(57)【要約】  本発明は、成長ホルモンの１つ以上のアミノ酸が置換により改変された成長ホルモン変異体を含む成長ホルモン受容体拮抗剤に関する。また、本発明の成長ホルモン受容体拮抗剤は、成長ホルモン変異体に融合された長時間作用型キャリアをさらに含んでもよい。前記成長ホルモン受容体拮抗剤は、成長ホルモン受容体との結合力が強く、持続的に拮抗作用を示すことができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン（growth hormone）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された成長ホルモン変異体（growth hormone variant）を含有する成長ホルモン受容体拮抗剤（growth hormone receptor antagonist）。
【請求項２】
前記他のアミノ酸への置換は、Ｎ末端から４６番目のアミノ酸のリシンへの置換、１２０番目のアミノ酸のリシンもしくはアルギニンへの置換、又はそれらの置換の組み合わせを含む、請求項１に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項３】
前記他のアミノ酸への置換は、Ｎ末端から１８番目のアミノ酸、２１番目のアミノ酸、５４番目のアミノ酸、６４番目のアミノ酸、１６７番目のアミノ酸、１６８番目のアミノ酸、１７１番目のアミノ酸、１７２番目のアミノ酸、１７４番目のアミノ酸、１７６番目のアミノ酸及び１７９番目のアミノ酸からなる群から選択される１つ以上の位置での置換をさらに含む、請求項２に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項４】
前記他のアミノ酸への置換は、Ｎ末端から１７４番目のアミノ酸のセリンへの置換、２１番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換、又はそれら置換の組み合わせをさらに含む、請求項２に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項５】
前記他のアミノ酸への置換は、Ｎ末端から１８番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換、２１番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換、４６番目のアミノ酸のリシンへの置換、５４番目のアミノ酸のプロリンへの置換、６４番目のアミノ酸のリシンへの置換、１２０番目のアミノ酸のリシン又はアルギニンへの置換、１６７番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換、１６８番目のアミノ酸のアラニンへの置換、１７１番目のアミノ酸のセリンへの置換、１７２番目のアミノ酸のアルギニンへの置換、１７４番目のアミノ酸のセリンへの置換、１７６番目のアミノ酸のチロシンへの置換、及び１７９番目のアミノ酸のトレオニンへの置換からなる群から選択される１つ以上の置換を含む、請求項１に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項６】
前記成長ホルモン変異体は、長時間作用型キャリア（long-acting carrier）が融合された形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項７】
前記長時間作用型キャリアは、前記成長ホルモン変異体のＮ末端又はＣ末端に融合されている、請求項６に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項８】
前記長時間作用型キャリアは、ポリエチレングリコール、脂肪酸、アルブミン又はそのフラグメント、アルブミン結合物質、α１−アンチトリプシン又はその変異体、免疫グロブリンＦｃ又はそのフラグメント、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体又はそのフラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織又はその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン、サッカライド、及び高分子重合体からなる群から選択される、請求項６又は７に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項９】
前記長時間作用型キャリアは、α１−アンチトリプシン又はその変異体である、請求項７に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項１０】
前記α１−アンチトリプシン変異体は、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであり、前記置換は、Ｎ末端から１番目〜２５番目のアミノ酸の１つ以上の位置での置換を含む、請求項９に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項１１】
前記α１−アンチトリプシン変異体は、Ｎ末端から９番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換、２３２番目のアミノ酸のセリンへの置換、３７番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換、及び３５９番目のアミノ酸のトレオニンへの置換からなる群から選択される１つ以上の置換を含む、請求項９又は１０に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項１２】
前記成長ホルモン変異体は、前記長時間作用型キャリアに直接融合されるか、又はリンカーを介して融合される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項１３】
前記リンカーは、ペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーである、請求項１２に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項１４】
前記非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸又はそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項１５】
前記ペプチド性リンカーは、２つ以上のアミノ酸が連結されている、請求項１３に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の成長ホルモン受容体拮抗剤を含む、ヒト成長ホルモンにより誘発される疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
前記疾患は、末端肥大症、巨人症、癌、糖尿病性腎症、関節炎、肺炎、成長ホルモン欠乏症（ＧＨＤ）、特発性低身長、ターナー症候群、プラダー・ウィリー（Prader-Willi）症候群、低出生体重児（small for gestational age）及び慢性腎不全（ＣＲＩ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
成長ホルモン（growth hormone）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された成長ホルモン変異体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を培養するステップを含む、成長ホルモン受容体拮抗剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモン（growth hormone）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された成長ホルモン変異体（growth hormone variant）を含有する成長ホルモン受容体拮抗剤（growth hormone receptor antagonist）に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモンは、成長を促進する内分泌ホルモンである。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、脳下垂体から分泌されて肝臓を含めて様々な組織に作用する。これは、ｈＧＨとの複合体により二量体を形成するｃｌａｓｓ Ｉサイトカイン受容体スーパーファミリーに属するヒト成長ホルモン受容体（ｈＧＨＲ）の細胞外ドメインに結合し（非特許文献１）、後続のシグナル伝達がインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の発現を増加させる（非特許文献２，３）。
【０００３】
ｈＧＨの過度な分泌とそれによるＩＧＦ−１産生の増加は、手足の肥大を典型的な症状とする慢性疾患である末端肥大症を誘発する。末端肥大症の治療方法として、癌性脳下垂体の外科的除去、放射線療法及びドーパミン作動薬の投与が用いられている。しかし、外科的治療に反応しない患者群があり（非特許文献４，５）、放射線療法は効果が低いだけでなく、効果が遅延する（非特許文献６，７）。ｈＧＨ受容体拮抗剤（ｈＧＨＲＡ）は、ｈＧＨの代わりにｈＧＨ受容体を占有することにより、ｈＧＨがｈＧＨ受容体に結合することを防止するので、代替的な治療方法である（非特許文献８，９）。
【０００４】
人体内で長期間持続可能なｈＧＨＲＡは、服用回数を減らして患者の生活の質を向上させることができる。Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔは、ｈＧＨ拮抗剤のペグ化されたバージョンとして市販されている（非特許文献１０，１１）。Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔの長期作用機序は、ポリエチレングリコールポリマーを治療用タンパク質に結合させることにより、分子の大きさを大きくし、腎臓で濾過されず、血流に留まるようにするものである（非特許文献１２）。ペグ化は、タンパク質分解酵素から当該タンパク質を保護するという面もある（非特許文献１３）。しかし、治療用タンパク質に対するペグ化（pegylation）は、その有用性が制限されることがある。ペグ化過程は一連の化学反応を必要とするが、これはコスト効率が悪く、反応生成物は一般的に均質でない。その結果、一般に実現困難な追加の精製ステップを必要とする。また、ペグ化タンパク質は、大きさの小さいポリエチレングリコール（例えば、５ｋＤａ）を用いる場合は安全であると考えられるが、動物研究において、腎臓の空胞形成（renal vacuolation）だけでなく、ペグ化に対する抗体出現の報告もあり、依然として安全面に課題が残っている。さらに、ペグ化されたタンパク質は、元のタンパク質よりタンパク質受容体との結合力が低下する傾向がある（非特許文献１４，１５，１６）。よって、長期間持続し、特に受容体との結合力を向上させ、抑制活性を向上させることができる、ｈＧＨＲＡの代替技術が求められている。また、コスト効率が良く、簡単なプロセスが求められている。
【０００５】
こうした背景の下、本発明者らは、長期間持続し、強力な成長ホルモン受容体抑制活性を示す新規な成長ホルモン受容体拮抗剤ｈＧＨＲＡを設計し、それを試験管内で特性化し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１３−０１３６８８３号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１３−００２９７１３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J.F. Bazan, Haemopoietic receptors and helical cytokines, Immunol. Today. 11 (1990) 350-354.
【非特許文献２】F.F. Casanueva, Physiology of growth hormone secretion and action, Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 21 (1992) 483-517.
【非特許文献３】H. Li, P.M. Bartold, C.Z. Zhang, R.W. Clarkson, W.G. Young, M.J. Waters, Growth hormone and insulin-like growth factor I induce bone morphogenetic proteins 2 and 4: a mediator role in bone and tooth formation, Endocrinology. 139 (1998) 3855-3862. doi:10.1210/endo.139.9.6211.
【非特許文献４】B. Swearingen, F.G. Barker, L. Katznelson, B.M. Biller, S. Grinspoon, A. Klibanski, N. Moayeri, P.M. Black, N.T. Zervas, Long-term mortality after transsphenoidal surgery and adjunctive therapy for acromegaly, J. Clin. Endocrinol. Metab. 83 (1998) 3419-3426.
【非特許文献５】S. Ahmed, M. Elsheikh, I.M. Stratton, R.C. Page, C.B. Adams, J.A. Wass, Outcome of transphenoidal surgery for acromegaly and its relationship to surgical experience, Clin. Endocrinol. (Oxf.). 50 (1999) 561-567.
【非特許文献６】A.L. Barkan, I. Halasz, K.J. Dornfeld, C.A. Jaffe, R.D. Friberg, W.F. Chandler, H.M. Sandler, Pituitary irradiation is ineffective in normalizing plasma insulin-like growth factor I in patients with acromegaly, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (1997) 3187-3191. doi:10.1210/jcem.82.10.4249.
【非特許文献７】A.J. van der Lely, W.W. de Herder, S.W. Lamberts, The role of radiotherapy in acromegaly, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (1997) 3185-3186. doi:10.1210/jcem.82.10.4325.
【非特許文献８】J.J. Kopchick, C. Parkinson, E.C. Stevens, P.J. Trainer, Growth Hormone Receptor Antagonists: Discovery, Development, and Use in Patients with Acromegaly, Endocr. Rev. 23 (2002) 623-646. doi:10.1210/er.2001-0022.
【非特許文献９】A.F. Muller, J.J. Kopchick, A. Flyvbjerg, V.D. Lely, A. Jan, Growth Hormone Receptor Antagonists, J. Clin. Endocrinol. Metab. 89 (2004) 1503-1511. doi:10.1210/jc.2002-022049.
【非特許文献１０】M.O. Thorner, C.J. Strasburger, Z. Wu, M. Straume, M. Bidlingmaier, S.S. Pezzoli, K. Zib, J.C. Scarlett, W.F. Bennett, Growth hormone (GH) receptor blockade with a PEG-modified GH (B2036-PEG) lowers serum insulin-like growth factor-I but does not acutely stimulate serum GH, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84 (1999) 2098-2103. doi:10.1210/jcem.84.6.5732.
【非特許文献１１】V. Goffin, P. Touraine, Pegvisomant. Pharmacia, Curr. Opin. Investig. Drugs Lond. Engl. 2000. 3 (2002) 752-757.
【非特許文献１２】R.J. Ross, K.C. Leung, M. Maamra, W. Bennett, N. Doyle, M.J. Waters, K.K. Ho, Binding and functional studies with the growth hormone receptor antagonist, B2036-PEG (pegvisomant), reveal effects of pegylation and evidence that it binds to a receptor dimer, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001) 1716-1723. doi:10.1210/jcem.86.4.7403.
【非特許文献１３】S. Jevsevar, M. Kunstelj, V.G. Porekar, PEGylation of therapeutic proteins, Biotechnol. J. 5 (2010) 113-128. doi:10.1002/biot.200900218.
【非特許文献１４】R.P. Garay, R. El-Gewely, J.K. Armstrong, G. Garratty, P. Richette, Antibodies against polyethylene glycol in healthy subjects and in patients treated with PEG-conjugated agents, Expert Opin. Drug Deliv. 9 (2012) 1319-1323. doi:10.1517/17425247.2012.720969.
【非特許文献１５】A. Bendele, J. Seely, C. Richey, G. Sennello, G. Shopp, Short communication: renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol-conjugated proteins, Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 42 (1998) 152-157. doi:10.1006/toxs.1997.2396.
【非特許文献１６】V.L. Elliott, G.T. Edge, M.M. Phelan, L.-Y. Lian, R. Webster, R.F. Finn, B.K. Park, N.R. Kitteringham, Evidence for metabolic cleavage of a PEGylated protein in vivo using multiple analytical methodologies, Mol. Pharm. 9 (2012) 1291-1301. doi:10.1021/mp200587m.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、成長ホルモンのアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された成長ホルモン変異体を含有する成長ホルモン受容体拮抗剤を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、成長ホルモン受容体拮抗剤を含有する、ヒト成長ホルモンにより誘発される疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、成長ホルモン受容体拮抗剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
なお、本明細書で開示される各説明及び実施形態はそれぞれの他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本明細書で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【００１３】
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本明細書に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本発明に含まれることが意図されている。
【００１４】
前記課題を解決するための本発明の一態様は、成長ホルモンのアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された成長ホルモン変異体を含有する成長ホルモン受容体拮抗剤を提供する。
【００１５】
本願における「成長ホルモン（growth hormone）」とは、脳下垂体から分泌されて体の成長を促進するペプチドホルモンを意味し、これは体の成長以外に他の物質代謝調節機能も有する。具体的には、成長ホルモンはヒトの成長ホルモン（human growth hormone: hGH）であり、ｈＧＨは公知の通り１９１個のアミノ酸からなる。
【００１６】
本発明における「成長ホルモン変異体」とは、成長ホルモン（growth hormone）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものを意味する。すなわち、１つ以上のアミノ酸の置換を有する成長ホルモンを意味する。
【００１７】
具体的には、前記置換は、成長ホルモンのアミノ酸配列における１２０番目のアミノ酸の置換（より具体的には、リシン又はアルギニンへの置換）を含んでもよい。また、４６番目のアミノ酸の置換（より具体的には、リシンへの置換）を含んでもよい。
【００１８】
さらに、前記置換は、成長ホルモンのアミノ酸配列における１７４番目のアミノ酸の置換（より具体的には、セリンへの置換）を含んでもよく、２１番目のアミノ酸の置換（より具体的には、アスパラギンへの置換）を含んでもよい。
【００１９】
具体的には、前記置換は、アミノ酸配列における１８番目のアミノ酸、２１番目のアミノ酸、４６番目のアミノ酸、５４番目のアミノ酸、６４番目のアミノ酸、１２０番目のアミノ酸、１６７番目のアミノ酸、１６８番目のアミノ酸、１７１番目のアミノ酸、１７２番目のアミノ酸、１７４番目のアミノ酸、１７６番目のアミノ酸及び１７９番目のアミノ酸からなる群から選択される１つ以上の位置の置換を含んでもよい。
【００２０】
より具体的には、前記置換は、成長ホルモンのアミノ酸配列におけるＨ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｑ４６Ｋ、Ｆ５４Ｐ、Ｒ６４Ｋ、Ｇ１２０Ｋ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ及びＩ１７９Ｔから選択される１つ以上の置換を含んでもよい。
【００２１】
場合によっては、前記変異体は、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
【００２２】
本発明の一例として、前記成長ホルモン変異体は、表１の配列番号で表されるタンパク質であってもよいが、これらに限定されるものではない。配列番号１〜９の成長ホルモン変異体は、それぞれ後述する実施例１〜９の成長ホルモン変異体の配列と同一である。一方、実施例１０及び実施例１１は、それぞれ配列番号７及び９の成長ホルモン変異体を含む。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
本発明における「成長ホルモン受容体（Growth Hormone Receptor: GHR）」とは、成長ホルモンに結合し、シグナルを細胞の内部に伝達する受容体を意味する。細胞膜を１回貫通する構造を有し、受容体が活性化すると、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してＳＴＡＴ二量体が核の内部で様々な遺伝子の転写を調節する。成長ホルモン受容体は、肝臓、筋肉、脂肪、腎臓、初期胚及び胎児の組織など、体内全般の組織で発見された。
【００２５】
成長ホルモンが受容体に結合すると、後続のシグナル伝達によりＩＧＦ（insulin like growth factor）−１の分泌が増加する。ｈＧＨの過度な分泌とそれによるＩＧＦ−１産生の増加は、手足の肥大を典型的な症状とする慢性疾患である末端肥大症を誘発する。
【００２６】
本発明における「成長ホルモン受容体拮抗剤（growth hormone receptor antagonist）」とは、成長ホルモン受容体に成長ホルモンが結合することを拮抗し、成長ホルモン受容体と成長ホルモンの結合過多により現れる副作用を抑制するための作用剤を意味する。
【００２７】
具体的には、成長ホルモン受容体拮抗剤は、成長ホルモン受容体との結合力が強く、競合的に成長ホルモンの効能を拮抗することのできる成長ホルモン変異体である。
【００２８】
また、成長ホルモン受容体拮抗剤は、成長ホルモン変異体に融合された長時間作用型キャリアを含むものであってもよい。
【００２９】
本発明における「長時間作用型キャリア」とは、生体内半減期を延長させることができる物質を意味する。本発明による成長ホルモン変異体に、従来から公知の様々な生体内半減期を延長させることが知られている長時間作用型キャリアを融合させると、成長ホルモン受容体を拮抗すると共に生体内半減期を延長させる持続性製剤として用いられるものと予想される。
【００３０】
本願における長時間作用型キャリアとして、腎クリアランス（renal clearance）を減少させることのできる様々なキャリア、具体的には、ポリエチレングリコール、脂肪酸、アルブミン又はそのフラグメント、アルブミン結合物質、α１−アンチトリプシン又はその変異体、免疫グロブリンＦｃ又はそのフラグメント、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体又はそのフラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織又はその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン、サッカライド、及び高分子重合体からなる群から選択される１つ以上が用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
より具体的には、α１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）又はその変異体が長時間作用型キャリアとして用いられる。
【００３２】
α１−アンチトリプシン又はその変異体については、特許文献１及び２に開示されている。具体的には、Ａ１ＡＴは、ヒト血漿において１リットル当たり１．５〜３．５グラムの濃度を有する最も豊富なタンパク質の一つであり、主に肝細胞で合成されて血液に分泌される。α１−アンチトリプシン変異体は、グリコシル化を促進し、その内在的活性をなくすために、Ａ１ＡＴに追加の突然変異を有するように設計されている。α１−アンチトリプシン変異体は、標的タンパク質に融合されると、標的タンパク質の半減期を延長させることができる。
【００３３】
α１−アンチトリプシン変異体技術の主な利点の一つは、非免疫原性である。特に、ヒト血漿のＡ１ＡＴは、肺気腫、肺疾患によるＡ１ＡＴ欠乏患者の治療剤として既に用いられており、毎週の服用量は体重１ｋｇ当たり６０ｍｇと非常に多い。深刻な副作用はまだ報告されておらず、これは治療剤としてのＡ１ＡＴの安全性を示すものである。
【００３４】
本発明においては、成長ホルモン受容体拮抗剤として、α１−アンチトリプシン変異体を成長ホルモン変異体に融合することにより長期間持続するｈＧＨＲＡを提供するが、これに限定されるものではない。前記α１−アンチトリプシン変異体は、α１−アンチトリプシンの配列において１番目〜２５番目のアミノ酸のうち１つ以上の置換を含むものであってもよく、前記成長ホルモン変異体は、成長ホルモンのアミノ酸配列においてＨ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｑ４６Ｋ、Ｆ５４Ｐ、Ｒ６４Ｋ、Ｇ１２０Ｋ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ及びＩ１７９Ｔから選択される１つ以上の置換を含むものであってもよい。
【００３５】
より具体的には、例えばα１−アンチトリプシン変異体は、表２の配列番号１０のアミノ酸配列を有してもよい。本発明のα１−アンチトリプシン変異体は、「ＮｅｘＰ」（特許文献１）であってもよい。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
血漿半減期の延長のためにα１−アンチトリプシン変異体が成長ホルモン変異体に融合された成長ホルモン受容体拮抗剤は、ペグ化された成長ホルモン変異体と比較して、成長ホルモン受容体との結合力が強いだけでなく、成長ホルモンの効能をより強く拮抗することができる。
【００３８】
具体的には、本発明における成長ホルモン受容体拮抗剤としての実施例４、６、７、８、９、１０及び１１は、従来から成長ホルモン抑制剤として知られているＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔと比較しても、ｈＧＨ受容体との結合力が強く、拮抗剤としての活性が高いことを示したが、これらに限定されるものではない（図４及び図５、表４参照）。
【００３９】
長時間作用型キャリアが成長ホルモン変異体に融合された成長ホルモン受容体拮抗剤において、前記長時間作用型キャリアは、前記成長ホルモン変異体のＮ末端又はＣ末端に融合されてもよい。
【００４０】
特に、特定の成長ホルモン変異体において、そのＮ末端に長時間作用型キャリアが融合された成長ホルモン受容体拮抗剤は、Ｃ末端に融合されたものと比較して、成長ホルモン受容体に対する結合力が著しく強いか、成長ホルモンの効能を強く拮抗することができる。本発明の一例として、ｈＧＨ−Ａ７及びｈＧＨ−Ａ９と比較して、ｈＧＨ−Ａ１０及びｈＧＨ−Ａ１１は、同じアミノ酸配列を有する成長ホルモン変異体であっても、変異体のＮ末端に融合されたもののほうが成長ホルモンの効能を著しく強く拮抗することが確認されたが、これらに限定されるものではない（図４のＣ及びＤ、図５、表４参照）。
【００４１】
本願における前記長時間作用型キャリアは、前記成長ホルモン変異体に直接融合されてもよく、リンカーを介して融合されてもよい。
【００４２】
前記リンカーは、長時間作用型キャリアと成長ホルモン変異体の共有結合に用いられて活性に影響を与えないものであればいかなるものでもよい。具体的には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−及びプロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸又はそれらの組み合わせの非ペプチド性リンカーであってもよく、２つ以上のアミノ酸が連結されたペプチド性リンカーであってもよい。一例としてＧＧＧＧＳが挙げられ、長さが様々に調節された（２Ｘ、３Ｘ、４Ｘなど…）リンカーを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
前記課題を解決するための本発明の他の態様は、成長ホルモン受容体拮抗剤を含む、ヒト成長ホルモンにより誘発される疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。ここで用いられる用語は前述した通りである。
【００４４】
本発明における「ヒト成長ホルモンにより誘発される疾患」とは、脳下垂体が成長ホルモンの分泌を正常に調節できずに過剰分泌するなどの原因により誘発される疾患を意味する。一例として、末端肥大症、巨人症、癌、糖尿病性腎症、関節炎、肺炎、成長ホルモン欠乏症（ＧＨＤ）、特発性低身長、ターナー症候群、プラダー・ウィリー（Prader-Willi）症候群、低出生体重児（small for gestational age）、慢性腎不全（ＣＲＩ）などが挙げられる。
【００４５】
また、ヒト成長ホルモンにより誘発される疾患には、成長ホルモンの作用過剰によるＩＧＦ（insulin like growth factor）−１の分泌増加に起因する疾患が含まれる。
【００４６】
本発明の実施例（ｈＧＨ−Ａ１〜ｈＧＨ−Ａ１１）においては、成長ホルモンとその受容体の結合を抑制するので、ヒト成長ホルモンにより誘発される疾患の予防又は治療用途に活用できることが確認されたが、これらに限定されるものではない（実験例及び表４参照）。
【００４７】
前記課題を解決するための本発明のさらに他の態様は、成長ホルモン（growth hormone）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された成長ホルモン変異体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を培養するステップを含む、成長ホルモン受容体拮抗剤の製造方法を提供する。ここで用いられる用語は前述した通りである。
【００４８】
前記細胞は、成長ホルモン変異体の発現ベクターを転移させた細胞であってもよく、一例としてＣＨＯ（Chinese hamster ovary）−Ｋ１などが用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
前記課題を解決するための本発明のさらに他の態様は、前記成長ホルモン受容体拮抗剤を含む薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、ヒト成長ホルモンにより誘発される疾患の予防又は治療方法を提供する。ここで用いられる用語は前述した通りである。
【００５０】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。本発明による製剤は、目的とする投与方法で様々な剤形に作製することができる。
【００５１】
投与は、予防的に又は治療的に行われてもよい。
【００５２】
本発明の製剤の投与頻度は、特にこれらに限定されるものではないが、１日１回投与してもよく、用量を数回に分けて投与してもよい。
【００５３】
本発明による製剤の投与対象となる個体とは、ヒトを含むあらゆる動物を意味する。前記動物は、ヒトだけでなく、それに類似した症状の治療を必要とするウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、カモシカ、イヌ、ネコなどの哺乳動物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
前記課題を解決するための本発明のさらに他の態様は、前記成長ホルモン受容体拮抗剤を含む薬学的組成物における、ヒト成長ホルモンにより誘発される疾患の予防又は治療用途を提供する。ここで用いられる用語は前述した通りである。
【発明の効果】
【００５５】
本発明による成長ホルモン受容体抑制剤は、成長ホルモン受容体との結合力が強く、持続的に拮抗作用を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】成長ホルモンと成長ホルモン受容体が結合された複合体の構造を示す図である（PDB id: 3HHR）。
【図２】ｈＧＨ、ｈＧＨ−Ａ１及びｈＧＨ−Ａ２におけるｈＧＨ効能を示す図である。
【図３】本発明の成長ホルモン受容体拮抗剤としてのｈＧＨＲ−Ａ３のクロマトグラフィーによる精製を示す図である。図３のＡはｈＧＨＲ−Ａ３の精製のための第２イオン交換カラムクロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図であり、図３のＢは各精製分画の１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。図３のＣはサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した、精製されたｈＧＨＲ−Ａ３の純度を示す図である。
【図４】ｈＧＨ−Ａ７、ｈＧＨ−Ａ９、ｈＧＨ−Ａ１０、ｈＧＨ−Ａ１１及びＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔを対象としたｈＧＨ受容体結合分析及びｈＧＨ競合的抑制活性分析の結果を示す図である。
【図５】ｈＧＨ−Ａ１〜ｈＧＨ−Ａ１１と比較例Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔの相対的結合力及びｈＧＨの競合効能の結果をプロットした図である。
【図６】本発明の成長ホルモン受容体拮抗剤を製造する過程の一例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するもので、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００５８】
製造例：成長ホルモン受容体拮抗剤の製造
１．クローニング、形質転換及び細胞培養
ｈＧＨ−ＮｅｘＰのｃＤＮＡクローンは、周知の方法により作製した。ｈＧＨ受容体拮抗剤（ｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰ）は、ｈＧＨ−ＮｅｘＰの遺伝子に対する部位特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）により製造した。その後、突然変異は、ＤＮＡ塩基配列分析により確認した。ＣＨＯ（Chinese hamster ovary）−Ｋ１細胞は、各ｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰクローンの塩基配列を含むプラスミドで一時的に形質転換した。形質転換した細胞は、５％ＣＯ2の加湿培養器において１０％ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ培地（Isocove's Modified Dulbecco's Medium）で７日間成長させた。
【００５９】
２．ｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰの精製
一時的に形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞から一連のカラムクロマトグラフィーによりｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰの変異体を精製した。培養上清液は、同じ体積の緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ８．０）で希釈し、緩衝液Ａで平衡化したイオン交換カラムに適用した。緩衝液Ａで洗浄し、その後緩衝液ＡからＮａＣｌの線形勾配でタンパク質を溶出した。次に、ｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰを含有する分画は、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で平衡化した親和性カラムに直接ロードした。緩衝液ＢからＭｇＣｌ2勾配で分画を溶出した。溶出プールのｐＨ及び電気伝導率を調節し、その後それを緩衝液Ｃ（２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，８０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で平衡化した第２イオン交換樹脂にロードした。タンパク質分画物は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０濃縮器（Sartorius）を用いて濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。
【００６０】
３．ＳＥ−ＨＰＬＣ分析
ｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰの純度を決定するために、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を行った。タンパク質溶液は、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Tosoh）にロードし、ランニングバッファー（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ，ｐＨ６．８）を用いて０．５ｍＬ／分の流速でクロマトグラムを得た。クロマトグラムの主要ピークの面積パーセント（％）を計算した。
【実施例】
【００６１】
成長ホルモン受容体拮抗剤の例示
本発明は、ｈＧＨ配列に対する部位特異的突然変異誘発と持続性を付与するＮｅｘＰ技術により、成長ホルモン受容体拮抗剤の抑制剤を製造することを目的とするものであり、ｈＧＨの１２０番目のアミノ酸が置換された実施例１（ｈＧＨ−Ａ１：Ｇ１２０Ｋ）及び実施例２（ｈＧＨ−Ａ２：Ｇ１２０Ｒ）を製造した。また、前記目的を達成するために、ｈＧＨ配列においてｈＧＨ−Ａ１のｓｉｔｅ １に追加のミューテーションを導入して実施例３〜７を製造した。具体的には、各実施例で置換されたアミノ酸は表３に示すものである。実施例９は、リシンの導入による陽イオン−π相互作用を誘導するために、Ｑ４６Ｋ変異を導入した。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
表３において、ｈＧＨ−Ａ１〜ｈＧＨ−Ａ９はＮｅｘＰが変異体のＣ末端に融合されたものであり、ｈＧＨ−Ａ１０及びｈＧＨ−Ａ１１はＮｅｘＰが変異体のＮ末端に融合されたものである。
【００６４】
前記ｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰタンパク質は、前述した製造例の通り、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換と一連のカラムクロマトグラフィーにより製造した。代表例として、第２イオン交換カラムクロマトグラフィーのクロマトグラムを図３のＡに示す。純粋なタンパク質をクロマトグラフィーから得たところ、精製されたタンパク質は１００ｋＤａと７０ｋＤａの間に移動していた（図３のＢ）。分画番号７〜１４の分画を集め、溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。タンパク質の純度は、ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムの主要ピークから分かるように、９５％の高い純度を示すことが確認された（図３のＣ）。
【００６５】
実験例：ｈＧＨ効能及び受容体結合力分析
１．ｈＧＨ効能の分析方法
この分析のために、ｈＧＨ受容体シグナルにより誘導されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するＨＥＫ２９３Ｆ細胞の染色体にｈＧＨ受容体遺伝子を導入した。生成された細胞株をｈＧＨＲ／Ｌｕｃ／ＨＥＫ２９３Ｆと命名した。ｈＧＨＲ／Ｌｕｃ／ＨＥＫ２９３Ｆを含有する９６ウェル白色プレートにｈＧＨとｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰの一連の希釈液をそれぞれ添加した。プレートを３７℃の５％ＣＯ2培養器で２４時間培養した。培養後に、１００μＬのルシフェラーゼ分析試薬（Steady-Glo（登録商標） luciferase assay system, Promega）を各ウェルに添加し、プレートを包装して光から保護した。室温で５分間放置し、マルチモードマイクロプレートリーダー（SpectraMax M5, Molecular Devices）を用いてウェルからの発光を分析した。
【００６６】
ｈＧＨ、ｈＧＨ−Ａ１及びｈＧＨ−Ａ２において測定された結果を図２に示す。ｈＧＨとは異なり、ｈＧＨ−Ａ１及びｈＧＨ−Ａ２は効能を示さないことが確認された。
【００６７】
２．ｈＧＨ受容体結合分析
ｈＧＨ受容体に対するｈＧＲＡ−ＮｅｘＰの結合親和力は、組換えｈＧＨ受容体Ｆｃキメラを用いる結合分析により評価した。マイクロプレートをｈＧＨ受容体キメラで２５℃にて一晩コーティングした。ＴＰＢＳ緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ緩衝液）で洗浄し、その後試料（実施例１〜１１とＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ）を各ウェルにロードした。サンプルを３回洗浄し、その後抗ｈＧＨ−ポリクローナル抗体−ビオチンとの接合反応を行った。さらに、洗浄ステップを経て、３，３'，５，５'−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）を各ウェルに添加してＴＭＢ反応を施した。反応からの吸光シグナルは４５０〜６５０ｎｍで記録した。
【００６８】
ｈＧＨ−Ａ７（●）、ｈＧＨ−Ａ９（○）及びＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（□）の結合プロファイルを測定した結果を図４のＡに示す。また、ｈＧＨ−Ａ１０（▲）、ｈＧＨ−Ａ１１（△）及びＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（□）の結合プロファイルを測定した結果を図４のＣに示す。
【００６９】
ｈＧＨ−Ａ７及びｈＧＨ−Ａ９は、Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔと比較してｈＧＨ受容体結合力が強いことが分かった。また、ｈＧＨ−Ａ１０及びｈＧＨ−Ａ１１は、Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔと比較してｈＧＨ受容体結合力が著しく強いことが分かった。
【００７０】
３．ｈＧＨ競合的抑制活性分析
ｈＧＨ競合分析により、下流シグナル伝達に対するｈＧＨＲＡ−ＮｅｘＰの抑制活性を分析した。ｈＧＨＲ／Ｌｕｃ／ＨＥＫ２９３Ｆを含有する９６ウェルプレートの各ウェルに実施例１〜１１とＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔの一連の希釈液を添加した。プレートを３７℃の５％ＣＯ2培養器で２４時間培養した。培養後に、１００μＬのルシフェラーゼ分析試薬（Steady-Glo（登録商標） luciferase assay system, Promega）を各ウェルに添加し、プレートを包装して光から保護した。室温で５分間放置し、マルチモードマイクロプレートリーダー（SpectraMax M5, Molecular Devices）を用いてウェルからの発光を分析した。
【００７１】
ｈＧＨ−Ａ７（●）、ｈＧＨ−Ａ９（○）及びＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（□）の結合プロファイルを測定した結果を図４のＢに示す。また、ｈＧＨ−Ａ１０（▲）、ｈＧＨ−Ａ１１（△）及びＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（□）の結合プロファイルを測定した結果を図４のＤに示す。
【００７２】
ｈＧＨ−Ａ７及びｈＧＨ−Ａ９は、Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔと比較してｈＧＨ競合的抑制活性が高いことが分かった。また、ｈＧＨ−Ａ１０及びｈＧＨ−Ａ１１は、Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔと比較してｈＧＨ競合的抑制活性が著しく高いことが分かった。
【００７３】
ｈＧＨ−Ａ１〜ｈＧＨ−Ａ１１と比較例Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔの相対的結合力及びｈＧＨ競合的抑制活性についての分析結果を表４に示す。その結果を図５にプロットした。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
表４に示すように、ｈＧＨ−Ａ４、ｈＧＨ−Ａ６、ｈＧＨ−Ａ７、ｈＧＨ−Ａ８、ｈＧＨ−Ａ９、ｈＧＨ−Ａ１０及びｈＧＨ−Ａ１１は、従来から知られているＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔと比較しても、強いｈＧＨ受容体結合力と高い競合的抑制活性を表して、特にＮｅｘＰが変異体のＮ末端に融合されたｈＧＨ−Ａ１０及びｈＧＨ−Ａ１１は、競合的抑制活性が著しく高かった。
【００７６】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導出されるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月25日(2020.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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