGGCCTCTGGATCTTCCTTTACCGGCTACAACATGAACTGGGTCCGGCAGAACATTGGCAAATCCCTGGAATGGATTGGCGCCATCGATCCTTACTACGGCGGCACATCATACAATCAGAAATTCAAGGGGCGAGCAACACTCACTGTCGACAAATCTTCATCCACCGCCTACATGCACCTGAAATCTCTCACATCCGAGGATAGTGCTGTCTACTACTGTGTCTCTGGCATGGAATACTGGGGACAGGGAACTTCTGTCACCGTGTCTAGTGCCAAAACCACACCTCCCTCCGTGTACGGACGAGTCACTGTCTCATCTGCTGAACCAAAATCCTGTGACAAAACACACACATGCCCACCTTGTCCTGCCCCTGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTCTTTCTGTTTCCCCCCAAACCCAAGGATACACTCATGATTTCTAGGACCCCCGAAGTCACTTGTGTCGTGGTCGATGTGTCTCACGAGGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGAGTCGAGGTCCACAATGCCAAAACAAAACCCCGGGAGGAACAGTACAATAGCACCTACCGAGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTCCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGTAAAGTGAGTAACAAGGCTCTCCCCGCTCCTATTGAAAAAACCATCTCAAAAGCAAAAGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCCTCACGGGACGAACTCACCAAAAATCAGGTGTCCCTCACTTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCTGTGGAATGGGAGTCAAATGGGCAGCCCGAAAACAACTACAAAACAACCCCCCCTGTGCTCGATTCCGATGGCTCTTTTTTCCTGTACTCCAAACTCACCGTGGACAAATCACGCTGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAATCATTACACCCAGAAATCCCTCTCACTCTCACCCGGCAAAAAGGACCCTAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCTCGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAAAACCCTGGCCCCATGCTGTTTAATCTGAGGATCCTGTTAAACAATGCAGCTTTTAGAAATGGTCACAACTTCATGGTTCGAAATTTTCGGTGTGGACAACCACTACAAAATAAAGTGCAGCTGAAGGGCCGTGACCTTCTCACTCTAAAAAACTTTACCGGAGAAGAAATTAAATATATGCTATGGCTATCAGCAGATCTGAAATTTAGGATAAAACAGAAAGGAGAGTATTTGCCTTTATTGCAAGGGAAGTCCTTAGGCATGATTTTTGAGAAAAGAAGTACTCGAACAAGATTGTCTACAGAAACAGGCTTAGCACTTCTGGGAGGACATCCTTGTTTTCTTACCACACAAGATATTCATTTGGGTGTGAATGAAAGTCTCACGGACACGGCCCGTGTATTGTCTAGCATGGCAGATGCAGTATTGGCTCGAGTGTATAAACAATCAGATTTGGACACCCTGGCTAAAGAAGCATCCATCCCAATTATCAATGGGCTGTCAGATTTGTACCATCCTATCCAGATCCTGGCTGATTACCTCACGCTCCAGGAACACTATAGCTCTCTGAAAGGTCTTACCCTCAGCTGGATCGGGGATGGGAACAATATCCTGCACTCCATCATGATGAGCGCAGCGAAATTCGGAATGCACCTTCAGGCAGCTACTCCAAAGGGTTATGAGCCGGATGCTAGTGTAACCAAGTTGGCAGAGCAGTATGCCAAAGAGAATGGTACCAAGCTGTTGCTGACAAATGATCCATTGGAAGCAGCGCATGGAGGCAATGTATTAATTACAGACACTTGGATAAGCATGGGACAAGAAGAGGAGAAGAAAAAGCGGCTCCAGGCTTTCCAAGGTTACCAGGTTACAATGAAGACTGCTAAAGTTGCTGCCTCTGACTGGACATTTTTACACTGCTTGCCCAGAAAGCCAGAAGAAGTGGATGATGAAGTCTTTTATTCTCCTCGATCACTAGTGTTCCCAGAGGCAGAAAACAGAAAGTGGACAATCATGGCTGTCATGGTGTCCCTGCTGACAGATTACTCACCTCAGCTCCAGAAGCCTAAATTTTAA
配列番号４０  代替的なＣＤ３ｚ
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
配列番号４１  代替的なＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分（ＭＲ１抗体に由来するＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ配列）をコードするＤＮＡ
atggactggatttggcgcatccttttccttgtcggcgctgctaccggcgcgcattctcaggtacaactccagcagtctgggggaggcttagtgaagcctggagcgtctctgaaactctcctgtgtaacctctggattcactttcagaaaatttggcatgtcttgggttcgccagactagtgacaagaggctggaatgggtcgcatccattagtactggcggttataacacgtactattcagacaatgtaaagggccgattcaccatctccagagagaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagtagtctgaagtctgaggacacggccttgtattactgtacaagaggctattctagtacctcttatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaagtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatcgagctcactcagtctccagcatccctgtccgtggctacaggagaaaaagtcactatcagatgcatgaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccagcagaagccaggggaaccccctaagttccttatttcagaaggcaatactcttcggccgggagtcccatcccgattttccagcagtggcactggcacagattttgtttttacaattgaaaacacactctcggaagatgttggagattactactgtttgcaaagctttaacgtgcctcttacattcggtgatggcaccaagcttgaaaaagctcta
配列番号４２  ＡＳＳ−１ドメインを含むＥＧＦＲｖＩＩＩの例示的なＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号４１によってコードされる代替的なＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分を採用）
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPMDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAK
配列番号４３  ＯＴＣドメインを含むＥＧＦＲｖＩＩＩの例示的なＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号４１によってコードされる代替的なＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分を採用）
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPMDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
配列番号４４  ＡＳＳ−１ドメインおよびＯＴＣドメインを含むＥＧＦＲｖＩＩＩの例示的なＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号４１によってコードされる代替的なＥＧＦＲｖＩＩＩ標的結合部分を採用）
MPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRRSWSPTGERLELEPVDRVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPGNMALPVTALLLPLALLLHAARPMDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSKGSVVLAYSGGLDTSCILVWLKEQGYDVIAYLANIGQKEDFEEARKKALKLGAKKVFIEDVSREFVEEFIWPAIQSSALYEDRYLLGTSLARPCIARKQVEIAQREGAKYVSHGATGKGNDQVRFELSCYSLAPQIKVIAPWRMPEFYNRFKGRNDLMEYAKQHGIPIPVTPKNPWSMDENLMHISYEAGILENPKNQAPPGLYTKTQDPAKAPNTPDILEIEFKKGVPVKVTNVKDGTTHQTSLELFMYLNEVAGKHGVGRIDIVENRFIGMKSRGIYETPAGTILYHAHLDIEAFTMDREVRKIKQGLGLKFAELVYTGFWHSPECEFVRHCIAKSQERVEGKVQVSVLKGQVYILGRESPLSLYNEELVSMNVQGDYEPTDATGFININSLRLKEYHRLQSKVTAKGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGLALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF
【図１】
2021507716.tif 000004
【図２】
2021507716.tif 000005
【図３】
2021507716.tif 000006
【図４】
2021507716.tif 000007
【図５】
2021507716.tif 000008
【図６】
2021507716.tif 000009
【図７】
2021507716.tif 000010
【図８】
2021507716.tif 000011
【図９】
2021507716.tif 000012
【図１０】
2021507716.tif 000013
【図１１】
2021507716.tif 000014
【図１２】
2021507716.tif 000015
【図１３】
2021507716.tif 000016
【図１４−１】
2021507716.tif 000017
【図１４−２】
2021507716.tif 000018
【配列表】
2021507716000001.app
【国際調査報告】
2021507716.tif 000019
2021507716.tif 000020