(57)【要約】  本発明は、薬物がコーティングされたマイクロニードル及びその製造方法に係り、より詳細には、皮膚の角質層を物理的に穿孔して薬物を送達する、薬物がコーティングされたマイクロニードル及びその製造方法に関する。前記薬物がコーティングされたマイクロニードルは、化学式１で表され、皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されることを特徴とする。［化学式１］ＭＮ−Ｓ−Ｓ−Ｄ（式中、ＭＮはシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルであり、Ｓ−Ｓはジスルフィド結合であり、Ｄは薬物である。）本発明に係る薬物がコーティングされたマイクロニードルは、機能に優れるものの、皮膚透過性は低い薬物を効果的に送達することにより、美白、シワ改善、抗炎などの機能性化粧品素材として有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの表面を改質して、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを製造するステップと、
（ｂ）薬物に、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むリンカーを結合させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物を製造するステップと、
（ｃ）スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物とを酸化反応させるステップと、を含む、化学式１で表され、皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されることを特徴とする、薬物がコーティングされたマイクロニードルの製造方法。
［化学式１］
ＭＮ−Ｓ−Ｓ−Ｄ
（式中、ＭＮはシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルであり、Ｓ−Ｓはジスルフィド結合であり、Ｄは薬物である。）
【請求項２】
前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルが海綿動物由来の針状骨片であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物がコーティングされたマイクロニードルの製造方法。
【請求項３】
前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの表面改質は、
シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルに、３−メルカプトプロピル−メチルジメトキシシラン（（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン）（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（Ｎ−［３−（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及び３，３’−ジチオジプロピオン酸（３，３’−Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）よりなる群から選択される１種を攪拌させることを特徴とする、請求項１に記載の薬物がコーティングされたマイクロニードルの製造方法。
【請求項４】
前記スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物は、下記化学式２〜８よりなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物がコーティングされたマイクロニードルの製造方法。
［化学式２］：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ
［化学式３］：Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｘ
［化学式４］：Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ
［化学式５］：Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｘ
［化学式６］：Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘ
［化学式７］：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ
［化学式８］：
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（前記化学式２〜８中、Ｘは、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及びシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）よりなる群から選択される１種以上である。）
【請求項５】
前記スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物との酸化反応は、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ）、リン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（２，３−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５，６−ｄｉｃｙａｎｏ−ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、ＤＤＱ）、デヒドロアスコルビン酸（Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、及び酸素（Ｏ２）よりなる群から選択される１種以上の酸化剤によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の薬物がコーティングされたマイクロニードルの製造方法。
【請求項６】
化学式１で表され、皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されることを特徴とする、薬物がコーティングされたマイクロニードル。
［化学式１］
ＭＮ−Ｓ−Ｓ−Ｄ
（式中、ＭＮはシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルであり、Ｓ−Ｓはジスルフィド結合であり、Ｄは薬物である。）
【請求項７】
前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルは海綿動物由来の針状骨片であることを特徴とする、請求項６に記載のマイクロニードル。
【請求項８】
前記化学式１で表されるマイクロニードルは、スルフヒドリル（−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（−ＳＨ）反応基を含む薬物との結合で製造されたことを特徴とする、請求項６に記載のマイクロニードル。
【請求項９】
前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルは、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を０．８×１０−６ｍｏｌ／ｇ〜１０×１０−６ｍｏｌ／ｇ含むことを特徴とする、請求項８に記載のマイクロニードル。
【請求項１０】
前記スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物は、下記化学式２〜８よりなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項８に記載のマイクロニードル。
［化学式２］：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ
［化学式３］：Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｘ
［化学式４］：Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ
［化学式５］：Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｘ
［化学式６］：Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘ
［化学式７］：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ
［化学式８］：
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（前記化学式２〜８中、Ｘは、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及びシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）よりなる群から選択される１種以上である。）
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載のマイクロニードルを含む化粧品組成物。
【請求項１２】
前記化粧品は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アンプル、ジェル、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー及びパウダーよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物がコーティングされたマイクロニードル及びその製造方法に係り、より詳細には、皮膚の角質層を物理的に穿孔して薬物を送達する、薬物がコーティングされたマイクロニードル及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外部環境から人体を保護する、生化学的及び物理的に最も重要な組織であって、大きく表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）及び皮下（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ）に分けられる。皮膚の最外殻層である角質層は、皮膚の水分蒸発及び吸収調節機能と、化学物質、毒性物質、細菌などの侵入に対するバリア機能とがある。皮膚の角質層（Ｓｔｒａｔｕｍ  Ｃｏｒｎｅｕｍ）は、基底層（Ｂａｓａｌ  ｌａｙｅｒ）で生産されたケラチノサイト（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）が約１４日かけて顆粒層まで上がってくる。顆粒層では、ケラトヒアリン（Ｋｅｒａｔｏｈｙａｌｉｎ）の作用により角質化が開始すると、細胞中の体液が抜け出して細胞は平坦な状態に角質化する。ケラチノサイトは、一日に数百万個ずつ皮膚から剥がれ落ち、新しいケラチノサイトに交換される。
【０００３】
皮膚老化の兆候の一つは、死んだ細胞を脱落させる能力の低下により、細胞の再生サイクルが増加し、皮膚が活力及び弾力性を失ってしまうことである。これを改善するために、皮膚剥離術を用いて表皮層を除去することにより、基底層での細胞の再生を刺激してハリのある皮膚に戻そうとする努力が盛んに行われている。
【０００４】
現在までに開発された角質除去用化粧品は、その角質除去方法によって大きく三つに区分される。一番目は、皮膚摩擦やレーザーなどの物理的な作用によって表皮を細かく削り取る方法であり、二番目は、角質溶解効果のあるＡＨＡ（Ａａｌｐｈａ−Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｃｉｄ）、ＢＨＡ（Ｂｅｔａ−Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｃｉｄ）、尿素などの化学成分を用いる化学的方式であり、三番目は、角質除去機能を有するタンパク質分解酵素を用いて角質を剥皮させる方式である。これらの剥皮方法は、皮膚をまず剥ぎ取った後、皮膚自体の再生力を誘導する方式である。
【０００５】
しかし、物理的な研磨の場合は、皮膚への適用の際に、かなりの刺激により皮膚が赤く腫れるか或いは激しい痛みを誘発するため、施術時に麻酔薬を使用するので、家庭用として使用し難いという問題点がある。また、化学的な剥皮の場合は、家庭用に使用することが難しいうえ、色素性皮膚異常変色、感染または傷跡などの永続的後遺症といった合併症を引き起こすおそれがあるという問題点がある。タンパク質分解酵素を用いた剥皮の場合は、高価で、保管上及び使用上の問題点があるので、家庭での使用に適さない。
【０００６】
かかる問題点を解決するために、海綿動物骨片を化粧料組成物として活用する研究が行われた。韓国特許第０９３７３８９号公報は、過酸化水素溶液を用いて海綿動物から微細針を抽出するステップと、抽出された微細針の多孔性を向上させるステップと、多孔質が向上した微細針を、幹細胞由来物質と皮膚有効成分とが混合された溶液に浸漬させて、コーティングを行うステップと、微細針が浸漬された混合溶液を凍結乾燥させるステップと、を含む、スキンケア化粧品組成物の製造方法を開示しており、韓国特許第１８１０２３１号公報は、プロポリスエキス、ローヤルゼリーエキス、ユガネバナエキス、及び紅参エキスで構成された複合抽出物と、微細針粉末を有効成分として含むニキビ及びアトピー改善用化粧料組成物を開示しており、韓国特許第１８５４４４６号公報は、クロイゲエキスと微細針を含有する化粧料組成物を開示している。
【０００７】
しかし、有効成分である薬物をマイクロニードルに浸漬コーティングさせるか或いは単純混合させる場合には、薬物によっては浸漬コーティング率が低いか、或いは皮膚浸透後に薬物が放出されないため、効果が微々たるという問題点があった。
【０００８】
そこで、本発明者らは、上述した問題点を解決するために努力した結果、ジスルフィド結合によって薬物と結合されたマイクロニードルを用いる場合、皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されるので、機能に優れるものの、皮膚透過性は低い薬物も効果的に送達することができるということを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、薬物送達効果に優れたマイクロニードル及びその製造方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、薬物送達効果に優れながらも使用が簡便であって、家庭でも使用可能な化粧品組成物を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの表面を改質して、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを製造するステップと、（ｂ）薬物に、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むリンカーを結合させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物を製造するステップと、（ｃ）スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物とを酸化反応させるステップと、を含む、化学式１で表され、皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されることを特徴とする、薬物がコーティングされたマイクロニードルの製造方法を提供する。
【００１４】
本発明において、前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの表面改質は、シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルに、３−メルカプトプロピル−メチルジメトキシシラン（（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン）（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（Ｎ−［３−（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及び３，３’−ジチオジプロピオン酸（３，３’−Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）よりなる群から選択される１種を攪拌させることを特徴とする。
【００１５】
本発明において、前記スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物との酸化反応は、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ）、リン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（２，３−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５，６−ｄｉｃｙａｎｏ−ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、ＤＤＱ）、デヒドロアスコルビン酸（Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、及び酸素（Ｏ２）よりなる群から選択される１種以上の酸化剤によって行われることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明は、化学式１で表され、皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されることを特徴とする、薬物がコーティングされたマイクロニードルを提供する。
【００１７】
［化学式１］
【００１８】
ＭＮ−Ｓ−Ｓ−Ｄ
【００１９】
式中、ＭＮはシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルであり、Ｓ−Ｓはジスルフィド結合であり、Ｄは薬物である。
【００２０】
本発明において、前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルは、海綿動物由来の針状骨片であることを特徴とする。
【００２１】
本発明において、前記化学式１で表されるマイクロニードルは、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物との結合で製造されたことを特徴とする。
【００２２】
本発明において、前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルは、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を０．８×１０−６ｍｏｌ／ｇ〜１０×１０−６ｍｏｌ／ｇ含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明において、前記スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物は、下記化学式２〜８よりなる群から選択される１以上であることを特徴とする。
【００２４】
［化学式２］：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ
【００２５】
［化学式３］：Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｘ
【００２６】
［化学式４］：Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ
【００２７】
［化学式５］：Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｘ
【００２８】
［化学式６］：Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘ
【００２９】
［化学式７］：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ
【００３０】
［化学式８］：
2021528497.tif 000003
【００３１】
前記化学式２〜８中、Ｘは、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及びシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）よりなる群から選択される１種以上である。
【００３２】
また、本発明は、前記マイクロニードルを含む化粧品組成物を提供する。
【００３３】
本発明において、前記化粧品は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アンプル、ジェル、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー及びパウダーよりなる群から選択されることを特徴とする。
【００３４】
【発明の効果】
【００３５】
本発明に係る薬物がコーティングされたマイクロニードルは、機能に優れるものの、皮膚透過性は低い薬物を効果的に送達することにより、美白、シワ改善、抗炎などの機能性化粧品素材として有用である。
【００３６】
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の一実施例によって精製されたシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルのＳＥＭ及び顕微鏡写真である。
【００３８】
【図２】本発明の一実施例によって製造されたスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むマイクロニードルのｇあたりスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基のモル数を測定して示すグラフである。
【００３９】
【図３】本発明の一実施例によって製造されたスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物の細胞毒性を評価して示すグラフである。
【００４０】
【図４】本発明の一実施例によって製造されたスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物のコラーゲン生成能を評価して示すグラフである。
【００４１】
【図５】スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基の種類によるマイクロニードルから分離された薬物のコラーゲン生成能を評価して示すグラフである。
【００４２】
【図６】ＧＳＨ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）の含有量による薬物のコラーゲン生成能を評価して示すグラフである。
【００４３】
【図７】本発明の一実施例によって製造されたクリームのシワ改善効果を確認して示す顕微鏡写真である。
【００４４】
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明では、機能に優れるものの、皮膚透過性は低い薬物を、マイクロニードルとジスルフィド結合させる場合、薬物がマイクロニードルと共に皮膚の角質層に浸透した後、酸化還元反応によって放出されるので、薬物を効果的に送達することができるということを確認しようとした。
【００４６】
本発明では、海綿動物由来のマイクロニードルの表面を改質して、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを製造し、薬物に、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むリンカーを結合させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物を製造した後、これらを酸化反応させて、最終的に、薬物がコーティングされたマイクロニードルを製造した。製造された薬物がコーティングされたマイクロニードルの細胞毒性及びコラーゲン生成能を確認した結果、細胞毒性はなく、コラーゲン生成効果に優れるということを確認した。
【００４７】
したがって、本発明は、ある観点から、（ａ）シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの表面を改質して、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを製造するステップと、（ｂ）薬物に、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むリンカーを結合させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物を製造するステップと、（ｃ）スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物とを酸化反応させるステップと、を含む、化学式１で表され、皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されることを特徴とする、薬物がコーティングされたマイクロニードルの製造方法に関する。
【００４８】
［化学式１］
【００４９】
ＭＮ−Ｓ−Ｓ−Ｄ
【００５０】
化学式１中、ＭＮはシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルであり、Ｓ−Ｓはジスルフィド結合であり、Ｄは薬物である。
【００５１】
【００５２】
本発明において、シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルは、海綿動物由来の針状骨片であるものを用いることができる。前記海綿動物としては、スポンジラ・ラクストリス（Ｓｐｏｎｇｉｌｌａ  ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、スポンジラ・フラジリス（Ｓｐｏｎｇｉｌｌａ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エフィダチア・フルビアチリス（Ｅｐｈｙｄａｔｉａ  ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ）などを例示することができるが、これらに限定されない。
【００５３】
前記針状骨片の大きさは、特に制限されず、長さ約１００〜３００μｍ及び幅約１０〜３０μｍのものを用いることができる。
【００５４】
前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルは、海綿動物由来の針状骨片の粉末を、硫酸及び水酸化ナトリウムを順次入れて撹拌、濾過、洗浄する精製過程を経たものを使用することが好ましい。図１は本発明の一実施例によって精製されたシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルのＳＥＭ及び顕微鏡写真である。
【００５５】
【００５６】
ペプチドのように単独で皮膚浸透が難しい薬物を皮膚に浸透させるために、薬物をマイクロニードルに結合させなければならないが、このように薬物とマイクロニードルとをジスルフィド結合させるためには、薬物とマイクロニードルのそれぞれにスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を導入しなければならない。
【００５７】
まず、本発明では、シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの表面を改質して、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを製造した。
【００５８】
前記シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの表面改質は、シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルに、３−メルカプトプロピル−メチルジメトキシシラン（（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン）（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（Ｎ−［３−（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及び３，３’−ジチオジプロピオン酸（３，３’−Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）よりなる群から選択される１種を攪拌させて製造することができる。
【００５９】
このように製造されたシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルは、マイクロニードルの形状、表面改質のためのメルカプトシランの種類及び反応条件によって異なり得るが、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を０．８×１０−６ｍｏｌ／ｇ〜１０×１０−６ｍｏｌ／ｇ含むことができ、マイクロニードルの表面積を考慮すると、２．０×１０−６ｍｏｌ／ｇを超えて結合させることが好ましい。
【００６０】
【００６１】
また、本発明では、薬物に、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むリンカーを結合させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物を製造した。
【００６２】
前記薬物は、皮膚に浸透して皮膚鎮静、活力増進、抗酸化、美白、保湿、皮膚再生、抗老化、抗炎、コラーゲン合成促進などの皮膚改善効果を向上させることができるものであれば、特に制限なく使用することができ、合成化合物だけでなく、ペプチドも使用することができる。
【００６３】
前記スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むリンカーは、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）などを例示することができるが、これらに限定されない。
【００６４】
薬物としてペプチドを用いるとき、システインをリンカーとして用いると、アミノ酸配列及び構造によって特性が変わり得るので、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ）を用いることが好ましく、分子量の小さいチオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）を用いることがより好ましい。
【００６５】
本発明では、ペプチドまたは化合物薬物に、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むリンカーを結合させて製造したスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物として、化学式２〜８を例示しているが、これに限定されるものではない。
【００６６】
［化学式２］：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ
【００６７】
［化学式３］：Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｘ
【００６８】
［化学式４］：Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ
【００６９】
［化学式５］：Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｘ
【００７０】
［化学式６］：Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘ
【００７１】
［化学式７］：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ
【００７２】
［化学式８］：
2021528497.tif 000004
【００７３】
前記化学式２〜８中、Ｘは、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及びシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）よりなる群から選択される１種以上である。
【００７４】
【００７５】
本発明では、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物とを酸化反応させて、薬物がコーティングされたマイクロニードルを製造した。
【００７６】
前記酸化反応のための酸化剤としては、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物とを酸化反応によって結合させることができるものであれば、特別な制限なしに使用することができ、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ）、リン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（２，３−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５，６−ｄｉｃｙａｎｏ−ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、ＤＤＱ）、デヒドロアスコルビン酸（Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、酸素（Ｏ２）などを例示することができる。
【００７７】
本発明では、上記の方法で皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されることを特徴とする、薬物がコーティングされたマイクロニードルを製造した。
【００７８】
したがって、本発明は、他の観点から、化学式１で表され、皮膚浸透後に酸化還元反応によって薬物が放出されることを特徴とする、薬物がコーティングされたマイクロニードルに関する。
【００７９】
［化学式１］
【００８０】
ＭＮ−Ｓ−Ｓ−Ｄ
【００８１】
化学式１中、ＭＮはシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルであり、Ｓ−Ｓはジスルフィド結合であり、Ｄは薬物である。
【００８２】
【００８３】
また、本発明は、前記薬物がコーティングされたマイクロニードルを含む化粧品組成物に関する。
【００８４】
前記薬物がコーティングされたマイクロニードルは、化粧品の種類によって異なるが、全体化粧品組成物に対して０．１〜１０．０重量％含まれ得る。
【００８５】
前記化粧品としては、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アンプル、ジェル、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダーなどを例示することができるので、これに限定されるものではない。
【００８６】
前記化粧品組成物は、それぞれの剤形において、前記薬物がコーティングされたマイクロニードルの他、剤形の種類または使用目的などに応じて、本発明に係る目的を阻害しない範囲内で他の成分が適切に配合できる。
【００８７】
また、最終製品の品質または機能に応じて、当該分野で通常使用される脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、遮断剤、湿潤化剤、エッセンシャルオイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、及び化粧品組成物で通常使用される任意の他の成分などの化粧料学または皮膚科学分野で通常使用される補助剤をさらに含むことができる。
【００８８】
但し、前記補助剤及びその混合割合は、本発明に係る化粧料組成物の好ましい性質に影響を及ぼさないように適切に選択することが好ましい。
【００８９】
【実施例】
【００９０】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないのは、当業分野における通常の知識を有する者にとって自明である。
【００９１】
【００９２】
実施例１：薬物がコーティングされたマイクロニードルの製造
【００９３】
１−１：シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの精製
【００９４】
スポンジラ・フラジリス・レイディ（Ｓｐｏｎｇｉｌｌａ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  Ｌｅｉｄｙ）由来の針状骨片（２８９ｇ）を硫酸（８０ｇ）と一緒に反応槽に入れて１時間攪拌した後、水を入れてさらに攪拌及び濾過した。針状骨片を水で洗浄し、さらに１〜２時間撹拌し、ＮａＯＨ及びＨＮＯ３をそれぞれ入れて撹拌を行い、ｐＨ６〜８に合わせた後、水で洗浄した。最終的に、エタノールで針状骨片を洗浄した後、濾過し、乾燥させた。
【００９５】
【００９６】
１−２：シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルの表面改質
【００９７】
精製された針状骨片（シリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードル）にスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を導入するために、加水分解反応及び脱アルコキシ反応を行った。
【００９８】
１−２−１：加水分解反応を用いた表面改質
【００９９】
下記［反応式１］に示すように、反応槽に精製されたマイクロニードル１０ｇ、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン［（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＭＰＴＭＳ］０．１〜３．０ｍｌ、水／エタノール混合液（５０％エタノール）１００ｇを添加した後、常温で４時間反応させた。反応物を洗浄した後、７０℃で４時間減圧乾燥させ、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを得た（Ｎｏ．１）。
【０１００】
［反応式１］
【０１０１】
2021528497.tif 000005
【０１０２】
【０１０３】
１−２−２乃至１−２−４：加水分解反応を用いた表面改質
【０１０４】
前記実施例１−２−１の条件で反応時間を８、１６及び２４時間に異ならせてそれぞれ反応させた。反応後、７０℃で４時間減圧乾燥させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを得た（Ｎｏ．２〜４）。
【０１０５】
【０１０６】
１−２−５及び１−２−６：加水分解反応を用いた表面改質
【０１０７】
前記実施例１−２−１の条件で反応温度をそれぞれ４０℃及び６０℃に調節し、２４時間反応させた。反応後、７０℃で４時間減圧乾燥させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを得た（Ｎｏ．５及び６）。
【０１０８】
【０１０９】
得られたスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルのｇあたりスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基のモル数をＥｌｌｍａｎ  Ａｓｓａｙ方法によって分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３  ＵＶ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定し、表１及び図２に示した。
【０１１０】
【表１】
2021528497.tif 000006
【０１１１】
表１及び図２から、反応温度及び反応時間に応じてＭＮ１ｇの−ＳＨモル数は０．９１３２〜１．７３４４μｍｏｌ／ｇであることが確認された。
【０１１２】
【０１１３】
１−２−７：脱アルコキシ反応を用いた表面改質
【０１１４】
下記［反応式２］に示すように、反応槽に、精製されたマイクロニードル５．０２ｇ、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン［（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＭＰＴＭＳ］０．１〜３．０ｍｌ及びトルエン５０ｇを添加した後、９０℃で４時間反応させた。反応物を洗浄した後、７０℃で２０時間減圧乾燥させ、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを得た（Ｎｏ．１）。
【０１１５】
［反応式２］
【０１１６】
2021528497.tif 000007
【０１１７】
【０１１８】
１−２−８乃至１−２−１０：脱アルコキシ反応を用いた表面改質
【０１１９】
前記実施例１−２−７の条件で反応時間を８、１６及び２４時間に異ならせてそれぞれ反応させた。反応後、７０℃で４時間減圧乾燥させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを得た（Ｎｏ．２〜４）。
【０１２０】
【０１２１】
１−２−１１及び１−２−１２：脱アルコキシ反応を用いた表面改質
【０１２２】
前記実施例１−２−７の条件で還流反応としてｐＨ２〜３で反応時間をそれぞれ１６及び２４時間に異ならせて反応させた。反応後、７０℃で４時間減圧乾燥させて、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルを得た（Ｎｏ．５及び６）。
【０１２３】
【０１２４】
得られたスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルのｇあたりスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基のモル数を、Ｅｌｌｍａｎ  Ａｓｓａｙ方法によって分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３  ＵＶ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定し、表２及び図２に示した。
【０１２５】
【表２】
2021528497.tif 000008
【０１２６】
表２及び図２から、反応温度及び反応時間に応じてＭＮ１ｇの−ＳＨモル数は０．９７８６〜１０．０５５μｍｏｌ／ｇであることが確認された。
【０１２７】
【０１２８】
１−３：薬物とスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むリンカーとの結合
【０１２９】
１−３−１：ペプチド薬物のリンカー結合
【０１３０】
本発明に使用されるアミノ酸の命名及び略語は、次のとおりに表記する。
【０１３１】
Ｌｙｓ：リシン／Ｈｉｓ：ヒスチジン／Ｇｌｙ：グリシン／Ｓｅｒ：セリン／Ｔｈｒ：スレオニン／Ａｒｇ：アルギニン／Ｇｌｎ：グルタミン／Ｍｅｔ：メチオニン／Ｇｌｕ：グルタミン酸
【０１３２】
【０１３３】
１−３−１−１：化学式２及び化学式３で表されるスルフヒドリル−トリペプチド（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−Ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）の製造
【０１３４】
下記（１）〜（６）の方法及び［反応式３］のように同じ合成サイクルに応じて連続的にペプチドを縮合（カップリング）した。つまり、化合物２及び３のアミノ酸配列の順序で下記アミノ酸を反応容器に添加してペプチド結合を行い、最終的に、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を有するリンカー（Ｘ）［チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＡ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＭＰＡ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＭＵＤ）及びシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＣＳ）］をそれぞれ添加してアミド結合を行い、化学式２及び化学式３で表されるスルフヒドリド−トリペプチド（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−Ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）を製造した。
【０１３５】
（１）ＤＭＦ溶媒（１０ｍＬ）で３回／ジクロロメタン（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ、ＤＣＭ）溶媒（１０ｍＬ）で３回洗浄
【０１３６】
（２）２０％（ｗ／ｖ）ピペリジンＤＭＦ溶液（３ｍＬ）を用いて１０分間２回脱保護
【０１３７】
（３）ＤＭＦ溶媒（１０ｍＬ）で５回洗浄
【０１３８】
（４）Ｆｍｏｃ−アミノ酸を添加
【０１３９】
（５）縮合試薬を添加してアミノ酸活性化及び２時間縮合
【０１４０】
（６）ＤＭＦ溶媒（１０ｍＬ）で５回洗浄
【０１４１】
【０１４２】
［化学式２］：Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ
【０１４３】
［化学式３］：Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｘ
【０１４４】
［反応式３］
【０１４５】
2021528497.tif 000009
【０１４６】
【０１４７】
１−３−１−２：化学式４及び化学式５で表されるスルフヒドリル−ペンタペプチド（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−Ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ）の製造
【０１４８】
［反応式４］及び前記１−３−１−１に記載されたペプチド合成方法によって、化学式４及び化学式５で表されるスルフヒドリル−ペンタペプチド（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−Ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ）を製造した。
【０１４９】
［化学式４］：Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ
【０１５０】
［化学式５］：Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｘ
【０１５１】
【０１５２】
［反応式４］
【０１５３】
2021528497.tif 000010
【０１５４】
【０１５５】
１−３−１−３：化学式６及び化学式７で表されるスルフヒドリル−ヘキサペプチド（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−Ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ）の製造
【０１５６】
［反応式５］及び前記１−３−１−１に記載されたペプチド合成方法によって、化学式６及び化学式７で表されるスルフヒドリル−ヘキサペプチド（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−Ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ）を製造した。
【０１５７】
［化学式６］：Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘ
【０１５８】
［化学式７］：Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ
【０１５９】
［反応式５］
【０１６０】
2021528497.tif 000011
【０１６１】
【０１６２】
１−３−２：合成化合物薬物のリンカー結合
【０１６３】
［反応式６］に示すように、デヒドロアスコルビン酸（Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に、リパーゼと一緒に、スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を有するリンカー（Ｘ）［チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＡ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＭＰＡ）、１１−メルカプトウンデカン酸（１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＭＵＤ）及びシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）］を反応させ、還元して、化学式８で表されるスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む合成化合物を製造した。
【０１６４】
［化学式８］：
【０１６５】
2021528497.tif 000012
【０１６６】
【０１６７】
［反応式６］
【０１６８】
2021528497.tif 000013
【０１６９】
【０１７０】
１−４：薬物がジスルフィド結合されたマイクロニードルの製造
【０１７１】
実施例１−２で製造されたスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含むシリカ（ＳｉＯ２）含有マイクロニードルと、実施例１−３で製造されたスルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物とを酸化反応によってジスルフィド結合させた。
【０１７２】
【０１７３】
１−４−１：ペプチド薬物の結合
【０１７４】
１−４−１−１：ヨウ素を用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０１７５】
反応容器に、実施例１−２で製造されたスルフヒドリルマイクロニードル０．３ｇと精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬを入れ、６０分間攪拌してマイクロニードルを均一に分散させた後、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）を１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）添加し、実施例１−３−１で製造された化学式２〜７のペプチド１．２μｍｏｌを添加した後、攪拌した。反応終了後、エタノール５．０ｍＬで５回以上洗浄し、２５℃で１２時間減圧乾燥させて、ペプチドがジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０１７６】
【０１７７】
１−４−１−２：リン酸カリウムを用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０１７８】
精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬの代わりに精製水５．０ｍＬを使用し、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）の代わりにリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、モル分子量１３６．０６ｇ／ｍｏｌ）４０．８μｇ（０．３μｍｏｌ）を使用した以外は、１−４−１−１と同様にして、ペプチドがジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０１７９】
【０１８０】
１−４−１−３：ＤＤＱを用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０１８１】
精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬの代わりにジクロロメタン５．０ｍＬを使用し、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）の代わりに２，３−ジクロロオ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（略語：ＤＤＱ、モル分子量２２７．０ｇ／ｍｏｌ）６８．１μｇ（０．３μｍｏｌ）を使用した以外は、１−４−１−１と同様にして、ペプチドがジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０１８２】
【０１８３】
１−４−１−４：ジヒドロアスコルビン酸を用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０１８４】
精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬの代わりに０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液５．０ｍＬを使用し、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）の代わりにデヒドロアスコルビン酸（Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、モル分子量１７４．１１ｇ／ｍｏｌ）５２．８４μｇ（０．３μｍｏｌ）を使用した以外は、１−４−１−１と同様にして、ペプチドがジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０１８５】
【０１８６】
１−４−１−５：過酸化水素を用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０１８７】
精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬの代わりに０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５．０ｍＬを使用し、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）の代わりに３０％過酸化水素１０μＬを使用した以外は、１−４−１−１と同様にして、ペプチドがジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０１８８】
【０１８９】
１−４−２：合成化合物薬物の結合
【０１９０】
１−４−２−１：ヨウ素を用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０１９１】
反応容器に、実施例１−２で製造されたスルフヒドリルマイクロニードル０．３ｇと精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬを入れ、６０分間攪拌してマイクロニードルを均一に分散させた後、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）を１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）添加し、実施例１−３−２で製造された化学式８の化合物１１２．６μｇ（０．４５μｍｏｌ）を添加した後に攪拌した。反応終了後、精製水とエタノール５．０ｍＬで５回以上洗浄し、７０℃で１２時間減圧乾燥させて、アスコルビン酸がジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０１９２】
【０１９３】
１−４−２−２：リン酸カリウムを用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０１９４】
精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬの代わりに精製水５．０ｍＬを使用し、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）の代わりにリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、モル分子量１３６．０６ｇ／ｍｏｌ）４０．８μｇ（０．３μｍｏｌ）を使用した以外は、１−４−２−１と同様にして、アスコルビン酸がジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０１９５】
【０１９６】
１−４−２−３：ＤＤＱを用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０１９７】
精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬの代わりにジクロロメタン５．０ｍＬを使用し、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）の代わりに２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（略語：ＤＤＱ、モル分子量２２７．０ｇ／ｍｏｌ）６８．１μｇ（０．３μｍｏｌ）を使用した以外は、１−４−２−１と同様にして、アスコルビン酸がジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０１９８】
【０１９９】
１−４−２−４：ジヒドロアスコルビン酸を用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０２００】
精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬの代わりに０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液５．０ｍＬを使用し、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）の代わりにデヒドロアスコルビン酸（Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、モル分子量１７４．１１ｇ／ｍｏｌ）５２．８４μｇ（０．３μｍｏｌ）を使用した以外は、１−４−２−１と同様にして、アスコルビン酸がジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０２０１】
【０２０２】
１−４−２−５：過酸化水素を用いた酸化反応ジスルフィド結合
【０２０３】
精製水／エタノール（５０％エタノール）５．０ｍＬの代わりに０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５．０ｍＬを使用し、ヨウ素（Ｉｏｄｉｎｅ、Ｉ２モル分子量２５３．８１、東京化成工業製）１２．７μｇ（０．５μｍｏｌ）の代わりに３０％過酸化水素１０μＬを使用した以外は、１−４−２−１と同様にして、アスコルビン酸がジスルフィド結合されたマイクロニードルを製造した。
【０２０４】
【０２０５】
実験例１：スルフヒドリル（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ、−ＳＨ）反応基を含む薬物のコラーゲン合成促進能の評価
【０２０６】
１−１：細胞株の選択及び培養
【０２０７】
韓国細胞株銀行から購入した繊維芽細胞（ＣＣＤ−９８６ＳＫ）を培養皿上に接種した後、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地を入れ、３７℃を維持して、５％二酸化炭素を含む培養器内で培養した。
【０２０８】
【０２０９】
１−２：細胞毒性試験方法（ＣＣＫ  ａｓｓａｙ）
【０２１０】
繊維芽細胞（ＣＣＤ−９８６ＳＫ）を２４ウェル（または９６ウェル）プレートにウェルあたり１．０×１０４（〜５．０×１０４）個で分注した後、細胞培養条件で２４時間培養した。培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、１０％ＦＢＳを含まない新しいＤＭＥＭ培地に交換し、一定濃度の試験物質（ＧＨＫ及びＧＨＫ−ＴＡ）を細胞に処理した後、２４時間培養した。培養後には、ＣＣＫを培地の１／１０だけ仕込み、ＥＬＩＳＡリーダー４５０ｎｍで測定し、その結果を図３に示した。
【０２１１】
図３に示すように、ＧＨＫペプチドは、７０〜２００ｐｐｍの濃度で細胞生存率の平均が８２．２％であり、ＧＨＫ−ＴＡは、７０〜２００ｐｐｍの濃度で細胞生存率の平均が１００．９％と安定的であることを確認することができた。
【０２１２】
【０２１３】
１−３：細胞株コラーゲン量の測定
【０２１４】
繊維芽細胞（ＣＣＤ−９８６ＳＫ）を２４ウェル（または９６ウェル）プレートにウェルあたり１．０×１０４〜５．０×１０４個で分注した後、細胞培養条件で２４時間培養した。培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した後、試験物質（トリペプチド（ＧＨＫ）、実施例１−３−１−１で製造された（ＧＨＫ）−ＴＡ、ペンタペプチド（ＫＴＴＫＳ）、実施例１−３−１−２で製造された（ＫＴＴＫＳ）−ＴＡ、ヘキサペプチド（ＥＥＭＱＲＲ）、実施例１−３−１−３で製造された（ＥＥＭＱＲＲ）−ＴＡ）及び新しいＤＭＥＭ培地を入れ、２４時間培養した。培養上澄み液を取り、コラーゲンの量を韓国の食品医薬品安全処のガイドラインに基づいて次のとおり測定し、その結果を図４に示した。
【０２１５】
抗体−ＰｏＤコンジュゲート溶液（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＰｏＤ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μＬをウェルに入れた後、培養液及び標準溶液２０μＬを入れ、３７℃で３時間培養した。ウェルから培養液を除去した後、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）４００μＬで４回洗浄した。発色試薬（Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ Ｉ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＩＡ  ｋｉｔ、タカラバイオ株式会社製）１００μＬを入れ、常温で１５分間培養し、１Ｎ硫酸１００μＬを入れた後、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【０２１６】
図４に示すように、ＧＨＫの場合、８０ｐｐｍ以下の濃度では、繊維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｌａｓｔ、ＣＣＤ−９８６ｓｋ）のコラーゲン合成及び促進が行われていないが、これに対し、スルフヒドリルＧＨＫ（ＧＨＫ−ＴＡ）は、７０〜８０ｐｐｍの濃度でもコラーゲン合成及び促進効果に優れている。このことから、ＧＨＫとスルフヒドリルＧＨＫ（ＧＨＫ−ＴＡ）は同じ配列のアミノ酸がペプチドを成しているが、スルフヒドリル基を導入する場合、７０〜１００ｐｐｍの低い濃度で機能が発現されるのに対し、ＧＨＫは相対的に高い濃度で効果が発現されることが分かった。
【０２１７】
ＫＴＴＫＳは、５０〜２００ｐｐｍまで濃度に比例しながらコラーゲンの合成及び促進効果が増加した。ＫＴＴＫＳよりはスルフヒドリルＫＴＴＫＳ（ＫＴＴＫＳ−ＴＡ）の効果がさらに優れた。
【０２１８】
ＥＥＭＱＲＲは、チオグリコール酸（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＡ）をリンカーとして使用することが、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＣＳ）をリンカーとして使用することよりもコラーゲンの合成及び促進効果に優れることが分かった。
【０２１９】
【０２２０】
実験例２：薬物がコーティングされたマイクロニードルのコラーゲン合成促進能の評価
【０２２１】
２−１：スルフヒドリル（−ＳＨ）反応基を有するリンカー（Ｘ）によるコラーゲン生成能
【０２２２】
実施例１−４で製造された薬物がコーティングされたマイクロニードル（ＧＨＫ−ＴＡ−ＭＮ、ＧＨＫ−ＭＰＡ−ＭＮ、ＧＨＫ−ＣＳ−ＭＮ）０．３ｇ及び０．１ＭＧＳＨ（グルタチオン）４０μｌを用いて８４０分間マイクロニードルからペプチドを分離し、上澄み液を遠心分離した後、実験例１−３と同様の方法で、細胞内のコラーゲン生成促進能を評価し、その結果を図５に示した。
【０２２３】
図５に示すように、スルフヒドリル（−ＳＨ）反応基を有するリンカー（Ｘ）の種類に応じて、コラーゲン生成促進能の差があることが分かった。このような差は、スルフヒドリル（−ＳＨ）反応基を有するリンカーの分子量に起因したものと類推される。参考までに、リンカーの分子量はＴＡ＜ＣＳ＜ＭＰＡの順であり、ＣＳは側鎖にアミン基を有する。
【０２２４】
【０２２５】
２−２：ＧＳＨ（グルタチオン）の濃度によるコラーゲン生成能
【０２２６】
実施例１−４で製造された薬物がコーティングされたマイクロニードル（ＧＨＫ−ＭＰＡ−ＭＮ、ＧＨＫ−ＣＳ−ＭＮ、ＫＴＴＫＳ−ＴＡ−ＭＮ、ＧＨＫ−ＴＡ−ＭＮ）０．３ｇに０．１Ｍ  ＧＳＨ（グルタチオン）４０μｌを入れ、８４０分間マイクロニードルからペプチドを分離し、上澄み液を遠心分離した後、実験例１−３と同様の方法で、細胞内のコラーゲン生成促進能を評価し、その結果を図５に示した。
【０２２７】
また、実施例１−４で製造された薬物がコーティングされたマイクロニードル（ＧＨＫ−ＭＰＡ−ＭＮ、ＧＨＫ−ＣＳ−ＭＮ、ＫＴＴＫＳ−ＴＡ−ＭＮ、ＧＨＫ−ＴＡ−ＭＮ）０．３ｇに０．１Ｍ  ＧＳＨ（グルタチオン）１００μｌを入れ、１８０分間マイクロニードルからペプチドを分離し、上澄み液を遠心分離した後、実験例１−３と同様の方法で、細胞内のコラーゲン生成促進能を評価し、その結果を図６に示した。
【０２２８】
図６に示すように、ＧＳＨ（グルタチオン）を４０μｌ使用する場合と１００μｌ使用する場合のコラーゲン生成率は類似している。つまり、ＧＳＨ（グルタチオン）は、ジスルフィド結合を分離するのに必要な最小量だけ存在すれば、マイクロニードルに結合された薬物が放出されてその効果を示すことができることが分かった。
【０２２９】
【０２３０】
製造例１：薬物がコーティングされたマイクロニードルを含む化粧品
【０２３１】
１−１：アンプルの製造
【０２３２】
下記表３の組成でクリームを製造した。
【０２３３】
【表３】
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【０２３４】
【０２３５】
実験例３：薬物がコーティングされたマイクロニードルを含む化粧品の効能
【０２３６】
製造例１で製造されたアンプル（原料名：スポンジリアトリペプチド−１）を４週間、１日２回（朝、夕）皮膚に１００ウォン硬貨の大きさだけ肌のキメに沿って滑らかに伸ばして塗り、軽く叩いて吸収させた。試料の適用２週目及び４週目に皮膚の変化を顕微鏡で確認し、その結果を図７に示した。
【０２３７】
図７に示すように、ＧＨＫ−ＴＡ−ＭＮを含むクリームは、シワ改善効果に優れることが分かった。
【０２３８】
【０２３９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に説明したが、当業分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は好適な実施態様に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されないのは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるべきである。
【０２４０】
【産業上の利用可能性】
【０２４１】
本発明に係る薬物がコーティングされたマイクロニードルは、機能に優れるものの、皮膚透過性は低い薬物を効果的に送達することにより、美白、シワ改善、抗炎などの機能性化粧品素材として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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