(57)【要約】  本発明は、自己免疫疾患のための治療に関し、炎症を引き起こす自己抗体の除去を提供する。最も効率的な方法で疾患を標的とするために、ナノコンジュゲート複合体が提供され、これは、自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識される少なくとも１つの特異的抗原構成要素、少なくとも１つのヘルパー部分及び構成要素を連結させるナノ粒子担体を含む。治療用ナノコンジュゲート複合体の各構成要素は、特異的結合、血流中での安定した抗体−治療薬複合体の形成及びこの複合体の肝臓への迅速なクリアランスを促進するナノコンジュゲート複合体を生じさせる、特異的な機能を有する。
2021512093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成要素：
ｉ．自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識される少なくとも１つの自己免疫疾患特異的抗原、
ｉｉ．少なくとも１つのヘルパー部分及び
ｉｉｉ．構成要素ｉ、ｉｉを連結するナノ担体
を含むナノコンジュゲート複合体。
【請求項２】
次の一般構造Ｉ：
【化１】
2021512093.tif 000023
（式中、Ａはナノ担体であり；Ｈ、Ｈ１及びＨ２は１つ以上の異なるヘルパー部分であり；Ｄは、１つ以上の自己免疫疾患特異的抗原であり；Ｌｄ及びＬｈは、共有結合又は非共有結合での１つ以上の異なるリンク又はリンカーであり；ｎｈ、ｎｈ１及びｎｈ２は、Ａに対して攻撃されるヘルパー基の数であり；ｎｈ３は、他のヘルパー基に対して攻撃されるヘルパー基の数であり；ｎｄ２は、Ａに対して攻撃される抗原基の数であり；ｎｄ１は、ヘルパー基に対して攻撃される抗原基の数である）
のうち１つを有する、請求項１に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項３】
Ｈ、Ｈ１及びＨ２が独立して脂質部分、炭水化物部分及びポリマー部分又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１又は２に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項４】
Ａが、ＰＡＭＡＭ、ビス−ＭＰＡ−アジドデンドリマー、キトサン、プルラン、絹フィブロイン、ポリエチレンイミン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）及びポリ（メタクリル酸）、好ましくはキトサンなどの多糖類から選択される、請求項１〜３の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項５】
以下の構成要素：
ｉ．自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識される少なくとも１つの自己免疫疾患特異的抗原、
ｉｉ．少なくとも１つの炭水化物部分、
ｉｉｉ．少なくとも１つの脂質部分、
ｉｖ．少なくとも１つのポリマー及び
ｖ．構成要素ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ及びｉｖを連結するナノ担体
を含む、請求項１に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項６】
次の一般構造ＩＩ：
【化２】
2021512093.tif 000024
（式中、Ａは、ｎｂ脂質部分（Ｂ）、ｎｃ炭水化物部分（Ｃ）、ｎｄ自己免疫疾患特異的抗原部分（Ｄ）及びｎｅポリマー部分（Ｅ）が、それぞれ直接的なリンク又はリンカーＬｂ、Ｌｃ、Ｌｄ及びＬｅを通じて連結され；ｎｄが少なくとも１であり、ｎｂ、ｎｃ及びｎｅが１〜Ｎ−３の独立した整数であり、ｎａ＋ｎｃ＋ｎｄ＋ｎｅの合計が４〜共有若しくは非共有結合のためにＡにおいて利用可能な表面基Ｎの総数である、ナノ担体である）
を有する請求項５に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項７】
Ａが、ＰＡＭＡＭ、ビス−ＭＰＡ−アジドデンドリマー、キトサン、プルラン、絹フィブロイン、ポリエチレンイミン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）及びポリ（メタクリル酸）、好ましくはＰＡＭＡＭなどのデンドリマーから選択される、請求項５又は６に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項８】
前記脂質が、鎖長６以上の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖を含有する脂肪酸から選択される同じ又は異なる脂肪酸である、請求項１〜７の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項９】
前記脂質が、カプロン酸（ヘキサン酸）、エナント酸（ヘプタン酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸及びパルミチン酸から選択される脂肪酸である、請求項８に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項１０】
前記炭水化物が同じであるか又は異なり、キトサン、ヒアルロン酸及びプルランなどの多糖類；又はマンノース、ガラクトース、グルコサミンなどの単糖類若しくは二糖類及びそれらのオリゴマーから選択される、請求項１〜９の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項１１】
前記ポリマーが同じであるか又は異なり、ＰＥＧ、キトサン、プルラン及びヒト血清アルブミンから選択される、請求項１〜１０の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項１２】
前記抗原が同じであるか又は異なり、自己免疫疾患に関連するペプチド、リン脂質又はオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１〜１１の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項１３】
前記リンク又はリンカーが、前記抗原、炭化水素、脂質及びポリマー構成要素を前記担体に共有又は非共有結合することによって連結し、前記リンク又はリンカーが、同じであるか又は異なり、エーテル、エステル、ジスルフィド、アミド、１，２，３−トリアゾール、ＰＥＧ及び静電的相互作用から選択される１つ以上の官能基からなる、請求項１〜１２の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項１４】
前記自己免疫疾患が、ＳＬＥ関連疾患、ＣＫＤ、ＲＡ、乾癬、Ｔ１Ｄ、強皮症及びＭＳから選択される、請求項１〜１３の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項１５】
前記抗原が同じであるか又は異なり、配列番号１〜８及び１０から選択される、請求項１〜１４の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
ＳＬＥ関連疾患、ＣＫＤ、ＲＡ、乾癬、Ｔ１Ｄ強皮症及びＭＳから選択される自己免疫疾患を処置する際の使用のための、請求項１〜１５の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体。
【請求項１８】
ａ．段階ｂ〜ｅで示されるようにナノコンジュゲート複合体の構成要素全てを連結する際の使用のための骨格を提供し、
ｂ．少なくとも１つのポリマー構成要素を前記担体に連結し、
ｃ．少なくとも１つの特異的抗原構成要素を前記担体に連結し、
ｄ．少なくとも１つの脂質構成要素を前記担体に連結し、
ｅ．少なくとも１つの炭水化物構成要素を前記担体に連結する、
段階を含む、請求項５〜１５の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体を調製する方法。
【請求項１９】
ａ．請求項１〜１５の何れか１項に記載のナノコンジュゲート複合体又は請求項１６に記載の医薬組成物を提供し；
ｂ．前記ナノコンジュゲート複合体又は前記医薬組成物を前記自己免疫疾患に罹患している患者に投与する、
段階を含む、自己免疫疾患の処置の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の治療法に関し、治療用ナノ粒子を形成するユニークなナノコンジュゲート複合体内で提示される合成抗原の適用により、ヒト及び動物において炎症を引き起こす自己抗体を排除するための新しい方法を提供する。本治療薬は、ＳＬＥ、関節リウマチ及びＩ型糖尿病などの自己免疫疾患を引き起こす循環自己免疫抗体に特異的に結合してそれを除去する。
【背景技術】
【０００２】
抗原−抗体認識は、細菌、ウイルス及び癌から我々を守る、ヒトにおける重要な免疫防御である。しかし、自己免疫疾患がある場合、抗体が自分自身の細胞及び組織を攻撃し、それにより炎症、疼痛、長期にわたる障害の可能性が生じ、場合によっては死に至る。
【０００３】
自己免疫状態は、病原体を検出し、かわし、破壊する免疫系の機能が狂い、対象自身の臓器、組織及び細胞を攻撃する場合に発症する。世界の総人口のおよそ５％〜８％が自己免疫疾患に罹患している。自己免疫疾患の影響は、それにより影響を受ける臓器に依存しており、全身性自己免疫疾患では、複数の臓器が影響を受け得る。自己免疫疾患に対する既存の治療選択肢は不十分であり、自己免疫疾患の早期診断及び処置のための確かなツール及び技術が求められている。
【０００４】
自己免疫疾患の処置は、過度に活動的な免疫応答を制御し、炎症を抑えることを目的とする。これらの状態の処置のために使用される従来薬としては、抗炎症薬（イブプロフェン及びナプロキセンなど）及び免疫抑制薬が挙げられる。免疫応答を包括的に弱める免疫抑制薬に依存する自己免疫疾患に対する伝統的な治療薬は、疾患制御を維持するために高用量で長期間処置するものとして必要とされることが多く、それにより患者は、生命を脅かす日和見感染症及び悪性腫瘍の長期リスクの影響を受け易い状態に置かれる。さらに、これらの薬物の多くの利点は、毒性及び深刻な副作用プロファイルによって相殺される。従って、全身性免疫抑制のリスクを低下させ、忍容性を改善する、より特異的なストラテジーの開発が求められている。
【０００５】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
ＳＬＥは、主に女性で発症する結合組織の慢性的で炎症性の不定性自己免疫疾患であり、通常は発熱、皮膚の発疹、疲労及び関節痛を特徴とし、皮膚、筋肉及び骨、血管、腎臓、心臓、肺及び脳の障害を特徴とすることが多い。ＳＬＥの原因は明確ではないが、環境要因と一緒に遺伝的要因が関与すると考えられている。この機序には、対象自身の組織に対する自己抗体による免疫応答が含まれる。これらは最も一般的には抗核抗体であり、これらにより炎症が起こる。診断は困難であり得、症状及び臨床検査の組み合わせに基づく。円板状エリテマトーデス、新生児ループス及び亜急性皮膚エリテマトーデスを含む多くの他の種類のエリテマトーデスがある。関節リウマチとは異なり、ループス関節炎は障害がより少なく、通常は関節の重度の破壊を引き起こさない。
【０００６】
ＳＬＥの結果、様々な自己免疫抗体が産生され、抗体のうち＞４０％は核の構成要素、即ち核酸及びそれらの結合タンパク質：ＤＮＡ、ＲＮＡ、核タンパク質ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼなどに対するものであり、核、細胞質、細胞膜、リン脂質、血液細胞、神経系、血漿タンパク質、内皮細胞及びマトリクスタンパク質の抗原を攻撃する１８０種類前後の自己抗体がＳＬＥ患者において認識されている。アポトーシス細胞の破片は、ＳＬＥ患者における自己抗原の主な起源であると考えられる。ＳＬＥの病因は、炎症性サイトカインの産生による組織損傷及び病原自己抗体の産生につながる自己反応性Ｔ及びＢ細胞の異常な活性化による臓器損傷をもたらす異常な先天的系の応答によって開始されると考えられる。核抗原はアポトーシス細胞から放出され、Ｂリンパ球及びＴヘルパー細胞に対する提示のために樹状細胞及びＴリンパ球に沈着し、その後自然免疫細胞が活性化される。疾患進行及び力価上昇時に、抗ＤＮＡ抗体及び他の抗核抗体（ＡＮＡ）活性化Ｔ細胞及びＢ細胞が身体の患部に蓄積し、これが複数の臓器におけるさらなる炎症を促進し得、多くの場合、時間が経過すると慢性腎疾患（ＣＫＤ）となる。特に、ＣＫＤはＳＬＥ患者における最もよく見られる死因である。ＳＬＥは、２つと同じものはないため、非常に複雑且つ困難である。
【０００７】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、腎機能の進行性及び永久的な喪失がある状態である。ＳＬＥ（ループス腎炎）により引き起こされるＣＫＤは、ＳＬＥ下で産生される自己抗体が腎臓に到達し、糸球体腎炎、糸球体に沈着する自己抗体により引き起こされる腎臓のろ過ユニットの炎症；又は間質性腎炎、腎臓の尿細管及び周囲構造の炎症、につながる場合に起こる。ＳＬＥ患者のうち最大６０％がループス腎炎及びＣＫＤを発症する。抗ＤＮＡ抗体（ＡＮＡ）及び他のＡＮＡは、ＣＫＤ発症において主要な役割を果たすことが証明されている。腎臓が炎症を起こしているとき、それらは正常に機能し得ず、例えばタンパク質を漏出させる。制御されない場合、ループス腎炎は腎不全及び死亡につながり得る［Ｅｈｒｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４８（３）：７０５−１１．；Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（１）：１３７−４２］。
【０００８】
ＳＬＥなどの自己免疫疾患によって引き起こされるＣＫＤは、抗ｄｓＤＮＡ抗体及び他のＡＮＡの強い影響を伴う多因子障害である。それにもかかわらず、免疫系遺伝子によって産生される抗原は、最も保存された遺伝子の１つである。従って、動物モデル及び特にループスマウスモデルは、腎疾患を研究するために積極的に研究されている［Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌｓ．７（１−２）：１３−１９］。ループスの自然発症マウスモデルは、多数の感受性遺伝子領域の同定につながっており、そこから治療に対していくつかの候補遺伝子が出現している。一方、ループスの誘発モデルからは、ループスの病因における環境因子の役割及び自己免疫抗体に関連する腎不全への洞察がもたらされている。
【０００９】
核酸に対する抗体は、ＳＬＥで発生する複雑な自己免疫応答の一部にすぎない。特にＳＬＥでは、核ペプチド、タンパク質（即ちヒストン）及び酵素に対して幅広い範囲の抗体が産生されている。最近の研究から、ＳＬＥにおけるヒストンの合成類似体の臨床的関連性が示された［Ｍｕｌｌｅｒ  ２０１４．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），ｃｈａｐｔｅｒ  ２３，ｐ１９５−２０１，ＥＬＳＥＶＩＥＲ］。
【００１０】
関節リウマチ（ＲＡ）
今日、世界で１億人を超える人間が生涯続く関節リウマチ（ＲＡ）の診断を下されている。既存の治療薬はＲＡの症状を軽減させるが、これらはＲＡ患者の身体的障害を防ぐものではない。これは、既存の処置に対して明確な課題を提起し、代替アプローチ、例えば抗体及び合成ナノ材料、の開発を促す。
【００１１】
好中球はヒトにおいて最も豊富な白血球細胞である。およそ１０１１個の好中球が毎日産生され、これは全白血球のおよそ５０〜７０％を占める。新たに出現した証拠から、好中球もＲＡで以前に認識されていない役割を持っていることが示唆される［Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１０，ｐ．５９３−６０１（２０１４）］。例えば、免疫寛容の喪失においてネオエピトープとして作用し得るシトルリン化タンパク質は、好中球内で酵素的に産生される。ペプチド及びタンパク質におけるアルギニンのシトルリン化は、過去２０年間、自己免疫疾患のバイオマーカーとして広く研究されてきた（Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９  Ｊａｎ  ４；９：３０３３；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１８  Ｄｅｃ；７０（１２）：１９３３−１９４５；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１９  Ｆｅｂ；７１（２）：２１０−２２１）。
【化１】
2021512093.tif 000003
アルギニン、シトルリンの化学構造及び関節リウマチに関連するシトルリン化ペプチドの例。
【００１２】
ＲＡにおけるシトルリン化ペプチドに対して最も一般的に受け入れられている分子機序は、細胞損傷又は無秩序なアポトーシスから生じる改変抗原が、これらのペプチド又はタンパク質全体に対する自己抗体につながる免疫応答を引き起こし得るということである。シトルリン化ペプチドに対する自己反応性抗体（ＡＣＰＡ）はＲＡに関連する。ＡＣＰＡは、様々なシトルリン化抗原を認識する−その中でも特筆すべきは、シトルリン化α−エノラーゼ、ビメンチン、ＩＩ型コラーゲン、フィブリノーゲン及びヒストンである。特に、ＡＣＰＡはＲＡ発症の何年も前に検出され得、重度疾患の予測因子となる。これにより、シトルリン酸ペプチドは、標的を定めた薬物送達のための面白い研究対象となり、有用な診断ツールとなった。
【００１３】
診断及び治療への応用を目的として、より優れたシトルリン化エピトープを発見するためのペプチドライブラリを開発した。この１０年間にわたり、第２世代の環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ２）及び第３世代の環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ３）アッセイが開発された。エピトープの主な違いは別として、ＣＣＰ２及びＣＣＰ３は両者とも酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用する。しかし、殆どの研究から、ＣＣＰ２アッセイと比較してＣＣＰ３の明らかな改善は示されない。
【００１４】
乾癬性関節炎（ＰｓＡ）
乾癬性関節炎（ＰｓＡ）は、殆どの症例において関節炎に乾癬が付随する慢性炎症性疾患である。ＰｓＡの生物学的及び臨床的スペクトルは、関節リウマチ（例えば手の対称性関節炎、急性期タンパク質の上昇）又は脊椎関節症の一般的クラス（例えば指炎、腱付着部炎、仙腸関節炎）に共通の要素を示し得る。別の一般的な特性として、抗環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）抗体は、ＲＡ患者だけでなくＰｓＡ患者の血液試料でも検出可能である。
【００１５】
Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）
１型糖尿病は、膵臓のβ細胞の細胞性自己免疫破壊を特徴とする自己免疫障害であり、インスリン欠乏を引き起こす。Ｔ１Ｄの発症は他のタイプの糖尿病よりも速く、通常、若年成人、青年及び小児で診断される。Ｔ１Ｄの正確な原因は未だ不明であり、依然として未然に防ぐことはできない。しかし、Ｔ１Ｄは遺伝的及び環境的要因の相互作用の結果であるという合意がある。大部分のＴ１Ｄは、Ｔ細胞の細胞性自己免疫攻撃であり、β細胞及びインスリン産生の部分的且つ完全な喪失を引き起こす。糖尿病のおよそ５％〜１０％の症例がＴ１Ｄであると推定される。Ｔ１Ｄ患者は、生存のため、血中のグルコースレベルの量を維持するために定期的にインスリン投薬を受けるべきである。インスリン自己抗体及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗体のような様々な自己抗体は、自己免疫反応を示し得る。β細胞の破壊を伴う膵臓における内分泌組織の炎症は、前糖尿病及び真性糖尿病を引き起こす。さらに、患者は、グラビス（Ｇｒａｖｉｓ）、アジソン病、セリアック病など、他の自己免疫疾患にも罹患し易い。ゲノムワイド関連研究及びメタ分析から、４０前後の遺伝子座がＴ１Ｄに関連することが示され、主要組織適合性領域における遺伝子座はＴ１Ｄを発症する可能性がより高い。分子模倣、寛容性の喪失及びサイトカイン誘発性損傷を含むβ細胞が介在する自己免疫を説明するために、過去数年間に様々な理論が提案されてきた。
【００１６】
多発性硬化症（ＭＳ）
ＭＳは、脳及び脊髄中の神経細胞の絶縁カバーが損傷を受けている脱髄性疾患である。［１］この損傷は、神経系の一部のコミュニケーション能力を混乱させ、その結果、身体的、精神的及び時には精神医学的問題を含む、一連の徴候及び症状を引き起こす。ＭＳは、中枢神経系に影響を与える最も一般的な免疫介在性障害である。
【００１７】
強皮症
強皮症は、皮膚線維症を特徴とする慢性疾患であり、２つの臨床実体：局在性強皮症及び全身性硬化症に分けられる。自己免疫抗体が疾患に関与していることが認識されている。
【００１８】
ナノ粒子（ＮＰ）ナノ粒子様ポリマー性ナノ粒子、ミクロスフェア、ウイルス性ナノ粒子、シリカナノ粒子、リポソーム、多糖類、デンドリマー及びカーボンナノチューブは、関心のある適切な部位に薬物を送達するために広く使用される。リポソーム低安定性及び低特異性及びポリマーの多分散性により、リポソーム及びポリマー系への注目度が低下した。しかし、デンドリマー及び多糖類は、ナノ治療技術に対する新規ストラテジーで使用される可能性がある。
【００１９】
活性部位を含有する多価表面を持つデンドリマーの球状超分岐構造及びデンドリマー中にデンドロンが連結されたコアにより、多岐にわたる修飾が可能になり、それにより、これは生物学、ナノテクノロジー及び治療用の薬における新規アプローチの１つになる。中心コア分子（アンモニア、エチレンジアミン及びポリジアミン又はベンゼントリカルボン酸クロリド）からの分岐点の数は、ナノメートルに到達し得るデンドリマーの長さ及び生成を決定し、精密に設計された巨大分子として使用され得る（Ｋｅｓｈａｒｗａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏ．３９（２０１４）ｐ．２６８−３０７）。ＰＡＭＡＭ（ポリアミドアミン）、ＰＰＩ（ポリプロピレンイミン）、ＤＡＢ（ジアミノブチル）、亜リン酸に基づくデンドリマー、カルボシランデンドリマー、ポリリジンデンドリマー及びＪａｎｕｓデンドリマーと呼ばれる新しいクラスのデンドリマーのような様々なデンドリマーは、複数の薬物及び標的指向化部分を結合させ、それにより、送達系及び薬物封入が可能になるということにおいてその卓越した特性により多くの注目を集めている。広く普及しているデンドリマーファミリーの中でも、ＰＡＭＡＭは他のデンドリマーファミリーよりも生体適合性が高いため、特徴が最もよく分かっており、最初に商品化されている。ＰＡＭＡＭは、様々な薬物の溶解度を高める表面上の活性アミン基を含む多数の分岐を持つ、詳細に明らかとなっている構造を有する。球状タンパク質のようなＰＡＭＡＭのユニークな特性並びにその機能性と併せて合成の費用効果が高いことにより、薬物開発、ナノテクノロジー及び治療法における有望な候補の１つとなった。
【００２０】
ＰＡＭＡＭ
ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）は、そのエチレンジアミンコア並びにアクリル酸メチル及びエチレンジアミンからなる分岐により様々な生物医学的応用において強力な位置を占める。ＰＡＭＡＭデンドリマーの表面上にあるアミノ基の数は４から１２８に指数関数的に増加し、Ｇ０からＧ５の世代サイズ（図１）及び機能的アミノ基は、特定の標的における薬物送達のためにデンドリマーを設計するために使用され得る。様々な薬物送達用途におけるその明確に定義された特性を持つ多数の適応性にもかかわらず、デンドリマーには、迅速な全身クリアランス及びその陽イオン基による毒性及び薬物放出の困難性を含むある種の制限がある。多数のアミノ基及びカルボキシル基が存在することにより、陽イオン性ＰＡＭＡＭと陰イオン性の細胞膜との間に強い相互作用が起こり、それにより膜の破壊及び毒性が生じるが、これはその使用において大きなハードルである。正荷電ＰＡＭＡＭの表面修飾は、これらの欠点を克服するための可能性のある解決策である。デンドリマーの表面は、毒性を低下させ、封入を強化し、その薬物送達能に影響を与えることなく生体適合性を改善するように修飾される。ＰＥＧ化、アセチル化、炭水化物コンジュゲーション、ペプチドコンジュゲーション、ＤＮＡ／遺伝子コンジュゲーション、中性ヒドロキシル、アセチル又は負荷電カルボキシル基、抗体コンジュゲーション、葉酸コンジュゲーションなどの中性又は陰イオン基によってＰＡＭＡＭデンドリマーの陽イオン基を中和するために様々なストラテジーが提案されている。これらの可能性の中で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＰＡＭＡＭデンドリマーとの結合に広く使用される。ＰＥＧは不活性、非免疫原性及び非抗原性分子であり、ＰＥＧ化は最も効果的であり最も容易なアプローチの１つである。ＰＥＧ化ＰＡＭＡＭ薬物送達系は、前述のデンドリマーの制限を克服するのに役立ち、ＰＥＧ分子の顕著な水溶性により疎水性薬物の可溶性が改善され、薬物送達系の能力が向上する（Ｌｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，Ｖｏｌ．４３（２０１６）ｐ．１４−２９）。
【００２１】
キトサン
キトサン（ＣＳ）は、ランダムに分布するβ−（１→４）−連結Ｄ−グルコサミン（脱アセチル化単位）及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化ユニット）から構成される、天然の水溶性及び生体接着性の直線状の多糖である。ヒアルロン酸（ＨＡ）は、結合組織、上皮組織及び神経組織全体に広く分布する陰イオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。キトサン／ヒアルロン酸コンジュゲート（ＣＳ−ＨＡ）ナノ粒子は、ＣＤ４４などのＨＡ受容体を過剰発現する細胞にＲＮＡ／ＤＮＡカーゴを送達可能であることが示されている（Ｌａｌｌａｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．Ｖｏｌ．１４（２０１７）ｐ．２４２２−２４３６）。
【００２２】
先行技術
米国特許出願公開第２０１５１１８１８３号明細書は、（例えばアジュバントとしての使用のため）担体として陽イオン性又はポリ陽イオン性化合物（例えばペプチド、タンパク質又はポリマー）を、及びカーゴとして少なくとも１つの核酸（分子）及び感染性疾患と関連がある病原体からの抗原；アレルギー若しくはアレルギー性疾患と関連がある抗原；自己免疫疾患と関連がある抗原；又は癌若しくは腫瘍疾患と関連がある抗原から選択される少なくとも１つの抗原を含む複合体を含む（負荷電）核酸を含む医薬組成物を開示する。本医薬組成物は、前記抗原に対する適応免疫応答の誘発を可能にする。
【００２３】
米国特許第９７４４２４１号明細書は、ヒアルロン酸−核酸複合体の使用による遺伝子サイレンシングなどの遺伝子治療を開示する。
【００２４】
国際公開第０７／１００６９９号パンフレットは、生分解性ポリマーをさらに含む微粒子を含む免疫原性組成物を開示する。微粒子組成物はまた、陽イオン性多糖、並びに抗原、免疫アジュバント及びそれらの組み合わせから選択される免疫種も含む。
【００２５】
国際公開第１２／０２４５３０号パンフレットは、例えば、治療用ペプチド又はタンパク質の送達、例えば、癌、炎症性障害、自己免疫障害、心血管疾患又は他の障害の処置において使用され得る粒子を開示する。粒子は、一般に、親水性−疎水性ポリマー（例えば、ジブロック又はトリブロックコポリマー）及び治療用ペプチド又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、疎水性ポリマー又は界面活性剤も含む。一般に、治療用ペプチドは、ポリマー、例えば親水性−疎水性ポリマー又は、存在する場合は疎水性ポリマーに連結される。
【発明の概要】
【００２６】
本発明は、自己免疫疾患のヒト及び動物における循環系から炎症性自己抗体を標的とし、除去することにより、自己免疫疾患の直接的処置における満たされていないニーズに対処する。具体的には、自己免疫疾患の原因及び進行に関与する自己ＤＮＡ及びペプチドに対する自己抗体は、ユニークなナノコンジュゲート複合体からなる本ナノ粒子により標的とされる。このアプローチは、特定のサブタイプの抗体に限定されず；自己免疫応答に関与する全てのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡ）を標的とし、除去し得る。
【００２７】
一般的な原理として、本発明は、循環自己抗体を標的とし、循環から排除し、さらなる炎症反応を妨げるように、官能化可溶性ナノ粒子の表面上に提示される自己免疫特異的抗原を含むナノコンジュゲート複合体を提供する。治療処置のための細胞へのアンチセンスヌクレオチド及び生物学的又は化学的薬物などの生物活性剤の送達のためのナノ粒子の以前開示された使用とは対照的に、本コンジュゲートは、自己免疫疾患の炎症過程に関与する循環自己抗体を標的とし、保持し、排除するために循環中にとどまるように官能化される。ナノ粒子は、循環から排除されるまで、抗原及び抗原−抗体複合体に対する担体として見られ得る。治療的使用のためのこのようなナノ粒子及びカーゴの担体又はトランスポーターは、上で論じたように、当技術分野で公知である。しかし、本発明によれば、ナノ粒子は、サイズ、溶解度及びその後のクリアランスのための特定臓器への輸送など、所望の特性を示すために、コンジュゲートに官能基を付加する様々なヘルパー部分で装飾され得る。
【００２８】
本発明のナノコンジュゲートの重要な特性は、それ自体は患者に対して毒性がないことである。荷電表面基の遮断とともに約１００〜約５００ｎｍのナノサイズ粒子を使用すると、細胞膜にわたる粒子の取り込みが非常に制限され、従って毒性が低下する。別の重要な特性は、使用する自己抗体特異的抗原を含め、ナノコンジュゲートは、患者自身では抗原性がないことである。これは、結合され、部分的に埋め込まれた自己抗原又は自己抗原模倣物による、（自己）免疫反応の誘導又は維持を消滅させる粒子によって達成される。
【００２９】
その最も広い態様では、本発明は、以下の構成要素：
ｉ．自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識される少なくとも１つの特異的抗原、
ｉｉ．少なくとも１つのヘルパー物質／部分及び
ｉｉｉ．構成要素ｉ及びｉｉに対するナノ粒子担体
を含むナノコンジュゲート複合体を提供し、
ここで、構成要素ｉ及びｉｉのそれぞれは、独立して、同じ構成要素又は異なる構成要素である。
【００３０】
本発明の一実施形態では、抗原（単数又は複数）及びヘルパー部分（単数又は複数）が共有結合及び／又は非共有結合によってナノ粒子担体に独立して直接連結される、ナノコンジュゲート複合体が提供される。
【００３１】
ナノコンジュゲート複合体は、以下の一般構造ＧＳにより例示され得る：
【化２】
2021512093.tif 000004
（図中、Ａはナノ粒子担体であり、それにｎｄ疾患特異的抗原部分（Ｄ）及びｎｈ表面修飾ヘルパー部分（Ｈ）が、それぞれ直接的リンク又はリンカーＬｄ及びＬｈを通じて連結され；ｎｄ及びｎｈは１〜Ｎ−１の独立した整数であり、ｎｄ及びｎｈの合計は２〜共有結合又は非共有結合に対するＡにおいて利用可能な表面基の総数Ｎであり；Ｈは、１つ以上の異なる表面修飾ヘルパー部分である）。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、ナノコンジュゲート複合体が提供され、抗原（１つ又は複数）は、共有結合又は非共有結合によってヘルパー部分Ｈ１に連結され、場合によっては他のヘルパー部分Ｈ２が独立に、共有若しくは非共有結合により、ナノ粒子担体に直接、及び／又はヘルパー部分Ｈ１を介して連結される。
【００３３】
この実施形態では、Ｄはヘルパー部分Ｈ／Ｈ１を介してＡに連結される。Ａは、場合によってはｎｈ２の他のヘルパー部分Ｈ２を含み、ＤはＬｈによってＡに直接連結されない。各Ｈ１におけるＤの数（ｎｄ１）は、０〜Ｄへの共役又は非共役結合に対するＨ１における利用可能な結合基である。ナノコンジュゲート複合体は、少なくとも１つのＤを含む。Ｈ１は、リンク／リンカーＬｈを介してｎｈ３ヘルパー部分Ｈ２をさらに連結し得る。
【化３】
2021512093.tif 000005
【００３４】
本発明のこの態様のナノコンジュゲート複合体は、ナノコンジュゲート複合体が血流中で可溶性であり、大きすぎて細胞膜を通過できないことを確実にする担体Ａの表面上に集められる異なる官能基Ｈ及びＤの複合体からなり、少なくとも１つの抗原（免疫原性ではないため防御的に）を提示し、循環自己抗体に選択的に結合可能であり、対象／患者にとって忍容でき（無毒性及び非免疫原性）、対象／患者において血流から自己抗体−ナノコンジュゲート複合体を輸送、除去及び枯渇させることが可能である。
【００３５】
好ましい実施形態では、Ａはキトサン若しくはプルランなどの多糖；又は絹フィブロイン若しくはヒト血清アルブミンなどのポリペプチドであり、Ｈ／Ｈ１は、ヒアルロン酸（ＨＡ）などの多糖類又はポリエチレングリコールなどのポリマー又はＰＥＧ化ＨＡなどの２つ以上の異なるＨのコンジュゲートである。
【００３６】
別の特定の態様では、本発明は、以下の構成要素：
ｉ．自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識される少なくとも１つの特異的抗原、
ｉｉ．少なくとも１つの炭水化物部分、
ｉｉｉ．少なくとも１つの脂質部分、
ｉｖ．少なくとも１つのポリマー部分及び
ｖ．構成要素ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ及びｉｖに対するナノ粒子担体
を含むナノコンジュゲート複合体を提供し、
ここで、個々に構成要素ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ及びｉｖのそれぞれは、独立して、同じ構成要素又は異なる構成要素である。
【００３７】
ナノコンジュゲート複合体は、次の一般構造ＩＩ：
【化４】
2021512093.tif 000006
（図中、Ａは、ｎｂ脂質部分（Ｂ）、ｎｃ炭水化物部分（Ｃ）、ｎｄ疾患特異的抗原部分（Ｄ）及びｎｅポリマー部分（Ｅ）が、それぞれ直接的なリンク又はリンカーＬｂ、Ｌｃ、Ｌｄ及びＬｅを通じて連結され；ｎｄが少なくとも１であり、ｎｂ、ｎｃ及びｎｅが１〜Ｘ−３の独立した整数であり、ｎａ＋ｎｃ＋ｎｄ＋ｎｅの合計が４〜共有若しくは非共有結合のためにＡにおいて利用可能な表面基Ｘの総数である、ナノポリマー性担体である）により例示され得る。
【００３８】
本発明のこの態様のナノコンジュゲート複合体は、ナノコンジュゲート複合体が血流中で可溶性であり、細胞膜を通過しないように十分に大きいことを確実にする担体Ａの表面上に集められる異なる官能基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの複合体からなり、少なくとも１つの抗原（防御的）を提示し、循環自己抗体に選択的に結合可能であり、対象／患者にとって忍容でき（無毒性及び非免疫原性）、対象／患者において血流から自己抗体−ナノコンジュゲート複合体を輸送、除去及び枯渇させることが可能である。
【００３９】
好ましい実施形態では、Ａは、ＰＡＭＡＭ、ＰＮＩＭＡＭなどの合成ポリマーである。別の実施形態では、Ａはキトサンなどの天然ポリマーである。
【００４０】
Ａは、ナノ粒子及び抗原の担体（トランスポーター）及び１つ以上の異なる他の官能基である。それは、心血管系における最適な輸送及び長い生存のためにナノサイズであり、好ましくは表面上に多くの活性部位を有する球状の形態であり、好ましくは天然有機ポリマー又は合成有機ポリマーの何れかである有機ポリマーである。ナノ粒子は、シリカ若しくは金などの無機粒子又は他の適切な無機担体でもあり得る。
【００４１】
天然有機ポリマーは当技術分野で公知であり、キトサン及びプルランなどの多糖類；絹フィブロイン及びヒト血清アルブミンなどのポリペプチド；リポソーム、リポプレックス；又は様々な化学組成の高分子ミセルを含む。
【００４２】
合成有機ポリマーは当技術分野で公知であり、デンドリマー及び同様の炭素に基づくポリマー構造を含む。デンドリマーは３次元の超分岐球状ナノポリマー構造を有し、薬物送達の分野で他の担体系を超える大きな可能性がある。これは、３つの構造ユニット、コア、分岐ユニット及びいくつかの末端基からなる。末端基（表面基）は正、負又は中性の電荷を保持し得、これらは薬物の輸送及び送達での使用に不可欠である。成長するポリマーに付加される分岐単位の各層は「世代」と呼ばれ、多くのデンドリマーが最大７又は８世代（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４など）で産生されている。ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、直鎖又は分岐ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ビス−ＭＰＡ−アジドデンドリマー、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）などの陽イオン性デンドリマーは、負荷電ＤＮＡと複合体を形成し得、デンドリマー上の正電荷は、負荷電分子及び生体細胞膜などの構造との相互作用を促進し、これが、細胞内のＤＮＡ及び薬物送達が可能なデンドリマーにつながる。しかし、細胞膜相互作用は、細胞毒性、溶血などにつながり得る。このような負の特性は、炭水化物、ＰＥＧ、アセタートなどの様々な薬剤によるデンドリマーの表面修飾によって克服し得る。（Ｋｅｓｈａｒｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３９（２０１４）ｐｐ．２６８−３０７；Ｌｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，Ｖｏｌ．４３（２０１６）ｐｐ．１４−２９）。カルボシランデンドリマーは陰イオン性である。デンドリマーは、分岐アプローチ又は収束アプローチの何れかによって合成され、形成される。陰イオン性ポリマーの例は、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）である。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡ）は、低温では水溶性であるが、より高温では非極性のポリマーである。
【００４３】
Ｂは、クリアランス及び／又は食作用のために、ナノ粒子に正しい標的組織を標的とさせることを確実にする１つ以上の異なる脂質である。脂質の例は、７個以上の炭素原子の鎖長を有する直鎖又は分岐鎖を含有する脂肪酸から選択される脂肪酸である。好ましい実施形態では、脂質は、カプロン酸（ヘキサン酸）、エナント酸（ヘプタン酸）又はアシッドエナンチック（ａｃｉｄｅｎａｎｔｈｉｃ）（ヘプタン）酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸及びパルミチン酸から選択される１つ以上の脂肪酸である。好ましくは、Ｂは、ヘキサン酸又はヘプタン酸などの単一脂質である。
【００４４】
Ｃは、血流中に存在する時間を延長させるために、特に脂質が連結される場合、複合体の溶解度を向上させる、及びクリアランス及び／又は食作用のために標的組織への到達において複合体を助ける１つ以上の様々な炭水化物である。炭水化物は天然又は合成であり得る。炭水化物は、誘導体化された天然炭水化物であり得る。特定の実施形態において、炭水化物は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、リボース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、セルビオース、マンノース、キシロース、アラビノース、グルクロン酸（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ガラクトロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン（ｇａｌａｔｏｓａｍｉｎｅ）及びノイラミン酸を含むが限定されない単糖又は二糖類を含む。特定の実施形態において、炭水化物は、プルラン、セルロース、マクロクリスタリンセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシセルロース（ＨＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、デキストラン、シクロデキストラン、グリコーゲン、ヒドロキシエチルデンプン、カラギーナン、グリコン、アミロース、キトサン、カルボキシルメチルキトサン、アルギン及びアルギン酸、デンプン、キチン、イヌリン、コンニャク、グルコマンナン、プスツラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、カードラン及びキサンタンを含むが限定されない多糖類である。好ましい例は、マンノース、ガラクトース、グルコサミン及びそれらのオリゴマーである。好ましい実施形態では、炭水化物は、ガラクトース、グルコサミン及びマンノースから選択される。
【００４５】
Ｄは、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びリン脂質から選択される１つ以上の自己免疫疾患特異的抗原である。
【００４６】
Ｅは、存在する場合は炭水化物部分とともに、心血管系における複合体の溶解性及び安定性を確実にする１つ以上の異なるポリマーである。ポリマーの重要な特性は、ナノ粒子担体上の荷電表面基の少なくとも一部を「遮断」すること及び、好ましくはナノ粒子が消されるまで、血流中で循環時間が延びるように、ナノ粒子複合体が細胞膜を横断するのを防ぐことである。ポリマーの例は、キトサン又はプルランなどの多糖類（α−１，４−；α−１，６−グルカンとしても知られる、マルトトリオース単位からなる水溶性多糖ポリマー）；グリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸、ウロン糖（グルクロン酸又はイズロン酸）又はガラクトースとともにアミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）からなる反復二糖単位からなる高極性の長い非分岐多糖の群に属する、陰イオン性、非硫酸化グリコサミノグリカンなど；ポリペプチド、例えば絹フィブロイン又はヒト血清アルブミンなど；ポリアルキレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などである。ポリマー自体が官能性表面基を含有する場合、これらは、例えばＰＥＧなどの「不活性」ブロッキング基の使用により遮断され得るか、又は化学的に（例えば脱アセチル化により）不活性化し得る。ポリマーはまた、球状ポリマー構造又は構築物を作製するために、及び／又は官能性表面基を不活性化するために必要な場合、当技術分野で公知の架橋剤の使用によって架橋することもできる。
【００４７】
本発明の一実施形態では、ナノコンジュゲート複合体の特異的抗原は同じであるか又は異なり、ＳＬＥ及び特に自己免疫性腎疾患ＣＫＤに関連するペプチド及びオリゴヌクレオチドから選択される。好ましい実施形態では、特異的抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、ナノコンジュゲート複合体の特異的抗原は同じであるか又は異なり、ＲＡ、関節リウマチに関連するペプチド及びオリゴヌクレオチドから選択される。好ましい実施形態では、特異的な抗原は配列番号１０である。
【００４９】
さらなる実施形態では、抗原及び他の表面置換基をナノコンジュゲート複合体のナノ粒子担体に連結するリンク又はリンカーは、エーテル、エステル、ジスルフィド、アミド、１，２，３−トリアゾール、ＰＥＧ及び静電的相互作用から選択される１つ以上の官能基からなり、同じであるか又は異なる。好ましい実施形態では、置換基の１つ以上が、２つの化合物の共有結合のための一般的な既知の技術であるクリック化学によって担体に連結される。
【００５０】
ナノコンジュゲートの代替的な構造では、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥユニットの２つ、３つ又は４つを１つのユニットで一緒に連結し、骨格担体Ａにさらに連結し得る。
【００５１】
本発明の別の態様は：
ａ．何らかの順序で段階ｂ〜ｅにおいて示されるようにナノコンジュゲート複合体の構成要素全てを連結する際の使用のためにナノ粒子担体を提供し、
ｂ．少なくとも１つのポリマー構成要素を担体に連結し、
ｃ．少なくとも１つの特異的抗原構成要素を担体に連結し、
ｄ．場合によっては、少なくとも１つの脂質構成要素を担体に連結し、
ｅ．場合によっては、少なくとも１つの炭水化物構成要素を担体に連結する、
段階を含む、本発明のナノコンジュゲート複合体を調製するための方法を提供する。
【００５２】
本発明のナノコンジュゲート複合体は、自己免疫疾患の処置に使用し得る。自己免疫疾患は、複合体での使用のために抗原が同定されているか又は同定され得る何らかの自己免疫疾患から選択される。自己免疫疾患の例は、ＣＫＤを含むＳＬＥ；ＲＡ；Ｔ１Ｄ；乾癬；血管炎；潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；多発性硬化症（ＭＳ）；ギランバレー症候群；グレーブス病；橋本甲状腺炎及び重症筋無力症である。
【００５３】
本発明の一態様では、薬学的に許容可能な添加剤又は賦形剤と一緒にナノコンジュゲート複合体を含む医薬組成物、並びにこれらの段階を含む、患者の自己免疫性腎疾患の処置のための方法が提供される。
【００５４】
次の段階を含む、自己免疫性腎疾患の処置の方法：
ａ．自己免疫疾患に関連する抗原を含む本発明によるナノコンジュゲート複合体又は医薬組成物を提供すること；及び
ｂ．前記ナノコンジュゲート複合体又は前記医薬組成物を前記自己免疫疾患に罹患している患者に投与すること。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ｇ０、Ｇ１及びＧ２の指数的分岐を例示するＰＡＭＡＭの構造。
【図２】合成されたナノコンジュゲート複合体１〜１０の例示。Ｒ＝ＰＡＭＡＭ  Ｇ５は、全ての合成されたナノコンジュゲート複合体に対する担体及び骨格である。この骨格は、炭水化物、脂質、ポリマー及び抗原構成要素に対する利用可能な付着部位に相当する１２８個の表面基を提供する。故に、４個の構成要素のそれぞれは、理論的には１〜１２５コピーにおいて存在し得るが、一方で全ての構成要素の合計は１２８を超え得ない。
【図３】脂質及び炭水化物の様々な比率でカップリングしたＰＡＭＡＭ（Ｇ５）−ＰＥＧの溶解度。
【図４】ＬＰＳ混入試験。右側（ＬＰＳ標準）でのゲル化は、グルコサミンコンジュゲート（プレートの左側）に対しては見られない。
【図５】補体活性化試験：健常対照（患者番号６〜１０）及び腎臓疾患の患者（患者番号１〜５）におけるＥＣ４ｄレベル。
【図６】インビボでのナノコンジュゲート複合体１の治療効果。対照＝ゲンタマイシン。
【図７】ナノコンジュゲート複合体１、６、７、８、９及び１０の添加時の細胞生存率。
【図８】Ａ）ｖナノコンジュゲート複合体処置及びＨＱ対照処置マウスに対するＳＬＥＤＡＩ（ＳＬＥ疾患活動性指数）をそれぞれ白丸及び黒丸で示す。Ｂ）健常マウスにおけるＣＳ−ＨＡ−ＰＥＧ５０００−Ｄ１対照。
【図９】シトルリン化ペプチド抗原ＰＥＰ１−ＰＥＰ２５（配列番号９〜３３）のＥＬＩＳＡスクリーニング；３０名のＲＡ患者、３０名の対応する健常対照者及び３０名の全身性エリテマトーデス患者のコホート。
【図１０】キトサン／ヒアルロン酸／ＰＥＧ／ＰＥＰ２ナノコンジュゲートのＮａｎｏｓｉｇｈｔ実験：サイズ分布データ及び最大粒子数のサイズ。Ａ）ＣＨ／ＨＡ対照、Ｂ）ペプチドの共有結合、Ｃ）ペプチドの非共有結合。
【図１１】キトサン／ヒアルロン酸／ＰＥＧ／ＰＥＰ２ナノコンジュゲートの走査型電子顕微鏡データ  Ａ）ペプチドの共有結合：平均ナノ粒子サイズは１００〜３００ｎｍである。Ｂ）ペプチドの非共有結合：平均ナノ粒子サイズは５２０ｎｍである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
定義
「自己免疫疾患」とは、免疫系が、感染症と闘う代わりに身体のそれ自身の組織を攻撃する自己抗体を産生する状態である。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「自己免疫性腎疾患」という用語は、自己抗体によって引き起こされる慢性腎疾患を意味する。
【００５８】
「ＣＫＤ」は、腎機能の進行性の喪失がある状態である慢性腎疾患を意味する。
【００５９】
「ＳＬＥ」は全身性エリテマトーデスを意味し；これは、ＣＫＤを引き起こし得る自己免疫疾患の例である。
【００６０】
「Ｔ１Ｄ」は、ＣＫＤを引き起こし得る自己免疫疾患の別の例である１型糖尿病を意味する。
【００６１】
「ＲＡ」は関節リウマチを意味する。
【００６２】
「ＭＳ」は多発性硬化症を意味する。
【００６３】
「自己抗体」は、個体自身の組織に対して免疫系によって産生される抗体である。
【００６４】
「ＡＮＡ」は、細胞核の内容物に結合する自己抗体である抗核抗体を意味する。
【００６５】
「抗ｄｓＤＮＡ（ａ−ｄｓ−ＤＮＡ）抗体」はＡＮＡの群であり、その標的抗原は二本鎖ＤＮＡである。
【００６６】
「抗ヒストン抗体」は、ＡＮＡのサブセットである自己抗体であり；それらはヌクレオソームのタンパク質構成要素、即ち転写的に不活性なクロマチンのサブ構造を形成するＤＮＡ−タンパク質複合体を標的とする。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「ナノコンジュゲート複合体」（ただ「ナノコンジュゲート」又は単に「コンジュゲート」又はナノ担体複合体とも呼ばれる）という用語は、少なくとも１つの特異的抗原、少なくとも１つのヘルパー部分及びナノ粒子担体を含む分子として定義する。このようなナノコンジュゲート複合体は、（ｉ）少なくとも１つの抗原、（ｉｉ）少なくとも１つの炭水化物、（ｉｉｉ）少なくとも１つの脂質、（ｉｖ）少なくとも１つのポリマー及び（ｖ）構成要素ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ及びｉｖを連結する骨格を含み得る。１つのナノコンジュゲート複合体は、必要に応じて、抗原及びヘルパー部分の構成要素のそれぞれのうち複数を含み得、唯一の制限は、構成要素の連結のための骨格における利用可能な表面基／官能基の数である。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「骨格」という用語は、ナノコンジュゲート複合体の構成要素を連結する分子である。また、これは、ナノ粒子担体又は単にナノ担体とも呼ばれる。骨格は、心血管系における１つ又は複数の抗原の担体及びトランスポーターとして機能する。
【００６９】
「ヘルパー部分」という用語は、例えば血流中での複合体の溶解度に寄与し、複合体が細胞膜を通過しないことを確実にすることなどによって、血流から自己抗体を除去するナノコンジュゲート複合体の機能を確実にすることを助ける分子を広く指す。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「連結部位」という用語は、ナノコンジュゲート複合体の異なる構成要素（抗原、炭水化物、脂質、ポリマー）がリンク又はリンカーによって骨格に連結され得る骨格上の部位を意味する。
【００７１】
「ＰＡＭＡＭ」ポリ（アミドアミン）は、骨格構成要素の例である。これは、アミド及びアミン官能基の繰り返し分岐したサブユニットからできたデンドリマーのクラスである。ＰＡＭＡＭは全体的に球状の形態であり、それぞれが外方向に「層」、即ち世代を持ち、指数関数的に増加する分岐点及び発生し得る官能基を含有する、樹状の分岐からなる内部分子構造という特徴を示す。
【００７２】
「ＨＳＡ」という用語は、ヒト血液中で見られる血清アルブミンであるヒト血清アルブミンを意味する。
【００７３】
「抗原」は、抗体に特異的に結合する構造分子である。本発明において、抗原は、ＳＬＥ関連疾患、ＣＫＤ、ＲＡ、乾癬、Ｔ１Ｄ、強皮症及びＭＳを有する患者に存在する自己抗体などの自己抗体によって認識される。本明細書中で使用される場合の抗原は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、それらの組み合わせ及び化学的類似体であり得る。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「ペプチド」という用語は、鎖長に明確な制限がないペプチド結合により一列に並べられたアミノ酸モノマーの鎖を意味する。
【００７５】
ポリペプチド及びタンパク質という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００７６】
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、鎖長に明確な制限はない。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列などの核酸の鎖である。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列など、実質的に等しい長さの２つの配列間の相同性の度合いの定量的尺度を示す。比較しようとする２つの配列は、ギャップの挿入又は或いはタンパク質配列の末端での短縮化により、可能な限り最適なフィットを与えるようにアライメントを行わなければならない。配列同一性は、（（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）１００）／（Ｎｒｅｆ）として計算し得る（式中、Ｎｄｉｆは、アライメントを行ったときの２つの配列の非同一残基の総数であり、Ｎｒｅｆは、配列の一方における残基の数である）。或いは、配列同一性は、ＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴＰプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８））（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）によって計算され得る。アライメントは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で利用可能なＴｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  １９９４に記載のような初期設定のパラメータを使用したＣｌｕｓｔａｌＷなどの配列アライメント法で実行され得る。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「炭水化物」という用語は、糖類並びにアミノ糖などの糖誘導体を意味する。糖類は、単糖、二糖、多糖又はオリゴ糖であり得る。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸、炭素原子数の明確な制限のない直鎖又は分岐脂肪族鎖を意味する。
【００８０】
本文脈において、ナノコンジュゲート複合体の構成要素としての「ポリマー」という用語は、体液中のナノコンジュゲート複合体の安定性並びに自己抗体に対する抗原提示を確実にする特定のサイズのかさばった分子を意味する。
【００８１】
「ＰＥＧ」は、ポリエーテル化合物であるポリエチレングリコールを意味する。ＰＥＧは、エチレンオキシドの重合により調製され、一般式Ｃ２ｎＨ４ｎ＋２Ｏｎ＋１の広範囲の分子を含む（式中、ｎは１〜１０００又はそれよりかなり大きいものであり得る）。
【００８２】
「リンク」又は「リンカー」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、ナノコンジュゲート複合体の骨格と抗原、炭水化物、脂質及びポリマー構成要素との間の連結を示す。より具体的には、リンカーは、エーテル、エステル、ジスルフィド、アミド、１，２，３−トリアゾール又はＰＥＧから選択される１つ以上の官能基を含み得る。共有結合はクリック化学によって形成され得る。或いは、リンクは、静電相互作用などの非共有結合であり得る。
【００８３】
「発熱性」とは、発熱を引き起こす能力である。
【００８４】
本発明は、ヒト又はイヌ、ネコ、ウマなどの動物などの対象における自己抗体によって引き起こされる自己免疫疾患に対する治療法に関する。最も効率的な方法で疾患を標的とするために、多成分原理が適用される。これは、本発明で開示される治療用ナノコンジュゲート複合体の各成分が特定の機能を有することを意味する。
【００８５】
本発明は、代替的に、本文脈で自己免疫腎疾患、ＲＡ、Ｔ１Ｄ、乾癬、硬化症、シェーグレン症候群など、とも呼ばれる、自己抗体によって引き起こされるＣＫＤを含む、ＳＬＥの異なる徴候から選択される自己免疫疾患の処置のための治療法に関する。
【００８６】
１．ナノコンジュゲート複合体
本発明の第１の態様は、以下の構成要素：
ｉ．自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識される少なくとも１つの特異的抗原、
ｉｉ．少なくとも１つのヘルパー部分、
ｉｉｉ．構成要素ｉ及びｉｉを連結するナノ粒子担体
を含むナノコンジュゲート複合体を提供する。
【００８７】
本態様の一実施形態では、ナノコンジュゲート複合体は、以下の構成要素：
ｉ．自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識される少なくとも１つの特異的抗原、
ｉｉ．少なくとも１つの炭水化物、
ｉｉｉ．少なくとも１つの脂質、
ｉｖ．少なくとも１つのポリマー及び
ｖ．構成要素ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ及びｉｖを連結する骨格
を含む。
【００８８】
構成要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つは、担体Ａ１個あたりのこれらのヘルパー部分の少なくとも１つを意味する。ヘルパー部分が複数のコピーで担体上に存在する場合、全コピーが同じでもよいし又は異なっていてもよい。異なるヘルパー部分は、好ましくは４〜２０コピーで独立して担体上に存在する。
【００８９】
新規ナノコンジュゲート複合体は、炎症性抗体に結合し、それらのさらなる生物学的活性を遮断する、疾患原因となる抗体に対する少なくとも１つの特異的抗原を含有する。ナノコンジュゲート複合体は、血流からの抗原−抗体複合体の迅速なクリアランスを支援するヘルパー構成要素／部分をさらに有し、それにより、さらなる炎症発生が防止され、可溶化エンハンサー、かさばる基及び骨格はそれを全て一緒に保持し、カーゴの担体として機能する。
【００９０】
好ましい一実施形態では、ナノコンジュゲート複合体は、次の一般構造ＩＩ：
【化５】
2021512093.tif 000007
（式中、Ａは、ｎｂ脂質部分（Ｂ）、ｎｃ炭水化物部分（Ｃ）、ｎｄ疾患特異的抗原部分（Ｄ）及びｎｅポリマー部分（Ｅ）が、それぞれ直接的なリンク又はリンカーＬｂ、Ｌｃ、Ｌｄ及びＬｅを通じて連結され；ｎｄが少なくとも１であり、ｎｂ、ｎｃ及びｎｅが１〜Ｘ−３である独立した整数であり、ｎａ＋ｎｃ＋ｎｄ＋ｎｅの合計が４〜共有若しくは非共有結合のためにＡにおいて利用可能な表面基Ｘの総数である、ナノポリマー性担体である）を有する。
【００９１】
本発明のこの態様のナノコンジュゲート複合体は、ナノコンジュゲート複合体が血流中で可溶性であり、細胞膜を通過しないように十分に大きいことを確実にする担体Ａの表面上に集められる異なる官能基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの複合体からなり、少なくとも１つの抗原（防御的）を提示し、循環自己抗体に選択的に結合可能であり、対象／患者にとって忍容でき（無毒性及び非免疫原性）、対象／患者において血流から自己抗体−ナノコンジュゲート複合体を輸送、除去及び枯渇させることが可能である。
【００９２】
好ましい実施形態では、Ａは、ＰＡＭＡＭ、ＰＮＩＭＡＭなどの合成ポリマーである。
【００９３】
本ナノコンジュゲート複合体は、骨格（Ａ）１個あたり少なくとも１個のＢ、即ちＡ１個あたり１個以上のＢを含み得る。Ｂが複数のコピーでＡ上に存在する場合、Ｂの全てのコピーが同じでもよいし又は異なっていてもよい。ナノコンジュゲート複合体は、Ａ１個あたり少なくとも１個のＣ、即ちＡ１個あたり１個以上のＣを含み得る。Ｃが複数のコピーにおいてＡ上に存在する場合、Ｃの全てのコピーが同じでもよいし又は異なっていてもよい。本ナノコンジュゲート複合体は、Ａ１個あたり少なくとも１個のＤ、即ちＡ１個あたり１個以上のＤを含み得る。Ｄが複数のコピーにおいてＡ上に存在する場合、Ｄの全てのコピーが同じでもよいし又は異なっていてもよい。本ナノコンジュゲート複合体は、Ａ１個あたり少なくとも１個のＥ、即ちＡ１個あたり１個以上のＥを含み得る。Ｅが複数のコピーにおいてＡ上に存在する場合、Ｅの全てのコピーは好ましくは同じであり得る。Ａ上のＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの数は相互に独立している。本ナノコンジュゲート複合体のナノ担体に関する次のセクションでより詳細に説明するように、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの数は、Ａ上の「利用可能な結合部位」の数によってのみ制限される。
【００９４】
代替的な実施形態では、Ｂは、Ｃ及び／又はＤ及び／又はＥにカップリングされ得；Ｃは、Ｂ及び／又はＤ及び／又はＥにカップリングされ得；ＤはＢ及び／又はＣ及び／又はＥにカップリングされ得；Ｅは、Ｂ及び／又はＣ及び／又はＤにカップリングされ得；Ａに連結され得る。
【００９５】
本ナノコンジュゲート複合体の異なる構成要素の骨格上の位置は、互いに対して、どのような物理的／化学的に可能な配置でもよく、上記の一般的な構造で例示されるレイアウトに限定されるべきではない。
【００９６】
１．１  本ナノコンジュゲート複合体の骨格、ナノ粒子担体
本ナノコンジュゲート複合体の骨格は、複合体の全ての構成要素を連結する分子である。骨格の選択に応じて、構成要素にとって利用可能な連結部位の数は異なり得る。
【００９７】
異なるデンドリマーを治療用途に対する候補として設計し得る。デンドリマーは、通常はコア周囲で対称であり、球状の３次元形態をとることが多い、繰り返し分岐する分子である。一例は、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸（ビス−ＭＰＡ）モノマー単位に基づく超分岐ナノ粒子であるビス−ＭＰＡアジドデンドリマーである。このデンドリマーのアジド構造は、デンドリマーの合成に対する周知の方法であるクリック化学を使用して容易に官能化され得る。本発明のナノコンジュゲート複合体における骨格としてＢｉｓ−ＭＰＡアジドデンドリマーを適用すると、アジド分岐は、（１又は複数の）抗原、（１又は複数の）炭水化物、（１又は複数の）脂質及び（１又は複数の）ポリマー構成要素に対する利用可能な連結部位となる。
【００９８】
別のデンドリマー：ポリアミドアミド（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、本発明のナノコンジュゲート複合体の（１又は複数の）抗原、（１又は複数の）炭水化物、（１又は複数の）脂質及び（１又は複数の）ポリマー構成要素に対する利用可能な連結部位に相当し得るアミノ及びカルボキシル基を多数有する。ＰＡＭＡＭは全体的に球状の形態であり、それぞれが外方向に「層」、即ち世代を持ち、指数関数的に増加する分岐点を含有する、樹状の分岐からなる内部分子構造により典型的に表される。図１で示されるように、デンドリマーは反復的な製造工程において中央コアから「成長」し、後続の各段階は、デンドリマーの新しい「世代」（Ｇ）に相当し、例えばＧ０は４個の表面基があり、Ｇ１は８個の表面基があり、Ｇ２は１６個の表面基があり、Ｇ３は３２個の表面基があり、Ｇ４には６４個の表面基があり、Ｇ５には１２８個の表面基があり、これらの表面基は、抗原、炭水化物、脂質及びポリマー構成要素に対する利用可能な連結部位となる。表面基は、ヒドロキシ表面ＰＡＭＡＭ、コハク酸表面ＰＡＭＡＭ、カルボン酸ナトリウム表面ＰＡＭＡＭ、疎水性物質置換ＰＡＭＡＭ又は他の表面基を提供するためなど、構成要素の付着前に修飾され得る。ＰＡＭＡＭの機能は容易に調整され、その均一性、サイズ及び高反応性「分子ベルクロ（登録商標）」表面は、それらの使用のための機能的な鍵である。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、細胞株における遺伝物質の送達に使用されており、免疫応答及び細胞毒性を最小限に抑えるように設計される。このために、ＰＥＧ化、アセチル化、炭水化物コンジュゲーション、ペプチドコンジュゲーション、ＤＮＡ／遺伝子コンジュゲーション、中性ヒドロキシル、アセチル又は負荷電カルボキシル基、抗体コンジュゲーション、葉酸コンジュゲーションのようなデンドリマーの様々な修飾機序が提案されている。
【００９９】
骨格が毒性を誘導しないことは重要である。文献に基づいて［Ａｙａｔｏｌｌａｈｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｎｏｖ；９２：２１０−２１７］、ＰＡＭＡＭ及び類似の足場分子は、毒性の点で安全であり、本発明のナノコンジュゲート複合体に対する骨格として適用され得る。他の有用な骨格単位は、当業者にとって明らかである。
【０１００】
一実施形態では、ナノコンジュゲート複合体の骨格は、何れかの世代サイズのＰＡＭＡＭ又はビス−ＭＰＡ−アジドデンドリマーから選択される足場分子などのデンドリマーである。別の実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の骨格は、キトサン及びプルランなどの炭水化物、又は絹フィブロインなどの生体分子、又はポリエチレンイミン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）及びポリ（メタクリル酸）から選択される。好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の骨格はＰＡＭＡＭである。
【０１０１】
骨格の構造に基づいて、本発明のナノコンジュゲート複合体の構成要素にとって連結するための複数の部位が利用可能であり得る。本ナノコンジュゲート複合体の骨格上の全ての利用可能な連結部位は、機能性構成要素、例えば特異的抗原（Ｄ）、脂質（Ｃ）、炭水化物（Ａ）及びポリマー構成要素（Ｅ）などが連結されてもよいし、又は連結されなくてもよい。例えば、Ｇ５−ＰＡＭＡＭの場合、全ての末端（分岐）のうち２５〜３０％のみが機能的な構成要素で修飾される可能性がある。しかし、約５％、約１０％、約１５％又は約２０％など、より少ない末端分岐（活性部位）が修飾され得るか；又は約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％及び最大１００％など、より多くの末端分岐が修飾される。従って、構造Ｉは、ナノコンジュゲート複合体が特異的抗原（Ｄ）、脂質（Ｃ）、炭水化物（Ａ）及びポリマー構成要素（Ｅ）を含むことの単なる例示とみなされるべきであり、各構成要素の１つに限定されるとみなされるものではない。本ナノコンジュゲート複合体は、各構成要素の１つ以上を含み得る。構成要素の比率は１：１に限定されず、変動し得る。異なる構成要素を混合し、分岐状骨格全体にランダムに連結し得るか；又はそれらの位置が具体的に予め選択され得る。
【０１０２】
本発明の別の好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体は、次の一般構造Ｉ：
【化６】
2021512093.tif 000008
（式中、Ａはナノ担体、例えば多糖類又はポリペプチドなどであり；Ｈ、Ｈ１及びＨ２は１つ以上の異なるヘルパー部分であり；Ｄは、１つ以上の自己免疫疾患特異的抗原であり；Ｌｄ及びＬｈは、共有結合又は非共有結合での１つ以上の異なるリンク又はリンカーであり；ｎｈ、ｎｈ１及びｎｈ２は、Ａに対して攻撃されるヘルパー基の数であり；ｎｈ３は、他のヘルパー基に対して攻撃されるヘルパー基の数であり；ｎｄ２は、Ａに対して攻撃される抗原基の数であり；ｎｄ１は、ヘルパー基に対して攻撃される抗原基の数である）のうち１つを有する。
【０１０３】
担体Ａが、キトサン又はプルランなどのこのような目的に対して知られる多糖類の１つから選択される場合、ヘルパー部分として炭水化物を含める必要はない。細胞膜を透過せず、血流中での溶解性を確保するのに適切なサイズのナノ粒子を作製するために、ヒアルロン酸などのヘルパー部分をキトサンコアに結合させ得る。キトサン及び／又はヘルパー部分、例えばヒアルロン酸は、例えばＰＥＧなどの表面中和ヘルパー部分でさらに修飾され得る。キトサン、ヒアルロン酸及びＰＥＧは全て毒性又は免疫原性がないことが知られており、従って医学的処置での使用に対して比較的安全である。抗原は、担体、例えばキトサン、又はヘルパー部分の１つ、例えばヒアルロン酸又はＰＥＧに連結され得る。全ての部分を共有結合又は非共有結合によって結合させ得る。
【０１０４】
１．２  本ナノコンジュゲート複合体の特異的抗原成分
本ナノコンジュゲート複合体の自己免疫疾患特異性は、結合される抗原に限定される。炭水化物、脂質、ポリマー並びに担体から選択される全てのヘルパー部分は、疾患特異的ではないが、記載のようにさらなる有益な特性を追加することにより、複合体に寄与する。特異的抗原は自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識され；それによって特異的抗原が結合し、自己免疫疾患自己抗体のクリアランス促進に役立つ。個々の患者におけるパターンは変動する；言い換えると、同じ抗原が認識されても、各患者に対して認識は抗原間でレベルが異なる。疾患特異的抗原配列の選択は、利用可能な文献を調査することにより裏付けられる、コンピュータ及び実験室スクリーニングの組み合わせを使用して、従来の抗原ライブラリスクリーニングによって、又は合理的な設計によって、より高い時間及び費用効率で行われ得る。成功した疾患特異的抗原は安定であり、患者における疾患関連自己抗体に対する親和性が高い。
【０１０５】
自己免疫疾患に関連する自己抗体によって認識される、本発明のナノコンジュゲート複合体の特異的抗原は、核酸配列、ペプチド、リン脂質又は他の細胞関連の構成要素であり得る。本ナノコンジュゲート複合体は、少なくとも１つの特異的抗原、即ち１つ以上の特異的抗原を含む。特異的抗原が１つ以上のコピーで存在する場合、全てのコピーが同じであってもよいし、又は異なっていてもよい。特異的抗原が同じナノコンジュゲート複合体内の異なる抗原の組み合わせである場合、このような組み合わせは、同じナノコンジュゲート複合体内の異なるオリゴヌクレオチド、同じナノコンジュゲート複合体内の異なるペプチド、又は同じナノコンジュゲート複合体内の（１又は複数の）オリゴヌクレオチド及び（１又は複数の）ペプチドの混合物であり得る。
【０１０６】
一実施形態では、特異的抗原は、同じであるか又は異なり、自己免疫性腎疾患に関連する（１又は複数の）ペプチド及び（１又は複数の）オリゴヌクレオチドから選択される。別の実施形態では、特異的抗原は、同じであるか又は異なり、ＲＡに関連する（１又は複数の）ペプチド及び（１又は複数の）オリゴヌクレオチドから選択される。
【０１０７】
適切なヘルパー部分を選択すること及び自己抗原又は特異的な疾患関連自己抗原を模倣する構成要素を結合させる方法における別の重要な要素は、新たな免疫反応を発する可能性がある免疫細胞と接触しないように、抗原の免疫原性エピトープを失活させる必要性である。ヘルパー部分の結合及び特性により、このようなエピトープがコンジュゲートに「埋め込まれ」、従って細胞膜への連結に関して失活させられる。自己抗体特異的エピトープは循環している自己抗体とのみ接触する。
【０１０８】
自己免疫性腎疾患に関連するペプチドは、配列番号３など、ＡＮＡ結合の有効性が確認されているため、ヒストンＨ３ペプチドを模倣するペプチドから選択され得る。さらに、治療薬の毒性の可能性及び費用を低減させるために、配列番号３に由来する配列番号５及び配列番号６など、元の配列の一部を使用し得る。さらに、自己抗体−ナノコンジュゲート複合体のクリアランスは、配列番号４などの肝臓標的化ペプチドによって改善され得る。
【０１０９】
自己免疫性腎疾患に関連するオリゴヌクレオチドは、ＳＬＥ疾患における抗ＤＮＡ抗体によりＤＮＡ配列標的から選択され得る。配列番号１及び配列番号２は、このようなオリゴヌクレオチドの例である。他の例は、配列番号７及び配列番号８であり、配列番号８は抗ＳＬＥ特異的である。
【０１１０】
さらなる実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、自己免疫腎疾患に関連する自己抗体により認識されることを特徴とし、オリゴヌクレオチド配列番号１、配列番号２及び配列番号８並びに配列番号１、配列番号２又は配列番号８に対して＞６０％配列同一性があるオリゴヌクレオチドから選択され；別の実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、ペプチド配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６並びに配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に対して＞６０％配列同一性があるペプチドから選択され；また別の実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号８並びに、選択される配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号８の何れかに対して＞６０％配列同一性がある配列のうち２つ以上の組み合わせである。
【０１１１】
さらなる実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、自己免疫腎疾患に関連する自己抗体により認識されることを特徴とし、オリゴヌクレオチド配列番号１、配列番号２及び配列番号８並びに配列番号１、配列番号２又は配列番号８に対して＞８０％配列同一性があるオリゴヌクレオチドから選択され；別の実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、ペプチド配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６並びに配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に対して＞８０％配列同一性があるペプチドから選択され；また別の実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号８並びに、選択される配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号８の何れかに対して＞８０％配列同一性がある配列のうち２つ以上の組み合わせである。
【０１１２】
さらなる実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、自己免疫腎疾患に関連する自己抗体により認識されることを特徴とし、オリゴヌクレオチド配列番号１、配列番号２及び配列番号８並びに配列番号１、配列番号２又は配列番号８に対して８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６又は９８％を超える配列同一性があるオリゴヌクレオチドから選択され；また別の実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、ペプチド配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６並びに配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に対して８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６又は９８％を超える配列同一性があるペプチドから選択され；別の実施形態では、自己免疫腎疾患特異的抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号８並びに、選択される配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号８の何れかに対して８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６又は９８％を超える配列同一性がある配列のうち２つ以上の組み合わせである。
【０１１３】
好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の自己免疫腎疾患特異的抗原は、オリゴヌクレオチド配列番号１又は配列番号１と＞８０％の配列同一性がある何らかのオリゴヌクレオチドである。より好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の自己免疫性腎疾患特異的抗原は、オリゴヌクレオチド配列番号１である。
【０１１４】
好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の自己免疫腎疾患特異的抗原は、オリゴヌクレオチド配列番号１又は配列番号１に対して８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６又は９８％を超える配列同一性がある何らかのオリゴヌクレオチドである。より好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の自己免疫性腎疾患特異的抗原は、オリゴヌクレオチド配列番号１である。
【０１１５】
異なる患者間の抗原配列内の相違は、上述のように、配列同一性の相違の１つの理由である。別の理由は、抗原の変化が、同程度の自己抗体への認識及び／又は結合又はその増強につながる可能性である。
【０１１６】
ＲＡ及び特定の形態の乾癬は、罹患した患者におけるシトルリン化タンパク質又はペプチドの存在に関連することが知られている。特異的なシトルリン化ペプチドエピトープは、例えばＲＡ血清において、タンパク質断片及びそれらの突然変異した変異体をスクリーニングすることにより選択され得る。例として、ＲＡ患者からの血清に対して、フィブリノーゲン、ビメンチン及びヒストン３に由来する２５種類のシトルリン化ペプチドエピトープのライブラリをスクリーニングし、これらのペプチドのうち１つがＲＡ血清に選択的に結合することが分かった。最も強力なペプチドエピトープを選択したところ、これは一連のインビトロアッセイによる評価のためにロードされたナノ粒子に含まれた。スクリーニングしたライブラリは、シトルリン化ペプチド配列番号９〜配列番号３３を含んだ。配列番号１０は、ＲＡ自己抗体特異的抗原エピトープを含むことが示された。
【０１１７】
好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の自己免疫ＲＡ特異的抗原は、ペプチド配列番号１０又は配列番号１０に対して＞８０％の配列同一性がある何らかのペプチドである。より好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の自己免疫ＲＡ特異的抗原は、ペプチド配列番号１０又は配列番号１０に対して８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６又は９８％を超える配列同一性がある何らかのオリゴヌクレオチドである。最も好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の自己免疫ＲＡ特異的抗原は、ペプチド配列番号１０である。
【０１１８】
１．３  構造ＩＩを有するナノコンジュゲート複合体の脂質構成要素
脂質は、様々な薬物の輸送、体内分布、有効性及び細胞取り込みに影響を及ぼし；故に、脂質は、溶解度及び吸着の向上並びにバイオアベイラビリティの向上を促進し得る。本ナノコンジュゲート複合体の脂質成分は、抗体：ナノコンジュゲート複合体に対するクリアランスシグナルとして作用する［Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２０１７  Ｆｅｂ；２３（２）：８２−９４］。これは特定の脂肪酸に限定されないが、より長い鎖（Ｃ７以上）は分子を肝臓に標的化し、消化を促進することが知られている。さらに、ＰＥＧ（以下を参照）と一緒に、脂質構成要素は、生体内分布を改善し、血清中の半減期を延長させる。
【０１１９】
本ナノコンジュゲート複合体は、少なくとも１個の脂質、即ち１個以上の脂質を含む。脂質が複数のコピーで存在する場合、全てのコピーが同じでもよいし又は異なっていてもよい。
【０１２０】
一実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の脂質構成要素は、市販業者から容易に入手可能なものなどの天然脂肪族脂肪酸から選択される１つ以上の脂肪酸である。脂肪酸は、直鎖又は分岐鎖であり得；それらは飽和、不飽和又はそれらの組み合わせであり得る。好ましい実施形態では、本発明のナノコンジュゲート複合体の脂肪酸は、非分岐であり飽和している。好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の脂質構成要素は、エナント酸（ヘプタン酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸及びパルミチン酸から選択される。
【０１２１】
別の実施形態では、脂質構成要素は、脂肪酸がカプロン酸（ヘキサン酸）、エナント酸（ヘプタン酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸から選択される場合など、同じナノコンジュゲート複合体内の２つ以上の異なる脂肪酸の組み合わせなど、同じナノコンジュゲート複合体内の異なる脂質の組み合わせであり得る。
【０１２２】
１．４  構造ＩＩを有するナノコンジュゲート複合体の炭水化物構成要素
ナノコンジュゲート複合体の炭水化物構成要素は、脂質付加分子の溶解度を向上させる。同時に、炭水化物は、炎症を引き起こす死細胞及びそれらの一部（微粒子と呼ばれる）並びにアポトーシス小体のクリアランスを促進し得る。最近、自己抗体関連腎疾患の患者の血液に微粒子が広範囲に分泌されていることが示されている［Ｇｉａｎｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｂｅｔｏｌ．２０１７；１６：１１８］。これらの粒子は、特異的な炭水化物を認識する表面タンパク質を含有する。従って、これらを排除するのを助けるために、炭水化物構成要素が本発明のナノコンジュゲート複合体に含まれる。
【０１２３】
本ナノコンジュゲート複合体は、少なくとも１つの炭水化物、即ち１つ以上の炭水化物を含む。炭水化物が複数のコピーで存在する場合、全てのコピーが同じでもよいし又は異なっていてもよい。
【０１２４】
一実施形態では、ナノコンジュゲート複合体の炭水化物構成要素は、微粒子表面グリコシル化において利用可能な文献から選択される。グルコサミンは、グリコシル化タンパク質及び脂質の生化学的合成における主要な前駆体である。微粒子表面のグリコシル化に関する他の炭水化物は、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース及びそれらのオリゴマーを含む。全体的なコンジュゲート設計に応じて、様々な炭水化物が適用され得る。炭水化物は、単糖、二糖、多糖又はオリゴ糖であり得る。
【０１２５】
一実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の炭水化物構成要素は、マンノース、ガラクトース、グルコサミン及びそれらのオリゴマーから選択される。好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の炭水化物構成要素は、ガラクトース及びグルコサミンから選択される。
【０１２６】
さらなる実施形態では、炭水化物構成要素は、マンノース、ガラクトース、グルコサミン及びそれらのオリゴマーから選択される２つ以上の異なる炭水化物の組み合わせなど、同じナノコンジュゲート複合体内の異なる炭水化物の組み合わせであり得る。
【０１２７】
１．５  構造ＩＩを有するナノコンジュゲート複合体のポリマー構成要素
本ナノコンジュゲート複合体は、体液中での安定性及び自己抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ）に対する抗原提示を確実にするためにポリマー構成要素を含む。ＰＥＧなどのポリマーは、分子の分子量を大きくすることにより、薬物溶解性の向上、循環寿命の延長、薬物安定性の向上及びタンパク質分解からの保護の強化など、いくつかの重要な薬理学的利点をもたらす。従って、ポリマーは親水性である必要がある。サイズに関しては、ポリマーは、ＰＥＧ３０００〜ＰＥＧ２００００までなど、幅広い範囲であり得る。ペグ化は、それにより、標的化された目的地への本ナノコンジュゲート複合体の効果的な送達を助ける。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、これらの有益な特性を達成するための別の選択肢である。
【０１２８】
本ナノコンジュゲート複合体は、少なくとも１個のポリマー、即ち１個以上のポリマーを含む。ポリマーが複数のコピーで存在する場合、全てのコピーが同じでもよいし又は異なっていてもよい。
【０１２９】
一実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体のポリマー構成要素は、キトサン及びプルランなどの官能化炭水化物、又はヒト血清アルブミンなどの生物学的薬物の生体内分布を改善することが知られているタンパク質誘導体から選択され得る。好ましい実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体のポリマーはＰＥＧである。ＰＥＧは様々な形態で市販されており、本ナノコンジュゲート複合体の担体及び他のヘルパー部分の特性と組み合わせて選択され得る。
【０１３０】
別の実施形態では、ポリマー構成要素は、ＰＥＧ、キトサン、プルラン及びヒト血清アルブミンから選択される２つ以上のポリマーの組み合わせなど、同じナノコンジュゲート複合体内の異なるポリマーの組み合わせであり得る。
【０１３１】
１．６  ナノコンジュゲート複合体のリンク又はリンカー
構造ＩＩのリンク又はリンカーＬｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、Ｌｅは、抗原、炭水化物、脂質及びポリマー構成要素を骨格に連結し、構造Ｉ中のＬｄ及びＬｈは、抗原及びヘルパー部分を骨格に連結する。共役化学の選択は、出発物質の化学的特性及び生成物において生成される結合の所望の安定性に依存する。リンク又はリンカーは同じでもよいし、又は異なっていてもよい。好ましい実施形態では、リンカーは、エーテル、エステル、ジスルフィド、アミド、１，２，３−トリアゾール又はＰＥＧなどの何らかの官能基であり得る。或いは、リンクは、静電相互作用などの非共有結合であり得る。
【０１３２】
さらなる実施形態では、リンカーは、１つのリンカー内に２つ以上の官能基の組み合わせを含み得、官能基は、エーテル、エステル、ジスルフィド、アミド、１，２，３−トリアゾール及びＰＥＧから選択される。
【０１３３】
選択された実施形態では、リンクは非共有結合である。
【０１３４】
２  ナノコンジュゲート複合体の調製
本発明の第２の態様は、本発明のナノコンジュゲート複合体を調製するための方法に関する。
【０１３５】
一実施形態では、本発明の構造Ｉのナノコンジュゲート複合体は、
ａ．本ナノコンジュゲート複合体の構成要素全てを連結する際の使用のためのナノ担体を提供し、
ｂ．少なくとも１つのヘルパー部分を担体に連結し、
ｃ．少なくとも１つの特異的抗原を担体又はヘルパー部分に連結する
段階を含む方法によって調製され、
ここで、段階ｂ及びｃは、任意の順序で実行され得るか、又は組み合わせられ得る。
【０１３６】
別の態様では、本発明の構造ＩＩのナノコンジュゲート複合体は、
ａ．段階ｂ〜ｅで示されるようにナノコンジュゲート複合体の構成要素全てを連結する際の使用のためのナノ担体を提供し、
ｂ．少なくとも１つのポリマー構成要素を担体に連結し、
ｃ．少なくとも１つの特異的抗原構成要素を担体に連結し、
ｄ．少なくとも１つの脂質成分を担体に連結し、
ｅ．少なくとも１つの炭水化物構成要素を担体に連結する、
段階を含む方法により調製され、
ここで、段階ｂ、ｃ、ｄ及びｅのうち２つ以上が組み合わせられ得；これらの段階は、任意の選択される順序で実行され得る。
【０１３７】
ナノコンジュゲートを調製する何らかの実施形態では、共有結合又は非共有結合が必要に応じて選択され得る。共有結合の場合、クリック化学が好ましい合成であり、当技術分野で周知である。当業者によって識別されるように、必要な場合、さらなる透析及び標識段階をさらに導入し得る。
【０１３８】
アセンブリの構造に関しては、異なる構成要素をランダムに担体骨格に連結し得るか、又は位置を予め選択し得る。さらに、最終的なナノコンジュゲート複合体が各構成要素の１つ以上を含むように、各構成要素の複数単位が本ナノコンジュゲート複合体の骨格に連結され得る。構成要素の比に明確な制限はない。担体上の利用可能な官能性表面基は、構成要素の総数の上限を定める。好ましくは、利用可能な表面基の１０〜７０％が、（１又は複数の）抗原及びヘルパー部分により占められる。より好ましくは、基の２０〜５０％が占められる。
【０１３９】
抗原並びに炭水化物、脂質及びポリマー構成要素などのヘルパー部分は、以下に指定されるように、リンカー又はリンクなどを通じて、共有結合により、本ナノコンジュゲート複合体の骨格に連結され得るか；又は非共有結合により連結され得る。好ましい実施形態では、リンカーは、エーテル、エステル、ジスルフィド、アミド、１，２，３−トリアゾール又はＰＥＧなどの何らかの官能基であり得る。或いは、リンクは、静電相互作用などの非共有性であり得る。さらなる実施形態では、リンカーは、１つのリンカー内に２つ以上の官能基の組み合わせを含み得、この官能基は、エーテル、エステル、ジスルフィド、アミド、１，２，３−トリアゾール及びＰＥＧから選択される。ナノコンジュゲート複合体の異なる構成要素を連結するために、リンク又はリンカーのタイプに応じて、標準的なＰＥＧ化、クリック化学連結及びＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）化学結合プロトコールを含むが限定されないものなど、当業者により公知の様々な連結プロトコールが使用され得る。
【０１４０】
一実施形態では、ナノコンジュゲート複合体がペグ化される。ペグ化は、分子にポリマーＰＥＧの鎖を結合する工程であり、それにより、立体構造の変化、静電結合、疎水性などを含む生理化学的特性が変化する。ペグ化は、ヒドロキシスクシンイミド化学によって行われるものなど、当業者により公知の標準的プロトコールに従って行われ得る［Ａｌｉｂｏｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１７．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ５１９，３５２−３６４］。
【０１４１】
一実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の１つ以上の選択構成要素は、骨格を含有する撹拌溶液に予め選択された比率で構成要素をゆっくりと添加することにより、非共有結合によって骨格に連結され、混合物を十分な時間にわたり温置しておく。
【０１４２】
別の実施形態では、本ナノコンジュゲート複合体の１つ以上の選択構成要素は、クリック化学によって骨格に連結される［国際公開第２００７０１１９６７Ａ２号パンフレット］。反応は、アジド及びアルキンの古典的な銅触媒クリック反応によって行われるものなど、当業者により公知の標準的なプロトコールに従って行われ得る［Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｃ．Ｐａｔｔｏｎ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ８，２００４］。好ましい実施形態では、ｐＨは酸性から塩基性まで変動し得るが、反応構成要素の濃度は低ミリモル範囲に維持すべきであろう。
【０１４３】
別の実施形態では、ナノコンジュゲート複合体の選択構成要素は、遊離アミノ基とのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル反応によって骨格に連結される。アミノ基は殆ど常に、タンパク質及びペプチドに含有され、従って、ＮＨＳエステル反応によるこれらの生体ポリマーの修飾は特に一般的である。他の例は、アミノオリゴヌクレオチド、アミノ修飾ＤＮＡ及びアミノ含有糖である。反応は、当業者により公知の標準的なプロトコールに従って行われ得る。ＮＨＳエステルとアミンとの反応は、ｐＨに強く依存する：低ｐＨでは、アミノ基がプロトン化され、修飾は行われない。最適よりも高いｐＨでは、ＮＨＳエステルの加水分解が速く、修飾収率が低下する。好ましい実施形態では、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル反応に対するｐＨ値は８．３〜８．５である。
【０１４４】
低分子治療薬の標準的な多段階合成と比較して、本発明のナノコンジュゲート複合体の調製は、上記の説明並びに例１から明らかなように、実験的に単純である。合成スキームは柔軟であり、製品内の抗原を最も効率的に提示することを目指して、特異的なナノコンジュゲート組成に対して調整し得る。
【０１４５】
３．ナノコンジュゲート複合体による自己免疫疾患の処置
本発明の第３の態様は、ナノコンジュゲート複合体を含む医薬組成物に関する。治療用ナノコンジュゲート複合体は、一般構造Ｉ又はＩＩのものであり得るか、又は異なる特異的抗原、異なる炭水化物、異なる脂質、又はさらには異なるポリマーを含む複合体など、２つ以上のナノコンジュゲート複合体の組み合わせを含み得る。例えば、医薬の組み合わせは、２つの異なるオリゴヌクレオチド、２つの異なるペプチド又は（１又は複数の）オリゴヌクレオチド及び（１又は複数の）ペプチドの組み合わせなど、抗原が異なる２つの異なる複合体を含む。同様に、医薬の組み合わせは、３つ又はさらにそれを超える異なるナノコンジュゲート複合体を含み得る。
【０１４６】
本ナノコンジュゲート複合体は、既存の低分子薬及び生物製剤（例えばメトトレキサート及び／又はリツキシマブなどのモノクローナル抗体をさらに含む医薬組成物の一部であり得る［Ｃｒａｖｅｄｉ．Ｇ  Ｉｔａｌ  Ｎｅｆｒｏｌ．２０１２  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２９（３）：２７４−８２；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２９２］）。
【０１４７】
治療薬に対する重要な要件としては、低毒性、高い標的結合特異性及びインビボでの長期的効果が挙げられる。これらの特性は、本発明のナノコンジュゲート複合体において、１つの複合体内の複数の活性構成要素：活性抗原、可溶化試薬、標的抗体が認識され、結合される場合、十分な生体内分布及び血流からのクリアランスを助けるいくつかの最新のヘルパー分子を組み合わせることにより得られる。さらに、本発明のナノコンジュゲート複合体の殆どの構成要素は生体分子であり；これにより、治療薬の低毒性が確実になる。
【０１４８】
本発明の第４の態様は、自己免疫腎疾患、ＲＡ、乾癬、Ｔ１Ｄ、硬化症などの自己免疫疾患の処置において本ナノコンジュゲート複合体を使用することに関し、次の段階：
ａ．少なくとも１つの本発明によるナノコンジュゲート複合体又は医薬組成物を提供し；
ｂ．このナノコンジュゲート複合体又はこの医薬組成物を自己免疫疾患に罹患している患者に投与する、
段階を含む処置の方法を提供する。
【０１４９】
ナノコンジュゲート複合体で処置しようとする患者は、何らかの病期の自己抗体によって引き起こされるＣＫＤ、ＲＡ又は他の自己免疫疾患に罹患しているヒト又は動物であり得る。
【０１５０】
本ナノコンジュゲート複合体は、静脈内注射、輸血、筋肉内注射によって、又は医薬複合体を投与するための当業者により公知の他のこのような方法によって、患者に投与され得る。本ナノコンジュゲート複合体は、選択される期間にわたり、選択される間隔で、いくつかの投与量で投与され得る。治療薬の使用は、血中の自己抗体レベルの測定に基づいて調整され得る。ｉｖ投与によりナノコンジュゲートを血流に直接投与することが最も好ましい。
【０１５１】
本発明の治療用ナノコンジュゲート複合体は、腎疾患、ＲＡ及び他の自己免疫疾患の原因に対処し、そのような面で現在使用される対症療法薬よりも安全且つ効率的である。ナノコンジュゲート複合体は自己抗体に結合するだけでなく、新しい炎症が妨げられるように血流からそれらを排除するのにも役立つ。従って、自己抗体が体内に蓄積せず、処置のさらなる成功は自己抗体のインビボ分解に依存しない。このナノ材料を使用すると、慢性炎症による組織損傷が防止されるので、自己免疫疾患をそのコースのより早い段階で処置し得、結果が患者にとってより良好となる。
【０１５２】
例
以下の例は、本発明の原理を例示することのみを意図しており、従って、特許請求される発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。
【０１５３】
例１：インビトロアッセイ−適切なＳＬＥ／ＣＫＤ抗原の同定
ナノコンジュゲート複合体を合成する前に、腎臓自己免疫疾患に関与する自己抗体を狙う様々な可能性のある抗原（表１）の適合性を試験した。自己免疫性腎疾患に関連するオリゴヌクレオチドは、ＳＬＥ疾患において抗ＤＮＡ抗体が標的とするＤＮＡ配列から選択した。このようなオリゴヌクレオチドを試験するために、ＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴ（配列番号１）及び（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ）配列番号２を選択した。１つの被験ペプチド、ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＧＧＣ（配列番号３）は、ＡＮＡ結合の有効性が確認されているため、ヒストンＨ３ペプチドを模倣する自己免疫性腎疾患に関する。元の配列の一部、配列番号３由来のＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号５）及びＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＧ（配列番号６）も試験する。
【表１】
2021512093.tif 000009
【０１５４】
配列番号４は、担体に連結されるときに自己抗体−ナノコンジュゲート複合体のクリアランスを改善するために使用され得る肝臓標的化ペプチドである。
【０１５５】
表１で示される抗原のＳＬＥ／ＣＫＤ疾患状態血清との結合は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１ｘＰＢＳ中の濃度５μｇ／ｍＬの個別の抗原で一晩（室温；１５０μＬ／ウェル）コーティングした。１ｘＰＴ（２ｘ３００μＬ／ウェル、ＰＴ：１Ｌ  １ｘＰＢＳ中５０μＬ  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した後、１ｘＰＴＢでプレートをブロッキング処理した（１時間、３７℃；１００μＬ／ウェル、ＰＴＢ：１Ｌ  １ｘＰＢＳ中２０ｇ  ＢＳＡ、５０μＬ  Ｔｗｅｅｎ−２０）。希釈液：１Ｌ  １ｘＰＢＳ中の２ｇ  ＢＳＡ、５０μＬ  Ｔｗｅｅｎ−２０（１００μＬ／ウェル）を使用して、３７℃で１．５時間、所望の希釈率のＳＬＥ／ＣＫＤ血漿との温置を行った。これに続いて、洗浄し（２ｘ３００μＬ  １ｘＰＢＳ）、供給者により提供される二次抗体の同じ希釈液及び希釈を使用し（ＨＰＲ結合ａ−ａＩｇＧ又はａ−ａＩｇＭ；Ｓｉｇｍａ）、ＨＰＲ標識二次抗体とともに３７℃で１．５時間、温置した。その後の洗浄（２ｘ３００μＬ  ＰＴ）及び新たに調製したＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液（Ｓｉｇｍａ；１００μＬ／ウェル）との温置に続いて、停止溶液（１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４；５０μＬ／ウェル）を添加し、Ｍａｇｅｌｌａｎ  Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍにて、生じた吸光度値を読み取った。
【０１５６】
一連の対照希釈（１：５０〜１：２０００希釈のＩｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎから購入した対照血清）を試験することを介して各抗原（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４）の直線状範囲を決定した。直線性から、選択した濃度範囲が抗体の検出に適していたこと、及び他の血清／アッセイ構成要素が結果に干渉しなかったことが確認された。結果によれば、血漿希釈液１：１００〜１：５００は各抗原に対するアッセイの直線範囲内であった（Ｒ２＞０．９５）。
【０１５７】
例２：ナノコンジュゲート複合体の合成
腎臓の自己免疫疾患を狙う様々なナノコンジュゲート複合体を以下に記載のように調製した。
【０１５８】
２．１合成したナノコンジュゲート複合体の組成
合成したナノコンジュゲート複合体は、一般構造ＩＩ：
【化７】
2021512093.tif 000010
（式中、Ａは、少なくとも１つの（ｎｂ）脂質（Ｂ）、少なくとも１つの（ｎｃ）炭水化物（Ｃ）、少なくとも１つの腎臓自己免疫疾患特異的抗原（ｎｄ）（Ｄ）及び少なくとも１つの（ｎｅ）ポリマー（Ｅ）がそれぞれリンク又はリンカーＬｂ、Ｌｃ、Ｌｄ及びＬｅを通じて連結されるナノ粒子骨格／担体である）に従う。
【０１５９】
合成したナノコンジュゲート複合体のそれぞれの組成を表２に要約し、様々な構成要素を表３でさらに特定する。
【表２】
2021512093.tif 000011
【表３】
2021512093.tif 000012
【０１６０】
図２では、合成されたナノコンジュゲート複合体１〜１０を例示する。ＰＡＭＡＭ  Ｇ５は、合成ナノコンジュゲート複合体に対する骨格担体（Ａ）である。この骨格担体は、理論的に、脂質（Ｂ）、炭水化物（Ｃ）、抗原（Ｄ）及びポリマー（Ｅ）構成要素に対する利用可能な付着部位を表す１２８個の表面アミノ基を提供する。故に、４個の構成要素のそれぞれ（Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）は、理論的には１〜１２５コピーで存在し得るが、一方で全ての構成要素の合計は１２８を超え得ない。異なる構成要素間の比は固定されていないものの、１：３：１：２のＢ：Ｃ：Ｄ：Ｅの比が以下に記載の合成プロトコールにより意図された。さらに、合成ナノコンジュゲート複合体（番号１〜５及び７〜８）及び対照（番号６、９及び１０）の場合、骨格担体の表面基のうち全部でおよそ２５〜３０％のみが構成要素Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥで占められていた。
【０１６１】
２．２  ナノコンジュゲート複合体の合成のための試薬、材料など
ナノコンジュゲート複合体の調製で使用される全ての試薬及び緩衝液を表４で列挙する。市販業者から入手した試薬及び緩衝液は、受け取ったものをそのまま使用した。
【表４】
2021512093.tif 000013
【０１６２】
次のプラスチック及び他の小規模な機器を使用した：
マイクロ遠心チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｇｅｒｍａｎｙ，２１５０Ｎ）、ガラスバイアル（ＶＷＲ  Ｄｅｎｍａｒｋ，１１３４５９）、ピペットマンセット（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ，ＵＫ，ＰＩＰＥＴＭＡＮ（登録商標）Ｃｌａｓｓｉｃ）、ピペットチップ（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ，ＵＫ，ＰＩＰＥＴＭＡＮ  ＤＩＡＭＯＮＤ  Ｔｉｐｓ−Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｔｉｐｓ，１４３２４）、シェーカー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）Ｓ４４ｉ  Ｓｈａｋｅｒ，ＵＳＡ）、遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ  Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｒ０１６５）。
【０１６３】
２．３  ＰＥＧ化ＰＡＭＡＭ前駆体の合成
添加しようとする様々な構成要素の量を表５で報告し、次のように計算した：
ＰＡＭＡＭデンドリマーの量＝２０ｍｇ
ＰＥＧ３０００：デンドリマーの比＝１：３．３３
必要なＰＥＧ３０００の量＝（３０／１００）ｘ２０＝６ｍｇ
質量比が６ｍｇ：４８ｍｇ：４８ｍｇであるとした場合の、ＰＥＧとＮＨＳ及びＥＤＣとの比は１：８：８である。
【表５】
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【０１６４】
ＰＥＧ化ＰＡＭＡＭ前駆体の合成は、次の段階により実施した［Ａｌｉｂｏｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．２０１７  Ｍａｒ  １５；５１９（１−２）：３５２−３６４］：
１．ＰＡＭＡＭデンドリマーをｐＨ７．４のＰＢＳ中で溶解させた
２．６ｍｇのＰＥＧ−ＣＯＯＨを溶液に添加し、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ：ＮＨＳ：ＥＤＣ  １：８：８の比でＮＨＳ及びＥＤＣと混合した
３．混合物を遮光して８００ｒｐｍで１６時間撹拌した。
４．非結合ＰＥＧ及び残留ＥＤＣ／ＮＨＳを除去するために、３ｍＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４に対して２４時間にわたり透析を行った（カットオフ：１４０００Ｄａ）。
５．ＳＰＥＥＤ  ＶＡＣを使用して試料体積を減少させた。
６．ＤＬＳ及び１Ｈ−ＮＭＲによって特徴評価を行った。
【０１６５】
選択コンジュゲーション時及び１０〜２０ＭＷＫＯ膜での２４ｈの長時間透析による精製後に、コンジュゲートの特徴を調べるために、ＮＭＲを使用した。ＮＭＲシグナルにおいて観察される変化によって、ナノコンジュゲート複合体の調製における抗原の結合成功を確認した。
【０１６６】
２．４  抗原／炭水化物／脂質のＰＥＧ化ＰＡＭＡＭ前駆体への連結
ナノコンジュゲート複合体の様々な構成要素は、様々な方法により骨格に連結され得る。様々な「連結方法」の一般的な説明並びにナノコンジュゲート複合体番号１の合成のための段階的な工程を以下で提供する。
【０１６７】
一般的な非共有結合プロトコール：１ｘＰＢＳ（１ｍＬ）中の標的ナノコンジュゲートを得るために、必要な量の構成要素の１０％過剰量を１ｘＰＢＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．２、２ｍＬ）中のＰＥＧ化デンドリマーの撹拌溶液に２時間かけて滴下して添加した。反応混合物を２４時間撹拌し、その後、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００（ＤＴＵ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上で１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの１０Ｋ透析キットを使用して、この生成物を濃縮した。
【０１６８】
一般的なクリック化学連結プロトコール：ｐＨ７．０の１００ｍＭ  ＴＥＡＡ緩衝液中で対応するアルキン又はアジド基を含有するＰＥＧ化ＰＡＭＡＭにアジド又はアルキン試薬の１０％過剰量を添加した（２ｍＭ溶液ＰＡＭＡＭ、１ｍＬ）。アルキン／アジド含有ＰＡＭＡＭ前駆体は、Ｓｉｇｍａなどの市販業者から入手可能であるか、又は、例えばＬｕｍｉｐｒｏｂｅから入手可能なＮＨＳ−アルキン及びＮＨＳ−アジド試薬を使用したＰＥＧ連結と一緒に行われ得る（ナノコンジュゲート１に対する例を参照）。ペプチド又はＤＮＡ配列などのクリックされる構成要素は、クリック化学用の所望のアルキン又はアジド標識を含むとともに、市販業者から入手されるか、又は社内で合成される。その後、銅−ＴＨＰＴＡ及び新たに調製したアスコルビン酸を添加し、得られた混合物をアルゴンにより脱気し、室温で１２時間保持した。得られた混合物を１０Ｋ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通して透析にかけた。生成物は、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００（ＤＴＵ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
【０１６９】
一般的なＮＨＳ化学連結プロトコール：１００ｍＭ重炭酸緩衝液ｐＨ８．３中の遊離アミノ基を含有するＰＥＧ化ＰＡＭＡＭにＮＨＳ試薬の１０％過剰量を添加した（２ｍＭ溶液ＰＡＭＡＭ、１ｍＬ）。反応物を室温で４時間穏やかに撹拌し、次に１０Ｋ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通して透析した。生成物は、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００（ＤＴＵ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
【０１７０】
２．５  ナノコンジュゲート複合体番号１の合成のための段階的プロトコール
コンジュゲート１に対する一般的合成ストラテジー：
１．Ｇ５  ＰＡＭＡＭに対するＮＨＳ−ＰＥＧカップリング、透析；
２．３当量のヘプタン酸とのカップリング反応、透析；
３．アジド−ＰＥＧ３−アミン（Ｌｉｍｉｐｒｏｂｅ，カタログ番号２１８−１ｇ）での段階（２）の生成物の処理；
４．モル比３：１での、ガラクトース−アルキン及びオリゴヌクレオチド−アルキン混合物の、段階（３）の生成物に対するクリック化学。
【０１７１】
段階１．セクション１．３「ＰＥＧ化ＰＡＭＡＭ前駆体の合成」に記載のものと同じく、続いて製造元のプロトコールに従って、１０ｋＤａ  ＭＷＫＯ膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８７７２９）を使用して透析を行った。
【０１７２】
段階２．段階１で調製したペグ化Ｇ５  ＰＡＭＡＭを濃度１ｍｇ／ｍＬ（１ｍＬ）で、１００ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で再懸濁した。ヘプタン酸（ｔ−ＢｕＯＨ中の１０ｍＭ保存液６μＬ）及びＥＤＣ（ＤＭＦＡ中の１０ｍＭ保存液１２μＬ）を添加し、穏やかに撹拌（２００ｒｐｍ）しながら室温で３６時間にわたり反応を維持した。１４ｋＤａ  ＭＷＫＯ膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して生成物を２４時間透析し、段階３のために、１ｍＬの１００ｍＭ重炭酸緩衝液、ｐＨ８．２で復元した。
【０１７３】
段階３．１００ｍＭ重炭酸塩（ｐＨ８．２）中の段階２の生成物の溶液をＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（７μＬ；ＤＩＣ、Ｓｉｇｍａ  Ｄ１２５４０７）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０μＬのｍｉｌｉＱ水中１０ｍＭ保存液）；Ｓｉｇｍａ（カタログ番号１３０６７２）とともに室温で２時間温置した。アジド−ＰＥＧ３−アミン（ｍｉｌｉＱ水中１０ｍＭ保存液１５μＬ；Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ、カタログ番号２１８−１ｇ）を添加し、反応物を穏やかに撹拌（２００ｒｐｍ）しながら室温で１２時間維持した。１４ｋＤａ  ＭＷＫＯ膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して生成物を２４時間透析し、２００μＬの１００ｍＭ  ＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７．２で復元した。
【０１７４】
段階４．１００ｍＭ  ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．２、濃度１ｍｇ／ｍＬで３０μＬ）の段階３の生成物の溶液に、次の試薬を続けて添加した：ＤＭＳＯ（２０μＬ）、Ｄ１−５’−ヘキシニルオリゴヌクレオチド（５μＬ  ｍｉｌｉＱ水中４．４ｎｍｏｌヘキシニル／ＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴ；ＩＤＴ）、ベータ−Ｇａｌ−ＴＥＧ−アルキン（５μＬ  ｍｉｌｉＱ水中８．８ｎｍｏｌ、；ＩＤＴ、ＩＲＩＳ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＧＢＢ１３８５）、銅ＴＢＴＡリガンド（１０μＬ、１０ｍＭ保存液、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ  ２１０５０）及び新たに調製したアスコルビン酸（ｍｉｌｉＱ水中の２５ｍＭ保存液５μＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａ９２９０２−２５Ｇ）。アルゴンで３分間にわたりフラッシュすることにより混合物を脱気し、４８時間にわたり２００ｒｐｍで振盪しながら室温に保った。２０ｋＤａ  ＭＷＫＯ膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して生成物を２４時間透析し、２００μＬの１００ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２で復元した。
【０１７５】
例３：ナノコンジュゲート複合体の溶解度
ナノコンジュゲート複合体の溶解度に対する炭水化物構成要素の効果は、漸増量のグリコースがＧ５−ＰＡＭＡＭ−ＰＥＧ−酪酸にカップリングされる滴定実験によって示される。蒸発させたコンジュゲート（１ｍｇ）に１００ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ、ｐＨ７．２、Ｓｉｇｍａ）を滴下した。溶解度は、単純に、溶解していないコンジュゲートをろ過し、乾燥させ、計量することにより測定し得る。図３は、脂質への炭水化物構成要素の添加量の関数として、コンジュゲートに対する溶解度データを示す。図３で見られるように、炭水化物：脂質（Ｃ：Ｌ／Ｂ）の最適な比はおよそ１：１以上であり；１：１未満のＣ：Ｌ／Ｂ比を適用すると、溶解度は劇的に低下する。炭水化物構成要素が存在しない場合、０．０１ｍｇのナノコンジュゲート複合体のみが水中で溶解され、これは、治療用途には適していない。
【０１７６】
例４：発熱性及び補体活性化
ナノコンジュゲート複合体のインビボ試験を妨げ得る発熱性及び補体活性化を評価するために、標準的な手順を使用した［Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．２０１６  Ｏｃｔ；２４（１０）：１７６９−１７７５］。発熱性は、殆どの場合、リポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌抗原によって引き起こされる。新鮮なＭＱ水及び層流の設定で、１：１００〜１：１００，０００の希釈中で、ナノコンジュゲート複合体対市販ＬＰＳ標準に対して発熱性を試験した。この結果は、全プレートが本発明のコンジュゲートについて「クリーン」であったため、コンジュゲートにおいて汚染がないことを確認する一方で、対照としてのＬＰＳの存在下でゲル化が観察された（図４）。ナノコンジュゲート複合体番号１（例１より）及び対照（ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びＴＡＴペプチド）を３７℃で２４時間温置し、標準的ＥＬＩＳＡにより補体活性化に対するバイオマーカー（ＥＣ４ｄ）を測定して、ＳＬＥ陽性ヒト血液中で補体活性化を試験した（Ｏｄｅｎｓｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ｎ＝５）。この目的のためのＥＬＩＳＡキットは市販業者から購入し、供給業者によって示唆される手順に従っている。図５は、健康な対照（患者番号６〜１０）及び腎臓自己免疫疾患の患者（患者番号１〜５）のＥＣ４ｄレベルを示し；健康な対照と比較して腎臓自己免疫疾患患者におけるＥＣ４ｄレベルの増加がないことを示しているため、ＣｐＧ及びＴＡＴと比較して、ナノコンジュゲート複合体番号１については２４時間で補体活性化はない。
【０１７７】
例５：ナノコンジュゲート複合体の安定性：酸化、保存及び凝集
濃度１ｍｇ／ｍＬの１００ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２、Ｓｉｇｍａ）中のナノコンジュゲート又は対照の溶液を−２０℃又は＋４℃で保存した。アリコートを毎月採取した。凝集について評価するために、２６０（ＤＮＡ抗原）／２８０ｎｍ（ペプチド抗原）で光学密度を測定することにより、上清試料を分析した。＞１５％の光学濃度の低下は凝集とみなした。最初の化合物の質量を試料と比較して、ＨＲＭＳによって酸化を試験した。質量がｍ／ｚ３２以上増加することによって、酸化を確認した。ＬＣ  ＭＳ、ＰＢＳ緩衝液中の溶出系定組成勾配ｔＢｕＯＨを１０−＞９０％、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、ＭＳ分光計に接続されたＣ１８分析カラムにおいて、化学組成を試験した。対照として使用した最初の化合物と試料の質量を比較した。ＬＣプロファイルの偏差及びＭＳ＞１５％は分解とみなした。結果を表６で報告する。
【表６】
2021512093.tif 000015
【０１７８】
例６：毒性試験
合理的な設計によって選択される全ての抗原及びナノコンジュゲートは、細胞毒性に関して試験されており；これには、表２で示される全てのナノコンジュゲートが含まれる。細胞株及びインビボでＩＬ−１９及びＫＩＭ−１バイオマーカーを使用してコンジュゲート１〜５を試験した。コンジュゲート６〜１０は、生存アッセイを使用してヒト血液で試験したが、以下を参照のこと。
【０１７９】
見かけの毒性は配列依存性であり、選択される抗原及びヘルパー分子の慎重な設計及び試験を必要とする。実験室レベルから動物モデルへのコンジュゲートの倫理的に合理的な移行を確実にするために、細胞株試験を行った。ロバスト性及び低コストにより、ＢＨＫ細胞を選択した。ＢＨＫ（新生児ハムスター腎臓）細胞（ＢＨＫ−２１［Ｃ−１３］ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１０（商標）、ＵＳＡ）をＭＥＭ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ＵＳＡ）中で増殖させた。ＢＨＫ細胞に対する完全培地はＭＥＭ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｅｎｍａｒｋ，１２９４８０８）；＋５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ  Ｆ２４４２）である。加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で細胞を増殖させ、１：５で３回継代し、９０％の集密度に達した。細胞増殖には合計１１日かかった。濃度１ｎＭ又は１０ｎＭのナノコンジュゲート複合体の溶液を１ｘＰＢＳ中の細胞に添加し、２４時間温置した。その後、ＭｅＯＨ（Ｓｉｇｍａ、細胞培養グレード）で細胞を固定し、破壊し、製造元のプロトコールに従って、市販のＥＬＩＳＡキット（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＩＬ  １９キット、Ｒ＆Ｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＡ）を使用してＩＬ−１９の分析に供した。結果を表７で示す。
【０１８０】
【表７】
2021512093.tif 000016
【０１８１】
表７で示すように、毒性に対するバイオマーカーであるＩＬ−１９のレベルを測定するＢＨＫ細胞を使用した分析では、明らかな毒性は検出されなかった。合成ペプチドＴＡＴ（細胞アッセイにおける毒性に対する陽性対照）を添加した場合、ＩＬ−１９レベルが増加した（データは示さない）。全てのレベルが正常な範囲内（７０〜１５０ｐｇ／ｍＬ）であり、コンジュゲートに明らかな毒性がないことを確認したので、次にコンジュゲートをＮＺＢ／Ｗマウスで試験した。
【０１８２】
９週齢のＮＺＢ／Ｗマウスは、Ｈｅｅｇａａｒｄ  ｇｒｏｕｐ，Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋの厚意により提供されたものであり；１０匹のマウス（全て雌）をフィルターで覆われた滅菌ボックスで維持し、滅菌水及び餌を与えた。マウスを１０週間成長させ、平均１７〜１９ｇの体重に達した。標準的ＥＬＩＳＡによって抗ｄｓＤＮＡ抗体（ａ−ｄｓＤＮＡ）の存在について調べるために実験前にマウスから採血した。この実験については、力価１：１０００〜１：１２０００であるａ−ｄｓＤＮＡのみを使用した。ナノコンジュゲート複合体を尾静脈に添加した。１ｘＰＢＳ中でＩＶを使用してナノコンジュゲート複合体を投与し、１０ｎＭ濃度については１６０μｇ／ｋｇ動物体重でナノコンジュゲート複合体を適用した。最初の投与から３６時間後に血液試料を採取し、製造元のプロトコールに従い、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ  １９  ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＡ；ＫＩＭ  １  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  ＡＤＩ−９００−２２６−０００１，ＥＮＺＯ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用してＩＬ−１９及びＫＩＭ−１の分析に供した。これらの結果も表５で示す。
【０１８３】
安定性及び毒性の試験に基づいて、ナノコンジュゲート複合体番号１を最も強力な候補として選択し、インビボでさらに試験した。
【０１８４】
例７：インビボマウスアッセイ
さらなるインビボ試験については、詳細が分かっているマウスモデル：ＮＺＢ／Ｗマウスを選択したが、これらは、１９６０年代初期から自己免疫疾患に対するモデルとして使用されてきた。この雑種交配のマウスは、ヒトＳＬＥに類似した自己免疫疾患を発症する。
【０１８５】
９週齢のＮＺＢ／Ｗマウスは、Ｈｅｅｇａａｒｄ  ｇｒｏｕｐ，Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋの厚意により提供されたものであり；これらを、例６に記載のように、成長させ、抗ｄｓＤＮＡ抗体の存在について試験した。
【０１８６】
ナノコンジュゲート複合体を尾静脈に添加し、１ｘＰＢＳ中でＩＶを使用して投与し、１０ｎＭ濃度に対して１６０μｇ／ｋｇ動物体重で、１ｎＭ濃度に対して１６μｇ／ｋｇ動物体重で、ナノコンジュゲート複合体を適用した。各コンジュゲートに対して２匹のマウスを使用した。マウスにＩＶコンジュゲート／対照投与（各回同量）を５日間１２時間間隔で行い、その後３週間にわたって３日間隔で同用量を投与した。ゲンタマイシンでの処置は、同じ系統及び週齢の対照動物において、それぞれ最終１０ｎＭ及び１ｎＭ投与になるように、１０ｍｇ／ｋｇ動物体重及び１ｍｇ／ｋｇの投与量で使用した。ナノコンジュゲート複合体の場合と同じ投与計画：１２時間間隔で５日間、尾静脈にＩＶ投与し、その後３日間隔で同用量を投与した。
【０１８７】
各処理の開始後２４時間、４８時間、１週間、４週間の時点で血液試料を採取した。Ｑｉａｇｅｎ血液保存チューブを使用して血漿を遠心分離し、分析前に−２０℃で保管した。血清希釈１：１００〜１：５００で製造元のプロトコールを使用してＥＬＩＳＡ分析を実行した。ナノコンジュゲート複合体１に対する結果を図６で示す。１０ｎＭ及び１ｎＭ投与でのコンジュゲートによって、１か月間にわたって疾患活動性指数（ＤＡＩ）が低下するが、一方で対照ではＤＡＩの短期的な低下しか誘発しない。初期の時点では、１０ｎＭコンジュゲートは１ｎＭよりも良好に機能する。しかし、１か月を超えると、ＤＡＩは１ｎＭ及び１０ｎＭの両方のコンジュゲートについて同様に低下し、終了時にＤＡＩは、処置の開始時を２２とすると５となる（ＤＡＩの７８％低下）。
【０１８８】
補体活性化によって引き起こされ得る疾患活動性指数の急上昇がないため、図６のデータにより、ＤＡＩ上昇を引き起こす、コンジュゲートによる補体活性化がないことがさらに間接的に確認される。
【０１８９】
例８：ナノコンジュゲート複合体とヒト初代血液細胞との相互作用
細胞毒性及び血液細胞による取り込みは全て、ナノコンジュゲートに対する潜在的な問題である。これについて、Ｇ５  ＰＡＭＡＭ対照とともに、初代ヒト血液細胞及びコンジュゲート１及び６〜１０（表２）を使用して、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）により実験した。ＦＡＣＳを行うために、このプロトコール後、ＣＹ５．５  ＮＨＳ試薬（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）でナノコンジュゲート複合体及び対照をさらに標識した：１００μＬ重炭酸塩（０．１Ｍ、ｐＨ８．３）中の１ｍｇ／ｍＬの濃度のコンジュゲート１、６〜１０をＤＭＳＯ中の２０μＬの１０ｍＭ色素保存液に添加した。製造元の手順に従って、混合物を３００ｒｐｍで暗所にて一晩撹拌し、その後１０ＫＤａ  ＭＷＫＯ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ透析カセット  カタログ番号８７７２９）で透析した。その後、コンジュゲートをｐＨ７．２の１００ｍＭ  ＰＢＳ中で維持した。
【０１９０】
ＦＡＣＳ実験については、５名のドナー（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）からの新鮮全血を使用した。血液処理及びコンジュゲートとの温置に対するプロトコールを以下で示す。
１．２本のヘパリンチューブからの血液を一緒にプールする（合計約２０ｍＬ）。
２．２０ｍＬの市販のＲＰＭＩ緩衝液（ＦＢＳなし）（Ｓｉｇｍａ  Ｒ０８８３）を添加する。
３．１６００ｒｐｍ、５分、上部のピンク色の層を廃棄する。
４．段階２〜３を２回繰り返す。
５．各ＦＡＣＳチューブに２５０μＬの血液を分注する。
６．３ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１０４９２−０１）でＲＴにて１０分間溶解させる。
７．１６００ｒｐｍ、５分間、上清を廃棄する。
８．２ｍＬのＲＰＭＩ緩衝液で２回洗浄する。
９．２５０μＬ  ＲＰＭＩ緩衝液で再懸濁する。
１０．細胞を数える。５μＬの細胞を取り、９５μＬのトリパンブルーを添加する。
１１．ＲＰＭＩ緩衝液中で調製した指定のコンジュゲート２５０μＬを各チューブに添加する（２０ｎＭを２５０μＬ）。
１２．各５カウントで３回ボルテックス処理することにより、ナノチューブと細胞を混合する。
１３．３７℃で３０分間温置する。キャップを緩めたまま、細胞を生存させ続ける。
１４．チューブを２０分間氷に移すことにより温置を停止する。
１５．２ｍＬのＲＰＭＩ緩衝液を添加し、１６００ｒｐｍ、５分間、上清を廃棄する。
１６．段階１２を繰り返す。
１７．１００μＬのｍｉｌｌｉＱ水の溶液（ＬＤ  ａｑｕａ  ＰＢＳで１：１０００希釈）中で細胞ペレットを再懸濁し、ホイルで覆って室温で１０分。
１８．ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し（ＢＤ  ＦＡＣＳ（登録商標）チューブを使用する場合の洗浄では、各洗浄に対して５００μＬを使用）、５分間、１５００ｒｐｍでスピンし、上清を除去する。ＦＡＣＳ緩衝液は、２％ウシ血清（Ｓｉｇｍａ  １２１３３Ｃ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％アジ化ナトリウムであった。
１９．１００μＬブロッキング緩衝液中でペレットを再懸濁する＊（ＰＢＳ中５％熱不活化ＡＢ血清及び５％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４４１７）））。
２０．氷上で１５分間温置する。
２１．抗体ＣＤ２０（ＣＤ２０抗体（０．Ｎ．８５）：ｓｃ−７０５８２，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＨＬＡＤＲ（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、ヒト（クローン：ＡＣ１２２）、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を直接細胞に添加する（各抗体に対して２μＬ／１００μＬ細胞懸濁液）。
２２．氷上で３０分間温置する。
２３．１５００ｒｐｍで５分、４℃でスピンする。
２４．２００μＬのＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ溶液（ＢＤ  ５５４７１４）中でペレットを再懸濁することにより細胞を固定する。ボルテックスしながら、又は頻繁にボルテックスしながら、Ｃｙｔｏｆｉｘ溶液を細胞ペレットにゆっくりと添加する。暗所にてＲＴで２０〜３０分間温置する。
２５．５００μＬのＦＡＣｓ緩衝液で洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁する。
２６．４℃に維持し、分析まで（２４時間以内）光を避ける。
【０１９１】
得られた試料をＢＤ  ＦＡＣＳ（登録商標）機器（ＢＤ  ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（商標））上で分析した。特異的な細胞取り込みに対する結果を表８で示す。
【０１９２】
【表８】
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【０１９３】
表８は、ＰＥＧ化Ｇ５  ＰＡＭＡＭデンドリマー（対照）が好中球によって殆ど取り込まれ、ＮＫ、Ｔ、及びＢ細胞によってあまり取り込まれず、一方で単球がＧ５のごく僅かしか取り込まないことを示す。オリゴヌクレオチド、炭水化物及び脂質を添加する場合（コンジュゲート１）、全ての細胞に対するレベルがＧ５のみに幾分類似しているが、一方で脂質部分（コンジュゲート６）を除去すると、好中球による取り込みが増加する。ヒストンペプチド（コンジュゲート７〜１０）の場合、脂質の効果は劇的になる。脂質が存在しない場合（コンジュゲート９〜１０）は、取り込みが多く、これはほぼ好中球によるものであり、脂質の存在下では８〜１２に低下する（コンジュゲート７〜８）。
【０１９４】
このデータは、次の３つの重要な事実を示唆している：（１）Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球は、コンジュゲートによりあまり影響を受けない。これは、活性化がないことを意味し、治療薬に対する低毒性／副作用を確認するものである；（２）ペプチド含有治療薬は、ＤＮＡコンジュゲートよりも単球によってより多く取り込まれるが、Ｔ及びＢ細胞は依然として影響をあまり受けない；（３）特にペプチド含有コンジュゲートに対して、好中球による取り込み強度を精密に調整するための道具として脂質付加が使用され得る。これは、例えば関節リウマチにおいて、薬物送達のために非常に重要である。この発見から、血流中で治療薬を維持することが目標であると仮定すると、生体内分布における脂質付加の好ましい影響も示唆される。
【０１９５】
例９：コンジュゲートを付加した際の細胞生存率
コンジュゲートを付加した際の細胞生存率は、Ａｂｃａｍ発光キット（ａｂ６５３１４  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）を使用して評価した。アッセイに対する手順は、製造元のプロトコールに従って実行した。ＡｂｃａｍのＣｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ａｂ６５３１４（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）は、哺乳動物細胞におけるアポトーシス及び細胞増殖を同時に迅速にスクリーニングするためにＡＴＰレベルの生物発光検出を利用する。アッセイは、ＡＴＰ及びルシフェリンからの光の形成を触媒するためにルシフェラーゼを利用し、光はルミノメーター又はベータカウンターを使用して測定し得る。アッセイはハイスループット（１０秒／試料）用に完全自動化される。ナノコンジュゲート複合体との初代細胞に対する温置反応を含有するマイクロタイタープレートを分析した。初期のＡＴＰ濃度（コンジュゲート添加前）は０．１５ｐＭ±４％であった。細胞生存率は、図７（Ｍａｇｅｌｌａｎ  Ｔｅｃａｎマイクロプレートサンライズリーダーを使用）で与えられるように、ウェルあたりのＡＴＰ濃度の変化が低い〜変化がないものとして監視した。検出に対する原理は、ＡＴＰ＋ルシフェラーゼ＋ルシフェリン−＞可視光（プレートリーダーにより検出）であり、故にＡＴＰが多い＝光が多い（詳細については、キットマニュアル（ａｂ６５３１４  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）を参照）。陽性対照：１５％ＤＭＳＯ−１ｘＰＢＳ（１０２３６２７６００１  Ｒｏｃｈｅ）中の濃度１ｍｇ／ｍＬのＤＡＰＩ。ＤＡＰＩの場合、ＡＴＰレベルの初期濃度からの低下は、４８時間の時点で２６倍に達した。
【０１９６】
それぞれ無毒性及び高毒性のものとしての、何も添加していない細胞に対するデータ及びＤＡＰＩデータと、コンジュゲートに対して得られた値を比較した。細胞生存率が低値であることは毒性が高いことを意味し、その逆もまた成立する。細胞生存率アッセイから、コンジュゲート構造において毒性の可能性があるペプチドが存在する場合でも、コンジュゲートの添加により初代ヒト細胞に対して僅かしか影響がないことが分かった（コンジュゲート対ＤＡＰＩ）。また、脂質付加は、後の時点４８時間で、コンジュゲート７、８対９、１０に対して、生存に好ましい効果があることも分かった。
【０１９７】
例１０：標識付加ＰＡＭＡＭナノ粒子の合成
段階１．スルホ−Ｃｙ５．５によるＰＡＭＡＭの標識化
最初の段階で、ＰＡＭＡＭ  Ｇ５をスルホ−Ｃｙ５．５  ＮＨＳ試薬で標識した。ＤＭＳＯ中のスルホ−Ｃｙ５．５  ＮＨＳの保存溶液（１０ｍＭ；０．５μＬ）を１００ｍＭ重炭酸緩衝液、ｐＨ８．３（２００μＬ）中のＰＡＭＡＭ／Ｇ５前駆体（１ｎｍｏｌ）の溶液に添加した。反応物を一晩暗所で維持し、２０Ｋメンブレン２ｘ５００ｍＬ  ｍＱに対する、１時間及び一晩（５００ｍＬ  ＭＱ）の透析により精製した。
【化８】
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【０１９８】
段階１で使用したスルホ−シアニン５．５ＮＨＳエステルの化学構造。
【０１９９】
段階２．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１５ｍＭ；１００μＬ）をＭＱ水：ＤＭＦＡ４：１ｖ／ｖ中でＰＥＧ５０００  ＣＯＯＨ（１０ｍＭ；１００μＬ）及び／又は脂質／炭水化物試薬（１０ｍＭ；１００μＬ）と３時間にわたり温置した。生じた溶液を１５ｍＭ  ＤＩＣの存在下で、１ｘ重炭酸緩衝液（ｐＨ８．２；２００μＬ）中の１ｍＭ  Ｇ５  ＰＡＭＡＭに添加した。段階１からの標識デンドリマー及びその非標識前駆体の両方を個別の実験で反応させた。反応物を室温で一晩振盪しながら（３００ｒｐｍ）維持し、生成物を１０Ｋメンブレン２ｘ５００ｍＬ  ＭＱに対して一晩透析することにより精製した（５００ｍＬ  ＭＱ）。
【０２００】
段階３：ペプチド抗原とのアミドカップリング
Ｖａｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  Ｖｏｌ．３８（２００９）ｐｐ６０６−６３１に記載のようにカップリングを実行した。所望のペプチド（３００μＬ  ＤＭＳＯ中２０ｎｍｏｌ）をＤＣＣ（３０ｎｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（３０ｎｍｏｌ）とともに室温で１時間温置した。生じた混合物を段階２の生成物（２００μＬ  ｍＱ中１ｎｍｏｌ）に添加し、反応物を２５０ｒｐｍ下で振盪しながら室温で２時間維持した。２ｘ５００ｍＬ  ＭＱを使用して一晩（５００ｍＬ  ＭＱ）、１４Ｋメンブレンに対して透析することにより生成物を精製した。
【０２０１】
下記のように、ゲル電気泳動、ＵＶ−ｖｉｓ吸光度及び蛍光によって生成物を分析した。ｐＨ８．２でＯＤ２５５によって製品中のＰＡＭＡＭの濃度を測定した。ナノ粒子は、ＤＬＳ及びＳＥＭにより特徴評価した。
【０２０２】
例１１：標識付加キトサン−ヒアルロン酸（ＣＳ−ＨＡ）ナノ粒子の合成
この研究では、ＣＳ−ＨＡナノ粒子の高い複合体形成活性により、抗原の連結を非共有結合的に行った。ＣＳ及びＨＡは炭水化物そのものであるので、及び脂質のカップリングはＣＳ−ＨＡ複合体に対する許容されるｐＨ範囲では効率的ではなかったため、脂質及び炭水化物はこの研究については複合体に追加しなかった。
【０２０３】
段階１．ＤＮＡ／ＲＮＡ及び／又はペプチド抗原の封入
ｐＨ６．５で、０．０６９％ｗ．キトサン（１２０ｋＤａ）を２ｍＬの１ｘＰＢＳ及びＤＮＡ／ＲＮＡ（１．２ｎｍｏｌ）及び／又はペプチド（１．２ｎｍｏｌ）中で溶解させた。混合物を撹拌下、１０００ｒｐｍで１０分間維持した。製品は、製造元のプロトコールに従って、ＭＷＫＯ  ５ｋＤａのＡｍｉｃｏｎフィルター装置で精製した。生成物を２ｍＬの１ｘＰＢＳ、ｐＨ６．５で再構成した。
【０２０４】
段階２  ヒアルロン酸の標識及びペグ付加
ヒアルロン酸（０．１５ｍｇ／ｍＬ；１０ｋＤａ）を１．７ｍＬのｍＱ水中で溶解させ、ＮＨＳ（０．６μｍｏｌ、１０μＬの水中６．９ｍｇ／ｍＬ新鮮保存液）を添加した。混合物を１０００ｒｐｍで一晩撹拌し、その後１ｘ重炭酸塩（ｐＨ８．０；２００μＬ）、メトキシ−ＰＥＧ−アミン（０．３μｍｏｌ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２６０２６−１）及び／又はスルホ−Ｃｙ５．５アミン（０．３μｍｏｌ；Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ））を総体積２．３ｍＬで添加した。反応物を室温、１０００ｒｐｍ、暗所で一晩撹拌し、製造元のプロトコールに従ってＡｍｉｃｏｎ  １０ｋＤａ  ＭＷＫＯを使用して処理した。生成物を２ｍＬの１ｘＰＢＳ、ｐＨ５で再構成した。スルホ−Ｃｙ５．５標識製品は加熱するべきではなく、光に曝露させ得ない。
【化９】
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【０２０５】
スルホ−Ｃｙ５．５アミン及びメトキシ−ＰＥＧ５０００−アミン試薬の化学構造。
【０２０６】
段階３：ヒアルロン酸とのキトサンの複合化
段階１の生成物（１ｍＬ）を上記の緩衝液中の段階２の生成物（１ｍＬ）と混合した。製造元のプロトコールに従って、混合物を室温で３０分間、１０００ｒｐｍで振盪しながら維持し、５０ｋＤａ  ＭＷＫＯ  Ａｍｉｃｏｎにより精製した。
ナノ粒子は、ＤＬＳ及びＳＥＭにより特徴評価した。
【０２０７】
例１２：ＳＬＥマウス試験
ＣＳ−ＨＡ−ＰＥＧ５０００−Ｄ１ナノコンジュゲート複合体（例１１に記載のとおりに合成）をＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスで試験した：１０ｎＭ濃度に対して１６０μｇ／ｋｇ動物体重のコンジュゲート投与量で、１ｘＰＢＳ中のＣＳ−ＨＡ−ＰＥＧ５０００−Ｄ１を２週間にわたり１２時間ごとに尾静脈にＩＶ投与した。３０匹のマウスを試験した；８０％は雌であり；平均２０週齢；平均体重／中央値２０，２ｇ（１８，４ｇ〜２３，１ｇ）。ハイドロキノン（ＨＱ）を対照として、ＰＯ、２ｍｇ／ｋｇで、２週間にわたり２４時間ごとに使用した。
【０２０８】
図８Ａでは、ＣＳ−ＨＡ−ＰＥＧ５０００−Ｄ１ナノコンジュゲート複合体処置で処置したマウスに対するＳＬＥＤＡＩ（ＳＬＥ疾患活動性指数）をＨＱ対照と比較して、それぞれ白丸及び黒丸として示す。ＨＱ処理はＳＬＥＤＡＩをより早く低下させるが；この疾患は処置第１７日の後に再燃する。ＣＳ−ＨＡ−ＰＥＧ５０００−Ｄ１は、処置コース全体にわたりＳＬＥＤＡＩをより安定して低下させ、２週間後に低いＳＬＥＤＡＩレベルを維持する。
【０２０９】
対照として、２０匹の健康なマウス（対照；ＫＯ）をＣＳ−ＨＡ−ＰＥＧ５０００−Ｄ１複合体で処理し；上記と同じ治療計画を実施した。結果を図８Ｂに示し、ＤＡＩレベルがないことを確認する。
【０２１０】
例１３：抗原Ｄ７及びＤ８の選択性
目標は、合成抗原を使用して疾患関連抗体を精製し；抗原の選択性をさらに研究することであった。
【０２１１】
合成抗原Ｄ７及びＤ８（表９参照）を合成し、それらの選択性を試験した。
【０２１２】
【表９】
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【０２１３】
血清からのＳＬＥ抗体は、ＮＨＳ−セファロース及び表９で指定されるような修飾抗原を使用したアフィニティクロマトグラフィーによって捕捉した。抗体の重力アフィニティ精製であるＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅのプロトコールに従った：カラムにセファロースを充填し、０．０１％冷ＨＣｌで洗浄し；０．１Ｍ重炭酸塩ｐＨ＞８中の２ｍｇ／ｍＬ  ｄｓ抗原を添加し；１時間温置し；１０カラム体積のＮａＯＡｃで洗浄し；５〜１０カラム体積の５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７で洗浄した。血清をＣａＣｌ２／デキストランで前処理して、カラムに適用する前にリポタンパク質を除去した。血清試料をカラムに添加し；４分間温置し；２０ｍＭ  ＰＢＳ、５カラム体積で流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで洗浄し；最後に３カラム体積の１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、１０％ジオキサンｐＨ２．５〜３でＳＬＥ抗体を溶出させた。
【０２１４】
標準ＥＬＩＳＡを使用して、Ｄ７及びＤ８の選択性を試験した。他の抗体を含む対照試料と比較して、精製ＳＬＥ抗体に特異的に結合するそれらの能力について、それぞれ抗原Ｄ７及びＤ８を含むＥＬＩＳＡプレートを試験した。特にＤ８はＳＬＥ抗体に対して選択的である一方で、Ｄ７はそうではなかったことが分かった。
【０２１５】
例１４：ＲＡ  ｃｉｔ−ＰＥＰライブラリのスクリーニング
自己免疫疾患では、エピトープ−抗体複合体は、薬物の特異的な取り込みを惹起するための強力な相互作用である。特にＡＣＰＡは、ＲＡ関連の免疫細胞に侵入するための興味深い受容体である。従って、最初の目標は、ＲＡ関連細胞を標的とするための効果的なシトルリン化ペプチドエピトープを同定することであった。表１０は、この研究でスクリーニングしてきた選択された２５種類のペプチド配列を示す。
【０２１６】
【表１０】
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【０２１７】
シトルリン化ペプチドエピトープは、それらが由来するタンパク質に基づいて３つの主要な群：フィブリノーゲン（ＰＥＰ１〜ＰＥＰ１４）、ビメンチン（ＰＥＰ１５〜ＰＥＰ２０）及びヒストン３（ＰＥＰ２１〜ＰＥＰ２５）由来のペプチドに属していた。ペプチド選択の背後にある理論的根拠は、報告された配列及びＲＡでの確認された活性である。ビメンチン及びフィブリノーゲンは個体間で突然変異していることが多い。これを考慮に入れるために、フィブリノーゲン及びビメンチンに対する突然変異した配列変異体は、ＢＳＩ  ＳＰＩＤＥＲ相同性検索ソフトウェアを使用して認識されている。
【０２１８】
シトルリン化ペプチド抗原ＰＥＰ１−ＰＥＰ２５（配列番号９〜３３）（遊離アミン及びカルボキシ末端）は、ＣＡＬＳＯ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋから購入し、３０名のＲＡ患者、３０名の対応健常対照及び３０名の全身性エリテマトーデス患者のコホートのＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。結果を表９で示す。全体として、３つの群全てからの１６種類のペプチド抗原（５３％）がＲＡ血清を認識した。しかし、ヒストン３由来のＰＥＰ２１〜ＰＥＰ２５は、１７〜２３％の健常対照でシグナル上昇を示した。複数のフィブリノーゲン由来ペプチドはＲＡ血清で、また対照疾患ＳＬＥ血清でも高い認識率を示し（１０〜５７％及び７〜２３％）、一方でビメンチンペプチドはＲＡで結合レベルがより低かった（２３〜３０％）。
【０２１９】
次に、発明者らは、突然変異フィブリノーゲン及びビメンチンのエピトープを天然タンパク質と比較した。ＥＬＩＳＡの前に、突然変異エピトープがＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴにおけるネイティブタンパク質に対する相同体として確認されており、同一性スコアは９０〜１００％であった。ＥＬＩＳＡでは、特にフィブリノーゲンエピトープにおける突然変異が抗体認識に大きな影響を及ぼした。逆に、ビメンチンエピトープにおける突然変異はＡＣＰＡ結合レベルに殆ど影響がなかった〜全く影響がなかった。発明者らの知る限りでは、これはＡＣＰＡ結合に対してフィブリノーゲンエピトープ内の突然変異が大きく影響することを示す最初の報告である。最後に、ＢＳＩはヒストン３由来の配列において突然変異体を識別せず、これは、ヒストンが稀にしか突然変異しない非常に保存的なタンパク質であるという事実と一致する。
【０２２０】
試験した全てのペプチドエピトープの中で、配列ＨＨＰ  ＧＩＡ  ＥＦＰ  Ｓ（Ｃｉｔ）Ｇ  ＫＳＹ  ＳＹＳ  ＫＱＦ（Ｃｉｔ＝シトルリン）を有するＰＥＰ２は、ＲＡ試料において高い結合を示し（５７％）、健常対照及びＳＬＥ（０％及び７％）における結合は低かった〜全くなかった。これは、ＲＡに対するシトルリン化フィブリノーゲンの高い関連性を示唆する以前の報告と一致している。
【０２２１】
例１５：ＰＥＰ２−ナノコンジュゲートの調製：キトサン／ヒアルロン酸／ＰＥＧ／ＰＥＰ２
Ｉ）ＣＳ／ＨＡへのＰＥＧを介したペプチドの共有結合
ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２Ｆｍｏｃを用いてＣ末端を介して固体支持体上でペプチド抗原を修飾した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して標準プロトコールに従ってＰＥＰ２上のＦｍｏｃ基を脱保護した。
【０２２２】
ヒアルロン酸及びＰＥＧ−ＰＥＰ２生成物の共有結合は、ＰＥＧ上のアミド結合を介して行った。これを行う際に、１ｍｇ  ＮＨＳ及び１．３ｍｇ  ＥＤＣを使用して、ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング反応を介してｐＨ８．３で１ｍｇヒアルロン酸と０．５ｍｇのＰＥＰ２−ＰＥＧ  ＮＨ２をカップリングさせた。混合物を８００ｒｐｍで６時間撹拌した。次に、ＮＨＳ／ＥＤＣ及び非コンジュゲートＰＥＧ−ＰＥＰ２の残留物を除去するための標準プロトコールに従って、分子量カットオフ（ＭＷＣＦ）５ｋＤａのＡｍｉｃｏｎフィルター装置で生成物を精製した。複合体の特性評価は、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ及びＵＶ  ＶＩＳによって行った。ＭＡＬＤＩの結果は、ペグペプチドのピークを示さず、続いてＵＶ  ＶＩＳにおける２８０ｎｍでのペプチドの吸収ピークを示し、これによりペグペプチドとヒアルロン酸との共有結合が示された。
【０２２３】
得られた共有結合複合体ＰＥＰ２−ＰＥＧ−ＨＡを３ｍｇのキトサンと８００ｒｐｍで１時間混合した。０．０１Ｍグリシンで１０分間反応を消滅させた。次に、試料を以下に示すＮａｎｏｓｉｇｈｔ及びＳＥＭにより分析した。
【０２２４】
ＩＩ）ＣＳ／ＨＡへのペプチドの非共有結合
段階１．ＰＥＰ２の封入：ｐＨ６．５で、０．０６９％ｗ．キトサンを２ｍＬの１ｘＰＢＳ中で溶解させ、ＰＥＰ２（１．２ｎｍｏｌ）を添加した。混合物を撹拌下、１０００ｒｐｍで１０分間維持した。製品は、製造元のプロトコールに従って、ＭＷＫＯ  ５ｋＤａのＡｍｉｃｏｎフィルター装置で精製した。生成物を２ｍＬの１ｘＰＢＳ、ｐＨ６．５で再構成した。
【０２２５】
段階２  ヒアルロン酸の標識及びペグ付加：ヒアルロン酸（０．１５ｍｇ／ｍＬ；１０ｋＤａ）を１．７ｍＬのｍＱ水中で溶解させ、ＮＨＳ（０．６μｍｏｌ、１０μＬの６．９ｍｇ／ｍＬ水中新鮮保存液）を添加した。混合物を１０００ｒｐｍで一晩撹拌し、その後１ｘ重炭酸塩（ｐＨ８．０；２００μＬ）、メトキシ−ＰＥＧ−アミン（０．３μｍｏｌ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２６０２６−１）を総体積２．３ｍＬで添加した。反応物を室温、１０００ｒｐｍ、暗所で一晩撹拌し、製造元のプロトコールに従ってＡｍｉｃｏｎ  １０ｋＤａ  ＭＷＫＯを使用して処理した。生成物を２ｍＬの１ｘＰＢＳ、ｐＨ５中で再構成した。
【０２２６】
段階３：ヒアルロン酸とのキトサンの複合化：上記の緩衝液中で段階１の生成物（１ｍＬ）を段階２の生成物（１ｍＬ）と混合した。製造元のプロトコールに従って、混合物を室温で３０分間、１０００ｒｐｍで振盪しながら維持し、５０ｋＤａ  ＭＷＫＯ  Ａｍｉｃｏｎにより精製した。
【０２２７】
Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ実験：Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ測定は、Ｊａｎｇ研究室、ＤＴＵで、Ｎａｎｏ  ｓｉｇｈｔ装置ＮＴＡバージョン：ＮＴＡ  ３．１  Ｂｕｉｌｄ  ３．１．４６をＳｃｒｉｐｔ  ＳＯＰ標準測定０３−４７−１９ＰＭ  ２０Ｄとともに使用して行った。装置のセルは、エタノール及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水により完全に洗浄し、ねじを外さなければならない。５００μＬの希釈試料を３回の試験に対して３回注入し、試料の濃度が分析に適合しない場合は、水ｐＨ６を使用してナノ粒子の濃度を調整した。サイズ分布データ及び最大粒子数のサイズを記録した。図１０を参照のこと。
【０２２８】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）：キトサンナノ粒子（ＮＰ）の形態を、Ｑｕａｎｔａ  ＦＥＧ  ３Ｄ走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して調査した。試料を両面接着カーボンテープで金属スタブに取り付け、スパッタコーター（Ｌｅｉｃａ  Ｃｏａｔｅｒ  ＡＣＥ  ２００）を使用して導電性をより高めるために６ｎｍの金でコーティングした。平均ＮＰ直径は、各画像に対する異なるＮＰで測定された画像Ｊ分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して計算した。共有結合した複合体（図１１Ａ）に対して平均ナノ粒子サイズは１００〜３００ｎｍであり、ナノサイトの測定（図１０Ｂ）と一致し、一方で非共有結合複合体（図１１Ｂ）に対する平均ナノ粒子サイズは５２０ｎｍであり、同様にナノサイトの測定と一致する（図１０Ｃ）。
【０２２９】
ＰＥＰ２−ナノコンジュゲートのＥＬＩＳＡ試験：
ＥＬＩＳＡの前に、既知の濃度のＢＳＡ対照の標準曲線（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により各試料中のタンパク質の総量を推定した。Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート対照（濃度２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ標準試料）及び血漿試料を製造元のプロトコール（ＢｉｏＲａｄ）に従ってＢｒａｄｆｏｒｄ試薬と混合した。血漿試料は１：１００希釈で使用した。生じた５９５ｎｍの吸光度をＭａｇｅｌｌａｎ  Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーで測定した。タンパク質の総量は、標準曲線を使用して計算した。
【０２３０】
ＥＬＩＳＡ：Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を１ｘＰＢＳ中濃度８μｇ／ｍＬのナノ粒子抗原／対照で一晩（室温；１００μＬ／ウェル）コーティングした。１ｘＰＴ（２ｘ３００μＬ／ウェル、ＰＴ：１Ｌ  １ｘＰＢＳ中５０μＬ  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した後、１ｘＰＴＢでプレートをブロッキング処理した（１時間、３７℃；１００μＬ／ウェル、ＰＴＢ：１Ｌ  １ｘＰＢＳ中２０ｇ  ＢＳＡ、５０μＬ  Ｔｗｅｅｎ−２０）。希釈液：２ｇ  ＢＳＡ、１Ｌ  １ｘＰＢＳ中の５０μＬ  Ｔｗｅｅｎ−２０（１００μＬ／ウェル）を使用して、室温で１．５時間にわたり所望の希釈率で血漿との温置を行った。これに続いて、洗浄し（２ｘ３００μＬ  １ｘＰＢＳ）、供給者により提供される二次抗体の同じ希釈液及び希釈を使用し（ＨＰＲ結合ａ−ａＩｇＧ；Ｓｉｇｍａ）、ＨＰＲ標識二次抗体とともに室温で１．５時間、温置した。その後の洗浄（２ｘ３００μＬ  ＰＴ）及び新たに調製したＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液（Ｓｉｇｍａ；１００μＬ／ウェル）との温置に続いて、停止溶液（１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４；５０μＬ／ウェル）を添加し、Ｍａｇｅｌｌａｎ  Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍにて生じた吸光度値を読み取った。各抗原に対する直線状範囲は、一連の対照希釈（１：５０〜１：２０００の希釈のＳＬＥ及び健常対照）を試験することを介して決定した。結果によれば、血漿希釈１：１００〜１：５００は各抗原に対するアッセイの直線範囲内であった（Ｒ２＞０．９５）。
【０２３１】
上記のように調製した抗原ＰＥＰ２及びＮＰに対するＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を表１１で示す。
【０２３２】
【表１１】
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【配列表フリーテキスト】
【０２３３】
配列表１  ＜２２３＞ＳＬＥ疾患において抗ＤＮＡ抗体により標的とされる特異的ＤＮＡ−抗原
配列表２  ＜２２３＞ＳＬＥ疾患において抗ＤＮＡ抗体により標的とされる特異的ＤＮＡ−抗原
＜２２３＞ＳＬＥ疾患において抗ＤＮＡ抗体により標的とされる特異的ＤＮＡ−抗原
配列表３  ＜２２３＞抗核抗体に結合するためにヒストンＨ３ペプチドを模倣する特異的ペプチド抗原
配列表４  ＜２２３＞Ｐ４１、肝臓標的ペプチド
配列表５〜６  ＜２２３＞抗核抗体に結合するためにヒストンＨ３ペプチド（部分的）を模倣する特異的ペプチド抗原。本ペプチドはＮ末端でアセチル化される。
配列表７〜８  ＜２２３＞抗原
配列表９〜３３  ＜２２３＞可能性のあるペプチドエピトープ
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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