(57)【要約】  本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに関し、該ｒＡＡＶビリオンは、新規キャプシドタンパク質を含む。特に、本発明は、関節炎疾患、例えば関節リウマチ、またはその症状の、好ましくは関節内投与による、処置のための遺伝子治療におけるこのようなビリオンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するための修飾キャプシドタンパク質を含み、前記修飾キャプシドタンパク質が前記タンパク質のＣ末端部分にアミノ酸配列Ｚを含み、その残基が前記キャプシドタンパク質の表面上に露出している、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項２】
前記アミノ酸配列Ｚが、
ａ．式Ｉ：
ｙ−Ｇ−Ｑ−ｘ−Ｇ−（ｘ）３−Ｒ−（ｘ）３−ｙ−Ａ−Ｑ−Ａ−Ａのアミノ酸残基の配列を含むまたはそれからなり、
式中、ｘは単一のアミノ酸残基を表し、ｙは０、１または２個のアミノ酸残基を表し、
ｂ．野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質のＣ末端から１００〜２００、好ましくは１２０〜１８０、より好ましくは１３０〜１７０、より好ましくは１４０〜１６０位のアミノ酸残基に対応する位置に存在する、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項３】
前記配列Ｚが、式ＩＩ：
ＥＥＥＩｘｘｘｘＰＶＡＴＥｘｘＧｘｘｘｘＮｘＱｙ−Ｚ−（ｘ）ｎＬＰＧＭＶＷＱｘＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧによって表される位置にて前記修飾キャプシドタンパク質に含まれ、
ａ．式中、Ｚ、ｘ及びｙは、請求項１で定義した通りであり、
ｂ．ｎは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である、請求項１または請求項２に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。
【請求項４】
前記キャプシドタンパク質が、
ｉ）配列番号１を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号１の５８８〜６０２位のアミノ酸が配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号２を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号２の５８５〜５９９位のアミノ酸が配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号３を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号３の５８７〜６０１位のアミノ酸が配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｉｖ）配列番号４を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号４の５８６〜６００位のアミノ酸が配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｖ）配列番号５を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号５の５８８〜６０２位のアミノ酸が配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｖｉ）配列番号６を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号６の５８８〜６０２位のアミノ酸が配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｖｉｉ）配列番号７を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号７の５８７〜６０１位のアミノ酸が配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記修飾キャプシドタンパク質が、同じ条件下で試験したとき、配列番号１３〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する非修飾キャプシドタンパク質と比較して、好ましくはヒトＦＬＳ細胞における発現において少なくとも２倍の増加を提供し、好ましくは、前記非修飾キャプシドタンパク質が、前記アミノ酸配列配列番号１９を有するまたは前記修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。
【請求項５】
前記キャプシドタンパク質が、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。
【請求項６】
前記ｒＡＡＶビリオンが、
ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含むヌクレオチド配列、及び
ｉｉ）目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは目的の遺伝子産物をコードする前記ヌクレオチド配列が、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列の間に位置する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。
【請求項７】
目的の前記遺伝子産物が、関節炎疾患に関連する症状を、処置、予防または抑制し、好ましくは、目的の前記遺伝子産物が、インターロイキン、免疫調節剤、抗体、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、成長因子、プロテアーゼ、ヌクレオチダーゼ／ヌクレオシダーゼ、ペプチド、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤、酵素及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、目的の前記遺伝子産物が、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＩＦＮ−βのうちの少なくとも１つである、請求項６に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。
【請求項８】
前記ｒＡＡＶビリオンが、
（ｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで、前記または各ガイドＲＮＡは、ゲノム内の標的ポリヌクレオチド配列（複数可）に実質的に相補的である、及び
（ｉｉ）ヌクレアーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含み、前記ヌクレアーゼが、前記ガイドＲＮＡとリボヌクレアーゼ複合体を形成し、前記リボヌクレアーゼ複合体が、前記ゲノム内で部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＤＢ）を作成する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン。
【請求項９】
関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するためのｒＡＡＶ組成物であって、請求項１〜８のいずれか一項において定義する通りのｒＡＡＶビリオン及び医薬的に許容可能な担体を含む、前記ｒＡＡＶ組成物。
【請求項１０】
前記ｒＡＡＶ組成物が、空キャプシドを、少なくとも１：１の空キャプシド対ｒＡＡＶビリオンの比率にてさらに含む、請求項９に記載の使用のためのｒＡＡＶ組成物。
【請求項１１】
関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するためのｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤であって、前記ｒＡＡＶ組成物が、請求項９または１０のいずれか一項に定義する通りであり、前記処置または予防が、個体への前記ｒＡＡＶ組成物の投与及び前記免疫抑制剤の投与を含む、前記ｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１２】
前記関節炎疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、痛風、偽痛風、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、敗血症性関節炎、関節炎、若年性特発性関節炎、鈍的外傷、関節置換術、及びスティル病からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオン、請求項９もしくは１０に記載の使用のためのｒＡＡＶ組成物、または請求項１１に記載の使用のためのｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１３】
前記ｒＡＡＶビリオンまたは前記ｒＡＡＶ組成物が全身及び／または局所投与される、請求項１〜８及び１２のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンまたは請求項９、１０及び１２のいずれか一項に記載の使用のためのｒＡＡＶ組成物。
【請求項１４】
前記ｒＡＡＶ組成物及び前記免疫抑制剤のうちの少なくとも一方が局所投与される、請求項１１に記載の使用のためのｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤。
【請求項１５】
前記局所投与が、関節内投与である、請求項１３に記載の使用のためのｒＡＡＶビリオンもしくはｒＡＡＶ組成物または請求項１４に記載の使用のためのｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をベースとする遺伝子治療の分野、特に関節炎疾患の処置または予防における突然変異キャプシドｒＡＡＶの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトにおける遺伝子の送達に関して優れた安全性及び有効性プロファイルを実証している。それゆえ、ｒＡＡＶベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療において広く使用されており、前臨床モデルならびに臨床治験において安全及び有効であると示されている。ｒＡＡＶベクターは、血友病Ｂ、血友病Ａ、嚢胞性線維症、アルファ１抗トリプシン欠乏症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、パーキンソン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びレーバー先天性黒内障を含む、様々な疾患に関する多くの遺伝子治療臨床試験において成果を収めている（Ｓｅｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１４，１０７２−１０８２）。アリポジーンチパルボベック（Ｇｌｙｂｅｒａ（登録商標）、ｕｎｉＱｕｒｅ）は、リポ蛋白リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）の処置のための遺伝子治療として、ヨーロッパにおいて販売承認を取得している。その後、皮膚癌の処置のためのヘルペスウイルスをベースとするタリモジェンラヘルパレプベク（Ｔ−Ｖｅｃ、Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）及びＡＤＡ−ＳＣＩＤの処置のためのｅｘ  ｖｉｖｏ幹細胞レトロウイルスをベースとする遺伝子治療ストリムベリス（ＧＳＫ）に遺伝子治療薬承認が与えられた。
【０００３】
ｒＡＡＶベクターをベースとする遺伝子治療は、人口の約１％が罹る慢性炎症性疾患である、関節リウマチ（ＲＡ）にも適用されている。ＲＡの病理は滑膜性関節全体に広がる。関節の局所的な性質は、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療を非常に魅力的なものにする。ＲＡにおけるバランスを抗炎症状態にシフトすることを目的とした抗炎症タンパク質を提供する治療が適用されている。
【０００４】
多くの研究が、所望の特性を備えたＡＡＶキャプシドタンパク質の開発に焦点を合わせている。そのような特性としては、より高い形質導入効率、組織／臓器向性、望ましくない組織／臓器の脱標的化、または既存の中和抗体の回避が含まれ得る。
【０００５】
しかしながら、当該技術分野では、ｒＡＡＶ遺伝子治療ベクターをさらに改善する必要が依然としてある。特に、関節炎疾患におけるｒＡＡＶ遺伝子治療ベクターの使用を改善する必要があり、より正確には、滑膜性関節または滑膜性関節内の特定の細胞型、好ましくは線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）などの標的組織に遺伝物質を送達する効率を改善する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
第一の態様では、本発明は、関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するための修飾キャプシドタンパク質を含み、修飾キャプシドタンパク質がタンパク質のＣ末端部分にアミノ酸配列Ｚを含み、その残基がキャプシドタンパク質の表面上に露出している、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに関する。好ましくは、アミノ酸配列Ｚは、
ａ．式Ｉ：
ｙ−Ｇ−Ｑ−ｘ−Ｇ−（ｘ）３−Ｒ−（ｘ）３−ｙ−Ａ−Ｑ−Ａ−Ａのアミノ酸残基の配列を含むまたはそれからなり、
式中、ｘは単一のアミノ酸残基を表し、ｙは０、１または２個のアミノ酸残基を表し、
ｂ．野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質のＣ末端から１００〜２００、好ましくは１２０〜１８０、より好ましくは１３０〜１７０、より好ましくは１４０〜１６０位のアミノ酸残基に対応する位置に存在する。
【０００７】
好ましくは、式Ｉのアミノ酸残基は、キャプシドタンパク質の表面上に露出している。好ましい実施形態では、配列Ｚは、式ＩＩ：
ＥＥＥＩｘｘｘｘＰＶＡＴＥｘｘＧｘｘｘｘＮｘＱｙ−Ｚ−（ｘ）ｎＬＰＧＭＶＷＱｘＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧによって表される位置にて修飾キャプシドタンパク質に含まれ、
式中、Ｚ、ｘ及びｙは、上記に定義した通りであり、ｎは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。
【０００８】
好ましい実施形態では、本発明は、関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するための修飾キャプシドタンパク質を含み、修飾キャプシドタンパク質が、ｉ）配列番号１を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号１の５８８〜６０２位のアミノ酸が配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号２の５８５〜５９９位のアミノ酸が配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｉｉｉ）配列番号３を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号３の５８７〜６０１位のアミノ酸が配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｉｖ）配列番号４を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号４の５８６〜６００位のアミノ酸が配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｖ）配列番号５を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号５の５８８〜６０２位のアミノ酸が配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｖｉ）配列番号６を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号６の５８８〜６０２位のアミノ酸が配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びｖｉｉ）配列番号７を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有し、配列番号７の５８７〜６０１位のアミノ酸が配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、修飾キャプシドタンパク質が、同じ条件下で試験したとき、配列番号１３〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する非修飾キャプシドタンパク質と比較して、発現において少なくとも２倍の増加を提供し、好ましくは、非修飾キャプシドタンパク質は、配列番号１９を有するアミノ酸配列を有するまたは修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型を有する、ｒＡＡＶビリオンに関する。
【０００９】
好ましい実施形態では、修飾キャプシドタンパク質は、同じ条件下で試験したとき、配列番号１３〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する非修飾キャプシドタンパク質と比較して、ヒトＦＬＳ細胞における発現において少なくとも２倍の増加を提供し、好ましくは、非修飾キャプシドタンパク質は、配列番号１９を有するアミノ酸配列を有するまたは修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型を有する。
【００１０】
あるいは、または先行する実施形態のいずれか１つと組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００１１】
あるいは、または先行する実施形態のいずれか１つと組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含むヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ビリオンは、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。さらにより好ましくは、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列の間に位置する。
【００１２】
好ましい実施形態では、目的の遺伝子産物は、関節炎疾患に関連する症状を、処置、予防または抑制し、好ましくは、目的の遺伝子産物は、インターロイキン、免疫調節剤、抗体、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、成長因子、プロテアーゼ、ヌクレオチダーゼ／ヌクレオシダーゼ、ペプチド、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤、酵素及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、目的の遺伝子産物は、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＩＦＮ−βのうちの少なくとも１つである。
【００１３】
あるいは、または先行する実施形態のいずれか１つと組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、（ｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで、該または各ガイドＲＮＡは、ゲノム内の標的ポリヌクレオチド配列（複数可）に実質的に相補的である、及び（ｉｉ）ヌクレアーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含み、ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡとリボヌクレアーゼ複合体を形成し、リボヌクレアーゼ複合体は、ゲノム内で部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＤＢ）を作成する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するためのｒＡＡＶ組成物に関し、該ｒＡＡＶ組成物は、本発明に従うｒＡＡＶビリオン及び医薬的に許容可能な担体を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、空キャプシドを、少なくとも１：１、少なくとも５：１または少なくとも１０：１の空キャプシド対ｒＡＡＶビリオンの比率にてさらに含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するためのｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤に関し、該ｒＡＡＶ組成物は本発明に従うｒＡＡＶ組成物であり、好ましくは、処置または予防は、個体へのｒＡＡＶ組成物の投与及び免疫抑制剤の投与を含む。
【００１６】
あるいは、または先行する実施形態のいずれか１つと組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、関節炎疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、痛風、偽痛風、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、敗血症性関節炎、関節炎、若年性特発性関節炎、鈍的外傷、関節置換術、スティル病からなる群から選択される。
【００１７】
あるいは、または先行する実施形態のいずれか１つと組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、ｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶ組成物は、全身及び／または局所投与される。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤のうちの少なくとも一方は局所投与される。好ましくは、局所投与は、関節内投与である。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、関節炎疾患に関連する症状を処置する、予防する、または抑制する方法に関し、該方法は、本発明に従う有効量のｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶ組成物を含む医薬品の関節内投与のステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、修飾キャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンが、細胞の形質導入において驚くほど効率的であり、特に滑膜性関節の細胞の形質導入において効率的であることを発見した。線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）が典型的には、例えば関節リウマチなどの関節炎疾患の処置における関節内の主要な標的細胞であるため、本発明の目的は、ｒＡＡＶ投与の際に、当該技術分野で公知のキャプシドタンパク質と比較して、以下の特性、ｉ）滑膜組織、特にＦＬＳにおけるより高い発現レベル、ｉｉ）滑膜組織向性の改善、特にＦＬＳに対する向性の改善、及び／またはｉｉｉ）望ましくない組織／臓器に対する脱標的化の改善のうちの１つまたは複数において改善されているキャプシドタンパク質を提供することである。特に、本発明の修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンのこれらの特性は、非修飾キャプシドタンパク質、好ましくは修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型の野生型キャプシドタンパク質及び／またはＡＡＶ５キャプシドタンパク質と比較して改善されている。ＡＡＶ５キャプシドが、他のＡＡＶ血清型と比較したとき、最も高いＦＬＳ発現レベルをもたらすことが、以前に確立されている（Ａｄｒｉａａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６４：１６７７−１６８４；Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６：４２６−４３４）。組織／細胞向性特性を付与するのはキャプシドであるため、本発明に記載の修飾キャプシドは、好ましくは非修飾ＡＡＶ５と比較したとき、亢進されたＦＬＳ形質導入能力の特性を有する。特に、本発明のキャプシドタンパク質が、滑膜組織、特にＦＬＳにおいて、好ましくは関節内投与の際に、非修飾キャプシドタンパク質（すなわち、試験されるべき修飾を伴わない同じキャプシドタンパク質、好ましくは修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型のもの）、好ましくは野生型非修飾キャプシドタンパク質（好ましくは、修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型のもの）、より好ましくは非修飾ＡＡＶ５またはｗｔＡＡＶ５キャプシドタンパク質と比較して、より高い発現レベルを提供することが好ましい。
【００２０】
従って、第一の態様では、本発明は、修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンに関する。本明細書で定義するｒＡＡＶビリオンは、遺伝子治療における使用に関して特に有用である。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「遺伝子治療」は、疾患もしくは障害を処置もしくは予防するため、または疾患もしくは障害の症状を処置もしくは予防するための、個体の細胞及び／または組織への核酸配列（例えば、本明細書で以下に定義されるような導入遺伝子（目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列とも称する））の挿入である。
【００２２】
ＡＡＶは分裂細胞及び静止細胞の両方に感染する可能性があり、感染はキャプシドタンパク質と細胞膜受容体との相互作用、それに続くＡＡＶビリオンのエンドサイトーシスによって生じる。ＡＡＶはディペンドウイルス属に属し、これはパルボウイルスとも称される、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅのサブファミリーに属し、脊椎動物に感染することができる。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅは、小ＤＮＡ動物ウイルスのファミリー、すなわちＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに属する。これらの属の名称から推測され得るように、ディペンドウイルスのメンバーは、細胞培養における増殖性感染のために、通常、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスとの同時感染を必要とするという点で、特有である。ディペンドウイルス属には、通常はヒトに感染するＡＡＶ及び、他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジのアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅの他のメンバーに関するさらなる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に記載されている。便宜上、本発明は、ＡＡＶを参照することにより、本明細書にてさらに例示及び説明される。しかしながら、本発明が、ＡＡＶに限定されず、他のパルボウイルスに等しく適用され得ることが理解されたい。
【００２３】
全ての公知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直鎖状、一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造的複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造的（ＶＰ）タンパク質の、固有のコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）は、ＶＰ２／ＶＰ３のオープンリーディングフレームと重複する別のオープンリーディングフレームにおいてコードされている、集合活性化タンパク質（ＡＡＰ）の助けを借りて（一部の血清型に関して）、キャプシドまたはタンパク質外殻を形成する。末端ヌクレオチドは自己相補性であり、Ｔ字型ヘアピンを形成する、エネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成されている。末端ヌクレオチドのサイズは、血清型に依存する。例えば、ＡＡＶ２の場合、末端１４５ｎｔのうち、１２５ｎｔは自己相補性であり、残りの２０ｎｔは一本鎖のままである。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能する。哺乳動物細胞における野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）感染後、Ｒｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）は、それぞれｐ５プロモーター及びｐ１９プロモーターによって転写されたｍＲＮＡから発現される。どちらのＲｅｐタンパク質も、ウイルスゲノムの複製において機能を有する。Ｒｅｐ  ＯＲＦにおけるスプライシング事象により、実際には４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現がもたらされる。しかしながら、スプライシングされていないｍＲＮＡによってコードされる、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質が、哺乳動物細胞では、ＡＡＶベクター産生に十分であることが示されている。哺乳動物細胞におけるｗｔＡＡＶまたはｒＡＡＶの産生は、２つのスプライスアクセプター部位の交互の使用及び、ＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの準最適な利用との組み合わせにさらに依存し、これにより、およそ１：１：１０の比率（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）にて３つ全てのキャプシドタンパク質の適切な発現が確かなものとなる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「ｒＡＡＶビリオン」（本明細書では「ｒＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶ導入遺伝子ベクター」とも称する）は、非天然核酸配列を含むＡＡＶキャプシドを意味する。ｒＡＡＶ内のそのような配列は、一般に、好ましくはｗｔＡＡＶからの、ＩＴＲ配列に隣接し、好ましくは、目的の遺伝子産物、例えば導入遺伝子または相同性アームをコードする。言い換えると、ｒＡＡＶビリオンは、（ｉ）目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列及び（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む、キャプシドタンパク質によってキャプシド形成されたｒＡＡＶゲノムを意味する。ｒＡＡＶゲノムは、１つまたは好ましくは全てのｗｔＡＡＶ遺伝子が削除され得るが、依然として機能的なＩＴＲ核酸配列を含み得る。好ましくは、ｒＡＡＶビリオンは、ウイルスタンパク質をコードするいずれのヌクレオチド配列、例えばＡＡＶのｒｅｐ（複製）またはｃａｐ（キャプシド）遺伝子を含まない。ゆえに、ｒＡＡＶビリオンはｗｔＡＡＶビリオンと区別され、それはウイルスゲノムの全てまたは一部が、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列で置換されているためであり、これは本明細書においてさらに定義するようにＡＡＶ核酸配列に関して非天然核酸である。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明の修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するためのものである。本明細書に記載する医学的用途（例えば、関節炎疾患（に関連する症状）の処置または予防のための遺伝子治療）は、本明細書に定義する疾患（複数可）及び／または障害（複数可）の予防または処置のための医薬品として使用するための本発明に従うｒＡＡＶビリオンとして製剤化されるが、（ｉ）本明細書に定義する疾患（複数可）及び／もしくは障害（複数可）またはその症状を予防または処置する方法であって、十分または有効量の本発明に従うｒＡＡＶビリオンを、それを必要とする対象に投与することを含む該方法として、（ｉｉ）本明細書に定義する疾患（複数可）及び／または障害（複数可）を予防または処置するための医薬品の調製において使用するための本発明に従うｒＡＡＶビリオンとして、あるいは（ｉｉｉ）本明細書に定義する疾患（複数可）及び／または障害（複数可）の予防または処置のための本発明に従うｒＡＡＶビリオンの使用として等しく製剤化され得る。そのような医学的使用は全て、本発明により想定される。好ましくは、修飾キャプシドタンパク質は、タンパク質のＣ末端部分にアミノ酸配列Ｚを含み、その残基はキャプシドタンパク質の表面上に露出している。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、本発明のｒＡＡＶビリオンの関節炎疾患を有する対象への適用または投与を指し、その目的は、関節炎疾患の、または関節炎疾患に関連する症状の進行または重症度を、治癒する、部分的または完全に逆転、緩和、寛解、阻害、遅延、抑制、減速または停止させることである。「処置すること」という用語は、関節炎疾患の少なくとも１つの有害作用または症状を低下または緩和することを含む。１つまたは複数の症状または臨床マーカーが低下する場合に、処置は概して「有効」である。あるいは、関節炎疾患の進行が低下または停止する場合に、処置は「有効」である。すなわち、「処置」には、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置の不在下で予想され得る症状の進行または悪化の休止または少なくとも減速も含まれる。有益または所望の臨床結果としては、検出可能であるか検出不能であるかに関わらず、１つまたは複数の症状（複数可）の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の病態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患病態の寛解または緩和、及び（部分的か完全かに関わらず）緩解が挙げられるが、これらに限定されない。関節炎疾患の「処置」という用語は、関節炎疾患の症状または副作用の軽減を提供すること（緩和処置を含む）も含む。本明細書で使用する場合、「予防する」、「予防」、または「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）」（予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）とも称する）という用語は、関節炎疾患に対する素因を有する対象への本発明に従うｒＡＡＶビリオンの適用または投与を指し、起こり得る関節炎疾患の１つまたは複数の症状または特徴の、発症を遅延もしくは予防する、進行を緩和、寛解、軽減、阻害する、重症度を低下させる、及び／または発生率を低下させることを目的とする。ゆえに、本発明に従うｒＡＡＶビリオンは、関節炎疾患の兆候を呈さない対象及び／または関節炎疾患の初期徴候のみを呈する対象に、好ましくは関節炎疾患に関連する病理を発症するリスクを低減する目的で、投与されてよい。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「治癒する」または「治癒すること」という用語は、関節炎疾患の１つまたは複数、好ましくは全ての症状または特徴を完全に緩和することを意味する。本明細書で使用する場合、「遅延する」または「遅延すること」という用語は、関節炎疾患の症状または特徴のうちの１つまたは複数の発症を遅延させる及び／または進行を阻害する及び／または重症度を低下することを意味する。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明の修飾キャプシドタンパク質は、同じ条件下で試験したとき、非修飾キャプシドタンパク質と比較して発現において少なくとも２倍の増加を提供する。好ましくは、非修飾キャプシドタンパク質は、修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型のキャプシドタンパク質であるが、試験されるべき修飾を伴わない。より好ましくは、非修飾キャプシドタンパク質は、修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型の野生型（ｗｔ）キャプシドタンパク質であり、ｗｔキャプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号１３〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。あるいは、非修飾キャプシドタンパク質は、配列番号１３〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することが好ましい。最も好ましくは、非修飾キャプシドタンパク質は、配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列を有する。好ましい非修飾キャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶビリオンによって標的とされるべき組織に依存し得る。例えば、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を伴うｒＡＡＶは、ＦＬＳ細胞に適したビリオンであるように思われ（Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６（４）：４２６−４３４；Ａｄｒｉａａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６４（１２）：１６７７−１６８４）、従って−ｒＡＡＶ突然変異ビリオンの元の血清型に関係なく−ｒＡＡＶ対照ビリオンは、好ましくはＡＡＶ５キャプシドタンパク質、より好ましくは野生型ＡＡＶ５（ｗｔＡＡＶ５）キャプシドタンパク質を含み、より好ましくは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有し、さらにより好ましくは、ｒＡＡＶ対照ビリオンは、ｒＡＡＶ５ビリオンである。ｒＡＡＶ対照ビリオンは、修飾キャプシドタンパク質の代わりに、本明細書に定義するような非修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンである。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶビリオン（修飾キャプシドタンパク質を含む）は、実施例に記載の方法を使用して、修飾キャプシドタンパク質の代わりに本明細書に定義するような非修飾キャプシドタンパク質を伴う同じｒＡＡＶビリオンと比較して、リウマチ様関節炎患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞（ＲＡ−ＦＬＳ）及び／またはＨＥＫ２９３、好ましくはＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入の際により高い発現を提供する。言い換えれば、キャプシドタンパク質を除いて、ｒＡＡＶビリオン及びｒＡＡＶ対照ビリオンは好ましくは同一である。好ましくは、形質導入効率は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイにおいて検出され、これはＧＦＰ、ＹＦＰ及び／またはルシフェラーゼなどの導入遺伝子によりコードされるレポーター遺伝子の発現レベルを測定することによる。好ましい実施形態では、発現を決定するための試験は、実施例２／３に記載するようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイである。簡潔には、９６ウェルプレート（ＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号３１９６６−０２１）、１０％ＦＢＳ（熱非働化（ＨＩ）ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ参照番号Ａ１５−１５１）、１００μｇ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、参照番号Ｐ０７８１；３７℃／５％ＣＯ２）に、ＲＡ−ＦＬＳ（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓａｎｄｅ  ＭＧ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７０：４２３−４２７に記載される通りに単離される）を２５００個の細胞／ウェルでプレートするか、またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胚性腎細胞）を４０，０００個の細胞／ウェルでプレートする。２４時間後、上清を除去し、ｒＡＡＶ突然変異ビリオンまたはｒＡＡＶ対照ビリオンを含有する培地（ＤＭＥＭ−ｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号３１９６６−０２１）、０．００１％プルロニックＦ６８（Ｓｉｇｍａ、参照番号ｐ５５５９））により置換する−サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で全てが黄色蛍光タンパク質（ｙＦＰ）及び／またはルシフェラーゼを発現する−感染多重度（ＭＯＩ）は、１０，０００、２０，０００、１００，０００とする。粗溶解物（すなわち、ｒＡＡＶ産生のために必要な全てのプラスミドを用いてトランスフェクトされ、レポーター発現ビリオンを含有する細胞の非精製上清）または精製ＡＡＶ（好ましくは、イオジキサノール精製または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配精製に基づく）を使用することができる。形質導入の４時間後、ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｄ１５１５、最終濃度０．４μＭ）、ＦＢＳ（最終濃度１％）を含有する培地（ＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、１０％ＦＢＳ  １００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を加える。４８時間後（ＨＥＫ２９３Ｔ）または４〜６日後（ＲＡ−ＦＬＳ）、細胞を、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーにより、ＹＦＰまたはルシフェラーゼを発現している細胞の割合（％）についてアッセイする。好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイを、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の患者から単離されたＦＬＳなどの異なる患者から単離されたＦＬＳを用いて、複数回行う。
【００２９】
「血清型」は、従来、別のウイルスと比較してあるウイルスに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて定義される。このような交差反応性の差は、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基における差に起因する（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列の差に起因する）。従来の定義下では、血清型とは、目的のウイルスが、全ての既存の及び特徴決定された血清型に特異的である血清に対して、中和活性に関して試験され、目的のウイルスを中和する抗体が見出されていないことを意味する。より多くの天然に生じるウイルス単離体が発見され、キャプシド突然変異体が生成されるにつれ、現在存在する血清型のいずれかとの血清学的な差がある場合もあり、ない場合もある。ゆえに、新規ＡＡＶが血清学的な差を有さない場合、この新規ＡＡＶは、対応する血清型の亜群または変異体であるだろう。多くの場合では、それらが血清型の従来の定義に従って別の血清型であるかどうかを決定するための、中和活性に関する血清学試験は、キャプシド配列修飾を有する突然変異ウイルスに対してまだ行われていない。従って、便宜上及び反復を避けるために、「血清型」という用語は、血清学的に区別されるウイルス（例えば、ＡＡＶ）、ならびに所与の血清型の亜群または変異体内にあり得る血清学的に区別されていないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広く指す。
【００３０】
「形質導入」は、ウイルスベクターによるレシピエント宿主細胞への導入遺伝子の移行を指す。本発明のｒＡＡＶビリオンによる標的細胞の形質導入は、そのｒＡＡＶビリオンに含有される導入遺伝子の形質導入される細胞への移行をもたらす。「宿主細胞」または「標的細胞」は、個体の滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）もしくは滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）などの、または患者からの単離されたＦＬＳ細胞もしくはｉｎ  ｖｔｒｏ形質導入アッセイの場合にはＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの、ＤＮＡ送達が生じる細胞を指す。ＡＡＶベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を形質導入することができる。例えばＧＦＰなどの目的の遺伝子産物を含む細胞では、目的の遺伝子産物は、細胞のｒＡＡＶ「形質導入」によって、導入／移行／形質導入されている。導入遺伝子が導入されている細胞は、「形質導入された」細胞と呼ばれる。
【００３１】
導入遺伝子が形質導入されるレシピエント宿主細胞は、好ましくは、処置されるべき疾患に罹っている細胞、例えば、関節炎の場合では、滑膜細胞、より具体的にはＦＬＳ、マクロファージ、単球、好中球、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、Ｔ−リンパ球、樹状細胞、形質細胞、マスト細胞、Ｂリンパ球などである。本明細書で使用する場合、「滑膜」または「滑膜組織」または「滑膜細胞」は、滑膜性関節の非軟骨性表面を覆う、細胞の内張を指し、Ｔａｋ（２０００，Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ａｎｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ．Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  ＧＳ，Ｐａｎｙａｎｉ  ＧＳ，Ｗｏｌｌｈｅｉｍ  ＦＡ  ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．５５−６８に記載）においてさらに記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。滑膜は、内膜の内層（または滑膜表層）及び滑膜下内層（滑膜下層）からなり、関節包と合わさる。内膜の内層は、内膜マクロファージ（またはマクロファージ様滑膜細胞もしくはＡ型滑膜細胞）及びＦＬＳ（またはＢ型滑膜細胞）を含む。それゆえ、「滑膜」は、「滑膜組織」で置き換えられてよい、または同義である。滑膜細胞は、ＦＬＳ及びマクロファージ様滑膜細胞を含む滑膜内に存在する任意の細胞を含むことができる。滑膜細胞は、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／または結合組織細胞であってよく、これらは全てが滑膜内に存在してよい。
【００３２】
「線維芽細胞様滑膜細胞」（ＦＬＳ）は、例えばいくつかのタイプのコラーゲンなどの特定のタンパク質の発現など、線維芽細胞と共通する多くの特徴を示す間葉系起源の細胞である。しかしながら、ＦＬＳは、例えばルブリシンなど、他の線維芽細胞系統には通常存在しないタンパク質も分泌する。加えて、ＦＬＳは、細胞接着の媒介に重要である分子、例えばカドヘリン−１１、ＶＣＡＭ−１、数種のインテグリン及びそれらの受容体を発現する。ＣＤ５５の発現はＦＬＳに特有であり、それゆえ典型的にはこのタンパク質を使用して、免疫組織化学によって滑膜内のＦＬＳを同定する。ＦＬＳは、滑膜の関節の内側に位置する特殊化した細胞型を表し、その細胞は、関節リウマチ（ＲＡ）などの慢性炎症性疾患の病理発生において決定的な役割を担う。「リウマチ様滑膜」または「リウマチ様滑膜細胞」または「リウマチ様滑膜組織」という用語は、ＲＡに罹患している個体の関節の炎症を起こした滑膜を指す。リウマチ様滑膜は、内膜の内層肥厚ならびに、滑膜下層におけるＦＬＳ、Ｔ細胞、形質細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞及び樹状細胞の蓄積を特徴とする。これらの蓄積された細胞は、リウマチ様滑膜細胞の定義に含まれている。ＲＡが進行する間、滑膜組織は一定の炎症過程が生じる場所となり、最終的には軟骨の損傷ならびに関節の破壊及び変形をもたらし得る。ＲＡの間に滑膜内に存在するＦＬＳは、正常組織内に存在するＦＬＳと比較して変化した表現型を示すことが報告されている。例えば、リウマチ様滑膜内のＦＬＳは「接触阻害」を喪失する、つまり、より多くの細胞が互いに接触するようになった際にその増殖を停止する特性を喪失する。加えて、これらは接着面上で増殖する依存性を喪失する。結果として、罹患した滑膜内のＦＬＳの数が増加する。炎症は、数種の炎症誘発性シグナル伝達分子、具体的にはインターロイキンＩＬ−６及びＩＬ−８、プロスタノイドならびにマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生によって、さらに亢進される。
【００３３】
あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明に従う修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、同じ条件下で試験したとき、本明細書に定義するような非修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンと、好ましくは配列番号１３〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する非修飾キャプシドタンパク質と比較して、ヒトＦＬＳにおける導入遺伝子の発現において少なくとも２倍の増加を提供し、好ましくは、非修飾キャプシドタンパク質は、修飾キャプシドタンパク質と同じ血清型を有するまたは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する。
【００３４】
より好ましくは、本発明のｒＡＡＶビリオンは、上記のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入の際に、ｒＡＡＶ対照ビリオンと比較してヒトＦＬＳ細胞において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０倍の増加した発現レベルで、導入遺伝子の発現レベルの増加をもたらす。
【００３５】
また好ましい、または上記に加えて、ｒＡＡＶビリオンは、疑似滑膜腔（ａｉｒ  ｐｏｕｃｈ  ｓｙｎｏｖｉｕｍ）（ＡＰＳ）マウスモデル（実施例４に記載のようにＥｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １３４：１４７−１５６から適応）へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与の際に、ｒＡＡＶ対照ビリオンと比較して、好ましくはｗｔＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンと比較して、導入遺伝子の発現の増加を提供し、ただしｒＡＡＶが（そのキャプシドタンパク質（複数可）以外の）他の点では同一であることを条件とする。好ましくは、導入遺伝子の発現は、本発明の方法の突然変異キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶを使用して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５倍増加する。例示的な方法は、実施例に提供する。
【００３６】
また好ましい、または上記に加えて、修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、同じ血清型の、非修飾、好ましくは野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質を含む同じｒＡＡＶビリオンと比較して、同様またはより低い中和抗体（ｎＡｂ）力価を提供する。ＷｔＡＡＶ５キャプシドは、魅力的なｎＡｂプロファイルを有することが知られており、それゆえ、ｗｔＡＡＶ５と比較して本発明に従う修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶの同様またはより低いｎＡｂ力価は好ましい。
【００３７】
あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイを、上記と同様だが、標的とするべき細胞型に応じて、ＦＬＳとは異なる細胞型／細胞株において、例えば、初代肝細胞、肝細胞株、例えば、ＨｕＨ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＡ１−６、心臓細胞、骨格筋細胞、肺細胞、例えば細胞株Ａ５４９、ＣＮＳ細胞、眼細胞、消化管細胞、骨髄細胞及び血液細胞、例えば細胞株ＴＨＰ−１からなる群から選択される細胞において行うことができる。これもまた、野生型キャプシドタンパク質の向性に応じて、好ましい対照として異なるＡＡＶ血清型を必要とし得る。一般に、対照ベクターは、好ましくは、適した組織を自然に標的とする野生型キャプシドタンパク質を含む。当業者が理解するように、これはまた、投与様式：局所性または全身性に依存し得る。例えば、ＡＡＶ２は、最も広範に検査されてきたＡＡＶであり、骨格筋細胞、ニューロン、血管平滑筋細胞及び肝細胞に対する向性を示し、ＡＡＶ６は、気道上皮細胞に対する向性を示し、ＡＡＶ７は、骨格筋細胞に対する向性を示し、ＡＡＶ８は、肝細胞に対する向性を示し、ＡＡＶ１及びＡＡＶ５は、血管内皮細胞に対する向性を示す。全身投与の際、ＡＡＶ１〜３及び５〜９は肝臓に対して向性を有し、ＡＡＶ９、８、７、６、１で高いタンパク質レベルが、及びより少ない程度に５及び２で観察され、心臓は、ＡＡＶ４、６、７、８及び９により形質導入され、胸部発現は、ＡＡＶ４及び６に関して見られる（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６（６）：１０７３−１０８０）。
【００３８】
いかなる理論にも束縛されることを望まないが、本発明者らは、ｒＡＡＶ対照ビリオンと比較して本発明の修飾キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンによって達成される発現の増加は、細胞へのｒＡＡＶの形質導入の改善によって、おそらくは向性の変化によって引き起こされ、結果として（ｉ）形質導入される細胞集団内の細胞数の増加、及び／または（ｉｉ）例えば、より良好なビリオンの取り込み及び／または細胞内プロセシングに起因する細胞あたりの発現レベルの増加がもたらされると考える。
【００３９】
本発明に従う修飾キャプシドタンパク質を伴うｒＡＡＶビリオンの別の利点は、好ましくは、既存の中和抗体の潜在的な回避などの他の改善であり得る。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、修飾キャプシドタンパク質はアミノ酸配列Ｚを含み、好ましくはアミノ酸配列Ｚはタンパク質のＣ末端部分に含まれる。好ましくは、配列Ｚの長さは１２〜１８アミノ酸残基である（本明細書では「ループ領域」及び「インサート」とも称する）。好ましい実施形態では、配列Ｚは、キャプシドタンパク質のＣ末端部分に、好ましくは、野生型キャプシドタンパク質のＣ末端から、１００〜２００、好ましくは１２０〜１８０、より好ましくは１３０〜１７０、より好ましくは１４０〜１６０、最も好ましくは約１５０位のアミノ酸に対応する位置に配置され、例えば、配列番号１３〜１９に示される。アミノ酸配列Ｚの残基は、好ましくは、キャプシドタンパク質の表面上に露出している、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の残基がキャプシドタンパク質の表面上に露出している（いわゆる「ループ」）。好ましい実施形態では、配列Ｚの長さは、１４〜１８アミノ酸残基、より好ましくは、１５、１６、１７または１８残基、最も好ましくは１５、１７または１８アミノ酸残基である。配列Ｚは、非修飾、例えば野生型キャプシドタンパク質配列と比較して、いくつかのアミノ酸残基を置換し得る。好ましくは、インサートは、同じ配列だがインサートを伴わない、好ましくは非修飾、より好ましくは野生型配列の３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基、より好ましくは６または７アミノ酸残基を置換する。配列Ｚ／インサートとは別に、ゆえに、フレームワークにおいて、キャプシドタンパク質は、アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）などのさらなる修飾を含み得る、またはフレームワークキャプシドタンパク質は野生型アミノ酸配列であり得る。インサートが含まれるフレームワークＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶＤＪなどの任意の血清型のものであることができる。好ましくは、配列Ｚが含まれるフレームワークＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＤＪからなる群から、より好ましくは、配列番号１３〜１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する非修飾キャプシドタンパク質から選択される。本発明に従うインサートは、好ましくは、キャプシドタンパク質のＣ末端部分に、好ましくは、野生型キャプシドタンパク質のＣ末端から、１００〜２００、好ましくは１２０〜１８０、より好ましくは１３０〜１７０、より好ましくは１４０〜１６０、最も好ましくはおよそ１５０位のアミノ酸残基に対応する位置に含まれ、例えば、配列番号１３〜１９などに示され、ここでインサートの位置は、式ＩＩ：
ＥＥＥＩｘｘｘｘＰＶＡＴＥｘｘＧｘｘｘｘＮｘＱｙ−Ｚ−（ｘ）ｎＬＰＧＭＶＷＱｘＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧによって表され、
式中、ｘは単一のアミノ酸残基を表し、ｙは０、１、もしくは２個のアミノ酸残基（複数可）（ゆえに、存在しない場合がある）を表し、ｎは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５、好ましくは８、９もしくは１０である、またはインサートの位置は、式ＩＩと少なくとも９０、９３、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する配列によって表される。好ましくは、本発明の配列ＺのＮ末端に先行する最後の３個のアミノ酸残基は、ＮＬＱ、ＮＨＱまたはＮＦＱである。好ましくは、ｙは０または２個のアミノ酸残基を表す。いくつかの場合では、ｙは２個のアミノ酸残基を表し、ゆえに、２個の追加のアミノ酸残基、好ましくは２個のセリン残基が、ＮｘＱモチーフと本発明のインサートとの間に存在し得る。これは好ましくは、ＮｘＱモチーフがＮＦＱである場合、例えば、ＡＡＶキャプシドが配列番号１において表されるようなＡＡＶ１キャプシド配列である場合である。当業者は、これらのモチーフ及びインサートが配置されるこの領域を、またこれらも本発明の範囲に包含される、アミノ酸置換または欠失などのいくつかの変更を有するか否かも決定することができるだろう。
【００４１】
好ましい実施形態では、図４及び５に示されるアライメントに基づいて、インサート（配列Ｚ）は、式：ｘ１−Ｇ−Ｑ−ｘ２−Ｇ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−Ｒ−ｘ６−ｘ７−ｘ８−ｘ９−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３−ｘ１４−ｘ１５の配列を含むまたはそれからなり、式中、ｘ１はＱまたは無し、ｘ２はＳまたはＲ、ｘ３はＮまたはＣ、ｘ４はＤ、ＹまたはＥ、ｘ５はＣ、Ｖ、ＳまたはＡ、ｘ６はＧ、ＳまたはＶ、ｘ７は無し、Ａ、ＶまたはＲ、ｘ８はＤ、ＮまたはＥ、ｘ９はＣまたはＡ、ｘ１０はＦまたはＱ、ｘ１１は無し、ＣまたはＡ、ｘ１２は無しまたはＡ、ｘ１３は無しまたはＱ、ｘ１４は無しまたはＡ、Ｘ１５は無しまたはＡである。あるいはインサート（配列Ｚ）は、式：ｙ１−Ｇ−Ｑ−ｙ２−Ｇ−ｙ３−ｙ４−ｙ５−Ｒ−ｙ６−ｙ７−ｙ８−ｙ９−ｙ１０−Ａ−ｙ１１−ｙ１２−ｙ１３の配列を含むまたはそれからなり、式中、ｙ１はＱまたは無し、ｙ２はＳまたはＲ、ｙ３はＮまたはＣ、ｙ４はＤ、ＹまたはＥ、ｙ５はＣ、Ｖ、ＳまたはＡ、ｙ６はＧ、ＳまたはＶ、ｙ７は無しまたはＤ、ｙ８は無しまたはＣ、ｙ９はＡ、Ｖ、ＲまたはＦ、ｙ１０はＮ、Ｄ、ＥまたはＣ、ｙ１１は無しまたはＱ、ｙ１２は無しまたはＡ、ｙ１３は無しまたはＡである。さらに別の代替では、最も好ましい実施形態では、図６及び７に示すアライメントに基づいて、インサート（配列Ｚ）は、一般式Ｉ：
ｙ−Ｇ−Ｑ−ｘ−Ｇ−（ｘ）３−Ｒ−（ｘ）３−ｙ−Ａ−Ｑ−Ａ−Ａの配列を含むまたはそれからなり、
式中、ｘは単一のアミノ酸残基を表し、ｙは０、１または２個のアミノ酸残基（ゆえに存在しない場合もある）を表す。好ましくは、（ｉ）Ｎ末端にてｙが０個のアミノ酸を表す場合に、式Ｉ内の他のｙは０個のアミノ酸残基を表す、または（ｉｉ）Ｎ末端にてｙが１個のアミノ酸残基を表す場合に、式Ｉ内の他のｙは２個のアミノ酸残基を表す。より好ましくは、インサート（配列Ｚ）は、より特異的な式：
ｚ０−Ｇ−Ｑ−ｚ１−Ｇ−ｚ２−ｚ３−ｚ４−Ｒ−ｚ５−ｚ６−ｚ７−ｚ８−ｚ９−Ａ−Ｑ−Ａ−Ａの配列を含むまたはそれからなり、
式中、ｚ０は無しまたはＱ、ｚ１はＲまたはＳ、ｚ２はＣまたはＮ、Ｚ３はＤ、ＥまたはＹ、ｚ４はＣ、Ａ、ＳまたはＶ、ｚ５はＧ、ＶまたはＳ、ｚ６はｄまたは無し、ｚ７はＣまたは無し、ｚ８はＦ、Ｒ、ＶまたはＡ、ｚ９はＣ、Ｄ、ＮまたはＥである。より好ましくは、ｚ０が無しの場合、ｚ６及びｚ７はどちらも無しを表す。
【００４２】
より好ましくは、配列Ｚ／インサートは、配列番号８〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと、少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。配列Ｚ／インサートが、上記の式のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、配列番号８〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つと、少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
【００４３】
哺乳動物細胞では、正しい化学量論での３つのＡＡＶキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）の発現は、２つのスプライスアクセプター部位の交互使用と、昆虫細胞では正確に複製されない、ＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの準最適活用との組み合わせに依存する。正しい化学量論は、ＡＡＶ粒子の感染性にとって重要である。昆虫細胞で３つのＡＡＶキャプシドタンパク質を正しい化学量論で産生するには、スプライシングを必要とせずに３つ全てのＶＰタンパク質を発現できる単一のポリシストロニックメッセンジャーへと転写される構築物を使用するのが一般的である。これを達成するためには、ＶＰ１タンパク質は、ＡＴＧの代わりに準最適な翻訳開始コドンの制御下にあり得る。そのような準最適な翻訳開始コドンの例は、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧである（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１９３５−１９４３；米国特許第２００３０１４８５０６号；米国特許第２００４０１９７８９５号；ＷＯ２００７／０４６７０３）。あるいは、昆虫細胞におけるｒＡＡＶの産生では、核酸カセットを使用してＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を発現させることができ、この場合これらのタンパク質は、ＶＰ２  ＡＣＧ開始コドンの前にプロモーターを含むイントロンを含むＶＰ発現カセットが開示されている欧州特許第２，０６１，８９１Ｂ１に記載されるような重複オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸配列によってコードされている。本発明の修飾キャプシドタンパク質は、ＶＰ１キャプシドタンパク質のタンパク質配列に関して定義される。しかしながら、配列Ｚ／インサートは、ＶＰ１タンパク質のＣ末端部分に位置するので、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質もまた配列Ｚ／インサートを保有し、ゆえに（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞などにおけるｒＡＡＶの産生方法に関係なく）修飾されることが本発明に含まれる。
【００４４】
あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明に従う修飾キャプシドタンパク質は、ｉ）配列番号１を有するアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、配列番号１の位置５８８〜６０２にあるアミノ酸が配列番号１１と少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２を有するアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、配列番号２の位置５８５〜５９９にあるアミノ酸が配列番号１０と少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｉｉｉ）配列番号３を有するアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、配列番号３の位置５８７〜６０１にあるアミノ酸が配列番号９と少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｉｖ）配列番号４を有するアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、配列番号４の位置５８６〜６００にあるアミノ酸が配列番号８と少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｖ）配列番号５を有するアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、配列番号５の位置５８８〜６０２にあるアミノ酸が配列番号９と少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｖｉ）配列番号６を有するアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、配列番号６の位置５８８〜６０２にあるアミノ酸が配列番号８と少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及びｖｉｉ）配列番号７を有するアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、配列番号７の位置５８７〜６０１にあるアミノ酸が配列番号１２と少なくとも８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。好ましくは、インサートが含まれるフレームワークＡＡＶキャプシドタンパク質は、例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０もしくはＡＡＶＤＪなどの野生型ＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。より好ましくは、インサートが含まれるフレームワークＡＡＶキャプシドタンパク質は、ｗｔＡＡＶ５キャプシドのアミノ酸配列、または保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。
【００４５】
「配列同一性」は、本明細書では、配列を比較することにより決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。好ましい実施形態では、配列同一性は、２つの所与の配列番号の全長またはその一部に基づいて計算される。その一部は、好ましくは、両方の配列番号の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％または１００％を意味する。当該技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、そのような配列のストリング間の一致によって決定される、アミノ酸配列または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。本明細書で別段に示されない限り、所与の配列番号との同一性または類似性は、前記配列の全長に基づく（すなわち、その全体の長さにわたるまたは全体としての）同一性または類似性を意味する。
【００４６】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができ、限定されないが、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８））に記載のものが含まれる。
【００４７】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されてる。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の情報源から一般に利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。周知のスミスウォーターマンアルゴリズムを使用して、同一性を決定してもよい。
【００４８】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターには、以下のアルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；及びギャップ長ペナルティ：４が含まれる。このようなプログラムは、ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐからの「Ｏｇａｐ」プログラムとして一般に利用可能である。前述のパラメーターは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメータである（エンドギャップについてはペナルティは伴わない）。
【００４９】
核酸比較のための好ましいパラメーターには、以下のアルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３が含まれる。ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐからギャッププログラムとして利用可能である（ｗｗｗ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｇｃｇ／ｇａｐ）。上記に記載するものは、核酸比較のためのデフォルトパラメータである。
【００５０】
任意選択的に、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者は、当業者に明らかであるように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮に入れてもよい。保存的アミノ酸置換は、類似する側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示するアミノ酸配列の置換変異体は、開示する配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基が代わりに挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に生じるアミノ酸のそれぞれの好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕまたはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅ；及びＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕ。
【００５１】
あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらに好ましい実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１〜７からなる群から、より好ましくは配列番号１、２、３、４、６及び７からなる群から、さらにより好ましくは配列番号３、４及び６からなる群から、なおもより好ましくは配列番号４及び６からなる群から、最も好ましくは配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００５２】
機能性ＩＴＲ配列は、ｒＡＡＶビリオンの複製、レスキュー、及びパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であってよい、または野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％の配列同一性を有してよい、またはそれらが機能性である限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって改変されてよい。この文脈において、機能性とは、ゲノムをキャプシド外殻内に直接パッケージングし、次いで形質導入されるべき宿主細胞または標的細胞における発現を可能にする能力を指す。典型的には、野生型ＡＡＶゲノムのＩＴＲは、ｒＡＡＶベクター内に保持される。ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスゲノムからクローニングする、またはＡＡＶ  ＩＴＲを含むベクターから切り出すことができる。ＩＴＲヌクレオチド配列は、標準的な分子生物学技術を使用して、本明細書に定義するような導入遺伝子にいずれかの末端にて連結し得るか、またはＩＴＲ間の野生型ＡＡＶ配列を所望のヌクレオチド配列で置換し得る。ｒＡＡＶベクターは、好ましくは、少なくともＡＡＶ血清型のうちの１つのＩＴＲ領域のヌクレオチド配列、またはそれに実質的に同一であるヌクレオチド配列、及び２つのＩＴＲの間に挿入された（適切な調節エレメントの制御下にある）治療用タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。現在使用されているｒＡＡＶベクターの大部分は、ＡＡＶ血清型２由来のＩＴＲ配列を使用する。ｒＡＡＶベクターに存在する最も好ましいＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型のものである。他の好ましいＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５またはＡＡＶ６血清型のものである（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０（１）：４２６−４３９）。ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖または二本鎖（自己相補性）ＤＮＡを含むことができる。一本鎖核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかであり、これは、両方の極性が等しくＡＡＶキャプシドへとパッケージングすることができるからである。一本鎖ｒＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ＩＴＲ配列を利用し得、二本鎖（自己相補性）ｒＡＡＶベクターは、ＩＴＲの修飾版を利用し得る。あるいは、一実施形態では、二本鎖ベクターは１つのＩＴＲを含み、このＩＴＲはＡＡＶ４由来である。ｒＡＡＶベクターは、マーカーまたはレポーター遺伝子、例えば当該技術分野で公知の、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子、あるいは化学的、酵素的または別途検出可能及び／もしくは選択可能な生成物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＳＥＡＰ、Ｌｕｃ、Ｎｅｏ、Ｂｌａ、など）をさらに含んでよい。
【００５３】
ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型キャプシド及びＡＡＶゲノムＩＴＲの任意の考えられ得る組み合わせを含み、当該技術分野で公知の方法を使用して、例えば、哺乳動物ｒＡＡＶ産生システムまたは昆虫細胞ｒＡＡＶ産生システムを使用して産生される。当該技術分野で公知の方法は、例えば、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９）７３：３４１０−３４１７）、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）１０：１０３１−１０３９）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１１）８０７：３６１−４０４）、Ｇｒｉｍｍ（Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）２８（２）：１４６−１５７）に記載されており、昆虫細胞システムは、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００２）１３：１９３５−１９４３）、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２（６）：１２１７−１２２５）、国際特許公開ＷＯ２００７／０４６７０３、国際特許公開ＷＯ２００７／１４８９７１、国際特許公開ＷＯ２００９／０１４４４５、国際特許公開ＷＯ２００９／１０４９６４、国際特許公開ＷＯ２００９／１５４４５２、国際特許公開ＷＯ２０１１／１１２０８９、国際特許公開ＷＯ２０１３／０３６１１８、米国特許第６，７２３，５５１Ｂ号に基づき、これらは参照により本明細書に組み込まれる。要約すると、本方法は、概して、（ａ）宿主細胞へのｒＡＡＶゲノム構築物の導入、（ｂ）宿主細胞へのＡＡＶヘルパー構築物の導入、ここでヘルパー構築物は、野生型ｒＡＡＶゲノムから欠失したウイルス機能を含み、及び（ｃ）宿主細胞へのヘルパーウイルス構築物の導入を伴い得る。ｒＡＡＶベクターへのｒＡＡＶゲノムの複製及びパッケージングを達成するためには、ｒＡＡＶベクター複製及びパッケージングのための全ての機能が存在する必要がある。宿主細胞への導入は、標準的な分子生物学技術を使用して行うことができ、同時にまたは連続して行うことができる。最後に、宿主細胞を培養してｒＡＡＶベクターを生成し、これを次いで、ＣｓＣｌ勾配（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０９８−８１０８）またはイオジキサノール精製などの標準的な技術を使用して精製する。精製されたｒＡＡＶベクターは、次いで、典型的には、本方法において使用する準備が整う。１０１２粒子／ｍｌを超える高力価及び高純度（検出可能なヘルパー及び野生型ウイルスを含まない）を達成することができる（例えば、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．上掲及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９−３７を参照されたい）。ＩＴＲ領域間のｒＡＡＶベクターへと挿入される導入遺伝子の合計サイズは、一般的に、５キロベース（ｋｂ）より小さいサイズである。
【００５４】
本発明の文脈において、キャプシドタンパク質外殻は、（ｉ）目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列及び（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶゲノムとは異なる血清型のものであり得る。ゆえに、本発明のｒＡＡＶゲノムは、本発明のキャプシドタンパク質外殻、すなわち、正二十面体キャプシドタンパク質によってキャプシド化され得、これは本発明に従うキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３）、例えば、本発明に従うＡＡＶキャプシドタンパク質の変異体を含み、一方でそのｒＡＡＶベクターに含有されるＩＴＲ配列は、例えばＡＡＶ２またはＡＡＶ５を含む、上記のＡＡＶ血清型のいずれかであり得る。一実施形態では、ｒＡＡＶビリオンに存在するｒＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２またはＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型８に由来する。ＡＡＶ５及び他のＡＡＶ血清型の完全なゲノムが配列決定されており（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２，ｐ１３０９−１３１９）、ＡＡＶ５のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにて入手可能である（アクセッション番号ＡＦ０８５７１６）。ゆえに、ＡＡＶ２及びＡＡＶ５のＩＴＲヌクレオチド配列は、当業者にとって容易に入手可能である。ＡＡＶ２の完全なゲノムは、ＮＣＢＩ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００１４０１．２）にて入手可能である。それらは、例として、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって供給されるようなオリゴヌクレオチド合成装置を使用して当該技術分野で公知の化学合成によって、または標準的な分子生物学技術によって、クローン化または作成することができる。
【００５５】
あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
「導入遺伝子」または「目的の遺伝子産物」という用語は、本明細書では互換可能に使用され、ＡＡＶ核酸配列に関して非天然の核酸を指す。それらは、細胞または生物に導入することができるポリヌクレオチドを指すために使用される。目的の遺伝子産物には、任意のポリヌクレオチド、例えばポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子、阻害性ポリヌクレオチドへと転写されるポリヌクレオチド、または転写されない（例えば、転写を駆動するプロモーターなどの発現制御エレメントを欠く）ポリヌクレオチドが含まれる。本発明の目的の遺伝子産物は、それぞれが異なるか、または異なる治療分子をコードする、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含み得る。少なくとも２つの異なるヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）エレメントによって連結され、単一のプロモーターの制御下でバイシストロン性転写物を提供し得る。好適なＩＲＥＳエレメントは、例えば、Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：９１０−９１７）に記載されている。さらに、異なる（治療用）ポリペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも２つの異なるヌクレオチド配列は、ウイルス２Ａ配列によって連結されて、単一のプロモーターから両方の導入遺伝子を効率的に発現させ得る。２Ａ配列の例としては、口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルス、ゾーシー・アシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス、ブタテスコウイルス−１（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１１）６（４）：ｅ１８５５６）からの配列が挙げられる。目的の遺伝子産物は、好ましくは、ｒＡＡＶゲノム内またはＩＴＲ配列間に挿入される。目的の遺伝子産物はまた、コード配列及び３’終結配列に作動可能に連結したプロモーターまたは転写調節配列などの発現調節エレメントを含む発現構築物であってもよい。目的の遺伝子産物は、欠損しているものを置換または補足する機能性突然変異対立遺伝子であることができる。遺伝子治療はまた、本質的に阻害性である、すなわち、望ましくないまたは異常な（例えば、病原性）遺伝子またはタンパク質などの内因性または外因性遺伝子またはタンパク質の発現、活性または機能を、阻害、低減または低下させる導入遺伝子の挿入も含む。そのような導入遺伝子は、外因性であり得る。外因性分子または配列は、処置されるべき細胞、組織及び／または個体において通常は発生しない分子または配列であると理解される。後天性疾患及び先天性疾患の両方が遺伝子治療に適している。
【００５７】
「遺伝子」または「コード配列」は、特定のタンパク質を「コードする」ＤＮＡまたはＲＮＡ領域を指す。コード配列は、プロモーターなどの適切な調節領域の制御下に置かれたとき、ポリペプチドへと転写（ＤＮＡ）及び翻訳（ＲＮＡ）される。遺伝子は、いくつかの作動可能に連結したフラグメント、例えばプロモーター、５’リーダー配列、イントロン、コード配列及び３’非翻訳配列を含み得、これはポリアデニル化部位またはシグナル配列を含む。キメラ遺伝子または組換え遺伝子は、例えば、転写されたＤＮＡ領域の一部または全部に本来はプロモーターが結合しない遺伝子のような、自然界には通常見出されない遺伝子である。「遺伝子の発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写される及び／または活性タンパク質に翻訳されるプロセスを指す。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」または「転写調節配列」という用語は、１つまたは複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置する核酸フラグメントを指し、限定されるものではないが、転写因子結合部位、抑制タンパク質結合部位及び活性化タンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写量を直接的にまたは間接的に調節することが当業者に知られている他の任意のヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、及び任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的条件下及び発生学的条件下で、ほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば、化学誘引物質の適用により生理学的または発生学的に調節されるプロモーターである。好ましい誘導性プロモーターは、炎症時に誘導性であるＮＦ−κＢ応答性プロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織または細胞において優先的に活性である。適切なプロモーター配列の選択は、一般に、ＤＮＡセグメントの発現のために選択された宿主細胞に依存する。本発明のｒＡＡＶ及び／または導入遺伝子内の好ましいプロモーター配列は、リウマチ様滑膜の細胞、例えば内膜マクロファージ及び／またはＦＬＳ及び／または他の滑膜細胞、例えば、限定されないが、Ｔ細胞において発現を付与するプロモーターである。好ましいプロモーターは、例えば、滑膜細胞で発現することが知られている遺伝子のプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、ＩＬ−６遺伝子のプロモーターもしくはＳＶ４０プロモーター、または本明細書で先に同定したＮＦ−κＢ誘導性プロモーターなどであり、当業者により容易に決定される。あるいは、導入遺伝子は、効率的な全身発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結される。好適なプロモーター配列は、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡ（ニワトリベータアクチン）、または肝臓特異的プロモーター、例えばヒトアルファ−１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）またはＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）である。好ましくは、ｒＡＡＶ及び／または導入遺伝子内のプロモーターは、ステロイド誘導性プロモーターではない。より好ましくは、ｒＡＡＶ及び／または導入遺伝子内のプロモーターは、デキサメタゾン誘導性プロモーターではない。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド（またはポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれたとき、「作動可能に連結」している。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結している。「作動可能に連結」しているということは、連結したＤＮＡ配列が典型的には連続しており、必要であれば２つのタンパク質コード領域の連結が連続しており、リーディングフレーム内に存在することを意味する。
【００６０】
「目的の遺伝子産物」は、「治療用ポリペプチド」または「治療用タンパク質」であることができ、個体に対して有益な効果を有することができるポリペプチドまたはタンパク質として本明細書において理解されるべきであり、好ましくは、前記個体はヒトであり、より好ましくは、前記ヒトは疾患に罹患している。このような治療用ポリペプチドは、酵素、補因子、サイトカイン、抗体、成長因子、ホルモン及び抗炎症性タンパク質からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
【００６１】
あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列の間に配置される。あるいは、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接している、すなわち、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列のいずれかの末端に１つのＩＴＲがある。
【００６２】
あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい実施形態では、目的の遺伝子産物は、関節炎疾患に関連する症状を、処置、予防または抑制し、好ましくは、目的の遺伝子産物は、インターロイキン、免疫調節剤、抗体、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、成長因子、プロテアーゼ、ヌクレオチダーゼ／ヌクレオシダーゼ、ペプチド、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤、酵素及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、目的の遺伝子産物は、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＩＦＮ−βのうちの少なくとも１つである。これらの例は、インターロイキン１（ＩＬ−１）阻害剤（例えば、アナキンラ、カナキヌマブ、リロナセプト）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害剤（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルチリズマブペゴル、ゴリムマブ）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、可溶性ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１７阻害剤（例えば、セクキヌマブ、ブロダルマブ、イキセキズマブ、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３阻害剤（ウステキヌマブ、リサンキズマブ、グセルクマブ、チルドラキズマブ）、Ｔ細胞共刺激阻害剤（例えば、アバタセプト）、Ｂ細胞枯渇剤及び阻害剤（例えば、リツキシマブ、ベリムマブ、イナルマブ、タバルマブ）、ＩＬ−１５阻害剤（例えば、ＡＭＧ−７１４）、ＩＬ−２２阻害剤（例えば、フェザクニマブ）、ＧＭ−ＣＳＦの阻害剤（レンジルマブ、ナミルマブ）インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（例えば、ｒｈＦＧＦ−１８／スプリフェルミン）、核因子カッパ−Βリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）阻害剤（例えば、デノスマブ）、補体５ａ阻害剤（例えば、Ｃ５ａＲ−１５１）、骨形成タンパク質ファミリーメンバー（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、増殖分化因子ファミリー（ＧＤＦ）、インターロイキン−１８阻害剤（例えば、タデキニグアルファ／ＩＬ−１８結合タンパク質）、ＩＬ−２阻害剤（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、可溶性ＴＮＦα（ｓＴＮＦα）受容体ｐ５５またはｓＴＮＦα受容体ｐ７５、ＩｇＧと融合したｓＴＮＦα受容体、ＴＮＦα受容体ｐ５５の阻害剤、ｓＴＮＦα受容体ｐ７５の阻害剤、ドミナントネガティブＩκＢキナーゼ（ｄｎ−ＩＫＫ−β）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）（Ｆ８ＩＬ１０／デカビル（Ｄｅｋａｖｉｌ））、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）、ＭＭＰファミリーの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）、プラスミノーゲン活性化阻害剤（ＰＡＩ）、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）、シグナル伝達分子／転写因子（例えば、ＳＭＡＤ、Ｓｏｘ９、ＩｋＢ）、細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、プロテオグリカン、エラスチン）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）及び分化抗原群７３（ＣＤ７３）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ならびにそれらの組み合わせである。
【００６３】
本発明の全ての実施形態において使用するための機能的なゲノム編集システムは、当業者に公知であり、以下：転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７−４０５）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）上記）、Ｉ−ＳｃｅＩなどのメガヌクレアーゼ（Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７１（１）：４９−６５；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０８（３２）：１３０７７−１３０８２）、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ系、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０（１０）：９５７−９６３；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１（９）：８３３−８３８；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８１９−８２３）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７７１）、三重鎖形成分子、合成ポリアミドならびにデザイナージンクフィンガータンパク質（Ｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（２１）：６０６４−６０７８）を含む。機能性ゲノム編集システムは、ヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の所望の位置にて部位特異的二本鎖切断を作製する。誘導された二本鎖切断は、非相同末端結合または相同組換えを通して修復される。結果として、標的とする突然変異が得られる。遺伝子のごく一部が改変される必要がある場合、完全なコード配列及び調節配列がｒＡＡＶビリオンに含まれている必要がないため、これらの方法のいずれかによって、欠損遺伝子（疾患または障害の原因となる）を正常な対立遺伝子に、その本来の位置にて置き換えることは有利である。部分的に置換された遺伝子の発現はまた、ビリオンによって運ばれる完全な遺伝子よりも正常な細胞生物学と一致すると考えられる。好ましい遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含む）であり、それは他の方法よりも迅速及び安価だからである。主要な利点としてはまた、ＣＲＩＳＰＲは、ＣＲＩＳＰＲシングルガイドＲＮＡを使用して、簡単に転用して異なるＤＮＡ配列を標的とすることができることである。ゆえに、あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、（ｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで、ガイドＲＮＡは、ゲノム内の標的ポリヌクレオチド配列（複数可）に実質的に相補的−好ましくは相補的−である、及び（ｉｉ）ヌクレアーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含み、ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡとリボヌクレアーゼ複合体を形成し、リボヌクレアーゼ複合体は、ゲノム内で部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＤＢ）を作成する。
【００６４】
第二の態様では、本発明は、関節炎疾患に関連する症状の処置、予防または抑制において使用するためのｒＡＡＶ組成物に関し、該ｒＡＡＶ組成物は、本発明のｒＡＡＶビリオンならびに医薬的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／または賦形剤、好ましくは医薬的に許容可能な担体を含む。そのような医薬的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／または賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００に見出され得る。任意の好適な医薬的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／または賦形剤を本組成物において使用することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｐｒｉｌ  １９９７を参照されたい）。好ましい医薬形態は、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、もしくは緩衝溶液、または他の医薬的に許容可能な滅菌液体と組み合わさっているだろう。あるいは、例えば、マイクロキャリアビーズなどの固体担体を使用してもよい。
【００６５】
医薬組成物は、典型的には、製造及び保管の条件下で滅菌及び安定である。医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度を収容するのに好適な他の秩序構造として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びその好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物内に含むことが好ましいだろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物内に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことによって、もたらすことができる。パルボウイルスビリオンは、ボーラスとして、または制御放出製剤にて、例えば、徐放性ポリマー、またはインプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む、急速な放出から化合物を保護することになる他の担体を含む組成物にて、投与することができる。生分解性、生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸、ポリグリコールコポリマー（ＰＬＧ）を例えば使用してよい。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容可能な担体」または「賦形剤」は、好ましくは、生理学的に適合性のある、あらゆる及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。医薬的に許容可能な担体には、滅菌水溶液または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。医薬的に活性な物質に関するこのような媒体及び作用物質の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または作用物質が本活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。
【００６６】
投与の容易性及び投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが有利であり得る。本明細書で使用する場合、「単位剤形」は、処置されるべき対象のための単位の投薬として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体を伴って所望の治療効果をもたらすように算出された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形に関する仕様は、活性化合物の固有の特徴及び達成されるべき特定の治療効果によって、ならびに個体の状態の処置のためにかかる活性化合物を配合する技術分野に固有の制限によって指示され得る。
【００６７】
補助的な活性成分もまた、本発明の医薬組成物内に組み込むことができる。追加の治療薬の同時投与に関するガイダンスは、例えば、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ（ＣＰＳ）に見出され得る。
【００６８】
一実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、空の粒子（すなわち、キャプシドのみの粒子、ゆえに、ｒＡＡＶゲノムを含まない）をさらに含む。それゆえ、あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらなる実施形態では、本発明のｒＡＡＶ組成物は、空キャプシドを、少なくとも１：１、より好ましくは少なくとも５：１、さらにより好ましくは少なくとも１０：１の空キャプシド対ｒＡＡＶビリオンの比率にてさらに含む。ｒＡＡＶ組成物は、上で定義するようなｒＡＡＶビリオンならびに、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０５５４３７で定義された、及びＡａｌｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２８（２）：１６８−１７８に記載されるような空キャプシドを含むことができる。空キャプシドは、本発明の組成物のｒＡＡＶ導入遺伝子ベクターと比較して、同じ血清型または異なる血清型のものであり得る。好ましくは、空キャプシドは、ｒＡＡＶビリオンと同じ血清型のものである。そのようなｒＡＡＶ組成物内で、空キャプシド及びｒＡＡＶビリオンのキャプシドは、本発明の修飾キャプシドタンパク質、好ましくは同じ型の修飾キャプシドタンパク質を含み得る。しかしながら、空キャプシドが、ｒＡＡＶビリオンの修飾キャプシドタンパク質と比較して、異なる血清型を有するまたは異って修飾されたキャプシドタンパク質である、ｒＡＡＶ組成物も包含される。空キャプシドが、血清型の混合物、例えば、限定されないが、ＡＡＶ２及びＡＡＶ５キャプシドの混合物を有する、ｒＡＡＶ組成物がさらに包含される。本発明者らは、有意な量の空キャプシドと混合されたｒＡＡＶビリオンの関節内投与後、関節における導入遺伝子発現の増加効果を報告する。好ましくは、ｒＡＡＶビリオン及び空キャプシドでは、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、５０：１、１００：１または１０００：１、好ましくは少なくとも５：１の空キャプシド対ｒＡＡＶビリオンの比率（すなわち、空キャプシドの量は、ｒＡＡＶ導入遺伝子ベクターの量の少なくとも５倍である）にて組成物内に存在する。好ましくは、前記組成物は、ｒＡＡＶビリオン及び空キャプシドを、最大で１００００：１、５０００：１、４０００：１、３０００：１、２０００：１、１０００：１、５００：１、４００：１、３００：１、２００：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１または５：１、好ましくは最大で１０００：１の空キャプシド対ｒＡＡＶ導入遺伝子ベクターの比率にて含む。好ましくは、前記組成物は、ｒＡＡＶビリオン及び空キャプシドを、１：１〜１００：１、２：１〜１００：１、５：１〜１００：１、１：１〜２０：１、２：１〜２０：１の間、または好ましくは５：１〜２０：１の間の空キャプシド対ｒＡＡＶビリオンの比率にて含む。
【００６９】
ｒＡＡＶビリオン及び空キャプシドが単一の組成物内に存在する実施形態を、本明細書内上記で提供する。また、本発明には、ｒＡＡＶビリオン及び空キャプシドが（少なくとも２つ以上の）分離した、別個の組成物内に存在する代替の実施形態も包含される。この代替の実施形態では、ｒＡＡＶビリオン及び空キャプシドは、時間（例えば、連続して）及び／または局所性において分離して投与することができ、ここで、局所性は投与部位として理解されたい。さらに、ｒＡＡＶビリオン及び空キャプシドは、同時に、例えば、実質的に同じタイミングで、任意選択で分離した場所にて、投与されることができる。
【００７０】
第三の態様では、本発明は、関節炎疾患の処置もしくは予防において使用するためまたは関節炎疾患に関連する症状の処置もしくは予防において使用するためのｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤に関し、ｒＡＡＶ組成物は上記に定義した通りであり、処置または予防は、個体へのｒＡＡＶ組成物の投与及び免疫抑制剤の投与を含む。参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０５５４３７は、対象が免疫抑制剤とｒＡＡＶビリオンの両方で処置されたとき、ＡＡＶ導入遺伝子発現に対する免疫抑制剤の増加効果を開示している。さらに、ＷＯ２０１６／０５５４３７は、ｒＡＡＶ導入遺伝子発現に対する空のベクターを伴う免疫抑制剤の驚くべき相乗効果を開示している。一実施形態では、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶ組成物とは分離して適用され、分離とは、場所及び／または時間において分離することを意味する。そのような実施形態では、免疫抑制剤及びｒＡＡＶ組成物は、分離した及び別個の組成物内に存在し得る。免疫抑制剤、ｒＡＡＶビリオン及び任意選択で空のベクターは、さらにはそれぞれが、分離した、別個の組成物内に存在し得る。別の実施形態では、免疫抑制剤及びｒＡＡＶ組成物は、単一の組成物内に存在し得る。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶビリオン及び免疫抑制剤は、単一の組成物内に存在し、好ましくは、この組成物は、空キャプシドを含む分離した組成物と一緒に処置において使用される。なおもさらなる実施形態では、免疫抑制剤及び空キャプシドは、単一の組成物内に存在し、好ましくは、この組成物は、ｒＡＡＶビリオンを含む分離した組成物と一緒に処置において使用される。それゆえ、本発明は、本明細書に定義するような空キャプシド及び免疫抑制剤を含む組成物、本明細書に定義するようなｒＡＡＶビリオン及び免疫抑制剤を含む組成物、ならびに本明細書に定義するようなｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤を含む組成物も提供する。
【００７１】
好ましくは、本発明で使用するための免疫抑制剤は、自然免疫細胞阻害剤、好ましくはマクロファージ阻害剤である。本明細書では、自然免疫細胞は、好中球、マクロファージ、単球、好酸球、好塩基球、または樹状細胞として定義し、外来物質に対する炎症反応に関与する可能性がある。自然免疫細胞阻害剤は、本明細書では、自然免疫細胞活性及び／または自然免疫細胞数の低減をもたらす作用物質として定義する。マクロファージ阻害剤は、本明細書では、マクロファージ活性及び／またはマクロファージ数の低減をもたらす作用物質として定義する。「マクロファージ」は、本明細書では、食作用と呼ばれるプロセスにおいて細胞デブリ、外来物質、微生物、及び癌細胞を貪食して消化する自然免疫細胞として理解される。好ましくは、本発明の自然免疫細胞阻害剤またはマクロファージ阻害剤は、処置前の自然免疫細胞またはマクロファージの初期の数または活性と比較して、自然免疫細胞またはマクロファージの数または活性の少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５％または好ましくは１００％の減少をもたらす。自然免疫細胞またはマクロファージの活性及び／または数は、当業者に公知の任意の好適なアッセイ、例えば限定されないが、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３１（１９９０）１６５−１７２）に記載されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏでマクロファージ細胞傷害活性を試験するためのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色アッセイによって、サイトカインレベル（例えば、ＣＣＬ２、ＴＮＦ）の測定によって、組織学的及び組織化学的検出方法によって、例えばＣＤ６８標識によって、またはＹｉ−Ｘｉａｎｇ  Ｊ．Ｗａｎｇ（Ｑｕａｎｔ．Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｅｄ  Ｓｕｒｇ（２０１１）１：３５−４０）によって概説されている、好ましくはＳＰＩＯの静脈内投与後の、マクロファージによる超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）取り込みのｉｎ  ｖｉｖｏでの磁気共鳴画像（ＭＲＩ）検出によって、検出することができる。検出は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかであり得る。好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏ検出は、動物モデル、好ましくはラットまたはマウスモデルにおけるものである。
【００７２】
好ましくは、免疫抑制剤は、グルココルチコイド及び／またはビスホスホネート、好ましくはリポソームビスホスホネートである。グルココルトコイドの特定の非限定的な例は、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン及びアルドステロンである。好ましくは、免疫抑制剤は、トリアムシノロンである。ビスホスホネートの特定の非限定的な例は、エチドロネート、クロドロンテ、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート及びゾレドロネートである。好ましくは、ビスホスホネートは、リポソーム封入ビスホスホネートまたはリポソームビスホスホネート、好ましくはリポソームクロドロネートである。好ましくは、グルココルチコイドはデキサメタゾンではない。本発明の炎症性またはマクロファージ阻害剤は、グルココルチコイド及び／またはビスホスホネートに限定されないことが理解されたい。例えば、本発明の炎症性またはマクロファージ阻害剤は、炎症性またはマクロファージ枯渇抗体、例えば抗Ｆ４／８０抗体であることもできる。好ましくは、このような抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。本発明で使用されるさらなる関連免疫抑制剤は、細胞分裂阻害薬（例えば、アルキル化剤及び／または代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート）、プリン作動性シグナル伝達経路を修飾する薬剤（例えば、メトトレキサート、アデノシン類似体、アデノシン受容体アンタゴニストまたはアゴニスト）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、ジクロフェナク、メロキシカム、ナプロキセン、アセチルサリチル酸）、生物学的製剤、例えばＴＮＦブロッカー（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ）、ＩＬ−６ブロッカー（例えば、トシリズマブ）、ＩＬ−２ブロッカー（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ＩＬ−１βブロッカー（例えば、アナキンラ、リロナセプト、カナキヌマブ）、ＩＬ−１７（セクキヌマブ、ブロダルマブ、イキセキヌマブ）、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３（ウステキヌマブ）、ＰＤＥ４阻害剤（アプレミラスト）ムロモナブ、アバタセプト、及び／もしくはリツキシマブ、ならびに／または他の化合物、例えばヒドロキシクロロキン、クロロキン、レフルノミド、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、金塩、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン／シロリムス、エベロリムス）及びペニシラミンである。
【００７３】
好ましくは、ｒＡＡＶ組成物及び／または空キャプシドを含む組成物及び／または免疫抑制剤を含む組成物は、本明細書の他の箇所で定義するような医薬的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／または賦形剤をさらに含む。
【００７４】
好ましくは、本発明に従う遺伝子治療は、ｒＡＡＶ組成物内に存在するか、または分離した別個の組成物に含まれる、すなわちｒＡＡＶ組成物とは分離し別個である、本明細書に定義するような免疫抑制剤の投与をさらに含む。投与時に、本発明のｒＡＡＶ組成物及び／または空キャプシド及び／または免疫抑制剤は、個体、前記個体の細胞、組織または臓器、好ましくは本明細書に定義するような状態または疾患に罹患している個体に送達される。好ましくは、ｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤は、同時に投与される。同時投与は、本明細書では、多かれ少なかれ同時に、好ましくは１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、１２時間または２４時間以上時間が離れない、好ましくは１５分以上時間が離れない、投与として理解されたい。別の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤は、連続して投与され、好ましくは、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶ組成物の前に投与される。好ましくは、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶ組成物の投与の少なくとも１時間、３時間、１２時間、２４時間、２日、４日または１週間前に投与される。ｒＡＡＶビリオン及び空キャプシドが分離した組成物内に存在する場合、免疫抑制剤は同時に、または空キャプシドの少なくとも１５分、１時間、２時間、３時間、１日、２日もしくは１週間前に投与され得、空キャプシドは同様に、同時に、またはｒＡＡＶビリオンの少なくとも１５分、１時間、２時間、３時間、１日、２日もしくは３日前に投与される。
【００７５】
本明細書に定義する実施形態内では、免疫抑制剤は、繰り返して、すなわち、ｒＡＡＶ組成物の前及び／またはこれと同時に投与され得る。本明細書で上記に示したように、好ましくは、ｒＡＡＶ組成物は、有意な量の空キャプシドを含む。さらに、本発明は、ｒＡＡＶ導入遺伝子ベクター及び空キャプシドの両方を、分離した、別個の組成物にて投与することを包含し、それらは、本発明の方法または使用において同時にまたは連続的に投与され得る。分離した組成物に含まれる場合、ｒＡＡＶ導入遺伝子ベクター及び空キャプシドは、好ましくは同時に投与される。さらなる実施形態では、空キャプシドは、ｒＡＡＶ導入遺伝子ベクター投与の、最大で３日、２日、１日、２４時間、１２時間、３時間、２時間、１時間、３０分、１５分または５分、好ましくは最大で２４時間前に投与される。さらに、分離した組成物に含まれる場合、ｒＡＡＶ導入遺伝子ベクター及び空キャプシドは、好ましくは同じ部位にて投与される。
【００７６】
免疫抑制剤の用量は、免疫抑制剤の種類に依存する。有効な投与量は当業者に公知である。トリアムシノロンの好ましい治療上有効な投与量は上記に示されている。リポソームクロドロネートの好ましい治療上有効な投与量は、好ましくは当業者に公知の治療有効量、例えば、好ましくは８０〜３２０ｍｇ／関節内用量、より好ましくは１６０ｍｇ／関節内用量である（Ｂａｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ｖｏｌ  ４３（９），ｐ１９５１−１９５９）。
【００７７】
一般に、関節障害は関節症と呼ばれ、１つまたは複数の関節の炎症を伴う場合、その障害は関節炎と呼ばれる。大半の関節障害は関節炎を伴うが、しかしながら、体の外傷を原因とする関節の損傷は、典型的には、関節炎と呼ばない。本明細書で使用する場合、「関節炎疾患」という用語は、「関節炎」とも称され、本明細書では、１つまたは複数の関節の炎症を伴う関節障害の形態として定義する。現在、百を超えるさまざまな形態の関節炎があると推定されている。関節炎疾患は、本明細書では、「関節痛」または「関節疾患」を指すと理解される。好ましい実施形態では、関節炎疾患は、成人発症スティル病、強直性脊椎炎、関節炎、腰痛、ベーチェット病、鈍的外傷、滑液包炎、ピロリン酸カルシウム沈着症（ＣＰＰＤ）、手根管症候群、軟骨軟化症膝蓋骨、慢性疲労症候群、複合性局所疼痛症候群、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、変性椎間板疾患、股関節の発達異形成、エーラース−ダンロス、家族性地中海熱、線維筋痛症、第五病、巨細胞性動脈炎、痛風、ヘモクロマトーシス、感染性関節炎、炎症性関節炎、炎症性腸疾患、関節置換術、若年性関節炎、若年性皮膚筋炎（ＪＤ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、若年性関節リウマチ、若年性強皮症、川崎病、ループス、小児及び１０代におけるループス、ライム病、混合性結合組織病、筋炎（多発性筋炎、皮膚筋炎を含む）、変形性関節症（ＯＡ）、骨粗しょう症、パジェット、パリンドロームリウマチ、膝蓋大腿痛症候群、小児リウマチ性疾患、小児ＳＬＥ、リウマチ性多発筋痛症、偽痛風、乾癬性関節炎、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、リウマチ熱、リウマチ、関節リウマチ、強皮症、敗血症性関節炎、シェーグレン病、脊柱管狭窄症、脊椎関節炎、スティル病、全身若年性特発性関節炎、全身性ループスエリテマトーデス、小児及び１０代における全身性ループスエリテマトーデス、全身性硬化症、側頭動脈炎、腱炎、血管炎、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態では、関節炎疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、痛風、偽痛風、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、敗血症性関節炎、関節炎、若年性特発性関節炎、鈍的外傷、関節置換術、スティル病からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、関節炎疾患は、１つまたは複数の関節の炎症を伴う関節障害である。好ましくは、関節炎疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、変形性関節症（ＯＡ）、痛風、偽痛風、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、敗血症性関節炎、関節炎、若年性特発性関節炎、及びスティル病からなる群から選択される。
【００７８】
あるいは、または別の実施形態と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい実施形態では、ｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶ組成物は、全身及び／または局所投与される。本発明のｒＡＡＶ組成物及び／または空キャプシド及び／または免疫抑制剤は、当該技術分野で公知の好適な手段を使用して直接または間接的に投与されてよい。本発明の方法及び使用は、ｒＡＡＶ組成物及び／または空ベクター及び／または免疫抑制剤の、全身、局在もしくは局所、または任意の経路による、例えば、注射、注入、経口（例えば、摂取または吸入）、もしくは局所性（例えば、経皮）による送達及び投与を含む。例示的な投与及び送達経路には、静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、筋肉内、非経口、皮下、胸膜内、局所、皮膚、皮内、経皮、非経口的、例えば、経粘膜、頭蓋内、脊髄内、経口（栄養）、粘膜、呼吸、鼻腔内、挿管、肺内、肺内注入、バッカル、舌下、血管内、髄腔内、体腔内、イオン導入、眼内、眼科的、光学的、腺内、臓器内、リンパ管内が含まれる。個体または前記個体の細胞、組織、臓器に、本発明のｒＡＡＶ組成物及び／または空キャプシド及び／または免疫抑制剤を提供するための手段における改善は、これまでにすでに達成された進展を考慮して予想される。当然、そのような将来の改善を組み込んで、本発明に記載の効果を達成してよい。本発明のｒＡＡＶ組成物及び／または空キャプシド及び／または免疫抑制剤を投与するとき、このような組み合わせ及び／または組成物は、送達方法に適合する溶液中に溶解することが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、関節内及び／または脳室内投与に関しては、溶液が生理食塩水であることが好ましい。免疫抑制剤が本発明のｒＡＡＶ組成物内に存在する場合、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶ組成物と同じ部位にて、すなわち、好ましくは上記に示すように局所性に投与される。免疫抑制剤がｒＡＡＶ組成物とは異なる別個の組成物内に含まれる実施形態では、免疫抑制剤は全身性に、好ましくは筋肉内または静脈内に投与され得る。ｒＡＡＶ組成物はまた、局所性に、好ましくは本明細書に定義するようなマクロファージの実質的な数を含む身体の部位にて投与され得、免疫抑制剤は全身性に、好ましくは筋肉内または静脈内に投与される。また、本発明は、免疫抑制剤及びｒＡＡＶ組成物が、別個の組成物内に存在する場合であっても、同じ部位にて、好ましくは局所性に、より好ましくは関節内に投与される実施形態も包含する。本明細書でさらに示されるように、そのような別個の組成物の投与は、同時または連続的のいずれかであってよい。本発明の好ましい実施形態では、ｒＡＡＶ組成物及び免疫抑制剤のうちの少なくとも１つは、局所投与される。より好ましくは、局所投与は、関節内投与である。「関節内注射」（「関節注射」または「関節内注射」としても知られる）は、本明細書では、関節への注射または注入として定義する。関節内注射は、典型的には、炎症を患う関節への抗炎症剤の投与に使用される。
【００７９】
さらなる態様では、本発明は、本発明のｒＡＡＶビリオンならびに医薬的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤及び／または賦形剤、好ましくは本明細書に定義するような医薬的に許容可能な担体を含むｒＡＡＶ組成物に関する。好ましい実施形態では、組成物は、本明細書に定義するような空キャプシド及び／または本明細書に定義するような免疫抑制剤を、さらに含む。
【００８０】
さらなる態様では、本発明は、関節炎疾患に関連する症状を処置する、予防する、または抑制する方法に関し、該方法は、有効量の請求項１〜８のいずれか一項に定義するようなｒＡＡＶビリオンまたは上記に定義するようなｒＡＡＶ組成物を含む医薬品の関節内投与のステップを含む。
【００８１】
「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量及び期間にて有効な量を指す。治療有効量の核酸、核酸構築物、ｒＡＡＶビリオンまたは医薬組成物は、処置される対象の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに核酸、核酸構築物、ｒＡＡＶビリオン、または医薬組成物が対象において所望の応答を誘発するための能力などの要因によって変動し得る。最適な治療応答をもたらすように、投与レジメンを調整してよい。治療有効量はまた、典型的に、核酸、核酸構築物、ｒＡＡＶビリオン、または医薬組成物の任意の毒性または有害効果を、治療上有益な効果が上回る量である。「予防有効量」は、所望の予防結果、例えば様々な状態の予防または阻害を達成するために必要な投与量及び期間にて有効な量を指す。予防用量は、疾患の発症前または初期にある対象において使用されてよく、予防有効量は、場合によっては治療有効量より多くても少なくてもよい。投与される投与量は、処置される対象の状態及びサイズ、ならびに治療製剤、処置の頻度及び投与経路に大きく依存し得る。用量、製剤、及び頻度を含む継続療法のレジメンは、初期応答及び臨床判断によって導かれ得る。
【００８２】
「対象」または「患者」という用語は、本明細書では互換可能に使用され、本発明の組成物及び／またはｒＡＡＶを用いて処置可能な、ヒト種を含む、動物を指す。従って、「対象」または「患者」という用語には、ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、及び他の類人猿及びサル種、または任意の哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウシなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、本発明に従うｒＡＡＶを用いて処置される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒト、イヌ、ネコまたはウマ、最も好ましくはヒトである。
【００８３】
本明細書及びその請求項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用形は、非限定的な意味で使用され、この語の後に記載される事項を含むが、具体的に言及されない事項が除外されるわけではないことを意味する。加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、要素が１つ及び１つのみ存在することを文脈が明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。ゆえに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００８４】
「およそ」または「約」という語は、数値に伴って使用されるとき（およそ１０、約１０）、好ましくは、その値が、所定の値１０より、１０％多いまたは少ない値であり得ることを意味する。
【００８５】
本明細書内で引用される全ての特許及び参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８６】
以下の実施例は、例証目的で提示されるにすぎず、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００８７】
本発明を、添付の図面を参照して、以下により詳細に考察する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＦＬＳ細胞でのキャプシド血清型のスクリーニング。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現する７種の突然変異キャプシド血清型（及びＡＡＶ５）を含有する粗溶解物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または（それぞれ異なるＲＡ患者に由来する）３種の異なるＦＬＳ細胞株を形質導入した。７２時間後（ＨＥＫ２９３Ｔ）または６日後（ＦＬＳ）、細胞を、フローサイトメトリーにより、ＹＦＰを発現している細胞の割合（％）に関してアッセイした。試料の凡例を、表２に示す。パネルＡは、ＹＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の割合（％）を示す。
【図１Ｂ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＦＬＳ細胞でのキャプシド血清型のスクリーニング。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現する７種の突然変異キャプシド血清型（及びＡＡＶ５）を含有する粗溶解物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または（それぞれ異なるＲＡ患者に由来する）３種の異なるＦＬＳ細胞株を形質導入した。７２時間後（ＨＥＫ２９３Ｔ）または６日後（ＦＬＳ）、細胞を、フローサイトメトリーにより、ＹＦＰを発現している細胞の割合（％）に関してアッセイした。試料の凡例を、表２に示す。パネルＢは、３種の異なるＦＬＳ細胞株におけるＹＦＰ発現細胞の割合（％）を示す。
【図１Ｃ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＦＬＳ細胞でのキャプシド血清型のスクリーニング。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現する７種の突然変異キャプシド血清型（及びＡＡＶ５）を含有する粗溶解物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または（それぞれ異なるＲＡ患者に由来する）３種の異なるＦＬＳ細胞株を形質導入した。７２時間後（ＨＥＫ２９３Ｔ）または６日後（ＦＬＳ）、細胞を、フローサイトメトリーにより、ＹＦＰを発現している細胞の割合（％）に関してアッセイした。試料の凡例を、表２に示す。パネルＣは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図１Ｄ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＦＬＳ細胞でのキャプシド血清型のスクリーニング。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現する７種の突然変異キャプシド血清型（及びＡＡＶ５）を含有する粗溶解物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または（それぞれ異なるＲＡ患者に由来する）３種の異なるＦＬＳ細胞株を形質導入した。７２時間後（ＨＥＫ２９３Ｔ）または６日後（ＦＬＳ）、細胞を、フローサイトメトリーにより、ＹＦＰを発現している細胞の割合（％）に関してアッセイした。試料の凡例を、表２に示す。パネルＤは、３種の異なるＦＬＳ細胞株（全ての細胞）におけるＭＦＩを示す。
【図１Ｅ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＦＬＳ細胞でのキャプシド血清型のスクリーニング。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現する７種の突然変異キャプシド血清型（及びＡＡＶ５）を含有する粗溶解物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または（それぞれ異なるＲＡ患者に由来する）３種の異なるＦＬＳ細胞株を形質導入した。７２時間後（ＨＥＫ２９３Ｔ）または６日後（ＦＬＳ）、細胞を、フローサイトメトリーにより、ＹＦＰを発現している細胞の割合（％）に関してアッセイした。試料の凡例を、表２に示す。パネルＥは、３種の異なるＦＬＳ細胞株（陽性集団のみ）におけるＭＦＩを示す。
【図２Ａ】キャプシド突然変異体は、ＦＬＳ細胞においてｗｔＡＡＶ５に対してルシフェラーゼ発現の増加を示す。ＹＦＰ−Ｌｕｃ融合タンパク質を発現する精製ＡＡＶ（４種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を使用して、異なるＲＡ患者に由来する３種の異なるＦＬＳ細胞株：ＢＢ５４９８（ＦＬＳ１）、ＢＢ５５４０（ＦＬＳ２）及びＢＢ７１４４（ＦＬＳ３）を、２つのＭＯＩ（２００００または１０００００ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して形質導入した。４日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現を測定した。データは、絶対ルシフェラーゼ発現値（ＲＬＵ；白色棒）またはＡＡＶ５に対する増加倍数（黒色棒）として表示する。空白の棒は、ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＡは、ＭＯＩ２０ＫでのＦＬＳ１を示す。
【図２Ｂ】キャプシド突然変異体は、ＦＬＳ細胞においてｗｔＡＡＶ５に対してルシフェラーゼ発現の増加を示す。ＹＦＰ−Ｌｕｃ融合タンパク質を発現する精製ＡＡＶ（４種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を使用して、異なるＲＡ患者に由来する３種の異なるＦＬＳ細胞株：ＢＢ５４９８（ＦＬＳ１）、ＢＢ５５４０（ＦＬＳ２）及びＢＢ７１４４（ＦＬＳ３）を、２つのＭＯＩ（２００００または１０００００ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して形質導入した。４日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現を測定した。データは、絶対ルシフェラーゼ発現値（ＲＬＵ；白色棒）またはＡＡＶ５に対する増加倍数（黒色棒）として表示する。空白の棒は、ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＢは、ＭＯＩ１００ＫでのＦＬＳ１を示す。
【図２Ｃ】キャプシド突然変異体は、ＦＬＳ細胞においてｗｔＡＡＶ５に対してルシフェラーゼ発現の増加を示す。ＹＦＰ−Ｌｕｃ融合タンパク質を発現する精製ＡＡＶ（４種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を使用して、異なるＲＡ患者に由来する３種の異なるＦＬＳ細胞株：ＢＢ５４９８（ＦＬＳ１）、ＢＢ５５４０（ＦＬＳ２）及びＢＢ７１４４（ＦＬＳ３）を、２つのＭＯＩ（２００００または１０００００ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して形質導入した。４日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現を測定した。データは、絶対ルシフェラーゼ発現値（ＲＬＵ；白色棒）またはＡＡＶ５に対する増加倍数（黒色棒）として表示する。空白の棒は、ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＣは、ＭＯＩ２０ＫでのＦＬＳ２を示す。
【図２Ｄ】キャプシド突然変異体は、ＦＬＳ細胞においてｗｔＡＡＶ５に対してルシフェラーゼ発現の増加を示す。ＹＦＰ−Ｌｕｃ融合タンパク質を発現する精製ＡＡＶ（４種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を使用して、異なるＲＡ患者に由来する３種の異なるＦＬＳ細胞株：ＢＢ５４９８（ＦＬＳ１）、ＢＢ５５４０（ＦＬＳ２）及びＢＢ７１４４（ＦＬＳ３）を、２つのＭＯＩ（２００００または１０００００ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して形質導入した。４日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現を測定した。データは、絶対ルシフェラーゼ発現値（ＲＬＵ；白色棒）またはＡＡＶ５に対する増加倍数（黒色棒）として表示する。空白の棒は、ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＤは、ＭＯＩ１００ＫでのＦＬＳ２を示す。
【図２Ｅ】キャプシド突然変異体は、ＦＬＳ細胞においてｗｔＡＡＶ５に対してルシフェラーゼ発現の増加を示す。ＹＦＰ−Ｌｕｃ融合タンパク質を発現する精製ＡＡＶ（４種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を使用して、異なるＲＡ患者に由来する３種の異なるＦＬＳ細胞株：ＢＢ５４９８（ＦＬＳ１）、ＢＢ５５４０（ＦＬＳ２）及びＢＢ７１４４（ＦＬＳ３）を、２つのＭＯＩ（２００００または１０００００ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して形質導入した。４日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現を測定した。データは、絶対ルシフェラーゼ発現値（ＲＬＵ；白色棒）またはＡＡＶ５に対する増加倍数（黒色棒）として表示する。空白の棒は、ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＥは、ＭＯＩ２０ＫでのＦＬＳ３を示す。
【図２Ｆ】キャプシド突然変異体は、ＦＬＳ細胞においてｗｔＡＡＶ５に対してルシフェラーゼ発現の増加を示す。ＹＦＰ−Ｌｕｃ融合タンパク質を発現する精製ＡＡＶ（４種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を使用して、異なるＲＡ患者に由来する３種の異なるＦＬＳ細胞株：ＢＢ５４９８（ＦＬＳ１）、ＢＢ５５４０（ＦＬＳ２）及びＢＢ７１４４（ＦＬＳ３）を、２つのＭＯＩ（２００００または１０００００ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して形質導入した。４日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現を測定した。データは、絶対ルシフェラーゼ発現値（ＲＬＵ；白色棒）またはＡＡＶ５に対する増加倍数（黒色棒）として表示する。空白の棒は、ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＦは、ＭＯＩ１００ＫでのＦＬＳ３を示す。
【図２Ｇ】異なる実験では、ＲＡ患者に由来する３種の追加のＦＬＳ細胞株：ＢＢ４３０８（ＦＬＳ４）、ＢＸ１５９２（ＦＬＳ５）、ＢＢ４４２６（ＦＬＳ６）を、ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ（７種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を用いて、２つのＭＯＩ（１０Ｋまたは１００Ｋ  ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して、形質導入した。空白の棒は、ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＧは、ＭＯＩ１０ＫでのＦＬＳ４を示す。
【図２Ｈ】異なる実験では、ＲＡ患者に由来する３種の追加のＦＬＳ細胞株：ＢＢ４３０８（ＦＬＳ４）、ＢＸ１５９２（ＦＬＳ５）、ＢＢ４４２６（ＦＬＳ６）を、ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ（７種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を用いて、２つのＭＯＩ（１０Ｋまたは１００Ｋ  ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して、形質導入した。空白の棒は、ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＨは、ＭＯＩ１００ＫでのＦＬＳ４を示す。
【図２Ｉ】異なる実験では、ＲＡ患者に由来する３種の追加のＦＬＳ細胞株：ＢＢ４３０８（ＦＬＳ４）、ＢＸ１５９２（ＦＬＳ５）、ＢＢ４４２６（ＦＬＳ６）を、ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ（７種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を用いて、２つのＭＯＩ（１０Ｋまたは１００Ｋ  ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して、形質導入した。空白の棒は、ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＩは、ＭＯＩ１０ＫでのＦＬＳ５を示す。
【図２Ｊ】異なる実験では、ＲＡ患者に由来する３種の追加のＦＬＳ細胞株：ＢＢ４３０８（ＦＬＳ４）、ＢＸ１５９２（ＦＬＳ５）、ＢＢ４４２６（ＦＬＳ６）を、ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ（７種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を用いて、２つのＭＯＩ（１０Ｋまたは１００Ｋ  ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して、形質導入した。空白の棒は、ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＪは、ＭＯＩ１００ＫでのＦＬＳ５を示す。
【図２Ｋ】異なる実験では、ＲＡ患者に由来する３種の追加のＦＬＳ細胞株：ＢＢ４３０８（ＦＬＳ４）、ＢＸ１５９２（ＦＬＳ５）、ＢＢ４４２６（ＦＬＳ６）を、ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ（７種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を用いて、２つのＭＯＩ（１０Ｋまたは１００Ｋ  ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して、形質導入した。空白の棒は、ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＫは、ＭＯＩ１０ＫでのＦＬＳ６を示す。
【図２Ｌ】異なる実験では、ＲＡ患者に由来する３種の追加のＦＬＳ細胞株：ＢＢ４３０８（ＦＬＳ４）、ＢＸ１５９２（ＦＬＳ５）、ＢＢ４４２６（ＦＬＳ６）を、ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ（７種の突然変異血清型またはＡＡＶ５）を用いて、２つのＭＯＩ（１０Ｋまたは１００Ｋ  ｒＡＡＶ粒子／細胞）を使用して、形質導入した。空白の棒は、ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。パネルＬは、ＭＯＩ１００ＫでのＦＬＳ３を示す。
【図２Ｍ】７種の突然変異血清型またはＡＡＶ５（ＭＯＩ１００Ｋ）の形質導入有効性をＨＥＫ２９３Ｔ細胞においても評価した。空白の棒は、ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示し、塗りつぶされた棒は、ＡＡＶ５に対する「増加倍数」を示す。
【図３Ａ】キャプシド突然変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子発現の増加を呈する。２種のキャプシド突然変異体（ＡＡＶ９−Ａ２及びＡＡＶ７−Ａ６）を、疑似滑膜腔モデルを使用してｗｔＡＡＶ５と比較した。ルシフェラーゼ発現ベクターを空気嚢形成後０日目に投与し、ルシフェラーゼ発現を形質導入後３日目にライブ動物のイメージング（ＩＶＩＳ）により測定した。示されているデータは、平均＋ＳＥＭでの空気嚢におけるルミネセンス（フォトン／秒／平方センチメートルｍ２／ステラジアン）である。
【図３Ｂ】第二の実験では、５種の選択したキャプシド突然変異体（ＡＡＶ１−Ｐ４、ＡＡＶ７−Ａ６、ＡＡＶ９−Ａ２、ＡＡＶｒｈ１０−Ａ２、ＡＡＶｒｈ１０−Ａ６）及びｗｔＡＡＶ５をマウスの膝関節に注入した。ルシフェラーゼ発現ベクターを０日目に注射し、投与後、指定の時点にてライブイメージング（ＩＶＩＳ）により発現を測定した。示されているデータは、平均＋ＳＥＭでのルミネセンス（フォトン／秒／平方センチメートルｍ２／ステラジアン）（左パネル）である。１４日目でｗｔＡＡＶ５に対して＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００１。
【図３Ｃ】ｗｔＡＡＶ５に対する増加倍数。
【図４】ＭＡＦＦＴ  ＦＦＴ−ＮＳ−Ｉ（ｖ７．２１５）によるＣＬＵＳＴＡＬ形式のアライメント。アライメントの下には、保存された残基（＊）、及び非保存的な突然変異（  ）を示すキーがある。
【図５】ＭＵＳＣＬＥ（３．８）によるＣＬＵＳＴＡＬマルチプル配列アライメント。アライメントの下には、保存された残基（＊）、保存的な突然変異（：）、半保存的な突然変異（．）、及び非保存的な突然変異（  ）を示すキーがある。
【図６】ＭＡＦＦＴ  ＦＦＴ−ＮＳ−Ｉ（ｖ７．２１５）によるインサートＰ４、Ａ２、Ａ６、Ｐ２、及びＱＲ−Ｐ２（配列番号８〜１２）のＣＬＵＳＴＡＬ形式のアライメント。アライメントの下には、保存された残基（＊）、及び非保存的な突然変異（  ）を示すキーがある。
【図７】ＭＵＳＣＬＥ（３．８）によるインサートＰ４、Ａ２、Ａ６、Ｐ２及びＱＲ−Ｐ２（配列番号８〜１２）のＣＬＵＳＴＡＬマルチプル配列アライメント。アライメントの下には、保存された残基（＊）、及び非保存的な突然変異（  ）を示すキーがある。
【００８９】
配列表
表１は、配列番号と相関させた配列参照の説明を提供する。
【００９０】
【表１】
2021510528.tif 000002
【実施例】
【００９１】
実施例１
キャプシドライブラリーの初期スクリーニング
１．１．材料及び方法
９１の異なるＡＡＶキャプシド血清型からのＡＡＶを含有する粗溶解物がスポットされた（その後乾燥された）９６ウェルプレートを、ハイデルベルク大学のＤｉｒｋ  Ｇｒｉｍｍ及びＫａｔｈｌｅｅｎ  Ｂｏｒｎｅｒから入手した。各ベクターは、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＹＦＰ導入遺伝子をコードした。ＦＬＳが関節における主要な標的細胞であるため、（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓａｎｄｅ  ＭＧ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７０：４２３−４２７にて説明されている通りに）関節リウマチ患者（ＲＡ−ＦＬＳ）の関節から単離されたヒトＦＬＳにおいて発現の増加を示す血清型について、ＡＡＶキャプシド突然変異体ライブラリーをスクリーニングした。ＲＡ−ＦＬＳを、スポットされたプレート（ＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号３１９６６−０２１）、１０％ＦＢＳ（熱非働化（ＨＩ）ウシ血清ゴールド、Ｇｉｂｃｏ、参照番号Ａ１５−１５１）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号１５６３０−０５６）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、参照番号１５７１０−０４９）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、参照番号Ｐ０７８１）上に直接プレーティングし（２５００／ウェル、３７℃／５％ＣＯ２）、全てのウェルを、６日後に蛍光顕微鏡によりＹＦＰ発現に関して可視化した。
【００９２】
１．２．結果
ＲＡ患者由来のＦＬＳにおけるキャプシド突然変異体対ＷＴ−ＡＡＶ５の形質導入有効性。
９１キャプシド突然変異体のスクリーニングにおいて、全体的な発現レベルは低かったが、本発明者らは、ｗｔＡＡＶ５よりも高い発現を示す７種の異なる血清型を同定した：ＡＡＶ９−Ａ２、ＡＡＶ７−Ａ６、ＡＡＶ１−Ｐ４、ＡＡＶＤＪ−ＱＲ−Ｐ２、ＡＡＶｒｈ１０−Ａ６、ＡＡＶｒｈ１０−Ａ２及びＡＡＶ２−Ｐ２（アミノ酸配列配列番号１〜７、ｗｔＡＡＶ５配列番号１９）。
【００９３】
７種のベクター全ての粗溶解物を、３種の異なる患者ＦＬＳ細胞株及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイにて使用した（実施例２）。
【００９４】
【表２】
2021510528.tif 000003
【００９５】
実施例２
７種の選択した突然変異体の粗溶解物の発現
２．１．材料及び方法
ＡＡＶ産生
粗ＡＡＶ溶解物の生産に関する詳細は、Ｇｒｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，２０１７，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１１９８−１７）に見出すことができる。
【００９６】
選択した７種のキャプシド突然変異体（及び対照としてｗｔＡＡＶ５）のそれぞれの粗溶解物のアリコートを使用して、細胞（ＨＥＫ２９３ＴまたはＲＡ患者から単離した３種の異なるＦＬＳ細胞株）を形質導入し、ＹＦＰ発現をフローサイトメトリーにより、形質導入の３日（ＨＥＫ２９３Ｔ）〜５日（ＦＬＳ）後に測定した。詳細には、ＨＥＫ２９３Ｔを、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、参照番号６５５１８０）に４５０００個の細胞／ウェルにて播種した。ＲＡ−ＦＬＳは、９６ウェルプレートに２５００個の細胞／ウェルにて播種した。一晩インキュベーションした後、細胞上清を、０．００１％プルロニックＦ６８溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５５５６）を含有する４０μｌ  ＤＭＥＭ−ｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ３１９６６−０２１）で置き換えた。ウイルス溶解物を、二重で、１０μｌ／ウェルで加えた。４時間後、ＦＢＳ（熱非働化（ＨＩ）ウシ血清ゴールド、Ｇｉｂｃｏ、参照番号Ａ１５−１５１）、最終濃度１％）を含有するＤＭＥＭ−ｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ中のドキソルビシン（最終濃度０．４μＭ）（Ｓｉｇｍａ  Ｄ１５１５）を、ウェルに加えた（５０μｌ／ウェル）。翌日、ＦＬＳの培地を除去し、ＤＭＥＭ−ｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（１０％ＦＢＳ（熱非働化（ＨＩ）ウシ血清ゴールド、Ｇｉｂｃｏ、参照番号Ａ１５−１５１））、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号１５６３０）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ参照番号１５７１０−０４９）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、参照番号Ｐ０７８１））を加えた（２００μｌ／ウェル）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培地は変更しなかった。形質導入の３日（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）または６日（ＦＬＳ）後、細胞を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号１００１０）中０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ参照番号１５４００−０５４）を使用してトリプシン処理し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＹＦＰ発現に関して分析した。全ての細胞に関する発現細胞の割合（％）及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）の両方を決定した。
【００９７】
２．２．結果
７種のベクター全ての粗溶解物を、３種の異なる患者ＦＬＳ細胞株及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイにて使用した。蛍光顕微鏡法（データは示さず）またはフローサイトメトリー（図１パネルＡ〜Ｅ）により、ＹＦＰを発現する細胞の割合（％）に関して細胞をアッセイした。細胞型間でいくらか変動したが、全ての突然変異キャプシドは、ＡＡＶ５−ＷＴよりも、ＦＬＳ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方において高い発現を示した（図１）。表２は、図１の試料凡例を提供する。これらの結果に基づき、４種のキャプシド突然変異体をさらなる調査のために選択した（実施例３を参照されたい）。
【００９８】
実施例３
ＨＥＫ２９３Ｔ及びＦＬＳにおけるキャプシド変異体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
３．１材料及び方法
３．１．１  ４種の突然変異キャプシドタンパク質、ＡＡＶ９−Ａ２、ＡＡＶ７−Ａ６、ＡＡＶ１−Ｐ４、及びＡＡＶＤＪ−ＱＲ−Ｐ２をさらに調査した。（可視化（ＹＦＰ）ならびにルシフェラーゼアッセイによる定量化を可能にするために）ＹＦＰ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現する精製されたベクター（イオジキサノール勾配）を生成した。（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓａｎｄｅ  ＭＧ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７０：４２３−４２７に記載される通りに）関節リウマチ患者から単離された３種の異なる初代ＦＬＳ株を、各血清型を用いて、２つのベクター用量（ＭＯＩ２０，０００または１００，０００）にて形質導入し、４日後、細胞を回収し、遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイキット）により定量化した。
【００９９】
詳細には、ＲＡ−ＦＬＳを、培地（ＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ参照番号３１９６６−０２１）、１０％ＦＢＳ（熱非働化（ＨＩ）ウシ血清ゴールド、参照番号Ａ１５−１５１）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ参照番号１５６３０−０５６）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、参照番号１５７１０−０４９）、１００ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍｅｒｃｋ参照番号Ｐ０７８１）中、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、参照番号６５５２０７）に２５００個の細胞／ウェルにてプレーティングした。４８時間後、培地を除去し、（０．００１％プルロニック−６８溶液（Ｓｉｇｍａ参照番号ｐ５５５６）を含有するＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ中）ウイルスを、２０，０００または１００，０００のＭＯＩにて加えた。４時間後、ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｄ１５１５、最終濃度０．４μＭ）及びＦＢＳ（最終濃度１％）を含有する培地を加えた。
【０１００】
２４時間後、培地を、ＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１００ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で置き換えた。形質導入の４日後、細胞を、１００μｌ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号１００１０）を用いて１回洗浄し、ルシフェラーゼ活性を、ＯＮＥ  Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照番号Ｅ６１１０）を使用して決定した。１００μｌの溶解バッファーを加え、細胞を室温にて９００ｒｐｍで１０分間、撹拌機上に置いた。続いて、２０μｌの溶解物を、白色９６ウェルプレートに移し、８０μｌの基質を（３分間（暗所）で加え、ルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した（１秒／ウェル、ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ、Ｂｉｏｔｅｋ）。
【０１０１】
３．１．２．同様の実験では、関節リウマチ患者から単離された３種の追加のＦＬＳ細胞株を、ルシフェラーゼ遺伝子（ＭＯＩ１０，０００及び１００，０００）を含有する３．１．１（ＡＡＶ９−Ａ２、ＡＡＶ１−Ｐ４、ＡＡＶ７−Ａ６、ＡＡＶＤＪ−ＱＲ−Ｐ２、ＡＡＶｒｈ１０−Ａ６、ＡＡＶｒｈ１０−Ａ２、ＡＡＶ２−Ｐ２）に記載したものとは異なるＡＡＶ調製物からのＡＡＶ５及び７キャプシド突然変異体を用いて形質導入した。空粒子の数は、ＡＡＶ調製物間で異なった。形質導入の有効性に対する影響の可能性を排除するために、空キャプシド補正を、ＡＡＶ５空粒子を追加して、調製物一つあたりの空粒子の割合（％）を等しくすることによって行った。
【０１０２】
３．１．３．３．１．２にて記載したものと同じ調製物からの７種のキャプシド突然変異体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においても試験した。詳細には、ＨＥＫ２９３Ｔを、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、参照番号６５５１８０）に５００００個の細胞／ウェルにて播種した。一晩インキュベーションした後、細胞上清を、０．００１％プルロニックＦ６８溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５５５６）を含有するＤＭＥＭ−ｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ３１９６６−０２１）で置き換えた。さまざまなベクターを、二重で、１００，０００のＭＯＩにて追加した。このプロトコルでは、空キャプシド補正を、３．１．２に記載する通りに行った。４時間後、ＦＢＳ（熱非働化（ＨＩ）ウシ血清ゴールド、Ｇｉｂｃｏ、参照番号Ａ１５−１５１）、最終濃度１％を含有するＤＭＥＭ−ｇｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ中のドキソルビシン（最終濃度０．４μＭ）（Ｓｉｇｍａ  Ｄ１５１５）を、ウェルに加えた。形質導入の３日後、細胞を回収し、遺伝子発現を、ルミノメーター（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイキット）により、定量化した。
【０１０３】
３．２．結果
３．２．１  ３．１．１に記載のプロトコルに従って、４種の突然変異キャプシド（ならびに、同じ様式で作成された、対照としてのＡＡＶ５）のうちの１つを含む組換えＡＡＶを使用して、３種の異なるＦＬＳ細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入を行った。ＡＡＶ５と比較すると、４種の血清型全てが発現レベルの増加を示し、使用した血清型及び細胞株に応じて、２倍から３５倍の範囲で増加した（図２Ａ〜Ｆ）。
【０１０４】
３．２．２  別の一連の実験では、７種の突然変異キャプシド（ならびに、同じ様式で作成された、ＡＡＶ５対照）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入有効性を、３種のＦＬＳ細胞株にて評価した。ＡＡＶ５と比較すると、７種の血清型全てがルシフェラーゼの発現レベルの増加を示し、使用した血清型及び細胞株に応じて、６倍から５５倍の範囲で増加した（図２Ｇ〜Ｌ）。
【０１０５】
３．２．３  同様の実験を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において行った。７種の血清型全てを用いた形質導入は、ｗｔＡＡＶ５と比較して、２倍から１２倍の増加範囲でルシフェラーゼ発現の亢進をもたらした（図２Ｍ）。
【０１０６】
実施例４
疑似滑膜腔モデルでのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
４．１．材料及び方法
動物
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（８〜１０週齢、体重２０〜２５ｇ；（Ｈａｒｌａｎ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を、アムステルダムのアカデミックメディカルセンターの動物施設にて個別の換気ケージに収容した。食餌及び水は、自由に入手可能とした。全ての動物実験は、アムステルダム大学のＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って行われた。
【０１０７】
疑似滑膜腔（ＡＰＳ）モデル
２種の血清型、ＡＡＶ９−Ａ２及びＡＡＶ７−Ａ６を、ｗｔＡＡＶ５に対して比較した。疑似滑膜腔モデルは、Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８１；Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １３４：１４７−１５６）から適応した。０日目に、３ｍｌの空気を、７〜９週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃＯｌａＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ）の背部皮膚内へと皮下注射した（０日目）。空気嚢の形成直後に、１ｍｌの空気を除去し、１ｍｌのＡＡＶ（０．００１％プルロニックＦ６８（Ｓｉｇｍａ、参照番号ｐ５５５６）を含有するＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号１００１０中２ｅ１０ベクターゲノム／マウスを、直接空気嚢内に加えた。形質導入の３日後、遺伝子発現を、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物イメージングにより測定した。
【０１０８】
ルシフェラーゼ発現のイメージング
ルシフェラーゼ発現を３日目に測定した。当初は、ベクター投与後最大３ヶ月間にわたって発現のモニタリングを継続する予定だったが、動物施設がパルボウイルスに感染したため、全ての進行中の実験が早期に終了した。Ｄ−ルシフェリンカリウム塩基質（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、（１５０ｍｇ／ｋｇ体重、およそ２００μｌの容量にて）腹腔内注射した。冷却した電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラシステム（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｉｍａｇｅｒ，Ｂｉｏｓｐａｃｅ  Ｌａｂ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、基質投与の１０分後、５分間、光子計数を獲得し、画像処理ならびにシグナル強度の定量化及び分析を、Ｍ３  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ  Ｌａｂ）を使用して行った。放出された光子の数／秒／平方センチメートル／ステラジアンを、ルシフェラーゼ活性の尺度として計算した。
【０１０９】
一般的な動物条件及び倫理に関する陳述
空気嚢形成、ベクター投与、及びｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、イソフルラン麻酔（３％イソフルラン及び酸素）下で行った。実験の最後に、動物を、イソフルラン麻酔下で心臓穿刺により屍殺し、その後頸椎脱臼を行った。研究は、アムステルダム大学の動物実験委員会（ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって審査及び承認され、オランダの動物福祉法（オランダ語：「Ｗｅｔ  ｏｐ  Ｄｉｅｒｐｒｏｅｖｅｎ」）の推奨事項に厳密に従って実施された。動物は、アムステルダム大学の動物施設において、病原菌の無い条件下で維持された。
【０１１０】
４．２．結果
これらの有望な結果に基づいて、疑似滑膜腔（ＡＰＳ）モデルを使用して、予備的なｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行い、２種の血清型、ＡＡＶ９−Ａ２及びＡＡＶ７−Ａ６を、ｗｔＡＡＶ５に対して比較した。不幸にも動物施設における感染があり、この研究を早期に終了する必要があったため、本発明者らは、単一の時点、ベクター投与３日後からのデータしか得られなかった。この時点で、ＡＡＶ５と比較したとき、キャプシド突然変異体は、遺伝子発現の増加を引き起こしており、ＡＡＶ７−Ａ６は約６倍及びＡＡＶ９−Ａ２は約２２倍の発現増加を示した（図３Ａ）。
【０１１１】
実施例５：
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究：健常動物における関節内注射
５．１．材料及び方法
動物
雄ＤＢＡ１／Ｊマウス（１２週齢、Ｅｎｖｉｇｏ）を、アムステルダムのアカデミックメディカルセンターの動物施設にて個別の換気ケージに収容した。食餌及び水は、自由に入手可能とした。全ての動物実験は、オランダのアムステルダム大学のＣｅｎｔｒａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ＣＣＤ）及びＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認後に行われた。
【０１１２】
発現研究
キャプシド突然変異体を含む５種のｒＡＡＶ、すなわちＡＡＶ９−Ａ２、ＡＡＶ１−Ｐ４、ＡＡＶ７−Ａ６、ＡＡＶｒｈ１０−Ａ６及びＡＡＶｒｈ１０−Ａ２を、ｗｔＡＡＶ５に対して比較した。キャプシドの負荷が発現に影響を与える可能性がある（Ａａｌｂｅｒｓ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１７；２８（２）：１６８−１７８）ため、ｒＡＡＶ調製物を、キャプシドの負荷に関して、ｗｔＡＡＶ５空粒子を追加することによって補正した。健常マウス（ｎ＝９／群）の両膝に、ルシフェラーゼ遺伝子を運ぶＡＡＶベクターを関節内注射した（７．５×１０９ウイルスゲノム／膝）。遺伝子発現を、ベクター投与後のいくつかの時点にてｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって決定した。
【０１１３】
ルシフェラーゼ発現のイメージング
ルシフェラーゼ発現は、指定の時点で決定した（図３Ｂ）。各時点にて、Ｄ−ルシフェリンカリウム塩基質（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、（１５０ｍｇ／ｋｇ体重、およそ２００μｌの容量にて）腹腔内注射した。冷却した電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラシステム（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｉｍａｇｅｒ，Ｂｉｏｓｐａｃｅ  Ｌａｂ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、基質投与の１５分後、５分間、光子計数を獲得した。画像処理ならびにシグナル強度の定量化及び分析を、Ｍ３  Ｖｉｓｉｏｎ  （Ｂｉｏｓｐａｃｅ  Ｌａｂ）を使用して行った。放出された光子の数／秒／平方センチメートル／ステラジアンを、ルシフェラーゼ活性の尺度として計算した。
【０１１４】
一般的な動物条件及び倫理に関する陳述
ベクター投与及びｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、イソフルラン麻酔（４％イソフルラン及び酸素）の下で行った。研究は、オランダの動物福祉法（オランダ語：「Ｗｅｔ  ｏｐ  Ｄｉｅｒｐｒｏｅｖｅｎ」）の推奨事項に厳密に従って実施された。動物は、アムステルダム大学の動物施設において、病原菌の無い条件下で維持された。
【０１１５】
５．２．結果
最初の時点である３日目に、膝におけるＡＡＶ媒介性発現が全ての群において検出され、経時的に増加している（図３Ｂ）。ＡＡＶ１−Ｐ４を除く全てのキャプシド突然変異体は、ｗｔＡＡＶ５と比較して発現の増加を示し、ＡＡＶ９−Ａ２が最も高い発現を示している（１４日目にてｗｔＡＡＶ５に対して約５倍増加）（図３Ｃ）。１４日目の発現レベルは、高低順で：ＡＡＶ９−Ａ２＞ＡＡＶｒｈ１０−Ａ２＞ＡＡＶｒｈ１０−Ａ６＞ＡＡＶ７−Ａ６＞ｗｔＡＡＶ５＞ＡＡＶ１−Ｐ４である。７日目に、ＡＡＶｒｈ１０−Ａ２、ＡＡＶ９−Ａ２及びＡＡＶｒｈ１０−Ａ６が、ｗｔＡＡＶ５と比較して有意に増加した発現を示している（１４日目にてｗｔＡＡＶ５に対して、＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００１）（図３Ｂ）。
【０１１６】
実施例６：
ヒト血清におけるキャプシド突然変異体に対する中和抗体力価の決定
６．１  材料及び方法
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェル透明底プレート中９％ＦＢＳ、０．９％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭにプレーティングした。細胞を、（３７℃、５％ＣＯ２にて）２４時間放置してから形質導入した。ヒト血清試料（フランスの血液研究所から入手）を以下の通りに希釈した：無添加の未希釈の血清−１：４−１：１６−１：６４−１：２５６−１：１，０２４（無添加の血清とは、１容量の血清に対して１容量のウイルスを意味する）。プールされたマウス血漿試料（１０匹のＤＢＡ／１マウス由来、ＡＡＶ５ベクターの関節内注射の４２日後に採取）を、以下の通りにＦＢＳ中に段階的に希釈した：１：１０−１：５０−１：２５０−１：６，２５０−１：３１，２５０。ヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶｉｇ，Ｓａｎｑｕｉｎ、ロット１５Ｄ３０Ｈ４５６０Ａ）の溶液を、１：１０から１：１０，０００に至るまで段階的にセミログ希釈した。試料及び対照を、適切なキャプシド突然変異体またはｗｔＡＡＶ５ベクターと一緒に３０分±５分間、３５〜３８℃にて、２，５００のＭＯＩにて（以前に決定通り）、インキュベートした。４８±２時間後、ルシフェラーゼ試薬を添加し、ＶｉｃｔｏｒＸマイクロプレートリーダーを用いてルミネセンス発光を測定した。形質導入阻害力価は、検出可能な中和活性、すなわち５０％を超える中和活性に依然として関連している血清の最高希釈として決定された。
【０１１７】
６．２結果
表３に表すように、試料の７０％〜８５％は、ｗｔＡＡＶ５または７種のキャプシド突然変異体に対する中和抗体を含有しなかった。大半の試料は、７種のキャプシド突然変異体に対する応答性が共通していたため、野生型ＡＡＶ５キャプシドに対する応答性を有する血清試料も、他のキャプシドに対して応答した。応答のレベルに関しては、それらはキャプシド突然変異体間でも同等であった。応答しなかった試料の数（ＮＤ＝不検出）を、各キャプシド突然変異体に対して示す。力価を異なるベクターと比較することは非常に難しいため、これらのデータは情報としてのみ提供する。関節内注射された関節からのプールされたマウス血清試料に関して、それは動物を免疫化するために使用したＷＴ  ＡＡＶ５キャプシドに対してのみ応答し、突然変異キャプシドに対する応答は観察されなかった（表３）。全てのキャプシド突然変異体及びＷＴ  ＡＡＶ５を、ＩＶＩｇ（力価＞１００）によって中和した（データは示さず）。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
本発明を、図面に示すようないくつかの例示的な実施形態を参照して上記に説明してきた。一部分または要素の変更及び代替実装が可能であり、添付の特許請求の範囲にて定義される保護の範囲に含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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