(57)【要約】本発明は、生体適合性ポリマーが、少なくとも１つの糖鎖の末端に接続したインビボ持続放出性組換え凝固因子ＶＩＩＩ、及びその調製方法を提供する。本発明によるインビボ持続放出性組換え凝固因子ＶＩＩＩは、従来の糖コンジュゲーション技術よりも綿密且つ安全な方法により修飾されたタンパク質表面を有し、免疫原性を減少し且つインビボでの持続可能性を増加させる利点を享有する。【選択図】  なし
2021510683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝固因子ＶＩＩＩの少なくとも１つの糖鎖の末端でシアル酸誘導体に連結されるリンカーを含むインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩであって、前記リンカーが式１によって表される、インビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩ：
【化１】
2021510683.tif 000025
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ３〜６シクロアルキル、３〜１０員のヘテロシクロアルキル、アミノ、（アミノ）Ｃ１〜６アルキル、（アミノ）Ｃ３〜６シクロアルキル、（アミノ）Ｃ６〜１２アリール、（アミノ）（３〜１０員のヘテロシクロアルキル）、又は５〜１２員のヘテロアリールであり（ここで、前記ヘテロシクロアルキル及び前記ヘテロアリールは、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよく；前記アミノは、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜６アルキル、ハロＣ１〜３アルキル若しくはＣ１〜６アルコキシカルボニルからなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに組み合わされて、８〜１６員のヘテロ縮合環を形成していてもよく（ここで、前記ヘテロ縮合環は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）；
前記リンカーは、少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、又はＲ１及びＲ２が互いに組み合わされる場合に形成される環に接続される生体適合性ポリマーを含有する）。
【請求項２】
前記生体適合性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリオキサゾリン、ヘパロサン、及びその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載のインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩ。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールが、５〜４０ｋＤａの重量平均分子量を有する、請求項２に記載のインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩ。
【請求項４】
式１の構造が、式２〜１８及びその異性体からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載のインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩ：
【化２】
2021510683.tif 000026
【化３】
2021510683.tif 000027
【化４】
2021510683.tif 000028
【化５】
2021510683.tif 000029
【化６】
2021510683.tif 000030
（式中、Ｌは、単結合、ハロゲン、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、−ＣＯ−、−Ｒ３ＣＯＮＲ３−、−ＯＣＯＮＲ３−、又は−Ｒ３ＮＣＯＲ３−であってもよく（ここで、Ｒ３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル及びＣ６〜１２アリールから選択されてもよい）、Ｘは、生体適合性ポリマーである）。
【請求項５】
式１の構造が、式１９〜２６からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載のインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩ：
【化７】
2021510683.tif 000031
【化８】
2021510683.tif 000032
（式中、ｎは、１００〜３，０００の整数である）。
【請求項６】
インビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩを調製する方法であって、
（１）宿主細胞に、凝固因子ＶＩＩＩをコードするヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入するステップ；及び
（２）前記宿主細胞を、第１の官能基が結合されたシアル酸代謝産物の誘導体を補充された培養培地で培養して、前記第１の官能基が結合されたシアル酸誘導体が、少なくとも１つの糖鎖の末端に導入されている凝固因子ＶＩＩＩを得るステップ
を含む方法。
【請求項７】
前記第１の官能基がアジド基又はアルキン基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（２）において、前記シアル酸代謝産物の誘導体が、式２７〜３２及びその異性体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項６に記載の方法：
【化９】
2021510683.tif 000033
【化１０】
2021510683.tif 000034
。
【請求項９】
ステップ（２）において、前記シアル酸代謝産物の誘導体は、前記宿主細胞が１．０Ｘ１０５又はより高い濃度を有するときに、０．１〜３００ｕＭの濃度に補充される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（２）において、温度は、前記シアル酸代謝産物の誘導体が補充される場合、２９℃〜３５℃に調整される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（３）前記シアル酸代謝産物の誘導体を、前記培養培地から除去するステップ；
（４）前記培養培地に、第２の官能基とそれに結合させた生体適合性ポリマーとを有する化合物を添加して、クリック反応を可能にするステップ；並びに
（５）前記生体適合性ポリマーが、少なくとも１つの糖鎖の末端に結合された凝固因子ＶＩＩＩを収集するステップを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体適合性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリオキサゾリン、ヘパロサン、及びその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の官能基がアジド基である場合、前記第２の官能基はアルキン基又はシクロアルキン基である；及び前記第１の官能基がアルキン基である場合、前記第２の官能基はアジド基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（４）において、前記第２の官能基とそれに結合させた前記生体適合性ポリマーとを有する化合物が、式３３〜４９及びその異性体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項１１に記載の方法：
【化１１】
2021510683.tif 000035
【化１２】
2021510683.tif 000036
【化１３】
2021510683.tif 000037
【化１４】
2021510683.tif 000038
（式中、Ｌは、単結合、ハロゲン、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、−ＣＯ−、−Ｒ３ＣＯＮＲ３−、−ＯＣＯＮＲ３−、又は−Ｒ３ＮＣＯＲ３−であってもよく（ここで、Ｒ３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル及びＣ６〜１２アリールから選択されてもよい）、Ｘは、生体適合性ポリマーである）。
【請求項１５】
前記インビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩが、前記凝固因子ＶＩＩＩの少なくとも１つの糖鎖の末端で前記シアル酸誘導体に連結されるリンカーを含み、前記リンカーが式１によって表される、請求項６に記載の方法：
【化１５】
2021510683.tif 000039
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ３〜６シクロアルキル、３〜１０員のヘテロシクロアルキル、アミノ、（アミノ）Ｃ１〜６アルキル、（アミノ）Ｃ３〜６シクロアルキル、（アミノ）Ｃ６〜１２アリール、（アミノ）（３〜１０員のヘテロシクロアルキル）、又は５〜１２員のヘテロアリールであり（ここで、前記ヘテロシクロアルキル及び前記ヘテロアリールは、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよく；前記アミノは、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜６アルキル、ハロＣ１〜３アルキル若しくはＣ１〜６アルコキシカルボニルからなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに組み合わされて、８〜１６員のヘテロ縮合環を形成していてもよく（ここで、前記ヘテロ縮合環は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）；
前記リンカーは、少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、又はＲ１及びＲ２が互いに組み合わされる場合に形成される環に接続される生体適合性ポリマーを含有する）。
【請求項１６】
式１の構造が、式１９〜２６からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１５に記載の方法：
【化１６】
2021510683.tif 000040
【化１７】
2021510683.tif 000041
（式中、ｎは、１００〜３，０００の整数である）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性ポリマーが、少なくとも１つの糖鎖の末端に接続した構造を有するインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩ、及びその調製方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は、タンパク質産生プロセスの間にゴルジ体でタンパク質残基に接続される糖鎖を表面に含有するタンパク質を指す。糖タンパク質では、糖鎖の機能が、タンパク質特性に大きな効果を有する。例えば、糖鎖は、タンパク質の水溶性の改善、プロテアーゼからのタンパク質の保護、タンパク質の免疫原性の減少、タンパク質の細胞内輸送及び局在化の方向性の決定、又は細胞間相互作用に影響を与えることができる（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３Ｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎｓ  ｏｎ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２０１２、１３、８３９８〜８４２９）。
【０００３】
この糖鎖の重要性に起因して、糖鎖工学によってタンパク質特性を改善しようと試みられている。例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）に関して、２個の追加のＮ糖鎖をエリスロポエチンに導入することにより、身体中でのエリスロポエチンの半減期を改善することができる（Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  ２００５  ９４（８）：  １６２６〜３５）。加えて、がん細胞を標的とする抗体治療のケースでは、フコースを欠く抗体が、糖鎖工学によって作製され、宿主の免疫応答をより良く誘導し、より良い治療効果を有することが報告されている（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ、ＭＡｂｓ．  ２００９  １（３）：  ２３０〜２３６）。糖鎖工学を使用する、これらの方法は、副反応によって生じる副産物の生成を最小化することができるとの利点を有し、そのような方法は、従来の化学的な方法と比較して、効率的である。
【０００４】
一方、糖鎖の変化による糖タンパク質特性を改善する方法に関して、代謝性糖鎖工学（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を適用しようと試みられており、糖鎖の変化が、より洗練された手段で実行される；しかしながら、特定の用途及びその商業上の使用は、まだ十分とはなっていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、生体適合性ポリマーが、少なくとも１つの糖鎖の末端に導入されたシアル酸誘導体に接続したインビボ長時間作用性組換え糖タンパク質、好ましくは、生体適合性ポリマーが、少なくとも１つの糖鎖の末端に導入されたシアル酸誘導体に接続した凝固因子ＶＩＩＩを提供することである。
【０００６】
本発明の別の課題は、代謝性標識化技術を適用して、凝固因子ＶＩＩＩの少なくとも１つの糖鎖の末端でのシアル酸が、アジド又はアルキン基が導入されたシアル酸誘導体に修飾される、インビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩを調製する方法を提供することである。
【０００７】
本発明の更に別の課題は、糖鎖の末端でシアル酸誘導体に生体適合性ポリマーを導入することによって修飾が行われる、修飾型インビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩを調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記で言及した課題を達成するために、本発明の実施形態では、凝固因子ＶＩＩＩの少なくとも１つの糖鎖の末端でシアル酸誘導体に連結されるリンカーを含むインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩが提供され、前記リンカーは式１によって表される：
【０００９】
【化１】
2021510683.tif 000003
【００１０】
式中のＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ３〜６シクロアルキル、３〜１０員のヘテロシクロアルキル、アミノ、（アミノ）Ｃ１〜６アルキル、（アミノ）Ｃ３〜６シクロアルキル、（アミノ）Ｃ６〜１２アリール、（アミノ）（３〜１０員のヘテロシクロアルキル）、又は５〜１２員のヘテロアリールであり（ここで、前記ヘテロシクロアルキル及び前記ヘテロアリールは、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよく；前記アミノは、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜６アルキル、ハロＣ１〜３アルキル若しくはＣ１〜６アルコキシカルボニルからなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに組み合わされて、８〜１６員のヘテロ縮合環を形成していてもよく（ここで、前記ヘテロ縮合環は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）；
前記リンカーは、少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、又はＲ１及びＲ２が互いに組み合わされる場合に形成される環に接続される生体適合性ポリマーを含有する。
【００１１】
加えて、本発明の別の実施形態では：（１）宿主細胞に、凝固因子ＶＩＩＩをコードするヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入するステップ、及び（２）前記宿主細胞を、第１の官能基が結合されたシアル酸代謝産物の誘導体を補充された培養培地で培養して、前記第１の官能基が結合されたシアル酸誘導体が、少なくとも１つの糖鎖の末端に導入されている凝固因子ＶＩＩＩを得るステップを含む、インビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩを調製する方法が提供される。
【００１２】
加えて、本発明の更に別の実施形態では：（３）ステップ（２）を実施した後、前記シアル酸代謝産物の誘導体を、前記培養培地から除去するステップ；（４）前記培養培地に、第２の官能基とそれに結合させた生体適合性ポリマーとを有する化合物を添加して、クリック反応を可能にするステップ；並びに（５）前記生体適合性ポリマーが、少なくとも１つの糖鎖の末端に結合された凝固因子ＶＩＩＩを収集するステップを更に含む、インビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩを調製する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によるインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩは、タンパク質表面に存在する糖鎖にコンジュゲートした生体適合性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を有し、糖タンパク質である凝固因子ＶＩＩＩ自体の免疫原性を、身体において減少させることができ、そのインビボ長時間作用性性能を改善することができる。加えて、本発明によるインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩを調製する方法は、組換えＤＮＡ技術を使用して糖タンパク質発現において目的の宿主細胞の正常な糖代謝プロセスを利用し、それによって、糖鎖と生体適合性ポリマーとの間のコンジュゲーションが高効率で正確であるという利点を有する。したがって、糖コンジュゲーション技術を使用して糖タンパク質糖鎖を変換する従来の方法と比較して、安定且つプロセス効率の高い様式で修飾型組換え凝固因子ＶＩＩＩを提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１．１でｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を宿主細胞にトランスフェクトする場合に使用される発現ベクターのマップを示す図である。
【図２】実施例１．２でｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４＿Ｂ３の精製プロセスをＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析することによって得られた結果を示す図である（レーン１：分子量マーカー、レーン２：細胞培養培地濃縮物、レーン３：ＶＩＩＩ選択溶出液、レーン４：精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３）。
【図３】実施例２．１での細胞培養プロセス及びそのそれぞれのサイクルの詳細を示す図である。
【図４Ａ】Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ（Ｎ−（４−ペンチノイル）−マンノサミン−テトラアシル化）を有するｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を発現する細胞株及びＡｃ４ＭａｎＮＡｌなしのｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を発現する細胞株に関する、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の増殖曲線を示す図である。
【図４Ｂ】Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ（Ｎ−（４−ペンチノイル）−マンノサミン−テトラアシル化）を有するｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を発現する細胞株及びＡｃ４ＭａｎＮＡｌなしのｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を発現する細胞株に関する、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の発現レベルを示す図である。
【図５】Ａｃ４ＭａｎＮＡｚを有するｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を発現する細胞株及びＡｃ４ＭａｎＮＡｚ（Ｎ−アジドアセチルマンノサミン−テトラアシル化）なしのｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を発現する細胞株に関する、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の発現レベルを示す図である。
【図６Ａ】ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの糖ＰＥＧ化反応産物及び精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  ＡｚをＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析することによって得られた結果を示す図である（レーン１：分子量マーカー、レーン２：２０ｋＤａ  ＤＢＣＯ  ＰＥＧを有するｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの反応産物、レーン３：３０ｋＤａ  ＤＢＣＯ  ＰＥＧを有するｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの反応産物、レーン４：４０ｋＤａ  ＤＢＣＯ  ＰＥＧを有するｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの反応産物、レーン５：精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ）。
【図６Ｂ】ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの糖ＰＥＧ化反応産物及び精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  ＡｚをＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析することによって得られた結果を示す図である（レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ、レーン３：１０ｋＤａ  ＤＢＣＯ  ＰＥＧを有するｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの反応産物）。
【図６Ｃ】ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの精製されたバージョン及びｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの糖ＰＥＧ化反応産物をＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析することによって得られた結果を示す図である（レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ、レーン３：精製された２０ｋＤａ  ＤＢＣＯ  ＰＥＧコンジュゲート型ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ、レーン４：分子量マーカー）。
【図６Ｄ】ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚの糖ＰＥＧ化反応産物の精製されたバージョンをＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析することによって得られた結果を示す図である（レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製された１０ｋＤａ  ＤＢＣＯ  ＰＥＧコンジュゲート型ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ）。
【図７】クリック反応が、Ｃｕ２＋の存在下でアジド−ＰＥＧ４０ｋＤａをｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｌに添加することによって行われたケースで得られた産物をＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析することによって得られた結果を示す図である。
【図８】非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩと比較して、糖ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの静脈内投与後に経時的に血液に残るＶＩＩＩ因子の活性を示すグラフである。
【図９】非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩと比較して、糖ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの皮下投与後に経時的に血液に残るＶＩＩＩ因子の活性を示すグラフである。
【図１０Ａ】非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩと比較して、糖ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの皮下投与後に経時的に血液に残るＶＩＩＩ因子の活性を示すグラフである。
【図１０Ｂ】非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩと比較して、糖ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの皮下投与後に経時的に血液に残るＶＩＩＩ因子の活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の態様では、凝固因子ＶＩＩＩの少なくとも１つの糖鎖の末端でシアル酸誘導体に連結されるリンカーを含むインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩ（ＶＩＩＩ因子、ＦＶＩＩＩ）を提供することができ、前記リンカーは式１によって表される：
【００１６】
【化２】
2021510683.tif 000004
【００１７】
式中のＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ３〜６シクロアルキル、３〜１０員のヘテロシクロアルキル、アミノ、（アミノ）Ｃ１〜６アルキル、（アミノ）Ｃ３〜６シクロアルキル、（アミノ）Ｃ６〜１２アリール、（アミノ）（３〜１０員のヘテロシクロアルキル）、又は５〜１２員のヘテロアリールであり（ここで、前記ヘテロシクロアルキル及び前記ヘテロアリールは、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよく；前記アミノは、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜６アルキル、ハロＣ１〜３アルキル若しくはＣ１〜６アルコキシカルボニルからなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに組み合わされて、８〜１６員のヘテロ縮合環を形成していてもよく（ここで、前記ヘテロ縮合環は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）；
前記リンカーは、少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、又はＲ１及びＲ２が互いに組み合わされる場合に形成される環に接続される生体適合性ポリマーを含有する。
【００１８】
凝固因子ＶＩＩＩは、糖鎖がタンパク質残基に共有結合を介して連結される糖タンパク質である。糖タンパク質のタンパク質表面における糖鎖を修飾することにより、タンパク質の水溶性の改善、プロテアーゼからのタンパク質の保護、及び細胞間相互作用におけるタンパク質の方向性の決定などのタンパク質特性に影響を与え得ることが知られている。
【００１９】
したがって、本発明者らは、代謝性糖鎖工学を使用して、式１によって表されるリンカーを介してタンパク質糖鎖を生体適合性ポリマーにコンジュゲートし、その結果、インビボ長時間作用性性能及び凝固因子ＶＩＩＩの安定性が改善され、したがって本発明が完成した。
【００２０】
特に、本発明では、凝固因子ＶＩＩＩが、細胞毒性を有する銅などの触媒を必要としないアジド−アルキン環化反応（クリック反応）を使用して、生体適合性ポリマーで標識される。他の化学反応と異なり、前記化学反応は、身体においてであっても、前駆体に実行可能であり、その理由は、前もって前駆体に導入されている反応基がアジド又はアルキンであり、これが身体に既存の物質によって生じるいかなる妨害もなく化学反応が起きることを可能にするからである。
【００２１】
生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリオキサゾリン、及びヘパロサンからなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、ポリエチレングリコールが好ましい。
【００２２】
加えて、ポリエチレングリコールは、５〜４０ｋＤａ、５〜３０ｋＤａ、又は５〜２０ｋＤａの重量平均分子量を有してもよい。４０ｋＤａ又はより低い分子量を有する小さなサイズのポリエチレングリコールの複数コンジュゲーションは、より高い分子量を有するポリエチレングリコールのコンジュゲーションに際して引き起こされるＰＥＧ毒性の可能性を減少させることがあり、糖タンパク質の半減期を更に改善し、皮下投与の際のそのバイオアベイラビリティーを改善する。
【００２３】
加えて、式１の構造は、式２〜１８及びその異性体からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。
【００２４】
【化３】
2021510683.tif 000005
【００２５】
【化４】
2021510683.tif 000006
【００２６】
【化５】
2021510683.tif 000007
【００２７】
【化６】
2021510683.tif 000008
【００２８】
【化７】
2021510683.tif 000009
【００２９】
式中のＬは、単結合、ハロゲン、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、−ＣＯ−、−Ｒ３ＣＯＮＲ３−、−ＯＣＯＮＲ３−、又は−Ｒ３ＮＣＯＲ３−であってもよく（ここで、Ｒ３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル及びＣ６〜１２アリールから選択されてもよい）、Ｘは、生体適合性ポリマーである。
【００３０】
特に、化合物は、式１９〜２６によって表される化合物のいずれか１つであってもよい（式中、ｎは１００〜３，０００の整数である）。
【００３１】
【化８】
2021510683.tif 000010
【００３２】
【化９】
2021510683.tif 000011
【００３３】
野生型ＶＩＩＩ因子タンパク質（Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインから構成される）は、単一鎖タンパク質として発現され、次に、プリンによって成熟して、肝細胞において重鎖及び軽鎖を含有する２８０ｋＤａのヘテロ二量体を形成する。本発明において修飾されてもよいＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号１によって表すことができる通常のＶＩＩＩ因子であり、好ましくは、ＶＩＩＩ因子（ｓｃＦＶＩＩＩ）の単一鎖形態である。
【００３４】
加えて、ＶＩＩＩ因子タンパク質は、近接又は非近接様式で部分的に欠失しているＢドメイン領域及び部分的に欠失しているａ３ドメイン領域を含有する；並びに近接又は非近接様式で部分的に欠失しているＢドメイン領域及び部分的に欠失しているａ３ドメイン領域を含有する、単一鎖形態のＶＩＩＩ因子は、配列番号２（Ｂドメイン及びａ３ドメイン領域のアミノ酸残基７８９〜１６５３の欠失により配列番号１から得られる形態）、配列番号３（Ｂドメイン及びａ３ドメイン領域のアミノ酸残基８３３〜１６５３の欠失により配列番号１から得られる形態）、配列番号４（Ｂドメイン及びａ３ドメイン領域のアミノ酸残基９０３〜１６５３の欠失により配列番号１から得られる形態）、配列番号５（Ｂドメイン及びａ３ドメイン領域のアミノ酸残基９６６〜１６５３の欠失により配列番号１から得られる形態）、配列番号６（Ｂドメイン及びａ３ドメイン領域のアミノ酸残基９０３〜１６５３及び１６４３〜１６５３の欠失により配列番号１から得られる形態）、配列番号７（Ｂドメイン及びａ３ドメイン領域のアミノ酸残基９６６〜１６５３の欠失により配列番号１から得られる形態）、並びに配列番号８（アミノ酸残基７８２でのイソロイシンからシステインへの置換により配列番号４から得られる形態）のうちのいずれか１つを含んでもよい。
【００３５】
加えて、ＶＩＩＩ因子タンパク質には、種々に修飾されたペプチド、すなわち、バリアントが含まれてもよい。修飾は、ＶＩＩＩ因子の機能を変更しない範囲内の１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加によって実施してもよい。これらの様々なペプチドは、配列番号２〜８のアミノ酸配列のいずれか１つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％又はそれ以上の同一であってもよい。
【００３６】
加えて、リンカーが接続される、ＶＩＩＩ因子タンパク質における糖鎖は、配列番号１アミノ酸配列に基づいて、アミノ酸残基４２、２３９、５８２、７５７、７８４、８２８、９００、９６３、１００１、１００５、１０５５、１０６６、１１８５、１２５５、１２５９、１２８２、１３００、１４１２、１４４２、１８１０、及び２１１８の少なくとも１つの位置に含まれてもよい。単一鎖ＶＩＩＩ因子（ｓｃＦＶＩＩＩ）を含むＶＩＩＩ因子タンパク質は、それ自体、表面に多くの糖鎖を有し、したがって、本発明による代謝性糖鎖工学を適用することによってタンパク質表面を修飾するのに適切である。
【００３７】
加えて、本発明の別の態様では：（１）宿主細胞に、凝固因子ＶＩＩＩをコードするヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入するステップ、及び（２）前記宿主細胞を、第１の官能基が結合されたシアル酸代謝産物の誘導体を補充された培養培地で培養するステップを含む、インビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩを調製する方法が提供され得る。
【００３８】
ステップ（１）において、凝固因子ＶＩＩＩの配列は、配列番号２〜８のアミノ酸配列のいずれか１つであってもよく、またヌクレオチドの核酸配列は、配列番号９〜１５のヌクレオチド配列のいずれか１つであってもよい。更に、ヌクレオチドは、シグナル配列又はリーダー配列を追加で含有してもよい。
【００３９】
本明細書で使用される、用語「シグナル配列」は、融合タンパク質の分泌を方向づけるシグナルペプチドをコードする核酸を指す。シグナルペプチドは、宿主細胞において翻訳され、次に切断される。特に、本発明のシグナル配列は、小胞体（ＥＲ）膜を通したタンパク質の移動を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明において有用なシグナル配列には、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ  １９８９．  １２５：  １９１〜２０２）、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら．、Ｎａｔｕｒｅ、１９８０．  ２８６：  ６７６〜６８３）、及び当技術分野において知られている他のシグナル配列（例えば、ワトソンら．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４．  １２：  ５１４５〜５１６４）が含まれる。
【００４０】
シグナルペプチドの特性は、当技術分野において周知である。シグナルペプチドは、典型的には、１６〜３０アミノ酸残基を含有し、より多い又はより少ないアミノ酸残基を含有してもよい。典型的なシグナルペプチドは、３つの領域、すなわち、塩基性のＮ末端領域、中心の疎水性領域、及びより極性のＣ末端領域からなる。
【００４１】
中心疎水性領域は、未成熟ポリペプチドの移動の間に膜状の脂質二重層を横断してシグナル配列を固定化する、４〜１２の疎水性残基を含有する。開始後、シグナル配列は、一般にシグナルペプチダーゼとして知られる細胞酵素によってＥＲの腔内で切断される。ここで、シグナル配列は、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰａ）のシグナル配列、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ＨＳＶ  ｇＤ）のシグナル配列、又は成長ホルモンの分泌シグナル配列であってもよい。好ましくは、哺乳動物などを含む高等真核生物細胞において使用される分泌シグナル配列が、使用され得る。加えて、本発明の分泌シグナル配列に関して、野生型ＩＬ−７に含まれるシグナル配列が、使用され得る、又は宿主細胞において高い発現頻度を有するコドンで置換された上で使用され得る。
【００４２】
加えて、発現ベクターは、宿主細胞に導入することができ、宿主細胞のゲノムと組み換え、挿入することができるベクターである。ベクターには、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、及びその類似体が含まれる。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルスが含まれるが、限定されない。加えて、プラスミドは、選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子を含有してもよい、またプラスミド含有宿主細胞は、選択条件下で培養されてもよい。
【００４３】
加えて、本明細書で使用される、用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターを導入することができる、原核生物又は真核生物細胞を指す。本明細書で使用される、用語「形質導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）」、「形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、及び「トランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」、は、当技術分野において知られている技術を使用する細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を指す。適切な宿主細胞は、本発明のヌクレオチド配列で形質導入又はトランスフェクトされることによるＶＩＩＩ因子タンパク質の発現及び／又は分泌に使用してもよい。本発明に使用することができる好ましい宿主細胞には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、不死化ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０ミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ヒト羊水由来細胞（ＣａｐＴ細胞）、又はＣＯＳ細胞が含まれる。例えば、本発明におけるＶＩＩＩ因子タンパク質を発現させるために使用される最も好ましい宿主株はＣＨＯ−Ｓであり、遺伝子及び同じものを使用する方法は当技術分野において知られている。
【００４４】
加えて、ステップ（２）において、宿主細胞を培養する場合、第１の官能基が結合されたシアル酸代謝産物の誘導体の補充が、宿主細胞タンパク質のシアル酸代謝経路を介して、第１の官能基が結合されたシアル酸誘導体が凝固因子ＶＩＩＩの糖鎖の末端に導入されるよう行われる。すなわち、ステップ（２）において、凝固因子ＶＩＩＩは、第１の官能基が結合されたシアル酸誘導体で修飾することができる。
【００４５】
ここで、第１の官能基は、アジド基又はアルキン基であってもよい。加えて、シアル酸代謝産物の誘導体は、細胞に効率的に送達するために、アセチル基、又はアルキル基、例えば、エチル基及びプロピル基を含有してもよい。アルキル基は、第１の官能基が結合されたシアル酸代謝産物のヒドロキシル基とエステル結合を形成して、その細胞浸透を促進する；及び細胞浸透後、アルキル基は、細胞内エステラーゼによって除去される。したがって、アルキル基は、補充されたシアル酸代謝産物が糖鎖の一部を置き換えるのを妨げない。
【００４６】
加えて、ステップ（２）において、シアル酸代謝産物（凝固因子ＶＩＩＩのシアル酸生合成経路における中間物質）を置き換えることができる、シアル酸代謝産物の誘導体は、式２７〜３２及びその異性体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物であってもよい：
【００４７】
【化１０】
2021510683.tif 000012
【００４８】
【化１１】
2021510683.tif 000013
【００４９】
一方、ステップ（２）において、シアル酸代謝産物の誘導体は、動物細胞由来宿主細胞が１．０Ｘ１０５又はより高い細胞濃度を有するときに、０．１〜３００ｕＭ（マイクロモル）の濃度に補充されてもよい。本発明による方法が細胞の糖代謝プロセスを利用するので、第１の官能基が結合されたシアル酸代謝産物は、標的凝固因子ＶＩＩＩの一部だけではなく、宿主細胞における全ての糖タンパク質と関連する代謝から生じる代謝産物の一部も置き換え得る。したがって、凝固因子ＶＩＩＩに、糖鎖修飾の目的のために高い割合で第１の官能基を導入するために、宿主細胞が高い細胞濃度、好ましくは、１．０Ｘ１０５又はより高い細胞濃度を有するときに、シアル酸代謝産物の誘導体が補充されることが好ましい。
【００５０】
宿主細胞は、以下のように培養されることが好ましい。宿主細胞の増殖期の間に、その培養が、シアル酸代謝産物の誘導体を補充されることなく行われる；ある特定レベルの細胞増殖が達成された後、細胞培養条件は、細胞増殖速度が減少し、細胞生存が維持される条件下に変更される；及び次に、宿主細胞は、第１の官能基を有するシアル酸代謝産物の誘導体を補充された培養培地で培養される。宿主細胞の増殖が減少するときに補充されるシアル酸代謝産物は、細胞が増殖している場合よりも高い割合で標的タンパク質の糖鎖にシアル酸に導入することができる。
【００５１】
ここで、細胞増殖速度が減少する条件として、温度を低温に調整する又は培養培地の栄養成分を制限する方法が存在する。特に、培養温度が、細胞増殖期の間に３７℃から、シアル酸代謝産物の誘導体を補充するときに２９℃〜３５℃に変更される場合、細胞増殖が遅くなることがある、一方、標的タンパク質（凝固因子ＶＩＩＩ）の発現は、１０日又はより長く継続されることがある。加えて、細胞培養培地における生物学的な増殖因子、ビタミン、及び必須アミノ酸などの栄養分の濃度を減少させることが可能である。加えて、ＶＩＩＩ因子の糖鎖を代謝性標識に供試するケースでは、酪酸などの物質を添加して細胞周期に影響を与えて、細胞増殖を停止させ、ＶＩＩＩ因子の発現をそのまま維持し、それによって、ＶＩＩＩ因子の糖鎖に導入される第１の官能基を有するシアル酸誘導体の割合を増加させる。
【００５２】
加えて、方法は：（３）第１の官能基が結合されたシアル酸誘導体をその糖鎖が含有する凝固因子ＶＩＩＩを、ステップ（２）から、精製した後、前記シアル酸代謝産物の誘導体を、前記培養培地から除去するステップ；（４）前記培養培地に、第２の官能基とそれに結合させた生体適合性ポリマーとを有する化合物を添加して、クリック反応を進行させることを可能にするステップ；並びに（５）前記生体適合性ポリマーが、少なくとも１つの糖鎖の末端に結合された凝固因子ＶＩＩＩを収集するステップを更に含んでいてもよい。
【００５３】
凝固因子ＶＩＩＩにおけるシアル酸誘導体の第１の官能基を第２の官能基と反応させるために、培養培地に過剰に存在するシアル酸代謝産物の誘導体を除去することが必要である。
【００５４】
ここで、第１の官能基は、アジド基又はアルキン基であってもよい。加えて、第１の官能基がアジド基である場合、第２の官能基はアルキン基又はシクロアルキン基である；及び第１の官能基がアルキン基である場合、第２の官能基はアジド基であってもよい。
【００５５】
特に、ステップ（４）において、生体適合性ポリマーのコンジュゲーションは、本発明の方法のステップ（２）による標的タンパク質の糖鎖に導入されているアジド基又はアルキン基を有するシアル酸誘導体に対してクリック反応を使用して行われてもよい。例えば、アジド基が結合されたシアル酸代謝産物の誘導体がステップ（２）に使用される場合、アルキン基又はシクロアルキン基とそれに結合させた生体適合性ポリマーとを有する化合物がステップ（４）に使用されてもよい；並びにアルキン基が結合されたシアル酸代謝産物の誘導体がステップ（２）に使用される場合、アジド基及びそれに結合させた生体適合性ポリマーを有する化合物がステップ（４）に使用されてもよい。
【００５６】
ステップ（４）において、第２の官能基とそれに結合させた生体適合性ポリマーとを有する化合物は、式３３〜４９及びその異性体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物であることが好ましい：
【００５７】
【化１２】
2021510683.tif 000014
【００５８】
【化１３】
2021510683.tif 000015
【００５９】
【化１４】
2021510683.tif 000016
【００６０】
【化１５】
2021510683.tif 000017
【００６１】
式中のＬは、単結合、ハロゲン、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、−ＣＯ−、−Ｒ３ＣＯＮＲ３−、−ＯＣＯＮＲ３−、又は−Ｒ３ＮＣＯＲ３−（ここで、Ｒ３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル及びＣ６〜１２アリールから選択されてもよい）であってもよく、Ｘは生体適合性ポリマーである。
【００６２】
加えて、ステップ（４）において収集される凝固因子ＶＩＩＩは、式１によって表されるリンカーを含有し、これは、少なくとも１つの糖鎖の末端でシアル酸誘導体に連結され、その特定の特性又は例は、本発明によるインビボ長時間作用性組換え凝固因子ＶＩＩＩに関して上に記載されているとおりである：
【００６３】
【化１６】
2021510683.tif 000018
【００６４】
式中のＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１２アリール、Ｃ３〜６シクロアルキル、３〜１０員のヘテロシクロアルキル、アミノ、（アミノ）Ｃ１〜６アルキル、（アミノ）Ｃ３〜６シクロアルキル、（アミノ）Ｃ６〜１２アリール、（アミノ）（３〜１０員のヘテロシクロアルキル）、又は５〜１２員のヘテロアリールであり（ここで、前記ヘテロシクロアルキル及び前記ヘテロアリールは、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよく；前記アミノは、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜６アルキル、ハロＣ１〜３アルキル若しくはＣ１〜６アルコキシカルボニルからなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに組み合わされて、８〜１６員のヘテロ縮合環を形成していてもよく（ここで、前記ヘテロ縮合環は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｓ及びＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有してもよく、並びに、それぞれ独立して、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、及びＣＦ３からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい）；
前記リンカーは、少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、又はＲ１及びＲ２が互いに組み合わされる場合に形成される環に接続される生体適合性ポリマーを含有する。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明は、実施例の手段によって、より詳しく記載される。しかしながら、以下の実施例は、本発明を例示のみに対するものであり、本発明の範囲は、それに限定されない。特に、本発明の技術はｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３について記載され、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３は本特許出願前の本発明者らによって出願された特許出願（ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００６６３３）において作製される様々なｓｃＦＶＩＩＩのうち１つのｓｃＦＶＩＩＩである。しかしながら、１つのｓｃＦＶＩＩＩが本発明の技術を記載するのに選択される理由は、選択されたｓｃＦＶＩＩＩが特定の利点を有するからではなく、提示される技術的な記載が、単に実施形態としてより明らかになるからである。
【００６６】
実施例１．  組換え単一鎖（ｓｃ）ＶＩＩＩ因子の調製
実施例１．１．  ｓｃＦＶＩＩＩ発現細胞株の産生
本発明者らによって出願された特許出願（ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００６６３３）に記載されるｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３（配列番号８のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号１５のヌクレオチド配列）を発現する、ベクター（図１を参照されたい）を使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞株を形質転換した。形質転換後、ＣＨＯ−Ｓ細胞株を５００ｍＭ又はより高いメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で継代し、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３高発現細胞株（ＣＨＯ−Ｓ  Ｇ４  Ｂ３）を選択した。選択した細胞株（ＣＨＯ−Ｓ  Ｇ４  Ｂ３クローン）をＣＤ  ＦｏｒｔＣＨＯ細胞培養培地で繁殖させ、次に窒素タンクに保存した。
【００６７】
実施例１．２．  ｓｃＦＶＩＩＩの培養及び精製
選択したｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３高発現細胞株（ＣＨＯ−Ｓ  Ｇ４  Ｂ３）をＣＤ  ＦｏｒｔＣＨＯ培地に添加し、細胞の数を３Ｘ１０５／ｍＬにし、次に細胞培養を４日間行った。細胞培養後、培養培地を収集し、発現したｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を精製した。ｓｃＦＶＩＩＩを培養培地から精製するために、５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を培養培地（ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３が発現される）に添加し、ＮａＣｌが最終濃度１．０Ｍを有し、次に培養培地を０．２μｍメンブランフィルターに通して、微細な懸濁物を除去した。次に、濾過物を、ＦＶＩＩＩ選択平衡溶液（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）で平衡化されたＦＶＩＩＩ選択樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を、それに結合させた。次に、ＶＩＩＩ選択平衡緩衝液を使用して不純物を除去し、ＶＩＩＩ選択溶出緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．９Ｍアルギニン、４５％プロピレングリコール、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ６．５）を使用して（アフィニティークロマトグラフィーを使用して）溶出を行った。次に、ＶＩＩＩ選択溶出液を、イオン交換クロマトグラフィーのための平衡緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）で５倍又はより高い倍率で希釈し、次にイオン交換クロマトグラフィーのための平衡溶液で平衡化されたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗイオン交換クロマトグラフィー樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。
【００６８】
その後、イオン交換クロマトグラフィーのための平衡溶液を使用して不純物を除去し、イオン交換クロマトグラフィー溶出液（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を使用して純粋なｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３を溶出した。精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３のＦＶＩＩＩ活性を、以下の実施例１．３．に記載されたＣＳアッセイで定量した。それぞれの精製段階での中間物質を分析するために行ったＳＤＳ  ＰＡＧＥの結果は、図２に示されるとおりである。
【００６９】
実施例１．３．  ｓｃＦＶＩＩＩ活性の測定
精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４＿Ｂ３を、ＦＶＩＩＩ活性に関してＣＳ法で測定した。発色法によって活性を測定するために、ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸによって販売される発色アッセイキットを、エンドポイント法で使用した。本試験に適切であるよう以下のように修飾した製造者により提供される試験法を使用して試験を実行した。特に、サンプルを、１Ｘ希釈緩衝液を使用して標準範囲内（０．２５〜１ＩＵ／ｍＬ）に希釈した。標準（較正血漿）を、１Ｘ希釈緩衝液を使用して０、０．２５、０．５、１ＩＵ／ｍＬの濃度を有するよう調製した。このように調製したサンプル及び標準のそれぞれ１０ｍＬを、７９０ｍＬの１ｘ希釈緩衝液で希釈した。次に、それぞれ５０ｕＬの希釈物を、９６ウェルプレートに分注し、３７℃で５分間置いた。自動ディスペンサーピペットを使用して、それぞれ５０ｕＬのエージェントサンプルを各ウェルに分注し、反応を３７℃で２分間で引き起こされることを可能にした。５０ｕＬの基質を、各ウェルに分注し、次に発色前に３７℃で２分間置いた。発色したサンプルに５０ｕＬの２％クエン酸を添加して、反応を停止した。吸光度を４０５ｎｍの波長で測定して、リニアキャリブレーション曲線を描画した。次に、サンプルの吸光度を、キャリブレーション曲線に入れてサンプルの活性を測定した。結果は以下の表１に示される。精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４＿Ｂ３は約７，０００ＩＵ／ｍｇの活性を有していた。これは、血友病を処置することが意図される商業的に利用可能な組換えＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））の活性と類似している。したがって、精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４＿Ｂ３が、血友病に対する治療剤として使用されるのに十分な活性のレベルを有していることが決定された。
【００７０】
【表１】
2021510683.tif 000019
【００７１】
実施例２．  糖代謝性標識を使用するｓｃＦＶＩＩＩの標識化
実施例２．１．  Ａｃ４ＭａｎＮＡｌでのｓｃＦＶＩＩＩの標識化
ＣＨＯ−Ｓ  ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３細胞株を細胞培養培地（ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ）に懸濁して、細胞濃度０．３〜３．０Ｘ１０６にし、次に細胞培養を１４０ｒｐｍで撹拌し、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で４日間行った。細胞濃度がある特定のレベルに達したとき、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ（Ｎ−（４−ペンチノイル）−マンノサミン−テトラアシル化）を補充して最終濃度１００ｕＭにし、次に細胞培養を１４０ｒｐｍで撹拌し、３１℃及び５％ＣＯ２の条件下で２４時間行った。細胞培養の完了後、細胞培養培地を１，０００ｒｐｍで遠心分離して培養培地を除去し、次に収集した細胞をＡｃ４ＭａｎＮＡｌを最終濃度１００ｕＭに補充した細胞培養培地（ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ）に懸濁し、細胞濃度を約０．１〜１．５Ｘ１０７のレベルに調整した。次に、培養を、１４０ｒｐｍで撹拌し、３１℃及び５％ＣＯ２の条件下で２４時間行った。引き続いて、細胞培養サイクルを、３回又はそれ以上の回数進行させること（偽灌流サイクル）を可能にした。それぞれのサイクルには、２４時間毎に細胞培養培地を、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌを最終濃度１００ｕＭに補充した新鮮な細胞培養培地で置き換える間、培養が上と同じ条件下で行われるプロセスが関与する。細胞培養プロセスは、図３に示される。
【００７２】
ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３細胞の増殖及びｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の発現におけるＡｃ４ＭａｎＮＡｌを有する培地の補充の効果を決定するために、初期４日の細胞増殖期後、引き続く細胞培養サイクルを、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌを補充していない細胞培養培地で進行されることを可能にし、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の細胞増殖及び発現における比較をＦＶＩＩＩ活性の観点で行った。１００ｕＭでのＡｃ４ＭａｎＮＡｌの補充は、ＣＨＯ−Ｓ  ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３細胞の増殖及びｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の発現に有意な効果を有していなかった。Ａｃ４ＭａｎＮＡｌなしの初期４日培養は、約１．０Ｘ１０７細胞／ｍＬのレベルに達する細胞濃度を生じ、１００ｕＭでＡｃ４ＭａｎＮＡｌを補充後に行った引き続く培養は、１．７Ｘ１０７細胞／ｍＬのレベルに達する細胞濃度を生じた。その後、細胞濃度を、定常レベルに維持した。図４Ａの増殖曲線及び図４Ｂの発現レベルグラフに示されているとおり、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３が、１００ｕＭでＡｃ４ＭａｎＮＡｌを補充されるかに関係なく類似するレベルが発現されることが特定された。したがって、培養に使用される濃度範囲でのＡｃ４ＭａｎＮＡｌの補充が、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３発現細胞株の増殖及びｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の発現レベルに有意な効果を有さないことが分かった。
【００７３】
実施例２．２．  Ａｃ４ＭａｎＮＡｚでのｓｃＦＶＩＩＩの標識化
ＳｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３細胞を類似する様式で培養したが、実施例２．１と同じ方法にＡｃ４ＭａｎＮＡｌに代えて１００ｕＭでＡｃ４ＭａｎＮＡｚ（Ｎ−アジドアセチルマンノサミン−テトラアシル化）を補充した。初期３日培養後、継代のそれぞれのサイクルの間、高い細胞濃度を維持するために、実施例２．１．における継代培養培地の５０％に対応する容量の継代培養培地で培養を行った。Ａｃ４ＭａｎＮＡｌと類似して、１００ｕＭでのＡｃ４ＭａｎＮＡｚの補充は、細胞増殖及びｓｃＦＶＩＩＩの発現に有意な効果を有していなかった。細胞濃度に関して、培養を３１℃にシフト後４日から開始し、培養培地を実施例２．１．と等しい容量の新鮮な培地で毎日置き換えた。ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３細胞を、培養の終了まで１．５Ｘ１０７又はより高いレベルで維持し；細胞生存度を培養の終了まで９０％又はより高く維持した。図５に示されるとおり、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の発現レベルは、実施例２．１．においてＡｃ４ＭａｎＮＡｌが補充されながらｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３細胞が培養されるケースにおいて得られたものと類似していた。結論として、培養に使用される濃度でのＡｃ４ＭａｎＮＡｚの補充が、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３細胞株の細胞増殖にもｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の発現にも有意な効果を有さないことが見出された。
【００７４】
実施例３．  修飾されたｓｃＦＶＩＩＩの調製
実施例３．１．  アジド又はアルキン基で標識されたｓｃＦＶＩＩＩの精製及びその活性測定
それぞれ、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＭａｎＮＡｌを使用して、アジド基及びアルキン基で標識された、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚ（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識）及びｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｌ（Ａｃ４ＭａｎＮＡｌで標識）を、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３に関して、上の実施例１．２．に記載されたのと同じ方法で精製した。精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚ及びｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｌの活性測定も、上の実施例１．３．と同じ方法で行った。結果は以下の表２に示される。ＣＳ活性測定は、精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚ及びｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｌの特異的な活性が、表２に示されるｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３のものと類似していたことを示す。これらの結果から、グリコール代謝性標識化によるＡｃ４ＭａｎＮＡｚ又はＡｃ４ＭａｎＮＡｌでのｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の標識化は、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４の活性に効果を有さないことが見出された。
【００７５】
【表２】
2021510683.tif 000020
【００７６】
実施例３．２．  クリック化学反応による糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩの調製
実施例３．２．１．  Ｃｕ２＋フリークリック化学反応での糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩの調製
コンジュゲーション緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．５）への交換後、実施例３．１．において精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ）のｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚに対するそれぞれのモル比が１００：１となるように、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ１０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ２０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ３０ｋＤａを添加した。次に、反応を４℃で４８時間進行させることを可能にし、このようにして糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩ（ＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚ、ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚ）を作製した。図６Ａ及び６Ｂに示されるとおり、糖がＡｃ４ＭａｎＮＡｚで修飾されているｓｃＦＶＩＩＩである、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚのほとんどが、ＤＢＣＯ  ＰＥＧとコンジュゲートされることが特定された。加えて、ｓｃＦＶＩＩＩの糖鎖における複数のシアル酸分子が、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで修飾されるとの事実と一致して、複数のコンジュゲーションが引き起こされて、ポリマーコンジュゲートの混合物が形成されることが特定された。上のＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−、ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−、及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩを、同じ方法によって精製した。特に、反応コンジュゲートを、接着させるために平衡緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）で平衡化されたＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗイオン交換樹脂に注入し、次に未ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚを、洗浄緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）で除去した。次に、糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚを、溶出緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）で溶出した。糖ＰＥＧ化反応産物及び精製された糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩをＳＤＳ  ＰＡＧＥを通してチェックした。結果は図６Ｃに示される。溶出された糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩ（ＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ、ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ、ＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ）の活性を、上の実施例１．３．に記載されているとおりＣＳ法によって測定した。表３に示されているとおり、それらの活性は、糖ＰＥＧ化前、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４＿Ｂ３Ａｚと比較して、減少しなかった。結果として、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ代謝での標識化及び引き続く糖ＰＥＧ化が、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３Ａｚの活性を減少させないことが見出された。
【００７７】
【表３】
2021510683.tif 000021
【００７８】
実施例３．２．２．  Ｃｕ２＋クリック化学反応を使用する糖ＰＥＧ化単一鎖ＦＶＩＩＩの産生
コンジュゲーション緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）への交換後、実施例３．１．において精製されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｌに、アジド−ＰＥＧ４０ｋＤａのｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｌに対するモル比が１：１００となるようにアジド−ＰＥＧ４０ｋＤａ（Ｎａｎｏｃｓ、ＰＧ１−ＡＺ−４０ｋ）を添加した。ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｌとアジド−ＰＥＧ４０ｋＤａ、Ｃｕ２＋とＴＨＰＴＡとの間のコンジュゲーション反応を開始するために、Ｃｕ２＋とＴＨＰＴＡを添加した、Ｃｕ２＋は最終濃度０．１ｍＭを有し、ＴＨＰＴＡは最終濃度０．５ｍＭを有した；及び次にアスコルビン酸を添加した、アスコルビン酸は最終濃度５ｍＭを有した。次に、反応を、室温で２４時間進行させることを可能にした。コンジュゲーション反応産物をＳＤＳ  ＰＡＧＥを通してチェックした。結果は図７に示される。ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｌのほとんどが、コンジュゲートされた。これは、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３の糖鎖のほとんどが、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌの手段によってアルキンで修飾されたことを意味する。２４時間のコンジュゲーション反応後、コンジュゲーション反応産物の活性を、実施例１．３．に記載されているとおりＣＳ法によって測定した。コンジュゲーション産物が、コンジュゲーション反応前、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  ＡｌにおけるＦＶＩＩＩの活性と比較して、５０％又はより大きく活性を失うことが特定された。これらの結果は想定されており、その理由は、フリーラジカルが、アルキン標識ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｂ３  Ｇ４Ａｌとアジド−ＰＥＧ４０ｋＤａとの間のコンジュゲーション反応に添加されているＣｕ２＋及びアスコルビン酸の反応によって生成され、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｌタンパク質の変性を招くからである。
【００７９】
実施例４．  ポリエチレングリコール標識糖鎖を有するｓｃＦＶＩＩＩのインビボ長時間作用性性能の評価
実施例４．１．  静脈内注射による投与後の薬物動態
血友病マウスは、実施例３．１．及び実施例３．２．１．によって調製されたポリエチレングリコールで標識されたｓｃＦＶＩＩＩ（糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩ）を静脈内注射によって投与された。次に、その薬物動態を測定した。ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ、ＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ、及び陽性対照Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を、１３週齢雌血友病マウス（Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ／Ｊ（ＦＶＩＩＩ−ノックアウト））の尾静脈を通して静脈内注射によって投与した。次に、血液に残るＦＶＩＩＩの活性を、７２時間まで測定した。ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ、ＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ、及びＡｄｖａｔｅ（登録商標）を、静脈内を通して尾静脈注射で、２００ＩＵ／ｋｇの用量で、それぞれ投与した；及び血液を、それぞれのマウスの眼窩後方静脈洞から、固定された時点（２分、６時間、１６時間、３０時間、４０時間、４８時間、６４時間、７２時間）で収集した。収集された血液に、抗凝血剤（３．２％クエン酸ナトリウム）を添加した、抗凝血剤は最終濃度１０％（ｖ／ｖ）を有していた。次に、遠心分離を行って血漿を得た。投与された物質の定量及び血漿に残るＦＶＩＩＩの活性の定量を、実施例１．３．に記載されているとおりＣＳ測定法によって行った。それぞれのサンプル群におけるマウスからそれぞれの時点で収集された、血漿に残るＦＶＩＩＩの活性は、図８に示される。加えて、血漿に残るＦＶＩＩＩ活性の測定値に基づいて、それらからＰＫパラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用する非コンパートメント解析（ＮＣＡ）法によって導出した。結果は表４に示される。ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚのそれぞれの半減期を、マウスの平均ＦＶＩＩＩ活性に基づいて、初期２分〜７２時間計算した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）と比較して、半減期は、それぞれ、２．８倍（ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚに対して）及び３．２倍（ＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚに対して）増加した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）と比較して、曲線下面積（ＡＵＣＩＮＦ）も、それぞれ、３．７倍（ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚに対して）及び５．１倍（ＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚに対して）増加した。したがって、静脈内注射によって投与されているケースでは、本発明により調製された修飾型ＶＩＩＩ因子タンパク質が、既存のＦＶＩＩＩと比較して、長時間身体に残り、これと一致することに、長時間作用性効果を呈することが特定された。
【００８０】
【表４】
2021510683.tif 000022
【００８１】
実施例４．２．１．  皮下注射による投与後の薬物動態
血友病マウスが、実施例３．１．及び実施例３．２．１．によって作製された糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩの皮下注射によって投与される薬物動態試験を行った。１３週齢雌血友病マウス（Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ／Ｊ（ＦＶＩＩＩ−ノックアウト））は、ＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ（糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩである）、及び陽性対照Ａｄｖａｔｅ（登録商標）の皮下注射によって投与された。次に、血液に残るＦＶＩＩＩの活性を、４８時間まで測定した。マウスは、ＦＶＩＩＩ活性に基づいて（ＦＶＩＩＩについての国際力価標準の力価に基づいて）３８０ＩＵ／ｋｇの用量で、それぞれのサンプルを皮下注射によって投与された；及び血液を、それぞれのマウスの眼窩後方静脈洞から、固定された時点（１時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間）で収集した。収集された血液に、抗凝血剤（３．２％クエン酸ナトリウム）を添加した、抗凝血剤は最終濃度１０％（ｖ／ｖ）を有していた。次に、遠心分離を行って血漿を得て、血漿をＦＶＩＩＩ活性の測定まで凍結して保存した。それぞれのサンプル群におけるマウスからそれぞれの時点で収集された、血漿に残るＦＶＩＩＩの活性は、図９に示される。血漿に残るＦＶＩＩＩ活性の測定値に基づいて、それらからＰＫパラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用する非コンパートメント解析（ＮＣＡ）法によって導出した。結果は表５に示される（ＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚが、皮下に投与されるケースで得られた薬物動態パラメータ）。それぞれのマウスにおけるＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚは、１４〜２４時間のレベルに対応する最終半減期（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有していた。これは、実施例４．１．におけるＡｄｖａｔｅ（登録商標）の半減期と比較して、１．８〜３．２倍増加したレベルであった。既存のＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティーが、マウスにおいて皮下に投与されるケース（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  （ＡＳＨ）  ２０１５、組換えＦＶＩＩＩＦｃ−ＶＷＦ−ＸＴＥＮは血友病Ａマウスにおいて皮下投与後の有意なバイオアベイラビリティーを実証する）で１％未満であるとの事実と一致して、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）は皮下に投与されるケースで血液に観察されないレベルで存在した。しかしながら、ＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚは、血友病マウスにおける出血に対して止血反応を生じる十分高いレベルで、４８時間まで観察された。これは、ＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ（糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩである）が、皮下環境で安定であり、血流に入った後でさえも安定であり、それによって、既存のＦＶＩＩＩよりも高いバイオアベイラビリティーを呈することを意味する。結果として、ＤＢＣＯＰＥＧ１０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ（糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩである）が、既存のＦＶＩＩＩとは異なり、皮下製剤として開発できることが見出された。
【００８２】
【表５】
2021510683.tif 000023
【００８３】
実施例４．２．２．  皮下注射による投与後の薬物動態
血友病マウスは、実施例３．１．及び実施例３．２．１．によって作製された糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩの静脈内注射によって投与された。次に、その薬物動態を測定した。１３週齢雌血友病マウス（Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ／Ｊ（ＦＶＩＩＩ−ノックアウト））は、それぞれ、ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ（糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩである）の皮下注射によって投与された。次に、血液に残るＦＶＩＩＩの活性を、それぞれの時点で測定した。マウスは、ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚを、ＦＶＩＩＩ活性に基づいて１８０ＩＵ／ｋｇの用量で、皮下注射によって投与され；血液を、それぞれのマウスの眼窩後方静脈洞から、固定された時点（１時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間）で収集した。収集された血液に、抗凝血剤（３．２％クエン酸ナトリウム）を添加した、抗凝血剤は最終濃度１０％（ｖ／ｖ）を有していた。次に、遠心分離を行って血漿を得て、血漿をＦＶＩＩＩ活性の測定まで凍結して保存した。投与された物質の定量及び血漿に残るＦＶＩＩＩの活性の定量を、実施例１．３．に記載されているとおりＣＳ測定法によって行った。実施例４．１で皮下投与の際に得られたバイオアベイラビリティーを計算するために、ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚを２００ＩＵ／ｋｇの用量で静脈内投与の際に得られたＡＵＣを、皮下投与に対する用量である、１８０ＩＵ／ｋｇで較正し、バイオアベイラビリティーが計算された。この較正によって計算されたバイオアベイラビリティーは、以下のとおり表される：（ＡＵＣｓｃ／ＡＵＣｉｖ）Ｘ（用量ｉｖ／用量ｓｃ）（ＡＵＣｓｃ：皮下投与の際に得られたＡＵＣ；ＡＵＣｉｖ：静脈内投与の際に得られたＡＵＣ；用量ｉｖ：静脈内投与に対する用量；用量ｓｃ：皮下投与に対する用量）。ＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩのＰＥＧコンジュゲートに関して、血液におけるインビボでの低下割合は、物質の濃度のみに依存しており、静脈内投与の際に得られた血中濃度を、それらの初濃度で較正して、予想することが可能となる（Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２０１７  １５（６）：  １１０６〜１１１４  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ−ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ；  ＩＳＴＨ  ２０１７  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｎ８−ＧＰ  （ｔｕｒｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａ  ｐｅｇｏｌ）  ｄｏｓｅｄ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＰＫ  ｐｒｏｆｉｌｅ）。サンプルを皮下に投与されたマウス群からそれぞれの時点で収集された、血漿に残るＦＶＩＩＩの活性は、図１０に示される。それぞれのマウス群の血漿におけるＦＶＩＩＩ活���の平均値に基づいて、それらからＰＫパラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用する非コンパートメント解析（ＮＣＡ）法によって導出した。結果は表６に示される。ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚは、それぞれ１４．６時間及び１６．９時間の最終半減期を有していた。皮下投与の際に得られたＡｄｖａｔｅ（登録商標）の曲線下面積（ＡＵＣ）は、１％未満であった、一方、ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚは、皮下注射によって投与されているケースでは、それぞれ、３５％及び４３％のバイオアベイラビリティーを有していた。すなわち、本発明による糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩが、既存のＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））のものよりもはるかに高いバイオアベイラビリティーを有することが見出された。それによって、糖ＰＥＧ化ｓｃＦＶＩＩＩ、ＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚが、既存のＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））とは異なり、皮下製剤として開発できることが示される。
【００８４】
したがって、本発明の方法によって作製されるＤＢＣＯＰＥＧ２０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚ及びＤＢＣＯＰＥＧ３０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４  Ｂ３  Ａｚが、以下の理由のために、皮下に投与されるケースで、高いバイオアベイラビリティーを有することが推測される：皮下環境では、それらは、既存のＦＶＩＩＩＩよりも安定であり、タンパク分解酵素からより完全に保護され、したがって効率的な抵抗性を有し、それらのバイオアベイラビリティーが増加する。
【００８５】
【表６】
2021510683.tif 000024
【００８６】
これらの結果から、本発明による方法によってポリエチレングリコールポリマーで修飾されたｓｃＦＶＩＩＩが、既存のＦＶＩＩＩである、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）よりも、身体（すなわち、血液及び皮下組織）に、より長く残る可能性があり、その結果、薬物の治療有効性がより長く維持され得ることが特定された。
【００８７】
上の記載のとおり、本発明は、その実施形態を参照して、記載されている。しかしながら、本発明が、特許請求の範囲に記載される本発明の精神から逸脱することなく、構成要素の付加、変更、欠失などにより、種々に修飾及び変化してもよく、そのような修飾又は変化も本発明の範囲内に含まれることが当業者によって認識されよう。
【図１】
2021510683.tif 000042
【図２】
2021510683.tif 000043
【図３】
2021510683.tif 000044
【図４Ａ】
2021510683.tif 000045
【図４Ｂ】
2021510683.tif 000046
【図５】
2021510683.tif 000047
【図６Ａ】
2021510683.tif 000048
【図６Ｂ】
2021510683.tif 000049
【図６Ｃ】
2021510683.tif 000050
【図６Ｄ】
2021510683.tif 000051
【図７】
2021510683.tif 000052
【図８】
2021510683.tif 000053
【図９】
2021510683.tif 000054
【図１０Ａ】
2021510683.tif 000055
【図１０Ｂ】
2021510683.tif 000056
【配列表】
2021510683000001.app
【国際調査報告】
2021510683.tif 000057
2021510683.tif 000058
2021510683.tif 000059
2021510683.tif 000060
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