(57)【要約】  本開示は、Ｔ細胞の有効性を改善する方法を提供する。一態様では、本開示は、養子細胞移入または治療（ＡＣＴ）のためのＴ細胞の持続性を増強する方法をさらに提供する。本開示の方法を介して、養子注入されたＴ細胞の持続性を予測できるサイトカイン感受性アッセイ（ＣＳＡ）および関連する方法が、さらに提供される。本開示は、それを必要とする対象においてがんを治療する方法、ならびに本明細書に記載される方法によって生産されるＴ細胞集団もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１人の個人からＴ細胞を得るステップと、
前記Ｔ細胞を活性化するステップと、
前記活性化Ｔ細胞の第１の部分を一定期間増殖させるステップと、
前記増殖されたＴ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、
前記培養されたＴ細胞におけるサイトカイン応答を測定するステップと、
最大サイトカイン応答をもたらす期間を同定するステップと、
前記活性化Ｔ細胞の第２の部分を最大サイトカイン応答をもたらす期間にわたり増殖させるステップと
を含んでなる、Ｔ細胞を生産する方法。
【請求項２】
前記活性化Ｔ細胞の前記増殖された第１の部分を培養前に凍結するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化Ｔ細胞の前記冷凍された増殖された第１の部分を培養前に解凍するステップをさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化Ｔ細胞の前記解凍された増殖された第１の部分を培養前に休止させるステップをさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞が、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含んでなる刺激因子によって活性化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記期間が、活性化後約１日間〜約１５日間、約２日間〜約１４日間、約３日間〜約１３日間、約３日間〜約１２日間、約３日間〜約１１日間、約３日間〜約１０日間、約３日間〜約９日間、約３日間〜約８日間、約３日間〜約７日間、約３日間〜約６日間、約３日間〜約５日間、約３日間〜約４日間、約４日間〜約６日間、または約４日間〜約５日間である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−２の濃度が、約１０Ｕ／ｍｌ〜約５００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約４５０Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約４００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約３５０Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約３００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約２５０Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約２００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約５０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ〜約４０Ｕ／ｍｌ、約２５Ｕ／ｍｌ〜約３５Ｕ／ｍｌ、または約３０Ｕ／ｍｌ〜約３５Ｕ／ｍｌである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＬ−７の濃度が、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ、または０．１ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩＬ−１５の濃度が、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ、または０．１ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌである、請求項７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカイン応答が、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）および／または幹記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）／Ｔ中央記憶（Ｔｃｍ）の増殖の増加、アポトーシスの減少、個体数の増加、およびそれらの組み合わせの１つまたは複数から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記休止させるステップが、約０．５時間〜約４８時間、約０．５時間〜約３６時間、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１８時間、約０．５時間〜約１２時間、約０．５時間〜約６時間、約１時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、約４時間ｔｏ６時間、約１時間〜約２４時間、約２〜約２４時間、約１２〜約４８時間、約０．５時間〜約１２０時間、約０．５時間〜約１０８時間、約０．５時間〜約９６時間、約０．５時間〜約８４時間、約０．５時間〜約７２時間、または約０．５時間〜約６０時間内に実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体が、それぞれ約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約８．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約６．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約４．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．８μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．６μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．２５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ〜約０．４μｇ／ｍｌ、または約０．４μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性化するステップが、約１時間〜約１２０時間、約１時間〜約１０８時間、約１時間〜約９６時間、約１時間〜約８４時間、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約２４時間、約４時間〜約２４時間、約６時間〜約２４時間、約８時間〜約２４時間、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約７２時間、約２４時間〜約７２時間、約６時間〜約４８時間、約２４時間〜約４８時間、約６時間〜約７２時間、または約１時間〜約１２時間内に実行される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記得られたＴ細胞が、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１人のドナー、患者、または個人へ注入するために、前記活性化Ｔ細胞の前記増殖された第２の部分を採取するステップをさらに含んでなる請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の活性化Ｔ細胞の採取された増殖された第２の部分の有効量を患者に投与するステップを含んでなる、がんを有する患者を治療する方法。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞が前記患者から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞が健常ドナーから得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記がんが、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の活性化Ｔ細胞の採取された増殖された第２の部分と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
前記Ｔ細胞を活性化するステップと、
前記活性化Ｔ細胞を活性化後に約３日間〜約５日間増殖させるステップと、
前記少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人へ注入するために、前記増殖されたＴ細胞を採取するステップと
を含んでなり、約３〜約５日間増殖された前記Ｔ細胞の成長が、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞の成長を超える、Ｔ細胞の成長を増加させる方法。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞が活性化後に約４日間増殖され、前記Ｔ細胞の成長が、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞の成長を超える、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記増殖されたＴ細胞が、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞が、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含んでなる刺激因子によって活性化される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
約３〜約５日間増殖された前記Ｔ細胞が、がん治療を必要とする患者における養子免疫療法で使用される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法であって、前記がんが、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択される、方法。
【請求項２７】
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
前記Ｔ細胞を活性化するステップと、
前記活性化Ｔ細胞を活性化後に約３日間〜約５日間増殖させるステップと、
前記少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人へ注入するために、前記増殖されたＴ細胞  を採取するステップと
を含んでなり、約３〜約５日間増殖された前記Ｔ細胞の細胞死が、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞の細胞死と比較して減少する、養子免疫療法で使用するためのＴ細胞の細胞死を減少させる方法。
【請求項２８】
前記増殖されたＴ細胞が、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ナイーブＴ細胞（ＴＮ）および／または幹記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）／Ｔ中央記憶（Ｔｃｍ）表現型を提示する増殖されたＴ細胞の数が、前記活性化後に約７日間を超えて増殖された前記活性化Ｔ細胞の数を超える、請求項２７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
前記Ｔ細胞を活性化するステップと、
前記活性化Ｔ細胞を活性化後に約３日間〜約５日間増殖させるステップと、
前記少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人へ注入するために、前記増殖されたＴ細胞を採取するステップと
を含んでなり、約３〜約５日間増殖された前記Ｔ細胞の養子免疫療法のための有効性が、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞と比較して改善される、養子免疫療法のための有効性が改善されたＴ細胞を作製する方法。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞が活性化後に約４日間増殖され、前記Ｔ細胞の養子免疫療法のための有効性が、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞の養子縁組免疫療法のための有効性を超える、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記増殖されたＴ細胞が、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記増殖されたＴ細胞が、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）および／または幹記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）／Ｔ中央記憶（Ｔｃｍ）表現型を提示する、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｔ細胞が、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含んでなる刺激因子によって活性化される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
約３〜約５日間増殖された前記Ｔ細胞が、がん治療を必要とする患者における養子免疫療法で使用される、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法であって、前記がんが、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択される、方法。
【請求項３６】
約３〜約５日間増殖された前記Ｔ細胞が、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞と比較して、増殖および生存率の増加を提示する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記増殖させるステップの前に、前記活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップをさらに含んでなり、前記ウイルスベクターがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレトロウイルスベクターである、請求項１、２２、２７、および３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレンチウイルスベクターである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１、２２、２７、および３０のいずれか一項に記載の方法によって生産される、Ｔ細胞集団。
【請求項４０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって生産される、Ｔ細胞集団。
【請求項４１】
前記培養するステップが、抗原提示細胞の非存在下である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記培養するステップが、前記増殖されたＴ細胞を約１，０００〜約１×１０６個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約５００，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約２５０，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約２００，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約１５０，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約１００，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約５０，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約１０，０００個の細胞／ｃｍ２、または約１，０００〜約５，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で播種するステップを含んでなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記培養するステップが、前記増殖されたＴ細胞を約１，０００〜約２００，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約１５０，０００個の細胞／ｃｍ２、または約１，０００〜約１００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で播種するステップを含んでなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
複数の増殖期間で増殖された凍結保存Ｔ細胞を解凍するステップと、
前記解凍されたＴ細胞をサイトカインの非存在下で休止させるステップと、
前記休止したＴ細胞を播種するステップと、
前記播種されたＴ細胞を少なくとも１サイクル期間培養するステップと
を含んでなる、固形腫瘍におけるＴ細胞の生体内持続性を予測する方法であって、
前記少なくとも１サイクル期間の開始時に、１つまたは複数のサイトカインを培養に添加し、
前記少なくとも１サイクル期間の終了時に、前記添加された１つまたは複数のサイトカインが枯渇し、
前記少なくとも１サイクル期間中に、前記培養されたＴ細胞を複数の時点で試料採取し、
前記試料採取されたＴ細胞のサイトカイン応答を測定し、
複数の増殖期間から、前記試料採取されたＴ細胞が最大サイトカイン応答を提示する増殖期間を同定し、
同定された増殖期間にわたって増殖された前記Ｔ細胞を固形腫瘍を治療するための組成物に製剤化する、方法。
【請求項４５】
前記Ｔ細胞が、活性化後約１日間〜約１５日間、約２日間〜約１４日間、約３日間〜約１３日間、約３日間〜約１２日間、約３日間〜約１１日間、約３日間〜約１０日間、約３日間〜約９日間、約３日間〜約８日間、約３日間〜約７日間、約３日間〜約６日間、約３日間〜約５日間、約３日間〜約４日間、約４日間〜約６日間、または約４日間〜約５日間増殖される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記休止させるステップが、約０．５時間〜約４８時間、約０．５時間〜約３６時間、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１８時間、約０．５時間〜約１２時間、約０．５時間〜約６時間、約１時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、または約１時間〜約２４時間、約２〜約２４時間、約１２〜約４８時間、約０．５時間〜約１２０時間、約０．５時間〜約１０８時間、約０．５時間〜約９６時間、約０．５時間〜約８４時間、約０．５時間〜約７２時間、または約０．５時間〜約６０時間内に実行される、請求項４４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記播種するステップが、約１，０００〜約２００，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約１５０，０００個の細胞／ｃｍ２、または約１，０００〜約１００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つまたは複数のサイトカインが、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記１サイクル期間が、サイクル当たり１〜１０日間、サイクル当たり２〜１０日間、サイクル当たり３〜１０日間、サイクル当たり４〜１０日間、サイクル当たり５〜１０日間、サイクル当たり６〜１０日間、サイクル当たり７〜１０日間、サイクル当たり８〜１０日間、またはサイクル当たり９〜１０日間である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１サイクル期間が、１サイクル期間、２サイクル期間、３サイクル期間、４サイクル期間、５サイクル期間、６サイクル期間、７サイクル期間、８サイクル期間、９サイクル期間、または１０サイクル期間である、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記サイトカイン応答が、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）および／または幹記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）／Ｔ中央記憶（Ｔｃｍ）の個体数の増加、増殖の増加、アポトーシスの減少、およびそれらの組み合わせの１つまたは複数から選択される、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記固形腫瘍が、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択される、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１８年３月２１日に提出された米国仮特許出願第６２／６４６，１８０号明細書および２０１８年４月１１日に提出された独国特許出願第１０２０１８１０８６１２．１号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、Ｔ細胞の有効性を改善する方法を提供する。一態様では、本開示は、養子細胞移入または治療（ＡＣＴ）のためのＴ細胞の持続性を増強する方法をさらに提供する。本開示の方法を介して、養子注入されたＴ細胞の持続性を予測できるサイトカイン感受性アッセイ（ＣＳＡ）および関連する方法が、さらに提供される。本開示は、それを必要とする対象においてがんを治療する方法、ならびに本明細書に記載される方法によって生産されるＴ細胞集団もまた提供する。
【背景技術】
【０００３】
養子細胞移入または治療（ＡＣＴ）は、患者への養子免疫伝達のための抗原特異的Ｔ細胞の生体外単離および増殖を伴う、免疫療法の一形態である。血液学的悪性疾患および黒色腫の治療では臨床的有用性が得られているものの、ＡＣＴの有効性は、生体内では移入されたＴ細胞が機能できず持続できないので、ほとんどの固形腫瘍の治療では一般に限定的である。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する耐性、および抑制的な腫瘍環境に起因する腫瘍特異的Ｔ細胞の阻害などの因子が、この失敗に寄与していてもよい。さらに、患者への注入に十分な数を得るために、腫瘍特異的Ｔ細胞を大規模に培養する必要性は、Ｔ細胞の質に大きな影響を及ぼし得る。
【０００４】
Ｔ細胞の持続性はＡＣＴの有効性の推進力であると考えられ、Ｔ細胞の持続性／若い表現型を前臨床および臨床転帰に相関させる。培養Ｔ細胞を増強し、サイトカイン媒介シグナル伝達を介して表現型を調節するために、共通γ鎖（γｃ）−サイトカインＩＬ−２がＴ細胞を増殖させる。高用量のＩＬ−２はまた、ＡＣＴ  Ｔ細胞培養を増殖させるために使用されている。Ｔ細胞によるＩＬ−２の強制発現は、生体外生存期間の長期化をもたらし、腫瘍の特異性および機能を維持する。しかしＩＬ−２は、ＡＣＴ使用法にとって好ましくない表現型をもたらすこともあるＴ細胞の分化を促進し得る。ＡＣＴのための生体外Ｔ細胞培養を最適化するために、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１などのその他のγｃ−サイトカインは、記憶Ｔ細胞の形成、増殖、および生存に役割を果たすが、Ｔ細胞のより低い分化度をもたらしながら、抗腫瘍応答をなおも増強できることが記載されている。
【０００５】
米国特許第７，９９３，６３８号明細書は、活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を対象に投与するステップと；ＣＴＬの持続性に影響を及ぼす、インターフェロン−α−２ｂおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）をはじめとする、少なくとも２つのサイトカインを対象に投与するステップとを含む、がんの治療を必要とする対象を治療するための方法を列挙する。
【０００６】
米国特許出願公開第２０１５／００１７１２０号明細書は、ＡＣＴを与えられているがん患者に、移入された細胞の持続性を延長するのに有効な量で、増殖された薬物動態ＩＬ−２を投与するステップを含む、養子細胞療法（ＡＣＴ）を受けているがん患者において、移入された細胞の持続性を延長し、移入された細胞の増殖を刺激し、または標的細胞集団に対するΤ細胞媒介免疫応答を刺激する方法を列挙する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
がん患者におけるＡＣＴの予後を改善する必要性が、なおもある。この技術的問題の解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に記載されるように、本開示は、Ｔ細胞の有効性および生存率を改善する方法を提供する。
【０００９】
本開示は、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
Ｔ細胞を活性化するステップと、
活性化Ｔ細胞を活性化後に約３日間〜約５日間増殖させるステップと、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人へ注入するために、増殖されたＴ細胞を採取するステップと
を含んでなる、養子免疫療法のための改善された有効性を有するＴ細胞を生産する方法をさらに提供し、約３〜約５日間増殖されたＴ細胞の養子免疫療法のための有効性は、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞と比較して改善される。
【００１０】
一態様では、本開示は、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
Ｔ細胞を活性化するステップと、
活性化Ｔ細胞を活性化後に約３日間〜約５日間増殖させるステップと、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人へ注入するために、増殖されたＴ細胞を採取するステップと
を含んでなる、Ｔ細胞の成長を増加させる方法を提供し、約３〜約５日間増殖されたＴ細胞の成長は、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞の成長を超える。
【００１１】
別の態様では、本開示は、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
Ｔ細胞を活性化するステップと、
活性化Ｔ細胞を活性化後に約３日間〜約５日間増殖させるステップと、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人へ注入するために、増殖されたＴ細胞を採取するステップと
を含んでなる、養子免疫療法で使用するためのＴ細胞の細胞死を減少させる方法を提供し、約３〜約５日間増殖されたＴ細胞の細胞死は、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞の細胞死と比較して減少する。
【００１２】
本開示は、Ｔ細胞が活性化後に約４日間増殖され、Ｔ細胞の養子免疫療法のための有効性が、活性化後に約７日間以上増殖された活性化Ｔ細胞の養子縁組免疫療法のための有効性を超える方法をさらに提供する。
【００１３】
本開示は、Ｔ細胞が活性化後に約３日間増殖され、Ｔ細胞の養子免疫療法のための有効性が、活性化後に約６日間以上増殖された活性化Ｔ細胞の養子縁組免疫療法のための有効性を超える方法をさらに提供する。
【００１４】
本開示は、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
Ｔ細胞を活性化するステップと、
活性化Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップと、
形質導入されたＴ細胞を活性化後に約３日間〜約５日間増殖させるステップと、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人へ注入するために、形質導入されたＴ細胞を採取するステップと
を含んでなる、養子免疫療法のための改善された有効性を有するＴ細胞を生産する方法をさらに提供し、約３〜約５日間増殖されたＴ細胞の養子免疫療法のための有効性は、活性化後に約７日間以上増殖された、活性化され形質導入されたＴ細胞と比較して改善される。
【００１５】
一態様では、本開示は、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
Ｔ細胞を活性化するステップと、
活性化Ｔ細胞を活性化後の第１の期間にわたり増殖させるステップと、
少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人へ注入するために、増殖されたＴ細胞を採取するステップと
を含んでなる、養子免疫療法のための改善された有効性を有するＴ細胞を生産する方法を提供し、活性化後の第１の期間にわたり増殖されたＴ細胞の養子免疫療法のための有効性は、活性化後の第２の期間にわたり増殖された活性化Ｔ細胞と比較して改善され、前記第１の期間は前記第２の期間より短い。
【００１６】
一態様では、第１の期間は約２〜約５日間で、前記第２の期間は約６日間〜約１０日間であり；第１の期間は約３〜約５日間で、前記第２の期間は約７日間〜約１０日間であり；第１の期間は約２〜約５日間で、前記第２の期間は約６日間〜約１４日間であり；第１の期間は約６日間未満で、前記第２の期間は約７日間を超える。
【００１７】
一態様では、増殖されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００１８】
別の態様では、増殖されたＴ細胞は、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）および／または幹記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）／Ｔ中央記憶（Ｔｃｍ）表現型を提示する。
【００１９】
追加的な態様によれば、Ｔ細胞は刺激因子によって活性化される。
【００２０】
別の態様では、刺激因子は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含んでなる。
【００２１】
一態様では、本明細書に記載のＴ細胞は、がん治療を必要とする患者における養子免疫療法で使用され、がんは、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択される。
【００２２】
一態様では、本開示は、
少なくとも１人のドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
Ｔ細胞を活性化するステップと、
活性化Ｔ細胞の第１の部分を一定期間増殖させるステップと、
増殖されたＴ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、
培養されたＴ細胞におけるサイトカイン応答を測定するステップと、
最大サイトカイン応答をもたらす期間を同定するステップと、
活性化Ｔ細胞の第２の部分を最大サイトカイン応答をもたらす期間にわたり増殖させるステップと
を含んでなる、Ｔ細胞生存率を評価するアッセイを提供する。
【００２３】
本開示は、
少なくとも１人のドナー、患者、または個人からＴ細胞を得るステップと、
Ｔ細胞を活性化するステップと、
活性化Ｔ細胞の第１の部分を時間をかけて増殖させるステップと、
増殖されたＴ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、
培養されたＴ細胞におけるサイトカイン応答を測定するステップと、
最大サイトカイン応答をもたらす期間を同定するステップと、
活性化Ｔ細胞の第２の部分を最大サイトカイン応答をもたらす期間にわたり増殖させるステップと
を含んでなる、Ｔ細胞を生産する方法をさらに提供する。
【００２４】
一態様では、Ｔ細胞は、少なくとも１人の健常ドナー、患者、または個人から得られる。別の態様では、Ｔ細胞は、少なくとも１人のがんのないドナー、患者、または個人から得られる。
【００２５】
一態様では、Ｔ細胞は、治療される患者にとって同種異系である。別の態様では、Ｔ細胞は、治療される患者にとって自己由来である。
【００２６】
一態様では、本開示は、活性化Ｔ細胞の増殖された第１の部分を培養前に凍結することを提供する。
【００２７】
別の態様では、本開示は、活性化Ｔ細胞の冷凍された増殖された第１の部分を培養前に解凍することを提供する。
【００２８】
なおも別の態様では、本開示は、活性化Ｔ細胞の解凍された増殖された第１の部分を培養前に休止させることを提供する。
【００２９】
別の態様では、本開示は、活性化Ｔ細胞をウイルスベクターまたは非ウイルスベクターで増殖前に形質導入することを提供する。
【００３０】
本明細書に記載の一態様では、ベクターは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレトロウイルスベクター、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはＴＣＲを発現するリポソームなどの非ウイルスベクターであってもよい。
【００３１】
一態様では、Ｔ細胞増殖は、活性化後約１日間〜約１５日間、約２日間〜約１４日間、約３日間〜約１３日間、約３日間〜約１２日間、約３日間〜約１１日間、約３日間〜約１０日間、約３日間〜約９日間、約３日間〜約８日間、約３日間〜約７日間、約３日間〜約６日間、約３日間〜約５日間、約３日間〜約４日間、約４日間〜約６日間、または約４日間〜約５日間測定される。
【００３２】
一態様では，少なくとも１つのサイトカインは、（インターロイキン）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３３】
別の態様では、ＩＬ−２の濃度は、約１０Ｕ／ｍｌ〜約５００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約４５０Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約４００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約３５０Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約３００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約２５０Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約２００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約１００Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ〜約５０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ〜約４０Ｕ／ｍｌ、約２５Ｕ／ｍｌ〜約３５Ｕ／ｍｌ、または約３０Ｕ／ｍｌ〜約３５Ｕ／ｍｌである。
【００３４】
別の態様では、本明細書で提供されるＩＬ−７の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ、または０．１ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌである。
【００３５】
別の態様では、ＩＬ−１５の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ、または０．１ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌである。
【００３６】
本開示は、サイトカイン応答が、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）および／または幹記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）／Ｔ中央記憶（Ｔｃｍ）の増殖の増加、アポトーシスの減少、個体数の増加、およびそれらの組み合わせの１つまたは複数から選択される方法をさらに提供する。
【００３７】
一態様では、休止ステップは、約０．５時間〜約４８時間、約０．５時間〜約３６時間、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１８時間、約０．５時間〜約１２時間、約０．５時間〜約６時間、約１時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、または約１時間〜約２４時間、約２〜約２４時間、約１２〜約４８時間、約０．５時間〜約１２０時間、約０．５時間〜約１０８時間、約０．５時間〜約９６時間、約０．５時間〜約８４時間、約０．５時間〜約７２時間、または約０．５時間〜約６０時間内に実行される。
【００３８】
本開示によると、一態様では、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、それぞれ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約８．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約６．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約４．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．８μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．６μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．２５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．３μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ〜約０．４μｇ／ｍｌ、または約０．４μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００３９】
別の態様では、活性化は、約１時間〜約１２０時間、約１時間〜約１０８時間、約１時間〜約９６時間、約１時間〜約８４時間、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約２４時間、約４時間〜約２４時間、約６時間〜約２４時間、約８時間〜約２４時間、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約７２時間、約２４時間〜約７２時間、約６時間〜約４８時間、約２４時間〜約４８時間、約６時間〜約７２時間、または約１時間〜約１２時間内に実行される。
【００４０】
一態様では、本明細書に記載される方法によって得られるＴ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００４１】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される方法と、方法ステップとを用いて、Ｔ細胞の生存率を評価する方法を提供する。一態様では、本明細書に記載される方法は、インビトロ法ステップのみを含む。その他の態様では、本明細書に記載される方法は、インビボ法ステップを含まない。なおも別の態様では、本明細書に記載される方法は、生体外および生体内で実施される方法ステップの組み合わせを含む。
【００４２】
一態様では、本明細書に記載される方法は、例えば、遺伝子組換えマウスなどの遺伝子組換え動物の使用による、分析または評価を含まない。なおも別の態様では、本明細書に記載される方法は、例えば、遺伝子組換えマウスなどの遺伝子組換え動物の使用が関与する方法よりも迅速に、Ｔ細胞産生および／またはＴ細胞生存のための条件を判定できる。
【００４３】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、それを必要とする患者または対象への注入のために利用できる、生存可能なＴ細胞を提供する。その他の態様では、本明細書に記載される方法は、生体外で実施され、生体内結果を叙述する。その他の態様では、本開示は、輸液のためのＴ細胞の生体内生存率を予測する、高スループット生体外アッセイを提供する。
【００４４】
一態様では、本明細書は、養子注入されたＴ細胞の持続性を予測できるサイトカイン応答（ＣＲ）アッセイ、および関連する方法を提供する。一態様では、本明細書は、サイトカインに応答する能力、および継続的なサイトカイン刺激の非存在下で生存する能力に対する、生体外増殖の長さの影響を測定できる、サイトカイン感受性アッセイを提供する。
【００４５】
別の態様では、高スループットインビトロ法を利用することによって、本明細書に記載される方法を用いて、どのタイプのＴ細胞が生体内で持続するかが判定されてもよい。
【００４６】
本明細書で記載され生産されたＴ細胞を含んでなる医薬組成物が、さらに提供される。別の態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、またはその塩を含む。
【００４７】
本明細書に記載される方法によって生産されたＴ細胞集団は、本開示を介してさらに提供される。一態様では、Ｔ細胞は操作されたＴ細胞である。
【００４８】
一態様では、本明細書は、
複数の増殖期間で増殖された凍結保存Ｔ細胞を解凍するステップと、
解凍されたＴ細胞をサイトカインの非存在下で休止させるステップと、
休止したＴ細胞を播種するステップと、
播種されたＴ細胞を少なくとも１サイクル期間培養するステップと
を含んでなる、固形腫瘍におけるＴ細胞の生体内持続性を予測する方法を提供し、
少なくとも１サイクル期間の開始時に、１つまたは複数のサイトカインが培養に添加され、
少なくとも１サイクル期間の終了時に、添加された１つまたは複数のサイトカインが枯渇し、
少なくとも１サイクル期間中に、培養されたＴ細胞が複数の時点で試料採取され、
試料採取されたＴ細胞のサイトカイン応答が測定され、
複数の増殖期間から、試料採取されたＴ細胞が最大サイトカイン応答を提示する増殖期間が同定され、
同定された増殖期間にわたって増殖されたＴ細胞が、固形腫瘍を治療するための組成物に製剤化される。
【００４９】
別の態様では、複数の増殖期間は、活性化後約１日間〜約１５日間、約２日間〜約１４日間、約３日間〜約１３日間、約３日間〜約１２日間、約３日間〜約１１日間、約３日間〜約１０日間、約３日間〜約９日間、約３日間〜約８日間、約３日間〜約７日間、約３日間〜約６日間、約３日間〜約５日間、約３日間〜約４日間、約４日間〜約６日間、または約４日間〜約５日間である。
【００５０】
別の態様では、１サイクル期間は、サイクル当たり１〜１０日間、サイクル当たり２〜１０日間、サイクル当たり３〜１０日間、サイクル当たり４〜１０日間、サイクル当たり５〜１０日間、サイクル当たり６〜１０日間、サイクル当たり７〜１０日間、サイクル当たり８〜１０日間、またはサイクル当たり９〜１０日間である。
【００５１】
別の態様では、少なくとも１サイクル期間は、１サイクル期間、２サイクル期間、３サイクル期間、４サイクル期間、５サイクル期間、６サイクル期間、７サイクル期間、８サイクル期間、９サイクル期間、または１０サイクル期間である。
【００５２】
別の態様では、固形腫瘍は、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｔ細胞アポトーシス（例えば、再刺激誘発性細胞死（ＲＩＣＤ）およびサイトカイン離脱誘発性細胞死（ＣＷＩＤ）、および記憶形成を示す。（その内容全体が本明細書に参照により援用される、Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０８（２０１７）１９０−１９６）。
【図２】それぞれ内因的または外因的アポトーシス経路を阻害することによる、液体腫瘍および固形腫瘍を標的とするＡＣＴにおける生体内Ｔ細胞生存のモデルを示す。
【図３】それぞれ連続殺滅アッセイまたはサイトカイン感受性アッセイによる、液体腫瘍および固形腫瘍を標的とするＡＣＴにおける生体内Ｔ細胞生存試験のモデルを示す。
【図４】本開示の一実施形態による、サイトカイン感受性アッセイを示す。
【図５】ＣＤ４５ＲＯ（低）およびＣＣＲ７＋によって特徴付けられる、生体外増殖中のＴｓｃｍ様形成を示す。
【図６】初期の増殖されたＴｓｃｍが、アッセイにおいて２１日間にわたりＩＬ−１５サイトカイン感受性を維持することを示す。
【図７】初期の増殖された細胞（約４日間の増殖）が、７日目および１０日日目での増殖と比較して、細胞成長の増加を実証することを示す。グラフの下のラベルは、使用されたサイトカインの量を表す。線形二次ライン適合が、細胞の挙動をモデル化するために用いられる。４、７、または１０日間増殖されたＴ細胞は、２１日間かけて２〜３日毎に試料採取され、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ａ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（Ｂ）、または３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｃ）の存在下で評価された。増殖倍数は、指定された時点でのＴ細胞数に対する開始Ｔ細胞数の比率として計算される。各プロットは、データの可視化を容易にするために、Ｙ軸上に異なるスケールを有することに留意されたい。最良適合ラインは、細胞生存率の線形二次方程式によって導出される。
【図８−１】図８Ａ〜Ｃ：Ｔ細胞の生体外増殖の短縮（約４日間の増殖）が、７日目および１０日目での増殖と比較して、より高いサイトカイン濃度での生存率の増加と相関することを示す。４、７、または１０日間増殖されたＴ細胞は、２１日間かけて２〜３日毎に試料採取され、３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ａ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｂ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（Ｃ）の存在下で評価された。統合生存率は、図７Ａ〜７Ｃに示されるように、増殖倍数プロットの曲線下面積である。それぞれの点は各ドナーの３つの技術的複製物を表し、合計３人のドナーが示される。図８Ｄ〜Ｆ：形質導入されたＴ細胞の生体外増殖の短縮が、より高いサイトカイン濃度での生存率の増加と相関することを示す。
【図８−２】同上
【図８−３】同上
【図９−１】Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、より低いサイトカイン濃度での生存率の増加と相関することを示す。
【図９−２】同上
【図１０】Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、アポトーシスの減少と相関することを示す。
【図１１−１】Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、より高いサイトカイン濃度でのアポトーシスの減少と相関することを示す。４、７、または１０日間増殖されたＴ細胞は、２１日間かけて２〜３日毎に試料採取され、３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ａ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｂ）、または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（Ｃ）の存在下で評価された。統合アポトーシスは、アッセイの１０日目までにヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶについて陽性に染色された、リンパ球の百分率に基づいて計算される。それぞれの点は各ドナーの３つの技術的複製物を表し、合計３人のドナーが示される。
【図１１−２】同上
【図１２】Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、アポトーシスの減少と相関することを示す。
【図１３】Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、（Ａ）ＩＬ−７、（Ｂ）ＩＬ−１５、および（Ｃ）ＩＬ−２の存在下での細胞分裂の増加と相関することを示す。
【図１４−１】形質導入されたＴ細胞の生体外増殖の短縮が、より高いサイトカイン濃度での細胞分裂の増加と相関することを示す。４、７、または１０日間増殖されたＴ細胞は、２１日間かけて２〜３日毎に試料採取され、３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ａ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｂ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（Ｃ）の存在下で評価された。統合分裂は、アッセイの１０日目までにＰｋＨ６７の検出可能な希釈が検出されたリンパ球の百分率に基づいて、計算される。それぞれの点は各ドナーの３つの技術的複製物を表し、合計３人のドナーが示される。
【図１４−２】同上
【図１５】Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、（Ａ）ＩＬ−７、（Ｂ）ＩＬ−１５、および（Ｃ）ＩＬ−２に対する感受性の増加と相関することを示す。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃ：形質導入されたＴ細胞の生体外増殖の短縮が、より高いサイトカイン濃度での細胞分裂の増加と相関することを示す。図16D:形質導入されたＴ細胞の生体外増殖の短縮が、ＣＤ２５発現の増加と相関することを示す。
【図１７】ＩＬ−２の存在下でのＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現と、生存率／分裂との間の相関関係を示す。
【図１８】ＩＬ−１５の存在下でのＩＬ−１５受容体（ＣＤ１２２）の発現と、生存率／分裂との間の相関関係を示す。
【図１９】ＩＬ−７の存在下でのＩＬ−７受容体（ＣＤ１２７）の発現と、生存率／分裂との間の相関関係を示す。
【図２０】Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、Ｔ細胞ポテンシャルを維持することを示す。（その内容全体が本明細書に参照により援用される、Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０８（２０１７）１９０−１９６）。
【図２１】図２１Ａ:細胞記憶コンパートメントが、２１日間の培養期間中、０日目と７日目毎のフローサイトメトリーによって測定されたことを示す。Ｔｎａｉｖｅ／ｓｃｍ＝ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−、Ｔｃｍ＝ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、Ｔｅｍ＝ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ＋、およびＴｅｆｆ＝ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ−。図２１Ｂ:供試細胞が培養開始時にＰｋＨ増殖色素で標識され、異なる記憶コンパートメントでの増殖が、培養期間７日目までにＰｋＨの希釈率に基づいて測定されたことを示す。
【図２２】ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞増殖中のテロメア長の継続的な損失を示す。相対的テロメア長は、４人の健常ドナー（Ｄ１〜Ｄ４）における腫瘍細胞株対照と比較して、蛍光原位置ハイブリダイゼーションによって評価された。それぞれのサンプル点は、技術的複製の反復試験を表す。ドナーの年齢：Ｄ１：５０歳、Ｄ２：３１歳、Ｄ３：４９歳、およびＤ４：４５歳。
【図２３】ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞増殖の長期化に伴う、テロメラーゼ活性の低下を示す。テロメラーゼ活性は、Ｔ細胞増殖の４、７、または１０日目から採取された細胞の細胞溶解産物から、ＥＬＩＳＡに基づく比色アッセイを介して測定された。それぞれの点は、合計５つの生物学的複製物からの技術的三連サンプルを表す。
【図２４】３人の生物学的ドナーＤ４、Ｄ５、およびＤ６からのＣＤ３／ＣＤ２８製造中のＴ細胞分化を示す。代表的なＰＢＭＣが培養され、次に、示された増殖日に、フローサイトメトリーによって表現型同定された。記憶表現型は、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７発現に基づいて定義される；Ｔｎａｉｖｅ／ｓｃｍ＝ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋、Ｔｃｍ＝ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋、Ｔｅｍ＝ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−、およびＴｅｍｒａ＝ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−。
【図２５】３人の生物学的ドナーＤ１、Ｄ７、およびＤ８からのＣＤ３／ＣＤ２８製造中の共刺激の損失を示す。ＣＤ２７およびＣＤ２８発現は、Ｔ細胞増殖期間中の４、７、および１０日目に、フローサイトメトリーを介して評価された。
【図２６】より後期の増殖された細胞と比較して、より初期の増殖された細胞のクラスターを独特のクラスターとして同定する、差次的遺伝子発現分析を示す。３人の生物学的ドナー（Ｄ４、Ｄ５、およびＤ６）は、４、７、または１０日間増殖され、次に全ＲＮＡが単離され、ＲＮＡ配列決定分析およびバイオインフォマティクスのためにＮｏｖｏｇｅｎｅに送付された。
【図２７−１】Ｔ細胞製造中のＲＮＡｓｅｑ分析を示す。Ｔ細胞製造中のＲＮＡｓｅｑデータを（Ａ）４日目対７日目、（Ｂ）４日目対１０日目、および（Ｃ）７日目対１０日目で比較した、火山型プロット表示。ＤＥＧカットオフは、０．０５未満のｐａｄｊ値で１倍上または下に設定された。ＤＥＧの数は、各プロットのキーに示される。
【図２７−２】同上
【図２７−３】同上
【図２８−１】Ｔ細胞製造中のＫｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）経路解析を示す。左側パネルは、サンプル間で上方制御される経路を示す。右側パネルは、サンプル間で下方制御される経路を示す。各上方制御または下方制御について、より後の時点が参照される（すなわち、ｄａｙ_７とｄａｙ_４_ｄｏｗｎは、７日目のサンプルと４日目のサンプルにおいて下方制御された経路を示す）。
【図２８−２】同上
【図２８−３】同上
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本明細書に記載されるように、本開示は、Ｔ細胞の有効性および生存率を改善する方法を提供する。
【００５５】
本明細書に記載の一態様では、最小限に増殖された操作されたＴ細胞は、ナイーブ性および生体内での増殖および持続能力の増大のために、生体外で延長された期間増殖されたＴ細胞と比較して、より大きな臨床的有効性を実証する。一態様では、最小限に増殖された操作されたＴ細胞は、約７〜約１０日間の延長された発現と比較して、約３〜約５日間増殖される。
【００５６】
本明細書に記載の一態様では、約３〜約５日間のより短い増殖期間を有するＴ細胞は、１）増殖、２）アポトーシスの減少、および３）同一方法であるが延長された約７〜約１０日間の増殖期間で生産されたＴ細胞に優る持続性によって、サイトカイン応答の増加を提示する。
【００５７】
一態様では、養子細胞移入または治療法（ＡＣＴ）は、細胞がドナーから取り出され、生体外で培養および／または操作され、疾患の治療のために患者に投与される、治療方法を含んでなる。いくつかの実施形態では、移入された細胞は自己由来細胞であってもよく、これは、患者が自らのドナーの役割を果たすことを意味する。いくつかの実施形態では、移入された細胞は、例えば、Ｔ細胞などのリンパ球であってもよい。いくつかの実施形態では、移入された細胞は、患者への投与前に遺伝子改変されてもよい。例えば、移入された細胞は操作されて、関心のある抗原に対する特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。一実施形態では、移入された細胞は操作されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現してもよい。特定の実施形態では、移入された細胞は操作されて（例えば、形質移入またはコンジュゲーションによって）、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１２）、抗アポトーシス分子（ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｘ）、またはケモカイン（ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２Ｂ）などの細胞の抗腫瘍活性を促進する分子を発現してもよい。特定の実施形態では、移入された細胞は操作されて、ＣＡＲと、抗腫瘍活性または細胞の持続性を促進する分子との双方を発現してもよい。
【００５８】
一態様では、本開示は、最小限に増殖されたＴ細胞をがん対象に投与することによって、養子細胞移入または治療法（ＡＣＴ）の予後が改善され得る方法に関する。
【００５９】
治療方法
一態様では、本明細書に記載の増殖された操作されたＴ細胞は、異常なアポトーシスまたは分化プロセス（例えば、がんなどの細胞の増殖障害または細胞の分化障害）に関連した障害を治療するのに有用である。本発明の方法を用いた治療に適していてもよいがんの非限定的例が、以下に記載される。
【００６０】
細胞の増殖および／または分化障害の例としては、がん（例えば、がん腫、肉腫、転移性障害、または例えば白血病などの造血性新生物障害）が挙げられてもよい。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房、および肝臓の腫瘍をはじめとするが、これに限定されるものではない、多数の原発腫瘍型から発生し得る。したがって、本開示の組成物（例えば、最小限に生体外で増殖された操作されたＴ細胞）は、がんを有する患者に投与され得る。
【００６１】
本明細書の用法では、「がん」（または「がん性」）、「過剰増殖性」、および「新生物性」という用語は、自律的増殖能力（すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴付けられる異常な状態または病状）を有する細胞を指すために使用されてもよい。過剰増殖性および新生物性疾患状態は、病理的（すなわち、病態を特徴付けまたは構成する）として分類されてもよく、またはそれらは、非病的として（すなわち、正常からの逸脱であるが、病態とは関連していないとして）分類されてもよい。この用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲段階にかかわりなく、全てのタイプのがん性増殖または発がんプロセス、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織、または器官が含むことが意図される。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖によって特徴付けられる疾患状態で発生してもよい。非病的過剰増殖性細胞の例としては、創傷修復に関連した細胞の増殖が挙げられてもよい。
【００６２】
「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ組織、胃腸器官、および尿生殖路に影響を及ぼすものをはじめとする、様々な器官系の悪性腫瘍を指すために、ならびにほとんどの結腸がん、腎細胞がん、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、肺の非小細胞がん、小腸がん、および食道がんなどの悪性腫瘍を含むと一般に考えられる腺がんを指すために、使用されてもよい。発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門または肛門管または肛門直腸のがん、眼がん、肝内胆管がん、関節がん、頸部または胆嚢または胸膜のがん、鼻または鼻腔または中耳のがん、外陰部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、子宮頸がん、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、腹膜および網および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、軟部組織がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、膀胱がん、および例えば、食道がん、胃がん、膵臓がん、胃がん、小腸がん、消化管カルチノイド腫瘍などの消化管がん、口腔がん、結腸がん、および肝胆道がんのいずれかをはじめとする、任意のがんであり得る。
【００６３】
「がん腫」という用語は、呼吸器系がん腫、消化器系がん腫、泌尿生殖器系がん腫、精巣がん腫、乳がん腫、前立腺癌、内分泌系がん腫、および黒色腫をはじめとする、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。例示的ながん腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、および卵巣組織から形成するものが挙げられる。この用語には、がん性肉腫および肉腫性組織からなる悪性腫瘍をはじめとする、がん肉腫もまた含まれてもよい。「腺がん」は、腺組織に由来するがん腫、またはその中で腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するがん腫を指す。
【００６４】
増殖障害の追加的な例としては、造血性新生物障害が挙げられてもよい。本明細書の用法では、「造血性新生物障害」という用語は、例えば、骨髄系、リンパ系または赤血球系、またはそれらの前駆細胞から生じる、造血器起源の過形成細胞／新生物細胞を伴う疾患を含んでもよい。好ましくは、疾患は、不十分に分化した急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じてもよい。追加的な例示的骨髄性障害としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７で概説される）；Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含めた、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）をはじめとするが、これらに限定されないリンパ系悪性腫瘍が挙げられてもよいが、これらに限定されない。悪性リンパ腫の追加的な形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその変異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、およびリード・シュテルンベルク病が挙げられてもよいが、これらに限定されない。
【００６５】
最小限に増殖された操作されたＴ細胞の量は、腫瘍の増殖およびサイズを減少させるのに十分であること、または治療的有効量は、特定の選択された組成物だけでなく、投与経路、治療される病状の性質、および患者の年齢および病状によっても変動してよく、最終的には、患者の医師または薬剤師の裁量となることが、当業者によって理解されるであろう。本方法において、使用される最小限に増殖された操作されたＴ細胞が与えられる時間の長さは、個々のベースで変化する。治療法に関する本明細書における参照は、表記されるがんおよび症状の予防法ならびに治療法に及ぶことが、当業者によって理解されるであろう。
【００６６】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含んでもよい。特定の実施形態で使用するのに適した例示的なＴ細胞集団としては、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、または任意のその他のＴ細胞のサブセットが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で使用するのに適したその他の例示的なＴ細胞集団としては、マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＨＬＡ−ＤＲの１つまたは複数を発現するＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されず、所望ならば、正または負の選択技術によってさらに単離され得る。
【００６７】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、丸い核を有する任意の血液細胞（すなわち、リンパ球、単球、またはマクロファージ）を指す。これらの血球は、感染症と戦い、侵入者に適応するための免疫系の重要な構成要素である。リンパ球集団は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞、ＣＤ１４＋単球、および好塩基球／好中球／好酸球／樹状細胞からなる。これらの細胞は、血液の層を分離して血漿の層の下に単球およびリンパ球がバフィーコーを形成する親水性多糖類であるＦＩＣＯＬＬ（商標）を使用して、全血またはｌｅｕｋｏｐａｃｋｓから分離されることが多い。一実施形態では、「ＰＢＭＣ」は、少なくともＴ細胞、および任意選択的にＮＫ細胞、および抗原提示細胞を含んでなる、細胞集団を指す。
【００６８】
「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されている、Ｔ細胞の状態を指す。特定の実施形態では、活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能に付随し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、増殖中のＴ細胞を指す。Ｔ細胞の完全な活性化には、ＴＣＲを介して生成されたシグナルだけでは不十分であり、１つまたは複数の二次的シグナルまたは共刺激シグナルもまた必要である。したがって、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した一次刺激シグナルと、１つまたは複数の二次的共刺激シグナルとを含んでなる。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を介したまたはＣＤ２を介した刺激などの一次活性化シグナルを受信したＴ細胞による、増殖および／またはサイトカイン産生によって証明され得る。
【００６９】
本明細書の用法では、休止Ｔ細胞は、分裂していないか、またはサイトカインを産生していないＴ細胞を意味する。休止Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞（およそ１２〜１５ミクロン）と比較して、サイズが小さい（およそ６〜８ミクロン）。
【００７０】
本明細書の用法では、プライミングされたＴ細胞は、少なくとも一度は以前に活性化されており、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１０８時間、または少なくとも約１２０時間にわたり活性化刺激から除去されている、休止Ｔ細胞である。代案としては、休止は、約０．５時間〜約１２０時間、約０．５時間〜約１０８時間、約０．５時間〜約９６時間、約０．５時間〜約８４時間、約０．５時間〜約７２時間、約０．５時間〜約６０時間、約０．５時間〜約４８時間、約０．５時間〜約３６時間、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１８時間、約０．５時間〜約１２時間、約０．５時間〜約６時間、約１時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、または約４時間〜約５時間内に実行されてもよい。プライミングされたＴ細胞は、通常は記憶表現型を有する。
【００７１】
本開示の実施形態は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩＬ−７＋ＩＬ−１５などのそれらの組み合わせなどのサイトカイン非存在下でのまたはサイトカイン存在下での、例えば約４〜約６時間など、約０．５時間〜約４８時間、約０．５時間〜約３６時間、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１８時間、約０．５時間〜約１２時間、約０．５時間〜約６時間、約１時間〜約６時間、約２時間〜約５時間、約３時間〜約５時間、約４時間ｔｏ６時間、約１時間〜約２４時間、約２〜約２４時間、約１２〜約４８時間、約０．５時間〜約１２０時間、約０．５時間〜約１０８時間、約０．５時間〜約９６時間、約０．５時間〜約８４時間、約０．５時間〜約７２時間、または約０．５時間〜約６０時間にわたる休止を含んでもよい。
【００７２】
適応免疫応答中および応答後の双方における、リンパ球の制御された増殖および縮小は、健康な免疫系を維持するために不可欠であってもよい。リンパ球アポトーシスの外因的経路と内因的経路の双方をプログラムして、適切な時間で細胞が排除され、免疫恒常性が確保されてもよい。このリンパ球アポトーシス障壁なしでは、活性化リンパ球の長期持続性および／または抑制されない蓄積が、免疫病理学、自己免疫、およびリンパ系がんをもたらし得る。
【００７３】
図１は、ほとんどの体細胞と同様に、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞が一般に静止状態の代謝状態で動作し、ＡＴＰ生成のためにミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）を利用することを示す。しかし、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激に続いて、応答中のＴ細胞は、酸素の存在下でも解糖を使用するように急速に切り替わる（ワールブルク効果）。活性化Ｔ細胞は増殖されて、解糖代謝と関連してもよい、強力なエフェクター機能を獲得してもよい（例えば、ＩＦＮ−γ産生）。Ｔ細胞応答の過程における細胞代謝のこれらの変化は、記憶の生成をはじめとする、細胞の生存および分化に大きな影響を及ぼしてもよい。しかし、増殖および好気的解糖のこのウィンドウの間に、エフェクターＴ細胞は、再刺激誘発性細胞死（ＲＩＣＤ）に対して感受性になってもよい。
【００７４】
再刺激誘発性細胞死（ＲＩＣＤ）は、感染中にエフェクターＴ細胞の増殖の上限を最終的に設定してもよい、アポトーシスプログラムである。ＲＩＣＤ感受性は、先行する活性化；ＩＬ−２などのサイトカインを介した細胞周期誘導；およびエフェクターのサブセットにおけるアポトーシスを誘導する、ＴＣＲを介して伝搬する引き続く強力な再刺激シグナルに依存してもよい。エフェクターＴ細胞とは異なり、ナイーブおよび休止記憶Ｔ細胞は、ＲＩＣＤに対して比較的耐性であってもよい。抗原誘発性増殖期中のエフェクターＴ細胞数を制限することによって、この自己調節死経路は、宿主への過度の非特異的な免疫病理学的損傷を排除することにより、免疫恒常性を維持するのを助けてもよい。実際、ＲＩＣＤの欠損は、Ｘ連鎖リンパ球増殖性障害を有する患者で指摘されているように、過剰なＴ細胞蓄積および宿主組織への致死的損傷の一因となる。
【００７５】
サイトカイン離脱誘発性細胞死（ＣＷＩＤ）は、感染が解消された後に、例えば、ＩＬ−２などのサイトカインのレベルが低下することによって引き起こされる、エフェクターＴ細胞の大部分を淘汰する役割を担うアポトーシスプログラムであり、記憶Ｔ細胞として生き残る選択された少数の細胞が残されてもよい。過剰な同化代謝（例えば、解糖）が、エフェクターＴ細胞のＲＩＣＤに対する感受性を高いままにしてもよい一方で、異化代謝（例えば、オートファジーおよび脂肪酸酸化（ＦＡＯ））は、異なる記憶コンパートメントに由来するＴ細胞をサイトカイン離脱誘発性死から保護し得る。したがって、ＣＷＩＤ感受性は、どのＴ細胞がまたどのくらいのＴ細胞が縮小を生き延びて記憶プールに入るのかを判定する上で主要な役割を果たし、異なる記憶サブセットに由来する二次応答に影響を与えてもよい。
【００７６】
ＣＷＩＤおよびＲＩＣＤは、細胞、抗原、およびサイトカインの動的な局在化によって影響を受け、免疫応答の異なる段階でハードワイヤードフィードバック応答プログラムとして動作してもよい。どちらのプロセスも、抗原およびＩＬ−２、ならびにその他の成長／生存サイトカインの利用可能性によって絶妙に制御される。機構的に、これら２つのプロセスは、内因的および外因的経路として知られるアポトーシスの異なる生化学的機序を介して、Ｔ細胞を排除してもよい。内因的経路は、ミトコンドリア外膜電位（ＭＯＭＰ）を調節するＢｃｌ−２ファミリータンパク質の相対的な発現によって制御される。ミトコンドリアが脱分極すると、チトクロームＣの放出が、プロカスパーゼ９の切断および活性化を触媒する。外因的アポトーシスは、主にＦａｓなどの腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの細胞死受容体（ＤＲ）を介して、シグナル伝達される。
【００７７】
ＣＷＩＤは、内因的アポトーシスを誘発する。ＩＬ−２またはその他のγ鎖サイトカインの離脱は、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリータンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＭｃｌ−１）の機能と拮抗する重要なプロアポトーシスタンパク質であるＢｉｍを特異的に上方制御して活性化し、Ｂａｘを活性化して、それはミトコンドリアの透過化を引き起こす。ＲＩＣＤは、再刺激されたＴ細胞の表面に露出した膜固定型ＦａｓＬによってシスまたはトランスで刺激されてもよいＦａｓを介した、外因的アポトーシスシグナルに起因することもある。
【００７８】
異化作用代謝（すなわちオートファジー）は、異なる記憶コンパートメントに由来するＴ細胞をサイトカイン離脱によって誘発される死、すなわちＣＷＩＤから保護し得るので、生体外Ｔ細胞増殖の１つの目的は、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）および／または幹記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）／Ｔ中央記憶（Ｔｃｍ）などの記憶形成細胞の量の増加であってもよい。
【００７９】
図２は、固形腫瘍および液体腫瘍を治療するための従来のＡＣＴ  Ｔ細胞の違いを示す。固形腫瘍を治療するために、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化されてもよく、一定期間の増殖がそれに続く。液体腫瘍と比較して同族抗原へのアクセスが減少した固形腫瘍環境、非同族抗原、および限定的アポトーシス阻害剤で活性化／増殖された操作されたＴ細胞は、例えば、損傷誘発性細胞死（ＤＩＣＤ）またはＣＷＩＤなどの生体外増殖中に誘導される内因的アポトーシス経路を被ってもよい。液体腫瘍の治療では、腫瘍および抗原提示細胞との同族抗原に富む液体腫瘍環境内で活性化／増殖された操作されたＴ細胞は、ＣＷＩＤによるアポトーシスを被る可能性が低くあってもよいが、抗原刺激の増加による活性化誘発性細胞死（ＡＩＣＤ）を被る可能性が高くあってもよく、固形腫瘍の治療では、ＡＩＣＤよりもＣＷＩＤに耐えるＴ細胞が必要であってもよいことが示唆される。
【００８０】
図３は、生体外で増殖されたＴ細胞が、サイトカイン刺激の離脱を生き延びる能力を試験するために、例えば、固形腫瘍において、サイトカイン感受性アッセイが用いられてもよいことを示す。他方、生体外で増殖されたＴ細胞が、例えば、液体腫瘍などにおいて、反復的なＴＣＲ刺激中で生き延びて機能する能力を試験するために、連続殺滅アッセイが用いられてもよい。
【００８１】
表１は、液体腫瘍と固形腫瘍の生体内でのＴ細胞生存率の差を要約する。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
抗原枯渇環境で固形腫瘍を標的とするＡＣＴ中の生体外で増殖されたＴ細胞は、液体腫瘍を標的とするものよりも、生存のためにサイトカインにより多く依存してもよいので、生体外記憶形成およびＣＷＩＤ減少は、液体腫瘍を標的とするものよりも、固形腫瘍を標的とする、生体外で増殖されたＴ細胞にとってより重要であってもよい。したがって、ＡＣＴについて、高スループットの患者特異的様式で、生体内で持続し得るＴ細胞型を選択することは、固形腫瘍を標的とする臨床的有効性を高めてもよい。本開示のサイトカイン感受性アッセイを用いて、抗原枯渇環境において生体内で持続し得る、増殖されたＴ細胞タイプが予測され選択されてもよい。
【００８４】
Ｔ細胞源
Ｔ細胞の増殖および遺伝子修飾前に、Ｔ細胞源が対象から得られてもよい。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍をはじめとするいくつかの起源から得られ得る。特定の実施形態では、当該技術分野で利用できる任意の数のＴ細胞株が使用されてもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に知られている任意の数の技術を用いて、対象から採取された血液の単位から得られ得る。好ましい一実施形態では、個人の循環血液からの細胞は、血液成分分離によって得られてもよい。血液成分分離製品は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞をはじめとするリンパ球、その他の有核白色血液細胞、赤血球、および血小板を含有する。血液成分分離によって採取された細胞は、洗浄されて血漿画分が除去され、後続の処理ステップのために適切な緩衝液または培地に入れられてもよい。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄されてもよく、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよく、または全部でないとしても多くの二価の陽イオンを欠いてもよい、洗浄液で洗浄されてもよい。カルシウムの非存在下での初期活性化ステップは、拡大された活性化をもたらし得る。当業者は容易に理解するであるように、洗浄ステップは、製造業者の使用説明に従って、半自動化「通過型」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｉｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）などを使用することによって、当業者に知られている方法によって達成されてもよい。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａ３＋非含有、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａなどの様々な生体適合性緩衝液に、または緩衝液ありまたはなしのその他の生理食塩水に再懸濁されてもよい。代案としては、血液成分分離サンプルの望ましくない成分が除去され、細胞が培養液に直接再懸濁されてもよい。
【００８５】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解して、例えば、パーコール（商標）勾配を通じた心分離によって、または向流遠心分離水簸によって、単球を枯渇させることで、末梢血リンパ球から単離されてもよい。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団は、正または負の選択技術によってさらに単離され得る。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の正の選択に十分な期間にわたる、ダイナビーズ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）共役ビーズとのインキュベーションによって単離されてもよい。
【００８６】
負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成され得る。１つの方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介した、細胞選別および／または選択であってもよい。例えば、負の選択によってＣＤ４＋を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８ＣＤ８に対する抗体を含んでもよい。特定の実施形態では、典型的には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌ１、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現してもよい調節Ｔ細胞を濃縮すること、または正に選択することが望ましくあってもよい。代案としては、特定の実施形態では、Ｔ調節細胞は、抗ＣＤ２５共役ビーズまたはその他の類似した選択方法によって枯渇されてもよい。
【００８７】
正または負の選択による所望の細胞集団の単離では、細胞濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変化させ得る。特定の実施形態では、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、その中でビーズと細胞が共に混合されてもよい体積を著しく減少させる（すなわち、細胞濃度を増加させる）ことが望ましくあってもよい。例えば、一実施形態では、２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用されてもよい。一実施形態では、１０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用されてもよい。さらなる実施形態では、１億個の細胞／ｍｌを超える濃度が使用されてもよい。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用されてもよい。なおも別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用されてもよい。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高い濃度を使用することで、細胞収量、細胞活性化、および細胞増殖の増加をもたらし得る。さらには、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの関心のある標的抗原を弱く発現してもよい細胞の、または数多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など）からの細胞の、より効率的な捕捉を可能にしてもよい。このような細胞の集団は、治療的価値を有してもよく、取得することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用して、通常はより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にしてもよい。関連する実施形態では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましくあってもよい。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を著しく希釈することによって、粒子と細胞の間の相互作用が最小化されてもよい。これは、粒子に結合する所望の抗原を多量に発現する細胞を選択してもよい。
【００８８】
Ｔ細胞の遺伝子修飾の前かまたは後かにかかわらず、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；米国特許第６，５３４，０５５号明細書；米国特許第６，９０５，６８０号明細書；米国特許第６，６９２，９６４号明細書；米国特許第５，８５８，３５８号明細書；米国特許第６，８８７，４６６号明細書；米国特許第６，９０５，６８１号明細書；米国特許第７，１４４，５７５号明細書；米国特許第７，０６７，３１８号明細書；米国特許第７，１７２，８６９号明細書；米国特許第７，２３２，５６６号明細書；米国特許第７，１７５，８４３号明細書；米国特許第５，８８３，２２３号明細書；米国特許第６，９０５，８７４号明細書；米国特許第６，７９７，５１４号明細書；米国特許第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号明細書で記載されるような方法を使用して、一般に細胞が活性化され増殖され得る。これらの特許および出願のそれぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。Ｔ細胞の集団を増殖させるための追加的なストラテジーは、例えば、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００３；２６：３３２−４２；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１０；３５５：５２−６０；およびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２；１０：６９に記載される。前述の参照事項の全内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００８９】
自己由来細胞の投与
自己由来細胞は、当技術分野で公知の任意の適切な経路によって投与され得る。好ましくは、細胞は、約３０〜約６０分間持続する、動脈内または静脈内注入として投与されてもよい。その他の例示的な投与経路としては、腹腔内、クモ膜下腔内、およびリンパ管内が挙げられてもよい．
【００９０】
同様に、自己由来細胞の任意の適切な用量が投与され得る。例えば、一実施形態では、約１．０×１０８個の細胞〜約１．０×１０１２個の細胞が投与されてもよい。一実施形態では、平均で約５．０×１０１０個のＴ細胞で、約１．０×１０１０個の細胞〜約１３．７×１０１０個のＴ細胞が投与されてもよい。代案としては、別の実施形態では、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０個のＴ細胞が投与されてもよい。
【００９１】
一実施形態では、ＡＣＴのために使用される自己由来細胞は、例えば、Ｔ細胞などのリンパ球であってもよい。一実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，３８３，０９９号明細書に記載されるように、例えば、１９〜３５日齢の間の「若い」Ｔ細胞であってもよい。若いＴ細胞は、古いＴ細胞より長いテロメアを有すると考えられており、場合によっては、より長いテロメア長は、ＡＣＴに続く臨床転帰の改善に関連してもよい。
【００９２】
一態様では、本明細書に記載のＴ細胞およびＴ細胞生産方法は、ＡＣＴの代表的なストラテジー：腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、抗原増殖されたＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍抗原を特異的に認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞の１つまたは複数と併用されてもよい。これらの各アプローチの簡単な非限定的記述は、後述される。
【００９３】
腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）
１つのＡＣＴストラテジーは、腫瘍転移の腫瘍断片または単一細胞酵素消化物から生体外で増殖された、自己由来ＴＩＬの移植を伴う。腫瘍のＴ細胞浸潤物は本質的にポリクローナルであり、複数の腫瘍抗原を集合的に認識する。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８８）３１９：１６７６−１６８０を参照されたい。
【００９４】
例示的なＴＩＬ  ＡＣＴプロトコルでは、腫瘍は、患者から切除され、滅菌条件下で、小さな（例えば、３〜５ｍｍ２）断片に刻まれてもよい。断片は、成長培地と共に培養プレートまたはフラスコに入れられ、高用量ＩＬ−２で処理されてもよい。この初期ＴＩＬ増殖相（「プレＲＥＰ」相としても知られる）は、典型的には、約３〜約５週間持続し、その間、約５×１０７個以上のＴＩＬが生産されてもよい。次に、得られたＴＩＬはさらに増殖され（例えば、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）に従って）、対象への注入に適したＴＩＬが生産されてもよい。プレＲＥＰＴＩＬは、より後の増殖のために冷凍保存され得て、またはそれらは即座に増殖されてもよい。またプレＲＥＰ  ＴＩＬをスクリーニングして、増殖前の抗腫瘍反応性の高い培養物が識別され得る。典型的なＲＥＰは、例えば、照射ＰＢＭＣ支持細胞の存在下で、抗ＣＤ３  ｍＡｂなどのＴ細胞刺激抗体を使用して、ＴＩＬを活性化することを伴ってもよい。支持細胞は、患者対象から、または健常ドナー対象から得られ得る。ＩＬ−２が約６，０００Ｕ／ｍＬの濃度でＲＥＰ培養物に添加され、迅速なＴＩＬ細胞分裂を促進してもよい。この様式でのＴＩＬの増殖は約２週間以上かかり得て、約１００億〜１５００億個のＴＩＬのプールがもたらされる。増殖された細胞は、洗浄およびプールされてもよく、患者への注入に適にしていてもよい。患者は、典型的には、１０９〜１０１１個の細胞の１回または２回（１〜２週間隔離で）の注入を受けてもよい。患者には、注入後のＴＩＬ細胞の支持を助けるために、高用量のＩＬ−２療法（例えば、約２日から約３日間にわたる８時間毎の７．２×１０５ＩＵ／ｋｇ）が投与される。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ（２００８）８：２９９−３０８を参照されたい。注入前に、患者は、任意選択的に、シクロホスファミド（Ｃｙ）およびフルダラビン（Ｆｌｕ）を使用してリンパ球除去され得る。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）２９８：８５０−８５４を参照されたい。さらに、内因的調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の再出現を防ぐために、全身照射（ＴＢＩ）がリンパ球枯渇と共に使用されており、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００８）２６（３２）：５２３３−５２３９を参照されたい。
【００９５】
ＡＣＴレジメンを受けている対象に、最小限に増殖されたＴＩＬを注入することは、移入された細胞の持続性を促進し、移入された細胞の持続性、増殖、生存を刺激して、腫瘍退縮を改善する。
【００９６】
抗原増殖されたＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞
自己由来末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、抗原によって生体外で刺激され、ＡＣＴに使用され得る腫瘍抗原特異的またはポリクローナルＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを産生し得る。例えば、それぞれの内容が参照により本明細書に援用される、Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００６）２４（３１）：５０６０−５０６９；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００２）２０（４）：１０７５−１０８６；Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）９９（２５）：１６１６８−１６１７３；Ｈｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００８）３５８（２５）：２６９８−２７０３；Ｖｅｒｄｅｇａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００１）６０（７）：９５３−９６３を参照されたい。ナイーブＰＢＭＣ集団から腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させるという、時間がかかる労力集約的な工程を回避するために、ＡＣＴの抗原特異的Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、共刺激分子、および膜結合サイトカインを使用する、自己由来ＰＢＭＣの複数の刺激を使用して生成されてもよい。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｕｈｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００７）１５（５）：９８１−９８８；Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１）３（８０）：８０ｒａ３４を参照されたい。
【００９７】
一実施形態では、Ｔ細胞は、任意選択的に、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２またはＩＬ−１５などの（ＩＬ−２が好ましい）Ｔ細胞成長因子の存在下でベクターから発現され得る、がんの１つまたは複数の抗原（エピトープ、または細胞などのその抗原性部分を含めた）を用いた生体外での末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激によって、迅速に増殖され得る。生体外で誘導されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２を発現する抗原提示細胞上にパルスされた、同一のがん抗原の再刺激によって、迅速に増殖されてもよい。代案としては、Ｔ細胞は、例えば、照射された自己由来リンパ球、または照射されたＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球、およびＩＬ−２を用いて、再刺激され得る。
【００９８】
一実施形態では、細胞集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮されてもよい。Ｔ細胞培養物は、例えば、ＣＤ８マイクロビーズ分離を使用して、ＣＤ４＋細胞が枯渇されＣＤ８＋細胞について濃縮されていてもよい（例えば、Ｃｌｉｎｉ−ＭＡＣＳＰｐｌｕｓ  ＣＤ８マイクロビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（商標）を使用して）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮は、ＣＤ４＋Ｔ調節細胞を除去することによってＡＣＴの予後を改善してもよい、
【００９９】
ＡＣＴレジメンを受けている対象に、例えば、ＰＢＭＣの刺激から得られたＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞などの最小限に増殖されたＴ細胞を注入することは、移入された細胞の持続性を促進し、移入された細胞の持続性、増殖、および生存を刺激して、腫瘍退縮を改善してもよい。
【０１００】
腫瘍抗原を特異的に認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞
【０１０１】
場合によっては、ＡＣＴに必要な量の腫瘍抗原に対する高い結合力を有するＴＩＬを得ることが、可能でないこともある。したがって、リンパ球を遺伝的に改変して、対象への注入前に、関心のある抗原を特異的に認識してもよい細胞集団を得ることが望ましくあってもよい。ＴＣＲをコード化する遺伝子は、高い結合力を有するがん抗原を特異的に認識するＴ細胞から単離され得る。末梢血から単離されたＴリンパ球は、所望の特異性を保有するＴＣＲをコード化する遺伝子を含有するレトロウイルスまたはレンチウイルスで形質導入され得る。この方法は、ＡＣＴのための多数の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を迅速に生産することを可能にしてもよい。
【０１０２】
Ｔ細胞は、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９：４９６−５１０（２００８）およびＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１４：５３５−４６（２００９）に記載の形質導入技術を用いて、がん抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように形質導入されてもよい。これらの参考文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。関心のある抗原を認識するＴＣＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞を用いたＡＣＴは、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１４（５７９６）：１２６−１２９によって公開された、臨床試験プロトコルに従って実施され得る。この参考文献の内容は、その全体が本明細書に参照により援用される。
【０１０３】
例えば、ＡＣＴレジメンを受けている対象に、腫瘍抗原を認識するＴＣＲ（または修飾ＴＣＲ）を発現するように遺伝的に操作されているＴ細胞などの最小限に増殖されたＴ細胞を注入することは、移入された細胞の持続性を促進し、移入された細胞の持続性、増殖および生存を刺激して、腫瘍退縮を改善してもよい。
【０１０４】
一態様では、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できる、ＴＡＡペプチドとしては、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３７０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許出願公開第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２５３６３３号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２６０２４９号明細書、２０１８００５１０８０、および米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書に記載されるＴＡＡペプチドが挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。一態様では、本明細書に記載されるＴ細胞は、上記の特許および刊行物の１つまたは複数に記載されるＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。
【０１０５】
一態様では、本明細書に記載される方法と共に使用できるＴ細胞受容体としては、例えば、米国特許出願公開第２０１７０２６７７３８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０３１２３５０号明細書、米国特許出願公開第２０１８００５１０８０号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１６１３９６号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１６２９２２号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２７３６０２号明細書、米国特許出願公開第２０１９０００２５５６号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１３５０３９号明細書に記載されるものが挙げられ、これらの各出版物の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１０６】
別の態様では、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できるＴＡＡは、配列番号１〜配列番号１５７から選択される少なくとも１つを含む。一態様では、Ｔ細胞は、配列番号１〜１５７に記載される、または本明細書に記載の特許または出願のいずれかに記載される、ＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。
【０１０７】
【表２−１】
2021518121.tif 000003
【表２−２】
2021518121.tif 000004
【表２−３】
2021518121.tif 000005
【０１０８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞
上述のような所望の特異性を有するＴＣＲを発現させるためのＴ細胞の遺伝子操作は、ＡＣＴのための非常に有望なアプローチであってもよい。それにもかかわらず、操作されたＴＣＲα鎖およびβ鎖と、内因的ＴＣＲ鎖とのミスペアリングの可能性がある。さらに、操作されたＴＣＲを発現する細胞を使用したＡＣＴの成功は、標的とされるがん細胞における、ＴＣＲによって認識される特定のＭＨＣ分子の発現に依存する。これらの潜在的な複雑さを回避するために、Ｔ細胞は、代案としてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されてもよい。
【０１０９】
それらの最も単純な形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖の細胞質尾部からの膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインと共役された、抗原結合ドメインを含有してもよい。ＣＤ３ζ鎖が、導入されたＴ細胞を完全に活性化するには、不十分であってもよい証拠がいくつかある。したがって、ＣＡＲは、好ましくは、抗原結合ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有してもよい。ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと組み合わせて共刺激ドメインを使用すると、Ｔ細胞活性化の２シグナルモデルが模倣される。ＣＡＲ抗原結合ドメインは、ＦａｂまたはｓｃＦｖなどの抗体または抗体断片であり得る。
【０１１０】
抗原結合ドメインは、膜貫通ドメインによって、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインから分離される。膜貫通ドメインは、任意の膜貫通タンパク質に由来してもよい。一実施形態では、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に結合している膜貫通ドメインが使用されてもよい。別の実施形態では、外因的または合成膜貫通ドメインが使用される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、その他の膜タンパク質との相互作用を最小化するために選択され、またはアミノ酸置換によって修飾され得る。
【０１１１】
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインの間には、スペーサーが任意選択的に組み込まれていてもよい。スペーサーは、膜貫通ドメインを細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのどちらかに連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドであってもよい。スペーサーは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、より好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含有してもよい。
【０１１２】
ＣＡＲの細胞内ドメインは、その中でＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与してもよい。エフェクター機能としては、例えば、サイトカインの分泌などの細胞溶解活性またはヘルパー活性が挙げられてもよい。したがって、分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達して特化した機能を果たすよう細胞に指示する、タンパク質の部分を指してもよい。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得る一方で、多くの場合、選択された部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、細胞内ドメインの一部が使用されてもよい。ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で、または共刺激ドメインとの組み合わせで含み得る。共刺激ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答を促進する、細胞表面分子であってもよい。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３リガンド、またはそれらの組み合わせなどの共刺激分子の細胞内ドメインを含有してもよい。例示的な実施形態では、共刺激分子は、４−１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメインであってもよい。
【０１１３】
例えば、ＡＣＴレジメンを受けている対象に、腫瘍抗原を認識するＣＡＲを発現するように遺伝的に操作されているＴ細胞などの最小限に増殖されたＴ細胞を注入することは、移入された細胞の持続性を促進し、移入された細胞の持続性、増殖および生存を刺激して、腫瘍退縮を改善してもよい。
【０１１４】
上述したように、固形腫瘍の治療は、ＡＩＣＤよりもＣＷＩＤに耐えるＴ細胞を必要としてもよい。同族抗原限定的固形腫瘍環境における、製造されたＴ細胞の持続性を判定する従来法は、動物モデルに依存することが多い。対照的に、本開示の実施形態は、生体内でＴ細胞の持続性を増強してもよいＴ細胞製造条件を判定するためのサロゲートとして、生体外アッセイを用いる。この目的を達成するために、製造されたＴ細胞は、非同族抗原または低同族抗原環境で試験されてもよい。例えば、製造されたＴ細胞は、例えば、同族の抗原提示腫瘍細胞、樹状細胞、またはマクロファージなどの同族の抗原提示細胞の非存在下で、例えば、約１，０００〜約１×１０６個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約５００，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約２５０，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約２００，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約１５０，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約１００，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約５０，０００個の細胞／ｃｍ２、約１，０００〜約１０，０００個の細胞／ｃｍ２、または約１，０００〜約５，０００個の細胞／ｃｍ２などの低密度で培養中に播種されてもよい。製造されたＴ細胞を低サイトカイン刺激環境で試験するために、製造されたＴ細胞は、例えば、約１〜約３０日間、約２〜約２５日間、約３〜約２１日間、約３〜約１４日間、約３〜約１０日間、または約３〜約７日間などの長期間にわたり、例えば、約１〜約１，０００ｎｇ／ｍｌ、約１〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約１〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１〜約５０ｎｇ／ｍｌ、約５〜約５０ｎｇ／ｍｌ、約５〜約４０ｎｇ／ｍｌ、約５〜約３０ｎｇ／ｍｌ約５〜約２０ｎｇ／ｍｌ、またはｆｒｏｍ約５〜約１０ｎｇ／ｍｌなどの低濃度のサイトカインの存在下、非同族抗原環境または低同族抗原環境で培養されてもよい。
【実施例】
【０１１５】
実施例１
サイトカイン感受性アッセイ（ＣＳＡ）
Ｔ細胞の適応度に対する生体外Ｔ細胞増殖の長さの役割を調査するために、Ｔ細胞を４、７、または１０日間かけて製造した。この製造後、ＣＳＡを介してＴ細胞を解析し、以下のメトリックスを解析した：（１）Ｔ細胞の増殖倍数によって測定される細胞生存、（２）ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶ染色を介して測定されるアポトーシス、（３）増殖染料ＰｋＨ６７の希釈率によって測定される分裂、（４）フローサイトメトリーによって測定されるサイトカイン受容体発現、および（５）フローサイトメトリーによって測定されるＴ細胞記憶表現型。
【０１１６】
ＣＳＡは、以下の観察によって評価されるように、ＣＳＡ内で評価された場合、長期の増殖がＴ細胞の適応度の有意な低下をもたらしてもよいことを示す。（１）Ｔ細胞生存率の低下、（２）アポトーシスの増加、（３）分裂速度の低下、（４）サイトカイン受容体発現相関、および（５）Ｔｎａｉｖｅ／ｓｃｍコンパートメントの生存率の低下。
【０１１７】
ＣＳＡを２１日間実施し、各サンプルは、時間挙動の単一のメトリックを定義してもよい、７つの時点で分析した。この目的のために、時間データの曲線下面積（積分）を計算し、以下の結果の２１日間にわたるサンプルの挙動を表すための単一の定義メトリックとして用いた。
【０１１８】
血液成分分離されたＴ細胞は、健康な同種異系ドナーまたは患者から得てもよい。これらのＴ細胞は、例えば、ＩＬ−２存在下でＯＫＴ３などの活性化抗ＣＤ３抗体を用いて、またはＩＬ−２存在下で抗ＣＤ３被覆および抗ＣＤ２８抗体被覆常磁性ビーズを用いて、またはＯＫＴ３およびＩＬ−２を有する４−１ＢＢＬおよびＦｃ受容体を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を用いて、活性化または刺激してもよい。次に、活性化Ｔ細胞は、レトロウイルスまたはレンチウイルスプラットフォームを用いて、組換えＴＣＲで形質導入してもよい。形質導入されたＴ細胞は、例えば、４日間（４日目）、７日間（７日目）、または１０日間（１０日目）などの異なる期間増殖してもよく、活性化は０日目に始まる。組換えＴＣＲはＴ細胞ゲノムに組み込まれてもよいので、増殖中に生産される全ての娘細胞もまた、組換えＴＣＲを発現してもよい。増殖／形質導入されたＴ細胞は、即座に使用してもよく、または将来の使用のために凍結保存してもよい。
【０１１９】
図４は、本明細書に記載されるサイトカイン感受性アッセイの実施形態を示す。図４では、（例えば、４日間、７日間、または１０日間）凍結保存または冷凍した増殖ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞は、例えば、２×１０５個の細胞／ウェルなどの限定数で細胞培養ウェルに入れる前に、解凍し、サイトカインなしで４時間休止させてもよい。例えば、様々な濃度のＰｋＨ２６染色などの増殖色素、およびそれぞれのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、またはそれらの組み合わせ）を添加して、例えば、２１日間などの期間にわたりインキュベートしてもよい。２１日間のアッセイ中、７日毎に、すなわち、０日、７日、および１４日目に、新鮮なサイトカインを培養Ｔ細胞に供給してもよい。７日毎のアッセイの終了時には、培地は、アッセイ開始時と比較してサイトカインのレベルが低下しているであろう。アッセイの異なる時点で、増殖された操作されたＴ細胞を採取し、例えば、アネキシンＶ染色を介して、細胞数、増殖、アポトーシスについて、例えば、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７マーカーを介して、記憶表現型について、例えば、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）、ＩＬ−７受容体（ＣＤ１２７）、およびＩＬ−１５受容体（ＣＤ１２２）を介して、サイトカイン受容体発現について、分析してもよい。
【０１２０】
実施例２
Ｔ細胞の生体外増殖の短縮は、２１日間のアッセイにわたり、持続的なＴｓｃｍ様の表現型を示す（生体内有効性のために望まれる）
図５Ａ〜５Ｄは、健常ドナーから得られ、（Ａ）０日、（Ｂ）４日、（Ｃ）７日、および（Ｄ）１０日間培養された、ＴＣＲ導入Ｔ細胞の表現型を示す。増殖されたＴ細胞をＣＤ４５ＲＯ染色によってリンパ球から分離し、引き続いてＣＣＲ７染色によってＴｎａｉｖｅ／Ｔｓｃｍ（ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋）を識別したところ、例えば、２３．２％（４日目の増殖されたＴ細胞）、１６．４％（７日目の増殖されたＴ細胞）、２２．９％（１０日目日目の増殖されたＴ細胞）であった。０日め（４９．４％、増殖なし）と比較して、４日、７日、および１０日目の増殖されたＴ細胞は、Ｔｓｃｍ様の表現型を有する細胞数の減少を示す。
【０１２１】
ＴＣＲ導入Ｔ細胞に対するサイトカイン枯渇の影響を調べるために、４日間、７日間、または１０日間培養したＴ細胞を、ＩＬ−１５の存在下で２１日間培養した。２１日間のアッセイ中、７日毎に、すなわち、０日、７日、および１４日目に、新鮮なＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を培養Ｔ細胞に供給した。各７日日間のＩＬ−１５供給の終了時、すなわち、培養中のＩＬ−１５レベルが最も低い、７日、１４日、および２１日目に、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７染色を用いたフローサイトメトリーによって、Ｔｓｃｍ様の表現型を調べた。
【０１２２】
図６Ａ〜６Ｉは、４日目の増殖されたＴ細胞が、２１日間のアッセイを通じてＴｓｃｍ様、すなわち、Ｔｎａｉｖｅ／Ｔｓｃｍ細胞集団を保持することによって、より良好なＩＬ−１５感受性を提示することを示す。Ｔｓｃｍ様の表現型は、生体内Ｔ細胞持続性と相関するので、これらの結果は、より初期の増殖された（例えば、約４日間）操作されたＴ細胞が、例えば、約７日間以上などのより長期間増殖されたものよりも優れていてもよいことを示唆する。
【０１２３】
どのＴ細胞の記憶コンパートメントが持続しているかを調べるために、培養期間中７日毎に、フローサイトメトリーに基づくＴ細胞の表現型決定を実施した。
【０１２４】
図２０Ａは、増殖２１日目では、３日目（初期）の増殖サンプルでは、ナイーブ（ｓｃｍ）および中央記憶（Ｔｃｍ）Ｔ細胞の割合が有意に高い一方で、７日目（中期）および１０日目（後期）の増殖サンプルでは、これらのあまり分化していないＴ細胞コンパートメントの双方が、劇的に減少していることを示す。
【０１２５】
図２０Ｂは、一貫して、ＩＬ−１５を用いた培養期間において、７日目までのＰｋＨ希釈に基づくＣＣＲ７発現細胞の増殖の増加があったことを示しており、増殖の減少は、サイトカイン受容体の発現の増加による増殖能の保持をもたらしてもよいことを示唆する。集合的にこのデータは、初期に増殖されたＴ細胞が、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５に応答して増殖できる初期分化型ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を保持していることを示す。
【０１２６】
実施例３
Ｔ細胞の生体外増殖の短縮は生存率の向上と相関する
解凍された増殖されたＴ細胞を追加的な抗原またはＣＤ３刺激の非存在下、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２の存在下で生存する能力について評価した。４日目の増殖されたＴ細胞は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２中で、約１０倍、３０倍、および１５倍のピーク増殖倍数を示し、３つ全てのサイトカイン条件において、より後期の増殖されたＴ細胞よりも実質的により成長できた。逆に、７日目および１０日目の増殖されたＴ細胞は、いずれのサイトカイン条件でも実質的な成長を維持できなかった。さらに、全てのサイトカインの非存在下では、各Ｔ細胞集団は、増殖プロトコルの長さに関係なく、同程度の速度で死亡した。
【０１２７】
増殖されたＴ細胞の増殖または生存に対するサイトカイン枯渇の影響を判定するために、ＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５の存在下における、増殖されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の細胞成長を２１日間にわたって測定した。図７Ａ〜７Ｃは、４日目の増殖されたＴ細胞が、例えば、７日および１０日間などのより長期間増殖されたものと比較して、２１日間にわたって、（Ａ）ＩＬ−７、（Ｂ）ＩＬ−１５、および（Ｃ）ＩＬ−２の存在下で、より高い細胞増殖またはより多くの生存細胞を提示することを示す。点線は１に設定され、開始細胞数に対する増殖倍数成長に差がないことを示す。
【０１２８】
経時的な細胞挙動は、例えば、ＩＬ−２（３００Ｕ／ｍｌ）（図８Ａ）、ＩＬ−７（１０．０ｎｇ／ｍｌ）（図８Ｂ）、またはＩＬ−１５（１０．０ｎｇ／ｍｌ）（図８Ｃ）などのより高濃度のサイトカインの存在下で、より長期にわたって増殖されたものよりも、より初期の増殖されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の方が良好である。それぞれの増殖倍数曲線の統合生存率は、曲線下面積を計算することによって判定した。３人の生物学的ドナーの分析から、より初期の増殖されたＴ細胞は、より後期の増殖された細胞を上回る傾向があった。ＩＬ−２では、４日目と７日目の増殖された細胞の間に約５倍の生存率の低下があり、７日目と１０日目の増殖された細胞の間に約２倍の生存率の低下があった。ＩＬ−７では、４日目と７日目の増殖された細胞の間に約６倍の統合生存率の低下があり、７日目と１０日目の増殖された細胞の間に約４倍の低下があった。ＩＬ−１５では、４日目と７日目の増殖された細胞の間に約８倍の統合生存率の低下があり、７日目と１０日目の増殖された細胞の間に約６倍の低下があった。ドナー間の変動が大きかったために統計的有意性はなかった一方で、より初期の増殖された細胞は、より後期の増殖された細胞よりも長く生存する一貫した傾向があった。
【０１２９】
アッセイの２１日目では、例えば、ＩＬ−２（３００Ｕ／ｍｌ）（図８Ｄ）、ＩＬ−７（１０．０ｎｇ／ｍｌ）（図８Ｅ）、またはＩＬ−１５（１０．０ｎｇ／ｍｌ）（図８Ｆ）などのより高濃度のサイトカインの存在下で、より長期間にわたって増殖されたものよりも、より初期の増殖されたＴＣＲ（例えば、ＣＤ８Ｖｂ８＋）形質導入Ｔ細胞の方が、統合生存率もまたより良好である。
【０１３０】
同様の結果は、例えば、ＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）（図９Ａ）、ＩＬ−７（１．０ｎｇ／ｍｌ）（図９Ｂ）、またはＩＬ−１５（１．０ｎｇ／ｍｌ）（図９Ｃ）などのより低い濃度のサイトカインの存在下でもまた観察された。例えば、アッセイの２１日目には、例えば７日間および１０日間の増殖などのより長期間増殖されたＴ細胞と比較して、４日間増殖されたＴ細胞がより良好な生存率であった。これらの結果は、生体外でのＴ細胞の増殖の短縮が、サイトカイン枯渇状態での生存率の増加と相関することを示す。
【０１３１】
実施例４
Ｔ細胞の生体外増殖の短縮はアポトーシスの減少と相関する
より初期の増殖された細胞の増殖倍数の増加、および分裂の増加があったことから、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアネキシンＶによる染色を介して評価されるように、アポトーシスに対応する減少があり得た。
【０１３２】
増殖されたＴ細胞のアポトーシスに対するサイトカイン枯渇の影響を判定するために、ＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５の存在下で増殖されたＴ細胞のアポトーシスを２１日間にわたって測定した。図１０Ａ〜１０Ｃは、４日間増殖されたＴ細胞が、７日間および１０日間増殖されたものと比較して、（Ａ）ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）、（Ｂ）ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、および（Ｃ）ＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、より少ないアポトーシス細胞を含有することを示す。リンパ球のアポトーシスの％は、壊死組織片および低ＦＳＣ集団を除外することによってゲートした。図１１Ａ〜１１Ｃは、アッセイの１０日目に、約４日目の増殖されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の曲線下面積によって判定されるように、より低い統合されたアポトーシスを示す。ＩＬ−２条件では、４日目と７日目の細胞の間にアポトーシスの統計的に有意でない増加（約１．８倍）があった一方で、４日目と１０日目の細胞の間には統計的に有意な増加（約３倍）があった（ｐ＝０．００９２）。ＩＬ−７条件では、４日目と７日目の細胞の間にアポトーシスの統計的に有意でない増加（約２倍）があった一方で、４日目と１０日目の細胞の間には統計的に有意な増加（約７倍）があった（ｐ＜０．０００１）。ＩＬ−１５条件では、４日目と７日目の細胞の間にアポトーシスの統計的に有意でない増加（約１．６倍）があった一方で、４日目と１０日目の細胞の間には統計的に有意な増加（約５．５倍）があった（ｐ＝０．００１０）。
【０１３３】
図１２は、アッセイの１０日目に、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、４日目の増殖されたＴ細胞が、例えば、（Ｂ）７日目（１０．６％、アネキシンＶ＋／ＰＩ−）および（Ｃ）１０日目（１８．２％、アネキシンＶ＋／ＰＩ−）などのより長期間増殖されたものよりも、より少ない（４．９７％、アネキシンＶ＋／ＰＩ−）アポトーシス細胞を含むことを示す。これらの結果は、サイトカイン枯渇状態においては、Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、アポトーシスの減少と相関することを実証する。
【０１３４】
実施例５
Ｔ細胞の生体外増殖の短縮は細胞分裂の増加と相関する
増殖されたＴ細胞の細胞分裂に対するサイトカインの影響を判定するために、ＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５の存在下での増殖されたＴ細胞の細胞分裂を測定した。図１３Ａ〜１３Ｃは、（Ａ）ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）、（Ｂ）ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、および（Ｃ）ＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、例えば７日目および１０日目などのより長期間増殖されたものと比較して、例えば、４日目などのより初期の増殖されたＴＣＲ導入Ｔ細胞が、より多くの分裂細胞を含むことを示す。アッセイの１０日後の１０日目の細胞が欠如しているため、１０日目までのデータを示す。アッセイの１０日目に、例えば、ＩＬ−２（３００Ｕ／ｍｌ）（図１４Ａ）、ＩＬ−７（１０．０ｎｇ／ｍｌ）（図１４Ｂ）、またはＩＬ−１５（１０．０ｎｇ／ｍｌ）（図１４Ｃ）などのより高濃度のサイトカインの存在下で、例えば、７日目および１０日日目などのより長期間増殖されたものの増殖よりも、例えば、４日目などのより初期の増殖されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞のより多くの分裂細胞が増殖した。例えば、４日目などのより初期の増殖された細胞は、ＣＳＡ中の１０日間にわたる各時点で、増殖色素を希釈した細胞の百分率によって計算されるように分裂を起こした。より後期の増殖された細胞は、１０日を過ぎた後の正確な分析にとって十分な細胞がなかったため、分析は１０日目まで行った。ＩＬ−２では、４日目と７日目の増殖された細胞拡大細の間に約３０％の統合分裂の低下があり、４日目と１０日目の増殖された細胞の間に約５０％の低下があり、ｐ＝０．０３０７であった。ＩＬ−７でも同様の傾向が見られ、４日目と７日目の増殖された細胞の間に約４０％、４日目と１０日目の増殖された細胞の間に約８０％の低下があり、ｐ＝０．０００６であった。ＩＬ−１５でも同様の傾向が観察され、４日目と７日目の増殖された細胞の間に約２０％、４日目と１０日目の増殖された細胞の間に約４０％の低下があり、ｐ＝０．００２５であった。
【０１３５】
サイトカイン感受性は、サイトカインによって誘導される細胞分裂のレベルによって判定されてもよい。増殖されたＴ細胞のサイトカイン感受性を判定するために、例えば、アッセイ中の３日間、サイトカイン非限定的条件で、ＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５によって誘導された増殖されたＴ細胞の統合細胞分裂を測定した。統合細胞分裂は、アッセイ中の３日間にわたる細胞分裂の曲線下面積を計算することによって、積分して計算してもよい。図１５Ａ〜１５Ｃは、（Ａ）ＩＬ−７（１０．０ｎｇ／ｍｌ）、（Ｂ）ＩＬ−１５（１０．０ｎｇ／ｍｌ）、および（Ｃ）ＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、例えば７日目および１０日目などのより長期間増殖されたものと比較して、例えば、４日目などのより初期の増殖されたＴ細胞が、より多くの分裂細胞を含むことを示す。これらの結果は、Ｔ細胞の生体外増殖の短縮が、より長期間増殖されたＴ細胞よりもさらに良好にサイトカインに応答することを示す。同様に、アッセイの３日目に、例えば、ＩＬ−２（３００Ｕ／ｍｌ）（図１６Ａ）、ＩＬ−７（１０．０ｎｇ／ｍｌ）（図１６Ｂ）、またはＩＬ−１５（１０．０ｎｇ／ｍｌ）（図１６Ｃ）などのより高濃度のサイトカインの存在下で、より長期間増殖されたものよりも、より初期の増殖されたＴ細胞のより多くの分裂細胞が増殖した。
【０１３６】
実施例６
生体外増殖の短縮はサイトカイン感受性の増加と相関する
ＣＳＡにおいて、リンパ球の百分率に基づくＣＤ２５発現（Ｒ２＝０．８２）またはＣＤ２５発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｒ２＝０．８９）と、ＩＬ２誘導生存率との間には強い相関関係があった。ＣＳＡにおいて、リンパ球の百分率に基づくＣＤ１２７の発現（Ｒ２＝０．０４）と、ＩＬ７誘導生存率との間には相関関係はなかった。注目すべきことに、ＣＤ１２７発現のＭＦＩ（Ｒ２＝０．７６）とＩＬ７誘導生存率との間には、中等度の相関があった。ＣＳＡにおいて、リンパ球の百分率に基づくＣＤ１２２発現（Ｒ２＝０．４２）とＩＬ１５誘導生存率に対する応答との間には、弱い相関関係があり、またはＣＤ１２２発現のＭＦＩ（Ｒ２＝０．６７）とＩＬ１５誘導生存率に対する応答との間には、中等度の相関関係があった。
【０１３７】
サイトカイン感受性はまた、サイトカインの存在下で細胞のシグナル伝達経路を媒介する、サイトカイン受容体の発現レベルによって判定してもよい。ＣＳＡは、サイトカインが誘導する、生存、増殖、およびアポトーシスに対する応答を測定する。これらの変化は、アッセイ開始時の各Ｔ細胞集団内のそれぞれのサイトカイン受容体の発現と相関してもよい。したがって、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５サイトカイン受容体の定義するサブユニット、すなわち、それぞれＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ１２２の発現を測定した。注目すべきことに、ＣＤ１２２は、ＩＬ−２受容体とＩＬ−１５受容体の間の共有サブユニットであるが、一般にはＩＬ−１５受容体の反応性サブユニットに割り当てられる。例えば、図１６Ｄは、アッセイの３日後の４日目の増殖されたＴ細胞が、例えば、７日目および１０日目などのより長期にわたって増殖されたものと比較して、より多くのＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）を発現することを示す。図１７Ａは、このＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）発現の増加を示し、これは、４日目の増殖されたＴＣＲ導入Ｔ細胞がアッセイの対象となる前に測定され、例えば、Ｒ２＝０．８９および０．８２などのＩＬ−２媒介細胞生存率の増加と良好に相関する。ＡＵＣは、曲線下面積の略である。図１７Ｂは、このＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）発現の増加が、例えば、Ｒ２＝０．８１および０．６９などのＩＬ−２媒介細胞分裂の増加ともまた良好に相関することを示す。
【０１３８】
図１８Ａおよび１８Ｂはそれぞれ、４日目の増殖されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞がアッセイの対象となる前に測定されたＩＬ−１５受容体（ＣＤ１２２）発現が、例えば、Ｒ２＝０．６７および０．４２などのＩＬ−１５媒介細胞生存率の増加、そして例えば、Ｒ２＝０．５５および０．６７などのＩＬ−１５媒介細胞分裂の増加と、適度に相関することを示す。
【０１３９】
図１９Ａおよび１９Ｂはそれぞれ、４日目の増殖されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞がアッセイの対象となる前に測定されたＩＬ−７受容体（ＣＤ１２７）発現が、例えば、Ｒ２＝０．７６および０．００４などのＩＬ−７媒介細胞生存率の増加、そして例えば、Ｒ２＝０．６１および０．０８などのＩＬ−７媒介細胞分裂の増加と、貧弱に相関することを示す。
【０１４０】
これらのアッセイからの結果は、例えば、約３〜約５日間など、より初期の製造された（または最小限に増殖された）操作されたＴ細胞、が、例えば、約７〜約１０日など、より長く増殖された細胞と比較して、より良好に作動することを示す。例えば、図２０に示されるように、例えば、約３〜約５日間など、最小限に増殖された操作されたＴ細胞は、例えば、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）および／または幹記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）／Ｔ中央記憶（Ｔｃｍ）の個体数の増加などのナイーブ性の増大、増殖能力の増加、および例えば、ＣＷＩＤによって誘発されるアポトーシスの減少を介した持続性の増加のために、例えば、約７〜約１０日間など、延長された期間にわたり生体外で増殖された操作されたＴ細胞よりも、高い臨床的有効性を示してもよい。
【０１４１】
実施例７
ＣＤ３／ＣＤ２８製造中の細胞の作用機序（ＭＯＡ）表現型決定
ＣＳＡの結果から、Ｔ細胞は増殖性サイトカインに応答する機能が低下しているようであったが、これはサイトカイン受容体発現が喪失していることが一因であってもよい。これらのデータは、１０日目の増殖されたＴ細胞のわずかな一部が、サイトカインに応答する能力を維持してもよいことを示唆する。この観察は、Ｔ細胞集団の不均一性が、観察された挙動に関与していてもよいことを示唆する。この多様性と可能性の喪失を調べるために、（１）最終的相対テロメア長、（２）テロメラーゼ活性、（３）共刺激分子発現、（４）全ＲＮＡ配列解析に対する、Ｔ細胞増殖の影響を分析した。
【０１４２】
延長されたＣＤ３／ＣＤ２８製造によるテロメア長の短縮
細胞は高度に分化して最終的には老化するので、テロメア長の損失は、機能不全細胞の証明である。この効果が、本発明者らの差次的に増殖されたＴ細胞で起こっているかどうかを調べるために、蛍光原位置ハイブリダイゼーションアッセイを用いて、内部細胞株対照と対照してＴ細胞の相対的テロメア長（ＲＴＬ）を評価した。
【０１４３】
図２２は、分析された４人のドナー（Ｄ１〜Ｄ４）全てについて、増殖プロトコル全体を通じてＲＴＬの損失があり、４日目の増殖細胞が最も高いＲＴＬを有することを示す。全てのドナーをグループ化した場合、４日目と７日目の間にＲＴＬのおよそ２０％の損失があり、７日目と１０日目の間にＲＴＬのさらなる１０％の損失があった。データにはまた、年齢の偏りの徴候があり、１０日目の増殖時点で比較すると、より若いドナーは、平均してより高齢のドナーと比較してより長いＲＴＬを有した。ドナーの年齢：Ｄ１：５０歳、Ｄ２：３１歳、Ｄ３：４９歳、およびＤ４：４５歳。
【０１４４】
延長されたＣＤ３／ＣＤ２８製造中のテロメラーゼ活性の低下
ＣＤ３＋ＣＤ２８刺激に続いて、テロメア長の減少およびテロメラーゼ誘導の不均一性の減少に基づいて、活性テロメラーゼのレベルを酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して判定した。
【０１４５】
図２３は、４日目と７日目の増殖された培養物の間に、統計的に有意でない減少（およそ１０％）があったことを示す。対照的に、４日目と７日目の増殖された細胞の間には統計的に有意な（ｐ＝０．０００４）４０％の活性の減少があり、７日目と１０日目の間にはこれもまた統計的に有意な（ｐ＝０．０１６５）およそ２５％の減少があった。総合すると、ＲＴＬと活性テロメラーゼの最終レベルとの双方に増殖相関性の損失があり、増殖の長期化は、追加的な増殖にはあまり適さないこともある細胞を生じる。
【０１４６】
ＣＤ３／ＣＤ２８製造中のＴ細胞初期記憶表現型の喪失
ＣＳＡの結果は、差次的に増殖された細胞間で、開始記憶コンパートメントに明白な差があってもよいことを示す。開始記憶コンパートメントに対してより高解像度の分析を実施して、差次的に増殖されたサンプル間の差を検出した。
【０１４７】
図２４は、４、７、および１０日目の間では、Ｔｎａｉｖｅ／ｓｃｍコンパートメントに、統計的に有意でない差があったことを示す（ＣＤ８細胞の平均値は２０．０３％、１１．１％、１７．４７％）。しかし、４、７、および１０日目の増殖された細胞間では、Ｔｃｍコンパートメント内に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があった（ＣＤ８細胞の平均値は５８．２７、３７．７３、１６．８％）。４、７、および１０日目の増殖された細胞間では、Ｔｅｍコンパートメント内に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があった（ＣＤ８細胞の平均値は１８．９、４８．１３、および５８．９％）。４日目、７日目、および１０日目の増殖された細胞間では、Ｔｅｍｒａコンパートメント内に、統計的に有意でない差があった（ＣＤ８細胞の平均値は２．７０、３．０６、および６．８０％）。これらの結果は、主要な記憶コンパートメントの差が、ＴｃｍからＴｅｍへの遷移にあってもよいことを示し、より後期の増殖された細胞は、より少ないＴｃｍＴ細胞とより多くのＴｅｍＴ細胞を含む。
【０１４８】
ＣＤ３／ＣＤ２８製造中のＣＤ２８およびＣＤ２７発現の喪失
従来の記憶コンパートメントに加えて、どちらも生体内でのＴ細胞の持続性の増加に伴うことが知られている、共刺激マーカーＣＤ２８およびＣＤ２７の発現について、細胞を表現型同定した。
【０１４９】
図２５は、ＣＤ３＋ＣＤ２８増殖中、ＣＤ２８とＣＤ２７の双方に段階的損失があったことを示し、製造期間中の１０日目までに最も劇的な損失があった。４、７、および１０日目の培養物の間の比較がいずれも統計的に有意でなかった一方で（ｐ＜０．０５）、４および１０日目の培養物の間のＣＤ２７＋ＣＤ２８＋コンパートメント内では、有意性傾向があった（ＣＤ８細胞の平均値は５８．４７および２１．４３％）。さらに、４日目および１０日目の増殖された細胞の間に、二重陰性ＣＤ２７−ＣＤ２８−コンパートメントの濃縮（ｐ＝０．１５８１）があった（ＣＤ８細胞の平均値は１０．２４％および２９．７７％）。
【０１５０】
差次的遺伝子発現分析は、より後期の増殖された細胞と比較して、より初期の増殖された細胞を独自のクラスターとして同定する。
【０１５１】
データが、差次的に増殖されたＴ細胞の間の表現型の差を示唆する一方で、調査は、検討された指定された標的（例えば、ＣＤ２８またはＴ細胞記憶コンパートメント）の数に制限されることもある。表現型決定研究の範囲を広げるために、４、７、または１０日間増殖された３人の生物学的ドナーからの全ＲＮＡ配列決定を実施した。
【０１５２】
図２６は、クラスター分析に基づいて、中間クラスターに出現した７日目と比較した４日目の増殖された細胞の明確なグループ化を示す一方で、１０日目の細胞は独自のクラスターで出現した。これらの結果は、７日目および１０日目の増殖された細胞と比較して、４日目の増殖された細胞のクラスター化パターンが明白に異なることを示す。このデータは、Ｔ細胞増殖の線形分化モデルを支持し、その中では増殖プロトコル全体を通じてＲＮＡレベルでの漸進的変化が起こる。
【０１５３】
より初期の増殖された細胞は、より後期の増殖されたサンプルと比較して、差次的発現遺伝子の数が増加していることを示す。
【０１５４】
３人の生物学的ドナー全体にわたり、４、７、および１０日目の増殖された細胞の間の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）について、全ＲＮＡ配列決定を解析した。
【０１５５】
図２７は、４日目と７日目の比較では５，０７８個のＤＥＧ、４日目と１０日目の比較では５，６４３個のＤＥＧによって明らかなように、製造工程の最も早い時期に変化した遺伝子発現プロファイルを示す。双方のセットに関して、上方制御および下方制御された遺伝子のほぼ等しい分布があった。対照的に、７日目と１０日目の製造された細胞を比較すると、比較的少ないＤＥＧが存在して９０個の遺伝子が同定され、上方制御および下方制御された遺伝子の間で等しく分かれていた。
【０１５６】
Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）の解析では、製造過程における細胞周期関連遺伝子の喪失、およびアポトーシス関連遺伝子の上方制御が強調されている。
【０１５７】
製造中に起こる劇的な遺伝子発現変化をより良く理解するために、ＫＥＧＧ経路解析を実施して、異なる遺伝子セットで過剰に表現された遺伝子経路を同定した。ＫＥＧＧ経路は、例えば、生存、分裂、アポトーシスなどのＣＳＡから得られた機能性結果に基づいて、Ｔ細胞の増殖および持続性に関連していてもよい。
【０１５８】
図２８は、製造中のより後の時点と４日目とを比較すると、ＤＮＡ複製および細胞周期遺伝子経路に有意な下方制御があることを示す。この効果に加えて、製造中の同一時期に、アポトーシス、ｐ５３シグナル伝達遺伝子経路における有意な上方制御があった。図２７の遺伝子発現結果と一致して、製造の７日目から１０日目の間で、有意に濃縮された経路は非常に少なかった。
【０１５９】
実施例８
方法
Ｔ細胞製造
健常ドナー全血をＨｅｍａｃａｒｅから購入し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によってＰＢＭＣを単離した。４℃のＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ１７−５１６Ｆ）中の１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６−００３７−８５）および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６−０２８９−８５）抗体で一晩被覆された組織培養フラスコ上に、１×１０６個の生ＰＢＭＣ／ｍｌを蒔種することによって、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ１００−３１８）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ１３０−０９７−１９６）培地中で、ＰＢＭＣを１６〜２４時間活性化した。翌日、全細胞を単離して、１×１０６個の生細胞／ｍｌに再懸濁し、５ｍｌをＧｒｅｘ２４ウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ  ８０１９２Ｍ）のウェル内に播種した。細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ２００−０７）、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ２００−１５）、および１０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下で、模擬形質転換するか、またはＴＣＲレンティウイルスコンストラクト（Ｌｅｎｔｉｇｅｎによって製造される）で形質転換した。翌日、細胞に、上記濃度でＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充した３５ｍｌの完全ＴｅｘＭＡＣＳを供給した。細胞は、所望の製造時間（合計４、７、または１０日間）に応じて、２、５、または８日間さらに培養した。製造後、細胞をカウントし、Ｃｙｒｏｓｔｏｒｅ１０内で５×１０６／ｍｌで凍結し、−８０℃に１６〜２４時間置き、必要になるまでＬＮ２気相で長期保存した。
【０１６０】
ＰｋＨ６７染色
細胞分裂は、増殖色素ＰｋＨ６７を希釈することによって測定してもよい。ＰｋＨ６７（Ｓｉｇｍａ  ＰＫＨ６７ＧＬ）染色は、７日目または１０日目の製造された細胞に比べてより大きな細胞サイズを考慮して、４日目の製造された細胞を２倍の濃度で染色したことを除いて、製造業者のプロトコルに従って実施した。ＰｋＨ染色は、フローサイトメトリー生存色素染色前に実施した。
【０１６１】
サイトカイン感受性アッセイ（ＣＳＡ）
Ｔ細胞生成物は、５％ヒトＡＢ血清および１００Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ１０１１４）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ中で、１〜２ｘ１０６／ｍｌでおよそ４時間解凍し、休止させた。休止期間に続いて細胞をＰｋＨで標識し、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２０２−ＩＬ）を滴定したＧｒｅｘ２４ウェルフラスコ内で、２×１０５個のリンパ球を合計２１日間培養した。この間、３〜４日毎に、容積測定フローサイトメトリーによって細胞をカウントし、７日毎に記憶Ｔ細胞パネルで表現型同定した。サイトカインは７日毎に、出発濃度まで補充した。
【０１６２】
フローサイトメトリー染色および取得
生細胞を定量化し、ＰＢＳ中で１〜２×１０６個の生細胞／ｍｌに再懸濁し、次に製造業者のプロトコルに従って、生死染色で染色した。次に、細胞を流動緩衝液で洗浄し、下の表に示されるように所望の抗体濃度で再懸濁して４℃の暗所で１５〜３０分間染色したが、例外としてＣＣＲ７染色は、３７℃の血清非含有ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ１１８３５−０３０）中で行った。次に、細胞を流動緩衝液で洗浄し、固定緩衝液中に再懸濁して、ＢＤ  ＦｏｒｔｅｓｓａまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置上で取得するまで４℃で保存した。以下の表は、全てのフローサイトメトリー染色で使用される試薬を含む。
【０１６３】
【表３】
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【０１６４】
テロメア長判定
相対テロメア長は、製造業者の指示（Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｋ５３２７）に従って判定した。簡潔に述べると、Ｔ細胞と対照腫瘍細胞１３０１（４Ｎゲノム）とを１：１の比率で混合した。次に、細胞を透過処理し、テロメアＰＮＡ  ＦＩＴＣプローブを一晩ハイブリダイズした。翌日、対比ヨウ化プロピジウム染色を実施して無傷の細胞を識別し、フローサイトメトリーによって細胞を取得した。試験細胞のテロメア長は、対照腫瘍細胞株１３０１のテロメア長との比として計算した。
【０１６５】
ＣＤＲ３配列決定（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＴ細胞受容体可変β鎖配列決定解析
ヒトＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３領域の免疫配列決定は、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）アッセイ（ワシントン州シアトルのＡｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。抽出されたゲノムＤＮＡは、バイアス制御されたマルチプレックスＰＣＲ中で増幅させ、高スループット配列決定がそれに続いた。さらなる解析のために、各固有のＴＣＲβ  ＣＤＲ３領域の絶対量を同定して定量化するために、配列を畳み込んでフィルタリングした。
【０１６６】
ＴＣＲβ配列決定結果の統計解析
クローン性は１−Ｐｅｉｌｏｕの均一性と定義され、
【数１】
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によって、生産的再配列に基づいて計算され、式中、πは再配列ｉの比例豊富度であり、Ｎは再配列の総数である。クローン性値は０〜１までの範囲であり、頻度分布の形状を表す：０に近いクローン性値が非常に均一な頻度の分布を示す一方で、１に近い値は、その中に少数のクローンが高頻度で存在する、非対称分布が増している分布を示す。統計分析は、Ｒバージョン３．２で実施した。
【０１６７】
ＲＮＡｓｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）データ解析
下流解析は、ＳＴＡＲ、ＨＴｓｅｑ、Ｃｕｆｆｌｉｎｋ、および本発明者らによるラップスクリプトを含む、プログラムの組み合わせを用いて実施した。アライメントはＴｏｐｈａｔプログラムを用いて解析し、ＤＥＳｅｑ２／ｅｄｇｅＲを通じて差次的発現差動発現を判定した。ＧＯおよびＫＥＧＧ濃縮は、ＣｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒによって実行した。Ｓｔａｒ−ｆｕｓｉｏｎおよびｒＭＡＴＳソフトウェアによって、遺伝子の融合、そして代替スプライシング事象の差を検出した。
【０１６８】
参照ゲノムへのＲＮＡｓｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）リードマッピング
参照ゲノムおよび遺伝子モデルのアノテーションファイルは、ゲノムウェブサイトブラウザ（ＮＣＢＩ／ＵＣＳＣ／Ｅｎｓｅｍｂｌ）から直接ダウンロードした。ＳＴＡＲを用いて参照ゲノムのインデックスを構築し、ＳＴＡＲ（ｖ２．５）を用いて、対合末端クリーンリードを参照ゲノムに整列させた。ＳＴＡＲは、Ｍａｘｉｍａｌ  Ｍａｐｐａｂｌｅ  Ｐｒｅｆｉｘ（ＭＭＰ）法を用いて、ジャンクションリードに対する正確なマッピング結果を生成し得る。
【０１６９】
遺伝子発現レベルのＲＮＡｓｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）定量化
ＨＴＳｅｑ  ｖ０．６．１を用いて、各遺伝子のマッピングされたリード数をカウントした。次に、遺伝子の長さと、この遺伝子にマッピングされたリードカウントとに基づいて、各遺伝子のＦＰＫＭを計算した。ＦＰＫＭ、マップされた百万リード当たりのエクソンモデルのキロベース当たりリードは、配列決定深度および遺伝子長の影響を同時に考慮し、遺伝子の発現レベルを推定するために一般に用いられる。
【０１７０】
ＲＮＡｓｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）差次的発現解析
生物学的複製物を有するＤＥＳｅｑ２では、ＤＥＳｅｑ２  Ｒパッケージ（２_１．６．３）を用いて、２つの条件／グループ間の差次的発現解析（条件当たり２つの生物学的複製物）を実施した。ＤＥＳｅｑ２は、負の二項分布に基づくモデルを用いて、デジタル遺伝子発現データにおける差次的発現を判定するための統計的ルーチンを提供する。結果として得られたｐ値は、偽検出率（ＦＤＲ）を制御するためのＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇのアプローチを用いて補正した。ＤＥＳｅｑ２によって検出された補正ｐ値＜０．０５を有する遺伝子は、差次的に発現されるものとして割り当てた。
【０１７１】
生物学的反復実験なしのｅｄｇｅＲでは、差次的遺伝子発現解の前に、各配列決定ライブラリについて、１つのスケーリング正規化係数を通じて、ｅｄｇｅＲプログラムパッケージによって読み取り数を補正したｅｄｇｅＲ  Ｒパッケージ（３．１６．５）を用いて、２つの条件の差次的発現解析を実施した。ｐ値は、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて補正した。０．０５の補正ｐ値、および１の絶対倍数変化を有意な差次的発現の閾値として設定した。
【０１７２】
ＲＮＡｓｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）相関
対数調整を可能にするために、０ＦＰＫＭを有する遺伝子に、０．００１の値を割り当てる相関関係は、Ｒのｃｏｒ．ｔｅｓｔ関数を用いて、オプションセットａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ＝"ｇｒｅａｔｅｒ"およびｍｅｔｈｏｄ＝"Ｓｐｅａｒｍａｎ"で判定した。
【０１７３】
ＲＮＡｓｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）クラスタリング
差分間の相関を同定するために、異なるサンプルを表現レベルＦＰＫＭを用いてクラスター化し、ヒートマップ、ＳＯＭ（Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇ）、シルエット係数を用いたｋｍｅａｎｓの関数を備えた階層的クラスタリング距離法を用いて相関を確認し、Ｒのデフォルトパラメータで最適な分類を適応させた。
【０１７４】
差次的発現遺伝子のＲＮＡｓｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）ＧＯおよびＫＥＧＧ濃縮分析
遺伝子長の偏りが補正されたｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｒパッケージによって、差次的発現遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析を実施した。補正されたｐ値が０．０５未満のＧＯ項は、差次的発現遺伝子によって、有意に濃縮されていると見なされた。ＫＥＧＧは、分子レベルの情報から、特にゲノム配列決定およびその他の高スループット実験技術によって作成された大規模分子データセットから、細胞、生物、および生態系などの生体系の高レベル機能および有用性を理解するためのデータベース資源である。クラスタープロファイラーＲパッケージを用いて、ＫＥＧＧ経路における差次的発現遺伝子の統計的濃縮を試験した。
本開示の利点としては、高スループットの患者特異的様式で、移入された細胞の増殖および生存を増加させてアポトーシスを減少させることによって生体内で持続し、ひいては腫瘍の退縮を改善してＡＣＴの有効性を高めてもよい、生体外で製造されたＴ細胞のタイプを判定するために用いられてもよいサイトカイン感受性アッセイが挙げられてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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