(57)【要約】本開示は、ゲノム工学、特に、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の標的化された遺伝子改変の分野にある。具体的には、記載されている方法および組成物は、内在性ミトコンドリアゲノム（変異体または野生型）のヌクレアーゼを介したゲノム改変（例えば、１もしくはそれを超える挿入および／または欠失）に関する。標的とされた組織の野生型（例えば、分子的および生化学的表現型）への表現型復帰をもたらす、１またはそれを超える特異的な組織および／または臓器中（例えば、心臓組織中）を含む、ミトコンドリア病を有する被験体中での変異体および野生型ｍｔＤＮＡの比のヌクレアーゼを介したシフトなどによって、ミトコンドリアゲノムは、疾患原因となる変異の標的とされた矯正のために改変され得る。
2021518440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア障害の処置を必要とする被験体におけるミトコンドリア障害の処置のための、第一および第二のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むジンクフィンガーヌクレアーゼの使用であって、前記第一のＺＦＮが、切断ドメインと野生型ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）中の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）とを含み、前記第二のＺＦＮが、切断ドメインと、前記被験体中の変異体ｍｔＤＮＡが低減されまたは除去されるように変異体ｍｔＤＮＡ中の標的部位に結合するＺＦＰとを含む、使用。
【請求項２】
前記第一のＺＦＮが左ＺＦＮであり、前記第二のＺＦＮが右ＺＦＮである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、１またはそれを超えるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、１またはそれを超えるＡＡＶベクターによって運ばれる、請求項１または請求項２または請求項３に記載の使用。
【請求項５】
被験体がヒト被験体である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ｍｔＤＮＡが、前記被験体の心臓、脳、肺および／または筋肉中にある、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記変異体ｍｔＤＮＡが、以下の変異：ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ、１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃおよび／または１４７０９Ｃを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記変異体ｍｔＤＮＡが、前記５０２４Ｃ＞Ｔ変異を含み、前記左ＺＦＰが配列番号３３内の標的部位に結合し、前記右ＺＦＰが配列番号３４内の標的部位に結合する、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記左ＺＦＮがＷＴＭ１／４８９６０と表記されるＺＦＰを含み、かつ前記右ＺＦＮがＭＴＭ６２／４８９６２、ＭＴＭ２４／５１０２４、ＭＴＭ２５／５１０２５、ＭＴＭ２６／５１０２６、ＭＴＭ２７／５１０２７、ＭＴＭ２８／５１０２８、ＭＴＭ２９／５１０２９、ＭＴＭ３０／５１０３０、ＭＴＭ３２／５１０３２、ＭＴＭ３３／５１０３３、ＭＴＭ３６／５１０３６、ＭＴＭ３７／５１０３７、ＭＴＭ３９／５１０３９、ＭＴＭ４２／５１０４２、ＭＴＭ４３／５１０４３またはＭＴＭ４５／５１０４５と表記されるＺＦＰを含む、請求項２に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
被験体中のミトコンドリア病を処置する方法であって、ミトコンドリア病を処置することを必要とする被験体中で、前記被験体中の変異体ｍｔＤＮＡが低減または除去されるように、請求項１〜９のいずれかに記載のＺＦＮを発現させることを含む、方法。
【請求項１１】
左および右ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むジンクフィンガーヌクレアーゼであって、前記左ＺＦＮが切断ドメインと、配列番号３３内の野生型ミトコンドリアＤＮＡ中の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）とを含み、前記右ＺＦＮが切断ドメインと、配列番号３４または配列番号３５内の変異体ミトコンドリアＤＮＡ中の標的部位に結合するＺＦＰとを含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
【請求項１２】
１またはそれを超えるポリヌクレオチドであって、必要に応じて１またはそれを超えるＡＡＶベクターによって運ばれる、請求項１１に記載のヌクレアーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１０に記載のヌクレアーゼまたは請求項１２に記載の１もしくはそれを超えるポリヌクレオチドを含む細胞、必要に応じて、心臓、脳、肺および／または筋肉の細胞。
【請求項１４】
前記細胞中の５０２４位の変異体ｍｔＤＮＡが低減されまたは除去されている、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１３もしくは請求項１４に記載の細胞から産生されたまたは該細胞に由来する細胞または細胞株。
【請求項１６】
請求項１１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、請求項１２に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１１に記載のヌクレアーゼ、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞および／または請求項１６に記載の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月２１日に出願された米国仮出願第６２／６４６，１５６号の利益を主張し、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ゲノム工学、特に、ミトコンドリアゲノム（ｍｔＤＮＡ）の標的化された改変の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
ミトコンドリア病は、遺伝的に多彩な群の遺伝性多系統障害（しばしば、心臓、脳、筋肉および肺など、最も大量のエネルギーを必要とする臓器を冒す）であり、ミトコンドリア病の多くは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の変異を通じて伝達され、成人５，０００人におよそ１人が罹病する。例えば、Ｇｏｒｍａｎら、（２０１５）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７７：７５３〜７５９を参照。これまでに性質決定された少なくとも２５０の病因性ｍｔＤＮＡ変異が存在し（Ｔｕｐｐｅｎら、（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７９７：１１３〜１２８）、これらの変異は、数種類のヒト疾患において役割を果たしているように見受けられる。ヒトｍｔＤＮＡは、細胞当たりおよそ１００〜１０，０００コピーで存在する小さな、二本鎖の、多コピーゲノムである。疾患状態では、変異したｍｔＤＮＡは、（卵子を通じた複数のミトコンドリアの母性遺伝から生じる）「ヘテロプラスミー」として知られる現象において、野生型ｍｔＤＮＡとしばしば共存する。変異体ｍｔＤＮＡは、通例、機能的に劣性であるので、変異したｍｔＤＮＡの存在は野生型ゲノムによって促進され、ヘテロプラスミーｍｔＤＮＡ変異によって引き起こされる状態の疾患重症度は変異荷重と相関する。例えば、Ｇｏｒｍａｎら、（２０１６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ２：１６０８０参照。症状が現れる前に、＞６０％の変異体ｍｔＤＮＡ荷重を超過しなければならないという閾値効果は、ヘテロプラスミーｍｔＤＮＡ疾患の明確な特徴であり、この閾値より下にヘテロプラスミー比をシフトさせることを試みて、これらの不治の、本質的に処置不可能な障害の処置を目指す数多くの研究が行われてきた。
【０００４】
１つこのようなアプローチは、ゲノム工学ツールの中でも特に、ミトコンドリアを標的としたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｍｔＺＦＮｓ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を用いる、ｍｔＤＮＡに向けられた核酸分解を基礎とする。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、（２００１）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０：３０９３−３０９９（２００１）；Ｂａｃｍａｎら、（２０１３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９：１１１１−１１１３；Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１４）ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：４５８−４６６；Ｒｅｄｄｙら、（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６１：４５９−４６９；Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４：７８０４−７８１６；Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅ  ３４（２）：１０１）参照。哺乳動物のミトコンドリアは、効率的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路を欠くので、変異体ｍｔＤＮＡ中へのＤＳＢの選択的な導入は、完全には性質が明らかとなっていない機序を通じて、これらの分子の急速な分解をもたらす。ｍｔＤＮＡコピー数は細胞種特異的な定常状態レベルに維持されているので、変異体ｍｔＤＮＡの選択的除去は、残存するｍｔＤＮＡプールの複製を刺激し、ヘテロプラスミー比のシフトを惹起する。培養された細胞中のミトコンドリアへＺＦＮを送達する方法は、患者由来の細胞培養物の表現型救出をもたらすヘテロプラスミーの大きなシフトを生じ得ることが示されている。例えば、Ｍｉｎｃｚｕｋら、（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０３：１９６８９−１９６９４（２００６）；Ｍｉｎｃｚｕｋら、（２０１０）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ５：３４２−３５６；Ｍｉｎｃｚｕｋら、（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：３９２６−３９３８；Ｇａｕｄｅら、（２０１８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６９：５８１−５９３；米国特許第９，１３９，６２８号参照。
【０００５】
１９８０年代後半に出現したヒト疾患と関連するｍｔＤＮＡ変異の当初の記載に関わらず（例えば、Ｈｏｌｔら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：７１７−７１９；Ｗａｌｌａｃｅら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１４２７−１４３０；Ｗａｌｌａｃｅら（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５５：６０１−６１０参照）、ヘテロプラスミックなミトコンドリア病に対する有効な処置は、この間の数十年には現れていない。ミトコンドリアの補充療法を通じてｍｔＤＮＡ変異の伝達を抑制することが盛んに行われてきたが（例えば、Ｃｒａｖｅｎら、（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６５：８２−８５；Ｔａｃｈｉｂａｎａら、（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９３：６２７−６３１；Ｈｙｓｌｏｐら、（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  ５３４：３８３−３８６；Ｋａｎｇら、（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４０：２７０−２７５参照）、ｍｔＤＮＡボトルネックの性質（Ｆｌｏｒｏｓら、（２０１８）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：１４４−１５１）、ミトコンドリア病の不均一な症状（Ｖａｆａｉら、（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４９１：３７４−３８３）および新たな症例の大半におけるミトコンドリア病の家族歴のその後の欠如を考えると、ミトコンドリアの補充の有用性は限られたものになり得る。さらに、ミトコンドリア病の処置のための分子経路は、ヘテロプラスミックなミトコンドリア病に対する臨床的に適切な治療を与えてこなかった。例えば、Ｖｉｓｃｏｍｉら、（２０１５）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ａｃｔａ  １８４７：５４４−５５７；Ｐｆｅｆｆｅｒら、（２０１３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ  ９：４７４−４８１参照。
【０００６】
したがって、変異体ミトコンドリア配列の量を低減することによって、多様な遺伝的起源のミトコンドリア病を処置するための普遍的治療法を提供するために、ｍｔＤＮＡ遺伝子改変のための、特に、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーシフトのためのさらなる方法および組成物がなお必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｏｒｍａｎら、（２０１５）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７７：７５３〜７５９
【非特許文献２】Ｔｕｐｐｅｎら、（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７９７：１１３〜１２８
【非特許文献３】Ｇｏｒｍａｎら、（２０１６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ２：１６０８０
【非特許文献４】ｕｃｌｅａｓｅｓ）を用いる、ｍｔＤＮＡに向けられた核酸分解を基礎とする。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、（２００１）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０：３０９３−３０９９（２００１）
【非特許文献５】Ｂａｃｍａｎら、（２０１３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９：１１１１−１１１３；Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１４）ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：４５８−４６６
【非特許文献６】Ｒｅｄｄｙら、（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６１：４５９−４６９
【非特許文献７】Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４：７８０４−７８１６
【非特許文献８】ａｍｍａｇｅら、（２０１８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅ  ３４（２）：１０１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、遺伝子治療およびゲノム工学において使用するための組成物および方法を記載する。具体的には、記載されている方法および組成物は、内在性ミトコンドリアゲノム（変異体または野生型）のヌクレアーゼを介したゲノム改変（例えば、１もしくはそれを超える挿入および／または欠失）に関する。標的とされた組織の野生型（例えば、分子的および生化学的表現型）への表現型復帰をもたらす、１またはそれを超える特異的な組織および／または臓器中（例えば、心臓組織中）を含む、ミトコンドリア病を有する被験体中での変異体および野生型ｍｔＤＮＡの比のヌクレアーゼを介したシフトなどによって、ミトコンドリアゲノムは、疾患原因となる変異の標的とされた矯正のために改変され得る。この復帰は、（ミトコンドリアにおけるように）効率的なＤＮＡ修復機構の不存在下で、標的化されたヌクレアーゼによる選択的切断後に疾患と関連するｍｔＤＮＡである上記変異体が分解されるように変異体配列を切断することによって、変異体ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡの比を変化させるヘテロプラスミーを通じて生じる。
【０００９】
したがって、ゲノム改変（例えば、ヘテロプラスミーシフト）は、切断に続く切断されたｍｔＤＮＡ配列の分解を含み得、これらの遺伝子改変および／またはこれらの改変を含む細胞は、エクスビボまたはインビボ方法において使用され得る。
【００１０】
したがって、ミトコンドリア障害の処置を必要とする被験体においてミトコンドリア障害の処置をするための、左および右ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むジンクフィンガーヌクレアーゼの使用（または前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを含む医薬組成物）であって、１つのＺＦＮパートナーは、切断ドメインと変異体ミトコンドリアＤＮＡ（変異体ｍｔＤＮＡ）中の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）とを含み、他方のＺＦＮパートナーは、切断ドメインと、前記被験体中の変異体ｍｔＤＮＡが低減されまたは除去されるように（例えば、野生型対変異体ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー比をシフトさせる）、野生型ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）または変異体ｍｔＤＮＡ（変異体ｍｔＤＮＡ）のいずれかの中にある標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）とを含む、使用（または上記医薬組成物）が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、右および左ＺＦＰの両方が変異体ｍｔＤＮＡ中の標的に結合するのに対して、他の実施形態においては、１つのＺＦＮパートナーが野生型ｍｔＤＮＡに結合し、他方のＺＦＮパートナーが変異体ｍｔＤＮＡに結合する。さらなる実施形態において、野生型ｍｔＤＮＡに結合するＺＦＮは左ＺＦＮであるのに対して、右ＺＦＮは変異体ｍｔＤＮＡに結合し、または右ＺＦＮは野生型ｍｔＤＮＡに結合するのに対して、左ＺＦＮは変異体ｍｔＤＮＡに結合する。本明細書に記載されているＺＦＮを被験体中で発現させることによって、ミトコンドリア障害を処置する必要がある被験体においてミトコンドリア障害を処置する方法も記載されている。本明細書に記載されている使用または方法のいずれにおいても、変異体ｍｔＤＮＡは、以下の変異：５０２４Ｃ＞Ｔ、１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃおよび／または１４７０９Ｃの１つまたはそれより多くを含む。ある実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、１またはそれを超えるＡＡＶベクターによって運ばれる１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない、１またはそれを超えるポリヌクレオチド（例えば、左および右ＺＦＮをコードする別個のポリヌクレオチドまたは左および右ＺＦＮの両方をコードする同じポリヌクレオチド）によってコードされる。被験体はヒト被験体であり得、ｍｔＤＮＡは被験体の任意の組織中に存在し得る。いくつかの実施形態において、ｍｔＤＮＡは、被験体の脳、肺および／または筋肉中に存在し得る。ＺＦＮおよび／またはポリヌクレオチドは、静脈内注射を含む任意の適切な手段によって投与され得る。変異体ｍｔＤＮＡが５０２４Ｃ＞Ｔ変異を含む実施形態において、左ＺＦＰは配列番号３３内の標的部位に結合し得、および右ＺＦＰは配列番号３４内の標的部位に結合し得、左ＺＦＮがＷＴＭ１／４８９６０と表記されるＺＦＰを含み、および右ＺＦＮがＭＴＭ６２／４８９６２、���ＴＭ２４／５１０２４、ＭＴＭ２５／５１０２５、ＭＴＭ２６／５１０２６、ＭＴＭ２７／５１０２７、ＭＴＭ２８／５１０２８、ＭＴＭ２９／５１０２９、ＭＴＭ３０／５１０３０、ＭＴＭ３２／５１０３２、ＭＴＭ３３／５１０３３、ＭＴＭ３６／５１０３６、ＭＴＭ３７／５１０３７、ＭＴＭ３９／５１０３９、ＭＴＭ４２／５１０４２、ＭＴＭ４３／５１０４３またはＭＴＭ４５／５１０４５と表記されるＺＦＰを含むＺＦＮが挙げられるが、これに限定されない。
【００１１】
左および右ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むジンクフィンガーヌクレアーゼであって、左ＺＦＮが切断ドメインと、配列番号３３内の野生型ミトコンドリアＤＮＡ中の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）とを含み、右ＺＦＮが切断ドメインと、配列番号３４または配列番号３５内の変異体ミトコンドリアＤＮＡ中の標的部位に結合するＺＦＰとを含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼも記載されている。ある実施形態において、ＺＦＮは、（例えば、ＡＡＶベクターによって運ばれる）１またはそれを超えるポリヌクレオチドによってコードされる。本明細書に記載されているとおりのヌクレアーゼおよび／またはポリヌクレオチドを含む細胞（例えば、心臓、脳、肺および／または筋肉細胞）も記載されており、細胞中の５０２４位における変異体ｍｔＤＮＡが低減されまたは除去されている細胞ならびにこれらの細胞に由来する細胞、細胞株および部分的にまたは完全に分化した細胞（ＺＦＮまたはＺＦＮをコードするポリヌクレオチドを含まないことがあり得る）が含まれる。本明細書に記載されている、１もしくはそれを超えるジンクフィンガーヌクレアーゼ；１もしくはそれを超えるポリヌクレオチドおよび／または細胞を含む医薬組成物も提供される。
【００１２】
一態様において、１またはそれを超えるヌクレアーゼを用いたｍｔＤＮＡ遺伝子の標的化された改変のための方法および組成物が本明細書に開示されている。（野生型と変異体ミトコンドリアゲノム間におけるように）ヘテロプラスミーがシフトされ、変異体ｍｔＤＮＡの量が低減されるように、ミトコンドリアゲノム、典型的には変異体ミトコンドリアゲノムにおいてＤＮＡを切断するために、ヌクレアーゼ、例えば、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（用語「ＺＦＮ」は、ＺＦＮの対を含む。）、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（制限エンドヌクレアーゼからのおよび／またはメガヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインとのＴＡＬＥエフェクタードメインの融合物を含むＴＡＬＥＮ（メガＴＡＬＥおよびコンパクトＴＡＬＥＮなど）（用語「ＴＡＬＥＮ」は、ＴＡＬＥＮの対を含む。）、Ｔｔａｇｏ系および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が、使用される。ｍｔＤＮＡ中の二重修復経路は非効率であり、したがって、変異体ｍｔＤＮＡの選択的切断（野生型ｍｔＤＮＡは切断されない）は変異体ｍｔＤＮＡの急速な分解および変異体ｍｔＤＮＡに対する野生型ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー比の対応するシフトをもたらすので、標的（例えば、変異体ｍｔＤＮＡ）は、切断後に不活化され得る。本明細書に記載されているヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ中の二本鎖（ＤＳＢ）または一本鎖切断（切れ目）を誘導することができる。いくつかの実施形態において、２つの切れ目を導入することによってＤＳＢを作出するために、２つのニッカーゼが使用される。いくつかの事例において、ニッカーゼはＺＦＮであり、一方、他の事例では、ニッカーゼはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである。本明細書に記載されているヌクレアーゼのいずれもが（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）、例えば、野生型または変異体配列の９〜２０またはそれを超える（９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超える）連続的または非連続的ヌクレオチドを含む標的部位など、例えば、表２に示されている標的配列などの変異体ｍｔＤＮＡを特異的に標的とし得る。ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔを含むがこれに限定されない任意の変異体が、ＤＮＡ結合ドメインによって標的とされ得る。例えば、ｍｔＤＮＡ変異と関連する非限定的な一群のヒト疾患としては、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ；進行性筋症、眼筋麻痺、心筋症）；ＣＰＥＯ：慢性進行性外眼筋麻痺；およびピアソン症候群（汎血球減少症、乳酸アシドーシス）が挙げられ、ここで、３つ全てが、ミトコンドリアゲノム中の単一の巨大な欠失（約５ｋｂ）と関連している。変異体ミトコンドリアと関連する他のヒト疾患は、ＴＲＮＬ１遺伝子中の３２４３Ａ＞Ｇ変異（本明細書において、Ａ３２４３Ｇまたは３２４３Ｇとも称される。）および／または３２７１Ｔ＞Ｃ変異（本明細書において、Ｔ３２７１Ｃまたは３２７１Ｃとも称される。）またはＮＤ１およびＮＤ５中の孤発性変異と関連するＭＥＬＡＳ（筋症、脳症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様エピソード）；ＴＲＮＫ遺伝子中の８３４４Ａ＞Ｇおよび／または８３５６Ｔ＞Ｃ変異（本明細書において、Ａ８３４４Ｇまたは８３４４Ｇ／Ｔ８３５６Ｃまたは８３５６Ｃと称される。）と関連するＭＥＲＲＦ（赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん、筋症）；ＡＴＰ６遺伝子中の８９９３Ｔ＞Ｇ変異（本明細書において、Ｔ８９９３Ｇまたは８９９３Ｇと称される。）と関連するＮＡＲＰ（神経障害、運動失調、網膜色素変性）；ＡＴＰ６中の８９９３Ｔ＞Ｇ／Ｃ変異（本明細書において、Ｔ８９９３Ｇ、Ｔ８９９３Ｃ、８９９３Ｇ、８９９３Ｃと称される。）および／または９１７６Ｔ＞Ｇ／Ｃ変異（本明細書において、Ｔ９１７６Ｇ、Ｔ９１７６Ｃ、９１７６Ｇ、９１７６Ｃと称される。）とも関連するＭＩＬＳ（進行性脳幹障害、母性遺伝リー症候群としても知られる。）；ＴＲＮＬ１遺伝子中の３２４３Ａ＞Ｇ変異（本明細書において、Ａ３２４３Ｇまたは３２４３Ｇと称される。）と関連するＭＩＤＤ（糖尿病、聴覚喪失）；ＮＤ１中の３４６０Ｇ＞Ａ変異（本明細書において、Ｇ３４６０Ａまたは３４６０Ａとも称される。）、ＮＤ４中の１１７７８Ｇ＞Ａ変異（本明細書において、Ｇ１１７７８Ａまたは１１７７８Ａと称される。）および／またはＮＤ６遺伝子中の１４４８４Ｔ＞Ｃ変異（本明細書において、Ｔ１４４８４Ｃまたは１４４８４Ｃと称される。）と関連するＬＨＯＮ（視神経症）；ＴＲＮＥ遺伝子中の１４７０９Ｔ＞Ｃ変異（本明細書において、Ｔ１４７０９Ｃまたは１４７０９Ｃと称される。）と関連する筋症および糖尿病；ＲＮＲ１遺伝子中の１５５５Ａ＞Ｇ変異（本明細書において、Ａ１５５５Ｇまたは１５５５Ｇと称される。）およびＴＲＮＳ１遺伝子中の孤発性変異と関連する感音難聴および聴覚喪失；ＣＹＢ遺伝子中の孤発性変異と関連する運動不耐性；ならびにＮＤ３遺伝子中の１０１５８Ｔ＞Ｃ（Ｔ１０１５８Ｃまたは１０１５８Ｃと称される。）および／または１０１９１Ｔ＞Ｃ（Ｔ１０１９１Ｃまたは１０１９１Ｃと称される。）変異および／または１０１９７Ｇ＞Ａ変異（Ｇ１０１９７Ａまたは１０１９７Ａと称される。）と関連する致死性乳児脳症リー／リー様症候群である。ｍｔＤＮＡ中の他の変異としては、ＮＤ６遺伝子中の１４７０９Ｔ＞Ｃ変異（Ｔ１４７０９Ｃまたは１４７０９Ｃと称される。）；リー症候群と関連する、ＮＤ６遺伝子中の１４４５９Ｇ＞Ａおよび／または１４４８７Ｔ＞Ｃ変異（本明細書において、Ｇ１４４５９Ａまたは１４４５９ＡおよびＴ１４４８７Ｃまたは１４４８７Ｃと称される。）および／またはＮＤ４遺伝子中の１１７７７Ｃ＞Ａ変異（Ｃ１１７７７Ａまたは１１７７７Ａと称される。）および／または１６２４Ｃ＞Ｔ変異（Ｃ１６２４Ｔまたは１６２４Ｔと称される。）；ＮＤ５遺伝子中の１３５１３Ｇ＞Ａ変異（Ｇ１３５１３Ａまたは１３５１３Ａと称される。）；聴覚喪失および筋症と関連する、７４４５Ａ＞Ｇ変異（Ａ７４４５Ｇまたは７４４５Ｇと称される。）および／または７４７２における挿入；多系統障害と関連する５５４５Ｃ＞Ｔ変異（Ｃ５５４５Ｔまたは５５４５Ｔと称される。）；ならびに心筋症と関連する４３００Ａ＞Ｇ変異（Ａ４３００Ｇまたは４３００Ｇと称される。）が挙げられる。例えば、Ｇｒｅａｖｅｓ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ（２００６）ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ５８（３）���１４３−１５１；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｂｕｌｌ（２００５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ６（５）：３８９−４０２；およびＴｕｐｐｅｎら、（２０１０）同書）参照  全ての変異は、野生型配列に対して付番されている。
【００１３】
一態様において、ｍｔＤＮＡゲノム中の標的部位に結合する天然に存在しないジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、１またはそれを超える操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含むＺＦＰが本明細書に記載されている。一実施形態において、ＺＦＰは、関心対象の標的ゲノム領域を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、ＺＦＮは１またはそれを超える操作されたジンクフィンガー結合ドメインとヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断半ドメインとを含む。切断ドメインおよび切断半ドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから取得することができ、野生型であり得、または操作され得る（変異体）。一実施形態において、切断半ドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。ある実施形態において、ジンクフィンガードメイン、表１の１行中に示されているとおりに順序付けられた認識ヘリックスドメインを有するジンクフィンガータンパク質。これらのジンクフィンガータンパク質を含むヌクレアーゼは、（例えば、ジンクフィンガータンパク質を切断ドメインに連結する）任意のリンカー配列および任意の切断ドメイン（例えば、ＥＬＤ変異体などの二量体化変異体；４１６、４２２、４４７、４４８および／もしくは５２５の１つもしくはそれより多くに変異を有するＦｏｋＩドメイン；ならびに／またはニッカーゼ機能性をもたらす触媒性ドメイン変異体）を含み得る。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号；同第９，２００，２６６号；同第８，６２３，６１８号；および同第７，９１４，７９６号；ならびに米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号参照。ある実施形態において、ＺＦＮのＺＦＰは、表２に示されている配列内の９〜１８またはそれを超えるヌクレオチドの標的部位に結合する。ある実施形態において、ＺＦＮは、ＺＦＮが（野生型ｍｔＤＮＡの切断と比較して）変異体ｍｔＤＮＡを選択的に切断するように、（野生型ｍｔＤＮＡと比較して）変異体ｍｔＤＮＡに選択的に結合する。さらなる実施形態において、ＺＦＮは、以下の変異：１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃまたは１４７０９Ｃのうちの１つまたはそれより多くを含む変異体ｍｔＤＮＡ中の標的部位に選択的に結合し、付番は野生型配列に対して為されており、位置の後のヌクレオチドは変異体配列を示す。本明細書に記載されているＺＦＮのいずれもが、対の１つの構成要素（member）が変異体ｍｔＤＮＡに結合し、対の１つの構成要素が野生型ｍｔＤＮＡに結合するＺＦＮの対（例えば、左および右）を含み得る。または、本明細書に記載されているＺＦＮは、両方のＺＦＮが野生型ｍｔＤＮＡに結合し、または両方のＺＦＮが変異体ｍｔＤＮＡに結合するＺＦＮの対（左および右）を含み得る。
【００１４】
別の態様において、ｍｔＤＮＡ中の表２中に示されている標的配列の標的部位（例えば、少なくとも９または１２の（例えば、９〜２０またはそれより多くの）ヌクレオチドを含む標的部位に結合するＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ））タンパク質であって、１またはそれを超える操作されたＴＡＬＥ結合ドメインを含むＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質が本明細書に記載されている。一実施形態において、ＴＡＬＥは、関心対象の標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であって、１またはそれを超える操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断半ドメインとを含むヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。切断ドメインおよび切断半ドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）から取得することができる。一実施形態において、切断半ドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。他の実施形態において、切断ドメインは、メガヌクレアーゼに由来し、メガヌクレアーゼドメインはＤＮＡ結合機能も示し得る。ある実施形態において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮが（野生型ｍｔＤＮＡの切断と比較して）変異体ｍｔＤＮＡを選択的に切断するように、（野生型ｍｔＤＮＡと比較して）変異体ｍｔＤＮＡに選択的に結合する。さらなる実施形態において、ＴＡＬＥＮは、以下の変異：１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃまたは１４７０９Ｃを含む標的部位に選択的に結合し、付番は野生型配列に対して為されており、位置の後のヌクレオチドは変異体配列を示す。本明細書に記載されているＴＡＬＥＮのいずれもが、対の１つの構成要素が変異体ｍｔＤＮＡに結合し、対の１つの構成要素が野生型ｍｔＤＮＡに結合するＴＡＬＥＮの対（例えば、左および右）を含み得る。または、本明細書に記載されているＴＡＬＥＮは、両方のＴＡＬＥＮが野生型ｍｔＤＮＡに結合し、または両方のＴＡＬＥＮが変異体ｍｔＤＮＡに結合するＴＡＬＥＮの対（左および右）を含み得る。
【００１５】
別の態様において、ｍｔＤＮＡ中の標的部位に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であって、１またはそれを超える操作されたシングルガイドＲＮＡまたは機能的等価物およびＣａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が本明細書に記載されている。ある実施形態において、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、表２に示されている標的部位の９、１２またはそれを超える連続的ヌクレオチドを含む配列に結合する。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが（野生型ｍｔＤＮＡの切断と比較して）変異体ｍｔＤＮＡを選択的に切断するように、ｓｇＲＮＡは、（野生型ｍｔＤＮＡと比較して）変異体ｍｔＤＮＡに選択的に結合する。さらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、以下の変異：１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃまたは１４７０９Ｃを含む標的部位に選択的に結合し、付番は野生型配列に対して為されており、位置の後のヌクレオチドは変異体配列を示す。本明細書に記載されているｓｇＲＮＡのいずれもが、変異体ｍｔＤＮＡまたは野生型ｍｔＤＮＡに選択的に結合し得る。ｓｇＲＮＡの対が使用される場合には、一方または両方の構成要素が野生型または変異体ｍｔＤＮＡに結合し得る。
【００１６】
本明細書に記載されているとおりのヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロンなどの、ｍｔＤＮＡのコード領域もしくは非コード領域中にある関心対象の領域またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの転写されない領域内にある関心対象の領域に結合し、および／または切断し得る。標的部位は、表２に示されている標的部位またはｍｔＤＮＡ中の１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃもしくは１４７０９Ｃを包含する標的部位を含む長さ９〜１８またはそれを超えるヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、ヌクレアーゼ（複数可）のＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）は、（野生型ｍｔＤＮＡの切断と比較して）変異体ｍｔＤＮＡに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ＴＲＮＬ１、ＮＤ１、ＮＤ５、ＴＲＮＫ、ＡＴＰ６、ＮＤ４、ＮＤ６、ＴＲＮＥ、ＲＮＲ１、ＴＲＮＳ、ＣＹＢ、ＣＹＴｂ、１２ＳｒＲＮＡおよび／またはＮＤ３ミトコンドリア遺伝子中の選択された位置に結合する。
【００１７】
別の態様において、１またはそれを超えるヌクレアーゼ（例えば、本明細書に記載されているＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドが、本明細書に記載されている。ある実施形態においては、同じポリヌクレオチドが、１つのヌクレアーゼ（例えば、対を成すヌクレアーゼの両方の左および右単量体またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の全ての成分）をコードするのに対して、他の実施形態においては、ヌクレアーゼの成分に対して別個のポリヌクレオチドが使用される（例えば、対を成すヌクレアーゼの１つの構成要素（例えば、左構成要素／単量体）をコードする第一のヌクレアーゼおよび対を成すヌクレアーゼの他方の構成要素（例えば、右構成要素／単量体）をコードする第二のポリヌクレオチド。ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ、Ａｄ、レトロウイルスベクターなどおよびｍＲＮＡ、プラスミド、ミニサークルＤＮＡなどを含むがこれらに限定されない、ウイルスまたは非ウイルスベクター中に組み立てられ得る。ある実施形態において、ベクターは、特異的な組織または臓器に標的化される、例えば、ＡＡＶベクターは心臓（心臓組織）に標的化される。ある実施形態において、ヌクレアーゼは、ＡＡＶベクター組成物として別々に組み立てられて、併せて投与される左および右ＺＦＮを含むＺＦＮである（例えば、両方のＡＡＶベクターを含む単一の医薬組成物として製剤化される）。
【００１８】
別の態様において、プロモーターに動作可能に連結された、本明細書に記載されている１またはそれを超えるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドを含む、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ発現ベクターが本明細書に記載されている。一実施形態において、発現ベクターはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）である。一態様において、ウイルスベクターは組織特異的向性を呈する。
【００１９】
別の態様において、１またはそれを超えるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書に記載されている。
【００２０】
別の態様において、本明細書に記載されているとおりの（例えば、１またはそれを超えるヌクレアーゼの１またはそれを超える成分を含む）発現ベクターを含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１を超える発現ベクターを含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、第一のポリヌクレオチドを含む第一の発現ベクターと、第二のポリヌクレオチドを含む第二の発現ベクターとを含む。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドは異なる。いくつかの実施形態において、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドは実質的に同一である。ある実施形態において、医薬組成物は、ＺＦＮ対の左単量体をコードする第一のＡＡＶベクターおよび／またはＺＦＮ対の右単量体をコードする第二のＡＡＶベクターを含む。ある実施形態において、医薬組成物（例えば、一方または両方の単量体を含むＡＡＶベクターなどのポリヌクレオチドを含む薬学的）の濃度は、細胞または被験体当たり１×１０１０〜１×１０１４（またはその間の任意の値）ベクターゲノム（ｖｇ）である。いくつかの実施形態において、医薬組成物の濃度は、（例えば、尾静脈注射によって）細胞または被験体当たり１×１０１２、５×１０１２または１×１０１３ｖｇである。医薬組成物は、全身的、腹腔内、静脈内、筋肉内、粘膜もしくは局所送達方法または（ｏｆ）これらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、被験体への送達に適している。医薬組成物は、ドナー配列（例えば、ミトコンドリア障害などの疾患または障害において欠如または欠失するタンパク質をコードする導入遺伝子）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ドナー配列は、発現ベクターと関連する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥまたはｓｇＲＮＡまたはメガヌクレアーゼ）と野生型または操作された切断ドメインまたは切断半ドメインとを含む融合タンパク質が提供される。
【００２２】
別の態様において、ＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）とヌクレアーゼ（切断）ドメインとを含むヌクレアーゼなど、本明細書に記載されているヌクレアーゼ
（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）の１またはそれより多くを含む組成物が本明細書に記載されている。ある実施形態において、組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて、１またはそれを超えるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、それぞれの組が異なる特異性を有する、ヌクレアーゼの２つまたはそれを超える組（対）を含む。他の態様において、組成物は、異なる種類のヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態においては、組成物はｍｔＤＮＡ特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、一方、他の実施形態においては、組成物はｍｔＤＮＡ特異的ヌクレアーゼタンパク質を含む。ある実施形態において、組成物は、全身的送達を介することを含む、被験体への送達に適している。
【００２３】
別の態様において、本明細書に記載されている１またはそれを超える、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ成分（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のヌクレアーゼドメイン）をコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載されている。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｍＲＮＡは、化学的に修飾され得る（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら、（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（２）：１５４−１５７参照）。他の態様において、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャプを含み得る（米国特許第７，０７４，５９６号；および同第８，１５３，７７３号参照）。さらなる実施形態において、ｍＲＮＡは、修飾されていないヌクレオチドと修飾されたヌクレオチドの混合物を含み得る（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号参照）。別の態様において、プロモーターに動作可能に連結された、本明細書に記載されている１またはそれを超えるヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを含むヌクレアーゼ発現ベクターが本明細書に記載されている。一実施形態において、発現ベクターはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターである。
【００２４】
別の態様において、１またはそれを超えるヌクレアーゼ、本明細書に記載されているとおりの１またはそれを超えるヌクレアーゼ発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書に記載されている。ある実施形態において、宿主細胞は、変異体ｍｔＤＮＡの量が低減されまたは除去されており、それにより、（野生型細胞と比較した場合に）細胞中のｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー比をシフトさせることを含む。ある実施形態において、ヘテロプラスミー比は、少なくとも５％またはそれを超えて、好ましくは少なくとも１０％またはそれを超えて、さらにより好ましくは少なくとも２０％またはそれを超えて、野生型（非変異体ｍｔＤＮＡ）の方にシフトされる。宿主細胞は、１またはそれを超えるヌクレアーゼ発現ベクターで安定に形質転換され得、または一過性に形質移入され得、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。別の態様において、１またはそれを超えるヌクレアーゼ発現ベクターは、宿主細胞中で１またはそれを超えるヌクレアーゼを発現する。別の実施形態において、宿主細胞は、外来性ポリヌクレオチドドナー配列をさらに含み得る。本明細書に記載されている実施形態のいずれにおいても、宿主細胞は、胚細胞、例えば、１またはそれを超えるマウス、ラット、ウサギまたはその他の哺乳動物細胞の胚（例えば、非ヒト霊長類）を含むことができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は組織を含む。ｍｔＤＮＡ中に改変（例えば、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー比）を含む多能性細胞、全能性細胞、複能性細胞または分化した細胞などの、本明細書に記載されている細胞から産生されたまたはこれらの細胞に由来する細胞または細胞株も記載されている。ある実施形態において、本明細書に記載されている改変を含む本明細書に記載されているとおりの分化された細胞であって、本明細書に記載されている幹細胞に由来する分化された細胞が本明細書に記載されている。ある実施形態において、宿主細胞は、心臓細胞または幹細胞、例えば、造血幹細胞または人工多能性幹細胞である。
【００２５】
別の態様において、細胞中のｍｔＤＮＡ遺伝子を切断する方法であって、（ａ）ヌクレアーゼ（複数可）が発現され、ｍｔＤＮＡが切断されるような条件下で、ｍｔＤＮＡを標的とする１またはそれを超えるヌクレアーゼをコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドを細胞中に導入することを含む、方法が本明細書に記載されている。ある実施形態において、変異体ｍｔＤＮＡは、野生型ｍｔＤＮＡと比較して選択的に切断される。これは、変異体ｍｔＤＮＡ：野生型ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー比のシフトをもたらす。必要に応じて、これらの方法は、細胞のゲノム中にまたはｍｔＤＮＡ中に組み込まれ得る、ドナー（例えば、治療用タンパク質）を細胞に投与することをさらに含む。１またはそれを超えるドナー分子の組み込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）関連修復によって起こる。さらに、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドおよび／またはドナーは、送達系（例えば、非ウイルスベクター、ＬＮＰまたはウイルスベクター）の任意の１つまたは組み合わせを用いて細胞中に導入され得る。ある実施形態において、ある細胞、組織および／または臓器の種類に対して特異的であるベクター、例えば、心臓組織、脳組織、肺組織、筋肉組織などに対して特異的であるＡＡＶベクターが使用される。ある実施形態において、変異体ｍｔＤＮＡの切断は、野生型（例えば、野生型配列への部分的または完全な回復を含む。）配列の方向にヘテロプラスミーをシフトし、これにより、ミトコンドリア病を処置および／または予防することを必要とする被験体において、ミトコンドリア病を処置および／または予防する。ある実施形態において、切断され、野生型に回復された変異体ｍｔＤＮＡは、点変異（例えば、５０２４Ｃ＞Ｔ）を含む。
【００２６】
本明細書に記載されている組成物または方法のいずれにおいても、１またはそれを超えるポリヌクレオチドは、所望の効果を与える任意の濃度（用量）で提供および／または送達することができる。好ましい実施形態において、１またはそれを超えるポリヌクレオチドは、細胞または被験体当たり１０，０００〜１×１０１４またはそれを超えるベクターゲノム（またはこの間にある任意の値）でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて送達される。ある実施形態において、１またはそれを超えるポリヌクレオチドは、２５０〜１，０００（またはこの間にある任意の値）のＭＯＩでレンチウイルスベクターを用いて送達される。別の実施形態において、１またはそれを超えるポリヌクレオチドは、１５０〜１，５００ｎｇ／１００，０００細胞（またはこの間にある任意の値）でプラスミドベクターを用いて送達される。別の実施形態において、１またはそれを超えるポリヌクレオチドは、１５０〜１，５００ｎｇ／１００，０００細胞（またはこの間にある任意の値）でｍＲＮＡとして送達される。２またはそれを超えるポリヌクレオチドが送達される場合、ベクターは同一のベクターまたは異なるベクターであり得、同一のベクターは、１：１の比率を含むがこれに限定されない任意の比率で送達され得る。ある実施形態において、１×１０１０〜１×１０１４（またはこの間にある任意の値）を含むがこれに限定されない、任意の単量体当たり濃度で、必要に応じて、５×１０１２ｖｇ／単量体で、対を成すヌクレアーゼの成分（例えば、ＭＴＭ２５単量体およびＷＴＭ１単量体を含むＺＦＮ）を送達するために、２つのＡＡＶベクターが使用される。ある実施形態において、各単量体の用量、または総用量（両単量体）は、（例えば、尾静脈注射によって）細胞または被験体当たり１×１０１２、５×１０１２または１×１０１３ｖｇである。いくつかの実施形態において、ＺＦＮは、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量（例えば、２．５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの各ＡＡＶ−ＺＦＮ単量体）；１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量（例えば、０．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの各ＡＡＶ−ＺＦＮ単量体）；５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量（例えば、２．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇの各ＡＡＶ−ＺＦＮ単量体）；１ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量（例えば、０．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの各ＡＡＶ−ＺＦＮ単量体）；５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量（例えば、２．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇの各ＡＡＶ−ＺＦＮ単量体；または１ｅ１５ｖｇ／ｋｇの総ＡＡＶ用量（例えば、０．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇの各ＡＡＶ−ＺＦＮ単量体）で与えられる。ある実施形態において、ＡＡＶは、静脈内注射によって投与される。
【００２７】
さらに別の態様において、遺伝子改変されたｍｔＤＮＡを含む細胞、例えば、変異体ｍｔＤＮＡに対する野生型ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー比が、細胞中の変異体ｍｔＤＮＡを低減および／または除去することによって改変されている細胞が本明細書に提供されている。ある実施形態において、ミトコンドリア障害を有する被験体から得た細胞と比較して、細胞ヘテロプラスミー比は低減されている。変異体ｍｔＤＮＡは、ｍｔＤＮＡの変異体形態に対して特異的なヌクレアーゼ（例えば、表２に示されているまたは以下の変異：１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃまたは１４７０９Ｃのうちの１もしくはそれより多くを包含する９〜２０またはそれを超える塩基対の配列に標的化されるヌクレアーゼによる変異体ｍｔＤＮＡの切断後の分解によって、細胞から低減されおよび／または除去される  分解を引き起こす切断は、標的部位（複数可）および／もしくは切断部位（複数可）内ならびに／または標的配列の９〜１８もしくはそれを超える塩基対の標的部位の末端の１〜５０塩基対内であり得る。本明細書に記載されている改変された細胞は単離され得、または被験体、例えば、ミトコンドリア障害を有する被験体内にあり得る。
【００２８】
本明細書に記載されている方法および組成物のいずれにおいても、細胞は任意の真核生物細胞であり得る。ある実施形態において、細胞は、分化した細胞、例えば、心臓細胞、脳細胞、肝細胞、腎臓細胞、筋肉細胞、神経細胞、腸の細胞、目の細胞および／または耳の細胞などである。他の実施形態において、細胞は幹細胞である。他の実施形態において、細胞は、患者由来の、例えば、（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）投与によって、患者中で、骨髄から末梢血中に動員された）自家ＣＤ３４＋（造血）幹細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、任意の適切な方法によって、採集し、精製し、培養し、ヌクレアーゼを細胞中に導入することができる。
【００２９】
別の態様において、本発明の方法および組成物は、例えば、ミトコンドリア病の処置および／または予防において使用するための、本明細書に記載されている組成物（ヌクレアーゼ、医薬組成物、ポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、細胞株および／またはトランスジェニック動物などの動物）の使用を提供する。ある実施形態において、これらの組成物は、
ミトコンドリア障害の処置において使用するための、薬物ライブラリーおよび／または他の治療用組成物（すなわち、抗体、構造ＲＮＡなど）のスクリーニングにおいて使用される。このようなスクリーニングは、巧みに操作された細胞株または初代細胞を用いて、細胞レベルで開始することができ、動物個体の処置のレベル（例えば、獣医学的治療またはヒト治療）まで進むことができる。したがって、ある態様において、ミトコンドリア病を処置および／または予防することを必要とする被験体において、ミトコンドリア病を処置および／または予防する方法であって、本明細書に記載されている１またはそれを超えるヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドおよび／または細胞を前記被験体に投与することを含む方法が本明細書に記載されている。これらの方法は、エクスビボまたはインビボであり得る。ある実施形態において、本明細書に記載されている細胞が被験体に投与される。本明細書に記載されている方法のいずれにおいても、細胞は、被験体に由来する幹細胞（患者由来の幹細胞）であり得る。
【００３０】
本明細書に記載されている組成物および方法のいずれにおいても、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ形態でおよび／または１もしくはそれを超える非ウイルスベクター（複数可）、ＬＮＰベクター（複数可）またはウイルスベクター（複数可）を用いて導入される。ある実施形態において、ヌクレアーゼ（複数可）は、ｍＲＮＡ形態で導入される。別の実施形態において、ヌクレアーゼ（複数可）は、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ１０、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を含むアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を用いて、またはレンチウイルスベクターもしくは組み込み欠損レンチウイルスベクターを用いて導入される。
【００３１】
細胞に送達されると、ヌクレアーゼ（複数可）は転写および／または翻訳され、ヌクレアーゼタンパク質はミトコンドリアによって取り込まれる。したがって、いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ（複数可）は、ミトコンドリア標的化ペプチドを含む（例えば、米国特許第９，１３９，６２８号；Ｏｍｕｔａ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２３（６）：１０１０−６参照）。ある実施形態において、組織または細胞特異的ベクター、例えば、心臓（心臓組織）に対して特異的であるベクターが使用される。
【００３２】
細菌、昆虫、酵母、魚、哺乳動物（非ヒト哺乳動物を含む。）および植物細胞などの原核細胞または真核細胞を含むがこれらに限定されない任意の細胞を、本発明の組成物および方法を用いて改変することができる。ある実施形態において、細胞は、心臓細胞、脳細胞、肝細胞、脾臓細胞、腸細胞または免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）、樹状細胞、Ｂ細胞などである。他の実施形態において、細胞は、多能性、全能性または複能性幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋）、胚性幹細胞などである。本発明の方法および組成物とともに使用され得る具体的な幹細胞の種類としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）が挙げられる。ｉＰＳＣは、患者の試料および／または正常な対照に由来することができ、患者由来のｉＰＳＣを関心対象の遺伝子における正常なもしくは野生型遺伝子配列へ変異させることができ、または正常な細胞を関心対象の遺伝子における公知の疾患対立遺伝子へ変化させることができる。同様に、造血幹細胞は、患者からまたはドナーから単離することができる。
【００３３】
したがって、ｍｔＤＮＡゲノムを変化させ（変異体ｍｔＤＮＡの選択的切断を含むがこれに限定されない）、（例えば、ｍｔＤＮＡゲノムを変化させることを必要とする被験体の）細胞、臓器および／または組織中の変異体および野生型ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー比を変更し、これにより、ミトコンドリア病を処置および／または予防するための方法および組成物が本明細書に記載されている。該組成物および方法は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで用いることができ、ｍｔＤＮＡに標的化されるＤＮＡ結合ドメインを含む、人工の転写因子またはヌクレアーゼを投与することを含む。
【００３４】
本発明の核酸、ヌクレアーゼおよび／または細胞を含むキットも提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、適切な発現ベクター中に含有される遺伝子をコードする、ＲＮＡ分子またはＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）または分割量の、ヌクレアーゼタンパク質、ドナー分子、適切な幹細胞性修飾因子、細胞、本発明の方法を実施するための指示などを含み得る。
【００３５】
これらのおよびその他の態様は、開示全体に照らせば、当業者にとって自明である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｇは、ミトコンドリアＤＮＡに標的化されるヌクレアーゼおよびインビボｍｔＤＮＡヘテロプラスミー改変の設計を図示する。図１Ａは、野生型および変異体ゲノム中のｍ．５０２４の上流にある配列に結合した単量体「ＷＴＭ１」（配列番号１）ならびに標的部位中のＣ＞Ｔ変異によって変異させた部位（＊によって表されている。）に優先的に結合した変異体特異的単量体「ＭＴＭ２５」（配列番号２）を示す模式図である。絶対ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメインの二量体化は、ＤＮＡ二本鎖切断を生成し、変異体ｍｔＤＮＡの特異的枯渇をもたらした。図１Ｂは、マウスｍｔＤＮＡに標的化されたヌクレアーゼをスクリーニングするために使用されたライブラリーの模式図（左パネル）、およびスクリーニングアッセイの模式図（右パネル）を図示する。スクリーニングのために、骨格が別個のプロモーター（ＳＶ４０）からｍＣｈｅｒｒｙも共発現するように、リボソームスタッタリングＴ２Ａ部位（「２Ａ」）、ＷＴＭ１  ｍｔＺＦＮ（「ＷＴＭ１」）およびハンマーヘッド型リボザイム（「ＨＨＲ」）を含有する骨格中に、ＭＴＭ（ｎ）ｍｔＺＦＮライブラリー（「ＭＴＭ（ｎ）」と表記される。）をクローニングした。ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔを保有するマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）中にこれらの構築物を形質移入し、２４時間の時点で、形質移入体を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分別し、ＤＮＡを抽出し、パイロシークエンシングによって、形質移入された線維芽細胞中のヘテロプラスミーシフトを決定した。図１Ｃは、テトラサイクリン感受性ＨＨＲ７によって促進された、対照または異なる濃度のＭＴＭ２５／ＷＴＭ１を形質移入されたＭＥＦからのｍ．５０２４Ｃ＞Ｔヘテロプラスミーのパイロシークエンシング分析の結果を示す。試験された異なる条件にしたがって、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔヘテロプラスミーの変化（「Δｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ（％）」）をプロットした。「ｕｔＺＦＮ」は、マウスｍｔＤＮＡ７中に標的部位を有さないｍｔＺＦＮである。ｎ＝４〜８。エラーバーは、標準偏差を示す。統計解析を行った：両側スチューデントのｔ検定＊＊＊ｐ＜０．０１。図１Ｄは、インビボ実験を図示する模式図である。ＭＴＭ２５およびＷＴＭ１は、ＡＡＶ９．４５においてキャプシドで囲まれる別個のＡＡＶゲノム中にコードされ、次いで、同時に全身的に（尾静脈）投与された。注射後６５日に、動物を屠殺した。図１Ｅは、ＭＴＭ２５および／またはＷＴＭ１を注射された動物から得た全心臓タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。両タンパク質はＨＡタグを含み、分子量によって区別される。図１Ｅは、耳および心臓の全ＤＮＡからのｍ．５０２４Ｃ＞Ｔヘテロプラスミーのパイロシークエンシング分析を示す。これらの間でのｍ．５０２４Ｃ＞Ｔの変化（Δ）がプロットされている。ｎ＝４〜２０（表Ｓ１）。エラーバーは、ＳＥＭ（平均値の標準誤差）を示す。統計解析を行った：両側スチューデントのｔ検定。＊＊＊ｐ＜０．００１。図１Ｆは、ｑＰＣＲによるｍｔＤＮＡコピー数の分析を示す。各四角が、１匹の動物を示す。ｎ＝４〜８（表Ｓ１）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。統計解析を行った：両側スチューデントのｔ検定＊＊ｐ＜０．０１。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【図１−５】同上。
【００３７】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｅは、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ  ｍｔＤＮＡヘテロプラスミーの低下が生存被験体中での表現型救出をもたらすことを図示する。図２Ａは、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ変異によってコードされるｍｔ−ｔＲＮＡ：ＡＬＡの図解である。５０２４Ｃ＞Ｔ変異の故に挿入された変異体「Ａ」の位置は、丸によって示されている。この変異の性質および位置を考えると、変異誤対合を含有する転写されたｔＲＮＡ分子は、正しく折り畳まれるまたはアミノアシル化される見込みがなく、高レベルのｍ．５０２４Ｃ＞Ｔヘテロプラスミーにおいて、ｍｔ−ｔＲＮＡ：ＡＬＡの低下した定常状態レベルをもたらす。図２Ｂは、全心臓ＲＮＡ抽出物のノーザンブロット分析の定量を示す。ｍｔ−ｔＲＮＡ存在量は、５ＳｒＲＮＡに対して正規化されている。ｎ＝４〜６。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。統計解析を行った：両側スチューデントのｔ検定。＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、非処理細胞と比較した、ＷＴＭ１／ＭＴＭ２５  ＺＦＮ対で処理された細胞中での、ｍｔ  ｔＲＮＡ：ＣＹＳに対して正規化されたｍｔ  ｔＲＮＡ：ＡＬＡの存在の増加を示した。図２Ｃは、ｍｔ−ｔＲＮＡＡＬＡ分子表現型救出の生理学的効果を評価するために使用された、中間用量（５ｅ１２ｖｇ／動物）ＡＡＶで処置されたマウスおよび年齢／当初のヘテロプラスミーを合わせた（ビヒクル処理された）対照に対するメタボロームデータの主成分分析（ＰＣＡ）プロットを図示する。各四角が、１匹の動物を示す（実施例２参照）。図２Ｄは、ＬＣ／ＭＳによる、中間用量ＡＡＶ処置されたマウス（右の棒「＋ＡＡＶ」）および年齢／当初のヘテロプラスミーを合わせた対照（左の棒「ＶＥＨ」）のマウス心臓組織からの総代謝物存在量（左のグラフはホスホエノールピルビン酸；中央のグラフはピルビン酸；右のグラフは乳酸）の測定値を示す。最終解糖系代謝物の化学構造およびこれらをつなぐ反応が、一番上のパネルに図示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。統計解析を行った：片側スチューデントのｔ検定。＊ｐ＜０．０５。図２Ｅは、マウス心臓組織からの解糖系経路の最初の反応物および生成物の化学構造（一番上のパネル）およびインビボ存在量を示す。処置された動物の心臓中の、減少した下流代謝物存在量（中央のグラフに示されているグルコース−６−リン酸および右のグラフに示されているフルクトース−６−リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｓｅ））を伴う上昇したグルコースレベル（左のグラフ）は、対照（左の棒「ＶＥＨ」）と比較した場合の処置された動物（右の棒「＋ＡＡＶ」）中で観察された、ミトコンドリア代謝の回復および好気的解糖の強化の特性に寄与する。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
ｍｔＤＮＡ中のヘテロプラスミーがシフトされ、野生型への分子的および生物化学的表現型の復帰が達成されるような、変異体ｍｔＤＮＡの選択的切断を含む、ｍｔＤＮＡの標的化された改変のための組成物および方法が本明細書に開示されている。
【００３９】
本発明は、任意の遺伝的起源のミトコンドリア病の処置および／または予防を必要とする被験体における、任意の遺伝的起源のミトコンドリア病の処置および／または予防のための、変異体ｍｔＤＮＡの選択的切断を含むがこれらに限定されないｍｔＤＮＡに対する遺伝的改変を想定する。ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ、１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃおよび／または１４７０９Ｃを含むがこれらに限定されない任意の変異体ｍｔＤＮＡが、ＤＮＡ結合ドメインによって標的とされ得る。
総論
【００４０】
方法の実施ならびに本明細書に開示されている組成物の調製および使用は、別段の記述がなければ、本分野の技術に属する、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連する分野における慣用技術を利用する。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的な改訂版；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９参照。
定義
【００４１】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、直鎖または環状立体構造の、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表す。本開示において、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものと解釈されるべきではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知の類縁体ならびに塩基、糖および／またはホスフェート部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含することができる。一般に、あるヌクレオチドの類縁体は、同じ塩基対合特異性を有する、すなわち、Ａの類縁体はＴと塩基対を形成する。
【００４２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために互換的に使用される。本用語は、１またはそれを超えるアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類縁体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００４３】
「結合」は、高分子間での（例えば、タンパク質と核酸間での）配列特異的な非共有相互作用を表す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的であることを必要とするわけではない（例えば、ＤＮＡ骨格中のホスフェート残基との接触）。このような相互作用は、一般的には、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）によって特徴づけられる。「親和性」は、結合の強度を表す、すなわち、増加した結合親和性はより低いＫｄと相関する。
【００４４】
「結合ドメイン」は、別の分子に非共有的に結合することができる分子である。結合分子は、例えば、ＤＮＡ分子（ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬエフェクタードメインタンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質またはシングルガイドＲＮＡ）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合分子の場合には、タンパク質結合分子は、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／または１もしくは複数の異なるタンパク質の１もしくはそれを超える分子に結合することができる。結合分子は、１種類を超える結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。したがって、人工ヌクレアーゼおよび転写因子のＤＮＡ結合成分を含むＤＮＡ結合分子には、ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよびｓｇＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域であってその構造が亜鉛イオンの配位を通じて安定化されている１またはそれを超えるジンクフィンガーを通じて、配列特異的な様式でＤＮＡを結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称される。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメインを含むことができる（ＺＦＮに対してはヌクレアーゼドメインまたはＺＦＰ−ＴＦに対しては転写制御ドメイン）。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語には、１つのＺＦＮの他、二量体化して標的遺伝子を切断するＺＦＮの対（左および右ＺＦＮとしても知られる第一および第二のＺＦＮを含む。）も含まれる。
【００４６】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１またはそれを超えるＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。１つの「反復単位」（「反復」とも称される。）は、典型的には３３〜３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号参照。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメインを含むことができる（ＴＡＬＥＮに対してはヌクレアーゼドメインまたはＴＡＬＥＮ−ＴＦに対しては転写制御ドメイン）。「ＴＡＬＥＮ」という用語には、１つのＴＡＬＥＮの他、二量体化して標的遺伝子を切断するＴＡＬＥＮの対（左および右ＴＡＬＥＮとしても知られる第一および第二のＴＡＬＥＮを含む。）も含まれる。
【００４７】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１またはそれを超えるアミノ酸を変更すること）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作する」ことができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的判定基準から生じる天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的判定基準としては、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計ならびに結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための置換規則およびコンピュータ化されたアルゴリズムの適用が挙げられる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；および同第８，５８５，５２６号参照；国際公開第９８／５３０５８号；同第９８／５３０５９号；同第９８／５３０６０号；同第０２／０１６５３６号および同第０３／０１６４９６号も参照。
【００４８】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その作製がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実証的過程から主として由来する天然に見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；同第８，５８６，５２６号；ならびに国際公開第９５／１９４３１号；同第９６／０６１６６号；同第９８／５３０５７号；同第９８／５４３１１号；同第００／２７８７８号；同第０１／６０９７０号；同第０１／８８１９７号；および同第０２／０９９０８４号を参照。
【００４９】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている原核生物のアルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓら、同書、Ｇ．Ｓｈｅｎｇら、（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，６５２）参照。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要とされる全ての成分である。
【００５０】
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含むがこれに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換の過程を表す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機序を介した細胞中での二本鎖切断の修復の間に起こるこのような交換の特殊化された形態を表す。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）のテンプレート修復のための「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の導入をもたらすので、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」と様々に称されている。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、このような導入は、切断された標的とドナーとの間で形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正および／または標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」および／または関連する過程を伴う場合がある。このような特殊化されたＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、しばしば、標的分子の配列の変化をもたらす。
【００５１】
本開示の方法では、本明細書に記載されている１またはそれを超える標的とされるヌクレアーゼは、所定の部位に、標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作出する。ＤＳＢは、相同組換え修復によってまたは非相同組換え修復機序によって、欠失および／または挿入をもたらし得る。欠失は、任意の数の塩基対を含み得る。同様に、挿入は、例えば、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を必要に応じて有する「ドナー」ポリヌクレオチドの組み込みなど、任意の数の塩基対を含み得る。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介した切断の修復のためのテンプレートとして使用され、ドナー中などのヌクレオチド配列の全部または一部の細胞クロマチン中への導入をもたらす。したがって、細胞のクロマチン中の第一の配列は変化させることができ、ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へ変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報的な意味での配列の置換）を表すと理解することができ、あるポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換を必ずしも必要としない。
【００５２】
本明細書に記載されている方法のいずれにおいても、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のさらなる対を使用することができる。
【００５３】
本明細書に記載されている方法のいずれも、任意のサイズのドナーの挿入のために、および／または関心対象の遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的化された組み込みによる細胞中の１もしくはそれを超える標的配列の部分的なもしくは完全な不活化のために使用することができる。部分的にまたは完全に不活化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
【００５４】
本明細書に記載されている方法のいずれにおいても、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、関心対象の領域中のゲノム配列に相同であるが同一ではない配列を含有することができ、これにより、関心対象の領域中に非同一配列を挿入するために相同組換えを刺激する。したがって、ある実施形態において、関心対象の領域中の配列に相同であるドナー配列の部分は、置換されるゲノム配列と約８０〜９９％（またはその間にある任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態において、例えば、ドナーと１００を超える連続する塩基対のゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なれば、ドナーとゲノム配列との間の相同性は９９％より高い。ある事例では、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が関心対象の領域中に導入されるように、関心対象の領域中に存在しない配列を含有することができる。これらの例では、非相同配列は、一般に、関心対象の領域中の配列と相同または同一である、５０〜１，０００塩基対（またはこの間にある任意の整数値）または１，０００より大きい任意の数の塩基対の配列に挟まれている。他の実施形態において、ドナー配列は第一の配列に対して非相同であり、非相同組換え機序によってゲノム中に挿入される。
【００５５】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を表す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むがこれらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または粘着末端のいずれかの生成をもたらすことができる。ある実施形態において、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために、融合ポリペプチドが使用される。
【００５６】
「切断半ドメイン」は、第二のポリペプチド（同一のまたは異なる）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第一および第二の切断半ドメイン；」「＋および−切断半ドメイン」および「右および左切断半ドメイン」は、二量体化する切断半ドメインの対を表すために互換的に使用される。
【００５７】
「操作された切断半ドメイン」は、別の切断半ドメイン（例えば、別の操作された切断半ドメイン）との絶対ヘテロ二量体を形成するように改変された切断半ドメインである。米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号も参照、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５８】
用語「配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖、環状または分岐であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る任意の長さのヌクレオチド配列を表す。用語「ドナー配列」は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を表す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１００，０００，０００ヌクレオチドの長さ（またはこれらの間またはこれらの上にある任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１００，０００ヌクレオチドの長さ（またはこれらの間にある任意の整数）、より好ましくは、約２０００〜２０，０００ヌクレオチドの長さ（またはこれらの間にある任意の値）、さらに好ましくは約５〜１５ｋｂ（またはこれらの間にある任意の値）であり得る。
【００５９】
「クロマチン」は、細胞のゲノムを含む核タンパク質構造物である。細胞のクロマチンは、核酸、主にＤＮＡと、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質とを含む。真核生物の細胞のクロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のそれぞれ２つを含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じた可変の長さの）リンカーＤＮＡが、ヌクレオソームコアの間に広がる。ヒストンＨ１の分子が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示において、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方のあらゆる種類の細胞の核タンパク質を包含するものとする。細胞のクロマチンには、染色体のクロマチンとエピソームのクロマチンが両方含まれる。
【００６０】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合であるその核型によって、しばしば特徴付けられる。細胞のゲノムは、１またはそれを超える染色体を含むことができる。
【００６１】
「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体または他の構造物である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある種のウイルスのゲノムが挙げられる。
【００６２】
「接近可能な領域」は、標的部位を認識する外因性分子によって、核酸中に存在する標的部位を結合することができる、細胞のクロマチン中の部位である。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、接近可能な領域は、ヌクレオソームの構造へとパッケージされない領域であると考えられる。接近可能な領域の特徴的な構造は、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感度によって、しばしば検出することができる。
【００６３】
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在するのに十分な条件が与えられれば、結合分子が結合する核酸の部分を規定する核酸配列である。標的部位は、任意の長さ、例えば、９〜２０またはそれを超えるヌクレオチドであり得、長さおよび結合されるヌクレオチドは連続的または非連続的であり得る。
【００６４】
「外因性」分子は、細胞中に通常存在しないが、１またはそれを超える遺伝学的、生化学的またはその他の方法によって細胞中に導入することができる分子である。「細胞中での通常の存在」は、細胞の具体的な発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成体の筋肉細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能しない内在性分子の機能するバージョンまたは正常に機能する内在性分子の機能しないバージョンを含むことができる。
【００６５】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるような小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体もしくは上記分子の１つまたはそれより多くを含む任意の複合体などの高分子であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖、分岐または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二本鎖を形成することができる核酸の他、三本鎖を形成する核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化されたＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
外因性分子は、内在性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソームまたは細胞中に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞中に外因性分子を導入する方法は当業者に公知であり、脂質によって媒介される導入（すなわち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介される導入およびウイルスベクターによって媒介される導入が含まれるが、これらに限定されない。外因性分子は、内在性分子と同じ種類の分子であるが、細胞が由来する種とは異なる種にも由来し得る。例えば、マウスまたはハムスターから当初得られた細胞株中に、ヒト核酸配列が導入され得る。
【００６７】
これに対して、「内在性」分子は、特定の環境条件下において、特定の発達段階で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア葉緑体もしくはその他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム性核酸を含むことができる。さらなる内在性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を挙げることができる。
【００６８】
本明細書において使用される「外因性核酸の産物」という用語には、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。
【００６９】
「融合」分子は、２つまたはそれを超えるサブユニット分子が、好ましくは共有結合で、連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的種類の分子とすることができ、または異なる化学的種類の分子とすることができる。融合分子の第一の種類の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと１またはそれを超える活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。融合分子の第二の種類の例としては、三本鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
細胞中での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達の結果または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達の結果生じることができ、ここで、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結も、細胞中でのタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の他の箇所に提示されている。
【００７１】
本開示において「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）の他、そのような制御配列がコード配列および／または転写された配列に隣接しているか否かを問わず、遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００７２】
「遺伝子発現」は、遺伝子中に含有されている情報の、遺伝子産物への変換を表す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００７３】
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性の変化を表す。発現のモジュレーションとしては、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。発現をモジュレートするために、ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活化、ランダム変異）を使用することができる。遺伝子不活化は、本明細書に記載されているＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した、遺伝子発現の任意の低下を表す。したがって、遺伝子不活化は、部分的または完全であり得る。
【００７４】
「関心対象の領域」は、外因性分子を結合することが望ましい細胞のクロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えを目的とすることができる。関心対象の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染性ウイルスゲノム中に存在することができる。関心対象の領域は、遺伝子のコード領域内に、転写された非コード領域内に、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの中に、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかにある非転写領域内に存在し得る。関心対象の領域は、単一のヌクレオチド対と同じ小ささであり得、または最大２，０００ヌクレオチド対の長さであり得、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００７５】
「真核生物の」細胞としては、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるがこれらに限定されず、幹細胞（多能性および複能性）が含まれる。
【００７６】
「機能的な連結」および「機能的に連結された」（または「動作可能に連結された」）という用語は、両成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが、少なくとも１つの他の成分に対して発揮される機能を媒介することができる可能性を許容するように成分が配置されている２またはそれを超える成分（配列要素など）の並置に関して互換的に使用される。例として、１またはそれを超える転写制御因子の存在または不存在に応答して、転写制御配列がコード配列の転写のレベルを調節すれば、プロモーターなどの転写制御配列はコード配列に機能的に連結されている。転写制御配列は、一般的に、コード配列とシスに機能的に連結されるが、コード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえ連続していなくても、コード配列に機能的に連結される転写制御配列である。
【００７７】
融合ポリペプチドに関して、「機能的に連結された」という用語は、成分のそれぞれが他の成分と連結されていない場合と同様に、成分のそれぞれが他の成分と連結されて同じ機能を実行するという事実を表すことができる。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏもしくはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することを可能にしながら、融合ポリペプチド中において、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することが可能であれば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインは機能的に連結されている。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏもしくはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドの場合、切断ドメインが標的部位の近傍のＤＮＡを切断することを可能にしながら、融合ポリペプチド中において、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することが可能であれば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは機能的に連結されている。
【００７８】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能をなお保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子より多い、より少ないもしくは同じ数の残基を有することができ、および／または１もしくはそれを超えるアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸配列とハイブリッドを形成する能力）を決定する方法は、本分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動の移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは相補性によって、遺伝学的および生化学的の両方で決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号および国際公開第９８／４４３５０号を参照。
【００７９】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、関心対象の遺伝子の発現を誘導することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、本用語は、クローニング、および発現媒体ならびに組み込みベクターを含む。
【００８０】
「被験体」および「患者」という用語は互換的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよびその他の動物などの実験動物を表す。したがって、本明細書において使用される「被験体」または「患者」という用語は、本発明のヌクレアーゼ、ドナーおよび／または遺伝子改変された細胞を投与することができる任意の哺乳動物の患者または被験体を意味する。本発明の被験体には、障害を有する被験体が含まれる。
【００８１】
「幹細胞性」は、幹細胞様の様式で行動する任意の細胞の相対的能力、すなわち、任意の特定の幹細胞が有し得る、全能性、多能性または寡能性の程度および拡大したまたは無限の自己再生を表す。
「ＡＣＴＲ」は、外来的に供給された抗体に結合することが可能な操作されたＴ細胞成分である抗体結合型Ｔ細胞受容体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。ＡＣＴＲ成分への抗体の結合は、抗体によって認識される抗原と相互作用するようにＴ細胞を強化し、抗原に遭遇したときに、ＡＣＴＲを含むＴ細胞は、抗原と相互作用するよう誘発される（米国特許出願公開第２０１５／０１３９９４３号参照）。
融合分子
【００８２】
細胞中のｍｔＤＮＡ中の選択された標的遺伝子の切断に有用である組成物、例えば、ヌクレアーゼが本明細書に記載されている。
【００８３】
ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）またはＴＡＬエフェクタードメイン（「ＴＡＬＥ」）由来のＤＮＡ結合ドメインと、全て標的ＤＮＡ部位に特異的に結合するように設計されている、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼとを含む組換え転写因子は、内在性遺伝子の遺伝子発現を制御する能力を有しており、ゲノム工学、遺伝子治療およびミトコンドリア障害の処置において有用である。例えば、それらの内容の全体があらゆる目的のために参照により組み込まれる、米国特許第９，３９４，５４５号；同第９，１５０，８４７号；同第９，２０６，４０４号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９３６，９３６号；同第８，９４５，８６８号；同第８，８７１，９０５号；同第８，５８６，５２６号；同第８，５６３，３１４号；同第８，３２９，９８６号；同第８，３９９，２１８号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／００６３２３１号；同第２００８／０１５９９９６号；同第２０１０／０２１８２６４号；同第２０１２／００１７２９０号；同第２０１１／０２６５１９８号；同第２０１３／０１３７１０４号；同第２０１３／０１２２５９１号；同第２０１３／０１７７９８３号；同第２０１３／０１７７９６０号；および同第２０１５／００５６７０５号を参照。さらに、アルゴノート系（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから得られる、Ｓｗａｒｔｓら、（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９１）：２５８−２６１参照）に基づいて、標的化されたヌクレアーゼが開発されており、同じく、ゲノム編集および遺伝子治療において使用できる潜在性を有し得る。
【００８４】
ヌクレアーゼによって媒介される遺伝子治療は、（例えば、導入遺伝子挿入を介して、および／または内在性配列の修正を介して）１もしくはそれを超える不活化された遺伝子を有するように、および／またはその細胞中で以前には産生されていなかった産物をその細胞に発現させるように、細胞を遺伝的に操作するために使用することができる。導入遺伝子挿入の使用の例としては、１もしくはそれを超える新規治療用タンパク質をコードする１もしくはそれを超える遺伝子の挿入、細胞中でもしくは個体中で欠如しているタンパク質をコードするコード配列の挿入、変異された遺伝子配列を含有する細胞中での野生型遺伝子の挿入、および／またはｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの構造核酸をコードする配列の挿入が挙げられる。内在性遺伝子配列の「修正」の有用な応用の例としては、疾患関連遺伝子変異の改変、ヘテロプラスミーのシフト、スプライス部位をコードする配列中の改変、制御配列中の改変およびタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的化された改変が挙げられる。導入遺伝子構築物は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって駆動されるプロセス中の末端捕捉のいずれかによって挿入することができる。例えば、米国特許第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第７，８８８，１２１号；および同第８，７０３，４８９号参照。
【００８５】
これらの操作された転写因子およびヌクレアーゼを使用する臨床試験は、これらの分子が、がん、ＨＩＶおよび／または血液障害（異常ヘモグロビン症および／または血友病など）を含む様々な状態を処置することが可能であることを示した。例えば、Ｙｕら、（２００６）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０：４７９−４８１；Ｔｅｂａｓら、（２０１４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０（１０）：９０１参照。したがって、これらのアプローチは、疾患の処置のために使用することができる。
【００８６】
ある実施形態において、融合分子の１またはそれを超える成分（例えば、ヌクレアーゼ）は天然に存在する。他の実施形態において、融合分子の成分（例えば、ヌクレアーゼ）の１またはそれより多くは、天然に存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合分子および／または切断ドメイン中において操作されている。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合部分は、選択された標的部位に結合するように改変され得る（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のシングルガイドＲＮＡまたは同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されているメガヌクレアーゼ）。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。したがって、本発明の実施においては、標的遺伝子を切断し、その切断が標的遺伝子のゲノム改変をもたらす（例えば、切断された遺伝子中への挿入および／または欠失）、少なくとも１つのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼなどを含むがこれらに限定されない任意のヌクレアーゼが使用され得る。
【００８７】
ヌクレアーゼ複合体の操作された切断半ドメインパートナーの独立した滴定を通じて切断活性の特異性を増加させる方法も本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、２つのパートナー（半切断ドメイン）の比は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０または１：２０の比またはこれらの間にある任意の値で与えられる。他の実施形態において、２つのパートナーの比は、１：３０より大きい。他の実施形態において、２つのパートナーは、１：１とは異なるように選択された比で配置される。個別にまたは組み合わせて使用される場合、本発明の方法および組成物は、標的以外の切断活性の低下を介して、標的特異性の驚くべき、予想外の増加を与える。これらの実施形態において使用されるヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓおよびＴｔＡｇｏならびにこれらの任意の組み合わせを含み得る。
Ａ．ＤＮＡ結合分子
【００８８】
本明細書に記載されている融合分子は、タンパク質ドメインおよび／またはポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインを含む任意のＤＮＡ結合分子（ＤＮＡ結合ドメインとも称される。）を含むことができる。ある実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、９〜１８またはそれを超えるヌクレオチドの標的部位に結合し、標的部位は１またはそれを超える変異体ｍｔＤＮＡを含む。変異は、点変異、例えば、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ変異を含む標的部位であり得る。
【００８９】
ある実施形態において、本明細書に記載されている組成物および方法は、ドナー分子に結合するためにおよび／または細胞のゲノム中の関心対象の領域に結合するために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを利用する。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーという４つのファミリーに分けられる。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号および同第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎら、（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４‐２２８；Ｇｉｍｂｌｅら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔら、（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位を結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔら、（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈら、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓら、（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６；および米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号を参照。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ全体との関係で改変され得（すなわち、ヌクレアーゼが、同族切断ドメインを含むように）、または異種の切断ドメインに融合され得る。
【００９０】
他の実施形態において、本明細書に記載されている方法および組成物において使用されるヌクレアーゼの１またはそれより多くのＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な農作物に多くの疾患を引き起こすことが知られている。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞中に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質としては、植物の転写活性因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを巧みに操作する（manipulate）転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Ｋａｙら、（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく性質決定されたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａから得られるＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら、（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：１２７−１３６および国際公開第２０１０／０７９４３０号参照）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中型ドメイン（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）を含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、ＴＡＬエフェクターは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説として、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  ら、（２００６）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６‐２７２を参照）。さらに、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００において、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であるｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子が見出された（Ｈｅｕｅｒら、（２００７）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９‐４３８４を参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いと９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかしながら、両遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照。
【００９１】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピート中に見出される配列に依存する。反復される配列はおよそ１０２ｂｐを含み、リピートは、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。リピートの多型は、通常、１２および１３位に位置し、１２および１３位における超可変二残基（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）（ＲＶＤ）の同一性と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の連続するヌクレオチドの同一性との間には１対１の対応が存在するとみられる（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１およびＢｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９‐１５１２を参照）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードが決定されており、１２および１３位におけるＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合する。新しい配列と相互作用し、植物細胞中で非内在性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工の転写因子を作るために、これらのＤＮＡ結合リピートは、新しいリピートの組み合わせおよび数を有するタンパク質に組み立てられた（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断半ドメインに連結して、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）が得られた。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照。ある実施形態において、ＴＡＬＥドメインは、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されているようなＮキャップおよび／またはＣキャップを含む。
【００９２】
ある実施形態において、細胞のゲノムのインビボ切断および／または標的化切断のために使用されるヌクレアーゼの１またはそれより多くのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択した標的部位に結合するように操作されている点で天然には存在しない。例えば、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏら、（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌら、（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏら、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照。
【００９３】
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新しい結合特異性を有することができる。操作する方法としては、合理的な設計および様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的な設計としては、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個別の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含み、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列を結合するジンクフィンガーの１またはそれを超えるアミノ酸配列と関連付けられているデータベースを使用することが挙げられる。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照。
【００９４】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法が、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際公開第９８／３７１８６号；同第９８／５３０５７号；同第００／２７８７８号；同第０１／８８１９７号；および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化が、例えば、共有の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００９５】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれを超えるアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の適切なリンカー配列を用いて一緒に連結され得る。６またはそれを超えるアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【００９６】
ＺＦＰは、ＺＦＮを形成するために、１またはそれを超えるヌクレアーゼ（切断）ドメインに、動作可能に会合（連結）させることができる。用語「ＺＦＮ」は、二量体を形成して標的遺伝子を切断するＺＦＮの対を含む。方法および組成物は、オフターゲット部位として知られる他の意図されない切断部位に比べて、その意図する標的に対するヌクレアーゼ対を含むＺＦＮの特異性を増加させるために使用することもできる（米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号参照）。したがって、本明細書に記載されているヌクレアーゼは、そのＤＮＡ結合ドメイン骨格領域の１もしくはそれより多くの中に変異を含むことができ、および／またはそのヌクレアーゼ切断ドメイン中に１もしくはそれを超える変異を含むことができる。これらのヌクレアーゼは、ＤＮＡ骨格上のホスフェートと非特異的に相互作用することができるＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン（「ＺＦＰ骨格」）内にアミノ酸に対する変異を含むことができるが、ＤＮＡ認識ヘリックス中には変化を含まない。したがって、本発明は、ヌクレオチド標的特異性にとって必要とされない、ＺＦＰ骨格中の陽イオン性アミノ酸残基の変異を含む。いくつかの実施形態において、ＺＦＰ骨格中のこれらの変異は、陽イオン性アミノ酸残基を中性または陰イオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。いくつかの実施形態において、ＺＦＰ骨格中のこれらの変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることを含む。好ましい実施形態において、変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して位置（−５）、（−９）および／または位置（−１４）に作られる。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーは、（−５）、（−９）および／または（−１４）に１またはそれを超える変異を含み得る。さらなる実施形態において、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質中の１またはそれを超えるジンクフィンガーは、（−５）、（−９）および／または（−１４）に変異を含み得る。いくつかの実施形態において、（−５）、（−９）および／または（−１４）におけるアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）へ変異される。
【００９７】
いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）は、野生型と比較して、変異体ｍｔＤＮＡを優先的に標的とする。対を成すヌクレアーゼにおいて、１つのＤＮＡ結合ドメインは野生型配列を標的とし得、他のＤＮＡ結合ドメインは変異体配列を標的とし得る。または、ＤＮＡ結合ドメインの両方が、野生型または変異体配列を標的とし得る。ある実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、表２に示されている変異体ｍｔＤＮＡ（例えば、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ）中の部位（９〜１８またはそれを超えるヌクレオチド）を標的とする。他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、以下の変異：１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃまたは１４７０９Ｃの１もしくはそれより多くを含む変異体ｍｔＤＮＡ中の配列を標的とする。
【００９８】
標的部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築の方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ならびに国際公開第９５／１９４３１号；同第９６／０６１６６号；同第９８／５３０５７号；同第９８／５４３１１号；同第００／２７８７８号；同第０１／６０９７０号；同第０１／８８１９７号；同第０２／０９９０８４号；同第９８／５３０５８号；同第９８／５３０５９号；同第９８／５３０６０号；同第０２／０１６５３６号；および同第０３／０１６４９６号に詳しく記載されている。
【００９９】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれを超えるアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の適切なリンカー配列を用いて一緒に連結され得る。６またはそれを超えるアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【０１００】
ある実施形態において、ＤＮＡ結合分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号およびに米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号を参照。系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａら、（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａら、（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  １：７；Ｈａｆｔら、（２００５）ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組み合わせの他、ＣＲＩＳＰＲによって媒介される核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡ要素を含有する。
【０１０１】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく性質決定された系の１つであり、４つの連続するステップで、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を行う。第一に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイとｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリッド形成し、各スペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第三に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的認識のためにさらに必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にある標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間でのワトソンクリック塩基対合を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ９を誘導する。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作出する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、（ｉ）「アダプテーション」と呼ばれるプロセスでの、将来の攻撃を防ぐための、ＣＲＩＳＰＲアレイ中への外来ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現ならびにアレイの発現およびプロセシングに続く（ｉｉｉ）ＲＮＡによって媒介される外来核酸の干渉という３つのステップから構成される。したがって、細菌の細胞中では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、外来ＤＮＡなどの挿入のような機能において役割を果たす。
【０１０２】
ある実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」とは、天然配列ポリペプチドと共通する質的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」としては、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が挙げられるが、これらに限定されず、但し、これらは、対応する天然配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有する。本明細書において想定される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片へ加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾（covalent modifications）およびこれらの融合物のいずれをも包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体としては、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合的修飾が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から取得可能であり得、または化学的にもしくはこれら２つの手順の組み合わせによって合成され得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であり得、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内在性Ｃａｓタンパク質を産生するようにもしくは内在性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする外因性に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であり得る。いくつかの事例において、細胞は、天然にはＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介して送達するための小さなＣａｓ９オルソログである（Ｒａｎら、（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５１０，ｐ．１８６）。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合分子は、ＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓら、同書；Ｓｈｅｎｇら、同書を参照）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、アルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは、小さな（１９〜３１ヌクレオチド）ＲＮＡに結合される。このタンパク質‐ＲＮＡサイレンシング複合体は、小さなＲＮＡと標的との間でのワトソン‐クリック塩基対形成を介して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的に切断する（Ｖｏｇｅｌ（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４：９７２‐９７３）。これに対して、原核生物のＡｇｏタンパク質は、小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、おそらく、外来の（多くの場合、ウイルスの）ＤＮＡを検出し、除去するように機能する（Ｙｕａｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９，４０５；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら（２０１３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５１，５９４；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。例示的な原核生物のＡｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものが挙げられる。
【０１０４】
最もよく性質決定された原核生物のＡｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものである（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を有する１５ヌクレオチドまたは１３〜２５ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏによって結合されるこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質‐ＤＮＡ複合体が、サードパーティ分子中のワトソン‐クリック相補的ＤＮＡ配列を結合するように導く役割を果たす。これらのガイドＤＮＡ中の配列情報が標的ＤＮＡの特定を可能にすると、ＴｔＡｇｏ‐ガイドＤＮＡ複合体は標的ＤＮＡを切断する。このような機序は、その標的ＤＮＡに結合している間のＴｔＡｇｏ‐ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（Ｇ．Ｓｈｅｎｇら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖら、同書）。
【０１０５】
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質上にロードすることができる（Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって誘導されるので、研究者が指定した外因性ガイドＤＮＡとともに形成されたＴｔＡｇｏ‐ＤＮＡ複合体は、したがって、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を、研究者が指定した相補的な標的ＤＮＡに誘導する。このようにして、標的化された二本鎖切断をＤＮＡ中に作出し得る。ＴｔＡｇｏ‐ガイドＤＮＡ系（または他の生物に由来するオルソロガスなＡｇｏ‐ガイドＤＮＡ系）を使用することにより、細胞内でのゲノムＤＮＡの標的化切断が可能になる。このような切断は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断については、哺乳動物細胞中での発現に関してコドン最適化されたバージョンのＴｔＡｇｏを使用することが好ましいであろう。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞透過性ペプチドに融合される場合には、インビトロで形成されたＴｔＡｇｏ‐ＤＮＡ複合体で細胞を処理することが恐らく好ましい。さらに、変異誘発を介して３７℃において改善された活性を有するように改変されたバージョンのＴｔＡｇｏタンパク質を使用することが恐らく好ましい。Ａｇｏ‐ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ切断を活用するための本分野における標準的な技術を用いて、遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子修正、標的化された遺伝子欠失を含む多数の結果をもたらすために使用する可能性がある。
【０１０６】
したがって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）をその中に挿入することが所望される任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合する点で、ＤＮＡ結合分子を含む。
Ｂ．切断ドメイン
【０１０７】
ヌクレアーゼを形成するために、任意の適切な切断ドメインをＤＮＡ結合ドメインに機能的に連結することができる。例えば、様々な生物中でゲノム改変において使用するなどのために、その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを通じてその意図される核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位の近くでＤＮＡが切断されるようにすることができる機能的実体であるＺＦＮを作製するために、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼドメインに融合されてきた。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号；ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号を参照。同様に、ＴＡＬＥＮを作製するために、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼドメインに融合されてきた。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号参照。
【０１０８】
上記のように、切断ドメインはＤＮＡ結合ドメインに対して異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってもよい、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメインまたはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインであってもよい。異種の切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得することができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；緑豆ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮＡアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。切断ドメインおよび切断半ドメインの供給源として、これらの酵素（またはその機能的断片）の１つまたはそれより多くを使用することができる。
【０１０９】
同様に、切断半ドメインは、上述のように、切断活性のために二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合には、２つの融合タンパク質が切断のために必要とされる。または、２つの切断半ドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断半ドメインは、同一のエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することができ、または各切断半ドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することができる。さらに、好ましくは、２つの融合タンパク質に対する標的部位は、２つの融合タンパク質がそれぞれの標的部位に結合することにより、切断半ドメインが例えば二量体化によって機能的切断ドメインを形成することが可能な互いに対しての空間的方向に切断半ドメインを置くように、互いに関して配置される。したがって、ある実施形態において、標的部位の端部付近は、５〜８ヌクレオチドによってまたは１５〜１８ヌクレオチドによって隔てられる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在することができる（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれを超える）。一般に、切断の部位は標的部位の間に位置する。
【０１１０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在しており、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異的結合および結合の部位またはその近くにおけるＤＮＡの切断が可能である。ある種の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位においてＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインと切断ドメインとを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号；および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍら、（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍら、（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（または切断半ドメイン）と１またはそれを超えるジンクフィンガー結合ドメインとを含み、これらは操作されてもよく、操作されなくてもよい。
【０１１１】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５；１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示において、開示された融合タンパク質中で使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断半ドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用する標的化された二本鎖切断および／または細胞配列の標的化された置換のために、それぞれがＦｏｋＩ切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質を、触媒的に活性を有する切断ドメインを再構成するために使用することができる。または、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する単一のポリペプチド分子も使用することができる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を用いる標的化された切断および標的化された配列改変のためのパラメータは、本開示の他の箇所に提供されている。
【０１１２】
切断ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【０１１３】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインと切断ドメインを含有し、これらは本開示によって想定される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照。
【０１１４】
ある実施形態において、切断ドメインは、例えば、その全ての開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号；ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号に記載されているように、ホモ二量体化を最小限にするまたは抑止する１またはそれを超える操作された切断半ドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される。）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断半ドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。
【０１１５】
ある実施形態において、操作された切断半ドメインはＦｏｋＩに由来し、以下に示されているように、野生型ＦｏｋＩ切断半ドメイン（完全長ＦｏｋＩの残基３９４〜５７９）に対して付番されたアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５の１またはそれより多くの中に１またはそれを超える変異を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号参照）。
野生型ＦｏｋＩ切断半ドメイン（配列番号１）
QLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF
【０１１６】
これらの変異は、ＦｏｋＩドメインとＤＮＡ分子間の非特異的相互作用を減少させる。他の実施形態において、ＦｏｋＩに由来する切断半ドメインは、アミノ酸残基４１４〜４２６、４４３〜４５０、４６７〜４８８、５０１〜５０２および／または５２１〜５３１の１つまたはそれより多くの中に変異を含む。これらの変異には、ＦｏｋＩと相同な天然の制限酵素中に見出される残基に対する変異が含まれ得る。ある実施形態において、変異は、置換、例えば、異なるアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）での野生型残基の置換、例えば、Ｒ４１６ＳまたはＫ５２５Ｓである。好ましい実施形態において、４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５位における変異は、無電荷のアミノ酸または負に帯電したアミノ酸での正に帯電したアミノ酸の置換を含む。別の実施形態において、操作された切断半ドメインは、１またはそれを超えるアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８または５２５中の変異に加えて、アミノ酸残基４９９、４９６および４８６中に変異を含む。好ましい実施形態において、本発明は、操作された切断半ドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８または５２５位の１またはそれを超える変異に加えて、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置換されており、４９９位の野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置換されており、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置換されている（「ＥＬＤ」または「ＥＬＥ」）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【０１１７】
１を超える変異、例えば、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と表記される操作された切断半ドメインを作製するための、１つの切断半ドメイン中における４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）での変異を有する切断ドメインは、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と表記される操作された切断半ドメインを作製するために、別の切断半ドメイン中に４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させることによって使用される；４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）もしくはＧｌｕ（Ｅ）残基で置換する変異（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される。）；４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番されている。）に変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基もしくはＡｒｇ（Ｒ）で置換する変異（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される。）を含む操作された切断半ドメイン；ならびに／または操作された切断半ドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番されている。）を含み、操作された切断半ドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番されている。）に変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基もしくはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される。）を含む。例えば、それらの開示の全体があらゆる目的のために参照により組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号を参照。別の実施形態において、操作された切断半ドメインは、「シャーキー」および／または「シャーキー」変異を含む（Ｇｕｏら、（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６−１０７を参照）。
【０１１８】
または、ヌクレアーゼは、いわゆる、「開裂酵素（ｓｐｌｉｔ−ｅｎｚｙｍｅ）」技術を用いて、核酸標的部位において、インビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８１６４号参照）。このような開裂酵素の成分は、別個の発現構築物上で発現され得、または、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって、各成分が隔てられている１つの読み取り枠中に連結することができる。成分は、個別のジンクフィンガードメインであり得、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１１９】
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されているような酵母を基礎とする染色体系中で、使用前に、活性に関してスクリーニングすることができる。
【０１２０】
Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって介在されたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイという２つのＲＮＡ非コード成分を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム工学を実現するためには、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら、（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ１２３１１４３参照）。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物を介してまたは別個のＲＮＡとして供給される。他の実施形態において、キメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（シングルガイドＲＮＡとも名付けられる。）を作製するために、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されているキメラＲＮＡが構築される。（Ｊｉｎｅｋら、（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１；Ｊｉｎｅｋら、（２０１３）ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４７１．ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．００４７１  ａｎｄ  Ｃｏｎｇ、同書参照）。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系が使用される。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属種中で同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞中で強固なＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系である。機能的に保存されているが、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性など、多くの面で異なる（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄら、（２０１５）Ｇｅｎｏｍ  Ｂｉｏ１６：２５１参照）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との主な差異は、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを使用せず、したがって、ｃｒＲＮＡのみを必要とすることである。ＦｎＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、４２〜４４ヌクレオチド（１９ヌクレオチドリピートおよび２３〜２５ヌクレオチドスペーサー）であり、二次構造を保持する配列変化を許容する単一ステムループを含有する。さらに、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって必要とされる約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡより有意に短く、ＦｎＣｐｆＩのＰＡＭ要求性は、置換された鎖上での５’−ＴＴＮ−３’および５’−ＣＴＡ−３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１はいずれも標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を作るが、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端化された切断を作るために、そのＲｕｖＣ様およびＨＮＨ様ドメインを使用するのに対して、Ｃｐｆ１は、シードの外側に互い違いの切断を生成するために、ＲｕｖＣ様ドメインを使用する。Ｃｐｆ１は、互い違いの切断を重要なシード領域から離れて作るので、ＮＨＥＪは標的部位を崩壊させず、したがって、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで、Ｃｐｆ１は同じ部位を確実に切断し続けることができる。したがって、本明細書に記載されている方法および組成物において、「Ｃａｓ」という用語は、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１タンパク質の両方を含むことが理解される。したがって、本明細書において使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の両方を表し、ヌクレアーゼおよび／または転写因子系の両方を含む。
標的部位
【０１２２】
上に詳しく記載されているように、ＤＮＡ結合ドメインは、選択した任意の配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して新しい結合特異性を有することができる。
【０１２３】
ヌクレアーゼ（複数可）は、ある実施形態において、任意の野生型または変異体ｍｔＤＮＡ配列を標的とすることができ、ヌクレアーゼは、変異体ｍｔＤＮＡ、例えば、１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃもしくは１４７０９Ｃまたは表２に示されている標的部位などの、変異体ｍｔＤＮＡ配列を包含する９〜２５またはそれを超えるヌクレオチドの標的部位（連続または非連続）を選択的に標的とする。
【０１２４】
本明細書の教示に従ったこのような発現カセットの構築は、分子生物学の分野において周知の方法論を使用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓ参照）。トランスジェニック動物を作製するために発現カセットを使用する前に、適切な細胞株（例えば、初代細胞、形質転換された細胞または不死化された細胞株）中に発現カセットを導入することによって、選択された調節要素を伴うストレス誘導因子に対する発現カセットの応答性を試験することができる。
【０１２５】
さらに、発現のために必要とされないが、外因性配列は、転写または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、ハンマーヘッド型リボザイム、標的化ペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルでもあり得る。さらに、関心対象の遺伝子の調節要素は、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作製するために、レポーター遺伝子に動作可能に連結することができる。
【０１２６】
非コード核酸配列の標的化された挿入も達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列も、標的化された挿入のために使用され得る。
【０１２７】
さらなる実施形態において、ドナー核酸は、さらなるヌクレアーゼ設計に対する特異的な標的部位である非コード配列を含み得る。引き続いて、元のドナー配列が切断され、関心対象の別のドナー分子の挿入によって改変されるように、さらなるヌクレアーゼを細胞中で発現させ得る。このようにして、ドナー分子の反復組み込みが生成され得、関心対象の特定の遺伝子座におけるまたはセーフハーバー遺伝子座における形質スタッキングを可能にする。
細胞
【０１２８】
したがって、遺伝子改変されたｍｔＤＮＡ遺伝子を含む遺伝子改変された細胞が本明細書において提供される。ある実施形態において、改変は、ヘテロプラスミー比ｍｔＤＮＡが変更されるような変異体ｍｔＤＮＡの切断を含む。ある実施形態において、変異体ｍｔＤＮＡは、ミトコンドリア障害と関連する障害または症状が処置および／または予防されるように、１またはそれを超えるミトコンドリア障害を有する患者中で切断される。ヌクレアーゼは、任意の変異体ｍｔＤＮＡを差次的に結合および切断し得、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔなどの点変異での結合が含まれるが、これに限定されない。
【０１２９】
ランダム切断とは異なり、標的化された切断では、例えば、ＤＮＡ結合ドメインが変異配列に結合し、変異体形態に対して特異性を示すようにヌクレアーゼが設計されている場合に、野生型と比べて、ｍｔＤＮＡの変異体形態が優先的に切断されることが確保される。
【０１３０】
細胞および細胞株を含むがこれらに限定されない任意の細胞種を、本明細書に記載されているとおりに、遺伝子改変することができる。改変されたｍｔＤＮＡを含有する細胞の他の非限定的な例としては、心臓細胞、脳細胞、肺細胞、肝細胞、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）；樹状細胞；Ｂ細胞；自家（例えば、患者由来）または異種の多能性、全能性または複能性幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞など）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に記載されている細胞は、患者由来のＣＤ３４＋細胞である。
【０１３１】
本明細書に記載されている細胞は、例えば、インビボまたはエクスビボ治療によって、障害を有する被験体中のミトコンドリア病を処置および／または予防する上で有用である。エクスビボ治療のために、ヌクレアーゼ改変された細胞を増加させ、次いで、標準的な技術を用いて患者中に再導入することができる。例えば、Ｔｅｂａｓら、（２０１４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０（１０）：９０１を参照。幹細胞の場合には、被験体中に注入後に、野生型（疾患）細胞と比べて変更されたヘテロプラスミー比を有するｍｔＤＮＡを発現する細胞へのこれらの前駆体のインビボでの分化が生じる。本明細書に記載されている細胞を含む医薬組成物も提供される。さらに、細胞は、患者への投与前に凍結保存され得る。
【０１３２】
本明細書に記載されている細胞およびエクスビボ方法は、被験体（例えば、哺乳動物の被験体）中の障害（例えば、ミトコンドリア障害）の処置および／または予防を提供し、継続的な予防的医薬品投与または同種異系間骨髄移植またはガンマレトロウイルスの送達などの危険性のある手法の必要性をなくす。このため、本明細書に記載されている発明は、より安全な、費用対効果が高く、時間的に効率なミトコンドリア障害を処置および／または予防する方法を提供する。
送達
【０１３３】
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドおよび本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適切な手段によって送達され得る。ある実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーはインビボで送達される。他の実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、患者へのエクスビボ送達において有用な改変された細胞を与えるために、単離された細胞（例えば、自家または異種幹細胞）に送達される。
【０１３４】
本明細書に記載されているヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、それらの全ての開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号：同第６，５０３，７１７号：同第６，５３４，２６１号：同第６，５９９，６９２号：同第６，６０７，８８２号：同第６，６８９，５５８号：同第６，８２４，９７８号：同第６，９３３，１１３号：同第６，９７９，５３９号：同第７，０１３，２１９号：および同第７，１６３，８２４号に記載されている。
【０１３５】
本明細書に記載されているヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、裸のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）およびこれらの成分の１またはそれより多くをコードする配列を含有するベクターを含む、任意の核酸送達機構を用いても送達され得る。プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどならびにこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意のベクター系が使用され得る。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３３５０６３号も参照。さらに、これらの系のいずれもが、処置のために必要とされる配列の１またはそれより多くを含む得ることが自明である。したがって、１またはそれを超えるヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞中に導入される場合には、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同一の送達系上でまたは異なる送達機構上で運ばれ得る。複数の系が使用される場合には、各送達機構は、１または複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列（例えば、１もしくはそれを超えるヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよび／または１もしくはそれを超えるドナー構築物を運ぶｍＲＮＡもしくはＡＡＶ）を含み得る。
【０１３６】
細胞（例えば、哺乳動物の細胞）および標的組織中にヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー構築物を導入するために、慣用のウイルスおよび非ウイルスをベースとする遺伝子導入法を使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、裸の核酸およびリポソームまたはポロクサマーなどの送達ビヒクルと複合化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームまたは取り込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子治療手順の総説として、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａら、ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）；およびＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照。
【０１３７】
核酸の非ウイルス性送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸抱合体、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ付きＲＮＡ、人工のビリオンおよび作用物質によって増強されたＤＮＡの取り込み（agent-enhanced uptake of DNA）が挙げられる。核酸の送達のために、例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いた音響穿孔も使用することができる。
【０１３８】
さらなる例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって提供されるものが挙げられる（例えば、米国特許第６，００８，３３６号参照）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号のものが挙げられる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはｍＲＮＡとして送達され、導入遺伝子は、ウイルスベクター、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子などの他の様式を介して送達される。
【０１３９】
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，９４６，７８７を参照）。
【０１４０】
さらなる送達の方法としては、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へと送達されるべき核酸のパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達される。抗体がＥＤＶを標的細胞表面に運び、次に、エンドサイトーシスによって、ＥＤＶが細胞中に運び込まれる。いったん細胞中に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７）：６４３参照）。
【０１４１】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスをベースとする系の使用は、ウイルスを体内の特異的な細胞に向かわせ、ウイルスペイロードを核に運ぶための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、被験体に直接投与することができ（インビボ）、または細胞をインビトロで処置するために使用することができ、改変された細胞が被験体に投与される（エクスビボ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するための慣用のウイルスをベースとした系としては、遺伝子導入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム中の組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法によって可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞種および標的組織中で、高い形質導入効率が観察されてきた。
【０１４２】
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むこと、標的細胞の潜在的標的集団を増加させることによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するまたは感染させることが可能であり、典型的には、高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用性末端反復配列から構成される。ベクターの複製およびパッケージングのためには、最小限のシス作用性ＬＴＲで十分であり、次いで、ベクターは、標的細胞中に治療用遺伝子を組み込んで永続する導入遺伝子発現を与えるために使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびこれらの組み合わせを基礎とするものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎら、（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４；国際公開第１９９４／０２６８７７号を参照）。
【０１４３】
一過性発現が好ましい用途においては、アデノウイルスを基礎とする系を使用することができる。アデノウイルスを基礎とするベクターは、多くの細胞種で極めて高い形質導入効率を可能にし、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価および高い発現のレベルが得られてきた。このベクターは、比較的単純な系内で大量に作製することができる。例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手法のために、標的核酸を有する細胞を形質導入するために、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも使用される（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９３／２４６４１号；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む多数の刊行物中に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ  ｒｈ１０ならびにＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などの偽型化ＡＡＶを含む任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。
【０１４４】
臨床試験における遺伝子導入のために、現在、少なくとも６種のウイルスベクターアプローチが利用可能であり、これらは、形質導入因子を生成するために、ヘルパー細胞株中に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補を含むアプローチを利用する。
【０１４５】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓパッケージされたベクターに対しては、５０％またはそれを超える形質導入効率が観察されてきた。（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１４６】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損した非病原性パルボウイルスであるアデノ随伴２型ウイルスを基礎とする有望な別の遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５塩基対（ｂｐ）の逆位反復配列のみを保持するプラスミドに由来する。効率的な遺伝子導入および形質導入された細胞のゲノム中への組み込みによる安定な導入遺伝子送達が、このベクターの鍵となる特徴である。（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４５およびＡＡＶｒｈ１０ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などの偽型化ＡＡＶを含むその他のＡＡＶ血清型も、本発明にしたがって使用することができる。いくつかの実施形態において、心臓（ｃａｒｄｉａｃ）、肺、脳および／または筋肉を標的とするＡＡＶ血清型が使用され、血液脳関門を横切ることができるＡＡＶ血清型が使用されることを含むが、これに限定されない。
【０１４７】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生させることができ、多数の異なる細胞種に容易に感染することができる。多くのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置換し、続いて、複製欠損性ベクターが、欠失された遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞中で増殖するように操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉中などに見出される細胞などの分裂しない分化した細胞を含む、複数種の組織をインビボで形質導入することができる。慣用のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床試験におけるＡＤベクターの使用の一例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１４８】
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主中への組み込み（該当する場合）のために必要とされる最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットによって置換されている。喪失しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組み込みのために必要とされるＡＡＶゲノム由来の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠如するヘルパープラスミドを含有する細胞株中でパッケージングされる。細胞株は、また、ヘルパーとしてアデノウイルスで感染させられる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠如しているために、有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイスがＡＡＶより感受性が高い熱処理によって低減することができる。
【０１４９】
多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織の種類に対して高度の特異性をもって送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所定の細胞種に対して特異性を有するように改変することができる。リガンドは、関心対象の細胞種上に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスがｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、この組換えウイルスがヒト上皮増殖因子受容体を発現するある種のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス・標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように操作することができる。上記記載は主にウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理を非ウイルスベクターに当てはめることができる。このようなベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを好む特異的な取り込み配列を含有するように操作することができる。
【０１５０】
遺伝子治療ベクターは、個々の被験体への投与によって、典型的には、以下に記載されているような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下または頭蓋内注入）局所適用によってまたは肺吸入を介して、インビボで送達することができる。または、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）または万能ドナー造血幹細胞など、エクスビボで細胞に送達することができ、その後、通常は、ベクターを取り込んだ細胞に関して選択した後に、患者中への細胞の再移植が続く。
【０１５１】
ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、インビボでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。または、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路により、注射、注入、局所適用、吸入および電気穿孔を含むがこれらに限定されない。このような核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、当業者に周知であって、特定の組成物を投与するために１を超える経路を使用することができるが、多くの場合、別の経路より、特定の経路がより直ちにより効果的な反応を与えることができる。
【０１５２】
本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適したベクターとしては、組み込み欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Ｏｒｙら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７−２２２；米国特許第８，９３６，９３６号を参照。
【０１５３】
薬学的に許容され得る担体は、１つには、投与されている具体的な組成物によって、および組成物を投与するために使用される具体的な方法によって決定される。したがって、以下に記載されているとおり、利用可能な医薬組成物の多様な適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８９参照）。
【０１５４】
ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物は、同じ系または異なる系を用いて送達できることが自明である。例えば、ドナーポリヌクレオチドはＡＡＶによって運ぶことができるのに対して、１またはそれを超えるヌクレアーゼはｍＲＮＡによって運ぶことができる。さらに、異なる系は、同一の経路または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、その他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射によって投与することができる。複数のベクターは、同時にまたは任意の逐次的順序で送達することができる。
【０１５５】
エクスビボおよびインビボの両方の投与のための製剤としては、液体または乳化液体状態の懸濁剤が挙げられる。活性成分は、しばしば、薬学的に許容され得るおよび活性成分と適合的である賦形剤と混合される。適切な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびこれらの組み合わせが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬などの微量の補助物質を含有し得る。
【０１５６】
ミトコンドリア障害の処置および／または予防のためになど、ｍｔＤＮＡの改変のために投与されるべき有効量は、被験体ごとに、ならびに投与の様式および投与の部位にしたがって変動する。したがって、有効量は、組成物を投与する者によって決定するのが最良であり、適切な投与量は当業者によって容易に決定することができる。ある実施形態において、発現のために十分な時間を置いた後（典型的には、例えば２〜１５日またはそれを超える）、ｍｔＤＮＡ改変に対する血清またはその他の組織レベルの分析および投与前との比較は、投与されている量が少なすぎるか、適切な範囲内にあるか、または多すぎるかどうかを決定する。最初のおよびその後の投与に対する適切な計画も変動し得るが、必要であればその後の投与が後続する最初の投与が典型となる。その後の投与は、毎日から毎年から数年ごとの範囲の、変動可能な間隔で投与され得る。ある実施形態において、ＡＡＶなどのウイルスベクターを使用する場合、投与される総用量または成分用量は、１×１０１０〜５×１０１５ｖｇ／ｍＬ（またはこの間にある任意の値）、さらに好ましくは、１×１０１１〜１×１０１４ｖｇ／ｍＬ（またはこの間にある任意の値）、さらにより好ましくは、１×１０１２〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ（またはこの間にある任意の値）であり得る。いくつかの実施形態において、総用量は静脈内に投与され得、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ〜１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ（またはこの間にある任意の値）、より好ましくは、５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ（またはこの間にある任意の値）、さらにより好ましくは５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ（またはこの間にある任意の値）であり得る。
用途
【０１５７】
本明細書に開示されている方法および組成物は、例えば、疾患または障害が処置されおよび／または予防されるように、野生型ＤＮＡに対する変異体ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー比を改変することによって、ミトコンドリア病および障害に対する治療を与えるための方法および組成物である。細胞は、インビボで改変され得、またはエクスビボで改変され、続いて、被験体に投与され得る。したがって、これらの方法および組成物は、ミトコンドリア障害の処置および／または予防を提供する。
【０１５８】
本明細書に記載されている方法および組成物を用いて処置および／または予防することができるミトコンドリア障害の非限定的な例としては、ＬＨＯＮ（レーベル遺伝性視神経症）、ＭＭ（ミトコンドリア筋症）、ＡＤ（アルツハイマー病）、ＬＩＭＭ（致死性乳児ミトコンドリア筋症）、ＡＤＰＤ（アルツハイマー病およびパーキンソン病）、ＭＭＣ（母性筋症および心筋症）、ＮＡＲＰ（神経原性筋力低下、運動失調および網膜色素変性；この遺伝子座での別の表現型は、リー病として報告される）、ＦＩＣＰ（致死性乳児心筋症プラス、ＭＥＬＡＳ関連心筋症）、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様エピソード）、ＬＤＹＴ（レーベル遺伝性視神経症およびジストニア）、ＭＥＲＲＦ（ミオクローヌスてんかんおよび赤色ぼろ筋線維）、ＭＨＣＭ（母性遺伝肥大型心筋症）、ＣＰＥＯ（慢性進行性外眼筋麻痺）、ＫＳＳ（カーンズ・セイヤー症候群）、ＤＭ（糖尿病）、ＤＭＤＦ（糖尿病＋聴覚喪失）、ＣＩＰＯ（筋症および眼筋麻痺を伴う慢性偽性腸閉塞）、ＤＥＡＦ（母性遺伝聴覚喪失またはアミノグリコシド誘発性聴覚喪失）、ＰＥＭ（進行性脳症）、ＳＮＨＬ（感音難聴）、加齢、脳筋症、ＦＢＳＮ（家族性両側性線条体壊死）、ＰＥＯおよびＳＮＥ（亜急性壊死性脳症）が挙げられる。
【０１５９】
ヌクレアーゼによって媒介される切断は、疾患と関連するｍｔＤＮＡ配列（例えば、点変異、置換変異など）を修正するために使用され得る。修正は、例えば、ミトコンドリアにおいて典型的であるように、効率的なＤＮＡ修復機構の不存在下での、切断されたｍｔＤＮＡ配列の分解を介し得る。標的とされ得る具体的な変異体ヒトｍｔＤＮＡとしては、１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃおよび１４７０９Ｃが挙げられる。
【０１６０】
非限定的な例として、本明細書に記載されている方法および組成物は、ミトコンドリア筋症；糖尿病および聴覚喪失（ＤＡＤ）；レーベル；視神経および網膜の変性に起因する中心視野の進行性喪失を特徴とし、フィンランドでは５万人に１人が罹患するレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；リー症候群；母性遺伝リー症候群；リー様症候群；神経障害；運動失調、網膜色素変性および眼瞼下垂（ＮＡＲＰ）；筋神経原性胃腸脳症（ＭＧＮＩＥ）；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）；ミトコンドリア筋症、脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様症状（ＭＥＬＡＳ）；ｍｔＤＮＡ枯渇ミトコンドリア神経胃腸脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、心筋症、聴覚喪失、その他を含むがこれらに限定されないミトコンドリア障害の処置および／または予防のために使用することができる。
【０１６１】
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは、例示のみを目的とすること、他のヌクレアーゼ、例えば、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有する、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ならびに／または天然に存在するもしくは（ｏｆ）操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインと異種切断ドメインとの融合物ならびに／またはメガヌクレアーゼとＴＡＬＥタンパク質との融合物を使用することができることが理解される。例えば、さらなるヌクレアーゼは本明細書に開示された配列（例えば、表２）の９〜１２の連続するヌクレオチドを含む配列に結合するように設計され得る。さらに、以下の実施例は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬエフェクタードメイン、ｓｇＲＮＡなど）が、（表２に示されているとおりの）５０２４Ｃ＞Ｔ変異を有するｍｔＤＮＡに選択的に結合するヌクレアーゼに関する。これは、例示のみを目的とすること、以下の位置：１５５５Ｇ、１６２４Ｔ、３２４３Ｇ、３４６０Ａ、３２７１Ｃ、４３００Ｇ、５５４５Ｔ、７４４５Ｇ、７４７２無作為挿入、８３４４Ｇ、８３５６Ｃ  ８９９３Ｇ、９１７６Ｇ／Ｃ、１０１５８Ｃ、１０１９１Ｃ、１０１９７Ａ、１１７７７Ａ、１１７７８Ａ、１３５１３Ａ、１４４５９Ａ、１４４８４Ｃ、１４４８７Ｃおよび／または１４７０９Ｃの１つまたはそれより多くにおける１またはそれを超える変異を含むが、これらに限定されないその他の変異体ｍｔＤＮＡ配列に結合するヌクレアーゼが想定されることが自明である。
【実施例】
【０１６２】
［実施例１］ｍｔＤＮＡヌクレアーゼ
本質的に、Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１４）ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．６：４５８−４６６；Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３５１：１４５−１６２；米国特許第６，５３４，２６１号および同第９，１３９，６２８号に記載されているとおりに、ｍｔＤＮＡに標的化されるジンクフィンガータンパク質を設計し、ｍＲＮＡ、プラスミド、ＡＡＶまたはアデノウイルスベクター中に取り込ませた。
【０１６３】
具体的には、変異体ｍｔＤＮＡ（ｍ５０２４Ｃ＞Ｔ）に対して単一ヌクレオチド結合特異性を有するＺＦＰの対を作製した。図１を参照されたい。マウスｍｔＤＮＡ中のこの部位はＺＦＰに関して困難である（challenging）ので、異なる数のジンクフィンガーモチーフ、スペーサー領域の長さおよび追加のリンカーを用いる標的化戦略の選択を利用した。候補ＺＦＰのアセンブリによって、変異体特異的単量体（ＭＴＭ）と称される、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ部位を標的とする２４の特有のＺＦＰのライブラリー（図１Ａ）および野生型特異的単量体１（ＷＴＭ１）と称される、反対側鎖上の隣接配列を標的とする単一パートナーＺＦＰが得られた。
【０１６４】
５’ＥｃｏＲＩと３’ＢａｍＨＩ制限部位の間、ＦｏｋＩ（＋）の上流にＭＴＭ  ＺＦＰドメインを挿入することによって、ＭＴＭ（ｎ）＿Ｔ２Ａ＿ＷＴＭ１ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ候補ライブラリーをクローニングした。次いで、Ｔ２Ａ配列および３’ＸｈｏＩ部位も取り込みながら、５’ＡｐａＩ部位を含め、３’停止コドンを除去するために、この生成物をＰＣＲ増幅した。次いで、ＡｐａＩ／ＸｈｏＩ部位を用いて、ｐｃｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ６２８０３）中にこの断片をクローニングした。５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＢａｍＨＩ部位を用いて、３’ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲ）を取り込んでいるｐｃｍＣｈｅｒｒｙ＿３ｋ１９ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ１０４４９９）中のＦｏｋＩ（−）の上流にＷＴＭ１  ＺＦＰを別個にクローニングし、５’ＸｈｏＩおよび３’ＡｆｌＩＩ部位を含めるために得られた生成物をＰＣＲ増幅して、ＭＴＭ（ｎ）バリアントの下流のクローニングを可能にした。
【０１６５】
Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３５１：１４５−１６２に以前に記載されたとおりに、ＭＴＭ２５（＋）およびＷＴＭ１（−）単量体も別個のｐｃｍＣｈｅｒｒｙおよびｐＴｒａｃｅｒベクター中にクローニングした。ＡＡＶ産生を目的としたｍｔＺＴＮのベクター構築は、５’ＥａｇＩおよび３’ＢｇｌＩＩ部位を取り込む、ＭＴＭ２５（＋）＿ＨＨＲおよびＷＴＭ１（−）＿ＨＨＲ導入遺伝子のＰＣＲ増幅によって達成した。
【０１６６】
次いで、５’ＥａｇＩおよび３’ＢａｍＨＩ部位の間に、これらの生成物をｒＡＡＶ２−ＣＭＶ中にクローニングした。ＰＣＲによって、ＷＴＭ１（−）のＦＬＡＧエピトープタグをヘマグルチニン（ＨＡ）タグで置き換えた。ＵＮＣ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，ＮＣ）において、組換えＡＡＶ２／９．４５ーＣＭＶ−ＭＴＭ２５およびＡＡＶ２／９．４５ーＣＭＶ−ＷＴＭ１ウイルス粒子を生成するために、得られたプラスミドを使用した。発現レベルを制限しながら、ＣＭＶからの導入遺伝子の遍在的な発現を可能にするために、３Ｋ１９ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲ）配列（Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎら、（２０１５）ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ  ４：５２６−５３４）をｍｔＺＦＮ−ＡＡＶ９，４５構築物中に取り込んで、大きなｍｔＤＮＡコピー数の枯渇を誘導することなく、標的化された組織中での細胞の効果的な共形質導入を確保するために必要とされる高いウイルス力価の投与を可能にした。
【０１６７】
表１は、例示的なｍｔＤＮＡ  ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合ドメイン内の認識ヘリックスおよびこれらのＺＦＰに対する標的部位を示す（ＤＮＡ標的部位は大文字で示されており、接触されないヌクレオチドは小文字で示されている。）。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触される標的部位中のヌクレオチドは、大文字で示されており、接触されないヌクレオチドは、小文字で示されている。本分野において公知の方法にしたがって、表２に示されている配列（例えば、表２に示されている標的部位の、９〜２０またはそれを超える（９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１またはそれより多くを含む。）ヌクレオチド（連続または非連続）を含む標的部位に対して、ＴＡＬＥＮおよび／またはｓｇＲＮＡも設計した。例えば、（ＴＡＬＥＮに対してカノニカルまたは非カノニカルＲＶＤを使用する）米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号を参照。
表１：ｍｔＤＮＡジンクフィンガータンパク質認識ヘリックス設計
【表１−１】
2021518440.tif 000003
【表１−２】
2021518440.tif 000004
【表１−３】
2021518440.tif 000005
表２：ジンクフィンガータンパク質の標的部位
【表２】
2021518440.tif 000006
【０１６８】
全てのＺＦＮの対の組み合わせを切断活性に関して試験した。２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、野生型およびｍ．５０２４Ｃ＞Ｔマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞株を培養した。ＭＥＦ１キットおよびＴ２０プログラムを使用し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ装置（Ｌｏｎｚａ）を用いて、電気穿孔によって細胞を形質移入した。Ｇａｍｍａｇｅら、（２０１６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １３５２：１４５−１６２に記載されているとおりに、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を実施した。全細胞タンパク質抽出がどのようにして実行されたかも記載するＧａｍｍａｇｅら、（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４：７８０４中に以前に記載されたとおりにＨＨＲ自己触媒の速度を調節しながら、培地中へのテトラサイクリンの滴定を通じて、ｍｔＺＦＮ発現の調節を達成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスＢｏｌｔゲル上で２０〜１００μｇの抽出されたタンパク質を分離することによって、ウェスタンブロッティングによるタンパク質の検出を達成した。ｉＢｌｏｔ２  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、これらをニトロセルロースに転写した。本研究でウェスタンブロッティングに対して使用された抗体：ラット抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ，１：５００）、ヤギ抗ラットＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，１：１０００）。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ローディングのためにゲルを染色した。全ての対が活性を示すことが見出された。
【０１６９】
ヘテロプラスミーシフト活性を評価するために、構築物を、約６５％のｍ．５０２４Ｃ＞Ｔを有するマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）中での数回のスクリーニングにも供した。図１に示されているように、これらのスクリーニングは、ＭＴＭ２５／ＷＴＭ１対の一貫した特異的活性を同定し、パイロシークエンシングによって決定すると、ＭＥＦ細胞株中で６５％から４５％ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔへ、約２０％のシフトをもたらした。簡潔に述べると、パイロシークエンシングによって、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ  ｍｔＤＮＡヘテロプラスミーの評価を行った。以下のプライマーと１００ｎｇテンプレートＤＮＡとを用いる４０サイクルに対して、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、パイロシークエンシングのためのＰＣＲ反応物を調製した。
ｍ．４，９６２−４，９８６  フォワード
5’ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG 3’(配列番号36)
ｍ．５，３６０−ｍ．５，３８３リバース
5’ [Btn]GAGGGTTCCGATATCTTTGTGATT 3’(配列番号37)
ｍ．５００３−ｍ．５０２２  配列決定プライマー
5’ AAGTTTAACTTCTGATAAGG3’(配列番号38)
【０１７０】
さらに、Ｍｉｎｃｚｕｋら、（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６４９：２５７−２７０に記載されているとおりに、固定されたＭＥＦ細胞中の免疫蛍光によって、ミトコンドリアの局在を確認した。ＭＴＭ２５およびＷＴＭ１は専らミトコンドリア中に局在化しており、さらなるインビボ実験のために、この対を選択した。
【０１７１】
これらの設計は、米国特許第９，３９４，５３１号に記載されているような、（フィンガー間の）カノニカルもしくは非カノニカルリンカーおよび／またはＺＦＰと切断ドメインとの間のリンカーを含むがこれらに限定されない任意のリンカーを、フィンガーモジュールのいずれかの間および／またはＺＦＰと切断ドメインとの間に含み得ることが自明である。米国特許第８，７７２，４５３号および米国特許出願公開第２０１５／００６４７８９号も参照。
【０１７２】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ  などを含む、ＺＦＮ以外のヌクレアーゼを、上に示されている９〜１８またはそれを超えるヌクレオチドの標的部位に対して設計することができる。ヌクレアーゼのいずれも（ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびＴＡＬＥＮ）が、操作された切断ドメイン、例えば、米国特許第８，６２３，６１８号（例えば、ＥＬＤおよびＫＫＲ操作された切断ドメイン）に開示されているヘテロ二量体ならびに／または、米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号に記載されているように、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位および／または５２５位に１もしくはそれを超える（ｍｏｒｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）変異を有する切断ドメインを含むことができる。これらの変異体は、本明細書に記載されている例示的なＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインとともに使用された。
［実施例２］  インビボヌクレアーゼ活性
【０１７３】
マウス中で、インビボにおいてもヌクレアーゼ活性を試験した。本研究で使用されたＣ５７ＢＬ／６ｊ−ｔＲＮＡＡＬＡマウスは、１２時間の明暗周期および６０％の相対湿度の温度調節された（２１℃）部屋の中で、ケージ当たり１〜４匹で飼育した。
【０１７４】
ＭＴＭ２５およびＷＴＭ１  ｍｔＺＦＮ単量体は別個のウイルスゲノム中にコードされ、心臓向性の操作されたＡＡＶ９．４５血清型内にキャプシドで囲まれた（図１Ｄ）。Ｐｕｌｉｃｈｅｒｉａら、（２０１１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １９：１０７０−１０７８を参照。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスＢｏｌｔゲル上で２０〜１００μｇの抽出されたタンパク質を分離することによって、ウェスタンブロッティングによるタンパク質の検出を達成した。ｉＢｌｏｔ２  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、これらをニトロセルロースに転写した。本研究でウェスタンブロッティングに対して使用された抗体：ラット抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ，１１８６７４３１００１，１：５００）、ヤギ抗ラットＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＳＣ２０６５，１：１０００）。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ローディングのためにゲルを染色した。
【０１７５】
図１Ｅに示されているように、マウス当たり単量体当たり５×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）の全身（尾静脈）投与後に、全マウス心臓組織中でのＭＴＭ２５およびＷＴＭ１のロバストな発現がウェスタンブロッティングによって検出された。
【０１７６】
さらなるインビボ実験を以下のとおり実施した。４４％〜８１％のｍ．５０２４Ｃ＞Ｔヘテロプラスミーを有する２〜８月齢の雄のマウス（ビヒクル２０、単一の単量体７、ｍｔＺＦＮ−ＡＡＶ９．４５投与量当たり４）を、以下に示されている群で処置した。
【表３】
2021518440.tif 000007
【０１７７】
ビヒクル（１×ＰＢＳ、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  ｗ／ｖ  Ｄ−ソルビトール）およびＡＡＶの処置を、尾静脈注射によって全身的に投与した。
【０１７８】
マウス心臓組織に関しては、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ分離機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％（ｖ／ｖ）デオキシコレート、０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ）中で５０ｍｇをホモジナイズした。４℃で１０分間、１０，０００×ｇで、得られたホモジネートを遠心分離し、次いで、上清を回収し、４℃で１０分間、１０，０００×ｇで遠心分離した。細胞および組織タンパク質抽出物の両方の濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。
【０１７９】
パイロシークエンシングによるｍｔＤＮＡヘテロプラスミーの評価を行い、２週齢（実験的介入前）で決定された耳穿孔遺伝子型と死後の心臓遺伝子型間の変化（Δ）として表した。簡潔に記載すると、製造業者のプロトコールにしたがってＰｏｗｅｒＵｐ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｑＰＣＲによって、マウス心臓試料のミトコンドリアＤＮＡコピー数を決定した。７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、試料を分析した。以下のプライマーを使用した。
ＭＴ−ＣＯＩ  フォワード
5’TGCTAGCCGCAGGCATTACT 3’(配列番号39)
ＭＴ−ＣＯＩ  リバース
5’CGGGATCAAAGAAAGTTGTGTTT 3’(配列番号40)
ＲＮアーゼＰ  フォワード
5’GCCTACACTGGAGTCCGTGCTACT 3’(配列番号41)
ＲＮアーゼＰ  リバース
5’CTGACCACACACGAGCTGGTAGAA 3’(配列番号42)
【０１８０】
それぞれ、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス核およびミトコンドリアゲノムに対するＮＣＢＩ参照配列ＧＲＣｍ３８．ｐ６およびＮＣ＿００５０８９．１を用いて、パイロシークエンシングおよびｑＰＣＲのための全てのプライマーを設計した。
【０１８１】
図１Ｆおよび１Ｇに示されているように、注射の６５日後における注射された動物は、ｍｔＺＦＮ処置されたマウス中での、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ変異体ｍｔＤＮＡの特異的な除去を示したが、ビヒクルまたは単一の単量体を注射された対照中では除去を示さなかった。ｍｔＺＦＮ処置によってヘテロプラスミーが改変された程度は、二相性のＡＡＶ用量依存性傾向をたどり、中間用量（５×１０１２ｖｇ）は、ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔ変異体ｍｔＤＮＡを除去する上で最も効率的であった。最低の（１×１０１２ｖｇ）用量は、おそらくは、ｍｔＺＦＮの不十分な濃度および／またはＡＡＶによって標的化された組織のモザイク状形質導入のために、ヘテロプラスミーシフトをもたらさなかった。最高の用量（１×１０１３ｖｇ）は、おそらくは、より低用量を投与したときには観察されない部分的なｍｔＤＮＡコピー数枯渇をもたらすオフターゲット効果のために、中間用量（５×１０１２ｖｇ）と比べて、減弱したヘテロプラスミーシフト活性を示した（図１Ｇ）。後者の結果は本発明者らの過去の観察と合致しており、効率的なｍｔＤＮＡヘテロプラスミー改変のためにミトコンドリア中のｍｔＺＦＮレベルを微調整することの重要性を明確に示す。
【０１８２】
ｍ．５０２４Ｃ＞Ｔヘテロプラスミーのロバストなシフトがインビボで達成される条件を確定したので、本発明者らは、次に、ミトコンドリア病の動物モデル中での疾病関連表現型の修正に取り組んだ（Ｋａｕｐｐｉｌａら、（２０１６）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １６：２９８０−２９９０参照。ｔＲＮＡＡＬＡマウスモデル中で繰り返された、ミトコンドリア病におけるｍｔ−ｔＲＮＡ変異の共通する特徴は、変異体ロードに比例するｍｔ−ｔＲＮＡ分子の不安定さである。図２Ａ；Ｙａｒｈａｍら、（２０１０）Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｄｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  ＲＮＡ  １：３０４−３２４参照。
【０１８３】
投与量範囲にわたってｍｔＺＦＮで処置された動物の心臓中でのｍｔ−ｔＲＮＡＡＬＡの安定性に対するｍｔＺＦＮ処置の効果を評価するために、Ｐｅａｒｃｅら、（２０１７）Ｅｌｉｆｅ  ６，デジタルオブジェクト識別子：１０−７５５４／ｅＬｉｆｅ．２７５９６中に本質的に記載されているとおりに、ノーザンブロッティングを行った。簡潔に記載すると、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ分離機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いたホモジネーションによって、Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、２５ｍｇのマウス心臓組織から全ＲＮＡを抽出した。特に、８Ｍ尿素を含有する１０％ポリアクリルアミドゲル上で、５μｇの全ＲＮＡを分離した。正に帯電したナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）上にゲルを乾燥ブロットし、２５４ｎｍＵＶ光への曝露、１２０ｍＪ／ｃｍ２によって、得られた膜を架橋した。ｔＲＮＡプローブについては、マウスｍｔＤＮＡの適切な領域に対応するＰＣＲ断片から転写された放射性標識されたＲＮＡプローブＴ７と、架橋された膜をハイブリダイズした。相補的なα［３２Ｐ］末端標識されたＤＮＡオリゴを用いて、５Ｓ  ｒＲＮＡをプローブした。ストレージフォスファスクリーンに膜を曝露し、Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光体画像システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて走査した。信号は、Ｆｉｊｉソフトウェアを用いて定量した。オリゴ配列は、以下のとおりであった。
ＭＴ−ＴＡ  フォワード
5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACTAAGGACTGTAAGACTTCATC 3’(配列番号43)
ＭＴ−ＴＡ  リバース（配列番号４４）
5’GAGGTCTTAGCTTAATTAAAG 3’
ＭＴ−ＴＣ  フォワード（配列番号45）
5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGTCTTAGTAGAGATTTCTC 3’
ＭＴ−ＴＣ  リバース（配列番号46)
5’GGTCTTAAGGTGATATTCATG 3
５Ｓ  ｒＲＮＡ  オリゴ：
5’AAGCCTACAGCACCCGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGTACTAACCA 3’(配列番号47)
【０１８４】
それぞれ、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス核およびミトコンドリアゲノムに対するＮＣＢＩ参照配列ＧＲＣｍ３８．ｐ６およびＮＣ＿００５０８９．１を用いて、ノーザンブロッティングのための全てのプライマーを設計した。
【０１８５】
図２Ｂに示されているように、これらのマウスで検出されたヘテロプラスミーシフトに比例した、ｍｔ−ｔＲＮＡＡＬＡ定常状態レベルの有意な増加が存在した（図１Ｆ）。高ウイルス用量の投与と関連するｍｔＤＮＡコピー数の枯渇（図１Ｇ）は、ヘテロプラスミーシフト後のｍｔ−ｔＲＮＡＡＬＡ定常状態レベルの回復に影響を与えるように見受けられなかったが、これは、重度のｍｔＤＮＡ枯渇でさえも、ミトコンドリアＲＮＡ定常状態レベルの比例的な変化として現れないという以前に公表されたデータと合致する。Ｊａｚａｙｅｒｉら、（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：９８２３−９８３０参照。
【０１８６】
ｍｔ−ｔＲＮＡＡＬＡ分子表現型救出の生理学的効果を評価するために、さらなる実験を行った。特に、中間ウイルス力価（５×１０１２ｖｇ）で処置されたマウスから得た心臓組織中の定常状態代謝物の存在量を評価した。簡潔に述べると、瞬間凍結された組織試料を切断し、セラミックビーズを予め詰めたＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ（Ｓｔｒｅｔｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，ＵＫ）中に秤量した。正確な容量の抽出溶液（３０％アセトニトリル、５０％メタノールおよび２０％水）を加えて、１ｍＬの抽出溶液当たり４０ｍｇの試料を得た。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４ホモジナイザー（Ｓｔｒｅｔｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、組織試料を溶解した。懸濁液を混合し、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中にて、４℃で１５分間インキュベートした後、遠心分離した（１６，０００ｇ、４℃で１５分）。上清を集めて、オートサンプラーガラスバイアル中に移し、さらなる分析まで、−８０℃で保存した。機械の変動によるバイアスを避けるために、試料を無作為化し、盲検で処理した。Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕ３０００  ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）に連結されたＱＥｘａｃｔｉｖｅ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を用いて、ＬＣ−ＭＳ分析を実施した。液体クロマトグラフィーシステムにＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）のＳｅｑｕａｎｔ  ＺＩＣ−ｐＨＩＬＩＣカラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）およびガードカラム（２０ｍｍ×２．１ｍｍ）を取り付け、温度を４０℃で維持した。移動相は、水中の、２０ｍＭ炭酸アンモニウムおよび０．１％水酸化アンモニウム（溶媒Ａ）ならびにアセトニトリル（溶媒Ｂ）から構成された。Ｍａｃｋａｙら、（２０１５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ５６１：１７１−１９６に以前に記載されているとおりのグラジエントを用いて、流速を２００μＬ／分に設定した。質量分析計は、フルＭＳおよび極性スイッチングモードで動作した。ＸＣａｌｉｂｕｒ  Ｑｕａｌ  ＢｒｏｗｓｅｒおよびＸＣａｌｉｂｕｒ  Ｑｕａｎ  Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、獲得されたスペクトルを分析した。
【０１８７】
図２Ｃ〜２Ｅに示されているように、この分析はｍｔＺＦＮ処置されたマウス中において、改変された代謝シグネチャを明らかにし（図２Ｃ）、対照と比較して、より低い乳酸レベルを伴った、上昇したホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸レベルを実証した（図２Ｄ）。さらに、処置された動物は、より高いグルコースレベルを示したが、より低いグルコースー６−リン酸およびフルクトースー６−リン酸レベルを示した（図２Ｅ）。
【０１８８】
このように、ヌクレアーゼを用いたｍ．５０２４Ｃ＞Ｔヘテロプラスミーシフトに際してミトコンドリア機能の回復が達成された。
【０１８９】
要約すると、データは、変異体ミトコンドリアＤＮＡ配列を標的とするヌクレアーゼは、マウスｍｔＤＮＡ中のヘテロプラスミー変異を巧みに操作し、心臓組織中の疾患表現型の分子的および生理学的救出をもたらすために、インビトロ、インビボで使用することができることを実証する。
【０１９０】
本明細書に挙げられている全ての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
理解を明確にするために、例示および実施例によって、いくぶん詳しく開示を提供してきたが、様々な変更および修正が本開示の精神または範囲から逸脱することなく実施できることが当業者に自明である。したがって、先述の記載および実施例は、限定するものとして解釈すべきでない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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