(57)【要約】  キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴｒｅｇは、局在された及び効果的な免疫抑制応答を誘発するために、ＲＡ患者の関節に存在する抗原を標的とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記抗原特異的結合ドメインが、ビメンチンポリペプチド又はそのペプチドを含む抗原に特異的に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記ビメンチンポリペプチド又はそのペプチドが翻訳後に修飾され、シトルリン化されたビメンチン（ＣＶ）ポリペプチド又はそのペプチドを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記抗原特異的結合ドメインが、抗体、抗体フラグメント、ラクダ科ナノボディ又はアプタマーを含む、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記抗体フラグメントが、単鎖フラグメントである、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記単鎖フラグメントが、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８又は４１ＢＢポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
ａ）前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｂ）前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
ａ）前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｂ）前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
ａ）前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｂ）前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
ａ）前記ヒンジドメインが、配列番号８の核酸配列によりコードされ；
ｂ）前記膜貫通ドメインが、配列番号９の核酸配列によりコードされ；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ、そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１の核酸配列によりコードされる、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
ａ）前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｂ）前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
ａ）前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｂ）前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
ａ）前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｂ）前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
ａ）前記ヒンジドメインが、配列番号８の核酸配列によりコードされ；
ｂ）前記膜貫通ドメインが、配列番号９の核酸配列によりコードされ；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ、そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２の核酸配列によりコードされる、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記ＣＶ−ＣＡＲが、配列番号２１又は２２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
前記ＣＶ−ＣＡＲが、配列番号２１又は２２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
前記ＣＶ−ＣＡＲが、配列番号２１又は２２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
前記ＣＶ−ＣＡＲが、配列番号２１又は２２を含むＣＶペプチドに特異的に結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
少なくとも１つの共刺激ドメインに結合される抗原結合ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインがシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）に特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するよう修飾された単離されたＴ細胞。
【請求項２０】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８又は４１ＢＢポリペプチドを含む、請求項１９に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２１】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１９又は２０に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２２】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１９又は２０に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２３】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１９又は２０に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２４】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８の核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９の核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１の核酸配列によりコードされる、請求項１９又は２０に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２５】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１９又は２０に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２６】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１９又は２０に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２７】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１９又は２０に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２８】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８の核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９の核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２の核酸配列によりコードされる、請求項１９又は２０に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞が哺乳類調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７− ＦＯＸＰ３＋である、請求項２９に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項３１】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
対象から得られた生物学的サンプルからＴリンパ球を単離し；
ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔreg）を、従来のＴ細胞（Ｔconv）から分離し、ここで前記Ｔreg細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７−であり、そして前記ＴconvはＣＤ４＋ＣＤ２５―ＣＤ１２７＋であり；
シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターによりＴreg細胞を形質導入し；
前記形質導入されたＴregを、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで少なくとも一度エクスビボで拡大し、ＣＶ抗原に対して特異的な拡大されたＴreg細胞を得；そして
Ｔregを対象に再注入し、それにより対象を治療することを含んで成る、関節リウマチと診断された対象を治療する方法。
【請求項３４】
前記Ｔreg細胞が自己細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＡＲが、少なくとも１つの共刺激ドメインに結合される抗原結合ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、ここで前記抗原結合ドメインがシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）に特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８又は４１ＢＢポリペプチドを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項４０】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８の核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９の核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１の核酸配列によりコードされる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項４２】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項４３】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項４４】
ａ）前記ＣＡＲが、配列番号８の核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；
ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号９の核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；
ｃ）前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ；そして／又は
ｄ）前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２の核酸配列によりコードされる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項４５】
１又は２以上の抗炎症剤及び／又は治療剤を対象に投与することをさらに含む、請求項３３〜４４のいずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
前記抗炎症剤が、前炎症性サイトカインに特異的に結合する、１又は２以上の抗体を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体が、抗−ＴＮＦα、抗−ＩＬ−６又はそれらの組合せである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗原特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記抗原特異的結合ドメインが抗体又は抗体フラグメントを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項４９】
前記抗体フラグメントが、翻訳後修飾された抗原に特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項４８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５０】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８又は４１ＢＢポリペプチドを含む、請求項４８又は４９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５１】
請求項１〜１８及び請求項４８〜５０のいずれか１項に記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞、請求項３１に記載の発現ベクター、又は請求項３２に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月１１日に出願された米国仮特許出願第２６／６２９，１０３号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
本発明の実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、及び自己免疫疾患などの疾患の治療への使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
伝統的に、抗原特異的Ｔ細胞は、標的抗原に対して本来的に特異的な未梢血Ｔ細胞の選択的増殖により生成されて来た。しかしながら、ほとんどの癌及び自己抗原に対して特異的な多数のＴ細胞を選択し、そして増殖することは困難であり、多くの場合、不可能である。統合型ベクターによる遺伝子療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現が、未梢血Ｔ細胞の多量集団のエクスビボウィルスベクター形質導入により、任意の表面抗原に特異的な多数のＴ細胞の生成を可能にするので、この問題の解決作を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の実施形態は、部分的に、自己免疫疾患に関連する抗原を特異的に認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。特に、ＣＡＲは翻訳後修飾された抗原に対して特異的である。ＣＡＲは、自己免疫応答又は細胞毒性Ｔ細胞を抑制する調節Ｔ細胞などのＴ細胞に形質導入される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明の１つの側面によれば、抗原特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、ここで前記抗原特異的ドメインは、シトルリン化タンパク質、例えばシトルリン化細胞外マトリックスタンパク質、及びシトルリン化細胞表面タンパク質を含む、修飾されたポリペプチド又はそのペプチドに特異的に結合する。
【０００６】
本発明の第２の側面によれば、抗原特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、ここで前記抗原特異的結合ドメインはシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）ポリペプチド又はそのペプチドに特異的に結合する。
【０００７】
第３の側面によれば、本発明は、少なくとも１つの共刺激ドメインに結合される抗原結合ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインがシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）に特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するよう修飾された単離されたＴ細胞を提供する。特定の実施形態によれば、抗原結合ドメインは、抗体、抗体フラグメント、ラクダ科なのボディ又はアプタマーを含む。
【０００８】
特定の実施形態によれば、前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【０００９】
特定の実施形態によれば、前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００１０】
特定の実施形態によれば、前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００１１】
特定の実施形態によれば、前記ヒンジドメインが、配列番号８の核酸配列によりコードされ；前記膜貫通ドメインが、配列番号９の核酸配列によりコードされ；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ、そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１の核酸配列によりコードされる。
【００１２】
特定の実施形態によれば、前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００１３】
特定の実施形態によれば、前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００１４】
特定の実施形態によれば、前記ヒンジドメインが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記膜貫通ドメインが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００１５】
特定の実施形態によれば、前記ヒンジドメインが、配列番号８の核酸配列によりコードされ；前記膜貫通ドメインが、配列番号９の核酸配列によりコードされ；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ、そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２の核酸配列によりコードされる。
【００１６】
特定の実施形態によれば、前記ＣＶ−ＣＡＲは、配列番号３又は４に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する。特定の実施形態によれば、前記ＣＶ−ＣＡＲは、配列番号３又は４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する。
【００１７】
特定の実施形態によれば、前記ＣＶ−ＣＡＲは、配列番号３又は４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する。
【００１８】
特定の実施形態によれば、前記ＣＶ−ＣＡＲは、配列番号３又は４を含むＣＶペプチドに特異的に結合する。
【００１９】
特定の実施形態によれば、前記ＣＶ−ＣＡＲは、配列番号２１又は２２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する。特定の実施形態によれば、前記ＣＶ−ＣＡＲは、配列番号２１又は２２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する。
【００２０】
特定の実施形態によれば、前記ＣＶ−ＣＡＲは、配列番号２１又は２２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに特異的に結合する。
【００２１】
特定の実施形態によれば、前記ＣＶ−ＣＡＲは、配列番号２１又は２２を含むＣＶペプチドに特異的に結合する。
【００２２】
第４の側面によれば、本発明は、少なくとも１つの共刺激ドメインに結合される抗原結合ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインがシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）に特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するよう修飾された単離されたＴ細胞を提供する。特定の実施形態によれば、共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４１ＢＢポリペプチドを含む。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８の核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９の核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ；そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１の核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも７５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも９５％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８の核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９の核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０の核酸配列によりコードされ；そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２の核酸配列によりコードされる。
【００２３】
特定の実施形態によれば、前記Ｔ細胞は哺乳類調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。特定の実施形態によれば、前記Ｔ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７− ＦＯＸＰ３＋である。
【００２４】
特定の実施形態によれば、発現ベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。
【００２５】
第５の側面によれば、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクター、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するよう修飾されている単離されたＴ細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
第６の側面によれば、本発明は、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するよう修飾されている単離されたＴ細胞を投与することを含む、関節リウマチと診断された対象を治療するための方法を提供する。特定の実施形態によれば、抗炎症剤及び／又は治療剤がまた、対象に投与される。特定の実施形態によれば、関節リウマチと診断された対象を治療するための方法は、対象から得られた生物学的サンプルからＴリンパ球を単離し；ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔreg）を、従来のＴ細胞（Ｔconv）から分離し、ここで前記Ｔreg細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７−であり、そして前記ＴconvはＣＤ４＋ＣＤ２５―ＣＤ１２７＋であり；シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターによりＴreg細胞を形質導入し；前記形質導入されたＴregを、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで少なくとも一度エクスビボで拡大し、ＣＶ抗原に対して特異的な拡大されたＴreg細胞を得；そしてＴregを対象に再注入し、それにより対象を治療することを含んで成る。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、少なくとも１つの共刺激ドメインに結合される抗原結合ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、ここで前記抗原結合ドメインがシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）に特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態によれば、共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４１ＢＢポリペプチドである。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記ＣＤ２８共刺激ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、前記ＣＡＲが、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるヒンジドメインを含み；前記ＣＡＲが、配列番号９に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる膜貫通ドメインを含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号１０に対して少なくとも５０％は配列同一性を有する核酸配列によりコードされ；そして／又は前記４１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００２７】
第７の側面によれば、本発明は、Ｔ細胞、例えば調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）を含む種々のタイプの細胞；免疫系の他のタイプの細胞、例えばナチュラルキラー細胞（ＮＫ）；幹細胞、細胞系などに形質導入されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲは、特定の疾患標的抗原、例えば細胞外抗原、細胞表面抗原、ウィルス抗原、翻訳後修飾された抗原などに対して生成された抗原結合ドメインを含む。
【００２８】
他の側面は、以下に記載される。
定義
【００２９】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、関連する技術の文脈での意味と一致する意味を持つものとして解釈されるべきであり、そして本明細書で明示的にそのように定義されない限り、理想的又は過度に正式な意味で解釈されないことが理解されるであろう。
【００３０】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形も含むことが意図されている。さらに、「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「と共に（with）」、又はそれらの変形が、詳細な説明及び/又は特許請求の範囲で使用される範囲で、そのような用語は、「含む（comprising）」という用語と同様に包括的である。
【００３１】
用語「約（about）」又は「およそ（approximately）」は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、 測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、1以内又は1を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」は、所定の値又は範囲の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の５倍以内、および２倍以内の大きさの範囲内を意味することができる。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特にことわらない限り、用語「約」は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、結合強度の尺度として意味される。 理論に縛られることなく、親和性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の立体化学的適合の近さ、それらの間の接触領域のサイズ、及び荷電基と疎水基の分布に依存する。親和性はまた、「アビディティ」という用語も含み、これは、可逆的複合体の形成後の抗原−抗体結合の強度を指す。抗原に対する抗体の親和性を計算する方法は、親和性を計算するための結合実験の使用を含めて、当技術分野で知られている。機能的アッセイ（フローサイトメトリーアッセイなど）での抗体活性も、抗体親和性を反映している。抗体及び親和性は表現型で特徴付けられ、機能敵アッセイ（フローサイトメトリーアッセイなど）を使用して比較できる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「剤」という用語は、疾患又は他の病状を予防、改善、又は治療することができる任意の分子、化学物質、組成物、薬物、治療剤、化学療法剤、又は生物学的薬剤を包含することを意味する。この用語には、小分子化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siＲＮＡ試薬、抗体、エピトープ認識部位を担持する、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ '、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、抗体模倣物（例えば、ＤＡＲＰins、アフィボディ分子、アフィリン、アフィチン、アンチカリン、アビマー、ファイノマー、クニッツドメインペプチド及びモノボディ）、ペプトイド、アプタマー; 酵素、ペプチド有機又は無機分子、天然又は合成化合物などを含む。薬剤は、臨床試験中、試験前試験中、又はＦＤＡ承認後の任意の段階で、本発明の方法に従ってアッセイすることができる。
【００３４】
「改善する」とは、疾患の発症又は進行を減少、抑制、減弱、減少、停止、又は安定化させることを意味する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷の抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子のフラグメントも意味する。そのようなフラグメントはまた、当該分野で周知であり、そしてインビトロ及びインビボの両方で定期的に使用される。従って、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性フラグメントＦ（ａｂ '）２及びＦａｂも意味する。Ｆ（ａｂ '）２、及び無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠くＦａｂフラグメントは、循環からより迅速に除去され、無傷の抗体の非特異的組織結合が少ない可能性がある(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)。本発明の抗体は、天然抗体全体、二重特異性抗体； キメラ抗体; Ｆａｂ、Ｆａｂ '、一本鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、及び従来にない抗体を含む。
【００３６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「又は」は、内容が明確に他のことを指示しない限り、「及び／又は」を含むその意味で一般に使用される。
【００３７】
用語「キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor）」又は「ＣＡＲ」とは、本明細書で使用される場合、免疫細胞を活性化するか又は刺激できる細胞内シグナル伝達ドメインに融合される抗原結合ドメインを意味し、そして特定の実施形態によれば、ＣＡＲはまた、膜貫通ドメインも含む。特定の実施形態によれば、ＣＡＲ細胞外抗原結合ドメインは、ネズミ又はヒト化モノクローナル抗体の可変Ｈ及びＬ鎖領域の融合に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から構成される。他方では、Ｆａｂ（例えば、Ｆａｂライブラリーから得られた抗体からではなく）から誘導されたｓｃＦｖが使用される。種々の実施形態によれば、ｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに、及び次に、細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。「第１世代」のＣＡＲは、抗原結合に基づいてＣＤ３ζシグナルのみを提供するそれらのＣＡＲを含み、「第２世代」のＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）の両者を提供するそれらのＣＡＲを含む。「第３世代」のＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）を提供するそれらのＣＡＲを含む。ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＡＲコンストラクトを含むベクターがサイトカインカセットを有するサイトカイン殺害（ＴＲＵＣＫＳ）をリダイレクトした、第４世代のＣＡＲが記載されている。ＣＡＲが連結される場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞は前炎症性サイトカインを腫瘍病変中に沈着させる。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞である。本明細書で使用され、そして当業界において一般的に使用される「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という語句は、細胞外ドメインへの抗原の結合に基づいて、特別な機能を実行するよう細胞を指示する細胞内ドメインに結合された抗原特異的細胞外ドメインを有する組換え融合タンパク質を言及する。用語「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」及び「キメラ免疫受容体」とは、本明細書においてそれぞれ、用語「キメラ抗原受容体」と互換的に使用され得る。
【００３８】
本明細書において使用される場合、アイテム、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの定義又は説明された要素に関して、用語「含む（comprising）」、「含む（comprise）」又は「含まれる（comprised）」、及びそれらの変形は、包括的又はオープンエンドであることを意味し、追加の要素を許可し、それにより、定義又は説明されるアイテム、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどは、それらの指定された要素、又は必要に応じて、それらの同等物を含み、そして他の要素が含まれ得、そしてさらに、定義されたアイテム、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの範囲／定義内に含まれることを示唆する。
【００３９】
「診断」又は「診断された」とは、病的状態の存在又は性質を同定することを意味する。診断方法は、それらの感度及び特異性において異なる。診断アッセイの「感度」は、検査で陽性となった罹患者の割合（「真の陽性」の割合）である。アッセイにより検出されなかった罹患者は、「偽陰性」である。罹患しておらず、そしてアッセイで陰性と判断された対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率であり、ここで「偽陽性」率は、疾患を持たずに陽性となるヒトの割合として定義される。特定の診断方法は状態の確定診断を提供できない場合があるが、その方法が診断に役立つ肯定的な指標を提供する場合はそれで十分である。
【００４０】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持することができず、そして疾患が改善されない場合、動物の健康は悪化し続ける、動物健康の状態である。疾患の例は、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）などの自己免疫疾患を含む。
【００４１】
用語「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」とは、柔軟なコネクター領域、例えば天然又は合成のポリペプチド、又は隣接するポリペプチド領域に構造的柔軟性及び間隔を提供する、任意の他のタイプの分子を言及する。
【００４２】
「レンチウィルス」とは、本明細書で使用される場合、レトロウィルス科の属を指す。レンチウィルスは、非分裂細胞に感染することができることにおいて、レトロウィルス間でユニークであり；それらは、大量の遺伝子情報を宿主細胞のＤＮＡに送達できるので、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶはすべてレンチウィルスの例である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「スペーサー」又は「スペーサードメイン」としても言及される「リンカー」という用語は、本発明の融合タンパク質における２つのアミノ酸配列の間に任意に配置されるアミノ酸又はアミノ酸の配列を言及する。
【００４４】
免疫原性組成物の「非経口」投与は、例えば皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）、又は胸骨内注射、又は注入技術を含む。
【００４５】
用語「患者」又は「個体」又は「対象」とは、本明細書では互換的に使用され、そして治療される哺乳類対象を言及し、そしてヒト患者が好ましい。場合によっては、本発明の方法は、実験動物に、獣医学的適用に、並びにマウス、ラット及びハムスターを含む齧歯動物、及び霊長類を含む、疾患についての動物モデルの開発に用途を見出している。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「一本鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」とは、免疫グロブリンのＨ鎖（ＶＨ）及びＬ鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。Ｈ鎖（ＶＨ）及びＬ鎖（ＶＬ）は、直接結合されるか、又はＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを連結するか、又はＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端とを連結する、ペプチドコードのリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５個のアミノ酸）により連結される。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに富んでおり、そして溶解性のためにセリン又はトレオニンに富んでいる。定常領域の除去、及びリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Huston, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)により記載されるように、ＶＨ及びＶＬをコードする配列を含む核酸から発現され得る。また、米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号及び 第４，９５６，７７８号；及び米国特許公開番号第２００５０１９６７５４号及び第２００５０１９６７５４号も参照のこと。阻害活性を有する拮抗性ｓｃＦｖが記載されている（例えば、Zhao et al., Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51; Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12; Shieh et al., J Imunol 2009 183(4):2277-85; Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63; Fife et al., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61; Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3): 173-84; Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40)を参照のこと）。刺激活性を有するアゴニストのｓｃＦｖが記載されている（例えばPeter et al., J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7; Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71; Ledbetter et al., Crit Rev Immunol l997 17(5-6):427-55; Ho et al., BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66を参照のこと）。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、「治療（treatmento）」などの用語は、それに関連する障害及び／又は症状を軽減又は改善することを指す。除外されていないが、障害又は状態を治療することは、それに関連する障害、状態又は症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。
【００４８】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、そして単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る物質の組成物である。ベクターの例は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルス。従って、用語「ベクター」とは、自律的に複製するプラスミド又はウィルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミド及び非ウィルス化合物を含むと解釈される。ウィルスベクターの例は、以下を含むことが、但しそれらだけには限定されない：アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど。
【００４９】
本明細書に開示される全ての遺伝子、遺伝子名、及び遺伝子産物は、本明細書に開示される組成物及び方法が適用できる任意の種からのホモログに対応することが意図される。従って、それらの用語は、ヒト及びマウスからの遺伝子及び遺伝子産物を含むが、但しそれらだけには限定されない。特定の種からの遺伝子又は遺伝子産物が開示される場合、この開示は例示のみを意図しており、そして明らかに現れる文脈が明確に示さない限り、限定として解釈されるべきではないことが理解される。従って、例えば、本明細書に開示される遺伝子又は遺伝子産物については、いくつかの実施形態によれば、哺乳類の核酸及びアミノ酸配列に関連し、限定されないが、他の哺乳類、魚類、両生類、爬虫類及び鳥類を含む他の動物からの相同及び／又はオーソロガス遺伝子及び遺伝子産物を包含することが意図される。好ましい実施形態によれば、遺伝子、核酸配列、アミノ酸配列、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質はヒトのものである。用語「遺伝子」はまた、変異体を含むことも意図される。
【００５０】
本明細書で提供される範囲は、範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、 ２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０から成る群からの任意の数、数の組合せ、又は部分範囲を含むと理解される。
【００５１】
本発明の実施は、特に断らない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物の従来の技法を使用し、それらは当業者の範囲内である。例えば、以下を参照のこと：Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodic updates); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000)。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、いくつかの実施形態に従って実施されるプロセスを示す概略図である。
【００５３】
【図２】図２は、（ＣＶ）−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇを生成するために、いくつかの実施形態に従って実施されるプロセスを示す概略図である。
【００５４】
【図３】図３は、患者における抗原を標的とするＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇを示す概略図である。
【００５５】
【図４】図４は、ＢＶＣＡ１抗体から合成された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＣＶに対する特異性及び親和性の評価を示す。ヒト及びネズミのサンプルが評価された。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が使用された。結果は、ＢＶＣＡ１抗体（図７に記載される）と同様に、ＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖがシトルリン化ビメンチンに対して特異的であることを示す。
【００５６】
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂは、ＢＶＣＡ１抗体から合成された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＣＶに対する特異性及び親和性の評価を示す。解離定数（ＫD）は、プラスモン共鳴（Biacore system）を用いて測定された。結果は、（図５Ａ）ＢＶＣＡ１完全ヒトＩｇＧとヒトＣＶペプチドとの間のＫＤが１０ｎＭであり、そして（図５Ｂ）ＢＶＣＡ１  ｓｃｆとヒトＣＶペプチドとの間のＫＤが１９８ｎＭであることを示す。結果は、ＢＶＣＡ１抗体のように、ＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖがシトルリン化ビメンチンに対して特異的であることを示す。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂは、ＢＶＣＡ１抗体から合成された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＣＶに対する特異性及び親和性の評価を示す。解離定数（ＫD）は、プラスモン共鳴（Biacore system）を用いて測定された。結果は、（図５Ａ）ＢＶＣＡ１完全ヒトＩｇＧとヒトＣＶペプチドとの間のＫＤが１０ｎＭであり、そして（図５Ｂ）ＢＶＣＡ１  ｓｃｆとヒトＣＶペプチドとの間のＫＤが１９８ｎＭであることを示す。結果は、ＢＶＣＡ１抗体のように、ＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖがシトルリン化ビメンチンに対して特異的であることを示す。
【００５７】
【図６】図６は、配列が非常に類似しており、そしてシトルリン化後にシトルリンに修飾される３つのアルギニンアミノ酸（Ｒと省略される）が両方の種において同一の位置にあることを示す、ヒト及びネズミビメンチンペプチド６０−７５の配列の比較を示す。
【００５８】
【図７】図７は、ＢＶＣＡ１抗体によるＣＶについての特異性及び親和性の評価を示す。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が使用された。結果は、ヒト及びネズミの両方のＢＶＣＡ１抗体が、ヒト及びネズミの両方のシトルリン化ビメンチンに対して特異的であることを示す。
【００５９】
【図８Ａ】図８Ａは、ＣＶ−ＣＡＲのドメインを示す、ＣＶ−ＣＡＲの概略図を示す。
【００６０】
【図８Ｂ】図８Ｂは、いくつかの実施形態に従って創造されたＣＶ−ＣＡＲの特定のドメインの１つの例の概略図を示す。ＣＡ−ＣＡＲは、αＣＶｓｃＦｖ、ヒンジ領域及び膜貫通モチーフ（ＴＭ）、共刺激ドメイン（ＣＤ２８（ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ）または４１ＢＢ（ＣＶ.４１ＢＢｚ−ＣＡＲ）のいずれか）、ＣＤ３ζを含む。ＣＤ２８の天然ＴＭ部分が使用され；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）の切断されたバージョンは、レポーターとして使用されるべきＣ末端にあり、そしてＥＧＦＲｔレポーターの切断を可能にするＴ２ＡペプチドによりＣＡＲ配列から分離される。
【００６１】
【図９】図９は、Ｔｒｅｇに導入されたＣＶ特異的ＣＡＲのインビトロ生成、拡張及び評価についてのタイムラインの例を示す。
【００６２】
【図１０Ａ】図１０Ａ、１０Ｂは、ＣＡＲコンストラクトの異なった長さのヒンジの分析を示す。形質導入後５日目に、ＣＶ−ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇｓが、ＥＧＦＲｔの発現に基づいてフローサイトメトリーにより分類された。次の分類されたＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓが、抗−ＣＤＢ／ＣＤ２８ビーズ又はＣＶ−ペプチド／ストレプトアビジン（ＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡ）ビーズの存在又は非存在下で再刺激された。図１０Ａ：再刺激後の３日目での活性化マーカーＣＤ７１及びＣＤ２５の発現の分析。図１０Ｂ：再刺激後の５日目での細胞拡張の分析。
【図１０Ｂ】図１０Ａ、１０Ｂは、ＣＡＲコンストラクトの異なった長さのヒンジの分析を示す。形質導入後５日目に、ＣＶ−ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇｓが、ＥＧＦＲｔの発現に基づいてフローサイトメトリーにより分類された。次の分類されたＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓが、抗−ＣＤＢ／ＣＤ２８ビーズ又はＣＶ−ペプチド／ストレプトアビジン（ＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡ）ビーズの存在又は非存在下で再刺激された。図１０Ａ：再刺激後の３日目での活性化マーカーＣＤ７１及びＣＤ２５の発現の分析。図１０Ｂ：再刺激後の５日目での細胞拡張の分析。
【００６３】
【図１１Ａ】図１１Ａ−１１Ｄは、異なるバージョンのＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖを用いてのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトの比較分析を示す。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞は、刺激誤の２日目で異なるバージョンのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトにより形質導入された。形質導入効率がフローサイトメトリーにより評価された。細胞表面でＣＡＲ−レポーター遺伝子（図１１Ａ）及びＣＶ−ＣＡＲ（図１１Ｂ）を発現する細胞の割合が示される。異なる刺激条件（ＩＬ−２のみ、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＡ−ＳＡビーズ）の存在下で２回目の刺激後２日で、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ７１の発現が、フローサイトメトリーにより分析された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｄは、異なるバージョンのＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖを用いてのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトの比較分析を示す。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞は、刺激誤の２日目で異なるバージョンのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトにより形質導入された。形質導入効率がフローサイトメトリーにより評価された。細胞表面でＣＡＲ−レポーター遺伝子（図１１Ａ）及びＣＶ−ＣＡＲ（図１１Ｂ）を発現する細胞の割合が示される。異なる刺激条件（ＩＬ−２のみ、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＡ−ＳＡビーズ）の存在下で２回目の刺激後２日で、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ７１の発現が、フローサイトメトリーにより分析された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
【図１１Ｃ】図１１Ａ−１１Ｄは、異なるバージョンのＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖを用いてのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトの比較分析を示す。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞は、刺激誤の２日目で異なるバージョンのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトにより形質導入された。形質導入効率がフローサイトメトリーにより評価された。細胞表面でＣＡＲ−レポーター遺伝子（図１１Ａ）及びＣＶ−ＣＡＲ（図１１Ｂ）を発現する細胞の割合が示される。異なる刺激条件（ＩＬ−２のみ、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＡ−ＳＡビーズ）の存在下で２回目の刺激後２日で、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ７１の発現が、フローサイトメトリーにより分析された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
【図１１Ｄ】図１１Ａ−１１Ｄは、異なるバージョンのＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖを用いてのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトの比較分析を示す。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞は、刺激誤の２日目で異なるバージョンのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトにより形質導入された。形質導入効率がフローサイトメトリーにより評価された。細胞表面でＣＡＲ−レポーター遺伝子（図１１Ａ）及びＣＶ−ＣＡＲ（図１１Ｂ）を発現する細胞の割合が示される。異なる刺激条件（ＩＬ−２のみ、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＡ−ＳＡビーズ）の存在下で２回目の刺激後２日で、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ７１の発現が、フローサイトメトリーにより分析された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
【００６４】
【図１２Ａ】図１２Ａ−１２Ｃは、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の評価を示す。図１２Ａ：異なるＣＡＲコンストラクトによる形質導入の後４日目でのフローサイトメトリーによる、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の評価。全てのドナー（ｎ＝４）のデータの要約。図１２Ｂ：異なるＣＡＲコンストラクトによる形質導入の後４日目でのフローサイトメトリーによる、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の代表的ドットプロット。図１２Ｃ：ビオチン化−ＣＶペプチド（ｐｅｐ）／ＳＡ−ＦＩＴＣ複合体の略図。図１２Ｄ：ＴｒｅｇにおけるレポーターＥＧＦＲｔ及びＣＶ−ＣＡＲの表面発現の評価。Ｔｒｅｇ細胞が、形質導入の後５日目でＦＩＴＣ（ＣＶｐｅｐ−ＳＡ−ＦＩＴＣ）及びＥＧＦＲｔ抗体により結合されたビオチン化ＣＶ−ペプチド／ストレプトアビジンテトラマーを用いて、ＣＶ−ＣＡＲに対して染色された。ドットプロットは、４つの独立した実験の代表である。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−１２Ｃは、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の評価を示す。図１２Ａ：異なるＣＡＲコンストラクトによる形質導入の後４日目でのフローサイトメトリーによる、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の評価。全てのドナー（ｎ＝４）のデータの要約。図１２Ｂ：異なるＣＡＲコンストラクトによる形質導入の後４日目でのフローサイトメトリーによる、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の代表的ドットプロット。図１２Ｃ：ビオチン化−ＣＶペプチド（ｐｅｐ）／ＳＡ−ＦＩＴＣ複合体の略図。図１２Ｄ：ＴｒｅｇにおけるレポーターＥＧＦＲｔ及びＣＶ−ＣＡＲの表面発現の評価。Ｔｒｅｇ細胞が、形質導入の後５日目でＦＩＴＣ（ＣＶｐｅｐ−ＳＡ−ＦＩＴＣ）及びＥＧＦＲｔ抗体により結合されたビオチン化ＣＶ−ペプチド／ストレプトアビジンテトラマーを用いて、ＣＶ−ＣＡＲに対して染色された。ドットプロットは、４つの独立した実験の代表である。
【図１２Ｃ】図１２Ａ−１２Ｃは、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の評価を示す。図１２Ａ：異なるＣＡＲコンストラクトによる形質導入の後４日目でのフローサイトメトリーによる、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の評価。全てのドナー（ｎ＝４）のデータの要約。図１２Ｂ：異なるＣＡＲコンストラクトによる形質導入の後４日目でのフローサイトメトリーによる、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖにおけるレポーターＥＧＦＲｔの表面発現の代表的ドットプロット。図１２Ｃ：ビオチン化−ＣＶペプチド（ｐｅｐ）／ＳＡ−ＦＩＴＣ複合体の略図。図１２Ｄ：ＴｒｅｇにおけるレポーターＥＧＦＲｔ及びＣＶ−ＣＡＲの表面発現の評価。Ｔｒｅｇ細胞が、形質導入の後５日目でＦＩＴＣ（ＣＶｐｅｐ−ＳＡ−ＦＩＴＣ）及びＥＧＦＲｔ抗体により結合されたビオチン化ＣＶ−ペプチド／ストレプトアビジンテトラマーを用いて、ＣＶ−ＣＡＲに対して染色された。ドットプロットは、４つの独立した実験の代表である。
【００６５】
【図１３】図１３は、ビオチン化ＣＶペプチドにより被覆されたＳＡ  ＤＹＮＡＢＥＡＤ（登録商標）から形成されたビオチン化ＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡビーズの略図である。
【００６６】
【図１４Ａ】図１４Ａ−１４Ｃは、生成されたＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓを活性化するＣＶ−ＣＡＲを介したシグナルの能力の評価を示す。フローサイトメトリーによるＣＶ特異的ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇｓの富化の後、細胞は、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はビオチン化ＣＶ（ＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡ）ビーズの存在又は非存在下で再刺激された。図１４Ａ：１日目でのクラスター化する細胞の評価。図１４Ｂ：３日目での活性化マーカーＣＤ７１及びＣＤ２５の発現の評価。図１４Ｃ：再刺激の５日目で測定された全ての条件での異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団の拡大倍率の評価。
【図１４Ｂ】図１４Ａ−１４Ｃは、生成されたＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓを活性化するＣＶ−ＣＡＲを介したシグナルの能力の評価を示す。フローサイトメトリーによるＣＶ特異的ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇｓの富化の後、細胞は、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はビオチン化ＣＶ（ＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡ）ビーズの存在又は非存在下で再刺激された。図１４Ａ：１日目でのクラスター化する細胞の評価。図１４Ｂ：３日目での活性化マーカーＣＤ７１及びＣＤ２５の発現の評価。図１４Ｃ：再刺激の５日目で測定された全ての条件での異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団の拡大倍率の評価。
【図１４Ｃ】図１４Ａ−１４Ｃは、生成されたＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓを活性化するＣＶ−ＣＡＲを介したシグナルの能力の評価を示す。フローサイトメトリーによるＣＶ特異的ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇｓの富化の後、細胞は、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はビオチン化ＣＶ（ＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡ）ビーズの存在又は非存在下で再刺激された。図１４Ａ：１日目でのクラスター化する細胞の評価。図１４Ｂ：３日目での活性化マーカーＣＤ７１及びＣＤ２５の発現の評価。図１４Ｃ：再刺激の５日目で測定された全ての条件での異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団の拡大倍率の評価。
【００６７】
【図１５Ａ】図１５Ａ−１５Ｃは、インビトロ拡張後のＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓの表現型及び安定性の評価を示す。非形質導入Ｔｒｅｇｓ及びＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓは２回の刺激を受け、そして２回目の活性化は、抗―ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はＣＶ−ＳＡビーズのいずれかによるものであった。図１５Ａ：１８日目でのＣＤ２５及びＣＤ１２７表面発現についてのフローサイトメトリーによる細胞の評価。図１５Ｂ：１８日目のＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓ核内発現についてのフローサイトメトリーによる細胞の評価。図１５Ｃ：細胞がＰＭＡ／イオノマイシンにより４時間、最後の２時間はブレフェルジンＡの存在下で刺激された後、拡張されたＴｒｅｇｓのサイトカイン産生の評価。次に、細胞が固定され、そしてＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７を標的とする抗体により染色された。
【図１５Ｂ】図１５Ａ−１５Ｃは、インビトロ拡張後のＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓの表現型及び安定性の評価を示す。非形質導入Ｔｒｅｇｓ及びＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓは２回の刺激を受け、そして２回目の活性化は、抗―ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はＣＶ−ＳＡビーズのいずれかによるものであった。図１５Ａ：１８日目でのＣＤ２５及びＣＤ１２７表面発現についてのフローサイトメトリーによる細胞の評価。図１５Ｂ：１８日目のＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓ核内発現についてのフローサイトメトリーによる細胞の評価。図１５Ｃ：細胞がＰＭＡ／イオノマイシンにより４時間、最後の２時間はブレフェルジンＡの存在下で刺激された後、拡張されたＴｒｅｇｓのサイトカイン産生の評価。次に、細胞が固定され、そしてＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７を標的とする抗体により染色された。
【図１５Ｃ】図１５Ａ−１５Ｃは、インビトロ拡張後のＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓの表現型及び安定性の評価を示す。非形質導入Ｔｒｅｇｓ及びＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓは２回の刺激を受け、そして２回目の活性化は、抗―ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はＣＶ−ＳＡビーズのいずれかによるものであった。図１５Ａ：１８日目でのＣＤ２５及びＣＤ１２７表面発現についてのフローサイトメトリーによる細胞の評価。図１５Ｂ：１８日目のＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓ核内発現についてのフローサイトメトリーによる細胞の評価。図１５Ｃ：細胞がＰＭＡ／イオノマイシンにより４時間、最後の２時間はブレフェルジンＡの存在下で刺激された後、拡張されたＴｒｅｇｓのサイトカイン産生の評価。次に、細胞が固定され、そしてＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７を標的とする抗体により染色された。
【００６８】
【図１６Ａ】図１６Ａ、１６Ｂは、関節リウマチ（ＲＡ）患者の関節から採取された滑液の存在下で活性化されるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力の評価を示す。種々のＣＡＲコンストラクトを発現する拡張されたＴｒｅｇｓ、及び非形質導入Ｔｒｅｇｓが、ＣＶ−ＳＡビーズ又はＲＡ患者からの滑液と共に又はそれを伴わないで、ＩＬ−２の存在下で培養された。ＣＤ７１の発現が、３．５日間の培養の後、フローサイトメトリーにより評価された。図１６Ａ：ＣＤ７１及びＥＧＦＲｔの発現の評価（ドットプロット）。赤の数字（各グラフの右上隅）は、ＥＧＦＲｔ＋画分中のＣＤ７１＋細胞の割合を表す。図１６Ｂ：異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団におけるＥＧＦＲｔ−及びＥＧＦＲｔ＋画分中のＣＤ７１＋細胞の割合。
【図１６Ｂ】図１６Ａ、１６Ｂは、関節リウマチ（ＲＡ）患者の関節から採取された滑液の存在下で活性化されるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力の評価を示す。種々のＣＡＲコンストラクトを発現する拡張されたＴｒｅｇｓ、及び非形質導入Ｔｒｅｇｓが、ＣＶ−ＳＡビーズ又はＲＡ患者からの滑液と共に又はそれを伴わないで、ＩＬ−２の存在下で培養された。ＣＤ７１の発現が、３．５日間の培養の後、フローサイトメトリーにより評価された。図１６Ａ：ＣＤ７１及びＥＧＦＲｔの発現の評価（ドットプロット）。赤の数字（各グラフの右上隅）は、ＥＧＦＲｔ＋画分中のＣＤ７１＋細胞の割合を表す。図１６Ｂ：異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団におけるＥＧＦＲｔ−及びＥＧＦＲｔ＋画分中のＣＤ７１＋細胞の割合。
【００６９】
【図１７Ａ】図１７Ａ、１７Ｂは、レンチウィルス形質導入の後のＴｒｅｇｓの表面で発現されるＣＶ−特異的ＣＡＲの能力の評価を示す。ＣＡＲ（抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を使用する）及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）の両方が、フローサイトメトリーにより検出された。図１７Ａ：非形質導入Ｔｒｅｇ、ＣＶ /ＣＤ２８ζＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇ、及びＣＶ /４１ＢＢζＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇの表面でのＣＡＲ及びＥＧＦＲｔの発現の評価。図１７Ｂ：種々の実験におけるＣＡＲ＋細胞の割合。
【図１７Ｂ】図１７Ａ、１７Ｂは、レンチウィルス形質導入の後のＴｒｅｇｓの表面で発現されるＣＶ−特異的ＣＡＲの能力の評価を示す。ＣＡＲ（抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を使用する）及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）の両方が、フローサイトメトリーにより検出された。図１７Ａ：非形質導入Ｔｒｅｇ、ＣＶ /ＣＤ２８ζＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇ、及びＣＶ /４１ＢＢζＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇの表面でのＣＡＲ及びＥＧＦＲｔの発現の評価。図１７Ｂ：種々の実験におけるＣＡＲ＋細胞の割合。
【００７０】
【図１８Ａ】図１８Ａ−１８Ｃは、関節リウマチ（ＲＡ）患者の関節から採取された滑液の存在下で活性化されるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力の評価を示す。種々のＣＡＲコンストラクト（１９．２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ、１９．４１ＢＢζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ、ＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ及び１９．４１ＢＢζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ）を発現する拡張されたＴｒｅｇｓ、及び非形質導入（ＵＴＤ）Ｔｒｅｇｓが、ＣＶ−ＳＡビーズ、又は３人の異なるＲＡ患者からの滑液（ＳＦ）、又は対照の痛風患者からのＳＦと共に、又はそれらを伴わないで、ＩＬ−２の存在下で培養された。活性化マーカーＣＤ７１の発現が、培養の３．５日後にフローサイトメトリーにより評価された。図１８Ａ：種々の条件下での共培養の後、ＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇ集団におけるＣＤ７１及びＥＧＦＲｔの発現。図１８Ｂ：痛風陰性対照患者又はＲＡ  ＳＦからのＳＦの存在下での１９．２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ及びＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ ＴｒｅｇｓにおけるＥＧＦＲｔに対するＣＤ７１の発現を示す代表的なドットプロット。図１８Ｃ：ＲＡ患者からのＳＦの存在下での共培養の後、異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団におけるＥＧＦＲｔ−及びＥＧＦＲｔ＋画分の間のＣＤ７１＋細胞の割合の要約（ｎ＝４）。
【図１８Ｂ】図１８Ａ−１８Ｃは、関節リウマチ（ＲＡ）患者の関節から採取された滑液の存在下で活性化されるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力の評価を示す。種々のＣＡＲコンストラクト（１９．２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ、１９．４１ＢＢζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ、ＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ及び１９．４１ＢＢζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ）を発現する拡張されたＴｒｅｇｓ、及び非形質導入（ＵＴＤ）Ｔｒｅｇｓが、ＣＶ−ＳＡビーズ、又は３人の異なるＲＡ患者からの滑液（ＳＦ）、又は対照の痛風患者からのＳＦと共に、又はそれらを伴わないで、ＩＬ−２の存在下で培養された。活性化マーカーＣＤ７１の発現が、培養の３．５日後にフローサイトメトリーにより評価された。図１８Ａ：種々の条件下での共培養の後、ＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇ集団におけるＣＤ７１及びＥＧＦＲｔの発現。図１８Ｂ：痛風陰性対照患者又はＲＡ  ＳＦからのＳＦの存在下での１９．２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ及びＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ ＴｒｅｇｓにおけるＥＧＦＲｔに対するＣＤ７１の発現を示す代表的なドットプロット。図１８Ｃ：ＲＡ患者からのＳＦの存在下での共培養の後、異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団におけるＥＧＦＲｔ−及びＥＧＦＲｔ＋画分の間のＣＤ７１＋細胞の割合の要約（ｎ＝４）。
【図１８Ｃ】図１８Ａ−１８Ｃは、関節リウマチ（ＲＡ）患者の関節から採取された滑液の存在下で活性化されるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力の評価を示す。種々のＣＡＲコンストラクト（１９．２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ、１９．４１ＢＢζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ、ＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ及び１９．４１ＢＢζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ）を発現する拡張されたＴｒｅｇｓ、及び非形質導入（ＵＴＤ）Ｔｒｅｇｓが、ＣＶ−ＳＡビーズ、又は３人の異なるＲＡ患者からの滑液（ＳＦ）、又は対照の痛風患者からのＳＦと共に、又はそれらを伴わないで、ＩＬ−２の存在下で培養された。活性化マーカーＣＤ７１の発現が、培養の３．５日後にフローサイトメトリーにより評価された。図１８Ａ：種々の条件下での共培養の後、ＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇ集団におけるＣＤ７１及びＥＧＦＲｔの発現。図１８Ｂ：痛風陰性対照患者又はＲＡ  ＳＦからのＳＦの存在下での１９．２８ζ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ及びＣＶ.２８ζ−ＣＡＲ ＴｒｅｇｓにおけるＥＧＦＲｔに対するＣＤ７１の発現を示す代表的なドットプロット。図１８Ｃ：ＲＡ患者からのＳＦの存在下での共培養の後、異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団におけるＥＧＦＲｔ−及びＥＧＦＲｔ＋画分の間のＣＤ７１＋細胞の割合の要約（ｎ＝４）。
【００７１】
【図１９】図１９は、形質導入後３日でのフローサイトメトリーによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＲｔの発現の評価を示す。ＣＶ−ＣＡＲコンストラクトは、形質導入の後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞表面で効率的に発現される。
【００７２】
【図２０Ａ】図２０Ａ、２０Ｂは、ＰＡＤ２−ＧＦＲレンチウィルスプラスミドによる形質導入の後、ＳＫＮＢＥ２ｃ腫瘍細胞系におけるシトルリン化ビメンチンの発現の評価を示す。ヒト酵素ペプチジルアルギニンデアミナーゼ（ＰＡＤ２）の遺伝子が、ＧＦＰレポーターと共にレンチウィルスベクター中に挿入され、そして次に、細胞表面でビメンチンタンパク質を発現することが知られている腫瘍細胞系であるＳＫＮＢＥ２ｃ細胞に形質導入された。図２０Ａ：形質導入の３日後、ＳＫＮＢＥ２ｃ細胞におけるＧＦＰ発現がフローサイトメトリーにより評価された。図２０Ｂ：野生型（ＷＴ）及びＰＡＤ２−ＧＦＰにより形質導入されたＳＫＮＢＥ２ｃ細胞におけるシトルリン化ビメンチンの存在が、免疫蛍光染色により評価された。
【図２０Ｂ】図２０Ａ、２０Ｂは、ＰＡＤ２−ＧＦＲレンチウィルスプラスミドによる形質導入の後、ＳＫＮＢＥ２ｃ腫瘍細胞系におけるシトルリン化ビメンチンの発現の評価を示す。ヒト酵素ペプチジルアルギニンデアミナーゼ（ＰＡＤ２）の遺伝子が、ＧＦＰレポーターと共にレンチウィルスベクター中に挿入され、そして次に、細胞表面でビメンチンタンパク質を発現することが知られている腫瘍細胞系であるＳＫＮＢＥ２ｃ細胞に形質導入された。図２０Ａ：形質導入の３日後、ＳＫＮＢＥ２ｃ細胞におけるＧＦＰ発現がフローサイトメトリーにより評価された。図２０Ｂ：野生型（ＷＴ）及びＰＡＤ２−ＧＦＰにより形質導入されたＳＫＮＢＥ２ｃ細胞におけるシトルリン化ビメンチンの存在が、免疫蛍光染色により評価された。
【００７３】
【図２１】図２は、直接ＥＬＩＳＡによる滑液中のシトルリン化ビメンチンの検出を示す。シトルリン化ビメンチンの存在が、ＲＡ及び陰性対照の痛風患者からの滑液中においてＥＬＩＳＡにより評価された。シトルリン化及び非シトルリン化ビメンチンタンパク質が、陽性及び陰性対照として、それぞれ使用された。
【００７４】
【図２２Ａ】図２２Ａ、２２Ｂは、ＲＡ患者からの無細胞滑液の存在下でのＣＶ特異的ＣＡＲ  ＴｒｅｇｓにおけるＣＡＲ介在性刺激の評価を示す。図２２Ａ：ＲＡ患者からの全又は無細胞滑液上清の存在下での３日間の培養の後のＥＧＦＲｔに対するＣＤ７１の発現を示す代表的なドットプロット。図２２Ｂ：ＲＡ患者からの全又は無細胞滑液との共培養後のＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  ＴｒｅｇｓにおけるＥＧＦＲｔ−及びＥＧＦＲｔ＋画分間のＣＤ７１＋細胞の割合。
【図２２Ｂ】図２２Ａ、２２Ｂは、ＲＡ患者からの無細胞滑液の存在下でのＣＶ特異的ＣＡＲ  ＴｒｅｇｓにおけるＣＡＲ介在性刺激の評価を示す。図２２Ａ：ＲＡ患者からの全又は無細胞滑液上清の存在下での３日間の培養の後のＥＧＦＲｔに対するＣＤ７１の発現を示す代表的なドットプロット。図２２Ｂ：ＲＡ患者からの全又は無細胞滑液との共培養後のＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  ＴｒｅｇｓにおけるＥＧＦＲｔ−及びＥＧＦＲｔ＋画分間のＣＤ７１＋細胞の割合。
【００７５】
【図２３Ａ】図２３Ａ、２３Ｂは、ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇ細胞の生成を示す。図２３Ａ：ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇを生成するためのプロトコルの概略図。図２３Ｂ：９日目でのフローサイトメトリーによる富化後のＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇ細胞の純度。上のドットプロットは、０日目でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＴＣＲノックアウトを受けなかった細胞を示し、ところが下のドットプロットはそれを受けた細胞を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ、２３Ｂは、ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇ細胞の生成を示す。図２３Ａ：ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇを生成するためのプロトコルの概略図。図２３Ｂ：９日目でのフローサイトメトリーによる富化後のＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇ細胞の純度。上のドットプロットは、０日目でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＴＣＲノックアウトを受けなかった細胞を示し、ところが下のドットプロットはそれを受けた細胞を示す。
【００７６】
【図２４Ａ】図２４Ａ、２４Ｂは、ＣＡＲ介在性刺激後のＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓの抑制機能の評価を示す。図２４Ａ：ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇは、プレート結合の抗−ＣＤ３及びＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡビーズ（ＣＶｂ）の存在下で、示されるレスポンダー対サプレッサー細胞比率でレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養された。３Ｈ−チミジンが３日目で添加された。結果は、レスポンダー及びＴｒｅｇ細胞の共培養において、及び条件レスポンダーのみにおいて得られた３Ｈチミジンの取り込みにより測定された、１分当たりの平均（ＣＰＭ）に基づいて計算された抑制の割合として示される（実験は重複して実施された）。図２１Ｂ：ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇは、プレート結合抗−ＣＤ３抗体及びＣＶｂ又はビメンチンビーズの存在下で、２：１の比率（レスポンダー：Ｔｒｅｇｓ）でのレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞であった。１９．２８ｚ−ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇｓは、プレート結合抗−ＣＤ３抗体及びＣＶｂの存在下で２：１の比率（レスポンダー：Ｔｒｅｇｓ）で、ＣＦＳＥ標識されたレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞と共に共培養された。データは図２におけるようにして分析された。
【図２４Ｂ】図２４Ａ、２４Ｂは、ＣＡＲ介在性刺激後のＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓの抑制機能の評価を示す。図２４Ａ：ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇは、プレート結合の抗−ＣＤ３及びＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡビーズ（ＣＶｂ）の存在下で、示されるレスポンダー対サプレッサー細胞比率でレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養された。３Ｈ−チミジンが３日目で添加された。結果は、レスポンダー及びＴｒｅｇ細胞の共培養において、及び条件レスポンダーのみにおいて得られた３Ｈチミジンの取り込みにより測定された、１分当たりの平均（ＣＰＭ）に基づいて計算された抑制の割合として示される（実験は重複して実施された）。図２１Ｂ：ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇは、プレート結合抗−ＣＤ３抗体及びＣＶｂ又はビメンチンビーズの存在下で、２：１の比率（レスポンダー：Ｔｒｅｇｓ）でのレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞であった。１９．２８ｚ−ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇｓは、プレート結合抗−ＣＤ３抗体及びＣＶｂの存在下で２：１の比率（レスポンダー：Ｔｒｅｇｓ）で、ＣＦＳＥ標識されたレスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞と共に共培養された。データは図２におけるようにして分析された。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
自己免疫疾患の治療法を提供するという満たされていない必要性がある。例えば、関節リウマチを治療する治療法はまだ発見されていない。ＲＡ患者は生涯にわたる治療を受け、それに関連する全ての費用がかかり、副作用及び不便の可能性がある。この最初の満たされていない必要性は、適切な免疫寛容を回復することによりＲＡ患者を治癒するために、本明細書で具体化される発明により対処される。より一般的には、癌におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の使用は集中的に研究されており、そして臨床試験において非常に有望な結果を示しているが、ＣＡＲ  Ｔ細胞の使用は、自己免疫疾患において、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）が役割を果たす腫瘍及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＤＰＤ）などの他の疾患状態においては、まだ試験されていない。従って、本明細書において具体化される本発明により対処される第２の満たされていない必要性は、Ｔエフェクター細胞の代わりにＴｒｅｇｓを用いることにより自己免疫疾患の治療のためにＣＡＲ  Ｔ細胞療法を適用することである。
【００７８】
従って、以下の実施例のセクションに詳細に説明されるように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、関節リウマチ（ＲＡ）患者における疾患性関節の細胞外マトリックスにおいて、及び一部の腫瘍細胞上で発現されるシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）という翻訳後修飾されたタンパク質を特異的に標的とするよう構築された。ＣＶ−ＣＡＲの一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）部分が、ＲＡ患者の末梢血から単離されたＣＶタンパク質に対して高い特異性を有する抗体から得られた。ＣＶ特異的ｓｃＦｖ鎖が、レンチウィルスベクターにおいてクローン化された第２世代ＣＡＲコンストラクトに挿入された。このＣＡＲコンストラクトは、Ｔエフェクター細胞及び調節Ｔ細胞の両者に導入された。ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓは、ＣＶペプチドテトラマーの存在下で、及びＲＡ患者からの滑液と共に共培養される場合、それらの標的抗原を特異的に認識できた。抗原の認識の後、ＣＡＲ−ＣＶ  Ｔｒｅｇｓが活性化され、そしてＴｒｅｇ表現型を維持しながら、拡張された。
キメラ抗原受容体及びＴ細胞  
【００７９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原特異性をＴ細胞に割り当てるよう企画された、設計された膜貫通キメラタンパク質である。それらは、抗原結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域を含む組換え受容体である。
【００８０】
一般的に、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓは、ＲＡ患者のための細胞療法の開発に使用するために生成された。例えば、図２を参照のこと。取られる治療アプローチは、血液サンプルから細胞を単離することにより、患者（自己）のＴｒｅｇｓを用いることである。次に、単離されたＴｒｅｇｓは、ＣＶ−ＣＡＲトランスジーンを担持するレンチウィルスベクターを用いて遺伝子操作される。ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇｓは、インビトロで２回の拡張を受け、そして次に、抗ＴＮＦ治療と組合して、又は組合さないで、患者に注入され、患者の部位でのＴｒｅｇｓの効率が最適化される。例えば、図１を参照のこと。
【００８１】
ＣＶ―ＣＡＲにより標的化された抗原は、翻訳後に修飾された抗原であり、そしてタンパク質のシトルリン化バージョンに結合するが、しかしその天然型には結合しない。ＣＶ−ＣＡＲは、シトルリン化抗原の標的化するよう開発された最初のＣＡＲである。実施例セクションに記載される結果は、翻訳後修飾された抗原を標的化するＣＡＲはそれらの標的を正常に認識し、そして細胞を活性化できることを示しており、前記翻訳後修飾された抗原は自己免疫疾患及び一部、癌においてさえ、新規の治療戦略の開発における非常に興味ある治療ツールを表すという証拠を提供する。さらに、このＣＡＲは、ＣＡＲの新規使用法を表す可能性がある多量体複合体に、いくつかの細胞により分泌される細胞外マトリックスタンパク質を標的にする。シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）は、関節リュウマチ（ＲＡ）患者の炎症性関節の細胞外マトリックスに存在し、そしていくつかの腫瘍細胞上に発現される。ビメンチンは、タイプIIIの中間フィラメントタンパク質であり、そしてそのシトルリン化形は、関節の微小環境に多く存在する。ＣＶの発現は、健康なヒトにおいては、脾臓、胎盤に限られる。ＲＡ患者の５０％は、滑膜組織に非常に多く存在するＣＶを有する。例えば、図３を参照のこと。
【００８２】
従って、特定の実施形態によれば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、ここで前記抗原特異的結合ドメインは、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）ポリペプチド又はそのペプチドに対して特異的に結合する。ＣＶポリペプチド又はそのペプチドは、翻訳後修飾される。特定の実施形態によれば、共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４１ＢＢポリペプチドを含む。特定の実施形態によれば、抗原特異的結合ドメインは、抗体、抗体フラグメント又はアプタマーを含む。特定の実施形態によれば、抗体フラグメントは、一本鎖フラグメントである。例えば、一本鎖フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【００８３】
特定の実施形態によれば、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）ポリペプチド又はペプチドに対して特異的なキメラ抗原受容体は、配列番号１又は２を含む。
【００８４】
特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１として示される核酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１として示される核酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１として示される核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は配列番号１を含む核酸配列によりコードされる。
【００８５】
いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を有する。
【００８６】
特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号２として示される核酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号２として示される核酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号２として示される核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は配列番号２を含む核酸配列によりコードされる。
【００８７】
いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を有する。
【００８８】
特定の実施形態によれば、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）ポリペプチド又はペプチドに対して特異的なキメラ抗原受容体は、配列番号１又は２、又はそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる１又は２以上のキメラ抗原受容体成分（例えば、ＣＶ特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び／又はＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む。例えば、いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１又は２によりコードされる抗−ＣＶ  ＳｃＦｖ、例えば配列番号７の核酸配列又はそれに対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされるｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１又は２によりコードされるヒトＣＤ２８スペーサードメイン、例えば配列番号８の核酸配列又はそれに対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされるヒトＣＤ２８スペーサードメインを含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１又は２によりコードされるＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば配列番号９の核酸配列又はそれに対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされるＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１又は２によりコードされるＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、例えば配列番号１０の核酸配列又はそれに対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされるＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１又は２によりコードされる共刺激ドメイン、例えば配列番号１１又は１２の核酸配列又はそれに対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる共刺激ドメインを含む。
【００８９】
特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１で示される核酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列、例えば配列番号５の核酸配列によりコードされる。従って、いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号５に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号５として示される核酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号５として示される核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号５を含む核酸配列によりコードされる。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００９１】
特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１３に対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１３に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１３に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【００９２】
特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号２で示される核酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列、例えば配列番号６の核酸配列によりコードされる。従って、いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号６に対して少なくとも５０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号６として示される核酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号６として示される核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号６を含む核酸配列によりコードされる。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００９４】
特定の実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１４に対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１４に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【００９５】
特定の実施形態によれば、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０又は４１ＢＢを含む１又は２以上の共刺激ドメインを含む。本発明のＧＡＲ又は細胞の細胞内シグナル伝達領域は、本明細書で特定された他の領域に加えて、それらのタンパク質の１、２、３、４又は５つの全てからのシグナル伝達領域を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１１の核酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列又は配列番号１９に対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１２の核酸配列又は配列番号１２に対して少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列又は配列番号２０に対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。
【００９６】
本発明のＣＡＲ又は細胞の共刺激ドメインは、４１ＢＢ及びＣＤ２８の両方からの共刺激ドメインを含むことができる。４１ＢＢ共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインの下流に存在することができる。
【００９７】
特定の実施形態によれば、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号１０の核酸配列、又は配列番号１０に対して少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列、又は配列番号１８に対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。
【００９８】
特定の実施形態によれば、ＣＡＲは、ＣＤ２８からの膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号９の核酸配列、又は配列番号９に対して少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列、又は配列番号１７に対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。
【００９９】
ＣＡＲはまた、抗原結合領域とＴ細胞原形質膜との間に位置するスペーサー又はヒンジ領域も含むことができる。通常、スペーサー又はヒンジは、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ又はＣＤ８に由来する配列である。特定の実施形態によれば、ヒンジ領域は、ＣＤ２８モチーフを含む。ヒンジ領域の長さは任意である。いくつかの実施形態によれば、ヒンジ領域は、１個のアミノ酸又は１０個のアミノ酸又は２０個のアミノ酸又は５０個のアミノ酸又は６０個のアミノ酸又は７０個のアミノ酸又は８０個のアミノ酸又は１００個のアミノ酸又は１２０個のアミノ酸又は１４０個のアミノ酸又は１６０個のアミノ酸又は１８０個のアミノ酸又は２００個のアミノ 酸又は２５０個のアミノ酸又は３００個のアミノ酸又はそれらの間の任意の数のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば、スペーサーは、配列番号８の核酸配列、又は配列番号８に対して少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。いくつかの実施形態によれば、スペーサーは、配列番号１６のアミノ酸配列、又は配列番号１６に対して少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するその変異体によりコードされる。
【０１００】
ＣＡＲはさらに、リンカー領域を含むことができる。これは、柔軟性のためにグリシンに富んでいる。リンカー領域は、溶解性のためにセリン及びトレオニンに富んでいる。リンカー領域は、可変Ｈ（ＶＨ）鎖のＮ末端に可変Ｌ（ＶＬ）鎖のＣ末端を連結することができ、又はその逆もまた同様である。
抗原結合ドメイン
【０１０１】
特定の実施形態によれば、抗原結合ドメインは、抗体又は抗体フラグメントであるか、又はそれを含む。特定の実施形態によれば、抗体は、標的分子を結合することが知られているものを含む、ヒト抗体である。本明細書において、用語「抗体」とは、最も広い意味で使用され、そして損なわれていない抗体及び機能的（抗原結合）抗体を含む、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含み、それらのフラグメントは、以下も含む：フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ '）２フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒｌｇＧ）フラグメント、抗原に特異的に結合できる可変Ｈ鎖（ＶＨ）領域、一本鎖抗体フラグメント、 一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、ラクダ科ナノボディ）又はフラグメント。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作された及び／又は他方では、修飾された形、例えば、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば、二重特異性、抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦｖ、タンデムトリ−ｓｃＦｖを包含する。特にことわらない限り、用語「抗体」とは、その機能的抗体フラグメントを包含すると理解されるべきである。その用語はまた、ＩｇＧ及びそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＤを含む任意のクラス又はサブクラスの抗体を含む、損なわれていないか、又は完全長の抗体も包含する。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体又はそのフラグメントである。「ヒト化抗体」とは、全ての又は実質的に全てのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、そして全ての又は実質的に全てのＦＲアミノ酸残基に基いたヒトＦＲに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意には、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。非ヒト抗体の「ヒト化形」は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、典型的にはヒトに対する免疫原性を低めるためにヒト化を受けた非ヒト抗体の変異体を指す。いくつかの実施形態によれば、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基により置換される。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、抗体のＨ鎖及びＬ鎖は、完全長であっても、又は抗原結合部分（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ '）２、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））であっても良い。他の実施形態によれば、抗体Ｈ鎖定常領域は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥから選択され、特に例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、より特定には、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）から選択される。別の実施形態によれば、抗体Ｌ鎖定常領域は、例えばカッパ又はラムダ、特にカッパから選択される。
【０１０４】
提供される抗体の中には、抗体フラグメントがある。「抗体フラグメント」とは、損なわれていない抗体が結合する抗原を結合する損なわれていない抗体の一部を含む損なわれていない抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ '、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆ（ａｂ'）２; ダイアボディ; 線形抗体; 可変Ｈ（ＶＨ）領域、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体分子、及び単一ドメインＶＨ単一抗体; 及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体。特定の実施形態によれば、抗体は、可変Ｈ鎖領域及び／又は可変Ｌ鎖領域を含む一本鎖抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖである。
【０１０５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体、例えば抗体フラグメントに関して使用される場合、抗体の抗原への結合に関与する抗体Ｈ鎖又はＬ鎖のドメインを指す。天然抗体のＨ鎖及びＬ鎖（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは一般的に類似する構造を有し、ここで各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つのＣＤＲを含む（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原を結合する抗体は、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、抗原を結合する抗体からのＶＨ又はＶＬを用いて単離され得る。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照のこと。
【０１０６】
単一ドメイン抗体は、抗体のＨ鎖可変ドメインの一部、又はＬ領域ドメインの全て又は一部を含む抗体フラグメントである。
【０１０７】
抗体フラグメントは、損なわれていない抗体のタンパク質分解消化及び組換え宿主細胞による産生を含む種々の技法により製造され得る。いくつかの実施形態によれば、抗体は、組換えにより生成されたフラグメント、例えば天然に存在しない配置を含むフラグメント、例えば合成リンカー、例えばペプチドリンカーにより連結される複数の抗体領域又は鎖を有するそれらのフラグメント、及び／又は天然に存在する損なわれていない抗体の酵素消化により生成され得ないそれらのフラグメントである。いくつかの側面によれば、抗体フラグメントはｓｃＦｖである。
【０１０８】
特定の実施形態によれば、ＣＡＲの抗体又は抗体フラグメントは、特異的標的抗原又は翻訳後に修飾された標的抗原に対して高い結合親和性を有する。特定の実施形態によれば、高められた結合親和性は、参照抗原によって影響されるよりも大きい。
【０１０９】
特定の実施形態によれば、キメラ抗原は、配列番号３又は４に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＶペプチドに対して特異的に結合する。特定の実施形態によれば、キメラ抗原は、配列番号３又は４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに対して特異的に結合する。特定の実施形態によれば、キメラ抗原は、配列番号３又は４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに対して特異的に結合する
【０１１０】
特定の実施形態によれば、キメラ抗原は、配列番号２１又は２２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＶペプチドに対して特異的に結合する。特定の実施形態によれば、キメラ抗原は、配列番号２１又は２２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに対して特異的に結合する。特定の実施形態によれば、キメラ抗原は、配列番号２１又は２２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＶペプチドに対して特異的に結合する。
【０１１１】
特定の実施形態によれば、キメラ抗原は、ＣＶペプチドに対して特異的に結合する。
【０１１２】
Ｔ細胞：調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、Ｔｒｅｇ集団の遺伝的又は物理的切除の壊滅的な結果により証明されるように、免疫細胞の恒常性の維持に重要である。特に、Ｔｒｅｇ細胞は、他の免疫細胞に支配的な負の規制を強制することにより、免疫システムの秩序を維持する。天然又は適応（誘導）Ｔｒｅｇに広く分類される；天然のＴｒｅｇは、免疫恒常性においてそれらの役割を実施するために、胸腺から発生し、そして移住するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞である。適応Ｔｒｅｇは、胸腺の外でＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）発現を獲得する非調節ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そして炎症及び疾患プロセス、例えば自己免疫及び癌により典型的には、誘発される。
【０１１３】
Ｔｒｅｇが、免疫抑制可溶性因子、例えばＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＴＧＦβの分泌、高親和性ＴＣＲ及び他の共刺激分子、例えばＧＴＬＡ−４、ＧＩＴＲを介した細胞接触介在性調節、及び細胞溶解活性を含む無数のメカニズムを通してそれらの機能を発揮するという証拠が増えている。ＴＧＦβの影響下で、適応Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ前駆体から、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）を含む末梢部位で成熟し、ここでそれらは、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４及びＧＩＴＲ／ＡＩＴＲを含むＴｒｅｇの典型的なマーカーの発現を獲得する。転写因子Ｆｏｘｐ３のアップレギュレーション時に、Ｔｒｅｇ細胞はそれらの抑制効果を開始する。これは、エフェクターＴ細胞周期の停止又はアポトーシスを誘発することができるＩＬ−１０及びＴＧＦβを含むサイトカインの分泌、及び樹状細胞の共刺激及び成熟の遮断を含む。
生存Ｔｒｅｇ細胞の単離
【０１１４】
Ｔｒｅｇ細胞を単離するために使用される手順は、以下の実施例セクションに詳細に提供される。
【０１１５】
一般的に、Ｔ調節細胞は、当初、免疫応答を抑制する能力を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団として同定された。Ｔｒｅｇの「マスターレギュレーション」としてのＦｏｘｐ３の同定は、Ｔｒｅｇを異なるＴ細胞系統として定義する上で主要な工程であった。Ｔｒｅｇの表面上の追加の抗原マーカーの同定は、生存Ｔｒｅｇの同定及びＦＡＣＳソーティングをより高い純度で可能にし、より高く富化された抑制Ｔｒｅｇ集団をもたらした。ＣＤ４及びＣＤ２５に加えて、マウス及びヒトの両方のＴｒｅｇは、ＧＩＴＲ／ＡＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４を発現するが、しかし低レベルのＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒａ）のみを発現することが現在知られている。さらに、Ｔｒｅｇは、表面マーカーの発現に基づいて同定され得る異なる状態で存在することができる。ＣＤ４＋胸腺細胞から胸腺において発生するＴｒｅｇは、「天然」Ｔｒｅｇとして知られているが、しかしながら、Ｔｒｅｇはまた、低用量のＴＣＲ、ＴＧＦβ及びＩＬ−２に応答してナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から末梢において誘発され得る。それらの「誘発された」Ｔｒｅｇは、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０を分泌する。Ｔｒｅｇの表現型は、それらが活性化すると、再び変化し、そしてマウス及びヒトにおけるＧＡＲＰを含むマーカー、及びマウスにおけるＣＤ１０３は、活性化されたＴｒｅｇの同定のために有用であることが知られている。ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ４５ＲＡは、ヒトＣＤ４細胞の異なるサブセットにより独占的に発現され、そしてヒトＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞を以下の３つの表現型的に及び機能的に異なるサブ集団に分割するために使用され得る：ＣＤ４５ＲＡ ＋ ＣＤ２５ ＋ ＦｏｘＰ３ｌｏｗ休止Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ４５ＲＯ ＋ ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘＰ３ｈｉｇｈ活性化Ｔｒｅｇ細胞（どちらもインビトロで抑制的であった）、及び炎症性サイトカイン産生ＣＤ４５ＲＯ ＋ ＣＤ２５ ＋ ＦｏｘＰ３ｌｏｗ非抑制エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆｓ）。
【０１１６】
従って、特定の実施形態によれば、単離されたＴ細胞は、少なくとも１つの共刺激ドメインに結合される抗原結合ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインがシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）に特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するよう修飾される。特定の実施形態によれば、共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４１ＢＢポリペプチドを含む。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を有する。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる１又は２以上のＣＡＲ成分（例えば、ＣＶ特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又はＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１３に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸から選択された１又は２以上のＣＡＲ成分（例えば、ＣＶ特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又はＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる１又は２以上のＣＡＲ成分（例えば、ＣＶ特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又はＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１４に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸から選択された１又は２以上のＣＡＲ成分（例えば、ＣＶ特異的結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又はＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。特定の実施形態によれば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１３に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。いくつかの実施形態によれば、４１ＢＢ共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体は、配列番号１４に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸を含む。
【０１１７】
特定の実施形態によれば、Ｔ細胞は、哺乳類調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、ここでＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４ ＋、ＣＤ２５ ＋、ＣＤ１２７−、ＦＯＸＰ３ ＋及び/又はＨｅｌｉｏｓ ＋/−である。他の実施形態によれば、Ｔ細胞は、哺乳類調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、ここでＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４ ＋、ＣＤ２５ ＋、ＣＤ１２７−、及び/又はＦＯＸＰ３ ＋である。
細胞の単離方法
【０１１８】
当業界において知られている任意の数の方法が、細胞、例えばＴｒｅｇ、又は対象の治療の実施に使用され得る任意の他の細胞型を単離するために使用され得る。従って、キメラ抗原受容体、例えばＣＡＲを発現する、種々の他の遺伝子操作された細胞も提供される。細胞は一般的に、真核細胞、例えば哺乳類細胞であり、そして典型的には、ヒト細胞である。いくつかの実施形態によれば、細胞は、血液、骨髄、リンパ、又はリンパ系器官に由来し、免疫系の細胞、例えば自然又は適応免疫系の細胞、例えばリンパ球を含む骨髄系又はリンパ系細胞、典型的にはＴ細胞及び／又はＮＫ細胞である。他の例示的な細胞は、幹細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、多能性及び多能性幹細胞を含む。細胞は典型的には、初代細胞、例えば対象から直接単離された及び／又は対象から単離され、そして凍結されたそれらの細胞である。いくつかの実施形態によれば、細胞は、Ｔ細胞又は他の細胞型の１又は２以上のサブセット、例えば全細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びそれらの亜集団、例えば機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、拡大、再循環、局在、および/または持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器またはコンパートメント内の存在、マーカーまたはサイトカイン分泌プロファイル、及び/又は分化の程度により定義されるそれらの細胞を含む。治療される対象に関して、細胞は同種異系及び／又は自己由来であり得る。方法には、既知の方法が含まれる。いくつかの側面によれば、例えば、既知技法によれば、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞である。いくつかの実施形態によれば、方法は、本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離し、それらを調製し、処理し、培養し、そして／又は操作し、そして凍結保存の前又は後、それらを同じ患者に再導入することを含む。
【０１１９】
Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団は、以下である：ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞、及びそれらのサブタイプ、例えば幹細胞記憶Ｔ（ＴＳＣＭＸ）、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）、エフェクター記憶Ｔ（ＴＥＭ）、又は最終分化エフェクター記憶Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然に存在しそして適応性のある調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えばＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞ヘルパーＴ細胞、α/βＴ細胞、及びδ/γT細胞。
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態によれば、細胞は、単球又は顆粒球、例えば骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球及び／又は好塩基球である。
【０１２１】
いくつかの実施形態によれば、細胞は、遺伝子工学を介して導入された１又は２以上の核酸を含み、そしてそれにより、そのような核酸の組換え産物又は遺伝子操作された産物を発現する。いくつかの実施形態によれば、核酸は異種性であり、すなわち通常、細胞又は細胞から得られたサンプル、例えば別の生物又は細胞から得られたサンプルには存在せず、そのサンプルは通常、操作されている細胞及び／又はそのような細胞が由来する生物には見出されない。いくつかの実施形態によれば、核酸は、複数の異なる細胞からの種々のドメインをコードする核酸のキメラ組合せを含む、天然には存在せず、例えば天然は見出されない核酸である。
【０１２２】
細胞を単離し、そしてそれらの細胞をＣＡＲにより操作する例示的な方法は、以下の実施例セクションに記載されている。
【０１２３】
いくつかの実施形態によれば、操作された細胞の調製は、１又は２以上の培養及び／又は調製工程を含む。ＣＡＲの導入のための細胞は、サンプル、例えば生物学的サンプル、例えば対象から得られるか、又は対象に由来するサンプルであり得る。いくつかの実施形態によれば、細胞が単離される対象は、疾患又は状態を有するか、又は細胞療法の必要性があるか、又は細胞療法が行われる対象である。対象は、いくつかの実施形態によれば、細胞が単離され、処理され、そして／又は操作される養子細胞療法などの特定の治療的介入を必要とするヒトである。
【０１２４】
従って、細胞は、いくつかの実施形態によれば、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。サンプルは、対象から直接的に採取された組織、体液及び他のサンプル、並びに、１又は２以上の処理工程、例えば分離、遠心分離、遺伝子工学（例えば、ウィルスベクターによる形質導入）、洗浄及び／又はインキュベーションから得られたサンプルである。生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接的に得られたサンプル、又は処理されるサンプルであり得る。生物学的サンプルは、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：体液、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿及び汗、組織、及びそれらに由来する処理済みサンプルを含む器官サンプル。
【０１２５】
いくつかの側面によれば、細胞が由来されるか又は単離されるサンプルは、血液又は血液由来のサンプルであるか、又はアフェレーシス又は白血球アフェレーシス産物であるか、又はそれに由来する。例示的なサンプルは、以下を含む：全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺、または他の器官、及び/又はそれらに由来する細胞。サンプルは、細胞療法、例えば養子細胞療法に関連して、自己及び同種異系の源からのサンプルを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態によれば、細胞は、細胞系、例えばＴ細胞系に由来する。細胞は、いくつかの実施形態によれば、異種起源、例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類、又はブタから得られる。
【０１２７】
いくつかの実施形態によれば、細胞の単離は、１又は２以上の調製及び／又は非親和性に基づく細胞分離工程を含む。いくつかの例によれば、例えば不要な成分を除去し、所望の成分を富化し、溶解し、又は特定の試薬に対して感受性のある細胞を除去するために、細胞が洗浄され、遠心分離され、そして／又は１又は２以上の試薬の存在下でインキュベートされる。いくつかの例によれば、細胞は、１又は２以上の特性、例えば密度、付着特性、サイズ、感度、及び／又は特定の成分に対する耐性に基いて分離される。
【０１２８】
いくつかの例によれば、対象の循環血液からの細胞が、アフェレーシス又は白血球アフェレーシスにより得られる。サンプルは、いくつかの側面によれば、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞及び／又は血小板を含むリンパ球を含み、そしていくつかの側面によれば、赤血球細胞及び血小板以外の細胞を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態によれば、対象から採取された血液細胞は、例えば血漿画分を除去するために、及びその後の処理工程のために適切な緩衝液又は培地に細胞を入れるために洗浄される。いくつかの実施形態によれば、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄される。いくつかの実施形態によれば、洗浄溶液は、カルシウム及び／又はマグネシウム、及び／又は多くの又は全てのニ価カチオンを欠いている。いくつかの側面によれば、洗浄工程は、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、the Cobe 2991 cell processor, Baxter）により、その製造業者の説明書に従って達成される。いくつかの側面によれば、洗浄工程は、接線流濾過（ＴＦＦ）により、その製造業者の説明書に従って達成される。いくつかの実施形態によれば、細胞は、洗浄の後、種々の生体適合性緩衝液、例えばＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＰＢＳに再懸濁される。特定の実施形態によれば、血液細胞サンプル中の成分は除去され、そして細胞は培養培地に再懸濁される。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、密度に基づく細胞分離法、例えば赤血球細胞を溶解することによる末梢血液からの白血球の分離及びパーコール又はフィコール勾配を通しての遠心分離を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態によれば、単離方法は、１又は２以上の特定分子、例えば表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー、又は核酸の細胞における発現又は存在に基づいての異なる細胞型の分離を含む。いくつかの実施形態によれば、分離は、親和性−又は免疫親和性に基づく分離である。例えば、単離は、いくつかの側面によれば、例えば、マーカーを特異的に結合する抗体又は結合パートナーとのインキュベーション、続いて一般的には、洗浄工程、及び抗体又は結合パートナーに結合しているそれらの細胞から、抗体又は結合パートナーを結合している細胞の分離による、１又は２以上のマーかー、典型的には細胞表面マーカーの細胞発現又は発現レベルに基づいての細胞及び細胞集団の分離を含む。
【０１３２】
そのような分離工程は、試薬を結合した細胞がさらなる使用のために保持される正の選択、及び／又は抗体又は結合パートナーに結合していない細胞が保持されている負の選択に基づかれ得る。いくつかの例によれば、両画分がさらなる使用のために保持される。いくつかの側面によれば、負の選択は、異種集団における細胞型を特異的に固定する抗体が利用できない場合、特に有用であり、分離は所望の集団以外の細胞により発現されたマーカーに基づいて最良に実行される。
【０１３３】
分離は、特定の細胞集団、又は特定のマーカーを発現する細胞の１００％富化又は除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定型の細胞の正の選択又は富化は、そのような細胞の数又は割合を高めることを指すが、しかしマーカーを発現しない細胞の完全な不在をもたらす必要はない。同様に、特定の細胞、例えばマーカーを発現する細胞の負の選択、除去又は枯渇は、そのような細胞の数又は割合を低めることを指すが、しかしそのような全ての細胞の完全な除去をもたらす必要はない。
【０１３４】
いくつかの例によれば、複数回の分離工程が実施され、ここで１つの工程からの正の又は負の選択された画分が、別の分離工程、例えば続く正の又は負の選択にゆだねられる。いくつかの例によれば、１回の分離工程は、複数のマーカーを同時に発現する細胞を、負の選択のための標的となるマーカーに対してそれぞれ特異的な、複数の抗体又は結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることにより、枯渇することができる。同様に、複数の細胞型は、種々の細胞型で発現される複数の抗体又は結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることにより、同時に確実に選択され得る。例えば、いくつかの側面によれば、Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば陽性細胞、又は１又は２以上のマーカーを発現する細胞、例えばＣＤ４ ＋、ＣＤ２５ ＋、ＣＤ１２７−、ＦＯＸＰ３ ＋、及び/又はＨｅｌｉｏｓ ＋が存在する。
【０１３５】
Ｔ細胞は、正の又は負の選択技法により単離される。例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８接合の磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ ＣＤ３ / ＣＤ２８ Ｔ細胞エキスパンダー）を用いて確実に選択され得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態によれば、単離は、正の選択による特定の細胞集団の富化、又は負の選択による特定の細胞集団の枯渇により実施される。いくつかの実施形態によれば、正の又は負の選択は、それぞれ、正に又は負に選択された細胞上で発現されるか、又は比較的高レベル（マーカー〔１〕high）で発現された１又は２以上の表面マーカー（マーカー〔１〕）に対して特異的に接合する１又は２以上の抗体又は他の結合剤と共に細胞をインキュベートすることにより達成される。
【０１３７】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞は、非Ｔ細胞、例えばＢ細胞、単球、又はＣＤ１４などの他の白血球細胞上で発現されるマーカーの負の選択により、ＰＢＭＣサンプルから分離される。いくつかの側面によれば、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋選択工程が、ＣＤ４＋ヘルパー及びＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞を分離するために使用される。そのようなＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団はさらに、１又は２以上のナイーブ、記憶及び／又はエフェクターＴ細胞亜集団上で発現されるか、又は比較的高度に発現されるマーカーの正の又は負の選択により、亜集団に分類される。
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、ＣＤ８＋細胞はさらに、ナイーブ、中央記憶、エフェクター記憶及び／又は中央記憶幹細胞について、例えばそれぞれの亜集団に関連する表面抗原に基いての正の又は負の選択により、富化されるか、又は枯渇される。いくつかの実施形態によれば、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の富化は、効能を高めるために、例えば投与の後、長期生存、拡張及び／又は正着を改善するために実施され、これは、いくつかの側面によれば、そのような亜集団において、特に強い。Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照のこと。いくつかの実施形態によれば、ＴＣＭ富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を組み合わせると、さらに効能が増強する。
【０１３９】
いくつかの実施形態によれば、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の富化は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及び/又はＣＤ１２７の正の又は高い表面発現に基かれ；いくつかの側面によれば、それはＣＤ４５ＲＡ及び／又はグランザイムＢを発現するか又は高く発現する細胞についての負の選択にも基づかれる。
【０１４０】
いくつかの側面によれば、ＣＤ４発現に基づく選択工程は、ＣＤ４＋細胞集団又は亜集団を生成するために使用され、これにより、ＣＤ４に基づく分離からの正の及び負の画分の両方が保持され、そして方法の続く工程に、任意には、１又は２以上のさらなる正の又は負の選択工程に続いて使用される。
【０１４１】
１つの例においては、ＰＢＭＣのサンプル、又は他の白血球細胞サンプルは、ＣＤ４＋細胞の選択にゆだねられ、ここで負の及び正の画分の両方が保持される。次に、負の画分は例えば、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡの発現に基く負の選択、及び中央記憶Ｔ細胞、例えばＣＤ６２Ｌ又はＣＣＲ７に特徴的なマーカーに基く正の選択にゆだねられ、ここで正及び負の選択は何れの順序でも実施される。
【０１４２】
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ、中央記憶及びエフェクター細胞に分離される。ＣＤ４＋リンパ球は、標準方法により得られる。いくつかの実施形態によれば、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋である。
【０１４３】
１つの例によれば、負の選択によりＣＤ４＋細胞を富化するためには、モノクローナル抗体カクテルは典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体又は結合パートナーは、正の及び／又は負の選択のための細胞の分離を可能にするために、固体支持体又はマトリックス、例えば磁気ビーズ又は常磁性ビーズに結合される。例えば、いくつかの実施形態によれば、細胞及び細胞集団は、免疫磁気（又は親和性磁気）分離技法を用いて分離又は単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher(著作権)Humana Press Inc., Totowa, NJに再考される）。
【０１４４】
いくつかの側面によれば、分離される細胞のサンプル又は組成物は、小さな、磁化可能な又は磁気応答性材料、例えば磁気応答性粒子又は微粒子、例えば常磁性ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ又は ＭＡＣＳビーズ）と共にインキュベートされる。磁気応答性材料、例えば粒子は一般的に、結合パートナー、例えば分子、例えば分離することが所望される、例えば負に又は正に選択されることが所望される、細胞、複数の細胞又は細胞集団上に存在する表面マーカーに対して特異的に結合する抗体に対して、直接的に又は間接的に結合される。
【０１４５】
いくつかの実施形態によれば、磁気粒子又はビーズは、特異的結合メンバー、例えば抗体又は他の結合パートナーに結合される磁気応答性材料を含む。それらは、磁気分離法に使用される多くの既知の磁気応答性材料がある。適切な磁気粒子は、米国特許第４，４５２，７７３号（Ｍｏｌｄａｙ）及び欧州特許明細書ＥＰ４５２３４２Ｂに記載されるそれらであり、前記特許は引用により本明細書に組込まれる。コロイドサイズの粒子、例えば米国特許第４，７９５，６９８号、及び米国特許第５，２００，０８４号（Ｌｉｂｅｒｔｉなど）に記載されるそれらは、他の例である。
【０１４６】
インキュベーションは、一般的に、抗体又は結合パートナー、又は分子、例えば磁気粒子又はビーズに結合される、そのような抗体又は結合パートナーに特異的に結合する、二次抗体又は他の試薬が、サンプル内の細胞上に存在する場合、細胞表面分子に特異的に結合する、条件下で実施される。
【０１４７】
いくつかの側面によれば、サンプルは磁場に置かれ、そしてそれらに結合される磁気応答性又は磁化可能な粒子を有するそれらの細胞が磁石に引き付けられ、そして非標識細胞から分離される。正の選択の場合、磁石に引き付けられる細胞が保持され；負の選択の場合、引き付けられない細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの側面によれば、正の及び負の選択の組合せが、同じ選択工程の間、実施され、ここで正の及び負の画分が保持され、そしてさらに、処理されるか、又はさらなる分離工程の対象となる。
【０１４８】
特定の実施形態によれば、磁気応答性粒子は、一次抗体又は他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素又はストレプトアビジンで被覆される。特定の実施形態によれば、磁気粒子は、１又は２以上のマーカーに対して特異的な一次抗体の被覆を介して細胞に結合される。特定の実施形態によれば、ビーズよりもむしろ細胞が、一次抗体又は結合パートーにより標識され、そして次に、細胞型特異的二次抗体又は他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）により被覆された磁気粒子が添加される。特定の実施形態によれば、ストレプトアビジン被覆の磁気粒子が、ビオチン化された−次又は二次抗体、又はビオチン化されたペプチドと共に使用される。
【０１４９】
いくつかの実施形態によれば、磁気応答性粒子は、続いてインキュベートされ、培養され、そして／又は操作されるべき細胞に結合されたままであり；いくつかの側面によれば、粒子は、患者への投与のために細胞に結合されたままである。いくつかの実施形態によれば、磁化可能又は磁気応答性粒子は、細胞から除去される。磁化可能粒子を細胞から除去する方法は知られており、そして例えば、競合する非標識抗体、磁化可能粒子、又は切断可能リンカーに結合された抗体などの使用を包含する。いくつかの実施形態によれば、磁化可能粒子は生分解性である。
【０１５０】
いくつかの実施形態によれば、親和性に基く選択は、磁気活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）による。磁気活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）システムは、それに結合された磁化粒子を有する細胞を高純度で選択できる。特定の実施形態によれば、ＭＡＣＳは、外部磁場の適用後に、非標的及び標的種が連続的に溶出されるモードで作動する。すなわち、磁化粒子に結合される粒子は、非結合種が溶出される間、適所に保持される。次に、この最初の溶出工程が完結された後、磁場に閉じ込められ、そして溶出を妨げられた種は、それらが溶出され、そして回収されるよう、何らかの方法で開放される。特定の実施形態によれば、非標的細胞は、標識され、そして異種細胞集団から除去される。
【０１５１】
特定の実施形態によれば、単離又は分離は、方法の１又は２以上の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養及び／又は製剤化工程を実施するシステム、デバイス又は装置を用いて実行される。いくつかの側面によれば、このシステムは、閉鎖又は無菌環境でそれらの工程の個々を実行するために、例えば誤差、使用者の操作及び／又は汚染を最小限にするために使用される。１つの例によれば、システムは、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０７２００３号、又はＵＳ２０１１０００３３８０Ａ１に記載されるようなシステムである。
【０１５２】
いくつかの実施形態によれば、システム又は装置は、統合された又は自己完結型システム及び／又は自動化された又はプログラム可能な方法における単離、処理、操作及び製剤化工程の１又は２以上、例えば全てを実行する。いくつかの側面によれば、システム又は装置は、システム又は装置と通信するコンピューター及び／又はコンピュータープログラムを含み、これにより、使用者は、処理、単離、操作及び製剤化工程の種々の側面のプログラム、制御、結果の評価、そして／又は調製することが可能である。
【０１５３】
いくつかの側面によれば、分離及び／又は他の工程は、例えば閉鎖された及び無菌システムにおいて臨床規模のレベルで細胞を自動分離するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム(Miltenyi Biotec)を用いて実施される。構成要素は、統合されたマイクロコンピューター、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ及び種々のピンチバルブを含むことができる。いくつかの側面によれば、統合されたコンピューターは、装置の全ての構成要素を制御し、そして標準化された順序で反復手順を実行するようシステムに指示する。磁気分離ユニットは、いくつかの側面によれば、可動永久磁石及び選択カラムのホルダーを含む。蠕動ポンプは、チューブセット全体の流量を制御し、そしてピンチバルブと共に、システムを通して緩衝液の流れの制御及び細胞の継続的な懸濁を確保する。
【０１５４】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムは、いくつかの側面によれば、無菌の非発熱性溶液で供給される抗体結合の磁化可能粒子を使用する。いくつかの実施形態によれば、磁気粒子による細胞の標識の後、細胞は洗浄され、過剰の粒子が除去される。次に、細胞調製バッグがチューブセットに連結され、次にチューブセットは、緩衝液を含むバッグ及び細胞収集バッグに連結される。チューブセットは、プレカラム及び分離カラムを含む、事前に組立てられた無菌チューブから成り、そして１回のみ使用のためである。分離プログラムの開始後、システムは、自動的に細胞サンプルを、分離カラム上に適用する。標識された細胞はカラム内に保持されるが、ところが非標識細胞は、一連の洗浄工程により除去される。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、標識されておらず、そしてカラム保持されていない。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、標識され、そしてカラム保持されている。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、磁場の除去後にカラムから溶出され、そして細胞収集バッグ内に収集される。
【０１５５】
特定の実施形態によれば、分離及び／又は他の工程は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ システム (Miltenyi Biotec)を用いて実行される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ システムは、いくつかの側面によれば、遠心分離による細胞の自動洗浄及び分画を可能にする細胞処理ユニティが装備される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ システムはまた、オンボードカメラ、及びソース細胞製品の肉眼で見える層を見分けることにより、最適な細胞分画エンドポイントを決定する画像認識ソフトウェアを含むことができる。例えば、末梢血液は自動的に、赤血球、白血球及び血漿層に分離され得る。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ システムはまた、細胞培養プロトコル、例えば細胞分化及び増殖、抗原負荷、及び長期細胞培養を実現する、統合された細胞培養チャンバーを含むことができる。入力ポートは、培地の無菌除去及び補充を可能にし、そして細胞は、統合された顕微鏡を用いてモニターされ得る。例えば、Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82, 及びWang et al. (2012) Immunother. 35(9):689-701を参照のこと。
【０１５６】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される細胞集団は、フローサイトメトリーを介して収集され、そして富化され（又は枯渇され）、ここで細胞表面マーカーについて染色される細胞が流体の流れ下で運ばれる。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される細胞集団は、分取スケール（ＦＡＣＳ）分類を介して収集され、そして富化される（又は枯渇される）。特定の実施形態によれば、本明細書に記載される細胞集団は、ＦＡＣＳに基づく検出システムと組合して微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップの使用により収集され、そして富化される（又は枯渇される）（例えば、国際公開第 2010/033140号, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 及び Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376を参照のこと）。両方の場合、細胞は、複数のマーカーにより標識され、明確なＴ細胞サブセットの高純度での単離を可能にする。
【０１５７】
いくつかの実施形態によれば、抗体又は結合パートナーは、正の及び／又は負の選択のための分離を提供するために、１又は２以上の検出可能マーカーにより標識される。例えば、分離は、蛍光標識された抗体への結合に基づかれ得る。いくつかの例によれば、１又は２以上の細胞表面マーカーに対して特異的な抗体又は他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、例えばフローサイトメトリー検出システムと組合して、分取スケール（ＦＡＣＳ）及び／又は微小電気機器システムを含む蛍光活性化細胞分類（ＭＥＭ）チップにより、液体の流れにおいて行われる。そのような方法は、同時に複数のマーカーに基づく正の及び負の選択を可能にする。
【０１５８】
いくつかの実施形態によれば、調製方法は、単離、インキュベーション、及び／又は操作の前又は後のいずれかに、細胞を凍結、例えば凍結保存するための工程を含む。いくつかの実施形態によれば、凍結及び続く解凍工程は、細胞集団内の顆粒球及びある程度は、単球を除去する。いくつかの実施形態によれば、例えば、血漿及び血小板を除去するための洗浄工程に続いて、凍結溶液に懸濁される。いくつかの側面によれば、種々の既知の凍結溶液及びパラメーターが使用される。１つの例は、２０％のＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＰＢＳ、又は他の適切な細胞凍結培地の使用を含む。次に、これは、培地で１：１に希釈され、結果的に、ＤＭＳ及びＨＳＡの最終濃度は、それぞれ、１０％及び４％である。次に、細胞は、毎分１°の速度で−８０℃に凍結され、そして液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵される。
【０１５９】
いくつかの実施形態によれば、提供される方法は、培養、インキュベーション、及び／又は遺伝子工学の工程を含む。例えば、いくつかの実施形態によれば、枯渇された細胞集団及び培養開始組成物もインキュベート及び／又は操作するための方法が提供される。
【０１６０】
従って、いくつかの実施形態によれば、細胞集団は、培養開始組成物においてインキュベートされる。インキュベーション及び／又は操作は、培養容器、例えばユニット、チャンバー、ウェル、カラム、管、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、又は培養又は細胞を培養するための他の容器において実施され得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態によれば、細胞は、遺伝子操作の前又はそれに関連して、インキュベートされ、そして／又は培養される。インキュベーション工程は、培養、刺激、活性化、及び／又は増殖を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、組成物又は細胞は、刺激条件又は刺激剤の存在下でインキュベートされる。そのような条件は、集団内の細胞の増殖、拡張、活性化及び／又は生存を誘導し、抗原暴露を模倣し、そして／又は遺伝子操作、例えば組換え抗原受容体の導入のために細胞を準備するよう企画されたそれらの条件を含む。
【０１６２】
条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、剤、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン及び／又は刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、及び細胞を活性化するように企画されたいずれかの他の剤の１つ又は複数を含むことができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態によれば、刺激条件又は剤は、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化できる１又は２以上の剤、例えばリガンドを含む。いくつかの側面によれば、剤は、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードをオンにするか又は開始する。そのような剤は、抗体、例えばＴＣＲに対して特異的なそれら、例えば抗−ＣＤ３を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、刺激条件は、共刺激受容体を刺激できる１又は２以上の剤、例えばリガンド、例えば抗−ＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態によれば、そのような剤及び／又はリガンドは、固体支持体、例えばビーズ、及び／又は１又は２以上のサイトカインに結合され得る。任意には、拡張方法は、さらに、抗−ＣＤ３及び／又は抗−ＣＤ２８抗体を培養培地に添加する工程（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、刺激剤は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７を含む。いくつかの側面によれば、ＩＬ−２濃度は、少なくとも約１０単位／ｍｌである。
【０１６４】
いくつかの側面によれば、インキュベーションは、米国特許第６，０４０，１７７号（Ｒｉｄｄｅｌｌなど）；Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82, 及び/又は Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されるそれらの技法に従って実施される。
【０１６５】
いくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞は、培養開始組成物にフィーダー細胞、例えば非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を添加し（例えば、結果として得られる細胞集団は、拡張される初期集団における各Ｔリンパ球に対して少なくとも５、１０、２０又は４０又はそれ以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含む）；そしてその培養物をインキュベートすることにより（例えば、Ｔ細胞の数を拡張するのに十分な時間）、拡張される。いくつかの側面によれば、非分裂フィーダー細胞は、γ線を照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、ＰＢＭＣは、細胞分裂を防ぐために、約３０００〜３６００ラドの範囲のγ線により照射される。いくつかの側面によれば、フィーダー細胞は、Ｔ細胞集団の添加の前、培養培地に添加される。
【０１６６】
いくつかの実施形態によれば、刺激条件は、ヒトＴリンパ球の増殖のために適切な温度、例えば少なくとも約２５℃、一般的には、少なくとも約３０℃、及び一般的には、約３７℃を含む。任意には、インキュベーションはさらに、非分裂ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を、フィーダー細胞として添加することを含む。ＬＣＬは、約６０００〜１０，０００ラドの範囲でのγ線により照射され得る。ＬＣＬフィーダー細胞は、いくつかの側面によれば、適切な量、例えば少なくとも約１０：１の比率のＬＣＬフィーダー細胞：初期Ｔリンパ球の量で提供される。
治療方法
【０１６７】
特定の実施形態によれば、関節リウマチと診断された対象を治療する方法は、対象から得られた生物学的サンプルからＴリンパ球を単離し；従来のＴ細部（Ｔｃｏｎｖ）
からＣＤ４＋Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）を分離し、ここでＴｒｅｇ細胞はＣＤ４＋Ｃ２２５＋ＣＤ１２７−であり、そしてＴｃｏｎｖはＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋であり；シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）抗原に対して特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターによりＴｒｅｇ細胞を形質導入し；ＣＶ抗原に対して特異的なＴｒｅｇ細胞を得るために、少なくとも１回、エクスビボでＣＶ抗原により、形質導入されたＴｒｅｇを刺激し；そしてＴｒｅｇを対象に再注入し、それにより、対象を治療することを含む。特定の実施形態によれば、Ｔｒｅｇ細胞は自己細胞である。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それだけには限定されないが、対象から収集されたＴ細胞などの当業界において知られているＴ細胞のいずれかの源から生成され得る。対象は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする関節リウマチなどの自己免疫疾患を有する患者、又はＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする自己免疫疾患を有する対象と同じ種の対象であり得る。収集されたＴ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するために、ＣＡＲによる形質導入の前、当業界においては一般的である方法を用いてエクスビボで拡張され得る。  
【０１６８】
シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）抗原はまた、腫瘍及びＣＯＰＤに関連し、従って、特定の実施形態によれば、腫瘍又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療する方法は、対象から得られた生物学的サンプルからＴリンパ球を単離し；従来のＴ細部（Ｔｃｏｎｖ）からＣＤ４＋Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）を分離し、ここでＴｒｅｇ細胞はＣＤ４＋Ｃ２２５＋ＣＤ１２７−であり、そしてＴｃｏｎｖはＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋であり；シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）抗原に対して特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターによりＴｒｅｇ細胞を形質導入し；ＣＶ抗原に対して特異的なＴｒｅｇ細胞を得るために、少なくとも１回、エクスビボでＣＶ抗原により、形質導入されたＴｒｅｇを刺激し；そしてＴｒｅｇを対象に再注入し、それにより、対象を治療することを含む。特定の実施形態によれば、Ｔｒｅｇ細胞は自己細胞である。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それだけには限定されないが、対象から収集されたＴ細胞などの当業界において知られているＴ細胞のいずれかの源から生成され得る。
【０１６９】
Ｔ細胞におけるＣＡＲ企画、送達及び発現のための方法、及び臨床グレードのＣＡＲ−Ｔ細胞集団の製造は、当業界において知られている。例えば、Lee et al., Clin. Cancer Res. 2012, 18(10): 2780-90（その全体が引用により本明細書に組込まれている）を参照のこと。たとえば、操作されたＣＡＲは、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を、標的細胞ゲノム中に効果的に及び安定して組込む、レトロウィルスを用いてＴ細胞中に導入され得る。レンチウィルスベクターを用いる例示的な方法は、以下の実施例セクションに記載されている。
【０１７０】
ＣＡＲは、ベクターによりコードされ得、そして／又は以下に詳細に記載されるように、１又は２以上の送達ビークル及び製剤中に包含され得る。
【０１７１】
当業界において知られている他の方法は、レンチウィルス形質導入、トランスポゾンに基づくシステム、直接的ＲＮＡトランスフェクション、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、適切なＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ Ｏｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又は ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ５、Ｃｍ５ 、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６などを用いてのＩ型、II型又はIII型システム）を含むが、但しそれらだけには限定されない。
【０１７２】
ベクターは例えば、複製起点、足場付着領域（ＳＡＲ）及び／又はマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、宿主細胞に選択可能な表現型を付与することができる。例えば、マーカーは、殺生物剤耐性、例えば抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン又はハイグロマイシン）に対する耐性を付与することができる。発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作又は検出（例えば、精製又は局在化）を促進するよう企画されたタグ配列を含むことができる。タグ配列、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン又はＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）配列は典型的には、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。そのようなタグは、カルボキシル又はアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内のどこにでも挿入され得る。別の例は、ＥＧＦＲｔレポーター、及びＥＧＦＲｔタンパク質を欠くＣＡＲを生成するために切断される自己切断可能なＴ２Ａ配列である。いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲｔは必要とされない。
【０１７３】
追加の発現ベクターはまた、例えば染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むことができる。適切なベクターは、以下を含む：ＳＶ４０の誘導体及び既知の細菌プラスミド、例えばＥ．コリプラスミドｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、プラスミド、例えばＲＰ４；ファージＤＮＡ、例えばファージ１の多くの誘導体、例えばＮＭ９８９、及び他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及び糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば２μプラスミド又はその誘導体、真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫又は哺乳類細胞において有用なベクター；プラスミド及びファージＤＮＡ、例えばファージＤＮＡ又は他の表現制御配列を使用するよう修飾されたプラスミドの組合せに由来するベクター。
【０１７４】
いくつかの送達方法は、インビトロ（細胞培養）及びインビボ（動物及び患者）システムのために、単離された核酸配列と共に利用され得る。いくつかの実施形態によれば、レンチウィルス遺伝子送達システムが利用され得る。そのようなシステムは、大きなＤＮＡ挿入体のための広い向性及び能力を備え、分裂及び非分裂細胞における遺伝子の安定した長期存在を提供する（Dull et al, J Virol, 72:8463-8471 1998）。１つの実施形態によれば、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は、送達方法として利用され得る。ＡＡＶは、インビトロ及びインビボシステムにおいて治療遺伝子を送達するために近年積極的に使用されて来た、非病原性の一本鎖ＤＮＡウィルスである（Choi et al, Curr Gene Ther, 5:299-310, 2005）。ＡＡＶは、血清型１〜９を含む。非ウィルス送達方法の例は、ナノ粒子技法を利用することができる。このプラットフォームは、インビボで医薬品としての有用性を実施している。ナノ技法は、固い上皮及び内皮バリアを通過する薬物のトランスサイトーシスを改善した。それは、特定の方法で細胞及び組織への標的化されたペイロードを提供する（Allen and Cullis, Science, 303:1818-1822, 1998）。
【０１７５】
ベクターはまた、調節領域を含むことができる。用語「調節領域」とは、転写又は翻訳開始及び速度、及び転写又は翻訳生成物の安定性及び／又は移動性に影響及ぼすヌクレオチドを指す。調節領域は、以下を含むが、それらだけには限定されない：プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導要素、タンパク質結合配列、５ '及び３'非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、及びイントロン。
【０１７６】
用語「操作可能的に連結される」とは、そのような配列の転写又は翻訳に影響を及ぼすために、核酸における転写される調節領域及び配列の配置を指す。例えば、プロモーターの制御下にコード配列を置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、プロモーターの下流の１〜約５０個のヌクレオチド間に、典型的には配置される。しかしながら、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチド上流、又は転写開始部位の下流の約２，０００ヌクレオチド上流に配置され得る。プロモーターは典型的には、少なくともコア（基礎）プロモーターを含む。プロモーターはまた、少なくとも１つの制御要素、例えばエンハンサー配列、下流要素又は上流活性化領域（ＵＡＲ）を含むこともできる。含まれるべきプロモーターの選択は、効率、選択性、誘導性、所望する発現レベル及び細胞又は組織選択的発現を含む（但し、それらだけには限定されない）いくつかの要因に依存する。コード配列に関するプロモーター及び他の調節領域を適切に選択し、そして配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的なことである。
【０１７７】
ベクターは例えば、ウィルスベクター（例えば、アデノウィルスＡｄ、ＡＡＶ、レンチウィルス及び水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）及びレトロウィルス）、リポソーム及び他の脂質含有複合体、及び宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することができる他の高分子複合体を含む。ベクターはまた、遺伝子送達及び／又は遺伝子発現をさらに調節するか、又は標的細胞に有益な特性を提供する他の成分又は機能性も含むことができる。以下により詳細に説明及び図示されるように、そのような他の成分は、例えば細胞への結合又は標的化に影響を及ぼす成分（細胞型又は組織特異的結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分；取り込み後、細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分（例えば、核局在を媒介する剤）；及びポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分を含む。そのような分はまた、マーカー、例えばベクターにより送達された核酸を取り込み、そして発現する細胞を検出するか又は選択するために使用され得る検出可能及び／又は選択可能マーカーも含む。そのような成分は、ベクターの天然の特徴として提供され得（例えば、結合及び取り込みを媒介する成分又は機能を有する特定のウィルスベクターの使用）、又はベクターはそのような機能を提供するよう修飾され得る。他のベクターは、Chen et al; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)により記載されたそれらのものを含む。多くの種類のそのようなベクターが当業界において知られており、そして一般的に入手可能である。「組換えウィルスバクター」とは、１又は２以上の異種遺伝子産物又は配列を含むウィルスベクターを指す。多くのウィルスベクターはパッケージングに関連するサイズ制約を示すので、異種遺伝子産物又は配列は、典型的には、ウィルスゲノムの１又は２以上の部分を置換することにより導入される。そのようなウィルスは複製欠陥による可能性があり、ウィルス複製／又はキャプシド化の間、トランスで提供されるべき欠失された機能を必要とする（例えば、ヘルパーウィルス、又は複製及び／又はキャプシド化のために必要な遺伝子産物を担持するパッケージング細胞系を用いることによる）。送達されるポリヌクレオチドがウィルス粒子の外側に運ばれる修飾されたウィルスベクターもまた記載されている（例えば、Curiel, D T, et al. PNAS 88: 8850-8854, 1991を参照のこと）。
【０１７８】
追加のベクターは、ウィルスベクター、融合タンパク質及び化学的接合体を含む。レトロウィルスベクターは、モロニーマウス白血病ウィルス及びＨＩＶに基づくウィルスを含む。１つのＨＩＶに基づくウィルスベクターは、少なくとも２つのベクターを含み、ここでｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノムからであり、そしてｅｎｖ遺伝子は別のウィルスからである。ＤＮＡウィルスベクターは、ポックスベクター、例えばオルソポックス又はアビポックスベクター、ヘルペスウィルスベクター、例えば単離ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ベクター（Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A.I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)], Adenovirus Vectors [LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)）、及びアデノ随伴ウィルスベクター（Kaplitt, M.G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)）を含む。
【０１７９】
本明細書において具体化されるポリヌクレオチドは、微小送達ビークル、例えばカチオン性リボソーム及びアデノウィルスベクターと共に使用され得る。リポソーム調製、標的化、及び内容物の送達の手順の再考のためには、Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682 (1988)を参照のこと。また、Felgner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989) 及びMaurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989)も参照のこと。
【０１８０】
複製欠損組換えアデノウィルスベクターは、既知技法に従って生成され得る。Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992); 及びRosenfeld, et al., Cell, 68:143-155 (1992)を参照のこと。
【０１８１】
別の方法は、細胞内で発現産物を産生できる一本鎖ＤＮＡ生成ベクターを使用することである。例えば、Chen et al, BioTechniques, 34: 167-171 (2003)を参照のこと（その全体は、参照により本明細書に組込まれる）。
【０１８２】
本発明の核酸配列は、対象の適切な細胞に送達され得る。これは、例えば、食細胞、例えばマクロファージによる食作用を最適化するようにサイズ設定された、ポリマーの生分解性微粒子、又はマイクロカプセル送達ビークルの使用により達成され得る。例えば、直接約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ−ラクト−コ−グリコリド）微粒子が使用され得る。ポリヌクレオチドは、マイクロファージにより取り込まれ、そして細胞内で徐々に生分解されるそれらの微粒子にカプセル化され、それによりポリヌクレオチドが放出される。放出されると、ＤＮＡは細胞内で発現される。２番目のタイプの微粒子は、細胞により直接取り込まれるのではなく、しかしむしろ、生分解による微粒子からの放出後のみ細胞により取り込まれる核酸の徐放性貯蔵体として主に機能することを目的としている。従って、それらのポリマー粒子は、食作用を排除するのに十分な大きさでなければならない（すなわち、５μｍより大きく、そして好ましくは、２０μｍより大きい）。核酸の取り込みを達成する別の方法は、標準方法により調製されたリポソームを使用することである。核酸は、それらの送達ビークルに単独で組込まれるか、又はＴｒｅｇ細胞に対して、又は標的としての腫瘍細胞への送達に対して特異的な細胞又は組織特異的抗体と共に同時組込まれ得る。他方では、静電力又は共有結合力によりポリ−Ｌ−リシンに結合されるプラスミド又は他のベクターから構成される分子複合体が調製され得る。ポリ−Ｌ−リシンは、標的細胞上の受容体に結合できるリガンドに結合する。筋肉内、皮内又は皮下部位への「裸のＤＮＡ」（すなわち、送達ビークルなしの）の送達は、インビボ発現を達成するための別の手段である。関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）においては、上記のように、ＣＡＲをコードする配列を含む単離された核酸配列コードする核酸配列が存在する。
【０１８３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ナノ粒子、例えばＤＮＡと複合体化された高分子量線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）のコアから成り、ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）低分子量ＬＰＥＩのシエルで囲まれたナノ粒子として製剤化され得る。核酸分子及びベクターはまた、装置（例えば、カテーテル）の表面に適用され得るか、又はポンプ、パッチ、又は他の薬物送達装置内に含まれ得る。本明細書に開示される核酸及びベクターは、薬学的に許容される賦形剤又は担体（例えば生理食塩水）の存在下で、単独で、又は混合物で投与され得る。賦形剤又は担体は、投与の様式及び経路に基づいて選択される。適切な医薬品担体、及び医薬製剤への使用に必要な医薬品は、この分野で良く知られている参考文献であるRemington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)、及びUSP/NF (United States Pharmacopeia and the National Formulary)に記載されている。
【０１８４】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、本明細書で具体化される組成物をカプセル化するナノ粒子として配合され得る。
【０１８５】
組成物が核酸として投与されるか、又はポリペプチドとして投与されるかにかかわらず、それらは、哺乳類細胞による取り込みを促進するような手段で配合される。有用なベクターシステム及び製剤は、上に記載される。いくつかの実施形態によれば、ベクターは、組成物を特定の細胞型に送達することができる。しかしながら、本発明はそのように限定されず、そして例えばリン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポフレックス、界面活性剤及びペルフルオロ化学液体を用いるＤＮＡ送達、例えば化学的トランスフェクションの他方法もまた、物理的送達方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、弾道粒子、及び「遺伝子銃」システムと同様に、企画される。
【０１８６】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、１又は２以上のＣＡＲをコードする１又は２以上のベクター又は核酸により形質転換又はトランスフェクトされた細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、エクスビボで適用され得る。すなわち、対象の細胞が身体から取り出され、そして所望する標的抗原を有する培養中の組成物により形質導入され、標的抗原特異的Ｔ細胞が拡張され、そして拡張された細胞が対象の体に戻される。細胞は、対象の細胞であり、又はそれらはハプロタイプが一致するか、又は細胞系であり得る。細胞は、複製を防ぐために照射され得る。いくつかの実施形態によれば、細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致した自己細胞系、又はそれらの組合せである。他の実施形態によれば、細胞は幹細胞であり得る。例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（誘発された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））である。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（誘発された多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含む多くの動物種から確立された。それらのタイプの多能性幹細胞は、それらの多能性を維持しながら活発に分裂する能力を維持しながら、適切なそれらの分化誘導によりほとんど全ての器官に分化できるので、再生医療のための最も有用な細胞源となる。ｉＰＳ細胞は特に、自己由来の体細胞から確立され得、従って、胚の破壊により生成されるＥＳ細胞と比較して、倫理的、及び社会的な問題を引起しにくい。さらに、自己由来の細胞であるｉＰＳ細胞は、再生医療又は移植療法の最大の障害である拒絶反応の回避を可能にする。
【０１８７】
ＣＡＲは、当業界において知られている方法、例えばｓｉＲＮＡを送達する方法により対象に容易に送達され得る。従って、ＣＡＲ分子は、現在の遺伝子治療で採用されているアプローチに類似して、臨床学的に使用され得る。特に、細胞移植療法及びワクチン接種のためのＣＡＲ安定発現幹細胞又はｉＰＳの細胞は、対象への使用のために開発され得る。
【０１８８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それらがエクスビボで拡張されたら、治療的有効量で対象に再注入され得る。１つの実施形態によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それらのインビトロ拡張のために抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激される。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、自己免疫疾患抗原（例えば、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ））に応答して使用され得る。用語「治療的有効量」とは、本明細書で使用される場合、そのような治療を必要とする哺乳類、特にヒトに投与される場合のＣＡＲ  Ｔ細胞の量が、自己免疫疾患、例えば関節リウマチを治療するのに十分であることを意味する。
【０１８９】
投与されるＣＡＲ  Ｔ細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、疾患の程度及び状態における個人差を考慮して、医師により決定され得る。
【０１９０】
典型的には、Ｔ細胞治療薬の投与は、体重１ｋｇ当たりの細胞の数により定義される。しかしながら、Ｔ細胞は、移植後、複製し、そして増殖するので、投与される細胞量は、最終的な定常状態の細胞数とは異なるであろう。
【０１９１】
１つの実施形態によれば、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９個の細胞／ｋｇ体重の用量で投与され得る。別の実施形態によれば、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞を含む医薬組成物は、１０５〜１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量で、それらの範囲内のすべての整数値を含めて投与され得る。
【０１９２】
本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物はまた、それらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、当業界に知られている注入技法を用いることにより投与され得る（例えば、Rosenberg et al., 1988, New England Journal of Medicine, 319: 1676を参照のこと）。特定の対象に対する最適な投与量及び治療計画は、疾患の徴候について患者をモニターし、そしてそれに応じて、治療を調整することにより、当業者により容易に決定され得る。
【０１９３】
特定の実施形態によれば、本明細書において具体化される組成物、例えば自己免疫疾患の治療のためのＣＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかの投与は、他の細胞に基づく治療薬、例えば幹細胞、抗原提示細胞などと組合わされ得る。
【０１９４】
本発明の組成物は、当業界において知られている方法で調製され得、そして１又は２以上の医薬的に許容できる担体又は希釈剤と共に、治療的に有効量の組成物のみを含む、哺乳類、特にヒトへの非経口投与のために適切なそれらである。
【０１９５】
用語「医薬的に許容できる担体」とは、本明細書に使用される場合、任意の適切な担体、希釈剤又は賦形剤を意味する。それらは、意図される受容者の血液と組成物とを等張にする、抗酸化剤、緩衝液、溶質を含むことができる全ての水性及び非水性等張滅菌注射液；緩衝剤、及び増粘剤、分散媒体、抗真菌及び抗菌剤、等張剤及び吸収剤を含む水性及び非水性滅菌懸濁液などを含む。本発明の組成物はまた、他の補足的な生物活性剤も含むことができことが理解されるであろう。
【０１９６】
担体は、組成物中の他の成分と適合でき、そして対象に害を及ぼさないという意味で、医薬的に「許容できる」ものでなければならない。組成物は、皮下、筋肉内、関節内、静脈内及び皮内投与を含む非経口投与のために適切なそれらを含む。組成物は、好都合には、単位剤形で提供されてもよく、そして製薬業界で周知の任意の方法により調製されてもよい。そのような方法は、ＣＡＲ細胞との会合のための担体を調製することを含む。一般的に、組成物は、任意の活性成分と液体担体とを、均一且つ密接に会合させることにより調製される。
【０１９７】
１つの実施形態によれば、組成物は、非経口投与のために適切である。別の実施形態によれば、組成物は、静脈内投与のために適切である。別の実施形態によれば、組成物は、関節内投与のために適切である。
【０１９８】
非経口投与に適した組成物は、意図した受容者の血液と組成物とを等張する、抗酸化剤、緩衝液、殺菌剤及び溶質を含む水性及び非水性等張滅菌注射溶液；及び懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。
【０１９９】
本発明はまた、本発明の組成物と、他の薬物及び／又はさらに、他の治療レジメ又はモダリティ、例えば手術との組合せも企画する。本発明の組成物が既知の治療剤と組合して使用される場合、組成物は、順次（連続的に、又は治療のない期間によって分割されて）、又は同時に、又は混合物として投与され得る。自己免疫疾患、例えば関節リウマチの場合、治療は、本明細書で具体化された組成物、例えばシトルリン化ビメンチン（ＣＶ）に対して特異的なＣＡＲにより形質導入された自己Ｔ細胞、及び１又は２以上の抗炎症剤及び／又は治療剤を対象に投与することを含む。抗炎症剤は、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインに対して特異的に結合する１又は２以上の抗体を含む。特定の実施形態によれば、抗体は、抗−ＴＮＦα、抗−ＩＬ−６又はそれらの組合せである。特定の実施形態によれば、炎症性サイトカインを低める、抗体以外の１又は２以上の剤、例えば非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が投与され得る。炎症性サイトカインを低める、抗体及び１又は２以上の剤の任意の組合せが投与され得る。
【０２００】
組合せでの治療はまた、例えば維持療法として、本発明の組成物とその後の既知の治療による治療、又は既知の剤による治療、続く本発明の組成物による治療を包含すると考えられる。例えば、自己免疫疾患の治療においては、免疫細胞、例えばＴ細胞及びＢリンパ球の過剰かつ長期の活性化、及びマスター炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）の過剰発現が、他のメディエーター、例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）と一緒に、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）及び強直性脊椎炎（ＡＳ）における自己免疫性炎症反応の病因に中心的な役割を果たす。
【０２０１】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）は、伝統的に自己免疫炎症性疾患の治療に使用される。ＮＳＡＩＤ及びグルココルチコイドは、痛みの緩和及び炎症の抑制に効果的であるが、ＤＭＡＲＤは、炎症応答により引起される組織及び器官の損傷を軽減する能力を有する。最近では、ＲＡ及び他の自己免疫疾患の治療は、ＴＮＦが疾患の進行において決定的に重要であるという発見により革命をもたらされて来た。抗ＴＮＦ生物製剤（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、及びセルトリズマブペポール）は、自己免疫性炎症性疾患の管理結果を著しく改善した。
【０２０２】
非ステロイド性抗炎症薬は、関節炎及び頭痛のような状態の治療のために頻繁に使用される鎮痛、解熱及び抗炎症効果を有する。ＮＳＡＩＤは、は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素をブロックすることで痛みを緩和する。ＣＯＸは、炎症及び痛みを引起すメディエーターのプロスタグランジンの生成を促進する。ＮＳＡＩＤは、異なる化学構造を有するが、それらの全ては、類似する治療効果、例えば自己免疫性炎症性応答の抑制効果を有する。一般的に、ＮＳＡＩＤは以下の２つの広いカテゴリーに分けられ得る：従来の非選択的ＮＳＡＩＤ及び選択的シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤（再考のためには、P. Li et al. Front Pharmacol. 2017; 8: 460を参照のこと）。
【０２０３】
抗ＴＮＦ剤に加えて、他の炎症性サイトカイン又は免疫適格分子を標的とする生物製剤もまた、広範囲に研究され、そして活発に開発されて来た。ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン及びＩｇＧ１のＦｃ画分の完全にヒト化された融合タンパク質であるアバタセプトは、抗ＴＮＦ治療に対する不十分な応答のＲＡ患者に承認されている。アバタセプトの主な免疫学的メカニズムは、共刺激経路（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の選択的阻害及びＴ細胞の活性化である。ヒト化抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗体であるトシリズマブは、ＤＭＡＲＤ及び／又は抗ＴＮＦ生物製剤に対して耐性のないＲＡ患者に対して承認された。この治療用ｍＡｂは、ＩＬ−６受容体の可溶型及び膜型との結合を介して、ＩＬ−６の膜貫通シグナル伝達を遮断する。ＩＬ−１（アナキンラ）、Ｔｈ１免疫応答（ＩＬ−１２ / ＩＬ−２３、ウステキヌマブ）、Ｔｈ１７免疫応答（ＩＬ−１７、セクキヌマブ）及びＣＤ２０（リツキシマブ）を標的とする生物学的薬物もまた、自己免疫疾患の治療に承認されている（再考のためには、P. Li et al. Front Pharmacol. 2017; 8: 460を参照のこと）。
【０２０４】
本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。 矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、及び例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０２０５】
実施例１：ＣＶ−ＣＡＲを発現するレンチウィルスベクターの生成：
ＣＡＲの有効性において重要な役割を果たす異なる要素を評価した。従って、いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦｖの３つの異なるバージョンを比較し、ヒンジの２つの長さを評価し、そして２つの異なる共刺激ドメインを分析した。それらの各工程で、最良なＴ細胞活性化プロファイルを提供するＣＶ−ＣＡＲ候補体の１つを選択した。
【０２０６】
ＣＶ特異的ｓｃＦｖの生成：ＢＶＣＡ１抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域を配列決定し、そしてＶＨ−リンカー−ＶＬフォーマットでＣＶ特異的ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために使用した。ｓｃＦｖタンパク質を、前記配列をｐＳＹＮプラスミド中に挿入することにより生成し、そしてＤＨ５−αＥ．コリ  コンピテント細胞中に接種した。単一のコロニーを、２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンにより補充された２ＹＴ培地５ｍｌにおいて、シェーカー内で３０℃で一晩、増殖した。５ｍｌのＯ／Ｎ培養液を、５０ｍｌの新鮮な２ＹＴ培地（０．１％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に接種し、そしてＯＤ６００＝０．９になるまで、３７℃で２．５時間インキュベートした。ｓｃＦｖの発現を、２５０μｌのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、誘発し、そして次に、振盪しながら、３０℃で４時間インキュベートした。５０００ｒｐｍでの２０分間の遠心分離の後、細菌ペレットを、１２．５ｍｌの氷冷却ペリプラズの抽出緩衝液（ＰＰＢ、２００ｇ／ｌのスクロース、３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）により再懸濁し、そして氷Ｏ／Ｎ上で維持した。次の日、細菌を、１０，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、上清液を保持し、そしてペレットを、１２．５ｍｌの５ｍＭの氷冷却Ｍｇ２ＳＯ４により再懸濁し、そして氷上で３０分間、保持し、浸透圧ショックを誘発した。溶解された細菌を、１０，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、そして上清液を前のものと組合した。次に、ＣＶ特異的ｓｃＦｖを、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製した。
【０２０７】
ＣＶペプチドに対するＢＶＣＡ１抗体及びｓｃＦｖの結合特異性及び親和性の評価：ＢＶＣＡ１  ＩｇＧ及びｓｃＦｖの結合特異性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン５０μｌにより、４℃でＯ／Ｎ被覆した。ウェルを３度、洗浄し、そして２００μｌの１×ＰｂＳ  １％ＢＳＡによりＲＴで１時間、ブロックし、そして再び洗浄した。ＰＢＳ  １％ＢＳＡで希釈された１０μｇ／ｍｌでのビオチン化ペプチド１００μｌを添加し、そしてＲＴで１時間インキュベートした。次に、ウィルを３度、洗浄した。１００μｌのＢＶＣＡ１  ＩｇＧ又はｓｃＦｖ又はアイソタイプ対照を、種々の濃度で添加した（連続希釈）。ＲＴでの１．５時間のインキュベーションの後、ウェルを３度、洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合された適切な二次抗体をウェルに添加した：完全ヒトＢＶＣＡ１  ＩｇＧの場合、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ａｂ−ＡＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ ６２−８４２２）を、１／５０００希釈度で使用し、マウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むキメラバージョンのＢＶＣＡ１  Ａｂに関しては、ヤギ抗−マウスＩｇＧ（分子全体）Ａｂ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ番号Ａ３５６２）を、１／１０，０００希釈度で使用し、ＢＶＣＡ１のｓｃＦｖに関連しては、抗−ｃ−Ｍｙｃ  Ａｂ（クローン９Ｅ１０、マウスＩｇＧ１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｓｃ−４０）を、１／２００の希釈度で使用し、続いて抗−マウスＩｇＧ−Ａｂ（Ｓｉｇｍａ、Ａ３５６２）を、１／１００００希釈度で使用した。ウェルを３度、洗浄し、そして１００μｌのＳｔｅｐ  ｐＮＰＰ基質溶液を添加した。反応を、１５〜３０分後、５０μｌの３ＭのＮａＯＨにより停止し、そして吸光度を、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダーで読み取った。ＣＶペプチドに対するＢＶＣＡ１  Ｉｇ及びｓｃＦｖの反応速度及び親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いての表面プラズモン共鳴により分析した。ビオチン化ＣＶペプチドを、ストレプトアビジン被覆されたセンサーチップ（ＣＭ５）上に固定した。種々の濃度の抗体を、３０μｌ／分の流速で挿入した。
【０２０８】
ＣＶ特異的ＣＡＲコンストラクトの生成：（Ｇｉｂｓｏｎ  アセンブリー法（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＢｉｏＬａｂｓ、製造業者の説明書による）を使用することにより、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ配列を、むしろＣＤ２８ｚ又は４１ＢＢｚ細胞内ドメイン、続いてＣＤ３ζドメイン、及び受容体として使用され、そしてＴ２ＡドメインによりＣＡＲ（ＣＡＲコンストラクトは、Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより提供された）から分離された切断バージョンを有するｐ１０００１レンチウィルスプラスミドにクローン化された既存の１９−ＣＡＲコンストラクト中にＣＶ特異的ｓｃＦｖ配列により置換した。それらのＣＡＲコンストラクトは、両者とも、短いヒンジ（ＩｇＧ４−３６ｂｐ）を有し、従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリー法を再び使用し、短いヒンジを、長いヒンジ（ヒトＣＤ２８配列の細胞外ドメインの１１７ｂｐ）により置換した。従って、短い又は長いヒンジ、及び４１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激ドメインを有する複数のＣＶ特異的ＣＡＲコンストラクトを生成した。
【０２０９】
ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞トランスフェクション及びレンチウィルス粒子滴定：ＨＥＫ  ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ（抗生物を含まない）により補充された２ｍｌのＤＭＥＭ高グルコース培地を含む６ウェルプレートに、プレート当たり８００，０００個の細胞でプレートし、そして３７℃で５％ＣＯ２下に一晩置いた。ウェル内の集密性が８０％になる場合、１．５μｇのＣＶ−ＣＡＲ  ｐ１０００１と１．３３μｇのパッケージングベクターｐ８．９１、０．１６８μｇのＶＳＶエンペロープベクターｐＭＤ２．Ｇ及び９μｇのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）との混合物を、各ウェルに一滴ずつゆっくり添加した。ウィルス粒子産生の効率を改善するために、培地を、１４時間後、ＶｉｒａｌＢｏｏｓｔ 試薬(１/５００で希釈された; ＶＣ−１００, Ａｌｓｔｅｍ)を補充された新鮮な１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ高グルコース培地により交換した。ウィルス上清液を、２日後に収穫し、そしてレンチウィルス沈殿溶液（ＶＰ１００、Ａｌｓｔｅｍ、製造業者の指示に従った）を用いて、１００倍に濃縮した。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション効果を、抗−ＥＧＦＲｔ  Ａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ，  Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を用いて、フローサイトメトリーにより評価した。レンチウィルス粒子を力価測定するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（９６ウェルプレートにおいて各ウェル当たり１０，０００）を、４日間、ウィルスの連続希釈下で培養し、次に抗ＥＧＦＲｔ  Ａｂにより染色し、そしてフローサイトメトリー（ＬＳＲ  II；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。１％〜２０％の陽性細胞を生成する希釈溶液を用いて、次の等式によりウィルス力価を決定した：〔標的細胞の数×（ＥＧＦＲｔ＋細胞の％／１００）〕／上清液の体積（ｍｌ）。
【０２１０】
図１９は、トランスフェクションの３日後、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の細胞表面でのＣＶ特異的ＣＡＲ発現の評価を示す。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション及びレンチウィルス粒子の滴定に使用された技法は、上に記載されている。
【０２１１】
実施例２：ＣＶ−ＣＡＲを発現するレンチウィルスベクターの生成：
ＣＶ−ＣＡＲコンストラクトの生成：レンチウィルスベクターで発現されたＣＶ−ＣＡＲコンストラクトを生成するために、レンチウィルスバックボーンプラスミドｐ１００１（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．から入手できる）に存在するＣＤ１９−ＣＡＲコンストラクトの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー法を用いて、ＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖにより置換した（図８Ａ及び８Ｂ）。ヒト及びマウスビメンチンのアミノ酸配列間に、わずかな異なりが観察されないので、抗ＣＶ抗体は、ヒト及びマウスの両方のペプチドに対して高い特異性を示す。これは、インビトロでのヒトサンプル及びインビボでのＲＡマウスモデルの両方の評価の実行を可能にする。ヒトビメンチンペプチド及びマウスビメンチンペプチドの一部のアラインメントを示す図６は、ＢＶＤＡ１モノクローナル抗体がヒト及びマウスの両方のシトルリン化ビメンチンに対して特異的である理由を説明する。図７は、ＢＶＣＡ１抗体から合成された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＣＶに対する特異性及び親和性の評価を示す。図５は、ＢＶＣＡ１完全ヒトＩｇＧとヒトＣＶペプチドとの間の解離定数が約１０ｎＭであり（図５Ａ）、そしてＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖとヒトＣＶペプチドとの間のＫＤが約１９８ｎＭである（図５Ｂ）ことを示す。この結果は、ＢＶＣＡ１抗体として、ＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖがシトルリン化ビメンチンに対して特異的であることを示す。
【０２１２】
図８Ｂに示されるように、ＣＶ特異的ＣＡＲの２つのバージョンが創造され、個々はＣＤ３ζとＣＤ２８ (ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ) 又は ４１ＢＢ (ＣＶ.４１ＢＢｚ−ＣＡＲ)共刺激ドメインのいずれかを含む。記載される実施形態にしたがってのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトは、任意の適切なタイプの共刺激ドメインを有することができる。ＴＲＡペプチドによりＣＡＲから分離されたＥＧＦＲ遺伝子の切断バージョンを、レポーター遺伝子として使用した。レンチウィルス粒子を、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることにより生成した。上清液を３日後、収集し、そしてウィルス粒子を、沈殿させ、富化した。
【０２１３】
図９は、ＣＶ−ＣＡＲコンストラクトの生成及び生成されたコンストラクトの続く評価のタイムラインの例を示す。コンストラクトの生成及び評価の種々の工程の詳細及び例がこの開示全体で記載されている。
【０２１４】
異なる長さのＣＶ−ＣＡＲコンストラクトヒンジの評価：２つの異なる長さのヒンジを有するコンストラクトを比較した：（１）ＩｇＧ４モチーフ由来の短いヒンジ、及び（２）ヒトＣＤ２８の細胞外ドメインの一部である長いヒンジ。ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ 及びＣＶ.４１ＢＢｚ−ＣＡＲの両方に関して、長いヒンジの存在がＣＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞のより効率的な活性化を誘発したことが観察された。ＣＡＲコンストラクトの標的抗原に依存して、ヒンジの最適な長さを決定し、適切な抗原結合を可能にすることができる。ヒンジの長さがＣＶ特異的ＣＡＲ  Ｔｒｅｇ活性化のために最適であることを評価するために、以下の２つの異なるヒンジを比較した：短いヒンジのＩｇＧ４（３６ｂｐ）及びヒトＣＤ２８の細胞外ドメインの一部を用いて創造された長いヒンジ（１１７ｂｐ）。ＣＤ２８ｚ細胞内ドメインを有するＣＶ−ＣＡＲ、及び４１ＢＢｚ細胞内ドメインを有するＣＶ−ＣＡＲの両者における異なるヒンジを研究するために、ＣＶ−ＣＡＲコンストラクトの以下の４つのバージョンを生成した：短いヒンジを有する2つ（ＣＶ−ＩｇＧ４−２８ｚ 及び ＣＶ−ＩｇＧ４−４１ＢＢｚ）及び長いヒンジを有する２つの（ＣＶ−ＣＤ２８−２８ｚ 及びＣＶ−ＣＤ２８−４１ＢＢｚ）。それらの異なるＣＶ−ＣＡＲコンストラクトのＴｒｅｇへの発現を、レンチウィルス形質導入により誘発し、そしてＣＶ−  ＳＡビーズの存在下で再刺激された後、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇの活性化プロファイルを分析した。図１０Ａに示されるように、３日目で、より高い割合の細胞が、短いヒンジを有するＣＡＲコンストラクトに比較して、長いヒンジを有するＣＡＲコンストラクトを発現するＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団において活性化マーカーＣＤ７１を発現した。３日目でＣＤ２５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を評価する場合、同じ観察が行われた。さらに、長いヒンジを有するＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは、短いヒンジを有するそれらよりも効率的に拡張した（図１０Ｂ）。
【０２１５】
ｓｃＦｖの異なるバージョンの評価：本発明者は、シトルリン化ビメンチンタンパク質を特異的に結合する新規ｓｃＦｖ、ＢＶＣＡ１を開発した。ＲＡ患者に見出されるシトルリン化タンパク質を標的とする抗体のほとんどは、特異性が低く、そして多数のシトルリン化タンパク質と交差反応する。従って、さらなる分析は、ＢＶＣＡ．１を使用した。しかしながら、この単一のＩｇＧから、以下の３つのバージョンのｓｃＦｖを生成した。：（１）１つは、２４個のアミノ酸リンカーと共に起源のヌクレオチド配列を有するＶＬ及びＶＨ鎖を有する（ｓｃＦｖ＃１）、（２）２番目は、起源のヌクレオチド配列及び（ＧＧＧＧＳ）３リンカーを有する（ｓｃＦｖ＃２）、及び（３）３番目は、ＶＬ及びＶＨ鎖のコドン最適化配列及び（ＧＧＧＧＳ）３リンカーを有する（ｓｃＦｖ＃３）。
【０２１６】
図１１Ａ−１１Ｄに示されるように、ｓｃＦｖ＃１を有するＣＶ−ＣＡＲのみが、形質導入の３日後で、Ｔｒｅｇ及びＴｃａｎｖの細胞表面で効率的に発現されたが、ところがレポーター遺伝子の発現は、３つの異なるＣＡＲコンストラクト間で同等の形質導入効果を示唆した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。ＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡビーズ（ＣＶビーズ）の存在下での再刺激後２日目で、以前にＣＶ−ＣＡＲ  ｓｃＦｖ＃１により形質導入されたＴｒｅｇ集団において活性化マーカーＣＤ７１及びＣＤ６９を発現する細胞の割合の上昇が、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇの２つの他のグループに比較して、観察された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。それらの結果に基づいて、ｓｃＦｖ＃１を有するＣＶ―ＣＡＲコンストラクトを選択し、ＣＶ−ＣＡＲコンストラクトの開発を続けた。
【０２１７】
実施例３：ＣＶ−ＣＡＲ形質導入ヒトＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖの生成：
サンプル、細胞選別及びインビトロ刺激：新鮮な全血ユニットは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の一般集団から採用された健康なドナーから入手されるか、又はＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供された。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ培地（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、密度勾配沈降により単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気細胞選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）により、ＰＢＭＣからの陽性選択により富化した。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ１２７に対して特異的な蛍光標識されたｍＡｂにより染色し、そしてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＡｒｉａ； ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、以下の２つのサブセットに、９７％よりも高い純度で分離した：ＣＤ４ ＋ ＣＤ２５ ＋ ＣＤ１２７−（ＣＤ４ ＋調節性Ｔ細胞; Ｔｒｅｇ）及びＣＤ４ ＋ ＣＤ２５−ＣＤ１２７ ＋（ＣＤ４ ＋ Ｔ従来型細胞; Ｔｃｏｎｖ）。次に、選別された細胞集団を、Ｔ細胞培地において、インターロイキン−２（ＩＬ−２； Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ； Ｔｃｏｎｖは１００Ｕ / ｍｌ、Ｔｒｅｇは３００Ｕ / ｍｌ）の存在下で、抗ＣＤ３ /抗ＣＤ２８被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｔｃｏｎｖの場合、１：１の比率で及びＴｒｅｇの場合、２ビーズに対して１細胞の比率で刺激した：ここで前記細胞培地は、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭの Ｌ−グルタミン、各５０ｍｇ/ｍｌのペニシリン/ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、５ｍＭの非必須アミノ酸、５ ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、及び1０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により補充されたＲＰＭＩ１６４０培地である。ＩＬ−２を含む新鮮な培地を、２日ごとに添加し、そして細胞を、必要に応じて、分けた。
【０２１８】
Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ集団のレンチウィルス形質導入及び形質導入効率評価：選別されたＣＤ４＋集団の刺激後２日で、細胞を計数し、そして２４ウェルプレート中にウェル当たり２５０，０００〜５００，０００個の細胞で播種し、そしてインキュベーターに３７℃で少なくとも１時間、置いた。次に、ウィルス粒子及び硫酸プロタミン（１００μｇ／ｍｌ）の混合物を、ウェルに添加し、細胞当たり１粒子の感染多重度（ＭＯＩ）に到達させた。次に、細胞を、１２００ｘｇで３０分間、３２℃でスピノキュレートした。次に、プレートを３７℃で９０分間戻した。細胞を５分間、回転させ、そして接種培地を、ＩＬ−２を含む新鮮なものと交換した。３日後、形質導入の効率を、抗−ＥＧＦＲｔ  Ａｂを用いてフローサイトメトリーにより測定した。ＥＧＦＲｔ＋細胞の割合がそれらの細胞の細胞表面でのＣＡＲの発現を表すものであることを確認するために、細胞を、ＡＰＣ又はＰＥと結合したＥＧＦＲｔ  Ａｂ及びＣＶ−ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＡＦ４８８テトラマーにより共染色し、そして攪拌下で４℃で２時間インキュベートし、そして形質導入の４日後、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＶ−ＳＡ−ＡＦ４８８複合体を、ビオチン化ＣＶペプチド（Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ）とＳＡ−ＡＦ４８８接合体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを、４つのビオチン化ペプチドに対して１つのＳＡタンパク質の比率で、攪拌下で、４℃で１５分間、共にインキュベートし、そして菅を高１４０００×ｇで１５分間、回転沈降することにより、細胞染色の直前に製造した。
【０２１９】
結果：
ＣＶ−ＣＡＲレンチウィルスベクターを用いて、ヒトＴ  ＣＤ４＋調節細胞（Ｔｒｅｇ）及び従来の細胞（Ｔｃｏｎｖ）を、１細胞に対して１つのウィルスの比率で形質導入した。それらの細胞を、健康なドナー（ＨＤ）の末梢血液から単離し、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ１２７（Ｔｒｅｇ：ＣＤ４ ＋ ＣＤ２５ ＋ ＣＤ１２７−、Ｔｃｏｎｖ：ＣＤ４ ＋ ＣＤ２５−ＣＤ１２７ ＋）の発現に基づいて、フローサイトメトリーにより選別し、そして形質導入の前、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより２日間、刺激した。細胞をまた、対照として使用されるＣＤ１９．２８ｚ−ＣＡＲ及びＣＤ１９．４１ＢＢｚ−ＣＡＲにより形質導入した。
【０２２０】
形質導入の４日後、ＥＧＦＲｔ＋細胞の割合を、抗−ＥＧＦＲｔ抗体を用いて決定した。データは、ＣＶ−ＣＡＲ及びＣＤ１９−ＣＡＲによる形質導入が、Ｔｒｅｇ間、及びＴｃｏｎｖ集団間で類似する割合のＥＧＦＲｔ＋をもたらしたことを示した（図１２Ａ）。さらに、ＴｒｅｇがＴｃｏｎｖよりも効率的に形質導入されたことが、試験された全てのＣＡＲで観察された。従って、１つの実験においては、約７０％〜約８０％のＴｒｅｇが、Ｔｃｏｎｖ集団の約５３％〜約５９％に比較して、ＣＡＲコンストラクトに依存してＥＧＦＲｔ＋であった（図１２Ａ）。図１２Ｂの例に示されるように、平均蛍光強度（ＭＦＩ）はまた、ＥＧＦＲｔ＋Ｔｃｏｎｖに比較して、ＥＧＦＲｔ＋Ｔｒｅｇにおいてより高かった。
【０２２１】
ＥＧＦＲｔ発現が細胞表面でＣＡＲ発現を表すことを検証し、そしてＣＶ−ＣＡＲコンストラクトがそれらの標的抗原に結合する能力を評価するために、細胞を、図１２Ｃに示されるＦＩＴＣ（ＣＶｐｅｐ−ＳＡ−ＦＩＴＣ）により結合されるビオチン化ＣＶ−ペプチド／ストレプトアビジンテトラマー及びＥＧＦＲｔ抗体により染色した。データは、ＥＧＦＲｔ発現がＴｒｅｇの全ての表面でＣＶ−ＣＡＲ発現と相関することを確認し、そしてＢＶＣＡ１  ｓｃＦｖのＣＶに結合する能力が、ＣＶ−ＣＡＲコンストラクトにおける挿入後に保存されたことを証明した（図１２Ｄ）。類似する結果が、Ｔｃｏｎｖ細胞によって得られた。結果は、Ｔｒｅｇの表面で発現されたＣＶ特異的ＣＡＲがＣＶペプチドを特異的に結合することを実証する。
【０２２２】
実施例４：インビトロでのＴｒｅｇ活性化及び拡張に対するＣＶ−ＣＡＲシグナル伝達の効果の分析：
２回目の刺激に対する細胞の調製：抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８被覆のＤｙｎａｂｅａｄの存在による細胞の残存活性化を回避するために、それらのビーズを、磁石（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製造業者の説明書に従って）を用いて、７日目で細胞培養物から除いた。さらに、示されている場合、ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ集団を、7日目でフローサイトメトリーによりＥＧＦＲｔの発現に基づいて選別した。
【０２２３】
ＣＶ―ＣＡＲ  Ｔ細胞の再刺激：最初の刺激の後、９又は１０日目で、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を再刺激した。刺激の異なる条件を用いて、ＣＡＲ又はそれらの内因性ＴＣＲを介して刺激される場合、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化プロファイルを比較した。ＣＶペプチドを提示するビーズを、ビオチン化ＣＶペプチド（Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ）と、ＣＶ−ＳＡビーズと呼ばれるＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ ストレプトアビジン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製造業者の説明書に従って)とをカップリングすることにより生成した。細胞を、１つの細胞に対して、抗ＣＤ３ /抗ＣＤ２８被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓが１：１の比率で、又はＣＶ−ＳＡビーズが２の比率で存在するか、又は存在しない場合、ＩＬ−２（Ｔｃｏｎｖの場合、１００Ｕ／ｍｌ及びＴｒｅｇの場合、３００Ｕ／ｍｌ）の存在下で再刺激した。ＩＬ−２を含む新鮮な培地を２日ごとに添加し、そして細胞、必要とされる場合、分割した。
【０２２４】
２回目の刺激の後、ＣＶ−ＣＡＲ細胞の活性化プロファイル及び拡張の研究：細胞の再刺激後１日目で、細胞クラスターを、明視野顕微鏡を用いて可視化した。２及び３日目、各刺激条件からの細胞の小画分を収穫し、そしてＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＥＧＦＲｔ及びＬＩＶＥ / ＤＥＡＤ固定可能な青い染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する抗体により染色し、そして４℃で２０分間インキュベートした。細胞を、ＬＩＶＥ  ＣＤ４＋細胞上にゲーティングすることにより、フローサイトメトリーにより分析した。再刺激後のＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇの拡張倍率を測定するために、ＣＶ−ＣＡＲ＋細胞を、２日目の刺激の前（最初の刺激後７日目で）、フローサイトメトリーにより富化した。それらの選別されたＣＶ−ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇを再刺激後５日目で計数し、そして拡張倍率を計算した（５日目の細胞数／０日目での細胞数）。
【０２２５】
生成されたＣＶ−ＣＡＲ  ＴｒｅｇのＣＡＲを介して媒介されるシグナルの細胞を活性化する能力を評価した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを、形質導入後５日で除き、そして形質導入されたＴｒｅｇを、ＩＬ−２のみの存在下で2日間、培養し、それらを休止させ、そしてしたがって、活性化の残りの兆候を回避した。次に、ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの異なる集団を、ＩＬ−２のみ（負の対照）、又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（正の対照）又はビオチン化ＣＶペプチドにより被覆されたＳＡ  Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）のいずれかと組合わされたＩＬ−２の存在下で再刺激した（ＣＶ−ＳＡビーズ、図１３）。
【０２２６】
再刺激後１日で、ウェル中のクラスターの存在を、細胞とビーズとの間の相互作用の指標として、評価した。図Ａに示されるように、クラスターは、ＩＬ−２のみの状態（ビーズなし）では、形質導入されたＣＡＲの特異性に関係なく、全てのウェルに不在であった。また図１４Ａにも示されるように、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ状態においては、クラスターを、全てのＴｒｅｇ集団に観察した。この例においては、細胞がＣＶ−ＳＡビーズの存在下で培養される場合、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇウェルにおいてのみ目に見え、これは、ＣＶ−ＳＡビーズと特異的に相互作用したことを示している可能性がある。
【０２２７】
３日目での細胞の細胞表面での活性化マーカーＣＤ７１及びＣＤ２５の発現を、フローサイトメトリーにより評価した。ＩＬ−２のみの条件下で、細胞はＣＤ７１を発現しておらず、そしてＣＤ２５  ＭＦＩは低かったのに対して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激は、大多数のＣＡＲ  Ｔｒｅｇ（ＣＤ１９及びＣＶ特異的）でＣＤ７１発現、及びＣＤ２５  ＭＦＩの強い上昇を誘発した（図１４Ｂ）。ＣＤ７１発現の誘発は、ＣＶ−ＳＡビーズ条件下においてのみ、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇで観察された。ＣＤ７１＋細胞の割合は、特にＣＶ.４１ＢＢｚ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓにおいて、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで観察されるものよりも低かった。同様に、ＣＤ２５  ＭＦＩは、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇにおいてのみ、ＣＶ−ＳＡ状態において上昇し、そしてＣＶ.４１ＢＢｚ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓにおいてわずかに高いＭＦＩを有した（図１４Ｃ）。
【０２２８】
図１４Ａ−１４Ｃは、ＣＶ特異的ＣＡＲを発現するＴｒｅｇのみが、ＣＶ−ＳＡビーズの存在下で刺激される場合、活性化の徴候を示したことを示している。
【０２２９】
次に、ＣＶ−ＳＡビーズの存在下で誘発されたＣＶ特異的ＣＡＲ媒介刺激が細胞の拡張を誘発するのに十分であったかどうかを評価した。全ての条件下で異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団の拡張倍率を、再刺激の５日後に測定した（図１４Ｃ）。得られるデータは、ＣＶ−ＳＡビーズにより誘発された拡張倍率が、抗ＣＤ３／ＣＤ３８ビーズの存在下で観察された倍率よりも低い場合でされ、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは、ＣＶ特異的ＣＡＲを介在して媒介された刺激の後、効率的に増殖したことを示した。図１４Ｂに示されるデータと一致して、ＣＶ．４１ＢＢｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは、ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇよりも効率的に拡張しないようであり、このことは、ＣＶ．２８−ＣＡＲシグナル伝達が細胞の活性化においてより強力であり得ることを示唆している。それらの実験はまた、Ｔｃｏｎｖ細胞に対しても行われ、そして類似する結果を得た。
【０２３０】
さらに、ＣＶ−ＳＡビーズを用いて誘発された活性化がＣＶ６０−７５ペプチドの存在によるものであることを検証するために、アルギニン−ビメンチン６０−７５（ＡｒｇＶｉｍ）ペプチド−ＳＡビーズ及びシトルリン化−フィブリノーゲンβ鎖３６−５２（ＣｉｔＦｉｂ）ペプチド−ＳＡビーズをまた生成した。ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇが被覆されていないＳＡビーズ、ＡｒｇＶｉｍ ＳＡビーズ又はＣｉｔＦｉｂ ＳＡビーズの存在下で共培養される場合、活性化の兆候は観察されなかった。
【０２３１】
実施例５：インビトロ拡張後のＣＶ−ＣＡｒ  Ｔｒｅｇの表現型及び安定性の評価：
拡張されたＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇにおけるサイトカイン産生の表現型分析及び評価：１８日目、２回の刺激の最後で、異なるＴｒｅｇ集団の画分を、ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＥＧＦＲｔ及びＬＩＶＥ / ＤＥＡＤ固定可能ブルーに対して特定的な蛍光標識されたＡｂにより、４℃で２０分間、表面染色した。並行して、細胞の別のサンプルを、ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＥＧＦＲｔ及びＬＩＶＥ / ＤＥＡＤ固定可能ブルーにより染色し、続いて、製造業者の説明書に従って、Ｆｏｘｐ３染色緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＰＯＸＰ３及びＨｅｌｉｅｓの核内染色を行った。サイトカイン産生の評価のために、細胞を、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びイノマイシン（１μｇ／ｍｌ）により４時間、刺激し、そしてインキュベーションの開始の２時間後、ベルフェルディンＡ（１Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。次に、細胞を、ＬＩＶＥ / ＤＥＡＤ修正可能ブルー及び抗ＣＤ４、−ＣＤ１２７、−ＥＧＦＲｔ Ａｂｓにより染色し、１×ＰＢＳ中、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及び２％Ｄ−グルコースにより固定し、ＰＢＳ５％ＦＢＳ中、０．１％サポニンにより透過処理し、そしてＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７及びＩＬ−１０に対して特異的なＡｂにより染色した。細胞を、フローサイトメトリー（ＬＳＲ  II；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【０２３２】
２回の拡張後のＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇの表現型安定性を評価するために、主要なＴｒｅｇ表面マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ１２７）及び転写因子（ＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓ）の発現プロファイル、並びに１８日目でのサイトカイン産生を試験した。非形質導入及びＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは２回の刺激を受け、２回目の活性化は、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はＣＶ−ＳＡビーズのいずれかによるものであった。１８日目で、細胞を、ＣＤ２５及びＣＤ１２７表面発現（図１５Ａ）及びＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｅｓ核内発現（図１５Ｂ）についてフローサイトメトリーにより評価した。図１７Ａ及び１５Ｂに示されるように、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは、インビトロでの２回の刺激の後、Ｔｒｅｇ表現型を維持する。
【０２３３】
それらの拡張されたＴｒｅｇのサイトカイン産生プロファイルを評価するために、細胞を、ＰＭＡ／イノマイシンにより４時間刺激し、最後の２時間は、ブレフェルジンＡの存在下で刺激した。次に、細胞を固定し、そしてＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０ 及び ＩＬ−１７を標的とする抗体により染色した（図１５Ｃ）。
【０２３４】
３つのサブセット：図１５Ａ及び１５Ｂに示されるような、非形質導入Tｒｅｇｓ、ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ及びＣＶ.４１ＢＢｚ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓは、Ｔｒｅｇ表現型（すなわち、ＣＤ２５ ＋ ＣＤ１２７−、ＦＯＸＰ３ ＋）を維持した。何れのＴｒｅｇも、拡張の後、ＩＬ−２又は炎症性サイトカインＩＮＦ−ｇ及びＩＬ−１７を発現しなかったことが観察された（図１５Ｃ）。非形質導入ＴｒｅｇとＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇとの間の差異は観察されなかった。再刺激の以下の２つの条件を、２回目で評価した：抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又はＣＶ−ＳＡビーズ。類似するプロファイルが、Ｔｒｅｇが、ＣＶ−ＣＡＲを介した活性化の後、それらの表現型を維持するという概念を支持する両条件下で得られた。
【０２３５】
実施例６：ＲＡにおけるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇの治療効果を評価するためのインビトロアッセイの開発：
ＲＡ患者からの滑液とのＣＶ−ＣＡｒ  Ｔｒｅｇの共培養：Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｇｒａｆにより提供されたＲＡ患者からの滑液（ＳＦ）サンプルを用いて、シトルリン化ビメンチンのより疾患に関連する情報源を用いることにより、ＣＡＲを介して活性化されるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇの能力を評価した。最初の刺激の後９日目で、滑液サンプル（新鮮な又は解凍された）を、１：８、１：１６又は１：３２（ＳＦ：細胞培地）の比率でＩＬ−２を補充されたＴ細胞培地と共に混合した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、９６ウェルプレートにウェルあたり５０，０００個の細胞で播種し、そしてＳＦ及びＴ細胞培養培地の混合物２００μｌを、各ウェルに添加した。３日後、細胞を、前に記載されたように、ＣＤ４、ＣＤ７１、ＣＤ２５及びＬＩＶＥ / ＤＥＡＤの修正可能な青い染色に対して特異的な抗体により染色した。ＣＤ７１を発現する細胞の割合及びＣＤ２５のＭＦＩを、ＬＩＶＥ  ＣＤ４＋集団をゲーティングすることにより、フローサイトメトリーにより得た。
【０２３６】
シトルリン化ビメンチンを発現する腫瘍細胞系の生成及び特徴付け：ＳＫＮＢＥ２ｃは、細胞表面でビメンチンを発現することが知られている神経芽細胞腫瘍細胞系である。ＳＫＮＢＥ２ｃ細胞（ＡＴＣＣから）を解凍し、そしてＧｌｕｔａｍａｚ、１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰ／Ｓを有するＲＰＭＩにおいて培養した。Ｇｉｂｓｏｎ アセンブリー法 (Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＢｉｏＬａｂｓ)を用いることにより、ヒト酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ２（ＰＡＤ２）の遺伝子を、ｐＣＤＨ−ＥＦ１−Ｔ２Ａ−ＧＦＰレンチウィルスベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）中に挿入した。ウィルス粒子を、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることにより生成し、そしてＳＫＮＢＥ２ｃを、細胞あたり１粒子のＭＯＩで形質導入した。トランスフェクション及び形質導入効率を、ＧＦＰの発現をフローサイトメトリーにより検出することにより評価した。シトルリン化工程に関与する酵素ＰＡＤ２の発現の人工誘発がＳＫＮＢＥ２Ｃにおけるシトルリン化ビメンチンタンパク質の産生を誘発したかどうかを決定するために、免疫蛍光染色を行った。簡単に言えば、野生型（ＷＴ）及びＰＡＤ−ＧＦＰにより形質導入されたＳＫＮＢＥ２Ｃ細胞系の両方を、８ウェルチャンバーのホウケイ酸カバーガラス（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）に播種した。集密性に達した場合、細胞を、冷１×ＰＢＳ中、２％ＰＦＡにより２０分間、固定し、１×ＰＢＳ中、２％ＢＳＡによりＲＴで３０分間、ブロックし、一次抗体（マウスＩｇＧ２ａを含むキメラＢＶＣＡ１  Ａｂ又はアイソタイプ対照）と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、二次抗体を、暗闇の中で１時間、添加し、そして細胞をＤＡＰＩにより１０分間、対比染色した。細胞を、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００ シリーズ、 Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて可視化した。結果は、図２０Ａ及び２０Ｂに示される。
【０２３７】
ＣＶ−ＣＡＲ  ＴｒｅｇとＰＡＤ２−ＧＦＰ  ＳＫＮＢＥ２Ｃ細胞系との共培養：ＷＴ及びＰＡＤ２−ＧＦＰ  ＳＫＮＢＥ２Ｃ細胞を、平底９６ウェルプレートに播種した。集密性に達したら、最初の刺激の１０日目での非形質導入Ｔｒｅｇ、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇ及びＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇを、３００Ｕ／ｍｌでのＩＬ−２により補充されたＴ細胞培地の存在下でウェルに添加した。共培養の３日後、細胞を収穫し、そして前述のようにして、ＣＤ４、ＣＤ７１、ＣＤ２５及びＬＩＶＥ / ＤＥＡＤの修正可能な青い染色に対して特異的な抗体により染色した。ＣＤ７１を発現する細胞の割合、及びＣＤ２５のＭＦＩを、ＬＩＶＥ  ＣＤ４＋集団をゲーティングすることにより、フローサイトメトリーにより測定した。
【０２３８】
いくつかのインビトロアプローチを使用して、シトルリン化ビメンチンのより疾患関連の供給源を用いて活性化されるＣＤ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力を実証した。ＣＶ源としてＲＡ患者又はＣＶ発現腫瘍細胞系からの滑液を用いて得られるデータは、ＣＶ．４１ＢＢｚ−ＣＡＲ形質導入Ｔｒｅｇがそれらの条件では活性化されなかったが、ところがＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ形質導入Ｔｒｅｇは効率的に活性化されたことを示した。これは、両方のＣＶ−ＣＡＲコンストラクトがＣＶ−ＳＡビーズ（標的抗原の人工提示）の存在下でＣＡＲ発現Ｔ細胞に効率的な活性化シグナルを誘発する場合でさえ、ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲのみがより生理学的状況下で細胞を活性化することを実証する。
【０２３９】
インビトロアプローチの１つは、ＲＡにおけるシトルリン化ビメンチンの主要源の１つである、好中球及び好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）においいて富化されることが知られているＲＡ患者の関節から収穫された滑液の存在下でＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇを共培養することである。種々のＣＡＲコンストラクトを発現する拡張されたＴｒｅｇ及び非形質導入Ｔｒｅｇを、ＣＶ−ＳＡビーズ又はＲＡ患者からの滑液の有無下で、ＩＬ−２の存在下で培養した。ＣＤ７１の発現を、培養の３．５日後、フローサイトメトリーにより評価した（図１６Ａ）。図１６Ｂは、異なるＣＡＲ  Ｔｒｅｇ集団におけるＥＧＦＲｔ−及びＥＧＦＲｔ＋画分の間のＣＤ７１＋細胞の割合を示す。
【０２４０】
ＲＡ滑液の存在下で３．５日後、ＣＤ７１により細胞を染色することにより、ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  ＴｒｅｇのＥＧＦＲｔ＋画分のみがＣＤ７１活性化マーカーを、高い割合で発現したことが観察された（図１６Ａ及び１６Ｂ）。図１６Ｂは、４人の異なる患者からのＳＦにより得られたデータの要約であり、非形質導入Ｔｒｅｇ、ＣＤ１９．２８ｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇ及びＣＤ１９．４ＢＢｚは滑液の存在下で活性化のいずれの徴候も示さなかった。この実験はまた、Ｔｃｏｎｖ細胞に対しても行われ、そして類似する結果が得られた（データは示されていない）。異なる患者からの３つの滑液サンプルを試験し、そしてそれらの全てがＥＧＦＲｔ＋ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ（図１８Ａ）及びＴｃｏｎｖ（データは示されていない）においてＣＤ７１発現を特異的に誘発した。それらのデータは、インビトロ滑液媒介活性化がＣＶ−ＣＡＲ依存性であることを示唆する。重要なことには、ＣＤ７１の弱い発現のみが、３．５日でＥＧＦＲｔ＋ ＣＶ.４１ＢＢｚ−ＣＡＲの表面で誘発された（図１６Ｂ）。この観察は、ＣＶ．４１ＢＢｚ−ＣＡＲ媒介シグナルが、図１４Ａ−１４Ｃに示されるように、ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲを介して誘発されたシグナルよりも細胞を活性化する能力が低いという事実と関連している可能性がある。
【０２４１】
実施例７：ＲＡにおけるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇによるヒト対象の治療：
図１に戻ると、ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは、関節リウマチを有する患者のための細胞療法の開発に使用されるべき記載の技法に従って生成された。この治療アプローチは、患者の血液サンプルから細胞を単離することにより、患者白体（自己）のＴｒｅｇを使用することを包含する。単離されたＴｒｅｇは、ＣＶ−ＣＡＲトランスジーンを担持するレンチウィルスベクターを用いて遺伝子組み換えされる。ＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは、インビトロで２回の拡張を受け、そして次に、患者に注入される。これは、抗ＴＮＦ治療と組合して行うことができ、疾患の部位でのＴｒｅｇの効率を最適にする。
【０２４２】
従って、いくつかの実施形態によれば、関節リウマチと診断された対象の治療方法が提供され、この方法は、対象から得られた生物学的サンプルからＴリンパ球を単離し、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）から分離し、ここで前記Ｔreg細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ＣＤ１２７−であり、そして前記ＴconvはＣＤ４＋ＣＤ２５―ＣＤ１２７＋であり、シトルリン化ビメンチン（ＣＶ）抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターによりＴreg細胞を形質導入し、ＣＶ抗体に対して特異的な十分な数のＴｒｅｇ細胞を得るために、少なくとも１度、エクスビボで、形質導入されたＴｒｅｇ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズにより刺激し、そしてＴregを対象に再注入し、それにより対象を治療することを含む。
【０２４３】
実施例８：ＣＶ−ＣＡＲの表面発現：
いくつかの実施形態によれば、Ｔｒｅｇの表面で拡張されるＣＶ特異的ＣＡＲの能力を、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｂを用いることにより、図１７Ａ−１７Ｂに示されるようにして評価した。これは、レンチウィルス発現の後に行われた。ＣＡＲ及び上皮成長因子受容体（ＣＧＦＲｔ）の両方を、フローサイトメトリーにより検出した。図１７Ａは、形質導入Ｔｒｅｇ、ＣＶ /ＣＤ２８ζＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇｓ、及びＣＶ /４１ＢＢζＣＡＲ ＋ Ｔｒｅｇｓの表面でのＣＡＲ及びＥＧＦＲｔの発現の評価を示す。図１７Ｂは、種々の実験におけるＣＡＲ＋細胞の割合を示す。
【０２４４】
実施例９：ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは、ＲＡ患者からの滑液の存在下で活性化される：
シトルリン化ビメンチンのより臨床的に適切な供給源の存在下で認識及びシグナル伝達するＣＶ−ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇの能力を実証するために、ＲＡにおけるＣＶの主要生産体の１つである、好中球及び好中球細胞外トラップ（ＮＧＴ）において富化されることが知られているＲＡ患者の関節から収積された滑液の存在下でＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇを共培養した。ＲＡ又は痛風の患者からの滑液との共培養後３日目、最近のものは陰性対照として使用され、ＣＤ７１の発現が、Ｔｒｅｇ細胞間で分析された。痛風患者からの滑液の存在下で、ＣＤ７１発現の誘導は、Ｔｒｅｇサブセットの何れにおいても観察されなかった（図１８Ｂ）。しかしながら、ＲＡ患者からの滑液との共培養の後、ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ ＥＧＦＲｔ＋ Ｔｒｅｇｓは高い割合の活性化マーカーＣＤ７１を発現したが、同じウェルに存在しているＥＧＦＲｔ−Ｔｒｅｇ、又はCD１９．２８ｚ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ及び ＣＤ１９．４１ＢＢｚ−ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓは、活性化のいずれの兆候も示さなかった（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。それらのデータと一致して、シトルリン化ビメンチンは、ＲＡ患者からの滑液に検出されたが、痛風の患者からの滑液では検出されなかった（図２１）。
【０２４５】
実施例１０：ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇは、ＲＡ患者からの無細胞滑液の存在下で活性化される：
シトルリン化ビメンチンは、炎症性関節における細胞外マトリックスに主に存在することが記載されており、このことは、ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇがそれらの標的抗原を効率的に結合できるためには、細胞間相互作用が必要とされないことを示唆している。その仮説を検証するために、密度勾配遠心分離の後に得た上層を用いることにより、ＲＡ患者からの全滑液又は無細胞滑液の存在下での共培養の後、ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇの活性化プロファイルを比較した。我々のデータは、滑液中の細胞の存在又は非存在下で、ＲＡ患者からの滑液との共培養に応答して、類似する割合のＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  ＴｒｅｇがＣＤ７１を発現していることを明らかにした（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。総合する、それらのデータは、ＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲを発現するＴｒｅｇが、ＲＡ患者の炎症性関節に位置する細胞マトリックスにおけるそれらの標的抗原を結合できるという概念を強く支持する。
【０２４６】
実施例１１：ＣＡＲ媒介刺激後のＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇ細胞抑制機能：
ＣＡＲ媒介刺激後のＣＶ．２８ｚ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇ細胞の抑制能力を評価するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技法を使用して、Ｔｒｅｇにおける内因性ＴＣＲをノックアウトし、ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ＋ Ｔｒｅｇｓを生成した（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。抑制アッセイを、レスポンダーとしてプレート結合抗−ＣＤ３抗体により刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて行った。ＣＶ−ｐｅｐ−ＳＡビーズ（ＣＶｂ）（図２４Ａ及び２４Ｂ）又はビメンチンビーズ（図２４Ｂ）の存在下でそれらのＴＣＲ刺激レスポンダーがＴ細胞を抑制するＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ＋ Ｔｒｅｇｓの能力を、異なるレスポンダー：サプレッサー細胞比率で評価した。我々のデータは、ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ＋ Ｔｒｅｇｓが、ＣＶ−ＳＡビーズの存在下でＣＡＲ媒介刺激の後、抑制的であるが、ここらがＴＣＲＫＯ ＣＤ１９．２８ｚ−ＣＡＲ＋ Ｔｒｅｇｓは、ＣＶ−ＳＡビーズの存在下で抑制的ではなかったことを示す
【０２４７】
実施例１２：材料及び方法：
ＲＡ患者からの滑液とＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇとの共培養：Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｇｒａｆから提供されたＲＡ患者又は負の対照の痛風患者からの滑液（ＳＦ）サンプルを使用して、シトルリン化ビメンチンのより疾患関連性の供給源を用いることにより、ＣＡＲを介して活性化されるＣＶ−ＣＡＲ  Ｔｒｅｇの能力を評価した。滑液サンプルが十分な量で存在する場合、その液体の一部を１×ＰＢＳにより希釈し、そして密度勾配遠心分離により処理した。上層（無細胞）を、遠心分離の後に収集し、そして−８０℃で貯蔵した。最初の刺激後９日目で、全滑液サンプル及び無細胞滑液サンプルを解凍し、そしてＩＬ−２を異なる比率で補充したＴ細胞培地と共に混合した。ＣＡＲ  Ｔ細胞をウェル当たり５０，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種し、そしてＳＦ及びＴ細胞培養物の混合物２００μｌを、各ウェルに添加した。３日後、細胞を、前に記載されたようにして、ＣＤ４、ＣＤ７１、ＣＤ２５及びＬＩＶＥ / ＤＥＡＤの修正可能な青い染色に対して特異的な抗体により染色した。ＣＤ７１を発現する細胞の割合及びＣＤ２５のＭＦＩを、ＬＩＶＥ  ＣＤ４＋集団をゲーティングすることにより、フローサイトメトリーにより得た。
【０２４８】
直接的ＥＫＩＳＡによる滑液中のシトルリン化ビメンチンの存在の検出：９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌでニワトリ抗−ビメンチンＡｂで４℃でＯ／Ｎ被覆した。ウェルを３回、洗浄し、そして２００μｌの１×ＰＢＳ  １％ＢＳＡによりＲＴで１時間ブロックし、そして再び洗浄した。ＰＢＳ  １％ＢＳＡ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に希釈された滑液上清液の異なるサンプルを添加し、そしてＲＴで１．５時間インキュベートした。いくつかの他のウェルにおいては、滑液の代わりにビメンチンタンパク質及びシトルリン化ビメンチンタンパク質を添加し、それぞれ陰性及び陽性対照として使用した。ウェルを３回、洗浄した。１０μｇ／ｍｌでのマウスキメラＢＶＣＡ１  ＩｇＧ（マウスＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）１００μｌ又はアイソタイプ対照を添加した。ＲＴでの１時間のインキュベーションの後、ウェルを３度、洗浄し、そして接合されたヤギ抗−マウスＩｇＧ２ａニ次Ａｂ―ＡＰ（Ａｂｃａｍ、ａｂ９８６９５）を、１／１０００希釈度でウェル添加した。ウェルを３度、洗浄し、そして１００μｌのＳｔｅｐ  ＰＮＰＰ基質溶液を添加した。４５分後、５０μｌの３ＭのＮａＯＨにより反応を停止し、そして吸光度を、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダーにより読み取った。
【０２４９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技法を用いてのＴＣＲノックアウトＣＶ−ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇ細胞の生成：Ｔｒｅｇ細胞を、実施例３に記載されるように、フローサイトメトリーにより新鮮なＰＢＭＣから単離し、９０ｇで１０分間、遠心分離し、そして１００万個の細胞当たり２０μｌの緩衝液を用いて、Ｌｏｎｚａエレクトロポレーション緩衝液Ｐ３に再懸濁した。次に、Ｔｒｅｇ細胞を、Ｌｏｎｚａ  ４０  ９６ウェルエレクトロポレーションシステム及びパルスコードＥＨ１１５を用いて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体でエレクトロポレーション処理した。エレクトロポレーションの直後、８０μｌの予熱した培地を各ウェルに添加し、そして細胞を３７℃で１５分間、静置した。次に、実施例３に詳細されるように、１ｍｌ当たり３００ＵＩのＩＬ−２の存在下で、１：１の比で、Ｔｒｅｇ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。選別及びエレクトロポレーションの２日後、Ｔｒｅｇ細胞を、実施例３に記載されるようにして、異なるＣＡＲコンストラクトにより形質導入した。７日後、細胞を、ＥＧＦＲｔ及びＣＤ３の発現に基いて、ＴＣＲKOＣＡ+又はＴＣＲ＋ＣＡＲ＋集団に選別した。次に、細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより、１ｍｌ当たり３００ＵＩのＩＬ−２の存在下で１：１の比で５〜６日間、再刺激した。
【０２５０】
ＴＣＲＫＯＣＡＲ＋Ｔｒｅｇによる抑制アッセイ：Ｔｒｅｇ抑制を、〔３Ｈ〕チミジン取り込みに基づいて増殖を測定することにより評価した。拡張の１２日後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを、ＴＣＲＫＯ ＣＶ.２８ｚ−ＣＡＲ＋ Ｔｒｅｇ 及び ＴＣＲＫＯ １９．２８ｚ−ＣＡＲ＋ Ｔｒｅｇ培養物から除去した。細胞は、抑制アッセイの前、２日間休止された。アッセイの前日、ＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞（レスポンダー細胞）を解凍し、そして３０ＵＩ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で、３７℃で５％ＣＯ２下で一晩、保持した。丸底９６ウェルプレートを５ｍｇ／ｍｌでの抗ＣＤ３抗体により一晩、被覆し、そして１×ＰＢＳにより洗浄した。アッセイの日、ＴＣＲＫＯＣＡＲ＋Ｔｒｅｇ集団及びレスポンダー細胞を２度洗浄し、残留ＩＬ−２を培地から除いた。次に、細胞を、ウェル当たり５０，０００のレスポンダー細胞で、抗ＣＤ３  Ａｂ被覆のウェルにプレートし、そしてＴＣＲＫＯＣＡＲ＋Ｔｒｅｇをビメンチン−ＳＡ−ビーズ、ＣＶ−ＳＡ−ビーズ、ＣＤ１９−ビーズの存在下で、又はビーズなしで、異なるレスポンダー：Ｔｒｅｇ比（２：１〜６４：１）で添加した。３日後、２０μｌの〔３Ｈ〕地地味（１μＣｉ）を各ウェルに添加した。１６時間後、プレートを、−２０℃で凍結した。プレートを、Ｐａｃｋａｒｄ ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ上に収穫し、そして各ウェルについてのカウント／分（ＣＰＭ）をＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーション及びルミネセンスカウンター（パーキンエルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）上で読み取った。両アッセイに関して、抑制率を以下のようにして計算した：抑制率＝１−〔平均ＣＰＭ（Ｔｒｅｇ＋レスポンダー）／平均ＣＰＭ（レスポンダーのみ）〕×１００％。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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