(57)【要約】本出願は、導入遺伝子の送達および発現のための直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターについて説明する。ｃｅＤＮＡベクターは、２つのＩＴＲ配列が隣接する発現カセットを含み、発現カセットは、導入遺伝子をコードする。一部のｃｅＤＮＡベクターは、調節スイッチを含むシス調節エレメントをさらに含む。さらに本明細書では、ｃｅＤＮＡベクターを使用した、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの信頼できる遺伝子発現のための方法および細胞株が提供される。本明細書では、細胞、組織、または対象における抗体または融合タンパク質の発現に有用なｃｅＤＮＡベクターを含む、方法および組成物が提供される。そのような抗体または融合タンパク質は、疾患を治療するために、あるいは商業的環境での抗体または融合タンパク質の産生のために発現させることができる。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターであって、
隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの抗体および／または融合タンパク質をコードする、ｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、抗体をコードする、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３】
前記抗体が、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、単一ドメイン抗体、または単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、単一ドメイン抗体または単鎖抗体をコードする、請求項３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項５】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記単一ドメイン抗体または単鎖抗体の上流の分泌リーダー配列をさらにコードする、請求項４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項６】
第１の異種ヌクレオチド配列が、重鎖可変領域をコードし、第２の異種ヌクレオチド配列が、軽鎖可変領域をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項７】
前記第１の異種ヌクレオチド配列が、重鎖可変領域および重鎖定常領域またはその一部をコードし、前記第２の異種ヌクレオチド配列が、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域またはその一部をコードする、請求項４に記載のｃＤＮＡベクター。
【請求項８】
前記第１の異種ヌクレオチド配列および／または前記第２の異種ヌクレオチド配列が、前記重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の上流の分泌リーダー配列をさらにコードする、請求項６または請求項７に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項９】
前記抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１０】
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１１】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１２】
前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である、請求項１１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１３】
前記抗体が、表２、３Ａ、３Ｂ、４、および５に列挙されている標的から選択される少なくとも１つの標的に結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１４】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、融合タンパク質をコードする、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記融合タンパク質の上流の分泌リーダー配列をさらにコードする、請求項１４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、Ｆｃ領域に融合した少なくとも１つの受容体細胞外ドメインを含む、請求項１４または請求項１５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１７】
前記受容体細胞外ドメインが、ＣＴＬＡ−４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＬＦＡ−３、ＴＮＦＲ、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１ＲＡｃＰ、およびＡＣＶＲ２Ａから選択される受容体の細胞外ドメインである、請求項１６に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１８】
前記抗体または融合タンパク質が、表１、２、３Ａ、３Ｂ、４、または５の抗体および融合タンパク質から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１９】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、１つ以上のポリＡ部位を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２０】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列に操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２１】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２２】
少なくとも１つのＩＴＲが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２３】
前記ＩＴＲの一方または両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２４】
前記隣接するＩＴＲが、対称または非対称である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２５】
前記隣接するＩＴＲが、対称または実質的に対称である、請求項２４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２６】
前記隣接するＩＴＲが、非対称である、請求項２４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２７】
前記ＩＴＲの一方または両方が野生型であるか、または前記ＩＴＲの両方が野生型である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２８】
前記隣接するＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項２９】
前記隣接するＩＴＲが、表６に示されるウイルス血清型の対に由来する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３０】
前記ＩＴＲの一方または両方が、表７の配列から選択される配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３１】
前記ＩＴＲの少なくとも一方が、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列から、前記ＩＴＲの全体的な３次元コンフォメーションに影響を与える欠失、付加、または置換によって変更されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３２】
前記ＩＴＲの一方または両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３３】
前記ＩＴＲの一方または両方が、合成のものである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３４】
前記ＩＴＲの一方もしくは両方が野生型でないか、または前記ＩＴＲの両方が野生型でない、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３５】
前記ＩＴＲの一方または両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択される前記ＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３６】
前記欠失、挿入、および／または置換が、通常は前記Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’  Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項３５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３７】
前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３８】
前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項３９】
前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の一部、ならびに／または通常は前記ＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４０】
前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に、単一のステムループ構造を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４１】
前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に、単一のステムおよび２つのループを含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４２】
前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に、単一のステムおよび単一のループを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４３】
両方のＩＴＲが、前記ＩＴＲが互いに対して反転されたときに全体的な３次元対称性をもたらすような様式で変更されている、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４４】
前記ＩＴＲの一方または両方が、表７、９Ａ、９Ｂ、および１０の配列から選択される配列を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４５】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの調節スイッチの制御下にある、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４６】
少なくとも１つの調節スイッチが、バイナリ調節スイッチ、小分子調節スイッチ、パスコード調節スイッチ、核酸ベース調節スイッチ、転写後調節スイッチ、放射線制御または超音波制御の調節スイッチ、低酸素媒介調節スイッチ、炎症反応調節スイッチ、剪断活性化調節スイッチ、およびキルスイッチから選択される、請求項４５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項４７】
細胞を請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターと接触させることを含む、細胞内で抗体または融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項４８】
接触される前記細胞が、真核細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、インビトロまたはインビボである、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記真核細胞での発現のためにコドン最適化される、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体または融合タンパク質が、前記細胞から分泌される、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体または融合タンパク質が、前記細胞に保持される、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
治療用抗体または治療用融合タンパク質で対象を治療する方法であって、前記方法が、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを前記対象に投与することを含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記治療用抗体または治療用融合タンパク質をコードする、方法。
【請求項５４】
前記対象が、癌、自己免疫疾患、神経変性障害、高コレステロール血症、急性臓器拒絶、多発性硬化症、閉経後骨粗しょう症、皮膚状態、喘息、または血友病から選択される疾患または障害を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記癌が、固形腫瘍、軟部組織肉腫、リンパ腫、および白血病から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチおよびクローン病から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記皮膚状態が、乾癬およびアトピー性皮膚炎から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、薬学的組成物。
【請求項６０】
請求項１〜４６のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、細胞。
【請求項６１】
請求項１〜４６のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターおよび脂質を含む、組成物。
【請求項６２】
前記脂質が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター、または請求項６１もしくは６２に記載の組成物、または請求項６０に記載の細胞を含む、キット。
【請求項６４】
抗体または融合タンパク質を産生する方法であって、請求項６０に記載の細胞を、前記抗体または融合タンパク質を産生するのに適した条件下で培養することを含む、方法。
【請求項６５】
前記抗体または融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１８年２月１４日に提出された米国仮特許出願第６２／６３０，６７０号、２０１８年６月４日に提出された米国仮特許出願第６２／６８０，０８７号、２０１８年２月１４日に提出された米国仮特許出願第６２／６３０，６７６号、および２０１８年６月４日に提出された米国仮特許出願第６２／６８０，０９２号の利益を主張し、各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年２月１３日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、０８０１７０−０９１１００−ＷＯＰＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズは１２８，７８８バイトである。
【０００３】
本発明は、対象または細胞において導入遺伝子または単離されたポリヌクレオチドを発現させるための非ウイルス性ベクターの産生を含む、遺伝子療法の分野に関する。本開示はまた、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、プロモーター、ベクター、および宿主細胞、ならびに外因性ＤＮＡ配列を標的細胞、組織、器官、または生物に送達する方法に関する。例えば、本開示は、非ウイルス性ＤＮＡベクターを使用して、細胞から治療用抗体などの抗体を発現させるための方法を提供する。本開示はまた、非ウイルス性ＤＮＡベクターを使用して、細胞から治療用融合タンパク質などの融合タンパク質を発現させるための方法を提供する。方法および組成物は、例えば、市販の抗体もしくは融合タンパク質の産生に、または治療を必要とする対象の細胞もしくは組織において治療用抗体もしくは融合タンパク質を発現させることにより疾患を治療する目的のために適用することができる。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子突然変異または後天性疾患のいずれかを罹患している患者の臨床転帰を改善することを目的とする。遺伝子療法は、欠陥遺伝子、または障害、疾患、悪性腫瘍等をもたらし得る異常調節もしくは発現、例えば過小発現もしくは過剰発現から生じる医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患もしくは障害は、補正遺伝物質を患者に送達することによって治療、予防、もしくは改善され得るか、または患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらす、患者への補正遺伝物質を用いて欠陥遺伝子を改変もしくはサイレンシングすることによって治療、予防、もしくは改善され得る。
【０００５】
遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または別の結果をもたらし得る。そのような結果は、活性化抗体もしくは融合タンパク質または阻害性（中和）抗体もしくは融合タンパク質の発現に起因し得る。遺伝子療法を使用して、他の要因によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝子障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の補正遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。使用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組み換えレトロウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えアデノウイルス等）の中で、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
【０００６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組み換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞反応、例えばインターフェロン媒介性反応を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であると見なされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を制限するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であると見なされるため、著しい免疫反応を誘起せず（ｉｉを参照）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。
【０００７】
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コーディング能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補者を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングする必要があることである。第３の欠点は、初回治療から排除されなかった患者への再投与を予防するカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに反応して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ  ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。
【０００８】
追加として、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有する１つまたは複数のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。しかしながらそのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入し、カプシドはまた、免疫反応を誘導することもわかった。
【０００９】
したがって、遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫反応に起因する）患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、および遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。
【００１０】
細胞、組織、または対象における治療用抗体（例えば、分泌された抗体もしくはイントラボディ）または融合タンパク質（例えば、受容体細胞外ドメイン−Ｆｃ融合）の発現を可能にする、あるいは精製および／または商業的産生のためにインビトロまたはインビボで抗体または融合タンパク質を生成する目的のための技術が、当該技術分野で必要とされている。さらに、既存のまたは従来の方法またはベクターと比較して、抗体（例えば、治療用抗体）および融合タンパク質（例えば、治療用融合タンパク質）の産生を改善するための産生および／または発現特性が改善された制御可能な組み換えＤＮＡベクターの重要な満たされていないニーズが残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に記載される技術は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書では、「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と称される）を使用する、抗体および融合タンパク質（治療用抗体および融合タンパク質など）の発現のための方法および組成物に関する。これらのｃｅＤＮＡベクターを使用して、疾患の治療、悪性腫瘍の治療、モニタリング、および診断のための抗体および融合タンパク質、ならびに市販の抗体または融合タンパク質を産生することができる。１つの例示的な抗体は、抗腫瘍壊死因子抗体またはその抗体結合断片であり、モノクローナル抗体アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））が含まれるが、これに限定されず、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して対象の細胞または組織で発現させることができる。そのような治療用抗体は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、およびクローン病を治療する目的で使用することができる。
【００１２】
したがって、本明細書に記載される発明は、細胞内での抗体、例えば分泌型抗体またはイントラボディの発現を可能にするための、抗体（例えば、軽鎖、重鎖、フレームワーク、Ｆａｂｓ´、単鎖抗体）またはその抗原結合断片をコードする異種遺伝子を含む、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」もしくは「ｃｅＤＮＡベクター」と称される）に関する。本発明はまた、細胞内での融合タンパク質の発現を可能にするための、融合タンパク質をコードする異種遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクターに関する。発現されるそのような抗体もしくは融合タンパク質は、治療用抗体もしくは融合タンパク質であり得、かつ／または適用される技法は、商業的目的のための抗体もしくは融合タンパク質の生成において使用され得る。特に、本明細書に記載される技術は、ｃｅＤＮＡベクターを使用した抗体および融合タンパク質の産生の改善に関する。
【００１３】
本明細書に記載される抗体および融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端（直鎖状、連続、および非カプシド化構造）を有する相補的ＤＮＡの連続鎖から形成されるカプシド不含直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＩＴＲ配列を含み、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、互いに対して同じ対称の３次元構成（すなわち、対称もしくは実質的に対称）を有し得るか、または代替として５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、互いに対して異なる３次元構成（すなわち、非対称ＩＴＲ）を有し得る。さらに、ＩＴＲは、同じまたは異なる血清型に由来し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有するように、対称の３次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得る（すなわち、それらは同じであるか、または互いに対して鏡像である）。いくつかの実施形態では、一方のＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。
【００１４】
したがって、本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾されたＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含む、抗体または融合タンパク質の発現および／または産生の改善のためのｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、真核細胞中で産生され得、したがって昆虫細胞中の原核ＤＮＡ修飾および細菌内毒素汚染を欠き得る。
【００１５】
本明細書に記載される方法および組成物は、一部には、少なくとも１つの抗体および／もしくは融合タンパク質、または複数の抗体および／もしくは融合タンパク質を細胞から発現させるために使用することができる共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）の発見に関連する。方法および組成物は、例えば、市販の抗体もしくは融合タンパク質の産生に、または治療用抗体または融合タンパク質で疾患を治療する目的のために適用することができる。
【００１６】
したがって、本明細書において、一態様では、２つの異なるＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に位置付けられたプロモーターに操作可能に連結された抗体もしくは抗原結合断片またはその融合タンパク質をコードする少なくとも１つの導入遺伝子をコードする少なくとも１つの異種核酸を含む、ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）が提供され、ＩＴＲの一方は、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲの一方は、他方のＩＴＲに対して欠失、挿入、または置換を含み、導入遺伝子は、抗体もしくはその断片（例えば、その抗原結合断片）または融合タンパク質であり、ＤＮＡは、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状の連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する。他の態様には、本明細書に記載されるような、ｃｅＤＮＡベクターからインビボで発現させることによる治療用抗体または融合タンパク質の送達、さらに、そのような抗体または融合タンパク質を使用した様々な疾患の治療が含まれる。本明細書ではまた、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む細胞も企図される。
【００１７】
本発明の態様は、本明細書に記載される細胞における抗体もしくは融合タンパク質の産生または抗体もしくは融合タンパク質の発現に有用なｃｅＤＮＡベクターを産生する方法に関する。他の実施形態では、本明細書に提供される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターに関する。一実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）は、最初の５’逆位末端反復（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）、異種核酸配列、および３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）をこの順序で含むポリヌクレオチド発現構築物テンプレートを含むプラスミド（本明細書では「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」と称される）から得られ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称または対称（例えば、ＷＴ−ＩＴＲまたは修飾型対称ＩＴＲ）であり得る。
【００１８】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本開示を読むことにより、熟練者に既知であろういくつかの手段によって取得可能である。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、例えば、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質、および／またはレポーター遺伝子をコードする核酸を含む発現カセットが挿入され得るＩＴＲの間に操作可能に位置付けられた制限クローニング部位（例えば、配列番号１２３および／または１２４）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、対称または非対称のＩＴＲ（修飾型またはＷＴ  ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドテンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）から産生される  。  
【００１９】
許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下では、少なくとも２つのＩＴＲを有するポリヌクレオチドテンプレートが複製して、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを産生する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、Ｒｅｐタンパク質を介したテンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノム等）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質およびＲｅｐ結合部位は、当業者に周知である。当業者は、少なくとも１つの機能的ＩＴＲに基づいて、核酸配列に結合し、複製する血清型からＲｅｐタンパク質を選択することを理解する。例えば、複製可能ＩＴＲがＡＡＶ血清型２に由来する場合、対応するＲｅｐは、その血清型と共働するＡＡＶ血清型に由来し、例えばＡＡＶ２  ＩＴＲはＡＡＶ２またはＡＡＶ４  Ｒｅｐと共働するが、ＡＡＶ５  Ｒｅｐとは共働しない。複製時に、共有結合性閉端ｃｅＤＮＡベクターは、許容細胞中で蓄積し続け、ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは標準複製条件下、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、長期間にわたって十分に安定して、例えば、少なくとも１ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも２ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも３ｐｇ／細胞、より好ましくは少なくとも４ｐｇ／細胞、さらにより好ましくは少なくとも５ｐｇ／細胞の量で蓄積する。
【００２０】
したがって、本発明の一態様は、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含む、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを産生するプロセスに関する。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中で抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ビリオン強制サイズ制限はない。
【００２１】
宿主細胞から単離された抗体または融合タンパク質の産生に有用なｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡを、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を変性ゲルおよび非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【００２２】
この開示の目的のために、ｃｅＤＮＡによって発現される導入遺伝子は、抗体もしくは抗体結合断片または融合タンパク質をコードする。抗体および融合タンパク質は、当該技術分野において周知であり、リガンド、受容体、毒素、ホルモン、酵素、または細胞表面タンパク質、または病原体もしくはウイルスタンパク質もしくは抗原、ならびに糖タンパク質またはＳＵＭＯ化タンパク質（例えば、抗ＳＵＭＯ２／３抗体）などの翻訳前および翻訳後修飾タンパク質を含むが、これらに限定されない関心対象の任意のタンパク質に結合し得る。抗体および抗原結合断片はまた、核酸、例えばＤＮＡ（例えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体）、ＲＮＡ（例えば、抗ＲＮＡ結合抗体）を含むが、これらに限定されない任意の抗原に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターによって産生される抗体は、中和抗体またはその抗原結合断片である。標的となる例示的な遺伝子および関心対象のタンパク質は、本明細書の使用方法および治療方法のセクションにおいて詳細に記載されている。
【００２３】
また本明細書では、細胞または対象においてｃｅＤＮＡベクターを使用して、治療用途を有する抗体または融合タンパク質を発現させる方法も提供される。そのような抗体または融合タンパク質は、疾患の治療に使用することができる。したがって、本明細書では、治療用抗体または融合タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療のための方法である。他の実施形態では、治療用抗体または融合タンパク質は、悪性細胞を標的にするため、特定のタンパク質を監視するため、または診断目的のために使用することができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１．カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターであって、
隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの抗体および／または融合タンパク質をコードする、ｃｅＤＮＡベクター。
１．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が抗体をコードする、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２．抗体が、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、単一ドメイン抗体、または単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、単一ドメイン抗体または単鎖抗体をコードする、請求項３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、単一ドメイン抗体または単鎖抗体の上流の分泌リーダー配列をさらにコードする、請求項４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
５．第１の異種ヌクレオチド配列が、重鎖可変領域をコードし、第２の異種ヌクレオチド配列が、軽鎖可変領域をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
６．第１の異種ヌクレオチド配列が、重鎖可変領域および重鎖定常領域またはその一部をコードし、第２の異種ヌクレオチド配列が、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域またはその一部をコードする、請求項４に記載のｃＤＮＡベクター。
７．第１の異種ヌクレオチド配列および／または第２の異種ヌクレオチド配列が、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の上流の分泌リーダー配列をさらにコードする、請求項６または請求項７に記載のｃｅＤＮＡベクター。
８．抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
９．抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１０．抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１０に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１１．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である、請求項１１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１２．抗体が、表１、２、３Ａ、３Ｂ、４、および５に列挙されている標的から選択される少なくとも１つの標的に結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１３．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、融合タンパク質をコードする、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１４．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、融合タンパク質の上流の分泌リーダー配列をさらにコードする、請求項１４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１５．融合タンパク質が、Ｆｃ領域に融合した少なくとも１つの受容体細胞外ドメインを含む、請求項１４または請求項１５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１６．受容体細胞外ドメインが、ＣＴＬＡ−４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＬＦＡ−３、ＴＮＦＲ、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１ＲＡｃＰ、およびＡＣＶＲ２Ａから選択される受容体の細胞外ドメインである、請求項１６に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１７．抗体または融合タンパク質が、表１、２、３Ａ、３Ｂ、４、または５の抗体および融合タンパク質から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１８．ｃｅＤＮＡベクターが、１つ以上のポリＡ部位を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
１９．ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列に操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２０．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２１．少なくとも１つのＩＴＲが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２２．ＩＴＲの一方または両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２３．隣接するＩＴＲが、対称または非対称である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２４．隣接するＩＴＲが、対称または実質的に対称である、請求項２４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２５．隣接するＩＴＲが、非対称である、請求項２４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２６．ＩＴＲの一方または両方が野生型であるか、またはＩＴＲの両方が野生型である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２７．隣接するＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２８．隣接するＩＴＲが、表６に示されるウイルス血清型の対に由来する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
２９．ＩＴＲの一方または両方が、表７の配列から選択される配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３０．ＩＴＲの少なくとも一方が、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列から、ＩＴＲの全体的な３次元コンフォメーションに影響を与える欠失、付加、または置換によって変更されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３１．ＩＴＲの一方または両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３２．ＩＴＲの一方または両方が、合成のものである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３３．ＩＴＲの一方もしくは両方が野生型でないか、またはＩＴＲの両方が野生型でない、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３４．ＩＴＲの一方または両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３５．欠失、挿入、および／または置換が、通常はＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項３５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３６．ＩＴＲの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３７．ＩＴＲの一方または両方が、通常はＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３８．ＩＴＲの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の一部、ならびに／または通常はＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
３９．ＩＴＲの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に、単一のステムループ構造を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４０．ＩＴＲの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に、単一のステムおよび２つのループを含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４１．ＩＴＲの一方または両方が、通常はＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む領域に、単一のステムおよび単一のループを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４２．両方のＩＴＲが、ＩＴＲが互いに対して反転されたときに全体的な３次元対称性をもたらすような様式で変更されている、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４３．ＩＴＲの一方または両方が、表７、９Ａ、９Ｂ、および１０の配列から選択される配列を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４４．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの調節スイッチの制御下にある、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４５．少なくとも１つの調節スイッチが、バイナリ調節スイッチ、小分子調節スイッチ、パスコード調節スイッチ、核酸ベース調節スイッチ、転写後調節スイッチ、放射線制御または超音波制御の調節スイッチ、低酸素媒介調節スイッチ、炎症反応調節スイッチ、剪断活性化調節スイッチ、およびキルスイッチから選択される、請求項４５に記載のｃｅＤＮＡベクター。
４６．細胞を請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターと接触させることを含む、細胞内で抗体または融合タンパク質を発現させる方法。
４７．接触される細胞が、真核細胞である、請求項４７に記載の方法。
４８．細胞が、インビトロまたはインビボである、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
４９．少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、真核細胞での発現のためにコドン最適化される、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
５０．抗体または融合タンパク質が、細胞から分泌される、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
５１．抗体または融合タンパク質が、細胞に保持される、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
５２．治療用抗体または治療用融合タンパク質で患者を治療する方法であって、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、治療用抗体または治療用融合タンパク質をコードする、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを対象に投与することを含む、方法。
５３．対象が、癌、自己免疫疾患、神経変性障害、高コレステロール血症、急性臓器拒絶、多発性硬化症、閉経後骨粗しょう症、皮膚状態、喘息、または血友病から選択される疾患または障害を有する、請求項５３に記載の方法。
５４．癌が、固形腫瘍、軟部組織肉腫、リンパ腫、および白血病から選択される、請求項５３に記載の方法。
５５．自己免疫疾患が、関節リウマチおよびクローン病から選択される、請求項５３に記載の方法。
５６．皮膚状態が、乾癬およびアトピー性皮膚炎から選択される、請求項５３に記載の方法。
５７．神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項５３に記載の方法。
５８．請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、薬学的組成物。
５９．請求項１〜４６のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、細胞。
６０．請求項１〜４６のいずれかに記載のｃｅＤＮＡベクターおよび脂質を含む、組成物。
６１．脂質が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項６１に記載の組成物。
６２．請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター、または請求項６１もしくは６２に記載の組成物、または請求項６０に記載の細胞を含む、キット。
６３．抗体または融合タンパク質を産生する方法であって、請求項６０に記載の細胞を、抗体または融合タンパク質を産生するのに適した条件下で培養することを含む、方法。
６４．抗体または融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）に関し、ｃｅＤＮＡベクターは、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列が非対称、または対称、または実質的に対称であり得る２つの逆位末端反復配列の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、任意に異種核酸配列は、導入遺伝子（例えば、抗体または融合タンパク質）をコードし、ベクターは、ウイルスカプシド中に存在しない。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記でさらに詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【００２８】
上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【００２９】
【図１Ａ】非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、抗体または融合タンパク質をコードする核酸は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。
【図１Ｂ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを備えた非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、抗体または融合タンパク質をコードする核酸は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の野生型ＩＴＲと隣接する。
【図１Ｃ】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを備えた非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、導入遺伝子、例えば、抗体または融合タンパク質をコードする核酸の、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への挿入を可能にする。発現カセットは、互いに対して非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲと隣接し、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。
【図１Ｄ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、抗体または融合タンパク質をコードする核酸は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｅ】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、導入遺伝子、例えば、抗体または融合タンパク質をコードする核酸の、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への挿入を可能にする。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｆ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称のＷＴ−ＩＴＲまたは実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、抗体または融合タンパク質をコードする核酸は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ  ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｇ】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、導入遺伝子、例えば、抗体または融合タンパク質をコードする核酸の、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への挿入を可能にする。発現カセットは、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ  ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）に隣接している。
【図２Ａ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の特定を有するＡＡＶ２（配列番号５２）の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を提供し、末端分解部位（ｔｒｓ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。さらに、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲまたは突然変異型ＩＴＲ上で集成したＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。ＤおよびＤ’領域は、転写因子結合部位および他の保存構造を含有する。
【図２Ｂ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）、および末端分解部位（ｔｒｓ）の特定を有するＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を含む、野生型ＩＴＲ（配列番号５３）中の提案されたＲｅｐ触媒ニッキングおよびライゲーション活性を示し、またいくつかの転写因子結合部位を含むＤおよびＤ’領域、および他の保存構造も示す。
【図３Ａ】野生型左ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）および二次構造（右）を提供する。
【図３Ｂ】左ＩＴＲの例示的な突然変異型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な突然変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、左）（配列番号１１３）のＡ−Ａ’アーム、Ｃアーム、およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。
【図３Ｃ】野生型右ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５５）のＡ−Ａ’ループ、ならびにＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および二次構造（右）を示す。
【図３Ｄ】例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な突然変異型右ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、右）（配列番号１１４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’およびＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。左および右のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲまたは他のウイルス血清型または合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを、本明細書で教示されるように使用することができる。図３Ａ〜３Ｄポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中で使用される配列を指す。プラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中のｃｅＤＮＡベクター構成および予測されたＧｉｂｂｓ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡ二次構造もまた、図３Ａ〜３Ｄの各々に含まれる。
【図４Ａ】図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおける、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｃｅＤＮＡの産生の例示的な方法の概略図であり、図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクターの産生を確認するための生化学的方法およびプロセスを示す。
【図４Ｃ】図４Ｂは、ｃｅＤＮＡの産生の例示的な方法の概略図であり、図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクターの産生を確認するための生化学的方法およびプロセスを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄおよび図４Ｅは、図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性条件で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性条件で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。
【図４Ｅ】図４Ｄおよび図４Ｅは、図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性条件で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性条件で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。
【図５】エンドヌクレアーゼでの消化を有する（＋）または有しない（−）ｃｅＤＮＡベクターの変性ゲル流動例の例示的な図である（ｃｅＤＮＡ構築物１および２の場合ＥｃｏＲＩ、ｃｅＤＮＡ構築物３および４の場合ＢａｍＨ１、ｃｅＤＮＡ構築物５および６の場合ＳｐｅＩ、ならびにｃｅＤＮＡベクター７および８の場合ＸｈｏＩ）構築物１〜８は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の実施例１に記載されている。アスタリスクで強調されたバンドのサイズを判定し、図の下に示した。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを生成するための例示的な構築物およびプラスミドを示し、例示目的のために、アデュカヌマブをコードするｃｅＤＮＡベクターを示す。当業者は、アデュカヌマブをコードする核酸を、異なる抗体または融合タンパク質をコードする任意の他の核酸で容易に置き換えることができる。図６Ａは、アデュカヌマブ（完全ＩｇＧ１）を発現するｃｅＤＮＡベクターを生成するための例示的なｃｅＤＮＡプラスミド（ｐＦＢｄｕａｌ−ｃｅＤＮＡ−アデュカヌマブ、配列番号５６）を示す。このｃｅＤＮＡプラスミドは、コドンが最適化され、非対称ＩＴＲ対（すなわち、ＷＴ５´ＩＴＲ（ｗｔ  ＩＴＲ）と３´ｍｏｄ−ＩＴＲ（Ｒ−ａｓｙｍ  ＩＴＲ）との間に隣接している、アデュカヌマブを発現するための核酸配列を含む。このＩＴＲ対は、本明細書に記載されるように、別の非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対によって容易に置き換えることができる。さらに、このプラスミドは、ＩＴＲ対の間に隣接し、５´から３´方向に、ＳＶ４０エンハンサー（配列番号１２６）、ヒトＥＦ１αプロモーター（配列番号７７）またはその断片（配列番号７８）、およびＶＨ１−０２分泌リーダー配列（配列番号８８）、最適化アデュカヌマブ重鎖（ＨＣ）核酸配列（配列番号５７）、ＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号８６）を含み、アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）配列の上流に、ＣＭＶエンハンサー（配列番号８３）、ｒＥＦ１プロモーター（配列番号８５または配列番号１５０）、ＶＫ  Ａ２６リーダー配列（配列番号８９）、最適化アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）核酸配列（配列番号５８）、およびＢＧＨポリアデニル化配列（配列番号６８または配列番号１４８）を含む。最適化アデュカヌマブ重鎖（ＨＣ）配列および最適化アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）核酸配列は、本明細書に記載される抗体の任意の他の重鎖配列または軽鎖配列と容易に置き換えることができる。例えば、本明細書の表１〜５を参照されたい。図６Ｂは、図６Ａのようにプラスミドを生成するために所望のｃｅＤＮＡベクターに挿入されるモジュール構成要素として使用され得る例示的な挿入物である。図６Ｃは、アデュカヌマブを生成するための配列を含む、ｃｅＤＮＡ−Ａｄｕ−ｆｕｌｌ−ＩｇＧ１プラスミドの領域の線形化された図である。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを生成するための例示的な構築物およびプラスミドを示し、例示目的のために、アデュカヌマブをコードするｃｅＤＮＡベクターを示す。当業者は、アデュカヌマブをコードする核酸を、異なる抗体または融合タンパク質をコードする任意の他の核酸で容易に置き換えることができる。図６Ａは、アデュカヌマブ（完全ＩｇＧ１）を発現するｃｅＤＮＡベクターを生成するための例示的なｃｅＤＮＡプラスミド（ｐＦＢｄｕａｌ−ｃｅＤＮＡ−アデュカヌマブ、配列番号５６）を示す。このｃｅＤＮＡプラスミドは、コドンが最適化され、非対称ＩＴＲ対（すなわち、ＷＴ５´ＩＴＲ（ｗｔ  ＩＴＲ）と３´ｍｏｄ−ＩＴＲ（Ｒ−ａｓｙｍ  ＩＴＲ）との間に隣接している、アデュカヌマブを発現するための核酸配列を含む。このＩＴＲ対は、本明細書に記載されるように、別の非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対によって容易に置き換えることができる。さらに、このプラスミドは、ＩＴＲ対の間に隣接し、５´から３´方向に、ＳＶ４０エンハンサー（配列番号１２６）、ヒトＥＦ１αプロモーター（配列番号７７）またはその断片（配列番号７８）、およびＶＨ１−０２分泌リーダー配列（配列番号８８）、最適化アデュカヌマブ重鎖（ＨＣ）核酸配列（配列番号５７）、ＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号８６）を含み、アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）配列の上流に、ＣＭＶエンハンサー（配列番号８３）、ｒＥＦ１プロモーター（配列番号８５または配列番号１５０）、ＶＫ  Ａ２６リーダー配列（配列番号８９）、最適化アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）核酸配列（配列番号５８）、およびＢＧＨポリアデニル化配列（配列番号６８または配列番号１４８）を含む。最適化アデュカヌマブ重鎖（ＨＣ）配列および最適化アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）核酸配列は、本明細書に記載される抗体の任意の他の重鎖配列または軽鎖配列と容易に置き換えることができる。例えば、本明細書の表１〜５を参照されたい。図６Ｂは、図６Ａのようにプラスミドを生成するために所望のｃｅＤＮＡベクターに挿入されるモジュール構成要素として使用され得る例示的な挿入物である。図６Ｃは、アデュカヌマブを生成するための配列を含む、ｃｅＤＮＡ−Ａｄｕ−ｆｕｌｌ−ＩｇＧ１プラスミドの領域の線形化された図である。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを生成するための例示的な構築物およびプラスミドを示し、例示目的のために、アデュカヌマブをコードするｃｅＤＮＡベクターを示す。当業者は、アデュカヌマブをコードする核酸を、異なる抗体または融合タンパク質をコードする任意の他の核酸で容易に置き換えることができる。図６Ａは、アデュカヌマブ（完全ＩｇＧ１）を発現するｃｅＤＮＡベクターを生成するための例示的なｃｅＤＮＡプラスミド（ｐＦＢｄｕａｌ−ｃｅＤＮＡ−アデュカヌマブ、配列番号５６）を示す。このｃｅＤＮＡプラスミドは、コドンが最適化され、非対称ＩＴＲ対（すなわち、ＷＴ５´ＩＴＲ（ｗｔ  ＩＴＲ）と３´ｍｏｄ−ＩＴＲ（Ｒ−ａｓｙｍ  ＩＴＲ）との間に隣接している、アデュカヌマブを発現するための核酸配列を含む。このＩＴＲ対は、本明細書に記載されるように、別の非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対によって容易に置き換えることができる。さらに、このプラスミドは、ＩＴＲ対の間に隣接し、５´から３´方向に、ＳＶ４０エンハンサー（配列番号１２６）、ヒトＥＦ１αプロモーター（配列番号７７）またはその断片（配列番号７８）、およびＶＨ１−０２分泌リーダー配列（配列番号８８）、最適化アデュカヌマブ重鎖（ＨＣ）核酸配列（配列番号５７）、ＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号８６）を含み、アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）配列の上流に、ＣＭＶエンハンサー（配列番号８３）、ｒＥＦ１プロモーター（配列番号８５または配列番号１５０）、ＶＫ  Ａ２６リーダー配列（配列番号８９）、最適化アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）核酸配列（配列番号５８）、およびＢＧＨポリアデニル化配列（配列番号６８または配列番号１４８）を含む。最適化アデュカヌマブ重鎖（ＨＣ）配列および最適化アデュカヌマブ軽鎖（ＬＣ）核酸配列は、本明細書に記載される抗体の任意の他の重鎖配列または軽鎖配列と容易に置き換えることができる。例えば、本明細書の表１〜５を参照されたい。図６Ｂは、図６Ａのようにプラスミドを生成するために所望のｃｅＤＮＡベクターに挿入されるモジュール構成要素として使用され得る例示的な挿入物である。図６Ｃは、アデュカヌマブを生成するための配列を含む、ｃｅＤＮＡ−Ａｄｕ−ｆｕｌｌ−ＩｇＧ１プラスミドの領域の線形化された図である。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に開示される様々な異なる抗体もしくは抗原結合断片または融合タンパク質を発現することができる例示的なｃｅＤＮＡベクターを示す。例示されたｃｅＤＮＡベクターはまた、ＩＲＥＳ配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リンカー配列、ポリアデニル化配列の使用に関して複数の構成も示している。図７Ａは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流に任意のエンハンサーを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｂは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流にＩＲＥＳを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｃは、図７Ａと同様の抗体断片（例えば、抗原結合断片）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示し、重鎖Ｆａｂ断片配列の後にポリＡ配列および軽鎖断片核酸配列の上流に任意のエンハンサーを含む。図７Ｄは、軽鎖配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｅは、重鎖配列の後にポリＡ配列有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｆは、ｄＡｂ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｇは、単鎖抗体配列のｓｃＦｖ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単鎖可変断片融合タンパク質（ｓｃＦｖ）または単鎖抗体などの抗体断片を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。当業者が理解するように、本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体またはその断片をコードする所望の調節配列または異種核酸が他の所望の配列と交換され得るように、モジュール様式で使用され得る。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の適用に合わせてカスタマイズ可能である。また、図７Ａ〜７Ｇには、可変鎖（ＶＨおよびＶＬ）ならびに定常鎖（ＣＨおよびＣＬ）の核酸配列と、Ｆｃ配列とが互いに近位に位置するか、または代替としてＦｃが、本明細書に開示されるリンカー配列を介して、ＶＨおよびＶＬをコードする配列に結合され得る実施形態が示される。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に開示される様々な異なる抗体もしくは抗原結合断片または融合タンパク質を発現することができる例示的なｃｅＤＮＡベクターを示す。例示されたｃｅＤＮＡベクターはまた、ＩＲＥＳ配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リンカー配列、ポリアデニル化配列の使用に関して複数の構成も示している。図７Ａは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流に任意のエンハンサーを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｂは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流にＩＲＥＳを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｃは、図７Ａと同様の抗体断片（例えば、抗原結合断片）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示し、重鎖Ｆａｂ断片配列の後にポリＡ配列および軽鎖断片核酸配列の上流に任意のエンハンサーを含む。図７Ｄは、軽鎖配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｅは、重鎖配列の後にポリＡ配列有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｆは、ｄＡｂ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｇは、単鎖抗体配列のｓｃＦｖ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単鎖可変断片融合タンパク質（ｓｃＦｖ）または単鎖抗体などの抗体断片を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。当業者が理解するように、本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体またはその断片をコードする所望の調節配列または異種核酸が他の所望の配列と交換され得るように、モジュール様式で使用され得る。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の適用に合わせてカスタマイズ可能である。また、図７Ａ〜７Ｇには、可変鎖（ＶＨおよびＶＬ）ならびに定常鎖（ＣＨおよびＣＬ）の核酸配列と、Ｆｃ配列とが互いに近位に位置するか、または代替としてＦｃが、本明細書に開示されるリンカー配列を介して、ＶＨおよびＶＬをコードする配列に結合され得る実施形態が示される。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に開示される様々な異なる抗体もしくは抗原結合断片または融合タンパク質を発現することができる例示的なｃｅＤＮＡベクターを示す。例示されたｃｅＤＮＡベクターはまた、ＩＲＥＳ配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リンカー配列、ポリアデニル化配列の使用に関して複数の構成も示している。図７Ａは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流に任意のエンハンサーを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｂは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流にＩＲＥＳを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｃは、図７Ａと同様の抗体断片（例えば、抗原結合断片）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示し、重鎖Ｆａｂ断片配列の後にポリＡ配列および軽鎖断片核酸配列の上流に任意のエンハンサーを含む。図７Ｄは、軽鎖配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｅは、重鎖配列の後にポリＡ配列有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｆは、ｄＡｂ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｇは、単鎖抗体配列のｓｃＦｖ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単鎖可変断片融合タンパク質（ｓｃＦｖ）または単鎖抗体などの抗体断片を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。当業者が理解するように、本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体またはその断片をコードする所望の調節配列または異種核酸が他の所望の配列と交換され得るように、モジュール様式で使用され得る。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の適用に合わせてカスタマイズ可能である。また、図７Ａ〜７Ｇには、可変鎖（ＶＨおよびＶＬ）ならびに定常鎖（ＣＨおよびＣＬ）の核酸配列と、Ｆｃ配列とが互いに近位に位置するか、または代替としてＦｃが、本明細書に開示されるリンカー配列を介して、ＶＨおよびＶＬをコードする配列に結合され得る実施形態が示される。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に開示される様々な異なる抗体もしくは抗原結合断片または融合タンパク質を発現することができる例示的なｃｅＤＮＡベクターを示す。例示されたｃｅＤＮＡベクターはまた、ＩＲＥＳ配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リンカー配列、ポリアデニル化配列の使用に関して複数の構成も示している。図７Ａは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流に任意のエンハンサーを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｂは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流にＩＲＥＳを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｃは、図７Ａと同様の抗体断片（例えば、抗原結合断片）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示し、重鎖Ｆａｂ断片配列の後にポリＡ配列および軽鎖断片核酸配列の上流に任意のエンハンサーを含む。図７Ｄは、軽鎖配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｅは、重鎖配列の後にポリＡ配列有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｆは、ｄＡｂ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｇは、単鎖抗体配列のｓｃＦｖ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単鎖可変断片融合タンパク質（ｓｃＦｖ）または単鎖抗体などの抗体断片を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。当業者が理解するように、本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体またはその断片をコードする所望の調節配列または異種核酸が他の所望の配列と交換され得るように、モジュール様式で使用され得る。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の適用に合わせてカスタマイズ可能である。また、図７Ａ〜７Ｇには、可変鎖（ＶＨおよびＶＬ）ならびに定常鎖（ＣＨおよびＣＬ）の核酸配列と、Ｆｃ配列とが互いに近位に位置するか、または代替としてＦｃが、本明細書に開示されるリンカー配列を介して、ＶＨおよびＶＬをコードする配列に結合され得る実施形態が示される。
【図７Ｅ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に開示される様々な異なる抗体もしくは抗原結合断片または融合タンパク質を発現することができる例示的なｃｅＤＮＡベクターを示す。例示されたｃｅＤＮＡベクターはまた、ＩＲＥＳ配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リンカー配列、ポリアデニル化配列の使用に関して複数の構成も示している。図７Ａは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流に任意のエンハンサーを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｂは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流にＩＲＥＳを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｃは、図７Ａと同様の抗体断片（例えば、抗原結合断片）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示し、重鎖Ｆａｂ断片配列の後にポリＡ配列および軽鎖断片核酸配列の上流に任意のエンハンサーを含む。図７Ｄは、軽鎖配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｅは、重鎖配列の後にポリＡ配列有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｆは、ｄＡｂ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｇは、単鎖抗体配列のｓｃＦｖ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単鎖可変断片融合タンパク質（ｓｃＦｖ）または単鎖抗体などの抗体断片を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。当業者が理解するように、本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体またはその断片をコードする所望の調節配列または異種核酸が他の所望の配列と交換され得るように、モジュール様式で使用され得る。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の適用に合わせてカスタマイズ可能である。また、図７Ａ〜７Ｇには、可変鎖（ＶＨおよびＶＬ）ならびに定常鎖（ＣＨおよびＣＬ）の核酸配列と、Ｆｃ配列とが互いに近位に位置するか、または代替としてＦｃが、本明細書に開示されるリンカー配列を介して、ＶＨおよびＶＬをコードする配列に結合され得る実施形態が示される。
【図７Ｆ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に開示される様々な異なる抗体もしくは抗原結合断片または融合タンパク質を発現することができる例示的なｃｅＤＮＡベクターを示す。例示されたｃｅＤＮＡベクターはまた、ＩＲＥＳ配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リンカー配列、ポリアデニル化配列の使用に関して複数の構成も示している。図７Ａは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流に任意のエンハンサーを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｂは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流にＩＲＥＳを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｃは、図７Ａと同様の抗体断片（例えば、抗原結合断片）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示し、重鎖Ｆａｂ断片配列の後にポリＡ配列および軽鎖断片核酸配列の上流に任意のエンハンサーを含む。図７Ｄは、軽鎖配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｅは、重鎖配列の後にポリＡ配列有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｆは、ｄＡｂ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｇは、単鎖抗体配列のｓｃＦｖ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単鎖可変断片融合タンパク質（ｓｃＦｖ）または単鎖抗体などの抗体断片を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。当業者が理解するように、本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体またはその断片をコードする所望の調節配列または異種核酸が他の所望の配列と交換され得るように、モジュール様式で使用され得る。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の適用に合わせてカスタマイズ可能である。また、図７Ａ〜７Ｇには、可変鎖（ＶＨおよびＶＬ）ならびに定常鎖（ＣＨおよびＣＬ）の核酸配列と、Ｆｃ配列とが互いに近位に位置するか、または代替としてＦｃが、本明細書に開示されるリンカー配列を介して、ＶＨおよびＶＬをコードする配列に結合され得る実施形態が示される。
【図７Ｇ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に開示される様々な異なる抗体もしくは抗原結合断片または融合タンパク質を発現することができる例示的なｃｅＤＮＡベクターを示す。例示されたｃｅＤＮＡベクターはまた、ＩＲＥＳ配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リンカー配列、ポリアデニル化配列の使用に関して複数の構成も示している。図７Ａは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流に任意のエンハンサーを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｂは、重鎖配列の後にポリＡ配列および軽鎖核酸配列の上流にＩＲＥＳを有する抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｃは、図７Ａと同様の抗体断片（例えば、抗原結合断片）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示し、重鎖Ｆａｂ断片配列の後にポリＡ配列および軽鎖断片核酸配列の上流に任意のエンハンサーを含む。図７Ｄは、軽鎖配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｅは、重鎖配列の後にポリＡ配列有するものを含む、本明細書に開示される抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｆは、ｄＡｂ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。図７Ｇは、単鎖抗体配列のｓｃＦｖ配列の後にポリＡ配列を有するものを含む、本明細書に開示される単鎖可変断片融合タンパク質（ｓｃＦｖ）または単鎖抗体などの抗体断片を産生するためのｃｅＤＮＡベクター構築物の実施形態を示す。当業者が理解するように、本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体またはその断片をコードする所望の調節配列または異種核酸が他の所望の配列と交換され得るように、モジュール様式で使用され得る。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の適用に合わせてカスタマイズ可能である。また、図７Ａ〜７Ｇには、可変鎖（ＶＨおよびＶＬ）ならびに定常鎖（ＣＨおよびＣＬ）の核酸配列と、Ｆｃ配列とが互いに近位に位置するか、または代替としてＦｃが、本明細書に開示されるリンカー配列を介して、ＶＨおよびＶＬをコードする配列に結合され得る実施形態が示される。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、発現されたタンパク質の一段階精製後に、実施例９に記載されるようにｃｅＤＮＡ−ＩｇＧ１−Ａｄｕ構築物から発現されたアデュカヌマブ（完全ＩｇＧ１）抗体の発現の例示的なＳＤＳ−Ｐａｇｅ（図８Ａ）およびウェスタンブロット（図８Ｂ）分析を示す。図８Ａは、発現された抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像を示す。レーンは次のとおりである。Ｍ１は、タンパク質マーカー（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号３４５２）であり、精製されたアデュカヌマブは、還元条件（レーン１）および非還元条件（レーン２）で示される。還元条件での２つのバンドの存在および非還元条件での単一バンドのみの存在は、重鎖および軽鎖を有する抗体であるタンパク質と一致し、これは非還元条件で単一バンドとして移動し、還元条件下で構築物重鎖および軽鎖として移動する。図８Ｂは、抗ヒトＩｇＧ抗体で免疫染色したウェスタンブロット画像を示す。レーンは次のとおりである。Ｍ２は、タンパク質マーカー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００５２１）であり、Ｐは、陽性対照のヒトＩｇＧ１抗体（Ｓｉｇｍａ）である。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、発現されたタンパク質の一段階精製後に、実施例９に記載されるようにｃｅＤＮＡ−ＩｇＧ１−Ａｄｕ構築物から発現されたアデュカヌマブ（完全ＩｇＧ１）抗体の発現の例示的なＳＤＳ−Ｐａｇｅ（図８Ａ）およびウェスタンブロット（図８Ｂ）分析を示す。図８Ａは、発現された抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像を示す。レーンは次のとおりである。Ｍ１は、タンパク質マーカー（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号３４５２）であり、精製されたアデュカヌマブは、還元条件（レーン１）および非還元条件（レーン２）で示される。還元条件での２つのバンドの存在および非還元条件での単一バンドのみの存在は、重鎖および軽鎖を有する抗体であるタンパク質と一致し、これは非還元条件で単一バンドとして移動し、還元条件下で構築物重鎖および軽鎖として移動する。図８Ｂは、抗ヒトＩｇＧ抗体で免疫染色したウェスタンブロット画像を示す。レーンは次のとおりである。Ｍ２は、タンパク質マーカー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００５２１）であり、Ｐは、陽性対照のヒトＩｇＧ１抗体（Ｓｉｇｍａ）である。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、ｃｅＤＮＡ−ＩｇＧ１−Ａｄｕベクターから発現されたＧＦＰまたはアデュカヌマブ（完全ＩｇＧ１）抗体を発現するｃｅＤＮＡの発現を示す。図９Ａは、実施例８に記載されるように、ｃｅＤＮＡ−ＧＦＰプラスミド（上パネル）およびｃｅＤＮＡ−ＧＦＰベクター（下パネル）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡画像を提供する。両方の画像における豊富な蛍光の存在は、いずれかのｃｅＤＮＡ処理を行った細胞において、導入遺伝子ＧＦＰの著しいトランスフェクションおよび発現が起こったことを示す。図９Ｂは、実施例８に記載されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動的に分離された細胞試料の同じ膜転写の２つの異なる画像を提供する。下パネルは、すべてのタンパク質含有量を示すポンソー染色された膜である。上パネルは、目に見えるバンドがヒト抗体の存在を反映するウェスタンブロットである。レーン７〜１０では、抗体重鎖は、およそ５０ｋＤａで移動し、抗体軽鎖は、およそ２５ｋＤａで移動する。両方の鎖が、４つのレーンすべてで見られる。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、ｃｅＤＮＡ−ＩｇＧ１−Ａｄｕベクターから発現されたＧＦＰまたはアデュカヌマブ（完全ＩｇＧ１）抗体を発現するｃｅＤＮＡの発現を示す。図９Ａは、実施例８に記載されるように、ｃｅＤＮＡ−ＧＦＰプラスミド（上パネル）およびｃｅＤＮＡ−ＧＦＰベクター（下パネル）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡画像を提供する。両方の画像における豊富な蛍光の存在は、いずれかのｃｅＤＮＡ処理を行った細胞において、導入遺伝子ＧＦＰの著しいトランスフェクションおよび発現が起こったことを示す。図９Ｂは、実施例８に記載されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動的に分離された細胞試料の同じ膜転写の２つの異なる画像を提供する。下パネルは、すべてのタンパク質含有量を示すポンソー染色された膜である。上パネルは、目に見えるバンドがヒト抗体の存在を反映するウェスタンブロットである。レーン７〜１０では、抗体重鎖は、およそ５０ｋＤａで移動し、抗体軽鎖は、およそ２５ｋＤａで移動する。両方の鎖が、４つのレーンすべてで見られる。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ｃｅＤＮＡが産生したアデュカヌマブ抗体の特性を示す。図１０Ａは、実施例９に記載されるＨＰＬＣ分析の結果を示し、ｃｅＤＮＡ産生アデュカヌマブに対応する単一のピークを示している。図１０Ｂは、実施例９に記載されるように、固定化されたβ−アミロイド（１〜４２）リガンドを認識する精製されたアデュカヌマブ抗体の能力を評価するＥＬＩＳＡ分析の結果を表す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ｃｅＤＮＡが産生したアデュカヌマブ抗体の特性を示す。図１０Ａは、実施例９に記載されるＨＰＬＣ分析の結果を示し、ｃｅＤＮＡ産生アデュカヌマブに対応する単一のピークを示している。図１０Ｂは、実施例９に記載されるように、固定化されたβ−アミロイド（１〜４２）リガンドを認識する精製されたアデュカヌマブ抗体の能力を評価するＥＬＩＳＡ分析の結果を表す。
【図１１】実施例１０に記載される実験の結果をグラフで表す。アデュカヌマブ導入遺伝子を欠くｃｅＤＮＡ構築物で治療されたマウスからの陰性対照試料（ｃｅＤＮＡ陰性対照としてラベル付けされる）は、アッセイの定量下限以下であった。対照的に、ｃｅＤＮＡ−ＩｇＧ構築物で治療されたマウスの血清には、３日目および７日目の両方の時点で高レベルのヒト免疫グロブリンが存在していた。
【図１２】実施例１２に記載されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動的に分離された細胞試料の同じ膜転写の２つの異なる時間曝露を提供する。上パネルは、６秒の曝露で撮影され、下パネルは、２０秒の曝露後に撮影された。無傷の抗体に対応するバンドが、ゲルの上部に見られ（それぞれ、約５０ｋＤａおよび約２５ｋＤａで移動する限られた量の重鎖と軽鎖の低減）が、レーン５、７（両方ともアデュカヌマブ）、および１１（ベバシズマブ）に見られる（矢印を参照）。レーン９では、Ｆｃ融合タンパク質の存在がレーンの上部近くで観察され、予想どおり、より低分子量の構築産物は観察されない。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書では、抗体をコードする１つ以上の異種核酸（例えば、重鎖、軽鎖、フレームワーク、Ｆａｂ´、ｓｃＡｂ）を含む、本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターが提供される。本明細書では、融合タンパク質をコードする１つ異常の異種核酸を含む、本明細書に記載される融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターも提供される。そのようなベクターは、ｃｅＤＮＡベクターからの細胞内発現により、市販の抗体もしくは融合タンパク質の産生において、または本明細書に記載される治療用抗体もしくは融合タンパク質の送達において使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体もしくは融合タンパク質の発現は、それが発現される細胞からの抗体もしくは融合タンパク質の分泌を含み得るか、または代替として、いくつかの実施形態では、発現された抗体もしくは融合タンパク質は、それが発現される細胞内のタンパク質を標的とすることができる（例えば、抗体はイントラボディである）。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対象の筋肉（例えば、骨格筋）において抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質を発現し、これは多くの全身区画への抗体または融合タンパク質の産生および分泌のためのデポーとして作用し得る。
【００３１】
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．，２０１１（ＩＳＢＮ  ９７８−０−９１１９１０−１９−３）、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ  ９７８３５２７６００９０８）、およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ‘ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ  ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ���：ＤＮＡ，Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ  ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ  ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加として、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー）、１つ以上のイントロン、および１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。
【００３４】
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重らせんＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然、化学的もしくは生化学的修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５〜約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、または当該技術分野で知られている方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００３５】
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ天然に存在しないような様式で核酸のセグメントを含むように修飾されるか、または合成のものである、一本鎖または二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。
【００３６】
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボ条件下で配列特異的、逆平行方法で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で知られているように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、およびシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）と対合することも当該技術分野で知られている。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の状況で、遺伝暗号の縮重（すなわち、冗長性）を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であると見なされ、逆もまた同様である。したがって、対象のＤＮＡ標的ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であると見なされないが、代わりに相補的であると見なされる。
【００３７】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、任意の抗体もしくは抗体断片（すなわち、機能的抗体断片）、または所望の抗原もしくはエピトープに対する抗原結合活性を保持する抗原結合断片を包含する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、免疫グロブリン鎖またはその断片および少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。抗体の例には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖、軽鎖、重鎖および軽鎖、完全抗体（例えば、Ｆｃ、Ｆａｂ、重鎖、軽鎖、可変領域等の各々を含む）、二重特異性抗体、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体、イントラボディ、モノクローナル抗体、キメラ抗体、または多量体抗体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、抗体は、任意の哺乳動物、例えば霊長類、ヒト、ラット、マウス、ウマ、ヤギ等に由来し得る。一実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体は、修飾抗体である。いくつかの実施形態では、抗体の成分は、抗体がタンパク質成分の発現後に自己集成するように、別々に発現させることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、疾患または疾患の症状を治療する目的で、所望の機能、例えば、所望のタンパク質の相互作用および阻害を有する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、フレームワーク領域またはＦｃ領域を含む。抗体断片は、完全抗体の活性の１０〜９９％を保持することができる（例えば、１０〜９０％、１０〜８０％、１０〜７０％、１０〜６０％、１０〜５０％、１０〜４０％、１０〜３０％、１０〜２０％、５０〜９９％、５０〜９０％、５０〜８０％、５０〜７０％、５０〜６０％、２０〜９９％、３０〜９９％、４０〜９９％、６０〜９９％、７０〜９９％、８０〜９９％、９０〜９９％、またはその間の任意の活性）。本明細書ではまた、機能的抗体断片が、無傷の抗体の活性よりも高い（例えば、少なくとも２倍以上）活性を含むことも企図される。別の実施形態では、抗体断片は、同じ標的（例えば、エピトープ）に対する無傷の抗体の親和性と実質的に同様であるその標的に対する親和性を含む。抗体は、それが標的タンパク質の活性を増加させるように「活性化」することができるか、または標的タンパク質の活性を減少させるように「阻害」（例えば、抗体を中和または遮断）することができる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、抗体分子の「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原結合に関与する抗体分子、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の部分を指す。実施形態では、抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖と軽鎖の可変領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、超可変領域と称され、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された隣接ストレッチの間に配置される。ＦＲは、免疫グロブリンの超可変領域の間およびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列である。実施形態では、抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間において互いに対して配置されて、結合した抗原の３次元表面に相補的である抗原結合表面を形成する。重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。フレームワーク領域およびＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７において定義され、記載されている。各可変鎖（例えば、可変重鎖および可変軽鎖）は、典型的に３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸順序で配置されている。本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。所与のＣＤＲの精密なアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），″Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，″５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）によって記載されるものを含む、いくつかの既知のスキームのうちのいずれかを使用して決定され得る。本明細書で使用される場合、「Ｃｈｏｔｈｉａ」数スキームに従って定義されたＣＤＲは、「超可変ループ」と称されることもある。例えば、Ｋａｂａｔの下では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残には、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基には、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（���ＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられている。Ｃｈｏｔｈｉａの下では、ＶＨのＣＤＲアミノ酸には、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられ、ＶＬのアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられている。各ＶＨおよびＶＬには、典型的に３つのＣＤＲおよび４つのＦＲが含まれ、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「全長抗体」という用語は、例えば、天然に存在し、通常の免疫グロブリン遺伝子断片の組み換えプロセスによって形成される、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ抗体）を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「機能的抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は互換的に使用され、無傷の（例えば、全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原またはエピトープに結合する抗体断片を指す。「抗体断片」または「機能的断片」という用語はまた、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片などの可変領域からなる単離された断片、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続される組み換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、Ｆｃ断片または単一のアミノ酸残基など、抗原結合活性のない抗体の部分を含まない。いくつかの実施形態では、機能的抗体断片は、例えば、標的タンパク質の活性化または阻害の程度を測定することによって評価されるように、無傷または全長抗体の活性の少なくとも２０％を保持する。他の実施形態では、機能的抗体断片は、無傷の抗体に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％（すなわち、実質的に同様）の活性を保持する。機能的抗体断片は、無傷の抗体と比較して増加した活性（例えば、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００以上）を含むことも本明細書において企図される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列を指す。例えば、配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含み得る。例えば、配列は、１、２、もしくはそれ以上のＮもしくはＣ末端アミノ酸を含んでも含まなくてもよく、またはタンパク質構造の形成に適合する他の変更を含んでもよい。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、可変領域からＣＤＲを引いた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なるシステムによって決定され得るため、フレームワーク配列の意味は、それに対応して異なる解釈の対象となる。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３および重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）はまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の４つの下位領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１は、ＦＲ１とＦＲ２との間に位置付けられ、ＣＤＲ２は、ＦＲ２とＦＲ３との間に位置付けられ、ＣＤＲ３は、ＦＲ３とＦＲ４との間に配置される。特定の下位領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４として指定せずに、他によって言及されるフレームワーク領域は、単一の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の複合ＦＲを表す。本明細書で使用される場合、ＦＲは、４つの下位領域のうちの１つを表し、ＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つの下位領域のうちの２つ以上を表す。
【００４４】
特定の抗体または抗原結合断片を「コードする」ＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡおよび／またはタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはＤＮＡ標的ＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、融合タンパク質は、（ｉ）抗体もしくはその断片（例えば、抗体の抗原結合部分もしくは抗原結合断片）またはリガンド結合ドメインおよび（ｉｉ）少なくとも１つの非抗体タンパク質を含み得る。本明細書に包含される融合タンパク質は、抗体、または関心対象のタンパク質、例えば、受容体、リガンド、酵素、もしくはペプチドの細胞外ドメインに融合した抗体のＦｃまたは抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。融合タンパク質の一部である抗体またはその抗原結合断片は、単一特異性抗体または二重特異性もしくは多重特異的性抗体であり得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ゲノムセーフハーバー遺伝子」または「セーフハーバー遺伝子」という用語は、内因性遺伝子活性に重大な悪影響を及ぼすことなく、または癌を促進することなく、配列が予測可能な方法で統合および機能し得る（例えば、関心対象のタンパク質を発現する）ように、核酸配列を挿入することができる遺伝子または遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子はまた、挿入された核酸配列が非セーフハーバー部位よりも効率的かつ高レベルで発現され得る遺伝子座または遺伝子である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡが遺伝子療法の適用のために宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補鎖であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ］と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、統合、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補鎖でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を行うことができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、２つより多くのＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーウイルスは、脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび無脊椎動物に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅの２つのサブファミリーで構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
【００４９】
「野生型ＩＴＲ」または「ＷＴ−ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性およびＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶまたは他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ−ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コードまたはドリフトの縮退のために、天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ−ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ−ＩＴＲ配列を含む。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ」または「実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ−ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な３次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であると見なすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ−ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有する。実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループを有する。実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」または「ｍｏｄ−ＩＴＲ」または「突然変異体ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ−ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに突然変異を有するＩＴＲを指す。突然変異は、同じ血清型のＷＴ−ＩＴＲの３次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし得、３次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその３次元構造）の変化をもたらし得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも呼ばれる「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補鎖ではない単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの３次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、３次元空間でのそれらのＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ−Ｃ’アームおよび／または短いＢ−Ｂ’ループを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点突然変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型または合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ−ＩＴＲは、短いＣ−Ｃ’アームを有することができ、他のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ−ＩＴＲと比較して、異なる３次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、または短いＢ−Ｂ’アーム等）を有し得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して突然変異または修飾され、それらの全長にわたって逆相補鎖である単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。どちらのＩＴＲも野生型ＩＴＲ  ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは修飾型ＩＴＲであり、突然変異体ＩＴＲとも呼ばれる）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点突然変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」または「実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称と見なすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対は、３次元空間に構成された同じＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ−ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補鎖ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称の３次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な３次元形状をもたらす突然変異を有する。例えば、ｍｏｄ−ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する突然変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称の３次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが３次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ−ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）またはデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ−ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称の３次元空間構成を有する。実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ−Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ−ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ−ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ−Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。
【００５５】
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡおよびＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のための所望の処理で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミドまたはバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供する、または増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位等に便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、または既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分解部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒ等を挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分解部位との間に組み込むことができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、および「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ  Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実行できるようにする。ＲＢＳ配列およびその逆相補鎖は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたＲＢＳ配列である５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ  ＲＢＳ配列および他の天然に既知のまたは合成ＲＢＳ配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’−（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）−３’（配列番号６０）に直接結合し、安定に集成すると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質−ＤＮＡ複合体を安定させる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ  ｐｏｌ  δまたはＤＮＡ  ｐｏｌ  εを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン−ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替として、Ｒｅｐ−チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲであるとき、得られる産生物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたヘキサヌクレオチド配列である５’−ＧＧＴＴＧＡ−３’（配列番号６１）を含む。他の既知のＡＡＶ  ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号６２）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号６３）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号６４）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号６５）などの他の天然に既知のまたは合成ＴＲＳ配列、およびＲＲＴＴＲＲ（配列番号６６）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本発明の実施形態において使用することができる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ−ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」および「ｃｅＤＮＡ」という用語は交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
【００６６】
本明細書で定義されるように、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起されたときに細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生成する反応を触媒させ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産生物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の反応性の範囲および複雑性を拡張する。
【００６８】
転写調節因子は、関心対象の遺伝子の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定的な例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、およびロイシン−ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに操作可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤または環境入力の存在または非存在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合および入力剤結合、または反応性エレメントもしくはドメインを含む形態のモジュールである。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意かつすべての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等が挙げられる。薬学的活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときに、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「入力剤反応性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して反応性にするような様式で、条件または入力剤に反応する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤反応性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
【００７２】
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実行される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（５’配向）に伸びる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質または転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０〜１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
【００７５】
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「操作可能に位置付けられた」、「操作可能に連結された）、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
【００７６】
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組み換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方が、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組み換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する突然変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照、各々が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラスト等の非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
【００７８】
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子または誘導剤の存在下、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方法で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の非存在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本明細書で交換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、および「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等の転写および翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）またはコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドもしくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供および／もしくは調節し、かつ／またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
【００８０】
「操作可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分が、それらが意図された方法で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結されている異種ＤＮＡ配列を含む。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加として、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。追加として、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、スペイン人、中東人等であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、または成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、またはヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、または非ヒト胚もしくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物またはｃｅＤＮＡ発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞）、人工多能性幹細胞、またはいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。あるいは、宿主細胞は、組織、器官、または生物における原位置またはインビボの細胞であり得る。
【００８３】
「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞中に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドを指し得る。あるいは、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞または生物における核酸またはポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現またはレベルをもたらすことが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系または細胞に対して天然である物質を指す。
【００８４】
「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメーターは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
【００８５】
本明細書で使用される「相同性」または「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば相同性アームの核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する未変性または未編集の核酸配列（例えば、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一である場合、「相同」と見なされる。
【００８６】
本明細書で使用される「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸またはタンパク質には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（またはその変異体）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、変異体ポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
【００８７】
「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、またはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源および／または最終形態でウイルス性または非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用されるとき、一般にｃｅＤＮＡベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝的エレメントを包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組み換えベクターであり得る。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、必ずしもそうではないが、細胞にとって異種であることが多い。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、ならびにクローニングおよび増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳およびタンパク質の折りたたみ、修飾および処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に操作可能に連結された場合に、インビトロまたはインビボでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる場合と含まれない場合がある。
【００８９】
「組み換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物および治療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
【００９０】
本明細書で使用される「遺伝性疾患」という語句は、ゲノムの１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的または完全に、直接的または間接的に引き起こされる疾患を指す。異常は、突然変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性疾患、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得るが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成成分（複数可）に関して使用される。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【００９３】
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意の要素を除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらそれぞれの構成成分を指す。
【００９４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および／または本開示等を読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、および／またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定的な例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
【００９５】
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。パーセンテージに関連して使用される「約」という用語は、±１％を意味する場合がある。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されてはならない。
【００９６】
本明細書に開示される本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書で見られる他の要素との任意の組み合わせで参照および主張することができる。グループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、グループに含める、またはグループから削除することができる。そのような任意の包含または削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むと見なされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記述を満たす。
【００９７】
いずれかの態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業もしくは商業目的でのヒト胚の使用、または人もしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、およびそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。
【００９８】
本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
【００９９】
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、および係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用されるすべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、またはいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
【０１００】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態および実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は、所与の順序で提示されるが、代替の実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参考文献および出願の構成、機能、および概念を用いて本開示のさらなる実施形態を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、種類または量の生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更および他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１０１】
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または置き換えることができる。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、すべての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
【０１０２】
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、決してこれらをさらに限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０３】
ＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または融合タンパク質の発現
本明細書に記載される技術は、一般に、非ウイルス性ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターからの細胞における抗体または融合タンパク質の発現および／または産生を対象とする。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書において「ｃｅＤＮＡベクター全般」と題されたセクションに記載されている。特に、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、一対のＩＴＲ（例えば、本明細書に記載される対称または非対称）、およびＩＴＲ対の間に、プロモーターまたは調節配列に操作可能に連結された、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質をコードする核酸を含む。従来のＡＡＶベクター、さらにはレンチウイルスベクターよりも、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、所望のタンパク質をコードする異種核酸配列にサイズの制約がないことである。したがって、例えば、２つの重鎖Ｆｃ領域、リンカー、およびＦａｂ断片を含む全長抗体でさえ、単一のｃｅＤＮＡベクターから発現され得る。特に抗体の発現および／または産生のために、それらのサイズを考えると、ｃｅＤＮＡベクターは、使いやすさのために従来のベクターよりも有利であり、サイズの制約がないため、制御された様式で異なるドメイン構造を有する抗体（多量体抗体を含む）を発現させることが容易に可能になる。さらに、複数の投与を行うことができ、異なる抗体または融合タンパク質を発現する異なるｃｅＤＮＡベクターのカクテルを投与するのを可能にすることができる。したがって、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、それを必要とする対象において治療用抗体または融合タンパク質を発現させることができる。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、バイオリアクターを使用して、または所望の宿主での産生のために、商業的設定での抗体または融合タンパク質の産生に使用することができる。
【０１０４】
理解されるように、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター技術は、任意のレベルの複雑さに適合させることができるか、または抗体もしくは融合タンパク質の異なる成分の発現が独立した様式で制御され得るモジュール方式で使用することができる。例えば、本明細書で設計されたｃｅＤＮＡベクター技術は、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して単一の異種遺伝子配列（例えば、所望の抗体の重鎖もしくは軽鎖）を発現するのと同様に簡単であり得るか、または複数のｃｅＤＮＡベクターを使用する場合と同様に複雑であり得、各ベクターは、異なるプロモーターによって各々独立して制御される複数の抗体または抗体成分を発現する。以下の実施形態は、本明細書で具体的に企図され、必要に応じて当業者が適応させることができる。
【０１０５】
実施形態では、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、抗体または融合タンパク質の単一の成分、例えば、重鎖または軽鎖を発現させることができる。あるいは、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、単一のプロモーター（強力なプロモーターなど）の制御下で、抗体または融合タンパク質の複数の成分（例えば、少なくとも２つ）を発現させることができ、必要に応じてＩＲＥＳ配列（複数可）を使用して、各成分の適切な表現を保証する。
【０１０６】
また本明細書において、別の実施形態では、少なくとも２つの挿入物（例えば、重鎖または軽鎖を発現する）を含む単一のｃｅＤＮＡベクターが企図され、各挿入物の発現はそれ自体のプロモーターの制御下にある。プロモーターは、同じプロモーターの複数のコピー、複数の異なるプロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。当業者が理解するように、多くの場合、抗体の成分を異なる発現レベルで発現させ、したがって、発現される個々の成分の化学量論を制御して、細胞における効率的な抗体の折りたたみおよび組み合わせを確実にすることが望ましい。
【０１０７】
ｃｅＤＮＡベクター技術のさらなるバリエーションは、当業者によって想定され得るか、または従来のベクターを使用する抗体産生方法から適応され得る。
【０１０８】
Ａ．抗体または融合タンパク質を発現させるための異種配列
本質的に任意の抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、機能的断片）または融合タンパク質は、本明細書中に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターから発現され得る。当業者は、抗体断片が、少なくとも、抗原またはエピトープ結合に必要なアミノ酸（例えば、ｓｃＡｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、ｄＡｂ、およびＦｖ）を含むことを理解するであろう。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＨと略される）、および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＬと略される）を含み得る。一実施形態では、抗体分子は、重鎖および軽鎖（本明細書では半抗体と称される）を含むか、またはそれらからなる。別の実施例では、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列および２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それによって２つの抗原結合部位、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価および二重特異性）、および抗体全体または組み換えＤＮＡ技術を使用して新規に合成されたものの修飾によって産生され得るキメラ（例えば、ヒト化）抗体を形成する。そのような機能的抗体断片は、それらのそれぞれの抗原またはエピトープと選択的に結合し、標的タンパク質を活性化または阻害する能力を保持する。
【０１０９】
融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターもまた本明細書に含まれる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、生体機能性融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、トラップ技術、例えば、抗体−リガンドトラップに有用であり、ここで融合タンパク質は、ペプチドに融合された抗体（例えば、単一特異性もしくは二重特異性抗体）または抗体断片（例えば、抗原結合断片）、あるいはリガンドを捕捉し、それによりリガンドの活性を阻害するリガンド結合ドメインまたは受容体ドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、当該技術分野においてトラップまたはＹトラップと称される融合タンパク質をコードし、発現させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、融合タンパク質、例えば、ＶＥＧＦ−トラップ融合タンパク質、ＩＧＦ−トラップ融合タンパク質（Ｖａｎｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１８，８（１），１７３６１を参照）またはＴＧＦβ−トラップ融合タンパク質を発現させる。例示的なＴＧＦβ−トラップは、Ｙ−トラップ、例えば標的細胞微小環境においてオートクリン／パラクリンＴＧＦβを同時に不能にするＴＧＦβ受容体ＩＩエクトドメイン配列に融合されたＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体（ａ−ＣＴＬＡ４−ＴＧＦβＲＩＩｅｃｄおよびａ−ＰＤＬ１−ＴＧＦβＲＩＩｅｃｄ）を含む、二機能性抗体−リガンドトラップ（Ｙ−トラップ）である（例えば、Ｒａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ  ２０１８，９（１）；７４１）。いくつかの実施形態では、本明細書での使用のために包含され、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される融合タンパク質は、抗体−リガンドトラップであり、融合タンパク質は、リガンド結合ドメインまたはリガンドをトラップする受容体ドメイン（例えば、細胞外受容体ドメイン）に融合された抗体または抗体断片（例えば、抗原結合断片）を含み、リガンドは、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＬＦＡ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１、ＴＰＯを含むが、これらに限定されない任意の一般に知られている成長因子またはリガンドから選択される。
【０１１０】
例示的な融合タンパク質には、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ＩＩの７５ｋＤａ可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合されたリンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）の第１のＥＣＤを含むアレファセプト（ＡＭＥＶＩＶＥ（登録商標））、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合されたヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子−４（ＣＴＬＡ−４）のＥＣＤを含むアバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））、各々がヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合されたＩＬ−１ＲＩ  ＥＣＤのＮ末端に融合されたＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質リガンド結合領域のＣ末端を含む、２つの鎖を含むリロナセプト（ＡＲＣＡＬＹＳＴ（登録商標））、アグリコシル化ヒトＩｇＧ１  ＦｃのＣ末端に融合されたペプチドトロンボポエチン（ＴＰＯ）模倣体を含むロミプロスチム（ＮＰＬＡＴＥ（登録商標））、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合されたＣＴＬＡ−４のＥＣＤを含み、ＣＴＬＡ−４領域における２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４Ｅ、Ａ２９Ｙ）がアバタセプトとは異なるベラタセプト（ＮＵＬＯＪＩＸ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
抗体および抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含むがこれらに限定されない任意のクラスの抗体から、および抗体の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）からのものであり得る。抗体は、モノクローナルであり得る。本明細書に記載される方法を使用して産生された抗体は、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植、またはインビトロで生成された抗体であり得る。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有し得る。抗体はまた、例えば、κまたはλから選択される軽鎖を有し得る。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」という用語と互換的に使用される。そのような抗体のコード配列をｃｅＤＮＡベクターに挿入することにより、事実上あらゆる抗体が産生され得る。一実施形態では、軽鎖および重鎖遺伝子は、調節スイッチの制御下にある。同じまたは代替実施形態では、軽鎖および重鎖遺伝子は、ＩＲＥＳ配列（例えば、配列番号１９０）と接続される。
【０１１２】
典型的には、抗体または融合タンパク質遺伝子はまた、分泌配列もコードし、それにより抗体は、ゴルジ装置および小胞体に向けられ、抗体がＥＲを通過して細胞から出ると、シャペロン分子によって正しいコンフォメーションに折りたたまれる。例示的な分泌配列には、ＶＨ−０２（配列番号８８）およびＶＫ−Ａ２６（配列番号８９）およびＩｇＫシグナル配列（配列番号１２６）、ならびにタグ付きタンパク質がサイトゾルから分泌されるのを可能にするＧｌｕｃ分泌シグナル（配列番号１８８）、タグ付きタンパク質をゴルジ体に向けるＴＭＤ−ＳＴ分泌配列（配列番号１８９）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
イントラボディが所望される場合、抗体をコードする核酸または遺伝子は、典型的に、分泌配列をコードしない。いくつかの例では、それは分泌配列をコードすることができるが、それを細胞内に保つためにＫＤＥＬ配列などであるがこれに限定されない意図された標的配列も有する。他の実施形態では、イントラボディ遺伝子は、別の細胞内標的化配列、例えば核局在化配列をコードする。
【０１１４】
調節スイッチを使用して、抗体（イントラボディを含む）または融合タンパク質の発現を微調整することができ、それにより抗体は、必要に応じて（所望の発現レベルまたは量での抗体または融合タンパク質の発現を含むが、これに限定されない）、あるいは細胞シグナル伝達事象を含む特定のシグナルの存在または不在がある場合に発現される。例えば、本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または融合タンパク質の発現は、本明細書において「調節スイッチ」と題されたセクションに記載されるように、特定の状態が発生したときにオンまたはオフにすることができる。
【０１１５】
例えば、また単なる例示の目的のために、抗体または融合タンパク質を使用して、アダリムマブなどの抗ＴＮＦα抗体の場合と同様に、望ましくない反応を止めることができる。他の場合では、抗体または融合タンパク質は、免疫反応の増強を助け得る。例えば、悪性細胞、例えば腫瘍に関して。抗体遺伝子は、抗体を所望の細胞にもたらすために腫瘍関連マーカーを含み得る。しかしながら、いずれの状況でも、抗体または融合タンパク質の発現を調節することが望ましい場合がある。ｃｅＤＮＡベクターは、抗体による調節スイッチの使用に容易に対応する。ｃｅＤＮＡベクターはまた、重鎖とおよび軽鎖の化学量論の制御も可能する。融合タンパク質の例には、ＶＥＧＦ−トラップおよびＴＧＦβトラップ技術が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
抗体分子には、無傷の分子ならびにその抗原結合断片および機能的断片が含まれる。抗体分子の定常領域は、抗体の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体結合、システイン残基の数等のうちの１つ以上を増加または減少させる）ように変更する、例えば突然変異させることができる。抗体分子の抗原結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）断片、（ｖｉ）ラクダまたはラクダ化可変ドメイン、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）、（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。これらの抗体断片は、ｃｅＤＮＡベクターを使用して取得され、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされ得る。
【０１１７】
従来のＡＡＶベクター、さらにはレンチウイルスベクターよりもｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、所望のタンパク質をコードする異種核酸配列にサイズの制約がないことである。したがって、２つの重鎖Ｆｃ領域、リンカー、およびＦａｂ断片を含む全長抗体でさえ、単一のｃｅＤＮＡベクターから発現され得る。さらに、必要な原子化学に応じて、同じ抗体または融合タンパク質の複数のセグメント（例えば、軽鎖および重鎖）を発現させることができ、同じまたは異なるプロモーターを使用することができ、また調節スイッチを使用して各領域の発現を微調整することができる。例えば、実施例に示されるように、デュアルプロモーター系を含むｃｅＤＮＡベクターを使用することができ、それによりアデュカヌマブ抗体の重鎖および軽鎖の各々に異なるプロモーターが使用される。抗体または融合タンパク質を産生するためのｃｅＤＮＡプラスミドの使用には、重鎖と軽鎖の発現のためのプロモーターの独自の組み合わせが含まれ、機能的抗体または融合タンパク質の形成のための重鎖および軽鎖の適切な比率をもたらす。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、抗体または融合タンパク質の異なる領域を別々に（例えば、異なるプロモーターの制御下で）発現させることができる。いくつかの実施形態では、重鎖をコードする核酸は、第１のプロモーターまたは第１の調節スイッチに操作可能に連結することができ、軽鎖をコードする核酸は、第２のプロモーターまたは第２の調節スイッチに操作可能に連結することができすることができ、したがって重鎖および軽鎖の制御された発現または調整可能な発現を可能にし、互いに独立して、機能的抗体または融合タンパク質の産生のための重鎖と軽鎖の比率の制御が可能になる。
【０１１８】
ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または融合タンパク質の発現は、１つ以上の誘導性または抑制性プロモーターを使用して空間的かつ時間的に達成することができる。
【０１１９】
抗体分子はまた、単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含み得る。例には、重鎖抗体、軽鎖を天然に欠く抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が含まれるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、当該技術のいずれか、または将来の任意の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、抗体は、例えば同じ標的タンパク質上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合する、または少なくとも２つの異なるタンパク質を同時に標的とする２つ以上の可変領域を含む多重特異性抗体である。すなわち、多重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じまたは異なる標的上にあり得る。
【０１２１】
他の実施形態では、抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープまたは標的を認識し、結合することができる二重特異性抗体である（例えば、例示的な二重特異性抗体構造については、Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１２）１２：１２−１８、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｗ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１１）１０８（２７）：１１１８７−９２を参照）。第２世代の二重特異性抗体、例えば、「三機能性二重特異性」抗体もまた、本明細書に記載される方法および組成物で企図される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、提供される抗体は、二重特異性抗体を含む多重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例示的な二重特異性抗体は、結合特異性の一方がＡβに対するものであり、他方が任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、Ａβの２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、細胞毒性剤を細胞に局在化させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を産生するためのｃｅＤＮＡベクターは、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１０：３６５５（１９９１）を参照）および「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製し（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋し（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生し（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照）、二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用し（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用し（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）、例えばＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるように三重特異性抗体を調製するための静電操舵効果を操作することによって作製され得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体をコードし、これも本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照）。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ａβおよび別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」である抗体または融合タンパク質をコードする（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照）。
【０１２５】
一実施形態では、抗体は「抗体変異体」であり、これは、対応する天然抗体と比較して変更されたアミノ酸配列、組成、または構造を有する抗体を指す。例えば、抗体変異体は、抗体が宿主細胞から分泌されるのを可能にする非天然分泌シグナルを含み得る。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体変異体、例えば「チオＭＡｂ」をコードする。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起こる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それにより抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、本明細書でさらに記載されるように、抗体を薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分に複合して免疫複合体を作成するために使用することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基のうちのいずれか１つ以上をシステインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成することができる。
【０１２７】
別の実施形態では、抗体は、可変軽鎖、可変重抗原結合ドメイン、および任意に１つ以上のエフェクタードメイン（例えば、組織特異的標的）を含む一価または二価抗体である、小型化抗体であり得る。本明細書では小型化抗体の使用が具体的に企図されているが、ｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸配列に関してサイズによって制約されておらず、したがって、全長抗体でさえ発現させるという利点を有する。
【０１２８】
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターから発現される抗体または融合タンパク質は、蛍光、酵素活性、分泌シグナル、または免疫細胞活性化因子などの追加の機能をさらに含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる抗体は、ダイアボディ（二重特異性単鎖抗体）またはユニボディ（免疫活性化のリスクを低減するためのヒンジ領域を欠くＩｇＧ４分子）を含む。
【０１３０】
本明細書に記載される抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、細胞機能（例えば、代謝、細胞分裂、転写、翻訳等）に影響を及ぼす細胞内タンパク質を標的とすることができる融合タンパク質またはイントラボディ（すなわち、細胞内抗体）の発現に有用である。イントラボディは、ｓｃＦｖであり得る。イントラボディは、Ｃ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬ）、ミトコンドリア標的配列、核局在化配列等のシグナル伝達モチーフを組み込むことにより、特定の細胞区画に向けることができる。
【０１３１】
イントラボディは、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、ハンチントン病等、ミスフォールドタンパク質に関連する疾患の治療に特に適している。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質は、例えば、リンカードメインをさらに含むことができる。本明細書で使用される場合、「リンカードメイン」は、本明細書に記載される抗体のドメイン／領域のうちのいずれかを一緒に連結する、長さが約２〜１００アミノ酸のオリゴまたはポリペプチド領域を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に移動できるように、グリシンおよびセリンなどの柔軟な残基を含むか、またはそれらから構成され得る。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないようにすることが望ましい場合は、より長いリンカーを使用することができる。リンカーは、切断可能であるか、または切断不可能であり得る。切断可能なリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカーまたはそれらの機能的同等物、およびそれらの組み合わせが含まれる。リンカーは、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスに由来するＴ２Ａであるリンカー領域であり得る。
【０１３３】
例えば、融合タンパク質、重鎖、軽鎖、可変領域等の既知のおよび／または公的に利用可能なタンパク質配列を取り、ｃＤＮＡ配列を逆操作して、そのようなタンパク質（例えば、融合タンパク質）または抗体をコードすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。次いで、意図される宿主細胞と一致するようにｃＤＮＡをコドン最適化し、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。
【０１３４】
一実施形態では、抗体をコードする配列は、例えば、ハイブリドーマ細胞株から得られたｍＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲを使用して配列を増幅することにより、既存のハイブリドーマ細胞株に由来し得る。
【０１３５】
Ｂ．抗体または融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクター
所望の抗体をコードする１つ以上の配列を有する抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、プロモーター、分泌シグナル、ポリＡ領域、およびエンハンサーなどの調節配列を含むことができる。最低でも、ｃｅＤＮＡベクターは、抗体または融合タンパク質をコードする１つ以上の異種配列を含む。抗体または融合タンパク質の産生のための例示的なｃｅＤＮＡベクターは、図７Ａ〜７Ｇに示されている。
【０１３６】
非常に効率的かつ正確な抗体または融合タンパク質のアセンブリを実現するために、いくつかの実施形態では、抗体、融合タンパク質、または個々の抗体ドメインが小胞体ＥＲリーダー配列を含み、それをＥＲに導き、タンパク質の折りたたみが発生する。例えば、発現されたタンパク質（複数可）を折りたたみのためにＥＲに向ける配列。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、細胞または細胞外局在化シグナル（例えば、分泌シグナル、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル等）は、抗体または融合タンパク質の分泌または所望の細胞内局在化を指示するために、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、図１０Ｇを参照）に含まれ、それにより抗体または融合タンパク質は、細胞内標的（複数可）（例えば、イントラボディ）または細胞外標的（複数可）に結合することができる。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、抗体産生のためのｃｅＤＮＡベクターはイントラボディをコードすることができ、いくつかの実施形態では、イントラボディは、全長抗体および一本鎖であり得る。イントラボディは、ウイルス性疾患、および癌などの細胞性疾患を治療することを含む幅広い分野で使用され得る。例えば、米国特許第６，００４，９４０号を参照されたい。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクター（例えば、図６Ａに示される例示的なｃｅＤＮＡベクターを参照）は、モジュール様式で任意の所望の抗体または融合タンパク質の集成および発現を可能にする。本明細書で使用される場合、「モジュール」という用語は、構築物から容易に除去され得る、ｃｅＤＮＡ発現プラスミドにおけるエレメントを指す。例えば、ｃｅＤＮＡ生成プラスミドのモジュールエレメントは、構築物内の各要素に隣接する制限部位の固有の対を含み、個々のエレメントの排他的な操作を可能にする（例えば、図７Ａ〜７Ｇを参照）。したがって、ｃｅＤＮＡベクタープラットフォームは、任意の所望の抗体または融合タンパク質構成の発現および集成を可能にすることができる。本明細書では、様々な実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードする所望のｃｅＤＮＡベクターを集成するのに必要な操作量を低減および／または最小化できるｃｅＤＮＡプラスミドベクターが提供される。
【０１４０】
Ｃ．ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体および融合タンパク質
特に、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、疾患、機能障害、損傷、および／または障害の１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、例えば、抗体、抗原結合断片、融合タンパク質、ならびにその変異体および／または活性断片をコードすることができるが、これらに限定されない。一態様では、疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害は、ヒト疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、補因子または他のポリペプチド、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡ（コードもしくは非コード、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｃｅＤＮＡから発現した抗体もしくは融合タンパク質と組み合わせて使用され得るアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードすることもできる。さらに、抗体または融合タンパク質をコードする配列を含む発現カセットはまた、実験または診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のものを含み得る。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、複数の異なる抗体および／または融合タンパク質を、１つ以上のｃｅＤＮＡベクターを使用して投与することができる。したがって、細胞、組織または対象の「カクテル」で所望の数の抗体および／または融合タンパク質を発現できることが具体的に企図されている。
【０１４３】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、例えば、癌、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、クローン病）、アルツハイマー病、高コレステロール血症、急性臓器拒絶、多発性硬化症、閉経後骨粗しょう症、皮膚の状態（例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎）、喘息、または血友病の治療のための抗体および融合タンパク質を送達することができる。
【０１４４】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、任意の所望の治療用抗体または融合タンパク質を発現させることができる。例示的な治療用抗体および融合タンパク質には、アブシキシマブ、アバロパラチド、アダリムマブ、アダリムマブ−ａｔｔｏ、ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、アデュカヌマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バピネズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ボコシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コンシズマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エカランチド、エクリズマブ、エロツズマブ、エムタンシン、エミシズマブ、エボロクマブ、エビナクマブ、第ＩＸ因子−Ｆｃ抗体、第ＶＩＩＩ因子−Ｆｃ抗体、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、インクラクマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ−ａｂｄａ、インフリキシマブ−ｄｙｙｂ、イピリムマブ、イキセキズマブ、ラナデルマブ、ロデルシズマブ、メポリズマブ、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、オルチクマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ラルパンシズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、ロレズマブ、ロモソズマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、ソラネズマブ、ソタテルセプト、タドシズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、サリルマブ、リツキシマブ、グセルクマブ、イノツズマブオゾガミシン、アダリムマブ−ａｄｂｍ、ゲムツズマブオゾガミシン、ベバシズマブ−ａｗｗｂ、ベンラリズマブ、エミシズマブ−ｋｘｗｈ、トラスツズマブ−ｄｋｓｔが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、疾患の治療に機能的である治療用抗体または融合タンパク質を発現するための核酸配列を含む。好ましい実施形態では、治療用抗体または融合タンパク質は、それが望まれない限り、免疫系反応を引き起こさない。
【０１４６】
一実施形態では、抗体は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤＬ１）を標的とする、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される治療用抗体または融合タンパク質であり、例えば、癌（例えば、固形腫瘍、乳癌、リンパ腫、肝臓癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、白血病、血液癌、皮膚癌、多発性骨髄腫等）の治療に使用され得る。一実施形態では、治療用抗体または融合タンパク質は、チェックポイント阻害剤、例えばＰＤＬ１、ＣＤ４７、メソテリン、ガングロシド２（ＧＤ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｒｏｎキナーゼ、ｃ−Ｍｅｔ、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロリドチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、スルビビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２，ＭＣ１Ｒ、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−Ｂ受容体、ＡＦＰ、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＣＤＫ４、ＣＤＣ２７、ＣＤ４７、αアクチニン−４、ＴＲＰ１／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ１、ガングリオシド、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、上皮性腸因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ２０、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ１、ＭＵＭ２、ＭＵＭＳ、ＮＡ８８−１、ＮＰＭ、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＲＣＣ、ＲＵＩ１、ＲＵＩ２、ＳＡＧＥ、ＴＲＧ、ＴＲＰ１、ＴＳＴＡ、葉酸受容体α、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１）、炭水化物（Ｌｅ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、線維芽細胞活性化プロテアーゼ（ＦＡＰ）、ＴＧＦ−β、ヒアルロン酸、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩＶ、テネイシンＣ、またはテネイシンＷ）、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ９９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２２、ＳＬＡＭＦ７、またはＮＹ−ＥＳＯ１を標的とする。
【０１４７】
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エボロクマブモノクローナル抗体を発現し、高脂血症の治療に使用される。エボロクマブは、プロタンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を阻害する。ＰＣＳＫ９は、分解のためにＬＤＬ受容体を標的とするタンパク質であり、ＬＤＬ−Ｃまたは「悪玉」コレステロールを血液から除去する肝臓の能力を低下させる。エボロクマブは、ＵＳ８，９９９，３４１にさらに記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
本明細書に開示される方法および組成物において使用するためのｃｅＤＮＡベクターから発現される例示的な抗体および融合タンパク質は、本明細書の表１、表２、表３Ａ、表３Ｂ、表４、または表５に列挙される任意の抗体または融合タンパク質であり得る。
【表１−１】
2021513355.tif 000003
【表１−２】
2021513355.tif 000004
【表１−３】
2021513355.tif 000005
【表１−４】
2021513355.tif 000006
【表２−１】
2021513355.tif 000007
【表２−２】
2021513355.tif 000008
【表２−３】
2021513355.tif 000009
【表２−４】
2021513355.tif 000010
【表２−５】
2021513355.tif 000011
【表２−６】
2021513355.tif 000012
【表２−７】
2021513355.tif 000013
【表３Ａ】
2021513355.tif 000014
【表３Ｂ】
2021513355.tif 000015
【表４−１】
2021513355.tif 000016
【表４−２】
2021513355.tif 000017
【表５−１】
2021513355.tif 000018
【表５−２】
2021513355.tif 000019
【０１４９】
ｃｅＤＮＡベクターによって発現されるさらなる例示的な抗体および融合タンパク質には、以下に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１５０】
ブロダルマブ（ＳＩＬＩＱ（登録商標）、ＬＵＭＩＣＥＦ（登録商標）、ＫＹＮＴＨＥＵＭ（登録商標）、ＡＭＧ−８２７）は、ＩＬ−１７受容体Ａ（ＩＬ−１７ＲＡ）を標的とし、ＩＬ−１７ＲＡを通したＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−１７Ｃ炎症促進性サイトカインの炎症性シグナル伝達を防止するヒトＩｇＧ２抗体である。ブロダルマブは、米国（ＳＩＬＩＱ（登録商標））、ＥＵ（ＫＹＮＴＨＥＵＭ（登録商標））、および日本（ＬＵＭＩＣＥＦ（登録商標））で承認されている。ブロダルマブは、全身療法または光線療法の候補であり、応答しなかった、または他の全身療法への応答を停止した、中程度から重度の尋常性乾癬を有する成人患者の治療に適応される。
【０１５１】
デュピルマブ（ＤＵＰＩＸＥＮＴ（登録商標）、ＲＥＧＮ６６８／ＳＡＲ２３１８９３）は、ＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）を標的とするヒトＩｇＧ４  ｍＡｂであり、したがってＩＬ−４およびＩＬ−１３を介した炎症応答を遮断する。ｍＡｂは、アトピー性皮膚炎の患者に対して米国およびＥＵで承認された。
【０１５２】
オクレリズマブ（ＯＣＲＥＶＵＳ（登録商標））は、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞を標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体である。そのようなＢ細胞は、ミエリン損傷および多発性硬化症の病因において役割を果たす。
【０１５３】
オクレリズマブは、米国において再発性多発性硬化症（ＲＭＳ）および原発性進行性多発性硬化症（ＰＰＭＳ）の治療薬として承認された。
【０１５４】
サリルマブ（ＫＥＶＺＡＲＡ（登録商標）、ＳＡＲ１５３１９１、ＲＥＧＮ８８）は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を標的とするヒトＩｇＧ１抗体であり、カナダ、米国、およびＥＵにおいて、メトトレキサート（ＭＴＸ）などの１種以上の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）に対する不適切な応答または不耐性を有していた中程度〜重度の活動性関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者に対して承認された。
【０１５５】
ベンラリズマブ（ＦＡＳＥＮＲＡ（登録商標）、ＭＥＤＩ−５６３）は、好酸球に見られるＩＬ−５Ｒのαサブユニットを標的とするアフコシル化ＩｇＧ１  ｍＡｂであり、１２歳以上の重度の喘息を有する患者のアドオン維持治療のためにＦＤＡの承認を受けている。
【０１５６】
エミシズマブ（ＨＥＭＬＩＢＲＡ（登録商標）、エミシズマブ−ｋｘｗｈ、ＡＣＥ９１０、ＲＯ５５３４２６２）は、第ＩＸａ因子および第Ｘ因子を標的とする二重特異性ＩｇＧ４  ｍＡｂであり、ＦＤＡにより承認された。この薬剤は、開発された第ＶＩＩＩ因子阻害剤を有する成人および小児の血友病Ａ患者における出血エピソードの頻度を予防または軽減するために承認された。２０１７年１２月１日の時点で、米国またはＥＵのいずれかで合計９種の抗体治療薬が規制審査を受けていた。これらのうち、８つ（イバリズマブ、ブロスマブ、チルドラキズマブ、カプラシズマブ、エレヌマブ、フレマネズマブ、ガルカネズマブ、ロモソズマブ）は、まだ販売承認を受けていない。モガムリズマブは、２０１２年３月２０日に日本で初めて世界的に承認された。
【０１５７】
イバリズマブは、ＣＤ４を標的とするＩｇＧ４  ｍＡｂであり、ＦＤＡにより多剤耐性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症の治療薬として評価されている。
【０１５８】
ブロスマブ（ＫＲＮ２３）は、腎臓によるリン酸塩の排泄および活発なビタミンＤの産生を調節するホルモンである、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ２３）を標的とするヒトＩｇＧ１  ｍＡｂである。
【０１５９】
チルドラキズマブ（ＳＣＨ９００２２２／ＭＫ−３２２２）は、ＩＬ−２３ｐ１９を標的とするヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂである。中程度〜重度の尋常性乾癬の治療薬としてのチルドラキズマブの販売承認申請が、ＥＵおよび米国で提出されている。
【０１６０】
カプラシズマブ（ＡＬＸ−００８１）は、フォン・ヴィレブランド因子を標的とする二価の単一ドメイン抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））であり、ａＴＴＰ患者における低い血小板数、組織虚血、および臓器機能不全につながる微小血栓の形成を伴う稀な生命を脅かす血栓障害である、後天性血栓性血小板減少性紫斑病（ａＴＴＰ）の治療薬として規制審査を受けている。
【０１６１】
エレヌマブ（ＡＩＭＯＶＩＧ（商標）、ＡＭＧ  ３３４）は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の受容体を標的とするＩｇＧ２  ｍＡｂであり、感作された侵害受容ニューロンの発生に関与している。ＥＵおよび米国では、月に４日間以上の片頭痛を経験している患者の片頭痛を予防するためのエレヌマブの販売承認申請が提出された。
【０１６２】
フレマネズマブ（ＴＥＶ−４８１２５）は、片頭痛の予防的治療のための規制審査を受けているＣＧＲＰを標的とするＩｇＧ２  ｍＡｂである。
【０１６３】
ガルカネズマブ（ＬＹ２９５１７４２）は、成人における一時的および慢性的な片頭痛の予防のための規制審査を受けている、ＣＧＲＰを標的とするＩｇＧ４  ｍＡｂである。
【０１６４】
ロモソズマブ（ＥＶＥＮＩＴＹ（商標）、ＡＭＧ７８５）は、スクレロスチンを標的とするヒト化ＩｇＧ２  ｍＡｂであり、女性および男性の骨粗しょう症の治療薬として評価されている。
【０１６５】
モガムリズマブ（ＫＷ−０７６１、ＰＯＴＥＬＩＧＥｏ（登録商標））は、菌状息肉腫およびセザリー症候群を含む皮膚Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＣＴＣＬ）を有する患者の腫瘍細胞上に発現するＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）を標的とするＩｇＧ１アフコシル化ヒト化ｍＡｂである。
【０１６６】
ラナデルマブ（ＳＨＰ６４３、ＤＸ−２９３０）は、血漿カリクレインを標的とし、それによりブラジキニンの産生を妨げるヒトＩｇＧ１  ｍＡｂである。
【０１６７】
クリザンリズマブ（ＳＥＧ１０１）は、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２としても知られる）を標的とするヒト化ｍＡｂであり、鎌状赤血球症患者の血管閉塞によって引き起こされる、鎌状赤血球関連疼痛危機（ＳＣＰＣ）の治療薬として評価を受けている。
【０１６８】
ラブリズマブ（ＡＬＸＮ１２１０）は、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）を有する患者の２つの第３相試験で評価を受けているヒト化ｍＡｂ標的補体成分５（Ｃ５）である。
【０１６９】
エプチネズマブ（ＡＬＤ４０３）は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）を標的とするＩｇＧ１  ｍＡｂであり、片頭痛予防のために評価されている。
【０１７０】
リサンキズマブ（ＡＢＢＶ０６６、ＢＩ６５５０６６）は、乾癬の病因に関与しているＩＬ−２３のｐ１９サブユニットを標的とするＩｇＧ１  ｍＡｂである。
【０１７１】
サトラリズマブ（ＳＡ２３７）は、ＩＬ−６Ｒを標的とするヒト化ＩｇＧ２であり、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）またはＮＭＯスペクトラム障害を有する患者を対象とした２つの第３相試験で評価を受けている。
【０１７２】
ブロルシズマブ（ＲＴＨ２５８）は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）−Ａを標的とする単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【０１７３】
ＰＲＯ１４０は、ヒト化ＩｇＧ４  ｍＡｂであり、Ｔ細胞上のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）共受容体ＣＣＲ５をブロックし、それによりウイルスの侵入を防ぐ。
【０１７４】
ランパリズマブ（ＲＧ７４１７、ＦＣＦＤ４５１４Ｓ）は、ヒト化抗原結合断片（Ｆａｂ）であり、補体因子Ｄを結合することによって代替副経路の活性化および増幅を阻害する。
【０１７５】
ロレズマブ（ＬＦＢ−Ｒ５９３）は、ＬＦＢ  Ｓ．Ａ．のＥＭＡＢＬＩＮＧ（登録商標）技術プラットフォームに由来するヒトＩｇＧ１抗ｒｈｅｓｕｓ（Ｒｈ）Ｄ  ｍＡｂであり、フコシル化を変化させ、エフェクター細胞への抗体のより効果的な結合をもたらす。抗体は、すなわち、ＲｈＤ陽性胎児を身ごもっているＲｈＤ陰性妊婦において、いくつかの母児間同種免疫状態を予防するように設計されている。
【０１７６】
ファシヌマブ（ＲＥＧＮ４７５）は、神経成長因子を標的とするヒトＩｇＧ４  ｍＡｂであり、腰または膝の中程度から重度の変形性関節症の痛み、および慢性的な腰痛の治療薬として、多くの後期研究で評価されている。
【０１７７】
エトロリズマブ（ＲＨ７４１３）は、α４β７およびαＥβ７インテグリンヘテロ二量体のβ７サブユニットに結合するヒト化ｍＡｂであり、それにより、それぞれリガンドＭＡｄＣＡＭ−１およびＥ−カドヘリンとの相互作用を阻害する。
【０１７８】
ＮＥＯＤ００１は、ヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂであり、心臓、腎臓、および肝臓を含む組織および臓器におけるタンパク質凝集体の過剰な蓄積を特徴とする疾患である、アミロイド軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスを引き起こす可溶性および不溶性の軽鎖凝集体を標的とする。
【０１７９】
ガンテネルマブ（ＲＯ４９０９８３２）は、アルツハイマー病の治療薬として調査を受けている原線維性アミロイドβを標的とするヒトｍＡｂである。
【０１８０】
アニフロルマブ（ＭＥＤＩ−５４６）は、ＳＬＥの治療薬として評価されている、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）受容体サブユニット１を標的とするヒトＩｇＧ１  ｍＡｂである。
【０１８１】
モキセツモマブパスドトクス（ＨＡ２２、ＣＡＴ−８０１５）は、ＣＤ２２を標的とする抗体可変断片に融合したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの３８ｋＤａ細胞毒性部分を含む組み換え免疫毒素である。
【０１８２】
プログラムされた死−１（ＰＤ１）を標的とするヒト抗体である、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０、ＳＡＲ４３９６８４）は、転移性または切除不能の皮膚扁平上皮癌（ＣＳＣＣ）の治療薬として評価されている。
【０１８３】
ウブリツキシマブ（ＬＦＢ−Ｒ６０３、ＴＧＴ−１１０１、ＴＧＴＸ−１１０１）は、ＣＤ２０を標的とする糖鎖工学的キメラｍＡｂである。
【０１８４】
トレメリムマブ（ＣＰ−６７５、２０６）は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）を標的とするヒトＩｇＧ２抗体である。生理学的条件では、ＣＤ２８は、Ｂ７リガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６）と相互作用し、Ｔ細胞の活性化、増殖、ＣＴＬＡ−４上方調節につながる。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８よりも高い親和性でＢ７リガンドに結合し、Ｔ細胞応答を終了させる。
【０１８５】
イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）は、再発性および難治性の多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者の治療のために評価されている抗ＣＤ３８  ＩｇＧ１キメラ抗体である。
【０１８６】
ＢＣＤ−１００は、プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）を標的とするヒト抗体である。
【０１８７】
カロツキシマブ（ＴＲＣ１０５）は、血管新生および増殖性の内皮細胞で高度に発現するタンパク質である、エンドグリン（ＣＤ１０５）を標的とするキメラＩｇＧ１抗体である。ｍＡｂは、１〜２ｎｇ／ｍＬのＫＤで増殖内皮上のヒトＣＤ１０５に結合し、ヒト臍帯静脈内皮細胞のＡＤＣＣを誘導する。
【０１８８】
カムレリズマブ（ＩＮＣＳＨＲ−１２１０、ＳＨＲ−１２１０）は、ＰＤ−１を標的とするＩｇＧ４κヒト化抗体である。
【０１８９】
グレンバツムマブベドチン（ＣＤＸ−０１１、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ）は、癌細胞に放出されると腫瘍細胞死につながる可能性がある細胞毒性薬であるモノメチルアウリスタチンＥに複合された膜貫通型糖タンパク質非転移性遺伝子Ｂ（ｇｐＮＭＢ）を標的とするＩｇＧ２ヒト抗体である。
【０１９０】
ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）は、抗有糸分裂剤であるメイタンシノイド薬物ＤＭ４の３〜４分子に複合された葉酸受容体α（ＦＲα）を標的とする抗体である。
【０１９１】
オポルツズマブモナトックス（ＶＩＣＩＮＩＵＭ（商標）、ＶＢ４−８４５）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａに複合された抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）組み換えヒト化抗体ｓｃＦｖ断片である。
【０１９２】
Ｌ１９ＩＬ２／Ｌ１９ＴＮＦ（ＤＡＲＯＭＵＮ）は、ヒトＩＬ２またはヒトＴＮＦのいずれかに融合された、フィブロネクチンのエクストラドメインＢを標的とするＬ１９抗体のｓｃＦｖで構成される融合タンパク質である。
【０１９３】
さらなる追加の例示的な抗体および融合タンパク質は、以下のうちのいずれかから選択され得る。ベンラリズマブ、ＭＥＤＩ−８９６８、アニフロルマブ、ＭＥＤＩ７１８３、シファリムマブ、ＭＥＤＩ−５７５、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａおよびＭｅｄＩｍｍｕｎｅからのトラロキヌマブ；Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ／Ｅｉｓａｉ  Ｃｏ．ＬＴＤ（「Ｅｉｓａｉ」）／／ＢｉｏＡｒｃｔｉｃ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＢからのＢＡＮ２４０１；ＣＤＰ７６５７、抗ＣＤ４０Ｌ一価ペグ化Ｆａｂ抗体断片、ＳＴＸ−１００抗ａｖＢ６  ｍＡｂ、ＢＩＩＢ０５９、抗ＴＷＥＡＫ（ＢＩＩＢ０２３）、およびＢｉｏｇｅｎからのＢＩＩＢ０２２；ＪａｎｓｓｅｎおよびＡｍｇｅｎからのフルラヌマブ；ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＧｅｎｅｎｔｅｃｈからのＢＩ−２０４／ＲＧ７４１８；Ｂｉｏｔｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＢＴ−０６２（インダツキシマブラブタンシン）；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ／ＸｅｎｃｏｒからのＸｍＡｂ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂからの抗ＩＰ１０；ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＬＬＣからのＪ  ５９１  Ｌｕ−１７７；ＣＤＸ−０１１（グレンバツムマブベドチン）、Ｃｅｌｌｄｅｘ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＣＤＸ−０４０１；Ｃｒｕｃｅｌｌからのフォラビルマブ；Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄからのティガツズマブ；ＥｉｓａｉからのＭＯＲＡｂ−００４、ＭＯＲＡｂ−００９（アマツキシマブ）；Ｅｌｉ  ＬｉｌｌｙからのＬＹ２３８２７７０；ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ  ＩｎｃからのＤＩ１７Ｅ６；Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．からのザノリムマブ；ＦｉｂｒｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．からのＦＧ−３０１９；Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  ＳＥ＆Ｃｏ．ＫＧａＡからのカツマキソマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈからのパテクリズマブ、ロンタリズマブ；Ｇｅｎｚｙｍｅ＆Ｓａｎｏｆｉからのフレソリムマブ；ＧｉｌｅａｄからのＧＳ−６６２４（シムツズマブ）；ＪａｎｓｓｅｎからのＣＮＴＯ−３２８、バピネズマブ（ＡＡＢ−００１）、カルルマブ、ＣＮＴＯ−１３６；ＫａｌｏＢｉｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からのＫＢ００３；ＫｙｏｗａからのＡＳＫＰ１２４０；Ｌａｂｒｙｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｉｎｃ．からのＲＮ−３０７；Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのエクロメキシマブ；Ｅｌｉ  ＬｉｌｌｙからのＬＹ２４９５６５５、ＬＹ２９２８０５７、ＬＹ３０１５０１４、ＬＹ２９５１７４２；ＭａｓｓＢｉｏｌｏｇｉｃｓからのＭＢＬ−ＨＣＶ１；ＭＥＮＴＲＩＫ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＬＬＣからのＡＭＥ−１３３ｖ；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡからのアビツズマブ；Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からのＭＭ−１２１；Ｎｏｖａｒｔｉｓ，ＡＧからのＭＣＳ  １１０、ＱＡＸ５７６、ＱＢＸ２５８、ＱＧＥ０３１；Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧおよびＸＯＭＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（「ＸＯＭＡ」）からのＨＣＤ１２２；Ｎｏｖｏ  ＮｏｒｄｉｓｋからのＮＮ８５５５；Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からの���ビツキシマブ、コタラ；Ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からのＰＳＭＡ−ＡＤＣ；Ｑｕｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．からのオレゴボマブ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎからのファシヌマブ（ＲＥＧＮ４７５）、ＲＥＧＮ１０３３、ＳＡＲ２３１８９３、ＲＥＧＮ８４６；ＲｏｃｈｅからのＲＧ７１６０、ＣＩＭ３３１、ＲＧ７７４５；ＴａｉＭｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｉｎｃ．からのイバリズマブ（ＴＭＢ−３５５）；Ｔｈｅｒａｃｌｏｎｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＴＣＮ−０３２；ＴＲＡＣＯＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からのＴＲＣ１０５；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．からのＵＢ−４２１；Ｖｉｖｅｎｔｉａ  Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．からのＶＢ４−８４５；ＡｂｂＶｉｅからのＡＢＴ−１１０；Ａｂｌｙｎｘからのカプラシズマブ、オゾラリズマブ；ＣｙｔｏＤｙｎ，Ｉｎｃ．からのＰＲＯ  １４０；Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．からのＧＳ−ＣＤＡ１、ＭＤＸ−１３８８；ＡｍｇｅｎからのＡＭＧ  ８２７、ＡＭＧ  ８８８；ＴＧ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．からのウブリツキシマブ；Ｔｏｌｅｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのＴＯＬ１０１；ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．からのｈｕＮ９０１−ＤＭ１（ロルボツズマブメルタンシン）；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのエプラツズマブＹ−９０／ベルツズマブの組み合わせ（ＩＭＭＵ−１０２）；Ａｇｅｎｉｘ，Ｌｉｍｉｔｅｄからの抗フィブリンｍＡｂ／３Ｂ６／２２  Ｔｃ−９９ｍ；Ａｌｄｅｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からのＡＬＤ４０３；ＰｆｉｚｅｒからのＲＮ６Ｇ／ＰＦ−０４３８２９２３；ＣＧ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのＣＧ２０１；ＫａｌｏＢｉｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＳａｎｏｆｉからのＫＢ００１−Ａ；Ｋｙｏｗａ．からのＫＲＮ−２３；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのＹ−９０  ｈＰＡＭ  ４；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ＆ＯｎｃｏＭｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からのタレキシツマブ；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ＆Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧからのＬＦＧ３１６；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ＆ＪａｎｎｓｅｎからのＣＮＴＯ３１５７、ＣＮＴＯ６７８５；Ｒｏｃｈｅ＆ＣｈｕｇａｉからのＲＧ６０１３；Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（「Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ」）からのＭＭ−１１１；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅからのＧＳＫ２８６２２７７；ＡｍｇｅｎからのＡＭＧ  ２８２、ＡＭＧ  １７２、ＡＭＧ  ５９５、ＡＭＧ  ７４５、ＡＭＧ  ７６１；ＢｉｏｃｏｎからのＢＶＸ−２０；ＣｅｌｌｔｒｉｏｎからのＣＴ−Ｐ１９、ＣＴ−Ｐ２４、ＣＴ−Ｐ２５、ＣＴ−Ｐ２６、ＣＴ−Ｐ２７、ＣＴ−Ｐ４；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅからのＧＳＫ２８４９３３、ＧＳＫ２３９８８５２、ＧＳＫ２６１８９６０、ＧＳＫ１２２３２４９、ＧＳＫ９３３７７６Ａ；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ＆Ｂａｙｅｒ  ＡＧからのアネツマブラブタンシン；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ＆Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＩｎｇｅｌｈｅｉｍからのＢＩ−８３６８４５；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ＆Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧからのＮＯＶ���７、ＮＯＶ−８；ＭｅｒｒｉｍａｃｋからのＭＭ−３０２、ＭＭ−３１０、ＭＭ−１４１、ＭＭ−１３１、ＭＭ−１５１、Ｒｏｃｈｅ＆Ｓｅａｔｔｌｅ  ＧｅｎｅｔｉｃｓからのＲＧ７８８２；Ｒｏｃｈｅ／ＧｅｎｅｎｔｅｃｈからのＲＧ７８４１；ＰｆｉｚｅｒからのＰＦ−０６４１０２９３、ＰＦ−０６４３８１７９、ＰＦ−０６４３９５３５、ＰＦ−０４６０５４１２、ＰＦ−０５２８０５８６；ＲｏｃｈｅからのＲＧ７７１６、ＲＧ７９３６、ゲンテネルマブ、ＲＧ７４４４；ＡｓｔｒａｚｅｎｅｃａからのＭＥＤＩ−５４７、ＭＥＤＩ−５６５、ＭＥＤＩ１８１４、ＭＥＤＩ４９２０、ＭＥＤＩ８８９７、ＭＥＤＩ−４２１２、ＭＥＤＩ−５１１７、ＭＥＤＩ−７８１４；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂからのウロクプルマブ、ＰＣＳＫ９アドネクチン；ＦｉｖｅＰｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのＦＰＡ００９、ＦＰＡ１４５；ＧｉｌｅａｄからのＧＳ−５７４５；Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  ＫｉｒｉｎからのＢＩＷ−８９６２、ＫＨＫ４０８３、ＫＨＫ６６４０；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡからのＭＭ−１４１；ＲｅｇｅｎｅｒｏｎからのＲＥＧＮ１１５４、ＲＥＧＮ１１９３、ＲＥＧＮ１４００、ＲＥＧＮ１５００、ＲＥＧＮ１９０８−１９０９、ＲＥＧＮ２００９、ＲＥＧＮ２１７６−３、ＲＥＧＮ７２８；ＳａｎｏｆｉからのＳＡＲ３０７７４６；Ｓｅａｔｔｌｅ  ＧｅｎｅｔｉｃｓからのＳＧＮ−ＣＤ７０Ａ；ＡｂｌｙｎｘからのＡＬＸ−０１４１、ＡＬＸ−０１７１；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのミラツズマブ−ＤＯＸ、ミラツズマブ、ＴＦ２；ＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍからのＭＬＮＯ２６４；ＡｂｂＶｉｅからのＡＢＴ−９８１；ＡｂＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．からのＡｂＧｎ−１６８Ｈ；ＡＶＥＯからのフィクラツズマブ；ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからのＢＩ−５０５；Ｃｅｌｌｄｅｘ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＣＤＸ−１１２７、ＣＤＸ−３０１；Ｃｅｌｌｅｒａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．からのＣＬＴ−００８；ＣｉｒｃａｄｉａｎからのＶＧＸ−１００；Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＬｉｍｉｔｅｄからのＵ３−１５６５；Ｄｅｋｋｕｎ  Ｃｏｒｐ．からのＤＫＮ−０１；Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙからのフランボツマブ（ＴＹＲＰ１タンパク質）、ＩＬ−１β抗体、ＩＭＣ−ＣＳ４；Ｅｌｉ  ＬｉｌｌｙおよびＩｍＣｌｏｎｅ，ＬＬＣからのＶＥＧＦＲ３  ｍＡｂ、ＩＭＣ−ＴＲ１（ＬＹ３０２２８５９）；Ｅｌｕｓｙｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．からのＡｎｔｈｉｍ；Ｇａｌａｘｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣからのＨｕＬ２Ｇ７；ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．からのＩＭＧＢ８５３、ＩＭＧＮ５２９；ＪａｎｓｓｅｎからのＣＮＴＯ−５、ＣＮＴＯ−５８２５；ＫａｋｅｔｓｕｋｅｎからのＫＤ−２４７；ＫａｌｏＢｉｏｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＫＢ００４；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．からのＭＧＡ２７１、ＭＧＡＨ２２；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ／ＸｅｎｃｏｒからのＸｍＡｂ５５７４；Ｎｅｏｇｅｎｉｘ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．からのエンシツキシマブ（ＮＰＣ−１Ｃ）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧおよびＸＯ���ＡからのＬＦＡ１０２；Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧからのＡＴＩ３５５；Ｓａｎｔａｒｕｓ  Ｉｎｃ．からのＳＡＮ−３００；ＳｅｌｅｘｙｓからのＳｅｌＧ１；Ｔａｒｇａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．からのＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．（「Ｔｅｖａ」）およびＶａｃｃｉｎｅｘ  Ｉｎｃ．からのＶＸ１５；Ｔｈｅｒａｃｌｏｎｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＴＣＮ−２０２；ＸｅｎｃｏｒからのＸｍＡｂ２５１３、ＸｍＡｂ５８７２；ＸＯＭＡおよびアメリカ国立アレルギー・感染症研究所からのＸＯＭＡ  ３ＡＢ；ＭａｂＶａｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの神経芽細胞腫抗体ワクチン；ＣｙｔｏＤｙｎ，Ｉｎｃ．からのＣｙｔｏｌｉｎ；Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．からのＴｈｒａｖｉｘａ；ならびにＣｙｔｏｖａｎｃｅ  ＢｉｏｌｏｇｉｃｓからのＦＢ  ３０１；Ｊａｎｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｎｏｆｉからの狂犬病ｍＡｂ；Ｊａｎｓｓｅｎからのおよびアメリカ国立アレルギー・感染症研究所により一部資金提供されたｆｌｕ  ｍＡｂ；Ｍａｐｐ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．からのＭＢ−００３およびＺＭａｐｐ；ならびにＤｅｆｙｒｕｓ  ＩｎｃＧからのＺＭＡｂ。
【０１９４】
ＩＩＩ．抗体および融合タンパク質の産生に使用するための一般的なｃｅＤＮＡベクター
本発明の実施形態は、導入遺伝子（例えば、抗体または融合タンパク質）を発現することができる、閉端線形二本鎖（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む方法および組成物に基づく。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、抗体または融合タンパク質をコードする配列である。本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、サイズによって制限されず、それにより、例えば、単一ベクターからの導入遺伝子の発現に必要なすべての構成成分の発現を可能にする。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
【０１９５】
一般に、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’〜３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含む。ＩＴＲ配列は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾されたＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ−ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。
【０１９６】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む方法および組成物が本明細書に包含され、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。使用のために包含される非限定的な例示的リポソームナノ粒子系が、本明細書に開示されている。いくつかの態様では、本開示は、ｃｅＤＮＡおよびイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製および負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。
【０１９７】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子等の挿入を許可する。
【０１９８】
図１Ａ〜１Ｅは、抗体または融合タンパク質の産生のための非限定的な例示的ｃｅＤＮＡベクターの概略図、または対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターはカプシドを含まず、第１のＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから得ることができる。発現カセットは、導入遺伝子の発現を可能にするおよび／または制御する１つ以上の調節配列を含み得、例えば、発現カセットは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順番で含み得る。
【０１９９】
発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子、例えば抗体または融合タンパク質のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、抗体または融合タンパク質の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、所望される場合、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
【０２００】
発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００〜１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００〜５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１０００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜５，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が効率的な導入遺伝子の発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
【０２０１】
ｃｅＤＮＡ発現カセットは、例えば、レシピエント対象において存在しない、不活性、もしくは不十分な活性であるタンパク質をコードする発現可能な外因性配列（例えば、オープンリーディングフレーム）もしくは導入遺伝子、または所望の生物学的もしくは治療的効果を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、欠陥遺伝子または転写産物の発現を訂正するように機能することができる遺伝子産物をコードすることができる。原則として、発現カセットは、突然変異のために減少もしくは欠如しているタンパク質、ポリペプチド、もしくはＲＮＡをコードする、または過剰発現が本開示の範囲内であると見なされる場合に治療効果をもたらす任意の遺伝子を含み得る。
【０２０２】
発現カセットは、任意の導入遺伝子（例えば、抗体または融合タンパク質をコードする）、例えば、対象における疾患または障害を治療するために有用な抗体または融合タンパク質、すなわち、治療用抗体または融合タンパク質を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターを単独で、またはポリペプチドをコードする核酸もしくは非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲ等）、ならびに対象のゲノム中のウイルス配列、例えば、ＨＩＶウイルス配列等を含む外因性遺伝子およびヌクレオチド配列と組み合わせて使用して、関心対象の任意の抗体または融合タンパク質を対象に送達し、発現させることができる。好ましくは、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、もしくは獣医学的使用）または免疫原性ポリペプチドに使用される。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、またはＲＮＡ（コードまたは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））、抗体、融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、任意の関心対象の遺伝子を対象において発現させるのに有用である。
【０２０３】
発現カセットはまた、ポリペプチド、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡ（コードもしくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。発現カセットは、実験または診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のものを含み得る。
【０２０４】
発現カセット、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの発現構築物で提供される配列は、標的宿主細胞に対してコドン最適化され得る。本明細書で使用される場合、「コドン最適化される」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０  Ｆｏｘ  Ｍｉｌｌ  Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ  ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）または別の公開データベースを使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードする核酸は、当技術分野で知られているように、ヒト発現のために最適化され、かつ／あるいはヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはその抗原結合断片である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される抗体または融合タンパク質は、治療用活性化抗体または融合タンパク質または治療用中和（例えば、遮断もしくは阻害）抗体または融合タンパク質を含む、治療用抗体または融合タンパク質である。
【０２０６】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、抗体または融合タンパク質をコードする。抗体および融合タンパク質は、当該技術分野において周知であり、リガンド、受容体、毒素、ホルモン、酵素、または細胞表面タンパク質、または病原体もしくはウイルスタンパク質もしくは抗原、ならびに糖タンパク質またはＳＵＭＯ化タンパク質（例えば、抗ＳＵＭＯ２／３抗体）等の翻訳前および翻訳後修飾タンパク質を含むが、これらに限定されない関心対象の任意のタンパク質に結合し得る。抗体はまた、核酸、例えばＤＮＡ（例えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体）、ＲＮＡ（例えば、抗ＲＮＡ結合抗体）を含むが、これらに限定されない任意の抗原に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターによって産生される抗体または融合タンパク質は、中和抗体または融合タンパク質である。標的となる例示的な遺伝子および関心対象のタンパク質は、本明細書の使用方法および治療方法のセクションにおいて詳細に記載されている。疾患、機能不全、損傷、および／または障害のうちの１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善に使用するための抗体、融合タンパク質、ならびにその変異体、および／またはその活性断片が、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含される。例示的な治療遺伝子は、本明細書において「治療の方法」と題されたセクションに記載されている。
【０２０７】
プラスミド系発現ベクターとは異なる抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合および末端分解部位（ＲＢＳおよびＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、ヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、ならびに細菌型ＤＮＡメチル化、または実際に哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の非存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定的な例としてプロモーターまたはエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。
【０２０８】
本明細書に提供される方法によって産生された抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって判定して、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｄ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組み換えられて突然変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクターおよびｃｅＤＮＡ−プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）およびこれらの異なる対象物（下記を参照）を産生および精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ−プラスミドの場合は原核細胞タイプおよびｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
【０２０９】
プラスミド系発現ベクターを超える本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを使用するいくつかの利点があり、そのような利点としては、次のことが挙げられるが、これらに限定されない。１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核細胞特異的メチル化、例えば、６−メチルアデノシンおよび５−メチルシトシンメチル化に供されるが、カプシド不含ＡＡＶベクター配列は、真核細胞起源であり、原核細胞特異的メチル化を受けず、結果として、カプシド不含ＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症および免疫反応を誘導する可能性が低い。２）プラスミドは、産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない。３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解をバイパスするために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼに対する耐性を付与するウイルスシスエレメント、すなわちＩＴＲを含有し、核に対して標的化され、送達されるように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小定義エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０））および末端分解部位（ＴＲＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＡＧＴＴＧＧ−３’（配列番号６４））に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列であると仮定する。４）ｃｅＤＮＡベクターは、報告によれば受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーに結合し、Ｔ細胞媒介性免疫反応を誘起する原核細胞由来のプラスミドにおいてしばしば見出されるＣｐＧジヌクレオチドの過剰提示を有しない。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
【０２１０】
ＩＶ．ＩＴＲｓ
本明細書に開示されているように、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子または異種核酸配列を含み、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、２つのサブファミリー：脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび昆虫に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅを含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルスに由来し得る。パルボウイルス亜科（パルボウイルスと称される）は、ディペンドウイルス族を含み、そのメンバーは、ほとんどの条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ディペンドウイルス族は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４）に感染するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ならびに他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ随伴ウイルス）を含む。パルボウイルスおよびＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーの他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，″Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，″Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に一般に記載されている。
【０２１２】
ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２  ＷＴ−ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、または任意の合成ＡＡＶからのＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ随伴ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書で論じられるように、５’ＷＴ−ＩＴＲは、１つの血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。
【０２１３】
熟練者であれば、ＩＴＲ配列が、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形またはＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａおよび図３Ａを参照）、各ＷＴ−ＩＴＲが、より大きなパリンドロームアーム（Ａ−Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアームまたはループ（Ｂ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’）、ならびに一本鎖Ｄ配列によって形成される（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップまたはフロップ配向を定義する）ことを知っている。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６）からのＩＴＲの構造分析および配列比較を参照されたい。Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４−３７９、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９；２６１；８−１４に記載されている。当業者は、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ−プラスミドで使用するための任意のＡＡＶ血清型からＷＴ−ＩＴＲ配列を容易に決定することができる。例えば、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９に記載される異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６、ならびにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）およびウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））からのＩＴＲの配列比較を参照されたい。これは、他の血清型からの左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの同一性％を示す：ＡＡＶ−１（８４％）、ＡＡＶ−３（８６％）、ＡＡＶ−４（７９％）、ＡＡＶ−５（５８％）、ＡＡＶ−６（左ＩＴＲ）（１００％）、およびＡＡＶ−６（右ＩＴＲ）（８２％）。
【０２１４】
Ａ．対称ＩＴＲ対
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’〜３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）および第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称または実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の３次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、Ｂ−Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ−ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ−ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。代替実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の３次元形状を有し得る。
【０２１５】
（ｉ）野生型ＩＴＲ
いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、または実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ−ＩＴＲ）である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ−ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ−ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な３次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
【０２１６】
したがって、本明細書で開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの隣接する野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子または異種核酸配列を含み、互いに逆相補（逆位）であるか、または代替として互いに実質的に対称である。すなわち、ＷＴ−ＩＴＲ対は、対称の３次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＷＴ−ＩＴＲ）は、機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、例えば、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’、配列番号６０）および機能性末端分解部位（ＴＲＳ、例えば５’−ＡＧＴＴ−３’、配列番号６２）を含む。
【０２１７】
一態様では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つのＷＴ逆位末端反復配列（ＷＴ−ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ  ＷＴ−ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ−ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ−ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称の３次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、同じまたは異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲは、互いの鏡像であり、すなわち、それらは対称である。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型に由来する。
【０２１８】
ＷＴ  ＩＴＲは周知である。一実施形態では、２つのＩＴＲは、同じＡＡＶ２血清型に由来する。ある特定の実施形態では、他の血清型からのＷＴを使用することができる。相同であるいくつかの血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８がある。一実施形態では、密接に相同なＩＴＲ（例えば、類似のループ構造を有するＩＴＲ）を使用することができる。別の実施形態では、より多様なＡＡＶ  ＷＴ  ＩＴＲ、例えばＡＡＶ２およびＡＡＶ５を使用することができ、さらに別の実施形態では、実質的にＷＴであるＩＴＲを使用することができる、すなわち、それはＷＴの基本ループ構造を有するが、特性を変更しないかまたは影響しないいくつかの保存的ヌクレオチド変化を有する。同じウイルス血清型に由来するＷＴ−ＩＴＲを使用する場合、１つ以上の調節配列をさらに使用することができる。ある特定の実施形態では、調節配列は、ｃｅＤＮＡの活性、例えば、コードされた抗体または融合タンパク質の発現の調整を可能にする調節スイッチである。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターに関し、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの野生型逆位末端反復配列（ＷＴ−ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、ＷＴ−ＩＴＲは、同じ血清型、異なる血清型に由来し得るか、または互いに対して実質的に対称であり得る（すなわち、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるように対称の３次元空間構成を有するか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループを有する）。いくつかの実施形態では、対称ＷＴ−ＩＴＲは、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシドにはない。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲは同じであるが、互いの逆相補鎖である。例えば、５’ＩＴＲの配列ＡＡＣＧは、対応する部位の３’ＩＴＲのＣＧＴＴ（すなわち、逆相補鎖）であり得る。一実施例では、５’ＷＴ−ＩＴＲセンス鎖は、ＡＴＣＧＡＴＣＧの配列を含み、対応する３’ＷＴ−ＩＴＲセンス鎖は、
【化１】
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（すなわち、ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補鎖）を含む。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ  ｃｅＤＮＡは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（複製タンパク質結合部位と呼ばれることもある）、例えばＲｅｐ結合部位をさらに含む。
【０２２１】
ＷＴ−ＩＴＲを含む抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＷＴ−ＩＴＲ配列は、ＷＴ−ＩＴＲの対（５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲ）を示す本明細書の表７に示されている。
【０２２２】
例示的な実施例として、本開示は、調節スイッチの有無にかかわらず、導入遺伝子（例えば、遺伝子編集配列）に操作可能に連結されたプロモーターを含む抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを提供し、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠き、（ａ）ＷＴ−ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ−プラスミド（例えば、図１Ｆ〜１Ｇを参照）から産生され、各ＷＴ−ＩＴＲは、そのヘアピン二次構成で同じ数の分子内二重化塩基対を有し（好ましくはこれらの参照配列と比較して、この構成のいかなるＡＡＡまたはＴＴＴ末端ループの欠失も除外する）、および（ｂ）実施例１の未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの同定のためのアッセイを使用してｃｅＤＮＡとして同定される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、隣接するＷＴ−ＩＴＲは、互いに実質的に対称である。この実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲが同一の逆相補鎖ではないように、５’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶの１つの血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し得る。例えば、５’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、３’ＷＴ−ＩＴＲは、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶのうちのいずれかから選択される２つの異なるパルボウイルスから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ  ＩＴＲのそのような組み合わせは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６からのＷＴ−ＩＴＲの組み合わせである。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、一方が他方のＩＴＲに対して反転されたときに、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％…９７％…９８％…９９％…９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、同じ対称の３次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、それらが対称の３次元空間構成を有する、例えば、Ａ、Ｃ−Ｃ’、Ｂ−Ｂ’、およびＤアームの同じ３次元構成を有するため、実質的に対称である。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対は、他方に対して反転され、互いに少なくとも９５％同一、少なくとも９６％…９７％…９８％…９９％…９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、一方のＷＴ−ＩＴＲは、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する。いくつかの実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対は、互いに対して反転され、互いに少なくとも９５％同一、少なくとも９６％…９７％…９８％…９９％…９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、一方のＷＴ−ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する。相同性は、ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）、デフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなど、当該技術分野で周知の標準的な手段によって決定することができる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲのヌクレオチド配列、２つ以上のエレメント間の空間、または上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、ＡおよびＡ’アーム、ＢおよびＢ’アーム、ＣおよびＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）およびＲＢＥ’（すなわち、相補的ＲＢＥ配列）、ならびに末端分解部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。
【０２２５】
単なる例として、表６は、ＷＴ−ＩＴＲの例示的な組み合わせを示す。
【０２２６】
表６：同じ血清型もしくは異なる血清型、または異なるパルボウイルスからのＷＴ−ＩＴＲの例示的な組み合わせ。示されている順序は、ＩＴＲ位置を示すものではなく、例えば、「ＡＡＶ１、ＡＡＶ２」は、ｃｅＤＮＡが５’位置にＷＴ−ＡＡＶ１  ＩＴＲおよび３’位置にＷＴ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ、またはその逆、５’位置にＷＴ−ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび３’位置にＷＴ−ＡＡＶ１  ＩＴＲを含み得ることを明示する。略語：ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）；ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノム（例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、温血動物のＩＴＲ（トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジＡＡＶ）、Ｂ１９パルボウイルスからのＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）；ガチョウ：ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ００１７０１）；ヘビ：ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【０２２７】
単なる例として、表７は、いくつかの異なるＡＡＶ血清型からの例示的なＷＴ−ＩＴＲの配列を示す。
【表７】
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【０２２８】
いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ配列のヌクレオチド配列は、（例えば、１、２、３、４もしくは５個以上のヌクレオチドまたはその中の任意の範囲を修飾することにより）修飾され得、それにより修飾は、相補的ヌクレオチドの置換、例えば、Ｃの場合はＧ、およびその逆、Ａの場合はＴ、およびその逆である。
【０２２９】
本発明のある特定の実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、配列番号１、２、５〜１４のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列からなるＷＴ−ＩＴＲを有しない。本発明の代替実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターが、配列番号１、２、５〜１４のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含むＷＴ−ＩＴＲを有する場合、隣接するＩＴＲもＷＴであり、ｃｅＤＮＡは、例えば、本明細書および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に開示されているように、調節スイッチを含む（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表１１を参照）。いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、および配列番号１、２、５〜１４からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択されたＷＴ−ＩＴＲを含む。
【０２３０】
本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持するＷＴ−ＩＴＲ構造を含み得る。例示の目的で野生型ＩＴＲを使用する図２Ａおよび図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０））および末端分解部位（ＴＲＳ、５’−ＡＧＴＴ（配列番号６２））を含む１つ以上の機能性ＷＴ−ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲは、機能的である。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターが互いに実質的に対称である２つのＷＴ−ＩＴＲを含む代替実施形態では、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲが機能的であり、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲが非機能的である。
【０２３１】
Ｂ．非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターの一般的な修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ−ＩＴＲ）
本明細書で論じられるように、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、対称ＩＴＲ対または非対称ＩＴＲ対を含み得る。どちらの場合も、一方または両方のＩＴＲは修飾型ＩＴＲであり得、その違いは、第１の場合（すなわち、対称ｍｏｄ−ＩＴＲ）では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、同じ３次元空間構成を有する（すなわち、同じＡ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’アーム構成を有する）が、第２の場合（すなわち、非対称ｍｏｄ−ＩＴＲ）では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、異なる３次元空間構成を有する（すなわち、Ａ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’アームの異なる構成を有する）ことである。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）と比較して、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されるＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例えば、ＡＡＶ２の場合は５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’、配列番号６０）および機能性末端分解部位（ＴＲＳ；例えば、５’−ＡＧＴＴ−３’、配列番号６２）を含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能性ＩＴＲである。一実施形態では、異なるまたは修飾型ＩＴＲは各々、異なる血清型からの野生型ＩＴＲではない。
【０２３３】
ＩＴＲの特定の変更および突然変異が本明細書において詳細に説明されているが、ＩＴＲの文脈では、「変更型」または「突然変異型」または「修飾型」とは、ヌクレオチドが野生型、参照、または元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたことを示す。変更型または突然変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」と見なされる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、合成のものであり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶ系配列を含まない。さらに別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、または全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐまたは特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、または場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、突然変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。
【０２３５】
熟練者であれば、既知の手段によって他の血清型における対応する配列を判定することができる。例えば、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、またはＤ領域中に変化が存在するかどうかを判定し、別の血清型における対応する領域を判定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）または他の相同性アラインメントプログラムをデフォルト状態で使用して、対応する配列を判定することができる。本発明は、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからｍｏｄ−ＩＴＲを含む集団および複数のｃｅＤＮＡベクターをさらに提供する。すなわち、１つのｍｏｄ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他のｍｏｄ−ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。理論に束縛されるものではないが、一実施形態では、１つのＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の１つ以上のＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得る。
【０２３６】
任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、または塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロンおよび骨格筋を選好的に標的し、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、および光受容体を標的とする。ＡＡＶ６は、骨格筋および肺を選好的に標的とする。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、および膵臓組織を選好的に標的とする。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、および肺組織を選好的に標的とする。一実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲに基づいている。
【０２３７】
より具体的には、構造エレメントが特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを修飾することによって変更され得る。例えば、構造エレメントのヌクレオチド配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、およびｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲであり得、ＡもしくはＡ’アームまたはＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＣまたはＣ’アーム、ＲＢＥ、およびｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＢおよびＢ’アームは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ  ＢおよびＢ’アームで置き換えられる。
【０２３８】
単なる例として、表８は、修飾型ＩＴＲの領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの例示的な修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示し、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対するそのセクションにおける少なくとも１つの核酸の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示す。いくつかの実施形態では、Ｃおよび／またはＣ’および／またはＢおよび／またはＢ’の領域のうちのいずれかにおける少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例えば、単一Ｃ−Ｃ’アーム、もしくは単一Ｂ−Ｂ’アーム）、または修飾型Ｃ−Ｂ’アームもしくはＣ’−Ｂアーム、または少なくとも１つの切断されたアーム（例えば、切断されたＣ−Ｃ’アームおよび／もしくは切断されたＢ−Ｂ’アーム）を有する２つのアームＩＴＲのうちのいずれかをもたらす場合、少なくとも単一アーム、または２つのアームＩＴＲのアーム（１つのアームは切断され得る）のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。いくつかの実施形態では、切断されたＣ−Ｃ’アームおよび／または切断されたＢ−Ｂ’アームは、末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を有する。
【表８】
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【０２３９】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するためのｍｏｄ−ＩＴＲは、本明細書に開示される非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含み、表８に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、およびＢ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣもしくはＣ’またはＢもしくはＢ’領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、依然としてステムループの末端ループを保存する。いくつかの実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。代替実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ａヌクレオチド（すなわち、ＡＡＡ）を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表８に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’、Ａ、および／またはＤから選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表８に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ領域における少なくとも１つの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）も含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表８に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表８に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡおよび／またはＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表８に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＤ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。
【０２４０】
一実施形態では、構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）、修飾型構造エレメントを産生することができる。一実施形態では、ＩＴＲに対する特定の修飾が本明細書に例示されているか（例えば、配列番号３、４、１５〜４７、１０１〜１１６、もしくは１６５〜１８７）、または２０１８年１２月６日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７Ａ〜７Ｂに示されている（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の配列番号９７〜９８、１０１〜１０３、１０５〜１０８、１１１〜１１２、１１７〜１３４、５４５〜５４）。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲を修飾することによって）修飾され得る。他の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３、４、１５〜４７、１０１〜１１６、もしくは１６５〜１８７の修飾型ＩＴＲのうちの１つ、または配列番号３、４、１５〜４７、１０１〜１１６、もしくは１６５〜１８７、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２〜９（すなわち、配列番号１１０〜１１２、１１５〜１９０、２００〜４６８）に示されている、Ａ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有セクションと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定アームの全部、例えば、Ａ−Ａ’アームの全部もしくは一部、またはＢ−Ｂ’アームの全部もしくは一部、またはＣ−Ｃ’アームの全部もしくは一部の除去または欠失、あるいはステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去（例えば、２０１８年１２月６日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７ＡのＩＴＲ−２１を参照）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る（例えば、２０１８年１２月６日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図３ＢのＩＴＲ−１または図７ＡのＩＴＲ−４５を参照）。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去、およびＢ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起され、例えば、Ｃ−Ｃ’アームにおける６つの塩基対、およびＢ−Ｂ’アームにおける２つの塩基対が除去され得る。例示的な実施例として、図３Ｂは、修飾型ＩＴＲが、少なくとも１つのアーム（例えば、Ｃ−Ｃ’）が切断される２つのアームを含むように、Ｃ部分およびＣ’部分の各々から欠失された少なくとも７つの塩基対、Ｃ領域とＣ’領域との間のループ中のヌクレオチドの置換、ならびにＢ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を有する例示的な修飾型ＩＴＲを示す。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲはまた、Ｂ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を含み、それによりＢ−Ｂ’アームもＷＴ  ＩＴＲに対して切断される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１〜５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長ＷＴ  ＩＴＲ配列に対して１〜３０ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２〜２０ヌクレオチド欠失を有す。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例えば、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、もしくは末端分解部位でのニッキング）に干渉しないように、ＡまたはＡ’領域のＲＢＥ含有部分にいかなるヌクレオチド欠失も含まない。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のために包含される修飾型ＩＴＲは、本明細書に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、および／またはＣ領域に１つ以上の欠失を有する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、対称ＩＴＲ対または非対称ＩＴＲ対を含む抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、および配列番号３、４、１５〜４７、１０１〜１１６、または１６５〜１８７からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択された少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを含む。
【０２４５】
別の実施形態では、構造エレメントの構造は、修飾され得る。例えば、構造エレメントは、ステムの高さおよび／またはループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。一実施形態では、ステムの高さは約５ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用し得る。別の実施形態では、ステムの高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用し得る。別の例では、ループは３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲を有し得る。
【０２４６】
別の実施形態では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位またはＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加または減少され得る。一実施例では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、もしくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、またはその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列またはＧＡＧＹと同様の配列であり得る。
【０２４７】
別の実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥおよびヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加または減少）、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。
【０２４８】
本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ構造に関して修飾されるＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持する。図２Ａおよび図２Ｂは、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０））および末端分解部位（ＴＲＳ、５’−ＡＧＴＴ（配列番号６２））を含む１つ以上の機能性ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ（野生型または修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、または非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲが機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲが非機能的である。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２（すなわち、配列番号１３５〜１９０、２００〜２３３）；表３（例えば、配列番号２３４〜２６３）；表４（例えば、配列番号２６４〜２９３）；表５（例えば、本明細書の配列番号２９４〜３１８）；表６（例えば、配列番号３１９〜４６８）；および表７〜９（例えば、配列番号１０１〜１１０、１１１〜１１２、１１５〜１３４）または表１０Ａもしくは１０Ｂ（例えば、配列番号９、１００、４６９〜４８３、４８４〜４９９）に列挙されている。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含む抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための修飾型ＩＴＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２、３、４、５、６、７、８、９、および１０Ａ〜１０Ｂに示されるもののうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０２５１】
上記のクラスの各々に非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含む抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための追加の例示的な修飾型ＩＴＲを表９Ａおよび９Ｂに示す。表９Ａの右修飾型ＩＴＲの予測二次構造は、２０１８年１２月６日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図７Ａに示され、表９Ｂの左修飾型ＩＴＲの予測二次構造は、２０１８年１２月６日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の図７Ｂに示される。
【０２５２】
表９Ａおよび表９Ｂは、例示的な右および左修飾型ＩＴＲを示す。
【表９Ａ−１】
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【表９Ａ−２】
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【０２５３】
【表９Ｂ−１】
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【表９Ｂ−２】
2021513355.tif 000029
【０２５４】
一実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、５´から３´方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５´ＩＴＲ）および第２のＩＴＲ（３´ＩＴＲ）は、互いに非対称である。すなわち、それらは互いに異なる３次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得るか、またはその逆であり、第１のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、両方ともｍｏｄ−ＩＴＲであるが、異なる配列を有するか、または異なる修飾を有し、したがって同じ修飾型ＩＴＲではなく、異なる３次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを用いたｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ−ＩＴＲに対する１つのＩＴＲのいかなる変更も他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを含むか、あるいは非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合は、互いに対して異なる配列および異なる３次元形状を有し得る。ｃｅＤＮＡベクター中の、抗体または融合タンパク質の産生のための、およびｃｅＤＮＡ−プラスミドを生成するために使用するための例示的な非対称ＩＴＲは、表９Ａおよび９Ｂに示されている。
【０２５５】
代替実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つの対称的なｍｏｄ−ＩＴＲを含む。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ配列を有するが、互いの逆相補鎖（逆位）である。いくつかの実施形態では、対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対は、同じＡＡＶ血清型からの野生型ＩＴＲ配列と比較して、欠失、挿入、または置換の少なくとも１つまたは任意の組み合わせを含む。対称ＩＴＲの付加、欠失、または置換は同じであるが、互いの逆相補鎖である。例えば、５’ＩＴＲのＣ領域への３ヌクレオチドの挿入は、３’ＩＴＲのＣ’領域の対応するセクションへの３つの逆相補ヌクレオチドの挿入に反映される。単に説明の目的でのみ、付加が５’ＩＴＲのＡＡＣＧである場合、付加は、対応する部位における３’ＩＴＲのＣＧＴＴである。例えば、５’ＩＴＲセンス鎖が
【化２】
2021513355.tif 000030
であり、ＧとＡとの間に
【化３】
2021513355.tif 000031
の付加を伴い、配列
【化４】
2021513355.tif 000032
（配列番号５１）をもたらす場合。対応する３’ＩＴＲセンス鎖は、
【化５】
2021513355.tif 000033
（
【化６】
2021513355.tif 000034
の逆相補鎖）であり、ＴとＣとの間に
【化７】
2021513355.tif 000035
（すなわち、ＡＡＣＧの逆相補鎖）の付加を伴い、配列
【化８】
2021513355.tif 000036
（配列番号４９）（
【化９】
2021513355.tif 000037
の逆相補鎖）（配列番号５１）をもたらす。
【０２５６】
代替実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の３次元形状を有し得る。例えば、１つの修飾型ＩＴＲは、１つの血清型に由来し得、他の修飾型ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得るが、それらは同じ領域において同じ突然変異（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失、または置換）を有する。言い換えると、単なる説明の目的で、５’ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、Ｃ領域に欠失を有し、３’ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＡＡＶ５に由来し得、Ｃ’領域に対応する欠失を有する。５’ｍｏｄ−ＩＴＲおよび３’ｍｏｄ−ＩＴＲが同じまたは対称の３次元空間構成を有することを条件として、それらは本明細書における修飾型ＩＴＲ対としての使用に包含される。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ−Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ−ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ−ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ−Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。単なる例として、実質的に対称のＩＴＲは、それらの構造が幾何学的空間において同じ形状であるように、対称空間構成を有し得る。これは、例えば、Ｇ−Ｃ対が、例えばＣ−Ｇ対に、もしくはその逆に修飾されたとき、またはＡ−Ｔ対がＴ−Ａ対に、もしくはその逆に修飾されたときに起こり得る。したがって、
【化１０】
2021513355.tif 000038
（配列番号５１）としての修飾型５’ＩＴＲ、および
【化１１】
2021513355.tif 000039
（配列番号４９）としての修飾型３’ＩＴＲ（すなわち、
【化１２】
2021513355.tif 000040
の逆相補（配列番号５１））の上記の例示的な実施例を使用し、例えば、５’ＩＴＲが
【化１３】
2021513355.tif 000041
の配列（配列番号５０）を有していた場合（付加部のＧは、Ｃに修飾される）、これらの修飾型ＩＴＲは、依然として対称であり、実質的に対称の３’ＩＴＲは、付加部のＴを対応するａに修飾することなく、
【化１４】
2021513355.tif 000042
の配列（配列番号４９）を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲ対が対称立体化学を有するため、そのような修飾型ＩＴＲは、実質的に対称である。
【０２５８】
表１０は、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための、例示的な対称修飾型ＩＴＲ対（すなわち、左修飾型ＩＴＲおよび対称右修飾型ＩＴＲ）を示す。配列の太字（赤）部分は、図３１Ａ〜４６Ｂにも示されている部分的なＩＴＲ配列（すなわち、Ａ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループの配列）を識別する。これらの例示的な修飾型ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号６９）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号７０）、およびＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥに対する補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号７１）を含み得る。
【表１０−１】
2021513355.tif 000043
【表１０−２】
2021513355.tif 000044
【表１０−３】
2021513355.tif 000045
【表１０−４】
2021513355.tif 000046
【０２５９】
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対を含む抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の表９Ａ〜９Ｂのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列もしくはＩＴＲ部分配列、あるいは２０１８年１２月６日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（その全体が本明細書に組み込まれる）の図７Ａ〜７Ｂに示されているか、または２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０Ａ〜１０Ｂに開示されている配列における修飾のうちのいずれかに対応する修飾を有するＩＴＲを含み得る。
【０２６０】
Ｖ．例示的なｃｅＤＮＡベクター
上記のように、本開示は、組み換えｃｅＤＮＡ発現ベクター、および上記の非対称のＩＴＲ対、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対のうちのいずれか１つを含む、抗体または融合タンパク質の産生のための抗体または融合タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、隣接するＩＴＲ配列および導入遺伝子を有する抗体または融合タンパク質の産生のための組み換えｃｅＤＮＡベクターに関し、ＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称であり、ｃｅＤＮＡは、隣接するＩＴＲの間に位置する関心対象のヌクレオチド配列（例えば、導入遺伝子の核酸を含む発現カセット）をさらに含み、当該核酸分子は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている。
【０２６１】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも１つのＩＴＲが変更されている場合、本明細書に記載されるヌクレオチド配列（複数可）を含む組み換えＤＮＡ手順に都合よく供することができる任意のｃｅＤＮＡベクターであってよい。本開示の抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターが導入される宿主細胞と適合性がある。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、直鎖状であってもよい。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、染色体外実体として存在し得る。ある特定の実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞のゲノムへのドナー配列の組み込みを可能にするエレメント（複数可）を含み得る。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」および「異種ヌクレオチド配列」は同義であり、本明細書に記載されるように、抗体または融合タンパク質をコードする。
【０２６２】
ここで図１Ａ〜１Ｇを参照すると、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを作製するのに有用な２つの非限定的プラスミドの機能的構成成分の概略図が示されている。図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｆは、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの構築物または対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを含まず、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット、および第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから取得することができ、第１および第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを含まず、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子（タンパク質もしくは核酸）、および第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから取得することができ、第１および第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である。いくつかの実施形態では、発現可能な導入遺伝子カセットは、必要に応じて、エンハンサー／プロモーター、１つ以上の相同性アーム、ドナー配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ、例えば、配列番号６７））、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ、例えば、配列番号６８）を含む。
【０２６３】
図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡは、上記の図４Ａに関して、および実施例で論じられるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
【０２６４】
Ａ．調節エレメント
本明細書で定義される非対称のＩＴＲ対または対称のＩＴＲ対を含む、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子、例えば抗体または融合タンパク質のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、または抗体もしくはその抗原結合断片をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。本発明で使用され得る調節スイッチを含む調節エレメントは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより完全に論じられている。
【０２６５】
実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、調節配列、およびヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子調節配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。ある特定の実施形態では、調節配列は、宿主細胞におけるヌクレアーゼの発現を制御するのに適している。ある特定の実施形態では、調節配列は、本開示のヌクレアーゼ（複数可）をコードするヌクレオチド配列などのプロモーター配列に操作可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されたイントロン配列を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列がプロモーターの上流に提供されて、プロモーターの効力を増大させる。ある特定の実施形態では、調節配列は、エンハンサーおよびプロモーターを含み、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。
【０２６６】
合成的に、または本明細書において実施例に記載される細胞ベースの産生方法を使用して産生された抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号６７）およびＢＧＨポリＡ（配列番号６８）などのシス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含み得る。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。
【０２６７】
（ｉ）．プロモーター：
当業者は、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで使用されるプロモーターが、それらが促進する特定の配列に対して適切に調整されるべきであることを理解するであろう。
【０２６８】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの発現カセットは、全体発現レベルとともに細胞特異性に影響を及ぼし得るプロモーターを含み得る。導入遺伝子発現、例えば抗体または抗原結合断片発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモーターを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果および免疫反応を低減するために組織特異的真核細胞プロモーターを含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＣＡＧプロモーター（配列番号７２）などの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびに（ｉｉｉ）ウサギβ−グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替として、発現カセットは、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター（配列番号７３もしくは配列番号７４）、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター（配列番号７５もしくは配列番号７６）、またはヒト伸長因子−１α（ＥＦ１ａ）プロモーター（例えば、配列番号７７もしくは配列番号７８）を含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する、例えば、配列番号７９）を含む。代替として、誘導性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。
【０２６９】
上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号８０）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，４９７−５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号８１または配列番号１５５）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１−抗チプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号８２）等が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更され、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
【０２７０】
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、ＳＶ４０エンハンサー（配列番号１２６）を含むエンハンサー（例えば、配列番号７９および配列番号８３）をさらに含み得る。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ヒトα１−アンチタイプシン（ＨＡＡＴ）であり得る。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介して、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。
【０２７２】
本発明に従う使用のための好適なプロモーターの非限定的な例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター（配列番号７２）、ＨＡＡＴプロモーター（配列番号８２）、ヒトＥＦ１−αプロモーター（配列番号７７）、またはＥＦ１ａプロモーター（配列番号７８）、ＩＥ２プロモーター（例えば、配列番号８４）、およびラットＥＦ１−αプロモーター（配列番号８５）、ｍＥＦ１プロモーター（配列番号５９）、または１Ｅ１プロモーター断片（配列番号１２５）が挙げられる。
【０２７３】
（ｉｉ）．ポリアデニル化配列：
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、および核輸送および翻訳を助けるために、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、またはそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０〜５０ヌクレオチド、約４０〜５５ヌクレオチド、約４５〜５０ヌクレオチド、約３５〜５０ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。図１０Ａ〜１０Ｇに示されるように、ポリアデニル化配列は、抗体または抗体断片をコードする導入遺伝子の３´に位置することができる。いくつかの実施形態では、完全ＩｇＧまたは完全抗体をコードする抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ＩＲＥＳ配列が、ポリアデニル化配列の３´に位置する場合、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列（配列番号１９０）を含み得、それにより最初の導入遺伝子の３´に位置する２番目の導入遺伝子（例えば、抗体または抗原結合断片）が、同じｃｅＤＮＡベクターによって翻訳および発現され、ｃｅＤＮＡベクターが完全抗体を発現できるようになる（例えば、図１０Ｂを参照）。
【０２７４】
発現カセットは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、配列番号６８）もしくはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号８６）から単離された天然に存在する配列、または合成配列（例えば、配列番号８７）を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
【０２７５】
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号６７）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ−０２およびＶＫ−Ａ２６配列、例えば、配列番号８８および配列番号８９に連結され得る。
【０２７６】
（ｉｉｉ）．核局在化配列
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、アミノ末端またはその近く、カルボキシ末端またはその近く、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳおよび／またはカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）に位置する。複数のＮＬＳが存在する場合、各々を他のＮＬＳから独立して選択することができ、それにより、単一のＮＬＳが複数のコピーに、および／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在する。ＮＬＳの非限定的な例を表１１に示す。
【表１１】
2021513355.tif 000047
【０２７７】
Ｂ．ｃｅＤＮＡベクターの追加の構成成分
本開示の抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子編集のための他の構成成分をコードするヌクレオチドを含み得る。例えば、特定の遺伝子標的事象を選択するには、保護ｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡに埋め込み、アルブミン遺伝子座などの高活性遺伝子座に部位特異的に統合するように設計された組み換えｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。そのような実施形態は、Ｎｙｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ  ８，２０１６に記載されているような任意の遺伝的背景における遺伝子修飾肝細胞のインビボ選択および拡大のための系を提供し得る。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入などされた細胞の選択を可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを含み得る。選択可能なマーカーは、その産生物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、ＮｅｏＲ等を提供する遺伝子である。ある特定の実施形態では、正の選択マーカーが、ＮｅｏＲなどのドナー配列に組み込まれる。負の選択マーカーは、ドナー配列の下流に組み込むことができ、例えば、負の選択マーカーをコードする核酸配列ＨＳＶ−ｔｋを、ドナー配列の下流の核酸構築物に組み込むことができる。
【０２７８】
Ｃ．調節スイッチ
分子調節スイッチは、シグナルに反応して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチは、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターと有用に組み合わせて、ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または融合タンパク質の産生のための発現の出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体または抗原結合断片の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける抗体または抗原結合断片の発現を制御可能かつ調節可能な様式で開始または停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターでの使用に含まれる例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより完全に論じられている。
【０２７９】
（ｉ）バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体または抗原結合断片の発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの間に位置する発現カセットは、追加として、抗体または抗原結合断片に操作可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シスエレメント、リプレッサー、エンハンサー等を含み得、この調節領域は、１つ以上の共因子または外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定的な例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８０】
（ｉｉ）小分子調節スイッチ
様々な当該技術分野において既知の小分子系調節スイッチは、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターと組み合わせて、調節スイッチによって制御されるｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド／核受容体対、例えば、レチノイド受容体変異形／ＬＧ３３５およびＧＲＱＣＩＭＦＩ（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（２０１０）：１５に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに）；操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）には結合するＣ末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体（米国特許第５，３６４，７９１号）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド（Ｓａｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（２６）（２０００），１４５１２−１４５１７）、またはＳａｎｄｏ  Ｒ  ３ｒｄ；Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，１０（１１）：１０８５−８に開示される抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）によって制御されるスイッチのうちのいずれか１つまたは組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，７７１，６７９号および同第６，３３９，０７０号に開示されているものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
【０２８１】
（ｉｉｉ）「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現および／または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件ＡおよびＢが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、またはそれ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの条件（例えば、Ａ、Ｂ条件）が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの条件が起こる必要がある（例えば、Ａ、Ｂ、およびＣまたはＡ、Ｂ、およびＤ）。単なる例として、パスコード「ＡＢＣ」調節スイッチを有するｃｅＤＮＡからの遺伝子発現が起こるためには、条件Ａ、Ｂ、およびＣが存在しなければならない。条件Ａ、Ｂ、およびＣは、以下のとおりであり得る。条件Ａは、病態または疾患の存在であり、条件Ｂは、ホルモン反応であり、条件Ｃは、導入遺伝子の発現に対する反応である。例えば、導入遺伝子が欠陥ＥＰＯ遺伝子を編集する場合、条件Ａは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の存在であり、条件Ｂは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Ｃは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞（ＥＰＣ）動員が不全であるか、または代替としてＨＩＦ−２活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、または所望のＥＰＯレベルに達すると、導入遺伝子は、３つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチまたは「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲および複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を含む。既定条件の存在下で細胞死をトリガーするデッドマンスイッチとは対照的に、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」の存在下での細胞生存または導入遺伝子発現を可能にし、所定の環境条件またはパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子発現および／または細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。
【０２８３】
本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸系スイッチ、小分子−核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、および本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれかおよびすべての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Ｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．１２：２０１４１０００（２０１５）において考察され、Ｋｉｓの表１に要約されている。いくつかの実施形態では、パスコードシステムで使用するための調節スイッチは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ  ／  ＵＳ１８  ／  ４９９９６号の表１１に開示されるスイッチのうちのいずれかまたはそれらの組み合わせから選択することができる。
【０２８４】
（ｉｖ）．導入遺伝子発現を制御するための核酸系調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡによって発現された抗体または抗原結合断片を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づいている。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、ＵＳ２００９／０３０５２５３、ＵＳ２００８／０２６９２５８、ＵＳ２０１７／０２０４４７７、ＷＯ２０１８／０２６７６２Ａ１、米国特許第９，２２２，０９３号、および欧州特許出願第ＥＰ２８８０７１号に開示されるもの、またＶｉｌｌａ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８  Ｍａｙ；６（３）によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。ＷＯ２０１８／０７５４８６およびＷＯ２０１７／１４７５８５に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ）による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子の一部に対して相補的であるＲＮＡｉ分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子（例えば、抗体または抗原結合断片）は、ｃｅＤＮＡベクターによって発現されたとしてもそのようなＲＮＡｉが発現される場合、相補的ＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がｃｅＤＮＡベクターによって発現されたときにＲＮＡｉが発現されない場合、導入遺伝子（例えば、抗体または抗原結合断片）は、ＲＮＡｉによってサイレンシングされない。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２００２／００２２０１８に開示されている組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子（例えば、抗体または抗原結合断片）の発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子発現を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２０１４／０１２７１６２および米国特許第８，３２４，４３６号に開示されるリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。
【０２８６】
（ｖ）．転写後および翻訳後調節スイッチ。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された抗体または抗原結合断片を制御するための調節スイッチは、転写後修飾系である。例えば、そのような調節スイッチは、ＵＳ２０１８／０１１９１５６、ＧＢ２０１１／０７７６８、ＷＯ２００１／０６４９５６Ａ３、欧州特許第２７０７４８７号、およびＢｅｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，４（５），ｐｐ  ５２６−５３４、Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１６  Ｎｏｖ  ２；５．ｐｉｉ：ｅ１８８５８に開示されているように、テトラサイクリンまたはテオフィリンに感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性（オフスイッチ）アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性ｓｉＲＮＡの両方をコードすることができると想定される。
【０２８７】
（ｖｉ）．他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチをｃｅＤＮＡベクター中で使用して、環境変化によってトリガーされるものを含む、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された抗体または抗原結合断片の遺伝子発現を制御することができる。追加の例としては、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８；１００５１（２０１８）のＢＯＣ方法、遺伝子コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン／オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｃｏｔｔ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００  Ｊｕｌ；７（１３）：１１２１−５、米国特許第５，６１２，３１８号、同第５，５７１，７９７号、同第５，７７０，５８１号、同第５，８１７，６３６号、およびＷＯ１９９９／０２５３８５Ａ１を参照）。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第７，８４０，２６３号、ＵＳ２００７／０１９００２８Ａ１に開示されている、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、１つ以上のエネルギー形態によって制御される。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性またはストレス活性化スイッチ、例えば、ＷＯ１９９９／０６０１４２Ａ２、米国特許第５，８３４，３０６号、同第６，２１８，１７９号、同第６，７０９，８５８号、ＵＳ２０１５／０３２２４１０、Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ９，Ｓ３６８に開示されるものなど、ならびにＦＲＯＧ、ＴＯＡＤ、およびＮＲＳＥエレメント、および条件的に誘導可能なサイレンスエレメント（例えば、米国特許第９，３９４，５２６号に開示される、低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）、炎症反応エレメント（ＩＲＥ）、および剪断応力活性化エレメント（ＳＳＡＥ）を含む）である。そのような実施形態は、虚血後、または虚血性組織および／もしくは腫瘍において、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。
【０２８９】
（ｉｖ）．キルスイッチ
本明細書に記載される他の実施形態は、キルスイッチを含む、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺滅されるか、または導入されたｃｅＤＮＡベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターにおけるキルスイッチの使用が、通常は、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型（例えば、癌細胞）へのｃｅＤＮＡベクターの標的と結びつけられることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の非存在下でｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の急速かつロバストな細胞殺滅をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターによりコードされるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。そのようなキルスイッチは、抗体または抗原結合断片を発現するｃｅＤＮＡベクターを対象から除去すること、またはコードされた抗体または抗原結合断片を発現しないことを保証することが望ましいときに、生物学的封じ込め機能として役立つ。
【０２９０】
当業者に知られている他のキルスイッチは、例えばＵＳ２０１０  ／  ０１７５１４１、ＵＳ２０１３／０００９７９９、ＵＳ２０１１／０１７２８２６、ＵＳ２０１３／０１０９５６８に開示される、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクター、ならびにＪｕｓｉａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２０１４；１−５６、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００４；１０１；８４１９−９、Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０１１；４３；３１０−３１９、およびＲｅｉｎｓｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８，１１に開示されるキルスイッチでの使用に包含される。
【０２９１】
したがって、いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、エフェクター毒素またはレポータータンパク質をコードする核酸を含むキルスイッチ核酸構築物を含むことができ、エフェクター毒素（例えば、死タンパク質）またはレポータータンパク質の発現は、所定の条件によって制御される。例えば、所定の条件は、例えば外因性物質などの環境物質の存在であり得、それがなければ、細胞はデフォルトでエフェクター毒素（例えば、死タンパク質）の発現を起こして殺される。代替実施形態では、所定の条件は、２つ以上の環境物質の存在であり、例えば、細胞は、２つ以上の必要な外因性物質が供給された場合のみに生き残り、いずれもなければ、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺される。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を破壊するキルスイッチを組み込むように修飾され、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子のインビボ発現を効果的に終了させる（例えば、全長抗体、Ｆａｂ、ｓｃＡｂ）。具体的には、ｃｅＤＮＡベクターは、通常の生理学的条件下で哺乳類細胞では機能しないスイッチタンパク質を発現するようにさらに遺伝子操作されている。このスイッチタンパク質を特異的に標的とする薬物または環境条件を投与したときのみ、スイッチタンパク質を発現する細胞が破壊され、それにより治療用タンパク質またはペプチドの発現を終了させる。例えば、ＨＳＶ−チミジンキナーゼを発現する細胞は、ガンシクロビルおよびシトシンデアミナーゼなどの薬物を投与すると殺される可能性があると報告された。例えば、Ｄｅｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ，Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ−１  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ−ＴＫ），ｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｙｏｕ（２０１１）、およびＢｅｌｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（１５）：８６９９−８７０４（１９９９）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＩＳＥ（生存遺伝子排除によって引き起こされる死）と称されるｓｉＲＮＡキルスイッチを含むことができる（Ｍｕｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７；８：８４６４３−８４６５８．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＩＳＥ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【０２９３】
ＶＩ．ｃｅＤＮＡベクターの産生の詳細な方法
Ａ．一般的な産生
本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対を含む抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターのある特定の産生方法は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号のセクションＩＶに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に記載されるように、昆虫細胞を使用して産生され得る。代替実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、２０１９年１月１８日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているように、合成的に、またいくつかの実施形態では無細胞法で産生することができる。
【０２９４】
本明細書に記載されるように、一実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶまたは他のウイルス系ベクターにおいて天然に課されるものなどのサイズ制限はない。
【０２９５】
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【０２９６】
さらに別の態様では、本発明は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルスＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳類細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐおよびヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除および増幅を可能にする。
【０２９７】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば図４Ａ〜４Ｃおよび実施例１に記載される、ｃｅＤＮＡの非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するために操作される。
【０２９８】
次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存性、細胞形態論、細胞増殖等を考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の対部分がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ−ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ−ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製法が採用され得る。
【０２９９】
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
【０３００】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、ならびにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料および未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡの存在を確認することによって確認され得る。図４Ｃおよび図４Ｄは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を特定するための一実施形態を示す。
【０３０１】
Ｂ．ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、転写方向の操作可能に連結された構成成分として、少なくとも（１）５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサー等、および（３）修飾型３’ＩＴＲ配列（３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して非対称である）を提供する既知の技法を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐおよびｃａｐコード領域を置き換える。
【０３０２】
一態様では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書では、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、および突然変異型または修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」と称されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または突然変異型ＡＡＶ  ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’ＩＴＲは、互いに対して対称である。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または突然変異型ＡＡＶ  ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）突然変異型または修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’修飾型ＩＴＲは、同じ修飾を有する（すなわち、それらは互いに対して逆相補または対称である）。
【０３０３】
さらなる実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。追加として、特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドはまた、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、機能的ＡＡＶ  ｃａｐおよびＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ−３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。
【０３０４】
本発明のｃｅＤＮＡ−プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノムに由来する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって維持されるＵＲＬで入手可能なＫｏｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗウェブアドレス：ｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４）（注記−ＵＲＬまたはデータベースに対する参照は、本出願の有効な出願日現在のＵＲＬまたはデータベースの内容を指す）。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。別の特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’および３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。
【０３０５】
ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能または選択マーカーを任意に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシン等であり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子である。
【０３０６】
抗体または融合タンパク質の産生のための例示的なｃｅＤＮＡ（例えば、ｒＡＡＶ０）ベクターは、ｒＡＡＶプラスミドから産生される。ｒＡＡＶベクターの産生のための方法は、（ａ）宿主細胞に上記のようなｒＡＡＶプラスミドを提供することであって、宿主細胞およびプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を描いている、提供することと、（ｂ）ｃｅＤＮＡゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、（ｃ）細胞を採取し、当該細胞から産生されたＡＡＶゲノムを単離することと、を含み得る。
【０３０７】
Ｃ．ｃｅＤＮＡプラスミドからｃｅＤＮＡベクターを作製する例示的な方法
抗体または融合タンパク質の産生のためのカプシド不含ｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの産生方法は、（１）発現カセットおよび２つの対称ＩＴＲ配列を含む核酸構築物を宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中に導入するステップと、（２）任意に、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによってクローン細胞株を確立するステップと、（３）Ｒｅｐコード遺伝子を（当該遺伝子を担持するバキュロウイルスでのトランスフェクションまたは感染のいずれかによって）前述の昆虫細胞中に導入するステップと、（４）細胞を採取し、ｃｅＤＮＡベクターを精製するステップと、を含む。ｃｅＤＮＡベクターの産生のために上記の発現カセットおよび２つのＩＴＲ配列を含む核酸構築物は、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、または下記のようにｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスの形態であり得る。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定した組み込み、または当該技術分野において既知の他の方法によって宿主細胞中に導入され得る。
【０３０９】
Ｄ．細胞株：
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの産生において使用される宿主細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９、Ｓｆ２１など）もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞に由来する昆虫細胞株、または他の無脊椎動物、脊椎動物、もしくは哺乳類細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。熟練者に既知の他の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ−７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１  １８０、単球、ならびに成熟および未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のｃｅＤＮＡベクター産生のために、ｃｅＤＮＡ−プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。
【０３１０】
ＣｅＤＮＡ−プラスミドは、当該技術分野において既知の試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）または物理的手段（例えば、電気穿孔）を使用し、一時的なトランスフェクションによってＳｆ９細胞中に導入され得る。代替として、ｃｅＤＮＡ−プラスミドをそれらのゲノム中に安定して組み込んでいる安定したＳｆ９細胞株が確立され得る。そのような安定した細胞株は、選択マーカーを上記のｃｅＤＮＡ−プラスミド中に組み込むことによって確立され得る。細胞株をトランスフェクトするために使用されるｃｅＤＮＡ−プラスミドが、抗生物質などの選択マーカーを含む場合、ｃｅＤＮＡ−プラスミドでトランスフェクトされ、ｃｅＤＮＡ−プラスミドＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込んでいる細胞は、細胞増殖培地への抗生物質の添加によって選択され得る。次いで、細胞の耐性クローンは、単一細胞希釈またはコロニー移動技法によって単離され、伝播され得る。
【０３１１】
Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターを単離し、精製する
ｃｅＤＮＡベクターを取得し、単離するためのプロセスの例は、図４Ａ〜４Ｅおよび下記の特定の実施例に記載されている。本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡ−ベクターは、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（複数可）を発現するプロデューサー細胞から取得され、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスでさらに形質転換され得る。ｃｅＤＮＡベクターの産生に有用なプラスミドには、抗体重鎖および／もしくは抗体軽鎖をコードするプラスミド、または１つ以上のＲＥＰタンパク質をコードするプラスミドが含まれる。例示的なｃｅＤＮＡプラスミドが図６Ａに示されており、ここでアデュカヌマブＨＣをコードする導入遺伝子およびアデュカヌマンＬＣをコードする導入遺伝子は、関心対象の抗体または融合タンパク質の重鎖および／もしくは軽鎖を有する核酸配列で置き換えることができる（例えば、表１〜５を参照）。
【０３１２】
一態様では、ポリヌクレオチドは、プラスミド（Ｒｅｐ−プラスミド）、バクミド（Ｒｅｐ−バクミド）、またはバキュロウイルス（Ｒｅｐ−バキュロウイルス）中のプロデューサー細胞に送達されたＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８もしくは６８）をコードする。Ｒｅｐ−プラスミド、Ｒｅｐ−バクミド、およびＲｅｐ−バキュロウイルスは、上記の方法によって生成され得る。
【０３１３】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法は、本明細書に記載されている。本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド）、バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−バクミド）、および／またはバキュロウイルス（例えば、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス）であり得る。単なる例として、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスおよびＲｅｐ−バキュロウイルスに共感染した細胞から生成され得る。Ｒｅｐ−バキュロウイルスから産生されたＲｅｐタンパク質は、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを複製して、ｃｅＤＮＡベクターを生成する。代替として、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−プラスミド、Ｒｅｐ−バクミド、またはＲｅｐ−バキュロウイルス中で送達されるＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／５２）をコードする配列を含む構築物で安定してトランスフェクトされた細胞から生成され得る。ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスは、細胞に一時的にトランスフェクトされ、Ｒｅｐタンパク質によって複製され、ｃｅＤＮＡベクターを産生し得る。
【０３１４】
バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ−バクミド）は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎｉ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞などの許容昆虫細胞中にトランスフェクトされ得、対称ＩＴＲおよび発現カセットを含む配列を含む組み換えバキュロウイルスである、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを生成し得る。ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを昆虫細胞中に再度感染させて、次世代の組み換えバキュロウイルスを取得することができる。任意に、このステップを一回または複数回繰り返して、より多い量の組み換えバキュロウイルスを産生することができる。
【０３１５】
本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取し、収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存性、細胞形態論、細胞増殖等を考慮して選択され得る。通常、細胞は、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の対部分がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｑｉａｇｅｎ  ＥＮＤＯ−ＦＲＥＥ  ＰＬＡＳＭＩＤ（登録商標）キットなどのプラスミド精製キットを使用して、Ｓｆ９細胞から単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ｃｅＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、ならびに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。
【０３１６】
代替として、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することによって、精製が実装され得る。１つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ  Ｑ（登録商標））上に上清を負荷し、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上でさらなるクロマトグラフィー精製を実施することによって実施され得る。次いで、カプシド不含ＡＡＶベクターは、例えば、沈殿によって回収される。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、エキソソームまたは微粒子の形態で精製され得る。多くの細胞型が、膜微小胞の脱落を介して、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質／核酸カーゴも放出することは、当該技術分野において既知である（Ｃｏｃｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９、ＥＰ１０３０６２２６．１）。そのような小胞は、微小胞（微粒子とも称される）およびエキソソーム（ナノ小胞とも称される）を含み、それらの両方が、タンパク質およびＲＮＡをカーゴとして含む。微小胞は、形質膜の直接出芽から生成され、エキソソームは、多小胞エンドソームと形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを含有する微小胞および／またはエキソソームは、ｃｅＤＮＡプラスミド、またはｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスで形質導入された細胞から単離され得る。
【０３１８】
微小胞は、培養培地を２０，０００ｘｇでの濾過または超遠心分離、および１００，０００ｘｇでのエキソソームにかけることによって単離され得る。超遠心分離の最適な期間は、実験的に決定することができ、小胞が単離される特定の細胞型に依存する。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離（例えば、２０００×ｇで５〜２０分間）によって一掃され、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用し、スピン濃度に供される。微小胞およびエキソソームは、微小胞およびエキソソーム上に存在する特定の表面抗原を認識する特定の抗体を使用することによって、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを介してさらに精製され得る。他の微小胞およびエキソソーム精製方法としては、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、濾過、および特定の抗体またはアプタマーでコーティングされた磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。精製時に、小胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。ｃｅＤＮＡ含有小胞を送達するために微小胞またはエキソソームを使用する１つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体によって認識されるそれらの膜タンパク質上に含めることによって、様々な細胞型に標的化され得ることである。（ＥＰ１０３０６２２６も参照）
【０３１９】
本明細書における本発明の別の態様は、ｃｅＤＮＡ構築物をそれら自体のゲノム中に安定して組み込んでいる宿主細胞株からｃｅＤＮＡベクターを精製する方法に関する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
【０３２０】
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。ｃｅＤＮＡは、実施例の図４Ｄに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
【０３２１】
ＶＩＩ．薬学的組成物
別の態様では、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【０３２２】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに、適切なバッファーに必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を組み込んだ後、ｃｅＤＮＡベクターを含む濾過滅菌によって調製することができ、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化して、その中の導入遺伝子またはドナー配列の治療的発現をもたらし得る。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
【０３２３】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、細胞、例えば対象の細胞に様々な目的のための導入遺伝子を送達するように製剤化することができる。
【０３２４】
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
【０３２５】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、前房内、および硝子体内）、蝸牛内、ならびに粘膜（例えば、経口、直腸、鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。
【０３２６】
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のための１つ以上のｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生される細胞、およびそのような細胞を含むかまたはそのような細胞から産生される生物（動物、植物、または真菌など）も提供される。核酸の送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、およびＤＮＡでの薬剤強化取り込みが含まれ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、インビトロもしくはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
【０３２７】
核酸を細胞に送達するための様々な技法および方法が、当該技術分野において既知である。例えば、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、またはコアシェルナノ粒子中に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化またはカチオン性脂質（もしくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性または中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧもしくはＰＥＧ−脂質複合体）、および任意にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。
【０３２８】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡなどの核酸を細胞に送達するための別の方法は、細胞によって内在化されるリガンドと核酸を複合することによるものである。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的な複合体は、例えば、ＷＯ２０１５／００６７４０、ＷＯ２０１４／０２５８０５、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２００９／０８２６０６、ＷＯ２００９／０７３８０９、ＷＯ２００９／０１８３３２、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００４／０９０１０８、ＷＯ２００４／０９１５１５、およびＷＯ２０１７／１７７３２６に記載されている。
【０３２９】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡなどの核酸はまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ−１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、およびＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
【０３３０】
本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注入、注射、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって使用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応をもたらし得る。
【０３３１】
核酸ベクターの導入のための方法  本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば米国特許第５，９２８，６３８号に記載される方法によって、例えば造血幹細胞中に送達され得る。
【０３３２】
本発明による抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。化合物を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を含むが、これに限定されない例示的なリポソームおよびリポソーム製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号および２０１８年１２月６日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されている。例えば、「薬学的製剤」と題されるセクションを参照されたい。
【０３３３】
当該技術分野において既知の様々な送達方法またはそれらの修正を使用して、ｃｅＤＮＡベクターをインビトロまたはインビボで送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、またはレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、または当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは単独で、裸のＤＮＡとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、または肝臓細胞中に直接注入される。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金またはタングステン球状粒子（１〜３μｍ径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
【０３３４】
抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物は、本明細書で具体的に企図される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、熟練した開業医によって望まれる任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介して、口腔内投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内またはそれらの組み合わせを含む、異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って適切に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメントガン」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、または超音波などの他の物理的方法によって投与することができる。
【０３３５】
場合によっては、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、内臓および肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物および粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注入によって送達される。
【０３３６】
場合によっては、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓または腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、プラスミドＤＮＡのサイズおよび濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たす。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、磁場を使用することによってマグネトフェクションにより送達され、核酸を含有する粒子を標的細胞中に濃縮する。
【０３３７】
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセルまたはカチオン性ポリマーに俗するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、および脂質−ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３８】
Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームにパッケージ化されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生したｓ細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、ＢおよびＴリンパ球、マスト細胞（ＭＣ）、ならびに樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ〜１μｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、３０ｎｍ〜２５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
【０３３９】
Ｂ．微粒子／ナノ粒子：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ５（３）：４９８−５０７によって開示されるように、イオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびコート脂質（ポリエチレングリコール−ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含む。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約１０００ｎｍの間の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約３００ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５〜約２００ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ〜約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。
【０３４１】
当該技術分野において既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、および同第９，５１８，２７２号に記載される。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、例えば、Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５−１０８３によって記載されるように、金ナノ粒子に共有結合され得るか、または金ナノ粒子に非共有結合され得る（例えば、電荷−電荷相互作用によって結合される）。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子−核酸複合体は、例えば、米国特許第６，８１２，３３４号に記載されている方法を使用して産生される。
【０３４３】
Ｃ．複合体
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、複合される（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロール等）、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂ等）、およびポリアミン（例えば、スペルミン）に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１−８０９に開示されている。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、ポリマー（例えば、ポリマー分子）または葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、ＷＯ２０００／３４３４３およびＷＯ２００８／０２２３０９に記載されているように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されているように、ポリ（アミド）ポリマーに複合される。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されているように、葉酸分子に複合される。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されているように、炭水化物に複合される。
【０３４６】
Ｄ．ナノカプセル
代替として、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターのナノカプセル製剤が使用され得る。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方法で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
【０３４７】
Ｅ．リポソーム
本発明による抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【０３４８】
リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に既知である。改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、および同第５，７９５，５８７号）。
【０３４９】
Ｆ．例示的なリポソームおよび脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
本発明による抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要とする細胞への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【０３５０】
ｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号および２０１８年１２月６日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されており、それら全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターについての方法および組成物での使用が想定されている。
【０３５１】
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ〜約５，０００Ｄａであり得る。
【０３５２】
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間〜数週間の期間にわたって送達するリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間〜数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。
【０３５３】
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
【０３５４】
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
【０３５５】
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２〜１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を含む脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
【０３５６】
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
【０３５７】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
【０３５８】
いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０３５９】
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製され、負荷されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３に増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に駆動する。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４〜６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
【０３６０】
いくつかの態様では、本開示は、ｃｅＤＮＡおよびイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製および負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合および核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈および有機溶媒の除去によってさらに安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
【０３６１】
一般に、脂質粒子は、約１０：１〜３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量または重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１〜約２５：１、約１０：１〜約１４：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲内であり得る。脂質およびｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【０３６２】
イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、および膜会合および膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、または例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
【０３６３】
例示的なイオン化可脂質は、国際ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１８／０１１６３３号、同第ＷＯ２０１７／０４９２４５号、同第ＷＯ２０１５／０６１４６７号、同第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１５／０７４０８５号、同第ＷＯ２０１６／０８１０２９号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１７／０７５５３１号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１３／１４８５４１号、同第ＷＯ２０１３／１１６１２６号、同第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、同第ＷＯ２０１３／０１６０５８号、同第ＷＯ２０１２／１６２２１０号、同第ＷＯ２００８／０４２９７３号、同第ＷＯ２０１０／１２９７０９号、同第ＷＯ２０１０／１４４７４０号、同第ＷＯ２０１２／０９９７５５号、同第ＷＯ２０１３／０４９３２８号、同第ＷＯ２０１３／０８６３２２号、同第ＷＯ２０１３／０８６３７３号、同第ＷＯ２０１１／０７１８６０号、同第ＷＯ２００９／１３２１３１号、同第ＷＯ２０１０／０４８５３６号、同第ＷＯ２０１０／０８８５３７号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０１号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０６号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０５号、同第ＷＯ２０１０／０５４３８４号、同第ＷＯ２０１２／０１６１８４号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、同第ＷＯ２０１１／０００１０６号、同第ＷＯ２０１１／０００１０７号、同第ＷＯ２００５／１２０１５２号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０５号、同第ＷＯ２０１３／１２６８０３号、同第ＷＯ２００６／００７７１２号、同第ＷＯ２０１１／０３８１６０号、同第ＷＯ２００５／１２１３４８号、同第ＷＯ２０１１／０６６６５１号、同第ＷＯ２００９／１２７０６０号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０４号、同第ＷＯ２００６／０６９７８２号、同第ＷＯ２０１２／０３１０４３号、同第ＷＯ２０１３／００６８２５号、同第ＷＯ２０１３／０３３５６３号、同第ＷＯ２０１３／０８９１５１号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、および同第ＷＯ２０１３／０８６３５４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１６／０３１１７５９号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０１５１２８４号、同第ＵＳ２０１７／０２１０６９７号、同第ＵＳ２０１５／０１４００７０号、同第ＵＳ２０１３／０１７８５４１号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１５／０１４１６７８号、同第ＵＳ２０１５／０２３９９２６号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１７／０１１９９０４号、同第ＵＳ２０１２／０１４９８９４号、同第ＵＳ２０１５／００５７３７３号、同第ＵＳ２０１３／００９０３７２号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５２３号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２００９／００２３６７３号、同第ＵＳ２０１２／０１２８７６０号、同第ＵＳ２０１０／０３２４１２０号、同第ＵＳ２０１４／０２００２５７号、同第ＵＳ２０１５／０２０３４４６号、同第ＵＳ２０１８／０００５３６３号、同第ＵＳ２０１４／０３０８３０４号、同第ＵＳ２０１３／０３３８２１０号、同第ＵＳ２０１２／０１０１１４８号、同第ＵＳ２０１２／００２７７９６号、同第ＵＳ２０１２／００５８１４４号、同第ＵＳ２０１３／０３２３２６９号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１１／０２５６１７５号、同第ＵＳ２０１２／０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１１／００７６３３５号、同第ＵＳ２００６／００８３７８０号、同第ＵＳ２０１３／０１２３３３８号、同第ＵＳ２０１５／００６４２４２号、同第ＵＳ２００６／００５１４０５号、同第ＵＳ２０１３／００６５９３９号、同第ＵＳ２００６／０００８９１０号、同第ＵＳ２００３／００２２６４９号、同第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号、同第ＵＳ２０１３／０１１６３０７号、同第ＵＳ２０１０／００６２９６７号、同第ＵＳ２０１３／０２０２６８４号、同第ＵＳ２０１４／０１４１０７０号、同第ＵＳ２０１４／０２５５４７２号、同第ＵＳ２０１４／００３９０３２号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡまたはＭＣ３）である：
【化１５】
2021513355.tif 000048
。
【０３６５】
脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９−８５３３に記載されており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、脂質ＡＴＸ−００２である。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１２／０４０１８４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）である。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／１９９９５２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、化合物６または化合物２２である。
【０３６９】
無制限に、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０〜９０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０〜７０％（ｍｏｌ）、３０〜６０％（ｍｏｌ）、または４０〜５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％を含む。
【０３７０】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、およびアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を強化するために用いられる。
【０３７１】
本明細書に開示される方法および組成物での使用が想定される例示的な非カチオン性脂質は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号、および２０１８年１２月６日に提出された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に記載されている。例示的な非カチオン性脂質は、国際出願公開第ＷＯ２０１７／０９９８２３号および米国特許公開第ＵＳ２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜３０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の５〜２０％（ｍｏｌ）または１０〜１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１〜約８：１の範囲である。
【０３７３】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成成分をさらに含み得る。
【０３７４】
脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロールおよびその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体は、国際出願第ＷＯ２００９／１２７０６０号および米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０３７５】
ステロールなどの膜統合性を提供する構成成分は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０〜５０％（ｍｏｌ）、３０〜４０％（ｍｏｌ）である。
【０３７６】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または複合脂質分子をさらに含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／または立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ−脂質複合体、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミド−脂質複合体（ＡＴＴＡ−脂質複合体など）、カチオン性−ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複合脂質分子は、ＰＥＧ−脂質複合体、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）−複合脂質である。例示的なＰＥＧ−脂質複合体としては、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ−ＤＡＧ）（４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−１−Ｏ−（ｗ−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ−脂質複合体は、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、およびＵＳ２０１７／０１１９９０４に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている化合物である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＵＳ２０１５／０３７６１１５またはＵＳ２０１６／０３７６２２４（これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０３７８】
ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスト−５−エン−３［β］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］からなる群から選択され得る。
【０３７９】
ＰＥＧ以外の分子と複合した脂質は、ＰＥＧ−脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミド−脂質複合体（ＡＴＴＡ−脂質複合体など）、およびカチオン性−ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体を、ＰＥＧ−脂質の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ−脂質、（ＰＯＺ）−脂質複合体、ＡＴＴＡ−脂質複合体、およびカチオン性ポリマー−脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ１９９６／０１０３９２号、同第ＷＯ１９９８／０５１２７８号、同第ＷＯ２００２／０８７５４１号、同第ＷＯ２００５／０２６３７２号、同第ＷＯ２００８／１４７４３８号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、および同第ＷＯ２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／００７７８２９号、同第ＵＳ２００５／０１７５６８２号、同第ＵＳ２００８／００２００５８号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、および同第ＵＳ２０１１０１２３４５３号、ならびに米国特許第ＵＳ５，８８５，６１３号、同第ＵＳ６，２８７，５９１号、同第ＵＳ６，３２０，０１７号、および同第ＵＳ６，５８６，５５９号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的および生物作用に従って選択され得る。例えば、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、癌を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗癌剤（例えば、化学療法剤、標的癌療法（小分子または抗体を含むが、これらに限定されない）であり得る。別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗菌剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス化合物）であり得る。さらに別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患または障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫反応を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、または１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質または異なる化合物（治療剤など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物および方法で使用することができる。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激剤である。本明細書では、産生された脂質ナノ粒子に封入された昆虫細胞、または本明細書に記載される抗体もしくは融合タンパク質の産生のための合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
【０３８２】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤をさらに含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、および／またはグリシンをさらに含む。
【０３８３】
ｃｅＤＮＡベクターは、粒子の脂質部分と複合され得るか、または脂質ナノ粒子の脂質位置に封入され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
【０３８４】
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。制限なしに、非二重層の形態には、例えば、３次元のチューブ、ロッド、立方対称等が含まれ得る。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ−ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
【０３８６】
いくつかのさらなる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【０３８７】
脂質構成成分の組成物および濃度を制御することによって、脂質複合体が脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。さらに、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化および／または制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質複合体の組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御できることも明らかとなるであろう。
【０３８８】
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９−８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，１７２−１７６（２０１０）を参照。それら両方は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５〜約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で判定され得る。
【０３８９】
ＶＩＩＩ．使用の方法
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、抗体または融合タンパク質をコードする）を標的細胞（例えば、宿主細胞）に送達するための方法において使用され得る。この方法は、特に抗体または抗原結合断片を、それを必要とする対象の細胞に送達するため、および関心対象の疾患を治療するための方法であり得る。本発明は、抗体または融合タンパク質の発現の治療効果が生じるように、対象の細胞内のｃｅＤＮＡベクターにコードされる抗体または融合タンパク質のインビボ発現を可能にする。これらの結果は、ｃｅＤＮＡベクター送達のインビボおよびインビトロ両方の形態で見られる。
【０３９０】
加えて、本発明は、当該抗体または融合タンパク質をコードする本発明のｃｅＤＮＡベクターの多回投与を含む、それを必要とする対象の細胞中の抗体または融合タンパク質の送達のための方法を提供する。本発明のｃｅＤＮＡベクターは、カプシド形成されたウイルスベクターに対して典型的に観察されるような免疫応答を誘導しないため、そのような複数回投与戦略は、ｃｅＤＮＡベースの系においてより大きな成功を収めるであろう。
【０３９１】
ｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに、抗体または融合タンパク質の十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、静脈内（例えば、リポソーム製剤）、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、筋肉内、および他の投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。
【０３９２】
本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの送達は、発現された抗体または抗原結合断片の送達に限定されない。例えば、従来の方法で産生された（例えば、細胞ベースの産生方法（例えば、昆虫細胞産生方法）を使用して）または合成的に産生された本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子治療の一部を提供するために提供される他の送達系とともに使用され得る。本開示に従ってｃｅＤＮＡベクターと組み合わせることができる系の１つの非限定的な例は、抗体または融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの効果的な遺伝子発現のために１つ以上の補因子または免疫抑制因子を別々に送達する系を含む。
【０３９３】
本発明はまた、治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。選択されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望の抗体または融合タンパク質の転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の抗体または融合タンパク質配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０３９４】
本明細書に提供される組成物およびベクターを使用して、様々な目的のために抗体または融合タンパク質を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、抗体または融合タンパク質産生物の機能を研究するために使用されることが意図される抗体または融合タンパク質をコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図される抗体または融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、コードされる抗体または融合タンパク質は、哺乳動物対象における病態の治療または予防に有用である。抗体または融合タンパク質は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。
【０３９５】
原則として、発現カセットは、突然変異によって減少もしくは欠如している抗体または融合タンパク質をコードする、または過剰発現が本発明の範囲内であると見なされる場合に、治療効果をもたらす核酸または任意の導入遺伝子を含み得る。好ましくは、挿入されていない細菌ＤＮＡは存在せず、好ましくは、本明細書に提供されるｃｅＤＮＡ組成物中に細菌ＤＮＡは存在しない。
【０３９６】
ｃｅＤＮＡベクターは、１種のｃｅＤＮＡベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なる抗体もしくは融合タンパク質、または異なるプロモーターもしくはシス調節エレメントに操作可能に連結されるが同じ抗体または融合タンパク質を発現する複数のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞、組織、器官、または対象に同時にまたは順次に送達され得る。したがって、この戦略では、複数の抗体および／または融合タンパク質の遺伝子療法または遺伝子送達を同時に行うことができる。抗体の異なる部分を別々のｃｅＤＮＡベクターに分離することも可能であり（例えば、抗体または抗原結合断片の機能に必要な異なるドメインおよび／または補因子）、同時にまたは異なる時間に投与することができ、別々に調節可能であり得、それによって追加レベルの抗体または融合タンパク質の発現の制御を付加する。送達はまた、複数回、および重要なことに、ウイルスカプシドの非存在に起因する抗カプシド宿主免疫反応の欠失を仮定して、後に増加または減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド反応は起こらないと予想される。
【０３９７】
本発明はまた、治療有効量の本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０３９８】
ＩＸ．抗体または融合タンパク質の産生のためにｃｅＤＮＡベクターを送達する方法
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、様々な好適な方法によってインビトロまたはインビボで標的細胞に送達され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、単独で適用または注入され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、トランスフェクション試薬または他の物理的手段の助けなしに細胞に送達され得る。代替として、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、細胞へのＤＮＡの進入を促進する任意の当該技術分野において既知のトランスフェクション試薬または他の当該技術分野において既知の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクション、電気穿孔等を使用して送達され得る。
【０３９９】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが通常は困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
【０４００】
本明細書に記載される技術の一態様は、抗体または抗原結合断片を細胞に送達する方法に関する。典型的には、インビボおよびインビトロ方法では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される方法、ならびに当該技術分野で既知の他の方法を使用して細胞に導入されてもよい。本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、生物学的に有効な量で細胞に投与される。ｃｅＤＮＡベクターがインビボで細胞に（例えば、対象に）投与される場合、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的有効量は、標的細胞における抗体または抗原結合断片の形質導入および発現をもたらすのに十分な量である。
【０４０１】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面への、ならびに経皮投与）、リンパ内等、ならびに直接組織または器官注入（例えば、限定されないが、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜を含む筋肉、もしくは脳への）が挙げられる。
【０４０２】
ｃｅＤＮＡベクターの投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。ｃｅＤＮＡベクターの投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内またはその付近）に対するものであり得る。
【０４０３】
任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、および／または予防される病態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクターの性質に依存する。追加として、ｃｅＤＮＡは、単一のベクターまたは複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に複数の抗体を投与できるようにする。
【０４０４】
Ａ．ｃｅＤＮＡベクターの筋肉内投与
いくつかの実施形態では、対象における疾患を治療する方法は、治療有効量の抗体またはその抗原結合断片をコードするｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む。いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象の筋組織に投与される。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの投与は、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、または眼の筋肉からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。いくつかの実施形態では、本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患（例えば、ＰＡＤもしくはうっ血性心不全）を治療、改善、および／または予防するため）。
【０４０６】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの、本発明に従う骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、および／または下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、および／または指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内、四肢灌流（任意に、脚および／もしくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：３４５８−３４６４を参照）ならびに／または直接筋肉内注入によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）に、四肢灌流、任意に単離された四肢灌流（例えば、静脈内または動脈内投与による）によって投与される。実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、「流体力学的」技法を用いることなく投与され得る。例えば、従来のウイルスベクターの（例えば、筋肉への）組織送達は、血管系内の圧力を増加させ、ウイルスベクターが内皮細胞バリアと交差する能力を促進する流体力学的技法（例えば、大容量での静脈内／静脈内投与）によってしばしば強化される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、大量注入および／または血管内圧の上昇（例えば、通常の収縮期圧よりも高い、例えば通常の収縮期血圧よりも血管内圧力の５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下の増加）などの流体力学的技法の不在下で投与することができる。そのような方法は、浮腫、神経損傷、および／または区画症候群などの流体力学的技法に関連する副作用を低減または回避することができる。
【０４０７】
さらに、骨格筋に投与される、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物は、四肢（例えば、上腕、下腕、上脚、および／もしくは下肢）の骨格筋、背中、首、頭（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指に投与することができる。好適な骨格筋には、小指外転筋（手の）、小趾外転筋（足の）、母趾外転筋、第五中足骨外転筋（ａｂｄｕｃｔｏｒ  ｏｓｓｉｓ  ｍｅｔａｔａｒｓｉ  ｑｕｉｎｔｉ）、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、顎二腹筋、背側骨間筋（手の）、背側骨間筋（足の）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短趾伸筋、長趾伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手の）、短小趾屈筋（足の）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大臀筋、中臀筋、小臀筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋（ｉｌｌｉａｃｕｓ）、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｖｅｒｓｉ）、外側翼突筋、外直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（ｌｏｎｇ  ｒｏｔａｔｏｒｓ）、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手の）、虫様筋（足の）、咬筋、内側翼突筋、内直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋（ｓｈｏｒｔ  ｒｏｔａｔｏｒｓ）、ヒラメ筋、頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸部の筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋および小頬骨筋、ならびに当該分野において既知の任意の他の適切な骨格筋が含まれるが、これらに限定されない。
【０４０８】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの、横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。いくつかの実施形態では、発現した導入遺伝子のｃｅＤＮＡベクターから標的組織への送達は、ｃｅＤＮＡベクターを含む合成デポーを送達することによって達成することもでき、ｃｅＤＮＡベクターを含むデポーは、骨格、平滑、心臓および／もしくは横隔膜に移植されるか、または筋肉組織は、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを含むフィルムもしくは他のマトリックスと接触させることができる。そのような移植可能なマトリックスまたは基質は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載されている。
【０４０９】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの、心筋への投与には、左心房、右心房、左心室、右心室、および／または中隔への投与が含まれる。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、および／または冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。
【０４１０】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの、平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、および／またはその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。平滑筋の非限定的な例には、目の虹彩、肺の細気管支、喉頭筋（声帯）、胃、食道、小腸および大腸の筋肉層、胃腸管、尿管、膀胱の排尿筋、子宮子宮筋層、陰茎、または前立腺が含まれる。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患（例えば、ＰＡＤもしくはうっ血性心不全）を治療、改善、および／または予防するため）。代表的な実施形態では、本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、骨格筋、心臓筋および／または横隔膜筋の障害を治療および／または予防するために使用される。
【０４１２】
具体的には、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物は、眼（例えば、外直筋、内直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、下斜筋）、顔面筋（例えば、後頭前頭筋、側頭頭頂筋、鼻根筋、鼻筋、鼻中隔下制筋、眼輪筋、皺眉筋、眉毛下制筋、耳介筋、口輪筋、口角下制筋、笑筋、大頬骨筋、小頬骨筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、下唇下制筋、口角挙筋、頬筋、オトガイ筋）または舌筋（例えば、オトガイ舌筋、舌骨舌筋、小角舌筋、茎突舌筋、口蓋舌筋、上縦舌筋、下縦舌筋、垂直舌筋、および横筋）の１つ以上の筋肉に送達され得ることが企図される。
【０４１３】
（ｉ）筋肉内注入：いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物は、対象における所定の筋肉、例えば、骨格筋（例えば、三角筋、外側広筋、背腹筋の腹側腹筋、または幼児の場合は前外側大腿））の１つ以上の部位に針を使用して注入され得る。ｃｅＤＮＡを含む組成物は、筋細胞の他のサブタイプに導入することができる。筋細胞サブタイプの非限定的な例には、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および／または横隔膜筋細胞が含まれる。
【０４１４】
筋肉内注入のための方法は当業者に知られており、したがって、本明細書では詳細に説明しない。しかしながら、筋肉内注入を行う場合、適切な針のサイズは、患者の年齢およびサイズ、組成物の粘度、および注入部位に基づいて決定されるべきである。表１２は、例示的な注入部位および対応する針のサイズについてのガイドラインを提供する。
【表１２】
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【０４１５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、少量、例えば、所与の対象について表１２に概説される例示的な量で製剤化される。いくつかの実施形態では、必要に応じて、対象は、注入の前に全身麻酔または局所麻酔を投与され得る。これは、上記の一般的な注入部位ではなく、複数回の注入が必要な場合、またはより深部の筋肉が注入される場合に特に望ましい。
【０４１６】
いくつかの実施形態では、筋肉内注入を、エレクトロポレーション、送達圧力、またはトランスフェクション試薬の使用と組み合わせて、ｃｅＤＮＡベクターの細胞取り込みを増強することができる。
【０４１７】
（ｉｉ）トランスフェクション試薬：いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、筋管または筋肉組織へのベクターの取り込みを促進するための１つ以上のトランスフェクション試薬を含む組成物中で製剤化される。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている核酸は、本明細書の他の場所に記載されている方法を使用したトランスフェクションにより、筋細胞、筋管、または筋組織に投与される。
【０４１８】
（ｉｉｉ）エレクトロポレーション：ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡの細胞への侵入を促進するための担体の非存在下、または生理学的に不活性な薬学的に許容される担体（すなわち、カプシド不含非ウイルス性ベクターの筋管への取り込みを改善または増強しない担体）中で投与される。そのような実施形態では、カプシド不含非ウイルスベクターの取り込みは、細胞または組織のエレクトロポレーションによって促進することができる。
【０４１９】
細胞膜は、細胞外への細胞質への通過に自然に抵抗する。この抵抗を一時的に低減するための１つの方法は「エレクトロポレーション」であり、電界を使用して、細胞に永続的な損傷を与えることなく、細胞に細孔を作成する。これらの細孔は、ＤＮＡベクター、医薬品、ＤＮＡ、および他の極性化合物が細胞の内部にアクセスできるように十分な大きさである。時間の経過とともに、細胞膜の孔が閉じ、細胞が再び不透過性になる。
【０４２０】
エレクトロポレーションは、例えば、外因性ＤＮＡを生細胞に導入するために、インビトロおよびインビボの両方の適用で使用することができる。インビトロ適用は、典型的には、生細胞の試料を、例えば、ＤＮＡを含む組成物と混合する。次いで、細胞を平行板などの電極間に配置し、細胞／組成物混合物に電界を印加する。
【０４２１】
インビボエレクトロポレーションにはいくつかの方法があり、電極は、例えば、治療される細胞の領域の上にある表皮を把持するキャリパーなどの様々な構成で提供することができる。代替として、針状電極を組織に挿入して、より深部に位置する細胞にアクセスすることもできる。いずれの場合でも、例えば、核酸を含む組成物が治療領域に注入された後、電極は、領域に電界を印加する。いくつかのエレクトロポレーション適用では、この電界は、約１０〜６０ｍｓ持続期間の１００〜５００Ｖ／ｃｍ程度の単一の方形波パルスを含む。そのようなパルスは、例えば、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．のＢＴＸ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎによって作製されたＥｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  Ｔ８２０の既知のアプリケーションで生成されてもよい。
【０４２２】
典型的には、例えば、核酸の取り込みの成功は、筋肉が速やかに電気的に刺激された場合、または例えば筋肉への注入による組成物の投与直後にのみ起こる。
【０４２３】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションは、電界のパルスを使用して、または低電圧／長パルス治療レジメンを使用して（例えば、方形波パルスエレクトロポレーションシステムを使用して）達成される。パルス電界を生成することができる例示的なパルス発生器は、例えば、指数波形を生成することができるＥＣＭ６００、および方形波を生成することができるＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅＰｏｒａｔｏｒ（Ｔ８２０）を含み、いずれもＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）の部門であるＢＴＸから入手可能である。方形波エレクトロポレーションシステムは、設定された電圧まで急速に上昇し、設定された時間（パルス長）にわたってそのレベルに留まり、その後すぐにゼロまで低下する制御された電気パルスを送達する。
【０４２４】
いくつかの実施形態では、局所麻酔剤は、例えば、本明細書に記載されるカプシド不含非ウイルス性ベクターを含む組成物の存在下で組織のエレクトロポレーションに関連し得る疼痛を軽減するために、治療部位への注入によって投与される。さらに、当業者は、筋肉の線維症、壊死、または炎症をもたらす過剰な組織損傷を最小化および／または防止する組成物の用量が選択されるべきであることを理解するであろう。
【０４２５】
（ｉｖ）送達圧力：いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの筋肉組織への送達は、大容量と四肢（例えば、腸骨動脈）に供給する動脈への迅速な注入との組み合わせを使用する送達圧力によって促進される。この投与方法は、典型的に筋肉が血管クランプの止血帯を使用して体循環から隔離されている間に、ｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を肢血管系に注入することを含む様々な方法によって達成され得る。１つの方法において、組成物は、四肢の脈管構造を通して循環されて、細胞への管外遊出を可能にする。別の方法では、血管内流体力学的圧力を増加させて血管床を拡張し、筋肉細胞または組織へのｃｅＤＮＡベクターの取り込みを増加させる。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ組成物は、動脈に投与される。
【０４２６】
（ｖ）脂質ナノ粒子組成物：いくつかの実施形態では、筋肉内送達のために本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の他の場所に記載されるリポソームを含む組成物中で製剤化される。
【０４２７】
（ｖｉ）筋肉組織を標的とするｃｅＤＮＡベクターの全身投与：いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、間接的送達投与を介して筋肉を標的とするように製剤化され、ｃｅＤＮＡは、肝臓とは対照的に筋肉に輸送される。したがって、本明細書に記載される技術は、例えば、全身投与による、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の筋肉組織への間接投与を包含する。そのような組成物は、局所的、静脈内（ボーラスまたは連続注射による）、細胞内注入、組織内注入、経口、吸入、腹腔内、皮下、腔内で投与することができ、必要に応じてぜん動手段によって、または当業者による他の既知の手段によって送達することができる。薬剤は、必要に応じて、例えば静脈内注入によって全身投与することができる。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの筋肉細胞／組織への取り込みは、ベクターを筋肉組織に優先的に向ける標的化剤または部分を使用することによって増加する。したがって、いくつかの実施形態では、カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターは、身体の他の細胞または組織に存在するカプシド不含ｃｅＤＮＡベクターの量と比較して、筋肉組織に濃縮することができる。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物は、筋細胞への標的化部分をさらに含む。他の実施形態では、発現された遺伝子産物は、作用が望まれる組織に特異的な標的化部分を含む。標的化部分は、細胞または組織の細胞内、細胞表面、または細胞外バイオマーカーを標的化、相互作用、連結、および／または結合することができる任意の分子または分子の複合体を含み得る。バイオマーカーは、例えば、細胞プロテアーゼ、キナーゼ、タンパク質、細胞表面受容体、脂質、および／または脂肪酸を含み得る。標的化部分が、標的、相互作用、連結、および／または結合して、特定の疾患に関連する分子を含むことができるバイオマーカーの他の例。例えば、バイオマーカーは、上皮成長因子受容体およびトランスフェリン受容体などの、癌発生に関係する細胞表面受容体を含み得る。標的化部分には、合成化合物、天然化合物または産生物、高分子実体、生体工学分子（例えば、ポリペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片）、および標的筋組織で発現する分子に結合する小実体（例えば、小分子、神経伝達物質、基質、リガンド、ホルモン、元素化合物））が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０４３０】
ある特定の実施形態では、標的化部分は、例えば、標的細胞の特定の所望の分子を自然に認識する受容体を含む、受容体分子をさらに含み得る。そのような受容体分子には、標的分子との相互作用の特異性を高めるために修飾された受容体、受容体によって自然に認識されない所望の標的分子と相互作用するように修飾された受容体、およびそのような受容体の断片が含まれる（例えば、Ｓｋｅｒｒａ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，１３：１６７−１８７を参照）。好ましい受容体は、ケモカイン受容体である。例示的なケモカイン受容体は、例えば、Ｌａｐｉｄｏｔ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ，３０：９７３−８１およびＯｎｕｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ，２３：４５９−６７に記載されている。
【０４３１】
他の実施形態では、追加の標的化部分は、例えば、トランスフェリン（Ｔｆ）リガンドなどの、標的細胞の特定の所望の受容体を自然に認識するリガンドを含むリガンド分子を含み得る。そのようなリガンド分子には、標的受容体との相互作用の特異性を高めるために修飾されたリガンド、リガンドによって自然に認識されない所望の受容体と相互作用するように修飾されたリガンド、およびそのようなリガンドの断片が含まれる。
【０４３２】
さらに他の実施形態では、標的化部分は、アプタマーを含み得る。アプタマーは、標的細胞の所望の分子構造に特異的に結合するように選択されるオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、典型的には、ファージディスプレイの親和性選択（インビトロ分子進化としても知られている）と同様の親和性選択プロセスの産物である。このプロセスは、例えば、罹患した免疫原が結合している固体支持体を使用して親和性分離のいくつかのタンデム反復を実行し、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って免疫原に結合した核酸を増幅することを含む。したがって、親和性分離の各ラウンドは、所望の免疫原に首尾よく結合する分子の核酸集団を濃縮する。このようにして、核酸のランダムなプールを「教育」して、標的分子に特異的に結合するアプタマーを得ることができる。アプタマーは、典型的にはＲＮＡであるが、限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびホスホロチオエート核酸などのＤＮＡまたはその類似体または誘導体であり得る。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、標的化部分は、カプシド不含非ウイルス性ベクターまたは遺伝子産物が特定の組織に標的化されるように、例えば集束光線から放出される光分解性リガンド（すなわち、「ケージ化」リガンド）を含み得る。
【０４３４】
本明細書では、組成物が対象の１つ以上の筋肉の複数の部位に送達されることも企図される。すなわち、注入は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００の注入部位において行われ得る。そのような部位は、単一の筋肉の領域に広がるか、または複数の筋肉に分散することができる。
【０４３５】
Ｂ．非筋肉部位への抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの投与
別の実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターが、ＣＮＳに（例えば、脳または眼に）投与される。ｃｅＤＮＡベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉、皮質、基底核、海馬、および偏桃体を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、ならびに下丘中に導入されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターはまた、網膜、角膜、および／または視神経などの眼の異なる領域に投与されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達されてもよい。抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、さらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与されてもよい。
【０４３６】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域（複数可）に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、および眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ中の所望の領域または区画への直接注入（例えば、定位的注入）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。さらなる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。さらに追加の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等）を治療、改善、および／または予防することができる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。
【０４３８】
Ｃ．エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
【０４３９】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは、薬学的担体と組み合わせて「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞内で産生される、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質（導入遺伝子または異種ヌクレオチド配列と呼ばれることもある）をコードすることができる。例えば、本明細書で論じられる治療方法における本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを培養した細胞に導入し、発現した抗体または融合タンパク質を、例えば、抗体および融合タンパク質の産生のために細胞から単離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む培養細胞は、抗体または融合タンパク質の商業的産生に使用することができ、例えば、抗体または融合タンパク質の小規模または大規模バイオ製造の細胞源として役立つ。代替実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、小規模な産生を含む抗体または融合タンパク質のインビボ産生ならびに抗体および融合タンパク質の商業的な大規模産生のために、宿主非ヒト対象の細胞に導入される。
【０４４１】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、獣医学および医学の両方の用途で使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、およびキジ）および哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、およびウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、少年、および成人を含む。
【０４４２】
Ｄ．用量範囲
本明細書では、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む治療方法が提供される。当業者によって理解されるように、「有効量」という用語は、疾患の治療のための「治療有効量」での抗体または融合タンパク質の発現をもたらす、投与されたｃｅＤＮＡ組成物の量を指す。
【０４４３】
インビボおよび／またはインビトロアッセイを任意に用いて、使用のための最適投与量範囲を特定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路および病態の重症度に依存し、当業者の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定され得る。
【０４４４】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されるもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。
【０４４５】
特定の「治療効果」を達成するために必要な本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患または障害、および遺伝子（複数可）、ＲＮＡ産物（複数可）、または得られる発現タンパク質（複数可）の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化する。当業者は、前述の因子ならびに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患または障害を有する患者を治療するためのｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。
【０４４６】
最適な治療反応を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、いくつかの用量が毎日投与され得るか、または治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、または対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量およびスケジュールを容易に判定することができる。
【０４４７】
「治療有効量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注入は、多量を必要とする）。例えば、ヒト対象の骨格筋または心筋への直接インビボ注入の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ〜１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなる。ｃｅＤＮＡベクターを送達するためにエキソソームまたは微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ〜約１００ｇのベクターを送達することが予想される。さらに、治療有効量とは、疾患の１つ以上の症状の低減をもたらすが、著しいオフターゲットまたは著しい有害副作用には至らない、対象に影響を与えるのに十分な量の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡベクターの量である。一実施形態では、「治療有効量」は、疾患バイオマーカーの発現の統計的に有意な測定可能な変化または所与の疾患症状の低減をもたらすのに十分である、発現した抗体または融合タンパク質の量である。そのような有効量は、所与のｃｅＤＮＡベクター組成物についての臨床試験および動物実験で評価することができる。
【０４４８】
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の配合は、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与および治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
【０４４９】
インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０６細胞）に送達される本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１〜１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１〜２０μｇ、より好ましくは１〜１５μｇまたは８〜１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より高い用量を必要とする。エキソソームまたは微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定されるが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。
【０４５０】
疾患の治療のために、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの適切な投与量は、治療される特定のタイプの疾患、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、一度にまたは一連の治療にわたって適切に患者に投与される。本明細書では、様々な時点にわたる単回投与または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むがこれらに限定されない、様々な投薬スケジュールが企図される。
【０４５１】
疾患のタイプおよび重症度に応じて、ｃｅＤＮＡベクターは、コードされた抗体または融合タンパク質が、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、１５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、またはその範囲内の任意の投与量）で発現される量で、１回以上の別々の投与、または持続注入によって投与される。ｃｅＤＮＡベクターの１つの典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、約１５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲でコードされた抗体または融合タンパク質の発現をもたらすのに十分である。ｃｅＤＮＡベクターの１つの例示的な用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の、本明細書に開示されるコードされた抗体または融合タンパク質の発現をもたらすのに十分な量である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）でコードされた抗体または融合タンパク質の発現をもたらすのに十分な量のｃｅＤＮＡベクターの１回以上の用量を患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５０ｍｇ〜２５００ｍｇの範囲の総用量について、コードされた抗体または融合タンパク質の発現をもたらすのに十分な量である。ｃｅＤＮＡベクターの例示的な用量は、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２４００ｍｇ、または約２５００ｍｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）でコードされた抗体または融合タンパク質の総発現をもたらすのに十分な量である。ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または融合タンパク質の発現は、本明細書の調節スイッチによって、または代替として対象に投与される複数用量のｃｅＤＮＡベクターによって慎重に制御され得るため、ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または融合タンパク質の発現は、発現された抗体または融合タンパク質の用量が断続的に、例えば、毎週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、毎月、２ヶ月毎、３ヶ月毎、または６ヶ月毎に投与され得るような方法で制御され得る。この治療法の進行は、従来の技法およびアッセイによって監視され得る。
【０４５２】
ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇの用量で、または一定用量、例えば３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ以上で、コードされた抗体または融合タンパク質の発現をもたらすのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または融合タンパク質の発現は、抗体または融合タンパク質が一定期間にわたって毎日、隔日、毎週、２週間毎、または４週間毎に発現されるように制御される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または融合タンパク質の発現は、抗体または融合タンパク質が一定期間にわたって２週間毎または４週間毎に発現されるように制御される。ある特定の実施形態では、期間は、６ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、５年、１０年、１５年、２０年、または患者の生涯である。
【０４５３】
治療は、単一用量または複数用量の投与を必要とし得る。いくつかの実施形態では、複数の用量を対象に投与することができ、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシドの非存在に起因して、抗カプシド宿主免疫反応を誘起する誘起しないため、実際に、必要に応じて複数の用量を投与することができる。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１〜１００、好ましくは２〜２０用量であり得る。
【０４５４】
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本開示によって記載されるｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫反応の欠失（すなわち、カプシド構成成分の非存在）は、複数の場合に抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与できるようになる。いくつかの実施形態では、異種核酸が対象に送達される場合の数は、２〜１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）である。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１０回より多く対象に送達される。
【０４５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴週（例えば、７歴日）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月あたり１回（例えば、３０歴日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴年（例えば、３６５日または閏年では３６６日）あたり１回だけ対象に投与される。
【０４５６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの２回以上の投与（例えば、２、３、４回またはそれ以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって（例えば、毎日、毎週、毎月、毎年等）、所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
【０４５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターによってコードされる治療用抗体は、それが対象において少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月／１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、少なくとも５０年以上にわたって発現されるように、調節スイッチ、誘導性または抑制性プロモーターによって調節され得る。一実施形態では、発現は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを所定のまたは所望の間隔で繰り返し投与することによって達成することができる。代替として、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ等）の構成成分をさらに含み、実質的に永久的な治療または疾患の「治癒」のための抗体をコードする１つ以上の核酸配列の挿入を可能にし得る。遺伝子編集構成成分を含むそのようなｃｅＤＮＡベクターは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６４２４２に開示されており、限定されないが、抗体をコードする核酸をアルブミン遺伝子またはＣＣＲ５遺伝子などのセーフハーバー領域に挿入するために、５´および３´相同性アーム（例えば、配列番号１５１〜１５４、またはそれに対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％または、８０％の相同性を有する配列）を含み得る。
【０４５８】
治療の持続期間は、対象の臨床的進歩および治療への応答性に依存する。継続的で比較的低い維持量は、最初のより高い治療量の後に企図される。
【０４５９】
Ｅ．単位剤形
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的組成物は、単位剤形で都合よく提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、蒸発器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となる。
【０４６０】
Ｘ．治療の方法
本明細書に記載される技術はまた、開示されるｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、ならびに例えば、エクスビボ、生体外、インビトロ、およびインビボ適用、方法論、診断手順、ならびに／または遺伝子療法レジメンを含む様々な方法で開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを使用する方法を実証する。
【０４６１】
一実施形態では、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターから発現される発現された治療用抗体は、疾患の治療に機能的である。好ましい実施形態では、治療用抗体は、それが望まれない限り、免疫系反応を引き起こさない。
【０４６２】
治療有効量の、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、筋細胞もしくは組織、または他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患または障害を治療する方法が、本明細書に提供される。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実施されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む。特に、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望の抗体または融合タンパク質の転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の抗体または抗原結合断片ＤＮＡ配列を含み得る。本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０４６３】
本発明のｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、１種以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、または賦形剤と一緒に含む、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクター組成物および製剤が、本明細書に開示される。そのような組成物は、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための、１つ以上の診断的または治療的キットに含まれ得る。一態様では、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全は、ヒト疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全である。
【０４６４】
本明細書に記載される技術の別の態様は、診断的または治療的に有効な量の、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に提供するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示されるある量のｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象の細胞、組織、または器官に、ｃｅＤＮＡベクターからの抗体または抗原結合断片の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的または治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターによって発現される抗体または抗原結合断片を対象に提供することを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
【０４６５】
本明細書に記載される技術の別の態様は、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも抗体または融合タンパク質の産生のための開示されるｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための量および時間にわたって投与するステップを含む。そのような実施形態では、対象は、抗体／抗原結合断片の有効性、または代替として、対象における特定のタンパク質または組織位置（細胞および細胞内位置を含む）に対する抗原または抗原結合断片の検出について評価することができる。したがって、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、癌または他の適応症の検出のためのインビボ診断ツールとして使用することができる。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
【０４６６】
別の態様は、疾患または病態の１つ以上の症状を治療または低減するためのツールとしての、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターの使用である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節または構造タンパク質に関与し得るが、典型的には常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、補充療法のための正常な遺伝子の発現の増加をもたらす経路でタンパク質を中和する抗体または融合タンパク質を送達することができ、同様にいくつかの実施形態では、中和抗体または融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターを使用して、疾患の動物モデルを作成することができる。不均衡病態の場合、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、モデルシステムにおいて病態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その病態に対処する試みに使用することができる。したがって、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、病態は、疾患を引き起こす、またはそれをより重篤にする欠乏または不均衡を部分的または全体的に修繕することによって治療される。
【０４６７】
一実施形態では、筋肉内送達および筋肉における抗体の導入遺伝子の発現を使用して、筋肉特異的疾患を治療するか、または代替として、治療用導入遺伝子産物が遠位部位で作用するためのタンパク質産生の貯蔵所として作用することができることが本明細書で企図される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、筋肉において抗体または融合タンパク質を発現させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、標的遺伝子の発現および／または活性を増加させる。他の実施形態では、遺伝子産物は、標的遺伝子の発現および／または活性を減少させる。
【０４６８】
Ａ．宿主細胞：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、抗体または抗原結合断片導入遺伝子を対象の宿主細胞に送達する。いくつかの実施形態では、対象の宿主細胞は、ヒト宿主細胞であり、例えば、血液細胞、幹細胞、造血細胞、ＣＤ３４＋細胞、肝細胞、癌細胞、血管細胞、筋細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼もしくは網膜細胞、上皮もしくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、または哺乳類起源の任意の他の細胞（無制限に、肝（すなわち、肝臓）細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎（すなわち、腎臓）細胞、ニューロン細胞、血液細胞、骨髄細胞、もしくは遺伝子療法が企図される対象の任意の１つ以上の選択された組織を含む）が挙げられる。一態様では、対象宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。
【０４６９】
本開示はまた、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む、上述のような組み換え宿主細胞に関する。したがって、当業者には明らかであるように、目的に応じて複数の宿主細胞を使用することができる。構築物、またはドナー配列を含む本明細書に開示される抗体もしくは融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入して、ドナー配列が、前述のように染色体組み込み体として維持されるようにする。宿主細胞という用語は、複製中に生じる突然変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ドナー配列およびその供給源に大きく依存する。
【０４７０】
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物、または真菌細胞などの真核生物であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞（例えば、初代細胞、幹細胞、または不死化細胞株）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターをエクスビボで投与され、次いで遺伝子治療事象の後に対象に送達され得る。宿主細胞は、任意の細胞型、例えば、体細胞または幹細胞、人工多能性幹細胞、または血液細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞、または骨髄細胞であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、同種細胞である。例えば、Ｔ細胞ゲノム操作は、癌免疫療法、ＨＩＶ療法（例えば、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５などの受容体ノックアウト）などの疾患調整、および免疫不全療法に有用である。Ｂ細胞上のＭＨＣ受容体は、免疫療法の標的となり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾型宿主細胞、例えば、骨髄幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、または人工多能性幹細胞を、治療用タンパク質の発現のために患者に移植して戻すことができる。
【０４７１】
Ｃ．遺伝子療法のための追加の疾患：
一般に、上記の説明に従って本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、任意の抗体または抗原結合断片を送達して、対象における異常タンパク質発現または遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、または改善することができる。例示的な病態としては、嚢胞性線維症（および他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症および他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇および他の神経障害、癌、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（および他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、および亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）および心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個人の治療において有利に使用され得る。
【０４７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、遺伝子または遺伝子産物の突然変異によって引き起こされる疾患または障害を治療、改善、および／または予防することができる。ｃｅＤＮＡベクターで治療され得る例示的な疾患または障害としては、代謝疾患または障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン蓄積疾患）；尿素サイクル疾患または障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積疾患または障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群））；肝疾患または障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）；血液疾患または障害（例えば、血友病（ＡおよびＢ）、サラセミア、および貧血症）；癌および腫瘍、ならびに遺伝子疾患または障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７３】
いくつかの実施形態では、血液中の分泌および循環のための抗体もしくは融合タンパク質の産生のため、あるいは障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、ＶＩＩＩ）、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群等）またはリソソーム蓄積症（ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］もしくはファブリー病［α−ガラクトシダーゼＡ］）またはグリコーゲン蓄積疾患（ポンペ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ］など）を治療、改善、および／または予防するために、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、抗体または融合タンパク質を骨格筋、心筋、または横隔膜筋に送達することができる。代謝障害を治療、改善、および／または予防するための他の好適なタンパク質は、上に記載される。
【０４７４】
他の実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、それを必要とする対象の代謝障害を治療、改善、および／または予防する方法で抗体または抗原結合断片を送達することができる。例示的な代謝障害および抗体または抗原結合断片が、本明細書に記載されている。任意に、ポリペプチドが分泌される（例えば、その未変性状態の分泌ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば、当該技術分野において既知のような分泌シグナル配列との操作可能な会合によって分泌されるように操作されたポリペプチド）。
【０４７５】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを、任意の好適な手段によって、任意に、ｃｅＤＮＡベクターを含む呼吸域粒子のエアロゾル懸濁液を投与する（これを対象が吸入する）ことによって、対象の肺に投与することができる。呼吸域粒子は、液体または固体であり得る。ｃｅＤＮＡベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に既知であるように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いるなど、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ｃｅＤＮＡベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、薬学分野において既知の技法によって、任意の固体粒子薬剤エアロゾル生成器を用いて同様に産生され得る。
【０４７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳、眼）の組織に投与することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子障害、神経変性障害、精神障害、および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療、改善、または予防するために投与され得る。ＣＮＳの例示的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥーレット症候群、原発性側索硬化症、筋委縮性側索硬化症、進行性筋萎縮、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊椎または頭部傷害に起因する外傷、タイ・サック病、リーシュ・ナイアン病、癲癇、脳梗塞、気分障害（例えば、抑うつ、双極性感情障害、持続性感情障害、二次気分障害）を含む精神障害、統合失調症、薬物依存（例えば、アルコール依存および他の薬物依存）、ノイローゼ（例えば、不安症、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲痛、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、偏執病、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、悪液質、拒食症、および過食症）、ならびにＣＮＳの癌および腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７７】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで治療、改善、または予防され得る眼障害としては、網膜、後視床路、および視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が挙げられる。多くの眼科疾患および障害は、（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性の３種類の適応症の１つ以上に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを用いて、抗血管新生因子、抗炎症性因子、細胞変性を遅らせる、細胞節約を促進する、または細胞増殖を促進する因子、およびそれらの組み合わせを送達することができる。糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のいずれかで１つ以上の抗血管新生抗体または融合タンパク質を送達することによって治療され得る。本発明のｃｅＤＮＡベクターを治療、改善、または予防され得る追加の眼疾患としては、地図状萎縮、血管性または「滲出型」黄斑変性、スタルガルト病、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、アッシャー症候群、弾性線維性偽性黄色腫（ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性（ＸＬＲＰ）、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、全脈絡膜萎縮、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）、色盲、錐体杆体変性、フックス角膜内皮変性症、糖尿病黄斑浮腫、ならびに眼の癌および腫瘍が挙げられる。
【０４７８】
いくつかの実施形態では、炎症性眼疾患または障害（例えば、ブドウ膜炎）は、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、または予防され得る。１つ以上の抗炎症性抗体または融合タンパク質は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体または前眼房）投与によって発現され得る。
【０４７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、レポーターポリペプチドをコードする導入遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質またはアルカリホスファターゼなどの酵素）に関連する抗体または抗原結合断片をコードすることができる。いくつかの実施形態では、実験または診断の目的で有用なレポータータンパク質をコードする導入遺伝子は、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のもののうちのいずれかから選択される。いくつかの態様では、レポーターポリペプチドに連結された抗体または融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターを、診断目的のために、ならびに有効性を決定するため、またはそれらが投与される対象におけるｃｅＤＮＡベクターの活性のマーカーとして使用することができる。
【０４８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象の免疫原性ポリペプチドまたは免疫原に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を発現することができる。抗体または抗原結合断片は、当該技術分野において既知の関心対象の任意の免疫原をコードし得、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌抗原、ウイルス抗原等からの免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８１】
Ｄ．ｃｅＤＮＡベクターを使用した良好な遺伝子発現の試験
当該技術分野で周知のアッセイを使用して、ｃｅＤＮＡベクターによる抗体または抗原結合断片の遺伝子送達の効率を試験することができ、インビトロおよびインビボの両方のモデルで実施され得る。ｃｅＤＮＡによる抗体または抗原結合断片の発現のレベルは、抗体または抗原結合断片のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを測定することによって（例えば、逆転写ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））当業者により評価され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、例えば、蛍光顕微鏡法または発光プレートリーダーによりレポータータンパク質の発現を調べることによって、抗体または抗原結合断片の発現を評価するために使用できるレポータータンパク質を含む。インビボ適用の場合、タンパク質機能アッセイを使用して、所与の抗体または抗原結合断片の機能を試験して、遺伝子発現が良好に起こったかどうかを判断することができる。当業者は、インビトロまたはインビボでｃｅＤＮＡベクターによって発現された抗体または抗原結合断片の機能性を測定するための最良の試験を決定することができるであろう。
【０４８２】
本明細書では、細胞または対象におけるｃｅＤＮＡベクターからの抗体または抗原結合断片の遺伝子発現の効果は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１０か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年にわたって継続し得るか、または永続的であり得ることが企図される。
【０４８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセット、発現構築物、またはｃｅＤＮＡベクター中の抗体または抗原結合断片は、宿主細胞に対してコドン最適化され得る。本明細書で使用される場合、「コドン最適化される」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒト（例えば、ヒト化）の細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）または別の公的に入手可能なデータベースを使用して判定され得る。
【０４８４】
Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターからの抗体発現を評価することによって有効性を決定する
本質的に、タンパク質発現を決定するための当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、ｃｅＤＮＡベクターからの所望の抗体の発現を分析することができる。そのような方法／アッセイの非限定的な例には、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、親和性ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、連続希釈、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴分析、速度論的排除アッセイ、質量分析、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびＰＣＲが含まれる。
【０４８５】
インビボでの抗体発現を評価する場合、分析のために生物学的試料を対象から取得することができる。例示的な生体試料には、生体液試料、体液試料、血液（全血を含む）、血清、血漿、尿、唾液、生検および／または組織試料等が含まれる。生体試料または組織試料はまた、腫瘍生検、便、脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、皮膚の外切片、呼吸器、腸管、尿生殖路、涙、唾液、母乳、細胞（血液細胞を含むがこれに限定されない）、腫瘍、臓器、およびインビトロ細胞培養成分の試料を含むがこれらに限定されない、個人から分離された組織または体液の試料も指し得る。この用語はまた、上述の試料の混合物も含む。「試料」という用語は、未処置または前処置済み（または前処理済み）の生体試料も含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアッセイおよび方法に使用される試料は、試験される対象から収集された血清試料を含む。
【０４８６】
Ｆ．臨床パラメーターによって発現された抗体の有効性を決定する
関節リウマチまたは癌（乳癌、黒色腫等を含むがこれらに限定されない）などの所与の疾患（すなわち、機能的発現）に対するｃｅＤＮＡベクターによって発現された所与の抗体または抗原結合断片の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、癌の兆候または症状のいずれか１つまたはすべてが有益な方法で変更された場合、または他の臨床的に許容される疾患の症状またはマーカーが、例えば、本明細書に記載される治療用抗体をコードするするｃｅＤＮＡベクターでの治療後に少なくとも１０％向上または改善された場合、その用語が本明細書において使用されるように、治療は「有効な治療」と見なされる。有効性はまた、疾患の安定化、または医療介入の必要性（すなわち、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる）によって評価される個人の悪化の失敗によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／または本明細書に記載されている。治療は、個人または動物（いくつかの非限定的な例は、ヒトまたは哺乳動物を含む）における疾患の任意の治療を含み、以下を含む：（１）疾患を阻害すること、例えば、疾患（例えば、関節炎、癌）の進行の停止もしくは遅延させること、または（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の軽減を引き起こすこと、および（３）疾患の発症の可能性を防止もしくは低減すること、または疾患に関連する二次的疾患／障害（例えば、関節リウマチによる手の変形、もしくは癌転移）を防止すること。
【０４８７】
疾患の治療のための有効量とは、それを必要とする哺乳動物に投与したとき、その用語が本明細書で定義されているように、その疾患に対して有効な治療をもたらすのに十分である量を意味する。薬剤の有効性は、所与の疾患に特有の物理的指標を評価することによって決定することができる。例えば、癌の物理的指標には、疼痛、腫瘍サイズ、腫瘍成長率、血球数等が含まれるが、これらに限定されない。
【０４８８】
ＸＩ．抗体または融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの様々な適用
本明細書に開示されるように、本明細書に記載される抗体または融合タンパク質の産生のための組成物およびｃｅＤＮＡベクターを使用して、一連の目的のために抗体または融合タンパク質を発現させることができる。一実施形態では、抗体または融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターを使用して、例えば、抗体または融合タンパク質の標的の機能を研究するために、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成することができる。いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターは、哺乳動物対象の病態または障害の治療、予防、または改善に有用である。
【０４８９】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質は、発現の増加、遺伝子産物の活性の増加、または遺伝子の不適切な上方調節に関連する疾患を治療するのに十分な量で対象のｃｅＤＮＡベクターから発現され得る。そのような実施形態では、発現された抗体または融合タンパク質は、標的であるタンパク質または遺伝子産物の活性を阻害もしくは抑制または他の方法で減少させるように機能する、または抗体もしくは融合タンパク質が特異的に結合する、遮断または中和抗体または融合タンパク質であり得る。
【０４９０】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質は、タンパク質の発現の低下、発現の欠如、または機能不全に関連する疾患を治療するのに十分な量で対象のｃｅＤＮＡベクターから発現させることができる。例えば、発現された抗体または融合タンパク質は、活性化抗体または融合タンパク質であり、例えば、タンパク質を刺激するかまたはタンパク質のリプレッサーを阻害することにより、対象における発現および／または活性が減少したタンパク質の活性または機能を増大させることができる。
【０４９１】
導入遺伝子は、それ自体が転写される遺伝子のオープンリーディングフレームでなくてもよいことが当業者によって理解されるであろう。代わりに、それは標的遺伝子のプロモーター領域またはリプレッサー領域であり得、ｃｅＤＮＡベクターは、関心対象の遺伝子の発現をそのように調整する結果でそのような領域を修飾し得る。
【０４９２】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のための組成物およびｃｅＤＮＡベクターを使用して、上記のような様々な目的のために抗体または抗原結合断片を送達することができる。
【０４９３】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における病態の治療、改善、または予防に有用である、１つ以上の抗体または融合タンパク質をコードする。ｃｅＤＮＡベクターによって発現された抗体または融合タンパク質は、異常な遺伝子配列に関連する疾患を治療するのに十分な量で患者に投与され、これはタンパク質発現の増加、タンパク質の過剰活性、標的遺伝子またはタンパク質の発現の低減、発現の欠如、または機能不全のうちのいずれか１つ以上をもたらし得る。
【０４９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、診断およびスクリーニング方法での使用が想定され、それにより、抗体または抗原結合断片は、細胞培養系、または代替としてトランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定的に発現される。
【０４９５】
本明細書に記載されている技術の別の態様は、本明細書に開示されている抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターで哺乳動物細胞の集団を形質導入する方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも有効量の本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡのうちの１つ以上を含む組成物を、その集団の１つ以上の細胞に導入するステップを含む。
【０４９６】
追加として、本発明は、１つ以上の追加の成分で配合されるか、またはそれらの使用のために１つ以上の指示で調製された、本明細書に開示される抗体もしくは融合タンパク質の産生のための開示されるｃｅＤＮＡベクターもしくはｃｅＤＮＡ組成物の１つ以上を含む、組成物、ならびに治療および／または診断キットを提供する。
【０４９７】
本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターが投与される細胞は、任意のタイプのものであり得、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に脳細胞を含む）、肺細胞、腎細胞、上皮細胞（例えば、胃および呼吸器上皮細胞）、筋細胞、樹状細胞、膵細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。代替として、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。さらなる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。なおもさらなる代替として、細胞は、癌または腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上に示されるように、任意の種の起源に由来し得る。
【０４９８】
Ａ．市販の抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、バイオリアクターを使用して、または所望の宿主での産生のために、商業的設定での抗体または融合タンパク質の産生に使用することができる。
【０４９９】
例えば、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む細胞は、抗体または融合タンパク質の商業的産生に使用することができ、例えば、抗体または融合タンパク質の小規模または大規模バイオ製造の細胞源として役立つ。代替実施形態では、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターは、小規模な産生を含む抗体または融合タンパク質のインビボ産生ならびに抗体および融合タンパク質の商業的な大規模産生のために、宿主非ヒト対象の細胞に導入される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、腹水腫瘍を使用することにより、例えば、ラット、マウス、ウマ、ヤギ等において、インビボで抗体または融合タンパク質を産生することができる。
【０５００】
いくつかの実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターを使用して、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成することができ、次いで、これをＣＡＲ  Ｔ細胞の生成に使用することができる。ＣＡＲは、特定のモノクローナル抗体から可変の選択された単鎖断片、および１つ以上のＴ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインの融合タンパク質である。このＴ細胞の遺伝的修飾は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して起こり得る。したがって、本明細書では、キメラ抗原受容体を発現するｃｅＤＮＡベクターを、例えばエクスビボＴ細胞に投与して、限定されないが、白血病、乳癌、肺癌、卵巣癌等の癌の治療のためにＣＡＲ  Ｔ細胞を操作できることが企図される。
【０５０１】
Ｂ．抗体または融合タンパク質の産生および精製
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、インビトロまたはインビボのいずれかで抗体または融合タンパク質を産生するために使用されるものとする。この方法で産生された抗体または融合タンパク質は、単離され、所望の機能について試験され、研究でのさらなる使用または治療的処置として精製され得る。抗体または融合タンパク質の産生の各システムには、独自の利点／欠点がある。インビトロで産生された抗体または融合タンパク質は容易に精製することができ、短時間で抗体または融合タンパク質を産生することができるが、インビボで産生された抗体または融合タンパク質は、グリコシル化などの翻訳後修飾を有し得る。
【０５０２】
免疫化およびライブラリー表示（例えば、ファージ表示）などの抗体を生成するための従来の技法は、伝統的なベクター（例えば、プラスミド、ウイルス等）の代わりにｃｅＤＮＡを使用することにより、抗体または抗体成分をコードするように適応させることができる。さらに、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、バイオリアクター、バイオリアクター生成、または所望の宿主、細胞、組織、もしくは臓器における抗体の産生における従来のベクターに取って代わることができる。そのような技法は当業者に知られており、本明細書では詳細に説明されない。
【０５０３】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、ハイブリドーマ細胞株において所望の抗体を発現させることができる。ハイブリドーマ細胞株を生成するための方法は、当該技術分野において知られている。大規模な抗体産生のために、ハイブリドーマ細胞は、静止または撹拌細胞懸濁培養、ローラーボトル培養、またはバイオリアクター（例えば、中空繊維バイオリアクター）のいずれかで増殖させることができる。膜ベースの培養システムを使用して、インビトロで抗体を産生することもでき、この場合、細胞培養は、酸素およびガスの移動を促進する特殊なガス処理膜によって栄養素から分離される。代替として、ハイブリドーマ細胞がマトリックス上に固定化され、新鮮な培養培地が継続的に供給される、マトリックスベースの培養系。
【０５０４】
ｃｅＤＮＡベクターを使用して産生された抗体は、当業者に既知の任意の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、沈殿、または電気泳動を使用して精製することができる。
【０５０５】
本明細書に記載される方法および組成物によって産生された抗体は、所望の標的タンパク質への結合について試験することができる。
【０５０６】
ＸＩＩＩ．様々な他の実施形態
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
【０５０７】
１．２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に位置付けられたプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１つのその導入遺伝子をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む、ＤＮＡベクターであって、ＩＴＲが、任意に同じまたは異なるＩＴＲであり得、それらが異なるＩＴＲである場合、ＩＴＲの一方は、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲの一方は、他方のＩＴＲに対して欠失、挿入、または置換を含み、導入遺伝子が、抗体もしくはその断片、または融合タンパク質であり、ＤＮＡが、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状の連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する、ＤＮＡベクター。
【０５０８】
２．抗体が、全長抗体またはその断片である、パラグラフ１に記載のベクター。
【０５０９】
３．抗体が、モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ´断片、または単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）である、パラグラフ２に記載のベクター。
【０５１０】
４．ＤＮＡベクターが、分泌配列および重鎖タンパク質をコードする第１の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターと、軽鎖タンパク質をコードする第２の導入遺伝子に操作可能に連結された第２のプロモーターとを含む、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載のベクター。
【０５１１】
５．導入遺伝子が、融合タンパク質をコードし、融合タンパク質が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、パラグラフ１〜４のいずれか１つに記載のベクター。
【０５１２】
６．抗体が、表１〜５から選択される抗体である、パラグラフ１〜５のいずれか１つに記載のベクター。
【０５１３】
７．ＩＴＲが、機能的末端分解部位を含み、Ｒｅｐ結合部位が、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲであるか、または２つのＩＴＲが、対称もしくは実質的に対称であるか、または２つのＩＴＲが、非対称であるか、または２つのＩＴＲが、表７、９Ａ、９Ｂ、および１０に列挙されたものから選択される、パラグラフ１〜６のいずれか１つに記載のベクター。
【０５１４】
８．抗体が、アデュカヌマブである、パラグラフ１に記載のベクター。
【０５１５】
９．抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、パラグラフ１〜８のいずれか１つに記載のベクター。
【０５１６】
１０．抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体である、パラグラフ１〜９のいずれか１つに記載のベクター。
【０５１７】
１１．細胞またはその集団において抗体を発現させるための方法であって、有効量のパラグラフ１〜１０に記載のＤＮＡベクターを細胞またはその集団に投与し、細胞またはその集団を、細胞内で抗体を発現する条件下で培養することを含む、方法。
【０５１８】
１２．ＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡベクターが、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、パラグラフ１１に記載の方法。
【０５１９】
１３．抗体またはその断片が、細胞から分泌される、パラグラフ１１または１２に記載の方法。
【０５２０】
１４．抗体またはその断片が、イントラボディとして細胞内に保持される、パラグラフ１１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【０５２１】
１５．細胞が、哺乳動物細胞である、パラグラフ１１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０５２２】
１６．細胞が、ヒト細胞である、パラグラフ１５に記載の方法。
【０５２３】
１７．抗体が、細胞から単離され、精製される、パラグラフ１５に記載の方法。
【０５２４】
１８．治療用抗体を対象に送達するための方法であって、パラグラフ１〜１０に記載のＤＮＡベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、方法。
【０５２５】
１９．対象における疾患を治療するための方法であって、パラグラフ１〜１０に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を対象に投与し、それにより、対象において治療用抗体を発現させ、疾患を治療することを含む、方法。
【０５２６】
２０．ｃｅＤＮＡベクターが、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、パラグラフ１８または１９に記載の方法。
【０５２７】
２１．治療用抗体が、それが発現された細胞から分泌される、パラグラフ１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０５２８】
２２．治療用抗体が、それが発現された細胞内に保持される、パラグラフ１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０５２９】
２３．細胞またはその集団が、バイオリアクターで培養される、パラグラフ１１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０５３０】
２４．対象における疾患の治療に使用するための、パラグラフ１〜１０のいずれか１つに記載のベクターを含む、組成物。
【０５３１】
２５．対象の疾患の治療における、パラグラフ１〜１０のいずれか１つに記載のベクターを含む組成物の使用。
【０５３２】
２６．対象における疾患の治療のための薬剤の調製における、パラグラフ１〜１０に記載のいずれか１つによるベクターを含む組成物の使用。
【実施例】
【０５３３】
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。本明細書に記載される野生型または修飾型ＩＴＲのうちのいずれかからｃｅＤＮＡベクターを構築できること、および以下の例示的な方法を使用して、そのようなｃｅＤＮＡベクターの活性を構築し、評価できることを当業者は理解するであろう。これらの方法は、ある特定のｃｅＤＮＡベクターを用いて例示されているが、それらは、説明に沿って任意のｃｅＤＮＡベクターに適用可能である。
【０５３４】
実施例１：昆虫細胞ベースの方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを構築する
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の実施例１に記載されている。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノム等）からのテンプレートの切除（レスキュー）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
【０５３５】
ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ−プラスミドに由来する。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、各ｃｅＤＮＡ−プラスミドのポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲおよび右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列の間には、（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）から）を有する。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１〜Ｒ６）（図１Ａおよび図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入して、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）およびＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中に設計される。これらの配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ  Ｂプラスミドにクローニングした。
【０５３６】
ｃｅＤＮＡ−バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼプラスミドの形質転換体および維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β−ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍＬの培地中で培養した。
【０５３７】
組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドをＥ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍＬの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞または細胞残屑から分離した。
【０５３８】
任意に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０〜５００ｍＬの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４〜１５ｎｍのナイーブ直径から）１８〜１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０５３９】
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性または力価を判定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５〜２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０５４０】
ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図８Ａに開示される「Ｒｅｐ−プラスミド」は、Ｒｅｐ７８（配列番号１３１もしくは１３３）およびＲｅｐ５２（配列番号１３２）またはＲｅｐ６８（配列番号１３０）およびＲｅｐ４０（配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において産生された。Ｒｅｐ−プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ−プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「Ｒｅｐ−バクミド」）を生成した。Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）を含む正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン）中に播種した。組み換えバクミド（Ｒｅｐ−バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ−バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。
【０５４１】
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ−バキュロウイルス）を、培養物から単離した。任意に、第１世代のＲｅｐ−バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０〜５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０５４２】
ｃｅＤＮＡベクターの生成および特性評価
図４Ｂを参照して、次に、（１）ｃｅＤＮＡ−バクミドを含有する試料またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス、および（２）上記のＲｅｐ−バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００および１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４〜５日後に、細胞の直径および生存率が検出される。細胞直径が１８〜２０ｎｍに到達し、生存性が約７０〜８０％であったとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭＩＤＩ  ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
【０５４３】
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定した。
【０５４４】
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件または変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって特定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、ならびに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体および二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
【０５４５】
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、共感染Ｓｆ９細胞から得られたＤＮＡ（本明細書に記載される）を、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片についてさらに分析した。図４Ｄおよび４Ｅに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが期待される。
【０５４６】
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると特定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さであるとき（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する（図４Ｄを参照）。
【０５４７】
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３×および２／３×のＤＮＡベクター長の産生物を生成するであろう関心対象のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットまたは脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）Ｇ−２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）で消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０×変性溶液（１０×＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、１０×色素を添加し、緩衝せず、１０×変性溶液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ  ＮａＯＨで以前にインキュベートされた０．８〜１．０％ゲル上で４×に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲルおよびゲルボックス中で均一であり、１×変性溶液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズおよび所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解すであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１×ＴＢＥまたはＴＡＥ中で中和し、蒸留水または１×ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを含む１×ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００Ｘ濃縮物）および落射蛍光灯（青色）またはＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。
【０５４８】
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ−プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に負荷し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミド滴定を使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる。
【０５４９】
比較目的で、実施例１は、昆虫細胞ベースの方法およびポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用するｃｅＤＮＡベクターの産生を記載し、また参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の実施例１にも記載される。例えば、実施例１に従って本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノム等）からのテンプレートの切除（レスキュー）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
【０５５０】
昆虫細胞を使用する方法でｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ−プラスミドに由来する。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、各ｃｅＤＮＡ−プラスミドのポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲおよび右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列の間には、（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）から）を有する。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１〜Ｒ６）（図１Ａおよび図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入して、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）およびＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中に設計される。これらの配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ  Ｂプラスミドにクローニングした。
【０５５１】
ｃｅＤＮＡ−バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼプラスミドの形質転換体および維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β−ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍＬの培地中で培養した。
【０５５２】
組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドをＥ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍＬの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞または細胞残屑から分離した。
【０５５３】
任意に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０〜５００ｍＬの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４〜１５ｎｍのナイーブ直径から）１８〜１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０５５４】
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性または力価を判定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５〜２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０５５５】
「Ｒｅｐ−プラスミド」は、Ｒｅｐ７８（配列番号１３１もしくは１３３）またはＲｅｐ６８（配列番号１３０）およびＲｅｐ５２（配列番号１３２）またはＲｅｐ４０（配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において産生された。Ｒｅｐ−プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ−プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「Ｒｅｐ−バクミド」）を生成した。Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）を含む正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン）中に播種した。組み換えバクミド（Ｒｅｐ−バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ−バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。
【０５５６】
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ−バキュロウイルス）を、培養物から単離した。任意に、第１世代のＲｅｐ−バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０〜５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０５５７】
ｃｅＤＮＡベクターの生成および特性評価
次いで、（１）ｃｅＤＮＡ−バクミドまたはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを含有する試料、および（２）上記のＲｅｐ−バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００および１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４〜５日後に、細胞の直径および生存率が検出される。細胞直径が１８〜２０ｎｍに到達し、生存性が約７０〜８０％であったとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭＩＤＩ  ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
【０５５８】
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定した。精製されたｃｅＤＮＡベクターは、実施例５に記載される電気泳動方法論を使用して、適切な閉端構成について評価され得る。
【０５５９】
実施例２：二本鎖ＤＮＡ分子からの切除による合成ｃｅＤＮＡ産生
ｃｅＤＮＡベクターの合成産生は、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の実施例２〜６に記載されている。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。手短に言えば、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図７Ａ〜８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、例えば、２０１８年１２月６日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図６を参照されたい）。
【０５６０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチを含む。
【０５６１】
例示の目的で、実施例２は、この方法を使用して生成された例示的な閉端ＤＮＡベクターとして、ｃｅＤＮＡベクターを産生することを説明する。しかしながら、この実施例では、ＩＴＲおよび発現カセット（例えば、異種核酸配列）を含む二本鎖ポリヌクレオチドの切除に続いて、本明細書に記載される遊離３´および５´末端のライゲーションによって閉端ＤＮＡベクターを生成するインビトロ合成産生方法を例証するためにｃｅＤＮＡベクターが例示されているが、当業者は、上で例証されるように、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡ等を含むが、これらに限定されない任意の所望の閉端ＤＮＡベクターが生成されるように、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子を修飾できることを認識する。実施例２に記載される合成産生方法により産生され得る抗体または融合タンパク質の産生のための例示的なｃｅＤＮＡベクターは、「ＩＩＩ  ｃｅＤＮＡベクター全般」と題されたセクションで考察されている。ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体および融合タンパク質は、「ＩＩＣ  ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体および融合タンパク質」と題されたセクションに記載されている。
【０５６２】
この方法は、（ｉ）二本鎖ＤＮＡ構築物から発現カセットをコードする配列を切除することと、（ｉｉ）ＩＴＲのうちの１つ以上でヘアピン構造を形成することと、（ｉｉｉ）ライゲーションによって、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって遊離５´および３´末端を結合することを伴う。
【０５６３】
二本鎖ＤＮＡ構築物は、５´から３´に順番に、第１の制限エンドヌクレアーゼ部位、上流ＩＴＲ、発現カセット、下流ＩＴＲ、および第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。次いで、二本鎖ＤＮＡ構築物を１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、制限エンドヌクレアーゼ部位の両方で二本鎖切断を生成する。１つのエンドヌクレアーゼが両方の部位を標的とすることも、制限部位がｃｅＤＮＡベクターテンプレート内に存在しない限り、各部位を異なるエンドヌクレアーゼによって標的とすることもできる。これにより、制限エンドヌクレアーゼ部位の間の配列が、残りの二本鎖ＤＮＡ構築物から切除される（ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図９を参照）。ライゲーションすると、閉端ＤＮＡベクターが形成される。
【０５６４】
この方法で使用されるＩＴＲの一方または両方は、野生型ＩＴＲであり得る。修飾型ＩＴＲが使用されてもよく、ここで修飾は、ＢおよびＢ´アームならびに／またはＣおよびＣ´アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図６〜８および１０、図１１Ｂを参照）、２つ以上のヘアピンループ（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図６〜８、図１１Ｂを参照）または単一のヘアピンループ（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１０Ａ〜１０Ｂ、図１１Ｂを参照）を有し得る。ヘアピンループ修飾型ＩＴＲは、既存のオリゴの遺伝子修飾によって、または新規の生物学的合成および／もしくは化学合成によって生成され得る。
【０５６５】
非限定的な例では、ＩＴＲ−６左および右（配列番号１１１および１１２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ−Ｂ´およびＣ−Ｃ´アームに４０ヌクレオチドの欠失を含む。修飾型ＩＴＲに残っているヌクレオチドは、単一のヘアピン構造を形成すると予測される。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約−５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。機能的Ｒｅｐ結合部位またはＴｒｓ部位の任意の欠失を含む、ＩＴＲへの他の修飾を行うこともできる。
【０５６６】
実施例３：オリゴヌクレオチド構築によるｃｅＤＮＡ産生
様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例３に提供されており、ｃｅＤＮＡベクターは、５´オリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１１Ｂは、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
【０５６７】
本明細書に開示されるように、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ＷＴ−ＩＴＲ（例えば、図３Ａ、図３Ｃを参照）、または修飾型ＩＴＲ（例えば、図３Ｂおよび図３Ｄを参照）を含み得る。（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２（その全体が本明細書に組み込まれる）の図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、および７Ｂも参照されたい）。例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチドには、限定されないが、配列番号１３４〜１４５が含まれる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の表７を参照）。修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ´アームならびに／またはＣおよびＣ´アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。無細胞合成で使用される、本明細書に記載されるＷＴ−ＩＴＲまたはｍｏｄ−ＩＴＲを含むＩＴＲオリゴヌクレオチドは、遺伝子修飾または生物学的および／もしくは化学的合成によって生成することができる。本明細書で論じられるように、実施例２および３のＩＴＲオリゴヌクレオチドは、本明細書で論じられるように、対称または非対称構成のＷＴ−ＩＴＲまたは修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ−ＩＴＲ）を含み得る。
【０５６８】
実施例４：一本鎖ＤＮＡ分子によるｃｅＤＮＡ産生
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１９／／１４１２２の実施例４において提供され、センス発現カセット配列に隣接する２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖ＤＮＡを使用し、アンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成および／または産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５´および３´末端を互いにライゲーションして、閉じた一本鎖分子を形成する。
【０５６９】
ｃｅＤＮＡベクターの産生のための例示的な一本鎖ＤＮＡ分子は、５´から３´に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第１のＩＴＲを含む。
【０５７０】
実施例４の例示的な方法で使用するための一本鎖ＤＮＡ分子は、本明細書に記載される任意のＤＮＡ合成方法論、例えば、インビトロＤＮＡ合成によって形成され得るか、またはヌクレアーゼでＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）を切断し、得られたｄｓＤＮＡ断片を融解して、ｓｓＤＮＡ断片を提供することによって提供され得る。
【０５７１】
アニーリングは、センス配列およびアンチセンス配列の対の計算された融解温度を下回って温度を下げることによって達成され得る。融解温度は、特定のヌクレオチド塩基含有量、および使用している溶液の特性、例えば塩濃度に依存する。任意の所与の配列および溶液の組み合わせの融解温度は、当業者によって容易に計算される。
【０５７２】
アニーリングされた分子の遊離５´および３´末端は、互いにライゲーションされるか、またはヘアピン分子にライゲーションされてｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。好適な例示的ライゲーション方法論およびヘアピン分子は、実施例２および３に記載されている。
【０５７３】
実施例５：ｃｅＤＮＡの精製および／または産生の確認
例えば、実施例１に記載される昆虫細胞ベースの産生方法、または実施例２〜４に記載される合成産生方法を含む、本明細書に記載される方法によって産生されたＤＮＡベクター産物のいずれも、例えば、熟練者に一般に知られている方法を使用して、不純物、未使用成分、または副産物を除去するために精製することができ、かつ／または分析して、産生されたＤＮＡベクター（この例では、ｃｅＤＮＡベクター）が所望の分子であることを確認することができる。ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡの精製のための例示的な方法は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌｕｓ精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することおよび／またはゲル精製によるものである。
【０５７４】
以下は、ｃｅＤＮＡベクターの同一性を確認するための例示的な方法である。
【０５７５】
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件または変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって特定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、ならびに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体および二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
【０５７６】
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、精製されたＤＮＡを、選択された制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片についてさらに分析した。図４Ｃおよび４Ｄに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが期待される。
【０５７７】
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると特定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さであるとき（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する（図４Ｅを参照）。
【０５７８】
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３×および２／３×のＤＮＡベクター長の産生物を生成するであろう関心対象のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットまたは脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）Ｇ−２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）で消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０×変性溶液（１０×＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、１０×色素を添加し、緩衝せず、１０×変性溶液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ  ＮａＯＨで以前にインキュベートされた０．８〜１．０％ゲル上で４×に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲルおよびゲルボックス中で均一であり、１×変性溶液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズおよび所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解すであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１×ＴＢＥまたはＴＡＥ中で中和し、蒸留水または１×ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを含む１×ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００Ｘ濃縮物）および落射蛍光灯（青色）またはＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。前述のゲルベースの方法は、ｃｅＤＮＡベクターをゲルバンドから単離し、それを復元できるようにすることによって、精製目的に適合させることができる。
【０５７９】
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ−プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に負荷し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミド滴定を使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる。
【０５８０】
実施例６：ｃｅＤＮＡプラスミドからの抗体または融合タンパク質の産生
ｃｅＤＮＡベクターが抗体を発現する能力を実証するために、モノクローナル抗体アデュカヌマブをコードするｃｅＤＮＡプラスミドを生成した。
【０５８１】
アデュカヌマブは、βアミロイドタンパク質の凝集形態を標的とすることにより、アルツハイマー病の治療のために研究されているヒトモノクローナル抗体である。図６Ａは、全長アデュカヌマブを発現するように生成および決定された例示的なプラスミドを示す。図６Ｂは、図６ＡのｃｅＤＮＡプラスミドを使用して得ることができるｃｅＤＮＡベクターの概略図である。図６Ｂの発現カセットは、アデュカヌマブ抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれに異なるプロモーターが使用される二重プロモーター系を示す。アデュカヌマブ抗体の産生に使用されたｃｅＤＮＡプラスミドには、重鎖と軽鎖の発現のためのプロモーターの独自の組み合わせが含まれ、機能的な抗体の形成のための重鎖と軽鎖の適切な比率をもたらす。当業者は、無傷の抗体の効率的な形成を促進するための、発現される重鎖および／または軽鎖の所望の比率の産生をもたらすために、所望の抗体の軽鎖および重鎖のそれぞれについてプロモーターを選択する方法を理解するであろう。
【０５８２】
図６Ａに示されるように「ｐＦＢｄｕａｌ−ｃｅＤＮＡ−アデュカヌマブプラスミド」または「ｃｅＤＮＡ−ＩｇＧ−プラスミド」と称されるｃｅＤＮＡプラスミドは、実施例１に記載されるように調製され、２９３細胞の一時的トランスフェクションに使用された。２９３−６Ｅ細胞は、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で培養した。細胞を、オービタルシェーカー（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）上の５％  ＣＯ２を含む３７℃のエルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中で維持した。トランスフェクションの１日前に、細胞をＣｏｒｎｉｎｇエルレンマイヤーフラスコ中に適切な密度で播種した。トランスフェクションの日に、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を最適な比率で混合し、次いでトランスフェクションの準備が整った細胞が入ったフラスコに添加した。標的タンパク質をコードする組み換えプラスミドを、浮遊２９３−６Ｅ細胞培養に一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション後２日目、４日目、および５日目の細胞密度および生存率を表１３に列挙する。２日目、４日目、および５日目に収集された細胞培養上清試料を、タンパク質発現評価に使用した。トランスフェクション後６日目に採取した細胞培養上清を精製に使用した。
【０５８３】
【表１３】
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【０５８４】
抗体の発現および精製：タンパク質発現レベルを推定するために、トランスフェクション後２日目、４日目、および５日目に細胞培養上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析しました（データは示さず）。タンパク質精製のために、細胞培養ブロスを遠心分離し、上清を濾過した。濾過した上清を１．０ｍＬ／分でＭｏｎｏｆｉｎｉｔｙ  Ａ樹脂プレパックカラム１ｍｌ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の上に負荷し、続いて適切な緩衝液で洗浄し、溶出した。溶出した画分をプールし、緩衝液をＰＢＳ  ｐＨ７．２に交換した。精製されたタンパク質を、分子量、収率、および純度測定のための標準的なプロトコルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８Ａ）、ウェスタンブロット（図８Ｂ）、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（データは示さず）によって分析した。
【０５８５】
要約すると、アデュカヌマブは、浮遊培養で増殖させた２９３−６Ｅ細胞のｐＦＢｄｕａｌ−ｃｅＤＮＡ−アデュカヌマブプラスミドから産生されたｃｅＤＮＡベクターから発現された。抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して識別できるレベルで発現された（図８Ａ）。一段階精製の後、抗体は、還元条件下で約５５ｋＤａおよび約２５ｋＤａ、非還元条件下で約１５０ｋＤａの推定分子量で検出された（図８Ｂ）。これらのデータは、抗体の重鎖および軽鎖がこのシステムで完全抗体に自己集成したことを示している。
【０５８６】
実施例７：インビトロでの組み換え抗体の大規模産生
アデュカヌマブの重鎖および軽鎖をコードする配列を含むｃｅＤＮＡプラスミドは、実施例１および５で前述したように産生され、例えば、無血清条件で増殖するように適応されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｒ７９０−０７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の大規模浮遊培養へとトランスフェクトされ得る。懸濁液および無血清適応ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、１Ｘ１０５〜５Ｘ１０５生細胞／ｍＬの密度で、ベントキャップ（Ｓｉｇｍａ）付きの１２５ｍＬ滅菌エルレンマイヤーフラスコ内のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、オービタルシェーカープラットフォーム上で１３５ｒｐｍで回転させながら培養する。１Ｘ１０６生細胞／ｍＬで３０ｍＬの細胞を含む各１２５ｍＬフラスコを、製造元の指示に従って、ｃｅＤＮＡ  Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（３：１  Ｆｕｇｅｎｅ６：ｃｅＤＮＡ）でトランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間後、選択物（５０ｍｇ／ｍＬ）を細胞に添加し、細胞を、２Ｘ１０５〜５Ｘ１０５生細胞／ｍＬの密度で２週間にわたって選択物下で維持し、続いて１Ｌのシェーカープラスコ（Ｓｉｇｍａ）、１Ｌのスピナーボトル（Ｓｉｇｍａ）または５ＬのＷａｖｅバイオリアクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に拡張する。試料は、４８時間毎に収集され、ＩｇＧ発現レベルは、抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって決定される。ピーク発現時に培養上清を採取し、１０００Ｘｇで１５分間遠心分離し、０．４５ｍｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、使用するまで０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で４℃で保存する。抗体は、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および０．２μｍ濾過済み緩衝液を使用した５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による親和性クロマトグラフィーで精製され得る。例えば、カラムは、１０カラム容量（ＣＶ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）洗浄緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化され、上清は２ｍＬ／分の流量で負荷され、その後１０ＣＶの洗浄緩衝液で平衡化される。抗体を０．２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．３）で溶出し、２．５ｍＬの画分を、中和のために０．５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を含む管に収集した。
【０５８７】
実施例８：全長アデュカヌマブを発現するｃｅＤＮＡベクターの作製およびインビトロでの抗体のｃｅＤＮＡ発現
アデュカヌマブまたはＧＦＰを発現するｃｅＤＮＡプラスミドまたはｃｅＤＮＡベクターは、実施例１において調製されるｃｅＤＮＡ  Ａｄｕ−Ｆｕｌｌ−ＩｇＧ１プラスミド（ｐＦＢｄｕａｌ−ｃｅＤＮＡ−アデュカヌマブプラスミドまたはｃｅＤＮＡ−ＩｇＧ−プラスミド）（図６Ａ）を使用して、実施例１および５に記載されるように調製された。産生および精製されたｃｅＤＮＡベクター（「ｃｅＤＮＡ  ＩｇＧ」と称される）またはｃｅＤＮＡプラスミドの収量は、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて決定された。製造元の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。７２時間後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、全細胞上清を収集し、フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮した。得られた抗体の産生を、ウェスタンブロットによって調べた。細胞上清および溶解物試料を濃度で正規化し、それにより等量のタンパク質を負荷した。調製した試料を、ヒートブロック内で７０℃で１０分間煮沸し、次いで氷上に置いた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で２００Ｖで３２分間泳動させた後、標準的な手法を使用してニトロセルロース膜に移した。市販のヒトＩｇＧを陽性対照として使用した（Ａｂｃａｍ，Ｓｉｇｍａ）。膜を遮断緩衝液（Ｏｄｙｓｓｅｙ）で室温で３０分間遮断した。タンパク質バンドは、５分間ポンソーＳ染色で膜を染色し、その後蒸留水で洗浄し、ＴＢＳＴで脱色することによって可視化した。次いで、遮断緩衝液中で１：５０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに複合された一次抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を穏やかに撹拌しながら、膜を４℃で一晩プローブした。次いで、ブロットをＴＢＳＴで毎回５分間３回洗浄し、ＥＣＬキット（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で発達させ、ゲルイメージングシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ  Ｂｏｘ  Ｍｉｎｉ）を使用して撮像した。
【０５８８】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００トランスフェクション手順のトランスフェクション効率は、ｃｅＤＮＡ−ＧＦＰプラスミド（図９Ａ、上パネル）またはｃｅＤＮＡ−ＧＦＰベクター（図９Ａ、下パネル）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の蛍光を調べることによって評価された。図９Ａに示されるように、両方の試料は有意な蛍光を示し、トランスフェクションが両方のケースで成功したことを示している。各試料（図９Ｂ、下パネル）の有意なタンパク質含有量にもかかわらず、発現したアデュカヌマブの存在は、ｃｅＤＮＡ−ＩｇＧプラスミドまたはｃｅＤＮＡ−ＩｇＧ構築物のいずれかでトランスフェクトされた細胞からの試料でのみ検出された（図９Ｂ、上パネル、重鎖および軽鎖の両方が観察された）。これは、ｃｅＤＮＡベクターが２９３Ｔ細胞でアデュカヌマブを発現したことを示した。
【０５８９】
実施例９：発現した抗体の同一性の確認
アデュカヌマブをコードする関心対象の核酸を含むプラスミドを、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３−６Ｅ）細胞での発現のために調製した。ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞は、無血清培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。細胞を、オービタルシェーカー上の５％ＣＯ２を含む３７℃のエルレンマイヤーフラスコ中で維持した。トランスフェクションの１日前に、細胞をエルレンマイヤーフラスコ中に適切な密度で播種した。トランスフェクションの日に、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を最適な比率で混合し、次いでトランスフェクションの準備が整った細胞が入ったフラスコに添加した。標的タンパク質をコードする組み換えプラスミドを、浮遊ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞培養に一時的にトランスフェクトした。６日目に収集した細胞培養上清を精製に使用した。
【０５９０】
細胞培養ブロスを遠心分離し、濾過し、適切な流量で親和性精製カラム（Ｍｏｎｏｆｉｎｉｔｙ  Ａ  Ｒｅｓｉｎ（商標）プレパックカラム、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）上に負荷した。洗浄および溶出後、溶出した画分をプールし、緩衝液を最終製剤緩衝液に交換した。精製されたタンパク質を、（ａ）還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、（ｂ）化学蛍光検出を伴う、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）およびヤギ抗ヒトκＨＲＰを一次抗体として用いたウェスタンブロッティング、および（ｃ）ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）高速液体クロマトグラフィーを使用して分子量および純度を決定するサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。タンパク質濃度は、Ａ２６０／２８０での吸収によって決定された。結果を図１０Ａに示す。ＨＰＬＣ分析は、単一ピークを明らかにした（図１０Ａ）。このタンパク質の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した場合（図８Ａ）、非還元条件（レーン２）では単一のバンドが見られたが、試料を還元条件に供した場合（レーン１）、２つのバンドが見られた。これは、抗体であるタンパク質と一致しており、軽鎖および重鎖サブユニットは、非還元条件下ではジスルフィド結合のままで、単一のバンドとして移動するが、還元条件下では別々のサブユニットに分離し、２つのバンドとして移動する。ウェスタンブロットは、同様のバンディングパターンを示し（図８Ｂ）、検出はヒトＩｇＧおよびヒトκ軽鎖に特異的な一次抗体によるものであったため、抗体の存在をさらに確認した。
【０５９１】
精製されたアデュカヌマブがそのリガンドβ−アミロイド（１−４２）（「Ａβ」）を認識する能力を、ＥＬＩＳＡによって評価した。アミロイドは、インビトロで凝集し、プレートに付着した後、様々な濃度および時間でアデュカヌマブまたは対照抗体に曝露し、その後比色分析に曝露した。合成Ａβ１−４２ペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度のヘキサフルオロ−イソプロパノールで再構成し、風乾し、真空濃縮してフィルムを形成した。フィルムをＤＭＳＯに溶解し、ＡＢ４２オリゴマーおよびＡＢ４２フィブリルを、ＤＭＳＯ再構成モノマーを１００μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに希釈し、３７℃でそれぞれ少なくとも３日間および１週間インキュベートすることによって調製した。ＥＬＩＳＡプレートを凝集したアミロイドでコーティングした。
【０５９２】
手短に言えば、Ａβを調製し、Ｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１１）６７０：１３−３２によって記載される方法に従ってウェスタンブロットを実行し、染色した。等量のＡβを、レーン３、４、および５の各々においてゲル上で流動させた。ニトロセルロースに移した後、各レーンを分離し、異なる一次抗体でプローブした：レーン３には本明細書に記載される精製されたアデュカヌマブ、レーン４には精製された抗β−アミロイド（１７〜２４）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ  ４Ｇ８）、およびレーン５には精製された抗β−アミロイド（１〜１６）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローン６Ｅ１０）。洗浄後、各々を二次抗体としてヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（レーン３）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（レーン４および５）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）でプローブし、ＨＲＰ基質で発達させた。結果を図１０Ｂに示す。他の２つの抗Ａβ抗体と同様に、プラスミドで発現されたアデュカヌマブは、ニトロセルロース固定化Ａβモノマーに結合し、精製されたアデュカヌマブがそのリガンドを期待通りに認識できたことを示している。
【０５９３】
実施例１０：野生型マウスにおける抗体のインビボ発現
野生型左ＩＴＲおよび切断突然変異体右ＩＴＲを持ち、アデュカヌマブ重鎖および軽鎖をコードする導入遺伝子領域を有するｃｅＤＮＡベクターは、各々その独自のＥＦ１プロモーターの制御下で、実施例１および５において上記のように調製し、精製された（「ｃｅＤＮＡ  ＩｇＧベクター」）。肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡ  ＩｇＧベクターまたはｃｅＤＮＡ対照ベクターを、およそ６週齢の雄Ｃ５７ｂｌ／６Ｊマウスに投与した。カプセル化されていないｃｅＤＮＡベクターは、２．２ｍＬの容量で側尾静脈を介した流体力学的静脈内注入により、動物あたり０．００５ｍｇ（群あたり４動物）で投与された。血液試料は、３、７、１４、２１日目、および最終２８日目に各治療動物から収集された。血清試料中の発現したアデュカヌマブの存在は、製造元の指示（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に従って、市販のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｈｕｍａｎ／ＮＨＰ  ＩｇＧキットで任意の特異性のヒト抗体を認識するポリクローナル抗ヒト免疫グロブリン抗体を使用して、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０５９４】
図１１に示されるように、ヒト抗体は、ｃｅＤＮＡ  ＩｇＧベクターで治療したマウスの３日目および７日目の血清試料で容易に検出されたが、ヒト抗体ではなくルシフェラーゼを発現するｃｅＤＮＡで治療したマウスでは観察されなかった。この特定のベクターのこれら２つの時点で観察された血清発現の最大レベルは、およそ５００ｎｇ／ｍＬであった。
【０５９５】
実施例１１：アルツハイマー病マウスモデルにおける抗体のインビボ発現
アデュカヌマブ重鎖および軽鎖をコードする配列を持つｃｅＤＮＡベクターは、実施例１および５で前述されるように産生され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子とともに製剤化され、Ｔｇ２５７６マウス（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１（２）：３７２−３８１（２００１））および正常マウスに投与される。ＬＮＰ−ｃｅＤＮＡベクターは、１．２ｍＬの容量で０．３〜５ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学的投与を介して投与されるか、または例えば腹腔内注入によって投与される。正常なマウスへの投与は、対照として機能し、アデュカヌマブｍＡｂの存在および量を検出するために使用することができる。本明細書および実施例６に記載されるように、インビトロおよびエクスビボの両方の結合アッセイ（凝集したアミロイドおよび脳スライスＩＨＣを有するＥＬＩＳＡがそれぞれ実施される。
【０５９６】
急性投与後、例えば、単一用量のＬＮＰ−ＴＴＸ−Ａｄｕ  ｃｅＤＮＡ血漿および脳濃度は、ＥＬＩＳＡにより、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１０００、および２００日以上等の様々な時点で決定される。具体的には、凍結した脳を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ジエチルアミン（ＤＥＡ）を含有する１０容量（１０ｍＬ／ｇの湿組織）の溶液中でプロテアーゼ阻害剤により均質化し、氷上でおよそ１５〜２０秒間超音波処理する。試料を４℃で３０分間、１００，０００ｇで遠心分離し、上清をＤＥＡ抽出可溶性Ａβ画分として保持する。残りのペレットを１０容量の５Ｍ塩酸グアニジン（Ｇｕ−ＨＣｌ）中に再懸濁し、超音波処理して、上記のように遠心分離する。得られた上清は、グアニジン抽出不溶性Ａβ画分として保持され、残りのペレットは廃棄される。血漿および脳の抗体濃度については、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）を、４℃で一晩、冷たいコーティング緩衝液中５ｕｇ／ｍＬの濃度でＡβ（１−４２）ペプチド（Ａβ４２）によりコーティングする。血漿またはＤＥＡ抽出（すなわち、界面活性剤を含まない）脳ホモジネート試料を最終的な作業濃度に希釈し、室温で２時間インキュベートする。結合は、レポーター抗体、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ヤギ抗ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して決定され、その後、基質ＴＭＢを使用してＨＲＰ活性が測定される。濃度は、精製された抗体を使用して生成された標準曲線との比較によって決定される。代替として、血漿中のＡｂは、に記載されているようにウェスタンブロットを使用して確認される
【０５９７】
Ｔｇ２５７６マウスにおける単回投与後のＡβ沈着物への抗体のインビボ結合は、ビオチン化抗ヒト二次抗体を使用して決定することもでき、陽性対照として連続セクションでエクスビボで実施されたｐａｎ−Ａβ抗体５Ｆ３による染色と比較され得る。組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋され、５μｍで切片化され、脱パラフィン化され、ＥＤＴＡ−ホウ酸塩ベースの熱誘導エピトープ検索（Ｖｅｎｔａｎａ  ＣＣ１）を使用することができる。その後、ヤギ抗ヒト二次抗体を、１：５００希釈で組織に適用し、組織をヘマトキシリンで染色することができる。
【０５９８】
全身投与されたＬＮＰ−ＴＴＸ−Ａｄｕ  ｃｅＤＮＡは、血漿および脳で発現し、実質性アミロイド斑に高親和性で結合することが期待されている。
【０５９９】
実施例１２：ｃｅＤＮＡの投与後のアミロイド負荷の低減についてのアッセイ
Ｔｇ２５７６トランスジェニックマウスへの慢性投与後、アミロイド負荷の低減におけるｃｅＤＮＡ発現アデュカヌマブの有効性を評価する。例えば、０．３、１、３、１０〜３０ｍｇ／ｋｇ等の範囲の用量、またはＰＢＳは、所与の時間枠で、例えば毎週または毎月投与される。血漿および脳の薬物レベルは、実施例８で上述したようにＥＬＩＳＡによって測定される。血漿試料は、最終投与後２４時間〜７２時間に収集され、抗体レベルを測定して用量応答を決定する。
【０６００】
皮質および海馬の総脳アミロイド負荷は、免疫組織化学によって明らかにされる。具体的には、脳を解剖し、１０％中性緩衝ホルマリンに４８〜７２時間浸漬することによって固定する。次いで、固定された脳を処理し、水平方向に埋め込む。各ブロックは、海馬が識別されるまで切片化され、その時点で３００の連続した５μｍ切片（スライドあたり３切片）が得られる。６Ｅ１０およびチオフラビン−Ｓ染色の両方の場合、１４スライド毎に染色した（２２５μｍ毎におよそ１切片）。脳アミロイドを定義する免疫組織化学では、例えば、１：７５０希釈で一次抗体としてのマウス抗Ａβ１−１６モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ６Ｅ１０、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、およびＵｌｔｒａｍａｐ抗マウスアルカリホスファターゼキット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用し、本明細書に記載されるようにＶＩＳＩＯＰＨＡＲＭ（登録商標）ソフトウェアを使用して定量した。スライドを、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴイムノステイナーにかける前に、８８％ギ酸溶液で前処理する。スライドを、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）で対比染色し、カバーガラスをかけ、一晩風乾する。
【０６０１】
６Ｅ１０免疫染色後、製造元の指示に従って、Ａｐｅｒｉｏ  ＸＴ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）全スライドイメージングシステムを２０倍の倍率で用いてスライドを走査する。次いで、デジタル画像を検討し、別々のマスクとして手動で注釈を付けた後、ＶＩＳＩＯＰＨＡＲＭ´＾ソフトウェアで書かれたアルゴリズムを使用して分析することができる。アルゴリズムは、注釈付きの海馬または皮質の領域と、これらの解剖学的領域の実質および血管アミロイドの領域とを１０倍の仮想倍率で決定する。ソフトウェアのトレーニングは、例えば、５０枚のスライドのセットで実施される。またスライドを、（Ｂｕｓｓｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｈ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６５：９８７−９９５（２００４））に記載されるＴｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｓ（Ｔｈｉｏ−Ｓ）で染色し、ＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でカバーガラスをかける。Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｓ染色後、製造元の指示に従って、イメージングシステム、例えば、Ａｐｅｒｉｏ  ＦＬ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）蛍光全スライドイメージングシステムを２０倍の倍率で用いてスライドを走査する。６Ｅ１０と同様に、からの海馬または皮質は、別のマスクとして手動で注釈され、その後、ＶＩＳＩＯＰＨＡＲＭ（登録商標）ソフトウェアで書かれ、蛍光のために適合されたアルゴリズムを使用して分析される。アルゴリズムは、海馬および皮質の領域と、これらの解剖学的領域の実質性および血管アミロイドの領域とを１０倍の仮想倍率で決定する。ソフトウェアのトレーニングは、１０枚のスライドのセットで実施され得る。染色された堆積物が占める総面積は、ＰＢＳ対照と比較して大幅に低減すると予想される。
【０６０２】
実施例１３：インビトロでの抗体およびＦｃ融合タンパク質のｃｅＤＮＡに基づく発現
ｃｅＤＮＡがアデュカヌマブ以外の抗体および免疫グロブリン様分子を発現する能力を評価するために、実施例８の実験を２つの追加のｃｅＤＮＡ構築物で繰り返した。１つは、遺伝子カセットにおけるベバシズマブの軽鎖および重鎖（血管内皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）に特異的に結合する抗体）をコードするものであり、１つはＦｃ融合タンパク質アフリベルセプトをコードするものである（ヒトＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外ドメインのＶＥＧＦ結合部分に融合したヒトＩｇＧ１  Ｆｃ）。非還元試料に関するウェスタンブロットの結果を図１２に示す（６秒および１２秒の異なる露光時間の同じブロットの２つの画像が示される）。アデュカヌマブは、実施例８で以前に見出されたように、ｃｅＤＮＡ−Ａｄｕ−プラスミドおよびｃｅＤＮＡ−Ａｄｕベクタートランスフェクト細胞から再び発現した（レーン５および７）。ベバシズマブは、同様に、ｃｅＤＮＡ−ベバシズマブベクターをトランスフェクトした細胞において発現した（レーン１１）。アフリベルセプトもまた、ｃｅＤＮＡ−アフリベルセプトベクターをトランスフェクトした細胞において発現した（レーン９）。これは、ｃｅＤＮＡ構築物からの様々なＩｇＧおよび免疫グロブリン様分子の細胞における発現が得られることを実証する。
【０６０３】
参考文献
特許および特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書および本明細書の実施例で引用されるすべての刊行物および参考文献は、あたかも個々の刊行物または参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それら全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物および参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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