(57)【要約】本発明は、マイクロＲＮＡを含む脂質製剤に関する。製剤は、マイクロＲＮＡと共に脂質ナノ粒子を形成することができるカチオン性脂質を含む。製剤は、医薬品において有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子が、ジアミノ脂質及びｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのソースを含み、
ｉ）前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、抗がんｍｉＲＮＡであり、配列番号１７〜５０で表されるシード配列の７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましく、前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体からなる群から好ましくは選択され、
ｉｉ）前記ジアミノ脂質は、一般式（Ｉ）
【化１】
2021513508.tif 000028
（式中、
ｎは、０、１、又は２であり、
Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）
のものである、組成物。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡが、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ，、若しくはｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ模倣体、又は
ｉｉ）ｍｉＲＮＡ−３４２−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−３２４−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ，、若しくはｍｉＲＮＡ−３２４−５ｐ模倣体、又は
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ模倣体、又は
ｉｖ）ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３分子、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３模倣体、又は
ｖ）ｍｉＲＮＡ−３１５７−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−３１５７−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−３１５７−５ｐ模倣体、又は
ｖｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ模倣体、又は
ｖｉｉ）ｍｉＲＮＡ−７−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−７−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−７−５ｐ模倣体
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡのソースが、ｍｉＲＮＡの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡが、配列番号５１〜１２５、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、若しくは２２１のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、１５〜３０ヌクレオチド長である、
及び／又はｍｉＲＮＡの前記ソースが、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号１〜１６のうちのいずれか１つと、好ましくは配列番号１〜８のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
さらなるｍｉＲＮＡ又はその前駆体をさらに含み、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ジアミノ脂質が、一般式（Ｉ）（式中、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３が、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、マルガリル、ステアリル、α−リノレニル、γ−リノレニル、リノレイル、ステアリジル、バクセニル、オレイル、エライジル、パルミトレイル、及び３，７，１１−トリメチルドデシルからなる群から選択される）のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ジアミノ脂質が、一般式（Ｉ）（式中、ｎが１である）のものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ジアミノ脂質が、一般式（Ｉ）（式中、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３が、同一である）のものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
好ましくはアドステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、コレカルシフェロール、コレステンジオン、コレステノール、コレステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ジヒドロタキステロール、ジメチルコレステロール、エルゴカルシフェロール、エルゴステロール、エルゴステノール、エルゴスタトリエノール、エルゴスタジエノール、エチルコレステノール、フシジン酸、ラノステロール、ノルコレスタジエノール、β−シトステロール、スピナステロール、スチグマスタノール、スチグマステノール、スチグマスタジエノール、スチグマスタジエノン、スチグマステロール、及びスチグマステノン、より好ましくはコレステロールからなる群から選択される、ステロールをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥｇｇＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳｏｙＰＣ）、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択されるリン脂質をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートをさらに含み、
ｉ）水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチル−ｌ−アスパラギン）（ＰＨＥＡ）、ポリ−（ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）（ＰＨＥＧ）、ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）、ポリグリセロール（ＰＧ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡｍ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、及びポリ（２−オキサゾリン）（ＰＯｘ）、好ましくはポリ（エチレングリコール）からなる群から選択され、
ｉｉ）親油性アンカーが、ステロール、脂質、及びビタミンＥ誘導体からなる群から選択される、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、
ｉ）２０〜６０モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）０〜４０モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）３０〜７０モル％のステロール、及び
ｉｖ）請求項１１において規定されているような、０〜１０％の水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲート
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
医薬として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するための、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
免疫抑制腫瘍微小環境を下方調節することによって、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するための、請求項１３若しくは１４に記載の組成物、又は請求項１で規定した抗がんｍｉＲＮＡ。
【請求項１６】
前記抗がんｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、模倣体若しくは前駆体である、請求項１５に記載の組成物又は抗がんｍｉＲＮＡ。
【請求項１７】
がん細胞におけるＧ２／Ｍアレストを促進又は増加させることにより、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するための、請求項１５又は１６に記載の組成物又は抗がんｍｉＲＮＡ。
【請求項１８】
ｍｉＲＮＡの細胞内取込みを刺激するためのｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、細胞を請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡを含む脂質製剤に関する。製剤は、マイクロＲＮＡと共に脂質ナノ粒子を形成することができるカチオン性脂質を含む。製剤は、医薬品において有用である。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡにおける相補的配列に結合し、それによって、翻訳を阻害するか又はｍＲＮＡ分解を誘導することによって遺伝子発現を制御する、天然に存在する、一本鎖の低分子非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、近年、発生中の遺伝子発現の重要な調節因子として出現し、ヒトの疾患状態、特にがんにおいて誤って発現される頻度が高い。実際に、ｍｉＲＮＡは、特定のがん遺伝子をサイレンシングさせるために使用することができる。いくつかのｍｉＲＮＡは、がんの有効なモジュレーターであると報告されている。現在、ｍｉＲＮＡ療法を開発する際の主要な課題は、有効な送達系の欠如である。ｍｉＲＮＡは、ヌクレアーゼによる分解に感受性であり、低い生理学的安定性を示し、天然形態で細胞毒性を有する場合がある。ｍｉＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護する一方で、いかなる有害事象も誘導せずに、機能的なｍｉＲＮＡ分子又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体若しくはソースを標的（がん）細胞の細胞質中に送達する、有効な送達系に対する緊急の必要性がある。
【０００３】
有望な送達系は、封入されたｍｉＲＮＡを細胞膜を介して細胞内へと通過させる、細胞膜と同じ材料を含むか、又は類似する脂質若しくは脂質様材料を含む送達系である。送達系のこの分類の中には、いわゆる脂質ナノ粒子がある。脂質ナノ粒子は、一般的に、直径１０〜１００ｎｍの小型の複合体構造であり、生理学的条件で安定であり、免疫学的に不活性である（Ｔ．Ａｄｍａｄｚａｄａら  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１８年）１０：６９〜８６頁）。他の種類のオリゴヌクレオチドの送達における利点にもかかわらず、脂質ナノ粒子を使用するｍｉＲＮＡ送達の成功について公知の報告は存在しない。封入されたｍｉＲＮＡの作用を改善するために有効なｍｉＲＮＡナノ粒子製剤に対する継続的な必要性が存在する。
【０００４】
がんに対するマイクロＲＮＡ療法を改善するための継続的な必要性、及び処置に関する新たな戦略を切り開くことができる、がんのマイクロＲＮＡ処置へのより深い推定機構のための継続的な必要性が存在する。がん免疫応答のモジュレーションのための継続的な必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、本発明者らは、いくつかのがん適応症において顕著なｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示すｍｉＲＮＡナノ粒子製剤を特定した。
【０００６】
組成物
本発明者らは、驚くべきことに、ジアミノ脂質を含むナノ粒子製剤がすぐれた結果をもたらすことを見出した。したがって、本発明の第１の態様は、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、ジアミノ脂質及びそのｍｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、又はソースを含み、
ｉ）ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、抗がんｍｉＲＮＡ、好ましくは、配列番号１７〜５０で表されるシード配列の７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒであり、前記ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒからなる群から好ましくは選択され、
ｉｉ）ジアミノ脂質は、一般式（Ｉ）
【０００７】
【化１】
2021513508.tif 000002
【０００８】
（式中、
ｎは、０、１、又は２であり、
Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）
のものである、組成物を提供する。
【０００９】
このような組成物は、以降で、本発明による組成物と称される。本発明による組成物中に含まれるナノ粒子は、以降で、本発明によるナノ粒子と称される。下のｉ）に記載されているように、ｍｉＲＮＡ若しくはａｎｔａｇｏｍｉｒ又はそのソースは、以降で、組成物由来のｍｉＲＮＡと称され；組成物由来のｍｉＲＮＡは、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、又はｍｉＲＮＡ分子の前駆体、ｉｓｏｍｉＲ、若しくは模倣体である。
【００１０】
この出願の文脈では、ナノ粒子は、ナノメートル範囲、又は一部の場合にはマイクロメートル範囲の寸法を有する粒子である。好ましくは、ナノ粒子は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ナノメートル又はそれを超えるナノメートルの直径であり、直径は、好ましくは、ナノ粒子の集団の平均径である。好ましくは、ナノ粒子は、最大１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、５０００、又は１００００ナノメートルの直径である。より好ましくは、ナノ粒子は、４０〜３００ｎｍの、さらにより好ましくは５０〜２００ｎｍの、さらにより好ましくは５０〜１５０ｎｍの、最も好ましくは６５〜８５ｎｍの、例えば約７０ｎｍの平均径を有する。
【００１１】
本発明によるナノ粒子は、オリゴヌクレオチドをさらに含む脂質ナノ粒子である。オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子のカーゴ又はペイロードと考えることができる。したがって、ナノ粒子は、例えば、ミセル、リポソーム、リポプレックス、単層ベシクル、多層ベシクル、又はその架橋バリアントであり得る。ナノ粒子は、ミセル、リポソーム、又はリポプレックスであることが好ましい。ナノ粒子の組成について言及される場合、ジアミノ脂質及び任意選択でさらなる賦形剤への言及が意図され、いずれのカーゴ物質への言及も意図されない。非限定的な例として、ナノ粒子が５０モル％のジアミノ脂質及び５０モル％の他の賦形剤を含むと考えられる場合、モルパーセンテージは、ジアミノ脂質及び他の賦形剤のみに関し、オリゴヌクレオチドのモル分率又は溶媒のモル分率は考慮されていない。
【００１２】
本発明が、２以上のｍｉＲＮＡ分子、そのｉｓｏｍｉＲ、模倣体、若しくはソース又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒを含む組成物に関する場合、各ｍｉＲＮＡ分子、そのｉｓｏｍｉＲ、模倣体、若しくはソース又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒは、別々の組成物中にそれぞれ存在することが包含される。各組成物は、経時的に又は同時に対象に投与することができ、又は使用前に、単一の組成物中に混合することもできる。或いは、２以上のｍｉＲＮＡ分子、そのｉｓｏｍｉＲ、模倣体、若しくはソース又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒが、本明細書において定義されている組成物中に存在することも包含される。
【００１３】
ジアミノ脂質
本発明によるナノ粒子は、一般式（Ｉ）のジアミノ脂質を含むが、脂質をさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、ジアミノ脂質は、モルパーセントで、ナノ粒子中に最も蔓延している。本明細書で使用される場合、脂質という用語は、非極性溶媒に可溶性である物質を指す。本発明において使用されるジアミノ脂質は、スペーサーに連結した３つのテイルを有し、よって、天然に存在するトリグリセリド脂質に似ている。いくつかのこのような脂質が公知である（米国特許第８６９１７５０号）。
【００１４】
一般式（Ｉ）のジアミノ脂質は、様々な長さの脂肪族スペーサーによって分離されている２つの第三級アミンを含む。スペーサーは、脂質の頭部サイズを決定する助けとなる。ｎは、０、１、又は２であり得、そのため、スペーサーは、事実上、１，２−エチレン、ｎ−１，３−プロピレン、又はｎ−１，４−ブチレンスペーサーである。特に好ましい実施形態では、ｎは、０である。特に好ましい実施形態では、ｎは、１である。特に好ましい実施形態では、ｎは、２である。ｎが１であることが最も好ましい。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明による組成物を提供し、ジアミノ脂質は、一般式（Ｉ）（式中、ｎは１である）のものである。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、ジアミノ脂質及びｍｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、又はそのソースを含み、
ｉ）ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒが、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７〜５０によって表されるシード配列の７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒであり、前記ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒが、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒからなる群から選択され、
ｉｉ）ジアミノ脂質が、一般式（Ｉ−１）
【００１５】
【化２】
2021513508.tif 000003
【００１６】
（式中、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）
のものである、組成物を提供する。
【００１７】
Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、脂質のテイルと考えることができ、任意選択で不飽和あり、最大４つの任意選択の置換基を有する脂肪族Ｃ１０〜Ｃ１８である。Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、独立して選択されてもよく、又はＴ１、Ｔ２、及びＴ３のうちの２若しくは３つについて、同じ選択がなされてもよい。好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、ジアミノ脂質が、一般式（Ｉ）（式中、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は同一である）のものである、組成物を提供する。同一であることは、同位体の天然存在比を考慮すべきであることを意味するほど狭く解釈されるべきではなく−同一であることは、好ましくは、描写された構造式に表される分子構造を指すに過ぎない。
【００１８】
鎖が長いほど、一般的には、より強固な脂質膜をもたらすことになる。この出願では、Ｃ１０〜Ｃ１８における数値は、Ｃの総含量ではなく、決定することができる最も長い連続した鎖を指す。非限定的な例として、６位にｎ−プロピル置換基を有するｎ−ドデシル鎖は、１５Ｃ原子を含むが、最も長い連続鎖が１２Ｃ原子の長さを有することから、Ｃ１２鎖である。不飽和であることは、不飽和が鎖のｃｉｓにある場合、より強固ではない膜をもたらし、それを曲げることができる。好ましい不飽和は、ｃｉｓである。好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、０、１、２、３、又は４つの不飽和を含有する。より好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、１、２、３、又は４つの不飽和を含有する。さらにより好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、１、２、又は３つの不飽和、好ましくは３つの不飽和を含有する。
【００１９】
任意選択の置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。好ましい任意選択の置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、より好ましくはＣ１〜Ｃ２アルキルであり、最も好ましくはメチル（−ＣＨ２）である。このような置換基のうちの０、１、２、３、又は４つが存在し、このことは、置換基が存在しない可能性もあることを意味する。このように、置換基は任意選択的である。好ましくは、０、１、２、又は３つのこのような置換基が存在する。
【００２０】
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１４鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１２鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。
【００２１】
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、１、２、３つ又は４つの不飽和を有し、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。
【００２２】
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、１、２、又は３つの不飽和を有し、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル、及びＣ１〜Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。
【００２３】
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、１、２、又は３つの不飽和を有し、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルからなる群から選択される。
【００２４】
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、１、２、又は３つの不飽和を有し、１、２、又は３つの置換基を有するＣ１０〜Ｃ１４鎖であり、置換基は、Ｃ１〜Ｃ２アルキルからなる群から選択される。
【００２５】
Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３に関する好ましい実施形態は、以下の各構造式を表すそれぞれの選択肢に対する名称と共に、以下に示されている。体系的なＣｎの番号付けにおいて、コロンの後の番号は（Ｃ１２：３におけるように）、不飽和の程度を示す。
【００２６】
【化３】
2021513508.tif 000004
【００２７】
【化４】
2021513508.tif 000005
【００２８】
したがって、好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、ジアミノ脂質が、一般式（Ｉ）（式中、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３が、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、マルガリル、ステアリル、α−リノレニル、γ−リノレニル、リノレイル、ステアリジル、バクセニル、オレイル、エライジル、パルミトレイル、及び３，７，１１−トリメチルドデシルからなる群から選択される）のものである、組成物を提供する。好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、α−リノレニル、γ−リノレニル、リノレイル、ステアリジル、オレイル、パルミトレイル、及び３，７，１１−トリメチルドデシルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ステアリジル、パルミトレイル、及び３，７，１１−トリメチルドデシルからなる群から選択される。さらにより好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、及び３，７，１１−トリメチルドデシルからなる群から選択される。さらにより好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、及び３，７，１１−トリメチルドデシルからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、例えば、（２Ｅ，６Ｅ）ファルネシル、（２Ｅ，６Ｚ）ファルネシル、（２Ｚ，６Ｅ）ファルネシル、又は（２Ｚ，６Ｚ）ファルネシルであり、好ましくは、それらは、それぞれ、（２Ｅ，６Ｅ）ファルネシルである。
【００２９】
ファルネシルは、３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニルとしても公知であり、不飽和直鎖状Ｃ１２鎖であり；（２Ｅ，６Ｅ）、（２Ｅ，６Ｚ）、（２Ｚ，６Ｅ）、又は（２Ｚ，６Ｚ）であり得；好ましくは、（２Ｅ，６Ｅ）である。ラウリルは、ドデシルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１２鎖である。トリデシルは、飽和直鎖状Ｃ１３鎖である。ミリスチルは、テトラデシルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１４鎖である。ペンタデシルは、飽和直鎖状Ｃ１５鎖である。セチルは、パルミチルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１６鎖である。マルガリルは、ヘプタデシルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１７鎖である。ステアリルは、オクタデシルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。α−リノレニルは、（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９，１２，１５−オクタデカトリエニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。γ−リノレニルは、（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−６，９，１２−オクタデカトリエニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。リノレイルは、（９Ｚ，１２Ｚ）−９，１２−オクタデカジエニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。ステアリジルは、（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。バクセニルは、（Ｅ）−オクタデカ−１１−エニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。オレイルは、（９Ｚ）−オクタデカ−９−エニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。エライジルは、（９Ｅ）−オクタデカ−９−エニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。パルミトレイルは、（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。３，７，１１−トリメチルドデシルは、飽和ファルネシルであり、飽和直鎖状Ｃ１２鎖である。
【００３０】
抗がんｍｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、又はそのソース
好ましい実施形態では、前記抗がんｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、前記ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒからなる群から選択される。他のより好ましい実施形態では、前記ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、及びｍｉＲＮＡ−３１５７、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒからなる群から選択される。他のより好ましい実施形態では、前記ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡであり、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、及びｍｉＲＮＡ−３１５７、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒからなる群から選択される。
【００３１】
本発明による好ましいナノ粒子は、ｍｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、又はそのソース、好ましくはｍｉＲＮＡ又はそのソースを含み、ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７〜５０によって表されるシード配列の７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒであり、前記ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、ｍｉＲＮＡ−７、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒからなる群から選択される。より好ましくは、本発明によるナノ粒子は、ｍｉＲＮＡ又はそのソースを含み、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７〜５０によって表されるシード配列の７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであり、前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体からなる群から選択される。
【００３２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、１７〜２５ヌクレオチドの小さなＲＮＡであり、真核生物における遺伝子発現のレギュレーターとして機能する。ｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（プリ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる長い一次転写産物の一部として、核内で最初に発現される。核の内部では、プリ−ｍｉＲＮＡが、酵素Ｄｒｏｓｈａによって部分的に消化され、活性分子であるより短い成熟ｍｉＲＮＡへと、Ｄｉｃｅｒによってさらに処理するために細胞質へと輸送される、６５〜１２０ヌクレオチド長のヘアピン前駆体ｍｉＲＮＡ（プリ−ｍｉＲＮＡ）を形成する。動物では、これらの短いＲＮＡは、５’の近位「シード」領域（一般的には、ヌクレオチド２〜８）を含み、これは、ｍｉＲＮＡの、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）への対合特異性の主要な決定因子であると考えられる。より詳細な説明が、一般的定義に掲げられた部分に与えられる。
【００３３】
ｍｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ模倣体又はｍｉＲＮＡ  ｉｓｏｍｉＲ又はｍｉＲＮＡ  ａｎｔａｇｏｍｉｒ又はそれらのいずれかのソースに関する以下に与えられる定義のそれぞれを、この出願の、特定されたｍｉＲＮＡ、分子若しくは模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくはａｎｔａｇｏｍｉｒ又はそのソース：ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体若しくはａｎｔａｇｏｍｉｒ又はそのソースのそれぞれに対して使用するべきである。好ましい成熟配列（配列番号５１〜５７）、シード配列（配列番号１７〜５０、ここで、配列番号１７〜２３は、カノニカルなｍｉＲＮＡのシード配列であり、配列番号２４〜５０は、ｉｓｏｍｉＲに関するシード配列である）、ｉｓｏｍｉＲ配列（配列番号５８〜１２５）、又は前記ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲのソースの配列（配列番号１〜８のようなＲＮＡ前駆体、又は配列番号９〜１６のようなＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡ））は、それぞれ、配列表において特定される。
【００３４】
好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、前記ｍｉＲＮＡが、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ模倣体、又は
ｉｉ）ｍｉＲＮＡ−３４２−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−３４２−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−３２４−５ｐ模倣体、又は
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ模倣体、又は
ｉｖ）ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３分子、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３模倣体、又は
ｖ）ｍｉＲＮＡ−３１５７−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−３１５７−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−３１５７−５ｐ模倣体、又は
ｖｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ模倣体、又は
ｖｉｉ）ｍｉＲＮＡ−７−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−７−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡ−７−５ｐ模倣体
である、組成物を提供する。
【００３５】
他の好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、前記ｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒが、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのａｎｔａｇｏｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのａｎｔａｇｏｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのａｎｔａｇｏｍｉｒ、又はその模倣体である、組成物を提供する。
【００３６】
模倣体は、ｍｉＲＮＡ分子と類似するか又は同一の活性を有する分子である。この文脈では、類似する活性は、活性の許容されるレベルと同じ意味を与えられる。模倣体は、機能的決定において、ａｎｔａｇｏｍｉｒに対抗する。好ましい模倣体は、好ましくは、ロックド核酸モノマーなどの１つ若しくは複数のヌクレオチド類似体を含む合成オリゴヌクレオチド、並びに／又は足場修飾を含むヌクレオチド及び／若しくは塩基修飾を含むヌクレオチドである。模倣体は、ｍｉＲＮＡに関するか又はｉｓｏｍｉＲに関する模倣体であってもよく、また、ａｎｔａｇｏｍｉｒに関する模倣体であってもよい。好ましい模倣体は、ｍｉＲＮＡに関するか又はｉｓｏｍｉＲに関する模倣体である。
【００３７】
好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二重鎖オリゴヌクレオチドである。天然に存在するようなカノニカルなｍｉＲＮＡは、天然に存在する標的のセンス配列に対して相補的であるため、アンチセンス配列を有するものとして、本明細書において定義される。本発明による組成物に対して好ましい模倣体である二重鎖模倣体において、一方がセンス鎖として設計され、もう一方がアンチセンス鎖として設計されている二本鎖が存在することになる。アンチセンス鎖は、ｍｉＲＮＡと、若しくはｍｉＲＮＡの前駆体と、若しくはｉｓｏｍｉＲと同じ配列を有してもよく、又はその断片と同じ配列を有するか、若しくは同じ配列を含むか、若しくはその断片と同じ配列を含んでもよい。センス鎖は、アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に逆相補的であり、二重鎖模倣体の形成を可能にする。これらのセンス鎖は、それ自体必ずしも生物学的に活性ではなく、その重要な機能のうちの１つは、アンチセンス鎖を安定化させること又はその分解を防ぐことである。成熟ｍｉＲＮＡに関するセンス鎖の例は、配列番号１２６〜１３２である。ｉｓｏｍｉＲに関するセンス鎖の例は、配列番号１３３〜２００である。
【００３８】
好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は、好ましくは、架橋核酸ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオシド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド、２’−フルオロヌクレオシド、及び２’−アジドヌクレオシド、好ましくは２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオシドからなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。このような少なくとも１つの修飾ヌクレオシドによって、１番目若しくは最後のＲＮＡヌクレオシドが置き換えられるか、又は２番目若しくは最後から２番目のＲＮＡヌクレオシドが置き換えられることが好ましい。好ましい実施形態では、少なくとも２つの修飾ヌクレオシドによって、最初の２つの又は最後の２つのＲＮＡヌクレオシドが置き換えられる。より好ましくは、１番目と最後のＲＮＡヌクレオシドの両方が置き換えられ、さらにより好ましくは、最初の２つと最後の２つの両方が置き換えられる。修飾ヌクレオシドを置き換えることが、置き換えられるヌクレオシドと同じ対合能を有すること、好ましくは、同じ核酸塩基を有することが理解されるべきである。好ましくは、アンチセンス鎖は、最初の２つ又は最後の２つのＲＮＡヌクレオシドを除いて修飾ヌクレオシドを含まない。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖の最後の塩基は、ＤＮＡヌクレオシドであり；より好ましくは、アンチセンス鎖の最後の２つの塩基は、ＤＮＡヌクレオシドである。好ましくは、アンチセンス鎖がセンス鎖と対を形成する場合、アンチセンス鎖の最後の１つ又は２つの残基がオーバーハングを形成し；より好ましくは、アンチセンス鎖の最後の２つの残基が、このようなオーバーハングを形成する。好ましくは、アンチセンス鎖は、最後の２つのヌクレオシドを除いて、又はオーバーハングを除いて、ＤＮＡヌクレオシドを含まない。好ましくは、センス鎖は、ＲＮＡヌクレオシドのみを含む。
【００３９】
好ましくは、センス鎖とアンチセンス鎖は、完全には重複せず、３’末端に１、２、３、又は４つの追加の塩基を有し、好ましくは３’末端に２つの追加の塩基を有し、付着末端を形成する。したがって、対応するアンチセンス鎖では、３’末端の１、２、３、又は４つの塩基は、好ましくは、センス鎖に逆相補的塩基を有さず、付着末端も形成し；より好ましくは、センス鎖の最初の２つの塩基は、付着末端を形成し、アンチセンス鎖に相補的塩基を有さない。センス鎖は、必ずしも生物学的に活性ではなく、アンチセンス鎖の安定性を増加させるために主に作用する。模倣体に関するセンス／アンチセンス対の好ましい配列の例は、センス鎖では配列番号２０１〜２０７、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、及び２２０、より好ましくはセンス鎖では配列番号２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、及び２２０、並びにアンチセンス鎖では配列番号２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、及び２２１である。好ましい対は、配列番号２０１又は２０８及び配列番号２０９、配列番号２０２又は２１０及び配列番号２１１、配列番号２０３又は２１２及び配列番号２１３、配列番号２０４又は２１４及び配列番号２１５、配列番号２０５又は２１６及び配列番号２１７、配列番号２０６又は２１８及び配列番号２１９、及び配列番号２０７又は２２０及び配列番号２２１、より好ましくは配列番号２１８及び配列番号２１９である。
【００４０】
好ましい実施形態では、模倣体は、センス鎖とアンチセンス鎖を含む二重鎖オリゴヌクレオチドであり、両方の鎖は、１５〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１７〜２７ヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、配列番号５１〜１２５のうちのいずれか１つと７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有し、センス鎖は、配列番号１２６〜２００のうちのいずれか１つと７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を任意選択で有し、センス鎖とアンチセンス鎖は、好ましくはアニーリングして、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを形成することができ、任意選択で、オリゴヌクレオチドの一方又は両方の末端は、１、２、３、又は４つの、好ましくは２つのヌクレオチドの重複を有する付着末端であり、センス鎖は、化学修飾されたヌクレオチドを任意選択で含む。好ましくは、二重鎖模倣体の二本鎖は、同じ長さを有するか、又は１、２、３、４、５、若しくは６ヌクレオチド長で異なる。
【００４１】
ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体、又はそのソースのａｎｔａｇｏｍｉｒは、それが導出される対応するｍｉＲＮＡ分子のうちの１つに対して反対又は逆である、活性を有する分子である。ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、又は模倣体のａｎｔａｇｏｍｉｒもまた、前記ｍｉＲＮＡ分子又はｉｓｏｍｉＲ又は模倣体に拮抗することができるか又はその活性をサイレンシングするか若しくは低下させることができる分子として定義され得る。それが導出される対応するｍｉＲＮＡ分子のうちの１つと反対若しくは逆である活性又はそれが導出される前記ｍｉＲＮＡ分子の活性と拮抗することができる活性は、好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子又はｉｓｏｍｉＲ又は模倣体又はそのソースの活性を低下させることができる活性である。この文脈では、低下とは、前記ｍｉＲＮＡ分子又はｉｓｏｍｉＲ又は模倣体又はそのソースの活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の低下を意味する。ａｎｔａｇｏｍｉｒの模倣体は、本明細書で後に定義されているものなど化学的修飾を有する合成オリゴヌクレオチドであり得る。好ましい活性及び前記活性を評価するための好ましいアッセイについて、後に本明細書において定義される。
【００４２】
別段に指定されていなければ、本出願の全文脈内で、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子、ｍｉＲ、ｉｓｏｍｉＲ、ａｎｔａｇｏｍｉｒ、若しくは模倣体、又はそのソース若しくは前駆体と称される場合もある。本明細書で特定される各配列は、本出願の本文で使用される配列番号として、又は配列表における対応する配列番号として特定することができる。この出願において定義される配列番号は、前記ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、ａｎｔａｇｏｍｉｒ、模倣体、又は前駆体などのそのソースの塩基配列を指し得る。すべての配列番号について、一部の塩基が交換可能であることを当業者は認識している。例えば、各例のＴは、Ｕで個々に置換可能であり、その逆も同様である。成熟ｍｉＲＮＡに与えられるＲＮＡ配列は、例えば、ＲＮＡヌクレオチドの代わりにＤＮＡヌクレオチドを使用して、ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成され得る。このような場合には、ウラシル塩基の代わりにチミン塩基が使用され得る。或いは、デオキシリボース足場のチミン塩基が使用され得る。当業者は、塩基対合挙動が正確な配列よりも重要であり、Ｔ及びＵがこのような目的で一般的に交換可能であることを理解する。したがって、ａｎｔａｇｏｍｉｒは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のいずれかであってもよく、又は本明細書で後に定義されているようにさらに修飾されたオリゴヌクレオチドであってもよい。したがって、模倣体は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のいずれかであってもよく、又は本明細書で後に定義されているように、さらに修飾されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
ｍｉＲＮＡ  ａｎｔａｇｏｍｉｒは、本発明においても言及される。この用語は、本明細書において特定される治療適用において使用されるために、発現が上方調節／過剰発現／増加されるべきではない及び／又は活性が増加されるべきではない、本発明のｍｉＲＮＡ分子に関する。対照的に、治療上の所望の効果を得るために、これらのｍｉＲＮＡ分子の内因性発現は下方調節／低下される必要がある及び／又はこのようなｍｉＲＮＡ分子の活性は低下されるか若しくは低減されるか若しくは阻害される必要がある。これは、ａｎｔａｇｏｍｉｒを使用して、本明細書で後に説明されているように行われることが好ましい。したがって、本発明において、治療用途においてこれらのｍｉＲＮＡ分子のいずれかについて言及される場合、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子のａｎｔａｇｏｍｉｒ又はこれらのｍｉＲＮＡのａｎｔａｇｏｍｉｒの模倣体又はこれらのｍｉＲＮＡのａｎｔａｇｏｍｉｒのソースの使用を通常指す。したがって、ａｎｔａｇｏｍｉｒに言及する場合、本明細書において示されているように、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、若しくはｍｉＲＮＡー１９６ａ−５ｐ分子のａｎｔａｇｏｍｉｒ又は模倣体又はそのソースの使用を通常指す。ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲ又はこれらのいずれかのソースに関して本明細書において与えられる各定義は、この段落において特定されるａｎｔａｇｏｍｉｒとして使用されるｍｉＲＮＡ分子のいずれにも適用することができる。ｍｉＲＮＡ分子の所与のａｎｔａｇｏｍｉｒに関して本明細書において与えられる各定義は、それぞれ本明細書において定義されているように、別個のｍｉＲＮＡ分子の他のａｎｔａｇｏｍｉｒも保持する。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体に相補的であるか又は逆相補的であることが好ましい。
【００４４】
本発明の文脈では、ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲ又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒは、一般的定義に掲げられた部分においてさらに定義されているように、合成であるか又は天然であるか又は組換えであるか又は成熟しているか又は成熟ｍｉＲＮＡ若しくはヒトｍｉＲＮＡの一部であってもよく、又はヒトｍｉＲＮＡから導出されてもよい。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、ヒトの細胞、組織、器官又は体液中に見られるｍｉＲＮＡ分子である（すなわち、内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子）。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、ヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加によって内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子から導出されるヒトｍｉＲＮＡ分子でもあり得る。ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲ又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒは、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ分子であり得る。
【００４５】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲは、６〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１５〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００４６】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子のａｎｔａｇｏｍｉｒは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００４７】
好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲは、前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ（配列番号１７〜５０）のシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むか、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒである。好ましくは、この実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲは、６〜３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子若しくは模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲのシード配列に存在する、７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むか、又は同じ長さのそのａｎｔａｇｏｍｉｒである。さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲは、１５〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、シード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有するか、又は同じ長さのそのａｎｔａｇｏｍｉｒである。
【００４８】
この文脈では、シード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むことは、最大１つの位置でシード配列と異なる７ヌクレオチドの連続ストレッチを指すことを意図する。或いは、これは、単一ヌクレオチドの脱落によってのみシード配列と異なる６ヌクレオチドの連続ストレッチを指し得る。本出願全体を通して、より好ましいｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体、若しくはその前駆体は、示されたシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの７つすべてを含むか、又は、言い換えれば、前記シード配列と１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、又は模倣体中に含まれる場合、シード配列は、ヌクレオチド番号１、２、又は３で始まり、ヌクレオチド番号７、８、９、１０、又は１１で終わり；最も好ましくは、このようなシード配列は、ヌクレオチド番号２で始まり、ヌクレオチド番号８で終わる。
【００４９】
好ましいｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、及びｍｉＲＮＡー１９６ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、欧州特許第１７１９９９９７号の表２、４、５、及び６に記載されている。好ましいその前駆体は、欧州特許第１７１９９９９７号の表１及び３に記載されている。好ましいｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、欧州特許第１７１９９９９７号の表４又は５に特定されたシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。好ましくは、ａｎｔａｇｏｍｉｒでは、欧州特許第１７１９９９９７号の表４又は５で特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つに対して逆相補的な配列が代わりに含まれる。ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、又はｍｉＲＮＡ−１９６ａの好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、上記のｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、又はｍｉＲＮＡ−１９６ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体に対して相補的であるか又は逆相補的であり、好ましくは、欧州特許第１７１９９９９７号の表６に記載されている通りである。
【００５０】
好ましいｍｉＲＮＡ−３２３は、ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７又は２４〜２８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。好ましくは、ａｎｔａｇｏｍｉｒでは、配列番号１７又は２４〜２８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つに対して逆相補的な配列が代わりに含まれる。ｍｉＲＮＡ−３２３の好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、上記のｍｉＲＮＡ−３２３分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体に対して相補的であるか又は逆相補的である。
【００５１】
ｍｉＲＮＡ−３２３の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号１７又は２４〜２８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５１、５８〜６８、又は２０９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１２６、１３３〜１４３、２０１、又は２０８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００５２】
好ましいｍｉＲＮＡ−３４２は、ｍｉＲＮＡ−３４２−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１８又は２９〜４２のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つ含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。好ましくは、ａｎｔａｇｏｍｉｒでは、配列番号１８又は２９〜４２のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つに対して逆相補的な配列が代わりに含まれる。ｍｉＲＮＡ−３４２の好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、上記のｍｉＲＮＡ−３４２分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体に対して相補的であるか又は逆相補的である。
【００５３】
ｍｉＲＮＡ−３４２の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号１８又は２９〜４２のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５２、６９〜１１３、又は２１１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１２７、１４４〜１８８、２０２、又は２１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００５４】
好ましいｍｉＲＮＡ−５２０ｆは、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１９又は４３〜４４のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。好ましくは、ａｎｔａｇｏｍｉｒでは、配列番号１９又は４３〜４４のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つに対して逆相補的な配列が代わりに含まれる。ｍｉＲＮＡ−５２０ｆの好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、上記のｍｉＲＮＡ−５２０ｆ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体に対して相補的であるか又は逆相補的である。
【００５５】
ｍｉＲＮＡ−５２０ｆの好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号１９又は４３〜４４のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５３、１１４、１１５、又は２１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１２８、１８９、１９０、２０３、又は２１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００５６】
さらに好ましいｍｉＲＮＡ−５２０ｆは、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３分子又はその模倣体であり、配列番号２０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。好ましくは、ａｎｔａｇｏｍｉｒでは、配列番号２０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つに対して逆相補的な配列が代わりに含まれる。ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３の好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、上記のｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３分子又はその模倣体に対して相補的であるか又は逆相補的である。
【００５７】
ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号２０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５４又は２１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１２９、２０４、又は２１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００５８】
好ましいｍｉＲＮＡ−３１５７は、ｍｉＲＮＡ−３１５７−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２１又は４５〜４８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。好ましくは、ａｎｔａｇｏｍｉｒでは、配列番号２１又は４５〜４８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つに対して逆相補的な配列が代わりに含まれる。ｍｉＲＮＡ−３１５７の好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、上記のｍｉＲＮＡ−３１５７分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体に対して相補的であるか又は逆相補的である。
【００５９】
ｍｉＲＮＡ−３１５７の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号２１又は４５〜４８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５５、１１６〜１２０、又は２１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１３０、１９１〜１９５、２０５、又は２１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００６０】
好ましいｍｉＲＮＡ−１９３ａは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ、より好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２２又は４９のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。好ましくは、ａｎｔａｇｏｍｉｒでは、配列番号２２又は４９のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つに対して逆相補的な配列が代わりに含まれる。ｍｉＲＮＡ−１９３ａの好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、上記のｍｉＲＮＡ−１９３ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体に対して相補的であるか又は逆相補的である。
【００６１】
ｍｉＲＮＡ−１９３ａの好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号２２又は４９のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５６、１２１、１２２、又は２１９、好ましくは５６又は２１９、より好ましくは２１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１３１、１９６、１９７、２０６、又は２１８、より好ましくは２１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００６２】
好ましいｍｉＲＮＡ−７は、ｍｉＲＮＡ−７−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２３又は５０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。好ましくは、ａｎｔａｇｏｍｉｒでは、配列番号２３又は５０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つに対して逆相補的な配列が代わりに含まれる。ｍｉＲＮＡ−７の好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、上記のｍｉＲＮＡ−７分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体に対して相補的であるか又は逆相補的である。
【００６３】
ｍｉＲＮＡ−７の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号２３又は５０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５７、１２３〜１２５、又は２２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１３２、１９８〜２００、２０７、又は２２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００６４】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、配列番号１７〜５０のうちのいずれか１つの所与のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、配列番号５１〜１２５のうちのいずれか１つの成熟配列全体に対して少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
【００６５】
或いは、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド以下の長さを有し、配列番号１７〜５０のうちのいずれか１つの所与のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、配列番号５１〜１２５のうちのいずれか１つの成熟配列全体に対して少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子のｉｓｏｍｉＲは、配列番号５８〜１２５のうちのいずれか１つのｉｓｏｍｉＲ配列全体に対して少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれを超える。好ましくは、この実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子のｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００６７】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−３２３分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７、２４〜２８として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５１、５８〜６８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００６８】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−３２３分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７、２４〜２８として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５１、５８〜６８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００６９】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−３４２分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ−３４２−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１８、２９〜４２として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５２、６９〜１１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００７０】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−５２０ｆ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１９、４３〜４４として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５３、１１４〜１１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。さらに好ましいｍｉＲＮＡ  ５２０ｆ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３分子又はその模倣体であり、配列番号２０として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００７１】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡー３１５７分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ−３１５７−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２１、４５〜４８として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５５、１１６〜１２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００７２】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１９３ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２２又は４９として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５６、１２１〜１２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００７３】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−７分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ−７−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２３又は５０として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５７、１２３〜１２５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
【００７４】
別の好ましいｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、配列番号１７〜５０のうちのいずれか１つのシード配列と、又は配列番号５１〜５７のいずれか１つの成熟配列と、又は配列番号１〜１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号１〜８のいずれか１つの前駆体配列と、又は配列番号９〜１６のいずれか１つのＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡと、又は配列番号５８〜１２５のいずれか１つのｉｓｏｍｉＲ配列と、少なくとも６０％の同一性を有する。同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％であり得る。同一性は、所与の配列番号で特定されるように、配列番号全体に関して評価されるのが好ましい。しかし、同一性はまた、所与の配列番号の一部に関して評価されてもよい。一部とは、その配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を意味し得る。
【００７５】
前駆体配列は、成熟プロセスに応じて２つ以上のｉｓｏｍｉＲ配列を生じる場合がある−例えば、ある特定の組織において、複数のｉｓｏｍｉＲが特定されている（配列番号５８〜６８）ｍｉＲＮＡ−３２３（成熟配列の配列番号５１）を参照されたい。ｍｉＲＮＡ分子のｉｓｏｍｉＲは同じ前駆体に由来し、逆に、前駆体は複数のｍｉＲＮＡ分子をもたらす可能性があり、そのうちの１つはカノニカルなｍｉＲＮＡと称され（例えば、ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ、配列番号５１）、その他はｉｓｏｍｉＲと称される（例えば、配列番号５８〜６８によって表されるオリゴヌクレオチド）。カノニカルなｍｉＲＮＡとそのｉｓｏｍｉＲの間の差は、それらの蔓延度においてのみ存在すると考えられるが、一般的には、最も蔓延している分子がカノニカルなｍｉＲＮＡと呼ばれ、一方、その他はｉｓｏｍｉＲである。種類、環境、生活環における位置、又は細胞の病理学的状態に応じて、個々のｉｓｏｍｉＲ又はｍｉＲＮＡは異なるレベルで発現される可能性があり；発現は、人種又は性別間でさらに異なる可能性がある（Ｌｏｈｅｒら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１４年）ＤＯＩ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２４０５頁）。
【００７６】
ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲ又はそのソースのａｎｔａｇｏｍｉｒは、核酸、好ましくは、対応するｍｉＲＮＡ分子若しくはｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体の一部に対して相補的であるか又は逆相補的であるＲＮＡであってもよい。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、対応するｍｉＲＮＡ分子若しくはｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体の一部とハイブリダイズすることが好ましい。好ましいａｎｔａｇｏｍｉｒは、配列番号５１〜１２５の成熟ｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲの配列の一部に対して相補的であるか又は逆相補的である。一部とは、その配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味する。好ましい実施形態では、ａｎｔａｇｏｍｉｒ又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ分子若しくはｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体のシード配列又は前記シード配列の一部に対して相補的であるか又は逆相補的である。一部とは、そのシード配列の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味する。
【００７７】
ｍｉＲＮＡ分子若しくは模倣体又はそのソースのａｎｔａｇｏｍｉｒの、或いはｍｉＲＮＡの又はｉｓｏｍｉＲの模倣体におけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの化学構造を修飾して、安定性、結合親和性及び／又は特異性を増加させてもよい。前記ａｎｔａｇｏｍｉｒ又はセンス鎖若しくはアンチセンス鎖は、ＲＮＡ分子又は好ましくは修飾されたＲＮＡ分子を含むか又はそれからなってもよい。好ましい修飾されたＲＮＡ分子は、修飾された糖を含んでもよい。このような修飾の１つの例は、ヌクレアーゼ耐性及びＲＮＡに対する結合親和性を改善するための、核酸における２’−Ｏ−メチル又は２’−Ｏ−メトキシエチル基若しくは２’フルオリド基の導入である。このような修飾の別の例は、立体構造をロックし（ロックド核酸（ＬＮＡ））、相補的一本鎖ＲＮＡへの親和性を改善するための、２’−Ｏ原子と核酸の４’−Ｃ原子を接続するメチレン架橋の導入である。第３の例は、ヌクレアーゼの攻撃に対する安定性を改善するための、ＲＮＡ鎖における核酸間のリンカーとしてのホスホロチオエート基の導入である。第４の修飾は、安定性及び細胞内送達を改善するための、コレステロールなどの分子の３’末端における親油性部分のコンジュゲーションである。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子のａｎｔａｇｏｍｉｒは、完全にＬＮＡ修飾されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなる。本明細書において定義されるａｎｔａｇｏｍｉｒは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える糖修飾を含んでもよい。１つのａｎｔａｇｏｍｉｒに２つ以上の別個の糖修飾を導入することも本発明によって包含される。
【００７８】
好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最後の４塩基のうちの最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基と最後の４塩基のうちの最初の２塩基とは、修飾糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最後の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基と最後の２塩基とは、修飾糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最後の２塩基は、ＤＮＡ塩基である。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基と最後の４塩基のうちの最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有し、前記センス鎖の最後の２塩基は、ＤＮＡ塩基である。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有し、前記センス鎖の最後の２塩基は、ＤＮＡ塩基である。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最後の４塩基のうちの最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有し、前記センス鎖の最後の２塩基は、ＤＮＡ塩基である。
【００７９】
好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、
前記ｍｉＲＮＡが、配列番号５１〜１２５、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、若しくは２２１のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、１５〜３０ヌクレオチド長である、
及び／又はｍｉＲＮＡの前記ソースが、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号１〜１６のうちのいずれか１つと、好ましくは配列番号１〜８のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、組成物を提供する。
【００８０】
好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、前記ｍｉＲＮＡが、配列番号５１〜１２５、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、又は２２１のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、前記ｍｉＲＮＡが、１５〜３０ヌクレオチド長である、組成物を提供する。好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、前記ｍｉＲＮＡが、配列番号５１〜１２５、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、又は２２１のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、前記ｍｉＲＮＡが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、ｍｉＲＮＡの前記ソースが、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号１〜１６のうちのいずれか１つと、好ましくは配列番号１〜８のうちのいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、組成物を提供する。好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、前記ｍｉＲＮＡが、配列番号５１〜１２５、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、又は２２１のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、ｍｉＲＮＡの前記ソースが、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号１〜１６のうちのいずれか１つと、好ましくは配列番号１〜８のうちのいずれか１つと、少なくとも７０％の配列同一性を共有する、組成物を提供する。
【００８１】
ｍｉＲＮＡのソース又は模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲのソースは、本明細書において特定されるｍｉＲＮＡ分子の又は模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲの産生を誘導することができ、好ましくはヘアピン様構造及び／若しくは二本鎖核酸分子を含む任意の分子であってもよい。ヘアピン様構造の存在は、８０、１００及び１２０ｎｔ又はそれを超えるスライディングウインドウを使用するＲＮＡｓｈａｐｅｓプログラム（Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｐら  ２００６年）を使用して評価することができる。ヘアピン様構造は、ｍｉＲＮＡ分子の天然又は内因性ソースに通常存在するが、二本鎖核酸分子は、ｍｉＲＮＡ分子の又はｉｓｏｍｉＲ若しくはその模倣体の組換え又は合成ソースに通常存在する。
【００８２】
ｍｉＲＮＡ分子のａｎｔａｇｏｍｉｒのソース又はｍｉＲＮＡ分子のａｎｔａｇｏｍｉｒの模倣体のソースは、適当なベクターなどの前記ａｎｔａｇｏｍｉｒの産生を誘導することができる任意の分子であってもよい。
【００８３】
ｍｉＲＮＡ分子の又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくはａｎｔａｇｏｍｉｒのソースは、一本鎖、二本鎖ＲＮＡ又は部分的に二本鎖のＲＮＡであってもよく、又は三本鎖を含んでもよく、その例は、国際公開第２００８／１０５５８号に記載されている。本明細書で使用される場合、部分的に二本鎖とは、５’及び／又は３’末端に、一本鎖構造も含む二本鎖構造を指す。ｍｉＲＮＡ分子の各鎖が同じ長さを有さない場合も生じ得る。一般的に、このような部分的に二本鎖のｍｉＲＮＡ分子は、７５％未満の二本鎖構造及び２５％を超える一本鎖構造、又は５０％未満の二本鎖構造及び５０％を超える一本鎖構造、又はより好ましくは、２５％、２０％若しくは１５％未満の二本鎖構造及び７５％、８０％、８５％を超える一本鎖構造を有してもよい。
【００８４】
或いは、ｍｉＲＮＡ分子の又はその模倣体模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲのソースは、ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲの前駆体をコードするＤＮＡ分子である。この文脈では、好ましいＤＮＡ分子は、配列番号９〜１６である。本発明は、前記配列番号９〜１６と少なくとも７０％の同一性を有するｍｉＲＮＡ分子の前駆体をコードするＤＮＡ分子の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは、この実施形態では、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、配列番号９〜１６のＤＮＡ配列と少なくとも７０％の同一性を有する。
【００８５】
所与のｍｉＲＮＡ分子の又は模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲの産生の誘導、或いはその所与のａｎｔａｇｏｍｉｒの産生の誘導は、前記ソースが、以下に定義されているように、１つのアッセイを使用して細胞中に導入される場合に得られることが好ましい。本発明に包含される細胞は、後で定義される。
【００８６】
ｍｉＲＮＡ分子の又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲの好ましいソースは、その前駆体、より好ましくは前記ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲをコードする核酸である。好ましい前駆体は、天然に存在する前駆体である。前駆体は、合成又は組換え前駆体であってもよい。合成又は組換え前駆体は、天然に存在する前駆体を発現することができるベクターであってもよい。好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、ｍｉＲＮＡのソースが、ｍｉＲＮＡの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、組成物を提供する。
【００８７】
所与のｍｉＲＮＡ分子の好ましい前駆体は、配列番号１〜１６のうちのいずれか１つで表される配列を有する。本発明は、前記配列と少なくとも７０％の同一性を有する、ｍｉＲＮＡ分子の又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体の前駆体の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは、この実施形態では、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、配列番号１〜１６のうちのいずれか１つで表される配列と少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、この実施形態では、前駆体は、配列番号１７〜５０によって表される群から選択されるシード配列と、７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を含む。より好ましくは、前駆体は、配列番号１７〜５０によって表される群から選択されるシード配列を含む。所与のｍｉＲＮＡ分子のより好ましい前駆体は、配列番号１〜８のうちのいずれか１つで表される配列を有する。本発明は、前記配列と少なくとも７０％の同一性を有する、ｍｉＲＮＡ分子の又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体の前駆体の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは、この実施形態では、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、配列番号１〜８のうちのいずれか１つで表される配列と少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、この実施形態では、前駆体は、配列番号１７〜５０によって表される群から選択されるシード配列と、７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を含む。より好ましくは、前駆体は、配列番号１７〜５０によって表される群から選択されるシード配列を含む。
【００８８】
したがって、ｍｉＲＮＡ−３２３分子の好ましいソースは、配列番号１又は９、好ましくは配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号１７又は２４〜２８のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ−３２３分子の及びｍｉＲＮＡ−３２３  ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００８９】
したがって、ｍｉＲＮＡ−３４２分子の好ましいソースは、配列番号２又は１０、好ましくは配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号１８又は２９〜４２のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ−３４２分子の及びｍｉＲＮＡ−３４２  ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００９０】
したがって、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ分子の好ましいソースは、配列番号３又は１１、好ましくは配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号１９、２０、４３、又は４４のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ分子の及びｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−３ｐ−ｉ３などのｍｉＲＮＡ−５２０ｆ  ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００９１】
したがって、ｍｉＲＮＡ−３１５７分子の好ましいソースは、配列番号４又は１２、好ましくは配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号２１又は４５〜４８のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ−３１５７分子の及びｍｉＲＮＡ−３１５７  ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００９２】
したがって、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ分子の好ましいソースは、配列番号５又は１３、好ましくは配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号２２又は４９のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ分子の及びｍｉＲＮＡ−１９３ａ  ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００９３】
したがって、ｍｉＲＮＡ−７分子の好ましいソースは、配列番号６〜８又は１４〜１６、好ましくは配列番号６〜８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号２３又は５０のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ−７分子の及びｍｉＲＮＡ−７  ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００９４】
この文脈では、所与の成熟ｍｉＲＮＡ分子のいくつかの前駆体が同一のｍｉＲＮＡ分子をもたらす場合があることが指摘される。例えば、ｍｉＲＮＡ−７は、前駆体ｍｉＲＮＡ−７−１、ｍｉＲＮＡ−７−２又はｍｉＲＮＡ−７−３（好ましくは、それぞれ、配列番号６、７、又は８として特定される）に由来してもよい。また、この文脈では、所与の成熟ｍｉＲＮＡ分子のいくつかのｉｓｏｍｉｒが同一のシード配列を有するｍｉＲＮＡ分子をもたらす場合があることが指摘される。例えば、成熟ｍｉＲＮＡ−３２３−５ｐ（配列番号５１）及び配列番号５８又は５９を少なくとも有するｉｓｏｍｉｒはすべて、同じシード配列（好ましくは、配列番号１７として特定される）を共有する。
【００９５】
好ましいソース又は前駆体は、本明細書の他の箇所で定義されている。好ましいソースは、前記ｍｉＲＮＡの前記前駆体をコードするか又は前記ａｎｔａｇｏｍｉｒをコードする、核酸、すなわち、ＤＮＡを含む発現構築物を含むか（ｉｎｃｌｕｄｅ）又は含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、より好ましくは、前記発現構築物は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスに基づいて、遺伝子療法ベクターから選択されるウイルス性遺伝子療法ベクターである。好ましいウイルス遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターである。他の好ましいベクターは、腫瘍溶解性ウイルスベクターである。このようなベクターについては、本明細書の以下においてさらに記載される。或いは、ソースは、一般的定義に掲げられた部分でさらに定義されているように、合成ｍｉＲＮＡ分子又は化学的模倣体であってもよい。
【００９６】
好ましい実施形態では、この態様は、本発明によるナノ粒子組成物であって、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体、又はそのａｎｔａｇｏｍｉｒからなる群から選択されるさらなるｍｉＲＮＡ又はａｎｔａｇｏｍｉｒをさらに含む、ナノ粒子組成物を提供する。したがって、好ましい実施形態では、この態様は、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数、又は
ｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数、又は
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数、又は
ｉｖ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡー３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数、又は
ｖ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡー３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数、又は
ｖｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡー３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数、又は
ｖｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡー３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、及びｍｉＲＮＡ−３１５７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数、又は
ｖｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡー３４２、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数
をさらに含む組成物を提供する。
【００９７】
したがって、より好ましい実施形態では、この態様は、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体のうちの１つ若しくは複数、又は
ｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体のうちの１つ若しくは複数、又は
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体のうちの１つ若しくは複数、又は
ｉｖ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体のうちの１つ若しくは複数、又は
ｖ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体のうちの１つ若しくは複数、又は
ｖｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体のうちの１つ若しくは複数、又は
ｖｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ−ｉ３、及びｍｉＲＮＡ−３１５７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体のうちの１つ若しくは複数、又は
ｖｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ、ｍｉＲＮＡ−３２３、ｍｉＲＮＡ−３４２、ｍｉＲＮＡ−３１５７、及びｍｉＲＮＡ−７、若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、若しくはその模倣体、若しくはそのａｎｔａｇｏｍｉｒのうちの１つ若しくは複数
をさらに含む組成物を提供する。
【００９８】
ナノ粒子組成物
組成物は、溶媒及び／又は賦形剤、好ましくは薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。好ましい溶媒は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ又はクエン酸緩衝液などの水性溶液である。好ましいクエン酸緩衝液は、好ましくはＮａＯＨを使用して設定された、ｐＨ２．５〜３．５、例えば、ｐＨ３の５０ｍＭのクエン酸塩を含む。好ましいＰＢＳは、ｐＨ７〜８、例えば、ｐＨ７．４である。ＰＢＳは、二価のカチオン、例えば、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないのが好ましい。別の好ましい薬学的に許容される賦形剤は、エタノールである。最も好ましくは、組成物は、生理的緩衝液、例えば、ＰＢＳ又はグッドの緩衝液又はＨｅｐｅｓ緩衝食塩水又はハンクス平衡塩類溶液又はリンガー平衡塩類溶液又はＴｒｉｓ緩衝液を含む。好ましい組成物は、医薬組成物である。
【００９９】
組成物は、さらなる賦形剤を含んでもよい。これらのさらなる賦形剤は、ナノ粒子中に含まれてもよい。
【０１００】
好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、好ましくはアドステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、コレカルシフェロール、コレステンジオン、コレステノール、コレステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ジヒドロタキステロール、ジメチルコレステロール、エルゴカルシフェロール、エルゴステロール、エルゴステノール、エルゴスタトリエノール、エルゴスタジエノール、エチルコレステノール、フシジン酸、ラノステロール、ノルコレスタジエノール、β−シトステロール、スピナステロール、スチグマスタノール、スチグマステノール、スチグマスタジエノール、スチグマスタジエノン、スチグマステロール、及びスチグマステノン、より好ましくはコレステロールからなる群から選択される、ステロールをさらに含む組成物を提供する。より詳細には、好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、ナノ粒子が、好ましくは、アドステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、コレカルシフェロール、コレステンジオン、コレステノール、コレステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ジヒドロタキステロール、ジメチルコレステロール、エルゴカルシフェロール、エルゴステロール、エルゴステノール、エルゴスタトリエノール、エルゴスタジエノール、エチルコレステノール、フシジン酸、ラノステロール、ノルコレスタジエノール、β−シトステロール、スピナステロール、スチグマスタノール、スチグマステノール、スチグマスタジエノール、スチグマスタジエノン、スチグマステロール、及びスチグマステノン、より好ましくはコレステロールからなる群から選択される、ステロールをさらに含む、組成物を提供する。
【０１０１】
好ましくは、このようにさらに含まれるステロールは、いずれの部分にもコンジュゲートされない。コンジュゲートされたステロールはまた、本明細書で後に説明されるように含まれ得る。このように、コンジュゲートされたステロールとコンジュゲートされていないステロールの両方が含まれ得る。別段に明示的に示されていなければ、ステロールへの言及は、コンジュゲートされていないステロールへの言及を意図する。
【０１０２】
ステロールが組成物中に含まれる場合、ナノ粒子中に含まれることが好ましく、好ましくは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０モル％のステロールが含まれ；好ましくは、最大８０、７５、７０、６５、６０、６５、５０、４５、４０、３５、又は３０モル％のステロールが含まれる。上記で説明されたように、このモルパーセンテージは、脂質ナノ粒子を作製する物質に関するに過ぎず、溶媒又はオリゴヌクレオチドなどのカーゴに関するものではない。ステロールが組成物中に含まれる場合、好ましくは５〜７０モル％、１５〜６０モル％、２５〜６０モル％、３５〜６０モル％、４０〜６０モル％、又は４５〜５５モル％が含まれ；より好ましくは４０〜６０モル％又は４５〜５５モル％が含まれ、最も好ましくは４５〜５５モル％、例えば、４８モル％又は５４モル％が含まれる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥｇｇＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳｏｙＰＣ）、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択されるリン脂質をさらに含む、組成物を提供する。より詳細には、好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、ナノ粒子が、好ましくは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥｇｇＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳｏｙＰＣ）、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択されるリン脂質をさらに含む、組成物を提供する。
【０１０４】
好ましくは、このようにさらに含まれるリン脂質は、いずれの部分にもコンジュゲートされない。コンジュゲートされたリン脂質はまた、本明細書で後に説明されるように含まれ得る。このように、コンジュゲートされたリン脂質とコンジュゲートされていないリン脂質の両方が含まれ得る。
【０１０５】
リン脂質が組成物中に含まれる場合、ナノ粒子中に含まれることが好ましく、好ましくは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０モル％のリン脂質が含まれ；好ましくは、最大６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、又は５モル％のリン脂質が含まれる。上記で説明されたように、このモルパーセンテージは、脂質ナノ粒子を作製する物質に関するに過ぎず、溶媒又はオリゴヌクレオチドなどのカーゴに関するものではない。リン脂質が組成物中に含まれる場合、好ましくは０〜４０モル％、０〜３５モル％、０〜３０モル％、５〜３０モル％、５〜２５モル％、又は５〜２０モル％が含まれ；より好ましくは５〜２０モル％又は５〜１５モル％が含まれ、最も好ましくは５〜１５モル％、例えば、１０モル％又は１１モル％が含まれる。
【０１０６】
好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートをさらに含み、
ｉ）水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチル−ｌ−アスパラギン）（ＰＨＥＡ）、ポリ−（ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）（ＰＨＥＧ）、ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）、ポリグリセロール（ＰＧ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡｍ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、及びポリ（２−オキサゾリン）（ＰＯｘ）、例えば、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭｅＯｘ）及びポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥｔＯｘ）、又はそのコポリマーからなる群から選択され、
ｉｉ）親油性アンカーが、ステロール、脂質、及びビタミンＥ誘導体からなる群から選択される、組成物を提供する。好ましくは、親油性アンカーは、脂質、より好ましくはジグリセリドである。
【０１０７】
より詳細には、好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、ナノ粒子が、上記のように、水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートをさらに含む、組成物を提供する。水溶性ポリマーは、一般的に、親油性アンカーを介して連結されている、ナノ粒子のコロイド安定性を増大させる。一般的に、親油性アンカーは、脂質二重層又はミセル中に埋め込まれ、よって、水溶性ポリマーをナノ粒子表面に連結させる。このために、このような水溶性ポリマーを使用することは、当技術分野で公知である（Ｋｎｏｐら、２０１０年、ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２００９０２６７２）。好ましい水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）である。好ましくは、水溶性ポリマーは、約７５０Ｄａ〜約１５０００Ｄａ、より好ましくは約１０００Ｄａ〜約６０００Ｄａ、さらにより好ましくは約１０００Ｄａ〜約３０００Ｄａ、最も好ましくは約１５００Ｄａ〜約３０００Ｄａの範囲の、例えば、約２０００Ｄａの分子量を有する。したがって、ＰＥＧ−２０００は、上記のように、コンジュゲートにおいて使用するのに好ましい水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーは、直鎖状ポリマーであることが好ましく、その２つの末端のうちの１つでコンジュゲートされていることが好ましい。他の末端は、生理的条件で非荷電であること、例えば、ヒドロキシル基又はメチル若しくはエチルエーテルであることが好ましい。好ましくは、コンジュゲートされていない末端は、メチルエーテル又はヒドロキシル基、最も好ましくはメチルエーテルである。
【０１０８】
水溶性ポリマーがコンジュゲートされる親油性アンカーは、一般的に、水溶性ポリマーとナノ粒子の間の接続を確保するために機能する。ポリマーとアンカーの間のコンジュゲーション方法は重要ではなく、当業者は、任意の好適な化学結合、例えば、エステル結合、アミド結合、エーテル連結、トリアゾール、又は水溶性ポリマーを親油性アンカーにコンジュゲートすることによって得られる任意の他の部分を選択することができる。コハク酸又はグルタル酸などの小さなリンカーの使用も想定される。親油性アンカーは、ステロール、脂質、及びビタミンＥ誘導体からなる群から選択される。好ましいステロールは上記されている。好ましいビタミンＥ誘導体は、トコフェロール及びトコトリエノール、例えば、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、及び対応するトコトリエノールである。好ましくは、親油性アンカーは、脂質、より好ましくはジグリセリド又はリン脂質である。好ましい脂質の例は上記されており、好ましいジグリセリドの例は、ジステアロイルグリセロール、好ましくは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、ジパルミトイルグリセロール、好ましくは１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、ジオレオイルグリセロール、好ましくは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、及びジアラキドイルグリセロール、好ましくは１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロールである。最も好ましいジグリセリドは、ジステアロイルグリセロール、好ましくは１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロールである。
【０１０９】
上記のように、コンジュゲートの好適な例は、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−２０００）］エーテル、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−１５００）］エーテル、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−３０００）］エーテル、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−２０００）］エーテル、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−１５００）］エーテル、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−３０００）］エーテル、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−２０００）カルボキシレート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−１５００）カルボキシレート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−３０００）カルボキシレート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−２０００）カルボキシレート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−１５００）カルボキシレート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−３０００）カルボキシレート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−２０００）カルバメート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−１５００）カルバメート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−３０００）カルバメート、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−２０００）カルバメート］、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−１５００）カルバメート］、及び（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール−３０００）カルバメート］であり、ステアロイル部分は、他の脂肪酸によって、好ましくは他のＣ１０〜Ｃ２０脂肪酸によって任意選択で置き換えることができる。上記のように、カルバメート及びエステルでは、親アミン及び親アルコール及び親カルボン酸を入れ替えることもでき、例えば、ＰＥＧ−アルコールをジグリセリドのカルボン酸類似体と反応させることができる。コンジュゲートの最も好ましい例は、ＤＳＧ−ＰＥＧ（ＣＡＳ番号：３０８８０５ー３９−２）としても知られている、（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール）−［メトキシ（ポリエチレングリコールー２０００）］エーテル、及びそのエステル類似体（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［メトキシ（ポリエチレングリコール−２０００）カルボキシレート］、及びそのカルバメート類似体（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル）−［メトキシ（ポリエチレングリコールー２０００）カルバメート］又はＤＳＡ−ＰＥＧ、及びそのアミンド類似体としても知られている、１，２−ジステアロイルオキシプロピルアミン３−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００カルバモイルである。
【０１１０】
上記のようなコンジュゲートが組成物中に含まれる場合、ナノ粒子中に含まれることが好ましく、好ましくは、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、又は５．０モル％のコンジュゲートが含まれ；好ましくは、最大６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、又は０．５モル％のコンジュゲートが含まれる。上記で説明されているように、このモルパーセンテージは、脂質ナノ粒子を作製する物質に関するに過ぎず、溶媒又はオリゴヌクレオチドなどのカーゴに関するものではない。コンジュゲートが組成物中に含まれる場合、好ましくは、０〜４モル％、０〜３モル％、０．３〜３モル％、０．５〜３モル％、０．５〜２．５モル％、又は１〜２．５モル％が含まれ、より好ましくは、０．５〜２．５モル％又は０．７〜２．５モル％が含まれ、最も好ましくは、０．８〜２．４モル％、例えば、１モル％又は２モル％が含まれる。
【０１１１】
好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びステロールを含む。さらに好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びリン脂質を含む。さらに好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及び水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートを含む。好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びステロール及びリン脂質を含む。好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びステロール及び水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートを含む。好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びリン脂質及び水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートを含む。最も好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びステロール及びリン脂質及び水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートを含む。
【０１１２】
好ましい実施形態では、この態様は、本発明による組成物であって、ナノ粒子が：
ｉ）２０〜６０モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）０〜４０モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）３０〜７０モル％のステロール、好ましくはコレステロール、及び
ｉｖ）０〜１０モル％の、上で定義された水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲート
を含む、組成物を提供する。
【０１１３】
さらなる好ましい実施形態では、ナノ粒子は、
ｉ）２５〜５５モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）１〜３０モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）３５〜６５モル％のステロール、好ましくはコレステロール、及び
ｉｖ）０．１〜４モル％の、水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲート
を含む。
【０１１４】
さらなる好ましい実施形態では、ナノ粒子は、
ｉ）３５〜５０モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）５〜１５モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）４０〜６０モル％のステロール、好ましくはコレステロール、及び
ｉｖ）０．５〜２．５モル％の、水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲート
を含む。
【０１１５】
さらなる好ましい実施形態では、ナノ粒子は、
ｉ）約３８〜４２モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）約８〜１２モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）約４６〜５０モル％のステロール、好ましくはコレステロール、及び
ｉｖ）約１．８〜２．２モル％の、水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲート
を含む。
【０１１６】
医学的使用
本発明は、これらのナノ粒子、及び組成物由来のｍｉＲＮＡの医学的使用を提供する。したがって、この態様は、医薬品として使用するための、本発明による組成物の使用を提供する。したがって、この態様は、医薬品として使用するための、組成物由来のｍｉＲＮＡの使用を提供する。この使用は医薬品の製造における、組成物又はｍｉＲＮＡの使用であってもよい。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、好ましくはがんの処置において、医薬品として使用するためのものである。これは、がんを防止する、処置する、回復させる、治癒させる及び／又は遅延させるための医薬品として使用するためのものであってもよく、言い換えれば、抗腫瘍効果を得るためのものであってもよい。このような使用のための組成物は、以降で、本発明による使用のための組成物と称させる。上記の医学的使用では、組成物由来の好ましいｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくは前駆体であり、本発明による好ましい組成物は、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくは前駆体を含む。
【０１１７】
この文脈において好ましいがんは、結腸直腸がん、結腸がん、頭頚部がん、神経膠芽腫、脳腫瘍、子宮頸がん、癌腫、造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の腫瘍、肝臓がん、三重陰性乳がんなどの乳がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、肺がん、腎細胞がん、膵臓がん、又は黒色腫であり、より好ましいのは、結腸直腸がん、結腸がん、頭頚部がん、神経膠芽腫、脳腫瘍、子宮頚がん、癌腫、造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の腫瘍、肝臓がん、三重陰性乳がんなどの乳がん、又は黒色腫であり、なおより好ましくは、癌腫、造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の腫瘍、肝臓がん、三重陰性乳がんなどの乳がん、又は黒色腫であり、さらにより好ましくは、肝細胞癌（ＨＣＣ）などの肝がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺がん、白血病又はリンパ腫又は骨髄腫（白血病が好ましい）などの造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の腫瘍、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）などの乳がん、黒色腫、膵臓がん、結腸がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん（ＨＮＳＣＣ）などの扁平上皮癌、前立腺がん、及び肝細胞癌（ＨＣＣ）又は非小細胞肺癌又は扁平上皮癌などの癌腫である。白血病の例は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群、及び急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）であり、ＡＭＬが好ましい。リンパ腫の例は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（４つの亜型すべて、すなわち、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、及びリンパ球減少型）、及び非ホジキンリンパ腫（及びその亜型）である。骨髄腫は、形質細胞性骨髄腫としても知られている、多発性骨髄腫としても知られている。
【０１１８】
好ましい実施形態では、抗腫瘍活性は、対象の腫瘍細胞において評価される。より好ましくは、前記腫瘍細胞は、ＨＮＳＣＣ細胞（頭頚部扁平上皮癌）、すなわち、扁平上皮癌又は唇、内唇、口腔（口）、舌、口腔底、歯肉、硬口蓋、鼻腔（鼻の内部）、副鼻腔、上咽頭、中咽頭、下咽頭及び喉頭（すなわち、声門、声門上及び声門下のがんを含む喉頭がん）を含む咽頭、気管を含む上部気道消化管の粘膜若しくは上皮細胞である。或いは、前記腫瘍細胞は、結腸直腸細胞、結腸細胞、脳細胞、神経膠芽腫細胞、乳房細胞、子宮頚部細胞であってもよい。
【０１１９】
好ましい実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。好ましい実施形態では、がんは、結腸がんである。好ましい実施形態では、がんは、頭頚部がんである。好ましい実施形態では、がんは、神経膠芽腫である。好ましい実施形態では、がんは、脳腫瘍である。好ましい実施形態では、がんは、三重陰性乳がんなどの乳がんである。好ましい実施形態では、がんは、子宮頸がんである。好ましい実施形態では、がんは、癌腫である。好ましい実施形態では、がんは、造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の腫瘍である。好ましい実施形態では、がんは、肝臓がんである。好ましい実施形態では、がんは、前立腺がんである。好ましい実施形態では、がんは、膀胱がんである。好ましい実施形態では、がんは、卵巣がんである。好ましい実施形態では、がんは、肺がんである。好ましい実施形態では、がんは、腎細胞がんである。好ましい実施形態では、がんは、膵臓がんである。好ましい実施形態では、がんは、黒色腫である。
【０１２０】
別段に指定されていなければ、抗腫瘍効果は、処置前に及び処置された対象において少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月又はそれより長い期間後に、評価又は検出されることが好ましい。抗腫瘍効果は：
増殖の阻害又は腫瘍細胞の増殖の検出可能な低下又は腫瘍細胞若しくはメラニン形成細胞の細胞生存率の低下、並びに／或いは
腫瘍細胞の分化能の増加、並びに／或いは
腫瘍細胞の生存の低下と等しい、腫瘍細胞死の増加、並びに／或いは
転移及び／又は腫瘍細胞の移動の発生の遅延、並びに／或いは
腫瘍重量又は成長の増加の阻害又は防止又は遅延、並びに／又は
少なくとも１カ月、数カ月又はそれより長い期間の患者の生存の延長（処置されていないか若しくは対照で処置されたものと比較して、又は処置の開始時の対象と比較して）、並びに／或いは
腫瘍サイズ又は体積の減少
として対象において特定されるのが好ましい。
【０１２１】
本発明の文脈では、患者は、生存していてもよく、疾患を有さないとみなされてもよい。或いは、疾患又は状態が、停止又は遅延又は消失していてもよい。腫瘍細胞の増殖の阻害は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％又はそれより高い割合であってもよい。細胞の増殖は、公知の技法を使用して評価することができる。腫瘍細胞又はメラニン形成細胞の細胞生存率の低下は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％又はそれより高い割合の低下であってもよい。このような低下は、所与のｍｉＲＮＡ分子、その等価物又はソースによるトランスフェクションの４日後に評価されてもよい。細胞生存率は、ＭＴＳアッセイなどの公知の技法によって評価することができる。
【０１２２】
がんの処置は、腫瘍体積の低減又は腫瘍細胞生存率の低下であり得る。腫瘍体積の低減は、カリパスを使用して評価することができる。腫瘍体積又は細胞生存率又は生存の低下は、少なくとも、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合の低下であり得る。腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導又は腫瘍細胞死の誘導は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合であり得る。腫瘍細胞生存率又は生存又は死滅は、当業者に公知の技法を使用して評価することができる。腫瘍細胞生存率及び死滅は、ＭＲＩ、ＣＴ若しくはＰＥＴなどの通常の撮像法、及びその派生法、又は生検を使用して評価することができる。腫瘍細胞生存率は、いくつかの時点で、病変の拡大を可視化することによって評価されてもよい。少なくとも一度に観察される病変の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合の低下が、腫瘍細胞生存率の低下と考えられることになる。
【０１２３】
腫瘍細胞の増殖の阻害は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合であり得る。細胞の増殖は、標準的な増殖アッセイのような公知の技法を使用して評価することができる。このような増殖アッセイは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの生体染色を使用してもよい。これには、代謝酵素によって蛍光分子へと変換される基質分子が含まれる。その後、蛍光のレベルが、生きている、代謝的に活性な細胞の数を反映する。或いは、このような増殖アッセイは、有糸分裂指数を決定し得る。有糸分裂指数は、全腫瘍細胞数と比較した、増殖段階にある腫瘍細胞数に基づく。増殖細胞の標識化は、抗体Ｋｉ−６７及び免疫組織化学染色を使用して実施することができる。腫瘍細胞の増殖の阻害は、有糸分裂指数が少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％又はそれより高い割合で低減する場合に見ることができる（Ｋｅａｒｓｌｅｙ  Ｊ．Ｈら、１９９０年、ＰＭＩＤ：２３７２４８３頁に記載されているように）。
【０１２４】
転移及び／又は腫瘍細胞の移動の発生の遅延は、少なくとも１週間、１カ月、数カ月、１年又はそれより長い期間の遅延であり得る。転移の存在は、ＭＲＩ、ＣＴ若しくはエコー検査又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出を可能とする技法を使用して評価することができる。後者の検査の例は、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ  ＣＴＣ検査（Ｖｅｒｉｄｅｘ）、すなわち、末梢血由来のＣＴＣのＥｐＣａｍに基づく磁気選別である。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、腫瘍重量の阻害若しくは低下又は腫瘍成長の遅延又は腫瘍成長の阻害は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合であり得る。腫瘍重量又は腫瘍成長の体積は、当業者に公知の技法を使用して評価することができる。腫瘍成長の検出又は腫瘍細胞の増殖の検出は、グルコース類似体２−［１８Ｆ］−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（ＦＤＧ−ＰＥＴ）又は［１８Ｆ］−’３−フルオロ−’３−デオキシ−Ｌ−チミジン  ＰＥＴによるポジトロン放出断層撮影によって、グルコース利用の変化を測定することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏでの代替法は、Ｋｉ６７による腫瘍生検の染色であり得る。
【０１２６】
腫瘍細胞の分化能の増加は、特異的分化マーカーを使用し、処置細胞におけるこのようなマーカーの存在を追跡して評価することができる。好ましいマーカー又はパラメーターは、ｐ１６、Ｔｒｐ−１及びＰＬＺＦ、ｃ−Ｋｉｔ、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びメラニンである。これは、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング又は免疫組織化学を使用してなされる。分化能の増加は、特定された技法のいずれかを使用して、処置の少なくとも１週間後の少なくとも検出可能な増加であり得る。好ましくは、増加は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又はそれより高い割合の増加であり、したがって、所与の試料内の分化細胞数が増加することになる。ある特定の実施形態では、腫瘍成長は、少なくとも１週間、１カ月、２カ月又はそれより長い期間遅延され得る。ある特定の実施形態では、転移の発生は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月又はそれより長い期間遅延される。
【０１２７】
これらの方法又は医学的使用の例示的な実施形態の実践に対する縮図が実施例に示されている。
【０１２８】
本発明は、ｍｉＲＮＡの細胞内取込みを刺激するためのｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又はｅｘ  ｖｉｖｏ方法、細胞を本発明による組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。方法は、好ましくは、細胞膜を通過させることによって、本発明のナノ粒子を能動的又は受動的に細胞に侵入させることをさらに包含し得る。方法は、好ましくは、処置において使用するためのｍｉＲＮＡの有効性を増加させるためのものである。これらの方法又は医学的使用の例示的な実施形態の実践に対する縮図が実施例に示されている。
【０１２９】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、がんの処置において使用するためのものである。したがって、本発明は、本明細書で前記するように、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体、又はｍｉＲＮＡ分子の前駆体、ｉｓｏｍｉＲ、若しくは模倣体などの、がんの処置のための組成物由来のｍｉＲＮＡを提供する。
【０１３０】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、化学療法耐性のがん、例えば、ソラフェニブ耐性のがんの処置において使用するためのものである。
【０１３１】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、癌腫の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、化学療法耐性の癌腫、例えば、ソラフェニブ耐性の癌腫の処置において使用するためのものである。
【０１３２】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、肝細胞癌（ＨＣＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、例えば、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、又はバンデタニブ、好ましくはソラフェニブに耐性である肝細胞癌腫（ＨＣＣ）などの化学療法耐性のＨＣＣの処置において使用するためのものである。
【０１３３】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、プラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはシスプラチン又はカルボプラチン）に耐性であるか、又はタキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル又はドセタキセル、より好ましくはパクリタキセル）に耐性であるか、又はピリミジン系抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはゲムシタビン）に耐性であるか、又はビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、又はビノレルビン、好ましくはビノレルビン）に耐性であるか、又は葉酸抗代謝薬（アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、又はラルチトレキセド、好ましくはペメトレキセド）に耐性である、ＮＳＣＬＣなどの化学療法耐性ＮＳＣＬＣの処置において使用するためのものである。
【０１３４】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、アントラサイクリン耐性ＴＮＢＣ、例えば、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、又はゾルビシン、好ましくはドキソルビシンに耐性のＴＮＢＣなどの化学療法耐性ＴＮＢＣの処置において使用するためのものである。
【０１３５】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、黒色腫の処置において使用するためのものであり。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、非古典的細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、アルトレタミン、ミトブロニトール、又はピポブロマン、好ましくはダカルバジン又はテモゾロミド）に耐性であるか、又はタキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル、例えば、アルブミン結合パクリタキセル）に耐性であるか、又はプラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはシスプラチン又はカルボプラチン）に耐性であるか、又はビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、又はビノレルビン、好ましくはビンブラスチン）に耐性である、黒色腫などの化学療法耐性黒色腫の処置において使用するためのものである。
【０１３６】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、膵臓がんの処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、タキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル、例えば、アルブミン結合パクリタキセル）に耐性であるか、又はピリミジン系抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはフルオロウラシル又はゲムシタビン）に耐性であるか、又はトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、コシテカン、ベロテカン、ジマテカン、エキサテカン  イリノテカン、ラルトテカン、シラテカン、トポテカン、ルビテカン、好ましくはイリノテカン）に耐性である、膵臓がんなどの化学療法耐性膵臓がんの処置において使用するためのものである。
【０１３７】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、結腸がんの処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、ピリミジン系抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはフルオロウラシル又はカペシタビン）に耐性であるか、又はトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、コシテカン、ベロテカン、ジマテカン、エキサテカン、イリノテカン、ラルトテカン、シラテカン、トポテカン、ルビテカン、好ましくはイリノテカン）に耐性であるか、又はプラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはオキサリプラチン）に耐性であるか、又はトリフルリジン若しくはチピラシル、又はトリフルリジンとチピラシルの組合せに耐性である、結腸がんなどの化学療法耐性結腸がんの処置において使用するためのものである。
【０１３８】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、腎細胞がん（ＲＣＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、例えば、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、又はバンデタニブ、好ましくはスニチニブ、ソラフェニブ、又はパゾパニブ、より好ましくはソラフェニブに耐性であるＲＣＣなどの化学療法耐性ＲＣＣの処置において使用するためのものである。
【０１３９】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、頭頚部がん（ＨＮＳＣＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、タキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル又はドセタキセル）に耐性であるか、又はピリジン系抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはフルオロウラシル）に耐性であるか、又は葉酸抗代謝薬（アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、又はラルチトレキセド、好ましくはメトトレキサート）に耐性であるか、又はプラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはシスプラチン）に耐性であるか、又はアントラサイクリン（例えば、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、又はゾルビシン、好ましくはドキソルビシン）に耐性であるか、又はインターカレート架橋剤（例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、好ましくはブレオマイシン又はマイトマイシン）に耐性である、ＨＮＳＣＣなどの化学療法耐性ＨＮＳＣＣの処置において使用するためのものである。
【０１４０】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、前立腺がんの処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、タキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはドセタキセル）に耐性であるか、又はアントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン又はピクサントロン、好ましくはミトキサントロン）に耐性であるか、又はアルキル化抗腫瘍剤（例えば、エストロゲン系アルキル化抗腫瘍剤、例えば、アレストラムスチン、アトリムスチン、シテストロールアセテート（ｃｙｔｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、エストラジオールマスタード、エストラムスチン、エストロムスチン、スチルボスタット（ｓｔｉｌｂｏｓｔａｔ）；又はフェネストロール、好ましくはエストラムスチン）に耐性である、前立腺がんなどの化学療法耐性前立腺がんの処置において使用するためのものである。
【０１４１】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の腫瘍の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、ボルテゾミブに耐性であるか、若しくはレナリドミドに耐性である骨髄腫など、又はシクロホスファミドに若しくはヒドロキシダウノルビシンなどのアントラサイクリンに若しくはオンコビンに若しくはプレドニゾンに対する耐性など、ＣＨＯＰに若しくはリツキシマブに耐性であるリンパ腫など、又はビンクリスチン、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、クロラムブシル、シクロホスファミド、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾン若しくはプレドニゾロン、フルダラビン、ペントスタチン、若しくはクラドリビンに耐性である白血病などの、造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の化学療法耐性腫瘍の処置において使用するためのものである。本明細書に記載のソラフェニブ耐性がんなどの化学療法耐性がんの処置は、ソラフェニブ処置などの化学療法が、有効でないこと、又は所期若しくは所望の効果よりも低いことが判明した場合に、セカンドライン処置となり得る。
【０１４２】
固形腫瘍は、もともと上皮系であることが多い（すなわち、癌腫）。上皮細胞マーカー（例えば、Ｅ−カドヘリン）の損失及び間葉細胞マーカー（例えば、Ｎ−カドヘリン及びビメンチン）の取得は、前立腺がんを含む患者の腫瘍試料に対して公知である。がん細胞は、このいわゆる上皮間葉転換（ＥＭＴ）によって脱分化し得る。ＥＭＴの間、細胞間の細胞結合が破壊され、それによって、腫瘍細胞に、周囲組織へと又は血管壁を通って移動及び侵入する能力が与えられる。このような表現型の変化は、疾患の伝播において重要な役割を果たし、最終的に疾患の進行をもたらし、これは、患者にとって予後不良を伴うことが多い。
【０１４３】
Ｅ−カドヘリン発現の損失は、ＥＭＴの分子ホールマークとみなされる。腫瘍細胞におけるＥＭＴは、細胞の転写再プログラミングから生じる。特に、Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）遺伝子プロモーターの転写抑制は、ＥＭＴ表現型を誘発することが示されている。Ｅ−カドヘリンタンパク質は、上皮細胞／組織において細胞間の接触を媒介する最も重要なカドヘリン分子の１つである。ＣＤＨ１は、転写抑制因子、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＣＦ３、ＴＷＩＳＴ、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２又はＫＬＦ８の、ＣＤＨ１近位プロモーター領域の３つのいわゆるＥ−ボックスへの結合によって抑制される。これらの抑制因子のＣＤＨ１プロモーターへの結合を阻害することにより、間葉上皮転換（ＭＥＴ）とも呼ばれるＥＭＴが回復し、腫瘍細胞の侵入及び腫瘍進行が阻害される。
【０１４４】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、ＥＭＴに関連する疾患又は状態の処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。本明細書では、ｍｉＲＮＡは、好ましくは、ｍｉＲＮＡ−５１８ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−５２０ｆ分子、若しくはｍｉＲＮＡー５２４分子；又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体、又はその前駆体である。ＥＭＴに関連する疾患又は状態は、好ましくはがん、より好ましくは膀胱がん又は前立腺がんである。この使用は、間葉上皮転換を誘導することによるのが好ましい。
【０１４５】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、免疫抑制腫瘍微小環境を下方調節することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。関連する好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、腫瘍による宿主免疫の回避を防止又は低減することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。このような使用は、例えば、アデノシンを産生するためにＡＴＰを脱リン酸化するものなどの細胞表面エクトエンザイムの活性を阻害又は低減することによって、アデノシン生成を防止、阻害、又は低減するのに好ましい。このような使用は、ＮＴ５Ｅ発現を低減する及び／又はＥＮＴＰＤ１発現を低減する及び／又はアデノシン生成を阻害するのにより好ましい。より好ましくは、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、ＮＴ５Ｅ発現を低減するためのものであり；ここで、組成物のためのｍｉＲＮＡは、好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａである。より好ましくは、本発明によるこの組成物又は組成物に関するこのｍｉＲＮＡは、ＥＮＴＰＤ１発現を低減するためのものである。より好ましくは、本発明によるこの組成物又は組成物に関するこのｍｉＲＮＡは、アデノシン生成を阻害するためのものである。さらにより好ましい実施形態では、本発明によるこの組成物又は組成物に関するこのｍｉＲＮＡは、がん細胞の移動を低減するためのものであり、好ましくは、アデノシン誘導性のがん細胞の移動を低減するためのものであり、最も好ましくは、ＮＴ５Ｅ発現に関連するアデノシン誘導性のがん細胞の移動を低減するためのものである。ＮＴ５Ｅ又はＥＮＴＰＤ１発現の低減は、ルシフェラーゼアッセイによって又はＲＴ−ＰＣＲによって、より好ましくは、実施例に記載されているように評価されるのが好ましい。がん細胞の移動の低減は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスウェルアッセイによって、より好ましくは、実施例に記載されているように評価される。
【０１４６】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞における、好ましくは肝臓がん細胞における、肺がん細胞における、膵臓がん細胞における、癌腫細胞における、又は黒色腫細胞における、より好ましくは、肝臓がん細胞における、癌腫細胞における、又は黒色腫細胞における、さらにより好ましくは、肝細胞癌細胞における又は黒色腫細胞における、Ｇ２／Ｍアレストを促進又は増加させることによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。このような使用は、ＭＰＰ２及び／又はＳＴＭＮ１などの細胞骨格に関連することによって、細胞分裂及び／又は増殖を調節する因子の発現又は活性を低減するのに好ましい。このような使用は、ＹＷＨＡＺ及び／又はＣＣＮＡ２などの、サイクリン依存性キナーゼに結合及び／又はそれを封鎖する因子を促進又は増加させるのに好ましい。好ましくは、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、ＭＰＰ２、ＳＴＭＮ１、ＹＷＨＡＺ、及びＣＣＮＡ２のうちの少なくとも１つの発現又は活性を低減することによる、より好ましくは、少なくともＹＷＨＡＺ又はＳＴＭＮ１の、さらにより好ましくは、少なくともＹＷＨＡＺの、最も好ましくは、ＭＰＰ２、ＳＴＭＮ１、ＹＷＨＡＺ、及びＣＣＮＡ２のそれぞれの発現又は活性を低減することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。Ｇ２／Ｍアレストの増加は、未処置細胞と比較した場合の増加であることが好ましく、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％又はそれより高い割合の増加であることが好ましい。これは、ＤＮＡ染色と、その後の、ＤＮＡ含量に基づく核強度を決定するための顕微鏡画像によって評価されるのが好ましい。ＭＰＰ２、ＳＴＭＮ１、ＹＷＨＡＺ、及びＣＣＮＡ２のうちの少なくとも１つの発現又は活性の低減は、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して評価され、より好ましくは、実施例に記載されているように評価される。
【０１４７】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞の移動、がん細胞の付着、若しくはがん細胞の増殖を低下させるか若しくは低減することによる、又はがん細胞のアポトーシスを増加させるか若しくは促進することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。これらのがん細胞は、好ましくは、肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、黒色腫細胞、又は癌腫細胞、より好ましくは肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、又は癌腫細胞、さらにより好ましくは肺がん細胞、例えば、Ａ５４９及びＨ４６０、肝臓がん細胞、例えば、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７、乳がん細胞、例えば、ＢＴ５４９、並びに皮膚がん細胞、例えば、Ａ２０５８である。より好ましい実施形態では、がんの処置、防止、遅延、又は軽快におけるこの使用は、ＦＯＸＲＥＤ２、ＥＲＭＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＳＨＭＴ２、ＨＹＯＵ１、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＡＰ２Ｍ１、ＣＬＳＴＮ１、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＤＡＺＡＰ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＳＴＡＲＤ７、ＡＴＰ５ＳＬ、ＤＣＡＦ７、ＤＨＣＲ２４、ＤＰＹ１９Ｌ１、ＡＧＰＡＴ１、ＳＬＣ３０Ａ７、ＡＩＭＰ２、ＵＢＰ１、ＲＵＳＣ１、ＤＣＴＮ５、ＡＴＰ５Ｆ１、ＣＣＤＣ２８Ａ、ＳＬＣ３５Ｄ２、ＷＳＢ２、ＳＥＣ６１Ａ１、ＭＰＰ２、ＦＡＭ６０Ａ、ＰＩＴＰＮＢ、及びＰＯＬＥ３からなる群から選択される、さらにより好ましくは、ＮＴ５Ｅ及びＴＮＦＲＳＦ２１からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の発現又は活性を低下させることによるものであり；好ましくは、アポトーシス、細胞の移動、付着、及び増殖に関する上記の使用は、これらの遺伝子の少なくとも１つと関連するアポトーシス、細胞の移動、付着、及び／又は増殖に関する使用である。発現は、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲによって評価され、より好ましくは、実施例に記載されているように評価される。
【０１４８】
好ましい実施形態では、本発明によるこの組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞のアポトーシスを増加させるか又は促進することによる、好ましくは、ＫＣＮＭＡ１、ＮＯＴＣＨ２、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＹＷＨＡＺ、ＣＡＤＭ１、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＹＡＡ、ＥＴＳ１、ＡＩＭＰ２、ＳＱＳＴＭ１、ＺＭＡＴ３、ＴＧＭ２、ＣＥＣＲ２、ＰＤＥ３Ａ、ＳＴＲＡＤＢ、ＮＩＰＡ１、ＭＡＰＫ８、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＰＲＮＰ、ＰＲＴ１、ＧＣＨ１、ＤＨＣＲ２４、ＴＧＦＢ２、ＮＥＴ１、ＰＨＬＤＡ２、及びＴＰＰ１からなる群から、より好ましくは、ＮＯＴＣＨ２、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＹＷＨＡＺ、ＥＴＳ１、ＴＧＦＢ２、及びＭＡＰＫ８からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するアポトーシスを増加させるか又は促進することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１４９】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、血管新生、好ましくはがん細胞に関連する血管新生を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＣＲＫＬ、ＣＴＧＦ、ＺＭＩＺ１、ＴＧＭ２、ＥＬＫ３、ＬＯＸ、ＵＢＰ１、ＰＬＡＵ、ＣＹＲ６１、及びＴＧＦＢ２、さらにより好ましくはＣＲＫＬ，ＴＧＦＢ２又はＰＬＡＵ、最も好ましくはＰＬＡＵからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連する血管新生を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１５０】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞の小胞体ストレス応答をモジュレートすることによる、より好ましくはＥＲＭＰ１、ＮＣＥＨ１、ＳＥＣ３１Ａ、ＣＬＳＴＮ１、ＦＯＸＲＥＤ２、ＳＥＰＮ１、ＥＸＴＬ２、ＨＹＯＵ１、ＳＬＣ３５Ｄ１、ＳＵＬＦ２、ＰＴＰＬＢ、ＨＨＡＴ、ＥＲＡＰ２、ＦＡＦ２、ＤＰＭ３、ＰＤＺＤ２、ＳＥＣ６１Ａ１、ＤＨＣＲ２４、ＩＤＳ、ＭＯＳＰＤ２、ＤＰＭ、ＰＲＮＰ、及びＡＧＰＡＴ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連する小胞体ストレス応答をモジュレートすることによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。小胞体ストレス応答のモジュレーションは、好ましくは、小胞体ストレス応答の阻害又は低減である。
【０１５１】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞の走化性を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＣＸＣＬ１、ＲＡＣ２、ＣＸＣＬ５、ＣＹＲ６１、ＰＬＡＵＲ、ＫＣＮＭＡ１、ＡＢＩ２、及びＨＰＲＴ１、最も好ましくはＰＬＡＵＲからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連する走化性を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１５２】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞におけるタンパク質輸送を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＳＴＯＮ２、ＲＡＢ１１ＦＩＰ５、ＳＲＰ５４、ＹＷＨＡＺ、ＳＹＮＲＧ、ＧＣＨ１、ＴＨＢＳ４、ＳＲＰ５４、ＴＯＭＭ２０、ＳＥＣ３１Ａ、ＴＰＰ１、ＳＬＣ３０Ａ７、ＴＧＦＢ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＰ２Ｍ１、ＩＴＧＢ３、ＧＮＡＩ３、ＳＯＲＬ１、ＫＲＡＳ、ＳＬＣ１５Ａ１、ＳＥＣ６１Ａ１、ＡＰＰＬ１、ＬＲＰ４、ＰＬＥＫＨＡ８、ＳＴＲＡＤＢ、ＳＣＡＭＰ４、ＨＦＥ、ＣＡＤＭ１、ＺＭＡＴ３、ＡＲＦ３、ＶＡＭＰ８、ＮＵＰ５０、ＤＨＣＲ２４、ＲＡＢ１１ＦＩＰ５、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＳＱＳＴＭ１、及びＷＮＫ４、さらにより好ましくは，ＹＷＨＡＺ，ＴＧＦＢ２，又はＫＲＡＳ、最も好ましくはＹＷＨＡＺからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するタンパク質輸送を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１５３】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞におけるヌクレオシドの代謝を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＮＵＤＴ３、ＮＵＤＴ１５、ＮＵＤＴ２１、ＤＥＲＡ、ＮＴ５Ｅ、ＧＣＨ１、及びＨＰＲＴ１、最も好ましくはＮＴ５Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するヌクレオシドの代謝を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１５４】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞のグリコシル化を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＳＬＣ３５Ｄ１、ＳＴ３ＧＡＬ５、ＳＵＬＦ２、ＬＡＴ２、ＧＡＬＮＴ１、ＮＣＥＨ１、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＣＨＳＴ１４、Ｂ３ＧＮＴ３、ＤＰＭ３、ＧＡＬＮＴ１３、ＤＨＣＲ２４、ＮＵＤＴ１５、ＩＤＨ２、ＰＰＴＣ７、ＨＰＲＴ１、ＥＸＴＬ２、ＳＥＣ６１Ａ１、ＥＲＡＰ２、及びＧＡＬＮＴ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するグリコシル化を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１５５】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、発癌を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＣＣＮＤ１、ＣＢＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＲＫＬ、ＭＡＸ、ＫＣＮＭＡ１、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＧＮＡＩ３、ＹＷＨＡＺ、ＲＡＣ２、ＥＴＳ１、ＰＴＣＨ１、ＭＡＰＫ８、ＬＡＭＣ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＤＫ６、ＣＢＬ、ＡＰＰＬ１、ＧＮＡＩ３、ＰＤＥ３Ａ、ＴＧＦＢ２、ＡＢＩ２、ＭＡＸ、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸ、ＣＸＣＬ５、ＡＲＰＣ５、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＴＨＢＳ４からなる群から選択される、さらにより好ましくはＣＲＫＬ、ＴＧＦＢ２、ＹＷＨＡＺ、ＥＴＳ１、ＭＡＰＫ８、及びＣＤＫ６から、最も好ましくはＹＷＨＡＺ、ＥＴＳ１、ＭＡＰＫ８、及びＣＤＫ６から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連する発癌を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１５６】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、機能障害性創傷治癒を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＫＣＮＭＡ１、ＣＸＣＬ１、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＵ、ＣＣＮＤ１、ＺＭＩＺ１、ＥＬＫ３、ＹＷＨＡＺ、ＩＬ１１、ＰＬＡＵＲ、ＬＯＸ、ＣＴＧＦ、及びＴＧＦＢ２からなる群から選択される、さらにより好ましくはＴＧＦＢ２、ＮＯＴＣＨ２、ＰＬＡＵ、ＹＷＨＡＺ、及びＰＬＡＵＲから、最も好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＰＬＡＵ、ＹＷＨＡＺ、及び任意選択でＰＬＡＵＲから選択される、少なくとも１つの遺伝子と関連する機能障害性創傷治癒を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１５７】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡは、免疫活性化、好ましくはがんに対する免疫応答と関連する免疫活性化を増加させるか又は促進することによる、より好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＬＡＴ２、ＣＲＫＬ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＹＷＨＡＺ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＩＲＦ１、ＴＧＦＢ２、ＩＬ１１、ＵＮＧ、ＣＤＫ６、及びＨＰＲＴ１からなる群から選択される、さらにより好ましくはＣＲＫＬ、ＴＧＦＢ２、ＮＯＴＣＨ２、ＹＷＨＡＺ、及びＣＤＫ６から、最も好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＹＷＨＡＺ、及びＣＤＫ６から選択される、少なくとも１つの遺伝子と関連する免疫活性化を増加させるか又は促進することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による組成物によって又は組成物のためのｍｉＲＮＡによって、例えば、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによって、低減されるのが好ましい。
【０１５８】
本発明は、本発明による組成物のためのｍｉＲＮＡ又は組成物で、好ましくはｍｉＲＮＡ−１９３ａで又はｍｉＲＮＡ−１９３ａを含む本発明による組成物で処置した対象から得られたＴ細胞も提供する。このようなＴ細胞は、本明細書の他の箇所に記載したがんの処置において使用するためのものであり得る。その使用において、Ｔ細胞は、本発明による組成物のためのｍｉＲＮＡで又は組成物で処置した対象から前もって得られることが好ましい。Ｔ細胞は、ヒト対象に由来することが好ましい。ワクチンとして、又はがんの再発若しくは転移を防止するのに使用するためのものであることが好ましい。
【０１５９】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡ、好ましくはｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はｍｉＲＮＡ−１９３ａを含む本発明による組成物は、ＣＤＫ６、ＥＩＦ４Ｂ、ＥＴＳ１、ＩＬ１７ＲＤ、ＭＣＬ１、ＭＡＰＫ８、ＮＯＴＣＨ２、ＮＴ５Ｅ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＴＮＦＲＳＦ２１、及びＹＷＨＡＺからなる群から選択される、より好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＮＴ５Ｅ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、及びＹＷＨＡＺから選択される、少なくとも１つの遺伝子と関連するがんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。
【０１６０】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡ、好ましくはｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はｍｉＲＮＡ−１９３ａを含む本発明による組成物は、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＲＫＬ、ＮＴ５Ｅ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ１７ＲＤ、ＫＲＡＳ、ＫＩＴ、ＨＤＡＣ３、ＲＴＫ２、ＴＧＦＢ２、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＬＡＵ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、及びＹＡＰ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するがんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。これらの遺伝子は、抗腫瘍免疫における関与が知られている。
【０１６１】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡ、好ましくはｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はｍｉＲＮＡ−１９３ａを含む本発明による組成物は、ＥＴＳ１、ＹＷＨＡＺ、ＭＰＰ２、ＰＬＡＵ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＩＦ４Ｂ、ＲＡＤ５１、ＣＣＮＡ２、ＳＴＭＮ１、及びＤＣＡＦ７からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するがんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。これらの遺伝子は、細胞周期の調節に関与する。
【０１６２】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物のためのｍｉＲＮＡ、好ましくはｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はｍｉＲＮＡ−１９３ａを含む本発明による組成物は、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものであり、好ましいがんは、結腸癌などの結腸がん、肺癌などの肺がん、黒色腫、細網肉腫などのリンパ腫、膵腺癌などの膵臓がん、肝細胞癌又は肝細胞腫などの肝臓がん、乳癌などの乳がん、前立腺がん、腎腺癌などの腎臓がん、腺癌又は結腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、若しくは乳癌などの癌腫、及び膵腺癌又は腎腺癌などの腺癌からなる群から選択されるがんである。より好ましいがんは、結腸癌などの結腸がん、肺癌などの肺がん、黒色腫、細網肉腫などのリンパ腫、膵腺癌などの膵臓がん、肝細胞癌などの肝臓がん、乳癌などの乳がん、前立腺がん、腺癌又は結腸、肺、肝臓、膵臓、若しくは乳癌などの癌腫、及び膵腺癌などの腺癌からなる群から選択されるがんである。さらにより好ましいがんは、結腸癌などの結腸がん、肺癌などの肺がん、黒色腫、細網肉腫などのリンパ腫、及び結腸、肺などの癌腫からなる群から選択されるがんである。
【０１６３】
さらに好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、がんの処置において使用するためのものであり、組成物は、ソラフェニブなどのさらなる化学療法剤と組み合わされる。これは、以降で、本発明による組合せと称される。本発明による組合せは、本発明による使用のための組成物として、上記のように、使用するためのものであることが好ましい。
【０１６４】
本発明による組合せは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡを含む、及びがんの処置に好適なキナーゼ阻害剤薬物などの化学療法剤を含む組合せ、例えば、本発明による組成物を含む、及びソラフェニブを含む、又は、例えば、組成物由来のｍｉＲＮＡを含む及びソラフェニブを含む組合せなどである。
【０１６５】
好適な化学療法剤は、ソラフェニブなどのキナーゼ阻害剤薬物又はＢ−ｒａｆ阻害剤又はＭＥＫ阻害剤又はＲＮＲ阻害剤又はＡＵＲＫＢ阻害剤である。好ましいＢ−ｒａｆ阻害剤は、ベムラフェニブ及び／又はダブラフェニブである。好ましくはＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ及び／又はセルメチニブである。好ましいＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ｃｌｏｌａｒ  クロファラビン及びトリアピンからなる群から選択される。
【０１６６】
Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、ＢＲＡＦ遺伝子の変異形態をコードする、Ｂ−ｒａｆタンパク質を特異的に阻害する化合物である。ＢＲＡＦ遺伝子のいくつかの変異は、黒色腫を引き起こすことが知られており、Ｂ−ｒａｆタンパク質の変異形態を阻害する特異的化合物が開発されてきた。Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、ＧＤＣー０８７９、ＰＬＸー４７２０、ソラフェニブ、ＳＢ５９０８８５，ＰＬＸ４７２０，ＸＬ２８１及びＲＡＦ２６５を含む。Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、例えば、Ｗｏｎｇ  Ｋ．Ｋ．らに記載されている。１つのＢ−ｒａｆ阻害剤は、本発明による組合せにおいて他のＢ−ｒａｆ阻害剤と一緒に使用されてもよい。本発明で使用される好ましいＢ−ｒａｆ阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ又はベムラフェニブとダブラフェニブの混合物である。ベムラフェニブは、ＲＧ７２０４又はＮ−（３−｛［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］カルボニル｝−２，４ージフルオロフェニル）プロパン−１−スルホンアミドとしても知られており、Ｚｅｌｂｏｒａｆとして市販されている。ダブラフェニブは、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノピリミジン−４−イル）−２−（１，１−ジメチルエチル）チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドとしても知られている。
【０１６７】
ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫタンパク質を特異的に阻害する化合物である。いくつかのＭＥＫ阻害剤は、当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、セルメチニブ（ＡＺＤ−６２４４）、ＸＬ５１８、ＣＩ−１０４０、ＰＤ０３５９０１を含む。トラメチニブは、Ｎ−（３−（３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）フェニル）アセトアミドとしても公知である。セルメチニブは、６−（４−ブロモ−２−クロロフェニルアミノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチル−３Ｈベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミドとしても公知である。ＭＥＫ阻害剤は、例えば、Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｋ．（ＰＭＩＤ：１９１４９６８６）に記載されている。１つのＭＥＫ阻害剤は、本発明による組合せにおいて、他のＭＥＫ阻害剤と一緒に使用されてもよい。いくつかのＭＥＫ阻害剤は、いくつかの別個のＭＥＫ阻害剤と同義である。本発明において使用される好ましいＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ及び／又はセルメチニブである。
【０１６８】
ＲＮＲ及び／又はＡＵＲＫＢ阻害剤は、ＲＮＡ及び／又はＡＵＲＫＢタンパク質を特異的に阻害する化合物である。ＲＮＲは、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）であり、それ自体、リボヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）のデオキシリボヌクレオシド二リン酸（ｄＮＤＰ）へのｄｅ  ｎｏｖｏ変換を担う唯一の酵素である（Ｚｈｏｕら  ２０１３年）。ＲＮＲは、細胞内のｄＮＴＰ供給の重要な調節因子である。均衡なｄＮＴＰプールの維持は、ＤＮＡ合成及び修復のための基質における不均衡の結果に変異誘発及び細胞死が含まれるため、基礎的な細胞機能である。ヒトＲＮＲは、酵素調節因子に対する触媒部位と２つの結合部位を含有するサブユニット（ＲＲＭ１）及び触媒に必要な安定したチロシルラジカルを生じる二核鉄補因子（ｂｉｎｕｃｌｅａｒ  ｉｒｏｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒ）を有するｂサブユニット（ＲＲＭ２）から構成される。ＲＮＲの阻害剤は、ＲＲＭ１及び／又はＲＲＭ２を阻害し得る。好ましいＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ｃｌｏｌａｒ  クロファラビン及びトリアピンからなる群から選択される。
【０１６９】
ＡＵＲＫＢ（Ａｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼ）は、セントロメアへの紡錘体の付着において機能するタンパク質である。有糸分裂及び減数分裂の間の染色体分離は、キナーゼとホスファターゼによって調節される。Ａｕｒｏｒａキナーゼは、染色体移動及び分離の間の微小管に関連する。がん細胞では、これらの酵素の過剰発現が、がんのホールマークである異数体細胞を作成する、遺伝情報の不均一な分布をもたらす。
【０１７０】
化学療法剤は、本明細書で定義される抗がん作用を誘導又は促進することができる薬物である。好ましい化学療法剤は、キナーゼ阻害剤又はＲＮＲ阻害剤又はＡＵＲＫＢ阻害剤である。このような阻害剤の例は、ＲＮＲ及び／又はＡＵＲＫＢタンパク質を特異的に阻害する化合物である。ＲＮＲ及び／又はＡＵＲＫＢタンパク質を阻害する治療用化合物の能力を評価するために、リードアウトとしてＲＮＲ（ＲＲＭ１及び／又はＲＲＭ２）又はＡＵＲＫＢタンパク質を用いるウエスタンブロッティングを実施することができる。細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、０．０１、０．１及び１ｕＭの前記化合物で７２時間処置した。処置後、ＲＩＰＡ溶解緩衝液としての溶解緩衝液中に細胞をスクレープする。等量のタンパク質抽出物を１０％のＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用することによって分離し、次いで、ポリフッ化ビニリデンの膜に移した。０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０と５％の無脂肪乳を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中で１時間ブロッキングした後、ＲＮＲ（すなわち、ＲＲＭ１及び／又はＲＲＭ２）及び／又はＡＵＲＫＢ一次抗体、続いて、フィルム上での化学蛍光検出のための西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた二次抗体で膜をプローブした。チューブリンをローディング対照として使用する。使用される好ましいＲＲＭ２抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（製品番号  ｓｃ−１０８４６）に由来し、及び／又は好ましいＡＵＲＫＢ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ（製品番号  ３０９４）に由来する。前記ＲＮＲ及び／又はＡＵＲＫＢ阻害剤の治療能力の評価は、ノーザンブロットを行うことによって又はＰＣＲによってＲＮＡレベルでも評価することができる。
【０１７１】
本発明による好ましい組合せは：
ｉ）組成物が、好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくは前駆体を含むか、或いは組成物由来のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくは前駆体である、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡ、並びに
ｉｉ）
ａ．ＶＥＧＦ受容体阻害剤などの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、又はバンデタニブ、好ましくはスンチニブ、ソラフェニブ、又はパゾパニブ、より好ましくはソラフェニブ；
ｂ．プラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはシスプラチン又はカルボプラチン又はオキサリプラチン；
ｃ．タキサン、例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル又はドセタキセル、より好ましくはパクリタキセル又はドセタキセル；
ｄ．ピリミジン系抗代謝薬、例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはフルオロウラシル又はゲムシタビン又はカペシタビン；
ｅ．ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、又はビノレルビン、好ましくはビノレルビン又はビンブラスチン；
ｆ．葉酸抗代謝薬、アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、又はラルチトレキセド、好ましくはペメトレキセド又はメトトレキサート；
ｇ．アントラサイクリン、例えば、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、又はゾルビシン、好ましくはドキソルビシン；
ｈ．非古典的細胞周期非特異的抗腫瘍剤、例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、アルトレタミン、ミトブロニトール、又はピポブロマン、好ましくはダカルバジン又はテモゾロミド；
ｉ．タキサン、例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル、例えば、アルブミン結合パクリタキセル；
ｊ．トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテシン、コシテカン、ベロテカン、ジマテカン、エキサテカン、イリノテカン、ラルトテカン、シラテカン、トポテカン、ルビテカン、好ましくはイリノテカン；
ｋ．トリフルリジン又はチピラシル、又はトリフルリジンとチピラシルの組合せ；
ｌ．インターカレート架橋剤、例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシ、マイトマイシン、プリカマイシン、好ましくはブレオマイシン又はマイトマイシン；
ｍ．アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン又はピクサントロン、好ましくはミトキサントロン；及び
ｎ．アルキル化抗腫瘍剤、例えば、エストロゲン系アルキル化抗腫瘍剤、例えば、アレストラムスチン、アトリムスチン、シテストロールアセテート、エストラジオールマスタード、エストラムスチン、エストロムスチン、スチルボスタット；又はフェネストロール、好ましくはエストラムスチン
からなる群から選択される、少なくとも１つの化学療法剤
を含む。
【０１７２】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、がんの処置において使用するためのものであり、組成物は、がん細胞への免疫応答を増加させる。これは、免疫応答が存在しない場合に、免疫応答が開始することを意味し得る。
【０１７３】
免疫応答を増加させるためにより好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２を活性化する免疫系の生成を増加させるためのものである。好ましくは、サイトカイン産生は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で増加され、好ましくは、ＦＡＣＳによって、より好ましくは、実施例で実証されるように検出されるのが好ましい。実施例で実証されるように、サイトカインを活性化する免疫系を、処置の１週間後に、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）に関する４Ｔ１マウスモデルで増加させる。サイトカインの増加により、がんの免疫抑制の上昇が導かれ、そうでなければ免疫抑制に感受性ではないがんの免疫抑制又は部分的免疫抑制がもたらされ得る。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の機能を増大させる、例えば、ＩＦＮγ及びＩＬ−２の産生を増加させるためのものである。
【０１７４】
免疫応答を増加させるためのより好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、調節性Ｔ細胞集団を減少させるためのものである。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫抑制調節性Ｔ細胞であり、Ｔｒｅｇを減少させることは、がんに対する免疫応答を増加させる。好ましくは、Ｔｒｅｇは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で減少する。Ｔｒｅｇの減少は、ＦＯＸＰ３又はＬＡＧ３の決定によって、例えば、実施例に記載されているように決定することができる。この効果は、上記のように、サイトカイン産生の増加と並行することが好ましい。
【０１７５】
実施例で実証されているように、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の動員は、処置の２週間後に、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）に関する４Ｔ１マウスモデルで増加し、Ｔ細胞の機能が誘導される一方、Ｔｒｅｇ集団は減少する。したがって、免疫応答を増加させるための好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の出現頻度を増加させるためのものである。好ましくは、このような増加は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合である。このような増加は、ＣＤ８を測定することによって、例えば、実施例で実施されるように決定することができる。免疫応答を増加させるための好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の機能を誘導させるため、好ましくは、ＩＦＮγ産生を誘導することによってＴ細胞の機能を誘導するためのものである。最も好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の出現頻度を増加させ、好ましくは同時に調節性Ｔ細胞集団を減少させながら、同時にＴ細胞の機能を誘導するためのものである。Ｔｒｅｇが減少し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞が増加した腫瘍は、「ホット」腫瘍と称され、免疫抑制された微小環境を有さない腫瘍である。逆に、免疫抑制された微小環境における腫瘍は、「コールド」腫瘍と称される。
【０１７６】
さらに、本発明による組成物は、ＥＮＴＰＤ１（ＣＤ３９）又はＴＩＭ−３などの免疫抑制標的遺伝子の発現を低減することができる。このような低減は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合であることが好ましい。ＴＩＭ−３又はＥＮＴＰＤ１発現は、ｑＰＣＲによって、例えば、実施例で実証されているように、決定することができる。ＥＮＴＰＤ１は、トリホスホ及びジホスホヌクレオシドのγ−及びβーホスフェート残基のモノホスホヌクレオシド誘導体への加水分解を触媒するエクトヌクレオチダーゼである。これは、多量のアデノシンの生成によって免疫抑制の役割を有する。ＥＮＴＰＤ１発現の低減は、腫瘍細胞への免疫応答を増加させる。ＴＩＭ−３は、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られており、免疫抑制マーカーとして作用する阻害性受容体である、免疫チェックポイントである。ＴＩＭ−３は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上で主に発現され、マクロファージの活性化を抑制する。ＴＩＭ−３発現の低減は、腫瘍細胞への免疫応答を増加させる。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、ＥＮＴＰＤ１の若しくはＴＩＭ−３の発現を低減するためのものであるか又はＥＮＴＰＤ１及びＴＩＭ−３の発現を低減するためのものである。
【０１７７】
免疫系に関する本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡのプラスの効果は、それが、腫瘍細胞及びがん細胞に関するため、新たな腫瘍の成長を防止するか、転移を防止するか、又は例えば、手術によって、サイズで除去された腫瘍の成長を低減するのに好適である、本発明をもたらす。例えば、実施例４．４で実証されているように、本発明による組成物による処置によって、手術によって切除された腫瘍の再成長が低減され、このような腫瘍の転移が低減され、罹患した対象の生存が増加する。転移が由来する腫瘍は、原発腫瘍と称される。さらに、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡで処置された特定の腫瘍型を有する対象は、既に処置されたのと同じ型の新たな腫瘍細胞を再度負荷した場合に、腫瘍取込みの制限を示す。腫瘍取込みの制限後に、腫瘍は完全に退縮する。異なる腫瘍型を負荷した場合、腫瘍を完全に取り込むが、次に、完全に退縮もする。
【０１７８】
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び組成物由来のｍｉＲＮＡは、がん又は転移性がんを防止する、低減する、又は遅延させるための医薬品として使用するためのものである。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
【０１７９】
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び組成物由来のｍｉＲＮＡは、がんワクチンとして使用するためのものであり、好ましくは、がんの防止又は処置のためのがんワクチンとして使用するためのものである。このようなワクチンは、好ましくは、原発腫瘍の再成長又は再発を防止又は低減するためのものである。好ましくは、再成長は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。別の使用では、このようなワクチンは、好ましくは、転移性がんを低減又は処置するためのものである。好ましくは、転移性がんは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減され、或いはがん細胞の運動能は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
【０１８０】
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び組成物由来のｍｉＲＮＡは、医薬として使用するためのものであり。医薬は、転移性がんの防止、低減、又は処置のためのものであり、好ましくは、原発腫瘍は、手術によって切除されているか又は退縮しており、より好ましくは、原発腫瘍は、手術によって切除されている。好ましくは、転移性がんは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
【０１８１】
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び組成物由来のｍｉＲＮＡは、医薬として使用するためのものであり、医薬は、手術による切除後に、がんの再成長又は再発の防止、低減、又は処置のためのものである。好ましくは、再成長又は再発は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
【０１８２】
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び組成物由来のｍｉＲＮＡは、医薬として使用するためのものであり、医薬は、前記がんが退縮したか又は処置に成功した後の、がんの再成長又は再発の防止、低減、又は処置のためのものである。好ましくは、再成長又は再発は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
【０１８３】
好ましい実施形態では、本発明による組成物及び組成物由来のｍｉＲＮＡは、腫瘍細胞の増殖を阻害するためのものである。実施例で実証されているように、本発明による組成物は、Ｋ−ＲＡＳ及びＭＣＬ１の発現を低減し、腫瘍細胞の増殖の低減をもたらすことができる。ＫＲＡＳ、Ｋ−ｒａｓ、Ｋｉ−ｒａｓとしても知られているＫ−ＲＡＳは、当技術分野で公知の癌原遺伝子である。ＭＣＬ１は、誘導性骨髄性白血病細胞分化タンパク質Ｍｃｌ−１としても公知である。これは、アポトーシスを阻害することによって、がん細胞の生存を促進し得る。Ｋ−ＲＡＳとＭＣＬ１は両方とも、がん細胞の増殖を促進する。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、Ｋ−ＲＡＳの若しくはＭＣＬ１の発現を低減するためのものであるか又はＫ−ＲＡＳ及びＭＣＬ１の発現を低減するためのものである。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、Ｋ−ＲＡＳ及びＭＣＬ１及びＥＮＴＰＤ１及びＴＩＭ−３の発現を低減するためのものである。
【０１８４】
増殖の阻害は、アポトーシスの誘導によることが好ましい。実施例で実証されているように、本発明による組成物は、カスパーゼの活性化及びＰＡＲＰ切断によるＰＡＲＰの不活性化によって、がん細胞のアポトーシスを誘導する。好ましいカスパーゼの活性化は、カスパーゼ３／７の活性化である。ＰＡＲＰは、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼとしても公知であり、プログラム細胞死に関与するタンパク質のファミリーを指す。これは、カスパーゼ３によって及びカスパーゼ７によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断され、アポトーシスを誘発する。ＰＡＲＰの切断は、ブロッティング技法によって決定することができ、カスパーゼの活性化は、ブロッティングによりＰＡＲＰの切断を決定することによって、又はｑＰＣＲによって、例えば、実施例で実証されているように、アッセイすることができる。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、がん細胞においてアポトーシスを誘導するためのものである。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、カスパーゼ３及びカスパーゼ７を活性化するためのものである。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、ＰＡＲＰを不活性化するためのものである。好ましくは、ＰＡＲＰは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で不活性化される。ＰＡＲＰの不活性化は、実施例で実証されているように、ブロッティング技法によってモニタリングし、未切断酵素のより小さい断片を検出することができる。好ましくは、カスパーゼの活性は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で増加する。
【０１８５】
さらなる好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、Ｋ−ＲＡＳ、ＭＣＬ１、ＥＮＴＰＤ１、ＴＩＭ−３、ｃ−Ｋｉｔ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、及びＣＤ７３からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低減するためのものである。ｃ−Ｋｉｔは、チロシン−タンパク質キナーゼキット又はＣＤ１１７としても知られている癌原遺伝子であり、受容体チロシンキナーゼタンパク質をコードする。サイクリンＤ１の過剰発現は、早期のがん発症及び腫瘍進行と相関する。ＣＤ７３は、５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＴ）として、及びエクト−５’−ヌクレオチダーゼとしても公知である。ＣＤ７３によってコードされる酵素は、エクト−５−プライム−ヌクレオチダーゼ（５−プライム−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．１．３．５）であり、中性ｐＨで、プリン５−プライムモノヌクレオチドのヌクレオシドへの変換を触媒し、好ましい基質はＡＭＰである。このような遺伝子の発現は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減されるのが好ましく、例えば、実施例で実証されているようなｑＰＣＲ技法によって決定することができる。
【０１８６】
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、アデノシンＡ２Ａ受容体経路を調節するためのものである。ＡＤＯＲＡ２Ａとしても知られているアデノシンＡ２Ａ受容体は、免疫細胞を抑制することができるアデノシン受容体である。上記のように、ＣＤ７３の及び／又はＥＮＴＰＤ１の発現を低減する際の、本発明による組成物の活性は、Ａ２Ａ受容体経路を妨害し、免疫抑制を低減する。これは、免疫監視を回避する腫瘍細胞の能力が低減されるため、抗腫瘍効果をもたらす。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、免疫監視に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるためのものである。このような増加は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合の腫瘍体積の低減をもたらすのが好ましい。より好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の動員を増加させながら、好ましくは、ＬＡＧ３の若しくはＦｏｘＰ３の、又は両方の発現を低減することなどによって、Ｔｒｅｇを減少させながら、免疫監視に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるためのものである。免疫監視に対して増加した感受性は、腫瘍体積の低減をもたらすことが好ましい。
【０１８７】
本発明による組成物及び組成物由来のｍｉＲＮＡは、腫瘍細胞における細胞周期アレストを促進する。好ましい実施形態では、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、がんの処置において使用するためのものであり、その使用は、細胞周期アレストを誘導するためのものである。細胞周期アレストのプロファイルは、例えば、核の画像化又はフローサイトメトリーのいずれかを実施することによって、好ましくは、実施例で実証されているように、測定することができる。この文脈では、細胞周期アレストは、好ましくは、Ｇ２／Ｍ又はＳｕｂＧ１細胞周期アレストのプロファイルの誘導である。好ましくは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合の腫瘍細胞が、細胞周期アレストを受ける。好ましくは、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡが、黒色腫、肝臓がん、癌腫、肺がん、又は膵臓がんを処置するためのものである場合、本発明による組成物又は組成物由来のｍｉＲＮＡは、細胞周期アレストのプロファイルを増加させるためのものである。
【０１８８】
一般的定義
この文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含むこと（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用形は、その語の後に続く項目が含まれることを意味するために非限定的意味で使用されるが、具体的に述べられていない項目を除外するものではない。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈が要素のうちの１つ及び１つだけが存在することを明確に要求していなければ、要素の２つ以上が存在する可能性を除外するものではない。よって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１８９】
「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語は、数値と共に使用される場合（例えば、約１０）、好ましくは、その値が、その値の１％多いか又は少ない所与の値であってもよいことを意味する。分子の部分又は下位構造が同一であると言われる場合、同位体の天然存在度分布は説明されない。同一の性質は、描かれるであろう構造式を指す。
【０１９０】
本明細書で使用される場合、モル％は、モル分率（ｍｏｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）又はモル分率（ｍｏｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）又はモルパーセント又は物質量分率としても公知である、モルパーセンテージを指す。これは、混合物中の全成分の総量で除した、成分のモル量を指し、モルでも表される。
【０１９１】
構造式又は化学名が、キラル中心を有すると当業者によって理解されるが、キラリティーが未だ示されていない場合、各キラル中心に対して、ラセミ混合物、純粋なＲ鏡像異性体、及び純粋なＳ鏡像異性体の３つすべてに対して個別に言及がなされる。
【０１９２】
物質のパラメーターが、本発明の文脈で議論される場合はいつでも、別段に特定されていなければ、パラメーターは、生理学的条件下で、決定、測定、又は顕在化されることが想定される。生理学的条件は当業者に公知であり、水性溶媒系、気圧、６〜８の間のｐＨ値、室温から約３７℃までの範囲の温度（約２０℃〜約４０℃）、及び緩衝塩又は他の構成成分の好適な濃度を含む。電荷は平衡と関連することが多いことが理解される。電荷を運ぶか又は有すると考えられる部分は、このような電荷を有さないか又は運ばないよりも高い頻度で、このような電荷を有するか又は運ぶ状態で見られる部分である。それ自体、荷電される本開示で示されている原子は、特定の条件下で荷電されていない場合があり、天然の部分は、当業者に理解されるように、特定の条件下で荷電され得る。
【０１９３】
本発明の文脈では、評価されるパラメーターの低下又は増加は、そのパラメーターに対応する値の少なくとも５％の変化を意味する。より好ましくは、値の低下又は増加は、少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、又は１００％の変化を意味する。この後者の場合には、パラメーターと関連する検出可能な値がもはや存在しない場合であり得る。
【０１９４】
この文書において記載されているように、医薬としての物質の使用は、医薬の製造における前記物質の使用として解釈することもできる。同様に、物質が処置のために又は医薬として使用される際は常に、その物質は、処置のための医薬の製造のためにも使用することができる。使用のための製品は、処置方法において使用するのに好適である。
【０１９５】
本発明は、いくつかの例示的な実施形態に関して上記されている。いくつかの部品又は要素の修飾及び代替的実施が可能であり、添付の特許請求の範囲に定義されているように、保護の範囲内に含まれる。文献及び特許文書についての引用はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
本明細書で言及される一般的定義及び一般的技術
マイクロＲＮＡ分子（「ｍｉＲＮＡ」）は、１７ヌクレオチド長から最大２５ヌクレオチド長であることが報告されているが、一般的には、２１〜２２ヌクレオチド長である。したがって、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５の任意の長さが本発明に包含される。ｍｉＲＮＡはそれぞれ、より長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされる。前駆体ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体は、少なくとも５０、７０、７５、８０、８５、１００、１５０、２００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し得る。前駆体ｍｉＲＮＡは、動物においてＤｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって切断される、ステム−ループ−又はフォールド−バック様構造の形成を可能にする２つの相補的な領域を有する。Ｄｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａは、リボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼである。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、典型的には、ステムの一部である。
【０１９７】
プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも称される）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）という複合体として知られている大きな複合体の一部となり、特定の標的遺伝子を（下方）調節する。動物のｍｉＲＮＡの例には、ｍＲＮＡ標的と完全に又は不完全に塩基対合し、それぞれ、ｍＲＮＡ分解又は翻訳の阻害をもたらすものを含む（Ｏｌｓｅｎら、１９９９年、Ｓｅｇｇｅｒｓｏｎら、２００２年）。ＳｉＲＮＡ分子もＤｉｃｅｒによってプロセシングされるが、長い、二本鎖ＲＮＡ分子からはプロセシングされない。ＳｉＲＮＡは、動物細胞で天然には見られないが、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中のこのような細胞では機能し、ｍＲＮＡ標的の配列特異的切断を指示することができる（Ｄｅｎｌｉら  ２００３年）。
【０１９８】
ＳＩＲＯＣＣＯは、真核生物の複雑さのオーガナイザー及びコーディネーターとしてのサイレンシングＲＮＡを調査するＥＵコンソーシアムである（例えば、ウェブサイトｃｏｒｄｉｓ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｐｕｂ／ｌｉｆｅｓｃｉｈｅａｌｔｈ／ｄｏｃｓ／ｓｉｒｏｃｃｏ．ｐｄｆ及びｗｗｗ．ｓｉｒｏｃｃｏ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｅｕを参照されたい）。コンソーシアムとして、ＳＩＲＯＣＣＯは、ｍｉＲＮＡ配列情報のデータベースを維持している。ＳＩＲＯＣＣＯデータベースに列挙される各ｍｉＲＮＡエントリーは、観察され、検証された前記ｍｉＲＮＡの発現に基づく。
【０１９９】
内因性ｍｉＲＮＡ分子の研究は、米国特許出願第６０／５７５，７４３号に記載されている。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡにハイブリダイズするｍＲＮＡの翻訳を調節するタンパク質複合体が、成熟した、一本鎖ＲＮＡに結合する場合に、ｍｉＲＮＡは、細胞において明らかに活性である。内因的に発現したｍｉＲＮＡと同じように細胞に影響を及ぼす外因性ＲＮＡ分子を導入することは、内因性の成熟ｍｉＲＮＡと同じ配列の一本鎖ＲＮＡ分子が、翻訳の制御を容易にするタンパク質複合体によって取り込まれることを必要とする。種々のＲＮＡ分子の設計が評価されている。ｍｉＲＮＡ経路によって所望の一本鎖ｍｉＲＮＡの取込みを最大化する３つの一般的な設計が特定されている。３つの設計のうちの少なくとも１つを有するｍｉＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子は、合成ｍｉＲＮＡと称される場合がある。
【０２００】
本発明のｍｉＲＮＡ分子は、内因性ｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を置き換えるか又は補うことができる。このような分子の例、このような分子及びこのような分子を含む組成物の好ましい特徴及び修飾について、国際公開第２００９／０９１９８２号に記載されている。
【０２０１】
本発明のｍｉＲＮＡ分子又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体若しくはソースは、一部の実施形態では、２つのＲＮＡ分子を含み、１つのＲＮＡは、天然に存在する、成熟ｍｉＲＮＡと同一である。成熟ｍｉＲＮＡと同一であるＲＮＡ分子は、活性鎖又はアンチセンス鎖と称される。第２のＲＮＡ分子は、相補鎖又はセンス鎖と称され、活性鎖に少なくとも部分的に相補的である。活性鎖と相補鎖はハイブリダイズされ、二本鎖ＲＮＡを生じ、これは、細胞内のｍｉＲＮＡ活性化の直前に、タンパク質複合体が結合する天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体に類似する。前記ｍｉＲＮＡの活性を最大化することは、翻訳のレベルで遺伝子発現を調節するｍｉＲＮＡタンパク質複合体によって、活性鎖の取込みを最大化し、相補鎖の取込みを最小化することを必要とする。最適なｍｉＲＮＡ活性をもたらす分子設計は、相補鎖の修飾を含む。２つの設計は、相補鎖の化学的修飾を組み込んでいる。第１の修飾は、５’末端にホスフェート又はヒドロキシル以外の基を有する相補的ＲＮＡを生じることを含む。５’修飾の存在は、相補鎖の取込みを明らかに排除し、次に、ｍｉＲＮＡタンパク質複合体による活性鎖の取込みを支持する。５’修飾は、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、ビオチン、その他を含む種々の分子のいずれかであり得る。ｍｉＲＮＡ経路による相補鎖の取込みを有意に低減する第２の化学的修飾戦略は、相補鎖の最初の２〜６ヌクレオチドに糖修飾を有するヌクレオチドを組み込むことである。第２の設計戦略と一致する糖修飾を、ｍｉＲＮＡ活性をさらに促進する第１の設計戦略と一致する５’末端修飾と結びつけることができることに留意すべきである。第３のｍｉＲＮＡ設計は、活性鎖に相補的ではない相補鎖の３’末端にヌクレオチドを組み込むことを含む。得られた活性且つ相補的ＲＮＡのハイブリッドは、活性鎖の３’末端で非常に安定であるが、活性鎖の５’末端では比較的不安定である。ｓｉＲＮＡに関する研究によって、５’ハイブリッドの安定性が、ＲＮＡ干渉をサポートするタンパク質複合体によるＲＮＡ取込みの重要な指標であり、少なくとも細胞内のｍｉＲＮＡ経路に関連することが示される。本発明者らは、相補的ＲＮＡ鎖におけるミスマッチの賢明な使用によって、前記ｍｉＲＮＡの活性が有意に促進されることが見出された。
【０２０２】
核酸
本発明は、培養細胞に又は対象へとｍｉＲＮＡを導入することができるｍｉＲＮＡのソース又は前駆体とも呼ばれる核酸分子に関する。核酸は、化学的合成によって優先的に生成されるが、精製した酵素によって細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される場合もある。これらは、粗製であっても又は精製されていてもよい。用語「ｍｉＲＮＡ」は、別段に示されていなければ、その前駆体から切断された後の、プロセシングされたｍｉＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡの名称は、省略される場合が多く、接頭辞なしで称され、文脈に応じてそのまま理解される。別段に示されていなければ、本出願において言及されるｍｉＲＮＡは、ｍｉｒ−Ｘ又はｌｅｔ−Ｘ（式中、Ｘは、数値及び／又は文字である）として特定されるヒト配列である。
【０２０３】
ｍｉＲＮＡは、ゲノム配列又は非コード遺伝子に由来することが理解される。この点で、用語「遺伝子」は、所与のｍｉＲＮＡに関する前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列を指すために、簡便化のために使用される。しかし、本発明の実施形態は、プロモーター又は他の調節配列などのその発現に関与するｍｉＲＮＡのゲノム配列に関与する場合がある。
【０２０４】
用語「組換え」が使用されてもよく、これは、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作されたか、又は分子の複製産物又は発現産物である、このような分子を指す。
【０２０５】
用語「核酸」は当技術分野で周知である。「核酸」は、本明細書で使用される場合、一般的に、ＤＮＡ、ＲＮＡの分子（１又は複数の鎖）又は核酸塩基を含む、その誘導体若しくは類似体を指す。核酸塩基は、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」又はシトシン「Ｃ」）又はＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」又はＣ）で見られる、天然に存在するプリン又はピリミジン塩基を含む。用語「核酸」は、それぞれ、用語「核酸」の次類として、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」を包含する。
【０２０６】
用語「ｍｉＲＮＡ」は、一般的に、一本鎖分子を指すが、特定の実施形態では、本発明において実施される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域に対して又は別の核酸に対して、部分的に（鎖長全体にわたり、１０〜５０％の相補性）、実質的に（鎖長全体にわたり５０％を超えるが１００％未満の相補性）又は完全に相補的である領域又は追加の鎖も包含することになる。よって、核酸は、１つ若しくは複数の相補鎖若しくは自己相補鎖（複数可）を含む分子又は分子を含む特定の配列の「相補体（複数可）」を包含してもよい。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡは、最大１００％の相補性である、自己相補性領域を有してもよい。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズすることが可能な」は、サザンブロッティング手順などの当業者に公知の技法を使用して、二本鎖若しくは三本鎖分子又は部分的に二本鎖若しくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。用語「アニーリングする」は、本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズすることが可能な」は、以下に定義されるように、「低い」、「中程度の」又は「高い」ハイブリダイゼーション条件を意味し得る。
【０２０８】
低い、中程度、高いストリンジェンシー条件は、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００ｐｇ／ｍｌの剪断して変性させたサケの精子のＤＮＡ、及び、それぞれ、低い、中程度、高いストリンジェンシーに対して２５％、３５％又は５０％のホルムアミド中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。次に、ハイブリダイゼーション反応物を、それぞれ、２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ及び低い、中程度、高いストリンジェンシーに対して５５℃、６５℃、又は７５℃のいずれかを使用して、３０分間、３回洗浄する。
【０２０９】
本発明の核酸又はその誘導体は、一部の実施形態では、配列番号５１〜１２５に記載のいずれかのｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ配列を含むことになる。配列番号５１〜１２５に由来する本発明の核酸配列は、配列番号５１〜１２５由来の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３ド（又はその中から導き出せる任意の範囲）の連続ヌクレオチを有するか、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３ド（又はその中から導き出せる任意の範囲）の連続ヌクレオチドを有するか、又は最大５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３ド（又はその中から導き出せる任意の範囲）の連続ヌクレオチドを有する場合がある。他の実施形態では、核酸は、配列番号５１〜１２５のｍｉＲＮＡ配列と、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％同一であるか、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％同一であるか、又は最大８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％同一である。
【０２１０】
核酸塩基
本明細書で使用される場合、「核酸塩基」は、複素環塩基、例えば、少なくとも１つの天然に存在する核酸（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡ）に見られる天然に存在する核酸塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵ）、並びにこのような核酸塩基の天然に存在するか又は天然に存在しない誘導体（複数可）及び類似体などを指す。核酸塩基は、一般的に、天然に存在する核酸塩基の対合（例えば、ＡとＴ、ＧとＣ、及びＡとＵの間の水素結合）の代わりとなり得る方法で、少なくとも１つの天然に存在する核酸塩基と１つ又は複数の水素結合（「アニーリングする」又は「ハイブリダイズする」）を形成することができる。
【０２１１】
「プリン」及び／又は「ピリミジン」核酸塩基（複数可）は、天然に存在するプリン及び／又はピリミジン核酸塩基並びにこれらに限定されないが、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード）、チオール又はアルキルチオール部分のうちの１つ又は複数で置換されたプリン又はピリミジンを含む、その誘導体（複数可）及び類似体（複数可）も包含する。好ましくは、アルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、約１、約２、約３、約４、約５から約６個の炭素原子を含む。プリン又はピリミジンの他の非限定的な例としては、デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、ブロモチミン、８−アミノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、アザグアニン、２−アミノプリン、５−エチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−エチルウラシル、５−ヨードウラシル、５−クロロウラシル、５−プロピルウラシル、チオウラシル、２−メチルアデニン、メチルチオアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、アザアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヒドロキシアデニン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、４−（６−アミノヘキシル／シトシン）などが挙げられる。他の例は当業者に周知である。
【０２１２】
核酸塩基は、本明細書に記載されているか、又は当業者に公知の任意の化学的又は天然合成法を使用して、ヌクレオシド又はヌクレオチド中に含まれ得る。このような核酸塩基は、標識されてもよく、又は標識されて核酸塩基を含有する分子の一部であってもよい。
【０２１３】
ヌクレオシド
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基のリンカー部分に共有結合によって結合された核酸塩基を含む個々の化学的単位を指す。「核酸塩基のリンカー部分」の非制限的な例は、これらに限定されないが、デオキシリボース、リボース、アラビノース、又は５−炭素糖の誘導体若しくは類似体を含む、５−炭素原子を含む糖（すなわち、「５−炭素糖」）である。５−炭素糖の誘導体又は類似体の非制限的な例としては、２’−フルオロ−２’−デオキシリボース又は炭素が糖環中の酸素原子と置換された炭素環糖が挙げられる。
【０２１４】
核酸塩基のリンカー部分に対する核酸塩基の様々なタイプの共有結合による結合は、当技術分野で公知である。非制限的な例として、プリン（すなわち、Ａ又はＧ）又は７−デアザプリン核酸塩基を含むヌクレオシドは、典型的には、プリン又は７−デアザプリンの９位を５−炭素糖の１’位に共有結合により結合している。別の非制限的な例では、ピリミジン核酸塩基（すなわちＣ、Ｔ、又はＵ）を含むヌクレオシドは、典型的には、ピリミジンの１位を５−炭素糖の１’位に共有結合により結合している（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、１９９２年）。
【０２１５】
ヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、「骨格部分」をさらに含むヌクレオシドを意味する。骨格部分は一般的に、ヌクレオチドを、ヌクレオチドを含む別の分子に、又は別のヌクレオチドに、共有結合により結合させて、核酸を形成する。天然に存在するヌクレオチド中の「骨格部分」は典型的には、５−炭素糖に共有結合により結合されるリン部分を含む。骨格部分の結合は、典型的には、５−炭素糖の３’−位又は５’−位のいずれかにおいて生じる。しかし、他のタイプの結合は、特に、ヌクレオチドが天然に存在する５−炭素糖又はリン部分の誘導体又は類似体を含む場合には、当技術分野で公知である。
【０２１６】
核酸類似体
核酸は、核酸塩基の誘導体又は類似体、天然に存在する核酸中に存在し得る核酸塩基のリンカー部分及び／又は骨格部分を含むか、又はこれらから完全に構成されてもよい。核酸類似体を有するＲＮＡも、本発明の方法に従って標識され得る。本明細書で使用される場合、「誘導体」は、天然に存在する分子の化学的に修飾されたか又は改変された形態を指し、一方、用語「模倣体」又は「類似体」は、天然に存在する分子又は部分に構造的に似ている場合もあれば似ていない場合もあるが、類似の機能を有する分子を指す。本明細書で使用される場合、「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」は、一般的に、より大きな化学的構造又は分子構造の、より小さな化学的成分又は分子的成分を指す。核酸塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチドの類似体又は誘導体は、当技術分野で周知であり、文献に記載されている（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、１９８０年を参照されたい）。
【０２１７】
ヌクレオシド、ヌクレオチド又は５−炭素糖及び／若しくは骨格部分の誘導体若しくは類似体を含む核酸の追加の非制限的な例は、以下に記載する例を含む：ｄｓＤＮＡとの３重らせんを形成する及び／又はｄｓＤＮＡの発現を妨げるプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドについて記載している、米国特許第５，６８１，９４７号；特に、蛍光核酸プローブとして使用される、ＤＮＡ又はＲＮＡ中に見られるヌクレオシドの蛍光類似体を組み込んだ核酸について記載している、米国特許第５，６５２，０９９号及び同第５，７６３，１６７号；高いヌクレアーゼ安定性を有するピリミジン環上の置換を有するオリゴヌクレオチド類似体について記載している、米国特許第５，６１４，６１７号；核酸の検出に使用される修飾された５−炭素糖（すなわち、修飾型Ｔ−デオキシフラノシル部分）を有するオリゴヌクレオチド類似体について記載している、米国特許第５，６７０，６６３号、同第５，８７２，２３２号及び同第５，８５９，２２１号；ハイブリダイゼーションアッセイに使用することができる、４’位で水素以外の置換基と置換された少なくとも１つの５−炭素糖部分を含むオリゴヌクレオチドについて記載している、米国特許第５，４４６，１３７号；３’−５’のヌクレオチド間連結を有するデオキシリボヌクレオチドと、２’−５’のヌクレオチド間連結を有するリボヌクレオチドの両方を有するオリゴヌクレオチドについて記載している、米国特許第５，８８６，１６５号；核酸のヌクレアーゼ耐性を高めるために、ヌクレオチド間連結の３’−位の酸素が炭素と置き換えられている、修飾されたヌクレオチド間結合について記載している、米国特許第５，７１４，６０６号；ヌクレアーゼ耐性を高める１つ又は複数の５’メチレンホスホネートヌクレオチド間連結を含有するオリゴヌクレオチドについて記載している、米国特許第５，６７２，６９７号；高いヌクレアーゼ安定性と、薬物又は検出部分を輸送する能力とを提供するための、薬物又は標識を含むことができる置換基部分の、オリゴヌクレオチドの２’炭素への連結について記載している、米国特許第５，４６６，７８６号及び第５，７９２，８４７号；細胞内取込み、ヌクレアーゼに対する耐性、及び標的ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションを高めるために、隣接する５−炭素糖部分の４’位及び３’位を結合させる、２’又は３’炭素骨格の連結を有するオリゴヌクレオチド類似体について記載している、米国特許第５，２２３，６１８号；核酸ハイブリダイゼーション用プローブとして有用な少なくとも１つのスルファメート又はスルファミドのヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，４７０，９６７号；ヌクレアーゼ耐性、細胞内取込み及びＲＮＡ発現の調節の改善のために使用されるホスホジエステル骨格部分を置き換える、３個又は４個の原子リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドについて記載している、米国特許第５，３７８，８２５号、第５，７７７，０９２号、第５，６２３，０７０号、第５，６１０，２８９号及び第５，６０２，２４０号；膜透過性及び安定性を高めるためにオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ位に結合された疎水性担体剤について記載している、米国特許第５，８５８，９８８号；ＤＮＡ又はＲＮＡに対する高いハイブリダイゼーション；ヌクレアーゼに対する高い安定性を有する、５’端においてアントラキノンにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドについて記載している、米国特許第５，２１４，１３６号；ＤＮＡが、ヌクレアーゼ耐性、結合親和性、及びＲＮａｓｅ  Ｈを活性化する能力を高めるための２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオチドを含む、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡのキメラについて記載している、米国特許第５，７００，９２２号；並びにリボース部分が、２’酸素及び４’炭素に接続している余分な架橋で修飾されている、修飾されたＲＮＡヌクレオチドについて記載している、国際公開第ＷＯ９８／３９３５２号、同第ＷＯ９９／１４２２６号、同第ＷＯ２００３／９５４６７号及び同第ＷＯ２００７／０８５４８５号。ロックドリボースは、結合親和性と特異性を有意に増加させる；国際公開第２００８／１４７８２４号は、ＵＮＡ（アンロックド核酸）と称される修飾されたＲＮＡヌクレオチドについて記載している。ＵＮＡは、Ｃ２’原子とＣ３’原子の間の結合が切断されたＲＮＡの非環式類似体であり、相補鎖への結合親和性を低下させる。ＵＮＡは、ＲＮａｓｅのＨ認識とＲＮＡ切断に対応し、ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングを改善する；国際公開第ＷＯ２００８／０３６１２７号は、非荷電のサブユニット間連結とカチオン性サブユニット間連結の両方を含有するモルホリノ核酸類似体について記載している；国際公開第２００７／０６９０９２号及び欧州特許第ＥＰ２０７５３４２号は、カチオン部分としてスペルミン誘導体（Ｚ単位）をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせることを含有するＺｉｐ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＺＮＡ）について記載している；米国特許第５，７０８，１５４号は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成するためにＤＮＡに連結したＲＮＡについて記載している；米国特許第５，７２８，５２５号は、ユニバーサル蛍光標識を有するヌクレオシド類似体の標識化について記載している。
【０２１８】
ヌクレオシド類似体及び核酸類似体に関する追加の教示は、末端標識されているヌクレオシド類似体について記載している、米国特許第５，７２８，５２５号；米国特許第５，６３７，６８３号、同第６，２５１，６６６号（Ｌ−ヌクレオチド置換基）、及び同第５，４８０，９８０号（７−デアザ−２’−デオキシグアノシンヌクレオチド及びその核酸類似体）。他の類似体の使用は、本発明の文脈において使用するために具体的に企図される。分子全体にわたって又は選択されたヌクレオチドにおいての両方で、このような類似体は、本発明の合成核酸分子において使用されてもよい。これらには、以下に限定されないが、
１）リボース修飾（２’Ｆ、２’  ＮＨ２、２’Ｎ３，４’チオ、又は２’Ｏ−ＣＨ３など）及び
２）ホスフェート修飾（ホスホロチオエート、メチルホスホネート、及びホスホロボレートに見られるものなど）
が含まれる。
【０２１９】
このような類似体は、リボヌクレアーゼによって切断されるそれらの能力を低減又は排除することによって、ＲＮＡに安定性を付与するために作成されている。これらのヌクレオチド類似体がＲＮＡ中に存在する場合、これらは、動物のＲＮＡの安定性に大いにプラスの効果を有し得る。ヌクレオチド類似体の使用は単独で又は本発明の任意の核酸に関する合成ｍｉＲＮＡの設計修飾のいずれかと併せて使用することができることが具体的に企図される。
【０２２０】
修飾されたヌクレオチド
本発明のｍｉＲＮＡは、それらの活性を高めるよう修飾されたヌクレオチドの使用を企図する。このようなヌクレオチドは、ＲＮＡの５’又は３’末端に存在するもの及び分子内に存在するものを含む。前記ｍｉＲＮＡの相補鎖で使用される修飾されたヌクレオチドは、ＲＮＡの５’ＯＨ若しくはホスフェートをブロックするか又はｍｉＲＮＡの活性鎖の取込みを促進する内部糖修飾を導入するかのいずれかである。ｍｉＲＮＡに関する修飾は、ハイブリダイゼーションを促進する及び細胞内で分子を安定化する内部糖修飾並びに細胞内で核酸をさらに安定化する末端修飾を含む。さらに企図されるのは、合成ｍｉＲＮＡを含有する細胞を特定するために、顕微鏡又は他の方法で検出することができる修飾である。
【０２２１】
核酸の調製
核酸は、例えば、化学合成、酵素的産生又は生物学的産生など、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。
【０２２２】
ｍｉＲＮＡの設計
ｍｉＲＮＡは、典型的には、２つの鎖、すなわち、研究される成熟ｍｉＲＮＡと配列が同一である活性鎖と活性鎖に少なくとも部分的に相補的である相補鎖を含む。活性鎖は、生物学的に関連する分子であり、ｍＲＮＡの分解又は翻訳の制御のいずれかによって翻訳をモジュレートする細胞内の複合体によって優先的に取り込まれるべきである。活性鎖の優先的取込みは、２つの重大な結果を有する：（１）前記ｍｉＲＮＡの観察される活性が劇的に増加し、（２）意図しない効果が取込みによって誘導され、相補鎖の活性化が本質的に排除される。本発明によれば、いくつかのｍｉＲＮＡの設計を使用して、活性鎖の優先的取込みを確保することができる。
【０２２３】
５’ブロッキング剤
相補鎖の５’末端のホスフェート又はヒドロキシル以外の安定な部分を導入することにより、ｍｉＲＮＡ経路におけるその活性が損なわれる。このことによって、ｍｉＲＮＡの活性鎖のみが、細胞において翻訳を調節するために使用されることが確実となる。５’修飾としては、これらに限定されないが、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２’Ｏ−Ｍｅ、ＤＭＴＯ、フルオレセイン、チオール、若しくはアクリジン又はこのタイプの官能性を有する任意の他の基が挙げられる。
【０２２４】
他のセンス鎖修飾。２’−Ｏ  Ｍｅ、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−０−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−０−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−０−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−０−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−  ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−０−ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−０−ＮＭＡ）、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、ＤＭＴＯ、フルオレセイン、チオール、若しくはアクリジン又はｍｉＲＮＡの相補鎖においてこのタイプの官能性を有する任意の他の基のようなヌクレオチド修飾の導入によって、相補鎖の活性が排除され、ｍｉＲＮＡの活性鎖の取込みが促進され得る。
【０２２５】
センス鎖の塩基ミスマッチ。ｓｉＲＮＡに関するように（Ｓｃｈｗａｒｚ  ２００３年）、ｍｉＲＮＡの活性鎖の５’及び３’末端の相対的安定性によって、ｍｉＲＮＡ経路による活性鎖の取込み及び活性化が明らかに決定される。合成ｍｉＲＮＡの相補鎖の３’末端の塩基ミスマッチの戦略的配置による、ｍｉＲＮＡの活性鎖の５’末端の脱安定化が、活性鎖の活性を促進し、相補鎖の活性を本質的に排除する。
【０２２６】
宿主細胞及び標的細胞
ｍｉＲＮＡ又はそのソースが導入されるか又はｍｉＲＮＡの存在が評価される細胞は、任意の生物に由来するか又は含有されていてもよい。好ましくは、細胞は、脊椎動物の細胞である。より好ましくは、細胞は、哺乳動物の細胞である。さらにより好ましくは、細胞は、ヒトの細胞である。
【０２２７】
哺乳動物の細胞は、生殖系列又は体細胞、全能性又は多能性、分裂中又は非分裂中、上皮、不死化又は形質転換などに由来してもよい。細胞は、幹細胞などの未分化細胞であってもよく、又は器官若しくは組織の細胞由来のものなどの分化細胞であってもよい。或いは、細胞は、上皮又は内皮細胞、間質細胞、脳、乳房、子宮頚部、結腸、消化管、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、卵巣、膵臓、心臓、前立腺、膀胱、小腸、胃、精巣又は子宮として識別されてもよい。
【０２２８】
本明細書で使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、互換的に使用され得る。これらの用語はすべて、細胞分裂によって形成されるあらゆるすべての次の世代である、それらの子孫も含む。すべての子孫は、計画的又は偶然の変異によって同一ではない場合があることを理解されたい。宿主細胞は、「トランスフェクトされる」又は「形質転換される」場合があり、これは、外因性核酸が宿主細胞中に移入されるか又は導入されるプロセスを指す。形質転換細胞は、主要な対象細胞とその子孫を含む。本明細書で使用される場合、用語「操作された」及び「組換え」細胞又は宿主細胞は、外因性核酸配列、例えば、小さな干渉ＲＮＡ又はレポーター遺伝子をコードする鋳型構築物などが導入される細胞を指すことが意図される。したがって、組換え細胞は、組換えにより導入された核酸を含有しない天然に存在する細胞と区別される。
【０２２９】
組織は、形質転換されるか又は核酸送達組成物及び／又は追加の薬剤と接触させる宿主細胞又は細胞を含んでもよい。組織は、生物に由来する部分であるか又は生物から分離されていてもよい。ある特定の実施形態では、組織及びその構成細胞は、これらに限定されないが、脳、小脳（ｃｅｒｂｅｌｌｕｍ）、脊髄、上腕神経、肋間神経、筋皮神経（ｍｕｓｃｕｌｏｃｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｎｅｒｖｅ）、肋下神経、腰神経叢、仙骨神経叢、大腿神経、陰部神経（ｐｕｄｅｎｔａｌ  ｎｅｒｖｅ）、坐骨神経、大腿神経の筋枝、伏在神経（ｓａｐｈｎｏｕｓ  ｎｅｒｖｅ）、脛骨神経、橈骨神経、正中神経、腸骨下腹神経（ｉｌｉｏｐｈｙｐｏｇａｓｔｒｉｃ  ｎｅｒｖｅ）、陰部大腿神経、閉鎖神経、尺骨神経、総腓骨神経、深腓骨神経（ｄｅｅｐ  ｐｅｒｎｎｅａｌ  ｎｅｒｖｅ）、浅腓骨神経、神経節、視神経、神経細胞、幹細胞を含んでもよい。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、宿主細胞又は組織は、少なくとも１つの生物に含まれてもよい。ある特定の実施形態では、生物は、哺乳動物、ヒト、霊長類又はマウスであってもよい。当業者は、上記宿主細胞のすべてをインキュベートしてそれらを維持する条件及びそれらを分裂させて子孫を形成する条件をさらに理解するであろう。
【０２３１】
送達方法
ＲＮＡ分子は、ベクターに含まれる核酸分子によってコードされていてもよい。用語「ベクター」は、複製され得る細胞に導入するために核酸配列を挿入することができるキャリア核酸分子を指すために使用される。核酸配列は、「外因性」であってもよく、これは、核酸配列が、ベクターが導入される細胞に対して外来であること、又は配列が、その配列が通常見られない宿主細胞の核酸内の位置ではなく、細胞内の配列に対して相同であることを意味する。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、レンチウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含む。当業者は、共に参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９６年に記載されている、標準的な組換え技法によってベクターを構築するために十分に用意するであろう。修飾されたゲロニンなどの修飾されたポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは、タグ又は標的分子などの非修飾ポリペプチド配列をコードしてもよい。標的分子は、所望の核酸を、対象の身体内の特定の器官、組織、細胞、又は他の位置に方向付ける分子である。
【０２３２】
用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。発現ベクターは、種々の「制御配列」を含有することができ、これは、特定の宿主生物の作動可能に連結したコード配列の転写及び可能であれば翻訳に必要な核酸配列を指す。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能も果たし、記載されている核酸配列を含有してもよい。このようなベクターは、本発明による脂質ナノ粒子に封入されていてもよい。
【０２３３】
ナノ粒子の機能付与
種々の化合物をナノ粒子の周辺に付着させ、細胞膜を通るそれらの輸送を促進してきた。ＨＩＶ  ＴＡＴ、ＨＳＶ  ＶＰ２２、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、及び他のタンパク質に見られる短いシグナルペプチドは、膜を通る生体分子の急速な移入を可能にすることが見出されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ２０００年によって精査された）。これらのシグナルペプチドは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）と称され、オリゴヌクレオチドに結合して、それらの培養細胞への送達を促進している（Ｅｇｕｃｈｉ  Ａ、Ｄｏｗｄｙ  ＳＦ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．、２００９年  ７：３４１〜５頁）。同様に、ポリＬ−リジンをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせ、実効負電荷を低下させ、細胞への取込みを改善させた（Ｌｅｏｎｅｔｔｉ  １９９０年）。様々なシグナルペプチド又はリガンド又は形質導入ペプチド又はリガンドを、例えば、ペプチド又はリガンドを本明細書で先に定義した親油性アンカーにコンジュゲートさせることによって、本発明によるナノ粒子の表面に連結させることができる。
【０２３４】
治療適用
表現型形質に影響を及ぼすｍｉＲＮＡは、治療適用及び診断適用に対する介入点を提供する（特定のｍｉＲＮＡの存在又は非存在をスクリーニングすることによって）。本発明のＲＮＡ分子を使用して、前出の項目で議論した疾患又は状態のいずれかを処置できることが具体的に企図される。さらに、上記方法のいずれかを、本発明の治療態様及び診断態様に関して用いることもできる。例えば、ｍｉＲＮＡを検出すること又はそれをスクリーニングすることに関する方法を、診断の文脈で用いることもできる。治療適用では、有効量の本発明のｍｉＲＮＡが、動物におけるものであってもそうでなくてもよい細胞に投与される。一部の実施形態では、治療有効量の本発明のｍｉＲＮＡが、疾患又は状態の処置のために個体に投与される。用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、それが投与される細胞又は組織において所望の生理学的変化をもたらすのに必要である、本発明の分子の量として定義される。用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、本明細書で先に定義した血管新生に関連する疾患又は状態に関して所望の効果を達成する、本発明の分子の量として定義される。当業者は、多くの場合、分子は、治癒をもたらさないかもしれないが、部分的な利益、例えば、少なくとも１つの症状の軽減又は改善をもたらすことができることを容易に認識する。一部の実施形態では、いくつかの利益を有する生理学的変化は、治療上有益であるとも考えられる。よって、一部の実施形態では、生理学的変化をもたらす分子の量は、「有効量」又は「治療有効量」とみなされる。
【０２３５】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでもよい。他の実施形態では、活性化合物は、２％〜７５％の重量の単位、又は例えば、２５％〜６０％、及びその中から導き出せる任意の範囲を含んでもよい。他の非限定的な例では、用量は、投与当たり、体重１ｋｇ当たり１マイクログラム未満、又は体重１ｋｇ当たり１マイクログラム、体重１ｋｇ当たり５マイクログラム、体重１ｋｇ当たり１０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり５０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり１００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり２００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり３５０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり５００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり１ミリグラム、体重１ｋｇ当たり５ミリグラム、体重１ｋｇ当たり１０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり５０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり１００ミリグラム、体重１ｋｇ当たり２００ミリグラム、体重１ｋｇ当たり３５０ミリグラム、又は体重１ｋｇ当たり５００ミリグラムから体重１ｋｇ当たり１０００ｍｇ又はそれを超える量、及びその中から導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙した数値から導き出せる範囲の非限定的な例では、体重１ｋｇ当たり５ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり５マイクログラム〜体重１ｋｇ当たり５００ミリグラムなどの範囲を、上記数値に基づいて投与することができる。
【０２３６】
いずれの場合にも、組成物は、１つ又は複数の構成成分の酸化を遅らせるための様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用の防止は、これらに限定されないが、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール又はこれらの組合せを含む、様々な抗菌剤及び抗真菌剤などの保存剤によってもたらすことができる。
【０２３７】
分子は、遊離塩基、中性又は塩形態で組成物中に製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク性組成物の遊離アミノ基により形成されたもの、又は例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸のような有機酸により形成されたものを含む。遊離のカルボキシル基により形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム若しくは水酸化鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインのような有機塩基に由来してもよい。
【０２３８】
組成物は、一般的に、水性媒体中のナノ粒子の懸濁液である。しかし、これは、凍結乾燥されても、粉末として提供されてもよく、粉末は、ナノ粒子と任意選択で緩衝塩又は他の賦形剤を含む。
【０２３９】
有効投薬量
本発明の分子は、一般的に、意図される目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を処置又は防止するための使用では、本発明の分子、又はその医薬組成物は、治療有効量で投与又は適用される。治療有効量は、症状を軽快させるか又は防止するのに、又は処置される患者の生存を延長するのに有効な量である。治療有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細な開示を考慮して、十分に、当業者の能力の範囲内である。全身投与では、治療有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、細胞培養において決定されるＥＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルで製剤化することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。初期投薬量は、当技術分野で周知の技法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば、動物モデルから推定することもできる。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。投与量と投与間隔は、個々に調整され、治療効果を維持するのに十分な分子の血漿レベルをもたらすことができる。注射による投与のための通常の患者の投薬量は、１日に０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、又は１日に０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日に０．５〜１ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。治療上有効な血漿レベルは、毎日複数用量を投与することによって達成することができる。
【０２４０】
局所投与又は選択的取込みの場合には、タンパク質の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連しなくてもよい。当業者であれば、過度な実験なしで、治療上有効な局所投薬量を最適化することができるであろう。投与される分子の量は、当然のことながら、処置される対象、対象の重量、苦痛の重症度、投与方式及び処方する医師の判断に依存することになる。治療は、症状が検出可能である間又は症状が検出可能でない場合でさえ、断続的に繰り返すことができる。治療は、単独で又は他の薬物若しくは処置（手術を含む）と組み合わせて提供されてもよい。
【０２４１】
キット
本明細書に記載の組成物のいずれかは、キットに含まれていてもよい。非限定的な例では、個々のｍｉＲＮＡはキットに含まれ、ジアミノ脂質も含まれる。キットは、合成ｍｉＲＮＡの送達の作用を制御するために使用することができる、１つ又は複数の陰性対照合成ｍｉＲＮＡをさらに含んでもよい。キットは、合成ｍｉＲＮＡの２つの鎖のハイブリダイゼーションを容易にするための水及びハイブリダイゼーション緩衝液をさらに含んでもよい。キットは、ｍｉＲＮＡの細胞への送達を容易にするための１つ又は複数のトランスフェクション試薬（複数可）を含んでもよい。
【０２４２】
配列同一性
「配列同一性」は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ又はそれより多い核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ）配列の間の関係として定義される。当技術分野では、「同一性」は、核酸配列間の配列の関連性の程度も意味し、場合場合で、このような配列のストリング間のマッチによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，  Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年；並びにＣａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，、及びＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３頁（１９８８年）に記載されているものを含む、公知の方法によって容易に算出することができる。実施形態では、同一性は、所与の配列番号の全長に関して評価される。
【０２４３】
同一性を決定するための好ましい方法は、検査される配列間に最大マッチを与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムで体系化される。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するために好ましいコンピュータープログラム方法は、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：  ３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年）を含む。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公に利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年）。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を決定してもよい。
【０２４４】
核酸の比較に対して好ましいパラメーターは、以下のものを含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップレングスペナルティ：３。ウィスコンシン州マディソンに位置するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐからのギャッププログラムとして利用可能である。上記は、核酸比較のデフォルトパラメーターである。
【０２４５】
化学療法剤
本発明による組合せにおいて使用するための化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチロールメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（アドゼレシン、カルゼルシン及びビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオルカマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ及びカリケアマイシンオメガ）；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン（ｍｏｒｐｈｏｌｍｏ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｍ）、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリン−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フォリン酸などの葉酸補填剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；ガリウムトリニトラート；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−ＩＩ）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；ゲフィチニブ、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体が挙げられる。
【０２４６】
この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹＩ１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などの、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤；例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール、及びアナストロゾールなどの副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ及びＨ−Ｒａｓなどの、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；遺伝子療法ワクチンなどのワクチン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体も含まれる。認可された指示を伴う米国ＦＤＡ認可癌薬物のリストは、ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｃｄｅｒ／ｏｎｃｔｏｏｌｓ／ｄｒｕｇｌｉｓｔ．ｃｆｍにおけるワールドワイドウェブ上で見出すことができる。好適なＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ｃｌｏｌａｒ、クロファラビン、及びトリアピンからなる群から選択される。好適なＡＵＲＫＢ阻害剤は、ＡＺＤ１１５２、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、ＭＬＮ８２３７、ＰＨＡ６８０６３２、ＰＨ７３９３５８、ヘスペリジン、ＺＭ４４７４３９、ＪＮＪ７７０６２１、ＳＵ６６６８、ＣＣＴ１２９２０２、ＡＴ９２８３、ＭＰ５２９、ＳＮＳ３１４、Ｒ７６３、ＥＮＭＤ２０７６、ＸＬ２２８、ＴＴＰ６８７、ＰＦ０３８１４７３５及びＣＹＣ１１６からなる群から選択される。別の好適な抗がん薬は、ゲフィチニブである。
【０２４７】
さらに、特定の経路の活性において差を有する試料が比較されてもよいことが企図される。このような細胞経路は、これらに限定されないが、以下のものを含む：サイクリックＡＭＰ、タンパク質キナーゼＡ、Ｇタンパク質共役受容体、アデニリルシクラーゼ、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＰＥＣＡＭ、ＶＣＡＭ−Ｉ、α−アクチニン、パキシリン、カドヘリン、ＡＫＴ、インテグリン−α、インテグリン−β、ＲＡＦ−Ｉ、ＥＲＫ、ＰＩ−３キナーゼ、ビンキュリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ、ｐ８５、トレフォイル因子、プロフィリン、ＦＡＫ、ＭＡＰキナーゼ、Ｒａｓ、カベオリン、カルパイン−１、カルパイン−２、上皮成長因子受容体、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、コフィリン、アクチン、ゲルゾリン、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ、ミオシン軽鎖キナーゼ、血小板由来成長因子受容体又はエズリンに関与するものを含むがそれらに限定されない、任意の接着又は運動性経路；ＡＫＴ、Ｆａｓリガンド、ＮＦＫＢ、カスパーゼ−９、ＰＢキナーゼ、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＥｎｄｏＧ、グランザイムＢ、Ｂａｄ、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、ＡＰＡＦ−Ｉ、シトクロムＣ、ｐ５３、ＡＴＭ、Ｂｃｌ−２、ＰＡＲＰ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、Ｒｈｏ−２１、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｈｏ７３、Ｒａｄ５１、Ｍｄｍ２、Ｒａｄ５０、ｃ−Ａｂｌ、ＢＲＣＡ−１、パーフォリン、カスパーゼ−４、カスパーゼ−８、カスパーゼ−６、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−１０、Ｒｈｏ、Ｊｕｎキナーゼ、Ｊｕｎキナーゼキナーゼ、Ｒｉｐ２、ラミン−Ａ、ラミン−Ｂ１、ラミン−Ｂ２、Ｆａｓ受容体、Ｈ２Ｏ２、グランザイムＡ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ＨＭＧ２、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＴＲＡＤＤ、ＩＫＫ、ＦＡＤＤ、ＧＡＤＤ４５、ＤＲ３死受容体、ＤＲ４／５死受容体、ＦＬＩＰ、ＡＰＯ−３、ＧＲＢ２、ＳＨＣ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＲＡＦ−１、サイクリックＡＭＰ、タンパク質キナーゼＡ、Ｅ２Ｆ、網膜芽細胞腫タンパク質、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＡＣＨ受容体、１４−３−３、ＦＡＫ、ＳＯＤＤ、ＴＮＦ受容体、ＲＴＰ、サイクリン−Ｄ１、ＰＣＮＡ、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ＰＴＥＮ、ＡＴＭ、Ｃｄｃ２、タンパク質キナーゼＣ、カルシニューリン、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫγ、ＳＯＳ−１、ｃ−ＦＯＳ、Ｔｒａｆ−１、Ｔｒａｆ−２、ＩκＢβ又はプロテアソームに関与するものを含むがそれらに限定されない、任意のアポトーシス経路；タンパク質キナーゼＡ、一酸化窒素、カベオリン−１、アクチン、カルシウム、タンパク質キナーゼＣ、Ｃｄｃ２、サイクリンＢ、Ｃｄｃ２５、ＧＲＢ２、ＳＲＣタンパク質キナーゼ、ＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）、ホスホリパーゼＤ、ＡＫＡＰ９５、ｐ６８、オーロラＢ、ＣＤＫ１、Ｅｇ７、ヒストンＨ３、ＰＫＡｃ、ＣＤ８０、ＰＩ３キナーゼ、ＷＡＳＰ、Ａｒｐ２、Ａｒｐ３、ｐ３４、ｐ２０、ＰＰ２Ａ、アンジオテンシン、アンジオテンシン変換酵素、プロテアーゼ活性化型受容体−１、プロテアーゼ活性化型受容体−４、Ｒａｓ、ＲＡＦ−１、ＰＬＣβ、ＰＬＣγ、ＣＯＸ−１、Ｇタンパク質共役受容体、ホスホリパーゼＡ２、ＩＰ３、ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２／３、ユビ��チン、Ｒａｎ、Ｒａｎ−ＧＡＰ、Ｒａｎ−ＧＥＦ、ｐ５３、グルココルチコイド、グルココルチコイド受容体、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の構成成分、ＲａｎＢＰ１、ＲａｎＢＰ２、インポーチン、エクスポーチン、ＲＣＣ１、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｐ３８、ＤＣＫα、ＩＫＫβ、ＮＦＫＢ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＩＬ−４、ＩＬ−４受容体、ＣＤＫ５、ＡＰ−１転写因子、ＣＤ４５、ＣＤ４、Ｔ細胞受容体、ＭＡＰキナーゼ、神経成長因子、神経成長因子受容体、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｊｕｎキナーゼ、ＧＲＢ２、ＳＯＳ−１、ＥＲＫ−１、ＥＲＫ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２受容体、一酸化窒素合成酵素、ＴＹＫ２、ＩＦＮγ、エラスターゼ、ＩＬ−８、エピセリン、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体、ＣＤ２８、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＴＧＦβ若しくはＴＧＦβ受容体に関与するものを含むがそれらに限定されない、任意の細胞活性化経路；ＴＮＦ、ＳＲＣタンパク質キナーゼ、Ｃｄｃ２、サイクリンＢ、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ−１、ＳＨＣ、ｐ６８、オーロラキナーゼ、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、Ｅｇ７、ｐ５３、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、神経成長因子、上皮成長因子、網膜芽細胞腫タンパク質、ＡＴＦ−２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＫＴ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、１４−３−３、ＷＥＥ１、ＣＤＣ２５、ＣＤＣ６、起点認識複合体タンパク質、ｐ１５、ｐ１６、ｐ２７、ｐ２１、ＡＢＬ、ｃ−ＡＢＬ、ＳＭＡＤ、ユビキチン、ＳＵＭＯ、熱ショックタンパク質、Ｗｎｔ、ＧＳＫ−３、アンジオテンシン、ｐ７３任意ＰＰＡＲ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ｐ３００、ＭＤＭ２、ＧＡＤＤ４５、Ｎｏｔｃｈ、ｃｄｃ３４、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＳＫＰ１、プロテアソーム、ＣＵＬ１、Ｅ２Ｆ、ｐｉ０７、ステロイドホルモン、ステロイドホルモン受容体、ＩκＢα、ＩκＢβ、Ｓｉｎ３Ａ、熱ショックタンパク質、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、ＥＲＫ、ＩＫＫ、ＰＩ３キナーゼ、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、ＰＣＮＡ、ＭＡＰキナーゼ、ダイニン、ＲｈｏＡ、ＰＫＡｃ、サイクリンＡＭＰ、ＦＡＫ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、インテグリン、トロンボポエチン、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド、ＰＬＫ３、ＭＥＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、アセチルコリン、パキシリン  カルシニューリン、ｐ３８、インポーチン、エクスポーチン、Ｒａｎ、Ｒａｄ５０、Ｒａｄ５１、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｒａｎ−ＧＡＰ、Ｒａｎ−ＧＥＦ、ＮｕＭＡ、Ｔｐｘ２、ＲＣＣ１、ソニックヘッジホッグ、Ｃｒｍ１、パッチド（Ｐｔｃ−１）、ＭＰＦ、ＣａＭキナーゼ、チューブリン、アクチン、動原体関連タンパク質、セントロメア結合タンパク質、テロメラーゼ、ＴＥＲＴ、ＰＰ２Ａ、ｃ−ＭＹＣ、インシュリン、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、ＣＢＰ、ＩＫＢ、ＮＦＫＢ、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＥＰＯ、ジアシルグリセロール、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｊｕｎキナーゼ、低酸素誘導因子、ＧＡＴＡ４、β−カテニン、α−カテニン、カルシウム、アレスチン、スルビビン、カスパーゼ、プロカスパーゼ、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭ、カドヘリン、ＰＥＣＡＭ、コルチコステロイド、コロニー刺激因子、カルパイン、アデニリルシクラーゼ、成長因子、一酸化窒素、膜貫通受容���、レチノイド、Ｇタンパク質、イオンチャネル、転写活性化因子、転写共活性化因子、転写リプレッサー、インターロイキン、ビタミン、インターフェロン、転写コリプレッサー、核孔、窒素、毒、タンパク質分解、若しくはリン酸化に関与するものを含むがそれらに限定されない、任意の細胞周期調節、シグナル伝達、若しくは分化経路；又は、アミノ酸の生合成、脂肪酸の酸化、神経伝達物質及びその他の細胞シグナル伝達分子の生合成、ポリアミンの生合成、脂質及びスフィンゴ脂質の生合成、アミノ酸及び栄養素の異化、ヌクレオチド合成、エイコサノイド、電子伝達反応、ＥＲ関連分解、解糖、線維素溶解、ケトン体の形成、ファゴソームの形成、コレステロール代謝、食物摂取の調節、エネルギーホメオスタシス、プロトロンビン活性化、ラクトース及び他の糖の合成、多剤耐性、ホスファチジルコリンの生合成、プロテアソーム、アミロイド前駆体タンパク質、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅ、デンプン合成、グリコシル化、ホスホグリセリドの合成、ビタミン、クエン酸回路、ＩＧＦ−１受容体、尿素回路、小胞輸送、又はサルベージ経路に関与するものを含むがそれらに限定されない、任意の代謝経路。本発明の核酸分子は、上記経路又は因子のいずれかに関する診断及び治療方法において用いることができることがさらに企図される。よって、本発明の一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、本発明の方法の一部として企図される上記経路又は因子のうちの１つ又は複数を阻害するか、排除するか、活性化するか、誘導するか、増加させるか、又はそうでなければ、モジュレートする。核酸は、上記経路のいずれかに対するｍｉＲＮＡの関連に基づいて、疾患又は状態を診断するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２４８】
【図１】３ｍｇ／ｋｇのｓｉＨＰＲＴ１を３回、毎日連続注射した最後の注射の４７〜４９時間後のｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍におけるＨＰＲＴ１  ｍＲＮＡ発現。
【図２】処置開始の１２日後の相対的腫瘍体積。ｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍を有するマウスを、３ｍｇ／ｋｇのジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａで、１週目に５日連続で処置し、その後、週に２回注射した（月曜日／木曜日）。データは、メジアン（中央値）＋ＩＱＲ（四分位範囲）を表す（ｎ＝８）。
【図３】Ｎｏｖ３４０又はジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化した異なる用量のｍｉＲ−７及びｍｉＲ−１９３ａで、１週目に３又は５日連続で処置し、その後、さらに３週間、１週間に２回注射した（月曜日／木曜日）同所性Ｈｅｐ３腫瘍保有マウスの、ＰＢＳ又はソラフェニブで処置したマウスと比較した、ＡＦＰレベル（４２日目、左）及び腫瘍重量（４９日目、右）。データは、メジアン＋ＩＱＲを表す（ｎ＝６〜１６）。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１
【図４】処置開始の１週間後（Ａ）及び２週間後（Ｂ）のＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ細胞の比。ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置により、免疫抑制から免疫刺激性４Ｔ１腫瘍微小環境へのシフトがもたらされた（ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ細胞＞ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置開始の１、２週間後）。
【図５Ａ】ＣＤ４５＋  腫瘍細胞集団における免疫細胞及び細胞内サイトカインのパーセンテージ。１週目：Ａ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置により、Ｔ細胞機能の有意な増加がもたらされた（ＩＦＮγ及びＩＬ−２の産生）。
【図５Ｂ】Ｂ）調節性Ｔ細胞集団の有意な減少がもたらされた（ＦＯＸＰ３＋／ＬＡＧ３＋）。
【図５Ｃ】２週目：ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置により、Ｔ細胞機能（ＩＦＮγ）の穏やかな誘導と共に、Ｔ細胞出現頻度（ＣＤ８＋）の有意な増加がもたらされた。
【図５Ｄ】２週目：ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置により、調節性Ｔ細胞集団（ＦＯＸＰ３＋／ＬＡＧ３＋）の有意な減少がもたらされた。データは、メジアン＋ＩＱＲを表す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図６】免疫細胞におけるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）発現レベルのパーセンテージ。ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置の際に、ＣＤ７３発現レベルは、免疫細胞において下方調節される。データは、メジアン＋ＩＱＲを表す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。Ａ）１週目、２回目の投与の４８時間後；Ｂ）２週目、４回目の投与の４８時間後。
【図７】４Ｔ１腫瘍切除後に原発腫瘍の再成長を示すマウスのパーセンテージ。マウスに、乳房脂肪パッドにおける４Ｔ１細胞を注射し、細胞注射の１週間後に、週２回の処置（ｉ．ｖ．）を開始し、細胞注射後２０日目に、原発腫瘍を除去した。原発腫瘍の除去後、１０ｍｇ／ｋｇのジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲ−１９３ａで、週に２回のスケジュールでさらに６週間マウスを処置し、ＰＢＳ又は抗ＰＤ１で処置した、又は組合せで処置したマウスと比較した。
【図８】４Ｔ１腫瘍切除後に原発腫瘍の再成長を伴う個々のマウス。マウスに、乳房脂肪パッドにおける４Ｔ１細胞を注射し、細胞注射の１週間後に、週２回の処置（ｉ．ｖ．）を開始し、細胞注射後２０日目に、原発腫瘍を除去した。原発腫瘍の除去後、１０ｍｇ／ｋｇのジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲ−１９３ａで、週に２回のスケジュールでさらに６週間マウスを処置し、ＰＢＳ又は抗ＰＤ１で処置した、又は組合せで処置したマウスと比較した。群１、２、３、及び４において、それぞれ、１１頭のマウスのうちの５頭、１０頭のマウスのうちの１頭、１２頭のマウスのうちの６頭、及び１１頭のマウスのうちの３頭が、原発腫瘍除去後に腫瘍再成長を示した（処置後に示した日まで追跡した）。Ａ）ＰＢＳで処置した群；Ｂ）ジアミノ脂質ナノ粒子中のｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した群；Ｃ）抗ＰＤ１で処置した群；Ｄ）ジアミノ脂質ナノ粒子中のｍｉＲＮＡ−１９３ａと抗ＰＤ１の組合せで処置した群。
【図９】４Ｔ１腫瘍切除（６６日目）後に原発腫瘍の再成長を示すマウスのパーセンテージ。マウスに、乳房脂肪パッドにおける４Ｔ１細胞を注射し、細胞注射の１週間後に、週２回の処置（ｉ．ｖ．）を開始し、細胞注射後２０日目に、原発腫瘍を除去した。原発腫瘍の除去後、１０ｍｇ／ｋｇのジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲ−１９３ａで、週に２回のスケジュールでさらに６週間マウスを処置し、ＰＢＳ又は抗ＰＤ１で処置したマウスと比較した。
【図１０】生存しているｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスに、左に示したように、処置の終了後７５日目、１４日目に、４Ｔ１細胞を再負荷した。４Ｔ１細胞を負荷したナイーブマウスと比較して、腫瘍体積を真中と右のグラフに示す。＊＊＊＝ｐ＜０．００１
【図１１】４Ｔ１細胞を再負荷した際に、ナイーブマウスと比較して、腫瘍取込みを示した３頭のｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスの詳細な腫瘍体積（図１０から）。
【図１２】Ａ）生存しているｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスに、処置の終了後１０１日目、３８日目に、Ｈ２２細胞を再負荷した。Ｂ）Ｈ２２細胞を負荷したナイーブマウスと比較した腫瘍体積。＊＊＊＝ｐ＜０．００１。Ｃ）Ｈ２２細胞を再負荷した際に、ナイーブマウスと比較して、腫瘍取込み（１００％）を示したｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスの詳細な腫瘍体積（ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスのすべてで、１週間後に、顕著な時間依存的腫瘍退縮を伴う）。
【図１３】処置開始の２１日後の相対的腫瘍体積。ｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍を有するマウスを、異なる用量及び異なるレジメンの、ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａで、又はベムラフェニブで処置した。データは、メジアン＋ＩＱＲを表す。＊＝ｐ＜０．０５
【図１４】１０ｍｇ／ｋｇでＱＤ×２（１日に１回の注射、２日連続して）でｉ．ｖ．注射した後の経時的な腫瘍中のｍｉＲＮＡ−１９３ａ標的遺伝子の発現レベル。同所性４Ｔ１腫瘍を有するマウスを同様に処置し、異なる時点での薬力学分析のために、腫瘍を除去した（表１３を参照されたい）。個々の腫瘍発現値を表す。様々な標的遺伝子が、異なる時点で有意に下方調節される。データは、メジアン＋ＩＱＲを表す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１。軸上の時間は、最終のｍｉＲＮＡ−１９３ａ投与後の時間を示す。Ａ）ｍＫＲＡＳ；Ｂ）ｍＭＣＬ−１；Ｃ）ｍＴＩＭ３；Ｄ）ｍＥＮＴＰＤ１。
【図１５】ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐが、ＮＴ５Ｅ遺伝子を直接標的とし、異なる細胞株のＮＴ５ＥとＥＮＴＰＤ１の両方の遺伝子発現を下方調節すること。Ａ）１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ、偽（モック）及びＨｅｌａ細胞のスクランブル対照の存在下で、ＮＴ５Ｅ変異レポーターと比較したＮＴ５Ｅ野生型レポーターのルシフェラーゼ活性。ＮＴ５Ｅ野生型レポーターは、変異ＮＴ５Ｅレポーター及び対照と比較して、ルシフェラーゼ活性を低減する。Ｂ）Ａ２０５８黒色腫細胞株の偽対照と比較した、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの存在下でのＮＴ５Ｅ  ｍＲＮＡの下方調節。Ｃ）Ａ２０５８黒色腫細胞株の変異ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ、偽及びスクランブル対照と比較した、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ投与の２４時間後及び４８時間後のＮＴ５Ｅタンパク質の下方調節。チューブリンをローディング対照として使用する。変異したｍｉＲ−１９３ａ−３ｐは、そのシード配列に３つのヌクレオチドの変異を含有する  Ｄ）示したがん細胞株において、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ、偽対照、及びスクランブル対照（示さず）の存在下でのＥＮＴＰＤ１のｍＲＮＡの下方調節。すべてのｍＲＮＡ値は、偽に対して正規化する（偽の値を１に設定する）。
【図１６】ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐによる処置が、アデノシン生成経路に影響を及ぼすこと。Ａ）Ａ２０５８黒色腫細胞における対照条件（未処置（ＵＴ）、偽、スクランブル）と比較して、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐで処置した際に、遊離ホスフェート生成（アデノシン生成に関する間接的リードアウト）が低減する。ＮＴ５Ｅに対するｓｉＲＮＡは、同じ表現型を複製する。Ｂ）Ａ２０５８黒色腫細胞における対照条件（未処置（ＵＴ）、偽、スクランブル）と比較して、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐで処置した際に、アデノシン生成が低減する。ＮＴ５Ｅに対するｓｉＲＮＡは、同じ表現型を複製する。Ｃ）Ａ２０５８黒色腫細胞におけるスクランブルと比較して、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐで処置した際に、Ａ２０５８細胞の移動能は低下する。ＮＴ５Ｅに対するｓｉＲＮＡは、同じ表現型を複製する。
【図１７】核の画像化によって決定されるように、偽対照と比較して、濃度依存的方法で、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐが、がん細胞におけるＧ２／Ｍアレストを促進する（Ａ：ＨＥＰ３Ｂ；Ｂ：ＳＮＵ４４９；Ｃ：Ａ２０５８）こと。Ｇ０、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍは、細胞周期の異なる相である。
【図１８】ＲＴ−ＰＣＲによって決定されるように、異なる時点（時間で）の偽と比較して、異なる細胞株で（Ａ：ＨＥＰ３Ｂ；Ｂ：ＳＮＵ４４９；Ｃ：Ｈ１９７５）、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐを投与した際に、Ｇ２／Ｍに関連するｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの標的遺伝子（ＭＰＰ２、ＳＴＭＮ１、ＹＷＨＡＺ、及びＣＣＮＡ２）は下方調節される。
【図１９Ａ】Ａ）生存しているｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスと週齢の一致するナイーブマウスに、４Ｔ１細胞を再負荷した。
【図１９Ｂ】Ｂ）ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した、４Ｔ１再負荷の生存者と週齢の一致するナイーブマウスの群のＴ細胞を枯渇させ、４Ｔ１腫瘍細胞を再負荷し、腫瘍成長を追跡した。
【図１９Ｃ】ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した４Ｔ１を再負荷した生存者からナイーブマウスにＴ細胞を移入したマウスに、４Ｔ１を再負荷し、腫瘍成長を追跡した（ｍｉＲ−１９３ａは、製剤と一緒のｍｉＲ−１９３ａ−３ｐを指す）。
【図２０】Ｎｏｖ３４０中で製剤化した異なるマイクロＲＮＡで、１日置きに３週間処置した同所性Ｈｅｐ３腫瘍保有マウスの、ＰＢＳ又はソラフェニブで処置したマウスと比較した、ＡＦＰレベル（３９日目、Ａ）及び腫瘍重量（３９日目、Ｂ）。データはメジアンを表す  ＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１
【実施例】
【０２４９】
実施例１−ジアミノ脂質の提供
一般式（Ｉ）のジアミノ脂質を提供するための一般的方法
対応する式Ｔ１−ＯＨ、Ｔ２−ＯＨ、又はＴ３−ＯＨのアルコールは一般的に市販されている。これらのアルコールは、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、ピリジニウムクロロクロマートを使用して、対応するアルデヒドに変換することができ、又はアルデヒドがさらに市販されている場合もある。次いで、アルデヒドを必要とされるジアミンと、例えば、Ｎ−，エチル−１，３−ジアミノプロパン（式中、ｎ＝１）と反応させて、イミンを形成し、次に、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３部分の還元アミノ化で対応するアミンを還元することができる。以下は非限定的な例である：
【０２５０】
ファルネサール（又はファルネシルアルデヒド）
ファルネソール（又はファルネシルアルコール）の混合物（１０．０ｇ、４４．９ｍｍｏｌ、１等量）に、５００ｍＬのジクロロメタンピリジニウムクロロクロマート（ＰＣＣ、１４．５ｇ、６７．４  ｍｍｏｌ、１．５等量）中の炭酸ナトリウム（２．３８ｇ、２２．５ｍｍｏｌ、０．５等量）及び分子篩３Å（５ｇ）を添加した。懸濁液を室温で１時間撹拌した。次いで、２５０ｍＬのジクロロメタンを混合物に添加し、懸濁液を２５０ｍＬのシリカゲル（シリカゲル６０、０．０４〜０．０６３ｍｍ、２３０〜４００メッシュ）を通して濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、得られた残留物はアルデヒドであり、それをさらに精製することなく使用した。シクロヘキサン溶媒系（Ｒｆ＝０．５）中１０％の酢酸エチルと染色のためのメタノール中１０％の硫酸を使用して、化合物をＴＬＣプレートで解析した。
【０２５１】
（Ｎ’−メチル−Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ｔｒｉｓ（（２Ｅ，６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエン−１−イル）プロパン−１，３−ジアミン）（一般式（Ｉ）の化合物（式中、ｎ  ＝  １  であり、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３はそれぞれファルネシルである））：
１，２−ジクロロエタン１００ｍＬ中ファルネサール（８．７５ｇ、３９．７ｍｍｏｌ、３．５等量）及びＮ−メチル−１，３−ジアミノプロパン（１ｇ、１１．３ｍｍｏｌ、１．０等量）の溶液に、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１０．９ｇ、５１．４  ｍｍｏｌ、４．５５等量）及び酢酸（２．９４ｍＬ、５１．４ｍｍｏｌ、４．５５等量）を室温で添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。水酸化ナトリウム２Ｍ溶液で反応をクエンチし、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で混合物を２回抽出した。合わせた有機層をブライン（塩化ナトリウムの飽和水溶液）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲル（３００ｍＬのシリカゲル６０、０．０４〜０．０６３ｍｍ、２３０〜４００メッシュ）によるフラッシュクロマトグラフィーに供した。１０カラム容積の、酢酸エチルから０．５％のトリメチルアミンを含有する酢酸エチル中の４％メタノール（ＭｅＯＨ）までの勾配を用いて、生成物を溶出させた。所望の化合物が溶出している場合、２０ｍＬの画分を回収し、その後、化合物溶出液５０〜１００ｍＬの画分を回収した。ジクロロメタン溶媒系中５％のＭｅＯＨと染色のためのメタノール中１０％の硫酸（Ｒｆ＝０．４）を使用して、回収した画分をＴＬＣプレートで解析した。表題の化合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定した場合の典型的純度が９６％以上である、淡黄色の油状物（約４．６ｇ、６．６ｍｍｏｌ、収率６０％；化学式：Ｃ４９Ｈ８４Ｎ２；正確な質量：７００．６６）として得た。
【０２５２】
実施例２−ナノ粒子の提供
一般的手順
すべてのプラスチックバイアルとボトルを、使用前に滅菌濾過した脱イオン水で濯いだ。ｇスケールでの重量に対する標準誤差は、０．０１ｇであり、ｍｇでは０．００１ｇである。
【０２５３】
５０ｍＭのクエン酸緩衝液  ｐＨ３
８００ｍＬの滅菌脱イオン水に、１０．５１ｇのクエン酸一水和物と０．９３ｇのＮａＯＨを添加した。ｐＨを測定し、必要な場合は、２ＭのＮａＯＨでｐＨ３に調整した。滅菌脱イオン水を添加して１Ｌにした。試料を濾過する前に、２０ｍＬの滅菌濾過脱イオン水で濯いだ０．２μｍのボトルトップフィルターを通して緩衝液を濾過した。
【０２５４】
１×ＰＢＳ緩衝液  ｐＨ７．４
１０ｇのＰＢＳ  ダルベッコ  ｗ／ｏ  Ｃａ２＋  ｗ／ｏＭｇ２＋を１０Ｌの滅菌脱イオン水中に溶解させた。
【０２５５】
粒子の生成
ジアミノ脂質、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びＰＥＧ２０００−ＤＳＧのストック溶液を、エタノール中５０ｍＭの濃度で調製、混合し、それぞれ、４０：１０：４８：２のモル比で得た。最終脂質混合溶液をエタノールで希釈して、３３．８ｍＭの濃度にした。Ｈ２Ｏ中２０ｍｇ／ｍＬの濃度の核酸（ＲＮＡ）ストック溶液を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）中に希釈し、最終濃度を０．６５ｍｇ／ｍＬとした。ＲＮＡ質量に対する総脂質の比は、１０．３であった。
【０２５６】
脂質ナノ粒子を調製するために、有機脂質混合溶液をＲＮＡ水溶液中に注入し、２５％のエタノールを含有する最終懸濁液を得た。ＨＰＬＣポンプ（Ｐｕｍｐ  Ｐ−９００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ）を相対的容積流量３：１（１分当たり１８．７５ｍＬの水溶液：１分当たり６．２５ｍＬの有機溶液）で使用して溶液を注入し、Ｔ字型接合部（ＰＥＥＫ  Ｌｏｗ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｔｅｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  １／１６”  ＰＥＥＫ  ．０２０スルーホール、ＩＤＥＸ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、ＵＳＡ）を介して混合した。
【０２５７】
１０ｋＤのＭＷＣＯを用いる７０ｍＬのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用して、ナノ粒子溶液の２００倍容積のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して、ナノ粒子懸濁液を２回、直ちに透析し、エタノールを除去して、緩衝液の交換を達成した。１回目の透析を室温で４時間実施し、次いで、製剤を４℃で終夜透析した。得られたナノ粒子懸濁液を、ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０濃縮機を使用して遠心分離によって濃縮した。製剤を充填する前に、濃縮機を、２ｍＬの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で濯いだ（製剤の最大量は２０ｍＬ）。所望の濃度が達成されるまで（例えば、２ｍｇ／ｍＬ）、濃縮機を、４℃で、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３  ＦＲ遠心分離器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）のスイングローターで１０００ｇにてスピンした。異なる濃度のアリコートを、濃縮した製剤（例えば、２ｍｇ／ｍＬ）を滅菌濾過した１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈することによって調製した。得られたナノ粒子懸濁液を、０．２μｍの滅菌フィルターに通してガラスバイアル中に濾過し、圧着閉鎖で密封した。表１は、調製したさらなるナノ粒子の例を示す。
【０２５８】
【表１】
2021513508.tif 000006
【０２５９】
粒子のサイズ及び多分散指数（ＰＤＩ）を、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を用いる、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ、ＺＥＮ５６００、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、英国を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）法によって測定した。ＤＬＳは、ブラウン運動により動く粒子の拡散を測定し、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎの関係を使用して、これをサイズ及びサイズ分布に変換する。測定は、２５℃で、散乱角１７３°にて三連で、透明の使い捨てキュベット（１０×１０×４８ｍｍ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用して実施した。測定前に、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で、試料を１００倍希釈した。マルチプルナローモード分析において、Ｍａｌｖｅｒｎソフトウェア（ＤＴＳ  ｖ  ７．１１、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、英国）を使用して、分析を行った。結果は、三連の測定値の平均値であり、Ｚ平均径及びＰＤＩで表した。
【０２６０】
ナノ粒子のゼータ電位を、Ｍ３−ＰＡＬＳ技法を使用して同じＺｅｔａｓｉｚｅｒで測定した。粒子のゼータ電位は、粒子の電気泳動移動度を決定し、Ｈｅｎｒｙの方程式を適用することによって算出した。電気泳動移動度は、粒子が電気泳動によって移動している間の粒子の速度を測定することによって得られる。Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉの近似を使用して、電気泳動移動度を水性媒体中で決定した。測定は、２５℃にて三連で、透明の使い捨て折り曲げキャピラリーセル（ＤＴＳ１０７０、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、英国）中で実施した。測定前に、０．１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で、試料を１００倍希釈した。オートモード分析において、Ｍａｌｖｅｒｎソフトウェア（ＤＴＳ  ｖ  ７．１１、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、英国）を使用して、分析を行った。結果は、三連の測定値の平均値であり、ゼータ電位として表した。
【０２６１】
ＤＵ  ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ、ＣＡを使用するＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計によって核酸濃度（全ＲＮＡを測定する）を確定した。希釈したＲＮＡ試料の吸光度を２６０ｎｍで測定し、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔの法則を使用して濃度を算出した。簡便には、１００μＬの１×ＰＢＳ中で希釈した製剤を、９００μＬのメタノールとクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物中に添加し、ＬＮＰを溶解させた。混合した後、溶液の吸光度スペクトラムを、クウォーツのキュベットを使用して２３０ｎｍから３３０ｎｍの間で記録した（１０ｍｍのパス長、１２．５×１２．５×４５ｍｍ、Ｈｅｌｌｍａ）。製剤中のＲＮＡ濃度を、製剤中で使用されるＲＮＡの減衰係数及び２６０ｎｍの波長での吸光度と３３０ｎｍの波長でのベースライン補正値の間の差に基づいて算出した。ＲＮＡの減衰係数は、０．００５〜０．０５ｍｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度の６つのＲＮＡ溶液の２６０ｎｍでの吸光度を測定し、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔの法則を適用することによって確定する。
【０２６２】
ＲＮＡの封入効率を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）  ＲＮＡアッセイによって評価した。簡便には、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（ｐＨ７．５）中でおよそ５ｎｇ／ｍＬの濃度まで試料を希釈した。希釈した試料の５０μＬをポリスチレン９６ウェルプレートに移し、次いで、５０μＬのＴＥ緩衝液（未封入ＲＮＡを測定する）又は５０μＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液（全ＲＮＡ、すなわち、ＬＮＰ内に封入されたＲＮＡと未封入「遊離」ＲＮＡの両方を測定する）を添加した。試料を三連で調製した。プレートを３７℃の温度で１５分間インキュベートした。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬をＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１００μＬのこの溶液を各ウェルに添加した。約４８０ｎｍの励起波長及び約５２０ｎｍの発光波長で、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州、ウォルサム）を使用して、蛍光強度を測定した。試薬ブランクの蛍光値を各試料の蛍光値から減算し、封入効率を以下のように決定した：
【０２６３】
封入効率＝（１−（［未封入ＲＮＡ］／［全ＲＮＡ］））×１００
【０２６４】
表２は、多分散性（ＰＤＩ）を含む得られたナノ粒子の分析値を示す。
【０２６５】
【表２】
2021513508.tif 000007
【０２６６】
参照ナノ粒子
参照として、いわゆるＮｏｖ３４０脂質ナノ粒子も調製した。Ｎｏｖ３４０脂質ナノ粒子の組成物は、米国特許第９７３７４８２号に記載されており、以下のタイプの脂質を含む：両性脂質対（カチオン性及びアニオン性脂質）及び中性脂質。Ｎｏｖ３４０脂質ナノ粒子の脂質組成は以下の通りである：
【０２６７】
ＰＯＰＣ  パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ  ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＣＨＥＭＳ  コレステロールヘミスクシネート
ＭｏＣｈｏｌ  ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロールヘミスクシネート
【０２６８】
Ｎｏｖ３４０脂質混合物は、モルで構成される。以下の比率の％：６（ＰＯＰＣ）、２４（ＤＯＰＥ）、２３（ＣＨＥＭＳ）、及び４７（Ｍｏｃｈｏｌ）。Ｎｏｖ３４０脂質ナノ粒子の製剤は、米国特許第６８４３９４２号に記載されている方法に基づく。
【０２６９】
脂質（ＰＯＰＣ、Ｃｈｅｍｓ、及びＤＯＰＥ）を、５５℃の温蔵庫で、無水ＥｔＯＨ中に溶解させる。脂質が完全に溶解した後に、この溶液を、ＭｏＣｈｏｌが既に秤量された別のボトルに定量的に移した。この脂質混合物を、ＭｏＣｈｏｌが溶解するまで、５５℃で撹拌する。ＭｏＣｈｏｌ及びＣｈｅｍｓはＭｅｒｃｋから入手し、ＰＯＰＣ及びＰＯＰＥはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから入手した。２ステップの脂質溶解を行い、ＭｏＣｈｏｌのＣｈｏｌへの分解を減少させる。次いで、最終脂質溶液を、０．２μｍ孔径のフィルターを通して、５５℃に予熱した調製システム中に濾過する。並行して、オリゴヌクレオチドを、室温（ＲＴ）で、Ｎａ−アセテート／スクロースのｐＨ４の緩衝液に溶解させ、０．２μｍ孔径のフィルターを通して、ＡＰＩボトルに直接濾過した。
【０２７０】
米国特許第６８４３９４２号に記載されている方法を使用して、脂質溶液とＡＰＩ溶液を合わせた場合、リポソームは注射部位に形成する。リポソーム形成後直ちに、懸濁液を、ＮａＣｌ／Ｎａ２ＨＰＯ４のｐＨ９．０の緩衝液で希釈し、製剤のｐＨをｐＨ７．５まで上昇させる。注射緩衝液及び希釈緩衝液は、ＲＴに保たれる。生じたリポソーム（中間体積）をボトルに集める。押出し前に、リポソームをＲＴで３０分間撹拌する。
【０２７１】
中間体積を、２００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜を通して押出し、そのサイズとサイズ分布を精緻化する。両パラメーターは、最終０．２μｍの滅菌濾過を可能にし、生成物のロスを減らすのに重要である。
【０２７２】
中空糸膜（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過を実施して、遊離のＲＮＡ及びＥｔＯＨをリポソーム試料から除去した。限外濾過中に、試料を標的体積まで濃縮し（標的ＲＮＡ濃度を達成するため）、次いで、透析濾過中に、ＰＢスクロース（ｐＨ７．５）で１０容量交換を実施し、ＥｔＯＨと遊離オリゴヌクレオチドの完全な除去を保証し、外側の緩衝液を交換した。リポソームを、シリンジフィルターを使用して、０．２μｍで濾過し、滅菌バイアルに充填した。バイアルを密封したままにして、２〜８℃で保存し、光から保護した。
【０２７３】
サイズ測定：リポソームのサイズ／Ｐｄｌ決定のための測定を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して動的レーザー光散乱（ＤＬＳ）で実施した。このシステムは、６３３ｎｍ波長の４ｍＷのヘリウム／ネオンレーザーを備え、検出角度１７３°の非侵襲的後方散乱技術によりリポソーム試料を測定する。リポソームを精製水で希釈し、最適なリポソーム濃度にして、実験を２５℃で行った。
【０２７４】
ゼータ電位：リポソームのゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して測定した。
【０２７５】
ＲＮＡの定量：ＲＮＡの定量は、ＯＤ：２６０ｎｍの分光光度計によって行った。製剤化した脂質ナノ粒子を、最初に精製水で希釈し、次いで、メタノール／クロロホルムで希釈し、リポソームを溶解し、封入されたＲＮＡの量を放出させた。
【０２７６】
脂質の定量：試料中の脂質濃度を、ＨＰＬＣ法を使用して、バルク体積から測定した。
【０２７７】
実施例３−オリゴヌクレオチドの提供
この発明で使用されるすべてのｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ分子、例えば、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、及びＨＲＰＴ１  ｓｉＲＮＡなどでは、パッセンジャー鎖とガイド鎖が、Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ４００オリゴヌクレオチド合成機などの市販の合成機を使用して、固相合成によって化学的に合成される。一本鎖を製造するために使用されるプロセスは、ｓｉ／ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成するために、産業において通常使用される。合成後、オリゴヌクレオチドの一本鎖が固体支持体から切断され、脱保護される。粗製のオリゴヌクレオチドの一本鎖は、ＨＰＬＣを使用して精製される。その後、一本鎖は脱塩され、濃縮され、アニーリングされ、凍結乾燥される。これらの実施例を通して、何か他に意図されていることが文脈によって明らかにならなければ、ｍｉＲ−１９３ａは、配列番号２１９のアンチセンス鎖を有する配列番号２１８（模倣体、センス）のｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの二本鎖を指す。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において、ネイキッドで使用されるか、又はｉｎ  ｖｉｖｏ研究において製剤と一緒に使用される。
【０２７８】
実施例４−前臨床ｉｎ  ｖｉｖｏマウス実験
材料及び方法
ＲＮＡの単離
全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従って、ＴｒｉＺｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、腫瘍から単離した。単離したＲＮＡをヌクレアーゼを含まない水（ＮＦＷ）中に再懸濁させた。
【０２７９】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
ｃＤＮＡを調製するために、最初に１００ｎｇの全ＲＮＡを、ＮＦＷ中最終体積が１２．５μｌのＲａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒｓ（Ｑｉａｇｅｎ；最終濃度  ２μＭ）と混合し、７０℃で５分間変性させ、直ちに氷上で冷却した。次に、５×ＲＴ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）４μｌ、２５ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．４μｌ、２００Ｕ／μＬのＭＭＬＶ  ＲＴ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｌ、４０Ｕ／μＬのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μＬ及びＮＦＷ１．６μＬからなるｃＤＮＡ合成ミックス７．５μｌを添加した。以下のｃＤＮＡ合成プロトコールを使用した：
１．  １０分  ２５℃
２．  ６０分  ３７℃
３．  ５分  ８５℃
４．  無限  ４℃
【０２８０】
単回のｑＰＣＲ反応のために、以下のミックスを調製した：
１．  ｃＤＮＡ  １μＬ
２．  フォワードプライマー（２５０μＭ）  ０．０５μＬ
３．  リバースプライマー（２５０μＭ）  ０．０５μＬ
４．  ＮＦＷ  ８．９μＬ
５．  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）  １０μＬ
【０２８１】
以下のｑＰＣＲプロトコールを使用した：
１．  １サイクル：５分  ９５℃
２．  ４０サイクル：１５秒  ９５℃＋３０秒  ６０℃
【０２８２】
各試料を、ＣＦＸ９６リアルタイムｑＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、技術的に三連として分析した。ＨＰＲＴ１の発現を２−（ＣｔＨＰＲＴ１  −  ＧＥＯＭＥＡＮ（ＣｔＵＢＣ；ＣｔＧＵＳＢ））を使用して算出した。ｑＰＣＲで使用したプライマーを以下に示す：
【０２８３】
【表３】
2021513508.tif 000008
【０２８４】
腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）効果の決定：
ＴＧＩ効果を決定するために、Ｔ／Ｃ（腫瘍／対照）比を、各群の個々のマウスに対して、ＴＶ（腫瘍体積）の相対的パーセンテージ増加を算出し（基準点として無作為化の日のＴＶ）、次いで、処置群に関するＴＶの群のメジアンの相対的増加を、ＰＢＳ群のもので除すことによって決定した。各処置群内のはずれ値（個々のＴＶに関する）を、式Ｑ１−１．５×ＩＱＲ（下限）とＱ３＋１．５×ＩＱＲ（上限）を使用して決定した。
【０２８５】
統計分析：
統計分析をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を使用して実施した。両側、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、相対的腫瘍体積の差を算出した（「Ｘ」日目のＴＶを無作為化の日のＴＶで除した）。すべての統計検定で、検定項目の効果をＰＢＳ群と比較した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０２８６】
この発明で使用されるすべてのｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ分子、例えば、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、及びＨＰＲＴ１  ｓｉＲＮＡなどでは、パッセンジャー鎖とガイド鎖が、Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ４００オリゴヌクレオチド合成機などの市販の合成機を使用して、固相合成によって化学的に合成される。一本鎖を製造するために使用されるプロセスは、ｓｉ／ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成するために、産業において通常使用される。合成後、オリゴヌクレオチドの一本鎖が固体支持体から切断され、脱保護される。粗製のオリゴヌクレオチドの一本鎖は、ＨＰＬＣを使用して精製される。その後、一本鎖は脱塩され、濃縮され、アニーリングされ、凍結乾燥される。
【０２８７】
腫瘍試料に関するＦＡＣＳ分析
新たに単離した同所性４Ｔ１腫瘍を、最小腫瘍体積（ＴＶ）の３００ｍｍ３に達した際に、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置後５日目（１週目）と１２日目（２週目）に、ＦＡＣＳ分析のために調製した。腫瘍試料を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからのマウス腫瘍分解キット（カタログ番号１３０−０９６−７３０）を使用して消化した。腫瘍細胞消化後に、１μｇ／ｍｌのＦｃ−Ｂｌｏｃｋ（Ｍｏｕｓｅ  ＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（商標）  カタログ番号５５３１４１）を含む２００μｌの染色緩衝液中に、細胞を再懸濁させ、暗所で４℃にて１５分間インキュベートした。様々なマーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ３３５、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１、ＣＤ７３、ＬＡＧ３／ＣＤ２２３、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｒ、ＰＤ−１、Ｌ／Ｄ染料）がＦＡＣＳ分析のために使用されている。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｒ及びＬＡＧ３を除くすべてのマーカーのための抗体混合物を、各試料用にＦｃブロッキング緩衝液中で希釈し、暗所で、氷上にて３０分間染色した。次いで、２ｍｌの氷冷ＰＢＳを各チューブに添加することによって、細胞を穏やかに洗浄した。各チューブを３００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞内マーカー（ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｒ及びＬＡＧ３）を検出するために、消化された細胞の刺激を実施した。そうするために、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）を含む白血球活性化カクテルを使用した。水浴中でカクテルを３７℃で急速に解凍し、１ｍＬの細胞培養物（例えば、約１０６細胞／ｍＬ）毎に、２μＬのカクテルを添加し、しっかり混合した。刺激するために、細胞培養ミックスを３７℃の加湿したＣＯ２インキュベーターに４〜６時間置いた。次いで、細胞を採取し、ＦＡＣＳ染色緩衝液で洗浄した。染色のために、細胞ペレットをパルスボルテックスで再懸濁させ、２００ｕｌの調製したＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎを各試料に添加した。試料を、暗所で、ＲＴにて１０分間インキュベートした。次いで、１ｍｌの１×透過緩衝液（蒸留したＨ２Ｏで希釈した１０×透過緩衝液から作製した）を添加することによって、試料を２回洗浄し、続いて遠心分離し、上清をデカントし、各試料を、１×透過緩衝液中のＦｏｘＰ３、ＩＦＮ−ｒ及びＩＬ−２を含有する抗体カクテルと共にインキュベートし、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。最後に、細胞を１５０μｌの染色緩衝液に再懸濁させ、血球計算機で解析した。Ｋａｌｕｚａフローサイトメトリーソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒから）によってデータを解析した。
【０２８８】
Ｔ細胞枯渇及び全血に関するＦＡＣＳ分析
すべての場合に、モノクローナル抗体を、リン酸緩衝生理食塩水２００μｌ中で、腹腔内注射によりマウスに送達した。枯渇及び中和実験のために、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）とＣＤ８（クローン２．４３）抗体を同時に使用した。枯渇又は中和は、腫瘍細胞接種の１週間前に開始した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇のために、２５０μｇの示された抗体を、最初の週にＱＯＤ×３のスケジュールで、次いで、Ｑ３Ｄのスケジュールでさらに３週間送達した。所望のＴ細胞集団（複数可）の枯渇を、フローサイトメトリーによって全血で確認した（データは示さず）。１００μＬの全血を、腫瘍細胞接種後０日目と１４日目に、動物毎に採血した（０日目＝ＱＯＤ×３の２４時間後、１４日目：ＱＯＤ×３とＱ３Ｄを２週間の２４時間後）。次いで、抗体と混合した。穏やかなボルテックスの後に、ミックスを、暗所で、室温（ＲＴ）にて３０分間インキュベートした。２ｍｌの１×ＦＡＣＳ溶解緩衝液を溶液に添加し、ＲＴで１０分間インキュベートした。次いで、溶液ミックスを５分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、細胞を、１５０μｌの染色緩衝液に再懸濁させ、血球計算機で解析した。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗ＣＤ３を除き、すべてのフローサイトメトリー抗体（抗−ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−ｃｙ５５（クローン：３０−Ｆ１１、抗ｉ−ＣＤ３−ＦＩＴＣ（クローン：１７Ａ２）、抗−ＣＤ４−ＡＰＣ（クローン：ＲＭ４−４）、抗−ＣＤ８−ＰＥ（クローン：５３−６．７））をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。（ＱＯＤ×３：１日置きに３日間、Ｑ３Ｄ：３日置き（月曜日〜木曜日））。
【０２８９】
養子Ｔ細胞の移入
生存マウス由来の養子ＣＤ３＋  Ｔ細胞のナイーブマウスへの移入を、脾臓、補助、上腕、及び鼠径リンパ節切除後に実施した。細胞懸濁液を示した器官とプールから作製した。次いで、製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従って、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を磁性ビーズを使用してプールから単離した。マウス１頭当たり１×１０７のＣＤ３＋  Ｔ細胞を静脈内に注射した。
【０２９０】
ＭＴＳアッセイ
がん細胞型に応じて、３０００〜６０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞が付着した後、これらを異なる濃度のｍｉＲＮＡ−１９３ａでトランスフェクトし、異なる時点で生存能を測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生存能の測定を実施した。２０μＬのＭＴＳ試薬を９６ウェルプレートの各ウェルの１００μＬの培地に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。９６ウェルプレートリーダーで各試料について、４９０ｎＭで吸光度を測定した。
【０２９１】
カスパーゼＧＬＯ  カスパーゼ３／７アッセイ（アポトーシスアッセイ）
がん細胞型に応じて、３０００〜６０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞が付着した後、これらを異なる濃度のｍｉＲＮＡ−１９３ａでトランスフェクトし、異なる時点でアポトーシス誘導を測定した。このアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａのキットを使用して実施した。１００μＬのカスパーゼ試薬を９６ウェルプレートの各ウェルの１００μＬの培地に添加し、暗所で、室温にて２時間インキュベートした。蛍光プレートリーダーで蛍光シグナルを読み取った。
【０２９２】
ボイデンチャンバーアッセイ
細胞の移動能をチェックするために、０．８μｍ孔径の膜（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ）によって分離された２つの培地を充填した区画のチャンバーに基づくボイデンチャンバーアッセイを実施した。このアッセイでは、細胞型に応じて、６０，０００〜１２０，０００個の細胞を、無血清培地中の膜の上の区画に播種し、膜の孔を通って、培地中に血清が存在する下の区画に移動させた。血清は、化学誘因物質として作用する。適当なインキュベーション時間の後、２つの区画の間の膜を固定し、染色して、各膜から６つの異なる画像を得た。移動性細胞の数を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  分析を使用して計数した。
【０２９３】
核画像化（細胞周期プロファイルを測定する）
がん細胞型に応じて、３０００〜６０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞が付着した後、これらを異なる濃度のｍｉＲＮＡ−１９３ａでトランスフェクトし、異なる時点で細胞周期プロファイルを測定した。選択した時点で、培地をウェルから吸い取り、ＤＮＡ染色溶液（Ｈｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２／Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＦＡ）を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、Ｔｈｅｒｍｏ  ＣｅｌｌＩｎｓｉｔｅを使用して細胞の画像を得て、ここで、核を特定し、核強度を測定した。プログラムＲを使用して核強度を分析し、ＤＮＡ含量に基づいて細胞周期（Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ）の異なる相を決定した。
【０２９４】
アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウムアポトーシスアッセイ（フローサイトメトリー）
アポトーシスを受けている細胞を特異的に検出するために、ＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  アポトーシス検出キット（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した。がん細胞型に応じて、異なる数の細胞を６ウェルプレートに播種し、測定の時点で約７０％のコンフルエンシーを有した。細胞が付着した後、これらを異なる濃度のｍｉＲＮＡ−１９３ａでトランスフェクトし、製造業者のプロトコールに従って、異なる時点でアポトーシスアッセイを測定した。このアッセイで、本発明者らは、細胞周期のＳｕｂＧ１相を示すアポトーシス細胞のパーセンテージを検出した。
【０２９５】
３’ＵＴＲルシフェラーゼアッセイ
ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有するホタルルシフェラーゼレポーター構築物を、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ又はスクランブル対照と共にＨｅｌａ細胞においてトランスフェクトした。細胞抽出物をトランスフェクションの２４時間後に調製し、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。３’ＵＴＲがｍｉＲＮＡの標的である場合、ｍｉＲＮＡは３’ＵＴＲと相互作用し、より低いルシフェラーゼシグナルをもたらす。
【０２９６】
ウエスタンブロット
およそ１×１０６個の細胞を採取し、免疫沈降ＲＩＰＡ溶解緩衝液中に溶解させ、ライセートをＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。一次抗体で膜を終夜プローブし、結合した抗体をＨＲＰ連結二次抗体（Ｃｅｌｌ−Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を使用して可視化した。ウエスタンブロットに使用した抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの抗ＮＴ５Ｅ（Ｄ７Ｆ９Ａ）、及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚからの抗αチューブリンを含んでいた。αチューブリンをウエスタンブロット実験のローディング対照として使用した。
【０２９７】
マラカイトグリーンホスフェートアッセイ
２０００個のＡ２０５８黒色腫細胞を、９６ウェルプレートのウェル毎に播種した。播種の２４時間後に、細胞を異なる濃度のｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ、スクランブル対照、対照としてのｓｉＮＴ５Ｅ及びｓｉＰｏｏｌでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間と４８時間後に、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの標的遺伝子としてのＣＤ３９（ＥＮＴＰＤ１）及びＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）を阻害した後、マラカイトグリーンホスフェートアッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ヌクレオシド三リン酸ＡＴＰからのリン酸の遊離を測定した。反応からの急速な色素形成を、プレートリーダー（６００〜６６０ｎｍ）で都合よく測定することができる。
【０２９８】
アデノシンアッセイ
４０００個のＡ２０５８黒色腫細胞を、９６ウェルプレートのウェル毎に播種した。播種の４時間後に、細胞を異なる濃度のｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ、スクランブル対照、対照としてのｓｉＮＴ５Ｅ及びｓｉＰｏｏｌでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を５００μＭのＡＭＰで処理し、処理の２４時間後に、アデノシン測定キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）からのステップに従って、アデノシン測定を実施した。
【０２９９】
ＲＮＡシーケンシングのための細胞調製
６つのヒトがん細胞株を適当な培地で培養し（表３）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用する１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ又は偽によるトランスフェクションの２４時間前に、６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションの１６時間後に試薬を吸い取り、新たな６ウェルプレートに細胞を継代した。トランスフェクションの２４時間後に培地を吸い取り、プレートを−８０℃で保存した。各細胞株について、３つの独立した複製を実施した。
【０３００】
【表４】
2021513508.tif 000009
【０３０１】
ＲＮＡシーケンシングのためのＲＮＡ単離
ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを単離した。手順は、オンカラムＤＮａｓｅ処理を含んだ。ＮａｎｏｄｒｏｐＯｎｅでＲＮＡ濃度を測定した。１５０ｎｇのそれぞれ独立した複製をプールし、４５０ｎｇの試料（表）をＧｅｎｏｍｅＳｃａｎ  ＢＶ（オランダ、ライデン）に提出した。
【０３０２】
【表５】
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【０３０３】
ＲＮＡシーケンシングの手順
ポリＡ濃縮を実施し、続いて、ＧｅｎｏｍｅＳｃａｎ  ＢＶでＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｏｖａＳｅｑ  ６０００を使用して、次世代ＲＮＡシーケンシングを実施した。データ処理ワークフローは、生データ品質管理、アダプタートリミング、及び短いリードのアラインメントを含んだ。参照ＧＲＣｈ３７．７５．ｄｎａ．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙを各試料に対するリードのアラインメントに使用した。アラインメントファイルにマッピングした位置に基づいて、どの程度の頻度でリードが転写物にマッピングされたかを決定した（特徴集計）。集計をカウントファイルに保存し、下流ＲＮＡ−Ｓｅｑ示差発現分析のためのインプットとした。
【０３０４】
ＲＮＡシーケンシングのためのデータ解析
ＧｅｎｏｍｅＳｃａｎ  ＢＶによって設定された短いリードデータに関して、示差発現分析を実施した。リード集計をＲ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｖ３．４．４内の統計パッケージであるＤＥＳｅｑパッケージ  ｖ１．３０．０にローディングした。試料サイズが小さく、過剰に分散したＲＮＡ−Ｓｅｑデータに関して、２つの条件（偽対ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ）の間の示差発現遺伝子を見つけるために、ＤＥＳｅｑを特異的に開発した。示差発現比較の群分けを表に示す。
【０３０５】
【表６】
2021513508.tif 000011
【０３０６】
実施例４．１：ｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍を有するマウスにおけるＬＮＰの有効性の比較
４〜６週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、５０％のマトリゲル中１×１０７個のＡ２０５８細胞を、脇腹に、片側性に皮下注射した（マウス１頭当たり０．２ｍＬ）。無作為化の時点で、ＴＶは１３４．５〜５３８．７ｍｍ３の範囲であった（メジアン２１３．４、ＩＱＲ１７８．３〜２６５．９）。体重とＴＶ（カリパス測定）を１週間に３回決定した。
【０３０７】
無作為化後、マウスは全部で３回のｉ．ｖ．注射を受け、それぞれ３日連続で投与した（ＱＤ×３）。投与スキームについて、表６を参照されたい。ＱＤ×３＝１日当たり１回の注射を３日連続。
【０３０８】
【表７】
2021513508.tif 000012
【０３０９】
最終投与後４７〜４９時間に腫瘍を回収した。最初に、イソフルランを使用してマウスに麻酔し、次いで、頸椎脱臼によって屠殺した。腫瘍を液体窒素中で急速に凍結させ、−８０℃で保存した。図１は、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＨＰＲＴ１の３日連続注射の最終注射の４７〜４９時間後の、ｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍におけるＨＰＲＴ１のｍＲＮＡ発現を示す。
【０３１０】
結論：
本発明によるナノ粒子は、ｓｕｂｑ腫瘍へのｓｉＨＰＲＴ１の機能的送達を媒介し、一方、ＮＯＶ３４０は媒介しなかった（図１）。
【０３１１】
実施例４．２：ｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍を有するマウスにおけるジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａの腫瘍成長阻害効果
４〜６週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、５０％のマトリゲル中１×１０７個のＡ２０５８細胞を、脇腹に、片側性に皮下注射した（マウス１頭当たり０．２ｍＬ）。無作為化の時点で、ＴＶ（腫瘍体積）は１３９．４〜２４５．５ｍｍ３の範囲であった（メジアン１６１．３、ＩＱＲ＝１４９．９〜１７５．１）。体重とＴＶ（カリパス測定）を１週間に３回決定した。
【０３１２】
無作為化後、マウスは、最初の週に全部で５日連続のｉ．ｖ．注射を受け、その後、ＢＩＱ維持投与を受けた。投与スキームについて、表７を参照されたい。＊ＱＤ×５＝１日当たり１回の注射を５日連続；ＢＩＷ＝１週間に２回。
【０３１３】
【表８】
2021513508.tif 000013
【０３１４】
処置開始の１２日後の相対的腫瘍体積を図１２に表す。この段階で、本発明による組成物で処置した群で、０．４４のＴ／Ｃが観察された。本発明者らは、研究のリマインダーの間のＢＩＷ維持投与が、有意なＴＧＩ効果を支持するのに不十分であったことに気付いた。図２は、処置開始の１２日後の相対的腫瘍体積を示し、この図では、ｍｉＲ−１９３ａは、脂質ナノ粒子製剤中のｍｉＲ−１９３ａ−３ｐを指す。３ｍｇ／ｋｇのジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａで、１週目に５日連続で処置され、続いて、週に２回注射された（月曜日／木曜日）ｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍を有するマウス。
【０３１５】
結論：
本発明によるナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａは、ヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍のｓｕｂｑマウスモデルにおいて有意なＴＧＩ効果を媒介した。
【０３１６】
実施例４．３：同所性ヒトＨｅｐ３ｂ肝細胞癌腫瘍を有するマウスにおけるジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａ又はｍｉＲＮＡー７又はＮＯＶ３４０の腫瘍成長阻害効果
７〜８週齢の雌のＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ、中国、上海）に、ｓｕｂｑ成長Ｈｅｐ３ｂ腫瘍の単一の２×２×２ｍｍ片を左の肝葉に同所的に移植した。２１日目のＡＦＰレベルに基づいてマウスを無作為化した。無作為化の時点で、ＡＦＰレベル（血漿１ｍｌ当たりのｎｇ）は１０１９〜１９７７９ｎｇ／ｍｌの範囲であった（メジアン  ５２０３、ＩＱＲ＝２６９０〜９４９８）。処置を２２日目に開始し、３週間続けた（投与スキームについては表８を参照されたい）。ＡＦＰを１週間に１回測定し（合計４回）、ＢＷを１週間に２回測定した。研究の終了時に、腫瘍重量も決定した。ＱＤ×３、ＱＤ×５＝１日当たり１回の注射を３日又は５日連続；ＢＩＷ＝１週間に２回；ＢＩＤ＝１日に２回；ｐｏ＝経口。
【０３１７】
【表９】
2021513508.tif 000014
【０３１８】
最終的な屠殺後に決定した、４２日目の血漿中ＡＦＰレベルと腫瘍重量を図３に表す。
【０３１９】
結論：
ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲ−１９３ａは、ヒトＨｅｐ３ｂ  ＨＣＣ（肝細胞癌）腫瘍の同所性マウスモデルにおいて有意なＴＧＩ効果を媒介したが、ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲ−７又はＮＯＶ３４０では、それぞれ、非常に弱い効果を示すか又は効果を示さなかった。
【０３２０】
実施例４．４：乳房脂肪パッドに移植した４Ｔ１三重陰性乳がん腫瘍の同系マウスモデルにおけるジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａの腫瘍成長阻害効果及び長期免疫
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃ  マウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ、中国、上海）に、ＰＢＳ中３×１０５個の４Ｔ１マウス腫瘍細胞（マウス１頭当たりの０．１ｍＬ）を乳房脂肪パッドに注射した。無作為化の時点で、ＴＶは、６９．９〜１７３．９ｍｍ３の範囲であった（メジアン  １０５．７、ＩＱＲ＝１００．７〜１２５．４）。体重とＴＶ（カリパス測定）は、１週間に２〜３回決定した。
【０３２１】
無作為化後（腫瘍接種後９日目）に、マウスは、異なる投与レジメンで異なる処置を受けた（投与スキームについては表９を参照されたい）。すべての群で、最初の週と２番目の週に、２回目のｍｉＲＮＡ−１９３ａ注射の４８時間後に、４頭のマウスを屠殺した。接種後２０日目に、原発腫瘍を乳房脂肪パッドから手術により除去した。３日間の回復期間後、６３日目まで、さらに６週間処置を再開した。（遠位）腫瘍の再成長を、ＢＷに加えてモニタリングし、エンドポイントに達したらマウスを屠殺した。
【０３２２】
４Ｔ１細胞に対してｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスの長期免疫を調査するために、接種後７５日目に、ｍｉＲＮＡ−１９３ａを処置したマウスと８頭のナイーブ（腫瘍を有さない）マウスに、ＰＢＳ中３×１０５個の４Ｔ１マウス腫瘍細胞（マウス１頭当たり０．１ｍＬ）の右脇腹前方への皮下注射を再負荷した。ＴＶとＢＷを３週間モニタリングした。次いで、他の細胞型に対してｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスの免疫化状態を調査するために、１０１日目に、ｍｉＲＮＡ−１９３ａを処置したマウスと８頭のナイーブ（腫瘍を有さない）マウスに、ＰＢＳ中Ｈ２２（マウスの肝臓腫瘍細胞）細胞（マウス１頭当たり０．１ｍＬ）の右脇腹下部への皮下注射を再負荷した。
【０３２３】
【表１０】
2021513508.tif 000015
【０３２４】
図４は、処置開始の１週間後（Ａ）と２週間後（Ｂ）のＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ細胞の比を示す。ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置により、免疫抑制から免疫刺激性４Ｔ１腫瘍微小環境へのシフトがもたらされた（ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ細胞＞ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置開始の１、２週間後）。
【０３２５】
図５は、ＣＤ４５＋腫瘍細胞集団における免疫細胞及び細胞内サイトカインのパーセンテージを示す。１週間後、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置により、Ｔ細胞機能の有意な増加がもたらされ（ＩＦＮγ及びＩＬ−２の産生）、調節性Ｔ細胞集団の有意な減少がもたらされた（ＦＯＸＰ３＋／ＬＡＧ３＋）。２週間後、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処理により、Ｔ細胞機能（ＩＦＮγ）の穏やかな誘導と共に、Ｔ細胞出現頻度（ＣＤ８＋）の有意な増加がもたらされ、調節性Ｔ細胞集団の有意な減少がもたらされた（ＦＯＸＰ３＋／ＬＡＧ３＋）。
【０３２６】
図６は、免疫細胞におけるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）発現レベルのパーセンテージを示す。ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置の際に、ＣＤ７３発現レベルは、免疫細胞において下方調節される。
【０３２７】
結論では、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置により、１週目にＴ細胞の機能を高め、２週目にＴ細胞の出現頻度を誘導することによって、免疫抑制から免疫刺激性４Ｔ１腫瘍微小環境へのシフトがもたらされた。このがん免疫プロファイルは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａがコールド腫瘍微小環境をホット腫瘍微小環境に転じることができることを示す。
【０３２８】
図７は、４Ｔ１腫瘍切除後の原発腫瘍再成長を示すマウスのパーセンテージを示す。マウスに、乳房脂肪パッドにおける４Ｔ１細胞を注射し、細胞注射の１週間後に、週２回の処置（ｉ．ｖ．）を開始し、細胞注射後２０日目に、原発腫瘍を除去した。原発腫瘍の除去後、１０ｍｇ／ｋｇのジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲ−１９３ａで、週に２回のスケジュールでさらに６週間マウスを処置し、ＰＢＳ又は抗ＰＤ１で処置した、又は組合せで処置したマウスと比較した。図８は、４Ｔ１腫瘍切除後の原発腫瘍再成長を有する個々のマウスに関する結果を示す。
【０３２９】
結論
ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａによる処置によって、腫瘍切除後の腫瘍再成長が低減した。
【０３３０】
図９は、４Ｔ１腫瘍切除後に原発腫瘍再成長を示すマウスのパーセンテージを示す（６６日目）。図１０は、生存しているｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスが、４Ｔ１細胞を再負荷された場合の結果を示す。図１１は、４Ｔ１細胞を再負荷した場合に、ナイーブマウスと比較して腫瘍取込みを示した３頭のｍｉＲＮＡ−１９６ａで処置したマウスの詳細な腫瘍体積を示す（図１０から）。
【０３３１】
結論
ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａによる処置によって、腫瘍切除後と４Ｔ１腫瘍の再負荷後の両方で腫瘍再成長が低減し、マウスの生存にもプラスの影響を及ぼした。予想通り、再移植したマウス４Ｔ１細胞は、ナイーブ動物においてｓｕｂｑ腫瘍を形成することができた。ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した動物における腫瘍取込み／成長の顕著な防止は、４Ｔ１細胞に対する長期免疫化を強く示唆している。
【０３３２】
図１２は、生存しているｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスが、処置終了後１０１日目、３８日目にＨ２２細胞を再負荷される方法を示し、Ｈ２２細胞を負荷したナイーブマウスと比較した腫瘍体積を示す。Ｈ２２細胞を再負荷した際に、ナイーブマウスと比較して、腫瘍取込み（１００％）を示したｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスの詳細な腫瘍体積（ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した動物のすべてで、１週間後に、顕著な時間依存的腫瘍退縮を伴う）。
【０３３３】
結論
予想通り、移植したマウスＨ２２細胞は、ナイーブ動物においてｓｕｂｑ腫瘍を形成することができた。効率的な（１００％）腫瘍取込みがｍｉＲＮＡ−１９６ａで処置したマウスにおいて起こったが、Ｈ２２腫瘍成長の迅速な阻害が見られ、時間依存的退縮がもたらされた。このことは、関連しないＨ２２細胞に対する長期免疫化を強く示唆する（交差抗原反応）。
【０３３４】
全体的に、ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａによる処置は：
腫瘍切除後の腫瘍再成長を低減し、マウスの生存にプラスの影響を及ぼした
免疫抑制から免疫刺激性４Ｔ１腫瘍微小環境へのシフトがもたらされた
ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した動物における腫瘍取込み／成長の顕著な防止は、４Ｔ１細胞に対する長期免疫化を強く示唆する（ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ細胞＞１）
効率的な（１００％）腫瘍取込みがｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した動物において起こるが、Ｈ２２腫瘍成長の迅速な阻害が、時間依存的退縮をもたらし、関連しないＨ２２細胞に対する長期免疫化を示唆する（交差抗原「ワクチン接種」）。
【０３３５】
実施例４．５：ｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍を有するマウスにおける異なる濃度の、ジアミノナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａの腫瘍成長阻害効果
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ、中国、上海）に  ＰＢＳ中５×１０６個のＡ２０５８腫瘍細胞を、右脇腹に、片側性に皮下注射した（マウス１頭当たり０．１ｍＬ）。無作為化の時点で、ＴＶは、５０．３〜１５６．３ｍｍ３の範囲であった（メジアン  １０４．８、ＩＱＲ＝９１．９〜１２７．１）。無作為化後、マウスは、異なる投与レジメンで異なるｍｉＲＮＡ−１９３ａ投与濃度を受けた（投与スキームについては表１０を参照されたい）。ＢＲＡＦ阻害剤であるベムラフェニブも含まれた。体重とＴＶ（カリパス測定）を１週間に３回決定した。＊ＱＤ×３、ＱＤ×４＝１日当たり１回の注射を３日又は４日連続；ＢＩＷ＝１週間に２回；ＢＩＤ＝１日に２回。Ｐｏ＝経口。
【０３３６】
【表１１】
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【０３３７】
図１３は、処置開始後２１日目の相対的腫瘍体積を示す。ｓｕｂｑヒトＡ２０５８黒色腫腫瘍を有するマウスを、異なる用量及び異なるレジメンの、ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａで、又はベムラフェニブで処置した。
【０３３８】
結論：
６．７ｍｇ／ｋｇの本発明によるナノ粒子中で製剤化したｍｉＲ−１９３ａをＱＤ×３で、腫瘍成長の有意な低減が観察されたが、他の投与レジメンでは弱い傾向しか示されなかった。
【０３３９】
実施例４．６：異なる時点での同所性４Ｔ１マウス乳がん同系モデルにおけるｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置のＰＤ効果を調査すること
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ、中国、上海）に、ＰＢＳ中３×１０５個の４Ｔ１マウス腫瘍細胞（マウス１頭当たりの０．１ｍＬ）を乳房脂肪パッドに注射した。無作為化の時点で、腫瘍体積（ＴＶ）は、２５２．３０〜３７０．４５ｍｍ３の範囲であった。
【０３４０】
無作為化後、マウスは、類似する投与レジメンで類似する処置を受けた（表１１を参照されたい）。所定の時点でマウスを屠殺した（表１１を参照されたい）。各マウスからの腫瘍を回収し、液体窒素中で急速に凍結させ、次いで、−８０℃で保存した。
【０３４１】
【表１２】
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【０３４２】
ｍｉＲＮＡ−１９３ａの標的遺伝子であることが判明したいくつかの重要な遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルに関するｍｉＲＮＡ−１９３ａの効果を調査するために（薬力学的効果）、ｑＰＣＲ及び上記プライマーを使用して、腫瘍における異なる時点での発現レベルを定量した。評価した遺伝子には、Ｋ−ＲＡＳ、ＭＣＬ１、ＥＮＴＰＤ１（ＣＤ３９）及びＴＩＭ−３が含まれた。これらの標的遺伝子の役割及び生物学的重要性は、表１２において明白に議論されている。結果を図１４に示す。
【０３４３】
【表１３】
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【０３４４】
図１４は、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．注射をＱＤ×２（１日に１回の注射を２日間連続で）後の経時的な腫瘍におけるｍｉＲＮＡ−１９３ａ標的遺伝子の発現レベルを示す。同所性４Ｔ１腫瘍を有するマウスを同様に処置し、異なる時点での薬力学分析のために、腫瘍を除去した（表１１を参照されたい）。個々の腫瘍発現値を表す。様々な標的遺伝子が、異なる時点で有意に下方調節される。
【０３４５】
結論
ＱＤ×２のスケジュールで、１０ｍｇ／ｋｇを投与したｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置により、様々な時点でのアポトーシス及び免疫経路に関与する標的ｍＲＮＡ発現の有意な低下がもたらされた。
【０３４６】
実施例４．７：使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ設定におけるｍｉＲＮＡ−１９３ａの作用方式
ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの異なる生物学的効果を種々のがん細胞系で試験した（表１３を参照されたい）。このために、様々な細胞を、異なる濃度（１、３、１０ｎＭ）のｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した。すべての実験について、対照（未処置、偽及びスクランブル）を測定した。すべてのアッセイは、２４時間、４８時間及び７２時間の時点で実施した。表１３に示されているデータは、指定した時点での１０ｎＭ濃度のｍｉＲＮＡ−１９３ａに関する結果である。すべての結果を定量し、偽対照に対して正規化した。１０ｎＭは、細胞がその濃度で毒性作用の徴候を示さないため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置に対して好適な濃度であることが示された。
【０３４７】
【表１４】
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【０３４８】
様々ながん細胞株におけるｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置によって、ＭＴＳアッセイ又は細胞計数のいずれかによって測定した場合、経時的な細胞生存率が低下した。カスパーゼ３／７アポトーシスアッセイによって測定した場合、アポトーシス誘導が経時的に促進された。核画像化又はフローサイトメトリーを実施して、細胞周期アレストプロファイルを測定した。ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置は、細胞株に依存する方式で、Ｇ２／Ｍ又はＳｕｂＧ１細胞周期アレストプロファイルを誘導した。Ｈｕｈ７、Ｈ１２９９、及びＨＣＴ１６６では、指定した方法の後に、明らかな細胞周期アレストプロファイルは観察されなかったが、これらの細胞株におけるｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置の後に、カスパーゼ３／７の活性化によって示され、ウエスタンブロットでｐａｒｐタンパク質の切断が促進されたように（データは示さず）、アポトーシスの増加が観察された。この結果は、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置がアポトーシスの誘導を介してがん細胞の生存率に影響を及ぼすことを示す。各細胞株の固有特性及び遺伝子変異状態により、アポトーシスを検出するために１つの方法を実施することが、すべての細胞株にとって常に理想的であるとは限らないことに留意されたい。いくつかのがん細胞株の細胞運動能は、ボイデンチャンバーアッセイによって評価した場合、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置で有意に低下した。
【０３４９】
結論
がん細胞株に関するｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置は、アポトーシスを誘導し、細胞周期アレストプロファイルを増加させることによって、部分的に細胞生存率を低下させる。ｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置はまた、がん細胞の細胞運動能も低下させ、がん細胞移動の阻害の役割を示している。
【０３５０】
実施例４．８：ｍｉＲＮＡ−１９３ａは、ＣＤ７３及びＣＤ３９の調節によってアデノシン生成経路に部分的に影響を及ぼす
アデノシン生成は、特定の腫瘍が宿主免疫を回避するルートの１つである。ＣＤ３９（ＥＮＴＰＤ１）及びＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）は、ＡＴＰを脱リン酸化してアデノシンを生成する２つの細胞表面エクトエンザイムであり、よって、細胞外空間におけるアデノシン及びＡＴＰレベルを制御する。細胞外のアデノシンは、抗腫瘍Ｔ細胞免疫を制限することによって、腫瘍成長及び転移を促進することが示されている。ＣＤ７３及びＣＤ３９は、ほとんどの腫瘍細胞でかなり過剰発現され、腫瘍微小環境におけるアデノシンレベルの上昇をもたらす。
【０３５１】
ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐに対する標的として、ＣＤ７３を検証するために、３’ＵＴＲアッセイを実施し、ここで、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐは、Ｈｅｌａ細胞において過剰発現し、偽及びスクランブル対照と比較して、ＮＴ５Ｅ  ３’ＵＴＲ領域を含有するレポーター構築物の活性の下方調節をもたらした。一方、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの過剰発現は、ＣＤ７３  ３’ＵＴＲの変異形態を含有するレポーター構築物のルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった（図１５Ａ）。これは、ＣＤ７３の３’ＵＴＲがｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐと完全に相補的であり、ＣＤ７３は、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの検証済み標的の１つであることを示す。
【０３５２】
図１５Ｂ〜Ｄに示されているように、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ処置は、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルで、様々な細胞株のアデノシン生成経路に関与する両酵素の発現を下方調節した。アデノシン生成に関するｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの影響を評価するために、Ａ２０５８黒色腫細胞における遊アウト離ホスフェートの放出を、上清中のＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの脱リン酸化からのリードとして測定した。図１６に例証されているように、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ処置は、遊離ホスフェート生成のレベルを低下させた。細胞培養物上清において、アデノシンの直接的な量を測定することによって、同様の結果が見られた（図１６Ｂ）。さらに、Ａ２０５８がん細胞移動におけるｍｉＲＮＡ−１９３ａの役割を調査した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスウェルアッセイを使用して、本発明者らは、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ処置が、Ａ２０５８細胞の移動能を有意に抑制したことを示した（図１６Ｃ）。興味深いことに、ｓｉＲＮＡに媒介されるＮＴ５Ｅの枯渇は、これらの実験におけるｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置の効果の表現型を複製し、ｍｉＲＮＡ−１９３ａが、ＮＴ５Ｅを標的とすることによって、少なくとも部分的に、アデノシン生成と移動に関してその機能を発揮することを強く示唆した（図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃ）。
【０３５３】
結論
ｍｉＲＮＡ−１９３ａは、ＮＴ５Ｅ及びＥＮＴＰＤ１を標的とすることによって、部分的に免疫抑制腫瘍微小環境を下方調節すること並びにアデノシン生成の阻害に役割を果たす。ｍｉＲＮＡ−１９３ａはまた、ＮＴ５Ｅを標的とすることによって、アデノシンに誘導されるがん細胞の移動能を部分的に低下させる。
【０３５４】
実施例４．９：最適な時点での異なる細胞株におけるｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置の際の細胞周期分布
ｍｉＲＮＡ−１９３ａの抗増殖特性を調査するために、本発明者らは、対照としての偽と比較して、異なる濃度（１ｎＭ、３ｎＭ及び１０ｎＭ）及び時点（４８時間、７２時間及び９６時間）でのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ処置の際の異なるがん細胞の細胞周期状態をプロファイルした。ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ処置は、Ｈｅｐ３Ｂ及びＳＮＵ４４９のＨＣＣ細胞株及び黒色腫Ａ２０５８細胞においてＧ２／Ｍアレスト表現型をもたらし（図１７）、これは、最終的には細胞死をもたらした（データは示さず）。同様の表現型がＰａｎｃ１（膵臓がん細胞）及びＨ１９７５（肺がん細胞）で観察された（データは示さず）。ｍｉＲＮＡ−１９３ａ依存性Ｇ２／Ｍアレスト表現型に部分的に対処するために、Ｇ２／Ｍアレストにおいて役割を果たすいくつかのｍｉＲＮＡ−１９３ａ標的遺伝子の発現レベルを異なる時点で（２４時間、４８時間及び７２時間）調査し、Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ４４９及びＨ１９７５がん細胞において下方調節されることが示された（図１８）。これらの遺伝子の発現レベルは、Ｇ２／Ｍアレスト表現型が示される他の細胞株でも下方調節される（データは示さず）。ＭＰＰ２及びＳＴＭＮ１は、細胞骨格に関連し、したがって、Ｇ２／Ｍ相での細胞分裂及び増殖を調節するが、一方、ＹＷＨＡＺ及びＣＣＮＡ２は、サイクリン依存性キナーゼに結合し、封鎖することによってＧ２／Ｍ相チェックポイントの調節に役割を果たす。
【０３５５】
結論
すべての検査したがん細胞株において、ｍｉＲＮＡ−１９３ａの発現は、そのＧ２／Ｍアレスト表現型を誘導し、細胞分裂を停止するその効果によって、少なくとも部分的にがん細胞死を誘発する。この表現型は、細胞骨格及び細胞分裂に関連する遺伝子を阻害するマイクロＲＮＡ薬物によって部分的にもたらされる。
【０３５６】
実施例４．１０：６つの異なるがん細胞株におけるｍｉＲＮＡ−１９３ａ処置の際のＲＮＡシーケンシング、遺伝子セット濃縮分析、及び経路分析
ハイスループットＲＮＡシーケンシングの実施は、遺伝子及びエクソンレベルで、全トランスクリプトームの包括的特徴に対して、並びに高い解像度及び有効性で、差示的に発現した遺伝子、新規遺伝子及び転写物を特定する特有の能力に関する強力なツールとなっている。しかし、今日まで、がん発症におけるその特異的役割について非常に少ないｍｉＲＮＡしか特徴付けられてこなかった。したがって、本発明者らは、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ処置の２４時間後に、Ａ５４０及びＨ４６０（共に肺がん）、Ｈｕｈ７及びＨｅｐ３Ｂ（共に肝臓がん）Ａ２０５８（皮膚がん）及びＢＴ５４９（乳がん）を含む６つの異なるがん細胞株でｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐを過剰発現させた後、ハイスループットＲＮＡシーケンシングを使用した。遺伝子発現を対照としての偽と比較し、本発明者らは、差示的に発現した遺伝子及びそれらの生物学的経路を特定した。
【０３５７】
トランスフェクションの２４時間後に下方調節された遺伝子のリスト（相対的発現ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ／相対的発現  偽＜１）を６つの細胞株すべてについて作成した。次に、本発明者らは、少なくとも１つの細胞株で又は複数の細胞株で有意に（ｐ＜０．１に調整）下方調節された遺伝子のリストを作成した（表１４）。少なくとも２つの細胞株で下方調節された遺伝子の６５％超が、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎツール（ｍｉＲＮＡ標的予測ツール）にしたがって、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ標的を予測した。
【０３５８】
【表１５】
2021513508.tif 000020
【０３５９】
ｍｉＲＮＡ−１９３ａは、調整したｐ＜０．１を考慮して、６つの細胞株すべてにおいて３５の遺伝子を下方調節し（表１５）、アポトーシス、細胞移動、付着、増殖、及び他の発癌機能の調節において役割を果たすことが期待される。
【０３６０】
【表１６】
2021513508.tif 000021
【０３６１】
クラスタリング及び経路分析のために、より大きな遺伝子セットを必要とした。したがって、本発明者らは、遺伝子を機能的に関連する群にクラスタリングする、ＤＡＶＩＤ機能的分類ツールのためのインプットとして少なくとも３つの細胞株（ｐ＜０．１に調整）で下方調節された２４２の遺伝子を使用した（表１６）。この分析は、最も豊富なクラスターが、アポトーシスを調節する遺伝子を含むことを示した。他のクラスターは、血管新生、小胞体ストレス応答、走化性、タンパク質輸送、ヌクレオシド代謝、グリコシル化、発癌、創傷治癒において役割を果たす遺伝子を含有した。興味深いことに、免疫活性化を調節する遺伝子は、ｍｉＲＮＡ−１９３ａによっても影響を受けていた。少なくとも３つのがん細胞株（ｐ＜０．１に調整）において下方調節された２４２の有意な遺伝子の中で、１６１の遺伝子が、ｍｉＲＮＡ−１９３ａに対する標的であると、異なる標的予測プログラムによっても予測されたため、ｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐの文脈で対象となる。これら１６１の遺伝子は、ＥＲＭＰ１、ＭＣＬ１、ＺＤＨＨＣ１８、ＫＩＡＡ１１４７、ＩＤＳ、ＥＩＦ４Ｂ、ＥＴＳ１、ＴＸＬＮＡ、ＮＴ５Ｅ、ＷＳＢ２、ＰＬＡＵＲ、ＬＲＲＣ４０、ＰＴＰＬＢ、ＳＬＣ１５Ａ１、ＮＣＥＨ１、ＩＬ１７ＲＤ、ＳＴＭＮ１、ＡＩＭＰ２、ＰＨＡＣＴＲ２、ＧＡＬＮＴ１、ＬＡＭＣ２、ＳＣＰ２、ＳＬＣ２６Ａ２、ＬＵＺＰ１、ＳＨＭＴ２、ＵＢＰ１、ＰＨＬＤＡ２、ＳＴ５、ＥＮＤＯＤ１、ＣＧＮＬ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＲＡＢ１１ＦＩＰ５、ＣＣＮＤ１、ＲＵＳＣ１、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＰＴＣ７、ＳＬＣ３９Ａ５、ＡＣＳＳ２、ＴＰＰ１、ＨＹＯＵ１、ＤＣＴＮ５、ＣＲＫＬ、ＷＤＦＹ２、ＷＤＲ８２、ＳＬＣ６Ａ１２、ＣＤＫ６、ＳＵＬＦ２、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＡＴＰ５Ｆ１、ＡＬＤＨ９Ａ１、ＴＯＲ４Ａ、ＮＥＴ１、ＲＳＦ１、ＮＵＰ５０、ＺＭＡＴ３、ＡＰ２Ｍ１、ＭＰＰ２、ＩＴＧＢ３、ＧＡＬＮＴ１４、ＳＬＣ３５Ｄ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＭＳＡＮＴＤ３、ＣＬＳＴＮ１、ＰＩＴＰＮＢ、ＣＥＣＲ２、ＫＩＡＡ１６４４、ＡＲＨＧＡＰ２９、ＫＩＡＡ１１９１、ＧＲＥＢ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＳＥＰＮ１、ＳＹＮＲＧ、ＬＲＰ４、ＺＮＦ３６５、ＣＲＹＡＡ、ＭＥＤ２１、ＧＮＡＩ３、ＡＴＰ５ＳＬ、ＵＢＥ２Ｌ６、ＡＮＫＲＤ１３Ａ、ＧＣＨ１、ＮＩＰＡ１、ＴＲＩＭ６２、ＵＳＰ３９、ＨＥＧ１、ＤＣＡＦ７、ＬＲＲＣ８Ａ、ＳＯＸ５、ＩＲＦ１、ＭＯＲＣ４、ＵＮＣ１１９Ｂ、ＦＡＦ２、ＳＬＣ３０Ａ１、Ｃ１ＱＢＰ、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＴＲＩＢ２、ＴＢＣ１Ｄ５、ＴＭＰＰＥ、ＭＡＰＫ８、ＣＢＸ１、ＣＡＤＭ１、ＣＣＤＣ２８Ａ、ＹＷＨＡＺ、ＥＲＡＰ２、ＳＴＯＮ２、ＡＰ５Ｍ１、ＴＧＦＢ２、ＣＹＴＨ１、ＦＡＭ２０Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ１、ＡＲＨＧＡＰ１９、ＬＰＡＲ３、ＬＭＬＮ、ＮＵＤＴ１５、ＰＬＡＵ、ＶＡＭＰ８、ＨＨＡＴ、ＡＧＰＡＴ１、ＡＴＰ８Ｂ２、ＡＣＰＬ２、ＳＣＡＭＰ４、ＬＡＴ２、ＯＳＭＲ、ＮＵＤＴ２１、ＨＰＲＴ１、ＳＴＡＲＤ７、ＧＡＢＰＡ、ＣＤＣ４２ＥＰ２、ＴＨＢＳ４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＰＲＮＰ、ＧＦＰＴ１、ＭＡＸ、ＫＲＡＳ、ＣＮＯＴ６、ＮＵＤＴ３、ＲＦＷＤ３、ＡＰＰＬ１、ＳＬＣ２３Ａ２、ＢＯＤ１、ＰＤＥ３Ａ、ＳＬＣ３０Ａ７、ＣＥＰ４１、ＮＯＴＣＨ２、ＲＧＳ２、ＣＤＣ４２ＥＰ４、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＳＱＳＴＭ１、ＤＤＡＨ１、ＳＬＣ３５Ｄ２、ＦＯＣＡＤ、ＧＰＡＴＣＨ１１、ＣＢＬ、ＴＭＥＭ３０Ｂ、ＨＦＥ、ＰＬＥＫＨＢ２、ＡＲＰＣ５、及びＡＢＩ２である。これらの遺伝子の中で、ＮＴ５Ｅ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＹＷＨＡＺ、ＭＡＰＫ８、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＮＯＴＣＨ２、ＥＴＳ１、ＩＬ１７ＲＤ、ＣＤＫ６、ＥＩＦ４Ｂ、及びＭＣＬ１は、細胞周期の経路、免疫活性化、及び細胞移動において、これらが重大に関与するため、特に興味深い。有意に下方調節された（Ｐ＜０．０５）すべての遺伝子の中で、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＲＫＬ、ＮＴ５Ｅ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ１７ＲＤ、ＫＲＡＳ、ＫＩＴ、ＨＤＡＣ３、ＲＴＫ２、ＴＧＦＢ２、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＬＡＵ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、及びＹＡＰ１は、抗腫瘍免疫において、これらの公知の関与のために、特に興味深い。ＥＴＳ１、ＹＷＨＡＺ、ＭＰＰ２、ＰＬＡＵ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＩＦ４Ｂ、ＲＡＤ５１、ＣＣＮＡ２、ＳＴＭＮ１、及びＤＣＡＦ７は、細胞周期の調節において、これらが重大に関与するため、特に興味深い。
【０３６２】
【表１７】
2021513508.tif 000022
【０３６３】
結論：
６つの異なるがん細胞株におけるｍｉＲ−１９３ａの過剰発現によって、異なる経路に影響を及ぼす種々の標的の阻害がもたらされた。６つの異なるがん細胞すべてにおいて顕著に標的化されているいくつかの共通遺伝子が存在したが、各細胞株においてのみ標的化された特有の遺伝子も存在し、状況依存的な効果が示された。少なくとも３つの異なるがん細胞株において標的とされた遺伝子に関するパスウェイエンリッチメント分析（ｐａｔｈｗａｙ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により、血管新生、小胞体ストレス応答、走化性、タンパク質輸送、ヌクレオシド代謝、グリコシル化、発癌、創傷治癒、及び免疫活性化の遺伝子サインが顕著に示される。これらのデータによって、ｍｉＲ−１９３ａが腫瘍進行の重要なモジュレーターであり、複数の経路を標的とするその能力により、抗がん薬としての治療能力が魅力的であることが示唆される。
【０３６４】
実施例４．１１：乳房脂肪パッドに移植された４Ｔ１の三重陰性乳がん腫瘍の同系マウスモデルにおけるジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａのＴ細胞媒介性免疫
４Ｔ１がん細胞に対するｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスにおけるＴ細胞媒介性長期免疫を調査するために、実施例４．４に類似する条件で新たな研究を実施した。腫瘍接種の５日後に、マウスを２つの群に無作為化し、実施例４．４に類似する処置と投与レジメンを受けさせた（表９の群１〜２のみを参照されたい）。群の平均腫瘍体積が８００ｍｍ３に達した場合に原発腫瘍を外科手術により除去した後に、処置を再度行い、５８日目まで続けた。
【０３６５】
ＰＢＳ対照と比較して、ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスでは、腫瘍が再成長しなかったため（この研究に関しては示されていないが、類似のデータが実施例４．４に関して図８Ｂに示されている）、本発明者らは、４Ｔ１細胞に対するｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスの長期免疫について再調査した。そうするために、腫瘍接種後７６日目に、ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスとナイーブ（週齢の一致する腫瘍を有さない）マウスに、４Ｔ１マウス腫瘍細胞を再度負荷した。再負荷後の腫瘍再成長は、最大３週間追跡した。以前に見えるｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスは、ナイーブマウスと比較して、いかなる触知可能な腫瘍も生じなかった（図１９）。これらのマウスにおけるＴ細胞媒介性長期免疫に関する本発明者らの仮定を調査するために、腫瘍細胞接種後１０３日目に、以前にｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した４Ｔ１再負荷マウスとナイーブマウスを、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体で処置してＴ細胞を枯渇させた（処置スケジュールに関する表１７を参照されたい）。すべての群のマウス由来の血液試料に関してＦＡＣＳ分析して、Ｔ細胞の枯渇に関する結果を確認した。ＣＤ８＋細胞は完全な枯渇を示し、ＣＤ４＋細胞は部分的枯渇を示した（データは示さず）。枯渇処理の５日後に、すべての群のマウスに、４Ｔ１マウス腫瘍細胞を再度再負荷し（脇腹の前方にＰＢＳ  ０．１ｍＬ中の３×１０５）、腫瘍成長を最長４週間追跡した。興味深いことに、ナイーブマウスと同様に、ｍｉＲＮＡ−１９３ａで以前に処置したマウスにおけるＴ細胞枯渇によって４Ｔ１腫瘍成長がもたらされたが、Ｔ細胞を枯渇させなかった、ｍｉＲＮＡ−１９３ａで以前に処置したマウスは触知可能な４Ｔ１腫瘍を示さなかった（図１９）。
【０３６６】
ｍｉＲＮＡ−１９３ａで以前に処置したマウスのＴ細胞依存性長期免疫についてさらに確認するために、週齢の一致するナイーブマウスにおいて触知可能な腫瘍を生じなかった生存マウス（表１７、群２ｂ）からのＴ細胞の移入を実施した。腫瘍細胞接種後１３３日目に、生存している動物の脾臓、補助、上腕、及び鼠径リンパ節からＣＤ３＋Ｔ細胞を採取した。Ｔ細胞をプールし、６頭の週齢の一致するナイーブマウスにｉ．ｖ．移入した（０日目にマウス１頭当たり１×１０７のＣＤ３＋Ｔ細胞）。Ｔ細胞移入の１日後に、６頭の週齢の一致するナイーブマウス（対照群として）と６頭のＣＤ３＋Ｔ細胞を受けたマウスの右側乳房脂肪パッドにＰＢＳ中の３×１０５  ４Ｔ１細胞（マウス１頭当たり０．１ｍＬ）を再負荷した。腫瘍成長を約５週間追跡した。興味深いことに、Ｔ細胞を受けたナイーブマウスは、対照のナイーブマウスと比較して、いかなる４Ｔ１腫瘍成長も示さなかった（図１９）。
【０３６７】
【表１８】
2021513508.tif 000023
【０３６８】
結論
ｍｉＲＮＡ−１９３ａによる処置（この場合には、ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａ−３ｐ）により、４Ｔ１腫瘍細胞による再負荷後の腫瘍成長が低減され、マウスの生存が促進された。予想通り、再移植したマウス４Ｔ１細胞によって、ナイーブ動物におけるｓｕｂｑ腫瘍の形成が可能となった。ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した動物における腫瘍取込み／腫瘍成長の顕著な防止によって、４Ｔ１に対する長期間の免疫化が強く示唆された。以前に、マウス４Ｔ１細胞を再移植後に生存していたｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスは、Ｔ細胞非枯渇群と比較して、Ｔ細胞枯渇の際にのみ腫瘍再成長を示した。この結果は、Ｔ細胞に依存する免疫化を強く示す。さらに、以前にｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置した再負荷後も生存していたマウスからナイーブマウスへのＴ細胞の移入によって、４Ｔ１腫瘍による再負荷後の腫瘍再成長が抑制された。このことにより、ｍｉＲＮＡ−１９３ａで処置したマウスにおけるＴ細胞媒介性免疫が強く示唆される。
【０３６９】
実施例４．１２：１２の同系腫瘍モデルにおける原発腫瘍成長に関するジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａの有効性
この研究では、ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡ−１９３ａの効果を、１２の同系腫瘍モデルのパネルにおける原発腫瘍成長に関して調査した。６〜８週齢のマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ、中国、上海）に、がんモデルに応じて、適当な数の同系がん細胞を皮下注射した（表１８を参照）。無作為化の際に、腫瘍体積（ＴＶ）はおよそ８０〜１２０ｍｍ３であった。体重とＴＶ（カリパス測定）を１週間に２〜３回決定した。無作為化後に（０日目と示される）、マウスは、表１９に示されているように、ＰＢＳ又はｍｉＲ−１９３ａ（ジアミノ脂質ナノ粒子中で製剤化した）による処置を受けた。各腫瘍モデルは、表１９に示したように２つの群を有した。マウスについて、最大４週間の処置後に、フォローアップを２週間行った後、安楽死させるようスケジュールを立てた。しかし、様々な処置及び実験腫瘍モデルの腫瘍成長速度に応じて、何頭かのマウスは、人道的エンドポイントで計画したよりも早く安楽死させた（１群当たりの平均ＴＶが２０００ｍｍ３に達するか又は個々のマウスが３０００ｍｍ３のＴＶを示した場合）。Ｈ２２、Ｐａｎ０２、Ｂ１６−ＢＬ６、ＲＭ−１、Ｂ１６Ｆ１０、ＭＣ３８、Ａ２０、及びＥＭＴ−６モデルにおいて、ｍｉＲＮＡ−１９３ａは、腫瘍成長の阻害（ＴＧＩ）を有意に誘導した。ＣＴ２６、Ｒｅｎｃａ、及びＨｅｐａ１−６モデルでは、ｍｉＲ−１９３ａによる処置は、有意なＴＧＩを誘導しなかった（表２０）。表２０では、ＰＢＳと比較したｍｉＲＮＡ−１９３ａによる腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）のパーセンテージを、処置群の間で最も直近の比較可能な時点でメジアン腫瘍体積を使用して計算した。
【０３７０】
【表１９】
2021513508.tif 000024
【０３７１】
【表２０】
2021513508.tif 000025
【０３７２】
【表２１】
2021513508.tif 000026
【０３７３】
結論：
ｍｉＲＮＡ−１９３ａによる処置によって、広範囲の同系腫瘍モデル（すなわち、Ｈ２２、Ｐａｎ０２、Ｂ１６−ＢＬ６、ＲＭ−１、Ｂ１６−Ｆ１０、ＭＣ３８、Ａ２０、及びＥＭＴ−６）における原発腫瘍に関する有意な腫瘍成長阻害がもたらされた。これらの結果によって、ｍｉＲＮＡ−１９３ａが、広範囲の同系モデルにおける確立された皮下原発腫瘍の成長への抑制剤効果を有することが示唆された。
【０３７４】
実施例４．１３：他の脂質ナノ粒子中で製剤化したｍｉＲＮＡは同所性ヒトＨｅｐ３ｂ肝細胞癌腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍成長を阻害しない
６〜８週齢の雌のＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ、中国、上海）の左の肝葉中に、単一の２×２×２ｍｍの皮下成長したＨｅｐ３ｂ腫瘍片を、同所性移植した。２１日目のＡＦＰレベルに基づいて、マウスを無作為化した。無作為化の際に、ＡＦＰレベル（血漿１ｍｌ当たりのｎｇ）は、４０１〜４０６２８ｎｇ／ｍｌの範囲であった（メジアン  ２５３６、ＩＱＲ＝１０３７〜５５１０）。処置は、ソラフェニブ、ビヒクル対照、又はＮＯ３４０脂質ナノ粒子に包まれた様々なｍｉＲＮＡ（又はスクランブルされたｍｉＲＮＡ対照）によるものであった（Ｓｉｍｏｎｓｏｎ及びＤａｓ、Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、２０１５年、１５（６）：４６７〜４７４頁、ＰＭＩＤ：２５８０７９４１）。処置は、２２日目に開始し、３週間続けた（表２１の投与スキーム）。ＡＦＰを、週に１回、４週間測定し、ＢＷを１週間に２回測定した。研究の終了時に、腫瘍重量も決定した。ＱＯＤｘ９＝１日置きに１回の注射を９回；ＢＩＤ＝１日に２回；ｐｏ＝経口。
【０３７５】
【表２２】
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【０３７６】
３９日目の最終の屠殺後に、ＡＦＰレベルと腫瘍重量を決定した。ＮＯＶ３４０ナノ粒子を含有する様々なｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−７；ｍｉＲ−３４ａ又はｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ）は、ＡＦＰによって測定したヒトＨｅｐ３ｂ  ＨＣＣ（肝細胞癌）腫瘍の成長及び腫瘍重量を阻害しなかったが、ソラフェニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ）は阻害した。これらの結果を図２０に表している。
【０３７７】
結論：
ソラフェニブと比較して、様々なＮＯＶ３４０ナノ粒子により製剤化したｍｉＲＮＡによる処置は、腫瘍成長及び／又は重量を阻害することができない。
【０３７８】
参照文献：
Admadzada T. et al, Biophysical Reveiews(2018) 10:69-86
Kearsley J.H., et al, 1990, PMID: 2372483
Knop et al., 2010, doi: 10.1002/anie.200902672
Loher et al., Oncotarget (2014) DOI:10.18632/oncotarget.2405
Steffen P., Voss B., et al., Bioinformatics,22:500-503, 2006
Wong, K.K. (PMID: 19149686)
Zhou et al., 2013, DOI:10.1158/0008-5472.CAN-13-1094
EP17199997  WO2008/10558    US8691750    US9737482    US6843942
【図１】
2021513508.tif 000029
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2021513508.tif 000035
【図５Ｄ】
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【図６】
2021513508.tif 000037
【図７】
2021513508.tif 000038
【図８】
2021513508.tif 000039
【図９】
2021513508.tif 000040
【図１０】
2021513508.tif 000041
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2021513508.tif 000047
【図１７】
2021513508.tif 000048
【図１８】
2021513508.tif 000049
【図１９Ａ】
2021513508.tif 000050
【図１９Ｂ】
2021513508.tif 000051
【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【配列表】
2021513508000001.app
【国際調査報告】
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