(57)【要約】  214nmでのUV吸光度により少なくとも93%のQS-21主ピーク及び0.25〜3%の2018成分を含有するサポニン抽出物、前記抽出物を作製する方法、そのワクチンアジュバントとしての使用及び関連する態様。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
214nmでのUV吸光度により少なくとも93%のQS-21主ピーク及び0.25〜3%の2018成分を含有するサポニン抽出物。
【請求項２】
最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項1に記載のサポニン抽出物。
【請求項３】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98%のQS-21群を含有する、請求項1又は2に記載のサポニン抽出物。
【請求項４】
214nmでのUV吸光度により1%以下のlyo不純物を含有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項５】
214nmでのUV吸光度により1%以下のQS-21群以外の最も大きいピークを含有する、請求項4に記載のサポニン抽出物。
【請求項６】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98%のQS-21群、少なくとも93%のQS-21主ピーク、0.25〜3%の2018成分、1%以下のQS-21群以外の最も大きいピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項1に記載のサポニン抽出物。
【請求項７】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65%、例えば少なくとも70%の1988成分を含有する、請求項1から6のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項８】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により30%以下、例えば25%以下の1856成分を含有する、請求項1から7のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項９】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5%、例えば少なくとも10%の1856成分を含有する、請求項1から8のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項１０】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により10%以下、例えば5%以下の2002成分を含有する、請求項1から9のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項１１】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%の2002成分を含有する、請求項1から10のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項１２】
214nmでのUV吸光度により少なくとも1%の2018成分を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項１３】
214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、及び0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有するサポニン抽出物。
【請求項１４】
最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項13に記載のサポニン抽出物。
【請求項１５】
214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有する、B-異性体及びlyo不純物を除くトリテルペノイド配糖体を含有する、請求項13又は14に記載のサポニン抽出物。
【請求項１６】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有する、請求項13から15のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項１７】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有する、lyo不純物を除くトリテルペノイド配糖体を含有する、請求項13から16のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項１８】
214nmでのUV吸光度により1%以下の、lyo不純物のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有する、請求項13から17のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項１９】
214nmでのUV吸光度により1%以下のその他のピークを含有する、請求項18に記載のサポニン抽出物。
【請求項２０】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、1%以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項13に記載のサポニン抽出物。
【請求項２１】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65%、例えば少なくとも70%の1988成分を含有する、請求項13から20のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項２２】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により30%以下、例えば25%以下の1856成分を含有する、請求項13から21のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項２３】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5%、例えば少なくとも10%の1856成分を含有する、請求項13から22のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項２４】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により10%以下、例えば5%以下の2002成分を含有する、請求項13から23のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項２５】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%の2002成分を含有する、請求項13から24のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項２６】
214nmでのUV吸光度により少なくとも1%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含む、請求項13から25のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項２７】
214nmでのUV吸光度により、少なくとも93%の
【化１】
2021504424.tif 000058
2021504424.tif 000059
及び0.25〜3%の
【化２】
2021504424.tif 000060
を含有するサポニン抽出物。
【請求項２８】
最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項27に記載のサポニン抽出物。
【請求項２９】
少なくとも98%の
【化３】
2021504424.tif 000061
2021504424.tif 000062
2021504424.tif 000063
を含有する、請求項27又は28に記載のサポニン抽出物。
【請求項３０】
少なくとも98%の
【化４】
2021504424.tif 000064
2021504424.tif 000065
2021504424.tif 000066
及び2118成分を含有する、請求項27から29のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項３１】
1%以下の
【化５】
2021504424.tif 000067
を含有する、請求項27から30のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項３２】
214nmでのUV吸光度により1%以下のその他のピークを含有する、請求項31に記載のサポニン抽出物。
【請求項３３】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の
【化６】
2021504424.tif 000068
2021504424.tif 000069
2021504424.tif 000070
少なくとも93%の
【化７】
2021504424.tif 000071
2021504424.tif 000072
0.25〜3%の
【化８】
2021504424.tif 000073
1%以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項27に記載のサポニン抽出物。
【請求項３４】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の
【化９】
2021504424.tif 000074
2021504424.tif 000075
2021504424.tif 000076
又は2118成分、
少なくとも93%の
【化１０】
2021504424.tif 000077
2021504424.tif 000078
0.25〜3%の
【化１１】
2021504424.tif 000079
1%以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項27に記載のサポニン抽出物。
【請求項３５】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65%、例えば少なくとも70%の
【化１２】
2021504424.tif 000080
を含有する、請求項27から34のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項３６】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により30%以下、例えば25%以下の
【化１３】
2021504424.tif 000081
を含有する、請求項27から35のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項３７】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5%、例えば少なくとも10%の
【化１４】
2021504424.tif 000082
を含有する、請求項27から36のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項３８】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により10%以下、例えば5%以下の
【化１５】
2021504424.tif 000083
を含有する、請求項27から37のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項３９】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%の
【化１６】
2021504424.tif 000084
を含有する、請求項27から38のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項４０】
214nmでのUV吸光度により少なくとも1%の
【化１７】
2021504424.tif 000085
を含む、請求項27から39のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項４１】
乾燥されている、請求項1から40のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項４２】
精製されたサポニン抽出物の製造に使用されるキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を同定する方法であって、
(i)214nmでのUPLC-UV吸光度により2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ、及び
(ii)0.075以下の2018成分/QS-21主ピークの比を有する粗製水性抽出物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項４３】
ステップ(ii)で選択される粗製水性抽出物が0.064以下の2018成分/QS-21主ピークの比を有する、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
請求項1から41のいずれか一項に記載のサポニン抽出物の製造に使用される、請求項42又は43に記載の方法。
【請求項４５】
(i)0.075以下の2018成分対QS-21主ピークの比を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリビニルピロリドン吸着により抽出物を精製するステップ、
(iii)透析ろ過、限外ろ過又は透析により抽出物を精製するステップ、
(iv)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、及び
(v)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ
を含む、精製されたサポニン抽出物を製造する方法。
【請求項４６】
ステップ(iii)が透析ろ過による精製を使用する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ(iv)が、アセトニトリル及び水を、特に勾配条件下で使用する、請求項45又は46に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ(v)が、アセトニトリル及び水を、特にアイソクラティック条件下で使用する、請求項45から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
溶媒を除去して乾燥したサポニン抽出物を提供する追加のステップを含む、請求項45から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
溶媒を除去するステップが、凍結乾燥を使用する、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
C8樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を濃縮する追加のステップを含む、請求項45から50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
C8樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を濃縮するステップが、アセトニトリル及び水を、特に段階的勾配条件下で使用する、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
溶媒を交換する追加のステップを含む、請求項51又は52に記載の方法。
【請求項５４】
溶媒を交換するステップが、透析ろ過、限外ろ過又は透析、殊に透析ろ過を使用する、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.064以下の2018成分対QS-21主ピークの比を有する、請求項45から54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.01以上の2018成分対QS-21主ピークの比を有する、請求項45から55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.005以上の2018成分対QS-21主ピークの比を有する、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.45以下の先行するピーク対QS-21主ピークの比を有する、請求項45から57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.40以下の先行するピーク対QS-21主ピークの比を有する、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、少なくとも1g/L、例えば少なくとも2g/L、殊に少なくとも2.5g/L、特に少なくとも2.8g/LのQS-21主ピークを含有する水溶液である、請求項45から59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が樹皮抽出物である、請求項45から60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ(i)が、粗製水性抽出組成物を試験して2018成分含量を決定することを含む、請求項45から61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
医薬、例えばアジュバント又は免疫原性組成物の製造における、請求項1から41のいずれか一項に記載のサポニン抽出物の使用。
【請求項６４】
アジュバントとして使用するための請求項1から41のいずれか一項に記載のサポニン抽出物。
【請求項６５】
請求項1から41のいずれか一項に記載のサポニン抽出物を含むアジュバント組成物。
【請求項６６】
アジュバントがリポソーム製剤である、請求項63から65のいずれか一項に記載の使用、サポニン抽出物又はアジュバント組成物。
【請求項６７】
アジュバントがTLR4アゴニストを含む、請求項63から66のいずれか一項に記載の使用、サポニン抽出物又はアジュバント組成物。
【請求項６８】
TLR4アゴニストが3D-MPLである、請求項67に記載の使用、サポニン抽出物又はアジュバント組成物。
【請求項６９】
請求項65から68のいずれか一項に記載のアジュバント組成物と、免疫原若しくは抗原、又は免疫原若しくは抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む免疫原性組成物。
【請求項７０】
抗原が、例えば、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する細菌、菌類、寄生性微生物若しくは多細胞寄生生物を含むヒト若しくは非ヒト病原体、又はがん細胞若しくは腫瘍細胞に由来する、請求項69に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
抗原が、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫に由来し、例えば配列番号1の抗原である、請求項70に記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
抗原がマイコバクテリウム属の種に由来し、例えば配列番号2〜5のいずれか1つに由来する、請求項70に記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
抗原が水痘帯状疱疹ウイルスに由来し、例えば配列番号6の抗原である、請求項70に記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
抗原がヒト呼吸器多核体ウイルスに由来し、例えば配列番号7の抗原である、請求項70に記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
抗原がHIVに由来し、例えば配列番号8又は9の抗原である、請求項70に記載の免疫原性組成物。
【請求項７６】
抗原が無莢膜型インフルエンザ菌(NTHi)及び/又はモラクセラ・カタラーリスに由来する、請求項70に記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
抗原がポリペプチドとして提供される、請求項69から76のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
ポリペプチド抗原をコードするポリヌクレオチドが提供される、請求項69から76のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中の2018成分/QS-21主ピークの比を決定する方法であって、
(i)214nmでのUPLC-UV吸光度によりキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中の2018成分含量を決定するステップ、
(ii)214nmでのUPLC-UV吸光度によりキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中のQS-21主ピーク含量を決定するステップ、及び
(iii)2018成分含量をQS-21主ピーク含量と比較して2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、一般にサポニン抽出物、特にキラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)の抽出物、その製造方法及び関連する態様に関する。
【背景技術】
【０００２】
特に免疫原性の弱いサブユニットワクチンの場合、体液性及び細胞性免疫応答を改良するためにアジュバントをワクチンに含ませる。病原体による自然感染と同様に、アジュバントは、長期にわたる適応免疫を増進する先天性免疫系の活性化に依拠している。
【０００３】
Adjuvant System 01(AS01)は、2種類の免疫刺激剤、3-O-デスアシル-4'-モノホスホリルリピドA(3D-MPL)及びQS-21を含有するリポソームをベースとするアジュバントである(Garcon及びVan Mechelen、2011;Didierlaurentら、2017)。3D-MPLは、TLR4アゴニストであるサルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)由来のリポ多糖の非毒性誘導体であり、QS-21は南米の木キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮由来の天然のサポニン抽出物である(Kensilら、1991;Ragupathiら、2011)。AS01は、マラリアに対する最近開発されたワクチン(RTS,S - Mosquirix(登録商標))及び帯状疱疹(Herpes zoster)(HZ/su - Shingrix(登録商標))、並びに病原体、例えばヒト免疫不全ウイルス及び結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に対して開発中の多数の候補ワクチンに含まれている。
【０００４】
AS01の注入の結果、動物モデルにおいて先天性免疫の迅速且つ一時的な活性化が生じる。免疫化の際好中球及び単球が流入領域リンパ節(dLN)に迅速に補充される。更に、AS01が、T細胞活性化にとって必要なMHCIIhigh樹状細胞(DC)の補充及び活性化を誘発する(Didierlaurent A.M.ら、2014)。また、AS01の成分の作用機序に関する幾つかのデータも利用可能である。3D-MPLはTLR4を介して伝わってNF-κB転写活性及びサイトカイン産生を刺激し、ヒト及びマウスの両方で抗原提示細胞(APC)を直接活性化する(De Beckerら、2000;Ismailiら、2002;Martinら、2003;Mata-Haroら、2007)。QS-21は、マウスにおいて高い抗原特異的抗体応答及びCD8+ T細胞応答を(Kensil及びKammer、1998;Newmanら、1992;Soltysikら、1995)、そしてヒトにおいて抗原特異的抗体応答を(Livingstonら、1994)増進する。その物理的性質のため、QS-21はin vivoで危険信号として機能するかもしれないと考えられる(Lambrechtら、2009;Liら、2008)。QS-21はASC-NLRP3インフラマソーム及びその後のIL-1β/IL-18放出を活性化することが示されているが(Marty-Roix, R.ら、2016)、サポニンのアジュバント効果に関わる正確な分子経路はまだ明確に定義付けられていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒトの医薬として承認されている製品のあらゆる成分と同様に、QS-21の生産には、要求仕様を満たすことを保証するために、承認された製造プロセスを使用し、最終組成を注意深く制御することが必要とされる。現存するプロセスの修正には費用がかかり時間がかかる再確認が必要とされ、それでも仕様からの逸脱は廃棄の結果となる。QS-21の製造のための頑強な方法及び明確な組成のQS-21物質に対するニーズが引き続き存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、214nmでのUV吸光度により少なくとも93%のQS-21主ピーク及び0.25〜3%の2018成分を含有するサポニン抽出物を提供する。
【０００７】
また、214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の、負イオンエレクトロスプレー質量分析で1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、及び214nmでのUV吸光度により0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有するサポニン抽出物も提供される。
【０００８】
更に、214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の
【０００９】
【化１】
2021504424.tif 000002
2021504424.tif 000003
及び0.25〜3%の
【００１０】
【化２】
2021504424.tif 000004
を含有するサポニン抽出物が提供される。
【００１１】
更に、
(i)適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリスチレン樹脂を用いる逆相クロマトグラフィーによって抽出物を精製するステップ、及び
(iii)フェニル樹脂を用いる逆相クロマトグラフィーによって抽出物を精製するステップ
を含む、サポニン抽出物を製造する方法が提供される。
【００１２】
医薬の製造における本発明のサポニン抽出物の使用が提供される。
【００１３】
また、本発明のサポニン抽出物を含むアジュバント組成物及びワクチン組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】粗製の水性キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮抽出物のHPLCクロマトグラムである。
【図２】粗製の水性キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮抽出物のHPLC-UVクロマトグラムである。
【図３】粗製の水性キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮抽出物のUPLC-UVクロマトグラムである。
【図４】ポリスチレンで精製されたサポニン抽出物のUPLC-UVクロマトグラムである。
【図５】精製されたキラヤ・サポナリア・モリナサポニン抽出物のUPLC-UV/MSクロマトグラムである。
【図６】精製されたキラヤ・サポナリア・モリナサポニン抽出物のUPLC-UV/MSクロマトグラムの詳細である。
【図７】精製されたキラヤ・サポナリア・モリナサポニン抽出物の1988及び2002分子量イオンに対して抽出されたマスクロマトグラムである。
【図８】精製されたキラヤ・サポナリア・モリナサポニン抽出物の結合質量中心スペクトル(combined centroid spectrum)である。
【図９】gE AS01ワクチン接種したマウスにおける21日目でのCD4 T細胞応答である。
【図１０】gE AS01ワクチン接種したマウスにおける21日目での抗体応答である。
【図１１】gE AS01ワクチン接種したマウスにおける28日目での抗体応答である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
配列識別子の簡単な説明
配列番号1:RTSポリペプチド配列
配列番号2:結核菌(M. tuberculosis)H37Rv株Rv1196ポリペプチド配列
配列番号3:結核菌H37Rv株Rv0125ポリペプチド配列
配列番号4:M72融合ポリペプチド配列
配列番号5:M72-2his融合ポリペプチド配列
配列番号6:水痘帯状疱疹(Varicella zoster)ウイルストランケート化したgEポリペプチド配列
配列番号7:立体配座的に制限されたRSV PreF抗原ポリペプチド配列
配列番号8:HIV TV1 gp120ポリペプチド配列
配列番号9:HIV 1086.C gp120ポリペプチド配列
【００１６】
発明の詳細な説明
既に述べたように、ヒトの医薬として認可されている製品のあらゆる成分は、要求仕様を満たすことを保証するために、承認された製造プロセスを使用し、最終組成を慎重に制御することが必要とされる。仕様からの逸脱は廃棄の結果となる。しかしながら、安全性及び有効性の調査は規定された組成物の試験に依拠しており、したがって成分仕様の適合はリスクを導入する。現存するプロセスの修正には費用がかかり時間がかかる再確認が必要とされる。
【００１７】
本発明者らは、キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物の組成が、特に本明細書中で2018成分といわれる成分に関して変化し、現存の承認されている製造プロセスを適用することによって余分な2018成分を分離するのが困難であることを見出した。したがって、本発明は、明確な組成の粗製水性抽出物を使用することによって、一貫性のある精製抽出物を獲得する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、214nmでのUV吸光度により少なくとも93%のQS-21主ピーク及び0.25〜3%の2018成分を含有するサポニン抽出物、特に、最も豊富な化学種のモノアイソトープ(monoisotope)が1987.9m/zである、サポニン抽出物を提供する。サポニン抽出物は214nmでのUV吸光度により少なくとも98%のQS-21群を含有するのが適切である。典型的には、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度により1%以下のlyo不純物、殊に1%以下のQS-21群以外の最も大きいピークを含有する。
【００１９】
特に興味深いのは、214nmでのUV吸光度により少なくとも98%のQS-21群、少なくとも93%のQS-21主ピーク、0.25〜3%の2018成分、1%以下のQS-21群以外の最も大きいピークを含有するサポニン抽出物であり、最も豊富な化学種のモノアイソトープは1987.9m/zである。
【００２０】
また、214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、及び0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有するサポニン抽出物、特に、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、サポニン抽出物も提供される。望ましくは、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有する、B-異性体及びlyo不純物を除くトリテルペノイド配糖体、並びに0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有し、特に、最も豊富な化学種のモノアイソトープは1987.9m/zである。サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有するのが適切である。望ましくは、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有する、lyo不純物を除くトリテルペノイド配糖体を含有する。典型的には、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度により1%以下のlyo不純物を含有する。サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度により1%以下のその他のピークを含有するのが適切である。
【００２１】
特に興味深いのは、214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、1%以下のその他のピークを含有するサポニン抽出物であり、最も豊富な化学種のモノアイソトープは1987.9m/zであり、殊に、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有する、lyo不純物を除くトリテルペノイド配糖体、並びに少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有する、B-異性体及びlyo不純物を除くトリテルペノイド配糖体、0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、1%以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープは1987.9m/zである。
【００２２】
加えて、214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の
【００２３】
【化３】
2021504424.tif 000005
2021504424.tif 000006
及び0.25〜3%の
【００２４】
【化４】
2021504424.tif 000007
を含有するサポニン抽出物が提供され、特に、最も豊富な化学種のモノアイソトープは1987.9m/zである。サポニン抽出物は少なくとも98%の
【００２５】
【化５】
2021504424.tif 000008
2021504424.tif 000009
2021504424.tif 000010
を含有するのが適切である。サポニン抽出物は、98%の前述の成分及び2118成分を含有するのが適切である。典型的には、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度により1%以下の
【００２６】
【化６】
2021504424.tif 000011
殊に1%以下のその他のピークを含有する。
【００２７】
特に興味深いのは、214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の
【００２８】
【化７】
2021504424.tif 000012
2021504424.tif 000013
少なくとも93%の
【００２９】
【化８】
2021504424.tif 000014
2021504424.tif 000015
0.25〜3%の
【００３０】
【化９】
2021504424.tif 000016
1%以下のその他のピークを含有するサポニン抽出物であり、最も豊富な化学種のモノアイソトープは1987.9m/zである。殊に興味があるのは、214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の
【００３１】
【化１０】
2021504424.tif 000017
2021504424.tif 000018
2021504424.tif 000019
又は2118成分、
少なくとも93%の
【００３２】
【化１１】
2021504424.tif 000020
2021504424.tif 000021
0.25〜3%の
【００３３】
【化１２】
2021504424.tif 000022
1%以下のその他のピークを含有するサポニン抽出物であり、最も豊富な化学種のモノアイソトープは1987.9m/zである。
【００３４】
幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により決定して少なくとも65%、例えば少なくとも70%の1988成分を含有する。幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により決定して85%以下、例えば80%以下の1988成分を含有する。
【００３５】
幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により30%以下、例えば25%以下の1856成分を含有する。幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5%、例えば少なくとも10%、殊に少なくとも15%の1856成分を含有する。
【００３６】
幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により6%以下、例えば4%以下の2002成分を含有する。幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%の2002成分を含有する。
【００３７】
幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%、又は少なくとも2%の2018成分を含有する。
【００３８】
幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65%、例えば少なくとも70%の
【００３９】
【化１３】
2021504424.tif 000023
を含有する。
【００４０】
幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により30%以下、例えば25%以下の
【００４１】
【化１４】
2021504424.tif 000024
を含有する。幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5%、例えば少なくとも10%、殊に少なくとも15%の
【００４２】
【化１５】
2021504424.tif 000025
を含有する。
【００４３】
幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により10%以下、例えば5%以下の
【００４４】
【化１６】
2021504424.tif 000026
を含有する。幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%の
【００４５】
【化１７】
2021504424.tif 000027
を含有する。
【００４６】
幾つかの実施形態において、サポニン抽出物は、214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%、又は少なくとも2%の
【００４７】
【化１８】
2021504424.tif 000028
を含有する。
【００４８】
Quil Aは、南米の木キラヤ・サポナリア・モリナから単離されたサポニン調製物であり、1974年Dalsgaardらによりアジュバント活性を有すると最初に記載された("Saponin adjuvants"、Archiv. fur die gesamte Virusforschung、44巻、Springer Verlag、Berlin、243〜254頁)。Quil Aに関連する毒性をもたずにアジュバント活性を保持するQuil Aの精製された画分がHPLCにより単離されている(例えば、欧州特許第03622789号参照)。様々な画分、例えばQS-7、QS-17、QS-18及びQS-21がアジュバント活性を有することが見出されているが、その毒性はかなり変化する。
【００４９】
用語「サポニン抽出物」は、本明細書で使用される場合、キラヤ・サポナリア・モリナの抽出物を意味する。
【００５０】
用語「トリテルペノイド配糖体」は、本明細書で使用される場合、グリコシド結合を介して結合された糖類により誘導体化されたトリテルペノイドコアを有する実体を意味する。
【００５１】
本明細書において幾つかの構造がMS/MSにより決定されており、幾つかの分岐立体化学及び異性体の糖化学種(例えばアピオース及びキシロース)を識別する際のこの技術の制限は、幾つかの構造は推定上のものであり仮定された保存コアに基づいていることを意味している。したがって、推定上の構造は、その推定上の構造が何らかの理由で正しくない場合、他の方法で確認されている成分の実際の構造を意味するべきである。
【００５２】
用語「2018成分」は、図6で「2018ピーク」と同定されているトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法における2018成分はおよそ4.5分の保持時間を有し、2017.9のモノアイソトピック分子量を有するピークの主成分であるのが適切である。2018成分はまた、本明細書に記載されているUPLC-UV方法において保持時間およそ5.8分とも同定され得る。この主要な2018成分はMS/MSにより次の推定上の構造を有することが確認されている。
【００５３】
【化１９】
2021504424.tif 000029
【００５４】
用語「1988成分」は、図6でQS-21主ピークの一部として同定され、1987.9のモノアイソトピック分子量を有するトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法における1988成分はおよそ4.4分の保持時間及び1987.9のモノアイソトピック分子量を有するのが適切である。この1988成分はQS-21A V1:
【００５５】
【化２０】
2021504424.tif 000030
及びQS-21A V2
【００５６】
【化２１】
2021504424.tif 000031
からなり得る。
【００５７】
用語「1856成分」は、図6でQS-21主ピークの一部として同定され、1855.9のモノアイソトピック分子量を有するトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法における1856成分はおよそ4.4分の保持時間及び1855.9のモノアイソトピック分子量を有するのが適切である。この1856成分は
【００５８】
【化２２】
2021504424.tif 000032
からなり得る。
【００５９】
用語「2002成分」は、図6でQS-21主ピークの一部として同定され、2001.9のモノアイソトピック分子量を有するトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法における2002成分はおよそ4.4分の保持時間及び2001.9のモノアイソトピック分子量を有するのが適切である。この2002成分はMS/MSにより推定上の構造:
【００６０】
【化２３】
2021504424.tif 000033
を有することが確認されている。
【００６１】
用語「lyo不純物」は、図6で「凍結乾燥ピーク」と同定されているトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法におけるlyo不純物はおよそ4.7分の保持時間を有し、ピークの主成分は1855.9のモノアイソトピック分子量を有するのが適切である。この主要なlyo不純物はMS/MSにより推定上の構造:
【００６２】
【化２４】
2021504424.tif 000034
を有することが確認されている。
【００６３】
用語「B-異性体」は、図6で「B-異性体」と同定されているトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法におけるB-異性体はおよそ4.0分の保持時間を有し、ピークの主成分は1987.9のモノアイソトピック分子量を有するのが適切である。この主要なB-異性体成分はMS/MSにより推定上の構造:
【００６４】
【化２５】
2021504424.tif 000035
を有することが確認されている。
【００６５】
用語「1518成分」は、図6で「1518ピーク」と同定されているトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法における1518成分はおよそ4.2分の保持時間を有し、ピークの主成分は1517.7のモノアイソトピック分子量を有するのが適切である。この主要な1518成分はMS/MSにより推定上の構造:
【００６６】
【化２６】
2021504424.tif 000036
を有することが確認されている。
【００６７】
用語「1712成分」は、図6で「1712ピーク」と同定されているトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法における1712成分はおよそ4.6分の保持時間を有し、ピークの主成分は1711.8のモノアイソトピック分子量を有するのが適切である。この主要な1712成分はMS/MSにより推定上の構造:
【００６８】
【化２７】
2021504424.tif 000037
を有することが確認されている。
【００６９】
用語「2118成分」は、図6で「4.607」と同定されているトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法における2118成分はおよそ4.6の保持時間を有し、ピークの主成分は2118のモノアイソトピック分子量を有するのが適切である。
【００７０】
用語「QS-21主ピーク」は、図6で「QS-21」と同定されているトリテルペノイド配糖体を意味する。本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法におけるQS-21主ピークはおよそ4.4分の保持時間並びに1855.9、1987.9及び2001.9m/zの分子量成分を有するのが適切である。このQS-21主ピークは、QS-21A V1:
【００７１】
【化２８】
2021504424.tif 000038
QS-21A V2:
【００７２】
【化２９】
2021504424.tif 000039
1856成分:
【００７３】
【化３０】
2021504424.tif 000040
及び
2002成分:
【００７４】
【化３１】
2021504424.tif 000041
からなり得る。
【００７５】
用語「QS-21群」は、本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法においてB-異性体からlyo不純物に先行するピークまでのおよそ4.0分〜およそ4.7分の保持時間を有するとして同定され、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118の主要なモノアイソトピック分子量を有するトリテルペノイド配糖体を意味する。QS-21群は、QS-21A V1:
【００７６】
【化３２】
2021504424.tif 000042
QS-21A V2:
【００７７】
【化３３】
2021504424.tif 000043
1856成分:
【００７８】
【化３４】
2021504424.tif 000044
2002成分:
【００７９】
【化３５】
2021504424.tif 000045
2018成分:
【００８０】
【化３６】
2021504424.tif 000046
B-異性体:
【００８１】
【化３７】
2021504424.tif 000047
1518成分:
【００８２】
【化３８】
2021504424.tif 000048
1712成分:
【００８３】
【化３９】
2021504424.tif 000049
及び
2118成分
からなり得る。
【００８４】
用語「QS-21群以外の最も大きいピーク」は、本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法で検出可能な、QS-21群の一部ではないUVによる最も大きいピークを意味する。
【００８５】
用語「先行するピーク」は、本明細書に記載されているHPLC-UV方法におけるQS-21主ピークの直前の先行するピークを意味する(図2参照)。
【００８６】
用語「m/z」は、モノアイソトープピークの質量対電荷比を意味する。他に規定しない限り、「m/z」は、負イオンエレクトロスプレー質量分析で決定される。
【００８７】
用語「イオン存在量」は、試料中、又は状況によって必要な場合は所与のピークで測定される規定のm/zの量を意味する。規定されたm/zに対するマスクロマトグラムは本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法におけるMS全イオンクロマトグラムから引き出すことができる。マスクロマトグラムは信号強度を時間に対してプロットしたものである。イオン存在量は積分ピークの面積として測定される。規定のm/zに対する面積/相対参照m/zに対する面積=相対存在量。
【００８８】
用語「214nmでのUV吸光度」は、UV吸光度クロマトグラムにおける積分ピークの面積を意味する。(規定のピークに対する面積)/(クロマトグラムにおける全積分ピークの面積)×100=規定のピークに対する面積百分率。
【００８９】
用語「214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量」は、共流出する化学種に対する所与のm/zの割合に対する推定値を意味する。(所与のUVピークに対する面積百分率)×(所与のピーク中の興味があるm/zに対する相対イオン存在量)/(所与のピークに対する全相対イオン存在量の合計)=所与のUVピーク中の興味があるm/zの割合は、全ての共流出する化学種に対して含まれる相対イオン存在量を仮定している。
【００９０】
用語「最も豊富な化学種のモノアイソトープが1988m/zである」とは、m/zに付き最も高い反応の同位体群内の第1のピークである最も豊富な化学種のモノアイソトープはm/zが1987.9であることを意味する。最も豊富な化学種は、本明細書に記載されているUPLC-UV/MS方法(負イオンエレクトロスプレー)を用いて全イオンクロマトグラム全体にわたって結合スペクトルを作成することによって決定することができる。
【００９１】
用語「乾燥した」は、実質的に全ての溶媒が除去されていることを意味する。乾燥した抽出物は通例5%未満(w/w)の溶媒(例えば5%未満(w/w)の水)を含有する。乾燥した抽出物は100ppm以下(w/w)のアセトニトリルを含有するのが適切である。
【００９２】
更に、
(i)適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、及び
(iii)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ
を含む、サポニン抽出物を製造する方法が提供される。
【００９３】
望ましくは、方法は、
(i)適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)抽出物をポリビニルピロリドン吸着により精製するステップ、
(iii)抽出物を透析ろ過、限外ろ過又は透析により精製するステップ、
(iv)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、及び
(v)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ
を含み、
ステップ(ii)及び(iii)は場合により逆の順序であってもよく、又は同時に行われてもよいが、通例示された順序である。
【００９４】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物は水性抽出により得られる(しかし、水性形態である必要はなく、例えばその後乾燥されてもよく、溶媒交換に供されてもよく、又は異なる溶媒中に再構成されてもよい)。用語「適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物」は、2018成分対QS-21主ピークの比が0.075以下、特に0.064以下(214nmでのUPLC-UV吸光度により決定される)である抽出物を意味する。望ましくは、2018成分/QS-21主ピークの比は214nmでのUV吸光度により測定して少なくとも0.005、例えば少なくとも0.01である。
【００９５】
先行するピーク対QS-21主ピークの比は0.45以下、特に0.4以下であるのが適切である(214nmでのHPLC-UV吸光度により決定される)。先行するピーク対QS-21主ピークの比は0.05以上、特に0.1以上であり得る(214nmでのHPLC-UV吸光度により決定される)。
【００９６】
通例粗製水性抽出物は樹皮抽出物である。キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物の水溶液中のQS-21主ピーク含量は少なくとも1g/L、例えば少なくとも2g/L、殊に少なくとも2.5g/L、特に少なくとも2.8g/Lであるのが適切である(例えばUV吸光度により既知の濃度の対照試料に対して決定される)。
【００９７】
適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップは、組成物を試験して2018成分含量を決定することを含むのが適切である。
【００９８】
抽出物をポリビニルピロリドン吸着により精製するステップは、抽出物をポリビニルピロリドン樹脂で処理することを含む。通例抽出物をポリビニルピロリドン樹脂と共に掻き混ぜる。抽出物はその後、不純物が吸着したポリビニルピロリドン樹脂からろ過により分離してもよい。方法のこのステップは一般にポリフェノール性不純物、例えばタンニンを除去する。
【００９９】
透析ろ過、限外ろ過又は透析により抽出物を精製するステップは、通例接線流を用いる透析ろ過による精製が適切である。膜の適当な例は30kDaカットオフである。方法のこのステップは一般に塩、糖類及びその他の低分子量物質を除去する。
【０１００】
ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップは、通例、通常は適切な酸、例えば酢酸で酸性化された、アセトニトリル及び水を溶媒として使用する。適切な樹脂の例はAmberchrom XT20である。クロマトグラフィーはアイソクラティック条件を用いて行ってもよいが、通例は溶媒勾配(連続、例えば直線、又は段階的)下で、例えば実施例に挙げられているようにして作動させる。方法のこのステップは一般に非サポニン物質を除去し、所望のサポニンを富化する。選択された画分をプールして、所要の基準(通例%QS-21≧18%、HPLC-UV後のUV吸光度により決定、及び2018/QS-21比≦0.054、UPLC-UV後のUV吸光度により決定)に適合する物質の収量を最大化し得る。各々のポリスチレンクロマトグラフィーランは通例25〜200gの間のQS-21、例えば50〜150gの間、特に70〜110gの間の規模である(量はUVによる物質中のQS-21主ピーク含量に基づく)。
【０１０１】
フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーによる抽出物の精製では通例、通常適切な酸、例えば酢酸で酸性化されたアセトニトリル及び水を溶媒として使用する。クロマトグラフィーは溶媒勾配(連続、例えば直線、又は段階的)を用いて行ってもよいが、通例アイソクラティック条件で作動させる。方法のこのステップは所望のサポニンの最終精製を提供する。選択された画分をプールして、所要の基準(通例%QS-21群≧98.5、%QS-21主ピーク≧94.5、2002/1988≦0.027、%2018≦2.7%、QS-21群以外の主ピーク≦1%、UPLC-UV/MSにより決定)に適合する物質の収量を最大化し得る。各々のフェニルクロマトグラフィーランは通例4〜40gの間のQS-21、例えば10〜30gの間、特に13〜21gの間の規模である(量はUVによる物質中のQS-21主ピーク含量に基づく)。
【０１０２】
方法は、溶媒を除去して乾燥したサポニン抽出物を提供する更なるステップを含み得る。したがって、本発明は、
(i)適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、
(iii)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、及び
(iv)溶媒を除去して乾燥したサポニン抽出物を提供するステップ
を含む、サポニン抽出物を製造する方法を提供する。
【０１０３】
本発明はまた、
(i)適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリビニルピロリドン吸着により抽出物を精製するステップ、
(iii)透析ろ過、限外ろ過又は透析により抽出物を精製するステップ、
(iv)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、
(v)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、及び
(vi)溶媒を除去して乾燥したサポニン抽出物を提供するステップ
を含む、サポニン抽出物を製造する方法であって、ステップ(ii)及び(iii)は場合により逆の順序であってもよく、又は同時に行われてもよいが、通例示された順序である、方法も提供する。
【０１０４】
乾燥効率を改良するために、乾燥ステップに先立って、例えば適当な技術、例えば逆相クロマトグラフィー(例えばC8樹脂を用いる)を用いる捕獲及び解放により抽出物を濃縮する、並びに/又は溶媒を交換するという更なるステップを実施するのが望ましいであろう。
【０１０５】
また、
(i)適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリビニルピロリドン吸着により抽出物を精製するステップ、
(iii)透析ろ過、限外ろ過又は透析により抽出物を精製するステップ、
(iv)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、
(v)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、
(vi)場合により、抽出物を濃縮するステップ、
(vii)場合により、溶媒を交換するステップ、及び
(viii)残留する溶媒を除去して乾燥したサポニン抽出物を提供するステップ
を含む、サポニン抽出物を製造する方法であって、ステップ(vi)及び(vii)は場合により逆の順序であってもよく、又は同時に行われてもよいが、通例示された順序である、方法も提供される。
【０１０６】
また、
(i)適切な2018成分組成を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリビニルピロリドン吸着により抽出物を精製するステップ、
(iii)透析ろ過、限外ろ過又は透析により抽出物を精製するステップ、
(iv)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、
(v)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、
(vi)C8樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を濃縮するステップ、
(vii)溶媒を交換するステップ、及び
(viii)残留する溶媒を除去して乾燥したサポニン抽出物を提供するステップ
を含む、サポニン抽出物を製造する方法も提供される。
【０１０７】
抽出物の濃縮は任意の適切な技術を用いて行うことができる。例えば、濃縮は捕獲及び解放方法、例えば、特にC8樹脂を用いる逆相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。逆相クロマトグラフィーでは通例、通常適切な酸、例えば酢酸で酸性化された、アセトニトリル及び水を溶媒として使用する。クロマトグラフィーは通例溶媒勾配下で作動させられ、サポニン抽出物は低有機溶媒中に捕獲され、高有機溶媒、特に段階的溶媒勾配に溶離される。
【０１０８】
溶媒の交換は任意の適切な技術、特に透析ろ過、限外ろ過又は透析、殊に透析ろ過を用いて行うことができる。溶媒交換は例えば、例えば国際公開第2014016374号に記載されているアセトニトリル含量を低下するのに有用であり得る。適切な膜はサポニン抽出物を保持しながら溶媒交換を可能とするように選択され得、例えば1kDa膜であり得る。
【０１０９】
溶媒を除去することによる乾燥は、任意の適切な手段、特に凍結乾燥により行うことができる。乾燥中、サポニン抽出物の劣化が起こる可能性があり、lyo不純物の生成を引き起こす可能性がある。したがって、例えば乾燥温度及び/又は乾燥時間を限定することにより、lyo不純物の生成を制限する条件下で乾燥するのが望ましい。溶媒の除去は単一の凍結乾燥プロセスによって行われるのが適切である。必要とされる乾燥の程度は溶媒の性質に依存し、例えば薬学的に許容できない溶媒は高度に除去するのが望ましく、一方幾らかの薬学的に許容できる溶媒(例えば水)はそれより少ない程度に除去することができる。
【０１１０】
本発明の方法は、25〜1000gの間のQS-21、例えば50〜500gの間、特に100〜500gの間の規模で行われるのが適切である(量はUVによる物質中のQS-21主ピーク含量に基づく)。
【０１１１】
また、精製されたサポニン抽出物、例えば本発明のサポニン抽出物の製造に使用するためのキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を同定する方法も提供され、前記方法は、
(i)214nmでのUPLC-UV吸光度により2018成分対QS-21主ピークの比を決定するステップ、
(ii)0.075以下の2018成分対QS-21主ピークの比を有する粗製抽出物を選択するステップ
を含む。
【０１１２】
1つの実施形態において、ステップ(ii)で選択される粗製水性抽出物は0.064以下の2018成分対QS-21主ピークの比を有する。
【０１１３】
本発明はまた、キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中の2018成分対QS-21主ピークの比を決定する方法も提供し、前記方法は、
(i)キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中の2018成分含量を214nmでのUPLC-UV吸光度により決定するステップ、
(ii)キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中のQS-21主ピーク含量を214nmでのUPLC-UV吸光度により決定するステップ、及び
(iii)2018成分含量をQS-21主ピーク含量と比較して2018成分対QS-21主ピークの比を決定するステップ
を含む。
【０１１４】
医薬の製造における本発明のサポニン抽出物の使用が提供される。更に、医薬として、特にアジュバントとして使用するための本発明のサポニン抽出物が提供される。また、本発明のサポニン抽出物を含むアジュバント組成物も提供される。
【０１１５】
本発明のサポニン抽出物は、更なるアジュバント、例えばTLR4アゴニスト、特にリポ多糖TLR4アゴニスト、例えばリピドA誘導体、殊にモノホスホリルリピドA、例えば3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)と組み合わせてもよい。モノホスホリルリピドA(3D-MPL)。3D-MPLはGlaxoSmithKline Biologicals N.A.により「MPL」という名称で販売されており、文書を通じて3D-MPLと称されている。例えば、米国特許第4,436,727号、同第4,877,611号、同第4,866,034号及び同第4,912,094号参照。3D-MPLは英国特許出願公開第2 220 211号に記載されている方法に従って製造することができる。化学的にはそれは、4、5又は6つのアシル化された鎖を有する3-脱アシル化されたモノホスホリルリピドAの混合物である。
【０１１６】
本発明で役に立ち得る他のTLR4アゴニストとしては、例えば国際公開第2008/153541号若しくは国際公開第2009/143457号又は文献論文Coler RNら、(2011)、Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant.、PLoS ONE、6(1): e16333.、doi:10.1371/journal.pone.0016333及びArias MAら、(2012)、Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140.、PLoS ONE、7(7): e41144.、doi:10.1371/journal.pone.0041144に記載されているグルコピラノシル脂質アジュバント(GLA)がある。国際公開第2008/153541号又は国際公開第2009/143457号は、本発明で役に立ち得るTLR4アゴニストを規定する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
アジュバントの典型的な成人ヒト用量はヒト用量当たり1〜100ugの間の量でサポニン抽出物を含む。サポニン抽出物は約50ugのレベルで使用できる。適切な範囲の例は40〜60ug、適切には45〜55ug又は49〜51ug、例えば50ugである。更なる実施形態において、ヒト用量は約25ugのレベルでサポニン抽出物を含む。より低い範囲の例として20〜30ug、適切には22〜28ug又は24〜26ug、例えば25ugがある。小児向けに意図されたヒト用量は成人向けに意図されたものと比較して低減し得る(例えば50%低減)。
【０１１８】
TLR4アゴニスト、例えばリポ多糖、例えば3D-MPLはヒト用量当たり1〜100ugの間の量で使用することができる。3D-MPLは約50ugのレベルで使用できる。適切な範囲の例は40〜60ug、適切には45〜55ug又は49〜51ug、例えば50ugである。更なる実施形態において、ヒト用量は約25ugのレベルで3D-MPLを含む。より低い範囲の例として20〜30ug、適切には22〜28ug又は24〜26ug、例えば25ugがある。小児向けに意図されたヒト用量は成人向けに意図されたものと比較して低減し得る(例えば50%低減)。
【０１１９】
TLR4アゴニスト及びサポニン抽出物の両方がアジュバント中に存在する場合、TLR4アゴニスト対サポニンの重量比は1:5〜5:1の間、適切には1:1であるのが適している。例えば、3D-MPLが50ug又は25ugの量で存在する場合、適切にはQS-21もヒト用量当たり50ug又は25ugの量で存在するとよい。
【０１２０】
アジュバントはまた、適切な担体、例えばエマルション(例えば水中油エマルション)又はリポソームも含むことができる。
【０１２１】
リポソーム
用語「リポソーム」は当技術分野で周知であり、水性の空間を取り囲む1つ以上の脂質二重層を含む小胞の一般的カテゴリーを規定する。それ故、リポソームは1つ以上の脂質及び/又はリン脂質二重層からなり、その構造中に他の分子、例えばタンパク質又は炭水化物を含有することができる。脂質及び水性相が両方とも存在するので、リポソームは水溶性の物質、脂溶性の物質、及び/又は両親媒性の化合物をカプセル化又は封じ込めることができる。
【０１２２】
リポソームのサイズはリン脂質の組成及びその調製に使用した方法に応じて30nmから数umまで変化し得る。
【０１２３】
本発明で役に立つリポソームは、(サポニン及び場合によりTLR4アゴニストと共に)DOPCを含有するか、又は、DOPC及びステロールから本質的になるのが適切である。
【０１２４】
本発明において、リポソームのサイズは50nm〜200nm、殊に60nm〜180nm、例えば70〜165nmの範囲である。最適には、リポソームは安定であっておよそ100nmの直径を有していてろ過による便利な滅菌が可能であるべきである。
【０１２５】
リポソームの構造完全性は、リポソームのサイズ(Z平均直径、Zav)及び多分散性を測定する動的光散乱(DLS)のような方法により、又は、リポソームの構造解析のための電子顕微鏡法により評価することができる。1つの実施形態において、平均粒径は95〜120nmの間であり、及び/又は、多分散性(PdI)指数は0.3以下(例えば0.2以下)である。
【０１２６】
更なる添加物(賦形剤)
更なる実施形態において、緩衝剤が組成物に加えられる。液体調製物のpHは、組成物の成分及び対象への投与に対する必要な適合性を考慮して調節される。液体混合物のpHは少なくとも4、少なくとも5、少なくとも5.5、少なくとも5.8、少なくとも6であるのが適切である。液体混合物のpHは9未満、8未満、7.5未満又は7未満でよい。他の実施形態において、液体混合物のpHは4〜9の間、5〜8の間、例えば5.5〜8の間である。それ故、pHは6〜9の間、例えば6.5〜8.5であるのが適切である。特に好ましい実施形態において、pHは5.8〜6.4の間である。
【０１２７】
適当な緩衝剤は酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩及びTRISから選択し得る。1つの実施形態において、緩衝剤はリン酸緩衝液、例えばNa/Na2PO4、Na/K2PO4又はK/K2PO4である。
【０１２８】
緩衝剤は少なくとも6mM、少なくとも10mM又は少なくとも40mMの量で液体混合物中に存在することができる。緩衝剤は100mM未満、60mM未満又は40mM未満の量で液体混合物中に存在することができる。
【０１２９】
周知のように、非経口投与用の溶液は細胞の変形又は溶解を回避するために薬学的に許容できるオスモル濃度を有するべきである。薬学的に許容できるオスモル濃度とは、一般に、溶液がおおよそ等張又はやや高張のオスモル濃度を有することを意味する。組成物(乾燥形態で提示されたならば、再構成された場合)は250〜750mOsm/kgの範囲のオスモル濃度を有するのが適切であり、例えばオスモル濃度は250〜550mOsm/kgの範囲、例えば280〜500mOsm/kgの範囲でよい。特に好ましい実施形態において、オスモル濃度は280〜310mOsm/kgの範囲でよい。オスモル濃度は当技術分野で公知の技術に従って、例えば商業的に入手可能な浸透圧計、例えばAdvanced Instruments Inc.(USA)から入手可能なAdvanced(登録商標)Model 2020を使用して測定することができる。
【０１３０】
「等張剤」は、生理学的に容認され、製剤と接触する細胞膜を横切る正味の水の流れを防ぐのに適した張度を製剤に付与する化合物である。幾つかの実施形態において、組成物に使用される等張剤は塩(又は塩の混合物)であり、塩は塩化ナトリウムであるのが便利であり、およそ150nMの濃度が適切である。しかし、他の実施形態において、組成物は非イオン性の等張剤を含み、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は100mM未満、例えば80mM未満、例えば50mM未満、例えば40mM未満、30mM未満、殊に20mM未満である。組成物中のイオン強度は100mM未満、例えば80mM未満、例えば50mM未満、例えば40mM未満又は30mM未満であり得る。
【０１３１】
特定の実施形態において、非イオン性の等張剤はポリオール、例えばショ糖及び/又はソルビトールである。ソルビトールの濃度は、例えば約3%〜約15%(w/v)の間、例えば約4%〜約10%(w/v)の間であり得る。免疫学的に活性なサポニン画分及びTLR4アゴニストを含み、等張剤が塩又はポリオールであるアジュバントは国際公開第2012/080369号に記載されている。
【０１３２】
0.05ml〜1mlの間、例えば0.1〜0.5mlの間のヒト用量容積、特に約0.5ml、又は0.7mlの用量容積が適切である。使用される組成物の容積は送達経路及び位置に依存し得、皮内経路ではより小さい用量が使われる。単位用量容器は、単位用量の投与中の物質の的確な操作を可能にするために過多量を含有することがある。
【０１３３】
サポニン:DOPCの比率は通例1:50〜1:10(w/w)の程度、適切には1:25〜1:15(w/w)の間、好ましくは1:22〜1:18(w/w)、例えば1:20(w/w)である。
【０１３４】
サポニンは、外因性のステロール、例えばコレステロールを用いてクエンチされる反応原性の(reactogenic)より少ない組成物として提示されるのが適切である。コレステロールはMerck Index、第13版、381頁に獣脂中に見られる天然に存在するステロールとして開示されている。コレステロールは式(C27H46O)を有し、(3β)-コレスタ-5-エン-3-オールともいわれる。
【０１３５】
サポニン:ステロールの比率は通例1:100〜1:1(w/w)の程度、適切には1:10〜1:1(w/w)の間、好ましくは1:5〜1:1(w/w)である。過剰のステロールが存在するのが適切であり、サポニン:ステロールの比率は少なくとも1:2(w/w)である。1つの実施形態において、サポニン:ステロールの比率は1:5(w/w)である。1つの実施形態において、ステロールはコレステロールである。
【０１３６】
リポソームの量(脂質及びステロールの重量)は通例組成物のヒト用量当たり0.1mg〜10mgの範囲、特に組成物のヒト用量当たり0.5mg〜2mgである。
【０１３７】
特に適切な実施形態において、本発明で使用されるリポソームはDOPC及びステロール、特にコレステロールを含む。したがって、特定の実施形態において、本発明で使用される組成物はリポソームの形態でサポニン抽出物を含み、前記リポソームはDOPC及びステロール、特にコレステロールを含む。
【０１３８】
抗原
本発明に従って調製されるアジュバントは免疫原又は抗原と併せて利用することができる。幾つかの実施形態において、免疫原又は抗原をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【０１３９】
アジュバントは免疫原若しくは抗原とは別に投与してもよいし、又は製造中若しくはその場で併用投与のための免疫原性組成物として免疫原若しくは抗原と組み合わせてもよい。
【０１４０】
したがって、免疫原若しくは抗原、又は免疫原若しくは抗原をコードするポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物の調製方法が提供され、前記方法は、
(i)本発明のサポニン抽出物を含むアジュバント組成物を調製するステップ、
(ii)免疫原若しくは抗原、又は免疫原若しくは抗原をコードするポリヌクレオチドとアジュバントを混合するステップを
含む。
【０１４１】
また、医薬の製造における本発明のサポニン抽出物を含むアジュバントの使用も提供される。医薬は免疫原若しくは抗原、又は免疫原若しくは抗原をコードするポリヌクレオチドを含むのが適切である。
【０１４２】
更に、医薬として使用するための本発明のサポニン抽出物を含むアジュバントが提供される。医薬は免疫原若しくは抗原、又は免疫原若しくは抗原をコードするポリヌクレオチドを含むのが適切である。
【０１４３】
用語免疫原とは、免疫応答を引き起こすことができるポリペプチドを意味する。免疫原は、少なくとも1つのB又はT細胞エピトープを含む抗原であるのが適切である。引き起こされる免疫応答は、中和抗体を生成する抗原特異的なB細胞応答であってもよい。引き起こされる免疫応答は、全身性及び/又は局所応答であり得る抗原特異的なT細胞応答であってもよい。抗原特異的なT細胞応答は、CD4+ T細胞応答、例えば複数のサイトカイン、例えばIFNガンマ、TNFアルファ及び/又はIL2を発現するCD4+ T細胞が関与する応答を含み得る。代わりに、又は加えて、抗原特異的なT細胞応答はCD8+ T細胞応答、例えば複数のサイトカイン、例えばIFNガンマ、TNFアルファ及び/又はIL2を発現するCD8+ T細胞が関与する応答を含む。
【０１４４】
抗原は、ヒト若しくは非ヒト病原体、例えば、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する細菌、菌類、寄生性微生物若しくは多細胞寄生生物、又はがん細胞若しくは腫瘍細胞に由来し得る(例えばそれらから得ることができる)。
【０１４５】
1つの実施形態において、抗原は組換えタンパク質、例えば組換え原核生物タンパク質である。
【０１４６】
1つの実施形態において、抗原は、マラリア原虫(Plasmodium spp.)(例えば熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum))、マイコバクテリウム属の種(Mycobacterium spp.)(例えば結核菌(TB))、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ヒト呼吸器多核体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、モラクセラ属の種(Moraxella spp.)(例えばモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis))又は無莢膜型インフルエンザ菌(nontypable Haemophilus influenzae)(ntHi)に由来する。
【０１４７】
抗原は、マラリアを引き起こす寄生生物、例えば熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)に由来する調製物を含み得るか又はそれからなり得る。
【０１４８】
1つの実施形態において、抗原は熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲(CS)タンパク質又はその変異体でよい。CSタンパク質の適切な変異体は、CSタンパク質の一部がB型肝炎の表面抗原S(HBsAg)とのハイブリッドタンパク質の形態である変異体であり得る。CS変異体抗原は例えばCSタンパク質の実質的に全てのC末端部分、CSタンパク質免疫優性領域の4つ以上のタンデム反復配列、及びHBsAgを含むハイブリッドタンパク質の形態であり得る。ハイブリッドタンパク質は、少なくとも160個のアミノ酸を含有し、CSタンパク質のC末端部分と実質的に相同であるが疎水性のアンカー配列を欠く配列を含み得る。CSタンパク質はC末端の最後の12個のアミノ酸を欠いていてもよい。更に、4個以上、例えば10個以上のAsn-Ala-Asn-Proテトラペプチド(NANP)反復モチーフを含有していてもよい。
【０１４９】
本発明で使用されるハイブリッドタンパク質は、線状のリンカーを介してHBsAgのN末端にインフレームで融合したNF54株由来の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)クローン3D7のアミノ酸207〜395に実質的に対応する熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク質の一部分を含むタンパク質でよい。リンカーはHBsAg由来のpreS2の一部分を含み得る。本発明で使用するのに適切なCS構築体は、米国では米国特許第5,928,902号及び同第6,169,171号(いずれも、本発明で使用するのに適切なタンパク質を説明する目的で参照により組み込まれる)として特許された国際公開第93/10152号に概説されている。
【０１５０】
本発明で使用される特定のハイブリッドタンパク質は、RTSとして公知のハイブリッドタンパク質であり(配列番号1、国際公開第2015/150568号、国際公開第93/10152号(RTS*と表示されている)及び国際公開第98/05355号にも記載されている)、これは
-  メチオニン残基
-  3個のアミノ酸残基Met Ala Pro
-  熱帯熱マラリア原虫3D7株のCSタンパク質のアミノ酸207〜395を表す一続きの189個のアミノ酸
-  グリシン残基
-  B型肝炎ウイルス(adw血清型)preS2タンパク質の4個のカルボキシ末端残基を表す4個のアミノ酸残基Pro VaI Thr Asn、及び
-  ヌクレオチド1653〜2330によりコードされており、B型肝炎ウイルス(adw血清型)のSタンパク質を規定する一続きの226個のアミノ酸
からなる。
【０１５１】
RTSはRTS,S混合粒子の形態であり得る。RTS,S粒子は2つのポリペプチドRTS及びSを含んでおり、同時に合成され得、自発的に複合の微粒子状構造(RTS,S)を形成し得る。
【０１５２】
抗原はマイコバクテリウム属の種、例えばウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)又は結核菌、特に結核菌に由来する調製物を含み得るか又はそれからなり得る。
【０１５３】
結核の分野で興味のある抗原としてRv1196及びRv0125がある。Rv1196(例えば、Dillonら、Infection and Immunity、1999、67(6): 2941〜2950にMtb39aという名称で記載されている)は、H37Rv、C、Haarlem、CDC1551、94-M4241A、98-R604INH-RIF-EM、KZN605、KZN1435、KZN4207、KZNR506株、単一の点突然変異Q30Kを有するF11株(殆どの他の臨床分離株が90%を超えるH37Rvとの同一性を有する)にわたって100%の配列同一性で高度に保存されている。Rv0125(例えば、Skeikyら、Infection and Immunity、1999、67(8): 3998〜4007にMtb32aという名称で記載されている)も、多くの株にわたって100%の配列同一性で高度に保存されている。全長Rv0125はN末端シグナル配列を含んでおり、これは開裂されて成熟タンパク質を生じる。
【０１５４】
1つの実施形態において、抗原はRv1196に由来し、例えば配列番号2と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも80%、特に少なくとも90%、殊に少なくとも95%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%の同一性を有する配列を含み、例えばそれからなる。典型的なRv1196関連抗原は少数の欠失、挿入及び/又は置換を有する配列番号2の誘導体を含む(例えばそれからなる)。例は、0〜5の位置に5個までの残基の欠失、0〜5の5つの位置に5個までの残基の挿入及び20個までの残基の置換を有するものである。Rv1196の他の誘導体は、配列番号2の断片であって、少なくとも200個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも250個のアミノ酸の長さ、特に少なくとも300個のアミノ酸の長さ、殊に少なくとも350個のアミノ酸の長さである断片を含む(例えばそれからなる)ものである。
【０１５５】
1つの実施形態において、抗原はRv0125に由来し、例えば配列番号3と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも80%、特に少なくとも90%、殊に少なくとも95%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%の同一性を有する配列を含み、例えばそれからなる。典型的なRv0125関連抗原は少数の欠失、挿入及び/又は置換を有する配列番号3の誘導体を含む(例えばそれからなる)。例は0〜5の位置に5個までの残基の欠失、0〜5の5つの位置に5個までの残基の挿入及び20個までの残基の置換を有するものである。Rv0125の他の誘導体は配列番号3の断片であって、少なくとも150個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも200個のアミノ酸の長さ、特に少なくとも250個のアミノ酸の長さ、殊に少なくとも300個のアミノ酸の長さである断片を含む(例えばそれからなる)ものである。Rv0125の特定の誘導体は配列番号3の残基1〜195に対応する配列番号3の断片を含む(例えばそれからなる)ものである。Rv0125の更なる免疫原性誘導体は配列番号3の残基192〜323に対応する配列番号3の断片を含む(例えばそれからなる)ものである。特に好ましいRv0125関連抗原は、触媒三残基の少なくとも1個(例えば1個、2個又は更には3個全部)が置換されているか又は欠失していて、プロテアーゼ活性が低下しており、タンパク質がより容易に生産される、即ち触媒のセリン残基が欠失していてもよいし若しくは置換されていてもよく(例えばアラニンで置換されている)及び/又は触媒のヒスチジン残基が欠失していてもよいし若しくは置換されていてもよく、触媒のアスパラギン酸残基が欠失していてもよいし若しくは置換されていてもよい配列番号3の誘導体である。触媒のセリン残基が置換されている(例えばアラニンで置換されている)配列番号3の誘導体が殊に興味がある。また、配列番号3と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも80%、特に少なくとも90%、殊に少なくとも95%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%の同一性を有し、触媒三残基の少なくとも1個が置換されているか若しくは欠失している配列を含み、例えばそれからなるRv0125関連抗原、又は配列番号3の断片であって、少なくとも150個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも200個のアミノ酸の長さ、特に少なくとも250個のアミノ酸の長さ、殊に少なくとも300個のアミノ酸の長さであり、触媒三残基の少なくとも1個が置換されているか若しくは欠失している、断片を含み、例えばそれからなるものも興味がある。Rv0125の更なる免疫原性誘導体は、配列番号3の残基192〜323に対応する配列番号3の断片であって、触媒三残基の少なくとも1個(例えば1個、2個又は更には3個全部)が置換されているか又は欠失している、断片を含む(例えばそれからなる)ものである。Rv0125の特定の免疫原性誘導体は、配列番号3の残基1〜195に対応する配列番号3の断片であって、触媒のセリン残基(配列番号3の位置176)が置換されている(例えばアラニンで置換されている)、断片を含む(例えばそれからなる)ものである。
【０１５６】
抗原は配列番号4と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも80%、特に少なくとも90%、殊に少なくとも95%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%の同一性を有する配列を含み、例えばそれからなるのが適切である。典型的なM72関連抗原は少数の欠失、挿入及び/又は置換を有する配列番号4の誘導体を含み、例えばそれからなる。例は、0〜5の位置に5個までの残基の欠失、0〜5の5つの位置に5個までの残基の挿入及び20個までの残基の置換を有するものである。M72の他の誘導体は配列番号4の断片であって、少なくとも450個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも500個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも550個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも600個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも650個のアミノ酸の長さ又は少なくとも700個のアミノ酸の長さである断片を含み、例えばそれからなるものである。M72は2つの個々の抗原Rv0125及びRv1196に由来する融合タンパク質であるので、少なくとも450個の残基のいずれかの断片が全長配列に由来する複数のエピトープを含む(Skeikyら、J. Immunol.、2004、172:7618〜7628;Skeiky、Infect. Immun.、1999、67(8):3998〜4007;Dillon、Infect. Immun.、1999、67(6):2941〜2950)。
【０１５７】
M72関連抗原は配列番号4と少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも80%、特に少なくとも90%、殊に少なくとも95%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%の同一性を有する配列を含み、例えばそれからなる。
【０１５８】
典型的なM72関連抗原は少数の欠失、挿入及び/又は置換を有する配列番号4の誘導体を含み、例えばそれからなる。例は0〜5の位置に5個までの残基の欠失、0〜5の5つの位置に5個までの残基の挿入及び20個までの残基の置換を有するものである。
【０１５９】
特定の実施形態において、M72関連抗原は配列番号4の残基2〜723を含み、例えば配列番号4を含み(又はそれからなり)、又は配列番号5を含む(又はそれからなる)。
【０１６０】
本発明に従って使用できる更なる抗原は、例えば国際公開第2010010180号に記載されている結核抗原Rv1753及びその変異体、例えば国際公開第2010010180号の配列番号1及び2〜7から選択されるRv1753配列、特に配列番号1である。結核の分野で興味のある別の抗原は、例えば国際公開第2010010179号に記載されているRv2386及びその変異体、例えば国際公開第2010010179号の配列番号1及び2〜7から選択されるRv2386配列、特に配列番号1である。結核の分野で興味がある他の抗原には、例えば国際公開第2011092253号に記載されているRv3616及びその変異体、例えば国際公開第2011092253号の配列番号1及び2〜7から選択される天然のRv3616配列又は改変されたRv3616配列、例えば国際公開第2011092253号の配列番号161〜169、179及び180から選択されるもの、特に配列番号167がある。興味のある追加の抗原は、国際公開第97044463号、国際公開第03044048号及び国際公開第2010149657号に記載されているようなHBHAである。上述の特許出願国際公開第2010010180号、国際公開第2010010179号、国際公開第2011092253号、国際公開第97044463号、国際公開第03044048号及び国際公開第2010149657号は本発明で役に立ち得る抗原を規定する目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
興味のある他の抗原は、国際公開第2010010177号の配列番号8に記載されているようなDPVともいわれるRv1174、国際公開第2010010177号の配列番号10に記載されているようなMTI又はMtb9.9ともいわれるRv1793、国際公開第2010010177号の配列番号9に記載されているようなMSL又はMtb9.8ともいわれるRv2087、国際公開第2010010177号の配列番号1及び2〜7又は国際公開第2011092253号の配列番号161〜169、179若しくは180に記載されているようなHTCC1又はMtb40ともいわれるRv3616、及び/或いは国際公開第2010010177号の配列番号9に記載されているようなCFP10又はTb38.1ともいわれるRv3874、或いは免疫原性の一部分(例えばそれに由来する少なくとも20、50、75又は100個の残基)又はその変異体(例えばそれと少なくとも70%、80%、90%又は95%の同一性を有する)を含む(又はそれからなる)ものである(国際公開第2010010177号及び国際公開第2011092253号は本発明で役に立ち得る抗原を規定する目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【０１６２】
結核抗原はポリペプチドの形態で最も適切に利用されるが、代わりに前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で提供され得る。
【０１６３】
本発明に従って使用できる更なる抗原は水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)に由来する。本発明で使用されるVZV抗原は任意の適切なVZV抗原又はその免疫原性誘導体でよく、精製されたVZV抗原が適切である。
【０１６４】
1つの実施形態において、VZV抗原はVZV糖タンパク質gE(gp1ともいわれる)又はその免疫原性誘導体である。野生型又は全長gEタンパク質はシグナルペプチド、タンパク質の主要部、疎水性アンカー領域(残基546〜558)及びC末端尾部を含む623個のアミノ酸からなる。1つの態様において、gE C末端トランケート体(トランケート化gE又はgEトランケート体ともいわれる)が使用され、ここでトランケーションにより全アミノ酸残基の4〜20パーセントがカルボキシ末端から除去される。更なる態様において、トランケート化gEはカルボキシ末端アンカー領域(野生型配列のおよそアミノ酸547〜623が適切である)を欠いている。更なる態様において、gEは配列番号6の配列を有するトランケート化gEである。
【０１６５】
gE抗原、そのアンカーなしの誘導体(これも免疫原性誘導体でもある)及びその製造は欧州特許第0405867号及びその参照文献に記載されている(Vafai A.、Antibody binding sites on truncated forms of varicalla-zoster virus gpI(gE) glycoprotein、Vaccine、1994、12:1265〜9も参照)。欧州特許第192902号もgE及びその製造を記載している。トランケート化gEはまた、参照により全体が本明細書に組み込まれているHaumontら、Virus Research、(1996)、40巻、199〜204頁にも記載されている。本発明に従って使用するのに適切なアジュバントで補強した(アジュバント化;adjuvanted)VZV gE組成物、即ち、更にコレステロールを含有するQS-21、3D-MPL及びリポソームを含むアジュバントと組み合わせたカルボキシ末端をトランケート化したVZV gEが国際公開第2006/094756号に記載されている。Leroux-Roels I.ら(J. Infect. Dis.、2012、206: 1280〜1290)はアジュバントで補強したVZVトランケート化gEサブユニットワクチンを評価したフェーズI/II臨床試験について報告した。
【０１６６】
抗原はヒト呼吸器多核体ウイルス(RSV)に由来する調製物を含み得るか又はそれからなり得る。幾つかの有利な実施形態において、ポリペプチド抗原はRSVに由来するFタンパク質ポリペプチド抗原である。本発明においてポリペプチド抗原成分として特に適切なのは立体配座的に制限されたFポリペプチド抗原である。立体配座的に制限されたFタンパク質は融合前(prefusion)(PreF)及び融合後(postfusion)(PostF)の立体配座の両方について以前に記載されている。そのような立体配座的に制限されたFタンパク質は通例工学処理したRSV Fタンパク質外部ドメインを含む。Fタンパク質外部ドメインポリペプチドはRSV Fタンパク質の細胞外ドメインの全部又は一部分を含み、機能性の(例えば、欠失又は置換による)膜貫通ドメインを欠くRSV Fタンパク質の一部分であり、例えば、細胞培養で可溶性の(膜に付着していない)形態で発現することができる。
【０１６７】
融合前立体配座において立体配座的に制限された代表的なFタンパク質抗原は当技術分野で既に記載されており、例えば各々が融合前Fポリペプチド(及び核酸)、及びその製造方法を説明する目的で参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,563,002号(国際公開第2009079796号)、米国特許出願公開第2012/0093847号(国際公開第2010/149745号)、米国特許出願公開第2011/0305727号(国際公開第2011/008974号)、米国特許出願公開第2014/0141037号、国際公開第2012/158613号及び国際公開第2014/160463号に詳細に開示されている。通例、抗原はポリペプチドの三量体の形態である。融合前立体配座のFタンパク質の例を提供する追加の刊行物として、各々本明細書に開示されている免疫原性の組合せとの関連で使用することもできるMcLellanら、Science、340巻: 1113〜1117;McLellanら、Science、342巻: 592〜598、及びRigterら、PLOS One、8巻: e71072がある。
【０１６８】
例えば、融合前立体配座が安定化されたFタンパク質ポリペプチドは通例Fタンパク質の融合前立体配座を安定化させた少なくとも1つの改変を含むFタンパク質の外部ドメイン(例えば、可溶性のFタンパク質ポリペプチド)を含む。例えば、改変は、三量化ドメインの(通例C末端への)付加、1つ以上のフリン開裂部位の(アミノ酸およそ105〜109及びおよそ133〜136での)欠失、pep27ドメインの欠失、疎水性ドメインでの親水性アミノ酸の置換又は付加(例えば、HRA及び/又はHRB)から選択することができる。一実施形態において、立体配座的に制限されたPreF抗原はフリン開裂部位が介在しないRSV Fタンパク質ポリペプチドのF2ドメイン(例えば、アミノ酸1〜105)及びF1ドメイン(例えば、アミノ酸137〜516)を含み、ポリペプチドは更にF1ドメインに対してC末端に位置する異種の三量化ドメインを含む。場合により、PreF抗原はグリコシル化を変える(例えば、グリコシル化を増やす)改変、例えばRSV Fタンパク質のアミノ酸およそ500〜502に対応する位置の1個以上のアミノ酸の置換も含む。オリゴマー化配列が存在する場合は三量化配列が好ましい。適切なオリゴマー化配列は当技術分野で周知であり、例えば、酵母GCN4ロイシンジッパータンパク質のコイルドコイル、バクテリオファージT4フィブリチン由来三量化配列(「フォルドン(foldon)」)、及びインフルエンザHAの三量体ドメインが包含される。加えて、又は代わりに、融合前立体配座において立体配座的に制限されたFポリペプチドは少なくとも2個の導入されたシステイン残基を含むことができ、これらは互いに近接しており、融合前RSV Fポリペプチドを安定化するジスルフィド結合を形成する。例えば、2つのシステインは互いの約10Å以内であることができる。例えば、システインは位置165及び296又は位置155及び290に導入することができる。代表的なPreF抗原は配列番号7で表される。
【０１６９】
抗原はHIVに由来する調製物を含み得るか、又はそれからなり得る。抗原はHIVエンベロープタンパク質のようなHIVタンパク質でよい。例えば、抗原はHIVエンベロープgp120ポリペプチド又はその免疫原性断片であってもよい。
【０１７０】
1つの適切な抗原は公開された出願国際公開第2008/107370号の配列番号8のHIVクレードB gp120ポリペプチド(又はこのポリペプチドの免疫原性断片)である。国際公開第2008/107370号の配列番号8は参照によりこの出願に組み込まれる。
【０１７１】
適切な抗原としては、また、公開された出願国際公開第2015/036061号の配列番号1のV1V2領域を含むポリペプチド、又は配列番号1のV1V2領域の免疫原性の誘導体若しくは断片もある。加えて、国際公開第2015/036061号の配列番号5のV1V2領域を含むポリペプチド又は配列番号5のV1V2領域の免疫原性の誘導体若しくは断片を適切な抗原として使用してもよい。国際公開第2015/036061号の配列番号1及び配列番号5は参照により組み込まれる。
【０１７２】
別の実施形態において、抗原は2つ以上の異なるHIVエンベロープgp120ポリペプチド抗原(又はこれらのポリペプチドの免疫原性断片)を含んでいてもよい。適切な抗原は、TV1 gp120(配列番号8)及び1086.C gp120(配列番号9)を含むHIVクレードC gp120ポリペプチド抗原を包含する。
【０１７３】
他の適切なHIV抗原として、Nef、Gag及びPol HIVタンパク質並びにこれらの免疫原性断片がある。
【０１７４】
組成物は、例えばフィンブリンタンパク質[(米国特許第5,766,608号、Ohio State Research Foundation)]及びそれ由来のペプチドを含む融合体[例えばLB1(f)ペプチド融合体、米国特許第5,843,464号(OSU)又は国際公開第99/64067号]、OMP26[国際公開第97/01638号(Cortecs)]、P6[欧州特許第281673号(State University of New York)]、TbpA及び/若しくはTbpB、Hia、Hsf、Hin47、Hif、Hmw1、Hmw2、Hmw3、Hmw4、Hap、D15(国際公開第94/12641号)、プロテインD(欧州特許第594610号)、P2、及びP5(国際公開第94/26304号)、プロテインE(国際公開第07/084053号)並びに/又はPilA(国際公開第05/063802号)から選択される無莢膜型インフルエンザ菌抗原を含んでいてもよい。組成物は、例えばOMP106[国際公開第97/41731号(Antex)及び国際公開第96/34960号(PMC)]、OMP21、LbpA及び/又はLbpB[国際公開第98/55606号(PMC)]、TbpA及び/又はTbpB[国際公開第97/13785号及び国際公開第97/32980号(PMC)]、CopB[Helminen MEら、(1993)、Infect. Immun.、61:2003〜2010]、UspA1及び/又はUspA2[国際公開第93/03761号(University of Texas)]、OmpCD、HasR(国際出願PCT/EP99/03824)、PilQ(国際出願PCT/EP99/03823)、OMP85(国際出願PCT/EP00/01468)、lipo06(英国特許出願第9917977.2号)、lipo10(英国特許出願第9918208.1号)、lipo11(英国特許出願第9918302.2号)、lipo18(英国特許出願第9918038.2号)、P6(国際出願PCT/EP99/03038)、D15(国際出願PCT/EP99/03822)、OmplA1(国際出願PCT/EP99/06781)、Hly3(国際出願PCT/EP99/03257)、並びにOmpEから選択されるモラクセラ・カタラーリスタンパク質抗原を含んでいてもよい。
【０１７５】
一実施形態において、組成物は無莢膜型インフルエンザ菌(H. influenzae)(NTHi)タンパク質抗原及び/又はモラクセラ・カタラーリス(M. catarrhalis)タンパク質抗原を含んでいてもよい。組成物はインフルエンザ菌由来のプロテインD(PD)を含んでいてもよい。プロテインDは国際公開第91/18926号に記載されているものでよい。組成物は更にインフルエンザ菌由来のプロテインE(PE)及び/又はピリンA(PilA)を含んでいてもよい。プロテインE及びピリンAは国際公開第2012/139225号に記載されているものでよい。プロテインE及びピリンAは融合タンパク質、例えば国際公開第2012/139225号に記載されているLVL735として提示されてもよい。例えば、組成物は3つのNTHi抗原(PD、PE及びPilA、後の2つはPEPilA融合タンパク質として一緒にされる)を含んでいてもよい。組成物は更にモラクセラ・カタラーリス由来のUspA2を含んでいてもよい。UspA2は国際公開第2015125118号に記載されているものでよく、例えば国際公開第2015125118号に記載されているMC-009((M)(UspA2 31-564)(HH))でもよい。例えば、組成物は3つのNTHi抗原(PD、PE及びPilA、後の2つはPEPilA融合タンパク質として一緒にされる)及び1つのモラクセラ・カタラーリス抗原(UspA2)を含んでいてもよい。
【０１７６】
複数の抗原が提供され得る。例えば、引き起こされる免疫応答を強化する(例えば強固な保護を確実にする)ために複数の抗原を提供してもよいし、免疫応答を拡大する(例えば広範囲の病原菌株に対する、又は対象の集団の大部分で保護を確実にする)ために複数の抗原を提供してもよいし、又は幾つかの障害に対する免疫応答を広く引き起こす(それにより投与プロトコールを簡単にする)ために複数の抗原を提供してもよい。複数の抗原が提供される場合、これらは区別されるタンパク質であってもよいし、又は1つ以上の融合タンパク質の形態であってもよい。
【０１７７】
抗原はヒト用量当たり0.1〜100ugの量で提供され得る。
【０１７８】
本発明は、上記の1つ以上の抗原に関連する疾患又は障害の治療又は予防における使用に適用され得る。1つの実施形態において、疾患又は障害はマラリア、結核、COPD、HIV及びヘルペスから選択される。
【０１７９】
アジュバントは免疫原若しくは抗原と別に投与してもよいし、又は製造中若しくはその場で免疫原若しくは抗原と併用投与用の免疫原性組成物として組み合わせてもよい。
【０１８０】
殺菌(滅菌)
特に非経口投与の場合、組成物は無菌でなければならない。殺菌は様々な方法で行うことができるが、無菌グレードフィルターを通すろ過によって行うのが便利である。殺菌はアジュバント又は免疫原性組成物の調製中何度行ってもよいが、通例少なくとも製造終了時に行う。
【０１８１】
「無菌グレードフィルター」とは、有効ろ過面積1cm2当たり1×107以上の負荷レベルでの微生物による負荷後無菌の流出液を生成するフィルターを意味する。無菌グレードフィルターは本発明の目的で本発明の当技術分野の当業者に周知であり、無菌グレードフィルターは0.15〜0.25umの間、適切には0.18〜0.22um、例えば0.2又は0.22umの細孔径を有する。
【０１８２】
無菌グレードフィルターの膜は当業者に公知のいずれかの適切な材料、例えば限定されることはないが酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)から作製することができる。本発明の特定の実施形態において、本発明の1つ以上又は全てのフィルター膜はポリエーテルスルホン(PES)、特に親水性のポリエーテルスルホンを含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載されている方法で使用されるフィルターは二重層フィルター、特にエンドフィルターの細孔径より大きい細孔径を有するビルドインプレフィルターを有する無菌フィルターである。1つの実施形態において、滅菌フィルターは、プレフィルター膜層が0.3〜0.5nmの間、例えば0.35又は0.45nmの細孔径を有する二重層フィルターである。更なる実施形態によると、フィルターは非対称のフィルター膜、例えば非対称の親水性PESフィルター膜を含む。代わりに、滅菌フィルター層は、例えば非対称の親水性PESプレフィルター膜層と組み合わせてPVDFで作製してもよい。
【０１８３】
意図される医療用途を考慮して、材料は医薬品級(例えば非経口グレード)であるべきである。
【０１８４】
本出願中の特許出願及び許可された特許を含めて全ての文献の教示は参照により完全に本明細書に組み込まれる。ある種の要素を「含む」として定義されている組成物又は方法若しくはプロセスは(それぞれ)その要素からなる組成物、方法又はプロセスを包含すると理解される。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」とは、追加の成分が存在してもよいことを意味するが、それらが全体としての性質又は機能を変えないことを条件とする。
【０１８５】
以下の非限定的実施例を参照して本発明を更に記載する。
【実施例】
【０１８６】
[実施例1]
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物のHPLC
C4カラム及び勾配溶離:移動相A-水/アセトニトリル、7/3 v/v、0.15%トリフルオロ酢酸;移動相B-アセトニトリル、0.15%トリフルオロ酢酸を用いた逆相HPLCにより粗製の樹皮抽出物を分離した。UV検出は214nmであった。
【０１８７】
粗製の樹皮抽出物試料を、必要に応じて精製水で希釈する。PVPP(60mg/mL)を加え、混合物をおよそ30分撹拌し、次いで遠心分離してPVPP樹脂を上清から分離した。
【０１８８】
次いで上清を分析してHPLC UVクロマトグラムを得た。
【０１８９】
図1は、HPLC UVクロマトグラムの代表例を示す。QS-21画分に対応するピークが示されている。
【０１９０】
[実施例2]
分析方法
HPLC-UV
機器
Waters Alliance 2690/2695分離モジュール
Waters 2487 UV Detector又は2996 PDA Detector
Vydac Protein C4 4.6×250mm 5umカラム
移動相A(MPA)-水/アセトニトリル(70:30 v/v)中0.15%トリフルオロ酢酸
移動相B(MPB)-アセトニトリル中0.15%トリフルオロ酢酸
【０１９１】
【表１】
2021504424.tif 000050
【０１９２】
10ulの試料を注入する。UV検出は214nMに設定する。
【０１９３】
参照用にブランク注入を用いて、クロマトグラム中のピークの積分は総吸光度を提供する。興味があるピーク(例えばQS-21主ピーク)を総吸光度と比較してピーク含量を百分率として決定する。
【０１９４】
UPLC-UV
機器
Waters Acquity UPLC
Waters Acquity Tunable UV Detector
Waters Acquity BEH C18 2.1×100mm 1.7umカラム
移動相A(MPA)-水/アセトニトリル(70:30 v/v)中0.025%酢酸
移動相B(MPB)-水/アセトニトリル(30:70 v/v)中0.025%トリフルオロ酢酸
【０１９５】
【表２】
2021504424.tif 000051
【０１９６】
カラム温度28℃。10ulの試料を注入する。UV検出は214nMに設定する。
【０１９７】
参照用にブランク注入を用いて、クロマトグラムのピークの積分は総吸光度を提供する。興味があるピーク(例えばQS-21主ピーク)を総吸光度と比較してピーク含量を百分率として決定する。
【０１９８】
UPLC-UV/MS
機器
Waters Acquity UPLC
Waters Acquity Tunable UV Detector
Waters Single-Quadrupole Mass Detector
Waters Acquity BEH C18 2.1×100mm 1.7umカラム
移動相A(MPA)-水/アセトニトリル/イソプロピルアルコール(75:20:5 v/v)中0.025%トリフルオロ酢酸
移動相B(MPB)-水/アセトニトリル/イソプロピルアルコール(10:72:18 v/v)中0.025%トリフルオロ酢酸
【０１９９】
【表３】
2021504424.tif 000052
【０２００】
試験試料は水/アセトニトリル(70:30 v/v)中0.2%酢酸として調製する。カラム温度55℃。10ulの試料を注入する。UV検出は214nMに設定する。
【０２０１】
保持時間はラン間で多少変化するが、QS-21群はおよそ3.8分(B-異性体)〜およそ4.5分(lyo不純物より前)に位置する。
【０２０２】
参照用のブランク注入を用いて、溶媒先端後0.5分〜5.50分付近の間で溶離するがブランク内には見られないクロマトグラムのピークの積分を行う。
【０２０３】
最も豊富な化学種のモノアイソトープを、クロマトグラム全体にわたりTICを組み合わせることによって同定して結合スペクトルを作成する。
【０２０４】
2002成分対1988成分の比は、2002成分に関連するイオン電流をQS-21主ピーク内の1988成分に関連するイオン電流と比較することによって計算される。
【０２０５】
図5は、本発明のサポニン抽出物の代表的なクロマトグラムを示す。図6は、QS-21群及びlyo成分を含む領域の拡大された詳細を示す。
【０２０６】
図7は、精製されたキラヤ・サポナリア・モリナサポニン抽出物の1988及び2002の分子量イオンに対する代表的な抽出されたマスクロマトグラムを示す。
【０２０７】
[実施例3]
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物の精製
0.064以下の2018成分対QS-21主ピークの比及び0.4以下の先行するピーク対QS-21主ピークの比を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物をPVPPで処理した(粗製水性抽出物1リットル当たり1kgのPVPP)。吸着後混合物をろ過してPVPP及び結合した不純物を液から分離した。
【０２０８】
図2は、(先行するピーク対QS-21主ピークの比の決定のために使用された)キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物に対するHPLC-UVクロマトグラムの一例を示す。
【０２０９】
図3は、(2018成分対QS-21主ピークの比の決定のために使用された)キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物に対するUPLC-UVクロマトグラムの一例を示す。
【０２１０】
ろ過した液を濃縮し、30kD Hellicon膜を用いて限外ろ過/透析ろ過により更に精製した。
【０２１１】
【表４】
2021504424.tif 000053
【０２１２】
画分をプールして次の組成を有するポリスチレンで精製されたサポニン抽出物を得た:
%QS-21主ピーク≧18%(HPLCによる)
及び
2018成分/QS-21主ピーク比≦0.054(UPLC-UVによる)。
【０２１３】
図4は、ポリスチレンで精製されたサポニン抽出物のプールに対するUPLC-UVクロマトグラムの一例を示す。
【０２１４】
【表５】
2021504424.tif 000054
【０２１５】
画分をプールして次の組成を有するフェニルで精製されたサポニン抽出物を得た:
%QS-21群≧98.5
%QS-21主ピーク≧94.5
%2018成分≦2.7%
QS-21群以外の主ピーク≦1%(UPLC-UV/MSによる)。
【０２１６】
合わせたフェニルで精製されたサポニン抽出物を、C8樹脂(Lichroprep RP8)及び次の条件を用いた逆相クロマトグラフィーによる捕獲及び解放により濃縮した:
24%アセトニトリル及び0.20%酢酸でコンディショニングされたカラムにロードする。
60%アセトニトリル及び0.20%酢酸で溶離する。
11cmカラム
ロード:注入1回当たり50〜142g
【０２１７】
C8で濃縮されたサポニン抽出物を、限外ろ過/透析ろ過及びPellicon 1kDa膜を用いて溶媒交換に供して、アセトニトリル含量を21%未満に低下させた。
【０２１８】
得られた溶媒交換したサポニン抽出物を、次いで、単一ステップで凍結乾燥して最終生成物を得た。
【０２１９】
仕様外のサポニン抽出物をもたらす一連のプロセスランは過剰の2018成分含量を有する粗製の樹皮抽出物の使用に起因することが判明した。
【０２２０】
適切な2018成分組成を有する粗製抽出物から出発した本発明に従う複数のランを実施したところ、各々の場合に最終生成物は仕様内であった。
【０２２１】
実施例3に記載したプロセスを使用すると、QS-21主ピーク及び2018成分の点で明確な含量、例えば一貫して少なくとも93%のQS-21主ピーク及び0.25〜3%の2018を有し、図5、図6及び図7に示したクロマトグラムに匹敵するクロマトグラフプロフィールを呈するキラヤ・サポナリア・モリナの精製されたサポニン抽出物を一貫して提供することができる。
【０２２２】
[実施例4]
免疫応答
6〜8週齢のメスのC57BL6マウス(5匹/群)に、本発明に従って調製された、3D-MPL及びサポニン抽出物を含むリポソーム製剤であるアジュバントシステムAS01を用いて調合したgE抗原を14日間隔で二回筋肉注射した。対照群の5匹のマウスには緩衝剤のみと共にgEを投与した。
【０２２３】
3つの異なるロットのサポニン抽出物からワクチンを調製した。結果は、2つの異なる投与レベルについて提供する(動物1匹当たり0.4及び0.1ugの3D-MPL/QS-21で、それぞれヒト用量の1/125及び1/500に相当する)。
【０２２４】
D21に脾臓を、D21及びD28に血清を集め、それぞれT及びB細胞応答を分析した。
【０２２５】
-  ICS(細胞内サイトカイン染色)
脾臓をRPMI培地に収集し、ポッター型組織粉砕機(ホモジナイザー)で2つの往復行程を用いて解離させた。ホモジナイズした試料を50mlのポリプロピレンチューブに移した。100uMナイロンセルストレイナーに通して繊維状物質をろ過により除去した。次いで細胞を洗浄し、カウントし、107細胞/mlに再懸濁した。
【０２２６】
ICSは、サイトカイン産生に基づいて抗原特異的なTリンパ球の定量化を可能にする科学技術である。
【０２２７】
リンパ球様細胞を、タンパク質輸送阻害剤(ブレフェルジンA)の存在下ペプチドgE又は培地によりin vitroで一晩(O.N)再刺激する。次いでこれらの細胞を、蛍光抗体(細胞外染色:CD4、CD8、細胞内染色:TNF-アルファ、IFN-ガンマ及びIL2)を用いる従来の免疫蛍光法によって処理する。
【０２２８】
結果は、各々のマウスに対する培地条件の控除後CD4細胞集団内のサイトカイン陽性細胞の頻度として表される。データは、少なくとも2種のサイトカイン(IL2、IFN-アルファ又はTNF-アルファ)の発現を示した集団について示す。結果を図9に示す。
【０２２９】
-  ELISA
抗gE総IgGをELISAで測定した。96ウェルプレートに抗原を一晩4℃で塗布した。次いでプレートを洗浄し、飽和緩衝剤を用いて1時間37℃で飽和した。その後、100ulの希釈したマウス血清又は標準若しくは対照を加え、37℃で1時間30分インキュベートした。洗浄後、プレートを100μlのビオチン化抗マウスIgGと共に1時間37℃でインキュベートした。洗浄後、プレートを100ulのストレプトアビジン-PODコンジュゲートと共に30分37℃でインキュベートした。洗浄後、100ulのTMB/ウェルを加え、プレートを暗所に室温で15分保った。反応を停止させるために、1ウェル当たり100ulのH2SO4 0.4Nを加えた。Elisaプレートリーダーにより450/630nmの波長で吸光度を読み取った。結果は、Softmax-Proソフトウェアを用いて計算した。結果を図10(D21)及び図11(D28)に示す。
【０２３０】
結論
サポニン抽出物の異なる生産ロットに対して一貫性のある組成の結果、限定された程度の変動を伴って免疫学的応答が生じた。
【０２３１】
参考文献一覧
2021504424.tif 000055
2021504424.tif 000056
2021504424.tif 000057
【図１】
2021504424.tif 000086
【図２】
2021504424.tif 000087
【図３】
2021504424.tif 000088
【図４】
2021504424.tif 000089
【図５】
2021504424.tif 000090
【図６】
2021504424.tif 000091
【図７】
2021504424.tif 000092
【図８】
2021504424.tif 000093
【図９】
2021504424.tif 000094
【図１０】
2021504424.tif 000095
【図１１】
2021504424.tif 000096
【配列表】
2021504424000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月14日(2020.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
214nmでのUV吸光度により少なくとも93％のQS-21主ピーク及び0.25〜3％の2018成分を含有するサポニン抽出物。
【請求項２】
最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項１記載のサポニン抽出物。
【請求項３】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98％のQS-21群を含有する、請求項１又は２記載のサポニン抽出物。
【請求項４】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98％のQS-21群、少なくとも93％のQS-21主ピーク、0.25〜3％の2018成分、1％以下のQS-21群以外の最も大きいピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項１記載のサポニン抽出物。
【請求項５】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65％、例えば少なくとも70％の1988成分を含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項６】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5％、例えば少なくとも10％の1856成分を含有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項７】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5％、例えば少なくとも1％の2002成分を含有する、請求項１〜６のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項８】
214nmでのUV吸光度により少なくとも93％の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、及び0.25〜3％の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有するサポニン抽出物。
【請求項９】
最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項８記載のサポニン抽出物。
【請求項１０】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98％の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有する、請求項８又は９記載のサポニン抽出物。
【請求項１１】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98％の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、少なくとも93％の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、0.25〜3％の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、1％以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項８記載のサポニン抽出物。
【請求項１２】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65％、例えば少なくとも70％の1988成分を含有する、請求項８〜１１のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項１３】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5％、例えば少なくとも10％の1856成分を含有する、請求項８〜１２のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項１４】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5％、例えば少なくとも1％の2002成分を含有する、請求項８〜１３のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項１５】
214nmでのUV吸光度により、少なくとも93％の
【化１】
2021504424.tif 000097
2021504424.tif 000098
及び、0.25〜3％の
【化２】
2021504424.tif 000099
を含有するサポニン抽出物。
【請求項１６】
最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項１５記載のサポニン抽出物。
【請求項１７】
少なくとも98％の
【化３】
2021504424.tif 000100
2021504424.tif 000101
2021504424.tif 000102
を含有する、請求項１５又は１６記載のサポニン抽出物。
【請求項１８】
少なくとも98％の
【化４】
2021504424.tif 000103
2021504424.tif 000104
2021504424.tif 000105
及び2118成分を含有する、請求項１５〜１７のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項１９】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98％の
【化５】
2021504424.tif 000106
2021504424.tif 000107
2021504424.tif 000108
少なくとも93％の
【化６】
2021504424.tif 000109
2021504424.tif 000110
0.25〜3％の
【化７】
2021504424.tif 000111
1％以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項１５記載のサポニン抽出物。
【請求項２０】
214nmでのUV吸光度により少なくとも98％の
【化８】
2021504424.tif 000112
2021504424.tif 000113
2021504424.tif 000114
又は2118成分、
少なくとも93％の
【化９】
2021504424.tif 000115
2021504424.tif 000116
0.25〜3％の
【化１０】
2021504424.tif 000117
1％以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、請求項１５記載のサポニン抽出物。
【請求項２１】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65％、例えば少なくとも70％の
【化１１】
2021504424.tif 000118
を含有する、請求項１５〜２０のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項２２】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5％、例えば少なくとも10％の
【化１２】
2021504424.tif 000119
を含有する、請求項１５〜２１のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項２３】
214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5％、例えば少なくとも1％の
【化１３】
2021504424.tif 000120
を含有する、請求項１５〜２２のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項２４】
214nmでのUV吸光度により少なくとも1％の
【化１４】
2021504424.tif 000121
を含む、請求項１５〜２３のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項２５】
乾燥されている、請求項１〜２４のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項２６】
精製されたサポニン抽出物の製造に使用されるキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を同定する方法であって、
(i)214nmでのUPLC-UV吸光度により2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ、及び
(ii)0.075以下の2018成分/QS-21主ピークの比を有する粗製水性抽出物を選択するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれか１項記載のサポニン抽出物の製造における使用のための、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
(i)0.075以下の2018成分対QS-21主ピークの比を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリビニルピロリドン吸着により抽出物を精製するステップ、
(iii)透析ろ過、限外ろ過又は透析により抽出物を精製するステップ、
(iv)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、及び
(v)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ
を含む、精製されたサポニン抽出物を製造する方法。
【請求項２９】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、少なくとも1g/L、例えば少なくとも2g/L、殊に少なくとも2.5g/L、特に少なくとも2.8g/LのQS-21主ピークを含有する水溶液である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が樹皮抽出物である、請求項２８又は２９記載の方法。
【請求項３１】
アジュバントとして使用するための、請求項１〜２５のいずれか１項記載のサポニン抽出物。
【請求項３２】
請求項１〜２５のいずれか１項記載のサポニン抽出物を含むアジュバント組成物。
【請求項３３】
アジュバントがリポソーム製剤である、請求項３１又は３２記載のサポニン抽出物又はアジュバント組成物。
【請求項３４】
アジュバントがTLR4アゴニストを含む、請求項３１〜３３のいずれか１項記載のサポニン抽出物又はアジュバント組成物。
【請求項３５】
TLR4アゴニストが3D-MPLである、請求項３４記載のサポニン抽出物又はアジュバント組成物。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のいずれか１項記載のアジュバント組成物と、免疫原若しくは抗原、又は免疫原若しくは抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む免疫原性組成物。
【請求項３７】
抗原が水痘帯状疱疹ウイルスに由来し、例えば配列番号６の抗原である、請求項３６記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
抗原がヒト呼吸器多核体ウイルスに由来し、例えば配列番号７の抗原である、請求項３６記載の免疫原性組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）214nmでのUV吸光度により少なくとも93%のQS-21主ピーク及び0.25〜3%の2018成分を含有するサポニン抽出物。
（２）最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、（1）に記載のサポニン抽出物。
（３）214nmでのUV吸光度により少なくとも98%のQS-21群を含有する、（1）又は（2）に記載のサポニン抽出物。
（４）214nmでのUV吸光度により1%以下のlyo不純物を含有する、（1）から（3）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（５）214nmでのUV吸光度により1%以下のQS-21群以外の最も大きいピークを含有する、（4）に記載のサポニン抽出物。
（６）214nmでのUV吸光度により少なくとも98%のQS-21群、少なくとも93%のQS-21主ピーク、0.25〜3%の2018成分、1%以下のQS-21群以外の最も大きいピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、（1）に記載のサポニン抽出物。
（７）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65%、例えば少なくとも70%の1988成分を含有する、（1）から（6）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（８）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により30%以下、例えば25%以下の1856成分を含有する、（1）から（7）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（９）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5%、例えば少なくとも10%の1856成分を含有する、（1）から（8）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（１０）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により10%以下、例えば5%以下の2002成分を含有する、（1）から（9）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（１１）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%の2002成分を含有する、（1）から（10）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（１２）214nmでのUV吸光度により少なくとも1%の2018成分を含む、（1）から（11）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（１３）214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、及び0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有するサポニン抽出物。
（１４）最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、（13）に記載のサポニン抽出物。
（１５）214nmでのUV吸光度により少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有する、B-異性体及びlyo不純物を除くトリテルペノイド配糖体を含有する、（13）又は（14）に記載のサポニン抽出物。
（１６）214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有する、（13）から（15）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（１７）214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有する、lyo不純物を除くトリテルペノイド配糖体を含有する、（13）から（16）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（１８）214nmでのUV吸光度により1%以下の、lyo不純物のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含有する、（13）から（17）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（１９）214nmでのUV吸光度により1%以下のその他のピークを含有する、（18）に記載のサポニン抽出物。
（２０）214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の、1517.7、1711.8、1855.9、1987.9、2001.9、2017.9又は2118のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、少なくとも93%の、1855.9、1987.9又は2001.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、0.25〜3%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体、1%以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、（13）に記載のサポニン抽出物。
（２１）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65%、例えば少なくとも70%の1988成分を含有する、（13）から（20）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（２２）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により30%以下、例えば25%以下の1856成分を含有する、（13）から（21）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（２３）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5%、例えば少なくとも10%の1856成分を含有する、（13）から（22）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（２４）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により10%以下、例えば5%以下の2002成分を含有する、（13）から（23）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（２５）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%の2002成分を含有する、（13）から（24）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（２６）214nmでのUV吸光度により少なくとも1%の、2017.9のm/zを有するトリテルペノイド配糖体を含む、（13）から（25）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（２７）214nmでのUV吸光度により、少なくとも93%の
【化４０】
2021504424.tif 000122
2021504424.tif 000123
及び0.25〜3%の
【化４１】
2021504424.tif 000124
を含有するサポニン抽出物。
（２８）最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、（27）に記載のサポニン抽出物。
（２９）少なくとも98%の
【化４２】
2021504424.tif 000125
2021504424.tif 000126
2021504424.tif 000127
を含有する、（27）又は（28）に記載のサポニン抽出物。
（３０）少なくとも98%の
【化４３】
2021504424.tif 000128
2021504424.tif 000129
2021504424.tif 000130
及び2118成分を含有する、（27）から（29）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（３１）1%以下の
【化４４】
2021504424.tif 000131
を含有する、（27）から（30）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（３２）214nmでのUV吸光度により1%以下のその他のピークを含有する、（31）に記載のサポニン抽出物。
（３３）214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の
【化４５】
2021504424.tif 000132
2021504424.tif 000133
2021504424.tif 000134
少なくとも93%の
【化４６】
2021504424.tif 000135
2021504424.tif 000136
0.25〜3%の
【化４７】
2021504424.tif 000137
1%以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、（27）に記載のサポニン抽出物。
（３４）214nmでのUV吸光度により少なくとも98%の
【化４８】
2021504424.tif 000138
2021504424.tif 000139
2021504424.tif 000140
又は2118成分、
少なくとも93%の
【化４９】
2021504424.tif 000141
2021504424.tif 000142
0.25〜3%の
【化５０】
2021504424.tif 000143
1%以下のその他のピークを含有し、最も豊富な化学種のモノアイソトープが1987.9m/zである、（27）に記載のサポニン抽出物。
（３５）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも65%、例えば少なくとも70%の
【化５１】
2021504424.tif 000144
を含有する、（27）から（34）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（３６）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により30%以下、例えば25%以下の
【化５２】
2021504424.tif 000145
を含有する、（27）から（35）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（３７）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも5%、例えば少なくとも10%の
【化５３】
2021504424.tif 000146
を含有する、（27）から（36）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（３８）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により10%以下、例えば5%以下の
【化５４】
2021504424.tif 000147
を含有する、（27）から（37）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（３９）214nmでのUV吸光度及び相対イオン存在量により少なくとも0.5%、例えば少なくとも1%の
【化５５】
2021504424.tif 000148
を含有する、（27）から（38）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（４０）214nmでのUV吸光度により少なくとも1%の
【化５６】
2021504424.tif 000149
を含む、（27）から（39）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（４１）乾燥されている、（1）から（40）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（４２）精製されたサポニン抽出物の製造に使用されるキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を同定する方法であって、
(i)214nmでのUPLC-UV吸光度により2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ、及び
(ii)0.075以下の2018成分/QS-21主ピークの比を有する粗製水性抽出物を選択するステップ
を含む方法。
（４３）ステップ(ii)で選択される粗製水性抽出物が0.064以下の2018成分/QS-21主ピークの比を有する、（42）に記載の方法。
（４４）（1）から（41）のいずれか一に記載のサポニン抽出物の製造に使用される、（42）又は（43）に記載の方法。
（４５）(i)0.075以下の2018成分対QS-21主ピークの比を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ、
(ii)ポリビニルピロリドン吸着により抽出物を精製するステップ、
(iii)透析ろ過、限外ろ過又は透析により抽出物を精製するステップ、
(iv)ポリスチレン樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ、及び
(v)フェニル樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップ
を含む、精製されたサポニン抽出物を製造する方法。
（４６）ステップ(iii)が透析ろ過による精製を使用する、（45）に記載の方法。
（４７）ステップ(iv)が、アセトニトリル及び水を、特に勾配条件下で使用する、（45）又は（46）に記載の方法。
（４８）ステップ(v)が、アセトニトリル及び水を、特にアイソクラティック条件下で使用する、（45）から（47）のいずれか一に記載の方法。
（４９）溶媒を除去して乾燥したサポニン抽出物を提供する追加のステップを含む、（45）から（48）のいずれか一に記載の方法。
（５０）溶媒を除去するステップが、凍結乾燥を使用する、（49）に記載の方法。
（５１）C8樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を濃縮する追加のステップを含む、（45）から（50）のいずれか一に記載の方法。
（５２）C8樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーにより抽出物を濃縮するステップが、アセトニトリル及び水を、特に段階的勾配条件下で使用する、（51）に記載の方法。
（５３）溶媒を交換する追加のステップを含む、（51）又は（52）に記載の方法。
（５４）溶媒を交換するステップが、透析ろ過、限外ろ過又は透析、殊に透析ろ過を使用する、（53）に記載の方法。
（５５）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.064以下の2018成分対QS-21主ピークの比を有する、（45）から（54）のいずれか一に記載の方法。
（５６）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.01以上の2018成分対QS-21主ピークの比を有する、（45）から（55）のいずれか一に記載の方法。
（５７）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.005以上の2018成分対QS-21主ピークの比を有する、（56）に記載の方法。
（５８）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.45以下の先行するピーク対QS-21主ピークの比を有する、（45）から（57）のいずれか一に記載の方法。
（５９）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、0.40以下の先行するピーク対QS-21主ピークの比を有する、（58）に記載の方法。
（６０）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が、少なくとも1g/L、例えば少なくとも2g/L、殊に少なくとも2.5g/L、特に少なくとも2.8g/LのQS-21主ピークを含有する水溶液である、（45）から（59）のいずれか一に記載の方法。
（６１）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物が樹皮抽出物である、（45）から（60）のいずれか一に記載の方法。
（６２）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物を選択するステップ(i)が、粗製水性抽出組成物を試験して2018成分含量を決定することを含む、（45）から（61）のいずれか一に記載の方法。
（６３）医薬、例えばアジュバント又は免疫原性組成物の製造における、（1）から（41）のいずれか一に記載のサポニン抽出物の使用。
（６４）アジュバントとして使用するための（1）から（41）のいずれか一に記載のサポニン抽出物。
（６５）（1）から（41）のいずれか一に記載のサポニン抽出物を含むアジュバント組成物。
（６６）アジュバントがリポソーム製剤である、（63）から（65）のいずれか一に記載の使用、サポニン抽出物又はアジュバント組成物。
（６７）アジュバントがTLR4アゴニストを含む、（63）から（66）のいずれか一に記載の使用、サポニン抽出物又はアジュバント組成物。
（６８）TLR4アゴニストが3D-MPLである、（67）に記載の使用、サポニン抽出物又はアジュバント組成物。
（６９）（65）から（68）のいずれか一に記載のアジュバント組成物と、免疫原若しくは抗原、又は免疫原若しくは抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む免疫原性組成物。
（７０）抗原が、例えば、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する細菌、菌類、寄生性微生物若しくは多細胞寄生生物を含むヒト若しくは非ヒト病原体、又はがん細胞若しくは腫瘍細胞に由来する、（69）に記載の免疫原性組成物。
（７１）抗原が、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫に由来し、例えば配列番号1の抗原である、（70）に記載の免疫原性組成物。
（７２）抗原がマイコバクテリウム属の種に由来し、例えば配列番号2〜5のいずれか1つに由来する、（70）に記載の免疫原性組成物。
（７３）抗原が水痘帯状疱疹ウイルスに由来し、例えば配列番号6の抗原である、（70）に記載の免疫原性組成物。
（７４）抗原がヒト呼吸器多核体ウイルスに由来し、例えば配列番号7の抗原である、（70）に記載の免疫原性組成物。
（７５）抗原がHIVに由来し、例えば配列番号8又は9の抗原である、（70）に記載の免疫原性組成物。
（７６）抗原が無莢膜型インフルエンザ菌(NTHi)及び/又はモラクセラ・カタラーリスに由来する、（70）に記載の免疫原性組成物。
（７７）抗原がポリペプチドとして提供される、（69）から（76）のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
（７８）ポリペプチド抗原をコードするポリヌクレオチドが提供される、（69）から（76）のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
（７９）キラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中の2018成分/QS-21主ピークの比を決定する方法であって、
(i)214nmでのUPLC-UV吸光度によりキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中の2018成分含量を決定するステップ、
(ii)214nmでのUPLC-UV吸光度によりキラヤ・サポナリア・モリナの粗製水性抽出物中のQS-21主ピーク含量を決定するステップ、及び
(iii)2018成分含量をQS-21主ピーク含量と比較して2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ
を含む方法。
以下の非限定的実施例を参照して本発明を更に記載する。
【国際調査報告】
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2021504424.tif 000151
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