(57)【要約】  本開示は、糖鎖改変、および様々な治療目的で糖鎖改変を活用する方法に関する。
2021506343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体重鎖ＣＨ２領域と、
抗体重鎖ＣＨ３領域と、
糖タンパク質のシアリル化を触媒するシアル酸転移酵素の触媒ドメインと
を含む融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記シアル酸転移酵素がベータ−ガラクトシドアルファ−２，６シアル酸転移酵素１である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記シアル酸転移酵素がヒトシアル酸転移酵素である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記抗体重鎖ＣＨ２領域がヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ２領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記抗体重鎖ＣＨ３領域がヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ３領域である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
抗体重鎖ＣＨ２領域と、
抗体重鎖ＣＨ３領域と、
糖タンパク質のガラクトシル化を触媒するガラクトシル転移酵素の触媒ドメインと
を含む融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記ガラクトシル転移酵素がベータ−１，４−ガラクトシル転移酵素１である、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記ガラクトシル転移酵素がヒトガラクトシル転移酵素である、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記抗体重鎖ＣＨ２領域がヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ２領域である、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記抗体重鎖ＣＨ３領域がヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ３領域である、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含み、場合により請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１４】
抗体重鎖ＣＨ２領域、抗体重鎖ＣＨ３領域、および糖タンパク質のシアリル化を触媒するシアル酸転移酵素の触媒ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、
抗体重鎖ＣＨ２領域、抗体重鎖ＣＨ３領域、および糖タンパク質のガラクトシル化を触媒するガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含む第２の融合ポリペプチドと
を含むヘテロ多量体。
【請求項１５】
前記ヘテロ多量体がヘテロ二量体であり、前記第１の融合ポリペプチドが前記第２の融合ポリペプチドと会合し、これによりヘテロ二量体を形成する、請求項１４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６】
前記シアル酸転移酵素がベータ−ガラクトシドアルファ−２，６シアル酸転移酵素１である、請求項１４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７】
前記シアル酸転移酵素がヒトシアル酸転移酵素である、請求項１４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８】
前記ガラクトシル転移酵素がベータ−１，４−ガラクトシル転移酵素１である、請求項１４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９】
前記ガラクトシル転移酵素がヒトガラクトシル転移酵素である、請求項１４に記載のヘテロ多量体。
【請求項２０】
ＩｇＧ介在性障害を有する対象を処置する方法であって、
請求項１４から１９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を含む組成物の有効量を前記対象に投与するステップ
を含む方法。
【請求項２１】
前記ＩｇＧ介在性障害が炎症である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩｇＧ介在性障害が自己免疫疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が関節炎である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患がグッドパスチャー病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記自己免疫疾患が腎毒性腎炎である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記自己免疫疾患がセリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、または全身性ループスエリテマトーデスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＩｇＧ介在性障害を有する対象を処置する方法であって、
シアル酸転移酵素の触媒ドメインを含む第１のポリペプチドの有効量、およびガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含む第２のポリペプチドの有効量を前記対象に投与するステップ
を含み、
前記シアル酸転移酵素の触媒ドメインが糖タンパク質のシアリル化を触媒し、前記ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインが糖タンパク質のガラクトシル化を触媒する、方法。
【請求項２８】
前記第１のポリペプチドが、抗体重鎖ＣＨ２領域と、抗体重鎖ＣＨ３領域とをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のポリペプチドが、抗体重鎖ＣＨ２領域と、抗体重鎖ＣＨ３領域とをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩｇＧ介在性障害が炎症である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩｇＧ介在性障害が自己免疫疾患である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患が関節炎である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記自己免疫疾患がグッドパスチャー病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記自己免疫疾患が腎毒性腎炎である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記自己免疫疾患がセリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、または全身性ループスエリテマトーデスである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
臓器移植中の対象における抗体介在性損傷を処置する方法であって、
請求項１４から１９のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を含む組成物の有効量を前記対象に投与するステップ
を含む方法。
【請求項３７】
臓器移植中の対象における抗体介在性損傷を処置する方法であって、
シアル酸転移酵素の触媒ドメインを含む第１のポリペプチドの有効量、およびガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含む第２のポリペプチドの有効量を前記対象に投与するステップ
を含み、
前記シアル酸転移酵素の触媒ドメインが糖タンパク質のシアリル化を触媒し、前記ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインが糖タンパク質のガラクトシル化を触媒する、方法。
【請求項３８】
コラーゲン三量体化ドメインおよびシアル酸転移酵素の触媒ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、
コラーゲン三量体化ドメインおよびガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含む第２の融合ポリペプチドと、
コラーゲン三量体化ドメインを含む第３の融合ポリペプチドと
を含むヘテロ多量体であって、
前記第１の融合ポリペプチド、前記第２の融合ポリペプチド、および前記第３の融合ポリペプチドが互いに結合し、前記ヘテロ多量体を形成する、ヘテロ多量体。
【請求項３９】
前記第３の融合ポリペプチドが、シアル酸転移酵素の触媒ドメインをさらに含む、請求項３８のヘテロ多量体。
【請求項４０】
前記第３の融合ポリペプチドが、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインをさらに含む、請求項３８のヘテロ多量体。
【請求項４１】
４つのストレプトアビジンポリペプチドを含む四量体と４つのポリペプチドとを含むヘテロ多量体であって、
前記４つのポリペプチドの各々が、ビオチンと結合し、前記４つのポリペプチドの１つまたは複数が、シアル酸転移酵素の触媒ドメインまたはガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含み、
前記４つのポリペプチドの各々が、前記４つのストレプトアビジンポリペプチドを含む前記四量体に結合する、ヘテロ多量体。
【請求項４２】
前記４つのポリペプチドの各々が、シアル酸転移酵素の触媒ドメインまたはガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含む、請求項４１に記載のヘテロ多量体。
【請求項４３】
前記４つのポリペプチドの各々が、シアル酸転移酵素の触媒ドメインを含む、請求項４１に記載のヘテロ多量体。
【請求項４４】
前記４つのポリペプチドの各々が、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含む、請求項４１に記載のヘテロ多量体。
【請求項４５】
前記４つのポリペプチドの２つが、それぞれシアル酸転移酵素の触媒ドメインを含み、前記４つのポリペプチドの２つが、それぞれガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含む、請求項４１に記載のヘテロ多量体。
【請求項４６】
抗体またはその抗体断片と、
シアル酸転移酵素の触媒ドメインと、
ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインと
を含むヘテロ多量体であって、
前記シアル酸転移酵素の触媒ドメインおよび前記ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインが、それぞれ前記抗体またはその抗体断片に結合されている、ヘテロ多量体。
【請求項４７】
前記ヘテロ多量体が抗体を含み、前記抗体が２つの抗体重鎖と、２つの抗体軽鎖とを含む、請求項４６に記載のヘテロ多量体。
【請求項４８】
前記シアル酸転移酵素の触媒ドメインが前記抗体重鎖のＣ末端に結合されている、請求項４６に記載のヘテロ多量体。
【請求項４９】
前記シアル酸転移酵素の触媒ドメインが前記抗体軽鎖のＣ末端に結合されている、請求項４６に記載のヘテロ多量体。
【請求項５０】
前記ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインが、前記抗体重鎖のＣ末端に結合されている、請求項４６に記載のヘテロ多量体。
【請求項５１】
前記ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインが前記抗体軽鎖のＣ末端に結合されている、請求項４６に記載のヘテロ多量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１７年１２月１８日に出願された米国仮出願第６２／６０７，１１１号明細書の利益を主張するものである。上記の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究または開発
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された助成金番号ＡＲ０６８２７２の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、糖鎖改変、例えば、様々な治療効果、例えば、ＩｇＧ介在性障害の処置、自己抗体介在性炎症の軽減、自己免疫疾患の処置、および／または臓器移植中の抗体介在性損傷の処置のために、抗体グリカンをインビボで改変することによってＩｇＧエフェクター機能を調節することに関する。
【背景技術】
【０００４】
人体を構成するタンパク質および細胞は、糖によって修飾される（Varki, A. Glycobiology 3, 97-130（1993））。糖は、生体分子の多くのタイプに結合して複合糖質を形成することができる。糖／糖類を自身および他の分子に結合させる酵素的プロセスはグリコシル化として知られる。糖タンパク質、プロテオグリカン、および糖脂質は、哺乳動物細胞で見出される最も大量に存在する複合糖質である。
【発明の概要】
【０００５】
異常なグリコシル化は、多くの異なる疾患と関連していることが究明されている。故に、グリコシル化を改変するためのツールおよび方法を開発し、異常なグリコシル化と関連する様々な障害を処置するためにそのようなツールまたは方法をさらに使用する必要がある。
【０００６】
本開示は、糖鎖改変に関する。
【０００７】
１つの態様において、本開示は、抗体重鎖ＣＨ２領域、抗体重鎖ＣＨ３領域、および糖タンパク質のシアリル化を触媒するシアル酸転移酵素の触媒ドメインを有する融合ポリペプチドに関する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素はベータ−ガラクトシドアルファ−２，６シアル酸転移酵素１である。いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素はヒトシアル酸転移酵素である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、抗体重鎖ＣＨ２領域はヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ２領域である。いくつかの実施形態において、抗体重鎖ＣＨ３領域はヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ３領域である。
【００１０】
別の態様において、本開示は、抗体重鎖ＣＨ２領域、抗体重鎖ＣＨ３領域、および糖タンパク質のガラクトシル化を触媒するガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する融合ポリペプチドに関する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ガラクトシル転移酵素はベータ−１，４−ガラクトシル転移酵素１である。いくつかの実施形態において、ガラクトシル転移酵素はヒトガラクトシル転移酵素である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、抗体重鎖ＣＨ２領域はヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ２領域である。いくつかの実施形態において、抗体重鎖ＣＨ３領域はヒトＩｇＧ重鎖ＣＨ３領域である。
【００１３】
１つの態様において、本開示は、本明細書に記載される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
別の態様において、本開示はまた、本明細書に記載される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターも提供する。
【００１５】
１つの態様において、本開示は、本明細書に記載されるベクターを有する細胞に関し、ベクターは、本明細書に記載される融合ポリペプチドを場合により発現する。
【００１６】
１つの態様において、本開示は、抗体重鎖ＣＨ２領域、抗体重鎖ＣＨ３領域、および糖タンパク質のシアリル化を触媒するシアル酸転移酵素の触媒ドメインを有する第１の融合ポリペプチド、ならびに抗体重鎖ＣＨ２領域、抗体重鎖ＣＨ３領域、および糖タンパク質のガラクトシル化を触媒するガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する第２の融合ポリペプチドを有するヘテロ多量体に関する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ヘテロ多量体はヘテロ二量体であり、第１の融合ポリペプチドが第２の融合ポリペプチドと会合し、これによりヘテロ二量体を形成する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素はベータ−ガラクトシドアルファ−２，６シアル酸転移酵素１である。いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素はヒトシアル酸転移酵素である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ガラクトシル転移酵素はベータ−１，４−ガラクトシル転移酵素１である。いくつかの実施形態において、ガラクトシル転移酵素はヒトガラクトシル転移酵素である。
【００２０】
１つの態様において、本開示は、ＩｇＧ介在性障害を有する対象を処置する方法に関する。方法は、本明細書に記載されるヘテロ多量体を有する組成物の有効量を対象に投与するステップを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ介在性障害は炎症である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ介在性障害は自己免疫疾患である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は関節炎である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患はグッドパスチャー病である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は腎毒性腎炎である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患はセリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、または全身性ループスエリテマトーデスである。
【００２３】
別の態様において、本開示はまた、ＩｇＧ介在性障害を有する対象を処置する方法にも関する。方法は、シアル酸転移酵素の触媒ドメインを有する第１のポリペプチドの有効量、およびガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する第２のポリペプチドの有効量を対象に投与するステップを含み、シアル酸転移酵素の触媒ドメインは糖タンパク質のシアリル化を触媒し、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインは糖タンパク質のガラクトシル化を触媒する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、抗体重鎖ＣＨ２領域、および抗体重鎖ＣＨ３領域をさらに有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、抗体重鎖ＣＨ２領域、および抗体重鎖ＣＨ３領域をさらに有する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ介在性障害は炎症である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ介在性障害は自己免疫疾患である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は関節炎である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患はグッドパスチャー病である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は腎毒性腎炎である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患はセリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、または全身性ループスエリテマトーデスである。
【００２８】
１つの態様において、本開示はまた、対象における臓器移植中の抗体介在性損傷を処置する方法にも関する。方法は、本明細書に記載されるヘテロ多量体を有する組成物の有効量を対象に投与するステップを含む。
【００２９】
別の態様において、本開示はまた、対象における臓器移植中の抗体介在性損傷を処置する方法にも関する。方法は、シアル酸転移酵素の触媒ドメインを有する第１のポリペプチドの有効量、およびガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する第２のポリペプチドの有効量を対象に投与するステップを含み、シアル酸転移酵素の触媒ドメインは糖タンパク質のシアリル化を触媒し、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインは糖タンパク質のガラクトシル化を触媒する。
【００３０】
１つの態様において、本開示はまた、コラーゲン三量体化ドメインおよびシアル酸転移酵素の触媒ドメインを有する第１の融合ポリペプチド、コラーゲン三量体化ドメインおよびガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する第２の融合ポリペプチド、ならびにコラーゲン三量体化ドメインを有する第３の融合ポリペプチドを有するヘテロ多量体であって、第１の融合ポリペプチド、第２の融合ポリペプチド、および第３の融合ポリペプチドが互いに結合し、ヘテロ多量体を形成する、ヘテロ多量体も提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、第３の融合ポリペプチドは、シアル酸転移酵素の触媒ドメインをさらに有する。いくつかの実施形態において、第３の融合ポリペプチドは、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインをさらに有する。
【００３２】
別の態様において、本開示はまた、４つのストレプトアビジンポリペプチドを有する四量体と；各々がビオチンと結合する４つのポリペプチドであって、４つのポリペプチドの１つまたは複数が、シアル酸転移酵素の触媒ドメインまたはガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する、４つのポリペプチドとを有するヘテロ多量体であって、
４つのポリペプチドの各々が、４つのストレプトアビジンポリペプチドを有する四量体に結合する、
ヘテロ多量体にも関する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、４つのポリペプチドの各々は、シアル酸転移酵素の触媒ドメインまたはガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、４つのポリペプチドの各々は、シアル酸転移酵素の触媒ドメインを有する。いくつかの実施形態において、４つのポリペプチドの各々は、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、４つのポリペプチドの２つは、それぞれシアル酸転移酵素の触媒ドメインを有し、４つのポリペプチドの２つは、それぞれガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを有する。
【００３６】
１つの態様において、本開示はまた、抗体またはその抗体断片と、シアル酸転移酵素の触媒ドメインと、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインとを有するヘテロ多量体であって、シアル酸転移酵素の触媒ドメインおよびガラクトシル転移酵素の触媒ドメインが、それぞれ抗体またはその抗体断片に結合されている、ヘテロ多量体も提供する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ヘテロ多量体は抗体を有し、抗体は２つの抗体重鎖、および２つの抗体軽鎖を有する。いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素の触媒ドメインは抗体重鎖のＣ末端に結合されている。いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素の触媒ドメインは抗体軽鎖のＣ末端に結合されている。いくつかの実施形態において、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインは抗体重鎖のＣ末端に結合されている。いくつかの実施形態において、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインは抗体軽鎖のＣ末端に結合されている。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「多量体」は、２つ以上のポリペプチドを有するタンパク質、または２つ以上のポリペプチドによって形成されるポリペプチド複合体を指す。ポリペプチドは互いに会合し、四次構造を形成することができる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ多量体」は、１つを超えるタイプのポリペプチドを有する多量体を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「ホモ二量体」は、２つの同一のポリペプチドを有する多量体を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ二量体」は、２つのポリペプチドを有する多量体を指し、２つのポリペプチドは異なる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「内腔ドメイン」または「酵素内腔ドメイン」は、ゴルジ装置の内腔内にその天然の状態で位置するグリコシル化酵素の部分を指す。グリコシルトランスフェラーゼの酵素内腔ドメインは通常、グリコシル化酵素の可溶性部分である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「可溶性部分」または「可溶性ドメイン」は、可溶性であるグリコシル化酵素の部分を指す。トランスゴルジグリコシル化酵素では、可溶性部分はグリコシル化酵素の酵素内腔ドメインである場合が多い。非トランスゴルジグリコシル化酵素では、グリコシル化酵素全体が可溶性であり得る。故に、いくつかの実施形態において、可溶性部分は、グリコシル化酵素全体またはグリコシル化酵素の一部であり得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「触媒ドメイン」は、触媒活性を有するタンパク質の部分を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＧ介在性障害」は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のレベルの増加または活性の増加によって引き起こされるまたは特徴付けられる障害を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「結合された（linked）」は、例えば、化学結合（例えば、ペプチド結合、または炭素−炭素結合）によって、疎水性相互作用によって、ファンデルワールス相互作用によって、および／または静電相互作用によって共有または非共有結合的に会合していることを指す。
【００４７】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明で使用するために本明細書に記載されている。当技術分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用することができる。材料、方法、および例は例示のみであり、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
【００４８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｅは、可溶化および改変グリコシルトランスフェラーゼ酵素を示す図である。（Ａ〜Ｃ）ＩｇＧ、その複合体、二分岐Ｆｃグリカン、および酵素−Ｆｃ融合物の模式図が示されている。（Ａ）Ｎ２９７に単一のＮ−結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ  ＦａｂおよびＦｃ。（Ｂ）グリカンコア構造（枠内）は、ＧｌｃＮＡｃ（四角）、マンノース（緑の丸）、およびフコースの可変的付加（赤い三角）、二分枝（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（黄色い丸）、またはシアル酸（紫の菱形）からなる。（Ｃ）トランスゴルジ酵素Ｂ４ＧＡＬＴ１およびＳＴ６ＧＡＬ１は、細胞質（ｃｙｔｏ）、膜貫通（ＴＭＤ）、および酵素内腔ドメイン（Ｌｕｍｅｎ）を有する。ＳＴ６ＧＡＬ１の分泌をもたらすＳＴ６ＧＡＬ１切断部位ＥＦＱ４１〜４３は赤で示される。Ｂ４ＧＡＬＴ１およびＳＴ６ＧＡＬ１の酵素内腔ドメインをＩｇＧ  Ｆｃに融合した（それぞれ、Ｂ４ＦｃおよびＳＴ６Ｆｃ）。（Ｄ、Ｅ）Ｂ４Ｆｃ、ＳＴ６Ｆｃの、個別または組み合わせたグリコシルトランスフェラーゼ活性に関する結合特異的レクチンブロットアッセイ。改変酵素および糖ヌクレオチド供与体（Ｂ４Ｆｃに対するＵＤＰ−Ｇａｌ、ＳＴ６Ｆｃに対するＣＭＰ−ＳＡ）とインキュベーション後の標的糖タンパク質フェチュインの末端β１，４ガラクトース（ＥＣＬ）もしくはα２，６シアル酸（ＳＮＡ）（Ｄ）、またはマウスおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｅ）。
【図１−２】図１−１と同様である。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｈは、インビボシアリル化の抗炎症活性を示す図である。（Ａ）マウスをＫ／ＢｘＮ血清およびＰＢＳ（黒丸）、ＳＴ６Ｆｃ（ピンク色の三角）、Ｂ４Ｆｃ（オレンジ色の菱形）、またはＩＶＩＧ（青い四角）で処置し、肢の腫脹を数日にわたってモニターした。（Ｂ）（Ａ）の個々のマウスの１０日目の臨床スコアがプロットされている。（Ｃ）Ｋ／ＢｘＮ処置マウスにＰＢＳ（黒丸）、ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（赤い三角）を与え、肢の腫脹を数日にわたってモニターした。（Ｄ）（Ｃ）からの個々のマウスの９日目の臨床スコアが示されている。（Ｅ）ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃで処置したマウスにおける関節炎の誘導７日後の肢切片のＨ＆Ｅ染色。ＮＴＮを誘導し、ＰＢＳ（黒丸）、ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（赤い三角）で処置したマウスの７日目の血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル（Ｆ）および生存（Ｇ）。（Ｈ）ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ投与後７日のＮＴＮ処置マウスからの染色凍結腎臓切片のＰＡＳ。平均および標準偏差がプロットされている。結果は、少なくとも２つの独立した反復を代表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ（有意でない）（二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＴｕｋｅｙの事後検定によって決定）。
【図２−２】図２−１と同様である。
【図２−３】図２−１と同様である。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｇは、インビボシアリル化のための受容体に関する要求性を示す図である。（Ａ）ＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスにＫ／ＢｘＮ血清およびＰＢＳ（黒丸）、ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（赤い三角）を与え、肢の腫脹を数日にわたってモニターした。（Ｂ）（Ａ）からの個々のマウスの６日目の臨床スコアがプロットされている。（Ｃ）ＷＴマウスにＴＫＯ  ＳＩＧＮ−Ｒ１抗体およびＫ／ＢｘＮ血清およびＰＢＳ（黒丸）、ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（赤い三角）を投与し、肢の腫脹を数日にわたってモニターした。（Ｄ）（Ｃ）からの個々のマウスの６日目の臨床スコアが示されている。（Ｅ）ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−および（Ｆ）ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋／ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスにＫ／ＢｘＮ血清およびＰＢＳ（丸）、ＩＶＩＧ（四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（三角）を与え、肢の腫脹を数日にわたってモニターした。（Ｇ）ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−およびｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋／ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスの６日目の臨床スコアが示されている。平均および標準偏差がプロットされている。結果は、少なくとも２つの独立した反復を代表している。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ（有意でない）（二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＴｕｋｅｙの事後検定によって決定）。
【図３−２】図３−１と同様である。
【図３−３】図３−１と同様である。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｅは、インビボシアリル化のための酵素に関する要求性を示す図である。（Ａ）Ｂ４ＧＡＬＴ１および酵素的に死んでいるＳＴ６ＧＡＬ１（Ｃ３５０Ａ、Ｃ３６１Ａ）および得られたＢ４ＳＴ６ＦｃＣＡＣＡの模式図。（Ｂ）Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ−ＥｎｄｏをもたらすＥｎｄｏＳ処置後のＢ４ＦｃおよびＳＴ６ＦｃのＦｃグリカンの除去の模式図。（Ｃ）Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ、Ｂ４ＳＴ６ＦｃＣＡＣＡ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ−Ｅｎｄｏとインキュベーション後のヒトＩｇＧ  Ｆｃの末端β１，４ガラクトース（ＥＣＬ）またはα２，６シアル酸（ＳＮＡ）に関する結合特異的レクチンブロットアッセイ。ガラクトシル化を、（Ｇ０）ＩｇＧ  ＦｃでＵＤＰ−Ｇａｌとのインキュベーションによってアッセイした。シアル酸転移酵素活性を、（Ｇ２）ＩｇＧ  ＦｃでＣＭＰ−ＳＡとのインキュベーションによって評価した。（Ｄ）ＷＴマウスにＫ／ＢｘＮ血清およびＰＢＳ（黒丸）、ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（赤い三角）、Ｂ４ＳＴ６ＦｃＣＡＣＡ（黒いバツ印、赤い点線）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ−Ｅｎｄｏ（黒縁の赤い三角、赤い点線）を投与し、肢の腫脹を数日にわたってモニターした。（Ｅ）（Ｄ）からのマウスの６日目の臨床スコアが示されている。平均および標準偏差がプロットされている。結果は、少なくとも２つの独立した反復を代表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ（有意でない）（二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＴｕｋｅｙの事後検定によって決定）。
【図４−２】図４−１と同様である。
【図４−３】図４−１と同様である。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｅは、自己免疫炎症中のインビボシアリル化の特徴付けを示す図である。（Ａ、Ｂ）ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ投与後の７日目のＮＴＮ処置マウスの血清または腎臓ＩｇＧから回収した全グリカンのＨＰＬＣトレース。網掛けは、末端糖の保持時間に対応する（青、Ｇ０；黄色、Ｇ１；オレンジ色、２つのＧ２；ピンク色、１つのＳ１；紫、Ｓ２）。（Ｃ、Ｄ）（Ａ、Ｂ）に記載されたＩｇＧからのモノシアリル化およびアガラクトシル化グリカンの比（Ｓ１／Ｇ０）。（Ｅ）ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃを受けたＮＴＮ処置マウスの血清および腎臓から精製した全ＩｇＧを、マウスおよびヒトＩｇＧに関する免疫ブロッティングによってプローブした。平均および標準偏差がプロットされている。結果は、少なくとも２つの独立した反復を代表している。＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ（有意でない）（二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＴｕｋｅｙの事後検定によって決定）。
【図５−２】図５−１と同様である。
【図５−３】図５−１と同様である。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｈは、血小板活性化およびインビボシアリル化を示す図である。（Ａ）ＰＢＳ、ＩＶＩＧおよびＢ４ＳＴ６Ｆｃで処置後の未処置および７日目のＮＴＮ処置マウスの腎臓を、糸球体（ｍＮｅｐｈｒｉｎ、緑）、マウスＩｇＧ（青）、血小板（ＣＤ４１、赤）、活性化血小板（ＣＤ６２、黄色）について調べた。代表的な個々の画像およびオーバーレイ画像が示されている。（Ｂ、Ｃ）未処置およびクロピドグレル処置マウスにＫ／ＢｘＮ血清およびＰＢＳ（黒丸）、ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（赤い三角）を与え、肢の腫脹を数日にわたってモニターした。（Ｄ）未処置およびクロピドグレル処置マウスの６日目の臨床スコアが示されている。ＮＴＮを未処置（Ｅ、Ｆ）およびクロピドグレル処置（Ｇ、Ｈ）動物で誘導し、７日目のＢＵＮレベル（ｍｇ／ｄＬ）および生存をモニターした。平均および標準偏差がプロットされている。結果は、少なくとも２つの独立した反復を代表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ（有意でない）（二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＴｕｋｅｙの事後検定によって決定）。
【図６−２】図６−１と同様である。
【図６−３】図６−１と同様である。
【図６−４】図６−１と同様である。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄは、治療的インビボシアリル化を示す図である。（Ａ、Ｂ）ヒト血小板血漿を、未処置、活性化（トロンビン＋）、またはクロピドグレル処置後に活性化（トロンビン＋、クロピドグレル＋）し、ＵＰＤ−Ｇａｌ（Ａ）およびＣＭＰ−ＳＡ（Ｂ）についてアッセイした。（Ｃ−Ｄ）マウスを、０日目のＫ／ＢｘＮ血清および３日目のＰＢＳ（黒丸）、ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（赤い三角）で処置し、肢の腫脹を数日にわたってモニターした（Ｃ）。（Ｄ）（Ｃ）からの個々のマウスの７日目の臨床スコアが示されている。平均および標準偏差がプロットされている。結果は、少なくとも２つの独立した反復を代表している。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ（有意でない）（二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＴｕｋｅｙの事後検定によって決定）。
【図７−２】図７−１と同様である。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、可溶性ガラクトシル転移酵素およびシアル酸転移酵素タンパク質の改変および特徴付けを示す図である。（Ａ）ヒトＳＴ６ＧＡＬ１のタンパク質配列。黄色およびライトブルーに網掛けされた配列は、それぞれ、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を表す。番号が付いた赤い三角は、ＩｇＧ  Ｆｃに融合されたシアル酸転移酵素の開始部位を示す。星が付いた三角は、本稿の全ての実験で使用された可溶性ＳＴ６ＧＡＬ１の開始部位を示す。（Ｂ）各ＳＴ６ＧＡＬ１の略図が示されている。（Ｃ）ＩｇＧに対する反応性に関するＦｃ−酵素タンパク質免疫ブロット（Ｎ、未変性タンパク質；Ｄ、変性タンパク質）。ＳＴ６Ｆｃは、ＥＦＱ４１〜４３の上流で融合された場合、変性するとＦｃおよびＳＴ６ＧＡＬ１に切断された。（Ｄ）Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＴ６ＧＡＬ１、またはＩｇＧに対する反応性に関するＳＴ６Ｆｃ、Ｂ４Ｆｃ、およびＢ４ＳＴ６Ｆｃの免疫ブロット。
【図８−２】図８−１と同様である。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、ＮＴＮ誘導後の抗ヒツジ応答を示す図である。（Ａ、Ｂ）ＮＴＮ誘導マウスをＰＢＳ（黒丸）、高用量ＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ）（赤い三角）で処置した。７日目の抗ヒツジＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡによって決定した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、インビボシアリル化対照群での受容体に関する要求性を示す図である。（Ａ、Ｂ）それぞれ図２Ｂおよび２ＤのＫ／ＢｘＮ注射後の未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスの６日目の臨床スコア。これらは、図３Ａ〜３Ｄに示されたＦｃγＲＩＩＢ−／−（Ａ）およびＴＫＯ−ＳＩＧＮ−Ｒ１（Ｂ）処置の対照群からのものである。結果は、少なくとも２つの独立した反復を代表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ（有意でない）（二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＴｕｋｅｙの事後検定によって決定）。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｄは、恒常性維持中のインビボシアリル化を示す図である。投与後の定められた期間でのＩＶＩＧ（Ａ）およびＢ４ＳＴ６Ｆｃ（Ｂ）の血清濃度が、半減期の挿入と共にプロットされている。（Ｃ）ＰＢＳ（黒丸）、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ（１週間前）（赤い三角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（２ヶ月前）（白抜きの赤い三角）の投与後の血液検査値。ＷＢＣ、白血球；ＬＹＭ、リンパ球；ＭＯＮＯ、単球；ＧＲＡＮ、顆粒球；ＨＣＴ、ヘマトクリット；ＭＣＶ、平均赤血球容積；ＲＤＷ、赤血球分布幅；ＨＧＢ、ヘモグロビン；ＭＣＨＣ、平均赤血球ヘモグロビン濃度；ＭＣＨ、平均赤血球ヘモグロビン；ＲＢＣ、赤血球（red blood cell）（赤血球（erythrocyte））数；ＰＬＴ、血小板；ＭＰＶ、平均血小板容積；ＢＵＮ、血中尿素窒素；ＡＬＴ（ＧＰＴ）、アラニンアミノ基転移酵素；ＡＬＰ、アルカリホスファターゼ；ＧＧＴ、ガンマグルタミン酸転移酵素。（Ｄ）ＰＢＳ、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ（１週間前）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（２ヶ月前）の投与後のモノシアリル化およびアガラクトシル化グリカンの比（Ｓ１／Ｇ０）がプロットされている。
【図１１−２】図１１−１と同様である。
【図１１−３】図１１−１と同様である。
【図１２】炎症中の部位特異的インビボシアリル化を示す図である。ＮＴＮ誘導マウスの腎臓から回収したＩｇＧにおけるジシアリル化およびアガラクトシル化グリカンの比（Ｓ２／Ｇ０）。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＮＴＮのインビボシアリル化中の血小板を示す図である。（Ａ）ＰＢＳ、ＩＶＩＧおよびＢ４ＳＴ６Ｆｃ処置動物におけるＮＴＮ誘導後未処置および７日の腎臓を、糸球体（ｍＮｅｐｈｒｉｎ、緑）、ＤＡＰＩ（青）、血小板（ＣＤ４１）、活性化血小板（ＣＤ６２）に付いて調べた。代表的な個々の画像およびオーバーレイ画像が示されている。（Ｂ）ＰＢＳ（黒丸）、高用量ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ）（赤い三角）で処置したＮＴＮ誘導マウス（一部はクロピドグレルも受けた）の７日目の抗ヒツジＩｇＧ力価。
【図１３−２】図１３−１と同様である。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、予防的および治療的インビボシアリル化を示す図である。（Ａ）Ｋ／ＢｘＮ処置マウスに、０日目にＰＢＳ（黒丸）、ＩＶＩＧ（青い四角）、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（赤い三角）を与え、肢の腫脹を数日にわたってモニターした。（Ｂ）個々のマウスの７日目の臨床スコアが示されている。これらは、図７Ｃおよび７Ｄに示されたデータの対照群である。
【図１５】図１５Ａは、グリコシル化酵素の可溶性部分を示す模式図である。図１５Ｂは、ＩｇＧ  Ｆｃに融合されたグリコシル化酵素の可溶性部分によって形成される二量体を示す模式図である。図１５Ｃは、コラーゲン三量体化ドメインに融合されたグリコシル化酵素の可溶性部分によって形成される三量体を示す模式図である。図１５Ｄは、ビオチンリガーゼによってビオチン化され、その後ストレプトアビジン（ＳＡ）とインキュベートされるグリコシル化酵素の可溶性部分によって形成される四量体を示す模式図である。
【図１６】図１６Ａは、抗体の重鎖のＣ末端に融合されたグリコシル化酵素の可溶性部分を示す模式図である。図１６Ｂは、抗体の軽鎖のＣ末端に融合されたグリコシル化酵素の可溶性部分を示す模式図である。
【図１７】改変グリコール−酵素が、炎症を処置するのに使用され得ることを示す模式図である。
【図１８】「ノブ・イントゥ・ホール」変異を含むおよび含まないＢ４ＳＴ６Ｆｃ、ＳＴ６Ｆｃホモ二量体、ならびにＢ４Ｆｃホモ二量体のウエスタンブロット結果（抗ヒトＩｇＧを用いた）およびクマシーゲル染色を示す図である。
【図１９】関節炎モデルにおける本来のＢ４ＳＴ６Ｆｃ、ヘテロ二量体Ｂ４ＳＴ６ＦｃＫｌｎ、およびＢ４ＳＴ６ＦｃＧ３の効果を示す図である。
【図２０】いくつかの例示的なグリコシル化酵素のアミノ酸配列を列挙する図である。
【図２１−１】図２１は、いくつかのヒトおよびマウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の例示的な断片結晶性領域（Ｆｃ）のアミノ酸配列を列挙する図である。
【図２１−２】図２１−１と同様である。
【図２１−３】図２１−１と同様である。
【図２１−４】図２１−１と同様である。
【図２２−１】図２２は、いくつかの例示的なグリコシル化酵素−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を列挙する図である。
【図２２−２】図２２−１と同様である。
【図２２−３】図２２−１と同様である。
【図２２−４】図２２−１と同様である。
【図２２−５】図２２−１と同様である。
【図２２−６】図２２−１と同様である。
【図２２−７】図２２−１と同様である。
【図２２−８】図２２−１と同様である。
【図２２−９】図２２−１と同様である。
【図２２−１０】図２２−１と同様である。
【図２３−１】図２３は、イヌＩｇＧ重鎖Ａ、イヌＩｇＧ重鎖Ｂ、イヌＩｇＧ重鎖Ｃ、イヌＩｇＧ重鎖Ｄ、イヌＳＴ６ＧＡＬ１、およびイヌＢ４ＧＡＬＴ１のアミノ酸配列を列挙する図である。
【図２３−２】図２３−１と同様である。
【図２３−３】図２３−１と同様である。
【図２３−４】図２３−１と同様である。
【図２４−１】図２４は、ネコＩｇＧ１ａ重鎖、ネコＩｇＧ１ｂ重鎖、ネコＳＴ６ＧＡＬ１、およびネコＢ４ＧＡＬＴ１のアミノ酸配列を列挙する図である。
【図２４−２】図２４−１と同様である。
【図２５−１】図２５は、ウシＩｇＧ１重鎖定常領域、ウシＩｇＧ２重鎖定常領域、ウシＩｇＧ３重鎖定常領域、ウシＳＴ６ＧＡＬ１、およびウシＢ４ＧＡＬＴ１のアミノ酸配列を列挙する図である。
【図２５−２】図２５−１と同様である。
【図２５−３】図２５−１と同様である。
【図２５−４】図２５−１と同様である。
【図２５−５】図２５−１と同様である。
【図２６−１】図２６は、ウマＩｇＧ１重鎖定常領域、ウマＩｇＧ２重鎖定常領域、ウマＩｇＧ３重鎖定常領域、ウマＩｇＧ４重鎖定常領域、ウマＩｇＧ５重鎖定常領域、ウマＩｇＧ６重鎖定常領域、ウマＳＴ６ＧＡＬ１、およびウマＢ４ＧＡＬＴ１のアミノ酸配列を列挙する図である。
【図２６−２】図２６−１と同様である。
【図２６−３】図２６−１と同様である。
【図２６−４】図２６−１と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）抗体は、免疫系の極めて顕著なエフェクタータンパク質である。該抗体は、病原体曝露後またはワクチン接種後に不可欠であり、微生物の排除のために適応免疫系および自然免疫系を橋渡ししているが、自己抗原に対して生成される場合は自己免疫疾患の病因に寄与することもある（Nimmerjahn and Ravetch, 2008b）。ＩｇＧ抗体の二峰性の活性は、高い親和性を有する抗原結合断片（Ｆａｂ、図１Ａ）による抗原の同時認識、ならびに結晶性断片（Ｆｃ、図１Ａ）と自然免疫細胞によって発現されるＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）の間の相互作用を通じた白血球、または補体カスケードのイニシエーター、Ｃ１ｑの動員および活性化を可能にする（Nimmerjahn et al., 2015）。これは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、認識された抗原の取り込み、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのＩｇＧの古典的炎症性エフェクター機能をトリガーする（Franklin, 1975, Huber et al., 1976）。
【００５１】
単一Ｎ−結合型グリカンは全てのＩｇＧの各重鎖に存在し、Ｆｃ中のアスパラギン２９７に位置する（Ｎ−２９７、図１Ａ〜１Ｂ）（Arnold et al., 2007）。グリカンのコア７糖は、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、またはシアル酸の付加によって異なり得る複合体二分岐構造を有する（図１Ｂ）。これらの可変的付加は、途方もない多様性の要因となっており、３０種類以上の異なるグリカンが健康な個体の循環ＩｇＧで同定されている（Kaneko et al., 2006b）。重要なことには、この１０年間にわたる研究により、Ｆｃグリカンの組成がＩｇＧエフェクター機能に重大な影響を及ぼすことが示された（Jefferis, 2005, Jefferis, 2009a, Jefferis, 2009b）。Ｆｃグリカンがアフコシル化されたＩｇＧは、フコシル化ＩｇＧと比べて活性化ＦｃγＲ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が５０倍増強し、インビボで著しく増強したＡＤＣＣを示す（Ferrara et al., 2011、Natsume et al., 2005、Okazaki et al., 2004、Shields et al., 2002）。結果として、ＡＤＣＣを誘発することが意図されたいくつかの次世代の治療用ＩｇＧは、フコースを欠くように改変されている（Beck et al., 2010）。実際に、最近の研究は、これらの知見を感染症まで広げ、Ｆｃグリカンがアフコシル化されたデング熱特異的ＩｇＧとデング出血熱との関連を同定し（Wang et al., 2017）、潜伏性および非活動性ＴＢ感染の制御においてＩｇＧをアフコシル化した（Lu et al., 2016）。これまでに最も成功したＨＩＶワクチン試験は、ＩｇＧ  Ｆｃグリカンの二分枝ＧｌｃＮＡｃのレベルの増加をもたらした。これは、アフコシル化より程度は少ないものの、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性も増加させる修飾であった（Ackerman et al., 2013、Chung et al., 2014、Davies et al., 2001）。反対に、Ｆｃグリカンの末端シアリル化はＩ型  ＦｃγＲに対するＩｇＧ親和性を低減し、シアリル化ＩｇＧはインビボでＡＤＣＣを惹起する能力を低減した（Scallon et al., 2007、Anthony et al., 2008a、Li et al., 2017）。インフルエンザワクチン接種後のＩｇＧにおけるシアリル化の増強は、ＩＩ型ＦｃγＲ−ＣＤ２３経路を通じた親和性成熟の改善によるものであった（Wang et al., 2015）。ＩｇＧグリコシル化の制御は完全には理解されていないが、ＩＬ−２３はＳＴ６ＧＡＬ１の発現の制御に関与している（Pfeifle et al., 2017）。
【００５２】
逆説的であるが、ＩｇＧは、炎症を抑制するために臨床で一般的に使用されている（Negi et al., 2007）。静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、何万人もの健康なドナーに由来するポリクローナル単量体ＩｇＧの治療用製剤であり、炎症性および自己免疫疾患を処置するために高用量（１〜２ｇ／ｋｇ）でほぼ４０年間臨床で成功裏に使用されている（Imbach et al., 1981、Nimmerjahn and Ravetch, 2008a）。機構研究は、ＩＶＩＧのＦｃ部分がインビボでの抗炎症活性に十分であること（Debre et al., 1993、Samuelsson et al., 2001）、およびこれは抑制性ＦｃγＲＩＩＢを必要とすること（Samuelsson et al., 2001、Schwab et al., 2012、Schwab et al., 2014、Tackenberg et al., 2009、Tackenberg et al., 2010）を明らかにした。さらなる研究は、Ｆｃグリカンのシアリル化がこの活性に不可欠であることを示した（Kaneko et al., 2006b、Anthony et al., 2008a）。活性化Ｉ型ＦｃγＲに結合する代わりに、シアリル化ＩｇＧ  Ｆｃは、ＩＩ型ＦｃγＲ、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮまたはマウスＳＩＧＮ−Ｒ１に結合し、結果的に炎症性エフェクター細胞における抑制性ＦｃγＲＩＩＢの表面発現が増加した（Anthony et al., 2011、Anthony et al., 2008b、Samuelsson et al., 2001）。故に、ＩｇＧ  Ｆｃグリカン組成、特に末端シアル酸は、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＦｃγＲＩＩＢと一緒に、インビボでのＩｇＧの抗炎症活性に関与している（Kaneko et al., 2006b、Tackenberg et al., 2009、Anthony et al., 2011、Washburn et al., 2015）。
【００５３】
本開示は、Ｆｃに融合されたグリコシル化酵素の触媒ドメインを含む融合ペプチドを含む方法および組成物（例えば、グリコシル化酵素−Ｆｃ融合タンパク質）に関する。本明細書に記載された方法および組成物は、様々な治療効果のためにインビボで抗体グリカンを改変することによってＩｇＧエフェクター機能を調節するのに使用することができる。例えば、本開示は、自己抗体介在性炎症を軽減するための新規の手段としての、抗体グリカンをインビボで改変することによるＩｇＧエフェクター機能の調節に関する。シアリル化を含むグリコシル化は、ＩｇＧ生物学に多大な影響を与えることが十分に確立されている。実際に、感染症へのＩｇＧグリコシル化の寄与はますます理解されており、ＩｇＧグリコフォームはデング熱および結核の臨床像に寄与すると報告されている（Lu et al., 2016、Wang et al., 2017）。活性化ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が増強されたアフコシル化ＩｇＧは、デング出血熱に罹患する可能性の高い患者、およびまた潜伏性であるが活動性でないＴＢ感染患者で見出された。シアリル化により、ＦｃγＲに対するＩｇＧの親和性は著しく低減し、ＩｇＧは炎症をトリガーできなくなる（Scallon et al., 2007、Kaneko et al., 2006b、Anthony et al., 2008a、Li et al., 2017）。インフルエンザ特異的ＩｇＧ  Ｆｃグリカンにおけるシアリル化の増強はワクチン接種後に見出され、ＣＤ２３−ＩＩ型  ＦｃγＲ依存的にインフルエンザ特異的広域中和抗体と関連していた（Wang et al., 2015）。また、シアリル化ＩｇＧ  Ｆｃは、十分な高用量で投与されると抗炎症活性をもたらす（Anthony et al., 2008a、Kaneko et al., 2006b、Washburn et al., 2015）。
【００５４】
ＩｇＧの用量依存的抗炎症作用を支配する機構は広く議論されてきた（Clynes, 2007、Schwab and Nimmerjahn, 2013）。しかし、ＩＶＩＧの機能テストは、ＩｇＧのシアリル化がこの抗炎症活性にインビボで関与していることを一貫して示している（Washburn et al., 2015、Zhang et al., 2016、Fiebiger et al., 2015、Schwab et al., 2012、Schwab et al., 2014、Ohmi et al., 2016）。ＦｃグリカンをＩｇＧから除去することにより、ＩＶＩＧは自己免疫炎症を抑制できなくなる（Kaneko et al., 2006b）。さらに、Ｆｃグリカンから末端シアル酸を除去するためにノイラミニダーゼで処置されたＩＶＩＧもまた抗炎症活性を示さなかった（Kaneko et al., 2006b）。故に、ＩｇＧ  Ｆｃグリカン組成、特にシアル酸は、インビボでのＩｇＧの抗炎症活性に関与している。
【００５５】
シアリル化ＩｇＧ  Ｆｃの生成は容易ではなく、文献上の混乱の一因となっている可能性がある。実際に、混入ＬＰＳ、Ｆｃの分解、不適切なレクチンエンリッチメント（Stadlmann et al., 2009）、適切でないのインビトロアッセイ（Bayry et al., 2009）、およびＩＶＩＧにおけるＦａｂ特異性の多様性が結果を混乱させている。さらに、ＳＴ６ＧＡＬ１はシアル酸に結合することもそれを除去することもできることから、シアリル化物質の特徴付けが不一致の一部に対する説明を提供している（Washburn et al., 2015）。重要なことには、いくつかのグループが、シアリル化ｈＩｇＧ１はギランバレー症候群（Zhang et al., 2016）、およびコラーゲン誘導関節炎（Ohmi et al., 2016）の実験モデルにおいて、実際には抗炎症性であるという最初の報告と似た知見を報告している。注目すべきことに、ＩｇＧをインビボでシアリル化することにより、抗炎症性シアリル化ＩｇＧを生成する技術的問題の多くが回避されている。
【００５６】
成功したインビボ糖鎖改変の試みは、細菌由来グリカン修飾酵素を使用している（Albert et al., 2008、Xiao et al., 2016）。連鎖球菌エンドグリコシダーゼ、ＥｎｄｏＳは、ＩｇＧ介在性炎症を軽減することが示されている（Albert et al., 2008）。また、ＡＤＣＣを改善するために腫瘍グリコカリックスをコレラ菌（Vibrio cholerae）ノイラミニダーゼの標的にした（Xiao et al., 2016）。これらの試験は糖鎖改変の力を証明したが、これらの薬物の反復投与は、細菌由来酵素を標的にする免疫応答のため困難であると判明することがある。Ｂ４ＳＴ６Ｆｃは免疫応答によって標的にされることが可能であるが、他のヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合物が良好な忍容性を示している。
【００５７】
インビボシアリル化の可能性のある適用は、自己免疫および炎症状態を優に超える。実際に、これらの方法は、高用量ＩＶＩＧによって現在処置されている状態に適用することができる。しかし、ワクチン接種後に生成される最初のＩｇＧがシアリル化され、これらのシアリル化ＩｇＧがＩＩ型ＦｃγＲ依存的機構を通じた親和性成熟の改善に寄与することが研究により報告されていることから（Wang et al., 2015）、ＩｇＧシアリル化の調節はワクチン有効性の改善にも利用され得る。さらに、インビボシアリル化は、処置後に定められた期間で治療用ＩｇＧの活性を止めるのに有効であり得る。また、これらのグリコシルトランスフェラーゼおよびこれらの融合タンパク質のＦｃ部分は、延長した血清半減期までのＦｃＲｎ親和性の増加、または受容体結合の増加／減少を含め、さらに改変され得る（Schlothauer et al., 2016）。
【００５８】
したがって、本開示は、トランスゴルジで見出されるヒトグリコシル化酵素をＩｇＧ  Ｆｃに融合することによるＩｇＧ生物学におけるシアリル化の機能に関する。効率的なシアリル化は、ガラクトースおよびシアル酸に結合する両方の酵素を必要とする（Anthony et al., 2008a）。重要なことには、グリコシル化酵素のこの組み合わせは、炎症部位に沈着したＩｇＧを選択的にシアリル化することによって２つの異なるモデルにおいてインビボで自己抗体介在性炎症を軽減することができる。この酵素の組み合わせの投与は、循環中のＩｇＧのシアリル化、または循環中の他の糖タンパク質のシアリル化には影響を与えないようである。データは、これはおそらく、血小板が炎症部位でのみガラクトースおよびシアル酸基質を放出するためであることを示している。故に、本開示は、内因性抗体を糖鎖改変し、それらを抗炎症性メディエーターに変換することによる、有害な自己抗体介在性炎症を軽減するための有力なアプローチを提供する。
【００５９】
本明細書に記載された方法および組成物（例えば、グリコシル化酵素−Ｆｃ融合タンパク質）はまた、様々な他の治療効果、例えば、ＩｇＧ介在性障害の処置、自己免疫疾患の処置、または臓器移植中の抗体介在性損傷の処置に使用することもできる。さらに、本開示で記載されるグリコシル化酵素−Ｆｃ融合タンパク質は、全血球計算（ＣＢＣ）および包括的代謝パネル（ＣＭＰ）分析が投与１週間後および２ヶ月後ともに正常レベル内であることから良好な忍容性を示し、臨床用途に適している。故に、本開示は、ＩｇＧ介在性障害（例えば、炎症、および自己免疫疾患）および臓器移植中の抗体介在性損傷を処置するための有用なアプローチを提供する。
【００６０】
グリカン
グリカンは、多くのタンパク質の機能において重要な役割を有している。グリカンは、複合糖質（例えば、糖タンパク質、糖ペプチド、ペプチドグリカン、糖脂質、グリコシドおよびリポ多糖）の炭水化物部分を形成する糖類（すなわち、グリコシド結合した複数の単糖）である。グリカンは小胞体でタンパク質に付加され得、タンパク質がゴルジ装置を通って移動するときに修飾され得る。前駆体グリカン構造は、アスパラギン（Ｎ−結合型）、セリンまたはスレオニン（Ｏ−結合型）、リン脂質（ＧＰＩ）、トリプトファン（Ｃ−結合型）に結合され得、またはホスホジエステル結合（ホスホグリコシル化）によって結合され得る。多くの生物学的機能がグリカンに起因しているが、グリコシル化の機能の２つの一般型は、（１）糖タンパク質の構造または機能の維持または修飾、および（２）炭水化物受容体またはレクチンのためのグリカンベースの認識プラットホームの提供である。
【００６１】
Ｎ−結合型グリコシル化
小胞体の内腔では、１４残基前駆体オリゴ糖（グルコース３マンノース９Ｎ−アセチルグルコサミン２、（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２））が酵素オリゴサッカリルトランスフェラーゼによって、コンセンサス配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔで見出されるアスパラギン残基に転移される（Schachter et al., in Essentials of Glycobiology, Edn. 2010/03/20, eds. V. A et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor（NY）, 2009）。前駆体グリカンは、合成中のタンパク質が組み立てられ、ゴルジに輸送される間に、エキソグリコシダーゼによって高マンノース構造（Ｍａｎ８〜９ＧｌｃＮＡｃ２）にトリミングされる。グリカンは次いで、タンパク質が分泌経路を通過するときにさらにプロセシングされ得る。
【００６２】
コア複合体二分岐グリカン構造（ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）は、β１，２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩによるＧｌｃＮＡｃの転移によって生成される。この構造はＩｇＧ抗体の定常領域で見出され、さらに修飾され得る。コアＧｌｃＮＡｃは、α１，６−フコシルトランスフェラーゼによるフコシル化に利用可能である。二分枝Ｎ−アセチルグルコサミンは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩＩによってコアに結合される。タンパク質が分泌経路に沿って進むとき、グリカンは、それぞれβ１，４ガラクトシル転移酵素およびα２，６シアル酸転移酵素によるガラクトースおよびシアル酸のアームへの付加によって、トランスゴルジでさらに修飾され得る。
【００６３】
Ｏ−結合型グリコシル化
Ｏ−結合型グリコシル化は、セリンまたはスレオニンへのＧｌｃＮＡｃの結合によって惹起される（Schachter et al., in Essentials of Glycobiology, Edn. 2010/03/20., eds. V. A et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (NY), 2009）。これらの修飾に関与する経路は、Ｎ−結合型グリコシル化ほど理解されていない。少なくとも８つの哺乳動物Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素が存在すると推定され、それらは細胞タイプに応じて差次的に発現される。故に、ＥＲまたはゴルジがこのグリコシル化の最初の部位であるかどうかは定かでない。Ｏ−結合型グリカンの既知のコンセンサスアミノ酸配列は存在しないが、その代わりに二次構造選好性が示唆されている。実際には、ほとんどのＯ−グリコシル化がβターンで見出される。さらに、プロリン残基のエンリッチメントは−１および＋３位で顕著であるが、荷電残基はこれらの位置では好ましくない。
【００６４】
ほとんどのＯ−グリカンは、コア１β１−３ガラクトシル転移酵素（コア１ＧａｌＴ）によるβ１−３結合でのＧｌｃＮＡｃへのガラクトースの付加により形成されるコア１サブタイプ構造を含有する。コア２型Ｏ−グリカンは、β１−６結合でのＧａｌＮＡｃへのＧｌｃＮＡｃの付加により生成され得る。コア２Ｏ−グリカンは、基質としてコア１構造を必要とする。コア３Ｏ−グリカンの生成は、ＧｌｃＮＡｃ−セリン／スレオニン基質を使用するコア３ＧｌｃＮＡｃＴ活性によって制御される。一部の細胞タイプにおけるまたは特定の糖タンパク質間でのコア１ＧａｌＴ酵素とコア３ＧａｌＴ酵素の競合が、コア１およびコア３生成を制御している可能性がある。
【００６５】
ＧＰＩ−結合型グリコシル化
スフィンゴ糖脂質の新規生合成は、ＥＲ−ゴルジ経路の膜の内葉で始まる（Schachter et al., in Essentials of Glycobiology, Edn. 2010/03/20, eds. V. A et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (NY), 2009）。セラミドが最初に合成され、次いで特異的グリコシルトランスフェラーゼによってグルコシル化またはガラクトシル化される。β結合ガラクトース残基の付加が続いて起こる。その後、分子は段階的に伸長され、多種多様の異なるコア構造をもたらし得る。シアル酸、フコース、またはグルクロン酸残基の付加を含むスフィンゴ糖脂質の外側伸長は、Ｎ−およびＯ−グリカンと共通することが多い。
【００６６】
グリコシル化酵素
グリコシル化酵素は、炭水化物、すなわちグリコシル供与体が、別の分子のヒドロキシル基または他の官能基（グリコシル受容体、例えば、タンパク質、脂質、およびグリカン）に結合される反応に関与している。これらのグリコシル化酵素の可溶性部分（または酵素内腔ドメイン）または触媒ドメインは、Ｆｃ、または他の適当なペプチドと融合して多量体を形成することができ、本明細書に記載された任意の方法において使用することができる。
【００６７】
α−２，６シアル酸転移酵素（ＳＴ６ＧＡＬ１）
ＩｇＧ  Ｆｃグリカンにおけるガラクトースへのシアル酸の結合は、酵素α−２，６シアル酸転移酵素（ＳＴ６ＧＡＬ１；ＮＰ＿００３０２３．１；配列番号１）によって触媒される。ＳＴ６ＧＡＬ１によるＩｇＧのシアリル化は、典型的には、ＳＴ６ＧＡＬ１が膜貫通ドメイン（ＴＭＤ、図１Ｃ）によってゴルジにアンカーされた状態で見出されるトランスゴルジで生じる。このトランスゴルジ酵素は、末端シアル酸を複合体二分岐グリカンに結合させることができる。図１Ｃに示すように、トランスゴルジ酵素ＳＴ６ＧＡＬ１は、細胞質ドメイン（ｃｙｔｏ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、および酵素内腔ドメイン（Ｌｕｍｅｎ）（配列番号１のアミノ酸２４〜４０６、配列番号１のアミノ酸２９〜４０６、配列番号１のアミノ酸３４〜４０６、または配列番号１のアミノ酸４１〜４０６）を有する。触媒ドメイン（アミノ酸：配列番号１の１６０〜３９０）は、酵素内腔ドメイン内に位置する。
【００６８】
いくつかの異なるプロモーターが、この転移酵素の細胞および組織特異的発現を制御している（Kalcheva et al. Mammalian genome: official journal of the International Mammalian Genome Society 8, 619-620 (1997)；Wang et al. The Journal of biological chemistry 268, 4355-4361 (1993)）。例えば、プロモーター１は、肝細胞によってＳＴ６ＧＡＬ１を発現させるためにもっぱら使用されるが、Ｂ細胞はプロモーター２を使用する（Appenheimer, M.M. et al. Glycobiology 13, 591-600 (2003)）。肝細胞は、切断され、循環に分泌される可溶性ＳＴ６ＧＡＬ１（ｓＳＴ６ＧＡＬ１）の産生にもっぱら関与している。重要なことには、肝臓特異的プロモーター１の遺伝子破壊により、野生型対照と比べて循環シアリル化ＩｇＧのレベルは著しく低減した。しかし、両方のマウス株由来のＢ細胞は該酵素を発現することができ、ＩｇＧシアリル化におけるこの酵素の肝臓可溶型の関与を示した。
【００６９】
β−１，４−ガラクトシル転移酵素１（Ｂ４ＧＡＬＴ１）
ベータ−１，４−ガラクトシル転移酵素１は、ヒトにおいてＢ４ＧＡＬＴ１遺伝子によってコードされる酵素である。Ｂ４ＧＡＬＴ１（ＮＰ＿００１４８８．２；配列番号２）は、供与体基質ＵＤＰ−ガラクトースに対する排他的特異性を有すると思われるＩＩ型膜結合糖タンパク質である。Ｂ４ＧＡＬＴ１は、単糖または糖タンパク質炭水化物鎖の非還元末端のどちらかである類似の受容体糖（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ））に、ベータ１，４結合でガラクトースを転移させる。触媒ドメイン（アミノ酸：配列番号２の１８５〜３９０）は、Ｂ４ＧＡＬＴ１の内腔ドメイン（配列番号２のアミノ酸７９〜３９８、または配列番号２のアミノ酸１０６〜３９８）内に位置する。
【００７０】
可溶性グリコシル化酵素
多くのグリコシル化酵素が分泌されている。可溶型は、カルボキシル末端の方向で、膜貫通（ＴＭ）領域近くでのタンパク質切断によって、例えば、その膜結合型から得ることができる。
【００７１】
図１Ｃに示すように、トランスゴルジ酵素Ｂ４ＧＡＬＴ１およびＳＴ６ＧＡＬ１は、細胞質ドメイン（ｃｙｔｏ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、および酵素内腔ドメイン（Ｌｕｍｅｎ）を含む。単一の疎水性セグメントは、シグナルアンカー配列として機能する。この膜貫通セグメント（ＴＭＤ）は、ゴルジ装置の膜を含む分泌経路の脂質二重層にまたがっている。グリコシルトランスフェラーゼの酵素内腔ドメインは、ゴルジ装置の内腔内に位置する。膜テザー転移酵素は、その「ステム」領域でタンパク質切断を受けやすい。タンパク質分解は、触媒活性可溶型の酵素を解放し、該酵素は細胞から放出され得る。結果として、多くのグリコシル化酵素が、循環中および様々な体液中に可溶型で見出される。興味深いことに、肝細胞および内皮におけるこれらの可溶性酵素の産生は、特定の炎症状態下でも劇的に増加され得る。
【００７２】
ＳＴ６ＧＡＬ１は、ＥＦＱ４１〜４３のその内腔ドメインにβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）切断部位を有し、その分泌をもたらすことができる（図１Ｃ、図８Ａ〜８Ｄ）。可溶性ＳＴ６ＧＡＬ１は循環中で酵素的に活性であり、ＩｇＧ  Ｆｃグリカンのシアリル化に寄与することができる。
【００７３】
Ｂ４ＧＡＬＴ１の切断部位は、Ｌ７９およびＳ１０６である。この酵素の亜集団がそのステムドメインでのタンパク質切断後に分泌され、この酵素の可溶型は酵素的に活性である。
【００７４】
故に、１つの態様において、本開示は、シアル酸転移酵素の酵素内腔ドメインまたはシアル酸転移酵素の触媒ドメインを含むまたはからなる融合タンパク質またはペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素の酵素内腔ドメインはＢＡＣＥ１切断部位を有さない。いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素の酵素内腔ドメインは、配列番号１のアミノ酸２４〜４０６、配列番号１のアミノ酸２９〜４０６、配列番号１のアミノ酸３４〜４０６、または配列番号１のアミノ酸４１〜４０６を含むまたはからなる。シアル酸転移酵素の触媒ドメインは、糖タンパク質のシアリル化を触媒する。いくつかの実施形態において、シアル酸転移酵素の触媒ドメインは、配列番号１のアミノ酸１６０〜３９０を含むまたはからなる。
【００７５】
本開示はまた、ガラクトシル転移酵素の酵素内腔ドメインまたはガラクトシル転移酵素の触媒ドメインを含むまたはからなる融合タンパク質またはペプチドも提供する。いくつかの実施形態において、ガラクトシル転移酵素の酵素内腔ドメインは、配列番号２のアミノ酸７９〜３９８、または配列番号２のアミノ酸１０６〜３９８を含むまたはからなる。ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインは、糖タンパク質のガラクトシル化を触媒する。いくつかの実施形態において、ガラクトシル転移酵素の触媒ドメインは、配列番号２のアミノ酸１８５〜３９０を含むまたはからなる。
【００７６】
核酸配列およびアミノ酸配列
本開示は、様々な核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、本明細書に開示された核酸配列のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態において、核酸配列は、本開示に記載された配列のいずれかと同一である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、本明細書に開示されたアミノ酸配列のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、本開示に記載された配列のいずれかと同一である。
【００７９】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列が最適な比較目的で整列される（例えば、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップが導入されてもよく、比較目的のために非相同配列は無視されてもよい）。比較目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態においては少なくとも９０％、９５％、または１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次いで比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。本開示の目的のために、配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を用いたＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスを使用して達成することができる。
【００８０】
ＦｃＢ４、ＦｃＳＴ６、およびＦｃＣｈｍ
ＳＴ６ＧＡＬ１およびＢ４ＧＡＬＴ１を含むゴルジ酵素は、ゴルジＩＩ型膜タンパク質である。酵素の転移酵素活性は、該タンパク質のＣ末端に位置する（図１Ｃ）。
【００８１】
グリコシル化酵素、その酵素内腔ドメイン、可溶性ドメイン、または触媒ドメインは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）またはその一部に融合することができる。いくつかの実施形態において、グリコシル化酵素、その酵素内腔ドメイン、可溶性ドメイン、または触媒ドメインは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のＦｃ部分に対して使用され得る。Ｆｃ融合物はいくつかの利点を有する。すなわち、可溶性タンパク質は血清半減期が延長され（例えば、５日、１０日、１４日、または２０日超）、また二量体も形成するでろう。いくつかの実施形態において、これらの融合ポリペプチドは、グリコシル化標的に応じてホモ二量体またはヘテロ二量体を形成することができる。
【００８２】
ＩｇＧ  Ｆｃは、当技術分野で公知の任意のＩｇＧのＦｃ領域であってもよい。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（例えば、配列番号３のアミノ酸２６〜２５６を含む）、ヒトＩｇＧ２−Ｆｃ（例えば、配列番号４のアミノ酸５２〜２６６を含む）、ヒトＩｇＧ３−Ｆｃ（例えば、配列番号５のアミノ酸４１〜３１８を含む）、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃ（例えば、配列番号６のアミノ酸５３〜２６８を含む）、マウスＩｇＧ１−Ｆｃ（例えば、配列番号７のアミノ酸２６〜２５２を含む）、マウスＩｇＧ２ａ−Ｆｃ（例えば、配列番号８のアミノ酸２１〜２５３を含む）、マウスＩｇＧ２ｂ−Ｆｃ（例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜２５９を含む）、マウスＩｇＧ３−Ｆｃ（例えば、配列番号１０のアミノ酸２１〜２５３を含む）、イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ（例えば、配列番号１５のアミノ酸２１〜２４４を含む）、またはネコＩｇＧ１  Ｆｃ（例えば、配列番号１７のアミノ酸２１〜２４３を含む）であってもよい。好ましくは、免疫グロブリンの種は、融合タンパク質が投与される対象の種と対応するように選択される。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＩｇＧ抗体重鎖ＣＨ２領域と、ＩｇＧ抗体重鎖ＣＨ３領域と、シアル酸転移酵素の酵素内腔ドメインまたは触媒ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１１に記載されたアミノ酸配列を有する。本開示はまた、ＩｇＧ抗体重鎖ＣＨ２領域と、ＩｇＧ抗体重鎖ＣＨ３領域と、ガラクトシル転移酵素の酵素内腔ドメインまたは触媒ドメインとを含むポリペプチドも提供する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、これらのポリペプチドは、ホモ二量体を形成してもよい。ホモ二量体は、シアル酸転移酵素の２つの酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）を有してもよい（例えば、ＦｃＳＴ６またはＳＴ６Ｆｃ）。いくつかの他の場合において、ホモ二量体は、ガラクトシル転移酵素の２つの酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）を有してもよい（例えば、ＦｃＢ４またはＢ４Ｆｃ）。いくつかの実施形態において、これらのポリペプチドは、シアル酸転移酵素の１つの酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）、およびガラクトシル転移酵素の１つの酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）を有するヘテロ二量体（ＦｃＣｈｍまたはＦｃＢ４／ＦｃＳＴ６）を形成してもよい。
【００８４】
図２２は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−Ｂ４ＧＡＬＴ１融合タンパク質（配列番号１１）、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ−ＳＴ６ＧＡＬ１融合タンパク質（配列番号１２）、マウスＩｇＧ１  Ｆｃ−Ｂ４ＧＡＬＴ１融合タンパク質（配列番号１３）、マウスＩｇＧ１  Ｆｃ−ＳＴ６ＧＡＬ１融合タンパク質（配列番号１４）、イヌＩｇＧ−Ａ（ＩｇＧ１）Ｆｃ−ＳＴ６ＧＡＬ１融合タンパク質（配列番号１５）、イヌＩｇＧ−Ａ（ＩｇＧ１）Ｆｃ−Ｂ４ＧＡＬＴ１融合タンパク質（配列番号１６）、ネコＩｇＧ１  Ｆｃ−ＳＴ６ＧＡＬ１融合タンパク質（配列番号１７）、ネコＩｇＧ１  Ｆｃ−Ｂ４ＧＡＬＴ１融合タンパク質（配列番号１８）を含む、グリコシル化酵素−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの例を示している。
【００８５】
いくつかの実施形態において、これらのペプチドは、さらに、シグナル配列、例えば、ＩＬ２−シグナル配列（配列番号３のアミノ酸１〜２０）、またはκ−シグナル配列（配列番号４のアミノ酸１〜３９）を有してもよい。これらのシグナル配列は、通常、ペプチドのＮ末端に存在している。
【００８６】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫＩＨ）変異を有してもよい。ＫＩＨ変異は、ヘテロ二量体の形成を容易にするために使用され得る。いくつかの実施形態において、一方のＦｃは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（全てＥＵナンバリング）からなる群から選択される１つまたは複数の変異を有する。他方のＦｃは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（全てＥＵナンバリング）からなる群から選択される一方または両方の変異を有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｆｃ−Ｂ４ＧＡＬＴ１融合タンパク質は、配列番号４２に記載された配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ−ＳＴ６ＧＡＬ１融合タンパク質は、配列番号４３に記載された配列を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、グリコシル化酵素の酵素内腔ドメイン、可溶性ドメイン、または触媒ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の一部または全部に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、グリコシル化酵素の酵素内腔ドメイン、可溶性ドメイン、または触媒ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ部分に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はＩｇＧ３のＦｃである。
【００８８】
所望の特異性を有するインタクトな抗体がグリコシル化酵素に融合され、酵素の特異的標的化を可能にしてもよい。さらに、類似のタンパク質融合物が、イヌ／ネコ／ウマ／ウシの同等／相同抗体またはグリコシル化酵素を使用して生成され、ヒト以外の動物（例えば、ペットおよび家畜）の処置を可能にしてもよい。
【００８９】
単量体、二量体、三量体、および四量体
例示的な単量体を図１５Ａに示す。図１５Ａに示すように、単量体は、グリコシル化酵素（例えば、シアル酸転移酵素またはガラクトシル転移酵素）の酵素内腔ドメイン、可溶性ドメイン、または触媒ドメインであってもよい。
【００９０】
多量体が、当技術分野で公知の任意の方法によって生成されてもよい。いくつかの実施形態において、多量体は、グリコシル化酵素の１つ、２つ、３つ、４つの、または４つを超える酵素内腔ドメイン、可溶性ドメイン、または触媒ドメインを有してもよい。いくつかの実施形態において、多量体は、シアル酸転移酵素の１つ、２つ、３つ、４つの、または４つを超える酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）を有してもよい。いくつかの実施形態において、多量体は、ガラクトシル転移酵素の１つ、２つ、３つ、４つの、または４つを超える酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）を有してもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、多量体は二量体であってもよい（例えば、ＦｃＢ４、ＦｃＳＴ６、およびＦｃＣｈｍ）。
【００９２】
多量体はまた、三量体、または四量体でもあってもよい。三量体、および四量体は、それぞれ、内腔酵素部分または可溶性部分を、例えば、コラーゲン様ペプチド足場（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）×１０、またはビオチン化部位に融合させて生成することができる。図１５Ｃ〜１５Ｄに示すように、グリコシル化酵素の可溶性部分は、コラーゲン三量体化ドメインに融合させて三量体として（図１５Ｃ）、またはビオチンリガーゼ認識部位を含め、ビオチンリガーゼを用いて融合物をビオチン化し、その後ストレプトアビジンとインキュベートして四量体として（図１５Ｄ）改変されてもよい。図１５Ｃ〜１５Ｄでは、多量体はヘテロ多量体として描かれているが、必要に応じてホモ多量体として作製することもできる。多価タンパク質結合剤を作製する詳細な方法は、例えば、その全体が参照により組み込まれるFan, Chia-Yu, et al. " Production of multivalent protein binders using a self-trimerizing collagen-like peptide scaffold." The FASEB Journal 22.11 (2008): 3795-3804に記載されている。
【００９３】
部位特異的糖鎖改変
可溶性ゴルジ酵素は全身で見出されるが、明確な解剖学的位置へとこれらの酵素を選択的に標的化する能力がより望ましい適用および状況がある。いくつかの適当な場合において、酵素内腔ドメインまたは触媒ドメインは、完全長抗体−酵素コンジュゲートを生じるように免疫グロブリン（例えば、抗体、または一本鎖可変断片）に結合されてもよい。
【００９４】
単一の天然ＩｇＧ抗体は、軽鎖の２つの同一のコピーおよび重鎖の２つの同一のコピーを含む。各々が１個の可変ドメイン（または可変領域、ＶＨ）および３個の定常ドメイン（または定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含有する重鎖は、その定常ドメイン内のジスルフィド結合を介して互いに結合して抗体の「幹」を形成する。各々が１個の可変ドメイン（または可変領域、ＶＬ）および１個の定常ドメイン（または定常領域、ＣＬ）を含有する軽鎖は、各々がジスルフィド結合を介して１つの重鎖に結合する。各軽鎖の可変領域は、これが結合している重鎖の可変領域と整列される。断片抗原結合（Ｆａｂ）断片は、抗原に結合する抗体の領域である。該断片は、重鎖および軽鎖の各々の１個の定常領域および１個の可変領域からなる。断片結晶性領域（Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する抗体の尾部領域である。この特性により、抗体は免疫系を活性化できるようになる。
【００９５】
ＩｇＧにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常領域に由来する、２つの同一のタンパク質断片からなる。
【００９６】
ＦｃまたはＦａｂの定常Ｃ末端への融合は、特異的適用に依存するであろう（図１６Ａ〜１６Ｂ）。同様に、完全長免疫グロブリンで使用される可変領域配列は、免疫グロブリン結合グリコシル化酵素を局在化させる能力によって選択されるであろう。可変領域配列の基準は、融合された酵素が標的グリカンを修飾するためにすぐ近くにくるように、目的とするグリコシル化部位に隣接して位置するモチーフを認識することを含むであろう。また、グリカンに直接結合する、またはグリカンの接近性をブロックする可変領域配列は避けられるであろう。最後に、Ｆｃ部分は、所望の抗体依存性エフェクター機能を誘発するように改変されてもよい（図１６Ａ）。例えば、感染病原体を標的化するグリコシル化酵素の場合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増強を示すＦｃが有効であり得る。対照的に、異種移植片移植を含む他の適用のためのグリコシル化酵素−融合物は、ＡＤＣＣの能力がないＦｃを含有するであろう。
【００９７】
図１６Ａ〜１６Ｂに示すように、酵素融合物は、目的とする免疫グロブリン可変鎖および定常鎖を使用して生成することができる。酵素は、適用に応じてＦｃまたは定常ＦａｂのＣ末端に融合され得る。Ｆａｂは、意図されたグリカンに十分に近いグリコシル化酵素に結合するその特異性、能力について選択される。Ｆｃは、所望の免疫グロブリンエフェクター機能を誘発する、または誘発しないように改変されてもよい。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本開示は、ヘテロ多量体を提供する。ヘテロ多量体は、抗体またはその抗体断片、シアル酸転移酵素の酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）、および／またはガラクトシル転移酵素の酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗体断片は、２つの重鎖、および２つの軽鎖を有する。シアル酸転移酵素の酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）は、重鎖または軽鎖のＣ末端に融合することができる。同様に、ガラクトシル転移酵素の酵素内腔ドメイン（または触媒ドメイン）も、重鎖または軽鎖のＣ末端に融合することができる。
【００９９】
処置方法
本明細書に記載された方法は、ＩｇＧ介在性障害（例えば、炎症、自己免疫疾患）および臓器移植における抗体介在性損傷を処置するための方法を含む。いくつかの実施形態において、障害は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、多発性硬化症、全身性ループスエリテマトーデス、関節リウマチ、慢性炎症性脱髄性ニューロパチー、シェーグレン症候群、および多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー肉芽腫症）等などの自己免疫疾患である。これらの自己免疫疾患は、例えば、Dal, Mehmet Sinan, et al. "Assessment of the underlying causes of the immune thrombocytopenia: Ten years experience." JPMA. The Journal of the Pakistan Medical Association 67.7 (2017): 1004；Prineas, John W., and John DE Parratt. "Multiple sclerosis: Serum antiCNS autoantibodies." Multiple Sclerosis Journal (2017): 1352458517706037；Bai, Yunqiang, et al. "Self - dsDNA in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus." Clinical & Experimental Immunology (2017)；Hughes, Graham RV. "Frequency of anti-DNA antibodies in SLE, RA and other diseases: experience with the ammonium sulphate precipitation technique." Scandinavian Journal of Rheumatology 4.supll (1975): 42-51；Fu, S. M., et al. "Autoantibodies and glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus." Lupus 12.3 (2003): 175-180；Tan, EngM. "Autoantibodies and autoimmunity: A three - decade perspective. A tribute to Henry G Kunkel." Annals of the New York Academy of Sciences 815.1 (1997): 1-14；Querol et al., "Autoantibodies in chronic inflammatory neuropathies: diagnostic and therapeutic implications." Nat Rev Neurol. 2017 Sep ; 13 (9): 533-547に記載され、それらの各々は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０１００】
一般的に、方法は、グリコシル化酵素の酵素内腔ドメインもしくは触媒ドメインを含むもしくはからなる薬剤（例えば、融合タンパク質またはペプチド）、多量体（例えば、ＦｃＢ４、ＦｃＳＴ６、ＦｃＣｈｍ）、または本明細書に記載される組成物の治療的に有効な量を、そのような処置を必要とする、またはそのような処置を必要とすると判断された対象に投与するステップを含む。
【０１０１】
この文脈で使用される場合、「処置する（treat）」は、障害または疾患の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。多くの場合、処置は症状の改善をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は炎症の低減をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、臨床症状の１つもしくは複数が改善もしくは低減され、持続期間が短縮され、症状の発生頻度が低減され、または臨床症状の出現が予防される（すなわち、症状のリスクが低減される）。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、本明細書全体を通じて互換的に使用され、本発明の方法による処置が提供される動物、ヒトまたはヒト以外、例えば、哺乳動物を表す。獣医学的および非獣医学的用途が本発明によって企図される。ヒト患者は、成人または若年者（例えば、１８歳未満のヒト）であってもよい。ヒトに加えて、患者には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、および霊長類が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ヒト以外の霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ等）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ類、ブタ（swine）（例えば、ブタ（pig）、ミニブタ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ならびに他の飼育動物、家畜、および動物園動物が含まれる。故に、本明細書に記載されるグリコシル化酵素、抗体、またはその一部（例えば、抗体のＦｃ領域またはグリコシル化酵素の触媒ドメイン）は、これらのヒト以外の動物にも由来してもよい。本開示は、さらに、これらのヒト以外の動物のいくつかに由来するグリコシル化酵素、および抗体またはその一部のアミノ酸配列を提供する。例えば、図２３は、イヌＩｇＧ重鎖Ａ、イヌＩｇＧ重鎖Ｂ、イヌＩｇＧ重鎖Ｃ、イヌＩｇＧ重鎖Ｄ、イヌＳＴ６ＧＡＬ１、およびイヌＢ４ＧＡＬＴ１のアミノ酸配列を列挙する。図２４は、ネコＩｇＧ１ａ重鎖、ネコＩｇＧ１ｂ重鎖、ネコＳＴ６ＧＡＬ１、およびネコＢ４ＧＡＬＴ１のアミノ酸配列を列挙する。図２５は、ウシＩｇＧ１重鎖定常領域、ウシＩｇＧ２重鎖定常領域、ウシＩｇＧ３重鎖定常領域、ウシＳＴ６ＧＡＬ１、およびウシＢ４ＧＡＬＴ１のアミノ酸配列を列挙する。図２６は、ウマＩｇＧ１重鎖定常領域、ウマＩｇＧ２重鎖定常領域、ウマＩｇＧ３重鎖定常領域、ウマＩｇＧ４重鎖定常領域、ウマＩｇＧ５重鎖定常領域、ウマＩｇＧ６重鎖定常領域、ウマＳＴ６ＧＡＬ１、およびウマＢ４ＧＡＬＴ１のアミノ酸配列を列挙する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、対象は、年齢が２５歳以上、３０歳以上、４０歳以上、５０歳以上、６０歳以上、７０歳以上、または８０歳以上のヒト（例えば、男性または女性）である。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、互換的に使用され、用量または量に適用される用語「治療的に有効な（therapeutically effective）」および「有効量（effective amount）」は、それを必要とする対象に投与したときに所望の活性をもたらすのに十分な、組成物、化合物または医薬製剤の量を指す。本開示の文脈内において、用語「治療的に有効な」は、十分な量の組成物、化合物または医薬製剤が、本明細書に記載される障害の少なくとも１つの症状または１つの状態を低減または排除できることを指す。
【０１０５】
ＩｇＧ介在性障害
本明細書で使用される場合、用語「ＩｇＧ介在性障害」は、ＩｇＧのレベルの増加または活性の増加によって引き起こされるまたは特徴付けられる任意の障害を指す。したがって、ＩｇＧの活性を阻害することがＩｇＧ介在性障害に対する処置となる場合が多い。ＩｇＧ介在性障害には、炎症、および様々な自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
実際に、ＩｇＧは、炎症を抑制するために臨床で広く使用されている。静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、何万人もの健康なドナーに由来するポリクローナル単量体ＩｇＧの治療用製剤である。ＩｇＧは、抗体補充療法として４００〜６００ｍｇ／ｋｇで免疫低下患者に与えられる。１９８１年、自己抗体が血小板を標的化する自己免疫疾患（免疫介在性血小板減少症、ＩＴＰ）を患う小児患者に、ＩＶＩＧが高用量（１〜２ｇ／ｋｇ）で投与された。処置は血小板数を正常まで回復させ、患者に一時的な緩和をもたらした（Imbach, P. et al. Lancet 1, 1228-1231 (1981)）。それ以来、ＩＶＩＧは、自己免疫疾患ＩＴＰ、多発性硬化症、全身性ループスエリテマトーデスを含む多くの疾患を処置するための、および固形臓器移植のための抗炎症療法として日常的に使用されている（例えば、Fillit, H. Lancet Neurol 3, 704 (2004)；Fillit, H., Hess, G., Hill, J., Bonnet, P. & Toso, C. Neurology 73, 180-185 (2009)；Hack, C.E. & Scheltens, P. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75, 1374-1375 (2004)；Ishii, N., Hashimoto, T., Zillikens, D. & Ludwig, R.J. Clin Rev Allergy Immunol 38, 186-195 (2010)；Nimmerjahn, F. & Ravetch, J.V. Annu Rev Immunol 26, 513-533 (2008)を参照）。
【０１０７】
ＩｇＧの用量依存的な炎症促進性作用および抗炎症作用を支配する機構は、広く研究されてきた（Clynes, R. Curr Opin Immunol 19, 646-651 (2007)；Schwab, I. & Nimmerjahn, F. Nat Rev Immunol 13, 176-189 (2013)）。ＩｇＧからのＦｃグリカンの除去は、ＩｇＧの抗炎症活性を駆動する機構の解明に役立った（Kaneko, Y., Nimmerjahn, F. & Ravetch, J.V. Science 313, 670-673 (2006)）。脱グリコシル化ＩＶＩＧは、関節リウマチモデルにおいて炎症を抑制することができなかった。さらに、Ｆｃグリカンから末端シアル酸を除去するためにノイラミニダーゼで処置されたＩＶＩＧもまた抗炎症活性を示さなかった。故に、ＩｇＧ  Ｆｃグリカン組成、特に末端シアル酸は、ＩｇＧの抗炎症活性に関与している。さらに、シアリル化ＩｇＧ  Ｆｃは、ＩＶＩＧより３０倍低い用量で抗炎症活性を示した。
【０１０８】
したがって、本開示に記載された方法は、様々なＩｇＧ介在性障害（例えば、炎症、自己免疫疾患）を処置するのに使用することができる。
【０１０９】
別の態様において、本開示に記載された方法は、ＩＶＩＧによって処置され得る任意の疾患または障害を処置するのに使用されてもよい。これらの疾患または障害には、炎症、自己免疫疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、多発性硬化症、全身性ループスエリテマトーデス、およびアルツハイマー病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、方法は、ＩｇＧ介在性障害を有する対象を特定するステップ、および対象に、任意のポリペプチド、多量体、または本開示で記載される組成物を対象に投与するステップを含む。
【０１１１】
炎症
炎症は、有害な刺激に対する身体組織の複雑な生物学的応答の一部である。炎症の機能は、細胞傷害のそもそもの原因を排除し、最初の損傷および炎症プロセスで傷つけられた壊死細胞および組織を取り除き、組織修復を開始することである。しかし、いくつかの場合において、炎症は身体に害を及ぼし得る。上記に論じたように、炎症は抗体によって媒介される場合が多い。したがって、本明細書に記載された方法は、炎症を処置、阻害、低減、または制御するのに使用されてもよい。
【０１１２】
自己免疫疾患
自己免疫疾患は、正常な身体部分に対する異常な免疫応答から生じる状態である。自己免疫疾患は、ＩｇＧの異常な機能によって媒介される場合が多いことから、故に本開示に記載された方法は、様々な自己免疫疾患を処置するのに使用することができる。自己免疫疾患は、主要組織（例えば、心臓、腎臓、肝臓、肺、皮膚、および生殖器）、腺（例えば、副腎、膵臓、甲状腺、および唾液腺）、消化器系、血液、結合組織、筋肉、神経系、眼、耳、脈管系等に影響を与え得る。いくつかの一般的な自己免疫疾患には、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、および全身性ループスエリテマトーデスが含まれる。
【０１１３】
本開示に記載された方法によって処置することができる自己免疫疾患のリストには、アジソン病、ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ｇｂｍ／抗ｔｂｍ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫肝炎、自己免疫性内耳疾患、軸索型＆神経型ニューロパチー、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグストラウス、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、全身性ループスエリテマトーデス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、妊娠ヘルペスまたは妊娠性類天疱瘡、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎病、ランバート−イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織疾患、モーレン潰瘍、ムッハ−ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus（レンサ球菌感染性小児自己免疫神経精神障害））、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症、パリー−ロンベルグ症候群、周辺部ブドウ膜炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ−ターナー症候群、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎（perivenous encephalomyelitis）、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群（polyneuropathy、organomegaly、endocrinopathy、monoclonal gammopathy、skin changes（多発ニューロパチー、臓器腫大、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、皮膚症状））、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、関節リウマチ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精液精巣自己免疫（sperm & testicular autoimmunity）、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病（例えば、特発性血小板減少性紫斑病）、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組���病、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症と呼ばれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
いくつかの場合において、自己免疫疾患は、後天性自己免疫障害である。例えば、ＨＩＶ感染は、いくつかの臓器系および組織に対する損傷につながる免疫系の破壊を引き起こし得る。故に、１つの態様において、本開示に記載された方法は、後天性自己免疫障害を処置するのに使用することができる。
【０１１５】
固形臓器移植
移植拒絶反応は、移植された組織がレシピエントの免疫系によって拒絶されるときに起こり、移植された組織を破壊する。移植拒絶反応は、抗体介在性傷害を伴う場合が多い。移植における抗体の役割は、例えば、その全体が参照により組み込まれるHourmant et al. "Frequency and clinical implications of development of donor-specific and non-donor-specific HLA antibodies after kidney transplantation." Journal of the American Society of Nephrology 16.9 (2005): 2804-2812に記載されている。故に、１つの態様において、本開示に記載された方法は、移植拒絶反応を処置もしくは制御する（例えば、抗体介在性傷害を低減または最小限にする）、または移植片対宿主病を処置するのに使用することができる。いくつかの実施形態において、移植臓器は、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、皮膚、または胸腺である。
【０１１６】
ワクチン接種改善
ワクチンは、免疫系を刺激して病原体抗原に特異的な抗体を生成することができる。研究は、フィードフォワード機構を通じて、ワクチン抗原に特異的なシアリル化抗体が、高度に特異的な高親和性抗体の生成をもたらすことを示した。この機構は、例えば、Wang, Taia T., et al. "Anti-HA glycoforms drive B cell affinity selection and determine influenza vaccine efficacy." Cell 162.1 (2015): 160-169に記載されている。故に、本明細書に記載された方法は、ワクチン抗原に特異的なシアリル化抗体を生成し、最終的に病原体抗原に対する高度に特異的な高親和性抗体を産生するために、標準的なワクチン接種と併せて使用することもできる。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、方法は、ポリペプチド、多量体（例えば、ＦｃＢ４、ＦｃＳＴ６、および／またはＦｃＣｈｍ）、または本明細書に記載される組成物の治療的に有効な量を、対象がワクチンを投与される前、投与中、または投与された後で、対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンおよびポリペプチド、多量体（例えば、ＦｃＢ４、ＦｃＳＴ６、および／またはＦｃＣｈｍ）を含む組成物、または本明細書に記載される組成物が対象に投与される。
【０１１８】
発現系
本明細書に記載される融合タンパク質またはペプチドを使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましい場合がある。これは、様々な方法で行うことができる。例えば、融合タンパク質またはペプチドをコードする核酸が、複製および／または発現のために原核細胞または真核細胞に形質転換するための中間ベクターにクローニングされてもよい。中間ベクターは、典型的には、産生のための融合タンパク質またはペプチドをコードする核酸を貯蔵または操作するための、原核生物ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。融合タンパク質またはペプチドをコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞（好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞）、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与のために、発現ベクターにクローニングすることもできる。
【０１１９】
発現を得るために、融合タンパク質またはペプチドをコードする配列は、転写を指示するためのプロモーターを含有する発現ベクターに典型的にはサブクローニングされる。適切な細菌および真核生物プロモーターは当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protcols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。改変タンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、桿菌属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ）において利用可能である（Palva et al., 1983、Gene 22:229-235）。そのような発現系用のキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞用の真核生物発現系は当技術分野で周知であり、同様に市販されている。いくつかの実施形態において、融合タンパク質およびペプチドは、本開示で記載される融合タンパク質およびペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いた、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、Ｅｘｐｉ２９３細胞、またはＣＨＯ細胞のトランスフェクションによって発現される。
【０１２０】
核酸の発現を指示するのに使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、強い構成的プロモーターは、典型的には融合タンパク質の発現および精製に使用される。対照的に、融合タンパク質またはペプチドをコードするベクターがインビボで投与される場合、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかが特定のニーズに応じて使用され得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質またはペプチドをコードするベクターを投与するためのプロモーターは、ＨＳＶ  ＴＫまたは類似の活性を有するプロモーターなどの弱いプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、トランス活性化に応答性であるエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびにテトラサイクリン調節系およびＲＵ−４８６系などの小分子制御系を含むこともできる（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547；Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol., 16:757-761を参照）。
【０１２１】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核細胞または真核細胞のいずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要とされる全ての追加のエレメントを含有する転写単位または発現カセットを含有する。典型的な発現カセットは、故に、例えば、融合タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要とされる任意のシグナルを含有する。カセットの追加のエレメントは、例えば、エンハンサー、および異種スプライシングイントロンシグナルを含んでもよい。
【０１２２】
遺伝子情報を細胞に輸送するのに使用される特定の発現ベクターは、意図された用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物等での発現に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの市販のタグ融合発現系が含まれる。
【０１２３】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターは、真核生物発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パイローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルスに由来するベクターで使用される場合が多い。他の例示的な真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に有効であることが示された他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【０１２４】
融合タンパク質またはペプチドを発現するベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含んでもよい。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後に哺乳動物細胞での融合タンパク質またはペプチドの発現を可能にする。
【０１２５】
いくつかの発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞株を選択するための、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどのマーカーを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示下でコード配列を有する、昆虫細胞でのバキュロウイルスベクターの使用などの、高収率発現系もまた適している。
【０１２６】
典型的には発現ベクターに含まれるエレメントには、大腸菌（E. coli）で機能するレプリコン、組換えプラスミドを内部に持つ細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の固有の制限部位も含まれる。
【０１２７】
標準的なトランスフェクション方法を使用して大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株を作製し、次いで標準的な手法を使用して該細胞株が精製される（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264: 17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)を参照）。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準的な手法に従って行われる（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照）。
【０１２８】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するためのあらゆる公知の手順が使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソームおよび組み込みの両方）、およびクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子物質を宿主細胞に導入するためのあらゆる他の周知の方法の使用が含まれる（例えば、Sambrook et al.、上記を参照）。必要なのは、使用される特定の遺伝子工学的手順により、融合タンパク質またはペプチドを発現することができる宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を成功裏に導入できることのみである。
【０１２９】
本開示はまた、例えば、本明細書に記載された様々な方法において使用するための、ベクターおよびベクターを含む細胞、ならびに本明細書に記載されたタンパク質および核酸を含むキットも含む。
【０１３０】
投与量
「有効量」は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成するものである。この量は、疾患または疾患症状の発症を防ぐために必要な量である、予防的に有効な量と同じまたは異なっていてもよい。有効量は、１つまたは複数の投与、適用または投与量で投与することができる。ポリペプチド、多量体（例えば、ＦｃＢ４、ＦｃＳＴ６、ＦｃＣｈｍ）、または組成物（すなわち、有効投与量）の治療的に有効な量は、選択されるポリペプチド、多量体、または組成物に依存する。組成物は、１日１回〜１回以上から、週に１回または複数回（１日おきを含む）投与されてもよい。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全般的健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要とされる投与量およびタイミングに影響を与え得ることを理解するであろう。さらに、ポリペプチド、多量体、または本明細書に記載された組成物の治療的に有効な量を用いた対象の処置は、単回処置または一連の処置を含み得る。
【０１３１】
ポリペプチド、多量体、または組成物の投与量、毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は治療的指標であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指標を示すポリペプチド、多量体、または組成物が好ましい。毒性の副作用を示すポリペプチド、多量体、または組成物が使用されてもよいが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を低減するために、患部組織部位にポリペプチド、多量体、または組成物を標的化する送達系を設計するように注意が払われるべきである。
【０１３２】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を策定する上で使用することができる。ポリペプチド、多量体、または組成物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないまたはないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形態および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。本開示で記載される方法において使用される任意のポリペプチド、多量体、または組成物に関して、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達するテストポリペプチド、多量体、または組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、用量が動物モデルで策定されてもよい。そのような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定されてもよい。
【０１３３】
医薬組成物および投与方法
本明細書に記載された方法は、本開示で記載される任意のポリペプチドまたは多量体（例えば、ＦｃＢ４、ＦｃＳＴ６、および／またはＦｃＣｈｍ）を活性成分として含む医薬組成物の使用、および組成物それ自体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＦｃＢ４、ＦｃＳＴ６、およびＦｃＣｈｍを含む。
【０１３４】
医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、語「薬学的に許容される担体」には、薬学的投与と適合する生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。
【０１３５】
医薬組成物は、典型的には、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。
【０１３６】
適切な医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005；およびシリーズDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)中の本を参照。例えば、非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調整剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入されてもよい。
【０１３７】
注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれ得る。静脈内投与に関して、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射できる程度に流動的であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【０１３８】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせと共に、本開示で記載されるポリペプチド、多量体、または組成物を必要量で適当な溶媒に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒および上記に列挙された成分からの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、ポリペプチド、多量体、または組成物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって滅菌濾過されたその溶液から活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末を産生する、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１３９】
経口組成物は、一般的に不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性剤は賦形剤と共に組み込まれてもよく、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用されてもよい。経口組成物はまた、口腔洗浄薬として使用するための液体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料が組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれか、または類似した性質の薬剤を含有することができる：微結晶性セルロース、トラガントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Sterote）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味剤。
【０１４０】
吸入による投与のために、組成物は、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。そのような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されたものが含まれる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドまたは多量体は、留置剤およびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤などの、身体からの迅速な排除からポリペプチドまたは多量体を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤は、標準的な手法を使用して調製することができ、または例えば、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（細胞性抗原に対するモノクローナル抗体を用いて、選択された細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載された方法に従って調製することができる。
【０１４２】
医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
【実施例】
【０１４３】
本発明は、以下の例にさらに記載される。以下の例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【０１４４】
[実施例１]
ＩｇＧ抗体のインビボシアリル化は自己免疫疾患を軽減する
内因性ＩｇＧのインビボでの糖鎖改変によりＩｇＧ介在性炎症を調節する治療効果を決定するために、実験を行った。
【０１４５】
材料および方法：
グリコシル化酵素−Ｆｃ融合物の構築および作製
ＩＬ２分泌シグナル配列に先行されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ、およびＳＴ６ＧＡＬ１（ベータ−ガラクトシドアルファ−２，６シアル酸転移酵素１）またはＢ４ＧＡＬＴ１（ベータ−１，４−ガラクトシル転移酵素１）の可溶性ドメインを、ヒトＩｇＧ  Ｆｃが酵素の５’末端に融合されるようにオーバーラップＰＣＲによって結合した。この試験で使用したプライマーのリストを表２に示す。ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）、ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）の制限部位を表に示した。Ｆｃ−酵素融合遺伝子を、次いで、製造者のプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って哺乳動物発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．４にＴＯＰＯクローン化した。組換えＦｃ−酵素を、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造者のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞へのプラスミドの一過性トランスフェクションによって生成した。Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ酵素を、ｐｃＤＮＡ３．４／ＳＴ６ＦｃおよびｐｃＤＮＡ３．４／Ｂ４Ｆｃを１：１比で同時トランスフェクトして作製した。プロテインＧアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して酵素を培養上清から精製し、インビボ注射のためにＰＢＳ中で透析した。
【０１４６】
インビボ動物試験  ７〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６およびＮＯＤマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＧＨ）の動物施設で国立衛生研究所（ＮＩＨ）ガイドラインに従って特定病原体未感染条件下で維持した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（Ｋ／Ｂ）のＫＲＮ  ＴＣＲトランスジェニックマウスは、Ｄ．ＭａｔｈｉｓおよびＣ．Ｂｅｎｏｉｓｔ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から寄贈され、ＮＯＤマウスに交配してＫ／ＢｘＮマウス（Korganow et al., 1999）を生成した。Ｋ／ＢｘＮ血清を以前に記載されているように調製した（Kaneko et al., 2006）。炎症性関節炎をＫ／ＢｘＮ血清の静脈内注射によって誘導した（マウス１匹あたり２００μＬのプールＫ／ＢｘＮ血清）。治療的介入実験のために、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、Ｂ４Ｆｃ（１．２５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＳＴ６Ｆｃ（１．２５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、または生理食塩水をＫ／ＢｘＮ血清後０日目または３日目に注射した。記載されているように（Kaneko et al., 2006）、関節炎を臨床検査によってスコア化し、全ての四肢の指標を加えた（０＝影響なし、１＝１つの関節の腫脹、２＝１つを超える関節の腫脹、３＝肢全体の重度の腫脹）。Ｋ／ＢｘＮ血清注射の前にＰＢＳ、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ（５０μｇ）を１時間注射した。腎毒性腎炎実験のために、マウスを腹腔内経路によりＣＦＡ中２００μｇのヒツジＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）で予備免疫し、その後、４日後にヒツジＮＴＳ（Ｐｒｏｂｅｔｅｘ，Ｉｎｃ．）（マウス１グラムあたり２μｌの血清）を静脈内注射した。ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ（５０μｇ）またはそのビヒクル単独を、ヒツジＮＴＳ注射の１時間前に注射した。血清中尿素窒素（ＢＵＮ）を、修飾ウレアーゼキット（Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して酵素結合平衡方法によって測定した。全ての動物実験は、ＭＧＨの所内動物実験委員会に従って実施した。
【０１４７】
クロピドグレル処置  以前に記載されているように（Pucci et al., 2016）、血小板阻害を１０ｍｇ／ｋｇクロピドグレル（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）の毎日注射によって行った。炎症性関節炎モデルではＫ／ＢｘＮ血清の２日前に処置を開始した。腎毒性腎炎モデルでは、ヒツジＩｇＧによる予備免疫の２日後に処置を開始した。処置は３週間継続した。
【０１４８】
インビトログリコシル化  融合酵素の酵素の活性を、以前に記載されているように（Anthony et al., 2008）インビトロで調べた。簡単には、グリカン受容体タンパク質（フェチュイン、ヒトまたはマウスＩｇＧ  Ｆｃ）を、３７℃で終夜、シアリダーゼＡ（ＰｒｏＺｙｍｅ）およびβ１，４−ガラクトシダーゼ−Ｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で処理して、シアル酸およびガラクトースを除去した。Ｂ４ＦｃまたはＢ４ＳＴ６Ｆｃのガラクトシル転移酵素活性を評価するために、アシアリル化、アガラクトシル化グリカン−受容体タンパク質を、２×ガラクトシル化緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．２）中３７℃で終夜、５ｍＭ  ＵＤＰ−ガラクトース（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とインキュベートした。ＳＴ６ＦｃまたはＢ４ＳＴ６Ｆｃのシアル酸転移酵素活性を評価するために、アシアリル化糖タンパク質を、シアリル化緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中３７℃で終夜、５ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）とインキュベートした。
【０１４９】
ウエスタンおよびレクチンブロット  ウエスタンおよびレクチンブロットを以前に記載されているように（Anthony et al., 2008）行った。簡単には、タンパク質の等量を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、次いでポリビニリデンジフルオリド膜に転写した。膜をウエスタンブロット用にＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中５％粉乳でブロックした後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）；抗ヒトＢ４ＧＡＬＴ１（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、その後の抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）；または抗ヒトＳＴ６ＧＡＬ１血清（１：１００、Ｄｒ．Ｊ．Ｐａｕｌｓｏｎからの寛大な贈り物）と、その後の抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰのどちらかを使用してタンパク質を検出した。レクチンブロットのために、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で膜をブロックし、ビオチン化Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＳＮＡ；５μｇ／ｍｌ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはビオチン化Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  Ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＥＣＬ；５μｇ／ｍｌ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のどちらかでプローブして、それぞれ末端シアル酸またはガラクトースを検出した。
【０１５０】
ＨＰＬＣグリカン分析  完全またはＦｃ特異的Ｎ−結合型グリカンを、製造者の説明書に従ってそれぞれＰＮＧａｓｅＦまたはＥｎｄｏ  Ｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を使用して糖タンパク質から放出させた。脱グリコシル化反応を３７℃で終夜実行して、グリカンの有効な放出を確実にした。ＧｌｙｋｏＣｌｅａｎ（商標）Ｇカートリッジ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を使用してグリカンを反応から精製し、乾燥し、２−ＡＢ（２−アミノベンズアミド）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で蛍光標識した。標識グリカンをＧｌｙｋｏＣｌｅａｎ（商標）Ｓ−プラスカートリッジ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を用いて洗浄し、乾燥し、ＨＰＬＣ分析に供した。グリカン試料を１００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４．５）に溶解し、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏグリカンマッピングカラム２．１×１５０ｍｍ、２．７μｍおよび蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ＬＣシステムを使用して分離した。生じたピークをＯｐｅｎＬＡＢソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析し、市販のヒトＩｇＧ  Ｎ−結合型グリカンライブラリーのピークを比較してグリコフォームを割り当てた。
【０１５１】
ヒツジＩｇＧ特異的循環ＩｇＧレベルの測定  ５μｇ／ｍＬのヒツジＩｇＧでコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５％ウシ血清アルブミンでブロックした後、１：５００希釈血清とインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで洗浄後、プレートをＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートした。結合ＩｇＧの量を３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって評価し、吸光度を２Ｍ硫酸の添加後に４５０ｎｍで測定した。
【０１５２】
ＩｇＧ精製のための腎臓および関節ホモジネートの調製  抗ＧＢＭ抗血清注射後４日目および７日目にマウスを採血した。血清を血清ゲルチューブ（ＢＤ）によって血液から分離し、ＩｇＧ精製のためにプロテインＧ大容量アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。関節より上でカットした肢および腎臓を解体し、プロテアーゼ阻害剤および２ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したおよび１ｍＬ  ＰＢＳに懸濁し、小片にカットした後、ステンレススチールビーズおよびＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）で２分間、３Ｈｚ／ｓで機械的にホモジナイズした。ホモジネートを、次いで容量の５倍に希釈し（タンパク質阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）、７０μｍメッシュを通して濾過し、１０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を使用して、ＩｇＧをプロテインＧ大容量アガロースビーズを用いて精製した。
【０１５３】
組織学的検査  足首関節を解体し、固定および脱灰液Ｃａｌ−Ｅｘ  ＩＩ中で４８時間〜７２時間インキュベートし（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、パラフィンに包埋した。４μｍ切片を組織学的分析のためにヘマトキシリン／エオジンで染色した。腎臓を解体し、１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。光学顕微鏡による分析のために、４μｍパラフィン切片を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、およびヘマトキシリン／エオジンで染色した。４μｍ  ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）凍結腎臓切片をアセトンで固定し、記載がある場合は、製造者の説明書に従って、ラット抗マウスＣＤ４１−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ラット抗マウスＣＤ６２Ｐ−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびヤギ抗マウスネフリン（Ｒ＆Ｄ系）とその後のロバ抗ヤギＩｇＧ−ＡＦ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と組み合わせた、ＤＡＰＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＤｙＬｉｇｈｔ４０５（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用してスライドを調べた。
【０１５４】
血小板調製  血小板単離、活性化および阻害は、過去の研究（Boilard et al., 2010、Lee et al., 2014）から適合させた。健常者はインフォームドコンセントに同意し、クエン酸ナトリウム緩衝採血チューブ（ＢＤ）に全血を採取し、２００×ｇで１０分間遠心分離した。上清の多血小板血漿（ＰＲＰ）を採取し、９００×ｇで５分間さらに遠心分離した。上清の乏血小板血漿を除去した後、ペレット化した血小板を１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に再懸濁した。０．２Ｕのトロンビン（Ｒｏｃｈｅ）を３７℃で５分間使用して血小板活性化を達成した。０．２５ｍｇのクロピドグレルを室温で１５分間使用して血小板活性化を阻害した。血小板を１０００×ｇで５分間、遠心分離によってペレット化し、血小板上清をＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−ＳＡについて定量化した。
【０１５５】
ヒト血清中のガラクトースおよびシアル酸供与体の定量化  グリカン供与体の定量を、ヒト血小板上清で１つを例外として、シアル酸転移酵素およびグリコシルトランスフェラーゼ活性キットを使用して製造者（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって示されるように行った。濃度をより正確に報告するために、ＵＤＰ−ＧａｌおよびＣＭＰ−ＳＡの範囲を使用して標準曲線を生成した。
【０１５６】
血清半減期実験  ５０μｇのＩＶＩＧまたはＢ４ＳＴ６ＦｃをＣ５７ＢＬ／６メスマウスに静脈内投与した。マウスを注射後４日までは毎日、１０日目までは１日おきに採血した。マウス血清中のＩＶＩＧまたはＢ４ＳＴ６ＦｃをＥＬＩＳＡによって検出した。簡単には、９６ウェルプレートを５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でコーティングし、ＰＢＳ中２％  ＢＳＡでブロックし、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）でプローブした。検出には３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、２Ｍ硫酸を使用して反応を停止した。
【０１５７】
血液検査  ５０μｇのＢ４ＳＴ６Ｆｃをマウスに静脈内注射した。酵素の投与の１週間または２ヶ月後、マウスを採血し、全血球計算および包括的代謝パネル検査のために全血および血清をＭＧＨ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅへ送った。
【０１５８】
定量化および統計分析  データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで分析した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１（二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＴｕｋｅｙの事後検定によって決定）。
【０１５９】
【表１−１】
2021506343.tif 000003
【０１６０】
【表１−２】
2021506343.tif 000004
【０１６１】
【表２】
2021506343.tif 000005
【０１６２】
[実施例２]
可溶性グリコシルトランスフェラーゼの改変
ＳＴ６ＧＡＬ１は、Ｎ−結合型グリカンのガラクトースへのα２，６シアル酸の結合を触媒する（Meng et al., 2013）。ＳＴ６ＧＡＬ１によるシアリル化は、グリコシルトランスフェラーゼが膜貫通ドメイン（ＴＭＤ、図１Ｃ）によってアンカーされるトランスゴルジで典型的には生じる。β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）切断部位は、ＥＦＱ４１〜４３のＳＴ６ＧＡＬ１の内腔ドメインに存在しており、ＳＴ６ＧＡＬ１分泌をもたらす（図１Ｃおよび８）（Woodard-Grice et al., 2008）。注目すべきことに、最近の研究により、可溶性ＳＴ６ＧＡＬ１はＩｇＧ  Ｆｃグリカンのシアリル化に寄与することが示唆されている（Jones et al., 2012、Sugimoto et al., 2007、Jones et al., 2016）。ＩｇＧ生物学に対するシアリル化の驚くべき効果は、本発明者らがＩｇＧをインビボで糖鎖改変する治療的可能性を探求するきっかけとなった。
【０１６３】
この目的のために、グリコシル化酵素をヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合した。これは、膜タンパク質の可溶型を生成する一般的なアプローチである。アミノ酸配列にＥＦＱ４１〜４３の上流領域を含むＦｃおよびＳＴ６ＧＡＬ１の融合物を含む発現構築物は、ＢＡＣＥ１活性と一致する複数のタンパク質産物をもたらした（図８）。しかし、ＳＴ６ＧＡＬ１の最初の４０個のアミノ酸を除き、ＦｃをＥ４１に直接結合した場合、単一の産物が生成された（ＳＴ６Ｆｃ、図１Ｃおよび８Ｂ）。シアリル化効率はガラクトース含量の増加とともに改善するため（Anthony et al., 2008a）、同様のアプローチをＩｇＧ  Ｆｃグリカンへのガラクトースの結合に関与するＢ４ＧＡＬＴ１酵素に使用した。ヒトＩｇＧ１  ＦｃとのＢ４ＧＡＬＴ１内腔ドメインの改変融合物は、単一のタンパク質産物をもたらした（Ｂ４Ｆｃ、図１Ｃおよび８Ｂ）。改変グリコシルトランスフェラーゼは正しい分子量であると判定され、免疫ブロッティングによるＢ４ＧＡＬＴ１、ＳＴ６ＧＡＬ１、およびヒトＩｇＧに特異的な抗体によって認識された（図８Ｄ）。
【０１６４】
糖鎖改変の標的として、高度にグリコシル化されたタンパク質であるフェチュインを使用して、インビトロでの改変酵素の活性を調べた。フェチュインを、シアル酸残基およびガラクトース残基を除去するグリコシダーゼで最初に処理し、アシアリル化、ガラクトシル化（Ｇ２）およびアガラクトシル化（Ｇ０）フェチュイン（図１Ｄ）を生成した。Ｇ０およびＧ２フェチュインを、Ｂ４Ｆｃ、ＳＴ６Ｆｃ、または両方の酵素（Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ）および糖−ヌクレオチド供与体（ガラクトースおよびシアル酸について、それぞれ、ＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）およびＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ））とインキュベートした。結合特異的グリコシル化をレクチンブロッティングして調べ、Ｂ４Ｆｃが末端ガラクトースにβ１，４結合で効率的に結合し、ＳＴ６Ｆｃがα２，６末端シアル酸に結合することを明らかにした（図１Ｄ）。Ｂ４ＳＴ６Ｆｃは、ガラクトース供与体（ＵＤＰ−Ｇａｌ、図１Ｄ）とインキュベートした場合、β１，４ガラクトースに結合した。上述の通り、おそらく潜在的シアリル化部位の数を増加させることによって、ガラクトシル化はシアリル化の効率を向上させることが研究により示されており（Anthony et al., 2008a）、ガラクトースおよびシアル酸供与体の両方とインキュベートすると、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃはフェチュインを効率的にシアリル化した（図１Ｄ）。さらに、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃは、ガラクトースおよびシアル酸をマウスおよびヒトＩｇＧの両方に転移した（図１Ｅ）。
【０１６５】
[実施例３]
インビボシアリル化の抗炎症活性
これらの改変グリコシル化酵素のインビボで炎症を軽減する能力をテストした。マウスに、処置後数日内に浮腫および炎症細胞浸潤を呈する、主にＩｇＧ１自己抗体によって媒介される関節炎を惹起する関節炎誘発性Ｋ／ＢｘＮ血清を与えた（Korganow et al., 1999）。動物は、ＰＢＳ、高用量ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、Ｂ４Ｆｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＳＴ６Ｆｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、またはＢ４ＦｃおよびＳＴ６Ｆｃの両方（Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ、２．５ｍｇ／ｋｇ、図２Ａ〜２Ｄ）も受けた。関節炎誘発性血清は、ＰＢＳ処置動物において臨床スコアによって測定した強い炎症を誘導したが、炎症はＩＶＩＧによって軽減した（図２Ａ〜２Ｂ）。Ｂ４ＦｃもＳＴ６Ｆｃも個別には誘導炎症を低減することができなかった。しかし、改変酵素を同時投与した場合（Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ、２．５ｍｇ／ｋｇ）、炎症はＩＶＩＧによって達成された類似のレベルまで有意に軽減した（図２Ｃ〜２Ｄ）。処置７日後の関節への炎症性浸潤、および組織破壊は、ＰＢＳ処置対照と比べてＩＶＩＧおよびＢ４ＳＴ６Ｆｃ処置動物で著しく低減した（図２Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ガラクトースおよびシアル酸の両方に結合する酵素の投与が、インビボで受動的自己免疫性関節炎症の軽減に有効であることを示している。
【０１６６】
これらの知見を自己免疫疾患の活性モデルに広げるために、腎臓損傷をもたらす腎臓に沈着したＩｇＧ２ｂベースの免疫複合体によって主に駆動される、腎毒性腎炎（ＮＴＮ）をもたらすグッドパスチャー病のモデル（Lerner et al., 1967、Schrijver et al., 1990、Kaneko et al., 2006a）を使用した。Ｂ４ＳＴ６Ｆｃの投与は、７日時点の血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルによって測定した場合、ＩＶＩＧと同じくらい有効に腎臓病態を抑制し（図２Ｆ）、生存を延長した（図２Ｇ）。実際に、７日時点の腎臓への炎症細胞浸潤は、ＰＢＳ対照と比べてＢ４ＳＴ６ＦｃおよびＩＶＩＧによって低減した（図２Ｈ）。血清または腎臓ＩｇＧ力価によって測定した場合、ＩＶＩＧもＢ４ＳＴ６Ｆｃも誘導された病原性抗体応答に影響を与えなかった（図９Ａ〜９Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃによるインビボシアリル化が、免疫調節性高用量ＩＶＩＧより４００倍低い用量で自己抗体介在性腎臓破壊を有効に改善することを示している。
【０１６７】
[実施例４]
インビボシアリル化のための要求性
ＩＶＩＧおよびシアリル化ＩｇＧ  Ｆｃの抗炎症活性のために抑制性ＦｃγＲＩＩＢが要求されることは、マウスモデルを使用した機能研究によって支持されており（Samuelsson et al., 2001、Bruhns et al., 2003、Anthony et al., 2011、Schwab et al., 2014）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー患者への高用量ＩＶＩＧの投与後に観察されたように、白血球でのＦｃγＲＩＩＢの表面発現を増加させた（Tackenberg et al., 2009）。さらに、シアリル化ＩｇＧ  Ｆｃは、炎症を抑制するためにマウスＳＩＧＮ−Ｒ１またはヒトＤＣ−ＳＩＧＮを必要とすることが示された（Anthony et al., 2011、Anthony et al., 2008b、Schwab et al., 2012）。故に、ＩｇＧのシアリル化は受容体選択性をＩＩ型ＦｃγＲに変換し、シアリル化ＩｇＧによるこれらの受容体のライゲーションにより、炎症細胞での抑制性ＦｃγＲＩＩＢの上方制御に至る（Pincetic et al., 2014）。インビボシアリル化が、ＩＶＩＧと似た経路を通じて炎症を抑制するかどうかを決定するために、実験も行った。ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃと一緒にＫ／ＢｘＮ血清を野生型またはＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスに投与し、その後数日にわたって肢の炎症を追跡した。ＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスでは、ＰＢＳと比べてＩＶＩＧもＢ４ＳＴ６Ｆｃも炎症を抑制せず（図３Ａ、３Ｂおよび１０Ａ）、これらの抗炎症活性のために受容体が要求されることが示された。次に、インビボでのＩＶＩＧおよびシアリル化ＩｇＧ抗炎症活性を軽減することが示されている（Anthony et al., 2008b）、ＳＩＧＮ−Ｒ１の一時的ノックダウンをもたらす抗体（ＴＫＯ  ＳＩＧＮ−Ｒ１（Kang et al., 2004））をマウスに投与した。これにより、Ｋ／ＢｘＮおよびＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃで処置したマウスにおける差は観察されず、ＳＩＧＮ−Ｒ１撹乱が、ＩＶＩＧおよびインビボシアリル化の両方の抗炎症活性を阻害することを示した（図３Ｃ、３Ｄ、および１０Ｂ）。
【０１６８】
次に、Ｋ／ＢｘＮ血清を、ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−バックグラウンドと交配したＳＩＧＮ−Ｒ１−／−およびヒトＤＣ−ＳＩＧＮ  トランスジェニックマウスに投与した（ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋／ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−、図３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ）。マウスはＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃも受け、その後数日にわたって炎症をモニターした。ＰＢＳ処置と一緒のＫ／ＢｘＮ血清の導入は、両方の遺伝子型に強い炎症をもたらした（図３Ｅ、３Ｆ）。ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−動物は、誘導された関節炎からＩＶＩＧまたはＢ４ＳＴ６Ｆｃによって守られなかった（図３Ｅ）。しかし、ＩＶＩＧおよびＢ４ＳＴ６Ｆｃはいずれも、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ＋／ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスにおける誘導炎症を軽減した（図３Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＩＶＩＧならびに改変ガラクトシルおよびシアル酸転移酵素によるインビボシアリル化が、類似の経路を通じて炎症を抑制することを示唆している。
【０１６９】
ＩＶＩＧとインビボシアリル化の間の共通の受容体および経路は、改変酵素上のＦｃグリカンがインビボでの抗炎症活性に関与し、酵素活性は関与していない可能性を提起した。したがって、２つの酵素ドメインのシステイン残基をアラニンに変異させることによる酵素的に不活性なＳＴ６Ｆｃを生成した（Ｃ３５０Ａ、Ｃ３６１Ａ、ＳＴ６ＦｃＣＡＣＡ、図４Ａ（Meng et al., 2013））。並行して、Ｂ４ＦｃおよびＳＴ６Ｆｃを、ＩｇＧ  Ｆｃ特異的エンドグリコシダーゼ、ＥｎｄｏＳで処置してＦｃグリカンを除去した（Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ−Ｅｎｄｏ、図４Ｂ）（Collin and Olsen, 2001）。Ｆｃグリカンの酵素的除去により、ＩｇＧおよびＦｃγＲの相互作用が切断されることが示されている（Allhorn et al., 2010、Benkhoucha et al., 2012、Yang et al., 2010）。重要なことには、Ｂ４ＳＴ６ＦｃＣＡＣＡはインビトロでシアル酸をヒトＩｇＧ  Ｆｃに転移することができなかったが、ガラクトシル転移酵素活性は、インタクトなままであった（図４Ｃ）。しかし、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ−Ｅｎｄｏは、ガラクトシルおよびシアル酸転移酵素活性を保持した（図４Ｃ）。これらの酵素を、インビボでの抗炎症活性についてテストした。Ｋ／ＢｘＮ血清をマウスに投与した。マウスは、ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ、Ｂ４ＳＴ６ＦｃＣＡＣＡ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ−Ｅｎｄｏも受けた。Ｋ／ＢｘＮの導入は強い炎症を誘導し、該炎症は、ＩＶＩＧ、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ、およびＢ４ＳＴ６Ｆｃ−Ｅｎｄｏによって軽減された（図４Ｄ、４Ｅ）。しかし、Ｂ４ＳＴ６ＦｃＣＡＣＡは、誘導炎症を抑制することができなかった（図４Ｄ、４Ｅ）。これらの結果は、転移酵素活性がインビボでの炎症の抑制に必要であり、改変酵素上のＦｃグリカンは必要でないことを示している。
【０１７０】
[実施例５]
インビボでの部位特異的シアリル化
改変グリコシルトランスフェラーゼの投与は自己免疫炎症を強力に抑制したものの、潜在的な望ましくない副作用がオフターゲットグリカン修飾であり得る。一般に、健康な個体の全ＩｇＧの５〜１０％はシアリル化Ｆｃグリカンを有することから、低レベルのシアル酸がＩｇＧ  Ｆｃグリカンで見出される。細胞および可溶性糖タンパク質のほとんどの複合体二分岐グリカンは高度にシアリル化されており、インビボシアリル化の潜在的なオフターゲット作用を限定する（Kaneko et al., 2006b、Youings et al., 1996）。それでもなお、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ投与後のインビボでの毒性および全身性グリコシル化を調べるために、実験を行った。循環中のＢ４ＳＴ６Ｆｃの半減期は、ＩＶＩＧと類似していた（それぞれ、８および７日、図１１Ａ、１１Ｂ）。これは、これらの分子のＦｃ部分が、インビボでの血清半減期を同様に制御していることを示唆している。投与１週間後および２ヶ月後のＢ４ＳＴ６Ｆｃの恒常性の影響も調べるために、実験を行った（図１１Ｃ）。赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）および血小板の全血球計算（ＣＢＣ）分析では、有害作用は顕著ではなかった。血清グルコースおよびカルシウムレベルは正常範囲内のままであり、一方、腎臓および肝臓機能は、包括的代謝パネル（ＣＭＰ）分析では変わらなかった。分析は、ＰＢＳ処置群とどちらのＢ４ＳＴ６Ｆｃ処置群の間にほとんど差がないことを明らかにし、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃの投与が毒性ではないことを示唆した（図１１Ｃ）。Ｂ４ＳＴ６Ｆｃの投与後１週間および２ヶ月のＩｇＧおよび全血清タンパク質のグリコシル化を調べるために、さらなる実験を行った（図１１Ｄ）。グリコシル化のわずかな変化が、ＰＢＳ処置対照と比べてＢ４ＳＴ６Ｆｃ処置動物で観察され、わずかなオフターゲット作用がインビボシアリル化から生じることを示唆した。
【０１７１】
両方の改変酵素の投与はインビボで抗炎症性であるが、恒常性状態中の血清ＩｇＧまたはタンパク質グリコシル化を特に変化させなかったため、炎症応答中のグリコシル化を調べるために、実験を行った。ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃを受けたマウスのパネルでＮＴＮを誘導し、全Ｎ−結合型グリコシル化を調べた。疾患誘導７日後、ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ処置マウスの循環中のＩｇＧに差は観察されず、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃが循環糖タンパク質のグリコシル化に影響を与えないという知見と一致した（図５Ａ）。興味深いことに、ＰＢＳまたはＩＶＩＧ処置マウスの腎臓から回収したＩｇＧと比べて、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ処置動物の腎臓から回収したＩｇＧのシアリル化が増加したことが観察された（図５Ｂ）。血清の炎症性アガラクトシル化ＩｇＧ  Ｆｃグリカンに対する抗炎症性モノシアリル化ＩｇＧ  Ｆｃグリカンの比（Ｓ１／Ｇ０％）は、血清ＩｇＧのシアル酸含量に差がないことを明らかにし、一方、腎臓から回収したＩｇＧはシアリル化が有意に増加していたが、ジシアリル化対アガラクトシル化腎臓ＩｇＧ  Ｆｃグリカンに変化はなかった（図５Ｃ、５Ｄ、１２）。ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃ処置動物の血清（Ｓ）および腎臓（Ｋ）から精製したＩｇＧの免疫ブロット分析は、全ての試料で測定可能なレベルのマウスＩｇＧを明らかにしたが、ヒトＩｇＧ  Ｆｃは、ＩＶＩＧで処置したマウスでのみ検出可能であった（図５Ｅ）。これは、ＰＢＳおよびＢ４ＳＴ６Ｆｃ処置群でのＩｇＧグリカンの分析が内因性マウスＩｇＧ  Ｆｃに限定され、改変グリコシルトランスフェラーゼのＦｃに限定されなかったことを示している。まとめるとこれらの結果は、炎症部位の内因性ＩｇＧがＢ４ＳＴ６Ｆｃによって選択的にシアリル化されることを示すものである。
【０１７２】
[実施例６]
インビボシアリル化は血小板活性化を必要とする
可溶性ＳＴ６ＧＡＬ１の活性を調べた研究は、シアリル化反応に必要なＣＭＰ−シアル酸の供与体（ＣＭＰ−ＳＡ）として血小板を関係づけた（Jones et al., 2016、Jones et al., 2012、Lee et al., 2014）。したがって、血小板がＢ４ＳＴ６Ｆｃに糖−ヌクレオチド供与体を提供するかを決定するために、実験を行った。実際に、ＣＤ４１＋血小板が、ＮＴＮが誘導されているマウス腎臓の糸球体で検出されたが、未処置腎臓の糸球体では検出されず、炎症部位への血小板動員を示した以前の研究と一致した（図６Ａおよび１３Ａ）（Devi et al., 2010、Boilard et al., 2010）。さらに、ＮＴＮ炎症腎臓中のＣＤ４１＋血小板も血小板活性化マーカー、ＣＤ６２Ｐを発現した（図６Ａ、１３Ａ）。ＮＴＮ炎症中のＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃによる処置は、血小板の蓄積および活性化に影響を与えなかった（図６Ａ、１３Ａ）。
【０１７３】
インビボシアリル化の抗炎症活性に血小板活性化が必要であるかどうかも決定するために、実験を行った。Ｋ／ＢｘＮ血清の投与の２日目前に、マウスにクロピドグレル（１０ｍｇ／ｋｇ）を毎日与えて血小板活性化を防いだ（Pucci et al., 2016）。マウスは、ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃも受け、その後数日にわたって炎症をモニターした。クロピドグレル処置は、ＰＢＳ処置動物の誘導炎症に影響を与えなかった（図６Ｂ〜６Ｄ）。ＩＶＩＧは、クロピドグレルの存在下で炎症を抑制した（図６Ｂ〜６Ｄ）。しかし、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃはクロピドグレルと協調的に与えられた場合、炎症を軽減することができなかった（図６Ｃ、６Ｄ）。
【０１７４】
これらの結果を広げようと、クロピドグレルを投与され、次いでＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃを受けたマウスでＮＴＮを誘導した（図６Ｅ〜６Ｈ）。重要なことには、これらの処置は、処置マウスの抗ヒツジＩｇＧ力価に影響を与えなかった（図１３Ｂ）。ＮＴＮの誘導は、クロピドグレルおよびＰＢＳ処置動物において、血中尿素窒素レベルおよび生存によって測定した腎臓損傷を引き起こした（図６Ｇ、６Ｈ）。ＩＶＩＧは、クロピドグレル処置に関係なく処置マウスを腎臓疾患から保護した（図６Ｅ〜Ｈ）。しかし、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃは、クロピドグレルと一緒に与えられた場合、疾患の軽減に無効であった（図６Ｇ、６Ｈ）。まとめると、これらの結果は、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃの抗炎症活性はインビボでの血小板活性化に依存しているが、ＩＶＩＧは依存しないことを示している。
【０１７５】
ヒト血小板が、シアリル化に必要な糖ヌクレオチド供与体を放出するかを決定するためにさらなる実験を行い、健康なドナーから多血小板血漿（ＰＲＰ）を生成した（Lee et al., 2014、Jones et al., 2016、Tan et al., 2016）。血小板を、未処置のまま、活性化（トロンビン＋）、またはクロピドグレル処置後に活性化（クロピドグレル＋／トロンビン＋）し、シアル酸およびガラクトースヌクレオチド供与体（ＣＭＰ−ＳＡ、ＵＤＰ−Ｇａｌ）の放出についてアッセイした。実際に、ヒト血小板は、活性化するとシアル酸およびガラクトースヌクレオチド供与体の両方を放出し、放出はクロピドグレルによって有意に阻害された（図７Ａ、７Ｂ）。興味深いことに、活性化は、ガラクトースヌクレオチド供与体放出を増加させたが、シアル酸供与体放出は増加させなかった。
【０１７６】
進行中の炎症を抑制するには、奏功する抗炎症治療薬が必要とされる。インビボシアリル化が治療的に有効かどうかを決定するために、マウスを関節炎誘導血清で処置し、次いで、関節炎の誘導後０日目または３日目にＰＢＳ、ＩＶＩＧ、またはＢ４ＳＴ６Ｆｃを与えた。ＩＶＩＧおよびＢ４ＳＴ６Ｆｃは０日目に投与した場合、誘導された関節炎の低減に有効であったが、ＰＢＳは有効でなかった（図１４Ａ、１４Ｂ）。しかし、ＩＶＩＧは、疾患誘導後３日目に投与した場合、誘導された関節炎を抑制することができなかった（図７Ｃ、７Ｄ）。重要なことには、３日目に関節炎誘発性血清およびＢ４ＳＴ６Ｆｃで処置したマウスは、ＩＶＩＧおよびＰＢＳ処置群と比べて７および８日目に炎症の有意な低減を示した（図７Ｃ、７Ｄ）。これらの結果は、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃが自己抗体誘導炎症を治療様式で有効に軽減できることを明らかにしている。これは、このモデルにおいてＩＶＩＧでは達成できなかったことであり、以前の結果と一致する（Bruhns et al., 2003）。
【０１７７】
[実施例７]
Ｂ４ＦｃおよびＳＴ６Ｆｃのヘテロ二量体化
Ｂ４ＦｃおよびＳＴ６Ｆｃのヘテロ二量体化を達成するために、「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫＩＨ）変異を各重鎖、ＣＨ３ドメインに導入した。具体的には、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ点変異を、それぞれＢ４Ｆｃ（配列番号４２）およびＳＴ６Ｆｃ（配列番号４３）に導入した。
【０１７８】
図１８は、本来のＢ４ＳＴ６Ｆｃおよび新たな「ノブ・イントゥ・ホール」Ｂ４ＳＴ６Ｆｃのウエスタンブロット結果（抗ヒトＩｇＧによる）およびクマシーゲル染色を示す。図中、ＳＴ６ＦｃはＳＴ６Ｆｃホモ二量体を表す。Ｂ４ＦｃはＢ４Ｆｃホモ二量体を表す。本来のＢ４ＳＴ６Ｆｃはノブ・イントゥ・ホール変異を有さず、故にこれは、ＳＴ６Ｆｃホモ二量体、Ｂ４Ｆｃホモ二量体、およびＢ４ＦＣＳＴ６Ｆｃヘテロ二量体の混合物である可能性がある。「ＫＩＨ」Ｂ４ＳＴ６ＦｃはＢ４ＦＣＳＴ６Ｆｃヘテロ二量体であり、クマシーゲルで示されるゲルではわずかに高く流れた。
【０１７９】
[実施例８]
関節炎モデルにおけるＢ４ＦＣＳＴ６Ｆｃヘテロ二量体のテスト
インビボでの活性をテストするために、マウスにＫ／ＢｘＮ血清を投与し、次いで、高用量のＩＶＩＧ、本来のＢ４ＳＴ６Ｆｃ、ヘテロ二量体Ｂ４ＳＴ６ＦｃＫｌｎ（「ノブ・イントゥ・ホール」Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ）、およびＢ４ＳＴ６ＦｃＧ３（ＫＩＨ変異を含まないＩｇＧ３  Ｆｃドメインを有する）をマウスに投与した。肢の腫脹をその後数日にわたってモニターした。図１９に示すように、ＰＢＳ処置対照（円）では、Ｋ／ＢｘＮ血清は肢に強い炎症を誘導した。対照的に、高用量のＩＶＩＧ（四角）、Ｂ４ＳＴ６Ｆｃ（実線の三角）、ヘテロ二量体Ｂ４ＳＴ６ＦｃＫｌｎ（点線および菱形）、およびＢ４ＳＴ６ＦｃＧ３（逆三角）は全て、炎症を軽減した。結果は、本来のＢ４ＳＴ６Ｆｃ、ヘテロ二量体Ｂ４ＳＴ６ＦｃＫｌｎ、およびＢ４ＳＴ６ＦｃＧ３は関節炎モデルにおいて炎症を軽減でき、故に自己免疫障害を処置するのに使用できることを示している。
【０１８０】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、前述の記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するためのものであり、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
（参考文献）
【０１８１】
【表３−１】
2021506343.tif 000006
【０１８２】
【表３−２】
2021506343.tif 000007
【０１８３】
【表３−３】
2021506343.tif 000008
【０１８４】
【表３−４】
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【０１８５】
【表３−５】
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【０１８６】
【表３−６】
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【表３−８】
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【０１８９】
【表３−９】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２２−８】
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【図２２−９】
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【図２２−１０】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月13日(2020.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021506343.tif 000082
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