(57)【要約】  対象におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを治療する方法が、本明細書において説明される。これらの方法は、対象における治療に大きい有効性があり、且つ対象において忍容性が良好である、具体的投薬レジメンを含む。
2021518381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを、それを必要とする対象において治療する方法であって、下記式を有する化合物１：
【化１】
2021518381.tif 000028
又はその医薬として許容し得る塩の治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含み、ここで該治療的有効量が、総一日量約１０ｍｇ〜２，０００ｍｇである、方法。
【請求項２】
前記治療的有効量が、総一日量約１０ｍｇ〜５０ｍｇである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記治療的有効量が、総一日量約５０ｍｇ〜３００ｍｇである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記治療的有効量が、総一日量約５０ｍｇ〜１５０ｍｇである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記治療的有効量が、総一日量約１５０ｍｇ〜８００ｍｇである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記治療的有効量が、総一日量約８００ｍｇ〜１，６００である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記治療的有効量が、総一日量約８００ｍｇである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
治療的有効量が、総一日量約１，６００ｍｇである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記化合物１が、ＨＣｌ塩型である、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物１が、経口投与される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物１が、１日１回投与される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物１が、１日２回投与される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物１が、１日３回投与される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物１が、１日４回投与される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを、それを必要とする対象において治療する方法であって、下記式を有する化合物１：
【化２】
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又はその医薬として許容し得る塩の治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含み、ここで化合物１の治療的有効量が、少なくとも５μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、方法。
【請求項１６】
前記化合物１の治療的有効量が、少なくとも６μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物１の治療的有効量が、少なくとも７．５μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物１の治療的有効量が、少なくとも８μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物１の治療的有効量が、５〜３０μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物１の治療的有効量が、５〜２５μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物１の治療的有効量が、６〜２０μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物１の治療的有効量が、７．５〜１５μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物１の治療的有効量が、７．５〜１０μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症、老人性全身性アミロイドーシス、中枢性アミロイドーシス、眼アミロイドーシス、脳軟膜アミロイドーシス、眼軟膜アミロイドーシス、硝子体アミロイドーシス、消化管アミロイドーシス、神経原性アミロイドーシス、非−神経原性アミロイドーシス、非−遺伝性アミロイドーシス、反応性／続発性アミロイドーシス、脳アミロイドーシスからなる群から選択される疾患又は病態である、請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、脳軟膜アミロイドーシスである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記脳軟膜アミロイドーシスが、１８位のアスパラギン酸のグリシンへの変異（Ｄ１８Ｇ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記脳軟膜アミロイドーシスが、５３位のグリシンのアルギニンへの変異（Ｇ５３Ｒ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記脳軟膜アミロイドーシスが、１１４位のチロシンのシステインへの変異（Ｙ１１４Ｃ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記脳軟膜アミロイドーシスが、４９位のトレオニンのプロリンへの変異（Ｔ４９Ｐ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）心筋症又はトランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）ポリニューロパチーである、請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、６０位のトレオニンのアラニンへの変異（Ｔ６０Ａ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、２４位のプロリンのセリンへの変異（Ｐ２４Ｓ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、３８位のアスパラギン酸のアラニンへの変異（Ｄ３８Ａ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、５８位のロイシンのヒスチジンへの変異（Ｌ５８Ｈ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）心筋症である、請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡＴＴＲ心筋症が、野生型ＡＴＴＲ心筋症（ＡＴＴＲｗｔ−ＣＭ）である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記ＡＴＴＲ心筋症が、家族性ＡＴＴＲ心筋症（ＡＴＴＲｍ−ＣＭ）である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡＴＴＲｍ−ＣＭが、１２２位のバリンのイソロイシンへの変異（Ｖ１２２Ｉ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ＡＴＴＲｍ−ＣＭが、４９位のトレオニンのプロリンへの変異（Ｔ４９Ｐ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＴＲアミロイドーシスが、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）ポリニューロパチーである、請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
前記ＡＴＴＲポリニューロパチーが、野生型ＡＴＴＲポリニューロパチー（ＡＴＴＲｗｔ−ＰＮ）である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記ＡＴＴＲポリニューロパチーが、家族性ＡＴＴＲポリニューロパチー（ＡＴＴＲｍ−ＰＮ）である、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＴＴＲｍ−ＰＮが、３０位のバリンのメチオニンへの変異（Ｖ３０Ｍ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記ＡＴＴＲｍ−ＰＮが、６４位のフェニルアラニンのロイシンへの変異（Ｆ６４Ｌ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記ＡＴＴＲｍ−ＰＮが、１１４位のチロシンのシステインへの変異（Ｙ１１４Ｃ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
ＡＴＴＲ心筋症の対象における化合物１の治療的有効量の投与が、対象のニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類を改善、安定化、又は増悪を遅延する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
化合物１の治療的有効量の投与が、対象のニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類を軽減する、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記ＮＹＨＡ機能分類が、クラスＩＶからクラスＩＩＩへ、クラスＩＶからクラスＩＩへ、又はクラスＩＶからクラスＩへ軽減される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記ＮＹＨＡ機能分類が、クラスＩＩＩからクラスＩＩへ軽減される、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記ＮＹＨＡ機能分類が、クラスＩＩＩからクラスＩへ軽減される、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
前記ＮＹＨＡ機能分類が、クラスＩＩからクラスＩへ軽減される、請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
ＡＴＴＲ心筋症の対象における化合物１の治療的有効量の投与が、対象のカンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）分類の改善、安定化、又は増悪を遅延する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
対象が、対象のカンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）分類の少なくとも１レベルの平均改善を有する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
ＡＴＴＲ心筋症の対象における化合物１の治療的有効量の投与が、対象のＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）分類を改善、安定化、又は増悪を遅延する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
対象が、ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）効用スコアにおいて少なくとも５ポイントの平均改善を有する、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
ＡＴＴＲ心筋症の対象における化合物１の治療的有効量の投与が、６分間歩行試験における対象の成績を改善する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、化合物１による治療前に測定したベースライン距離よりも、少なくとも２５ｍ更に歩行する、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
ＡＴＴＲ心筋症の対象における化合物１の治療的有効量の投与が、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の血中血清レベルを減少する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
前記対象のＢＮＰの血中血清レベルが、化合物１による治療前の該対象におけるＢＮＰのベースラインレベルと比べ、少なくとも１０％減少する、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
ＡＴＴＲ心筋症の対象における化合物１の治療的有効量の投与が、Ｎ−末端プロ−脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎ−末端プロ−ＢＮＰ）の血中血清レベルを減少する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
前記対象のＮ−末端プロ−ＢＮＰの血中血清レベルが、化合物１による治療前の該対象におけるＮ−末端プロ−ＢＮＰのベースラインレベルと比べ、少なくとも１０％減少する、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ＡＴＴＲ心筋症の対象における化合物１の治療的有効量の投与が、治療を受けていない対象と比べ、心臓血管に関連した入院の頻度を減少する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
ＡＴＴＲ心筋症の対象における化合物１の治療的有効量の投与が、治療を受けていない対象と比べ、死亡率を低下する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
ＡＴＴＲポリニューロパチーの対象における化合物１の治療的有効量の投与が、該対象における神経障害スコア（ＮＩＳ）を改善する、請求項４０〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
前記ＮＩＳスコアが、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１０％だけ低下される、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
ＡＴＴＲポリニューロパチーの対象における化合物１の治療的有効量の投与が、該対象における補正神経障害スコア＋７（ｍＮＩＳ＋７）を改善する、請求項４０〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
前記ｍＮＩＳ＋７スコアが、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１０％だけ低下される、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
ＡＴＴＲポリニューロパチーの対象における化合物１の治療的有効量の投与が、対象のノーフォークＱＯＬ糖尿病性ニューロパチー（ＱＯＬ−ＤＮ）質問票スコアを改善する、請求項４０〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
前記ノーフォークＱＯＬ−ＤＮスコアが、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１０％だけ改善される、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
ＡＴＴＲポリニューロパチーの対象における化合物１の治療的有効量の投与が、対象の複合自律神経症状スコア（ＣＯＭＰＡＳＳ−３１）のスコアを改善する、請求項４０〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
前記ＣＯＭＰＡＳＳ−３１スコアが、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも０．５ポイント改善される、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
ＡＴＴＲポリニューロパチーの対象における化合物１の治療的有効量の投与が、対象の修正ＢＭＩ（ｍＢＭＩ）を改善する、請求項４０〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
ＡＴＴＲポリニューロパチーの対象における化合物１の治療的有効量の投与が、対象の１０メートル歩行試験速度を改善する、請求項４０〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
前記化合物１が、慢性的に投与される、請求項１〜７３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
前記化合物１が、２８日間投与される、請求項１〜７３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
前記化合物１が、５６日間投与される、請求項１〜７３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
前記化合物１が、８４日間投与される、請求項１〜７３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
前記化合物１が、１８ヶ月間投与される、請求項１〜７３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
前記化合物１が、３０ヶ月間投与される、請求項１〜７３のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
前記対象が、利尿治療薬剤を受け取っている、請求項１〜７９のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
前記利尿治療薬剤が、フロセミド又はトラセミドである、請求項８１記載の方法。
【請求項８２】
下記式を有する化合物１：
【化３】
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又はその医薬として許容し得る塩を、約１０〜１，０００ｍｇ含有する、単回単位用量（single unit dosage）。
【請求項８３】
前記単回単位剤形（single unit dosage form）が、化合物１約２００ｍｇを含有する、請求項８２記載の単回単位剤形。
【請求項８４】
前記単回単位剤形が、化合物１約４００ｍｇを含有する、請求項８２記載の単回単位剤形。
【請求項８５】
前記単回単位剤形が、錠剤である、請求項８２〜８４のいずれか一項記載の単回単位用量。
【請求項８６】
前記単回単位剤形が、カプセル剤である、請求項８２〜８４のいずれか一項記載の単回単位用量。
【請求項８７】
前記化合物１が、ＨＣｌ塩型である、請求項８２〜８６のいずれか一項記載の単回単位用量。
【請求項８８】
請求項８２〜８７のいずれか一項記載の１又は複数の単位用量を含む、キット。
【請求項８９】
化合物１の投与に関する指示を記したラベルを更に含む、請求項８８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１８年３月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／６４７，４１１号；２０１８年８月１７日に出願された第６２／７６５，０９６号；２０１８年９月１４日に出願された第６２／７３１，６２９号；２０１８年１１月９日に出願された第６２／７５８，２３５号；及び、２０１９年２月２６日に出願された第６２／８１０，６５１号の、優先権の恩恵を主張するものであり、これらの各開示はそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
連邦の支援の研究開発の下で行われた発明に対する権利の陳述
該当なし。
【０００３】
コンパクトディスク上に提出される「配列表」、表、又はコンピュータプログラムリストの付属物の言及
本出願はこれにより、本出願と共にコンピュータ可読型で提出される配列表を、その全体で、参照により組み込んでいる。この出願されたファイル名は以下である：「Sequence Listing - 051418-505」。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
タンパク質のミスフォールディング又はシグナル伝達経路の過剰活性化のいずれかを介した、異常なタンパク質相互作用及び凝集は、数多くのヒト変性疾患の基礎となる原因である。従って、標的化タンパク質タンパク質相互作用（ＰＰＩ）は、治療上興味深いものである。
【０００５】
異常なタンパク質凝集の一つのそのような例は、可溶性タンパク質トランスサイレチン（ＴＴＲ又はプレアルブミン）である。ＴＴＲは、血液及び脳脊髄液中に存在する、５５ｋＤａのホモ四量体タンパク質である。そのホモ四量体型から解離した場合、ＴＴＲ二量体は、アミロイド形成的単量体へミスフォールディングし得る。これは、野生型ＴＴＲ、並びに１００種を超える様々な変異したバリアントにより観察される。研究は、ＴＴＲの四量体型の安定化は、アミロイド形成性単量体のミスフォールディング、並びにそれに続くＴＴＲアミロイド形成及び沈着を阻害することを示している。
【０００６】
タファミジスと称されるベンゾオキサゾール誘導体である（２−（３，５−ジクロロフェニル）−１，３−ベンゾオキサゾール−６−カルボン酸は、異常なＴＴＲ凝集及び原線維形成を阻害することが説明されており、且つ家族性及び野生型ＴＴＲ患者の心筋症の治療に関する臨床試験が進行している。タファミジスは依然、主要医薬品登録機関であるＦＤＡによる評価段階にある。
【０００７】
異常なＴＴＲ凝集及び原線維形成を伴う対象の治療の管理及び改善において努力が続けられているにもかかわらず、未だほとんど改善はない。例えば、米国における最大のアミロイド照会センターであるMayo Clinicからの最新のレトロスペクティブな総説は、１９６５年と２０１３年の間で、ＴＴＲアミロイド心筋症（ＡＴＴＲ−ＣＭ）の対象の全体の死亡率において認識できる変化はないことを指摘した(Groganら、J Am Coll Cardiol 2016; 68(10): 1014-20)。
【０００８】
従って、異常なＴＴＲ凝集及び原線維形成を治療する方法を提供することの必要性が、当該技術分野において存在する。本開示は、これらの必要性に対処し、且つ更に関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
簡単な発明の概要
一部の態様において、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを、それを必要とする対象において治療する方法であって、下記式を有する化合物１：
【化１】
2021518381.tif 000003
又はその医薬として許容し得る塩の治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含み、ここで該治療的有効量が、総一日量約５０ｍｇ〜２，０００ｍｇである方法が、本明細書に提供される。
【００１０】
一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約８００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約１，６００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１のＨＣｌ塩型が投与される。
【００１１】
一部の実施態様において、化合物１は、１日１回投与される。一部の実施態様において、化合物１は、１日２回投与される。
【００１２】
一部の態様において、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを、それを必要とする対象において治療する方法であって、下記式を有する化合物１：
【化２】
2021518381.tif 000004
又はその医薬として許容し得る塩の治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含み、ここで化合物１の治療的有効量が、化合物１の所望のトラフ血中血漿濃度を維持する方法が、本明細書に提供される。
【００１３】
追加の態様において、下記式を有する化合物１：
【化３】
2021518381.tif 000005
又はその医薬として許容し得る塩の約１０〜１，０００ｍｇの単回単位用量（single unit dosage）が、本明細書に提供される。
【００１４】
一部の実施態様において、単回単位剤形（single unit dosage form）は、化合物１の２００ｍｇを含有する。一部の実施態様において、単回単位剤形は、化合物１の４００ｍｇを含有する。一部の実施態様において、単回単位用量は、化合物１のＨＣｌ塩を含有する。
【００１５】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ＡＧ１０・ＨＣｌの経口投与量５０ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ、及び８００ｍｇでの、単回投与漸増コホート１−４の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す。
【００１７】
【図２】図２は、単回投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口投与量３００ｍｇ）における、摂食、対、絶食の対象のＰＫプロファイルを示す。
【００１８】
【図３】図３は、１２日間にわたる、１２時間毎の、ＡＧ１０・ＨＣｌの経口投与量１００ｍｇ、３００ｍｇ、８００ｍｇでの、反復投与漸増コホート１−３のＰＫプロファイルを示す。
【００１９】
【図４】図４は、時間の関数としての、標的会合率を表す、単回投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口３００ｍｇ）の蛍光プローブ排除（ＦＰＥ）アッセイの時間経過を示す。このコホートにおいて、６名の対象には、化合物１が投与されるのに対し、２名の対象には、プラセボが投与される。プラセボ群は、対象１及び４である。
【００２０】
【図５】図５は、時間の関数としての、標的会合率を表す、単回投与漸増コホート４（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口８００ｍｇ）のＦＰＥアッセイの時間経過を示す。このコホートにおいて、６名の対象には、化合物１が投与されるのに対し、２名の対象には、プラセボが投与される。プラセボ群は、対象１及び７である。
【００２１】
【図６】図６は、時間の関数としての、各単回投与漸増コホートに関する、平均標的会合率を示す。
【００２２】
【図７Ａ】図７Ａは、単回投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの３００ｍｇ）に関するウェスタンブロットデータを示す。ゲルの側方の矢印は、分子量及びＴＴＲ特異抗体による認識を基にした、ＴＴＲ四量体の位置を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、単回投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの３００ｍｇ）に関するウェスタンブロットデータを示す。ゲルの側方の矢印は、分子量及びＴＴＲ特異抗体による認識を基にした、ＴＴＲ四量体の位置を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、単回投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの３００ｍｇ）に関するウェスタンブロットデータを示す。ゲルの側方の矢印は、分子量及びＴＴＲ特異抗体による認識を基にした、ＴＴＲ四量体の位置を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、単回投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの３００ｍｇ）に関するウェスタンブロットデータを示す。ゲルの側方の矢印は、分子量及びＴＴＲ特異抗体による認識を基にした、ＴＴＲ四量体の位置を示す。
【００２３】
【図８】図８は、単回投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口３００ｍｇ）に関するウェスタンブロットデータとＦＰＥデータの間の相関を示している。
【００２４】
【図９】図９は、１２日間を通じた反復投与漸増コホート１（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口１００ｍｇ、ｑ１２ｈ）に関するＦＰＥアッセイの時間経過を示す。このコホートにおいて、６名の対象には、化合物１が投与されたのに対し、２名の対象には、プラセボが投与された。プラセボ群は、対象１及び８である。
【００２５】
【図１０】図１０は、１２日間を通じた反復投与漸増コホート２（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口３００ｍｇ、ｑ１２ｈ）に関する、ＦＰＥアッセイの時間経過を示す。このコホートにおいて、６名の対象には、化合物１が投与されたのに対し、２名の対象には、プラセボが投与された。プラセボ群は、対象３及び５である。
【００２６】
【図１１】図１１は、１２日間を通じた反復投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口８００ｍｇ、ｑ１２ｈ）に関する、ＦＰＥアッセイの時間経過を示す。このコホートにおいて、６名の対象には、化合物１が投与されたのに対し、２名の対象には、プラセボが投与された。プラセボ群は、対象１及び７である。
【００２７】
【図１２】図１２は、ＦＰＥアッセイを使用する、１２日間を通じたコホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口８００ｍｇ、ｑ１２ｈ）に関する、ピーク、平均、及びトラフの標的会合率を示す。
【００２８】
【図１３】図１３は、反復投与漸増コホート３（ＡＧ１０・ＨＣｌの経口８００ｍｇ、ｑ１２ｈ）に関するウェスタンブロットデータを示す。ゲルの側方の矢印は、分子量及びＴＴＲ特異抗体による認識を基にしたＴＴＲ四量体の位置を示す。対象１及び３は、ＡＧ１０を受け取るのに対し、対象２は、プラセボを受け取った。
【００２９】
【図１４】図１４は、単回投与漸増コホート及び反復投与漸増コホートから集約された薬物動態及び薬力学のデータを示し、ここでは予測される投与量−反応性ＰＤ作用が存在する。
【００３０】
【図１５】図１５は、ＡＧ１０アナログ１、２、３、及び４の合成を示す。ａ）５ａ、ｉ．アセチルアセトン、ＤＢＵ、ベンゼン、ｒｔ、３日間；ｉｉ．ヒドラジン水和物、エタノール、９０℃、４ｈ；ｉｉｉ．ＮａＯＨ、ＭｅＯＨ／水、５０℃、１４ｈ；ｂ）５ｂ、ｉ．アセチルアセトン、ＤＢＵ、ベンゼン、ｒｔ、３日間；ｉｉ．ヒドラジン水和物、エタノール、９０℃、４ｈ；ｃ）i．ＮａＨ、ＭｅＩ、ＤＭＦ、ｒｔ、１２時間；ｉｉ．ＮａＯＨ、ＭｅＯＨ／水、５０℃、１４ｈ；ｄ）５ｂ、ｉ．３，５−ヘプタンジオン、ＤＢＵ、ベンゼン、ｒｔ、３日間；ｉｉ．ヒドラジン水和物、エタノール、９０℃、４時間；ｅ）ＮａＯＨ、ＭｅＯＨ／水、５０℃、１４時間。
【００３１】
【図１６】図１６Ａ−Ｃは、緩衝液中のＴＴＲに関する安定化剤の結合親和性及び効能を示す。（ａ）ＩＴＣにより評価したＴＴＲの安定化剤との相互作用。熱力学データ（表５に要約）；ΔＧは青色バーであり、ΔＨは緑色バーであり、且つ−ＴΔＳは赤色バーである。（ｂ）プローブ単独（対照ＤＭＳＯ）又はＴＴＲ安定化剤（２．５μＭ；安定化剤のＴＴＲに対する比１：１）の存在下でモニタリングしたＦＰＥプローブによる、緩衝液中のＴＴＲ（２．５μＭ）の修飾により引き起こされた蛍光変化。（ｃ）プローブ単独と比較した、３時間のインキュベーション後に測定したＦＰＥプローブの存在下での、安定化剤による緩衝液中のＴＴＲの占有率の棒グラフ表示。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキー多重比較検定により測定した（＊ｐ≦０．０５；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【００３２】
【図１７】図１７Ａ−Ｄは、ヒト血清中のＴＴＲの占有及び安定化における安定化剤の有効性を示す。（ａ）以下の指定された投与量で投与された場合の、定常状態でのそれらの推定平均臨床Ｃmaxで試験したＡＧ１０（１０μＭ）及び他の安定化剤の存在下での酸媒介された（ｐＨ４．０）変性に供されたヒト血清中のＴＴＲの安定化に関する代表的ウェスタンブロット画像：ジフルニサル（２５０ｍｇ、ＢＩＤ、２００μＭ）；タファミジス（８０ｍｇ、ｑｄ）、２０μＭ；トルカポン（１００ｍｇ、ｔｉｄ）、２０μＭ。（ｂ）ウェスタンブロット実験から得られた安定化データの棒グラフ表示。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。（ｃ）プローブ単独（対照ＤＭＳＯ）、ＡＧ１０（１０μＭ）、又はＴＴＲ安定化剤（それらの推定平均臨床定常状態Ｃmaxにおいて）の存在下でモニタリングしたＦＰＥプローブによるヒト血清中のＴＴＲの修飾により引き起こされた蛍光変化。（ｄ）プローブ単独と比較した、３時間のインキュベーション後に測定したＦＰＥプローブの存在下での、安定化剤による緩衝液中のＴＴＲの占有率の棒グラフ表示。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝４）。有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキー多重比較検定により測定した（ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【００３３】
【図１８】図１８Ａ−Ｄは、Ｔ１１９Ｍ変異及びＡＧ１０のＴＴＲへの結合により引き起こされた類似の相互作用を協調する結晶構造を示す。（ａ）個別に着色した単量体によるリボン表示として示したＶ１２２Ｉ−ＴＴＲ（ＰＤＢ：４ＨＩＱ）に結合したＡＧ１０の四次構造を示す。結合部位を構成する四量体の２つの単量体について異なる色のリボンを伴う２つの同一Ｔ４結合部位の一つの拡大図。ＡＧ１０のピラゾール環とＳ１１７／１１７’の間の重要な水素結合は、破線により強調している。（ｂ）Ｓ１１７とＳ１１７’のヒドロキシル基の間の重要な相互作用を強調する破線をつけた、安定化しているＴ１１９Ｍ−ＴＴＲバリアント（ＰＤＢ：１ＦＨＮ）の結晶構造。（ｃ）ＴＴＲｗｔ（ＰＤＢ：３ＣＦＭ）の結晶構造。（ｄ）熱力学的に安定化したＲ１０４Ｈ−ＴＴＲ（ＰＤＢ：１Ｘ７Ｔ）の結晶構造。
【００３４】
【図１９】図１９Ａ−Ｅは、ＡＧ１０のピラゾール環とＴＴＲのＳ１１７／Ｓ１１７’の間の水素結合は、ＴＴＲへの効果的結合に重要であることを図示している。（ａ）合成されたＡＧ１０アナログ１、２、３、及び４の化学構造及びインシリコドッキング試験。ドッキング実験に使用したＴＴＲに結合したＡＧ１０の共結晶。１は、ＡＧ１０のヨード−アナログである。２は、Ｋ１５／１５’と塩橋を形成することができないＡＧ１０のメチル−エステル型である。３は、Ｋ１５又はＫ１５’のいずれかと唯一の水素結合を潜在的に形成することができるＡＧ１０のメチル−ピラゾール型である。４は、Ｓ１１７／Ｓ１１７’との両方の水素結合に影響を及ぼすＡＧ１０のジエチル−ピラゾールアナログである。（ｂ）ＩＴＣにより評価したＴＴＲのアナログとの相互作用。熱力学データ；ΔＧは青色バーであり、ΔＨは緑色バーであり、且つ−ＴΔＳは赤色バーである。（ｃ）プローブ単独（対照ＤＭＳＯ）又はＴＴＲ安定化剤（２．５μＭ；安定化剤のＴＴＲに対する比１：１）の存在下でモニタリングしたＦＰＥプローブによる、緩衝液中のＴＴＲ（２．５μＭ）の修飾により引き起こされた蛍光変化。（ｄ）プローブ単独と比較した、３時間のインキュベーション後に測定したＦＰＥプローブの存在下での、安定化剤による緩衝液中のＴＴＲの占有率の棒グラフ表示。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。（ｅ）アナログ（１０μＭ；安定化剤のＴＴＲに対する比２：１）によるヒト血清中のＴＴＲの安定化に関するウェスタンブロットデータの棒グラフ表示。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝４）。有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキー多重比較検定により測定した（ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【００３５】
【図２０】図２０Ａ−Ｆは、ＡＧ１０は、アルブミン又は他の豊富なヒト血清タンパク質を上回るＴＴＲ結合に関する高い選択性を有することを図示している。（ａ）精製したヒト血清アルブミン（６００μＭ）と一緒にインキュベーションしたＡＧ１０及びタファミジス（各々３０μＭ）を比較する、ゲル濾過及び透析アッセイ。ゲル−濾過後（すなわち透析時間０時間）にアルブミンに結合したタファミジスの濃度を、１００％に規準化した。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。（ｂ）精製したヒトＴＴＲ（５μＭ）と一緒にインキュベーションしたＡＧ１０（１０μＭ）の透析に関する２４時間の時間経過。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。（ｃ）プローブ単独（黒円形）、プローブ＋アルブミン（６００μＭ）（黒三角）、プローブ＋全て［フィブリノゲン（５μＭ）、アルブミン（６００μＭ）、ＩｇＧ（７０μＭ）、トランスフェリン（２５μＭ）］（灰三角）；プローブ及びＡＧ１０（１０μＭ）（赤四角）、又はプローブ及びＡＧ１０＋アルブミン（緑菱形）、プローブ及びＡＧ１０＋全て［フィブリノゲン（５μＭ）、アルブミン（６００μＭ）、ＩｇＧ（７０μＭ）、トランスフェリン（２５μＭ）］（青円形）の存在下で６時間モニタリングしたＦＰＥプローブによる、精製したヒトＴＴＲ（５μＭ）の修飾に起因した蛍光変化。（ｄ）プローブ単独と比較した、３時間のインキュベーション後に測定したＦＰＥプローブ又は他の血清タンパク質の存在下での、ＡＧ１０による緩衝液中のＴＴＲ占有％。（ｅ、ｆ）ＡＧ１０について説明したものと同じ実験を、タファミジスについて行った。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキー多重比較検定により測定した（ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【００３６】
【図２１】図２１Ａ−Ｄは、プールしたイヌ血清により行ったＦＰＥ及びウェスタンブロットアッセイにおけるＡＧ１０及びタファミジスの活性を示す。（ａ）プローブ単独（対照ＤＭＳＯ、黒円形）、ＡＧ１０（１０μＭ）又はタファミジス（１０μＭ）の存在下でモニタリングしたＦＰＥプローブによる、市販のビーグル犬血清中のイヌＴＴＲの修飾により引き起こされた蛍光変化。（ｂ）プローブ単独と比較した、３時間のインキュベーション後に測定したＦＰＥプローブの存在下での、ＡＧ１０及びタファミジスによるイヌ血清中のイヌＴＴＲの占有率。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝４）。（ｃ）ＡＧ１０（１０μＭ）及びタファミジス（１０μＭ）の存在下で酸媒介された変性に対するプールされたイヌ血清中のＴＴＲの安定化に関するウェスタンブロット画像。血清試料は、架橋及び免疫ブロッティング前に、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中で、ＤＭＳＯ又は被験化合物と一緒に所望の時間（０及び７２時間）インキュベーションした。（ｄ）ウェスタンブロット実験から得られた安定化データの棒グラフ表示。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキー多重比較検定により測定した（ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【００３７】
【図２２】図２２Ａ−Ｄは、経口投与されたＡＧ１０は、イヌにおけるＴＴＲの結合及び安定化に有効であることを示す。（ａ及びｂ）投与量漸増のＡＧ１０の経口投与（ＱＤで７日間）後の、ビーグル犬におけるＴＴＲの占有。円形（●）は、１日目投薬前を示し、四角形（■）は、７日目投薬前（ＣminでのＡＧ１０濃度）を示し、且つ三角形（▲）は、７日目投薬後（ＣmaxでのＡＧ１０濃度）を示す。４群の動物に投薬した：（ｉ）０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１２、６雄／６雌）；（ｉｉ）５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４、２雄／２雌）；（ｉｉｉ）１００ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４、２雄／２雌）；（ｉｖ）２００ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１２、６雄／６雌）。（ｂ）３時間でのＴＴＲ占有を表す棒グラフ。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。（ｃ及びｄ）ＡＧ１０・ＨＣｌの（ｃ）５ｍｇ／ｋｇ及び（ｄ）２０ｍｇ／ｋｇの単回経口投与量を受け取るイヌにおけるＡＧ１０の薬物動態−薬力学（ＰＫ−ＰＤ）分析。様々な時点でイヌから得られた血清試料の濃度［ＡＧ１０］、対、ＴＴＲ占有％の散布図（ｎ＝４、１つの投薬群につき２雄／２雌）。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキー多重比較検定により測定した（ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【００３８】
【図２３】図２３は、ＡＧ１０・ＨＣｌの５ｍｇ／ｋｇの経口投薬後の３匹の雄カニクイザル由来の血清中の３時間での、ＴＴＲ占有％を図示している。データは、３回の繰り返しの平均±ＳＤである。
【００３９】
【図２４】図２４は、サルにおける経口投与されたＡＧ１０とＴＴＲ安定化の間の投与量依存の関係を図示している。
【００４０】
【図２５】図２５は、Aviva Systems BiologyのプレアルブミンＥＬＩＳＡキット（ヒト）を使用し作製された標準較正曲線を示す。
【００４１】
【図２６】図２６は、各ＭＡＤコホート（投薬された健常志願者の総数＝２４；プラセボ：実薬＝１：３；ＭＡＤ１コホート＝１００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間；ＭＡＤ２コホート＝３００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間；ＭＡＤ３コホート＝８００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間）に関する経時的ＴＴＲ濃度の相対変化を示す。この変化は、ベースライン値に対して規準化することにより計算した。
【００４２】
【図２７】図２７は、全てのプラセボ及びＡＧ１０処置したＭＡＤ対象におけるベースラインから１２日目までの血中血清ＴＴＲ濃度における平均変化率を図示している。
【００４３】
【図２８】図２８は、全てのプラセボ及びＡＧ１０・ＨＣｌ処置したコホート（投薬された健常志願者の総数＝２４；プラセボ：実薬＝１：３；ＭＡＤ１コホート＝１００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間；ＭＡＤ２コホート＝３００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間；ＭＡＤ３コホート＝８００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間）におけるベースライン及び１２日目の血中血清ＴＴＲ濃度をプロットしている。
【００４４】
【図２９】図２９は、全てのプラセボ及びＡＧ１０処置したコホート（投薬された健常志願者の総数＝２４；プラセボ：実薬＝１：３；ＭＡＤ１コホート＝１００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間；ＭＡＤ２コホート＝３００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間；ＭＡＤ３コホート＝８００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間）におけるベースライン及び１２日目の血中血清ＴＴＲ濃度をプロットしている。
【００４５】
【図３０】図３０は、各処置群の対象に関する血清ＴＴＲレベルの投与量−反応変化を図示している。データは、ベースラインから２８日目までの変化の百分率として報告している。
【００４６】
【図３１】図３１は、ＡＧ１０並びにＴＴＲ安定化剤タファミジス及びジフルニサルは全て、ＴＴＲ血清濃度を増加することを示している。報告されたＡＧ１０コホートに関するＴＴＲ血清濃度は、処置の２８日後である。報告されたタファミジスのＴＴＲ血清濃度は、２週目及び６週目の値を基に内挿した２８日目である。報告されたジフルニサルのＴＴＲ血清濃度は、処置後１年である。
【００４７】
【図３２】図３２は、ＡＴＴＲ−ＣＭ患者において、ＡＧ１０処置は、低いＴＴＲレベルを、正常範囲に回復することを示す。血清ＴＴＲ濃度の低レベル及び正常レベルを示している各処置群（プラセボ、４００ｍｇ  ＢＩＤ、及び８００ｍｇ  ＢＩＤ）におけるＡＴＴＲ−ＣＭ患者の百分率が、処置前（左側）及び処置２８日後（右側）に報告されている。
【００４８】
【図３３】図３３は、第２相試験に参加している各個人のベースライン血清ＴＴＲ濃度の分布を、プロットしている。
【００４９】
【図３４】図３４は、四量体ＴＴＲの安定化を評価するためにウェスタンブロットアッセイにより決定されたＴＴＲの安定化率を図示している。提供されたデータは、本試験における全ての個人（左側カラム）、ＷＴ−ＴＴＲの個人（中央カラム）、及び変異体ＴＴＲの個人（右側カラム）に関する。提供されたエラーバーは、平均の標準誤差である。
【００５０】
【図３５】図３５は、２８日目トラフ（投薬前）及び２８日目ピーク（投薬後１時間）での、蛍光プローブアッセイにより決定されたＡＧ１０の占有率を図示している。提供されたデータは、本試験の全ての個人（塗りつぶしカラム）、ＷＴ−ＴＴＲの個人（白色カラム）、及び変異体ＴＴＲの個人（市松柄カラム）に関する。
【００５１】
【図３６】図３６は、蛍光プローブ結合と血中血漿ＡＧ１０の濃度の間の関係をプロットしている。蛍光プローブがＴＴＲに結合している場合は、プローブ蛍光が測定され、ＡＧ１０の占有のために蛍光プローブがＴＴＲに結合することができない場合は、蛍光は測定されない。
【００５２】
【図３７】図３７は、指定された時点で蛍光プローブアッセイにおいて測定した相対蛍光単位をプロットしている。投薬前は、トラフレベルであるのに対し、投薬の１時間後(1 hour pose dose)は、ピークレベルである。ｙ−軸は、バックグラウンドについて補正した６０分の相対蛍光単位の平均値を表す。データ提示は、４００ｍｇのＡＧ１０・ＨＣｌ塩をＢＩＤで受け取る個人に由来する。
【００５３】
【図３８】図３８は、指定された時点で蛍光プローブアッセイにおいて測定した相対蛍光単位をプロットしている。ｙ−軸は、バックグラウンドについて補正した６０分の相対蛍光単位の平均値を表す。投薬前は、トラフレベルであるのに対し、投薬の１時間後は、ピークレベルである。データ提示は、８００ｍｇのＡＧ１０・ＨＣｌ塩をＢＩＤで受け取る個人に由来する。
【００５４】
【図３９】図３９は、指定された時点で蛍光プローブアッセイにおいて測定した相対蛍光単位をプロットしている。ｙ−軸は、バックグラウンドについて補正した６０分の相対蛍光単位の平均値を表す。投薬前は、トラフレベルであるのに対し、投薬の１時間後は、ピークレベルである。データ提示は、プラセボ処置を受け取る個人に由来する。
【００５５】
【図４０】図４０は、１４日目トラフ（投薬前）及び１４日目ピーク（投薬後０．５時間）での、蛍光プローブアッセイにより決定されたＡＧ１０の占有率を図示している。提供されたデータは、Ｖ３０Ｍ変異を有するＴＴＲタンパク質を伴うＡＧ１０・ＨＣｌ処置群の８００ｍｇ  ＢＩＤ投薬群の個人に関する。
【００５６】
【図４１】図４１は、四量体ＴＴＲの安定化を評価するための、ウェスタンブロットアッセイにより決定されたＴＴＲの安定化率を図示している。提供されたデータは、Ｖ３０Ｍ変異を有するＴＴＲタンパク質を伴うＡＧ１０・ＨＣｌ処置群の８００ｍｇ  ＢＩＤの個人に関する。
【００５７】
【図４２】図４２Ａ−Ｄは、母集団ＰＫモデルにおける変量効果（ＥＴＡ）、対、カテゴリ共変量プロットをプロットしている。パネルＡ及びＢは、クリアランスに対する効果をプロットしているのに対し、パネルＣ及びＤは、容積に対する効果をプロットしている。“ＤＩＳ”と記されたプロット（パネルＡ及びＣ）において、０＝健常志願者、１＝罹患した対象である。“ＣｏｎＭｅｄ１”と記されたプロット（パネルＢ及びＤ）において、０＝フロセミド又はトラセミド(Torsemide)のいずれかを受け取った対象、１＝フロセミド又はトラセミドのいずれも受け取っていない患者である。ＤＩＳ：０（ｎ＝４２）＝全てＡＧ１０−００１（ＳＡＤ及びＭＡＤ）からのＡＧ１０処置した健常成人志願者。１（ｎ＝３２）＝これらは全て、母集団ＰＫ解析に含まれた、ＡＧ１０−２０１からの実薬ＡＴＴＲ−ＣＭ患者である。４００ｍｇ  ＢＩＤ群１６名及び８００ｍｇ  ＢＩＤ群１６名。ＣｏｎＭｅｄ１：０（ｎ＝４９）＝併用利尿薬：フロセミド又はトラセミドを受け取っていない対象（４２名の健常成人志願者、７名のＡＴＴＲ−ＣＭ患者）、１（ｎ＝２５）＝フロセミド又はトラセミドのいずれかを受け取っている対象。
【００５８】
【図４３】図４３は、ＭＡＤ  ３（試験ＡＧ１０−００１）からの１２日目のＡＧ１０のトラフレベルの、８００ｍｇ  ＢＩＤが投薬されたＡＴＴＲ−ＣＭ患者（ＡＧ１０−２０１）におけるトラフレベルに対する比較をプロットしている。ボックス及びウィスカプロットは、各群の最高値に対し最も小さく広がるウィスカを持つ結果の２５パーセンタイルから７５パーセンタイルを示す。直線は中央値を示し、＋は平均を示す。両方の試験は、投薬に関して２００ｍｇ  ＡＧ１０錠剤を使用した。
【００５９】
【図４４】図４４は、４００ｍｇ錠剤で処置した健常対象におけるＡＧ１０のトラフレベルの、ＡＧ１０−２０１からの４００ｍｇ  ＢＩＤが投薬されたＡＴＴＲ−ＣＭ患者におけるトラフレベルに対する比較をプロットしている。ボックス及びウィスカプロットは、各群の最高値に対し最も小さく広がるウィスカを持つ結果の２５パーセンタイルから７５パーセンタイルを示す。直線は中央値を示し、＋は平均を示す。健常志願者試験（ＡＧ１０−００３）は、投薬に関して４００ｍｇ  ＡＧ１０錠剤を使用し、第２相試験ＡＧ１０−２０１は、投薬に関して２００ｍｇ錠剤を使用した。
【００６０】
【図４５】図４５は、ＡＴＴＲ−ＣＭの対象における第３相臨床試験に関する治験デザインのまとめを示している。
【００６１】
【図４６】
【発明を実施するための形態】
【００６２】
発明の詳細な説明
I.  全般
本明細書において対象におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスの治療方法が、説明されている。これらの方法は、対象の治療において大きい有効性を有し且つ対象において良く忍容される特定の投薬レジメンを含む。
【００６３】
ＩＩ．  定義
本発明の様々な実施態様及び態様が、本明細書において示され且つ説明されているが、そのような実施態様及び態様は、単に例のために提供されることは当業者には明白であろう。数多くの変動、変化、及び置き換えを、本発明から逸脱することなく、当業者にはここで思いつく。本明細書において説明された本発明の実施態様に対する様々な改変が、本発明の実践において利用され得ることは理解されるべきである。
【００６４】
本明細書において使用される節見出しは、単にまとめることを目的とし、説明された目的を限定するために構築されるものではない。非限定的に特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル、及び論文を含む、本出願に引用された全ての文献、又は文献の一部は、何らかの目的のためにそれらの全体が引用により本明細書中に明確に組み込まれている。
【００６５】
別に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singletonらの「Dictionary of Microbiology and Molecular Biology」第2版、J. Wiley & Sons社(ニューヨーク, NY 1994)；Sambrookらの「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、Cold Springs Harbor Press社(コールドスプリングハーバー、NY 1989)を参照されたい。本明細書に説明されたものと類似又は同等の任意の方法、装置及び材料を、本発明の実践において使用することができる。以下の定義は、本明細書において頻用される特定の用語の理解を促進するために提供され、本開示の範囲を限定する意味はない。
【００６６】
「化合物１」は、下記式を有する化学物質３−（３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）−４−フルオロ安息香酸（ＡＧ１０）、
【化４】
2021518381.tif 000006
(化合物１)
又はそれらの医薬として許容し得る塩を意味する。患者へ投与される化合物１の特定の量を言及する場合、本出願は、投与される化合物１のＨＣｌ塩の量を意味する。当業者は、遊離塩基又は異なる塩型の化合物１の同量を投与するために、投与される全体量の微調整が必要であることを認めるであろう。
【００６７】
本明細書において使用される用語「ある(a)又は(an)」は、１又は複数を意味する。
【００６８】
用語「含んでなる(comprise)」、「含む(include)」、及び「有する(have)」は、本明細書において、包括的無制限の用語として互換的に使用される。例えば、「含んでなっている」、「含んでいる」、及び「有している」の使用は、要素を含んでなるか、有するか又は含まれるかにかかわらず、その動詞を含む条項の対象により包含される要素のみではないことを意味する。
【００６９】
本明細書において使用される用語「約」は、当業者が特定された値に合理的に類似していると考える、特定された値を含む値の範囲を意味する。一部の実施態様において、用語「約」は、一般に当該技術分野において許容され得る測定を使用する標準偏差内を意味する。一部の実施態様において、約は、特定された値の±１０％に広がる範囲を意味する。一部の実施態様において、約は、特定された値を意味する。
【００７０】
本明細書において使用される「治療」又は「治療している」又は「緩和している」又は「改善している」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、治療的恩恵を含むが、これに限定されるものではない、有益な又は所望の結果を得るための方式を指す。治療的恩恵により、治療される基礎となる障害の根絶又は改善を意味する。また、治療的恩恵は、対象が基礎となる障害に依然患わされているとしても、改善が対象において認められるように、基礎となる障害に関連した１又は複数の生理的症状の根絶又は改善により達成される。治療は、組成物の投与により、疾患の臨床症状の進展の遅延を引き起こすこと；疾患を抑制する、すなわち疾患の臨床症状の軽減を引き起こすこと；疾患を阻害する、すなわち症状の最初の出現後に組成物を投与することにより臨床症状の進展を停止すること；及び／又は、疾患を和らげる、すなわちそれらの最初の出現後に組成物を投与することにより臨床症状の退行を引き起こすことを含む。例えば、本明細書記載の特定の方法は、ＴＴＲ原線維形成の出現又は進行を減少もしくは軽減することにより、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを治療するか；又は、ＴＴＲアミロイドーシスの症状を減少することにより、ＴＴＲアミロイドーシスを治療する。
【００７１】
「有効量」又は「医薬的有効量」は、言及された目的を達成する(例えば、投与される目的の効果を達成する、疾患を治療する、酵素活性を減少する、疾患又は病態の１又は複数の症状を軽減する）のに十分な量である。「有効量」の例は、疾患の１又は複数の症状の治療、又は軽減に寄与するのに十分な量であり、これはまた「治療的有効量」とも称される。１又は複数の症状の「軽減」（及びこの語句の文法的同等物）は、症状（複数可）の重症度もしくは頻度の減少、又は症状（複数可）の除去を意味する。有効性はまた、「−倍」の増加又は減少としても表すことができる。例えば、治療的有効量は、対照よりも少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、又はそれ以上の効果を有することができる。
【００７２】
「患者」又は「対象」又は「それを必要とする対象」は、本明細書に提供される方法を使用することにより治療され得る疾患又は病態に罹患している又はその傾向がある生体を指す。この用語は、対象は特定の疾患と診断されていることを必ずしも示さないが、典型的には医学的監視下の個人を指す。非限定的例は、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、乳牛、シカ、及び他の非-哺乳動物の動物を含む。一部の実施態様において、患者、対象、又はそれを必要とする対象は、ヒトである。
【００７３】
III.  実施態様の詳細な説明
方法
一態様において、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを治療する方法が、本明細書に提供される。この方法は、下記式を有する化合物１：
【化５】
2021518381.tif 000007
又はその医薬として許容し得る塩の治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含み、ここでこの治療的有効量は、総一日量約１０ｍｇ〜２，０００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約１０ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜３００ｍｇ、５０ｍｇ〜１５０ｍｇ、１５０ｍｇ〜８００ｍｇ、８００ｍｇ〜１，６００ｍｇ、又は８００ｍｇ〜２，０００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約１０ｍｇ〜５０ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約５０ｍｇ〜３００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、５０ｍｇ〜１５０ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、１５０ｍｇ〜８００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、８００ｍｇ〜１，６００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、８００ｍｇ〜２，０００ｍｇである。本開示において、列挙された化合物１の量は、投与される化合物１のＨＣｌ塩の量であることが、理解される。当業者は、遊離塩基又は異なる塩型の化合物１の同量を投与するために、投与される全体量の微調節が必要であることを認めるであろう。
【００７４】
一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約１０ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約２５ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約５０ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約１０００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約１５０ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約２００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約３００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約６００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約８００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の総一日量は、約１，６０００ｍｇである。
【００７５】
化合物１は、１日に１回（ＳＩＤ又はｑｄ）、２回（ＢＩＤ又はｑ１２ｈ）、３回（ＴＩＤ）、又は４回（ＱＩＤ）で投与されることができる。一部の実施態様において、化合物１は、１日１回投与される。一部の実施態様において、化合物１は、１日２回投与される。一部の実施態様において、化合物１は、１日３回投与される。一部の実施態様において、化合物１は、１日４回投与される。
【００７６】
一部の実施態様において、化合物１の約５０ｍｇが、１日１回投与される。一部の実施態様において、化合物１の約１５０ｍｇが、１日１回投与される。一部の実施態様において、化合物１の約３００ｍｇが、１日１回投与される。一部の実施態様において、化合物１の約８００ｍｇが、１日１回投与される。
【００７７】
一部の実施態様において、化合物１の約１００ｍｇが、１日２回投与される。一部の実施態様において、化合物１の約３００ｍｇが、１日２回投与される。一部の実施態様において、化合物１の約４００ｍｇが、１日２回投与される。一部の実施態様において、化合物１の約８００ｍｇが、１日２回投与される。
【００７８】
別の態様において、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを治療する方法が、本明細書に提供される。この方法は、下記式を有する化合物１：
【化６】
2021518381.tif 000008
又はその医薬として許容し得る塩の治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含み、ここで化合物１の治療的有効量は、少なくとも５μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。一部の実施態様において、化合物１の治療的有効量は、少なくとも６μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。一部の実施態様において、化合物１の治療的有効量は、少なくとも７．５μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。一部の実施態様において、化合物１の治療的有効量は、少なくとも８μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。
【００７９】
一部の実施態様において、化合物１の治療的有効量は、５〜３０μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。一部の実施態様において、化合物１の治療的有効量は、５〜２５μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。一部の実施態様において、化合物１の治療的有効量は、６〜２０μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。一部の実施態様において、化合物１の治療的有効量は、７．５〜１５μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。一部の実施態様において、化合物１の治療的有効量は、７．５〜１０μＭの化合物１のトラフ血中血漿濃度を維持する。
【００８０】
一部の実施態様において、治療的有効量の化合物１を受け取る対象は、ベースラインレベルに比べ、トランスサイレチン（ＴＴＲ）の血中血清濃度の増加を経験している。一部の実施態様において、治療的有効量の化合物１を受け取る対象は２８日間の治療後に、ベースラインレベルと比べ、トランスサイレチン（ＴＴＲ）の血中血清濃度の少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０％又はそれ以上の増加を経験している。一部の実施態様において、治療的有効量の化合物１を受け取る対象は、２８日間の治療後に、ベースラインレベルと比べ、トランスサイレチン（ＴＴＲ）の血中血清濃度の少なくとも約２５％の増加を経験している。一部の実施態様において、治療前の対象は、ベースライン血清(seru)ＴＴＲ濃度（２０ｍｇ／ｄＬ  ＴＴＲ）を下回るＴＴＲ血中血清レベルを有する。一部の実施態様において、有効量の化合物１を２８日間受け取っている対象は、血中血清ＴＴＲのレベルがベースラインレベルを上回るような、増加した血中血清ＴＴＲレベルを経験している。一部の実施態様において、増加したＴＴＲレベルを経験している対象は、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）心筋症と診断された対象である。
【００８１】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスに関連した様々な疾患又は障害が存在する。これらは、家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症、老人性全身性アミロイドーシス、中枢性アミロイドーシス、眼アミロイドーシス、脳軟膜アミロイドーシス、眼軟膜アミロイドーシス、硝子体アミロイドーシス、消化管アミロイドーシス、神経原性アミロイドーシス、非−神経原性アミロイドーシス、非−遺伝性アミロイドーシス、反応性／続発性アミロイドーシス、脳アミロイドーシスを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
一部の実施態様において、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスに関連した疾患又は障害は、脳軟膜アミロイドーシスである。一部の実施態様において、脳軟膜アミロイドーシスの対象は、１８位のアスパラギン酸のグリシンへの変異（Ｄ１８Ｇ）を伴うトランスサイレチンタンパク質を有する。一部の実施態様において、脳軟膜アミロイドーシスの対象は、５３位のグリシンのアルギニンへの変異（Ｇ５３Ｒ）を伴うトランスサイレチンタンパク質を有する。野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質は、配列番号：１として本明細書に提供される。
【００８３】
一部の実施態様において、脳軟膜アミロイドーシスの対象は、１１４位のチロシンのシステインへの変異（Ｙ１１４Ｃ）を伴うトランスサイレチンタンパク質を有する。１１４位のチロシンのシステインへの変異（Ｙ１１４Ｃ）を持つ対象は、ＡＴＴＲｍ−ＰＮ症状、脳軟膜アミロイドーシス症状、又は両方の組合せを示し得る。
【００８４】
一部の実施態様において、脳軟膜アミロイドーシスの対象は、４９位のトレオニンのプロリンへの変異（Ｔ４９Ｐ）を伴うトランスサイレチンタンパク質を有する。４９位のトレオニンのプロリンへの変異（Ｔ４９Ｐ）を持つ対象は、ＡＴＴＲｍ−ＣＭ症状、脳軟膜アミロイドーシス症状、又は両方の組合せを示し得る。
【００８５】
一部の実施態様において、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシス疾患は、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）心筋症又はＡＴＴＲポリニューロパチーである。一部の実施態様において、ＴＴＲアミロイドーシスは、６０位のトレオニンのアラニンへの変異（Ｔ６０Ａ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる。一部の実施態様において、ＴＴＲアミロイドーシスは、２４位のプロリンのセリンへの変異（Ｐ２４Ｓ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる。一部の実施態様において、ＴＴＲアミロイドーシスは、３８位のアスパラギン酸のアラニンへの変異（Ｄ３８Ａ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる。一部の実施態様において、ＴＴＲアミロイドーシスは、５８位のロイシンのヒスチジンへの変異（Ｌ５８Ｈ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる。これらの変異を伴う患者では、ＡＴＴＲ心筋症とＡＴＴＲポリニューロパチーの両方の症状の組合せが存在することが多い。野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質は、配列番号：１として本明細書に提供される。
【００８６】
一部の実施態様において、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシス疾患は、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）心筋症である。一部の実施態様において、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシス疾患は、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）ポリニューロパチーである。
【００８７】
ＡＴＴＲ心筋症は、野生型ＡＴＴＲ心筋症（ＡＴＴＲｗｔ−ＣＭ）及び遺伝性（家族性）ＡＴＴＲ心筋症（ＡＴＴＲｍ−ＣＭ）を含む。ＡＴＴＲｍ−ＣＭは、ＴＴＲタンパク質の変異により引き起こされるのに対し、ＡＴＴＲｗｔ−ＣＭは、変異により引き起こされない。代わりに、ＡＴＴＲｗｔ−ＣＭは、一般に経過は加齢に関連している。一部の実施態様において、ＡＴＴＲ心筋症は、ＡＴＴＲｗｔ−ＣＭである。一部の実施態様において、ＡＴＴＲ心筋症は、ＡＴＴＲｍ−ＣＭである。一部の実施態様において、ＡＴＴＲｍ−ＣＭの対象は、ＴＴＲタンパク質において、１２２位のバリンのイソロイシンへの変異（Ｖ１２２Ｉ）を有する。一部の実施態様において、ＡＴＴＲｍ−ＣＭの対象は、４９位のトレオニンのプロリンへの変異（Ｔ４９Ｐ）を有する。４９位のトレオニンのプロリンへの変異（Ｔ４９Ｐ）を伴う対象は、ＡＴＴＲｍ−ＣＭ症状、脳軟膜アミロイドーシス症状、又は両方の組合せを示し得る。野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質は、配列番号：１として本明細書に提供される。
【００８８】
ＡＴＴＲポリニューロパチーは、野生型及び遺伝性（家族性）の両方のＡＴＴＲポリニューロパチーを含む。心筋症について考察したように、ＡＴＴＲｍ−ＰＮは、ＴＴＲタンパク質の変異により引き起こされるのに対し、ＡＴＴＲｗｔ−ＰＮは、遺伝的成分を含まない。一部の実施態様において、ＡＴＴＲ−ＰＮは、ＡＴＴＲｗｔ−ＰＮである。一部の実施態様において、ＡＴＴＲ−ＰＮは、ＡＴＴＲｍ−ＰＮである。一部の実施態様において、ＡＴＴＲｍ−ＰＮは、３０位のバリンのメチオニンへの変異（Ｖ３０Ｍ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる。一部の実施態様において、ＡＴＴＲｍ−ＰＮは、６４位のフェニルアラニンのロイシンへの変異（Ｆ６４Ｌ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる。一部の実施態様において、ＡＴＴＲｍ−ＰＮは、１１４位のチロシンのシステインへの変異（Ｙ１１４Ｃ）を含むＴＴＲタンパク質により特徴付けられる。１１４位のチロシンのシステインへの変異（Ｙ１１４Ｃ）を伴う対象は、ＡＴＴＲｍ−ＰＮ症状、脳軟膜アミロイドーシス症状、又は両方の組合せを示し得る。野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質は、配列番号：１として本明細書に提供される。
【００８９】
ＡＴＴＲ心筋症（野生型及び家族性の両方）は、罹患した対象において心不全及び死亡を引き起こす、進行が緩徐な疾患である。本開示の方法は、ＡＴＴＲ心筋症の対象において、心筋層のＴＴＲ原線維の蓄積を停止又は緩徐化することにより、臨床の改善を提供する。この過程を通じて、現在説明される方法は、ＡＴＴＲ心筋症対象における臨床の改善を提供する。臨床の改善は、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類の改善、カンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）反応、ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）の改善、６分間歩行試験の成績における改善、トロポニンＴ、トロポニンＩ、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、及びＮ−末端プロ−ＢＮＰなどの心臓の健康に関連したマーカーの改善、心臓血管に関連した入院の頻度の減少、及び／又は死亡率の減少を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
一部の実施態様において、本明細書に提供される方法は、対象のニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類を改善するか、安定化するか、又は増悪を遅延する。ＮＹＨＡ機能分類は、心不全症状の重症度を、４つの機能クラスの１つとして等級化する。ＮＹＨＡ機能分類は、治療に対する反応を評価し且つ管理を指導するために使用することができる重症度の標準説明を提供するので、これは、臨床の実践及び研究において広範に使用されている。ＮＹＨＡ機能分類は、症状の重症度及び身体活動の制限を基にしている：
クラスＩ：身体活動の制限なし。通常の身体活動で、過度の息切れ、疲労、又は心悸亢進を引き起こさない。
クラスＩＩ：身体活動のわずかな制限。安静時には快適であるが、通常の身体活動の結果、過度の息切れ、疲労、又は心悸亢進を生じる。
クラスＩＩＩ：身体活動の顕著な制限。安静時には快適であるが、通常よりも軽い身体活動の結果、過度の息切れ、疲労、又は心悸亢進を生じる。
クラスIV：不快さを伴わずにあらゆる身体活動を実行することが不可能。安静時にも症状が存在し得る。もし何らかの身体活動をすると、不快さが増加する。
【００９１】
一部の実施態様において、治療的有効量の化合物１の投与は、対象のニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類を低下する。一部の実施態様において、ＮＹＨＡ機能分類は、クラスＩＶからクラスＩＩＩへ、クラスＩＶからクラスＩＩへ、又はクラスＩＶからクラスＩへ低下される。一部の実施態様において、ＮＹＨＡ機能分類は、クラスＩＶからクラスＩＩＩへ低下される。一部の実施態様において、ＮＹＨＡ機能分類は、クラスＩＶからクラスＩＩへ低下される。一部の実施態様において、ＮＹＨＡ機能分類は、クラスＩＩＩからクラスＩＩへ低下される。一部の実施態様において、ＮＹＨＡ機能分類は、クラスＩＩＩからクラスＩへ低下される。一部の実施態様において、ＮＹＨＡ機能分類は、クラスＩＩからクラスＩへ低下される。
【００９２】
一部の実施態様において、本明細書に提供される方法は、対象のカンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）分類を改善するか、安定化するか、又は増悪を遅延する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、カンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）において改善されたスコアを提供し(Green CPら、(2000) Journal of the American College of Cardiology 35: 1245-55)、その内容は全ての目的に関して引用により本明細書中に組み込まれている。ＫＣＣＱは、心臓の健康に関連した具体的質問を含み、且つ疾患−特異的健康−関連した生活の質が検証され、信頼でき且つ感度のよい測定を提供する。
【００９３】
ＫＣＣＱ質問票は、患者の生活の通常の局面を実行することがどのように制限されたか（例えば、重度に制限された、かなり制限された、中程度に制限された、わずかに制限された、又は全く制限されないなど）を評価するよう、対象に依頼する。一部の実施態様において、対象は、化合物１による治療後、質問状の全ての質問について、少なくとも１レベルの平均の改善（例えば、重度に制限されたからかなり制限されたへ、かなり制限されたから中程度に制限されたへ、中程度に制限されたからわずかに制限されたへ）を有する。
【００９４】
一部の実施態様において、本明細書に提供される方法は、対象におけるＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）スコアを改善するか、安定化するか、又は増悪を遅延する。ＥＱ−５Ｄ−５Ｌは、完成するのに約５分を要する、簡潔な、自己記入式の(self-administered)全般的健康状態の手段(instrument)である。この手段は、２つのパートを含む。第一のパートにおいて、回答者は、自身の現時点での健康状態を５ディメンション（移動、身の回りの管理、普段の活動、痛み又は不快感、並びに不安又はふさぎこみ）について等級化するように依頼され、各ディメンションは、５つの機能レベルを有する（１−問題はない、２−少し問題がある、３−中程度の問題がある、４−かなり問題がある、及び５−極めて問題がある）。第二のパートは、「最良の想定し得る健康状態」（スコア１００）及び「最悪の想定しうる健康状態」（スコア０）と記された端点を持つ、視覚的アナログ尺度（ＥＱ  ＶＡＳ）上への現時点での健康状態の回答者の自己等級化である。この５ディメンションからのスコアを用いて、単独の指標値を計算することができ、これはまたユーティリティスコアとして知られている。ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ質問票は、パブリックドメインにあり、且つＥｕｒｏＱｏＬから入手することができる。
【００９５】
一部の実施態様において、本明細書記載の治療方法を受け取っている患者は、ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）ユーティリティスコアにおいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８(either)、９、又は１０ポイントの平均改善を有する。一部の実施態様において、本明細書記載の治療方法を受け取っている患者は、ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）ユーティリティスコアにおいて、少なくとも５ポイントの平均改善を有する。
【００９６】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、対象の６分間歩行試験の成績を改善する。６分間歩行試験は、対象の機能的能力のレベルを評価するための、６分間の自分のペースでタイミングをとった歩行である。対象は、仕事のレベルが自身の快適なレベルを超える場合、この試験の途中で停止及び休憩することができる。治療前、治療後及び治療中の評価は、評価が比較的容易であり、且つ６分間の期間に対象が歩行した距離の測定からなる。従って一部の実施態様において、対象は、化合物１による治療後の６分間歩行試験においてカバーされる総距離を増大する。一部の実施態様において、対象は、化合物１による治療前に測定されたベースライン距離よりも少なくとも２５ｍ余計に歩行した。一部の実施態様において、対象は、化合物１による治療前に測定されたベースライン距離よりも少なくとも３０ｍ余計に歩行した。一部の実施態様において、対象は、化合物１による治療前に測定されたベースライン距離よりも少なくとも５０ｍ余計に歩行した。一部の実施態様において、対象は、化合物１による治療前に測定されたベースライン距離よりも少なくとも７５ｍ余計に歩行した。一部の実施態様において、対象は、化合物１による治療前に測定されたベースライン距離よりも少なくとも１００ｍ余計に歩行した。一部の実施態様において、本明細書記載の治療方法を受け取っている対象は、６分間歩行距離において遅れの減少を有した。例えば一部の実施態様において、対象は、治療前とほぼ同じ６分間歩行距離を維持する。一部の実施態様において、対象は、６分間歩行試験において１０ｍ少なくカバーする。一部の実施態様において、６分間歩行試験は、治療群を非治療群と比較するために使用される。一部の実施態様において、ベースラインからの群間の平均変化は、少なくとも１０ｍである。一部の実施態様において、ベースラインからの群間の平均変化は、少なくとも２０ｍである。一部の実施態様において、ベースラインからの群間の平均変化は、少なくとも３０ｍである。一部の実施態様において、本明細書に提供される治療方法は、治療を受け取っていない個人と比べ、６分間歩行距離の減少を低下した。
【００９７】
トロポニンＴ、トロポニンＩ、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、及びＮ−末端プロ−ＢＮＰは、心筋の健康状態が悪い対象の血中血清において上昇したポリペプチドである。一部の実施態様において、トロポニンＴ、トロポニンＩ、ＢＮＰ及び／又はＮ−末端プロ−ＢＮＰのレベルは、化合物１による治療後減少する。一部の実施態様において、トロポニンＴ、トロポニンＩ、ＢＮＰ及び／又はＮ−末端プロ−ＢＮＰのレベルは、化合物１による治療前の該対象のトロポニンＴ、トロポニンＩ、ＢＮＰ及び／又はＮ−末端プロ−ＢＮＰのベースラインレベルと比べ、約１０％減少する。一部の実施態様において、トロポニンＴ、トロポニンＩ、ＢＮＰ及び／又はＮ−末端プロ−ＢＮＰのレベルは、化合物１による治療前の該対象のトロポニンＴ、トロポニンＩ、ＢＮＰ及び／又はＮ−末端プロ−ＢＮＰのベースラインレベルと比べ、約１５％減少する。
【００９８】
先に考察したように、開示された方法の一部の実施態様において提供される臨床の改善は、治療を受け取っていない対象と比較した、治療を受け取っている対象の心臓血管に関連した入院の割合の減少である。一部の実施態様において、患者は、治療を受けていない者と比べ、１年につき心臓血管に関連した入院が平均して少なくとも０．５、１、１．５、２、３、４、５回少ない。
【００９９】
本明細書において開示された方法の一部の実施態様において提供される追加の臨床的恩恵は、治療を受け取っていない個人と比べた死亡率の低下である。一部の実施態様において、死亡率は、治療を受け取っていない対象と比べ、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０％又はそれ以上低下される。
【０１００】
ＡＴＴＲポリニューロパチーは、ＴＴＲアミロイド（ＡＴＴＲ）の沈着が、正常な神経機能を損なうか又はそうでなければ傷つける疾患である。ＡＴＴＲポリニューロパチーは、罹患した対象において悪液質及び死亡を引き起こす進行性疾患である。本開示の方法は、ＴＴＲ原線維の蓄積を停止又は遅らせることにより、ＡＴＴＲポリニューロパチーの対象における臨床の改善を提供する。この過程を通じて、ここで説明された方法は、臨床の改善したＡＴＴＲポリニューロパチー対象を提供する。臨床の改善は、神経障害スコア（ＮＩＳ）又は補正神経障害スコア＋７（ｍＮＩＳ＋７）の改善、ノーフォークＱＯＬ糖尿病性ニューロパチー（ＱＯＬ−ＤＮ）質問票の改善、複合自律神経症状スコア（ＣＯＭＰＡＳＳ−３１）のスコアの改善、修正ボディマス指数（ｍＢＭＩ）により測定される改善された栄養状態、並びに／又は対象の１０ｍ歩行試験における改善を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、改善された神経障害スコア（ＮＩＳ）を提供する。ＮＩＳは、虚弱、感覚及び反射を測定するスコア化システムを指す。ＮＩＳスコアは、虚弱に関する標準筋肉群（１は２５％低下、２は５０％低下、３は７５％低下、３．２５は重力に抗する動きであり、３．５は取り除かれた重力による動きであり、３．７５は動きを伴わない筋肉のぴくつきであり、及び４は麻痺である）、筋肉の伸展反射の標準群（０は正常であり、１は減少であり、２は存在しない）、並びに触圧覚、振動、関節の位置及び動き、並びに痛覚(pinprick)（全て、人差し指及び親指で等級化：０は正常であり、１は減少し、２は存在しない）を評価する。評価は、年齢、性別、及び体力について補正される。
【０１０２】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１を服用していない対象と比べＮＩＳスコアの増加率が減少するように、疾患の進行を遅らせる。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療後のＮＩＳスコアの変化が存在しないように、疾患の進行を停止する。
【０１０３】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療後のＮＩＳスコアを減少する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０％だけ、ＮＩＳスコアを減少する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも５％だけ、ＮＩＳスコアを減少する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１０％だけ、ＮＩＳスコアを減少する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１５％だけ、ＮＩＳスコアを減少する。
【０１０４】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、改善された補正神経障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）を提供する。ｍＮＩＳ＋７は、小径神経線維及び大径神経線維の機能の電気生理学的測定（ＮＣＳ及びＱＳＴ）、並びに自律神経機能の測定（体位性血圧）と組み合わせた、神経機能障害（ＮＩＳ）の臨床試験ベースの評価を指す。ｍＮＩＳ＋７スコアは、ＮＩＳ＋７スコアの補正（これはＮＩＳ＋７種の試験を表す）である。ＮＩＳ＋７は、虚弱及び筋肉の伸展反射を分析する。７種の試験のうち５種は、神経伝導の特質を含む。これらの特質は、腓骨神経複合筋活動電位の振幅、運動神経伝導速度及び運動神経遠位潜時（ＭＮＤＬ）、脛骨ＭＮＤＬ、並びに腓腹知覚神経活動電位の振幅である。これらの値は、年齢、性別、身長及び体重の変動について補正される。７種の試験のうち残りの２種は、振動検出閾値及び深呼吸後の心拍数減少を含む。ｍＮＩＳ＋７スコアは、スマート定量的体性感覚試験の使用、新規の自律神経評価、並びに尺骨神経、腓骨神経、及び脛骨神経の振幅の複合筋活動電位の使用、並びに尺骨神経及び腓腹神経の知覚神経活動電位を考慮するようにＮＩＳ＋７を補正する(Suanprasert, N.ら、Retrospective study of a TTR FAP cohort to modify NIS+7 for therapeutic trials, J. Neurol. Sci., 2014. 344(1-2): 121-128)。ｍＮＩＳ＋７試験の更なる詳細は、全ての目的に関して、ＵＳ２０１７／０３０７６０８において認めることができ、この内容は引用により本明細書中に組み込まれている。
【０１０５】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ｍＮＩＳ＋７スコア増加の割合が、化合物１を服用していない対象と比べ減少するように、疾患の進行を遅らせる。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療後にｍＮＩＳ＋７スコアの変化が存在しないように、疾患の進行を停止する。
【０１０６】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療後のｍＮＩＳ＋７スコアを減少する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ｍＮＩＳ＋７スコアを、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０％だけ減少する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ｍＮＩＳ＋７スコアを、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも５％だけ減少する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ｍＮＩＳ＋７スコアを、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１０％だけ減少する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ｍＮＩＳ＋７スコアを、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１５％だけ減少する。
【０１０７】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ノーフォークＱＯＬ糖尿病性ニューロパチー（ＱＯＬ−ＤＮ）質問票における改善されたスコアを提供する。この質問票は、当業者には周知であり、且つ大径線維、小径線維、及び自律神経ニューロパチーに関連した疼痛を捕獲する検証された質問票である。この質問票は、対象により経験された症状に関連した項目及びニューロパチーの対象の日常活動に対する影響に関連する質問を含む。
【０１０８】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ノーフォークＱＯＬ−ＤＮスコアの減少の割合が、化合物１を服用しない対象と比べ、減少されるように、疾患の進行を遅らせる。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療後に、ノーフォークＱＯＬ−ＤＮスコアに変化が存在しないように、疾患の進行を停止する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療後にノーフォークＱＯＬ−ＤＮスコアに変化が存在しないように、疾患の進行を遅らせる。
【０１０９】
一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、化合物１による治療後のノーフォークＱＯＬ−ＤＮスコアを改善する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ノーフォークＱＯＬ−ＤＮを、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０％だけ改善する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ノーフォークＱＯＬ−ＤＮスコアを、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも５％だけ改善する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ノーフォークＱＯＬ−ＤＮスコアを、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１０％だけ改善する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、ノーフォークＱＯＬ−ＤＮスコアを、化合物１による治療前に測定されたベースラインレベルと比べ、少なくとも１５％だけ改善する。一部の実施態様において、本明細書記載の方法は、対象のノーフォークＱＯＬ−ＤＮの、対象のベースラインスコアと比べ、約−１．５、−２．０、−２．５、−３．０、−３．５、−４．０、−４．５、−５．０、−５．５、−６．０、−６．７、−７．０、−７．５、−８．０、−８．５、−９．０、−９．５、又は−１０．０の変化を提供する。
【０１１０】
一部の実施態様において、本明細書に開示された方法は、複合自律神経症状スコア（ＣＯＭＰＡＳＳ−３１）を提供する。複合自律神経症状スコア（ＣＯＭＰＡＳＳ−３１）は、自律神経異常症の症状を評価する患者質問票である。一実施態様において、本発明の方法は、ＣＯＭＰＡＳＳ−３１スコアにおけるベースラインに対する改善を対象に提供する。そのような改善は、対象のＣＯＭＰＡＳＳ−３１スコアのポイントの少なくとも０．１、例えば、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、又は少なくとも０．５、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、又は０．５の増加の形をとることができる。一部の実施態様において、これらの方法は、ＣＯＭＰＡＳＳ−３１スコアにおいて変化が存在しないように、疾患の進行を遅らせる。更に別の実施態様では、本発明の方法は、ＣＯＭＰＡＳＳ−３１スコアが減少する速度を遅らせ、例えばＡＧ１０により治療されない対象におけるＣＯＭＰＡＳＳ−３１スコアの減少の速度と比べ、ＡＧ１０により治療された対象におけるＣＯＭＰＡＳＳ−３１スコアの減少の速度を遅らせる。
【０１１１】
一部の実施態様において、本明細書に開示された方法は、個人のＢＭＩにそれらの血清アルブミンレベルを積算することにより決定される、修正ボディマス指数（ｍＢＭＩ）により測定される改善された栄養状態を提供する。ｍＢＭＩの計算は、総体重に対する浮腫の寄与を考慮している。一実施態様において、本開示の方法は、ｍＢＭＩにおけるベースラインに対する改善を対象に提供する。そのような改善は、約２、５、７、１０、１２、１５、２０、又は約２５のｍＢＭＩスコアの減少の形をとることができる。他の実施態様において、これらの方法は、増加するｍＢＭＩ指数スコアを停止し、例えばこれらの方法は、ｍＢＭＩスコアの０％の増加を生じる。更に別の実施態様では、本発明の方法は、ｍＢＭＩスコアが増加する速度を遅らせ、例えば、ＡＧ１０により治療されない対象におけるｍＢＭＩスコアの増加の速度と比べ、ＡＧ１０により治療された対象におけるｍＢＭＩスコアの増加の速度を遅らせる。
【０１１２】
一部の実施態様において、本明細書に開示された方法は、１０ｍ歩行試験における改善を提供する。この試験は、１０ｍにわたる個人の歩行速度を測定する。一実施態様において、本開示の方法は、１０ｍ歩行試験におけるベースラインからの増加を対象に提供する。一部の実施態様において、１０ｍ歩行試験におけるベースラインからの増加は、約０．０２５、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、又は約５．０ｍ／秒である。
【０１１３】
一部の実施態様において、本明細書において開示された方法は、改善されたＤｙｃｋ／Ｒａｎｋｉｎスコアを提供する。Ｄｙｃｋ／Ｒａｎｋｉｎスコアは、当該技術分野において公知であり、且つ患者の症状、神経障害、試験結果を評価し、且つ日常生活の活動を行う患者の能力を検証した後に、医師により割当てられる。末梢ニューロパチーに関連した不能のみが、等級化される。患者が、特定の作業を実行するか又は日常生活を活動するための困難又は不能を有するかどうかを決定する上で、患者の報告を超えるものが判断に使用され；医師は客観的判定基準を使用しなければならない。ステージ（０−８）を、以下に概説している：
０．  ニューロパチーなし
・症状なし（ＮＳＳ＜１）、徴候なし（ＮＩＳ＜２ポイント）；又は、ニューロパチー異常の試験なし（例えば、７試験＜９７．５番目）。
１．  最少のニューロパチー（Ａ、Ｂ、Ｃのただ一つが異常である）
ａ）試験が、唯一の異常である（例えば、７試験＞９７．５番目）；又は
ｂ）ニューロパチー徴候が、唯一の異常である（例えば、ＮＩＳ＞２ポイント）；又は
ｃ）ニューロパチー症状が、唯一の異常である（例えば、ＮＳＳ＞１）
２．  最少のニューロパチー：１ａ＋１ｂ
３．  症候性ニューロパチー：１ａ、１ａ＋１ｃ；１ａ＋１ｃ又は１ｂ＋１ｃ。患者は、通常のように日常生活の活動、仕事又は余暇活動を継続することができ、並びに通常通り家庭的及び社会的責任を果たすことができる。
＊  ニューロパチーの症状：ＮＳＳ≧１筋肉の虚弱、萎縮又はけいれんの症状；陰性又は陽性、ニューロパチー感覚性症状（Ｎ−ＮＮＳ、Ｐ−ＮＳＳ）；或いは、ニューロパチー自律神経症状。
−  日常生活、仕事、余暇並びに社会的及び家庭的活動の通常の活動：ニューロパチー症状にも関わらず、患者は、自分の通常の活動で仕事し、自分の通常の家庭での義務を維持し、且つ余暇活動に参加することができる。一般に、患者は、若干の運動、感覚又は自律神経の症状にもかかわらず続けることができる。患者は、並外れた活動、例えば運動競技、我慢の偉業(feats of endurance)などを行うことができない。
４．  仕事、日常生活の通常の活動、余暇活動、又は家庭的及び社会的義務を妨害及び制限する症候性ニューロパチー（３で規定）であるが、自立機能(independent function)は、他者の介助なしに可能である。このスコアでは、ニューロパチーのために、通常の＊仕事、日常又は余暇の活動、家庭的もしくは社会的義務＊のはっきりした制限が存在する。
＊  運動、感覚もしくは自律神経の症状又は機能障害の程度は、仕事をし、日常生活の通常の活動、余暇活動を行い、又は家庭的及び通常の社会的責任を果たす能力を制限するのに十分な程度である。患者が、日常生活の「通常の」活動、余暇活動を行い、且つ社会的及び家庭的責任を果たすことができる場合を除いて、杖（ｃａｎ）又は矯正装置の使用は、恐らく患者を、この（又はより高い）範疇に配置する（その後、彼等はより低い範疇に入れる）。
５．  日常生活の活動、仕事及び余暇活動を制限する、症候性ニューロパチー（３において規定）。他の介護者の介助＊（＜２．５時間／日）が必要である。車椅子の使用が日常生活(daily loving)の活動、余暇活動、又は社会的及び家庭的責任に必須である場合、患者は、通常このスコア又はより高いスコア（＞５）に入れる。
＊  家族の一員又は訪問看護師は、日常生活の活動（入浴、髭剃り、歯磨き、食事など）、鎮痛薬もしくはアヘン剤の毎日の管理を提供するか、或いは患者が自身で適切且つ安全に行うことができない自律神経機能障害の管理により介助することが必要とされる。
６．  ５において説明したような≧２．５時間から＜８時間／日の介護者の介助を必要とする、症候性ニューロパチー（３において規定）。
７．  ＞８時間／日の、しかしステージ８におけるように連続ではない、介護者の介助を必要とする、症候性ニューロパチー（３において規定）。
８．  集中治療室における不断の看護を必要とする、症候性ニューロパチー（３において規定）。
【０１１４】
投与の期間は、治療される特定の疾患を含む、数多くの因子により変動するであろう。例えば、特にトランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシス疾患又は病態において、慢性（すなわち、連続、長期間）投与が必要とされる遺伝的成分が存在する。しかし、一部の実施態様において、対象がＴＴＲアミロイドーシス疾患又は病態に関連した症状を顕在化又は経験している間か、或いは特定のエンドポイントが達成された後（例えば、症状の軽減又は完全な除去）の設定された期間にわたり、化合物１の遺伝的ＴＴＲアミロイドーシス疾患を伴う対象への投与は継続する。ＴＴＲアミロイドーシス疾患の症状が再発するか又は再顕在化が始まった場合、化合物１の投与が再度開始される。
【０１１５】
遺伝的に結びつけられないＴＴＲアミロイドーシス疾患を伴う対象に関して、数多くの投与の選択肢が利用可能であり、且つ疾患の重症度及び提示された臨床症状によって決まるであろう。一部の実施態様において、化合物１の長期間投与が必要である。一部の実施態様において、化合物１のより短い期間、又は急性の投与が必要である。一部の実施態様において、対象がＴＴＲアミロイドーシス疾患又は病態に関連した症状を顕在化又は経験している間か、或いは特定のエンドポイントが達成された後（例えば、症状の軽減又は完全な除去）の設定された期間にわたり、化合物１の遺伝的に結びつけられないＴＴＲアミロイドーシス疾患を伴う対象への投与は継続する。ＴＴＲアミロイドーシス疾患の症状が再発するか又は再顕在化が始まった場合、化合物１の投与が再度開始される。
【０１１６】
一部の実施態様において、化合物１は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００日間又はそれよりも長く投与される。一部の実施態様において、化合物１は、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、又は５６日間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、２８日間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、５６日間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、８４日間投与される。
【０１１７】
一部の実施態様において、化合物１は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヶ月間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヶ月間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、６ヶ月間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、１２ヶ月間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、１８ヶ月間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、２４ヶ月間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、３０ヶ月間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、３６ヶ月間投与される。一部の実施態様において、化合物１は、４２ヶ月間投与される。
【０１１８】
有利なことに、利尿薬療法において使用される薬剤は、治療時にＡＧ１０の曝露を変更しなかった。従って、利尿薬療法を受け取っている患者は、変更された又は特定された投薬レジメンを伴わずに、ＡＧ１０を投与されることができる。結果、一部の実施態様において、ＡＧ１０を受け取っている対象は、追加の利尿薬療法の薬剤も受け取っている。利尿薬療法の薬剤は、エタクリン酸、ブメタニド、フロセミド、及びトラセミドを含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、利尿薬は、フロセミド又はトラセミドからなる群から選択される。
【０１１９】
医薬組成物
化合物１は、対象への送達に適した様々な組成物に調製することができる。対象への投与に適した組成物は、典型的には化合物１、又はその医薬として許容し得る塩、及び医薬として許容し得る賦形剤を含有する。
【０１２０】
化合物１の投与のための医薬組成物は、好都合なことに単位剤形で提示されることができ、且つ調剤及び薬物送達の分野において公知の任意の方法により調製されることができる。全ての方法は、この活性成分を、１又は複数の付属成分を含む担体と会合させる工程を含む。概して、この医薬組成物は、活性成分を、液体担体又は細かく分割された固形担体又は両方と均一且つ密接に会合させ、その後必要ならばこの製品を所望の製剤へ成形することにより、調製される。
【０１２１】
本発明における使用に適した製剤は、「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」第21版、Gennaro編集、Lippincott Williams & Wilkins社(2003)において認められ、これは引用により本明細書中に組み込まれている。本明細書記載の医薬組成物は、当業者に公知である様式で、すなわち、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠−製造、粉末化(levigating)、乳化、カプセル封入、取込み(entrapping)又は凍結乾燥のプロセスにより、製造することができる。以下の方法及び賦形剤は、単なる例証であり、いかなる場合にも限定ではない。
【０１２２】
化合物１は、治療的投与のために、様々な製剤に混入することができる。より特定すると、化合物１は、適切な医薬として許容し得る担体又は希釈剤による製剤化により、一緒に又は個別に、医薬組成物へ製剤化することができ、且つ錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠、ゲル剤、スラリー、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾルなどの、固体、半固体、液体又は気体の形状の調製品へ製剤化することができる。従って、本発明の化合物の投与は、経口、口腔内、非経口、静脈内、皮内（例えば、皮下、筋肉内）、経皮投与などを含む、様々な様式で達成することができる。更に、化合物１は、例えば、デポ剤又は持続放出製剤など、全身様式よりも局所様式で投与することができる。
【０１２３】
経口使用のための製剤はまた、活性成分が、不活性固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンなどと混合された、硬ゼラチンカプセル剤として、又は活性成分が、水又は油性媒体、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油などと混合された、軟ゼラチンカプセル剤として、提示されてよい。加えて、乳剤は、油分などの非−水混和性成分により調製し、且つモノ−ジグリセリド、ＰＥＧエステルなどの界面活性剤により安定化することができる。
【０１２４】
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合された活性物質を含む。そのような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントガム及びアカシアゴムであり；分散剤又は湿潤剤は、天然のホスファチド、例えばレシチン、アルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシ−エチレンステアレート、又はエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドの脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなど、又はエチレンオキシドの脂肪酸及び無水ヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートであってよい。水性懸濁剤はまた、１又は複数の保存剤、例えばエチル、もしくはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルなど、１又は複数の着色剤、１又は複数の香味剤、及びショ糖もしくはサッカリンなどの１又は複数の甘味剤も含んでよい。
【０１２５】
水の添加による水性懸濁剤の調製に適した分散性散剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１又は複数の保存剤と混合した、活性成分を提供する。好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、先に既に言及したものにより例証される。追加の賦形剤、例えば甘味料、香味剤及び着色剤も、存在してよい。
【０１２６】
医薬剤形
本開示は、化合物１の医薬剤形、又はその医薬として許容し得る形状を含む。本明細書記載の剤形は、対象への経口投与に適している。この剤形は、非限定的にカプセル剤又は錠剤を含む、経口投与に適した任意の形状であってよい。
【０１２７】
一部の実施態様において、本開示は、下記式を有する化合物１：
【化７】
2021518381.tif 000009
又はその医薬として許容し得る塩を、１０〜１，０００ｍｇ含有する、単回単位剤形のカプセル剤又は錠剤の形状を提供する。
【０１２８】
一部の実施態様において、化合物１の量は、約１００〜８００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の量は、約１５０〜６００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の量は、約２００〜４００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の量は、約２００ｍｇである。一部の実施態様において、化合物１の量は、約４００ｍｇである。一部の実施態様において、単回用量のカプセル剤又は錠剤は、化合物１のＨＣｌ塩を含有する。
【０１２９】
一部の実施態様において、化合物１の単回単位剤形は、錠剤である。
【０１３０】
一部の実施態様において、化合物１の単回単位剤形は、カプセル剤である。
【０１３１】
一部の実施態様において、単回単位剤形は、サイズ＃０、＃１、＃２、＃３、＃４、又は＃５のカプセル剤である。一部の実施態様において、単回単位剤形は、サイズ＃０のカプセル剤である。一部の実施態様において、単回単位剤形は、サイズ＃１のカプセル剤である。一部の実施態様において、単回単位剤形は、サイズ＃２のカプセル剤である。一部の実施態様において、単回単位剤形は、サイズ＃３のカプセル剤である。一部の実施態様において、単回単位剤形は、サイズ＃４のカプセル剤である。一部の実施態様において、単回単位剤形は、サイズ＃５のカプセル剤である。
【０１３２】
キット
本開示はまた、本発明の医薬組成物及び剤形を含むキットも包含している。
【０１３３】
一部の態様において、本発明は、化合物１又はその医薬として許容し得る塩を含むキットを提供する。本明細書記載のキットの一部は、化合物１を投与する方法を説明するラベルを含む。本明細書記載のキットの一部は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを治療する方法を説明するラベルを含む。一部の実施態様において、本明細書記載のキットは、野生型トランスサイレチンアミロイド心筋症（ＡＴＴＲ−ＣＭ、老人性全身性アミロイドーシスとも称される）を治療する方法を説明するラベルを含む。一部の実施態様において、本明細書記載のキットは、家族性アミロイド心筋症（ＡＴＴＲ−ｍＣＭ）を治療する方法を説明するラベルを含む。一部の実施態様において、本明細書記載のキットは、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＡＴＴＲ−ＰＮ、ＦＡＰとも称す）を治療する方法を説明するラベルを含む。
【０１３４】
本発明の組成物は、非限定的に米食品医薬品局（ＦＤＡ）又は他の規制機関により承認されたボトル、ジャー、バイアル、アンプル、チューブ、ブリスターパック、又は他の容器封止システム中に、化合物１を含有する組成物を含み、それらは、化合物１又はその医薬として許容し得る塩を含む１又は複数の単位用量を提供することができる。包装又はディスペンサーもまた、医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定された形状で容器に結びつけられた注意書、機関による承認を示す注意書を添付することができる。特定の態様において、キットは、本明細書記載の製剤又は組成物、その製剤又はその製剤を含有する１もしくは複数の単位剤形を含む容器封止システム、及び本明細書記載の使用方法を説明する注意書又は指示書を含むことができる。
【０１３５】
ブリスターパックなどの包装システムは、医薬包装及び蓋型(type lid)の押出しに適している、熱成形可能な硬質フィルム又はＰＶＣを含む。蓋は、プライマー／アルミニウム／熱融着−コーティングで製造された、フォイルを含むことができるか、或いは紙ベースであってよい。当業者は、化合物１を含むブリスターパックを容易に調製するであろう。本明細書記載のボトルシステムは、様々なサイズで（例えば、７５ｃｃ、１００ｃｃ、２００ｃｃなど）製造することができ、且つ一般にポリプロピレンで製造され得る子供が開けることができない封止を含む。一部の実施態様において、化合物１の医薬剤形は、子供が開けることができない封止を備えた、７５ｃｃボトル内に包装される。当業者は、本明細書記載のボトルシステムを容易に調製することができる。
【０１３６】
一部の実施態様において、本開示は、１日２回投薬のためのキットを提供する。これらのキットは、各投与に関して化合物１を含む単位投与量を１又は複数提供する。
【０１３７】
一部の実施態様において、化合物１の総１日投与量は、８００ｍｇであり、４００ｍｇが初回投薬で投与され、及び４００ｍｇが２回目の投薬で投与されることを意味する。一部の実施態様において、２００ｍｇの化合物１を含有する単位投与量の２つが、初回投薬で投与され、及び２００ｍｇの化合物１を含有する単位投与量の２つが、２回目の投薬で投与される。一部の実施態様において、４００ｍｇの化合物１を含有する単位投与量の１つが、初回投薬で投与され、及び４００ｍｇの化合物１を含有する単位投与量の１つが、２回目の投薬で投与される。一部の実施態様において、化合物１のＨＣｌ塩型が投与される。
【０１３８】
一部の実施態様において、化合物１の総１日投与量は、１，６００ｍｇであり、８００ｍｇが初回投薬で投与され、及び８００ｍｇが２回目の投薬で投与されることを意味する。一部の実施態様において、２００ｍｇの化合物１を含有する単位投与量の４つが、初回投薬で投与され、及び２００ｍｇの化合物１を含有する単位投与量の４つが、２回目の投薬で投与される。一部の実施態様において、４００ｍｇの化合物１を含有する単位投与量の２つが、初回投薬で投与され、及び４００ｍｇの化合物１を含有する単位投与量の２つが、２回目の投薬で投与される。一部の実施態様において、化合物１のＨＣｌ塩型が投与される。
【実施例】
【０１３９】
ＩＶ．  実施例
以下の実施例は、請求される本発明を例証するために提供され、これを限定するものではない。
【０１４０】
材料及び方法
以下の全般的材料及び方法は、指定されるよう、使用されるか、又は下記実施例において使用されてよい。
【０１４１】
ＡＧ１０血中血漿濃度の決定
ＡＧ１０及び内部標準ＡＧ１０−Ｄ6を含有するヒト血漿を、タンパク質沈殿を用いて抽出し、ＨＰＬＣカラムを装着したSciex API4000 ＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析した。ＡＧ１０生成物イオンのピーク面積は、ＡＧ１０−Ｄ6内部標準の生成物イオンのピーク面積に対して測定した。定量を、抽出日に調製した較正標準から作製した、重み付き１／χ2線形最小二乗回帰分析を用いて行った。
【０１４２】
蛍光プローブ排除アッセイ（ＦＰＥ）
四量体ＴＴＲのサイロキシン結合ポケット中のＡＧ１０の占有を、６時間の反応時間にわたり、血清中の遊離四量体ＴＴＲ結合部位へ共有的に結合する蛍光プローブ（Ｐｒｏｂｅ）の能力により、決定する。
【０１４３】
各血清試料のアリコートを、９６ウェルプレートに配置する。プローブの添加後の蛍光変化（λex＝３２８ｎｍ及びλem＝３８４ｎｍ）を、ＲＴで６時間にわたり、蛍光可能な(capable)マイクロプレートを用い、１５分毎にモニタリングする。
【０１４４】
四量体ＴＴＲ安定化の評価のためのウェスタンブロット
ＡＧ１０によるＴＴＲの四量体の安定化は、ウェスタンブロットゲルの濃度測定により決定される、７２時間の酸変性後に残存する四量体ＴＴＲタンパク質の量を、四量体ＴＴＲタンパク質の最初の量と比較することにより、決定する。
【０１４５】
０時及び７２時の両方の時点ポイントで、対象由来の血中血漿試料を、酸性化緩衝液（酢酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、ｐＨ約４．０）で希釈する。時点０時試料は、グルタルアルデヒドにより直接架橋させ、その後クエンチする。７２時試料は、室温で７２時間インキュベーションし、その後同じプロトコールにより、架橋させ、クエンチする。全ての試料は次に、ＳＤＳゲル装加緩衝液を添加し、ゲル装加前に煮沸することにより、変性させる。各試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離し、抗−ＴＴＲ抗血清（ポリクローナルウサギ抗−ヒトプレアルブミン、DAKO、カタログ番号A0002）を使用する免疫ブロッティングにより分析する。全てのＴＴＲバンドの濃度は、赤外ＬＩＣＯＲ造影システム又は蛍光造影システムを用いて定量し、LICOR 925-32232又はInvitrogen 84546を使用し、ＩｇＧバンドの規準化を報告する。
【０１４６】
以下に更に詳細に考察する実験、表、及び図において、採血の名目時間を、全ての薬物動態及び薬力学データについて使用する。
【０１４７】
実施例１：ＡＧ１０・ＨＣｌの調製 
【化８】
2021518381.tif 000010
式ＩＩＩａの化合物（１００ｇ、４９５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、アセトン（１Ｌ）中に溶解した。式ＩＩの化合物（４９．５９ｇ、４９５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、先の溶液へ添加し、引き続きＫ2ＣＯ3（８２．１４ｇ、５９４．３８ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＫＩ（４１．１１ｇ、２４７ｍｍｏｌ、０．５当量）を、撹拌しながら室温で添加した。この反応混合物を、６０±５℃に加熱し、この温度で４０時間撹拌した。反応混合物を濾過し、その後減圧下で濃縮し、粘稠なオレンジ色液体として、式ＩＶの化合物（１０２ｇ）を供した。
【０１４８】
【化９】
2021518381.tif 000011
式ＩＶの化合物（１００ｇ、６３２ｍｍｏｌ、１．０当量）を、エタノール（１Ｌ）中に溶解した。ヒドラジン水和物（８７ｇ、１７３８ｍｍｏｌ、２．７５当量）及び濃ＨＣｌ（４．６ｍＬ、０．２当量）を、先の溶液へ、室温で添加した。この反応混合物を、７５±５℃まで加熱し、この温度で３時間撹拌した。ＴＬＣ（７０％酢酸エチル：ｎ−ヘキサン、ヨウ素で可視化）による反応の完了及び質量分析での生成物ピークの観察後、反応混合物を、減圧下で濃縮し、無色の液体シロップとして式Ｖの化合物（７０ｇ）を供し、これをそのまま次工程で使用した。
【０１４９】
【化１０】
2021518381.tif 000012
式Ｖの化合物（３５ｇ、２２７ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１，２−ジクロロエタン（５２５ｍＬ）中に溶解した。ＰＢｒ3（６４．６７ｍＬ、６８１ｍｍｏｌ、３当量）を、室温で３０分間かけて少量ずつ添加した。反応混合物を、７５±５℃まで加熱し、この温度で３時間撹拌した。ＴＬＣ（５０％酢酸エチル：ｎ−ヘキサン、ヨウ素で可視化）による反応の完了及び質量分析での生成物ピークの観察後、反応混合物を、ジクロロメタン（３５０ｍＬ）により希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液によりｐＨ＝７〜８となるまでクエンチした。有機層及び水層の両方を分離し、収集した。有機層を、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過した。濾液を、減圧下で濃縮し、粘稠なオレンジ色液体として式ＶＩａの化合物（３８ｇ）を供した。
【０１５０】
【化１１】
2021518381.tif 000013
４−（３−ブロモプロピル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール臭化水素酸塩（ＶＩａ）及びＤＭＳＯを、容器に投入し、２０±１０℃で１０分間激しく攪拌した。次にこの混合物を、撹拌しながら、５５±５℃まで加熱した。この混合物へ、４−フルオロ−３−ヒドロキシ−安息香酸メチルエステル（ＶＩＩａ）、炭酸カリウム及び無水ＤＭＳＯを含有する撹拌溶液を移した。臭化アルキルのＤＭＳＯ溶液を、内部温度５５．０±５℃を維持するために、ゆっくり移した。添加は、６時間後に完了し、この混合物を、５５．０±５℃で更に１時間、激しく攪拌した。この混合物を、３０分間かけて２５±５℃まで冷却し、温度を２５℃以下に維持しながら、水を添加した。この混合物を、酢酸エチルにより抽出し、戻した水層を、酢酸エチルにより抽出した。プールした酢酸エチル溶液を、ブラインで洗浄した。一緒にした酢酸エチル洗浄液を、最少容積まで、真空下で濃縮し、ヘプタンを添加し、これはＶＩＩＩａを沈殿した。この混合物を、７５±５℃まで加熱し、１時間撹拌して熟成させた(aged)。この混合物を、２時間かけて、２５±５℃まで冷却し、生じた固形物を濾過により収集した。フィルターケーキを、ヘプタン中の酢酸エチル（３０％）により洗浄した。単離された固形物を、窒素流れにより乾燥させた。固形物を、容器へ投入し、酢酸エチル及びヘプタンと一緒にした。生じた混合物を、７５±５℃まで加熱し、固形物を溶解した。この溶液を、２時間かけて、２５±５℃まで冷却し、生じた固形物を濾過により収集した。固形物を、３０％酢酸エチル／ヘプタン溶媒混合液により洗浄し、５５℃で真空炉において乾燥させ、ＶＩＩＩａを純度＞９９．５％で生じた。
【０１５１】
【化１２】
2021518381.tif 000014
ジャケット付きガラス容器に、式ＶＩＩＩａの化合物（１．０当量）及びメタノールを投入した。この混合物を、１０±５℃まで撹拌しながら冷却し、２０分間かけて水酸化ナトリウム水溶液（３当量）を投入した。この混合物を、ＮＬＴ  ２時間かけて、２０±５℃で撹拌することにより熟成させ、この時点で反応は完了していた。撹拌を停止し、水を添加した。その後メタノールを、内部温度ＮＭＴ  ３５℃で、真空蒸留により除去した。生じる濃縮された透明な水溶液を、１０℃まで冷却し、濃ＨＣｌを、ｐＨが１．４〜１．６（ｐＨメーター）を下回るまで添加し、ＨＣｌ塩を沈殿させた。固形物を、濾過により収集し、０．２Ｎ  ＨＣｌで洗浄し、真空下、５０℃で乾燥させ、式Ｉａの化合物を純度ＮＬＴ  ９９．５％で生じた。
【０１５２】
実施例２：第１相臨床試験
試験ＡＧ１０−００１は、単回及び反復投与後のＡＧ１０の安全性、忍容性、ＰＫ及びＰＤを評価するために、健常成人志願者において実施された、２パート無作為化二重盲検プラセボ対照単回及び反復投与漸増ファーストインヒューマン試験であった。この試験はまた、ＡＧ１０のＰＫに対する食物の作用を評価するためにデザインされた。
【０１５３】
パートＡは、単回投与漸増（ＳＡＤ）デザインであり、ここでは８名の健常男性及び／又は女性の４コホートを、全体比３：１で、ＡＧ１０又はマッチするプラセボに無作為化した。
【０１５４】
パートＢは、反復投与漸増（ＭＡＤ）デザインであり、ここでは８名の健常男性及び／又は女性の３コホートを、１２日間の投薬に関して、３：１の比で、ＡＧ１０又はそのプラセボに無作為化した。合計すると、各８名の健常対象を含む４コホート（合計３２名の対象、ＡＧ１０・ＨＣｌが投薬される２４名及びマッチするプラセボの８名）には、盲検化された試験薬物療法の５０ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ及び８００ｍｇの漸増投与量が投薬され、本治験のＳＡＤ部分を完了した。これらのＳＡＤコホートの１名は、２回の３００ｍｇ投与量を受け取り、１名は絶食条件下で、他の者は、適切なウォッシュアウト期間後、高脂肪被験食に従った。各８名の健常対象を含む３つのコホート（合計２４名の対象、ＡＧ１０・ＨＣｌが投薬される１８名及びマッチするプラセボの６名）には、１２日間にわたり１２時間毎に盲検化された試験薬物療法の１００ｍｇ、３００ｍｇ又は８００ｍｇが投薬され、本治験のＭＡＤ部分を完了した。
【０１５５】
単回投与漸増
５０ｍｇ  ＡＧ１０・ＨＣｌ（ＳＡＤコホート１）、１５０ｍｇ  ＡＧ１０・ＨＣｌ（ＳＡＤコホート２）、３００ｍｇ  ＡＧ１０・ＨＣｌ（ＳＡＤコホート３）及び８００ｍｇ  ＡＧ１０・ＨＣｌ（ＳＡＤコホート４）が投薬された健常対象に関して認められたＰＫプロファイルは、ＡＧ１０は、１時間以下の平均Ｔmax及びおよそ２２〜２７時間の排泄半減期を伴う、迅速な経口吸収を有することを明らかにしている。表１は、ＳＡＤコホート１−４に関するＰＫパラメータの幾何平均を列挙している。更に、図１に示したように、ＳＡＤコホート１−４のＰＫにおいて、中程度の対象間変動が存在し、Ｃmaxに関する％ＣＶは、１０．０％〜４１．９％の範囲であり、並びにＡＵＣinfに関する％ＣＶは、１２．５％〜４０．４％の範囲である。
【表１】
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【０１５６】
加えて、図２（コホート３を示す）に示したように、ＳＡＤ試験の食物作用部分は、ＡＧ１０の薬物動態に対する最少の食物作用を明らかにし、摂食、対、絶食状態において、Ｃmaxのわずかな減少、及びわずかに長いＴmaxを伴ったが、ＡＵＣ0-24により規定されるような曝露における全般的に有意な変化はなかった。コホート３に関するＰＫデータを、下記表２に示す。
【表２】
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【０１５７】
反復投与漸増
ＭＡＤコホート１（１００ｍｇのＡＧ１０・ＨＣｌが１２時間毎に１２日間投薬された健常対象）、コホート２（３００ｍｇのＡＧ１０・ＨＣｌが１２時間毎に１２日間投薬された健常対象）、及びコホート３（８００ｍｇのＡＧ１０・ＨＣｌが１２時間毎に１２日間投薬された健常対象）に関する薬物動態プロットを、図３に示し、ＰＫパラメータを表３に列挙している。例え各投与量群のＣmax値において若干の対象間変動が認められたとしても、ＡＵＣ0-12値は、驚くほど類似しており、％ＣＶ値は８％〜２２．２％の範囲であった。１２日間にわたる投薬において、有意な蓄積は認められなかった。
【表３】
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【０１５８】
ＡＧ１０薬力学
ＡＧ１０の薬力学（ＰＤ）特性は、蛍光プローブ排除（ＦＰＥ）アッセイ又はウェスタンブロットアッセイ（先に記載）を使用し評価し、これらは両方共、ＴＴＲ標的会合及びＴＴＲ安定化の確立されたアッセイである。
【０１５９】
図４及び図５に示したように、ＦＰＥアッセイからのデータは、３００ｍｇ及び８００ｍｇの単回投与量での標的会合、ピーク濃度でのＴＴＲの完全な安定化、並びに３００ｍｇでは２９％〜６２％の及び８００ｍｇでは５６％〜８２％の範囲である最大１２時間持続された安定化を確認した。図６は、時間の関数としての各単回投与漸増コホートに関する平均標的会合率を示し；このデータは、漸増投与量は安定化を増大することを明らかにしている。同様に、ウェスタンブロットアッセイ（図７Ａ及び７Ｂ）は、ピーク濃度でのＴＴＲの完全な安定化、並びにＡＧ１０・ＨＣｌの３００ｍｇの単回投与量で最大１２時間持続された安定化を確認した。ＳＡＤコホート３に関するＦＰＥアッセイ及びウェスタンブロットアッセイの結果は、Ｒ2係数＞０．９で、良く相関している（図８）。両方の薬理学的活性の測定は、互いに良く相関している。
【０１６０】
加えて、図９、図１０及び図１１に示したように、ＡＧ１０・ＨＣｌの１００ｍｇ  ｑ１２ｈ、及び３００ｍｇ  ｑ１２ｈ、及び８００ｍｇ  ｑ１２ｈの連続する１２日間の投薬後に、ＦＰＥアッセイからのデータは、定常状態で持続された標的会合を確認し、投薬最終日の投薬後１２時間時点でのＴＴＲの平均安定化は、１００ｍｇ  ｑ１２ｈ投与量の３３％から８００ｍｇ  ｑ１２ｈ投与量の８９％までの範囲であった。図１２は、ＡＧ１０・ＨＣｌによる８００ｍｇ  ｑ１２ｈ投薬のコホートの１２日間にわたるピーク、平均、及びトラフのＴＴＲ標的会合率を示している。
【０１６１】
図１３は、８００ｍｇ  ＡＧ１０・ＨＣｌ  ｑ１２ｈで治療されたコホート３の３名の対象からのＴＴＲウェスタンブロットを示している。対象１及び３には、ＡＧ１０が投薬され、対象２にはプラセボが投薬された。投薬前１２日目の０時間と記されたレーンは、１１日間の投薬後（合計２２投与量）に対象から収集したＡＧ１０のトラフレベルで試料を含んでいる。投薬後１２日目と記されたレーンは、ＡＧ１０の２３回目の投与量後のピークレベルで収集された試料を示している。先に説明したよう、７２時間にわたる酸性化、それに続く架橋、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングを使用し、四量体ＴＴＲタンパク質の安定化を検出する。対象２は、この実験プロトコールにより検出される残存するＴＴＲ四量体は示さない。対照的に、対象１及び３は、ＡＧ１０のトラフレベル及びピークレベルの両方での四量体ＴＴＲの完全な安定化を示している。
【０１６２】
図１４に示したＳＡＤコホート及びＭＡＤコホートからの平均ＰＫ−ＰＤデータは、ＡＧ１０が投薬されたヒト対象におけるＦＰＥアッセイにより測定されたＡＧ１０の予測可能で投与量−反応性のＰＤ作用を明らかにしている。
【０１６３】
まとめ
本明細書に提供されるＡＧ１０に関するデータは、単回及び反復投与量の両方の後の、ピーク濃度でのＴＴＲの完全な安定化を伴い、最大１２時間安定化が続く、標的会合を確認している。
【０１６４】
実施例３：計画された第２相臨床試験
第２相試験は、安定した心不全療法の背景を持つＡＴＴＲ−ＣＭ患者におけるＡＧ１０の安全性、忍容性、ＰＫ及びＰＤを評価するための、無作為化多施設二重盲検並行群間プラセボ対照投与量−変動試験として計画される。スクリーニング及び無作為化に、２８日間の盲検化されプラセボ対照された治療期間が続く。およそ４５名の対象が、第２相試験に登録するよう計画される。この第２相試験の概要を、表４に提供する。
【表４】
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【０１６５】
実施例４：ＡＧ１０によるトランスサイレチンのエンタルピー−駆動した安定化は、トランスサイレチンアミロイドーシスから保護する天然の一般的(generic)変動を模倣する
下記実施例は、ＡＧ１０のエンタルピー性結合と、多タンパク質複合体の安定化における増強された効能の間の相関を説明している。
【０１６６】
材料及び方法
等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）。結合実験は、２５℃でMicroCal PEAQ-ITCを使用し行った。リガンド溶液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５％ＤＭＳＯ中２５μＭ）を調製し、同一緩衝液中２μＭ  ＴＴＲを含むＩＴＣセルへ滴定した。リガンド（各２．０μＬ）の１９の注入を、ＴＴＲがリガンドにより完全に飽和された時点まで、ＩＴＣセル（２５℃で）へ注入した。熱量データを、プロットし、標準単独部位結合モデルを用いてフィットさせた。対照に関して、本発明者らは、ＴＴＲへ緩衝液中の保存(bank)ＤＭＳＯを滴定することにより引き起こされたエンタルピー変化を試験し、生じた結合エンタルピーは＜０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。本発明者らはまた、ＩＴＣを使用し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対しタファミジス及びＡＧ１０を滴定した。タファミジスのＫｄ値（２．３μＭ）は、先に報告された値（Ｋｄ＝２．５μＭ；EMA Assesment Report EMA/729083/2011）と類似していた。ＡＧ１０の結合親和性は、およそ８μＭと計算され、これもまた図２０の我々のデータ（ここでＡＧ１０は、タファミジスと比べアルブミンへのより低い結合を有する）とフィットする。
【０１６７】
緩衝液及びヒト又はイヌ血清中のＴＴＲ結合に関するＦＰＥアッセイ。緩衝液及び血清中のＡＧ１０及び他の安定化剤のＴＴＲへの結合親和性及び選択性を、緩衝液及びヒト血清中でＴＴＲへ結合する蛍光プローブ排除（ＦＰＥプローブ）の結合と競合するそれらの能力により決定した。ＦＰＥプローブは、それ自身は蛍光でないが、ＴＴＲのＴ４結合部位と結合した時点で、リジン１５（Ｋ１５）を共有的に修飾し、蛍光共役を生じるチオエステルＴＴＲリガンドである。ＴＴＲのＴ４部位に結合するリガンドは、より少ない蛍光により観察されるように、ＦＰＥプローブ結合を減少する。ＦＰＥアッセイはまた、イヌ血清を使用することにも適用した。緩衝液中のＴＴＲによるＦＰＥ。ＰＢＳ中のＴＴＲ（ｐＨ７．４、最終濃度：２．５μＭ）の９８μＬのアリコートを、被験化合物（２．５μＭ）の１μＬ及びＦＰＥプローブ（ＤＭＳＯ中０．１８ｍＭストック溶液：最終濃度：１．８μＭ）の１μＬと混合した。蛍光の変化（λｅｘ＝３２８ｎｍ及びλｅｍ＝３８４ｎｍ）を、マイクロプレート分光光度リーダー(SpectraMax M5)を用いて、ｒｔで６時間モニタリングした。ヒト及びイヌ血清中のＴＴＲによるＦＰＥ。プールしたヒト血清（ヒト男性ＡＢ型血漿から調製、Sigma；カタログ番号H4522；ＴＴＲ濃度５μＭ）又はイヌ血清（Innovative Research、カタログ番号：IBG-SER；ＴＴＲ濃度４．６μＭ）の９８μＬのアリコートを、被験化合物［全ての化合物は、ＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液として調製し、以下に従いＤＭＳＯにより希釈した（血清中の最終濃度：ＡＧ１０  １０μＭ；ジフルニサル２００μＭ；タファミジス２０μＭ；トルカポン２０μＭ）］の１μＬ及びＦＰＥプローブ（ＤＭＳＯ中０．３６ｍＭストック溶液；最終濃度：３．６μＭ）の１μＬと混合した。イヌ血清（ＡＧ１０の経口処置後）の場合、ＦＰＥプローブの１μＬ及びＤＭＳＯの１μＬを、各ウェルに添加し、適切なイヌ血清試料９８μＬと混合した。蛍光の変化（λｅｘ＝３２８ｎｍ及びλｅｍ＝３８４ｎｍ）を、マイクロプレート分光光度リーダー(SpectraMax M5)を用いて、ｒｔで６時間モニタリングした。
【０１６８】
免疫ブロッティングによる血清中ＴＴＲの安定性試験。ウェスタンブロッティングを、先に報告したように行った。全ての化合物は、ＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液として調製し、以下に従いＤＭＳＯにより希釈した（血清中の最終濃度：ＡＧ１０  １０μＭ；ジフルニサル２００μＭ；タファミジス２０μＭ；トルカポン２０μＭ）。各化合物２μＬを、ヒト血清（ＴＴＲ濃度５μＭ）９８μＬに添加した。これらの試料を、３７℃で２時間インキュベーションし、その後試料１０μＬを、酸性化緩衝液（ｐＨ４．０、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）により１：１０で希釈した。ウェスタンブロットアッセイをまた、先に報告したように、尿素緩衝液（ｐＨ７．４）中で行った。試料を、室温で７２時間インキュベーションし、グルタルアルデヒド（最終濃度２．５％）により５分間架橋させ、次に０．１Ｍ  ＮａＯＨ中の７％水素化ホウ素ナトリウム溶液１０μＬによりクエンチした。全ての試料は、ＳＤＳゲル装加緩衝液１００μＬの添加及び５分間の煮沸により、変性させた。各試料１０μＬを、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離し、抗−ＴＴＲ抗血清（DAKO A0002、ヒト血清について１：１０，０００及びイヌ血清について１：２，０００希釈）を使用する免疫ブロッティングにより分析した。ＴＴＲバンド（ＴＴＲ四量体及びＲＢＰに結合した四量体）の一緒にした強度を、Odyssey IR造影システム(LI-COR Bioscience)を使用し定量し、０時（１００％安定化と考える）及び７２時（１０％〜３５％の範囲の残存ＴＴＲ）でのＤＭＳＯ対照のＴＴＲ四量体濃度に対するＴＴＲ四量体の百分率として報告した。四量体安定化率は、１００×［（四量体及び四量体＋ＲＢＰの濃度、７２時）／（ＤＭＳＯの四量体及び四量体＋ＲＢＰの濃度、０時）］として計算した。
【０１６９】
インシリコ構造及びモデリング試験。ＴＴＲの結晶構造の分析を、RCSB PDBサイトから得た４種のＴＴＲ結晶構造について行った。ＴＴＲ四量体の生物学的集成は、pdbファイルにおいて与えられたＸ線結晶学的単位セル情報を用いて構築した。複数のモデルが示唆される場合、最初の選択モデルを使用した。Molden38により構築されたＡＧ１０及びその４種の誘導体（１、２、３、及び４）の初期配置(geometry)を使用し、且つ配置の最適化は、ガウス０９プログラムパッケージを使用する６−３１１＋Ｇ（ｄ）基本セットによる、ハイブリッド濃度関数Ｂ３ＬＹＰレベルで行った(Wallingford, CT, USA: Gaussian, Inc., 2009)。最適化された配置に関する振動数計算を行い、これらは仮想振動数を有さないことを確認した。ドック６プログラムを、ドッキング実験に使用した。ＡＧ１０とのＶ１２２Ｉ変異体ＴＴＲ複合体(pdb id：4HIQ)の結晶構造を、レセプターとして使用した。四量体ＴＴＲは、結晶学的データを用いて構築し、溶媒及び他のヘテロ原子は除去し、且つＴ４結合部位を含む、一つの大きいドッキンググリッドを選択した。全てのドッキング実験に関して、同じレセプター及びグリッドを使用した。ねじれ角周りの回転を可能にするために、自由リガンドドッキングを実行した。ＵＣＳＦキメラパッケージを、可視化及び３Ｄ構造解析に使用した。
【０１７０】
ＡＧ１０及びタファミジスのヒト血清アルブミンへの結合。被験化合物（ＡＧ１０又はタファミジス；両方共３０μＭ）を、アッセイ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＫＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）中のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；６００μＭ；ヒト血清由来のアルブミン；Sigma Aldrich、カタログ番号：A3782）と共に、３７℃で１時間インキュベーションした。アッセイ緩衝液中のＨＡＳ及びＡＧ１０又はタファミジス混合物の溶液５００μＬを、重力によるPD Minitrap G25カラム(GE Life Sciences、カタログ番号45-001-529)上のゲル濾過に供し、且つＨＳＡを含有する画分を、NanoDrop(商標)により同定した。ＨＳＡの濃度（すなわち０時の濃度）もまた、NanoDrop(商標)を用いて決定した（既知のＨＡＳ濃度の較正曲線を基に）。ＨＳＡ濃度は、タファミジス試料について３５１μＭ、及びＡＧ１０試料について３４５μＭであった。これらの画分中の被験化合物の濃度（すなわち０時の濃度）は、ＨＰＬＣを用いて評価した（既知濃度の被験化合物の較正曲線を基に）。次に各ＨＳＡ／被験化合物試料５００μＬを、Slide-A-Lyzer透析カセットG2(3.5K MWCO、Thermo Scientific、カタログ番号PI87722)に添加した。この透析カセットを、アッセイ緩衝液１００ｍｌ中に配置し、室温で撹拌した。２４時間後、試料を透析カセットから取りだし、容積を測定した。ＨＡＳ及び被験化合物の濃度を、先に説明したようにNanoDrop(商標)及びＨＰＬＣを使用し決定した。
【０１７１】
ＡＧ１０：ＴＴＲ複合体の透析。ＡＧ１０（１０μＭ）を、アッセイ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＫＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）中で、ヒト野生型ＴＴＲ（５μＭ；ヒト血漿から精製；Sigma Aldrich、カタログ番号P1742)と共に、37℃で1時間インキュベーションした。その後各ＡＧ１０／ＴＴＲ溶液５００μＬを、Slide-A-Lyzer透析カセットG2へ添加した。この透析カセットを、アッセイ緩衝液１００ｍｌ中に配置し、室温で撹拌した。透析緩衝液から試料を、異なる時点で採取した（０、０．５、１、２、６、及び２４時間）。２４時間後、試料を透析カセットから取りだし、容積を測定し、結果を規準化した。アッセイ緩衝液から得られたＴＴＲ及びＡＧ１０の濃度を、各々、NanoDrop(商標)及びＬＣＭＳを使用し決定した。
【０１７２】
他の血清タンパク質と比較したＡＧ１０及びタファミジスのＴＴＲに対する選択性。ＦＰＥアッセイを改変し、精製したヒトＴＴＲｗｔ（５μＭ）で行った。他の血清タンパク質を、個別に又は組合せて［フィブリノゲン（５μＭ）、アルブミン（６００μＭ）、ＩｇＧ（７０μＭ）、トランスフェリン（２５μＭ）］のいずれかで、ＴＴＲ及びＦＰＥの混合物へ添加し、蛍光を先に説明したように６時間モニタリングした。３時間インキュベーション後に測定した血清タンパク質の存在下でＴＴＲへ結合するＦＰＥプローブの百分率を、ＴＴＲ占有率の計算に使用した。
【０１７３】
イヌへのＡＧ１０の７日間反復経口投薬。１６匹の雄（Ｍ）及び１６匹の雌（Ｆ）のビーグル犬を、４つの処置群に分け、ビヒクル（０ｍｇ／ｋｇで６Ｍ／６Ｆ）又は０．５％メチルセルロース製剤中のＡＧ１０（５０ｍｇ／ｋｇで２Ｍ／２Ｆ、１００ｍｇ／ｋｇで２Ｍ／２Ｆ、及び２００ｍｇ／ｋｇで６Ｍ／６Ｆ）を、合計３２匹のイヌに強制的に経口投薬した。試験１日目（投薬前Ｄ１）、７日目投薬前試験（投薬前Ｄ７）、及び７日目投薬後１時間試験（投薬後Ｄ７）に、血液（およそ１．５ｍＬ）を、頚静脈から血清分離チューブへ収集した。これらの血清試料を、先に説明したＦＰＥアッセイを用い、それらのＴＴＲ占有について分析した。
【０１７４】
ＴＴＲへの結合及び安定化に関する曝露−作用（ＰＫ−ＰＤ）関係を決定するためのイヌへのＡＧ１０の単回経口投薬。４匹の雄及び４匹の雌のビーグル犬を、２つの処置群へ分け（ｎ＝２／性別／群）、合計８匹のイヌを、ＴＴＲへのＡＧ１０結合及び安定化について、同時薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）データを獲得するために評価した。各動物は、０．５％メチルセルロース中の５又は２０ｍｇ／ｋｇのいずれかの単回投与量で、ＡＧ１０の単回経口強制投与（ＰＯ）を受け取った。血液は、投薬前、並びに投薬後２、４、６、８、１２及び２４時間に収集し、且つ分析した。これらの血清試料中のＡＧ１０の濃度はＬＣＭＳにより分析し、及びＦＰＥアッセイによりＴＴＲ占有を分析した。
【０１７５】
統計解析。全ての結果は、平均±ＳＤとして表した。全ての統計解析は、GraphPad PRISMソフトウェアにより行った。有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキー多重比較検定により測定した（ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【０１７６】
全般的化学。別に注記しない限り、全ての反応は、無水条件下乾燥溶媒を用い、アルゴン大気下で行った。使用した溶媒は、FisherのACS等級であった。試薬は、Aldrich及びFisherから購入し、更に精製することなく使用した。反応は、可視化剤としてＵＶ光を使用し、蛍光インジケーターＵＶ２５４を備える０．２０ｍｍ POLYGRAM(登録商標)SILシリカゲルプレート(Art.-Nr. 805 023)上で実行した、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニタリングした。順相フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Davisil(登録商標)シリカゲル（１００〜２００メッシュ、Fisher）を使用し行った。1Ｈ  ＮＭＲ及び13Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Jeol JNM-ECA600スペクトロメーター上で記録し、内部標準として残存する未変性の溶媒を使用し較正した。カップリング定数（Ｊ）は、ヘルツで表した。以下の略語を、多重度を説明するために使用した：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線。高解像質量分析（ＨＲＭＳ）は、JEOL DART AccuTOF（リアルタイム直接分析）により記録した。ＨＰＬＣ分析は、ＵＶ範囲２００〜４００ｎｍで操作するダイオードアレイ検出器に接続した、Agilent 1100シリーズHPLCシステム上で行い、且つAgilent Chemstationソフトウェアを用いて定量した。ＨＰＬＣ分析は、ブランク緩衝液、標準及び／又は試料の各々５０μｌの注入時に、外界温度で、Ｌ１パッキング（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）及びＳｙｍｍｅｔｒｉｃＴＭ  Ｃ４（２．１×１５０ｍｍ、５μｍ）を備える両方のWaters(商標)XBridge C18カラム上で行い、クロマトグラムを得た。移動相は、０．１％ギ酸を含有するメタノール−水（５：９５、ｖ／ｖ）からなる溶媒Ａ、及び０．１％ギ酸を含有するメタノール−水（９５：５、ｖ／ｖ）からなる溶媒Ｂで構成された。ＨＰＬＣプログラムは、０〜２０分にわたる０％から１００％まで溶媒Ｂが線形に増加し、その後３０分間１００％溶媒Ｂで維持する、勾配分離法であった。
【０１７７】
重要化合物の純度：ＨＰＬＣ分析を、Ｃ１８及びＣ４逆相カラムの両方において行った。全ての重要化合物の純度は、＞９５％であった。純度分析の説明は、実験セクションに含まれている。重要化合物の詳細なＨＰＬＣ情報（トレース、保持時間、及び％純度）は、改訂された原稿の補遺情報に含まれる。
【０１７８】
合成手順。ＡＧ１０及びタファミジスは、先に報告したように合成した。トルカポン及びジフルニサルは、Fisherから購入した。全てのＡＧ１０アナログは、以下に説明したように調製した。
【０１７９】
３−（３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）−４−ヨード安息香酸（１ａ）；ベンゼン（３ｍｌ）中の３−（３−ブロモプロポキシ）−４−ヨード安息香酸メチル（５ａ）（８３４ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、ベンゼン（７ｍｌ）中のアセチルアセトン（０．４３ｍｌ、４．２ｍｍｏｌ、２当量）及びＤＢＵ（０．６２７ｍｌ、４．２ｍｍｏｌ、２当量）の溶液へ滴加した。この反応混合物を、室温で３日間撹拌した。混合物を濾過し、濃縮した。エタノール（５ｍｌ）中のこの中間体の溶液へ、ヒドラジン水和物（０．２８ｍｌ、５．２５ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加し、反応物を還流下で４時間加熱した。この反応物を、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）により精製し、化合物１ａのメチルエステルを供した；水（２．５ｍｌ）中の水酸化ナトリウム（７９ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ、２当量）を、メタノール（１０ｍｌ）中のエステル中間体（４１２ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、この反応物を、還流下で４時間（５０℃）加熱した。この反応物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）により精製し、化合物１ａを供した（１８３ｍｇ、３工程の収率２２％）；（ＨＰＬＣによる純度９８．３％）：ｔＲ（カラム）（Ｃ１８）＝２５．７２分；ｔＲ（Ｃ４）＝１６．０６分。1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.86 (d, 1H, J＝8.4 Hz), 7.41 (d, 1H, J＝1.2 Hz), 7.34 (dd, 1H, J＝1.2 Hz及び8.4 Hz), 4.0 (t, 2H, J＝6.0 Hz), 2.67 (t, 2H, J＝7.2 Hz), 2.13 (s, 6H), 1.97-1.93 (m, 2H)。13C NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 168.5, 157.6, 142, 139.2, 133.2, 123.1, 114, 117.8, 91.7, 67.5, 29.6, 18.7, 9.3；(HRMS (DART) m/z：C15H17IN2O3 + H+の計算値401.0362；実測値401.0347(M+H+)。
【０１８０】
３−（３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）−４−フルオロ安息香酸メチル（２）；ベンゼン（３ｍｌ）中の３−（３−ブロモプロポキシ）−４−フルオロ安息香酸メチル（５ｂ）（７８０ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ、ベンゼン（７ｍｌ）中のアセチルアセトン（０．５５２ｍｌ、５．３８ｍｍｏｌ、２当量）及びＤＢＵ（０．８０４ｍｌ、５．３８ｍｍｏｌ、２当量）の溶液を滴加した。この反応混合物を、室温で３日間撹拌した。この混合物を濾過し、濃縮した。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製し、アルキル化された中間体を供し、これを次工程で直接使用した。エタノール（５ｍｌ）中のこの中間体の溶液へ、ヒドラジン水和物（０．３６ｍｌ、６．７３ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加し、この反応物を、４時間還流加熱した。この反応物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）により精製し、化合物２（２８８ｍｇ、収率３５％）を供した；（ＨＰＬＣによる純度９６．３％）：ｔＲ（カラム）（Ｃ１８）＝２５．１１分；ｔＲ（Ｃ４）＝１４．０３分。1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.63-7.58 (m, 2H), 7.19-7.15 (m, 1H), 4.00 (t, 2H, J＝6.0 Hz), 3.86 (s, 3H), 2.58 (t, 2H, J＝7.2 Hz), 2.12 (s, 6H), 1.97-1.92 (m, 2H)。13C NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 168.1, 158.4, 156.7, 148.9, 128.5, 124.6, 117.6, 117.0, 115.6, 69.4, 53.3, 31.1, 20.2, 10.9；HRMS(DART) m/z：C16H19FN2O3 + H+の計算値 307.1458；実測値307.1463 (M+H+)。
【０１８１】
４−フルオロ−３−（３−（１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）安息香酸（３）：ＤＭＦ（３ｍｌ）中の２（２１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、水素化ナトリウム（５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、３当量）及びヨウ化メチル（１７μｌ、０．２８ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。この反応混合物を、室温で２時間撹拌した。混合物を、ブラインにより抽出し、濾過し、濃縮した。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、０．５〜２％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）により精製し、アルキル化された中間体を供し、これを次工程において直接使用した。水（０．５ｍｌ）中の水酸化ナトリウム（５．６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、２当量）を、メタノール中のアルキル化された中間体の溶液（２ｍｌ）へ添加し、この反応物を、４時間還流加熱した（５０℃）。この反応物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）により精製し、化合物３（１１ｍｇ、２工程の収率５２％）を供した；（ＨＰＬＣによる純度９７．８％）：ｔＲ（カラム）（Ｃ１８）＝２５．２５分；ｔＲ（Ｃ４）＝１５．７１分。1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.58-7.51 (m, 2H), 7.10-7.06 (m, 1H), 3.92 (t, 2H, J＝6.0 Hz), 3.56 (s, 3H), 2.49 (t, 2H, J＝7.2 Hz), 2.05 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.83-1.88 (m, 2H)。13C NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 168.1, 154.6, 146.8, 145.3, 137.2, 128.1, 122.8, 115.5, 115.4, 114.8, 67.4, 34.3, 29.4, 18.8, 10.1, 7.9；HRMS (DART) m/z：C16H19FN2O3 + H+の計算値307.1458；実測値307.1449 (M+H+)。
【０１８２】
３−（３−（３，５−ジエチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）−４−フルオロ安息香酸（４）：水（０．５ｍｌ）中の水酸化ナトリウム（３．２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、２当量）を、メタノール（２ｍｌ）中の６（１３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ添加し、この反応物を、４時間還流加熱した（５０℃）。この反応物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）により精製し、化合物４（１０ｍｇ、収率８０％）を供した；（ＨＰＬＣによる純度９６．０％）：ｔＲ（カラム）（Ｃ１８）＝２５．１６分；ｔＲ（Ｃ４）＝１５．５６分。1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.57-7.49 (m, 2H), 7.08-7.04 (m, 1H), 3.94 (t, 2H, J＝6.0 Hz), 2.51-2.43 (m, 6H), 1.87-1.82 (m, 2H), 1.06 (t, 6H, J=7.8 Hz)。13C NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 169.8, 157.9, 156.3, 149.3, 148.5, 124.6, 117.2, 117.1, 114.1, 69.4, 31.8, 20.1, 19.9, 14.7；HRMS(DART) m/z：C17H21FN2O3 + H+の計算値321.1614；実測値321.1601(M+H+)。
【０１８３】
３−（３−ブロモプロポキシ）−４−フルオロ安息香酸メチル（５）：化合物５を、先に報告したように合成した。ＤＭＦ（１５ｍｌ）中の４−フルオロ−３ヒドロキシ安息香酸メチル（１．０ｇ、５．８７ｍｍｏｌ、１当量）及び１，３−ジブロモプロパン（３．０ｍｌ、２９．４ｍｍｏｌ、５当量）の溶液へ、Ｋ2ＣＯ3（０．９８ｇ、７．１ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。反応混合物を、室温で１６時間撹拌した。混合物を、ＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）で希釈し、ブラインで洗浄し（３×２００ｍｌ）、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥させた。この溶液を濾過し、濃縮した。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製し、化合物５（１．３ｇ、収率７６％）を供した；1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.67-7.61 (m, 2H), 7.14-7.07 (m, 1H), 4.21 (t, 2H, J＝5.89 Hz), 3.89 (s, 3H), 3.62 (t, 2H, J＝6.38 Hz), 2.38-2.31 (m, 2H)；(ESI+) m/z：C11H12BrFO3 + H+の計算値290.00；実測値290.01(M + H+)。
【０１８４】
３−（３−（３，５−ジエチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）プロポキシ）−４−フルオロ安息香酸メチル（６）：ベンゼン（２ｍｌ）中の５ｂ（１００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、ベンゼン（５ｍｌ）中の３，５−ヘプタンジオン（０．０９５ｍｌ、０．７ｍｍｏｌ、２当量）及びＤＢＵ（０．１０４ｍｌ、０．７ｍｍｏｌ、２当量）の溶液へ滴加した。この反応混合物を、室温で３日間撹拌した。この混合物を濾過し、濃縮した。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製し、アルキル化された中間体を供し、これを次工程において直接使用した。ヒドラジン水和物（０．０４７ｍｌ、０．８７５ｍｍｏｌ、２．５当量）を、エタノール（４ｍｌ）中のアルキル化された中間体へ添加し、この反応物を、４時間還流加熱した。反応物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）により精製し、化合物６（７５ｍｇ、２工程の収率６５％）を供した；1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 7.59-7.54 (m,2H), 7.15-7.11 (m, 1H), 3.98 (t, 2H, J＝6.0 Hz), 3.81 (s, 3H), 2.56-2.47 (m, 6H), 1.91-1.86 (m, 2H), 1.13 (t, 6H, J=7.8 Hz)。C NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 167.9, 156.6, 156.2, 148.8, 148.7, 124.4, 117.5, 117.3, 116.9, 113.9, 69.5, 53.1, 31.8, 20.1, 14.7；HRMS (DART) m/z：C18H23FN2O3 + H+の計算値335.1771：実測値335.1773(M+H+)。
【０１８５】
結果
安定化剤とＴＴＲの間の相互作用の結合親和性及び熱力学の決定。本発明者らは、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を使用し、結合親和性（Ｋｄ）、並びに臨床開発中の全てのＴＴＲ安定化剤（すなわち、ＡＧ１０、タファミジス、ジフルニサル及びトルカポン）並びにＡＧ１０アナログ１、２、３、及び４の分子相互作用の基礎となる機序を決定した。報告されたＴＴＲリガンドのほとんどは、ＴＴＲの２つの同一Ｔ４結合部位に強力な負の協同作用(negative cooperativity)により結合し、その結果、第一のリガンドの結合は、全体の結合エネルギー並びに安定化作用を支配するであろう。ＩＴＣサーモグラムにおいて協同作用の若干の差異を認めることができるが、これらの差異は、結合エネルギー並びに安定化作用に対する影響は小さいであろう。従って、表５に報告されたＫｄ値は、独立した単独部位結合モデルにフィットしたデータを基にした。ＡＧ１０及びタファミジスの緩衝液中のＴＴＲへの結合親和性（各々、Ｋｄ＝４．８±１．９及び４．４±１．３ｎＭ）は、トルカポン（Ｋｄ＝２０．６±３．７ｎＭ）よりも４倍、及びジフルニサル（Ｋｄ＝４０７±３５ｎＭ）よりも〜１００倍高かった。化合物１−４のＫｄ値は、９０〜１２５０ｎＭの範囲であり、これらの結果は、表５にまとめている。安定化剤のＴＴＲへの結合に関するＫｄは、ギブスの結合自由エネルギーの差（ΔＧ）で表され、ここでΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳである。各分子の熱力学的シグネチャを分析することにより、本発明者らは、エンタルピー力（ΔＨ；化学結合の形成又は破壊を表す）及びエントロピー力（ΔＳ；疎水性相互作用により結合した水分子の放出に支配され且つ好ましいシステム及び振動数の障害の量に関連している）の相対寄与を評価することができる。ＡＧ１０及びタファミジスの緩衝液中のＴＴＲへの類似の結合親和性（すなわち、類似のΔＧ値）にもかかわらず、それらのＴＴＲへの結合エネルギー論(energetics)は著しく異なる。ＡＧ１０の結合（ΔＨ＝-１３．６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ及びＴΔＳ＝-２．２６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、エンタルピーにより駆動されるのに対し、タファミジスの結合は、およそ５０％はエントロピー性及び５０％はエンタルピー性である（ΔＨ＝-５．００ｋｃａｌ／ｍｏｌ及びＴΔＳ＝６．３９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）（図１６ａ及び表５）。トルカポン（ΔＨ＝-１０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ及びＴΔＳ＝０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及びジフルニサル（ΔＨ＝-８．３８ｋｃａｌ／ｍｏｌ及びＴΔＳ＝０．３４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の結合は、エントロピー性が好ましいが、主にエンタルピー性相互作用により駆動される。ＴＴＲに関するＡＧ１０の好ましくないエントロピー性結合エネルギー（ＴΔＳ＝−２．２６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、他のＴＴＲ安定化剤と比べ、それのより高い極性及び／又はコンホメーションの柔軟さに起因するであろう。化合物１−４とＴＴＲの間の結合相互作用の熱力学を、以下に考察する。
【表５】
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【０１８６】
エンタルピー力は、緩衝液中のＴＴＲ安定化剤の効能及びヒト血清中の有効性を予測する。ジフルニサル及び他の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＡＳＡＩＤｓ）による最新の研究は、好ましい（すなわちより大きい負の）ΔＨを持つリガンドは、ΔＨの影響がより低いリガンドと比べ、比例してより大きいＴＴＲ選択性を持つことを認めた。この研究は、エンタルピー力とＴＴＲ安定化剤の選択性の間の相関について説明しているが、リガンドの結合エンタルピーと、ＴＴＲの、又は我々の知識ではいずれか他の多量体タンパク質の安定化に関する効能の間の相関は、まだ報告されていない。緩衝液中のＴＴＲの占有及び安定化における安定化剤の効能を評価するために、本発明者らは、蛍光プローブ排除（ＦＰＥ）アッセイを使用した。ＦＰＥアッセイは、それ自身は蛍光でないが、ＴＴＲのＴ４結合部位と結合した時点で、リジン１５（Ｋ１５）を共有的に修飾し、蛍光共役を生じるチオエステルＴＴＲリガンドである、発蛍光型プローブ（ＦＰＥプローブ）を使用する。ＴＴＲのＴ４部位へ結合するリガンドは、より少ない蛍光により認められるように、ＦＰＥプローブ結合を減少するであろう。ＦＰＥアッセイにおける蛍光の程度と、ＴＴＲの安定化の間には、線形相関が報告されている。従って、本発明者らは、最初にＦＰＥアッセイを使用し、緩衝液中のＴＴＲの結合及び安定化に関する安定化剤の効能を測定した（安定化剤のＴＴＲ四量体に対する比１：１で試験した；図１６ｂ、ｃ及び表５）。緩衝液中のＴＴＲに関する安定化剤の効能の順番は、ＡＧ１０＞トルカポン＞タファミジス＞ジフルニサルであった。
【０１８７】
次に本発明者らは、ＦＰＥ及びウェスタンブロットアッセイを使用し、ヒト血清中のＴＴＲの占有及び安定化（ＴＴＲ濃度５μＭ）における安定化剤（１０μＭ）の有効性（効能及び選択性の両方を表す）を評価した（表５）。ウェスタンブロットアッセイは、安定化剤の存在及び非存在下での、酸処理の７２時間後の、インタクトなＴＴＲ四量体の量を測定する。ヒト血清中の安定化剤の有効性の順番は、緩衝液中のＴＴＲの効能について我々が観察したものに類似していた（ＡＧ１０＞トルカポン＞タファミジス＞ジフルニサル；表５）。ジフルニサルの効能及び有効性は、全ての他の安定化剤と比べ、ＴＴＲへのその有意に低い結合親和性（Ｋｄ＝４０７±３５ｎＭ）を基に予測されるように最低であった（他の安定化剤よりも２０〜８０倍低い親和性）。驚くべきことに、３種の他の安定化剤のＫｄ値と、緩衝液及びヒト血清の両方の中のＴＴＲの占有及び安定化におけるそれらの効能及び有効性の間に、相関は存在しなかった。例えばトルカポンのＴＴＲへの結合親和性（Ｋｄ＝２０．６±３．７ｎＭ）は、タファミジスのＴＴＲへの結合親和性（Ｋｄ＝４．４±１．３ｎＭ）よりもわずかに低いという事実にもかかわらず、トルカポンの効能及び有効性は、タファミジスのそれよりも高かった。興味深いことに、緩衝液及び血清中のＴＴＲに関するこれらの安定化剤の効能及び有効性の両方は、それらの結合エンタルピー（ＡＧ１０、トルカポン及びタファミジスについて各々、ΔＨ＝−１３．６、-１０．１、及び−５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と、非常に良く相関していた（Ｒ2＝０．９８）。このデータは、ＡＧ１０及びトルカポンのＴＴＲへのエンタルピー性に駆動された結合（以下で詳細に考察）は、他の安定化剤と比べ、それらのＴＴＲの効率的安定化の主要な駆動者であることを指摘している。
【０１８８】
次に本発明者らは、ウェスタンブロットアッセイを使用し、ＡＧ１０（１０μＭ）の有効性を、それらの報告されたヒトにおける平均最大血漿濃度で、他の安定化剤と比較した（Ｃmaxは、８０ｍｇタファミジスＱＤについて２０μＭ；ジフルニサル２５０ｍｇ  ＢＩＤについて２００μＭ；及び、トルカポン１００ｍｇ投与量ＴＩＤについて２０μＭ）。ＡＧ１０は１０μＭで、ヒト血清中のＴＴＲを完全に安定化し（％ＴＴＲ安定化：９５．４±４．８％）；他の化合物は、それらの報告された臨床Ｃmaxで、四量体ＴＴＲの〜５０−７５％を安定化した（図１７ａ、ｂ）。ＡＧ１０（ｐＫａ＝４．１３）及びタファミジス（ｐＫａ＝３．７３）に関するｐＫａ値は、ジフルニサル（ｐＫａ＝２．９４）に関する値よりも高かった。従って安定化剤のカルボン酸基のイオン化率は、ｐＨ４で変動し得る。これは、カルボン酸基と、Ｔ４結合部位の頂点のリジン１５（Ｋ１５）及びＫ１５’のε−アミノ基の間の静電気的相互作用の強度に影響を及ぼし、このことは安定化剤の効能に影響を及ぼすであろう。この懸念に対処するために、本発明者らは、尿素緩衝液（ｐＨ７．４）を使用し、ウェスタンブロットアッセイを行った。尿素緩衝液中のＴＴＲ安定化データは、酸性ｐＨでのウェスタンブロットから得られたデータ、及び生理的ｐＨでのＦＰＥアッセイから得られたデータに類似していた。ウェスタンブロットＴＴＲ安定化アッセイデータと一致して、ＦＰＥアッセイにおける１０μＭ  ＡＧ１０によるＴ４結合部位占有は、本質的に完全であり（ＴＴＲ占有率９６．６±２．１％）、且つそれらの報告された臨床Ｃmaxでの全ての安定化剤よりも高かった。トルカポン２０μＭに関する標的占有（ＴＴＲ占有率８６±３．２％）は、タファミジス及びジフルニサルのものよりも高かった（それぞれ、２０μＭ及び２００μＭでの、ＴＴＲ占有率〜６５％）（図１７ｃ、ｄ）。
【０１８９】
ＡＧ１０とＴＴＲのＳ１１７／Ｓ１１７’の間の結合相互作用は疾患−保護的Ｔ１１９Ｍ変異内の分子相互作用を模倣する。本発明者らは、ＴＴＲバリアント（Ｔ１１９Ｍ及びＲ１０４Ｈ）を安定化する結晶構造に対し、ＴＴＲと安定化剤の報告された共結晶構造を比較することにより、結合エンタルピーとＴＴＲ安定化の間の相関を調べた。本発明者らは、これは、ＴＴＲの結合及び安定化に重要であるＴＴＲのＴ４結合部位内のアミノ酸の官能基を、我々が同定することは可能であると仮定した。ＡＧ１０、タファミジス、ジフルニサルのカルボン酸部分、及びトルカポン上のヒドロキシル基は全て、Ｔ４結合部位の頂点でのリジン１５（Ｋ１５）及びＫ１５’のε−アミノ基との静電気的相互作用に参加する。ＡＧ１０及びトルカポンのＴＴＲへのエンタルピー性に駆動された結合は、両方の分子がＴ４結合部位内で形成する追加の水素結合により、駆動される。トルカポンのカルボニル基は、ＴＴＲｗｔのＴ１１９のヒドロキシル側鎖と１個の水素結合を形成する（距離〜２．６Å；水素結合の理想的距離は＜３Åである）。トルカポンのカルボニル基と隣接単量体上のＴ１１９’のヒドロキシル側鎖の間のより長い距離（距離〜７．６Å）は、第二の水素結合の形成が起こらないようにする。興味深いことに、この相互作用は、トルカポンとＶ１２２Ｉ−ＴＴＲの間でより弱く（トルカポンのカルボニル基とＶ１２２Ｉ−ＴＴＲのＴ１１９及びＴ１１９’のヒドロキシル側鎖の間の距離は、各々〜５．５Å及び〜９．６Åである）、このことは、トルカポンのＶ１２２Ｉ−ＴＴＲに対する、ＴＴＲｗｔと比べて、より低い結合親和性（Ｋｄ＝５６ｎＭ）及び効能を説明することができる。タファミジスの場合、Ｔ４ポケットの底には、水素結合は存在せず；代わりに、３，５−ジクロロ環の塩素原子もまた、ハロゲン結合ポケット（ＨＢＰ）３及び３’へ配置され、そこでこれらは主に疎水性相互作用によりＴＴＲと相互作用する。ＡＧ１０のカルボン酸部分とＫ１５／Ｋ１５’の静電気的相互作用に加え、ＡＧ１０もまた、Ｔ４結合部位の内部の低誘電性大型分子内の隣接単量体のヒドロキシル側鎖セリン１１７（Ｓ１１７）及びＳ１１７’との２つの水素結合（距離〜２．８Å）を形成する（図１８ａ）。これらの追加の水素結合は、ＡＧ１０のＴＴＲへの主要なエンタルピー性結合に関する駆動力に恐らく寄与するであろう。意外なことに、類似の水素結合が、速度論的に安定化しているトランス−サプレッサーＴ１１９Ｍ−ＴＴＲバリアントの内部空洞内で報告されている（図１８ｂ）。
【０１９０】
Ｔ１１９ＭバリアントＴＴＲ中の単量体Ａ及びＢの２つのＳ１１７側鎖ヒドロキシル基は、距離２．８Åの直接水素結合を形成し、これはＴＴＲｗｔにおいては認められない（これら２つのＳ１１７残基間の距離は〜６．０Å）（図１８ｃ）。これらの独特な水素結合は、ＴＴＲ四量体内のこれら２つの二量体のより近い接触（〜４．８Å）につながり、且つＴＴＲ四量体上のＴ１１９Ｍバリアントの抗−アミロイドーシス作用及び疾患−保護的作用におけるこれらの水素結合の潜在的重要性を強調する。安定化するＴＴＲにおけるＳ１１７の役割もまた、１つのＳ１１７と、単独の水素結合を形成することが可能であるフラボノイドの結合により示唆されている。興味深いことに、四量体ＴＴＲの速度論的安定化に関与しない、熱力学的に安定化されたＲ１０４Ｈバリアント中のＳ１１７とＳ１１７’残基の間の距離は、ＴＴＲｗｔのそれに類似している（平均二量体−二量体距離は、〜５．６Åである、図１８ｃ、ｄ）。Ｒ１０４Ｈバリアント（これはＴ１１９Ｍよりも効力が低いトランス−サプレッサー変異体である）におけるＳ１１７及びＳ１１７’のヒドロキシル基間の水素結合の欠如は、Ｔ１１９ＭバリアントにおけるＴＴＲ四量体の速度論的安定化の作用を抑制する抗−アミロイド形成性疾患におけるこれらの水素結合の重要性を強調している。ＴＴＲ四量体中のＳ１１７及びＳ１１７’と２つの直接水素結合を形成することにより、ＡＧ１０は、保護的Ｔ１１９Ｍバリアントにおいて認められるものに類似した静電気橋を形成する。このデータは、Ｔ１１９Ｍ−ＴＴＲ（距離〜４．８Å）及びＡＧ１０-Ｖ１２２Ｉ−ＴＴＲ（距離〜４．６６Å）の両方の結晶構造の、ＴＴＲｗｔ又はＴＴＲｍ（距離〜５．５Å）と比べ、より近い二量体-二量体接触を強調した、４０種の報告された結晶構造の解析により、裏付けられる（補遺表１）。他の公知のＴＴＲ安定化剤は、ＴＴＲのＳ１１７／Ｓ１１７’と相互作用しないことに注目することは、重要である。
【０１９１】
ＴＴＲ安定化に重要なＡＧ１０の鍵となる官能基の特徴決定。ＴＴＲ結合及び安定化に対するＡＧ１０の各官能基のエンタルピー性寄与を調べるために、本発明者らは、４種のＡＧ１０アナログ（化合物１、２、３、及び４；図１５）を合成し、試験し、且つＴＴＲに結合し安定化するそれらの能力を評価した（図１９）。ＡＧ１０は、ＴＴＲへ、好ましくないエントロピー（ＴΔＳ＝−２．２６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）で結合する。ＡＧ１０のフッ素原子は、ＴＴＲのＨＢＰ１へ配置され、その結果本発明者らは、ＡＧ１０のＴＴＲへのエントロピー性結合は、ＡＧ１０のフッ素原子のヨウ素との置き換え（化合物１ａ）により最適化されるだろうと仮定した。モデリング研究は、１のヨウ素は、ＴＴＲのＨＢＰ１においてフィットし（ここでＴ４のヨウ素が結合する）、このことは、ＨＢＰ１からのより多くの水分子を置き換えることにより、エントロピー性結合を改善することを示唆している（図１９ａ）。化合物１ａは、ＡＧ１０（Ｋｄ＝４．８±１．９ｎＭ）と比べ、緩衝液中のＴＴＲへの、有意に低い結合親和性（Ｋｄ＝９０±１４ｎＭ）を示した。ＩＴＣ分析は、１のＴＴＲとのエントロピー性相互作用は、ＡＧ１０と比べより好ましい（各々、ＴΔＳ＝−０．２１ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び−２．２６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が、この結合へのエンタルピー性寄与には著しい低下が存在する（各々、ΔＨ＝−９．８２ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び−１３．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）ことを示した（図１９ｂ）。モデリングにより示唆されるように、結合エンタルピーの減少は、１のカルボン酸部分とＫ１５／Ｋ１５’の間の塩橋の強度の減少により説明することができる（ＡＧ１０についての距離〜２．８Åと比べ〜４．７Å）。化合物１ａはまた、ＡＧ１０と比べ、緩衝液中（５８．３±０．９８％）及びヒト血清中（７５．９±３．１％）のＴＴＲに関する低下した効能を示した（図１９ｃ−ｅ及び表５）。
【０１９２】
ＡＧ１０のカルボン酸部分は、ＡＧ１０の周囲のＴ４ポケットに近づけ、且つこれを溶媒から部分的に遮蔽するように働く、Ｔ４−結合部位の外縁(periphery)で、Ｋ１５及びＫ１５’のε−アミノ基と２つの塩橋を直接形成する。本発明者らは、ＡＧ１０のメチル−エステルアナログ（化合物２、図１９ａ）を合成し、ＡＧ１０がＴ４−結合部位の外縁に形成する２つの塩橋を修飾する作用を試験した。化合物２は、ＡＧ１０（Ｋｄ＝４．８±１．９ｎＭ）と比べ、緩衝液中のＴＴＲへの有意に低い親和性（Ｋｄ＝２５８±１７ｎＭ）を示し、このことは、ＡＧ１０中の塩橋と比べ、２のエステル基とＫ１５／Ｋ１５’の間の可能性のある水素結合のより低い強度（ΔＨ＝−６．４９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）により説明される（図１９ｂ）。化合物２もまた、緩衝液中及びヒト血清中のＴＴＲについて、ＡＧ１０及び化合物１ａと比べ、低下した効能を示した（図１９ｃ−ｅ及び表５）。
【０１９３】
ＡＧ１０の３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール環は、Ｔ４−結合部位の内部空洞内の深くに位置し、且つ隣接サブユニットのＳ１１７及びＳ１１７’と２つの水素結合を形成している。これらの相互作用をブロックすることにより、本発明者らは、各々、ＩＴＣびＦＰＥアッセイを使用し、それらのエンタルピー性寄与及を効果的に観察することができる。従って本発明者らは、Ｎ−メチルピラゾールを有する化合物３を合成した。Ｎ−メチル基は、３のピラゾール環を束縛し、隣接ＴＴＲサブユニットの１つとただ１個の水素結合を形成するであろう（図１９ａ）。本発明者らはまた、ＡＧ１０のジメチルピラゾールがジエチルピラゾールと置き換えられた化合物４も合成した。モデリング研究は、大部分のジエチル基は、それらの分子がＴ４−結合部位中の深部に達することを妨害し、これによりそれがＳ１１７／Ｓ１１７’と任意の水素結合を潜在的に形成する能力を減少することを示唆した（図１９ａ）。モデリングにより推定されるように、３（Ｋｄ＝２５１±１２ｎＭ）及び４（Ｋｄ＝１２５３±７９ｎＭ）は両方共、緩衝液中のＴＴＲへの大きく減少された結合親和性を示した。この減少された親和性は、特に化合物４に関する、緩衝液及びヒト血清中のＴＴＲに関する効能の有意な減少に言い換えられた。ＴＴＲを安定化する効能の順番は、緩衝液及び血清において類似していた（１＞２＞３＞４；図１９ｃ−ｅ及び表５）。本発明者らが臨床的ＡＴＴＲ安定化剤により認めたように、ＴＴＲの占有及び安定化におけるＡＧ１０並びに化合物１、２、３及び４の効能は、これらの分子の結合エンタルピーと非常に良く相関（Ｒ2＝０．９８）していた（各々、ΔＨ＝−１３．６、−９．８２、−６．４９、−４．７３、及び−２．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。興味深いことに、２及び３の結合親和性は類似しているにかかわらず、それらの効能は、著しく異なっていた（表５）。エラー! 参照元が見つかりません。２の３と比べてより高い効能は、その好ましいエンタルピー性結合により説明することができるであろう（各々、ΔＨ＝−６．４９ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び−４．７３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）（図１９ｂ）。この知見は、ＡＧ１０及びタファミジスについて得られたデータ（すなわち、類似したＫｄ値であるが、著しく異なる効能）に類似している（表５）。これらの結果は、ピラゾール環により果たされる重要な役割、並びに保護的Ｔ１１９Ｍ−ＴＴＲ変異における相互作用を模倣し、且つＴＴＲ四量体の速度論的安定性を増強する、それが２つのＴＴＲ二量体と形成する水素結合の重要性を強調している。
【０１９４】
ＡＧ１０のＴＴＲに対する選択性に対するエンタルピーの作用の試験。ＡＧ１０の他の豊富な血清タンパク質を上回るＴＴＲに関する選択性に対するエンタルピーの役割を試験するために、本発明者らは、ＦＰＥアッセイにおける全ヒト血清中のＡＧ１０及びタファミジスの濃度−作用関係を試験した。本発明者らは、緩衝液中のＴＴＲへのそれらの結合親和性は非常に類似しているので（各々、Ｋｄ＝４．８±１．９ｎＭ及び４．４±１．３ｎＭ）、ＡＧ１０及びタファミジスを試験したが、ＴＴＲ結合に関するそれらの熱力学、特にエンタルピー成分は、著しく異なっている。従って血清中で得られたデータは、選択性を大きく反映するであろう。ＡＧ１０は、漸増濃度−依存型の占有を示し、完全な占有は、ＡＧ１０濃度≧１０μＭで達成された。例え化学量論的濃度を下回ったとしても、ＡＧ１０は、ＴＴＲの大部分を占有し安定化することができる（５μＭで、ＦＰＥによるＴＴＲ占有６９．２％、ウェスタンブロットによる７４．５％の安定化）。対照的に、２０μＭを上回る濃度では、タファミジスの占有又は活性の安定化のいずれかで、より小さい増分が存在した。ＡＧ１０の活性が評価される場合、ＴＴＲ占有（ＦＰＥによる）とＴＴＲ安定化（ウェスタンブロットによる）の間に、良好な相関（Ｒ2＝１．０）が認められた。タファミジスに関して、最大１０μＭの濃度で良好な相関（Ｒ2＝０．８７）が存在したが、より高い濃度では、ＦＰＥアッセイにおいてプラトーが存在した。
【０１９５】
ＴＴＲに関するＡＧ１０及びタファミジスの選択性を、精製した血清タンパク質の存在又は非存在下で、緩衝液中でこれらのアッセイを繰り返すことにより、更に調べた。ＡＧ１０又はタファミジス（３０μＭ）は、精製したヒト血清アルブミン（その生理的濃度６００μＭで）とプレインキュベーションし、その後ゲル濾過、引き続き透析に供した。０時（ゲル濾過直後）で、タファミジスと比べ、より少ないＡＧ１０が、アルブミンに結合した（１８．３±０．９８μＭ、対、２４．１±１．１μＭ；図２０ａ）。緩衝液に対する２４時間の透析後、ＨＳＡに結合したＡＧ１０の濃度は、タファミジスのそれよりも低かった（７．８±０．１μＭ、対、１８．８±２．１μＭ）。これらのデータは、ＡＧ１０は、タファミジスと比べ、アルブミンに関するより低い結合親和性を有することを示している。並行して、ＡＧ１０のＴＴＲへの結合も、このゲル濾過／透析アッセイにおいて調べた。ＡＧ１０（１０μＭ）は、等モル比のＴＴＲ（四量体ＴＴＲの５μＭは、ＴＴＲ  Ｔ４結合部位１０μＭを表す）とプレインキュベーションした。ＡＧ１０のＴＴＲからの解離は、最初の６時間は緩徐であり（ＡＧ１０−ＴＴＲモル比〜１．２：１）、２４時間のインキュベーションにわたり１：１モル比を維持した（図２０ｂ）。
【０１９６】
最後に、ヒト血清中のＴＴＲへの結合に関するＡＧ１０及びタファミジスの選択性を、ヒト血清が、緩衝液（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）中の精製したヒトＴＴＲにより置き換えられた改変ＦＰＥアッセイを使用し、評価した。精製したＴＴＲ（５μＭ）に加え、４種の個別の代表的且つ豊富な血漿タンパク質が、緩衝液中のＦＰＥアッセイに添加された。アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン又は免疫グロブリン（ＩｇＧ）の添加は、ＡＧ１０によるＴＴＲ占有に影響を及ぼさなかった（これらのタンパク質のいずれかの非存在又は存在下で＞９７％ＴＴＲ占有、図２０ｃ、ｄ）。アルブミンは、試験した他の血清タンパク質とは異なり、タファミジスによるＴＴＲ占有と干渉した（４１．５±０．９％、対、アルブミンの非存在下で６８．２±０．１％；図２０ｅ、ｆ）。試験した全ての血漿タンパク質の添加は、同時に、ＡＧ１０に関する同一の結果を生じた。ＴＴＲに関するＡＧ１０のより高い選択性は、数多くの特性に寄与することができ、これはエンタルピー性結合、並びにより親油性であるタファミジス（ＣｌｏｇＰ＝４．２）と比べ、ＡＧ１０のより大きい親水性（ＣｌｏｇＰ＝２．７８）を含む。
【０１９７】
健常ビーグル犬は、ＴＴＲ安定化剤の有効性の評価に関する好適な実験モデルである。本発明者らは次に、ＴＴＲに関するＡＧ１０の高い効能及び選択性が、インビボにおいて維持され得るかどうかを調べた。ヒトＡＴＴＲ−ＣＭの病理を忠実に再現するトランスジェニック動物モデルは、未だ入手できない。従って本発明者らは、ＡＧ１０、対、他のＴＴＲ速度論的安定化剤の有効性を試験するために臨床において現在使用される類似したアプローチを採用した。ＴＴＲの占有及び安定化におけるＴＴＲ安定化剤の活性は、安定化剤の投薬前後に患者から得られた血液試料中でエクスビボにおいて通常評価される。ＡＧ１０のインビボ活性を調べるために、これと同じアプローチを、健常ビーグル犬において使用した。健常ビーグル犬は、いくつかの理由で実験モデルとして選択した。ＡＧ１０及び他の安定化剤が結合するＴＴＲのＴ４結合部位の全てのアミノ酸は、イヌとヒトの間で保存されている。本発明者らはまた、イヌ血清中のＴＴＲの濃度を試験し（〜４．６μＭ）、且つこれが健常ヒトのそれと類似していることを認めた。イヌ試験に関してヒト−ベースの試薬が使用されるアッセイの適性を確認するために、ＡＧ１０及びタファミジスの活性を、先に説明した実験において使用したものと同じＦＰＥ及びウェスタンブロットアッセイを使用し、プールしたイヌ血清において評価した。イヌ血清を用いて繰り返した両方のアッセイにおけるＡＧ１０及びタファミジスのインビトロＴＴＲ結合及び安定化の濃度−作用関係は、ヒト血清において認められたものに類似していた（図２１）。これらの特徴は、健常イヌを、その後の研究に適したシステムとした。
【０１９８】
ＡＧ１０は経口投与後イヌＴＴＲへ強力且つ選択的に結合する。インビボにおける薬物動態−薬力学（ＰＫ−ＰＤ）関係を調べるために、ＡＧ１０を、健常ビーグル犬へ、経口強制的に７日間、毎日投与した。合計１６匹雄（Ｍ）及び１６匹雌（Ｆ）のビーグル犬を、４つの処置群とした：（ｉ）０ｍｇ／ｋｇ／日の６Ｍ／６Ｆ（ビヒクル対照）；（ｉｉ）５０ｍｇ／ｋｇ／日の２Ｍ／２Ｆ；（ｉｉｉ）１００ｍｇ／ｋｇ／日の２Ｍ／２Ｆ；並びに、（ｉｖ）２００ｍｇ／ｋｇ／日の６Ｍ／６Ｆ。試験１日目の投薬前（ベースライン）、試験７日目の投薬前（定常状態でのトラフ濃度、又はＣminを表す）、及び試験７日目の投薬後１時間（定常状態でのピーク濃度、又はＣmaxを表す）の時点での血清試料を、収集した。ＡＧ１０によるＴＴＲの結合占有を、ＦＰＥアッセイにより評価した（図２２ａ、ｂ）。ビヒクル単独で処置したイヌからの全ての試料、及びＡＧ１０への曝露前の実薬処置アームから収集したものは、ゼロＴＴＲ占有を示した。ＡＧ１０−処置したイヌ由来の血清は、定常状態トラフでの結合占有において、投与量−比例した反応を示し（７日目投薬前；〜８１−９４％ＴＴＲ占有）、且つ全てのＡＧ１０処置群は、定常状態Ｃmax（７日目投薬後）で、完全な（＞９７％）ＴＴＲ占有を示した。ＴＴＲに依然効果的に結合し且つ安定化するＡＧ１０の最小有効投与量を確定するために、ＡＧ１０のより低い投与量を、ＰＫ−ＰＤ（曝露−作用）関係を更に調べるために、引き続き試験した。８匹のイヌを、５又は２０ｍｇ／ｋｇのいずれかのＡＧ１０・ＨＣｌを単回経口投与量として受け取る、２つの実薬処置群に分けた。これらの結果は、２０ｍｇ／ｋｇ、対、５ｍｇ／ｋｇの投与量群において、増強されたＴＴＲ占有を示した（図２２ｃ、ｄ）。ＣmaxでのＴＴＲ占有％は、両方の投与量についてＣminよりも、有意に高かった（ｐ≦０．００１）。Ｃminでの５ｍｇ／ｋｇ投与量と比べ、２０ｍｇ／ｋｇ投与量に関して、有意に高い（ｐ≦０．００１）ＴＴＲ占有が存在した。このデータはまた、ＡＧ１０の循環血漿濃度は、ＴＴＲ占有率と良く相関することを示した。
【０１９９】
まとめると、ビーグル犬は、ＡＧ１０は、特定の用量レベルで、経口的に利用可能であり、且つ四量体ＴＴＲに強力で選択的に結合し且つ安定化する投与量−依存型血漿濃度を達成することを明らかにした。
【０２００】
実施例５：静脈内投与又は経口強制によるサルに投与されたＡＧ１０・ＨＣｌの単回投与試験
ＡＧ１０・ＨＣｌを、３匹の雄カニクイザルへ、静脈内１ｍｇ／ｋｇ又は１回の経口で５ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで、投与した。これら２つの相の間には、２週間のウォッシュアウト期間を置いた。血液試料を、投薬前並びに投薬後のほぼ０．０８３（ＩＶのみ）、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２及び９６時間に収集した。血漿試料を、ＡＧ１０及びＡＧ１０アシルグルクロニドについてアッセイし、且つ血清を、ＦＰＥアッセイにおいて試験した。図２３に示したように、ＦＰＥアッセイからの結果は、経口投与されたＡＧ１０は、サル血清において、ＴＴＲへ効果的に結合したことを明らかにしている。
【０２０１】
ＦＰＥアッセイはまた、経口投与されたＡＧ１０は、投与量依存型の様式でＴＴＲを安定化したことを明らかにした（図２４）。
【０２０２】
実施例６：ＴＴＲ血中血清濃度はＡＧ１０投薬された健常個体において増加する
血中血清ＴＴＲ濃度を測定するために、Aviva Systems BiologyからのプレアルブミンＥＬＩＳＡキット（ヒト）、カタログ番号OKIA00081-96W、ロット番号KC0699を、使用した。
【０２０３】
本試験は、ＥＬＩＳＡキット製造業者により提供されたプロトコールに従い実行した。本方法は、製造業者が推奨した較正曲線に３つの標準濃度を追加することにより改変した。供給されたＴＴＲ較正物質を、蒸留水１ｍＬ中に溶解し、濃度８．８５μｇ／ｍＬを生じた。第一の追加標準は、１０００ｎｇ／ｍＬであり、これは較正物質１７８．４μＬを１×希釈剤１４００μＬへ添加することにより調製した。第二の追加標準は、２００ｎｇ／ｍＬであり、これは較正物質３２．４μＬを１×希釈剤１４００μＬへ添加することにより調製した。第三の追加標準は、０．７８１２５ｎｇ／ｍＬであり、これは１．５６２５ｎｇ／ｍＬ標準の６００μＬを、１×希釈剤の６００μＬへ添加することにより調製した。このＥＬＩＳＡキットは、捕獲及び検出のために、ヤギポリクローナル抗−ＴＴＲ抗体を利用した。この抗体は、未変性のヒトＴＴＲタンパク質に対して生じた。プールされたヒト血清は、Innovative Research社から購入した(カタログ番号IPLA-SER、ロット番号24453)。
【０２０４】
プールしたヒト血清及びＭＡＤ血清試料を、水浴中で、３７℃で１０分間解凍した。全ての試料は、二段階で１：１００００に希釈した。最初に、血清５μＬを、ＥＬＩＳＡキットに提供された１×希釈剤９９５μＬと混合した。第二に、この混合物５μＬを、非−結合マイクロプレート中の１×希釈剤２４５μＬへ添加した。各々の最終的に希釈した試料１００μＬを、このＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。全ての標準及び試料を、２つ組で試験した。ＴＴＲ試験は、この時点から先は、更なる改変をせずに、製造業者のプロトコールに従った。簡単に述べると、標準及び血清試料を、ＥＬＩＳＡプレート中で、室温で１時間インキュベーションした。ＥＬＩＳＡプレートを、１×洗浄緩衝液で４回洗浄し、次に１×ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと一緒に、室温で３０分間、遮光して、インキュベーションした。次にＥＬＩＳＡプレートを、４回洗浄した。ＴＭＢ基質を添加し、１０分間呈色させ、その後停止溶液を添加した。最後に、４５０ｎｍでの吸光度を、各ウェルについて測定した。
【０２０５】
吸光度測定値は、２つ組の０ｎｇ／ｍＬウェルの４５０ｎｍでの平均吸光度を得、これを各ウェルの総４５０ｎｍ吸光度から減算することにより参照補正した。
【０２０６】
標準曲線は、GraphPad PRISMソフトウェアを用い、各ＥＬＩＳＡプレートについて作製した。標準のｌｏｇ（ｎｇ／ｍＬ）を、Ｘ軸上にプロットし、且つ参照補正した４５０ｎｍ吸光度値を、Ｙ軸上にプロットした。このデータは、Ｓ字型４パラメータ曲線を用いて、フィットさせた。プールしたヒト血清及びＭＡＤ血清試料のｌｏｇ（ｎｇ／ｍＬ）を、標準曲線から内挿した。ｌｏｇ（ｎｇ／ｍＬ）値を、血清ＴＴＲ濃度（ｍｇ／Ｌ）へ変換し、試料希釈について補正した。供給された較正物質(calibrant)を用いて作製した標準曲線は、再現可能であり（図２５）、このキットは、１：５０００から１：２００００までの増加する希釈比で、プールしたヒト血清試料をうまく識別した。従って、Aviva ＥＬＩＳＡキットを、試験に使用した。
【０２０７】
ＭＡＤ試験の３つのコホート（１００、３００、８００ｍｇのＡＧ１０・ＨＣｌが１日２回、１２日間連続して投薬された）に加え、プラセボコホートからのヒト健常志願者の試料を、Aviva ＥＬＩＳＡキットを用いて試験した。各コホートに関する経時的ＴＴＲ濃度の相対変化を、ベースライン値に対して規準化することにより計算した（図２６）。図２７は、全てのプラセボ及びＡＧ１０処置コホートにおける、ベースラインから１２日目までの血中血清ＴＴＲ濃度の平均変化率を示している。図２８及び図２９は、全てのプラセボ及びＡＧ１０処置コホートにおける、ベースライン及び１２日目の血中血清ＴＴＲ濃度をプロットしている（投薬された健常志願者の総数＝２４；プラセボ：実薬＝１：３；ＭＡＤ１コホート＝１００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間；ＭＡＤ２コホート＝３００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間；ＭＡＤ３コホート＝８００ｍｇ  Ｑ１２ｈを１２日間）。
【０２０８】
ＡＲＵＰプレアルブミンアッセイ（免疫比濁アッセイ）
ＡＲＵＰプレアルブミンアッセイもまた、試験したＭＡＤコホートにおけるＴＴＲ血中血清濃度を分析するために使用した。ＡＲＵＰは、Roche Diagnosticsから提供されるプレアルブミン試薬キットを使用し、且つRoche Diagnostics c702モジュール上で試行し、プレアルブミンについて、試料を分析する。最低測定限界は、３ｍｇ／ｄＬである。
【０２０９】
表６は、各コホートについて測定した、ベースライン及び投薬後（２４時間後）の血中血清ＴＴＲ濃度をまとめている。各試験群において、２４時間の測定期間にわたり、ＴＴＲ濃度の測定可能な増加が存在する。
【表６】
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【０２１０】
実施例７：第２相臨床試験結果−ＡＴＴＲ−ＣＭの個人
第２相臨床試験は、本質的に実施例３において説明したように行った。合計４９名の患者(patents)が、４５名の代わりに含まれ：１６名は、４００ｍｇ  ＢＩＤを受け取り；１６名は、８００ｍｇ  ＢＩＤを受け取り；及び、１７名は、プラセボを受け取った。
【０２１１】
本試験に参加した個人のベースライン特徴を、下記表７に示している。
【表７】
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【０２１２】
結果
ＴＴＲ安定化は、実施例セクションの最初に説明したＦＰＥアッセイ及びウェスタンブロットアッセイを用い、エクスビボにおいて測定した。ＴＴＲ安定化は、治験参加者において、ＴＴＲ血清濃度をモニタリングすることにより、インビボにおいて測定した。
【０２１３】
図３０は、各処置群における対象に関する血清ＴＴＲレベルの投与量−反応変化を図示している。データは、ベースラインから２８日目までの変化の百分率として報告している。４００ｍｇのＡＧ１０・ＨＣｌを１日２回受け取る個人は、血清ＴＴＲレベルの３６％の平均増加を有し、且つ８００ｍｇのＡＧ１０・ＨＣｌを１日２回受け取る個人は、血清ＴＴＲレベルの５０％の平均増加を有した。比較的、プラセボ処置群は、血清ＴＴＲレベル７％の平均減少を有した。
【０２１４】
ＡＧ１０・ＨＣｌ投薬群（４００ｍｇ及び８００ｍｇ  ＢＩＤの両方）における血清ＴＴＲレベルの増加は、先に試験したＴＴＲ安定化剤について先に報告された知見を辿る。図３１は、本試験における各処置群に関する、ベースラインから投薬２８日目までの、平均変化率をプロットしている。タファミジス第２相(FDA CDER Advisory Committee Meetingバックグラウンドパッケージ)及びジフルニサル経過観察試験(Hanson, J.L.S.ら、Circ Hert Fail 2018 11:e004000)について報告された血清ＴＴＲレベルにおける変化率も、プロットしている。この図において認めることができるように、ＡＧ１０、タファミジス、及びジフルニサルは全て、血清ＴＴＲレベルを増加した。
【０２１５】
処置前に、４００ｍｇ  ＢＩＤ処置群の対象の４０％、及び８００ｍｇ  ＢＩＤ処置群の対象の５６％は、正常ＴＴＲレベル（ＴＴＲの正常レベルは２０〜４０ｍｇ／ｄＬ（３．６〜７．３μＭ）である）を下回る血清ＴＴＲレベルを有した。処置の２８日後、各実薬コホートの１００％は、正常範囲内の血清ＴＴＲ濃度を有した（すなわち、全ての処置した患者は、２８日間の処置レジメンの終了までに、正常な血清ＴＴＲレベルを有した）。比較的、プラセボ個人の１８％は、処置前に正常ＴＴＲレベルを下回る血清ＴＴＲレベルを有した。２８日間の処置後、血清ＴＴＲ濃度の正常レベルを有さないその数は、プラセボ個人の３１％まで増加した。図３２参照。本試験の個人に関する血清ＴＴＲ濃度のベースライン分布を、図３３に示している。
【０２１６】
エクスビボにおけるウェスタンブロット分析は、ＡＧ１０・ＨＣｌの４００ｍｇ  ＢＩＤ及び８００ｍｇ  ＢＩＤの各投薬レベルは、ＴＴＲを効果的に安定化したことを確認している。図３４を参照し、これは投薬前時点（Ｄ１ｈ０）での低レベルの安定化と比べた、１４日目及び２８日目のトラフ（ｈ０）及びピーク（ｈ１）時点での高レベルのＴＴＲ安定化を図示している。提供されたエラーバーは、平均の標準誤差である。
【０２１７】
このウェスタンブロットの結果を、蛍光プローブアッセイにより更に確認し、これは野生型及び変異体ＴＴＲの両方を伴う個人における、２８日目トラフ（投薬前）及び２８日目ピーク（投薬後１時間）での高レベルのＴＴＲ安定化を示している。図３５参照。
【０２１８】
ＡＧ１０循環血中血漿濃度と四量体ＴＴＲのサイロキシン結合ポケット内のＡＧ１０による占有の関係をプロットする場合、著しい標的会合（ＡＧ１０による占有）は、血中血漿濃度５μＭ辺りで生じ、且つ完全な標的会合は、約７．５μＭで生じることを決定した。図３６参照。
【０２１９】
図３７及び図３８は、蛍光プローブアッセイにおいて、４００ｍｇ  ＢＩＤコホート（図３７）及び８００ｍｇ  ＢＩＤコホート（図３８）について、１日目投薬前、１４日目投薬前（トラフ）、１４日目投薬後１時間（ピーク）、２８日目投薬前（トラフ）、及び２８日目投薬後１時間（ピーク）に測定した相対蛍光単位をプロットしている。両方の図において認めることができるように、蛍光プローブアッセイは、トラフ及びピークの両時点で、４００ｍｇ  ＢＩＤ及び８００ｍｇ  ＢＩＤの両コホートにおいて、１４日目までに、ほぼ完全な標的会合が存在することを指摘している。比較的、図３９は、プラセボ対照群において先に言及した各時点で測定した相対蛍光単位をプロットしている。このプロットは、プラセボ対照群に関する標的会合の欠如を明らかにしている。
【０２２０】
まとめると、ここで提示されたデータは、ＡＧ１０は、症状性ＡＴＴＲ−ＣＭ患者において２８日間にわたり忍容性が良好であること、ＡＧ１０は投与量-依存的様式で血清ＴＴＲ濃度を増加すること、ＡＧ１０は低ＴＴＲレベルを正常レベルまで回復すること、並びにＡＧ１０は試験した両方の投薬レベルにわたりＴＴＲを完全に安定化することを指摘していた。
【０２２１】
試験したコホートにおける野生型及び特定の変異体ＴＴＲ集団を調べる場合、各実薬投薬群−ＴＴＲ遺伝子型にかかわらず−は、開始レベルと比べ、投薬終了時に、血中血清ＴＴＲ濃度の増加を示した。ＴＴＲ血液血清データを、実施例６において説明したＡＲＵＰプレアルブミンアッセイを用いて分析し、下記表８に示している。
【表８】
2021518381.tif 000022
【０２２２】
Ｖ３０Ｍ  ＴＴＲ変異（家族性ＡＴＴＲポリニューロパチー（ＡＴＴＲｍ−ＰＮ）に関連して高度に見られる変異）を持つ個人のデータを詳細に見ると、処置の１４日目にほぼ完全な標的会合が、及び２８日目にほぼ完全なＴＴＲ安定化が、各々、ＦＰＥアッセイ及びウェスタンブロットアッセイを使用し、この患者集団について認められた。図４０及び図４１参照。
【０２２３】
実施例８：通常使用される利尿薬はＡＧ１０曝露と干渉しない
心不全の臨床上の痕跡を伴うＡＴＴＲ−ＣＭ患者は、体液過剰又は上昇した心内圧の徴候及び症状が現れることが多い。これは、利尿薬による治療を必要とする(Ruberg及びBerk、Circulation 2012 126:1286-300)。フロセミド又はトラセミドなどの利尿薬は、ＡＴＴＲ−ＣＭ患者におけるＡＧ１０−２０１第２相試験において使用される最も一般的な薬物療法である。表９参照。
【表９】
2021518381.tif 000023
【０２２４】
母集団ＰＫ分析に関して、フォーマル３−段階共変量選択法(formal 3-step covariate selection process)を利用し、それらのＡＧ１０薬物動態に対する影響を調べた。複数の共変量が、変数増加(forwaed addition)時に有意として確定されるが、分布のセントラル容積上の唯一の疾患状態は、変数減少(backward elimination)時には有意レベルα＝０．０１で有意ではないことがわかった。従って、最終モデルは、分布のセントラル容積上に疾患状態を維持した。
【０２２５】
母集団ＰＫ分析を、フロセミドのような利尿薬の共投与が、ＡＧ１０の薬物動態に何らかの影響を及ぼすかどうかを決定するために使用した。ＡＧ１０が投薬された第２相の３２名の対象のうち、２５名は、フロセミド又はトラセミドにより治療された。プラセボ対象の１７名のうち、１４名は、フロセミド又はトラセミドを受け取った。
【０２２６】
ＡＧ１０のクリアランスにおける差異は、患者の状態又は利尿薬（フロセミド／トラセミド）を基に、第１相の健常成人志願者と第２相の対象の間で認められなかった（図４２Ａ、Ｂ）。
【０２２７】
先に言及したように、分布のセントラル容積は、ＡＴＴＲ−ＣＭの疾患状態により影響された。下側の容積（図４２Ｃ，Ｄ）では、以下が観察された：
ａ）第２相のＡＴＴＲ−ＣＭ患者、対、第１相の健常成人志願者
ｂ）フロセミド又はトラセミドを受け取るＡＴＴＲ−ＣＭ患者、対、フロセミド又はトラセミドを受け取らない患者。
【０２２８】
従って、分布容積は、フロセミド／トラセミドの対象において、健常成人志願者と比べて、より低かった。薬物−疾患相互作用（すなわち、分布容積に対する慢性心不全の作用）と薬物−薬物相互作用（分布容積に対する利尿薬の作用）の間に、差異はなかった。分布容積の変動は、主に薬物のピーク血漿濃度に影響を及ぼす。第１相（ＡＧ１０−００１）健常成人志願者試験（ＭＡＤ３、８００ｍｇ  Ｑ１２ｈ）及びＡＴＴＲ−ＣＭ患者の第２相（ＡＧ１０−２０１）の両方は、ＡＧ１０の循環トラフ濃度〜８μＭは、ＴＴＲの安定化を基にした適切な目標であることを明らかにした。図４３に示したように、ＡＧ１０の８００ｍｇ  ＢＩＤの投薬は、フロセミド又はトラセミドにより治療される患者及び併用利尿薬を服用していない対象の両方において、好適な濃度に到達する。
【０２２９】
健常志願者の反復投薬における血漿ＡＧ１０のＣmaxでの平均蓄積比は、１．３〜１．６の範囲であった。この蓄積比を使用し、定常状態でのＡＧ１０  ４００ｍｇ錠の投薬の薬物動態プロファイルを予測した。図４４は、単回４００ｍｇのＡＧ１０錠の投与後１２時間のＡＧ１０の血漿レベルを、蓄積比１．４５を仮定し（４００ｍｇ錠の反復投薬後）、推定されたＡＧ１０のトラフ定常状態循環濃度、及び第２相におけるＡＧ１０  ４００ｍｇ  ＢＩＤで投薬されたＡＴＴＲ−ＣＭ患者のＡＧ１０の実際の循環濃度と比較した。毎日８００ｍｇ  ＢＩＤ投与量（４×２００ｍｇ  ＡＧ１０錠を１日２回）で得られた結果同様、より高い投与量の強い錠剤（４００ｍｇ）による推定されたトラフレベルもまた、第２相のより低い４００ｍｇ  ＢＩＤの毎日投与群（２×２００ｍｇのＡＧ１０錠の１日２回）のトラフプロファイルとマッチした。
【０２３０】
従って、通常使用される利尿薬は、ＡＧ１０の曝露と干渉しない。
【０２３１】
実施例９：第３相臨床試験−ＡＴＴＲ−ＣＭ
このプロスペクティブ無作為化多施設並行群間試験は、安定した心不全療法の背景で投与される、症候性対象における、プラセボと比較した、ＡＧ１０の有効性及び安全性を評価する。スクリーニング及び無作為化後に、合計３０ヶ月間の盲検化されたプラセボ対照治療された。１２ヶ月間の治療（パートＡ）の終了時に、ＡＧ１０の有効性を、機能的エンドポイント（６ＭＷＴ）及び健康状態に関連したＱｏＬエンドポイント（ＨＦに特異的な測定ＫＣＣＱにより測定）の解析により評価した。３０ヶ月間の治療（パートＢ）の終了時に、ＡＧ１０の有効性を、全死亡率及びＣＶ−関連の入院の分析により、更に評価した。
【０２３２】
ＡＴＴＲ−ＣＭの治療に関して適応とされた承認された療法は現時点では存在しない。ＡＴＴＲ−ＣＭの治療に関して、認可されていない(off-label)又は非処方サプリを使用した他の治験的治療又は療法は、許されていない。しかし、他の療法が、本治験の実行時に１又は複数の地域(geography)において、ＡＴＴＲ−ＣＭの治療に関する特定の適応により規制承認が与えられる事象において、被験対象に関するいくつかの可能性のある経路が存在する：
・対象は、何らかの承認され適応とされた製品の利用可能性とは関わりなく、盲検化された試験療法の少なくとも１２ヶ月間にわたり、本治験に留まることが奨励される。対象が、任意の時点で本治験を退出することを選択する場合、彼等は、早めに最終来院及び関連する手順を完了することが奨励される。
・既に盲検化された試験療法を少なくとも２４ヶ月間完了し、その後承認され適応とされた製品へのアクセスを獲得した任意の被験対象は、本治験に留まり、且つその製品による療法の開始後であっても、盲検化された試験治療を継続することが奨励される。承認され適応とされた製品による療法を開始し且つ本治験に留まる対象は、併用療法の開始前に、試験評価のため予定外の来院をしなければならない。
【０２３３】
３０ヶ月間の盲検化された試験療法及び二重盲検化された治療期間の最終評価を完了した全ての対象は、長期ＡＧ１０治療のオープンラベル後続試験への参加に適格とされる。
【０２３４】
適格な対象は、ＡＧ１０  ８００ｍｇ又はマッチするプラセボのＢＩＤ経口投与へ、２：１の比で無作為化される。対象は、野生型ＡＴＴＲ−ＣＭ（ＡＴＴＲｗｔ−ＣＭ）又は変異体ＡＴＴＲ−ＣＭ（ＡＴＴＲｍ−ＣＭ）を有するかどうかを基に無作為化の時点で層別化され、ＡＴＴＲｍ−ＣＭを伴う対象は最低２０％であることを目標とする。遺伝子型判定により、ＴＴＲ状態（野生型又はバリアント）を確認するために、あらゆる努力を払う。例外的状況（対象が遺伝子試験を受けることを拒否する場合）においては、文書による遺伝子型判定を伴わない対象を登録するために、メディカルモニター又は指定者に承認を求めることができる。承認され且つ対象が本試験に登録される場合、ＴＴＲ状態が不明であるそのような対象は、「野生型ＴＴＲ」層に層別化する。対象はまた、スクリーニング時の、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベル（≦３０００、対、＞３０００ｐｇ／ｍＬ）及びｅＧＦＲにより規定された腎機能（≧４５、対、＜４５ｍＬ／分／１．７３ｍ2）に従っても層別化される。
【０２３５】
血漿ＰＫ及び血清／血漿ＰＤのための試料は、ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験において収集する。
【０２３６】
ＡＥ及び併用薬物に関する情報は、本試験を通じて収集される。安全性及び本試験の実施は、独立したデータモニタリング委員会（ＤＭＣ）によりモニタリングされる。
【０２３７】
治験デザインの概要は、図４５に示す。
【０２３８】
本試験のパートＡは、１２ヶ月間の治療後の６分間歩行試験（６ＭＷＴ）におけるベースラインからの変化において、ＡＧ１０群とプラセボ群の間の差異を評価することにより、症候性トランスサイレチンアミロイド心筋症（ＡＴＴＲ−ＣＭ）の対象の治療におけるＡＧ１０の有効性を決定する。
【０２３９】
本試験のパートＢは、３０ヶ月間にわたる全死亡率と心臓血管（ＣＶ）に関連した入院の累積頻度を組合せたエンドポイントにおけるＡＧ１０群とプラセボ群の間の差異を評価することにより、症候性ＡＴＴＲ−ＣＭの対象の治療におけるＡＧ１０の有効性を決定する。
【０２４０】
対象母集団及び統計
慢性で安定した症候性（ＮＹＨＡクラスＩ−ＩＩＩ）ＡＴＴＲ−ＣＭを伴う年齢１８歳以上及び９０歳以下のおよそ５１０名の男性及び女性が、本試験において２：１の比で無作為化される（３４０名の対象は実薬治療へ、１７０名はマッチするプラセボへ）。対象は、無作為化時点で、ＡＴＴＲｍ−ＣＭ又はＡＴＴＲｗｔ−ＣＭのいずれであるかに従い、層別化され、ＡＴＴＲｍ−ＣＭを伴う対象は最低２０％であることを目標とする。遺伝子型判定により、ＴＴＲ状態（野生型又はバリアント）を確認するために、あらゆる努力を払う。例外的状況（対象が遺伝子試験を受けることを拒否する場合）においては、文書による遺伝子型判定を伴わない対象を登録するために、メディカルモニター又は指定者に承認を求めることができる。承認され且つ対象が本試験に登録される場合、ＴＴＲ状態が不明であるそのような対象は、「野生型ＴＴＲ」層に層別化する。対象はまた、スクリーニング時の、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベル（≦３０００、対、＞３０００ｐｇ／ｍＬ）及びｅＧＦＲにより規定された腎機能（≧４５、対、＜４５ｍＬ／分／１．７３ｍ2）に従っても層別化される。
【０２４１】
治療期間
対象は、忍容性が良好でない場合を除き、治験薬（ＡＧ１０又はプラセボ）により、３０ヶ月間治療される。３０ヶ月間の治療を完了する適格対象は、治験担当医師の指示で、ＡＧ１０を受け取るためにＯＬＥを継続する。
【０２４２】
パートＡ、パートＢ及びＯＬＥは、個別に報告する。本治験は、治療後最終来院を完了した全ての対象のデータが最終データベースに含まれ、且つ本治験の最終報告書が感性された後に、完了する。
【０２４３】
投与される治療
適格性判定に合致する対象は、二重盲検様式で以下の治療アームを受け取るように、２：１の様式（ＡＧ１０：プラセボ）で無作為化される：
・８００ｍｇ  ＡＧ１０  ＢＩＤ、経口（２個の４００ｍｇ  ＡＧ１０錠、ＢＩＤ）
・マッチするプラセボＢＩＤ、経口（２個のマッチするプラセボ錠、ＢＩＤ）。
【０２４４】
試験薬物療法の忍容性が良好でないことを指摘する対象のＡＥ報告を基に、治験担当医師が投与量調節が正当化されることを決定するような事象において、盲検化された投与量は、ＢＩＤで投与される４００ｍｇ  ＡＧ１０又はマッチするプラセボへ減少されてよい。これは、試験スタッフが、試験薬物療法の２錠の代わりに、錠剤１錠をＢＩＤで服用するよう対象を指導することにより達成される。あらゆる投与量調節は、データデースに文書化する。
禁忌薬物療法
１．パチシラン、イノテルセン、タファミジス［下記「注記」参照］又はＡＴＴＲ−ＣＭ治療に関する他の治験薬の使用は、本試験期間中は禁止される。
２．ジフルニサル、ドキシサイクリン；ＡＴＴＲ−ＣＭの未証明の療法として使用される天然製品又は誘導体（例えば、緑茶抽出物、タウロウルソデオキシコール酸[TUDCA]／ウルソジオール）の使用は、禁止される。
３．カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ベラパミル、ジルチアゼム）又はジギタリスの使用は、禁止される。
【０２４５】
注記：本試験参加時に、タファミジスが市販可能となり且つ対象がこれにアクセスする場合は、対象は、少なくとも24ヶ月間の盲検化された試験療法が完了したならば、併用薬物療法としてタファミジスによる療法を開始することが許可される。
【０２４６】
試験手順
評価スケジュール
本試験を通じて実行される手順の説明を、以下に提供する。
スクリーニング（−３５日目から−１日目）
【０２４７】
スクリーニングは、ＩＭＰの初回投与量の投与前３５日以内に行われる。以下の手順を、スクリーニング時に行う：
・インフォームドコンセントの記入
・対象が適格であることを確認するための、組み入れ／除外基準の検証
・診断確定委員会（ＤＣＣ）が必要とする原資料の提出は、スクリーニング期間にできるだけ早く完了し、且つ以下のいずれかを含まなければならない：
１．  心内膜心筋生検の報告書；
又は
２．  陽性99mＴｃ−ピロリン酸エステル又は−ビスホスホネート走査の平面画像、
並びに、（血清及び／又は尿の免疫固定電気泳動（ＩＦＥ）、並びに血清遊離軽鎖（ｓＦＬＣ）分析の両方を基にした）ＡＬアミロイドーシスの診断を除外する、臨床検査の証拠。
【０２４８】
注記：意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）を併発している対象は、質量分析による心内膜心筋生検による、ＡＴＴＲ−ＣＭの確定診断を必要とする。
・内科的及び外科的病歴の評価
・ＮＹＨＡクラス評価
・体重及び身長測定を含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・ＬＶ壁（心室中隔又はＬＶ後壁）厚さが、心エコー又はＣＭＲを基にした病歴に記録されていない場合、安静時経胸壁心エコー（ＥＣＨＯ）
・６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、＞２４時間から≦２週間間をあけた２回の評価
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・血清及び血漿の探索的試験のための血液試料収集
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・薬歴評価。
【０２４９】
治療日
試験手順は、以下に試験日別に列挙し、理想的には各日について、以下に列挙した順番で行う。
【０２５０】
１日目及び３ヶ月毎（±７日）
これらの評価は、１日目、及び３、６、９、１５、１８、２１、２４、及び２７ヶ月目に行う：
・対象が適格であることを確認するための、組み入れ／除外基準の検証（１日目）
・対象の治療アームへの無作為化及び無作為化番号の割付け（１日目）
・ＮＹＨＡクラス評価
・体重測定を含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・カンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）
・ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）
・６、９、１８、２４ヶ月目の６分間歩行試験（６ＭＷＴ）
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＴＴＲ安定化の分析のためのＰＤ血液試料収集（投薬前）
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＰＫ血液試料収集（投薬前）
・プレアルブミン血液試料収集（投薬前）
・指定された立会人（すなわち、施設の担当者）によるＩＭＰの配布／収集及び投与
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命状態評価／入院の決定
・ＩＭＰ服薬順守評価（１日目を除く全ての来院時）。
２８日目（±３日）
・ＮＹＨＡクラス評価
・体重測定を含む理学的検査
・生命徴候評価
・投薬前及び投薬後１時間での安静時１２−誘導ＥＣＧ
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＴＴＲ安定化の分析のためのＰＤ血液試料収集（投薬前及び投薬後１時間）
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＰＫ血液試料収集（投薬前及び投薬後１時間）
・プレアルブミン血液試料収集（投薬前）
・指定された立会人（すなわち、施設の担当者）によるＩＭＰの配布／収集及び投与
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命状態評価／入院の決定
・ＩＭＰ服薬順守評価。
１２ヶ月目（±７日）
・ＮＹＨＡクラス評価
・体重測定を含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・カンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）
・ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）
・６分間歩行試験（６ＭＷＴ）
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＴＴＲ安定化の分析のためのＰＤ血液試料収集（投薬前）
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＰＫ血液試料収集（投薬前）
・プレアルブミン血液試料収集（投薬前）
・指定された立会人（すなわち、施設の担当者）によるＩＭＰの配布／収集及び投与
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命状態評価／入院の決定
・ＩＭＰ服薬順守評価。
毎月の電話による連絡（±７日）
これらの電話による連絡は、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、及び２９ヶ月目に行う：
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命徴候評価／入院の決定
・ＩＭＰ服薬順守評価。
【０２５１】
対象が、試験薬及び試験評価を中断する場合、生命状態に関する毎月の連絡を完了することにより本試験の経過にわたり、或いはコンセントの取り下げまで、対象の経過観察を継続するようにあらゆる努力が払われなければならない。
【０２５２】
３０ヶ月目（±７日）及びオープンラベル後続試験の開始
３０ヶ月間の二重盲検治療期間を完了した対象は、ＯＬＥにおいて、ＡＧ１０の受け取りを継続する。
・ＮＹＨＡクラス評価
・体重測定を含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・カンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）
・ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）
・６分間歩行試験（６ＭＷＴ）
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＴＴＲ安定化の分析のためのＰＤ血液試料収集（投薬前）
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＰＫ血液試料収集（投薬前）
・プレアルブミン血液試料収集（投薬前）
・指定された立会人（すなわち、施設の担当者）によるＩＭＰの配布／収集及び投与
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命状態評価／入院の決定
・ＩＭＰ服薬順守評価。
オープンラベル後続試験開始後１ヶ月目（±３日）
・ＮＹＨＡクラス評価
・体重測定を含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＴＴＲ安定化の分析のためのＰＤ血液試料収集（投薬前）
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＰＫ血液試料収集（投薬前）
・プレアルブミン血液試料収集（投薬前）
・指定された立会人（すなわち、施設の担当者）によるＩＭＰの配布／収集及び投与
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命状態評価／入院の決定
・ＩＭＰ服薬順守評価。
オープンラベル後続試験開始後３ヶ月毎（±７日）
・ＮＹＨＡクラス評価
・体重測定を含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・カンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）
・ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）
・６ヶ月毎の６分間歩行試験（６ＭＷＴ）
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＴＴＲ安定化の分析のためのＰＤ血液試料収集（投薬前）
・ＰｏｐＰＫ−ＰＤ予備試験におけるＰＫ血液試料収集（投薬前）
・プレアルブミン血液試料収集（投薬前）
・指定された立会人（すなわち、施設の担当者）によるＩＭＰの配布／収集及び投与
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命状態評価／入院の決定
・ＩＭＰ服薬順守評価。
【０２５３】
薬物濃度測定
ＰＫ血液採取スケジュール
参加施設で対象の亜群において、ＡＧ１０血漿濃度を決定するために、ＰＫ試料を以下の時点で収集する：
・試験来院の１日目、及び３ヶ月毎：投薬前
・２８日目：投薬前及び投薬後１時間
・ＯＬＥ開始後１ヶ月目及びＯＬＥの３ヶ月毎：投薬前
・ＥＴ。
【０２５４】
ＰＤ血液採取スケジュール
参加施設で対象の亜群において、蛍光プローブ排除（ＦＰＥ）アッセイ及びウェスタンブロットを含む、ＴＴＲ安定化の確立されたアッセイにより、ＡＧ１０のＰＤ特性を、評価する。これらのＰＤアッセイを行うために、サンプリングを以下の時点で行う：
・試験来院の１日目、及び３ヶ月毎：投薬前
・２８日目：投薬前及び投薬後１時間
・ＯＬＥ開始後１ヶ月目及びＯＬＥの３ヶ月毎：投薬前
・ＥＴ。
【０２５５】
プレアルブミン血液サンプリング手順
プレアルブミン濃度を測定するためのサンプリングは、以下の時点で行う：
・試験来院の１、２８日目、及び３ヶ月毎：投薬前
・ＯＬＥ開始後１ヶ月目及びＯＬＥの３ヶ月毎：投薬前
・ＥＴ。
【０２５６】
６分間歩行試験（６ＭＷＴ）
無作為化の前に、２回の６ＭＷＴを、＞２４時間から≦２週間、間をあけて、行った。歩行距離は、≧１５０ｍでなければならず、且つ歩行した距離は、異なる日の２回の連続試験について１５％以内でなければならない。２回の試験の結果が１５％以内でない場合は、追加の６ＭＷＴを、一方の６ＭＷＴの２４時間から２週間以内に繰り返すこととする。最後の試みが依然一方の６ＭＷＴの１５％以内でない場合、対象は、参加不適格である。
【０２５７】
６ＭＷＴは、必要とされる来院時に、ＫＣＣＱ及びＥＱ−５Ｄ−５Ｌの完了後に実行される。
【０２５８】
Ｂｏｒｇスケールを伴う６ＭＷＴは、米国胸部学会(American Thoracic Society)の指針に従い実行される。６ＭＷＴの手順に関する完全な詳細は、試験手順マニュアル（ＳＰＭ）に提供される。
【０２５９】
カンサスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ）
ＫＣＣＱは、心不全の対象の健康状態及び健康に関連した生活の質を測定するために開発された、２３項目質問票である。項目は、心不全の症状、身体機能及び社会機能への影響、並びに患者の心不全が患者の生活の質（ＱｏＬ）にどのように影響を及ぼすかを含む。これは、投薬前に対象により完成されることとする。完全な詳細は、試験手順マニュアルに提供される。
【０２６０】
ＥｕｒｏＱｏＬ−５ディメンション（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）
ＥＱ−５Ｄ−５Ｌは、完成するのに約５分を要し、且つＫＣＣＱの完了後に実行されるべき、簡潔な、自己記入式の全般的健康状態の手段である。この手段は、２つのパートを含む。第一のパートにおいて、回答者は、自身の現在の健康状態を５ディメンション（移動、身の回りの管理、普段の活動、痛み又は不快感、及び不安又はふさぎこみ）で等級化するように依頼され、各ディメンションは、５つの機能レベルを有する（１−問題はない、２−少し問題がある、３−中程度の問題がある、４−かなり問題がある、及び５−極めて問題がある）。第二のパートは、「最良の想定し得る健康状態」（スコア１００）及び「最悪の想定しうる健康状態」（スコア０）と記された端点を持つ、視覚的アナログ尺度（ＥＱ  ＶＡＳ）上への現在の健康状態の回答者の自己等級化である。この５ディメンションからのスコアを使用し、単独の指標値を計算することができ、これはまたユーティリティスコアとしても知られている。完全な詳細な記入及びスコア化は、試験手順マニュアルに提供される。
【０２６１】
臨床検査測定
臨床検査試験のための血液試料及び尿試料を、収集する。スクリーニング時に、治験担当医師は、臨床検査室より提供される参照範囲の外側のあらゆる値の臨床的意味を評価し、臨床上意味があると判断した異常を伴う対象は、本試験から除外する。
以下の臨床検査試験を行う。
【表１０】
2021518381.tif 000024
【０２６２】
生命徴候
試験施設のスタッフは、投薬前及び投薬後５分間の安静の後、生命徴候を評価する。臨床的に意味があるとみなされる（すなわち、症状に関連し、及び／又は医学的介入を必要とする）あらゆる異常な生命徴候は、ＡＥとして記録する。
【０２６３】
心電図
標準１２−誘導ＥＣＧを評価する。ＥＣＧは、投薬前に５分間安静にした後、仰臥位で行う。ＱＴｃに対するＰＫ−ＰＤ関係に関する追加の第１相データが収集され且つ分析されるまで、２８日目の投薬後１時間に、ＥＣＧを行う。ＰＫ−ＰＤデータの結果を基に、２８日目の投薬後１時間のＥＣＧは、対象の負担(burden)を減らすために、最早必要ではない。全ての治験担当医師は、日常的連絡により、この変化を伝える。
【０２６４】
治験担当医師又は資格のある治験分担医師は、臨床的意味に関して全てのＥＣＧ解釈及び測定の間隔期間について検証する。臨床的に意味があると見なされる（すなわち、症状に関連し及び／又は医学的介入を必要とする）あらゆるＥＣＧ解釈は、ＡＥと報告される。
【０２６５】
理学的検査
対象は、体重及び身長の測定を含む、完全な理学的検査（ＰＥ）を受け、これは医師又は適切に訓練された医療従事者により完了される。臨床的意味があると見なされる（すなわち、症状に関連し及び／又は医学的介入を必要とする）あらゆる異常な理学的検査所見は、ＡＥと記録される。
【０２６６】
ＣＶ−関連の入院の定義
心臓血管に関連の入院とは、少なくとも２４時間の滞在（又は、入／退院時刻が入手できない場合は、日付の変化）を生じる医学的療法のために設定する急性看護に対する非予約入院と、或いは退院診断及び介入が、病院滞在の目的が非代償性心不全の管理のための静脈内利尿薬療法のためであることを指摘する場合は、２４時間未満の病院滞在と、定義される。治験担当医師は、収集され且つ記録された入院日及び退院日を含む、可能性のある試験エンドポイントを保証し；入院が、ＣＶ−関連しているかどうかの、治験担当医師の評価を提供し；並びに、死亡又は入院を生じるような全ての有害事象に関してＡＥ通告書を提出する、責任がある。
【０２６７】
実施例１０：第３相臨床試験−ＡＴＴＲ−ＰＮ
このプロスペクティブな無作為化多施設並行群間試験は、ＡＴＴＲ−ＰＮの症候性対象における、プラセボと比較した、ＡＧ１０の安全性及び有効性を評価する。スクリーニング及び無作為化に、１８ヶ月間の二重盲検化プラセボ対照治療期間が続く。
【０２６８】
適格対象は、経口ＢＩＤ投与されるＡＧ１０  ８００ｍｇ又はマッチするプラセボに、１：１比で無作為化する。対象は、カットオフ＜３０ポイント及び≧３０ポイントの、スクリーニング神経障害スコア（ＮＩＳ）を基に、並びにタファミジス(Vyndaqel(登録商標)、Pfizer)を現在服用しているかしていないか（これが入手できない国又は地域において）どうかに従い、無作為化時に層別化される。
【０２６９】
ＡＥ及び併用薬物療法に関する情報は、本試験を通じて収集される。安全性及び本試験の実施は、独立したデータモニタリング委員会（ＤＭＣ）によりモニタリングされる。
【０２７０】
本治験デザインのまとめは、図４６に示している。
【０２７１】
対象母集団及び統計
ポジティブ遺伝子型の文書化が、ＡＴＴＲ−ＰＮの確定診断を確認するために、必要である。重要な適格性判定基準は、プラセボ群における進行を示すのに十分に進展される(advanced)が、疾患状態の変化の検出を排除するようには進行されない、疾患を伴う対象集団を確定するために選択された（例えば、ＰＮＤスコア≦ＩＩＩａ及びカルノフスキー全身状態スコア≧６０％）。多くのＡＴＴＲ−ＰＮ患者は、心臓の関与を有するので、その心筋症の程度に関連した高い死亡率を考えると、ＮＹＨＡクラスＩＶ症状の対象は排除される。ＡＧ１０に起因する有効性及び安全性のシグナルをより良く明確化するために、トランスサイレチン生成又は安定性を変更する他の療法の併用は排除される（利用可能ならば、タファミジス２０ｍｇ／日の例外の可能性あり）。
【０２７２】
神経障害スコア（ＮＩＳ）は、筋肉、反射及び感覚のモダリティ並びに特定部位の標準群を使用し、臨床的神経障害のまとめ（虚弱、反射の減少及び感覚消失）の提示を行うことが比較的容易である、神経学的評価である。０〜２４４のスケールで計算し、より高いスコアは、疾患の増悪を示す。ＮＩＳは、疾患重症度及び予後のその他の測定と相関することが示されており、並びに〜３０の中央値はＡＴＴＲ−ＰＮ患者の大きいコホートにおいて報告されているので、スクリーニング時のＮＩＳスコア（＜３０及び≧３０）の統計は、治療アームにまたがるニューロパチーの重症度において、潜在的不均衡を軽減することが含まれる（Ａｄａｍｓ、２０１５）。対象はまた、利用可能である一部の国又は地域において、ＡＴＴＲ−ＰＮの治療について適応とされるタファミジス２０ｍｇ／日を服用するかどうかに従っても、層別化される。
【０２７３】
治療期間
対象は、１８ヶ月間にわたり、試験薬（ＡＧ１０又はプラセボ）により治療される。
【０２７４】
いくつかの公開されたコホートにおいて認められた長期間にわたる評価を基に、１８ヶ月目のこの対象集団における進行の割合は、ｍＮＩＳ＋７で〜１２．５から１７ポイントであることが予想される(Adams、2017、Berk、2013)。ｍＮＩＳ＋７により測定されるプラセボ対象における疾患進行は、徐々にであるので、少なくとも１２ポイントの悪化が、１８ヶ月間の治験期間にわたって予想される(Adams、2017、Berk、2013)。ＡＧ１０は、進行するアミロイド形成を妨害することにより、疾患進行を停止すると予想されるので、１８ヶ月間は、ｍＮＩＳ＋７スコアの臨床的に意味のあるプラセボ−調節した変化を検出するのに、恐らく十分な長さであろう。
【０２７５】
投与される治療
対象は、二重盲検様式で、以下の治療アームを受け取るよう、１：１様式（ＡＧ１０：プラセボ）で無作為化される：
・８００ｍｇ  ＡＧ１０  ＢＩＤ、経口（２個の４００ｍｇ  ＡＧ１０錠、ＢＩＤ）
・マッチするプラセボＢＩＤ、経口（２個のプラセボ錠、ＢＩＤ）。
【０２７６】
試験薬物療法の忍容性が良くないことを指摘する対象のＡＥ報告を基に、治験担当医師が投与量調節が正当化されることを決定するような事象において、盲検化された投与量は、ＢＩＤで投与される４００ｍｇ  ＡＧ１０又はマッチするプラセボへ減少されてよい。これは試験スタッフが、試験薬物療法の２個の錠剤の代わりに１個をＢＩＤ服用するよう対象を指導することにより達成される。あらゆる投与量調節は、データベースに文書化される。
禁忌薬物療法
１．  パチシラン、イノテルセン、又は任意の他のＡＴＴＲ−ＰＮ治療に関する承認薬もしくは治験中の薬（タファミジス用量２０ｍｇ以外）の使用は、本試験期間中は禁止される。
２．  ＡＴＴＲ治療の適応（例えば、ジフルニサル、ドキシサイクリン）を除く承認された製品、又はＡＴＴＲの未確認療法として使用される天然製品もしくは誘導体（例えば、緑茶抽出物、タウロウルソデオキシコール酸[TUDCA]／ウルソジオール）の使用は、本試験期間中は禁止される。
【０２７７】
試験手順
評価スケジュール
本試験を通じて実行される手順の説明を、以下に提供する。
【０２７８】
スクリーニング（−２８日目から−１日目）
スクリーニングは、ＩＭＰの初回投与量の投与前、２８日以内に行われる。以下の手順を、スクリーニング時に行う：
・インフォームドコンセントの記入
・対象が適格であることを確認する、組み入れ／除外基準の検証
・内科及び外科の病歴の評価
・ＮＹＨＡクラス評価
・カルノフスキー全身状態
・ｍＢＭＩを含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・ＰＮＤスコア
・ＮＩＳ
・ｍＮＩＳ＋７
・１０メートル歩行試験（１０ＭＷＴ）、＞２４時間から＜１週間間を空けて、２回の評価
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・血清及び血漿の探索的検査のための血液試料収集
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・薬歴評価。
【０２７９】
治療日
試験手順は、試験日別に以下に列挙し、理想的には、各日について、以下に列挙された順番で行う。
【０２８０】
１日目及び３ヶ月毎（±７日）
これらの評価は、１日目[0001]          及び３、６、９、１５ヶ月目に行う：
・対象が適格であることを確認する、組み入れ／除外基準の検証（１日目）
・対象の治療アームへの無作為化及び無作為化番号の割付け（１日目）
・ＮＹＨＡクラス評価  
・ｍＢＭＩを含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・ＰＮＤスコア
・Ｄｙｃｋ／Ｒａｎｋｉｎスコア
・ｍＮＩＳ＋７
・ノーフォークＱＯＬ−ＤＮ
・ＣＯＭＰＡＳＳ−３１
・１０メートル歩行試験（１０ＭＷＴ）、
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・ＴＴＲ安定化の分析のためのＰＤ血液試料収集（投薬前）
・ＰＫ血液試料収集（投薬前）
・プレアルブミン血液試料収集（投薬前）
・指定された立会人（すなわち、施設の担当者）によるＩＭＰの配布／収集及び投与
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命状態評価
・ＩＭＰ服薬順守評価（１日目を除く全ての来院時）。
１８ヶ月目（±７日）
・ＮＹＨＡクラス評価  
・ｍＢＭＩを含む理学的検査
・生命徴候評価
・安静時１２−誘導ＥＣＧ
・ＰＮＤスコア
・Ｄｙｃｋ／Ｒａｎｋｉｎスコア
・ｍＮＩＳ＋７
・ノーフォークＱＯＬ−ＤＮ
・ＣＯＭＰＡＳＳ−３１
・１０メートル歩行試験（１０ＭＷＴ）、
・血液学、血清化学（循環バイオマーカーを含む）のための血液試料収集、尿検査
・妊娠可能な女性対象のみ、尿妊娠試験
・ＴＴＲ安定化の分析のためのＰＤ血液試料収集（投薬前）
・ＰＫ血液試料収集（投薬前）
・プレアルブミン血液試料収集（投薬前）
・指定された立会人（すなわち、施設の担当者）によるＩＭＰの配布／収集及び投与
・併用薬物療法使用の評価
・ＡＥ／生命状態評価
・ＩＭＰ服薬順守評価。
毎月の電話連絡（±７日）
これらの電話による連絡は、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７ヶ月目に行う：
・併用薬物療法使用評価
・ＡＥ／生命徴候評価
・ＩＭＰ服薬順守評価。
【０２８１】
対象が、試験薬及び試験評価を中断する場合、生命状態に関する毎月の連絡を完了することにより本試験の経過にわたり、或いはコンセントの取り下げまで、対象の経過観察を継続するようにあらゆる努力が払われなければならない。
【０２８２】
薬物濃度測定
ＰＫ血液採取スケジュール
参加施設で対象の亜群において、ＡＧ１０血漿濃度を決定するために、ＰＫ試料を以下の時点で収集する：
・試験来院の１日目、及び３ヶ月毎：投薬前
【０２８３】
ＰＤ血液採取スケジュール
参加施設で対象の亜群において、蛍光プローブ排除（ＦＰＥ）アッセイ及びウェスタンブロットを含む、ＴＴＲ安定化の確立されたアッセイにより、ＡＧ１０のＰＤ特性を、評価する。これらのＰＤアッセイを行うために、サンプリングを以下の時点で行う：
・試験来院の１日目、及び３ヶ月毎：投薬前。
【０２８４】
プレアルブミン血液サンプリング手順
プレアルブミン濃度を測定するためのサンプリングは、以下の時点で行う：
・試験来院の１、２８日目、及び３ヶ月毎：投薬前
【０２８５】
評価
以下の評価を完了する：
・１０メートル歩行試験（１０ＭＷＴ）、
・神経障害スコア（ＮＩＳ）
・補正神経障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）
・ＣＯＭＰＡＳＳ−３１
・Ｄｙｃｋ／Ｒａｎｋｉｎスコア
・栄養状態（ｍＢＭＩを基に計算）。
【０２８６】
１０メートル歩行試験（１０ＭＷＴ）
１０ＭＷＴは、短い距離にわたり１秒につき歩行する速度をメートルで評価するために使用した、行動測定である。これは、機能的移動度、歩行(git)、及び前庭機能を決定するために利用する。無作為化の前に、２回の１０ＭＷＴを、＞２４時間から＜１週間、間をあけて、行った。
【０２８７】
神経障害スコア（ＮＩＳ）
ＮＩＳは、筋肉、反射及び感覚のモダリティ及び特定部位の標準群を使用し、臨床的神経障害のまとめ（虚弱、反射の減少及び感覚消失）を表す神経学的評価である。
【０２８８】
補正神経障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）
ｍＮＩＳ＋７神経試験は、一部において、筋肉虚弱、感覚消失、及び低下した筋肉伸展反射を評価する複合スケールである。
【０２８９】
複合自律神経症状スコア−３１（ＣＯＭＰＡＳＳ−３１）
ＣＯＭＰＡＳＳ−３１は、各対象の自立神経症状[0002]            に対するＴＴＲアミロイドーシスの影響を定量するために使用される。
【０２９０】
Ｄｙｃｋ／Ｒａｎｋｉｎスコア
Ｄｙｃｋ／Ｒａｎｋｉｎスコアを使用し、生活の質が評価される。
【０２９１】
栄養状態
栄養状態は、ｍＢＭＩにおける変化を基に評価される。
【０２９２】
臨床検査測定
臨床検査試験のための血液試料及び尿試料を、収集する。スクリーニング時に、治験担当医師は、臨床検査室より提供される参照範囲の外側のあらゆる値の臨床的意味を評価し、臨床上意味があると判断した異常を伴う対象は、本試験から除外する。
以下の臨床検査試験を行う。
【表１１】
2021518381.tif 000025
【０２９３】
生命徴候
試験施設のスタッフは、投薬前及び投薬後５分間の安静の後、生命徴候を評価する。臨床的に意味があるとみなされる（すなわち、症状に関連し、及び／又は医学的介入を必要とする）あらゆる異常な生命徴候は、ＡＥとして記録する。
【０２９４】
心電図
標準１２−誘導ＥＣＧを評価する。ＥＣＧは、投薬前に５分間安静にした後、仰臥位で行う。治験担当医師又は資格のある治験分担医師は、臨床的意味に関して全てのＥＣＧ解釈及び測定の間隔期間について検証する。臨床的に意味があると見なされる（すなわち、症状に関連し及び／又は医学的介入を必要とする）あらゆるＥＣＧ解釈は、ＡＥと報告される。
【０２９５】
理学的検査
対象は、ｍＢＭＩを含む、完全な理学的検査（ＰＥ）を受け、これは医師又は適切に訓練された医療従事者により完了される。臨床的意味があると見なされる（すなわち、症状に関連し及び／又は医学的介入を必要とする）あらゆる異常な理学的検査所見は、ＡＥと記録される。
【表１２】
2021518381.tif 000026
【表１３】
2021518381.tif 000027
【０２９６】
前記発明は、理解を明確化することを目的として図面及び実施例により一部詳細に説明されているが、当業者は、特定の変更及び改変が、添付された請求項の範囲内で行われ得ることを理解するであろう。加えて、本明細書に提供される各参考文献は、各々の参考文献が個別に引用により組み込まれているのと同程度に、その全体が引用により組み込まれている。本出願とそこで提供される参考文献の間に矛盾が存在する場合、本出願が支配するものである。
【図１】
2021518381.tif 000031
【図２】
2021518381.tif 000032
【図３】
2021518381.tif 000033
【図４】
2021518381.tif 000034
【図５】
2021518381.tif 000035
【図６】
2021518381.tif 000036
【図７Ａ】
2021518381.tif 000037
【図７Ｂ】
2021518381.tif 000038
【図７Ｃ】
2021518381.tif 000039
【図７Ｄ】
2021518381.tif 000040
【図８】
2021518381.tif 000041
【図９】
2021518381.tif 000042
【図１０】
2021518381.tif 000043
【図１１】
2021518381.tif 000044
【図１２】
2021518381.tif 000045
【図１３】
2021518381.tif 000046
【図１４】
2021518381.tif 000047
【図１５】
2021518381.tif 000048
【図１６】
2021518381.tif 000049
【図１７】
2021518381.tif 000050
【図１８】
2021518381.tif 000051
【図１９】
2021518381.tif 000052
【図２０】
2021518381.tif 000053
【図２１】
2021518381.tif 000054
【図２２】
2021518381.tif 000055
【図２３】
2021518381.tif 000056
【図２４】
2021518381.tif 000057
【図２５】
2021518381.tif 000058
【図２６】
2021518381.tif 000059
【図２７】
2021518381.tif 000060
【図２８】
2021518381.tif 000061
【図２９】
2021518381.tif 000062
【図３０】
2021518381.tif 000063
【図３１】
2021518381.tif 000064
【図３２】
2021518381.tif 000065
【図３３】
2021518381.tif 000066
【図３４】
2021518381.tif 000067
【図３５】
2021518381.tif 000068
【図３６】
2021518381.tif 000069
【図３７】
2021518381.tif 000070
【図３８】
2021518381.tif 000071
【図３９】
2021518381.tif 000072
【図４０】
2021518381.tif 000073
【図４１】
2021518381.tif 000074
【図４２】
2021518381.tif 000075
【図４３】
2021518381.tif 000076
【図４４】
2021518381.tif 000077
【図４５】
2021518381.tif 000078
【図４６】
2021518381.tif 000079
【配列表】
2021518381000001.app
【国際調査報告】
2021518381.tif 000080
2021518381.tif 000081