(57)【要約】  本発明は、生物学的サンプルにおいて標識せずに白血球の細胞種を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、顕微鏡観察器具が細胞のイメージングを行い、細胞の物理的パラメータは、自動イメージ分析によって細胞のイメージから確認され、白血球の細胞種は、物理的パラメータに基づいておよび主成分分析パラメータ（ＰＣＡパラメータ）に基づいて決定され、主成分分析パラメータは、物理的パラメータのうちの少なくとも一部の一次結合を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルにおいて標識せずに白血球の細胞種を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、顕微鏡観察器具が細胞のイメージングを行い、細胞の物理的パラメータは、自動イメージ分析によって細胞のイメージ表示から確認され、
白血球の細胞種は、物理的パラメータに基づいておよび主成分分析パラメータ（ＰＣＡパラメータ）に基づいて決定され、該主成分分析パラメータは、該物理的パラメータのうちの少なくとも一部の一次結合を含む、
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２】
白血球の決定された細胞種は、以下の白血球の主要な種類、すなわち、単球、好中球、好塩基球、好酸球、およびリンパ球を含む群のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
決定された細胞種は、骨髄球、後骨髄球、前骨髄球、芽球、巨核球、形質細胞、非定型リンパ球、およびセザリー細胞を含む群からの、白血球の主要な種類ならびに／または白血球の亜型のうちの１つである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中の多様な白血球のそれぞれの細胞種の決定を使用して、それぞれの細胞集団を特徴づけ、本細胞集団を使用して、サンプルが由来する患者において急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が存在するかどうかを決定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞の物理的パラメータは、細胞に覆われた面積、細胞の周囲長、細胞の幅、細胞の高さ、細胞の幅対高さの比、細胞の幾何学的形状の円に対する類似度、細胞の平均半径、細胞の半径の分散、細胞の被覆の度合、細胞の覆われた面積に対応する当量直径、細胞の光学的体積、細胞の最大の光学的高さ、細胞の最小の光学的高さ、細胞の光学的高さの平均、細胞の光学的高さの分散、細胞の両凹性、細胞の真球度、細胞の質量中心のシフト、細胞のコントラスト、細胞の相違度、細胞の均一性、細胞のエネルギー、細胞のエントロピーを含む群からのパラメータを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞のイメージングは、参照波を対象波上にオーバーレイし、生じるインターフェログラムおよび／またはコンピュータで実行した数学的再構成を記録することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
顕微鏡観察器具は、デジタルホログラフィー顕微鏡観察（ＤＨＭ）、干渉位相顕微鏡観察、または定量的位相顕微鏡観察を行うための顕微鏡である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
白血球は、フローセルにおいて顕微鏡観察器具によってイメージングし、該フローセルは、好ましくは長方形または正方形の横断面を有するチャネルを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
白血球は、層状シース流によって、好ましくは４つの層状シース流によって集中される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
白血球を顕微鏡観察器具によってイメージングする前に、赤血球を選択的溶解によってサンプルから除去する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
非染色および／または非乾燥細胞を使用して実行する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
−標識を用いて細胞を表現型決定すること、および／または
−細胞のさらなる割当てのために事前に決定された受容体を発現させること
をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
全血サンプルを使用して行う、ならびに／または、生物学的サンプルは血液細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、および／もしくはリンパ球を含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行するために構成されている、細胞分析装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞分析装置を含む、生物学的サンプルの細胞の細胞種を標識せずに決定するための顕微鏡観察器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡観察器具を使用することによって、生物学的サンプルにおいて標識せずに白血球の細胞種を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を決定し、これらを細胞種に割り当てることは、細胞学において非常に重要である。たとえば、血液学的検査では、細胞性血液成分、すなわち、赤血球、血小板、および白血球を決定および定量する。白血球の数（「白血球数」、ＷＢＣ）の確認で、包括的な診断のために白血球の主要集団を鑑別することができるであろう。白血球を、顆粒細胞（好中球、好酸球、好塩基球）および非顆粒性細胞（リンパ球、単球）に応じて鑑別する。顆粒性に加えて、細胞は、細胞核の断片化（断片化なし：単核細胞、すなわち、リンパ球および単球；多形核細胞：好酸球、好塩基球、および好中球）ならびに細胞サイズに関しても異なる。染色を、顆粒細胞、特に好酸球および好塩基球を鑑別するために使用する。細胞集団は通常、完全自動の血液学的分析計または顕微鏡観察によって評価する。完全自動の分析計では、設定されたアルゴリズムに従って集団を分析しなければならない（たとえば、インピーダンス、迷光、および吸収の測定の助けを借りる）。しかし、これはしばしば、たとえば病理学的サンプルの場合に、エラーメッセージの表示をもたらす。通常は、血液学的分析計によって不正確に決定された細胞の妥当性確認方法として、顕微鏡観察を次の工程で実行する。この工程は、サンプル調製、顕微鏡観察、および手動で実行するさらなる作業に加えて手動の評価も必要とするため、複雑かつ高価である。
【０００３】
血球数の変化は多くの疾患に付随する現象であり、したがって、これらの変化は重要な鑑別診断への寄与を行う。血球数は最も一般的な実験室検査のうちの１つであり、とりわけ、ヘモグロビンの決定、ならびに赤血球、白血球、および血小板細胞の数の確認を含む。全血球数は、白血球鑑別も含まれる鑑別血球数をさらに含有する。
【０００４】
用いる方法（たとえばミー散乱）が理由で、複雑なサンプル調製（細胞の染色または部分的な溶解）が、特に白血球を分析するために必要である。しかし、病理学的血液サンプルの場合、溶解などのサンプル調製は、多くの場合は不十分にしか実施されず、したがって、たとえばスミアリングおよび染色による、血液細胞の手動検査が必要である。しかし、この方法は定性的でしかなく、計数される細胞が少数であることが理由で（スライド１枚あたり約１００〜２００個の細胞）、珍しい白血球には制限された使用しか有さない。しかし、たとえば白血病などの病理学的サンプルの初期診断では、血液スメアおよび続く血液細胞の染色が現在の標準方法である。
【０００５】
全血における機械化された白血球鑑別は、たとえば、抵抗測定、コンダクタンス測定、レーザー迷光測定、フローサイトメトリー、または細胞化学的ペルオキシダーゼ反応によって実施することができる。ここでは、赤血球を最初に溶解し、白血球をフローセルにおいて単個化する。
【０００６】
例として、定量的血液細胞診断を実行するために、血液学的分析計を省略し、その代わりに顕微鏡観察をそれぞれの個々の細胞に適用することが可能である。これにより、設定した評価アルゴリズムおよびフラグとは独立して、血球数の定量的決定が可能となる。しかし、この手法の不利点は、血液学的分析計の場合よりも低いサンプルスループット、ならびに目的担体上の細胞の固定および染色に関連する、依然として存在する出費である。さらに、これらの染色は制限された再現性しか有しておらず、湿度、染色時間、温度などに高い依存性を示す。血液学的分析計において使用するフローサイトメーターと比較した、純粋な顕微鏡観察の不利点は、細胞体積の定量にある。
【０００７】
手動血球数を生じるために、たとえばライト−ギムザ染色などの、全血の分析用に設計された特異的染色技法を利用する。この目的を達成するために、全血を目的担体上にスミアリングし、たとえば約１００個の白血球まで、困難な事例では必要な場合は約３×１００個の細胞まで計数して、鑑別血球数を生じる。
【０００８】
血液スメアおよび続く血液細胞の染色が、病理学的サンプルの初期診断の標準方法である。白血病の場合、鑑別血球数に基づいて、特徴的に発生している細胞集団によって、「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）」、「急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）」、「慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）」、および「慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）」の型の間で区別を行うことができる。
【０００９】
血液スメアの場合（スライド１枚あたり約１００〜２００個の細胞）における小規模な統計学が理由で、診断を検証するため、および白血病の亜型のより正確な決定のために、概してフローサイトメトリーを使用する。この方法では、白血球を特異的な（蛍光）抗体で標識し、鑑別は特徴的な発現パターンによって実施し、これらは散乱イメージに反映される。さらに、複雑な事例において正確な診断のために骨髄穿刺が必要であり得る。
【００１０】
異なる（血液）細胞間を鑑別するための、色素の使用は、１８６０年代に既に開発されていた。グスタフ・ギムザは、自身にちなんで命名された染色方法を開発し、これは、最初はマラリア寄生虫を可視化させるものであり、後に梅毒の原因である梅毒トレポネーマの染色用に改変された。現在使用されているライト−ギムザ染色は、白血球が識別されることを可能にし、したがって白血病疾患の初期診断を表す。
【００１１】
白血病の免疫表現型を正確に決定するために、フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞分取、ＦＡＣＳ）を標準として使用する。ここでは、多様な様々な（蛍光）抗体を使用し；末梢血および骨髄サンプルの両方をサンプルとして使用する。評価は、ＦＡＣＳデータを分析するための特定のプログラム（たとえばカルーツァ）によって実施する。ここでは、「ゲート」とも呼ばれる事前に設定した領域中のデータ点の存在によって、様々な臨床像間を識別することが可能である。染色／標識せずに、純粋な顕微鏡方法を使用することによって４つの前述した白血病の形態間を識別することは、現在までに知られていない。
【００１２】
特許文献１は、白血球の鑑別を直接決定することができ、それを用いたイメージングフローサイトメーターを開示している。しかし、この場合では、特に好酸球と好塩基球とを識別するために、染色も使用されている。その結果、前述の不利点がここでも生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＵＳ８４０６４９８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、白血球を鑑別するためのより効率的かつ頑強方法、具体的には血液細胞の染色および／または標識を必要としないものを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的は、本発明による方法、本発明による細胞分析装置、および独立特許クレームによる顕微鏡観察器具によって達成される。本発明の有利な展開は従属クレームによって指定される。
【００１６】
生物学的サンプルにおいて標識せずに血液細胞の細胞種を決定するための、本発明によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、顕微鏡観察器具および細胞分析装置の助けにより実行する。ここでは、顕微鏡観察器具とは、非常に小さな対象を高い拡大率下で観察することを可能にする用具であり、たとえば、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡、位相差顕微鏡、デジタルホログラフィー顕微鏡、または超音波センサーを備えた顕微鏡（たとえば音波顕微鏡）を含む。この方法では、顕微鏡観察器具が細胞のイメージングを行う。細胞の物理的パラメータは、自動イメージ分析によって細胞のイメージ表示から確認される。
【００１７】
細胞分析装置、すなわち、電子データ処理に適しており、自動イメージ分析によって細胞のイメージ表示から細胞の物理的パラメータを確認するように構成されている用具または用具構成要素は、以下により詳述するように、本発明による方法を実行する。
【００１８】
発明の主題は、生物学的サンプルにおいて標識せずに白血球の細胞種を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、顕微鏡観察器具が細胞のイメージングを行い、細胞の物理的パラメータは、自動イメージ分析によって細胞のイメージ表示から確認され、白血球の細胞種は、物理的パラメータに基づいておよび主成分分析パラメータ（ＰＣＡパラメータ）に基づいて決定され、主成分分析パラメータは、物理的パラメータのうちの少なくとも一部の一次結合を含む、方法に関する。
【００１９】
好ましくは、白血球の細胞種は、物理的パラメータおよび主成分分析パラメータ（ＰＣＡパラメータ）に関して事前に決定された基準に基づいて決定され、それぞれの事前に決定された基準が満たされている場合に対応する細胞種が存在する。
【００２０】
語句「事前に決定された基準」とは、１つまたはそれ以上の物理的パラメータおよび／または主成分分析パラメータ（ＰＣＡパラメータ）のために決定する、基準または複数の基準に関する。ここでは、それぞれの基準は、好ましくは、識別する様々な白血球種の対応するイメージ表示間の比較に基づいて決定する。
【００２１】
染色方法の省略が理由で、この方法は、高いサンプルスループットならびに細胞の定性的および／または定量的決定を可能にする。これにより、高いサンプルスループットを有する顕微鏡観察方法が促進され、慣用の血液学的分析計を省略することが可能である。
【００２２】
好ましくは、白血球の決定された細胞種は、以下の白血球の主要な種類、すなわち、単球、好中球、好塩基球、好酸球、およびリンパ球を含む群のうちの１つである。
【００２３】
本発明による方法のさらなる好ましい実施形態では、決定された細胞種は、骨髄球、後骨髄球、前骨髄球、芽球、巨核球、形質細胞、非定型リンパ球、およびセザリー細胞を含む群からの、白血球の主要な種類ならびに／または白血球の亜型のうちの１つである。
【００２４】
さらなる好ましい実施形態では、サンプル中の多様な白血球のそれぞれの細胞種の決定を使用して、それぞれの細胞集団を特徴づけ、本細胞集団を使用して、サンプルが由来する患者において急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が存在するかどうかを決定する。
【００２５】
好ましくは、細胞の物理的パラメータは、細胞に覆われた面積（細胞面積）、細胞の周囲長（周囲長）、細胞の幅（幅）、細胞の高さ（高さ）、細胞の幅対高さの比（アスペクト比）、細胞の幾何学的形状の円に対する類似度（真円度）、細胞の平均半径（半径平均）、細胞の半径の分散（半径分散）、細胞の被覆の度合（剛率）、細胞の覆われた面積に対応する当量直径（当量直径）、細胞の光学的体積（光学的体積）、細胞の最大の光学的高さ（光学的高さ最大）、細胞の最小の光学的高さ（光学的高さ最小）、細胞の光学的高さの平均（光学的高さ平均）、細胞の光学的高さの分散（光学的高さ分散）、細胞の両凹性（両凹性）、細胞の真球度（真球度）、細胞の質量中心のシフト（質量中心シフト）、細胞のコントラスト（コントラスト）、細胞の相違度（相違度）、細胞の均一性（均一性）、細胞のエネルギー（エネルギー）、細胞のエントロピー（エントロピー）を含む群からのパラメータを含む。
【００２６】
好ましくは、細胞の物理的パラメータは、以下に記載のように定義される。
【００２７】
【表１】
2021518527.tif 000003
【表２】
2021518527.tif 000004
【００２８】
コントラスト、およびグレーレベル共起行列から抽出される５つの機能の定義に関する詳細は、カルガリー大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙ）のウェブページのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｐ．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／ｍｈａｌｌｂｅｙ／ｔｕｔｏｒｉａｌ．ｈｔｍ（Ｕｒｌ  ｈｔｔｐ：／／ｈｄｌ．ｈａｎｄｌｅ．ｎｅｔ／１８８０／５１９００）の下、「ＧＬＣＭ  Ｔｅｘｔｕｒｅ：Ａ  Ｔｕｔｏｒｉａｌ  ｖ．３．０、２０１７年３月」中に見つけることができる。
【００２９】
さらに好ましい実施形態では、顕微鏡観察方法に応じて追加で利用可能な追加の情報を獲得することができる。例として、強度分布、偏光コントラスト、または蛍光コントラストを追加で使用して、より良好な鑑別を促進することができる。
【００３０】
好ましくは、主成分分析パラメータ（ＰＣＡパラメータ）は、パラメータの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの異なる一次結合を含む。
【００３１】
好ましくは、主成分分析パラメータ（ＰＣＡパラメータ）は、以下に記載のパラメータの一次結合を含む。
【００３２】
少なくとも１つのＰＣＡパラメータは、好ましくは、細胞面積、周囲長、幅、高さ、アスペクト比、真円度、半径平均、半径分散、剛率、当量直径、光学的体積、光学的高さ最大、光学的高さ最小、光学的高さ平均、光学的高さ分散、両凹性、真球度、質量中心シフト、コントラスト、相違度、均一性、エネルギー、エントロピーのパラメータの一次結合を含む。
【００３３】
具体的には、ＰＣＡパラメータは合計６つのＰＣＡパラメータを含み、ＰＣＡパラメータのそれぞれは、それぞれ好ましくは細胞面積、周囲長、幅、高さ、アスペクト比、真円度、半径平均、半径分散、剛率、当量直径、光学的体積、光学的高さ最大、光学的高さ最小、光学的高さ平均、光学的高さ分散、両凹性、真球度、質量中心シフト、コントラスト、相違度、均一性、エネルギー、およびエントロピーのパラメータの一次結合を含む。
【００３４】
好ましくは、主成分分析パラメータ（ＰＣＡパラメータ）は以下のパラメータＶａｌ１〜Ｖａｌ６を含む。
【００３５】
Ｖａｌ１＝−０．２５１４２３５９３００８７＊（（細胞．細胞面積−（４２．９７５５０１６７４４））／１０．５７８８８６７２６３１４６）＋−０．２４９９７４７４８４９８９７１＊（（細胞．周囲長−（２４．５７６７５３５００４９４））／３．２０１０９０８８４８７２２１）＋−０．２３７５９３７４４５８９１６９＊（（細胞．幅−（７．３５７２３４６８３５９４３６））／１．００７９０８３４６２３４８５）＋−０．２４１３８５２４３７３０１６７＊（（細胞．高さ−（７．２８７２４８６４６３２５３８））／１．００１６７３７９９５２９６７）＋０．０５００６９０７５０７６７１９１＊（（細胞．アスペクト比−（１．０７２７０８４０３５９２３））／０．０５０３９４０３２８９４３０９１）＋−０．０３２５９３４３６２８００６３５＊（（細胞．真円度−（０．８７９２０３８９８３１９６９５））／０．０１７１３７４１４１１９０３０３）＋−０．２５１７４８６８２２１５６０６＊（（細胞．半径平均−（３．６７４８１４３０２０３９６１））／０．４７８０７４９４５２３５０９）＋−０．０３５８６８６３７３６９７５７２＊（（細胞．半径分散−（０．５３４３３４３４７５７３４２３））／０．１３５８６１１３２１５７５７５）＋−０．０７１３４２９０２８９３５０５２＊（（細胞．剛率−（０．９７３６５３３６７９４８１６７））／０．００６４２９７７９６６２９５２２９）＋−０．２５１８０１９５９１１７６１２＊（（細胞．当量直径−（７．３３４９８９９３４９２０４９））／０．９５７１２５６２９６９５２５６）＋−０．２７１８５９９６６９１０４５５＊（（細胞．光学的体積−（１０．９４３４８９３２７２５３２））／４．３９７８９３０６７６３４８７）＋−０．２６４８９３２５６２０７９８４＊（（細胞．光学的高さ最大−（４．０５０８６０８２５２１８２））／１．１３３８６５１６８６４４９２）＋−０．０１９４９９７２６２８２５４４＊（（細胞．光学的高さ最小−（０．９１７６２８９８８３２５１１９））／０．００９４３８１２１８４９２２２２４）＋−０．２６３４０３６６６２４４８６８＊（（細胞．光学的高さ平均−（２．５６９１３３２６００７２５５））／０．５７８６４００４６０４９５８７）＋−０．２６４３９８２０２２８６３４３＊（（細胞．光学的高さ分散−（０．８９１４９４６７９５８７９３５））／０．３１９５９９３１３０８５１８６）＋０．０６８３１１３５２１９６４８７２＊（（細胞．両凹性−（−０．１５９０４２７８８８３８６））／０．０８７８６６２３３０９８２１３７）＋０．０５３２７０６２６４４０９６４３＊（（細胞．真球度−（０．９５２１７９３４０８０９９２４））／０．０５５６２１５６５９４８２９４５）＋−０．１３５０１７５６９５５１９５７＊（（細胞．質量中心シフト−（０．３２１７８７３７７９６４２３８））／０．２７９７８７２０３９７１９６６）＋−０．２３７７５５５８９０６９４１＊（（細胞．コントラスト−（５．９９４１５４４０５２３２９９））／３．２８７３７８３４９０８７５７）＋−０．２４５２２３４３６３８４６９２＊（（細胞．相違度−（１．８２６１９４７２５５６２８））／０．５２４５３３０２７０４６９８６）＋０．２４１１９８０１７８４６５３１＊（（細胞．均一性−（０．４２１１９６３９６９１４４７５））／０．０７８７５０８１３１２５８１７１）＋０．２５８９５８１７９８４６１６３＊（（細胞．エネルギー−（０．１０６２３４０９９９３３３３５））／０．０３０３７７７８３５４３７８４８）＋−０．２６７３５２７６２５７１２４９＊（（細胞．エントロピー−（４．８５０１７５５１２５７２４８））／０．５５２２７０２５２４４１６８９）＋０；
【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
Ｖａｌ５＝０．２７７１８５２０６６４８５１５＊（（細胞．細胞面積−（２９．４３９５２０１５８０３１１））／５．１１００５１２１９０８８５５）＋０．２８９０２５８６１１６７００１＊（（細胞．周囲長−（２０．４７１４４６９０１０９９４））／１．７３７６３１１９８８６２５４）＋０．２７８６９７７１３７２１５６＊（（細胞．幅−（６．１２９５９７５１１３０４３５））／０．５９５４８５１８６８７１３３）＋０．２２６７９１９７７７３１３８５＊（（細胞．高さ−（６．０５１５０４２１９４４１５９））／０．５９１６０９１７３５２５８４９）＋−０．０１５４０１６５５７８６９１９５＊（（細胞．アスペクト比−（１．０８６９９１２９４９３３８））／０．０５４６５２６３７６５７０４８８）＋−０．１０４９６２０１５１９８４１７＊（（細胞．真円度−（０．８７６９４１９４６２７２０４３））／０．０１７９５２１４３９６０５０３６）＋０．２８０１１８１７１３０６２５４＊（（細胞．半径平均−（３．０５８７６８１９５５７２６８））／０．２５５９００８４３６９７６８９）＋０．１２２０７１７３７８２５６４４＊（（細胞．半径分散−（０．５１６０６４４３３９８９３５７））／０．１１１４５９０５８６９３６２４）＋−０．０７５７８０６４１５３６５６４９＊（（細胞．剛率−（０．９７１５９７８００７９８１７６））／０．００７２０４０４２５８１１７２１９）＋０．２７９７７６１８１９９４２４４＊（（細胞．当量直径−（６．１０１０１２３３３６３７５５））／０．５１１１３９８００８３０７９４）＋０．１２７０７９６６７２５７６１５＊（（細胞．光学的体積−（５．４９６３７１４３２９５３２１））／１．３９３５６６８３１２０８６７）＋−０．１６６６７４６８６５１５４８８＊（（細胞．光学的高さ最大−（２．７８９９７６３２１０８２０４））／０．３５７４５９５５６７４２８２９）＋−０．０８０１２０６１０２２８７０４４＊（（細胞．光学的高さ最小−（０．９１６９８２５４４７５９３９５））／０．０１１４６０７２４３４０３５１５）＋−０．１３９０４５８５２７３３９７＊（（細胞．光学的高さ平均−（１．９０６１０８２６７８５６０９））／０．１７６３１９０７９５６１６０５）＋−０．１５７３２０２０１６５１４３７＊（（細胞．光学的高さ分散−（０．５３１９３８９０７６９０７６３））／０．１０７０１９１７９７２９９７５）＋−０．０１３７４９６０４９８２４３８５＊（（細胞．両凹性−（−０．１１８７４２９１５５５０６８））／０．０８７８９５７４０８２３４９６７）＋−０．０１２４７５４６６３６５６２０７＊（（細胞．真球度−（０．９５５６３４９０９８９９６２１））／０．０４２６４１６８６４４６９７）＋−０．００３５４７０７６５５６６５２４８＊（（細胞．質量中心シフト−（０．２０５４１３０９７３５０６１１））／０．１４３２６６４９３４０６０５１）＋−０．３３７３１７１０４４７１５２７＊（（細胞．コントラスト−（２．９４７３９１９３１８６４４５））／０．８５２９７９８４８４８３４２１）＋−０．３５１６０５４８９０７０９６３＊（（細胞．相違度−（１．３１２３１８６９６１９６８１））／０．１８５６６６１２５６３５１４４）＋０．３２４１１５００１６７１０１５＊（（細胞．均一性−（０．４９９１７７２９９３９２１４５））／０．０４３９２９３４３７６３２２９）＋０．２０２８６０８６４８４８７２＊（（細胞．エネルギー−（０．１４１９１９９５６７０３９１３））／０．０２１３９５９６７９１９５１４２）＋−０．２０８５２８３１７３４８６６２＊（（細胞．エントロピー−（４．２０３１７１３４１２９７２７））／０．２６３３９１４７１０１７２９１）＋０；
【００４０】
Ｖａｌ６＝−０．０８２２１１７０１３４１１０２４＊（（細胞．細胞面積−（２９．４３９５２０１５８０３１１））／５．１１００５１２１９０８８５５）＋−０．０１３６９８３４４１８０１８７９＊（（細胞．周囲長−（２０．４７１４４６９０１０９９４））／１．７３７６３１１９８８６２５４）＋−０．０４２１９６５７６７１５５２６７＊（（細胞．幅−（６．１２９５９７５１１３０４３５））／０．５９５４８５１８６８７１３３）＋−０．０１０５０９７６９４６０２１７６＊（（細胞．高さ−（６．０５１５０４２１９４４１５９））／０．５９１６０９１７３５２５８４９）＋０．０８２９５５３４５３２５６７８１＊（（細胞．アスペクト比−（１．０８６９９１２９４９３３８））／０．０５４６５２６３７６５７０４８８）＋−０．６０１８０２５８００１５１７８＊（（細胞．真円度−（０．８７６９４１９４６２７２０４３））／０．０１７９５２１４３９６０５０３６）＋−０．０８３２９６１２７７５８５５９２＊（（細胞．半径平均−（３．０５８７６８１９５５７２６８））／０．２５５９００８４３６９７６８９）＋０．３１２１２５０３６２６４２５３＊（（細胞．半径分散−（０．５１６０６４４３３９８９３５７））／０．１１１４５９０５８６９３６２４）＋−０．５４８６４４９１１１６６９１７＊（（細胞．剛率−（０．９７１５９７８００７９８１７６））／０．００７２０４０４２５８１１７２１９）＋−０．０８８７２２６１１１０９９７２２＊（（細胞．当量直径−（６．１０１０１２３３３６３７５５））／０．５１１１３９８００８３０７９４）＋−０．０６５５５８０７４７２４３８１＊（（細胞．光学的体積−（５．４９６３７１４３２９５３２１））／１．３９３５６６８３１２０８６７）＋０．００６３５２００７７９２７７０７６＊（（細胞．光学的高さ最大−（２．７８９９７６３２１０８２０４））／０．３５７４５９５５６７４２８２９）＋−０．２０８２４２７５１７４６０４３＊（（細胞．光学的高さ最小−（０．９１６９８２５４４７５９３９５））／０．０１１４６０７２４３４０３５１５）＋−０．０５２８５５４６７１７７８９４＊（（細胞．光学的高さ平均−（１．９０６１０８２６７８５６０９））／０．１７６３１９０７９５６１６０５）＋０．０１３９４２５５０３５４１６２３＊（（細胞．光学的高さ分散−（０．５３１９３８９０７６９０７６３））／０．１０７０１９１７９７２９９７５）＋０．０２１２７０８２６０４６３３９４＊（（細胞．両凹性−（−０．１１８７４２９１５５５０６８））／０．０８７８９５７４０８２３４９６７）＋−０．２８１８９０９０５４６７４９６＊（（細胞．真球度−（０．９５５６３４９０９８９９６２１））／０．０４２６４１６８６４４６９７）＋０．２５８３９１３２７６２６０１６＊（（細胞．質量中心シフト−（０．２０５４１３０９７３５０６１１））／０．１４３２６６４９３４０６０５１）＋０．０７４４５１７９３２９５６９４８＊（（細胞．コントラスト−（２．９４７３９１９３１８６４４５））／０．８５２９７９８４８４８３４２１）＋０．０５８７６３７３５４２０１５６５＊（（細胞．相違度−（１．３１２３１８６９６１９６８１））／０．１８５６６６１２５６３５１４４）＋−０．０４０４６６７５１８４０９８５２＊（（細胞．均一性−（０．４９９１７７２９９３９２１４５））／０．０４３９２９３４３７６３２２９）＋−０．０１５９２８９７４４００１＊（（細胞．エネルギー−（０．１４１９１９９５６７０３９１３））／０．０２１３９５９６７９１９５１４２）＋０．０２４７２９２１３６８６０１０８＊（（細胞．エントロピー−（４．２０３１７１３４１２９７２７））／０．２６３３９１４７１０１７２９１）＋０；
【００４１】
好ましくは、細胞のイメージングは、参照波を対象波上にオーバーレイし、生じるインターフェログラムおよび／またはコンピュータで実行した数学的再構成を記録することを含む。
【００４２】
ここでは、対象の位相情報の定量的獲得を可能にするため、デジタルホログラフィー顕微鏡観察の適用が特に有利である。本発明による方法のさらなる実施形態によれば、白血球のイメージ表示は、したがって、デジタルホログラフィー顕微鏡観察、干渉位相顕微鏡観察、および／または定量的位相顕微鏡観察によって確認される。これらの顕微鏡観察方法は、特に高い距離分解能、すなわち、顕微鏡の光学軸の方向のものを促進する。デジタルホログラフィー顕微鏡観察はｚ方向に１ｎｍまでの分解能を促進する。これは、他の既知の光学顕微鏡方法（たとえば共焦点顕微鏡）よりも１００〜１０００倍高い精度に対応している。その結果、高さプロフィールの正確な確認が理由で、細胞種のより正確な決定が可能である。
【００４３】
したがって、顕微鏡観察器具は、好ましくは、デジタルホログラフィー顕微鏡観察（ＤＨＭ）、干渉位相顕微鏡観察、または定量的位相顕微鏡観察を行うための顕微鏡である。
【００４４】
好ましくは、白血球は、フローセルにおいて顕微鏡観察器具によってイメージングし、該フローセルは、好ましくは長方形または正方形の横断面を有するチャネルを含む。
【００４５】
好ましくは、白血球は、層状シース流によって、好ましくは４つの層状シース流によって集中される。
【００４６】
好ましくは、白血球を顕微鏡観察器具によってイメージングする前に、赤血球を選択的溶解によってサンプルから除去する。
【００４７】
１つまたはそれ以上の非染色および／または非乾燥細胞を使用して方法を実行する場合に、さらなる利点が得られる。細胞の活力は本発明による方法によって損なわれないため、本方法によって決定された細胞は、決定方法が完了した後、続く分析にさらに使用することができる。
【００４８】
さらなる例示的な実施形態によれば、本発明による方法は、標識を用いて細胞を表現型決定すること、および／または細胞のさらなる割当てのために事前に決定された受容体を発現させることを含むことができる。これにより、決定された細胞のより徹底的な分子生物学的検査が促進される。
【００４９】
さらなる実施形態によれば、本発明による方法では、全血サンプルを使用して行う場合、ならびに／または、生物学的サンプルが血液細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、および／もしくはリンパ球を含有する場合に、特定の関連性が得られる。これは、血液学において血球数を決定する場合に主な使用が見つかる。
【００５０】
本発明のさらなる主題は、本発明による方法の上述の実施形態のうちの１つまたはそれ以上を実行するように構成されている、細胞分析装置、たとえばマイクロチップまたはマイクロコントローラを含むものに関する。
【００５１】
本発明のさらなる主題は、本発明による細胞分析装置を含む、標識せずに生物学的サンプルの白血球の細胞種を決定するための顕微鏡観察器具に関する。
【００５２】
好ましくは、顕微鏡観察器具はデジタルホログラフィー顕微鏡を含む。
【００５３】
本発明による方法のさらなる実施形態によれば、白血球種の決定は、細胞の細胞期の決定、特に、細胞齢、細胞の生理的もしくは形態学的状態、または細胞の活性状態の鑑別を含むことができる。これにより、イメージシーケンス、たとえば細胞における活性化手順のものの記録が促進される。
【００５４】
干渉位相顕微鏡観察とも呼ばれるデジタルホログラフィー顕微鏡観察（ＤＨＭ）は、１つの記録で対象の強度および位相の両方を定量的に獲得できることによって識別される。この目的を達成するために、記録されるのは、慣用の顕微鏡観察のような対象での光の吸収および散乱によって生じる強度分布ではなく、対象波および参照波の重ね合わせから生じる波面である。このことから、対象の強度および位相情報をコンピュータの助けにより再構成することができる。
【００５５】
この顕微鏡観察方法は、さらなるサンプル調製なしに可視光に対して実質的に透明であり、したがって慣用の顕微鏡においてコントラストをわずかしか有さないため、生物学的サンプルの検査に適している。位相情報を記録することによって、細胞の形態学を非常に正確に獲得し、本情報の助けにより細胞の鑑別を行うことが可能である。
【００５６】
通常は対物レンズ中の位相リングおよびコンデンサ中の環状ストップによって現実化される、慣用の位相差顕微鏡と比較して、ＤＨＭは、位相を定量的に決定できるという利点を提供する。したがって、これは定量的位相差顕微鏡観察とも呼ばれる。対象の高さプロフィールの再現性のある再構成は、位相を定量することによってのみ促進され、これのみが細胞種の自動決定を可能にする。
【００５７】
光の位相シフトは対象を通る光路長によって決定される；すなわち、対象の幾何学的厚さおよび屈折率の両方がこの場合に役割を果たすことに注意されたい。真の幾何学的高さプロフィールを位相情報から得るためには、サンプルの屈折率が知られていなければならない。しかし、細胞の顕微鏡観察の好ましい応用では、概ね一定かつ知られている屈折率を仮定することができ、その結果、位相情報を高さプロフィールへと直接変換することができる。あるいは、位相情報を様々な波長で記録し、それによる計算によって屈折率の影響を除去することができる。
【００５８】
さらに、位相情報は３６０°の位相角までしかユニークに決定されないことにも注意されたい。例として、測定された位相シフト１０°は、実際には３７０°、７３０°などの位相シフトに対応している場合がある。したがって、ユニークさの範囲は光の波長に限定される。生体細胞は急勾配の側面を有しておらず、したがって隣接ピクセルの位相値は接続状態で利用可能なため、細胞の顕微鏡観察の選択された応用では、この限定は同様に無視できる。
【００５９】
本発明による方法は、鑑別血球数を作成するために現在適用されている手順を、標識せずに行うことを可能にする。鑑別血球数を作成するための例示的な手順は、たとえば、細胞サイズの確認、細胞の成熟状態、すなわち細胞齢、核細胞質比、細胞質封入体の獲得、およびクロマチン構造の獲得を含む。
【００６０】
デジタルホログラフィー顕微鏡観察（ＤＨＭ）とも呼ばれる干渉位相顕微鏡観察は、１つの記録で対象の強度および位相の両方を定量的に獲得できることによって識別される。この目的を達成するために、獲得されるのは、慣用の顕微鏡観察のような対象のイメージ表示ではなく、対象波および参照波の重ね合わせから出現する波面である。このことから、対象の強度および位相情報を細胞分析装置、たとえばコンピュータの助けにより再構成することができる。
【００６１】
この顕微鏡観察方法は、さらなるサンプル調製なしに可視光に対して実質的に透明であり、したがって慣用の顕微鏡においてコントラストをわずかしか有さないため、生物学的サンプルの検査に適している。位相情報を記録することによって、細胞の形態学を非常に正確に獲得し、本情報の助けにより細胞の鑑別を行うことが可能である。
【００６２】
細胞を染色することなしに、たとえば複数の細胞の再構成した位相情報に基づいて、たとえば白血球の鑑別を実行することが可能であり、作業を新鮮な乾燥していない細胞で実行することが可能となる。その結果、乾燥および染色中のサンプルの取扱いの様々な事例から生じる不必要な人為的結果が回避される。ここでは、イメージは再現性があり、自動コンピュータ支援画像処理によってより容易に識別可能である。方法の工程数が最小限となる。これにより費用および時間が節約され、信頼性がありより速い診断が促進される。
【００６３】
事前分析では、これにより、たとえば、丸め緩衝液（ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（すなわち高希釈のＳＤＳ緩衝溶液）の使用を血液学的分析計に関して省略することが可能となる。後者は、フローサイトメーターにおいて散乱光の測定に適しているが、同時に人為的結果をもたらす、細胞の丸まりをもたらす。
【００６４】
本発明を添付の図面に基づいて、具体的な例示的な実施形態によって、再度、より詳細に説明する。示した例は本発明の好ましい実施形態を表す。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＡＭＬサンプルの概要を示す図であり、ＰＣＡパラメータをプロットしている。
【図２】ＣＭＬサンプルの概要を示す図であり、ＰＣＡパラメータをプロットしている。
【図３】ＡＬＬサンプルの概要を示す図であり、ＰＣＡパラメータをプロットしている。
【図４】ＣＬＬサンプルの概要を示す図であり、ＰＣＡパラメータをプロットしている。
【図５】ＯＭＦサンプルの概要を示す図であり、ＰＣＡパラメータをプロットしている。
【図６】健康なサンプルの概要を示す図であり、ＰＣＡパラメータをプロットしている。
【図７】ＡＭＬサンプルの、骨髄芽球およびリンパ芽球のゲートの特徴的な散乱パターンを示す図である。
【図８】ＣＭＬサンプルの、骨髄芽球およびリンパ芽球のゲートの特徴的な散乱パターンを示す図である。
【図９】ＡＬＬサンプルの、骨髄芽球およびリンパ芽球のゲートの特徴的な散乱パターンを示す図である。
【図１０】ＣＬＬサンプルの、骨髄芽球およびリンパ芽球のゲートの特徴的な散乱パターンを示す図である。
【図１１】ＯＭＦサンプルの、骨髄芽球およびリンパ芽球のゲートの特徴的な散乱パターンを示す図である。
【図１２】健康なサンプルの、骨髄芽球およびリンパ芽球のゲートの特徴的な散乱パターンを示す図である。
【図１３】定義された領域（「ゲート」）における特徴的な散乱パターンに基づいた、単球の識別を示す図である。ＰＣＡパラメータ（Ｖａｌ−Ｘ）または物理的パラメータおよびＰＣＡパラメータの組合せをプロットしている。
【図１４】定義された領域（「ゲート」）における特徴的な散乱パターンに基づいた、好中球、好酸球の識別を示す図である。ＰＣＡパラメータ（Ｖａｌ−Ｘ）または物理的パラメータおよびＰＣＡパラメータの組合せをプロットしている。
【図１５】定義された領域（「ゲート」）における特徴的な散乱パターンに基づいた、好塩基球、リンパ球の識別を示す図である。ＰＣＡパラメータ（Ｖａｌ−Ｘ）または物理的パラメータおよびＰＣＡパラメータの組合せをプロットしている。
【図１６】定義された領域（「ゲート」）における特徴的な散乱パターンに基づいた、好酸球、前骨髄球、芽球、巨核球の識別を示す図である。ＰＣＡパラメータ（Ｖａｌ−Ｘ）または物理的パラメータおよびＰＣＡパラメータの組合せをプロットしている。
【図１７】定義された領域（「ゲート」）における特徴的な散乱パターンに基づいた、後骨髄球の識別を示す図である。ＰＣＡパラメータ（Ｖａｌ−Ｘ）または物理的パラメータおよびＰＣＡパラメータの組合せをプロットしている。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法の助けにより、生物学的サンプルにおいて標識せずに白血球の細胞種の決定を行うことができる。この場合、標識せずにとは、細胞を、たとえば蛍光色素または放射性粒子によって、標識する必要がないことを意味する。ここでは、生物学的サンプルは、たとえば動物またはヒトの血液細胞のサンプルを含み得る。好ましくは、これは全血サンプルであり、たとえば、血液細胞１０、たとえば、白血球、好酸球、または好塩基球を含む。
【００６７】
第１の実験例では、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、およびＯＭＦを、それぞれの特徴的な散乱パターンに基づいて識別する。
【００６８】
図１から図６は、ＡＭＬ（図１）、ＣＭＬ（図２）、ＡＬＬ（図３）、ＣＬＬ（図４）、ＯＭＦ（図５）、および健康なサンプル（図６）の特徴的な散乱パターンを示す。ここでは、「ＯＭＦ」は、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）の群の亜型である骨骨髄線維症を表す。ＰＣＡパラメータＶａｌ４およびＶａｌ５（対応する一次結合には上記を参照）を区別に使用する。
【００６９】
様々な種類の白血病のうちの１つを有する患者または健康な対象のサンプルの識別基準は、以下の通りである。
【００７０】
健康な対象のサンプル：３つの明確に分離されたデータ領域：
第１の領域：Ｖａｌ４＝４００〜６５０、Ｖａｌ５＝２００〜５００、
第２の領域：Ｖａｌ４＝６００〜７５０、Ｖａｌ５＝４００〜６００、
第３の領域：Ｖａｌ４＝７００〜８５０、Ｖａｌ５＝２５０〜４００。
【００７１】
ＡＭＬを有する患者のサンプル：１つだけの連続的なデータ領域：
Ｖａｌ４＝６００〜９００、Ｖａｌ５＝３００〜６００。
【００７２】
ＣＭＬを有する患者のサンプル：３つの領域へと細区分することができる、隣接するデータ領域：
第１の領域：Ｖａｌ４＝４００〜５５０、Ｖａｌ５＝２００〜５００の領域中の小集団、
第２の領域：Ｖａｌ４＝５００〜７００、Ｖａｌ５＝２００〜５００の領域中の支配的な主集団、
第３の領域：Ｖａｌ４＝７００〜８５０、Ｖａｌ５＝２５０〜４００の領域中の小集団。
【００７３】
ＡＬＬを有する患者のサンプル：大きな主集団および２つの小さな二次集団：
第１の領域：Ｖａｌ４＝７００〜８５０、Ｖａｌ５＝３００〜５００の領域中の支配的な主集団、
第２の領域：Ｖａｌ４＝５５０〜７００、Ｖａｌ５＝３００〜４５０の領域中の小集団、
第３の領域：Ｖａｌ４＝５００〜７００、Ｖａｌ５＝４５０〜６００の領域中の小集団。
【００７４】
ＣＬＬを有する患者のサンプル：大きな主集団および１つの小さな二次集団：
第１の領域：Ｖａｌ４＝６５０〜９００、Ｖａｌ５＝３００〜５００の領域中の支配的な主集団、
第２の領域：Ｖａｌ４＝４００〜６００、Ｖａｌ５＝３００〜５００の領域中の小集団。
【００７５】
ＯＭＦを有する患者のサンプル：４つの領域へと細区分することができる、隣接するデータ領域：
第１の領域：Ｖａｌ４＝７００〜９００、Ｖａｌ５＝２００〜４００、
第２の領域：Ｖａｌ４＝６００〜７５０、Ｖａｌ５＝４００〜５５０、
第３の領域：Ｖａｌ４＝５００〜６５０、Ｖａｌ５＝２５０〜４５０、
第４の領域：Ｖａｌ４＝４００〜６５０、Ｖａｌ５＝４５０〜７００の領域中の小集団。
【００７６】
第２の実験例では、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、およびＯＭＦを、それぞれの特徴的な散乱パターンに基づいて識別する。
【００７７】
図７から図１２は、ＡＭＬ（図７）、ＣＭＬ（図８）、ＡＬＬ（図９）、ＣＬＬ（図１０）、ＯＭＦ（図１１）、および健康なサンプル（図１２）の特徴的な散乱パターンを示す。ＰＣＡパラメータＶａｌ３およびＶａｌ４（対応する一次結合には上記を参照）を区別に使用する。２つの大きな領域を定義する：
第１の領域：Ｖａｌ４＝２３５〜９２０、Ｖａｌ５＝５７６〜８１６ （＝「骨髄芽球」ゲート（２））、
第２の領域：Ｖａｌ４＝２３５〜９２０、Ｖａｌ５＝８１６〜１０１５ （＝「リンパ芽球」ゲート（１））。
【００７８】
様々な種類の白血病のうちの１つを有する患者または健康な対象のサンプルの識別基準は、以下の通りである。
【００７９】
健康な対象のサンプル：両方のゲート中にゼロまたは非常に少数のみのデータ点。
【００８０】
ＡＭＬを有する患者のサンプル：第１の領域中に顕著な集団：
第１の領域中の全データ点の＞９０％、
第２の領域中の全データ点の＜１０％。
【００８１】
ＣＭＬを有する患者のサンプル：第１の領域中に少数のデータ点：
第１の領域中の全データ点の＞９０％、
第２の領域中の全データ点の＜１０％。
【００８２】
ＡＬＬを有する患者のサンプル：顕著な集団が第１および第２の領域にわたって広がる：
第１の領域中の全データ点の＜９０％、
第２の領域中の全データ点の＞１０％。
【００８３】
ＣＬＬを有する患者のサンプル：第２の領域中に顕著な集団：
第１の領域中の全データ点の＜１０％、
第２の領域中の全データ点の＞９０％。
【００８４】
ＯＭＦを有する患者のサンプル：第１および第２の領域中に少数のデータ点：
第１の領域中の全データ点の＞８０％、
第２の領域中の全データ点の＜２０％。
【００８５】
第３の実験例では、標識せずに５つの主要な白血球の種類およびさらなる亜型間で区別される。
【００８６】
図１３から図１７は、定義された領域（「ゲート」）中の特徴的な散乱パターンに基づいて、標識せずに５つの主要な白血球の種類およびさらなる亜型間の区別を示す。略記「Ｅ＆Ｎ＆ＩＧ」（１２）は、好酸球、好中球、および未成熟顆粒球を表す（図１３を参照）。この場合、未成熟顆粒球は後骨髄球および骨髄球である。以下の領域は細胞種間を識別するために定義されている（使用パラメータおよび定義された領域（ゲート）のＸ／Ｙ座標をそれぞれの事例で指定している）：
【００８７】
第１の領域＝「単球」ゲート（３）：単球細胞種は、Ｖａｌ４およびＶａｌ５の値が理由で以下のように識別される。
【００８８】
【表３】
2021518527.tif 000005
【００８９】
第２の領域＝「好中球」ゲート（４）：好中球細胞種は、Ｖａｌ４およびＶａｌ５の値が理由で以下のように識別される。
【００９０】
【表４】
2021518527.tif 000006
【００９１】
第３の領域＝「好酸球」ゲート（５）：好酸球細胞種は、Ｖａｌ４およびエントロピーの値が理由で以下のように識別される。
【００９２】
【表５】
2021518527.tif 000007
【００９３】
第４の領域＝「好塩基球」ゲート（６）：好塩基球細胞種は、Ｖａｌ４およびＶａｌ５の値が理由で以下のように識別される。
【００９４】
【表６】
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【００９５】
第５の領域＝「リンパ球」ゲート（７）：リンパ球細胞種は、Ｖａｌ４およびＶａｌ５の値が理由で以下のように識別される。
【００９６】
【表７】
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【００９７】
第６の領域＝「巨核球」ゲート（８）：巨核球細胞種は、Ｖａｌ３およびエントロピーの値が理由で以下のように識別される。
【００９８】
【表８】
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【００９９】
第７の領域＝「前骨髄球」ゲート（９）：前骨髄球細胞種は、Ｖａｌ３およびエントロピーの値が理由で以下のように識別される。
【０１００】
【表９】
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【０１０１】
第８の領域＝「骨髄球」ゲート（１０）：骨髄球細胞種は、当量直径および均一性の値が理由で以下のように識別される。
【０１０２】
【表１０】
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【０１０３】
第９の領域＝「後骨髄球」ゲート（１１）：後骨髄球細胞種は、当量直径および均一性の値が理由で以下のように識別される。
【０１０４】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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