(57)【要約】本出願は、抗Ｃ５抗体（ラブリズマブ）の産生方法に関し、本方法は、−抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することと、−回収工程、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製、低ｐＨウイルス不活性化工程、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製、アニオン交換クロマトグラフィーによる精製、ウイルス減少濾過工程、濃縮および透析濾過工程からなる群から選択される２つ以上の工程を実行することと、を含む。
2021528957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｃ５抗体の産生方法であって、前記方法が、
ａ．細胞培養産生培地中で前記抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養することであって、前記培養により、前記抗Ｃ５抗体が前記細胞培養産生培地中で産生される、培養することと、
ｂ．回収工程、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製、低ｐＨウイルス不活性化工程、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製、アニオン交換クロマトグラフィーによる精製、ウイルス減少濾過工程、ならびに濃縮および透析濾過工程からなる群から選択される２つ以上の工程を行うことと、を含み、
前記抗Ｃ５抗体が、配列番号１９、１８、および３にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３重鎖配列、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３軽鎖配列を含む、方法。
【請求項２】
抗Ｃ５抗体の産生方法であって、前記方法が、
ａ．前記抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、前記培養により、前記抗Ｃ５抗体が前記細胞培養産生培地中で産生される、培養することと、
ｂ．回収工程と、
ｃ．プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製と、
ｄ．低ｐＨウイルス不活性化工程と、
ｅ．カチオン交換クロマトグラフィーによる精製と、
ｆ．アニオン交換クロマトグラフィーによる精製と、
ｇ．ウイルス減少濾過工程と、
ｈ．濃縮および透析濾過工程と、を含む、方法。
【請求項３】
前記抗Ｃ５抗体が、配列番号１２に記載の重鎖可変領域と、配列番号８に記載の軽鎖可変領域と、を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗Ｃ５抗体が、配列番号１３に記載の重鎖定常領域をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドと、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドと、を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗Ｃ５抗体が、ｐＨ７．４および２５℃で、０．１ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲である親和性解離定数（ＫＤ）でヒトＣ５に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗Ｃ５抗体が、ｐＨ６．０および２５℃で、ＫＤ≧１０ｎＭでヒトＣ５に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗Ｃ５抗体が、ラブリズマブである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記回収工程が、細胞培養産生培地をデプスフィルターを通して濾過することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記デプスフィルターが、２段階のデプス濾過トレインである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記回収工程の処理条件が、
ａ．通常の稼働範囲では≦１００Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲では≦１００Ｌ／ｍ２のＤ０ＨＣデプスフィルター負荷、
ｂ．通常の稼働範囲では≦２００Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲では≦２００Ｌ／ｍ２のＡ１ＨＣデプスフィルター負荷、
ｃ．通常の稼働範囲では≦８００Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲では≦８００Ｌ／ｍ２の０．５／０．２μｍフィルター負荷、
ｄ．通常の稼働範囲では１８〜３７℃および立証された許容範囲では１５〜３７℃の収集物負荷温度、
ｅ．通常の稼働範囲では２０〜２５Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲では０〜３０Ｌ／ｍ２の緩衝液チェイス体積、
ｆ．通常の稼働範囲では≦１０日および立証された許容範囲では≦１６日の清澄化収集物保持時間、
ｇ．≧７０％の収率、
ｈ．＜３．３時間の総濾過時間、
ｉ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬのバイオバーデン、ならびに／または
ｊ．＜５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン、のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロテインＡ親和性クロマトグラフィーが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡ親和性クロマトグラフィーである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡ親和性クロマトグラフィーが、
ａ．殺菌のための０．１Ｎの水酸化ナトリウム、
ｂ．平衡化および負荷後洗浄１のための、７．６のｐＨの２０ｍＭのトリスおよび６５ｍＭの塩化ナトリウム、
ｃ．負荷後洗浄２のための、６．０のｐＨの５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、および３００ｍＭのアルギニン塩酸塩、
ｄ．負荷後洗浄３のための、７．６のｐＨの２０ｍＭのトリスおよび６５ｍＭの塩化ナトリウム、
ｅ．溶出のための３．７５のｐＨの２５ｍＭの酢酸ナトリウム、
ｆ．ストリッピングのための１００ｍＭの酢酸、
ｇ．フラッシングのための注射用水（ＷＦＩ）、ならびに／または
ｈ．保管のための２０％のエタノール、からなる群から選択される１つ以上の緩衝液を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテインＡ親和性クロマトグラフィーの処理条件が、
ａ．通常の稼働範囲では３０〜６０分および立証された許容範囲では３０〜７５分のバッチ前の殺菌保持時間、
ｂ．通常の稼働範囲では３０〜６０分および立証された許容範囲では３０〜７５分のバッチ後の殺菌保持時間、
ｃ．通常の稼働範囲では≦１００および立証された許容範囲では≦１００のカラムサイクル、
ｄ．通常の稼働範囲では≦７日および立証された許容範囲では≦１０日の溶出液保持時間、
ｅ．≧７０％の工程収率、
ｆ．＜５０ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過前バイオバーデン、
ｇ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過後バイオバーデン、ならびに／または
ｈ．＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液濾過後エンドトキシン、のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記低ｐＨウイルス不活性化工程が、前記プロテインＡ親和性クロマトグラフィー精製工程からの溶出プールを低ｐＨ条件に供することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記低ｐＨが、３．６０〜３．７０の範囲内である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、酢酸で前記溶出プールを処理することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記低ｐＨウイルス不活性化工程の処理条件が、
ａ．通常の稼働範囲では３．６０〜３．７０および立証された許容範囲では３．５５〜３．８０の滴定直後の酸性化ｐＨ、
ｂ．通常の稼働範囲では３．６０〜３．７５および立証された許容範囲では３．５５〜３．８０の保持時間直後の酸性化ｐＨ、
ｃ．通常の稼働範囲では６０〜１２０分および立証された許容範囲では≧６０〜３６０分の低ｐＨでの保持時間、
ｄ．通常の稼働範囲では６０〜１２０分および立証された許容範囲では≧６０分の０．５／０．２μｍの濾過前の中和されたｐＨでの保持時間、
ｅ．通常の稼働範囲では≦７日および立証された許容範囲では≦７日の濾過された中和産物保持時間、
ｆ．≧９０％の収率、
ｇ．＜５０ＣＦＵ／１０ｍＬの中和された濾過前プールバイオバーデン、
ｈ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの中和された濾過後プールバイオバーデン、ならびに／または
ｉ．＜５ＥＵ／ｍＬの中和された濾過後プールエンドトキシン、のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記低ｐＨウイルス不活性化工程からの中和濾液が、カチオン交換カラム上に負荷される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記カチオン交換カラムが、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０カチオン交換カラムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記カチオン交換工程が、
ａ．平衡化および負荷後洗浄１のための、５．０のｐＨの５０ｍＭの酢酸ナトリウム、
ｂ．負荷後洗浄２のための、４．９のｐＨの５０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび６０ｍＭの塩化ナトリウム、
ｃ．溶出のための、５．０のｐＨの５０ｍＭの酢酸ナトリウム、９０ｍＭのアルギニン塩酸塩、および３０ｍＭの塩化ナトリウム、
ｄ．ストリッピングのための、２．０Ｍの塩化ナトリウム、
ｅ．殺菌のための１．０Ｎの水酸化ナトリウム、ならびに／または
ｆ．保管のための０．１Ｎの水酸化ナトリウム、からなる群から選択される１つ以上の緩衝液を使用することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記カチオン交換工程の処理条件が、
ａ．通常の稼働範囲では２２〜４５ｇ／Ｌおよび立証された許容範囲では１５〜５０ｇ／Ｌの負荷容量、
ｂ．通常の稼働範囲では１５〜２５℃および立証された許容範囲では１３〜２７℃の温度、
ｃ．通常の稼働範囲では４．９０〜５．１０および立証された許容範囲では４．９０〜５．１０の溶出緩衝液ｐＨ、
ｄ．通常の稼働範囲では１１．１〜１３．６ｍＳ／ｃｍおよび立証された許容範囲では１１．１〜１３．６ｍＳ／ｃｍの溶出緩衝液導電率、
ｅ．通常の稼働範囲では１５０〜３００ｃｍ／時および立証された許容範囲では１２０〜３３０ｃｍ／時の溶出流量、
ｆ．通常の稼働範囲では≦７日および立証された許容範囲では≦１０日の溶出液保持時間、
ｇ．通常の稼働範囲では≦１００および立証された許容範囲では≦１００のカラムサイクル、
ｈ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過後バイオバーデン、
ｉ．＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液濾過後エンドトキシン、
ｊ．≧５８％の工程収率、ならびに／または
ｋ．２．３〜５．０カラム体積の溶出液体積、のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記カチオン交換工程からの前記プールされた溶出液が、９．０のｐＨの１００ｍＭのトリス、１８０ｍＭのアルギニン、および注射用水を用いて、８．００のｐＨおよび８．５ｍＳ／ｃｍの導電率に調整される、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記カチオン交換工程からの前記調整されプールされた溶出液が、前記調整から２４時間以内にアニオン交換カラムに負荷される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アニオン交換工程が、
ａ．負荷ｐＨ調整のための、９．０のｐＨの１００ｍＭのトリスおよび１８０ｍＭのアルギニン、
ｂ．負荷導電率調整およびフラッシュのための、注射用水、
ｃ．状態調節のための、２Ｍの塩化ナトリウム、
ｄ．平衡化および負荷後チェイスのための、７．６のｐＨの２０ｍＭのトリスおよび６５ｍＭの塩化ナトリウム、
ｅ．負荷後溶出ストリッピングのための、２Ｍの塩化ナトリウム、
ｆ．殺菌のための１．０Ｎの水酸化ナトリウム、ならびに／または
ｇ．保管のための０．１Ｎの水酸化ナトリウム、からなる群から選択される１つ以上の緩衝液を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アニオン交換工程の処理条件が、
ａ．通常の稼働範囲では７．９０〜８．１０および立証された許容範囲では７．８０〜８．２０の負荷ｐＨ、
ｂ．通常の稼働範囲では８．０〜９．０ｍＳ／ｃｍおよび立証された許容範囲では７．０〜１０．０ｍＳ／ｃｍの負荷導電率、
ｃ．通常の稼働範囲では２５〜９０ｇ／Ｌおよび立証された許容範囲では２５〜１００ｇ／Ｌの負荷容量ｐＨ、
ｄ．通常の稼働範囲では≦１日、立証された許容範囲では≦４日の保持時間（アニオン交換負荷調整からアニオン交換負荷の開始まで）、
ｅ．通常の稼働範囲では≦４日および立証された許容範囲では≦６日の産物保持時間（アニオン交換負荷調整の終了から限外濾過／透析濾過の終了まで）、
ｆ．通常の稼働範囲では≦１００および立証された許容範囲では≦１００のカラムサイクル、
ｇ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの濾過後溶出液バイオバーデン、ならびに／または
ｈ．＜５ＥＵ／ｍＬの濾過後溶出液エンドトキシン濃度、ならびに
ｉ．≧６７％の産物の収率、のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アニオン交換工程からの貫流濾液が、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するために濾過される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルス濾過工程が、注射用水によるプレフラッシュ、および／または平衡化、ならびに２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）および６５ｍＭの塩化ナトリウムを使用した負荷後チェイスを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルス濾過工程の処理条件が、
ａ．通常の稼働範囲では２１〜３２ｐｓｉｄおよび立証された許容範囲では２１〜３５ｐｓｉｄの負荷およびチェイス中のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏフィルター差圧、
ｂ．通常の稼働範囲では０分および立証された許容範囲では≦１２０分の負荷およびチェイス中の総休止時間、
ｃ．通常の稼働範囲では≦１５Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲では≦２０Ｌ／ｍ２のチェイス体積、
ｄ．使用後の整合性試験に合格すること、
ｅ．通常の稼働範囲では３．０〜６．０ｇ／Ｌおよび立証された許容範囲では≦６．７ｇ／Ｌの負荷濃度、
ｆ．通常の稼働範囲では≦７００Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲では≦１２００Ｌ／ｍ２のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｈプレフィルター負荷、
ｇ．通常の稼働範囲では≦７００Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲では≦７００Ｌ／ｍ２のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏフィルター負荷、
ｈ．通常の稼働範囲では≦４日および立証された許容範囲では≦６日の産物保持時間（アニオン交換負荷調整の終了から限外濾過／透析濾過の終了まで）、
ｉ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの濾過前バイオバーデン、
ｊ．＜２ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度（ウイルス濾液）、
ｋ．使用前の整合性試験に合格すること、ならびに／または
ｌ．≦１２時間の処理時間（負荷開始から負荷終了まで）、ならびに／または
ｍ．≧９０％の工程収率、のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルス濾過工程からのプールが、濃縮され、透析濾過される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルス濾過工程からのプールが、
ａ．３０ｋＤａ分子量カットオフ限外濾過膜を使用して、限外濾過され、５５ｇ／Ｌに濃縮され、
ｂ．６透析濾過体積で、７．０のｐＨで１０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む製剤緩衝液中に透析濾過され、
ｃ．産物濃度を測定し、１０．０ｇ／Ｌの産物濃度まで希釈される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記希釈産物が、０．５／０．２μｍ濾過され、ポリソルベート８０が、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の最終濃度を達成するために希釈産物プールに添加される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記限外濾過および透析濾過工程が、
ａ．フラッシュとしての注射用水、
ｂ．殺菌のための０．５Ｍの水酸化ナトリウム、
ｃ．平衡化、透析濾過、チェイスおよびプール希釈のための、７．０のｐＨの１０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウム、
ｄ．保管のための、０．１Ｍの水酸化ナトリウム、ならびに／または
ｅ．賦形剤用の１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、からなる群から選択される１つ以上の緩衝液の使用を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記限外濾過および透析濾過工程の処理条件が、
ａ．通常の稼働範囲では計算体積の１％以内および立証された許容範囲では計算体積の３％以内の希釈、
ｂ．１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０が、通常の稼働範囲では０．１９〜０．２１％（ｗ／ｖ）の希釈限外濾過／透析濾過産物および立証された許容範囲では０．１７〜０．２３％（ｗ／ｖ）の希釈限外濾過／透析濾過産物であること、
ｃ．６．５〜７．５の未製剤化製剤原料ｐＨ、
ｄ．９．０〜１１．０ｍｇ／ｍＬの希釈限外濾過／透析濾過産物濃度、
ｅ．使用前整合性試験に合格すること、
ｆ．通常の稼働範囲では１００〜５００ｇ／ｍ２および立証された許容範囲では５０〜６００ｇ／ｍ２の膜負荷量、
ｇ．通常の稼働範囲では２４０〜４２０ＬＭＨおよび立証された許容範囲では１８０〜４４０ＬＭＨの供給流束、
ｈ．通常の稼働範囲では１０〜３０ｐｓｉおよび立証された許容範囲では８〜３５ｐｓｉ以内の膜間圧力差、
ｉ．通常の稼働範囲では１５〜２５℃および立証された許容範囲では１２〜３０℃の圧力、
ｊ．通常の稼働範囲では１〜３および立証された許容範囲では１〜５のフェドバッチ（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）比、
ｋ．通常の稼働範囲では１３〜１７ｇ／Ｌおよび立証された許容範囲では１２〜２０ｇ／Ｌの限外濾過目標の終了時の濃度、
ｌ．通常の稼働範囲では５．５〜７．０および立証された許容範囲では４．５〜７．０の透析当量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）、
ｍ．通常の稼働範囲では≦４日および立証された許容範囲では≦６日の未製剤化限外濾過および透析濾過未透過液保持、
ｎ．通常の稼働範囲では≦７日および立証された許容範囲では≦１４日の希釈限外濾過／透析濾過産物保持、
ｏ．≧９０％の工程収率、
ｐ．≦１１．１時間の初期濃縮の開始から透析濾過の終了までの処理時間、
ｑ．初期の７５〜１２５％の使用後の正規化水透過性（ＮＷＰ）流束、
ｒ．＜１０ＣＦＵ／１０ｍＬの希釈された限外濾過／透析濾過の濾過前のプールバイオバーデン、ならびに
ｓ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの希釈された限外濾過／透析濾過の濾過後のプールバイオバーデン、および／または＜２ＥＵ／ｍＬの希釈された限外濾過／透析濾過の濾過後のプールエンドトキシン濃度、のうちの１つ以上を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記限外濾過および透析濾過工程の処理条件が、
ａ．４０〜６０ｇ／Ｌの初期濃度目標、
ｂ．最終濃度目標（１４０〜１６０ｇ／Ｌ）（１．０７回収係数を含む）、
ｃ．６．０の目標での、４．５〜７．５の透析当量、
ｄ．≦２４時間の希釈されていない限外濾過／透析濾過された産物の保持、
ｅ．≦２４時間の希釈された限外濾過／透析濾過された産物の保持、
ｆ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ３  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  Ｃスクリーン３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターの使用、
ｇ．≧２０Ｌ／ｍ２のフラッシュＷＦＩ、
ｈ．５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＬ−Ａｒｇ（≧２０Ｌ／ｍ２）の平衡化、
ｉ．≦６００Ｌ／ｍ２の膜負荷、
ｊ．３６０ＬＭＨのすべての産物工程の目標供給流量、
ｋ．１５ｐｓｉのすべての産物工程の目標膜間圧力差、
ｌ．供給圧力または≦５０ｐｓｉ（増加させることができる）、
ｍ．平衡化と同じ透析濾過緩衝液、
ｎ．供給圧力によって制御できる最終濃度（ＴＭＰまたは供給流量ではない）、
ｏ．１５〜３５℃の温度、
ｐ．≦１×システム保持体積（ＣＳＤごとに計算が必要）による回収、
ｑ．ＤＦ／平衡化緩衝液による目標の１２０ｇ／Ｌへの希釈、
ｒ．０．１９１９〜０．２３９３ｋｇ／ｋｇの賦形剤添加緩衝液（ＥＡＢ−５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＬ−Ａｒｇ、３０％スクロース０．３０％（ｗ／ｖ）、ＰＳ  ８０）を１２０ｇ／ＬのＵＦ／ＤＦ産物に添加し、最終製剤にすること、
ｓ．最大２０サイクルの膜再使用、
ｔ．０．５ＭのＮａＯＨによる殺菌、
ｕ．０．１ＭのＮａＯＨとともに保管、
ｖ．＞６０％の収率（９０％を超えると予想される）、
ｗ．≦４０Ｌ／ｍ２のＳＨＣ濾過性１２０ｇ／Ｌ  ＵＦ／ＤＦ産物を表すこと、ならびに
ｘ．≦３０４５Ｌ／ｍ２のＳＨＣ濾過性ＢＤＳを表すこと、のうちの１つ以上を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／６９１，４２８号および２０１９年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８１１，７１０号の利益を主張するものである。上述の仮特許出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、診断、治療、および生物学的研究用途に大きく利用される。しかしながら、抗体安定性は、これらのタンパク質の精製および製剤化において課題を提示する。抗体不安定性は、タンパク質製剤中の高レベルの凝集をもたらし、タンパク質活性の変化および患者における潜在的に望ましくない免疫学的応答を含むいくつかの欠点を有し得る。したがって、産生および精製プロセスを向上させ、産物回収を増加させるための改善された技術の長期にわたる必要性が存在する。本開示は、この必要性に対処し、さらなる利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）を産生する方法が本明細書に提供される。
【０００４】
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を、細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、回収工程、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製、低ｐＨウイルス不活性化工程、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による精製、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）による精製、ウイルス減少濾過工程、濃縮および透析濾過工程、ならびにバルク濾過工程からなる群から選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つ）の工程を行うことを含む。
【０００５】
別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製することを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、低ｐＨウイルス不活性化工程を行うことを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、ＣＥＸによって精製することを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、ＡＥＸによって精製することを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、ウイルス減少濾過工程を行うことを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、濃縮および透析濾過／限外濾過工程を行うことを含む。
【０００６】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、ＣＥＸおよび／またはＡＥＸによる精製を含む、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つ）の工程を行うことを含む。
【０００７】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、単一の透析濾過／限外濾過工程（すなわち、ただ１つの透析濾過／限外濾過工程）を含む、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つ）の工程を行うことを含む。
【０００８】
抗Ｃ５抗体の産生方法も提供され、本方法は、
ａ．抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養することと、
ｂ．回収工程と、
ｃ．プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製と、
ｄ．低ｐＨウイルス不活性化工程と、
ｅ．ＣＥＸによる精製と、
ｆ．ＡＥＸによる精製と、
ｇ．ウイルス減少濾過工程と、
ｈ．濃縮および透析濾過工程と、を含む。
【０００９】
別の実施形態では、本方法は、バルク濾過工程をさらに含む。
【００１０】
別の実施形態では、本方法は、
ａ．抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養することと、
ｂ．回収工程と、
ｃ．プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製と、
ｄ．低ｐＨウイルス不活性化工程と、
ｅ．ＣＥＸによる精製と、
ｆ．ＡＥＸによる精製と、
ｇ．ウイルス減少濾過工程と、
ｈ．濃縮および透析濾過工程と、を含む。
【００１１】
別の実施形態では、本方法は、バルク濾過工程をさらに含む。
【００１２】
一実施形態では、工程（ａ）〜（ｈ）は、順次実行される。例えば、一実施形態では、本方法は、（ａ）抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて（ｂ）回収工程、続いて（ｃ）プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製、続いて（ｄ）低ｐＨウイルス不活性化工程、続いて（ｅ）ＣＥＸによる精製、続いて（ｆ）ＡＥＸによる精製、続いて、（ｇ）ウイルス減少濾過工程、続いて（ｈ）濃縮および透析濾過工程、および任意に、それに続くバルク濾過工程を含む。
【００１３】
別の実施形態では、工程（ａ）〜（ｈ）は、任意の順序および／または任意の組み合わせで実行される。例えば、一実施形態では、ＡＥＸによる精製は、ＣＥＸによる精製の前に実行される。別の実施形態では、精製工程のうちのいずれかおよび／またはすべては、低ｐＨウイルス不活性化および／またはウイルス減少濾過工程（複数可）の前に実行される。
【００１４】
別の実施形態では、本方法は、１０工程以下の工程を含む。別の実施形態では、本方法は、９工程以下の工程を含む。別の実施形態では、本方法は、８工程以下の工程を含む。別の実施形態では、本方法は、７工程以下の工程を含む。別の実施形態では、本方法は、６工程以下の工程を含む。別の実施形態では、本方法は、５工程以下の工程を含む。
【００１５】
本明細書に記載の方法は、細胞培養産生培地を濾過することを含む回収工程も含み得る。一実施形態では、細胞培養産生培地は市販の細胞培養培地（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）である。別の実施形態では、細胞培養産生培地は、特注の細胞培養産生培地ではない。別の実施形態では、細胞培養産生培地は、タンパク質を含まない、合成細胞培養産生培地である。別の実施形態では、細胞培養産生培地は、ウシ血清アルブミンを含まない。
【００１６】
一実施形態では、細胞培養培地は、デプス濾過によって濾過される。別の実施形態では、細胞培養培地は、デプス濾過トレイン（例えば、２段階デプス濾過トレイン）を通して濾過され、続いて容器（例えば、２，０００Ｌの単回使用混合バイオプロセス容器）中への追加の濾過（例えば、直列に２つの０．５／０．２μｍフィルターを通して）が行われる。別の実施形態では、デプス濾過トレインは、使用前にＷＦＩでフラッシュされ、緩衝液で平衡化される。別の実施形態では、平衡化緩衝液および／またはチェイシング（ｃｈａｓｉｎｇ）緩衝液は、約７．６のｐＨ（例えば、７．４、７．５、７．６、７．７、または７．８のｐＨ）でトリス（例えば、２０ｍＭまたは約２０ｍＭ）および塩化ナトリウム（例えば、６５ｍＭまたは約６５ｍＭ）を含む。別の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）および６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、細胞培養産生培地は、緩衝液、例えば２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）および６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液で２段階のデプス濾過トレインを通してチェイス（ｃｈａｓｅ）される（例えば、フラッシュされる）。別の実施形態では、回収工程は、清澄化された収集物質をもたらす。
【００１７】
別の実施形態では、回収工程のための処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を含む：ＮＯＲでは≦１００Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは≦１００Ｌ／ｍ２のＤ０ＨＣデプスフィルター負荷；ＮＯＲで≦２００Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは≦２００Ｌ／ｍ２のＡ１ＨＣデプスフィルター負荷；ＮＯＲでは≦８００Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは≦８００Ｌ／ｍ２の０．５／０．２μｍフィルター負荷；ＮＯＲでは１８〜３７℃およびＰＡＲでは１５〜３７℃の収集物負荷温度；ＮＯＲでは２０〜２５Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは０〜３０Ｌ／ｍ２の緩衝液チェイス体積；ＮＯＲでは≦１０日およびＰＡＲでは≦１６日の清澄化された収集物保持時間（収集物濾過の開始から最終ＰｒｏＡサイクル負荷終了まで）；≧７０％の収率；＜３．３時間の総濾過時間（収集物濾過の開始から終了まで、フラッシュおよび平衡化を除く）；＜３ＣＦＵ／１０ｍＬのバイオバーデン；ならびに／または＜５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度。
【００１８】
一実施形態では、前の工程からの材料（例えば、回収工程からの清澄化された収集物質）は、フィルター（例えば、０．５／０．２μｍフィルター）を通してタンパク質Ａカラム上に負荷される。
【００１９】
別の実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）水酸化ナトリウム、（ｂ）トリスおよび塩化ナトリウム、（ｃ）リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびアルギニン塩酸塩、（ｄ）酢酸ナトリウム、（ｅ）酢酸、（ｆ）注射用水（ＷＦＩ）、および（ｇ）エタノール。一実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、殺菌のために、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを含む。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程は、平衡化および負荷後洗浄１のために、約７．６のｐＨで２０ｍＭのトリスおよび６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程は、負荷後洗浄２のために、６．０のｐＨで５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、および３００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含む。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程は、負荷後洗浄３のために、約７．６のｐＨで２０ｍＭのトリスおよび６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程は、溶出のために、３．７５のｐＨで２５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。別の実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、ストリッピングのために、１００ｍＭの酢酸を含む。別の実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、フラッシングのために、ＷＦＩを含む。別の実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、保管のために、２０％のエタノールを含む。
【００２０】
別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーの処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つ）を含む：
ａ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では３０〜６０分および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では３０〜７５分のバッチ前の殺菌保持時間、
ｂ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では３０〜６０分および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では３０〜７５分のバッチ後の殺菌保持時間、
ｃ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦１００および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１００のカラムサイクル、
ｄ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦７日、立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１０日の溶出液保持時間（濾過の終了から低ｐＨ酸性化の開始まで）、
ｅ．≧７０％の工程収率、
ｆ．＜５０ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過前バイオバーデン
ｇ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過後バイオバーデン、ならびに／または
ｈ．＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液濾過後エンドトキシン。
【００２１】
本明細書に記載される方法は、低ｐＨウイルス不活性化工程も含み得る。一実施形態では、直接不活性化工程は、前の工程からの物質（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー精製からの溶出プール）を酢酸で処理すること、低いｐＨ（例えば、３．６０〜３．７５のｐＨの範囲内）を確認することと、ｐＨを上昇させることと、次いで中和されたウイルス不活性化物質を濾過することと、を含む。別の実施形態では、低ｐＨウイルス不活性化工程は、（ａ）前の工程からの物質（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー精製からの溶出プール）を酢酸（例えば、３．６０〜３．７０のｐＨ範囲の１Ｍ酢酸）で処理することと、（ｂ）プールを第２の容器に移し、混合せずに周囲温度で最短６０分間インキュベートし、ｐＨ範囲が３．６０〜３．７５以内であることを確認することと、（ｃ）ｐＨ５．０に上昇させて（例えば、１Ｍのトリスを使用する）、混合せずに周囲温度で最短６０分間インキュベートすることと、（ｄ）中和されたウイルス不活性化物質を事前濾過する（例えば、０．５／０．２μｍフィルター）ことと、濾過産物を保管することと、を含む。
【００２２】
別の実施形態では、低ｐＨウイルス不活性化工程の処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を含む：
ａ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では３．６０〜３．７０および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では３．５５〜３．８０の滴定直後の酸性化ｐＨ、
ｂ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では３．６０〜３．７５および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では３．５５〜３．８０の保持時間直後の酸性化ｐＨ、
ｃ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では６０〜１２０分および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≧６０〜３６０分の低ｐＨでの保持時間、
ｄ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では６０〜１２０分および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≧６０分の０．５／０．２μｍの濾過前の中和されたｐＨでの保持時間、
ｅ．≦７日の濾過された中和産物保持時間（濾過の終了からＣＥＸ負荷の終了まで）、
ｆ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では、および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦７日、
ｇ．≧９０％の収率、
ｈ．＜５０ＣＦＵ／１０ｍＬの中和された濾過前プールバイオバーデン、
ｉ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの中和された濾過後プールバイオバーデン、ならびに／または
ｊ．＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液濾過後エンドトキシン。
【００２３】
本明細書に記載の方法は、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程も含み得る。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、ＣＥＸおよび／またはＡＥＸによる精製を含む、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つ）の工程を行うことを含む。
【００２４】
一実施形態では、前の工程からの物質（例えば、低ｐＨウイルス不活性化工程からの中和濾液）を、例えば０．５／０．２μｍフィルターを通してカチオン交換カラム（例えば、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０カチオン交換カラム）上に負荷する。一実施形態では、ＣＥＸ工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）酢酸ナトリウム、（ｂ）塩化ナトリウム、（ｃ）水酸化ナトリウム、（ｄ）酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム、ならびに（ｅ）酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびアルギニン塩酸塩。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、平衡化および負荷後洗浄１のために、５０ｍＭの酢酸ナトリウムを５．０のｐＨで含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、負荷後洗浄２のために、５０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび６０ｍＭの塩化ナトリウムを４．９のｐＨで含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、溶出のために、５．０のｐＨで５０ｍＭの酢酸ナトリウム、９０ｍＭのアルギニン塩酸塩、および３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、ストリッピングのために、２．０Ｍの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、殺菌のために、１．０Ｎの水酸化ナトリウムを含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、保管のために、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを含む。
【００２５】
別の実施形態では、ＣＥＸの処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個）を含む：
ａ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では２２〜４５ｇ／Ｌおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では１５〜５０ｇ／Ｌの負荷容量、
ｂ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では１５〜２５℃および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では１３〜２７℃の温度、
ｃ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では４．９０〜５．１０および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では４．９０〜５．１０の溶出緩衝液ｐＨ、
ｄ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では１１．１〜１３．６ｍＳ／ｃｍおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では１１．１〜１３．６ｍＳ／ｃｍの溶出緩衝液導電率、
ｅ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では１５０〜３００ｃｍ／時および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では１２０〜３３０ｃｍ／時の溶出流量、
ｆ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦７日および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１０日の溶出液保持時間（溶出液回収の開始からＡＥＸ負荷量の調整の終了まで）、
ｇ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦１００および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１００のカラムサイクル、
ｈ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過後バイオバーデン、
ｉ．＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液濾過後エンドトキシン、
ｊ．≧５８％の工程収率、ならびに／または
ｋ．２．３〜５．０カラム体積の溶出液体積。
【００２６】
本明細書に記載の方法は、ＡＥＸ工程も含み得る。一実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、ＡＥＸカラムに負荷する前にｐＨを調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、トリス、アルギニン、およびＷＦＩを使用してｐＨを調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、約８．０のｐＨに調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、８．５ｍＳ／ｃｍの導電率に調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、９．０のｐＨで１００ｍＭのトリス、１８０ｍＭのアルギニンおよびＷＦＩを用いて、８．００のｐＨおよび８．５ｍＳ／ｃｍの導電率に調整される。
【００２７】
別の実施形態では、ＡＥＸカラムは、ＰＯＲＯＳ  ＨＱ５０  ＡＥＸカラムである。別の実施形態では、ＡＥＸカラムは、貫流モードで動作するＰＯＲＯＳ  ＨＱ５０  ＡＥＸカラムである。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、調整された溶出プール）は、調整の２４時間以内（例えば、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、または２３時間以内）にＡＥＸカラムに負荷される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、調整された溶出プール）は、フィルター（例えば、０．５／０．２μｍフィルター）を通してＡＥＸカラムに負荷され、結果として生じる産物は、例えば、フィルター（例えば、０．５／０．２μｍフィルター）を通して濾液容器中に濾過された緩衝液を使用して、ＡＥＸカラムからチェイスされる（例えば、フラッシュされる）。
【００２８】
別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）トリスおよびアルギニン、（ｂ）ＷＦＩ、（ｃ）塩化ナトリウム、（ｄ）トリスおよび塩化ナトリウム、ならびに（ｅ）水酸化ナトリウム。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、負荷ｐＨ調整のために、９．０のｐＨで１００ｍＭのトリスおよび１８０ｍＭのアルギニンの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、負荷導電率調整およびフラッシュのために、ＷＦＩの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、状態調節のために、２Ｍの塩化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、平衡化および負荷後のチェイスのために、７．６のｐＨで２０ｍＭのトリスおよび６５ｍＭの塩化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、負荷後の溶出ストリッピングのために、２Ｍの塩化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、殺菌のために、１．０Ｎの水酸化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、保管のために、０．１Ｎの水酸化ナトリウムの使用を含む。
【００２９】
別の実施形態では、ＡＥＸの処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個）を含む：
ａ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では７．９０〜８．１０および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では７．８０〜８．２０の負荷ｐＨ、
ｂ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では８．０〜９．０ｍＳ／ｃｍおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では７．０〜１０．０ｍＳ／ｃｍの負荷導電率、
ｃ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では２５〜９０ｇ／Ｌおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では２５〜１００ｇ／Ｌの負荷容量ｐＨ、
ｄ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦１日、立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦４日の保持時間（ＡＥＸ負荷調整からＡＥＸ負荷の開始まで）、
ｅ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦４日および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦６日の産物保持時間（ＡＥＸ負荷調整の終了からＵＦ／ＤＦの終了まで）、
ｆ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦１００および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１００のカラムサイクル、
ｇ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液バイオバーデン（濾過後）、ならびに／または
ｈ．＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液エンドトキシン（濾過後）、および≧６７％の収率。
【００３０】
本明細書に記載の方法は、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程も含み得る。一実施形態では、フィルターは使用前にフラッシュされる（例えば、ＷＦＩおよび緩衝液を使用して）。別の実施形態では、ＡＥＸからの貫流濾液は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ  Ｓｈｉｅｌｄプレフィルター（例えば、０．５／０．２μｍ）を通して濾過され、その後、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏフィルター（例えば、２０ｎｍ）を通して濾過される。
【００３１】
別の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）トリスおよび塩化ナトリウム、ならびに（ｂ）ＷＦＩ。別の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程は、使用前のフラッシュとしてのＷＦＩの使用を含む。別の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程は、平衡化および負荷後のチェイスのために、７．６のｐＨで２０ｍＭのトリスおよび６５ｍＭの塩化ナトリウムの使用を含む。
【００３２】
別の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個）を含む：
ａ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では２１〜３２ｐｓｉｄおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では２１〜３５ｐｓｉｄの負荷およびチェイス中のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏフィルター差圧、
ｂ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では０分および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１２０分の総休止時間、
ｃ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦１５Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦２０Ｌ／ｍ２のチェイス体積、
ｄ．使用後の整合性試験に合格すること、
ｅ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では３．０〜６．０ｇ／Ｌおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦６．７ｇ／Ｌの負荷濃度、
ｆ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦７００Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１２００Ｌ／ｍ２のｓｈｉｅｌｄ  Ｈプレフィルター負荷、
ｇ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦７００Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦７００Ｌ／ｍ２のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏフィルター負荷、
ｈ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦４日および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦６日の産物保持時間（ＡＥＸ負荷調整の終了からＵＦＤＦの終了まで）、
ｉ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬのバイオバーデン（前濾過ウイルスフィルター負荷）、
ｊ．＜２ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン（ウイルス濾液）、
ｋ．使用前の整合性試験に合格すること、ならびに／または
ｌ．≦１２時間の処理時間（負荷開始から負荷終了まで）、および／または≧９０％の工程収率。
【００３３】
本明細書に記載の方法は、濃縮および透析濾過工程も含み得る。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、単一の透析濾過／限外濾過工程（すなわち、ただ１つの透析濾過／限外濾過工程）を含む、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つ）の工程を行うことを含む。
【００３４】
一実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ウイルス濾過工程からのプール）は、限外濾過され、濃縮される。別の実施形態では、プールはさらに透析濾過される。別の実施形態では、産物の濃度は測定され、希釈される（例えば、１０．０ｇ／Ｌまたは１００ｇ／Ｌ）。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ウイルス濾過からのプール）は、（ａ）３０ｋＤａのＭＷＣＯ  ＵＦ膜を使用して、例えば５５ｇ／Ｌまで限外濾過および濃縮され、（ｂ）製剤緩衝液中に（例えば、６透析濾過体積で）透析濾過し、産物濃度が測定され、希釈される（例えば、１０．０ｇ／Ｌまたは１００ｇ／Ｌまで）。別の実施形態では、製剤緩衝液は、７．０のｐＨで１０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、希釈産物が濾過され（例えば、０．５／０．２μｍフィルターを通して）、ポリソルベート８０が希釈産物プールに添加されて、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の最終濃度を達成する。
【００３５】
別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）ＷＦＩ、（ｂ）水酸化ナトリウム、（ｃ）リン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ならびに（ｄ）ポリソルベート８０。別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、フラッシュとしてのＷＦＩの使用を含む。別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、殺菌のために、０．５Ｍの水酸化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、平衡化、透析濾過、チェイス、および／またはプール希釈のために、７．０のｐＨで１０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、保管のために、０．１Ｍの水酸化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、賦形剤のために、１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の使用を含む。
【００３６】
別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個）を含む：
ａ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では計算体積の１％以内および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では計算体積の３％以内の希釈、
ｂ．１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０が、通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では０．１９〜０．２１％（ｗ／ｖ）の希釈ＵＦ／ＤＦ産物および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では０．１７〜０．２３％（ｗ／ｖ）の希釈ＵＦ／ＤＦ産物であること、
ｃ．６．５〜７．５の未製剤化製剤原料ｐＨ、
ｄ．９．０〜１１．０ｍｇ／ｍＬの希釈ＵＦ／ＤＦ産物濃度、
ｅ．使用前整合性試験に合格すること、
ｆ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では１００〜５００ｇ／ｍ２および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では５０〜６００ｇ／ｍ２以内の膜負荷量、
ｇ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では２４０〜４２０ＬＭＨおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では１８０〜４４０ＬＭＨ以内の供給流束、
ｈ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では１０〜３０ｐｓｉおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では８〜３５ｐｓｉ以内の膜間圧力差、
ｉ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では１５〜２５℃および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では１２〜３０℃以内の圧力、
ｊ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では１〜３および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では１〜５以内のフェドバッチ（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）比、
ｋ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では１３〜１７ｇ／Ｌおよび立証された許容範囲（ＰＡＲ）では１２〜２０ｇ／Ｌ以内の限外濾過目標の終了時の濃度、
ｌ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では５．５〜７．０および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では４．５〜７．０以内の透析当量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）、
ｍ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦４日および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦６日以内の未製剤化限外濾過および透析濾過未透過液保持、
ｎ．通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦７日および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１４日以内の産物保持（希釈された限外濾過／透析濾過産物）、
ｏ．≧９０％の工程収率、
ｐ．≦１１．１時間の処理時間（初期濃縮の開始から透析濾過の終了まで）、
ｑ．初期の７５〜１２５％の使用後のＮＷＰ、
ｒ．＜１０ＣＦＵ／１０ｍＬの希釈された限外濾過／透析濾過の濾過前のプールバイオバーデン、ならびに／または
ｓ．＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの希釈された限外濾過／透析濾過の濾過後のプールバイオバーデン、および／または＜２ＥＵ／ｍＬの希釈された限外濾過／透析濾過の濾過後のプールエンドトキシン。
【００３７】
別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個）を含む：
ａ．４０〜６０ｇ／Ｌの初期濃度目標、
ｂ．最終濃度目標（１４０〜１６０ｇ／Ｌ）（１．０７回収係数を含む）、
ｃ．６．０の目標での、４．５〜７．５の透析当量、
ｄ．≦２４時間の希釈されていない限外濾過／透析濾過された産物の保持）、
ｅ．≦２４時間の希釈された限外濾過／透析濾過された産物の保持）、
ｆ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ３  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  Ｃスクリーン３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターの使用、
ｇ．≧２０Ｌ／ｍ２のフラッシュＷＦＩ、
ｈ．５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＬ−Ａｒｇ（≧２０Ｌ／ｍ２）の平衡化、
ｉ．≦６００Ｌ／ｍ２の膜負荷、
ｊ．３６０ＬＭＨのすべての産物工程の目標供給流量、
ｋ．１５ｐｓｉのすべての産物工程の目標膜間圧力差、
ｌ．供給圧力または≦５０ｐｓｉ（増加させることができる）、
ｍ．平衡化と同じ透析濾過緩衝液、
ｎ．供給圧力によって制御できる最終濃度（ＴＭＰまたは供給流量ではない）、
ｏ．１５〜３５℃の温度、
ｐ．≦１×システム保持体積（ＣＳＤごとに計算が必要）による回収、
ｑ．ＤＦ／平衡化緩衝液による目標の１２０ｇ／Ｌへの希釈、
ｒ．０．１９１９〜０．２３９３ｋｇ／ｋｇの賦形剤添加緩衝液（ＥＡＢ−５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＬ−Ａｒｇ、３０％スクロース０．３０％（ｗ／ｖ）、ＰＳ  ８０）を１２０ｇ／ＬのＵＦ／ＤＦ産物に添加し、最終製剤にすること、
ｓ．最大２０サイクルの膜再使用、
ｔ．０．５ＭのＮａＯＨによる殺菌、
ｕ．０．１ＭのＮａＯＨとともに保管、
ｖ．＞６０％の収率（９０％を超えると予想される）、
ｗ．≦４０Ｌ／ｍ２のＳＨＣ濾過性１２０ｇ／Ｌ  ＵＦ／ＤＦ産物を表すこと、および
ｘ．≦３０４５Ｌ／ｍ２のＳＨＣ濾過性ＢＤＳを表すこと。
【００３８】
例示的な抗Ｃ５抗体は、それぞれ配列番号１４および１１に示される配列を有する重鎖および軽鎖を含むラブリズマブ（ＡＬＸＮ１２１０および抗体ＢＮＪ４４１としても知られる）、またはその抗原結合断片および変異型である。他の実施形態では、抗体は、ラブリズマブの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）または可変領域（ＶＲ）を含む。したがって、一実施形態では、抗体は、配列番号１２に示される配列を有するラブリズマブの重鎖可変（ＶＨ）領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号８に示される配列を有するラブリズマブの軽鎖可変（ＶＬ）領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１９、１８、および３にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３重鎖配列、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３軽鎖配列を含む。
【００３９】
別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１２および配列番号８で記載されるアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【００４０】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１３に記載の重鎖定常領域を含む。
【００４１】
別の実施形態では、抗体は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する変異型ヒトＦｃ定常領域を含み、変異型ヒトＦｃ  ＣＨ３定常領域は、それぞれＥＵ番号付けにおけるメチオニン４２８およびアスパラギン４３４に対応する残基におけるＭｅｔ−４２９−ＬｅｕおよびＡｓｎ−４３５−Ｓｅｒ置換を含む。
【００４２】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１９、１８、および３にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３重鎖配列、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３軽鎖配列、ならびにヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する変異型ヒトＦｃ定常領域を含み、変異型ヒトＦｃ  ＣＨ３定常領域は、それぞれＥＵ番号付けにおけるメチオニン４２８およびアスパラギン４３４に対応する残基におけるＭｅｔ−４２９−ＬｅｕおよびＡｓｎ−４３５−Ｓｅｒ置換を含む。
【００４３】
別の実施形態では、抗体は、上述した抗体のようなＣ５上の同じエピトープとの結合で競合し、および／または同じエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、配列番号１２および配列番号８と少なくとも約９０％、９５％、または９９％の可変領域同一性）を有する。
【００４４】
別の実施形態では、抗体は、ｐＨ７．４および２５℃で、０．１ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲である親和性解離定数（ＫＤ）でヒトＣ５に結合する。別の実施形態では、抗体は、ｐＨ６．０および２５℃で、ＫＤ≧１０ｎＭでヒトＣ５に結合する。さらに別の実施形態では、抗体の［ｐＨ６．０および２５℃でのヒトＣ５への抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）／（ｐＨ７．４および２５℃でのヒトＣ５への抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）］は、２５超である。
【００４５】
別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ＢＮＪ４２１抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２２５および米国特許第９，０７９，９４９号に記載）。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、７０８６抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む（米国特許第８，２４１，６２８号および同第８，８８３，１５８号を参照）。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、８１１０抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む（米国特許第８，２４１，６２８号および同第８，８８３，１５８号を参照）。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、３０５ＬＯ５抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む（ＵＳ２０１６／０１７６９５４Ａ１を参照）。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ＳＫＹ５９抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む（Ｆｕｋｕｚａｗａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐ．２０１７  Ａｐｒ  ２４；７（１）：１０８０を参照）。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ＲＥＧＮ３９１８抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む（ＵＳ２０１７／０３５５７５７を参照）。
【００４６】
一実施形態では、本明細書に開示される方法に従って産生される抗Ｃ５抗体は、１０ｍｇ／ｍＬ溶液に製剤化される。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、例えば、ＩＶ投与に好適な殺菌された防腐剤を含まない１０ｍｇ／ｍＬ溶液に製剤化される。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、２０ｍＬの単回使用バイアルに供給される。別の実施形態では、各バイアルは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％のポリソルベート８０、および７．０のｐＨの注射用水中に１５０ｍｇのラブリズマブを含有する。
【００４７】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法に従って産生される抗Ｃ５抗体は、１００ｍｇ／ｍＬ溶液に製剤化される。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、例えば、皮下投与に好適な殺菌された防腐剤を含まない１００ｍｇ／ｍＬ溶液に製剤化される。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、２ｍＬの単回使用バイアルに供給される。別の実施形態では、各バイアルは、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのアルギニン、５％のスクロース、および０．０５％のポリソルベート８０、ならびに７．４のｐＨの注射用水中に１００ｍｇ／ｍＬのラブリズマブを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ラブリズマブの製造プロセスの流れ図である。
【図２】接種材料増殖製造プロセスのためのプロセスフローおよびキープロセスパラメータ（ＫＰＰ）およびキープロセス属性（ＫＰＡ）を示す。
【図３】生産バイオリアクターにおける細胞培養プロセスのプロセス制御（ＩＰＣ）およびキープロセス属性におけるプロセスフローならびに重要プロセスパラメータおよびキープロセスパラメータ（ＣＰＰ、ＫＰＰ）を示す。
【図４】ラブリズマブ製造プロセスの工程３のプロセスフローならびにＫＰＰおよびＫＰＡを示す。
【図５−１】ラブリズマブ精製プロセスの概要を示す。
【図５−２】ラブリズマブ精製プロセスの概要を示す。
【図５−３】ラブリズマブ精製プロセスの概要を示す。
【図６】ラブリズマブ医薬品の製造プロセスおよび対照の流れ図である。
【図７】実施例２で使用される高濃度限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）プロセスの概略図である。
【図８】緩衝液チェイス体積対濃度（０．２のＦ因子）のプロットである。
【図９】緩衝液チェイス体積対濃度（０．８のＦ因子）のプロットである。
【図１０】ＪＭＰソフトウェアを使用した実験（ＤＯＥ）２の設計のためにプロファイル化された予測のための設定である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
方法
補体成分Ｃ５に結合する抗体（抗Ｃ５抗体、例えば、ラブリズマブ）を産生するための方法が本明細書に提供される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「精製すること」および「分離すること」という用語は、互換的に使用され、対象となるタンパク質（例えば、抗Ｃ５抗体）を含有する混合物からの汚染物質の除去を指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「混合物」は、対象となるタンパク質（精製が所望される）および１つ以上の他の成分、場合によっては、例えば、汚染物質、すなわち、不純物を含む。一実施形態では、混合物は、対象となるタンパク質を発現する宿主細胞（天然または組換えのいずれか）から産生される。このような混合物としては、例えば、細胞培養物、細胞溶解物、および清澄化バルク（例えば、清澄化細胞培養上清）が挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「汚染物質」という用語は、混合物内の任意の望ましくない成分または化合物をカバーするために最も広義に使用される。細胞培養物、細胞溶解物または清澄化バルク（例えば、細胞培養上清）において、汚染物質としては、例えば、細胞培養培地中に存在する宿主細胞核酸（例えば、ＤＮＡ）および宿主細胞タンパク質が挙げられる。宿主細胞汚染タンパク質としては、宿主細胞によって天然にまたは組換えで産生されるタンパク質、ならびに対象となるタンパク質（例えば、タンパク質分解断片）および他のプロセスに関連する汚染物質（例えば、対象となるタンパク質の切断および凝集変種）に関連するか、またはそれに由来するタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「洗浄」または「チェイス」は、適切な緩衝液をカチオン交換樹脂または緩衝液を通過させることを指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「溶出」は、対象となるタンパク質（例えば、抗Ｃ５抗体）を樹脂またはカラムから除去することを指す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「細胞培養物」は、対象となるタンパク質（例えば、抗Ｃ５抗体）を産生する液体培地中の細胞を指す。細胞は、例えば、細菌、真菌、哺乳動物または植物を含む任意の生物由来であってもよい。好適な液体培地として、例えば、栄養素培地および非栄養素培地が挙げられる。一実施形態では、細胞培養生成培地は市販の細胞培養培地（例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）である。別の実施形態では、細胞培養産生培地は、特注の細胞培養産生培地ではない。別の実施形態では、細胞培養産生培地は、タンパク質を含まない、合成細胞培養産生培地である。別の実施形態では、細胞培養産生培地は、ウシ血清アルブミンを含まない。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「清澄化バルク」という用語は、粒子状物質（例えば、細胞）が実質的に除去された混合物を指す。清澄化バルクには、細胞培養上清、または細胞もしくは細胞残渣が、例えば、濾過または遠心分離によって実質的に除去された細胞溶解物が挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、混合物中の対象となる溶質、例えば、抗Ｃ５抗体が、混合物中の他の溶質から、プロセスの特定の緩衝作用条件下で、その溶質の特性、例えば、ｐＩ、疎水性、サイズ、および構造などに起因して、その溶質の特性によって、その溶質を多かれ少なかれ強力に吸着または保持する吸着剤を通じて混合物の浸透によって分離されるプロセスを指す。
【００５８】
「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、対象となるイオン性溶質（例えば、混合物中の抗Ｃ５抗体）が、対象となる溶質が、混合物中の溶質不純物または汚染物質よりも多かれ少なかれ荷電化合物と非特異的に相互作用するように、ｐＨおよび導電性の適切な条件下で、固相イオン交換材料に連結された（例えば、共有結合によって）反対に荷電されたリガンドと相互作用するクロマトグラフィープロセスを指す。混合物中の汚染溶質は、イオン交換材料のカラムから洗浄することができるか、または対象となる溶質よりも速くもしくは遅く樹脂に結合するか、または樹脂から除外される。「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的には、カチオン交換（ＣＥＸ）、アニオン交換（ＡＥＸ）、および混合モードクロマトグラフィー（例えば、単一のクロマトグラフィー系における２つ（またはそれ以上）の保持機構の組み合わせ使用）を含む。
【００５９】
「樹脂」という用語は、有機ポリマーを指す。ポリマーは、天然または合成であってもよい。樹脂は、多くの場合、クロマトグラフィーのための固相支持材料として使用される。
【００６０】
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞培養産生培地中で、例えば抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、回収工程、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製、低ｐＨウイルス不活性化工程、ＣＥＸによる精製、ＡＥＸによる精製、ウイルス減少濾過工程、ならびに濃縮および透析濾過工程からなる群から選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つ）の工程を行うことを含む。
【００６１】
培養工程には、任意の好適な哺乳類細胞を使用することができる。例示的な哺乳類細胞として、ネズミ骨髄腫細胞（ＮＳ０）、マウスハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、およびＰＥＲ．Ｃ６ヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施形態では、哺乳動物細胞はＮＳ０細胞ではない。
【００６２】
一実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製することを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、低ｐＨウイルス不活性化工程を行うことを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、ＣＥＸによって精製することを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、ＡＥＸによって精製することを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、ウイルス減少濾過工程を行うことを含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体（例えば、ラブリズマブ）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、続いて、濃縮および透析濾過工程を行うことを含む。
【００６３】
また、抗Ｃ５抗体の産生方法も提供され、本方法は、抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、回収工程、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製、低ｐＨウイルス不活性化工程、ＣＥＸによる精製、ＡＥＸによる精製、ウイルス減少濾過工程、ならびに濃縮および透析濾過工程を含む。別の実施形態では、本方法は、抗Ｃ５抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することであって、該培養により、抗Ｃ５抗体が該細胞培養産生培地中で産生される、培養すること、回収工程、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製、低ｐＨウイルス不活性化工程、ＣＥＸによる精製、ＡＥＸによる精製、ウイルス減少濾過工程、ならびに濃縮および透析濾過工程からなる。
【００６４】
一実施形態では、精製工程は記載される順序で順次実行される。別の実施形態では、精製工程は任意の順序および／または任意の組み合わせで実行される。例えば、一実施形態では、ＡＥＸによる精製は、ＣＥＸによる精製の前に実行される。別の実施形態では、精製工程のうちのいずれかおよび／またはすべては、低ｐＨウイルス不活性化および／またはウイルス減少濾過工程（複数可）の前に実行される。
【００６５】
別の実施形態では、本方法は、１０工程以下の工程を含む。別の実施形態では、本方法は、９工程以下の工程を含む。別の実施形態では、本方法は、８工程以下の工程を含む。
【００６６】
回収工程
本明細書に記載の方法は、細胞培養産生培地を遠心分離および／または濾過することを含む回収工程を含み得る。一実施形態では、細胞培養培地は、遠心分離される。別の実施形態では、細胞培養培地は、デプス濾過を通して濾過される。別の実施形態では、細胞培養培地は遠心分離され、かつデプス濾過される。デプスフィルターは、単に媒体の表面上ではなく、媒体全体にわたって粒子を保持するために多孔質濾過媒体を使用するフィルターである。これらのフィルターは、他のタイプのフィルターと比較して、詰まる前に大量の粒子を保持することができるため、濾過される流体が粒子の高負荷を含有する場合に一般的に使用される（Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．＆  Ｋａｎｄｕｌａ，Ｊ．，ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２１：３４−４５，２００８）。
【００６７】
デプス濾過は、細胞培養物の清澄化に広く使用されている。細胞培養系は、酵母、細菌および他の汚染細胞を含有する可能性があり、したがって、細胞および他のコロイド状物質を分離して粒子を含まない細胞系を産生するためには、効率的な清澄化段階が不可欠である。細胞系採取などの製薬学的プロセスで使用されるほとんどのデプスフィルターは、セルロース繊維およびフィルター補助剤から構成されている。デプスフィルターのダイレクトフロー設計は、産物の最大回収率を確保しながら、フィルターチャネル内の汚染物質を捕捉する経済的に好適な溶液を提供する。このシステムの他の利点としては、デプス濾過中に利用されるポンプが、システム内の低圧に起因して最小限の電力入力を必要とするため、その低電力コストが挙げられる。デプス濾過はまた、高収率（＞９５％）を出力しながら拡大または縮小することができるという点でも柔軟である。細胞培養用途では、デプス濾過トレイン（例えば、２、３、４またはそれ以上の段階フィルターシステム）がしばしば使用され、より効率的な処理をもたらす。
【００６８】
一実施形態では、デプス濾過が使用される。別の実施形態では、２段階デプス濾過トレインが使用される。別の実施形態では、デプス濾過トレインは、使用前に注射用水（ＷＦＩ）でフラッシュされ、緩衝液で平衡化される。別の実施形態では、細胞培養産生培地は、緩衝液で２段階のデプス濾過トレインを通してチェイスされる（例えば、フラッシュされる）。別の実施形態では、平衡化緩衝液および／またはチェイス緩衝液は、トリス（例えば、２０ｍＭまたは約２０ｍＭ）、約ｐＨ７．６（例えば、７．４、７．５、７．６、７．７、または７．８のｐＨ）、および塩化ナトリウム（例えば、６５ｍＭまたは約６５ｍＭ）を含む。
【００６９】
別の実施形態では、追加の濾過は、デプス濾過の後に実行される。別の実施形態では、追加の濾過は、１つ以上の０．５／０．２μｍフィルター（例えば、１、２、３、または４つの０．５／０．２μｍフィルター）を通して実行される。別の実施形態では、追加の濾過は、直列になった２つの０．５／０．２μｍフィルターを通して容器に向けて実行される。一実施形態では、濾過は、バイオプロセス容器（例えば、２，０００Ｌの単回使用混合バイオプロセス容器）に向けて実施される。別の実施形態では、回収工程は、清澄化された収集物質をもたらす。
【００７０】
別の実施形態では、回収工程のための処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を含む：通常の稼働範囲（ＮＯＲ）では≦１００Ｌ／ｍ２および立証された許容範囲（ＰＡＲ）では≦１００Ｌ／ｍ２のＤ０ＨＣデプスフィルター負荷；ＮＯＲで≦２００Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは≦２００Ｌ／ｍ２のＡ１ＨＣデプスフィルター負荷；ＮＯＲでは≦８００Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは≦８００Ｌ／ｍ２の０．５／０．２μｍフィルター負荷；ＮＯＲでは１８〜３７℃およびＰＡＲでは１５〜３７℃の収集物負荷温度；ＮＯＲでは２０〜２５Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは０〜３０Ｌ／ｍ２の緩衝液チェイス体積；ＮＯＲでは≦１０日およびＰＡＲでは≦１６日の浄化された収集物保持時間（収集物濾過の開始から最終ＰｒｏＡサイクル負荷終了まで）；≧７０％の収率；＜３．３時間の総濾過時間（収集物濾過の開始から終了まで、フラッシュおよび平衡化を除く）；＜３ＣＦＵ／１０ｍＬのバイオバーデン；ならびに／または＜５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度。
【００７１】
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程
本明細書に記載の方法は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程を含み得る。「プロテインＡ親和性クロマトグラフィー」は、プロテインＡを使用して物質および／または粒子を分離もしくは精製することを指し、プロテインＡは概して固相上に固定化される。タンパク質Ａは、元々Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓに見られる４０〜６０ｋＤの細胞壁タンパク質である。タンパク質Ａ樹脂への抗体の結合は、高度に特異的である。プロテインＡは、免疫グロブリンのＦｃ領域に高い親和性で結合する。これは、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２、ならびにマウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂに対して高い親和性で結合する。プロテインＡは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ、ならびにマウスＩｇＧ３およびＩｇＧ１に中程度の親和性で結合する。ＣＨ２／ＣＨ３領域を含むタンパク質は、タンパク質Ａに可逆的に結合してもよく、またはタンパク質Ａに吸着してもよい。
【００７２】
プロテインＡ樹脂は当該技術分野において既知であり、本発明での使用に好適である。市販のプロテインＡ樹脂の非限定的な例としては、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（登録商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、ｒｍｐＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４ＢおよびｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  ＦＦ（すべて、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されている）；ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ａ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−ｖＡ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−ｖＡ  ＵｌｔｒａおよびＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−Ｖａ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（すべて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている）；Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＡおよびＭａｂｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）Ａ（両方ともＰｏｒｏｓから市販されている）；ＩＰＡ−３００、ＩＰＡ−４００およびＩＰＡ−５００（すべて、ＲｅｐｌｉＧｅｎ  Ｃｏｒｐ．から市販されている）；Ａｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡおよびＡｆｆｉ−ｐｒｅｐ（登録商標）ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（両方とも、Ｂｉｏ−Ｒａｄから市販されている）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ  Ｆ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）；Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡおよびＡｇａｒｏｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（両方とも、ＰＩＥＲＣＥから市販されている）；ならびにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｌｌｔｈｒｕ  ３００およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ（両方とも、Ｓｔｅｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓから市販されている）が挙げられる。特定の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィーである。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーは、ｒｍｐプロテインＡクロマトグラフィーではない。
【００７３】
一実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）水酸化ナトリウム、（ｂ）トリスおよび塩化ナトリウム、（ｃ）リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびアルギニン塩酸塩、（ｄ）酢酸ナトリウム、（ｅ）酢酸、（ｆ）注射用水（ＷＦＩ）、および（ｇ）エタノール。一実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、殺菌のために、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを含む。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程は、平衡化および負荷後洗浄１のために、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）および６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程は、負荷後洗浄２のために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、および３００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含む。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程は、負荷後洗浄３のために、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）および６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程は、溶出のために、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．７５）を含む。別の実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、ストリッピングのために、１００ｍＭの酢酸を含む。別の実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、フラッシングのために、ＷＦＩを含む。別の実施形態では、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー工程は、保管のために、２０％のエタノールを含む。別の実施形態では、回収工程からの清澄化収集物質は、フィルター（例えば、０．５／０．２μｍフィルター）を通してタンパク質Ａカラム上に負荷される。
【００７４】
別の実施形態では、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーの処理条件としては、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つ）を含む：ＮＯＲでは３０〜６０分およびＰＡＲでは３０〜７５分のバッチ前の殺菌保持時間、ＮＯＲでは３０〜６０分およびＰＡＲでは３０〜７５分のバッチ後の殺菌保持時間、ＮＯＲでは≦１００およびＰＡＲでは≦１００のカラムサイクル、ＮＯＲでは≦７日、ＰＡＲでは≦１０日の溶出液保持時間（濾過の終了から低ｐＨ酸性化の開始まで）、≧７０％の工程収率、＜５０ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過前バイオバーデン、＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過後バイオバーデン、ならびに／または＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液濾過後エンドトキシン。
【００７５】
低ｐＨウイルス不活性化工程
抗体産生中に導入される供給源物質（例えば、細胞株、細胞残渣）およびウイルスは、ウイルス汚染リスクを提示する可能性があり、これは、深刻な臨床的および経済的影響を伴う潜在的な結果をもたらし得る。プロセス中間体の極端なｐＨへの直接曝露は、バイオ医薬品製造におけるウイルスクリアランスのために使用されてきた。研究は、例えば、親和性クロマトグラフィー後のモノクローナル抗体の低ｐＨ処理（例えば、ｐＨ３．０〜３．７５）が、エンベロープウイルスに対して有効であることを証明している（Ｂｒｏｒｓｏｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８２：３２１−９，２００３）。一般に、モノクローナル抗体の製造中の極端なｐＨへの曝露は、有効かつ堅牢なウイルス減少（例えば、＞４．０ｌｏｇ１０の低減）を提供することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、低ｐＨウイルス不活性化工程も含み得る。
【００７６】
一実施形態では、本方法は、前の工程からの物質（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー精製からの溶出プール；「プール」は、クロマトグラフィー工程からの組み合わせ分画、例えば、溶出分画を含有する分画）を低ｐＨ条件に供することを含む。一実施形態では、低ｐＨは、３．０、３．１、３．２、３．２５、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７または３．７５のｐＨである。別の実施形態では、低ｐＨは３．０〜３．７５の範囲内である。別の実施形態では、低ｐＨは３．６０〜３．７５の範囲内である。別の実施形態では、本方法は、前の工程の物質を酢酸で処理することを含む。別の実施形態では、本方法は、低ｐＨが確認された後にｐＨを上昇させることと、次いで中和されたウイルス不活性化物質を濾別することとを含む。
【００７７】
別の実施形態では、低ｐＨウイルス不活性化工程は、（ａ）前の工程からの物質（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー精製からの溶出プール）を酢酸（例えば、３．６０〜３．７０のｐＨ範囲の１Ｍの酢酸）で処理することと、（ｂ）それを第２の容器に移し、混合せずに周囲温度（例えば、２０℃、２１℃、２３℃、２４℃、または２５℃）で最短６０分間（例えば、少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００分間）インキュベートし、ｐＨ範囲が３．６０〜３．７５以内であることを確認することと、（ｃ）ｐＨ５．０に上昇させて（例えば、１Ｍのトリスを使用する）、混合せずに周囲温度で最短６０分間（例えば、少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００分間）インキュベートすることと、（ｄ）中和されたウイルス不活性化物質を事前濾過する（例えば、０．５／０．２μｍフィルター）ことと、濾過産物を保管することと、を含む。
【００７８】
別の実施形態では、低ｐＨウイルス不活性化工程の処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を含む：ＮＯＲでは３．６０〜３．７０およびＰＡＲでは３．５５〜３．８０の滴定直後の酸性化ｐＨ、ＮＯＲでは３．６０〜３．７５およびＰＡＲでは３．５５〜３．８０の保持時間直後の酸性化ｐＨ、ＮＯＲでは６０〜１２０分およびＰＡＲでは≧６０〜３６０分の低ｐＨでの保持時間、ＮＯＲでは６０〜１２０分およびＰＡＲでは≧６０分の０．５／０．２μｍの濾過前の中和されたｐＨでの保持時間、ＮＯＲでは≦７日およびＰＡＲでは≦７日の濾過された中和産物保持時間（濾過の終了からＣＥＸ負荷の終了まで）、≧９０％の収率、＜５０ＣＦＵ／１０ｍＬの中和された濾過前プールバイオバーデン、＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの中和された濾過後プールバイオバーデン、ならびに／または＜５ＥＵ／ｍＬの中和された濾過後プールのエンドトキシン濃度。
【００７９】
カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
本明細書に記載の方法は、ＣＥＸ工程も含み得る。ＣＥＸは、分子をその正味表面電荷に基づいて分離するために使用される、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）の形態である。ＣＥＸは、より具体的には、負荷電官能基で修飾された樹脂を使用する。これらは、スルホプロピル、スルホエチルおよびスルホイソブチル基などの強酸性リガンド、またはカルボキシル基などの弱酸性リガンドであり得る。ＣＥＸは、中性から塩基性の範囲のｐＩ値を有する多くのモノクローナル抗体の精製プロセスに適用されている。ほとんどのヒト化ＩｇＧ１およびＩｇＧ２サブクラスは、ＣＥＸのための完璧な候補であり、抗体は、負荷工程中に樹脂に結合し、溶出緩衝液中の導電性の増加またはｐＨの増加のいずれかを通じて溶出される。ＤＮＡ、いくつかの宿主細胞タンパク質、浸出プロテインＡ、およびエンドトキシンなどの最も負に荷電したプロセス関連不純物を、負荷中に除去し、分画を洗浄する。ＣＥＸは、脱アミド産物、酸化種およびＮ末端切断形態、ならびに高分子量種などの標的抗体産物からの抗体変異型を低減するための分離力を提供することができる。
【００８０】
「カチオン交換樹脂」または「ＣＥＸ樹脂」は、負に荷電され、固相を通り過ぎる、または通過する水溶液中のカチオンと交換するための遊離カチオンを有する固相を指す。ＣＥＸ樹脂を形成するのに好適な固相に結合した任意の負に荷電したリガンド、例えば、カルボキシレート、スルホネート、および他のものを使用することができる。市販のＣＥＸ樹脂には、例えば、スルホネート系基（例えば、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓおよび３０Ｓ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＳＰ−６５０ＳおよびＳＰ−６５０Ｍ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｓ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｓ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＭおよびＬＳ  ＳＰならびにＳｐｈｅｒｏｄｅｘ  ＬＳ  ＳＰ）；スルホエチル系基（例えば、ＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ（登録商標）Ｓ−１０およびＳ−２０）；スルホプロピル系基（例えば、ＴｏｓｏｈからのＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＳＰ  ５ＰＷおよびＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＳ−２０およびＨＳ  ５０）；スルホイソブチル系基（例えば、ＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ．ｓｕｂ．３．ｓｕｐ．）；スルホキシエチル系基（例えば、ＷｈａｔｍａｎからのＳＥ５２、ＳＥ５３およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｓ）、カルボキシメチル系基（例えば、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＣＭ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＬＳ  ＣＭ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭａｔｒｅｘ（登録商標）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）Ｃ５００およびＣ２００、ＷｈａｔｍａｎからのＣＭ５２、ＣＭ３２、ＣＭ２３およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｃ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＣＭ−６５０Ｓ、ＣＭ−６５０ＭおよびＣＭ−６５０Ｃ）；スルホン酸およびカルボン酸系基（例えば、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（登録商標）Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｓｕｌｆｏｎ）；カルボン酸系基（例えば、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＷＰ  ＣＢＸ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ（登録商標）ＭＡＣ−３、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ、およびＤｉａｉｏｎ（登録商標）Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  ＥｘｃｈａｎｇｅｒｓならびにＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ）；スルホン酸系基（例えば、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄ���ｏｃｅｌｌ  ＳＰ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ａｃｉｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、ＷＰ  Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｓｔｒｏｎｇ  ＣａｔｉｏｎおよびＤｉａｉｏｎ（登録商標）Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）；ならびにオルトホスフェート系基（例えば、ＷｈａｔｍａｎからのＰ１１）を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０カチオン交換カラムが使用される。
【００８１】
一実施形態では、前の工程からの物質（例えば、低ｐＨウイルス不活性化工程からの中和濾液）を、例えば０．５／０．２μｍフィルターを通してカチオン交換カラム（例えば、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０カチオン交換カラム）上に負荷する。一実施形態では、ＣＥＸ工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）酢酸ナトリウム、（ｂ）塩化ナトリウム、（ｃ）水酸化ナトリウム、（ｄ）酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム、ならびに（ｅ）酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびアルギニン塩酸塩。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、平衡化および負荷後洗浄１のために、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、負荷後洗浄２のために、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）および６０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、溶出のために、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、９０ｍＭのアルギニン塩酸塩、および３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、ストリッピングのために、２．０Ｍの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、殺菌のために、１．０Ｎの水酸化ナトリウムを含む。別の実施形態では、ＣＥＸ緩衝液は、保管のために、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを含む。
【００８２】
別の実施形態では、ＣＥＸの処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個）を含む：ＮＯＲでは２２〜４５ｇ／ＬおよびＰＡＲでは１５〜５０ｇ／Ｌの負荷容量、ＮＯＲでは１５〜２５℃およびＰＡＲでは１３〜２７℃の温度、ＮＯＲでは４．９０〜５．１０およびＰＡＲでは４．９０〜５．１０の溶出緩衝液ｐＨ、ＮＯＲでは１１．１〜１３．６ｍＳ／ｃｍおよびＰＡＲでは１１．１〜１３．６ｍＳ／ｃｍの溶出緩衝液導電率、ＮＯＲでは１５０〜３００ｃｍ／時およびＰＡＲでは１２０〜３３０ｃｍ／時の溶出流量、ＮＯＲでは≦７日およびＰＡＲでは≦１０日の溶出液保持時間（溶出液回収の開始からＡＥＸ負荷量の調整の終了まで）、ＮＯＲでは≦１００およびＰＡＲでは≦１００のカラムサイクル、＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液濾過後バイオバーデン、＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液濾過後エンドトキシン、≧５８％の工程収率、ならびに／または２．３〜５．０カラム体積の溶出液体積。
【００８３】
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）
本明細書に記載の方法は、ＡＥＸ工程も含み得る。ＡＥＸは、樹脂に固定化された正荷電基（ジエチルアミノエチル、ＤＥＡＥもしくはジメチルアミノエチル、ＤＭＡＥなどの弱い塩基性基、または第四級アミノエチル、Ｑもしくはトリメチルアンモニウムエチル、ＴＭＡＥもしくは第四級アミノエチル、ＱＡＥなどの強い塩基性基）を使用する。これは、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシンおよび浸出プロテインＡなどのプロセス関連不純物、二量体／凝集体などの産物関連不純物、内因性レトロウイルス、ならびにパルボウイルス、仮性狂犬病ウイルスなどの外来性ウイルスを除去するための強力なツールである（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８４：１７９−８６，２００３；Ｎｏｒｌｉｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１０６９：７９−８９，２００５；およびＺｈｏｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１１３４：６６−７３，２００６）。ＡＥＸは、抗体のｐＩおよび除去される不純物に応じて、貫流モード、または結合および溶出モードのいずれかで使用することができる。ほとんどのヒト化ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体を含む、７．５を超えるｐＩを有する抗体に関して、貫流モードは、不純物を除去するためのより良い選択であり得る。貫流モードでは、不純物は樹脂に結合し、対象となる産物が貫流する。樹脂上の結合部位は不純物によってのみ占有されるため、カラム負荷容量はかなり高くすることができる。ほとんどのヒト化ＩｇＧ４抗体を含む酸性から中性範囲のｐＩを有する抗体については、結合モードおよび溶出モードを使用して、対象となる産物からプロセス関連および産物関連の不純物を除去することができる。
【００８４】
貫流モードのＡＥＸは、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、浸出プロテインＡ、および様々なウイルスなどの残留不純物を除去するために２つまたは３つの単位操作で設計されたモノクローナル抗体精製プロセスにおける研磨工程として広く使用されてきた。操作ｐＨは通常８〜８．２であり、産物負荷ならびに平衡化および洗浄緩衝液中の導電率は最大１０ｍＳ／ｃｍである。条件は、産物がカラムに結合しない一方で、核酸および宿主細胞タンパク質などの酸性不純物が結合するように選択される。抗体産物の樹脂、負荷条件および電荷変異型プロファイルに応じて、負荷された産物の量は、産物の品質を損なうことなく、樹脂１リットル当たり１００グラムに達することができる（Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１８：３０１−２７，２００１）。一般に、貫流モードで負荷される産物の量は、除去される不純物の種およびレベルに依存する。産物中の不純物のレベルが低いほど、産物の負荷量が高くなる。
【００８５】
例示的なアニオン交換樹脂には、第四級アミン樹脂または「Ｑ−樹脂」（例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＱＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）樹脂（例えば、ＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（登録商標）、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ベンゾイル化ナフトイル化ＤＥＡＥ、ジエチルアミノエチルＳｅｐｈａｃｅｌ（登録商標））、Ａｍｂｅｒｊｅｔ（登録商標）樹脂、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）樹脂（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−６７、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）強塩基性、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）弱塩基性）、コレスチラミン樹脂、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）樹脂（例えば、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＳＡＸ−１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＡＸ−１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ−１０）、ＴＳＫ−ＧＥＬ樹脂（例えば、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＤＥＡＥ−ＮＰＲ；ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＤＥＡＥ−５ＰＷ）、およびＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＡＥＸカラムは、例えば貫流モードで動作する、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ５０  ＡＥＸカラムである。
【００８６】
一実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、ＡＥＸカラムに負荷する前にｐＨを調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、トリス、アルギニン、およびＷＦＩを使用してｐＨを調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、約８．０のｐＨに調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、８．５ｍＳ／ｃｍの導電率に調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、１００ｍＭのトリス（ｐＨ９．０）、１８０ｍＭのアルギニンおよびＷＦＩを用いて、８．００のｐＨおよび８．５ｍＳ／ｃｍの導電率に調整される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、調整の２４時間以内（例えば、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、または２３時間以内）にＡＥＸカラムに負荷される。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ＣＥＸ工程からの溶出プール）は、フィルター（例えば、０．５／０．２μｍフィルター）を通してＡＥＸカラムに負荷され、結果として生じる産物は、例えば、フィルター（例えば、０．５／０．２μｍフィルター）を通して濾液容器中に濾過された緩衝液を使用して、ＡＥＸカラムからチェイスされる（例えば、フラッシュされる）。
【００８７】
別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）トリスおよびアルギニン、（ｂ）ＷＦＩ、（ｃ）塩化ナトリウム、（ｄ）トリスおよび塩化ナトリウム、ならびに（ｅ）水酸化ナトリウム。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、負荷ｐＨ調整のために、１００ｍＭのトリス（ｐＨ９．０）および１８０ｍＭのアルギニンの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、負荷導電率調整およびフラッシュのために、ＷＦＩの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、状態調節のために、２Ｍの塩化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、平衡化および負荷後のチェイスのために、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）および６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、負荷後の溶出ストリッピングのために、２Ｍの塩化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、殺菌のために、１．０Ｎの水酸化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、ＡＥＸ工程は、保管のために、０．１Ｎの水酸化ナトリウムの使用を含む。
【００８８】
別の実施形態では、ＡＥＸの処理条件は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個）を含む：ＮＯＲでは７．９０〜８．１０およびＰＡＲでは７．８０〜８．２０の負荷ｐＨ、ＮＯＲでは８．０〜９．０ｍＳ／ｃｍおよびＰＡＲでは７．０〜１０．０ｍＳ／ｃｍの負荷導電率、ＮＯＲでは２５〜９０ｇ／ＬおよびＰＡＲでは２５〜１００ｇ／Ｌの負荷容量ｐＨ、ＮＯＲでは≦１日、ＰＡＲでは≦４日の保持時間（ＡＥＸ負荷調整からＡＥＸ負荷の開始まで）、ＮＯＲでは≦４日およびＰＡＲでは≦６日の産物保持時間（ＡＥＸ負荷調整の終了からＵＦ／ＤＦの終了まで）、ＮＯＲでは≦１００およびＰＡＲでは≦１００のカラムサイクル、＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの溶出液バイオバーデン（濾過後）、ならびに／または＜５ＥＵ／ｍＬの溶出液エンドトキシン（濾過後）、ならびに≧６７％の収率。
【００８９】
ウイルス濾過
バイオ医薬品のための多くの精製プロセスは、ウイルス排除のための全体的な戦略の一部としてウイルス減少濾過を使用する（Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，４２：７９−８５，２０１４；およびＭａｒｑｕｅｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２５：４８３−９１，２００９）。ウイルス減少フィルターは、大型および中型ウイルスの堅牢かつ有効な除去を提供することができる。このようなフィルターはまた、≦２０ｎｍの孔径を有する非常に小さいウイルス（例えば、パルボウイルス）を有効に除去することができる。
【００９０】
典型的なウイルス濾過膜は、親水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、親水性ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）および再生セルロースから作製される。除去されるウイルスのサイズ分布によると、ウイルスフィルターは、レトロウイルスフィルターとパルボウイルスフィルターとに分類することができる。例示的なウイルスフィルターとしては、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）１５Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）３５Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ  ＢｉｏＥＸ（登録商標）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＰ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＲ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｕｌｔｉｐｏｒ（登録商標）ＤＶ２０、Ｕｌｔｉｐｏｒ（登録商標）ＤＶ５０、およびＶｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶが挙げられるが、これらに限定されない。パルボウイルスは、１８〜２６ｎｍの直径を有し、典型的なｍＡｂは、８〜１２ｎｍの流体力学的径を有する。
【００９１】
本明細書に記載の方法は、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程も含み得る。一実施形態では、フィルターは使用前にフラッシュされる（例えば、ＷＦＩおよび緩衝液を使用して）。別の実施形態では、ＡＥＸからの貫流濾液は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ  Ｓｈｉｅｌｄプレフィルター（例えば、０．５／０．２μｍ）を通して濾過され、その後、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏフィルター（例えば、２０ｎｍ）を通して濾過される。
【００９２】
別の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）トリスおよび塩化ナトリウム、ならびに（ｂ）ＷＦＩ。別の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程は、使用前のフラッシュとしてのＷＦＩの使用を含む。別の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程は、平衡化および負荷後のチェイスのために、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）および６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００９３】
別の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子を除去するための濾過工程は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個）を含む：ＮＯＲでは２１〜３２ｐｓｉｄおよびＰＡＲでは２１〜３５ｐｓｉｄの負荷およびチェイス中のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏフィルター差圧、ＮＯＲでは０分およびＰＡＲでは≦１２０分の負荷およびチェイス中の総休止時間、ＮＯＲでは≦１５Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは≦２０Ｌ／ｍ２のチェイス体積、使用後の整合性試験に合格すること、ＮＯＲでは３．０〜６．０ｇ／ＬおよびＰＡＲでは≦６．７ｇ／Ｌの負荷濃度、ＮＯＲでは≦７００Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは≦１２００Ｌ／ｍ２のｓｈｉｅｌｄ  Ｈプレフィルター負荷、ＮＯＲでは≦７００Ｌ／ｍ２およびＰＡＲでは≦７００Ｌ／ｍ２のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏフィルター負荷、ＮＯＲでは≦４日およびＰＡＲでは≦６日の産物保持時間（ＡＥＸ負荷調整の終了からＵＦ／ＤＦの終了まで）、＜３ＣＦＵ／１０ｍＬのバイオバーデン（前濾過ウイルスフィルター負荷）、＜２ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン（ウイルス濾液）、使用前の整合性試験に合格すること、ならびに／または≦１２時間の処理時間（負荷開始から負荷終了まで）、ならびに／または≧９０％の工程収率。
【００９４】
濃度および透析濾過
本明細書に記載の方法は、濃縮および透析濾過工程も含み得る。一実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ウイルス濾過工程からのプール）は、限外濾過され、濃縮される。
【００９５】
透析濾過は、限外濾過膜を使用して、タンパク質、ペプチド、核酸、および他の生体分子を含有する溶液から塩または溶媒の濃度を完全に除去、置き換え、または低下させる技術である。本プロセスは、透過性（多孔質）膜フィルターを選択的に利用して、それらの分子量に基づいて溶液および懸濁液の成分を分離する。限外濾過膜は、膜の孔よりも大きい分子を保持する一方で、１００％透過性である塩、溶媒、および水などのより小さい分子は、膜を自由に通過する。
【００９６】
限外濾過は、タンパク質濃縮および緩衝液交換に広く使用される圧力駆動膜プロセスである。限外濾過は、膜孔より大きな種が保持され、より小さい種が自由に通過するサイズベースの分離である。分離は、所与の圧力駆動力下での膜を通る異なる成分の濾過率における差異を通して達成される（ｖａｎ  Ｒｅｉｓ，Ｒ．＆Ｚｙｄｎｅｙ，Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ  ＭＣ，Ｄｒｅｗ  ＳＷ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；１９９９．ｐｐ．２１９７−２２１４）。緩衝液交換は、所望の最終組成物の緩衝液が濾液が除去されるのと同じ速度で保持剤系に添加される透析濾過モードを使用して達成され、したがって一定の保持剤体積を維持する。
【００９７】
一実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ウイルス濾過工程からのプール）は、透析濾過される。別の実施形態では、得られた濃縮産物は測定され、希釈される（例えば、１０．０ｇ／Ｌまで）。別の実施形態では、前の工程からの物質（例えば、ウイルス濾過工程からのプール）は、（ａ）３０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＵＦ膜を使用して、例えば５５ｇ／Ｌまで限外濾過および濃縮され、（ｂ）製剤緩衝液中に（例えば、６倍の透析濾過体積で）透析濾過し、得られた濃縮産物が測定され、希釈される（例えば、１０．０ｇ／Ｌまで）。別の実施形態では、製剤緩衝液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、希釈産物が濾過され（例えば、０．５／０．２μｍフィルターを通して）、ポリソルベート８０が希釈産物プールに添加されて、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の最終濃度を達成する。
【００９８】
別の実施形態では、濃縮および透析濾過工程は、限定されないが、以下を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つ）の緩衝液の使用を含む：（ａ）ＷＦＩ、（ｂ）水酸化ナトリウム、（ｃ）リン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ならびに（ｄ）ポリソルベート８０。別の実施形態では、濃縮および透析濾過工程は、フラッシュとしてのＷＦＩの使用を含む。別の実施形態では、濃縮および透析濾過工程は、殺菌のために、０．５Ｍの水酸化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、濃縮および透析濾過工程は、平衡化、透析濾過、チェイス、および／またはプール希釈のために、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、濃縮および透析濾過工程は、保管のために、０．１Ｍの水酸化ナトリウムの使用を含む。別の実施形態では、濃縮および透析濾過工程は、賦形剤のために、１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の使用を含む。
【００９９】
別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個）を含む：ＮＯＲでは計算体積の１％以内およびＰＡＲでは計算体積の３％以内の希釈、１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０が、ＮＯＲでは０．１９〜０．２１％（ｗ／ｖ）の希釈ＵＦ／ＤＦ産物およびＰＡＲでは０．１７〜０．２３％（ｗ／ｖ）の希釈ＵＦ／ＤＦ産物であること、６．５〜７．５の未製剤化製剤原料ｐＨ、９．０〜１１．０ｍｇ／ｍＬの希釈ＵＦ／ＤＦ産物濃度、使用前整合性試験に合格すること、ＮＯＲでは１００〜５００ｇ／ｍ２およびＰＡＲでは５０〜６００ｇ／ｍ２以内の膜負荷量、ＮＯＲでは２４０〜４２０ＬＭＨおよびＰＡＲでは１８０〜４４０ＬＭＨ以内の供給流束、ＮＯＲでは１０〜３０ｐｓｉおよびＰＡＲでは８〜３５ｐｓｉ以内の膜間圧力差、ＮＯＲでは１５〜２５℃およびＰＡＲでは１２〜３０℃以内の圧力、ＮＯＲでは１〜３およびＰＡＲでは１〜５以内のフェドバッチ（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）比、ＮＯＲでは１３〜１７ｇ／ＬおよびＰＡＲでは１２〜２０ｇ／Ｌ以内の限外濾過目標の終了時の濃度、ＮＯＲでは５．５〜７．０およびＰＡＲでは４．５〜７．０以内の透析当量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）、ＮＯＲでは≦４日およびＰＡＲでは≦６日以内の未製剤化ＵＦ／ＤＦ未透過液保持、ＮＯＲでは≦７日およびＰＡＲでは≦１４日以内の産物保持（希釈されたＵＦ／ＤＦ産物）、≧９０％の工程収率、≦１１．１時間の処理時間（初期濃度の開始から透析濾過の終了まで）、初期の７５〜１２５％の使用後の正規化水透過性（ＮＷＰ）流速、＜１０ＣＦＵ／１０ｍＬの希釈された限外濾過／透析濾過の濾過前のプールバイオバーデン、ならびに／または＜３ＣＦＵ／１０ｍＬの希釈されたＵＦ／ＤＦの濾過後のプールバイオバーデン、ならびに／または＜２ＥＵ／ｍＬの希釈されたＵＦ／ＤＦの濾過後のプールエンドトキシン。
【０１００】
別の実施形態では、濃縮および／または透析濾過工程は、以下のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個）を含む：４０〜６０ｇ／Ｌの初期濃度目標、最終濃度目標（１４０〜１６０ｇ／Ｌ）（１．０７回収係数を含む）、６．０の目標での、４．５〜７．５の透析当量、≦２４時間の希釈されていない限外濾過／透析濾過された産物の保持、≦２４時間の希釈された限外濾過／透析濾過された産物の保持、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ３  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  Ｃスクリーン３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターの使用、ｇ．≧２０Ｌ／ｍ２のフラッシュＷＦＩ、５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＬ−Ａｒｇ（≧２０Ｌ／ｍ２）の平衡化、≦６００Ｌ／ｍ２以下の膜負荷、３６０ＬＭＨのすべての産物工程の目標供給流量、１５ｐｓｉのすべての産物工程の目標膜間圧力差、供給圧力または≦５０ｐｓｉ（増加させることができる）、平衡化と同じ透析濾過緩衝液、供給圧力によって制御できる最終濃度（ＴＭＰまたは供給流量ではない）、１５〜３５℃の温度、≦１×システム保持体積（ＣＳＤごとに計算が必要）による回収、ＤＦ／平衡化緩衝液による目標の１２０ｇ／Ｌへの希釈、０．１９１９〜０．２３９３ｋｇ／ｋｇの賦形剤添加緩衝液（ＥＡＢ−５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＬ−Ａｒｇ、３０％スクロース０．３０％（ｗ／ｖ）、ＰＳ  ８０）を１２０ｇ／ＬのＵＦ／ＤＦ産物に添加し、最終製剤にすること、最大２０サイクルの膜再使用、０．５ＭのＮａＯＨによる殺菌、０．１ＭのＮａＯＨとともに保管、＞６０％の収率（９０％を超えると予想される）、≦４０Ｌ／ｍ２のＳＨＣ濾過性１２０ｇ／Ｌ  ＵＦ／ＤＦ産物を表すこと、および≦３０４５Ｌ／ｍ２のＳＨＣ濾過性ＢＤＳを表すこと。
【０１０１】
バルク濾過
本明細書に記載の方法は、バルク濾過工程も含み得る。一実施形態では、前の工程から（例えば、限外濾過および透析濾過工程から）の物質をバルク濾過する。
【０１０２】
抗Ｃ５抗体
「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原結合部位（例えば、ＶＨ／ＶＬ領域もしくはＦｖ、またはＣＤＲ）を含むポリペプチドを説明する。抗体には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、イムノアドヘシン、抗体−イムノアドヘシンキメラ、ヒト化、ヒト、キメラ、一本鎖、ラクダ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、移植、またはインビトロ生成抗体が挙げられるが、これらに限定されない、既知の形態の抗体が含まれる。抗体は、完全長抗体または抗体断片であり得る。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、またはキメラ抗体であり得る。抗体はまた、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ＳＭＩＰ、アフィボディ（登録商標）、ナノボディ、または単一ドメイン抗体であり得る。抗体はまた、以下のアイソタイプのいずれかであり得る：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはそれらのキメラバージョンがある。抗体は、天然に存在する抗体またはタンパク質操作技術によって（例えば、変異、欠失、置換、非抗体部分へのコンジュゲーションによって）変更された抗体であり得る。抗体は、例えば、抗体の特性（例えば、機能特性）を変化させる１つ以上の変異型アミノ酸（天然に存在する抗体と比較して）を含むことができる。そのような改変の多くは、例えば、患者における抗体に対する半減期、エフェクター機能、および／または免疫応答に影響を与える当該技術分野で既知である。抗体という用語はまた、少なくとも１つの抗体由来抗原結合部位を含む人工または操作されたポリペプチド構築物も含む。
【０１０３】
例示的な抗Ｃ５抗体は、それぞれ配列番号１４および１１に示される配列を有する重鎖および軽鎖を含むラブリズマブ、またはその抗原結合断片および変異型である。ラブリズマブは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２２５および米国特許第９，０７９，９４９号に記載されており、これらの教示は参照により本明細書に組み込まれる。ラブリズマブは、ヒト補体タンパク質Ｃ５に選択的に結合し、補体活性化中にそのＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断を阻害する。この阻害は、微生物のオプソニン作用および免疫複合体のクリアランスに不可欠な補体活性化の近位または初期成分（例えば、Ｃ３およびＣ３ｂ）を保持しながら、炎症誘発性媒介体Ｃ５ａの放出および細胞溶解性細孔形成膜攻撃複合体（ＭＡＣ）Ｃ５ｂ−９の形成を防止する。
【０１０４】
他の実施形態では、抗体は、ラブリズマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む。したがって、一実施形態では、抗体は、配列番号１２に記載の配列を有するラブリズマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号８に記載の配列を有するラブリズマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１９、１８、および３にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１２および配列番号８で記載されるアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【０１０５】
他の実施形態では、本明細書に開示される方法に従って産生される抗Ｃ５抗体は、１０ｍｇ／ｍＬ溶液に製剤化される。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、例えば、ＩＶ投与に好適な殺菌された防腐剤を含まない１０ｍｇ／ｍＬ溶液に製剤化される。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、２０ｍＬの単回使用バイアルに供給される。別の実施形態では、各バイアルは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％のポリソルベート８０、および７．０のｐＨの注射用水中に１５０ｍｇのラブリズマブを含有する。
【０１０６】
他の実施形態では、本明細書に開示される方法に従って産生される抗Ｃ５抗体は、１００ｍｇ／ｍＬ溶液に製剤化される。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、例えば、皮下投与に好適な殺菌された防腐剤を含まない１００ｍｇ／ｍＬ溶液に製剤化される。別の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、２ｍＬの単回使用バイアルに供給される。別の実施形態では、各バイアルは、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのアルギニン、５％のスクロース、および０．０５％のポリソルベート８０、ならびに７．４のｐＨの注射用水中に１００ｍｇ／ｍＬのラブリズマブを含有する。
【０１０７】
ＣＤＲの正確な境界は、異なる方法に従って異なるように定義されている。いくつかの実施形態では、軽鎖または重鎖可変ドメイン内のＣＤＲまたはフレームワーク領域の位置は、Ｋａｂａｔらによって定義された通りであり得る［（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ．」ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ］。このような場合、ＣＤＲは、「Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ」（例えば、「Ｋａｂａｔ  ＬＣＤＲ２」または「Ｋａｂａｔ  ＨＣＤＲ１」）と称され得る。いくつかの実施形態では、軽鎖または重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．らによって定義される通りであり得る（Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８３，１９８９）。したがって、これらの領域は、「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ」（例えば、「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＬＣＤＲ２」または「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＨＣＤＲ３」）と称され得る。いくつかの実施形態では、軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ−Ｃｈｏｔｈｉａ組み合わせ定義によって定義され得る。このような実施形態では、これらの領域は、「組み合わせたＫａｂａｔ−Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ」と称され得、（Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ．，３３：１３８９−４０１，１９９６）は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義によるＣＤＲ境界の識別を例示する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、ＧＨＩＦＳＮＹＷＩＱ（配列番号１９）を含むかまたはそれからなる重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、ＥＩＬＰＧＳＧＨＴＥＹＴＥＮＦＫＤ（配列番号１８）を含むかまたはそれからなる重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＨＩＦＳＮＹＷＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＧＨＴＥＹＴＥＮＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＦＦＧＳＳＰＮＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＧＡＳＥＮＩＹＧＡＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＬＮＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む。
【０１１０】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、それぞれ配列番号２０および１１に示される配列を有する重鎖および軽鎖を含む抗体ＢＮＪ４２１、またはその抗原結合断片および変異型である。ＢＮＪ４２１は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２２５および米国特許第９，０７９，９４９号に記載されており、これらの教示は参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、抗体は、ＢＮＪ４２１の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む。したがって、一実施形態では、抗体は、配列番号１２に記載の配列を有するＢＮＪ４２１のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号８に記載の配列を有するＢＮＪ４２１のＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１９、１８、および３にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１２および配列番号８で記載されるアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【０１１１】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、米国特許第８，２４１，６２８号および同第８，８８３，１５８号に記載される７０８６抗体である。一実施形態では、抗体は、７０８６抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２１、２２、および２３にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号２４、２５、および２６にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７に記載の配列を有する７０８６抗体のＶＨ領域、および、配列番号２８に記載の配列を有する７０８６抗体のＶＬ領域を含む。
【０１１２】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、米国特許第８，２４１，６２８号および同第８，８８３，１５８号にも記載される８１１０抗体である。一実施形態では、抗体は、８１１０抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２９、３０、および３１にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号３２、３３、および３４にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号３５に記載の配列を有する８１１０抗体のＶＨ領域、および、配列番号３６に記載の配列を有する８１１０抗体のＶＬ領域を含む。
【０１１３】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、ＵＳ２０１６／０１７６９５４Ａ１に記載される３０５ＬＯ５抗体である。一実施形態では、抗体は、３０５ＬＯ５抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３７、３８、および３９にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号４０、４１、および４２にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号４３に記載の配列を有する３０５ＬＯ５抗体のＶＨ領域、および、配列番号４４に記載の配列を有する３０５ＬＯ５抗体のＶＬ領域を含む。
【０１１４】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、ＳＫＹ５９抗体である（Ｆｕｋｕｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，７：１０８０．２０１７）。一実施形態では、抗体は、ＳＫＹ５９抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む。別の実施形態では、抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号４５を含む重鎖および配列番号４６を含む軽鎖を含む。
【０１１５】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、ＵＳ２０１７／０３５５７５７に記載されるＲＥＧＮ３９１８抗体（Ｈ４Ｈ１２１６６ＰＰとしても知られる）である。一実施形態では、抗体は、配列番号４７を含む重鎖可変領域および配列番号４８を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号４９を含む重鎖および配列番号５０を含む軽鎖を含む。
【０１１６】
本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、いくつかの実施形態では、変異型ヒトＦｃ定常領域が由来する天然ヒトＦｃ定常領域よりも高い親和性でヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する変異型ヒトＦｃ定常領域を含むことができる。Ｆｃ定常領域は、例えば、変異型ヒトＦｃ定常領域が由来する天然ヒトＦｃ定常領域と比較して、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８つ以上）のアミノ酸置換を含むことができる。置換は、例えば、変異型Ｆｃ定常領域を含有するＩｇＧ抗体のｐＨ６．０でのＦｃＲｎへの結合親和性を増加させる一方で、相互作用のｐＨ依存性を維持することができる。抗体のＦｃ定常領域における１つ以上の置換が、（相互作用のｐＨ依存性を維持しながら）ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対するＦｃ定常領域の親和性を増加させるかどうかを試験する方法が当該技術分野で既知であり、実施例に例示される（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２２５および米国特許第９，０７９，９４９号、これらのそれぞれの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１１７】
ＦｃＲｎに対する抗体Ｆｃ定常領域の結合親和性を増強させる置換は当該技術分野において既知であり、例えば、（１）Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ三重置換（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：２３５１４−２４，２００６）；（２）Ｍ４２８ＬまたはＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ置換（Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：６２１３−６，２００４；Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７６：３４６−５６，２００６）；および（３）Ｎ４３４ＡまたはＴ３０７／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ置換（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：１７５９−６９，２００６）が挙げられる。さらなる置換対形成、例えば、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、およびＤ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈも記載されている（Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２：１７０９−１７，２００７）。引用文献の各々の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、変異型定常領域は、ＥＵアミノ酸残基２５５においてバリンに対する置換を有する。いくつかの実施形態では、変異型定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３０９においてアスパラギンに対する置換を有する。いくつかの実施形態では、変異型定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３１２においてイソロイシンに対する置換を有する。いくつかの実施形態では、変異型定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３８６において置換を有する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ定常領域は、それが由来する天然定常領域に対して、３０個以下（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下）のアミノ酸置換、挿入または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０ＩおよびＶ３０８Ｆからなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ヒトＦｃ定常領域は、それぞれＥＵ番号付けにおいて、４２８位にメチオニンを含み、４３４位にアスパラギンを含む。いくつかの実施形態では変異型Ｆｃ定常領域は、例えば、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，０８８，３７６号に記載される４２８Ｌ／４３４Ｓ二重置換を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、これらの変異の正確な位置は、抗体操作のために天然ヒトＦｃ定常領域位置からシフトされ得る。ＩｇＧ２／４キメラＦｃで使用される場合４２８Ｌ／４３４Ｓ二重置換は、例えば、ラブリズマブに見出され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，０７９，９４９号に記載されるＭ４２９ＬおよびＮ４３５Ｓ変異型と同様に４２９Ｌおよび４３５Ｓに対応し得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、変異型定常領域は、天然ヒトＦｃ定常領域に対するアミノ酸位置２３７、２３８、２３９、２４８、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６５、２７０、２８６、２８９、２９７、２９８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３２５、３３２、３３４、３６０、３７６、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、４２４、４２８、４３３、４３４または４３６（ＥＵ番号付け）での置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、２３７位のグリシンに対するメチオニン；２３８位のプロリンに対するアラニン；２３９位のセリンに対するリジン；２４８位のリジンに対するイソロイシン；２５０位のスレオニンに対するアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン；２５２位のメチオニンに対するフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン；２５４位のセリンに対するスレオニン；２５５位のアルギニンに対するグルタミン酸；２５６位のスレオニンに対するアスパラギン酸、グルタミン酸またはグルタミン；２５７位のプロリンに対するアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、スレオニンまたはバリン；２５８位のグルタミン酸に対するヒスチジン；２６５位のアスパラギン酸に対するアラニン；２７０位のアスパラギン酸に対するフェニルアラニン；２８６位のアスパラギンに対するアラニンまたはグルタミン酸；２８９位のスレオニンに対するヒスチジン；２９７位のアスパラギンに対するアラニン；２９８位のセリンに対するグリシン；３０３位のバリンに対するアラニン；３０５位のバリンに対するアラニン；３０７位のスレオニンに対するアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンまたはチロシン；３０８位のバリンに対するアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミンまたはスレオニン；３０９位のロイシンまたはバリンに対するアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリンまたはアルギニン；３１１位のグルタミンに対するアラニン、ヒスチジンまたはイソロイシン；３１２位のアスパラギン酸に対するアラニンまたはヒスチジン；３１４位のロイシンに対するリジンまたはアルギニン；３１５位のアスパラギンに対するアラニンまたはヒスチジン；３１７位のリジンに対するアラニン；３２５位のアスパラギンに対するグリシン；３３２位のイソロイシンに対するバリン；３３４位のリジンに対するロイシン；３６０位のリジンに対するヒスチジン；３７６位のアスパラギン酸に対するアラニン；３８０位のグルタミン酸に対するアラニン；３８２位のグルタミン酸に対するアラニン；３８４位のアスパラギンまたはセリンに対するアラニン；３８５位のグリシンに対するアスパラギン酸またはヒスチジン；３８６位のグルタミンに対するプロリン；３８７位のプロリンに対するグルタミン酸；３８９位のアスパラギンに対するアラニンまたはセリン；４２４位のセリンに対するアラニン；４２８位のメチオニンに対するアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシン；４３３位のヒスチジンに対するリジン；４３４位のアスパラギンに対するアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、またはチロシン；および４３６位のチロシンまたはフェニルアラニンに対するヒスチジン（すべてがＥＵ番号付けされている）からなる群から選択される。
【０１２２】
例示的な抗Ｃ５抗体は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド、および／または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。あるいは、抗Ｃ５抗体は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド、および／または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１２３】
一実施形態では、抗体は、ｐＨ７．４および２５℃で、少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１５、０．１７５、０．２、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５または０．９７５）ｎＭである親和性解離定数（ＫＤ）でＣ５に結合する。いくつかの実施形態では、抗Ｃ５抗体、またはその抗原結合断片のＫＤは、１以下（例えば、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３または０．２）ｎＭ以下である。
【０１２４】
他の実施形態では［（２５℃、ｐＨ６．０でのＣ５への抗体のＫＤ）／（２５℃、ｐＨ７．４でのＣ５への抗体のＫＤ）］は、２１を超える（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００または８０００を超える）。
【０１２５】
以下の実施例は単なる例示にすぎず、多くの変形形態および透過物が本開示を読むと当業者には明白になるであろうため、本開示の範囲をいかなる方法でも限定するものと解釈されるべきではない。本出願を通して引用されるすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許、および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：ラブリズマブ製造プロセス
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）起源の３Ａ５−５０Ｄ６細胞を含有するワーキングセルバンク（ＷＣＢ）のバイアルを解凍し、産生バイオリアクターに接種する前に、振盪フラスコ、ロッカーバイオリアクター、およびシード増殖バイオリアクターを使用して一連の細胞培養工程を通して成長培地を使用して培養物を徐々に増殖させた。細胞培養工程の完了時に、細胞および細胞残渣を、一連のデプスフィルターによって除去した。精製の前に、０．５／０．２μｍのフィルターを通して、清澄化収集物を濾過した。
【０１２７】
下流ラブリズマブ製剤原料製造プロセスは、３つのクロマトグラフィー工程（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、およびＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ５０アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー）、低ｐＨウイルス不活性化工程、およびウイルス濾過（２０ｎｍ）工程を含む。最終濃縮／透析濾過および製剤化工程の後、製剤化され希釈された限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）プールを容器に０．５／０．２μｍで濾過し、ラブリズマブ製剤原料を差し止めバッチ処分、長期保管、および医薬品製造施設への配送前に２〜８℃で保管した。ラブリズマブ製剤原料の製造プロセスの流れ図を図１に記載する。製造プロセスの全体を通して、バイオリアクターバッグ、中間保持容器、およびフィルターを含む単回使用消耗品を利用した。
【０１２８】
製剤原料の一貫した効力および安全性を確保するラブリズマブの包括的な制御戦略を採用するために、製剤原料製造プロセスのすべてのパラメータおよび属性の重要度が決定されている。製造現場に移管すると、現場の疱疹／定義に合わせて、施設固有のリスクアセスメントが完了した。制御戦略から任意のパラメータまたは属性に割り当てられた重要度に変化はなかった。
【０１２９】
リスクアセスメントによって推進されるプロセス特性評価試験を完了し、製品の品質に影響を与える可能性がある製造プロセス内で特定された各パラメータについて立証された許容範囲（ＰＡＲ）を決定した。製造プロセス記述内の日常的な操作のために、ＰＡＲ以内またはＰＡＲに等しい通常の稼働範囲（ＮＯＲ）が特定された。日常的な処理の間、ＮＯＲの外側のいかなる可動域も、逸脱の開始およびその後の調査を促した。調査の後、材料はそれに応じて処分されたであろう。
【０１３０】
ラブリズマブを、２，０００ＬのバイオリアクタースケールでＣＨＯ細胞中で製造した。２，０００Ｌの産生バイオリアクターの接種に使用した細胞は、単一のＷＣＢバイアルに由来した。しかしながら、複数の製剤原料バッチは、ロールバック培養を利用することによって、ＷＣＢの単一バイアルから産生され得る。各製剤原料バッチは、１０ｇ／Ｌのラブリズマブの濃度で約３００Ｌをもたらした。抗体発現および工程収率は、個々のバッチ収率に影響を及ぼすラブリズマブ製剤原料製造プロセスにおける因子である。単位操作ごとに固有の識別バッチ番号が割り当てられた。ウイルス濾過またはバルク濾過工程での再処理の場合には、新たな固有の識別バッチ番号が割り当てられた。
【０１３１】
１．細胞培養および一次回収
このセクションでは、ラブリズマブ製剤原料の製造のための細胞培養および一次回収（採取）プロセスについて説明する。細胞培養および採取プロセスは、図１に要約され、図２〜４にさらに詳述される３つの別個の工程（接種材料増殖、産生バイオリアクター中の細胞培養、および一次回収）を含む。
【０１３２】
ａ．工程１：接種材料増殖
接種材料増殖プロセス工程の目的は、２，０００Ｌ産生バイオリアクターに接種するのに十分な細胞質量にＷＣＢを増殖させるであった。接種材料増殖工程中の培養条件の温度を３６．５℃の設定値に維持した。図２は、接種材料増殖製造プロセスのプロセスフローおよび主要プロセスパラメータ（ＫＰＰ）ならびに主要プロセス属性（ＫＰＡ）を概説している。表１は、接種材料増殖についてのＫＰＰおよびＫＰＡを含む。
【０１３３】
ＷＣＢのバイアルを液体窒素貯蔵の蒸気相から除去し、生産設備内の安全キャビネットに移した。細胞を解凍し、洗浄して冷凍保存培地を除去し、再懸濁し、接種培地（２５μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を補充したＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴ培地）を用いて２５０ｍＬの振盪フラスコ中で培養した。フラスコ培養物を１０％のＣＯ２下でインキュベートし、表１に記載される基準が満たされるまで最長６日間撹拌した後、１Ｌの振盪フラスコに播種した。これにより、接種材料増殖の振盪フラスコ相が開始される。
【０１３４】
細胞を１０％のＣＯ２下でインキュベートした接種培地中で増殖させ、表１に記載される基準が満たされるまで最長６日間撹拌した後、接種材料増殖のロッカーバイオリアクター相に播種した。１Ｌの振盪フラスコ培養物は、バックアップ培養物を接種するために使用され得る。バックアップ培養物が必要でない場合、それを２０Ｌのロッカーバイオリアクター増殖時に廃棄した。
【０１３５】
ロッカーバイオリアクターから５０Ｌのシードバイオリアクターに移行する前に、体積を増大させた（２Ｌから２０Ｌに）ロッカーバイオリアクター中の接種培地中で細胞をさらに増殖させた。各ロッカーバイオリアクターを５％のＣＯ２でインキュベートし、表１に記載の基準が満たされるまで最長６日間振動させた後、サイズを増大させた次のロッカーバイオリアクターに進むか、または接種材料増殖のシードバイオリアクター相に播種した。必要に応じて、２０Ｌのロッカーバイオリアクター培養物を使用して、ロールバック２Ｌ培養物を接種することができた。
【０１３６】
細胞を、体積を増大させた（５０Ｌから５００Ｌに）単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）中の増殖培地（ＭＳＸ補充を伴わないＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴ培地）中で増殖させた後、プロセスの工程２に移行した。接種後、各ＳＵＢに必要に応じて、表１に記載の基準が満たされるまで、空気および酸素で最長６日間撹拌しながら、スパージした後、サイズを増大させた次のＳＵＢに進むか、またはプロセスの工程２に進んだ。３０％の溶存酸素設定値および６．９５の設定値のｐＨを維持した。ｐＨは、炭酸ナトリウムを塩基として、ＣＯ２を酸として使用して制御した。発泡を制御するために、必要に応じて、消泡剤（動物由来を含まない）をシードバイオリアクターに添加することができた。
【表１】
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【０１３７】
ｂ．工程２：生産バイオリアクターにおける細胞培養
この工程の目的は、ラブリズマブ抗体を産生することであった。図３は、産生バイオリアクターにおける細胞培養プロセスのための、プロセス制御（ＩＰＣ）およびＫＰＡにおけるプロセスフローおよび重要なプロセスパラメータ（ＣＰＰ）ならびにＫＰＰを概説する。
【０１３８】
硫酸銅五水和物を、２０μＭの濃度で２，０００Ｌの産生バイオリアクターに添加した。５００ＬのＳＵＢ細胞培養物を産生培地（０．３４ｇ／ｋｇのＬ−システイン塩酸塩一水和物および０．２７ｇ／ｋｇのＬ−チロシンを補充したＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴ培地）に接種した。酸性対照のためのＣＯ２および塩基対照のための１Ｍの炭酸ナトリウムの使用によって、バイオリアクターのｐＨを制御した。ｐＨを目標の６．９５に維持し、温度を目標の３６．５℃に維持した。発泡を最小限に抑えるために、過剰な発泡があったときに、消泡剤を添加することができた。溶存酸素を、必要に応じて空気および酸素をスパージすることによって、３０％の設定値で制御した。培養物を必要に応じてブドウ糖で補充した。４日目、６日目および８日目に、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｃ＋を産生バイオリアクターに添加した。
【０１３９】
プロセスの産生バイオリアクター相は、表３に特定された採取基準が満たされるまで継続し、その後プロセスの工程３に進んだ。バイオバーデン、マイコプラズマ、インビトロウイルスアッセイ、および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＰＣＲ）によるネズミ微小ウイルスアッセイのために試料を採取した。
【表２】
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【表３】
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【０１４０】
ｃ．工程３：一次回収：清澄化および採取後の０．５／０．２μｍ濾過
一次回収工程は、細胞培養ブロス中のラブリズマブ抗体を細胞および細胞残渣から分離する。デプス濾過トレインをフラッシュし、使用前に平衡化した。細胞培養ブロスを濾過し、連続する２段階のデプス濾過トレインを通してチェイスした後、連続する２つの０．５／０．２μｍのフィルターを通して、ジャケット付きの２，０００Ｌの単回使用混合バイオプロセス容器に濾過した。
【０１４１】
図４は、ラブリズマブの製造プロセスの工程３のプロセスフローならびにＫＰＰおよびＫＰＡを示す。一次回収工程で使用した緩衝液を表４に提示する。表５は、一次回収工程についてのＫＰＰおよびＫＰＡを含む。
【表４】
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【表５】
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【０１４２】
２．精製および修飾反応
精製プロセスは、直交精製工程を使用して清澄化された収集物からプロセスおよび産物に関連する不純物を除去し、続いて濃縮して原薬（ＢＤＳ）に製剤化することによってラブリズマブを精製するように設計された。図５は、ラブリズマブ精製プロセスの概要を提供する。全精製プロセス中の温度を周囲温度に維持した。
【０１４３】
精製プロセスは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによるラブリズマブ抗体の捕捉から開始した。次いで、このプールを低ｐＨウイルス不活性化ホールドで処理し、続いて、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０  ＣＥＸクロマトグラフィーおよびＰＯＲＯＳ  ＨＱ５０  ＡＥＸクロマトグラフィー工程によるさらなる精製を行った。次いで、このプールを、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ（登録商標）２０ｎｍウイルス減少濾過工程を通して濾過した。この濾液を濃縮し、医薬品製剤緩衝液中に透析濾過した。最後に、ポリソルベート８０を添加して産物の製剤を完成した。得られた材料は、医薬品製造のために配送する前に、２〜８℃での保管用のバッグに０．５／０．２μｍで濾過した。
【０１４４】
プロセス全体を通して、図５に記載されるように、０．５／０．２μｍの濾過を使用した。濾過直前に、それぞれのプロセスホールドの終了時に、バイオバーデンおよびエンドトキシンについてプロセス中間体をサンプリングした。微生物モニタリングの限界を、表７、表９、表１２、表１５、表１８、表２１、および表２３に含めた。
【０１４５】
ａ．工程４：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡ親和性クロマトグラフィー
この工程の目的は、ラブリズマブ抗体の一次捕捉であった。プロテインＡクロマトグラフィーは、樹脂がラブリズマブのＦＣ部分に選択的に結合し、不純物が負荷されたカラムを流れることを可能にする親和性クロマトグラフィー工程である。次いで、結合した産物を、溶出緩衝液でｐＨを減少させることによって樹脂から溶出させる。この工程に使用した緩衝液を、表６に列挙する。
【０１４６】
各バッチの最初の使用前および各サイクルの後、カラムは洗浄／殺菌され、平衡化される。カラム負荷後、カラム性能を検証し、理論プレート数≧１０００Ｎ／ｍ（ＫＰＡ）および非対称係数０．８〜１．６（ＫＰＡ）を達成した。
【０１４７】
工程３からの清澄化された収集物質は、ＭａｂＳｅｌｃｔ  ＳｕＲｅカラムの負荷物として機能した。材料を、０．５／０．２μｍのフィルターを通してカラムに負荷した。不純物を洗浄緩衝液で除去した。産物を溶出緩衝液を使用してカラムから溶出させた。この工程は通常、バッチ当たり３サイクルで操作され、さらなる処理のために溶出液をプールした。プールを、次のプロセス工程の開始前に周囲温度で保管した。
【０１４８】
表７は、ＭａｂＳｅｌｃｔ  ＳｕＲｅクロマトグラフィー工程についてのＫＰＰおよびＫＰＡを要約する。カラム負荷量を、清澄化された収集物のプロテインＡ  ＨＰＬＣによる力価に基づいて計算した。工程収率は、清澄化した収集物からの濃度測定（ＰｒｏＡ力価に基づく）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡ親和性プールらのＡ  ２８０によって測定した濃度に基づいた。各サイクル後、カラムを回収し（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）、フラッシュし、洗浄／殺菌した。
【表６】
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【表７】
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【０１４９】
ｂ．工程５：低ｐＨ保持ウイルス不活性化
この工程の目的は、低ｐＨ処理によってプロセス流中の潜在的なエンベロープウイルスを不活性化することであった。プロテインＡプールを、１Ｍの酢酸で、３．６０〜３．７０のｐＨ範囲まで処理した。ｐＨ調整後、プールを第２の容器に移し、保持中に混合することなく、周囲温度で最短６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了時に、インキュベーション後にｐＨが３．６０〜３．７５以内であるように再度測定した。保持後、１Ｍのトリスを使用してｐＨをｐＨ５．０に上昇させ、保持中に混合することなく最短６０分間周囲温度でインキュベートして、その後、濾過によって除去される一貫した沈殿物形成を可能にした。中和されたウイルス不活性化物質を予め濾過し、次いで０．５／０．２μｍで濾過し、工程６の開始まで周囲温度で保管した。
【０１５０】
表８は、ＣＰＰおよび受入れ基準を要約している。表９は、低ｐＨウイルス不活性化工程についてのＫＰＰおよびＫＰＡを要約している。工程収率は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡ親和性プールからの濃度測定（Ａ２８０）および中和されたウイルス不活性化物質からのＡ２８０による濃度測定に基づいた。
【表８】
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【表９】
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【０１５１】
ｃ．工程６：ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
この工程の目的は、プロセス流から高分子量の不純物、ならびに他のプロセス関連不純物および潜在的なウイルスを除去することである。ウイルス不活性化工程からのプロセス内物質を、産物がＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０  ＣＥＸ樹脂に結合するクロマトグラフィーカラムを使用して精製した。次いで、結合した産物を、溶出緩衝液でイオン強度を増加させることによって樹脂から溶出させた。この工程は通常、１サイクルで操作された。
【０１５２】
使用前および各バッチの使用後に、カラムを殺菌した。この工程に使用した緩衝液を、表１０に列挙する。カラム負荷後、カラム性能を検証し、理論プレート数≧１０００Ｎ／ｍ（ＫＰＡ）および非対称係数０．８〜１．６（ＫＰＡ）を達成した。
【０１５３】
各サイクル負荷について、低ｐＨ保持からの中和濾液は、カチオン交換カラムの負荷物として機能した。材料を、０．５／０．２μｍのフィルターを通してカラムに負荷した。産物を溶出緩衝液を使用してカラムから溶出させた。単一の溶出液をインライン０．５／０．２μｍフィルターを通して収集し、工程７の開始まで周囲温度で保管した。
【０１５４】
表１１はＣＰＰおよび受入れ基準を要約し、表１２はＣＥＸ工程についてのＫＰＰおよびＫＰＡを要約する。カラム負荷は、工程５からの濾液のＡ２８０に基づいて計算した。工程収率は、低ｐＨ濾液およびＣＥＸ濾過溶出液からのＡ２８０測定値に基づいた。各サイクル後、カラムを回収し、洗浄／殺菌し、フラッシュし、最終保管溶液で保管した。
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【０１５５】
ｄ．工程７：ＰＯＲＯＳ  ＨＱ５０アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）
この工程の目的は、プロセス流から高分子量の不純物、ならびに他のプロセス関連不純物および潜在的なウイルスをさらに除去することであった。調整したＣＥＸ溶出液を、ＰＯＲＯＳ  ＨＱ５０アニオン交換樹脂で負荷され、貫流モードで動作させたクロマトグラフィーカラムを使用してさらに精製した。工程は通常、１サイクルで動作される。
【０１５６】
ＣＥＸプールを、１００ｍＭのトリス（ｐＨ９．０）、１８０ｍＭのアルギニン、およびＷＦＩを用いて、ｐＨ８．００および導電率８．５ｍＳ／ｃｍに調整した。クロマトグラフィーカラム上での処理を、負荷調整の２４時間以内に開始した。
【０１５７】
使用前に、カラムを殺菌、状態調節、平衡化した。この工程に使用した緩衝液を、表１３に列挙する。カラム負荷後、カラム性能を検証し、理論プレート数≧１０００Ｎ／ｍ（ＫＰＡ）および非対称係数０．８〜１．６（ＫＰＡ）を達成した。調整した材料を、０．５／０．２μｍのフィルターを通してカラムに負荷した。産物を、インライン０．５／０．２μｍを通して濾液容器中に濾過した緩衝液を使用してカラムからチェイスした。
【０１５８】
表１４はＣＰＰおよび受入れ基準を要約し、表１５はＡＥＸ工程についてのＫＰＰおよびＫＰＡを要約する。調整した物質のカラム負荷量は、ＣＥＸ工程からの濾液のＡ２８０に基づいて計算した。予想される工程収率は、ＣＥＸおよびＡＥＸプールからのＡ２８０測定値に基づいた。各サイクル後、カラムを回収し、殺菌し、保管した。
【表１３】
2021528957.tif 000015
【表１４】
2021528957.tif 000016
【表１５】
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【０１５９】
ｅ．工程８：ウイルス濾過（２０ｎｍ）
この工程の目的は、サイズに基づいて、潜在的なウイルスまたはウイルス様粒子をプロセス流から除去することであった。ウイルス減少は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｈプレフィルターを通したＡＥＸ貫流濾液の濾過、続いてＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏフィルター（２０ｎｍ）を通した濾過によって達成された。
【０１６０】
使用前に、２０ｎｍフィルターを整合性試験し、ＷＦＩおよび緩衝液を使用してフラッシュした。物質をフィルターに負荷した後、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）、６５ｍＭの塩化ナトリウムでフラッシュして、産物損失を最小限に抑えた。Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ濾液を０．５／０．２μｍで濾過した。ウイルス減少フィルターを、使用後の整合性を試験した。
【０１６１】
表１６は、この工程で使用される緩衝液を含む。フィルターを整合性試験した。再処理が妥当であると判断された場合、物質は一度再処理される可能性がある。作用限界を超えるバイオバーデンのために再処理は行われなかった。表１７はＣＰＰおよび受入れ基準を要約し、表１８はこのウイルス濾過工程についてのＫＰＰおよびＫＰＡを要約する。工程収率は、ＡＥＸ濾液およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ濾液からのＡ２８０測定値に基づいており、周囲条件下で保管した。
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【０１６２】
ｆ．工程９：限外濾過／透析濾過（３０ｋＤａ）および製剤
このＵＦ／ＤＦ工程の目的は、プロセス流をその指定濃度に濃縮し、プロセス緩衝液を製剤緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）と交換し、ポリソルベート８０を添加することによって製剤を完成させることであった。
【０１６３】
使用前に、産物専用のＵＦ膜をフラッシュし、整合性試験し、殺菌した。その後、膜をウイルス濾液を負荷する前に平衡化した。この工程で使用される緩衝液を、表１９に概説する。
【０１６４】
ウイルス減少濾過工程からのプールを、３０ｋＤａ  のＭＷＣＯ  ＵＦ膜を使用して１５ｇ／Ｌの目標に濃縮した。次いで、濃縮プールを６倍の透析濾過体積で製剤緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）中に透析濾過した。ＵＦ膜を製剤緩衝液でフラッシュして、産物回収を増強させた。産物濃度を測定し、１０．０ｇ／Ｌに希釈した。希釈した物質を、０．５／０．２μｍで濾過した。希釈したプールにポリソルベート８０を添加し０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０の最終濃度を達成した。
【０１６５】
表２０は重要な処理条件および受入れ基準を要約し、表２１はＵＦ／ＤＦ工程についてのＫＰＰおよびＫＰＡを要約する。工程収率は、ＵＦ／ＤＦ後のＡ２８０測定値およびウイルス濾過濾液に基づいた。
【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【０１６６】
ｇ．工程１０：最終濾過、ＢＤＳ負荷、保管、および輸送
工程９からの製剤化ＢＤＳを０．５／０．２μｍフィルターを通してバイオプロセスバッグに濾過した。ＵＦ／ＤＦ後および負荷後のタンパク質質量に基づいて、期待される収率パーセントは≧９０％であった。負荷が完了したら、最終フィルターはフィルター整合性試験に合格している必要がある。再処理が必要と判断された場合、産物を同一のＵＦ／ＤＦ保持容器にプールし、産物を一度ＢＤＳに再処理することができた。バイオバーデン過剰作用限界のために再処理は行われなかった。表２２はＩＰＣおよび受入れ基準を要約し、表２３は製剤原料負荷工程についてのＫＰＡを要約する。
【表２２】
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【表２３】
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【０１６７】
ＢＤＳを標識付けし、２〜８℃で保管し、光から保護した。バイオプロセス容器を安全に包装し、密閉された二次プラスチック格納容器内に保管して、バイオプロセス容器に対する保護を加え、湿度の環境変動を最小限に抑えた。配送処理のためのＢＤＳリリース後、ＢＤＳを、地上道路輸送と航空貨物輸送との組み合わせを介して、能動的温度制御配送材を使用して医薬品製造のために２〜８℃で配送した。
【０１６８】
３．医薬品の製造
ラブリズマブ製剤原料は、１００Ｌの使い捨てバッグに１０ｍｇ／ｍＬの濃度で無菌的に負荷された液体産物として供給される。医薬品の製造は、単一の０．２２μｍのバイオバーデン減少フィルターを介して、配合容器内に製剤原料をプールすることから開始する。プーリングプロセスが完了すると、製剤原料を滅菌濾過し、自動負荷機（負荷ライン１）を使用して滅菌された脱パイロジェンバイアルに無菌的に負荷する。次いで、無菌的に負荷されたバイアルに栓をして、キャップをかける。ラブリズマブ医薬品製造プロセスにおいて許容される再処理工程または手順は存在しない。ラブリズマブ医薬品の製造プロセスおよび制御の流れ図を図６に記載する。
【０１６９】
ａ．工程１：機器および部品の調製
湿潤部品調製の活動は、ＩＳＯ  ８（グレードＤ、クラス１００，０００）分類エリアで行われた。部品のオートクレーブ処理を含む乾燥部品調製の活動は、ＩＳＯ  ７（グレードＣ、クラス１０，０００）分類エリアで行われた。調製の後、滅菌包装された成分を、ＩＳＯ  ６（グレードＢ、クラス１，０００）分類エリアで保管した。
【０１７０】
各医薬品製造キャンペーンの前に、ストッパーボウル、トラック、ピック／プレースヘッド、プッシャーピン、およびサージ容器を分解洗浄し（ｃｌｅａｎｅｄ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｐｌａｃｅ（ＣＯＰ））、オートクレーブ内で滅菌した。
【０１７１】
組み込まれたフィルターおよびプーリングマニホールドを有するバイオバーデン濾過および滅菌濾過マニホールドを、滅菌済み（ガンマ照射）で供給し、使い捨て（単回使用）した。滅菌フィルターを使用前および使用後の両方で整合性試験し、使用後の試験を第２のフィルター上で行った。第２のフィルターでの試験で問題があった場合、第１のフィルターは、使用後に試験された可能性がある。滅菌フィルター間の移送ラインは、ＩＳＯ  ７（グレードＣ、クラス１０，０００）分類エリアにあり、ＩＳＯ  ５（グレードＡ、クラス１００）のサージタンクは、滅菌済みで供給された単回使用の使い捨て管材マニホールドで構成されていた。
【０１７２】
一次製品接触包装部品は、３０ｍＬのガラスバイアルおよびゴムストッパーを含む。負荷作業の開始前に、下記に記載されるように、医薬品容器閉鎖システム部品を処理し、使用のために調製した。洗浄、殺菌および脱パイロジェンパラメータを、表２４に要約する。
【０１７３】
バイアルを、バイアルワッシャー（ＩＳＯ  ７（グレードＣ、クラス１０，０００））内の一連のすすぎステーションを通して反転状態で洗浄した。ステーションには、リサイクルされたＷＦＩを用いた内側および外側のすすぎ、続いて新鮮なＷＦＩを用いた内側および外側のすすぎが含まれる。濾過された清浄な乾燥空気を使用して、バイアルの内側および外側表面を乾燥させた後、反転させ、脱パイロジェントンネルの送込みベルト上に配置した。バイアルを加熱ゾーンに移し、ここでは、電気的に加熱された層状空気が連続的に流れてバイアルを脱パイロジェンした。加熱ゾーンの下流では、バイアルはガラス温度が２５℃未満に段階的に低下した冷却ゾーンに入った。脱パイロジェンバイアルを、負荷機械に供給する蓄積テーブル上のＩＳＯ  ５（グレードＡ、クラス１００）環境に排出させた。
【０１７４】
ストッパーのバッグを滅菌の準備ができた状態で供給し、現場でオートクレーブ処理した。滅菌されたストッパーを、移送ポートを介してストッパーボウルに移した。
【０１７５】
シールを滅菌の準備ができた状態で供給し、オートクレーブ処理し、キャッピングおよび圧着エリアに持ち込み、キャッピング機に負荷した。負荷アセンブリ、ニードルコネクタ、ニードル、およびサージタンクをオートクレーブ処理し、ＩＳＯ  ５（グレードＡ、クラス１００）負荷キャビネットに移送した。
【表２４】
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【０１７６】
ｂ．工程２：プーリングおよび撹拌
製剤原料を２〜８℃の保管場所から取り出し、プーリングルーム（ＩＳＯ  ７、グレードＣ、クラス１０，０００）に移した。最大２つの製剤原料バッチを、検証された最大バッチサイズまで単一の医薬品バッチにプールすることができた。
【０１７７】
各バッグを単回使用プーリングマニホールドに接続し、製剤原料を、単一の０．２２μｍのバイオバーデン低減フィルターを介して蠕動ポンプによって一度に１つのバッグを１，０００Ｌのステンレス鋼（３１６グレード）温度制御ジャケット付き配合タンクに汲み入れた。蠕動ポンプを介した製剤原料のタンクへの移送は、２〜８℃の保管場所から製剤原料を取り出した後１２時間以内に完了しなければならない。プールした製剤原料を６０ＲＰＭで３０〜９０分間混合し、ミキサーをオフにする前に温度が２〜８℃であることを検証した。
【０１７８】
製剤原料は、滅菌濾過を開始し、負荷機に移す前に、配合タンク内に最長２４時間、２〜８℃で保持することができた。プーリングおよび撹拌工程のプロセスパラメータおよびプロセス内制御を表２５に提示する。
【表２５】
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【０１７９】
ｃ．工程３：滅菌濾過
滅菌濾過は、（ＩＳＯ  ７、グレードＣ、クラス１０，０００）分類エリアの閉鎖システム下で行った。負荷を開始する準備ができたら、濾過前バイオバーデンおよびエンドトキシン試験のために、プールされた製剤原料の試料を容器から採取した。
【０１８０】
製剤原料を、各々が０．７３ｍ２の濾過面積を有する、２つの連続親水性１０インチ絶対０．２２μｍのデュラポアポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）（ＫＶＧＬＧ１ＴＴＴ１）滅菌グレードフィルターを通して滅菌濾過した。圧力伝達（窒素容器設定値目標圧力０．５（範囲０．２〜１．３Ｂａｒ））は、産物を配合タンクから配合室に直列に配置された２つの０．２２μｍフィルターを通って、ＩＳＯ  ６（グレードＢ、クラス１，０００）エリアの照射管を経て、無菌負荷室（グレードＡ（ＲＡＢＳ）／Ｂ（室））に移動させた。両方のフィルターを整合性試験し、ＷＦＩ前濾過を用いて湿潤させた。負荷ラインに最も近い第２のフィルターを、最終滅菌産物フィルターと見なした。このフィルターを気泡点試験し、ＷＦＩで湿らせ、濾過後処理した。第２のフィルターが整合性試験基準を満たさなかった場合、第１のフィルターは、使用後にＷＦＩで整合性試験された。滅菌濾過工程のプロセスパラメータおよびプロセス内制御を表２６に提示する。
【０１８１】
使用後のフラッシュ手順は以下の通りであった。滅菌後濾過では、産物がマニホールドまで視覚的に除去され、負荷ラインサージタンク上に到達するまで、滅菌濾過マニホールド上の各フィルターの後にプロセス窒素によるブローダウンを実施した。この産物ブローダウンの後、両方のフィルターでＷＦＩフラッシュを実行した。滅菌フィルター１を最初に１０ＬのＷＦＩでフラッシュし、次いで両方のフィルターを３６ＬのＷＦＩでフラッシュし、総フラッシュ体積が４６ＬのＷＦＩとなった。次いで、第２のフィルターに対する使用後フィルター整合性試験を行った。
【表２６】
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【０１８２】
ｄ．工程４：無菌負荷
負荷プロセスで使用したすべての産物接触機器は使い捨てであった。滅菌濾過された製剤原料を、自動負荷機（グレードＢの部屋のグレードＡ  ＲＡＢＳ  ＬＡＦ）を使用して滅菌された脱パイロジェンバイアルに無菌的に負荷した。各バイアルを、重量に基づいて３２．００±０．９６ｇに負荷した（１．００８ｇ＝１．００ｍＬ）。次いで、負荷機械によって負荷バイアルにストッパーを無菌的に挿入した。負荷工程を通して負荷重量の１００％のプロセス内モニタリングを行い、バイアル負荷重量が効果的にモニタリングおよび制御されたことを確認した。負荷重量限界の外側にバイアルが見出された場合、バイアルは却下された。
【０１８３】
負荷作業中、システム制御（例えば、温度、差圧）とともに、ＩＳＯ  ５環境（グレードＡ、クラス１００ＬＡＦ）についての微粒子および微生物モニタリングを実施した。確立された手順に従って、負荷中に環境モニタリングおよび作業者モニタリングを適宜実施した。無菌負荷工程についてのプロセスパラメータおよびプロセス内制御を表２７に提示する。
【表２７】
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【０１８４】
ｅ．工程５：キャッピング
負荷および栓付バイアルを、ＩＳＯ  ５（グレードＡ、クラス１００）環境でキャッピングするためにキャッピング機械に搬送した。バイアルはキャッピング機から出て、ＩＳＯ  ８（グレードＤ、クラス１００，０００）環境に入った。バイアルは、インクジェットプリンターによってシールに印刷されたバッチ番号を有した。負荷、密封、および符号化バイアルをポリプロピレンボックスに負荷した。キャッピング工程についてのプロセスパラメータおよびプロセス内制御を、表２８に提示した。
【表２８】
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【０１８５】
キャッピングを含む無菌負荷工程全体は、滅菌濾過の開始の２４時間以内に完了しなければならない。密封バイアルを、微粒子、密封欠陥、ガラス、および軽微な欠陥について１００％目視検査した。欠陥バイアルを除去した。
【０１８６】
４．保管および配送
ラブリズマブ医薬品を２〜８℃で保管した。医薬品のラベルの付いていないバイアルを二次容器に梱包し、包装およびラベル貼付のために温度制御条件下で輸送した。
【０１８７】
５．ラベル貼付および二次包装
バイアルは、専用の生産室で完全に自動化されたラベル貼付機を使用してラベルを貼付した。二次包装の前に、ラベル、カートン、および添付文書（ＰＩ）を検査した。ラベル添付されていないバイアルを２〜８℃の保管場所から取り出し、ラベル貼付および二次包装プロセスの残部を周囲温度に温めた。
【０１８８】
ラベル貼付中、ラベルをバイアルに適用し、ラベル貼付バイアルをＰＩとともにユニットカートンに挿入し、カートンを閉じた。完成したユニットカートンを一定間隔でサンプリングし、目視および／または電子的に検査した。完成したユニットカートンを外装用段ボールに梱包し、その後２〜８℃で保管し、流通業者に配送した。
【０１８９】
６．ラブリズマブ医薬品
ラブリズマブは、栓付き３０ｍＬのバイアル中の１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する静脈内投与のための滅菌水溶液として供給される。
【０１９０】
ラブリズマブ医薬品の定量的および定性的組成を表２９に提示する。賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）、および／または日本薬局方（ＪＰ）に従って試験した。ラブリズマブバイアルの含有量は、抽出可能な体積に基づいている。
【表２９】
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【０１９１】
ラブリズマブ医薬品についての放出および安定性仕様を表３０に提示する。
【表３０】
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【０１９２】
実施例２：製造規模での高濃度モノクローナル抗体についてＵＦ／ＤＦ回収戦略
限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）は、生体分子の分離および精製のための迅速かつ効率的な方法である。下流処理の過程における高濃度のモノクローナル抗体中間溶液の産生において、ＵＦは製造規模における業界標準である。ＵＦ／ＤＦは、１０ｍＬから数千リットルの体積の範囲のサンプル溶液を濃縮および脱塩するために使用することができる。
【０１９３】
ＵＦＤＦに関連する主な課題は、特に皮下投与を意図した治療用タンパク質について、ハイエンド濃度を達成し、プロセス時間および凝集体形成の両方を低減することである。ＵＦ工程収率は、システム設計および回収手順の影響を受ける。
【０１９４】
ＵＦ／ＤＦ回収に影響を及ぼすパラメータは、本実験によって、（１）回収チェイス体積、（２）目標のバルク濃度、および（３）本明細書において「Ｆ因子」と称される比として特定された。Ｆ因子は、システム保持体積対全保持体積の比として定義される。回収チェイスは、システムに保持されている残りの製品をチェイスするために追加された緩衝液の容量として定義される。システムの保持体積は、異なる製造施設で異なる。これは、最終製剤ＵＦ／ＤＦ中に保持体積が考慮されない場合、最終的にはより希釈または濃縮された産物となる場合がある。表３１は、重要な命名を定義する。
【表３１】
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【０１９５】
これら３つのパラメータを中心としたＪＭＰソフトウェアを使用して、フル要因実験計画（ＤＯＥ）試験を設計した。この試験から、Ｆ因子の範囲の特定のチェイス体積が定義され、保持体積に関係なく任意の製造施設に転送することができた。この試験の目的は、（１）保持体積に関係なく、任意の製造施設に転送することができるＦ因子の範囲の特定のチェイス体積を決定し、（２）堅牢な回収方法を開発することによって、工程内Ａ２８０測定値の数を最小限に抑えることによって、プロセス時間を短縮することであった。図７は、本試験に使用されるＵＦ／ＤＦの概略図を示す。表３２に示される２つの中心点出の試験を含む、１２のＵＦ／ＤＦの試験をランダムな順序で生成した。回収チェイスは、ＤＦ緩衝液を使用してＤＯＥ設計によって指示されるように実行され、１０分間再循環させた。重量および濃度を使用して、目標の１２０ｇ／Ｌにするために未透過産物に添加するチェイス体積を計算した。組み合わせた産物濃度が＞１２５ｇ／Ｌの場合、ＤＦ緩衝液を用いて希釈して、目標の１２０ｇ／Ｌとした。最終の賦形剤添加緩衝液（ＥＡＢ）によって、１００ｇ／Ｌの目標濃度を達成した。
【表３２】
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【０１９６】
１００ｍｇ／ｍＬの最終ＵＦ／ＤＦおよび製剤についての重要な処理パラメータ（ＣＰＰ）は、以下の通りであった。賦形剤添加緩衝液（ＥＡＢ）添加までのＵＦＤＦ産物時間（最終濃縮の終了からＥＡＢ添加開始まで）≦１６時間；およびＥＡＢ添加：０．１９１９〜０．２３９３ｋｇのＥＡＢ／希釈されたＵＦＤＦ産物のｋｇ。
【０１９７】
主要な処理パラメータ（ＫＰＰ）は以下の通りであった。
使用前の膜の整合性試験；
膜負荷（ｇ／ｍ２）；
供給流量（ＬＭＨ）；
ＴＭＰ（ｐｓｉ）；
温度（Ｃ）；
フェドバッチ比
初期濃度目標（４０〜６０ｇ／Ｌ）；
最終濃度目標（１４０〜１６０ｇ／Ｌ）；
透析当量（４．５〜７．５）；
未希釈ＵＦ／ＤＦ産物保持（≦２４時間）；および
希釈ＵＦ／ＤＦ産物保持（≦２４時間）。
【０１９８】
具体的なユニット操作の詳細は以下の通りであった。
フィルターＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ３  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  Ｃスクリーン３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ
フラッシュ：ＷＦＩ≦２０Ｌ／ｍ２；
平衡化：５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＬ−Ａｒｇ（≧２０Ｌ／ｍ２）；
膜負荷：≦６００Ｌ／ｍ２；
初期濃度：４０〜６０ｇ／Ｌ；
供給流量（すべての産物工程）：目標３６０ＬＭＨ；
膜間圧力差（すべての産物工程）：目標１５ｐｓｉ；
供給圧力：≦５０ｐｓｉ（増加させ得る）；
ＤＦ緩衝液：平衡化と同じ；
透析当量：４．５〜７．５（目標６．０）
最終濃度を１４０〜１６０ｇ／Ｌにする（１．０７回収因子を含む）；
最終濃度は、供給圧力（ＴＭＰまたは供給流量ではない）によって制御され得る。
温度：１５〜３５℃
≦１×システム保持体積（ＣＳＤごとに計算が必要）による回収；
ＤＦ／平衡化緩衝液による目標の１２０ｇ／Ｌへの希釈、
０．１９１９〜０．２３９３ｋｇ／ｋｇの賦形剤添加緩衝液（ＥＡＢ−５０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＬ−Ａｒｇ、３０％スクロース０．３０％（ｗ／ｖ）、ＰＳ  ８０）を１２０ｇ／ＬのＵＦ／ＤＦ産物に添加し、最終製剤にすること、
膜の再利用：最大２０サイクル
殺菌：０．５ＭのＮａＯＨ；
保管：０．１ＭのＮａＯＨ；
収率：＞６０％（９０％を超えると予想される）；
ＳＨＣ濾過性１２０ｇ／Ｌ  ＵＦ／ＤＦ産物の表現：≦４０Ｌ／ｍ２；および
ＳＨＣ濾過性ＢＤＳの表現：≦３０４５Ｌ／ｍ２（産物の損失を最小限に抑えるために「適切なサイズ」フィルターを使用されたい）。
【０１９９】
追加の実験を行って、０．２のＦ因子および１５０ｇ／Ｌの目標バルク濃度でのＵＦ／ＤＦ評価のための増分緩衝液体積添加による緩衝液チェイス濃度の変化を決定した。緩衝液体積および濃度データを表３３および図８に示す。線形回帰をデータに適合させ、勾配およびｙ切片を計算した。
【表３３】
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【０２００】
０．８のＦ因子および緩衝チェイス体積０．４および１．１倍を有する多変量試験の目標濃度は、１４０および１６０ｇ／Ｌであった。緩衝液チェイス濃度（Ｃｃ）ならびに組み合わされた未透過液およびチェイス濃度（Ｃａ）の平均を実施して、理論濃度を１５０ｇ／Ｌで得た。計算に使用される個々のデータポイントおよび平均データを表３４および表３５に示す。表３６および図９に示されるように、平均０．８のＦ因子およびＤＯＥ実験１１データを使用して、緩衝チェイス濃度に関連する緩衝チェイス体積の結合データセットを構築した。
【表３４】
2021528957.tif 000036
【表３５】
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【表３６】
2021528957.tif 000038
【０２０１】
図８および図９からの勾配およびｙ切片を平均化して、０．２〜０．８のＦ因子範囲にわたって適用することができる線形表現を提供した（表３７を参照）。
【表３７】
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【０２０２】
プロセス回収は、未透過液および緩衝液チェイス産物を組み合わせた後の収率として定義した。多変量試験からの回収データを表３２に示す。これらのデータは、Ｆ因子およびチェイス体積がプロセス回収に影響を及ぼす重要な因子であることを示す。図９は、ＤＯＥ実験０２を一例として使用した予測プロファイラーを示す。１４０および１６０ｇ／Ｌの目標バルク濃度で０．２〜０．３で評価したＦ因子、ならびにチェイス体積０．４〜１．１倍は、８７．２〜９１．７％の収率を提供した。これらのデータは、０．２〜０．３以内のＦ因子が、未透過産物濃度にかかわらず、より広範な回収チェイス戦略を可能にすることを示している。しかしながら、Ｆ因子が約０．９に増加するにつれて、未透過液濃度および緩衝液チェイス体積は、プロセス回収に対して有意になる（表３８）。
【表３８】
2021528957.tif 000040
【０２０３】
このデータセットおよび式１を使用して、所与のＦ因子について許容可能なチェイス体積範囲を予測し、≧１２０ｇ／Ｌおよび９０％のプロセス回収を確実にするためにモデルを開発した。Ｆ因子を０．１〜０．９から評価し、緩衝液チェイス体積を０．１〜１．６倍から評価し、未透過液濃度を１４０ｇ／Ｌに維持して、最悪の場合の濃度結果を考慮した。各Ｆ因子および緩衝液チェイス体積の理論的希釈ＵＦ／ＤＦ産物濃度を表３８に示す。≧１２０ｇ／ＬをもたらしたＦ因子および緩衝液チェイス体積条件は太字であり、１２０ｇ／Ｌの値は、許容される条件および許容されない条件を明確に識別するために下線が引かれている。試験の結果を使用して、Ｆ因子を３つのレベルにグループ分けし、バッチレコードの実装を容易にするために対応する緩衝液掃体積範囲を提供した。本試験から製造制御戦略を実施した。
【表３９】
2021528957.tif 000041
【０２０４】
結論として、Ｆ因子および緩衝液チェイス体積ＵＦ／ＤＦパラメータをＫＰＰとして分類した。表３５を使用して、Ｆ因子を３つのレベルにグループ分けし、ＣＭＯでのバッチレコード実装の容易さのために対応する緩衝液チェイス体積範囲を提供した。これにより、個々のＵＦ／ＤＦ産物およびチェイスのＡ２８０測定値を排除した。これら２つの工程でＡ２８０測定値を排除すると、総ＵＦ／ＤＦ処理時間が短縮され、産物の安定性を維持するのに役立つ。
【表４０−１】
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【表４０−２】
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【表４０−３】
2021528957.tif 000044
【表４０−４】
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【表４０−５】
2021528957.tif 000046
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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