(57)【要約】  本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）治療薬であって、ＥＶが、例えばｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、環状ＲＮＡ、及び／またはＤＮＡ分子などの核酸（ＮＡ）ベース治療薬を含む、細胞外小胞（ＥＶ）治療薬に関係する。ＮＡ治療薬は、ＥＶ内への装填を強化し標的細胞内部でＮＡカーゴ分子の放出を容易にするための発明的なタンパク質及びＮＡ操作戦略を用いて、ＥＶ内に装填される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの核酸（ＮＡ）結合ドメインと少なくとも１つのエクソソームポリペプチドとを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記少なくとも１つのＮＡ結合ドメインが、ＰＵＦ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、及び／またはＮＡアプタマー結合ドメインのうちの１つ以上である、細胞外小胞（ＥＶ）。
【請求項２】
少なくとも１つのＮＡカーゴ分子をさらに含む、請求項１に記載のＥＶ。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＮＡカーゴ分子が、前記融合ポリペプチドの助けにより前記ＥＶ内に輸送される、請求項２に記載のＥＶ。
【請求項４】
前記ＮＡカーゴ分子が、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、リボザイム、ミニサークルＤＮＡ、及び／またはプラスミドＤＮＡを含む群から選択される、請求項２〜３のいずれか１項に記載のＥＶ。
【請求項５】
各ＮＡカーゴ分子が、（ｉ）ＮＡ結合ドメインのための少なくとも１つの結合部位と、（ｉｉ）治療ポリヌクレオチドドメインとを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載のＥＶ。
【請求項６】
前記ＮＡカーゴ分子が、前記少なくとも１つの結合部位と前記治療ポリヌクレオチドドメインとの間に切断部位を含む、請求項５に記載のＥＶ。
【請求項７】
前記ＮＡカーゴ分子が治療ポリペプチドをコードする、請求項２〜６のいずれか１項に記載のＥＶ。
【請求項８】
前記治療ポリペプチドが、抗体、細胞内抗体、１本鎖可変断片、アフィボディ、酵素、トランスポーター、腫瘍抑制物質、ウイルスまたは細菌阻害物質、細胞構成要素タンパク質、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害物質、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害物質及び誘導物質、毒素、構造タンパク質、神経栄養因子、膜トランスポーター、ヌクレオチド結合タンパク質、ヒートショックタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ならびにこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項７に記載のＥＶ。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、ＮＡ結合ドメインがＮ及び／またはＣ末端側に隣接する少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含み、かつ／または前記少なくとも１つのＮＡ結合ドメインが前記エクソソームポリペプチドの配列内に挿入される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＥＶ。
【請求項１０】
前記エクソソームポリペプチドが、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、ＡＡＲＤＣ１、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ構成要素、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、その他のエクソソームポリペプチド、及びこれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＥＶ。
【請求項１１】
少なくとも１つの標的化部分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＥＶ。
【請求項１２】
前記ＮＡカーゴ分子が、直線状である、環状化されている、かつ／または任意の２次構造及び／もしくは３次構造及び／もしくはその他の構造を有する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載のＥＶ。
【請求項１３】
前記ＮＡカーゴ分子が以下のうちの１つ以上を含む、請求項２〜１２のいずれか１項に記載のＥＶ：
（ｉ）任意選択で組織及び／もしくは細胞タイプ特異的である、ｍｉＲＮＡ結合のための部位、
（ｉｉ）少なくとも１つの安定化ドメイン、例えばポリＡテールもしくはステムループ、または
（ｉｉｉ）５′及び／もしくは３′末端にある少なくとも１つのハイブリッドＵＴＲ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＥＶの集団。
【請求項１５】
ＥＶの前記集団全体におけるＥＶ当たりのＮＡカーゴ分子の平均数がＥＶ当たり１個超である、請求項１４に記載の集団。
【請求項１６】
前記集団が少なくとも２つのサブ集団を含み、
第１のＥＶサブ集団がＥＶ当たり平均で融合ポリペプチド１個超を含み、
第２のＥＶサブ集団が、問題とされる前記ＮＡカーゴ分子を、ＥＶ当たり平均で融合ポリペプチド１個超と組み合わせて含む、
請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の集団。
【請求項１７】
全てのＥＶのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及び／または少なくとも９５％が少なくとも１つのＮＡカーゴ分子を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の集団。
【請求項１８】
少なくとも１つのＮＡ結合ドメインと少なくとも１つのエクソソームポリペプチドとを含む融合ポリペプチドを含むポリペプチドコンストラクトであって、前記少なくとも１つのＮＡ結合ドメインが、ＰＵＦ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、及び／またはＮＡアプタマー結合ドメインのうちの１つ以上である、ポリペプチドコンストラクト。
【請求項１９】
以下のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１８に記載のポリペプチドコンストラクト：
（ｉ）少なくとも１つの多量体化ドメイン、
（ｉｉ）少なくとも１つのリンカー、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの放出ドメイン、例えばインテイン、
（ｉｖ）少なくとも１つのＲＮＡ切断ドメイン、
（ｖ）少なくとも１つのエンドソームエスケープ部分、及び／または
（ｖｉ）少なくとも１つの標的化部分。
【請求項２０】
請求項１８〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチドコンストラクトをコードする、ポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドが、本質的に直線状である、環状化されている、かつ／または任意の２次構造及び／もしくは３次構造及び／もしくはより高次の構造を有する、かつ／またはベクター（例えば、プラスミド、環状ＤＮＡポリヌクレオチド、ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、及び／もしくはミニサークル）に含まれている、請求項２０に記載のポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＥＶを生成する方法であって、
（ｉ）ＥＶ生成細胞に、請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクトを導入することと、
（ｉｉ）前記ＥＶ生成細胞内で、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされた少なくとも１つのポリペプチドコンストラクトを発現させて前記ＥＶを産生することと
を含む、方法。
【請求項２３】
（ｉ）請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクト、及び／または（ｉｉ）請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドコンストラクト、及び／または（ｉｉｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＥＶを含む、細胞。
【請求項２４】
モノクローナル細胞及び／またはモノクローナル細胞株である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチドコンストラクトをコードする少なくとも１つのモノシストロン性、バイシストロン性、またはマルチシストロン性のポリヌクレオチドコンストラクトと、少なくとも１つのＮＡカーゴ分子とを含むように安定的に修飾される、請求項２３〜２４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２６】
少なくとも１つのＲＮＡカーゴ分子の細胞内送達のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、標的細胞を、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＥＶ、及び／または請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＥＶ集団、及び／または請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクトに接触させることを含む、方法。
【請求項２７】
（ｉ）請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクト、（ｉｉ）請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドコンストラクト、（ｉｉｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＥＶ、（ｉｖ）請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞、及び／または（ｖ）請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＥＶ集団と、医薬的に許容される賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２８】
医薬分野で使用するための、（ｉ）請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクト、（ｉｉ）請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドコンストラクト、（ｉｉｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＥＶ、（ｉｖ）請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの細胞、（ｖ）請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＥＶ集団、または（ｖｉ）請求項２７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）治療薬であって、ＥＶが、内在的に装填されたＲＮＡ治療薬（例えば、ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び様々な他のＲＮＡ治療剤）を含む、細胞外小胞（ＥＶ）治療薬に関係する。
【背景技術】
【０００２】
核酸ベース治療薬は、急速なペースで臨床的有用性に近づいている。遺伝子療法、ｍＲＮＡベース療法、短いオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡベース治療薬は、ＲＮＡ治療薬ランドスケープ内における有り余るモダリティーのうちのいくつかの例に過ぎない。裸の核酸（典型的にはＲＮＡ）は、急速なクリアランス、ヌクレアーゼ活性、臓器特異的分布の欠如、及び細胞取込みの低い有効性によりｉｎ  ｖｉｖｏ送達が困難であり、特化された送達ビヒクルは、通常、生体活性送達を達成する手段として必須である。これは特に、非肝臓標的や高分子量ＲＮＡ治療薬（例えば、ｍＲＮＡ及び遺伝子療法）の場合に該当する。
【０００３】
細胞外小胞（例えば、エクソソーム）は、典型的には、ほとんどの細胞タイプによって生成されるナノメートルサイズの小胞であり、細胞間のタンパク質、核酸、ペプチド、脂質、及びその他の様々な分子のための身体の天然輸送システムとして機能している。ＲＮＡ含有ＥＶは複数の治療的用法を可能性として有し、既に、遺伝子療法、ｍＲＮＡ送達、及び様々な状況下での短い核酸の送達のための送達ビヒクルとして研究が行われている。ＷＯ２０１０／１１９２５６は、エクソソームを用いた核酸送達の分野における基礎的な発明に相当し、当該出願は、いくつかのタイプの核酸カーゴの送達におけるエクソソームの有用性を教示している。公開されていない出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５１４７９は、親細胞内で形成されるＥＶ内に目的ＲＮＡを引っ張り込むＲＮＡ結合タンパク質の助けによって様々なタイプのＲＮＡ治療薬を内在的に装填するための改良された方法を教示している。ＵＳ１４／５０２，４９４は、いわゆる標的化及びモジュールエクソソーム装填（ＴＡＭＥＬ：Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ａｎｄ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ）システムを利用して、あるいくつかのＲＮＡ種の装填にＲＮＡ結合タンパク質を利用するための別の方法を説明している。
【０００４】
しかし、このような進歩にもかかわらず、特異的かつ効率的な方式での大小ＲＮＡカーゴのＥＶ内装填は、依然として重大な改善の余地が存在する。さらに、標的細胞内への実際の生体活性送達はいかなる送達システムにおいてもキーとなる局面であり、従来技術はこの点においても改善の余地を有する。
【０００５】
ＵＳ１４／５０２，４９４に記載のＴＡＭＥＬ装填システム及び対応する参考文献（Ｈｕｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ２０１６，５：３１０２７）は複数の難点を有しており、本発明はこれを克服しようと試みている。ＴＡＭＥＬシステムの主な難点は、ｍＲＮＡの機能的送達を達成できないことである。すなわち、ＴＡＭＥＬシステムによってエクソソーム内に装填されたｍＲＮＡは、細胞がこのエクソソームに曝露されたとき、細胞によって翻訳されない。本出願は、カーゴｍＲＮＡの生体活性送達を達成する。
Ｔｕｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ（Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＳ２  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１８  Ｊａｎ；１５（１）：８１−８９）は、ＲＮＡ局在化及びライフサイクルを研究するためのＭＳ２タンパク質の使用について論じており、ＴＡＭＥＬシステムが使用するＭＳ２タンパク質がＲＮＡに対し非常に高い親和性で結合することを示している。当該論文は、この緊密な結合がｍＲＮＡ制御の研究にとって問題になると報告している。ＭＳ２の緊密な結合は、装填されたいかなるＲＮＡ／核酸も放出されないことを意味するため、発明者らは、ＥＶ装填の文脈ではこの高親和性結合もまた問題になると推測している。ｍＲＮＡ放出が妨げられると正常な翻訳が妨げられるであろうことは、ＵＳ１４／５０２，４９４でｍＲＮＡの翻訳が観察されていない理由を説明すると考えられる。
【０００６】
ＴＡＭＥＬシステムは全てのエクソソームに核酸を装填するわけではないように思われる。また、装填されるエクソソームにも非常に少数の核酸が装填されるに過ぎない（この可変かつ低いレベルの装填の難点については以下で詳細に論じられる）。この可変かつ低いレベルの装填は、装填される非常に少ない核酸が今度は放出される可能性が低く、そのため生体活性ではないという事実と合わせると、ＴＡＭＥＬシステムが多くの難点を有することを意味する。ＴＡＭＥＬシステムは、臨床的に意義のある量の生体活性の核酸を装填し送達するのに好適ではない。本発明はこれらの重大な難点を克服する。
ＴＡＭＥＬシステムのもう１つの難点は、生成されたＥＶが患者に送達されるときに望ましくない免疫学的応答を誘発する恐れのあるバクテリオファージタンパク質を用いていることである。本発明はこの難点も克服する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／１１９２５６
【特許文献２】ＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５１４７９
【特許文献３】ＵＳ１４／５０２，４９４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｕｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ２０１６，５：３１０２７
【非特許文献２】Ｔｕｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ（Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＳ２  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１８  Ｊａｎ；１５（１）：８１−８９）
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、標的細胞内への核酸（ＮＡ）ベース治療薬の装填とその後のＥＶ媒介送達とに関連する上記で特定された問題を克服すること、及び当技術分野における既存のニーズを満たすこと（例えば、問題とされるＮＡ治療剤と共に適切な細胞内区画に到達するのを可能にすること）である。
【００１０】
本発明は、ＮＡカーゴを装填及び放出するための新規のＥＶ操作技術を利用することにより、これを達成する。これは、ＥＮ内への効率性の高い装填だけでなく問題とされるＮＡの有効な放出も確実にするポリペプチド及びポリヌクレオチドコンストラクトの高度な操作によって達成される。第１の態様において、これは、少なくとも１つの核酸（ＮＡ）結合ドメインと少なくとも１つのエクソソームポリペプチドとを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む細胞外小胞（ＥＶ）であって、少なくとも１つのＮＡ結合ドメインが、Ｐｕｍｉｌｉｏ及びＦＢＦ相同タンパク質（ＰＵＦ）、Ｃａｓ６、ならびに／もしくはＮＡアプタマー結合ドメイン、またはこれらの任意の派生物及び／もしくはドメイン及び／もしくは類似体のうちの１つ以上である、細胞外小胞（ＥＶ）を提供することにより達成される。ＮＡ結合ドメインはいくつかのコピー内に有利に存在し得、各ＮＡカーゴ分子も複数のコピー内に存在し得、このときあらゆるコピーはＮＡ結合ドメインに対する複数の結合部位を有する。重要なことには、融合ポリペプチドの一部を形成しＮＡカーゴ分子との相互作用を担うＮＡ結合ドメインは放出可能なＮＡ結合ドメインであり、このことはＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との結合が可逆的で放出可能な相互作用であることを意味する。発明者らは、ＥＶ生成細胞内でのＮＡカーゴ分子の過剰発現が、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との相互作用を可能にするための十分に高い局所濃度をもたらし、一方で標的位置内（例えば、標的細胞内部）のＮＡ結合分子の濃度が低いとＮＡ分子の効率的な放出が可能になり、これがＮＡ分子の生体活性送達を可能にすることを理解した。そのため、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との間の結合が放出可能な性質であることは特に有利である。
【００１１】
本発明は、発明性を有する融合ポリペプチドコンストラクト自体にも関連し、さらにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトにも関連する。さらに、本発明は、問題とされるポリペプチドコンストラクトをコードするポリヌクレオチドコンストラクトに関連し、加えて安定性及び効力強化のために操作されたＮＡカーゴポリヌクレオチドにも関連する。
【００１２】
追加の態様において、本発明は、融合ポリペプチドコンストラクト及びＮＡカーゴ分子を含むＥＶ集団、さらにＥＶ、ＥＶ集団、ポリヌクレオチド及び／もしくはポリペプチドのコンストラクトの医薬組成物、ならびに／または上記の生体マクロ分子のいずれかを含有する細胞及び／もしくはその他のベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、ＨＳＶ、ＲＳＶなどのようなウイルス）に関連する。
【００１３】
また別の態様において、本発明は、本発明に従うＥＶを生成するための方法に関連する。このような方法は、少なくとも、（ｉ）ＥＶ生成細胞内に、少なくとも１つの好適なポリヌクレオチドコンストラクトを導入するステップと、（ｉｉ）ＥＶ生成細胞内で、少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされた少なくとも１つのポリペプチドコンストラクトを発現させるステップと、（ｉｉｉ）ＥＶ生成細胞から、ステップ（ｉｉ）経由で取得可能なポリペプチドを含むＥＶを収集するステップとを含み得る。さらに、本発明は、少なくとも１つのＲＮＡカーゴ分子の細胞内送達のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、標的細胞（典型的には標的細胞集団）を少なくとも１つのＥＶ及び／または少なくとも１つのＥＶ集団に接触させることを含む、方法にも関連する。
【００１４】
要約すると、本発明は、多数のＮＡ治療薬カーゴのＥＶ媒介送達のための新規の装填及び放出の戦略を提供する。有利なことには、本発明は、真核生物間でいずれも高度に保持されるタンパク質を使用するため、患者に送達されたときに有害な免疫応答を引き起こす可能性が低い。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に従う融合ポリペプチドコンストラクトを用いてＮＡカーゴ分子が装填されたＥＶの概略図。
【図２】エクソソームポリペプチドとしてのＣＤ６３とＮＡ結合ドメインとしてのＰＵＦ（本件ではＮＡ結合ＰＵＦドメインをヒトＰＵＭ１タンパク質から取得）またはＣａｓ６とを含む融合ポリペプチドコンストラクトを用いた、ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）及びｐ２１をコードするｍＲＮＡカーゴ分子のＭＳＣ由来ＥＶ内への装填を示すグラフ。当該実験は、ＮＡ結合ドメインに対する様々な数の結合部位、すなわち０、３、及び６つの結合部位も含んだ。エクソソームポリペプチドＣＤ６３のみの発現は、いかなるｍＲＮＡのＥＶ内への装填ももたらさなかった（右）。ＰＵＦを含む融合ポリペプチド（左のカラムセット：ＣＤ６３のＮ末端側及びＣ末端側の両方に隣接する２つのＰＵＦドメイン、すなわち合計４つのＰＵＦコンストラクト）（左から２番目のカラムセット：ＣＤ６３のＮ末端側及びＣ末端側の両方に隣接する１つのＰＵＦドメイン）ならびに変異Ｃａｓ６（右から２番目）は、ＥＶ供給源細胞内での発現の際に、ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）及びｐ２１  ｍＲＮＡの両方の著しいｍＲＮＡ装填をもたらした。ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）の装填は総じてｐ２１の装填よりも効率的であり、ＥＶ当たり最大およそ４５コピーが装填された。
【図３】ｓｈＲＮＡ標的化ハンチンチンのＥＶ媒介送達の際の標的細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏの遺伝子発現のサイレンシング。羊膜細胞を操作して、ｓｈＲＮＡと、ＮＡ結合ドメインとしてのＰＵＦ（ヒトＰＵＭタンパク質から取得）またはＣａｓ６を、ＥＶポリペプチドとしてのＣＤ６３またはＣＤ８１と合わせて含む融合ポリペプチドコンストラクトとを発現させた。細胞培養物からＡＥ−ＥＶを収集し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの標的細胞に添加した。Ｙ軸は、どのようにハンチンチン発現レベルがＮＡカーゴ分子内の結合部位数の増加に伴って減少しているかを示しており、抗ハンチンチンｓｈＲＮＡに装填するためのＰＵＦ−ＣＤ６３−ＰＵＦを含む融合ポリペプチドを用いておよそ８０％ノックダウンがもたらされた。
【図４】ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）ｍＲＮＡをＨＥＫ  ＥＶ媒介送達した後の標的Ｈｕｈ７細胞におけるレポーターシステムとしてのＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）の発現。ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）ｍＲＮＡカーゴ分子を操作して、融合ポリペプチドコンストラクトを構成するＮＡ結合ドメイン（本件ではＰＵＦｘ２−ＣＤ６３−ＰＵＦｘ２（エクソソームポリペプチドＣＤ６３のＮ末端側及びＣ末端側の両方に挿入された２つのＰＵＦ  ＮＡ−結合ポリペプチド）、ＰＵＦ−ＣＤ６３−ＰＵＦ、及びＣａｓ６−ＣＤ９−Ｃａｓ６）に対する０、３、または６つの結合部位を含むようにした。Ｙ軸はタンパク質μｇに対し正規化した相対光（発光）単位（ＲＬＵ）を示しており、これにより結合部位の数の増加に伴う送達及び／または翻訳の強化が示される。ヒトＰＵＭ１に加えてＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＰｕｍｉｌｉｏタンパク質から取得したＮＡ結合ＰＵＦも本アッセイで評価した。
【図５】配列番号１〜６の配列。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＮＡカーゴを生体活性様式で標的細胞内にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏで導入及び送達するための新規の操作アプローチを用いた、ＥＶ送達ＮＡ治療薬の装填の改善、放出の調節、及び有効性の強化に関連する。
【００１７】
便宜及び明快性のため、本明細書で用いられるあるいくつかの用語を集め、以下に記載する。別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００１８】
本発明の特色、態様、実施形態、または代替形態がマルクーシュグループの観点で記載されている場合、当業者は、本発明がその記載により、マルクーシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点でも記載されているものと認識するであろう。当業者はさらに、本発明がその記載により、マルクーシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの任意の組合せの観点でも記載されているものと認識するであろう。加えて、本発明の態様及び／または実施形態のうちの１つに関して記載されている実施形態及び特色は、本発明の他の全ての態様及び／または実施形態にも必要な変更を加えて適用されることに留意されたい。例えば、ＥＶに関して本明細書に記載されている融合ポリペプチドは、本明細書における他の全ての態様、教示、及び実施形態、例えば、ＥＶを生成するための方法もしくはＥＶに関する態様及び／もしくは実施形態、または本明細書に記載の対応するポリヌクレオチドコンストラクトに関連する態様及び／もしくは実施形態に関して開示され、関連し、かつ適合すると理解されるべきである。さらに、あるいくつかの態様に関して記載されているあるいくつかの実施形態、例えば、融合ポリペプチド及び任意選択でＮＡ薬物カーゴ分子を含むＥＶの投与経路は、あるいくつかの医学的症状の治療に関係する態様に対し記載されるように、当然ながら、医薬組成物に関係する態様及び／または実施形態のような他の態様及び／または実施形態に関しても該当し得る。さらに、本明細書で同定されている全てのポリペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドを融合させる従来的戦略を用いて、融合タンパク質内で自由に組み合わせることができる。非限定的な例として、本明細書に記載の（ポリペプチド由来の）ＮＡ結合ドメインは、１つ以上のエクソソームポリペプチドとの任意の組合せで自由に組み合わせることができ、任意選択で、本明細書における他の全てのポリペプチドドメイン、領域、配列、ペプチド、基、例えば、任意の多量体化ドメイン、放出ドメイン、及び／または標的化ペプチドと組み合わせることができる。また、エクソソームポリペプチド及び／またはＮＡ結合ドメインも互いに組み合わせて、２つ以上のエクソソームポリペプチド及び／または２つ以上のＮＡ結合ドメインを含むコンストラクトを産生することができる。さらに、あらゆる特色（例えば、マルクーシュグループのあらゆるメンバー）はあらゆる他の特色（例えば、他の任意のマルクーシュグループのあらゆるメンバー）と自由に組み合わせることができ、例えば、任意のＮＡ結合ドメインは任意のエクソソームポリペプチドと組み合わせることができる。さらに、本明細書の教示がＥＶに対し単数形で、及び／または個別的な天然のナノ粒子様小胞として言及する場合、全てのこのような教示は複数のＥＶ及びＥＶ集団にも同様に該当し適用可能であると理解されるべきである。一般論として、本発明に従うＮＡ結合ドメイン、エクソソームポリペプチド、ＥＶ生成細胞供給源、追加のドメイン及びペプチド、ＮＡカーゴ分子、ならびに他の全ての態様、実施形態、及び代替形態は、本発明の範囲及び骨子の逸脱を伴わないあらゆる可能な組合せで自由に組み合わせることができる。さらに、本発明の任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの配列（それぞれアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列）は、任意の所与の分子が本発明に関連する所望の技術的効果を実行する能力を保持する限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び配列からある程度逸脱してもよい。本出願に従うポリペプチド及び／またはポリヌクレオチド配列は、その生物学的特性が維持される限り、ネイティブ配列と比較して（例えば、ＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いた計算で）５０％逸脱してもよいが、可能な限り高い配列同一性が好ましい（例えば、６０％、７０％、８０％、または例えば９０％以上）。（例えば、いくつかのポリペプチドの）組合せ（融合）は、それぞれのポリペプチドのあるいくつかのセグメントが置換及び／もしくは修飾され得ること、ならびに／または配列が他のアミノ酸の連なりの挿入によって中断され得ることを含意し、これは、キーとなる特性（例えば、ＮＡ結合、ＥＶ内へのトラフィッキング、標的化能力など）が保存されている限り、ネイティブ配列からの逸脱は考慮に入れるべきであり得ることを意味する。したがって、同様の推論はこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にも当然ながら適用される。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質に関して本明細書で述べられる任意のアクセッション番号または配列番号は単に例及び参考としてみなされるものとし、全てのペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質には、当業者が理解するような通常の意味が与えられるものとする。したがって、上述のように、当業者は、本発明が本明細書で言及される特定の配列番号及び／またはアクセッション番号のみを包含するだけではなく、それらのバリアント及び派生物も包含することも理解するであろう。本明細書で言及される全てのアクセッション番号はＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号であり、本明細書で述べられる全てのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、当業者が理解する従来的な意味に従って解釈されるものとする。
【００１９】
「細胞外小胞」もしくは「ＥＶ」または「エクソソーム」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の形態の細胞から取得可能な任意のタイプの小胞、例えば、微小胞（例えば、細胞の形質膜からもたらされる小胞）、エクソソーム（例えば、エンドリソソーム経路から誘導される小胞）、（例えば、アポトーシス細胞から取得可能な）アポトーシス体、（例えば、血小板から誘導される）微粒子、（例えば、血清中の好中球及び単球から誘導可能な）エクソソーム、（例えば、前立腺癌細胞から取得可能な）プロスタトソーム、または（例えば、心臓細胞から誘導可能な）カルジオソームなどに関連するものと理解されたい。ＥＶのサイズは相当程度に変動し得るが、典型的にはＥＶはナノサイズの流体力学的直径、すなわち１０００ｎｍ未満の直径を有する。明らかに、ＥＶはｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの任意の細胞タイプから誘導することができる。好ましいＥＶとしては、エクソソーム及び微小胞が挙げられるが、他のＥＶも様々な状況下で有利であり得る。さらに、当該用語は、細胞外小胞模倣物や細胞膜ベース小胞（例えば、膜の押出、超音波処理、またはその他の技法を介し取得可能）などにも関連するように理解するものとする。ＥＶの医学的及び科学的な使用及び応用先について記載する場合、本発明が通常、複数のＥＶ、すなわち千、万、億単位のＥＶ、または兆単位ものＥＶを含み得るＥＶ集団に関連することは当業者には明らかであろう。後述の実験セクションから分かるように、ＥＶは、例えば、体積単位当たり（例えば、ｍｌ当たり）１０５、１０８、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１８、１０２５、１０３０個（しばしば「粒子」と称される）、またはこれより大きい、小さい、もしくはこれらの間にある他の任意の数字の濃度で存在し得る。同じように、「集団」という用語は、例えば、エクソソームポリペプチドとＮＡ結合ドメイン（ひいては目的ＮＡカーゴ分子に結合し得る）との間のある融合ポリペプチドを含むＥＶに関連する場合があるが、当該用語は、このような集団を構成する複数の実体を包含するように理解するものとする。言い換えれば、個々のＥＶは、複数で存在する場合、ＥＶ集団を構成する。したがって、当然ながら本発明は、当業者には明らかであろうように、個々のＥＶ及びＥＶを含む集団の両方に関係する。ｉｎ  ｖｉｖｏで適用する場合のＥＶの薬用量は、当然ながら、治療対象となる疾患、投与経路、治療活性、効果、ＮＡカーゴ分子の効力、ＥＶ上に存在する任意の標的化部分、医薬製剤などに応じて相当程度に変動し得る。さらに、本発明のＥＶは、ＮＡカーゴ分子に加えて追加の治療剤も含むことができる。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は少なくとも１つの治療小分子薬物であり得る。いくつかの実施形態において、治療小分子薬物は、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ合成を阻害する薬剤、微小管及びチューブリン結合剤、代謝拮抗物質、酸化損傷誘導物質、抗血管新生物質、内分泌療法、抗エストロゲン、免疫調節物質（例えば、トール様受容体アゴニストまたはアンタゴニスト）、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質、シグナル伝達阻害物質（例えば、キナーゼ阻害物���）、ヒートショックタンパク質阻害物質、レチノイド、成長因子受容体阻害物質、抗有糸分裂化合物、抗炎症物質、細胞周期制御物質、転写因子阻害物質、及びアポトーシス誘導物質、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択することができる。さらなる実施形態において、追加の治療剤は追加の治療核酸ベース薬剤であり得る。このような追加の核酸ベース治療剤は、１本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ、ｓｉＲＮＡのようなオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド鎖、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド、プラスミド、または他の任意のＲＮＡもしくはＤＮＡベクターを含む群から選択することができる。特に関心対象となるのは、化学的に合成された核酸ベース薬剤、及び／または化学的に修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、２’−Ｆ、２’−ＣＥ、２’−ＥＡ  ２’−ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ、ｔｒｉｃｙｃｌｏ−ＤＮＡなど）を含む核酸ベース薬剤である。またさらなる実施形態において、本発明に従うＥＶは、タンパク質及び／またはペプチドであり得る追加の治療剤を含むことができる。このようなタンパク質及び／またはペプチドは、ＥＶの内部に存在する場合もあれば、ＥＶ膜内に挿入されるかもしくはＥＶ膜に付随する場合もあり、またはＥＶから小胞外環境に突出している場合もある。このような治療タンパク質及び／またはペプチド薬剤は、以下を含めた非限定的な例の群から選択され得る：抗体、細胞内抗体、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、アフィボディ、二重及び多重特異性抗体または結合物質、アフィボディ、ｄａｒｐｉｎ、受容体、リガンド、酵素（例えば、酵素置換え療法または遺伝子編集のための酵素）、腫瘍抑制物質（非限定的な例としてはｐ５３、ｐ２１、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、及び／またはＳＴ１５が挙げられる）、ウイルスまたは細菌阻害物質、細胞構成要素タンパク質、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害物質、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害物質及び誘導物質、毒素（例えば、シュードモナス外毒素）、構造タンパク質、神経栄養因子（例えば、ＮＴ３／４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ならびに神経成長因子（ＮＧＦ）及びその個々のサブユニット（例えば、２．５Ｓベータサブユニット）、イオンチャネル、膜トランスポーター、プロテオスタシス因子、細胞シグナリングに関与するタンパク質、翻訳及び転写関連タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、タンパク質結合タンパク質、脂質結合タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びＧＡＧ結合タンパク質、代謝タンパク質、細胞ストレス制御タンパク質、炎症及び免疫システム制御タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、ならびにヒートショックタンパク質など。
【００２０】
「エクソソームポリペプチド」、「エクソソームタンパク質」、「エクソソーム担体タンパク質」、「ＥＶタンパク質」、及び「ＥＶポリペプチド」という用語は本明細書では互換的に使用され、これらの用語は、ポリペプチドコンストラクト（典型的には、エクソソームポリペプチドに加えて、ＮＡ結合ドメイン、例えば、ＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドを含む）を好適な小胞構造まで、すなわち好適なＥＶまで輸送するのに利用することができる任意のポリペプチドに関連するものと理解されたい。より具体的には、これらの用語は、融合タンパク質コンストラクトの小胞構造（例えば、ＥＶ）までの輸送、トラフィッキング、また移送を可能にする任意のポリペプチドを含むものとして理解されたい。このようなエクソソームポリペプチドの例としては、例えば、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体としても知られる）及びそのエンドソーム選別ドメイン、すなわちトランスフェリン受容体エンドソーム選別ドメイン、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８（シンデカン−１）、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、ＡＡＲＤＣ１、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体（例えば、ＴＮＦＲ及びｇｐ１３０）、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ構成要素、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＴＳＧ１０１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、その他のエクソソームポリペプチド、ならびにこれらの任意の組合せまたは誘導体があるが、ポリペプチドコンストラクトをＥＶに輸送可能な多くの他のポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも１つのエクソソームポリペプチドは、ＮＡカーゴ分子の装填を助けるためのＥＶ内に存在する融合タンパク質を形成するために、ＮＡ結合ドメインと融合している。このような融合タンパク質は、自らの機能（１つまたは複数）を最適化するための他の様々な構成要素も含むことができ、これにはリンカー、膜貫通ドメイン、細胞基質ドメイン、多量体化ドメインなどが含まれる。
【００２１】
「ＮＡ結合ドメイン」または「ＮＡ結合ポリペプチド」または「ＮＡ結合タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ヌクレオチドの連なりと結合可能な任意のドメインに関連する。ＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡのミックスマー、特定のタイプのＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、リボザイム、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなどと結合することができる。さらに、ＮＡ結合ドメイン（１つまたは複数）は、化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、２’−Ｆ、２’−ＣＥ、２’−ＥＡ  ２’−ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエート、トリシクロＤＮＡなどにも結合することができる。さらに、ＮＡ結合ドメインは、ＮＡの特定の配列、リピートなどのドメイン、またはＮＡモチーフ（例えば、ステムループもしくはヘアピン）にも結合することができる。ＮＡ結合ドメインのためのこのような結合部位は、ＮＡカーゴ分子内に天然に存在してもよく、かつ／またはＮＡカーゴ分子内で操作されてＥＶ装填及び生体活性送達をさらに強化してもよい。ＮＡ結合ドメインの核酸に対する結合親和性は、核酸が十分に高い親和性でエクソソームに移送され、ただし次に続く、核酸が標的細胞に送達されたときに生体活性であるようにするための核酸の標的細胞内への放出を妨げるほどには高くないようにする。したがって、重要かつ従来技術と完全に対照的であることには、本発明は、放出可能なＮＡ結合ドメインの助けによりＮＡカーゴ分子が装填されたＥＶであって、当該ＮＡ結合ドメインがエクソソームポリペプチドと共に融合ポリペプチドの一部を形成する、ＥＶに関連する。本発明のＮＡ結合ドメインは、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との間のプログラム可能で修飾可能な親和性を可能にし、ＮＡ結合ドメインと少なくとも１つのＮＡカーゴ分子とを含む融合ポリペプチドを含むＥＶの生成を可能にするように選択されており、このとき、融合ポリペプチドコンストラクトのＮＡ結合ドメインは、プログラム可能で可逆的で修飾可能な様式でＮＡカーゴ分子と相互作用し、ＥＶ内への装填と、ＥＶ内で及び／または標的細胞に関してのＮＡカーゴ分子の放出との両方を可能にする。これは、ＭＳ２タンパク質を用いて単にｍＲＮＡ分子のエクソソーム内への装填を可能にし、ただしＭＳ２タンパク質はｍＲＮＡに結合したままであり、その放出及び次に続く翻訳を阻害している先行技術とは完全に対照的である。
【００２２】
本発明は主に、３つの群のＮＡ結合ドメイン、すなわち、ＰＵＦタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド（Ｃａｓ）（具体的にはＣａｓ６及びＣａｓ１３）、ならびに様々なタイプのＮＡ結合アプタマーに関連する。本発明では、ＰＵＦタンパク質という用語は、全ての関連タンパク質及びこのようなタンパク質のドメイン（ＰＵＭタンパク質とも称され得る）、例えば、ヒトＰｕｍｉｌｉｏホモログ１（ＰＵＭ１）、ＰＵＭ１の重複物であるＰＵＭｘ２もしくはＰＵＦｘ２など、または任意のＰＵＦ（ＰＵＭ）タンパク質から取得可能な任意のＮＡ結合ドメインを包含するように使用される。ＰＵＦタンパク質は、典型的には、８つの連続したＰＵＦリピートの存在によって特徴づけられ、およそ４０アミノ酸の各々には、しばしば２つの関連配列Ｃｓｐ１及びＣｓｐ２が隣接する。各リピートは、芳香族残基及び塩基性残基を含有する「コアコンセンサス」を有する。ＰＵＦリピートの全体的クラスターはＲＮＡ結合に必要とされる。注目すべきことには、この同じ領域はタンパク質共制御物質とも相互作用し、ＰＵＦタンパク質変異体の欠点をかなりの程度まで救済するのに十分であり、これによりＰＵＦタンパク質は本発明で使用される変異に対し非常に好適なものとなる。さらに、ＰＵＦタンパク質は、好適な親和性でＮＡカーゴ分子に結合することでＰＵＦタンパク質のＮＡカーゴに対する放出可能で可逆的な接続を可能にする、放出可能なＮＡ結合ドメインの非常に好ましい例である。ＰＵＦタンパク質はほとんどの真核生物に見いだされ、胚形成及び発生に関与する。ＰＵＦは、概して３６アミノ酸を含有する８つのリピートから構成されるＲＮＡに結合する１つのドメインを有し、これが本特許出願でＲＮＡ結合のために典型的に利用されるドメインである。各リピートは特定のヌクレオチドに結合し、アミノ酸１３からのスタッキング相互作用を伴って特異性を付与するのは一般的に１２位及び１６位のアミノ酸である。天然に存在するＰＵＦは、アデノシン、ウラシル、及びグアノシンヌクレオチドに結合することができ、操作されたＰＵＦはシトシンヌクレオチドにも結合することができる。したがって、システムはモジュラー式であり、ＰＵＦドメインが結合する８ヌクレオチド配列はリピートドメインの結合特異性を切り替えることにより変化させることができる。したがって、本発明に従うＰＵＦタンパク質は天然であっても、ＲＮＡ分子内の任意の場所に結合するように操作されてもよく、または代替的に、異なる配列に対する異なる結合親和性を有するＰＵＦタンパク質を選び、ＲＮＡ分子が当該配列を含有するように操作してもよい。さらに、配列特異的方式で１６ヌクレオチドに結合する操作及び／または重複されたＰＵＦドメインが存在し、これはＮＡカーゴ分子に対する特異性をさらに増加させるために利用することもできる。したがって、ＰＵＦドメインは異なる親和性及び配列長で任意の配列に結合するように修飾することができ、これによりシステムのモジュール性は非常に高いものとなり、本発明に従う任意のＲＮＡカーゴ分子に対し適合可能になる。本発明に従うＮＡ結合ドメインとして使用することができるＰＵＦタンパク質及び領域ならびにその派生物としては、以下の非限定的なＰＵＦタンパク質のリストが挙げられる：ＦＢＦ、ＦＢＦ／ＰＵＦ−８／ＰＵＦ−６、−７、−１０（全てＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来）；Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＰｕｍｉｌｉｏ；Ｐｕｆ５ｐ／Ｍｐｔ５ｐ／Ｕｔｈ４ｐ、Ｐｕｆ４ｐ／Ｙｇｌ０１４ｗｐ／Ｙｇｌ０２３ｐ、Ｐｕｆ５ｐ／Ｍｐｔ５ｐ／Ｕｔｈ４ｐ、Ｐｕｆ５ｐ／Ｍｐｔ５ｐ／Ｕｔｈ４ｐ、Ｐｕｆ３ｐ（全てＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）；Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ由来のＰｕｆＡ；ヒトＰＵＭ１（Ｐｕｍｉｌｉｏ１、場合によりＰＵＦ−８Ｒとしても知られる）及びその任意のドメイン、少なくとも２つのＰＵＭ１由来のＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド、任意の切断または修飾または操作されたＰＵＦタンパク質、例えば、ＰＵＦ−６Ｒ、ＰＵＦ−９Ｒ、ＰＵＦ−１０Ｒ、ＰＵＦ−１２Ｒ、及びＰＵＦ−１６Ｒ、またはその派生物；ならびにＸｅｎｏｐｕｓ由来のＸ−Ｐｕｆ１。本発明に従う特に好適なＮＡ結合ＰＵＦとしては以下のものが挙げられる：ＰＵＦ５３１（非限定的な例として配列番号１が例示される）、ＰＵＦ  ｍＲＮＡ  ｌｏｃ（場合によりＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄもしくはＰＵＦｅｎｇと称される）（非限定的な例として配列番号２が例示される）、及び／またはＰＵＦｘ２（非限定的な例として配列番号３が例示される）、ならびにこれらの任意の派生物、ドメイン、及び／または領域。ＰＵＦ／ＰＵＭタンパク質は、ヒト由来であるように選択することができるため非常に有利である。配列番号１〜３の配列は図５に示されている。
【００２３】
ヒト由来のタンパク質は、有害な免疫応答を誘発する（ｉｌｌｉｃｉｔ）可能性がより低いため、ＵＳ１４／５０２，４９４で使用されているＭＳ２タンパク質のようなバクテリオファージ由来のタンパク質よりも有益である。さらに、ＭＳ２はバクテリオファージ由来のステムループと相互作用するが、これはＰＵＦタンパク質とは異なり、原核生物のＮＡ配列及びモチーフが選択されたＮＡ分子内に導入される必要があることを含意する。明らかに、このバクテリオファージ由来及び構造のステムループ構造の挿入は、ｍＲＮＡ翻訳を妨害して非機能的なｍＲＮＡカーゴ分子を生じるか、または免疫毒性を引き起こす恐れがある。
【００２４】
したがって、有利な実施形態において、本発明はエクソソームタンパク質と融合した真核生物ＮＡ結合タンパク質に関連する。好ましい実施形態において、ＮＡ結合ドメイン（１つまたは複数）はＰＵＦファミリー由来のもの、例えば、ＰＵＦ５３１、ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、及び／またはＰＵＦｘ２である。重要なことには、ＰＵＦタンパク質は、好ましくはｍＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのＥＶ媒介送達に使用され、これはＰＵＦタンパク質の配列特異性により、ＮＡ薬物カーゴの非常に調節され特異的な装填を可能にする。好ましい実施形態において、ＰＵＦタンパク質（１つまたは複数）は、膜貫通または可溶性エクソソームタンパク質と有利に組み合わされる。有利な融合タンパク質コンストラクトとしては、以下の非限定的な例が挙げられる：ＣＤ６３−ＰＵＦ５３１、ＣＤ６３−ＰＵＦｘ２、ＣＤ６３−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、ＣＤ８１−ＰＵＦ５３１、ＣＤ８１−ＰＵＦｘ２、ＣＤ８１−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、ＣＤ９−ＰＵＦ５３１、ＣＤ９−ＰＵｘ２、ＣＤ９−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、及びその他の膜貫通ベース融合タンパク質（好ましくは、１つ、２つ、またはそれ以上のＰＵＦタンパク質と融合したテトラスパニンエクソソームタンパク質に基づくもの）。ＰＵＦタンパク質と少なくとも１つの可溶性エクソソームタンパク質とを含む有利な融合タンパク質としては、以下の非限定的な例が挙げられる：シンテニン−ＰＵＦ５３１、シンテニン−ＰＵｘ２、シンテニン−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、シンデカン−ＰＵＦ５３１、シンデカン−ＰＵｘ２、シンデカン−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、Ａｌｉｘ−ＰＵＦ５３１、Ａｌｉｘ−ＰＵｘ２、Ａｌｉｘ−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、さらにＰＵＦタンパク質と融合した他の任意の可溶性エクソソームタンパク質。
【００２５】
ＰＵＦタンパク質が標的ＮＡカーゴ分子に対する修飾可能な配列特異性を有するという事実により、ＰＵＦタンパク質はエクソソームポリペプチドパートナー（１つまたは複数）と融合するための理想的なＮＡ結合ドメインとなる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、ＥＶには、（エクソソームタンパク質を有する融合タンパク質の一部としての）放出可能なＮＡ結合ドメインを用いてＮＡカーゴ分子が装填され、このとき、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との相互作用は標的ヌクレオチド配列に対する特異性に有利に基づき、（２次構造は配列特異性を可能にしないため）標的ヌクレオチドの２次構造には基づかない。好ましい実施形態において、ＮＡカーゴ分子は、ＮＡ結合ドメインとして選ばれたＰＵＦタンパク質のための標的ヌクレオチド配列を含むように操作され、かつ／またはこれを天然に含む。このような標的ヌクレオチド配列は、上述のように、例えばｍＲＮＡの３’ＵＴＲの一部である場合もあれば、任意のＮＡカーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、ＤＮＡなど）内に導入されて、ＰＵＦタンパク質がＮＡカーゴ分子に結合するのを可能にする場合もある。ＮＡカーゴ分子上のＰＵＦ結合部位は、典型的には、他の多くのＲＮＡ結合タンパク質（例えば、４ヌクレオチドとステムループとの組合せを認識するに過ぎないＭＳ２）が結合する配列よりも長いため、標的結合部位上のヌクレオチドの好ましい長さは、例えば、ＮＡ結合ドメインにおける修飾可能な配列特異性の必要性に応じて、５ヌクレオチド（ｎｔ）、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、またはさらに２０ｎｔ以上とすることができる。好ましい実施形態において、ＰＵＦタンパク質は、長さが６ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１２ｎｔ、または１６ｎｔの天然及び／または人工的に存在するＮＡカーゴ分子結合部位に対し特異的である。
【００２６】
ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド（Ｃａｓ）はもう１つのＮＡ結合ドメイン群に相当し、特にＣａｓ６（非限定的な例として配列番号４が例示され、これは図５に示されている）及びＣａｓ１３、ならびに任意の他のＲＮＡ結合Ｃａｓ分子が挙げられ得る。Ｃａｓ６は前駆体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に高い親和性で結合し、これを、後の取り込み（例えば、Ｃａｓ９内への取り込み）のために処理する。ＲＮＡ分子の切断速度は調節及び高度な定義をすることができ、したがって、ＲＮＡ分子とＣａｓ６との間の会合時間も非常に正確な様式で定義することができる。このことは、本発明の目的において重要である。変異させたＣａｓ６またはＣａｓ１３の変異バージョンを使用してＲＮＡ切断の効率を増加または減少させることができる。変異させたＣａｓ６またはＣａｓ１３の変異バージョンを使用してＲＮＡ結合の親和性を増加または減少させることができる。これは、例えば、ＲＮＡカーゴ分子が受容細胞内で放出されるときに利点となるであろう。次に、規定された会合時間は、生成細胞内ではなく小胞内部にＲＮＡ分子を放出するように調節することができる。Ｃａｓ６が認識できるＲＮＡ配列は、目的ＮＡ分子内に挿入されるように操作することができる。Ｃａｓ１３は、規定されたＲＮＡ標的のみに結合しそれを分解しないように操作することができる。Ｃａｓ１３−ｓｇＲＮＡ複合体は、ｓｇＲＮＡ分子の配列を変更することにより、２０〜３０ヌクレオチドの任意のＲＮＡ配列に結合するように調節することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質由来のＮＡ結合ドメインの使用は、短いＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）の送達に特に有利である。このような場合、選択されたＣａｓポリペプチドの切断活性は、例えばｓｈＲＮＡカーゴ分子を、例えばＣａｓ６が結合している結合部位から放出するのに使用することができる。さらに、ＰＵＦタンパク質の場合のように、Ｃａｓタンパク質は、好適な親和性でＮＡカーゴ分子に結合することでＣａｓタンパク質のＮＡカーゴに対する放出可能で可逆的な接続を可能にする、放出可能なＮＡ結合ドメインの非常に好ましい例である。ＰＵＦベースＮＡ結合ドメインと同様、Ｃａｓタンパク質は、標的ＮＡカーゴ分子に対するプログラム可能で修飾可能な配列特異性を伴った放出可能で可逆的なＮＡ結合ドメインに相当し、より低い全体親和性でより高い特異性を可能にし、それによりＮＡカーゴのＥＶ内への装填と、ＮＡカーゴの標的位置内での放出との両方を可能にする。
【００２７】
ＮＡアプタマー結合ドメインは、本発明に従うもう１つのＮＡ結合ドメイン群である。このようなＮＡアプタマー結合ドメインは、ＮＡベースアプタマーにより特異的に結合され得るドメイン、領域、アミノ酸の連なり、または全体のポリペプチドもしくはタンパク質である。アプタマーは、２次及び／または３次構造を形成して、標的抗原に対する抗体の親和性と同様に分子を認識するＲＮＡ配列である。したがって、このようなＲＮＡ分子は高い親和性を有する特定のアミノ酸配列を認識することができる。ＲＮＡアプタマーは、本発明ではＮＡ分子内に特定のヌクレオチド配列を挿入することにより適用され、特定のアミノ酸配列を認識する。このようなアミノ酸配列は、エクソソーム担体ポリペプチド内及び／またはその隣で操作されて、アプタマー（ＮＡカーゴ分子内及び／またはその隣で操作される）がそれに結合するのを可能にし、よってＮＡカーゴ分子をエクソソームポリペプチドの助けによりＥＶ内に移送することができる。好適な特徴を有する２つのアプタマーは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）アミノ酸の連なりに対し高い親和性を有するＨｉｓアプタマー（非限定的な例として配列番号５により例示される）、及びＨＩＶ  Ｔａｔドメインに対するアプタマー（非限定的な例として配列番号６により例示される）である。アプタマー配列（１つまたは複数）は、好ましくはｍＲＮＡの３’及び／もしくは５’非翻訳領域またはノンコーディングＲＮＡの非特異的領域に挿入される。また、２つ以上のアプタマーを１つのＮＡカーゴ分子内で組み合わせてエクソソーム担体タンパク質に対する特異性及び結合活性を増加させることもできる。配列番号５及び６の配列は図５に示されている。重要なことには、本発明の全てのＮＡ結合ドメインは、ＮＡカーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）に対するプログラム可能で配列特異的で可逆的で放出可能な結合をもたらし、先行技術に見いだされるＲＮＡに対する高親和性の非可逆的な結合とは完全に対照的である。本発明の好ましい実施形態において、ＮＡ結合ドメインはＰＵＦタンパク質またはＣａｓタンパク質である。これは、これらのタンパク質の容易にプログラム可能な性質及び配列特異性と、これらのタンパク質のＮＡカーゴ分子に対する可逆的で放出可能な結合とが組み合わされることによるものである。重要なことには、ＮＡ結合ドメインとしてのＣａｓタンパク質及びＰＵＦタンパク質の配列特異性は、好ましくは標的ＮＡ分子上の少なくとも６ｎｔ、好ましくは少なくとも８ｎｔとの相互作用に基づいており、これは、低親和性相互作用と組み合わせたときに、ＮＡカーゴ分子の高生産性のＥＶ媒介送達を可能にする。ＮＡカーゴ分子上の少なくとも６ｎｔの結合部位は、好ましくはヌクレオチドの連続する配列内に存在する。したがって、ＮＡカーゴ分子の結合部位は好ましくは長さが２つのコドンに対応する。
【００２８】
第１の態様において、本発明は、少なくとも１つの核酸（ＮＡ）結合ドメインと少なくとも１つのエクソソームポリペプチドとを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む細胞外小胞（ＥＶ）であって、少なくとも１つのＮＡ結合ドメインが、ＰＵＦ、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、及び／またはＮＡアプタマー結合ドメインのうちの１つ以上であってもよい、細胞外小胞（ＥＶ）に関連する。ＥＶは、ＮＡ結合ドメインが存在する結果として、典型的にはさらに、少なくとも１つのＮＡカーゴ分子を含む。通常は、あらゆるＥＶに含まれるＮＡカーゴ分子の数は相当なものであり、これは、通常達成する装填有効性が非常に低い先行技術にまさる明らかな改善である。本発明の場合、融合ポリペプチドコンストラクトの発明的設計は、少なくとも１つのＮＡカーゴ分子が（融合ポリペプチドの助けにより）非常に効率的にＥＶ内に輸送され、その後に顕著に改善した放出プロセスが行われることを意味する。ＮＡ結合ドメイン（融合ポリペプチドに含まれる）とＮＡカーゴ分子との間の結合の放出可能な性質は、（ＮＡカーゴ分子が通常は過剰発現する）ＥＶ生成細胞内でのＮＡカーゴ分子の結合を可能にすると同時に、標的細胞内及び／またはその付近の生体活性ＮＡ分子の送達を可能にするため、この性質は本発明のキーとなる点である。
【００２９】
したがって、先行技術とは異なり、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との間の相互作用がプログラム可能で親和性がより低いことにより、本発明は効率的にＥＶをＥＶ生成細胞に装填することが可能になると同時に、ＮＡカーゴ分子とＮＡ結合ドメインとの間の相互作用のより低い親和性及び放出可能な性質が非常に有利であるような好適な位置（典型的には標的細胞内部）でＮＡカーゴを放出することも可能になる。さらに、４ｎｔ及びステムループに結合する高親和性ＲＮＡ結合タンパク質としてＭＳ２を開示するに過ぎない先行技術とは異なり、本発明は、より長いためにより特異的である（例えば６ｎｔ長または８ｎｔ長の）ヌクレオチドの連なりに対する配列特異的な低親和性または中親和性の結合を可能にする。
【００３０】
結合部位の長さがより長ければ、一連の修飾された結合親和性を有する結合部位を産生する一連の異なる変異が導入され、よって上述されているプログラム可能なより低い親和性相互作用をもたらすことが可能になる。例えば、１つの点変異を６または８ヌクレオチド領域に導入すると結合親和性はわずかに修飾されるが、ＭＳ２のより短い４ヌクレオチド結合領域内では、１つの変異ですらＭＳ２のＲＮＡに対する結合親和性に著しく影響を及ぼすことが知られている。核酸の長さが長いほど、その核酸に対するタンパク質の結合親和性に影響を及ぼす１つ以上の変異を導入するための範囲が大きくなる。同様に、より長いヌクレオチドの連なりが結合するように求めれば、より長いヌクレオチド配列と相互作用可能な多数のアミノ酸がもたらされ、よってこれらの相互作用するアミノ酸を変異するためのより多くの可能性がもたらされ、さらに、様々な結合親和性を伴ったより広い範囲の考えられ得るタンパク質変異体がもたらされる。ＰＵＦ、Ｃａｓ６、及びＣａｓ１３のより長いヌクレオチド結合部位及びより大きなタンパク質結合部位は、ＭＳ２タンパク質またはＭＳ２  ＲＮＡ配列の変異によって達成されるであろう親和性よりも広い範囲の親和性が変異によって達成できるようにする点において利点をもたらす。したがって、このより長い配列は、カーゴ核酸の放出を改善するために必要な場合に個々の目的カーゴに対する結合親和性を特異的に調整するように核酸及び／または結合タンパク質を操作する可能性をより大きくする。上記で論じられたように、ヌクレオチドカーゴに対する結合の親和性を調節しヌクレオチドカーゴの放出能力を修飾及び調節する能力は、先行技術にまさる本発明の重大な利点であり、生体活性核酸の送達及び放出をもたらす。
【００３１】
１つの実施形態において、ＮＡカーゴ分子は、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、リボザイム、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む群から選択することができるが、本質的には、任意のタイプのＮＡ分子が本発明に従ってＥＶに含まれてもよい。１本鎖及び２本鎖両方のＮＡ分子が本発明の範囲内であり、ＮＡ分子は天然に存在するもの（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であってもよく、または化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、２’−Ｆ、２’−ＣＥ、２’−ＥＡ、２’−ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエート、トリシクロ−ＤＮＡなどを含み得る化学的に合成されたＲＮＡ及び／またはＤＮＡであってもよい。重要なことには、本発明はＮＡカーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）の内在的装填に非常に好適であるものの、外因的ＮＡ分子による装填にも適用可能であり、外因的ＮＡ分子は、ＥＶ生成細胞を問題とされるＮＡ分子に曝露することにより、かつ／またはＥＶ自体との共インキュベートもしくは製剤化により、装填することができる。
【００３２】
特定の実施形態において、ＮＡ結合ドメインはＣａｓ６またはＣａｓ１３であり、ＮＡカーゴ分子はｓｈＲＮＡである。Ｃａｓ６／Ｃａｓ１３の生得的活性は、Ｃａｓ６またはＣａｓ１３が結合するＮＡ結合ドメイン（１つまたは複数）からのｓｈＲＮＡの切断をもたらし、融合タンパク質とＮＡ結合ドメインとの間の複合体からｓｈＲＮＡを放出することから、Ｃａｓ６／Ｃａｓ１３とｓｈＲＮＡカーゴとの組合せは有利である。加えて、ｓｈＲＮＡは、ひとたび細胞質内に放出されるといかなるｃａｐにもポリＡにも機能することを要求しないため、切断されたｓｈＲＮＡは、高い活性を有する遺伝子を直ちにサイレンシングできる状態である。
【００３３】
本発明の実施形態において、本発明に従うＮＡカーゴ分子は、（ｉ）融合ポリペプチドのＮＡ結合ドメインに対する少なくとも１つの結合部位と、（ｉｉ）治療ポリヌクレオチドドメインとを含む。好ましい実施形態において、ＮＡカーゴ分子は少なくとも２つの結合部位を含み、さらにより好ましくは、より多数の結合部位、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、またはさらにより多数の結合部位を含む。発明者らは、４〜８つの結合部位を含めれば、カーゴの放出及び生体活性送達に負の影響が及ぶことなくＮＡカーゴ分子がＥＶ内に最適に装填されることを理解した。ＮＡ結合ドメインに対する結合部位は、３’及び／もしくは５’ＵＴＲ内に及び／もしくはそれに近接して遺伝的に操作することができ、かつ／または配列最適化によりＮＡカーゴ分子のコード領域内に配置することができる。
【００３４】
本発明に従うＮＡカーゴ分子は、有利には、ＮＡカーゴ分子の治療部分の放出を可能にするために、少なくとも１つの結合部位と治療ポリヌクレオチドドメインとの間に少なくとも１つの切断部位を含むことができる。
【００３５】
概して、ＮＡカーゴ分子は一連の機能を実行するように意図することができ、例えば、目的タンパク質（例えば、治療活性を有するタンパク質）のコード、標的とのアンチセンス相互作用を介した標的ヌクレオチド配列のサイレンシング、スプライシングの切り替え及び／またはブロック、（例えば、ＲＮアーゼＨ媒介の切断またはＲＩＳＣ複合体媒介のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した）標的ヌクレオチド配列の切断の媒介を実行するように意図することができる。特に関心対象となる実施形態において、ＮＡカーゴ分子は２つ以上の機能を実行することができ、例えば、目的タンパク質をコードし、（例えば、ガイド機能を有し得る）ＮＡ配列を含むことができる。これについての特に有利な例は、ＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードし、さらに、遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ、Ｃａｓ９（非限定的な例では、配列番号７に示されるようなアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２のＣａｓ９）、及び／もしくはＣａｓ６）を標的配列に誘導するためのガイド鎖ならびに／または（例えば、相同組換え修復のための）補正ＤＮＡ鎖を含む例である。このような実施形態において、ＮＡカーゴ分子によりコードされたタンパク質とＮＡカーゴ分子に含まれるガイド鎖との一方または両方の放出を可能にするためにＮＡ分子内に切断部位を含むことは、特に有利である。
【００３６】
ＮＡカーゴ分子によりコードされ得るタンパク質の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：抗体、細胞内抗体、１本鎖可変断片、アフィボディ、酵素、トランスポーター、腫瘍抑制物質（非限定的な例としてはｐ５３、ｐ２１、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、及び／またはＳＴ１５が挙げられる）、ウイルスまたは細菌阻害物質、細胞抗生物質タンパク質、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害物質、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害物質及び誘導物質、毒素、構造タンパク質、神経栄養因子、膜トランスポーター、ヌクレオチド結合タンパク質、ヒートショックタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、カスパーゼ、ならびにこれらの任意の組合せ及び／または派生物。
【００３７】
ＮＡカーゴ分子及び融合ポリペプチドコンストラクトの設計は、例えば、標的細胞内ならびに／または特定の臓器、組織、及び身体区画内への装填、放出、及び生体活性送達に対するキーとなる。発明者らが発見した特に有利な実施形態は、少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含むＥＶであって、エクソソームポリペプチドが片側または両側で少なくとも１つのＮＡ結合ドメインに隣接される（すなわち、片側または両側に少なくとも１つのＮＡ結合ドメインがある）、ＥＶである。代替的に、ＮＡ結合ドメインは、様々な場合において、例えば、外因的装填を強化するためにＥＶの外側でＮＡ結合ドメインを示すことが望ましい場合に、エクソソームポリペプチド内の少なくとも１つの位置（例えば、小胞外ループ（例えば、ＣＤ６３）上）に挿入することができる。エクソソームポリペプチドは、Ｃ及び／またはＮ末端のすぐ近くに隣接してもよいが、最も有利な設計は、エクソソームポリペプチドとＮＡ結合ドメインとの間にリンカーペプチドを含めて、エクソソームポリペプチド（１つまたは複数）及びＮＡ結合ドメイン（１つまたは複数）の両方の活性維持のためにスペーシング及びフレキシビリティをもたらすことである。このようなリンカーは、有利には、特定の数のリピートを含有するグリシン−セリン（ＧＳ）リンカーとすることができる。発明者らは、１〜４リピートのいずれかが、融合ポリペプチドを過度に非構造化することなく十分なフレキシビリティをもたらし、最も有利であることを理解したが、これより長いリンカーもＧＳベースでないリンカーも本出願の範囲内である。上述のように、ＮＡカーゴ分子の外因性装填を伴う適用については、好ましくは、ＥＶは、ＮＡ結合ドメインをエクソソームの表面上で曝露するため、そのＮ末端及び／もしくはＣ末端上、ならびに／またはエクソソームポリペプチドの任意の小胞外（すなわちＥＶの外側に存在する）領域内の少なくとも１つのＮＡ結合ドメインと融合した、少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。
【００３８】
融合ポリペプチドコンストラクトのエクソソームポリペプチド構成要素の設計及び選択は、効率的なＥＶ形成、ＥＶ内へのＮＡ装填、さらにＮＡカーゴ分子の放出を可能にするためのキーとなる。エクソソームタンパク質は、以下の非限定的な例から選択することができる：ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、ＡＡＲＤＣ１、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ＴＮＦＲ、ｇｐ１３０、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ構成要素、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、その他のエクソソームポリペプチド、及びこれらの任意の組合せ。
【００３９】
上述のように、本発明に従うＥＶには、融合ポリペプチドの助けによりＮＡカーゴ分子が装填される。いかなる理論にも拘泥することを望まないが、装填は、ＥＶ生成細胞内部でＥＶの形成と共に生じるか、または操作されたＥＶによりＮＡカーゴ分子（１つまたは複数）をインキュベートすることにより外因的に生じると推測される。融合ポリペプチドは通常はＮＡカーゴ分子（例えば、ＥＶ生成細胞内で共発現したｍＲＮＡ分子）に結合しこれを小胞内に輸送することができ、次にこの小胞がＥＶとして放出される。前述のように、ＮＡカーゴ分子は、融合ポリペプチドと同じＥＶ生成細胞内で発現する場合があり、かつ／またはひとたびＥＶが形成され任意選択で精製されたときにＥＶ内に外因的に装填される場合がある。ＮＡカーゴのＥＶ生成細胞内での共発現は、ＥＶ生成が単一の細胞内で単一ステップで生じて、プロセスの調整が可能になり上流及び下流の処理が単純化されることから、非常に有利な実施形態である。ＮＡカーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）は、融合ポリペプチドと同じポリヌクレオチドコンストラクトから発現してもよく、または別のコンストラクトから発現してもよい。いずれの方法にも利点があり、１つのコンストラクトの使用は、融合ポリペプチド及びＮＡカーゴ分子が一緒に翻訳／転写されることを確実にし、２つ以上のコンストラクトの使用は、２つの構成要素の差別的発現（例えば、融合ポリペプチドまたはＮＡカーゴ分子いずれかの発現レベルをより高くすること）を可能にする。好ましい実施形態において、融合ポリペプチド及び／またはＮＡカーゴ分子が発現するポリヌクレオチドコンストラクトは、一貫的で再生可能で高収量のＮＡ装填ＥＶ生成を可能にするために、有利に安定的にＥＶ生成細胞内に導入される。好ましい実施形態において、ＥＶ生成細胞は、融合ポリペプチドとＮＡカーゴ分子とを含むバイシストロン性またはマルチシストロン性のベクター（コンストラクトまたはポリヌクレオチドなどとしても知られる）を用いて安定的に形質移入及び／または形質導入される。このようなバイシストロン性またはマルチシストロン性のコンストラクトは、例えば、ＩＲＥＳエレメント（１つまたは複数）または２Ａペプチド結合を含むことができ、これにより（ｉ）ＮＡ結合ドメインとエクソソームタンパク質とを含む融合ポリペプチド、及び（ｉｉ）目的ＮＡカーゴ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他の任意のタイプのＮＡカーゴ分子の両方の発現が可能になる。バイシストロン性またはマルチシストロン性ベクターを使用することに加えて、複数のまたは２方向性のプロモーターは、本発明に従うＥＶ内に装填される２つの目的構成要素をコードする単一のコンストラクトを安定的に挿入するためのもう１つの扱いやすい方法に相当する。明らかに、代替的な実施形態において、２つ以上のコンストラクト（例えば、プラスミド）がＥＶ生成細胞内に形質移入及び／または形質導入することもできるが、等モル濃度の融合ポリペプチド（及びＮＡ結合ドメイン）とＮＡカーゴ分子自体を可能にし得ることから単一コンストラクトの使用が有利であると考えられる。重要なことには、本発明のＥＶ生成細胞は、通常、少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクトを過剰発現するように設計され、これによりＥＶ生成細胞内で好適な濃度にてＮＡカーゴ分子を適切に生成することが可能になり、よってＮＡ結合ドメインのＮＡ分子に対する可逆的で放出可能な接続が可能になる。ポリヌクレオチド（１つまたは複数）の過剰発現は、ＥＶ生成細胞内で比較的高いＮＡカーゴ分子濃度の創出を可能にし、それと同時にＮＡカーゴ分子の濃度がより低い標的細胞内でのＮＡカーゴ分子の放出を可能にする重要なツールである。これは特にＰＵＦ及びＣａｓタンパク質に該当する。
【００４０】
さらなる実施形態において、本発明に従うＥＶは、目的とする細胞、組織、臓器、及び／または区画への標的化された送達を可能にするために、少なくとも１つの標的化部分を含むことができる。標的化部分は融合ポリペプチドそれ自体に含まれてもよく、これは、ＥＶの表面上での標的化部分の表示を可能にするために膜貫通ドメインを伴うエクソソームポリペプチドを使用する場合に特に有利である。標的化部分は、タンパク質、ペプチド、１本鎖断片、または他の任意の抗体の派生物などであり得る。標的化部分は、ＥＶに含まれる別個のポリペプチドコンストラクトの一部も形成することができる。さらに、本発明のＥＶに含まれる融合ポリペプチドは、生体活性送達を強化するために様々な追加の部分も含むことができる。このような部分及び／またはドメインとしては、以下の機能的ドメインの非限定的な例が挙げられ得る：（ｉ）ＥＶ形成及び／もしくは装填を改善するために融合ポリペプチドを２量体化、３量体化、もしくは多量体化する多量体化ドメイン、（ｉｉ）立体障害を回避しフレキシビリティをもたらすための上述のようなリンカー、（ｉｉｉ）放出ドメイン、例えば、インテインのようなｃｉｓ切断エレメント（融合ポリペプチド及び／もしくはＮＡカーゴの特定の部分の放出に有用な自己切断活性を有する）、（ｉｖ）受容細胞内のＲＮＡ放出を改善するためのＲＮＡ切断ドメイン、例えば、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３のようなヌクレアーゼをコードするドメイン、（ｖ）エンドソームエスケープドメイン、例えば、ＨＡ２、ＶＳＶＧ、ＧＡＬＡ、Ｂ１８など、ならびに／または（ｖｉ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）。
【００４１】
本発明は、装填、放出、及び生体活性送達の高効率性を確実にするためのキーとなる、ＮＡカーゴ分子の発明的な様々な修飾にも関連する。例えば、ＮＡカーゴ分子を直線状または環状になるように設計することにより、装填の効率性及び安定性のような態様を増加または減少させることができる。さらに、配列の設計を最適化することにより、ＮＡカーゴの２次及び３次構造に影響を及ぼすことも可能であり、これはさらに、ＮＡ結合ドメインの標的ＮＡに対する容易なアクセス性を促進することにより、装填を促進することができる。
【００４２】
また別の有利な実施形態において、ＮＡカーゴ分子は、ＮＡカーゴ分子の装填の強化、放出の改善、組織特異的活性の増加、及び／または安定性の増加によって効力を増加させるための追加の部分を含むことができる。例えば、ＮＡカーゴ分子は以下のうちの１つ以上を含むことができる：（ｉ）優先的な細胞及び／もしくは組織特異的活性を駆動するためのｍｉＲＮＡ結合のための部位（このような部位は、任意選択で組織及び／もしくは細胞タイプ特異的である）、（ｉｉ）少なくとも１つの安定化ドメイン、例えば長いポリＡテールもしくは２つ以上のポリＡテール（例えば、２、３、もしくはさらに４つのポリＡテール）、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼ分解を阻害するための５’及び／もしくは３’ＵＴＲにおける少なくとも１つのステムループ構造、（ｉｖ）ＮＡカーゴ分子の転写を駆動するためのＲＮＡポリメラーゼ、（ｖ）ｍＲＮＡ安定性を増加させるためのコドン最適化された配列、（ｖｉ）ｍＲＮＡ翻訳効率を増加させるための５’及び／もしくは３’末端における少なくとも１つのハイブリッドＵＴＲ、ならびに／または（ｖｉｉ）リボザイム（１つまたは複数）。
【００４３】
上述のように、ＥＶは典型的には単一の小胞として存在するのではなく実質的な複数の小胞で存在し、したがって本発明はＥＶ集団にも関連する。有利な実施形態において、このような集団全体におけるＥＶ当たりのＮＡカーゴ分子の平均数は、ＥＶ当たり平均でＮＡカーゴ分子１個超、好ましくはＥＶ当たりＮＡカーゴ分子１０個超、さらにより好ましくはＥＶ当たりＮＡカーゴ分子１００個超である。ただし、集団全体においていかなるＮＡカーゴ分子も含まないＥＶが存在する場合もあるため、本発明はＥＶ当たり平均でＮＡカーゴ分子１個未満を含むＥＶ集団にも関連し得る。
【００４４】
重要なことには、先行技術は典型的に、ごく一部のＥＶ内へのＲＮＡカーゴ装填をもたらしているに過ぎない。例えば、ＵＳ１４／５０２，４９４に記載のＴＡＭＥＬシステムは、ＥＶ内への、具体的にはエクソソーム内への定量可能な装填を可能にしていないように思われる。このことは、ＴＡＭＥＬシステムがゼロ〜一桁以下のパーセンテージの単一ＥＶ装填をもたらすことを示すものである。ＴＡＭＥＬシステムの発明者らは、ＴＡＭＥＬシステムを使用する場合、エクソソーム内へのＲＮＡ分子の装填は最大で７倍強化されることを報告しているが、一方本発明は、例えばｍＲＮＡ及びその他のＮＡカーゴ分子の生産的装填を、以下のものに比べて典型的には少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２５倍、ただし多くの場合少なくとも５０倍、好ましくは少なくとも７０倍改善する：（ｉ）融合タンパク質中に存在するＮＡ結合ドメインを有しないＥＶ及び／もしくはＮＡカーゴ分子内のＮＡ結合ドメインに対する結合部位を有しないＥＶ、（ｉｉ）（例えば、図２に示されるような）融合タンパク質自体を有しないＥＶ、（ｉｉｉ）ＮＡカーゴ分子が単に受動的に装填されている操作されていないＥＶ、ならびに／または（ｉｖ）所与の内部ＮＡ調節分子。したがって、本発明は、相当程度により多くのＮＡカーゴ分子を所与のＥＶ集団に装填する方法を提供し、重要なことには、本発明は、先行技術と比較して顕著に高い割合のＥＶの装填も可能にする。１つの実施形態において、本発明はＥＶ集団であって、全てのＥＶのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及び／または少なくとも９５％が問題とされるＮＡカーゴ分子を含む、ＥＶ集団に関連する。
【００４５】
上述のように、本発明とＵＳ１４／５０２，４９４及びその他の先行技術文献との間の決定的な違いは、ＥＶ集団全体にわたる融合ポリペプチドの有効でない、かつ重要なことには不均一な分布に関連する。例えば、ＵＳ１４／５０２，４９４で使用されたＭＳ２タンパク質は、ごく一部のＥＶ内に存在するに過ぎず、これがＥＶ集団にわたるｍＲＮＡカーゴの装填が不均一に分布する結果をもたらす。逆に、本発明の融合タンパク質はＥＶ集団全体にわたり均一に分布しており、このことは、本質的に、あらゆるＥＶが本発明に従う少なくとも１つの融合ポリペプチド及び通常は少なくとも１つのＮＡカーゴ分子を含むことを意味する。したがって、１つの実施形態において、本発明は、本質的に２つのＥＶサブ集団を含むＥＶ組成物であって、（ｉ）第１のＥＶサブ集団が、ＥＶ当たり平均で（ＮＡ結合ドメインとエクソソームポリペプチドとを含む）融合ポリペプチド１個超を含み、（ｉｉ）第２のＥＶサブ集団が、問題とされる前記ＮＡカーゴ分子をＥＶ当たり平均で融合ポリペプチド１個超と組み合わせて含む、ＥＶ組成物に関連する。これに対し、先行技術、例えばＵＳ１４／５０２，４９４は、ＥＶ当たりの数が非常に少ない融合ポリペプチド、典型的には１０ＥＶ当たり融合ポリペプチド１個未満を含むＥＶを教示しており、これは明らかに、当該融合タンパク質に依存するＮＡカーゴ分子の生産的装填及び送達が、本出願の場合よりも著しく低いことを含意する。いかなる理論にも拘泥することを望まないが、先行技術が融合タンパク質のＥＶ内へのより高い装填を達成できない理由は、ＭＳ２及び類似の非真核生物タンパク質がエクソソームに効率的に移送されないという事実、及び／またはこれらのタンパク質が毒性を誘発するという事実に起因すると推測され、この２つの問題は本発明によって対処されている。
【００４６】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＮＡ結合ドメインと少なくとも１つのエクソソームポリペプチドとを含む、発明的な融合ポリペプチドであって、少なくとも１つのＮＡ結合ドメインが、ＰＵＦ、Ｃａｓ、及び／またはＮＡアプタマー結合ドメインのうちの１つ以上である、融合ポリペプチドに関連する。有利な実施形態において、融合ポリペプチドは任意選択でさらに、ポリペプチドに特定の機能を与える追加の領域、ドメイン、配列、及び／または部分を含むことができる。融合ポリペプチドに含まれる追加のドメインの非限定的な例としては、（ｉ）多量体化ドメイン、（ｉｉ）リンカー、（ｉｉｉ）放出ドメイン、（ｉｖ）ＲＮＡ切断ドメイン、（ｖ）エンドソームエスケープ部分、（ｖｉ）プロテアーゼ特異的切断部位、（ｖｉｉ）インテイン、及び／または（ｖｉｉｉ）標的化部分が挙げられる。
【００４７】
多量体化ドメインは、融合ポリペプチドの２量体化、３量体化、または任意のより高次の多量体化を可能にし、これにより融合ポリペプチドの選別及びＥＶ内へのトラフィッキングが増加し、またＥＶ生成細胞により生成される小胞の収量増加にも寄与し得る。リンカーは、融合ポリペプチドコンストラクトに対するフレキシビリティ、さらに対応するポリヌクレオチドコンストラクトに対するフレキシビリティの増加をもたらすのに有用であり、また融合ポリペプチドの立体障害回避及び機能性維持を確実にするために使用することもできる。放出ドメインは、元の融合ポリペプチドからの特定の部分またはドメインの放出を可能にするために融合ポリペプチドコンストラクトに含めることができる。これは、融合ポリペプチドの部分の放出がＮＡカーゴの生体活性送達を増加すると考えられる場合、及び／またはより小さいコンストラクトの部分であるときに融合ポリペプチドの特定の機能がより良好に働く場合に特に有利である。好適な放出ドメインは、ｃｉｓ切断配列、例えばインテイン、光誘導性単量体または２量体放出ドメイン、例えばＫａｅｄｅ、ＫｉｋＧＲ、ＥｏｓＦＰ、ｔｄＥｏｓＦＰ、ｍＥｏｓ２、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、ＧＦＰ様Ｄｅｎｄｒａタンパク質Ｄｅｎｄｒａ及びＤｅｎｄｒａ２、ＣＲＹ２−ＣＩＢＮなどであり得る。ＮＡ切断ドメインは、有利には、ＮＡカーゴの切断を引き起こすために融合ポリペプチドに含めることができる。ＮＡ切断ドメインの非限定的な例としては、エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、操作されたＰＵＦヌクレアーゼ、部位特異的ＲＮＡヌクレアーゼなどが挙げられる。さらに、本発明の融合ポリペプチドはエンドソームエスケープドメインを含んでエンドソームエスケープを駆動し、それによりＥＶ自体及びＥＶ  ＮＡカーゴ分子の生体活性送達を強化することもできる。送達を強化するためのもう１つの戦略は、ＥＶの標的を細胞、組織、及び／もしくは臓器、またはその他の身体区画にすることである。標的化は様々な手段により、例えば標的化ペプチドの使用により達成することができる。このような標的化ペプチドは、数アミノ酸長〜数百アミノ酸長のいずれか、例えば、３〜１００アミノ酸、３〜３０アミノ酸、５〜２５アミノ酸の間隔内のいずれか、例えば、７アミノ酸、１２アミノ酸、２０アミノ酸などであり得る。本発明の標的化ペプチドは、受容体、受容体リガンドなどのような全長タンパク質も含むことができる。さらに、本発明に従う標的化ペプチドは、抗体及び抗体派生物、例えば、モノクローナル抗体、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その他の抗体ドメインなども含むことができる。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従う融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトに関連する。ポリヌクレオチドコンストラクトは、様々な異なる形態で、及び／または異なるベクターにおいて存在することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、本質的に直線状、環状であってもよく、かつ／または任意の２次構造及び／もしくは３次構造及び／もしくはより高次の構造を有する。さらに、本発明は、このポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、プラスミド、任意の環状ＤＮＡポリヌクレオチド、ミニサークル、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス）、ｍＲＮＡ、及び／または修飾ｍＲＮＡなどのベクター）にも関連する。
【００４９】
本発明に従うポリヌクレオチドコンストラクトはさらに、特定の機能性をポリヌクレオチド内に付与するための１つ以上の部位またはドメインを含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドコンストラクトの安定性は、安定化ドメイン、例えば、ポリＡテールまたはステムループの使用により強化することができ、ポリヌクレオチドコンストラクトは、任意選択で細胞タイプ特異的な誘導的プロモーター、リンカーなどであってもよい特定のプロモーターによって調節することもできる。ポリＡテールは、任意選択で、安定化ポリＡテールを保持するｍＲＮＡの切断をもたらすようにＣａｓ６またはＣａｓ１３切断部位の上流に挿入することができる。
【００５０】
本発明はさらに、ＥＶを生成するための様々な方法に関連する。このような方法は、（ｉ）ＥＶ生成細胞内に少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクトを導入するステップと、（ｉｉ）ＥＶ生成細胞内で少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされた少なくとも１つのポリペプチドコンストラクトを発現させるステップと、任意選択で（ｉｉｉ）ＥＶ生成細胞から、ステップ（ｉｉ）からの目的ポリペプチドを含む生成されているＥＶを収集するステップとを含み得る。あるいくつかの実施形態では単一のポリヌクレオチドコンストラクトが使用され、一方他の実施形態では２つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトが用いられる。いかなる理論にも拘泥することを望まないが、ポリヌクレオチドコンストラクトが（ＥＶの目的及び使用に応じて一過的にまたは安定的に）挿入されたＥＶ生成細胞は、そのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドコンストラクトを含むＥＶ（例えば、エクソソーム）を生成すると推測される。次に、ＥＶは任意選択で、典型的には細胞培地から収集されてもよく、特定の使用に供される前に任意選択でさらに精製されてもよい。有利な実施形態において、当該方法により生成されるＥＶはさらに、融合ポリペプチドコンストラクトの助けによりＥＶ内に装填されるＮＡカーゴ分子を含む。典型的には、単一のＥＶはＮＡカーゴ分子のいくつかのコピーを含むが、単一のＥＶは２つ以上のタイプのＮＡ薬物カーゴ分子を含むこともできる。２つ以上のタイプのＮＡ薬物カーゴを含むＥＶの非限定的な例として、単一のＥＶ（すなわち、単一のタイプのＥＶ集団）は例えば、ｇＲＮＡ  ＮＡ薬物カーゴ分子及びｍＲＮＡ薬物カーゴ分子を含むことができる。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクト及び／または（ｉｉ）少なくとも１つのポリペプチドコンストラクトを含む細胞に関連する。さらに、本発明は、本発明に従うＥＶを含む細胞にも関係する。ＥＶ生成細胞は、例えば、初代細胞、細胞株、多細胞生物内に存在する細胞、または他の任意のタイプの細胞供給源及びＥＶ生成細胞材料の形態で存在し得る。「供給源細胞」もしくは「ＥＶ供給源細胞」もしくは「親細胞」もしくは「細胞供給源」もしくは「ＥＶ生成細胞」という用語、または他の任意の同様の用語は、好適な条件下で、例えば、懸濁培養もしくは接着培養、または他の任意のタイプの培養系においてＥＶを生成可能な任意のタイプの細胞に関係するものと理解されたい。本発明に従う供給源細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでエクソソームを生成する細胞も含むことができる。本発明に従う供給源細胞は、広範囲の細胞及び細胞株から選択することができ、例えば、間葉系幹細胞または間葉系間質細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、ワルトン膠質、周産期組織、胎盤、歯蕾、臍帯血、皮膚組織などから取得可能）、線維芽細胞、羊膜細胞、より具体的には任意選択で様々な早期マーカーを発現する羊膜上皮細胞、骨髄抑制細胞、Ｍ２極性化マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞などから選択することができる。特に関心対象となる細胞株としては、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、内皮細胞株（例えば、微小血管またはリンパ内皮細胞）、赤血球、赤血球前駆細胞、軟骨細胞、由来の異なるＭＳＣ、羊膜細胞、羊膜上皮（ＡＥ）細胞、羊水穿刺または胎盤から取得される任意の細胞、気道または肺胞上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞などが挙げられる。また、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞（ＤＣ））も本発明の範囲内であり、ＥＶを産生可能な本質的に任意のタイプの細胞も本明細書に包含される。概して、ＥＶは、初代細胞供給源または不死化細胞株であっても本質的に任意の細胞供給源から誘導することができる。ＥＶ供給源細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及び任意の方法により誘導される他の幹細胞を含めた任意の胚性、胎児性、及び成体の体性幹細胞タイプとすることができる。神経疾患を治療する場合、例えば、一次ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、及び神経前駆細胞を供給源細胞として利用することが考えられ得る。供給源細胞は、治療対象の患者に対し本来的に同種、自己由来、またはさらに異種であり得、すなわち細胞は、患者自身から、または非血縁、適合、もしくは非適合ドナーからであり得る。あるいくつかの文脈では、同種細胞は、ある徴候を患う患者の自己由来細胞から取得可能でない場合がある免疫修飾効果をもたらし得ることから、医学的観点からは同種細胞が好ましいと考えられる。例えば、全身性、末梢性及び／または神経系の炎症を治療する文脈では、同種ＭＳＣまたはＡＥのような細胞から得られるＥＶは、例えば、マクロファージ及び／または好中球表現型スイッチング（それぞれ、炎症促進性のＭ１またはＮ１表現型から抗炎症性のＭ２またはＮ２表現型へのスイッチング）���介して免疫修飾を可能にし得るため、同種ＭＳＣまたはＡＥが好ましいと考えられる。
【００５２】
上述のように、好ましい実施形態において、本発明のＥＶ生成細胞は、（ｉ）ＮＡ結合ドメインを含む融合ポリペプチド及び（ｉｉ）ＮＡカーゴ分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクト（１つまたは複数）を用いて、安定的に形質移入及び／または形質導入される。非常に好ましい実施形態において、ＥＶ生成細胞は、単一細胞クローンのクローナル選択を可能にするクローナル選択プロトコルに曝露される。したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明は、融合ポリペプチドとＮＡカーゴ分子と両方を含むＥＶを生成するために形質移入及び／または形質導入されるＥＶ生成細胞の単一細胞クローナル集団に関連する。単一クローンは、限界希釈法、単一細胞選別、及び／またはクローニングシリンダーを用いた個々の細胞の単離を用いて取得することができる。
【００５３】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのＲＮＡカーゴ分子の細胞内送達のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｅｘ  ｖｉｖｏで有利に行うことができる。本方法は、標的細胞を、本発明に従う少なくとも１つのＥＶ、またはより一般的には本発明に従うＥＶ集団に接触させるステップを含むことができる。さらに、本発明に従うＲＮＡカーゴ分子の送達のための方法は、任意の生体系（例えば、ヒト）に存在する細胞内に、本明細書の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することも含むことができる。
【００５４】
追加の態様において、本発明は、以下の構成要素：（ｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクト、（ｉｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドコンストラクト、（ｉｉｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのＥＶ、（ｉｖ）本明細書に記載の少なくとも１つの細胞、及び／または（ｖ）本明細書に記載の少なくとも１つのＥＶ集団、のうちのいずれか１つまたはそれ以上を含み、典型的には医薬的に許容される賦形剤、担体、及び／または希釈剤等で製剤化される、医薬組成物に関連する。さらに本発明は、医学分野における使用のための（ｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクト、（ｉｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドコンストラクト、（ｉｉｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのＥＶ、（ｉｖ）本明細書に記載の少なくとも１つの細胞、及び／または（ｖ）本明細書に記載の少なくとも１つのＥＶ集団、ならびに（ｖｉ）上述の医薬組成物にも関係する。より具体的には、本発明は、様々な疾患の予防及び／または治療及び／または緩和における使用に関連する。疾患及び状態の非限定的な例としては、以下の非限定的な例が挙げられる：クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＤＩＲＡ）の欠損、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、ギラン・バレー症候群、急性心筋梗塞、ＡＲＤＳ、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、腎不全、心不全または任意の急性もしくは慢性の臓器不全及び関連する基礎病因、移植片対宿主病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び他の筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、例えば、ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳＩ、ＩＩ（ハンター症候群）、及びＩＩＩ、ニーマン・ピック病Ａ、Ｂ、及びＣ型、ポンペ病など、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及びその他のトリヌクレオチドリピート関連疾患を含む）、認知症、ＡＬＳ、癌誘導性悪液質、食欲不振、２型糖尿病、ならびに様々な癌。ほぼ全てのタイプの癌が本発明の関連疾患標的であり、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫（小脳もしくは大脳）、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、脳幹グリオーマ、脳癌、脳腫瘍（小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣細胞腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部グリオーマ）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児、胃腸管）、原発不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫／悪性グリオーマ、子宮頸癌、白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、胃の（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、胃腸管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、もしくは卵巣）、妊娠性絨毛性腫瘍、グリオーマ（脳幹グリオーマ、大脳星細胞腫、視覚路及び視床下部グリオーマ）、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病（（急性リンパ芽球性（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄球性（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、慢性リンパ性（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、慢性骨髄性（慢性骨髄球性白血病とも呼ばれる）、有毛細胞白血病）、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌（原発性）、肺癌（非小細胞、小細胞）、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、髄芽腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄形成異常／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄球性白血病（急性、慢性）、骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在性腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（ユーイングファミリーの腫瘍肉腫、カポジ肉腫、軟組織肉腫、子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫、黒色腫）、小腸癌、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびに／またはウィルムス腫瘍が標的となる。
【００５５】
本発明に従うＥＶは、様々な異なる投与経路、例えば、耳介（耳）、頬側、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、腸、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊水内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、滑液内、心臓内、軟骨内、尾骨内、海綿体内、腔内、脳内、胸骨内、角膜内、（歯）冠内、冠動脈内、海綿体内、皮内、円板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、洞内、脊髄内、滑液嚢内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、小管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内急速、静脈内点滴、心室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレーシス、灌注、喉頭、鼻、経鼻胃、密封包帯法、眼部、経口、中咽頭、その他、非経口、経皮、関節周囲、硬膜上、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（吸入）、球後、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、及び／もしくは経膣の投与、ならびに／または上記投与経路の任意の組合せを介して、ヒトまたは動物対象に投与することができ、これは典型的には、治療対象となる疾患、及び／またはＥＶ、問題となるＮＡカーゴ分子、もしくはＥＶ集団のようなものの特色に依存する。
【００５６】
実施例及び実験セクション
材料及び方法
・コンストラクト設計及びクローニング
様々なＮＡ結合ドメイン及びそのバリアント（例えば、ＰＵＦ、変異ＰＵＦ、ＰＵＦｘ２、Ｃａｓ６、変異Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、変異Ｃａｓ１３など）をいくつかのエクソソームポリペプチド（例えば、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、シンテニン、シンデカン、Ａｌｉｘ、ＣＤ１３３など）と組み合わせて評価した。ＯＲＦは合成により典型的に産生し、哺乳類発現ベクターｐＳＦ−ＣＡＧ−Ａｍｐ内にクローニングした。簡潔に述べると、合成したＤＮＡ及びベクタープラスミドを、製造業者の指示（ＮＥＢ）に従って酵素ＮｏｔＩ及びＳａｌＩで消化した。制限された精製ＤＮＡ断片を、製造業者の指示（ＮＥＢ）に従ってＴ４リガーゼを用いて共にライゲーションした。好結果のライゲーションイベントは、アンピシリンを追加したプレート上での細菌形質転換のために選択した。形質移入用のプラスミドは、製造業者の指示に従って「マキシプレップ」により産生した。
【００５７】
・細胞培養及び形質移入
実験設計及びアッセイに応じて、あるいくつかのケースでは、従来的な２Ｄ細胞培養において非ウイルス一過性形質移入及びＥＶ生成を行い、一方他のケースでは、ウイルス媒介形質導入を用いて安定した細胞株を創出し、これを異なるタイプのバイオリアクター及び／または振とうインキュベーターで典型的に培養した。簡潔性のため、本明細書では数例のみについて述べる。
【００５８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１５ｃｍディッシュに典型的に播種し（ディッシュ当たり９×１０６細胞）、ＡＴＣＣの推奨通りに血清含有ＤＭＥＭ中で一晩放置した。次の日、細胞に直接添加したリポプレックスＤＮＡにより細胞を一過的に形質移入した。簡潔に述べると、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をＯｐｔｉＭＥＭ中で５分間別々にインキュベートしてから、室温で２０分間一緒に合わせた。リポプレックスＤＮＡ及び細胞を６時間共インキュベートし、その後に４８時間条件培地をＯｐｔｉＭＥＭに変更した。ディッシュ、フラスコ、及びその他の細胞培養容器内で評価した他の細胞及び細胞株には、骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）及びワルトン膠質由来ＭＳＣ（ＷＪ−ＭＳＣ）、羊膜細胞、羊膜上皮細胞、線維芽細胞、様々な内皮細胞及び上皮細胞、ならびに様々な免疫細胞及び細胞株が含まれた。
【００５９】
融合ポリペプチドコンストラクト及びＮＡカーゴ分子の様々な組合せのためのウイルス形質導入及び安定した細胞株の創出については、ＢＭ−ＭＳＣ、ＷＪ−ＭＳＣ、線維芽細胞、羊膜上皮細胞、線維芽細胞、様々な内皮細胞及び上皮細胞のような細胞供給源にレンチウイルス（LV）形質導入を典型的に使用し、ウイルス形質導入を行った。典型的には、感染の２４時間前に、１００．０００細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣなど）または２００．０００細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）を６ウェルプレートで平板培養する。２ｕＬのＬＶ及び任意選択でポリブレン（すなわち臭化ヘキサジメトリン、ウェル上の最終濃度８ｕｇ／ｍＬ）を添加し、形質導入から２４時間後に形質導入細胞の細胞培地を新鮮な完全培地に変更する。形質導入後７２時間時にピューロマイシンセレクション（４〜６μｇ／ｍｌ）を通常は７日間実施し、その後に融合ポリペプチドの安定発現の分析を行う。
【００６０】
安定細胞を２Ｄ培養またはバイオリアクターで培養し、次にエクソソーム調製のために条件培地を採取した。様々な調製及び精製ステップを実行した。標準的なワークフローは、上清の予備洗浄、濾過ベース濃縮、タンパク質不純物のクロマトグラフィーベース除去、及び任意選択でｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ用の好適なバッファー中での得られたエクソソーム組成物の製剤化のステップを含む。
【００６１】
・アッセイ及び分析
ウェスタンブロットは、ＥＶ内のＰｏｌの濃縮を評価するための利便性の高い分析方法である。簡潔に述べると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏｖｅｘ  ＰＡＧＥ  ４−１２％ゲル）に従って実施し、１×１０１０のエクソソーム及び２０ｕｇの細胞ライセートをウェルごとに装填した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのタンパク質を製造業者の指示（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（ＲＴＭ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＶＤＦ膜に移した。膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（Ｌｉｃｏｒ）でブロックし、ＮＡ結合ドメインポリペプチド及び／またはエクソソームタンパク質に対する抗体でプローブした（１次抗体：Ａｂｃａｍ、２次抗体：Ｌｉｃｏｒ）。分子プローブを６８０及び８００ｎｍ波長で視覚化した。
【００６２】
ＥＶサイズ定量については、分析ソフトウェアを装備したＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ＲＴＭ）装置、または場合によりＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｍａｔｒｉｃｓマシンを用いて、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）を実施した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ＲＴＭ）での記録については、全ての取得後設定において１３または１５のカメラレベル及び自動機能を使用した。電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡を頻繁に使用して、ＥＶの形態及びサイズを検証及び評価した。
【００６３】
様々な方法を用いて、典型的にはＴＦＦならびにサイズ除外液体クロマトグラフィー及び／またはビーズ溶離液体クロマトグラフィーのような濾過の組合せを用いて、ＥＶを単離及び精製した。典型的には、ＥＶ含有培地を収集し、３００ｇで５分間の低速スピンに供し、次いで２０００ｇで１０分間のスピンに供して、比較的大きい粒子及び細胞デブリを除去した。次に上清を０．２２μシリンジフィルターで濾過し、異なる精製ステップに供した。１００ｋＤａカットオフフィルター付きのＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０Ｒタンジェンシャルフロー（ＴＦＦ）デバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）または１００もしくは３００ｋＤａカットオフ中空糸フィルター付きのＫＲ２ｉ  ＴＦＦシステム（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ）を用いて、沢山の量を透析濾過しおよそ２０ｍｌに濃縮した。次に、予備濃縮した培地をビーズ溶離カラム（ＨｉＳｃｒｅｅｎ（ＲＴＭ）またはＨｉＴｒａｐ（ＲＴＭ）Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＲＴＭ）ｐｌｕｓまたはＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ２５（ＲＴＭ）クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した。カラム平衡化のための流速設定、サンプル充填、及び定位置のカラム洗浄手順は、製造業者の指示に従って選択した。試料をＵＶ吸収クロマトグラムに従って収集し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ分子量カットオフスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて最終体積１００μｌに濃縮し、さらなる下流分析のために−８０℃で保管した。タンパク質及びＲＮＡの溶離プロファイルを評価するために、１００ｋＤａ及び３００ｋＤａ中空繊維フィルターを用いたＫＲ２ｉ  ＴＦＦシステムで培地を濃縮及び透析濾過し、試料をＴｒｉｃｏｒｎ  １０／３００  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｓ４ＦＦ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。
【実施例】
【００６４】
実施例１．骨髄由来ＭＳＣを従来的な組織培養フラスコ内で培養し、ＰＥＩ形質移入を用いて一過的に形質移入して、ｍＲＮＡカーゴ分子及び融合ポリペプチドコンストラクトの装填及び発現を可能にした。図２は、ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）及びｐ２１をコードするｍＲＮＡカーゴ分子のＢＭ−ＭＳＣから取得されたＥＶにおける装填を示している。装填は、エクソソームポリペプチドとしてのＣＤ６３と、ＮＡ結合ドメインとしてのＰＵＦまたはＣａｓ６とを含む融合ポリペプチドコンストラクトを用いて達成した。当該実験は、ＮＡ結合ドメインに対する様々な数の結合部位、すなわち０、３、及び６つの結合部位も含み、これらはコード領域の３’及び／または５’隣接部に対し異なる場所で挿入した。
【００６５】
ＴＦＦ及びＳＥＣの経時的組合せを用いてＭＳＣ−ＥＶを精製した。エクソソームポリペプチドＣＤ６３のみの発現は、いかなるｍＲＮＡのＥＶ内への装填ももたらさなかった（図２のグラフ内の右のカラムセット）。ＰＵＦを含む融合ポリペプチド（左のカラムセット：ＣＤ６３のＮ末端側及びＣ末端側の両方に隣接する２つのＰＵＦドメイン、すなわち合計４つのＰＵＦコンストラクト）（左から２番目のカラムセット：ＣＤ６３のＮ末端側及びＣ末端側の両方に隣接する１つのＰＵＦドメイン）ならびに変異Ｃａｓ６（右から２番目）は、ＥＶ供給源細胞内での発現の際に、ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）及びｐ２１  ｍＲＮＡの両方の著しいｍＲＮＡ装填をもたらした。ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）の装填は総じてｐ２１の装填よりも効率的であり、ＥＶ当たり最大およそ４５コピーが装填された。
【００６６】
実施例２．ｓｈＲＮＡ標的化ハンチンチンのＥＶ媒介送達の際の標的細胞（ＨＥＫ２９３細胞）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏの遺伝子発現のサイレンシング。浸透インキュベーター内で培養した羊膜細胞に対し、レンチウイルス形質導入を用いて形質導入して、ｓｈＲＮＡを含むＥＶと、ＰＵＦまたはＣａｓ６のいずれかのＮＡ結合ドメインをＥＶポリペプチドとしてのそれぞれＣＤ６３またはＣＤ８１との組合せで含む融合ポリペプチドコンストラクトとを分泌させた。超遠心分離法を用いてＥＶを上清から精製した。図３のＹ軸は、どのようにハンチンチン発現レベルがＮＡカーゴ分子内の結合部位数の増加に伴って減少しているかを示しており、抗ハンチンチンｓｈＲＮＡに装填するためのＰＵＦ−ＣＤ６３−ＰＵＦを含む融合ポリペプチドを用いておよそ８０％ノックダウンがもたらされた。
【００６７】
実施例３．ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）ｍＲＮＡをＨＥＫ  ＥＶ媒介送達した後の標的Ｈｕｈ７細胞におけるレポーターシステムとしてのＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）の発現。ＨＥＫ２９３Ｔに対し安定的に形質導入して、レポーターＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）ｍＲＮＡカーゴをＥＶ内に装填するための様々な融合ポリペプチドコンストラクトを発現させた。ＮａｎｏＬｕｃ（ＲＴＭ）ｍＲＮＡカーゴ分子を操作して、融合ポリペプチドコンストラクトを構成するＮＡ結合ドメイン（本件ではＰＵＦｘ２−ＣＤ６３−ＰＵＦｘ２（エクソソームポリペプチドＣＤ６３のＮ末端側及びＣ末端側の両方に挿入された２つのＰＵＦ  ＮＡ−結合ポリペプチド）、ＰＵＦ−ＣＤ６３−ＰＵＦ、及びＣａｓ６−ＣＤ９−Ｃａｓ６（図４））に対する０、３、または６つの結合部位を含むようにした（図４）。
【００６８】
ビーズ溶離ＬＣと組み合わせたＴＦＦに基づいたＨＥＫ由来ＥＶの精製後、ＥＶを最適濃度でＨＥＫ細胞に添加した。このアッセイにおける最適濃度は、Ｈｕｈ７標的細胞の６ウェルプレート内のウェル当たり１０＾７  ＥＶであった。図４のＹ軸は、タンパク質μｇに対し正規化した相対光（発光）単位（ＲＬＵ）を示しており、これにより、異なる融合ポリペプチドコンストラクトを用いての、結合部位の数の増加に伴う送達及び／または翻訳の強化が示される。そのため図４は、本発明が生体活性ｍＲＮＡを細胞に送達することができるＥＶを提供し、送達後にそのｍＲＮＡが細胞によって首尾よく翻訳されることを実証するものである。これは本発明の重大な利点であり、単にＲＮＡと共にＥＶを装填することはできるがこのＲＮＡを能動的に翻訳されるように標的細胞のサイトゾルに送達することができない先行技術にまさるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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