(57)【要約】  本発明は、肥満及び／又は体重過多を予防、制御又は治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織の褐色化／褐色脂肪組織形成を向上させ、基礎代謝量を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を増加させ、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量支援し、脂肪減量を向上させ、かつ痩せた体を維持することから選択される少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分及びそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分及びそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、相乗的な草本組成物を開示している。本発明は、テオブロマ・カカオとシトラス・オーランティフォリアを含む相乗的な草本組成物を更に開示し、かつ薬学的に許容される賦形剤／希釈剤／担体から選択される少なくとも１種の成分、ヒト又は動物における肥満／体重過多の予防及び治療又は除脂肪体重の改善又はエネルギー消費量の安定化のための治療及び使用の方法を任意選択的に含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
相乗的な草本組成物であって、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される、少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、相乗的な草本組成物。
【請求項２】
前記抽出物または画分を、前記抽出物または画分中の少なくとも１種の植物化学成分参照マーカ化合物または生物学的活性マーカへと標準化し、植物化学成分マーカ化合物または植物化学成分の化合物のグループの濃度範囲が、前記抽出物の０．１重量％〜９９重量％である、請求項１に記載の相乗的な組成物。
【請求項３】
テオブロマ・カカオの種子の誘導成分の重量が１０％〜９０％の範囲で変化し、シトラス・オーランティフォリア果実の皮の誘導成分の重量が９０％〜１０％の範囲で変化する、請求項２に記載の相乗的な組成物。
【請求項４】
前記テオブロマ・カカオの種子の抽出物または画分はテオブロミンに標準化され、テオブロミンの濃度範囲が、組成物の０．１重量％〜２０重量％である、請求項３に記載の相乗的な組成物。
【請求項５】
前記シトラス・オーランティフォリア果実の皮の抽出物または画分はリモニンに標準化され、リモニンの濃度範囲が、組成物の０．１重量％〜１０重量％である、請求項３に記載の相乗的な組成物。
【請求項６】
薬学的または栄養補助的または栄養的に許容される賦形剤、担体または希釈剤から選択される少なくとも１種の成分を任意選択的に含む、請求項１に記載の相乗的な組成物。
【請求項７】
前記薬学的または栄養補助的または栄養的に許容される賦形剤、担体または希釈剤が、グルコース、デキストロース、フルクトース、ガラクトースなどといった単糖類；スクロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、キトビオースなどであるがこれに限定されない二糖類；デンプン、およびデンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、可溶性デンプンといった加工デンプン、および他の加工デンプンといったポリ炭水化物；黄色デキストリン、白色デキストリン、マルトデキストリン、アルギナートなどといった、デンプンまたはグリコーゲンの加水分解により製造されたデキストリン；ソルビトール、マンニトール、イノシトール、キシリトール、イソモルトなどであるがこれに限定されない多価アルコールまたは糖アルコール；微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどであるがこれに限定されないセルロースベースの誘導体；ノイシリン、ビーガム、タルク、コロイド状二酸化ケイ素などであるがこれに限定されないケイ酸塩；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛などであるがこれに限定されない金属ステアリン酸塩；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸などといった有機酸；ポリソルベートである脂肪酸エステルおよびエステル、アカシア、カラギーナン、グアーガム、キサンタンガムなどといった天然ゴム；ビタミンＢ群、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、アガーに限定されないタンパク質；塩化ナトリウム、塩化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、リン酸二カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛などであるがこれに限定されない無機金属塩；天然顔料、香料、クラスＩ＆クラスＩＩ保存料および上にて列挙された成分の単独または組み合わせた水溶液、アルコール溶液、水アルコール溶液、有機溶液から選択される、請求項６に記載の相乗的な組成物。
【請求項８】
前記抽出物、画分または植物化学成分が、葉、茎、柔らかい茎、柔らかい小枝、地上部、果実の皮全体、果実の皮の外皮、種子、頭状花、根、樹皮、硬木または植物全体またはそれらの混合物を含む群から選択される、少なくとも１種の植物部分から得られている、請求項１に記載の相乗的な組成物。
【請求項９】
前記抽出物、画分または植物化学成分が、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロピルアルコールなどのＣ１〜Ｃ５アルコール；アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン、ジクロロメタンおよびクロロホルムなどの塩素化溶媒、水、ヘキサンといったＣ１〜Ｃ７炭水化物；酢酸エチルおよび同等物などのエステル、ならびにそれらの混合物などを含む群から選択される、少なくとも１種の溶媒を用いて製造されている、請求項１に記載の相乗的な組成物。
【請求項１０】
前記組成物（複数可）が、乾燥粉末形態、液状形態、飲料、水に分散可能な剤形、食品、食事用サプリメントまたは錠剤、カプセル、柔らかく噛み砕けるもしくはグミ状のベアといった任意の好適な形態から選択される剤形へと製剤化されている、請求項１〜９に記載の相乗的な組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、健康食品、すなわちチョコレートまたは栄養バーのような固形食品、水に分散可能な飲料、クリーム、ジャムもしくはゲルのような半固形食品またはリフレッシュ飲料、乳酸菌飲料といった飲料、ドロップ、飴、チューインガム、グミキャンディ、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、ソフト小豆ゼリー、ゼリー、クッキー、茶、ソフトドリンク、ジュース、牛乳、コーヒー、シリアル、スナックバーおよびその同等物などの具体的な健康使用のための食品の剤形を熟慮し／剤形へと作製することができるような栄養的／食事サプリメントへと製剤化されている、請求項１〜９に記載の相乗的な組成物。
【請求項１２】
肥満および／または体重過多を予防、制御または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を増加し、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される前記健康上の恩典は、リポリシスの促進、脂肪生成の阻害、脂質蓄積の阻害、線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）の増加、脱共役タンパク質（ＵＣＰ−１）の増加およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）の増加のうち、少なくとも１つによって得られている、請求項１に記載の相乗的な組成物。
【請求項１３】
ヒトまたは動物において、肥満および／または体重過多を予防、制御または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を増加させ、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上させ、および痩せた体を維持する方法であって、前記方法が、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、かつ薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１種の追加成分を任意選択的に含有する、好適な用量の相乗的な草本組成物を対象に補給することを含む、方法。
【請求項１４】
ヒトまたは動物において、リポリシスを促進させ、脂肪生成を阻害し、脂質蓄積を阻害し、線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）を増加させ、脱共役タンパク質（ＵＣＰ−１）発現を増加させ、β３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）を増加させる方法であって、前記方法が、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、かつ薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１種の追加成分を任意選択的に含有する、好適な用量の相乗的な草本組成物を前記ヒトまたは動物に補給することを含む、方法。
【請求項１５】
好適な用量を前記ヒトまたは動物に補給することが、錠剤、カプセル、徐放性剤形の形態であるか、または所望の治療的恩典を得るため、ナノテクノロジー、マイクロカプセル化、コロイド担体システムおよび他のドラッグデリバリーシステムを含む技術による徐放性ポリマーベースコーティングを使用している、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
肥満および／または体重過多を予防、制御または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を増加させ、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持するため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、かつ薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１種の追加成分を任意選択的に含有する、相乗的な草本組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）から誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリア（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ）から誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体またはそれらの組合せから選択される少なくとも１種の成分を任意選択的に含有する、相乗的な草本組成物に関する。本発明はまた、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体またはそれらの組合せから選択される少なくとも１種の成分を任意選択的に含有する、好適な用量の相乗的な草本組成物を使用することにより、ヒトにおいて肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される少なくとも１つの健康上の恩典を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満および体重過多は、世界全体のますます多くの国々で、急速に増大しつつある状態である。近年のＷＨＯ報告によれば、世界全体の肥満は１９７５年の３倍となった。３０ｋｇ／ｍ２以上のボディマス係数（ＢＭＩ）を有するヒトは、一般に太りすぎであると考えられており、かつ体重過多は２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩであると確認された状態であり、この状態はどちらもエネルギー摂取量と消費量との間の不均衡によって引き起こされている。肥満は罹患率、若年死亡率の実質的な上昇、クオリティ・オブ・ライフの低下および医療費の増加に関係している。過剰な体重は、糖尿病、メタボリックシンドローム、高血圧症、脂質異常症、心筋梗塞、脳卒中、特定のがん、睡眠時無呼吸および変形性関節症が発症する見込みを増加させる。体重を減少させることができる治療薬開発のための主要戦略には、食物の消費もしくは吸収の減少および／またはエネルギー消費量の増加によるものが含まれる。肥満問題に対する回答として、多くの医薬品が商品化されたが、そのほとんどは許容不可能な副作用を理由として市場から撤退している。最近数十年間では、代謝障害領域の研究者は、肥満／体重過多およびそれに関連する疾患の治療を求め、食物由来成分に対して着目してきた。この成分は特に植物界および海洋界由来であった。いくつかの草本抽出物および食物成分は、食欲の調節、脂肪の酸化、エネルギー摂取または熱産生に影響を与えることを示している。草本成分は、有害な副作用がほとんどないという利点を有することで公知であり、これにより、肥満の管理に対する興味深い相補的なアプローチを呈し得る。
【０００３】
特許文献１は、アルケミラウルガリス（Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、オレア・エウロパエア（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、クミナム・シミナム（Ｃｕｍｉｎｕｍ  ｃｙｍｉｎｕｍ）およびメンタ・ロンギフォリア（Ｍｅｎｔｈａ  ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ）の混合物（重量比は１２：１０：５：４）およびテオブロマ・カカオ、カフェイン無水物、コフェア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ  Ａｒａｂｉｃａ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、アイレックス・パラグラリエンシス（Ｉｌｅｘ  ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）、ガラナ、およびコナから選択される追加成分を含む、減量製品を開示している。
【０００４】
特許文献２は、障害に関連する受容体型チロシンキナーゼを処置するためのテオブロマ・カカオ抽出物を開示している。
【０００５】
特許文献３は、乾癬ならびにニキビおよび真菌性疾患といった他の皮膚疾患を対象として、ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、シトラス・オーランティフォリア、ピメンタ・ラケモサ（Ｐｉｍｅｎｔａ  ｒａｃｅｍｏｓａ）およびクラプトフイルム・ピクタム（Ｇｒａｐｔｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｐｉｃｔｕｍ）の葉の水性液体抽出物を含有する組成物を開示している。
【０００６】
特許文献４は、カテキンおよびテオブロマ・カカオ抽出物を供給源とする、少なくとも３％のコロソリン酸を含む、減量を促進するダイエットサプリメントを開示している。
【０００７】
特許文献５は、ジンギベル・オフィキナレ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、コティヌス・コッギグリア（Ｃｏｔｉｎｕｓ  ｃｏｇｇｙｇｒｉａ）、シトラス・オーランティウム（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）、ルプロン、ホエイタンパク質単離物、ポリニコチン酸クロム、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、ローイソアルファ酸、ニワトコ属、ギムネマ・シルベスタ（Ｇｙｍｎｅｍａ  ｓｙｌｖｅｓｒｅ）、カメリア・シネンシス、アカシア・ニロティカ（Ａｃａｃｉａ  ｎｉｌｏｔｉｃａ）、マルス・プミラ（Ｍａｌｕｓ  ｐｕｍｉｌａ）、リベス・ニグラムＬ（Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ  Ｌ）、ハイペリクム・ペルフォラトゥム（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ）、テオブロマ・カカオ、スノキ、カメリア・シネンシス、ローザ・カニナ（Ｒｏｓａ  ｃａｎｉｎａ）、イソアルファ酸、ヴァシニウム・エリスロカルパム（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏＣａｒｐｕｍ）、ロイシン、ヒドラスチス・カナデンシス（Ｈｙｄｒａｓｔｉｓ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ラムナス・プルシアナ（Ｒｈａｍｎｕｓ  ｐｕｒｓｈｉａｎａ）、イカリソウ属（ホートニーゴードウィード）、クルクマ・ロンガ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）、オプンティア・フィクス・インディカ（Ｏｐｕｎｔｉａ  ｆｉｃｕｓ  ｉｎｄｉｃａ）、シジギウム・クミニ（Ｓｙｚｙｇｉｕｍ  ｃｕｍｉｎｉ）およびテトラヒドロイソアルファ酸から単離された植物化学成分または抽出物からなる群の、薬学的有効量の１つ以上の構成要素を含む組成物を用いることで、動物中の伸縮性細胞であるＡＭＰＫを活性化するための方法を開示している。
【０００８】
別の特許文献６は、有効量の緑茶、ショウガ、カフェイン、ココア、カルシウム、イェルバ・マテ、ホーソンベリー、パセリリーフのマシュマロ根、フェンネルの種子、ゲンゲ根、リコリス根、スマ、シナモン、セロリの種子およびアルファルファリーフを含む、減量錠剤を開示している。
【０００９】
したがって、肥満および体重過多の管理のため、有効性が高い草本組成物を含む代替的な治療を提供するという、当技術分野における継続した要求が存在している。加えて、許容性が良好であり、かつ従来以上に有効でもある草本抽出物および組成物は、肥満および体重過多の検討に関して、緊急に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許公開第２０１６／０４５５６０（Ａ１）号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１６／０４６３７５（Ａ１）号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００８／１１０８５３（Ａ１）号公報
【特許文献４】オーストラリア国特許第２００６３１２９４７（Ｂ２）号公報
【特許文献５】米国特許公開第２０１０／０１１２０９９（Ａ１）号公報
【特許文献６】米国特許第７，３２９，４１９（Ｂ２）号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的
本発明の目的は、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上し、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、相乗的な草本組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、ヒトまたは動物において肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上し、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持する方法を提供することであり、該方法は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、有効量の相乗的な草本組成物をヒトに補給することを含む。
【００１３】
本発明の更に別の目的は、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上し、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持すること選択される、少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、相乗的な草本組成物の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される、少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、相乗的な草本組成物を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、ヒトにおいて肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される健康上の恩典を得る方法を提供し、該方法は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、有効量の相乗的な草本組成物をヒトに補給することを含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、およびそれらの担体から選択される少なくとも１種の成分を任意選択的に含む。
【００１６】
本発明の別の態様は、ヒトにおいて肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される、少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む有効量の相乗的な草本組成物の使用を提供し、かつ薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、およびそれらの担体から選択される少なくとも１種の成分を任意選択的に含む。
【００１７】
本発明の他の態様は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、有効量の相乗的な草本組成物を提供し、かつ例えばリポリシスの促進といった代謝プロセスの改善、および脂肪生成の阻害、線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）の増大、脱共役タンパク質（ＵＣＰ−１）の増大およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲｓ）の増大のための、薬学的に許容される賦形剤／希釈剤、およびそれらの担体から選択される、少なくとも１種の成分を任意選択的に含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】１日目、８日目、１５日目、２２日目、および２８日目における、対照および処置グループにおける動物の体重（Ａ）を示す、棒図である。各棒は、平均体重±ＳＭを表す。ｐ＜０．０５では有意であり、＃はＧ１対Ｇ２であり、＊はＧ２対処置グループである。棒図は、２８日目における動物の対照および処置グループの体重における割合変化（Ｂ）を示す。Ｇ１およびＧ２は、通常の食事および高脂肪食を補給したラットのグループをそれぞれ表す。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、１００および３００ｍｇ／ｋｇ体重の組成物−６７ならびに１０ｍｇ／ｋｇ体重のシブトラミンを加えた高脂肪食を補給したラットをそれぞれ表す。
【図２】棒図は、組成物６７を補給した食事誘発性肥満ラットによる、毎日の食事のカロリー摂取量の低下を示している。各棒は、平均±ＳＤを表す。Ｇ１およびＧ２は、通常の食事および高脂肪食を補給したラットの群を表す。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、１００および３００ｍｇ／ｋｇ体重の組成物６７ならびに１０ｍｇ／ｋｇ体重のシブトラミンを加えた高脂肪食を補給したラットをそれぞれ表す。ｎ＝７であり、ｐ＜０．０５では有意であり、＃はＧ１対Ｇ２であり、＊はＧ２対処置グループである。
【図３】棒図は、組成物６７を補給した食事誘発性肥満ラットにおける、内臓脂肪量の減少を示している。各棒は、平均±ＳＤを表す。Ｇ１およびＧ２は、通常の食事および高脂肪食を補給したラットの群を表す。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、１００および３００ｍｇ／ｋｇ体重の組成物６７ならびに１０ｍｇ／ｋｇ体重のシブトラミンを加えた高脂肪食を補給したラットをそれぞれ表す。ｎ＝７であり、ｐ＜０．０５では有意であり、＃はＧ１対Ｇ２であり、＊はＧ２対処置グループである。
【図４】棒図は、組成物６７を補給した食事誘発性肥満ラットにおける、精巣上体脂肪細胞サイズの変化を示している。各棒は、μｍ２にて脂肪細胞面積の平均±ＳＥを表す。Ｇ１およびＧ２は、通常の食事および高脂肪食を補給したラットのグループをそれぞれ表す。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、１００および３００ｍｇ／ｋｇ体重の組成物６７ならびに１０ｍｇ／ｋｇ体重のシブトラミンを加えた高脂肪食を補給したラットをそれぞれ表す。ｎ＝７であり、ｐ＜０．０５では有意であり、＃はＧ１対Ｇ２であり、＊はＧ２対処置グループである。
【図５】棒図は、組成物６７を補給した食事誘発性肥満ラットにおける、血清レプチンレベルの正常化を示す。Ｇ１およびＧ２は、通常の食事および高脂肪食を補給したラットのグループをそれぞれ表す。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、１００および３００ｍｇ／ｋｇ体重の組成物６７ならびに１０ｍｇ／ｋｇ体重のシブトラミンを加えた高脂肪食を補給したラットをそれぞれ表す。ｎ＝７であり、ｐ＜０．０５では有意であり、＃はＧ１対Ｇ２であり、＊はＧ２対処置グループである。
【図６】棒図は、組成物６７を補給した食事誘発性肥満ラットにおける、甲状腺ホルモンバランスの改善を示す。各棒は、トリヨードサイロニン（Ｔ３）およびサイロキシン（Ｔ４）との比の平均±ＳＤを表す。Ｇ１およびＧ２は、通常の食事および高脂肪食を補給したラットのグループをそれぞれ表す。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、１００および３００ｍｇ／ｋｇ体重の組成物６７ならびに１０ｍｇ／ｋｇ体重のシブトラミンを加えた高脂肪食を補給したラットをそれぞれ表す。ｎ＝７であり、上の各棒の数は、相対Ｔ３／Ｔ４比の割合を表し、これはＧ１において１００％であると考えられる。
【図７】顕微鏡写真は、精巣上体脂肪組織中のＵＣＰ−１の免疫組織化学染色を示す。Ｇ１およびＧ２は、通常の食事および高脂肪食を補給したラットのグループをそれぞれ表す。Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、１００および３００ｍｇ／ｋｇ体重の組成物６７ならびに１０ｍｇ／ｋｇ体重のシブトラミンを加えた高脂肪食を補給したラットをそれぞれ表す。棒：５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
ここで、本発明は特定の好ましいおよび任意選択的な実施形態に関して詳細に記載しており、その結果、それらの種々の態様は完全に理解および評価され得る。
【００２０】
用語「アディポリシス」および「リポリシス」は、技術分野で認知された用語であり、本明細書全体を通して互換的に使用されている。当業者は、そのようなものとして同様のものを理解および評価する。同様に、褐色化、脂肪の褐色化、ベージュ脂肪および白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化もまた、互換的に使用されている。用語「ハーブ」および「植物」もまた、本明細書全体を通して互換的に使用されている。
【００２１】
脂肪生成は、前脂肪細胞の、成熟脂肪細胞または脂肪細胞への分化および増殖のプロセスである。このプロセスでは、前脂肪細胞または前駆脂肪細胞は、これらの細胞が成熟脂肪細胞の表現型へと分化した後に増殖する。核内受容体ＰＰＡＲγは、脂肪細胞分化と脂肪沈着において重要な役割を果たす点で公知である。脂肪細胞はエネルギーホメオスタシスにおいて不可欠な役割を果たし、動物体内におけるトリグリセリドのような、膨大なエネルギー保存を維持する要因となる。脂肪細胞は動的状態で存在し、これらはエネルギー消費量がその摂取量を上回る際に肥大化を開始する。このプロセスは、これらの細胞に非常に感受性が高い拮抗ホルモンにより、高次に調節されている。したがって、脂肪生成阻害は、肥満／体重過多に対する治療を開発し減量を促進させるという主要な目標の１つである。
【００２２】
アディポリシス（リポリシス）は、脂肪細胞内に貯蔵されたトリグリセリドの分解ならびに血流中への脂肪酸およびグリセロールの放出を促す代謝プロセスである。これは高度に調節されたプロセスであり、これにより遊離脂肪酸の適切な送達が可能となり、エネルギー所要量を満たす。したがって、アディポリシスの増大は肥満／体重過多を治療し、減量を促進させるという主要な目標の１つである。β３−アドレナリン受容体作動薬は、白色脂肪組織におけるリポリシスおよび褐色脂肪組織における熱産生を刺激することができる。リポリシス活性を有する植物抽出物、画分および植物化学成分剤は、肥満、体重過多および他の代謝障害の治療に有益であり得る。
【００２３】
したがって、本出願の発明者らは、抗脂肪生成＆プロアディポリシス活性のための非常に多くの植物抽出物および画分を無作為にスクリーニングし、テオブロマ・カカオおよびシトラス・オーランティフォリアから誘導した抽出物および画分が、表３〜表７にまとめたように抗脂肪生成および前脂肪細胞活性に依存する、効果の高い容量を示したことを見出した。
【００２４】
植物物質のそれぞれに関する簡単な概要は、本明細書において以下に提供されている。
【００２５】
テオブロマ・カカオ：テオブロマ・カカオＬは、小さいが経済的に重要な木である。これは常緑樹であり、４〜８ｍの高さのアオギリ科の木であり、アメリカ熱帯地域が原産である。カカオの種子はポリフェノールおよびテオブロミンの重要な源である。この種子はカカオマス、ココアパウダー、菓子、ガッシュおよびチョコレートを作製するために使用されている。ココア抽出物またはその植物化学成分は、血小板の凝集、高血圧、アテローム性動脈硬化、高血糖症および高コレステロール血症、炎症、肝臓がん形成、ＤＮＡ損傷および染色体異常誘発性作用に対し、一部の恩典的な効果を示した。テオブロミン（Ｉ）はテオブロマ・カカオにおける原理アルカロイドであり、（Ｄｏｎａｌｄ  Ｌ．Ｐａｖｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，１９７３，５０，７９１−７９２）かつ本発明にて使用された抽出物は、ＨＰＬＣ分析法によりテオブロミンに標準化されている。
【００２６】
【化１】
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【００２７】
シトラス・オーランティフォリア：シトラス・オーランティフォリアは、３〜５ｍの高さまで成長可能である、多年生の常緑樹である。これは不規則に細い枝ぶりであり、短く堅く鋭いとげや針を保持している。この花は短く、その一部は白く、芳香を放つ。この緑色の果実は丸く、直径にして３〜５ｃｍであり、熟れた時には果実は黄色くなる。シトラス・オーランティフォリアの分類：界（植物界）、下界（維管束植物）、上門（種子植物）、門（被子植物）、網（モクレン網）、亜網（バラ亜網）、目（ムクロジ目）、科（ミカン科）、属（柑橘類）、種（シトラス・オーランティフォリア）。これはインド、中国を含む、アジアおよび東南アジアの熱帯および亜熱帯地域が原産であり、北アフリカ、ヨーロッパおよび世界中に持ち込まれた。シトラス・オーランティフォリアの通称はライム（英語）である。これは飲料、加工食品および剤形中に香料として使用されるだけではなく、香水中の成分としても使用されている。シトラス・オーランティフォリアの皮は、抗糖尿病活性、抗脂質血症活性、殺虫剤（ａｎｔｉ−ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）活性、抗がん活性として伝統的に使用されている。これは、インビトロではキサンチンオキシダーゼ阻害作用、抗酸化体、細胞傷害抗ウイルス作用を示した。これは日焼け止め、棒状石鹸などといった化粧品に使用されている。リモニン（ＩＩ）は、シトラス・オーランティフォリアの原理代謝物として確認されており、本発明の抽出物は、ＨＰＬＣ分析法によってリモニン（ＩＩ）に標準化されている。
【００２８】
【化２】
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【００２９】
本発明において使用されているハーブの供給源は以下の通り：
【００３０】
１．テオブロマ・カカオの種子は、Ａｓｗａｒａｏｐｅｔａ村、Ａｓｗａｒａｏｐｅｔａパンチャーヤト、Ａｓｗａｒａｏｐｅｔａ郡、Ｂｈａｄｒａｄｒｉ  Ｋｏｔｈａｇｕｄｅｍ地区、Ｔｅｌａｎｇａｎａ州における耕作源から収集した。
【００３１】
２．シトラス・オーランティフォリアは、Ｒａｙａｐｕｄｉ村、Ｒａｙａｐｕｄｉパンチャーヤト、Ｔｈｕｌｌｕｒ郡、Ｇｕｎｔｕｒ地区、Ａｎｄｈｒａ  Ｐｒａｄｅｓｈ州における耕作源から収集した。
【００３２】
テオブロマ・カカオの種子を粉砕し、粉末を水、水性エタノール、エタノール、水性メタノールおよびｎ−ブタノールといった種々の溶媒を用いて抽出し、それぞれ水性抽出物（Ｔ．Ｃ−１）、水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）、エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）、水性メタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−４）およびｎ−ブタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−５）を得た。テオブロマ・カカオの種子の当該抽出物は、ＨＰＬＣ分析法によってテオブロミン（Ｉ）に標準化され、結果を表１にまとめた。同様に、シトラス・オーランティフォリア果実の皮を粉砕し、粉末を水性エタノール、エタノール、水、水性メタノールおよびｎ−ブタノールといった種々の溶媒を用いて抽出し、それぞれ水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）、エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）、水抽出物（Ｃ．Ａ−３）、水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）、およびｎ−ブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）を得た。シトラス・オーランティフォリアの抽出物は、ＨＰＬＣ分析法によってリモニン（ＩＩ）に標準化され、結果を表２にまとめた。
【００３３】
当該テオブロマ・カカオの種子の抽出物およびシトラス・オーランティフォリア果実の皮抽出物は、マウスの３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞セル中のインビトロ細胞モデルを利用して、それらの抗脂肪生成＆プロアディポリシス活性に関して評価された。結果は、該抽出物が脂肪生成の阻害およびアディポリシスの増加という点で効果が高いと指摘した。テオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）は例えば、５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの処置濃度にて、３８．３６％および４１．１０％の脂肪生成の阻害をそれぞれ示した。シトラス・オーランティフォリア果実の皮水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）は、５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの処置濃度にて、２５．８１％および３５．７４％の脂肪生成の阻害をそれぞれ示した。テオブロマ・カカオの種子およびシトラス・オーランティフォリア果実の皮の他の溶媒抽出物もまた、有効であるとわかった。
【００３４】
次いで、こうした個々の抽出物またはそれらの画分を、こうした成分間の相乗的有効性の可能性を調査するために評価した。テオブロマ・カカオから誘導された抽出物または画分およびシトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物または画分は、異なる比率にて混合され、組成物１〜６５（Ｃ−１〜Ｃ−６５）を得た。当該組成物（組成物１〜６５）を、対応する個々の成分と比較し、脂肪生成の阻害作用を試験した。こうした組成物に対するインビトロ脂肪生成阻害アッセイからのデータは、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物（複数可）、または画分（複数可）または植物化学成分またはそれらの混合物を、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物（複数可）、または画分（複数可）または植物化学成分またはそれらの混合物と組み合わせた際に相乗性を提示する傾向を有すると示唆しているそれらの対応する個々の成分と比較した際、脂肪生成の阻害という点で予期せぬ良好な有効性を示した。
【００３５】
例えば、１．６７μｇ／ｍＬ濃度でのテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）および３．３３μｇ／ｍＬ濃度でのシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）は、１５．２３％および１９．４７％の脂肪生成の阻害をそれぞれ示した。５μｇ／ｍＬで、１：２の比率にてテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）を含有する組成物−２は、４４．７８％の脂肪生成の阻害を示した。これは、対応する個々の成分により示された阻害から計算された３４．７％（１５．２３％＋１９．４７％）の相加効果よりも著しく良好である。こうした２つの抽出物（Ｔ．Ｃ−１およびＣ．Ａ−１）を、それぞれ１：３、１：１、２：１および３：１の比率で含有している組成物−１（Ｃ−１）および組成物−３〜５（Ｃ−１およびＣ−３〜Ｃ−５）はまた、表３にまとめたように、対応する個々の成分濃度のそれぞれによって示された阻害と比較した際、相乗性を提示した。シトラス・オーランティフォリアの皮（Ｃ．Ａ−２〜Ｃ．Ａ−５）の他の溶媒抽出物と組み合わせたテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）を含有している他の組成物（Ｃ６〜Ｃ１９）はまた、相乗的な脂肪生成の阻害を示した（表３）。
【００３６】
追加の例では、０．８３μｇ／Ｌ濃度でのテオブロマ・カカオの種子の５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）および１．６７μｇ／Ｌ濃度でのシトラス・オーランティフォリアの皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）は、２．０７％および２６．４６％の脂肪生成の阻害をそれぞれ示した。２．５μｇ／ｍＬにて、テオブロマ・カカオの種子の５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）およびシトラス・オーランティフォリアの皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）を１：２の比率にて含有している組成物−２１は、４０．１９％の脂肪生成の阻害を示した。これは、対応する個々の成分により示された阻害から計算された２８．５３％（２．０７％＋２６．４６％）の相加効果よりも著しく良好である。こうした２種の抽出物（Ｔ．Ｃ−２およびＣ．Ａ−１）を、他の成分比率にて含有している組成物−２０および組成物−２２〜２４（Ｃ−２０、Ｃ−２２〜Ｃ−２４）ならびにシトラス・オーランティフォリア果実の皮他の溶媒抽出物と組み合わせたテオブロマ・カカオの種子の５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）を含有している組成物もまた、表４にまとめたように、対応する個々の成分濃度のそれぞれによって示された阻害と比較した際に相乗性を提示した。
【００３７】
同様に、テオブロマ・カカオおよびシトラス・オーランティフォリアの他の溶媒抽出物を含む組成物（Ｃ−３９〜Ｃ−６５）は、表５にまとめたように、対応する個々の成分濃度のそれぞれによって示された阻害と比較した際に相乗性を提示した。
【００３８】
組成物（組成物１〜６５）は、対応する個々の成分と比較して、マウスの３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞セル中のインビトロ細胞モデルを利用してアディポリシスを増加させる有効性を更に試験した。こうした組成物に対するインビトロアディポリシスアッセイからのデータは、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物（複数可）、または画分（複数可）または植物化学成分またはそれらの混合物が、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物（複数可）、または画分（複数可）または植物化学成分またはそれらの混合物と混合した際に相乗性を提示する傾向性を有すると示唆しているそれらの対応する個々の成分と比較した際、アディポリシスの増加という点で予期せぬ良好な有効性を示した。
【００３９】
例えば、６．６７μｇ／ｍＬ濃度でのテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）および１３．３３μｇ／ｍＬ濃度でのシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）は、２９．５２％および７．１２％のアディポリシスの増加をそれぞれ示した。２０μｇ／ｍＬにて、１：２の比率でのテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリアの皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）を含有する組成物−２は、４７．８８％のアディポリシスの増加を示した。これは、対応する個々の成分により示された増加から計算された３６．６４％（２９．５２％＋７．１２％）の相加効果よりも著しく良好である。こうした２つの抽出物（Ｔ．Ｃ−１およびＣ．Ａ−１）を、他の成分比率で含有している組成物−１＆組成物−３〜５はまた、表６にまとめたように、対応する個々の成分濃度のそれぞれによって示された増加と比較した際に相乗性を提示した。テオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリア（Ｃ．Ａ−２〜Ｃ．Ａ−５）の他の溶媒抽出物を含有している他の組成物（Ｃ６〜Ｃ１９）はまた、相乗的なプロアディポリシス活性を示した（表６）。同様に、テオブロマ・カカオおよびシトラス・オーランティフォリアの他の溶媒抽出物を含む組成物（Ｃ−２０〜Ｃ−６５）は、表７にまとめたように、対応する個々の成分濃度のそれぞれによって示された増加と比較した際に相乗性を提示した。
【００４０】
興味深いことに、テオブロマ・カカオの種子およびシトラス・オーランティフォリア果実の皮から誘導された抽出物および画分およびそれらの組成物は、例えば脂肪の褐色化、熱産生、エネルギー消費量の安定化、甲状腺機能の向上、満腹状態の増加、以下にて議論されるようなＦＧＦ２１、ＵＣＰ−１およびβ３−ＡＲといった白色脂肪細胞の褐色化の要因となる分子的因子の調節といった、肥満および体重過多を検討するための他の機序において予期せぬ有効性を更に提示した。
【００４１】
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化およびエネルギー消費量の安定化：脂肪組織（体脂肪）は、脂肪細胞から構成されたゆるく結び付いた結合組織であり、前脂肪細胞から誘導されている。ヒトにおいては、脂肪組織は主に皮膚の下（皮下脂肪）および内臓器官周辺（内臓脂肪）に主に位置づけられている。白色脂肪組織（ＷＡＴ）は白色脂肪とも呼ばれているが、これは哺乳動物で見られる２種類の脂肪組織のうちの１つである。もう１種の脂肪組織は褐色脂肪組織（ＢＡＴ）である。白色脂肪組織は、脂質という形態でエネルギーを貯蔵し、これは肥満状態の間、病理学的な肥大を起こす。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、ヒトおよび哺乳動物において脂肪組織の固有形態である。ＢＡＴは、熱産生と呼ばれるプロセスを通じ、大量の化学エネルギーを熱として散逸させるように発達した。ＢＡＴは体温低下に対する重要な生体防御というだけではなく、飲食により誘発された熱産生においても役割を果たしている。褐色の脂肪細胞は、大量のミトコンドリアを持っており、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）として公知である固有のタンパク質も備えている。ＵＣＰ−１は電子伝達系を短期周回するが、そうではない場合には通常、細胞のＡＴＰ合成を駆動するのに使用されている。これにより、ミトコンドリアの膜ポテンシャルが熱を伝達可能な状態とし（熱産生）、それによりＢＡＴは、物理活性に関しては増加することなく、エネルギー消費量および燃料代謝を変化させることができる組織となる。
【００４２】
近年、褐色脂肪組織の話題は、ＷＡＴの褐色化でも公知であるように、白色脂肪組織（ＷＡＴ）からベージュ脂肪への転換に関する多くの新たな研究によって再度盛り上がりを見せてきている。いくらかの貯蔵物を由来とするＷＡＴは、適切な刺激に応答し、ベージュ細胞産生のための「褐色化」として知られるプロセスを引き起こすことができる。この細胞には多胞性脂肪滴および複数のミトコンドリアが存在し、ＵＣＰ−１といった特異なタンパク質の発現を増加させることによってＢＡＴの特性を身に付ける。「褐色化」刺激により誘導されたベージュ脂肪細胞は、相当量のミトコンドリアおよびＵＣＰ−１を有するＢＡＴ中の古典的褐色脂肪細胞と表現型的に同様である。このことにより、ベージュ脂肪細胞はＢＡＴと同様の熱産生能力を有し得ることが指摘された。線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、ＷＡＴの熱産生的な動員において生理学的な役割を果たしており、また褐色化の重要な制御因子でもある。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α（ＰＧＣ１α）は、ＷＡＴの褐色化に対する転写セントラルの重要な制御因子の１つである。また、白色脂肪組織の褐色化は、ノルエピネフリンと白色脂肪細胞のβ３−アドレナリン受容体（β３ＡＲ）とが関与することにより、交感神経性の刺激によって駆動される。β３ＡＲ活性化は、白色脂肪細胞中のＵＣＰ−１および他の熱産生タンパク質の過剰発現を生じさせるシグナル伝達カスケードを開始させる。こうした一連の出来事は、ベージュ細胞またはブライト細胞といった中間体の段階を経た、白色脂肪細胞の褐色化の一部である。加えて、甲状腺ホルモン、特にＴ３は、ＵＣＰ−１合成を積極的に調節する。Ｔ３はＵＣＰ−１合成を個別に刺激するか、または相乗的な方法にて交感神経性の刺激と連携して機能することができる。Ｔ３の活性はＴ４によって阻害されている。したがって、Ｔ３とＴ４との健常なバランスは、白色脂肪細胞の褐色化にとって重要である。
【００４３】
ＦＧＦ−２１：線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）は、ＦＧＦファミリーの新規メンバーであり、肝臓にて支配的に発現している。ＦＧＦ−２１は、グルコースホメオスタシス、インスリン感受性、ケトン体生成を調節し、かつ脂肪組織「褐色化」を促進することで代謝の制御に関与している。過去１０年間で、ＦＧＦ−２１は、肥満および糖尿病治療のための潜在的な治療目標であることが示されている。脂肪組織は、ＦＧＦ−２１作用の主要目標の１つであり、ＦＧＦ−２１の重要な代謝の恩典の１つが「褐色化」である。新たな証拠は、オートクライン−パラクラインを主軸としてＵＣＰ−１および他の熱産生遺伝子の発現を上方制御することにより、ＦＧＦ−２１が熱産生および白色脂肪組織の熱産生的動員において生理学的な役割を果たすと示唆している。ＦＧＦ２１はまた、脂肪組織中のＰＧＣ１αレベルを増強させる。
【００４４】
組成物−１〜組成物−６５の間から選択されるいくつかの組成物は、マウスの３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞セル中の細胞アッセイにて線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）を増加させる能力に関し、対応する個々の成分と比較して試験された。こうした組成物に対するインビトロＦＧＦ−２１アッセイからのデータは、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物（複数可）、または画分（複数可）または植物化学成分またはそれらの混合物が、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物（複数可）、または画分（複数可）または植物化学成分またはそれらの混合物と混合した際に相乗性を提示する傾向性を有すると示唆しているそれらの対応する個々の成分と比較した際、ＦＧＦ−２１の増加という点で予期せぬ良好な有効性を示した。
【００４５】
例えば、１．６７μｇ／ｍＬ濃度でのテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）および３．３３μｇ／ｍＬ濃度でのシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）は、１０．０８％および１８．６０％のＦＧＦ−２１の増加をそれぞれ示した。５μｇ／ｍＬにて、１：２の比率でのテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリアの５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）を含有する組成物−２は、４４．２１％のＦＧＦ−２１の増加を示した。これは、対応する個々の成分により示された増加から計算された２８．６８％（１０．０８％＋１８．６０％）の相加効果よりも著しく良好である。他の成分比率でこうした２つの抽出物（Ｔ．Ｃ−１およびＣ．Ａ−１）を含有している組成物−１および組成物−３〜５はまた、表８にまとめたように、対応する個々の成分濃度のそれぞれによって示された阻害と比較した際、相乗性を提示した。テオブロマ・カカオの水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリアの他の溶媒抽出物（Ｃ．Ａ−２〜Ｃ．Ａ−５）を含有している他の組成物（Ｃ−１０およびＣ−１５）ならびにテオブロマ・カカオの種子およびシトラス・オーランティフォリアの皮の他の溶媒抽出物を含有している組成物−２０〜２３および組成物−３６〜３８（Ｃ−２０〜Ｃ−２３＆Ｃ３６〜３８）もまた、表８にまとめられているように、対応する個別の成分濃度のそれぞれによって示された増加と比較した際に、ＦＧＦ２１活性における相乗的な増加を示した。
【００４６】
ＵＣＰ−１：肥満および他の代謝障害の世界的流行により、科学者集団は近年、白色脂肪組織（ＷＡＴ）およびその生物学に注目するようになった。ＷＡＴは、特定の生理学的および病態生理学な状態の下で、褐色脂肪様の組織へと転換可能である。特定の白色脂肪組織貯蔵物が脱共役タンパク質（ＵＣＰ−１）に対する遺伝子発現を著しく増加させ、その結果、一般的には熱産生および脂肪燃焼性を得ていると考えられる白色脂肪「褐色化」の現象は、その機能をエネルギー貯蔵からエネルギー散逸へと変化させる点でかなりの注目を集めている。ＵＣＰ−１は、褐色脂肪組織のミトコンドリア内膜で見出される膜内在性タンパク質であり、哺乳動物のふるえによるものではない熱産生のプロセスの一助となる。したがって、研究者らの主要な注目点は、「褐色化」応答を誘発させ、脂肪組織のＵＣＰ−１の発現および活性を増加させるような剤の特定である。これは、最終的に肥満および体重過多の発症ならびに他の代謝障害に対抗し、エネルギー消費量を促進させる。
【００４７】
したがって、組成物−１〜６５の中で選択されるいくつかの組成物は、マウスの３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞セル中の脱共役タンパク質（ＵＣＰ−１）発現活性に関して試験された。こうした組成物に対するインビトロＵＣＰ−１アッセイからのデータは、予期せぬことに、対照以上にＵＣＰ−１発現における著しい増加を示した。例えば、１：３、１：２、１：１、２：１および３：１の比率にてテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）を含有している組成物−１〜５は、対照を超え、３８．４８％、３４．２３％、３３．８１％、３０．７１％および２８．６９％のＵＣＰ−１発現の増加を伴う、著しい有効性を示した。同様に、１：１および２：１の比率にてテオブロマ・カカオの種子の５０％メタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−４）およびシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）を含有する組成物−５８および５９は、対照を超え、２４．６３％および１１．９６％のＵＣＰ−１発現における増加を伴う、著しい向上をも提示した。したがって、表９にまとめられたデータは、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物または画分およびシトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物または画分を含有する組成物が、ＵＣＰ−１発現を上方制御する可能性を有し得、次いで増加した脂肪褐色化、熱産生およびエネルギー消費量の安定化に相互関連していることを示唆している。
【００４８】
β３ＡＲ：β３−ＡＲは、主に脂肪組織中に位置づけられているβアドレナリン受容体である。この主な作用は、リポリシスおよび熱産生の調節を含む。古典的ＢＡＴ貯蔵物は、高次に神経支配されており、例えば寒さへの曝露および食事による特定の化学物質への曝露といった特定の刺激に応答して、脳内中枢によって活性化される。これにより、交感神経からノルエピネフリン（ＮＥ）の放出を促す。ＮＥをＢＡＴβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）に結合する場合、細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のレベルの増加によりリポリシスが促進され、このトリグリセリドの分解により、脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１）を上方制御および活性化する、遊離脂肪酸の放出が生じる。活性化ＵＣＰ−１は、熱産生を生じさせているミトコンドリア呼吸を脱共役し、これによりＢＡＴ脂肪細胞がミトコンドリア内にて目立つほど豊富な状態で、β３−ＡＲシグナル伝達は呼吸および非ふるえ熱産生を増加させる。古典的褐色脂肪細胞（ＢＡＴ）に加え、ベージュまたはブライト脂肪細胞もまた、同様の作用を示し得る。こうした細胞はＷＡＴ貯蔵物中に存在するが、これらは種々の刺激、最も著しい寒さへの曝露またはβ−ＡＲ−シグナル伝達の活性化因子によって、およびロシグリタゾンといったペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲγ）作動薬によって「褐色化」され得る。ブライト／ベージュ脂肪細胞の活性化は、ＢＡＴ中での発生と同様、ミトコンドリア非共役においても増加を生じさせる。したがって、β３−アドレナリン受容体（ＡＲ）の活性化は、褐色化、熱産生およびエネルギー消費量の安定化（ＲＥＥ）の増加を生じさせ得る。
【００４９】
したがって、組成物−１〜６５から選択されるいくつかの代表的な組成物を、脂肪細胞におけるβ３−アドレナリン受容体（β３ＡＲ）発現の増加について試験した。β３ＡＲアッセイにおいて、組成物を用いてインビトロで処置された３Ｔ３−Ｌ１細胞は、表１０にまとめたように、予想に反し、対照で処置された細胞以上にβ３ＡＲ発現における著しい増加を示した。例えば、１：３、１：２および１：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリアの皮５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）を含有している組成物−１、２および３（Ｃ−１、Ｃ−２およびＣ−３）は、対照を超え、β３ＡＲ発現においてそれぞれ３６．１７％、３７．４７％および５１．０２％の増加を示した。同様に、１：２および１：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）およびシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）を含有している組成物−２１＆２２（Ｃ−２１＆Ｃ−２２）は、表１０にまとめられるように、対照を超え、β３ＡＲ発現においてそれぞれ１８．７５％および１２．６６％の増加を示した。こうした結果は、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物と組み合わされたテオブロマ・カカオから誘導された抽出物を含有している組成物がβ３ＡＲの発現を増加することができ、同様に脂肪褐色化、熱産生およびリポリシスを増加させる能力を有し得ることを示唆している。
【００５０】
剤形：本発明はまた、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分および植物化学成分またはそれらの組合せから選択される少なくとも１種の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分および植物化学成分またはそれらの混合物から選択される第２の成分を含み、任意選択的に、薬学的または栄養補助的にまたは栄養的に許容される賦形剤、担体および希釈剤から選択される少なくとも１種の成分を含有している相乗的な草本組成物を提供する。
【００５１】
該組成物は、肥満、体重過多を予防または制御または治療し、除脂肪体重を改善させ、体重を維持し、かつ痩せた体を維持するため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分および植物化学成分またはそれらの組合せから選択される少なくとも１種の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分および植物化学成分またはそれらの混合物から選択される第２の成分を含み、薬学的または栄養補助的にまたは栄養的に許容される賦形剤、担体および希釈剤から選択される少なくとも１種の成分を任意選択的に含有しており、薬学的または栄養補助的または栄養的に許容される賦形剤、担体および希釈剤は、グルコース、デキストロース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類；スクロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、キトビオースなどであるがこれに限定されない二糖類；デンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、可溶性デンプンといった加工デンプン、および他の加工デンプンといったポリ炭水化物；黄色デキストリン、白色デキストリン、マルトデキストリンなどのデンプンまたはグリコーゲンの加水分解によって製造されたデキストリン；ソルビトール、マンニトール、イノシトール、キシリトール、イソモルトなどであるがこれに限定されない多価アルコールまたは糖アルコール；微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどであるがこれに限定されない、セルロースベースの誘導体；ノイシリン、ビーガム、タルク、コロイド状二酸化ケイ素などであるがこれに限定されないケイ酸塩；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛などであるがこれに限定されない、金属ステアリン酸塩；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸などの有機酸；ポリソルベートである脂肪酸エステルおよびエステル、アカシア、カラギーナン、グアーガム、キサンタンガムなどであるがこれに限定されない天然ゴム；ビタミンＢ群、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、アガーなどであるがこれに限定されないタンパク質；塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛などであるがこれに限定されない有機金属塩；天然顔料、香料、クラスＩ＆ＩＩ保存料および上に列挙した成分の単独または組合せの水溶液、アルコール溶液、水アルコール溶液、有機溶液から選択されている。
【００５２】
例えば、組成物−６６は、６０ｇのテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）、３０ｇのシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）、９ｇのマルトデキストリンおよび１ｇのシロイドを混合することで調製した。同様に、組成物−６７は、エタノール／水の存在下で、５３．３３ｇのテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）、２６．６７ｇのシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）、１８ｇのマルトデキストリンおよび２ｇのシロイドを混合し、その後乾燥させることで調製した。更に、組成物−６８は、エタノール／水の存在下で、５３．２ｇのテオブロマ・カカオの種子の水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）、２６．６ｇのシトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）、１８．２ｇのグルシデックス−１２Ｄおよび２ｇのシロイドを混合し、その後乾燥させることで調製し、組成物を得た。
【００５３】
高脂肪食（ＨＦＤ）誘発肥満動物における、組成物−６７のインビボ評価：インビトロモデルにおいて、テオブロマ・カカオおよびシトラス・オーランティフォリアを含む組成物によって示された、効果の高い抗肥満性および相乗的効果を、肥満のインビボモデルにて更に評価した。肥満は、オスのスプラーグドーリーラットに４週間高脂肪食を補給することにより、そのラットにて誘発された。対照グループ（Ｇ１）は通常の固形飼料を与えられた。４週間の誘導期の後、肥満ラットを、各グループに７匹の動物ずつ種々のＧ２〜Ｇ４のグループに無作為に割り当てた。処置グループに属する動物は、更に４週間、それぞれ１０ｍＬの水中０．５％ＣＭＣ中、ＣＭＣ１００ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）または３００ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）体重の組成物−６７または１０ｍｇのシブトラミン（Ｇ５）を毎日経口で補給した。動物の対照グループ（Ｇ２）は、ビヒクル（１０ｍＬの０．５％水中ＣＭＣ）のみを受容した。個々の動物の体重は、毎週記録し、各グループにおける動物の平均体重を測定した。体重の増加／変化は、それぞれの最初の体重と比較して、処置開始後１週目、２週目、３週目および４週目の終わりに計算した。ＨＦＤ対照グループ（Ｇ２）と比較した際、組成物−６７は、高脂肪食誘発肥満ラットにおいては著しくかつ用量依存的に体重増加を阻害した。これは、処置期の最後に１００ｍｇ／ｋｇおよび３００ｍｇ／ｋｇ体重の組成物−６７をそれぞれ補給した処置グループにおいて、９９．５％および１０９．１％の体重増加の減少を提示した。ただし、３００ｍｇ／ｋｇ用量グループにおいては、２週間の処置により効果は有意性を示し始めた。処置グループおよび対照グループに関する、体重および最終比率の体重変化の結果は図１Ａおよび図１Ｂにまとめられている。これらの結果は、組成物−６７が効果の高い抗肥満活性を有すると明確に示唆している。
【００５４】
加えて、組成物６７を補給したグループＧ３およびグループＧ４のラットに関して、１日の平均食物摂取量は著しく減少した。食物消費データは、図２には食事のカロリー摂取量（ＫＪ／日）として表示されている。まとめると、これらの観測は、組成物−６７の経口補給により体重増加が減少し、ＨＦＤラットの健康体重を維持する一助となり、またラットによる食事のカロリー消費を制限すると示している。
【００５５】
続いて該試験の終わりに安楽死させ、内蔵（後腹膜、精巣上体、腎臓周囲および腸間膜）脂肪組織をラットから採取して秤量した。ＨＦＤを与えたラットと比較した場合、組成物−６７を追加したグループの総脂肪重量は著しく減少しており、３００ｍｇの組成物−６７（Ｇ４）を補給したグループは統計学的な有意性を提示した（図３）。加えて、ＨＦＤ対照グループ（Ｇ２）ラットと比較した場合、ホルマリン固定パラフィン包埋脂肪組織の顕微鏡検査から、２８日間、３００ｍｇの組成物−６７を補給したグループＧ４が実質的に脂肪細胞サイズを低下させたことが明らかになった（図４）。まとめるとこうした観察は、組成物−６７の補給が体肥満または太りすぎたラット中の体脂肪を著しく減少させると示している。
【００５６】
追加２８日後、血清サンプルを循環レプチンレベル用に分析した。血清レプチンレベルは、図５にまとめたようにＨＦＤラットのものと比較すると、組成物−６７を補給した処置グループにおいては著しく減少された。興味深いことに、処置グループのレプチンレベルは、固形飼料を与えた対照動物の値へと減少された。このデータは組成物−６７が満腹状態を調整することによって食物消費を調節するという点で、有望な役割を有すると示している。この観測は、該試験において組成物−６７を補給したラットが飼料消費量の量を減らしたという根拠を説明することができる。
【００５７】
加えて、１つの興味深い観測は、ＨＦＤラットと比較した場合、組成物−６７を補給されたラットがＴ３／Ｔ４バランスを向上させたと示した点である（図６）。Ｔ３は、その前駆体であるＴ４から代謝転換によって形成された、活性甲状腺ホルモンである。Ｔ３は、体内におけるエネルギーホメオスタシスの主要な制御因子であり、これは体の基礎代謝量またはエネルギー消費量の安定化に積極的に影響を与える。更には、Ｔ３はまた白色脂肪細胞から褐色脂肪細胞への変換プロセスにとってもまた、重要な因子である。太りすぎた動物においては、Ｔ３／Ｔ４比率は、太りすぎではない個体よりも低い。我々の実験において、組成物−６７を補給されたラットは、ＨＦＤラットと比較した場合にＴ３／Ｔ４比率を向上させたと示した。この観測は、太りすぎたラットでは草本組成物は甲状腺機能を向上させたことを示している。まとめると、この観測は組成物−６７の補給により、向上した甲状腺機能に関連する褐色脂肪の産生を誘発させたと強く提案している。まとめると、こうした出来事は、太りすぎたラットにおいてエネルギー消費量の安定化を増加させたことで体脂肪減少したという根拠を提供した。
【００５８】
精巣上体の脂肪組織における免疫組織化学検査は、組成物−６７を補給したラットにおいて、ＵＣＰ−１の存在が褐色脂肪細胞を染色したと示している（図７）。固形飼料を与えたラット（Ｇ１）またはＨＦＤラット（Ｇ２）は、その精巣上体の脂肪組織中に褐色脂肪細胞が存在するとは示さなかった。したがって、この観測は、組成物−６７が褐色脂肪生成を潜在的に誘発したことを明白に示している。
【００５９】
前述（ｆｏｒｇｏｉｎｇ）の内容は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、相乗的な草本組成物は、脂肪生成を阻害し、リポリシスを加速させ、ＦＧＦ２１の産生を増加させ、ＵＣＰ−１、β３−ＡＲの発現を増加させ、脂肪の褐色化を増加させ、Ｔ３／Ｔ４バランスを向上させると示している。したがって、当該組成物は、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上させ、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される少なくとも１つの健康上の恩典を得るのに有益となり得る。
【００６０】
したがって、重要な実施形態である本発明は、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される、少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む、相乗的な草本組成物を提供する。
【００６１】
別の実施形態では、本発明はテオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、組成物中の第１の成分の濃度は、１０重量％〜９０重量％の範囲で変化し、第２の成分の濃度は、９０重量％〜１０重量％の範囲で変化する。
【００６２】
他の例示的な実施形態では、本発明は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの組合せから選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、薬学的または栄養補助的にまたは栄養的に許容される賦形剤、担体および希釈剤から選択される少なくとも１種の成分を任意選択的に含む。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、肥満、および／または体重過多を予防または制御または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を増加させ、甲状腺機能を向上させ、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上させ、かつ痩せた体を維持することから選択される少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの組合せから選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、薬学的または栄養補助的にまたは栄養的に許容される賦形剤、担体および希釈剤から選択される少なくとも１種の成分を任意選択的に含む。薬学的または栄養補助的または栄養的に許容される賦形剤、担体および希釈剤は、グルコース、デキストロース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類；スクロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、トレハロース、セロビオース、キトビオースなどであるがこれに限定されない二糖類；デンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウム、アルファ化デンプン、可溶性デンプンといった加工デンプン、および他の加工デンプンといったポリ炭水化物；黄色デキストリン、白色デキストリン、マルトデキストリンなどのデンプンまたはグリコーゲンの加水分解によって製造されたデキストリン；ソルビトール、マンニトール、イノシトール、キシリトール、イソモルトなどであるがこれに限定されない多価アルコールまたは糖アルコール；微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどであるがこれに限定されない、セルロースベースの誘導体；ノイシリン、ビーガム、タルク、コロイド状二酸化ケイ素などであるがこれに限定されないケイ酸塩；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛などであるがこれに限定されない、金属ステアリン酸塩；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸などの有機酸；ポリソルベートである脂肪酸エステルおよびエステル、アカシア、カラギーナン、グアーガム、キサンタンガムなどであるがこれに限定されない天然ゴム；ビタミンＢ群、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、アガーなどであるがこれに限定されないタンパク質；塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛などであるがこれに限定されない有機金属塩；天然顔料、香料、クラスＩ＆ＩＩ保存料および上に列挙した成分の単独または組合せの水溶液、アルコール溶液、水アルコール溶液、有機溶液から選択されている。
【００６４】
別の実施形態では、本発明は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの組合せから選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの組合せから選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、抽出物または画分は、葉、茎、柔らかい茎、柔らかい小枝、地上部、果実全体、果実の皮の外皮、種、頭状花、根、樹皮、硬木または植物全体またはそれらの混合物を含む群から選択される、少なくとも１種の植物部分から得られている。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの組合せから選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの組合せから選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、抽出物または画分は、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロピルアルコールのようなＣ１〜Ｃ５アルコール；アセトン、メチルイソブチルケトンといったケトン、ジクロロメタンおよびクロロホルムといった塩素化溶媒、水およびそれらの混合物、ヘキサンといったＣ１〜Ｃ７炭化水素、酢酸エチルおよび同等物などのエステル、ならびにそれらの混合物などを含む群から選択される、少なくとも１種の溶媒を用いて製造されている。
【００６６】
他の実施形態では、本発明はテオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、抽出物または画分は、少なくとも１種の植物化学成分参照マーカ化合物または抽出物または画分中の生物学的活性マーカへと標準化されており、植物化学成分マーカ化合物および植物化学成分化合物のグループの濃度範囲は、抽出物の０．１重量％〜９９重量％である。
【００６７】
別の実施形態では、本発明はテオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、抽出物または画分、テオブロマ・カカオの植物化学成分は、テオブロミンに標準化されており、テオブロミンの濃度範囲は、組成物の０．１重量％〜２０重量％である。
【００６８】
別の実施形態では、本発明はテオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、シトラス・オーランティフォリアの抽出物または画分は、リモニンに標準化されており、リモニンの濃度範囲は、組成物の０．１重量％〜１０重量％である。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの組合せから選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含む相乗的な草本組成物を提供し、組成物（複数可）は、乾燥粉末形態、液状形態、飲料、食品、食事用サプリメントまたは錠剤、カプセル、柔らかく噛み砕けるもしくはグミ状のベア（ｂｅａｒ）といった任意の好適な形態から選択される剤形へと製剤化されている。
【００７０】
上にて開示されている組成物（複数可）は、健康食品、すなわちチョコレートまたは栄養バーのような固形食品、クリーム、ジャムもしくはゲルのような半固形食品またはリフレッシュ飲料、乳酸菌飲料といった飲料、ドロップ、飴、チューインガム、グミキャンディ、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、ソフト小豆ゼリー、ゼリー、クッキー、茶、ソフトドリンク、ジュース、牛乳、コーヒー、シリアル、スナックバーなどの具体的な健康使用のための食品の剤形を熟慮し／剤形へと作製することができるような栄養的／食事サプリメントへと製剤化され得る。
【００７１】
更なる実施形態では、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上し、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持する方法を提供することであり、該方法は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１種の追加成分を任意選択的に含有する、好適な用量の相乗的な草本組成物を対象に補給することを含む。
【００７２】
別の実施形態では、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上し、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持する方法を提供することであり、該方法は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１種の追加成分を任意選択的に含有する、好適な用量の相乗的な草本組成物を対象に補給することを含み、当該肥満治療は、リポリシスの促進、脂肪生成、脂質の蓄積の阻害、線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）の増加、脱共役タンパク質（ＵＣＰ−１）の増加およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）の増加のうち少なくとも１つを含む。
【００７３】
別の実施形態では、本発明は、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上し、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持することから選択される少なくとも１つの健康上の恩典を得るため、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分とシトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１種の追加成分を任意選択的に含有する、相乗的な草本組成物の使用を提供する。
【００７４】
別の実施形態では、肥満および／または体重過多を予防、制御、または治療し、除脂肪体重を改善させ、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の褐色化を向上させ／褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の形成を向上させ、基礎代謝量（ＢＭＲ）を増加させ／エネルギー消費量を安定化させ、熱産生を向上し、甲状腺機能を向上し、健康体重を維持し、満腹状態を増加させ、減量を支援し、脂肪減量を向上および痩せた体を維持する方法を提供することであり、該方法は、テオブロマ・カカオから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第１の成分と、シトラス・オーランティフォリアから誘導された抽出物、画分、植物化学成分およびそれらの混合物から選択される第２の成分の組合せを含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体から選択される少なくとも１種の追加成分を任意選択的に含有する、好適な用量の相乗的な草本組成物を対象に補給することを含み、好適な用量を対象に追加することは、徐放性錠剤の形態であるか、または所望の治療的恩典を得るため、ナノテクノロジー、マイクロカプセル化、コロイド担体システムおよび他のドラッグデリバリーシステムを含む技術による徐放性ポリマーベースコーティングを使用している。
【００７５】
当業者は、それらの広範な発明の概念から逸脱することなく、上記実施形態に対して変更可能であることを理解するであろう。したがって、本発明は、本明細書において開示されている特定の実施形態または実施例に限定されることはないが、本明細書において定義されているように本発明の目的および範囲内にある変更を網羅することを意図している。提示されている実施例は、本発明を例示するものであるが、いかなる方法であっても本発明の範囲を限定すると考えられるべきではない。
【実施例】
【００７６】
実施例１：テオブロマ・カカオの種子の水抽出物の調製
テオブロマ・カカオの乾燥の種子（１００ｇ）を微粉砕し、粉末状の未加工の物質を室温（ｒｔ）で１時間、実験室用抽出器により水（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、用いた未加工の物質を同様の状況下で２回水（２×５００ｍＬ）を用いて再抽出した。混合した抽出物をろ過し、真空下にて濃縮させ、粉末として水抽出物の残留物を得た（Ｔ．Ｃ−１、１４ｇ）。
【００７７】
実施例２：テオブロマ・カカオの種子のエタノール抽出物および５０％水性エタノール抽出物の調製
テオブロマ・カカオの乾燥の種子（１００ｇ）を微粉砕し、粉末状の未加工の物質を室温（ｒｔ）で１時間、実験室用抽出器により５０％の水性エタノール（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、用いた未加工の物質を同様の状況下で２回、５０％水性エタノール（２×５００ｍＬ）を用いて再抽出した。混合した抽出物をろ過し、真空下にて濃縮させ、エタノール抽出物の残留物を得た（Ｔ．Ｃ−２、１１ｇ）。
【００７８】
テオブロマ・カカオの種子（１００ｇ）のエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３、４．４ｇ）は、抽出溶媒としてエタノールを用い、上記と同様の手順と適合させることによって得られた。
【００７９】
実施例３：テオブロマ・カカオの種子の５０％水性メタノール抽出物の調製
テオブロマ・カカオの乾燥の種子（１００ｇ）を微粉砕し、粉末状の未加工の物質を室温（ｒｔ）で１時間、実験室用抽出器により５０％の水性メタノール（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、用いた未加工の物質を同様の状況下で２回、５０％メタノール（２×５００ｍＬ）を用いて再抽出した。混合した抽出物をろ過し、真空下にて濃縮させ、５０％水性メタノール抽出物の残留物を得た（Ｔ．Ｃ−４、１０ｇ）。
【００８０】
実施例４：テオブロマ・カカオの種子のｎ−ブタノール抽出物の調製
テオブロマ・カカオの乾燥の種子（１００ｇ）を微粉砕し、粉末状の未加工の物質を室温（ｒｔ）で１時間、実験室用抽出器によりｎ−ブタノール（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、用いた未加工の物質を同様の状況下で２回、ｎ−ブタノール（２×５００ｍＬ）を用いて再抽出した。混合した抽出物をろ過し、真空下にて濃縮させ、ｎ−ブタノール抽出物の残留物を得た（Ｔ．Ｃ−５、２４．５ｇ）。
【００８１】
実施例５：テオブロマ・カカオの種子の抽出物の標準化
テオブロマ・カカオの種子の種々の抽出物は、ＨＰＬＣ分析法によってテオブロミンへと標準化され、結果を表１にまとめた。
【００８２】
【表１】
2021517120.tif 000004
【００８３】
実施例６：シトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性エタノール＆エタノール抽出物の調製
シトラス・オーランティフォリアの乾燥果実の皮の未加工の物質（１００ｇ）を微粉砕して粉末にし、室温（ｒｔ）で１時間、実験室用抽出器により１：１のエタノール／水（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、用いた未加工の物質を同様の状況下で２回、１：１のエタノール／水（２×５００ｍＬ）を用いて再抽出した。混合した抽出物をろ過し、真空下にて濃縮させ、５０％水性エタノールの残留物を茶色の粉末（Ｃ．Ａ−１、２１ｇ）として得た。ＵＶによる総フラボノイド：９．９２％。
【００８４】
エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２、９．５ｇ）は、抽出溶媒としてエタノールを用い、同様の手順と適合させることによって得られた。
【００８５】
同様に、シトラス・オーランティフォリアの乾燥させた果実全体の未加工の物質（１００ｇ）を上記と同様の抽出手順に供し、茶色粉末（１５ｇ）として５０％水性アルコール抽出物を得た。
【００８６】
実施例７：シトラス・オーランティフォリア果実の皮の水抽出物の調製
シトラス・オーランティフォリアの乾燥果実の皮（１００ｇ）を微粉砕し、粉末状の未加工の物質を室温（ｒｔ）で１時間、実験室用抽出器により水（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、用いた未加工の物質を同様の抽出状況下で２回水（２×５００ｍＬ）を用いて再抽出した。混合した抽出物をろ過し、真空下にて濃縮させ、茶色の粉末として水抽出物の残留物を得た（Ｃ．Ａ−３、２１ｇ）。
【００８７】
実施例８：シトラス・オーランティフォリア果実の皮の５０％水性メタノール抽出物の調製
シトラス・オーランティフォリアの乾燥果実の皮（１００ｇ）を微粉砕し、粉末状の未加工の物質を室温（ｒｔ）で１時間、実験室用抽出器により５０％の水性メタノール（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、用いた未加工の物質を同様の状況下で２回、５０％水性メタノール（２×５００ｍＬ）を用いて再抽出した。混合した抽出物をろ過し、真空下にて濃縮させ、茶色粉末として５０％水性メタノール抽出物の残留物を得た（Ｃ．Ａ−４、３０ｇ）。
【００８８】
実施例９：シトラス・オーランティフォリア果実の皮のブタノール抽出物の調製
シトラス・オーランティフォリアの乾燥果実の皮（１００ｇ）を微粉砕し、粉末状の未加工の物質を室温（ｒｔ）で１時間、実験室用抽出器によりｎ−ブタノール（７００ｍＬ）で抽出した。抽出物をろ過し、用いた未加工の物質を同様の状況下で２回、ｎ−ブタノール（２×５００ｍＬ）を用いて再抽出した。混合した抽出物をろ過し、真空下にて濃縮させ、茶色の粉末としてブタノール抽出物の残留物を得た（Ｃ．Ａ−５、７ｇ）。
【００８９】
実施例１０：シトラス・オーランティフォリア抽出物の標準化
シトラス・オーランティフォリアの種々の抽出物は、ＨＰＬＣ分析法によってリモニンに標準化され、結果を表２にまとめた。
【００９０】
【表２】
2021517120.tif 000005
【００９１】
実施例１１：テオブロマ・カカオ水抽出物の組成物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリア抽出物（Ｃ．Ａ−１〜Ｃ．Ａ−５）の調製
組成物−１（Ｃ−１）：組成物−１を、１：３の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−２（Ｃ−２）：組成物−２を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−３（Ｃ−３）：組成物−３を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−４（Ｃ−４）：組成物−４を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−５（Ｃ−５）：組成物−５を、３：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−６（Ｃ−６）：組成物−６を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−７（Ｃ−７）：組成物−７を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−８（Ｃ−８）：組成物−８を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−９（Ｃ−９）：組成物−９を、１：３の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−１０（Ｃ−１０）：組成物−１０を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−１１（Ｃ−１１）：組成物−１１を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−１２（Ｃ−１２）：組成物−１２を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−１３（Ｃ−１３）：組成物−１３を、３：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−１４（Ｃ−１４）：組成物−１４を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）とを混合することにより調製した。
組成物−１５（Ｃ−１５）：組成物−１５を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）とを混合することにより調製した。
組成物−１６（Ｃ−１６）：組成物−１６を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）とを混合することにより調製した。
組成物−１７（Ｃ−１７）：組成物−１７を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
組成物−１８（Ｃ−１８）：組成物−１８を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
組成物−１９（Ｃ−１９）：組成物−１９を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
【００９２】
実施例１２：テオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物の組成物（Ｔ．Ｃ−２）およびシトラス・オーランティフォリア抽出物（Ｃ．Ａ−１〜Ｃ．Ａ−５）の調製
組成物−２０（Ｃ−２０）：組成物−２０を、１：３の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−２１（Ｃ−２１）：組成物−２１を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−２２（Ｃ−２２）：組成物−２２を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−２３（Ｃ−２３）：組成物−２３を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−２４（Ｃ−２４）：組成物−２４を、３：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−２５（Ｃ−２５）：組成物−２５を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−２６（Ｃ−２６）：組成物−２６を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−２７（Ｃ−２７）：組成物−２７を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−２８（Ｃ−２８）：組成物−２８を、１：３の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−２９（Ｃ−２９）：組成物−２９を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−３０（Ｃ−３０）：組成物−３０を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−３１（Ｃ−３１）：組成物−３１を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−３２（Ｃ−３２）：組成物−３２を、３：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−３３（Ｃ−３３）：組成物−３３を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）とを混合することにより調製した。
組成物−３４（Ｃ−３４）：組成物−３４を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）とを混合することにより調製した。
組成物−３５（Ｃ−３５）：組成物−３３を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）とを混合することにより調製した。
組成物−３６（Ｃ−３６）：組成物−３６を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
組成物−３７（Ｃ−３７）：組成物−３７を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
組成物−３８（Ｃ−３８）：組成物−３８を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％水性エタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−２）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
【００９３】
実施例１３：テオブロマ・カカオ抽出物（Ｔ．Ｃ−３、Ｔ．Ｃ−４＆Ｔ．Ｃ−５）およびシトラス・オーランティフォリア抽出物（Ｃ．Ａ−１〜Ｃ．Ａ−５）の組成物の調製
組成物−３９（Ｃ−３９）：組成物−３９を、１：２の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−４０（Ｃ−４０）：組成物−４０を、１：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−４１（Ｃ−４１）：組成物−４１を、２：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−４２（Ｃ−４２）：組成物−４２を、１：２の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−４３（Ｃ−４３）：組成物−４３を、１：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−４４（Ｃ−４４）：組成物−４４を、２：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリアエタノール抽出物（Ｃ．Ａ−２）とを混合することにより調製した。
組成物−４５（Ｃ−４５）：組成物−４５を、１：２の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−４６（Ｃ−４６）：組成物−４６を、１：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−４７（Ｃ−４７）：組成物−４７を、２：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−４８（Ｃ−４８）：組成物−４８は、テオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）を１：２の比率で組み合わせることにより調製された。
組成物−４９（Ｃ−４９）：組成物−４９を、１：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）とを混合することにより調製した。
組成物−５０（Ｃ−５０）：組成物−５０を、２：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリア５０％水性メタノール抽出物（Ｃ．Ａ−４）とを混合することにより調製した。
組成物−５１（Ｃ−５１）：組成物−５１を、２：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
組成物−５２（Ｃ−５２）：組成物−５２を、１：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
組成物−５３（Ｃ−５３）：組成物−５３を、２：１の比率でテオブロマ・カカオエタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−３）とシトラス・オーランティフォリアブタノール抽出物（Ｃ．Ａ−５）とを混合することにより調製した。
組成物−５４（Ｃ−５４）：組成物−５４を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ５０％メタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−４）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−５５（Ｃ−５５）：組成物−５５を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％メタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−４）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−５６（Ｃ−５６）：組成物−５６を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％メタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−４）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−５７（Ｃ−５７）：組成物−５７を、１：２の比率でテオブロマ・カカオ５０％メタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−４）とシトラス・オーランティフォリア５０％エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−５８（Ｃ−５８）：組成物−５８を、１：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％メタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−４）とシトラス・オーランティフォリア５０％エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−５９（Ｃ−５９）：組成物−５９を、２：１の比率でテオブロマ・カカオ５０％メタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−４）とシトラス・オーランティフォリア５０％エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−６０（Ｃ−６０）：組成物−６０を、１：２の比率でテオブロマ・カカオブタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−５）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−６１（Ｃ−６１）：組成物−６１を、１：１の比率でテオブロマ・カカオブタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−５）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−６２（Ｃ−６２）：組成物−６２を、２：１の比率でテオブロマ・カカオブタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−５）とシトラス・オーランティフォリア水抽出物（Ｃ．Ａ−３）とを混合することにより調製した。
組成物−６３（Ｃ−６３）：組成物−６３を、１：２の比率でテオブロマ・カカオブタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−５）とシトラス・オーランティフォリア５０％エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−６４（Ｃ−６４）：組成物−６４を、１：１の比率でテオブロマ・カカオブタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−５）とシトラス・オーランティフォリア５０％エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
組成物−６５（Ｃ−６５）：組成物−６５を、２：１の比率でテオブロマ・カカオブタノール抽出物（Ｔ．Ｃ−５）とシトラス・オーランティフォリア５０％エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）とを混合することにより調製した。
【００９４】
実施例１４：組成物の処方
組成物−６６（Ｃ−６６）：組成物−６６は、６０ｇのテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）、３０ｇのシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）、９ｇのマルトデキストリンおよび１ｇのシロイドを混合することで調製した。
組成物−６７（Ｃ−６７）：組成物−６７は、エタノール／水の存在下で、５３．３３ｇのテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）、２６．６７ｇのシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）、１８ｇのマルトデキストリンおよび２ｇのシロイドを混合し、乾燥させて組成物を得た。
組成物−６８（Ｃ−６８）：組成物−６８は、エタノール／水の存在下で、５３．２ｇのテオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）、２６．６ｇのシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）、１８．２ｇのグルシデックス−１２Ｄおよび２ｇのシロイドを混合し、乾燥させて組成物を得た。
【００９５】
実施例１５：脂肪生成阻害アッセイ用の一般的手順
マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（５００μＬ中、５００００細胞／ウェル）を、４８−ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２の湿気のある環境で、１０％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地にて維持した。細胞をコンフルエントな状態（〜２日間）とした後、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭのデキサメタゾン、および５００ｎＭのインスリンを含有している分化培地（ＤＭ）にて４８時間、異なる濃度の試験サンプルを用いて処理した。細胞培養培地を、相対濃度の試験サンプルと１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、１００ｎＭのインスリンを含有しているポストＤＭへと変更し、相対濃度の試験サンプルと共にポストＤＭを、６日目まで４８時間ごとに新規に移し替えた。分化の開始８日後に、細胞をオイルレッドＯ染色にかけた。
【００９６】
オイルレッドＯ染色：培地を吸引し、０．５ｍＬの１０％ホルムアルデヒドを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートさせた。ホルムアルデヒドをウェルから除去し、０．２５ｍＬの６０％イソプロパノールを添加し、プレートを完全に乾燥させた。１００マイクロリットルの赤色油Ｏを添加し、室温の暗所にて２０分間インキュベートさせた。赤色油Ｏを吸引し、プレートを蒸留水で４回洗浄した。プレートを完全に乾燥させ、１５０μＬの１００％イソプロパノールを添加し、全体的に混合させて７５μＬを９６ウェルアッセイプレートに移し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ５ｅプレートリーダを用いて、５５０ｎｍにて吸光度を測定した。脂肪生成の阻害率は以下の式を用いて計算された：
【００９７】
【数１】
2021517120.tif 000006
【００９８】
上記手順を用いて、全ての組成物をその脂肪生成阻害に関してスクリーニングし、この結果を表３、４＆５に表した。
【００９９】
表３：テオブロマ・カカオ抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリア抽出物（Ｃ．Ａ−１〜Ｃ．Ａ−５）を含有している組成物の脂肪生成活性
【表３】
2021517120.tif 000007
【０１００】
表４：テオブロマ・カカオ抽出物（Ｔ．Ｃ−２）およびシトラス・オーランティフォリア抽出物（Ｃ．Ａ−１〜Ｃ．Ａ−４）を含有している組成物の脂肪生成活性
【表４】
2021517120.tif 000008
【０１０１】
表５：テオブロマ・カカオ抽出物（Ｔ．Ｃ−３、Ｔ．Ｃ−４、Ｔ．Ｃ−５）およびシトラス・オーランティフォリア抽出物（Ｃ．Ａ−１〜Ｃ．Ａ−５）を含有している組成物の脂肪生成活性
【表５】
2021517120.tif 000009
【０１０２】
実施例１６：アディポリシスアッセイの増加のための一般的手順
マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（５００μＬ中、５００００細胞／ウェル）を、４８−ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２の湿気のある環境で、１０％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭにて維持した。細胞をコンフルエントな状態（〜２日間）とした後、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、０．５ｎＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、および５００ｍＭのインスリンを含有している分化培地（ＤＭ）を用いて４８時間、分化を惹起させた。細胞培養培地を、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、１００ｎＭのインスリンを含有しているポストＤＭへと変更し、ポストＤＭを、６日目まで４８時間ごとに新規に移し替えた。７日目に、培地をウェルから吸引し、フェノールレッドを含まない６００μＬのＤＭＥＭを用いて洗浄した。細胞を、２％のＢＳＡ（５０μＬ）を含有しているフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地にて異なる分化濃度の試験サンプル（５０μＬ）を用いて処理し、ＣＯ２インキュベータを用い、３７℃で４時間インキュベートさせた。インキュベート後、２５μＬの細胞を含まない上澄みをウェルから採取して９６ウェルアッセイプレートへと入れ、グリセロールアッセイのために加工した。
【０１０３】
グリセロールアッセイ：２５マイクロリットルの標準物質またはサンプルを、９６ウェルアッセイプレート中で、１００μＬのグリセロール試薬［ＡＴＰ：２０．６５ｍｇ、ＭｇＣｌ２：４６．２０ｍｇ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン−ナトリウム塩：３１．１０ｍｇ、アミノアンチピロ−ル（Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｏｌ）：１．９０ｍｇ、グリセロールキナーゼ：１０．２μＬ、グリセロールオキシダーゼ：１２５μＬ、ＨＲＰ：６２．５μＬを、５０ｍＬの１倍ＰＢＳに溶解させた］を添加し、室温で１５分間インキュベートさせた。吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ５ｅプレートリーダを用いて５５０ｎｍにて測定した。７点のグリセロール標準曲線を、０．７８１〜５０μｇ／ｍＬの範囲で作成した。リポリシスにおける増加率は、以下の式を用いて概算した。
【０１０４】
【数２】
2021517120.tif 000010
【０１０５】
上記手順を用いて、全ての組成物をそのリポリシス増加に関してスクリーニングし、この結果を表６＆７に表した。
【０１０６】
表６：テオブロマ・カカオ抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリア抽出物（Ｃ．Ａ−１〜Ｃ．Ａ−４）を含有している組成物のアディポリシス活性
【表６】
2021517120.tif 000011
【０１０７】
表７：テオブロマ・カカオ抽出物（Ｔ．Ｃ−２およびＴ．Ｃ−３）およびシトラス・オーランティフォリア抽出物（Ｃ．Ａ−１〜Ｃ．Ａ−５）を含有している組成物のアディポリシス活性
【表７】
2021517120.tif 000012
【０１０８】
実施例１７：ＦＧＦ２１アッセイの一般的手順
マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（３ｍＬ中、１５００００細胞／ウェル）を、６−ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２の湿気のある環境で、１０％のＦＢＳおよび４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有しているＤＭＥＭ培地にて維持した。細胞をコンフルエントな状態（〜２日間）とした後、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、および５００ｎＭのインスリンを含有している分化培地（ＤＭ）を用いて４８時間、分化を惹起させた。細胞培養培地を、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、１００ｎＭのインスリンを含有しているポストＤＭへと変更し、ポストＤＭを、６日目まで４８時間ごとに新規に移し替えた。７日目に培地をウェルから吸引し、フェノールレッドを含まない１％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ培地を用いて、２回洗浄した。細胞を、１％のＦＢＳ（１ｍＬの総量）を含有しているＤＭＥＭ培地にて、異なる分化濃度の試験サンプル（５０μＬ）を用いて処理し、ＣＯ２インキュベータを用い、３７℃で更に４８時間インキュベートさせた。インキュベート後、５０μＬの細胞を含まない上澄みをウェルから採取し、ＥＬＩＳＡによるＦＧＦ２１分析のために加工した。ＦＧＦ２１のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃ＤＹ２５３９）は、製造者のプロトコールに従って実施された。
【０１０９】
ＦＧＦ２１における増加率は、以下の式を用いて計算した。
【０１１０】
【数３】
2021517120.tif 000013
【０１１１】
上記手順を用いて、選択される組成物を、対照を超えるそのＦＧＦ−２１増加に関してスクリーニングし、この結果を表８に表した。
【０１１２】
表８：テオブロマ・カカオ抽出物およびシトラス・オーランティフォリア抽出物を含有している組成物のＦＧＦ２１活性
【表８】
2021517120.tif 000014
【０１１３】
実施例１８：ＵＣＰ−１アッセイの一般的手順
マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（３ｍＬ中、１５００００細胞／ウェル）を、６−ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２の湿気のある環境で、１０％のＦＢＳおよび４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有しているＤＭＥＭ培地にて維持した。細胞をコンフルエントな状態（〜２日間）とした後、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、および５００ｎＭのインスリンを含有している分化培地（ＤＭ）を用いて４８時間、分化を惹起させた。細胞培養培地を、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、１００ｎＭのインスリンを含有しているポストＤＭへと変更し、ポストＤＭを、６日目まで４８時間ごとに新規に移し替えた。７日目に培地をウェルから吸引し、フェノールレッドを含まない１％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ培地を用いて、２回洗浄した。細胞を、１％のＦＢＳ（１ｍＬの総量）を含有しているＤＭＥＭ培地にて、異なる分化濃度の試験サンプル（５０μＬ）を用いて処理し、ＣＯ２インキュベータを用い、３７℃で更に４８時間インキュベートさせた。
【０１１４】
ウェスタンブロット：
インキュベート後、細胞培養プレートを製氷トレイ上に置き、１倍ＰＢＳを用いて２回洗浄した。８０マイクロリットルの溶解バッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬのアプロチニン、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１％のトリトンＸ−１００、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、および１μＭのペプスタチン）を各ウェルに添加し、細胞溶解液をそれぞれマイクロフュージ管に採取した。マイクロフュージ管を１分間超音波処理した。細胞のタンパク質を２１９５２ｘｇにて遠心分離にかけた後採取した。タンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃  ２３２２５）を用いて定量化した。タンパク質サンプルに対してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施し、分離したタンパク質をウェットブロッティング（ｗｅｔ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法を用いてニトロセルロース膜上へと移動させた。手短に、１０μｇのタンパク質をアクリルアミドゲル（１０％分解）上へと乗せ、およそ１００Ｖで１時間４０分間、泳動させた。泳動の終わりには、移動システムを４℃のチャンバ（１００Ｖで２時間）に置くことでニトロセルロース膜へと移動させた。移動後、ＵＣＰ−１を、１８時間４℃でインキュベートさせている抗−ＵＣＰ−１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃ＰＡ１−２４８９４、１：１００００希釈）を用いて探索した。β−アクチンを、２時間室温でインキュベートさせている抗−β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ＃Ａ４７００−１００ｕＬ、１：１００００希釈）を用いて探索した。ペルオキシダーゼ結合マウス抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔ＃２０５−０３５−１０８、１：１００００希釈）を添加し、３０分間室温でインキュベートさせた。最後に、化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃３４０８０）を用いてブロットを展開し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ分子画像装置（モデル：ＣｈｅｍｉＤＯＣ  ＸＲＳ＋）を用いて画像をキャプチャした。ＵＣＰ−１タンパク質バンドの強度は、Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  ＭＩソフトウェアを用いて計算し、β−アクチンを用いて標準化して相対指数を得た。対照を超えるＵＣＰ−１発現率は、以下の式を用いて計算された：
【０１１５】
【数４】
2021517120.tif 000015
【０１１６】
上記手順を用いて、選択される組成物を、対照を超えるそのＵＣＰ−１発現％に関してスクリーニングし、この結果を表９に表した。
【０１１７】
表９：テオブロマ・カカオ抽出物およびシトラス・オーランティフォリア抽出物の組成物のＵＣＰ−１発現
【表９】
2021517120.tif 000016
【０１１８】
実施例１９：β３ＡＲアッセイの一般的手順
マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（３ｍＬ中、１５００００細胞／ウェル）を、６−ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２の湿気のある環境で、１０％のＦＢＳおよび４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有しているＤＭＥＭ培地にて維持した。細胞をコンフルエントな状態（〜２日間）とした後、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、および５００ｎＭのインスリンを含有している分化培地（ＤＭ）を用いて４８時間、分化を惹起させた。細胞培養培地を、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、１００ｎＭのインスリンを含有しているポストＤＭへと変更し、ポストＤＭを、６日目まで４８時間ごとに新規に移し替えた。７日目に培地をウェルから吸引し、フェノールレッドを含まない１％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ培地を用いて、２回洗浄した。細胞を、１％のＦＢＳ（１ｍＬの総量）を含有しているＤＭＥＭ培地にて、異なる分化濃度の試験サンプル（５０μＬ）を用いて処理し、ＣＯ２インキュベータを用い、３７℃で更に４８時間インキュベートさせた。
【０１１９】
ウェスタンブロット：
インキュベート後、細胞培養プレートを製氷トレイ上に置き、１倍ＰＢＳを用いて２回洗浄した。８０マイクロリットルの溶解バッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬのアプロチニン、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１％のトリトンＸ−１００、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、および１μＭのペプスタチン）を各ウェルに添加し、細胞溶解液をそれぞれマイクロフュージ管に採取した。マイクロフュージ管を１分間超音波処理した。細胞のタンパク質を２１９５２ｘｇにて遠心分離にかけた後採取した。タンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃２３２２５）を用いて定量化した。タンパク質サンプルに対してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施し、分離したタンパク質をウェットブロッティング（ｗｅｔ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法を用いてニトロセルロース膜上へと移動させた。手短に、１０μｇのタンパク質をアクリルアミドゲル（１０％分解）上へと乗せ、およそ１００Ｖで１時間４０分間、泳動させた。泳動の終わりには、移動システムを４℃のチャンバ（１００Ｖで２時間）に置くことでニトロセルロース膜へと移動させた。移動後、β３ＡＲを、１８時間４℃でインキュベートさせている抗−β３ＡＲ抗体（Ｂｉｏｒｂｙｔ  Ｃａｔ＃ｏｒｂ２２１３４３、１：５００希釈）を用いて探索した。β−アクチンを、２時間室温でインキュベートさせている抗−β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ＃Ａ４７００−１００ｕＬ、１：１００００希釈）を用いて探索した。ペルオキシダーゼ結合マウス抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔ＃２０５−０３５−１０８、１：１００００希釈）を添加し、３０分間室温でインキュベートさせた。最後に、化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃３４０８０）を用いてブロットを展開し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ分子画像装置（モデル：ＣｈｅｍｉＤＯＣ  ＸＲＳ＋）を用いて画像をキャプチャした。β３ＡＲタンパク質バンドの強度は、Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  ＭＩソフトウェアを用いて計算し、β−アクチンを用いて標準化して相対指数を得た。対照を超えるβ３ＡＲ発現率は、以下の式を用いて計算された：
【０１２０】
【数５】
2021517120.tif 000017
【０１２１】
上記手順を用いて、全ての組成物をその対照を超えるβ３ＡＲ発現に関してスクリーニングし、この結果を表１０に表した。
【０１２２】
表１０：テオブロマ・カカオおよびシトラス・オーランティフォリアの組成物のβ３ＡＲ発現
【表１０】
2021517120.tif 000018
【０１２３】
実施例２０：スプラーグドーリーラットの高脂肪食誘発脂肪モデルにおける、テオブロマ・カカオ水抽出物（Ｔ．Ｃ−１）およびシトラス・オーランティフォリア５０％水性エタノール抽出物（Ｃ．Ａ−１）、マルトデキストリンおよびシロイドを含有する組成物−６７のインビボ抗肥満活性
【０１２４】
誘導：選択した健康なスプラーグドーリーラットを、正常対照（Ｎ＝７）または高脂肪食グループ（ｎ＝３４）に無作為に割り当てた。高脂肪食誘発肥満グループに割り当てられた動物は全て、高脂肪食を与えることにより、最初の４週間の誘導期の間の食事介入を通して実験的に肥満状態とした。誘導期の終わりには、体重に基づいて太りすぎの動物を４つのグループ（ｎ＝７）へと無作為抽出した。すなわち、Ｇ２−太りすぎた対照、Ｇ３−組成物−６７（１００ｍｇ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）、Ｇ４−組成物−６７（３００ｍｇ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）およびＧ５−シブトラミン（１０ｍｇ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）であった。
【０１２５】
処置：４週間の誘導段階の後、割り当てられた試験物質またはビヒクルを用いて４週間、動物を経口にて（経口摂食経管栄養を用いて）処置した。処置グループの動物には、４週間、１０ｍＬの水中０．５％ＣＭＣ中、１００ｍｇ（Ｇ３）または３００ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）体重の組成物−６７（Ｃ−６７）または１０ｍｇ／ｋｇ体重のシブトラミンを補給した。対照グループの動物は、この期間、ビヒクル（１０ｍＬの水中０．５％ＣＭＣ）のみを受容した。処置段階中、動物は全て、試験の終わりまで標準的なげっ歯類向けの食事を供給した。
【０１２６】
評価されたパラメータ：個々の動物の体重は、試験の全体継続時間中には毎週記録し、平均体重を測定した。処置段階中、処置の最後に、当初の体重とそれぞれ比較した体重増加を毎週計算した。結果を図１Ａおよび図１Ｂに示している。
【０１２７】
食事カロリーの消費量：試験の処置段階中、実験用ラットによる飼料消費の総量を記録した。２８日間で消費された飼料の総量を平均し、１日の飼料消費を（グラムにて）概算した。平均飼料消費量（グラム）は、通常の固形飼料（３．４３ＫＪ／グラム）と、高脂肪食（５．１５ＫＪ／グラム）によって補充されたエネルギーの量（ＫＪ／グラム）によって乗じられた。実験グループによる１日の平均的な食事カロリーの消費（ＫＪ／日）は、（図２）のように表されている。
【０１２８】
続いて安楽死させ、内蔵（後腹膜、精巣上体、腎臓周囲および腸間膜）脂肪組織をラットから採取し、電子はかりによって０．０１ｇの感度で秤量した（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）。内臓脂肪の重量における変化に関する観測を、図３にまとめている。
【０１２９】
脂肪組織の形態計測：個々の動物から採取した精巣上体の脂肪組織は、１０％のホルマリンで固定した。パラフィン包埋組織を５μｍ区分に切除し、該区分を以下の標準的なプロトコールに従って加工した。ヘマトキシリン−エオジン染色した組織区分は、顕微鏡で２０倍にて観察した（Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ  Ａ１，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。脂肪細胞のピクセルサイズを概算し、ピクセルあたり０．１６９４μｍの変換スケールを用いて各細胞の面積を概算した。脂肪細胞サイズのデータを図４に示している。
【０１３０】
血清バイオマーカ評価：試験の終わりに、全ての動物から血液サンプルを採取した。血液サンプルから血清を分離して、市販のＥＬＩＳＡキット（レプチンＥＬＩＳＡキット、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；Ｔ３およびＴ４ＥＬＩＳＡキット、Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ，ＥＬ  Ｃａｊｏｎ，ＣＡ）を用いて、レプチン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）およびチロキシン（Ｔ４）を分析した。取扱業者によって提供されている指示に従って、アッセイを実施した。対照グループと比較した処置グループに関する血清レプチンデータを図５にまとめている。甲状腺ホルモンバランス（Ｔ３／Ｔ４）は、全ての動物に関して計算し、結果を図６にまとめている。
【０１３１】
脂肪細胞免疫組織化学：ＵＣＰ−１の免疫組織化学は、キットの指示に従い、ＤＡＢ染色法を用いてパラフィン包埋精巣上体脂肪組織に実施した（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。組織区分をＵＣＰ−１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、その後ストレプトアビジン−共役ＨＲＰを用いて反応させた。最終的に、ジアミノベンゼデン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｅｄｅｎｅ）（ＤＡＢ）を用いて抗体特異性発色反応を展開した。ＵＣＰ−１染色組織区分の画像は、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１顕微鏡（Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてキャプチャした。ＵＣＰ−１染色精巣上体脂肪組織区分の代表的な顕微鏡写真を図７に表している。
【図１】
2021517120.tif 000019
【図２】
2021517120.tif 000020
【図３】
2021517120.tif 000021
【図４】
2021517120.tif 000022
【図５】
2021517120.tif 000023
【図６】
2021517120.tif 000024
【図７】
2021517120.tif 000025
【国際調査報告】
2021517120.tif 000026