(57)【要約】  本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化させるための二重特異性抗原結合分子を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関する。加えて、本発明は、このような抗体をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞とに関する。本発明はさらに、この抗体を生産するための方法、および疾患の治療にそれらを使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、抗体。
【請求項２】
（ｉ）ＶＨが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｉｉｉ）ＶＨが、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｉｖ）ＶＨが、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｖ）ＶＨが、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｖｉ）ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＩｇＧ抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ＩｇＧ抗体である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
完全長抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子およびＦ（ａｂ’）２分子の群より選択される抗体断片である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
多重特異性抗体である、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
（ａ）ＧＰＲＣ５Ｄである第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、
（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む第１の抗原結合部分；ならびに
（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分
を含む、二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
（ｉ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｉｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｉｖ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｖ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは
（ｖｉ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
第２の抗原がＣＤ３である、請求項８または９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
第２の抗原がＣＤ３εである、請求項１０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
第２の抗原結合部分が、配列番号２９のＨＣＤＲ１、配列番号３０のＨＣＤＲ２および配列番号３１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３３のＬＣＤＲ２および配列番号３４のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む、請求項１０または１１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
第２の抗原結合部分のＶＨが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬが、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
第１および／または第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項８から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、請求項８から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
第１の抗原結合部分が、定常ドメインにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である、請求項８から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
第１および第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項８から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
第１および第２の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項８から１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
第３の抗原結合部分を含む、請求項８から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
第３の抗原部分が第１の抗原結合部分と同一である、請求項１９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項８から２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
第１、第２および、存在する場合、第３の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ分子であり；
（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、かつ、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、かつ、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており；
第３の抗原結合部分は、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、
請求項２１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
ＦｃドメインがＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項２１または２２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
ＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項２３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメインの中に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメインの中の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメインの中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメインの中の隆起を配置可能な空洞が生成される、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合を低減させ、かつ／またはエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子をコードする１または複数の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含む１または複数のベクター、特に発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の生産方法であって、ａ）請求項３０に記載の宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養する工程、およびｂ）任意選択的に、抗体を回収する工程を含む、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法によって生産される、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体。
【請求項３３】
請求項１から２７のいずれか一項または請求項３２に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３４】
医薬としての使用のための、請求項１から２７のいずれか一項もしくは請求項３２に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子、または請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
疾患の治療における使用のための、請求項１から２７のいずれか一項もしくは請求項３２に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子、または請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
疾患ががんまたは自己免疫疾患である、請求項３５に記載の抗体、二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物。
【請求項３７】
疾患が多発性骨髄腫である、請求項３５に記載の抗体、二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物。
【請求項３８】
疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１から２７のいずれか一項または請求項３２に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項３９】
個体における疾患を治療する方法であって、請求項１から２７のいずれか一項または請求項３２に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記疾患ががんまたは自己免疫疾患である、請求項３８に記載の使用または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が多発性骨髄腫である、請求項３８に記載の使用または請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化させるための二重特異性抗原結合分子を含むＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関する。加えて、本発明は、このような抗体をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞とに関する。本発明はさらに、この抗体を生産するための方法、および疾患の治療にそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
欧州と米国では、毎年約７５０００人の新規患者が発生している多発性骨髄腫（ＭＭ）は、最も一般的な血液学的悪性腫瘍の１つであり、高いアンメットメディカルニーズがある。多発性骨髄腫は、非機能的なモノクローナル免疫グロブリンを分泌する高分化型の形質細胞によって特徴付けられる。短期的には、レナリドマイドおよびポマリドマイドなどの免疫調節薬、ならびにカルフィルゾミブまたはボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤は、多発性骨髄腫の第一選択治療の中心であり続ける可能性がある（Moreau, P. and S.V. Rajkumar, multiple myeloma-translation of trial results into reality. Lancet, 2016. 388(10040): p. 111-3）。しかし、これらの薬物は、罹患した細胞、例えば罹患した形質細胞（ＰＣ）を特異的に標的としない。多発性骨髄腫の形質細胞を選択的に枯渇させる努力がなされてきた。形質細胞を特異的にマークする表面タンパク質の欠如が、多発性骨髄腫に対する抗体または細胞療法の開発を妨げた。これまでのところ、例えばダラツムマブ（抗ＣＤ３８）やエロツズマブ（抗ＣＤ３１９）に代表されるような生物製剤の成功例はほとんどない。そして、これらの２つの分子は形質細胞によって一意に発現されるのではないことに注意が必要だ。そこで、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）など、多発性骨髄腫の形質細胞からの新規標的がＲＮＡ配列を用いて同定された。ＧＰＲＣ５Ｄは、多発性骨髄腫の形質細胞によって発現される特定の表面タンパク質である。ＧＰＲＣ５Ｄは患者の予後と腫瘍負荷に関連していることが報告されている（Atamaniuk, J., et al., Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest, 2012. 42(9): p. 953-60; およびCohen, Y., et al., GPRC5D is a promising marker for monitoring the tumor load and to target multiple myeloma cells. Hematology, 2013. 18(6): p. 348-51）。
【０００３】
ＧＰＲＣ５Ｄは、ヒトおよびヒトのがんにおけるリガンドまたは機能が知られていないオーファン受容体である。ＧＰＲＣ５Ｄをコードする遺伝子は、染色体１２ｐ１３．３上に位置し、３つのエクソンを含み、全長は約９．６ｋｂである（Brauner-Osborne, H., et al., Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupled receptor GPRC5D. Biochim Biophys Acta, 2001. 1518 (3 ; -48）。大きな最初のエクソンは７回膜貫通ドメインをコードする。ＧＰＲＣ５Ｄの生物学はほとんど不明である。ＧＰＲＣ５Ｄが動物の毛包におけるケラチン形成に関与していることが示されている（Gao, Y., et al., Comparative Transcriptome Analysis of Fetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goats. PLoS One, 2016. 11(3): p. e0151118; ならびにInoue, S., T. NambuおよびT. Shimomura, The RAIG family member, GPRC5D, is associated with hard-keratinized structures. J Invest Dermatol, 2004. 122 (3 ; -73）。
【０００４】
国際公開第２０１８／０１７７８６号は、ＧＰＲＣ５Ｄ特異的抗体または抗原結合断片を開示している。
【０００５】
がん、特に多発性骨髄腫を治療するための追加の薬物の必要性がある。このために特に有用な薬物には、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体、特に標的細胞上のＧＰＲＣ５Ｄと、Ｔ細胞上の活性化Ｔ細胞抗原（ＣＤ３など）とに結合する二重特異性抗体が含まれる。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、任意の傷害性Ｔ細胞を活性化させ、続いて標的細胞を溶解させる。
【０００６】
本発明は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する二重特異性抗体を含む新規抗体を提供する。特に、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とする本発明によるＴ細胞二重特異性抗体は、多発性骨髄腫を治療する効力を有する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、予期しなかった改善された特性を有する、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する新規の抗体を開発した。さらに、本発明者らは、新規のＧＰＲＣ５Ｄ抗体を組み込んだ、ＧＰＲＣ５Ｄと活性化Ｔ細胞抗原とに結合する二重特異性抗原結合分子を開発した。
【０００８】
第１の態様では、本発明はＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体を提供し、該抗体は、（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。あるいは、該抗体は、（Ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（ＩＩ）配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ  ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでもよい。一実施態様では、（ｉ）ＶＨは、配列番号１３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号１４の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｉ）ＶＨは、配列番号１５の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号１６の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号４８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号５３の配列と少なくと���約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４９の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号５２の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｖ）ＶＨは、配列番号５７の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号６４の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｖｉ）ＶＨは、配列番号５８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号６３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含む。別の実施態様では、（ｉ）ＶＨは配列番号１３のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬは配列番号１４のアミノ酸配列を含み；または（ｉｉ）ＶＨは配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬは配列番号１６のアミノ酸配列を含み；または（ｉｉｉ）ＶＨは配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬは配列番号５３のアミノ酸配列を含み；または（ｉｖ）ＶＨは配列番号４９のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬは配列番号５２のアミノ酸配列を含み；または（ｖ）ＶＨは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬは配列番号６４のアミノ酸配列を含み；または（ｖｉ）ＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬは配列番号６３のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体は完全長抗体である。別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子およびＦ（ａｂ’）２分子の群より選択される抗体断片である。一実施態様において、抗体は多重特異性抗体である。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、第１の抗原はＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分は（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。あるいは、第１の抗原結合部分は、（Ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（ＩＩ）配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ  ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分とを含んでもよい。一実施態様では、（ｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１５の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１６の配列と少なくとも約９５���、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｉｉ）配列番号４８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号５３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４９の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号５２の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｖ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号５７の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号６４の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｖｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号５８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号６３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含む。ある実施態様では、（ｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは配列番号１３のアミノ酸配列を含み、かつ、第１の抗原結合部分のＶＬは配列番号１４のアミノ酸配列を含み；または（ｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつ、第１の抗原結合部分のＶＬは配列番号１６のアミノ酸配列を含み；または（ｉｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつ、第１の抗原結合部分のＶＬは配列番号５３のアミノ酸配列を含み；または（ｉｖ）第１の抗原結合部分のＶＨは配列番号４９のアミノ酸配列を含み、かつ、第１の抗原結合部分のＶＬは配列番号５２のアミノ酸配列を含み；または（ｖ）第１の抗原結合部分のＶＨは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、かつ、第１の抗原結合部分のＶＬは配列番号６４のアミノ酸配列を含み；または（ｖｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列を含み、かつ、第１の抗原結合部分のＶＬは配列番号６３のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、第２の抗原はＣＤ３、特にＣＤ３εである。ある実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２９のＨＣＤＲ１、配列番号３０のＨＣＤＲ２および配列番号３１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３３のＬＣＤＲ２および配列番号３４のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。別の実施態様において、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％��たは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
ある実施態様では、第１および／または第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。これは、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子あっても、第２の抗原結合部分がＦａｂ分子あっても、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分がＦａｂ分子あってもよいことを意味する。別の実施態様において、第２の抗原結合部分は、可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１、特にＦａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。別の実施態様において、第１の抗原結合部分は、定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立に置換されており、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、Ｆａｂ分子である。別の実施態様では、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合される。別の実施態様では、第１および第２の抗原結合部分は各々、Ｆａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別の実施態様において、二重特異性抗原結合分子は第３の抗原結合部分を含む。別の実施態様において、第３の抗原部分は第１の抗原結合部分と同一である。別の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。別の実施態様では、第１、第２および、存在する場合、第３の抗原結合部分は各々、Ｆａｂ分子であり、ここで、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、かつ、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、かつ、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているかのいずれかであり；また、第３の抗原結合部分（存在する場合）がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。別の実施態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１Ｆｃドメインである。さらなる別の実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置��換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成されており、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成されている。別の実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる１または複数のアミノ酸置換を含む。これは、Ｆｃ受容体への結合が低下しても、エフェクター機能が低下しても、Ｆｃ受容体への結合とエフェクター機能が低下してもよいことを意味する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子をコードする、１または複数の単離されたポリヌクレオチドを提供する。さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む１または複数のベクター、特に発現ベクターを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
【００１２】
本発明の別の態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体の生産方法が提供され、この方法は、ａ）抗体の発現に適した条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養する工程と、ｂ）任意選択的に抗体を回収する工程とを含む。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって生産される、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体を提供する。本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。本発明の別の態様は、医薬としての使用のための、本明細書に記載の抗体もしくは二重特異性抗原結合分子、または本明細書に記載の薬学的組成物に関する。本発明の別の態様は、疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の抗体もしくは二重特異性抗原結合分子、または本明細書に記載の薬学的組成物に関する。ある実施態様では、疾患は、がん、特に多発性骨髄腫である。あるいは、疾患は、全身性紅斑性狼瘡および／または関節リウマチなどの自己免疫疾患である。
【００１３】
本発明はさらに、疾患、特に多発性骨髄腫の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。
あるいは、疾患は、全身性紅斑性狼瘡および／または関節リウマチなどの自己免疫疾患である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子を含む治療有効量の組成物を薬学的に許容される形態で個体に投与することを含む、個体における疾患、特にがん、より具体的には多発性骨髄腫を治療する方法に関する。あるいは、疾患は、全身性紅斑性狼瘡および／または関節リウマチなどの自己免疫疾患である。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−Ｆ】本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（図１Ａ、図２Ｄ）「１＋１のＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（図１Ｂ、図１Ｅ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂおよびＦａｂ成分を有する（「反転型」）「２＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（図１Ｃ、図１Ｆ）「２＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。
【図１Ｇ−Ｎ】本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（図１Ｇ、図１Ｋ）別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂおよびＦａｂ成分を有する（「反転型」）「１＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（図１Ｈ、図１Ｌ）「１＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（図１Ｉ、図１Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（図１Ｊ、図１Ｎ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂを有し、かつ、別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂおよびＦａｂ成分を有する（「反転型」）「２＋１のＩｇＧ  Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。
【図１Ｏ−Ｖ】本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（図１Ｏ、図１Ｓ）「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（図１Ｐ、図１Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」分子の図。（図１Ｑ、図１Ｕ）「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（図１Ｒ、図１Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ−（Ｆａｂ）２」分子の図。
【図１Ｗ−Ｚ】本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（図１Ｗ、図１Ｙ）「Ｆａｂ−（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図。（図１Ｘ、図１Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２−Ｆａｂ」分子の図。黒い点：ヘテロダイマー化を促す、Ｆｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋，−−：任意選択的にＣＨ１およびＣＬドメインに導入された反対電荷のアミノ酸。ＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むように描かれているが、ＣＨ１およびＣＬドメインに電荷の改変が導入されていない実施態様では、代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含む場合がある。
【図２】ＲＮＡｓｅｑによる形質細胞とＢ細胞上の腫瘍標的の遺伝子発現分析。
【図３】本発明の５Ｅ１１二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。黒い点：ヘテロダイマー化を促す、Ｆｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋，−−：任意選択的にＣＨ１およびＣＬドメインに導入された反対電荷のアミノ酸。
【図４】二重特異性抗原結合分子５Ｆ１１−ＴＣＢ（図４Ａ）おおよび５Ｅ１１−ＴＣＢ（図４Ｂ）およびコントロール抗体ＥＴ１５０−５−ＴＣＢ（図４Ｃ）の、多発性骨髄腫細胞株ＡＭＯ−１、Ｌ６３６、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、ＯＰＭ−２およびＷＳＵ−ＤＬＣＬ２への結合分析。
【図５】多発性骨髄腫細胞株ＡＭＯ−１（図５Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図５Ｂ）、ＲＰＭＩ−８２２６（図５Ｃ）およびＬ３６３（図５Ｄ）に対する、ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢを介したＴ細胞の細胞傷害性の分析。コントロール細胞株は、ＷＳＵ−ＤＬ  ＣＬ２である（図５Ｅ）。試験した分子：５Ｅ１１−ＴＣＢ  ５Ｆ１１−ＴＣＢ。コントロール分子：ＤＰ４７−ＴＣＢ（非標的化）およびＥＴ１５０−５−ＴＣＢ。
【図６】ＣＤ２５およびＣＤ６９を上方制御している多発性骨髄腫細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９およびネガティブコントロール細胞株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２を用いた、ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢ活性化Ｔ細胞関与の分析。
【図７】ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢ活性化Ｔ細胞の、細胞株ＡＭＯ−１（図７Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図７Ｂ）、ＲＰＭＩ−８２２６（図７Ｃ）、Ｌ３６３（図７Ｄ）およびＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（図７Ｅ）における多発性骨髄腫上方制御ＣＤ２５、ならびに細胞株ＡＭＯ−１（図７Ｆ）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図７Ｇ）、ＲＰＭＩ−８２２６（図７Ｈ）、Ｌ３６３（図７Ｉ）およびＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（図７Ｊ）における多発性骨髄腫上方制御ＣＤ６９との関与の分析。
【図８】蛍光共焦点顕微鏡による抗体の局在および内在化の可視化（図８Ａ）と膜対細胞質のシグナル強度の分析（図８Ｂ）。
【図９】ヒト、カニクイザルおよびマウスＧＰＲＣ５Ｄに対する異なる抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の結合を、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ（クローン１２）またはカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ（クローン１３）、マウスＧＰＲＣ５Ｄ（クローン４）またはヒトＧＰＲＣ５Ａ（クローン３０）のいずれかを用いて、ＥＬＩＳＡによち評価した。
【図１０】２０時間の共培養中に、ＧＰＲＣ５ＤまたはＢＣＭＡを標的とする異なるＴ細胞二重特異性分子によって誘導された、種々の多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株のＴ細胞媒介性溶解（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒト汎Ｔ細胞）。ＳＤと共に２回分が示されている。
【図１１】健常なドナーからの未処理骨髄細胞と同種異系汎ヒトＴ細胞の約２０時間の共培養（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒト汎Ｔ細胞）の間にＧＰＲＣ５ＤまたはＢＣＭＡを標的とする異なるＴ細胞二重特異性分子（図１１Ａの５Ｅ１１−ＴＣＢ；図１１Ｂの５Ｆ１１−ＴＣＢ；図１１Ｃの１０Ｂ１０−ＴＣＢ；図１１ＤのＢＣＭＡ−ＴＣＢ；図１１ＥのＢＣＭＡ−ＴＣＢ；図１１ＦのＤＰ４７−ＴＣＢ）によって誘導されたＴ細胞の活性化。描かれているのは、１の代表的なドナーからのＦＡＣＳドットプロットであり、ＣＤ４  Ｔ細胞（上段）またはＣＤ８  Ｔ細胞（下段）上の活性化マーカーＣＤ６９の上方制御を、すべてのＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞間での陽性細胞パーセントとして示している。
【図１２】同種異系汎ヒトＴ細胞と健康なドナーからの未処理骨髄細胞の約２０時間の共培養（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒト汎Ｔ細胞）の間にＧＰＲＣ５ＤまたはＢＣＭＡを標的とする異なるＴ細胞二重特異性分子によって誘導されたＴ細胞の活性化。描かれているのは、５０ｎＭのＴＣＢ（図１２Ａ）または５ｎＭ（図１２Ｂ）いずれかの選択された固定用量での、ＣＤ８  Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の上方制御を示す、評価されたドナー４名全員のサマリーである。
【図１３】ＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞を移植したヒト化ＮＳＧマウスのモデルにおける経時的な腫瘍成長速度によって示した、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とする異なるＴ細胞二重特異性分子（図１３Ａの５Ｆ１１−ＴＣＢ；図１３ＢのＢＣＭＡ−ＴＣＢ；図１３ＣのＢ７２−ＴＣＢ；図１３Ｄのビヒクル）により誘導されたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。プロットされているのはスパイダーグラフで、各線は１頭のマウスを表している。
【図１４】ＯＰＭ−２腫瘍細胞を移植したヒト化ＮＳＧマウスのモデルにおける経時的な腫瘍成長速度によって示した、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とする異なるＴ細胞二重特異性分子（図１４Ａの５Ｆ１１−ＴＣＢ；図１４Ｂの５Ｅ１１−ＴＣＢ；図１４ＣのＢ７２−ＴＣＢ；図１４Ｄのビヒクル）により誘導されたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。プロットされているのはスパイダーグラフで、各線は１頭のマウスを表している。
【図１５】発光によって決定された、およそ１６時間のインキュベーションの後のＰＧＬＡＬＡ−ＣＡＲ−Ｊの活性化。これは、ＧＰＲＣ５Ｄ発現多発性骨髄腫細胞株Ｌ−３６３へのＧＰＲＣ５Ｄ  ＩｇＧ（図１５Ａの５Ｆ１１−ＩｇＧ；図１５Ｂの５Ｅ１１−ＩｇＧ）の結合と、これらのＩｇＧ分子のＦｃ部分においてＴＣＲに対して向けられたＰＧＬＡＬＡ突然変異を発現するように遺伝的に操作されたＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞へのＰＧＬＡＬＡ修飾Ｆｃドメインの結合の同時結合の際に誘導される。ＳＤと共に２回分が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリンおよび誘導体（例えばその断片）である。
【００１８】
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれは異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現する２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００１９】
本明細書で使用する用語「価」は、抗原結合分子中の特定数の抗原結合部位の存在を意味する。したがって、「抗原への一価の結合」という用語は、抗原結合分子中の抗原に特異的な１つの（かつ、１つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
【００２０】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち、１または複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様において、抗原結合部分は、それが付着している実体（例えば第２の抗原結合部分）を、標的部位、例えば抗原決定基を持つ特定の種類の腫瘍細胞に向けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を介して、シグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、本明細書でさらに定義される抗体およびその断片を含む。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。一部の実施態様では、抗原結合部分は、後述でさらに定義される、当技術分野で既知の抗体定常領域を含む。有用な重鎖定常領域には、α、δ、ε、γまたはμの５つのアイソタイプのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、κとλの２つのアイソタイプ：のいずれかが含まれる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「抗原決定基」は、「抗原」および「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続ストレッチまたは非連続的アミノ酸の異なる領域で構成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上、ウイルス感染細胞の表面上、他の疾患細胞の表面上、免疫細胞の表面上に見出されるか、または血清中および／もしくは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に遊離して見出され得る。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質（例えばＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ３）は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）およびげっ歯類（例えばマウスおよびラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然形態を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は、「完全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的ヒトタンパク質は、ＣＤ３、特にＣＤ３のエプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１８５）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４、配列番号４０；またはカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン６９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号４１参照）またはＧＰＲＣ５Ｄ（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｑ９ＮＺＤ１（バージョン１１５）；ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｎｏ．ＮＰ＿０６１１２４．１、配列番号４５参照）である。特定の実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、様々な種由来のＣＤ３またはＧＰＲＣ５Ｄ抗原の中で、保存されたＣＤ３またはＧＰＲＣ５Ｄのエピトープに結合する。特定の実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子はヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する。
【００２３】
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくないまたは非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えばＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、および古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、または抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００２４】
「親和性」は、分子（例えば受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、または受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表され、この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じでままである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。特に親和性を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）がある。
【００２５】
「結合の低減」、例えばＦｃ受容体への結合の低減は、例えばＳＰＲによって測定した場合の、各相互作用に対する親和性の低下を指す。簡潔には、この用語は、親和性のゼロ（または分析方法の検出限界未満）への低下、すなわち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合増大」は、各相互作用に対する親和性の増大を指す。
【００２６】
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞の活性化を誘導することができる。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のエプシロンサブユニットである（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号４０を；またはカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ  ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号４１を参照）。
【００２７】
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現より選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１または複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
【００２８】
本明細書で使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞または腫瘍間質の細胞などの腫瘍中の細胞の表面上に存在する抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、ＧＰＲＣ５Ｄ、特に配列番号４５によるヒトＧＰＲＣ５Ｄである。
【００２９】
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ分子などに関して使用される「第１の」、「第２の」または「第３の」という用語は、各タイプの部分が２つ以上存在するとき、区別するために便宜上使用される。このような用語の使用は、明示的に記載されていない限り、二重特異性抗原結合分子の特定の順序または配向を付与することを意図しているのではない。
【００３０】
「融合した」とは、成分同士（例えばＦａｂ分子とＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合により、直接または１以上のペプチドリンカーを介して結合されていることを意味する。
【００３１】
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）と軽鎖のＶＬおよびＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）とからなるタンパク質を指す。
【００３２】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称される）とは、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインまたは定常ドメインが交換されている（すなわち互いによって置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し，すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１（ＶＬ−ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨおよび軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ−ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成されるペプチド鎖とを含む。簡潔には、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１  ＣＨ１を含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖を、ここでは（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
【００３３】
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、天然フォーマットのＦａｂ分子、すなわち重鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ−ＣＨ１）からなる重鎖と、軽鎖の可変ドメインおよび定常領域（Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＬ−ＣＬ）からなる軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
【００３４】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖および２つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメインまたは重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割り当てることができ、そのうちのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）にさらに分類することできる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された２つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
【００３５】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３６】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、あり得る変異体抗体、例えば天然に生じる変異を含むかまたはモノクローナル抗体調製物の生産時に発生するもの（通常、このような変異体は少量存在している）を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられたものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法およびその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【００３７】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものであり、すなわちその自然環境には存在しないものである。精製のレベルは特に求められない。例えば、単離された抗体は、その天然または自然の環境から取り除くことができる。宿主細胞に発現された組換え生産抗体は、本発明のために単離されたとみなされ、任意の適切な技術により分離、画分化または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換え抗体も同様である。したがって、本発明の抗体および二重特異性抗原結合分子は、単離されている。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば電気泳動法（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換または逆相ＨＰＬＣ）法により決定した場合、９５％または９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００３８】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」は、本明細書では互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体を指す。
【００３９】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照されたい。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of  Monoclonal Antibodies,, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)；ならびに国際公開第９３／１６１８５号；ならびに米国特許第５５７１８９４号および第５５８７４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつ、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価または二重特異性の２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); およびHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディおよびテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（マサチューセッツ州ウォルサムのＤｏｍａｎｔｉｓ社；例えば、米国特許第６２４８５１６号参照）。抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質消化、および本明細書に記載されているような組換え宿主細胞（例えば大腸菌またはファージ）による生産を含むがこれらに限定されない様々な技術で作製することができる。
【００４０】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、かつ、抗原の一部または全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１または複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００４１】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。通常、天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）から成る。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分である。可変領域配列に関して本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)によって規定された番号付けシステムを指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されていて、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」または「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の647-660頁参照）は、カッパおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、また、本明細書では「Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け」と呼ぶことによってこの場合さらに明確化されるＫａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１−７２３頁参照）が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）に使用される。
【００４３】
本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、抗体可変ドメインの各領域のうち、配列が超可変である領域を指し（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」；重鎖可変領域／ドメインのＣＤＲ  はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と略記され；軽鎖可変領域／ドメインのＣＤＲは、例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と略記される）、かつ／または構造的に画定されるループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原コンタクト」）を含有する。抗体は通常、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。本明細書での例示的ＨＶＲには、以下が含まれる。
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、および９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、および９４−１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組み合わせ。
【００４４】
他に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基および他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書ではＫａｂａｔら前掲書に従って番号付けされている。
【００４５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般にＶＨ（またはＶＬ）に以下の順序で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００４６】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。このような可変ドメインを、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ぶ。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性をもたらすように定常領域が追加的に修飾されているものまたは元の抗体から変更されているものである。
【００４７】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体の、またはヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、あるいは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えばマウス、ラットまたはウサギに由来する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片も、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
【００４８】
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００４９】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指すのに使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変動するが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６からまたはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までと定義される。しかしながら、宿主細胞によって産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１つまたは複数、特に１つまたは２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現により、宿主細胞によって生産される抗体は、完全長重鎖を含むことも、完全長重鎖の切断された変異体（本明細書では「切断された変異型重鎖」とも呼ぶ）を含むこともある。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）またはＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）とリジン（Ｋ４４７）は、存在してもしなくてもよい。Ｆｃドメイン（または本明細書において定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書では、特に断らない限り、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチドを有さないものとして示される。本発明の一実施態様では、本発明による抗体または二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様では、本発明による抗体または二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載の薬学的組成物などの本発明の組成物は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子の集団を含む。抗体または二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子および切断された変異型重鎖を有する分子を含み得る。抗体または二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と切断された変異型重鎖を有する分子との混合物からなることができ、この場合抗体または二重特異性抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、切断された変異型重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体または二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重���を含む抗体または二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、このような組成物は、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；および追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子から構成される抗体または二重特異性抗原結合分子の集団を含む。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991（上記も参照）に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一方、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００５０】
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合によるホモダイマーの形成を低減または防止する、ペプチド骨格の操作またはＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される会合を促進する修飾は、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第１および第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾を特に含み、この修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために、互いに対して相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、これらＦｃドメインサブユニットの一方または両方の構造または電荷を、それらの会合がそれぞれ立体的にまたは静電気的に望ましいものになるように変化させる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間に起こり、これらは、サブユニットの各々に融合したさらなる成分（例えば抗原結合部分）が同じでないという意味で同一ではない可能性がある。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【００５１】
用語「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、およびＢ細胞の活性化が含まれる。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「操作する、操作された、操作」という用語は、ペプチド骨格の任意の操作、または天然もしくは組換えポリペプチドもしくはその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、これらの手法の組合せが含まれる。
【００５３】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、削除、挿入および修飾を包含することを意味する。最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体への結合の減少、または別のペプチドとの会合の増加を有することを条件として、置換、削除、挿入および修飾の任意の組み合わせを行って、最終的なコンストラクトに到達することができる。アミノ酸配列の削除および挿入には、アミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の削除および挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。例えばＦｃ領域の結合特性を変化させる目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸を異なる構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸に置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸による置換、または２０の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例えば４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）による置換が含まれる。アミノ酸変異体は、当技術分野でよく知られている遺伝学的方法または化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法には、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれる。化学修飾のような遺伝子工学以外の方法でアミノ酸の側鎖基を修飾する方法も有用であると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すのに様々な表記を使用することができる。例えば、Ｆｃドメインの３２９位のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９ＧまたはＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示される。
【００５４】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である、候補配列のアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアまたはＦＡＳＴＡプログラムパッケージ等の一般に入受可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。ただし、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを備えたＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージはW. R. PearsonおよびD. J. Lipman (1988), 「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) 「Effective protein sequence comparison」 Meth. Enzymol. 266:227- 258；ならびにPearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36によって作成されたもので、http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtmlから一般に入手可能である。代替的には、http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgiからアクセスできるパブリックサーバーを使い、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラムおよびデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：−１０；ｅｘｔ：−２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して（ローカルではなく）グローバルアライメントを実行することで、これらの配列を比較することも可能である。アミノ酸の同一性パーセントは、出力アライメントヘッダーに示される。
【００５５】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子またはコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合または非通常の結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を構成し得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１または複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。
【００５６】
「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドとは、天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明においては単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（一部または大半が）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子が染色体外に、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ転写物、ならびにプラス鎖およびマイナス鎖型ならびに二本鎖型が含まれる。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により生産されたこのような分子が含まれる。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーター等の調節エレメントを含んでも含まなくてもよい。
【００５７】
「例えば本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子」をコードする単離されたポリヌクレオチド（または核酸）」は、抗体重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする１または複数のポリヌクレオチド分子を指し、これには、単一のベクターまたは別々のベクター中のこのようなポリヌクレオチド分子（複数可）、および宿主細胞中の１または複数の位置に存在するこのような核酸分子（複数可）が含まれる。
【００５８】
用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換えまたは合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片に組み込むことができる。発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列およびプロモーターが典型的に含まれる。特定の実施態様では、発現カセットは、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞内に作動可能に連結されている特定の遺伝子の発現を導入および誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクター、および導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを包含する。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が、細胞転写および／または翻訳機構により生産される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を含む発現カセットを含む。
【００６０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を、このような細胞の子孫も含め、指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、これには初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞等の哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞が含まれ、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養された植物もしくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
【００６１】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる関与に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
【００６２】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体でコートされた標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体またはその誘導体が通常Ｆｃ領域のＮ末端にあるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、用語「ＡＤＣＣの低減」は、上で定義したＡＤＣＣの機構により、標的細胞を取り囲む培地中の所定の抗体濃度で、所定の時間内に溶解される標的細胞の数の減少、および／またはＡＤＣＣの機構により、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体濃度の上昇のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準的な生産、精製、製剤化および保存方法（これらは当業者には既知である）を用いて、同じタイプの宿主細胞によって生産された同じ抗体であるが操作されていない抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較している。例えば、ＦｃドメインにＡＤＣＣを低減させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低減は、Ｆｃドメインにこのアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較している。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号または同第２０１２／１３０８３１号参照）。
【００６３】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞または組織の生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【００６４】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を得るのに必要な投与量および期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、疾患の有害作用を、例えば除去し、低下させ、遅延させ、最小化し、または妨げる。
【００６５】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えばヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えばマウスおよびラット）が含まれる。特に、個体または対象はヒトである。
【００６６】
用語「薬学的組成物」は、中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にすることができるような形態であり、組成物が投与される対象にとって許容できない毒性を有する追加の成分を含まない調製物を指す。
【００６７】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分であり、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤または保存剤が含まれる。
【００６８】
本明細書において用いられる場合、「治療」（および「治療する」などの文法的変形）は、治療されている個体の疾病の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理の過程において実施することができる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症または再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるかまたは疾患の進行を遅らせるために使用される。
【００６９】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌および／または注意事項についての情報を含む。
【００７０】
実施態様の詳細な説明
本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄ、特にヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体および二重特異性抗原結合分子を提供する。加えて、この分子は、生産可能性のみならず、治療的用途にとって好ましい他の特性、例えば有効性および／または安全性に関する特性も有する。
【００７１】
ＧＰＲＣ５Ｄ抗体
第１の態様では、本発明はＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体を提供し、該抗体は、（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００７２】
いくつかの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、かつ／またはＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、抗体は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、かつ、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【００７３】
特定の実施態様では、（ｉ）ＶＨは、配列番号１３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号１４の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｉ）ＶＨは、配列番号１５の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号１６の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号４８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号５３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４９の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号５２の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｖ）ＶＨは、配列番号５７の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号６４の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み；または（ｖｉ）ＶＨは、配列番号５８の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ＶＬは、配列番号６３の配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸を含む。
【００７４】
特定の実施態様では、抗体は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬとを含み；または（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨと、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬとを含み；または（ｉｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨと、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬとを含み；または（ｉｖ）配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬとを含み；または（ｖ）配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬと含み；または（ｖｉ）配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨと、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬと含む。
【００７５】
別の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体は完全長抗体である。別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子およびＦ（ａｂ’）２分子の群より選択される抗体断片である。一実施態様において、抗体は多重特異性抗体である。
【００７６】
特定の実施態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨまたはＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入または削除を含むが、その配列を含む抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄへの結合能を保持する。ある実施態様では、配列番号１３において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号１４において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号１５において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号１６において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号４８において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号５３において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号４９において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号５２において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号５７において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号６４において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号５８において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されており、かつ／または配列番号６３において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入および／もしくは削除されている。
【００７７】
特定の実施態様において、置換、挿入または削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意選択的に、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号１３にＶＨ配列を、および／または配列番号１４にＶＬ配列含む。任意選択的に、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号１５にＶＨ配列を、および／または配列番号１６にＶＬ配列含む。任意選択的に、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号４４８にＶＨ配列を、および／または配列番号５３にＶＬ配列含む。任意選択的に、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号４９にＶＨ配列を、および／または配列番号５２にＶＬ配列含む。任意選択的に、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号５７にＶＨ配列を、および／または配列番号６４にＶＬ配列含む。任意選択的に、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号５８にＶＨ配列を、および／または配列番号６３にＶＬ配列含む。
【００７８】
一実施態様において、抗体は、配列番号１３および配列番号１５の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【００７９】
一実施態様において、抗体は、配列番号１３および配列番号１２の群より選択されるＶＨ配列と、配列番号１６のＶＬ配列とを含む。
【００８０】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
【００８１】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む。
【００８２】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号４８のＶＨ配列と配列番号５３のＶＬ配列とを含む。
【００８３】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号４９のＶＨ配列と配列番号５２のＶＬ配列とを含む。
【００８４】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号５７のＶＨ配列と配列番号６４のＶＬ配列とを含む。
【００８５】
特定の実施態様では、抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号５８のＶＨ配列と配列番号６３のＶＬ配列とを含む。
【００８６】
一実施態様において、抗体は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＬドメインを含むＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３７および３８（それぞれヒトカッパおよびラムダのＣＬドメイン）、ならびに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示されている。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号３７または配列番号３９のアミノ酸配列、特に配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載されるように、Ｆｃドメインにおけるアミノ酸変異を含み得る。
【００８７】
一実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【００８８】
一実施態様において、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体は完全長抗体である。
【００８９】
一実施態様において、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ  Ｆｃドメイン、さらに詳細にはＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。一実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。抗体のＦｃドメインは、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。
【００９０】
別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子およびＦ（ａｂ’）２分子の群より選択される抗体断片、特にＦａｂ分子である。別の実施態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディである。
【００９１】
さらなる態様では、上記実施態様のいずれかによる抗体は、以下のセクションに記載される特徴のいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。
【００９２】
グリコシル化変異体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大または低減させるように修飾される。抗体へのグリコシル化部位の付加または削除は、１または複数のグリコシル化部位が作成または除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより、簡便に達成することができる。
【００９３】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合するオリゴ糖を変化させてもよい。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって通常結合している分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよびシアル酸の他、二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するためになされ得る。
【００９４】
一実施態様において、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接的にまたは間接的に）結合したフコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体変異体が提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化された」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分岐オリゴ糖構造の幹の第１のＧｌｃＮＡｃに結合したフコース残基を欠くＮ−結合型オリゴ糖である。一実施態様においては、天然抗体または親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している抗体変異体が提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、または約１００％（すなわちフコシル化オリゴ糖は存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、例えば国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定された、Ａｓｎ２９７に結合したすべてのオリゴ糖（例えば複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）の合計に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列変異に起因して、２９７位から上流または下流におよそ±３アミノ酸、すなわち２９４位から３００位の間に位置する場合もある。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したこのような抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合の改善および／またはエフェクター機能の改善、特にＡＤＣＣ機能の改善を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。
【００９５】
フコシル化が低下した抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質のフコシル化が欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；および国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えばYamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；および国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）、またはＧＤＰ−フコース合成もしくは輸送タンパク質の活性が低下もしくは停止されている細胞（例えば米国特許第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号参照）が含まれる。
【００９６】
さらなる実施態様では、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている抗体変異体が提供される。このような抗体変異体は、上述のように、低下したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えばUmana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); 国際公開第９９／５４３４２号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。
【００９７】
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；および同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【００９８】
システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１または複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作製することが望ましい。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書でさらに説明するように、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを作成するために使用できる。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号、同第８３０９３０号、同第７８５５２７５号、同第９０００１３０号または国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成され得る。
【００９９】
抗体誘導体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分には水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分岐でも未分岐でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、１を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療に使用されるかどうかなどを含めた（ただし、これらに限定されない）考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１００】
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005）。放射線は、任意の波長であってよく、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅する温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含むがこれに限定されない。
【０１０１】
イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素またはこれらの断片）または放射性同位体等、１または複数の治療剤にコンジュゲート（化学的に結合）した、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１０２】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が上述の１または複数の治療剤にコンジュゲートしている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は、典型的には、リンカーを用いて１または複数の治療剤に接続される。治療剤および薬物ならびにリンカーの例を含むＡＤＣ技術の概要は、Pharmacol Review 68:3-19 (2016)に明記されている。
【０１０３】
別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（エノマイシン）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含む（ただし、これらに限定されない）酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートしている、本明細書に記載の抗体を含む。
【０１０４】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートの生産のために利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。検出のために用いられるとき、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、ここでもヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄等を含む。
【０１０５】
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、および二活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res.52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０１０６】
本明細書のイムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、限定されないが、（例えば米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から）市販されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートを明確に意図している。
【０１０７】
多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。特定の実施態様では、結合特異性の１つはＧＰＲＣ５Ｄに対するものであり、他の（２つ以上の）特異性は、他の任意の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄの２つ（以上）の異なるエピトープに結合することができる。多重特異性（例えば二重特異性）抗体を使用して、細胞傷害性剤または細胞をＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞に局在化させることもできる。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０１０８】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature305: 537 (1983)参照）および「ノブ・イン・ホール」技術（例えば米国特許第５７３１１６８号およびAtwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)を参照）が含まれる。また、多重特異抗体は、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（例えば国際公開第２００９／０８９００４号参照）；２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を生産すること（例えばKostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)および国際公開第２０１１／０３４６０５号参照）；共通軽鎖の技術を使用して軽鎖の誤対合問題を回避すること（例えば国際公開第９８／５０４３１号参照）；「ダイアボディ」技術を使用して、二重特異性抗体断片を作製すること（例えばHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)参照）；および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えばGruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)参照）；例えばTutt et al. J. Immunol.147: 60 (1991)に記載されているように三重特異性抗体を調製することによって作製することもできる。
【０１０９】
例えば「オクトパス抗体」またはＤＶＤ−Ｉｇなど、３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば国際公開第２００１／７７３４２号および同第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、および国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。二重特異性抗体またはその抗原結合断片には、ＧＰＲＣ５Ｄおよび別の異なる抗原、またはＧＰＲＣ５Ｄの２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号および国際公開第２０１５／０９５５３９号参照）。
【０１１０】
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ以上の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメインを（例えば国際公開第２００９／０８０２５２号および同第２０１５／１５０４４７号参照）、ＣＨ１／ＣＬドメインを（例えば国際公開第２００９／０８０２５３号参照）、または完全なＦａｂアームを（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号参照、また、Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191およびKlein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20も参照）を交換することによっても提供され得る。非対称Ｆａｂアームは、荷電または非荷電アミノ酸変異をドメイン界面に導入して、正しいＦａｂ対合を誘導することによっても操作され得る。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照のこと。
【０１１１】
多重特異性抗体の種々のさらなる分子フォーマットが、当技術分野で既知であり、本明細書に含まれる（例えば、Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106参照）。
【０１１２】
本明細書にも含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞を死滅させるためのＴ細胞の再標的化のために、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化不変成分、例えばＣＤ３と、標的細胞（例えば標的細胞）上の表面抗原とに同時結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、特に結合特異性の一方がＧＰＲＣ５Ｄに対するものであり、他方がＣＤ３に対するものである二重特異性抗体である。
【０１１３】
このために有用であり得る二重特異性抗体フォーマットの例には、限定されないが、２つのｓｃＦｖ分子が可動性リンカーにより融合している、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（例えば国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号および同第２００８／１１９５６７号、Nagorsen and Baeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011))；ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)）およびその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)）；ダイアボディフォーマットに基づくがさらなる安定化のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)）、ならびに全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子である、いわゆるトリオマブ（triomab）（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010）に概説）が含まれる。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、同第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498に記載されている。
【０１１４】
ＧＰＲＣ５Ｄと第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合分子
本発明は、二重特異性抗原結合分子、すなわち２つの異なる抗原決定基  （第１および第２の抗原）に特異的に結合することのできる少なくとも２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子も提供する。
【０１１５】
本発明の特定の実施態様によれば、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分はＦａｂ分子  （すなわち、それぞれが可変および定常ドメインを含む重鎖および軽鎖から構成される抗原結合ドメイン）である。一実施態様において、第１および／または第２の抗原結合部分はＦａｂ分子である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト分子である。特定の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト重鎖および軽鎖定常ドメインを含む。
【０１１６】
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも１つはクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を減少させ、それにより組換え生産において本発明の二重特異性抗原結合分子の収率および純度を向上させる。本発明の二重特異性抗原結合分に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬとＶＨ）が交換されている。しかしながら、このようなドメイン交換によっても、二重特異性抗原結合分子の調製は、誤対合した重鎖と軽鎖間の、いわゆるベンズ・ジョーンズ型の相互作用に起因する特定の副生成物を含み得る（Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191参照）。異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖の誤対合をさらに減少させ、したがって所望の二重特異性抗原結合分子の純度と収率を向上させるために、反対の電荷を帯びる荷電アミノ酸を、第１の抗原（ＧＰＲＣ５Ｄ）に結合するＦａｂ分子（複数可）または第２の抗原（例えばＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原）のいずれかに結合するＦａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に導入することができる。これについては後述する。電荷改変（charge modification）は、二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（例えば図１Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｊに示すような）または二重特異性抗原結合分子に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（複数可）（例えば図１Ｄ−Ｆ、Ｋ−Ｎに示すような）のいずれかにおいて行われる（ただし両方で行われることはない）。特定の実施態様では、電荷改変は、二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（特定の実施態様において第１の抗原、すなわちＧＰＲＣ５Ｄに結合するもの）において行われる。
【０１１７】
本発明による特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）と，第２の抗原（例えば活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３）とに同時結合することができる。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄと活性化Ｔ細胞抗原とに同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。さらに特定の実施態様では、このような同時結合は、標的細胞、特にＧＰＲＣ５Ｄ発現腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。他の実施態様では、このような同時結合は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄへの同時結合を含まない、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３への二重特異性抗原結合分子の結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらさない。
【０１１８】
一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞へ再方向付けする（re-directing）ことができる。特定の実施態様では、前記再方向付けは、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示および／またはＴ細胞の特異性とは無関係である。
【０１１９】
特に、本発明の実施態様のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞、特にＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０１２０】
第１の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄ（第１の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する２つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。このような特定の実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に結合する。さらに特定の実施態様では、これら抗原結合部分のすべては同一であり、すなわちそれらは、本明細書に記載されるような（存在すれ場合）ＣＨ１およびＣＬドメイン内に同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する２つ以下の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
【０１２１】
特定の実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。このような実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。
【０１２２】
代替的実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。このような実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。
【０１２３】
ＧＰＲＣ５Ｄ結合部分は、二重特異性抗原結合分子を標的部位へと、例えばＧＰＲＣ５Ｄを発現する特定のタイプの腫瘍細胞へと方向付けることができる。
【０１２４】
科学的に明らかに不合理または不可能でない限り、二重特異性抗原結合分子の第１の抗原結合部分は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。
【０１２５】
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、および（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、および（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、およに（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、および（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、および（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、およに（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、および（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分はヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、かつ／またはＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、上記いずれかの実施態様におけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【０１２７】
一実施態様において、第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７および配列番号５８の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３および配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７および配列番号５８の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３および配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
【０１２９】
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７および配列番号５８の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３および配列番号６４の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【０１３０】
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７および配列番号５８の群より選択されるＶＨ配列と、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３および配列番号６４の群より選択されるＶＬ配列とを含む。
【０１３１】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
【０１３２】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む。
【０１３３】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４８のＶＨ配列と配列番号５３のＶＬ配列とを含む。
【０１３４】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４９のＶＨ配列と配列番号５２のＶＬ配列とを含む。
【０１３５】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５７のＶＨ配列と配列番号６４のＶＬ配列とを含む。
【０１３６】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５８のＶＨ配列と配列番号６３のＶＬ配列とを含む。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１および／またはＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３７および３８（それぞれヒトカッパおよびラムダのＣＬドメイン）、ならびに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示されている。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３７または配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得、かつ／またはクロスオーバーＦａｂ分子にある場合は１つ以上の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の削除もしくは置換を含み得る。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
【０１３７】
第２の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原（ＧＰＲＣ５Ｄとは異なる）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
【０１３８】
特定の実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）に結合する抗原結合部分（複数可）は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。二重特異性抗原結合分子に含まれるＧＰＲＣ５Ｄに結合する複数の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
【０１３９】
代替的な実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。二重特異性抗原結合分子に含まれる第２の抗原に結合する複数の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
【０１４０】
いくつかの実施態様では、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原（「活性化Ｔ細胞抗原結合部分」または「活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）である。特定の一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合能を有する１つ以下の抗原結合部分を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原への一価の結合を提供する。
【０１４１】
特定の実施態様では、第２の抗原はＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号４０）またはカニクイザルＣＤ３（配列番号４１）、最も特にはヒトＣＤ３である。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒトおよびカニクイザルのＣＤ３に交差反応性である（すなわち特異的に結合する）。いくつかの実施態様では、第２の抗原は、ＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３エプシロン）である。
【０１４２】
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２９のＨＣＤＲ１、配列番号３０のＨＣＤＲ２、配列番号３１のＨＣＤＲ３、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３３のＬＣＤＲ２および配列番号３４のＬＣＤＲ３を含む。
【０１４３】
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２９のＨＣＤＲ１、配列番号３０のＨＣＤＲ２および配列番号３１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３３のＬＣＤＲ２および配列番号３４のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
【０１４４】
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分はヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、かつ／またはＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、上記いずれかの実施態様におけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【０１４５】
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬ配列を含む。
【０１４６】
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
【０１４７】
一実施態様において、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【０１４９】
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のＶＨ配列と配列番号３６のＶＬ配列とを含む。
【０１５０】
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１および／またはＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３７および３８（それぞれヒトカッパおよびラムダのＣＬドメイン）、ならびに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示されている。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号３７または配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得、かつ／またはクロスオーバーＦａｂ分子にある場合は１つ以上の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の削除もしくは置換を含み得る。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
【０１５１】
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である（すなわち、このような実施態様によれば、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変または定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。このような一実施態様では、第１の（および存在する場合は第３の）抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
【０１５２】
一実施態様では、第２の抗原（例えばＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原）に結合する１つ以下の抗原結合部分が、二重特異性抗原結合分子中に存在する（すなわち二重特異性抗原結合分子は第２の抗原への一価の結合を提供する）。
【０１５３】
電荷改変
本発明の二重特異性抗原結合分子は、それに含まれるＦａｂ分子にアミノ酸置換を含むことができ、これは、その結合アームの１つ（または３つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合、２つ以上）にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の生産の際に生じ得る、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合（ベンズ・ジョーンズ型副生成物）を減少させるのに特に有効である（参照によりその全体が本明細書に援用されるＰＣＴ出願番号国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその実施例も参照されたい）。望ましくない副産物、特に結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗原結合分子において生じるベンズ・ジョーンズ型副生成物と比較した場合の所望の二重特異性抗原結合分子の比率は、ＣＨ１およびＣＬドメイン内の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに（本明細書では時に「電荷改変」と呼ばれることもある）より改善され得る。
【０１５４】
したがって、二重特異性抗原結合分子の第１および第２の抗原結合部分の両方がＦａｂ分子であり、抗原結合部分の一方（特に第２の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているいくつかの実施態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸が正に帯電したアミノ酸により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸が負に帯電したアミノ酸により置換されているか（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；あるいは
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸が正に帯電したアミノ酸により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸が負に帯電したアミノ酸により置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５５】
二重特異性抗原結合分子は、ｉ）およびｉｉ）に記載の修飾の両方を含むことはない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合部分の定常ドメインＣＬとＣＨ１は、互いによって置き換えられない（すなわち交換されないまま）。
【０１５６】
さらに特定の実施態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されているか（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；あるいは
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５７】
このような一実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５８】
さらなる実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１５９】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６０】
さらに特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６１】
さらに特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６２】
特定の実施態様では、上記実施態様によるアミノ酸置換が第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬと定常ドメインＣＨ１で行われる場合、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。
【０１６３】
代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換が第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬと定常ドメインＣＨ１の代わりに、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬと定常ドメインＣＨ１で行われてもよい。このような特定の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
【０１６４】
したがって、一実施態様において、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６５】
さらなる実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６６】
また別の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６７】
一実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６８】
別の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、かつ、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６９】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７０】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７１】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７２】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７３】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７４】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７５】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、ならびに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、かつ、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では、独立に、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、かつ、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立に置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１７６】
二重特異性抗原結合分子のフォーマット
本発明による二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構成で互いに融合することができる。例示的構成を図１Ａ−Ｚに示す。
【０１７７】
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分はＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１、第２、第３（など）の抗原結合部分は、本明細書において、それぞれ第１、第２、第３（など）のＦａｂ分子と呼ばれることがある。
【０１７８】
一実施態様において、二重特異性抗原結合分子の第１および第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。特定の実施態様では、第１および第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子である。このような一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のこのような実施態様では、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している実施態様では、これに加えて、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とが、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。
【０１７９】
ＧＰＲＣ５Ｄのような標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分（例えばＦａｂ分子）を有する二重特異性抗原結合分子（例えば図１Ａ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｋ、１Ｌに示すような）は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内在化が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内在化を増進させ、それによりその利用可能性を低下させる。
【０１８０】
しかしながら、他の場合には、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分（例えばＦａｂ分子）を含む二重特異性抗原結合分子（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍまたは１Ｎに示される例を参照）を有することは、例えば標的部位への標的化を最適化するため、または標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。
【０１８１】
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分を含む。
【０１８２】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、第１の抗原，すなわちＧＰＲＣ５Ｄに結合する。一実施態様では、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。
【０１８３】
一実施態様において、第３の抗原部分は第１の抗原結合部分と同一である。
【０１８４】
科学的に明らかに不合理または不可能でない限り、二重特異性抗原結合分子の第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分および／またはＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。
【０１８５】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１８６】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１８７】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１８８】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１８９】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１９０】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号６のＬＣＤＲ２および配列番号７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１９１】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１９２】
いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分はヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、かつ／またはＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第３の抗原結合部分は、上記いずれかの実施態様におけるＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【０１９３】
一実施態様において、第３の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７および配列番号５８の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第３の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３および配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
一実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７および配列番号５８の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３および配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
【０１９５】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７および配列番号５８の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３および配列番号６４の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【０１９６】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７および配列番号５８の群より選択されるＶＨ配列と、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３および配列番号６４の群より選択されるＶＬ配列とを含む。
【０１９７】
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
【０１９８】
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む。
【０１９９】
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４８のＶＨ配列と配列番号５３のＶＬ配列とを含む。
【０２００】
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４９のＶＨ配列と配列番号５２のＶＬ配列とを含む。
【０２０１】
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５７のＶＨ配列と配列番号６４のＶＬ配列とを含む。
【０２０２】
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５８のＶＨ配列と配列番号６３のＶＬ配列とを含む。
【０２０３】
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１および／またはＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３７および３８（それぞれヒトカッパおよびラムダのＣＬドメイン）、ならびに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に示されている。いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号３７または配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得、かつ／またはクロスオーバーＦａｂ分子にある場合は１つ以上の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の削除もしくは置換を含み得る。いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
【０２０４】
特定の実施態様では、第３および第１の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同一である。したがって、このような実施態様では、第１および第３の抗原結合部分は、同じ重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン構成を有する（すなわち従来のまたはクロスオーバー））。さらに、このような実施態様では、第３の抗原結合部分は、存在する場合、第１の抗原結合部分と同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書に「電荷改変」として記載されるアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分および第３の抗原結合部分の各々の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１において行われる。代替的に、前記アミノ酸置換は、（特定の実施態様ではＦａｂ分子でもある）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１において行われてもよいが、第１の抗原結合部分および第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１では行われない。
【０２０５】
第１の抗原結合部分と同様に、第３の抗原結合部分は特に従来のＦａｂ分子である。ただし、第１および第３の抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である（かつつ、第２の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である）実施態様も考慮される。したがって、特定の実施態様では、第１および第３の抗原結合部分はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他の実施態様において、第１および第３の抗原結合部分はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
【０２０６】
第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様では、第１および第３の抗原部分はＧＰＲＣ５Ｄに結合し、第２の抗原結合部分は第２の抗原、特に活性化Ｔ細胞抗原、さらに具体的にはＣＤ３、最も具体的にはＣＤ３エプシロンに結合する。
【０２０７】
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットは、安定した会合をすることができる。
【０２０８】
本発明による二重特異性抗原結合分子は、異なる構成を有することができる、すなわち第１、第２の（および任意選択的に第３の）抗原結合部分は、互いに、およびＦｃドメインに、異なる方法で融合することができる。これらの成分は互いに直接、または好ましくは１つ以上の適切なペプチドリンカーを介して融合することができる。Ｆａｂ分子の融合先がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端である場合、融合は、典型的には免疫グロブリンのヒンジ領域を介している。
【０２０９】
いくつかの実施態様では、第１および第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、またはＦｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
【０２１０】
一実施態様において、第１および第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１および第２のＦａｂ分子と、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｇおよび１Ｋに模式的に示されている（これらの例における第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合していてもよい。
【０２１１】
別の実施態様では、第１および第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１および第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１および第２のＦａｂ分子と、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーから本質的になり、第１および第２のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ａおよび１Ｄに模式的に示されている（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。第１および第２のＦａｂ分子は、直接、またはペプチドリンカーを介して間接的にＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様では、第１および第２のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【０２１２】
いくつかの実施態様では、第１および第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に、または（上述のように）Ｆｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
【０２１３】
一実施態様において、第１および第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１および第２のＦａｂ分子と、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｈおよび１Ｌに模式的に示されている（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合していてもよい。
【０２１４】
いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第１および第３のＦａｂ分子はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は本明細書に記載れるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１および第３のＦａｂ分子はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
【０２１５】
特定のこのような実施態様では、第２および第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２および第３のＦａｂ分子と、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｂおよび１Ｅ（これらの例では第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）と、図１Ｊおよび１Ｎ（これらの例では第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。第２および第３のＦａｂ分子は、直接またはペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様では、第２および第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてもよい。
【０２１６】
別のこのような実施態様では、第１および第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２および第３のＦａｂ分子と、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｃおよび１Ｆ（これらの例では第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）と、図１Ｉおよび１Ｍ（これらの例では第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。第１および第３のＦａｂ分子は、直接またはペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の実施態様では、第１および第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてもよい。
【０２１７】
Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端において免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインの各サブユニットのＮ末端に融合している二重特異性抗原結合分子の構成においては、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域およびＦｃドメインは、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらに特定の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。さらなる特定の実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである。一実施態様において、免疫グロブリンはヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
【０２１８】
本発明の二重特異性抗原結合分子のいくつかでは、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。第１および第２のＦａｂ分子の構成に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しているか、または第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合している。第１および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合はさらに、マッチしないＦａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の誤対合を減少させ、また本発明のいくつかの二重特異性抗原結合分子の発現に必要なプラスミドの数を減少させる。
【０２１９】
抗原結合部分は、直接または、１つ以上のアミノ酸、典型的には約２−２０のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインに、または互いに融合していてもよい。ペプチドリンカーは当分野において既知であり、本願明細書に記載されている。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎまたは４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５のアミノ酸長を、一実施態様では５から１００、さらなる実施態様では１０から５０のアミノ酸長を有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎまたは（ＧｘＳ）ｎＧｍ［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３，４，５または６、ｍ＝０，１，２または３）または（ｘ＝４、ｎ＝２，３，４または５、ｍ＝０，１，２または３）］であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２または３であり、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１および第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるのに特に特に適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１および第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖を接続するのに適切な例示的ペプチドリンカーは、配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４３および４４）を含む。別の適切なこのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。Ｆａｂ分子は、特にＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合、追加のペプチドリンカーの有無に関わらず、免疫グロブリンヒンジ領域またはその一部を介して融合され得る。
【０２２０】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含んでいる）、ひいてはカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインのサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
【０２２１】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており（すなわち第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、ひいてはカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインのサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
【０２２２】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいてはＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいてはＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【０２２３】
これらの実施態様のいくつかでは、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。これらの実施態様のその他では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、または、必要に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２））をさらに含む。
【０２２４】
これらの実施態様による二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、または（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））とをさらに含み得る。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
【０２２５】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ端末ペプチド結合を共有し、ひいてはＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいてはＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【０２２６】
これら実施態様のいくつかでは、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。これらの実施態様のその他では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＬ（１））、または、必要に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））をさらに含む。
【０２２７】
これらの実施態様による二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、または（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））とをさらに含み得る。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
【０２２８】
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子と、存在する場合第３のＦａｂ分子は、各々が従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬまたは定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子と、存在する場合第３のＦａｂ分子は、各々がクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
【０２２９】
このような一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１および第２の抗原結合部分と、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーから本質的になり、第１および第２の抗原結合部分は共にＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｏおよび１Ｓに模式的に示されている（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。
【０２３０】
別のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は第１および第２の抗原結合部分と、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第１および第２の抗原結合部分は共にＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｐおよび１Ｔに模式的に示されている（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。
【０２３１】
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２および第３のＦａｂ分子と、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーかり本質的になり、ここで第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｑおよび１Ｕ（これらの例では、第２の抗原結合ドメインがＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１および抗原結合部分の各々が従来のＦａｂ分子である）、または図１Ｘおよび１Ｚ（これらの例では、第２の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合部分の各々がＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。
【０２３２】
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２および第３のＦａｂ分子と、任意選択的に１つ以上のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。このような構成は、図１Ｒおよび１Ｖ（これらの例では、第２の抗原結合ドメインがＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１および抗原結合部分の各々が従来のＦａｂ分子である）、または図１Ｗおよび１Ｙ（これらの例では、第２の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子であり、第１および第３の抗原結合部分の各々がＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。
【０２３３】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。
【０２３４】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。
【０２３５】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。
【０２３６】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。
【０２３７】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０２３８】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＬ（２）を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０２３９】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０２４０】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（３）−ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０２４１】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第１のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０２４２】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第１のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいて第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第３のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（３）−ＣＬ（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））をさらに含む。
【０２４３】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第１のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３））をさらに含む。
【０２４４】
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第３のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、ひいては第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第１のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ひいては第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＬ（３）−ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＨ１（３））をさらに含む。
【０２４５】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２４６】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２４７】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２４８】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２４９】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５０】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５１】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５２】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５３】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５４】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５５】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５６】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５７】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５８】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、または定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２５９】
本発明による二重特異性抗原結合分子の様々な構成のすべてにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換は、存在する場合、第１および（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメイン、または第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインに存在し得る。好ましくは、そのような置換は、第１および（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインに存在する。本発明の概念によれば、本発明に記載されるアミノ酸置換が第１（および存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子においては行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子で行われる場合、そのようなアミノ酸置換は第１（および存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子においては行われない。アミノ酸置換は、特に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子を含む二重特異性抗原結合分子において行われる。
【０２６０】
特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１（および存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる、本発明による二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、第１（および存在する場合第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子で行われる、本発明による二重特異性抗原結合分子の他の実施態様では、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。いくつかの実施態様では、第１（および存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬおよび第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。
【０２６１】
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；かつ、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２６２】
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；かつ、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２６３】
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；かつ、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２６４】
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；かつ、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２６５】
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；かつ、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２６６】
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；かつ、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２６７】
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；かつ、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２６８】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２６９】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７０】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７１】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７２】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７３】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７４】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；ならびに
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分およびｃ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７５】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７６】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２および配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２および配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７７】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７８】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２７９】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ２および配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２および配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２８０】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２および配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２８１】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ２および配列番号９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ２および配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；
ｂ）活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３、さらに具体的にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
ａ）の第１の抗原結合部分およびｂ）の第２の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２８２】
上記実施態様のいずれによっても、二重特異性抗原結合分子の成分（例えばＦａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接または、本明細書に記載されているかもしくは当技術分野で既知である様々なリンカー、特に１つ以上のアミノ酸、典型的には約２−２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合され得る。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ，（Ｇ４Ｓ）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここでｎは通常１から１０、典型的には２から４の整数である。
【０２８３】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）ＧＰＲＣ５Ｄである第１の抗原に結合する、第１および第３の抗原結合部分であって、各々配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１および第３の抗原結合部分；
ｂ）ＣＤ３である第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｄ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ａ）の第１および第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１および第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびａ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２８４】
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）ＧＰＲＣ５Ｄである第１の抗原に結合する、第１および第３の抗原結合部分であって、各々配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１および第３の抗原結合部分；
ｂ）ＣＤ３である第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ａ）の第１および第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も特にはアルギニン（Ｒ）によって）、ａ）の第１および第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、ａ）の第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分およびａ）の第３の抗原結合部分が各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端に融合している。
【０２８５】
本発明のこの態様による一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２８６】
本発明のこの態様によるさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、または３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２８７】
本発明のこの態様によるまた別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基で置き換えられる（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２８８】
本発明のこの態様によるまた別の実施態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。
【０２８９】
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらに特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２９０】
別の特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらに特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０２９１】
Ｆｃドメイン
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。二重特異性抗原結合分子に関連して本明細書に記載されるＦｃドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるＦｃドメインに等しく当てはまる。
【０２９２】
二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン  Ｇ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットはＣＨ２およびＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、多くて１つのＦｃドメインを含む。
【０２９３】
一実施態様において、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を減少させる（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)参照)。さらなる特定の一実施態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。さらに特定の実施態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号４２に提示されている。
【０２９４】
ヘテロダイマー化を促すＦｃドメインの修飾
本発明による二重特異性抗原結合分子は複数の異なる抗原結合部分を含み、これらはＦｃドメインの２つのサブユニットの一方または他方に融合することができ、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは通常、２つの非同一のポリペプチド鎖に含まれている。これらポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組換え生産における二重特異性抗原結合分子の収率および純度を改善するためには、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
【０２９５】
すなわち、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促す修飾を含んでいる。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２つのサブユニット間でタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
【０２９６】
ヘテロダイマー化を実施するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおける修飾のための複数の手法が存在し、それらについては例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に詳細な記載がある。典型的には、そのような手法のすべてにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは共に、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）がそれ自体ともはやホモダイマー化することがないが、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロダイマー化するように（よって第１と第２のＣＨ３ドメインがヘテロダイマー化し、２つの第１のＣＨ３ドメイン間または２つの第２のＣＨ３ドメイン間にホモダイマーが形成されないように）相補的に操作される。重鎖ヘテロダイマー化の改善のためのこれら様々な手法は、重鎖／軽鎖誤対合およびベンズ・ジョーンズ型副生成物を減少させる二重特異性抗原結合分子における重鎖−軽鎖修飾（例えば１つの結合アームにおけるＶＨとＶＬの交換／置き換えおよびＣＨ１／ＣＬ界面における、反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた様々な代替法として考慮される。
【０２９７】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む。
【０２９８】
「ノブ・イントゥー・ホール」技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)および Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、この方法は、隆起（「ノブ」）を第１のポリペプチドの界面に導入し、対応する空洞（「ホール」）を第２のポリペプチドの界面に導入することを伴い、その結果隆起が空洞内に配置されて、ヘテロ二量体形成を促進し、かつ、ホモ二量体形成を妨げることができるようになる。隆起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより構築される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより、隆起と同一または類似のサイズの代償的な空洞が第２のポリペプチドの界面に作られる。
【０２９９】
このように、特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【０３００】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
【０３０１】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）からなる群より選択される。
【０３０２】
隆起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、またはペプチド合成により変化させることにより作製することができる。
【０３０３】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３０４】
またさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、または３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらにダイマーを安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３０５】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３０６】
特定の実施態様では、第２の抗原（例えば活性化Ｔ細胞抗原）に結合する抗原結合部分は、（任意選択的に、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する第１の抗原結合部分および／またはペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に融合する。理論に縛られることを望まないが、活性化Ｔ細胞抗原などの第２の抗原に結合する抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、活性化Ｔ細胞抗原に結合する２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成を（さらに）最小化するであろう（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。
【０３０７】
ヘテロダイマー化を実施するためのＣＨ３修飾の他の技術が、本発明による代替法として考慮されており、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
【０３０８】
一実施態様では、ＥＰ第１８７０４５９号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面内の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づいている。本発明の二重特異性抗原結合分子の１つの好ましい実施態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０ＥおよびＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）である。
【０３０９】
別の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらにはＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（Ｋａｂａｔ  Ｅｕインデックスによる番号付け）を含む。
【０３１０】
別の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、または前記二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、さらにＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０ＥおよびＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ（すべてＫａｂａｔ  Ｅｕインデックスによる番号付け）を含む。
【０３１１】
一実施態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９ＤおよびＬ３６８Ｅより選択されるアミノ酸変異（好ましくはＬ３６８Ｅ）（Ｋａｂａｔ  Ｅｕインデックスによる番号付け）をさらに含む。
【０３１２】
一実施態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０またはＫ３９２の位置に、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１ＥまたはＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９ＹまたはＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＶまたはＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０ＫまたはＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＦまたはＫ３９２Ｅから選択される、さらなるアミノ酸変異（Ｋａｂａｔ  Ｅｕインデックスによる番号付け）を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９ＲおよびＳ４００Ｒ（Ｋａｂａｔ  Ｅｕインデックスによる番号付け）をさらに含む。
【０３１３】
一実施態様では、例えば３６８および４０９からなる群より選択される位置（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）にアミノ酸修飾を用いる、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されたヘテロダイマー化の手法が代替的に使用される。
【０３１４】
一実施態様では、上述のノブ・イントゥー・ホール技術をやはり使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載のヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。
【０３１５】
一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０３１６】
一実施態様では、二重特異性抗原結合分子またはそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。
【０３１７】
代替的な一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるがヘテロ二量体化が静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面の１つ以上のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基によって置き換えることを伴う。このような一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２またはＮ３９２のアミノ酸置換（例えばグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２ＤまたはＮ３９２Ｄ）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正に帯電したアミノ酸でのＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６またはＥ３５７のアミノ酸置換（例えばリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６ＫまたはＥ３５７Ｋ、さらに好ましくはＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸でのＫ４０９またはＲ４０９のアミノ酸置換（例えばグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９ＤまたはＲ４０９Ｄ）をさらに含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸（例えばグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ））でのＫ４３９および／またはＫ３７０のアミノ酸置換（すべてＫａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を追加的にまたは代替的に含む。
【０３１８】
またさらなる実施態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２ＫおよびＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０ＫおよびＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３１９】
さらに別の実施態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されたヘテロダイマー化手法を代替的に使用することができる。
【０３２０】
一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０３２１】
Ｆｃ受容体の結合および／またはエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合分子（または抗体）に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような特性には、標的組織中への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、および望ましい組織−血液分配比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞へではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への二重特異性抗原結合分子（または抗体）の望ましくない標的化をもたらし得る。さらには、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化は、活性化Ｔ細胞特性（例えば、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合分子の実施態様において）および二重特異性抗原結合分子の長い半減期と組み合わせて、サイトカイン放出をもたらす可能性があり、その結果、サイトカイン受容体の過剰な活性化および全身投与時の重篤な副作用が生じる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を有する）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によってＴ細胞が破壊される可能性があるため、二重特異性抗原結合分子（特に、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合分子）の有効性を低下させる可能性さえある。
【０３２２】
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下および／またはエフェクター機能の低下を呈する。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（または天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を呈し、かつ／または、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（または天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、エフェクター機能を呈する。一実施態様では、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、かつ／またはエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、さらに具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびサイトカイン分泌の群から選択される１つまたは複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（または天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）の約７０％、特に約８０％を上回る、さらには特に約９０％を上回る、ＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。
【０３２３】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、かつ／またはエフェクター機能が低下するように操作される。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性および／またはエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ１つ以上のアミノ酸変異がＦｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、または少なくとも１０分の１低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらアミノ酸変異の組合せにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、または少なくとも５０分の１低下し得る。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、非操作型Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子と比較して、２０％未満、特に１０％未満、さらに特には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）がＦｃドメインの非操作型形態（またはＦｃドメインの前記非操作型形態を含む二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％を上回る親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、または前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、約８０％超、場合によっては約９０％超のこのような親和性を呈し得る。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較してエフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下には、限定されないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、またはＴ細胞プライミングの低減のうちの１または複数が含まれ得る。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、およびサイトカイン分泌の低減からなる群より選択される１または複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、低減したＡＤＣＣは、非操作型Ｆｃドメイン（または非操作型Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０３２４】
一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性および／またはエフェクター機能を低下させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１およびＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。そのような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。さらに具体的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位に、ならびにＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７およびＰ３３１より選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４およびＬ２３５位にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ  （「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」  または「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、特定の実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含み  （Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付け）、すなわちＦｃドメインの第１および第２のサブユニットの各々では、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基で置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３２５】
そのような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体（および補体）結合をほぼ完全に無効にする。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、およびＦｃ受容体結合またはエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。
【０３２６】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下およびエフェクター機能の低下を呈する。よって、いくつかの実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するその結合親和性および／またはそのエフェクター機能をさらに低下させるために、Ｌ２３５位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５およびＰ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメインの突然変異体およびそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０３２７】
特定の実施態様では、天然のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下および／またはエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａおよび任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインであるか、またはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、および任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３２８】
特定の実施態様ではＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７位におけるアミノ酸置換、特にアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）またはアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）により置き換えるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０３２９】
上記および国際公開第２０１２／１３０８３１号において記載されているＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能の低下を有するＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１または複数の置換を有するものも含まれる（米国特許第６７３７０５６号）（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７および３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。
【０３３０】
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的または化学的方法を用いるアミノ酸の削除、置換、挿入または修飾により調製することができる。遺伝学的方法には、ＤＮＡコード配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。ヌクレオチドの正しい変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０３３１】
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、またはＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥヘルスケア）などの標準的な器具を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。代替的に、Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０３３２】
Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) およびHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（カリフォルニア州マウンテンビューのＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０３３３】
いくつかの実施態様では、補体成分への、特にＣ１ｑＦｃドメインへの結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合できるかどうかと、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003);およびCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。
【０３３４】
ＦｃＲｎ結合、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定も、当分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al.、Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。
【０３３５】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
【０３３６】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、抗体または二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、または共発現される複数（例えば２以上）のポリヌクレオチドとして発現させてもよい。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合または他の手段を介して会合し、機能性抗体または二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、抗体または二重特異性抗原結合分子の軽鎖部分は、抗体または二重特異性抗原結合分子の重鎖を含む抗体または二重特異性抗原結合分子の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して抗体または二重特異性抗原結合分子を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットの一方および任意選択的に１つ以上のＦａｂ分子（の一部）を含む抗体または二重特異性抗原結合分子の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方および任意選択的にＦａｂ分子（の一部）を含む抗体または二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されるとき、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
【０３３７】
いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗体または二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗体または二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０３３８】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、単鎖でも二本鎖でもよい。
【０３３９】
組換え法
本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、例えば固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成法）または組換え生産によって得ることができる。組換え生産の場合、例えば上述の通り、抗体または二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローン化および／または発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離および配列決定することができる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの１または複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、抗体または二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であっても、または核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体または二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード化領域）が、プロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントと機能的に関連付けられてクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域等はコード化領域の一部ではない。２つ以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して翻訳後または翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された１または複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の抗体もしくは二重特異性抗原結合分子（断片）またはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているかまたは融合していないかのいずれかである異種コード化領域をコードし得る。異種コード領域には、限定されないが、例えば分泌シグナルペプチドまたは異種性機能ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが含まれる。機能的関連付けとは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような方法で、１つまたは複数の調節配列と関連している場合で���る。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドをコードする領域とそれに関連するプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨げないか、または転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「機能的に関連している」という。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に機能的に関連しているであろう。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと機能的に関連し得る。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域は本明細書に開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギ−βグロビン、ならびに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびに誘導性プロモーター（例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン）が含まれる。同様に、様々な翻訳調節エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにウイルス系由来のエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ））が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点および／またはレトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）もしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントといった他の特徴を含んでいてもよい。
【０３４０】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と関連していてもよい。例えば、抗体または二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の抗体もしくは二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする核酸の上流に配置されてもよい。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る排出輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を生産するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、またはそれに機能的に関連している、ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されていてもよい。
【０３４１】
後の精製を容易にするために、または抗体もしくは二重特異性抗原結合分子の標識化を補助するために使用できる短タンパク質配列（例えばヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードする抗体もしくは二重特異性抗原結合分子（断片）内または末端に含まれてもよい。
【０３４２】
さらなる実施態様では、本発明の１または複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１または複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチドおよびベクターは、ポリヌクレオチドおよびベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。そのような一実施態様において、宿主細胞は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードする１または複数のポリヌクレオチドを含む１または複数のベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換またはトランスフェクトされている）。本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、本発明の抗体もしくは二重特異性抗原結合分子またはその断片を生成するように操作できるいずれかの種類の細胞系を指す。抗体または二重特異性抗原結合分子の複製および発現補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクトまたは形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床適用のための十分な量の抗体または二重特異性抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核生物微生物、例えば大腸菌、または種々の真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などが含まれる。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生産することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生を結果として生じる菌類および酵母菌株を含む、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローン化または発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004),およびLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号および第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生産のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばGraham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載の２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載のＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載）、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質生産に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), p. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物もしくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０３４３】
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖または軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現している細胞は、発現の産物が重鎖および軽鎖の両方を有する抗体となるように、抗体鎖の他方も発現するよう操作することができる。
【０３４４】
一実施態様において、本発明による抗体または二重特異性抗原結合分子を生産する方法が提供され、この方法は、抗体または二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、本明細書に与えられるように、抗体または二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（または宿主細胞培地）から抗体または二重特異性抗原結合分子を回収することとを含む。
【０３４５】
本発明の二重特異性抗原結合分子（または抗体）の成分は、遺伝的に互いに対して融合することができる。二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、またはリンカー配列を介して間接的に融合するように、設計することができる。リンカーの組成および長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
【０３４６】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は通常、少なくとも、抗原決定基に結合することのできる抗体可変領域を含む。可変領域は、天然または非天然の抗体およびその断片の一部を形成することができ、かつ、そのような抗体および断片に由来し得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生産する方法は、当技術分野で周知である（例えばHarlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照）。天然には存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に生産することも、または例えば可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０３４７】
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメインまたは可変領域を、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメインまたは可変領域は、マウス、霊長類またはヒト起源のものであり得る。抗体または二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化または完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製され得る（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性または抗体機能を保持するために重要であるもの）を保持しているか否かを問わず、ヒト（例えばレシピエント抗体）のフレームワーク領域および定常領域の上にグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲまたはａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域および定常領域上にグラフトすること、または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えばAlmagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)にて総説されており、さらに、例えばRiechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA86:10029-10033 (1989)、米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号および第７０８７４０９号、Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフティングを記述）、Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991)（「リサーフェシング」を記述）、Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を記述）、ならびにOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)およびKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト化に用いることのできるヒトフレームワーク領域には、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えばSims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えばCarter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；およびPresta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えばAlmagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えばBaca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)およびRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）が含まれる。
【０３４８】
ヒト抗体は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)およびLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に概説されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005)を参照。例えばＸＥＮＯマウスＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号および同第６１５０５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号、Ｋ−Ｍ  マウス（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、およびＶｅｌｏｃｉマウス（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変され得る。
【０３４９】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記述されている。（例えばKozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；およびBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体もLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。さらなる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号  （ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生産を記載）およびNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)およびVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)にも記載されている。
【０３５０】
ヒト抗体は、本明細書に記載されるように、ヒト抗体ライブラリーからの単離によって生成されてもよい。
【０３５１】
本発明に有用な抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)に総説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗体のそのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当技術分野で既知である。このような方法は、例えばFrenzel et al. in mAbs8:1177-1194 (2016); Bazan et al.,  Human Vaccines and Immunotherapeutics8:1817-1828 (2012)およびZhao et al.. Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)、ならびにHoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)およびMarks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)に総説がある。
【０３５２】
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローン化し、ファージライブラリーにランダムに再結合させ、その後、Winter et al., Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして表示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。代替的に、GriffithsらによるEMBO Journal 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローン化して、免疫化無しで、広範囲の非自己抗原および自己抗原に対して抗体の単一起源を提供することができる。最後に、HoogenboomおよびWinterによるJournal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)によって記載されているように、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローン化し、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば米国特許第５７５０３７３号、同第７９８５８４０号、同第７７８５９０３号および同第８６７９４９０号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号および同第２００７／０２９２９３６号が含まれる。所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当技術分野で既知の方法のさらなる例には、リボソームおよびｍＲＮＡディスプレイ、ならびに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞での抗体ディスプレイおよび選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えばScholler et al., Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)およびCherf et al., Methods in Molecular biology1319:155-175 (2015)、ならびにZhao et al., Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)に総説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、He et al., Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) およびHanes et al. , PNAS 94:4937-4942 (1997)に記載されている。
【０３５３】
本明細書で記載のように調製される抗体または二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、抗体または二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体または抗原が使用され得る。例えば、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡまたはプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的に実施例に記載されている抗体または二重特異性抗原結合分子を単離することができる。抗体または二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定され得る。
【０３５４】
アッセイ
本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合分子が、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質および／または生物学的活性を同定し、スクリーニンし、または特徴付けることができる。
【０３５５】
アフィニティーアッセイ
Ｆｃ受容体または標的抗原に対する抗体または二重特異性抗原結合分子の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥヘルスケア）などの標準器具と、組換え発現により得られるような受容体または標的タンパク質とを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体または標的抗原に対する抗体または二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体または標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的かつ例示的な実施態様は、以下に記載される。
【０３５６】
一実施態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥヘルスケア）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０３５７】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付した組換えＦｃ受容体を抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）でＣＭ５チップ上に固定化して捕捉し、二重特異性コンストラクトを分析物として使用する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥヘルスケア）を、供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、５μｌ／ｍｉｎの流量で注入して、およそ６５００応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。その後、Ｆｃ受容体を４または１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度測定のため、抗体または二重特異性抗原結合分子の４倍の連続希釈液（５００ｎＭから４０００ｎＭの間の範囲）を、２５℃のＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥヘルスケア、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４）に流量３０μｌ／ｍｉｎで１２０秒間注入する。
【０３５８】
標的抗原に対する親和性を決定するため、抗体または二重特異性抗原結合分子を、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体について記載したように、活性化ＣＭ５−センサーチップ表面上に固定化された抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥヘルスケア）で捕捉する。結合したタンパク質の最終的な量は、約１２０００ＲＵである。抗体または二重特異性抗原結合分子は、３００ｎＭで９０秒間捕捉される。標的抗原を、３０μｌ／ｍｉｎの流量で２５０−１０００ｎＭの濃度範囲で１８０秒間フローセルに通過させる。解離を１８０秒間モニターする。
【０３５９】
バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正される。定常応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形カーブフィッティングにより解離定数ＫＤを得た。会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと。
【０３６０】
活性のアッセイ
本発明の二重特異性抗原結合分子（または抗体）の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、および腫瘍後退の誘導および／または生存率の改善が含まれる。
【０３６１】
組成、製剤、および投与の経路
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合分子のいずれかと、例えば以下に記載されるような少なくとも１の追加的治療剤を含む。
【０３６２】
さらには、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適した形態の、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を生産する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明による抗体または二重特異性抗原結合分子を得ること、および（ｂ）少なくとも１の薬学的に許容される担体とともに抗体または二重特異性抗原結合分子を製剤化することを含み、それにより、抗体または二重特異性抗原結合分子の調製物がｉｎ  ｖｉｖｏ投与用に製剤化される。
【０３６３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散された抗体または二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギーまたは他の有害な反応を生じない分子実体および組成物を指す。抗体または二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に援用される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与のために、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓまたは他の国の対応する官庁によって必要とされる無菌状態、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たさねばならない。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、当技術者に既知のように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味料、香料、染料、それらの類似物質および組合せが含まれる（例えば、参照により本明細書に援用されるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照）。従来の担体が有効成分と適合しない場合を除いて、治療または医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０３６４】
本発明のイムノコンジュゲート（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内および鼻腔内を含む任意の適切な手段により投与することができ、また、局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与であってもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期かまたは長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。
【０３６５】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理食塩水バッファー（physiological saline buffer）などの生理的に適合性のバッファー中で製剤化され得る。該溶液は、懸濁剤、安定剤および／または分散剤等の調合剤を含有することができる。代替的には、抗体または二重特異性抗原結合分子は、使用前に、適切なビヒクル、例えば発熱性物質除去蒸留水で構成するための粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成することができる。分散体は通常、塩基性分散媒および／または他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液またはエマルジョンを調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に滅菌濾過された液体培地から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生じる真空乾燥または凍結乾燥技術である。必要に応じて、液体培地を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする必要がある。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全量（例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満）で、最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール,
デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、または化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル（ethyl cleat）もしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。
【０３６６】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術または界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチン−マイクロカプセル、ポリ−（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはそれらの組合せなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物において使用することにより、注射可能な組成物の長期吸収をもたらすことができる。
【０３６７】
上記の組成物に加えて、抗体または二重特異性抗原結合分子は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、埋め込み（例えば皮下または筋肉内）により、または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、抗体または二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性または疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中のエマルジョンとしての）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０３６８】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、１種以上の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはタンパク質の薬学的に使用可能な調製物への加工を容易にする補助剤を使用して、従来の方法で製剤化できる。適した製剤は、選択される投与経路に応じて決まる。
【０３６９】
抗体または二重特異性抗原結合分子は、遊離酸または遊離塩基の、天然または塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸または遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、または例えば塩酸もしくはリン酸といった無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄等の無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性および他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０３７０】
治療的方法および組成物
本明細書において提供されるいずれの抗体または二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用されてもよい。
【０３７１】
治療法において使用される場合、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、医療実施基準に合致するように製剤化、調薬および投与される。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程および医療従事者が知る他の要因を包含する。
【０３７２】
一態様では、医薬としての使用のための本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療において使用される本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、治療法において使用される本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、必要とする個体の疾患の治療に使用される、本明細書に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、疾患を有する個体の治療法における使用のための抗体または二重特異性抗原結合分子を提供し、該方法は、該個体に治療的有効量の抗体または二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、該方法は、該個体に少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤など）の治療的有効量を投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導における使用のための、本明細書に記載の抗体または二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するために抗体または二重特異性抗原結合分子の有効量を該個体に投与することを含む、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のための抗体または二重特異性抗原結合分子を提供する。上記いずれの実施態様による「個体」も、哺乳動物、好ましくはヒトである。特定の実施態様では、治療される疾患は、特に全身性紅斑性狼瘡および／または関節リウマチである。自己反応性形質細胞による病原性自己抗体の産生は自己免疫疾患の特徴である。したがって、ＧＰＲＣ５Ｄを使用して自己免疫疾患の自己反応性形質細胞を標的とすることができる。
【０３７３】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造または調製における本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、必要とする個体の疾患の治療を目的とするものである。さらなる実施態様において、本医薬は、治療的有効量の医薬を疾患を有する個体に投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる実施態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのものである。上記いずれの実施態様による「個体」も、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【０３７４】
さらなる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、そのような疾患を有する個体に治療的有効量の本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を個体に投与することをさらに含む。上記いずれの実施態様による「個体」も、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【０３７５】
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子と標的細胞を接触させることを含む。さらなる態様において、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様では、方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量の抗体または二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０３７６】
特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例には、前立腺がん、脳のがん、頭部および頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、および腎臓がんが含まれる。本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を用いて治療され得る他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態または病変およびがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、および前立腺がんからなる群より選択される。一実施態様において、がんは前立腺がんである。抗体または二重特異性抗原結合分子は多くの場合、治癒をもたらさず、部分的恩恵をもたらすだけであり得ることは、当業者には容易に認識される。いくつかの実施態様では、いくらかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらす抗体または二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」または「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする対象、患者または個体は、一般的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０３７７】
いくつかの実施態様では、有効量の本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
【０３７８】
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子の（単独で使用されるか、または１種以上の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）適切な投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体または二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度および経過、抗体または二重特異性抗原結合分子が予防または治療のいずれの目的で投与されるか、直前または同時に行われる治療的介入、患者の病歴および抗体または二重特異性抗原結合分子に対する応答、ならびに主治医の裁量に応じて決定されるであろう。投与の責任を負う施術者は、いずれにしろ、組成物中の活性成分の濃度および個別の対象に適切な用量を決定する。本明細書では、様々な時点での単回または複数回の投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが企図されている。
【０３７９】
抗体または二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、または一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、例えば１回以上の別々の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ‐１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ‐１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体または二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。典型的な１日の投与量は、上記要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与の場合、状態にもによるが、一般的には疾患症状の望まれる抑制が起こるまで治療を継続することになる。抗体または二重特異性抗原結合分子の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ‐約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的実施例では、投与量はまた、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上、およびそこから導出可能な任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数字から導出可能な範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ‐体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム‐体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム等の範囲が投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらのいずれかの組み合わせ）のうちの１または複数の用量を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週または３週毎に（例えば患者が約２‐約２０回、または例えば約６回用量の抗体または二重特異性抗原結合分子を受けるように）投与してもよい。初期の高負荷用量の後、１回以上の低用量を投与することができる。しかしながら、他の用量レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニターされる。
【０３８０】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、通常、意図された目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療または予防するための使用のために、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子、またはその薬学的組成物は、治療的有効量で投与または適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３８１】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに基づいて推定することができる。次いで、動物モデルにおいてある用量を配合し、細胞培養で決定されたＩＣ５０を含む血中濃度範囲を得ることができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
【０３８２】
初期投与量は、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０３８３】
投与の量および間隔は、治療効果を維持するのに十分な抗体または二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１‐５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５‐１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、複数用量を毎日投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０３８４】
局所投与または選択的取り込みの場合、抗体または二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０３８５】
本明細書に記載される抗体または二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、通常、実質的な毒性なしで治療的恩恵を提供する。抗体または二重特異性抗原結合分子の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイおよび動物実験を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。大きな治療指数を呈する抗体または二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明による抗体または二重特異性抗原結合分子は高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量を配合する際に使用することができる。投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がないＥＤ５０を含む血中濃度の一定範囲内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な配合、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、本明細書に参照により全文が援用されるFingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照）。
【０３８６】
本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、臓器不全などのために、いつどのようにして投与を終了、中断または調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう（毒性を除く）。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。さらに、用量および恐らくは投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重および応答に応じて変化するであろう。
【０３８７】
その他の薬剤および治療
本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、治療において、１種以上の他の薬剤との組み合わせで投与され得る。例えば、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１種の追加的治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症状または疾患を治療するために投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは、相互に悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性成分を含んでもよい。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、またはアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤，  受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、または抗血管新生剤である。
【０３８８】
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される抗体または二重特異性抗原結合分子の量、障害または治療の種類、および上述した他の要因によって決まる。抗体または二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ投与量および投与経路で、または本明細書に記載された投与量の約１％‐９９％、または経験的に／臨床的に妥当であると判断される任意の投与量および任意の経路で使用される。
【０３８９】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２種以上の治療剤が同一または別個の組成物に含まれる場合）および別個の投与を包含し、この場合、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子の投与は、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前に、投与と同時に、および／または投与の後に実施することができる。本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用してもよい。
【０３９０】
製造品
本発明の他の態様では、上述した疾患の治療、予防および／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているかまたは付随しているラベルまたは添付文書とを備える。好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等が含まれる。該容器は、例えばガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態の治療、予防および／または診断に効果的である、単独のまたは別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体または二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に収容する第１の容器；および（ｂ）さらなる細胞傷害性またはその他の治療剤を含む組成物を中に収容する第２の容器を備え得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。代替的にまたは追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第２（または第３）の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
【０３９１】
診断および検出のための方法と組成物
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のいずれもが、生物学的試料中のＧＰＲＣ５Ｄの存在を検出するために有用である。本明細書において使用される「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的試料は細胞または組織、例えば前立腺組織を含む。
【０３９２】
一実施態様では、診断または検出の方法における使用のための抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料におけるＧＰＲＣ５Ｄの存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、生物学的試料を、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＧＰＲＣ５Ｄへの結合を許容する条件下で本明細書に記載される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体と接触させること、および抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＧＰＲＣ５Ｄの間に複合体が形成されているかどうかを検出することを含む。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法でもｉｎ  ｖｉｖｏ法でもよい。一実施態様では、例えばＧＰＲＣ５Ｄが患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を使用して、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を用いる療法に適した対象を選択する。
【０３９３】
本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な疾患には、がん、特に前立腺がんが含まれる。
【０３９４】
特定の実施態様では、標識化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が提供される。標識には、限定されないが、（例えば蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識等の）直接検出される標識または部分、および、例えば酵素反応または分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼおよび細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、色素前駆体（例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはマイクロペルオキシダーゼ等）を酸化させるため過酸化水素を利用し、酵素とカップリングさせた複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカル等が含まれる。
【０３９５】
本発明のさらなる態様は、可変重鎖領域（ＶＬ）を含むＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体（１０Ｂ１０）に関し、ＶＬは、配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得、ＶＬは配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。抗体はＶＨとＶＬを含み得、ＶＬは配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体は、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【０３９６】
本発明のさらなる態様は、抗体（１０Ｂ１０−ＴＣＢ）に関する。抗体は第１の軽鎖を含み得、第１の軽鎖は配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。抗体は第２の軽鎖を含み得、第２の軽鎖は配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。抗体は第１の重鎖を含み得、第１の重鎖は配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。抗体は第２の重鎖を含み得、第２の重鎖は配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様では、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【０３９７】
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【実施例】
【０３９８】
以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０３９９】
実施例１
腫瘍標的の発現
正常な形質細胞を上回る多発性骨髄腫の差次的遺伝子発現を確認するために、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来の試料１０個と健常ドナーの骨髄由来の形質細胞（ＰＣ）１０個を対してＲＮＡｓｅｑを実施した。製造業者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出中に、ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを除去した。抽出したＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｐｉｃｏチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で制御した。ＳＭＡＲＴｅｒ  ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＲＮＡ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、製造業者の指示書に従い、１．６ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、増幅した。その後、増幅された１ｎｇのｃＤＮＡを、製造業者の指示書に従い、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴライブラリー調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に供した。シーケンシングライブラリーを、Ｋａｐａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量し、Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで電気泳動により品質管理した。ライブラリーは、ＨｉＳｅｑ２５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、バージョン４クラスター生成キットとバージョン４シーケンシング試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、２ｘ５０サイクルでシーケンスされた。
【０４００】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、悪性形質細胞上に発現する細胞表面タンパク質であり、そのため多発性骨髄腫の標的として認識されている（Tai YT & Anderson KC, Targeting B-cell maturation antigen in multiple myeloma, Immunotherapy. 2015 Nov; 7(11): 1187-1199）。ＲＮＡｓｅｑ技術を用いた詳細な分析により、多発性骨髄腫患者の形質細胞において、ＧＰＲＣ５ＤがＢＣＭＡと同様に高発現していることが示された（図２）。さらに重要なことには、多発性骨髄腫患者の形質細胞と正常な形質細胞との間のＧＰＲＣ５Ｄの発現の差は約２０倍である。対照的に、多発性骨髄腫患者の形質細胞と正常な形質細胞との間のＢＣＭＡの発現の差はわずか２倍であった。ＧＰＲＣ５Ｄの全体的な発現は、ＳＬＡＭ７、ＣＤ１３８、ＣＤ３８等の他の既知の多発性骨髄腫標的分子の発現よりもはるかに高い。さらに、ＧＰＲＣ５Ｄは、正常なナイーブまたはメモリーＢ細胞ではほとんど発現していない。
【０４０１】
実施例２
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーの生成とＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーは、ラットのＤＮＡ免疫化、それに続くハイブリドーマの生成、スクリーニング、およびハイブリドーマのシーケンシングに続いてによって生成された。特異的結合のスクリーニングは、ＧＰＲＣ５Ｄを発現する形質転換体への結合によってＥＬＩＳＡで測定した。２つのＧＰＲＣ５Ｄバインダーを同定し、以下では５Ｅ１１（配列番号１３および１４）および５Ｆ１１（配列番号１５および１６）と呼ぶ。特異的なバインダーが同定されると、ＩｇＧはＴ細胞二重特異性抗体に変換された。バインダーをＴ細胞二重特異性抗体に変換する原理は当技術において例示され、例えば、参照により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載されている。Ｔ細胞二重特異性抗体は、図３に示すように、２つのＧＰＲＣ５Ｄ結合部分と１つのＣＤ３結合部分（抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体）を含む。以下の抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性抗体を調製した：ｉ）５Ｅ１１−ＴＣＢ（配列番号１７、１８、１９および２０）；ｉｉ）５Ｆ１１−ＴＣＢ（配列番号２１、２２、２３および２４）；ｉｉｉ）ＥＴ１５０−５−ＴＣＢ（配列番号２５、２６、２７および２８）；ｉｖ）Ｂ７２−ＴＣＢ（配列番号７３、７４、７５および７６）；およびｖ）ＢＣＭＡ−ＴＣＢ（配列番号７７、７８、７９および８０）。ＥＴ１５０−５  ＧＰＲＣ５Ｄ結合部分は、国際公開第２０１６／０９０３２９号に記載されている。用語「ＥＴ−１５０−５」は、本明細書において、「ＥＴ１５０−５「という用語と同義に使用され、逆もまた同様である。ネガティブコントロールとして、非標的化ＤＰ４７−ＴＣＢが準備された。ＤＰ４７−ＴＣＢは、ＣＤ３にのみ結合し、ＧＰＲＣ５Ｄには結合しない非標的化Ｔ細胞二重特異性抗体である。ＤＰ４７−ＴＣＢは、参照により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載されている。Ｂ７２−ＴＣＢは、国際公開第２０１８／０１１７７８６号の表２３に開示されているＧＣＤＢ７２抗体に由来し、ＧＣＤＢ７２のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。Ｂ７２−ＴＣＢは、クロスマブ１＋１フォーマット（配列番号：７３、７４、７５および７６）で生成された。ＢＣＭＡ−ＴＣＢは、国際公開第２０１６／１６６６２９号に由来し、そこに開示されているＡ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０１のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。ＢＣＭＡ−ＴＣＢは、クロスマブ２＋１フォーマット（配列番号７７、７８、７９および８０）で生成された。
【０４０２】
実施例３
多発性骨髄腫細胞株へのＴ細胞二重特異性抗体の結合
ＧＰＲＣ５Ｄへの結合を測定するために、本発明者らは、報告されている多発性骨髄腫細胞株でＦＡＣＳに基づく結合アッセイを行った（Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the diseas; Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar;46(3):226-38.）。細胞株ＡＭＯ−１、Ｌ３６３およびＯＰＭ−２を、２０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）および１％（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）および１％１００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０＋グルタマックス培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（ネガティブコントロール）を、１０％ＦＢＳのみを補充した同じ培地で培養した。細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＲＰＭＩ−８２２６も、５０μＭメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）と１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充した同じ培地で培養した。これらの細胞株を７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ）中で週に２回の継代で培養した。
【０４０３】
異なる抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１−ＴＣＢ、５Ｆ１１−ＴＣＢおよびＥＴ１５０−５  ＴＣＢ）の結合を間接染色を用いて評価した。細胞を、０．２倍の段階希釈を使用して１０μｇ／ｍｌ‐０．０００６４μｇ／ｍｌの範囲の抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢコンストラクト５Ｅ１１−ＴＣＢ、５Ｆ１１−ＴＣＢまたはＥＴ１５０−５  ＴＣＢと一緒に、または１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）中でコンストラクトなしで４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１：８００に希釈したＬｉｖｅ  ｂｌｕｅ色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で４℃で２０分間染色した後、フローサイトメトリー染色バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で１／３００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリー取得は、カスタム設計されたＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ上で実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（オレゴン州アシュランドのＴｒｅｅ  Ｓｔａｒ）とＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０４０４】
図４Ａ−Ｃは、５Ｅ１１−ＴＣＢと５Ｆ１１−ＴＣＢの両方が、試験した多発性骨髄腫細胞株のすべてに用量依存的に結合することを示している。対照的に、ＥＴ１５０−５−ＴＣＢは、試験した細胞株に非常に弱く結合する。抗ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢによって観察されたＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（非ホジキンリンパ腫のＧＰＲＣ５Ｄ−細胞株）への結合はなかった。
【０４０５】
実施例４
抗ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢ媒介性Ｔ細胞傷害性
抗ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢ抗体の機能性を測定するために、ｉｎ−ｖｉｔｒｏＴ細胞毒性アッセイを実施した。簡潔に言うと、ＡＭＯ−１、Ｌ３６３およびＯＰＭ−２細胞株を、２０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン１００Ｘ（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０＋グルタマックス培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２を、１０％ＦＢＳのみを補充した同じ培地で培養した。細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＲＰＭＩ−８２２６を、５０μＭメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）と１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充した同じ培地で培養した。これらの細胞株を７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ）中で週に２回の継代で培養した。
【０４０６】
この細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中でヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎのバフィーコート）から単離した３．１０５同種異系Ｔ細胞と一緒に、標的：エフェクター比率１：１０で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１−ＴＣＢ、５Ｆ１１−ＴＣＢ、ＥＴ１５０−５  ＴＣＢまたはＤＰ４７−ＴＣＢ）を、０．１倍の段階希釈で１μｇ／ｍｌ‐０．０００００１μｇ／ｍｌの範囲または０μｇ／ｍｌの様々な濃度で共培養物に添加した。５％ＣＯ２を用いて３７℃で２０時間インキュベートした後、ウェルあたり７５μｌの上清を、ウェルあたり２５μｌのＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む９６ウェルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に移した。室温で１５分間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎで発光を取得し、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍおよびＸＬフィットソフトウェアを使用して分析した。データは、ＬＤＨ放出の発光シグナルとしてプロットされる。
【０４０７】
図５Ａ−Ｅは、５Ｅ１１−ＴＣＢと５Ｆ１１−ＴＣＢの両方が多発性骨髄腫細胞株、特にＮＣＩ−Ｈ９２９（図５Ｂ）、ＲＰＭＩ−８２２６（図５Ｃ）、Ｌ３６３（図５Ｄ）、ＡＭＯ−１（図５Ａ）において強いＴ細胞傷害性を媒介したことを示しているが、ネガティブコントロール株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（図５Ｅ）において、死滅は全く観察されなかった。対照的に、ＥＴ１５０−５−ＴＣＢは、試験した多発性骨髄腫細胞株において、ごくわずかまたは有意に低い死滅を媒介した。表１は、図５Ａ−Ｅに示されているデータから導出されたＥＣ５０値をまとめたものである。ＥＣ５０値は、滴定されたＴＣＢに対してシグナルの生データをプロットすることにより、ＥｘｃｅｌのＸＬｆｉｔアドオン機能を使用して計算された。
【０４０８】
2021513334.tif 000024
【０４０９】
実施例５
抗ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢ媒介Ｔ細胞活性化
抗ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢの作用様式を機械論的に扱うために、抗ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢの存在下での標的多発性骨髄腫細胞株との共培養後のＴ細胞の活性化を測定した。実施例４および図５Ａ−Ｅに記載の実験と同様に、この細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中でヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎのバフィーコート）から単離した３．１０５同種異系Ｔ細胞と一緒に、標的：エフェクター比率１：１０で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１−ＴＣＢ、５Ｆ１１−ＴＣＢ、ＥＴ１５０−５−ＴＣＢまたはＤＰ４７−ＴＣＢ）を、０．１倍の段階希釈で１μｇ／ｍｌ‐０．０００００１μｇ／ｍｌの範囲または０μｇ／ｍｌの様々な濃度で共培養物に添加した。５％ＣＯ２を用いて３７℃で２０時間インキュベートした後、細胞を染色してＴ細胞の活性化を評価した。細胞を、まず、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１：８００に希釈したＬｉｖｅ  ｂｌｕｅ色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で４℃で２０分間染色した。その後、細胞を、ＡＦ７００抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、ＢＶ７１１抗ヒトＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＢＶ６０５抗ヒトＣＤ２５（クローンＢＣ９６）、ＡＰＣ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ６９（クローンＦＮ５０）（すべてＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）、およびＰＥ−Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ３（クローンＳＫ７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をフローサイトメトリーバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で４℃で３０分間染色した。フローサイトメトリー取得は、カスタム設計されたＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ上で実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（オレゴン州アシュランドのＴｒｅｅ  Ｓｔａｒ）とＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０４１０】
図６は、活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９を上方制御することにより、５Ｆ１１−ＴＣＢがＮＣＩ−Ｈ９２９細胞との共培養物においてＴ細胞活性化を誘導することを示しているが、コントロール（例えば非標的化ＤＰ４７−ＴＣＢおよびＴＣＢなし）はＴ細胞活性化を誘導しなかった。別のネガティブコントロールとして、５Ｆ１１−ＴＣＢ処理Ｔ細胞をＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞と共培養したところ、Ｔ細胞も活性化されなかった。これらの活性化プロファイルは、本発明者らが試験した複数の細胞株、例えばＡＭＯ−１、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６、Ｌ３６３（図７Ａ−Ｊ）で一貫していた。殺傷力の低さと一致して、ＥＴ１５０−５−ＴＣＢは、試験した最高濃度の１ｍｇ／ｋｇを除いて、Ｔ細胞の活性化を誘導しなかった。
【０４１１】
実施例６
抗ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢの局在化と内在化
ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞をＣＭＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、２４ウェルプレート中のポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）コーティングされたラウンドカバースリップ上に播種した。抗体（５Ｅ１１−ＩｇＧ、５Ｅ１１−ＴＣＢ、５Ｆ１１−ＩｇＧ、５Ｆ１１−ＴＣＢ）を２．５のモル比でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７スクシンイミジルエステル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ａ２０１１０６）で標識した。細胞を、３７℃で一晩接着させた後、蛍光標識抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識−５Ｅ１１−ＩｇＧ、−５Ｅ１１−ＴＣＢ、−５Ｆ１１−ＩｇＧ、−５Ｆ１１−ＴＣＢ）を、異なる持続時間および温度（氷上３０分、３７℃で１時間、３７℃で３時間で増殖培地に直接添加した。冷たいＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、反応を停止させ、各時点後に未結合の抗体を洗い流した。その後、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ）で４℃で２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、カバースリップを動かし、フルオロマウントＧ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してスライドガラスにマウントし、イメージング前に４℃で一晩暗所に保管した。蛍光共焦点顕微鏡法を、６０倍油浸（ｏｉｌ）対物レンズを備えたツァイス製の倒立型ＬＳＭ  ７００を使用して実施した。画像は、顕微鏡に接続されたＺｅｎソフトウェア（ツァイス）を使用して収集し、ＩＭＡＲＩＳソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）上で可視化した。図８Ａは、４℃または３７℃ですべての抗体が多発性骨髄腫細胞株の表面（原形質膜）を染色したことを示している。抗体が細胞によって内在化される場合、３７℃で培養すると、細胞質に蛍光染色が現れる。ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株によるＧＰＲＣ５Ｄ結合ＩｇＧまたはＧＰＲＣ５Ｄ結合ＴＣＢの内在化は全く観察されなかった。それはさらに、細胞の膜と細胞質で画定された細胞の対象領域の強度和を適用することによって確認された（３時間）。膜対細胞質のシグナル比の解析および定量には、ＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用した。図８Ｂは、異なる抗体でのインキュベーションの３時間後に、膜対細胞質の強度の比は約４で変化しておらず、つまり、蛍光シグナルは細胞質ではなく表面に集中していることを示している。
【０４１２】
実施例７
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーの特性評価：ＥＬＩＳＡによる組換え細胞結合
ヒトＧＰＲＣ５ＤまたはカニクイザルＧＰＲＣ５ＤまたはマウスＧＰＲＣ５ＤまたはヒトＧＰＲＣ５Ａのいずれかを発現する安定トランスフェクトされたＣＨＯクローンを使用して、潜在的なリード候補抗体のＩｇＧとしての結合を分析した。詳細には、新鮮な培地を使用して、１０４個の細胞（生存率≧９８％）を３８４ウェルマイクロタイタープレート（ＢＤ  Ｐｏｌｙ  Ｄ−Ｌｙｓｉｎ、＃３５６６６２、容量：２５μｌ／ウェル）に播種した。３７℃で一晩インキュベーションした後、抗体の２５μｌ／ウェル希釈液を４°Ｃで２時間細胞に添加した（１ｘＰＢＳで１５ｘ１：３希釈、アッセイ濃度は３０μｇ／ｍｌから開始）。９０μｌ／ウェルＰＢＳＴ（１０ｘＰＢＳ、ロシュ、＃１１６６６７８９００１＋０，１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた１回の洗浄工程の後、室温（ＲＴ）で１０分間、５０μｌ／ウェル０．０５％グルタルアルデヒド（シグマ  カタログ番号Ｇ５８８２、１ｘＰＢＳ中）の添加によって細胞を固定した。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴを使用してさらに３回洗浄した後、検出用に二次抗体を追加した：ヒト抗体の場合は、ブロッキングバッファー（１ｘＰＢＳ（ロッシュ＃１１６６６７８９００１）＋２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸不含、ロッシュ＃１０７３５０８６００１）＋０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１：２０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇ  κ鎖抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＡＰ５０２Ｐ）を使用した。ラット抗体の場合、ヤギ抗ラットＩｇＧ１抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ  ＃Ａ１１０−１０６Ｐ）、ヤギ抗ラットＩｇＧ２ａ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ  ＃Ａ１１０−１０９Ｐ）およびヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ  ＃Ａ１１０−１１１Ｐ）の混合物を、ブロッキングバッファー（２５μｌ／ウェル）中で各抗体を１：１００００に希釈して使用した。ＲＴで１時間インキュベートし、９０μｌ／ウェルＰＢＳＴを用いて３回の追加洗浄工程を行った後、２５μｌ／ウェルＴＭＢ基質（ロシュ  注文番号１１８３５０３３０１）を１０分間添加し、最終ＯＤまでの発色を３７０ｎｍ／４９２ｎｍでの測定により決定した。
【０４１３】
試験したすべての抗体は、ｐＭ範囲のＥＣ５０値（アビディティを反映）でヒトＧＰＲＣ５Ｄへの正の結合を示した。ラットＩｇＧ  １０Ｂ１０および０７Ａ０４のみが、カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄを発現するＣＨＯ細胞に対して、ヒト型の受容体と同等のＥＣ５０値で交差反応性を示した（図９）。カニクイザルの交差反応性は他のすべての抗体でも検出されたが、１０Ｂ１０と０７Ａ０４と比較して低いレベルであった（図９）。マウスＧＰＲＣ５Ｄを発現するＣＨＯ細胞への有意な結合は検出されず、また、ヒト型ＧＰＲＣ５Ａを発現するＣＨＯ細胞への結合は全く検出されなかった（図９）。結合のＥＣ５０値を表２にまとめる。
【０４１４】
2021513334.tif 000025
【０４１５】
実施例８
ＧＰＲＣ５Ｄバインダー：組換えＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢはＭＭ細胞株におけるＴ細胞の細胞傷害性を媒介する。
ＧＰＲＣ５Ｄ−ＴＣＢまたは他の標的化ＴＣＢの機能性を比較するために、複数のＭＭ細胞株を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞細胞傷害性アッセイを行った。ＭＯＬＰ−２（図１０Ｂ）、ＡＭＯ−１（図１０Ｃ）、ＥＪＭ（図１０Ｄ）およびＮＣＩ−Ｈ９２９（図１０Ｇ）。簡潔に言うと、細胞株を、２０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン１００Ｘ（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０＋グルタマックス培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＭＯＬＰ−２は、グルタマックス１Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したこの培地で培養した。ＯＰＭ−２（図１０Ａ）、ＲＰＭＩ−８２２６（図１０Ｅ）およびＬ−３６３（図１０Ｆ）細胞株を、１０％ＦＢＳのみを補充したこの培地で培養した。ＮＣＩ−Ｈ９２９は、５０μＭメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）およびグルタマックス１Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したこの培地で培養した。ＥＪＭは、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。すべての細胞株を７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ）中で週に２回の継代で培養した。
【０４１６】
細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎのバフィーコート）から単離した０．３百万個の同種異系Ｔ細胞と一緒に、エフェクター対ターゲット比１０対１で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ  ＴＣＢコンストラクト（５Ｅ１１−ＴＣＢ、５Ｆ１１−ＴＣＢ、１０Ｂ１０−ＴＣＢ、Ｂ７２−ＴＣＢ、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ、ＤＰ４７−ＴＣＢ）を、１／１０に段階希釈して１２．５ｎＭから０．００００１２５ｎＭまでの異なる濃度で添加し、未処理試料と比較した。５％ＣＯ２を用いて３７℃で２０時間インキュベーションした後、ウェルあたり７５μｌの上清を、ウェルあたり２５μｌのＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む９６ウェルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に移した。室温で１５分間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎで発光を取得し、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍおよびＸＬフィットソフトウェアを使用して分析した。データは、ＬＤＨ放出の発光シグナルとしてプロットされた（図１０）。図１０Ａ−Ｇは、５Ｅ１１−ＴＣＢおよび５Ｆ１１−ＴＣＢの両方が、ＭＭ細胞株においてＢＣＭＡ−ＴＣＢ、１０Ｂ１０−ＴＣＢおよびＢ７２−ＴＣＢよりもより強いＴ細胞細胞傷害性を媒介したことを示すデータを要約している。ＴＣＢ媒介死滅のＥＣ５０を表３に示す。これは、異なるドナーＴ細胞（ｎ＝２またはｎ＝３）を用いた異なる実験からの平均として計算した。
【０４１７】
2021513334.tif 000026
【０４１８】
実施例９
正常なヒト骨髄細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞活性化
４の異なる健常ドナーの新鮮な未処理の骨髄（Ｌｏｎｚａ  ＃１Ｍ−１０５、ロット００００７３９２５４；００００７３９２５５；００００７３９２５６および００００７３４００８）をサンプリングの１日または２日後に処理した。室温で５分間、ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｉｓｓｉｓバッファー（ＢＤ＃５５５８９９；滅菌水で１倍）を用いて迅速な赤血球溶解を行った後、細胞を１２６ｇおよび４４３ｇでそれぞれ遠心分離およびバッファー交換により２回洗浄した。細胞を計数し、ＲＰＭＩ  １６４０グルタマックス＋２０％ＨＩウシ胎児血清＋２％ヒト血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ製）に３０００００細胞／ｍＬで再懸濁し、９６ウェルプレート丸底（ＴＰＰ）のウェルごとに１００μＬの細胞懸濁液を播種した。５０μＬの培地、または段階希釈１／１０で２００ｎＭ（４Ｘ）から２０ｐＭまでのＢ７２−ＴＣＢ、５Ｆ１１−ＴＣＢ、５Ｅ１１−ＴＣＢ、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ、１０Ｂ１０−ＴＣＢもしくはＤＰ４７−ＴＣＢを補充した培地をウェルごとに添加した。最後に、正常なドナーＰＢＭＣからの汎Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−０９６−５３５）を用いて単離した同種異系Ｔ細胞５０μＬを６Ｍｉｏ／ｍＬ（エフェクターＴ対正常な骨髄標的細胞比１０：１）で添加した。加湿インキュベーターで３７℃で一晩インキュベートした後、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、ＰＢＳで１／８００に希釈した５０μＬのＬｉｖｅ  ｂｌｕｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｌ２３１０５）４℃で２０分間染色した。洗浄後、細胞をＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ１Ｘ、２％ウシ胎児血清、１％０．５ｍのＥＤＴＡ（ＰＨ８）、０．２５％ＮａＮ３アジ化ナトリウム（２０％））で希釈した以下の混合抗体と一緒に４℃で３０分間インキュベートした：１／１００に希釈したＣＤ２５  ＢＶ６０５、ＣＤ６９  ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＢＣＭＡ  ＢＶ４２１、ＣＤ３８  ＢＶ５１０、ＣＤ１３８  ＦＩＴＣ、ＦｃＲＨ５  ＰＥと、１／３００に希釈したＣＤ８  ＢＶ７１１、ＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙ５およびＣＤ４  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ７００（すべてＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）、ならびにＧＰＲＣ５Ｄ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７（内製、クローン５Ｅ１１  ＩｇＧ）。洗浄後、細胞を１００μＬのＦＡＣｓバッファーに再懸濁し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。
【０４１９】
図１１Ａ−Ｆに示すデータは、Ｂ７２−ＴＣＢが正常な骨髄においてＴ細胞の非特異的活性化（ＣＤ６９の上方制御により測定）を誘発したが、他の試験したＴＣＢでは誘発しなかったことを示している。示されているように、Ｂ７２−ＴＣＢによって誘発された非特異的活性化は濃度依存効果であり、５ｎｍよりも５０ｎｍで顕著だった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【０４２０】
実施例１０
ＴＣＢのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
有効性研究では、異なるＴＣＢコンストラクト（ＧＰＲＣ５Ｄ  ５Ｆ１１０−ＴＣＢ、５Ｅ１１−ＴＣＢ、ＢＣＭＡ−ＴＣＢ、Ｂ７２−ＴＣＢ）を、多発性骨髄腫を有する完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍退縮に関して比較した。ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞はもともとＡＴＣＣから、ＯＰＭ−２細胞はＤＳＭＺから取得された。両方の細胞株を増殖させた。細胞を、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩで培養した。この細胞を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下で３７℃で培養した。動物あたり２．５ｘ１０６個のＮＣＩ−Ｈ９２９および５ｘ１０６個のＯＰＭ−２細胞を、ＲＰＭＩ細胞培養液（Ｇｉｂｃｏ）およびＧＦＲマトリゲル（１：１、総体積１００ｕｌ）中の動物の右側腹部に生存率＞９５．０％で皮下注射した。
【０４２１】
実験開始時に４−５週齢のメスのＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（フランス、リヨンのチャールス・リバー社で飼育）を、専用のガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明／１２時間暗を１日サイクルとした特定の病原体がない条件下で維持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査および承認された（ＲＯＢ−５５．２−２５３２．Ｖｅｔ＿０３−１６−１０）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致および観察のために維持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０４２２】
プロトコールに従い、雌ＮＳＧマウスに１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンをｉ．ｐ．（腹腔内）注射し、続いて翌日臍帯血から単離された１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞をｉ．ｖ．注射した。幹細胞注射後の１６−２０週目に、マウスを出血させ、血液をフローサイトメトリーで分析し、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーで分析した。効率的に生着させたマウスを、それらのヒトＴ細胞の頻度に応じて異なる処置群（ｎ＝１０／群）にランダム化した。この時、上述のようにマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍の大きさが約２００ｍｍ３に達したときに、化合物またはＰＢＳ（ビヒクル）で週１回処置した。すべてのマウスに、異なる用量のＴＣＢ分子を静脈内注射した（図１３Ａ−Ｄおよび１４Ａ−Ｄを参照）。
【０４２３】
適切な量の化合物を得るために、原液をヒスチジンバッファー（２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で希釈した。腫瘍の成長をノギスを使用して週に２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した。
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ（Ｗ：幅，Ｌ：長さ）
【０４２４】
化合物を４回注射した後、試験を終了してすべてのマウスを処分し、腫瘍を外植して重量を測定した。
【０４２５】
図１３Ａ−Ｄは、ＮＣｌ−Ｈ９２９注射を受けた全動物における、処置後の腫瘍成長動態を示す。５Ｆ１１−ＴＣＢは、１ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇのいずれかで全動物において完全な腫瘍寛解を誘導した（図１３Ａ）のに対し、Ｂ７２−ＴＣＢは、１ｍｇ／ｋｇで使用した場合には部分的な腫瘍寛解のみを誘導し、０．１ｍｇ／ｋｇでは効果がなかった（図１３Ｃ）。ＢＣＭＡ−ＴＣＢもまた、１ｍｇ／ｋｇで部分的な腫瘍寛解を誘導した（図１３Ｂ）。
【０４２６】
図１４Ａ−Ｄは、ＯＰＭ−２注射を受けた全動物における、処置後の腫瘍成長動態を示す。５Ｆ１１−ＴＣＢ（図１４Ａ、上部パネル）および５Ｅ１１−ＴＣＢ（図１４Ｂ、上部パネル）は、０．１ｍｇ／ｋｇで大部分の動物に完全な腫瘍寛解を誘導したのに対し、Ｂ７２−ＴＣＢ（図１４Ｃ、上部パネル）は０．１ｍｇ／ｋｇでは腫瘍の成長を抑制する力がより弱かった。０．０１  ｍｇ／ｋｇでは、５Ｆ１１−ＴＣＢ（図１４Ａ、下のパネル）と５Ｅ１１−ＴＣＢ（図１４Ｂ、下のパネル）は、Ｂ７２−ＴＣＢ（図１４Ｃ、下のパネル）と比較して、腫瘍の成長を阻害する力がより強かった。
【０４２７】
実施例１１
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のヒト化
マウスの入力配列（可変部分にトリミングされている）について、ヒトのＶ領域およびＪ領域配列のＢＬＡＳＴｐデータベースを検索することにより、適切なヒトアクセプターフレームワークを同定した。ヒトアクセプターフレームワークの選択のための選択基準は、配列の相同性、同一または類似のＣＤＲ長、およびヒト生殖細胞の推定頻度だけでなく、ＶＨ−ＶＬドメイン界面での特定のアミノ酸の保存でもあった。生殖細胞の同定工程に続いて、マウス入力配列のＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク領域にグラフトした。これらの初期ＣＤＲグラフトと親抗体との間の各アミノ酸の違いが、それぞれの可変領域の構造的完全性に影響を与える可能性があるかどうかについて評価され、親配列への「逆突然変異」が適切と思われる場合はいつでも導入された。構造評価は、ＢＩＯＶＩＡ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔバージョン１７Ｒ２を使用して実装された社内の抗体構造相同性モデリングプロトコ−ルを使用して作成された、親抗体とヒト化変異体の両方のＦｖ領域相同性モデルに基づいていた。いくつかのヒト化変異体では、「正突然変異」、すなわち、親バインダーの所定のＣＤＲ位置に存在する元のアミノ酸を、ヒトアクセプター生殖細胞の同等の位置にあるアミノ酸に変更するアミノ酸交換が含まれていた。目的は、ヒト化変異体の全体的なヒト特性を（フレームワーク領域を超えて）高め、免疫原性リスクをさらに低減することである。
【０４２８】
社内で開発されたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏツールを用いて、対になったＶＨとＶＬのヒト化変異体のＶＨ−ＶＬドメイン配向を予測した（参照によりその全体が援用される国際公開第２０１６／０６２７３４号の通り）。結果を、親バインダーの予測されたＶＨ−ＶＬドメイン配向と比較して、元の抗体と形状が近いフレームワークの組み合わせを選択した。合理的なのは、結合特性に有害な影響を与える可能性のある２つのドメインのペアリングの破壊的な変化をもたらす可能性のあるＶＨ−ＶＬ界面領域において起こり得るアミノ酸交換を検出することである。
【０４２９】
ＧＰＲＣ５Ｄバインダー５Ｅ１１のためのアクセプターフレームワークの選択とその適合
アクセプターフレームワークを、次の表４に従って選択した。
【０４３０】
2021513334.tif 000027
【０４３１】
ポストＣＤＲ３フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＪ生殖細胞ＩＧＨＪ３＊０２（ＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）およびヒトＩＧＫＪ生殖細胞ＩＧＫＪ５＊０１（ＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ）から適合させた。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
【０４３２】
構造的考慮事項に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダーのアミノ酸への逆突然変異が、５Ｅ１１ヒト化変異体の特定の位置に導入された（表５および６）。さらに、いくつかの位置が、親バインダーのＣＤＲ中のアミノ酸がヒトアクセプター生殖細胞に見られるアミノ酸で置換される正突然変異の有望な候補として識別された。変更の詳細を下の表に示す。
【０４３３】
注：逆突然変異には接頭辞ｂが付き、正突然変異にはｆが付く。例えばｂＳ４９Ａは、４９位におけるセリンからアラニンへの逆突然変異（ヒト生殖細胞系アミノ酸から親抗体アミノ酸）を指す。残基のインデックスはすべて指数はＫａｂａｔ番号付けで示す。
【０４３４】
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【０４３５】
2021513334.tif 000029
2021513334.tif 000030
【０４３６】
ＧＰＲＣ５Ｄバインダー５Ｆ１１のためのアクセプターフレームワークの選択とその適合
アクセプターフレームワークを、次の表７に従って選択した。
【０４３７】
2021513334.tif 000031
【０４３８】
ポストＣＤＲ３フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＪ生殖細胞ＩＧＨＪ３＊０２（ＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）およびヒトＩＧＫＪ生殖細胞ＩＧＫＪ２＊０１（ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）から適合させた。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
【０４３９】
構造的考慮事項に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダーのアミノ酸への逆突然変異が、５Ｆ１１ヒト化変異体の特定の位置に導入された（表８および９）。さらに、いくつかの位置が、親バインダーのＣＤＲ中のアミノ酸がヒトアクセプター生殖細胞に見られるアミノ酸で置換される正突然変異の有望な候補として識別された。変更の詳細を下の表に示す。
【０４４０】
注：逆突然変異には接頭辞ｂが付き、正突然変異にはｆが付く。例えばｂＡ９３Ｔは、９３位におけるセリンからスレオニンへの逆突然変異（ヒト生殖細胞系アミノ酸から親抗体アミノ酸）を指す。残基のインデックスはすべて指数はＫａｂａｔ番号付けで示す。
【０４４１】
2021513334.tif 000032
【０４４２】
2021513334.tif 000033
2021513334.tif 000034
【０４４３】
ＥＬＩＳＡによるヒト化変異体の特性評価
ＧＰＲＣ５ＤバインダーのＶＨおよびＶＬドメインのヒト化変異体の特性評価のために、上記のＥＬＩＳＡプロトコールを使用した（実施例７を参照）。データを、５Ｅ１１のヒト化変異体については表１０に、５Ｆ１１のヒト化変異体については表１１にまとめた。表１２は、親５Ｅ１１のＣＤＲ配列、ならびに親５Ｅ１１および選択したヒト化変異体のＣＤＲ配列を示す。
【０４４４】
2021513334.tif 000035
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【０４４５】
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【０４４６】
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【０４４７】
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【０４４８】
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【０４４９】
実施例１２
選択した抗ＧＰＲＣ５Ｄ  ＩｇＧの異なるヒト化変異体の存在下でのＣＡＲ−Ｊ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化
異なるヒト化抗ＧＰＲＣ５Ｄ  ＩｇＧがＰＧＬＡＬＡ−ＣＡＲ−Ｊエフェクター細胞を活性化する能力を、以下で説明するように評価した。ＧＰＲＣ５Ｄを発現する多発性骨髄腫標的細胞Ｌ３６３（Diehl et al., Blut 36: 331-338 (1978)）を、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ第２０１８／０８６０３８号およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ第２０１８／０８６０６７号で開示されているように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分において抗ＰＧＬＡＬＡ−ＣＡＲ−Ｊエフェクター細胞（ＴＣＲに対して向けられたＰＧＬＡＬＡ（Ｐ３２９Ｇ  Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ）突然変異を発現し、ＮＦＡＴプロモーターを含むＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株）と一緒に共培養した。Ｌ３６３細胞およびＰＧＬＡＬＡ−ＣＡＲ−Ｊ細胞上のＧＰＲＣ５ＤにＩｇＧ分子が同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性なホタルルシフェラーゼの発現をもたらす。
【０４５０】
アッセイのために、ヒト化ＩｇＧ変異体をＲＰＭＩ  １６４０培地（グルタマックス、１５％ＨＩウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む；すべてＧＩＢＣＯ社製）で希釈し、丸底９６ウェルプレートに移した（最終濃度範囲０．２ｐｇ／ｍｌ‐１０μｇ／ｍｌ）。最終的なエフェクター（抗ＰＧＬＡＬＡ−ＣＡＲ−Ｊ）対標的（Ｌ３６３）細胞の比率が５：１になるように、ウェルあたり２００００個のＬ３６３細胞と抗ＰＧＬＡＬＡ−ＣＡＲ−Ｊエフェクター細胞を添加し、ウェルあたり２００μｌの最終容量を得た。細胞を、加湿したインキュベーター内で約１６時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、１００μｌ／ウェルの上清を白い平底の９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移し、別の１００μｌ／ウェルのＯＮＥ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と一緒に５分間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎを使用して発光を読み取った。行データ（row data）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてＩｇＧ濃度に対する相対発光シグナル（ＲＬＵ）としてプロットし、ＥＣ５０はＸＬフィットソフトウェアを用いて計算した。
【０４５１】
図１５Ａ−Ｂおよび表１３に示すように、評価したすべてのＧＰＲＣ５Ｄ  ＩｇＧは、ＧＰＲＣ５Ｄ発現標的細胞および抗ＰＧＬＡＬＡ−ＣＡＲ−Ｊ細胞への同時結合により、ＣＡＲ−Ｊ活性化を誘導する。抗ＧＰＲＣ５Ｄバインダー５Ｆ１１および５Ｅ１１の両方について、ヒト化前の親抗体と比較して、同様のＥＣ５０値または改善されたＥＣ５０値を有するヒト化変異体が同定された。バインダー５Ｆ１１については、最も強い活性化は、分子Ｐ１ＡＥ５７４１によって誘導され得る（図１５Ａ）。バインダー５Ｅ１１については、最も強い活性化は分子Ｐ１ＡＥ５７３０およびＰ１ＡＥ５７２３によって誘導され得た（図１５Ｂ）。
【０４５２】
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【０４５３】
前述の発明は明確な理解のために例示および実例によって幾分詳細に説明されているが、これらの説明および実例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許および科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
【図１Ａ−Ｆ】
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【図１Ｇ−Ｎ】
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【図１Ｏ−Ｖ】
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【図１Ｗ−Ｚ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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