(57)【要約】  淋菌感染等の生殖管感染症の再発を治療する及び低減する方法を提供する。前記方法は、高分子ミクロスフェアに組み込まれたＩＬ-１２の局所投与を含む。淋菌によって引き起こされる生殖管感染症の発生率を、淋菌由来の外膜小胞調製物及び高分子ミクロスフェアに組み込まれたＩＬ-１２の投与によって、低減するための方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において、淋菌による生殖管感染症のリスクを低減する方法であって、前記個体に、高分子ミクロスフェアに組み込まれたＩＬ-１２、及び淋菌に由来する外膜小胞(ＯＭＶ)を、生殖管感染症に罹患するリスクを低減するのに有効な量で、前記個体に鼻腔内投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
ＩＬ-１２ミクロスフェア及びＯＭＶが、同じ組成物中で送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＬ-１２ミクロスフェア及びＯＭＶが、３週間以内の期間にわたって複数回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ-１２ミクロスフェア及びＯＭＶが、投与と投与の間に少なくとも約１週間の間隔をあけて、２〜４回投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＩＬ-１２ミクロスフェア及びＯＭＶが、投与と投与の間に約２週間の間隔をあけて、２回投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＯＭＶが、一用量あたり０．０１〜２０００μｇタンパク質の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＯＭＶが、一用量あたり０．０１〜１０００μｇタンパク質の範囲内である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＯＭＶが、体重１ｋｇあたり０．５〜３０μｇの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＩＬ-１２が、一用量あたり１〜５００μｇの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬ-１２が、体重１ｋｇあたり１０ｎｇ〜１０μｇの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＯＭＶが、一用量あたり０．０１〜２０００μｇタンパク質の範囲内であり、ＩＬ-１２が、一用量あたり１〜５００μｇの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
鼻腔内投与用の組成物であって、淋菌外膜小胞(ＯＭＶ)及びＩＬ-１２を含有しており、ＩＬ-１２は、医薬キャリア中の、高分子ミクロスフェアに組み込まれている、組成物。
【請求項１３】
ＯＭＶが、一用量あたり０．０１〜２０００μｇタンパク質の範囲内であり、ＩＬ-１２が、一用量あたり１〜５００μｇの範囲内である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、可溶性ＩＬ-１２を実質的に含まない、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
淋菌感染症に対して個体を鼻腔内予防接種するためのキットであって、
淋菌外膜小胞(ＯＭＶ)及びＩＬ-１２を含有している鼻腔内投与に適した組成物を複数用量含んでおり、
ＩＬ-１２は、医薬キャリア中の、高分子ミクロスフェアに組み込まれており、
一用量あたりのＯＭＶの量は０．０１〜２０００μｇタンパク質であり、一用量あたりのＩＬ-１２の量は１〜５００μｇであり、任意で、組成物の投与に関する説明書を含む、キット。
【請求項１６】
淋菌感染症に対して個体を鼻腔内予防接種するためのキットであって、
ｉ）淋菌外膜小胞(ＯＭＶ)を含む鼻腔内投与に適した組成物：ここで、一用量あたりのＯＭＶの量は０．０１〜２０００μｇである；
ii）ＩＬ-１２を含む鼻腔内投与に適した組成物：ここで、ＩＬ-１２は、高分子ミクロスフェアに組み込まれており、一用量あたりのＩＬ-１２の量は１〜５００μｇである；及び
iii）任意で、ｉ）及びii）を組み合わせるため、及び組み合わせた組成物を投与するための説明書
を別々に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は2017年11月28日に出願された米国特許出願第15/824,700号の一部継続出願で2018年9月21日に出願された米国特許出願第16/138,526号の優先権を主張し、その各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成AI074791の下で、政府の支援を受けて完成された。政府は、本発明に所定の権利を有する
【背景技術】
【０００３】
本発明は、IL-12及び淋菌(Neisseria gonorrhoeae)由来の外膜小胞を含む組成物、ならびに生殖管感染症の治療のためのこのような組成物の使用方法に関する。
【０００４】
淋菌による生殖器(生殖管)感染症は淋疾を引き起こすが、これは米国で報告されている感染症のうち２番目に多く、年間３０万人以上に影響を及ぼすが、実際の発症率はその数の少なくとも２倍であると考えられている。淋病の世界的な発生率は、年間１億例を超えると推定されている。未治療の淋病は上部生殖器管に上行し、骨盤内炎症性疾患及び卵管瘢痕を引き起こし、不妊症及び生命を脅かす可能性のある子宮外妊娠のリスクにつながるため、女性は感染の負担が大きい。しかし、感染女性の大部分(さまざまであるが、最大で５０％あるいはそれ以上)は、無症候性に感染し、それにより、性的接触者に感染が広がる危険性が増大する。対照的に、男性は通常、数日以内に感染を自覚するようになるため、治療を求めるように促される。新生児は感染した産道を通った結果、眼に感染することがあり、未治療のままだと失明に至る。未治療の淋病はまた、HIVを獲得し、伝達するリスクを５倍まで増加させることが知られている。治療は抗生物質に依存するが、淋菌は最も最近のフルオロキノロン系(シプロフロキサシン)を含む、淋菌に対して使用される各クラスの抗生物質に対して急速に耐性となり、現在推奨されている抗生物質はセファロスポリン系である。しかし、これらに対する耐性が出現し始めており、淋菌多剤耐性となっている。様々な努力にもかかわらず、淋菌に対するワクチンは現在利用できない。ワクチンの努力は淋菌の広範な抗原変異性によって複雑になっており、リポオリゴ糖(LOS)、ポリン、ピリン、及び混濁タンパク質(Opa)を含む大部分の主要表面抗原は、相変異発現(LOS、Opa、線毛)、アレル変異(ポリン、Opa)、又は組換え発現(ピリン)を受ける。このように、疾患の治療及び制御のための選択肢は限られたものになりつつある。淋病の不可解ではあるがよく知られている特徴は、感染からの回復が、再感染に対する防御免疫につながらず、感染を繰り返すことが多いことである。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、淋菌抗原、及び、高分子ミクロスフェア(polymeric microsphere)に組み込まれたIL-12を個体に投与することによって、淋菌感染症を発症するリスクを低減する方法を提供する。淋菌抗原は、外膜小胞又は微小胞の形態であってもよい。他の形態の抗原(例えば、精製又は半精製された)もまた、使用され得る。淋菌抗原調製物(例えば、OMV)及びIL-12ミクロスフェアは単一の組成物又は異なる組成物中で、同じ経路又は異なる経路によって、同時に又は異なる時間に、同じ期間及び同じ送達レジメンで、又は異なる期間及び異なる送達レジメンで送達され得る。例えば、淋菌OMV及びIL-12ミクロスフェアは、膣内に送達され得るか、又は鼻腔内に送達され得る。
【０００６】
１つの局面において、本開示は、高分子ミクロスフェアに組み込まれたIL-12の局所適用による頸膣部感染の治療のための方法を提供する。いかなる特定の理論によっても束縛されることを意図しないが、高分子ミクロスフェアに組み込まれたIL-12の粘膜表面への局所的な適用は、既存の感染に対する身体自身の免疫応答を増強し、その結果、その感染の減少又は排除及び/又は反復感染に対する免疫の生成を生じると考えられる。一実施形態では、その量は、感染を引き起こす微生物に対するTh1誘発応答を促進するのに十分である。IL-12の量は、原因微生物に対する治療効果、予防効果、又はその両方を提供するのに十分であり得る。本方法により治療可能な感染症には、淋菌、クラミジア・トラコマチス(C. trachomatis)、又はその両方によって引き起こされる感染症が含まれるが、これらに限定されるものではない。IL-12のマイクロカプセル化に使用することができるポリマーの例はポリ乳酸である。
【０００７】
１つの局面において、本開示は、膣内送達に適した、淋菌から調製されたOMVと、IL-12を含有するミクロスフェア(ms)とを含む組成物を提供する。
【０００８】
１つの局面において、本開示は、淋菌から調製されたOMVとIL-12含有ミクロスフェアを膣内送達するためのキットを提供する。OMVおよびIL-12msは、別々の組成物または同じ組成物として存在してもよい。キットはOMV組成物及びIL-12組成物の複数用量、ならびに投与のための説明書を含んでもよく、これは頻度、投与レジメンの長さ、投与の様式などに関する説明書を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明の性質及び目的をより完全に理解するために、添付の図面と併せて以下の詳細な説明が参照される。
【００１０】
［図１］
図１は、ポリ乳酸(PLA)ミクロスフェアに封入された1μgのIL-12による膣内治療が、マウスにおいて、淋菌による膣感染の経過に及ぼす効果を示すグラフである。
【００１１】
［図２］
図２は、淋菌の一次感染時中のIL-12ミクロスフェアの膣内投与が、マウスにおいて、淋菌の二次腟感染の経過に及ぼす効果を示すグラフである(図１)。
【００１２】
［図３］
図３は、1μgの可溶性IL-12-対-マイクロカプセル化IL-12による膣内処置が、マウスにおいて、淋菌による膣感染の経過に及ぼす効果を示すグラフである。
【００１３】
［図４］
図４は、BALB/cマウスにおける一次淋菌感染に対する膣内IL-12ミクロスフェア(ms)処置の効果を示すグラフである。
（Ａ）IL-12ms用量最適化実験。規定用量のIL-12を含むミクロスフェアを、0、2、4、6、8日目に、各n＝8匹のマウスに投与した。淋菌(Ngo)負荷を膣スワブ培養により毎日モニタリングした。マイクロカプセル化IL-12の2.0μg(p＜0.01)、1.0μg(p＜0.01)、又は0.5μg(p＜0.05)で処置したマウスと対照との間で感染負荷の有意差が認められた(ANOVA)。
（Ｂ）IL-12ms、可溶性IL-12、IL-17ms、又は対照msで処置したマウス、又は未処置マウスにおける感染の経時変化；サイトカイン用量＝1.0μgを-1、1、3、5、7日目に投与；各群n＝8マウス。IL-12ms(p＜0.01)又はIL-17ms(p〜0.01)で処置したマウスと対照との間で感染負荷の有意差が認められた(ANOVA)。
（Ｃ）Ｂに示される実験からのデータは、示されたサイトカイン処置下で感染したままであるマウスのパーセンテージとしてプロットされた。IL-12ms(p＜0.0001)又はIL-17ms(p＜0.001)で処置したマウスでは、対照よりも感染が有意に素早く除去された(Kaplan-Meier)。
（Ｄ）偽感染マウス、あるいは、IL-12ms、IL-17ms、又は対照ms処置による感染マウス由来の単離ILN細胞におけるサイトカイン発現；各群n＝7マウス。感染後5日目に単離されたCD4+Ｔ細胞におけるIFN-γ、IL-4、及びIL-17の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。
（Ｅ）偽感染マウス、あるいは、IL-12ms、IL-17ms、又は対照ms処置を施した感染マウスから3日目に採取した膣組織におけるIFN-γ、IL-4、及びIL-17 mRNAレベルのRT-PCR分析；各群n＝7マウス。RT-PCR法で検出されたサイトカイン遺伝子発現量はβ-アクチンの発現に対して正規化し、偽感染群では1.0とした。
（Ｆ）偽感染マウス、あるいは、IL-17ms又は対照msで処置した感染マウスから5日目に単離した膣細胞の表現型プロファイル；各群n＝7マウス。
偽感染マウス、あるいは、IL-12ms、IL-17ms、又は対照ms処置による感染マウスにおける、（Ｇ）膣の及び（Ｈ）血清の抗-淋菌IgA及びIgG抗体応答；各群n＝7マウス。接種15日目に腟洗浄液及び血清を採取し、ELISA法により淋菌特異的及び総IgA及びIgGを測定した。３つの独立した実験のうちの１つの代表的なものからの結果を示す。Ｄ〜Ｈでは、#p＜0.05；*p＜0.01(片側ｔ検定)。
【００１４】
［図５］
図５は、一次感染中の膣内IL-12ミクロスフェア(ms)処置が、二次淋菌感染に及ぼす影響を示すグラフである。
（Ａ）一次感染中にIL-12ms、可溶性IL-12、IL-17ms、又は対照msを投与したマウス、又はIL-12ms投与有り又は無しでの、過去に偽感染したマウスにおける二次感染の経時変化；各群n＝8マウス。過去にIL-12ms(p〜0.01)で処置したマウスと対照との間で感染負荷の有意差が認められた(ANOVA)。
（Ｂ）Ａに示した実験のデータを、一次感染中に表示の処置をして、再感染後に感染したままのマウスのパーセンテージとしてプロットした。感染は対照よりもIL-12ms(p＜0.0001)で以前に処置したマウスで有意に速く消失した(Kaplan-Meier)。
（Ｃ）一次感染中にIL-12ms、IL-17ms、又は対照msで処置した再感染マウスから、又は一次及び二次相の両方で偽感染したマウス(「偽再感染」)から5日目に単離したILN CD4+Ｔ細胞におけるサイトカイン発現のフローサイトメトリー解析；1群あたりn＝7マウス。
（Ｄ）偽再感染マウス、あるいは、一次感染中にIL-12ms、IL-17ms、又は空msで処置した再感染マウスから3日目に採取した膣内のIFN-γ、IL-4、及びIL-17 mRNAレベルのRT-PCR分析；各群n＝7マウス。RT-PCRにより検出されたサイトカイン遺伝子発現量はβアクチンの発現に対して正規化され、偽再感染群では1.0とされた。
偽再感染マウス、あるいは、一次感染中にIL-12ms、IL-17ms、又は空msで処置した再感染マウスにおける二次感染に対する（Ｅ）膣の及び（Ｆ）血清の抗-淋菌IgA及びIgG抗体応答；各群n＝7マウス。接種15日後に腟洗浄液及び血清を採取し、ELISA法により淋菌特異的及び総IgA及びIgGを測定した。３つの独立した実験のうちの１つの代表的なものからの結果を示す。Ｃ〜Ｆでは、#p＜0.05；*p＜0.01(片側t検定)。
【００１５】
［図６］
図６は、淋菌OMV＋IL-12/msによる膣内(I.vag)免疫化が、淋菌による生殖器感染に対する抵抗性を誘導し、免疫応答を生じたことを示している。
ａ：マウスをFA1090株由来のOMV(タンパク質40μg)＋対照(空)ms又はIL-12/ms(1μg IL-12)により、7日間隔で３回免疫した；対照マウスは、空ms又はIL-12/ms単独のいずれかで偽免疫された。最後の免疫化の2週間後、すべてのマウスに淋菌株FA1090(5×106CFU)をi.vag.接種によって負荷し、感染を膣スワビング及びプレーティングによってモニターした。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、*P＜0.01(ANOVA)；右パネル：各時点で感染したままである動物の割合(％)、P＜0.01(Kaplan-Meier解析、log-rank検定、OMV＋IL-12/ms-対-OMV＋空ms)
ｂ：終了後(15日目)に採取したサンプル中の、FA1090株に対する膣洗浄液(左)及び血清(右)抗体、平均±SEMで示される、N＝5サンプル；#P＜0.05、*P＜0.01、スチューデントｔ検定。
ｃ：終了時(15日目)にILNから回収したCD4+細胞における細胞内サイトカイン染色、平均±SEMで示される、N＝3サンプル、各サイトカインに対するCD4+染色の割合、*P＜0.01 スチューデントｔ検定
ｄ：マウスを淋菌(Ngo)OMV(タンパク質40μg)＋空ms又はIL-12/ms(1μg IL-12)により、14日間隔で２回免疫した；対照マウスを空ms単独又はNTHI OMV(タンパク質40μg)＋IL-12/ms(1μg IL-12)で偽免疫した。2週間後、全マウスに淋菌FA1090(5×106CFU)を負荷した。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、*P＜0.01(ANOVA、淋菌OMV＋IL-12/ms-対-淋菌OMV＋空ms)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％、P＜0.0001(Kaplan-Meier解析、ログランク検定、淋菌OMV＋IL-12/ms-対-淋菌OMV＋空ms)。
【００１６】
［図７］
図７は、淋菌負荷前の、淋菌OMV＋IL-12/msによる免疫化によって生成された抗体反応を示す。
ａ：1、2、3用量の淋菌性OMV(タンパク質40μg)＋IL-12/ms(IL-12 1μg)による最終免疫から2週間後に、ELISAにより膣洗浄液(左パネル)及び血清(右パネル)抗体を測定した。対照サンプルは、空ms(3用量)で偽免疫したマウスから得た；さらに別のマウスを淋菌OMV＋空msで３回免疫した。データは、平均±SEM、N＝5サンプル、#P＜0.05、*P＜0.01(対照サンプルと比較して)(ANOVA)で示される。
2用量のFA1090 OMV＋空ms又はIL-12/msで免疫化したマウスにおける膣洗浄液（ｂ）及び血清（ｃ）の抗体持続時間；データは平均±SEMで示される、N＝5サンプル；C＝非免疫化マウスからの対照サンプル。
【００１７】
［図８］
ａ：淋菌OMV(タンパク質40μg)＋IL-12/ms(IL-12 1μg)で１，２，３回免疫化した際の、最後の免疫化から２週間後の、淋菌OMV＋IL-12/msでの免疫化によって誘導されたILN細胞におけるＴ細胞サイトカイン応答。対照ILNは、空ms(3用量)で偽免疫したマウスから得られ、さらに別のマウスを淋菌OMV＋空msで３回免疫した。データは、それぞれのサイトカインについて、平均±SEM、N＝3サンプル、CD4+又はCD8+細胞染色の％として示される。*P＜0.01(スチューデントt検定)は、IL-12/ms-対-空msでの免疫化を比較する。
ｂ：淋菌OMV＋IL-12/msでの又はOMV＋空msでの、２回の免疫化の1〜6ヶ月後の、CD4+ILN細胞におけるIFNγ応答の持続期間。データは、平均±SEM、N＝3サンプル、IFNγについて染色したCD4+細胞の％として示される。C＝未免疫マウス由来の対照ILN。
【００１８】
［図９］
図９は、淋菌(FA1090)チャレンジに対する抵抗性が、2用量の淋菌(FA1090)OMV＋IL-12/msによる免疫後、少なくとも6ヵ月間持続したことを示している。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、*P＜0.01(ANOVA、淋菌OMV＋IL-12/ms-対-淋菌OMV＋空ms)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％、P＜0.001(Kaplan-Meier解析、ログランク検定、淋菌OMV＋IL-12/ms-対-淋菌OMV＋空ms)。
【００１９】
［図１０］
図１０は、異種淋菌チャレンジに対する抵抗性を示している。
ａ：FA1090 OMV＋IL-12/ms又は空msによる免疫化の1ヵ月後に、マウスに淋菌株FA1090(同族チャレンジ)又はMS11株(異種チャレンジ)を負荷した。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、*P＜0.001(ANOVA、比較のために示される)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％、FA1090チャレンジについて、P＜0.02、IL-12/ms-対-空ms；MS11チャレンジについてP＜0.001、IL-12/ms-対-空ms(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
ｂ：MS11 OMVで免疫したマウスは、淋菌FA1090の負荷に対して抵抗性を示した。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、P＜0.01(ANOVA)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％、P＜0.01(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
ｃ：FA1090 OMVで免疫したマウスは、淋菌FA19の負荷に対して抵抗性を示した。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、*P＜0.01(ANOVA、比較のため示される)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％、FA1090負荷について、P＜0.01、IL-12/ms-対-空ms；FA19負荷について、P＜0.0001、IL-12/ms-対-空ms(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)、N＝8マウス。
ｄ：FA19 OMVで免疫したマウスは、淋菌FA1090の負荷に対して抵抗性を示した。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、P＜0.01(ANOVA)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％、P＜0.01(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
ｅ：FA1090 OMVで免疫したマウスは、臨床分離株GC68の負荷に対して抵抗性を示した。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、P＜0.01(ANOVA)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％)、P＜0.01(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
【００２０】
［図１１］
図１１は、淋菌OMVのイムノプロテオミクスを示す。
ａ：淋菌株FA1090、MS11、及びFA19由来のOMV調製物のSDS-PAGEを、クーマシーブルーで染色した。
ｂ： SDS-PAGEによって分離した淋菌OMV調製物について試験した、マウス血清のウェスタンブロット分析。レーン１、FA1090 OMV＋空msで免疫したマウス由来の対照血清、FA1090 OMVに対して試験した；レーン２〜４、FA1090 OMV＋IL-12/msで免疫したマウス由来の血清#1、FA1090由来のOMV(レーン２)、MS11(レーン３)、又はFA19(レーン４)に対して試験した；レーン５、FA1090 OMV＋IL-12/msで免疫したマウス由来の血清#2、FA1090由来のOMVに対して試験した；レーン６、FA1090 OMVに対して試験した抗体H5(抗-ポリンPIB3)。
ｃ〜ｅ：FA1090(c)、MS11(d)、及びFA19(e)に由来する、淋菌OMVのプロテオームマップは、2D電気泳動及びFlamingo蛍光染色(左パネル)によって明らかにされ、それらの対応する免疫ブロット(右パネル)は、マウス血清#2でプローブすることによって得られた。MS/MS分析に供される免疫反応性スポットは、スポット１及び２(矢印)として標識される。分子量マーカー(kDa)を左側に示す。
【００２１】
［図１２］
図１２は、淋菌OMV＋IL-12/msでの免疫化によって誘導されたチャレンジに対する抵抗性(IFNγ及びB細胞に依存)を示す。
ａ：FA1090 OMVで免疫化したIFNγ-koマウス-対-野生型マウスにおける感染経過(FA1090)；左パネル、淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、P＜0.01(ANOVA)；右パネル、各時点で感染したままである動物の％、野生型マウスについてP＜0.0001、IL-12/ms-対-空ms(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
ｂ：FA1090 OMVで免疫化したμMTマウス-対-野生型マウスにおける感染経過(FA1090)；左パネル、淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、P＜0.01(ANOVA)；右パネル、各時点で感染したままである動物の％、野生型マウスについてP＜0.0001、IL-12/ms-対-空ms(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
IFNγ-ko-対-野生型(平均±SEM、N＝5サンプル)における膣洗浄液（ｃ）及び血清（ｄ）抗体応答を、終了時(13日目)に解析した。膣洗浄液及び血清中のIgA及びIgG反応は、野生型マウスでは有意であったが(P＜0.05、スチューデントｔ検定、OMV＋空ms-対-OMV＋IL-12/ms)、IFNγ-koマウスでは有意ではなかった。
ｅ：μMTマウス-対-野生型マウスにおけるＴ細胞サイトカイン応答(平均±SEM、N＝3サンプル)を終了時(13日目)に解析した。OMV＋空ms-対-OMV＋IL-12/msによる免疫化に対するIFNγ応答は、野生型及びμMTマウスの両方に対して有意であった(P＜0.01)(ANOVA)。
ｆ：FA1090 OMVで免疫したCD4-koマウス-対-野生型マウスにおける感染経過(FA1090)；左パネル、淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、#P＜0.05、P＜0.01(ANOVA)、比較のために示される；右パネル、各時点で感染したままである動物の％、野生型マウスIL-12/ms-対-空msについてP＜0.001、CD4-koマウスIL-12/ms-対-空msについてP＜0.01(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
g：FA1090 OMVで免疫したCD8-koマウス-対-野生型マウスにおける感染経過(FA1090)；左パネル、淋菌の回収(CFU) (平均±SEM、N＝8マウス)、#P＜0.05、P＜0.01(ANOVA) 、比較のために示される；右パネル、各時点で感染したままである動物の％、野生型マウスIL-12/ms-対-空msについてP＜0.001、CD8-koマウスIL-12/ms-対-空msについてP＜0.02(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
【００２２】
［図１３］
図１３は、図１の複製である。淋菌OMV＋IL-12/msによるI.vag免疫化は、淋菌による生殖器感染に対する抵抗性を誘導し、免疫応答を生じた。
Ａ：マウスをFA1090株由来のOMV(タンパク質40μg)＋対照(空)ms又はIL-12/ms(IL-12 1μg)により、7日間隔で３回免疫した；対照マウスは、空ms又はIL-12/ms単独のいずれかで偽免疫された。最後の免疫化の2週間後、すべてのマウスを、淋菌株FA1090(5×106 CFU)のi.vag接種によってチャレンジし、感染を膣スワビング及びプレーティングによってモニターした。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、P＜0.01(ANOVA、OMV＋IL-12/ms-対-OMV＋空ms)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％、P＜0.001(Kaplan-Meier解析、ログランク検定、OMV＋IL-12-対-OMV＋空ms)。
Ｂ：終了後(15日目)に収集したサンプル中のFA1090株に対する膣洗浄液(左)及び血清(右)抗体を、平均±SEM、N＝5サンプルとして示す。
Ｃ：終了時(15日目)にILNから回収されたCD4+細胞における細胞内サイトカイン染色が、それぞれのサイトカインについて、平均±SEM、N＝3サンプル、CD4+染色の％として示される。
Ｄ：マウスを淋菌(Ngo)OMV(タンパク質40μg)＋空ms又はIL-12/ms(IL-12 1μg)により、14日間隔で２回免疫した；対照マウスは、空ms単独又はNTHI OMV(タンパク質40μg)＋IL-12/ms(IL-12 1μg)で偽免疫された。2週間後、すべてのマウスに淋菌FA1090を負荷した。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、*P＜0.001(ANOVA、淋菌OMV＋IL-12/ms-対-淋菌OMV＋空ms)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％、P＜0.001(Kaplan-Meier解析、ログランク検定、淋菌OMV＋IL-12/ms-対-淋菌OMV＋空ms)。
【００２３】
［図１４］
図１４は、図６Ｃに示されるデータについてのフローサイトメトリープロットの例を示す。図に示すように免疫したマウスにおける感染クリアランス(15日目)後のILN細胞の細胞内サイトカイン染色。X軸(FL4H)：サイトカイン蛍光；Y軸(PE2)：CD4蛍光(Ａ〜Ｌ)；CD8蛍光(Ｍ〜Ｐ)。
【００２４】
［図１５］
図１５は、NTHIから調製されたOMVでの免疫化によって誘導された反応を示す；サンプルは、免疫化の2週間後に採取された。Ａ：膣洗浄抗体(平均±SEM、N＝5サンプル)；Ｂ：血清抗体(平均±SEM、N＝5サンプル)；Ｃ：ILN細胞中のＴ細胞サイトカイン(平均±SEM、N＝3サンプル)。*P＜0.01  対-対照サンプル(スチューデントｔ検定)。
【００２５】
［図１６］
図１６は、淋菌OMV＋IL-12/msによる免疫化によって誘導された膣洗浄液（Ａ）及び血清（Ｂ）中の抗-淋菌抗体反応のIgGサブクラス(平均±SEM、N＝5サンプル)を示す。#P＜0.05、*P＜0.01  対-対照サンプル (スチューデントt検定)。
【００２６】
［図１７］
Ａ：淋菌抗原に対するILNにおけるＴ細胞応答の特異性。FA1090 OMV＋空ms又はIL-12/msで免疫したマウス由来のILN CD4+Ｔ細胞を、CFSEで前負荷し、抗原提示細胞の存在下で3日間、FA1090細胞の存在下(stim)又は非存在下で、インビトロにて培養した。増殖を、CD4についての表面染色後にフローサイトメトリーによって分析し、そしてサイトカイン分泌を、ELISAによって測定した。データは、平均±SEM、N＝7サンプルとして示される。*P＜0.01  対-対照サンプル(スチューデントｔ検定)。
Ｂ：OMV＋空ms又はIL-12/msによる最終免疫(1、2、又は3用量)の3日後に膣組織から抽出したRNAのRT-PCR分析。データは、平均±SEM、N＝7サンプルで示される。*P＜0.01  対-OMV＋空msで免疫したマウスのサンプル(Studentのt検定)。
Ｃ： OMV＋IL-12/msによる免疫後1〜6ヵ月目に採取されたCD4+ILN細胞におけるIFNγ反応の持続。データは、平均±SEM、N＝7サンプルとして示される。
【００２７】
［図１８］
図１８は、FA1090 OMV＋IL-12/msによる免疫化の6ヵ月後に、淋菌FA1090を負荷したマウスにおける反応を示す。Ａ：膣洗浄液抗体(平均±SEM、N＝5サンプル)、Ｂ：血清抗体(平均±SEM、N＝5サンプル)、Ｃ：CD4+ILN細胞によるサイトカイン産生(平均±SEM、N＝3サンプル)。#P＜0.05、* P＜0.01  対-偽感染マウスの対照サンプル(スチューデントt検定)。
【００２８】
［図１９］
図１９は、異種淋菌負荷後に、淋菌OMV＋空ms又はIL-12/msで免疫したマウスにおける反応を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ：FA1090 OMVで免疫し、MS11を負荷したマウス； MS11に対するＡ：膣洗浄液抗体、Ｂ：血清抗体(平均±SEM、N＝5サンプル)；Ｃ：CD4+ILN細胞におけるサイトカイン応答(平均±SEM、N＝3サンプル)。Ｄ、Ｅ、Ｆ：FA1090 OMVで免疫し、FA19を負荷したマウス； FA19に対するＤ：膣洗浄液抗体、Ｅ：血清抗体(平均±SEM、N＝5)；Ｆ：CD4+ILN細胞におけるサイトカイン応答(平均±SEM、N＝3サンプル)。#P＜0.05、*P＜0.01  対-偽感染マウスの対照サンプル(スチューデントt検定)。
【００２９】
［図２０］
図２０は、図７Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｇの複製である：免疫不全マウスにおける淋菌OMV＋IL-12/msによるI.vag免疫化。
Ａ：FA1090 OMVで免疫化したIFNγ-koマウス-対-野生型マウスにおける感染経過(FA1090)；左パネル、淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)、P＜0.01(ANOVA)；右パネル、各時点で感染したままである動物の％、野生型マウスについてP＜0.001、IL-12/ms-対-空ms(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
Ｂ：FA1090 OMVで免疫したμMTマウスにおける感染経過(FA1090)；左パネル、淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)。
Ｃ：FA1090 OMVで免疫したCD4-koマウスにおける感染経過(FA1090)；左パネル、淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)；右パネル、各時点で感染したままである動物の％、P＜0.01(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
Ｄ：FA1090 OMVで免疫したCD8-koマウス-対-野生型マウスにおける感染経過(FA1090)；左パネル、淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)；右パネル、各時点で感染したままである動物の％、P＜0.01(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
【００３０】
［図２１］
図２１は、BALB/cマウスにおける淋菌誘発感染に対する淋菌OMV(FA19株)＋IL-12/msによるi.n.免疫の効果を示す。Ａ：淋菌の回収(CFU)(平均±sem、N＝8マウス)、P＜0.01(ANOVA、淋菌OMV＋IL-12/ms-対-淋菌OMV＋空ms)；Ｂ：各時点で感染したままである動物の％。
【００３１】
［図２２］
図２２は、BALB/cマウスにおけるFA19株による異種淋菌誘発感染に対する、淋菌OMV(FA1090株)＋IL-12/msの異なる用量での免疫化の効果を示す。一用量当たり、高用量：60μg、中用量：30μg、低用量：15μgのOMV蛋白＋1μgのIL-12/ms。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8マウス)；右パネル：各時点で感染したままである動物のパーセンテージ。
【００３２】
［図２３］
Ａ：BALB/cマウスにおけるFA19株による異種淋菌誘発感染に対する、淋菌OMV(30μgタンパク質；FA1090株)＋1μg IL-12/msによる鼻腔内又は膣内免疫化の効果の比較。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝8〜9マウス)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％。終了時(負荷2週間後)、感染のクリアランス後に採取したサンプル中の淋菌に対する、Ｂ：血清抗体、Ｃ：膣洗浄液抗体、Ｄ：唾液抗体；* P＜0.01  対照と比較して (スチューデントt検定)。
【００３３】
［図２４］
図２４は、BALB/cマウスにおけるFA1090株による同種淋菌誘発感染に対する淋菌OMV(30μgタンパク質；FA1090株)＋1μg IL-12/msによる鼻腔内又は膣内免疫化の効果の比較を示す。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均値±SEM、N＝8〜9マウス)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％。
【００３４】
［図２５］
図２５は、BALB/cマウスにおけるMS11株による異種淋菌誘発感染に対する淋菌OMV(30μgタンパク質、FA1090株)＋1μg IL-12/msの鼻腔内免疫化の効果を示す。マウスにはOMV＋IL-12/msを１回投与するか、又は2週間隔で２回投与した；対照マウスには空msを２回投与した。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝9マウス)；右パネル：各時点で感染したままである動物のパーセンテージ。
【００３５】
［図２６］
図２６は、BALB/cマウスにおけるFA1090株による異種淋菌誘発感染に対する淋菌OMV(30μgタンパク質、MS11株)＋1μg IL-12/msの鼻腔内免疫化の効果を示す。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均値±SEM、N＝8〜9マウス)；右パネル：各時点で感染したままである動物の％。
【００３６】
［図２７］
図２７は、BALB/cマウスにおけるFA19株による異種淋菌誘発感染に対する淋菌OMV(30μgタンパク質、MS11株)＋1μg IL-12/msの鼻腔内免疫化の効果を示す。左パネル：淋菌の回収(CFU)(平均±SEM、N＝9マウス)；右パネル：各時点で感染したままである動物のパーセンテージ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、淋菌が免疫系に対して自身に対する有効な免疫応答を開始することを防ぐ方法を解明する助けとなった我々の研究に基づく。自身に対する免疫応答を抑制する淋菌の能力に打ち勝つための新規なアプローチが提供される。
【００３８】
１つの局面において、この方法は、淋菌からの抗原調製物、及び、ミクロスフェア(ms：microsphere)中に存在するIL-12の投与によって、個体が淋菌感染症に罹患する可能性を減少させることを包含する。淋菌由来の抗原調製物の例はOMVである。OMV及びIL-12msは、膣内に送達されてもよい。一実施形態では、OMV及びIL-12msは鼻腔内に送達されてもよい。OMV及びIL-12msは、別個の投与経路によって送達されてもよい。例えば、一方は膣内に送達され、他方は鼻腔内に送達されてもよい。一実施形態では、OMV及びIL-12msが同じ投与経路によって、例えば鼻腔内に送達される。
【００３９】
一実施形態では、OMV及びIL-12msは同じ組成物にて送達される。用量(一投与量)当たりのOMV及びIL-12msの量は、免疫応答が誘発される量であり得る。OMVは、用量当たり0.01〜1mgのタンパク質の範囲であり得る。一実施形態では、OMVが用量当たり0.01〜2mgのタンパク質の範囲であり得る。複数の実施形態において、OMVは、用量当たり10、50、100、250、500、750、1,000、1250、1,500、1,750又は2,000μgのタンパク質であり得る。一実施形態では、OMVは、用量当たり15〜300μgタンパク質の範囲であり得る。１つの実施形態において、OMV用量は、50〜1,000μgタンパク質であり得る。70kgのヒトについては、これは体重1kg当たり約0.7〜28マイクログラムのタンパク質のOMV用量に相当する。一実施形態では、OMVは、体重1kg当たり0.5〜30μgタンパク質であり得る。IL-12(ミクロスフェア中)は、1〜500μg/用量であり得る。これは、体重1kg当たり約14ng〜7μgに相当する(70kg体重と仮定する)。一実施形態において、IL-12は、体重1kg当たり10ng〜10μg/であり得る。一実施形態において、IL-12は、10、50、100、200、300、400又は500μg/用量であり得る。一実施形態では、IL-12は、体重1kg当たり10〜300ng又は5〜300ngであり得る。一実施形態では、IL-12は、用量当たりミクロスフェア中0.5〜20マイクログラムであり得る。ミクロスフェアの量の決定は、IL-12の負荷に基づいて行うことができる。組成物は、キャリア、緩衝液などを用いて提供されてもよく、又は凍結乾燥されてもよい。２つの成分は、別々に提供されてもよく、投与の直前に組み合わされてもよく、又は別々に投与されてもよい。一実施形態では、組成物は、遊離の可溶性IL-12を全く添加されていない。投与前にミクロスフェアから漏れるIL-12は、わずかであると考えられる。遊離可溶性IL-12が存在しても、本発明の効果及び方法に寄与するとは考えられない。むしろ、ミクロスフェア中に封入されたIL-12が、防御効果を得るために組成物中で必要とされる。
【００４０】
外膜小胞は、淋菌の外膜から調製することができる。例えば、OMVは、淋菌種の培養株の外膜から調製できる。OMVは、ブロス又は固体培地培養で増殖させた淋菌から得ることができる。調製は、培養培地から細菌細胞を分離すること(例えば、濾過又は低速遠心分離などによる)、細胞を溶解すること(例えば、界面活性剤の添加による、浸透圧ショック、超音波処理、キャビテーション、ホモジナイゼーションなど)、及び細胞質分子から外膜画分を分離すること(例えば、濾過による；又は外膜及び/又は外膜小胞の示差沈殿もしくは凝集による、又は親和性分離法による；又は高速遠心分離による)を含み得る。
【００４１】
組成物は、好ましくは間隔をあけて複数回投与することができる。例えば、少なくとも二用量を、間に少なくとも一週間の間隔をあけて投与することができる。間隔は、1〜3週間であってもよい。一実施形態では、二用量が約二週間の間隔をあけて使用される。
【００４２】
一実施形態では、本発明のIL-12製剤は、徐放性製剤である。一実施形態では、IL-12は、高分子微粒子(本明細書ではミクロスフェアとも呼ばれる)に組み込まれた状態で送達される(本明細書ではカプセル化又はマイクロカプセル化された状態とも呼ばれる)。一実施形態では、微粒子は生分解性であり、生体適合性である。このようなミクロスフェアの調製技術は、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第6,143,211号；第6,235,244号；第6,616,869号；及び第7,029,700号を参照のこと(これらの開示はミクロスフェアの調製のための方法及び組成物に関して、参照により本明細書中に包含される)。一実施形態では、マイクロカプセル化IL-12を調製するために、相反転技術が使用される。一般に、生分解性ポリマーは溶媒(ジクロロメタン又は他の有機溶媒など)に溶解され、次いで、微粉化されたIL-12(すなわち、IL-12とポリビニルピロリドンなどの賦形剤との凍結乾燥混合物)を、前記溶媒に溶解された前記ポリマーに添加することによって混合物が形成される。次いで、非溶媒(例えば、アルコール又はヘキサン)が導入され、マイクロカプセル化されたIL-12の自発的な形成を引き起こす。生分解性ポリマーの例としては、乳酸及びグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ(オルト)エステル、ポリウレタン、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ヒドロキシブチレート)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)及びポリ(ラクチド-コ-カプロラクトン)、ならびに天然ポリマーが挙げられる。一実施形態では、ミクロスフェアは、乳酸のポリマー(ポリ乳酸(PLA))から構成される。
【００４３】
１つの実施形態において、IL-12含有ミクロスフェアは、加水分解によって経時的にゆっくりと分解し、封入IL-12を放出する。ミクロスフェアは、使用前に懸濁され、許容可能な緩衝生理食塩水中で送達されてもよい。１つの実施形態において、約4日間などの期間にわたるIL-12の徐放は、局所組織又は循環中のIL-12の濃度を潜在的に有害なレベルまで上昇させることなく、局所的に存在する免疫細胞の連続的な刺激を可能にする。ミクロスフェアは、生分解性材料から作られる。一実施形態では、ミクロスフェアの加水分解産物は、正常代謝の無害な産物である乳酸である。PLAは吸収性縫合糸の構成成分であり、この目的のために何十年も使用されており、したがって安全であると考えられている。マイクロカプセル化されたIL-12は、周囲温度での貯蔵において安定であり、長い貯蔵寿命を有することが示されている。
【００４４】
ミクロスフェアは、10nm〜10ミクロンの範囲である。ミクロスフェアは、薬学的に許容される媒体、例えば生理学的緩衝液中に懸濁されてもよい。一実施形態では、IL-12の充填量は、粒子1mg当たり0.1〜10μgである。一実施形態では、充填量は、粒子1mg当たり1〜5μgのIL-12である。一実施形態では、充填量は、粒子1mg当たり約2.5μgのIL-12以上である。
【００４５】
IL-12製剤は、治療効果及び/又は予防効果をもたらす量で使用することができる。マウスにおける有効用量は、IL-12 1μgであることが観察された。ヒトに対する有効用量を決定することは、そのような感染症の治療に関与する臨床医及び他の個人の範囲内である。一般に、投与される量は、感染の重症度、個体の体重、健康及び年齢を含む様々な因子に依存する。このような因子は、臨床医によって容易に決定され得る。一実施形態では、用量は、一日当たり1μg〜200μgのIL-12であり得る。いくつかの実施形態では、用量は、用量当たり1、5、10、15、20、50、75、100、125、150、175及び200μg(1〜200μg間のすべての整数値とその間のすべての範囲を含む)のIL-12である。必要とされる用量は、抗菌剤と組み合わせて使用される場合、より少なくてもよい。
【００４６】
必要に応じて投与を繰り返してもよい。例えば、投与は、一日に一回、一日に複数回、又はより長い間隔(例えば、2〜4日間隔、毎週又は毎月)で繰り返されてもよい。一実施形態において、投与は、一日〜一ヶ月(28、29、30又は31日)又はそれを超える間隔及びそれらの間のすべての間隔で、繰り返される。必要に応じて治療レジメンを繰り返してもよい。いくつかの実施形態では、2、3、4、5、6、7、10、又は14日(又はそれより長く)ごとに服用量を投与する。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、高分子ミクロスフェアに組み込まれたIL-12の膣内投与によって、メスの被験体の生殖管感染症を治療する方法を提供する。この方法により治療できる感染には、細菌、真菌、寄生虫、ウイルス等が含まれる。一実施形態では、この量は、感染を引き起こす微生物に対するTh1-誘発応答を促進するのに十分である。一実施形態では、この量は、原因微生物に対する治療効果、予防効果、又はその両方を提供するのに十分である。本明細書中で使用される用語「治療される」又は「治療」は、感染を減少又は排除することを意味する。感染の根本原因が減少すれば、感染は減少すると考えられる。
【００４８】
一実施形態では、本発明の方法は、淋菌などの細菌によって引き起こされる、頸膣部感染症などの生殖管感染症を治療するのに有用である。この方法は、生分解性の生体適合性ミクロスフェアに組み込まれたサイトカイン・インターロイキン-12(IL-12)の局所(膣内)適用を提供する工程を含む。１つの実施形態において、用量は、淋菌による感染に対するTh1-誘発免疫応答を促進するのに十分である。１つの実施形態において、本発明は、IL-12ミクロスフェアの局所投与による、頸膣部淋菌感染(すなわち、淋病)の治療もしくは予防、又はその両方のための方法を提供する。いかなる特定の理論によっても束縛されることを意図しないが、この方法は、少なくとも部分的には、宿主の免疫応答を妨害する淋菌の能力を逆転させることによって、機能すると考えられる。
【００４９】
一実施形態では、IL-12製剤は、個体の生殖管の粘膜表面に局所的に送達される。一実施形態では、前記個体は、IL-12をまだ受けていないか、又は本方法の開始前にIL-12を投与されていない。一実施形態では、個体は、いかなる他の投与様式によってもIL-12を投与されていない。一実施形態では、製剤は他の治療薬を含まず、他の予防薬を含まず、又は治療及び予防の両方に役立つ他の薬剤を含まない。１つの実施形態において、製剤は、感染を引き起こす微生物(例えば、不活化された形態で)又はそれからの抗原を含まず、そして個体は、不活化された微生物又はそれからの抗原を投与されたことがない及び/又は投与されていない。別の実施形態において、製剤は、生殖管感染症(例えば、淋菌感染症)のための治療(IL-12以外)を既に受けている個体に送達されてもよい。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明は、個体に抗菌剤を投与する工程をさらに含む。例えば、１つの実施形態において、本発明の方法は、生殖管の感染に罹患しているか、又は生殖管の感染と診断された個体を特定する工程、生殖管に局所的に(膣内など)、治療的有効量、予防的有効量、又は治療的及び予防的有効量の両方の、生分解性高分子ミクロスフェア中のIL-12を含む組成物を送達する工程、及び任意に、１つ以上の抗菌剤(抗生物質、抗真菌剤又は抗ウイルス剤など)を個体に投与する工程を含む。抗菌剤は、IL-12製剤の投与前、投与中、又は投与後に投与することができる。このような治療の例は、抗生物質などの抗菌剤の投与である。生殖管感染症に使用される適切な抗生物質の例としては、フルオルキノロン、セファロスポリン、アジスロマイシン、セフトリアキソン、ドキシサイクリン、及びセフィキシムが挙げられる。
【００５１】
１つの実施形態において、本明細書に記載されるマイクロカプセル化IL-12の投与は、淋菌感染症を減少させる。一実施形態では、感染は排除される。感染の有無又は感染のレベルは、日常的な微生物学的方法(培養及び試験など)によって試験することができる。１つの実施形態において、感染は膣スワブを得、そして細菌の存在について試験することによって(例えば、コロニーを形成する能力によって)、又は核酸増幅方法によって試験され得る。
【００５２】
別の実施形態では、本明細書に記載されているマイクロカプセル化IL-12の投与は、淋菌感染症を軽減し、マイクロカプセル化IL-12による治療を停止した後の淋菌による反復感染リスクを軽減する。いかなる特定の理論によっても束縛されることを意図しないが、IL-12の予防効果は、免疫系の刺激によって達成されると考えられる。一実施形態において、IL-12の投与は、全身循環におけるIL-12のレベルを有意に増加させない。一実施形態では、IL-12の血清レベルは、50ピコグラム/mlを超えて増加しない。
【００５３】
膣内適用のために、本発明の製剤は、キャリアとして作用する製品に適用されて送達されることができる。例えば、製剤は、インサート、アプリケーター、錠剤、坐剤、膣リング、膣スポンジ、タンポンなどの中又は外に組み込まれてもよく、その後、それらを介して送達されてもよい。製剤はまた、液体、クリーム、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、スプレーなどの形態で送達されてもよい。
【００５４】
医薬製剤は、必要に応じて、薬学的に許容されるキャリア、緩衝液、希釈剤、可溶化剤又は乳化剤、及び種々の塩を含み得る。このような添加剤は、当技術分野で周知である。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042)を参照のこと。
【００５５】
本明細書中に記載されるようなマイクロカプセル化IL-12の局所適用の利点は、潜在的な全身毒性の問題を回避しながら、持続効果を提供し得ることである。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、生殖器クラミジア・トラコマチス感染(クラミジア)を治療するために使用される。クラミジアは、淋病よりもさらに高頻度に発生する別の性感染症(STD)であり、米国で最も頻繁に報告されている感染症であり、年間300万人(世界中で9200万人以上)に及ぶと考えられている。また、女性の骨盤内炎症性疾患やその後遺症(不妊症や子宮外妊娠のリスク)の主な原因となっている。従って、１つの実施形態において、高分子ミクロスフェアに組み込まれたIL-12の局所(膣内)適用は、クラミジア・トラコマチスに対する治療及び予防のための局所Th1免疫応答を促進するために使用される。一実施形態では、本発明の方法は、淋菌及びクラミジア・トラコマチスによる尿生殖器感染症を治療するために使用される。淋病とクラミジアは、同様の徴候と症状を呈し、鑑別診断は原因菌の同定に依存する可能性があるため、このことはSTDクリニックの場では有利であると考えられる。さらに、両方の混合感染が一般的である。他の実施形態において、他の生殖管感染症もまた、それらに対する局所免疫を増強するために、マイクロカプセル化IL-12の(膣内)適用で治療され得る。
【００５７】
他の実施形態において、マイクロカプセル化IL-12の局所適用は、正常な免疫応答がそれらを排除するのに不十分である他の局所粘膜感染症の治療において使用される。例として、気管支炎及び慢性閉塞性肺疾患(気道)、中耳炎(中耳感染、これは米国における小児科来院の最も頻度の高い理由)、ヘリコバクター・ピロリ感染(これは胃潰瘍を引き起こし、そして胃癌をもたらし得る)、及びおそらく歯周病(これは35歳以降のほとんどの成人を苦しめ、そして成人における歯の喪失の主な原因)が挙げられる。
【００５８】
一実施形態では、IL-12は、淋菌抗原を含有するワクチンと共に投与することができる。例えば、IL-12は、局所的に投与される非生存性の淋菌ワクチンと共に投与することができる。実施例３に記載されるように、本発明者らは、淋菌外膜小胞(OMV)製剤をIL-12/msと併用して又は併用せずに投与することにより、マウスをi.vag免疫した。OMVは、熱又は化学的不活性化によって変性されていない、天然のコンホメーションの表面抗原の大部分を含む。この結果は、少なくとも数カ月間持続し、抗原的に多様な淋菌株に対して有効な、Th1によって誘発される抗体依存性防御免疫応答の生成を実証している。実施例４に記載されるように、免疫化は、鼻腔内経路を介しても実施できる。
【００５９】
OMV及びIL-12ミクロスフェアは、メス又はオスの被験体に投与されてもよい。オスの被験体に投与される場合、組成物は鼻腔内に送達されてもよく、メスの被験体に投与される場合、組成物は膣内及び/又は鼻腔内に送達されてもよい。
【００６０】
以下の実施例は、本開示をさらに例示するために提供される。これらの実施例は、限定を意図するものではない。
【００６１】
［実施例１］
本発明は、膣淋菌感染のマウスモデルにおいて実証されている。マウスモデルの詳細は「Jerse, Infect. Immun. 67: 5699-5708; 1999」に記載されている。
【００６２】
淋菌による一時腟感染(0日目)の0、2、4日目にIL-12ミクロスフェア(1μg)をマウスに腟内投与したところ、空ミクロスフェアを投与した対照マウスと比較して、感染のクリアランスが促進された(図１参照)。
【００６３】
図１は、マウスにおける淋菌による膣感染の経過に対する、PLAミクロスフェアに封入された1μgのIL-12による膣内治療(0日目、2日目、及び4日目)の効果を示す。毎日採取された膣スワブから回収された淋菌の平均±SEM cfuとして示されるデータ；各群8匹のマウス。対照マウスには、空ミクロスフェアを投与した。マウスを14日目に抗生物質で治療し、その後二次感染のために安静にした(図２参照)。
【００６４】
一次腟淋菌感染中にIL-12ミクロスフェアで処置したマウスを回復させ、14日目に抗生物質(セフトリアキソン)で処置し、安静にし、その後、1ヵ月後に淋菌を再感染させたところ、一次感染中に空ミクロスフェアを投与した対照マウスよりも速く二次感染が除去された(図２参照)。通常、二次感染は一次感染と同様の動態で消失すると考えられ、抗体反応の発現はほとんどあるいは全く認められない。
【００６５】
図２は、淋菌の一次感染中のIL-12ミクロスフェアの腟内投与(図１参照)が、マウスにおける淋菌の二次膣感染の経過に及ぼす効果を示している。対照マウスには、空ミクロスフェアが投与された。毎日採取された膣スワブから回収された淋菌の平均±SEM cfuとして示されるデータ；各群N＝8マウス。
【００６６】
さらに、淋菌によるマウス生殖管感染の経過に対する、マイクロカプセル化IL-12(IL-12ミクロスフェア)による膣内治療の効果を、可溶性IL-12と比較した。この目的のために、1μgのIL-12を、淋菌による感染後0、2、4、6、8、及び10日目に(すなわち、感染が消失するまで1日おきに)、遊離可溶性形態(滅菌リン酸緩衝生理食塩水に溶解した)で、8匹のマウスの群に膣内注入し、IL-12ミクロスフェアで処置したマウス及びビヒクルのみで処置した対照群と直接比較した。IL-12ミクロスフェアで処置したマウスは7日以内に感染を除去し、対照群よりはるかに速かったが、可溶性IL-12で処置したマウスは対照群と同じ速度で感染を除去した(図３参照)。毎日採取された膣スワブから回収された淋菌の平均±SEM cfuとして示されるデータ；各群N＝8マウス。
【００６７】
結果は、可溶性IL-12による局所膣内治療は、感染の経過に影響を及ぼさなかったが、IL-12ミクロスフェアは前述のようにクリアランスを促進したことを示している。
【００６８】
［実施例２］
本実施例は、淋菌膣感染に対するIL-12ミクロスフェアの膣内適用の有効性を例示する別の一連の実験を記載する。
【００６９】
材料及び方法
マウス：BALB/cマウスをJackson Laboratories(Bar Harbor、ME)から購入し、バッファロー大学の実験動物施設において標準条件下で維持した。すべての動物の使用プロトコルは、バッファロー大学の動物実験委員会の承認を受けた。
【００７０】
細菌：淋菌FA1090を、ヘモグロビンと、濃縮培地(BD Diagnostic Systems、Franklin Lakes、NJ)であるISOVITALEX(登録商標)とを補充したGCアガー上で培養した。増殖を、Opaタンパク質及び線毛発現と一致するコロニー形態についてチェックし、淋菌をプレートから収集し、そして細胞密度を決定した。Opa発現は以下の通りであった：Opa A、B/D/G、E/K。
【００７１】
ミクロスフェア：サイトカインを、以下のように相反転ナノカプセル化(PIN＝Phase Inversion Nanoencapsulation)技術を用いて、ポリ乳酸(PLA)ミクロスフェア中に封入した。簡潔には、組換えIL-12(マウス又はヒト)を、スクロース(0.1％、w/w)及びポリビニルピロリドンを含む賦形剤と水中で混合し、次いで凍結乾燥する。凍結乾燥した材料を、tertyl-ブチルアルコール(TBA)に溶解し、TBAに溶解したポリ乳酸(PLA)レゾマー(resomer)と混合する(微粉化IL-12及びPLA溶液の比は１対３、vol：vol)。次いで、この溶液を100倍容量のヘプタンに注ぎ、粒子の形成を誘導する。次いで、粒子を濾過し、凍結乾燥する。３つの製剤を作製した：(a)サイトカイン又は抗体を含有しない対照ミクロスフェア；(b)マウスIL-12(0.25μg/粒子1mg)；及び(c)マウスIL-17(0.25μg/粒子1mg)。
【００７２】
マウス腟感染モデル：7〜9週齢の雌マウスに、前述のとおり、生きた淋菌FA1090を、0日目に腟内感染させた。膣粘液を、選択的抗生物質を添加したGCアガー上で毎日定量的に培養し、細菌コロニー形成量を測定した。検出限界は、100 CFUであった(マウス１匹当たりの回収)。ミクロスフェア調製物での膣内治療は、IL-12もしくはIL-17を含有するミクロスフェアをPBSに懸濁させた40μlの懸濁液、又は対照ミクロスフェアの注入によって、0日目から8日目まで1日おきに行われた。
【００７３】
細胞分離及びフローサイトメトリー：マウスを屠殺し、腸骨リンパ節(ILN)及び生殖管を無菌的に切除した。細胞を放出するために、ILNをHanks緩衝化塩溶液中で裂いた。膣単細胞懸濁液を酵素消化によって調製した。単離した細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、次いで、示した抗体と共に氷上で30分間インキュベートし、２回洗浄し、FACSCaliburサイトメーターで分析した。細胞内サイトカイン発現の測定のために、細胞を、タンパク質輸送阻害剤であるホルボールミリステートアセテート-イオノマイシン-GOLGISTOP(登録商標)(eBioscience、San Diego、CA)で5時間再刺激し、次いで固定/透過処理溶液であるCYTOFIX/CYTOPERM(登録商標)(eBioscience)で固定した。フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、又はアロフィコシアニンと結合したマウスCD4、CD8、CD19、CD11b、CD11c、NKG2D、Gr-1、IFN-γ、IL-4、及びIL-17Aに対する抗体をeBioscienceから購入した。
【００７４】
サイトカインELISA：血清又は膣洗浄サンプル中のIL-12p70、IFN-γ、IL-4、IL-5、及びIL-17A濃度を、eBioscienceから購入したELISAキットを用いて三連で測定した。
【００７５】
リアルタイムRT-PCR：マウスから採取した全膣の全細胞RNAを、RNEASY(登録商標)、RNA精製ミニキット(Qiagen、Valencia、CA)で単離し、ISCRIPT(登録商標)cDNA合成キット(Bio-Rad、Hercules、CA)を用いてcDNAに転写した。PCRのリアルタイムモニタリングのために、蛍光色素であるSYBR(登録商標)緑色色素(Bio-Rad)を使用して、ICYCLER IQ(登録商標)リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad)を用いて、リアルタイムRT-PCRを行った。標的遺伝子の相対定量を、Bio-Rad IQTM5光学システムソフトウェアによって決定された閾値サイクル(Ct)に基づいて分析した。
【００７６】
血清及び粘膜抗体のアッセイ：唾液、膣洗浄液、及び血清のサンプルを、接種後15日目に個々のマウスから採取した。唾液、血清、及び膣洗浄液中の淋菌特異的IgA、IgG、及びIgM、ならびに分泌物中の総IgA、IgG、及びIgM濃度を、ELISA法により測定した。
【００７７】
統計分析：データを平均±平均の標準誤差(SEM)として表す。膣淋菌感染症に対するIL-12-、IL-17-、抗TGF-β-、抗IL-10負荷ミクロスフェア-対-空ミクロスフェア治療の効果に関するデータを、ペアワイズ比較のボンフェローニ補正後検定による反復測定分散分析(ANOVA)を用いて分析した。感染クリアランスの比較には、ログランク検定によるKaplan-Meier解析も用いた。インビトロ実験からのデータを、２つの選択された群の間の平均値を比較するために、不対の両側t検定によって分析した。P＜0.05を統計学的に有意とみなした。
【００７８】
［結果］
IL-12ミクロスフェアの膣内投与は生殖管淋菌感染症からマウスを保護する
IL-12負荷ミクロスフェアの治療効果を調べるため、雌BALB/cマウス群を淋菌に感染させ、膣スワブ培養により細菌量を毎日モニタリングした。予備的な用量範囲の実験は、1.0μgのIL-12を含有するミクロスフェアの1日おきの膣内点滴注入が、空ミクロスフェアによる処置と比較して感染のクリアランスを加速するのに十分であることを示した；2.0μgのマイクロカプセル化IL-12ではクリアランスのさらなる増強は得られず、そしてより低い用量は漸進的に効果が低かった(図４Ａ)。
【００７９】
未処置又は空ミクロスフェア処置マウスは、約15日で感染を除去した(図４Ｂ、Ｃ)。最適1.0μg用量のマイクロカプセル化IL-12を膣内注入すると、4日目から回収可能な淋菌量が有意に減少し、これらのマウスは、空ミクロスフェア処置又は未処置マウスより、7、8日早い日までに感染を除去した(図４Ｂ、Ｃ)。治療が7日目に中止された後、感染は再発しなかった。対照的に、遊離可溶性IL-12の膣内投与は、淋菌のクリアランスの増強には全く効果がなかった(図４Ｂ、Ｃ)。
【００８０】
最適用量(1.0μg)でのIL-17負荷ミクロスフェアの膣内投与も、淋菌感染のクリアランスを加速したが、同じスケジュールで与えられたIL-12ミクロスフェアよりも程度は低かった(図４Ｂ、Ｃ)。
【００８１】
IL-12ミクロスフェアによる治療は、腟淋菌感染に対するTh1及び抗体反応を増強する
IL-12の治療効果の根底にある機序を解明するために、IL-12負荷ミクロスフェア又は空ミクロスフェアで処置したマウスにおける生殖器淋菌感染に対する局所免疫応答の特徴を明らかにした。細胞内IFN-γ、IL-4、IL-17を検出するために、フローサイトメトリーによる評価を目的として、淋菌又はビヒクル単独の接種から3、5、7、14日後に各群7匹のマウスのILN及び膣から単細胞懸濁液を調製した。接種後3日目から、IL-17+/CD4+Ｔ細胞が、局所排出ILN中に観察され、産生は5日目にピークに達し、感染期間の間持続した。5日目に、対照処置感染マウスのILN中に存在するCD4+Ｔ細胞の約22％が、IL-17+であったが、IFN-γ+は約3.5％しかなく、IL-4+/CD4+Ｔ細胞はほとんど検出されなかった(図４Ｄ)。IL-12ミクロスフェア治療は、淋菌に対するTh1免疫応答を顕著に増強し、これは、IFN-γ+/CD4+Ｔ細胞の数の有意な増加によって示される(図４Ｄ)。対照的に、IL-12ミクロスフェアは、ILN中のIL-4+/CD4+及びIL-17+/CD4+Ｔ細胞の数が処置群間で類似していることから、Th2又はTh17応答を変化させなかった(図４Ｄ)。RT-PCR分析の結果、IL-12ミクロスフェア処置後の感染マウスの膣では、IFN-γの発現が上昇したが、IL-4又はIL-17 mRNAの発現は上昇しなかった(図４Ｅ)。IL-17ミクロスフェアは淋菌感染を改善したが、この治療はTh1又はTh2応答の増強とは関連しなかったが(図４Ｄ、Ｅ)、Gr-1+好中球の生殖管への流入の増加があった(図４Ｆ)。
【００８２】
また、接種7日後に採取した膣洗浄液及び血清中のIL-12p70、IFN-γ、IL-4、IL-17濃度を、ELISA法で測定した。IL-12(176.5±48.6 pg/ml)は、IL-12ミクロスフェアで処置した感染マウスの膣洗浄液中で検出された。これらのマウスの血清中に低レベルのIL-12(41.7±10.7 pg/ml)が認められたことから、淋菌感染に対するIL-12ミクロスフェア処置の効果は、主としてサイトカインの循環血中への移動に起因するものではないことが示唆された。フローサイトメトリー試験と一致して、IFN-γはIL-12ミクロスフェアで処置した感染マウスの膣洗浄液(32.6±9.8 pg/ml)及び血清(43.3±11.5 pg/ml)に存在したが、IL-4及びIL-17は検出されなかった。これらのサイトカインはいずれも対照処置感染マウスでは検出されなかった。
【００８３】
IL-12は、IFN-γ依存的又は直接的に、体液性免疫応答を刺激することができる。そこで、淋菌感染中のIL-12ミクロスフェア処置が、接種15日後に採取した膣洗浄液、唾液、血清中の抗-淋菌抗体の産生につながるかどうかを調べた。IgM抗体は低レベルであり、実験群間の差はほとんどなかった(データは示さず)。いずれのマウス群においても唾液の淋菌-特異的抗体は検出されなかった(データは示さず)。対照処置マウスの淋菌感染は、膣洗浄液又は血清のいずれにおいても淋菌-特異的IgA又はIgG抗体を有意に上昇させなかった。しかし、IL-12ミクロスフェア処置は、膣及び血清の特異的IgG抗体(図４Ｇ、Ｈ)、ならびに膣の特異的IgA抗体産生を増加させた(図４Ｇ)。
【００８４】
IL-12ミクロスフェアによる処置は、二次淋菌感染に対する防御的既往免疫を誘導する
さらに、IL-12ミクロスフェア処置が、免疫記憶の生成及び再感染に対する防御免疫をもたらすかどうかを評価した。淋菌に感染したマウス群にIL-12負荷ミクロスフェア又は空ミクロスフェアを投与し、感染経過を追った後、マウスに15日目にセフトリアキソン(300μg i.p.)を投与して、淋菌が完全に排除されたことを確認した。IL-12ミクロスフェアで処置した偽感染マウスの追加群を用いて、感染がない場合のIL-12の持続効果の可能性を評価した。5〜6週間後、全マウスに同じ株の淋菌を接種したが、それ以上の処置は行わなかった。以前に観察されたように、対照処置マウスの一次感染は、その後の二次攻撃に対してマウスを防御しなかった：以前に空ミクロスフェア処置したマウスにおける二次淋菌感染の期間と細菌量は、年齢をマッチさせたナイーブマウスの一次感染と同じであった(図５Ａ、Ｂ)。対照的に、一次感染中にIL-12負荷ミクロスフェアを膣内投与すると、マウスは二次感染から保護された。一次感染中にIL-12ミクロスフェアを投与されていた再感染マウスは、対照よりも効果的にチャレンジに抵抗した(図５Ａ、Ｂ)。しかし、過去に偽感染マウスをIL-12ミクロスフェアで処置しても、その後の感染に対する防御は誘導されなかった(図５Ａ、Ｂ)。この結果は、残存するミクロスフェアが依然として淋菌の二次感染に影響を及ぼしている可能性も除外した。
【００８５】
二次感染の5日目と3日目にそれぞれ採取したILN細胞と膣のフローサイトメトリーとRT-PCR分析は、二次淋菌感染に対する過去のIL-12ミクロスフェア処置の防御効果が、Th1(IFN-γ)応答の有意な増強とも関連していることを示した(図５Ｃ、Ｄ)。また、IL-12ミクロスフェア処置マウスでは、淋菌を再負荷した後、強固な特異的二次抗体反応が認められた。IL-12ミクロスフェアで過去に治療された再感染マウスの膣洗浄液中の淋菌特異的IgA及びIgG抗体、ならびに血清中のIgG抗体は、対照群よりも有意に高かった(図５Ｅ、Ｆ)。
【００８６】
IL-12ミクロスフェア処置の効果とは対照的に、一次淋菌感染中のIL-17ミクロスフェア処置は、二次淋菌感染に対する防御免疫をもたらさず、既往Ｔ細胞又は抗体反応を誘発しなかった(図５Ａ〜Ｆ)。
【００８７】
［実施例３］
本実施例は、本実験的ワクチンが、マウスモデルにおいてTh1-誘発免疫応答及び淋菌感染に対する耐性を誘導することを記載する。
【００８８】
結果
【００８９】
淋菌OMV＋IL-12/msによるマウスの膣内免疫化は、淋菌による誘発感染のクリアランスを加速する
8匹の雌BALB/cマウスの群を、淋菌OMV(FA1090株；タンパク質40μg)＋IL-12/ms(IL-12 1μg)、又はOMV＋対照(空)msで、i.vagで免疫化した；さらに２つの対照群をIL-12/ms又は空ms単独で偽免疫した。1週間後と2週間後に免疫化を繰り返し、さらに2週間後にはすべてのマウスを、淋菌FA1090(5×106CFU)のi.vag点滴静注によってチャレンジした。対照(偽免疫)マウス、又はOMV＋空msで免疫したマウスは、チャレンジ後7日目に感染を除去しはじめ、15日目までにすべて除去した；クリアランスの中央日は10〜13日であった。これら３つの対照群間でクリアランス率に有意差はなかった(図６ａ)。しかしながら、OMV＋IL-12/msで免疫化したマウスは、6日目から感染を除去し始め、9日目までにすべて除去した；OMV＋空msで免疫化したマウスの12日と比較して、クリアランス中央値＝7.5日であった(P＜0.01、Kaplan-Meier；表1及び図６ａ)。この実験をさらに２回繰り返し、同様の結果を得た(表１及び図１３参照)。この発見の複製のさらなる例は、以下に報告される後続の実験において見られる。例えば、図６ｄ、９、１０ａ及びｃ)(及び、他の淋菌株については、図１０ｂ、ｄ及びｅ)、及び図１２ａ、ｂ、ｆ及びｇ(C57BL/6マウスで)。
【００９０】
【表１】
2021504478.tif 000002
【００９１】
クリアランス後(終了時、接種後15日目)に採取した血清及び膣洗浄サンプルを、ELISAによって、無傷の淋菌(FA1090)に対する抗体についてアッセイした。これは、OMV＋IL-12/msで免疫化したマウスでは膣及び血清中のIgG及びIgA抗体の発現量が最も高かったが、OMV＋空msで免疫化したマウスではこれらの抗体の発現量がはるかに低かったことを示した(図６ｂ)。免疫せず、偽感染させたマウスは、開始希釈にてアッセイバックグラウンドを超える検出可能な抗体を示さず、空ms単独で免疫化し、感染させたマウスも検出可能な抗体を発現しなかった(図６ｂ)。同時に採取した腸骨リンパ節(ILN)単核細胞を、表面CD4発現及び細胞内サイトカインについて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。これは、OMV＋IL-12/msで免疫したマウスのみがCD4+/IFNγ+(及びCD8+/IFNγ+)Ｔ細胞を生成したが、有意な数のCD4+/IL-4+Ｔ細胞を発現したマウスはいなかったことを明らかにした(図６ｃ；図１４も参照のこと)。しかし、免疫化にかかわらず、淋菌に感染した全てのマウスは、CD4+/IL-17+Ｔ細胞を発現した(図６ｃ及び図１４)。
【００９２】
さらなる実験を行い、感染に対する免疫抵抗性を誘導するのに必要な最小限の免疫回数を決定した。i.vagで投与されたOMV＋IL-12/msの単回投与は、チャレンジに対する耐性を一貫して生じなかったが、OMV(タンパク質40μg)＋IL-12/ms(IL-12 1μg)の2週間隔での２回投与は、感染に対する同様の耐性を誘導するのに十分であった。クリアランス中央値＝8日であった(図６ｄ；表１)。さらに、型判別不能のインフルエンザ菌(NTHI)から調製したOMV＋IL-12/msによる対照免疫では、淋菌に対する耐性は誘導されず、クリアランス中央値は13日であった(図６ｄ；表１)。これは、NTHIに対する抗体を誘導したが、淋菌に対する抗体は誘導せず(図１５ａ及びｂ)、ILNにおいてIFNγ-産生CD4+及びCD8+細胞を生成した(図１５ｃ)。
【００９３】
淋菌OMV＋IL-12/msによる腟内免疫は、持続的な淋菌-特異的抗体反応及びTh1細胞反応を誘導する
淋菌OMV＋IL-12/msで1、2、3回免疫した後、チャレンジする前の、局所及び全身性の免疫応答を明らかにするために、血清、膣洗浄液、ILNを、最終免疫の2週間後に、免疫マウスと対照マウスから採取した。血清の抗-淋菌IgM抗体は低レベルであり、実験群間の差はほとんどなかった。IgA及びIgG抗体は、空msのみを投与したマウスの膣洗浄液又は血清サンプルにおいて、バックグラウンドを超えて検出されなかった。淋菌OMV＋空msの３回接種による腟内免疫では、膣及び血清中の抗-淋菌IgA及びIgG抗体が上昇したが、OMV＋IL-12/msによる免疫化よりも程度は低かった(図７ａ)。対照的に、OMV＋IL-12/msの１回接種による免疫化では、血清及び膣洗浄液のいずれにおいても低レベルの抗-淋菌抗体が誘導された；２回目の投与では、抗体産生が上昇したが、３回の投与後にはそれ以上の上昇は見られなかった(図７ａ)。抗体は、Ecoli又はNTHIに対して、対照レベルを超えて検出されなかったことから、淋菌に特異的であると思われた。膣洗浄液及び血清の両方におけるIgGサブクラス抗体のアッセイは、IgG2aの優勢を示し、IgG1及びIgG2bの量は少なく、IgG3のレベルは低かった(図１６)。腟洗浄液及び血清中の抗-淋菌IgA抗体及びIgG抗体の産生は、OMV＋IL-12/msの２回接種による免疫後3ヵ月でピークに達し、免疫後6ヵ月で依然として検出可能であった(図７ｂ及びｃ)。
【００９４】
ILN細胞のフローサイトメトリー解析は、対照マウスのものと比較して、OMV＋IL-12/msで免疫したマウスのIFNγ+/CD4+及びIFNγ+/CD8+Ｔ細胞の数の増加を明らかにした(図８ａ)。抗体反応で観察されたように、１回の免疫はIFNγ産生を誘導するのに十分であり、それは２回の免疫によってさらに上昇した；３回の免疫ではそれ以上は増加しなかった。対照的に、OMV＋IL-12/msでの免疫化は、対照と比較して、IL-4+/CD4+及びIL-17+/CD4+Ｔ細胞の数を有意に増大させなかった(図８ａ)。誘導されたIFNγ+/CD4+(及びIFNγ+/CD8+)Ｔ細胞が、淋菌抗原に特異的であるかどうかを決定するために、ILNから単離されたCD4+細胞にCFSEをプレロードし、淋菌OMV有りの又は対照として刺激無しの抗原提示細胞の存在下にて、3日間インビトロで培養し、それらの増殖をフローサイトメトリーによって評価した。免疫マウスのILN由来のCD4+細胞は、対照マウス由来の細胞よりも、インビトロでの刺激に反応して、有意に増殖し、有意に多くのIFNγを産生した(図１７Ａ)。IL-4の産生は見られなかったが、IL-17は、淋菌OMVと共に培養されたCD4+Ｔ細胞によって産生された(図１７Ａ)。ILN CD4+Ｔ細胞によるIFNγ産生は、ゆっくりとレベルが低下するものの、免疫後4ヶ月間上昇したままであった(図８ｂ)。
【００９５】
さらに、最後の免疫化の3日後に、安楽死させたマウスから膣を切除し、全組織からRNAを抽出した。RT-PCR分析は、対照と比較して、淋菌OMV＋IL-12/msによる免疫化が、IFNγのmRNAの発現を有意に増強したが、IL-4又はIL-17のmRNAの発現は増強しなかったことを示した(図１７Ｂ)。膣組織におけるIFNγmRNA発現、及びILN CD4+細胞によるIFNγ産生は、淋菌OMV＋IL-12/msによるi.vag免疫化後2か月まで上昇したままであった (図１７Ｃ)。これらの知見は、排出ILNからの細胞で得られたサイトカイン発現結果を支持する。
【００９６】
ワクチン誘発性の感染抵抗性の持続期間
免疫抵抗性の期間を評価するために、8匹のマウスからなるグループを、淋菌OMV＋IL-12/msで免疫化し、免疫化の2、4、又は6か月後に、同じ淋菌株(FA1090)でチャレンジした。偽免疫化又はOMV＋空msで免疫化された、年齢をマッチさせた対照群と比較して、OMV＋IL-12/msで免疫化されたマウスは、免疫化の2又は4ヵ月後にチャレンジした場合、淋菌感染に対して耐性を示した；対照群のクリアランス中央値＝11〜11.5日に対して、免疫化マウスでは7日であった(表１＝補充表１)。同様の結果は、マウスを免疫化の6カ月後にチャレンジした場合の反復実験でも得られた；対照のクリアランス中央値＝9.5〜10日に対して、OMV＋IL-12/msで免疫化したマウスでは6.5日であった(図９；表１)。終了後、血清及び膣洗浄液中に、抗-淋菌抗体が検出された(図１８Ａ及びＢ)。IFNγ(IL-4-ではない)分泌CD4+Ｔ細胞がILNに存在した(図１８Ｃ)。注目すべきことに、チャレンジ後に検出された抗体及びIFNγ応答は、チャレンジ前よりも高く(図７ｂ、ｃ、及び８ｂと比較)、記憶のリコールを暗示した。以前に観察されたように、IL-17分泌性Ｔ細胞は、免疫化にかかわらず、淋菌によるチャレンジ後に常に認められた(図１８Ｃ)。マウスは加齢とともに淋菌感染に対する耐性が増すため、より長期間の評価は行われなかった。
【００９７】
免疫化は淋菌の異種株に対する抵抗性を誘導する
いかなるワクチンについても重要な考慮事項は、病原体の異なる株、ならびに免疫株と抗原的に相同な株に対しても有効であるべきであるということである。淋菌は、その表面抗原の大部分が複数の分子機構を介して関与するその抗原変異性でよく知られている。それゆえ我々は、淋菌OMVのある株でのi.vag免疫化が、同じ株でのチャレンジと同程度に他の株によるチャレンジに対して有効であるかどうかを決定した。最初に、マウス(各群8匹)を、FA1090株から調製したOMV＋IL-12/ms又は空msを用いてi.vagで免疫し、1ヶ月後に、淋菌株FA1090又はMS11(5×106CFU)をチャレンジした。FA1090 OMVによる免疫化は、FA1090又はMS11によるチャレンジに対する抵抗性を、同程度に誘導した(図１０ａ；表２)。チャレンジ及びクリアランス後、抗体は、MS11に対して同様のレベルに上昇し、ILN中のIFNγ+/CD4+Ｔ細胞によって示されるTh1応答は、同様に増強された(図１９Ａ、Ｂ、及びＣ)。相互様式において、MS11 OMV(＋IL-12/ms)での免疫化は、FA1090株でのチャレンジに対する抵抗性を誘導した(図１０ｂ；表２)。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
淋菌株FA1090及びMS11はいずれも、異なるサブタイプではあるが同じ主要タイプのポリン(PorB.1B)を保有している。従って、主要なポリンタイプが、免疫抵抗性に不可欠であるかどうかを決定するために、FA19株(PorB.1A)を用いてさらなる実験を行った。FA1090 OMV(＋IL-12/ms)での免疫化は、FA19でのチャレンジに対する抵抗性を誘導した(図１０ｃ；表２)。終了時にアッセイした抗体応答は、FA19に対する交差反応性を示し、ILN中のIFNγ+/CD4+Ｔ細胞は上昇した(図１９Ｄ、Ｅ、及びＧ)。相互的に、FA19 OMVでの免疫化は、FA1090株でのチャレンジに対する抵抗性を誘導した(図１０ｄ；表２)。他の免疫化及びチャレンジの組合せ(すなわち、FA19に対するMS11、及びその逆)も同様に、同様の交差抵抗性を示した(表２)。
【０１００】
淋菌FA1090、MS11、及びFA19株は、多くの研究室で広く使用されており、そのオリジナルが分離されて以来、広範に継代培養されている。その結果、突然変異を獲得し、その特徴の一部が変化した可能性がある。そこで、我々は、分離以来インビトロにて最小継代されてきた新規臨床株も、免疫マウスにチャレンジした。FA1090 OMV＋IL-12/msで免疫したマウスは、臨床分離株GC68(PorB.1B株；図１０ｅ；表２)及びGC69(PorB.1A；表２)によるチャレンジに対しても耐性を示した。
【０１０１】
免疫誘導抗体の標的となる抗原
一次元(1D)SDS-PAGEによって試験した場合、FA1090、MS11、及びFA19 OMVのタンパク質プロファイルは、類似していたが、明らかな定量的及び定性的変異を伴っていた(図１１ａ)。SDS-PAGEによって分離されたFA1090、MS11又はFA19 OMVに対する、FA1090 OMV＋IL-12/mで免疫化された一匹のマウス(#1)からの血清のウェスタンブロット分析は、約35〜80kDaで移動するバンドと反応性のIgG抗体を明らかにし、３つの株すべてのOMVに存在するバンドに対する反応性を示した(図１１ｂ、レーン２〜４)。H5抗体が同様の移動度のバンドと反応したので、約35kDaのこれらのバンドの１つは、ポリンに対応し得る(図１１ｂ、レーン６)。別の血清(#2)は、約45〜65kDaで移動する３つのバンドに対して強い反応性を示した(図１１ｂ、レーン５)。約45〜65kDaの抗原を同定するために、OMVの二次元(2D)SDS-PAGE分離と並行2D SDS-PAGEからなる免疫プロテオミクスアプローチと、それに続くイムノブロッティング(2D-イムノブロット)及び質量分析を用いた。Flamingo染色により明らかになったOMVの３つの2Dタンパク質マップは、多数のタンパク質種と、FA1090、MS11、及びFA19株の間で、OMVプロテオームにおける有意差を示した(図１１ｃ、ｄ、及びｅ)。対照的に、ブロットされたタンパク質マップは、それぞれ45kDa及び43kDa、ならびにpI 5.2及び5.5に対応する質量の２つのスポット(スポット１及びスポット２)(FA1090 OMV；図１１ｃ)、又はおよその質量45kDa及びpI 5.2を有する１つのスポット(スポット１)(MS11及びFA19 OMV；図１１ｄ及びｅ)を示した。スポット１及びスポット２(図１１ｃ、ｄ、及びｅ)から得られたトリプシンペプチドの質量分析は、それぞれ、トップヒットとしての翻訳伸長因子-Tu(EF-Tu)、及び推定ペリプラズムポリアミン結合タンパク質である、PotF3(表３)を明らかにした。EF-Tuは、３つの2D-イムノブロットすべてにおいて免疫反応性であったことから、最も信頼性の高い抗原として現れ、すべてのOMV製剤において最も高い信頼性(スコア485.0〜947.1)及びカバー率(64.2〜90.6)で同定された(表３)。
【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
淋菌に対する免疫抵抗性はIFNγと抗体に依存する
IL-12/msで免疫増強したOMVによる免疫化の防御作用が、IFNγ又は抗体応答、又はCD4+又はCD8+Ｔ細胞によって決定される免疫に依存するかどうかを決定するために、IFNγ(IFNγ-ko)B細胞(μMT)、CD4+Ｔ細胞(CD4-ko)、又はCD8+Ｔ細胞(CD8-ko)を欠損した突然変異C57BL/6マウスを用いて免疫化実験を行った。8匹のC57BL/6野生型(対照)及び免疫不全マウスの群を、FA1090 OMV＋IL-12/ms又は空のmsで免疫し、そして1ヶ月後に、淋菌 FA1090(5×106 CFU)でチャレンジした。膣淋菌感染の経過は、野生型対照と比較して、未免疫の免疫不全マウスでは変化しなかった。すべての野生型及び免疫不全マウスは、7〜11日目から回収可能な淋菌量を減少させ始め、12〜14日目(中央値9〜13日)までに感染を除去した。これは前節で述べた実験で用いたBALB/cマウスと同様であった(図１２ａ、ｂ、ｆ、ｇ；表４)。
【０１０４】
【表４】
2021504478.tif 000007
【０１０５】
野生型マウスとは対照的に、OMV＋IL-12/msで免疫化したIFNγ-ko又はμMTマウスでは、OMV＋空msで免疫化した場合と比較して、淋菌感染のクリアランスは加速されなかった(図１２ａ及びｂ；表４；図２０Ａ及びＢ)。このように、IFNγ又はB細胞のいずれかが欠損すると、生殖器淋菌感染に対する免疫抵抗性の発生におけるIL-12/msのアジュバント効果が抑制された。野生型マウスにおいてOMV＋IL-12/msにより誘導された淋菌-特異的腟及び血清IgA及びIgG抗体の産生は、IFNγ-koマウスでは抑制され(図１２ｃ及びｄ)、免疫化IFNγ-koマウスのILN細胞によるIFNγの産生は予想通り認められなかった(データは示さず)。同様に、μMTマウスにおいて、免疫化に対する検出可能な抗体応答はなかった(データは示さず)。対照的に、淋菌OMV＋IL-12/msで免疫したμMTマウスのILNにおけるIFNγ+/CD4+Ｔ細胞の数は、影響を受けず、IL-4反応はなかったが、IL-17反応は変化しなかった(図１０ｅ＝図５Ｅ)。これらの知見は、淋菌OMV＋IL-12/msによる免疫化によって誘導される抵抗性が、IFNγ及びB細胞の両方に依存し、後者はおそらく淋菌-特異的抗体を産生することを示している。
【０１０６】
淋菌OMV＋IL-12/msによる免疫の防御効果は、野生型対照(図１２ｆ及びｇ；表４；図２０Ｃ及びＤ)と比較して、CD4-koでは不完全に減少し、CD8-koマウスでも部分的に減少した。これらの知見は、免疫抵抗性を生じるためのCD4+Ｔ細胞の必要性が、IFNγも産生し得るCD8+又はNK細胞などの他の細胞によって部分的に補われ得ることを示唆する。しかし、CD8+細胞は、防御免疫にとってそれほど重要ではないようであった。
【０１０７】
考察
我々は、生殖器淋菌感染に対する免疫抵抗性のワクチン誘導状態が、無傷の哺乳動物免疫系によって確実に生成することを初めて実証した。免疫のこの状態は、B細胞による抗体の産生と、主にCD4+Ｔ細胞によるIFNγの産生に依存していると考えられた。淋菌OMV＋IL-12/ms(アジュバントとして)によるマウスのI.vagワクチン接種は、淋菌抗原に対する血清及び膣IgG及びIgA抗体、及び排出ILN中のIFNγを分泌するCD4+及びCD8+Ｔ細胞を誘導した。Th1細胞反応及び抗体反応はいずれも免疫後数カ月間持続し、淋菌の攻撃に対する抵抗性を少なくとも6カ月間誘発することができ、免疫記憶の想起が認められた。淋菌OMV単独によるI.vag免疫化は、アジュバントなし又は対照(空)msありのいずれでも、検出可能なIFNγ産生を伴わず、誘発感染に対する有意な抵抗性を示さず、弱い抗体反応しか誘発しなかった。NTHIから調製したOMV＋IL-12/msによる対照免疫では、IFNγ応答が誘導されたものの、免疫抵抗性や淋菌と交差反応性を示す抗体は生じなかった。したがって、IFNγは淋菌に対する抵抗性に必要であると思われるが、特異的な抗体がなければ十分ではない。
【０１０８】
淋菌OMVワクチンとともに、アジュバントとしてi.vag投与したIL-12/msが、生殖器淋菌感染の有意に短縮した経過によって明らかになったTh1-誘発防御免疫を増強することを本明細書にて報告する。遊離可溶性IL-12は無効であり、ms中に封入されたIL-12がOMVとのアジュバント効果に必要であったことは強調されるべきである。
【０１０９】
淋菌によって示されるよく知られた広範な抗原変異を考慮すると、抵抗性は、OMVワクチンを調製した相同株に対してだけでなく、異種株にも予想外に拡大した。今回の結果から、FA1090株由来のOMVによる免疫化は、MS11株及びFA19株に対して同等に抵抗性を増強し(逆もまた同様)、これらの「実験室株」に加えて淋菌の臨床分離株にも抵抗性が及ぶことが示される。主要な淋菌表面抗原の中で、FA1090、MS11、及びFA19は、それらのポリン(PorB)分子の点で異なることが分かっている。FA1090及びMS11は、異なるサブタイプのPorB.1Bを有し、そしてFA19はPorB.1Aを有する(Elkins et al., Mol. Microbiol. 14, 1059-1075 (1994))。十分に特徴付けられていないが、それらのゲノムにコードされるOpaタンパク質は異なっており(Hobbs et al., Front. Microbiol. 2, 123 (2011), Cole et al., PLoS One 4, e8108 (2009))、及びそれらのLOSは異なっている(Erwin et al., J. Exp. Med. 184, 1233-1241 (1996))。Opaタンパク質及びLOSグリカン鎖はまた相-可変性であり、異なる抗原性エピトープの発現を生じる(Apicella, M.A. et al. Phenotypic variation in epitope expression of the Neisseria gonorrhoeae lipooligosaccharide. Infect. Immun. 55, 1755-1761 (1987))。
【０１１０】
交差防御免疫と一致して、免疫によって誘導された抗体のELISA分析は、血清及び膣洗浄液中のIgG及びIgAの両方に関して、異なる株に対する検出可能な、定量的に類似したレベルの抗体を明らかにした。抗体はE.coli又はNTHIに対して検出されなかったことから、淋菌に特異的であると考えられ、それらはNTHIから調製したOMVによる免疫によっては産生されなかった。しかしながら、血清IgG抗体のウェスタンブロット分析は、淋菌の異なる株間で共有される抗原のエビデンスを明らかにした。45〜65kDaで移動するバンドは、30〜40kDaの範囲にあるポリン及びOpaのような主要な淋菌外膜タンパク質よりも高い分子量で移動した。
【０１１１】
我々の研究は、FA1090、MS11、及びFA19 OMVにおけるEF-Tu、ならびにFA1090におけるPotF3という２つの新規な淋菌ワクチン候補を同定した。両タンパク質は、４つの一般的な淋菌分離株(Zielke et al., Molec. Cell. Proteomics 13, 1299-1317 (2014))に由来する細胞エンベロープ及びOMVの定量的プロテオミクスプロファイリングにおいて同定されている。EF-Tuは、スポットと分析されたOMVすべてのどちらにおいても同定されているため、特に関心を集めている。EF-Tuは、細胞質のGTP結合タンパク質であり、タンパク質合成に必須の因子であると一般的に認識されている。
【０１１２】
本開示は、Th1-誘発アジュバントであるIL-12/msを伴う、不活化ワクチン(OMV)のi.vag投与によって、個体を淋菌に対して免疫化できることを実証する。これらの知見は、過去の挫折にもかかわらず淋菌に対するワクチンの実現可能性を示しており、これらの知見は、防御免疫を生み出すために誘導される必要がある免疫応答の種類にも光を当てている。
【０１１３】
方法
マウス
野生型BALB/c及びC57BL/6マウス、C57BL/6バックグラウンドに対する、B6.129S7-Ifngtm1Ts/J(IFNγ-欠損)、B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J(B細胞-欠損；μMTとしても知られる)、B6.129S2-Cd4tm1Mak/J(CD4-欠損)、及びB6.129S2-Cd8atm1Mak/J(CD8-欠損)マウスを含むすべてのマウスを、Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)から購入した。特に明記しない限り、BALB/cマウスを実験に使用した。マウスを、AAALACによって完全に認定されているバッファロー大学の実験動物施設のBSL2施設で管理した。すべての動物使用プロトコルは、バッファロー大学の動物実験委員会の承認を受けた。
【０１１４】
細菌
淋菌株FA1090はDr.Janne Cannon(ノースカロライナ大学チャペルヒル校)から、MS11株はDr.Daniel Stein(メリーランド大学)から、FA19株及び臨床分離株は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で維持されている臨床株のコレクションから得られた。マウス感染モデルで使用するために、淋菌株9087及び336を、FA1090株由来のストレプトマイシン耐性rpsL遺伝子で形質転換し、それぞれGC68及びGC69株を作製した。E.coli K12は、Dr.Terry Connell(バッファロー大学)によって提供された。分類不可能なインフルエンザ菌(NTHI)株6P24H1は、Dr.Timothy Murphy(バッファロー大学)から提供された。ヘモグロビン及び濃縮培地であるISOVITALEX(登録商標)(BD Diagnostic Systems、Franklin Lakes、NJ)を補充したGCアガー上で、淋菌を培養し、得られた増殖を、Opaタンパク質及び線毛発現と一致するコロニー形態についてチェックした。NTHIを、ヘモグロビンのみを補充したGCアガー上で培養した。E.coliをBHIアガーで培養した。細菌をプレートから回収し、細胞密度を決定した(Liu et al., Mucosal Immunol. 5, 320-331 (2012))。
【０１１５】
IL-12ミクロスフェア
マウスIL-12(Wyeth、Philadelphia、PA)を、ウシ血清アルブミンをスクロース(0.1％、w/w)で置き換えたことを除いて、以前に記載されたような相反転ナノカプセル化技術を使用して、ポリ乳酸ミクロスフェア中に封入した(Egilmez et al., Methods Mol. Med. 75, 687-696 (2003))。空ミクロスフェアを、IL-12なしで、同じ方法で調製した。
【０１１６】
淋菌外膜小胞(OMV)
補充GCアガー上で18〜22時間培養した後、淋菌をプレートから氷冷酢酸リチウム緩衝液(pH 5.8)中に採取し、25ゲージ針に10〜12回通して、細菌から外膜を剪断した。懸濁液を微量遠心管中で13,000 RPMで1分間回転させた。上清を回収し、107,000×gで2時間超遠心機にかけた。ペレットを50mMのTris-HCl(pH 8.0)で洗浄し、PBSに再懸濁した。タンパク質を、Micro BCAタンパク質キット(Thermo Scientific、Rockford、IL)又はRC DCタンパク質アッセイキット(Bio-Rad、Hercules、CA)でアッセイした。
【０１１７】
免役化スケジュールとマウス膣感染モデル
7〜9週齢の雌マウス8匹からなる群を、記載されている種々の株の淋菌OMV(タンパク質40μg)＋IL-12/ms(1μg IL-12)又は空ms(全容量40μl PBS)でi.vag免疫し、対照群をIL-12/ms又は空ms単独で偽免疫した。マウスを、示されるように、7〜14日間隔で1〜３回免疫した。さらに2週間〜6ヶ月後、免疫化マウスを、以前に記載されたように(Jerse, Infect. Immun. 67, 5699-5708 (1999；Liu et al., J. Infect. Dis. 208, 1821-1829 (2013))、5×106CFUの生きた淋菌に感染させた(0.5mgのプレマリン(Pfizer、Philadelphia、PA)を、-2、0、2日目に皮下投与されるエストラジオールとして使用したという改変を伴った)。毎日採取した膣スワブを、ヘモグロビン、ISOVITALEX(登録商標)(濃縮培地)及び選択的抗生物質(バンコマイシン、ストレプトマイシン、ナイシン、コリスチン、及びトリメトプリム)を補充したGCアガー上で定量的に培養し、細菌コロニー形成量を決定した。検出限界は、マウス当たり回収された100コロニー形成単位(CFU)であった。淋菌の回収は実験的治療に対して「盲検化」された個人によって計数され、検証のためにすべての実験を２回又は３回繰り返した。
【０１１８】
血清及び粘膜抗体のアッセイ
膣洗浄液及び血清のサンプルを、示された時点でマウスから採取した(Liu et al., mBio 2：(2011))。膣洗浄液及び血清中の淋菌-特異的IgA、IgG、IgM、及びIgGサブクラス抗体IgG1、IgG2a、IgG2b、及びIgG3を、未希釈の膣洗浄液及び出発希釈液として10倍希釈した血清を用いて、全淋菌でコーティングしたプレート上でELISAによって測定した17,26。分泌物中の総IgA、IgG、及びIgM濃度を、抗-IgA、-IgG、又は-IgM抗体(Southern Biotech、Birmingham、AL)でコーティングしたプレート上でELISAによってアッセイした。H5マウスモノクローナル抗体(淋菌ポリン血清型PIB3に特異的)又はアフィニティー精製マウスIgA、IgG及びIgM(Southern Biotech)を用いて標準曲線を確立した。結合した抗体を、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗-マウスIgA、IgG、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、又はIgG3抗体(Southern Biotech)及びp-ニトロフェニルホスフェート基質(Southern Biotech)によって検出した。プレートを、SoftMaxソフトウェア(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を用いたVersaMaxマイクロプレートリーダー又はKC Juniorソフトウェア(Bio-Tek Instruments、Winooski、VT)を用いたELX800ユニバーサルマイクロプレートリーダーで読み取った。抗体データは、同時にアッセイした対照サンプル(偽免疫マウス由来)において検出された抗体レベルに対する相対値(-倍の増加)として表した。
【０１１９】
フローサイトメトリー
単離した細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、次いで、示した抗体と共に氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、FACSCaliburサイトメーターで分析した。細胞内染色のために、細胞を最初にCYTOFIX/CYTOPERM(登録商標)(eBioscience)で固定した。FITC、PE、又はアロフィコシアニンと結合したマウスCD4、CD8、IFNγ、IL-4、及びIL-17Aに対する抗体を、eBioscienceから購入した。
【０１２０】
リンパ球の単離及び培養
単核細胞を、Histopaque 1083(Sigma-Aldrich、St Louis、MO)密度勾配遠心分離を使用して無菌的に採取したILNから単離し、そして2又は3匹のマウスからプールして、培養のために十分な数の細胞を提供した。CD4+Ｔ細胞を、Dynal CD4細胞単離キット(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いたネガティブ選択により精製した。細胞を24ウェル培養プレート中、2×106細胞/mlの密度で、同数のマイトマイシンC不活化脾臓細胞の存在下で培養し、刺激なし又は2×107の淋菌細胞ありのいずれかで、APCとして働かせた。
【０１２１】
増殖アッセイ
細胞に、カルボキシメチルフルオレセイン スクシンイミドエステル(CFSE； Sigma-Aldrich)を標識した。次いで、CFSE標識細胞をPBS中で２回洗浄し、再カウントし、そして上記のように刺激した。培養細胞を回収し、次いでアロフィコシアニン結合抗-マウスCD4抗体で染色した。データは、FACSCaliburサイトメーターでCD4+細胞集団をゲーティングすることによって得た。CFSE蛍光の減衰を用いて細胞増殖を測定した。
【０１２２】
サイトカインELISA
IFNγ、IL-4、及びIL-17Aレベルを、eBioscienceから購入したELISAキットを用いて三連で測定した。
【０１２３】
リアルタイムRT-PCR
マウスから採取した全膣の全細胞RNAを、RNEASY(登録商標)RNA精製ミニキット(Qiagen、Valencia、CA)で単離し、ISCRIPTTM cDNA合成キット(Bio-Rad、Hercules、CA)を用いてcDNAに転写した。PCRのリアルタイムモニタリングのために、SYBR(登録商標)緑色染料(Bio-Rad)を用いてICYCLER IQ(登録商標)検出システム(Bio-Rad)にて、リアルタイムRT-PCRを行った。使用したプライマーは以下の通りであった：
IFNγ, 5’-TACTGCCACGGCACAGTCATTGAA-3’(配列番号１), 5’-GCAGCGACTCCTTTTCCGCTTCCT-3’(配列番号２)；
IL-4, 5’-GAAGCCCTACAGACGAGCTCA-3’(配列番号３), 5’-ACAGGAGAAGGGACGCCAT-3’(配列番号４)；
IL-17A, 5’-TCAGGGTCGAGAAGATGCTG-3’(配列番号５), 5’-TTTTCATTGTGGAGGGCAGA-3’(配列番号６)；
β-アクチン 5’-CCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’(配列番号７), 5’-GAGGCATACAGGGACAGCACA-3’(配列番号８)
標的遺伝子の相対定量を、Bio-Rad IQTM5光学システムソフトウェアによって決定された閾値サイクル(Ct)に基づいて分析した。
【０１２４】
ウェスタンブロット
淋菌OMV調製物を、2-メルカプトエタノールを含有するドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ローディングバッファー中で5分間煮沸した。タンパク質定量は、RC DCタンパク質アッセイキットを用いて行った。各サンプルからの10マイクログラムのタンパク質を、10％ポリアクリルアミドSDS電気泳動ゲル上で分離した。タンパク質バンドを、電気泳動転写システム(Bio-Rad、Hercules、CA、USA)を用いてニトロセルロース膜上に転写した。ニトロセルロース膜を、4℃で一晩、3％スキムミルクを含有するPBSでブロックした後、1：200に希釈した血清サンプルとともに、又は3％スキムミルクを含有するPBSで1：20に希釈した膣洗浄サンプルとともに2時間インキュベートした。淋菌OMV調製物に結合した特異的抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗-マウスIgG(Santa Cruz Biotechnology、Paso Robles、CA)を用いて1：4000の希釈で検出した。化学発光検出にPierce検出キットを用い、画像をChemiDoc MP画像システム(Bio-Rad)で収集した。
【０１２５】
イムノプロテオミクス
OMVにおけるタンパク質濃度を、DCプロテインアッセイキット(Bio-Rad)を用いて測定した。OMVのサンプル[二次元(2D)SDS-PAGE-MS/MS分析及びイムノブロッティングのために、それぞれ300μg及び50μgのタンパク質]を、90％アセトン中で一晩沈殿させ、100％氷冷アセトンで２回洗浄し、風乾した。タンパク質ペレットを200μLの再水和緩衝液(7M尿素、2Mチオ尿素、2％CHAPS、2％ASB-14、1％DTT、2mM TBP、2％ 3-10 IPG緩衝液、微量のOrange G)中で再構成し、pH 4-7のReadyStrip IPGストリップ(Bio-Rad)を、25℃で一晩再水和するために使用した。等電点電気泳動は、PROTEAN(登録商標)i12TMIEFシステム(Bio-Rad)を用いて、合計26,000Vh以下の設定で行った：50μA電流制限、26,000Vh用の8000V急速ランプ、750Vホールド。二次元(2D)SDS-PAGEは、Criterion TGX Any kDゲル(Bio-Rad)を用いて行った。タンパク質をフラミンゴ蛍光染色(Bio-Rad)で一晩染色し、ChemiDoc画像システム(Bio-Rad)を用いてスポットを視覚化した。イムノブロッティングのために、分離したタンパク質を、TurboBlottトランスファーシステム(Bio-Rad)を用いてPVDF膜上に移した。膜を、5％のミルクを含むPBS Tween中で2時間ブロックし、免疫化マウスの血清との一晩のインキュベーションによってプローブし、その後、抗-マウスHRP-結合抗体(Bio-Rad)とのインキュベーションを行った。Clarity Western ECL基質及びChemiDoc MP画像システム(Bio-Rad)を用いてスポットを可視化した。膜上のタンパク質を、Novexリバーシブル膜タンパク質染色(InVitrogen)で染色して、選択した「アンカー」スポットの位置を、フラミンゴ染色した2Dゲルでオーバーレイした。一致するスポットを切除し、タンパク質をトリプシン消化した。抽出されたペプチドを含むサンプルを、ZipTip C18(Millipore, Billerica, MA)を用いて脱塩し、70％アセトニトリル/0.1％TFAで溶出し、SpeedVac中で乾燥させた。脱塩ペプチドを、0.1％ギ酸(20μL)中の2％アセトニトリル中に入れ、ハイブリッドOrbitrap Elite ETD(Thermo Scientific)質量分析計に連結したThermo Scientific Easy-nLC II(Thermo Scientific、Waltham、MA)ナノHPLCシステムを用いてLC/ESI MS/MSによって分析した(2μL)。インライン脱塩は、Magic C18AQ(5μm 200Å樹脂；Michrom Bioresources、Auburn、CA)を充填した逆相トラップカラム(100μm×20mm)を使用して行い、続いて、エレクトロスプレーイオン源上に直接乗せたMagic C18AQ(5μm 100Å樹脂； Michrom Bioresources)を充填した逆相カラム(75μm×250mm)上でペプチド分離を行った。0.1％ギ酸中の7％〜35％アセトニトリルの30分間勾配を、流量400nL/分にて、クロマトグラフィー分離に使用した。加熱キャピラリー温度を300℃に設定し、2750Vのスプレー電圧を、エレクトロスプレーチップに印加した。Orbitrap Elite機器は、データ依存モードで操作され、OrbitrapにおけるMSサーベイスキャン(AGC目標値100万、分解能24万、及び注入時間250ミリ秒)と、線形イオントラップにおけるMS/MSスペクトル取得(AGC目標値1万、及び注入時間100ミリ秒)とを自動的に切り替えた。フーリエ変換(FT)フルスキャンからの20個の最も強いイオンを、35％の正規化衝突エネルギーでの衝突誘起解離による線形トラップ中のフラグメンテーションのために選択した。選択されたイオンは、リストサイズ500及び質量幅±0.5による排除質量±0.5で、15秒間、動的に排除された。データ分析は、Proteome Discover 1.4(Thermo Scientific)を用いて行った。全ての同定されたペプチドを、一般的な汚染物質(thegpm.org/crap/)のデータベース��あるcRAP.fastaと組み合わせた淋菌データベース(FA1090、FA19、及びMS11)に対して検索した；これは、偶然又は不可避の汚染によって存在する、プロテオミクス実験で一般的に見出されるタンパク質のリストを作製する。トリプシンを、最大ミスド・クリベージ(maximum missed cleavages)を2に設定した酵素として設定した。プリカーサーイオン許容度は10ppm、フラグメントイオン許容度は0.8Daに設定した。可変修飾には、メチオニン(+15.995Da)の酸化及びシステイン上のカルバミドメチル(+57.021Da)が含まれた。Sequest HTを用いてデータを検索した。すべての検索結果は、スコアリングのためにPercolatorを通して実行された。
【０１２６】
統計解析
データは、平均±平均の標準誤差(SEM)として表す。接種後の淋菌の回収に対する免疫化の影響のデータを、フィッシャーの保護された最小有意差事後検定による反復測定のための二元配置分散分析を用いて分析した。さらに、ログランク検定によるKaplan-Meier解析を用いて、感染のクリアランス(回収がゼロになった連続3日間のうち最初の日と定義)を治療群間で比較した。免疫応答データについては、独立両側t検定を用いて2群間の平均値を比較、あるいは、多重比較にはボンフェローニ事後検定によるANOVAを用いた。P＜0.05を統計学的に有意とみなした。統計分析は、Microsoft Excel又はPrism 5(GraphPad Software、San Diego、CA)を用いて行った。
【０１２７】
［実施例４］
この実施例は、OMV及びIL-12msの鼻腔内投与を記載する。雌マウス(各群8匹)を、OMV(40μgタンパク質、FA19株)＋IL-12/ms(1μg IL-12)又は空msで、0日目及び14日目に鼻腔内免疫した。2週間後、すべてのマウスに、5×106 CFUの淋菌株FA1090を膣内チャレンジした。毎日採取した膣スワブを希釈し、選択的抗生物質を含有するGCアガープレート上で定量的に培養した。結果は、OMV＋IL-12msで免疫したマウスが、対照群よりも感染を有意に速く除去することを示す(p＜0.01、図２１)。加えて、細菌コロニー形成量は、OMV＋IL-12msで免疫したマウスで有意に低かった。
【０１２８】
［実施例５］
鼻腔内投与経路を介して送達されるOMV及びIL-12ミクロスフェアを含む組成物の防御効果、及び鼻腔内投与経路と膣内投与経路との比較をより詳しく説明するために研究を行った。
【０１２９】
マウスを、淋菌株FA1090のOMVタンパク質から調製した異なる用量(15μg、30μg、又は60μg)のOMVで、マイクロカプセル化IL-12(IL-12/ms；1μgのIL-12)と一緒に、又はIL-12/ms単独で、鼻腔内(i.n.)免疫した。2週間後に免疫化を繰り返した。最終投与の2週間後に、マウスを生きた淋菌株FA19で膣内チャレンジし、感染経過を、前述のように毎日の膣スワビング及びプレーティングによって観察した。図２２に示すように、低用量の15μg OMVで免疫したマウスは、IL-12/ms単独で免疫した対照群と比較して、感染のクリアランスの加速を示さなかった(クリアランス時間の中央値：両群とも10日間)。通常用量(中用量)30μgで又は60μgに増量したOMVで免疫したマウスは、対照群よりも感染を有意に速く除去した(それぞれクリアランス中央値6日間及び7.5日間)(P＜0.001、Kaplan-Meier、ログランク検定)。
【０１３０】
鼻腔内(i.n.)免疫化と膣内(i.vag.)免疫化とを以下のように比較した。マウスを、30μgの(タンパク質としての)淋菌FA1090 OMV＋IL-12/ms(1μg IL12)、又は空ミクロスフェア(ms)で、i.n.もしくはi.vag.のいずれかで免疫し、2週間後に免疫を繰り返した。2週間後、マウスに生きた淋菌株FA19をi.vag.チャレンジし(異種チャレンジ)、感染の経過を、前述のように毎日の膣スワビングとプレーティングによって観察した。図２３Ａ〜Ｄに示すように、OMV＋IL-12/ms i.n.で免疫したマウスは、i.vag.免疫したマウスと同等に感染を除去した。感染のクリアランス後(チャレンジから2週間後)、ELISA法によりIgG及びIgA抗-淋菌抗体をアッセイするために、血清、膣洗浄液、及び唾液サンプルを採取した。IL-12/msでi.n.免疫したマウスは、同じワクチンでi.vag.免疫したマウスと同程度に感染を除去した(図２３Ａ)。OMV＋IL-12/msでi.n.免疫したマウスは、i.vag.免疫したマウスよりも、高レベルで血清(図２３Ｂ)及び膣洗浄液(図２３Ｃ)においてIgG及びIgA抗体を生じた。OMV＋IL-12/msでi.n.免疫したマウスも、高レベルの唾液IgA抗体を発現した(図２３Ｄ)。
【０１３１】
マウスをOMVの調製に用いたのと同じ株である、FA1090でチャレンジした場合(同種チャレンジ)、OMV＋IL-12/msでi.n.免疫化したマウスは(図３に記載)、i.vag.免疫したマウスと同程度に感染を除去した(図２４)。
【０１３２】
マウスを淋菌FA1090 OMV(30μgタンパク質)＋IL-12/ms(1μg IL-12)で１回又は２回i.n.免疫し、対照マウスには空msを投与した。２回目の免疫化の2週間後に、マウスに淋菌MS11をi.vag.チャレンジした(異種チャレンジ)。図２５に示すように、OMV＋IL-12/msで２回免疫したマウスは、１回免疫したマウス(クリアランス時間中央値：9日)や対照マウス(クリアランス時間中央値：7日)よりも感染を速やかに除去した(クリアランス時間中央値：4日)；P＝0.0155(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
【０１３３】
マウスを、淋菌MS11から調製したOMV(30μgタンパク質)＋IL-12/ms(1μg IL-12)又は空msでi.n.免疫し、異種淋菌株FA1090でチャレンジした。図２６に示すように、MS11 OMV＋IL-12/msで免疫したマウスは、MS11 OMV＋空msで免疫したマウス(クリアランス時間中央値：11日)と比較して、又は免疫していない対照マウス(クリアランス時間中央値：12日)と比較して、より速く感染を除去した(クリアランス時間中央値：7日)；P＝0.0231(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
【０１３４】
マウスを、淋菌MS11から調製したOMV(30μgタンパク質)＋IL-12/ms(1μg IL-12)又は空msでi.n.免疫し、そして異種淋菌株FA19でチャレンジした。図２７に示すように、MS11 OMV＋IL-12/msで免疫したマウスは、MS11 OMV＋空msで免疫したマウス(クリアランス時間中央値：9日)と比較して、又は免疫していない対照マウス(クリアランス時間中央値：10日)と比較して、より速く感染を除去した(クリアランス時間中央値：5日)。P＝0.0007(Kaplan-Meier解析、ログランク検定)。
【０１３５】
これらの実験で用いた淋菌株は、異なるポリンタイプを発現することに注意すべきである。淋菌ポリンPorBは淋菌の主要な外膜タンパク質であり、PorB-1AとPorB-1Bの２つの主要なタイプに代表され、それぞれ多くのサブタイプを有している。FA1090株はポリンタイプPorB-1Bを有し、MS11株もポリンタイプPorB-1Bを有するが、FA1090とは異なるサブタイプであり、FA19株はポリンタイプPorB-1Aを有する。加えて、これらの株は異なるOpaタンパク質とリポオリゴ糖構造を発現するため、淋菌の広く異なる抗原変異体を示す。
【０１３６】
本発明を１つ又は複数の特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態が可能であることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ＡＢ】
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【図４ＣＤ】
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【図４ＥＦ】
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【図４ＧＨ】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図５ＥＦ】
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【図６ａｂ】
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【図６ｃｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａｂ】
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【図１０ｃｄｅ】
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【図１１】
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【図１２ａｂ】
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【図１２ｃｄｅ】
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【図１２ｆｇ】
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【図１３ＡＢＣ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ＡＢ】
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【図２０ＣＤ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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