(57)【要約】  本発明は、遺伝子伝達用細胞シートに関し、本発明による細胞シートは、既存の組織再生用途に使用された細胞シートとは異なって、局所的遺伝子伝達システムとして活用可能である。特に、遺伝子伝達システムとしてウイルスを使用する場合、ウイルスを細胞シート内で増殖させることができ、ウイルスが治療部位だけで局所的に作用することになるので、ウイルスの全身投与または腫瘍内投与と比較して、ウイルス投与量を顕著に低減しても、癌の予防または治療、癌の再発または癌の転移防止、特に多病巣性腫瘍の治療に卓越したものである。
2021507718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つ以上の細胞層を含み、そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムが導入されている、細胞シート。
【請求項２】
前記細胞シートは、支持体として体細胞を含む細胞層を含むものである、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項３】
前記体細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、筋上皮細胞（ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ）、上皮ケラチン細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、シュワン細胞（ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ）、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）、巨大細胞（ｍｅｇａｋａｒａｔｙｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、幹細胞および癌細胞よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項２に記載の細胞シート。
【請求項４】
前記遺伝子伝達システムは、（ｉ）ネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクターおよび（ｉｖ）前記ネイキッド組換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはニオソームの形態である、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項５】
前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、セムリキフォレストウイルスおよび麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項４に記載の細胞シート。
【請求項６】
前記遺伝子伝達システムは、組換えアデノウイルスである、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項７】
前記組換えアデノウイルスは、複製不能アデノウイルスまたは腫瘍殺傷アデノウイルスである、請求項６に記載の細胞シート。
【請求項８】
遺伝子伝達システムが導入される細胞層は、癌細胞または幹細胞を含むものである、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項９】
支持体として体細胞を含む細胞層と；
癌細胞または幹細胞を含む細胞層と；を含み、
組換えアデノウイルスが癌細胞または幹細胞を含む細胞層に導入されている、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項１０】
前記細胞シートは、遺伝子伝達システムが導入されている、癌細胞を含む細胞層を含み、
前記癌細胞は、放射線が照射されたものである、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターは、０．１〜５００ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の量で搭載される、請求項４に記載の細胞シート。
【請求項１２】
温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に、二つ以上の細胞層を含む細胞シートを形成し、そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムを導入し、温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離することを含む細胞シートの製造方法。
【請求項１３】
前記温度感応性ポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびポリラクテート−ｃｏ−グリコレート（ＰＬＧＡ）よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
支持体として体細胞を含む細胞層を含む細胞シートを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記体細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、筋上皮細胞（ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ）、上皮ケラチン細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、シュワン細胞（ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ）、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）、巨大細胞（ｍｅｇａｋａｒａｔｙｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、幹細胞および癌細胞よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子伝達システムは、（ｉ）ネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクターおよび（ｉｖ）前記ネイキッド組換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはニオソームの形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、セムリキフォレストウイルスおよび麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子伝達システムは、組換えアデノウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記組換えアデノウイルスは、複製不能アデノウイルスまたは腫瘍殺傷アデノウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子伝達システムが導入される細胞層は、癌細胞または幹細胞を含むものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
支持体として体細胞を含む細胞層を形成し；
前記細胞層上に癌細胞または幹細胞を含む細胞層を形成し、組換えアデノウイルスを癌細胞または幹細胞を含む細胞層に導入する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌細胞は、放射線が照射されたものである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスベクターを０．１〜５００ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のウイルス量で接種する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の細胞シートを含む遺伝子治療剤。
【請求項２５】
癌の予防または治療のためのものである、請求項２４に記載の遺伝子治療剤。
【請求項２６】
癌の再発または癌の転移防止のためのものである、請求項２４に記載の遺伝子治療剤。
【請求項２７】
前記癌は、多病巣性肝細胞癌腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、喉頭癌、すい臓癌、肺癌、非小細胞性肺癌、結腸癌、骨癌、すい臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、卵巣癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、肛門付近癌、大腸癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、脳幹部神経膠腫および脳下垂体腺腫よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項２５または２６に記載の遺伝子治療剤。
【請求項２８】
癌除去手術部位に請求項１に記載の細胞シートを移植する段階を含む癌再発防止方法。
【請求項２９】
癌治療が必要な部位に請求項１に記載の細胞シートを移植する段階を含む癌治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子伝達用細胞シートに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療剤の急速な発展にもかかわらず、癌は、依然として全世界的に死亡率が高い疾患の一つである。既存の臨床的に使用されている主な癌治療方法は、外科的手術、放射線治療、抗癌剤治療方法であるか、またはこれを併行する治療であって、最大限癌細胞を患者から除去する方法である。しかしながら、このような治療は、比較的初期癌において、転移にならない状態で癌細胞を完全に除去したときにのみ治療効果を示すという問題がある。
【０００３】
特に、肝細胞性癌腫（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）は、世界で五番目に多く発生する癌であって、癌関連死亡原因のうち３番目に多いと知られている。Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルス感染のような慢性肝疾患およびこれによる肝硬変は、すべての肝癌発生の８０〜９０％を占める。ＨＣＣの核心特性の一つは、多病巣性腫瘍病変（多発性／多核性／肝内転移性）を同時に発病することがあり、この多病巣性肝細胞は、高い再発率、薬物内科的特性および罹患率に寄与するということである。重要なことは、長期間のコホート研究は、肝硬変と多発性／多病巣性肝細胞癌腫との間の強い量の相関関係を示した。慢性ウイルス感染は、反復的な肝細胞壊死と密接に関連しており、その次に再生が起こる。そのような加速化した細胞周期は、多くの肝部位で腫瘍を発生させる肝での遺伝的エラーの蓄積と関連があり得、これら患者を多病巣性肝細胞癌腫に分類することができる。
【０００４】
ＨＣＣの現在標準治療法には、選択的内部放射線療法および化学療法剤を用いた全身療法が含まれる。しかしながら、癌特異性が欠如したこのような治療様相は、肝に対して非常に毒性があり、これは、肝機能障害を示す多数の肝細胞癌患者に深刻な問題を起こすので、腫瘍を撲滅するのに十分な量の薬物を投与することが難しい。前述した理由によって外科的切除が優先的な治療法として残っているが、多発性硬化症および肝硬変のような多様な理由によって肝細胞癌患者のほとんど（７０％未満）は、切除が不可能である  [Ｅｌ−Ｓｅｒａｇ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００８．１３４（６）：ｐ．１７５２−６３；Ｂｅｌｇｈｉｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒ．Ｋｉａｎｍａｎｅｓｈ，Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＨＰＢ（Ｏｘｆｏｒｄ），２００５．７（１）：ｐ．４２−９；Ｚｉｓｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  ｓｕｒｇｅｒｙ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、１９９９．９０（１）：ｐ．４２−５３]。
【０００５】
治癒的切除手術を施行するとしても、患者の高い再発率は、肝細胞癌の治療に重要な課題として残っている。
【０００６】
多様な臨床試験で強力かつ癌特異的な細胞殺傷効能を立証した腫瘍殺傷療法は、小分子化学療法に関連した標的細胞毒性を克服するための有望な候補者になりうる。
【０００７】
様々な腫瘍殺傷ベクターのうちアデノウイルス（Ａｄ）は、挿入突然変異の誘発危険がなく、高力価での容易な生産および高い転移遺伝子発現水準のようないくつかの有益な特性を有していて、癌遺伝子の治療に有利である。有望な前臨床結果にもかかわらず、臨床試験で最適な抗腫瘍効能を導き出すためには、不適切な伝達および不十分な水準の治療遺伝子伝達またはウイルス複製のようないくつかの障害物を克服しなければならない。重要なことは、安全問題と全身投与されたビリオンの効能制限によって臨床試験で好ましい投与経路として提示されるビリオンの腫瘍内接種は、多病巣性腫瘍の場合には可能でないことがあることを意味する。現在腫瘍殺傷ウイルスで様々な腫瘍を同時に治療する効果的かつ標準化されたプロトコルが不足している。全身投与が異なる標準治療法でこのような限界を避けることができるが、腫瘍殺傷ウイルスの免疫原性が強く、患者にＡｄに対する既存の免疫力が高ければ、このような接近法は、クリニックでは非実用的である。
【０００８】
多病巣性肝細胞癌腫に対する標準治療療法と腫瘍殺傷療法の内在的限界を克服するために、多発性肝細胞癌腫で腫瘍殺傷Ａｄの効能を向上させる有望な候補として細胞シートを研究した。
【０００９】
伝統的に、細胞シートは、主に損傷した組織の機能を代替したり復元するために組織工学に使用された。細胞シートの主な強みは、生体適合性、耐久性ある生着誘導能力、合成抗体より不利な炎症反応の危険を低減することである。しかしながら、このような細胞シートを遺伝子伝達のために使用した研究は、報告されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、遺伝子伝達システムの全身投与の問題点を解決するために、局所的遺伝子伝達プラットホームとして細胞シートを開発することによって、本発明を完成することになった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
二つ以上の細胞層を含み、
そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムが導入されている、
細胞シートを提供する。
【００１２】
また、本発明は、
温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に、
二つ以上の細胞層を含む細胞シートを形成し、
そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムを導入し、
温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離することを
含む、細胞シートの製造方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、
前記細胞シートを含む遺伝子治療剤を提供する。
【００１４】
また、本発明は、
癌除去手術部位または癌治療が必要な部位に前記細胞シートを移植することを含む癌再発防止方法または癌治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による細胞シートは、既存の組織再生用途に使用された細胞シートとは異なって、局所的遺伝子伝達システムとして活用可能である。特に、遺伝子伝達システムとしてウイルスを使用する場合、ウイルスを細胞シート内で増殖させることができ、ウイルスが治療部位だけで局所的に作用することになるので、ウイルスの全身投与または腫瘍内投与と比較して、ウイルス投与量を顕著に低減しても、癌の予防または治療、癌の再発または癌の転移防止、特に多病巣性腫瘍の治療に卓越したものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
図１は、温度反応性培養皿で分離したｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの外観（ａ）、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によるｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの組織学的分析結果（ｂ）およびＰＢＳ−処理された対照ＣＦＣＳｓ（ｃ）およびｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓ（ｄ）でＡｄ  Ｅ１Ａタンパク質の免疫染色による検出を示すものである［スケールバー：１ｃｍ（ａ）および２μｍ（ｂ−ｄ）］。
図２は、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳのウイルス生産および治療遺伝子発現プロファイルを示すものである［（ａ）ＣＦＣＳに感染したｏＡｄ−ＤＣＮのウイルス生成。ＣＦＣＳｓは、０．５のＭＯＩでｎａｋｅｄ  ｏＡｄ−ＤＣＮに感染した。感染後、４、１２、２４、４８、７２および９６時間にＣＦＣＳおよび上澄み液を回収した後、リアルタイム定量ＰＣＲによりウイルスゲノムコピーを測定した。（ｂ）ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓでのＤＣＮ発現。平均±ＳＤで示す１ＭＯＩデータでｏＡｄ−ＤＣＮで感染後、４８時間に回収した細胞溶解液および上澄み液を使用するＤＣＮの代表的なウェスタンブロット。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１］。
図３は、肝内移植後、生体内ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓのウイルス持続性に対する分解プロファイルおよび評価を示すものである［（ａ）細胞シートの分解プロファイル。ＣＦＣＳｓは、線維芽細胞とホタルルシフェラーゼ発現癌細胞（ＣＦＣＳｓ／Ｆｌｕｃ）で作った。引き続いて、ＣＦＣＳ／ＦｌｕｃにｏＡｄ−ＤＣＮを感染させた後、同所ＨＣＣ腫瘍があるヌードマウスの左側肝葉に移植した。（ｂ）ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの移植後、ウイルス持続性の評価。ＣＦＣＳをホタルルシフェラーゼ発現ｏＡｄ−ＤＣＮ（ｏＡｄ−ＤＣＮ／Ｆｌｕｃ／ＣＦＣＳｓ）に感染させた後、腫瘍保有マウスの左側肝葉の表面に移植した。生物発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）イメージングは、移植後に毎日モニタリングされた］。
図４は、多病巣性肝細胞癌腫（ＨＣＣ）の組織学結果を示すものである［ＰＢＳで処理した群において腫瘍細胞の注射後２１日目に多病巣性肝癌組織の断面を得、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。本来倍率：×４０、白色点線：腫瘍］。
図５は、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの強力な抗腫瘍効能を示したものであり、
図５ａは、Ｈｅｐ３Ｂ同所腫瘍モデルでｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの抗腫瘍効能を示すものである［同所肝腫瘍は、マウスの左側肝葉に１×１０６個のホタルルシフェラーゼを発現するＨｅｐ３Ｂ細胞を注入することによって確立された。細胞注射の直後に細胞注入部位をＰＢＳまたはスプレーにより３×１０８ＶＰ  ｏＡｄ−ＤＣＮ（スプレー）処理されたりＰＢＳ処理されたＣＦＣＳまたはｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ（ｎ＝６）に移植して処理した。また、６匹のマウスにＨｅｐ３Ｂ細胞注射後、尻尾静脈を通じて３×１０８ＶＰを全身的に注射した。腫瘍成長は、処理後、２、５、７、１４および２１日にモニタリングした］。
図５ｂは、バックグラウンド除去法（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）後の各治療群からＨＣＣからの生物発光信号を示すものである［データは平均±標準偏差で示した。＊Ｐ＜０．０５］。
図６は、ＰＢＳ、ｏＡｄ−ＤＣＮ血管内注射、ｏＡｄ−ＤＣＮ腹腔内注射、ＣＦＣＳ単独またはｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳで処理したマウスの腫瘍組織の組織学的分析結果である［処理された多病巣性肝細胞癌の断面は、ＰＢＳ、ｏＡｄ−ＤＣＮ血管内注射、ｏＡｄ−ＤＣＮ腹腔内注射、ＣＦＣＳ単独またはｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳで治療後１４日目に得られた。本来倍率：×５０、黒色点線：腫瘍］。
図７は、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳを形成する過程を図式化したものである。
図８は、腫瘍選択的殺傷アデノウイルスを搭載した細胞シートから複製されたアデノウイルスの生物学的活性を確認したものである。
図９は、腫瘍除去手術後、腫瘍選択的殺傷アデノウイルスが搭載された細胞シートを付着後、腫瘍の再発の有無を確認したものである。
図１０は、ワクシニアウイルスが搭載された細胞シートの形成を確認したものである。
図１１は、ワクシニアウイルスが搭載された細胞シートのワクシニアウイルス複製能を確認したものである。
図１２は、ワクシニアウイルスが搭載された細胞シートのワクシニアウイルス細胞死滅を確認したものである。
図１３は、放射線を照射した癌細胞の細胞生存能を確認したものである。
図１４は、放射線照射された癌細胞を含む細胞シートにおけるアデノウイルス複製能を確認したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、
二つ以上の細胞層を含み、
そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムが導入されている、
細胞シートを提供する。
【００１８】
本発明において、細胞シートは、局所的遺伝子伝達のために使用される。すなわち、遺伝子伝達システムを遺伝子治療が必要な体内部位に局所伝達することができる一種のキャリアとして役割をすることになる。
【００１９】
前記細胞シートは、製造および体内移植の過程でユーザのハンドリングに適した機械的物性を有することが好ましい。
【００２０】
このために、前記細胞シートは、細胞層のうち一つであって、支持体として作用する細胞層を含む。
【００２１】
一具体例において、前記細胞シートは、支持体として体細胞を含む細胞層を含む。
【００２２】
体細胞を含む細胞層は、遺伝子伝達システムが導入される細胞層の支持体の役割をし、体内環境と類似していて、多様な細胞の付着、増殖、分化および培養をすることができる環境を提供することができる。
【００２３】
このような役割をするに適した体細胞であれば、いずれのものでも使用することができ、特にその種類が制限されない。具体的に、前記体細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、筋上皮細胞（ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ）、上皮ケラチン細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、シュワン細胞（ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ）、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）、巨大細胞（ｍｅｇａｋａｒａｔｙｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）および癌細胞よりなる群から選ばれた一つ以上でありうるが、これに制限されない。
【００２４】
本発明において、遺伝子治療に使用できるものと知られたいかなる遺伝子伝達システムでも使用可能である。
【００２５】
例えば、本発明の遺伝子伝達システムは、（ｉ）ネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクターおよび（ｉｖ）前記ネイキッド組換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはニオソームの形態でありうる。
【００２６】
通常の遺伝子治療に用いられるすべての遺伝子伝達システムが、本発明による細胞シートに適用され得、好ましくは、プラスミド、アデノウイルス（Ｌｏｃｋｅｔｔ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：２０７５−２０８０（１９９７））、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ，Ｌａｓｈｆｏｒｄ  ＬＳ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，１９９９）、レトロウイルス（Ｇｕｎｚｂｕｒｇ  ＷＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ、１９９９）、レンチウイルス（Ｗａｎｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））、単純ヘルペスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５））、ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：６４９−６５７（１９９９））、リポソーム（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １９９，Ｓ．Ｃ．Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂａｓｕ（Ｅｄｓ．）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２）またはニオソームが使用され得る。
【００２７】
ｉ．アデノウイルス
アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高いタイター、広範囲なターゲット細胞および優れた感染性に起因して遺伝子伝達ベクターとして多く用いられている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐのＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）を含み、これは、ＤＮＡ複製およびパッケージングに必須のシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、転写および宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードする。
【００２８】
現在開発されたアデノウイルスベクターのうち、Ｅ１領域が欠如した複製不能アデノウイルスが多く用いられている。一方、Ｅ３領域は、通常のアデノウイルスベクターから除去されて外来遺伝子が挿入されるサイトを提供する（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３−５５１（１９８２）；およびＲｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０６６−１０７３（１９８９））。したがって、細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列は、欠失したＥ１領域（Ｅ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、欠失したＥ１領域に挿入される。本明細書でウイルスゲノム配列と関連して使用される用語「欠失」は、当該配列が完全に欠失したものだけでなく、部分的に欠失したものをも含む意味を有する。
【００２９】
アデノウイルスは、４２個の異なる血清型およびＡ−Ｆのサブグループを有する。この中で、サブグループＣに属するアデノウイルスタイプ２およびタイプ５が本発明のアデノウイルスベクターを得るための最も好ましい出発物質である。アデノウイルスタイプ２およびタイプ５に対する生化学的および遺伝的情報はよく知られている。
【００３０】
アデノウイルスにより運搬される外来遺伝子は、エピソームと同じ方式で複製され、これにより、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。したがって、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを用いた遺伝子治療が非常に安全なものと判断される。
【００３１】
ｉｉ．レトロウイルス
レトロウイルスは、自分の遺伝子を宿主のゲノムに挿入させ、大量の外来遺伝物質を運搬することができ、感染させることができる細胞のスペクトルが広いので、遺伝子伝達ベクターとして多く用いられている。
【００３２】
レトロウイルスベクターを構築するために、細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列は、レトロウイルスの配列の代わりに、レトロウイルスゲノムに挿入されて、複製不能のウイルスを生産する。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）とΨ配列はないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９（１９８３））。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列、ＬＴＲおよびΨ配列を含む組換えプラスミドを前記細胞株に移入すれば、Ψ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写体の生産を可能にし、この転写体は、ウイルスにパッケージングされ、ウイルスは、培地に排出される（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  “Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”  Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ｅｄｓ．），Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、４９４−５１３（１９８８））。組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し濃縮して遺伝子伝達システムに用いる。
【００３３】
２世代レトロウイルスベクターを用いた遺伝子伝達が発表された。Ｋａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１３７３−１３７６（１９９４））は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の変異体を製造し、ここで、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）配列をエンベロープ部位に挿入して、新しい結合特性を有するキメラタンパク質を生産した。本発明の遺伝子伝達システムも、このような２世代レトロウイルスベクターの構築戦略によって製造することができる。
【００３４】
ｉｉｉ．ＡＡＶベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非分裂細胞を感染させることができ、多様な種類の細胞に感染できる能力を有しているので、本発明の遺伝子伝達システムに適している。ＡＡＶベクターの製造および用途に関する詳細な説明は、米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号に詳細に開示されている。
【００３５】
遺伝子伝達システムとしてのＡＡＶに関する研究は、ＬａＦａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｏｌｏｇｙ，１６２：４８３４８６（１９８８），Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（ＮＹ），２１：９２８−９３３（１９９３），Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：１４４０−１４４８（１９９４）およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２：２９−３７（１９９５）に開示されている。
【００３６】
典型的に、ＡＡＶウイルスは、二つのＡＡＶ末端リピートが側傍に位置している目的の遺伝子配列（細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列）を含むプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３−１９７３（１９８８）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９））および末端リピートがない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド（ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：２９３６−２９４５（１９９１））を同時形質転換させて製造される。
【００３７】
ｉｖ．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の遺伝子伝達システムに用いることができる。ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：６４９−６５７（１９９９）；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，“ Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”  Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、４６７−４９２（１９８８）；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，“ Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ，”  Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ，ｅｄ．Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１１７−１４８（１９８６）およびＣｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６８：１−１０（１９８８））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））または単純ヘルペスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５））に由来したベクターも、目的ヌクレオチド配列を細胞内に運搬できる運搬システムに用いることができる。
【００３８】
その他にも、ウイルスベクターとしては、レオウイルス、ポックスウイルス、セムリキフォレストウイルスおよび麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）などがある。
【００３９】
ｖ．リポソーム
リポソームは、水相に分散したリン脂質により自動的に形成される。外来ＤＮＡ分子をリポソームで成功裏に細胞内に運搬した例は、ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０（１９８２）およびＮｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６（１９８７）に開示されている。一方、リポソームを用いた動物細胞の形質転換に最も多く用いられる試薬としては、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）がある。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を内包したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着またはプラズマ細胞膜との融合などの機序を通じて細胞と相互作用して細胞内に目的ヌクレオチド配列を運搬する。
【００４０】
一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムを導入する方法は、細胞層を成す細胞と前記遺伝子伝達システムを接触させることによって行われる。
【００４１】
本発明において、遺伝子伝達システムがウイルスベクターに基づいて製作された場合には、前記接触させる段階は、当業界に公知となったウイルス感染方法によって実施される。ウイルスベクターを用いた宿主細胞の感染は、上述した引用文献に記載されている。
【００４２】
本発明において遺伝子伝達システムがネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子またはプラスミドである場合には、微細注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ、２２：４７９（１９８０）；およびＨａｒｌａｎｄとＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：１０９４−１０９９（１９８５））、カルシウムホスフェート沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）；およびＣｈｅｎとＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１（１９８２）；およびＴｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８（１９８６））、リポソーム−媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ、１０：８７（１９８０）；ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０（１９８２）；およびＮｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６（１９８７））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５）），および遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））方法により遺伝子を細胞内に移入させることができる。
【００４３】
本発明の一具体例において、本発明による細胞シートは、ウイルス複製が可能な局部的な伝達プラットホームとして使用される。腫瘍殺傷ウイルスは、標的腫瘍部位をカバーし、腫瘍殺傷ウイルスを使用して腫瘍の除去に有利な特定遺伝子（例えば、デコリンなど）を発現させ、腫瘍殺傷ウイルスおよび治療遺伝子の効果的な複製を可能にする。また、細胞シートが体内で完全に分解されるまで細胞シートと腫瘍組織の全部でビリオンの活性複製を可能にすることによって、腫瘍組織で腫瘍殺傷ウイルスの長期維持を可能にする。
【００４４】
これによって、細胞シートが腫瘍内投与された既存の腫瘍殺傷ウイルスより強力な抗腫瘍効果を導き出し、多病巣性癌腫の形成を効果的に予防できることになる。また、腫瘍殺傷ウイルスの細胞シート−媒介伝達は、腫瘍部位に局所化されるので、正常組織へのビリオンの非特異的排出を防止する。細胞シートに搭載した腫瘍殺傷ウイルスの投与が、腫瘍内局所化を同時に強化し、ウイルスの非特異的放出を防止することによって、安全性プロファイルを向上させると共に、ウイルスの治療効能を延長、増幅および強化させることができる。
【００４５】
本発明の一具体例において、前記遺伝子伝達システムは、組換えアデノウイルスでありうる。
【００４６】
遺伝子伝達ベクターとして組換えアデノウイルスの様々な長所が浮び上がるに伴い、癌遺伝子の治療においてその使用頻度は着実に増加している傾向にある。特に、遺伝子治療剤で癌を治療しようとする場合、長期的かつ持続的な治療遺伝子の発現が必要でないという長所がある。また、ベクターとして使用されるウイルスにより誘導される宿主の免疫反応が大きく問題にならないか、かえって利点として作用できるので、組換えアデノウイルスは、癌治療用遺伝子伝達体として脚光を浴びている。
【００４７】
前記組換えアデノウイルスは、複製不能アデノウイルスまたは腫瘍殺傷アデノウイルスでありうる。
【００４８】
複製不能アデノウイルスは、アデノウイルスの複製に必須のＥ１遺伝子（全部または一部）の代わりに治療用遺伝子を挿入して組換えられたものであって、アデノウイルスが導入された細胞内で複製されないように作ったものである。
【００４９】
腫瘍殺傷アデノウイルスは、Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子が部分的に欠損したアデノウイルスであって、ｐ５３が機能的に非活性化された細胞だけで増殖が可能である。ｐ５３の機能が抑制されている癌細胞では、ウイルスの増殖が活発に起こることになる反面、正常細胞では、ウイルスの増殖が抑制される。したがって、腫瘍殺傷アデノウイルスは、正常細胞には影響を与えず、癌細胞だけを選択的に死滅させることができて、癌の治療にあって特に有利である。
【００５０】
本発明の一具体例において、組換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ  １９ｋＤａ遺伝子、Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子またはＥ１Ｂ  １９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子を有し、好ましくは、非活性化されたＥ１Ｂ  １９ｋＤａおよびＥ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子を有する。
【００５１】
本明細書において、遺伝子と関連して使用される用語「非活性化」は、その遺伝子の転写および／または解読が正常に行われなくて、その遺伝子によりコードされる正常なタンパク質の機能が現れないことを意味する。例えば、非活性化Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ遺伝子は、その遺伝子に変移（置換、付加、部分欠失または全体欠失）が発生して、活性のＥ１Ｂ  １９ｋＤａタンパク質を生成しない遺伝子である。Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ遺伝子が欠如した場合には、細胞死滅能を増加させることができ、Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子が欠如した場合には、腫瘍細胞特異性を有するようにする（参照：韓国特許出願第２００２−００２３７６０号）。
【００５２】
本発明の一具体例によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、活性のＥ１Ａ遺伝子を含むことができる。Ｅ１Ａ遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、複製可能な特性を有することになる。本発明のより好ましい具現例によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ  １９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子および活性のＥ１Ａ遺伝子を含む。本発明の一具体例によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子が欠失し、活性のＥ１Ａ遺伝子を含み、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、欠失したＥ１領域に挿入されているものである。
【００５３】
本発明の一具体例において、
遺伝子伝達システムが導入される細胞層は、癌細胞または幹細胞を含むことができる。
【００５４】
遺伝子伝達システムとして腫瘍殺傷アデノウイルスを使用する場合、遺伝子伝達システムが導入される細胞層は、癌細胞を含むことができる。先立って説明したように、腫瘍殺傷アデノウイルスは、癌細胞だけで増殖し、癌細胞を含む細胞層以外の正常細胞では、その複製が抑制される。したがって、細胞シートを長期間培養しても、支持体の役割をする細胞層の死滅による機械的物性の低下を心配する必要がない。また、細胞シートの体内移植後に腫瘍殺傷アデノウイルスにより癌細胞自体が死滅するので、癌細胞の体内残存を心配しなくてもよい。
【００５５】
腫瘍殺傷アデノウイルスでなく、他の遺伝子伝達システムを使用しても、癌細胞は、放射線照射させて、癌細胞自体の複製能を喪失させることができるので、遺伝子伝達システムが導入される細胞層に使用するのに何らの問題もない。本発明の一具体例において、前記細胞シートは、遺伝子伝達システムが導入されている、癌細胞を含む細胞層を含み、前記癌細胞は、放射線が照射されたものでありうる。
【００５６】
前記癌細胞は、具体的に、膠芽細胞腫、喉頭癌、すい臓癌、肺癌、非小細胞性肺癌、結腸癌、骨癌、すい臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、卵巣癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、肛門付近癌、大腸癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、脳幹部神経膠腫および脳下垂体腺腫よりなる群から選ばれた一つ以上の癌に由来した癌細胞でありうるが、これに制限されない。
【００５７】
他の具体例において、遺伝子伝達システムが導入される細胞層は、幹細胞を含むことができる。幹細胞は、腫瘍標的能を有しているので、本発明の細胞シートを癌患者に使用する場合、特に有利になりうる。ただし、一般的に、幹細胞は、アデノウイルスの感染率が低いものと知られているので、幹細胞導入能が改善された組換えアデノウイルスを使用することが好ましいことがある。これに制限されるものではないが、遺伝子伝達システムが導入される細胞層に幹細胞を含む場合、血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブ（ｋｎｏｂ）を含む幹細胞導入能が改善された組換えアデノウイルスを使用することが好ましいことがある。血清型３５のファイバー（ｆｉｂｅｒ）ノブ（ｋｎｏｂ）を含む組換えアデノウイルスの場合、間葉系幹細胞への導入効率に顕著に優れており、低いウイルス濃度でもよく導入され得る特徴を有する。
【００５８】
これに制限されるものではないが、本発明の一具体例において、本発明の組換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ  １９ｋＤａ遺伝子、Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子またはＥ１Ｂ  １９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子を有し、好ましくは非活性化されたＥ１Ｂ  １９ｋＤａおよびＥ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子を有する。
【００５９】
本明細書において、遺伝子と関連して使用される用語「非活性化」は、その遺伝子の転写および／または解読が正常に行われず、その遺伝子によりコードされる正常なタンパク質の機能が現れないことを意味する。例えば、非活性化Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ遺伝子は、その遺伝子に変移（置換、付加、部分欠失または全体欠失）が発生して、活性のＥ１Ｂ  １９  ｋＤａタンパク質を生成しない遺伝子である。Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ遺伝子が欠如した場合には、細胞死滅能を増加させることができ、Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子が欠如した場合には、腫瘍細胞特異性を有するようにする（参照：韓国特許出願第２００２−００２３７６０号）。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、活性のＥ１Ａ遺伝子を含む。Ｅ１Ａ遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、複製可能な特性を有するようになる。本発明のより好ましい具現例によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ  １９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子および活性のＥ１Ａ遺伝子を含む。本発明の最も好ましい具現例によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ  １９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａ遺伝子が欠失し、活性のＥ１Ａ遺伝子を含み、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、欠失したＥ１領域に挿入されているものである。
【００６１】
本発明において用いられる組換えアデノウイルスは、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターを含む。本発明に適したプロモーターは、哺乳動物ウイルスに由来したプロモーターおよび哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーター、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、メタロチオニンプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーター、癌細胞特異的プロモーター（例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅ２Ｆプロモーター、ＡＦＰプロモーター、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＡＦＰプロモーター、Ｅ２Ｆ−ＡＦＰ  ｈｙｂｒｉｄプロモーター、およびＥ２Ｆ−ＴＥＲＴ  ｈｙｂｒｉｄプロモーター）および組織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＣＭＶプロモーターである。トランス遺伝子を発現させるための発現コンストラクトでトランス遺伝子のダウンストリームにポリアデニル化配列が結合されていることが好ましい。前記ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンターミネーター（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６９８３−６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５３８６−５３９３（１９９２））、ＨＩＶ−１  ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１８７０−１８７６（１９９８））、βグロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４９：３９９−４０６（１９８７））、ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ  Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２１０４−２１１３（１９８５））またはポリオーマウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これに限定されるものではない。
【００６２】
本発明の組換えアデノウイルスは、選択標識として抗生剤耐性遺伝子およびレポータ遺伝子（例えば、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼおよびβグルクロニダーゼ）をさらに含むことができる。前記抗生剤耐性遺伝子は、当業界において通常的に用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子があり、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子である。
【００６３】
本発明による細胞シート内搭載されるウイルスベクター（例えば、組換えアデノウイルス）は、０．１〜５００ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の量で搭載されることが好ましい。より好ましくは、０．１〜２００ＭＯＩ、０．１〜１００ＭＯＩ、０．１〜５０ＭＯＩ、０．１〜１０ＭＯＩ、０．１〜５ＭＯＩ、０．５〜２００ＭＯＩ、０．５〜１００ＭＯＩ、０．５〜５０ＭＯＩ、０．５〜１０ＭＯＩまたは０．５〜５ＭＯＩで搭載され得る。これは、既存の腫瘍治療法で使用された腫瘍殺傷ウイルス量１×１０１０ＶＰ〜５×１０１０ＶＰに比べて顕著に少ない量を使用しても、癌細胞で増殖させることができるので、既存の腫瘍殺傷ウイルスを使用した腫瘍治療法に比べてウイルス搭載量を顕著に低減することができ、医師の負担感を顕著に減らすことができる。
【００６４】
また、本発明は、
温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に、
二つ以上の細胞層を含む細胞シートを形成し、
そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムを導入し、
温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離することを
含む細胞シートの製造方法を提供する。
【００６５】
前記で細胞シートと関連して記述したすべての内容が細胞シートの製造方法にそのまま適用または準用され得る。
【００６６】
これに制限されるものではないが、本発明による細胞シートの製造方法は、例えば、次のような段階を含んで行われ得る：
温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に体細胞を培養して、体細胞を含む第１細胞層を形成させる段階；
前記第１細胞層に癌細胞を培養して、癌細胞を含む第２細胞層を形成させて細胞シートを製造する段階；
前記第２細胞層に腫瘍殺傷ウイルスを接種させる段階；および
温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離する段階。
【００６７】
前記例を具体的に説明すれば、
まず、温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿にシリコンリングを載置し、シリコンリングの内側に支持体の役割をする体細胞を分注して、恒温装置で培養して、体細胞を含む第１細胞層を形成させる。
【００６８】
前記温度感応型培養皿は、表面の下限臨界温度（ｌｏｗｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＬＣＳＴ）以上では、細胞が付着して細胞シートを形成し、下限臨界温度以下では、ポリマーが膨潤して細胞をシート形態に回収することができる。
【００６９】
前記温度感応性ポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびポリラクテート−ｃｏ−グリコレート（ＰＬＧＡ）よりなる群から選ばれた一つ以上でありうるが、温度感応性を有するポリマーであれば、制限なしに使用することができる。
【００７０】
次に、前記第１細胞層上に癌細胞を分注して、恒温装置で培養して、癌細胞を含む第２細胞層を形成させて細胞シートを製造する。
【００７１】
特に、前記第２細胞層に細胞シートを構成する癌細胞による発癌の可能性を除去するために、放射線を照射する段階をさらに含ませることができる。
【００７２】
次に、前記第２細胞層に腫瘍殺傷ウイルスを接種させて、細胞シートにウイルスを搭載させる。
【００７３】
この際、腫瘍殺傷ウイルスを０．１〜５００ＭＯＩの量（より好ましくは０．１〜２００ＭＯＩ、０．１〜１００ＭＯＩ、０．１〜５０ＭＯＩ、０．１〜１０ＭＯＩ、０．１〜５ＭＯＩ、０．５〜２００ＭＯＩ、０．５〜１００ＭＯＩ、０．５〜５０ＭＯＩ、０．５〜１０ＭＯＩまたは０．５〜５ＭＯＩの量）で前記細胞シートの形成後、１２時間〜１日目に接種させる。一定の時間間隔を置いて接種させる場合にのみ、細胞がシートを形成することができ、また、細胞の個数当たりウイルスの搭載量の計算が可能である。このような腫瘍殺傷ウイルスを接種させることによって、癌細胞は、一定期間（接種後１２時間〜７日）後に自然に消滅する。また、腫瘍殺傷ウイルスが癌細胞に起因して増幅が可能で、少ない量を投与することによって、癌細胞の治療が可能である。
【００７４】
最後に、温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離させる。
【００７５】
前記温度感応型培養皿は、表面の下限臨界温度以下では、ポリマーが膨潤するので、細胞シートが培養皿から脱着させることができる。この際、ウイルス接種後６時間〜１日目に細胞シートを培養皿から分離させることが、搭載したウイルスの複製による細胞シートの分解が起こらずに、堅固な細胞シートの形態で剥き出すことができるので好ましい。
【００７６】
また、本発明は、本発明の細胞シートを有効成分として含む、遺伝子治療剤を提供する。
【００７７】
本発明の用語「遺伝子治療剤」は、疾病の治療などを目的に遺伝物質または遺伝物質を移入した担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を対象体に投与する細胞または医薬品を意味する。また、対象体の損傷した遺伝子に正常遺伝子あるいは治療効果を有する遺伝子を注入させて、遺伝的欠陥を治療したり予防する目的で使用される医薬品を意味する。
【００７８】
遺伝子治療剤として適用され得る薬学的に許容可能な担体は、滅菌および生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれら成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用することができるように、標的器官特異的抗体またはその他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。
【００７９】
好ましくは、本発明の遺伝子治療剤は、癌の予防または治療、癌の再発または癌の転移防止のために用いられる。
【００８０】
前記癌は、多病巣性肝細胞癌腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、喉頭癌、すい臓癌、肺癌、非小細胞性肺癌、結腸癌、骨癌、すい臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、卵巣癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、肛門付近癌、結腸癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、脳幹部神経膠腫および脳下垂体腺腫よりなる群から選ばれた一つ以上でありうる。
【００８１】
本発明の細胞シートを癌（腫瘍）が除去された手術部位、または癌が発生した部位に投与することによって、癌を治療したり癌転移または再発を防止することができる。本発明の細胞治療剤の好ましい投与量は、個体の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するのではない。
【００８２】
本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による細胞シートの投与によって癌（腫瘍）を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【００８３】
本発明において使用される用語「治療」とは、本発明による細胞シートの投与によって癌（腫瘍）に対する症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００８４】
本発明において使用される用語「転移」とは、悪性腫瘍が発病した臓器から離れた他の組織に伝播した状態を意味する。
【００８５】
本発明において使用される用語「再発」とは、腫癌が手術的摘出または放射線照射などにより一旦消失した後に同じ腫瘍が再び発育すること、残った腫瘍細胞が増殖することまたは腫瘍細胞が完全に消失し、新しく腫瘍が発生することを意味する。
【００８６】
また、本発明は、対象体の癌除去手術部位に本発明による細胞シートを移植する段階を含む癌再発防止方法を含む。
【００８７】
また、本発明は、対象体の癌治療が必要な部位に本発明による細胞シートを移植する段階を含む癌治療方法を含む。
【００８８】
本発明において「対象体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、げっ歯類（ラット、マウス、ギニアピッグなど）、犬、猫、馬、牛、羊、豚、ヤギ、ラクダ、レイヨウなどの哺乳類を意味する。
【００８９】
本発明による細胞シートは、移植後に一定期間（６日〜１０日）後に癌細胞層がウイルスの複製により破壊されるので、自然に消滅する。
【００９０】
これに制限されるものではないが、本発明の細胞シートを標的部位に移植させる方法は、例えば、次のような段階を含んで行われ得る：
温度反応性培養皿で形成したウイルスを感染させた細胞シートに培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄する。メンブレインを細胞シート上に載置したまま、温度を下げて、細胞シートを引き剥がすと、メンブレインに細胞シートが付着したまま、細胞シートを得ることができる。細胞シートが付着したメンブレインを標的（病変）部位に載置し、用心深くメンブレインを引き剥がすと、細胞シートは、標的部位に付着し、メンブレインを除去することによって、細胞シートを標的部位に移植可能である。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００９２】
［実施例］
実験方法
細胞株および細胞培養
すべての細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とペニシリン−ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ  ＵＳＡ）で培養した。
【００９３】
ＨＥＫ２９３（Ａｄ  Ｅ１領域を発現するヒト胚芽腎臓細胞株）、Ａ５４９（肺癌細胞株）、Ｈｅｐ３Ｂ（肝細胞癌腫細胞株）、Ｕ３４３（膠芽細胞腫細胞株）およびＮＩＨ３Ｔ３（線維芽細胞細胞株）細胞株は、アメリカンタイプ培養コレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。
【００９４】
すべての細胞株を５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃に維持させた。
【００９５】
ｏＡｄ−ＤＣＮ（デコリン−発現腫瘍殺傷Ａｄ）の製作
ｐＣＡ１４／ＤＣＮをＢｇｌ  ＩＩ制限酵素で切ってＤＣＮ発現カセットを得、これとＢａｍＨＩ制限酵素で切断したｐｄＥ１ｓｐ１Ｂ（ｐ）−ＨＲＥ−ｍＴＥＲＴ−Ｒｄ１９をライゲーションして、ｐｄＥ１ｓｐ１Ｂ（ｐ）−ＨＲＥ−ｍＴＥＲＴ−Ｒｄ１９／ＤＣＮ  Ｅ１  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒを製作した。
【００９６】
前記のベクターをＸｍｎＩ制限酵素を処理して一本鎖に作り、アデノウイルスのｋｎｏｂをＡｄ３５のもので置換したベクターであるｄｌ３２４−ｋ３５をＢｓｔＢＩ制限酵素処理して一本鎖を作って、二つのベクターを大腸菌ＢＪ５１８３に同時に形質転換させて、遺伝子相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を誘導することによって、ＤＣＮ−発現するｏＡｄベクター（ＨｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ，ｏＡｄ−ＤＣＮ）を製作した。
【００９７】
Ａｄ−搭載された癌細胞／線維芽細胞細胞シート（ｏＡｄ／ＣＦＣＳｓ）
線維芽細胞第１細胞層と癌細胞第２細胞層から構成された細胞シート（ＣＦＣＳ）は、温度反応性培養皿（ＴＲＣＤ；ＵｐＣｅｌｌ；ＮＵＮＣ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して製作した。
【００９８】
二重層の細胞シートを作るために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（３×１０５）を３５ｍｍのＴＲＣＤにシリコンリング（半径１．８ｃｍ）の中空の内部層に入れて、３７℃で培養した。培養４８時間後、Ｕ３４３細胞（３×１０５）をシリコンリング限定領域に添加して、細胞シートの第２層を形成し、２４時間の間培養した。各皿の培地を５％ＦＢＳが含有された新鮮なＤＭＥＭに交換した後、細胞を０．５または５の多重感染（ＭＯＩ）でデコリン−発現腫瘍殺傷Ａｄ（ｏＡｄ−ＤＣＮ）で感染させた。Ａｄ−ＤＣＮ−感染癌細胞／線維芽細胞細胞シート（ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓ）を培養温度を室温に３０分間下げて、感染４時間後に皿から分離した。
【００９９】
組織学
ｏＡｄ−ＤＣＮ  ＣＦＣＳは、ｏＡｄ−ＤＣＮの５ＭＯＩを使用して前記記述されたように生成され、対照群ＣＦＣＳは、細胞シートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で処理することによって生成された。
【０１００】
３０分間培養温度を室温に下げて２４時間の間４％パラホルムアルデヒドで固定させることによって、処理後１２時間目に腫瘍殺傷Ａｄ搭載またはＰＢＳ処理されたＣＦＣＳを回収した。固定されたサンプルをパラフィンに包埋し、５ｕｍ断面に切って、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のためにパラフィンを除去した。
【０１０１】
ウイルス生産分析
細胞シートで腫瘍殺傷Ａｄのウイルス生産を評価するために、ＣＦＣＳを１２−ウェルプレートに入れて、ｏＡｄ−ＤＣＮで０．５ＭＯＩで感染させた。感染４時間後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、５％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭに交換した。
【０１０２】
感染４、１２、２４、４８、７２および９６時間後、上澄み液と細胞シートの全部を収集し、リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ，ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ検出，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によりＡｄ粒子の数を評価した。
【０１０３】
ウェスタンブロッティング分析
ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓで腫瘍殺傷Ａｄ−媒介ＤＣＮ発現の水準を評価するために、シートをＭＯＩが１であるｏＡｄ−ＤＣＮで感染させ、４８時間の間培養した。引き続いて、シートをプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）が入っている氷冷ＲＩＰＡバッファー（Ｅｌｉｐｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｔａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で均質化し、生成された均質液を１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０１０４】
総タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質分析法（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により測定され、同等なタンパク質量（試料当たり２００μｇ）を電気泳動のためにドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルに載置した。タンパク質をポリビニリデンフルオライドメンブレインに移し、ヤギ抗−ＤＣＮ抗体（Ａｂ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）またはウサギ抗−β−アクチン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）とともに培養した。
【０１０５】
膜を２次Ａｂで西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合されたマウス抗−ヤギＩｇＧ  Ａｂまたはヤギ抗−ウサギＩｇＧ（細胞シグナリング）とともに培養し、免疫反応性バンドを強化された化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を通じて視覚化した。
【０１０６】
ＤＣＮの発現水準は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して準（ｓｅｍｉ）−定量分析した。
【０１０７】
ＭＴＴ分析
試験管内でＣＦＣＳのウイルス複製媒介分解を評価するために、ＣＦＣＳを４８−ウェルプレートに載置した後、ＭＯＩが５であるｏＡｄ−ＤＣＮで感染させた。
【０１０８】
感染４、１２、２４、４８、７２、９６時間後に培地を除去し、ＣＦＣＳｓを５００μＬの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）で処理した。引き続いて、プレートを５４０ｎｍでマイクロプレートリーダーで読み出した。ＰＢＳ−処理群からの吸光度を１００％生存能に設定した。
【０１０９】
ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの生体内分解プロファイルおよびウイルス持続性
生体内でＣＦＣＳｓの分解およびウイルス持続性を評価するために、二つの異なる類型の細胞シートを製作した。
【０１１０】
ＣＦＣＳの分解プロファイルは、線維芽細胞とホタルルシフェラーゼ（ｆｌｕｃ）発現癌細胞（ＣＦＣＳｓ／ｆｌｕｃ）から構成されたＣＦＣＳを用いて評価した後、ＭＯＩが５であるｏＡｄ−ＤＣＮに感染して、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓ／ｆｌｕｃを生成させることによって評価された。
【０１１１】
細胞シートのウイルス持続性を評価するために、線維芽細胞とｆｌｕｃ遺伝子を発現しない癌細胞を利用してＭＯＩが５であるホタルルシフェラーゼ発現ｏＡｄ−ＤＣＮ（ｏＡｄ−ＤＣＮ−ｆｌｕｃ）に感染させてＣＦＣＳを作った。ｏＡｄ−ＤＣＮ−ｆｌｕｃ／ＣＦＣＳｓ、Ｏａｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓ／ｆｌｕｃおよびｏＡｄ−ＤＣＮ−ｆｌｕｃ／ＣＦＣＳは、全部感染後４時間にＨＣＣを有するマウスの最も大きい肝葉に移植された。移植後２、４、６、８および１０日に、ＩＶＩＳ映像システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を通じてｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ／ｆｌｕｃの分解およびｏＡｄ−ＤＣＮ−ｆｌｕｃ／ＣＦＣＳの腫瘍殺傷Ａｄの持続性を評価するために、酸素で２％イソフルランで満たされたチャンバーで麻酔させ、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ，Ｃａｌｉｐｅｒ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を腹腔内注射した。
【０１１２】
インビボ抗腫瘍効能
ｏＡｄ−ＤＣＮの抗腫瘍効果を評価するために、ＣＦＣＳｓ、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓを同所（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）ＨＣＣ異種移植モデルで６〜７週齢の胸腺ヌードマウス（ＯｒｉｅｎｔＢｉｏＩｎｃ．，Ｓｅｏｎｇｎａｍ，Ｋｏｒｅａ）で肝葉の最も大きい葉に１×１０６ｆｌｕｃ−発現Ｈｅｐ３Ｂ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ／ｆｌｕｃ）を注入した。
【０１１３】
腫瘍細胞の注射直後、肝注射部位をトリプシンで５分間処理した後、ＣＦＣＳ群（ＣＦＣＳまたはｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ）を移植したり、ＰＢＳまたはｏＡｄ−ＤＣＮ（５ＭＯＩ）を噴射した。最後に、治療群の一つが尻尾静脈（他のｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｄを含む群と同じ量のウイルス投与）を通じてｏＡｄ−ＤＣＮで全身投与された。
【０１１４】
細胞注入２日後に、マウスを酸素のうち２％イソフルランで満たされたチャンバーで麻酔させ、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を通じてＨｅｐ３Ｂ／ｆｌｕｃ細胞の成功的な移植を確認するために、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ；Ｃａｌｉｐｅｒ，ＭＡ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を腹腔内注射した。
【０１１５】
生体内生物発光信号強度は、治療後２日、５日、７日、１４日および２１日に関心の対象身体部位（腫瘍）で秒当たりフォトン（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃｏｎｄ［ｐ／ｓ］）で得られた。
【０１１６】
組織学的および免疫組織化学的分析
Ｈｅｐ３Ｂ−ＨＣＣ腫瘍組織をＨＣＣ細胞注射後２１日目に回収し、１０％ホルマリンに固定させ、パラフィン包埋処理し、５μｍ断面で切断した。切片をＨ＆Ｅで染色し、光学顕微鏡で検査した。腫瘍組織でＡｄ粒子を検出するために、腫瘍切片をウサギ抗−Ａｄ  Ｅ１Ａポリクロナール抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で免疫染色した。
【０１１７】
また、腫瘍切片は、腫瘍細胞増殖または処理後に細胞死滅誘導を評価するために、増殖する細胞核抗原（ＰＣＮＡ）特異抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）または末端デオキシヌクレオチジル転移酵素ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）で免疫染色された。その後、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合されたヤギ抗−ラットＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）または西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合されたヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）で処理した。
【０１１８】
ジアミノベンジジン／水素ペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ）をクロモゲン基質として使用した。すべてのスライドは、メイヤー（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリンで対照染色された。
【０１１９】
統計分析
データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で表示された。統計的有意性は、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ−ｔｅｓｔまたはＯｎｅ−ｗａｙ  Ａｎｏｖａ  ｔｅｓｔ（ＳＰＳＳ  １３．０ソフトウェア，ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）により測定された。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意なものと見なされた。
【０１２０】
放射線を照射した癌細胞の細胞生存能の確認
Ｕ３４３細胞株に多様な強さの放射線を照射（１、５、１０、１５、３０、５０Ｇｙ）した後、放射線照射癌細胞の細胞生存能（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認するために、放射線を照射したＵ３４３細胞株を９６ウェルプレートに播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、９日目までＭＴＴアッセイを行った。
【０１２１】
放射線を照射した癌細胞を用いた細胞シートからウイルス複製能の確認
線維芽細胞第１細胞層と癌細胞第２細胞層から構成された細胞シート（ＣＦＣＳ）は、温度反応性培養皿（ＴＲＣＤ；ＵｐＣｅｌｌ；ＮＵＮＣ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して製作した。
【０１２２】
二重層の細胞シートを作るために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（３×１０５）を３５ｍｍのＴＲＣＤにシリコンリング（半径１．８ｃｍ）の中空の内部層に入れて、３７℃で培養した。培養４８時間後、放射線を照射しないＵ３４３細胞（対照群）、または５Ｇｙで放射線を照射したＵ３４３細胞（３×１０５）をシリコンリング限定領域に添加して、細胞シートの第２層を形成し、２４時間の間培養した。各皿の培地を５％ＦＢＳが含有された新鮮なＤＭＥＭに交換した後、細胞を０．５の多重感染（ＭＯＩ）でＤＣＮ−発現腫瘍殺傷Ａｄ（ｏＡｄ−ＤＣＮ）で感染させた。その後、４時間目に感染しないウイルスを除去するために、培養液を新鮮な（ｆｒｅｓｈ）ものに変え、４、２４、４８時間目に、培養液と細胞を回収して、そのうち存在するウイルスをＱ−ＰＣＲを通じて確認した。
【０１２３】
細胞シートを腫瘍除去手術（標的）部位に移植後に生物学的活性および腫瘍発生の有無の確認
図７のように、温度反応性培養皿にＮＩＨ３Ｔ３を分注して第１層を形成し、３日後にＵ３４３細胞株を分注して第２層を形成し、４８時間後に腫瘍選択的殺傷アデノウイルスを感染させ、２４時間後に温度反応性培養皿の温度を２０℃に下げて、細胞シートを引き剥がした。
【０１２４】
温度反応性培養皿で形成したウイルスを感染させた細胞シートに培養液を除去し、１Ｘ  ＰＢＳを利用して３回洗浄した。メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を細胞シートの上に載置したまま、温度を２０℃に下げて、細胞シートが付着した状態のメンブレンを得た。
【０１２５】
Ｈ４６０肺癌皮下腫瘍を有しているマウスモデルの腫瘍を外科的手術として除去し、細胞シートが付着したメンブレンを腫瘍除去手術部位に載置した後、用心深くメンブレンを引き剥がして、細胞シートを腫瘍除去手術部位に付着させた。その後、手術部位を縫合し、腫瘍の再発の有無を３０日目まで観察した。
【０１２６】
細胞シートで生産されたウイルスの生物学的活性分析
細胞シートで複製された腫瘍殺傷アデノウイルスの生物学的活性を評価するために、ＣＦＣＳを１２−ウェルプレートに入れて、０．５ＭＯＩのｏＡｄ−ＤＣＮで感染させた。感染４時間後、ウェルを１ＸＰＢＳで洗浄し、５％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭに交換した。感染４、１２、２４、４８および７２時間後、上澄み液と細胞シートの全部を収集した。
【０１２７】
Ａ５４９細胞株を９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、収集したサンプルでそれぞれ２５、５０、１００μＬを取って細胞に処理した後、４８時間目にＭＴＴアッセイを行うことによって、細胞シートで生産されたウイルスの癌細胞殺傷能を確認した。
【０１２８】
ウイルスを搭載した細胞シート製作
ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスを複製または伝達するための細胞シートを製作するために、温度反応性培養皿（ＴＲＣＤ）に内側直径が１．８ｍｍであるシリコンリングを載置し、シリコンリングの内側にＮＩＨ３Ｔ３細胞株を３×１０５個分注し、４８時間後、Ｕ３４３細胞株３×１０５個を分注して細胞シートを製作した。
【０１２９】
２４時間後、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスを細胞シートに感染させた。一定時間の後に温度反応性培養皿からウイルスが感染した細胞シートの培養液およびシリコンリングを除去し、１ＸＰＢＳで３回洗浄した後、２ｍＬの新しい１ＸＰＢＳを入れて、２０℃で引き剥がして、細胞シート形成を確認した。
【０１３０】
実験結果
ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの生成および特性糾明
Ａｄ複製を許容できるＣＦＣＳを製作するために、ヒト脳膠芽細胞腫細胞株（Ｕ３４３）およびマウス線維芽細胞細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）から構成された二重層細胞シートを用いた。
【０１３１】
ＣＦＣＳは、温度反応性培養皿（ＴＲＣＤ）で生成され、ＭＯＩが５であるｏＡｄ−ＤＣＮに感染して腫瘍殺傷Ａｄ感染したＣＦＣＳ（ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓ）を生成した。感染１２時間後、３０分間プレート温度を室温に下げることによって、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳをＴＲＣＤから分離させた。図１ａに示されたように、均一なサイズの円形シートがＴＲＣＤから容易に分離された。シートのＨ＆Ｅ染色は、癌細胞と正常線維芽細胞成分がシート層（図１ｂ）に存在することを示した。
【０１３２】
重要なことは、細胞シートのＡｄ  Ｅ１Ａ染色は、赤色スポットから見ることができる腫瘍殺傷Ａｄの広範囲な分布を示した（図１ｄ）。反面、ＰＢＳ−処理された対照シートは、検出可能なスポットがなかった（図１ｃ）。注目すべき点は、ＰＢＳと腫瘍殺傷Ａｄ−搭載されたＣＦＣＳが感染後１２時間で類似した構造と形状を示すということである。また、このような結果は、腫瘍殺傷Ａｄが細胞シートに搭載することができ、細胞シートの全般的な構造的無欠性に害にならないことを示した。
【０１３３】
ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ内でのウイルス複製および遺伝子発現プロファイル
シートの癌細胞層が腫瘍殺傷Ａｄ感染に対して許容可能であるかを評価するために、ウイルス複製および治療遺伝子発現プロファイルをそれぞれＱ−ＰＣＲおよびウェスタン  ブロッティングで分析した。
【０１３４】
図２ａに示されたように、腫瘍殺傷Ａｄは、感染後７２時間まで時間によって細胞シート内で効果的に複製して、細胞シートが腫瘍殺傷Ａｄ複製を許容することを立証した。（４時間目は、細胞シート内に感染したウイルスの量を検出することであるが、少ないＭＯＩを使用したので、Ｑ−ＰＣＲ上の検出限界以下の値であって、分析にならなかった）。
【０１３５】
処理後９６時間に、ｏＡｄ−ＤＣＮの腫瘍殺傷活性によってＡｄ量の若干の減少が観察され、処理後９６時間で細胞シートの顕著な分解を誘導した。このような結果によって、ウェスタンブロット分析によりｏＡｄ−ＤＣＮは、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ内で効果的にＤＣＮを生成することができることを明らかにした（図２ｂ）。
【０１３６】
また、このような結果は、細胞シートが腫瘍殺傷Ａｄ感染に影響を受けやすく、究極的に、シートがウイルス複製および治療遺伝子発現を許容する伝達スキャフォールドとして機能することができることを立証した。
【０１３７】
生体内ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓの分解プロピルおよびウイルス持続性
ＣＦＣＳで細胞シートの分解および搭載された腫瘍殺傷Ａｄの持続性をモニタリングし視覚化するために、ＨＣＣ異種移植マウスにｏＡｄ−ＤＣＮ−ｌｏａｄｅｄ  ｆｌｕｃ−発現ＣＦＣＳｓ（ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓ／Ｆｌｕｃ）（図３ａ）またはｆｌｕｃ−発現ｏＡｄ−ＤＣＮ（ｏＡｄ−ＤＣＮ−Ｆｌｕｃ／ＣＦＣＳｓ）に感染したＣＦＣＳｓ（レポータ遺伝子なし）を移植した（図４ｂ）。
【０１３８】
図３ａに示されたように、細胞シートのルシフェラーゼ信号は、時間依存的に減少したし、移植後１０日まで完全に消えた。
【０１３９】
また、移植後１０日目にマウスを犠牲させ、移植されたすべてのＣＦＣＳが肝で完全に分解されたことを肉眼で確認した。
【０１４０】
同様に、腫瘍殺傷Ａｄウイルスの信号は、また、時間依存的方式で減少して、１０日間細胞シートのようにルシフェラーゼ発現パターンで類似した時間依存的減少を示した（図３ｂ）。
【０１４１】
多病巣性肝細胞癌腫に対するｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの強力な抗腫瘍効能
同所（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）腫瘍モデルは、臨床関連性のため、重要な癌研究モデルの一つとして浮上している。ＨＣＣの多病巣性は、クリニックで成功的な治療に向かった重要な挑戦であるから、ルシフェラーゼを発現するＨｅｐ３Ｂ細胞に肝で最も大きい葉に多重注射をして、多病巣性肝細胞同所腫瘍モデルを確立した。
【０１４２】
図４に示されたように、ＨＣＣ病変は、ＰＢＳで処理したマウスの肝で検出され、同所多病巣性ＨＣＣが成功裏に確立されたことを確認した。
【０１４３】
図５ａに示されたように、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ処理は、治療後２１日目他のどんな治療群より顕著に高い抗腫瘍活性を示して、ＰＢＳ（７．２×１０８±４．５×１０８）、ＰＢＳ処理されたＣＦＣＳ（１．７×１０８±９．３×１０７）、またはｏＡｄ−ＤＣＮ（ｓｐｒａｙｅｄ）（１．２×１０８±１．３×１０８）よりそれぞれ２０．４倍、４．７倍または３．５倍さらに大きい腫瘍成長抑制を示した（図５ｂ）。
【０１４４】
また、すべてのｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳｓ処理マウスは、肝に多病巣性肝細胞癌を示さないので、ＣＦＣＳが媒介する腫瘍殺傷Ａｄの伝達が多病巣性腫瘍の形成を予防することができることを示唆する（図６）。
【０１４５】
また、このような結果は、細胞シートに搭載されたｏＡｄ−ＤＣＮが強力な抗腫瘍効能を導き出し、多病巣性肝細胞癌の形成を予防するために、腫瘍組織に効果的に伝達され得ることを示唆する。
【０１４６】
多病巣性肝細胞癌に対するｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳの組織学的分析
さらに治療効果を調査するために、各群（ＰＢＳ，ｏＡｄ−ＤＣＮ血管内注射、ｏＡｄ−ＤＣＮ腹腔内注射、ＣＦＣＳ単独またはｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ）で処理した後、２週に腫瘍組織を回収し、組織学的および免疫組織学的分析を通じて分析した。
【０１４７】
図６に示されたように、Ｈ＆Ｅ染色は、ＰＢＳ−処理、ｏＡｄ−ＤＣＮ血管内注射、ｏＡｄ−ＤＣＮ腹腔内注射、ＣＦＣＳｓ単独処理された組織または大食細胞での増殖する腫瘍細胞の大きい多病巣領域を示した。
【０１４８】
ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳでは、腫瘍細胞の小さい領域と多発性腫瘍が観察されなかった。総合すれば、ｏＡｄ局所伝達にＣＦＣＳを使用する場合、抗腫瘍効能が向上し、多病巣性腫瘍の成長を予防することを立証する。
【０１４９】
細胞シートを腫瘍除去手術（標的）部位に移植後に生物学的活性および腫瘍発生の有無の確認
図８は、腫瘍選択的殺傷アデノウイルスを搭載した細胞シートから複製されたアデノウイルスの生物学的活性を確認したものであって、複製されたウイルスの量が多いｌａｔｅ  ｔｉｍｅのサンプルであるほど、細胞殺傷能が増加することを確認することによって、細胞シートから複製されたアデノウイルスの生物学的活性があることを立証した。
【０１５０】
図９は、腫瘍除去手術後、腫瘍選択的殺傷アデノウイルスが搭載された細胞シートを付着後、腫瘍の再発の有無を確認したものであって、腫瘍除去手術後、細胞シートを付着しない対照群では、手術３０日以後に腫瘍の再発が観察された反面、細胞シートを付着し縫合した実験群では、腫瘍の再発が起こらなかったことを確認した。
【０１５１】
ワクシニアウイルスが感染した細胞シート形成の確認
ウイルスの感染有無と関係なく、細胞シートがよく形成されることを確認した。
【０１５２】
図１０は、温度反応性培養皿の細胞シートにワクシニアウイルスを０．５ＭＯＩで感染させ、６時間後の細胞シートの写真（ａ）、細胞シートを温度反応性培養皿から引き剥がすために、シリコンリングを除去し、１ＸＰＢＳで３回洗浄した後の細胞シート写真（ｂ）、温度反応性培養皿を２０℃で１５分間反応後、細胞シートを引き剥がし、ウイルスを感染させない細胞シート写真（ｃ）およびワクシニアウイルスを０．５ＭＯＩで感染させた細胞シート写真（ｄ）を示したものである。
【０１５３】
細胞シートでのワクシニアウイルス複製能の確認
細胞シートの癌細胞層でワクシニアウイルスの複製能を評価するために、図１１ａに示されたように、線維芽細胞第１細胞層と癌細胞第２細胞層から構成された細胞シートを形成し、ワクシニアウイルスを０．１ＭＯＩで感染させた後、４時間目に感染しないワクシニアウイルスを全部洗浄して除去した後、２４時間、４８時間、７２時間目に細胞培養液と細胞シートからＱ−ＰＣＲを通じてワクシニアウイルスを確認した。
【０１５４】
図１１ｂに示されたように、ワクシニアウイルスは、感染後７２時間まで時間によって細胞シート内で効果的に複製して、細胞シートがワクシニアウイルスの複製を許容することを立証した。
【０１５５】
ワクシニアウイルスによる細胞シートの細胞死滅の確認
ウイルス感染による細胞シートの細胞死滅を確認するために、図１１ａに示されたように、線維芽細胞第１細胞層と癌細胞第２細胞層から構成された細胞シートを形成し、ワクシニアウイルスを２または５ＭＯＩで感染させた後、死滅した細胞を赤色で染色できる７−ＡＡＤ  ｄｙｅを添加して、時間による細胞死滅を確認した。
【０１５６】
図１２ａから分かるように、２または５ＭＯＩでワクシニアウイルスを感染させた細胞シートの全部で時間によって死滅した細胞の数が増加することを確認し、写真での赤色を帯びる面積を定量化した（図１２ｂ）。
【０１５７】
図１１と図１２の結果を総合すれば、細胞シートは、アデノウイルスだけでなく、ワクシニアウイルスの感染も可能であり、その複製が可能にし、ウイルスの複製によって細胞シートが生分解性を有することを立証した。
【０１５８】
放射線を照射した癌細胞の細胞生存能の確認
多様な強さの放射線を照射（１、５、１０、１５、３０、５０Ｇｙ）したＵ３４３細胞の細胞生存能をＭＴＴアッセイを通じて確認した。１Ｇｙの放射線を照射したＵ３４３細胞株は、放射線を照射しない細胞（対照群）と類似した程度に細胞が分裂し、５Ｇｙの放射線を照射した場合、細胞の分裂速度が対照群に比べて遅れ、７日目以後には、細胞が死滅し始めた。１０〜５０Ｇｙの放射線を照射したＵ３４３の場合、細胞の分裂がほとんど起こらなく、６日目に全部死滅した（図１３）。
【０１５９】
放射線照射された癌細胞を含む細胞シートにおけるアデノウイルス複製能の確認
細胞シートの放射線が照射された癌細胞層でウイルスの複製能を評価するために、図１１ａに示されたように、線維芽細胞第１細胞層と癌細胞第２細胞層から構成された細胞シートを形成し、アデノウイルスを０．５ＭＯＩで感染させた後、４時間目に感染しないアデノウイルスを全部洗浄して除去した後、２４時間、４８時間、７２時間目に細胞培養液と細胞シートからＱ−ＰＣＲを通じてアデノウイルスを確認した。その結果、放射線が照射された癌細胞でもアデノウイルスの複製が起こることを確認した（図１４）。
【０１６０】
討議
肝臓で慢性ストレスによって頻繁に発生する多発性肝細胞癌腫は、突然変異が大きく、多くの肝臓を覆って、多くの患者で治癒切除手術を施行し難い。
【０１６１】
切除手術を受ける患者さえも再発率が高いので、５年生存率が５０％である予後が良くない。
【０１６２】
また、この患者において広範囲な肝損傷は、これらの薬物が激しい肝毒性を起こすので、適切な量の化学療法剤を全身投与しないようにする。
【０１６３】
伝統的なＨＣＣ治療オプションのこのような限界を解決するために、ＨＣＣの多病巣性同所に腫瘍殺傷Ａｄを効率的に伝達するために、生分解性およびＡｄ複製許容細胞シートを生成した。
【０１６４】
細胞シート伝達プラットホームのウイルス複製許容性質は、他の通常の治療経路（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｄの多くの地域および全身投与には、１〜５×１０１０ＶＰが必要である）と比較して比較的低いウイルス用量を有する多病巣性肝細胞癌の効果的な治療を可能にする。
【０１６５】
同等なウイルス用量で、ｏｃ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ治療は、長期的な腫瘍殺傷Ａｄ放出につながって、ｎａｋｅｄ  ｏＡｄ−ＤＣＮの全身または局所投与より優れた腫瘍成長抑制および多発性肝細胞癌形成の予防を示す（図６）。
【０１６６】
これに関する説明の一つは、ウイルス複製を媒介とする細胞溶解およびＣＦＣＳから放出された腫瘍に到達する多くのビリオンが、多病巣性腫瘍部位の広い領域を感染させることができることである。
【０１６７】
究極的に、長時間間治療用ウイルスの感染性を維持することは、臨床試験で主要な障害物として残っている。ハイドロゲル、パッチおよび治療剤の局所化および治療効能を向上させるために現在開発されている腫瘍内注射のようないくつかの他の局所伝達プラットホームがある［Ｐｅｓｏｎｅｎ，Ｓ．，Ｌ．Ｋａｎｇａｓｎｉｅｍｉ，ａｎｄ  Ａ．Ｈｅｍｍｉｎｋｉ，Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄａｔａ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１１．８（１）：ｐ．１２−２８；Ｗａｎｇ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ  Ｐａｔｃｈ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＰＤ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ，２０１６．１６（４）：ｐ．２３３４−４０；Ｋａｓａｌａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｏｎ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌ−ｃｏａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），２０１６．１１（１３）：ｐ．１６８９−７１３］。このようなプラットホームの主な問題点の一つは、ポリマー、リポソームおよびナノ粒子のような合成成分を頻繁に使用するということであり、分解生成物は、炎症およびその他副作用を誘発しうるということである。しかしながら、本発明の腫瘍殺傷ウイルスが搭載された細胞シート（例えば、ｏＡｄ−ＤＣＮ／ＣＦＣＳ）は、既存の他の局所伝達プラットホームとは異なって、合成成分が全く含まれていないので、生体適合性および分解性に優れている。クリニックでＣＦＣＳ接近法に対する重要な関心と障害物の一つは、他の腫瘍を生成することができるので、ウイルス複製を支援する癌細胞層を使用することである。このような憂慮を解消するために、放射線照射された癌細胞を利用してＣＦＣＳを生成させて、初期移植後に癌細胞層の撲滅を誘導して、ウイルス複製を支援した（図１３）。また、放射線照射は、細胞シート層にウイルス複製を強化させた（図１４）。
【０１６８】
このような結果は、放射線によるＤＮＡ損傷と補助的な放射線治療を通じて腫瘍殺傷Ａｄの複製が向上することができることを示し、ＤＮＡ復旧を加速化すれば、エピゾーム性アデノウイルスＤＮＡの複製をさらに大きくすることができる。
【０１６９】
さらに、放射線照射された癌細胞は、現在癌ワクチンの有望な候補として評価されている。腫瘍ワクチンと腫瘍殺傷Ａｄの同時伝達のための有望な免疫療法プラットホームになりうる潜在性を示す腫瘍特異的免疫反応を認知し、誘導する宿主免疫系に対する腫瘍関連抗原を提供することができるためである。
【０１７０】
腫瘍殺傷Ａｄ（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｄｓ）のＣＦＣＳ媒介伝達の潜在的な免疫学的調節は、現在未来研究として評価されている。
【０１７１】
結論
本発明の一部実施例は、腫瘍殺傷ウイルスと細胞シートを結合して、多病巣性腫瘍治療のための効率的な伝達システムを作り、このようなシステムは、効率的な増幅と持続的な放出を示し、許容細胞シートによるｏＡｄの非特異的排出を防止した。
【０１７２】
結論的に、本発明の一部の実施例は、既存の癌遺伝子治療法の限界を克服することによって、腫瘍殺傷ウイルス／細胞シートシステムの使用が腫瘍殺傷ウイルスの治療効果を最大化することができることを示す。
【０１７３】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。特に、本願で記述した実施例では、一部のウイルスに対する使用のみを例示しているだけであり、他のウイルスシステムにも変更可能である。
【図１ａ】
2021507718.tif 000003
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021507718.tif 000016
【図１１ａ】
2021507718.tif 000017
【図１１ｂ】
2021507718.tif 000018
【図１２ａ】
2021507718.tif 000019
【図１２ｂ】
2021507718.tif 000020
【図１３】
2021507718.tif 000021
【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月23日(2020.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）体細胞および（ｉｉ）癌細胞または幹細胞を含む、二つ以上の細胞層を含み、そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムが導入されている、細胞シート。
【請求項２】
前記体細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、筋上皮細胞（ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ）、上皮ケラチン細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、シュワン細胞（ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ）、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）、巨大細胞（ｍｅｇａｋａｒａｔｙｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、幹細胞および癌細胞よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項３】
前記遺伝子伝達システムは、（ｉ）ネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクターおよび（ｉｖ）前記ネイキッド組換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはニオソームの形態である、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項４】
前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、セムリキフォレストウイルスおよび麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項３に記載の細胞シート。
【請求項５】
前記遺伝子伝達システムは、組換えアデノウイルスである、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項６】
前記組換えアデノウイルスは、複製不能アデノウイルスまたは腫瘍殺傷アデノウイルスである、請求項５に記載の細胞シート。
【請求項７】
遺伝子伝達システムが導入される細胞層は、癌細胞または幹細胞を含むものである、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項８】
支持体として体細胞を含む細胞層と；
癌細胞または幹細胞を含む細胞層と；を含み、
組換えアデノウイルスが癌細胞または幹細胞を含む細胞層に導入されている、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項９】
前記細胞シートは、遺伝子伝達システムが導入されている、癌細胞を含む細胞層を含み、
前記癌細胞は、放射線が照射されたものである、請求項１に記載の細胞シート。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターは、０．１〜５００ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の量で搭載される、請求項３に記載の細胞シート。
【請求項１１】
温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に、二つ以上の細胞層を含む細胞シートを形成し、そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムを導入し、温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離することを含む、請求項１に記載の細胞シートの製造方法。
【請求項１２】
前記温度感応性ポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびポリラクテート−ｃｏ−グリコレート（ＰＬＧＡ）よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の細胞シートを含む遺伝子治療剤。
【請求項１４】
癌の予防もしくは治療のための、または、癌の再発もしくは癌の転移予防のための、請求項１３に記載の遺伝子治療剤。
【請求項１５】
前記癌は、多病巣性肝細胞癌腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、喉頭癌、すい臓癌、肺癌、非小細胞性肺癌、結腸癌、骨癌、すい臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、卵巣癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、肛門付近癌、大腸癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）腫瘍、１次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、脳幹部神経膠腫および脳下垂体腺腫よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項１４に記載の遺伝子治療剤。
【国際調査報告】
2021507718.tif 000023
2021507718.tif 000024
2021507718.tif 000025
2021507718.tif 000026
2021507718.tif 000027
2021507718.tif 000028