(57)【要約】本発明は、クロマトグラフィーを用いて2つ以上の異なるモノクローナル抗体などの2つ以上の異なる抗体の混合物の組成を制御するための方法に関する。該混合物は、製剤としての使用のためのものであり、該方法は、所定の比の2つ以上の異なる抗体の産生のための制御された下流のプロセスを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーによる抗体の分離を可能にする差をアミノ酸配列中に有する2つ以上の異なる抗体のアウトプット混合物を産生するための方法であって、
該2つ以上の異なる抗体が、アウトプット混合物中に所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在し、
該方法が、
（a）該2つ以上の異なる抗体が所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在していないインプット混合物を提供する段階、
（b）クロマトグラフィーによって該2つ以上の抗体を分離する段階、
（c）該2つ以上の抗体を、アウトプット混合物を提供するために必要な量で回収する段階
を含む、方法。
【請求項２】
アウトプット混合物が原薬である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
原薬を産生するためにアウトプット混合物を処理する段階であって、前記2つ以上の異なる抗体が、請求項1に規定される濃度比または本質的に該濃度比で存在する、段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
製剤を産生するためにアウトプット混合物を処理する段階であって、前記2つ以上の異なる抗体が、請求項1に規定される濃度比または本質的に該濃度比で存在する、段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記2つ以上の抗体の相対量および前記2つ以上の抗体の濃度の比が適用製剤規格に従う原薬または製剤を産生するために、アウトプット混合物が、抗体濃度の比を変更するまたは実質的に変更するためのいかなる追加的な手段も措置もなしに処理される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
インプット混合物中の各結合特異性バリアントおよび/または各抗体電荷バリアントが、アウトプット混合物中にも見出される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
段階（c）が、前記2つ以上の抗体を同一プールまたは画分中に回収し、それによりアウトプット混合物を得ることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
段階（c）が、前記2つ以上の抗体を複数のプールまたは画分中に回収し、かつ該複数のプールもしくは画分をまたは該複数のプールもしくは画分の一部を組み合わせ、それによりアウトプット混合物を得ることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
段階（b）におけるクロマトグラフィーが、溶出液およびフロースルーを産生し、アウトプット混合物が、
i）溶出液を収集し、かつフロースルーを捨てること、または
ii）溶出液を捨て、かつフロースルーを収集すること
によって産生される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
段階（b）が、
クロマトグラフィー段階の条件を、該条件下での所与の抗体に対する総結合能が、アウトプット混合物を提供するために必要なこの抗体の量を維持するのに十分であるように、調節すること
を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
段階（b）が、
クロマトグラフィー段階の条件を、該条件下での所与の抗体に対する総結合能が、アウトプット混合物を提供するために必要な量を超える各抗体の量を維持するのに十分であるように、調節すること
を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
前記2つ以上の異なる抗体の各々が、治療有効量で存在する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記2つ以上の異なる抗体のうちの最も少ないものが、前記2つ以上の異なる抗体のうちの最も豊富なものの量の少なくとも1％（w/w）、2％（w/w）、3％（w/w）、4％（w/w）、5％（w/w）、6％（w/w）、7％（w/w）、8％（w/w）、9％（w/w）または10％（w/w）である量で存在する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記2つ以上の抗体が、
任意の2つの抗体の量の比（w/w）が1：5〜5：1の間、例えば1：4〜5：1、1：3〜5：1、1：2〜5：1、1：1〜5：1、2：1〜5：1、3：1〜5：1、3：4〜5：1、1：5〜4：1、1：5〜3：1、1：5〜2：1、1：5〜1：1、1：5〜1：2、1：5〜1：3、1：5〜1：4、1：4〜4：1、1：4〜3：1、1：4〜2：1、1：4〜1：1、1：4〜1：2、1：4〜1：3、1：3〜4：1、1：3〜3：1、1：3〜2：1、1：3〜1：1、1：3〜1：2、1：2〜4：1、1：2〜3：1、1：2〜2：1、1：2〜1：1、1：1〜4：1、1：1〜3：1の間、または例えば1：1〜2：1の間である
ような量で、存在する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記2つ以上の異なる抗体の各々が活性薬学的成分である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
2〜10個の異なる抗体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記2つ以上の抗体のうちの少なくとも1つが、転移性固形腫瘍または転移性局所進行腫瘍または血液腫瘍などの腫瘍の表面に発現される抗原と結合する抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記2つ以上の抗体のうちの少なくとも1つが、免疫もしくは自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、中枢神経系（CNS）の疾患または筋骨格系疾患に関連する抗原または該疾患時に発現される抗原と結合する抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記2つ以上の抗体が、クロマトグラフィー樹脂と、異なって相互作用するように、前記2つ以上の異なる抗体のアミノ酸配列における差が、前記2つ以上の抗体の電荷特性における差をもたらす、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記2つ以上の抗体が、クロマトグラフィー樹脂と、異なって相互作用するように、前記2つ以上の異なる抗体のアミノ酸配列における差が、前記2つ以上の抗体の疎水特性における差をもたらす、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記2つ以上の異なる抗体のアミノ酸配列における差が、クロマトグラフィー樹脂に対する親和性における差をもたらす、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
クロマトグラフィー樹脂が、アフィニティー樹脂、イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂または混合モード樹脂を含む群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
所定の比の前記2つ以上の異なる抗体を回収するための、前記2つ以上の抗体の分離および前記抗体のうちの過剰な1つまたは複数の抗体の枯渇を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
アウトプット混合物の前記2つ以上の異なる抗体が、段階（c）において単一のプール中に回収される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
段階（b）における前記2つ以上の抗体が、異なる画分に分離され、
続いて、アウトプット混合物を回収するために、前記抗体のうちの1つを少なくとも80％の純度で含有する画分が、前記異なる抗体についての所定の濃度比でプールされる、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
i）段階（b）において前記2つ以上の抗体を異なる画分に分離すること、および各抗体についてこの抗体を少なくとも80％の純度で含有する1つまたは複数の画分を選択すること、ならびに
ii）選択された画分の体積をプールすることによってアウトプット混合物を提供することであって、該体積のサイズが、前記2つ以上の抗体の所定の濃度比を提供するように調整される、該提供すること
を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
抗体をプールする前に各画分中の抗体の濃度を決定するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記2つ以上の抗体の分離が、単一のクロマトグラフィー樹脂を使用する単一のクロマトグラフィー段階によって行われる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
単一のクロマトグラフィー樹脂が分取クロマトグラフィー樹脂である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記2つ以上の抗体の分離が、所定の比のクロマトグラフィー樹脂の混合物の使用によって行われる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
インプット混合物の組成が、段階（b）の前に分析アッセイを用いて測定される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
インプット混合物の組成が、段階（b）において、クロマトグラフィー段階とインラインの、分析アッセイによって測定される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
クロマトグラフィーによって前記2つ以上の抗体の分離可能性を決定する最初の段階であって、前記異なる抗体が分離できない場合、クロマトグラフィーによる分離可能性を得るために、前記抗体のうちの1つまたは複数の抗体のアミノ酸配列を修飾する、段階
を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体のうちの1つまたは複数の抗体のアミノ酸配列の修飾が、前記抗体のうちの1つまたは複数におけるアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、またはそれらの組み合わせより選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
修飾が、前記抗体のうちの1つまたは複数の抗体の定常ドメインにおける修飾を含む、請求項33〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
修飾が、前記抗体のうちの1つまたは複数の抗体の可変ドメインにおける修飾を含む、請求項33〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
修飾が、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のフレームワーク配列における修飾を含む、請求項33〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
修飾が、前記異なる抗体のうちの1つまたは複数における1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項33〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
修飾が、1つまたは複数の修飾された抗体の機能的特徴を変化させない、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
変化されない機能的特徴が、抗体結合親和性、CDCまたはADCCなどのエフェクター機能、アビディティー、およびクラスター形成を含む群より選択される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
修飾が、前記抗体のうちの1つまたは複数の抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域における1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、該置換が、重鎖可変領域における1、6、17、24、48、75、90、93、96、97を含む群ならびに/または軽鎖可変領域における1、4、47、48、51、68、74、80、90、93、および95を含む群より選択される位置にあり、ナンバリングが、IgG1可変領域のIMGTナンバリングに従う、請求項34〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
1つまたは複数の置換が、対応する位置の野生型アミノ酸と異なる電荷を有するアミノ酸を導入する、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
1つまたは複数のアミノ酸置換が、EUナンバリングシステムで重鎖定常領域におけるE345K置換を含む、請求項41〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
1つまたは複数の抗体を修飾することが、抗体のうちの1つまたは複数の抗体のカッパ軽鎖定常領域に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することを含み、該置換が、アフィニティー樹脂への結合を消失させ、該置換が、EUナンバリングシステムでV110D、V110R、V110E、V110H、V110K、V110N、V110P、V110Q、V110WおよびE143Dを含む群より選択され、クロマトグラフィーが、該置換によりそれへの結合が消失されているアフィニティー樹脂を使用する、請求項33〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
それへの結合が消失されているアフィニティー試薬が、KappaSelectまたはKappaXL樹脂などの、カッパ軽鎖に結合する樹脂である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
1つまたは複数の抗体を修飾することが、ナンバリングにIMGTを用いる場合に軽鎖可変領域におけるS12P置換である少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することを含み、該置換が、アフィニティー樹脂への結合を消失させ、クロマトグラフィーが、該置換によりそれへの結合が消失されているアフィニティー樹脂を使用する、請求項33〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
アフィニティー樹脂がプロテインL樹脂である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
1つまたは複数の抗体を修飾することが、抗体のうちの1つまたは複数の抗体に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することを含み、該置換が、CH1ドメイン中であり、かつEUナンバリングシステムでS157Tおよび/またはT164S変異を含み、該置換が、アフィニティー樹脂への結合を消失させ、クロマトグラフィーが、該置換によりそれへの結合が消失されているアフィニティー樹脂を使用する、請求項33〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
アフィニティー樹脂が、CaptureSelectアフィニティー樹脂などのIgG-CH1アフィニティー樹脂である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
1つまたは複数の抗体を修飾することが、該1つまたは複数の抗体の重鎖定常領域に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することを含み、該置換が、EUナンバリングシステムでM252A、S254M、E380A、E380M、E382A、E382L、S426M、M428G、M428T、M428V、H433D、N434A、N434G、N434S、M428Aを含む群より選択され、該置換が、アフィニティー樹脂への結合を消失させ、クロマトグラフィーが、該置換によりそれへの結合が消失されているアフィニティー樹脂を使用する、請求項33〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
アフィニティー樹脂がプロテインG樹脂である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
分離度（Rs）が、疎水性相互作用クロマトグラフィーアッセイ、陽イオン交換クロマトグラフィーアッセイおよび/または混合モードクロマトグラフィーアッセイを含む群より選択される1つまたは複数のクロマトグラフィーアッセイでイオン強度勾配を用いて決定されるとRs≧0.3である場合、前記2つ以上の抗体が分離可能であると決定され、ここでRs≧0.3は、式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）に基づき、式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間であり、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
カラムに結合しない未結合の画分中の抗体と、カラムから溶出する画分の中の抗体との間でベースラインの分離が達成される場合、または分離度（Rs）が、アフィニティークロマトグラフィーアッセイでpH勾配を用いて決定されるとRs≧0.3である場合、前記2つ以上の抗体が、アフィニティークロマトグラフィーアッセイで決定される場合に分離可能であると決定され、ここでRs≧0.3は、式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）に基づき、式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間であり、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
前記2つ以上の異なる抗体が、異なる生産宿主細胞中に発現され、かつ該細胞から提供される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
前記2つ以上の異なる抗体が、単一の容器中で共培養された異なる生産宿主細胞中に発現され、かつ該細胞から提供される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
前記2つ以上の異なる抗体が、単一の生産宿主細胞中に同時発現される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
前記2つ以上の異なる抗体が、所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在するように、アウトプット混合物についての異なるバッチ間で再現可能な結果をもたらす、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
前記2つ以上の異なる抗体が、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4抗体、またはそれらの組み合わせを含む群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
前記2つ以上の異なる抗体が完全長抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
前記2つ以上の異なる抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはこれらの組み合わせである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
前記2つ以上の異なる抗体がすべてヒト化抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
前記2つ以上の異なる抗体がすべてヒト抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
前記2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つがモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
前記2つ以上の異なる抗体のすべてがモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
疾患の処置、臨床試験、毒性研究のための医薬の製造のための抗体バッチの産生のためのもの、またはバッチ間の一貫性を決定するためのものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
前記2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つが、腫瘍細胞上の標的、例えばerbB1（EGFR）、erbB2（HER2）、erbB3、erbB4、MUC-l、CD19、CD20、CD4、CD38、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-エンベロープタンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFrvIII、U-CAM、AXL、組織因子（TF）、CD74、EpCAMおよびMRP3からなる群より選択される標的に特異的である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
前記2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つが、エフェクター細胞上の標的、例えばCD1、CD3、CD4、CD8、FcガンマRIII（CDI6）、CD25、CD89、CD32、CD32a、FCεRI、CD40、またはFcガンマRI（CD64）に特異的である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
前記請求項のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、2つ以上の異なる抗体の混合物。
【請求項６９】
前記2つ以上の異なる抗体が、所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在する、請求項68記載の混合物。
【請求項７０】
所定の比の2つ以上の異なる抗体を有する、2つ以上の異なる抗体の混合物であって、該抗体が、サイズ、電荷、疎水性、またはクロマトグラフィー樹脂に対する親和性に差を有する、混合物。
【請求項７１】
前記2つ以上の異なる抗体の各々が、治療有効量で存在する、請求項68〜70のいずれか一項記載の混合物。
【請求項７２】
前記2つ以上の異なる抗体のうちの最も少ないものが、前記2つ以上の異なる抗体のうちの最も豊富なものの量の少なくとも1％（w/w）である量で存在する、請求項68〜71のいずれか一項記載の混合物。
【請求項７３】
前記2つ以上の抗体が、任意の2つの抗体の量の比（w/w）が1：5〜5：1の間であるような量で、存在する、請求項68〜72のいずれか一項記載の混合物。
【請求項７４】
前記2つ以上の異なる抗体の各々が活性薬学的成分である、請求項68〜73のいずれか一項記載の混合物。
【請求項７５】
2〜10個の異なる抗体を含む、請求項68〜74のいずれか一項記載の混合物。
【請求項７６】
前記2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つがモノクローナル抗体である、請求項68〜75のいずれか一項記載の混合物。
【請求項７７】
前記2つ以上の異なる抗体のすべてがモノクローナル抗体である、請求項68〜76のいずれか一項記載の混合物。
【請求項７８】
1つまたは複数の前記抗体のうちの少なくとも1つが、二重特異性または多重特異性抗体である、請求項68〜77のいずれか一項記載の混合物。
【請求項７９】
前記2つ以上の異なる抗体の分離度（Rs）が、疎水性相互作用クロマトグラフィーアッセイ、陽イオン交換クロマトグラフィーアッセイおよび/または混合モードクロマトグラフィーアッセイを含む群より選択される1つまたは複数のクロマトグラフィーアッセイでイオン強度勾配、pH勾配または塩勾配を用いて決定されるとRs≧0.3であり、ここでRs≧0.3は、式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）に基づき、式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間であり、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である、請求項68〜78のいずれか一項記載の混合物。
【請求項８０】
前記2つ以上の抗体が、アフィニティークロマトグラフィーアッセイで決定される場合に分離可能であり、前記抗体は、カラムに結合しない未結合の画分中の抗体と、カラムから溶出する画分の中の抗体との間でベースラインの分離が達成される場合、または分離度（Rs）が、アフィニティークロマトグラフィーアッセイでpH勾配を用いて決定されるとRs≧0.3である場合、分離可能であり、ここでRs≧0.3は、式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）に基づき、式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間であり、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である、請求項68〜79のいずれか一項記載の混合物。
【請求項８１】
前記2つ以上の抗体のうちの少なくとも1つが、転移性固形腫瘍または転移性局所進行腫瘍または血液腫瘍などの腫瘍の表面に発現される抗原と結合する抗体である、請求項68〜80のいずれか一項記載の混合物。
【請求項８２】
前記2つ以上の抗体のうちの少なくとも1つが、免疫もしくは自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、中枢神経系（CNS）の疾患または筋骨格系疾患に関連する抗原または該疾患時に発現される抗原と結合する抗体である、請求項68〜81のいずれか一項記載の混合物。
【請求項８３】
前記抗体のうちの少なくとも1つが、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域に少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該置換が、重鎖可変領域における1、6、17、24、48、75、90、93、96、97を含む群ならびに/または軽鎖可変領域における1、4、47、48、51、68、74、80、90、93、および95を含む群より選択される1つまたは複数の位置にあり、ナンバリングが、IgG可変領域のIMGTナンバリングに従う、請求項68または82記載の2つ以上の異なる抗体の混合物。
【請求項８４】
活性成分、例えば活性薬剤としての、請求項68〜83のいずれか一項記載の混合物を含む、薬学的組成物。
【請求項８５】
無菌であり、かつ以下の特徴：
生理学的に許容されるpH、例えば5〜8の間であるpH；
600mOsm/kg以下である重量モル浸透圧濃度；および
組成物中の抗体の10重量％以下が凝集物の形態で存在するような、凝集物のレベル
のうちの1つまたは複数を有する、請求項84記載の薬学的組成物。
【請求項８６】
290〜300mOsm/kg、例えば295mOsm/kgである重量モル浸透圧濃度を有する組成物のように等張または実質的に等張である、請求項84または85記載の薬学的組成物。
【請求項８７】
医薬としての使用のための、請求項68〜83のいずれか一項記載の2つ以上の異なる抗体の混合物。
【請求項８８】
疾患を処置および/または予防するための方法における使用のための、請求項68〜83のいずれか一項記載の2つ以上の異なる抗体の混合物。
【請求項８９】
疾患が、癌または感染性疾患である、請求項68〜83のいずれか一項記載の使用のための混合物。
【請求項９０】
対象に混合物を投与する段階を含む、対象における疾患を処置する方法における使用のための、請求項68〜83のいずれか一項記載の2つ以上の異なる抗体の混合物。
【請求項９１】
処置されるべき疾患が、癌、腫瘍、免疫もしくは自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、中枢神経系（CNS）の疾患、筋骨格系疾患、または感染性疾患である、請求項90記載の使用のための混合物。
【請求項９２】
請求項68〜83のいずれか一項記載の2つ以上の異なる抗体の混合物または請求項78記載の薬学的組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、疾患の処置の方法。
【請求項９３】
疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項68〜83のいずれか一項記載の2つ以上の異なる抗体の混合物の、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、クロマトグラフィーを用いて2つ以上の異なる抗体の混合物の組成を制御するための方法に関する。該混合物は、製剤としての使用のためのものであり、該方法は、所定の比の2つ以上の異なる抗体の産生のための制御された下流のプロセスを含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
今日、多数のヒト疾患が治療用モノクローナル抗体で処置されている。しかし、一部の疾患はモノクローナル抗体によって十分に効果的には処置されないか、または例えば標的のダウンレギュレーションもしくは別個の病原性経路への切り替えのせいで、処置はモノクローナル抗体の適用時間の経過と共に効果を失う。したがって、代わりの方法は、ポリクローナル抗体によるまたは異なるモノクローナル抗体の混合物などの抗体混合物による処置であり得る。そのような抗体混合物は、同じ標的上の異なるエピトープに対する2つ以上の抗体、またはその代わりに、異なる標的に対する抗体の混合物、またはそれらの組み合わせを含むこともできる。
【０００３】
そのような抗体混合物を産生するためには、2つ以上のモノクローナル抗体を産生し、別々に特徴づけ、続いて混合して1つの製剤にすることができる。これは、別々に産生されたモノクローナル抗体の各々の制御された製造および分析のみならず、組成および効力における一貫性についての最終混合物の分析を必要とするであろう。しかし、平行する産生・精製列を用いて抗体混合物を産生することは、単一のバイオリアクター中で抗体の混合物を同時産生することと比較して、高い製造コストまたは開発コストを有する可能性がある。
【０００４】
抗体混合物は、2つ以上のモノクローナル抗体を発現している単一の細胞株から産生させることができる。WO2004/009618（特許文献1）は、すべて単一で同一の軽鎖を使用する抗体をコードする遺伝子を単一細胞にトランスフェクトするための方法を記載している。これは、単一の細胞株が少なくとも３つの結合特異性を産生されることを可能にする。このアプローチの欠点は、すべて同一の軽鎖を使用する抗体の産生に限られることであり、そのことが多数の利用可能な抗体配列および一般的な抗体同定プラットフォームの使用を妨げている。さらに、単一の軽鎖および複数の重鎖を同時発現させ、さらなる操作を行わないことは、細胞培養の間にどちらも所望の構成成分でない場合がある単一特異性抗体と二重特異性抗体との両方が複数の重鎖の発現比に特異的な組成で形成することに繋がる。WO2010/0089387（特許文献2）に記載される別のアプローチは、抗体をコードする遺伝子の各々が別個の真核生物プロモーターの制御下にある単一細胞において少なくとも2つの抗体を産生することである。細胞株は、抗体の各々の遺伝子の順次発現を可能にする条件下で培養される。このアプローチは、規模または補給の差などの大規模培養プロセスパラメーターに対して高度に敏感であると予想することができ、収量を損ない得るプロモーターの切り替えおよび採取のタイミングへの厳密な制御を必要とし、限られた複雑さの産物の製造だけを可能にする。培養条件の変更に対する個別の抗体鎖の発現レベルの感度が異なる場合、両方の同時発現アプローチは、本質的に産物の組成への制御をもたらさない。
【０００５】
あるいは、抗体の混合物は、それぞれ1つの抗体を発現している細胞株の同時培養によって産生することができる。組換え抗体混合物は、WO2004/061104（特許文献3）に記載されるような、各細胞の同じゲノム部位への1つの抗体発現プラスミドの部位特異的組み込みに基づく適応哺乳動物発現技術によって製造することができる。WO2008/145133（特許文献4）は、ランダム組み込みにより組換え抗体混合物を製造するための方法を記載しており、その際、宿主細胞のゲノムへの発現ベクターの部位特異的組み込みを回避する条件下で、宿主細胞に発現ベクターのセットが別々にトランスフェクトされる。複数のバイオリアクター中での組換え抗体混合物が産生され、上流の処理の後期の時点、または下流の処理の前もしくは途中で細胞株または抗体調製物が組み合わされるのための様々なアプローチが、WO2009/129814（特許文献5）に記載されている。WO2012/068317（特許文献6）は、ゲノム中の複数の安定な部位へのウイルスAAVに基づかない優先的組み込みを用いて抗体混合物を発現させるための方法、およびクローン細胞株の代わりの安定細胞プールの使用を記載している。産生の間に抗体混合物の組成をある程度まで制御することができるものの、この制御は、臨床試験または製剤のための組換え抗体混合物を産生するには不十分である。
【０００６】
DNA、宿主細胞タンパク質または産物関連不純物などの混入物を予め定義された規格未満に低減するために、治療用抗体は別個のクロマトグラフィー段階によって精製される。一般に、抗体精製方法は、（1）サイズおよび電荷などの物理化学的性質に基づく分画、（2）免疫グロブリンに対して特異的親和性を有する固定化生物学的リガンドによる特定の抗体クラスの固相結合を用いるクラス特異的親和性に基づく分画または（3）一般的にCurrent Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Coligan et al (eds)（非特許文献1）に記載されるような抗原特異的親和性に基づく分画を伴う。
【０００７】
二重特異性抗体に関連して、二重特異性抗体を産物関連不純物から分離するために精製段階が用いられる。EP2009101（特許文献7）は、2種類の抗体の重鎖の間の等電点における差であって、二重特異性抗体を構成する抗体の抗体可変領域中に存在するアミノ酸を修飾することによって導入される差に基づくクロマトグラフィーを用いて抗体を精製するための方法を記載している。
【０００８】
プロテインAの結合の差に基づき二重特異性抗体を単離するための別のアプローチは、米国特許第8,586,713号（特許文献8）に記載されている。この方法では、重鎖の一方のFc領域が、プロテインAに対して低減した親和性を有するように操作され、プロテインAに対するIgG領域の結合の差により二重特異性抗体の単離が可能になる。US2015239991（特許文献9）に記載される別のアプローチは、プロテインGに対して低減した親和性を有する操作抗体およびプロテインGアフィニティークロマトグラフィーを用いる単離に基づく。
【０００９】
プロテインL（GE Healthcare）、KappaSelect（GE Healthcare）、およびKappaXL（ThermoFisher）などの抗体のカッパ軽鎖に特異的に結合する様々な樹脂が記載されている。これらの使用は、二重特異性抗体に関連して記載されている。単一の重鎖と、一方がカッパ定常ドメインを含み他方がラムダ定常ドメインを含む2つの異なる軽鎖（LC）とから成る二重特異性モノクローナル抗体が、軽鎖特異的樹脂を使用して精製された方法が記載されている（WO2013/088259（特許文献10））。CH1ドメインの変異に基づき二重特異性抗体を精製するための方法もまた記載されている（WO2013/136186（特許文献11））。PCT/EP2016/065576（特許文献12）は、カッパ軽鎖に結合する樹脂を、当該樹脂へのカッパ軽鎖のうちの1つまたは複数の結合を防止または低減する変異と組み合わせて使用して、2つ以上のカッパ軽鎖を含有する二重特異性および多重特異性抗体などのヘテロ二量体結合タンパク質を精製する方法を記載している。
【００１０】
組換え抗体混合物について、マルチモーダルクロマトグラフィー、アパタイトクロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて混入多量体を除去するための方法が、WO2014/209508（特許文献13）に記載されている。
【００１１】
産生の下流で抗体混合物の組成を制御するための方法の必要性がある。これは、混合物の組成における必要な制御を達成しながら抗体混合物の同時産生を可能にすることができる。クロマトグラフィーを用いて組換え抗体混合物の組成を制御するための方法を提供することが、本発明の目的である。これらの方法は、混合物中の抗体の物理化学的性質に基づく分画を用いて混合物の組成を制御する段階を含む。これらの方法はまた、混合物中の抗体の物理化学的性質を変化させて分離を改善するためのタンパク質操作を含む。これらの方法はまた、アフィニティー樹脂への抗体の結合を防止または低減する変異を抗体に導入することを含み、抗体に結合する樹脂を使用する精製により抗体混合物の組成を制御する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2004/009618
【特許文献２】WO2010/0089387
【特許文献３】WO2004/061104
【特許文献４】WO2008/145133
【特許文献５】WO2009/129814
【特許文献６】WO2012/068317
【特許文献７】EP2009101
【特許文献８】米国特許第8,586,713号
【特許文献９】US2015239991
【特許文献１０】WO2013/088259
【特許文献１１】WO2013/136186
【特許文献１２】PCT/EP2016/065576
【特許文献１３】WO2014/209508
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Coligan et al (eds)
【発明の概要】
【００１４】
第1の局面において、本発明は、クロマトグラフィーによる抗体の分離を可能にする差をアミノ酸配列中に有する2つ以上の異なる抗体のアウトプット混合物を産生するための方法であって、
2つ以上の異なる抗体が、アウトプット混合物中に所望もしくは所定の濃度比で、またはその許容偏差内で存在し、
該方法が、
1.  2つ以上の異なる抗体が所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在していないインプット混合物を提供する段階、
2.   クロマトグラフィーによって2つ以上の抗体を分離する段階、
3.  2つ以上の抗体を、アウトプット混合物を提供するために必要な量で回収する段階
を含む、方法に関する。
【００１５】
第2の局面において、本発明は、2つ以上の異なる抗体の混合物であって、本発明の方法によって得ることができる混合物に関する。
【００１６】
第3の局面において、本発明は、本発明の混合物を含む薬学的組成物に関する。
【００１７】
第4の局面において、本発明は、疾患の処置の方法における使用のための抗体混合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の産生および精製プロセスの略図。（A）プロセスは、一貫して配布規格に適合するように抗体の産生レベルを制御することができない上流の同時生産プロセスを含む。抗体は、抗体混合物の組成を追加的に制御する下流の処理段階の間に精製される。クロマトグラフィーは、アフィニティー樹脂に対する抗体の結合特性における差に基づくアフィニティークロマトグラフィーを含むことができ、当該アフィニティークロマトグラフィーでは、（B）樹脂が正しい比の抗体混合物で飽和される；（C）分析アッセイを用いる抗体比の予備決定に続いて、樹脂が過剰な抗体と結合して、正しい比の抗体混合物をもたらす。クロマトグラフィーはまた、抗体の物理化学特性における差に基づくクロマトグラフィーを含むことができ、当該クロマトグラフィーでは、（D）分析アッセイを用いる抗体比の予備決定に続いて、過剰な抗体が混合物から除去されて、正しい比の抗体混合物をもたらすように、クロマトグラフィー実験のデザインスペースが予備探索されている；（E）クロマトグラムまたは画分の濃度測定に基づく分画および画分のプール。
【図２Ａ−１】（A）ヒト生殖系列ならびに抗体IgG1-1014-005、IgG1-2F8、およびIgG1-1021-511の重鎖可変領域の配列アライメントを示す。IMGTナンバリングに従ってアミノ酸をナンバリングする。星印は、点変異がいずれかの抗体に導入された位置を示す。
【図２Ａ−２】図2A-1の説明を参照のこと。
【図２Ｂ−１】（B）ヒト生殖系列ならびに抗体IgG1-1014-005、IgG1-2F8、およびIgG1-1021-511の軽鎖可変領域の配列アライメントを示す。IMGTナンバリングに従ってアミノ酸をナンバリングする。星印は、点変異がいずれかの抗体に導入された位置を示す。
【図２Ｂ−２】図2B-1の説明を参照のこと。
【図２Ｃ】（C〜E）抗体IgG1-2F8（C）、IgG1-1014-005（D）、およびIgG1-1021-511（E）の電荷変調された可変ドメインバリアントのアライメントを示す。アミノ酸を連続的に（アライメントの上）、またはヒト可変領域のIMGTナンバリングに従って（アライメントの下）、ナンバリングする；変異試験を行う位置を反転表示する。HA1、HA2、およびHA3（より大きくマイナス）、ならびにHB1、HB2、およびHB3（より大きくプラス）は、バリアントHCと比べた電荷差を段階的に増加させた重鎖可変ドメインを示し、C末端リシンを有しない定常ドメインとの融合物として発現された基準重鎖可変ドメイン配列を示す。HPは、C末端リシンおよび該当する場合にN末端ピログルタメートを含む配列として発現される親抗体の非変異重鎖可変ドメインの配列を示す。同様に、LA1、LA2、LA3（より大きくマイナス）およびLB1、LB2、およびLB3（より大きくプラス）は、軽鎖可変ドメインの配列を示す。
【図２Ｄ】図2Cの説明を参照のこと。
【図２Ｅ】図2Cの説明を参照のこと。
【図３】電荷変調された抗体バリアントのIgG力価の決定。IgG1-1014-005、IgG1-1021-511およびIgG1-2F8の各バリアントの抗体発現レベルを単一データ点として示す散布図。発現レベルは、十分緊密にクラスター形成され、IgG1-1014-005重鎖変異Q6Eを除く点変異が、タンパク質発現に大きな作用を有しなかったことを示している。Q6Eは、この変異を含有するすべてのバリアントの抗体力価に有害な作用を有した。
【図４−１】電荷変調された抗体バリアントの電荷特性の分析。（A）IgG1-1014-005、IgG1-1021-511およびIgG1-2F8の各バリアントの理論的等電点（pI）を示す散布図。（B）分析HPLC陽イオン交換（CEX）実験において抗体バリアントによりサンプリングされた保持時間を示す散布図。対照抗体バリアントを中が白く周りが灰色の記号により示すのに対し、フロースルー中に溶出し、これらの条件下でカラム樹脂と顕著な相互作用を示さない抗体バリアントを図から除く。分析陽イオン交換の保持時間と、（C）IgG1-1014-005電荷バリアント、（D）IgG1-1021-511電荷バリアントおよび（E）IgG1-2F8電荷バリアントについてのpIとの相関。これらのデータは、電荷変調点変異が抗体の電荷特性に顕著な効果を有することを示す。
【図４−２】図4-1の説明を参照のこと。
【図５−１】（A）IgG1-1014-005-HCLC、IgG1-2F8-HCLC、IgG1-1021-511-HCLCおよびIgG1-1014-153；（B）IgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153；（C）IgG1-2F8-HB3LB3、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153；（D）IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepC、（E）IgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153を含有する細胞培養上清からの抗体バリアントの混合物の例示的なプロテインA分離。280nmでの吸光度（実線）および伝導率またはpH（灰色の破線）をモニタリングした。すべての精製は、カラム負荷の間にフロースルー中の細胞培養上清由来の未結合物質により上昇した吸光度を示す。特異的に結合した抗体バリアントは、pH3.0で溶出し、これを280nmでの吸光度におけるピークによって検出した。洗浄段階の間の280nmでの副ピークは、あまり強固に結合していない物質を示す。
【図５−２】図5-1の説明を参照のこと。
【図６−１】精製された（A）類似濃度のIgG1-1014-005-HCLC、IgG1-2F8-HCLC、IgG1-1021-511-HCLCおよびIgG1-1014-153；（B）類似濃度のIgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153、（C）抗体バリアントを含有する上清から精製された、およそ5：3：2：1の比のIgG1-2F8-HB3LB3、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153、ならびに（D）抗体バリアントを含有する上清から精製された、およそ1：3：2：5の比のIgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153の例示的な分取陽イオン交換クロマトグラフィー分離。280nmでの吸光度（実線）および伝導率（灰色の破線）をモニタリングした。（パネルA）における非電荷変調バリアントは、約120mLにIgG1-1021-511-HCLCの規定のピークを示すが、その他の3つの種は分離不良である。4つの規定のピークが各々の抗体比で観察することができるので、電荷変調バリアント（パネルB、C）は分離されている。各実験におけるプールのスキームを、縦線のマーカーおよび数字（1〜4）によって示す。表1に3つの抗体混合物からのクロマトグラムを量で表す。（E）式Rs＝2(t2−t1）/(W1＋W2）［式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの時間を単位とする抗体の対応するピーク幅である］に基づく分離度（Rs）の計算を示す略図である。
【図６−２】図6-1の説明を参照のこと。
【図７Ａ】負荷抗体混合物および図6に示される分取陽イオン交換クロマトグラフィー分離から収集されたプール画分からの分析陽イオン交換クロマトグラム。（A）類似濃度のIgG1-1014-005-HCLC、IgG1-2F8-HCLC、IgG1-1021-511-HCLCおよびIgG1-1014-153。破線を使用して主ピークを識別する（a〜d）。抗体は、高分離度分析カラムで完全には分離せず、プールされた画分のいくつかは抗体混合物を含有する。
【図７Ｂ】負荷抗体混合物および図6に示される分取陽イオン交換クロマトグラフィー分離から収集されたプール画分からの分析陽イオン交換クロマトグラム。（B）類似濃度のIgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153。破線を使用して主ピークを識別する（a〜d）。抗体は、高分離度分析カラムで十分に分離され、プールされた画分は、分析陽イオン交換プロファイルの積分による推測で純度＞99％の抗体を含有する。
【図７Ｃ】負荷抗体混合物および図6に示される分取陽イオン交換クロマトグラフィー分離から収集されたプール画分からの分析陽イオン交換クロマトグラム。（C）IgG1-2F8-HB3LB3、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153。破線を使用して主ピークを識別する（a〜d）。抗体は、高分離度分析カラムで十分に分離され、プールされた画分は、分析陽イオン交換プロファイルの積分による推測で純度＞99％の抗体を含有する。
【図７Ｄ】負荷抗体混合物および図6に示される分取陽イオン交換クロマトグラフィー分離から収集されたプール画分からの分析陽イオン交換クロマトグラム。（D）異なる濃度のIgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153。破線を使用して主ピークを識別する（a〜d）。抗体は、高分離度分析カラムで十分に分離され、プールされた画分は、分析陽イオン交換プロファイルの積分による推測で純度＞99％の抗体を含有する。
【図７Ｅ】負荷抗体混合物および図6に示される分取陽イオン交換クロマトグラフィー分離から収集されたプール画分からの分析陽イオン交換クロマトグラム。（E）分取陽イオン交換クロマトグラフィー前のIgG1-2F8-HB3LB3、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153の非等モル混合物（上パネル）、ならびに分取クロマトグラフィーおよび再プール後の最終産物（下パネル）。表2にクロマトグラムを量で表す。
【図７Ｆ】負荷抗体混合物および図6に示される分取陽イオン交換クロマトグラフィー分離から収集されたプール画分からの分析陽イオン交換クロマトグラム。（F）分取陽イオン交換クロマトグラフィー前のIgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153の非等モル混合物（上パネル）、ならびに分取クロマトグラフィーおよび再プール後の最終産物（下パネル）。表2にクロマトグラムを量で表す。
【図８−１】（A）FreeStyle（商標）293-F細胞における一過性産生によって産生された物質を使用する、2g/L樹脂の負荷でのIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-K409RおよびIgG1-CD52-Campathの等モル混合物の分取陽イオン交換クロマトグラム。5つの抗体の分離からクロマトグラム中に3つの別個のピークを同定することができ、この実験において5つの抗体が分離を達成するには、それらの電荷特性の差では不十分であることを示している。K409R変異は抗体表面になく、結果として実効電荷に変化を生じないので、IgG1-CD19-21D4抗体の溶出挙動に顕著には影響しない。（B）FreeStyle（商標）293-F細胞における一過性産生によって産生された物質を使用する、2g/L樹脂の負荷でのIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの等モル混合物の分取陽イオン交換クロマトグラム。IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345KへのE345K変異の導入は、これらの抗体の保持時間を変化させ、これらのクロマトグラフィー条件でクロマトグラムに5つの分離されたピークを発生させる。（C）FreeStyle（商標）293-F細胞における一過性産生によって産生された物質を使用する、0.2g/L樹脂の負荷でのIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの等モル混合物の分取陽イオン交換クロマトグラム。溶出したピークを分画し、縦線のマーカーおよび数字（1〜5）によって示されるようにプールした。各実験において、280nmでの吸光度（実線）および伝導率（灰色の破線）をモニタリングした。
【図８−２】（D）ピークを個別に収集し（1〜5と表示）、陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析した。保持時間は、ピーク1〜5のそれぞれIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kとしての割り付けを可能にする。
【図８−３】（E）CHO細胞株から産生された物質を使用してIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの等モル混合物が0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、または50gの抗体混合物/L樹脂の総負荷で分離された個別の分離の縦に並んだクロマトグラムの溶出部分を示す負荷試験。280nmでの吸光度によって検出される5つの分離されたピークがすべての負荷で観察され、表3に量で表すように最高の負荷でピークのある程度の広がりが検出される。CHO細胞株から一過性産生された1つまたは複数の物質を使用した場合のクロマトグラムは類似している。
【図９Ａ】（A）順次段階溶出を用いるIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの混合物の分離を示す分取陽イオン交換クロマトグラム。混合物中の抗体の相対質量の計算に基づきIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kのそれぞれの負荷比を各パネルに示す。各分離物を分画し、縦線のマーカーおよび数字（1〜5）によって示されるようにプールした。280nmでの吸光度（実線）および伝導率（灰色の破線）をモニタリングした。表4にクロマトグラムを量で表す。
【図９Ｂ】（B〜E）分取クロマトグラフィー実験からの負荷物質の試料と並んで、4つの分画実験からの5つの画分のそれぞれを分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって個別に分析した。保持時間は、ピークa〜eのそれぞれIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kとしての割り付けを可能にする。各パネルにある比は、分取クロマトグラフィー実験前のIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kのインプット比を示す。
【図９Ｃ】図9Bの説明を参照のこと。
【図９Ｄ】図9Bの説明を参照のこと。
【図９Ｅ】図9Bの説明を参照のこと。
【図１０】カッパ軽鎖CLドメインの配列アライメント。（アロ）は、アロタイプバリエーションを示し；コンセンサス＋は、すべての交差反応性種に存在する保存された残基を示し；コンセンサス−は、非交差反応性種のうちの1つ（およびヒトラムダCL）に存在する「コンセンサス＋」残基を示し；PISA（界面）は、PDBePISAツール（http://pdbe.org/pisa/）によって決定された場合に露出表面積の＜50％がPDB 1HZH構造であるCL-VLおよびCL-CH1界面に位置する残基（＋）を示す（Krissinel, E. and Henrick, K.; J Mol Biol (372):774-97, 2007）；選択された残基（＊）を本研究でマウス等価残基に変異させた。EUナンバリングの取り決めを用いてアミノ酸残基をアノテートする（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。
【図１１】カッパ軽鎖VLドメインの配列アライメント。PDBePISAツール（http://pdbe.org/pisa/）を使用してPBD構造1HEZおよび1MHHを分析した（Krissinel, E. and Henrick, K.; J Mol Biol (372):774-97, 2007）。すべてのモデルでプロテインLとの界面にあると同定された残基に(＋）の印をつける。本研究では選ばれた残基（＊の印）を、カッパサブタイプV-II（P01617）またはラムダサブタイプV-1（P01699）配列に見出される等価の残基に変異させた。IMGTナンバリングを用いてアミノ酸残基をアノテートする（Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27, 55-77）。
【図１２−１】精製タンパク質（A）IgG1-2F8-F405L、または産生された（B）IgG1-2F8-F405L-mmF135L、（C）IgG1-2F8-F405L-V110D、（D）IgG1-2F8-F405L-E143Dおよび（E）IgG1-2F8-F405L-E165Dを含有する細胞培養上清を使用する修飾IgG1-2F8-F405Lバリアントの例示的なKappaSelect精製。280nmでの吸光度（実線）およびpH（灰色の破線）をモニタリングした。細胞培養上清からの精製は、カラム負荷の間にフロースルー中の未結合物質により上昇した吸光度を示す。特異的に結合したIgG1-2F8-F405LバリアントはpH3.0およびpH2.0で溶出し、それらを280nmでの吸光度におけるピークによって検出した。（F）SDS-PAGEを用いる修飾IgG1-2F8バリアントのKappaSelect精製からのフロースルー画分の分析。非還元SDS-PAGEゲルは、IgG1-2F8-F405L-mmF135L（レーン1）およびIgG1-2F8-F405L-V110D（レーン2）のフロースルー中にインタクトなIgG1バリアントのバンドを示すが、その他のIgG1-2F8-F405Lバリアントでは示さない（レーン3〜10）。他の主バンドを抗体フラグメントとして割り付ける。
【図１２−２】図12-1の説明を参照のこと。
【図１３−１】産生された（A）IgG1-7D8-K409R、（B）IgG1-7D8-K409R-V110R、（C）IgG1-7D8-K409R-V110K、（D）IgG1-7D8-K409R-V110D、（E）IgG1-7D8-K409R-V110E、（F）IgG1-7D8-K409R-V110Tを含有する細胞培養上清からの修飾IgG1-7D8-K409Rバリアントの例示的なCaptureSelect KappaXL分離。280nmでの吸光度（実線）およびpH（灰色の破線）をモニタリングした。すべての精製は、カラム負荷の間にフロースルー中の細胞培養上清由来の未結合物質により上昇した吸光度を示す。特異的に結合したIgG1-7D8-K409RバリアントはpH3.5で溶出し、それらを280nmでの吸光度におけるピークによって検出した。pH5.0の洗浄の間の280nmでのピークは、あまり強固に結合していない物質を示すのに対し、約30mLのグアニジン-HCl洗浄の間の280nmでのピークは、洗浄相および溶出相の間に抗体の不完全な溶出によって起こる。
【図１３−２】図13-1の説明を参照のこと。
【図１４】Bio-Layer干渉法およびCE-SDSを使用する修飾IgG1-7D8-K409RバリアントのCaptureSelect KappaXL分離からの画分の分析。（A）負荷試料、プールされたフロースルー試料およびプールされた溶出液試料中のIgG1-7D8-K409Rバリアントの濃度をbio-layer干渉法の測定から推測した。カッパ軽鎖の110位（EUナンバリングの取り決め）に異なるアミノ酸を有するIgG1-7D8-K409Rバリアントからのデータをグループ分けし、この位置のアミノ酸について一文字アミノ酸コードを使用して表示する。樹脂に対して検出可能な結合を示さないバリアントについて測定されたフロースルー中のタンパク質濃度は、精製実験の間のフロースルー試料の希釈の結果、負荷試料中よりも低い。（B）CE-SDSを用いる修飾IgG1-7D8-K409RバリアントのCaptureSelect KappaXL分離からの画分の分析。分子量標準に基づき較正された例示的な非還元CE-SDS電気泳動図は、IgG1-7D8-K409R、IgG1-7D8-K409R-V110D、IgG1-7D8-K409R-V110E、IgG1-7D8-K409R-V110K、IgG1-7D8-K409R-V110RおよびIgG1-7D8-K409R-V110Tの負荷試料において分子量およそ150kDaのインタクトなIgG1バリアントのバンドを示す。インタクトなIgG1バリアントは、CaptureSelect KappaXL樹脂へのIgG1-7D8-K409Rバリアントの相対結合に応じてフロースルーおよび/または溶出液中に検出される場合がある。より低い分子量のその他の主バンドは、抗体フラグメント、システム較正ピークまたは一過性産生実験による他の物質として割り付けられる。
【図１５】精製IgG-2F8-F405LバリアントのHiTrapプロテインL精製。精製された（A）IgG1-2F8-F405L、（B）IgG1-2F8-F405L-S9Lおよび（C）IgG1-2F8-F405L-S12Pの分離の間の280nmでの吸光度（実線）およびpHプロファイル（灰色の破線）を示すクロマトグラム。
【図１６−１】3つのアフィニティークロマトグラフィー樹脂について抗体バリアントの特異性を示すクロマトグラフィー実験。精製された（A）IgG1-2F8-V110D、（B）IgG1-7D8-S12P、（C）IgG1-HepCのHiTrapプロテインL分離。精製された（D）IgG1-2F8-V110D、（E）IgG1-7D8-S12P、（F）IgG1-HepCのHiTrap KappaSelect分離。（G）IgG1-2F8-V110D、（H）IgG1-7D8-S12P、（I）IgG1-HepCのHiTrap LambdaFabSelect分離。クロマトグラムは、分離の間の280nmでの吸光度（実線）およびpHプロファイル（灰色の破線）を示す。
【図１６−２】図16-1の説明を参照のこと。
【図１６−３】図16-1の説明を参照のこと。
【図１７】（A）4分、（B）2分、（C）1分の滞留時間でのHiTrap KappaSelectカラムへの精製IgG1-7D8-K409Rの負荷試験。クロマトグラムは、分離の間の280nmでの吸光度（実線）およびpHプロファイル（灰色の破線）を示す。負荷相の間の280nmでの吸光度における増加は、カラムが飽和するにつれカラムの負荷が結合能に近づいたことを示す。
【図１８】飽和条件下での混合物IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCのKappaSelect精製からのクロマトグラム。分離の間の280nmでの吸光度（実線）およびpH（灰色の破線）についてクロマトグラムをモニタリングした。負荷相の間の280nmでの吸光度における増加は、カラムが飽和するにつれカラムの負荷が結合能に近づいたことを示す。
【図１９】（A）精製IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCの分析陽イオン交換クロマトグラムを縦に並べたもの。（B）KappaSelect分離の前後のIgG1-HepC（アノテートA）、IgG1-7D8-S12P（アノテートB）およびIgG1-2F8-V110D（アノテートC）の混合物の分析陽イオン交換クロマトグラムを縦に並べたもの。表10にクロマトグラムを量で表す。
【図２０−１】（A）順次段階溶出を用いるIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの溶出の間の異なる塩濃度によるピーク形状のバリエーションを示す分取陽イオン交換クロマトグラムのオーバーレイ。280nmでの吸光度（破線）および緩衝液Bの％（実線）をモニタリングした。280nmでの吸光度におけるより高いピークは、より高いイオン強度を有する条件に対応する。（B）順次段階溶出を用いるIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの混合物の分離を示す分取陽イオン交換クロマトグラム。A280吸光度プロファイル（黒線）におけるベースラインが分離した5つのピークは、それぞれIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの溶出に対応する。緩衝液Bの％（灰色の線）をモニタリングした。
【図２０−２】（C）IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの2.5：1：2.5：1：2.5の負荷比を用いるデザインスペース実験の間に例示的な分取クロマトグラムを収集した。A280吸光度プロファイルにおける第1、第3および第5主ピーク内に（＊）で示した体積（実線；番号付き）は、IgG1-7D8、IgG1-CD37-37-3およびIgG1-CD52-Campath-E345Kの溶出の間にプールから取り出された、予め規定された可変体積30mLである。緩衝液Bの％（灰色の線）をモニタリングした。
【図２０−３】（D）IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの2.5：1：2.5：1：2.5の負荷比のデザインスペース実験のセットの間のIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの分析陽イオン交換クロマトグラムを縦に並べたもの。IgG1-7D8、IgG1-CD37-37-3およびIgG1-CD52-Campath-E345Kの廃液体積を増加させること（上から下に0mL、10mL、20mL、30mL、40mL）は、混合物からのこれらのタンパク質（それぞれ1、3、5と表示したピーク）の枯渇を引き起こす。
【図２０−４】（E〜F）プール中のタンパク質の量と、IgG1-7D8、IgG1-CD37-37-3およびIgG1-CD52-Campath-E345Kについての廃液画分のサイズとの関係を示す相関プロット。（V＝0）は、廃液体積＝0の精製からの分析陽イオン交換クロマトグラフィーから得られたタンパク質質量。
【図２０−５】H〜O インプット物質および最終産物の分析陽イオン交換クロマトグラムならびにIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの4つの混合物の分取陽イオン交換クロマトグラム。順次段階溶出を用いる混合物の分離を示す分取陽イオン交換クロマトグラムをパネルG、I、K、Mに示す。各クロマトグラフィー実験における廃液体積を（＊）で示す。280nmでの吸光度（黒線）および伝導率（灰色の線）をモニタリングした。インプット物質および最終産物の対応する分析陽イオン交換クロマトグラムは、それぞれパネルH、J、L、Nにあり、ピーク積分の境界を表示する。表12にクロマトグラムを量で表す。
【図２０−６】図20-5の説明を参照のこと。
【図２０−７】図20-5の説明を参照のこと。
【図２０−８】図20-5の説明を参照のこと。
【図２１−１】（A〜B）IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCの1：1：1（A）または1：1.5：2（B）混合物を負荷されたタンデムKappaSelect、LambdaFabSelectおよびプロテインLカラムの負荷を示す分取クロマトグラム。280nmでの吸光度をモニタリングし、クロマトグラム中に実線で示す。280nmでの吸光度は、負荷段階の間にプラトーに達し、カラムが飽和していることを示す。
【図２１−２】（C〜E）：KappaSelect（C）、プロテインL（D）およびLambdaFabSelect（E）カラムからのIgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCの1：1：1混合物の例示的な溶出。280nmでの吸光度、pHおよび伝導率をモニタリングした。特異的に結合したタンパク質を低pHで溶出し、280nmでの吸光度におけるピークによって検出した。（F）IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCの1：1：1混合物を含有する細胞培養上清からの抗体バリアントの混合物の例示的なプロテインA分離。280nmでの吸光度（実線）および伝導率またはpH（灰色の破線）をモニタリングした。精製は、カラム負荷の間にフロースルー中の細胞培養上清由来の未結合物質により上昇した吸光度を示す。特異的に結合した抗体バリアントをpH3.0で溶出させ、280nmでの吸光度におけるピークによって検出した。
【図２１−３】図21-2の説明を参照のこと。
【図２１−４】（G）IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepC上清の1：1：1もしくは1：1.5：2混合物、またはプロテインAアフィニティークロマトグラフィーもしくはKappaSelect、プロテインLおよびLambdaFabSelectカラムを使用するタンデムクロマトグラフィーによる精製後の抗体混合物の分析陽イオン交換クロマトグラムのセグメント。ピークを同定し、点線によって、個別に精製された基準タンパク質を基準にIgG1-HepC（1）、IgG1-7D8-S12P（2）およびIgG1-2F8-V110D（3）であると示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な開示
定義
「免疫グロブリン」という用語は、1対の軽鎖（LC）および1対の重鎖（HC）の、2対のポリペプチド鎖からなる糖タンパク質であって、4つがすべてジスルフィド結合によって相互接続されている、構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指す。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている。例として、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）を参照されたい。簡潔には、各重鎖は、典型的には重鎖可変領域（本明細書においてVHと略す）および重鎖定常領域（CH）から構成される。重鎖定常領域は、典型的には3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3から構成される。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」中のジスルフィド結合を介して相互に接続されている。各軽鎖は、典型的には軽鎖可変領域（本明細書においてVLと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、典型的には1つのドメイン、CLから構成される。CLは、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）アイソタイプであることができる。本明細書において、定常ドメインおよび定常領域は、互換的に使用される。
【００２０】
特に述べない場合、定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)に記載されるようなEUインデックスに基づく。VHおよびVL領域は、より大きく保存されたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域が散在する、相補性決定領域（CDR）とも名づけられる超可変性領域（または配列および/もしくは構造的に定義されたループの形態が超可変であり得る超可変領域）にさらに細分される場合がある。各VHおよびVLは、典型的にはアミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配列する3つのCDRおよび4つのFRから構成される（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)も参照されたい）。可変領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、状況と矛盾しないかぎり、Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27, 55-77に記載されるようなIMGTナンバリングに従う。
【００２１】
本発明に関連して、抗体とクロマトグラフィー樹脂との相互作用を変化させ得る置換は、アミノ酸を、下表に表される異なるクラスのアミノ酸のうちの1つに変化させることによる置換の場合がある。
【００２２】
置換のためのアミノ酸残基のクラス：
2021528435.tif 000002
【００２３】
ヒスチジンのイミダゾリウム基は、およそ6.0のpKaを有するので、溶液のpHおよびヒスチジン残基の局所化学環境に応じて中性または塩基性であることができる。
【００２４】
本発明に関連して、特に示さないかぎり、アミノ酸修飾を記載するために以下の表示法が使用される；修飾されたアミノ酸の名称、続いて修飾された位置の番号、続いて修飾によってもたらされるもの。したがって、修飾が置換である場合、以前のアミノ酸を置き換えるアミノ酸の名称がその後に入れられ、アミノ酸が欠失される場合、＊が入れられ、修飾が付加である場合、付加されるアミノ酸が入れられる。アミノ酸の名称は、一文字または三文字コードの場合がある。したがって、例えば409位のリシンのアルギニンによる置換はK409Rであり、409位のリシンの任意のアミノ酸による置換はK409Xであり、409位のリシンの欠失はK409＊で示され、K409位でのリシンの後のPの付加はK409KPで示される。修飾を導入する方法は、当業者に周知である。
【００２５】
本明細書において使用される婆、「Fc領域」および「Fcドメイン」という用語は、互換的に使用され、少なくともヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む抗体領域を指す（例えば、Kabat EA, in US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, Edn. 5th edition 662, 680, 689 (1991)を参照されたい。Fc領域は、抗体のパパイン消化によって生成する場合があり、その際Fc領域は、それによって得られる、免疫グロブリンの2つのCH2-CH3領域およびヒンジ領域を含むフラグメントである。抗体重鎖の定常ドメインは、抗体のアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgEを定義する。Fcドメインは、Fcレセプターと呼ばれる細胞表面レセプターおよび補体系タンパク質と共に抗体のエフェクター機能を媒介する。
【００２６】
「CH1領域」または「CH1ドメイン」という用語は互換的に使用され、本明細書において使用される場合、免疫グロブリンのCH1領域を指すことが意図される。したがって、例えばヒトIgG1抗体のCH1領域は、EUナンバリングシステムに従うアミノ酸118〜215に対応する。しかし、CH1領域はまた、本明細書において記載されるその他の抗体アイソタイプのいずれかの場合もある。
【００２７】
「CH2領域」または「CH2ドメイン」という用語は、互換的に使用され、本明細書において使用される場合、免疫グロブリンのCH2領域を指すことが意図される。したがって、例えばヒトIgG1抗体のCH2領域は、EUナンバリングシステムに従うアミノ酸228〜340に対応する。しかし、CH2領域はまた、本明細書に記載されるその他の抗体アイソタイプのうちのいずれかの場合もある。
【００２８】
「CH3領域」または「CH3ドメイン」という用語は、互換的に使用され、本明細書において使用される場合、免疫グロブリンのCH3領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH3領域は、EUナンバリングシステムに従うアミノ酸341〜447に対応する。しかし、CH3領域はまた、本明細書に記載されるその他の抗体アイソタイプのうちのいずれかの場合もある。
【００２９】
「抗体」という用語は、典型的な生理条件下で、少なくとも約30分、少なくとも約45分、少なくとも約1時間（h）、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間（h）、約24時間もしくはそれより長い時間、約48時間もしくはそれより長い時間、約3、4、5、6、7日もしくはそれより長い日数などのようなかなりの期間、または任意の他の関連する機能的に定義される期間（抗原への抗体結合と関連する生理学的応答を誘導、促進、増強、阻害および/もしくは調節するのに十分な時間、ならびに/または抗体がエフェクター活性を動員するのに十分な時間）の半減期で抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子のフラグメント、またはそれらのいずれかの誘導体を含む。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体（Ab）の定常領域は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）ならびに補体活性化古典経路の第1成分であるC1qのような補体系の成分を含む、宿主の組織または因子への免疫グロブリン分子の結合を媒介する場合がある。あるいは、定常領域は、不活性であるまたは非活性化的である場合があり、それにより、少なくともいかなるFcガンマレセプター（FcgR）と結合することも、FcgRのFc媒介架橋を誘導することも、個別の抗体の2つのFc領域を介して標的抗原のFcgR媒介架橋を誘導することもできず、C1qと結合することもできない。抗体はまた、二重特異性抗体、ダイアボディー（diabody）、多重特異性抗体または類似の分子の場合もある。抗体は、1つだけのエピトープに結合する/特異性を有する点で、単一特異的な親和性を有することができる。あるいは、1つの抗体分子が、複数の抗原上のエピトープおよび/または同じ抗原上の複数のエピトープに結合することができる/特異性を有するという意味で、抗体は、多重特異的な親和性を有する場合がある。「抗体」という用語は、以下に定義される、組換え抗体、ダイアボディー分子および「多重特異性抗体」、「二重特異性抗体」、「ヒト化抗体」、「ヒト抗体」、「キメラ抗体」、「完全長抗体」、および重鎖抗体または類似の分子を含む。
【００３０】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一の一次アミノ酸配列を有する、組換え産生された抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスなどのトランスジェニックまたは染色体導入非ヒト動物から得られたB細胞が不死化細胞と融合したものを含むハイブリドーマによって生成される場合がある。
【００３１】
本明細書において使用される用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体定常ドメインと、ヒト可変ドメインに対して高レベルの配列相同性を含有するように修飾された非ヒト可変ドメインとを含有する、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒になって抗原結合部位を形成する6つの非ヒト抗体相補性決定領域（CDR）を相同ヒトアクセプターフレームワーク領域（FR）上に移植することによって、達成することができる（WO92/22653およびEP0629240参照）。親抗体の結合親和性および特異性を完全に再構成するには、親抗体（すなわち非ヒト抗体）からのフレームワーク残基をヒトフレームワーク領域中に置換すること（復帰変異）が必要とされる場合がある。構造相同性モデリングは、抗体の結合特性にとって重要なフレームワーク領域中のアミノ酸残基を同定するのに役立ち得る。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトCDR配列、任意で非ヒトアミノ酸配列への1つまたは複数のアミノ酸復帰変異を含む主としてヒトのフレームワーク領域、および完全にヒトの定常領域を含み得る。任意で、親和性および生化学的特性などの好ましい特徴を有するヒト化抗体を得るために、必ずしも復帰変異ではない追加のアミノ酸修飾が適用される場合がある。
【００３２】
本明細書において使用される用語「キメラ抗体」は、可変領域が非ヒト種に由来し（例えば齧歯類に由来し）、定常領域がヒトなどの異なる種に由来する抗体を指す。キメラ抗体は抗体操作によって生成される場合がある。「抗体操作」は、さまざまな種類の抗体修飾に広く使用される用語であり、当業者には周知のプロセスである。特にキメラ抗体は、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15に記載される標準的DNA技法を用いて生成される場合がある。したがってキメラ抗体は、遺伝子的または酵素的に操作された組換え抗体であり得る。キメラ抗体を生成することは当業者に公知であるので、本発明によるキメラ抗体の生成は、本明細書に記載される方法以外の方法で行われる場合がある。治療応用用のキメラモノクローナル抗体は抗体の免疫原性を低減するために開発される。それらは、典型的には関心対象の抗原に特異的な非ヒト（例えばマウス）可変領域と、ヒト定常抗体重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインとを含有する場合がある。キメラ抗体に関連して使用される用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方のCDRおよびフレームワーク領域を含む領域を指す。
【００３３】
「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも2つの異なるエピトープ、典型的にはオーバーラップしていないエピトープに対する特異性を有する抗体、または2つの別個の抗原結合部位を含有する抗体を指す。二重特異性抗体は、ヘテロ二量体タンパク質として記載される場合があり、一方で単一特異性抗体は、ホモ二量耐性タンパク質として記載される場合がある。上記のように、本明細書における抗体という用語は、特に述べないかぎり、または状況と明らかに矛盾しないかぎり、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメントを含む。そのようなフラグメントは、酵素切断、ペプチド合成および組換え発現技法などの任意の公知の技法によって提供される場合がある。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメント、例えばFabまたはF（ab'）2フラグメントによって行われる場合があることが示されている。抗体という用語は、特に明記されないかぎり、モノクローナル抗体（mAb）、抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体も含むこともまた理解されるべきである。生成される抗体は、任意のアイソタイプを有することができる。
【００３４】
「多重特異性抗体」という用語は、2つよりも多い異なるエピトープ、典型的にはオーバーラップしていないエピトープに対して特異性を有する抗体または2よりも多い別個の抗原結合部位を含有する抗体を指す。上記のように、本明細書における抗体という用語は、特に述べないかぎり、または状況と明らかに矛盾しないかぎり、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメントを含む。そのようなフラグメントは、酵素切断、ペプチド合成および組換え発現技法などの任意の公知の技法によって提供される場合がある。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメント、例えばFabまたはF（ab'）2フラグメントによって行われる場合があることが示されている。抗体という用語は、特に明記されないかぎり、モノクローナル抗体（mAb）、抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体も含むこともまた理解されるべきである。生成される抗体は、任意のアイソタイプを有することができる。
【００３５】
「完全長抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、当該アイソタイプの抗体に通常見出される重鎖および軽鎖定常および可変ドメインをすべて含有する抗体を指す。
【００３６】
本明細書において使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、またはIgM）を指す。
【００３７】
本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むように意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムもしくは部位特異的な変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含む場合がある。しかし、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されない。
【００３８】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面グルーピングからなり、通常、特異的三次元構造特徴のみならず、特異的電荷特徴を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合が失われるが、後者に対する結合は失われないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与しているアミノ酸残基、および抗原結合ペプチドによって有効に遮断されるアミノ酸残基（換言すると、アミノ酸残基が抗原結合ペプチドのフットプリント内である）などの、結合に直接関与していない他のアミノ酸残基を含み得る。
【００３９】
所定の抗原に対する抗体の結合の状況で本明細書において使用される「結合」という用語は、典型的には、例えばOctet HTX装置を用いるBioLayer干渉法（BLI）によって、抗体をリガンドとして、抗原を分析物として使用して決定される場合、約10-6M以下、例えば10-7M以下、例えば約10-8M以下、例えば約10-9M以下、約10-10M以下、または約10-11Mまたはそれよりもいっそう小さいKDに対応する親和性を有する結合であって、抗体が、所定の抗原または密接に関係する抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）に対する結合のそのKDよりも少なくとも10倍低い、例えば少なくとも100倍低い、例えば少なくとも1,000倍低い、例えば少なくとも10,000倍低い、例えば少なくとも100,000倍低いKDに対応する親和性を有する所定の抗原に結合する、結合である。結合のKDがより低い量は、抗体のKDに依存し、その結果、抗体のKDが非常に低い場合、抗原に対する結合のKDが非特異的抗原に対する結合のKDよりも低い量は、少なくとも10,000倍であり得る（換言すると、抗体は高度に特異的である）。本明細書において使用される「KD」（M）という用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡定数を指す。本明細書において使用される親和性およびKDは、逆相関し、換言すると、より高い親和性はより低いKDを指すように意図され、より低い親和性はより高いKDを指すように意図される。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用」という用語は、第1のCH3/第2のCH3ヘテロ二量体タンパク質における第1のCH3領域と第2のCH3領域との間の相互作用を指す。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「第1のCH3領域と第2のCH3領域とのホモ二量体相互作用」という用語は、第1のCH3/第1のCH3ホモ二量体タンパク質における第1のCH3領域と別の第1のCH3領域との間の相互作用、および第2のCH3/第2のCH3ホモ二量体タンパク質における第2のCH3領域と別の第2のCH3領域との間の相互作用を指す。
【００４２】
本明細書において使用される「単離された抗体」は、その物質がその本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合は自然環境、またはそれが組換え発現される場合は宿主細胞、宿主細胞の培養物、もしくはその上清）から取り出されたことを意味する。また、抗体が精製された形態であることが有利である。「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、出発物質と比較して組成物中の混入物の濃度に対する抗体濃度が増加していることを示す、相対的な定義として意図される。
【００４３】
「抗体混合物」、「ポリクローナル混合物」、および「ポリクローナル抗体混合物」という用語は、所定の分子組成の2つ以上の異なる組換え抗体の混合物を記載するために互換的に使用される。所定の分子組成の2つ以上の異なる抗体の混合物は、当該混合物の産生前に分子の同一性が公知である、または公知であることができる抗体の混合物を指すように意図される。抗体の分子同一性は、抗体のアミノ酸配列を決定することによって定義することができる。所定の分子組成の混合物は、異なる発現もしくは産生システムから、例えば組換え修飾された宿主細胞から、ハイブリドーマから、または核酸配列のインビトロ転写および/もしくは翻訳を支持する細胞抽出物を使用して、収集することができる。例えば外来抗原または抗原の組み合わせによる免疫処置に応答した、ヒト、動物、またはトランスジェニック動物の血液、血漿、または血清から単離されたポリクローナル抗体混合物は、本出願に関連して、所定の分子組成の混合物でないと見なされる。混合物中の1つまたは複数の抗体が、組換え修飾された宿主細胞を使用して産生される場合、「抗体混合物」は、「組換え抗体混合物」と称される場合がある。本明細書において使用される「組換え修飾された宿主細胞」は、発現ベクター、例えば抗体をコードする発現ベクターが導入された細胞を指すように意図される。組換え宿主細胞は、例えば、トランスフェクトーマ、例えばCHO細胞、HEK293細胞、NS/0細胞、およびリンパ球を含む。
【００４４】
本明細書において使用される「アウトプット混合物」という用語は、2つ以上の異なる抗体が所望または所定の濃度比で存在する抗体混合物を指すように意図される。しかし、当業者が理解するように、アウトプット混合物における所望または所定の比からの幾分の偏差が許容され得る。これは、特に、偏差がアウトプット混合物またはアウトプット混合物から産生された原薬または製剤の機能性に本質的に測定可能な効果を有しない場合に当てはまる場合がある。特に、これは、アウトプット混合物、原薬または製剤の薬学的効果および安全性プロファイルを決定するために行われる関連する前臨床試験および臨床試験において偏差の効果が決定できない場合に当てはまる。したがって、任意の2つの抗体の所望または所定の濃度比は、所望または所定の濃度比からの許容偏差の規格、ならびに抗体の濃度比の許容される上限および下限と共に定義することができる。
【００４５】
したがって、アウトプット混合物を産生するプロセスであって、2つ以上の異なる抗体が、アウトプット混合物中に本質的に所望または所定の濃度比で存在するプロセスを提供することもまた、本発明の範囲内である。特に、それぞれの濃度の比が所望または所定の濃度比から許容偏差内である場合、任意の2つの抗体は、本質的に所望または所定の濃度比で存在すると見なされる場合がある。2つ以上の異なる抗体のうちの任意の2つについて、所望または所定の濃度比からの最大許容偏差は、例えば75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、または2.5％であり得る。
【００４６】
一例では、2つの抗体が、1（1：1）である所望または所定の濃度比で存在するアウトプット混合物が、本発明により提供される。所望または所定の濃度比からの許容偏差が10％の場合、2つの抗体間の濃度比が0.9〜1.1であるアウトプット混合物は、2つの抗体が本質的に所望または所定の濃度比で存在するアウトプット混合物と見なされる。同様に、所望または所定の濃度比からの許容偏差が10％の場合、2つの抗体が0.5（1：2）である所望または所定の濃度比で存在するアウトプット混合物について、2つの抗体間の濃度比が0.45〜0.55であるアウトプット混合物は、2つの抗体が本質的に所望または所定の濃度比で存在するアウトプット混合物と見なされる。
【００４７】
本明細書において使用される「インプット混合物」という用語は、「アウトプット混合物」に関連して参照される2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも2つが、所望もしくは所定の濃度比ではなく、かつ/または所望もしくは所定の濃度比からの許容偏差内にない濃度比で存在する、抗体混合物を指すように意図される。
【００４８】
「純度」という用語が、本発明によるプロセスで収集された画分に適用される場合、「純度」は、好ましくは、特定の抗体と異なるアミノ酸配列を有する1つまたは複数の抗体を含む他のタンパク質またはタンパク質性物質の量と比べた、モノクローナル抗体などの特定の抗体の量の尺度である。例として、本開示が、特定の抗体を少なくとも80％の純度で含有する画分を収集することを教示する、または複数のそのような画分をプールすることを教示する場合、各画分中の特定の抗体の量が、画分中のモノクローナル抗体などの他の抗体を含む他のタンパク質またはタンパク質性物質の合計量の少なくとも80％であることが必要である。「純度」の決定のために抗体の相対量は、すべて、重量/重量（w/w）ベースで決定または計算される］。
【００４９】
明細書において使用される「宿主細胞」という用語は、発現ベクター、例えば本発明の抗体をコードする発現ベクターがその中に導入されている細胞を指すように意図される。組換え宿主細胞は、例えばトランスフェクトーマ、例えばCHO細胞、HEK293細胞、NS/0細胞、およびリンパ球を含む。
【００５０】
本明細書において使用される場合の2つ以上の核酸構築物の「同時発現」という用語は、単一の宿主細胞における2つの構築物の発現を指す。
【００５１】
本明細書において使用される場合の、2つ以上の抗体の「同時産生」という用語は、バイオリアクターなどの単一の容器中での2つ以上の抗体の組換え産生を指す。
【００５２】
本明細書において使用される場合の「抗体比」は、混合物中の異なる抗体の比を指す。これは、混合物中の抗体の質量比またはモル比であることができる。抗体比は、分析クロマトグラフィー、質量分析または生物分析法などの分析法から推測することができる。
【００５３】
「所定の比」、「所定の濃度比」および「所定の抗体比」という用語は、所与の適用のための混合物中の抗体の必要抗体比を記載するために互換的に使用される。所定の比は、各抗体の相対比の許容される上限および下限を定義する規格により定義することができる。
【００５４】
本明細書において使用される「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識相および活性化相とは対照的に、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、骨髄系またはリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（細胞傷害性T細胞（CTL）を含むB細胞およびT細胞など）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば好中球、顆粒球、マスト細胞、および好塩基球を含む。いくつかのエフェクター細胞は特異的Fcレセプターを発現し、特異的免疫機能を実行する。いくつかの態様では、エフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞のように抗体依存性細胞傷害（ADCC）を誘導することができる。いくつかの態様では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食する場合がある。
【００５５】
「還元条件」または「還元環境」という用語は、抗体のヒンジ領域における鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にするのに十分な条件を指す。
【００５６】
「樹脂」という用語は、化学基または生体分子などのリガンドで修飾されたマトリックスであって、クロマトグラフィー適用における使用のための結合特性を有するマトリックスを提供するためのものを指す。クロマトグラフィーマトリックスは、ビーズ、一体化した支持体、フィルター、メンブランおよびゲルを含む。
【００５７】
本明細書において使用される場合の「アフィニティー試薬」という用語は、マトリックス上に固定化されたリガンドを含有する樹脂であって、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面基（surface grouping）に特異的に結合し、通常、特異的三次元構造特徴のみならず、特異的電荷特徴を有する樹脂を指す。アフィニティー試薬は、精製がリガンドと産物との間の特異的相互作用によって可能になるアフィニティークロマトグラフィーにおけるツールである。
【００５８】
本明細書において使用される場合の「プロテインL」という用語は、マトリックス上に固定化されて、免疫グロブリンカッパ軽鎖の可変ドメインのサブセットに対して親和性を有する親和性リガンドを形成する、組換えプロテインLを指す。例えば、プロテインLアフィニティー試薬は、GE HealthcareによってHiTrap（商標）プロテインLおよびCapto（商標）Lとして市販されていることができる。
【００５９】
本明細書において使用される場合の「LambdaFabSelect」という用語は、マトリックス上に固定化されて、ヒト免疫グロブリンラムダ軽鎖の定常ドメインに対して親和性を有する親和性リガンドを形成する、組換え13kDaラクダ由来一本鎖抗体を指す。例えば、LambdaFabSelectアフィニティー試薬は、GE HealthcareによってLambdaFabSelect（商標）として市販されていることができる。
【００６０】
本明細書において使用される場合の「KappaSelect」という用語は、マトリックス上に固定化されて、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖の定常ドメインに対して親和性を有する親和性リガンドを形成する、組換え13kDaラクダ由来一本鎖抗体を指す。例えば、KappaSelectアフィニティー試薬は、GE HealthcareによってKappaSelect（商標）としても市販されていることができる。
【００６１】
本明細書において使用される場合の「KappaXL」という用語は、マトリックス上に固定化されて、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖の定常ドメインに対して親和性を有する親和性リガンドを形成する、組換え13kDaラクダ由来一本鎖抗体を指す。例えば、KappaXLアフィニティー試薬は、Thermo FisherによってCaptureSelect（商標）KappaXLとしても市販されていることができる。
【００６２】
本明細書において使用される場合の「IgG-CH1」という用語は、マトリックス上に固定化されて、ヒトCH1ドメインに対して親和性を有する親和性リガンドを形成する、組換え13kDaラクダ由来一本鎖抗体を指す。例えば、IgG1-CH1アフィニティー試薬は、Thermo FisherによってCaptureSelect（商標）IgG-CH1としても市販されていることができる。
【００６３】
「処置」という用語は、症状または病状を緩和、寛解、停止または根絶（治癒）する目的での、本発明のモノクローナル抗体などの異なる抗体の治療活性混合物の有効量の投与を指す。
【００６４】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量を指す。本発明のモノクローナル抗体などの異なる抗体の治療活性混合物の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに結合作用物質が個体において所望の応答を誘発する能力に応じて変動する場合がある。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が本発明のモノクローナル抗体などの異なる抗体の混合物の任意の有毒または有害作用を上回る量でもある。
【００６５】
本発明に関連して、「活性薬剤」という用語は、製剤（医薬物）の製造に使用されるように意図される任意の物質または物質の混合物であって、薬物の産生に使用される場合、製剤の活性成分になる任意の物質または物質の混合物として定義される。そのような物質は、疾患の診断、治癒、軽減、処置、もしくは予防に薬理学的活性もしくは他の直接効果を与えるように、または身体の構造および機能に影響するように意図される。この定義は、医薬品規制調和国際会議（ICH）（http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q7/Step4/Q7_Guideline.pdfから入手可能な"ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE, GOOD MANUFACTURING PRACTICE GUIDE FOR ACTIVE PHARMACEUTICAL INGREDIENTS, Q7; Current Step 4 version, dated 10 November 2000を参照されたい）および米国食品医薬局（FDA）（https://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070273.pdfから入手可能なGuidance for Industry CGMP for Phase 1 Investigational Drugs, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) Office of Regulatory Affairs (ORA) July 2008を参照されたい）によって採択された「活性薬学的成分（Active Pharmacutical Ingredient）」の定義と一致する。
【００６６】
本発明のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）のNeedleプログラムの好ましくはバージョン5.0.0以降で実行されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch、1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて決定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティー10、ギャップ伸長ペナルティー0.5、およびEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と表示されるNeedleの出力（-nobriefオプションを用いて得られる）が、同一パーセントとして使用され、以下のように計算される：
（同一の残基×100）/（アライメント長−アライメント中のギャップの総数）。
【００６７】
類似残基の保持は、BLASTプログラムの使用によって（例えば、NCBIから入手可能なBLAST 2.2.8を標準的な設定BLOSUM62、オープンギャップ＝11および伸長ギャップ＝1で使用して）決定される類似性スコアにより同様にまたは代替的に測定される場合がある。
【００６８】
本発明のさらなる局面および態様
本発明は、一態様では、クロマトグラフィーによる抗体の分離を可能にする差をアミノ酸配列中に有する2つ以上の異なる抗体のアウトプット混合物を産生するための方法であって、
2つ以上の異なる抗体が、アウトプット混合物中に所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在し；
該方法が、
（a）2つ以上の異なる抗体が所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在していないインプット混合物を提供する段階；
（b）クロマトグラフィーによって2つ以上の抗体を分離する段階；
（c）2つ以上の抗体を、アウトプット混合物を提供するために必要な量で回収する段階
を含む、方法に関する。
【００６９】
本明細書によって、2つ以上の異なる抗体の制御された混合物を産生するための新規な方法が提供される。本方法は、異なる抗体の各々の同じ相対量を、インプット混合物中に提供される異なる抗体の濃度と無関係にアウトプット混合物中に得ることができるという利点を有する。したがって、異なる抗体のそれぞれの産物収量における変動性は、この方法により補正することができることにより、アウトプット混合物は所望の所定の比の抗体を得るように規準化される。
【００７０】
本発明によるプロセスは、特に、2つ以上の異なる抗体を含む抗体混合物である製剤または医薬物の製造における適用のために意図される。それに関連して、原薬を産生するために、本発明のプロセスが使用される場合があり、該原薬において、2つ以上の抗体の量または濃度、および2つ以上の抗体の濃度の比は、抗体濃度の比を変更または実質的に変更するためのいかなる追加的な手段も措置もなしに該原薬を適用製剤規格の必要条件に適合する組成物へと製剤化することができるようにするものである。
【００７１】
製剤規格は、配布されるために製剤バッチが満たさなければならない様々な基準を明記するものである。数種の抗体の制御された混合物である製剤について、製剤規格は、各々の個別の抗体について、各抗体の濃度比または相対量が入らなければならない範囲を明記する。一般に、初期臨床開発では、製剤規格によって明記されるそのような範囲は、エクスビボおよびインビボ試験から得られる前臨床データに基づく。開発プロセスのこの段階で明記される範囲は、一般的に比較的広い。臨床開発プロセスが進むにつれ、この範囲は臨床試験および製造プロセスからのデータに基づき修正される場合がある。当業者であれば分かるように、製剤規格は開発を通じて流動的であって、薬物を市販できる前に当局によって承認されなければならない。製剤の複数の連続するバッチにおいて抗体のうちの1つまたは複数の抗体の相対量が決定待ちの製剤規格に明記されるそれぞれの1つまたは複数の範囲に十分に入るという製造業者による成績を受けて、規制当局は、例えば製剤規格に明記される許容される比の範囲を狭める必要がある場合がある。
【００７２】
したがって、本発明に関連して、2つ以上の異なる抗体がアウトプット混合物中に存在する所望または所定の濃度比および所望または所定の濃度比からの許容偏差は、製剤規格の必要条件に対応する場合がある。あるいは、所定の濃度比は、製剤規格の濃度比に対応する場合があり、比からの許される偏差は製剤規格において許される比よりも小さい。それは、アウトプット混合物中の各抗体の相対量が製剤規格に明記される範囲の限界に決して近づかないことをこれが保証するからである。規制当局が濃度比の容認される範囲を変更する必要がある場合、本発明のプロセスのために確立された所定の濃度比および/またはそれからの許される偏差がそれに応じて変更される場合もあることになる。
【００７３】
各抗体の相対量に加えて、製剤規格は、抗体の合計量または製剤の合計タンパク質濃度を規定する場合がある。製剤規格によって規定されるさらなる基準は、例えば標的値およびそれからの容認される偏差によって定義されるpH、例えば許容される範囲によって定義される重量モル浸透圧濃度、例えば上限によって定義される宿主細胞タンパク質の含有量、産物の色および透明性ならびに視認可能および肉眼不可視の粒子の含量を含む場合がある。これらの基準のいずれかが、本発明により提供されるアウトプット混合物もしくは原薬および/またはアウトプット混合物もしくは原薬を製剤化することによって得られる医薬物に適用される場合がある。
【００７４】
本発明による方法では、アウトプット混合物は原薬であり得る。
【００７５】
いくつかの態様では、本発明のプロセスは、原薬を産生するためにアウトプット混合物を処理することであって、2つ以上の異なる抗体は、上に特定される所望または所定の濃度比と同じである濃度比または本質的に該濃度比で存在する、該処理することをさらに含む。さらなる態様では、本発明のプロセスは、製剤を産生するためにアウトプット混合物を処理することであって、2つ以上の異なる抗体は、上に特定される所望または所定の濃度比と同じである濃度比で存在するまたは本質的に存在する、該処理することをさらに含む。
【００７６】
他の態様では、2つ以上の抗体の相対量および2つ以上の抗体の濃度の比が適用製剤規格に従う原薬または製剤を産生するために、アウトプット混合物は、抗体濃度の比を変更するまたは実質的に変更するためのいかなる追加的な手段も措置もなしに処理される。混合物の2つ以上の異なる抗体が、各抗体を別々に産生および精製する必要なしに平行して産生、精製および回収される場合があることが、本発明の別の利点である。これは、製造プロセスを簡略にするので、各抗体を別々に精製し、続いてそれらを正しい比で混合することと比べて混合物の産生コストを節約する場合がある。
【００７７】
したがって、本発明の方法は、上流プロセスからのインプット混合物中に提供される異なる抗体の濃度が十分には制御または調節されていない場合に、所定の比の様々な異なる抗体の濃度を有する2つ以上の異なる抗体の制御されたアウトプット混合物を、下流のプロセス制御によって産生する効率的な新しい方法を提供する。
【００７８】
本発明の一態様では、混合物のための異なる抗体が別々の宿主細胞によって産生され、続いて例えば抗体の定常領域に対する親和性に基づき抗体を捕捉することで、抗体を細胞物質から分離する、例えばプロテインAまたはプロテインGの使用などの公知の方法によって最初に精製される。したがって一態様では、本方法のために提供される抗体は、最初に異なる抗体間の比の規準化なしに精製されている場合がある。この規準化は、本方法において混合物の異なる抗体がすべて所定の比で回収される、1つまたは複数の段階のクロマトグラフィーによって得られる。異なる抗体がクロマトグラフィー段階ですべて回収および規準化されるので、混合物の異なる抗体が所与のクロマトグラフィー方法によって分離可能であることが、本方法の重要な特徴である。異なる抗体は、クロマトグラフィーを用いて分離することができ、必要な組成を超えて存在する抗体が産物から枯渇されて、必要な組成をもたらす場合がある。あるいは、クロマトグラフィーを用いて異なる抗体を分離し、分画し、所望の組成で再プールすることができる。したがって、抗体がクロマトグラフィーによって最初に分離不能であることが見出される場合、抗体のうちの1つまたは複数は、分離を可能にするように修飾されなければならないであろう。好ましい態様では、本方法は、単一のクロマトグラフィー樹脂を好ましくは一段階で使用する。段階（c）において、2つ以上の異なる抗体を含有する、段階（b）で産生された溶出液またはフロースルーの一部を収集することによって、2つ以上の抗体が回収される場合がある。
【００７９】
本発明による方法では、インプット混合物中の各結合特異性および/または各抗体電荷バリアントがアウトプット混合物中にも見出されることが好ましい。
【００８０】
本発明による方法では、段階（c）は、2つ以上の抗体を同一プールまたは画分中に回収し、それによりアウトプット混合物を得ることを含む場合がある。あるいは、段階（c）は、2つ以上の抗体を複数のプールまたは画分中に回収し、かつ該複数のプールもしくは画分をまたは該複数のプールもしくは画分の一部を組み合わせ、それによりアウトプット混合物を得ることを含む場合がある。
【００８１】
本発明による方法では、段階（b）におけるクロマトグラフィーは、好ましくは、溶出液およびフロースルーを産生し、アウトプット混合物は、
i）溶出液を収集し、かつフロースルーを捨てること、または
ii）溶出液を捨て、かつフロースルーを収集すること
によって産生される場合がある。
【００８２】
図1Bに図解される本発明の特定の態様では、段階（b）は、クロマトグラフィー段階の条件を、該条件下での所与の抗体に対する総結合能が、アウトプット混合物を提供するために必要なこの抗体の量を維持するのに十分であるように、調整することを含む。
【００８３】
図1Dに図解される本発明の特定の態様では、段階（b）は、クロマトグラフィー段階の条件を、該条件下での所与の抗体に対する総結合能が、アウトプット混合物を提供するために必要な量を超える各抗体の量を維持するのに十分であるように、調整することを含む。
【００８４】
本発明の一態様では、本方法は、所定の比の2つ以上の異なる抗体を回収するための2つ以上の抗体の分離、および抗体のうちの過剰な1つまたは複数の抗体の枯渇を含む。クロマトグラフィー溶出液の所望の画分は、習慣的に廃液容器または収集容器のいずれかに溶出液流を方向づけるバルブを制御することによって収集される。過剰な1つまたは複数の抗体を枯渇させるために、分析アッセイを用いて所定の過剰なタンパク質を廃液容器に方向づけることができる。各抗体は、通常、電荷バリアントの集合として溶出し、その分布は、適正なプロセス制御により製造バッチ間で維持されて、バッチ間の一貫性を保証する。イオン交換樹脂または混合モード樹脂の溶出の間に比電荷により分離された抗体画分を廃液容器内に再方向付けすることによって過剰なタンパク質が抜き取られる場合、これは、収集された抗体画分の電荷分布に影響する場合がある。本発明の一態様では、インプット混合物中の各個別の抗体の電荷分布は、アウトプット混合物中に回収される。
【００８５】
本発明の一態様では、溶出される抗体ピークの期間全体にわたり廃液位置と収集位置との間で溶出スイッチバルブを切り替えることによって、インプット混合物中の各個別の抗体の電荷分布はアウトプット混合物中に回収される。溶出位置に割り当てられる時間遅延に対する廃液位置に割り当てられる時間遅延により、ピークの期間全体にわたり枯渇される相対量の制御が可能になる。それに続く廃液/収集サイクルの頻度が、電荷分布が維持される分離度を規定する。
【００８６】
本発明の別の態様では、インプット混合物中の各個別の抗体の電荷分布は、廃液容器と収集容器との間の溶出液流の動的分布を可能にする調整可能な分流弁または調整可能なフロースプリッターを使用することによってアウトプット混合物中に回収される。調整可能な分流弁または調整可能なフロースプリッターを使用して、溶出液流の所定の画分を廃液容器内に方向付け、同時に溶出液流の残りを収集容器内へ方向付けすることができる。アウトプット混合物中の2つ以上の異なる抗体の所定の比に応じて廃液容器または収集容器に方向付けられるべき相対割合は、段階（b）に沿った、またはその前の分析アッセイを用いて測定されるインプット混合物の組成から推測することができる。一態様では、調整可能な分流弁または調整可能なフロースプリッターを電子制御することができる。
【００８７】
本発明の一態様では、廃液流および収集液流の動的制御は、両方の液流に適用される別々のダイヤフラム弁によって達成される。本発明の一態様では、廃液流および収集液流の動的制御は、圧力逃し弁と組み合わせられた別々のダイヤフラム弁および液流のフィードバック圧制御によって達成される。ダイヤフラム弁により、溶出液または廃液ラインを通る流れの制御が可能になって、アウトプット混合物中の2つ以上の異なる抗体の所定の比が達成される。一態様では、前記態様のダイヤフラム弁は、ピンチバルブ、バタフライバルブ、またはバイオプロセス液流制御への適用に適した他のバルブに置き換えられる。
【００８８】
本発明による方法では、2つ以上の異なる抗体の各々は、好ましくはアウトプット混合物中に治療有効量で存在する。
【００８９】
本発明の特定の態様では、2つ以上の異なる抗体のうちの最も少ないものは、該2つ以上の異なる抗体のうちの最も豊富なものの量の少なくとも1％（w/w）、2％（w/w）、3％（w/w）、4％（w/w）、5％（w/w）、6％（w/w）、7％（w/w）、8％（w/w）、9％（w/w）または10％（w/w）である量で存在する。特に、2つ以上の抗体は、任意の2つの抗体の量の比（w/w）が1：5〜5：1の間、例えば1：4〜5：1、1：3〜5：1、1：2〜5：1、1：1〜5：1、2：1〜5：1、3：1〜5：1、3：4〜5：1、1：5〜4：1、1：5〜3：1、1：5〜2：1、1：5〜1：1、1：5〜1：2、1：5〜1：3、1：5〜1：4、1：4〜4：1、1：4〜3：1、1：4〜2：1、1：4〜1：1、1：4〜1：2、1：4〜1：3、1：3〜4：1、1：3〜3：1、1：3〜2：1、1：3〜1：1、1：3〜1：2、1：2〜4：1、1：2〜3：1、1：2〜2：1、1：2〜1：1、1：1〜4：1、1：1〜3：1の間、または例えば1：1〜2：1の間であるような量で、存在する場合がある。2つ以上の異なる抗体の各々は、活性薬学的成分であり得る。
【００９０】
抗体が、本発明により産生されたアウトプット混合物中にある特定の濃度比で存在するための必要条件に加えて、アウトプット混合物中に存在する各抗体の絶対量の必要最小限もまたあり得る。治療用または他の使用を意図したものであろうと、大部分の市販品において、抗体の量は実質的に1g/Lよりも大きい。したがって、本発明によるプロセスは、2つ以上の抗体を、アウトプット混合物を提供するために必要な量で回収する段階を含む場合があり、その際、抗体の合計量（すなわち、アウトプット混合物中に存在するすべての抗体を組み合わせた量）は、0.5g/L以上、例えば1g/L以上、1.5g/L以上、2g/L以上、3g/L以上、4g/L以上、5g/L以上、7g/l以上、8g/L以上、9g/L以上または例えば10g/L以上である。
【００９１】
さらに、本発明によるプロセスは、2つ以上の抗体を、アウトプット混合物を提供するために必要な量で回収する段階を含む場合があり、その際、抗体の合計量（すなわち、アウトプット混合物中に存在するすべての抗体を組み合わせた量）は、0.5〜20g/L、例えば1〜20g/L、1.5〜20g/L、2〜20g/L、3〜20g/L、4〜20g/L、5〜20g/L、7〜20g/l、8〜20g/L、9〜20g/L、または例えば10〜20g/Lである。
【００９２】
本発明によるプロセスは、高い抗体力価の産生に適用可能であり、したがって、アウトプット混合物は、癌治療に適用するための製剤などの高い製品需要がある適応症のための製剤であり得る。
【００９３】
本発明のいくつかの態様では、2つ以上の抗体のうちの少なくとも1つは、固形腫瘍、例えば転移性固形腫瘍または例えば転移性局所進行腫瘍、または例えば血液腫瘍などの腫瘍の表面に発現される抗原と結合する抗体である。固形腫瘍は、特に、結腸直腸癌腫および結腸直腸腺癌を含む結腸直腸癌、膀胱癌、骨肉腫、軟骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、膠芽腫、星細胞腫、神経芽腫、神経線維肉腫、神経内分泌腫瘍を含む中枢神経系の癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、胃腺癌を含む胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝細胞癌を含む肝癌、NSCLCおよびSCLCを含む肺癌、卵巣癌、膵管癌および膵腺癌を含む膵癌、肉腫または悪性黒色腫および非黒色腫皮膚癌を含む皮膚癌からなる群より選択される場合がある。
【００９４】
他の態様では、2つ以上の抗体のうちの少なくとも1つは、血液腫瘍、例えば慢性リンパ性白血病ならびに急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む骨髄性白血病を含む白血病、非ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫を含み、ホジキンリンパ腫を含み、骨髄異形成症候群を含むリンパ腫からなる群より選択される血液腫瘍において発現される抗原と結合する抗体である。
【００９５】
本発明の他の態様により、2つ以上の抗体のうちの少なくとも1つは、免疫もしくは自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、中枢神経系（CNS）の疾患または筋骨格系疾患に関連する抗原または該疾患時に発現される抗原と結合する抗体である。
【００９６】
本発明の方法の一態様では、異なる抗体の混合物は、2つの異なる抗体の混合物である。本発明の別の態様では、異なる抗体の混合物は、3つ以上の異なる抗体の混合物、例えば4つ以上、もしくは5つ以上、もしくは6つ以上、もしくは7つ以上、もしくは8つ以上、もしくは9つ以上の混合物、または10個以上の異なる抗体の混合物でさえある。本発明の一態様では、2つ以上の異なる抗体の混合物は、3つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、4つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、5つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、6つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、7つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、8つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、9つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、10個の異なる抗体の混合物である。本発明の一態様では、混合物の異なる抗体は、同じ標的と結合するが、標的の異なるエピトープと結合する。本発明の一態様では、混合物の異なる抗体のうちの2つ以上は、同じ標的と結合するが、標的の異なるエピトープと結合する。本発明の一態様では、混合物の異なる抗体のうちの3つ以上は、同じ標的と結合するが、標的の異なるエピトープと結合する。
【００９７】
特に、異なる抗体の混合物は、2〜10個の異なる抗体、例えば2〜9つ、2〜8つ、2〜7つ、2〜6つ、2〜5つ、2〜4つ、2〜3つ、3〜10個、3〜9つ、3〜8つ、3〜7つ、3〜6つ、3〜5つ、3〜4つ、4〜10個、4〜9つ、4〜8つ、4〜7つ、4〜6つ、4〜5つ、5〜10個、5〜9つ、5〜8つ、5〜7つ、5〜6つ、6〜10個、6〜9つ、6〜7つ、7〜10個、7〜9つ、7〜8つ、8〜10個、8〜9つ、または9〜10個の異なる抗体を含む場合がある。
【００９８】
本発明の一態様では、混合物の抗体は、すべて同じ標的と結合するが、標的の異なるエピトープと結合する。異なるエピトープは、オーバーラップするエピトープであり得る。本発明の一態様では、異なる抗体の混合物は、2つ以上の抗体が同じ標的と結合するが、異なるエピトープと結合し、1つまたは複数の抗体が異なる標的と結合する抗体の混合物である。別の態様では、混合物の異なる抗体は、異なる標的と結合する。
【００９９】
本発明の特定の態様では、2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つは、モノクローナル抗体である。さらなる態様では、2つ以上の異なる抗体は、すべてモノクローナル抗体である。本発明の一態様では、段階（a）における2つ以上の異なる抗体のインプット混合物は、クローン細胞集団からの同時発現によって産生される。本発明の一態様では、段階（a）における2つ以上の異なる抗体のインプット混合物は、単一の抗体種を各々発現している異なる細胞の単一のバイオリアクター中での同時培養によって産生される。本発明の一態様では、段階（a）における2つ以上の異なる抗体のインプット混合物は、1つまたは複数の抗体種を各々発現している異なる細胞の単一のバイオリアクター中での同時培養によって産生される。本発明の一態様では、段階（a）における2つ以上の異なる抗体のインプット混合物は、1つよりも多いバイオリアクター中で産生され、その後、下流の処理の前に細胞培養上清が混合される。本発明の一態様では、段階（a）における2つ以上の異なる抗体のインプット混合物は、単一の抗体種を各々発現している異なる細胞の別々のバイオリアクター中での培養によって産生され、その後、下流の処理の前に細胞培養上清が混合される。
【０１００】
本発明の一態様では、混合物の2つ以上の異なる抗体は、それらのアミノ酸配列に差を有し、その差が、2つ以上の抗体の電荷特性における差をもたらし、2つ以上の抗体が、イオン交換樹脂などのクロマトグラフィー樹脂と、異なって相互作用するようになる。ここで、2つ以上の異なる抗体は、陽イオン交換樹脂もしくは陰イオン交換樹脂などのイオン交換樹脂またはイオン構成成分を有する混合モード樹脂の相互作用への使用によって分離される場合がある。本発明の別の態様では、混合物の2つ以上の異なる抗体は、それらのアミノ酸配列に差を有し、その差が、2つ以上の抗体の疎水特性における差をもたらし、2つ以上のモノクローナル抗体が、クロマトグラフィー樹脂と、異なって相互作用するようになる。ここで、2つ以上の異なる抗体は、例えば疎水性相互作用樹脂または疎水性構成成分を有する混合モード樹脂の相互作用への使用によって分離される場合がある。本発明の別の態様では、混合物の2つ以上の異なる抗体は、それらのアミノ酸配列に差を有し、その差が、クロマトグラフィー樹脂に対する2つ以上の抗体の親和性における差をもたらす。ここで、2つ以上の異なる抗体は、アフィニティー樹脂の使用によって分離される場合がある。
【０１０１】
当業者は、沈殿、液：液抽出および高性能タンジェント流濾過を含む、不純物から生体分子を分離するために使用することができる様々な異なる方法を十分に認識している（Gagnon, P. J Chromatography A 1221 (2012) 57-70）。本発明に関連して適用されるクロマトグラフィーは、抗体などの生体分子の分取分離のための優位な方法であり、特定の目的に適する種類のクロマトグラフィーを選択することは、当業者の能力の範囲内であろう。
【０１０２】
クロマトグラフィーマトリックスの適用方式は、流動層または固定層クロマトグラフィーのいずれかであることができ、固定層形式が優位である（Gagnon, 2012）。Gagnonはまた、クロマトグラフィーの固定相構成を、拡散微粒子、灌流微粒子、吸着精密濾過メンブランまたはモノリスを含むと分類した。したがって、Gagnonの分類に基づき、上に定義されるプロセスにおける段階（b）を含む、本発明のプロセスに適用されるクロマトグラフィーの固定相構成は、拡散微粒子、灌流微粒子、吸着精密濾過メンブランおよびモノリスからなる群より選択される物質を含む場合がある。
【０１０３】
本発明のプロセスで、例えば、上に定義されるプロセスにおける段階（b）で、クロマトグラフィーマトリックスが構成される材料は、セルロース、アガロース、デキストランおよびキトサンなどの天然ポリマー；疎水性ビニルポリマー、ポリアクリルアミドポリマーおよびポリビニルスチレンなどの合成ポリマー；ヒドロキシアパタイト、シリカもしくは多孔質ガラスなどの無機媒質、または複合材料からなる群より選択される場合がある（Jungbauer, A. J Chromatography A, 1065 (2005) 3-12）。
【０１０４】
本発明のプロセスで、例えば、上に定義されるプロセスにおける段階（b）で使用されるクロマトグラフィーマトリックスは、リガンドの特性に応じて異なる作用原理を用いて生体分子を分離することができる樹脂を発生させるように、リガンドで修飾される場合がある。これらの作用原理は、吸着、イオン交換、サイズ排除、親和性、疎水性相互作用、金属キレート、順相、逆相クロマトグラフィー、または1つよりも多い作用原理を利用する混合モードクロマトグラフィーを含む（Jungbauer, 2005; Gagnon, 2012）。結果として生じる樹脂は、生体分子の混合物を物性に基づき分離することができる。抗体分離のためのそのような樹脂の最も重要なクラスは、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂または混合モード樹脂である（Gagnon, 2012）。したがって、本発明の特定の態様では、プロセスで、例えば、上に定義されるプロセスにおける段階（b）で使用されるクロマトグラフィー樹脂は、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂または混合モード樹脂からなる群より選択される場合がある。樹脂は、分離されるべき抗体およびこれらの電荷、サイズ、疎水性またはその他がどのように異なるかに基づき選ばれる場合がある。それは、当業者に周知であろう標準的なアッセイで検査することができる。
【０１０５】
適切な精製戦略を選択する場合に考慮する可能性があるとして、タンパク質の単一または混合モードクロマトグラフィーで使用されるいくつかの一般的なリガンドが総説されている（例えばKallberg, K et al. Biotechnol. J. 2012, 7, 1-11）（例えばLow, D et al. J Chromatography B; 848 (2007) 48-63; Clive Dennison. A Guide to Protein Isolation, Chromatography (Book Chapter), Chapter 4; p：71-114; 2002; Springer Netherlands）。混合物中の抗体の物性は、これらの樹脂上で分離を、したがって抗体混合物の組成の制御をさせには差が不十分な場合がある。そのような場合、以下に開示される置換などの1つまたは複数の置換または点変異を導入して分離を改善することによって、抗体のうちの1つまたは複数の抗体の物性を調節することができる。
【０１０６】
アフィニティー試薬は、抗体などの生体分子の分離のための、別の重要なクラスの樹脂である。ここで、生体分子がマトリックス上に固定化されて、抗体に特異的に結合する樹脂を形成する。固定化された生体分子は、しばしば安定性または別の特性を増大させるための修飾を有する、プロテインA、プロテインGおよびプロテインLを含む天然の免疫グロブリンリガンドなどの免疫グロブリンリガンドより選択することができる（Gagnon, 2012）。そのような生体分子に関する情報は、以下の表に提供される。
【０１０７】
生体分子性リガンド/アフィニティー試薬
2021528435.tif 000003
2021528435.tif 000004
【０１０８】
したがって、本発明の段階（b）におけるクロマトグラフィーは、マトリックス上に固定化された生体分子を含むアフィニティー試薬を使用する場合があり、固定化された生体分子は：
a）SEQ ID NO：62、63および64のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列；
b）少なくとも200個、例えば少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも600個、少なくとも700または800個の連続するアミノ酸残基を含む、a）における配列のうちのいずれか1つの部分配列；
c）a）およびb）に定義されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つと少なくとも80％、例えば85％、90％、95％、98％または99％の配列同一性を有するアミノ酸
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
あるいは、生体分子は、ラクダVHH IgG類似体リガンドなどのアフィニティー試薬であることができる（Gagnon, 2012）。アフィニティー試薬を使用して抗体混合物の組成を完全に制御するために、十分な数の特異的アフィニティー試薬を選択して、混合物中のすべての構成成分の特異性および制御を提供する必要がある。さらに、アフィニティー試薬に対する抗体の特異性は、特異的アフィニティー樹脂への抗体の結合を低減または防止する置換を抗体に導入することおよび/または点変異体を設計することによって抗体中に操作することができる。
【０１１０】
本発明による方法に有用であり得る他のアフィニティー樹脂は、Hisタグを認識する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）樹脂、Strep-tag IIおよびC-tagに結合するStrep-Tactin（登録商標）を含むタグに結合する樹脂である。潜在的に有用な他のアフィニティー樹脂は、糖質に結合する樹脂：レンチルレクチン樹脂およびCon A樹脂を含む。本発明により使用され得るなおさらなる樹脂は、CaptureSelect FcXLを含む。
【０１１１】
抗体のうちの2つ以上がクロマトグラム中で分離不能であることが最初に見出される場合、分離を可能にする差を得るために抗体のうちの少なくとも1つのアミノ酸配列が修飾される場合がある。一態様では、修飾は、クロマトグラムに分離可能性を導入するように置換される、野生型アミノ酸と異なる電荷を有する1つまたは複数のアミノ酸を導入する場合がある。一態様では、混合物の抗体のうちの2つ以上が、分離可能性を得るために修飾される。別の態様では、混合物の抗体のうち3つ以上が、分離可能性を得るために修飾される。2つ以上の抗体が、インプット混合物中に未知の濃度比で産生される場合があり、クロマトグラフィーによって分離される場合があり、正確な所定の濃度比で回収できることが、本発明の利点である。これは、インプットの各抗体がクロマトグラフィー方法で回収され、抗体のうちの過剰な1つまたは複数の抗体が混合物から枯渇されて正しい比を得ること、または異なる抗体がクロマトグラフィー実験で分画され、所望の組成で再プールされることを意味する。これは、クロマトグラム中の異なるピークの分析によって、したがって、異なる抗体の濃度のインライン分析によって得られる場合がある。これによって、正しい比の異なる抗体を回収することができ、任意の過剰な1つまたは複数の異なる抗体を捨てることができる。したがって、本発明の一態様では、アウトプット混合物の2つ以上の異なる抗体が段階（c）において単一のプール中に回収される場合がある。これは、異なる抗体の濃度のインライン分析によって得られる場合があり、それにより、抗体の各プールが、相互に正しい比で回収され、過剰な抗体が、廃液プール中に捨てられる。これによって、アウトプット混合物が回収され、単一のプール中に収集される。
【０１１２】
したがって、本発明の一態様では、本方法は、所定の比の2つ以上の異なる抗体を回収するための2つ以上の抗体の分離および抗体のうちの過剰な1つまたは複数の抗体の枯渇を含む。
【０１１３】
本発明の別の態様では、段階（b）における2つ以上の抗体は、異なる画分に分離され、続いて、アウトプット混合物を回収するために、抗体のうちの1つを少なくとも80％の純度で含有する画分が、異なる抗体についての所定の濃度比でプールされる。これによって、異なる抗体がクロマトグラフィー段階によって別々の画分中に回収される方法が提供される。異なる抗体がクロマトグラフィーによって分離可能であるので、これが可能である。収集される異なる画分は、異なる抗体を様々な純度で含有するであろう。抗体のうちの1つを少なくとも約80％の純度で含有する画分だけが使用され、他の抗体を少なくとも約80％の純度で含有する他の画分と共にプールされることを理解すべきである。各々の異なる抗体の様々な純粋な画分は、アウトプット混合物を得るために所定の比でプールされるであろう。したがって、本発明による方法は：
i）段階（b）において2つ以上の抗体を異なる画分に分離すること、および各抗体についてこの抗体を少なくとも80％の純度で含有する1つまたは複数の画分を選択すること、ならびに
ii）選択された画分の体積をプールすることによってアウトプット混合物を提供することであって、該体積のサイズが、該2つ以上の抗体の所定の濃度比を提供するように調整される、該提供すること
を含む場合がある。
【０１１４】
一態様では、本方法は、抗体をプールする前に各画分中の抗体の濃度を決定するさらなる段階を含む。これは、画分に関する分析論およびインライン分析論によって行われる場合がある。他の態様では、抗体のうちの1つを少なくとも約85％の純度で含有する画分だけが使用される。画分中により高い純度の抗体が必要な他の態様では、抗体を少なくとも約90％または少なくとも約95％または少なくとも約97％もしくは98％までもの純度で含有する画分だけが使用される。
【０１１５】
本発明のなお別の態様では、2つ以上の抗体の分離は、単一のクロマトグラフィー樹脂を使用する単一のクロマトグラフィー段階によって行われる。一態様では、単一のクロマトグラフィー樹脂は分取クロマトグラフィー樹脂である。
【０１１６】
本発明のなお別の態様では、2つ以上の抗体の分離は、所定の比のクロマトグラフィー樹脂の混合物の使用によって、または連続する複数の樹脂によって行われる。これは、樹脂が特異的で公知の結合能を有することにより、それがどれだけ多くの抗体と結合するかが分かっている場合に有利であり得る。過剰な抗体が樹脂に結合し、樹脂を飽和させることによって枯渇され、その結果、未結合の画分が収集されてアウトプット混合物を所定の濃度比で回収するか、または結合した抗体が続いて所定の比で溶出されるかのいずれかである。
【０１１７】
本発明のなお別の態様では、インプット混合物の組成は、段階（b）の前に分析アッセイを用いて測定される。これによって、段階（b）における分離前のプール中の各抗体の濃度は公知であり、この知識を用いて各抗体を所定の比で回収することができる。
【０１１８】
本発明の別の態様では、インプット混合物の組成は、段階（b）において、クロマトグラフィー段階とインラインの、分析アッセイによって測定される。これによって、インプット混合物の組成の測定を用いてクロマトグラフィーの溶出条件を調整することにより、過剰に存在する抗体が枯渇されて、所望の比の混合物をもたらす。
【０１１９】
上述のように、本発明の一態様では、方法は、2つ以上の抗体の分離可能性をクロマトグラフィーによって決定する最初の段階であって、異なる抗体が分離できない場合、クロマトグラフィーによる分離可能性を得るために、抗体のうちの1つまたは複数の抗体のアミノ酸配列を修飾する、段階を含む。
【０１２０】
本発明の一態様では、抗体のうちの1つまたは複数の抗体のアミノ酸配列の修飾は、抗体のうちの1つまたは複数におけるアミノ酸置換、付加もしくは欠失、またはそれらの組み合わせより選択される。したがって、混合物の抗体のうちの1つまたは複数は1つまたは複数の置換によって修飾され、ミックスの他の抗体は、1つもしくは複数のアミノ酸の欠失により、および/または1つもしくは複数のアミノ酸の付加により修飾されることがあり得る。他の態様では、抗体の修飾の唯一の種類は、置換によるものである。
【０１２１】
本発明の一態様では、1つまたは複数の修飾は、抗体のうちの1つまたは複数の抗体の定常ドメインにおける修飾を含む。
【０１２２】
本発明の別の態様では、1つまたは複数の修飾は、抗体のうちの1つまたは複数の抗体の可変ドメインにおける修飾を含む。好ましい態様では、修飾は、フレームワーク領域にあり、CDR領域にない。これによって、抗体の特異的親和性は変化しない、または2倍未満、もしくは3倍未満もしくは4倍未満変化する。修飾が抗体の機能性に関して無変化であることが好ましい。
【０１２３】
本発明の別の態様では、修飾は、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のフレームワーク配列における修飾を含む。
【０１２４】
本発明の別の態様では、修飾は、異なる抗体のうちの1つまたは複数における1つまたは複数のアミノ酸置換の修飾を含む。
【０１２５】
本発明の別の態様では、修飾は、抗体のうちの1つまたは複数における単一のアミノ酸置換である。本発明の別の態様では、修飾は、抗体のうちの1つだけにおける単一のアミノ酸置換である。本発明の別の態様では、修飾は、抗体のうちの2つにおける単一のアミノ酸置換である。本発明の別の態様では、修飾は、混合物の3つの異なるモノクローナル抗体における単一のアミノ酸置換である。本発明の別の態様では、修飾は、混合物の4つの異なる抗体における単一のアミノ酸置換である。本発明の別の態様では、修飾は、混合物の5つの異なる抗体における単一のアミノ酸置換である。
【０１２６】
本発明のなお別の態様では、修飾は、抗体のうちの1つまたは複数における2つのアミノ酸置換である。いくつかの態様では、分離可能性を得るために抗体のうちの1つまたは複数において3、4、5、6つまたはそれよりも多い置換が行われることもあり得る。
【０１２７】
本発明の別の態様では、修飾は、1つまたは複数の修飾された抗体の機能的特徴を変化させない。抗体に修飾を導入する主な目的は、抗体をクロマトグラフィーによって分離し、選択された比で回収できるように、抗体をクロマトグラフィーによって分離可能にすることである。
【０１２８】
本発明の別の態様では、変化されない機能的特徴は、抗体結合親和性、CDCまたはADCCなどのエフェクター機能、アビディティー、およびクラスター形成を含む群より選択される。
【０１２９】
本発明のなお別の態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、抗体のうちの1つまたは複数の抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域に修飾を含み、その際、置換は、重鎖可変領域における1、6、17、24、48、75、90、93、96、97を含む群ならびに/または軽鎖可変領域における1、4、47、48、51、68、74、80、90、93、および95を含む群より選択される1つまたは複数の位置にあり、その際、ナンバリングは、IgG1可変領域のIMGTナンバリングに従う。
【０１３０】
本発明の別の態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、抗体のうちの1つまたは複数の抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域中に修飾を含み、その際、置換は、重鎖可変領域中の1、6、17、24、48、75、90、93、96、97からなる群ならびに/または軽鎖可変領域中の1、4、47、48、51、68、74、80、90、93、および95からなる群より選択される1つまたは複数の位置にあり、その際、ナンバリングは、IgG可変領域のIMGTナンバリングに従う。
【０１３１】
本明細書によって、例えば2つ以上の異なる抗体がクロマトグラムで分離されない場合に置換によって修正され得るアミノ酸位置が提供される。これらのアミノ酸位置は、置換に適していて、クロマトグラフィーによる抗体の分離を可能にすることが、本発明者らによって見出されている。これらのアミノ酸は、樹脂の結合に影響することが見出されており、それにより、例えば野生型と比較して置換アミノ酸の電荷またはサイズまたは疎水性相互作用における変更によって、抗体は、クロマトグラフィー樹脂と、異なって相互作用する。それによって、分離可能性が得られる場合がある。アミノ酸置換が好ましくは抗体の機能的特徴を変更すべきでないことを理解すべきである。したがって、バリアント抗体が機能性について標準的なアッセイでスクリーニングされる場合があり、不変の機能性を有するバリアントが好ましい。
【０１３２】
別の態様では、変異は、ヒト抗体生殖系列のレパートリーに存在するアミノ酸への置換であって、あまり免疫原性がない。それは、インタクトな抗体またはプロセシングされたペプチドにおける変異はヒトの免疫系によって非自己として認識されないからである。したがって、天然生殖系列のバリエーションに基づき1つまたは複数の置換が選択される場合があり、その結果、免疫原性ではないがクロマトグラムに分離可能性を導入する置換を行うことができる。
【０１３３】
本発明の一態様では、1つまたは複数の置換は、対応する位置の野生型アミノ酸と異なる電荷を有するアミノ酸を導入する。
【０１３４】
特定の態様では、2つ以上の異なる抗体は、WO11/131746に記載されるようにFabアームの交換を可能にするように重鎖のCH3領域中に変異形成された第1および第2の抗体を含む。
【０１３５】
一態様では、二重特異性抗体の形成を可能にする条件が、WO11/131746に記載されている。好ましくは、これらの条件は、ヒンジ領域中の鎖間ジスルフィド結合の還元を可能にする還元条件である。一態様では、第1および第2の抗体は、CH3領域中に1つまたは複数の変異を含み、当該変異は異なり、第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が、第1のCH3領域と第2のCH3領域とのホモ二量体相互作用の各々よりも強いような変異である。一態様では、第1の抗体は、366、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、第2の抗体は、366、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、第1および第2の抗体は、同じ位置で置換されていない。一態様では、第1の抗体は、405位で置換されており、第2の抗体は、409位で置換されている。特定の態様では、第1の抗体はF405L置換を有する。別の態様では、第2の抗体はK409R置換を有する。好ましい態様では、第1の抗体は、CH3領域にF405L置換を有し、第2の抗体は、K409R変異を有する。
【０１３６】
さらなる態様では、2つ以上の異なる抗体は、上に開示される重鎖のCH3領域に変異を有するモノクローナル抗体からWO11/131746に記載されるようにFabアームの交換によって産生される二重特異性抗体を含む。
【０１３７】
一態様では、抗体のうちの1つまたは複数は、ヒト免疫グロブリンIgGのFc領域であって、EUナンバリングに従うヒトIgG1における位置E430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置に変異を含むFc領域を含む。EUナンバリングに従うヒトIgG1におけるE430、E345またはS440に対応する位置は、Fc領域のCH3ドメインに位置する。本発明に関連して、これらの変異は、「六量体化増強変異（hexamerization enhancing mutation）」と見なされる。
【０１３８】
これらの位置に変異を導入することについての理論的根拠は、各抗体が位置E430、E345またはS440に変異を有する場合、細胞表面の抗原上の第1および第2エピトープへの2つの抗体の結合の組み合わせがヘテロ六量体を形成し得るという知見に基づく。そのようなヘテロ六量体の形成は、Fc領域中に変異を有しない2つの抗体の組み合わせと比較して、抗体結合の効果を大きく高める。したがって、六量体化増強変異は、細胞表面上の対応する標的に結合した場合の変異を含む抗体間のFc-Fc相互作用を増強するが、一方で抗体分子は溶液中で単量体のままである（WO2013/004842；WO2014/108198）。
【０１３９】
本発明の一態様では、抗体のうちの1つまたは複数におけるFc領域は、ヒトIgG1のEUナンバリングでE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YまたはS440Wに対応する変異を含む。より詳細には、1つまたは複数の抗体は、各々、第1の重鎖および第2の重鎖を含むFc領域を含み、その際、上述の六量体化増強変異のうちの1つが、第1および/または第2の重鎖に存在し得る。
【０１４０】
本発明の一態様では、抗体のうちの1つまたは複数は、EUナンバリングに従うヒトIgG1におけるE430に対応するアミノ酸位置に変異を含み、その際、変異は、E430G、E430S、E430FおよびE430Tからなる群より選択される。本発明の一態様では、抗体のうちの1つまたは複数は、E430Gに対応する変異を含む。
【０１４１】
抗体のうちの1つまたは複数は、EUナンバリングに従うヒトIgG1におけるE345に対応するアミノ酸位置に変異を含む場合があり、その際、変異は、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yからなる群より選択される。好ましくは、変異は、E345Kに対応する。
【０１４２】
本発明の特定の態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、EUナンバリングシステムで重鎖定常領域におけるE345K置換を含む。
【０１４３】
本発明の一態様では、抗体のうちの1つまたは複数は、ヒトIgG1のEUナンバリングでK439EまたはS440Kなどの「六量体化阻害変異（hexamerization-inhibiting mutation）」をFc領域中に含む場合がある。K439EまたはS440Kなどの六量体化阻害変異は、同じ六量体化阻害変異を含む抗体とのFc-Fc相互作用を防止するが、K439E変異を有する抗体とS440K変異を有する抗体とを組み合わせることによって阻害効果は中和され、Fc-Fc相互作用は回復する。本発明の一態様では、抗体は、ヒトIgG1のEUナンバリングで以下の位置：S440またはK439のうち1つに対応するアミノ酸位置にさらなる変異を含むが、但し、位置S440での変異は、S440YでもS440Wでもない。本発明の一態様では、Fc領域は、S440またはK439に対応する位置にさらなる変異を含むが、但し、六量体化増強変異がS440にある場合、さらなる変異は位置S440にはない。本発明によるE430、E345またはS440に対応する位置における変異およびK439に対応するアミノ酸位置にK439E変異などのさらなる変異を含む抗体は、K439に対応するアミノ酸位置にK439E変異などのさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成しない。しかし、E430、E345またはS440における六量体化増強変異およびK439にK439Eなどのさらなる変異を含む抗体は、E430またはE435における六量体化増強変異およびS440にS440Kなどのさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成する。本発明によりE430またはE345に対応する位置における変異およびS440に対応するアミノ酸位置にS440K変異などのさらなる変異を含む抗体は、S440に対応するアミノ酸位置にS440K変異などのさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成しない。しかし、E430またはE345における六量体化増強変異およびS440にS440Kなどのさらなる変異を含む抗体は、E430またはE345における六量体化増強変異およびK439にK439などのさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成する。本発明の一態様では、Fc領域は、E430Gなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。本発明の一態様では、Fc領域はE435Kなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。本発明の別の態様では、Fc領域は、E430Gなどの六量体化増強変異およびS440Kなどの六量体化阻害変異を含む。本発明の一態様では、Fc領域は、E345Kなどの六量体化増強変異およびS440Kなどの六量体化阻害変異を含む。本発明の一態様では、Fc領域は、S440Yなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。これによって、K439E変異を含む抗体とS440K変異を含む抗体との組み合わせの間の排他的六量体化を可能にする態様が提供される。
【０１４４】
本発明の一態様では、Fc領域は、EUナンバリングに従うヒトIgG1中のS440に対応するアミノ酸位置に変異を含み、その際、変異は、S440WおよびS440Yからなる群より選択される。
【０１４５】
本発明のなお別の態様では、1つまたは複数の抗体を修飾することは、抗体のうちの1つまたは複数の抗体の軽鎖に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することを含み、その際、置換は、IMGTナンバリングシステムで軽鎖可変領域における位置12にプロリン（P）を導入する。好ましくは、置換は、アフィニティー樹脂への結合を消失させ、クロマトグラフィーは、置換によりそれへの結合が消失されているアフィニティー樹脂を使用する。ここで修飾された抗体は、アフィニティー樹脂に対して異なる親和性を有するので、2つ以上の抗体を分離するために当該樹脂が使用される場合がある。一態様では、アフィニティー試薬は、カッパ軽鎖に対して親和性を有するプロテインLである。HiTrap（商標）プロテインLおよびCapto（商標）Lは、GE Healthcareから得られる場合がある。
【０１４６】
本発明のなお別の態様では、1つまたは複数の抗体を修飾することは、抗体のうちの1つまたは複数の抗体の軽鎖に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することを含み、その際、置換は、アフィニティー樹脂への結合を消失させ、置換は、EUナンバリングシステムでV110D、V110R、V110E、V110H、V110K、V110N、V110P、V110Q、V110WおよびE143Dを含む群より選択され、クロマトグラフィーは、置換によりそれへの結合が消失されているアフィニティー樹脂を使用する。ここで修飾された抗体は、アフィニティー樹脂に対して異なる親和性を有するので、2つ以上の抗体を分離するために当該樹脂が使用される場合がある。一態様では、アフィニティー試薬は、カッパ軽鎖定常領域に対して親和性を有するCaptureSelect（商標）またはKappaXLである。CaptureSelect（商標）およびKappaXLは、ThermoFisherから得られる場合がある。別の態様では、アフィニティー試薬は、カッパ軽鎖定常領域に対して親和性を有するKappaSelect（商標）である。KappaSelect（商標）は、GE Healthcareから得られる場合がある。
【０１４７】
本発明の別の態様では、1つまたは複数の抗体を修飾することは、抗体のうちの1つまたは複数の抗体に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することを含み、その際、置換は、CH1ドメイン中であり、置換は、アフィニティー樹脂への結合を消失させ、置換は、EUナンバリングシステムでS157Tおよび/またはT164S変異を含み、クロマトグラフィーは、置換によりそれへの結合が消失されているアフィニティー樹脂を使用する。ここで修飾された抗体は、アフィニティー樹脂に対して異なる親和性を有するので、2つ以上の抗体を分離するために当該樹脂が使用される場合がある。一態様では、アフィニティー試薬は、例えばThermoFisherから得られる場合があるCaptureSelect（商標）IgG-CH1などのIgG-CH1アフィニティー試薬である。
【０１４８】
本発明の別の態様では、1つまたは複数の抗体を修飾することは、1つまたは複数の抗体の重鎖定常領域に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入することを含み、その際、置換は、EUナンバリングシステムでM252A、S254M、E380A、E380M、E382A、E382L、S426M、M428G、M428T、M428V、H433D、N434A、N434G、N434S、M428Aを含む群より選択され、置換は、アフィニティー樹脂に対する結合を消失させ、クロマトグラフィーは、置換によりそれへの結合が消失されているアフィニティー樹脂を使用する。ここで修飾された抗体は、アフィニティー樹脂に対して異なる親和性を有するので、2つ以上の抗体を分離するために当該樹脂が使用される場合がある。一態様では、アフィニティー試薬はプロテインGである。
【０１４９】
本発明のなお別の態様では、分離度（Rs）が、陽イオン交換クロマトグラフィーアッセイでイオン強度勾配を用いて決定されるとRs≧0.3であり；Rs≧0.3が式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）［式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である］に基づく場合、2つ以上の抗体は分離可能であると決定される。これによって、混合物の異なる抗体の分離可能性を決定することができる。そのような決定は、本明細書に開示される方法の段階（a）の前の最初の段階として行われる場合がある。異なる抗体のうちの2つ以上がそのようなクロマトグラフィーアッセイで分離できない場合、抗体がクロマトグラフィーによって分離可能になるように異なる抗体のうちの1つまたは複数が上記のように修飾される場合がある。しかし、混合物の抗体は、異なる樹脂または異なる溶出条件を用いる異なるクロマトグラフィーアッセイで分離可能な場合がある。したがって別の態様では、分離度（Rs）が、疎水性相互作用クロマトグラフィーアッセイでイオン強度勾配を用いて決定されるとRs≧0.3であり；Rs≧0.3が式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）［式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である］に基づく場合、2つ以上の抗体は分離可能であると決定される。なお別の態様では、分離度（Rs）が、混合モードクロマトグラフィーアッセイでイオン強度勾配を用いて決定されるとRs≧0.3であり；Rs≧0.3が式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）［式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である］に基づく場合、2つ以上の抗体は分離可能であると決定される。別の態様では、カラムに結合しない未結合の画分中の抗体と、カラムから溶出する画分の中の抗体との間でベースラインの分離が達成される場合、または分離度（Rs）が、アフィニティークロマトグラフィーアッセイでpH勾配を用いて決定されるとRs≧0.3であり；Rs≧0.3が式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）［式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である］に基づく場合、2つ以上の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーアッセイにおいて分離可能であると決定される。
【０１５０】
これによって、異なる抗体がクロマトグラフィーによって分離可能であるかを決定するために適する、異なる試験が与えられ、異なる抗体を分離するためにどのクロマトグラフィー樹脂がもっとも適しているかが決定される場合がある。上述のように、抗体がクロマトグラフィーによって分離できないと最初に見出された場合、上のように試験された場合に抗体が分離可能になるように、混合物の抗体のうちの1つまたは複数の抗体のアミノ酸配列を修飾することが望ましい場合がある。抗体がクロマトグラフィーによって分離可能である場合、単一のクロマトグラフィー段階から異なる抗体を所望および所定の比で回収することが可能である。
【０１５１】
一態様では、インプット混合物の2つ以上の異なる抗体は、異なる生産宿主細胞中に発現され、該細胞から提供される。別の態様では、2つ以上の異なる抗体は、単一の容器中で同時培養された異なる生産宿主細胞中に発現され、該細胞から提供される。なお別の態様では、2つ以上の異なる抗体は、単一の生産宿主細胞中に同時発現される。ここで、本発明は、混合物の異なる抗体の産生に関して汎用性がある。インプット混合物中の異なる抗体の濃度が、アウトプット混合物について必要な規格内に完全に制御されている必要はないので、上流のプロセスが混合物の各抗体の相対濃度に関して完全に制御されている必要はないことが、本発明の重要な要素である。異なる抗体の比の完全な制御および規準化が、クロマトグラフィーの使用により下流のプロセスを経由して得られる。
【０１５２】
異なる抗体の比の規準化を達成すべく措置が取られているが、そのような規準化が失敗している、生産プロセスの下流で、本発明によるプロセスが使用される場合があることをさらに理解すべきである。その状況で適切な下流のプロセスを行わない場合、唯一の選択肢は、産生バッチ全体を捨てることであろう。
【０１５３】
本発明の一態様では、2つ以上の異なる抗体は、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4抗体、またはそれらの組み合わせを含む群より選択される。一態様では、混合物の異なる抗体は、すべて同じアイソタイプに由来する。したがって、一態様では、混合物の異なる抗体は、すべてIgG1抗体である。別の態様では、混合物の異なる抗体は、すべてIgG2抗体である。別の態様では、混合物の異なる抗体は、すべてIgG3抗体である。別の態様では、混合物の異なる抗体は、すべてIgG4抗体である。別の態様では、混合物の異なる抗体は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4抗体の組み合わせである。別の態様では、混合物の異なる抗体は、IgG1抗体とIgG4抗体との組み合わせである。別の態様では、混合物の異なる抗体は、二重特異性抗体を含む。
【０１５４】
一局面では、本発明の方法は、薬物が異なる抗体の混合物である製剤の生産のためのものである。一局面では、本発明の方法は、疾患の処置、臨床試験、毒性研究のための医薬の製造のためのもの、またはバッチ間の一貫性を決定するためのものである。
【０１５５】
2つ以上の異なる抗体が、所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在するように、プロセスが、アウトプット混合物についての異なるバッチ間で再現可能な結果をもたらすことが、本発明の重要な要素である。
【０１５６】
別の局面では、本発明は、2つ以上の異なる抗体の混合物であって、本発明の方法によって得ることができる混合物に関する。本発明による混合物中に、2つ以上の異なる抗体は、所望もしくは所定または本質的に所望もしくは所定の濃度比で存在する。
【０１５７】
なお別の局面では、本発明は、所定の比の2つ以上の異なる抗体を有する、2つ以上の異なる抗体の混合物であって、抗体が、サイズ、電荷、疎水性、またはクロマトグラフィー樹脂に対する親和性に差を有する、混合物に関する。
【０１５８】
本発明の一態様では、異なる抗体の混合物は、3つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、4つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、5つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、6つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、7つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、8つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、9つの異なる抗体の混合物である。別の態様では、これは、10個の異なる抗体の混合物である。
【０１５９】
本発明の抗体混合物は、疾患の処置に使用される場合がある。単剤療法としての通常のモノクローナル抗体が処置に十分ではない様々な疾患の処置に、異なる抗体の混合物を使用することが有利な場合がある。これは、標的のダウンレギュレーションまたは別個の病原性経路への切替が原因であり得る。異なる抗体の混合物の使用により、標的のダウンレギュレーションまたは別個の病原性経路への切替を防止する場合がある複数の細胞表面レセプター抗原を標的化することが可能な場合がある。異なる抗体は、別個の作用機序を有する場合があり、または疾患を処置する効力が異なる場合があるので、抗体の混合物を使用して単一の標的上の複数のエピトープを標的化することがさらに有利な場合がある。
【０１６０】
一局面では、本発明による2つ以上の異なる抗体の混合物は、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域中に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む少なくとも1つの修飾された抗体を含み、その際、置換は、重鎖可変領域中の1、6、17、24、48、75、90、93、96、97を含む群ならびに/または軽鎖可変領域中の1、4、47、48、51、68、74、80、90、93、および95を含む群より選択される1つまたは複数の位置にあり、その際、ナンバリングは、IgG可変領域のIMGTナンバリングに従う。
【０１６１】
なお別の局面では、本発明による2つ以上の異なる抗体の混合物は、EUナンバリングシステムで重鎖定常領域における少なくともE345K置換を含む少なくとも1つの修飾された抗体を含む。ここで、抗体は、異なる電荷を有するように修飾され、異なる電荷は、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる抗体の分離を助ける場合がある。
【０１６２】
なお別の局面では、本発明による2つ以上の異なる抗体の混合物は、1つまたは複数の抗体のカッパ軽鎖定常領域中に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む少なくとも1つの修飾された抗体を含み、その際、置換は、EUナンバリングシステムでV110D、V110R、V110E、V110H、V110K、V110N、V110P、V110Q、V110W、およびE143Dを含む群より選択される。ここで修飾された抗体は、アフィニティー樹脂に対して異なる親和性を有するので、2つ以上の抗体を分離するために当該樹脂が使用される場合がある。一態様では、アフィニティー樹脂は、KappaSelectまたはKappaXL樹脂である。
【０１６３】
なお別の局面では、本発明による2つ以上の異なる抗体の混合物は、EUナンバリングシステムでCH1ドメインにおけるS157Tおよび/またはT164S置換を含む少なくとも1つの修飾された抗体を含む。そのような置換を有する抗体は、CaptureSelectアフィニティー樹脂などのIgG-CH1アフィニティー樹脂に対して修正された親和性を有する場合がある。なお別の局面では、本発明による2つ以上の異なる抗体の混合物は、EUナンバリングシステムで重鎖定常領域におけるM252A、S254M、E380A、E380M、E382A、E382L、S426M、M428G、M428T、M428V、H433D、N434A、N434G、N434S、M428Aを含む群より選択される1つまたは複数の置換を含む少なくとも1つの修飾された抗体を含む。そのような修飾された抗体は、例えばプロテインG樹脂などのアフィニティー樹脂に対して低減した結合を有する場合がある。
【０１６４】
別の態様では、本発明は、活性成分として上記の異なる抗体の混合物を含む薬学的組成物を提供する。
【０１６５】
本発明の薬学的組成物は、特に、無菌であり、かつ以下の特徴のうち1つまたは複数を有する組成物であり得る：
I.  生理学的に許容されるpH、例えば5〜8の間のpH、例えば6〜8の間のpH；
II.  600mOsm/kg以下、例えば600〜100mOsm/kgの間、または例えば600〜200mOsm/kgの間である重量モル浸透圧濃度；および
III.  組成物中の抗体の10重量％以下、例えば9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％または2重量％以下が凝集物の形態で存在するような、凝集物のレベル。
【０１６６】
薬学的組成物は、特に、290〜300mOsm/kg、例えば295mOsm/kgである重量モル浸透圧濃度を有するように等張または実質的な等張であり得る。
【０１６７】
なお別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための上記の2つ以上の異なる抗体の混合物に関する。好ましい態様では、混合物は、疾患を処置および/または予防するための方法における使用のためのものである。一態様では、疾患は癌である。別の態様では、疾患は感染性疾患である。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の佐剤および賦形剤を用いて通常の技法により製剤化される場合がある。本発明の薬学的組成物は、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、洗剤（例えば、Tween-20またはTween-80などの非イオン系洗剤）、安定化剤（例えば、糖類またはタンパク質不含アミノ酸）、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、および/または薬学的組成物中への包含に適する他の材料を含む場合がある。
【０１６８】
薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者への毒性なしに、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を実現するのに有効な活性成分の量を得るように変動される場合がある。選択される投薬レベルは、採用される本発明の特定の組成物またはそのアミドの活性、投与経路、投与時間、採用されている特定の化合物の排泄速度、処置の持続期間、採用される特定の組成物と併用される他の薬物、化合物、および/または物質、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、および前病歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因を含む様々な薬物動態要因に依存する。
【０１６９】
薬学的組成物は、任意の適切な経路および様式によって投与される場合がある。本発明の化合物をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は、当技術分野に周知であり、当業者によって選択される場合がある。
【０１７０】
一態様では、本発明の薬学的組成物は、非経口的に投与される。
【０１７１】
本明細書において使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という用語は、経腸投与および局所投与以外の、通常、注射による投与様式を指し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外、および胸骨内への注射および注入を含む。一態様では、本発明の薬学的組成物は、静脈内または皮下の注射または注入によって投与される。
【０１７２】
当業者が理解しているように、本発明の有用性は、任意の特定の標的または抗原に対する抗体に限定されない。本発明により処理された抗体についての例示的な標的は、5T4；ADAM-10；ADAM-12；ADAM17；AFP；AXL；ANGPT2炭疽菌抗原；BSG；CAIX；CAXII；CA72-4；癌関連抗原CTAA16.88；CCL11；CCL2；CCR4；CCR5；CCR6；CD2；CD3E；CD4；CD5；CD6；CD15；CD18；CD19；CD20；CD22；CD24；CD25；CD29；CD30；CD32B；CD33；CD37；CD38；CD40；CD40LG；CD44；CD47；CD52；CD56；CD66E；CD72；CD74；CD79a；CD79b；CD80；CD86；CD98；CD137；CD147；CD138；CD168；CD200；CD248；CD254；CD257；CDH3；CEA；CEACAM5；CEACAM6；CEACAM8；クローディン4；CS-1；CSF2RA；CSPG-4；CTLA4；クリプト（Cripto）；DLL4；ED-B；EFNA2；EGFR；エンドセリンBレセプター；ENPP3；EPCAM；ERBB2；ERBB3；FAPアルファ；FcガンマRI；FCER2；FGFR3；フィブリンIIベータ鎖；FLT1；FOLH1；FOLR1；FRP-1；GD3ガングリオシド；GDF2；GLP1R；グリピカン-3；GPNMB；HBV（B型肝炎ウイルス）；HCMV（ヒトサイトメガロウイルス）；熱ショックタンパク質90ホモログ[カンジダ アルビカンス（Candida albicans）]；単純ヘルペスウイルスgD糖タンパク質；HGF；HIV-1；HIV-1 IIIB gp120 V3ループ；HLA-DRB（HLA-DRベータ）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F；ICAM1；IFNA1；IFNA1；IFNB1；IgE Fc；IGF1R；IGHE接続領域；IL12B；IL13；IL15；IL17A；IL1A；IL1B；IL2RA；IL4；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL9；インターロイキン-2レセプターベータサブユニット；ITGA2；ITGA2B ITGB3；ITGA4 ITGB7；ITGA5；ITGAL；ITGAV_ITGB3；ITGB2；KDR；L1CAM；ルイス-y；リピドA、リポ多糖LPSのドメイン；LTA；MET；MMP14；MMp15；MST1R；MSTN；MUC1；MUC4；MUC16；MUC5AC；NCA-90顆粒球抗原；ネクチン4；NGF；NRP；NY-ESO-1；OX40L；PLAC-1；PLGF；PDGFRA；PD1；PDL1；PSCA；ホスファチジルセリン；PTK-7；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）血清型IATS O11；RSV（ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F）；ROR1；RTN4；SELL；SELP；STEAP1；志賀様毒素IIBサブユニット［大腸菌（Escherichia coli）]；SLAM7；SLC44A4；SOST；表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）リポタイコ酸；T細胞レセプターアルファ_ベータ；TF；TGFB1；TGFB2；TMEFF2；TNC；TNF；TNFRSF10A；TNFRSF10B；TNFRSF12A；TNFSF13；TNFSF14；TNFSF2；TNFSF7；TRAILR2；TROP2；TYRP1；VAP-1；およびビメンチンからなる群より選択される抗原を含む。
【０１７３】
ある特定の態様では、本発明により処理される2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つは、腫瘍細胞上の標的、例えばerbB1（EGFR）、erbB2（HER2）、erbB3、erbB4、MUC-l、CD19、CD20、CD4、CD38、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-エンベロープタンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFrvIII、U-CAM、AXL、組織因子（TF）、CD74、EpCAMおよびMRP3からなる群より選択される標的に特異的な場合がある。
【０１７４】
あるいは、2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つは、エフェクター細胞上の標的、例えばCD1、CD3、CD4、CD8、FcガンマRIII（CDI6）、CD25、CD89、CD32、CD32a、FCεRI、CD40、またはFcガンマRI（CD64）に特異的である。他の態様では、2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つは、FAS、DR1、DR2、DR3、DR4、DR5、DR6、TNFR1、EDARまたはNGFRからなる群より選択されるデスレセプターなどのデスレセプターに特異的である。
【０１７５】
なおさらなる態様では、2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つは、免疫チェックポイント標的、例えばCTLA4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、OX40、ネクチン-2、ネクチン-3、PVR、HVEM、CD80、PD-L2、CD86、ICOSL、4-1BBL、GITRL、CD27L、CD30L、CD40、OX40L、LIGHT、TL1A、CD3、TIGIT、BTLA、CD160、CD28、ICOS、4-1BB、GITR、CD27、CD30、CD40L、OX40、DR3、GAL9、TNF-R3、RANK、TACI、BAFFR、BCM、RELT、CD120b、TWEAKR、TAJ-アルファ、EDA2R、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、LY49、CD94、NKG2D、NKG2A、VISTA、CD96からなる群より選択される免疫チェックポイント標的に特異的である。
【０１７６】
他の態様では、2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つは、TfR、インスリンレセプター、MTfR、LfR、ApoER2、LRP1、LRP2、RAGE、DTR（＝HB-EGF）またはgp190からなる群より選択される血液脳関門タンパク質などの血液脳関門タンパク質に特異的である。
【０１７７】
なお異なる局面では、本発明は、対象における腫瘍を標的化する方法であって、対象に混合物を投与する段階を含む方法における使用のための、上記の2つ以上の異なるモノクローナルの混合物に関する。
【０１７８】
好ましくは、2つ以上の異なる抗体の各々は、混合物中に治療有効量で存在する；すなわち、2つ以上の異なる抗体の各々は、2つ以上の異なる抗体の各々の量または濃度をその他の抗体と比べて増加させるための追加的な段階なしに、混合物を製剤に処理できるようにする量または濃度で存在し、その際、2つ以上の異なる抗体の各々は、活性薬学的成分として製剤中に含まれる。本発明に関連する「製剤」という用語は、必然的にではなく一般的に、不活性成分と共に活性薬物成分または活性薬学的成分を含有する最終剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、液剤）を意味する。
【０１７９】
本発明により提供される混合物中に、2つ以上の異なる抗体のうちの最も少ないものは、好ましくは、該2つ以上の異なる抗体のうちの最も豊富なものの量の少なくとも1％（w/w）、2％（w/w）、3％（w/w）、4％（w/w）、5％（w/w）、6％（w/w）、7％（w/w）、8％（w/w）、9％（w/w）または10％（w/w）である量で存在する。
【０１８０】
2つ以上の抗体は、好ましくは、任意の2つの抗体の量の比（w/w）が1：5〜5：1の間、例えば1：4〜5：1、1：3〜5：1、1：2〜5：1、1：1〜5：1、2：1〜5：1、3：1〜5：1、3：4〜5：1、1：5〜4：1、1：5〜3：1、1：5〜2：1、1：5〜1：1、1：5〜1：2、1：5〜1：3、1：5〜1：4、1：4〜4：1、1：4〜3：1、1：4〜2：1、1：4〜1：1、1：4〜1：2、1：4〜1：3、1：3〜4：1、1：3〜3：1、1：3〜2：1、1：3〜1：1、1：3〜1：2、1：2〜4：1、1：2〜3：1、1：2〜2：1、1：2〜1：1、1：1〜4：1、1：1〜3：1の間、または例えば1：1〜2：1の間であるような量で混合物中に存在する。
【０１８１】
好ましい態様では、本発明により提供される混合物は、2つ以上の異なる抗体のそれぞれが活性薬学的成分である混合物である。
【０１８２】
本発明により提供される混合物は、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜10、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4、4〜10、4〜9、4〜8、4〜7、4〜6、4〜5、5〜10、5〜9、5〜8、5〜7、5〜6、6〜10、6〜9、6〜7、7〜10、7〜9、7〜8、8〜10、8〜9つ、または9〜10個の異なる抗体などの2〜10個の異なる抗体を含む場合がある。
【０１８３】
本発明による混合物中の2つ以上の異なる抗体のうちの少なくとも1つは、モノクローナル抗体であり得る。さらに、本発明による混合物中の2つ以上の異なる抗体は、すべてモノクローナル抗体であり得る。
【０１８４】
他の態様では、1つまたは複数の抗体のうちの少なくとも1つは、二重特異性または多重特異性抗体である。
【０１８５】
本発明による混合物中の2つ以上の異なる抗体の分離度（Rs）は、好ましくは、疎水性相互作用クロマトグラフィーアッセイ、陽イオン交換クロマトグラフィーアッセイおよび/または混合モードクロマトグラフィーアッセイを含む群より選択される1つまたは複数クロマトグラフィーアッセイでイオン強度勾配、pH勾配または塩勾配を用いて決定されるとRs≧0.3であり；Rs≧0.3が式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）［式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である］に基づく。
【０１８６】
本発明による混合物中の2つ以上の抗体は、好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーアッセイで決定される場合に分離可能であり、抗体は、カラムに結合しない未結合画分およびカラムから溶出する画分の中の抗体の間でベースラインの分離が達成される場合、または分離度（Rs）がアフィニティークロマトグラフィーアッセイでpH勾配を用いて決定されるとRs≧0.3であり、Rs≧0.3が式Rs＝2（t2−t1）/（W1＋W2）［式中、t1＝所与の抗体の保持時間、t2＝続いて溶出する抗体の保持時間、W1およびW2は、主ピークの比較的直線状の両側をベースラインまで外挿することによって得られる、ピークのベースでの、抗体の対応するピーク幅である］に基づく場合、分離可能である。
【０１８７】
なお異なる局面では、本発明は、上記の2つ以上の異なる抗体の混合物または上記の薬学的組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、疾患の処置方法に関する。
【０１８８】
なお異なる局面では、本発明は、疾患の処置のための医薬の製造のための、上記の2つ以上の異なる抗体の混合物の使用に関する。
【０１８９】
処置されるべき疾患は、癌、腫瘍、免疫もしくは自己免疫疾患、炎症性疾患、心血管疾患、中枢神経系（CNS）の疾患、筋骨格系疾患、または感染性疾患であり得る。
【０１９０】
処置は、特に、固形腫瘍、例えば結腸直腸癌腫および結腸直腸腺癌を含む結腸直腸癌、膀胱癌、骨肉腫、軟骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、膠芽腫、星細胞腫、神経芽腫、神経線維肉腫、神経内分泌腫瘍を含む中枢神経系の癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、胃腺癌を含む胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝細胞癌を含む肝癌、NSCLCおよびSCLCを含む肺癌、卵巣癌、膵管癌および膵腺癌を含む膵癌、肉腫または悪性黒色腫および非黒色腫皮膚癌を含む皮膚癌からなる群より選択される固形腫瘍の処置であり得る。
【０１９１】
処置は、特に、血液腫瘍、例えば慢性リンパ性白血病ならびに急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む骨髄性白血病を含む白血病、非ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫を含み、ホジキンリンパ腫を含み、骨髄異形成症候群を含むリンパ腫からなる群より選択される血液腫瘍の処置であり得る。
【実施例】
【０１９２】
実施例1：ヒトIgG1-2F8、ヒトIgG1-7D8、ヒトIgG1-1014-005、IgG1-1021-511またはヒトIgG1-HepCおよびバリアントの発現のための発現ベクター
単離された免疫グロブリンタンパク質の抗体発現のために、可変重（VH）鎖および可変軽（VL）鎖配列を遺伝子合成によって調製し（GeneArt Gene Synthesis; ThermoFisher Scientific, Germany）、IgG1m（f）アロタイプ重鎖（HC）および軽鎖（LC）定常領域を含有するpcDNA3.3発現ベクター（ThermoFisher Scientific, US）中にクローニングした。使用される重鎖定常領域アミノ酸配列は、下の配列参照表中に確認される。
【０１９３】
遺伝子合成または部位特異的変異誘発のいずれかによって所望の変異を導入した。本出願において言及される抗体は、以前に記載されたIgG1-1014-005（WO11/147982）、IgG1-2F8（WO02/100348）、およびIgG1-1021-511（WO16/005593）、IgG1-7D8（WO04/035607）、IgG1-1014-153（WO2012/143523）、IgG1-CD37-37-3（WO11/112978）、IgG1-CD19-21D4（WO/2009/054863）、Campath（Crowe et al., Immunology 87(1):105-110 (1992)）、IgG1-HepC（WO00/05266）、およびIgG1-224に由来するVHおよびVL配列を有する。配列はまた、本明細書においても提供される。
【０１９４】
配列の参照：
2021528435.tif 000005
【０１９５】
実施例2：IgG1-1014-005、IgG1-1021-511およびIgG1-2F8へのほとんど非免疫原性の電荷変調変異の導入
混合物としての同時産生および精製のために選択されたIgG1-1014-005、IgG1-2F8、およびIgG1-1021-511の重鎖および軽鎖DNA配列を、ヒト生殖系列配列の集合とアライメントした。図2Aは、ヒト可変ドメインのIMGTナンバリングスキームに従ってナンバリングされたヒト生殖系列重鎖可変領域のアライメントを、図2Bは、ヒト生殖系列カッパ軽鎖可変領域のアライメントをそれぞれ示す。親抗体IgG1-1014-005、IgG1-2F8、およびIgG1-1021-511のpIを調節する一方で、免疫原性の潜在的増加を最小限にするために、電荷バリエーションが天然ヒト生殖系列レパートリー中に観察されるアミノ酸位置、またはヒト生殖系列可変ドメインと比較して親抗体配列中に観察されるアミノ酸位置に電荷変調変異を導入した。それぞれの親軽鎖または重鎖配列について、7つのバリアント可変ドメイン：親抗体にN末端のピログルタミン酸が存在する場合、それを欠如する基準配列、pIが段階的に減少する3つの配列バリアントおよびpIが段階的に増加する3つの配列バリアントを設計した。これらの配列を、C末端リシンを欠如するヒトIgG1重鎖定常ドメイン（SEQ ID：61）と融合することによって、7つの重鎖可変ドメインの各々をインタクトな重鎖として発現させた。これらの配列を、ヒトカッパ定常ドメイン（SEQ ID：47）と融合することによって、7つの軽鎖可変ドメインの各々をインタクトなカッパ軽鎖として発現させた。比較のために、N末端ピログルタミン酸が親配列中に存在する場合にそれをコードし、C末端リシンをコードする配列を有する親抗体を発現させた。
【０１９６】
図2Cは、抗体IgG1-1014-005、IgG1-2F8、およびIgG1-1021-511について設計された抗体鎖配列可変ドメインバリアントのアライメントを示す。配列バリアントを以下のように名づけた：HA1は、基準配列HCと比較して負電荷を1つの余分に有する、より大きく酸性の重鎖バリアントを示し、一方でバリアントHA2およびHA3は、基準配列HCと比較して負電荷を2つおよび3つの余分に含有する。同様に、より大きく塩基性の電荷バリアントHB1、HB2およびHB3は、基準配列HCと比較した場合に正電荷を1、2、および3つ余分に含有する。HPは、C末端リシンをコードする定常ドメインとの融合物として発現された未変異の親重鎖可変ドメインの配列を示す。軽鎖バリアントも同様に名づけることにより、LA1は、基準配列LCと比較した場合に電荷を1つの余分に有する、より大きく酸性の軽鎖バリアントを示す、などである。
【０１９７】
抗体鎖DNA配列バリアントを、実施例1に記載されるような遺伝子合成によって産生した。実施例3に記載されるように重鎖バリアントをコードするベクターおよび軽鎖バリアントをコードするベクターの同時トランスフェクションによって抗体を生成し、以下のように名づけた：IgG1-1014-005-HA1LA1は、可変ドメイン配列1014-005HA1（SEQ ID 1：重鎖可変ドメイン1014-005HA1）を有する重鎖および可変ドメイン1014-005LA1（SEQ ID 9：軽鎖可変ドメイン1014-005LA1）を有する軽鎖を含む。表Aは、重鎖および軽鎖電荷バリアントの同時トランスフェクションによって産生された抗体の組成をまとめたものである。
【０１９８】
（表Ａ）
2021528435.tif 000006
2021528435.tif 000007
2021528435.tif 000008
2021528435.tif 000009
【０１９９】
実施例3：抗体の産生
293fectin（商標）（LifeTechnologies）を製造業者の説明書に基づき使用して、関連する重鎖および軽鎖発現ベクターをFreeStyle（商標）293-F細胞（LifeTechnologies）に同時トランスフェクトすることによって抗体を無血清条件下で産生した。あるいは、ExpiFectamine（商標）293（LifeTechnologies）を製造業者の説明書に基づき使用して、関連する重鎖および軽鎖発現ベクターをExpi293F（商標）細胞（LifeTechnologies）に同時トランスフェクトすることによって抗体を無血清条件下で産生した。分析および精製の前に0.2μmデッドエンドフィルターで培養上清を濾過した。
【０２００】
あるいは、IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの完全長重鎖および軽鎖オープンリーディングフレーム（ORF）をコードするDNA配列を実施例1で調製した。これらの配列をpcDNA 3.3発現ベクターから、同じベクターから両方のORFを発現している社内開発発現ベクターpGENpr6DGV中にサブクローニングした。発現ベクターは、上流のCMVプロモーターおよび下流のTKポリA転写終結シグナルによって調節される抗体オープンリーディングフレームと、SV40プロモーターフラグメントおよびSV40ポリA転写終結シグナルの制御下で発現されるグルタミンシンセターゼ選択マーカーとの両方を含有した。Amaxa Solution Vキットを本質的に製造業者の説明書に基づいて使用して、合成培地での懸濁培養に社内で適応させたCHO-K1細胞株（ECACCカタログ番号85051005）の細胞に1μg/1.0E＋06個のベクターをヌクレオフェクション（Lonza Nucleofector 2b）によって移行させた。発現ベクターを含有する細胞を、96ウェルプレート中のGS EM補助剤（Sigma）を含有するCD-CHO培地（Life Technologies/Thermo Scientific）中で、MSX選択（Sigma）下で4週間成長させ、その後、成長およびIgGの発現を示している親培養物のパネルをより大きい体積に増大させた。最高生産クローンをambr15プラットフォーム（TAP Biosystems）でのIgG発現について試験し、その後、もっともよく生産している親を、500mLから最大3Lまでのバイオリアクターの接種のために選択して、IgG物質を供給した。10〜12日後に細胞培養物を採集し、IgG含有上清を濾過によって収集した。あるいは、Gramer et al., MAbs 2013, 5: 962-973に記載されるようにIgG1-7D8-K409Rを産生した。
【０２０１】
実施例4：Bio-Layer干渉法を使用する細胞培養試料またはクロマトグラフィー画分中の抗体の定量化
Octet QK（ForteBio）を備えるプロテインAバイオセンサーを使用するBio-Layer干渉法を用いて細胞培養試料のIgG濃度を定量した。Sample Diluent（ForteBio）中に試料を4倍および20倍希釈した。60秒の読み取り時間および200rpmの振盪速度を用いて各試料の初期結合速度を測定し、標準曲線と対比することにより濃度を推測した。10mM グリシン、pH1.0を再生溶液として使用した。
【０２０２】
実施例5：プロテインAクロマトグラフィーを用いる細胞培養上清からの抗体の精製
プロテインA精製を用いて、生化学実験またはその後のクロマトグラフィー実験に使用するために細胞物質から抗体または抗体混合物を精製した。単離された抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって大量精製した。簡潔には、培養上清を5mL MabSelect SuReカラム（GE Healthcare）に負荷し、洗浄し、0.02M クエン酸ナトリウム-NaOH（pH3）で溶出させた。精製直後に溶出液をHiPrep Desaltingカラム（GE Healthcare）に負荷し、抗体が12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl（pH7.4）緩衝液（PBS、B.BraunまたはThermo Fisher）中になるよう交換した。あるいは、溶出した画分をプールし、適切なサイズの10kDa分子量カットオフのSlide-A-Lyzerキャリッジ（ThermoFisher）を使用してPBS中に透析した。緩衝液交換後、0.2μmデッドエンドフィルターで試料を無菌濾過した。SDS-PAGE/CE-SDSによって純度を決定し、280nmでの吸光度により濃度を測定した。精製された抗体を2〜8℃で保存した。あるいは、同じプロトコールによって抗体の混合物を細胞物質から大量精製した。これは、抗体の比を制御するためでなく、抗体の純粋混合物を生成することを意図するものであった。
【０２０３】
あるいは、小規模精製を行って、生化学実験のための単離された抗体を精製した。50μL MabSelect SuRe樹脂を予め充填したPreDictor MabSelect SuReプレート（GE-Healthcare）を本質的に製品マニュアルに基づいて使用する96ウェル形式で精製を行った。圧力真空ステーションに接続するMulti Screen HTS真空マニホールド上にプレートを装着した。保存溶液を除去し、樹脂をPBS（12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl（pH7.4）；B.BraunまたはThermo Fisher）で洗浄した。900rpmで5分間軌道撹拌して、樹脂を細胞培養上清0.33mLと共にインキュベートし、真空マニホールドを使用して上清を除去した。上清2mLが負荷されるまでこれを繰り返した。樹脂をPBSで洗浄した。150uL/ウェルの溶出緩衝液（20mM クエン酸、pH3.0）を使用して、結合した抗体を溶出させ、遠心分離によって収集した。中和緩衝液（2M トリス-HCl、pH9.0）の添加により、溶出液の各ウェルをおよそpH6.0に中和した。280nmでの吸光度を測定することによって各ウェル中の溶出液のタンパク質濃度を決定した。
【０２０４】
実施例6：イオン強度勾配を加える、HiScreen Capto S ImpActカラムを使用するモノクローナル抗体混合物の分取陽イオン交換クロマトグラフィー
クロマトグラフィーによるモノクローナル抗体の分離を可能にし、最終的にそれらの組成を制御する電荷特性における差を抗体配列が含有するかどうかを検討するために、プロテインA精製された抗体混合物を、分取陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離した。製造適用のために適用可能な高分離度陽イオン交換カラムとしてCapto S ImpAct（GE Healthcare）を選択した。HiScreenカラム形式（GE Healthcare）は、製造規模の精製のためのモデルとしてそのようなスクリーニング適用に適する10cmのベッド高を有する。
【０２０５】
プロテインA精製された抗体のインプット混合物を負荷緩衝液（20mM NaHPO4、pH6.75または20mM NaHPO4、pH6.5）中になるように緩衝液交換して、それらがカラムに結合するようにイオン強度を低下させた。適切なサイズの10kDa分子量カットオフSlide-A-Lyzerキャリッジ（ThermoFisher）を使用する透析または負荷緩衝液中への20倍希釈のいずれかによってこれを達成した。抗体混合物を5mL Capto S ImpActカラム（GE Healthcare）に2.3mL/分で負荷し、5カラム体積の負荷緩衝液を使用して洗浄した。負荷緩衝液から溶出緩衝液への直線勾配を用いて抗体混合物を分離した。負荷緩衝液および溶出緩衝液および溶出勾配を、抗体混合物の特性に基づき選択し、異なる抗体混合物についてこれを実施例7、9、23、25、26に述べる。カラムを1M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（pH9.0）または20mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、1000mM NaCl（pH8.5）または20mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、50mM NaCl（pH8.0）；および0.2または0.5M NaOHで順次洗浄し、負荷緩衝液を使用して再平衡化した。
【０２０６】
Unicornソフトウェアバージョン6.32（GE Healthcare）のピーク積分機能を使用して隣接ピークの分離度を計算した。ピークのウインドウを手作業で選択し、プロファイルを目で点検することにより極小値と極小値の間に手作業でピークを割り当てた。下ろした垂線を使用し、分離度アルゴリズム（Ret2−Ret1）/（（Width2＋Width1）/2）を用いて分離度を計算した。あるいは、それぞれの実施例に示されるように、Unicornソフトウェアバージョン6.32（GE Healthcare）のピーク積分機能を用い、skim比10でskim関数を用いて分離度を計算した。簡略化するために、好ましい方法は下ろした垂線を使用する。図6Eは、分離度計算の原理をまとめたものである。クロマトグラムを積分し、抗体の一次アミノ酸配列に基づき計算される各抗体の吸光係数に合わせて補正することによって、各ピーク中のタンパク質の量を推定した。
【０２０７】
実施例7：電荷変調抗体の使用、分取陽イオン交換カラムでの勾配溶出による抗体混合物の分離および予め定義された組成の抗体混合物をもたらすための回収
本実施例は、可変組成の混合物を採取し、ポリクローナル混合物の個別の構成成分の間の分離を提供するクロマトグラフィー段階を行い、かつ溶出した抗体を分画するための手順であって、その結果、画分の濃度測定を用いて抗体をプールして所定の組成の混合物をもたらすことができるようになる手順を記載する（図1E）。
【０２０８】
ヒト抗体IgG1-1014-005、IgG1-1021-511、およびIgG1-2F8の電荷変調バリアントの設計およびその産生を実施例2に記載した。簡潔には、天然生殖系列レパートリーが電荷バリエーションを示すフレームワークアミノ酸位置に変異を導入して、潜在的免疫原性への影響を最小限にした。具体的な事例では、4位に中性変異を有する軽鎖バリアントについて説明するように、生殖系列に荷電アミノ酸が存在するペプチド状況を転換させた。
【０２０９】
7つの軽鎖ベクターの各々を、7つの重鎖ベクターの各々と対にして組み合わせて、IgG1-1014-005、IgG1-1021-511およびIgG1-2F8について49個のユニークな組み合わせを生成した。配列を図2にまとめる。実施例3に記載されるように重鎖および軽鎖DNA配列をトランスフェクトすることによって抗体を産生し、実施例4に記載されるように抗体力価を決定した。図3は、この変異を含有するすべてのバリアントの発現に有害作用を有した抗体IgG1-1014-005における重鎖変異Q6Eを除き、電荷バリアントの大部分が、産生レベルに関して十分に耐容されたことを示す。
【０２１０】
重鎖および軽鎖の連結配列を使用して、EMBOSSのpepstatsモジュール（Jemboss version 1.5; Carver, T and Bleasby A. Bioinformatics. 2003 Sep 22;19(14):1837-43）を使用する理論的等電点について抗体電荷バリアントを分析した。可能な重鎖バリアントおよび軽鎖バリアントを組み合わせることによって等電点の範囲をサンプリングすることができた（図4A）。
【０２１１】
実施例5に記載されるように抗体電荷バリアントを精製し、抗体バリアントの電荷特性の多様性を説明するためのモデルシステムとして、実施例8に記載されるように分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析した。IgG1-1014-005、IgG1-1021-511およびIgG1-2F8の各々について広く多様な保持時間をサンプリングし（図4B〜E）、変異が陽イオン交換クロマトグラフィーアッセイにおける抗体バリアントの挙動に十分に影響することを示した。
【０２１２】
抗体混合物を産生するための上流プロセスを1つだけの同時産生事象で模倣するために、抗体上清を別々に産生し、混合した。第1の例では、分取陽イオン交換樹脂での混合物の分離挙動を評価するために、最高濃度および最低濃度の抗体が相互の2倍以内となるように抗体上清を混合した。実施例3に記載されるように抗体上清を別々に産生し、実施例4に記載されるように免疫グロブリン力価を決定し、その抗体力価を用いて上清を混合して、およそ150mLの総体積中に免疫グロブリンがおよそ10mgの混合物をもたらした。抗体バリアントIgG1-1014-005-HCLC、IgG1-2F8-HCLC、IgG1-1021-511-HCLCおよびIgG1-1014-153のインプット混合物を 電荷変調なしの対照抗体混合物として生成した。あるいは、インプット混合物中に入れるためにIgG1-1014-153と共に電荷バリアントIgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1およびIgG1-1021-511-HA3LB2を選択して、陽イオン交換クロマトグラフィーによる分離挙動を改善した。これらの電荷バリアントは、HCLCバリアントと比較して以下の変異体：IgG1-2F8-HB3LC：E6Q、A24K、E97G；IgG1-1014-005-HB3LB1：E17A、Q75A、S93R（HC）およびE95Q（LC）；IgG1-1021-511-HA3LB2：K48Q、Q90E、A96D（HC）およびE48K（LC）（図2）を含有した。実施例5に記載されるようにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清混合物を精製した。抗体の混合物を捕捉し、大量混入物から精製した（図5）。
【０２１３】
プロテインA精製された2つのインプット抗体混合物を、分取陽イオン交換クロマトグラフィーカラムでの挙動について分析した。負荷緩衝液（20mM NaHPO4、pH6.75）中になるよう透析により混合物を緩衝液交換し、実施例6に記載されるように別々の実験で5mL Capto S ImpAct カラム（GE Healthcare）に負荷した。30カラム体積にわたり0％〜38％（v/v）の溶出緩衝液（20mM NaHPO4、1M NaCl、pH6.75）の直線勾配を用いて抗体を溶出させ、溶出液を2mL画分として収集した。電荷変調された抗体混合物中の抗体は十分に分離されたのに対し、非電荷変調混合物中の抗体は十分には分離されなかった（図6A、B）。電荷変調された混合物の分離からのピークの分離度を、実施例6に記載されるように下ろした垂線を使用して計算した。非電荷変調抗体は十分には分離されず、4つの抗体の分離から2つのピークだけを観察することができるので、分離度を1つだけ計算することができた（表1）。
【０２１４】
分取陽イオン交換実験からの画分を負荷画分と一緒に分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析して、それらの同一性および相対純度を見出した。280nmで検出したクロマトグラムの検査に基づき画分をプールし、Sartorius stedim biotech Vivaspin 6、10000 MWCO PES（製品番号VS060L）を使用して濃縮した。実施例8に記載されるように分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてプール画分の組成を確認した。電荷変調された抗体混合物の分離からのプール画分は、本質的に純粋であり、抗体種が分離されたことを示している（図7B）。対照的に、非電荷変調バリアントからの画分は実質的に純粋ではなく、これらの種が分取陽イオン交換クロマトグラフィーによって十分には分離されなかったことを確認している（図7A）。
【０２１５】
本実施例は、クロマトグラフィーによる抗体混合物の分離可能性を決定するための方法を示す。ピークを分離することができず、画分が、ほぼ純粋な（＞80％）タンパク質を含有しなかったので、非電荷変調バリアントはクロマトグラフィーによって分離されなかった。本実施例は、抗体のアミノ酸配列を修飾してクロマトグラフィーによる分離可能性を得ることができることをさらに示す。例えば、IgG1-2F8-HCLCに塩基性残基を導入または酸性残基を除去して、E6Q、A24KおよびE97G点変異によりIgG1-2F8-HB3LCをもたらすこと（図2A）は、分取陽イオン交換実験においてIgG1-2F8-HCLCと比較してIgG1-2F8-HB3LCの保持時間に増加を引き起こす（図6）。アミノ酸変更の組み合わせは、抗体混合物を分取陽イオン交換クロマトグラフィーによって分離可能にした（図6B、表1）。
【０２１６】
分取陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて抗体のインプット混合物を分離することができ、それにより混合物を所定の比で回収できたことを示すために、代替的な電荷変調抗体混合物を調製した。組換え発現されたIgG1-2F8-HB3LB3（IgG1-2F8-HCLCと比較してHC変異体E6Q、A24K、E97GならびにLC変異体E68Q、E80GおよびT90Kを有する）、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153を含有する抗体上清を実施例3に記載されるように別々に産生し、実施例4に記載されるように免疫グロブリン力価を決定し、その抗体力価を用いて上清を混合して、組換え抗体を5：3：2：1の比で有するインプット混合物の最終量21mgをもたらした。あるいは、実施例3に記載されるように組換え発現されたIgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153を含有する抗体上清を別々に産生し、実施例4に記載されるように免疫グロブリン力価を決定し、その抗体力価を用いて上清を混合して、組換え抗体を1：3：2：5の比で有する最終量24mgのインプット混合物をもたらした。これらの混合物は、1：1：1：1の配布規格での同時生産プロセスを模倣することを意図したが、上流プロセスが所望の組成を提供するのに十分な制御をされなかった場合、比を規準化するためにクロマトグラフィー段階が必要であった。実施例5に記載されるようにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって抗体混合物を精製した。抗体の混合物を捕捉し、大量混入物から精製した（図5）。
【０２１７】
プロテインA精製されたインプット抗体混合物を分取陽イオン交換クロマトグラフィーカラムで分離した。負荷緩衝液（20mM NaHPO4、pH6.75）中になるよう透析により混合物を緩衝液交換し、実施例6に記載されるように5mL Capto S ImpActカラム（GE Healthcare）に負荷した。30カラム体積にわたる0％〜38％（v/v）の溶出緩衝液（20mM NaHPO4、1M NaCl、pH6.75）の直線勾配を用いて抗体を溶出させ、溶出液を2mL画分として収集した。クロマトグラムは、4つの分離されたピークを示す（図6CおよびD）。電荷変調された混合物の分離からのピークの分離度を、実施例6に記載されるように計算したが、これは、抗体が分離度＞0.3で分離されたことを示している（表1）。
【０２１８】
分取陽イオン交換実験からの画分を、負荷画分と一緒に分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析して、それらの同一性および相対純度を見出した。280nmで検出してクロマトグラムの点検に基づき画分をプールし、実施例8に記載されるようにSartorius stedim biotech Vivaspin 6、10000 MWCO PES（製品番号VS060L）を使用して濃縮し、分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて画分の組成を確認した。電荷変調された抗体混合物の分離からプールされた画分は、混合物の構成成分の相対組成の完全な制御を提供するのに十分な純度であった（図7C〜F）。ピークを個別にプールし、Nanodrop ND-1000分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）を使用してそれらの濃度について分析し、純粋な抗体の一次アミノ酸配列から吸光係数を計算した。プール画分の濃度測定を用いて画分を再混合して、ほぼ等しい質量濃度の抗体を有する混合物をもたらした。実施例8に記載されるように分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物の組成を分析して、予め定義された、ほぼ1：1：1：1の組成の抗体混合物をもたらした（図7E、F；表2）。ロバスト性を検査する実験の間に各プールの純度が一貫して類似することが示された、確立されたプロセスに関して、プールする前の中間プールの純度分析は必要ないであろう。
【０２１９】
（表１）積分ピーク面積および前のピークとの分離度について分析された抗体混合物の分取陽イオン交換クロマトグラムの定量化。ND - 未決定。インプット混合物中のIgG1-2F8-HB3LC、IgG1-1014-005-HB3LB1、IgG1-1021-511-HA3LB2およびIgG1-1014-153の濃度が、（＊）相互に2倍以内、（＊＊）1：3：2：5の比。
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【０２２０】
（表２）インプット抗体混合物および規準化抗体混合物の分析陽イオン交換クロマトグラフィープロファイルの定量化
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【０２２１】
実施例8：分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる精製抗体および抗体混合物の分析
高速液体クロマトグラフィー（HPLC） - 分析陽イオン交換クロマトグラフィー（CIEX）を用いて、異なる抗体および電荷変調された抗体変異体の保持時間を比較し、抗体インプット混合物および抗体アウトプット混合物中の抗体の相対量を定量した。Na2HPO4・2H2OおよびNaH2PO4（無水）からリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）の原液をMilliQ水中に調製した。移動相A（10mM リン酸塩緩衝液、pH7.0）中に2mg/mLの抗体試料をHPLCに注入した。あるいは、実施例5に記載される小規模精製の産物をHPLCに直接注入した。電荷に差があるIgG分子をProPac WCX-10 4mm×250mm分析カラムを使用して流速1mL/minで分離した。25μLの試料を注入し、移動相A（10mM リン酸塩緩衝液、pH7.0）から移動相B（10mM リン酸塩緩衝液、pH7.0、0.25M NaCl）への勾配を加えて溶出を行い、280nmで検出した。Empower 3ソフトウェア（Waters）を使用してクロマトグラムを分析し、特定の抗体の保持時間および総ピーク面積を報告し、抗体の一次アミノ酸配列から計算された吸光係数を用いてこれをさらに補正し、インプットおよびアウトプット混合物ならびにクロマトグラフィー画分中の各構成成分の相対存在量を決定した。個別の抗体のクロマトグラムを基準として使用して、最終産物中のそれらの位置を特定し、抗体の積分境界を規定した。
【０２２２】
実施例9：電荷変調抗体の使用、分取陽イオン交換カラムを用いる順次段階溶出による抗体混合物の分離および予め定義された組成の抗体混合物をもたらすための回収
本実施例は、様々な組成の混合物を採取し、ポリクローナル混合物の個別の構成成分の間の分離度を提供するクロマトグラフィー段階を行い、かつ溶出した抗体を分画するための手順であって、その結果、画分の濃度測定を用いてそれらをプールして所定の組成の混合物をもたらすことができるようになる手順を記載する（図1E）。
【０２２３】
質量比が等しい5つの組換え産生された抗体の混合物を、電荷変調抗体または非電荷変調抗体のいずれかとして生成して、分取陽イオン交換クロマトグラフィーによるそれらの分離可能性を評価した。非電荷変調混合物は、IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-K409RおよびIgG1-CD52-Campathを含んでいた（実施例1）。あるいは、実施例1に記載されるようにIgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345KへのE345K点変異により、IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの電荷変調混合物をもたらした。
【０２２４】
実施例3に記載されるように一過性産生またはCHO-K1に基づく発現系を使用して個別の抗体を組換え発現させることによって抗体混合物を調製した。実施例5に記載されるようにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって個別に精製した。Nanodrop ND-1000 分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）および純粋な抗体の一次アミノ酸配列から計算された吸光係数を使用して、個別の抗体の濃度を測定した。濃度を用いて抗体を等しい質量比で混合することにより、抗体混合物をPBS緩衝液（12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4緩衝液、B.BraunまたはThermo Fisher）中に調製した。
【０２２５】
電荷変調混合物および非電荷変調混合物を、分取陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上でのそれらの挙動について分析した。混合物を負荷緩衝液（20mM NaHPO4、pH6.5）中に20倍希釈し、実施例6に記載されるように別々の実験で5mL Capto S ImpActカラム（GE Healthcare）上に負荷した。1g/L樹脂の負荷を用いて0％〜25％（v/v）溶出緩衝液（20mM NaHPO4、1000mM NaCl、pH6.5）の40カラム体積の直線勾配を用いて抗体を溶出させた。あるいは、0.2g/L樹脂の負荷を用いて0％〜75％（v/v）溶出緩衝液（20mM NaHPO4、1000mM NaCl、pH6.5）の40カラム体積の直線勾配を用いて抗体を溶出させた。図8Aは、抗体の電荷特性の差が分離を可能にするには十分でないため、5つの非電荷変調抗体がクロマトグラフィー実験で分離されなかったことを示す。K409R変異は、抗体表面になく、実効電荷の変化を招くので、IgG1-CD19-21D4抗体の溶出挙動に顕著には影響しない。図8Bは、5つの電荷変調抗体の分離が、5つの別個のピークを生じることを示す。実施例8に記載されるようにピークをプールし、参照標準として精製タンパク質を用いる分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析することによって5つの主ピークの各々の同一性を評価した。調製クロマトグラムにおける各ピークは、単一の抗体に対応し（図8C、D）、割り当てられたピークは、保持時間の昇順にそれぞれIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kである。図8Aおよび8Bの比較は、E345K点変異の導入の結果、抗体が増加した保持時間で溶出し、抗体のクロマトグラフィーピークが分離可能になることを示している。したがって、これらのデータは、電荷変調抗体混合物がクロマトグラフィーによるモノクローナル抗体の分離を可能にする差を含有することを示している。
【０２２６】
費用効果の高い製造は、クロマトグラフィー樹脂への抗体の負荷を高くして、所与の質量の抗体混合物を精製するために必要な樹脂の体積を低減することから利益を得る。抗体の負荷の増加に伴うピークの広がりについて制御するために、負荷の増加に伴う電荷変調抗体のクロマトグラフィー特性のバリエーションを研究した。IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの等質量の混合物を調製した。実施例3に記載されるようにCHO-K1細胞から個別の抗体を組換え発現させた。実施例5に記載されるようにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって個別に精製した。Nanodrop ND-1000 分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）を使用して個別の抗体の濃度を測定し、純粋な抗体の一次アミノ酸配列から吸光係数を計算した。濃度を用いて抗体を等しい質量比で混合することによって、PBS緩衝液（12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4緩衝液、B.BraunまたはThermo Fisher）中に抗体混合物を調製した。分取陽イオン交換クロマトグラフィーカラムで負荷研究を行った。負荷緩衝液（20mM NaHPO4、pH6.5）中に混合物を20倍希釈し、実施例6に記載されるように別々の実験で5mL Capto S ImpActカラム（GE Healthcare）上に負荷した。0％〜25％（v/v）溶出緩衝液（20mM NaHPO4、1000mM NaCl、pH6.5）の40カラム体積の直線勾配を用いて0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、または50g/Lの最終合計負荷量を用いて抗体を溶出させた。
【０２２７】
すべての抗体負荷について5つの別個のピークを検出した（図8E）。下ろした垂線を使用して実施例6に記載されるように分離度を定量した。最高のカラム負荷である程度の広がりが検出されたが、すべての場合でピークは分離し（分離度＞0.3）（表3）、これは、製造適用に関連する負荷で分離を行うことができることを示している。
【０２２８】
同時生産プロセスおよび捕捉精製段階を含むプロセスを模倣するように、1：1：1：1：1の配布規格で抗体混合物を生成したが、上流プロセスが所望の組成を提供するのに十分な制御をされなかった場合、抗体の比を規準化するために追加的なクロマトグラフィー段階が必要であった。IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの3つの非規準化混合物ならびに1：1：1：1：1混合物を調製した。実施例3に記載されるように個別の抗体をCHO-K1細胞から組換え発現させた。実施例5に記載されるようにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって個別に精製した。Nanodrop ND-1000 分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）および純粋な抗体の一次アミノ酸配列から計算した吸光係数を使用して個別の抗体の濃度を測定した。個別に精製された抗体を1：1：1：1：1または0.30：0.50：1.0：0.38：0.38または1.0：0.25：0.38：1.0：0.50または0.50：1.0：0.40：1.0：0.83の質量比で混合することによって、抗体混合物をPBS緩衝液（12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4緩衝液、B.BraunまたはThermo Fisher）中に調製した。
【０２２９】
勾配に基づく分離スキームを、製造プロセスを簡略化することもできる代替として順次段階溶出に転換した。最終クロマトグラフィースキームでは、混合物を負荷緩衝液（20mM NaHPO4、pH6.5）中に20倍希釈した。19.5％、29.4％、38.6％、44.6％および61.2％（v/v）の溶出緩衝液（20mM NaHPO4、250mM NaCl、pH6.5）と混合された負荷緩衝液を含有している8カラム体積の5つの順次段階溶出段階で抗体を溶出させたことを除き、実施例6に基づき分離を行った。30mL画分を収集し、溶出の各段階の開始時に分画を始めた。
【０２３０】
異なる組成の電荷変調抗体混合物でこの溶出および分画スキームの能力を試した。各抗体の合計負荷を表4にまとめる。図9Aは、混合物の各々が、個別に分画された5つのピークに分離されたことを示す。Unicornソフトウェアバージョン6.32（GE Healthcare）のプール機能を製造業者のガイドラインに基づき使用して、クロマトグラムの積分から濃度を導いた。あるいは、Nanodrop ND-1000分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）を使用して280nmで測定された吸光度および純粋な抗体の一次アミノ酸配列から計算された吸光係数によって画分の濃度を分析した。負荷試料の組成および各々の個別の画分を、分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて確認した（実施例8）。
【０２３１】
クロマトグラムの分析は、負荷された各抗体の量と、クロマトグラムの積分から推測された量との間で良好な相関を示す（表4）。各画分を分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析し、データから各画分が高度に純粋な（＞98％）抗体を含有したことを確認した（図9B〜E）。画分の純度が制御されたことをプロセス設計および/またはロバスト性の検査が示すことができたので、最適化されたプロセスで画分をプールする前の画分への分析陽イオン交換分析は必ずしも必要ないであろう。
【０２３２】
クロマトグラムの積分から推測された各抗体画分の濃度を使用して画分を混合することによって、抗体のおよそ等モルのアウトプット混合物を調製して、およそ等質量濃度の抗体を生成するために必要な体積を計算した。あるいは、単離された画分の濃度を測定することから推測された各抗体画分の濃度を使用して画分を混合することによって、抗体のおよそ等モルのアウトプット混合物を調製して、およそ等質量濃度の抗体を生成するために必要な体積を計算した。実施例8に記載されるように分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて最終産物の組成を分析した。両方の場合において、プールすることにより、許容差を有して所定の組成に適合した抗体産物が生じた（表5）。本実施例は、関連する負荷のクロマトグラフィーを用い、かつ一連の段階溶出を用いて、可変組成の抗体負荷の組成を制御できることを示す。
【０２３３】
（表３）下ろした垂線を使用する積分ピーク面積および前のピークとの分離度について分析された、抗体混合物の分取陽イオン交換クロマトグラムの定量化
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【０２３４】
（表４）積分ピーク面積について分析された、異なる組成の抗体混合物の分取陽イオン交換クロマトグラムの定量化
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【０２３５】
（表５）インプット抗体混合物および規準化抗体混合物の分析陽イオン交換クロマトグラフィープロファイルの定量化。ND - 未決定。
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【０２３６】
実施例10：精製タンパク質または細胞培養上清を使用する修飾IgG1-2F8-F405LバリアントのKappaSelect分離
4つの1mL KappaSelect（GE Healthcare）カラムをタンデムに連結した。カラムをリン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mMリン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4、B.BraunまたはThermo Fisher）で予備平衡化した。抗体の細胞培養上清を0.2μmデッドエンドフィルターを通して濾過し、実施例4に記載されるようにBio-Layer干渉法を使用してIgG1の発現レベルを定量した。10mgから30mgの間の未精製IgG1-2F8-F405Lバリアントを含有する40mLから80mLの間の細胞培養上清をKappaSelectカラムに負荷した。あるいは、16mgの精製IgG-2F8-F405LをPBS（B.Braun）で合計体積80mLに希釈し、カラムに負荷した。カラムをPBSで洗浄し、0.1M グリシンHCl、pH3.0および0.1M グリシンHCl、pH2.0で順次に溶出させた。溶出した画分を数滴の2M トリスHCl、pH9.0で中和し、適切なサイズの10kDa分子量カットオフSlide-A-Lyzerキャリッジ（ThermoFisher）を使用してPBS（B.Braun）中に透析した。6M グアニジンHClを使用してカラムをクリーニングした。フロースルー画分をPBS洗浄液と合わせ、実施例13に記載されるようにSDS-PAGEによって分析した。
【０２３７】
実施例11：細胞培養上清または精製された免疫グロブリン溶液からの修飾IgG1-7D8-K409RバリアントのCaptureSelect KappaXL分離
製造業者の説明書に基づき均質なCaptureSelect KappaXL（ThermoFisher）のスラリーから口径6.6mmのHiTカラム（Omnifit）中に充填樹脂をおよそ1mL含有するカラムを手作業で充填した。リン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mM リン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4、ThermoFisher）でカラムを予備平衡化した。0.2μmデッドエンドフィルターを通して抗体細胞培養上清を濾過し、実施例4に記載されるようにBio-Layer干渉法を用いてIgG1の発現レベルを定量した。1〜10mgの未精製IgG1-7D8-K409Rバリアントを含有する上清10mLをCaptureSelect KappaXLカラムに負荷した。およそ5カラム体積のPBSおよび3カラム体積の0.1M クエン酸塩NaOH（pH5.0）を用いてカラムを順次に洗浄した。結合した物質を0.1M クエン酸塩NaOH（pH3.5）で溶出させた。数滴の2M トリスHCl（pH9.0）で1mLの画分を中和した。カラムを6M グアニジンHClで洗浄した。フロースルーをPBS洗浄液と共にプールした。pH5.0の洗浄液またはpH3.5の溶出液のいずれかからの280nmでの顕著な吸光度ピークを含有した画分をプールした。実施例4および14に記載されるようにBio-Layer干渉法およびCE-SDSを用いて負荷、プールされたフロースルーおよびプール画分を分析した。
【０２３８】
実施例12：修飾カッパ軽鎖可変ドメインを有する修飾IgG1-2F8-F405LバリアントのプロテインL分離
5mL HiTrapプロテインLカラム（GE Healthcare）をリン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mM リン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4）で予備平衡化した。IgG-2F8-F405L-R18P、IgG-2F8-F405L-T20S-T22S、IgG-2F8-F405L-R24SまたはIgG-2F8-F405L-K107Lを含有する抗体細胞培養上清を、0.2μmデッドエンドフィルターを通して濾過し、実施例4に記載されるようにBio-Layer干渉法を用いてIgG1の発現レベルを定量した。上清10mLをHiTrapプロテインLカラムに負荷した。あるいは、抗体培養上清を実施例5に記載されるようにプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。0.8mgから2.8mgの間の精製されたIgG-2F8-F405L、IgG-2F8-F405L-S9LまたはIgG-2F8-F405L-S12PをPBS中に合計体積が10mLになるよう混合し、HiTrapプロテインLカラムに負荷した。カラムをPBSで洗浄し、特異的に結合した物質をpH3.5、3.0および2.5の0.1M グリシン-HClで順次溶出させ、数滴の2M トリス、pH9.0で中和した。15mM 水酸化ナトリウムを使用してカラムを洗浄した。実施例4および14に記載されるようにBio-Layer干渉法およびCE-SDSを使用してフロースルー中の物質を分析した。
【０２３９】
実施例13：ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を用いるクロマトグラフィーフロースルー画分の試料の分析
試料を等量のNuPAGE LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、70℃で10分間加熱した。修正Laemmli法（Laemmli 1970 Nature 227(5259): 680-5）を用いて非還元条件下、4〜12％ NuPAGEビス-トリスゲル（Invitrogen）上で1×NuPAGE MOPS SDS泳動緩衝液（Invitrogen）を用いてSDS-PAGEを行った。クマシーでSDS-PAGEゲルを染色し、OptiGoイメージングシステム（Isogen Life Sciences）を使用してデジタルイメージ化した。SeeBlue Plus2予備染色標準を分子量標準として使用した（Invitrogen）。
【０２４０】
実施例14：キャピラリー電気泳動-ドデシル硫酸ナトリウム（CE-SDS）を使用するクロマトグラフィー画分の試料の分析
分析前に0.2μmデッドエンドフィルターを通して試料を濾過した。実施例4に記載されるBio-Layer干渉法濃度測定を用いて、または280nmでの吸光度に基づき、濃度が250ug/mL以下になるようにPBS中に希釈することによって試料濃度を調整した。製造業者の説明書に基づきHT Protein Express LabChip（Caliper Life Sciences, MA）上のLabChip GXII（Caliper Life Sciences, MA）を非還元条件で使用してCE-SDSを行った。LabChipGXソフトウェアV3.1（Caliper Life Sciences, MA）を使用してデータを解析した。
【０２４１】
実施例15：CaptureSelect LC-カッパ（Hu）アフィニティーマトリックスのためのノックアウト変異の同定
製造業者によって記載されるように、CaptureSelect LC-カッパ（Hu）アフィニティーマトリックス、KappaSelectおよびCaptureSelect KappaXL（GE-Healthcare, BAC）は、両方ともヒトカッパL鎖（CL）の定常部分のユニークなエピトープを認識する13kDaのラマ抗体フラグメントを含有する。さらに製造業者に従って、フラグメントは、非ヒト霊長類種と交差反応し、マウス、ウサギ、ウシおよびラットL鎖またはヒトラムダL鎖と交差反応しない。
【０２４２】
これらの異なる種のカッパCLドメインの配列アライメントは、ヒトおよび霊長類カッパ配列において保存されているが、他の配列では違っているいくつかのアミノ酸残基を明らかにした。これらのうち、軽鎖および重鎖の複合体において露出している残基を分析のために選択し、マウス（mm）CLドメインまたはマウス特異的対応物に対応する単一の点変異を含有するヒトカッパL鎖を設計した（図10）。mmCLドメインに追加的な点変異（F135L）を導入して、ヒトH鎖との効率的な対形成を容易にした。
【０２４３】
9つのカッパL鎖変異体を適切なH鎖と共に発現させ（表6）、それらがKappaSelect樹脂に結合する能力について評価した（実施例10に記載されるように）。精製されたIgG1-2F8-F405Lを、KappaSelect樹脂を使用するアフィニティー精製のための陽性対照として使用した（図12）。予想通り、mmCL（F135L）L鎖を含有するIgG1-2F8-F405LをKappaSelect樹脂によって精製することはできなかった（図12B）。V110Dを除いて、すべての変異体を依然として精製することができたが、これは、カッパLC中のV110が直接または間接的にKappaSelect結合部位の部分であることを示唆している（図12）。IgG1-2F8-F405L-E143Dは、主として他の変異体よりも高いpHで溶出し、このことは、カラム樹脂との相互作用がより弱いことを示している（図12D）。KappaSelect樹脂との結合に対する単一の点変異の効果を表7にまとめる。表中、（＋＋＋）は結合プロファイルが陽性対照と類似することを示し；（＋＋）は、対照と比べてより高いpHで溶出するIgG1の比率がより大きいことを示し；（＋）は、フロースルーおよびPBS洗浄液中にかなりのIgG1タンパク質が検出されることを示し、（−）は、樹脂との結合が検出されないことを示す。
【０２４４】
個別に発現されたカッパL鎖変異体を、位置V110にすべての天然アミノ酸（Cを除く）への置換を含有した適切なH鎖と共に（実施例11に記載されるように）精製することによってカッパL鎖の残基V110における置換に対するCaptureSelect KappaXLアフィニティーマトリックスの耐容性をさらに評価した。pH3.5の溶出の間に280nmで溶出ピークが検出されるので、予想通りIgG1-7D8-K409Rは樹脂に結合した。KappaSelect樹脂に対する結合を打ち消したV110D置換は、CaptureSelect KappaXL結合への結合も防止したが、これは、両方のマトリックスが同じまたは類似のエピトープに結合することを示唆している。V110Rは、これらの条件下で樹脂との検出可能な相互作用を示さなかった唯一の他の変異であった（図13および14）。他のIgG1-7D8-K409Rバリアントは、樹脂に対して低減した親和性を示す。例えばIgG1-7D8-K409R-V110EはpH3.5の溶出液およびフロースルー画分中に検出され、IgG1-7D8-K409R-V110KはpH5.0の洗浄液およびフロースルー画分中に検出され、IgG1-7D8-K409R-V110Tは、pH5.0の洗浄およびpH3.5の溶出の間の両方で溶出する（図13および14）。CaptureSelect KappaXL樹脂への結合に対する単一の点変異の効果を表8にまとめる。表中、（＋＋＋）は、結合プロファイルが陽性対照と類似することを示し；（＋＋）は、対照と比べてより高いpHで溶出するIgG1の比率がより大きいことを示し；（＋）は、フロースルーおよびPBS洗浄液中にかなりのIgG1タンパク質が検出されることを示し、（−）は、樹脂との結合が検出されないことを示す。
【０２４５】
（表６）IgG1-2F8-F405LおよびIgG1-7D8-K409RカッパL鎖バリアント
2021528435.tif 000016
【０２４６】
（表７）KappaSelect樹脂へのIgG1-2F8-F405Lおよびバリアントの結合挙動
2021528435.tif 000017
【０２４７】
（表８）CaptureSelect KappaXL樹脂へのIgG1-7D8-K409Rおよびバリアントの結合挙動
2021528435.tif 000018
【０２４８】
実施例16：プロテインLアフィニティーマトリックスに対するノックアウト変異の同定
プロテインLは、また、カッパサブタイプI、IIIおよびIVの可変部分に結合するが、カッパサブタイプIIにも大部分のラムダ サブタイプにも結合しないことが記載されている（Nilson et al. J Biol Chem. 1992;267(4)：2234-9）。さらに、ヒトおよびマウスカッパ軽鎖上のプロテインLのエピトープが、X線結晶学によって特定されている（Graille et al. Structure. 2001 9(8):679-87; Graille et al. Biol Chem. 2002 277(49):47500-6）。これらの結晶構造の分析は、両方の構造において重要な接触残基として17個の残基を特定している（図11）。これらのうち、7つの残基を構造の解析および配列アライメントに基づき選択し、単一または二重点変異を使用するカッパサブタイプII配列または大部分のラムダサブタイプI配列のいずれかにおいて等価の位置に通常見出される残基にそれらを変異させた（図11、表6）。
【０２４９】
これらのカッパL鎖変異体を適切なH鎖と共に発現させ、それらがプロテインL樹脂に結合する能力について評価した（実施例12に記載されるように）。精製されたIgG1-2F8-F405L陽性対照および変異されたタンパク質の大部分は樹脂によって結合された。対照的に、IgG1-2F8-S12Pは、これらの条件下で樹脂に結合しない（図15）。HiTrapプロテインLカラムへの結合に対する点変異の効果を表9にまとめる。表中、（＋＋＋）は、結合プロファイルが陽性対照と類似することを示し；（＋＋）は、対照と比べてより高いpHで溶出するIgG1の比率がより大きいことを示し；（＋）は、フロースルーおよびPBS洗浄液中にかなりのIgG1タンパク質が検出されることを示し、（−）は、樹脂との結合が検出されないことを示す。
【０２５０】
（表９）プロテインL樹脂へのIgG1-2F8-F405Lおよびバリアントの結合挙動
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【０２５１】
実施例17：HiTrapプロテインLに対するIgG1バリアントの結合特異性
5mL HiTrap プロテインLカラム（GE Healthcare）をリン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mM リン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4）で予備平衡化した。抗体培養上清を実施例5に記載されるようにプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。およそ250μgの精製IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PまたはIgG1-HepCをPBSと混合して合計体積5mLにし、別々の実験でHiTrapプロテインLカラムに負荷した。PBSに続いて0.02M クエン酸ナトリウム-NaOH、pH5.0でカラムを洗浄し、特異的に結合した物質を0.1M グリシン-HCl、pH3.0で溶出させた。0.015M NaOHを使用してカラムをクリーニングした。
【０２５２】
実施例18  HiTrap KappaSelectに対するIgG1バリアントの結合特異性
5mL HiTrap KappaSelectカラム（GE Healthcare）をリン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mM リン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4）で予備平衡化した。抗体培養上清を実施例5に記載されるようにプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。およそ500μgの精製IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PまたはIgG1-HepCをPBSと混合して合計体積5mLにし、別々の実験でHiTrap KappaSelectカラムに負荷した。カラムをPBSおよび0.1M グリシン-HCl、pH3.0で洗浄した。特異的に結合した物質を0.1M グリシン-HCl、pH2.5で溶出させた。6M グアニジンHClを使用してカラムをクリーニングした。
【０２５３】
実施例19：HiTrap LambdaFabSelectへのIgG1バリアントの結合特異性
1mL HiTrap LambdaFabSelectカラム（GE Healthcare）をリン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mM リン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4）で予備平衡化した。実施例5に記載されるようにプロテインAクロマトグラフィーによって抗体培養上清を精製した。およそ500μgの精製IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PまたはIgG1-HepCをPBSと混合して合計体積5mLにし、別々の実験でHiTrap LambdaFabSelectカラムに負荷した。カラムをPBSで洗浄し、特異的に結合した物質を0.1M グリシン-HCl、pH2.0に続いて0.5M 酢酸で溶出させた。0.025M NaOHを使用してカラムをクリーニングした。
【０２５４】
実施例20：アフィニティークロマトグラフィー樹脂に対する抗体バリアントの特異性
製造業者によって記載されるように、CaptureSelect LC-ラムダ（Hu）アフィニティーマトリックス、LambdaFabSelect（GE-Healthcare）は、ヒトカッパL鎖の定常部分のユニークなエピトープを認識する13kDaラマ抗体フラグメントを含有する。KappaSelectはヒトカッパL鎖の定常部分のエピトープに結合し、V110D変異は樹脂との相互作用を防止する（実施例15）。それに対して、プロテインLはカッパ軽鎖のサブタイプに結合し、カッパ軽鎖を有する抗体中にS12P変異を導入することは樹脂との相互作用を防止した（実施例16）。ラムダL鎖を有するIgG1-HepCならびにカッパL鎖を有するIgG1-2F8およびIgG1-7D8を組換え抗体混合物の構成成分として選択した。実施例1に記載されるようにIgG1-2F8-V110DおよびIgG1-7D8-S12P中にV110DおよびS12P点変異を導入し、それぞれ実施例17、18および19に記載されるように、個別に産生および精製された抗体の特異性をプロテインL、KappaSelectおよびLambdaFabSelectへの結合について試験した。図16は、IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCの各々が、それぞれプロテインL、KappaSelectおよびLambdaFabSelect樹脂に特異的に結合することを示す。
【０２５５】
実施例21：HiTrap KappaSelectの結合能の決定
1mL KappaSelect（GE Healthcare）カラムをリン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mM リン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4、B.BraunまたはThermo Fisher）で予備平衡化した。PBS中の精製IgG1-7D8-K409R 75mgを、およそ40mLの合計体積で、0.25、0.5または1mL/分の流速を用いてKappaSelectカラム（GE Healthcare）に負荷した。カラムをPBSで洗浄し、特異的に結合したタンパク質を0.1M グリシンHCl、pH2.5で溶出させ、6M グアニジンHClを使用してカラムをクリーニングした。フロースルーをプールし、無菌濾過し、Nanodrop ND-1000分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）を使用して280nmでの吸光度によってタンパク質濃度について分析した。フロースルー中のタンパク質濃度の分析は、負荷とフロースルー物質との間のタンパク質の量における差に基づきカラム能力を37〜41mgの間であると推測可能にした。結合能は、本質的に流速に依存せず、カラムが飽和していたことを確認するものであった。図17は、結合能の決定実験についてのクロマトグラムを示す。
【０２５６】
実施例22：KappaSelectアフィニティークロマトグラフィーを用いるIgG1バリアントの組換え抗体混合物の組成の制御
本実施例は、可変組成の混合物を採取し、異なる構成成分に対して特異性を有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂を使用するクロマトグラフィーを行うことにより、過剰な抗体を枯渇させて、所定の組成の混合物をもたらすための手順を記載する（図1C）。
【０２５７】
IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PまたはIgG1-HepCを実施例3に記載されるように組換え産生し、実施例4に記載されるように抗体力価を計算した。培養上清を混合して、biolayer干渉法測定に基づき1：2.4：1の理論比の抗体濃度をもたらし、抗体の混合物の同時産生のための上流プロセスをシミュレートした。この比を選択したのは、3つの抗体の1：1：1の質量比を目標にしたが、IgG1-7D8-S12Pが過剰産生されたことにより混合物の組成が制御されず、所望の比を達成するためにクロマトグラフィー分離が必要であった、上流の同時生産プロセスを模倣するためであった。実施例5に記載されるように混合物をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。図5Dは、抗体混合物のプロテインA精製のためのクロマトグラムを示す。Nanodrop ND-1000分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）を使用する280nmでの吸光度と、抗体の一次アミノ酸配列を用いて計算した3つの抗体の平均の吸光係数とによって、混合物のタンパク質濃度を分析した。実施例8に記載されるように分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて組成を分析した。図19は、精製されたIgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCが分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって分離されることを示す。分析陽イオン交換クロマトグラム（図19）、濃度測定および体積は、混合物の3つの構成成分の質量を推定可能にした（表10）。IgG1-7D8-S12Pは、適切に過剰であったので、実施例21におけるIgG1-7D8-K409Rについての結合能の決定に基づき、1mL KappaSelectカラムによって除去することができた。これは、変異がKappaSelect樹脂のエピトープと同じドメインではなかったので、これらのIgG1-7D8バリアントについての能力が類似すると仮定したものであった。この実験設定は、カラム能力が混合物から過剰な抗体を特異的に除去するために適するようにカラムのサイズまたはサイクル数が調整されたプロセスを模倣するためであった。
【０２５８】
1mL KappaSelect（GE Healthcare）カラムをリン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mM リン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4、B.BraunまたはThermo Fisher）で予備平衡化した。PBS中に合計体積56.7mLの組換え抗体混合物116.9mgを、50mL superloop（GE Healthcare）を使用してKappaSelectカラムに負荷した。カラムをPBSで洗浄し、結合した物質を0.1M グリシンHCl、pH2.5で溶出させ、6M グアニジンHClを使用してカラムをクリーニングした。フロースルー画分をプールし、適切なサイズの10kDa分子量カットオフSlide-A-Lyzerキャリッジ（ThermoFisher）を使用してPBS中に透析し、プールされた画分を無菌濾過した。Nanodrop ND-1000分光光度計を使用する280nmでの吸光度と、抗体の一次アミノ酸配列を用いて計算した3つの抗体の平均の吸光係数とによって、プールの濃度を測定した（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）。実施例8に記載され、図19に示されるように分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて組成を分析した。抗体混合物の組成の定量化は、クロマトグラフィーにより許容差内で所定の1：1：1を満たす抗体産物が生じたことを示し（表10）、クロマトグラフィーを用いて可変組成の抗体負荷の組成を制御できることを示す。
【０２５９】
（表１０）インプット抗体混合物および規準化抗体混合物の分析陽イオン交換プロファイルの定量化
2021528435.tif 000020
【０２６０】
実施例23：電荷変調抗体の使用、分取陽イオン交換カラムを用いた順次段階溶出による抗体混合物の分離および予め定義された組成の抗体混合物をもたらすための回収
本実施例は、可変組成の混合物を採取し、分析アッセイを行って組成を決定し、過剰な抗体を含有する廃棄画分を抜き取って所定の組成の混合物をもたらすことができるようにデザインスペースが十分に予備分析されているクロマトグラフィー段階を行うための手順を記載する（図1D）。
【０２６１】
実施例3に記載されるように一過性産生またはCHO-K1に基づく発現系を使用して個別の抗体を組換え発現させ、実施例5に記載されるようにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって個別に精製することによって、IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの混合物（実施例1）を調製した。Nanodrop ND-1000 分光光度計（Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands）および純粋な抗体の一次アミノ酸配列から計算した吸光係数を使用して個別の抗体の濃度を測定した。抗体を終濃度15.6mg/mLの等しい質量比で混合することによって、抗体混合物をPBS緩衝液（12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4緩衝液、B.BraunまたはThermo Fisher）中に調製した。
【０２６２】
順次段階溶出によって各抗体を個別に溶出させることができる溶出スキームは、実施例9に記載されている。第1段階が可変のイオン強度を有した一方で、第2段階が実施例9で使用されたものと同じであった2段階に、溶出スキーム中の5段階の各々を変換した。単一の抗体特異性を含有し、5つの抗体の各々で高さおよび幅が類似であった広いピークを溶出するように第1段階を設計した。残りのタンパク質をすべて溶出させ、次のタンパク質が溶出する前にベースラインの分離をもたらすように第2段階を設計した。
【０２６３】
抗体混合物を負荷緩衝液（20mM NaHPO4、pH6.5）中に20倍希釈した。塩濃度のスクリーニングの間、別々の実験で13％、19.5％、20.7％、29.4％、31.5％、39.5％、39.5％、44.6％、47％、61.2％；13.5％、19.5％、21.2％、29.4％、32％、39.5％、39.6％、44.6％、47.5％、61.2％；14％、19.5％、21.7％、29.4％、32.5％、39.5％、39.8％、44.6％、48％、61.2％；14.5％、19.5％、22.2％、29.4％、33％、39.5％、40％、44.6％、48.5％、61.2％または15％、19.5％、22.7％、29.4％、33.5％、39.5％、40.2％、44.6％、49％、61.2％（v/v）溶出緩衝液（20mM NaHPO4、250mM NaCl、pH6.5）と混合された負荷緩衝液を含有する10および7カラム体積の交互の10個の順次段階溶出段階で抗体を溶出したことを除き、実施例6に基づき10g/L樹脂の負荷で分離を行った。最終条件は、14％、19.5％、21.7％、29.4％、32.5％、39.5％、39.8％、44.6％、48％および61.2％v/v）溶出緩衝液（20mM NaHPO4、250mM NaCl、pH6.5）と混合された負荷緩衝液を使用して抗体を溶出させた。図20Aは、ピーク形状のバリエーションが5つの抗体の各々についてイオン強度により様々であり、緩衝液Bのより高い％がピーク高の増加に対応することを示し、図20Bは、クロマトグラムに基づき選択された溶出スキームを示す。
【０２６４】
デザインスペースを研究するために、別々の実験で異なる比の5つの抗体をカラムに適用した。各比について、混合物から枯渇された溶出タンパク質の体積を下記のように系統的に変動させた。アウトプット混合物のプールを分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析して、プール中の各タンパク質の量と枯渇された画分の体積との間の関係を理解した。本実施例では、3つのタンパク質（IgG1-7D8、IgG1-CD37-37-3およびIgG1-CD52-Campath-E345K；ピーク1 3および5）のデザインスペースを研究したのに対し、2つのタンパク質（IgG1-224およびIgG1-CD19-21D4-E345K；ピーク2および4）は枯渇されないことにより、それらは、分析陽イオン交換実験における対照として使用することができた。
【０２６５】
抗体の比が異なるIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの5つの混合物を、PBS緩衝液（12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4緩衝液、B.BraunまたはThermo Fisher）中に2.6mg/mL〜3.0mg/mLの間の終濃度で調製した。これらの混合物は、それぞれ1.5：1：1.5：1：1.5、2.5：1：2.5：1：2.5、1.5：1：1：1.5：1.5、2：1：1：2：2、2.5：1：1：2.5：2.5の質量比を有した。
【０２６６】
各混合物を負荷緩衝液（20mM NaHPO4、pH6.5）中に20倍希釈した。14％、19.5％、21.7％、29.4％、32.5％、39.5％、39.8％、44.6％、48％および61.2％ v/v）溶出緩衝液（20mM NaHPO4、250mM NaCl、pH6.5）と混合された負荷緩衝液の10および7カラム体積の交互の10個の順次段階溶出段階で抗体を溶出させたことを除き、実施例6に基づき10g/L樹脂の負荷で分離を行った。指定された所定の廃液体積を除き、IgG1-7D8、IgG1-CD37-37-3およびIgG1-CD52-Campath-E345Kの溶出の開始から2カラム体積後に始めて、最終産物タンパク質混合物を単一のアウトプット容器中に溶出させ、廃液は、それぞれの出口弁を切り替えることにより別の容器中に溶出させた；ピーク1 3および5（図20C）。廃液体積をそれぞれ0mL、10mL、20mL、30mLもしくは40mL（1.5：1：1.5：1：1.5および2.5：1：2.5：1：2.5混合物）、またはそれぞれ0mL、12.5mL、25mL、37.5mLもしくは50mL（1.5：1：1：1.5：1.5、2：1：1：2：2、2.5：1：1：2.5：2.5）に設定したことを除き、本質的に同じであった5つの異なるクロマトグラフィー実験を含むデザインスペース実験で各混合物を精製した。図20Cは、デザインスペース実験の間の例示的なクロマトグラムを示す。
【０２６７】
実施例8に記載されるように分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって、デザインスペース実験の間に収集された最終産物プールを分析した。1つのデザインスペース実験（2.5：1：2.5：1：2.5混合物）についての分析陽イオン交換クロマトグラムのセットを図20Dに示すが、図は、IgG1-7D8、IgG1-CD37-37-3およびIgG1-CD52-Campath-E345Kの第1溶出段階の間の体積増加に伴う枯渇効果を示している。
【０２６８】
各分析陽イオン交換クロマトグラムにおける5つのピークの各々の面積を、個別のタンパク質の比吸光係数に関して補正することによって濃度に変換し、IgG1-224（ピーク2；1.5：1：1：1.5：1.5、2：1：1：2：2および2.5：1：1：2.5：2.5混合物）またはIgG1-224およびIgG1-CD19-21D4-E345K（ピーク2および4；1.5：1：1.5：1：1.5および2.5：1：2.5：1：2.5混合物）の濃度に対して規準化した。単一の抗体混合物に対応し、廃液体積が異なる各セットの実験について、各タンパク質の質量を、廃液体積が除去されなかった精製からのタンパク質の量に対して規準化して、保持されたタンパク質の割合を計算した（表11；図20E〜F）。
【０２６９】
本実施例では、プール中のタンパク質の質量と廃液画分の体積との間の直線相関を仮定して、各タンパク質の負荷量について規準化されたIgG1-7D8、IgG1-CD37-37-3およびIgG1-CD52-Campath-E345Kについてのデータをフィッティングした。これは、ピークの形状に複雑さを仮定せず、カラムの負荷に伴うピークのシェアの変化も仮定しないことから、クロマトグラフィー挙動の簡略化モデルである。R2相関係数は、3つのタンパク質についてそれぞれ0.97、0.95および0.93であった（図20E）。最終的に、廃液体積を増加させながらすべての5つのタンパク質の相対枯渇を説明するための簡略モデルとして、各タンパク質の負荷量について規準化されたすべてのデータを同時にフィッティングした（図20F）。このモデルは、すべてのタンパク質の溶出挙動がこれらの条件下で同一であると仮定している。
【０２７０】
各構成成分について20％±2％の配布規格を有する、異なる抗体組成のIgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの4つの抗体の異なる混合物にモデルを適用した。最初に、個別にプロテインAで精製された構成成分をPBS緩衝液（12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4緩衝液、B.BraunまたはThermo Fisher）中で混合することによって混合物を調製して、組成の制御が不十分な上流プロセスに続く捕捉クロマトグラフィー段階を模倣した。次に、実施例8に記載されるように混合物を分析陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析した。個別のタンパク質の比吸光係数について補正することによって分析作用交換クロマトグラムにおける5つのピークの各々の面積を質量濃度に変換し、10g/L樹脂の合計タンパク質負荷を仮定することによって分取陽イオン交換カラム上に負荷されるべき各タンパク質の量を推測した。各タンパク質についての廃液体積を次式に基づき計算した：
V＝（mmin-m）/mk
式中、V＝等質量混合物をもたらすための廃液体積、m＝カラム上のタンパク質質量、mmin＝カラム上の制限タンパク質の質量、k＝枯渇速度の一次近似、図20F（-0.0178mL-1）。
【０２７１】
次に、分取陽イオン交換クロマトグラフィーを行って、5つの抗体の当質量混合物を回収した。14％、19.5％、21.7％、29.4％、32.5％、39.5％、39.8％、44.6％、48％および61.2％ v/v）溶出緩衝液（20mM NaHPO4、250mM NaCl、pH6.5）と混合された負荷緩衝液を含有する10および7カラム体積の交互の10個の順次段階溶出段階で抗体を溶出させたことを除き、実施例6に基づいて10g/L樹脂の負荷で分離を行った。指定された所定の廃液体積を除き、最終産物タンパク質混合物を単一のアウトプット容器中に溶出させ、廃液は、溶出の開始から2カラム体積後に開始して、4つの非限定的な抗体の各々について別々の容器に溶出させた。最後に、実施例8に基づき最終産物タンパク質混合物を分析陽イオン交換クロマトグラフィーにより分析した。4つの混合物の分取陽イオン交換クロマトグラムならびにインプット物質および最終産物の分析陽イオン交換クロマトグラムを図20G〜Nにまとめる。廃液体積および結果を表12にまとめる。
【０２７２】
結果は、インプット混合物A〜Cが規格（各構成成分について20％±2％）外であったが、アウトプット混合物は規格内であり、これは、本アプローチを使用してポリクローナル混合物の組成を制御できたことを示している。
【０２７３】
インプット混合物Dは規格外であったが、本方法を適用することによって規格内にならなかった。この混合物は、IgG1-CD52-Campath-E345Kが最大過剰であり、より低い相関係数によって実証されるようにデザインスペース実験による説明がもっとも不十分であり（図20E）、IgG1-224が大過剰であり、これはデザインスペース実験において変動されなかった。モデルを洗練させて各抗体のアウトプット量と廃液体積との間の関係をより十分に説明することによって、より難しい混合物に向けて本方法を改善することもできる。改善されたモデルは、例えば、混合物中の各構成成分について異なるモデルを適用することによって、モデル中により多くのデータポイントを使用することによって、一次近似に依存する代わりに実験ポイント間に補間を適用することによって、またはより複雑なモデルを使用すること、例えばガウスピーク形状をフィッティングすることによって、確立することもできる。
【０２７４】
（表１１）IgG1-7D8、IgG1-224、IgG1-CD37-37-3、IgG1-CD19-21D4-E345KおよびIgG1-CD52-Campath-E345Kの2.5：1：1：2.5：2.5混合物の分取陽イオン交換クロマトグラフィーの間の枯渇体積に応じたインプット混合物からの個別の抗体構成成分の枯渇速度の定量化。内部対象としての枯渇されていないIgG1-224について観察された面積（Area_ref）に対して各被験抗体について分析陽イオン交換クロマトグラフィーのピーク面積を規準化し（Area_rel）、一方でそれぞれの吸光係数（ext. coeff.；ε）について補正した。次に、保持されたタンパク質の割合（prot_ret）を、0.0mL枯渇体積で測定されたインプット混合物中に存在する量に対して規準化した。次に、枯渇速度kを、枯渇体積（枯渇V）にわたり保持されたタンパク質の割合（prot_ret）の一次導関数（傾き）として決定した。
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【０２７５】
（表１２）個別の構成成分の比吸光係数について規準化されたインプット抗体混合物およびアウトプット抗体混合物の分析陽イオン交換クロマトグラフィーのプロファイルの定量化、および分取クロマトグラフィーの廃液体積
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【０２７６】
実施例24：アフィニティークロマトグラフィー用いるIgG1バリアントの組換え抗体混合物の組成の制御
本実施例は、可変組成の混合物を採取し、異なる構成成分に対して特異性を有するアフィニティークロマトグラフィー樹脂を使用するクロマトグラフィーを行うための手順を記載し（図1B）、当該構成成分は、溶出されて所定の組成の混合物をもたらす。
【０２７７】
IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PまたはIgG1-HepCを実施例3に記載されるように組換え産生し、抗体力価を実施例4に記載されるように計算した。実施例15、16および20に記載されるように、それぞれプロテインL（GE Healthcare）、KappaSelect（GE Healthcare）、またはLambdaFabSelect（GE Healthcare）樹脂に特異的に結合するようにこれらのタンパク質を選択または操作した。培養上清を混合して、biolayer干渉法測定に基づきおよそ1：1：1または1：1.5：2の理論的抗体濃度比およびそれぞれおよそ185mgまたは275mgの合計量をもたらして、抗体混合物の同時産生のための上流プロセスをシミュレートした。
【０２７８】
タンデムに連結した1mL HiTrap（登録商標）KappaSelect （GE Healthcare）、LambdaFabSelect（GE Healthcare）およびプロテインL（GE Healthcare）カラムをリン酸緩衝食塩水（PBS；12.6mM リン酸ナトリウム、140mM 塩化ナトリウム、pH7.4、B.BraunまたはThermo Fisher）で予備平衡化した。IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCの1：1：1または1：1.5：2混合物をおよそ180mgまたは270mg含有する上清を流速0.5mL/分でカラムに負荷し、PBSで洗浄した（図21A〜B）。
【０２７９】
カラムの間で溶出緩衝液およびクリーニング緩衝液に差があったので、カラムを個別に溶出させた。HiTrap KappaSelectカラムを0.1M グリシン-HCl、pH3.0で溶出した。特異的に結合した物質を0.1M グリシン-HCl、pH2.5で溶出させた。6M グアニジンHClを使用してカラムをクリーニングした。HiTrapプロテインLカラムを0.02M クエン酸ナトリウム-NaOH、pH5.0で洗浄し、特異的に結合した物質を0.1M グリシン-HCl、pH3.0で溶出させた。0.015M NaOHを使用してカラムをクリーニングした。HiTrap LambdaFabSelectカラム（GE Healthcare）を0.1M グリシン-HCl、pH2.0に続いて0.5M 酢酸で溶出させた。0.025M NaOHを使用してカラムをクリーニングした。例示的なクロマトグラムを図21C〜Eに示す。各場合で280nMに顕著な吸光度を有して溶出した画分をプールし、適切なサイズの30kDa分子量カットオフのSlide-A-Lyzerキャリッジ（ThermoFisher）を使用してPBS中に透析し、プール画分を無菌濾過した。
【０２８０】
あるいは、IgG1-2F8-V110D、IgG1-7D8-S12PおよびIgG1-HepCの1：1：1または1：1.5：2混合物を含有するおよそ5mgの上清を実施例5に記載されるようにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。図21Fは、抗体混合物のプロテインA精製のための例示的なクロマトグラムを示す。
【０２８１】
分析陽イオン交換カラムに負荷され、実施例8に記載された方法と類似の方法によって分析された細胞培養上清混合物の無菌濾過物と一緒に、実施例8に記載されるように分析陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて異なる精製実験からのアウトプット混合物の組成を分析した。クロマトグラムを図21Gに示し、表13に量で表した。データは、インプット混合物の比が顕著に異なり、プロテインA精製段階が混合物の組成をあまり変化させない一方で、プロテインL、KappaSelectおよびLambdaFabSelectのタンデム精製が両方の混合物について類似の組成のアウトプット混合物を産生することを示し、ポリクローナル抗体混合物の組成を制御するためにこのアプローチを使用できることを示している。関連する負荷条件下で実験的に決定された樹脂の動的結合能に基づき、3つの直交アフィニティーカラムにおける樹脂の相対量を調整することによってアウトプット比を調整することもできる。軽鎖特異的アフィニティー樹脂を使用する場合、同時精製された遊離の軽鎖または軽鎖二量体を除去するために直交段階が必要とされることもできる。
【０２８２】
（表１３）インプット抗体混合物および規準化抗体混合物の分析陽イオン交換クロマトグラフィープロファイルの定量化
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【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２０−７】
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【図２０−８】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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