(57)【要約】  この発明は、全および／または特異的セルフリー核酸（ｃｆ−ＤＮＡなど）および／または細胞溶解を測定することによる、移植または埋め込みのための移植片の適合性を評価するための方法および組成物に関する。
2021506342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植または埋め込みのための潜在的な移植片の適合性を評価する方法であって、該方法は：
潜在的な移植片（例として、ex vivo）から放出される全ｃｆＤＮＡおよび／または移植片特異的ｃｆＤＮＡの量を取得すること（例として、潜在的なレシピエントの血液細胞との潜在的な移植片の接触の前に）、および
移植または埋め込みのための潜在的な移植片の適合性を決定するための量（単数または複数）を評価すること、
任意に、全および／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡの量（単数または複数）を定量化するための方法を、量を取得するために行うこと
を含む、前記方法。
【請求項２】
潜在的なレシピエントからの血液細胞との、潜在的な移植片またはその細胞の接触に後続する、潜在的な移植片（例として、ex vivo）から放出される全および／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡの量を取得することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移植または埋め込みのための潜在的な移植片の適合性を評価する方法であって、該方法は：
潜在的なレシピエントからの血液細胞との、潜在的な移植片またはその細胞の接触に後続する、潜在的な移植片（例として、ex vivo）から放出される全および／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡの量を取得すること、および
移植または埋め込みのための潜在的な移植片の適合性を決定するための量（単数または複数）を評価すること、
任意に、全および／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡの量（単数または複数）を定量化する方法を、量を取得するために行うこと
を含む、前記方法。
【請求項４】
細胞溶解の量を決定することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞溶解の量を決定することが、フラグメント分析を行うことを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
フラグメント分析が、長および／または短フラグメントを定量化することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料（単数または複数）への１、２、３またはそれ以上の遠心分離ステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
潜在的な移植片またはその細胞を取得することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
潜在的なレシピエントから血液を取得することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
１以上の追加の時点で、全および／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡの量を取得することおよび／または細胞溶解の量を決定することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
全および／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡの量（単数または複数）および／または細胞溶解の量を、閾値（単数または複数）かまたは追加の（例として、より早い）時点（単数または複数）から取得した量（単数または複数）と比較することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
量（単数または複数）が、潜在的な移植片またはそこからの細胞が含有されるかまたは血液細胞と接触する媒体の試料中において取得される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
量（単数または複数）が、灌流液試料中において取得される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
量（単数または複数）が、ＥＶＬＰ試料中において取得される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
潜在的なレシピエントから血液細胞（例として、血液）を取得することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
潜在的な移植片またはその細胞が、潜在的なドナーのものかまたは潜在的なドナーと同じ種の動物のものであるとすることができる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｃｆ−ＤＮＡが、潜在的な移植片から媒体中へと放出される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
媒体が、潜在的な移植片が含有されるかまたはこれと接触する保管、灌流もしくは他の保存媒体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
潜在的な移植片が、１または複数の臓器である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
臓器が、心臓、もしくは肺、もしくは心臓および肺であるか、または複数の臓器がこれを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
媒体の試料を取得すること、および試料中の全および／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡおよび／または細胞溶解の量を取得することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
１以上の追加の時点で潜在的な移植片から媒体中へと放出された全ｃｆ−ＤＮＡおよび／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡおよび／または細胞溶解の量を取得することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
全ｃｆ−ＤＮＡおよび／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡおよび／または細胞溶解の量（単数または複数）を、閾値（単数または複数）かまたは追加の（例として、より早い）時点（単数または複数）から取得した量（単数または複数）と比較することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
全セルフリーＤＮＡおよび／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡおよび／または細胞溶解の量（単数または複数）についての値を提供することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
量（単数または複数）についての値が、レポート中で提供される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
移植片の適合性に関して決定を行うことをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
潜在的な移植片が経時的にモニタリングされる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
移植片が、（例として、埋め込みまでの）１５分毎、３０分毎、１時間毎、１日毎、１週間毎、２週間毎または１か月毎に評価される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
全セルフリーＤＮＡおよび／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡおよび／または細胞溶解が、リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲなどのＰＣＲを含むものなどの定量的増幅に基づいた方法を使用して測定される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
全セルフリーＤＮＡおよび／または移植片特異的ｃｆ−ＤＮＡが、次世代シーケンシング法またはミスマッチＰＣＲ増幅法を使用して測定される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
量（単数または複数）についての値が、閾値かまたは異なる（例として、前の）時点からの値を上回るとき、移植片の適合性が減少していることまたは不適合性を示唆する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
量（単数または複数）についての値が、閾値かまたは異なる（例として、前の）時点からの値を下回るとき、移植片の適合性が増加していることまたは適合性を示唆する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
移植片または潜在的なドナーもしくはレシピエントの処置が行われるか、または、かかる処置に関する情報が与えられる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項の値（単数または複数）もしくは量（単数または複数）、または請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法を使用して得られた値（単数または複数）もしくは量（単数または複数）を含むレポート。
【請求項３５】
１以上の追加の時点からの１以上の閾値および／または値がレポートに包含される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１７年１２月1４日に出願された米国仮出願番号62/599,011の35 U.S.C.§119下の利益を主張し、その内容は全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
この発明は、全および／または移植片特異的セルフリー（cell-free）ＤＮＡなどのセルフリー（cell-free）核酸を測定することによる、移植または埋め込みのための移植片の適合性を評価するための方法および関連する組成物に関する。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
一側面において、移植片の適合性を評価する方法が提供される。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、方法は、１以上の試料を取得することをさらに含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値および／または特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値が、レポート中で提供される。一側面において、本明細書中で提供される方法のいずれか１つによって取得した値の１つ以上を伴うレポートが提供される。
【０００４】
一態様において、提供される方法のいずれか１つは、１以上の他の試料中の全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を取得すること、および／または１以上の他の試料中の特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を取得すること、をさらに含むことができ、ここで、１以上の他の試料は、１または複数の後続する時点からのものである。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、１以上の試料および／または１以上の他の試料は、移植片の取得（例として、移植片を保管すること、移植片を灌流すること、等々）の１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５５分以下など、数分以内に取得される。
【０００５】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、１以上の試料および／または１以上の他の試料は、移植片の取得（例として、移植片を保管すること、移植片を灌流すること、等々）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１８時間以下またはそれより長い時間以下など、数時間以内に取得される。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、最初の試料は、移植片の取得の１時間以内に取得され、および、１以上の他の試料は、閾値またはベースラインが到達される迄などの、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５５分の間隔以内、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１８時間またはそれより長い時間毎の間隔以内に取得される。
【０００６】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、１以上の他の後続する時点は、１時間毎の間隔でのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、１以上の他の後続する時点は、１日毎の間隔でのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、１以上の他の後続する時点は、１週間毎の間隔でのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、１以上の他の後続する時点は、２週間毎の間隔でのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、１以上の他の後続する時点は、１か月毎の間隔でのものである。
【０００７】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）は、移植片特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）である。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、方法は、１以上の試料および／または１以上の他の試料を取得することをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、方法は、１以上の試料を提供することをさらに含む。
【０００８】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、移植片のモニタリングは、本明細書中で提供される方法のいずれか１つを含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、試料は、媒体、血液、血漿または血清を含む。
一側面において、本明細書中で提供される値のいずれか１つ以上を含むレポートが提供される。提供されるレポートのいずれか１つの、一態様において、レポートは、１以上の試料中の全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値および／または１以上の試料中の全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を含む。
【０００９】
提供されるレポートのいずれか１つの、一態様において、レポートは、１以上の他の試料からの全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値および／または１以上の他の試料からの特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値をさらに含み、ここで、１以上の他の試料は、１または複数の後続する時点からのものである。提供されるレポートのいずれか１つの、一態様において、後続する時点は、少なくとも１日後である。提供されるレポートのいずれか１つの、一態様において、後続する時点は、少なくとも１週間後である。提供されるレポートのいずれか１つの、一態様において、後続する時点は、少なくとも２週間後である。提供されるレポートのいずれか１つの、一態様において、後続する時点は、少なくとも１か月後である。
【００１０】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量を取得するための方法は、リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲなどでの増幅を含む。リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲなどでの増幅を含むかかる方法のいずれか１つの、一態様において、１以上の標的が増幅させられる。これらの方法のいずれか１つの、一態様において、ＲＮａｓｅＰが、増幅の標的であるかまたは標的の１つである。数々のリファレンス遺伝子のいずれかを、分析のために増幅させることができる。増幅の標的としての役割を担うことができる他のリファレンス遺伝子は、当業者に知られるものとなる。
【００１１】
本明細書中で提供されるかかる方法のいずれか１つの、一態様において、特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量を取得するための方法は（例えば、移植片が異種移植片であるとき）、リアルタイムＰＣＲでなどの増幅を含む。かかる方法のいずれか１つの、一態様において、方法は、移植片に特異的な１以上の標的およびレシピエントまたは潜在的なレシピエントに特異的な１以上の標的の定量化を取得すること、を含む。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、方法は、１以上の移植片特異的標的および／または１以上のレシピエントまたは潜在的なレシピエント標的を取得することをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、定量化は、試料（単数または複数）中へとスパイクされ得る内部標準などの標準に対して相対的に、各標的について得られる。
【００１２】
本明細書中で提供されるかかる方法のいずれか１つの、一態様において、特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量を取得するための方法は、ミスマッチＰＣＲ増幅法を含むことができる。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的の各々について、試料またはその一部分に対する少なくとも１つのプライマー対でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量化アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイからの結果を取得することを含み、ここで、少なくとも１つのプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも１つのプライマー対は、ＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ミスマッチ（例として、最後から２番目のミスマッチ）であるがＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ダブルミスマッチであるものを伴うプライマーを含み、およびＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）を特異的に増幅させる。
【００１３】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、各ＳＮＶ標的について、少なくとも１つの別のプライマー対での定量化アッセイからの結果を取得することをさらに含み、ここで、少なくとも１つの別のプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも１つの別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）を特異的に増幅させる。
【００１４】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的の各々について、試料またはその一部分に対する少なくとも２つのプライマー対でのＰＣＲ定量化アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイを行うことを含み、ここで、各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ミスマッチ（例として、最後から２番目の）であるがＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ダブルミスマッチであるものを含み、およびＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）を特異的に増幅させ、ならびに少なくとも２つのプライマー対の別のものは、ＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）を特異的に増幅させる。
【００１５】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、試料またはその一部分に対して行われた、少なくとも２つのプライマー対での、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的の各々についての、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量化アッセイなどの、増幅に基づいた増幅アッセイからの結果を取得することを含み、ここで、各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ミスマッチ（例として、最後から２番目の）であるがＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ダブルミスマッチであるものを含み、およびＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）を特異的に増幅させ、ならびに少なくとも２つのプライマー対の別のものは、ＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）を特異的に増幅させる。
【００１６】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、試料に対する、各プライマー対がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも２つのプライマー対などの本明細書中で提供されるとおりの少なくとも１つのプライマー対での、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイからの結果を取得すること、特異的な核酸および／または非特異的な核酸の遺伝子型に基づいて有用な結果を選択すること、および、有用な結果に基づいて試料中の非特異的な核酸の量を決定することを含む。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、複数のＳＮＶ標的を同定することをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、非特異的な核酸の遺伝子型を推測することをさらに含む。 
【００１７】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、１）試料またはその一部分に対して行われた、各プライマー対がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも２つのプライマー対などの、少なくとも１つのプライマー対（ここで、少なくとも２つなどの少なくとも１つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ミスマッチ（例として、最後から２番目の）であるがＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ダブルミスマッチであるものを含み、およびＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）を特異的に増幅させる）での、複数のＳＮＶ標的の各々についての、ＰＣＲ定量化アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイ、および、２）特異的な遺伝子型に基づく有用な結果の決定および／または非特異的であると思われる遺伝子型の予測、からの結果を取得することを含む。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、少なくとも２つのプライマー対があるとき、別のプライマー対は、各ＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）を特異的に増幅させ、およびＳＮＶ標的の各々についての別のプライマー対での定量化結果が得られる。
【００１８】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、１）試料またはその一部分に対して行われた、各プライマー対がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも２つのプライマー対（ここで、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ミスマッチ（例として、最後から２番目の）であるがＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ダブルミスマッチであるものを含み、およびＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）を特異的に増幅させ、ならびに少なくとも２つのプライマー対の別のものは、ＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）を特異的に増幅させる）での、複数のＳＮＶ標的の各々についての、ＰＣＲ定量化アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイ、および、２）特異的な遺伝子型に基づく有用な結果の決定および／または非特異的であると思われる遺伝子型の予測、からの結果を取得することを含む。
【００１９】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、各ＳＮＶ標的につき少なくとも１つの別のプライマー対、および／または、それでのＰＣＲ定量化アッセイなどの増幅に基づいた定量化アッセイで結果を取得すること、をさらに含む。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、少なくとも１つの別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ミスマッチ（例として、最後から２番目の）であるがＳＮＶ標的の１つの配列（例として、アレル）に対する相対的な３’ダブルミスマッチであるものを含み、およびＳＮＶ標的の別の配列（例として、アレル）を特異的に増幅させる。
【００２０】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、結果に基づいて特異的核酸の量を評価することをさらに含む。
かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、結果は、有用な結果である。
【００２１】
かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、方法は、ＰＣＲ定量化アッセイなどの増幅に基づいた定量化アッセイの有用な結果を選択することをさらに含む。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、選択された有用な結果は、中央値平均などに、平均される。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、結果は、ロバスト統計でさらに分析されることができる。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、結果は、ロバスト標準偏差などの標準偏差、および／またはロバスト変動係数などの変動係数、または％ロバスト変動係数などの％変動係数で、さらに分析されることができる。
【００２２】
かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、ＰＣＲ定量化アッセイなどの増幅に基づいた定量化アッセイの有用な結果は、非特異的な核酸および／または特異的な核酸の遺伝子型に基づいて選択される。
かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、方法は、非特異的な核酸および／または特異的な核酸の遺伝子型を取得することをさらに含む。
【００２３】
かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、ＳＮＶ標的につき少なくとも１つのプライマー対、少なくとも２つのプライマー対、少なくとも３つのプライマー対、少なくとも４つのプライマー対またはそれ以上がある。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも４５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０またはそれ以上である。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも９０、９５またはそれ以上の標的である。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、複数のＳＮＶ標的は、９０、９５またはそれ以上の標的よりも少ない。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、複数のＳＮＶ標的は、１０５または１００の標的よりも少ない。
【００２４】
かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、ミスマッチのプライマー（単数または複数）は、フォワードプライマー（単数または複数）である。かかるミスマッチ法のいずれか１つの、一態様において、各ＳＮＶ標的についてのプライマー対についてのリバースプライマーは同じである。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量は、特異的な核酸の、全または非特異的な核酸に対する、比またはパーセンテージである。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、方法は、試料から核酸を抽出することをさらに含む。
【００２５】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、方法は、前増幅（pre-amplification）ステップをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、前増幅ステップは、定量化アッセイ（単数または複数）の前に行われる。
一態様において、本明細書中で提供される方法についての態様のいずれか１つは、提供されるレポートのいずれか１つについての態様とすることができる。一態様において、本明細書中で提供されるレポートについての態様のいずれか１つは、本明細書中で提供される方法のいずれか１つについての態様とすることができる。
【００２６】
図面の簡単な説明
添付の図面は、縮尺どおりに描かれていることを意図していない。図面は、例証的であるにすぎず、および、本開示の実施可能性には要求されない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＭＯＭＡプライマーの、例示的な、非限定的な図式を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて、ＳＮＶ Ａを含有する配列の伸長が起こると期待され、ＳＮＶ Ａの検出が結果としてもたらされ、これは続けて定量化され得る。しかしながら、ダブルミスマッチに起因して、ＳＮＶ Ｂの伸長が起こることは期待されない。
【図２】図２は、セルフリー核酸（ＤＮＡなど）を決定するための例示的な概説を示す。
【図３】図３は、試料処理スキームの一態様を描くワークフロー概略である。
【００２８】
【図４】図４は、対照（正常血漿検体）およびチューブ２〜５中の溶出液中の長フラグメントＤＮＡの割合（デュプリケーションの決定の平均として報告された）を示す。
【図５】図５は、チューブ２〜５中のフラグメント分布の代表的な電気泳動画像である。ピーク高さは、フラグメントレベルを表示する。フラグメント長さ（ＢＰ）は、追跡点上に表示されている。ＦＵ＝蛍光単位。
【００２９】
【図６】図６は、１４００×ｇスピン後のSTEEN／血漿上清を示し、STEENの不在下での血漿採集において見られたものに類似して、白血球が本質的に不在であることを示している（倍率４００×）（左パネル）。比較のために、ＰＰＴ後のSTEEN／血漿上清中の、後続する１４００×ｇスピンステップによる、あらゆる残余白血球の有効除去を示す２００μＬの再懸濁された１４００×ｇのペレット（倍率４００×）は、STEENなしの血漿を使用して見られた結果と調和する（右パネル）。
【図７】図７は、STEEN（商標）溶液に加えた異なる濃度のｇＤＮＡおよびヘパリンの、回収のパーセントを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な記載
灌流容器中のex vivoでの移植片の全セルフリーＤＮＡは、一般的には、移植片からの細胞およびドナーからの血液からのあらゆる細胞の溶解および／またはアポトーシスを表すことになる。理論により拘束されるものではないが、移植片が劣化し始めると、細胞のアポトーシスが増加し、および全セルフリーＤＮＡもまた増加すると考えられる。移植のための適切な移植片は、一般的に、低いかまたは定常状態レベルの全セルフリーＤＮＡを有する。
【００３１】
本開示の側面は、移植片の適合性を評価するための方法に関する。全および／または特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）値を経時的に取得するために、本明細書中で提供されるかまたは別様に当該技術分野において知られている方法を、複数回使用することができる。また包含されるのは、１以上のこれらの値を包含することができるレポートである。かかるレポートは、臨床医に価値のある情報を提供することができる。いくつかの態様において、臨床医は、次いで疾患状態（または移植片の適合性）を評価することおよび／またはそれに従って対象のための処置判断をすることができる。
【００３２】
本明細書中で使用される、「移植片」は、対象中にまたはその中へと移植されまたは埋め込まれ得る、臓器の少なくとも一部分などの、細胞または組織を含む生物材料を指す。いくつかの態様において、移植片は、移植片を保存または回復させるためなどで、体外（ex vivo）で維持された臓器の少なくとも一部分などの、細胞または組織を含む外植された材料である。本明細書中で提供される方法のいずれか１つを、将来的な生着のためのその適合性を評定するために使用することができる。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、材料は、対象からの除去の後および別の対象中への生着の前などの、ＥＶＬＰ肺である。
【００３３】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、移植片は、全臓器または１よりも多い臓器である。移植するかまたは埋め込むことができる臓器の例は、心臓、腎臓（単数または複数）、腎臓、肝臓、肺（単数または複数）、膵臓、腸、等々を包含するがこれに限定されない。１以上の臓器の例は、心臓と肺との組み合わせを包含する。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、他の態様において、移植片は、全臓器よりも小さく、および最大でも、弁など、その一部分である。移植片は、同じ種のものであり得るか、または異なる種のものであり得る。
【００３４】
したがって、本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、移植片は、レシピエントがヒトであるなど、ブタまたはウシでないときに、それぞれ、ブタまたはウシからのものであるなど、異なる種からのものである（または異種移植片である）。本明細書中で提供される移植片のタイプのいずれか１つは、異種移植片であり得る。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、移植片は、ブタまたはウシの弁である。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、他の態様において、移植片は、同じ種からのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、他の態様において、移植片は、脱細胞処理された異種移植片などの、脱細胞処理された移植片である。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、移植片は、自家移植片である。本明細書中で提供される方法または組成物のいずれか１つが、本明細書中に記載される移植片のいずれか１つを評価するために使用され得る。
【００３５】
本明細書中で使用される、試料は、生物学的試料とすることができる。かかる生物学的試料の例は、全血、血漿、血清、等々を包含する。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、試料は、移植片を中に入れられたかまたはこれと接触している媒体であり得るかまたはこれを含み得る。かかる試料のいずれか１つの、一態様において、媒体は、血液または血液代用品、保存溶液、またはあらゆる他の溶液であってin vitroの文脈などで移植片を中に入れられることができるかまたはこれと接触するもの、を含むことができる。かかる試料のいずれか１つの、一態様において、１または複数の臓器などの移植片は、灌流システム中に含有されることができる。
【００３６】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、移植片（例として、細胞、組織、臓器）は、移植片保管媒体中に維持される。臓器保存溶液などの移植片保管媒体は、当該技術分野においてよく知られている。移植片保管媒体は、細胞内（例として、灌流された）または細胞外とすることができ、および、保存される移植片に依存し得る。ほとんどの移植片を保存するためのアプローチは、単純な静的冷蔵貯蔵（ＳＣＳ）および動的保存（dynamic preservation）を包含する。動的保存の例は、低温機械灌流（ＨＭＰ）、常温機械灌流、および酸素吹込灌流（oxygen persufflation）を包含する。典型的には、低温との組み合わせで、移植片保管媒体は、血液が存在する摘出において凝固を防止し、ex vivoの取り扱いに関連するストレスおよび劣化を低減し、および微生物成長のリスクを減少させることができる。このため、いくつかの態様において、移植片保管媒体は、浸透圧活性剤、電解質、水素イオン緩衝剤、コロイド（単数または複数）、代謝阻害剤、代謝物、および抗酸化剤を含むことができる。細胞膨張を防止し得る、浸透圧活性剤の例は、ラクトビオン酸塩、ラフィノース、クエン酸塩、およびグルコン酸塩を包含する。浸透圧効果を発揮することができる、電解質は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムイオンを包含する。
【００３７】
水素イオン緩衝剤の例は、リン酸、ヒスチジン、およびＮ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤を包含する。最初の血管洗い流しおよび灌流の間使用され得る、コロイドの例は、アルブミンおよびＨＥＳを包含する。細胞構成要素の分解を抑制し得る、代謝阻害剤の例は、アロプリノール、抗プロテアーゼ、およびクロルプロマジンを包含する。再灌流相の間に代謝を復元することを助けることができる、代謝物の例は、アデノシン、グルタチオン、およびリン酸を包含する。酸素フリーラジカル損傷を阻害することができる、抗酸化剤の例は、ステロイド、ビタミンＥ、デフェロキサミン、およびトリプトファンを包含する。
【００３８】
移植片保管媒体は商業的に入手可能であり、および、例は、BELZER UW（登録商標）冷蔵保管溶液（VIASPAN（商標）またはUniversity of Wisconsin（ＵＷ）溶液）、CELSIOR（登録商標）、CUSTODIOL（登録商標）、およびIGL-1（登録商標）を包含する。
いくつかの側面において、方法は、全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値および／または特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を決定するためのステップを包含する。
本明細書中で使用される、「値」は、「量」に関しての情報を持つあらゆる指標である。指標は、量についての絶対値または相対値とすることができる。本明細書中で使用される、「量」は、核酸（ＤＮＡなど）の量（quantity）を指す。さらに、値は、量、頻度、比、パーセンテージ等々とすることができる。
【００３９】
いくつかの事例において、値は、「閾値」と比較することができる。本明細書中で使用される、「閾値」は、状態を示唆し、疾患状態の存在もしくは不在またはリスクの存在もしくは不在を示唆する、あらゆる所定のレベルまたはレベルの範囲を指す。閾値は、様々な形を取ることができる。それは、中央値または平均などの、単一のカットオフ値とすることができる。それは、１つの定義された群におけるリスクが別の定義された群におけるリスクの２倍である場合など、比較群に基づいて確立することができる。別の例としては、閾値は、状態、疾患状態またはリスクの存在がない、または処置の経過もしくは他の改善措置の後などの、ベースライン値である。かかるベースラインは、試験されているリスクまたは疾患状態または状態と関連していない正常または他の状態を示唆するものとすることができる。
【００４０】
本明細書中で使用される、「特異的セルフリー核酸」は、全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の内にあるセルフリー核酸（ＤＮＡなど）のサブセットを指す。いくつかの態様において、特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）は、移植片特異的（ＧＳ）なセルフリー核酸（ＤＮＡなど）である。ＧＳ ｃｆ−ＤＮＡは、推定上、移植片またはその細胞から落ちたＤＮＡを指し、その配列は、移植片を取得した対象の遺伝子型と（全体でまたは一部で）マッチする。本明細書中で使用される、ＧＳ ｃｆ−ＤＮＡは、ＧＳ ｃｆ−ＤＮＡ集団中のある配列（単数または複数）であって、レシピエントまたは潜在的なレシピエントのｃｆ−ＤＮＡから区別可能である（例として、特定のヌクレオチド座（単数または複数）で異なる配列を有する）ｃｆ−ＤＮＡ配列を指してもよく、または、それはＧＳ ｃｆ−ＤＮＡ集団全体を指してもよい。
【００４１】
核酸（ＤＮＡなど）の量（単数または複数）についての値は、本明細書中で提供される方法のいずれか１つによって「取得する」ことができ、および、あらゆる取得ステップ（単数または複数）は、参照により本明細書中に組み込まれまたは別様に本明細書中で提供される方法のいずれか１つを包含することができる。本明細書中で使用されるとおりの「取得すること」は、それぞれの情報または材料を獲得することができるあらゆる方法を指す。よって、それぞれの情報を、実験的な方法によって獲得することができる。それぞれの材料は、いくつかの態様において、様々な実験的または実験室的方法によって、作り出す、設計する等々することができる。それぞれの情報または方法はまた、レポート中などの情報を、または材料を、与えられるかまたはこれを提供されることによっても、獲得することができる。材料は、いくつかの態様において、商業的手段により（すなわち、購入することにより）与えられ得るかまたは提供され得る。
【００４２】
本明細書中で提供されるとおり、適合性は、全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての１以上の値および／または特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての１以上の値を使用して決定することができる。
理想的には、分析されるセルフリーＤＮＡのほとんどが臓器から来るものであり、および、血液は洗い流される。しかしながら、ドナーからの無傷の白血球は、依然として臓器中に存在する可能性がある。また、細胞の溶解は、全セルフリーＤＮＡ分析のための灌流液の質を低下させる可能性がある。よって、本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、灌流液試料などの試料から、コンタミネーションさせる無傷の細胞が、１以上の（例として、１、２、または３以上の）遠心分離ステップによって除去される。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、コンタミネーションさせる白血球の有効な洗い流しの後で、意味のあるｃｆＤＮＡ分析のためにベースラインを確立することができる。
【００４３】
適合性はまた、全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての１以上の値および／またはフラグメント分析からの１以上の値を使用しても決定することができる。
フラグメント分析は、短および／または長核酸フラグメントを評価することによって行うことができる。本明細書中で使用される、「長フラグメント」は、１７０ｂｐｓよりも大きいフラグメント（例として、長さ１７１〜３００ｂｐｓの間）を指し、一方で「短フラグメント」は、１７０ｂｐｓ以下のフラグメント（例として、長さ７５〜１７０ｂｐｓの間）である。かかる方法は、一般的に、長フラグメントおよび／または短フラグメントを標的とするプライマーで行われる。
【００４４】
フラグメントは、Ａｌｕフラグメントとすることができる。Ａｌｕエレメントは、元々Arthrobacter luteus（Ａｌｕ）制限エンドヌクレアーゼの作用によって特徴づけられた、ＤＮＡの短いストレッチである。Ａｌｕリピートは、ヒトゲノム中で最も豊富な配列であり、ゲノムにつき約１４０万のコピー数を伴う。Ａｌｕ配列は、典型的には３００ヌクレオチドである、短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）であり、これはゲノムの１０％よりも多くを占める。本明細書中で提供されるのは、一態様において長Ａｌｕフラグメントおよび／または短Ａｌｕフラグメントを分析することにより、ｃｆ−ＤＮＡ試料の細胞溶解の潜在的なコンタミネーション寄与を測定することを包含することができる、方法である。
【００４５】
提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、方法は、値（単数または複数）に基づいて移植または埋め込みのための移植片の適合性（例として、健康、状態、または疾患状態）を評価することをさらに包含する。いくつかの態様において、本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、１以上の値（例として、全および／または特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量について）の増加を、不適合性とまたは適合性が低下していることと相関付ける、あるいは、１以上の値（例として、全および／または特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量について）の減少を、適合性とまたは適合性が増加していることと相関付けることを、含むことができる。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、相関付けることは、適合性を、または適合性が増加もしくは減少していることを決定するために、レベル（例として、濃度、比またはパーセンテージ）を閾値または別の時点からの値と比較することを含む。よって、レベルにおける変遷を、経時的にモニタリングするものとすることができる。本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、グラフ（graph）の適合性を評価するために核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を閾値または別の時点からの値と比較する１以上のステップを包含することができる。
【００４６】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一態様において、方法は、評価するための追加の試験（単数または複数）をさらに包含し得る。追加の試験（単数または複数）は、本明細書中で提供される方法または当該技術分野において知られている方法のいずれか１つであり得る。
【００４７】
臨床医にとって特に有用であるのは、本明細書中で提供される値（単数または複数）を含有するレポートであることが見出されている。提供されるレポートのいずれか１つの、いくつかの態様において、レポートは、１以上の閾値をもまた包含する。一側面において、ゆえに、かかるレポートが提供される。レポートは、視覚化できるかまたは表示できる形などの、口頭、書類（またはハードコピー）もしくは電子的な形であり得る。いくつかの態様において、本明細書中で提供されるとおりの各アッセイについての「生の」結果が、レポート中で提供され、および、このレポートから、核酸（ＤＮＡなど）の量（単数または複数）を分析するためのさらなるステップを取ることができる。他の態様において、レポートは、核酸（ＤＮＡなど）の量についての複数の値を提供する。量から、いくつかの態様において、臨床医は、移植または埋め込みのための移植片の適合性、または、移植片を時間もしくは処置もしくは何らかの他の改善措置にわたってモニタリングする必要性を、評価し得る。
【００４８】
いくつかの態様において、量は、データベース中にあるかまたはデータベース中へと入力される。一側面において、かかる値を伴うデータベースが提供される。量（単数または複数）から、臨床医は、処置またはモニタリングの必要性を評価し得る。したがって、本明細書中で提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、１よりも多い時点での量（単数または複数）を評価することを含むことができる。かかる評価は、本明細書中で提供される方法または組成物のいずれか１つを用いて行うことができる。
本明細書中で提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、１または複数の別の時点での核酸（ＤＮＡなど）の量を評価することを包含することができる。かかる評価は、本明細書中で提供される方法のいずれか１つを用いて行うことができる。
【００４９】
全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）ならびに特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）を決定するための方法は、本明細書中で提供されるか、または別様に当該技術分野において知られている。例えば、ＰＣＴ出願第PCT/US2016/030313号の方法が、本明細書中で提供されるとおりの試料中の特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を決定するために使用され得る。よって、本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＴ出願第PCT/US2016/030313号において記載された方法のいずれか１つの、ステップを包含することができ、および、かかる方法およびステップは、参照により本明細書中に組み込まれる。同様に、米国出願公開第US-2015-0086477-A1号の、セルフリーＤＮＡを測定する方法もまた、参照により本明細書中に組み込まれ、および、かかる方法は、セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を決定するための本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、一部として包含されることができる。
【００５０】
さらなる例としては、リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲなどのＰＣＲを伴う増幅が、セルフリー核酸（ＤＮＡなど）および／または特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を決定するために使用され得る。例えば、本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、全セルフリー核酸（ＤＮＡなど）は、ＲＮａｓｅ Ｐを標的として使用したTaqmanリアルタイムＰＣＲで決定される。他の方法は、本明細書中の他の箇所で提供されるか、または、当業者には明らかである。本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、本明細書中で提供される値を決定する方法のいずれか１つを包含することができる。
【００５１】
上で言及したとおり、いくつかの態様において、本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、特異的セルフリー核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を決定するためにミスマッチ増幅（例として、ＭＯＭＡ）を活用する定量的アッセイのステップを包含し得る。かかるアッセイにおける使用のためのプライマーが取得され得、および、本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、定量的アッセイを行うための１以上のプライマー対を取得するステップを包含することができる。一般的に、プライマーは、核酸の量を定量化することにおけるそれらの使用を円滑にするような固有の特性を保有する。例えば、プライマー対のフォワードプライマーは、３’ヌクレオチド（例として、最後から２番目の３’ヌクレオチド）でミスマッチすることができる。
【００５２】
提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、このミスマッチは、３’ヌクレオチドにあるが、ＳＮＶ位置に隣接している。提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、ＳＮＶ位置に対する相対的なプライマーのミスマッチの位置取りは、図１に示されるとおりである。一般的に、かかるフォワードプライマーは、３’ミスマッチを伴ってさえも、増幅反応中で増幅産物を（適切なリバースプライマーと連動して）生産し、これによって、それぞれのＳＮＶを伴う核酸の、増幅およびその結果もたらされる検出を可能にさせる。特定のＳＮＶが存在せず、かつＳＮＶ標的の他方のアレルに対するダブルミスマッチがある場合には、増幅産物は一般的に生産されない。好ましくは、本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、各ＳＮＶ標的について、それによって各アレルの特異的増幅が他のアレル（単数または複数）の増幅なしに起こることができるようなプライマー対が得られる。
【００５３】
「特異的増幅」は、別の核酸の実質的な増幅のない、または、バックグラウンドまたはノイズを上回るような別の核酸配列の増幅のない、特異的な標的の増幅を指す。いくつかの態様において、特異的増幅は、特異的なアレルの増幅のみを結果としてもたらす。
【００５４】
本明細書中で使用される、「一塩基バリアント」は、核酸配列内に単一のヌクレオチドでの配列変化があるものを指す。いくつかの態様において、ＳＮＶは、ＳＮＶについて１つのメジャーアレルおよび１つのマイナーアレルがあるということを意味する両アレル性のＳＮＶである。いくつかの態様において、ＳＮＶは、集団内でなど、２よりも多いアレルを有し得る。一般的に、「マイナーアレル」は、遺伝子座に対する、核酸のセットにおいてより低頻度のアレルを指し、一方で「メジャーアレル」は、核酸のセットにおいてより高頻度のアレルを指す。本明細書中で提供される方法は、いくつかの態様においては、低いレベルで存在するときでさえ、核酸の混合物内のメジャーおよびマイナーアレルの核酸を定量化することができる。
【００５５】
ＳＮＶなどの、核酸配列内に配列同一性の変化があるものは、一般的に「標的」と呼ばれる。本明細書中で使用される、「ＳＮＶ標的」は、核酸配列内に単一のヌクレオチドでの配列変化があるものを指す。ＳＮＶ標的は、１よりも多いアレルを有し、および好ましい態様において、ＳＮＶ標的は、両アレル性である。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、ＳＮＶ標的は、ＳＮＰ標的である。これらの態様のいくつかにおいて、ＳＮＰ標的は、両アレル性である。提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、核酸の量は、複数のＳＮＶ標的に対するプライマーでの定量的ＰＣＲアッセイなどの、増幅に基づいた定量的アッセイを試みることによって決定される。「複数のＳＮＶ標的」は、各標的に対して少なくとも２つのアレルがある場合の、１よりも多いＳＮＶ標的を指す。好ましくは、いくつかの態様において、各ＳＮＶ標的は、両アレル性であることが期待され、および、ＳＮＶ標的の各アレルに特異的なプライマー対が、各アレルの核酸を特異的に増幅させるために使用され、ここで増幅は、特異的なアレルが試料中に存在する場合に起こる。
【００５６】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、両アレル性である各ＳＮＶ標的については、各々が２つのアレルのうちの１つに特異的である２つのプライマー対があり、および、よって、それが増幅させるアレルに対するシングルミスマッチと、それが増幅させないアレル（ここでも、これらのアレルの核酸が存在するのであれば）に対するダブルミスマッチとを有する。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、ミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、各ＳＮＶ標的についての２つのプライマー対のリバースプライマーは同じである。
【００５７】
これらのコンセプトを、本明細書中で提供される方法のいずれか１つのためのプライマー対の設計において使用することができる。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特異的な遺伝子座のフラグメントを増幅させるために、反対側の鎖（例として、センス鎖およびアンチセンス鎖）を結合させるように設計されているということが理解されるべきである。プライマー対のフォワードおよびリバースプライマーは、例えば本開示によるＳＮＶ標的のアレルの存在を検出するため、いずれかの適切なサイズの核酸フラグメントを増幅させるように、設計され得る。本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、本明細書中で記載されるとおりの１以上のプライマー対を取得するための１以上のステップを包含することができる。
【００５８】
一般的に、本明細書中で提供されるとおりの「有用な結果」は、試料中の核酸のレベルを定量化するのに使用することができる結果である。提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、特異的および／または非特異的核酸の量は、それぞれ、核酸についての有用な結果にわたる平均を表す。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、この平均は、絶対値としてまたはパーセンテージとして与えられる。好ましくは、本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、この平均は、中央値である。
【００５９】
特異的な核酸の、比またはパーセンテージなどの量は、必要に応じて、メジャーおよびマイナーアレルの量ならびに遺伝子型を用いて、決定され得る。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、アレルを、前もってのジェノタイピング（例として、それぞれ、レシピエントまたは潜在的なレシピエントの、および／または移植片がそこから得られたものである対象の）に基づいて決定することができる。ジェノタイピングのための方法は、当該技術分野において周知である。かかる方法は、次世代、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなどのシーケンシング、他の分離技術またはＰＣＲアッセイを包含する。本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、かかる遺伝子型を取得するステップを包含することができる。
【００６０】
本明細書中に記載されるプライマー対は、マルチプレックスＰＣＲアッセイなどのマルチプレックスアッセイに使用されてもよいということが理解されるべきである。したがって、いくつかの態様において、プライマー対は、ＰＣＲ反応において他のプライマー対と互換性があるように設計される。例えば、プライマー対は、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０等々の、ＰＣＲ反応における他のプライマー対と互換性があるように設計され得る。本明細書中で使用される、ＰＣＲ反応におけるプライマー対は、同じＰＣＲ反応においてそれらの標的を増幅させることを可能とする場合に、「互換性がある」。いくつかの態様において、プライマー対は、同じＰＣＲ反応中にマルチプレックス化されたときに、プライマー対がそれらの標的核酸（ＤＮＡなど）を増幅することから阻害されるのが１％以下、２％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、または６０％以下である場合に、互換性がある。
【００６１】
プライマー対は、プライマー二量体の形成、および、別のプライマー対と干渉し得る鋳型上のオフターゲット部位への結合、を包含するがこれに限定されない数々の理由のために、互換性がないことがあり得る。したがって、本開示のプライマー対は、他のプライマー対との二量体の形成を防止するように、または、オフターゲットの結合部位の数を限定するように、設計され得る。マルチプレックスアッセイにおける使用のためのプライマーを設計するための例示的な方法は、当該技術分野において知られており、および別様に本明細書中に記載されている。
【００６２】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、ミスマッチ増幅に基づいた定量的アッセイは、それによって核酸が増幅され、および核酸の量を決定することができる、あらゆる定量的アッセイである。かかるアッセイは、本明細書中に記載されるＭＯＭＡプライマーで核酸が増幅されおよび定量化されることによるものを包含する。かかるアッセイは、単純な増幅および検出、ハイブリダイゼーション技術、電気泳動などの分離技術、次世代シーケンシング、およびそのようなものを包含する。
【００６３】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、定量的アッセイは、定量的ＰＣＲアッセイを包含する。定量的ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、Taqman、等々を包含する。本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、ＰＣＲは、「リアルタイムＰＣＲ」である。かかるＰＣＲは、増幅プロセスが依然として進行している間にも液相中において反応速度をモニタリングすることができるＰＣＲ反応を指す。従来型ＰＣＲとは対照的に、リアルタイムＰＣＲは、増幅反応においてリアルタイムで同時に検出または定量化する能力を与える。特異的な染料からの蛍光強度の増加に基づいて、増幅がそのプラトーに達する前であっても標的の濃度を決定することができる。
【００６４】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つにおいて、ＰＣＲは、デジタルＰＣＲであり得る。デジタルＰＣＲには、希釈された増幅産物を、不連続な試験部位のほとんどがゼロまたは１つの増幅産物のいずれかを含むように、複数の不連続な試験部位へと分割することが関与する。増幅産物は、次いで、試料中の選択された興味の対象のゲノム領域の頻度の表現を提供するために分析される。不連続な試験部位につき１つずつの増幅産物の分析は、２値の「イエスかノーの」結果を、結果としてもたらし、これは、各不連続な試験部位について、選択された興味の対象のゲノム領域が定量化されること、および、互いとの関係での、選択された興味の対象のゲノム領域の相対頻度が決定されることを許容する。
【００６５】
ある側面において、加えてまたは代替として、所定の領域からのゲノム領域に対応する増幅産物を使用して複合分析が行われ得る。２以上の所定の領域の分析からの結果を、数々の増幅産物を定量化し、およびその相対頻度を決定することに使用することができる。試料中の頻度を決定するために２以上の所定の領域を使用することは、例として、増幅効率における変動を通して、偏りの可能性を低減し、これは単一検出アッセイを通してでは容易に明らかにならないものであり得る。デジタルＰＣＲを使用したＤＮＡを定量化するための方法は、当該技術分野において知られており、および例えば米国特許公開公報第US20140242582号において、以前に記載されている。
【００６６】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つは、セルフリーＤＮＡなどの核酸を抽出することを含むことができる。かかる抽出は、当該技術分野において知られているかまたは別様に本明細書中で提供されるあらゆる方法（例として、Current Protocols in Molecular Biology、最新版、またはQIAamp circulating nucleic acid kitもしくは他の適当な商業的に入手可能なキット、を参照）を使用してすることができる。血液からセルフリーＤＮＡを単離するための例示的な方法が記載される。ＥＤＴＡまたはＤＴＡなどの抗凝固剤を含有する血液が採集される。ｃｆ−ＤＮＡを含有する血漿が、血液中に存在する細胞から分離される（例として、遠心分離または濾過によって）。任意の第２の分離が、あらゆる残存する細胞を血漿から除去するために行われてもよい（例として、第２の遠心分離または濾過ステップ）。ｃｆ−ＤＮＡを、次いで、当該技術分野において知られているいずれかの方法を使用して、例として、Qiagenにより生産されたものなどの市販のキットを使用して、抽出することができる。
【００６７】
ｃｆ−ＤＮＡを抽出するための他の例示的な方法もまた、当該技術分野において知られている（例として、Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. 1000-1007；Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-5210；Circulating Nucleic Acids in Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 51, p.1317-1319；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. 1953-1955；Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-1613；およびand Swinkels et al. Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526、を参照）。
【００６８】
本明細書中で提供される方法のいずれか１つの、いくつかの態様において、前増幅ステップが行われる。かかる前増幅の例示的な方法は次のとおりであり、およびかかる方法は、本明細書中で提供される方法のいずれか１つに包含されることができる。プールされたプライマーが合計４μＭであった、おおよそ１３の標的とともに、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲにおいて、おおよそ１５ｎｇのセルフリー血漿ＤＮＡが増幅される。試料は、おおよそ２５サイクルを受ける。反応は、合計２５μｌである。増幅の後、試料は、AMPUREビーズ浄化、ビーズ精製、または単純にExoSAP-IT（商標）、またはZymoを包含する、数種のアプローチを使用して浄化されることができる。
【００６９】
本発明の様々な側面は、単独で、組み合わせて、または、前述で記載された態様において特には議論されていない様々な配置で使用され得、ゆえに、それらの適用において前述の記載において規定されているかまたは図面中で例証されている詳細および配置にまでは限定されない。例えば、一態様中に記載された側面は、他の態様中に記載された側面と、あらゆる様式で組み合わせられ得る。
【００７０】
また、本発明の態様は、その例が提供されている１以上の方法としても実装され得る。方法（単数または複数）の一部分として行われる動作は、あらゆる適切なやり方で順序付けられ得る。したがって、態様は、その行為が例証されたものとは異なる順序で行われて構成されていてもよく、これは、たとえ例証的な態様において逐次的な動作として示されていても、いくつかの動作を同時に行うことを包含してもよい。
【００７１】
クレーム要素を修飾するための請求項中の「第１の」、「第２の」、「第３の」等々といった順序の用語の使用は、それ自体によっては、いかなる優先順位、先行性、または１つのクレーム要素の別のものに対する順序も、または方法の動作が行われる時間的順序も、含意しない。かかる用語は、単にある名称を有する１つのクレーム要素を、同じ名称（ただし順序の用語を使用していることを除く）を有する別の要素から区別するための標識として使用される。
本明細書中で使用される言い回しおよび専門用語は、説明記載のためのものであって、限定するものとみなされてはならない。「包含する（including）」、「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「関与する（involving）」およびそれらのバリエーションの使用は、それ以降に列記される事項および追加の事項を網羅することを意味している。
【００７２】
本発明の数種の態様を詳細に記載してきたが、様々な改良および改善が、当業者には容易に起こり得る。かかる改良および改善は、本発明の精神および範囲の内にあることが意図される。したがって、前述の記載は、一例にすぎないのであって、限定するものとは意図されない。以下の記載は、本明細書中で提供される方法の例を提供する。
【実施例】
【００７３】
例
例１−  ゲルセパレータ血漿調製チューブ（ＰＰＴ）の評定
８ｍＬのニートなSTEEN（商標）を８．５ｍＬ ＰＰＴに加え、および１１００×ｇで１０分間スピンした。比較のために、１．０ｍＬのヒトバフィーコート（赤血球が混じっている血漿−白血球混合物）を、７．０ｍＬのニートなSTEEN（商標）に加え、および、１１００×ｇで１０分間、８．５ｍＬ ＰＰＴチューブ中でスピンした。物理的観測は、ゲルの栓上の流体相の遠心分離後の明瞭化および栓の下への細胞画分の移動という所見を包含した。分離後のゲルの最上部に観察された細い線は、ゲル材料中の赤血球フラグメントへの包埋に起因し、これは、全血を血漿セパレータゲルへとスピンさせたときにもまた見られる現象であった。
【００７４】
実験は、ex vivo肺灌流（ＥＶＬＰ）の肺を通って循環するSTEEN溶液内に存在し得る実質的な白血球／ＲＢＣ補完物をシミュレートするために、STEEN溶液中へのコントロールされたバフィーコートのスパイクを使用した。ゲルセパレータの下でＰＰＴの底に小さな赤色を帯びたペレットを形成した、ゲルセパレータを通しての細胞の移動は、STEEN（商標）溶液中に懸濁された細胞が、ＰＰＴのゲルの栓を通って、ＰＰＴ中のヒト全血試料の遠心分離の間に観察されたものと似たような様式で流体相から良く分離されたペレットを形成したということを示唆する。これは、ＥＶＬＰの間のSTEEN灌流液採集の試料については、ＰＰＴから注がれるスピン後の上清が、コンタミネーションさせる白血球からのＤＮＡによる問題のあるコンタミネーションなしのｃｆ−ＤＮＡ分析のために適切なものになるということを示唆する。
【００７５】
精製ヒト血漿対STEEN溶液の中へとスパイクされたバフィーコート細胞の細胞移動を実証する、条件付き対応ありコントロール（conditional paired control）のステップを、結果として行った。移植レシピエントの全血をＰＰＴ中で遠心分離することによってｃｆ−ＤＮＡ抽出および分析のために血漿を精製し、次いで、コニカルチューブ中にてＰＰＴ上清を低速で手早く再遠心分離したことで、あらゆる残余の細胞デブリをペレット化させた。ＥＶＬＰ内STEEN灌流液の流体相（全血とは対照的なものとしての）からの顕微鏡的レベルの白血球のクリアランスの程度を評定するために、上で記載されたとおりに調製した上清を、１５ｍＬコニカルチューブ中へと注ぎ、および１４００×ｇでの第２のスピンに１０分間供した。
【００７６】
第２のスピンからの上清を、次いで、小さい細胞ペレットの破壊を防ぐために２００μＬをチューブの底に残してコニカルチューブから除去した。採集した上清を、あらゆる残存する細胞質のために血球計算法によって顕微鏡的に検査した。ペレットを包含するチューブの底の２００μＬの体積を、再懸濁し、これもまた血球計を通して顕微鏡的に見た。図６は、顕微鏡的な結果を示す。
【００７７】
ゲルセパレータＰＰＴを通したバフィーコート−STEEN（商標）混合物の単一の低速スピン、これにはクリーンアップの低速（１４００×ｇで１０分間）のスピンが後に続くが、これは残存する血漿−STEEN（商標）流体相を、本質的に完全に、コンタミネーションさせる白血球のない状態にしておき、STEEN（商標）灌流液中のｃｆ−ＤＮＡの意味のある分析を可能にさせる。実験は、STEEN溶液およびその構成成分分子（例えば、デキストラン４０）は、ｃｆ−ＤＮＡ分析のために採集したSTEENに基づいたＥＶＬＰ灌流溶質からコンタミネーションさせる白血球を同様に除去するための、上で記載された血漿精製のためのプロトコルの能力には、実質的に影響しない、ということを実証している。
【００７８】
例２−  ニートなSTEEN（商標）中のヒトＤＮＡの存在／不在の決定
４ｍＬ体積のニートなSTEEN（商標）溶液、低ｃｆ−ＤＮＡの陽性抽出対照（ＰＥＣ；ヒト血漿）および陰性抽出対照（ＮＥＣ；ヌクレアーゼフリー水）を、自動化ＤＮＡ抽出ワークフローを使用してトリプリケートで抽出した。抽出プロセスからの溶出液を、ｃｆ−ＤＮＡの定量化について検証済みである高感度なＰＣＲ法によって、ヒトリファレンス遺伝子の検出のためにモニタリングした。比較のために、ＰＣＲ検出アッセイを、抽出なしでのニートなSTEEN（商標）溶液にもまた適用した。
【００７９】
【表１】
2021506342.tif 000003
【００８０】
ヒトＤＮＡは、非抽出STEEN（商標）または抽出STEEN（商標）のいずれにおいても検出されなかった。これは、STEEN（商標）中のヒトＤＮＡのベースラインレベルが、最小限の極めて低い、およびこの高感度アッセイの検出のレベルを下回るものであるということを示唆する。STEEN（商標）が、いくらかでもヒトＤＮＡを含んでいるとするならば、おそらくそれはｃｆ−ＤＮＡ測定に交絡をもたらすには低すぎるレベルである。
【００８１】
例３−  ＤＮＡの内因性の長または短フラグメントを使用した、ニートなSTEEN（商標）溶液中のＤＮＡの評定
ニートなSTEEN（商標）溶液の３つの４ｍＬ抽出物を抽出し、および、陽性抽出対照（ＰＥＣ；ヒト血漿試料）、陰性抽出対照（ＮＥＣ；ヌクレアーゼフリー水）、非抽出STEEN（商標）溶液、および非抽出０．１×ＴＥ緩衝液を包含する短および長フラグメントＤＮＡ試験を使用してトリプリケートで分析した。
【００８２】
長および短フラグメントｃｆ−ＤＮＡを標準的な自動化ｃｆ−ＤＮＡ抽出の後で、正常な、よく特徴づけされたＰＥＣにおいて歴史的に期待されるレベルで検出した。同じランにおいて、このより高感度な長および短フラグメント定量化アッセイを使用して、およびリファレンス遺伝子ｑＰＣＲアッセイを使用して例２において得られた結果と一致して、ＮＥＣ、非抽出STEEN（商標）溶液または抽出STEEN（商標）溶液中ではＤＮＡ増幅は検出されなかった。よって、STEEN（商標）溶液は、ヒトＤＮＡを、ｃｆ−ＤＮＡ評定に交絡をもたらす可能性があるとみられるレベルでは含有しないということが見出された。
【００８３】
例４−  せん断ゲノム（ｇＤＮＡ）または短フラグメントｇＤＮＡの、STEEN（商標）溶液対ヒト血漿中へのスパイクイン（リファレンス遺伝子ｑＰＣＲによる定量的検出）
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、コントロールされた様式で超音波処理によってフラグメント化し、および、ニートなSTEEN（商標）溶液（ヘパリンなどの添加物を加えていない）および血漿中へと定義された濃度でスパイクさせ、次いで、自動化ｃｆ−ＤＮＡ抽出方法論を使用して抽出した。結果としてもたらされた抽出溶出液中のｃｆ−ＤＮＡの濃度を、表２に示されるとおり、スパイクインされたＤＮＡの回収のパーセントを決定するためにリファレンス遺伝子ｑＰＣＲ法を使用して測定した。
【００８４】
【表２】
2021506342.tif 000004
【００８５】
ゲノムＤＮＡ抽出効率は、複数タイプの抽出方法論の知られている特性と調和して、たとえ短いフラグメント化されたＤＮＡ（例として、ｃｆ−ＤＮＡ）の効率的な翻訳のために最適に高効率となるようにｃｆ−ＤＮＡ抽出のために使用される化学が選択されていても、血漿またはSTEEN（商標）溶液からは程遠い。正常な血漿マトリックスは低いベースラインのｃｆ−ＤＮＡ含有量を有するということを認識して、表２におけるデータは、自動化ｃｆ−ＤＮＡ方法論が、ヒト血漿から全ｃｆ−ＤＮＡを単離することを可能とする、ということを実証する。
【００８６】
短フラグメントｇＤＮＡで同じ原則を検査するために、短ＤＮＡフラグメント対照の２５，０００コピーを、STEEN（商標）溶液およびヒト血漿の試料中（せん断ヒトｇＤＮＡ量の変動する量のバックグラウンドを含有する）へとスパイクさせ、次いで自動化ｃｆ−ＤＮＡ抽出プロトコルに供した。抽出溶出液中における短フラグメントの回収のパーセントを、リファレンス遺伝子ｑＰＣＲ法を使用して決定した。結果は以下で表３中に示される。
【００８７】
【表３】
2021506342.tif 000005
【００８８】
正常な血漿マトリックスは低いベースラインのｃｆ−ＤＮＡ含有量を有するということを認識して、表３におけるデータは、自動化ｃｆ−ＤＮＡ抽出方法論が、ヒト血漿から抽出したときに観察されたそれと同様の効率で、STEEN（商標）溶液から短ＤＮＡフラグメントを単離することを可能とするということを実証している。これは、ＥＶＬＰ試料の処理の間の細胞溶解からの細胞アポトーシスの決定に役立つ。
【００８９】
例５−  ＥＶＬＰ系中で使用した濃度でのヘパリンによるＰＣＲ阻害の程度の評定
ｇＤＮＡおよびヘパリンを、５０ＩＵ／ｍＬまでの様々な濃度でSTEEN（商標）溶液へ加えた。自動化抽出システムを使用して、ｃｆ−ＤＮＡを抽出し、および定量化し、および、抽出効率を、リファレンス遺伝子ｑＰＣＲを使用して測定した。結果は、図７中に示される。
【００９０】
周知のリファレンス遺伝子の定量化によって測定されたとおりの、ＰＣＲの阻害は、典型的に全血単位献血バッグにおいて使用されるヘパリンの濃度である、おおよそ５０ＩＵ／ｍＬのヘパリンで目立っている。この高い濃度のヘパリンでは、ゲノムのリファレンス遺伝子の回収は、図７に示されるとおり、劇的に下降する。採血チューブに類似したヘパリンの濃度（おおよそ１５ＩＵ／ｍＬ）、ＥＶＬＰ回路の開始での灌流液のヘパリンの濃度（おおよそ１．５ＩＵ／ｍＬ）、およびＥＶＬＰ補充の６時間後のそれら（おおよそ０．６５ＩＵ／ｍＬ）は、有意にＰＣＲを阻害することになるヘパリンの濃度を十分に下回る。
【００９１】
例６−  リファレンス遺伝子ｑＰＣＲ法によって測定したとおりのex vivo肺灌流（ＥＶＬＰ）灌流液中のヒトＤＮＡの定量化
最初のチューブ１〜５からの２ｍＬ体積を、細胞およびデブリを除去するための０回（試料レベル１）、１回（試料レベル２Ａ）、および２回（試料レベル３）の１１００×ｇ×１０分のスピンの後で自動化ＤＮＡ抽出に供した。リファレンス遺伝子ｑＰＣＲ法を使用して、全ＤＮＡ濃度について、抽出されたＤＮＡ溶出液を分析した。結果は表４に示される。
【００９２】
【表４】
2021506342.tif 000006
【００９３】
ヒト肺までの灌流回路内に曝露がないことと一致して、チューブ１中には、ヒトＤＮＡは検出されなかった。しかしながら、比較的高い濃度のヒトＤＮＡ（８５６〜１９２４ｎｇ／ｍｌ）が、遠心分離の前のチューブ２〜５（レベル１）中に検出された。遠心分離（レベル２ａおよび３）による流体相からの無傷の有核細胞の漸進的な除去で、存在する全ＤＮＡの濃度は、主として細胞のほとんどを除去したレベル２ａスピンの結果として予想どおり低減されたが、レベル２ａおよび３のセルフリー上清中では比較的高いままであった。
【００９４】
灌流液試料２〜５（レベル２ａおよび３）において観察されたｃｆ−ＤＮＡの濃度は、一例として、正常ヒト対象および心移植拒絶のあるほとんどの患者からの血漿中で歴史的に観察されていた正常な循環ｃｆ−ＤＮＡレベルと比較して、目立って上昇している。しかしながら、例７において記されたとおり、試料は、真の興味の対象のｃｆ−ＤＮＡが含有される流体相から細胞を分離するための採集の２時間以内の必須のスピンなしに、翌日配送で出荷されていた。翌日配送の出荷が受け取られる迄その遠心分離が可能でなかった、これらの現時点のＥＶＬＰ試料については、測定された高い「ｃｆ−ＤＮＡ」レベルは、採取後白血球溶解からまたはＥＶＬＰの間に起こる細胞溶解のいずれかから結果としてもたらされた可能性がある。
【００９５】
例７−  自動化細胞計数機（Cell-Dyne）によって評価された、遠心精製の機能としての灌流液試料の細胞含有量
０回（レベル１）、１回（レベル２Ａ）、および２回（レベル３）の１１００×ｇ低速スピンの後のチューブ１〜５から上清アリコートを採集した。これらのアリコートに対する細胞計数分析を、Cell-Dyne 3700 Hematology Analyzerを使用して行った（表５を参照）。
【００９６】
【表５】
2021506342.tif 000007
【００９７】
細胞計数分析は、これらの細胞カウントレベルでのCell-Dyne法の本来の変動の範囲内で、チューブ２と３との、およびチューブ４と５との、近い類似性を示す。これらの類似性は、最初に受け取ったチューブと遠心分離後のチューブとの外観の比較によってマッチさせられている。
重要なことに、レベル２ａから３までを通しての灌流液試料の遠心分離は、無傷の、計数可能な細胞を除去するのに極めて有効であることが見出された。しかしながら、ほとんどの細胞チューブの１つ（チューブ３）におけるＲＢＣおよびＷＢＣのわずかな残余物は、分析のための出荷の前の第３のスピンが役立ち得るということを提案する。
【００９８】
例８−  ＥＶＬＰ灌流液試料中のｃｆ−ＤＮＡフラグメント化の評定
チューブ２〜５の元のままのレベル４上清、および正常血漿対照検体の、デュプリケートでの２ｍＬアリコートから、自動化抽出技術を使用して、ＤＮＡを抽出した。抽出溶出液を、細胞アポトーシス（ごく短いＤＮＡフラグメントを生産するin vivoの典型的な細胞死の形式）、対、試料処理の間に典型的に起こる細胞溶解（これは、より長いＤＮＡフラグメントを生産する）の差別的な寄与の尺度として、ＤＮＡの長および短フラグメントを差別的に検出するための方法を使用して分析した。溶出液中の長フラグメントＤＮＡの比率（デュプリケートの決定の平均）が、図４に示される。
【００９９】
レベル４における抽出されたＤＮＡでは、ＵＴチューブ２〜５から調製された無細胞の上清は、溶解された白血球ＤＮＡで検体の流体相の真のｃｆ−ＤＮＡ補完物をコンタミネーションさせるものとなる白血球溶解の有意な程度を示唆することが以前に決定されたレベルを超える、高い比率の長フラグメントＤＮＡを含有する。分析のための出荷の前に２〜３の短い遠心分離ステップによって、試料採集の後ですぐにそれらの白血球およびあらゆる他の無傷の細胞を除去しない限り、これは灌流の間のex vivo肺損傷の尺度としてのｃｆ−ＤＮＡレベルの解釈を有意に複雑化するものとなる。
【０１００】
例９−  ＥＶＬＰ灌流液試料中の全体的なＤＮＡフラグメント長さ分布の評定（バイオアナライザミクロキャピラリに基づいた電気泳動）
チューブ２〜５からのレベル４の灌流液ＤＮＡを自動化抽出システムによって抽出した。１μｌの抽出された溶出液を、Agilent High Sensitivity DNA Bioanalyzerチップ上へとロードし、および、TAI’s Bioanalyzer 2100でランを行った。このミクロキャピラリに基づいた電気泳動セルは、ＤＮＡフラグメント長さ分布の迅速かつ高感度な調査を可能にさせる。代表的な追跡は、図５に示される。
図５における代表的な電気泳動およびゲル像は、アポトーシス性のＤＮＡ放出と一致する１５０ｂｐ前後のｃｆ−ＤＮＡの小さいピーク、および、５００〜１５，０００ｂｐから拡張したはるかに大きなピークを示す。この５００〜１５，０００ｂｐのピークは、灌流液試料中の顕著な細胞溶解を示唆し、および、独立して長フラグメント比率試験の所見を裏付けている（例３を参照）。
【０１０１】
例１０−  ＥＶＬＰ前のSTEEN（商標）中へとスパイクされた短ＤＮＡフラグメント対照の回収効率の評定
２５，０００コピーの短ＤＮＡフラグメント対照、および１５ｎｇ／ｍｌのせん断ヒトｇＤＮＡ（平均の長さ１５０ｂｐまでせん断された）を、例１および２において無細胞であって検出可能な内因性ＤＮＡを有しないと決定されていたチューブ１（レベル１）の流体のアリコート中へとスパイクさせた。ＤＮＡを、このチューブ１のスパイクされた試料から、自動化ＤＮＡ抽出プロトコルを使用して抽出し、および、ＤＮＡ抽出溶出液中の短フラグメントＤＮＡ対照およびせん断ｇＤＮＡの回収パーセントを、リファレンス遺伝子ｑＰＣＲ法を使用して決定した。加えて、短対長（short vs long）ＤＮＡフラグメントアッセイを、スパイクされた試料のＤＮＡの長フラグメント比率（これは、実験的なデザイン中に採用されたせん断プロトコルに基づいて低いことが期待される）を決定するために使用した。結果は以下で表６〜８中に示される。
【０１０２】
【表６】
2021506342.tif 000008
【０１０３】
【表７】
2021506342.tif 000009
【０１０４】
【表８】
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【０１０５】
表６〜８中に提示されたデータは、利用した自動化ｃｆ−ＤＮＡ抽出方法論が、ＥＶＬＰ前のSTEEN溶液を含有する標準ＥＶＬＰ添加物から短ＤＮＡフラグメント（ｃｆ−ＤＮＡのアポトーシスに典型的なものである）を抽出するのに良好な性能を示すということを実証する。抽出効率は、同じ方法を使用してヒト血漿試料から短フラグメントＤＮＡを抽出したときに歴史的に見られているそれに匹敵する。一般則として、短ＤＮＡフラグメントはいかなるＤＮＡ抽出法によっても長ＤＮＡフラグメントほど簡単に抽出されないが、本手順は、良好にそれをするように最適化されており、および、それはSTEEN溶液からも、ならびに血漿からも、実際にそのようにするのである。
【０１０６】
例１１−  ＥＶＬＰ灌流液試料中のコンタミネーションさせる細胞のタイプの免疫表現型同定（フローサイトメトリー）
レベル１のチューブ２〜５からの５ｍｌアリコートを、図３に示される試料処理プロトコルにつき、１５ｍＬコニカルチューブ中へと移し、および１１００×ｇで１０分間遠心分離した（レベル２ｂ）。上清を除去し、および、フローサイトメトリー分析のためにペレットを５００μｌ ＰＢＳ中に再懸濁させた。結果は、各チューブについて、以下に示される。
【０１０７】
【表９−１】
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【表９−２】
2021506342.tif 000012
【０１０８】
チューブ２〜５についてフローサイトメトリー分析によって作成した表は、試料が、標準ヒト白血球抗体パネルによって解明されたとおり細胞組成において匹敵することを示す。これは、細胞スピン調製物のマッチングにおいて見られた細胞形態学と一致する。
【０１０９】
例１２−  材料および方法（例６〜１１）
５つの匿名化された、遠心分離されていない、ヒトex vivo肺灌流（ＥＶＬＰ）手順からの試料を取得した（最初のチューブ１〜５）。使用したＥＶＬＰ手順は、４０％ドナー予測心拍出量（ＣＯ）の灌流を標的とし、血流の段階的な増加と連動しての正常な深部体温への肺の段階的な復温を包含した（Machuca et al., J Thorac Dis. 2014, 6(8):1054-1106）。増加したコロイド浸透圧を伴う、保護的肺換気および無細胞灌流は、ヒト血清アルブミンおよびデキストラン４０の使用を通して成し遂げられた。方法論は、人道機器適用免除（ＨＤＥ）の下でＦＤＡに承認されている。ＥＶＬＰの間、肺の灌流回路は、in vivo条件を模倣している。換気されたex vivoの肺が、赤血球なしのSTEEN（商標）溶液で灌流される。ガス交換、肺血管抵抗、コンプライアンス、および他の常温条件下における重要な変動要因などのパラメーターが、モニタリングされる。
【０１１０】
無細胞STEEN灌流液を使用しているとき、６時間以上のＥＶＬＰが、臨床的に標準とされている。緩衝化された細胞外溶液であるSTEEN（商標）溶液は、浸透圧のためのヒト血清アルブミン、および、過剰な白血球相互作用から上皮を覆いかつ保護するために使用される穏やかなスカベンジャーであるデキストラン４０を包含する（Steen et al., Lancet 2001, 357:825-829；Steen et al., Ann Thorac Surg. 2003, 76:244-252；Steen et al., Ann Thorac Surg. 2007；83:2191）。溶液は、肺移植オプションの長期的な評定を手助けし、および、ex vivoで単離されている肺の健康を促進するように設計されている。STEEN（商標）溶液を使用したＥＶＬＰは、よって、以前は拒絶されていた可能性を増加させ得る潜在性を有するが、ex vivoで回復された肺は、肺移植のための潜在的な臓器の利用可能性を増加させるために使用することができたと考えられる。
【０１１１】
５つの試料を、２つのヒト肺灌流手順から採集した。試料は、未処理で、冷蔵パックにて翌日配送で出荷された。試料は全く冷凍されなかった。試料の詳細は以下で表９中に提供される。
【０１１２】
【表１０】
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【０１１３】
５つの試料を、図３に概説される遠心分離ステップに供した。結果としてもたらされた上清および細胞ペレットを、以下に記載される実験において使用した。
細胞分析のために、図３の右半分（レベル２Ｂ）に表示されているとおり、４つの受け取ったチューブ（レベル１からのチューブ２〜５）の各々からの５ｍＬアリコートを、細胞防腐剤を伴うかまたは防腐剤なしのいずれかでスパイクされる、２つの別々の１５ｍＬコニカルチューブ中へと移した。チューブを、１１００×ｇで１０分間遠心分離した。チューブ２と３、およびチューブ４と５は、類似した外観を示した。結果としてもたらされたレベル２ｂ上清を除去し、および残存する細胞ペレットを、フローサイトメトリーおよび細胞計数のために、０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。
【０１１４】
ｃｆ−ＤＮＡ抽出およびフラグメント分析のために、図３にレベル２ａとして示されているとおり、受け取ったチューブ（レベル１のチューブ１〜５）の各々からの８．５ｍＬアリコートを、それらのチューブから同様に標識された別々のＰＰＴチューブ中へと移した。ＰＰＴチューブを、次いで、１１００×ｇで１０分間遠心分離した。チューブ１は、細胞ペレットを生み出さなかった。各レベル２ａ上清の５００μＬアリコートを、細胞計数分析（Cell Dyne）のために採集し、および、残存するおおよそ８ｍＬの上清を新しい１５ｍＬコニカルチューブへと移し、これを次いで、１１００×ｇでの第２の低速スピンに１０分間供した（図３のレベル３）。このスピンステップの後には、視覚的に明白な残余の細胞ペレットがなくなった。
【０１１５】
細胞計数分析、フローサイトメーター、および初期ＲＮＡｓｅＰ ＤＮＡ定量化のために、レベル３上清のアリコートを採集した（５００μＬ）。チューブ中の底部先端の最後の５００μＬを回避して、残存する上清を新しい１５ｍＬコニカルチューブへと移し、および１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。結果として生じた元のままのレベル４上清（図３）を、ｃｆ−ＤＮＡ抽出および定量化／フラグメント分析のために採集した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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