(57)【要約】  本発明は。アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定する方法を提供する。ある実施態様において、方法は、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるＡＡＶに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗ＡＡＶ抗体」)の力価を測定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定する方法であって、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるＡＡＶに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗ＡＡＶ抗体」)の力価を測定することを含む、方法。
【請求項２】
低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象における疾患を処置する方法であって、対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含み、ここで、該対象はＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルを使用して測定して低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定されているものである、方法。
【請求項４】
対象における疾患を処置する方法であって、(１)ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルの抗ＡＡＶ抗体の力価を測定し、ここで、該対象は低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定され、そして(２)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法。
【請求項５】
対象における疾患を処置する方法であって、(１)対象から生物学的サンプルを得て、(２)ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体の力価を測定し、ここで、対象は低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定され、そして(３)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法。
【請求項６】
疾患が心臓、肝臓、肺、眼、血液、神経系、リンパ系、筋肉、幹細胞またはこれらの何れかの組み合わせにおけるものである、請求項３〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
疾患が心疾患である、請求項３〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定するためのハイスループット法であって、ＥＬＩＳＡを使用して、複数の対象から得た対応する複数の生物学的サンプルの各々の力価を測定することを含む、方法。
【請求項９】
複数の対象が約５〜約１０、約１０〜約２０、約３０〜約４０または約４０〜約５０の対象を含む、請求項８のハイスループット法。
【請求項１０】
複数の生物学的サンプルの各々における力価が、並行してまたは連続して測定される、請求項８または９のハイスループット法。
【請求項１１】
抗ＡＡＶ抗体の力価が中和抗ＡＡＶ抗体の力価、非中和抗ＡＡＶ抗体の力価または両者を含む、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
ＥＬＩＳＡが中和抗ＡＡＶ抗体または非中和抗ＡＡＶ抗体に結合する二次抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＬＩＳＡが中和抗ＡＡＶ抗体および非中和抗ＡＡＶ抗体に結合する二次抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＡＶ治療が組み換えＡＡＶの投与を含む、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
ＡＡＶ治療がＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型(３Ａ型および３Ｂ型を含む)、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるＡＡＶの投与を含む、請求項１〜１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
ＡＡＶ治療がＡＡＶ５型の投与を含む、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
ＡＡＶ治療がＡＡＶ９型の投与を含む、請求項１〜１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
ＡＡＶ治療がＡＡＶ２型の投与を含む、請求項１〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
抗ＡＡＶ抗体が抗ＡＡＶ１型抗体、抗ＡＡＶ２型抗体、抗ＡＡＶ３型Ａ抗体、抗ＡＡＶ３型Ｂ抗体、抗ＡＡＶ４型抗体、抗ＡＡＶ５型抗体、抗ＡＡＶ６型抗体、抗ＡＡＶ７型抗体、抗ＡＡＶ８型抗体、抗ＡＡＶ９型抗体、抗ＡＡＶ１０型抗体、抗ＡＡＶ１１型抗体、抗ＡＡＶ１２型抗体、抗ＡＡＶ１３型抗体、抗ヘビＡＡＶ抗体、抗トリＡＡＶ抗体、抗ウシＡＡＶ抗体、抗イヌＡＡＶ抗体、抗ウマＡＡＶ抗体、抗ヒツジＡＡＶ抗体、抗ヤギＡＡＶ抗体または抗エビＡＡＶ抗体である、請求項１〜１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
抗ＡＡＶ抗体が抗ＡＡＶ５型抗体である、請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
抗ＡＡＶ抗体が抗ＡＡＶ９型抗体である、請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
抗ＡＡＶ抗体が抗ＡＡＶ２型抗体である、請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
ＡＡＶ治療のためのＡＡＶが抗ＡＡＶ抗体が結合するＡＡＶとは異なる血清型である、請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
ＥＬＩＳＡが化学発光ＥＬＩＳＡを含む、請求項１〜２３の何れかに記載の方法。
【請求項２５】
ＥＬＩＳＡが集団ＥＬＩＳＡである、請求項１〜２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
生物学的サンプルが血清サンプルを含む、請求項１〜２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
生物学的サンプルが血液サンプルを含む、請求項１〜２６の何れかに記載の方法。
【請求項２８】
生物学的サンプルをＥＬＩＳＡの前に希釈する、請求項１〜２７の何れかに記載の方法。
【請求項２９】
生物学的サンプルを少なくとも約１：２、少なくとも約１：３、少なくとも約１：４、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、少なくとも約１：２０、少なくとも約１：３０、少なくとも約１：４０、少なくとも約１：５０、少なくとも約１：１００、少なくとも約１：１５０、少なくとも約１：２００、少なくとも約１：２５０、少なくとも約１：３００、少なくとも約１：３５０、少なくとも約１：４００、少なくとも約１：４５０、少なくとも約１：５００、少なくとも約１：１０００に希釈する、請求項１〜２８の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
抗ＡＡＶ抗体力価が約８００未満〜約４０,０００未満である、請求項１〜２９の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
抗ＡＡＶ抗体力価が約４０,０００未満、約３５,０００未満、約３０,０００未満、約２５,０００未満、約２０,０００未満、約１５,０００未満、約１０,０００未満、約５０００未満、約４０００未満、約３０００未満、約２０００未満、約１０００未満、約９００未満または約８００未満である、請求項１〜３０の何れかに記載の方法。
【請求項３２】
抗ＡＡＶ抗体力価が約８００未満である、請求項１〜３１の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
対象が生物学的サンプルが化学発光ＥＬＩＳＡで約１００,０００未満、約１０,０００未満、約１０００未満、約９５０未満、約９００未満、約８５０未満、約８００未満、約７５０未満、約７００未満、約６５０未満、約６００未満、約５５０未満または約５００未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される、請求項１〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
対象が生物学的サンプルが化学発光ＥＬＩＳＡで約７００未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される、請求項１〜３３の何れかに記載の方法。
【請求項３５】
低力価の抗ＡＡＶ抗体が低力価の中和抗ＡＡＶ抗体と相関する、請求項２〜３４の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
ＡＡＶ治療が目的の遺伝子を含むＡＡＶの投与を含む、請求項１〜３５の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
目的の遺伝子が生物学的に活性なポリペプチドをコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＡＡＶが制御配列をさらに含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
制御配列が組織特異的プロモーターを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
組織特異的プロモーターが心臓、肝臓、肺、眼、神経系、リンパ系、筋肉および幹細胞からなる群から選択される組織における目的の遺伝子の発現を誘導する、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療を使用する、対象における疾患を処置する方法に関する。ある態様において、方法は、対象における抗ＡＡＶ抗体の総レベルの検出により、ＡＡＶ治療に適する患者を同定し、低抗ＡＡＶ抗体力価を有する対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)を担持する導入遺伝子は、変異体もしくはヌルタンパク質発現をもたらす遺伝的欠損の矯正または既存の低レベルタンパク質発現の増強のための遺伝子療法(Nathwani et al to A.M Keeler et. al)ならびにおそらく遺伝子ノックダウン、ゲノム編集または修飾および非コード化ＲＮＡ調節(Valdmanis et. al 2017)のための重要なツールである。しかしながら、ヒトは、ＡＡＶに幼少期に暴露され、ＡＡＶベクターの中和により遺伝子治療薬物の有効性に負に影響し得る、中和抗ＡＡＶ抗体を含む、抗ＡＡＶ抗体を獲得するようになっている(Blacklow et al., 1967; Boutin et al., 2010; Calcedo et al., 2009, 2011; Liu et al., 2013)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
高レベルの中和ＡＡＶ特異的抗体が予め存在する患者のプレスクリーニングおよび除外は、高い薬物有効性を達成する一つの方法である。インビトロの細胞ベースのレポーターアッセイは、ある集団における中和抗体の出現頻度を決定し、ＡＡＶ治療に応答する可能性がおそらく低い患者を除外するために、頻繁に用いられる(Amine M et. al., 2015, Manno C et. al., 2006)。しかしながら、細胞ベースの中和抗体アッセイは、処理量が限られる上に所要労力が大きく、一般に高変動性で低感受性という欠点があり、多数の患者のサンプルのスクリーニングは困難である。従って、既存抗体に関する情報を提供する低変動性で、より堅牢な方法であって、患者選別の目的で多数の対象のスクリーニングに使用できる自動化可能なハイスループット法に対する要求がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
ある態様において、本発明は、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定する方法であって、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるＡＡＶに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗ＡＡＶ抗体」)の力価を測定することを含む、方法に関する。ある実施態様において、方法は、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することをさらに含む。
【０００５】
ある態様において、本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含み、ここで、該対象は、ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルを使用して測定して、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定されているものである、方法に関する。
【０００６】
ある態様において、本発明は、ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルを使用して測定し、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定されている対象における疾患の処置に使用するためのＡＡＶ治療剤に関する。
【０００７】
ある態様において、本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、(１)ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルの抗ＡＡＶ抗体の力価を測定し、ここで、該対象は低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定され、そして(２)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法に関する。
【０００８】
ある態様において、本発明は、対象における疾患の処置に使用するためのＡＡＶ治療剤であって、ここで、対象から得た生物学的サンプルの抗ＡＡＶ抗体の力価がＥＬＩＳＡで測定され、そして、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象に投与される、ＡＡＶ治療剤に関する。
【０００９】
ある態様において、本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、(１)対象から生物学的サンプルを得て、(２)ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体の力価を測定し、ここで、対象は低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定され、そして(３)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法に関する。
【００１０】
ある態様において、本発明は、対象における疾患の処置に使用するためのＡＡＶ治療剤、ここで、ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体の力価が測定され、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象に投与される、ＡＡＶ治療剤に関する。
【００１１】
ある実施態様において、疾患は心臓、肝臓、肺、眼、血液、神経系、リンパ系、筋肉、幹細胞またはこれらの何れかの組み合わせにおけるものである。ある実施態様において、疾患は心疾患である。
【００１２】
ある態様において、本発明は、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定するためのハイスループット法であって、ＥＬＩＳＡを使用して、複数の対象から得た対応する複数の生物学的サンプルの各々の力価を測定することを含む、方法に関する。ある実施態様において、複数の対象は約５〜約１０、約１０〜約２０、約３０〜約４０または約４０〜約５０の対象を含む。ある実施態様において、複数の生物学的サンプルの各々における力価は、並行してまたは連続して測定される。
【００１３】
ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体の力価は中和抗ＡＡＶ抗体の力価、非中和抗ＡＡＶ抗体の力価または両者を含む。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは、中和抗ＡＡＶ抗体または非中和抗ＡＡＶ抗体に結合する二次抗体を含む。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは、中和抗ＡＡＶ抗体および非中和抗ＡＡＶ抗体に結合する二次抗体を含む。
【００１４】
ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、組み換えＡＡＶの投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型(３Ａ型および３Ｂ型を含む)、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるＡＡＶの投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療はＡＡＶ５型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療はＡＡＶ９型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療はＡＡＶ２型の投与を含む。
【００１５】
ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１型抗体、抗ＡＡＶ２型抗体、抗ＡＡＶ３型Ａ抗体、抗ＡＡＶ３型Ｂ抗体、抗ＡＡＶ４型抗体、抗ＡＡＶ５型抗体、抗ＡＡＶ６型抗体、抗ＡＡＶ７型抗体、抗ＡＡＶ８型抗体、抗ＡＡＶ９型抗体、抗ＡＡＶ１０型抗体、抗ＡＡＶ１１型抗体、抗ＡＡＶ１２型抗体、抗ＡＡＶ１３型抗体、抗ヘビＡＡＶ抗体、抗トリＡＡＶ抗体、抗ウシＡＡＶ抗体、抗イヌＡＡＶ抗体、抗ウマＡＡＶ抗体、抗ヒツジＡＡＶ抗体、抗ヤギＡＡＶ抗体または抗エビＡＡＶ抗体である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は抗ＡＡＶ５型抗体である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は抗ＡＡＶ９型抗体である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は抗ＡＡＶ２型抗体である。
【００１６】
ある実施態様において、ＡＡＶ治療のためのＡＡＶは、抗ＡＡＶ抗体が結合するＡＡＶとは異なる血清型である。
【００１７】
ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは化学発光ＥＬＩＳＡを含む。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは集団ＥＬＩＳＡである。
【００１８】
ある実施態様において、生物学的サンプルは血清サンプルを含む。ある実施態様において、生物学的サンプルは血液サンプルを含む。ある実施態様において、生物学的サンプルをＥＬＩＳＡの前に希釈する。ある実施態様において、生物学的サンプルを少なくとも約１：２、少なくとも約１：３、少なくとも約１：４、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、少なくとも約１：２０、少なくとも約１：３０、少なくとも約１：４０、少なくとも約１：５０、少なくとも約１：１００、少なくとも約１：１５０、少なくとも約１：２００、少なくとも約１：２５０、少なくとも約１：３００、少なくとも約１：３５０、少なくとも約１：４００、少なくとも約１：４５０、少なくとも約１：５００、少なくとも約１：１０００希釈する。
【００１９】
ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は約８００未満〜約４０,０００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は約４０,０００未満、約３５,０００未満、約３０,０００未満、約２５,０００未満、約２０,０００未満、約１５,０００未満、約１０,０００未満、約５０００未満、約４０００未満、約３０００未満、約２０００未満、約１０００未満、約９００未満または約８００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は約８００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は約４０,０００未満である。
【００２０】
ある実施態様において、対象は、生物学的サンプルが化学発光ＥＬＩＳＡで約１００,０００未満、約１０,０００未満、約１０００未満、約９５０未満、約９００未満、約８５０未満、約８００未満、約７５０未満、約７００未満、約６５０未満、約６００未満、約５５０未満または約５００未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、生物学的サンプルが化学発光ＥＬＩＳＡで約７００未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、低力価の抗ＡＡＶ抗体は低力価の中和抗ＡＡＶ抗体と相関する。
【００２１】
ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、目的の遺伝子を含むＡＡＶの投与を含む。ある実施態様において、目的の遺伝子は生物学的に活性なポリペプチドをコードする。ある実施態様において、ＡＡＶは制御配列をさらに含む。ある実施態様において、制御配列は組織特異的プロモーターを含む。ある実施態様において、組織特異的プロモーターは、心臓、肝臓、肺、眼、神経系、リンパ系、筋肉および幹細胞からなる群から選択される組織における目的の遺伝子の発現を誘導する。
実施態様
【００２２】
Ｅ１. アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定する方法であって、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるＡＡＶに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗ＡＡＶ抗体」)の力価を測定することを含む、方法。
【００２３】
Ｅ２. 低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することをさらに含む、Ｅ１の方法。
【００２４】
Ｅ３. 対象における疾患を処置する方法であって、対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含み、ここで、該対象はＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルを使用して測定して低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定されているものである、方法。
【００２５】
Ｅ４. 対象における疾患を処置する方法であって、(１)ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルの抗ＡＡＶ抗体の力価を測定し、ここで、該対象は低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定され、そして(２)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法。
【００２６】
Ｅ５. 対象における疾患を処置する方法であって、(１)対象から生物学的サンプルを得て、(２)ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体の力価を測定し、ここで、対象は低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定され、そして(３)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法。
【００２７】
Ｅ６. 疾患が心臓、肝臓、肺、眼、血液、神経系、リンパ系、筋肉、幹細胞またはこれらの何れかの組み合わせにおけるものである、Ｅ３〜Ｅ５の何れかの方法。
【００２８】
Ｅ７. 疾患が心疾患である、Ｅ３〜Ｅ６の何れかの方法。
【００２９】
Ｅ８. アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定するためのハイスループット法であって、ＥＬＩＳＡを使用して、複数の対象から得た対応する複数の生物学的サンプルの各々の力価を測定することを含む、方法。
【００３０】
Ｅ９. 複数の対象が約５〜約１０、約１０〜約２０、約３０〜約４０または約４０〜約５０の対象を含む、Ｅ８のハイスループット法。
【００３１】
Ｅ１０. 複数の生物学的サンプルの各々における力価が並行してまたは連続して測定される、Ｅ８またはＥ９のハイスループット法。
【００３２】
Ｅ１１. 抗ＡＡＶ抗体の力価が中和抗ＡＡＶ抗体の力価、非中和抗ＡＡＶ抗体の力価または両者を含む、Ｅ１〜Ｅ１０の何れかの方法。
【００３３】
Ｅ１２. ＥＬＩＳＡが中和抗ＡＡＶ抗体または非中和抗ＡＡＶ抗体に結合する二次抗体を含む、Ｅ１１の方法。
【００３４】
Ｅ１３. ＥＬＩＳＡが中和抗ＡＡＶ抗体および非中和抗ＡＡＶ抗体に結合する二次抗体を含む、Ｅ１１の方法。
【００３５】
Ｅ１４. ＡＡＶ治療が組み換えＡＡＶの投与を含む、Ｅ１〜Ｅ１３の何れかの方法。
【００３６】
Ｅ１５. ＡＡＶ治療がＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型(３Ａ型および３Ｂ型を含む)、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるＡＡＶの投与を含む、Ｅ１〜Ｅ１４の何れかの方法。
【００３７】
Ｅ１６. ＡＡＶ治療がＡＡＶ５型の投与を含む、Ｅ１〜Ｅ１５の何れかの方法。
【００３８】
Ｅ１７. ＡＡＶ治療がＡＡＶ９型の投与を含む、Ｅ１〜Ｅ１６の何れかの方法。
【００３９】
Ｅ１８. ＡＡＶ治療がＡＡＶ２型の投与を含む、Ｅ１〜Ｅ１７の何れかの方法。
【００４０】
Ｅ１９. 抗ＡＡＶ抗体が抗ＡＡＶ１型抗体、抗ＡＡＶ２型抗体、抗ＡＡＶ３型Ａ抗体、抗ＡＡＶ３型Ｂ抗体、抗ＡＡＶ４型抗体、抗ＡＡＶ５型抗体、抗ＡＡＶ６型抗体、抗ＡＡＶ７型抗体、抗ＡＡＶ８型抗体、抗ＡＡＶ９型抗体、抗ＡＡＶ１０型抗体、抗ＡＡＶ１１型抗体、抗ＡＡＶ１２型抗体、抗ＡＡＶ１３型抗体、抗ヘビＡＡＶ抗体、抗トリＡＡＶ抗体、抗ウシＡＡＶ抗体、抗イヌＡＡＶ抗体、抗ウマＡＡＶ抗体、抗ヒツジＡＡＶ抗体、抗ヤギＡＡＶ抗体または抗エビＡＡＶ抗体である、Ｅ１〜Ｅ１８の何れかの方法。
【００４１】
Ｅ２０. 抗ＡＡＶ抗体が抗ＡＡＶ５型抗体である、Ｅ１〜Ｅ１９の何れかの方法。
【００４２】
Ｅ２１. 抗ＡＡＶ抗体が抗ＡＡＶ９型抗体である、Ｅ１〜Ｅ１９の何れかの方法。
【００４３】
Ｅ２２. 抗ＡＡＶ抗体が抗ＡＡＶ２型抗体である、Ｅ１〜Ｅ１９の何れかの方法。
【００４４】
Ｅ２３. ＡＡＶ治療のためのＡＡＶが、抗ＡＡＶ抗体が結合するＡＡＶとは異なる血清型である、Ｅ１〜Ｅ１９の何れかの方法。
【００４５】
Ｅ２４. ＥＬＩＳＡが化学発光ＥＬＩＳＡを含む、Ｅ１〜Ｅ２３の何れかの方法。
【００４６】
Ｅ２５. ＥＬＩＳＡが集団ＥＬＩＳＡである、Ｅ１〜Ｅ２４の何れかの方法。
【００４７】
Ｅ２６. 生物学的サンプルが血清サンプルを含む、Ｅ１〜Ｅ２５の何れかの方法。
【００４８】
Ｅ２７. 生物学的サンプルが血液サンプルを含む、Ｅ１〜Ｅ２６の何れかの方法。
【００４９】
Ｅ２８. 生物学的サンプルをＥＬＩＳＡの前に希釈する、Ｅ１〜Ｅ２７の何れかの方法。
【００５０】
Ｅ２９. 生物学的サンプルを少なくとも約１：２、少なくとも約１：３、少なくとも約１：４、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、少なくとも約１：２０、少なくとも約１：３０、少なくとも約１：４０、少なくとも約１：５０、少なくとも約１：１００、少なくとも約１：１５０、少なくとも約１：２００、少なくとも約１：２５０、少なくとも約１：３００、少なくとも約１：３５０、少なくとも約１：４００、少なくとも約１：４５０、少なくとも約１：５００、少なくとも約１：１０００希釈する、Ｅ１〜Ｅ２８の何れかの方法。
【００５１】
Ｅ３０. 抗ＡＡＶ抗体力価が約８００未満〜約４０,０００未満である、Ｅ１〜Ｅ２９の何れかの方法。
【００５２】
Ｅ３１. 抗ＡＡＶ抗体力価が約４０,０００未満、約３５,０００未満、約３０,０００未満、約２５,０００未満、約２０,０００未満、約１５,０００未満、約１０,０００未満、約５０００未満、約４０００未満、約３０００未満、約２０００未満、約１０００未満、約９００未満または約８００未満である、Ｅ１〜Ｅ３０の何れかの方法。
【００５３】
Ｅ３２. 抗ＡＡＶ抗体力価が約８００未満である、Ｅ１〜Ｅ３１の何れかの方法。
【００５４】
Ｅ３３. 対象が、生物学的サンプルが化学発光ＥＬＩＳＡで約１００,０００未満、約１０,０００未満、約１０００未満、約９５０未満、約９００未満、約８５０未満、約８００未満、約７５０未満、約７００未満、約６５０未満、約６００未満、約５５０未満または約５００未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される、Ｅ１〜Ｅ３２の何れかの方法。
【００５５】
Ｅ３４. 対象が、生物学的サンプルが化学発光ＥＬＩＳＡで約７００未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される、Ｅ１〜Ｅ３３の何れかの方法。
【００５６】
Ｅ３５. 低力価の抗ＡＡＶ抗体が低力価の中和抗ＡＡＶ抗体と相関する、Ｅ２〜Ｅ３４の何れかの方法。
【００５７】
Ｅ３６. ＡＡＶ治療が目的の遺伝子を含むＡＡＶの投与を含む、Ｅ１〜Ｅ３５の何れかの方法。
【００５８】
Ｅ３７. 目的の遺伝子が生物学的に活性なポリペプチドをコードする、Ｅ３６の方法。
【００５９】
Ｅ３８. ＡＡＶが制御配列をさらに含む、Ｅ３６またはＥ３７の方法。
【００６０】
Ｅ３９. 制御配列が組織特異的プロモーターを含む、Ｅ３８の方法。
【００６１】
Ｅ４０. 組織特異的プロモーターが心臓、肝臓、肺、眼、神経系、リンパ系、筋肉および幹細胞からなる群から選択される組織における目的の遺伝子の発現を誘導する、Ｅ３８の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、商業的に得た正常ヒト血清サンプルにおける抗ｒＡＡＶ９型抗体の化学発光(図１Ａ)および比色分析(図１Ｂ)ＥＬＩＳＡ検出結果のグラフ表示である。血清サンプルを示すとおりにＳＢＴ２０緩衝液で希釈し、ｒＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１被覆プレートに加えた。化学発光(ＣＬ)(図１Ａ)または吸光度(図１Ｂ)単位を、最適化量の抗κおよび抗λ抗体でのｒＡＡＶ９型結合抗体の検出により得た。バックグラウンドは、ＳＢＴ２０緩衝液とインキュベートした対照ウェルを抗κおよび抗λ抗体で検出したときに観察されるＣＬ(図１Ａ)または吸光度(図１Ｂ)単位である。
【００６３】
【図２】図２は、化学発光(黒色棒)および比色分析(灰色棒)ＥＬＩＳＡ検出法のシグナル対ノイズ比の比較を表す棒グラフである。４００倍血清希釈での化学発光または吸光度単位を、抗κおよび抗λ検出抗体を使用して得て、ｒＡＡＶ９被覆プレートで、ＳＢＴ２０緩衝液インキュベーションのみおよび抗κおよび抗λ検出抗体で得たデータ単位で除すことにより得た。
【００６４】
【図３】図３Ａは、化学発光法と比色分析検出法の相関を示す散布図である。データを、示す相関プロットを作成するために各方法について血清希釈の線形範囲を選択した。図３Ｂは、図３Ａに示すデータの統計分析を提供する。
【００６５】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、化学発光ＥＬＩＳＡにおける抗ｒＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１抗体結合の競合の結果のグラフ表示である。４つの異なる正常ヒト血清サンプルを希釈し、各希釈物の３複製を溶液中のｒＡＡＶ９とのプレインキュベーションあり(Ｃｏｍｐ)およびなし(Ｎｏｎ  Ｃｏｍｐ)で試験した(図４Ａ)。図４Ｂ〜４Ｃは、１：４血清希釈(図４Ｂ)およびモノクローナル抗体対照(１：１０００でのＡＤＫ９；図４Ｃ)の競合ＥＬＩＳＡデータを示す。四角で囲った数字は、競合血清サンプルにおけるシグナルのパーセント阻害を示す(図４Ｂ〜４Ｃ)。
【００６６】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、化学発光ＥＬＩＳＡ法における抗ＡＡＶ９抗体検出の再現性を説明するグラフ表示である。１２の異なる正常ヒトサンプルを４０倍(図５Ａ)または４００倍(図５Ｂ)希釈し、総抗ＡＡＶ９抗体について２つの異なる実験で試験した。表(図５Ａおよび５Ｂ)は、各希釈での各サンプルの実験間精度を示す。
【００６７】
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、ｒＡＡＶ９カプシドを含む導入遺伝子(ｒＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１；灰色棒)およびルシフェラーゼレポーター(ｒＡＡＶ９ＨＬｕｃ；黒色棒)の互換性を示す棒グラフである。各カプシドタイプを等濃度で被覆し、材料および方法に記載する化学発光総抗体結合ＥＬＩＳＡにおける正常ヒト血清(ＮＨＳ)サンプルの３つの異なるロットの連続希釈(図６Ａ〜６Ｃ)で検出した。
【００６８】
【図７】図７は、心疾患患者血清サンプルにおける総抗ＡＡＶと中和抗体の相関を示す散布図である。１００名の患者を、１：４００の血清希釈で総結合抗体および１：１０の希釈で中和抗体について評価し、スピアマンの順位相関法を使用して相関させた。点線で示す任意のカットオフを各アッセイで設定する。
【００６９】
【図８】図８は、心疾患患者血清サンプルにおける総抗ＡＡＶ抗体とＡＡＶ９中和抗体の相関を示す散布図である。１００名の患者を、１：４００の血清希釈でＡＡＶ９との競合後ＡＡＶ特異的抗体についてＥＬＩＳＡでおよび１：１０の希釈で中和抗体について細胞ベースの中和抗体アッセイで評価し、スピアマンの順位相関法を使用して相関させた。点線で示す任意のカットオフを各アッセイで設定する。
【００７０】
【図９】図９は、心疾患患者血清サンプルにおける総ＡＡＶ２型結合抗体と中和抗体の相関を示す散布図である。３６名の患者を、１：４００の血清希釈でＡＡＶ特異的抗体についてＥＬＩＳＡでおよび１：１０の希釈で中和抗体について細胞ベースの中和抗体アッセイで評価した。点線で示す任意のカットオフを各アッセイで設定する。
【００７１】
【図１０】図１０は、１００名の患者サンプルにおけるＡＡＶ９中和、総抗ＡＡＶ９および特異的(競合工程に基づく、実施例参照)総抗ＡＡＶ９抗体の相関を示すノンスケールのベン図である。任意のカットオフは、各データセットについて括弧内に示す。総抗体(ｔＡｂ)データセットのカットオフは、細胞ベースの中和抗体アッセイにおける中和および非中和集団の分割に基づいた。
【００７２】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、化学発光(黒色棒)および比色分析(灰色棒)ＥＬＩＳＡ検出法のシグナル対ノイズ比の比較を表す棒グラフである。４倍(図１１Ａ)および４０倍(図１１Ｂ)血清希釈での化学発光または吸光度単位を抗κおよび抗λ検出抗体を使用して得て、ｒＡＡＶ９被覆プレートにおいてＳＢＴ２０緩衝液のみでのインキュベーションおよび抗κおよび抗λ検出抗体で得たデータ単位で除した。
【００７３】
【図１２】図１２は、ｒＡＡＶ９  ＡｂのＨＲＰコンジュゲート抗κおよび抗λ検出とＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＧ検出の比較を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
発明の詳細な記載
本発明のある態様は、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定する方法であって、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるＡＡＶに結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗ＡＡＶ抗体」)の力価を測定することを含む、方法に関する。本発明のある態様は、対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、対象における疾患を処置する方法に関する。ある態様において、対象は、ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルを使用して測定して低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある態様において、本発明は、ＡＡＶ治療に適する対象を同定するハイスループット法であって、ＥＬＩＳＡを使用して、複数の対象から得た対応する複数の生物学的サンプルの各々の力価を測定することを含む、方法に関する。
【００７５】
Ｉ. 用語
本発明がより容易に理解され得るために、一部用語をまず定義する。本出願で使用するものであって、本明細書で特に断らない限り、下記用語の各々は、次に示す意味を有する。さらなる定義は、本明細書をとおして示される。
【００７６】
用語「および／または」は、ここで使用されているとき、２つの特定した特性または要素の各々の、他方を伴うまたは伴わない具体的開示と解釈される。故に、ここで「Ａおよび／またはＢ」などの言い回しで使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの言い回しで使用される用語「および／または」は、次の態様の各々を含むことを意図する：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。
【００７７】
本明細書である態様が用語「含む」を用いて記載されている場合は常に、「からなる」および／または「本質的にからなる」の用語で記載されているものを除き、類似する態様も記載されていると理解される。
【００７８】
他に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、当業者に本明細書で使用される用語の多くの一般的辞書を提供する。
【００７９】
単位、接頭辞および記号は、その国際単位系(ＳＩ)が認めた形態である。数値範囲は、該範囲を定義する数値を含む。ここに提供する表題は、本明細書を全体として引用して得られる種々の態様の開示を制限しない。従って、すぐ下に定義する用語は、本明細書をその全体として引用して、より完全に定義される。
【００８０】
ここで使用する用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型(３Ａ型および３Ｂ型を含む)、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、Gao et al.(J. Virol. 78:6381 (2004))およびMoris et al.(Virol. 33:375 (2004))により開示されるＡＡＶ血清型および系統群ならびに現在知られるまたは今後発見されるあらゆる他のＡＡＶを含み、かつこれらに限定されない。例えば、FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)参照。ＡＡＶは、ウイルスのパルボウイルス科内のデペンドパルボウイルス(属)をいう。例えば、ＡＡＶは、天然に存在する「野生型」ウイルス由来のＡＡＶ、天然に存在するｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質由来カプシドにパッケージされた組み換えＡＡＶ(ｒＡＡＶ)ゲノムおよび／または非天然カプシドｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質由来カプシドにパッケージされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶであり得る。ここで使用する「ＡＡＶ」は、ウイルスそれ自体またはその誘導体をいうために使用し得る。本用語は、他に具体的に示されていない限り、全サブタイプおよび天然に存在するおよび組み換え両者の形態を包含する。ＡＡＶは、ＡＡＶ１型(ＡＡＶ−１)、ＡＡＶ２型(ＡＡＶ−２)、ＡＡＶ３型(ＡＡＶ−３)、ＡＡＶ４型(ＡＡＶ−４)、ＡＡＶ５型(ＡＡＶ−５)、ＡＡＶ６型(ＡＡＶ−６)、ＡＡＶ７型(ＡＡＶ−７)、ＡＡＶ８型(ＡＡＶ−８)、ＡＡＶ９型(ＡＡＶ−９)、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶおよびヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶをいい、「非霊長類ＡＡＶ」は霊長類ではない哺乳動物に感染するＡＡＶをいい、「ウシＡＡＶ」はウシ属哺乳動物に感染するＡＡＶをいうなど。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (3 d ed., Lippincott-Raven Publishers)参照。
【００８１】
用語「ｒＡＡＶ」は「組み換えＡＡＶ」をいう。ある実施態様において、組み換えＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種配列で置き換わっているＡＡＶゲノムを有する。ここで使用する「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列(すなわち、ＡＡＶにとって異種のポリヌクレオチド)、一般に細胞の遺伝形質転換にとって興味深い配列を含むＡＡＶベクターをいう。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１個および一般に２個のＡＡＶ末端逆位配列(ＩＴＲ; Inverted Terminal Repeated Sequences)が隣接する。用語ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミド両者を含む。
【００８２】
「カプシド・フリー」または「カプシド・レス」(またはその変形)ベクターまたは核酸分子は、カプシドがないベクター構築物をいう。ある実施態様において、カプシド・レスベクターまたは核酸分子は、例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードする配列がない。
【００８３】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１個のＡＡＶカプシドタンパク質(一般に野生型ＡＡＶの全カプシドタンパク質)およびカプシド形成されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターからなるウイルス粒子をいう。ウイルスまたは粒子が異種ポリヌクレオチド(すなわち哺乳動物細胞に送達すべき導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド)を含むならば、「ｒＡＡＶベクター粒子」と呼び得る。それ故に、ｒＡＡＶ粒子の産生は、ベクターがｒＡＡＶ粒子内に含まれる限り、必然的にｒＡＡＶベクターの産生を含む。
【００８４】
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ(例えば、野生型ＡＡＶ)が哺乳動物細胞により複製かつパッケージされることを可能にするウイルスをいう。多様なこのようなＡＡＶのためのヘルパーウイルスが当分野で知られ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアなどのポックスウイルスを含む。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを含むが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが知られ、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)およびエプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)ならびにサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)および仮性狂犬病ウイルス(ＰＲＶ)を含み、これらはまたＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。
【００８５】
ここで使用する「末端逆位配列」(または「ＩＴＲ」)は、一本鎖核酸配列の５’または３’末端に位置する核酸部分配列をいい、これは、一組のヌクレオチド(初期配列)とその後下流にその逆相補がある、すなわち、パリンドローム配列を含む。初期配列と逆相補の間のヌクレオチドの介在性配列はどんな長さでもよい。
【００８６】
ここで使用する用語「トロピズム」は、ＡＡＶベクターまたはビリオンが１以上の特定の細胞型に感染する能力をいうが、１以上の特定の細胞型の細胞にベクター機能を形質導入する方法も包含する。すなわち、トロピズムは、ＡＡＶベクターまたはビリオンのある細胞または組織タイプへの優先的侵入および／またはある細胞または組織タイプへの侵入を促進する細胞表面との優先的相互作用をいい、所望によりおよび好ましくは細胞内でのＡＡＶベクターまたはビリオンにより運ばれた配列の発現(例えば、転写および、所望により、翻訳)、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列の発現が続く。ここで使用する用語「形質導入」は、ＡＡＶベクターまたはビリオンが１以上の特定の細胞型に感染する能力をいう；すなわち、形質導入は、ＡＡＶベクターまたはビリオンの細胞への侵入と、ベクターゲノムから発現をさせるためのＡＡＶベクターまたはビリオン内に含まれる遺伝物質の細胞への伝達を含む。一部例では、しかし、全例ではないが、形質導入およびトロピズムは相関し得る。
【００８７】
「投与する」は、当業者に知られる種々の方法および送達系の何れかを使用した、対象への治療剤の物理的導入をいう。例えば、ＡＡＶ治療剤について、例示的投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語「非経腸投与」は、経腸および局所投与以外の、通常、注射による投与方法をいい、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および点滴ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。治療剤は非経腸ではない経路または経口で投与し得る。他の非経腸ではない経路は、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、膣、直腸、舌下または局所を含む。投与するはまた、例えば、１回、複数回および／または１以上のより長い期間にわたって実施され得る。
【００８８】
用語「抗体」(Ａｂ)は、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合により相互接続された、少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含む免疫グロブリンをいう。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は少なくとも３個の定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域１個の定常ドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と称される、より保存された領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、次の順に配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。
【００８９】
用語「抗体」(Ａｂ)はまた、限定しないが、抗原に特異的に結合し、ここに定義するとおりである、免疫グロブリンのあらゆる抗原結合部分もまた含む。
【００９０】
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般に知られるアイソタイプの何れかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプも当分野で周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラスまたはサブクラス(例えば、それぞれＩｇＭまたはＩｇＧ１)をいう。用語「抗体」は、例として、天然に存在するおよび天然に存在しない両者の抗体、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトまたは非ヒト抗体、完全合成抗体、および一本鎖抗体を含む。非ヒト抗体は、ヒトにおける免疫原性を低減するために組み換え方法によりヒト化され得る。明示されず、文脈に反しない限り、用語「抗体」はまた、前記免疫グロブリンの何れかの抗原結合フラグメントまたは抗原結合部分も含み、一価および二価フラグメントまたは一部および一本鎖Ａｂを含む。
【００９１】
「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう(例えば、ＡＡＶに特異的に結合する単離抗体は、ＡＡＶ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。さらに、単離抗体は、実質的に他の細胞物質および／または化学物質を含まない抗体をいい得る。
【００９２】
用語「モノクローナル抗体」(ｍＡｂ)は、単一分子組成の抗体分子、すなわち、一次配列が本質的に同一であり、特定のエピトープに単一結合特異性および親和性を示す抗体分子の天然に存在しない調製物をいう。モノクローナル抗体は単離抗体の一例である。モノクローナル抗体はハイブリドーマ、組み換え、トランスジェニックまたは当業者に知られる他の技術により産生され得る。
【００９３】
用語「中和抗体」(ｎＡｂ)は、標的に結合し、標的の機能を阻害または遮断する抗体をいう。例えば、ＡＡＶ−９に結合する中和抗体は、ＡＡＶ−９と結合し、ＡＡＶ−９の機能を妨害できる。ある実施態様において、中和ＡＡＶ抗体は、ウイルス粒子が結合し、標的細胞に入る前にＡＡＶウイルス粒子と結合し、ウイルス粒子が標的細胞と結合しおよび／または侵入し、細胞内で導入遺伝子を放出するのを阻止する。
【００９４】
「抗抗原抗体」は、抗原に特異的に結合する抗体をいう。例えば、抗ＡＡＶ抗体はＡＡＶウイルス粒子に特異的に結合する。
【００９５】
抗体の「抗原結合部分」(「抗原結合フラグメント」とも称する)は、抗体全体により結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントをいう。
【００９６】
ここで使用する「ハイスループット法」は、一アッセイで複数の生物学的サンプルの特徴づけを可能にする方法またはアッセイをいう。例えば、ハイスループット法を使用して、一アッセイで少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個または少なくとも１００個の生物学的サンプルにおける抗体力価を測定できる。ある実施態様において、ハイスループット法またはアッセイは、多ウェルプレートを使用する。ある実施態様において、複数の生物学的サンプルは、並行して測定される。ここで使用する「並行して」測定されるサンプルは、同時に測定される。ある実施態様において、複数の生物学的サンプルは連続的に測定される。
【００９７】
対象の「処置」または「治療」は、疾患と関連する症状、合併症、状態または生化学的徴候の発症、進行、進展、重症度または再発の反転、軽減、改善、阻止、減速または予防を目的として、対象に行う活性剤の投与を含むあらゆるタイプの介入または過程をいう。
【００９８】
「対象」はあらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌおよび齧歯類、例えばマウス、ラットおよびモルモットを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」は、ここでは、相互交換可能に使用される。
【００９９】
ここで使用する「力価」または「抗体力価」は、サンプル、例えば、対象から得た生物学的サンプル中の特定の抗体の量をいう。抗体の力価は、当分野で知られる方法の何れかを使用して測定され得る。ある実施態様において、抗体の力価は、抗体を含むサンプルを、抗体がバックグラウンドを超えてもはや検出されなくなるまで連続希釈することにより測定される。このような例では、抗体の力価は、それ以下では抗体の濃度がバックグラウンドレベルより低くなる希釈倍率として表される。例えば、１：８００の希釈が、一連の希釈でバックグラウンドレベルを超えて検出される最高希釈であるならば、抗体の力価は８００として表される。１：４０,０００の希釈が、一連の希釈でバックグラウンドレベルを超えて検出される最高希釈であるならば、抗体の力価は４０,０００として表される。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体の力価は約４０,０００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体の力価は約８００未満である。
【０１００】
ある実施態様において、抗体力価は酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)を使用して測定される。当分野で知られるあらゆるＥＬＩＳＡを、本発明の方法において使用できる。ＥＬＩＳＡは、インビトロでサンプルにおける標的の存在を検出するための一連の抗体相互作用により特徴づけられる。ＥＬＩＳＡは、直接アッセイ、間接アッセイまたは捕捉アッセイ(すなわち、サンドイッチアッセイ)を含み得る。直接アッセイでは、抗原を表面に結合させる。酵素にコンジュゲートした一次抗体を表面に適用し、一次抗体が抗原に結合する。次いで、基質を加え、それが酵素と反応して、検出可能なシグナルを発生させ、これが表面上の抗原の存在を示す。間接アッセイでは、抗原を表面に結合させる。次いで一次抗体を表面に適用し、一次抗体が抗原に結合する。次いで、酵素にコンジュゲートした二次抗体を表面に適用する。二次抗体は一次抗体と結合できる。次いで、基質を加え、それが酵素と反応して、検出可能なシグナルを生じさせ、これが表面上の抗原の存在を示す。捕捉アッセイでは、抗体を表面に結合させ、抗原を含むサンプルを表面に適用する。次いで、一次抗体および二次抗体を間接アッセイにおけるとおりに適用する。
【０１０１】
ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは「化学発光ＥＬＩＳＡ」である。「化学発光ＥＬＩＳＡ」または「発光アッセイ」または「化学発光アッセイ」は、標的の存在の指標として発光を使用するタイプのＥＬＩＳＡである。次いで、発光強度を測定し、サンプルにおける標的の量と相関させ得る。化学発光ＥＬＩＳＡにおいて、酵素は、基質を光量子を発する反応産物に変換する。ルミネセンスは、電子励起状態から基底状態に戻る際の物質からの発光として説明される。化学発光は、化学反応により生じる光である。励起中間体が安定な基底状態に戻るとき、光子が放出され、これが発光シグナル装置のセンサーにより検出される。発光シグナルの強度は化学発光単位として表すことができ、ここで、検出される化学発光単位数が大きいほど、生物学的サンプルにおける標的の力価が高い。
【０１０２】
あらゆる化学発光酵素および基質をここに記載する方法において使用できる。ある実施態様において、化学発光酵素はアルカリホスファターゼ(ＡＰ)を含む。ある実施態様において、化学発光酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)を含む。ある実施態様において、化学発光酵素はベータガラクトシダーゼおよびベータラクタマーゼを含む。
【０１０３】
ある実施態様において、ＥＬＩＳＡアッセイは、(１)表面をＡＡＶ標的、例えば、ＡＡＶ−９ウイルス粒子でコーティングし；(２)表面を１以上の抗ＡＡＶ抗体を含むサンプル、例えば、対象から得た生物学的サンプルと接触させ；(３)表面を酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)と融合した第二抗体と接触させ、ここで、第二抗体は抗ＡＡＶ抗体と結合でき；(４)表面と化学発光基質を接触させ；そして(５)表面からの発行を測定することを含む。
【０１０４】
選択肢(例えば、「または」)の使用は、選択肢の一方、両方またはこれらの何れかの組み合わせを意味すると理解すべきである。ここで使用する単数表現は、何らかの記載または列記された要素の「１以上」をいうと理解されるべきである。
【０１０５】
用語「約」または「本質的に含む」は、値または組成の測定または決定方法、すなわち、測定系の限界に一部依存する、当業者により決定される特定の値または組成について許容される誤差範囲内である値または組成をいう。例えば、「約」または「本質的に含む」は、当分野での実務により１または１を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」または「本質的に含む」は、２０％までの範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的系または過程に関して、本用語は値の一桁までまたは５倍までを意味し得る。特定の値または組成が本明細書および請求の範囲に提供されるとき、特に断らない限り、「約」または「本質的に含む」の意味は、その特定の値または組成について許容される誤差範囲内であることが推定される。
【０１０６】
ここで使用する用語「ほぼ週１回」、「ほぼ２週に１回」または何らかの他の類似投与間隔用語は、おおよその数字を意味する。「ほぼ週１回」は７日±１日、すなわち、６日毎〜８日毎を含み得る。「ほぼ２週に１回」は１４日毎±３日、すなわち、１１日毎〜１７日毎を含む。類似の近似が、例えば、ほぼ３週に１回、ほぼ４週に１回、ほぼ５週に１回、ほぼ６週に１回およびほぼ１２週に１回に適用される。ある実施態様において、ほぼ６週に１回またはほぼ１２週に１回の投与間隔は、最初の投与を第一週目の任意の曜日に実施してよく、次の投与を、それぞれ６週目または１２週目の任意の曜日に投与してよいことを意味する。他の実施態様において、ほぼ６週に１回またはほぼ１２週に１回の投与間隔は、最初の投与を第一週目の特定の曜日(例えば、月曜日)に実施し、次の投与をそれぞれ６週目または１２週目の同じ曜日(すなわち、月曜日)に実施することを意味する。
【０１０７】
ここに記載する、あらゆる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲または整数範囲は、特に断らない限り、記載する範囲内のあらゆる整数値および、適切なとき、その分数(例えば整数の１／１０および１／１００)を含むと理解されるべきである。
【０１０８】
本発明の種々の態様を、次のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０１０９】
II. 方法の開示
本発明のある態様は、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)治療に適する対象を同定する方法であって、ＥＬＩＳＡを使用して対象から得た生物学的サンプルにおけるＡＡＶに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分(「抗ＡＡＶ抗体」)の力価を測定することを含む、方法に関する。ある実施態様において、方法は、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することをさらに含む。
【０１１０】
本発明のある態様は、対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、対象における疾患を処置する方法に関し、ここで、該対象はＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルを使用して測定して低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定されている。本発明のある態様は、対象における疾患を処置する方法であって、(１)ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体の力価を測定し、そして(２)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとしてとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法に関する。ある態様において、本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、(１)対象から生物学的サンプルを得て、(２)ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体の力価を測定し、そして(３)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法に関する。ある態様において、本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、(１)対象からの生物学的サンプルを得ることまたは得られていること、(２)ＥＬＩＳＡで対象から得た生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体の力価を測定することまたは測定されていること、そして(３)低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定された対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む、方法に関する。
【０１１１】
本発明の方法は、ＡＡＶ治療を使用して処置できる当分野で知られるあらゆる疾患または状態の処置に有用である。例えば、ここに開示する方法を、対象の心臓、肝臓、肺、眼、血液、神経系、リンパ系、筋肉、幹細胞およびこれらの何れかの組み合わせに影響する疾患または状態の処置に使用し得る。ある実施態様において、疾患または状態は、中枢神経系に影響する疾患または状態である。ある実施態様において、疾患または状態は、心疾患を含む。ある実施態様において、疾患または状態は、心不全を含む。ある実施態様において、疾患または状態は、急性または慢性心不全を含む。具体的実施態様において、疾患または状態は、駆出率が低下した心不全(ＨＦｒＥＦ)を含む。具体的実施態様において、疾患または状態は、駆出率が保持された心不全を含む。ある実施態様において、疾患または状態は、嚢胞性線維症、血友病Ｂ、関節炎、遺伝的気腫、レーベル先天性黒内障、黄斑変性症(例えば、加齢黄斑変性症)、デュシェンヌ筋ジストロフィー(ＤＭＤ)、パーキンソン病、カナバン病、バッテン病、アルツハイマー病、脊髄筋萎縮、うっ血性心不全、二対立遺伝子ＲＰＥ６５変異関連網膜ジストロフィーまたはこれらの何れかの組み合わせである。
【０１１２】
本発明のある態様は、ＡＡＶ治療に適する対象を同定するハイスループット法であって、ＥＬＩＳＡを使用して、複数の対象から得た対応する複数の生物学的サンプルの各々の力価を測定することを含む、方法に関する。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約５００、少なくとも約７５０または少なくとも約１０００対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約１０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約２０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約３０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約４０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約５０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約６０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約７０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約８０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約９０対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、少なくとも約１００対象を含む。
【０１１３】
ある実施態様において、複数の対象は、２〜約１００対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は、２〜約９０対象、２〜約８５対象、２〜約８０対象、２〜約７５対象、２〜約７０対象、２〜約６５対象、２〜約６０対象、２〜約５５対象、２〜約５０対象、２〜約４５対象、２〜約４０対象、２〜約３５対象、２〜約３０対象、２〜約２５対象、２〜約２０対象、２〜約１５対象、２〜約１０対象または２〜約５対象を含む。
【０１１４】
ある実施態様において、複数の対象は、約５〜約１００対象、約１０〜約１００対象、約１５〜約１００対象、約２０〜約１００対象、約２５〜約１００対象、約３０〜約１００対象、約３５〜約１００対象、約４０〜約１００対象、約４５〜約１００対象、約５０〜約１００対象、約５５〜約１００対象、約６０〜約１００対象、約６５〜約１００対象、約７０〜約１００対象、約７５〜約１００対象、約８０〜約１００対象、約８５〜約１００対象、約９０〜約１００対象または約９５〜約１００対象を含む。
【０１１５】
ある実施態様において、複数の対象は、約１０〜約９０対象、約２０〜約８０対象、約３０〜約７０対象、約４０〜約６０対象、約２５〜約５０対象、約５０〜約７５対象、約２５〜約７５対象または約５０〜約１００対象を含む。ある実施態様において、複数の対象は約５〜約１０、約１０〜約２０、約３０〜約４０または約４０〜約５０の対象を含む。
【０１１６】
ある実施態様において、複数の生物学的サンプルの各々における力価は並行して測定される。ある実施態様において、複数の生物学的サンプルの各々における力価は連続的に測定される。
【０１１７】
ある実施態様において、本発明の方法は、生物学的サンプルまたは複数の生物学的サンプルの各々における抗ＡＡＶ抗体の力価の測定を含む。抗ＡＡＶ抗体は１クラスの抗ＡＡＶ抗体、例えば、中和抗ＡＡＶ抗体のみまたは１を超えるクラスの抗ＡＡＶ抗体、例えば、中和および非中和抗ＡＡＶ抗体の混合を含み得る。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体の力価は中和抗ＡＡＶ抗体の力価、非中和抗ＡＡＶ抗体の力価または両者を含む。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体の力価は中和抗ＡＡＶ抗体の力価または非中和抗体の力価のみを含む。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは、中和抗ＡＡＶ抗体または非中和抗ＡＡＶ抗体に結合する二次抗体を含む。ある実施態様において、本発明の方法は中和および非中和両者の抗ＡＡＶ抗体を測定する。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは、中和抗ＡＡＶ抗体および非中和抗ＡＡＶ抗体に結合する二次抗体を含む。ここに記載するとおり、本発明は、生物学的サンプルにおける総抗ＡＡＶ抗体力価と中和抗ＡＡＶ抗体の力価の相関を驚くべきことに同定する。
【０１１８】
抗ＡＡＶ抗体は任意の１タイプまたはクラスの抗ＡＡＶ抗体、例えば、抗ＡＡＶ−９抗体または抗ＡＡＶ−２抗体またはＡＡＶ−５抗体または１を超える抗ＡＡＶ抗体、例えば、抗ＡＡＶ−９抗体と抗ＡＡＶ−２抗体；抗ＡＡＶ−９抗体と抗ＡＡＶ−５；抗ＡＡＶ−２抗体と抗ＡＡＶ−５の混合物であり得る。抗ＡＡＶ抗体はまた任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥまたはこれらの組み合わせであり得る。
【０１１９】
II.Ａ. アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)
本発明のある態様は、対象における抗ＡＡＶ抗体を検出するおよび／またはＡＡＶを投与する方法に関する。アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)は、パルボウイルス科の無エンベロープ、一本鎖ＤＮＡウイルスである。パルボウイルス科の大部分の他のメンバーと対照的に、ＡＡＶは複製欠損であり、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルス存在下でのみ効率的に複製できる。
【０１２０】
ＡＡＶは、アデノウイルスのウイルス調製物への混入物として１９６０年代半ばに最初に報告された。Atchison R W, Casto B C, HAMMON W M. Science. 149(3685), 754-756 (1965)参照。それ以来、組み換えＤＮＡベクターとしてＡＡＶのより安全かつ有効な使用方法が開発され続けている。例えば、Hermonat P.L. and Muzyczka N. Proc Natl Acad Sci USA. 81(20), 6466-6470 (1984). 3. Laughlin C.A., et al. Gene, 23(1), 65-73 (1983). Matsushita T., et al. Gene Ther. 5(7), 938-945 (1998). Xiao X., et al.  Journal of Virology. 72(3), 2224-2232 (1998)参照。少ない数のＡＡＶゲノムが宿主染色体に統合され得ることが報告されている(Cheung AK, Hoggan MD, Hauswirth WW, et al. Integration of the adeno-associated virus genome into cellular DNA in latently infected human detroit 6 cells. J Virol 1980;33:739-748)。ＡＡＶは、あらゆる既知アデノウイルス抗原と免疫学的に異なる。ＡＡＶカプシドは一本鎖ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)ゲノムを含む((Rose JA, Berns KI, Hoggan MD, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1969;64:863-869)。
【０１２１】
ＡＡＶは、２個の末端逆位配列(ＩＴＲ)が隣接した複製(ｒｅｐ)遺伝子およびカプシド(ｃａｐ)遺伝子をコードする一本鎖、４.７kb  ＤＮＡゲノムである。優勢に非統合性であり、非分裂組織で安定なエピソームを形成する。成人集団での高い血清検出率にも関わらず、如何なるヒト疾患とも連づけられていない。Goncalves, M. Virol. J. 2, 43 (2005)参照。組織におけるＡＡＶの安定な発現、病原性欠如および高い力価産生の容易さにより、魅力的かつ汎用される遺伝子移入プラットフォームとなっている。
【０１２２】
組み換えＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種配列で置き換えられている遺伝子操作されたＡＡＶである。野生型ＡＡＶと同様、ｒＡＡＶは、最も可能性の高い理由としては、ｒＡＡＶの組み換えゲノムが核内に大型環状エピソームとして持続するため、有糸分裂後組織における長期導入遺伝子発現を誘発する。ｒＡＡＶの産生に必要なｒＡＡＶの唯一のシスエレメントはＡＡＶ末端逆位配列(ＩＴＲ)であり、一方ｒｅｐ、ｃａｐおよびアデノウイルスヘルパー遺伝子はトランスで提供され得る。それ故に、ここに開示するある実施態様において、ｒＡＡＶは、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子ＤＮＡのみを含み、このゲノムは、血清型特異的カプシド内でカプシド形成される。
【０１２３】
ＡＡＶは、細胞への外来ＤＮＡ送達のためのベクターとして魅力的となる特有の性質を有する。培養での細胞のＡＡＶ感染は一般に非細胞傷害性であり、ヒトおよび他の動物の天然感染は無症状かつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの異なるタイプの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とすることが許容される。ＡＡＶはまた、他の形態の遺伝子送達と比較して穏やかな免疫応答の促進ならびに非統合ベクターとして分裂および静止状態両者の細胞における永続性発現を含む、遺伝子送達に特に魅力的なウイルス系となるさらなる利点も有する。また、ＡＡＶは、アデノウイルス不活性化に使用する条件に耐え(５６°〜６５℃。数時間)、ｒＡＡＶベースのワクチンをあまり極端でない低温保存できる。
【０１２４】
ヘルパーウイルスは、ＡＡＶ形質導入およびＡＡＶゲノムの標的細胞への侵入に必要でない。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および組込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、内部の約４.７kbのゲノム(複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ−ｃａｐをコード)を、遺伝子治療剤として使用するＡＡＶに重要な機能を何ら失うことなく、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットなどの外来ＤＮＡで置き換え得る。
【０１２５】
ＡＡＶベクターは、シスまたはトランスで機能するさらなる要素を含み得る。具体的実施態様において、ベクターゲノムを含むＡＡＶベクターはまたドナー配列の５’または３’末端に隣接する１以上の末端逆位配列(ＩＴＲ)；構成的または制御可能制御要素または組織特異的発現制御要素などのドナー配列の転写を駆動する発現制御要素(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)；イントロン配列、スタッファーまたはフィラーポリヌクレオチド配列；および／またはドナー配列の３’に位置するポリアデニン配列も含む。
【０１２６】
ある実施態様において、ＡＡＶはヘルパーウイルスを利用して複製する。ＡＡＶのための多様なこのようなヘルパーウイルスが当分野で知られ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアなどのポックスウイルスを含む。個々のアデノウイルスタイプは多数の異なるサブグループを含むが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが知られ、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)およびエプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)ならびにサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)および仮性狂犬病ウイルス(ＰＲＶ)を含み、これらはまたＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。
【０１２７】
ＡＡＶベクターの例は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８の何れかのカプシドタンパク質またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８のカプシドバリアントを含む。本発明の組み換えＡＡＶベクターはまたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８何れかからのカプシドタンパク質およびそのバリアントを含む。特定のカプシドバリアントは、アミノ酸置換、欠失または挿入／付加を有するカプシドタンパク質などのＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８のカプシドバリアントを含む。
【０１２８】
本発明のある態様は、生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体を検出する方法に関する。抗ＡＡＶ抗体は、当分野で知られるＡＡＶの何れかまたは当分野で知られるＡＡＶの何らかの面、例えば、表面タンパク質に特異的であり得る。ＡＡＶの例は、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型(３Ａ型および３Ｂ型を含む)、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶおよびエビＡＡＶを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１型抗体、抗ＡＡＶ２型抗体、抗ＡＡＶ３型Ａ抗体、抗ＡＡＶ３型Ｂ抗体、抗ＡＡＶ４型抗体、抗ＡＡＶ５型抗体、抗ＡＡＶ６型抗体、抗ＡＡＶ７型抗体、抗ＡＡＶ８型抗体、抗ＡＡＶ９型抗体、抗ＡＡＶ１０型抗体、抗ＡＡＶ１１型抗体、抗ＡＡＶ１２型抗体、抗ＡＡＶ１３型抗体、抗ヘビＡＡＶ抗体、抗トリＡＡＶ抗体、抗ウシＡＡＶ抗体、抗イヌＡＡＶ抗体、抗ウマＡＡＶ抗体、抗ヒツジＡＡＶ抗体、抗ヤギＡＡＶ抗体または抗エビＡＡＶ抗体である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ２型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ３型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ４型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ５型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ６型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ７型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ８型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ９型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１０型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１１型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１２型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、抗ＡＡＶ１３型に結合する。
【０１２９】
ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は１を超えるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ２型およびＡＡＶ９型に結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は一つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ９型またはＡＡＶ２型に、他のあらゆるＡＡＶ血清型より高い親和性で結合する。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体は、一つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ９型またはＡＡＶ２型のみに特異的に結合する。
【０１３０】
本発明のある態様において、方法は、さらに、対象にＡＡＶ治療剤を投与することを含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、組み換えＡＡＶの投与を含む。当分野で知られるおよび／またはここに開示するあらゆる組み換えＡＡＶが本発明の方法で使用され得る。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型(３Ａ型および３Ｂ型を含む)、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるＡＡＶの投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ１型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療はＡＡＶ２型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ３型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ４型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療はＡＡＶ５型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ６型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ７型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ８型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療はＡＡＶ９型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ１０型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ１１型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ１２型の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶ１３型の投与を含む。
【０１３１】
ある態様において、本発明は明確な組織標的化能を有するＡＡＶ(例えば、組織トロピズム)に関する。ある実施態様において、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、さらに、非バリアント親カプシドポリペプチドと比較して１以上のヒト幹細胞型における形質導入またはトロピズムの増加を示す。ある実施態様において、ヒト幹細胞型は、胚幹細胞、成人組織幹細胞(すなわち、体性幹細胞)、骨髄、前駆細胞細胞、誘導型多能性幹細胞および初期化幹細胞を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、成人幹細胞は、オルガノイド幹細胞(すなわち、体内の興味ある何れかの臓器または臓器系由来の幹細胞)であり得る。ある実施態様において、ＡＡＶの標的組織は、生殖腺、横隔膜、心臓、胃、肝臓、脾臓、膵臓または腎臓である。ある実施態様において、体内のＡＡＶ標的臓器は、皮膚、髪、爪、感覚受容体、汗腺、脂肪分泌腺、骨、筋肉、脳、脊髄、神経、下垂体、松果体、視床下部、甲状腺、副甲状腺、胸腺、副腎、膵臓(島組織)、心臓、血管、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、扁桃、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門管、歯、唾液腺、舌、肝臓、胆嚢、膵臓、盲腸、腎臓、輸尿管、膀胱、尿道、精巣、輸精管、尿道、前立腺、陰茎、陰嚢、卵巣、子宮、子宮(ファローピウス)管、膣、外陰および乳腺(乳房)を含むが、これらに限定されない。体内の臓器系は、外皮系、骨格系、筋系、神経系、内分泌系、心血管系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系および生殖器系を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、形質導入および／またはトロピズムは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％増加される。ある実施態様において、形質導入および／またはトロピズムは約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％または約３０％〜約６０％増加される。
【０１３２】
ある実施態様において、ＡＡＶ治療のためのＡＡＶは、抗ＡＡＶ抗体が結合するＡＡＶとは異なる血清型である。例えば、ある実施態様において、ＡＡＶ治療はＡＡＶ２型の投与を含み、抗ＡＡＶ抗体は抗ＡＡＶ９型抗体である。ある実施態様において、ＡＡＶ治療のためのＡＡＶは抗ＡＡＶ抗体が結合するＡＡＶと同じ血清型である。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は組み換えＡＡＶ９型の投与を含み、抗ＡＡＶ抗体は抗ＡＡＶ９型抗体である。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は組み換えＡＡＶ５型の投与を含み、抗ＡＡＶ抗体は抗ＡＡＶ５型抗体である。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は組み換えＡＡＶ２型の投与を含み、抗ＡＡＶ抗体は抗ＡＡＶ２型抗体である。
【０１３３】
II.Ａ.１. 複製、カプシドおよびアセンブリーＡＡＶ遺伝子
ＡＡＶの一本鎖ゲノムは、３遺伝子ｓ、ｒｅｐ(複製)、ｃａｐ(カプシド)およびａａｐ(アセンブリー)を含む。これら３遺伝子は、３個のプロモーター、オルタナティブ翻訳開始部位および選択的スプライシングの使用を介して少なくとも９個の遺伝子産物を生じさせる。
【０１３４】
ｒｅｐ遺伝子はウイルスゲノム複製およびパッケージングに必要な４個のタンパク質(Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０)をコードする。
【０１３５】
ｃａｐ遺伝子発現は、外部カプシド殻を形成するウイルスカプシドタンパク質(ＶＰ１；ＶＰ２；ＶＰ３)を生じさせ、これはウイルスゲノムを保護し、細胞結合および内在化に能動的に関与する。ウイルス外皮は二十面体構造に配置された６０個のタンパク質からなると推定される。
【０１３６】
ａａｐ遺伝子は、ｃａｐ遺伝子に重複する代替リーディングフレームでアセンブリー活性化タンパク質(ＡＡＰ)をコードする。この核タンパク質は、カプシドアセンブリーのための足場機能を提供し、一部ＡＡＶ血清型におけるＶＰタンパク質の核小体局在化に役割を有すると考えられる。
【０１３７】
ある実施態様において、ｒｅｐ、ｃａｐまたはａａｐ遺伝子の１以上は天然に存在する、例えばｒｅｐ、ｃａｐまたはａｐｐ遺伝子は、パルボウイルスｒｅｐ、ｃａｐまたはａａｐ遺伝子の全てまたは一部を含む。ある実施態様において、ｒｅｐ、ｃａｐまたはａａｐ遺伝子の１以上は合成配列を含む。
【０１３８】
ある実施態様において、ｒｅｐ遺伝子は合成配列を含む。ある実施態様において、ｃａｐ遺伝子は合成配列を含む。ある実施態様において、ａａｐ遺伝子は合成配列を含む。ある実施態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は合成配列を含む。ある実施態様において、ｒｅｐおよびａａｐ遺伝子は合成配列を含む。ある実施態様において、ｃａｐおよびａａｐ遺伝子は合成配列を含む。ある実施態様において、ｒｅｐ、ｃａｐおよびａａｐ遺伝子は合成配列を含む。
【０１３９】
ある実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびこれらの何れかの組み合わせから選択されるＡＡＶゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ１ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ２ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ３ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ４ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ５ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ６ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ７ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ８ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ９ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ１０ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ１１ゲノム由来である。
【０１４０】
ある実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびこれらの何れかの組み合わせから選択されるＡＡＶゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ１ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ２ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ３ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ４ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ５ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ６ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ７ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ８ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ９ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ１０ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ１１ゲノム由来である。
【０１４１】
ある実施態様において、ａａｐはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびこれらの何れかの組み合わせから選択されるＡＡＶゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ１ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ２ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ３ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ４ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ５ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ６ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ７ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ８ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ９ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ１０ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ１１ゲノム由来である。
【０１４２】
ここに記載する特定のＡＡＶゲノムは、種々のＡＡＶゲノム(例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１からのゲノム)からの遺伝子を有し得ることは理解される。それ故に、ここに開示されるのは、ｒｅｐ、ｃａｐまたはａａｐの何れかの可能な並べ替えを含むＡＡＶである。
【０１４３】
ここに開示するある実施態様において、ＡＡＶは組み換えＡＡＶ(ｒＡＡＶ)である。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子の１以上を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｃａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはａａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子を欠き、かつｃａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子を欠き、かつａａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｃａｐ遺伝子を欠き、かつａａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子を欠く。
【０１４４】
ここに開示するある実施態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ遺伝子の１以上の発現が修飾されるように、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子の１以上が変異されるように修飾される。ある実施態様において、ｒｅｐ遺伝子が変異される。ある実施態様において、ｃａｐ遺伝子が変異される。ある実施態様において、ａａｐ遺伝子が変異される。ある実施態様において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が変異される。ある実施態様において、ｒｅｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子が変異される。ある実施態様において、ｃａｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子が変異される。ある実施態様において、ｃａｐ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子が変異される。
【０１４５】
II.Ａ.２. 末端逆位配列
ある実施態様において、ＡＡＶは第一ＩＴＲ、例えば、５’  ＩＴＲおよび第二ＩＴＲ、例えば、３’  ＩＴＲを含む。一般に、ＩＴＲは原核生物プラスミドからのパルボウイルス(例えば、ＡＡＶ)ＤＮＡ複製およびレスキューまたは切除に関与する(Samulski et al., 1983, 1987; Senapathy et al., 1984; Gottlieb and Muzyczka, 1988)。さらに、ＩＴＲは、ＡＡＶプロウイルス組込みおよびＡＡＶ  ＤＮＡのビリオンへのパッケージングに必要な最小配列であると報告されている(McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989)。これらの要素は、パルボウイルスゲノムの効率的増殖に必須である。
【０１４６】
ある実施態様において、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲを含む、例えば、ＩＴＲはパルボウイルスＩＴＲの全てまたは一部を含む。ある実施態様において、ＩＴＲは合成配列を含む。ある実施態様において、第一ＩＴＲまたは第二ＩＴＲは合成配列を含む。他の実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲの各々は合成配列を含む。ある実施態様において、第一ＩＴＲまたは第二ＩＴＲは天然に存在する配列を含む。他の実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲの各々は天然に存在する配列を含む。
【０１４７】
ある実施態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムからのＩＴＲを含む。ある実施態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびこれらの何れかの組み合わせから選択されるＡＡＶゲノムのＩＴＲである。特定の実施態様において、ＩＴＲはＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲである。他の実施態様において、ＩＴＲは、５’および３’末端に１以上のＡＡＶゲノム由来のＩＴＲを含むように遺伝子操作された合成配列である。ある実施態様において、ＩＴＲは、同じゲノム、例えば、同じウイルスのゲノムまたは異なるゲノム、例えば、２以上の異なるＡＡＶゲノムのゲノムに由来する。ある実施態様において、ＩＴＲは同じＡＡＶゲノムに由来する。具体的実施態様において、本発明の核酸分子に存在する２個のＩＴＲは同じであり、特にＡＡＶ２  ＩＴＲ、ＡＡＶ５  ＩＴＲまたはＡＡＶ９  ＩＴＲであり得る。ある特定の実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲは同一である。
【０１４８】
ある実施態様において、ＩＴＲはヘアピンループ構造を形成する。ある実施態様において、第一ＩＴＲはヘアピン構造を形成する。他の実施態様において、第二ＩＴＲはヘアピン構造を形成する。なお他の実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲ両者はヘアピン構造を形成する。
【０１４９】
ある実施態様において、ここに記載する核酸分子におけるＩＴＲは、転写活性化ＩＴＲである。転写活性化ＩＴＲは、少なくとも１個の転写活性のある要素の挿入により転写活性化されている野生型ＩＴＲの全てまたは一部を含み得る。種々のタイプの転写活性のある要素がこの状況における使用に適する。ある実施態様において、転写活性のある要素は構成的に転写活性のある要素である。構成的に転写活性のある要素は、継続しているレベルの遺伝子転写を提供し、導入遺伝子が継続的に発現されることが望まれるとき好ましい。他の実施態様において、転写活性のある要素は、誘導可能な転写活性のある要素である。誘導可能な転写活性のある要素は、一般にインデューサー(または誘導条件)非存在下では低活性を示し、インデューサー(または誘導条件へのスイッチ)の存在下で上方制御される。誘導可能な転写活性のある要素は、一定時間または一定場所でのみ発現が望まれるときまたは誘導剤を使用して発現レベルを力価測定することが望ましいときに、好ましいことがある。転写活性のある要素は組織特異的でもあり得る；すなわち、ある組織または細胞型でのみ活性を示す。
【０１５０】
転写活性のある要素を、多様な方法でＩＴＲに組み込み得る。ある実施態様において、転写活性のある要素を、ＩＴＲの任意の部分の５’またはＩＴＲの任意の部分の３’に組み込み得る。他の実施態様において、転写活性化ＩＴＲの転写活性のある要素は、２つのＩＴＲ配列間にある。転写活性のある要素が、離されているべき２以上の要素の間にあるならば、これらの要素はＩＴＲの部分と交互であり得る。ある実施態様において、ＩＴＲのヘアピン構造は欠失し、転写要素の逆方向反復と置き換わる。この後者の配置は、構造における欠失部分を模倣するヘアピンを作る。複数のタンデムの転写活性のある要素も転写活性化ＩＴＲに存在でき、これらは隣接していても離されていてもよい。さらに、タンパク質結合部位(例えば、Ｒｅｐ結合部位)を転写活性化ＩＴＲの転写活性のある要素に導入し得る。転写活性のある要素は、ＲＮＡを形成するためのＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの制御転写を可能にする何れかの配列を含んでよく、例えば、下記定義の転写活性のある要素を含み得る。
【０１５１】
転写活性化ＩＴＲは、核酸分子により運搬され、発現され得る導入遺伝子の長さを効率的に最大化する、比較的制限されたヌクレオチド配列長の核酸分子に、転写活性化およびＩＴＲ機能両者を提供し得る。転写活性のある要素のＩＴＲへの取り込みは多様な方法で達成され得る。ＩＴＲ配列と転写活性のある要素の配列要件の比較は、ＩＴＲ内に該要素をコードする方法に関する洞察を提供し得る。例えば、転写活性を、転写活性のある要素の機能的要素を複製する特定の変化のＩＴＲ配列への導入を介して、ＩＴＲに付加し得る。特定部位で特定のヌクレオチド配列を効率的に付加、欠失および／または変化させる多数の技術が当分野で存在する(例えば、Deng and Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200:81-88参照)。転写活性化ＩＴＲを作る他の方法は、ＩＴＲの所望の位置への制限部位の導入を含む。さらに、複数の転写活性化要素を、当分野で知られる方法を使用して、転写活性化ＩＴＲに組み込み得る。
【０１５２】
転写活性化ＩＴＲは、ＴＡＴＡボックス、ＧＣボックス、ＣＣＡＡＴボックス、Ｓｐ１部位、Ｉｎｒ領域、ＣＲＥ(ｃＡＭＰ制御要素)部位、ＡＴＦ−１／ＣＲＥ部位、ＡＰＢβボックス、ＡＰＢαボックス、ＣＡｒＧボックス、ＣＣＡＣボックスまたは当分野で知られる転写に関与するあらゆる他の要素などの１以上の転写活性のある要素を含むことにより産生され得ると説明できる。
【０１５３】
II.Ａ.３. 目的の遺伝子および他の配列
本発明のある態様は、対象にＡＡＶ治療剤を投与する方法に関する。ある実施態様において、ＡＡＶは目的の遺伝子(ＧＯＩ, Gene of Interest)を含む。ある実施態様において、目的の遺伝子は非ＡＡＶ遺伝子である。ある実施態様において、ＧＯＩは哺乳動物遺伝子である。ある実施態様において、ＧＯＩはヒト遺伝子である。ある実施態様において、目的の遺伝子は生物学的に活性なポリペプチドをコードする。ある実施態様において、生物学的に活性なポリペプチドはサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、凝固因子、ホルモン、抗体、インスリンまたはこれらの何れかの組み合わせである。
【０１５４】
ある実施態様において、目的の遺伝子は、例えば、治療ポリペプチドまたはその治療有効部分をコードする。目的の遺伝子は、ポリペプチドをコードする何れかのポリヌクレオチドであり得る。発現される遺伝子は、使用者により望まれるあらゆる必要な制御要素(例えば、プロモーター、オペレーター)を伴うタンパク質をコードするＤＮＡセグメントまたは転写によりリボザイムまたは抗感覚分子などのあるＲＮＡ含有分子の全てまたは一部が産生される非コード化ＤＮＡセグメントであり得る。
【０１５５】
ある実施態様において、ＡＡＶは１を超えるＧＯＩを含む。１を超えるＧＯＩを有するＡＡＶにおいて、ある実施態様は、一つのプロモーターからＩＲＥＳまたは２Ａなどの要素を共発現させるためにこれらの要素を含む。ある実施態様において、ＡＡＶは、ＩＲＥＳ要素により離された２個の目的の遺伝子を含む。ある実施態様において、ＡＡＶは、２Ａ要素により離された２個の目的の遺伝子を含む。ある実施態様において、ＡＡＶは、目的の遺伝子間のＩＲＥＳ要素により離された、３個の目的の遺伝子を含む(例えば、ＧＯＩ−ＩＲＥＳ−ＧＯＩ−ＩＲＥＳ−ＧＯＩ)。ある実施態様において、ＡＡＶは、目的の遺伝子間の２Ａ要素により離された、３個の目的の遺伝子を含む。
【０１５６】
ある実施態様において、ＡＡＶは制御配列を含む。ある実施態様において、ＡＡＶは非コード化制御ＤＮＡを含む。ある実施態様において、ＡＡＶゲノムは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を含む。用語「制御配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことが意図される。このような制御配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。制御配列の選択を含むＡＡＶの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの因子により得ることは、当業者に認識される。ある実施態様において、ＡＡＶゲノムは、ｍＲＮＡスプライスドナー／スプライスアクセプター部位を含む。哺乳動物宿主細胞での発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０  (ＳＶ４０)、アデノウイルス、(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ)およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス制御配列が使用され得る。なおさらに、制御要素は、ＳＶ４０早期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１の長い末端反復からの配列を含むＳＲａプロモーター系などの種々の供給源からの配列からなる(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。ある実施態様において、制御配列は組織特異的プロモーターを含む。ある実施態様において、組織特異的プロモーターは、心臓、肝臓、肺、眼、神経系、リンパ系、筋肉および幹細胞からなる群から選択される組織における目的の遺伝子の発現を誘導する。
【０１５７】
II.Ｂ. ＥＬＩＳＡ
本発明のある態様は、ＥＬＩＳＡを使用して生物学的サンプルにおける抗ＡＡＶ抗体の力価を検出および／または測定する方法に関する。当分野で知られるあらゆるＥＬＩＳＡをここに記載する方法において使用できる。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは集団ＥＬＩＳＡである。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは発光ＥＬＩＳＡである。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは化学発光ＥＬＩＳＡである。
【０１５８】
本発明のある態様において、ＥＬＩＳＡは、表面、例えば、表プレート表面への標的ＡＡＶの結合を含む。ある実施態様において、次いで、ＥＬＩＳＡは、表面に結合したＡＡＶと生物学的サンプルの接触を含む。ある実施態様において、次いで、ＥＬＩＳＡは、二次抗体の適用を含む。ある実施態様において、二次抗体は酵素に結合される。ある実施態様において、次いで、ＥＬＩＳＡは、は基質の適用を含み、ここで、基質は二次抗体に結合した酵素に特異的である。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡは、基質上で作用する酵素の産物の測定を含む。
【０１５９】
ある実施態様において、表面に結合する標的ＡＡＶは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型またはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、表面に結合する標的ＡＡＶは、ＡＡＶ２型を含む。ある実施態様において、表面に結合する標的ＡＡＶは、ｒＡＡＶ２型を含む。ある実施態様において、表面に結合する標的ＡＡＶは、ＡＡＶ５型を含む。ある実施態様において、表面に結合する標的ＡＡＶは、ｒＡＡＶ５型を含む。ある実施態様において、表面に結合する標的ＡＡＶは、ＡＡＶ９型を含む。ある実施態様において、表面に結合する標的ＡＡＶは、ｒＡＡＶ９型を含む。
【０１６０】
ある実施態様において、生物学的サンプルは、ＥＬＩＳＡの表面に適用される。生物学的サンプルは、対象から得た何らかのサンプルであってよく、ここで、該サンプルは１以上の抗ＡＡＶ抗体を含むかまたは含むことが考えられる。ある実施態様において、生物学的サンプルは血液サンプルを含む。ある実施態様において、生物学的サンプルは血漿サンプルを含む。ある実施態様において、生物学的サンプルは血清サンプルを含む。
【０１６１】
生物学的サンプルを、当分野で知られる何れかの方法により取得および／または獲得できる。ある実施態様において、生物学的サンプルは、対象から直接、例えば、対象の循環系から直接サンプルを採取することにより得る。他の実施態様において、生物学的サンプルを試験室から得て、ここで、該試験室またはその前任者は、対象から生物学的サンプルを予め直接得ている。ある実施態様において、生物学的サンプルは新鮮であり、例えば、サンプルは凍結されておらずまたは長期間保存されていない。他の実施態様において、生物学的サンプルは、３７℃未満の温度で保存されている。
【０１６２】
ある実施態様において、生物学的サンプルをＥＬＩＳＡの前に希釈する。ある実施態様において、生物学的サンプルは、少なくとも約１：２、少なくとも約１：３、少なくとも約１：４、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、少なくとも約１：２０、少なくとも約１：３０、少なくとも約１：４０、少なくとも約１：５０、少なくとも約１：１００、少なくとも約１：１５０、少なくとも約１：２００、少なくとも約１：２５０、少なくとも約１：３００、少なくとも約１：３５０、少なくとも約１：４００、少なくとも約１：４５０、少なくとも約１：５００、少なくとも約１：１０００、少なくとも約１：２０００、少なくとも約１：３０００、少なくとも約１：４０００、少なくとも約１：５０００、少なくとも約１：１０,０００、少なくとも約１：２０,０００、少なくとも約１：３０,０００、少なくとも約１：４０,０００、少なくとも約１：５０,０００または少なくとも約１：１００,０００に希釈される。ある実施態様において、生物学的サンプルは、少なくとも約１：４に希釈される。ある実施態様において、生物学的サンプルは、少なくとも約１：４０希釈にされる。ある実施態様において、生物学的サンプルは、少なくとも約１：４００に希釈される。ある実施態様において、生物学的サンプルは、少なくとも約１：４０００に希釈される。ある実施態様において、生物学的サンプルは、少なくとも約１：４０,０００に希釈される。これらの状況で一般に使用され、当分野で知られるあらゆる希釈剤が使用される。
【０１６３】
ある実施態様において、生物学的サンプルは、ＥＬＩＳＡの表面への適用前に精製される。
【０１６４】
ある実施態様において、二次抗体は、抗ヒト抗体を含む。ある実施態様において、二次抗体は、抗ヒトλ抗体を含む。ある実施態様において、二次抗体は、抗ヒトκ抗体を含む。ある実施態様において、二次抗体は、抗ヒトκ抗体と抗ヒトλ抗体の組み合わせを含む。ある実施態様において、二次抗体はヤギ抗ヒトλ抗体である。ある実施態様において、二次抗体はウサギ抗ヒトκ抗体である。ある実施態様において、二次抗体はウサギ抗ヒトλ抗体である。ある実施態様において、二次抗体はマウス抗ヒトκ抗体である。ある実施態様において、二次抗体はヤギ抗ヒトλ抗体である。ある実施態様において、二次抗体はマウス抗ヒトκ抗体である。ある実施態様において、二次抗体はラット抗ヒトλ抗体である。ある実施態様において、二次抗体はラット抗ヒトκ抗体である。
【０１６５】
ある実施態様において、二次抗体は酵素と結合される。酵素はＥＬＩＳＡに当分野で使用されるあらゆる酵素であり得る。ある実施態様において、二次抗体は、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)に結合される。ある実施態様において、二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)に結合される。ある実施態様において、二次抗体はＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトλ抗体である。ある実施態様において、二次抗体はＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトκ抗体である。ある実施態様において、二次抗体は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトλ抗体とＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトκ抗体の組み合わせを含む。
【０１６６】
本発明のある態様は、ＥＬＩＳＡを使用して、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有する対象を同定する方法に関する。ある実施態様において、低力価の抗ＡＡＶ抗体は約８００未満〜約４０,０００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約５０,０００未満、約４５,０００未満、約４０,０００未満、約３５,０００未満、約３０,０００未満、約２５,０００未満、約２０,０００未満、約１５,０００未満、約１０,０００未満、約９０００未満、約８０００未満、約７０００未満、約６０００未満、約５０００未満、約４０００未満、約３０００未満、約２０００未満、約１０００未満、約９００未満、約８００未満、約７００未満、約６００未満または約５００未満である。
【０１６７】
ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約４０,０００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約１０,０００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約４０００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約１０００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約９００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約８５０未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約８００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約７５０未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約７００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約６５０未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約６００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約５５０未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約５００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約４００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約３００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約２００未満である。ある実施態様において、抗ＡＡＶ抗体力価は、化学発光ＥＬＩＳＡにより測定して、約１００未満である。
【０１６８】
ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約１００,０００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約１００,０００未満、約５０,０００未満、約４５,０００未満、約４０,０００未満、約３５,０００未満、約３０,０００未満、約２５,０００未満、約２０,０００未満、約１５,０００未満、約１０,０００未満、約９０００未満、約８０００未満、約７０００未満、約６０００未満、約５０００未満、約４０００未満、約３０００未満、約２０００未満、約１０００未満、約９５０未満、約９００未満、約８５０未満、約８００未満、約７５０未満、約７００未満、約６５０未満、約６００未満、約５５００未満または約５００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。
【０１６９】
ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約１０,０００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約４０００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約１０００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約９００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約８５０未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約８００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約７５０未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、生物学的サンプルが化学発光ＥＬＩＳＡで約７００未満の化学発光単位を発するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約６５０未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約６００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約５５０未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。ある実施態様において、対象は、化学発光ＥＬＩＳＡで生物学的サンプルが約５００未満の化学発光単位を放出するならば、低力価の抗ＡＡＶ抗体を有するとして同定される。
【０１７０】
ある実施態様において、低力価の抗ＡＡＶ抗体は低力価の中和抗ＡＡＶ抗体と相関する。
【０１７１】
本発明を、さらに次の実施例により説明し、これはさらなる限定として解釈すべきではない。本明細書をとおして引用する全引用文献は、引用により明示的に本明細書に包含させる。
【実施例】
【０１７２】
実施例１
本試験は、患者除外目的のために細胞ベースのアッセイを総抗体アッセイに置き換えることを目的として、ＥＬＩＳＡを使用して測定した抗ＡＡＶ抗体の総力価と標準の細胞ベースのアッセイを使用して測定した中和抗体の力価の間に相関性があるかを決定することを意図とする。
【０１７３】
抗ＡＡＶ９抗体のための高度に感受性の化学発光プレートベースのＥＬＩＳＡ検出法を開発した。ＥＬＩＳＡシグナルの特異性を評価するための総抗体スクリーニング方法に確認層(confirmatory tier)も組み込んだ。このアッセイを使用して、１００を超える心疾患患者血清サンプルを総ＡＡＶ抗体について評価した。同じサンプルを抗体がＡＡＶ結合および細胞への侵入を阻止する能力を測定する、典型的細胞ベースのレポーターアッセイにおいて中和抗体についても評価した。
【０１７４】
結果は、ＡＡＶ血清型９での総抗体集団と中和抗体集団の強い相関を示唆する。これらの結果に基づき、ＡＡＶ９ベースの遺伝子治療を受ける患者のスクリーニングおよび選択のための総抗体ＥＬＩＳＡアッセイの使用が提案される。
【０１７５】
材料および方法
材料
血清サンプルを、スコットランド、ダンディー大学で同意した患者から採取した。対象は、ＨＦｒＥＦ(駆出率が低下した心不全)またはＨＦｐＥＦ(駆出率が保持された心不全)を有する心不全患者であった。血清サンプルをＢＭＳとダンディー大学間で締結された材料移送契約(ＭＴＡ)により調達し、使用するまでBMS Biorepositoryで−８０℃において保管した。
【０１７６】
酵素結合免疫吸着測定法
ｒＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１(AMT-120; uniQure Amsterdam)またはｒＡＡＶ９ＨＬｕｃ(ＡＡＶ９−ＣＭＶ−ルシフェラーゼ９２４；uniQure Amsterdam)保存品を炭酸−重炭酸緩衝液(SRE0034; SIGMA)で２.５〜５.１×１０１１力価粒子／mL(約４〜８μg／mL総タンパク質濃度)に希釈した。１００μLをＥＬＩＳプレートにコートし、プレートをマイクロプレートシーラー(WHA77040001; SIGMA)でシールし、４℃冷蔵庫で１６〜１８時間インキュベートして、プレートのポリスチレン表面へＡＡＶ９を受動吸着させた。比色分析ＥＬＩＳＡには、Ｎｕｎｃ  ９６ウェル透明ポリスチレンプレート(Thermo Fisher Roskilde, Denmark)を使用した。化学発光ＥＬＩＳＡには、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９６ウェル黒色ポリスチレンプレート(Corning Inc. NY)を使用した。翌日、プレートを３００μLのＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液(Chata Biosystems)を各回使用して、３回自動化プレート洗浄機(Biotek ELx405, Winooski VT)で洗浄した。３００μLのＳｕｐｅｒ遮断  Ｔ２０(ＳＢＴ２０)緩衝液(ThermoScientific)をプレートに加えて、さらなる工程における非特異的タンパク質検出を遮断した。プレートを密封し、２２℃インキュベーターで２.５〜３時間、振盪せずにインキュベートした。
【０１７７】
ＡＤＫ９抗ｒＡＡＶ９モノクローナル抗体対照(651162; Progen)およびヒト血清希釈をポリプロピレンプレート(951031861; Eppendorf)で、ＳＢＴ２０緩衝液を希釈剤として使用して調製した。ＡＤＫ９対照抗体を図面の説明文に示すとおり、１：５０、１：１００または１：１０００希釈で使用した。血清サンプルを、図に示す種々のレベルに希釈した。希釈物を使用するまで４℃で保管した。競合ＥＬＩＳＡについて、ＡＤＫ９対照および血清希釈を意図する濃度の２倍で調製し、等量を８μg／mLのｒＡＡＶ９(競合Ａｂ)または等体積のＳＢＴ２０緩衝液(非競合対照)と混合し、使用前ポリプロピレンプレートで２２℃において２時間インキュベートした。プレートを先に記載のとおり洗浄し、１００μLの希釈ｒＡＡＶ９  ＡＤＫ９対照抗体またはヒト血清をプレートに加えた。バックグラウンド対照について、１００μLのＳＢＴ２０緩衝液を対照ウェルに加えた。競合ＥＬＩＳＡで、１００μLの競合または非競合対照ｒＡＡＶ９  ＡＤＫ９抗体およびヒト血清をプレートに加えた。
【０１７８】
プレートを密封し、１.５〜２時間、２２℃インキュベーターで、約２００〜２５０rpmのマイクロプレートシェーカーでインキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＡ(62-6720; Thermo Scientific)検出抗体を希釈１,０００倍に希釈し、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトκ(2060-05; SouthernBiotech)およびＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトλ(2070-05; Southern Biotech)検出抗体をＳＢＴ２０緩衝液で１０,０００倍希釈した。希釈物を使用するまで４℃で保管した。プレートを再び洗浄し、１００μLの希釈検出抗体を、バックグラウンド対照ウェルを含む適当なウェルに加え、プレートを密封し、４５分〜１.５時間、２２℃でシェーカー上にてインキュベートした。プレートを再び洗浄し、１００μLのＴＭＢ基質(T5569; SIGMA)を比色分析ＥＬＩＳプレートに加え、または１００μLの化学発光基質(37069; Thermo Scientific)を化学発光ＥＬＩＳプレートに加えた。１００μLの停止試薬(S5814; SIGMA)を比色分析ＥＬＩＳプレートに加え、吸光度を４５０nMでSpectramax M5eプレートリーダー(Molecular Device, Sunnyvale, CA)で読んだ。化学発光ＥＬＩＳプレートを同じプレートリーダーで、５００ミリ秒積分時間設定のルミネセンスで読んだ。
【０１７９】
ＥＬＩＳＡ計算
ＥＬＩＳＡのシグナル対ノイズ(Ｓ／Ｎ)を、抗ＡＡＶ９  ＡＤＫ９抗体または血清インキュベートウェルで得た平均化学発光または吸光度単位(比色分析ＥＬＩＳＡ)を、バックグラウンド対照ウェル(ＳＢＴ２０緩衝液インキュベーションのみ)で得た平均化学発光または吸光度単位で除することにより計算した。ＡＤＫ９のＳ／Ｎは、ヤギ抗マウス検出抗体で得た単位を必要とした。ヒト血清のＳ／Ｎは、ヤギ抗ヒトκおよび抗ヒトλ検出抗体で得た単位を必要とした。
【０１８０】
ｒＡＡＶ９と溶液で競合したとき(競合ＥＬＩＳＡ)のＥＬＩＳプレートにコートされたｒＡＡＶ９に対する抗体結合のパーセント阻害を、次式を使用して計算した。１００×{(平均非競合化学発光単位−平均競合化学発光単位)／平均非競合化学発光単位}。
【０１８１】
グラフ作成および統計分析
全グラフを、GraphPad Prism v 7.03ソフトウェアを使用して作成した。総ＥＬＩＳＡ抗体および中和抗体の順位ベースのスピアマンの順位相関分析も同じソフトウェアを使用して実施した。両側Ｐ値および９５％信頼区間を相関分析で計算した。
【０１８２】
中和抗体アッセイ
Ｌｅｃ−２細胞(CRL 1736; ATCC)を、一夜、９６ウェルプレートで、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン(Catalog #15140122; ThermoFisher Scientific)および２mM  Ｌ−グルタミン(Catalog #25030081; ThermoFisher Scientific)を添加した１０％ＦＢＳ(Catalog #10438; Gibco)含有ＭＥＭ培地(M8042; Millipore SIGMA)で、３７℃／５％ＣＯ２で、２０,０００  Ｌｅｃ−２細胞／ウェル密度で培養した。翌日ｒＡＡＶ９ＨＬｕｃストックをＦＢＳ不含ＭＥＭ培地で２２,５００ＭＯＩまで希釈し、ＦＢＳ不含ＭＥＭ培地で２０倍希釈したヒト血清サンプルと、室温で１時間インキュベートした。陰性対照は、熱不活性化ＦＢＳのみと混合したｒＡＡＶＨＬｕｃからなった。培養培地をＬｅｃ−２細胞から吸引し、１００μLのＡＡＶ９および血清混合物または対照を細胞に加え、３０分間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。培地を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに置き換え、細胞を１６〜２０時間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。培地の除去および１００μL  １×ＤＰＢＳ(Catalog #14190094; Invitrogen)洗浄後、細胞を１００μLのＧＬＯ溶解緩衝液(E2661: Promega)を使用して溶解し、室温で５分間インキュベートした。１００μL  ルシフェラーゼ基質(E6120; Promega)を製造業者の指示に従い調製し、溶解細胞に加え、３分間インキュベートした。ルミネセンスシグナルをプレートリーダー(Enspire; Perkin Elmer)を使用して測定した。血清サンプルの中和活性を、陰性ＦＢＳ対照のパーセンテージ(％ＦＢＳ)として示した。
【０１８３】
結果
【０１８４】
マウスモノクローナル抗体対照を使用する総抗ＡＡＶ９抗体についての化学発光と比色分析ＥＬＩＳＡ検出法の比較
比色分析ＥＬＩＳＡは、抗ＡＡＶ  Ａｂの検出に以前使用されている。タンパク質特異的抗体全般の検出における化学発光ＥＬＩＳＡの優れた感受性から、抗ＡＡＶ抗体検出について２つの方法を比較した。透明または黒色ポリスチレンプレートを、ルシフェラーゼ(ｒＡＡＶ９−ＨＬｕｃ)またはＳ１００Ａ１(ｒＡＡＶ９−Ｓ１００Ａ１)の導入遺伝子を含むＡＡＶ９カプシドで、炭酸緩衝液中８μg／mL濃度で一夜コートし、方法セクションに記載するＡＤＫ９、マウスモノクローナル抗ＡＡＶ９抗体で検出した。ｒＡＡＶ９−ＨＬｕｃ粒子は、細胞ベースの中和抗体アッセイで使用するホタルルシフェラーゼレポーター構築物を含む。両ＡＡＶ９粒子は、同一カプシドを有するよう構築しているが、ルシフェラーゼカプシドをカプシド類似性を証明するためおよび総および中和抗体データセットの相関的照合を可能にするために、ＥＬＩＳＡに含めた。表１に示すとおり、１：５０および１：１００  ＡＤＫ９希釈で、およびルシフェラーゼおよび導入遺伝子含有構築物両者で、化学発光ＥＬＩＳＡは、比色分析ＥＬＩＳＡと比較してシグナル対ノイズ(Ｓ／Ｎ)比の２１〜３８倍改善を示した。ｒＡＡＶ９−Ｓ１００Ａ１およびｒＡＡＶ９−ルシフェラーゼ検出に差異はなく、ＡＡＶ９カプシドが抗体反応性の点で類似していることを示した。
【０１８５】
【表１】
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Ｓ／Ｎ＝シグナル対ノイズ比
【０１８６】
ヒト血清サンプルにおける総抗ＡＡＶ９抗体検出についての化学発光ＥＬＩＳＡの評価
上でマウスモノクローナル対照を使用して決定した条件が、ヒト抗ＡＡＶ９抗体検出に適用できることを確認するために、２種のＥＬＩＳＡ検出法を商業的に得た正常ヒト血清(ＮＨＳ)サンプルを使用して再評価した。プレートを、コーティング最適化実験(データは示していない)に従い４μg／mLのｒＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１でコートした。８つの異なるロットのＮＨＳサンプルの１０倍希釈を、ＳＢＴ２０緩衝液を使用して４倍希釈から出発して調製した。希釈物の一部を二等分し、ＨＲＰコンジュゲート抗κおよび抗λ検出抗体を使用する化学発光および比色分析検出法で試験した。化学発光法において、４倍〜４０００倍希釈範囲で直線性が観察され(図１Ａ)、一方比色分析法において、４００倍希釈範囲まで直線性が検出された(図１Ｂ)。故に、化学発光法は少なくとも１ログの動的範囲の改善を示す。シグナル対ノイズ比(Ｓ／Ｎ)を、方法セクションに記載のとおり１：４、１：４０および１：４００の血清希釈で、全３希釈が両方法でほぼ直線範囲に入ったため計算した。代表的コンパレーターとして、１：４００倍希釈で計算したＳ／Ｎを示す(図２)。全試験サンプルで、Ｓ／Ｎは比色分析法と比較して化学発光法で高かった(図２)。ＣＬ方法で１７／２１サンプルがＳ／Ｎ＞４.０を示し、比色分析法で１／２１サンプルのみ、Ｓ／Ｎ＞４.０を示した。１：４および１：４００倍血清希釈でのＳ／Ｎ比較を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。
【０１８７】
化学発光ＥＬＩＳＡ使用の実行可能性をさらに分析するため、比色分析ＥＬＩＳＡで４倍血清希釈および化学発光ＥＬＩＳＡで４００倍血清希釈から取得したデータを使用して、順位ベースのノンパラメトリック相関分析を実施した。血清希釈を、各方法で直線範囲から選択した(図１Ａ〜１Ｂ)。２方法に有意な相関関係が観察され(図３)、全試験サンプルで比色分析法を超える化学発光ＥＬＩＳＡ検出法の感受性の相関的増加が示された。
【０１８８】
化学発光ＥＬＩＳＡにおける抗ｒＡＡＶ９抗体結合特異性の確認
特異性層を、プレートに直接結合する非特異的血清要素ではなく、ＡＡＶ９特異的抗体が、検出されたことを確認するため、化学発光ＥＬＩＳＡに組み込んだ。正常ヒト血清サンプルを、示す濃度の２倍で調製し、ポリプロピレンプレート中、８μg／mL  ｒＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１(４μg／mL最終濃度)で２時間プレインキュベートし、その後血清サンプルを、洗浄し、遮断したｒＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１被覆プレートに加えた(図４Ａ〜４Ｃ)。溶液中の競合ＡＡＶ９カプシドに結合したままの抗体はＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１被覆プレートでのインキュベーション後のＥＬＩＳＡで洗い流されたと予測された。プレート被覆ＡＡＶ９カプシドの競合レベルまたは抗体結合特異性を、材料および方法に記載のとおり計算し、ＥＬＩＳＡシグナルのパーセント阻害として示した。この方法を使用して、４個の試験血清サンプルは競合ＥＬＩＳＡで５０％以上の阻害を示した(図４Ａ〜４Ｂ)。マウスＡＤＫ９モノクローナル抗体対照は９６％の阻害を示し、競合パラメータが阻害および特異性決定のほぼ最高レベルで最適であることを示した。
【０１８９】
化学発光ＥＬＩＳＡ法の再現性
１２の異なるロットの正常ヒト血清を、方法の再現性を確認するために異なる日に２回、各回、別の分析者により、化学発光ＥＬＩＳＡ法で試験した(図５Ａ〜５Ｂ)。直線範囲の２つの血清希釈物(図１Ａ〜１Ｂ参照)を本実験に選択した。結果は両試験希釈物での分析者間の良好な再現性を示し、実験間精度は３０％未満であった(図５Ａ〜５Ｂ)。
【０１９０】
導入遺伝子とルシフェラーゼ含有構築物の互換性
最終的目的は、心疾患集団からの血清サンプルのプレスクリーニングにおいて抗ｒＡＡＶ９総抗体と中和抗体の相関があるかの決定であった。しかしながら、総抗体アッセイは、Ｓ１００Ａ１導入遺伝子を封入するｒＡＡＶ９カプシドを使用し、一方中和抗体アッセイは、ルシフェラーゼレポーターを封入するｒＡＡＶ９カプシドを使用した。２つのデータセット間で見られる何らかの非相関が、各アッセイで使用したＡＡＶ９カプシド材料の差異によるものではないことを確認するために、両構築物を陽性対照として３つの異なるロットの正常ヒト血清を使用する総抗体ＥＬＩＳＡでまず試験した。等量のルシフェラーゼおよび導入遺伝子含有ｒＡＡＶ９カプシドをＥＬＩＳＡプレートにコートし、３つの異なるロットの正常ヒト血清サンプルの４希釈物を遮断および洗浄ＥＬＩＳプレートのプローブに使用した。両カプシドは、全３個の血清サンプルおよび全試験希釈でプローブしたとき、類似シグナルを示した(図６Ａ〜６Ｃ)。したがって、総および中和抗体アッセイデータ間で可能性のある相関は、２カプシドタイプ間の抗体結合エピトープにおける予期しない変動によるものではない。
【０１９１】
心疾患血清サンプルにおける総および中和抗ｒＡＡＶ９抗体の相関分析
２つのアッセイ、すなわち、細胞ベースの中和抗体および総抗体ＥＬＩＳＡで使用したカプシドが免疫反応性の点で類似することが証明され、心疾患患者からの１００血清サンプルのパネルで中和抗体データと総抗体データの相関の評価を勧めた。細胞ベースのアッセイについて、血清サンプルを２０倍希釈し、ｒＡＡＶ９−ＨＬｕｃカプシドと１時間インキュベートし、培養中のＬｅｃ−２細胞に加えた。対照はＨＬｕｃカプシド単独またはマウスモノクローナル抗体ＡＤＫ９からなった。次いで、細胞を洗浄し、ルシフェラーゼ基質を加え、アッセイを材料および方法に記載のとおり完了させた。
【０１９２】
抗体の中和能を、ＦＢＳ陰性対照(抗ｒＡＡＶ９中和抗体不含)存在下観察されたｒＡＡＶ９ＨＬｕｃの形質導入のパーセンテージとして表した。陰性対照とのｒＡＡＶ９ＨＬｕｃのインキュベーションが、カプシドの最大細胞侵入と続くルシフェラーゼ発現をもたらすと予測されるため、血清サンプルの何れかの存在下のルシフェラーゼ発現レベル減少は、サンプルにおける中和抗体の存在を示す。
【０１９３】
同じサンプルを４００倍希釈し(アッセイで直線範囲)、総抗体について材料および方法に記載のとおりＥＬＩＳＡで評価した。ＥＬＩＳＡデータを生データ単位に基づきプロットした。２つのデータセット間の順位ベースのスピアマンの順位相関分析は、中和および総抗体の有意な負の相関(ｒ−０.８２８６、ｐ＜０.０００１)を示した(図７、ｐ値＜０.０００１)。５０％の、任意のしかし広く用いられる中和カットオフ基準は、１００サンプル中６５を中和抗体陽性と同定した。総抗体ＥＬＩＳＡで、全中和抗体陽性対象は＞７００化学発光単位を示した(図７)。総抗体アッセイにおける７００化学発光単位カットオフは、上部右四分円に示す７つのさらなる中和抗体陰性個体も捕捉した(図７)。
【０１９４】
確認または競合ＥＬＩＳＡも、材料および方法に記載のとおり非競合ＥＬＩＳＡと並行して全１００対象で実施した。中和抗体および確認ＥＬＩＳＡ抗体データセット間の順位付けされた相関分析も、有意な負の相関を示した(ｒ−０.７１９３、ｐ＜０.０００１)。６５中和抗体陽性対象中、７個体が競合総抗体ＥＬＩＳＡで３０％以下の阻害レベルの抗体を示した(図８、下部左四分円)。７つのさらなる中和抗体陰性対象は、３０％の任意のカットオフでＥＬＩＳＡにおいて特異的抗体を有するとして同定された(図８、上部右四分円)。
【０１９５】
抗ＡＡＶ９型抗体で得られたのに類似する結果が、抗ＡＡＶ２型抗体の結果で観察された(図９)。
【０１９６】
全体的統計は、細胞ベースの中和アッセイおよび確認総抗体Ｅで除外される患者が近似であることを示す(６５対６６)(表２)。総抗体ＥＬＩＳＡで、中和抗体アッセイおよび確認ＥＬＩＳＡに対して、それぞれ、７または６のさらなる対象が、除外され得る。３つのデータセットを、患者スクリーニングおよび除外に３アッセイの何れか一つを使用する適切性を決定するために、重複について精査した。これらの評価は、中和抗体アッセイで≦５０％、スクリーニングまたは総抗体ＥＬＩＳＡで≧７００単位および確認抗体ＥＬＩＳＡで≧３０％の任意のカットオフに基づいた。中和アッセイのみ基準は、ＥＬＩＳＡで抗体の陽性が確認されなかった６対象の除外を伴った(図１０)。総抗体ＥＬＩＳＡのみに基づく患者の選択は、中和抗体集団の一部ではない(中和抗体偽陽性)７対象およびＥＬＩＳＡで陽性が確認されない１１対象を除外する。確認総抗体ＥＬＩＳＡに基づく患者の選択は、中和抗体アッセイで陽性である６対象を含む。
【表２】
2021528639.tif 000003
【０１９７】
ＡＡＶ２に関する相関分析を、ＡＡＶ２カプシドをＥＬＩＳＡおよび中和抗体アッセイで使用し、抗ＡＡＶ９抗体ではなく抗ＡＡＶ２抗体を検出した以外、ここに記載するＡＡＶ９に関する相関分析を実施したのと同じ方法(方法および図７参照)で、３６個体心疾患患者からの血清を使用して実施した(図９参照)。
【０１９８】
ＨＲＰコンジュゲート抗κおよび抗λ抗体によるｒＡＡＶ９抗体の検出を、ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＧ抗体による検出と比較した。ｒＡＡＶ９Ｓ１００Ａ１を４μg／mLで被覆し、ＥＬＩＳＡを、示す正常ヒト血清ロットの１：４００希釈倍率を使用して、材料および方法に記載のとおり実施した。１：１０,０００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ(A6029 SIGMA)を使用した。
【０１９９】
考察
ヒトは、野生型ＡＡＶに幼少期に暴露され、抗ＡＡＶ抗体を獲得するようになっている。血清型１〜９由来のＡＡＶベクターは、非臨床および臨床試験で最も一般に使用される血清型である。このような既存の抗ＡＡＶ抗体は、多様な実験成績により証明されるとおり、遺伝子療法のための組み換えアデノウイルのインビボ適用に限界を提起する。例えば、凝固第IX因子導入遺伝子をコードするＡＡＶ８ベクター投与前の精製ヒトＩｇＧでの受動免疫化の非臨床モデルは、肝臓の形質導入の遮断を示した(Mingozzi et al., 2012)。マウスまたは非ヒト霊長類へのＡＡＶ血清型の連続投与を含む他の研究において、１血清型に応答して産生された中和抗体は、同じ血清型による形質導入を完全に遮断したが、異なる血清型による形質導入は阻害しなかった(Majowicz et. al., 2014)。抗ＡＡＶ２中和抗体の相対力価の差異は、ヒト臨床治験における血友病Ｂ導入遺伝子形質導入の予防に貢献する可能性があると報告された(Manno et. al., 2006)。これら観察に鑑みて、既存のＡＡＶ抗体を有する臨床治験対象および患者の同定および除外は、導入遺伝子の形質導入率を増加させ得る。
【０２００】
一般に、細胞表面受容体へのウイルス結合と、続く宿主細胞への侵入を阻止するＡＡＶ中和抗体が、インビトロ細胞ベースのアッセイおよび非標準化アッセイ条件および同定基準を使用して患者血清サンプルで検出される。中和抗体アッセイは、通常アッセイ読み出しを可能にするために導入遺伝子の代わりにレポーター遺伝子(通常ルシフェラーゼ)を含むＡＡＶウイルスカプシドを用いる。細胞ベースのアッセイは大きな労働力を要し、処理量が少なくおよび変動しやすい。標的とする内因性宿主細胞受容体に類する適切な受容体を発現する細胞株の選択を含む、相当量のアッセイ最適化が各ＡＡＶ血清型について検討下にある。比較として、ＥＬＩＳＡは処理量が高く、低変動性であり、開発、自動化および検証が容易である。さらに、ＡＡＶ遺伝子治療剤は、ＥＬＩＳＡにおけるプレートコーティングおよび抗ＡＡＶ抗体の検出のための試薬として直接使用され得る。細胞ベースの中和抗体とＥＬＩＳＡで検出される総または結合抗体で相関が証明されたら、後者を既存のＡＡＶ抗体を有する個体の同定と臨床治験および薬物投与からの除外に使用できる。
【０２０１】
患者集団における中和および総両者の既存の抗体の出現頻度の理解と、次いでもしあるならば細胞ベースの中和データと総抗体データの間の強い相関を確立することを意図した。この目的に向けた第一段階として、抗ＡＡＶ９抗体検出のための高度に感受性のおよび特異的化学発光ＥＬＩＳＡの開発を実施した。精製ヒト抗ＡＡＶ抗体陽性対照がないため、初期アッセイ開発ならびにウイルス粒子コーティング濃度、コーティング緩衝液(ＰＢＳ対ＣａＣＯ３)、遮断緩衝液およびＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの洗浄サイクル数などのパラメータを含む最適化に市販マウスモノクローナルＡＡＶ９抗体(ＡＤＫ９)を使用した(データは示していない)。
【０２０２】
その後、正常健常ヒトドナーからのいくつかの市販血清サンプルを使用して、広い動的アッセイ範囲および直線性(約４ログの血清希釈)、再現性および精度を証明した。確認または特異性層を、血清サンプルを溶液でｒＡＡＶ９とプレインキュベートし、その後プレート結合ｒＡＡＶ９を加えることによりアッセイに組み込んだ。確認アッセイ条件は、マウスモノクローナルＡＤＫ９陽性対照の高レベルのＥＬＩＳＡシグナル阻害(９６％)により示されるとおり最適であった。種々のレベルの阻害が種々の血清サンプルロットで見られ(５０〜７２％範囲)、アッセイ条件が種々の特異性の抗体差別化にも最適であることが示唆された。抗ヒトＩｇＧ検出抗体を使用する早期試験が、１２の正常ヒト血清サンプル中少なくとも５つが抗ヒトκおよびλ検出抗体と比較して相対的に低いまたはバックグラウンドシグナル未満である結果となったため、ＣＬＥＬＩＳＡで汎アイソタイプ抗ヒトκおよびλ定常領域検出抗体を使用したことは注意すべきである(図１２)。
【０２０３】
遺伝子治療試験がＡＡＶ抗体検出のために慣習的に比色分析ＥＬＩＳＡを用いるため、２方法(化学発光対比色分析)間の一対一比較の実施が重要であると考えた。シグナル対ノイズ比(Ｓ／Ｎ)の観点で、化学発光(ＣＬ)ＥＬＩＳＡは結果セクションに記載するとおり明らかに比色分析ＥＬＩＳＡより優れた。ＣＬタンパク質ＥＬＩＳＡは抗体検出に使用されているが、知る限り、これが抗ＡＡＶ抗体検出にＣＬＥＬＩＳＡを適用した初めての報告である。また抗ＡＡＶ抗体検出のための確認または特異性層についても初めての報告である。
【０２０４】
心疾患を有する患者からの１００血清サンプルを、総抗体データセットと細胞ベースの中和抗体データを相関させる目的で、既存のＡＡＶ９抗体について分析した。相関分析前に、２つのカプシドが正常ヒト血清サンプルまたはマウスＡＤＫ９モノクローナル対照でプローブしたとき、抗体反応性について互いに類似することを確認した。１００心疾患患者血清サンプルの総抗体および中和抗体データの評価は、総抗体と中和抗体データセットの間の有意な負の相関を示し、ＣＬＥＬＩＳＡで検出された総抗体の大部分が中和性質を有したことが示された。中和抗体データと確認ＥＬＩＳＡデータ間の類似の相関分析はこれより低いが、なお強い有意レベルの負の相関をもたらした。本試験で観察された強い相関のため、総および／または確認抗体ＥＬＩＳＡは、ｒＡＡＶ９ベースの遺伝子治療のための対象のスクリーニングおよび除外のための細胞ベースの中和抗体アッセイの価値ある代替である。
【０２０５】
数個体の血清サンプルの重複における差にかかわらず、総および確認抗体ＥＬＩＳＡは、中和抗体陽性集団の大部分を捕捉するため、細胞ベースの中和抗体アッセイの容易かつ速い代替である。さらに、ＣＬＥＬＩＳＡは、受容体結合および侵入と無関係の機構により中和し得る抗体を同定するさらなる利点を有する。両形態(中和抗体および確認総抗体)で抗ＡＡＶ９抗体陽性と試験される個体の高いパーセンテージが推定されかつ研究員が多数の患者サンプルをスクリーニングすることが予測されるため、速度および低変動性により得られる利点は大きい。アッセイの阻害部分と競合する十分な薬物(導入遺伝子をカプセル封入するウイルスカプシド)が得られない場合、≧７００単位のカットオフでの総抗体アッセイは、対象スクリーニングおよび除外の価値ある代替である。総抗体ＥＬＩＳＡを、精製ヒトＩｇＧを使用する相対的定量を組み込むためにさらに開発でき、カットオフを体積抗体レベルあたりの重量に基づき確立し得る。
【０２０６】
過去に、ＥＬＩＳＡで検出された抗体力価(結合抗体)と細胞ベースのアッセイで測定された中和抗体力価の間に相関があるか否かに取り組んだいくつかの試験があったが、細胞ベースのアッセイをＥＬＩＳＡ方法に置き換える教示はどこにもない。さらに、これらの試験は、ＥＬＩＳＡにおける検出の比色分析法を使用し、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９および他のＡＡＶ血清型に対する抗体を検出するためにβ−ガラクトシダーゼ、ＡＡＶ複製タンパク質およびルシフェラーゼを含む多様なレポーターを細胞ベースの中和アッセイで使用した。これらの試験の２つは、ＡＡＶ２抗体について２アッセイ間で相関が低いことを示した(Chirmule et al., 1999; Erles et al., 1999)。５１の健常ドナー血清におけるＡＡＶ１力価を試験した一つの研究は、その特定の状況で、ＥＬＩＳＡにおけるＩｇＧ力価と中和力価の間に相関があるはずであることを示したが(Veron et al., 2012)、もう一つの研究は、１００の健常ヒトドナーサンプルでＡＡＶ９ＥＬＩＳＡと中和抗体力価の相関を評価し、大部分の抗ＡＡＶ９  ＩｇＧ力価が非中和性質であることを報告した(Thwaite et al., 2015)。我々は、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２について総ＥＬＩＳＡ抗体と中和抗体の強い相関を証明した；ＣＬ方法の感受性増加およびＥＬＩＳＡで汎アイソタイプ抗ヒトκおよびλ定常領域検出抗体を使用した事実が助けとなった可能性がある。方法開発初期は抗ヒトＩｇＧ検出抗体を試験し、１２の正常ヒト血清サンプル中少なくとも５つが、抗ヒトκおよびλ検出抗体と比較して比較的低いまたはバックグラウンドシグナル未満であることを示した(図１２)。
【０２０７】
要約すると、抗ＡＡＶ９抗体の検出のための高度に感受性の化学発光ＥＬＩＳＡが開発され、ＡＡＶ９中和力価との有意な相関関係が証明された。これにより、ＦＤＡ承認ＡＡＶ９モダリティでの臨床治験および患者処置における、患者スクリーニングおよび除外のために、細胞ベースの中和抗体アッセイの代わりにＡＡＶ９ＥＬＩＳＡが使用可能となる。またＡＡＶ９ＥＬＩＳＡに確認層を組み込み、これはスクリーニングのための第二層を容易にする。これは、特異性も評価する化学発光法でのＡＡＶ抗体検出について初めての報告である。力価測定と組み合わせて、このアッセイは、３層スクリーニング、確認および力価アプローチのＡＡＶ９ベースの遺伝子治療に対する応答により産生された抗薬物抗体(ＡＤＡ)同定にも使用でき、ここでカットオフは未処置対象に基づき設定される。
【０２０８】
具体的実施態様の前の記載は本発明の一般的性質を十分に確認し、他者が、当分野の技術内の知識を適用することにより、過度の実験なくおよび本発明の一般的概念から逸脱することなく、種々の適用のために具体的実施態様を容易に修飾および／または適用させることができる。それ故に、このような適用および修飾は、ここに提示する教示および指針に基づき、開示する実施態様の等価物の意味および範囲内であることが意図される。ここでの表現法および用語法は、本明細書の表現法および用語法が全体的教示および指針に鑑みて当業者により解釈されるように記載の目的であり、限定的ではないことは理解される。
【０２０９】
本発明の他の実施態様は、明細書の考察および本開示の実施により当業者には明らかである。明細書および実施例は単なる例として解釈されるべきであり、本開示の真の範囲および精神は次の特許請求の範囲により示されることが意図される。
【０２１０】
ここに引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許および特許出願が具体的におよび個々に引用によりその全体を本明細書に包含させると開示したのと同程度に、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０２１１】
本出願は２０１８年６月２０日出願の米国仮出願６２／６８７,５６４の理系を請求ｙし、それは引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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