(57)【要約】  本発明は、新規光増感剤複合ナノ多機能材料の調製及びその使用に関し、光線力学的治療の技術分野及び生物医学分野に属している。前記光増感剤複合ナノ多機能材料は、セルコスポリンと、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料とを自己組織化して調製されたものであり、酸感受性共重合体多機能材料は、ガラクトース修飾ローダミンＢを共有結合により連結したポリメタクリル酸Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルとポリ（３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリレートとの共重合体である。前記光増感剤複合ナノ多機能材料は、肝腫瘍細胞を特異的に認識し、ガラクトース−アシアロ糖タンパク質受容体の相互作用により細胞内に取りまれることができ、光増感剤であるセルコスポリンの放出をトリガーして光線力学的治療の効果を酸性ｐＨ条件下で発揮させることができ、腫瘍細胞に対する標的光線力学的治療において将来性が期待できる。【選択図】図１
2021510708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光増感剤であるセルコスポリンと、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料とを自己組織化して調製された、ことを特徴とする新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
【請求項２】
前記肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料は、ｐＨ感受性を有するメタアクリル酸Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルＤＭＡＥＭＡ単量体と疎水性の３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリル酸エステルＧＭＡ−Ｎ３単量体で形成された共重合体であり、一端には蛍光トレース機能を有する蛍光分子が修飾され、他端には肝標的化機能を有する糖分子が修飾されており、
該酸感受性共重合体多機能材料は、疎水性相互作用によって光増感剤分子であるセルコスポリンがその疎水性キャビティに封入されている、ことを特徴とする請求項１に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
【請求項３】
セルコスポリンの封入量が約９質量％であり、前記新規光増感剤複合ナノ多機能材料の粒子径が約１０３ｎｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
【請求項４】
前記肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料は、式１に示される構造式を有する、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
2021510708.tif 000004
（Ａは、ローダミンＢ、フルオレセインイソチオシアネート、ボディパイからなる蛍光トレース機能を有する蛍光分子から選ばれる同じ又は異なる１つ又は複数であり、；
Ｂは、肝癌細胞の表面に過剰発現させたアシアロ糖タンパク質受容体を特異的に認識できるガラクトース又はガラクトサミン残基を有する単糖又はオリゴ糖類分子から選ばれる同じ又は異なる１つ又は複数の分子であり、
式１にはＤＭＡＥＭＡの単量体構造が含まれ、ｍはその重合度を表し、ｍ＝４２であり、
式１にはＧＭＡ−Ｎ３の単量体構造が含まれ、ｎはその重合度を表し、ｎ＝６２である）。
【請求項５】
式１中のＡは蛍光分子であるローダミンＢであり、Ｂはガラクトース残基であり、蛍光分子であるローダミンＢ、ＤＭＡＥＭＡ、ＧＭＡ−Ｎ３のモル比が１：４２：６２であり、標的とした前記糖分子とＧＭＡ−Ｎ３のモル比が１：１である、ことを特徴とする請求項４に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料の調製方法であって、
肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料とセルコスポリンをそれぞれＤＭＳＯで溶解し、２種の溶液を混合して撹拌するステップ１）と、
ステップ１）で混合して得られた溶液を再蒸留水にて透析して、断続的に水を交換し、光増感剤複合ナノ多機能材料の溶液を調製するステップ２）と、
光増感剤複合ナノ多機能材料の溶液をろ過することで未担持のセルコスポリンを除去し、凍結乾燥させて、光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを調製するステップ３）と、を含む、ことを特徴とする調製方法。
【請求項７】
前記ステップ１）では、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料の濃度が１０〜５０ｍｇ／ｍＬ−１であり、
前記ステップ１）では、セルコスポリンの濃度が１０〜５０ｍｇ／ｍＬ−１であり、
前記ステップ１）では、ＤＭＳＯの使用量が０．５〜１ｍＬである、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料を含む肝がん治療のための医薬品。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料を含有することを特徴とする肝がん治療薬。
【請求項１０】
肝がん治療薬の開発における請求項１〜５のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規光増感剤複合ナノ多機能材料の調製及びその使用に関し、具体的には、セルコスポリンを、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体に封入して調製した新規光増感剤複合ナノ多機能材料、その調製方法及び用途に関し、光線力学的治療の技術分野及び生物医学分野に属している。
【背景技術】
【０００２】
光線力学的療法は、腫瘍疾患を治療するための非侵襲的な新技術であり、光増感剤をインキュベートし、特定の光照射と組み合わせると、酸化性の高い一重項酸素を生成することで、腫瘍組織や細胞を殺滅する目的を達成できる。光線力学的治療は、長年に亘って発展した結果、より広く使用されており、その作用機序もますます明らかになってきた。悪性腫瘍を治療するための光線力学的治療には、光増感剤、特定の波長の光照射、及び酸素の３つの要素が必要とされる。この治療戦略は、具体的には、低毒性の光増感剤を人体に入れて、次に腫瘍領域へ光を照射することでこのような光増感剤を励起し、光活性化後の三重項励起状態の光増感剤は、励起状態のエネルギーを周囲の腫瘍組織及び細胞内の酸素に伝達し、酸化力の高い一重項酸素を生成することで、リポソーム、タンパク質やその他の細胞内小器官を酸化的に損傷し、腫瘍細胞のアポトーシスと壊死を引き起こす。したがって、光増感剤の一重項酸素を生成する性能は、光線力学的治療の効果にとって非常に重要である。しかしながら、通常使用される光増感剤は、水溶性が低く、腫瘍に対する標的性を持たないため、その臨床応用が厳しく制限されてしまう。したがって、多くの科学的研究では、生物医学分野での光線力学的治療技術の応用に対応するように、化学修飾又はナノデリバリーシステムを利用して、さまざまな光増感剤の水溶性と標的性を高める。
【０００３】
数十年間に亘り発展させた結果、光増感剤は、種類と性能がともに十分に開発されており、第３世代まで発展しており、第１世代と第２世代の光増感剤は、主にポルフィリン誘導体、メソ位に置換アリールを有するポルフィン類、フタロシアニン類、クロロフィルａ分解生成物誘導体やヘマトポルフィリンモノメチルエーテルなどであり、第３世代の光増感剤は、主にアミノ酸結合光増感剤、重合体結合光増感剤、タンパク質又は糖結合光増感剤などの分子認識機能を備えた光増感剤を含む第２世代の光増感剤の機能的誘導体を指す。各世代の光増感剤の開発には、光線療法の性能、特に親水性と標的性の改善が伴う。現在、光線力学的治療の医学的応用において、より成熟した光増感剤には、ポルフィリン、ポルフィン、フタロシアニンなどが含まれる。さらに、新規光増感材料であるセルコスポリン（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｎ）は、セルコスポラから単離されたペリレンキノン類光増感化合物であり、一重項酸素量子収率（０．８１）が高くなっている。しかし、他の光増感剤と同様に、セルコスポリンは水溶性が低く、標的性が不十分であり、光線力学的治療の機能がまだ開発されておらず、現在、光線力学的治療の光増感剤として使用することについての報告はなかった。
【０００４】
高分子ミセルはナノデリバリーシステムの一種であり、優れた生体適合性を有する両親媒性高分子が自己組織化して水中でミセルを形成することができる。疎水性光増感剤に対しては、薬物として担持するか、又は親水性修飾を行うことで、光線力学的治療の要件を満たすことができる光増感剤担持ミセルを作製することができる。また、腫瘍組織又は細胞の特別な成長特性により、細胞膜表面でさまざまな標的受容体が過剰発現し、抗体、ポリペプチド、糖類物質などの一部の機能的標的分子はこれらの受容体を特異的に認識できるため、これらの標的分子を使って、高分子ミセルの表面を修飾し、受容体を介した認識を通じて腫瘍細胞に大量に取り込むことができることによって、光増感剤を標的に送達することで光線力学的治療を行い、正常細胞に対する光線力学的治療の毒性を低減できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、光線力学的治療において光増感剤の水溶性が低く、標的性が不十分であるという欠点を解決し、光線力学的治療用のセルコスポリンの潜在力を開発し、初めてセルコスポリンを複合ナノ多機能材料に用いることで、その毒性や副作用を低減させ、光線力学的治療としての潜在力を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の前記新規の光増感剤複合ナノ多機能材料は、セルコスポリンと、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能送達システムとを自己組織化して調製されたものであり、安定したナノ構造を形成し、酸性条件下でセルコスポリンのバースト放出をトリガーすることができる。セルコスポリンを標的に送達することで光線力学的治療を行い、それにより、肝癌細胞に対する毒性を向上させ、正常細胞に対する毒性を低減させる。該酸感受性共重合体多機能送達システムは、ガラクトース修飾ローダミンＢを共有結合により連結したポリメタクリル酸Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルとポリ（３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリレートとの共重合体であってもよい。
【０００７】
本発明の一態様は、下記式１に示す化合物である、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能送達システムに関する。
2021510708.tif 000003
（式１中、
Ａは、ローダミンＢ、フルオレセインイソチオシアネート、ボディパイ（ＢＯＤＩＰＹ：boron-dipyrromethene（ホウ素―ジピロメテン））などの蛍光トレース機能を有する蛍光分子から選ばれる同じ又は異なる１つ又は複数である。
Ｂは、１つ又は複数の、ガラクトース又はガラクトサミン残基を有する単糖又はオリゴ糖類分子であって、肝癌細胞の表面に過剰発現させたアシアロ糖タンパク質受容体を特異的に認識できる分子であり、
式１には、メタアクリル酸Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥＭＡ）の単量体構造が含まれ、ｍはその重合度を表わし、ｍ＝４２であり、
式１には、３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリル酸エステル（ＧＭＡ−Ｎ３）の単量体構造が含まれ、ｎはその重合度を表し、ｎ＝６２である。の分子である。）
【０００８】
本発明の一実施形態では、前記肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能送達システムにおいて、式１に示すように、蛍光分子ローダミンＢ、ＤＭＡＥＭＡ及びＧＭＡ−Ｎ３のモル比が１：４２：６２であり、前記標的糖分子とＧＭＡ−Ｎ３の比が１：１である。
【０００９】
本発明は、蛍光イメージング機能を有する蛍光分子を修飾して大分子開始剤とし、３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリル酸エステル（ＧＭＡ−Ｎ３）単量体とメタアクリル酸Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥＭＡ）とのラジカル重合反応を開始させることで、蛍光分子に共有結合により連結した重合体を得るステップを含む、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能送達システムの調製方法も提供している。該重合体では、ＰＧＭＡ−Ｎ３は親水性・疎水性相互作用によって疎水性薬物を担持する機能を有し、ＰＤＭＡＥＭＡの部分は、大量のアミノ基を含有するため、核酸類物質を被覆し、酸性条件下でプロトン化して、スポンジ効果をトリガーして封入体脱出を引き起こすことができ、肝に対する標的化機能を有するガラクトースの末端基の部位は、修飾によりアルキニル基を含有することで、共重合体中のＰＧＭＡ−Ｎ３の部分のアジド基とｃｌｉｃｋ反応することにより共有結合を介して共重合体に連結し、担体へ安定した標的化機能を提供できる。
【００１０】
本発明に関する酸感受性共重合体多機能送達システムの調製方法は、さらに、以下のステップを含む。
開始剤であるブロモローダミンＢ、ＤＭＡＥＭＡ単量体及びＧＭＡ−Ｎ３単量体を２５  ｍＬ丸底フラスコに１：２５：５０のモル比で添加し、テトラヒドロフラン２ｍＬで溶解し、アルゴンガスを３０分間通気してフラスコ内の酸素を除去する。ＤＭＡＥＭＡ単量体に対しては、その中の安定剤を予め除去し、すなわち、ＤＭＡＥＭＡ粗製品を塩基性アルミナカラムに迅速に通する必要がある。窒素ガスの保護下で、臭化第一銅とペンタメチルジエチレントリアミンを順次加え、フラスコを密閉し、窒素ガスの保護下、室温で８時間反応させる。反応終了後、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を反応液に加え、十分に撹拌してフラスコ内の反応液を溶解し、中性アルミナカラムに通して混合溶液中の銅配位子を除去し、収集した液体から回転蒸発により溶媒を除去した後、フラスコ内の粘稠な液体を石油エーテル（５００ｍＬ）にゆっくり滴下し、沈殿させ、沈殿を３回繰り返し、真空乾燥して、ローダミンＢ修飾共重合体を沈殿物として得る。
プロパルギル修飾デアセチルガラクトースとローダミンＢ修飾共重合体をＤＭＦ  ５ｍＬに溶解した後、硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウムを水５ｍＬに溶解し、上記反応液に滴下し、室温で反応液を４８時間撹拌する。反応液をろ過し、水溶液中で透析して（透析バッグの分画分子量：８〜１０ｋＤａ）、目的共重合体Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを得る。
【００１１】
セルコスポリンを封入した複合ナノ多機能材料の調製方法であって、
目的共重合体Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒとセルコスポリンをそれぞれＤＭＳＯで溶解し、２種の溶液を混合して６時間撹拌するステップ１）と、
混合した溶液を再蒸留水にて４８時間透析し、１２時間おきに水を１回交換し、光増感剤複合ナノ多機能材料の溶液を調製するステップ２）と、
光増感剤複合ナノ多機能材料の溶液から０．４５μｍの精密ろ過膜でろ過して未担持のセルコスポリンを除去し、凍結乾燥機で凍結乾燥させ、光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを調製するステップ３）と、を含む。
【００１２】
本発明に係る肝臓腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性ナノ重合体多機能送達システムにおいて、ＧＭＡ単量体は、疎水性部分を提供するものであり、一方では、疎水性のセルコスポリンと相互作用してそれを疎水性コアに封入し、他方では、その−Ｎ３基がプロパルギル基を含むガラクトースと化学的に反応して、標的性を有するガラクトース分子を共有結合によって重合体に導入でき、ＤＭＡＥＭＡ単量体は、親水性部分を提供するものであるとともに、アミノ基を大量に含んでいるため、酸性条件下でプロトン化してミセルを解離させて、封入された光増感剤を放出させ、スポンジ効果をトリガーして細胞の小胞体から脱出させることができ、それによって、封入された光増感剤を細胞質又は細胞核にさえ放出する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る新規光増感剤複合ナノ多機能材料は以下の有益な効果を有する。
（１）本発明の光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは、送達プロセス（ｐＨ７．４）中に安定して存在でき、光増感剤の漏れを効果的に低減でき、光照射の条件下で一重項酸素を生成する効率を大幅に低下させ、一方、酸性ｐＨ環境では、光増感剤の放出を促進し、光増感剤の放出量を増加させ、大量の一重項酸素を生成して細胞毒性を発生させる。
（２）本発明の光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは、共有結合により連結したローダミンＢ分子を含むため、生体内及び生体外でのリアルタイムイメージングを促進することができる。
（３）本発明の光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは、共有結合により連結したガラクトース分子を含むので、肝臓癌細胞の表面で過剰発現させたアシアロ糖タンパク質受容体を標的とし、標的化送達の目的を達成することができる。
（４）本発明の光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは、ガラクトースアシアロ糖タンパク質受容体によって特異的に認識されて細胞に取り込まれた後、酸性オルガネラから細胞質又は細胞核にさえ侵入して、光増感剤としての機能を発揮させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの動的光散乱粒子径分布図である。
【図２】光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの透過型電子顕微鏡像である。
【図３】光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを１０％胎児ウシ血清を含有する高糖培地にて５日間インキュベートしたときの粒子径の変化図である。
【図４】光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒのｐＨ  ７．４及び５．０のＰＢＳにおけるセルコスポリン放出率である。
【図５】各処理による１,３−ジフェニルイソベンゾフラン（ＤＰＢＦ）の吸収スペクトル（３５０〜５５０  ｎｍ）である。ａ）セルコスポリンをＤＭＳＯに溶解した。ｂ）亜鉛フタロシアニンをＤＭＳＯに溶解した。ｃ）光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒをＤＭＳＯに溶解した。ｄ）上記３種類の溶液の４１８ｎｍでの吸収光強度の変化。
【図６】各処理による９,１０−アントラセンジイル−ビス（メチレン）ジマロン酸（ＡＢＤＡ）の蛍光スペクトル（４００〜５５０  ｎｍ）である。ａ）光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒをＰＢＳ  ｐＨ  ５．０に溶解した。ｂ）光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒをＰＢＳ  ｐＨ  ７．４に溶解した。
【図７】ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２と正常ＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー結果である。ａ）ＨｅｐＧ２細胞と光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを８時間インキュベートした実験の結果。ｂ）ＨＥＫ２９３細胞と光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを８時間インキュベートした実験の結果。ｃ）ガラクトース競合がある条件下、ＨｅｐＧ２細胞と光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを８時間インキュベートした実験の結果。
【図８】ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２と正常ＨＥＫ２９３細胞の共焦点レーザー顕微鏡による実験結果である。ａ）ＨｅｐＧ２細胞と光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを８時間インキュベートした実験の結果。ｂ）ＨＥＫ２９３細胞と光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを８時間インキュベートした実験の結果。ｃ）ガラクトース競合がある条件下、ＨｅｐＧ２細胞と光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを８時間インキュベートした実験の結果。
【図９】ａ）ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２とｂ）正常ＨＥＫ２９３細胞のそれぞれを光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒと３、６、１２及び２４時間共培養した後、４６３ｎｍの灯光で１５分間、照射した後の細胞生存率である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、実施例にて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者が理解できるように、以下の実施例は本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではない。実施例では、特定の条件が示されていない場合、通常の条件又は製造元が推奨する条件に従って行う。使用される試薬又は機器は、メーカーが明記されていない場合、すべて市販品として入手する一般的な製品である。
【００１６】
実施例１：開始剤としてのブロモローダミンＢの調製
エチレングリコール１５．５２ｇ（２５．００ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１．０１ｇ（１０．００ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの三角フラスコに入れて撹拌し、氷水浴で０℃に冷却し、窒素ガスの雰囲気下、臭化２−ブロモイソブチリルを１．２０ｍＬ（１０．００ｍｍｏｌ）滴下して溶解し、次にゆっくりと室温まで昇温し、３時間磁気撹拌した。反応後の溶液に脱イオン水１００ｍＬを加えてクエンチした後、ジクロロメタン（１００ｍＬ×３）で抽出した。収集した有機相を脱イオン水（１００ｍＬ×３）で抽出した。抽出により得られた有機相に適量の無水硫酸マグネシウムを加え、１２時間乾燥させた。ろ過後、回転蒸発（ロータリーエバポレータ）により油状の粗製生成物を得て、減圧下（８５℃、３０ｍＴｏｒｒ）で蒸留して、無色の粘稠生成物として２−ブロモイソ酪酸２−ヒドロキシエチルを得た。
ローダミンＢ  ４．８１ｇ（１０．００ｍｍｏｌ）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２．９０ｇ（１５．００ｍｍｏｌ）、２−ブロモイソ酪酸２−ヒドロキシエチル化合物３．２２ｇ（１５．００ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン４０ｍＬに溶解して撹拌し、氷水浴で０℃に冷却した後、４−ジメチルアミノピリジン１．８２ｇ（１５μｍｏｌ）を加え、ゆっくりと室温まで昇温して１２時間反応させた。反応液を０．１  Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍＬ×３）で抽出した後、飽和重炭酸ナトリウムと飽和食塩水で３回洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させてろ過し、回転蒸発により溶媒を除去し、シリカカラム（ジクロロメタン／メタノール＝１０：１）で分離して開始剤としてのブロモローダミンＢを得た。具体的な方法については、文献（Ｍａｒｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ,２０１１,４４,２０５０−２０５７）を参照されたい。
【００１７】
実施例２：３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリレートＧＭＡ−Ｎ３の調製
アジ化ナトリウム３．７１ｇ（５７．００ｍｍｏｌ）、重炭酸ナトリウム３．８１ｇ（４５．２０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水（５：１ｖ  ｖ−１）６０ｍＬに溶解して撹拌し、メタアクリル酸グリシジル５．４２ｇ（３７．８０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で４８時間反応させた。ろ過して不溶性塩物質を除去した後、回転蒸発により溶媒を除去し、得られた濃縮物をジクロロメタンで２回抽出し、得られた有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させてろ過し、回転蒸発により溶媒を除去し、シリカカラム（ノルマルヘキサン／酢酸エチル＝９：１）で分離して、３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリレートを得た。具体的な方法については、文献（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,２０１５,６,３８７５−３８８４；  Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ,２００９,５,４７８８−４７９６）を参照されたい。
【００１８】
実施例３：ローダミンＢを共有結合により連結したポリメタクリル酸Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルとポリ（３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリレートの共重合体（ＲｈＢ−ＰＤＭＡＥＭＡ４２−ｃ−ＰＧＭＡ６２−Ｎ３）の調製
開始剤としてのブロモローダミンＢ  ７０．０ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＥＭＡ単量体４８４．０ｍｇ（２．７５ｍｍｏｌ）及び３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート化合物１．０１ｇ（５．５０ｍｍｏｌ）を正確に秤量し、２５ｍＬ丸底フラスコに加え、テトラヒドロフラン２ｍＬで溶解し、アルゴンガスを３０分間通気してフラスコ内の酸素を除去した。ＤＭＡＥＭＡ単量体に対しては、その中の安定剤を予め除去し、すなわち、ＤＭＡＥＭＡ粗製品をアルカリ性アルミナカラムに迅速に通した。窒素ガスの保護下で、ＣｕＢｒ１８．９ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）とＰＭＤＥＴＡ（２８μＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を順次加え、フラスコを密閉させ、窒素ガスの保護下、室温で８時間反応させた。反応終了後、反応液にテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を加え、充分に撹拌してフラスコ内の反応液を溶解し、中性アルミナカラムに通して混合液中の銅配位体を除去し、収集した液体から回転蒸発により溶媒を除去した後、フラスコ内の粘稠な液体を石油エーテル（５００ｍＬ）にゆっくりと滴下し、沈殿させ、沈殿を３回繰り返し、得られた沈殿物を真空乾燥させ、ローダミンＢ修飾共重合体ＲｈＢ−ＰＤＭＡＥＭＡ４２−ｃ−ＰＧＭＡ６２−Ｎ３を得た。
【００１９】
実施例４：プロパルギル修飾デアセチルガラクトースの調製
ペルアセチルガラクトース６．２１ｇ（１５．９０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン７５ｍＬに溶解し、プロパルギルアルコール１．０ｍＬ（１８．００ｍｍｏｌ）を加え、０℃に冷却して５分間撹拌し、１５分以内に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル３．０ｍＬ（２４．３０ｍｍｏｌ）を滴下した。０℃で１０分間撹拌しつづけた後、室温で１０時間反応させた。飽和炭酸カリウム溶液で反応を停止し、有機相をジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で３回洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させてろ過し、溶媒を回転蒸発により除去し、プロパルギル修飾ペルアセチルガラクトースを得た。
プロパルギル修飾ペルアセチルガラクトース２．０１ｇ（５．２０ｍｍｏｌ）を０．３０  ｍｏｌ  Ｌ−１ナトリウムメトキシドメタノール溶液５０ｍＬに溶解し、室温で反応させた。TLC（薄層クロマトグラフィー）プレートにスポットして検出して原料が消えたら、Ｈ＋交換樹脂を加えて反応溶液を中性に調整し、ろ過し、回転蒸発により溶媒を除去し、シリカゲルカラム（ジクロロメタン／メタノール＝１０：１）で分離して、プロパルギル修飾デアセチルガラクトースを得た。具体的な方法については、文献（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,２０１２,２３,１１６６−１１７３）を参照されたい。
【００２０】
実施例５：ガラクトース修飾ローダミンＢを共有結合により連結したポリメタクリル酸Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルとポリ（３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリレートとの共重合体（Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ）の調製
実施例４のプロパルギル修飾デアセチルガラクトース３５０．０ｍｇと実施例３のローダミンＢ修飾共重合体ＲｈＢ−ＰＤＭＡＥＭＡ２５−ｃ−ＰＧＭＡ５０−Ｎ３  ２００．１ｍｇをＤＭＦ  ５ｍＬに溶解し、次に硫酸銅９８．０ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム２４２．０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を水５ｍＬに溶解した後、上記反応液に滴下し、反応液を室温で４８時間撹拌した。反応液をろ過し、水溶液中で透析して（透析バッグの分画分子量：８〜１０ｋＤａ）、目的共重合体Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを得た。
【００２１】
実施例６：新規光増感剤複合ナノ多機能材料（Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ）の調製
実施例５の共重合体Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒとセルコスポリンをそれぞれＤＭＳＯに溶解し、２種類の溶液を混合して６時間撹拌した。混合した溶液を再蒸留水にて４８時間透析し、１２時間おきに水を１回交換して、セルコスポリンを担持した、光増感剤複合ナノ多機能材料溶液を調製した。その後、光増感剤複合ナノ多機能材料溶液を０．４５μｍの精密ろ過膜でろ過し、未担持のセルコスポリンを除去して、凍結乾燥機で凍結乾燥させ、セルコスポリンを封入した、光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを調製した。
調製した光増感剤複合ナノ多機能材料をＤＭＳＯに充分に溶解し、マイクロプレートリーダーにより４６３ｎｍでの溶液の吸光度を測定し、セルコスポリンのＤＭＳＯ溶液で作成した検量線より、対応する複合ナノ材料におけるセルコスポリンの濃度を得た。得られた光増感剤複合ナノ多機能材料中のセルコスポリンの担持量は、複合材料中のセルコスポリンの質量／共重合体の質量として９．０％であり、封入率は、複合材料中のセルコスポリンの質量／出発材料におけるセルコスポリンの質量として、３５．６％であった。
【００２２】
実施例７：新規光増感剤複合ナノ多機能材料（Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ）のキャラクタリゼーション
実施例６で調製したＣｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの粒子径分布を動的光散乱技術により測定し、その形態学的特徴を透過型電子顕微鏡により観察した。図１に示すように、動的光散乱粒子径検出を行ったところ、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは粒子径が約１０３±９．９ｎｍのミセルを形成できた。図２に示すように、透過型電子顕微鏡により観察したところ、円形の構造を有し、その粒子径分布が均一であった。
安定性は、光増感剤複合ナノ多機能材料の最も重要な特性の１つであり、生物医学の分野で使用されるナノ粒子は、培地に安定して分散できる必要がある。本実験で調製した光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを１０％ウシ胎児血清を含有する培地に分散させて、その粒子径の変化を測定したところ、図３に示すように、５日以内に明らかな粒子径の変化はなく、それは、この光増感剤複合ナノ多機能材料が良好な安定性を持っていることを示した。
【００２３】
実施例８：新規光増感剤複合ナノ多機能材料（Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ）の酸感受性放出特性
実施例６で調製したＣｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ  １２ｍｇをｐＨ  ５．０又はｐＨ  ７．４のＰＢＳ  １ｍＬに溶解し、透析バッグ（ＭＷＣＯ  ２０００  Ｄａ）に入れて、密閉させた透析バッグのそれぞれを、ｐＨ  ５．０又はｐＨ  ７．４のＰＢＳバッファー（それぞれ１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む）３５ｍＬを含有するビーカーに投入した。ビーカーを恒温（３７℃）のマグネチックスターラーに置き、サンプリング時間を設定し、ピペットを使用してビーカーから２００μＬの放出液を取り出し、対応するｐＨ値の新しいバッファー溶液２００μＬを追加した。マイクロプレートリーダーを使用して、取り出した放出液中のセルコスポリンの吸収強度を検出し、累積放出量を計算した。
図４に示した結果から、中性媒体では、セルコスポリンはゆっくりと放出され、４８時間後の放出率はわずか１５％であり、酸性媒体では、セルコスポリンは「バースト放出」の現象を示し、２４時間以内の累積放出量が７８％に達し、４８時間後の累積放出量が９３％に達した。そのような放出結果は、新規光増感剤複合ナノ多機能材料（Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ）が中性の生理学的条件下で安定して存在し、正常組織への毒性と副作用を低減でき腫瘍細胞・組織の酸性環境では、セルコスポリンをすばやく放出して、後続の光線力学的治療を行うことができることを示している。
【００２４】
実施例９：光増感剤セルコスポリンの一重項酸素生成能の測定
光増感剤の一重項酸素生成能は、光線力学的治療におけるその適用の重要な指標であり、光増感剤であるセルコスポリンの一重項酸素生成能を評価するために、一重項酸素捕捉剤である１,３−ジフェニルイソベンゾフラン（ＤＰＢＦ）の特徴的な吸収ピークの強度変化により一重項酸素の生成を特徴付けた。
図５に示すように、ＤＭＳＯ中の亜鉛フタロシアニンＺｎＰｃの一重項酸素収率は０．６７であり、これを対照とした。セルコスポリン、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ、又はＺｎＰｃのＤＭＳＯ溶液（１．５μＬ、０．１ｍＭ）をＤＰＢＦ溶液３ｍＬに加え、４６３ｎｍの光を０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０分間照射後の吸収スペクトル（３５０〜５５０ｎｍ）を測定した。式ΦΔ（ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｎ）＝ΦΔ（ＺｎＰｃ）×［Ｓ（ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｎ）／Ｓ（ＺｎＰｃ）］×［１−１０−ＯＤ（ＺｎＰｃ）］／［１−１０−ＯＤ（ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｎ）］により計算したところ、セルコスポリンの一重項酸素収率は０．８３であった。ΦΔは一重項酸素量子収量を表し、Ｓ（ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｎ）はセルコスポリンのＤＰＢＦ消費速度を表し、Ｓ（ＺｎＰｃ）は参照溶液でのＤＰＢＦ消費速度を表し、ＯＤ（ＺｎＰｃ）は４６３ｎｍでのＺｎＰｃの吸光度を表し、ＯＤ（ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｎ）は、４６３ｎｍでのセルコスポリンの吸光度を表した。測定されたＣｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ中のセルコスポリンの一重項酸素量子収率は０．８７であり、セルコスポリン単独の場合よりわずかに高く、その理由は、重合体材料中のローダミンＢも光強度を吸収した後、発光波長のエネルギーをセルコスポリンに移して、再び一重項酸素の発生をトリガーすることであった。
【００２５】
実施例１０：新規光増感剤複合ナノ多機能材料（Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ）の各ｐＨ条件での一重項酸素生成能の測定
９,１０−アントラセンジイル−ビス（メチレン）ジマロン酸（ＡＢＤＡ）は、水溶液中の一重項酸素発生を測定するための試薬として使用でき、新規光増感剤複合ナノ多機能材料（Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ）に特定の波長の光が照射すると、ＡＢＤＡは生成された一重項酸素によって酸化され、その蛍光強度が低下し、これにより、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの一重項酸素の生成が間接的に特徴付けられた。Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ（ｐＨ  ５．０のＰＢＳでは、１ｍｇ  ｍＬ−１）１５０μＬ及びＣｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ（ｐＨ  ７．４  ＰＢＳでは、１ｍｇ  ｍＬ−１）１５０μＬを２ｍＬ  ＡＢＤＡ（ｐＨ  ５．０のＰＢＳ又はｐＨ  ７．４のＰＢＳでは、１３  ｍＭ）に加え、４６３ｎｍの光を１０、２０、３０、４０、５０秒照射した後の蛍光スペクトル（４００〜５５０ｎｍ）を測定した。
図６に示した結果から、系のｐＨが７．４の場合、ＡＢＤＡの蛍光強度はほとんど変化しておらず、つまり、一重項酸素の生成は基本的に検出されなかったのに対して、系のｐＨが５．０の場合、ＡＢＤＡの蛍光強度は光照射時間が経るに伴い弱まり、それは、大量の一重項酸素が生成されたことを示した。この結果から明らかなように、酸性条件下では、セルコスポリンはナノ複合物から放出されて光線力学的治療の効果を発揮でき、正常な体液環境下では、ナノ複合物に封入されたままで、その光線力学性能を発揮しなかった。
【００２６】
実施例１１：フローサイトメーター検出による、肝癌細胞ＨｅｐＧ２細胞の表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対する、光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの特異的で標的な認識の証明
フローサイトメーターによる検出実験では、ＨｅｐＧ２細胞とＨＥＫ２９３細胞を、１０％新生仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（１００Ｕ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む）で培養し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて成長させた。対数増殖期にある細胞を取り、０．０２％ＥＤＴＡと０．２５％トリプシンを含有する消化液で消化し、次に、６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０４細胞を接種し、各ウェルに完全培養液２ｍＬを加え、培養プレートをインキュベータに入れて２４時間培養した。１群のＨｅｐＧ２細胞に最終濃度１０ｍｍｏｌ  Ｌ−１のガラクトースを添加して２４時間培養し続け、各群の細胞密度が７０％に達すると、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを加えて８時間培養し続けた。細胞をトリプシンで消化し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、凝集した細胞をＰＢＳに再懸濁してピペッティングした。この遠心分離プロセスを３回繰り返して、蛍光検出への干渉を減らすように、残った培地とミセル溶液を除去した。最後に、細胞をＰＢＳで分散させ、フローサイトメトリーチューブに入れ、各群の細胞の蛍光強度をフローサイトメーターで検出した。
実験では、２つの方法を使用してＨｅｐＧ２細胞を培養し、それぞれ、ガラクトースを含有する培地（表面受容体はガラクトースで事前に飽和されている）とガラクトースを含まない培地（表面のアシアロ糖タンパク質受容体は影響を受けない）で培養した。
図７に示すように、結果から明らかなように、ＨＥＫ２９３細胞内へのＣｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの量がＨｅｐＧ２細胞内へのＣｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの量よりも大幅に少ないことを示した。これは、ＨＥＫ２９３細胞の表面では低発現させたアシアロタンパク質受容体しかないので、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは、表面のガラクトース−アシアロ糖タンパク質受容体により標的に媒介されるエンドサイトーシスを介してすばやく細胞に入ることができないためである。表面のアシアロ糖タンパク質受容体が事前に飽和している場合、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは表面に結合されたガラクトースを介してＨｅｐＧ２細胞を認識できず、非標的エンドサイトーシスのみを介して腫瘍細胞に入ることができるため、ローダミンＢとセルコスポリンの蛍光強度はＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度に相当している。表面受容体を過剰に発現させたＨｅｐＧ２細胞の場合、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは、表面に結合されたガラクトースを介して腫瘍細胞の表面のアシアロ糖タンパク質受容体にすばやく結合し、受容体を介したエンドサイトーシスを介して腫瘍細胞に入ることができ、したがって、ＨｅｐＧ細胞におけるローダミンＢとセルコスポリンの蛍光強度はいずれも最も強かった。
この実験は、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒがＨｅｐＧ２細胞の表面の受容体を特異的に標的に認識し、細胞にうまく取り込まれることを証明した。
【００２７】
実施例１２：共焦点レーザー顕微鏡による実験による、肝癌細胞ＨｅｐＧ２表面のアシアロ糖タンパク質受容体に対する、光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの特異的で標的な認識の証明
実施例６で得られた光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを培養液に加えて、ＨｅｐＧ２及びＨＥＫ２９３細胞とともに細胞培養実験を行い、次に４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで細胞核を染色した。レーザー共焦点顕微鏡実験の結果を図８に示し、ＨｅｐＧ２細胞では、複合材料におけるローダミンＢ由来の蛍光とセルコスポリン由来の蛍光がはっきりと確認でき、一方、ＨＥＫ２９３細胞では、この蛍光はほとんど観察できず、そして、ガラクトース競合がある環境でも、ＨｅｐＧ２細胞ではローダミンＢとセルコスポリンの蛍光は観察されなかった。
この実験は、光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒがガラクトース−アシアロ糖タンパク質受容体によって認識され、ＨｅｐＧ２細胞に入り、セルコスポリンを細胞核に放出できることを証明した。
【００２８】
実施例１３：新規光増感剤複合ナノ多機能材料（Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ）の細胞レベルでの光線力学的治療の効率
ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２細胞と正常細胞ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて２４時間培養した。細胞が付着成長した後、異なる濃度のＣｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを含む新鮮な培養液を加えて、３、６、１２、又は２４時間培養した。培養液を捨て、ｐＨ  ７．４のＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な培地を加えた。培養皿に光（４６３ｎｍ、２０ｍＷ／ｃｍ２）を１５分間照射した後、１２時間培養しつづけた。次に、培養液を取り除き、ＰＢＳバッファー溶液で２回洗浄し、各ウェルにＣＣＫ−８試薬１００μＬを加え、インキュベーターで２時間インキュベートし続けた。多機能マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの各ウェルの吸光度（ＯＤ）を測定し、細胞生存率を計算した。図９に示した結果から、インキュベーション時間が長くなるにつれて、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの細胞に対する毒性は増加する傾向を示し、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒのＨｅｐＧ２に対する毒性はＨＥＫ２９３細胞に対する毒性よりもはるかに高かった。ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２細胞及び正常細胞ＨＥＫ２９３細胞に対するＣｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒの光線力学的治療の毒性実験を通じて、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒがガラクトース−アシアロ糖タンパク質受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを介して光増感剤であるセルコスポリンをＨｅｐＧ２がん細胞へ送達し、特定の波長４６３ｎｍの光により照射されると、がん細胞に対して強力な光線療法の効果を有し、Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒは、優れた光線力学的治療の性能を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月8日(2020.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光増感剤であるセルコスポリンと、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料とを自己組織化して調製された、ことを特徴とする新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
【請求項２】
前記肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料は、ｐＨ感受性を有するメタアクリル酸Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルＤＭＡＥＭＡ単量体と疎水性の３−アジド−２−ヒドロキシプロピルメタクリル酸エステルＧＭＡ−Ｎ３単量体で形成された共重合体であり、一端には蛍光トレース機能を有する蛍光分子が修飾され、他端には肝標的化機能を有する糖分子が修飾されており、
該酸感受性共重合体多機能材料は、疎水性相互作用によって光増感剤分子であるセルコスポリンがその疎水性キャビティに封入されている、ことを特徴とする請求項１に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
【請求項３】
セルコスポリンの封入量が約９質量％であり、前記新規光増感剤複合ナノ多機能材料の粒子径が約１０３ｎｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
【請求項４】
前記肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料は、式１に示される構造式を有する、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
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（Ａは、ローダミンＢ、フルオレセインイソチオシアネート、ボディパイからなる蛍光トレース機能を有する蛍光分子から選ばれる同じ又は異なる１つ又は複数であり、；
Ｂは、肝癌細胞の表面に過剰発現させたアシアロ糖タンパク質受容体を特異的に認識できるガラクトース又はガラクトサミン残基を有する単糖又はオリゴ糖類分子から選ばれる同じ又は異なる１つ又は複数の分子であり、
式１にはＤＭＡＥＭＡの単量体構造が含まれ、ｍはその重合度を表し、ｍ＝４２であり、
式１にはＧＭＡ−Ｎ３の単量体構造が含まれ、ｎはその重合度を表し、ｎ＝６２である）。
【請求項５】
式１中のＡは蛍光分子であるローダミンＢであり、Ｂはガラクトース残基であり、蛍光分子であるローダミンＢ、ＤＭＡＥＭＡ、ＧＭＡ−Ｎ３のモル比が１：４２：６２であり、標的とした前記糖分子とＧＭＡ−Ｎ３のモル比が１：１である、ことを特徴とする請求項４に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料の調製方法であって、
肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料とセルコスポリンをそれぞれＤＭＳＯで溶解し、２種の溶液を混合して撹拌するステップ１）と、
ステップ１）で混合して得られた溶液を再蒸留水にて透析して、断続的に水を交換し、光増感剤複合ナノ多機能材料の溶液を調製するステップ２）と、
光増感剤複合ナノ多機能材料の溶液をろ過することで未担持のセルコスポリンを除去し、凍結乾燥させて、光増感剤複合ナノ多機能材料Ｃｅｒ（ａ）Ｇａｌ−ｐｏｌｙｍｅｒを調製するステップ３）と、を含む、ことを特徴とする調製方法。
【請求項７】
前記ステップ１）では、肝腫瘍細胞に対する標的性、トレーサビリティを有する酸感受性共重合体多機能材料の濃度が１０〜５０ｍｇ／ｍＬ−１であり、
前記ステップ１）では、セルコスポリンの濃度が１０〜５０ｍｇ／ｍＬ−１であり、
前記ステップ１）では、ＤＭＳＯの使用量が０．５〜１ｍＬである、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料を含む肝がん治療のための医薬品。
【請求項９】
肝がん治療薬の開発における請求項１〜５のいずれか１項に記載の新規光増感剤複合ナノ多機能材料の使用。
【国際調査報告】
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