(57)【要約】  本願明細書中には、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、その組成物および使用方法が開示されている。より具体的には、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの免疫刺激性特性を最適化する方法、トル様レセプター２１（ＴＬＲ２１）―媒介免疫応答を誘発するために免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用する方法が開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列と少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記グアニンヌクレオチド富化配列が、第１の複数のグアニンヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記第１の複数のグアニンヌクレオチドが３〜８個のグアニンヌクレオチドを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９２、９３、９６、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１４３、または２５２を含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記グアニンヌクレオチド富化配列が、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６８）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、ＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）、またはＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３７、または１３８を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記第１の複数のグアニンヌクレオチドと前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間に第２の複数のグアニンヌクレオチドをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記第１の複数のグアニンヌクレオチド、前記第２の複数のグアニンヌクレオチド、またはその両方が、Ｇ−カルテット配列を含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記第１および第２の複数のグアニンヌクレオチドがＧ−ワイヤー配列を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
先行する請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、感染症を予防または治療するためのワクチン。
【請求項１１】
先行する請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、免疫刺激性組成物。
【請求項１３】
薬学的に受容可能な担体をさらに含む、請求項１２に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドおよび担体が連結されている、請求項１３に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１５】
トル様受容体２１（ＴＬＲ２１）を刺激する方法であって：
（ａ）オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与すること、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列は、第１の複数のグアニンヌクレオチドを含む
を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３７、または１３８を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドがＧ−ワイヤー配列をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１４１、１４２、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２５２、またはＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ３を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激活性を増加させるための方法であって、オリゴヌクレオチドの５’末端をグアニンヌクレオチド富化配列に融合させることを含む、前記方法。
【請求項２０】
対象において免疫応答を誘発する方法であって：
（ａ）それを必要とする対象に、オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列と少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドモチーフを有するオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物を投与すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、欧州特許出願番号ＥＰ１７２０７７４０．６、ＥＰ１７２０７７４６．３、およびＥＰ１７２０７７５０．５（それぞれ、２０１７年１２月１５日に出願された）の優先権及びその利益を主張する。その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列リスト
本出願はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列リストを含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１１月３０日に作成され、ＢＨＣ＿１６８０２８＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが７８，７９５バイトである。
【０００３】
発明の分野
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび組成物ならびにそれらの使用方法が本明細書に開示される。より具体的には、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を最適化する方法、および免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いてトル様受容体２１（ＴＬＲ２１）媒介免疫応答を誘発する方法が開示される。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
微生物のゲノム内に含まれる特定のモチーフ（例えば、メチル化されていないＣｐＧモチーフ）のような内部組成物と同様に、微生物の表面上のタンパク質および他の抗原を含む微生物のいくつかの分子的特性は、宿主生物の免疫系によって認識され得、そして免疫応答を誘発し得る。これらの分子特性、または病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と宿主の同族病原体認識受容体との相互作用は、免疫応答に関与する細胞シグナル伝達カスケードを開始させることができる。トル様受容体２１（ＴＬＲ２１）は、哺乳類トル様受容体９（ＴＬＲ９）のニワトリ機能ホモログであり、非メチル化ＣＰＧモチーフを認識できるＰＡＭＰ受容体である。これらのＣＰＧモチーフを有する核酸によるＴＬＲ２１の活性化は、微生物感染に対する免疫応答に関与する細胞シグナルを活性化することが示されている。
【０００５】
ニワトリの免疫応答におけるＴＬＲ２１の役割を理解することは、家禽産業における疾病予防または治療のシフトにつながっていない。ブローダー施設で飼育されている家禽の大集団は本質的に混雑した非無菌環境のため、生涯のすべての段階で微生物感染のリスクが高いが、現在利用可能な予防組成物および感染後の処置は一般的にＰＡＭＰ媒介免疫応答を誘発しない。その代わりに、大規模生産施設は、感染性集団発生を予防または抑制するために、市販のワクチンおよび抗生物質に頼っている。抗生物質は耐性の懸念や処理肉の摂取による意図しない結果のために嫌悪されるようになっているが、大規模なブローダーハウスを含む多くの農業現場では抗生物質投与は依然として標準的な操作手順であり、新しい方法の採用はかなり高価で負担がかかる可能性がある。ＴＬＲ２１アゴニストを予防的手段として、または感染の治療として採用することに対する１つの障害は、多数の候補化合物をスクリーニングすることに関連する非効率性を含み、これは、このようなアゴニストを同定するための研究を効果的に阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、ＴＬＲ２１刺激性組成物、それらを同定する方法、および組成物の免疫刺激特性を最適化する方法が必要とされている。開示される方法および組成物は、これらおよび他の重要な必要性を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化（「グアニン富化」）配列およびを少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが本明細書に開示される。
【０００８】
オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチド内にグアニンヌクレオチド富化配列を有するかまたは有さないおよび少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する５’−コレステリル修飾を含むオリゴヌクレオチドもまた、本明細書に開示される。
【０００９】
また、オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む、トル様受容体２１（ＴＬＲ２１）を刺激する方法も提供される。
【００１０】
オリゴヌクレオチドの５’末端をグアニンヌクレオチド富化配列に融合することを含む、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激活性を増加させるための方法も開示される。
【００１１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドモチーフを有するオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象における免疫応答を誘発するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
以下の詳細な説明と同様に、本発明の概要は、添付の図面と併せて読まれると、さらに理解される。開示された組成物および方法を例示する目的で、図面には組成物および方法の例示的な実施形態が示されているが、組成物および方法は開示された特定の実施形態に限定されない。図面において：
【図１】図１は、ｐｃＤＮＡＴＭ３．１（＋）のプラスミドマップである。
【図２】図２は、ＴＮＦ−α刺激ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ細胞およびＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１の用量反応曲線を比較する。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ＨＥＫ２９３−ｂｓｄおよびＨＥＫ２９３−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞に対する２００６−ＰＴＯおよび２００６−ＰＤＥの刺激効果をグラフで示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、２００６−ＰＤＥオリゴヌクレオチドの３’末端におけるグアニン残基の増加数の刺激効果をグラフで示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、２００６−ＰＤＥオリゴヌクレオチドの５’末端におけるグアニン残基の増加数の刺激効果をグラフで示す。
【図６】図６は、３’または５’末端に増加する数のグアニン残基を有する２００６−ＰＤＥオリゴヌクレオチドの半数効果濃度（ｐＥＣ５０）の負の対数（ｌｏｇ１０）を示す。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ５’末端および３’末端に増加する数のグアニンを有する２００６−ＰＤＥオリゴヌクレオチドの凝集を示す。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、その５’末端に６つの連続するグアニン（５ｄＧ６）、アデニン（５ｄＡ６）、シトシン（５ｄＣ６）、またはチミン（５ｄＴ６）残基を有する２００６−ＰＤＥオリゴヌクレオチドの刺激効果をグラフで示す。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、オリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１の刺激に対するＣｐＧモチーフの破壊の効果をグラフで示す。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端上のグアニンランそれぞれの刺激効果をグラフで示す。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端上の６つのグアニンラン内の単一のアデニン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示し、一方、図１１Ｃおよび図１１Ｄは、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端上の６つのグアニンラン内の２つのアデニン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示す。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端上の６のグアニンラン内の単一のシトシン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示し、一方、図１２Ｃおよび図１２Ｄは、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端上の６のグアニンラン内の２つのシトシン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示す。
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂは複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端上での６つのグアニンラン内での単一のチミン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示し、一方、図１３Ｃおよび図１３Ｄは、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端上での６つのグアニンラン内での２つのチミン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示す。
【図１４】図１４は、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチド（配列番号２７２）の５’末端上の６つのグアニンランにおける単一ヌクレオチド置換のＴＬＲ２１刺激に対する位置効果を実証する。
【図１５】図１５は、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチド（配列番号２７２）の５’末端上の６回のグアニンランにおける二重ヌクレオチド置換のＴＬＲ２１刺激に対する位置効果を実証する。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端上での４つのグアニンラン内での単一のアデニン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示す。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端上での４つのグアニンラン内での単一のシトシン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示す。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端での４つのグアニンラン内での単一チミン置換のＴＬＲ２１刺激に対する効果を示す。
【図１９】図１９は、複数のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチド（配列番号２７３）の５’末端上での４つのグアニンランにおける単一ヌクレオチド置換のＴＬＲ２１刺激に対する位置効果を実証する。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｋは、３’末端上での５つのグアニンランの融合、５プライム末端上での４つのグアニンラン、および文献に意味されるＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド配列の５’末端上での６つのグアニンランの効果を示す。図２０Ａは、ＯＤＮ  １６６８、１６６８−３ｄＧ５、１６６８−５ｄＧ４、および１６６８−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｂは、ＯＤＮ  １８２６−３ｄＧ５、１８２６−５ｄＧ４、および１８２６−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｃは、ＯＤＮ  ＢＷ００６、ＢＷ００６−３ｄＧ５、ＢＷ００−６５ｄＧ４、およびＢＷ００６−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｄは、ＯＤＮ  Ｄ−ＳＬＯ１、Ｄ−ＳＬＯ１−３ｄＧ５、Ｄ−ＳＬＯ１−５ｄＧ４、およびＤ−ＳＬＯ１−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｅは、ＯＤＮ  Ｍ３６２、Ｍ３６２−３ｄＧ５、Ｍ３６２−５ｄＧ４、およびＭ３６２−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｆは、ＯＤＮ  ２３９５、２３９５−５ｄＧ４、および２３９５−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｇは、ＯＤＮ  ２００７−ＰＤＥ、２００７−ＰＤＥ−３ｄＧ５、２００７−ＰＤＥ−５ｄＧ４、および２００７−ＰＤＥ−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｈは、ＯＤＮ  ＣＰＧ−６８５およびＣＰＧ−６８５−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｉは、ＯＤＮ  ＣＰＧ−２０２およびＣＰＧ−２０２−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｊは、ＯＤＮ  ＣＰＧ−２０００およびＣＰＧ−２０００−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。図２０Ｋは、ＯＤＮ  ＣＰＧ−２００２およびＣＰＧ−２００２−５ｄＧ６のＴＬＲ２１刺激活性をグラフで示す。
【図２１】図２１Ａは既知のテロメア配列を２００６−ＰＤＥおよび２００６−ＰＤＥ−Ｔ４に融合することの影響をグラフで示し、図２１Ｂおよび図２１Ｃは、テロメア配列またはプロモーター配列を２００６−ＰＤＥ−Ｔ４に融合することの影響をグラフで示す。
【図２２】図２２Ａおよび図２２Ｂは、既知のテロメア配列を２００６−ＰＤＥに融合することの影響を示す。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂはそれぞれ、Ｇ−カルテット配列を有するオリゴヌクレオチドのテトラマーの塩基対配置およびテトラマーを含むオリゴヌクレオチドの配向を示す（「ＴＧＧＧＧＴ」、配列番号２６５として開示）；図２３ＣはＧ−カルテットまたはＧ−ワイヤー立体配座（配列番号２５７）を形成する場合のオリゴヌクレオチドの相互作用を示す；図２３ＤがＧ−ワイヤー立体配座（配列番号２５７）の画像である。
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、ＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端にグアニンヌクレオチド富化配列を添加することによるＴＬＲ２１刺激に対する効果を示す。
【図２５】図２５は、Ｇ−ワイヤー配列を有する凝集オリゴデオキシヌクレオチドの存在を示す。
【図２６】図２６Ａ、図２６Ｂ、および図２６Ｃは、ＣｐＧｐＡモチーフに直接隣接するヌクレオチドの刺激影響をグラフで示す。図２６Ａは、基礎オリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激活性を示す。図２６Ｂは、追加の５’ｄＧ６配列を有する同じオリゴヌクレオチドを示す。図２６Ｃは、追加の５’Ｇｗｉｒｅ２配列を有する基底オリゴヌクレオチドを示す。
【図２７】図２７Ａ、図２７Ｂ、および図２７Ｃは、ＣｐＧｐＧモチーフに直接隣接するヌクレオチドの刺激影響をグラフで示す。図２７Ａは、基礎オリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激活性を示す。図２７Ｂは、追加の５’ｄＧ６配列を有する同じオリゴヌクレオチドを示す。図２７Ｃは、追加の５’Ｇｗｉｒｅ２配列を有する同じオリゴヌクレオチドを示す。
【図２８】図２８Ａ、図２８Ｂ、および図２８Ｃは、ＣｐＧｐＣモチーフに直接隣接するヌクレオチドの刺激影響をグラフで示す。図２８Ａは、基礎オリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激活性を示す。図２８Ｂは、追加の５’ｄＧ６配列を有する同じオリゴヌクレオチドを示す。図２８Ｃは、追加の５’Ｇｗｉｒｅ２配列を有する同じオリゴヌクレオチドを示す。
【図２９】図２９Ａ、図２９Ｂ、図２９Ｃ、および図２９Ｄは、ＣｐＧｐＴモチーフに直接隣接するヌクレオチドの刺激影響をグラフで示す。図２９Ａは、基礎オリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激活性を示す。図２９Ｂは、追加の５’ｄＧ６配列を有する同じオリゴヌクレオチドを示す。図２９Ｃおよび図２９Ｄは、追加の５’Ｇｗｉｒｅ２配列を有する同じオリゴヌクレオチドを示す。
【図３０】図３０は、５’Ｇｗｉｒｅ配列を有するオリゴヌクレオチドにおける唯一のＣｐＧモチーフを破壊する刺激効果を示す。
【図３１】図３１は、５’Ｇｗｉｒｅ配列とＣｐＧモチーフとの間の距離の刺激影響を示す。
【図３２】図３２は、５’Ｇｗｉｒｅ２配列およびＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの３’末端におけるチミジン５’−モノリン酸ヌクレオチドの数を修飾することの刺激影響を示す。
【図３３】図３３Ａおよび図３３Ｂは、異なる５’Ｇ−ワイヤー配列を有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を比較する。
【図３４】図３４は、５’Ｇｗｉｒｅ２配列を有するオリゴヌクレオチドの構造−活性を示す。図は、それぞれ、出現順に配列番号１８９、２６９、および２７０を開示する。
【図３５】図３５Ａおよび図３５Ｂは、５’Ｇｗｉｒｅ２配列およびＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの３’付近に単一、二重または三重ＧＣＧＴ配列エレメントを有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激能力を比較する。
【図３６】図３６Ａおよび図３６Ｂは、５’Ｇｗｉｒｅ２配列およびＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの３’付近に単一、二重または三重ＧＣＧＡ配列エレメントを有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激能力を比較する。
【図３７】図３７Ａおよび図３７Ｂは、５’Ｇｗｉｒｅ２配列およびＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの３’付近に単一、二重または三重ＡＣＧＣ配列エレメントを有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激能力を比較する。
【図３８】図３８Ａおよび図３８Ｂは、５’Ｇｗｉｒｅ２配列およびＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの３’付近に単一、二重または三重ＴＣＧＣ配列エレメントを有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激能力を比較する。
【図３９】図３９Ａおよび図３９Ｂは、５’Ｇｗｉｒｅ２配列およびＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの３’付近に単一、二重または三重ＣＣＧＣ配列エレメントを有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激能力を比較する。
【図４０】図４０は、Ｇｗｉｒｅ２配列およびＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの３’付近に単一、二重または三重ＧＣＧＧ配列エレメントを有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激能力を比較する。
【図４１】図４１Ａおよび図４１Ｂは、オリゴヌクレオチド中の２つのＣｐＧモチーフの間に１〜４つのチミンヌクレオチドを挿入する免疫刺激効果を比較する。
【図４２】図４２Ａおよび図４２Ｂは、２つのＣｐＧモチーフ間の単一ヌクレオチド分離または２つのＣｐＧモチーフ間の脱塩基（ｓｐａｃｅｒ）スペーサーの刺激効果を示す。
【図４３】図４３Ａ〜４３Ｅは、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧエレメント間の異なる構造的架橋を示す。図４３Ａは、Ｔ１スペーサーの構造を示す。図４３Ｂは、構造Ｔ３スペーサーを示す。図４３Ｃは、脱塩基スペーサーの構造を示す。図４３Ｄは、１，３−プロパンジオールスペーサーの構造を示す。図４３Ｅは、ヘキサエチレングリコールスペーサーの構造を示す。
【図４４】図４４Ａおよび図４４Ｂは、ＣｐＧモチーフ間にＣ３およびＣ１８スペーサーを挿入することの刺激影響を示す。
【図４５】図４５Ａおよび図４５Ｂは５’−Ｇｗｉｒｅ２モチーフを含むオリゴヌクレオチド中の増加する数のＣｐＧモチーフの免疫刺激効果を示し、ＣｐＧモチーフはＣ３スペーサーによって分離されている。
【図４６】図４６Ａおよび図４６Ｂは、５’末端にＴＧＧＧＧＴ配列（配列番号２６５）を有し及び１〜５個のＣｐＧモチーフの間がそれぞれＣ３スペーサーによって分離されているオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１の免疫刺激をグラフで示す。
【図４７】図４７は、脱塩基ジオール−ベースのスペーサーを示す。
【図４８】図４８は、Ｃ８スペーサー、基礎（ｂａｓａｌ）スペーサー、および脱塩基デオキシリボース架橋スペーサーを示す。
【図４９】図４９Ａおよび図４９ＢはＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）５’末端配列およびＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激をグラフで示し、ここで、ＣｐＧモチーフは、プロパンジオールまたは脱塩基デオキシリボース架橋によって分離される。
【図５０】図５０Ａおよび図５０ＢはＣｐＧモチーフおよびＧ−ワイヤー配列を有するオリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激能力を図示し、ここで、ＣｐＧモチーフは、エタンジオール、プロパンジオール、ブタンジオール、ペンタンジオール、およびヘキサンジオールによって分離されている。
【図５１】図５１は、ＴＬＲ２１の刺激に対するＣｐＧエレメント間の異なるジオール−ベースのスペーサーの影響を示す。
【図５２】図５２Ａおよび図５２Ｂは、プロパンジオールまたはヘキサエチレングリコールによって分離されたＡＣＧＣまたはＣＣＧＣ  ＣｐＧ配列エレメントのいずれかおよびＧ−ワイヤー５’末端配列を有するオリゴヌクレオチドへの暴露後のＴＬＲ２１刺激を示す。
【図５３】図５３Ａおよび図５３Ｂは、プロパンジオールによって分離されたＡＣＧＣまたはＣＣＧＣ  ＣｐＧ配列エレメントのいずれかおよびＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）５’末端配列を有するオリゴヌクレオチドへの暴露後のＴＬＲ２１刺激を示す。
【図５４】図５４Ａおよび図５４Ｂは、プロパンジオールまたはヘキサエチレングリコールのいずれかによって分離されたＣｐＧモチーフおよびＧ−ワイヤー５’末端配列を有するオリゴヌクレオチドへの暴露後のＴＬＲ２１刺激を示す。
【図５５】図５５は、ヘキサンジオールリンカーによって３’デオキシリボース部分に連結されたコレステロール部分の化学構造を示す。
【図５６】図５６Ａおよび図５６Ｂは、複数のＣｐＧモチーフおよび５’Ｇｗｉｒｅ２配列を有するオリゴヌクレオチドからのＴＬＲ２１刺激を、３’コレステリル基を有する同じオリゴヌクレオチドからのものと比較する。
【図５７】図５７Ａおよび図５７Ｂは、ＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）５’末端末端配列、複数のＣｐＧモチーフ、および３’コレステリル基を有する２つのオリゴヌクレオチドを比較する。
【図５８】図５８Ａおよび図５８Ｂは、２つの異なるデオキシヌクレオチドに対する５’コレステロール修飾を示す。
【図５９】図５９Ａおよび図５９ＢはＴＧＧＧＧＴ−５’末端配列（配列番号２６５）、複数のＣｐＧモチーフを有し、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによって引き起こされるＴＬＲ２１刺激を示す。
【図６０】図６０Ａおよび図６０Ｂは、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激を示す、ここで、コレステロール誘導体は異なる供給者（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から得られる。
【図６１】図６１Ａおよび図６１Ｂは、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激を示す。
【図６２】図６２Ａおよび図６２Ｂは、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激を示す。
【図６３】図６３Ａおよび図６３Ｂは、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激を示す。
【図６４】図６４は、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激を示す。
【図６５】図６５は、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激を示す。
【図６６】図６６Ａおよび図６６Ｂは、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激を示す。
【図６７】図６７は、５’コレステロール修飾を伴うかまたは伴わないオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ２１刺激を示す。
【図６８】図６８Ａおよび図６８Ｂは、マウスおよびヒト細胞それぞれにおけるオリゴヌクレオチドの５’末端上のグアニンヌクレオチドの数を増加させて修飾したオリゴヌクレオチドの免疫刺激効果をグラフで示す。
【図６９】図６９Ａおよび図６９Ｂは、マウスおよびヒト細胞それぞれにおけるオリゴヌクレオチドの３’末端上のグアニンヌクレオチドの数を増加させて修飾したオリゴヌクレオチドの免疫刺激効果をグラフで示す。
【図７０】図７０は、ワクチン接種後（ｐｖ）１４日目（上部パネル）および２１日目（下部パネル）におけるＯＤＮ１（ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ−５Ｃｈｏｌ）についての平均血球凝集阻害（ＨＩ）力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。アスタリスクは、有意水準を示す（＊＝有意〜＊＊＊＊＝非常に有意）。
【図７１】図７１は、試験全体の間のＯＤＮ１（ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ−５Ｃｈｏｌ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。
【図７２】図７２は、ワクチン接種後１４日目（上のパネル）および２１日目（下のパネル）におけるＯＤＮ２（ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。アスタリスクは、有意水準を示す（＊＝有意〜＊＊＊＊＝非常に有意）。
【図７３】図７３は、試験全体の間のＯＤＮ２（ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。
【図７４】図７４は、ワクチン接種後１４日目（上のパネル）および２１日目（下のパネル）におけるＯＤＮ３（２００６−ＰＴＯ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。アスタリスクは、有意水準を示す（＊＝有意〜＊＊＊＊＝非常に有意）。
【図７５】図７５は、研究全体の間のＯＤＮ３（２００６−ＰＴＯ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。
【図７６】図７６は、ワクチン接種後１４日目（上部パネル）および２１日目（下部パネル）の陽性および陰性対照試験品についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。アスタリスクは、有意水準を示す（＊＝有意〜＊＊＊＊＝非常に有意）。
【図７７】図７７は、試験全体の間の陽性および陰性対照試験品についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。
【図７８】図７８は、ＮＤＶワクチン単独と比較した、試験全体の間のＯＤＮの最適な濃度での平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。
【図７９】図７９は、ＮＤＶワクチン単独と比較した、ｐｖ１４日目（上部パネル）および２１日目（下部パネル）におけるＯＤＮの最適な濃度での平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
例示的な実施形態の詳細な説明  
開示される組成物および方法は、本開示の一部を形成する添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解され得る。開示される組成物および方法は、本明細書に記載および／または示される特定の組成物および方法に限定されず、本明細書で使用される用語は例としてのみ特定の実施形態を記載する目的のためであり、特許請求される組成物および方法を限定することを意図しないことを理解されたい。
【００１４】
特に断らない限り、可能なメカニズムまたは作用様式または改善の理由に関するいかなる説明も、単に例示的であることを意味し、開示された組成物および方法は、そのような示唆されたメカニズムまたは作用様式または改善の理由の正確さまたは不正確さによって制約されるべきではない。
【００１５】
本文中では、その記載は組成及び当該組成物を用いた方法を指す。本開示が組成物に関連する特徴または実施形態を記載または特許請求する場合、そのような特徴または実施形態は、前記組成物を使用する方法に等しく適用可能である。同様に、本開示が組成物を使用する方法に関連する特徴または実施形態を記載または特許請求する場合、そのような特徴または実施形態は、組成物に等しく適用可能である。
【００１６】
ある範囲の値が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。さらに、範囲で記載される値への言及は、当該範囲内のあらゆる値を含む。全ての範囲は包括的であり、組み合わせ可能である。値が近似値として表される場合、先行する「約」を使用することによって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。特定の数値への言及は文脈が特に明確に指示しない限り、少なくともその特定の値を含む。
【００１７】
明確にするために、別個の実施形態の文脈で本明細書に記載されている開示された組成物および方法の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される開示された組成物および方法の様々な特徴は別々に、または任意のサブコンビネーションで提供されてもよい。
【００１８】
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形を含む。
【００１９】
本明細書で使用されるように、「融合（ｆｕｓｅ）」または「融合すること（ｆｕｓｉｎｇ）」は、化学反応種間に化学結合を生成することを指す。本開示の文脈において、融合とは、ほとんどの場合、オリゴヌクレオチドに特定のエレメントを組み込むことをいう。例えば、チミンヌクレオチドのラン（ａ  ｒｕｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）はオリゴヌクレオチドの３’末端に融合され得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「Ｇ−カルテット配列（Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、オリゴヌクレオチドが他のＧ−カルテット配列と相互作用してＧ−カルテットを形成することを可能にする、オリゴヌクレオチドの５’末端付近の連続したグアニン残基のストレッチをいう。Ｇ−カルテットは、核酸の免疫刺激特性を増強する。例えば、Ｇ−カルテット配列を含むオリゴヌクレオチドは、相互作用して、Ｇ−カルテットを生じ得る。遺伝子のプロモーター領域に存在するＧ−カルテット配列は、遺伝子の発現の調節に関与する四次構造を形成する可能性がある。Ｇ−カルテット配列は任意の特定の配列に限定されないが、Ｇ−カルテット配列の例はＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）である。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「Ｇ−ワイヤー配列（Ｇ−ｗｉｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「Ｇ  ワイヤー配列（Ｇ  ｗｉｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「Ｇワイヤー配列（Ｇｗｉｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、および関連する用語は、複数の、最も頻繁には２つの、少なくとも４つの連続するグアニンヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に位置する複数のグアニンヌクレオチドは２つ以上の非グアニンヌクレオチド（すなわち、チミンヌクレオチド）によって分離される。Ｇ−ワイヤー配列は、他のＧ−ワイヤー配列と相互作用してＧ−ワイヤー構造を形成することができる。Ｇ−ワイヤー構造は、核酸の免疫刺激特性を増強することができる。例示的なＧ−ワイヤー配列は、ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）またはＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２５８）である。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「グアニンヌクレオチド富化配列（ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「グアニン富化配列（ｇｕａｎｉｎｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」などは、連続するグアニンヌクレオチド（通常、４〜６個のグアニンヌクレオチドの間）のラン、または核酸の領域であって、典型的にはオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に、アデニン、シトシン、またはチミンヌクレオチドよりも多いグアニンヌクレオチドを有するもののいずれかを含む核酸配列をいう。本明細書中に開示されるグアニンヌクレオチド富化配列は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を増強し得る。Ｇ−カルテットおよびＧ−ワイヤー配列は、両方ともグアニンヌクレオチド富化配列の型である。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「挿入する（ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ）」とは、オリゴヌクレオチドの合成の間に特定の位置に特定のヌクレオチドを付加することをいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「平行配向（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、異なるオリゴヌクレオチド間の方向性相互作用をいう。例えば、図２３Ｂの丸で囲んだ図は、オリゴヌクレオチドの四量体が互いに平行に配置されているので、平行な配向を有する４つのオリゴヌクレオチドを示す。いくつかの態様において、個々のオリゴヌクレオチドは、同じ５’から３’方向に配向され得る。
【００２５】
本明細書で使用される「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、任意の種類の鳥類、哺乳類、または水生種を含む任意の動物、特にニワトリを意味することが意図される。対象は、開示された方法を用いて、および開示された組成物を用いて処置され得る。
【００２６】
用語「ＴＬＲ２１試験」またはそのバリエーションは、オリゴヌクレオチドがＴＬＲ２１を刺激するかどうかを決定するために、実施例２に記載されるＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞株にオリゴヌクレオチドを投与することをいう。
【００２７】
記述の側面に関連する様々な用語は、明細書や特許請求の範囲を通して用いられる。このような用語は特に断らない限り、当該技術分野において通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供される定義と一致する方法で解釈されるべきである。
【００２８】
本明細書に開示されるのは、ブラスチシジン耐性遺伝子（ａ  ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）および合成ＳＥＡＰレポーター遺伝子構築物（「ＮＦκＢ−ＳＥＡＰ」）ならびにＮＦκＢ−ＳＥＡＰ構築物およびニワトリＴＬＲ２１構築物（ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１）と同時トランスフェクトされた安定細胞株を含む組換えＨＥＫ２９３細胞株である。この後者の細胞株を用いて、候補化合物のＴＬＲ２１媒介免疫刺激特性を試験することができる。実施例において実証されたように、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞株は、ＴＬＲ２１媒介免疫応答を誘発することができるオリゴヌクレオチドを同定するために使用することができる。
【００２９】
オリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ２１を活性化するか、または刺激する際にそのオリゴヌクレオチドを使用するための方法もまた、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、宿主生物において発現される病原体認識受容体と相互作用する、少なくとも１つの病原体関連分子マーカー（ＰＡＭＰ）、特に非メチル化ジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはまた、グアニンヌクレオチド富化配列を有する。これらの配列は、ＤＮＡ鎖の四次構造への折り畳みを容易にし得るか、またはオリゴヌクレオチドの場合、その配列を含む１つ以上のオリゴヌクレオチドの凝集を促進し得る。ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを有するオリゴヌクレオチドの免疫原性は、オリゴヌクレオチドがグアニンヌクレオチド富化配列をさらに含む場合に、増強され得ることが、本明細書中で実証される。グアニンヌクレオチド富化配列はグアニンヌクレオチドのみから構成される必要はないが、富化されなければならない。グアニン富化配列は上記およびこれらの開示を通して例示されるように、任意の他の残基（すなわち、アデニン、シトシン、チミンヌクレオチド）よりも多くのグアニンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのセグメントである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列および構造のさらなる操作は、ＴＬＲ２１を刺激するオリゴヌクレオチドの能力をさらに増強し得る。従って、本開示の１つの実施形態は、オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００３０】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの３’末端へのデオキシグアニン（ｄＧ）ヌクレオチドの付加は、インビトロでのＴＬＲ９活性化を増強することが以前から示されている。ＴＬＲ９はニワトリＴＬＲ２１の哺乳動物の機能的等価物であるので、３’ｄＧランはまた、ＴＬＲ２１を活性化するように設計されたオリゴヌクレオチドの免疫原性を改善することが予想された。驚くべきことに、これは、ＴＬＲ２１活性化における３’グアニンヌクレオチド富化配列には当てはまらない。２つ以上のｄＧの３’ランを有するオリゴヌクレオチドはＴＬＲ２１を活性化することができなかったが（図４Ａおよび４Ｂ）、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの５’末端へのｄＧランの添加はオリゴヌクレオチドの免疫原性を有意に改善した。
【００３１】
オリゴヌクレオチド中のグアニンヌクレオチド富化配列の位置がＴＬＲ２１活性化の増強に影響を及ぼすだけでなく、配列の内容も同様に影響を及ぼす。このため、本開示のいくつかの実施形態では、グアニンヌクレオチド富化配列が第１の複数の連続したグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、２〜８個のグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、２つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、３つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、４つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、５つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、６つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、７つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、８つのグアニンヌクレオチドを含む。さらに他の態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、８を超えるグアニンヌクレオチドを含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９２、９３、９６、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、または１４３を含む。いくつかの実施形態では、グアニンヌクレオチド富化配列がＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６８）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、またはＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）を含む。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドが配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３７、または１３８を含む。
【００３３】
ｄＧの単一のランは、ＴＬＲ２１刺激を増強し得る唯一の５’修飾ではない。例えば、アデニン、シトシン、およびチミンヌクレオチド富化配列はまた、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端に付加され得、そしてオリゴヌクレオチドの５’末端でグアニン富化配列によって誘発されるものより少ないにもかかわらず、増強されたＴＬＲ２１刺激を生じる（図８Ａおよび８Ｂを参照のこと）。オリゴヌクレオチドの５’末端の単一の複数のグアニン残基がＴＬＲ２１刺激を誘発し得るが、グアニンヌクレオチド富化配列における追加の複数のグアニンヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの刺激特性をさらに増強し得る。したがって、いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間に第２の複数のグアニンヌクレオチドを含む。
【００３４】
いくつかの態様において、複数のグアニンヌクレオチドは、Ｇ−カルテット配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数のグアニンヌクレオチド、第２の複数のグアニンヌクレオチド、またはその両方は、Ｇ−カルテット配列を含む。上記で定義したように、Ｇ−カルテット配列は、オリゴヌクレオチド間の相互作用を可能にする。理論に束縛されるものではないが、Ｇ−カルテット配列を介するオリゴヌクレオチドの相互作用はＣｐＧジヌクレオチドモチーフの濃度および対応するＴＲＬ２１による認識の増強された確率を可能にする。Ｇ−カーテット配列はまた、複数のＴＬＲ２１受容体相互作用（結合活性を増強する）および受容体架橋の機会を提供する。いくつかの実施形態において、免疫刺激性組成物はＧ−カルテット配列を有する少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドをさらに含み、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドは、四次構造において平行な配向を有する。いくつかの態様において、Ｇ−カルテット配列は、ＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）を含む。
【００３５】
Ｇ−ワイヤー配列は、ＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’に付加され得る別のグアニンヌクレオチド富化配列である。本開示のいくつかの態様において、第１および第２の複数のグアニンヌクレオチドは、Ｇ−ワイヤー配列を含む。いくつかの態様において、Ｇ−ワイヤー配列は、配列番号２５７または２５８を含む。さらに他の態様において、Ｇ−ワイヤー配列は、配列番号１４１、１４２、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、またはＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ３を含む。２つの複数のグアニンヌクレオチドは、非グアニンヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または任意の他のスペーサーもしくはリンカーによって分離され得る。例えば、本開示のいくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドおよび第２の複数のグアニンヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される。本明細書中で使用される場合、用語「スペーサー」は類似のヌクレオチドモチーフ間、すなわち２つのＣｐＧモチーフ間、または２つのグアニンヌクレオチド富化配列モチーフ間の化学結合をいい、一方、用語「リンカー」は異なるヌクレオチドモチーフ間、すなわちグアニンヌクレオチド富化配列と別のヌクレオチドモチーフ、例えばＣｐＧモチーフとの間の化学結合をいう。用語「スペーサー」および「リンカー」はオリゴヌクレオチドのどの態様が議論されているかを明確に記載するために使用される。しかしながら、スペーサーについて本明細書中に開示された構造はリンカーについて本明細書中に開示された構造と交換可能であり得、逆もまた同様であり得ることが、当業者によって理解される。
【００３６】
いかなる特定の理論にも束縛されることなく、Ｇ−ワイヤー配列は、オリゴヌクレオチドを、Ｇ−ワイヤー配列を有する他のオリゴヌクレオチドと相互作用させ、そして凝集させることを可能にすることが可能である。オリゴヌクレオチドおよびそれらのＣｐＧモチーフのこの蓄積は、ＴＬＲ２１の刺激の増強をもたらし得る。
【００３７】
オリゴヌクレオチド内のグアニンヌクレオチド富化配列は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または他のリンカーによってＣｐＧヌクレオチドモチーフから分離され得る。したがって、本開示のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド富化配列と下流の少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間にリンカーをさらに含む。リンカーはグアニンヌクレオチド富化配列またはＣｐＧモチーフのいずれかに直接隣接する必要はないが、リンカーはグアニンヌクレオチド富化配列とリンカーとの間、ならびにＣｐＧモチーフとリンカーとの間の介在配列にかかわらず、２つの配列モチーフの間に存在しなければならない。本開示のいくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも３つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーが窒素塩基を含まなくてもよい。例えば、いくつかの態様において、リンカーは、ヘキサエチレングリコール、プロパンジオール、トリエチレングリコール、またはそれらの誘導体である。他の例において、リンカーを有するオリゴヌクレオチドは、２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ１または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ３を含む。
【００３８】
本開示のオリゴヌクレオチド中に存在するジヌクレオチドＣｐＧモチーフは、ニワトリにおいてＴＬＲ２１によって認識されるＰＡＭＰであると考えられる。単一のＣｐＧモチーフであってもＴＬＲ２１を刺激することができるが、オリゴヌクレオチド上に存在する複数のＣｐＧは刺激されたＴＬＲ２１シグナル強度を増加させることができる。この理由のために、本発明のいくつかの態様において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、２つ、３つ、４つ、または５つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、６つ以上のＣｐＧモチーフを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、２つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、３つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、４つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣｐＧモチーフが４つのＣｐＧモチーフを含む。
【００３９】
本開示のオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態において、各ＣｐＧモチーフは、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログによって他のＣｐＧモチーフから分離され得る。いくつかの態様において、少なくとも１つのヌクレオチドは、２つまたは３つのチミンヌクレオチドである。他の態様において、介在ヌクレオチドの数は介在ヌクレオチドの配列に依存して異なり得るが、少なくとも１つのヌクレオチドは１〜４個のヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２１７、２１８、２１９、または２２０を含む。ＣｐＧモチーフに隣接するヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ自体と共に、ＣｐＧ配列エレメント（例えば、ＸＣＧＸ、Ｘ＝任意のヌクレオチド）を構成する。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドがＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、ＴＣＧＣ、またはそれらの任意の組合せであるＣｐＧ配列エレメントを含む。
【００４０】
本開示のいくつかの実施形態において、ＣｐＧモチーフは、４つのヌクレオチドを有するＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも６つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、８、１０、１５、またはさらには２０を超えるＣｐＧ配列エレメントを含む。
【００４１】
本開示のオリゴヌクレオチドの他の実施形態において、ＣｐＧモチーフの各々は、スペーサーまたはスペーサーと少なくとも１つのヌクレオチドとの組み合わせによって、互いに他のＣｐＧモチーフから分離される。いくつかの態様において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフはスペーサーまたはスペーサーと少なくとも１つのヌクレオチドとの組み合わせによって、最も近い他のＣｐＧモチーフから分離され、一方、少なくとも２つの他のＣｐＧモチーフは互いに隣接する。分離されたＣｐＧモチーフは設計されたオリゴヌクレオチドの免疫刺激能力を増強し得るが、互いに隣接するＣｐＧモチーフは依然としてＴＬＲ２１を刺激し得ることが認められる。
【００４２】
ＣｐＧモチーフを直線的に分離するために使用されるスペーサーは、ＣｐＧモチーフ間のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を架橋する任意の連結であり得る。スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋、多重炭素鎖、または反復化学単位を含むことができるが、必ずしもこれらに限定されない。スペーサーの１つの必須の特性は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド骨格と化学結合を形成する能力である。したがって、いくつかの実施形態では、スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋である。デオキシリボースリン酸架橋はいくつかの態様において窒素塩基を含み得、一方、他の態様において、デオキシリボースリン酸架橋は脱塩基性ある。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、脱塩基デオキシリボースリン酸架橋を含む配列番号２２１を含む。
【００４３】
本開示の他の実施形態では、スペーサーは炭素鎖を含む。炭素鎖は、２〜１２個の炭素原子を含むことができる。末端アルコール基は、オリゴヌクレオチドの末端アルコールおよび／またはリン酸基と反応することができるので、炭素鎖を含むジオールを使用することができる。いくつかの態様において、炭素鎖は２個の炭素原子を含み、いくつかの態様において、炭素鎖はエタンジオールから誘導される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ−Ｘ２（ここで、Ｘ２はエタンジオールである）を含む。
【００４４】
本開示の他の実施形態は、３個の炭素原子を含む炭素鎖を提供する。これらの実施形態のいくつかの態様において、炭素鎖は、１，３−プロパンジオールから誘導される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−２、またはＯＤＮ−Ｘ３、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−１、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−３、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−４、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−５、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−１、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−２、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−３、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−４、またはＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−５を含み、ここでＸ２は３個の炭素鎖であり；２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ２を含み、ここでＸ２は１，３−プロパンジオール由来の３個の炭素鎖である；または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ４を含み、ここでＸ４は１，３−プロパンジオール由来の３個の炭素鎖である。
【００４５】
本開示のさらに他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは炭素鎖スペーサーを含み、ここで、炭素鎖は、４個の炭素原子を含む。これらの実施形態のいくつかの態様において、炭素鎖は、１，４−ブタンジオールから誘導される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはＯＤＮ−Ｘ４を含み、ここで、Ｘ４は、１，４−ブタンジオールから誘導される４個の炭素鎖である。
【００４６】
本開示のさらに他の態様において、オリゴヌクレオチドは、反復化学単位を有するスペーサーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、反復化学単位はエチレングリコールである。反復化学単位は、２〜１２回繰り返されてもよい。いくつかの実施形態において、エチレングリコールは６回繰り返される。したがって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはＣＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ１を含み、Ｘ１は、ヘキサエチレングリコールから誘導されるスペーサーである。
【００４７】
オリゴヌクレオチドの３’末端上のｄＧランは、ＴＬＲ２１刺激はあったとしてもほとんど生じないが、他のヌクレオチドランはオリゴヌクレオチドに増強された免疫原性を付与することができる。具体的には本開示のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはトリチミンヌクレオチド３’末端をさらに含み得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは配列番号２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、または２１５を含む。
【００４８】
本明細書中に開示される各オリゴヌクレオチドについて、当業者は、ヌクレオチドがヌクレオチドアナログに置換され得ることを知る。いくつかの実施形態におけるオリゴヌクレオチドはホスホジエステル骨格を含むが、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドの他の実施形態はホスホロチオエート骨格を含む。
【００４９】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは脂質部分を含むことができ、それはオリゴヌクレオチドの免疫原性の増加をもたらすことができる。増加した免疫原性についての１つの可能な説明は、脂質部分がオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティーを増強するように機能し得ることである。いくつかの実施形態では、脂質部分がオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にある。この脂質「キャップ（ｃａｐ）」は分解を防止し、溶解性を増加させ、医薬組成物中のオリゴヌクレオチドの安定性を改善し、ミセルまたは他の凝集体形成を介して多座配位子をもたらし得、またはそれらの任意の組み合わをもたらし得る。いくつかの態様では、脂質部分はコレステロールである。
【００５０】
開示されるオリゴヌクレオチドはＴＬＲ２１を介して増強された免疫応答を刺激するので、本開示の他の実施形態は本明細書中に開示される免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することによって、疾患を予防または処置する方法を包含する。
【００５１】
本明細書に開示される免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物も提供される。これらの免疫刺激性組成物は本明細書中に記載されるようなオリゴヌクレオチドを含むが、組成物はまた、組成物の免疫原性、有効性、および効率に影響を及ぼす他の成分を含み得る。例えば、いくつかの態様において、免疫刺激性組成物は、薬学的に受容可能な担体を含む。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、乳房内、皮内、腹腔内、皮下、噴霧、エアゾール、卵内、粘膜、経皮、浸漬、経口、眼内、気管内、鼻腔内、肺、直腸、または当業者に公知の他の手段から選択される経路による投与に組成物を適合させる。薬学的に受容可能な担体は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルであり得、これらを用いて免疫刺激性組成物が投与される。このようなビヒクルは水および油のような液体であり得、石油、動物、植物、または合成起源のものを含み、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。例えば、０．４％の生理食塩水および０．３％のグリシンを使用することができる。これらの溶液は、無菌で一般に粒状物質を含まない。それらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤などの生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含有する可能性がある。このような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は幅広く、すなわち、約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％から１５または２０重量％まで変動し得、選択される特定の投与様式に従って、主に必要な用量、流体容量、粘度などに基づいて選択される。他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む好適なビヒクルおよび製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｒｏｙ、Ｄ．Ｂｅｄ．、Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ  ２００６、Ｐａｒｔ  ５、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１−１０９２（特にｐ．９５８−９８９参照）に記載されている。
【００５２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよび担体は連結される。オリゴヌクレオチドと担体との間の関係を記載するために使用されるように、「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」とは、オリゴヌクレオチドと担体との物理的会合をいう。オリゴヌクレオチドおよび担体が互いに結合され（ｂｏｕｎｄ）、互いに相互作用し、または組み合わされ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）、組み合わされ（ｃｏｕｐｌｅｄ）、または他の方法で結合される（ｊｏｉｎｅｄ）場合、それらは連結されているとみなすことができる。
【００５３】
本明細書中に記載される免疫刺激性組成物は、いくつかの実施形態において、ハプテンをさらに含む。いくつかの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ハプテンに連結される。ハプテンは特定の微生物（例えば、ＥｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられるが、これらに限定されない）に対する免疫応答を誘発し得、一方、免疫刺激性オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドとのＴＬＲ２１相互作用によって媒介される非特異的免疫応答を誘発する。住民が感染のリスクが高い大規模なブローダーハウスでは、これらおよび他の感染性微生物が特に懸念される。
【００５４】
免疫刺激性組成物のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載される免疫刺激性オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む、感染症を予防または処置するためのワクチンを提供する。オリゴヌクレオチドが任意の免疫応答を誘発するためには、標的が細胞培養物、ニワトリ、または別の脊椎動物であるかどうかにかかわらず、オリゴヌクレオチドをその標的に効果的に送達しなければならない。したがって、本開示の一態様は、本明細書中に記載される免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００５５】
免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および活性成分としてそのオリゴヌクレオチドのみを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドの効力は、その半数効果濃度（ＥＣ５０）によって測定することができる。ＥＣ５０は、組成物を投与することによって達成され得る最大応答の半分である応答を誘導する免疫刺激性組成物の濃度の測定値である。濃度が低ければ低いほど、オリゴヌクレオチドはより強力である。本開示のいくつかの態様では、免疫刺激性組成物がｐＭ範囲のＥＣ５０を有することができる。いくつかの態様において、ＥＣ５０は、約０．１〜１００ｐＭの間である。いくつかの態様において、ＥＣ５０は、約１００〜２００ｐＭの間である。いくつかの態様において、ＥＣ５０は、約２００〜３００ｐＭの間である。ある態様において、ＥＣ５０は、約３００〜４００ｐＭの間である。いくつかの態様において、ＥＣ５０は、約４００〜ら５００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ５０は約５００〜６００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ５０が約６００〜７００ｐＭの間である。いくつかの態様において、ＥＣ５０は、約７００から８００ｐＭの間である。いくつかの態様において、ＥＣ５０は、約８００から９００ｐＭの間である。ある態様において、ＥＣ５０は、約９００ｐＭから１ｎＭの間である。さらに他の態様では、ＥＣ５０は約１００ｐＭ未満である。
【００５６】
免疫刺激性組成物中のオリゴヌクレオチドの濃度に関して、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約０．１〜１０ｎＭである。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度が約１０〜２０ｎＭの間である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約２０〜３０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は約３０〜４０ｎＭの間である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約４０〜５０ｎＭの間である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約５０〜６０ｎＭの間である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約６０〜７０ｎＭの間である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約７０〜８０ｎＭの間である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約８０〜９０ｎＭの間である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約９０μＭ〜１μＭの間である。さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約２０ｎＭ未満である。
【００５７】
免疫刺激性組成物は、本開示のいくつかの実施形態において、Ｇ−ワイヤー配列を有する少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含み得る。Ｇ−ワイヤー配列は同じまたは類似のＧ−ワイヤー配列を有する他のオリゴヌクレオチドの凝集を容易にするので、免疫刺激性組成物の１つの態様はＧ−ワイヤー配列を有する少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む。免疫刺激性組成物がＧ−ワイヤー配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含むいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドは、Ｇワイヤコンホメーションを有する。
【００５８】
オリゴヌクレオチドの５’末端でまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、トル様受容体２１（ＴＬＲ２１）を刺激する方法もまた、本明細書中に提供される。また、オリゴヌクレオチドの５’末端でまたはその４ヌクレオチド内で始まる少なくとも１つのグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘発するための方法も提供される。
【００５９】
オリゴヌクレオチドは、上記のような免疫刺激性組成物の形態で投与することができる。免疫刺激性組成物は上記のように、ハプテン、薬学的に受容可能な担体、またはその両方をさらに含み得る。免疫刺激性組成物を投与することは、いくつかの態様において、静脈内、筋肉内、乳房内、皮内、腹腔内、皮下、噴霧、エアロゾル、卵内、粘膜内、経皮、浸漬、経口、眼内、気管内、または鼻腔内で行うことができる。投与を必要とする対象は動物である。いくつかの態様において、対象は、鳥類種のメンバーである。例えば、本明細書中に開示される免疫刺激性組成物は、胚化ニワトリ卵に卵内投与され得るか、またはふ化ニワトリまたは成鳥にさえ筋肉内投与され得る。
【００６０】
オリゴヌクレオチドの５’末端をグアニンヌクレオチド富化配列に融合することを含む、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１−刺激活性を増加させるための方法もまた、本明細書で提供される。いくつかの態様において、グアニンヌクレオチド富化配列は、Ｇ−カルテット配列である。いくつかの態様において、Ｇ−カルテット配列は、第１の複数のグアニンヌクレオチドを含む。この第１の複数のグアニンヌクレオチドは、ＴＧＧＧＧＴ配列（配列番号２６５）の一部を含み得る。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、３〜８個のグアニンヌクレオチドを含む。さらに他の態様において、Ｇ−カルテット配列は、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６８）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、またはＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）を含む。
【００６１】
本開示の他の実施形態は、第１および第２の複数のグアニンヌクレオチドを含むグアニンヌクレオチド富化配列を提供する。他の態様において、グアニンヌクレオチド富化配列は、Ｇ−ワイヤー配列を含む。いくつかの態様において、Ｇ−ワイヤー配列は、配列番号２５７または２５８を含む。本方法のさらに他の態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドおよび第２の複数のグアニンヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される。
【００６２】
本明細書中に開示されるような方法は、いくつかの実施形態において、第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間にリンカーを挿入することをさらに含み得る。リンカーは上記に記載されており、少なくとも３つのヌクレオチドまたはヘキサエチレングリコールを含み得るが、これらに限定されない。
【００６３】
ＴＬＲ２１を刺激するオリゴヌクレオチドの能力は、本発明のいくつかの態様に従って、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧモチーフの数を増加させることによってさらに増強され得る。いくつかの態様において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフは複数のＣｐＧモチーフであり、複数のＣｐＧモチーフは、２つ、３つ、４つ、または５つのＣｐＧモチーフを含む。ＣｐＧモチーフ間の距離は、オリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激特性に影響を及ぼすことができる。この理由のために、開示される方法のいくつかの態様は、ＣｐＧモチーフ間に少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを挿入することを提供する。少なくとも１つのヌクレオチドは、２つまたは３つのチミンヌクレオチドであり得る。
【００６４】
本方法の他の実施形態は、ＣｐＧモチーフの各々の間にスペーサーを挿入することを提供する。スペーサーは、１つの隣接するヌクレオチド鎖の３’末端および他のヌクレオチド鎖の５’末端に結合できなければならない。いくつかの態様では、スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋であり、これはいくつかの態様では脱塩基であり得る。
【００６５】
スペーサーは、いくつかの態様において、炭素鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、炭素鎖は２個の炭素原子を含む。いくつかの態様では、炭素鎖はエタンジオールから誘導される。他の実施形態は、３個の炭素原子を含む炭素鎖を提供する。いくつかの態様では、炭素鎖が１，３−プロパンジオールから誘導される。いくつかの実施態様では炭素鎖は４個の炭素原子を含み、いくつかの態様では炭素鎖は１，４−ブタンジオールから誘導される。さらに他の実施形態では、スペーサーが反復化学単位を含む。いくつかの態様では繰り返される化学単位はエチレングリコールであり、いくつかの態様ではスペーサーはヘキサエチレングリコールから誘導される。
【００６６】
オリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激特性を増強する方法では、オリゴヌクレオチドに少なくとも１つのヌクレオチドアナログまたは脂質部分を組み込むことも想定される。いくつかの態様において、脂質部分は、オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にある。本方法のさらに他の態様は、ＣｐＧモチーフに隣接するヌクレオチドを修飾することを含む。
【００６７】
［実施例］
以下の実施例は、本明細書中に開示される実施形態のいくつかをさらに記載するために提供される。実施例は開示された実施形態を説明することを意図したものであり、限定することを意図したものではない。  
実施例１：ＮＦκＢ経路レポーター遺伝子ＨＥＫ２９３細胞株の作出
ｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）および他の市販のプラスミドベクターは、ＮＦκＢ経路レポーター遺伝子細胞株を作出するために日常的に使用される。市販の形態のｐＮｉｆＴｙ２−ＳＥＡＰは細菌および哺乳動物の選択のためのゼオシン耐性遺伝子を含み、これは大量のこの細胞増殖抑制剤（４００μｇ／ｍｌまで）を必要とし、そしてこの選択は時には信頼できない。従って、より良好な選択マーカー、好ましくはブラスチシジン耐性を有するレポータープラスミドの生成が開始された。
【００６８】
ｐＮｉｆｔｙ２‐ＳＥＡＰコード化（分泌胚性アルカリ性ホスファターゼ）ＳＥＡＰ遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを、ヒトコドン最適化型で合成した。５つのＮＦκＢ認識部位および内皮−白血球接着分子（ＥＬＡＭ）プロモーター部位を含む、ＡＴＧ開始コドンの上流のｐＮｉｆｔｙ２−ＳＥＡＰ中の２８４ｂｐ領域もまた、以下の修飾を用いて合成した：ＫｐｎＩ部位をＡＴＧ開始コドンのすぐ上流に構築し（配列「ＧＧＴＡ」の挿入）、さらに上流に、５’〜３’のＥｃｏＲＶ、ＭｌｕＩ、およびＮｄｅＩ部位からなる配列を導入した。さらに、終止コドンの下流に、ＮｈｅＩ部位および第２のＥｃｏＲＶ部位を導入した。ＳＥＡＰオープンリーディングフレームにおけるこれらの部位の存在を避けるように注意した。
【００６９】
ＮＦκＢ−ＳＥＡＰ（ヒトコドン最適化）（配列番号１）（下線は、サブクローニングに使用される制限酵素部位（ＭｌｕＩおよびＮｄｅＩ）を示す。開始ＡＴＧと終止ＴＡＡコドンは太字で強調されている）
2021506245.tif 000002
2021506245.tif 000003
この合成ＳＥＡＰ遺伝子構築物（「ＮＦκＢ−ＳＥＡＰ」）を、ＭｌｕＩ／ＮｈｅＩ二重消化によってクローニングベクターから切り出し、そして連結によってｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（図１）に導入し、ＭｌｕＩ／ＮｈｅＩでプレカットし、そしてゲル精製して、ＣＭＶプロモーター領域を除去した。ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ／ＫａｎＲ）がブラスチシジン耐性遺伝子（ｂｓｄ→ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｂｓｄ）またはピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ→ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｐｕｒｏ）に置き換わったｐｃＤＮＡ３．１（＋）のホメメードバージョンを同様にプロセシングし、ＮＦκＢ−ＳＥＡＰ構築物と連結した。
【００７０】
この組の構築物から、ｂｓｄ含有プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｂｓｄ−ＮＦκＢ−ＳＥＡＰを、ＨＥＫ２９３トランスフェクションのために選択した。この目的のために、ＰｖｕＩ線状化形態を、標準的なトランスフェクション方法によって細胞に導入し、そしてゲノム組み込み構築物を有する細胞を、１０μｇ／ｍｌのブラスチシジンで選択した。耐性細胞プールを腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）誘導ＳＥＡＰ産生について試験し、単一細胞クローニングにより、特に有利なシグナル対ノイズ比を有する１クローン系統（ＨＥＫ２９３‐ＮＦκＢ‐ＳＥＡＰ‐ｂｓｄまたはＨＥＫ２９３‐ＮＦκＢ‐ｂｓｄ）をさらなる研究のために選択した。この細胞系のヒトＴＮＦ−αのＥＣ５０は３．２ｎｇ／ｍｌである（図２）。
【００７１】
実施例２：ニワトリＴＬＲ２１トランスジェニック細胞株の作出
ニワトリのトル様受容体２１（ＴＬＲ２１）は、哺乳動物のＴＬＲ９と機能的に相同であるが、オーソロガスではない非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ受容体である（Ｂｒｏｗｎｌｉｅら２００９、Ｋｅｅｓｔｒａら２０１０）。ニワトリＴＬＲ２１をコードする遺伝子を、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３０５５８の推定タンパク質配列に基づいて、ヒトコドン使用頻度に最適化することによって合成した。開始コドンＡＴＧの上流に、Ｋｏｚａｋ配列を含むＫｐｎＩ部位を導入し、一方、終止コドンの下流に、ＮｏｔＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位を添加した。ＴＬＲ２１遺伝子をクローニングベクターからＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ二重消化により切り出し、ゲル精製し、ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ切断哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に連結した。このｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｃＴＬＲ２１をＰｖｕＩで線形化し、ＰｖｕＩ線形化ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｂｓｄ−ＮＦκＢ−ＳＥＡＰと共にＨＥＫ２９３にトランスフェクトした結果、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１、またはＨＥＫ２９３−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１が得られた。
【００７２】
細胞プールを、ブラスチシジンおよびＧ４１８の同時適用によって選択し、ＴＮＦ−αによる機能的ＮＦκＢ経路について、およびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド２００６−ＰＴＯ（配列番号３）による活性ｃＴＬＲ２１について試験した。シングルセルクローニングにより、２００６−ＰＴＯに対応した優れたシグナル／ノイズ比を持つクローナルセルラインが導出された。クローンＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞株は、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄについて観察されたものと同様に、優れたＴＮＦ−α感受性（ＥＣ５０＝１．４ｎｇ／ｍｌ）を示した（図２）。
【００７３】
Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＴＬＲ２１−Ｇｅｎ（ＮＭ＿００１０３０５５８に基づく）（配列番号２）（開始ＡＴＧおよび停止ＴＡＧコドンを下線で強調する）：
CCCGGTACCATGATGGAAACAGCTGAGAAAGCCTGGCCATCTACCAGGATGTGTCCTAGTCACTGCTGTCCCCTCTGGCTGCTGCTGCTTGTTACCGTGACGCTGATGCCAATGGTACACCCTTATGGTTTCCGCAACTGCATCGAGGATGTCAAGGCTCCCTTGTACTTTAGGTGTATCCAGAGATTCCTGCAGAGCCCAGCCCTCGCGGTGAGTGATCTTCCTCCCCATGCCATTGCCTTGAACTTGAGTTACAACAAGATGCGGTGTCTCCAGCCATCAGCCTTCGCCCACCTGACGCAGTTGCATACGCTGGACCTGACTTACAATCTGCTCGAAACCCTGAGCCCTGGGGCCTTCAATGGCTTGGGCGTCCTCGTGGTGCTCGACCTGTCTCACAATAAGCTGACTACTCTTGCAGAAGGGGTGTTTAACAGTCTGGGTAATCTGTCCTCCCTGCAAGTGCAGCATAACCCTCTGAGCACAGTCTCACCATCAGCACTTTTGCCACTGGTCAATCTCCGCAGGCTGAGCCTGCGGGGAGGACGGCTGAATGGACTGGGCGCTGTTGCCGTGGCGGTTCAGGGACTTGCACAGCTTGAGCTGCTGGATCTGTGTGAAAATAATTTGACAACACTGGGACCCGGTCCGCCTCTGCCCGCTAGCCTGCTCACCCTGCAGCTGTGCAACAACTCACTGAGGGAGCTGGCCGGAGGAAGCCCTGAAATGCTGTGGCATGTGAAGATCCTGGATTTGTCATACAACAGCATCTCTCAGGCTGAAGTGTTTACTCAGCTCCACCTCCGCAATATCTCCCTTCTGCACTTGATTGGAAATCCCCTGGATGTGTTCCATTTGCTGGACATATCCGATATACAACCTAGGTCACTGGACTTCTCAGGTCTGGTTCTTGGTGCCCAAGGGCTGGACAAGGTGTGTCTGCGTCTGCAAGGGCCCCAGGCTCTTCGCCGTCTGCAACTTCAGAGAAACGGGCTCAAAGTCCTGCACTGCAACGCCCTGCAGCTTTGCCCCGTGCTGCGAGAGCTGGATCTGTCTTGGAACCGCCTGCAGCACGTCGGCTGTGCAGGCCGACTCCTCGGGAAGAAACAGCGGGAGAAACTGGAAGTTCTGACCGTGGAACACAATCTTCTGAAGAAACTCCCCAGTTGCTTGGGTGCCCAAGTGCTCCCTAGACTGTATAACGTCAGCTTCCGGTTCAATCGAATCCTGACTGTGGGTCCACAGGCCTTCGCCTATGCACCCGCGCTCCAGGTCCTTTGGCTGAACATTAACTCCCTTGTCTGGTTGGATCGTCAGGCTCTTTGGCGCCTCCATAATCTGACCGAGCTGAGACTTGATAACAATCTGTTGACAGATCTGTACCACAACTCTTTCATTGACCTTCACAGACTGCGGACCCTGAATCTCCGGAACAACCGCGTGAGCGTTCTGTTTTCCGGGGTTTTCCAGGGCTTGGCCGAGCTGCAGACCCTGGACCTGGGCGGCAACAATCTGCGACACCTCACAGCTCAGAGTCTGCAGGGCCTCCCAAAGCTGAGGAGGCTGTACCTCGACCGGAATAGACTTCTGGAGGTGTCCTCAACTGTATTTGCTCCCGTTCAAGCCACCCTCGGGGTGCTGGACCTGAGAGCCAACAATCTGCAGTATATCTCCCAGTGGCTTAGGAAACCGCCGCCATTTAGAAACTTGAGCAGCCTGTATGACCTGAAACTGCAGGCCCAGCAGCCGTATGGGCTGAAGATGCTGCCTCACTACTTCTTTCAGGGCCTGGTTAGACTGCAACAGCTCTCCCTTAGCCAAAACATGCTGAGGTCTATCCCACCGGACGTGTTTGAAGATCTCGGACAGCTCCGTAGCCTGGCTCTGGCTGACAGTAGCAATGGGCTGCATGATTTGCCCGACGGCATTTTCCGGAACCTCGGGAACCTGAGGTTTCTCGATCTTGAGAATGCGGGGTTGCACTCTCTCACCCTGGAGGTCTTTGGAAACCTCTCCCGCCTGCAAGTCCTGCATCTGGCAAGGAACGAACTCAAAACCTTCAATGACTCTGTGGCAAGCCGGCTGAGCAGCCTTCGCTATCTGGACCTCCGGAAGTGTCCTCTGTCTTGCACTTGCGATAATATGTGGCTGCAGGGGTGGTTGAATAATTCTCGGGTACAGGTAGTGTACCCCTACAACTACACATGCGGATCTCAACACAACGCATACATACACAGCTTTGACACACATGTCTGCTTTCTGGATCTGGGCTTGTACTTGTTCGCAGGCACCGCTCCTGCTGTACTGCTCCTCCTCGTCGTACCCGTAGTATATCATCGCGCATACTGGCGGTTGAAGTACCACTGGTATCTTCTGAGATGTTGGGTGAATCAGCGCTGGAGAAGGGAGGAAAAGTGCTATCTGTATGACTCATTTGTCTCTTACAACAGTGCGGATGAGTCCTGGGTTTTGCAAAAGCTCGTCCCAGAGCTCGAGCATGGGGCCTTCAGATTGTGTCTCCATCACAGGGACTTCCAGCCAGGAAGGAGTATTATCGACAATATCGTGGATGCGGTTTATAACAGTCGTAAAACGGTGTGCGTTGTGTCAAGATCCTACCTTAGATCCGAGTGGTGCAGCCTCGAGGTGCAGCTGGCATCCTATCGACTTCTGGATGAGCGCCGAGACATTTTGGTGCTGGTGCTGCTGGAGGATGTGGGTGACGCCGAGCTGAGCGCATATCATCGCATGAGGAGAGTGCTGCTGAGGCGCACATACCTCCGGTGGCCTCTGGATCCAGCCGCTCAACCCCTGTTTTGGGCTAGATTGAAACGAGCCCTTCGATGGGGCGAGGGCGGAGAAGAGGAGGAAGAAGAAGGTCTGGGAGGCGGCACTGGCCGGCCTCGTGAAGGCGACAAGCAGATGTAGCGGCCGCGATATC
ホスホロチオエート（ＰＴＯ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）２００６−ＰＴＯ（ＯＤＮ  ２００６）は、ＴＬＲ２１を活性化することが知られている。Ｋｅｅｓｔｒａ、Ａ．Ｍ．，ｄｅ  Ｚｏｅｔｅ，Ｍ．Ｒ．，Ｂｏｕｗｍａｎ，Ｌ．Ｉ．，ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ，Ｊ．Ｐ．，２０１０。ニワトリＴＬＲ２１は哺乳類ＴＬＲ９とは異なる先天性ＣｐＧ  ＤＮＡ受容体であるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５，４６０−４６７。本研究のクローンＴＬＲ２１細胞株（ＨＥＫ２９３‐ＮＦκＢ‐ｂｓｄ‐ｃＴＬＲ２１）において、２００６‐ＰＴＯも活性であり、活性化のＥＣ５０は〜８．５ｎＭであった。対照的に、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄはいかなるＳＥＡＰ分泌も示さなかった（図３Ａ）。これは、このＯＤＮの特異的相互作用がＴＬＲ２１に特異的であることを実証する。２００６−ＰＤＥ、２００６−ＰＴＯのホスホジエステル結合バージョンは、ＴＬＲ２１に対する刺激活性がはるかに弱かった。そのＥＣ５０の推定値は＞２５０  ｎＭであり、２００６−ＰＴＯと比較してはるかに低い最大刺激を有する（図３Ｂ）。
【００７４】
実施例３：５’Ｇ−カルテット形成配列を含むＯＤＮのＴＬＲ２１活性の増強
３’デオキシグアニン（ｄＧ）添加が２００６−ＰＤＥ（ＯＤＮ２００６、ホスホジエステル型）のＴＬＲ２１認識に及ぼす影響
実施例２に記載のＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞株において、３’−ｄＧ修飾がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響を検討するために、２００６−ＰＴＯのホスホジエステル結合バージョン、２００６−ＰＤＥを基礎として用いた。この目的のために、タイトレーション実験を、２０ｎＭで開始し、１５の希釈段階（１：２）で行い、最終希釈として約１ｐＭに到達させた。具体的には、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞を、４５μｌの増殖培地中、１０，０００細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに播種した。これらの細胞を、増殖培地に溶解したオリゴヌクレオチドに暴露し、３７℃で３〜４日間インキュベートした。ウェル当たりの培養上清１０μｌを３８４ウェルプレートに移し、９０μｌの５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭパラ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰ）（ｐＨ  ９．６）を添加し、４０５ｎＭでの光学濃度の時間変化の速度論的計測によって反応速度を決定した（ｍＯＤ４０５ｎｍ／分）。
【表１】
2021506245.tif 000004
【００７５】
予想通り、２００６‐ＰＴＯはナノモル範囲でＴＬＲ２１を刺激したが、２００６‐ＰＤＥは有意なＴＬＲ２１刺激活性を示さなかった。３’末端での１つのｄＧの添加はｎＭ範囲でいくらかの顕著なＴＬＲ２１刺激活性をもたらし、これははるかに弱いが、第２の（ｄＧ２）および第３（ｄＧ３）ｄＧ添加で依然として存在した。４番目、５番目、６番目、７番目および８番目のｄＧ（ｄＧ４−ｄＧ８）の添加は、ＴＬＲ２１不活性ＯＤＮをもたらした（図４Ａ）。０．３３ｎＭ（３３０ｐＭ）までの濃度範囲では、どのＯＤＮもＴＬＲ２１活性を示さなかった（図４Ｂ）。
【００７６】
５’ｄＧ添加が２００６−ＰＤＥ（ＯＤＮ２００６、ホスホジエステル型）のＴＬＲ２１認識に及ぼす影響
ＴＬＲ２１刺激活性に関する５’−ｄＧ修飾の効果を調べるために、２００６−ＰＴＯのホスホジエステル結合バージョン、２００６−ＰＤＥを基礎として使用した。この目的のために、タイトレーション実験を、２０ｎＭで開始し、１５の希釈段階（１：２）で行い、最終希釈として約１ｐＭに到達させた。
【表２】
2021506245.tif 000005
【００７７】
２００６‐ＰＴＯはナノモル範囲でＴＬＲ２１を刺激し、２００６‐ＰＤＥは有意なＴＬＲ２１刺激活性を示さなかった。２００６−ＰＤＥの５’末端に１つのｄＧおよび２つのＧを添加は、２桁のｎＭ範囲でいくつかのマイナーなＴＬＲ２１刺激活性もたらした。３番目のｄＧ（ｄＧ３）は、５１３ピコモル（ｐＭ）の計算されたＥＣ５０で、ＴＬＲ２１活性の劇的な増加をもたらした（表３）。４ｔｈのｄＧの付加はさらに１４倍活性を増加させた（３６ｐＭの計算されたＥＣ５０、表３）、一方で、５ｔｈ、６ｔｈ、７ｔｈおよび８ｔｈのｄＧ（ｄＧ４−ｄＧ８）は、さらなるＥＣ５０増加および１７．１〜２２．２ｐＭのＥＣ５０を有するＴＬＲ２１刺激プラトーをもたらした。以上を総合すると、５’末に３ｄＧｓ（まだ２ｄＧｓではない）が加わった後、ＯＤＮ構造に何らかの根本的な変化が起こり、それが、ほとんど不活性から強力なピコモラー活性へと、ＴＬＲ２１活動の大幅な増加をもたらし、それは、さらに５’ｄＧｓ付加により増加することがわかる。３’末端でのｄＧの同等の付加は高い活性をもたらさず、対応するＯＤＮ誘導体は大部分が不活性である（図４Ａ〜Ｂ、５Ａ〜Ｂ、および６、ならびに表３を比較されたい）。
【表３】
2021506245.tif 000006
【００７８】
ＴＬＲ２１で試験したＯＤＮの電気泳動移動挙動を調べるために、１６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、続いてメチレンブルー染色を行った。２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ０−８の場合、高次構造の出現（図７Ａ、７Ｂ）と高ＴＬＲ２１刺激活性との間に明確な相関がある。高次構造は、しばしば連続するＧによって形成されることが知られているＧ−カルテット構造の生成によって形成され、ＤＮＡの同じ鎖（「分子内Ｇ−カルテット」）または異なる鎖（「分子間Ｇ−カルテット」）を潜在的に含むようである。Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＪＲ，Ｇ−Ｑｕａｒｔｅｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ＤＮＡ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２３：７０３−７３０  （１９９４）；Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎ  Ｔ，Ｇ−Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ−Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａ  Ｔｈｅｍｅ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８２：６２１−６２８（２００１）。しかし、同じ凝集が２００６−ＰＤＥ−３ｄＧ０−８オリゴヌクレオチドで観察され、これはＴＬＲ２１では活性が乏しいかまたは不活性である。このことは、凝集のみでは強力なＴＬＲ２１刺激活性には十分ではないことを示唆している。５’末端への連続グアニンの配置は、ＴＬＲ２１刺激活性に影響を及ぼすようである。
【００７９】
実施例２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６を用いた強力なＴＬＲ２１刺激の５’グアニンランへの依存性のさらなる検討
２００６−ＰＤＥの５’ｄＧｎ  ｓｃａｎにおいてＴＬＲ２１刺激活性のプラトーを形成しているように見えるので、２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６を例として選択した（図５Ａ、５Ｂ、６、および表３参照）。５’−ｄＧ６ランは、ｄＡ６、ｄＴ６、またはｄＣ６に置き換えられた（表４）。
【表４】
2021506245.tif 000007
【００８０】
２００６−ＰＤＥがｄＮ６で５’端で修正されると、すべてのベースホモマーは改善の順：ｄＡ６＜ｄＣ６＜ｄＴ６＜＜＜＜＜＜＜＜ｄＧ６にＴＬＲ２１活動の多少の増加をもたらす（図８Ａ）。５’−ｄＧ６の改善は明らかに他の塩基の改善よりも桁違いに大きく（特に低濃度で見える、図８Ｂ）、これは、Ｇ−カルテット形成する可能性のあるこの修飾によって与えられる特別な質を示唆している。
【００８１】
実施例２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６を用いて、５’−ｄＧ−修飾２００６−ＰＤＥによる強力なＴＬＲ２１刺激のＣｐＧエレメントの存在への依存性検討
２００６−ＰＤＥの５’ｄＧｎ  ｓｃａｎにおいてＴＬＲ２１刺激活性のプラトーを形成しているように見えるので、２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６を例として選択した（図５Ａ、５Ｂ、６、および表３参照）。ＣｐＧモチーフがＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響を、１）このＯＤＮを４つのＣｐＧモチーフの全てのシチジンを置換する５‐メチル‐シチジンで合成すること、２）全てのＣｐＧモチーフをＧｐＣに反転すること、および３）ＣｐＧモチーフの全てのグアニンをアデニンで置換すること、全てのシトシンをチミンで置換すること、及びシトシンとグアニンをそれぞれチミンとアデニンで同時置換することにより検討した。得られたオリゴヌクレオチドを、実施例３に記載されるように、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞を使用して、ＴＬＲ２１を刺激する能力について試験した。
【表５】
2021506245.tif 000008
【００８２】
２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６におけるＣｐＧモチーフの完全性を妨げる、ここで調査された全ての改変は、活性の大量の損失をもたらし（図９Ａ）、これは低いＯＤＮ濃度で特に目立つ（図９Ｂ）。
【００８３】
２００６−ＰＴＯの３’−および５’−ｄＧ６修飾がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響の検討および２００６−ＰＤＥの同等の変化との比較
ｄＧラン付加によるＴＬＲ２１刺激活性改善がホスホロチオエート骨格を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＰＴＯ−ＯＤＮ）にも当てはまるかどうかを検討するために、２００６−ＰＤＥ、２００６−ＰＤＥ−３ｄＧ５及び２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６のＰＴＯ同族体を合成し（表６）、実施例３に記載したようなＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞を用いたそれらのＴＬＲ２１刺激能を相互に及びそれらのＰＤＥ−バージョンと比較した（表７、ＦＩＧ．１０Ａ及び１０Ｂ）。
【表６】
2021506245.tif 000009
【表７】
2021506245.tif 000010
【００８４】
５’ｄＧ残基の非存在下では、ＰＴＯ修飾がＰＤＥバージョンと比較して、ＯＤＮにはるかに高い活性を付与する（表７、図１０Ａおよび１０Ｂ）。これは、そのＰＴＯバージョンと比較した５’ｄＧ６−修飾２００６−ＰＤＥでは異なる。ここで、ＰＤＥはわずかに高い活性（ＥＣ５０）さえも付与し、これは予想外である（表７、図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【００８５】
２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６の５ｄＧ６ランにおけるｄＡ置換がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響の検討。
２００６−ＰＤＥの連続するｄＧ配列５’がＴＬＲ２１刺激活性を付与するＧ−カルテットを形成するという仮説に基づいて、Ｇ−カルテットｔ形成を破壊すると予想されるｄＧ６ランにおけるｄＡ置換は、その位置に依存して、ＴＬＲ２１刺激活性に負の影響を有することはずであると予測された。この目的のために、当業者によく知られた方法を使用して、単一および二重ｄＡ置換２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６  ＯＤＮを合成し、実施例３に記載されるように、ＴＬＲ２１を刺激するそれらの能力についてＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した（表８および９、図１１Ａ〜Ｄ）。
【表８】
2021506245.tif 000011
【表９】
2021506245.tif 000012
【００８６】
一般に、ｄＧ６ラン内の全てのｄＡ置換はＶｍａｘ（すなわち、比較実験で得られた最大レポーター遺伝子読み出し）にほとんど変化をもたらさなかったが、ＥＣ５０は２桁を超える大きさまでかなり変動した（表９ならびに図１１Ａおよび１１Ｂ）。１ｓｔおよび６ｔｈ位置での単回置換はＥＣ５０には非常に穏やかであったが、２ｎｄおよび５ｔｈ位置はより顕著な増大をもたらした。３ｒｄと４ｔｈ位置で最も強い変化が見られ、ＥＣ５０において１０倍以上の増加をもたらした。二重ｄＡ交換（表９、図１１Ｃ、図１１Ｄ）では、連続する１ｓｔと２ｎｄだけでなく、５ｔｈと６ｔｈも比較的緩やかなＥＣ５０の増大につながり、４ｔｈと５ｔｈはより強力な増大につながった。２ｎｄおよび３ｒｄ、ならびに３ｒｄおよび４ｔｈ位置の二重ｄＡ置換は、それぞれ６８５倍および４５９倍のＥＣ５０の増加をもたらした。本試験前において３連続ｄＧが強力なＴＬＲ２１活性の最小数として特定され、およびＥＣ５０増大がｄＧ３、ｄＧ４〜ｄＧ５の順序で認められ、その後、ＥＣ５０プラトーがｄＧ５−ｄＧ８から見られた（図５Ａ、５Ｂ、６、および表３を比較されたい）という事実を考慮すると、これらのデータはさらに、２００６−ＰＤＥのＧ−カルテット５’の乱されていない形成が強力なＴＬＲ２１刺激のための前提条件であるという概念を支持する。
【００８７】
２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６の５ｄＧ６ランにおけるｄＣ置換がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響の検討
２００６−ＰＤＥの連続するｄＧ配列５’がＴＬＲ２１刺激活性を付与するＧ−カルテットｔを形成するという仮説に基づいて、Ｇ−ｑカルテット形成を破壊すると予想されるｄＧ６ランにおけるｄＣ置換は、その位置に依存して、ＴＬＲ２１刺激活性に負の影響を有することはずであると予測された。この目的のために、単一および二重ｄＣ置換２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６  ＯＤＮを合成し、実施例３で説明したようにＴＬＲ２１を刺激するそれらの能力について試験した（表１０、表１１、図１２Ａ〜Ｄ）。
【表１０】
2021506245.tif 000013
【表１１】
2021506245.tif 000014
【００８８】
一般に、ｄＧ６ラン内の全てのｄＣ置換はＶｍａｘ（すなわち、比較実験で得られた最大レポーター遺伝子読み出し）にほとんど変化をもたらさなかったが、ＥＣ５０は２桁を超える大きさまでかなり変動した（表１１ならびに図１２Ａおよび１２Ｂ）。オリゴヌクレオチドの１ｓｔおよび６ｔｈ位における単一置換はオリゴヌクレオチドの２ｎｄおよび５ｔｈ位と同様に、ＥＣ５０に関して非常に穏やかであった。３ｒｄと４ｔｈ位置に対して最も強い変化が見られ、ＥＣ５０が１０倍以上増大した。二重ｄＣ置換（表１１および図１２Ｃおよび図１２Ｄ）では、連続する１ｓｔおよび２ｎｄだけでなく、５ｔｈおよび６ｔｈ位置が比較的緩やかなＥＣ５０の増大をもたらしたのに対し、４ｔｈ位置と５ｔｈ位置はより強い増大をもたらした。オリゴヌクレオチドの２ｎｄと３ｒｄ位置、並びに３ｒｄと４ｔｈ位置の二重ｄＣ置換は、それぞれ１６０倍と３０３倍のＥＣ５０の膨大な増大をもたらした。３つの連続したｄＧがこの研究において強力なＴＬＲ２１活性の最小数として特定され、ＥＣ５０増大がｄＧ３、ｄＧ４〜ｄＧ５の順序で認められ、その後、ＥＣ５０プラトーがｄＧ５−ｄＧ８から見られた（図５Ａ〜Ｂ、６、および表３を比較されたい）ことを考慮すると、これらのデータは、２００６−ＰＤＥのＧ−カルテット５’の乱されていない形成が強力なＴＬＲ２１刺激のための前提条件であるという概念をさらに支持する。
【００８９】
２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６の５ｄＧ６ランにおけるｄＴ置換がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響の検討
２００６−ＰＤＥの５’末端の連続するｄＧ配列がＴＬＲ２１刺激活性を付与するＧ−カルテットを形成するという仮説に基づいて、Ｇ−カルテットｔ形成を破壊すると予想されるｄＧ６ランにおけるｄＴ置換は、その位置に応じて、ＴＬＲ２１刺激活性に負の影響を及ぼすはずであると予測された。この目的のために、単一および二重ｄＴ置換２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６  ＯＤＮを合成し、実施例３に記載のようにＴＬＲ２１を刺激する能力についてＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した（表１２、表１３、図１３Ａ〜Ｄ）。
【表１２】
2021506245.tif 000015
【表１３】
2021506245.tif 000016
【００９０】
一般に、ｄＧ６ラン内のすべてのｄＴ置換はＶｍａｘにおいてほとんど変化をもたらさず、一方、ＥＣ５０は３桁以上（表１３およびＦＩＧ．１３Ａおよび１３Ｂ）までかなり変化した。オリゴヌクレオチドの１ｓｔおよび６ｔｈ位置における単一置換は、オリゴヌクレオチドの２ｎｄおよび５ｔｈ位置と同様に、ＥＣ５０について非常に穏やかであった。オリゴヌクレオチドの３ｒｄと４ｔｈ位置に対して最も強い変化が見られ、ＥＣ５０が６倍以上増加した。二重ｄＴ置換（表１３および図１３Ｃおよび図１３Ｄ）では、オリゴヌクレオチドの連続する１ｓｔおよび２ｎｄ、ならびに５ｔｈおよび６ｔｈ位置は比較的緩やかなＥＣ５０の増大をもたらし、一方で、４ｔｈ位置と５ｔｈ位置はより強い増大をもたらした。オリゴヌクレオチドの２ｎｄと３ｒｄ位置、並びに３ｒｄと４ｔｈ位置の二重ｄＴ置換は、それぞれ１７８１倍と６２２倍のＥＣ５０の膨大な増大をもたらした。３つの連続するｄＧがこの研究において、強力なＴＬＲ２１活性についての最小数として同定され、そしてＥＣ５０増大がｄＧ３、ｄＧ４〜ｄＧ５の順序で認められ、その後、ＥＣ５０プラトーがｄＧ５−ｄＧ８から見られた（図５Ａ、５Ｂ、６、および表３を比較されたい）ことを考慮すると、これらのデータはさらに、２００６−ＰＤＥのＧ−カルテット５’の乱されていない形成が強力なＴＬＲ２１刺激のための前提条件であるという概念を支持する。
【００９１】
図１４は、オリゴヌクレオチドの１位および６位におけるｄＧ置換がかなり良性であることを示す。対照的に、オリゴヌクレオチドの３位および４位での任意の置換は、ＴＬＲ２１刺激能の顕著な負の効果を有する。また、オリゴヌクレオチドの１位および２位、ならびに５位および６位における隣接するｄＧｄＧ二重置換も良性のようである。対照的に、図１５は、オリゴヌクレオチドの２位および３位ならびに３位および４位において、任意のホモジヌクレオチド（ｄＣｄＣ、ｄＡｄＡ、および特にｄＴｄＴ）による隣接ｄＧｄＧの置換がＴＬＲ２１刺激活性の劇的な損失をもたらすことを示す。オリゴヌクレオチドの４位および５位における隣接するｄＧｄＧ二重置換はより中程度であるが、活性の喪失にもつながる。
【００９２】
これらのデータは４つのｄＧの連続したランが高いＴＬＲ２１刺激活性に必須であり、任意の他のヌクレオチドによる４つのｄＧランの破壊が活性の劇的な損失をもたらすことを示す。
【００９３】
２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ４の５ｄＧ４ランにおけるｄＡ置換がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響の検討
２００６−ＰＤＥに高レベルの刺激活性を付与するのに、５’−ｄＧ４が必要であり、かつ十分であるという仮説をより厳密に試験するために、２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ４中のｄＧ部分を系統的にｄＡに置き換え、種々の誘導体を、実施例３に記載されるように、ＴＬＲ２１を刺激するそれらの能力についてＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した（表１４、表１５、図１６Ａおよび１６Ｂ）。
【表１４】
2021506245.tif 000017
【表１５】
2021506245.tif 000018
【００９４】
ｄＧ４ラン内の全てのｄＡ置換は、ＴＬＲ２１刺激活性の損失をもたらした。幾分驚くべきことに、ＴＬＲ２１刺激活性の劇的な変化が、ＥＣ５０を計算できない程度まで、１位に認められた（表１５ならびに図１６Ａおよび１６Ｂ）。２００６‐ＰＤＥ５ｄＧ４の２ｎｄと３ｒｄ位置における単一ｄＡ置換は、また、それぞれ３４２倍と４７１倍でＥＣ５０の膨大な増大をもたらした。活性の最も穏やかな損失は、ｄＧ４実験における４位のｄＡ置換において、１６倍のＥＣ５０増大で観察された（表１５および図１６Ａおよび１６Ｂ）。これらのデータはさらに、２００６−ＰＤＥのＧ−カルテット５’の乱されない形成が強力なＴＬＲ２１刺激のための前提条件であるという概念を支持する。
【００９５】
２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ４の５ｄＧ４ランにおけるｄＣ置換がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響の検討
２００６−ＰＤＥに高レベルの刺激活性を付与するのに、５’−ｄＧ４が必要であり、かつ十分であるという仮説をより厳密に試験するために、２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ４中のｄＧ部分を系統的にｄＣに置き換え、種々の誘導体を、実施例３に記載されるように、ＴＬＲ２１を刺激するそれらの能力についてＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した（表１６、表１７、図１７Ａおよび１７Ｂ）。
【表１６】
2021506245.tif 000019
【表１７】
2021506245.tif 000020
【００９６】
ｄＧ４ラン内の全てのｄＣ置換は、ＴＬＲ２１刺激活性の損失をもたらした。ＴＬＲ２１刺激活性の顕著な損失が８９倍のＥＣ５０の増大と共に、位置１で認められた（表１７ならびに図１７Ａおよび１７Ｂ）。２ｎｄと３ｒｄ位置における単一ｄＣ置換は、また、それぞれ８３１倍と５４５倍のＥＣ５０の膨大な増大をもたらした。活性の最も穏やかな損失は、ｄＧ４ランにおける位置４のｄＣ置換において、１５倍のＥＣ５０の増大と共にで見出された（表１７および図１７Ａおよび１７Ｂ）。これらのデータはさらに、２００６−ＰＤＥの５’末端でのＧ−カルテットの乱されていない形成が、強力なＴＬＲ２１刺激のための前提条件であるという概念を支持する。
【００９７】
２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ４の５ｄＧ４ランにおけるｄＴ置換がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響の検討
２００６−ＰＤＥに高いレベルの刺激活性を付与するのに、５’−ｄＧ４モチーフが必要かつ十分であるという仮説をより厳密に検証するために、２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ４中のｄＧモチーフをｄＴに系統的に置換し、種々の誘導体を、実施例３に記載されるように、ＴＬＲ２１を刺激するそれらの能力について、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した（表１８、表１９、図１８Ａおよび１８Ｂ）。
【表１８】
2021506245.tif 000021
【表１９】
2021506245.tif 000022
【００９８】
ｄＧ４ラン内の全てのｄＴ置換は、ＴＬＲ２１刺激活性の損失をもたらした。ＴＬＲ２１刺激活性のいくらか驚くべき劇的な変化が、ＥＣ５０が計算できない程度まで、位置１について観察された（表１９ならびに図１８Ａおよび１８Ｂ）。２ｎｄと３ｒｄ位置における単一ｄＡ置換は、それぞれ９２倍と２６５倍でＥＣ５０の膨大な増大につながった。活性の最も穏やかな損失は、ｄＧ４ランにおける４位のｄＴ置換において、５倍のＥＣ５０の増大で見出された（表１９および図１８Ａおよび１８Ｂ）。これらのデータはさらに、２００６−ＰＤＥのＧ−カルテット５’の乱されない形成が強力なＴＬＲ２１刺激のための前提条件であるという概念を支持する。
【００９９】
図１９が示すように、ｄＧ４ランにおける任意のｄＧ置換はＴＬＲ２１刺激活性に有害であり、これは、４つの連続したｄＧが高活性に必要とされるという観点に即している。興味深いことに、１位の置換は３つの連続したｄＧを保存しているにもかかわらずＴＬＲ２１活性を消失させたが、４位ｄＧの置換は、これも３つの連続したｄＧを保存しているが、比較的良性であった。ｄＧ２またはｄＧ３の置換は、ＴＬＲ２１活性に対して一様に有害であった。
【０１００】
５’−ｄＧ４および５’−ｄＧ６のＣｐＧ含有ＰＤＥ−ＯＤＮへの付加がＴＬＲ２１刺激活性の付与に及ぼす影響
哺乳動物ＴＬＲ９（しかし、大部分はＰＴＯバージョンとして記載されている）を刺激するものとして文献に含まれる１１のＣｐＧを含有するオリゴデオキシヌクレオチド配列を、ＰＤＥ誘導体として合成のために選択した（表２０）。ＴＬＲ２１相互作用は、これら全てのＰＤＥ  ＯＤＮについて未知であった。これらのＰＤＥ  ＯＤＮのうち５つについては、それらの３’−ｄＧ５−、５’−ｄＧ４−および５’−ｄＧ６−バージョンも合成された。１つのＯＤＮについてはその５’−ｄＧ４−および５’−ｄＧ６−バージョンが合成された；もう１つについてはその３’−ｄＧ５−および５’−ｄＧ６−バージョンが合成された；一方、他の４つについては対応する５’−ｄＧ６−バージョンのみが合成された（表２０）。これらのＯＤＮを、実施例３に記載されるようにＴＬＲ２１刺激試験に供した（表２１、図２０Ａ〜Ｉ）。
【表２０】
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【表２１】
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【０１０１】
未修飾ＰＤＥ  ＯＤＮのＴＬＲ２１活性化試験（表２０）において、１８２６、ＢＷ００６、Ｄ−ＳＬＯ１および２００７のみが、いくらかの軽微な活性（ｍｉｎｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示した（表２１、図２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｇ）。全ての他のＰＤＥ  ＯＤＮは、試験した濃度でＴＬＲ２１刺激活性を示さなかった（表２１、図２０Ａ、２０Ｅ、２０Ｆ、２０Ｈ、２０Ｉ、２０Ｊ、および２０Ｋ）。３’ｄＧ５の付加を有する６つのＯＤＮ誘導体は、ＴＬＲ２１活性を示さなかった（表２１）。これは、２００６−ＰＤＥの以前の観察結果と一致している。小さなＴＬＲ２１刺激シグナル（１８２６、ＢＷ００６、Ｄ−ＳＬＯ１、および２００７）を有する４つのＯＤＮについて、３’ｄＧ５添加は、それらの活性を死滅させた（図２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｇ）。
【０１０２】
対照的に、５’ｄＧ４（６つのＯＤＮ）または５’ｄＧ６（１１個のＯＤＮ）の添加は、５つの場合のナノモルＥＣ５０、１３の他の場合のピコモル（ｐＭ）ＥＣ５０を含む、それぞれの場合において、増加したＴＬＲ２１刺激活性をもたらした（表２１）。６つでも２桁のｐＭのＥＣ５０（２０ｐＭ程度の低さ）を有し、これは出発点がほぼゼロであると仮定すると非常に顕著である。まとめると、データは、以前は活性が不十分であったかまたは不活性であったＣｐＧ含有ＰＤＥ−ＯＤＮの５’末端（ただし３’末端ではない）にｄＧランを付着させることによって、強力なＴＬＲ２１活性を達成することができることを示唆する。
【０１０３】
ここで示したデータはまた、活性獲得がＧ‐カルテットＤＮＡ上部構造の５’ｄＧｎ−修飾ＯＤＮによる分子間生成と結びついていることを示唆している。
【０１０４】
２００６−ＰＤＥのマウスＴＬＲ９認識に対する５’ｄＧ付加の影響
２００６−ＰＴＯのホスホジエステル結合バージョン、２００６−ＰＤＥを、マウスＴＬＲ９およびヒトＴＬＲ９に対する刺激活性に対する５’−ｄＧ修飾の効果を調べるための基礎として使用した。タイトレーション実験は２０００ｎＭまたは５０００ｎＭ  ＯＤＮ濃度で開始し、１５希釈ステップ（１：２）で、最終希釈として約１００ｐＭまたは５００ｐＭに達した。２００６−ＰＴＥの誘導体ＯＤＮを表２１−２に示す。
【表２２】
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【０１０５】
２００６−ＰＴＯは、ナノモル範囲でマウスおよびヒトＴＬＲ９を刺激した。２００６−ＰＤＥは、軽微なマウスまたはヒトＴＬＲ９刺激活性のみを示した（図６８Ａおよび６８Ｂ）。２００６−ＰＤＥの５’末端での１〜８ｄＧの添加は、マウスＴＬＲ９の活性の増加を全くまたはほんのわずかしかもたらさなかった（図６８Ａ）。ヒトＨＥＫＢｌｕｅ細胞において、２００６−ＰＤＥの５’末端で１〜６ｄＧの添加は、刺激活性の増加をもたらさずまたは減少さえもたらした。ＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端におけるｄＧ７およびｄＧ８の添加はヒトＴＬＲ９の活性のいくらかの軽微な増加をもたらした（図６８Ｂ）。まとめると、この像は２００６−ＰＤＥのニワトリＴＬＲ２１刺激活性がオリゴヌクレオチドの５’末端における３〜８個のｄＧの添加によって強くブーストされるという観察とは全く対照的である。
【０１０６】
２００６−ＰＤＥのマウスおよびヒトＴＬＲ９認識に対する３’ｄＧ付加の影響
２００６−ＰＤＥの３’末端に１〜３ｄＧを添加すると、マウスＴＬＲ９の活性がわずかに漸進的に増加した（図６９Ａ）。オリゴヌクレオチドの３’末端に第４ｄＧを添加すると、マウスＴＬＲ９刺激活性が強く増加したが、これはオリゴヌクレオチドの３’末端に５、６、７または８番目の３’ｄＧを添加するとわずかに改善または保存された（図６９Ａ）。
【０１０７】
ヒトＴＬＲ９の刺激については、２００６−ＰＤＥの３’末端に１〜３ｄＧを添加すると、親の２００６−ＰＤＥと比較して刺激活性が著しく漸進的に増加した。オリゴヌクレオチドの３’末端に第４ｄＧを添加すると、ヒトＴＬＲ９刺激活性が強く増加した。この刺激効果は、５、６、７または８番目の３’ｄＧの添加によりわずかに改善または保存された（図６９Ｂ）。
【０１０８】
まとめると、この像は、２００６−ＰＤＥのニワトリＴＬＲ２１刺激活性が３’末端に３−８ｄＧｓを添加してもブーストされず、あるいは減少さえさせられるという観察とは全く対照的である。まとめると、ＴＬＲ刺激活性に関する２００６−ＰＤＥ上の５’−ｄＧおよび３’−ｄＧ付加の構造活性相関は、ニワトリ（およびおそらく鳥類）ＴＬＲ２１と比較して、マウスおよびヒト（およびおそらく哺乳類）ＴＬＲ９について基本的に異なっている。これはＴＬＲ２１が、機能的であるが、真の遺伝的ではない、鳥類におけるＴＬＲ９のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であるという事実を反映している可能性がある。
【０１０９】
実施例４：Ｇ−カルテット構造を形成することが知られているまたは疑われている配列は、主に不活性な２００６−ＰＤＥの５’末端と結びついている場合、ＴＬＲ２１刺激活性を呼び起こす。
試験フェーズＩ．提案されたＧ−カルテット形成能を有する多数のテロメアおよびプロモーター配列エレメントを２００６−ＰＤＥの５’末端に付加した。さらに、５’  Ｔ４−修飾２００６−ＰＤＥ（２００６−ＰＤＥ−Ｔ４）を用いて、実施例３に記載のようにＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞がＴＬＲ２１を刺激する能力を測定した（表２２）。
【表２３】
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【表２４】
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【０１１０】
ヒトテルモア配列を２００６−ＰＤＥおよび２００６−ＰＤＥ−Ｔ４に融合させた結果、ナノモラー（ｎＭ）ＥＣ５０またはピコモラー（ｐＭ）活性でＴＬＲ２１を活性化することができるＯＤＮが得られた（表２３、図２１Ａ）。酵母テロメア配列は高いＴＬＲ２１活性を与え、ＥＣ５０は１５２ｐＭと低かった。試験したｃ−ｍｙｃ−プロモーター派生配列はまた、ＴＬＲ２１刺激に対して２００６−ＰＤＥ−Ｔ４を活性化することができ、１つの誘導体は２桁のｐＭ活性を生じた（表２３、図２１Ｂおよび２１Ｃ）。
【０１１１】
オキシトリカ属（Ｏｘｙｔｒｉｃｈａ  ｓｐｐ．）テロメア（テロメア研究およびＧ−カルテット構造研究のための好ましい初期モデル種）の配列エレメントとの２００６−ＰＤＥ融合を合成し（表２２）、それらのＴＬＲ２１刺激能について試験した（表２４、図２２Ａおよび２２Ｂ）。この研究では、融合配列が以下のものを含んでいた：ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６８）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、またはＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）。
【表２５】
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【０１１２】
オキシトリカ属のテロメア配列エレメントは、不活性２００６‐ＰＤＥに非常に強力なＴＬＲ２１活性を与えた。得られた誘導体は、この時点までに同定された最も強力な誘導体の中にあった。
【０１１３】
試験フェーズＩＩ．Ｇ−カルテット形成を含むことが示されるかまたは予測される２０の異なるプロモーターエレメントを選択し、そして２００６−ＰＤＥおよびプロモーターエレメントを含む５’融合構築物を、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞における試験のために合成し（表２５）、ＴＬＲ２１を刺激するそれらの能力を決定した。
【表２６】
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【表２７】
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【０１１４】
ＴＬＲ２１アッセイは、試験した全てのエレメントが不活性な２００６−ＰＤＥに活性を付与したことを明らかにした。試験した２０個のエレメントのうちの１１個はＴＬＲ２１アゴニスト、２００６−５ｄＧ６の効力を超える効力を示し、ＥＣ５０値は３０ｐＭ未満であり、１５．６ｐＭと低い（表２６）。
【０１１５】
実施例５：ＣｐＧ−ＯＤＮにＴＬＲ２１刺激活性を付与する新しい配列エレメントおよび生物物理学的原理の同定、適用、および最適化
Ｇ−カルテット（図２３Ａ）は、分子内または分子間および平行または逆平行配向で形成することができる（図２３Ｂ、２３Ｃ）。Ｇ−カルテットを介したＯＤＮの凝集はＴＬＲ２１に対する複数の結合部位を有するリガンド変異体を生成すること（相互作用結合活性獲得および受容体クラスター形成につながる）により、ＴＬＲ２１刺激活性の増大をもたらすという仮説に基づき、配向および結合部位の多重性を最適化することにより、活性がさらに増強されるはずであるという仮説がさらに立てられた。
【０１１６】
試験フェーズＩ．提案されたＧ−クォート形成能を有する多数のテロメアおよびプロモーター配列エレメントを、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞における試験のために２００６−ＰＤＥおよび２００６−ＰＤＥ−Ｔ４の５’末端に融合させて、ＴＬＲ２１を刺激する能力を測定した（表２７）。
【０１１７】
この点で特に興味深いのは、ポリマーＴＬＲ２１リガンドを生成する可能性を有するので、Ｇ−ワイヤー（ｗｉｒｅ）（図２３Ｃおよび２３Ｄ）と呼ばれる、ＯＤＮモノマーからのポリマーＧ−カルテット構造の形成である。Ｍａｒｓｈ  ＴＣ，Ｖｅｓｅｎｋａ  Ｊ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｅ，Ａ  Ｎｅｗ  ＤＮＡ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｔｈｅ  Ｇ−ｗｉｒｅ、Ｉｍａｇｅｄ  ｂｙ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２３：６９６−７００（１９９５）。具体的には、その５’末端に融合した配列ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）を有する２００６−ＰＤＥがこのような構造を形成する傾向を有するようである（表２７）。ＣｐＧ−ＯＤＮの「活性（ａｃｔｉｖｅｓ）」の配置が、このような５’ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）によって形成されるポリマーに近すぎると、受容体相互作用のような不整合的な問題を引き起こす可能性が高いため、ｄＴ４スペーサーとの誘導体も合成した（表２７）。
【０１１８】
Ｇ−リッチヘキサヌクレオチドＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）は、優先的に平行配向四量体Ｇ−カルテット構造を形成することが以前に報告された（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｋ，Ｄａｕｔｅｒ  Ｚ，Ｍｕｒｃｈｉｅ  ＡＩ，Ｌｉｌｌｅｙ  ＤＭ，Ｌｕｉｓｉ  ＢＪ，Ｔｈｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｐａｒａｌｌｅｌ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｇｕａｎｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｐｌｅｘ  ａｔ  ０．９５Å  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２７３：１７１−１８２（１９９７））（図２３Ｂ）。５’−平行Ｇ−カルテットによって連結されたＣｐＧ−含有ＯＤＮのこのような四量体配列は、ＴＬＲ２１のための有利なリガンド配列を提供することが期待される。２００６−ＰＤＥのそのような誘導体を合成し（表２７）、２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ４および２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６と比較して、上記の誘導体と共に試験した（表２８、図２４Ａおよび２４Ｂ）。
【表２８】
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【表２９】
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【０１１９】
ＴＬＲ２１−不活性２００６−ＰＤＥ（２００６−ＰＤＥ−Ｇｗｉｒｅ１）の５’末尾にＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）を追加すると、ｐＭＥＣ５０を有するＯＤＮになったが、その活性は２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ４と２００６−ＰＤＥ−５ｄＧ６のＥＣ５０に達せず、本研究ではベンチマークとして使用された（表２８、図２４Ａと２４Ｂ）。しかし、Ｇ−ワイヤー配列と２００６−ＰＤＥ（２００６−ＰＤＥ−Ｇｗｉｒｅ２）との間への４ｄＴヌクレオチドの導入は、ＥＣ５０を５倍改善し、ベンチマークよりも優れた活性が得られた（表２８、図２４Ａおよび２４Ｂ）。２００６−ＰＤＥの５’末端へのＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）の付加は、この時点までのＴＬＲ２１について最低のＥＣ５０を有するＯＤＮをもたらした（表２８、図２４Ａおよび２４Ｂ）。５’Ｇ−ワイヤー修飾によるより高次の構造の形成は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって実証された（図２５）。
【０１２０】
総合すると、２００６‐ＰＤＥの強力なＴＬＲ２１刺激活性につながる２つの優れた、おそらくＧ‐カルテット配列エレメントが本研究で同定された。理論に束縛されるものではないが、ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）の強力なＴＬＲ２１活性化能力は、おそらく、いわゆるＧ−ワイヤー構造（図２３Ｃおよび２３Ｄ）を形成するその公知の可能性に関連し、有利な配向を有する多座配位子を提供する。また、ＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）の強力なＴＬＲ２１活性化能力は、おそらく、平行四量体分子間Ｇ−カルテットを形成するその既知の可能性に関連し、有利な配向を有する四座配位子を提供する（図２３Ｂ）。
【０１２１】
試験フェーズＩＩ．ベンチマーク配列ＧＧＧＧＧＧのＴＬＲ２１刺激増強活性の可能性を試験し、Ｇ−ワイヤー配列ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２５８）と比較したところ、先行研究において優れていることが判明した。この目的のために、一般的な配列ＴＴＴＴＴＴＴＸＣＧＸＴＴＴ（配列番号２５９）（ここで、Ｘは任意の塩基を表す）の１６個のオリゴヌクレオチドを設計した（表２９）。ｄＴを使用して、許容可能な長さ（１４塩基）のオリゴヌクレオチドを生成し、テトラヌクレオチドＣｐＧ「弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）」をＯＤＮコンテキストに入れたが、これはそれが合成において問題を生じないため、および望ましくない二次構造を形成する傾向が低いためである。ただ１つのＣｐＧエレメントおよびＰＤＥ結合を有するこのような短いＯＤＮは、低いＴＬＲ２１刺激活性を有すると予想される。したがって、ＴＬＲ２１の試験のための開始濃度は、２０ｎＭから１０００ｎＭに５０倍上昇した。これらの１６のＯＤＮはまた、５’−ＧＧＧＧＧＧ末端および５’−ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴ（Ｇｗｉｒｅ２；配列番号２５８）末端を有するように合成され（表２９）、ＴＬＲ２１を刺激するそれらの能力についてＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験された。
【表３０】
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【０１２２】
中央ＣｐＧを有するテトラヌクレオチドの全ての潜在的置換を含む１６の１４量体ＯＤＮはＡＣＧＣ含有種およびＣＣＧＣ含有種（それぞれＯＤＮ９および１１）を除いて、ＴＬＲ２１について１０００ｎＭまでの濃度でほとんど不活性であり、これは最高濃度で検出可能なシグナルを示した。
【０１２３】
基礎ＯＤＮ（配列番号１４４〜１５９）の５’末端へのｄＧ６（ＧＧＧＧＧＧ）の付加は、ＣＣＧＡ（ＯＤＮ１９）、ＣＣＧＧ（ＯＤＮ２３）、ＧＣＧＣ（ＯＤＮ２６）、およびＣＣＧＴ（ＯＤＮ３１）を除いて、ほとんどの場合、いくつかのＴＬＲ２１刺激活性をもたらした（図２６Ｂ、２７Ｂ、２８Ｂ、および２９Ｂ）。これは、ＧＣＧＧ（ＯＤＮ２２）、ＡＣＧＡ（ＯＤＮ２５）およびＴＣＧＣ（ＯＤＮ２８）を除いて、それぞれのシグナル強度は弱かったが（図２７Ｂおよび２８Ｂ）、５’−ＧＧＧＧＧＧがＣｐＧ  ＯＤＮにＴＬＲ２１活性を付与する可能性を確認する。
【０１２４】
基礎ＯＤＮ（配列番号１４４〜１５９）の５’末端へのＧｗｉｒｅ２（ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２５８））の付加はすべての場合においてＴＬＲ２１刺激活性をもたらし、ここで、５ｄＧ６が成功し、さらにＣＣＧＡ（ＯＤＮ３５）、ＣＣＧＧ（ＯＤＮ３９）およびＧＣＧＣ（ＯＤＮ４２）、一方で、ＣＣＧＴ（ＯＤＮ４７）は不応性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）のままであった（図２６Ｃ、２７Ｃ、２８Ｃ、および２９Ｃおよび２９Ｄ）。しかし、Ｇｗｉｒｅ２付加で得られた信号強度は、５ｄＧ６で見られたものよりはるかに高かった。これは、ＧＣＧＡ（ＯＤＮ１８対ＯＤＮ３４（それぞれ、図２６Ｂおよび２６Ｃ））、ＧＣＧＧ（ＯＤＮ２２対ＯＤＮ３８（それぞれ、図２７Ｂおよび２７Ｃ））、ＡＣＧＣ（ＯＤＮ２５対ＯＤＮ４１（それぞれ、図２８Ｂおよび２８Ｃ））、ＣＣＧＣ（ＯＤＮ２７対ＯＤＮ４３（それぞれ、図２８Ｂおよび２８Ｃ））、ＴＣＧＣ（ＯＤＮ２８対ＯＤＮ４４（それぞれ、図２８Ｂおよび２８Ｃ））、およびＧＣＧＴ（それぞれ、ＯＤＮ３０対ＯＤＮ４６（それぞれ、図２９Ｂおよび２９Ｃ））について特に明らかであった。後者のＯＤＮ、４６、ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２は最も顕著な種であり、それはすでにピコモル濃度で顕著なＴＬＲ２１刺激活性を示し、ＥＣ５０は２ｎＭに近いと決定された（図２９Ｄ）。
【０１２５】
ＣｐＧ含有配列エレメントＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、およびおそらくＴＣＧＣは、ＴＬＲ２１活性化の文脈において以前に記載されていない。
【０１２６】
ＸＣＧＡシリーズ．ＸＣＧＡシリーズからの１４量体のいずれも、１０００ｎＭまでのＴＬＲ２１活性を示さない。５’−ｄＧ６の付加はＧＣＧＡ＞ＡＣＧＡ＞ＴＣＧＡのいくらかの活性をもたらすが、ＣＣＧＡは不活性のままである。最も注目すべきことに、５’−Ｇｗｉｒｅ２の付加は、４つの誘導体すべてについてＴＬＲ２１活性をもたらす。ＴＬＲ２１活性の劇的な増加はＧＣＧＡについて注目され、一方、他のものは相対的順序ＴＣＧＡ＞ＡＣＧＡ＞ＣＣＧＡにおいて増加した活性を有する（図２６Ａ〜Ｃ）。
【０１２７】
ＸＣＧＧシリーズ．ＸＣＧＧシリーズからの１４量体のうちの２つは１０００ｎＭ（ＧＣＧＧ、ＴＣＧＧ）で、もしあれば、わずかなＴＬＲ２１活性を示すが、他の２つのオリゴヌクレオチドは不活性である。５’−ｄＧ６の付加はＧＣＧＧ＞ＡＣＧＧ＞＝ＴＣＧＧのいくらかの活性をもたらすが、ＣＣＧＧは不活性のままである。最も注目すべきことに、５’−Ｇｗｉｒｅ２の付加は、４つの誘導体すべてについてＴＬＲ２１活性をもたらす。ＴＬＲ２１活性の劇的な増加はＧＣＧＧについて注目されるが、他のものはＴＣＧＧ＞ＡＣＧＧ＞ＣＣＧＧの相対的順序で増加した活性を有する（図２７Ａ〜Ｃ）。
【０１２８】
ＸＣＧＣシリーズ．ＸＣＧＣシリーズからの１４量体のうちの２つはもしあれば、１０００および５００ｎＭ（ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ）でわずかなＴＬＲ２１活性を示すが、他の２つは不活性である。５’−ｄＧ６の付加はＴＣＧＣ＞ＡＣＧＣ＞ＣＣＧＣの強力な活性をもたらすが、ＧＣＧＣは不活性のままである。最も注目すべきことに、５’−Ｇｗｉｒｅ２の付加は、４つの誘導体全てについて再びＴＬＲ２１活性を導く。ＴＬＲ２１活性の大幅な増加はＴＣＧＣ＞ＡＣＧＣ＞ＣＣＧＣについて、その活性の順序で認められるが、ＧＣＧＣは弱いままである（図２８Ａ〜Ｃ）。
【０１２９】
ＸＣＧＴシリーズ．ＸＣＧＴシリーズからの１４量体のいずれも、１０００ｎＭまでなんらＴＬＲ２１活性を示さない（図２９Ａ）。５’−ｄＧ６の付加は、活性順序ＴＣＧＴ＞ＧＣＧＴ＞ＡＣＧＴ＞ＣＣＧＴにおいて、４つ全てのいくつかの活性をもたらす（図２９Ｂ）。最も注目すべきことに、５’−Ｇｗｉｒｅ２の付加がＧＣＧＴについてのＴＬＲ２１活性の劇的な増加をもたらし、そしてＴＣＧＴの活性はまた、ＴＣＧＴ−５ｄＧ６について記載されるよりも大きい（図２９Ｃ）。Ｇｗｉｒｅ２−修飾ＡＣＧＴおよびＣＣＧＴの活性は、５ｄＧ６誘導体よりも大きくない（図２９Ｃおよび２９Ｄ）。Ｇｗｉｒｅ２  １４量体（ｍｅｒ）  ＯＤＮ単体（ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２５８））は、基礎ＯＤＮに接続されており、ＴＬＲ２１について不活性である（表４９、図２９参照）。
【０１３０】
実施例６：最も強力な配列の骨格はＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２である：構造−活性関係（ＳＡＲ）
ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２のＳＡＲの研究は、反転（ＧＣ）およびピリミジン−ピリミジン（ＴＧ）ならびにプリン−プリン（ＣＡ）交換による中央ＣｐＧエレメントの修飾を含んだ（表３０）。実施例３で説明したように、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞におけるこれら誘導体の、ＴＬＲ２１を刺激する能力についての試験は、これらの操作（表３１、図３０）の後に、完全な活性喪失を明らかにし、ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２の潜在的なＴＬＲ２１刺激活性が、この単一のＣｐＧエレメントの存在に決定的に依存していることを確認した。
【表３１】
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【表３２】
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【０１３１】
ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２上の欠失Ｔ１−Ｔ４からの結果は、Ｖｍａｘのほとんど変化をもたらさず、Ｔ３を除いて、大部分が類似のＥＣ５０値をもたらした。しかしながら、Ｔ５およびＴ６の欠失はＥＣ５０の増加、および特にＶｍａｘの減少をもたらし、本質的な活動の喪失を示唆した（表３１、図３１）。
【０１３２】
第３のＳＡＲ研究のために、ＯＤＮの３’末端でＧＣＧＴエレメントに隣接するＴの数を減少させ（表３０）、対応するＯＤＮを試験した。効果は直ちに明らかであった。１つのＴ（ｅＴ１）の喪失はＥＣ５０の保存のもとでＶｍａｘの減少をもたらしたが、２つのＴ（ｅＴ２）の喪失はＥＣ５０を増加させ、Ｖｍａｘを劇的に減少させたが、３つのｄＴの喪失は全体として活動を排除した（表３１、図３２）。
【０１３３】
第４の実験では、ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２の内因性ＴＬＲ２１刺激活性に対する追加のＧＧＧＧＴＴモチーフ（ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ３、表３０）を組み込むことの効果を調べた。ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ３の活性は、親ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２の活性よりも優れていた（表３１、図３３Ａおよび３３Ｂ）。ＥＣ５０は８倍低く、Ｖｍａｘも増加した（表３１）。免疫刺激性ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２オリゴヌクレオチドの予備的ＳＡＲ結果を図３４に示す。
【０１３４】
実施例７：選択されたＸＣＧＸ−Ｇｗｉｒｅ２種のＴＬＲ２１刺激活性に対するＣｐＧエレメントコピー数の影響
【表３３】
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【表３４】
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【０１３５】
ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２は、予想されるナノモルＥＣ５０を示した。第２のＧＣＧＴＴＴＴエレメント（ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２−ｄｏ、表３２）を３’末端に付加すると、ＥＣ５０が大幅に改善し（〜６５倍）、Ｖｍａｘが増大した（表３３、図３５Ａおよび３５Ｂ）。ＧＣＧＴＴＴＴエレメント（ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２−ｔｒｉ、表３２）をさらに付加すると、ＥＣ５０が３倍（１３５コンポシット）低下し、Ｖｍａｘがわずかに上昇した（表３３、図３５Ａおよび３５Ｂ）。
【０１３６】
ＧＣＧＡ−Ｇｗｉｒｅ２は、予想されるナノモルＥＣ５０を示した。第２のＧＣＧＡＴＴＴエレメント（ＧＣＧＡ−Ｇｗｉｒｅ２−ｄｏ、表３２）を３’末端に追加すると、ＥＣ５０が（〜２４倍）強く改善し、Ｖｍａｘが増大した（表３３、図３６Ａおよび３６Ｂ）。ＧＣＧＡＴＴＴエレメント（ＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ２−ｔｒｉ、表３２）をさらに付加すると、ＥＣ５０が２倍（４８コンポシット）低下し、Ｖｍａｘがわずかに上昇した（表３３、図３６Ａおよび３６Ｂ）。
【０１３７】
ＡＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２は、予想されるナノモルＥＣ５０を示した。２番目のＡＣＧＣＴＴＴエレメント（ＡＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２−ｄｏ、表３２）を３’−ｅｎｄに付加すると、ＥＣ５０の穏やかな改善をもたらし（〜８倍）、Ｖｍａｘが向上した（表３３、図３７Ａおよび３７Ｂ）。さらに、ＡＣＧＣＴＴＴエレメント（ＡＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２−ｔｒｉ、表３２）を付加すると、ＥＣ５０が８倍（６４コンポジット）減少し、Ｖｍａｘがわずかに増加した（表３３、図３７Ａおよび３７Ｂ）。
【０１３８】
ＴＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２は、予想されるナノモルＥＣ５０を示した。第２のＴＣＧＣＴＴＴエレメント（ＴＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２−ｄｏ、表３２）を３’末端に付加すると、ＥＣ５０が（〜１２倍）強く改善し、Ｖｍａｘが増大した（表３３、図３８Ａおよび３８Ｂ）。さらに、ＴＣＧＣＴＴＴエレメント（ＴＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２−ｔｒｉ、表３２）を付加すると、ＥＣ５０が７倍（８４コンポジット）減少し、Ｖｍａｘがわずかに増加した（表３３、図３８Ａおよび３８Ｂ）。
【０１３９】
ＣＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２は、予想されるナノモルＥＣ５０を示した。第２のＣＣＧＣＴＴＴエレメント（ＣＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２−ｄｏ、表３２）を３’末端に付加すると、Ｖｍａｘ（表３３、図３９Ａおよび３９Ｂ）と同様に、ＥＣ５０（〜５０倍）が大幅に改善した。さらに、ＣＣＧＣＴＴＴエレメント（ＣＣＧＣ−Ｇｗｉｒｅ２−ｔｒｉ、表３２）をさらに付加すると、ＥＣ５０が１７倍（８５０コンポジット）減少し、Ｖｍａｘがわずかに増加した（表３３、図３９Ａおよび３９Ｂ）
ＧＣＧＧ−Ｇｗｉｒｅ２は、考察した低濃度範囲において弱いシグナルのみを示した。２番目のＧＣＧＧＴＴＴエレメント（ＧＣＧＧ−Ｇｗｉｒｅ２−ｄｏ、表３２）を３’−ｅｎｄに付加すると、Ｖｍａｘ（〜５１倍）だけでなく、ＥＣ５０も大幅に改善した（表３３、図４０）。さらに、ＧＣＧＧＴＴＴエレメント（ＧＣＧＧ−Ｇｗｉｒｅ２−ｔｒｉ、表３２）を付加すると、ＥＣ５０が４倍（２０４コンポジット）減少し、Ｖｍａｘがわずかに増加した（表３３．４０）。
【０１４０】
要約すると、Ｇｗｉｒｅ２配列および単一のＣｐＧエレメントを有するオリゴヌクレオチドへのさらなるＣｐＧ含有ＴＬＲ２１刺激配列エレメントの付加は、８倍から５５倍のＥＣ５０の改善をもたらし、一方、Ｖｍａｘは、典型的には２倍であることが示される。第３のエレメントの付加も、ＴＬＲ２１刺激活性をさらに均一に改善した。これは、最初の単純な低活性ヒットから高活性を発生する一般的な方法であると思われる。
【０１４１】
実施例８：合成／商品コストの利点を有する高活性ＴＬＲ２１刺激性ＯＤＮの達成：ａ）ＣｐＧ含有配列エレメント間での、およびｂ）Ｇ−カルテット形成部分内およびＣｐＧ含有配列エレメントへのその境界での、アルキルおよびエチレングリコールスペーサーによる付加またはヌクレオチド置換
５’−Ｇｗｉｒｅ２−テクノロジー（ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２５８））を用いて、概念的に単純な潜在的刺激配列のＴＬＲ２１刺激効力を調べた：５’−末端で４つのｄＴｓによって包まれた３つの連続したＣｐＧおよび３’−末端で３つのｄＴｓ（表３４  ＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ０）。ＣｐＧエレメントの間隔がＴＬＲ２１刺激活性に及ぼす影響を、３つのＣｐＧエレメントの間に１、２、３および４つのｄＴを段階的に挿入することにより検討した（結果としてＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ１  −  ＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ４、表３４）。ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１刺激アッセイを行い、実施例３に記載したように表３４のＯＤＮがＴＬＲ２１を刺激する能力を決定し、ＥＣ５０およびＶｍａｘ値を計算した（表３５、図４１Ａおよび４１Ｂ）。
【表３５】
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【表３６】
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【０１４２】
注目すべきことに、ＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ０は、検討された濃度範囲（２０ｎＭまで）においてＴＬＲ２１について完全に不活性であり、一方、ＣｐＧ間の１つのスペーシング（ｓｐａｃｉｎｇ）ｄＴは、ピコモル範囲のＥＣ５０を有する強力な刺激性ＯＤＮを既にもたらした。ＣｐＧ間の２番目のｄＴは活動を改善しなかったが、ｄＴ３とｄＴ４はそれぞれ１６．６ｐＭと１１．３ｐＭのＥＣ５０をもたらした（表３５、図４１Ａと４１Ｂ）。このことは、ＣｐＧエレメントの純粋な存在が活性のために十分ではなく；それらは正しい後先（ｒｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｅｘｔ）にある必要があることを示唆する。
【０１４３】
ＴＬＲ２１刺激活性はスペーサー基に塩基を必要とするか
ｄＴｓ（ＣＧ‐Ｇｗ２‐ａｂａｓｅ）の代わりに、ＣｐＧ間にデオキシリボースリン酸架橋（「脱塩基部位（ａｂａｓｉｃ  ｓｉｔｅｓ）」）を有するＯＤＮを合成した。このＯＤＮおよび親ＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ１を、実施例３に記載されるように、ＴＬＲ２１を刺激する能力について、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した（表３６、図４２Ａおよび４２Ｂ）。
【表３７】
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【表３８】
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【０１４４】
驚くべきことに、ＣＧ−Ｇｗ２−ａｂａｓｅ（図４３）は、ＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ１（ＥＣ５０＝１３３ｐＭ）よりもＴＬＲ２１（ＥＣ５０＝３４ｐＭ）で多少高い能力を示したが、Ｖｍａｘは多少低い（表３７、図４２Ａおよび４２Ｂ）。この結果は、ＣＧ‐Ｇｗ２‐Ｔ１  ＯＤＮ中のスペーシングヌクレオチド中の塩基がＴＬＲ２１刺激に必要でないだけでなく、ＥＣ５０に負の影響を及ぼすことを示す。
【０１４５】
ＣＧ−Ｇｗ２  ＯＤＮのＴＬＲ２１活性に対するリニアスペーサー基（ｌｉｎｅａｒ  ｓｐａｃｅｒ  ｇｒｏｕｐｓ）の影響
この研究では、ＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ１中の２つのＣｐＧをスペーシングするｄＴヌクレオチドを、「Ｃ１８」ヘキサエチレングリコールリンカーまたは「Ｃ３」プロパンジオールリンカーのいずれかで置き換えた（表３８）。これらのＯＤＮを、実施例３に記載されるように、ＴＬＲ２１を刺激する能力について、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した
【表３９】
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【表４０】
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【０１４６】
ＣＧ−Ｇｗ２のＣｐＧエレメントの間に挿入された場合にヘキサエチレングリコールによって形成されるＣ１８スペーサー（表３６、図４３）はＴＬＲ２１−不活性ＯＤＮ（表３９、図４４Ａ）を導くが、Ｃ３スペーサー（１，３−プロパンジオール、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２、表３８、図４３）による同じ修飾は、ＥＣ５０に関して、親ＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ１の効力を保持するだけでなく、わずかにさえ改善する（表３９、図４４Ｂ）。ヌクレオチドと比較してＣ３スペーサー構造が単純であると仮定すると（図４３）、これは最も顕著な結果である。Ｃ３スペーサーのような脱塩基部位が２つのホスホジエステル結合の間に３つの連結された炭素原子を含むことを考慮すると、Ｃ３は、高度に活性な脱塩基部位構造の単純化された形態であることが可能であり（図４３を参照のこと）、そしてまた、ＴＬＲ２１の活性化を効率的に支持することが可能である。
【０１４７】
Ｇ−ワイヤー（ｗｉｒｅ）およびＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）−活性化Ｃ３スペーサー結合ＣｐＧ構造のＴＬＲ２１刺激活性に関する検討
この研究では、ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）Ｇ−ワイヤー（ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−１）またはＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）エレメント（ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−１）のいずれかをＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧ−Ｘ２−ＣＧＴＴＴ（配列番号２７１）に連結し（表４０）、ＴＬＲ２１刺激効力を評価した。次いで、両方のＯＤＮを、ＣｐＧモチーフに連結されたＣ３−スペーサーの連続的な付加によってさらに改変し、３、４、および５つのＣｐＧモチーフを有するＯＤＮを生じ、それぞれＣ３によって分離された（表４０）。ＴＬＲ２１に対するそれらの活性化能は実施例３で説明したように、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において評価もした（表４１、図４５および４６）。
【表４１】
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【表４２】
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【０１４８】
Ｇ−ワイヤー活性化において、Ｃ３によって分離された２つのＣｐＧモチーフを有する最初のＯＤＮは、３桁の範囲ではあるが、すでにピコモル活性（ＥＣ５０＝３１２ｐＭ）を示した。第３のＣ３−分離（ｓｅｐａｒａｔｅｄ）ＣｐＧは７８．５ｐＭのＥＣ５０を与え、これは第２の別々に合成されたバッチについて決定された９６．５ｐＭと十分に比較される（表３９を参照のこと）。４番目のＣ３−分離ＣｐＧモチーフを加えると、効力がさらに１０倍増大した（ＥＣ５０＝７．４ｐＭ）。第５および第６のＣ３−分離ＣｐＧモチーフの添加は高い効力を保持し、軽微な改善さえももたらした。これらの一桁のピコモル効力はＴＬＲ２１でこれまで見られた最高の活性の中でも顕著であり、プロパンジオールホスフェート−分離ＣｐＧモチーフと同様に単純な構造エレメントについての予想外の功績である（表４１、図４４Ａおよび４４Ｂ）。Ｘ２−１からＸ２−５シリーズのＧ−ワイヤーエレメントを、平行分子間Ｇ−カルテット構造（表４０）を促進することが知られているＧＴＴＴＴＧエレメントで置き換えると、類似した、部分的にはさらに優れた効力のＯＤＮが得られた（表４１、図４６Ａおよび４６Ｂ）。
【０１４９】
Ｇ−ワイヤー活性化（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｃ３スペーサー−結合ＣｐＧモチーフのＴＬＲ２１刺激活性に対するスペーサー長と詳細な化学構造の影響の研究
本試験では、ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）Ｇ−ｗｉｒｅをＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧ−Ｘ−ＣＧＸＣＧＴＴＴ（配列番号２６０）（表４２）に接続し、ＴＬＲ２１刺激能力を評価した。ＸはＣｐＧモチーフを分離するために使用されるアルキルジオール−リン酸のシリーズであり（表４２、図４７）、そのＯＤＮ−Ｘ３はＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２（表３８を参照のこと）およびＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−２（表４０を参照のこと）の反復合成であった。さらに、脱塩基スペーサー（表４２、図４９；ＣＧ−Ｇｗ２−ａｂａｓｅ（表３６の配列番号２２１を参照のこと））ならびにトリエチレングリコール誘導体スペーサー（「Ｃ８」リンカー、図４９）を含むオリゴヌクレオチドを、実施例３に記載されるように、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１刺激についてアッセイした。
【表４３】
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【表４４】
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【０１５０】
構造的には、ＣＧ−Ｇｗ２−Ｔ１における１つのＣｐＧエレメントの３’−リン酸と次のＣｐＧエレメントの５’−リン酸との間の間隔（ｓｐａｃｉｎｇ）が５’Ｃから４’Ｃまで３’Ｃまでの３つの架橋炭素原子を介している（図４９）。塩基の欠如はデオキシリボース部分を変化させないので、脱塩基部位が使用される場合、同じ距離が維持される。非常に同じ配置がＯＤＮ−Ｘ３で維持され、そこで３つのメチレン（−ＣＨ２−）グループが３’−および５’−リン酸グループの間のスペーサーを形成する（図４７）。興味深いことに、ＥＣ５０によって決定されるＴＬＲ２１に対するそれらの効力は非常に類似しており（それぞれ、１３３ｐＭ、１２７ｐＭ、および１４９ｐＭ；表４３）、デオキシリボース幾何を部分的に維持している最も単純と考えられるリンカー１，３−プロパンジオールは不利であるとは思われないので、物理的な間隔が詳細な化学構造（例えば、塩基の存在、デオキシリボース部分の完全性）よりも重要であることを示唆する（表４３、図４９Ａおよび４９Ｂ）。
【０１５１】
１，３−プロパンジオールがデオキシチミン（ｄＴ）または脱塩基部位（表４３）とスペーサーとして等価であるという発見に基づいて（これはまた、以前の実験によって既に示唆されている（表３６〜３９））、本発明者らは、ＴＬＲ２１活性に対するスペーサー長の効果を調査した。
【０１５２】
より短い誘導体エタンジオール（ＯＤＮ−Ｘ２、表４２、図４７）は、１，３−プロパンジオール誘導体ＯＤＮ−Ｘ３（表４２、図４７）と比較して、ＴＬＲ２１刺激活性が２倍よりも弱かった（表４３、図５０Ａおよび５０Ｂ）。対照的に、１，４−ブタンジオール誘導体ＯＤＮ−Ｘ４中のスペーサー（表４２、図４７）はわずかにより高い活性を与えたが（表４３、図５０Ａおよび５０Ｂ）、２つの追加のメチル基（１，６−ヘキサンジオール、ＯＤＮ−Ｘ６）または５つの追加のメチレン基（１，９−ノナンジオール、ＯＤＮ−Ｘ９）によるさらなる伸長（表４２、図４７）はＴＬＲ２１刺激効力をそれぞれ８９倍および１３８倍劇的に減少させた（表４３、図５０Ａおよび５０Ｂ）。１２個のメチレン基（１，１２−ドデカンジオール、ＯＤＮ−Ｘ１２）を有するスペーサー（表４２、図４７）は、考えられる濃度範囲において完全に不活性であった（表４３、図５０Ａおよび５０Ｂ）。トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーも探索した（ＯＤＮ−ＸｔｒＥＧ、表４２、図４８）。この誘導体は、Ｃ８リンカーに立体的に対応する。従って、そのＴＬＲ２１  ＥＣ５０は、１，９−ノナンジオール誘導体ＯＤＮ−Ｘ９のＴＬＲ２１  ＥＣ５０よりも有意に低く、１，６−ヘキサンジオール誘導体ＯＤＮ−Ｘ６のＥＣ５０よりも依然として低いことは驚くべきであった（表４３、図５１参照）。
【０１５３】
Ｃ３スペーサーの原理は、ＣｐＧ含有テトラヌクレオチド構造に対しても機能するか
ＣｐＧ含有テトラヌクレオチド構造を有するＣ３スペーサー−（１，３‐プロパンジオール）−含有ＴＬＲ２１−活性ＯＤＮを調べた。この目的のために、第１の実験において、５’−Ｇ−ワイヤー配列−含有ＡＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ１、ＡＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ２、ＣＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ１およびＣＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ２を合成し、実施例３に記載されるようにＴＬＲ２１を刺激するそれらの能力についてＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した（表４４）。これに続いて、５’−Ｇ４Ｔ１６−含有ＡＣＧＣ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２およびＣＣＧＣ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２の合成およびＴＬＲ２１試験を行った（表４４）。
【表４５】
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【表４６】
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【０１５４】
ＣｐＧテトラヌクレオチド配列のＣ３間隔（ｓｐａｃｉｎｇ）は、明らかにＴＬＲ２１を刺激することができる。ＡＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ２およびＣＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ２（表４４）は、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２／ＯＤＮ−Ｘ３について以前に観察された範囲のＴＬＲ２１  ＥＣ５０（表４５、図５２Ａおよび５２Ｂ）を示した（表３９および４３を比較）。ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ１（表３９）について以前に観察されたように、また構造−活性相間から予測されるように、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ、「Ｃ１８」）誘導体ＡＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ１およびＣＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ１は、それぞれ不活性であるか、または非常に弱かった（表４５、図５２Ａおよび５２Ｂ）。５’−Ｇ−ワイヤー配列を、我々によって以前に同定された他の特権的５’−構造（ＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）、Ｇ４Ｔ１６）に置き換えると、２つの誘導体、ＡＣＧＣ−Ｇ４Ｔ１６−Ｘ２およびＣＣＧＣ−Ｇ４Ｔ１６−Ｘ２が得られ、ＥＣ５０がさらに改善された（表４５、図５３Ａおよび５３Ｂ）。
【０１５５】
ＴＬＲ２１−活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ＯＤＮの５’−Ｇ−リッチ（ｒｉｃｈ）配列に/中におけるＣ３およびＣ１８リンカーの影響
Ｃ３スペーサー（１，３‐プロパンジオール）またはＣ１８スペーサー（ヘキサエチレングリコール、ＨＥＧ）が、ＣｐＧモチーフとＧ‐カルテット配列の間に配置された場合、またはＧ‐カルテット配列内に配置された場合、ＴＬＲ２１−活性５’‐Ｇ‐カルテット−含有ＯＤＮの活性を改善できるかどうかを調べた。２００６‐ＰＤＥ５ｄＧ４に基づく２つのＯＤＮを合成した。１つは下流ｄＧ４配列の３’のＣ１８リンカーを有し（２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ１）、もう１つは同じ位置にＣ３リンカーを有する（２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ２）（表４６）。さらに、２００６−Ｇ−ｗｉｒｅ１を、ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）配列中のＴｓをＣ１８リンカー（２００６−５ｄＧ４−Ｘ３）またはＣ３リンカー（２００６−５ｄＧ４−Ｘ４）のいずれかによって置換することによって修飾した。全てのこれらの誘導体を、実施例３に記載されるように、ＴＬＲ２１を刺激する能力について、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞において試験した（表４７）。
【表４７】
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【表４８】
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【０１５６】
２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４では、ｄＧ４と２００６−ＰＤＥの間のＣ１８スペーサーの付加により、ＥＣ５０の測定値としてＴＬＲ２１活動が６倍以上改善された（表４７、図５４Ａ）。同じ位置のＣ３スペーサーは、ＴＬＲ２１刺激を２倍改善した（表４７、図５４Ａ）。２００６−ＰＤＥ−Ｇ−ｗｉｒｅ１では、Ｃ１８スペーサーによるＧ−ｗｉｒｅ配列中の２つのＴの置換が、ＥＣ５０による測定でＴＬＲ２１活性を約５倍改善した（表４７、図５４Ｂ）。同じ位置のＣ３スペーサーは、ＴＬＲ２１刺激を４倍改善した（表４７、図５４Ｂ）。総合すると、データは、ＴＬＲ２１活性化特性がＣ１８またはＣ３リンカーの存在によって損なわれず、さらにより改善された活性をもたらすことを示唆する。
【０１５７】
実施例９：３’−コレステロールであり、５’−コレステロールでないＯＤＮの修飾が、ＴＬＲ２１刺激活性が強く増加する。
古典的３’‐コレステロール修飾およびより稀に使用される５’‐コレステロール修飾が中等度および高度活性ＯＤＮ種のＴＬＲ２１刺激能に及ぼす影響を調べた。
【０１５８】
３’コレステロール修飾
一般的に適用される３’−コレステロール修飾（図５５）を、２つの高度にＴＬＲ２１活性なＯＤＮ、２００６−Ｇｗｉｒｅ２および２００６−Ｔ４−５ｄＴＧ４Ｔに適用した（表４８）。より具体的には、３’コレステロール部分を含むＯＤＮはユーロフィン（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）から購入した。コレステロール部分の構造は、ｗｗｗ＿ｌｉｎｋｔｅｃｈ＿ｃｏ＿ｕｋ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ＿ｇｒｏｕｐ＿ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＿ｐａｌｍｉｔａｔｅ＿ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ／９６９＿３−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｓｙｎｂａｓｅ−ｃｐｇ−１０００−１１０に示される３’Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ＳｙｎＢａｓｅTMに基づいた。実施例３で説明したＴＬＲ２１刺激試験を行った。
【表４９】
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【表５０】
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【０１５９】
結果は、両方のＯＤＮのＴＬＲ２１刺激活性が３’−コレステロール修飾で改善しなかったことを示唆する（表４９、図５６Ａ、５６Ｂ、５７Ａ、５７Ｂ）。３’−コレステロール修飾ＯＤＮのＥＣ５０はさらに増加し（表４９）、ＴＬＲ２１刺激活性のわずかな損失を示唆する。
【０１６０】
３’コレステロール部分を含むＯＤＮは、ユーロフィンから購入した。コレステロール部分の構造は、ｗｗｗ＿ｌｉｎｋｔｅｃｈ＿ｃｏ＿ｕｋ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ＿ｇｒｏｕｐ＿ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＿ｐａｌｍｉｔａｔｅ＿ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ／９６９＿３−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｓｙｎｂａｓｅ−ｃｐｇ−１０００−１１０に示される３’Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ＳｙｎＢａｓｅTMに基づいた。
【０１６１】
５’コレステロール修飾（Ｉ）
あまり一般的ではないが、５’−コレステロール修飾（図５８Ａおよび５８Ｂ）を、本発明者らの研究の過程で同定された高度にＴＬＲ２１活性なＯＤＮ、ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ上に合成した（表５０）。より具体的には、５’コレステロール部分を含むＯＤＮはＧｅｎｅｌｉｎｋに注文し、これらのＯＤＮの脂質部分の構造はｗｗｗ＿ｇｅｎｅｌｉｎｋ＿ｃｏｍ／ｎｅｗｓｉｔｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＭＯＤＰＤＦＦＩＬＥＳ／２６−６６０２．ｐｄｆに示される構造に基づいた。５’コレステロール部分を含む他のＯＤＮは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈに注文した。これらのＯＤＮの脂質部分の構造は、ｗｗｗ＿ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ＿ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｇｅｎｅｒａｌ＿Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／１／ｃｕｓｔｏｍ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ−ｇｕｉｄｅ．ｐｄｆ，ｐａｇｅｓ  ８５／８６頁に示される構造に基づいていた。５’コレステロール部分を含む他のＯＤＮは、ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓに注文し、ｗｗｗ＿ｉｂａ−ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ＿ｃｏｍ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ＿ｃｕｓｔｏｍ＿ｏｌｉｇｏｓ＿ｃｕｓｔｏｍ＿ＤＮａ＿Ｎｏｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ＿５−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌに示される構造に基づく構造を有した。実施例３に記載されているようにＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１刺激試験を実施した。
【表５１】
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【表５２】
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【０１６２】
２つの独立した測定の結果は、ＧＣＧＴ３−ＴＧ４ＴのＴＬＲ２１刺激活性が５’−コレステロール修飾によって大幅に改善されることを示唆する（表５１、図５９Ａ、５９Ｂ）。その未修飾バージョンと比較して、ＥＣ５０は、両方のアッセイにおいて２桁以上減少した（それぞれ１４７倍および１５２倍、表５１）。５’‐コレステリル修飾ＧＣＧＴ３‐ＴＧ４Ｔは、これまでに同定された最も活性なＴＬＲ２１刺激ＯＤＮの中にある。
【０１６３】
５’コレステロール部分を含むＯＤＮはＧｅｎｅｌｉｎｋに注文し、これらのＯＤＮの脂質部分の構造はｗｗｗ＿ｇｅｎｅｌｉｎｋ＿ｃｏｍ／ｎｅｗｓｉｔｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＭＯＤＰＤＦＦＩＬＥＳ／２６−６６０２．ｐｄｆに示される構造に基づいた。５’コレステロール部分を含む他のＯＤＮは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈに注文した。これらのＯＤＮの脂質部分の構造は、ｗｗｗ＿ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ＿ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｇｅｎｅｒａｌ＿Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／１／ｃｕｓｔｏｍ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ−ｇｕｉｄｅ．ｐｄｆ，８５／８６頁に示される構造に基づいていた。５’コレステロール部分を含む他のＯＤＮは、ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓに注文し、ｗｗｗ＿ｉｂａ−ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ＿ｃｏｍ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ＿ｃｕｓｔｏｍ＿ｏｌｉｇｏｓ＿ｃｕｓｔｏｍ＿ＤＮａ＿Ｎｏｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ＿５−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌに示される構造に基づく構造を有した。
【０１６４】
５’コレステロール修飾（Ｉ）
我々の研究の過程で同定された２つの高度にＴＬＲ２１活性なＯＤＮ、ＧＣＧＴ−３−ＴＧ４ＴおよびＧＣＧＴ−３−Ｇｗ２（表５２）上に５’−コレステロール修飾（図５８Ａおよび５８Ｂ）を合成し、実施例３に記載したようなＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１刺激試験を実施した。
【表５３】
2021506245.tif 000060
【表５４】
2021506245.tif 000061
【０１６５】
２つの独立した測定の結果は、ＧＣＧＴ−３−ＴＧ４ＴおよびＧＣＧＴ−３−Ｇｗ２の両方のＴＬＲ２１刺激活性が５’−コレステロール修飾によって大幅に改善されることを示唆する（表５３、図６０Ａ、６０Ｂ、６１Ａ、６１Ｂ）。それらの未修飾バージョンと比較して、ＥＣ５０は、両方のアッセイにおいて約１桁減少した（それぞれ、ＧＣＧＴ−３−ＴＧ４Ｔ−５Ｃｈｏｌについて１０倍および１３倍、ならびにＧＣＧＴ−３−Ｇｗ２−５Ｃｈｏｌについて３０倍および２４倍）（表５１）。５’‐コレステリル修飾ＯＤＮ、ＧＣＧＴ‐３‐ＴＧ４ＴおよびＧＣＧＴ‐３‐Ｇｗ２はこれまでに同定された最も活性なＴＬＲ２１刺激ＯＤＮであり、フェムトモル（ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ）ＥＣ５０値を示した。
【０１６６】
５’コレステロール修飾（ＩＩ）
我々の研究の過程で同定された２つの高度にＴＬＲ２１活性なＯＤＮ、ＧＣＧＴ−３−ＴＧ４ＴおよびＧＣＧＴ−３−Ｇｗ２（表５４）上に５’−コレステロール修飾（図５８Ａおよび５８Ｂ）を合成し、実施例３に記載したようなＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１刺激試験を実施した。
【表５５】
2021506245.tif 000062
【表５６】
2021506245.tif 000063
【０１６７】
２つの独立した測定の結果は、ＧＣＧＴ−３−ＴＧ４ＴおよびＧＣＧＴ−３−Ｇｗ２の両方のＴＬＲ２１刺激活性が５’−コレステロール修飾によって改善されることを示唆する（表５５、図６２Ａ、６２Ｂ、６３Ａ、６３Ｂ）。それらの未修飾バージョンと比較して、ＥＣ５０は、両方のアッセイにおいて約５〜１０倍減少した（ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ−５Ｃｈｏｌについて約５倍、およびＧＣＧＴ３−Ｇｗ２−５Ｃｈｏｌについて約１０倍（表５５））。ＧＣＧＴ３−５Ｃｈｏｌはその非修飾同族体と比較して約１７倍の活性であるので、５’−ｄＧ配列は５’−コレステロールの活性増強効果に必要ではないこともまた、この研究において示された（表５５、図６４）。
【０１６８】
５’コレステロール修飾（ＩＩＩ）
別の供給者によってＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ上に５’−コレステロール修飾（図５８Ａおよび５８Ｂ）を合成し（表５６）、実施例３に記載のＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１刺激試験を実施した。
【表５７】
2021506245.tif 000064
【表５８】
2021506245.tif 000065
【０１６９】
ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔの５’−コレステリル修飾形態は高度に強力なＴＬＲ２１刺激活性を示し、一桁のｐＭのＥＣ５０値を有した（表５７、図６５Ａおよび６５Ｂ）。対照的に、５’−コレステリルを欠くＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ形態はＥＣ５０に関して、ほぼ１５００倍弱い効力であり、５’脂質修飾の重要性を実証した（表５７、図６５Ａおよび６５Ｂ）。
【０１７０】
５’コレステロール修飾（ＩＶ）
５’−コレステロール修飾（図５８Ａおよび５８Ｂ）を、著者らの研究の過程で同定された異なるＣｐＧ−テトラヌクレオチドコアを有する別の高度にＴＬＲ２１活性なＯＤＮ、ＣＣＧＣ３−Ｇｗ２（表５８）上に合成し、実施例３に記載したようなＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−ｂｓｄ−ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１刺激試験を実施した。
【表５９】
2021506245.tif 000066
【表６０】
2021506245.tif 000067
【０１７１】
２つの独立した測定の結果は、ＣＣＧＣ３−Ｇｗ２のＴＬＲ２１刺激活性が５’−コレステロール修飾によって改善されることを示唆する（表５９、図６６Ａ、６６Ｂ）。修飾されていないバージョンと比較して、ＥＣ５０は、両方のアッセイにおいて約３〜５倍減少した（表５９）。この研究では、５’−ｄＧ配列が５’−コレステロールの活性増強効果に必要ではないことも示された：ＣＣＧＣ３−５Ｃｈｏｌがその非修飾同族体と比較して約３３倍活性である（表５９、図６７）。
【０１７２】
要約すると、これは、５’−コレステリル修飾によるＴＬＲ２１に対するＯＤＮの増加した固有活性に関する最初の報告であると考えられる。これは、３つの異なる供給者によって合成された３つの異なるバッチにおけるＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ（この研究シリーズにおいて新たに同定されたＯＤＮ）について示されている。ＴＬＲ２１活性増加作用は５’−Ｇ−カルテット形成配列（Ｇｗｉｒｅ２またはＴＧ４Ｔなど）による活性化に加えているが、それらを必要としない（ＧＣＧＴ３参照）。この研究シリーズで同定された別のＣｐＧ−ＯＤＮ：ＣＣＧＣ３−Ｇｗｉｒｅ２およびＣＣＧＣ３についても、ＴＬＲ２１活性増加作用が実証されている。３’−コレステリル修飾は、ＴＬＲ２１活性増加効果を有さない。５’コレステリル誘導体化は、ヌクレアーゼ分解に対する安定化効果も有するようである。コレステリルミセル集合が多座ＴＬＲ２１リガンドの形成に寄与すると推測できる。３’位置とは対照的に、５’位置は、ＣｐＧモチーフの正しい配向に必要とされるようである。さらに、５’コレステリル誘導体化は、インビボでのバイオアベイラビリティーに改変効果を有することが可能である。
【０１７３】
当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に対して多数の変更および修正を行うことができ、本発明の精神から逸脱することなくそのような変更および修正を行うことができることを理解するのであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲内に入るそのような均等な変形のすべてを包含することが意図される。
【０１７４】
この文献に引用または記載された各特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
実施例１０：ニワトリにおけるニューカッスル病ワクチン接種モデルにおける免疫刺激剤の有効性のＩｎ  ｖｉｖｏ研究
免疫刺激剤としてのＯＤＮ１、ＯＤＮ２、およびＯＤＮ３の適合性および有効性を決定するために、それぞれを３つの異なる濃度で試験した。
【０１７６】
以下の免疫刺激剤について検討した：
ＯＤＮ１：［ＣｈｏｌＴＥＧ］−ＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴ  （「ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ−５Ｃｈｏｌ」）  （配列番号２５２）  （［ＣｈｏｌＴＥＧ］＝５’− トリエチレングリコール−結合コレステリル修飾）、
ＯＤＮ２：ＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴ  （「ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ」）  （配列番号２５２）、
ＯＤＮ３：ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ  （「２００６−ＰＴＯ」）  （配列番号３）。
【０１７７】
各免疫刺激剤を、表６１に従って、不活化ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の最適以下の（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）濃度を含有するオイルエマルジョンに添加した。最適以下のＮＤＶワクチンの調製のために、ＮＤＶ抗原バッチをＮＤＶ陰性尿膜液（ＡＦ）中で５０倍希釈した。ＳＰＦ層ニワトリ（Ｌｅｇｈｏｒｎ）を用いて、ＯＤＮ１、ＯＤＮ２、およびＯＤＮ３とニューカッスル病ワクチンの最適以下の用量との併用の有効性を試験した。血清学的反応を測定し、免疫刺激剤を用いない同様の最適以下のＮＤＶワクチンと比較した。ワクチン接種後の異なる時点で抗体価を測定し、免疫刺激剤の添加がより早期の免疫応答につながるかどうかを検討した。３つのＯＤＮの最適な投与量を決定するために、各々が最適以下のＮＤＶワクチンに１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇの３つの異なる投与量で補充され、９つの免疫刺激剤群もたらした。これら９つの免疫刺激剤群の他に、５つの対照群を本研究に組み入れた。それらは、免疫刺激剤無しの最適以下のＮＤＶワクチン群、非希釈ＮＤＶワクチン群、陰性対照群（アジュバントとの併用での免疫刺激剤）および２つの異なる濃度でのポリイノシン：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）による２つの陽性対照群から成る（表６０）。
【０１７８】
以下のパラメーターを試験した：ニワトリの健康（データは示していない）および血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイによる血清学的検査。
【表６１】
2021506245.tif 000068
【０１７９】
治療群Ｔ０１〜Ｔ１４に登録されたニワトリには、試験デザインに従って試験品または対照品を投与した。Ｔ１３群およびＴ１４群では、試験開始前に２頭が消失したため、１群あたり１０羽のニワトリの代わりに９羽にワクチンを接種した。
【０１８０】
処理群Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６、Ｔ０７、Ｔ０８およびＴ０９に割り付けたニワトリに、３種類の異なる免疫刺激剤（ＯＤＮ）のうちの１種類を含む最適以下のＮＤＶ懸濁液（それぞれ、３種類の異なる濃度（１００、１０００、５０００ｎｇ／投与）をワクチン接種した。油中水型エマルジョンの調製のために、ＮＤＶ抗原懸濁液および免疫刺激剤（水相）を、アジュバント刺激剤（油相）と一緒に４：５の比で処方した（表６１）。
【表６２】
2021506245.tif 000069
2021506245.tif 000070
【０１８１】
Ｔ１０の対照群に割り付けたニワトリに、免疫刺激剤を含まない最適以下のＮＤＶ懸濁液（アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の）を４：５の比率でワクチン接種した。
【０１８２】
Ｔ１１の対照群に割り付けたニワトリに、免疫刺激剤を含まない非希釈ＮＤＶ懸濁液（アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の）を４：５の比率でワクチン接種した。
【０１８３】
Ｔ１２群に割り付けたニワトリに、免疫刺激剤１（３羽）、免疫刺激剤２（３羽）または免疫刺激剤３（３羽）をアジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中で４：５の比率でワクチン接種した。１匹のニワトリに、アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の希釈緩衝液をワクチン接種した。
【０１８４】
Ｔ１３（ｎ＝９）およびＴ１４（ｎ＝９）の対照群に割り当てたニワトリに、２つの濃度（１０，０００ｎｇおよび１００μｇ）のポリＩ：Ｃと組み合わせた最適以下のＮＤＶ懸濁液（アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の）を４：５の比でワクチン接種した。
【０１８５】
試験品または対照品の管理
−７０℃で保存した不活化ＮＤＶ株Ｕｌｓｔｅｒ懸濁液を解凍し、陰性尿膜液中で５０倍希釈して、最適以下のワクチン用量を作製した。免疫刺激剤を、研究デザインに従って添加した。得られた水相を、表６１に示すワクチン接種調製スキームに従って、４：５の比でＳｔｉｍｕｎｅと混合した。調製中、Ｓｔｉｍｕｎｅアジュバントを除く全てのワクチン成分を融解氷中に置いた。調製したワクチンを、調製直後に注射した（０．５ｍｌ、筋肉内）。
【０１８６】
全身の健康状態は、到着日から試験終了まで、経験豊富なバイオテクニシャンが毎日モニタリングした。
【０１８７】
血清採血
試験０日目（ワクチン接種前）、７日目、１４日目および２１日目に、すべてのニワトリから血清学的検査用の血液サンプルを採取した。血液サンプルには、試験番号、固有のサンプル識別、および採取日をラベル付けした。採取した血液量に応じて、血清を約０．５ｍｌの２つのアリコートに分け、−２０±５℃で保存した。
【０１８８】
赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ
簡単に述べると、希釈系列の血清を、８  ＨＡＵ（赤血球凝集単位）のＮＤＶ株Ｕｌｓｔｅｒと共に室温で６０分間インキュベートした。各アッセイの前にＨＡＵを滴定した。その後、ニワトリ赤血球を添加し、４℃で４５分間インキュベートした後、凝集を記録した。陰性対照血清および３つの陽性対照血清（低、中および高抗体価）を、それぞれのアッセイに含めた。
【０１８９】
ＨＩ力価の結果を、凝集を完全に阻害する最高血清希釈の逆数として表し、これを最終Ｌｏｇ２力価に対数変換した。
【０１９０】
統計
対数的に変換されたＨＩ結果を、動物ごとに要約した（表６２〜６５を参照のこと）。処置群ごとに、抗体価の平均値と標準偏差を算出した。統計解析は、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
【０１９１】
結果
いずれの群においても、ワクチン接種に関連した臨床症状及び有害事象は認められなかった。全試験期間中、すべてのニワトリは健康に見えた。
【０１９２】
しかしながら、２羽のニワトリを、研究開始の６日前に開始したペッキング行動に起因する軽度の損傷でスコア化した。ワクチン接種の日に、これらのニワトリを、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ群Ｔ１３（＃１１６５８）およびＴ１４（＃１１６７６）に割り当てた。ワクチン接種後１週間以内に回復した。
【０１９３】
ＯＤＮ１、ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ−５Ｃｈｏｌ
１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇのＯＤＮ１用量群のＬｏｇ２力価として表される個々のＨＩ結果を表６２に示す。これらの群の平均ＨＩ力価および標準偏差を、希釈ＮＤＶワクチン群の平均力価と比較して、図７０（ワクチン接種後（ｐｖ）１４日目および２１日目）および図７１（すべてのデータ）に示す。
【０１９４】
ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ−５Ｃｈｏｌ群は、希釈ＮＤＶワクチン（平均ＨＩ力価：４．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較して有意に高いＨＩ力価を示した。ｐｖ１４日目では、これは３つの用量のすべてのケースであった；１００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．４（ｐ＝０．０２１４）、１０００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．９Ｌｏｇ２／ＳＤ１．１（ｐ＝０．０００３）および５０００ｎｇ：平均ＨＩ５．９Ｌｏｇ２／ＳＤ０．７（ｐ＝０．０２４３）。
【０１９５】
しかし、ｐｖ２１日目では、ＮＤＶワクチン；ＨＩ力価６．２  Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０と比較した場合、１０００ｎｇの濃度は非常に有意に近いが、全ての濃度で有意差は観察されなかった；１００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．９Ｌｏｇ２／ＳＤ０．８（ｐ＝０．１９９５）；１０００ｎｇ：平均ＨＩ力価７．３Ｌｏｇ２／ＳＤ０．９（ｐ＝０．０５２７）；および５０００ｎｇ：平均ＨＩ６．７Ｌｏｇ２／ＳＤ０．９（ｐ＝０．４５２３）（図７０）。
【表６３】
2021506245.tif 000071
【０１９６】
ＯＤＮ２、ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ
１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇのＯＤＮ１用量群のＬｏｇ２力価として表される個々のＨＩ結果を表６３に示す。これらの群の平均ＨＩ力価および標準偏差を、希釈ＮＤＶワクチン群の平均力価と比較して、図７２（ｐｖ１４日目および２１日目）および図７３（すべてのデータ）に示す。
【０１９７】
ＯＤＮ２、ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ群は、希釈ＮＤＶワクチン（平均ＨＩ力価：４．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較して有意に高いＨＩ力価を示した。これは、３つの用量全てのワクチン接種後１４日目のケースだった；１００ｎｇ：平均ＨＩ力価７．１Ｌｏｇ２／ＳＤ１．２（ｐ＝０．０００３）、１０００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．４Ｌｏｇ２／ＳＤ０．７（ｐ＝０．００２７）、および５０００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．１Ｌｏｇ２／ＳＤ１．１（ｐ＝０．０２３６）。２１日目に、ＮＤＶワクチン（ＨＩ力価６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較した場合、７．６Ｌｏｇ２／ＳＤ０．８（ｐ＝０．００８３）の平均ＨＩ力価を有する１００ｎｇ投与量でのみ有意差が観察された。１０００ｎｇおよび５０００ｎｇの平均ＨＩ力価は、それぞれ７．１Ｌｏｇ２／０．６（ｐ＝０．０６９６）および７．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０（ｐ＝０．０９５６）であった（図７２）。
【表６４】
2021506245.tif 000072
【０１９８】
ＯＤＮ３、２００６−ＰＴＯ
測定した１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇのＯＤＮ１用量群のＬｏｇ２力価として表した個々のＨＩ結果を表６４に示す。３連のＨＩアッセイ実施の間に、異常値の結果が２１日目に動物１１５７０について観察され、これはピペッティングエラー（十分なＡＦが添加されていない）によって引き起こされた可能性が最も高く、したがって、この結果は最終分析から省略された（表６４において強調されている）。従って、この動物および日付について、平均ＨＩ力価は、二重測定に基づいた。
【０１９９】
これらの群の平均ＨＩ力価および標準偏差を、希釈ＮＤＶワクチン群の平均力価と比較して、図７４（ｐｖ１４日目および２１日目）および図７５（すべてのデータ）に示す。
【０２００】
ＯＤＮ３、２００６−ＰＴＯ群は、希釈ＮＤＶワクチン（平均ＨＩ力価：４．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較して有意に高いＨＩ力価を示した。これは、２つの用量についてのワクチン接種後１４日目のケースであった；１０００ｎｇ：平均ＨＩ力価：６．３Ｌｏｇ２／ＳＤ１．２（ｐ＝０．００８１）および５０００ｎｇ：平均ＨＩ力価：６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ０．８（ｐ＝０．００５９）。１００ｎｇ用量の平均ＨＩ力価は、５．３Ｌｏｇ２／ＳＤ０．５であった（ｐ＝０．２０９０）。ｐｖ２１日目に、有意差は、５０００ｎｇでのみ測定された：平均ＨＩ力価７．３Ｌｏｇ２／ＳＤ０．６（ｐ＝０．０２９６）。１００ｎｇおよび１０００ｎｇ用量では有意差は認められず、ＮＤＶワクチン；ＨＩ力価６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０と比較した場合の平均ＨＩ力価はそれぞれ６．６Ｌｏｇ２／ＳＤ０．５（ｐ＝０．７１８３）および６．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．１（ｐ＝０．１６８５）であった（図７４）。
【表６５】
2021506245.tif 000073
【０２０１】
対照群
１０μｇおよび１００μｇのＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃ用量群、希釈および非希釈ＮＤＶワクチン、ならびに陰性対照群のＬｏｇ２力価として表される個々のＨＩ結果を表６５に示す。これらの群の平均ＨＩ力価および標準偏差を、希釈ＮＤＶワクチン群の平均力価と比較して、図７６（ｐｖ１４日目および２１日目）および図７７（すべてのデータ）に示す。
【０２０２】
陽性対照群であるＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃについては、ＮＤＶワクチン（６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較した場合、１００μｇ用量：２１日目のＨＩ力価７．５Ｌｏｇ２／ＳＤ０．４（ｐ＝０．００５３）でのみ有意に高いＨＩ力価が観察された。１０μｇおよび１００μｇ用量群のｐｖ１４日目の平均ＨＩ力価は、それぞれ５．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．３（ｐ＝０．１８５９）および５．５Ｌｏｇ２／ＳＤ０．８（ｐ＝０．１６０９）であった。ｐｖ２１日目における１０μｇ用量群の平均ＨＩ力価は、６．４Ｌｏｇ２／ＳＤ１．３であった（ｐ＝０．７２７３）。有意差（ｐ＜０．０００１）が、非希釈ＮＤＶワクチン（８．３／ＳＤ０．５および８．５Ｌｏｇ２／ＳＤ０．７）と陰性対照群との間で、ワクチン接種後１４日目および２１日目（それぞれ４．８／ＳＤ１．０および６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）に希釈ＮＤＶ群と比較して観察された（図７６）。
【表６６】
2021506245.tif 000074
【０２０３】
結論
目的は、３種類の異なる免疫刺激剤のアジュバント活性を研究することであった。これは、最適以下の濃度の不活化ＮＤＶおよび３つの異なる免疫刺激剤のうちの１つの異なる濃度を含有するオイルエマルジョンワクチンでのワクチン接種後の血清学的応答を測定することによって試験された。
【０２０４】
以下の免疫刺激剤について検討した：
ＯＤＮ１：［ＣｈｏｌＴＥＧ］−ＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴ（「ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ−５Ｃｈｏｌ」）（配列番号２５２）（［ＣｈｏｌＴＥＧ］＝５’−トリエチレングリコール−結合コレステリル修飾）、
ＯＤＮ２：ＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴ（「ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ」）（配列番号２５２）、
ＯＤＮ３：ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ（「２００６−ＰＴＯ」）（配列番号３）。
【０２０５】
ＯＤＮ１およびＯＤＮ２免疫の骨格はホスホジエステル結合していたが、ＯＤＮ３の骨格はホスホロチオエート結合していた。各ＯＤＮの有効性は、最適以下のＮＤＶワクチンに補充した１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇの３種類の異なる用量で測定した。
【０２０６】
血清学的反応はワクチン接種後０日目（ワクチン接種前）、７日目、１４日目および２１日目に測定し、これらの免疫刺激剤の添加がより早期の免疫反応にもつながる可能性があるかどうかを検討した。ワクチン接種後（ｐｖ）０日目および７日目にはＮＤＶに対する抗体レベルは、７日目の非希釈ＮＤＶワクチン群の１動物（＃１１６１８）を除いて、検出されなかった。
【０２０７】
Ｌｏｇ２ＨＩ力価として表した血清学的反応はｐｖ１４日目と２１日目で非希釈ワクチンと最適以下のＮＤＶワクチンの間で有意差（ｐ＜０．０００１）を示し、５０倍の希釈係数が最適以下のワクチン用量を作り出すのに十分であることを示した。
【０２０８】
陰性対照群は全試験期間中陰性のままであり、ＮＤＶワクチン非接種の免疫刺激剤は非特異的免疫応答をもたらさないことが示された。
【０２０９】
陽性対照のＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃ  １００μｇ用量群は２１日目にナイーブＮＤＶワクチンと比較して有意に高いＨＩ力価を示し（ｐ＝０．００５３）、この用量群が有効な陽性対照群となることを示した。
【０２１０】
ＧＣＧＴ３‐ＴＧ４Ｔ‐５Ｃｈｏｌ（ＯＤＮ１）群は、３つの用量全てについて、希釈ＮＤＶワクチンと比較した場合、ｐｖ１４日目で有意に高いＨＩ力価を示した；１００ｎｇ（ｐ＝０．０２１４）、１０００ｎｇ（ｐ＝０．０００３）および５０００ｎｇ（ｐ＝０．０２４３）。しかし、ｐｖ２１日目では、有意差は観察されなかった。
【０２１１】
ＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ（ＯＤＮ２）群は、希釈したＮＤＶワクチンと比較した場合、ｐｖ１４日目で３つの用量すべてについて有意に高いＨＩ力価を示した；１００ｎｇ（ｐ＝０．０００３）、１０００ｎｇ（ｐ＝０．００２７）および５０００ｎｇ（ｐ＝０．０２３６）。２１日目に、有意差（ｐ＝０．００８３）は、１００ｎｇ用量群でのみ測定された。
【０２１２】
２００６−ＰＴＯ（ＯＤＮ３）群は、ｐｖ１４日目で希釈ＮＤＶワクチンと比較して、２回の用量で有意に高いＨＩ力価を示した；１０００ｎｇ（ｐ＝０．００８１）および５０００ｎｇ（ｐ＝０．００５９）。ｐｖ２１日目に、有意差（ｐ＝０．０２９６）は５０００ｎｇ投与群でのみ測定された。
【０２１３】
結論として、最高の平均ＨＩ力価は１００ｎｇのＧＣＧＴ３−ＴＧ４Ｔ（ＯＤＮ２）用量群、７．１Ｌｏｇ２（ｐｖ１４日目）および７．６Ｌｏｇ２（ｐｖ２１日目）で観察され、これはナイーブＮＤＶワクチンのｐｖ１４日目および２１日目それぞれの２．３Ｌｏｇ２および１．４Ｌｏｇ２と比較した場合、力価の増加を示す。
【０２１４】
１０００ｎｇのＧＣＧＴ３‐ＴＧ４Ｔ‐５Ｃｈｏｌ（ＯＤＮ１）用量群の、それぞれ６．９Ｌｏｇ２と７．３Ｌｏｇ２のｐｖ１４日目と２１日目の力価は、ＯＤＮ２群とほぼ同様であった。ｐｖ１４日目では、ＯＤＮ１群とＯＤＮ２群の間に有意差（ｐ＝０．７５１３）は観察されなかった。
【０２１５】
５０００ｎｇの２００６−ＰＴＯ（ＯＤＮ３）用量群の力価は、それぞれ、ｐｖ１４日目および２１日目で６．２Ｌｏｇ２および７．３Ｌｏｇ２であった。ｐｖ１４日目において、ＯＤＮ３群は、ＯＤＮ１群およびＯＤＮ２群の両方と有意に異なった（ｐ＝０．０３００）（図７８および図７９）。
【０２１６】
ｐｖ２１日目では、全てのＯＤＮ群間に有意差は示されなかった。
【０２１７】
従って、これらの結果は全てのＯＤＮが特にワクチン接種後１４日目に、血清学的反応を有意に増加させることができ、また、より早期の免疫の開始を示すことを示す。
［実施例］
【０２１８】
実施形態
さらなる例示のために、本開示のさらなる非限定的な実施形態を以下に記載する。
【０２１９】
例えば、実施形態１は、オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列と少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。
【０２２０】
実施形態２は、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列は第１の複数のグアニンヌクレオチドを含む。
【０２２１】
実施形態３は、実施形態２のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドは３〜８個のグアニンヌクレオチドを含む。
【０２２２】
実施形態４は、実施形態３に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここでオリゴヌクレオチドは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９２、９３、９６、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１４３、または２５２を含む。
【０２２３】
実施形態５は実施形態１〜３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列は、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６８）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、ＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）、またはＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）を含む。
【０２２４】
実施形態６は、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３７、または１３８を含む。
【０２２５】
実施形態７は、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間に第２の複数のグアニンヌクレオチドをさらに含む前述の実施形態１〜６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドである。
【０２２６】
実施形態８は、実施形態２〜７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチド、第２の複数のグアニンヌクレオチド、または両方がＧ−カルテット配列を含む。
【０２２７】
実施形態９は、実施形態８に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記Ｇ−カルテット配列は他のＧ−カルテット配列のための相互作用部位である。
【０２２８】
実施形態１０は、実施形態９に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記Ｇ−カルテット配列はＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）を含む。
【０２２９】
実施形態１１は、実施形態７のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記第１および第２の複数のグアニンヌクレオチドはＧ−ワイヤー配列を含む。
【０２３０】
実施形態１２は、実施形態１１に記載のオリゴヌクレオチドであり、前記Ｇ−ワイヤー配列は、他のＧ−ワイヤー配列のための相互作用部位である。
【０２３１】
実施形態１３は、実施形態１０または１１に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記Ｇ−ワイヤー配列は配列番号２５７または２５８を含む。
【０２３２】
実施形態１４は、実施形態１１または１２に記載のオリゴヌクレオチドであ、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１４１、１４２、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４，１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２５２、またはＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ３を含む。
【０２３３】
実施形態１５は、実施形態７〜１４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドおよび第２の複数のグアニンヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドによって分離されている。
【０２３４】
実施形態１６は、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間にリンカーをさらに含む実施形態１〜３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドである。
【０２３５】
実施形態１７は、実施形態１６に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記リンカーは少なくとも３つのヌクレオチドを含む。
【０２３６】
実施形態１８は、実施形態１６または１７のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記リンカーはヘキサエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロパンジオール、またはそれらの誘導体を含む。
【０２３７】
実施形態１９は、実施形態１６〜１８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ１または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ３を含む。
【０２３８】
実施形態２０は、前述の実施形態１〜１９に記載のいずれか１つのオリゴヌクレオチドであり、ここで、少なくとも１つのＣｐＧモチーフは複数のＣｐＧモチーフである。
【０２３９】
実施形態２１は、実施形態２０のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記複数のＣｐＧモチーフは２つ、３つ、４つ、または５つのＣｐＧモチーフを含む。
【０２４０】
実施形態２２は、実施形態２０または２１のオリゴヌクレオチドであり、ここで、各ＣｐＧモチーフは少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログによって他のＣｐＧモチーフから分離されている。
【０２４１】
実施形態２３は、実施形態２２に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記少なくとも１つのヌクレオチドは１〜４つのチミンヌクレオチドである。
【０２４２】
実施形態２４は、実施形態２２または２３のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２１７、２１８、２１９、または２２０を含む。
【０２４３】
実施形態２５は、実施形態２０に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記ＣｐＧモチーフの各々はスペーサーによって他のＣｐＧモチーフから分離されている。
【０２４４】
実施形態２６は、実施形態２５に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋である。
【０２４５】
実施形態２７は、実施形態２６に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記デオキシリボースリン酸架橋は脱塩基である。
【０２４６】
実施形態２８は、実施形態２７に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２２１を含む。
【０２４７】
実施形態２９は、実施形態２５のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記スペーサーは炭素鎖を含む。
【０２４８】
実施形態３０は、実施形態２９に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記炭素鎖は２つの炭素原子を含む。
【０２４９】
実施形態３１は、実施形態３０に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記炭素鎖はエタンジオールから誘導される。
【０２５０】
実施形態３２は、実施形態３１に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＯＤＮ−Ｘ２（Ｘ２はエタンジオールである）を含む。
【０２５１】
実施形態３３は、実施形態２９に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記炭素鎖は３つの炭素原子を含む。
【０２５２】
実施形態３４は、実施形態３３に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記炭素鎖は１，３−プロパンジオールから誘導される。
【０２５３】
実施形態３５は、実施形態３３または３４に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで前記ヌクレオチドはＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２、Ｇｗ２Ｘ２−２、またはＯＤＮ−Ｘ３、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−１、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−３、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−４、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−５、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−１、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−２、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−３、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−４、またはＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−５であり、ここで、Ｘ２は３炭素鎖である；２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ２であり、ここで、Ｘ２はプロパンジオールから誘導される３炭素鎖である；または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ４ある、ここで、Ｘ４はプロパンジオールから誘導される３炭素鎖である。
【０２５４】
実施形態３６は、実施形態２９に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記炭素鎖が４個の炭素原子を含む。
【０２５５】
実施形態３７は、実施形態３６に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記炭素鎖は１，４−ブタンジオールから誘導される。
【０２５６】
実施形態３８は、実施形態３６または３７に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＯＤＮ−Ｘ４（ここで、Ｘ４は１，４−ブタンジオールから誘導される４個の炭素鎖である）を含む。
【０２５７】
実施形態３９は、実施形態２５のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記スペーサーは反復化学単位を含む。
【０２５８】
実施形態４０は、実施形態３９に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記反復化学単位はエチレングリコールである。
【０２５９】
実施形態４１は、実施形態３９または４０に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＣＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ１（ここで、Ｘ１はヘキサエチレングリコールから誘導されるスペーサーである）を含む。
【０２６０】
実施形態４２は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログをさらに含む前述の実施形態１〜４１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドである。
【０２６１】
実施形態４３は、ホスホジエステル骨格をさらに含む前述の実施形態１〜４２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドであり。
【０２６２】
実施形態４４は、ホスホロチオエート骨格をさらに含む前述の実施形態１〜４３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドである。
【０２６３】
実施形態４５は、脂質部分をさらに含む前述の実施形態１〜４４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドである。
【０２６４】
実施形態４６は、実施形態４５に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記脂質部分はコレステロールである。
【０２６５】
実施形態４７は、実施形態４５または４６に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記脂質部分はオリゴヌクレオチドの５’末端にまたはその近傍にある。
【０２６６】
実施形態４８は、先述の実施形態１〜４７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記ＣｐＧモチーフは少なくとも４つのヌクレオチドを有するＣｐＧ配列エレメントを含む。
【０２６７】
実施形態４９は、少なくとも２つのＣｐＧ配列エレメントを含む実施形態４８のオリゴヌクレオチドである。
【０２６８】
実施形態５０は、少なくとも３つのＣｐＧ配列エレメントを含む、実施形態４８または４９のオリゴヌクレオチドである。
【０２６９】
実施形態５１は、実施形態４８〜５０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記ＣｐＧ配列エレメントはＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、ＴＣＧＣ、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０２７０】
実施形態５２は、トリチミンヌクレオチド３’末端をさらに含む、前述の実施形態１〜５１のいずれか１つのオリゴヌクレオチドである。
【０２７１】
実施形態５３は、実施形態５５に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、または２１５を含む。
【０２７２】
実施形態５４は、前述の実施形態１〜５３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドを含む、感染症を予防または治療するためのワクチンである。
【０２７３】
実施形態５５は、前述の実施形態１〜５４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドを含むベクターである。
【０２７４】
実施形態５６は、前述の実施形態１〜５５のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物である。
【０２７５】
実施形態５７は、薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態５６に記載の免疫刺激性組成物である。
【０２７６】
実施形態５８は、実施形態５７に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドおよび担体は連結されている。
【０２７７】
実施形態５９は、ハプテンをさらに含む実施形態５６に記載の免疫刺激性組成物である。
【０２７８】
実施形態６０は、実施形態５７に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドおよびハプテンは連結されている。
【０２７９】
実施形態６１は、トル様受容体２１（ＴＬＲ２１）を刺激する方法であり：
オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与し、グアニンヌクレオチド富化配列は、第１の複数のグアニンヌクレオチドを含む、前記方法。
【０２８０】
実施形態６２は、実施形態６１に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドの濃度は２０ｎＭ未満である。
【０２８１】
実施形態６３は、実施形態６１または６２に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０２８２】
実施形態６４は、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性組成物はハプテンをさらに含む。
【０２８３】
実施形態６５は、実施形態６１〜６４のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドの半数効果濃度（ＥＣ５０）は１００  ｐＭ未満である。
【０２８４】
実施形態６６は、実施形態６１〜６５のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化ヌクレオチド配列はＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６８）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、またはＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）を含む。
【０２８５】
実施形態６７は、実施形態６１〜６６のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３７、または１３８を含む、。
【０２８６】
実施形態６８は、実施形態６１〜６７のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＧ−ワイヤー配列をさらに含む。
【０２８７】
実施形態６９は、実施形態６８に記載の方法であり、ここで、前記Ｇ−ワイヤー配列は配列番号２５７または２５８を含む。
【０２８８】
実施形態７０は、実施形態６８に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１４１、１４２、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２５２、またはＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ３を含む。
【０２８９】
実施形態７１は、実施形態６１〜７０のいずれか１つに記載の方法であり、第２の複数のグアニンヌクレオチドを含み、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドおよび第２の複数のグアニンヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される。
【０２９０】
実施形態７２は、実施形態６１〜７１のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドが第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間にリンカーをさらに含む。
【０２９１】
実施形態７３は、実施形態７２に記載の方法であり、ここで、前記リンカーは少なくとも３つのヌクレオチドを含む。
【０２９２】
実施形態７４は、実施形態７２に記載の方法であり、ここで、前記リンカーはヘキサエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロパンジオール、またはそれらの誘導体を含む。
【０２９３】
実施形態７５は、実施形態７２〜７４に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ１または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ３を含む。
【０２９４】
実施形態７６は、実施形態７２〜７５に記載の方法であり、ここで、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは複数のＣｐＧモチーフである。
【０２９５】
実施形態７７は、実施形態７６に記載の方法であり、ここで、前記複数のＣｐＧモチーフは２つ、３つ、４つ、または５つのＣｐＧモチーフを含む。
【０２９６】
実施形態７８は、実施形態７６または７７に記載の方法であり、ここで、各ＣｐＧモチーフは少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログによって他のＣｐＧモチーフから分離されている。
【０２９７】
実施形態７９は、実施形態７８に記載の方法であり、前記少なくとも１つのヌクレオチドは１〜４つのチミンヌクレオチドである。
【０２９８】
実施形態８０は、実施形態７８または７９に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２１７、２１８、２１９、または２２０を含む。
【０２９９】
実施形態８１は、実施形態７６または７７の方法であり、ここで、前記ＣｐＧモチーフの各々はスペーサーによって他のＣｐＧモチーフから分離される。
【０３００】
実施形態８２は、実施形態８１の方法であり、ここで、前記スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋である。
【０３０１】
実施形態８３は、実施形態８２に記載の方法であり、ここで、前記デオキシリボースリン酸架橋は脱塩基である。
【０３０２】
実施形態８４は、実施形態８２または８３に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２２１を含む。
【０３０３】
実施形態８５は、実施形態８１記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは炭素鎖を含む。
【０３０４】
実施形態８６は、実施形態８５に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は２つの炭素原子を含む。
【０３０５】
実施形態８７は、実施形態８６に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖はエタンジオールから誘導される。
【０３０６】
実施形態８８は、実施形態８６または８７に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＯＤＮ−Ｘ２（ここで、Ｘ２はエタンジオールである）を含む。
【０３０７】
実施形態８９は、実施形態８５に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は３つの炭素原子を含む。
【０３０８】
実施形態９０は、実施形態８９に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は１，３−プロパンジオールから誘導される。
【０３０９】
実施形態９１は、実施形態８９または９０に記載の方法であり、ここで、前記ヌクレオチドはＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２、Ｇｗ２Ｘ２−２、またはＯＤＮ−Ｘ３、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−１、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−３、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−４、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−５、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−１、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−２、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−３、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−４、またはＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−５を含み、ここで、Ｘ２は３炭素鎖である；２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ２を含み、ここで、Ｘ２はプロパンジオールから誘導される３炭素鎖である；または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ４を含む、ここで、Ｘ４はプロパンジオールから誘導される３炭素鎖である。
【０３１０】
実施形態９２は、実施形態８５に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は４個の炭素原子を含む。
【０３１１】
実施形態９３は、実施形態９２に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は１，４−ブタンジオールから誘導される。
【０３１２】
実施形態９４は、実施形態９２または９３の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＯＤＮ−Ｘ４（ここで、Ｘ４は１，４−ブタンジオール誘導される４炭素鎖である）を含む。
【０３１３】
実施形態９５は、実施形態８１に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは反復化学単位を含む。
【０３１４】
実施形態９６は、実施形態９５に記載の方法であり、ここで、前記反復化学単位はエチレングリコールである。
【０３１５】
実施形態９７は、実施形態９５または９６に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＣＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ１（ここで、Ｘ１はヘキサエチレングリコールから誘導されるスペーサーである）を含む。
【０３１６】
実施形態９８は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログをさらに含む前述の実施形態６１〜９７のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１７】
実施形態９９は、脂質部分をさらに含む、前述の実施形態６１〜９８のいずれか１つの方法である。
【０３１８】
実施形態１００は、実施形態９９に記載の方法であり、ここで、前記脂質部分はコレステロールである。
【０３１９】
実施形態１０１は、実施形態９９または１００の方法であり、ここで、前記脂質部分はオリゴヌクレオチドの５’末端にまたはその近傍にある。
【０３２０】
実施形態１０２は、、実施形態６１〜１０１のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記ＣｐＧモチーフは少なくとも４つのヌクレオチドを有するＣｐＧ配列エレメントを含む。
【０３２１】
実施形態１０３は、実施形態１０２に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも２つのＣｐＧ配列エレメントを含む。
【０３２２】
実施形態１０４は、実施形態１０２または１０３に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも３つのＣｐＧ配列エレメントを含む。
【０３２３】
実施形態１０５は、実施形態１０１〜１０４のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記ＣｐＧ配列エレメントはＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、ＴＣＧＣ、またはそれらのいずれかの組み合わせである。
【０３２４】
実施形態１０６は、トリチミンヌクレオチド３’末端をさらに含む、実施形態６１の方法である。
【０３２５】
実施形態１０７は、実施形態１０６に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、または２１５を含む。
【０３２６】
実施形態１０８は、実施形態６１〜１０７のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性組成物は感染症を予防または治療するためのワクチンを含む。
【０３２７】
実施形態１０９は、実施形態６１〜１０７のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性組成物はベクターを含む。
【０３２８】
実施形態１１０は、実施形態６１〜１０９のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０３２９】
実施形態１１１は、実施形態１１０に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドおよび担体は連結されている。
【０３３０】
実施形態１１２は、実施形態６１〜１１１のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性組成物はハプテンをさらに含む。
【０３３１】
実施形態１１３は、実施形態１１２のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドおよびハプテンは連結されている。
【０３３２】
実施形態１１４は、実施形態６１〜１１３のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記投与は静脈内、筋肉内、乳房内、皮内、腹腔内、皮下、スプレー、エアロゾル、卵内、粘膜内、経皮、浸漬、経口、眼内、気管内、または鼻腔内で行われる。
【０３３３】
実施形態１１５は、実施形態６１〜１１４のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記対象は動物である。
【０３３４】
実施形態１１６は、実施形態６１〜１１５のいずれか１つの方法であり、ここで、前記対象は鳥類種のメンバーである。
【０３３５】
実施形態１１７は、オリゴヌクレオチドの５’末端をグアニンヌクレオチド富化配列に融合させることを含む、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激活性を増加させるための方法である。
【０３３６】
実施形態１１８は、実施形態１１７に記載の方法であり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列がＧ−カルテット配列である。
【０３３７】
実施形態１１９は、実施形態１１８に記載の方法であり、ここで、前記Ｇ−カルテット配列は第１の複数のグアニンヌクレオチドを含む。
【０３３８】
実施形態１２０は、実施形態１１９に記載の方法であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドが３〜８個のグアニンヌクレオチドを含む。
【０３３９】
実施形態１２１は、実施形態１１９または１２０に記載の方法であり、ここで、前記Ｇ−カルテット配列はＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６８）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、またはＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）を含む。
【０３４０】
実施形態１２２は、実施形態１１７〜１２１のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは第２の複数のグアニンヌクレオチドを含む。
【０３４１】
実施形態１２３は、実施形態１１７〜１２２のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列はＧ−ワイヤー配列を含む。
【０３４２】
実施形態１２４は、実施形態１２３に記載の方法であり、ここで、前記Ｇ−ワイヤー配列は配列番号２５７または２５８を含む。
【０３４３】
実施形態１２５は、実施形態１１９〜１２４のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドおよび第２の複数のグアニンヌクレオチドが少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される。
【０３４４】
実施形態１２６は、実施形態１１７に記載の方法であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間にリンカーを挿入することをさらに含む。
【０３４５】
実施形態１２７は、実施形態１２６に記載の方法であり、ここで、前記リンカーは少なくとも３つのヌクレオチドを含む。
【０３４６】
実施形態１２８は、実施形態１２６または１２７に記載の方法であり、ここで、前記リンカーはヘキサエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロパンジオール、またはそれらの誘導体を含む。
【０３４７】
実施形態１２９は、実施形態１２６〜１２８のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ１または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ３を含む。
【０３４８】
実施形態１３０は、実施形態１１７に記載の方法であり、ここで、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは複数のＣｐＧモチーフである。
【０３４９】
実施形態１３１は、実施形態１３０に記載の方法であり、ここで、前記複数のＣｐＧモチーフは２つ、３つ、４つ、または５つのＣｐＧモチーフを含む。
【０３５０】
実施形態１３２は、ＣｐＧモチーフ間に少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを挿入することをさらに含む、実施形態１３０または１３１に記載の方法である。
【０３５１】
実施形態１３３は、請求項１３２に記載の方法であり、ここで、前記少なくとも１つのヌクレオチドは１〜４つのチミンヌクレオチドである。
【０３５２】
実施形態１３４は、ＣｐＧモチーフの各々の間にスペーサーを挿入することをさらに含む、実施形態１１７に記載の方法である。
【０３５３】
実施形態１３５は、実施形態１３４に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋である。
【０３５４】
実施形態１３６は、実施形態１３５に記載の方法であり、ここで、前記デオキシリボースリン酸架橋は脱塩基である。
【０３５５】
実施形態１３７は、実施形態１３４に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは炭素鎖を含む。
【０３５６】
実施形態１３８は、実施形態１３７に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は２つの炭素原子を含む。
【０３５７】
実施形態１３９は、実施形態１３７または１３８に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖はエタンジオールから誘導される。
【０３５８】
実施形態１４０は、実施形態１３７に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は３つの炭素原子を含む。
【０３５９】
実施形態１４１は、実施形態１３７または１４０に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は１，３−プロパンジオールから誘導される。
【０３６０】
実施形態１４２は、実施形態１３７に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は４つの炭素原子を含む。
【０３６１】
実施形態１４３は、実施形態１３７または１４２に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は１，４−ブタンジオールから誘導される。
【０３６２】
実施形態１４４は、実施形態１３７に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは反復化学単位を含む。
【０３６３】
実施形態１４５は、実施形態１３７または１４４に記載の方法であり、ここで、前記反復化学単位はエチレングリコールである。
【０３６４】
実施形態１４６は、実施形態１３７、１４４、または１４５のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記スペーサーはヘキサエチレングリコールから誘導される。
【０３６５】
実施形態１４７は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを挿入することをさらに含む、実施形態１１７〜１４６のいずれか１つに記載の方法である。
【０３６６】
実施形態１４８は、脂質部分を挿入することをさらに含む、実施形態１１７〜１４７のいずれか１つに記載の方法である。
【０３６７】
実施形態１４９は、実施形態１４８に記載の方法であり、ここで、前記脂質部分はコレステロールである。
【０３６８】
実施形態１５０は、実施形態１４８または１４９の方法であり、ここで、前記脂質部分はオリゴヌクレオチドの５’末端にまたはその近傍にある。
【０３６９】
実施形態１５１は、ＣｐＧモチーフに隣接するヌクレオチドを修飾することをさらに含む、実施形態１１７〜１５０のいずれか１つに記載の方法である。
【０３７０】
実施形態１５２は対象において免疫応答を誘発する方法であり、以下を含む：
それを必要とする対象に、オリゴヌクレオチドの５’末端の４ヌクレオチドでまたはその４ヌクレオチド内で始まるグアニンヌクレオチド富化配列と少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドモチーフを有するオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物を投与すること。
【０３７１】
実施形態１５３は、実施形態１５２に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドの濃度は２０ｎＭ未満である。
【０３７２】
実施形態１５４は、実施形態１５２または１５３に記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０３７３】
実施形態１５５は、実施形態１５２〜１５４のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性組成物はハプテンをさらに含む。
【０３７４】
実施形態１５６は、実施形態１５２〜１５５のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性組成物の半数効果濃度（ＥＣ５０）は１００ｐＭ未満である。
【０３７５】
実施形態１５７は、実施形態１５２に記載の方法であり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列はＧ−カルテット配列を含む。
【０３７６】
実施形態１５８は、実施形態１５２〜１５６のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記Ｇ−カルテット配列はＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６８）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、ＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）、またはＴＧＧＧＧＴ（配列番号２６５）を含む。
【０３７７】
実施形態１５９は、実施形態１５２〜１５７のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３７、または１３８を含む。
【０３７８】
実施形態１６０は、実施形態１５２に記載の方法であり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列はＧ−ワイヤー配列を含む。
【０３７９】
実施形態１６１は、実施形態１６０に記載の方法であり、ここで、前記Ｇ−ワイヤー配列は配列番号２５７または２５８を含む。
【０３８０】
実施形態１６２は、実施形態１６０に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１４１、１４２、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２５２、またはＧＣＧＴ−Ｇｗｉｒｅ３を含む。
【０３８１】
実施形態１６３は、実施形態１５２に記載の方法であり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列は少なくとも１つのヌクレオチドによって分離された第１および第２の複数のグアニンヌクレオチドを含む。
【０３８２】
実施形態１６４は、実施形態１５２に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはグアニンヌクレオチド富化配列と少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間にリンカーをさらに含む。
【０３８３】
実施形態１６５は、実施形態１６４に記載の方法であり、ここで、前記リンカーは少なくとも３つのヌクレオチドを含む。
【０３８４】
実施形態１６６は、実施形態１６４に記載の方法であり、ここで、前記リンカーはヘキサエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロパンジオール、またはそれらの誘導体を含む。
【０３８５】
実施形態１６７は、実施形態１６４〜１６６に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ１または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ３を含む。
【０３８６】
実施形態１６８は、実施形態１５２に記載の方法であり、ここで、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは複数のＣｐＧモチーフである。
【０３８７】
実施形態１６９は、実施形態１６８に記載の方法であり、ここで、前記複数のＣｐＧモチーフは２つ、３つ、４つ、または５つのＣｐＧモチーフを含む。
【０３８８】
実施形態１７０は、実施形態１６８または１６９に記載の方法であり、ここで、前記各ＣｐＧモチーフは少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログによって他のＣｐＧモチーフから分離される。
【０３８９】
実施形態１７１は、実施形態１７０に記載の方法であり、ここで、前記少なくとも１つのヌクレオチドアナログは１〜４つのチミンヌクレオチドでる。
【０３９０】
実施形態１７２は、実施形態１７０または１７１に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２１７、２１８、２１９、または２２０を含む。
【０３９１】
実施形態１７３は、実施形態１６８または１６９に記載の方法であり、ここで、前記ＣｐＧモチーフの各々はスペーサーによって他のＣｐＧモチーフから分離される。
【０３９２】
実施形態１７４は、実施形態１７３に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋である。
【０３９３】
実施形態１７５は、実施形態１７４に記載の方法であり、ここで、前記デオキシリボースリン酸架橋は脱塩基である。
【０３９４】
実施形態１７６は、実施形態１７４または１７５に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２２１を含む。
【０３９５】
実施形態１７７は、実施形態１７３記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは炭素鎖を含む。
【０３９６】
実施形態１７８は、実施形態１７７に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は２つの炭素原子を含む。
【０３９７】
実施形態１７９は、実施形態１７７または１７８に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖はエタンジオールから誘導される。
【０３９８】
実施形態１８０は、実施形態１７７〜１７９に記載のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＯＤＮ−Ｘ２（ここで、Ｘ２はエタンジオールである）を含む。
【０３９９】
実施形態１８１は、実施形態１７７に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は３つの炭素原子を含む。
【０４００】
実施形態１８２は、実施形態１７７または１８１に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は１，３−プロパンジオールから誘導される。
【０４０１】
実施形態１８３は、実施形態１７７、１８１、または１８２のいずれか１つの方法であり、ここで、前記ヌクレオチドはＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２、Ｇｗ２Ｘ２−２、またはＯＤＮ−Ｘ３、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−１、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−３、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−４、ＣＧ−Ｇｗ２Ｘ２−５、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−１、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−２、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−３、ＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−４、またはＣＧ−Ｇ４Ｔ１６Ｘ２−５を含み、ここで、Ｘ２は３炭素鎖である；２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ２であり、ここで、Ｘ２はプロパンジオールから誘導される３炭素鎖である；または２００６−ＰＤＥ５ｄＧ４−Ｘ４ある、ここで、Ｘ４はプロパンジオールから誘導される３炭素鎖である。
【０４０２】
実施形態１８４は、実施形態１７７に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は４つの炭素原子を含む。
【０４０３】
実施形態１８５は、実施形態１７７または１８４に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は１，４−ブタンジオールから誘導される。
【０４０４】
実施形態１８６は、実施形態１７７、１８４、または１８５のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＯＤＮ−Ｘ４を含み、ここで、Ｘ４は１，４−ブタンジオールから誘導される４炭素鎖である。
【０４０５】
実施形態１８７は、実施形態１７３に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは反復化学単位を含む。
【０４０６】
実施形態１８８は、実施形態１８７に記載の方法であり、ここで、前記反復化学単位はエチレングリコールである。
【０４０７】
実施形態１８９は、実施形態１８７または１８８に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドはＣＣＧＣ−Ｇｗ２Ｘ１を含みおよびここで、Ｘ１はヘキサエチレングリコールから誘導されるスペーサーである。
【０４０８】
実施形態１９０は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログをさらに含む、実施形態１５２〜１８９のいずれか１つに記載の方法である。
【０４０９】
実施形態１９１は、脂質部分をオリゴヌクレオチド中に付着させることをさらに含む、実施形態１５２〜１９０に記載の方法である。
【０４１０】
実施形態１９２は、実施形態１９１の方法であり、ここで、前記脂質部分はコレステロールである。
【０４１１】
実施形態１９３は、実施形態１９１または１９２の方法であり、ここで、前記脂質部分はオリゴヌクレオチドの５’末端にまたはその近傍にある。
【０４１２】
実施形態１９４は、実施形態１５２に記載の方法であり、ここで、前記ＣｐＧモチーフは少なくとも４つのヌクレオチドを有するＣｐＧ配列エレメントを含む。
【０４１３】
実施形態１９５は、少なくとも２つのＣｐＧ配列エレメントを含む実施形態１９４に記載の方法である。
【０４１４】
実施形態１９６は、少なくとも３つのＣｐＧ配列エレメントを含む実施形態１９４または１９５に記載の方法である。
【０４１５】
実施形態１９７は、実施形態１９４〜１９６のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記ＣｐＧ配列エレメントはＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、ＴＣＧＣ、またはそれらのいずれかの組み合わせである。
【０４１６】
実施形態１９８は、オリゴヌクレオチドの３’末端上にトリチミンヌクレオチドランを挿入することをさらに含む、実施形態１５２に記載の方法である。
【０４１７】
実施形態１９９は、実施形態１９８に記載の方法であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドは配列番号２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、または２１５を含む。
【０４１８】
実施形態２００は、配列番号２５２を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。
【０４１９】
実施形態２０１は、５’コレステリル修飾をさらに含む実施形態２００のオリゴヌクレオチドである。
【０４２０】
実施形態２０２は、実施形態２０１に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、前記５’コレステリル修飾はトリエチレングリコールリンカーを含む。
【０４２１】
本開示の要素またはその好ましい実施形態を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「Ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は１つまたは複数の要素が存在することを意味することを意図し、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は包括的であることを意図し、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【０４２２】
上記に鑑みて、本開示のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が達成されることが分かるのであろう。
【０４２３】
本開示の範囲から逸脱することなく、上記の物および方法に様々な変更を加えることができるので、上記の説明に含まれるすべての事項は例示的なものとして解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではないことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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