(57)【要約】  本明細書には、動物の感染を処置若しくは予防し、且つ／又は病原体（例えば、動物病原体）若しくはそれらのベクターの適応度を低減させる方法に有用である、複数の植物メッセンジャーパック（例えば、植物細胞外小胞（ＥＶ）又はその断片、部分若しくは抽出物など）を含む病原体防除組成物が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物であって、前記複数のＰＭＰの各々は、異種病原体防除剤を含み、前記組成物は、農業若しくは獣医学対象動物病原体又はそれらのベクターへの送達のために製剤化される、病原体防除組成物。
【請求項２】
前記異種病原体防除剤は、抗菌剤、抗真菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤である、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３】
前記抗菌剤は、ドキソルビシンである、請求項２に記載の病原体防除組成物。
【請求項４】
前記抗菌剤は、抗生物質である、請求項２に記載の病原体防除組成物。
【請求項５】
前記抗生物質は、バンコマイシンである、請求項４に記載の病原体防除組成物。
【請求項６】
前記抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、マクロライド、アミノグリコシド、キノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、グリコペプチド、リポグリコペプチド、オキサゾリジノン、リファマイシン、ツベルアクチノマイシン、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、チニダゾール、ニトロフラントイン、テイコプラニン、テラバンシン、リネゾリド、シクロセリン２、バシトラシン、ポリミキシンＢ、バイオマイシン又はカプレオマイシンである、請求項４に記載の病原体防除組成物。
【請求項７】
前記抗真菌剤は、アリルアミン、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、ポリエン又はエキノカンジンである、請求項２に記載の病原体防除組成物。
【請求項８】
前記殺虫剤は、クロロニコチニル、ネオニコチノイド、カルバメート、有機リン酸エステル、ピレトロイド、オキサジアジン、スピノシン、シクロジエン、有機塩素、フィプロール、メクチン、ジアシルヒドラジン、ベンゾイル尿素、有機スズ、ピロール、ジニトロテルペノール、ＭＥＴＩ、テトロン酸、テトラミン酸又はフタルアミドである、請求項２に記載の病原体防除組成物。
【請求項９】
前記異種病原体防除剤は、小分子、核酸又はポリペプチドである、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項１０】
前記小分子は、抗生物質又は二次代謝産物である、請求項９に記載の病原体防除組成物。
【請求項１１】
前記核酸は、阻害性ＲＮＡである、請求項９に記載の病原体防除組成物。
【請求項１２】
前記異種病原体防除剤は、複数のＰＭＰの各々によって封入される、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項１３】
前記異種病原体防除剤は、前記複数のＰＭＰの各々の表面に埋め込まれる、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項１４】
前記異種病原体防除剤は、前記複数のＰＭＰの各々の表面に共役される、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項１５】
前記複数のＰＭＰの各々は、追加的な病原体防除剤をさらに含む、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項１６】
前記病原体は、細菌、真菌、寄生昆虫、寄生線虫又は寄生原虫である、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項１７】
前記細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である、請求項１６に記載の病原体防除組成物。
【請求項１８】
前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、請求項１７に記載の病原体防除組成物。
【請求項１９】
前記エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１７に記載の病原体防除組成物。
【請求項２０】
前記真菌は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種である、請求項１６に記載の病原体防除組成物。
【請求項２１】
前記寄生昆虫は、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種である、請求項１６に記載の病原体防除組成物。
【請求項２２】
前記寄生線虫は、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種である、請求項１６に記載の病原体防除組成物。
【請求項２３】
前記寄生原虫は、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種である、請求項１６に記載の病原体防除組成物。
【請求項２４】
前記ベクターは、昆虫である、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項２５】
前記ベクターは、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである、請求項２４に記載の病原体防除組成物。
【請求項２６】
室温で少なくとも１日間にわたって安定しており、且つ／又は４℃で少なくとも１週間にわたって安定している、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項２７】
前記ＰＭＰは、４℃で少なくとも２４時間、４８時間、７日間又は３０日間にわたって安定している、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項２８】
前記ＰＭＰは、少なくとも２０℃、２４℃又は３７℃の温度で安定している、請求項２７に記載の病原体防除組成物。
【請求項２９】
前記組成物中の前記複数のＰＭＰは、動物病原体の適応度を低減させるのに有効な濃度である、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３０】
前記組成物中の前記複数のＰＭＰは、動物病原体ベクターの適応度を低減させるのに有効な濃度である、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３１】
前記組成物中の前記複数のＰＭＰは、病原体に感染した動物の感染を処置するのに有効な濃度である、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３２】
前記組成物中の前記複数のＰＭＰは、病原体への感染のリスクがある動物において感染を予防するのに有効な濃度である、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３３】
前記組成物中の前記複数のＰＭＰは、０．０１ｎｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇ、２ｎｇ、３ｎｇ、４ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、７５０ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌの濃度である、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３４】
農業的に許容可能な担体を含む、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３５】
薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３６】
前記ＰＭＰを安定化するために製剤化される、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３７】
液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化される、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３８】
少なくとも５％のＰＭＰを含む、請求項１に記載の病原体防除組成物。
【請求項３９】
複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物であって、前記ＰＭＰは、
（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、前記植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；
（ｂ）前記初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、前記粗ＰＭＰ画分は、前記初期サンプル中のレベルに対して、前記植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベルを有する、ステップ；
（ｃ）前記粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、前記複数の純粋なＰＭＰは、前記粗ＥＶ画分中のレベルに対して、前記植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベルを有する、ステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記複数のＰＭＰに病原体防除薬剤をロードするステップ；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記ＰＭＰを農業若しくは獣医学対象動物病原体又はそのベクターへの送達のために製剤化するステップ
を含むプロセスによって植物から単離される、病原体防除組成物。
【請求項４０】
請求項１に記載の病原体防除組成物を含む動物病原体。
【請求項４１】
請求項１に記載の病原体防除組成物を含む動物病原体ベクター。
【請求項４２】
動物に病原体防除組成物を送達する方法であって、請求項１に記載の組成物を前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項４３】
感染の処置を、それを必要とする動物において行う方法であって、有効量の、請求項１に記載の組成物を前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項４４】
感染を、そのリスクがある動物において予防する方法であって、有効量の、請求項１に記載の組成物を前記動物に投与するステップを含み、非処置動物に対して前記動物における前記感染の可能性を低減させる方法。
【請求項４５】
前記感染は、病原体によって引き起こされ、且つ前記病原体は、細菌、真菌、ウイルス、寄生昆虫、寄生線虫又は寄生原虫である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記真菌は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記寄生昆虫は、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記寄生線虫は、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記寄生原虫は、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記病原体防除組成物は、前記動物に経口、静脈内又は皮下投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
病原体防除組成物を病原体に送達する方法であって、前記病原体を、請求項１に記載の組成物と接触させるステップを含む方法。
【請求項５３】
病原体の適応度を低減させる方法であって、請求項１に記載の組成物を前記病原体に送達するステップを含み、非処置病原体に対して前記病原体の前記適応度を低減させる方法。
【請求項５４】
前記病原体が成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に前記組成物を送達するステップを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物は、前記病原体による摂取のための病原体摂食可能組成物として送達される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記病原体は、細菌、真菌、寄生昆虫、寄生線虫又は寄生原虫である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記真菌は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記寄生昆虫は、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記寄生線虫は、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記寄生原虫は、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
動物病原体ベクターの適応度を低減させる方法であって、有効量の、請求項１に記載の組成物を前記ベクターに送達するステップを含み、非処置ベクターに対して前記ベクターの前記適応度を低減させる方法。
【請求項６４】
前記ベクターが成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に前記組成物を送達するステップを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記組成物は、前記ベクターによる摂取のための摂食可能組成物として送達される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ベクターは、昆虫である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記昆虫は、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
真菌感染を有する動物を処置する方法であって、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項７０】
真菌感染を有する動物を処置する方法であって、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記動物に投与するステップを含み、前記複数のＰＭＰは、抗真菌剤を含む、方法。
【請求項７１】
前記抗真菌剤は、前記真菌感染を引き起こす真菌の遺伝子の発現を阻害する核酸である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記遺伝子は、フィラメント成長促進タンパク質（ＥＦＧ１）である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記真菌感染は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）によって引き起こされる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＰＭＰを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記真菌感染低減させるか又は実質的に排除する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
細菌感染を有する動物を処置する方法であって、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項７７】
細菌感染を有する動物を処置する方法であって、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記動物に投与するステップを含み、前記複数のＰＭＰは、抗菌剤を含む、方法。
【請求項７８】
前記抗菌剤は、アムホテリシンＢである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＰＭＰを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記細菌感染を低減させるか又は実質的に排除する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記動物は、獣医学対象動物又は家畜動物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８３】
寄生昆虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記寄生昆虫に送達するステップを含む方法。
【請求項８４】
寄生昆虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記寄生昆虫に送達するステップを含み、前記複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む、方法。
【請求項８５】
前記殺虫剤は、ペプチド核酸である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記昆虫は、トコジラミである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
非処置寄生昆虫に対して前記寄生昆虫の前記適応度を低減させる、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
寄生線虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記寄生線虫に送達するステップを含む方法。
【請求項８９】
寄生線虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記寄生線虫に送達するステップを含み、前記複数のＰＭＰは、殺線虫剤を含む、方法。
【請求項９０】
前記寄生線虫は、ヘリグモソモイデス・ポリギルス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
非処置寄生線虫に対して前記寄生線虫の前記適応度を低減させる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
寄生原虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記寄生原虫に送達するステップを含む方法。
【請求項９３】
寄生原虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記寄生原虫に送達するステップを含み、前記複数のＰＭＰは、抗寄生虫剤を含む、方法。
【請求項９４】
前記寄生原虫は、膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
非処置寄生原虫に対して前記寄生原虫の前記適応度を低減させる、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記ベクターに送達するステップを含む方法。
【請求項９７】
動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を前記ベクターに送達するステップを含み、前記複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む、方法。
【請求項９８】
非処置ベクターに対して前記ベクターの前記適応度を低減させる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記昆虫は、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである、請求項９６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
動物病原体（例えば、細菌、真菌、寄生体又はウイルス）を含む病原体は、ヒト及び動物に深刻な疾患を引き起こす。動物病原体又はそれらのベクターを防除するために多数の手段が使用されているが、安全且つ効果的な病原体防除戦略に対する需要が高まっている。従って、動物病原体を防除するための新規の方法及び組成物が当技術分野において求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本明細書には、感染の処置を、それを必要とする動物において行うか、感染を、そのリスクがある動物において予防するか、又は病原体（例えば、動物病原体）若しくはそれらのベクターの適応度を低減させる方法に有用である、複数の植物メッセンジャーパックを含む病原体防除組成物が開示される。
【０００３】
一態様では、本開示は、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、本組成物は、動物への送達のために製剤化され、本組成物は、ｗｔ／ｖｏｌにより測定して少なくとも５％のＰＭＰ、パーセントＰＭＰタンパク質組成物及び／又はパーセント脂質組成物（例えば、蛍光標識脂質を測定することによる）を含む。
【０００４】
別の態様では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、本組成物は、動物病原体への送達のために製剤化され、本組成物は、少なくとも５％のＰＭＰを含む。
【０００５】
また別の態様では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、本組成物は、動物病原体ベクターへの送達のために製剤化され、本組成物は、少なくとも５％のＰＭＰを含む。
【０００６】
さらに別の態様では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、本組成物は、室温で少なくとも１日間にわたって安定しており、且つ／又は４℃で少なくとも１週間にわたって安定している。
【０００７】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、動物病原体又は動物病原体ベクターの適応度を低減させるのに有効な濃度である。一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、病原体に感染した動物の感染を処置するのに有効な濃度である。他の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、病原体への感染のリスクがある動物の感染を予防するのに有効な濃度である。
【０００８】
別の態様では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、組成物中の複数のＰＭＰは、動物病原体の適応度を低減させるのに有効な濃度である。
【０００９】
また別の態様では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、組成物中の複数のＰＭＰは、動物病原体ベクターの適応度を低減させるのに有効な濃度である。
【００１０】
さらに別の態様では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、組成物中の複数のＰＭＰは、病原体に感染した動物の感染を処置するのに有効な濃度である。
【００１１】
さらにまた別の態様では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、組成物中の複数のＰＭＰは、病原体に感染するリスクがある動物の感染を予防するのに有効な濃度である。
【００１２】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、少なくとも０．０１ｎｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇ、２ｎｇ、３ｎｇ、４ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、７５０ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌの濃度である。一部の実施形態では、複数のＰＭＰは、追加的な病原体防除剤をさらに含む。
【００１３】
別の態様では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、複数のＰＭＰの各々は、異種病原体防除剤を含み、組成物は、農業若しくは獣医学対象動物病原体又はそれらのベクターへの送達のために製剤化される。
【００１４】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、異種病原体防除剤は、抗菌剤、例えばドキソルビシン、抗真菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤である。一部の実施形態では、抗菌剤は、抗生物質、例えばバンコマイシン、ペニシリン、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、マクロライド、アミノグリコシド、キノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、グリコペプチド、リポグリコペプチド、オキサゾリジノン、リファマイシン、ツベルアクチノマイシン、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、チニダゾール、ニトロフラントイン、テイコプラニン、テラバンシン、リネゾリド、シクロセリン２、バシトラシン、ポリミキシンＢ、バイオマイシン又はカプレオマイシンである。
【００１５】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、抗真菌剤は、アリルアミン、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、ポリエン又はエキノカンジンである。
【００１６】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、殺虫剤は、クロロニコチニル、ネオニコチノイド、カルバメート、有機リン酸エステル、ピレトロイド、オキサジアジン、スピノシン、シクロジエン、有機塩素、フィプロール、メクチン、ジアシルヒドラジン、ベンゾイル尿素、有機スズ、ピロール、ジニトロテルペノール、ＭＥＴＩ、テトロン酸、テトラミン酸又はフタルアミドである。
【００１７】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、異種病原体防除剤は、小分子（例えば、抗生物質若しくは二次代謝物）、核酸（例えば、阻害性ＲＮＡ）又はポリペプチドである。
【００１８】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、異種病原体防除剤は、複数のＰＭＰの各々によって封入されるか；複数のＰＭＰの各々の表面に埋め込まれるか；又は複数のＰＭＰの各々の表面に共役される。一部の実施形態では、複数のＰＭＰの各々は、追加的な病原体防除剤をさらに含む。
【００１９】
一部の実施形態では、病原体は、細菌（例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種若しくはカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種）、真菌（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種若しくはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種）、寄生昆虫（例えば、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種）、寄生線虫（例えば、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種）又は寄生原虫（例えば、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種）である。
【００２０】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、ベクターは、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである。
【００２１】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、組成物は、室温で少なくとも１日間にわたって安定しており、且つ／若しくは４℃で少なくとも１週間にわたって安定しているか；４℃で少なくとも２４時間、４８時間、７日間若しくは３０日間にわたって安定しているか；又は少なくとも２０℃、２４℃若しくは３７℃の温度で安定している。
【００２２】
病原体防除組成物の一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、動物病原体若しくは動物病原体ベクターの適応度を低減させるのに有効な濃度；病原体に感染した動物の感染を処置するのに有効な濃度；又は病原体への感染のリスクがある動物の感染を予防するのに有効な濃度である。
【００２３】
一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、少なくとも０．０１ｎｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇ、２ｎｇ、３ｎｇ、４ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、７５０ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍＬの濃度である。
【００２４】
一部の実施形態では、組成物は、農業的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＭＰを安定化するために製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも５％のＰＭＰを含む。
【００２５】
別の実施形態では、本開示は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を特徴とし、ここで、ＰＭＰは、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプル中のレベルに対して、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベルを有する、ステップ；（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分中のレベルに対して、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベルを有する、ステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）の複数のＰＭＰに病原体防除薬剤をロードするステップ；及び（ｅ）ステップ（ｄ）のＰＭＰを農業若しくは獣医学対象動物病原体又はそのベクターへの送達のために製剤化するステップを含むプロセスによって植物から単離される。
【００２６】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される病原体防除組成物のいずれか１つを含む動物病原体を特徴とする。
【００２７】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される病原体防除組成物のいずれか１つを含む動物病原体ベクターを特徴とする。
【００２８】
また別の態様では、本開示は、病原体防除組成物を動物に送達する方法を特徴とし、これは、本明細書に記載される病原体防除組成物のいずれか１つを動物に投与するステップを含む。
【００２９】
さらに別の実施形態では、本開示は、感染の処置を、それを必要とする動物において行う方法を特徴とし、ここで、本方法は、有効量の、本明細書に記載される組成物のいずれか１つを動物に投与するステップを含む。
【００３０】
さらにまた別の実施形態では、本開示は、感染を、そのリスクがある動物において予防する方法を特徴とし、ここで、本方法は、有効量の、本明細書に記載される病原体防除組成物のいずれか１つを動物に投与するステップを含み、本方法は、非処置動物に対して動物の感染の可能性を低減させる。
【００３１】
前述した方法の一部の実施形態では、感染は、病原体によって引き起こされ、且つ病原体は、細菌（例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種若しくはカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種）、真菌（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種若しくはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種）、ウイルス、寄生昆虫（例えば、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種）、寄生線虫（例えば、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種）又は寄生原虫（例えば、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種）である。
【００３２】
一部の実施形態では、病原体防除組成物は、動物に経口、静脈内又は皮下投与される。
【００３３】
別の態様では、本開示は、病原体防除組成物を病原体に送達する方法を特徴とし、これは、病原体を、本明細書に記載の病原体防除組成物のいずれか１つと接触させるステップを含む。
【００３４】
別の態様では、本開示は、病原体の適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、本明細書に記載の病原体防除組成物のいずれか１つを病原体に送達するステップを含み、本方法は、非処置病原体に対して病原体の適応度を低減させる。
【００３５】
一部の実施形態では、本方法は、病原体が成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達するステップを含む。一部の実施形態では、本組成物は、病原体による摂取のための病原体摂食可能組成物として送達される。
【００３６】
前述した方法の一部の実施形態では、病原体は、細菌（例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種若しくはカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種）、真菌（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種若しくはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種）、寄生虫（例えば、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種）、寄生線虫（例えば、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種）又は寄生原虫（例えば、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種）である。
【００３７】
一部の実施形態では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される。
【００３８】
別の態様では、本開示は、動物病原体ベクターの適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、有効量の、本明細書に記載の病原体防除組成物のいずれか１つをベクターに送達するステップを含み、本方法は、非処置ベクターに対して上記ベクターの適応度を低減させる。
【００３９】
一部の実施形態では、本方法は、ベクターが成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達するステップを含む。一部の実施形態では、本組成物は、ベクターによる摂取のための摂食可能組成物として送達される。一部の実施形態では、ベクターは、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミである。一部の実施形態では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される。
【００４０】
別の態様では、本開示は、真菌感染を有する動物を処置する方法を特徴とし、ここで、本方法は、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含む。
【００４１】
別の態様では、本開示は、真菌感染を有する動物を処置する方法を特徴とし、ここで、本方法は、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗真菌剤を含む。
【００４２】
一部の実施形態では、抗真菌剤は、真菌感染を引き起こす真菌の遺伝子の発現を阻害する核酸である。一部の実施形態では、遺伝子は、フィラメント成長促進タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＦＧ１）である。一部の実施形態では、真菌感染は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）によって引き起こされる。
【００４３】
一部の実施形態では、組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＰＭＰを含む。
【００４４】
一部の実施形態では、本方法は、真菌感染を低減するか又は実質的に排除する。
【００４５】
別の態様では、本開示は、細菌感染を有する動物を処置する方法を特徴とし、ここで、本方法は、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含む。
【００４６】
別の態様では、本開示は、細菌感染を有する動物を処置する方法を特徴とし、ここで、本方法は、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗菌剤を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、抗菌剤は、アムホテリシンＢである。
【００４８】
一部の実施形態では、細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である。
【００４９】
一部の実施形態では、組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＰＭＰを含む。
【００５０】
一部の実施形態では、本方法は、細菌感染を低減するか又は実質的に排除する。
【００５１】
一部の実施形態では、動物は、獣医学対象動物又は家畜動物である。
【００５２】
別の態様では、本開示は、寄生昆虫の適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生昆虫に送達するステップを含む。
【００５３】
別の態様では、本開示は、寄生昆虫の適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生昆虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、殺虫剤は、ペプチド核酸である。
【００５５】
一部の実施形態では、寄生虫は、トコジラミである。
【００５６】
一部の実施形態では、本方法は、非処置寄生昆虫に対して寄生昆虫の適応度を低減させる。
【００５７】
別の態様では、本開示は、寄生線虫の適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生線虫に送達するステップを含む。
【００５８】
別の態様では、本開示は、寄生線虫の適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生線虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺線虫剤を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、寄生線虫は、ヘリグモソモイデス・ポリギルス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）である。
【００６０】
一部の実施形態では、本方法は、非処置寄生線虫に対して寄生線虫の適応度を低減させる。
【００６１】
別の態様では、本開示は、寄生原虫の適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生原虫に送達するステップを含む。
【００６２】
別の態様では、本開示は、寄生原虫の適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生原虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗寄生虫剤を含む。
【００６３】
一部の実施形態では、寄生原虫は、膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）である。
【００６４】
一部の実施形態では、本方法は、非処置寄生原虫に対して寄生原虫の適応度を低減させる。
【００６５】
別の態様では、本開示は、動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物をベクターに送達するステップを含む。
【００６６】
別の態様では、本開示は、動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低減させる方法を特徴とし、ここで、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物をベクターに送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、本方法は、非処置ベクターに対してベクターの適応度を低減させる。一部の実施形態では、昆虫は、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである。
【００６８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００６９】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「動物」は、ヒト、家畜、農場動物又は獣医学対象哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ及びヒト以外の霊長類を含む）を指す。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「病原体の適応度を低減させる」は、限定されないが、以下の所望の効果：（１）病原体の個体群の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（２）病原体の繁殖率の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（３）病原体の移動性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（４）病原体の体重若しくは質量の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（５）病原体の代謝率又は活動の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える低減；又は（６）病原体による病原体伝染（例えば、１つの昆虫から別の昆虫への病原体の垂直若しくは水平伝染）の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少のいずれか１つ以上を含め、本明細書に記載される病原体防除組成物の投与がもたらす結果としての病原体の生理機能のいずれかの破綻を指す。病原体適応度の低減は、例えば、非処置病原体と比較して決定することができる。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「ベクターの適応度を低減させる」は、限定されないが、以下の所望の効果：（１）ベクターの個体群の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（２）ベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）の繁殖率の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（３）ベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）の移動性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（４）ベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）の体重の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（５）ベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）の代謝率又は活動の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える増加；（６）ベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）によるベクター−ベクター病原体伝染（例えば、１つの昆虫から別の昆虫へのベクターの垂直若しくは水平伝染）の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（７）ベクター−動物病原体伝染の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（８）ベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）寿命の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える減少；（９）農薬（例えば、殺虫剤）に対するベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）感受性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える増大；又は（１０）ベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）によるベクター競合性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％若しくはそれを超える低減のいずれか１つ以上を含め、本明細書に記載されるベクター防除組成物の投与がもたらす結果としてのベクターの生理機能又は前記ベクターにより実施される任意の活動のいずれかの破綻を指す。ベクター適応度の低減は、例えば、非処置ベクターと比較して決定することができる。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、用語「動物への送達のために製剤化される」とは、薬学的に許容可能な担体を含む病原体防除組成物を指す。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「病原体への送達のために製剤化される」とは、薬学的に許容可能な担体又は農業的に許容可能な担体を含む病原体防除組成物を指す。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクターへの送達のために製剤化される」とは、農業的に許容可能な担体を含む病原体防除組成物を指す。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、用語「感染」は、動物（例えば、動物の１つ若しくは複数の部分）体内、動物（例えば、動物の１つ若しくは複数の部分）身体上又は動物周囲の生息場所における病原体の存在又はそのコロニー形成を指し、特に例えば疾患、疾患症状又は免疫（例えば、炎症）反応を引き起こすことにより、その感染が動物の適応度を低減させる場合を指す。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、置き換え可能であり、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００又はそれを超える核酸）とは関係なく、直鎖状若しくは分岐、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はそれらのハイブリッドを指す。この用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ヌクレオチドは、典型的に、リン酸ジエステル結合により核酸中で連結されるが、用語「核酸」は、他のタイプの結合又は骨格（例えば、中でも、ホスホロアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダート、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）結合又は骨格）を有する核酸類似体も包含する。核酸は、一本鎖、二本鎖であり得るか、又は一本鎖及び二本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ並びに例えばアデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル及び修飾若しくは非標準塩基（例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン及び５ヒドロキシメチルシトシンシトシンを含む）をはじめとする塩基の任意の組合せを含み得る。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、用語「病原体」は、例えば、（ｉ）動物に直接感染することにより、（ｉｉ）動物に疾患若しくは疾患症状を引き起こす物質を産生する（例えば、病原性毒素などを産生する細菌）ことにより、且つ／又は（ｉｉｉ）動物に免疫（例えば、炎症反応）を誘発する（例えば、刺咬昆虫、例えばトコジラミ）ことにより、動物に疾患又は疾患症状を引き起こす微生物又は無脊椎動物などの生物を指す。本明細書で使用されるとき、病原体は、限定されないが、細菌、原虫、寄生体、真菌、線虫、昆虫、ウイロイド及びウイルス又はそれらの組合せを含み、この場合、各病原体は、単独で又は別の病原体と共同でヒトに疾患又は症状を誘発し得る。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、用語「病原体防除組成物」は、複数の植物メッセンジャー（ＰＭＰ）パックを含む抗菌剤、抗真菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤（例えば、殺蠕虫薬）、寄生虫駆除剤、抗寄生虫剤、殺虫剤、殺線虫剤又はベクター忌避剤組成物を指す。複数のＰＭＰの各々は、病原体防除剤、例えば異種病原体防除剤を含み得る。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」、「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００アミノ酸又はそれを超える）、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）の有無又は例えばペプチドに共有結合的に連結した１つ以上の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質等）の存在に関わらず、天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸鎖（Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸のいずれも）を包含し、例えば天然タンパク質、合成若しくは組換えのポリペプチド及びペプチド、ハイブリッド分子、ペプトイド又はペプチドミメティクスが含まれる。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、２つの配列間の「パーセント同一性」は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されるＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムによって決定される。ＢＬＡＳＴ解析の実行用ソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に利用可能である。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、用語「病原体防除剤」は、昆虫、軟体動物、線虫、真菌、細菌又はウイルスなどの農業、環境又は家庭／住居病原体又は病原体ベクターの適応度を制御するか又は低減させる（例えば、殺傷するか、又は成長、繁殖、分裂、生殖若しくは拡大を阻害する）薬剤、組成物又はそれに含まれる物質を指す。病原体防除剤は、天然に存在するか又は合成の殺虫剤（幼虫駆除剤若しくは成虫駆除剤）、昆虫成長調節物質、殺ダニ剤（ダニ駆除剤）、軟体動物駆除剤、殺線虫剤、外部寄生生物撲滅薬、殺菌剤、殺真菌剤又は除草剤を包含するものと理解される。用語「病原体防除剤」は、抗生物質、抗ウイルス薬、農薬、抗真菌薬、抗寄生虫剤、栄養素及び／又は病原体若しくは病原体ベクターの運動を停止又は緩徐にする薬剤をさらに包含し得る。一部の例では、病原体防除剤は、アレロケミカルである。本明細書で使用されるとき、「アレロケミカル」又は「アレロケミカル薬剤」は、別の生物（例えば、病原体又は病原体ベクター）の生理学的機能（例えば、発芽、成長、生存又は繁殖）に影響を及ぼすことができる生物（例えば、植物）によって産生される物質である。
【００８２】
病原体防除剤は、異種であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「異種」は、（１）植物に対して外来性である（例えば、ＰＭＰが産生される植物若しくは植物部分ではない起源に由来する）（例えば、本明細書に記載のロード手法により添加される）か、又は（２）ＰＭＰが産生される植物細胞若しくは組織に対して内在性であるが、天然に存在するより高い（例えば、天然に存在する植物細胞外小胞中に存在する濃度より高い）濃度でＰＭＰ中に存在する（例えば、本明細書に記載のロード手法、遺伝子操作、インビトロ若しくはインビボ手法を用いてＰＭＰに添加される）かのいずれかである薬剤（例えば、病原体防除剤）を指す。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、用語「植物」は、全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子及びその子孫を指す。植物細胞には、限定なしに、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉又は小胞子の細胞が含まれる。植物部位には、限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、果実、収穫物、腫瘍組織、樹液及び様々な形態の細胞及び培養物（例えば、単一細胞、プロトプラスト、胚及びカルス組織）を含めた、分化した及び未分化の組織が含まれる。植物組織は、植物のものであるか、又は植物器官、組織若しくは細胞培養物のものであり得る。加えて、植物は、例えば、本明細書に記載の方法又は組成物におけるいずれかの病原体防除組成物の異種タンパク質若しくはＲＮＡを生産するように遺伝子操作され得る。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、用語「植物細胞外小胞」、「植物ＥＶ」又は「ＥＶ」は、植物中に天然に存在する内包脂質二重層構造を指す。任意選択で、植物ＥＶは、１つ又は複数の植物ＥＶマーカを含む。本明細書で使用されるとき、用語「植物ＥＶマーカ」は、植物タンパク質、タンパク質核酸、植物小分子、植物脂質又はそれらの組合せなどの天然に植物に付随する成分を指し、限定されないが、付録に列挙する植物ＥＶマーカのいずれかを含む。一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物ＥＶマーカの識別マーカであるが、農業用薬剤ではない。一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物ＥＶマーカの識別マーカであり、且つ農業用薬剤でもある（例えば、複数のＰＭＰと結合しているか若しくはそれらに封入されているか、又は複数のＰＭＰと直接結合していないか若しくはそれらに封入されていない）。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、用語「植物メッセンジャーパック」又は「ＰＭＰ」は、直径が約５〜２０００ｎｍ（例えば、少なくとも５〜１０００ｎｍ、少なくとも５〜５００ｎｍ、少なくとも４００〜５００ｎｍ、少なくとも２５〜２５０ｎｍ、少なくとも５０〜１５０ｎｍ又は少なくとも７０〜１２０ｎｍ）の脂質構造（例えば、脂質二重層、単層、多層構造；例えば、小胞脂質構造）を指し、これは、それらに結合した脂質若しくは非脂質成分（例えば、ペプチド、核酸若しくは小分子）を含め、植物起源又はその断片、部分若しくは抽出物から得られ（例えば、濃縮、単離若しくは精製され）、植物、植物部分又は植物細胞から濃縮、単離若しくは精製されており、この場合、濃縮又は単離は、起源植物から１つ若しくは複数の混入物又は不要な要素を除去することである。ＰＭＰは、天然に存在するＥＶの高度に精製された調製物であり得る。好ましくは、起源植物からの混入物又は不要な要素、起源植物からの１つ若しくは複数の混入物又は不要な要素、例えば植物細胞壁要素；ペクチン；植物オルガネラ（例えば、ミトコンドリア；葉緑体、白色体若しくはアミロプラストなどの色素体；及び核）；植物クロマチン（例えば、植物染色体）；又は植物分子凝集体（例えば、タンパク質凝集体、タンパク質−核酸凝集体、リポタンパク質凝集体若しくは脂質−タンパク質構造）の少なくとも１％（例えば、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％若しくは１００％）が除去される。好ましくは、ＰＭＰは、重量（ｗ／ｗ）、スペクトルイメージング（％透過率）又は伝導率（Ｓ／ｍ）により測定した場合、起源植物からの１つ若しくは複数の混入物又は不要な要素に対して、少なくとも３０％純粋（例えば、少なくとも４０％純粋、少なくとも５０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも７０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９９％純粋若しくは少なくとも１００％純粋）である。
【００８６】
ＰＭＰは、任意選択で、異種機能性薬剤、例えば病原体防除剤、忌避剤、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子などの追加的な薬剤を含み得る。ＰＭＰは、薬剤を標的植物に送達することを可能にする様々な方法において、例えば薬剤の封入、脂質二重層構造内への薬剤の組込み又は脂質二重層構造の表面と薬剤の結合（例えば、共役）により、追加的な薬剤（例えば異種機能性薬剤）を担持させるか又はそれらと結合させることができる。異種機能性薬剤は、インビボ（例えば、植物中に）又はインビトロ（例えば、組織細胞中、細胞培養物中に若しくは合成により組み込んで）のいずれかでＰＭＰに組み込むことができる。本明細書で使用されるとき、用語「忌避剤」は、病原体ベクター（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、ダニ又はシラミ）が動物に接近又はそこに残留することを防ぐ薬剤、組成物又はそれらに含まれる物質を指す。忌避剤は、例えば、動物上又はその近傍の病原体ベクターの数を減少させ得るが、必ずしも病原体ベクターを殺傷するか又はその適応度を低減させるわけではない。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、用語「処置」は、予防及び／又は治療目的で動物に医薬組成物を投与することを指す。「感染を予防すること」は、依然として病気ではないが、特定の疾患に罹患しやすいか又はそうでなければそのリスクがある動物の予防的処置を指す。「感染を処置すること」は、動物の状態を改善又は安定化するために、既に罹患した動物に対して処置を施すことを指す。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、用語「感染を処置する」とは、個体の状態を改善又は安定化するために、既にある疾患に罹患した個体に対して処置を施すことを指す。これは、初期量と比較して、動物体内、身体上若しくは周囲の１つ若しくは複数の病原体による病原体のコロニー形成を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％）低減すること及び／又は個体に対する利益（例えば、症状の分利に十分な量のコロニー形成の減少）を可能にすることを含み得る。このような例では、感染処置は、症状の低減（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）として現れ得る。一部の例では、個体の生存の可能性を増加する（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％の増加）か、又は個体群の全生存率を増加する（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％の増加）上で有効である。例えば、組成物及び方法は、感染を「実質的に排除する」上で有効であり得るが、これは、動物の症状を持続可能に（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月にわたって）分利する上で十分な量の感染の低減を指す。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、用語「感染を予防する」とは、初期病原体個体群（例えば、健康な個体に存在する大まかな量）を維持するのに十分な量で動物体内、身体上若しくは周囲の１つ若しくは複数の病原体によるコロニー形成の増加を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超）予防し、感染の発症を予防し、且つ／又は感染に関連する症状若しくは状態を予防することを指す。例えば、免疫不全個体（例えば、癌、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを有するか若しくは免疫抑制剤を摂取している個体）又は長期抗生物質療法を受けている個体において、侵襲的医療処置の準備（例えば、移植、幹細胞療法、移植片、プロテーゼを受けるか、長期若しくは高頻度で静脈内カテーテル法を受けるか、又は集中治療室内での処置を受けるなどの手術の準備）をする間、個体は、真菌感染を予防するための予防処置を受けることができる。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、用語「安定したＰＭＰ組成物」（例えば、ロード又は非ロードＰＭＰを含む組成物）は、一定の期間（例えば、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも３０日、少なくとも６０日又は少なくとも９０日）にわたり、任意選択で規定の温度範囲（例えば、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃若しくは３０℃）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃若しくは２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃若しくは１５℃）、少なくとも−２０℃（例えば、少なくとも−２０℃、−１５℃、−１０℃若しくは０℃）又は少なくとも−８０℃（例えば、少なくとも−８０℃、−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃若しくは−３０℃）の温度）において、（例えば、生成若しくは製剤化時点の）ＰＭＰ組成物中のＰＭＰの数と比較して、ＰＭＰの初期数（例えば、溶液１ｍＬ当たりのＰＭＰ）の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％）を保持するか；又は任意選択で規定の温度範囲（例えば、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃若しくは３０℃）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃若しくは２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃若しくは１５℃）、少なくとも−２０℃（例えば、少なくとも−２０℃、−１５℃、−１０℃若しくは０℃）又は少なくとも−８０℃（例えば、少なくとも−８０℃、−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃若しくは−３０℃）の温度）において、（例えば、生成若しくは製剤化時点の）ＰＭＰの初期活性と比較して、その活性（例えば、病原体防除及び／又は忌避剤活性）の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％）を保持する、ＰＭＰ組成物を指す。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、用語「非処置」は、病原体防除組成物を送達されていない個別の動物を含め、病原体防除組成物と接触させていないか、又はそれを送達されていない動物又は病原体ベクターを指し、処置を受けた同じ動物を病原体防除組成物の送達前の時点で評価するか、又は処置を受けた同じ動物をその動物の非処置部分で評価する。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、保有宿主から動物に動物病原体を運搬又は伝播することができる昆虫を指す。例示的なベクターとして、昆虫、例えばカメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）及び一部のハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）並びに双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）に見出されるような突き刺し、吸う口器を有するもの、例えば蚊、ミツバチ、スズメバチ、ユスリカ、シラミ、ツェツェバエ、ノミ及びアリ並びにマダニ及びダニなどのクモ網（Ａｒａｃｈｎｉｄａｅ）のメンバーが挙げられる。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、用語「砂じょう（ｊｕｉｃｅ  ｓａｃ）」又は「砂じょう（ｊｕｉｃｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）」は、ミカン状果、例えば柑橘類の内果皮（心皮）の果汁含有膜結合要素を指す。一部の態様では、砂じょうは、果実の他の部分、例えば皮（外皮若しくはフラベド）、内皮（中果皮、アルベド若しくは髄）、中心柱（プラセンタ）、分割壁又は種子から分離される。一部の態様では、砂じょうは、グレープフルーツ、レモン、ライム又はオレンジの砂じょうである。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】ブレンダの使用を含む破壊的搾汁ステップ、続いて超遠心分離及びショ糖勾配精製を用いるグレープフルーツＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。１０００×ｇで１０分間の遠心分離後のグレープフルーツ果汁及び１５０，０００×ｇで２時間の超遠心分離後のショ糖勾配バンドパターンの画像が含まれる。
【図１Ｂ】Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ  ＮＣＳ１により測定されるＰＭＰ粒度分布のプロットである。
【図２】メッシュフィルタの使用を含む穏やかな搾汁ステップ、続いて遠心分離及びショ糖勾配精製を用いるグレープフルーツＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。１０００×ｇで１０分間の遠心分離後のグレープフルーツ果汁及び１５０，０００×ｇで２時間の超遠心分離後のショ糖勾配バンドパターンの画像が含まれる。
【図３Ａ】超遠心分離、続いてＰＭＰ含有画分を単離するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用するグレープフルーツＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。溶出したＳＥＣ画分は、粒子濃度（ＮａｎｏＦＣＭ）、メジアン粒径（ＮａｎｏＦＣＭ）及びタンパク質濃度（ＢＣＡ）について分析される。
【図３Ｂ】溶出されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）画分中の１ｍＬ当たりの粒子濃度を示すグラフである（ＮａｎｏＦＣＭ）。大部分のＰＭＰを含む画分（「ＰＭＰ画分」）を矢印で示す。ＰＭＰは、画分２〜４に溶出されている。
【図３Ｃ】ＮａｎｏＦＣＭを用いて測定される通り、選択したＳＥＣ画分についての粒径（ｎｍ）を示す一連のグラフ及び表である。グラフは、画分１、３、５及び８のＰＭＰ粒度分布を示す。
【図３Ｄ】ＢＣＡアッセイを用いて測定される、ＳＥＣ画分中のタンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。大部分のＰＭＰを含む画分（「ＰＭＰ画分」）を標識し、矢印は、混入物を含む画分を示す。
【図４Ａ】果汁絞り機、続いて大きい残屑を除去するための分画遠心分離、ＴＦＦを用いる果汁の１００×濃縮及びＰＭＰ含有画分を単離するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用する、１リットルのグレープフルーツ果汁（約７個のグレープフルーツ）からのスケール化ＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。ＳＥＣ溶出画分は、粒子濃度（ＮａｎｏＦＣＭ）、メジアン粒径（ＮａｎｏＦＣＭ）及びタンパク質濃度（ＢＣＡ）について分析される。
【図４Ｂ】１０００ｍｌのグレープフルーツ果汁のスケール化出発材料からのＳＥＣ溶出液体積（ｍｌ）のタンパク質濃度（ＢＣＡアッセイ、上のパネル）及び粒子濃度（ＮａｎｏＦＣＭ、下のパネル）を示すグラフの対であり、後期ＳＥＣ溶出体積中の多量の混入物を示している。
【図４Ｃ】最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．１５を有する粗グレープフルーツＰＭＰ画分のインキュベーション、続いて３００ｋＤａ膜を用いる一晩の透析により、２８０ｎｍでの吸光度により示されるように、後期ＳＥＣ溶出画分中に存在する混入物の除去に成功したこと示すグラフである。使用した透析バッファー（カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ、ｐＨ７．４、ＭＥＳｐＨ６、トリスｐＨ８．６）に差はなかった。
【図４Ｄ】終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．１５を有する粗グレープフルーツＰＭＰ画分のインキュベーション、続いて３００ｋＤａ膜を用いる一晩の透析により、ＢＣＡタンパク質分析（タンパク質の検出以外に、糖及びペクチンの存在を感知できる）により示されるように、ＳＥＣ後の後期溶出画分中に存在する混入物の除去に成功したこと示すグラフである。使用した透析バッファー（カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ、ｐＨ７．４、ＭＥＳｐＨ６、トリスｐＨ８．６）に差はなかった。
【図５Ａ】果汁絞り機、続いて大きい残屑を除去するための分画遠心分離、ペクチン高分子の形成を抑制するためのＥＤＴＡとのインキュベーション、大きい粒子を除去するための連続濾過、ＴＦＦによる５×濃縮／洗浄、混入物除去のための一晩の透析、ＴＦＦによるさらなる濃縮（２０×最終）及びＰＭＰ含有画分を単離するためのＳＥＣを使用する、グレープフルーツ果汁からのＰＭＰ生成のプロトコルを示す概略図である。
【図５Ｂ】複数のＳＥＣカラムを用いる溶出グレープフルーツＳＥＣ画分の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ．Ｕ．）を示すグラフである。ＰＭＰは、早期画分４〜６に溶出され、混入物は、後期画分に溶出される。
【図５Ｃ】複数のＳＥＣカラムを用いる溶出グレープフルーツＳＥＣ画分のタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。ＰＭＰは、早期画分４〜６に溶出され、混入物は、後期画分に溶出される。
【図５Ｄ】複数のＳＥＣカラムを用いる溶出レモンＳＥＣ画分の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ．Ｕ．）を示すグラフである。ＰＭＰは、早期画分４〜６に溶出され、混入物は、後期画分に溶出される。
【図５Ｅ】複数のＳＥＣカラムを用いる溶出レモンＳＥＣ画分のタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。ＰＭＰは、早期画分４〜６に溶出され、混入物は、後期画分に溶出される。
【図５Ｆ】０．２２ｕｍ濾過滅菌後のグレープフルーツＰＭＰ含有ＳＥＣ画分中の粒径を示す散布図及びグラフである。上のパネルは、ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、合わせたＳＥＣ画分中の粒子の散布図である。下のパネルは、ゲート化粒子（バックグラウンド除去）の粒度（ｎｍ）分布グラフである。ＰＭＰ濃度（粒子／ｍｌ）及びメジアン粒径（ｎｍ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従い、ビーズ標準を用いて決定した。
【図５Ｇ】０．２２ｕｍ濾過滅菌後のレモンＰＭＰ含有ＳＥＣ画分中の粒径を示す散布図及びグラフである。上のパネルは、ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、合わせたＳＥＣ画分中の粒子の散布図である。下のパネルは、ゲート化粒子（バックグラウンド除去）の粒度（ｎｍ）分布グラフである。ＰＭＰ濃度（粒子／ｍｌ）及びメジアン粒径（ｎｍ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて決定した。
【図５Ｈ】ＮａｎｏＦＣＭにより測定される通り、様々な時点（生成からの日数）でのＰＭＰ濃度（ＰＭＰ粒子／ｍｌ）により決定した、４℃でのグレープフルーツ及びレモンＰＭＰ安定性を示すグラフである。
【図５Ｉ】ＮａｎｏＦＣＭにより測定される通り、表示温度で１週間の保存後のＰＭＰ濃度（ＰＭＰ粒子／ｍｌ）により決定した、４℃で保存したレモンＰＭＰと比較して、−２０℃及び−２０℃で凍結融解サイクル後のレモン（ＬＭ）ＰＭＰの安定性を示す棒グラフである。
【図６Ａ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、溶出ＢＭＳ植物細胞培養物ＳＥＣ画分中の粒子濃度（粒子／ｍｌ）を示すグラフである。ＰＭＰは、ＳＥＣ画分４〜６に溶出された。
【図６Ｂ】ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計で測定される、溶出ＢＭＳ  ＳＥＣ画分中の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ．Ｕ．）を示すグラフである。ＰＭＰは、画分４〜６に溶出され；画分９〜１３は、混入物を含有した。
【図６Ｃ】ＢＣＡ分析により決定される通り、溶出ＢＭＳ  ＳＥＣ画分中のタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。ＰＭＰは、画分４〜６に溶出され；画分９〜１３は、混入物を含有した。
【図６Ｄ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、合わせたＢＭＳ  ＰＭＰ含有ＳＥＣ画分中の粒子を示す散布図である。ＰＭＰ濃度（粒子／ｍｌ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて決定した。
【図６Ｅ】図６Ｄのゲート化粒子（バックグラウンド除去）のＢＭＳ  ＰＭＰの粒度分布（ｎｍ）を示すグラフである。メジアンＰＭＰ粒径（ｎｍ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。
【図７Ａ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、ＤｙＬｉｇｈｔ８００ｎｍ標識グレープフルーツＰＭＰを示す散布図及びグラフである。上のパネルは、合わせたＳＥＣ画分中の粒子の散布図である。ＰＭＰ濃度（４．４４×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて決定した。下のパネルは、グレープフルーツＤｙＬｉｇｈｔ８００−ＰＭＰの粒度（ｎｍ）分布グラフである。メジアンＰＭＰ粒径は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。メジアングレープフルーツＤｙＬｉｇｈｔ８００−ＰＭＰ粒径は、７２．６ｎｍ＋／−１４．６ｎｍ（ＳＤ）であった。
【図７Ｂ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、ＤｙＬｉｇｈｔ８００ｎｍ標識レモンＰＭＰを示す散布図及びグラフである。メジアンＰＭＰ濃度（５．１８×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて決定した。下のパネルは、グレープフルーツＤｙＬｉｇｈｔ８００−ＰＭＰの粒度（ｎｍ）分布グラフである。ＰＭＰ粒径は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。メジアンレモンＤｙＬｉｇｈｔ８００−ＰＭＰ粒径は、６８．５ｎｍ＋／−１４ｎｍ（ＳＤ）であった。
【図７Ｃ】処理から２時間後の細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））並びに酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））によるグレープフルーツ及びレモン由来ＤｙＬ８００標識ＰＭＰの取込みを示す棒グラフである。取込みは、相対蛍光強度（Ａ．Ｕ．）で決定され、これは、色素単独処理微生物対照の相対蛍光強度に対して正規化した。
【図８Ａ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、精製レモンＰＭＰ（合わせて、ペレット化したＰＭＰ  ＳＥＣ画分）を示す散布図及びグラフである。上のパネルは、合わせたＳＥＣ画分中の粒子の散布図である。最終レモンＰＭＰ濃度（１．５３×１０１３ＰＭＰ／ｍｌ）は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて決定した。下のパネルは、精製レモンＰＭＰの粒度（ｎｍ）分布グラフである。下のパネルは、ゲート化粒子の粒度（ｎｍ）分布グラフである。メジアンＰＭＰ粒径は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。メジアンレモンＰＭＰ粒径は、７２．４ｎｍ＋／−１９．８ｎｍ（ＳＤ）であった。
【図８Ｂ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８）標識レモンＰＭＰを示す散布図及びグラフである。上のパネルは、散布図である。粒子は、非標識粒子及びバックグラウンドシグナルに対し、ＦＩＴＣ蛍光シグナルについてゲート化した。検出された粒子の総数に対して蛍光粒子の数により決定される通り、標識効率は、９９％であった。蛍光粒子の数から、またＮａｎｏＦＣＭの指示に従う既知濃度のビーズ標準を用いて、最終ＡＦ４８８−ＰＭＰ濃度（１．３４×１０１３ＰＭＰ／ｍｌ）を決定した。下のパネルは、ＡＦ４８８標識レモンＰＭＰの粒度（ｎｍ）分布グラフである。メジアンＰＭＰ粒径は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。メジアンレモンＰＭＰ粒径は、７２．１ｎｍ＋／−１５．９ｎｍ（ＳＤ）であった。
【図９Ａ】ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計で測定される、様々なＳＥＣカラム（カラムＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）から生成される溶出グレープフルーツＳＥＣ画分の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ．Ｕ．）を示すグラフである。ＰＭＰは、画分４〜６に溶出された。
【図９Ｂ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、精製グレープフルーツＰＭＰ（合わせて、ペレット化したＰＭＰ  ＳＥＣ画分）を示す散布図である。ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて、最終グレープフルーツＰＭＰ濃度（６．３４×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）を決定した。
【図９Ｃ】精製グレープフルーツＰＭＰの粒度（ｎｍ）分布を示すグラフである。メジアンＰＭＰ粒径は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。メジアングレープフルーツＰＭＰ粒径は、６３．７ｎｍ＋／−１１．５ｎｍ（ＳＤ）であった。
【図９Ｄ】ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計で測定される、使用した様々なＳＥＣカラムの溶出レモンＳＥＣ画分の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ．Ｕ．）を示すグラフである。ＰＭＰは、画分４〜６に溶出された。
【図９Ｅ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、精製レモンＰＭＰ（合わせて、ペレット化したＰＭＰ  ＳＥＣ画分）を示す散布図である。ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて、最終レモンＰＭＰ濃度（７．４２×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）を決定した。
【図９Ｆ】精製レモンＰＭＰの粒度（ｎｍ）分布を示すグラフである。メジアンＰＭＰ粒径は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。メジアンレモンＰＭＰ粒径は、６８ｎｍ＋／−１７．５ｎｍ（ＳＤ）であった。
【図９Ｇ】ドキソルビシンをアクティブ（超音波／押出し）又はパッシブ（インキュベーション）ロードした、レモン（ＬＭ）及びグレープフルーツ（ＧＦ）ＰＭＰのＤＯＸロード能力（１０００ＰＭＰ当たりのｐｇ  ＤＯＸ）を示す棒グラフである。ロード能力は、ＰＭＰ−ＤＯＸサンプル中のＤＯＸの総濃度（ｐｇ／ｍＬ）（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計を用いる蛍光強度測定（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５５０ｎｍ）により評価される）をサンプルの総ＰＭＰ濃度（ＰＭＰ／ｍＬ）で割った商として計算した。
【図９Ｈ】ＮａｎｏＦＣＭにより測定される通り、様々な時点（ローディングからの日数）でのＰＭＰ濃度（ＰＭＰ粒子／ｍｌ）により決定した、４℃でのグレープフルーツ及びレモンＤＯＸロードＰＭＰの安定性を示すグラフである。
【図１０Ａ】ペクチナーゼ及びＥＤＴＡで処理し、３００ｋＤａ  ＴＦＦを用いて５×濃縮し、ＰＢＳの６容量交換により洗浄した後、最終濃度２０×まで濃縮した４リットルのグレープフルーツ果汁からのＰＭＰプロトコル生成を示す概略図である。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＰＭＰ含有画分を溶出した。
【図１０Ｂ】使用した９つの異なるＳＥＣカラム（ＳＥＣカラムＡ〜Ｊ）を介して溶出されたＳＥＣ画分の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ．Ｕ．）を示すグラフである。ＰＭＰは、画分３〜７に溶出された。
【図１０Ｃ】使用した９つの異なるＳＥＣカラム（ＳＥＣカラムＡ〜Ｊ）を介して溶出されたＳＥＣ画分のタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。ＰＭＰは、画分３〜７に溶出された。矢印は、混入物を含む画分を示す。
【図１０Ｄ】ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により測定される通り、精製グレープフルーツＰＭＰ（合わせて、ペレット化したＰＭＰ  ＳＥＣ画分）を示す散布図である。ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うビーズ標準を用いて、最終グレープフルーツＰＭＰ濃度（７．５６×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）を決定した。
【図１０Ｅ】精製グレープフルーツＰＭＰの粒度（ｎｍ）分布を示すグラフである。メジアンＰＭＰ粒径は、ＮａｎｏＦＣＭの指示に従うＥｘｏビーズ標準を用いて決定した。メジアングレープフルーツＰＭＰ粒径は、７０．３ｎｍ＋／−１２．４ｎｍ（ＳＤ）であった。
【図１０Ｆ】緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のドキソルビシン（ＤＯＸ）ロードグレープフルーツＰＭＰの細胞傷害性作用を示すグラフである。細菌をＰＭＰ−ＤＯＸで０（陰性対照）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭの有効ＤＯＸ濃度まで２回反復して処理した。６００ｎｍでのカイネティック吸光度測定（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計）を実施して、表示した時点での培養物のＯＤをモニターした。高濃度の６００ｎｍでのＤＯＸ蛍光漏れ込み（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を正規化するために、まず処理用量当たりの全てのＯＤ値をその用量の最初の時点のＯＤに対して正規化した。細菌に対するＰＭＰ−ＤＯＸの細胞傷害性作用を決定するために、非処置対照（１００％に設定）と比較して、各処理群内で相対ＯＤを決定した。
【図１０Ｇ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のドキソルビシン（ＤＯＸ）ロードグレープフルーツＰＭＰの細胞傷害性作用を示すグラフである。細菌をＰＭＰ−ＤＯＸで０（陰性対照）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭの有効ＤＯＸ濃度まで２回反復して処理した。６００ｎｍでのカイネティック吸光度測定（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計）を実施して、表示した時点での培養物のＯＤをモニターした。高濃度の６００ｎｍでのＤＯＸ蛍光漏れ込み（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を正規化するために、まず処理用量当たりの全てのＯＤ値をその用量の最初の時点のＯＤに対して正規化した。細菌に対するＰＭＰ−ＤＯＸの細胞傷害性作用を決定するために、非処置対照（１００％に設定）と比較して、各処理群内で相対ＯＤを決定した。
【図１０Ｈ】Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）のドキソルビシン（ＤＯＸ）ロードグレープフルーツＰＭＰの細胞傷害性作用を示すグラフである。酵母細胞をＰＭＰ−ＤＯＸで０（陰性対照）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭの有効ＤＯＸ濃度まで２回反復して処理した。６００ｎｍでのカイネティック吸光度測定（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計）を実施して、表示した時点での培養物のＯＤをモニターした。高濃度の６００ｎｍでのＤＯＸ蛍光漏れ込み（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を正規化するために、まず処理用量当たりの全てのＯＤ値をその用量の最初の時点のＯＤに対して正規化した。酵母に対するＰＭＰ−ＤＯＸの細胞傷害性作用を決定するために、非処置対照（１００％に設定）と比較して、各処理群内で相対ＯＤを決定した。
【図１１】Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水（陰性対照）、３ｎｇの遊離ルシフェラーゼタンパク質（タンパク質単独対照）又はルシフェラーゼタンパク質ロードＰＭＰ（ＰＭＰ−Ｌｕｃ）による３ｎｇの有効ルシフェラーゼタンパク質用量でＲＴにおいて２ｈｒ、サンプルを２回反復して処理した緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細菌の発光（Ｒ．Ｌ．Ｕ．相対発光単位）を示すグラフである。上清及びペレット化した細菌中のルシフェラーゼタンパク質を、ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた発光により測定し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計で測定した。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本明細書には、植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）、すなわち全体又は一部が植物細胞外小胞（ＥＶ）又はその断片、部分若しくは抽出物から産生される脂質集合体を含む病原体防除組成物によって病原体を防除するための組成物及び関連方法が記載される。ＰＭＰは、追加的な薬剤を含有することなく、抗病原体作用（例えば、感染を処置する目的で動物への投与に適した薬剤、例えば抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤若しくは殺線虫剤）又は昆虫忌避作用を有し得るが、任意選択で追加的な抗病原体剤、農薬又は昆虫忌避剤を含有するように修飾され得る。また、ＰＭＰが実質的に純粋な形態又は濃縮された形態でもたらされる製剤も含まれる。本明細書に記載の病原体防除組成物及び製剤は、病原体感染を処置又は予防するために直接動物に送達することができる。加えて又は代わりに、病原体防除組成物は、種々の動物病原体又は動物病原体のベクターに送達することにより、病原体又はそのベクターの適応度を低減させ、それによって有害病原体の拡大を制御することもできる。
【００９６】
Ｉ．病原体防除組成物
本明細書に記載の病原体防除組成物は、複数の植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む。ＰＭＰは、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物（例えば、脂質抽出物）を含む脂質（例えば、脂質二重層、単層若しくは多層構造）構造である。植物ＥＶとは、植物中に天然に存在する内包脂質二重層構造を指す。ＰＭＰは、直径が約５〜２０００ｎｍであり得る。植物ＥＶは、多様な植物生合成経路を起源とし得る。天然では、植物ＥＶは、植物アポプラストなどの植物の細胞内及び細胞外コンパートメント、原形質膜の外側に位置して、一連の細胞壁と細胞外空間により形成されるコンパートメント内に見られ得る。代わりに、ＰＭＰは、植物細胞からの分泌時に細胞培地中見られる濃縮された植物ＥＶであり得る。植物ＥＶは、本明細書により詳細に記載される様々な方法により、植物から（例えば、アポプラスト液から）分離し、これによりＰＭＰをもたらすことができる。
【００９７】
病原体防除組成物は、追加的な抗病原体剤、農薬又は忌避剤を含有することなく、病原体に対する抗病原体作用（例えば、抗菌、抗真菌、抗線虫、抗寄生虫若しくは抗ウイルス作用）、農薬作用又は忌避剤作用を有するＰＭＰを含み得る。しかし、ＰＭＰは、異種病原体防除剤、例えば抗病原体剤（例えば、抗菌、抗真菌、抗線虫、抗寄生虫若しくは抗ウイルス剤）、農薬用薬剤又は忌避剤をさらに含有し得、これらは、インビボ又はインビトロで導入することができる。このように、ＰＭＰは、抗病原体、農薬作用を有する物質を含み得、これらは、ＰＭＰが産生される植物によってＰＭＰ中又はＰＭＰ上にロードされる。例えば、インビボでＰＭＰにロードされる異種機能性薬剤は、植物に対して内因性の因子又は植物に対して外因性の因子（例えば、遺伝子操作された植物内で異種遺伝子構築物により発現されるような）のいずれでもあり得る。代わりに、ＰＭＰに異種機能性薬剤をインビトロでロードし得る（例えば、本明細書により詳細に記載される様々な方法による生成後）。
【００９８】
ＰＭＰは、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含み得、その場合、植物ＥＶは、直径が約５〜２０００ｎｍである。例えば、ＰＭＰは、約５〜５０ｎｍ、約５０〜１００ｎｍ、約１００〜１５０ｎｍ、約１５０〜２００ｎｍ、約２００〜２５０ｎｍ、約２５０〜３００ｎｍ、約３００〜３５０ｎｍ、約３５０〜４００ｎｍ、約４００〜４５０ｎｍ、約４５０〜５００ｎｍ、約５００〜５５０ｎｍ、約５５０〜６００ｎｍ、約６００〜６５０ｎｍ、約６５０〜７００ｎｍ、約７００〜７５０ｎｍ、約７５０〜８００ｎｍ、約８００〜８５０ｎｍ、約８５０〜９００ｎｍ、約９００〜９５０ｎｍ、約９５０〜１０００ｎｍ、約１０００〜１２５０ｎｍ、約１２５０〜１５００ｎｍ、約１５００〜１７５０ｎｍ又は約１７５０〜２０００ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、約５〜９５０ｎｍ、約５〜９００ｎｍ、約５〜８５０ｎｍ、約５〜８００ｎｍ、約５〜７５０ｎｍ、約５〜７００ｎｍ、約５〜６５０ｎｍ、約５〜６００ｎｍ、約５〜５５０ｎｍ、約５〜５００ｎｍ、約５〜４５０ｎｍ、約５〜４００ｎｍ、約５〜３５０ｎｍ、約５〜３００ｎｍ、約５〜２５０ｎｍ、約５〜２００ｎｍ、約５〜１５０ｎｍ、約５〜１００ｎｍ、約５〜５０ｎｍ又は約５〜２５ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約５０〜２００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約５０〜３００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約２００〜５００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約３０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。
【００９９】
一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも８５０ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも９５０ｎｍ若しくは少なくとも１０００ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、１０００ｎｍ未満、９５０ｎｍ未満、９００ｎｍ未満、８５０ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３５０ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満若しくは５０ｎｍ未満の平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有する。当技術分野で標準的な様々な方法（例えば、動的光散乱法）を使用して、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物の粒径を測定することができる。
【０１００】
一部の例では、ＰＭＰは、７７ｎｍ２〜３．２×１０６ｎｍ２（例えば、７７〜１００ｎｍ２、１００〜１０００ｎｍ２、１０００〜１×１０４ｎｍ２、１×１０４〜１×１０５ｎｍ２、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２又は１×１０６〜３．２×１０６ｎｍ２）の平均表面積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、６５ｎｍ３〜５．３×１０８ｎｍ３（例えば、６５〜１００ｎｍ３、１００〜１０００ｎｍ３、１０００〜１×１０４ｎｍ３、１×１０４〜１×１０５ｎｍ３、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２、１×１０６〜１×１０７ｎｍ３、１×１０７〜１×１０８ｎｍ３、１×１０８〜５．３×１０８ｎｍ３）の平均体積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも７７ｎｍ２（例えば、少なくとも７７ｎｍ２、少なくとも１００ｎｍ２、少なくとも１０００ｎｍ２、少なくとも１×１０４ｎｍ２、少なくとも１×１０５ｎｍ２、少なくとも１×１０６ｎｍ２若しくは少なくとも２×１０６ｎｍ２）の平均表面積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも６５ｎｍ３（例えば、少なくとも６５ｎｍ３、少なくとも１００ｎｍ３、少なくとも１０００ｎｍ３、少なくとも１×１０４ｎｍ３、少なくとも１×１０５ｎｍ３、少なくとも１×１０６ｎｍ３、少なくとも１×１０７ｎｍ３、少なくとも１×１０８ｎｍ３、少なくとも２×１０８ｎｍ３、少なくとも３×１０８ｎｍ３、少なくとも４×１０８ｎｍ３若しくは少なくとも５×１０８ｎｍ３）の平均体積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。
【０１０１】
一部の例では、ＰＭＰは、植物ＥＶ又はその断片、抽出物若しくは部分と同じ大きさを有し得る。代わりに、ＰＭＰは、ＰＭＰが産生される初期植物ＥＶと異なる大きさを有し得る。例えば、ＰＭＰは、約５〜２０００ｎｍの直径を有し得る。例えば、ＰＭＰは、約５〜５０ｎｍ、約５０〜１００ｎｍ、約１００〜１５０ｎｍ、約１５０〜２００ｎｍ、約２００〜２５０ｎｍ、約２５０〜３００ｎｍ、約３００〜３５０ｎｍ、約３５０〜４００ｎｍ、約４００〜４５０ｎｍ、約４５０〜５００ｎｍ、約５００〜５５０ｎｍ、約５５０〜６００ｎｍ、約６００〜６５０ｎｍ、約６５０〜７００ｎｍ、約７００〜７５０ｎｍ、約７５０〜８００ｎｍ、約８００〜８５０ｎｍ、約８５０〜９００ｎｍ、約９００〜９５０ｎｍ、約９５０〜１０００ｎｍ、約１０００〜１２００ｎｍ、約１２００〜１４００ｎｍ、約１４００〜１６００ｎｍ、約１６００〜１８００ｎｍ又は約１８００〜２０００ｎｍの平均直径を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも８５０ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも９５０ｎｍ、少なくとも１０００ｎｍ、少なくとも１２００ｎｍ、少なくとも１４００ｎｍ、少なくとも１６００ｎｍ、少なくとも１８００ｎｍ又は少なくとも２０００ｎｍの平均直径を有し得る。当技術分野で標準的な様々な方法（例えば、動的光散乱法）を使用して、ＰＭＰの粒径を測定することができる。一部の例では、ＰＭＰの大きさは、異種機能性薬剤のローディング後又はＰＭＰに対する他の修飾後に決定する。
【０１０２】
一部の例では、ＰＭＰは、７７ｎｍ２〜１．３×１０７ｎｍ２（例えば、７７〜１００ｎｍ２、１００〜１０００ｎｍ２、１０００〜１×１０４ｎｍ２、１×１０４〜１×１０５ｎｍ２、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２又は１×１０６〜１．３×１０７ｎｍ２）の平均表面積を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、６５ｎｍ３〜４．２×１０９ｎｍ３（例えば、６５〜１００ｎｍ３、１００〜１０００ｎｍ３、１０００〜１×１０４ｎｍ３、１×１０４〜１×１０５ｎｍ３、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２、１×１０６〜１×１０７ｎｍ３、１×１０７〜１×１０８ｎｍ３、１×１０８〜１×１０９ｎｍ３又は１×１０９〜４．２×１０９ｎｍ３）の平均体積を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも７７ｎｍ２（例えば、少なくとも７７ｎｍ２、少なくとも１００ｎｍ２、少なくとも１０００ｎｍ２、少なくとも１×１０４ｎｍ２、少なくとも１×１０５ｎｍ２、少なくとも１×１０６ｎｍ２又は１×１０７ｎｍ３）の平均表面積を有する。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも６５ｎｍ３（例えば、少なくとも６５ｎｍ３、少なくとも１００ｎｍ３、少なくとも１０００ｎｍ３、少なくとも１×１０４ｎｍ３、少なくとも１×１０５ｎｍ３、少なくとも１×１０６ｎｍ３、少なくとも１×１０７ｎｍ３、少なくとも１×１０８ｎｍ３、少なくとも１×１０９ｎｍ３、少なくとも２×１０９ｎｍ３、少なくとも３×１０９ｎｍ３又は少なくとも４×１０９ｎｍ３）の平均体積を有する。
【０１０３】
一部の例では、ＰＭＰは、インタクトな植物ＥＶを含有し得る。代わりに、ＰＭＰは、植物ＥＶの小胞の全表面積の断片、部分又は抽出物（例えば、小胞の全表面積の１００％未満（例えば、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満若しくは１％未満）を含む断片、部分又は抽出物）を含有し得る。断片、部分又は抽出物は、円周方向断片、球状断片（例えば、半球）、曲線断片、線状断片又は平板型断片など、任意の形状であり得る。断片が、小胞の球状断片である場合、球状断片は、平行線の対に沿った球状小胞の分割から生じたもの又は非平行線の対に沿った球状小胞の分割から生じたものを呈示し得る。従って、複数のＰＭＰは、複数のインタクトな植物ＥＶ、複数の植物ＥＶ断片、部分若しくは抽出物又はインタクトな植物ＥＶ及びその断片の混合物を含み得る。当業者は、インタクト及び断片化植物ＥＶの比が、使用した具体的な単離方法によって変動することを理解するであろう。例えば、植物若しくはその部分の粉砕又はブレンドにより、真空浸潤法などの非破壊抽出方法よりも高い比率の植物ＥＶ断片、部分又は抽出物を含有するＰＭＰを生成することができる。
【０１０４】
ＰＭＰが、植物ＥＶの断片、部分又は抽出物を含有する例では、ＥＶ断片、部分又は抽出物は、インタクトな小胞のそれより小さい平均表面積、例えば７７ｎｍ２、１００ｎｍ２、１０００ｎｍ２、１×１０４ｎｍ２、１×１０５ｎｍ２、１×１０６ｎｍ２又は３．２×１０６ｎｍ２）未満の平均表面積を有し得る。一部の例では、ＥＶ断片、部分又は抽出物は、７０ｎｍ２、６０ｎｍ２、５０ｎｍ２、４０ｎｍ２、３０ｎｍ２、２０ｎｍ２又は１０ｎｍ２）未満の表面積を有する。一部の例では、ＰＭＰは、インタクトな小胞のそれより小さい平均体積、例えば６５ｎｍ３、１００ｎｍ３、１０００ｎｍ３、１×１０４ｎｍ３、１×１０５ｎｍ３、１×１０６ｎｍ３、１×１０７ｎｍ３、１×１０８ｎｍ３又は５．３×１０８ｎｍ３）未満の平均体積を有する植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。
【０１０５】
ＰＭＰが、植物ＥＶの抽出物を含む例、例えばＰＭＰが、植物ＥＶから抽出された（例えば、クロロホルムで）脂質を含む例では、ＰＭＰは、植物ＥＶから抽出された（例えば、クロロホルムで）脂質の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上を含有し得る。多数のＰＭＰは、植物ＥＶ断片及び／又は植物ＥＶ抽出脂質又はそれらの混合物を含有し得る。
【０１０６】
本明細書では、ＰＭＰの生成方法、ＰＭＰと結合させることができる植物ＥＶマーカ及びＰＭＰを含む組成物の製剤についての詳細をさらに概説する。
【０１０７】
Ａ．生成方法
ＰＭＰは、植物又は植物組織若しくは植物細胞を含むその部分に天然に存在する植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物（例えば、脂質抽出物）から生成することができる。ＰＭＰを生成する例示的な方法は、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップと；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプル中のレベルに対して、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベルを有する、ステップとを含む。この方法は、粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成する追加的なステップ（ｃ）であって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＰＭＰ画分のレベルに対して、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベルを有する、追加的なステップ（ｃ）をさらに含み得る。各生成ステップについては、以下にさらに詳細に論じる。ＰＭＰの単離及び精製に関する例示的な方法は、例えば、Ｒｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  Ａｌ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（１７）：ｅ２５３３，２０１７；Ｒｅｇｅｎｔｅ  ｅｔ  Ａｌ，Ｊ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６８（２０）：５４８５−５４９６，２０１７；Ｍｕ  ｅｔ  Ａｌ，Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．，５８，１５６１−１５７３，２０１４並びにＲｅｇｅｎｔｅ  ｅｔ  Ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８３：３３６３−３３６６，２００９に見出され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込む。
【０１０８】
例えば、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップと；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプル中のレベルに対して、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベル（例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％若しくは１００％低減したレベル）を有する、ステップと；（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分に対して、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベル（例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％若しくは１００％低減したレベル）を有する、ステップとを含むプロセスによって複数のＰＭＰを植物から単離され得る。
【０１０９】
本明細書に提供されるＰＭＰは、多様な植物から単離した植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含み得る。ＰＭＰは、任意の属の植物（維管束若しくは非維管束）から単離することができ、こうした植物として、限定されないが、被子植物（単子葉及び双子葉植物）、裸子植物、シダ、イワヒバ（ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ）、トクサ、裸茎植物（ｐｓｉｌｏｐｈｙｔｅｓ）、ヒカゲノカズラ（ｌｙｃｏｐｈｙｔｅ）、藻類（例えば、単細胞若しくは多細胞、例えばアーケプラスチダ（ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ））又はコケ類が挙げられる。特定の例では、ＰＭＰは、維管束植物、例えば単子葉若しくは双子葉又は裸子植物から生成することができる。例えば、ＰＭＰは、アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、オオムギ、カノーラ、トウゴマ、チコリー、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、クランベ、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム、ヤマイモ、ユーカリ属、ウシノケグサ、亜麻、グラジオラス、ユリ科、亜麻仁、キビ、マスクメロン、カラシ、オーツムギ、アブラヤシ、アブラナ、パパイヤ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ、ジャガイモ、ナタネ、コメ、ライムギ、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、芝草、コムギ又はレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物などの野菜作物；リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなどの果実及び堅果樹；ブドウ、キウイ、ホップなどのブドウ；ラズベリー、ブラックベリー、セイヨウスグリなどの果実低木及びキイチゴ；セイヨウトネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クルミ、ポプラなどの森林樹；アルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、クランベ、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、コメ、ベニバナ、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ又はコムギから生成することができる。
【０１１０】
ＰＭＰは、全植物（例えば、全ロゼット若しくは苗）又は代替的に１つ若しくは複数の植物部分（例えば、葉、種子、根、果実、野菜、花粉、師管液若しくは木部樹液）から生成することができる。例えば、ＰＭＰは、新芽植物器官／構造（例えば、葉、茎若しくは塊茎）、根、花及び花器／構造（例えば、花粉、包葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯若しくは胚珠）、種子（胚、胚乳若しくは種皮を含む）、果実（成熟した子房）、樹液（例えば、師部若しくは木部樹液）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織、腫瘍組織など）並びに細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、カルス組織、孔辺細胞、卵細胞など）又はこれらの子孫から生成することができる。例えば、単離ステップは、（ａ）植物又はその一部を用意することを含み得る。一部の例では、植物部分は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉である。植物は、任意の発育段階のものであり得る。例えば、ＰＭＰは、苗、例えば１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週又は８週齢の苗（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の苗）から生成することができる。他の例示的ＰＭＰは、根（例えば、根生姜）、果汁（例えば、グレープフルーツ果汁）、野菜（例えば、ブロッコリー）、花粉（例えば、オリーブ花粉）、師部液（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の師部液）又は木部樹液（例えば、トマト植物木部樹液）から生成されたＰＭＰを含み得る。
【０１１１】
ＰＭＰは、様々な方法により、植物又はその部分から生成することができる。植物のＥＶ含有アポプラスト画分又はそうでなければ分泌されたＥＶを含むＰＭＰを含有する細胞外画分（例えば、細胞培地）の放出を可能にするいずれの方法も本方法において好適である。ＥＶは、破壊的（例えば、植物若しくは任意の植物部分の粉砕若しくはブレンド）又は非破壊的（植物若しくは任意の植物部分の洗浄若しくは真空浸潤法）方法のいずれかによって放出され得る。例えば、植物又はその部分を真空浸潤、粉砕、ブレンド又はこれらの組合せに付して、植物又は植物部分からＥＶを単離し、これによりＰＭＰを生成することができる。例えば、単離ステップは、（ｂ）初期サンプル（例えば、植物、植物部分又は植物若しくは植物部分由来のサンプル）から粗ＰＭＰ画分を単離することを含み得、単離ステップは、植物（例えば、小胞単離バッファーと一緒に）を真空浸潤して、アポプラスト画分を放出させ、収集することを含む。代わりに、単離ステップは、（ｂ）植物又はその部分を提供するステップを含み、放出させるステップは、植物を粉砕又はブレンドして、ＥＶを放出させ、これによりＰＭＰを生成することを含む。
【０１１２】
植物ＥＶを単離することにより、ＰＭＰを生成したら、ＰＭＰを粗ＰＭＰ画分（例えば、アポプラスト画分）に分離又は収集することができる。例えば、分離ステップは、植物組織残屑、植物細胞若しくは植物細胞オルガネラ（例えば、核、ミトコンドリア若しくは葉緑体）をはじめとする大きい混入物から、ＰＭＰ含量画分を分離するための遠心分離（例えば、分画遠心分離若しくは超遠心分離）及び／又は濾過を用いて、複数のＰＭＰを粗ＰＭＰ画分に分離することを含み得る。このように、粗植物ＥＶ画分は、起源植物又は植物部分からの初期サンプルと比較して、例えば植物組織残屑、植物細胞又は植物細胞オルガネラ（例えば、核、ミトコンドリア又は葉緑体）などの大きい混入物の数が減少する。
【０１１３】
複数の純粋なＰＭＰを生成するために、追加的な精製方法により粗ＰＭＰ画分をさらに精製することもできる。例えば、超遠心分離により、例えば密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）の使用、サイズ排除及び／又は凝集要素を除去するための他の手法（例えば、沈殿若しくはサイズ排除クロマトグラフィー）の使用により、粗ＰＭＰ画分を他の植物要素から分離することができる。得られた純粋なＰＭＰは、より早期の分離ステップ中に生成された１つ若しくは複数の画分と比較して又は所定の閾値レベル、例えば商業的公開仕様と比較して、低減したレベルの混入物（例えば、１つ若しくは複数の非ＰＭＰ要素、例えばタンパク質凝集体、核酸凝集体、タンパク質−核酸凝集体、遊離リポタンパク質、脂質−タンパク質構造）、核、細胞壁要素、細胞オルガネラ又はこれらの組合せ）を有し得る。例えば、純粋なＰＭＰは、初期サンプルのレベルに対して、植物オルガネラ又は細胞壁要素の低減したレベル（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超；又は約２×、４×、５×、１０×、２０×、２５×、５０×、７５×、１００×若しくは１００×超）を有し得る。一部の例では、純粋なＰＭＰは、タンパク質凝集体、核酸凝集体、タンパク質−核酸凝集体、遊離リポタンパク質、脂質−タンパク質構造）、核、細胞壁要素、細胞オルガネラ又はこれらの組合せなどの１つ若しくは複数の非ＰＭＰ要素を実質的に含有しない（例えば、それらの検出不能レベルを有する）。放出及び分離ステップのさらに別の例を実施例１に見出すことができる。ＰＭＰは、例えば、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３又は１×１０１３ＰＭＰｓ／ｍＬ超の濃度であり得る。
【０１１４】
例えば、単離したＰＭＰから、タンパク質凝集体を除去することができる。例えば、単離したＰＭＰ溶液を様々なｐＨ（例えば、ｐＨプローブを用いて測定されるように）に付して、溶液中にタンパク質凝集体を沈殿させることができる。ｐＨは、例えば、水酸化ナトリウム又は塩酸の添加により、例えばｐＨ３、ｐＨ５、ｐＨ７、ｐＨ９又はｐＨ１１に調節することができる。溶液が指定ｐＨに達したら、これを濾過して微粒子を除去することができる。代わりに、単離したＰＭＰ溶液をＰｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ  ２６４０などの荷電ポリマーの添加により凝集させることもできる。手短には、Ｐｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ  ２６４０を溶液に添加し、インペラで混合する。次に、溶液を濾過して微粒子を除去する。代わりに、塩濃度を増加させることにより凝集体を可溶化することもできる。例えば、単離したＰＭＰ溶液にＮａＣｌを、それが例えば、１ｍｏｌ／Ｌになるまで添加することができる。次に、溶液を濾過して、ＰＭＰを単離する。代わりに、昇温によって凝集体を可溶化することもできる。例えば、単離したＰＭＰを混合しながら、溶液が例えば、約５０℃の均一温度に達するまで５分間加熱することができる。次に、ＰＭＰ混合物を濾過して、ＰＭＰを単離することができる。代わりに、標準的手順に従うサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＰＭＰ溶液から可溶性混入物を分離することができ、この場合、最初の画分中にＰＭＰを溶出させる一方、タンパク質及びリボ核タンパク質並びに一部のリポタンパク質をのちに溶出させる。タンパク質凝集体除去の効率は、ＢＣＡ／Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量を用いて、タンパク質凝集体の除去前後のタンパク質濃度を測定及び比較することにより決定することができる。
【０１１５】
生成方法の任意のステップでＰＭＰを特性決定又は同定するために、本明細書に記載される生成方法のいずれにも、当技術分野で公知のいかなる定量的又は定性的方法も追加し得る。ＰＭＰは、ＰＭＰ収率、ＰＭＰ濃度、ＰＭＰ純度、ＰＭＰ組成又はＰＭＰサイズを推定するための多様な分析方法によって特性決定され得る。ＰＭＰは、ＰＭＰの視覚化、定量又は定性的特性決定（例えば、組成物の同定）を可能にする、当技術分野で公知のいくつかの方法、例えば顕微鏡検査（例えば、透過電子顕微鏡）、動的光散乱法、ナノ粒子追跡、分光法（例えば、フーリエ変換赤外分光法）若しくは質量分析法（タンパク質及び脂質分析）により評価することができる。特定の例では、方法（例えば、質量分析法）を用いて、ＰＭＰに存在する植物ＥＶマーカ、例えば付録に開示されるマーカを同定することができる。ＰＭＰ画分の分析及び特性決定を補助するために、ＰＭＰをさらに標識又は染色することができる。例えば、３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド（ＤＩＯＣ６）、蛍光親油性色素、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ（登録商標）４８８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で、ＰＭＰを染色することができる。高度な形態のナノ粒子追跡の非存在下でも、この比較的単純な手法は、総膜含量を定量することから、ＰＭＰの濃度を間接的に測定するために使用することができる（Ｒｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（１７）：ｅ２５３３，２０１７）。より正確な測定のため、またＰＭＰの粒度分布を評価するためにナノ粒子追跡又は調整可能抵抗パルスセンシングを使用することができる。
【０１１６】
生成工程中、任意選択で、ＰＭＰが対照又は初期サンプル中のＥＶレベルに対して高い濃度（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超；又は約２倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍若しくは１００倍超）であるように、ＰＭＰを調製することができる。単離したＰＭＰは、病原体防除組成物の約０．１％〜約１００％、例えば約０．０１％〜約１００％、約１％〜約９９．９％、約０．１％〜約１０％、約１％〜約２５％、約１０％〜約５０％、約５０％〜約９９％又は約７５〜約１００％のいずれか１つを占め得る。一部の例では、組成物は、例えば、ｗｔ／ｖｏｌ、パーセントＰＭＰタンパク質組成物及び／又はパーセント脂質組成物により測定して（例えば、蛍光標識脂質の測定により）；例えば、実施例３を参照されたい）、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはそれを超えるＰＭＰのいずれかを含む。一部の例では、市販の製品のような濃縮薬剤を使用し、例えば、最終ユーザは、希釈された薬剤を使用し得、これは、実質的に低い濃度の有効成分を有する。一部の実施形態では、組成物は、病原体防除濃縮製剤、例えば高濃度少量製剤として製剤化する。
【０１１７】
実施例１に説明されるように、多様な植物又はその部分（例えば、葉アポプラスト、種子アポプラスト、根、果実、野菜、花粉、師管液若しくは木部樹液）からＰＭＰを生成することができる。例えば、ＰＭＰは、植物のアポプラスト画分、例えば葉のアポプラスト（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）葉のアポプラスト）又は種子のアポプラスト（例えば、ヒマワリ種子のアポプラスト）から単離することができる。他の例示的なＰＭＰは、根（例えば、根生姜）、果汁（例えば、グレープフルーツ果汁）、野菜（例えば、ブロッコリー）、花粉（例えば、オリーブ花粉）、師管液（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）師管液）、木部樹液（例えば、トマト植物木部樹液）又は細胞培養上清（例えば、ＢＹ２タバコ細胞培養上清）から生成される。この実施例は、これらの種々の植物供給源からＰＭＰの生成をさらに示す。
【０１１８】
実施例２に説明されるように、様々な方法により、例えば超遠心分離及び／又は凝集混入物を除去する方法、例えば沈殿若しくはサイズ排除クロマトグラフィーと一緒に密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）を使用することにより、ＰＭＰを精製することができる。例えば、実施例２では、実施例１で概説される分離ステップによって得られたＰＭＰの精製を説明する。さらに、ＰＭＰは、実施例３に説明される方法に従って特性決定することができる。
【０１１９】
一部の例では、本組成物及び方法のＰＭＰは、植物又は植物部分から単離することができ、ＰＭＰにさらなる修飾を加えることなく、これを使用することができる。他の例では、本明細書にさらに概説するように、使用前にＰＭＰを修飾することができる。
【０１２０】
Ｂ．植物ＥＶマーカ
本組成物及び方法のＰＭＰは、植物ＥＶ（及び／又はその断片、部分若しくは抽出物を含む）から生成されるものとしてＰＭＰを同定する多様なマーカを有し得る。本明細書で使用される場合、用語「植物ＥＶマーカ」は、天然に植物に付随し、植物タンパク質、植物核酸、植物小分子、植物脂質又はそれらの組合せなど、インプランタで植物ＥＶ中若しくは上に組み込まれる要素を指す。植物ＥＶマーカの例は、例えば、Ｒｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒａｉｍｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．６（２３）：１９５１４，２０１５；Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．２１（７）：１３４５−１３５７，２０１３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  Ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２２（３）：５２２−５３４，２０１４；及びＲｅｇｅｎｔｅ  ｅｔ  Ａｌ，Ｊ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６８（２０）：５４８５−５４９６，２０１７に見出すことができ；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。植物ＥＶマーカのさらに別の例は付録に列挙されており、これらについては、本明細書においてさらに概説する。
【０１２１】
植物ＥＶマーカは、植物脂質を含み得る。ＰＭＰに見られ得る植物脂質マーカの例としては、フィトステロール、カンペステロール、β−シトステロール、シグマステロール、アベナステロール、グリコシルイノシトールホスホリルセラミド（ＧＩＰＣ）、糖脂質（例えば、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）若しくはジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）又はそれらの組合せが挙げられる。例えば、ＰＭＰは、ＧＩＰＣを含み得、これは、植物の主要スフィンゴ脂質クラスの代表であり、植物において最も豊富な膜脂質の１つである。他の植物ＥＶマーカは、非生物的又は生物的ストレッサー（例えば、細菌若しくは真菌感染）に応答して植物中に蓄積する脂質、例えばホスファチジン酸（ＰＡ）又はホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＰＩ４Ｐ）を挙げることができる。
【０１２２】
代わりに、植物ＥＶマーカは、植物タンパク質を含み得る。一部の例では、タンパク質植物ＥＶマーカは、植物により天然に産生される抗微生物タンパク質であり得、そうしたものとして、非生物的又は生物的ストレッサー（例えば、細菌若しくは真菌感染）に応答して植物が分泌する防御タンパク質がある。植物病原体防御タンパク質としては、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子結合タンパク質受容体タンパク質（ＳＮＡＲＥ）タンパク質（例えば、Ｓｙｎｔａｘｉｎ−１２１（ＳＹＰ１２１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１８７７８８．１若しくはＮＰ＿９７４２８８．１）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ１（ＰＥＮ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６７４６２．１））又はＡＢＣ輸送体Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ３（ＰＥＮ３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１９１２８３．２）がある。植物ＥＶマーカの他の例としては、植物中のＲＮＡの長距離輸送を促進するタンパク質があり、こうしたものとして、師部タンパク質（例えば、師部タンパク質２−Ａ１（ＰＰ２−Ａ１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１９３７１９．１）、カルシウム依存性脂質結合タンパク質又はレクチン（例えば、ジャカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）関連レクチン、例えばヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）ジャカリン（Ｈｅｌｊａ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＨＺ８６９７８．１）が挙げられる。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質は、グリシンリッチＲＮＡ結合タンパク質−７（ＧＲＰ７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１７９７６０．１）であり得る。加えて、プラスモデスマータ機能を調節するタンパク質が、一部の例で、植物ＥＶ中に見られ得るが、こうしたものとして、Ｓｙｎａｐ−Ｔｏｔｇａｍｉｎ  Ａ  Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６５４９５．１）がある。一部の例では、植物ＥＶマーカは、ホスホリパーゼＣ又はホスホリパーゼＤなど、脂質機序に関与するタンパク質を含み得る。一部の例では、植物タンパク質ＥＶマーカは、植物の細胞トラフィッキングタンパク質である。植物ＥＶマーカがタンパク質である特定の例では、タンパク質マーカは、分泌タンパク質と典型的に結合するシグナルペプチドが欠失している場合がある。非古典的分泌タンパク質は、（ｉ）リーダ配列の欠失、（ｉｉ）ＥＲ又はゴルジ装置に特異的なＰＴＭの非存在、及び／又は（ｉｉｉ）古典的ＥＲ／ゴルジ依存性分泌経路を遮断するブレフェルディンＡによる影響を受けない分泌のような、いくつかの共通の特徴を有すると思われる。当業者は、一般に自由に利用可能な様々な手段（例えば、ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ  Ｄａｔａｂａｓｅ；ＳＵＢＡ３（ＳＵＢｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ））を使用して、シグナル配列又はその欠失についてタンパク質を評価することができる。
【０１２３】
植物ＥＶマーカがタンパク質である例では、タンパク質は、植物ＥＶマーカ、例えば付録に列挙される植物ＥＶマーカのいずれかと、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。例えば、タンパク質は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＰＥＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６７４６２．１）と、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【０１２４】
一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物によりコードされる核酸、例えば植物ＲＮＡ、植物ＤＮＡ又は植物ＰＮＡを含む。例えば、ＰＭＰは、植物によりコードされるｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得る。一部の例では、核酸は、本明細書で論じるように、植物においてＲＮＡの長距離輸送を促進するタンパク質に関連するものであり得る。一部の例では、核酸植物ＥＶマーカは、宿主誘導遺伝子サイレンシング（ＨＩＧＳ）に関与するものであり得、これは、植物が、植物有害生物（例えば、真菌などの病原体）の外来転写物を抑制するプロセスである。例えば、核酸は、細菌又は真菌遺伝子を抑制するものであり得る。一部の例では、核酸は、真菌病原体（例えば、バーティシリウム・ダリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ））中の遺伝子をターゲティングする、ｍｉＲ１５９又はｍｉＲ１６６などのマイクロＲＮＡであり得る。一部の例では、タンパク質は、植物防御化合物の運搬に関与するもの、例えばグルコシノレート（ＧＳＬ）輸送及び代謝に関与するタンパク質であり得、こうしたものとして、グルコシノレートトランスポータ−１−１（ＧＴＲ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６６８９６．２）、グルコシノレートトランスポータ−２（ＧＴＲ２；ＮＰ＿２０１０７４．１）又はエピチオ特異的修飾因子１（ＥＳＭ１；ＮＰ＿１８８０３７．１）が挙げられる。
【０１２５】
植物ＥＶマーカが核酸である例では、核酸は、植物ＥＶマーカ、例えば付録に列挙される植物ＥＶマーカをコードするものなどと、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。例えば、核酸は、ｍｉＲ１５９又はｍｉＲ１６６と、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有し得る。
【０１２６】
一部の例では、植物ＥＶマーカは、植物により産生される化合物を含む。例えば、化合物は、非生物的又は生物的ストレッサーに応答して産生される防御化合物、例えば二次代謝物などであり得る。ＰＭＰ中に見られ得るこうした二次代謝物の１つは、グルコシノレート（ＧＳＬ）であり、これは、主にアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物に見られる窒素及びイオウ含有二次代謝物である。他の二次代謝物は、アレロケミカルを含み得る。
【０１２７】
一部の例では、ＰＭＰは、典型的には植物によって産生されないが、一般に他の生物（例えば、動物ＥＶ、細菌ＥＶ若しくは真菌ＥＶのマーカ）に関連する特定のマーカ（例えば、脂質、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド）の欠失に基づいて植物ＥＶから産生されるものとしても同定され得る。例えば、一部の例では、ＰＭＰは、動物ＥＶ、細菌ＥＶ若しくは真菌ＥＶに典型的に見られる脂質を欠失している。一部の例では、ＰＭＰは、動物ＥＶに典型的な脂質（例えば、スフィンゴミエリン）を欠失している。一部の例では、ＰＭＰは、細菌ＥＶ又は細菌膜に典型的な脂質（例えば、ＬＰＳ）を含有しない。一部の例では、ＰＭＰは、真菌膜に典型的な脂質（例えば、エルゴステロール）を欠失している。
【０１２８】
小分子（例えば、質量分光法、質量分析法）、脂質（例えば、質量分光法、質量分析法）、タンパク質（例えば、質量分光法、イムノブロッティング）又は核酸（例えば、ＰＣＲ分析）の同定を可能にする、当技術分野で公知の任意の手法を用いて、植物ＥＶマーカを同定することができる。一部の例では、本明細書に記載のＰＭＰ組成物は、検出可能な量、例えば所定閾値量の本明細書に記載の植物ＥＶマーカを含有する。
【０１２９】
Ｃ．薬剤のローディング
ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば本明細書に記載するものなどの病原体防除剤又は忌避剤を含有するように修飾することができる。ＰＭＰは、薬剤を標的植物又は植物有害生物に送達することを可能にする様々な手段で、例えば薬剤の封入、脂質二重層構造内への成分の組込み又はＰＭＰの脂質二重層構造の表面と成分の結合（例えば、共役）により、こうした薬剤を担持させるか又はそれらと結合させることができる。
【０１３０】
異種機能性薬剤は、ＰＭＰと薬剤同士の結合を直接若しくは間接的に可能にする、当技術分野で公知の任意の方法により、ＰＭＰ中若しくは上に組み込むか又はロードすることができる。異種機能性薬剤は、インビボ法（例えば、インプランタ、例えば異種薬剤を含むトランスジェニック植物からのＰＭＰの産生により）若しくはインビトロで（例えば、組織培養若しくは細胞培養で）又はインビボ及びインビトロ法の両方によってＰＭＰに組み込むことができる。
【０１３１】
ＰＭＰに異種機能性薬剤（例えば、病原体防除剤又は忌避剤）をインビボでロードする例では、ＰＭＰは、インプランタで、組織培養物又は細胞培養物にロードされたＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物から産生され得る。インプランタ法は、異種機能性薬剤を発現するように遺伝子修飾された植物における異種機能性薬剤（例えば、病原体防除剤又は忌避剤）の発現を含む。一部の例では、異種機能性薬剤は、植物に対して外性である。代わりに、異種機能性薬剤は、植物中に天然に見られ得るが、非遺伝子修飾植物に見られるレベルより高いレベルで発現され得る。
【０１３２】
一部の例では、ＰＭＰは、インビトロでロードすることができる。限定されないが、物理的、化学的及び／又は生物学的方法を用いて、物質をＰＭＰ上若しくは中にロードすることができる（例えば、ＰＭＰにより封入することができる）。例えば、異種機能性薬剤は、エレクトロポレーション、超音波処理、受動的拡散、攪拌、脂質抽出又は押出しの１つ又は複数によってＰＭＰ中に導入することができる。ロードされた薬剤の存在又はレベルを確認するために、様々な方法、例えばＨＰＣＬ（例えば、小分子評価のため）；イムノブロッティング（例えば、タンパク質評価のため）；及び定量的ＰＣＲ（例えば、ヌクレオチドの評価のため）を用いて、ロードしたＰＭＰを評価することができる。しかし、当業者には、ＰＭＰへの目的の物質のローディングは、上に例示した方法に限定されるわけではないことが理解されるべきである。
【０１３３】
一部の例では、異種機能性薬剤をＰＭＰに共役させることができ、この場合、異種機能性薬剤は、ＰＭＰに間接的又は直接結合若しくは連結される。例えば、１つ又は複数の病原体防除剤が、ＰＭＰの脂質二重層に直接連結される（例えば、共有結合若しくはイオン結合により）ように、１つ又は複数の病原体防除剤をＰＭＰに化学的連結させることができる。一部の例では、ＰＭＰに対する種々の病原体防除剤の共役は、最初に、好適な溶媒中で１つ又は複数の異種機能性薬剤を適切な架橋剤（例えば、Ｎ−エチルカルボ−ジイミド（「ＥＤＣ」）；これは、一般に、１級アミンとアミド結合のためのカルボキシル活性化剤として使用され、リン酸基とも反応する）と混合することによって達成することができる。異種機能性薬剤と架橋剤の結合を可能にするのに十分なインキュベーション時間後、架橋剤／異種機能性薬剤混合物をＰＭＰと合わせて、さらなるインキュベーション時間後、ショ糖勾配（例えば、８、３０、４５及び６０％ショ糖勾配）に付して、ＰＭＰに共役した病原体防除剤から遊離異種機能性薬剤及び遊離ＰＭＰを分離することができる。混合物をショ糖勾配と合わせるステップ及び付随の遠心分離ステップの一環として、病原体防除剤に共役させたＰＭＰは、この時点で、ショ糖勾配中のバンドとして認められ、従って、次に、共役ＰＭＰを収集し、洗浄し、本明細書に記載の使用のために好適な溶液に溶解させることができる。
【０１３４】
一部の例では、例えば植物又は有害生物へのＰＭＰの送達前及び送達後、ＰＭＰを異種機能性薬剤と安定に結合させる。別の例では、例えば植物又は有害生物へのＰＭＰの送達後、異種機能性薬剤がＰＭＰから解離されるように、ＰＭＰを異種機能性と結合させる。
【０１３５】
ＰＭＰは、ＰＭＰの機能的及び構造的特徴をさらに改変するように、他の要素（例えば、脂質、例えばステロール、例えばコレステロール；又は小分子）でさらに修飾することもできる。例えば、ＰＭＰの安定性を高める（例えば、室温で少なくとも１日及び／又は４℃で少なくとも１週間にわたって安定している）安定化分子でＰＭＰをさらに修飾することができる。
【０１３６】
ＰＭＰには、具体的な薬剤又は使用に応じて、様々な濃度の異種機能性薬剤をロードすることができる。例えば、一部の例では、本明細書に開示される病原体防除組成物が、約０．００１、０．０１、０．１、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは９５（又は約０．００１から９５までの任意の範囲）以上のｗｔ％の病原体防除剤及び／若しくは忌避剤を含むように、ＰＭＰにロードする。一部の例では、病原体防除組成物が、約９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１．０、０．１、０．０１、０．００１（又は約９５から０．００１までの任意の範囲）以下のｗｔ％の病原体防除剤及び／若しくは忌避剤を含むように、ＰＭＰにロードする。例えば、病原体防除組成物は、約０．００１〜約０．０１ｗｔ％、約０．０１〜約０．１ｗｔ％、約０．１〜約１ｗｔ％、約１〜約５ｗｔ％又は約５〜約１０ｗｔ％、約１０〜約２０ｗｔ％の病原体防除剤及び／若しくは忌避剤を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰに、約１、５、１０、５０、２００若しくは５００、１，０００、２，０００（又は約１から２，０００までの任意の範囲）以上のμｇ／ｍｌの病原体防除剤及び／若しくは忌避剤をロードすることができる。本発明のリポソームには、約２，０００、１，０００、５００、２００、１００、５０、１０、５、１（又は約２，０００から１までの任意の範囲）以下のμｇ／ｍｌの病原体防除剤及び／若しくは忌避剤をロードすることができる。
【０１３７】
一部の例では、ＰＭＰには、本明細書に開示される病原体防除組成物が、少なくとも０．００１ｗｔ％、少なくとも０．０１ｗｔ％、少なくとも０．１ｗｔ％、少なくとも１．０ｗｔ％、少なくとも２ｗｔ％、少なくとも３ｗｔ％、少なくとも４ｗｔ％、少なくとも５ｗｔ％、少なくとも６ｗｔ％、少なくとも７ｗｔ％、少なくとも８ｗｔ％、少なくとも９ｗｔ％、少なくとも１０ｗｔ％、少なくとも１５ｗｔ％、少なくとも２０ｗｔ％、少なくとも３０ｗｔ％、少なくとも４０ｗｔ％、少なくとも５０ｗｔ％、少なくとも６０ｗｔ％、少なくとも７０ｗｔ％、少なくとも８０ｗｔ％、少なくとも９０ｗｔ％又は少なくとも９５ｗｔ％の病原体防除剤及び／若しくは忌避剤をロードする。一部の例では、ＰＭＰには、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、少なくとも１，０００μｇ／ｍｌ、少なくとも２，０００μｇ／ｍｌの病原体防除剤及び／若しくは忌避剤をロードすることができる。
【０１３８】
ＰＭＰにロードすることができる具体的な病原体防除剤又は忌避剤の例は、「異種機能性薬剤」と題するセクションでさらに概説する。
【０１３９】
Ｄ．医薬製剤
本明細書には、例えば、動物への投与のための医薬組成物に製剤化することができる病原体防除組成物が含まれる。医薬組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体及び／又は賦形剤と一緒に動物に投与され得る。投与方法及び用量に応じて、本明細書に記載の方法の医薬組成物は、容易な送達を可能にする好適な医薬組成物に製剤化され得る。単回用量は、必要に応じて単位用量剤形であり得る。
【０１４０】
病原体防除組成物は、動物への経口投与、静脈内投与（例えば、注射若しくは注入）又は皮下投与のために製剤化され得る。注射製剤の場合、種々の効果的な医薬担体が当技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄ．，（２０１２）及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，（２０１４）を参照されたい）。
【０１４１】
本組成物において薬学的に許容可能な担体及び賦形剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。許容可能な担体及び賦形剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ及びＴＡＥなどの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤、塩化ヘキサメトニウム、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、レゾルシノール及び塩化ベンザルコニウムなどの保存料、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン及び免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、ヒスチジン及びリシンなどのアミノ酸並びにグルコース、マンノース、スクロース及びソルビトールなどの炭水化物を挙げることができる。組成物は、従来の製薬業務規範に従って製剤化され得る。製剤中の化合物の濃度は、投与しようとする有効薬剤（例えば、ＰＭＰ）の用量、投与経路をはじめとするいくつかの要因に応じて変動し得る。
【０１４２】
動物への経口投与の場合、病原体防除組成物は、経口製剤の形態で調製することができる。経口用製剤は、非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合して有効成分を含有する錠剤、カプレット、カプセル、シロップ又は経口液体剤形を含み得る。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤又は充填剤（例えば、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンなどのデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム又はリン酸ナトリウム）；造粒剤及び崩壊剤（例えば、微結晶セルロースなどのセルロース誘導体、ジャガイモデンプンなどのデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩又はアルギン酸）；結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファデンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール）；並びに潤滑剤、滑剤及び付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油又はタルク）であり得る。他の薬学的に許容可能な賦形剤は、着色料、香味料、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などであり得る。また、経口用製剤は、チュアブル錠、非チュアブル錠、カプレット、カプセルとして（有効成分が不活性固体希釈剤と混合されているハードゼラチンカプセルとして又は有効成分が水若しくは油媒体と混合されているソフトゼラチンカプセルとして）単位剤形で提供され得る。本明細書に開示される組成物は、即時放出、持続的放出又は遅延放出製剤もさらに含み得る。
【０１４３】
動物への非経口投与の場合、病原体防除組成物は、液体溶液又は懸濁液の形態で製剤化して、非経口経路（例えば、皮下、静脈内又は筋肉内）により投与することができる。医薬組成物は、注射又は注入のために製剤化することができる。非経口投与のための医薬組成物は、滅菌溶液又は任意の薬学的に許容可能な液体をビヒクルとして用いて製剤化することができる。薬学的に許容可能なビヒクルとして、限定されないが、滅菌水、生理食塩水又は細胞培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−改変イーグル培地（α−ＭＥＭ）、Ｆ−１２培地）が挙げられる。製剤化方法は、当技術分野で公知であり、例えばＧｉｂｓｏｎ（ｅｄ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００９）を参照されたい。
【０１４４】
Ｅ．農業製剤
本明細書には、例えば、病原体又は病原体ベクター（例えば、昆虫）への投与の目的で農業組成物に製剤化することができる病原体防除組成物が含まれる。医薬組成物は、農業的に許容可能な希釈剤、担体及び／又は賦形剤と一緒に病原体又は病原体ベクター（例えば、昆虫）に投与され得る。本組成物及び方法に有用な農業製剤のさらなる例を本明細書にさらに概説する。
【０１４５】
適用、取扱い、輸送、貯蔵及び最大活性を容易にするために、有効物質、ここではＰＭＰを他の物質と一緒に製剤化することができる。ＰＭＰは、例えば、ベイト、濃縮エマルジョン、粉剤、乳剤、燻蒸剤、ゲル、顆粒、マイクロカプセル封入剤、種子処理剤、懸濁剤、サスポエマルジョン剤、錠剤、水溶性液体、水分散性顆粒若しくはドライフロワブル（ｄｒｙ  ｆｌｏｗａｂｌｅ）、水和剤及び極微量溶液に製剤化することができる。製剤の種類に関するさらに詳細な情報については、“Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ”Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ｎ°２，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣｒｏｐＬｉｆｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２）を参照されたい。
【０１４６】
有効物質（例えば、異種機能性薬剤、例えば抗病原体剤、農薬用薬剤若しくは忌避剤を含むか又は含まないＰＭＰ）は、最も一般的には、このような薬剤の濃縮製剤から調製される水性懸濁液又はエマルジョンとして適用することができる。こうした水溶性、水懸濁性又は乳化性製剤は、固体（通常、水和剤として知られる）、又は水分散性顆粒、又は通常、乳剤として知られる液体、又は水性懸濁液のいずれでもあり得る。圧縮して、水分散性顆粒を形成することができる水和剤は、農薬、担体及び界面活性剤の均質混合物を含む。担体は、通常、アタパルジャイト（ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ）クレイ、モンモリロナイト粘土、珪藻土又は精製ケイ酸から選択される。約０．５％〜約１０％の水和剤を含む、有効な界面活性剤としては、スルホン化リグニン、濃縮ナフタレンスルホネート、ナフタレンスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、スルホン酸アルキル及びアルキルフェノールのエチレンオキシド付加物などの非イオン界面活性剤が挙げられる。
【０１４７】
乳剤は、水溶性溶媒又は水溶性有機溶媒と乳化剤との混合物のいずれかである担体に溶解させた液体１リットル当たり約５０〜約５００グラムといった好適な濃度のＰＭＰを含有し得る。有用な有機溶媒としては、芳香油、特にキシレン及び石油留分、特に石油の高沸点ナフタレン及びオレフィン部分、例えば重質芳香族ナフサが挙げられる。また、他の有機溶媒、例えばロジン誘導体を含むテルペン溶媒、シクロヘキサノンなどの脂肪族ケトン及び２−エトキシエタノールなどの錯体アルコールを使用し得る。乳剤に好適な乳化剤は、一般的な陰イオン及び非イオン界面活性剤から選択される。
【０１４８】
水性懸濁液は、約５％〜約５０重量％の範囲の濃度で水性担体中に分散される水不溶性農薬の懸濁液を含む。懸濁液は、農薬を微粉砕し、これを、水及び界面活性剤を含む担体中に激しく混合することにより調製される。また、水性担体の密度及び粘性を増大するために、無機塩及び合成又は天然ゴムなどの材料を添加し得る。
【０１４９】
ＰＭＰは、顆粒状組成物として適用され得、これは、特に土壌への適用に有用である。顆粒状組成物は、通常、粘土又は類似の物質を含む担体に分散させた約０．５％〜約１０重量％の農薬を含有する。こうした組成物は、通常、好適な溶媒に製剤を溶解させた後、約０．５〜約３ｍｍの範囲の適切な粒径に事前に形成された顆粒状担体に適用することにより調製される。こうした組成物は、担体と化合物のダフ又はペーストを作製し、粉砕した後、乾燥させて、所望の顆粒粒径を得ることによって製剤化され得る。
【０１５０】
本ＰＭＰ製剤を含有する粉剤は、好適な粉末状の担体、例えばカオリンクレイ、摩砕した火山岩などと一緒に粉末状のＰＭＰを均質混合することにより調製される。粉剤は、好適には、パケットの約１％〜約１０％を占め得る。粉剤は、ダストブロワー機で、種子粉衣又は葉適用として適用することができる。
【０１５１】
同様に、好適な有機溶媒、通常、農業化学で広く使用されている石油、例えばスプレーオイル中の溶液の形態の本製剤を適用するのも実用的である。
【０１５２】
ＰＭＰは、エアゾール組成物の形態で適用することもできる。こうした組成物では、パケットを、圧力発生噴霧剤混合物である担体に溶解又は分散させる。エアゾール組成物を容器内にパッケージし、この容器から霧状化弁を介して混合物を投与する。
【０１５３】
別の実施形態は、水中油形エマルジョンであり、エマルジョンは、油滴を含み、これらは、それぞれラメラ液晶コーティングを備え、水相に分散されており、各油滴は、農業的に有効な少なくとも１つの化合物を含み、（１）少なくとも１つの非イオン親油性界面活性剤、（２）少なくとも１つの非イオン親水性界面活性剤、及び（３）少なくとも１つのイオン界面活性剤を含むモノラメラ又はオリゴラメラ層で個別にコーティングされており、この場合、油滴は、８００ナノメートル未満の平均粒径を有する。上記実施形態に関するさらに詳細な情報は、２００７年２月１日に公開された米国特許出願公開第２００７００２７０３４号明細書に開示されている。使用しやすいように、この実施形態は、「ＯＩＷＥ」と呼ぶ。
【０１５４】
加えて、一般に、上に開示した分子を製剤に使用する場合、こうした製剤は、他の成分も含有することができる。これらの成分として、限定されないが、（これは、非排他的且つ非相互排他的リストである）湿潤剤、展着剤、粘着剤、浸透剤、緩衝剤、金属イオン封鎖剤、ドリフト制御添加剤、適合性薬剤、消泡剤、洗浄剤及び乳化剤が挙げられる。いくつかの成分を以降に記載する。
【０１５５】
湿潤剤は、液体に添加されると、液体と、それが展着される表面との間の界面張力を低減することにより、液体の展着又は浸透力を高める物質である。湿潤剤は、農業化学製剤の２つの主要な機能：処理及び製造工程中、水による粉末の湿潤速度を高めて、可溶性液体のための濃縮物又は懸濁剤を製造し；スプレータンク中で水と製品の混合工程中、水和剤の湿潤時間を短縮して、水分散性顆粒への水の浸透を改善するために使用される。水和剤、懸濁剤及び水分散性顆粒製剤に使用される湿潤剤の例は、ラウリル硫酸ナトリウム；ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム；アルキルフェノールエトキシレート；及び脂肪族アルコールエトキシレートである。
【０１５６】
分散剤は、粒子の表面に吸着して、粒子の分散状態を保存することを促進すると共に、粒子が再凝集することを防ぐ物質である。分散剤は、製造工程中の分散及び懸濁を促進するため、且つスプレータンク内の水中に粒子を確実に再分散させるために農薬製剤に添加される。分散剤は、水和剤、懸濁剤及び水分散性顆粒剤に広く使用されている。分散剤として使用される界面活性剤は、粒子表面に強力に吸着して、粒子の再凝集に対する荷電又は立体障害をもたらす能力がある。最も一般的に使用される界面活性剤は、陰イオン、非イオン又はこれら２種類の混合物である。水和剤の場合、最も一般的な分散剤は、リグノスルホン酸ナトリウムである。懸濁剤の場合、高分子電解質、例えばナトリウムナフタレンスルホン酸ホルムアルデヒド縮合物を使用して、非常に優れた吸着及び安定化が達成される。トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステルも使用される。アルキルアリールエチレンオキシド縮合物及びＥＯ−ＰＯブロックコポリマーなどの非イオン界面活性剤は、懸濁剤濃縮物として陰イオン界面活性剤と組み合わせる場合もある。近年、新たなタイプの非常に高分子量のポリマー界面活性剤が分散剤として開発されている。これらは、非常に長い疎水性「骨格」と、「コーム」界面活性剤の「歯」を形成する多数のエチレンオキシド鎖を有する。これらの高分子量ポリマーは、疎水性骨格が、粒子表面に多くの固定点を有することから、懸濁剤に対して非常に良好な長期安定性を付与することができる。農薬製剤に使用される分散剤の例は、リグノスルホン酸ナトリウム；ナトリウムナフタレンスルホン酸ホルムアルデヒド縮合物；トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステル；脂肪族アルコールエトキシレート；アルキルエトキシレート；ＥＯ−ＰＯ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；及びグラフトコポリマーである。
【０１５７】
乳化剤は、別の液相中の１つの液相の液滴の懸濁を安定化させる物質である。乳化剤がなければ、２つの液体は、２つの非混和性液相中に分離するであろう。最も一般的に使用される乳化剤ブレンドは、１２以上のエチレンオキシド単位を有するアルキルフェノール又は脂肪族アルコールと、ドデシルベンゼンスルホン酸の油溶性カルシウム塩を含有する。８から１８までの親水性−親油性バランス（「ＨＬＢ」）値の範囲が、通常、優れた安定エマルジョンを提供する。エマルジョンの安定性は、時として、少量のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー界面活性剤の添加により改善することができる。
【０１５８】
可溶化剤は、臨界ミセル濃度を超える濃度のミセル水溶液を形成する界面活性剤である。そのため、ミセルは、ミセルの疎水性部分内で水不溶性材料を溶解又は可溶化させることができる。可溶化のために通常使用される界面活性剤のタイプは、非イオン界面活性剤、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノオレートエトキシレート及びオレイン酸メチルエステルである。
【０１５９】
標的に対する農薬の生物学的性能を改善するために、界面活性剤が、単独で又はスプレータンクミックスへの補助剤としての鉱油若しくは植物油などの他の添加剤と一緒に使用される場合もある。バイオエンハンスメントのために使用される界面活性剤のタイプは、一般に、農薬の性質及び作用モードに応じて変わる。しかし、これらは、多くの場合、アルキルエトキシレート；直鎖脂肪族アルコールエトキシレート；脂肪族アミンエトキシレートといった非イオン界面活性剤である。
【０１６０】
農薬製剤中の担体又は希釈剤は、必要な強度の製剤を提供するために農薬に添加される材料である。担体は、通常、高い吸収力を備える材料であるのに対し、希釈剤は、通常、低い吸収力を備える材料である。担体及び希釈剤は、粉剤、水和剤、顆粒及び水分散性顆粒の製剤に使用される。
【０１６１】
有機溶媒は、主として、乳剤、水中油形エマルジョン、サスポエマルション及び極少量製剤、また程度は低いが顆粒剤の製剤に使用される。溶媒の混合物が使用される場合もある。溶媒の第１主要グループは、ケロセン又は精製パラフィンなどの脂肪族パラフィン油である。第２の主要グループ（及び最も一般的）は、キシレン及びＣ９及びＣ１０芳香族溶媒のより高分子量の画分などの芳香族溶媒を含む。塩素化炭化水素は、製剤を水に乳化する場合に農薬の結晶化を防止するための共溶媒として有用である。溶解力を高めるための共溶媒として、アルコールが使用される場合もある。他の溶媒としては、植物油、種子油及び植物及び種子油のエステルが挙げられ得る。
【０１６２】
増粘剤又はゲル化剤は、主として、液体のレオロジー又は流動性を変化させるため、且つ分散した粒子又は液滴の分離及び沈殿を防止するために、懸濁剤、エマルジョン及びサスポエマルジョンの製剤に使用される。増粘剤、ゲル化剤及び沈殿防止剤は、概して２つのカテゴリー、即ち水不溶性粒子及び水溶性ポリマーに属する。粘土及びシリカを用いて、懸濁製剤を製造することが可能である。これらのタイプの材料の例として、限定されないが、モンモリロナイト粘土、ベントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム及びアタプルガイトが挙げられる。水溶性多糖が、増粘−ゲル化剤として長年使用されている。最も一般的に使用されている多糖のタイプは、種子及び海藻の天然抽出物であるか又はセルロースの合成誘導体である。これらのタイプの材料の例として、限定されないが、グアーガム；ローカストビーンガム；カラギーナン；アルギン酸塩；メチルセルロース；ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＳＣＭＣ）；ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）が挙げられる。他のタイプの沈殿防止剤は、加工デンプン、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール及びポリエチレンオキシドを基材とする。別の優れた沈殿防止剤は、キサンタンガムである。
【０１６３】
微生物は、製剤化した製品の腐敗を引き起こし得る。そのため、微生物の作用を排除又は抑制するために、防腐剤が用いられる。こうした薬剤の例として、限定されないが、以下のものが挙げられる：プロピオン酸及びその塩；ソルビン酸及びそのナトリウム又はカリウム塩；安息香酸及びその塩；ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム塩；ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル；並びに１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（ＢＩＴ）。
【０１６４】
界面活性剤の存在は、往々にして、生成及びスプレータンクからの適用での混合工程中に水性製剤を泡立たせる。泡立つ傾向を軽減するために、生産段階中又は瓶詰め前に消泡剤を添加することが多い。一般に、２種類の消泡剤、即ちシリコーン及び非シリコーンがある。シリコーンは、通常、ジメチルポリシロキサンの水性エマルジョンであり、非シリコーン消泡剤は、水不溶性油、例えばオクタノール及びノナノール又はシリカである。いずれの場合にも、消泡剤の機能は、界面活性剤を空気−水界面から移すことである。
【０１６５】
「グリーン（Ｇｒｅｅｎ）剤」（例えば、助剤、界面活性剤、溶媒）は、作物保護製剤の環境フットプリント全体を低減することができる。グリーン剤は、生分解性であり、一般に、天然及び／又は持続可能な供給源、例えば植物及び動物源由来である。具体的な例は、植物油、種子油及びそれらのエステル、さらにはアルコキシル化アルキルフェノールポリグルコシドである。
【０１６６】
一部の例では、ＰＭＰをフリーズドライ又は凍結乾燥することができる。米国特許第４，３１１，７１２号明細書を参照されたい。ＰＭＰは、後に水又は別の液体と接触させて再構成することができる。凍結乾燥若しくは再構成したリポソームに、他の成分、例えば他の病原体防除剤、農薬用薬剤、忌避剤、農業的に許容可能な担体又は本明細書に記載の製剤に従う他の物質を添加することができる。
【０１６７】
本組成物の他の任意の特徴は、ＵＶ及び／又は酸性条件から病原体防除組成物を保護する担体又は送達ビヒクルを含む。一部の例では、送達ビヒクルは、ｐＨバッファーを含有する。一部の例では、組成物は、約４．５〜約９．０の範囲内のｐＨを有するように製剤化され、例えば約５．０〜約８．０、約６．５〜約７．５又は約６．５〜約７．０のいずれか１つのｐＨ範囲を含む。
【０１６８】
本組成物は、有害生物、例えば病原体ベクター（例えば、昆虫）を本組成物の近傍に誘引する誘引物質（例えば、化学誘引物質）と一緒にさらに製剤化され得る。誘引物質としては、フェロモン、動物、特に有害生物により分泌される化学物質又は同じ種の他の生物の挙動若しくは発生に影響を及ぼす化学誘引物質が挙げられる。他の誘引物質としては、砂糖及びタンパク質加水分解物シロップ、酵母及び腐肉が挙げられる。誘引物質は、有効成分と組み合わせて、処理領域内の葉全体又は他の品目に噴霧することもできる。有害生物の餌の探索、産卵又は交配場所若しくは交配相手といった有害生物の挙動に影響を与える多様な誘引物質が知られている。本明細書に記載される方法及び組成物に有用な誘引物質として、例えばオイゲノール、プロピオン酸フェネチル、カルボン酸エチルジメチルイソブチル−シクロプロパン、ベンゾジオキサンカルボン酸プロピル、シス−７，８−エポキシ−２−メチルオクタデカン、トランス−８，トランス−０−ドデカジエノール、シス−９−テトラデセナール（シス−１１−ヘキサデセナールを含む）、トランス−１１−テトラデセナール、シス−１１−ヘキサデセナール、（Ｚ）−１１，１２−ヘキサデカジエナール、酢酸シス−７−ドデセニル、酢酸シス−８−ドデセニル、酢酸シス−９−ドデセニル、酢酸シス−９−テトラデセニル、酢酸シス−１１−テトラデセニル、酢酸トランス−１１−テトラデセニル（シス−１１を含む）、酢酸シス−９，トランス−１１−テトラデセニル（シス−９，トランス−１２を含む）、酢酸シス−９，トランス−１２−テトラデセニル、酢酸シス−７，トランス−１１−ヘキサデカジエニル（シス−７，トランス−１１を含む）、酢酸シス−１３，シス−１３−オクタデカジエニル、酢酸トランス−３，シス−１３−オクタデカジエニル、アネトール及びサリチル酸イソアミルが挙げられる。
【０１６９】
農薬製剤に関するさらに詳細な情報については、以下を参照されたい：“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄ．Ａ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９８  ｂｙ  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。また、以下も参照されたい：“Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ−Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”ｂｙ  Ａ．Ｓ．Ｐｅｒｒｙ，Ｉ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．Ｉｓｈａａｙａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｐｅｒｒｙ，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９８  ｂｙ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。
【０１７０】
ＩＩ．処置方法
本明細書に記載の病原体防除組成物は、様々な処置方法において、特に動物の病原体感染の予防又は処置のために有用である。本発明は、本明細書に記載の病原体防除組成物を動物に送達するステップを含む。
【０１７１】
本明細書には、本明細書に開示される病原体防除組成物を植物に投与する方法が提供される。本方法は、動物の病原体感染を予防又は処置する上で有用となり得る。
【０１７２】
例えば、本明細書には、真菌感染を有する動物を処置する方法が提供され、本方法は、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含む。一部の例では、本方法は、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗真菌剤を含む。一部の例では、抗真菌剤は、真菌感染を引き起こす真菌の遺伝子（例えば、フィラメント成長促進タンパク質（ＥＦＧ１））の発現を阻害する核酸である。一部の例では、真菌感染は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）によって引き起こされる。一部の例では、組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＥＶから産生されたＰＭＰを含む。一部の例では、本方法は、真菌感染を低減するか又は実質的に排除する。
【０１７３】
別の態様では、本明細書には、細菌感染を有する動物を処置する方法が提供され、本方法は、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含む。一部の例では、本方法は、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗菌剤（例えば、アムホテリシンＢ）を含む。一部の例では、細菌は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種又はエスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種である。一部の例では、組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＥＶから産生されたＰＭＰを含む。一部の例では、本方法は、細菌感染を低減するか又は実質的に排除する。一部の例では、動物は、ヒト、獣医学対象動物又は家畜動物である。
【０１７４】
本方法は、動物の感染（例えば、動物病原体に起因するものなど）を処置する上で有用であり、これは、動物の状態を改善又は安定化するために、既に疾患に罹患した動物に処置を施すことを指す。これは、初期量と比較して、動物体内、身体上若しくは周囲の１つ若しくは複数の病原体による病原体のコロニー形成を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％）低減すること及び／又は個体に利益（例えば、症状の分利に十分な量のコロニー形成の減少）を付与することを含み得る。このような例では、処置を受けた感染は、症状の低減（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）として現れ得る。一部の例では、個体の生存の可能性を増加する（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％の増加）か、又は個体群の全生存率を増加する（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％の増加）上で有効である。例えば、組成物及び方法は、感染を「実質的に排除する」上で有効であり得るが、これは、動物の症状を持続可能に（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月にわたって）分利する上で十分な量の感染の低減を指す。
【０１７５】
本方法は、感染（例えば、動物病原体に起因するものなど）を予防する上で有用であり、これは、初期病原体個体群（例えば、健康な個体に存在する大まかな量）を維持するのに十分な量で動物体内、身体上若しくは周囲の１つ若しくは複数の病原体によるコロニー形成の増加を（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超）予防し、感染の発症を予防し、且つ／又は感染に関連する症状若しくは状態を予防することを指す。例えば、個体は、免疫不全個体（例えば、癌、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを有するか若しくは免疫抑制剤を摂取している個体）又は長期抗生物質療法を受けている個体において、侵襲的医療処置の準備（例えば、移植、幹細胞療法、移植片、プロテーゼを受けるか、長期若しくは高頻度で静脈内カテーテル法を受けるか、又は集中治療室内での処置を受けるなどの手術の準備）をする間、個体は、真菌感染を予防するための予防処置を受けることができる。
【０１７６】
病原体防除組成物は、以下を含む任意の好適な方法による投与のために製剤化するか、又はそうした方法によって投与することができる：例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、腹膜内、結膜下、膀胱内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、眼窩内、経口、局所、経皮、硝子体内（例えば、硝子体内注射による）、点眼薬により、吸入により、注射により、移植により、注入により、連続点滴により、標的細胞を局在化灌流浴に直接付すことにより、カテーテルにより、洗浄により、クリーム又は脂質組成物中において。本明細書に記載の方法で使用される組成物は、全身投与又は局所投与することもできる。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される化合物又は組成物並びに治療しようとする状態、疾患又は障害の重大度）に応じて変動し得る。一部の例では、病原体防除組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、頭蓋内、心室内又は鼻内投与される。投与は、一部には投与が短期又は長期であるかに応じて、任意の好適な経路、例えば静脈内又は皮下注射などの注射によって行うことができる。本明細書では、限定されないが、単回投与若しくは様々な時点での複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含む多様な投与スケジュールが考慮される。
【０１７７】
本明細書に記載の感染の予防又は処置のために（単独で又は１つ若しくは複数の他の追加的な治療薬と組み合わせて使用する場合）、治療しようとする疾患の種類、疾患の重症度及び経過、それが予防若しくは治療目的のいずれで投与されるか、過去の治療、患者の病歴並びに病原体防除組成物に対する応答に応じて変動し得る。病原体防除組成物は、例えば、１回で又は一連の処置にわたって患者に投与することができる。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、処置は、概して、疾患症状の所望の抑制が起こるか、又は感染が検出できなくなるまで持続されることになる。こうした用量は、断続的に、例えば毎週又は２週間毎に（例えば、患者が、病原体防除組成物の用量を例えば約２〜約２０回受けるように）投与され得る。初期の比較的高い用量後、１つ又は複数のより低い用量を投与し得る。しかし、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０１７８】
一部の例では、個体（例えば、ヒト）に投与される病原体防除組成物の量は、個体の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｇ／ｋｇの範囲（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ又は約１ｇ／ｋｇ〜５ｇ／ｋｇ）であり得る。一部の例では、個体（例えば、ヒト）に投与される病原体防除組成物の量は、個体の体重の少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ（例えば、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｇ／ｋｇ又は少なくとも５ｇ／ｋｇ）である。用量は、単回用量又は複数回用量（例えば、２、３、４、５、６、７若しくは８回以上の用量）として投与され得る。一部の例では、動物に投与される病原体防除組成物は、単独で又は追加的な治療薬若しくは病原体防除剤と組み合わせて投与され得る。併用療法で投与される抗体の用量は、単独処置と比較して低いことができる。この療法の進行は、従来の技術によって容易にモニターされる。
【０１７９】
ＩＩＩ．農業方法
本明細書に記載の病原体防除組成物は、様々な農業方法において、特に動物への病原体感染の予防又は処置及び例えば病原体ベクターによるこのような病原体の拡大の抑制のために有用である。本方法は、本明細書に記載の病原体防除組成物を病原体又は病原体ベクターに送達するステップを含む。
【０１８０】
本組成物及び関連方法を使用して、病原体又は病原体ベクターが常在する任意の生息場所（例えば、動物の外部、例えば植物上、植物部分（例えば、根、果実及び種子）上、土壌中若しくは土壌上、水又は別の病原体若しくは病原体ベクター生息地における病原体又は病原体ベクターによる寄生を予防するか、又はそれらの数を低減することができる。従って、本組成物及び方法は、ベクターを殺傷するか、障害するか又は活動を緩徐にすることにより、病原体ベクターの有害作用を低減することができ、これにより、病原体が動物に広がることを抑制することができる。本明細書に開示される組成物を用いて、あらゆる発生段階、例えばそれらの卵、若虫、虫齢、幼虫、成虫、幼若体又は乾燥形態にある任意の病原体又は病原体ベクターを防除、殺傷、障害、麻痺させるか、又はその１つ若しくは複数の活動を低減することができる。これらの方法の各々の詳細については、以下にさらに記載する。
【０１８１】
Ａ．病原体への送達
本明細書には、病原体を病原体防除組成物と接触させることにより、本明細書に開示されるものなどの病原体に病原体防除組成物を送達する方法が提供される。本方法は、例えば、病原体防除組成物の送達の結果として、病原体感染を予防若しくは処置するか又は病原体の拡大を制御するために病原体の適応度を低減させる上で有用となり得る。本明細書に記載の方法に従ってターゲティングすることができる病原体の例としては、細菌（例えば、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種若しくはエスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種）、真菌（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種）、寄生昆虫（例えば、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種）、寄生線虫（例えば、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種）又は寄生原虫（例えば、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種）が挙げられる。
【０１８２】
例えば、本明細書には、病原体の適応度を低減させる方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを病原体に送達するステップを含み、本方法は、非処置病原体に対して病原体の適応度を低減させる。一部の実施形態では、本方法は、病原体が成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達するステップを含む。本明細書に記載の方法の一部の例では、組成物は、病原体による摂取のための病原体摂食可能組成物として送達される。本明細書に記載の方法の一部の例では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として（例えば、病原体に）送達される。
【０１８３】
また、本明細書には、寄生昆虫の適応度を低減させる方法も提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生昆虫に送達するステップを含む。一部の例では、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生昆虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む。例えば、寄生昆虫は、トコジラミであり得る。寄生昆虫の他の非限定的な例は、本明細書に記載する。一部の例では、本方法は、非処置寄生昆虫に対して寄生昆虫の適応度を低減させる。
【０１８４】
加えて、本明細書には、寄生線虫の適応度を低減させる方法も提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生線虫に送達するステップを含む。一部の例では、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生線虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺線虫剤を含む。例えば、寄生線虫は、ヘリグモソモイデス・ポリギルス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）である。寄生線虫の他の非限定的な例は、本明細書に記載する。一部の例では、本方法は、非処置寄生線虫に対して寄生線虫の適応度を低減させる。
【０１８５】
さらに、本明細書には、寄生原虫の適応度を低減させる方法も提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生原虫に送達するステップを含む。一部の例では、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生線虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗寄生虫剤を含む。例えば、寄生原虫は、膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）である。寄生原虫の他の非限定的な例は、本明細書に記載する。一部の例では、本方法は、非処置寄生原虫に対して寄生原虫の適応度を低減させる。
【０１８６】
病原体防除組成物の送達の結果としての病原体の適応度の低減は、いくつかの様式で現れ得る。一部の例では、病原体の適応度の低減は、病原体防除組成物の送達の結果として、病原体の生理機能の劣化又は衰え（例えば、健康状態若しくは生存率の低減）として現れ得る。一部の例では、生物の適応度は、病原体防除組成物が投与されなかった病原体と比較して、限定されないが、繁殖率、生殖能力、寿命、生存能力、移動性、繁殖力、病原体発生、体重、代謝率若しくは活動又は生存率を含む１つ又は複数のパラメータにより測定することができる。例えば、本明細書に記載の方法又は組成物は、病原体の健康全般を低減させるか、又は病原体の全生存率を低減させるのに有効であり得る。一部の例では、病原体の生存率低減は、参照レベル（例えば、病原体防除組成物を受けていない病原体で見られるレベルと比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超である。一部の例では、本方法又は組成物は、病原体防除を投与されていない病原体と比較して病原体の繁殖（例えば、繁殖率、生殖力）を低減させるのに有効である。一部の例では、本方法又は組成物は、移動性、体重、寿命、繁殖力又は代謝率などの他の生理学的パラメータを参照レベル（例えば、病原体防除組成物を受けていない病原体で見られるレベル）と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低減させるのに有効である。
【０１８７】
一部の例では、病害虫適応度の低減は、病原体防除組成物が送達されていない病原体と比較して、抗病原体剤に対する病原体の感受性の増加及び／又は抗病原体剤に対する病原体の耐性の低減として現れ得る。一部の例では、本明細書に記載の方法又は組成物は、病原体防除剤に対する病原体の感受性を参照レベル（例えば、病原体防除組成物を受けていない病原体で見られるレベル）と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。
【０１８８】
一部の例では、病原体適応度の低減は、病原体防除（組成物が送達されていない病原体と比較して、他の適応不利点、例えば特定の環境因子に対する耐性（例えば、高温若しくは低温耐性）の低減、特定の生息場所で生存する能力の低減又は特定の食餌を持続する能力の低減として現れ得る。一部の例では、本明細書に記載の方法又は組成物は、本明細書に記載されるいずれか複数の方法で病原体の適応度を低減させるのに有用であり得る。さらに、病原体防除組成物は、任意の数の病原体綱、目、科、属又は種（例えば、１つの病原体種、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２００、２５０、５００又はそれを超える病原体種）の病原体適応度を低減させることができる。一部の例では、病原体防除組成物は、単一の病原体綱、目、科、属又は種に作用する。
【０１８９】
病原体適応度は、当技術分野における任意の標準的方法を用いて判定することができる。一部の例では、病害虫適応度は、個別の病原体を評価することにより判定され得る。代わりに、病害虫適応度は、病原体個体群を評価することにより判定され得る。例えば、病原体適応度の低減は、他の病原体との競合の成功の低減として現れ、それが病原体個体群サイズの減少につながり得る。
【０１９０】
Ｂ．病原体ベクターへの送達
本明細書には、病原体を病原体防除組成物と接触させることにより、本明細書に開示されるものなどの病原体ベクターに病原体防除組成物を送達する方法が提供される。本方法は、例えば、病原体防除組成物の送達の結果として、病原体の拡大を制御するために、病原体ベクターの適応度を低減させる上で有用となり得る。本明細書に記載の方法に従ってターゲティングすることができる病原体の例としては、セクションＩＶ．Ｇに記載されるものなどの昆虫が挙げられる。
【０１９１】
例えば、本明細書には、動物病原体ベクターの適応度を低減させる方法が提供され、この方法は、有効量の、本明細書に記載の組成物のいずれかをベクターに送達するステップを含み、本方法は、非処置ベクターに対してベクターの適応度を低減させる。一部の例では、本方法は、ベクターが成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達するステップを含む。一部の例では、組成物は、ベクターによる摂取のための摂食可能組成物として送達される。一部の例では、ベクターは、昆虫である。一部の例では、昆虫は、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである。一部の例では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される。
【０１９２】
例えば、本明細書には、動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低減させる方法が提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物をベクターに送達するステップを含む。一部の例では、本方法は、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物をベクターに送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む。例えば、昆虫ベクターは、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである。病原体ベクターの他の非限定的な例は、本明細書に記載する。一部の例では、本方法は、非処置ベクターと比較してベクターの適応度を低減させる。
【０１９３】
一部の例では、ベクター適応度の低減は、組成物の投与の結果として、ベクターの生理機能の劣化又は衰え（例えば、健康状態若しくは生存率の低減）として現れ得る。一部の例では、生物の適応度は、組成物が送達されていないベクターと比較して、限定されないが、繁殖率、寿命、移動性、繁殖力、体重、代謝率若しくは活動又は生存率を含む１つ又は複数のパラメータにより測定することができる。例えば、本明細書に記載の方法又は組成物は、ベクターの健康全般を低減させるか、又はベクターの全生存率を低減させるのに有効であり得る。一部の例では、ベクターの生存率低減は、参照レベル（例えば、組成物を受けていないベクターで見られるレベル）と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超である。一部の例では、本方法又は組成物は、組成物が投与されていないベクター生物と比較してベクターの繁殖（例えば、繁殖率）を低減させるのに有効である。一部の例では、本方法又は組成物は、移動性、体重、寿命、繁殖力又は代謝率などの他の生理学的パラメータを参照レベル（例えば、組成物が送達されていないベクターで見られるレベル）と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低減させるのに有効である。
【０１９４】
一部の例では、ベクター適応度の低減は、組成物が送達されていないベクター生物と比較して、農薬用薬剤に対するベクターの感受性の増加及び／又は農薬用薬剤に対するベクターの耐性の低減として現れ得る。一部の例では、本明細書に記載の方法又は組成物は、農薬用薬剤に対するベクターの感受性を参照レベル（例えば、組成物を受けていないベクターで見られるレベル）と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。農薬用薬剤は、殺虫剤を含め、当技術分野で公知の任意の農薬用薬剤であり得る。一部の例では、本明細書に記載の方法又は組成物は、組成物が送達されていないベクターと比較して、農薬用薬剤を使用可能な基質に代謝又は分解するベクターの能力を低減することにより、農薬用薬剤に対するベクターの感受性を増加させ得る。
【０１９５】
一部の例では、ベクター適応度の低減は、組成物が送達されていないベクター生物と比較して、他の適応不利点、例えば特定の環境因子に対する耐性（例えば、高温若しくは低温耐性）の低減、特定の生息場所で生存する能力の低減又は特定の食餌を持続する能力の低減として現れ得る。一部の例では、本明細書に記載の方法又は組成物は、本明細書に記載されるいずれか複数の方法でベクターの適応度を低減させるのに有用であり得る。さらに、本組成物は、任意の数のベクター綱、目、科、属又は種（例えば、１つのベクター種、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２００、２５０、５００又はそれを超えるベクター種）のベクター適応度を低減させることができる。一部の例では、組成物は、単一のベクター綱、目、科、属又は種に作用する。
【０１９６】
ベクター適応度は、当技術分野における任意の標準的方法を用いて判定することができる。一部の例では、ベクター適応度は、個別ベクターを評価することにより判定され得る。代わりに、ベクター適応度は、ベクター個体群を評価することにより判定され得る。例えば、ベクター適応度の低減は、他のベクターとの競合の成功の低減として現れ、それがベクター個体群サイズの減少につながり得る。
【０１９７】
動物病原体を担持するベクターの適応度を低減させることにより、本明細書に記載の組成物は、ベクター媒介病の拡大を低減するのに有効である。本明細書に記載される製剤及び送達のいずれかを用いて、疾患の伝染を低減する、例えばベクター同士の垂直若しくは水平伝染を低減し、且つ／又は動物への伝染を低減するのに有効な量及び時間で本組成物を昆虫に送達することができる。例えば、本明細書に記載の組成物は、ベクター媒介病原体の垂直又は水平伝染を、組成物が送達されていないベクター生物と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低減し得る。別の例として、本明細書に記載の組成物は、昆虫ベクターのベクター競合を、組成物が送達されていないベクター生物と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低減し得る。
【０１９８】
本明細書に記載の組成物及び方法により防除され得る疾患の非限定的な例として、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスに起因する疾患（例えば、チクングニア熱、ロスリバー熱、マヤロ熱、オニョンニョン熱、シンドビス熱、東部馬脳炎、西部馬脳炎、ベネズエラ馬脳炎若しくはバーマ森林（Ｂａｒｍａｈ  ｆｏｒｅｓｔ））；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｄａｅ）ウイルスに起因する疾患（例えば、デング熱、黄熱病、キャサヌル森林病、オムスク出血熱、日本脳炎、マレー渓谷脳炎、ロシオ（Ｒｏｃｉｏ）、セントルイス脳炎、ウエストナイル脳炎若しくはダニ媒介性脳炎）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスに起因する疾患（例えば、サシチョウバエ熱、リフトバレー熱、ラクロス脳炎、カリフォルニア脳炎、クリミア・コンゴ出血熱若しくはオロプーシェ熱）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスに起因する疾患（例えば、水疱性口炎）；オルビウイルス科（Ｏｒｂｉｖｉｒｉｄａｅ）に起因する疾患（例えば、ブルータング）；細菌に起因する疾患（例えば、プラーク、野兎病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱、発疹熱（Ｍｕｒｉｎｅ  ｔｙｐｈｕｓ）、ボタン熱、クイーンズランド発疹熱（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  ｔｉｃｋ  ｔｙｐｈｕｓ）、シベリア発疹熱（Ｓｉｂｅｒｉａｎ  ｔｉｃｋ  ｔｙｐｈｕｓ）、ツツガムシ病（Ｓｃｒｕｂ  ｔｙｐｈｕｓ）、回帰熱若しくはライム病）；又は原虫に起因する疾患（例えば、マラリア、アフリカトリパノソーマ症、ナガナ病（Ｎａｇａｎａ）、シャーガス病、リーシュマニア症、ピロプラズマ症、バンクロフトフィラリア症若しくはブルギアフィラリア症）が挙げられる。
【０１９９】
Ｃ．適用方法
本明細書に記載の病原体又は病原体ベクターは、病原体又は病原体ベクターに対する組成物の送達又は投与を可能にする任意の好適な方法で本明細書に記載の組成物のいずれかに曝露することができる。病原体防除組成物は、単独で又は他の活性物質（例えば、農薬用薬剤）若しくは非活性物質と組み合わせてのいずれかで送達され得、例えば有効濃度の病原体防除組成物を送達するように製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、散布液、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態において、例えば噴霧、マイクロインジェクション、植物経由、注入、浸漬によって適用され得る。本明細書に記載される組成物の適用量及び適用部位は、概して、病原体又は病原体ベクターの習性、病原体又は病原体ベクターを病原体防除組成物によりターゲティングすることができる生活環ステージ、適用が行われる部位並びに病原体防除組成物の物理的及び機能的特性によって決定される。本明細書に記載される病原体防除組成物は、病原体又は病原体ベクターに経口摂取によって投与され得るが、クチクラを通した浸透又は病原体若しくは病原体ベクターの呼吸器系への浸透を可能にする手段によっても投与され得る。
【０２００】
一部の例では、病原体防除組成物を含む溶液に病原体又は病原体ベクターを単純に「浸漬」するか、又は病原体又は病原体ベクターに上記溶液を「噴霧」することができる。代わりに、病原体防除組成物を病原体又は病原体ベクターの飼料成分（例えば、摂食可能物）に連結して送達を容易にし、且つ／又は病害虫による病原体防除組成物の取込みを増大することもできる。経口導入方法には、例えば、病原体防除組成物を病原体又は病原体ベクターの飼料と直接混合すること、病原体又は病原体ベクターの生息場所若しくは畑に病原体防除組成物を噴霧すること及び飼料として使用される種が病原体防除組成物を発現するように改変した後、次に影響を与えようとする病原体又は病原体ベクターに給餌する操作手法が含まれ得る。一部の例では、例えば、病原体防除組成物は、病原体又は病原体ベクターの食餌中に配合するか又は食餌の上にかけることができる。例えば、病原体防除組成物は、病原体又は病原体ベクターが生息する作物畑の上に噴霧することができる。
【０２０１】
一部の例では、本組成物は、例えば、背負式散布、空中散布、作物散布／散粉等により、植物、例えば作物の上に直接噴霧される。病原体防除組成物が植物に送達される例では、病原体防除組成物を受け取る植物は、いずれかの植物成長段階であり得る。例えば、製剤化された病原体防除組成物は、植物成長初期に種子コーティング若しくは経根処理として又は作物サイクル後期に植物全体の処理として適用することができる。一部の例では、病原体防除組成物は、局所薬剤として植物に適用され得、これにより病原体若しくは病原体ベクターがその植物を摂食するか、又はそうでなければその植物との相互作用時に植物と接触するようにする。
【０２０２】
さらに、病原体防除組成物は、植物又は動物病原体若しくは病原体ベクターの組織を通して吸収され、分布する全身薬として（例えば、植物が成長する土壌中又は植物の水やりに使用される水中に）適用され得、これにより、それを餌にする病原体又は病原体ベクターが有効用量の病原体防除組成物を摂取するようにする。一部の例では、植物又は飼料生物は、病原体防除組成物を発現するように遺伝的に形質転換され得、これにより、その植物又は飼料生物を餌にする病原体又は病原体ベクターが病原体防除組成物を摂食するようにする。
【０２０３】
また、遅延放出又は継続的放出は、病原体防除組成物又は１つ以上の病原体防除組成物を含む組成物をゼラチンなどの溶解性又は生体内分解性コーティング層で被覆することにより、このコーティングが使用環境内で溶解又は分解し、次に病原体防除組成物が利用可能になるようにするか、又は薬剤を溶解性又は分解性マトリックス中に分散させることにより達成することができる。有利には、こうした継続的放出及び／又は分注手段装置を使用して、本明細書に記載される１つ又は複数の病原体防除組成物の有効濃度を特定の病原体又は病原体ベクター生息場所内で常に維持することができる。
【０２０４】
病原体防除組成物は、病原体又は病原体ベクターが成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する媒体に配合することもできる。例えば、病原体防除組成物は、飼料容器、餌場、保護用ラッピング材又は巣箱に配合することができる。いくつかの適用の場合、病原体防除組成物は、粉末形態での適用又はトラップ若しくは餌場への適用のための固体支持体に結合し得る。例として、組成物が特定の病原体又は病原体ベクターのためのトラップにおいて又はベイトとして使用される適用の場合にも組成物を固体支持体に結合するか又は時限放出材料に封入し得る。例えば、本明細書に記載の組成物は、農業病原体又は病原体ベクターが成長、生息、繁殖又は摂食する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達することにより投与され得る。
【０２０５】
農薬は、多くの場合、野外適用の場合、１ヘクタール当たりの農薬の量（ｇ／ｈａ若しくはｋｇ／ｈａ）又は１ヘクタール当たりの有効成分若しくは酸同等物の量（ｋｇ  ａ．ｉ．／ｈａ若しくはａ．ｉ．／ｈａ）として推奨される。一部の例では、組成物中にＰＭＰを含まない農薬を適用した場合と同じ結果を達成するために、本組成物中では、より少ない量の農薬が土壌、植物培地、種子植物組織又は植物に適用されることが必要とされ得る。例えば、農薬用薬剤の量は、非ＰＭＰ組成物中に適用される同じ農薬用薬剤、例えば同じ農薬用薬剤の直接適用より約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０若しくは１００倍（又は約２から約１００倍までの任意の範囲、例えば約２〜１０倍；約５〜１５倍、約１０〜２０倍；約１０〜５０倍）低いレベルで適用され得る。本明細書に開示される病原体防除組成物は、１ヘクタール当たりの様々な量、例えば約０．０００１、０．００１、０．００５、０．０１、０．１、１、２、１０、１００、１，０００、２，０００、５，０００（又は約０．０００１〜５，０００の任意の範囲）ｋｇ／ｈａで適用することができる。例えば、約０．０００１〜約０．０１、約０．０１〜約１０、約１０〜約１，０００、約１，０００〜約５，０００ｋｇ／ｈａである。
【０２０６】
ＩＶ．病原体又はそれらのベクター
本明細書に記載される病原体防除組成物及び関連方法は、動物病原体の適応度を低減させ、これにより動物への感染を処置又は予防するのに有用である。本病原体防除組成物又は関連方法で処理することができる動物病原体又はそれらのベクターの例を本明細書にさらに記載する。
【０２０７】
Ａ．真菌
病原体防除組成物及び関連方法は、例えば、動物の真菌感染を予防又は処置するために、真菌の適応度を低減させる上で有用であり得る。病原体防除組成物を真菌と接触させることにより、病原体防除組成物を真菌に送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、病原体防除組成物を動物に投与することにより、真菌感染のリスクがある動物又はそれを必要とする動物の真菌感染（例えば、本明細書に記載の真菌に起因するもの）を予防又は処置するステップを含む。
【０２０８】
病原体防除組成物及び関連方法は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ニューモシスチス・イロベチイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、コクシジオイデス・イミチス／ポサダシ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ／ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（フィロバシジエラ・ネオフォルマンス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ））、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）（エンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ  ｂｉｅｎｅｕｓｉ））、ケカビ亜門（Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）（ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リクテイミア・コリムビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ））に属する真菌に起因する感染を含め、動物の真菌感染の処置又は予防に好適である。
【０２０９】
一部の例では、真菌感染は、以下の門：子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ケカビ亜門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）又は接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）に属する真菌に起因するものである。真菌感染又は過剰増殖は、１つ又は複数の真菌種、例えばカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．アウリス（Ｃ．ａｕｒｉｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マラッセジア・グロボース（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｇｌｏｂｏｓｅ）、Ｍ．レストリクタ（Ｍ．ｒｅｓｔｒｉｃｔａ）又はデバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ジベレラ・モニリフォルミス（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、アルタルナリア・ブラシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ニューモシスチス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、Ｐ．イロベチイ（Ｐ．ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、Ｐ．ムリナ（Ｐ．ｍｕｒｉｎａ）、Ｐ．オリクトラギ（Ｐ．ｏｒｙｃｔｏｌａｇｉ）、Ｐ．ワケフィールジアエ（Ｐ．ｗａｋｅｆｉｅｌｄｉａｅ）及びアスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）を含み得る。これらの真菌種は、病原体又は日和見病原体と考えられ得る。
【０２１０】
一部の例では、真菌感染は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に起因する（すなわちカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）感染）。例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）感染は、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．アウリス（Ｃ．ａｕｒｉｓ）、Ｃ．パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．オルトプシロシス（Ｃ．ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．ギリエルモンデイ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ルゴース（Ｃ．ｒｕｇｏｓｅ）及びＣ．ルシタニア（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）からなる群から選択される、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の真菌に起因し得る。本明細書に開示される方法により処置することができるカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）感染として、限定されないが、カンジダ菌血症、口腔咽頭カンジダ症、食道カンジダ症、粘膜カンジダ症、性器カンジダ症、外陰膣カンジダ症、直腸カンジダ症、肝カンジダ症、腎カンジダ症、肺カンジダ症、脾カンジダ症、耳真菌症、骨髄炎、化膿性関節炎、心血管カンジダ症（例えば、心内膜炎）及び侵襲性カンジダ症が挙げられる。
【０２１１】
Ｂ．細菌
病原体防除組成物及び関連方法は、例えば、動物の細菌感染を予防又は処置するために、細菌の適応度を低減させる上で有用であり得る。病原体防除組成物を細菌と接触させることにより、病原体防除組成物を細菌に送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、病原体防除組成物を動物に投与することにより、細菌感染のリスクがある動物又はそれを必要とする動物の細菌感染（例えば、本明細書に記載の細菌に起因するもの）を予防又は処置することを含む。
【０２１２】
病原体防除組成物及び関連方法は、以下にさらに記載する任意の細菌に起因する動物の細菌感染を予防又は処置するのに好適である。例えば、細菌は、以下に属するものであり得る：バシラス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（肺炎レンサ球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）（ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ））、スピロヘータ目（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ）（ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ））、クラミジア目（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ）（クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ））、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）（ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アビウム菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ））、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）（発疹チフスリケッチア（Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）、Ａ．ファゴサイトフィルム（Ａ．ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｅ．シャフェンシス（Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ））、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）（ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ））、バークホルデリア目（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ）（ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、Ｂ．シュードマレイ（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、ナイセリア目（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）（淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、カンピロバクター目（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）（カンピロバクター・ジェジュニ（（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ））、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）（レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、シュードモナス目（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）（Ａ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、エアロモナス目（Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）（アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）種）、ビブリオ目（Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ）（コレラ菌（Ｖｉｂｒ���ｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｖ．腸炎ビブリオ（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））、チオトリックス目（Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、腸内細菌目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、Ｙ．エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））。
【０２１３】
一部の例では、細菌は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０２１４】
Ｃ．寄生昆虫
病原体防除組成物及び関連方法は、例えば、動物への寄生昆虫感染を予防又は処置するために、寄生昆虫の適応度を低減させる上で有用であり得る。用語「昆虫」には、任意の発育段階にある、すなわち幼虫及び成虫の、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）及び昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）又は蛛形綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）に属するあらゆる生物が含まれる。病原体防除組成物と昆虫を接触させることにより、病原体防除組成物を昆虫に送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、病原体防除組成物を動物に投与することにより、リスクがあるか又はそれを必要とする動物の寄生昆虫感染（本明細書に記載の寄生昆虫に起因するもの）を予防又は処置することを含む。
【０２１５】
病原体防除組成物及び関連方法は、以下に属する昆虫による感染を含め、寄生昆虫による動物の感染を予防又は処置するのに好適である：シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）：シラミ亜目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）（吸血性シラミ）、ホソツノハジラミ亜目（Ｉｓｃｈｎｏｃｅｒａ）（咀嚼性シラミ）、マルツノハジラミ亜目（Ａｍｂｌｙｃｅｒａ）（咀嚼性シラミ）。ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）：ヒトノミ科（Ｐｕｌｉｃｉｄａｅ）（ネコノミ（Ｃａｔ  ｆｌｅａｓ）、ナガノミ科（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｉｄａｅ）（ニワトリノミ（Ｃｈｉｃｋｅｎ−ｆｌｅａｓ）。双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）：カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）（蚊（Ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ））、ヌカカ科（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）（ユスリカ（Ｍｉｄｇｅｓ））、チョウバエ科（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ）（サシチョウバエ（Ｓａｎｄｆｌｉｅｓ））、ブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）（ブユ（Ｂｌａｃｋｆｌｉｅｓ）、アブ科（Ｔａｂａｎｉｄａｅ）（ウシアブ（Ｈｏｒｓｅ−ｆｌｉｅｓ））、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）（イエバエ（Ｈｏｕｓｅ−ｆｌｉｅｓ）など）、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）（クロバエ（Ｂｌｏｗｆｌｉｅｓ））、ツェツェバエ科（Ｇｌｏｓｓｉｎｉｄａｅ）（ツェツェバエ（Ｔｓｅｔｓｅ−ｆｌｉｅｓ））、ヒツジバエ科（Ｏｅｓｔｒｉｄａｅ）（ウマバエ（Ｂｏｔ−ｆｌｉｅｓ））、シラミバエ科（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ）（シラミバエ（Ｌｏｕｓｅ−ｆｌｉｅｓ））。カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）：サシガメ科（Ｒｅｄｕｖｉｉｄａｅ）（サシガメ（Ａｓｓａｓｓｉｎ−ｂｕｇｓ））、トコジラミ科（Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ）（トコジラミ（Ｂｅｄ−ｂｕｇｓ））。蛛形綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）：ヒゼンダニ科（Ｓａｒｃｏｐｔｉｄａｅ）（ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｉｃ  ｍｉｔｅｓ））、キュウセンヒゼンダニ科（Ｐｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ）（キュウセンヒゼンダニ（Ｐｓｏｒｏｐｔｉｃ  ｍｉｔｅｓ））、シトジチダエ科（Ｃｙｔｏｄｉｔｉｄａｅ）（気嚢ダニ（Ａｉｒ−ｓａｃ  ｍｉｔｅｓ））、ラミノシオプテス（Ｌａｍｉｎｏｓｉｏｐｔｅｓ）（シストダニ（Ｃｙｓｔ−ｍｉｔｅｓ））、ウモウダニ科（Ａｎａｌｇｉｄａｅ）（ウモウダニ（（Ｆｅａｔｈｅｒ−ｍｉｔｅｓ）、コナダニ科（Ａｃａｒｉｄａｅ）（コナダニ（Ｇｒａｉｎ−ｍｉｔｅｓ））、ニキビダニ科（Ｄｅｍｏｄｉｃｉｄａｅ）（毛包ダニ（Ｈａｉｒ−ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｍｉｔｅｓ））、ツメダニ科（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌｉｄａｅ）（毛皮ダニ（Ｆｕｒ−ｍｉｔｅｓ）、ツツガムシ科（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌｉｄａｅ）（ツツガムシ（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌｉｄｓ））、ワクモ科（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｉｄａｅ）（トリダニ（Ｂｉｒｄ  ｍｉｔｅｓ））、オオサシダニ科（Ｍａｃｒｏｎｙｓｓｉｄａｅ）（トリダニ（Ｂｉｒｄ  ｍｉｔｅｓ））、ヒメダニ科（Ａｒｇａｓｉｄａｅ）（軟ダニ（Ｓｏｆｔ−ｔｉｃｋｓ））、マダニ科（Ｉｘｏｄｉｄａｅ（マダニ（Ｈａｒｄ−ｔｉｃｋｓ））。
【０２１６】
Ｄ．原虫
病原体防除組成物及び関連方法は、例えば、動物の寄生原虫感染を予防又は処置するために、寄生原虫の適応度を低減させる上で有用であり得る。用語「原虫」には、原生動物門（Ｐｒｏｔｏｚｏａ）に属するあらゆる生物が含まれる。病原体防除組成物と寄生原虫を接触させることにより、寄生原虫に病原体防除組成物を送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、病原体防除組成物を動物に投与することにより、リスクがあるか又はそれを必要とする動物の原虫感染（本明細書に記載の原虫に起因するもの）を予防又は処置することを含む。
【０２１７】
病原体防除組成物及び関連方法は、以下に属する原虫を含め、寄生原虫による動物の感染を予防又は処置するのに好適である：ユーグレノゾア目（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ブルセイ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種）、ヘテロロボセア綱（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｂｏｓｅａ）（フォーラーネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ））、ディプロモナス目（Ｄｉｐｌｏｍｏｎａｄｉｄａ）（ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ））、アメーバ動物門（Ａｍｏｅｂｏｚｏａ）（アカントアメーバ・カステラーニ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）、バラムチア・マンドリラリス（Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ  ｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ））、ブラストシスチス属（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ）（ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ））、アピコンプレックス門（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）（バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、クリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、シクロスポラ・カイエタネシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トキソプラズマ・ゴンデイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ））。
【０２１８】
Ｅ．線虫
病原体防除組成物及び関連方法は、例えば、動物の寄生線虫感染を予防又は処置するために、寄生線虫の適応度を低減させる上で有用であり得る。病原体防除組成物と寄生線虫を接触させることにより、寄生線虫に病原体防除組成物を送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、病原体防除組成物を動物に投与することにより、リスクがあるか又はそれを必要とする動物の寄生線虫感染（本明細書に記載の寄生線虫に起因するもの）を予防又は処置することを含む。
【０２１９】
病原体防除組成物及び関連方法は、以下に属する線虫を含め、寄生線虫による動物の感染を予防又は処置するのに好適である：線形動物門（Ｎｅｍａｔｏｄａ）（回虫（ｒｏｕｎｄｗｏｒｍｓ））：広東住血線虫（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃａｎｔｏｎｅｎｓｉｓ）（ネズミ肺線虫（ｒａｔ  ｌｕｎｇｗｏｒｍ））、アスカリス・ルンブリコイデス（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）（ヒト回虫（ｈｕｍａｎ  ｒｏｕｎｄｗｏｒｍ））、ベイリサスカリス・プロシオニス（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ  ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ）（アライグマ回虫（ｒａｃｃｏｏｎ  ｒｏｕｎｄｗｏｒｍ））、トリクリス・トリキウラ（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）（ヒト鞭虫（ｈｕｍａｎ  ｗｈｉｐｗｏｒｍ））、トリヒネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストロンギロイデス・ステルコラリス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）、十二指腸鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）及びアメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）（ヒト鉤虫（ｈｕｍａｎ  ｈｏｏｋｗｏｒｍｓ））、条虫綱（Ｃｅｓｔｏｄａ）（サナダムシ（ｔａｐｅｗｏｒｍｓ））：単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、多包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）（カギサナダ（ｐｏｒｋ  ｔａｐｅｗｏｒｍ））。
【０２２０】
Ｆ．ウイルス
病原体防除組成物及び関連方法は、例えば、動物のウイルス感染を予防又は処置するために、ウイルスの適応度を低減させる上で有用であり得る。病原体防除組成物とウイルスを接触させることにより、ウイルスに病原体防除組成物を送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、病原体防除組成物を動物に投与することにより、リスクがあるか又はそれを必要とする動物のウイルス感染（本明細書に記載のウイルスに起因するもの）を予防又は処置することを含む。
【０２２１】
病原体防除組成物及び関連方法は、以下に属するウイルスによる感染を含め、動物のウイルス感染を予防又は処置するのに好適である：ＤＮＡウイルス（ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ）：パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ）：アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）、レスピロウイルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）、ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、モリビリウイルス（Ｍｏｒｉｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ））、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（マルブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ））、ボルナオウイルス科（Ｂｏｒｎａｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、ナイロウイルス（Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ）、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）、オルトブニヤウイルス（Ｏｒｔｈｏｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）、フレボウイルス（Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）。一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓ）：アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ））、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（ヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ））、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（ヘパトウイルス（Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ））；又はｄｓＲＮＡウイルス（ｓＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ）及びレトロ−転写ウイルス（Ｒｅｔｒｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）：レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、コルチウイルス（Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ）、セアドルナウイルス（Ｓｅａｄｏｒｎａｖｉｒｕｓ））、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（デルタレトロウイルス（Ｄｅｌｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ））、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（オルトヘパドナウイルス（Ｏｒｔｈｏｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）。
【０２２２】
Ｇ．病原体ベクター
本明細書に提供される病原体防除組成物及び関連方法は、動物病原体のベクターの適応度を低減させる上で有用であり得る。一部の例では、ベクターは、昆虫であり得る。例えば、昆虫ベクターとして、限定されないが、カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）及び一部のハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）並びに双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）に見出されるような突き刺し、吸う口器を有するもの、例えば蚊、ミツバチ、スズメバチ、ユスリカ、シラミ、ツェツェバエ、ノミ及びアリ並びにマダニ及びダニなどの蛛形網（Ａｒａｃｈｎｉｄａｅ）のメンバー：ダニ目（Ａｃａｒｉｎａ）の目、網又は科（マダニ及びダニ）、例えば以下の科：ヒメダニ科（Ａｒｇａｓｉｄａｅ）、ワクモ科（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｉｄａｅ）、マダニ科（Ｉｘｏｄｉｄａｅ）、キュウセンヒゼンダニ科（Ｐｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ）若しくはヒゼンダニ科（Ｓａｒｃｏｐｔｉｄａｅ）の代表的なもの並びに以下の種：キララマダニ属（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ）種、アノセントン属（Ａｎｏｃｅｎｔｏｎ）種、ナガヒメダニ属（Ａｒｇａｓ）種、ウシマダニ属（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ）種、ツメダニ属（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌａ）種、ショクヒヒゼンダニ属（Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ）種、ニキビダニ属（Ｄｅｍｏｄｅｘ）種、カクマダニ属（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）種、ワクモ属（Ｄｅｎｍａｎｙｓｓｕｓ）種、チマダニ属（Ｈａｅｍｏｐｈｙｓａｌｉｓ）種、イボマダニ属（Ｈｙａｌｏｍｍａ）種、マダニ属（Ｉｘｏｄｅｓ）種、リンクサカルス属（Ｌｙｎｘａｃａｒｕｓ）種、トゲダニ亜目（Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａｔａ）種、ショウセンコウヒゼンダニ属（Ｎｏｔｏｅｄｎｅｓ）種、カズキダニ属（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ）種、イエダニ属（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ）種、オトビウス属（Ｏｔｏｂｉｕｓ）種、ミミヒゼンダニ属（ｏｔｏｄｅｃｔｅｓ）種、ニューモニサス属（Ｐｎｅｕｍｏｎｙｓｓｕｓ）種、キュウセンヒゼンダニ属（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ）種、コイタマダニ属（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ）種、ヒゼンダニ科属（Ｓａｎｃｏｐｔｅｓ）種若しくはツツガムシ属（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌａ）種の代表的なもの；シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）（吸血及び刺咬性シラミ）、例えば以下の種：ボビコーラ属（Ｂｏｖｉｃｏｌａ）種、ケモノジラミ属（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ）種、ケモノホソジラミ属（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ）種、タンカクハジラミ属（Ｍｅｎｏｐｏｎ）種、ヒトジラミ属（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ）種、タマワタムシ属（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）種、ネアブラムシ属（Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ）種若しくはソレノポテス属（Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ）種の代表的なもの；双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）（ハエ）、例えば以下の種：ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）種、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）種、オオクロバエ属（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ）種、オビキンバエ属（Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ）種、メクラアブ属（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ）種、コクリオミイヤ属（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ）種、イエカ属（Ｃｗ／ｅｘ）種、サシバエ属（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ）種、ウサギヒフバエ属（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ）種、ヒフバエ属（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ）種、ウマバエ属（Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ）種、ツェツェバエ属（Ｇｌｏｓｓｉｎａ）種、ノサシバエ属（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ）種、ゴマフバエ属（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ）種、ウマシラミバエ属（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃａ）種、ウシバエ属（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ）種、キンバエ属（Ｌｕｃｉｌｉａ）種、リペロシア属（Ｌｙｐｅｒｏｓｉａ）種、ヒツジシラミバエ属（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ）種、ヒツジバエ属（Ｏｅｓｔｒｕｓ）種、フェニシア属（Ｐｈａｅｎｉｃｉａ）種、サシチョウバエ属（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ）種、クロキンバエ属（Ｐｈｏｒｍｉａ）種の代表的なもの、ダニ目（Ａｃａｒｉ）（ヒゼンダニによる疥癬（ｓａｒｃｏｐｔｉｃ  ｍａｎｇｅ））、例えばヒゼンダニ属（Ｓａｒｃｏｐｔｉｄａｅ）種、ニクバエ属（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ）種、ブユ属（Ｓｉｍｕｌｉｕｍ）種、サシバエ属（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ）種、アブ属（Ｔａｂａｎｕｓ）種、タンニア属（Ｔａｎｎｉａ）種若しくはＺｚｐｕ／アルファ属（Ｚｚｐｕ／ａｌｐｈａ）種；ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）（刺咬性シラミ）、例えば以下の種：ダマリナ属（Ｄａｍａｌｉｎａ）種、フェリコラ属（Ｆｅｌｉｃｏｌａ）種、ヘテロドクス属（Ｈｅｔｅｒｏｄｏｘｕｓ）種若しくはケモノハジラミ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ）種の代表的なもの；又はノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）（無翅昆虫（ｗｉｎｇｌｅｓｓ  ｉｎｓｅｃｔｓ））、例えば以下の種：ナガノミ属（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ）種、ネズミノミ属（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ）種の代表的なもの；トコジラミ科（Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ）（半翅類の昆虫（ｔｒｕｅ  ｂｕｇｓ）、例えば以下の種：キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種、オオサシガメ属（Ｔｒｉｔｏｍｉｎａｅ）種、ロドニウス属（Ｒｈｏｄｉｎｉｕｓ）種若しくはサシガメ属（Ｔｒｉａｔｏｍａ）種の代表的なもの。
【０２２３】
一部の例では、昆虫は、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の吸血性昆虫（例えば、カ亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）、例えばカ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ））である。一部の例では、昆虫は、イエカ亜科（Ｃｕｌｉｃｉｎａｅ）、コレトリナ（Ｃｏｒｅｔｈｒｉｎａｅ）、ヌカカ科（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）又はブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）のものである。一部の例では、昆虫は、イエカ属（Ｃｕｌｅｘ）種、テオバルディア属（Ｔｈｅｏｂａｌｄｉａ）種、ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）種、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）種、ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）種、ホルシポミア属（Ｆｏｒｃｉｐｏｎｉｙｉａ）種、サシバエ属（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ）種又はヘレア属（Ｈｅｌｅａ）種のものである。
【０２２４】
特定の例では、昆虫は、カである。特定の例では、昆虫は、マダニである。特定の例では、昆虫は、コダニである。特定の例では、昆虫は、ハジラミである。
【０２２５】
Ｖ．異種機能性薬剤
本明細書に記載の病原体防除組成物は、異種機能性薬剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤）などの追加的な薬剤をさらに含み得る。一部の例では、異種機能性薬剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤）は、ＰＭＰ中に含有される。例えば、ＰＭＰは、異種機能性薬剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤）を封入し得る。代わりに、異種機能性薬剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤）は、ＰＭＰの表面に埋め込むか又はその表面と共役させることができる。一部の例では、病原体防除組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種超）の異なる異種機能性薬剤を含む。
【０２２６】
他の例では、病原体防除組成物は、異種機能性薬剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤）を含むように製剤化することができ、その場合、必ずしもＰＭＰと結合されるわけではない。製剤及びこれらの製剤から調製される使用形態において、病害虫防除組成物は、例えば、抗菌剤、殺虫剤、滅菌剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺ウイルス剤、誘引剤又は忌避剤などの追加的な有効化合物を含み得る。
【０２２７】
農薬用薬剤は、動物病原体のベクターに送達するのに好適な薬剤、例えば抗真菌剤、抗菌剤、殺虫剤、軟体動物駆除剤、殺線虫剤、殺ウイルス剤又はこれらの組合せなどの農業用薬剤であり得る。農薬用薬剤は、化学物質、例えば当技術分野で公知のものなどであり得る。農薬用薬剤は、多様な動物病原体若しくはそのベクターの適応度を低減させることができる任意の薬剤であるか、又は１つ若しくは複数の標的動物病原体若しくはそのベクター（例えば、特定の種若しくは属の病原体又はそれらのベクター）をターゲティングするものであり得る。
【０２２８】
代わりに又は加えて、異種機能性薬剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤）は、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド又は小分子であり得る。一部の例では、異種機能性薬剤を修飾することができる。例えば、修飾は、化学修飾、例えばマーカ、例えば蛍光マーカ若しくは放射性マーカに対する共役であり得る。他の例では、修飾は、薬剤、例えば脂質、グリカン、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、カチオン部分の安定性、送達、ターゲティング、生体利用可能性又は半減期を増大する部分との共役若しくは機能的連結を含み得る。
【０２２９】
本明細書に開示される病原体防除組成物及び方法に使用することができる異種機能性薬剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤）の追加的な例を以下に概説する。
【０２３０】
Ａ．抗菌剤
本明細書に記載される病原体防除組成物は、抗菌剤をさらに含み得る。例えば、本明細書に記載されるような抗生物質を含む病原体防除組成物は、標的動物体内若しくは動物身体上で標的レベル（例えば、所定若しくは閾値レベル）の抗生物質濃度を達成し；且つ／又は動物の細菌感染を処置若しくは予防するのに十分な量及び時間で動物に投与することができる。本明細書に記載の抗菌剤は、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体防除組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。一部の例では、病原体防除組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種超）の異なる抗菌剤を含む。
【０２３１】
本明細書で使用されるとき、用語「抗菌剤」は、植物病原菌などの細菌を殺傷するか、又はその成長、増殖、分裂、繁殖若しくは拡大を阻害する物質を指し、殺細菌剤（例えば、消毒剤化合物、防腐剤若しくは抗生物質）又は静菌剤（例えば、化合物若しくは抗生物質）が挙げられる。殺菌抗生物質は、細菌を殺傷するが、静菌抗生物質は、それらの成長又は繁殖を緩徐にするのみである。
【０２３２】
殺菌剤は、消毒剤、防腐剤若しくは抗生物質を含み得る。最も使用される消毒剤は、以下を含み得る：活性塩素（即ち次亜塩素酸塩（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）、クロラミン、ジクロロイソシアヌル酸塩及びトリクロロイソシアヌル酸塩、液体塩素、塩素ジオキシドなど）、活性酸素（過酸化物、例えば過酸、過硫酸カリウム、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム及びウレアパーヒドレート）、ヨウ素（ヨードポビドン（ｉｏｄｐｏｖｉｄｏｎｅ）（ポビドンヨード、Ｂｅｔａｄｉｎｅ）、ルゴール溶液、ヨウ素チンキ剤、ヨウ化非イオン界面活性剤）、濃縮アルコール（主に、エタノール、１−プロパノール（ｎ−プロパノールとも呼ばれる）及び２−プロパノール（イソプロパノールと呼ばれる）並びにそれらの混合物；さらに、２−フェノキシエタノール並びに１−フェノキシプロパノール及び２−フェノキシプロパノールが使用される）、フェノール物質（例えば、フェノール（炭酸とも呼ばれる）、クレゾール（液体カリウムセッケンと組み合わせてＬｙｓｏｌｅと呼ばれる）、ハロゲン化（塩素化、臭素化）フェノール、例えばヘキサクロロフェン、トリクロサン、トリクロロフェノール、トリブロモフェノール、ペンタクロロフェノール、ジブロモール（Ｄｉｂｒｏｍｏｌ）及びそれらの塩）、陽イオン界面活性剤、例えばいくつかの四級アンモニウムカチオン（例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム又は塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンゼトニウム）及びその他；非四級化合物、例えばクロルヘキシジン、グルコプロタミン、二塩酸オクテニジンなど）；強力な酸化剤、例えばオゾン及び過マンガン酸溶液；重金属及びその塩、例えばコロイド銀、硝酸銀、塩化水銀、フェニル水銀塩、硫酸銅、酸化銅−塩化銅、水酸化銅、オクタン酸銅、オキシ塩化硫酸銅、硫酸銅、硫酸銅五水和物など。重金属及びそれらの塩は最も毒性が高く、環境に有害な殺菌剤であるため、それらの使用は強く抑圧されるか又は取り消され；さらに、適切に濃縮された強酸（リン酸、硝酸、硫酸、アミド硫酸、トルエンスルホン酸）及びアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム）である。防腐剤（即ちヒト又は動物の身体、皮膚、粘膜、創傷などに使用することができる抗菌剤）として、上に挙げた消毒剤のいくつかを、適切な条件（主に、濃度、ｐＨ、温度及びヒト／動物に対する毒性）下で使用することができる。中でも、以下のものが重要である：適切に希釈された塩素調製物（即ちデーキン液、ｐＨ７〜８に調節された０．５％次亜塩素酸ナトリウム若しくはカリウム溶液又はベンゼンスルホクロラミドナトリウムの０．５〜１％溶液（クロラミンＢ））、いくつかのヨウ素調製物、例えば様々なガレヌス製剤（軟膏、溶液、創傷石膏）中のヨードポビドン、過去にはルゴール液、ウレアパーヒドレート及びｐＨ緩衝０．１〜０．２５％過酸溶液などの過酸化物、主に皮膚消毒に使用される消毒添加物を含むか若しくは含まないアルコール、ソルビン酸などの弱有機酸、安息香酸、乳酸及びサリチル酸、一部のフェノール酸化合物、例えばヘキサクロロフェン、トリクロサン及びジブロモール（Ｄｉｂｒｏｍｏｌ）並びに陽イオン活性化合物、例えば０．０５〜０．５％ベンザルコニウム、０．５〜４％クロルヘキシジン、０．１〜２％オクテニジン溶液。
【０２３３】
本明細書に記載される病原体防除組成物は、抗生物質を含み得る。当技術分野で公知の任意の抗生物質を使用することができる。抗生物質は、一般に、その作用機序、化学構造又は活性スペクトルに基づいて分類される。
【０２３４】
本明細書に記載される抗生物質は、あらゆる細菌機能又は成長プロセスをターゲティングすることができ、静菌性（例えば、細菌の成長を緩徐にするか若しくは予防する）又は殺菌性（例えば、殺菌する）のいずれでもあり得る。一部の例では、抗生物質は、殺菌性抗生物質である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、細菌細胞壁をターゲティングするもの（例えば、ペニシリン及びセファロスポリン）；細胞膜をターゲティングするもの（例えば、ポリミキシン）；又は実質的な細菌酵素を阻害するもの（例えば、リファマイシン、リピアルマイシン（ｌｉｐｉａｒｍｙｃｉｎ）、キノロン及びスルホンアミド）である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、アミノグリコシド（例えば、カスガマイシン）である。一部の例では、抗生物質は、静菌性抗生物質である。一部の例では、静菌性抗生物質は、タンパク質合成をターゲティングする（例えば、マクロライド、リンコサミド及びテトラサイクリン）。本明細書で使用することができる別のクラスの抗生物質としては、環状リポペプチド（例えば、ダプトマイシン）、グリシルサイクリン（例えば、チゲサイクリン）、オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド）又はリピアルマイシン（例えば、フィダキソマイシン）が挙げられる。抗生物質の例としては、リファンピシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン及びポリミキシンＢが挙げられる。本明細書に記載の抗生物質は、任意のレベルの標的特異性（例えば、狭又は広スペクトル）を有し得る。一部の例では、抗生物質は、狭スペクトル抗生物質であり、従って、グラム陰性菌又はグラム陽性菌などの特定の種類の細菌をターゲティングする。代わりに、抗生物質は、多様な細菌をターゲティングする広スペクトル抗生物質である。一部の例では、抗生物質は、ドキソルビシン又はバンコマイシンである。
【０２３５】
動物の処置に好適な抗生物質の例としては、以下のものが挙げられる：ペニシリン（アモキシシリン、アンピシリン、バカムピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、クリスチシリン３００Ａ．Ｓ．、ペンチド、ペルマペン、ファイザーペン（Ｐｆｉｚｅｒｐｅｎ）、ファイザーペン（Ｐｆｉｚｅｒｐｅｎ）−ＡＳ、ウィシリン、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピバムシリン、ピブメシリナム、チカルシリン）、セファロスポリン（セファセトリル（Ｃｅｆａｃｅｔｒｉｌｅ）（セファセトリル（ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ））、セファドロキシル（Ｃｅｆａｄｒｏｘｉｌ）（セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｙｌ））、セファレキシン（Ｃｅｆａｌｅｘｉｎ）（セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ））、セファログリシン（Ｃｅｆａｌｏｇｌｙｃｉｎ）（セファログリシン（ｃｅｐｈａｌｏｇｌｙｃｉｎ））、セファロニウム（Ｃｅｆａｌｏｎｉｕｍ）（セファロニウム（ｃｅｐｈａｌｏｎｉｕｍ））、セファロリジン（Ｃｅｆａｌｏｒｉｄｉｎｅ）（セファロラジン（ｃｅｐｈａｌｏｒａｄｉｎｅ）、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）（セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ））、セファピリン（Ｃｅｆａｐｉｒｉｎ）（セファピリン（ｃｅｐｈａｐｉｒｉｎ））、セファトリジン、セファザフルール、セファゼドン、セファゾリン（Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）（セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ））、セフラジン（Ｃｅｆｒａｄｉｎｅ（セフラジン（ｃｅｐｈｒａｄｉｎｅ））、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル（Ｃｅｆｐｒｏｚｉｌ）（セフプロキシル（ｃｅｆｐｒｏｘｉｌ））、セフロキシム、セフゾナム、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトレン、セファタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム、セフピミゾール、セフポドキシム、セフテラム、セフチチブテン、セフチオフール、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフクリジン、セフェピム、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロール、セフタロリン、セファクロメジン、セファロラム、セファパロール、セフカネル、セフェドロロール、セフェムピドン、セフェトリゾール、セフィビトリル、セフマチレン、セフメピジウム、セフォベシン、セフォキサゾール、セフロチル、セフスミド、セフラセチム、セフチオキシド、併用薬、セフタジム／アビバクタム、セフトロザン／タゾバクタム）、モノバクタム（アズトレオナム）、カルバペネム（イミペネム、イミペネム／シラスタチン、ドリペネム、エルタペネム、メロペネム、メロペネム／バボルバクタム）、マクロライド（アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン）、リンコサミド（クリンダマイシン、リンコマイシン）、ストレプトグラミン（プリスチナマイシン、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン）、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン）、キノロン（フルメキン、ナリジクス酸、オキソリン酸、ピロミジン酸、ピペミジン酸、ロソキサシン、第２世代（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、シプロフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、バロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、パズフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、ベシフロキサシン、デラフロキサシン、クリナフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルリフロキサシン、シタフロキサシン、トロバフロキサシン）、スルホンアミド（スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルフイソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール）、テトラサイクリン（デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲサイクリン）、その他（リポペプチド、フルオロキノロン、リポグリコペプチド、セファロスポリン、マクロサイクリック、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、チニダゾール、ニトロフラントイン、グリコペプチド、バンコマイシン、テイコプラニン、リポグリコペプチド、テラバンシン、オキサゾリジノン、リネゾリド、シクロセリン２、リファマイシン、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、ポリペプチド、バシトラシン、ポリミキシンＢ、チュバーアクチノマイシン、バイオマイシン、カプレオマイシン）。
【０２３６】
当業者は、組成物中の各抗生物質の好適な濃度が、抗生物質の有効性、安定性、個別の抗生物質の数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動することを理解するであろう。
【０２３７】
Ｂ．抗真菌剤
本明細書に記載される病原体防除組成物は、抗真菌剤をさらに含み得る。例えば、本明細書に記載されるような抗生物質を含む病原体防除組成物は、標的動物体内若しくは動物身体上で標的レベル（例えば、所定若しくは閾値レベル）の抗真菌剤濃度を達成し；且つ／又は動物の真菌感染を処置若しくは予防するのに十分な量及び時間で動物に投与することができる。本明細書に記載の抗真菌剤は、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体防除組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。一部の例では、病原体防除組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種超）の異なる抗真菌剤を含む。
【０２３８】
本明細書で使用されるとき、用語「殺真菌剤」又は「抗真菌剤」は、動物に対して病原性の真菌などの真菌を殺傷するか、又はその成長、増殖、分裂、繁殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。多くの様々な種類の抗真菌剤が商業的に製造されている。抗真菌剤の非限定的な例として、以下のものが挙げられる：アリルアミド（アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン）、イミダゾール（（ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、テルコナゾール）；トリアゾール（アルバコナゾール、エフィナコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール）、チアゾール（アバフンジン）、ポリエン（アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン）、エキノカンジン（アニデュラフンギン、カスポフンギン、ミカフンギン）、その他（トルナフタート、フルシトシン、ブテナフィン、グリセオフルビン、シクロピロクス、硫化セレン、タバボロール）。当業者は、組成物中の各抗真菌剤の好適な濃度が、抗真菌剤の有効性、安定性、個別の抗真菌剤の数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動することを理解するであろう。
【０２３９】
Ｃ．殺虫剤
本明細書に記載される病原体防除組成物は、殺虫剤をさらに含み得る。例えば、殺虫剤は、動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低減させる（例えば、成長を低減するか又は殺傷する）ことができる。本明細書に記載される殺虫剤を含む病原体防除組成物は、（ａ）昆虫内若しくは昆虫上で標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の殺虫剤濃度を達成し；且つ（ｂ）昆虫の適応度を低減させるのに十分な量及び時間で昆虫と接触させることができる。一部の例では、殺虫剤は、寄生昆虫の適応度を低減させる（例えば、成長を低減するか又は殺傷する）ことができる。本明細書に記載される殺虫剤を含む病原体防除組成物は、（ａ）寄生昆虫内若しくは昆虫上で標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の殺虫剤濃度を達成し；且つ（ｂ）寄生昆虫の適応度を低減させるのに十分な量及び時間で寄生昆虫又はそれに感染した動物と接触させることができる。本明細書に記載の殺虫剤は、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体防除組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。一部の例では、病原体防除組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種超）の異なる殺虫剤を含む。
【０２４０】
本明細書で使用されるとき、用語「殺虫剤」又は「殺虫薬剤」は、動物病原体又は寄生昆虫の昆虫ベクターなどの昆虫を殺傷するか、又はその成長、繁殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。殺虫剤の非限定的な例を表１に示す。好適な殺虫剤のさらに別の非限定的な例として、アザジラクチン、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）種、ボーベリア属（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）種、コドレモン、メタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）種、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）種、チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）及びバーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）種などの生物剤、ホルモン又はフェロモン並びに燻蒸剤のように作用機構が不明若しくは不明瞭である有効化合物（例えば、リン化アルミニウム、臭化メチル及びフッ化スルフリルなど）及び選択性摂餌阻害剤（例えば、氷晶石、フロニカミド及びピメトロジンなど）が挙げられる。当業者は、組成物中の各殺虫剤の好適な濃度が、殺虫剤の有効性、安定性、個別の殺虫剤の数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動することを理解するであろう。
【０２４１】
2021528484.tif 000002
【０２４２】
2021528484.tif 000003
【０２４３】
Ｄ．殺線虫剤
本明細書に記載される病原体防除組成物は、殺線虫剤をさらに含み得る。一部の例では、病原体防除組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０超）の異なる殺線虫剤を含む。例えば、殺線虫剤は、寄生線虫の適応度を低減させる（例えば、成長を低減するか又は殺傷する）ことができる。本明細書に記載される殺線虫剤を含む病原体防除組成物は、（ａ）標的線虫内若しくは線虫上で標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の殺線虫剤濃度を達成し；且つ（ｂ）寄生線虫の適応度を低減させるのに十分な量及び時間で寄生線虫又はそれに感染した動物と接触させることができる。本明細書に記載の殺線虫剤は、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。
【０２４４】
本明細書で使用されるとき、用語「殺線虫剤」又は「殺線虫性薬剤」は、寄生線虫などの線虫を殺傷するか、又はその成長、繁殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。殺線虫剤の非限定的な例を表２に示す。当業者は、組成物中の各殺線虫剤の好適な濃度が、殺線虫剤の有効性、安定性、個別の殺線虫剤の数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動することを理解するであろう。
【０２４５】
2021528484.tif 000004
【０２４６】
Ｅ．抗寄生虫剤
本明細書に記載される病原体防除組成物は、抗寄生虫剤をさらに含み得る。例えば、抗寄生虫剤は、寄生原虫の適応度を低減させる（例えば、成長を低減するか又は殺傷する）ことができる。本明細書に記載される抗寄生虫剤を含む病原体防除組成物は、（ａ）原虫内若しくは原虫上又はそれに感染した動物で標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の抗寄生虫剤濃度を達成し；且つ（ｂ）原虫の適応度を低減させるのに十分な量及び時間で原虫と接触させることができる。これは、動物における寄生体の処置又は予防に有用であり得る。例えば、本明細書に記載される抗寄生虫剤を含む病原体防除組成物は、動物体内又は身体上で標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の抗寄生虫剤濃度を達成し；且つ動物における寄生体（例えば、寄生線虫、寄生昆虫又は原虫）感染を処置又は予防するのに十分な量及び時間で動物に投与することができる。本明細書に記載の抗寄生虫剤は、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体防除組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。一部の例では、病原体防除組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種超）の異なる抗寄生虫剤を含む。
【０２４７】
本明細書で使用されるとき、用語「抗寄生虫剤」又は「抗寄生虫薬剤」は、寄生原虫、寄生線虫若しくは寄生昆虫などの寄生体を殺傷するか、又はその成長、増殖、繁殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。抗寄生虫剤の例として、以下のものが挙げられる：駆虫剤（ベフェニウム、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、ニクロサミド、ピペラジン、プラジカンテル、ピランテル、ピルビニウム、ベンジミダゾール、アルベンダゾール、フルベンダゾール、メベンダゾール、チアベンダゾール、レバミゾール、ニタゾキサニド、モノパンテル、エモデプシド、スピロインドール）、殺疥癬虫薬（安息香酸ベンジル、安息香酸ベンジル／ジスルフィラム、リダン、マラチオン、ペルメトリン）、殺シラミ薬（ピペロニルブトキシド／ピレトリン、スピノサド、モキシデクチン）、殺疥癬虫薬（クロタミトン）、抗条虫薬（Ａｎｔｉｃｅｓｔｏｄｅｓ）（ニクロサミド、プランジカンテル、アルベンダゾール）、抗アメーバ薬（リファンピン、アムホテリシンＢ）；又は抗原虫薬（メラルソプロール、エルフロルニリン、メトロニダゾール、チニダゾール、ミルテホシン、アルテミシニン）。特定の例では、抗寄生虫剤は、家畜の感染を処置又は予防するために使用され得、例えばレバミソール、フェンベンダゾール、オクスフェンダゾール、アルベンダゾール、モキシデクチン、エプリノメクチン、ドラメクチン、イベルメクチン又はクロスロンがある。当業者は、組成物中の各抗寄生虫剤の好適な濃度が、抗寄生虫剤の有効性、安定性、個別の抗寄生虫剤の数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動することを理解するであろう。
【０２４８】
Ｆ．抗ウイルス剤
本明細書に記載される病原体防除組成物は、抗ウイルス剤をさらに含み得る。例えば、本明細書に記載されるような抗ウイルス剤を含む病原体防除組成物は、動物体内若しくは動物身体上で標的レベル（例えば、所定若しくは閾値レベル）の抗ウイルス剤濃度を達成し；且つ／又は動物のウイルス感染を処置若しくは予防するのに十分な量及び時間で動物に投与することができる。本明細書に記載の抗ウイルス剤は、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体防除組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。一部の例では、病原体防除組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種超）の異なる抗ウイルス剤を含む。
【０２４９】
本明細書で使用されるとき、用語「抗ウイルス剤」又は「殺ウイルス剤」は、動物感染するウイルス病原体などのウイルスを殺傷するか、又はその成長、増殖、繁殖、発生若しくは拡大を阻害する物質を指す。いくつかの薬剤を抗ウイルス剤として使用することができ、そうしたものとして、化学物質又は生物剤（例えば、核酸、例えばｄｓＲＮＡ）がある。本明細書で有用な抗ウイルス剤の例として、以下のものが挙げられる：アバカビル、アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（アシクロビル（Ａｃｉｃｌｏｖｉｒ））、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル（アジェネラーゼ（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ））、アンプリジェン（Ａｍｐｌｉｇｅｎ）、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、バラビル、シドフォビル、コンビビル、ドルテグラビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンズ、エムトリシタビン、エンフビリチド、エンテカビル、エコリエベル（Ｅｃｏｌｉｅｖｅｒ）、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、融合阻害剤、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（Ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、ＩＩＩ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル（Ｎｅｘａｖｉｒ）、ニタゾキサニド、ヌクレオシド類似体、ノビル（Ｎｏｖｉｒ）、オセルタミビル（タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ））、ペグインターフェロンα−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（Ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サキナビル、ソフォスブビル、スタブジン、相乗的増強剤（抗レトロウイルス）、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、トロマンタジン、ツルバダ（Ｔｒｕｖａｄａ）、バラシクロビル（バルトレックス（Ｖａｌｔｒｅｘ））、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン（Ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン、ザナミビル（リレンザ（Ｒｅｌｅｎｚａ））又はジドブジン。当業者は、組成物中の各抗ウイルス剤の好適な濃度が、抗ウイルス剤の有効性、安定性、個別の抗ウイルス剤の数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動することを理解するであろう。
【０２５０】
Ｇ．忌避剤  
本明細書に記載される病原体防除組成物は、忌避剤をさらに含み得る。例えば、忌避剤は、昆虫などの動物病原体のベクターを忌避し得る。本明細書に記載の忌避剤は、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体防除組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。一部の例では、病原体防除組成物は、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種超）の異なる忌避剤を含む。
【０２５１】
例えば、本明細書に記載される忌避剤を含む病原体防除組成物は、（ａ）標的レベル（例えば、所定若しくは閾値レベル）の忌避剤濃度を達成し；且つ／又は（ｂ）対照と比較して、動物の付近若しくは近傍の昆虫のレベルを低減させるのに十分な量及び時間で昆虫ベクター又はベクターの生息場所と接触させることができる。代わりに、本明細書に記載される忌避剤を含む病原体防除組成物は、（ａ）標的レベル（例えば、所定若しくは閾値レベル）の忌避剤濃度を達成し；且つ／又は（ｂ）非処置動物と比較して、動物の付近若しくは近傍の昆虫のレベルを低減させるのに十分な量及び時間で動物と接触させることができる。
【０２５２】
公知の昆虫忌避剤のいくつかの例として、以下のものが挙げられる：ベンジル；安息香酸ベンジル；２，３，４，５−ビス（ブチル−２−エン）テトラヒドロフルフラル（ＭＧＫ  Ｒｅｌｅｌｌｅｎｔ  １１）；ブトキシポリプロピレングリコール；Ｎ−ブチルアセタニリド；ノルマル−ブチル−６，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−１，４−ピロン−２−カルボキシレート（Ｉｎｄａｌｏｎｅ）；アジピン酸ジブチル；フタル酸ジブチル；コハク酸ジ−ノルマル−ブチル（Ｔａｂａｔｒｅｘ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−メタ−トルアミド（ＤＥＥＴ）；ジメチルカルベート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｃａｒｂａｔｅ）（エンド，エンド）−ジメチルビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボキシレート）；フタル酸ジメチル；２−エチル−２−ブチル−１，３−プロパンジオール；２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（Ｒｕｔｇｅｒｓ  ６１２）；ジ−ノルマル−プロピルイソシンコメロネート（ＭＧＫ  Ｒｅｌｅｌｌｅｎｔ  ３２６）；２−フェニルシクロヘキサノール；ｐ−メタン−３，８−ジオール及びノルマル−プロピルＮ，Ｎ−ジエチルスクシナメート。他の忌避剤として、シトロネラ油、フタル酸メチル、ノルマル−ブチルメシチルオキシドオキサレート及び２−エチルヘキサンジオール−１，３が挙げられる（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１１：７２４−７２８；及びＴｈｅ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，８ｔｈ  Ｅｄ．，ｐ７５６を参照されたい）。
【０２５３】
一部の例では、忌避剤は、合成又は非合成昆虫忌避剤を含む昆虫忌避剤である。合成昆虫忌避剤の例としては、メチルアントラニレート及び他のアントラニレート基剤昆虫忌避剤、ベンズアルデヒド、ＤＥＥＴ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド）、ジメチルカルベート、フタル酸ジメチル、イカリジン（即ちピカリジン、Ｂａｙｒｅｐｅｌ及びＫＢＲ３０２３）、インダロン（例えば、「６−２−２」混合物（６０％フタル酸ジメチル、２０％インダロン、２０％エチルヘキサンジオール）中に使用されるような）、ＩＲ３５３５（３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸、エチルエステル）、メトフルトリン、ペルメトリン、ＳＳ２２０又はトリシクロデセニルアリルエーテルが挙げられる。天然の昆虫忌避剤の例としては、ビューティーベリー（ｂｅａｕｔｙｂｅｒｒｙ）（カリカルバ（Ｃａｌｌｉｃａｒｐａ））葉、カバの木の樹皮、ボクマートル（ｂｏｇ  ｍｙｒｔｌｅ）（ヤチヤナギ（Ｍｙｒｉｃａ  Ｇａｌｅ））、キャトニップオイル（例えば、ネペタラクトン）、シトロネラオイル、レモンユーカリ（レモンユーカリ（Ｃｏｒｙｍｂｉａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ））；例えば、ｐ−メンタン−３，８−ジオール（ＰＭＤ））の精油、ニームオイル、レモングラス、ティーツリー（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）の葉由来のティーツリーオイル、タバコ又はそれらのエキスが挙げられる。
【０２５４】
Ｈ．生物剤
ｉ．ポリペプチド
本明細書に記載される病原体防除組成物（例えば、ＰＭＰ）は、ポリペプチド、例えば抗菌剤、抗真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は殺ウイルス剤であるポリペプチドを含み得る。一部の例では、病原体防除組成物は、病原体内の経路をターゲティングするポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体を含む。本明細書に記載されるポリペプチドを含む病原体防除組成物は、（ａ）標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のポリペプチド濃度を達成し；且つ（ｂ）病原体を低減又は排除するのに十分な量及び時間で病原体又はそのベクターに投与することができる。一部の例では、本明細書に記載されるポリペプチドを含む病原体防除組成物は、（ａ）動物体内に標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のポリペプチド濃度を達成し；且つ（ｂ）病原体を低減又は排除するのに十分な量及び時間で病原体による感染を有するか、又はそのリスクがある動物に投与することができる。本明細書に記載のポリペプチドは、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体防除組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。
【０２５５】
本発明で使用することができるポリペプチドの例として、酵素（例えば、代謝リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ若しくはユビキチン化タンパク質）、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンが挙げられ得る。
【０２５６】
本発明に含まれるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は組換えにより作製された変異体を含み得る。一部の例では、ポリペプチドは、その機能性断片又は変異体（例えば、酵素として活性の断片又はその変異体）であり得る。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する本明細書に記載される任意のポリペプチドの機能的に活性な変異体であり得る。一部の例では、ポリペプチドは、目的のタンパク質と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれを超える）同一性を有し得る。
【０２５７】
本明細書に記載のポリペプチドは、本明細書に記載される使用のいずれかのために組成物に配合することができる。本明細書に開示される組成物は、任意の数又は種類（例えば、クラス）のポリペプチド、例えば少なくとも約１つのポリペプチド、２、３、４、５、１０、１５、２０若しくはそれを超えるポリペプチドを含み得る。組成物中の各ポリペプチドの好適な濃度は、ポリペプチドの有効性、安定性、組成物中の個別のポリペプチドの数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動する。一部の例では、液体組成物中の各ポリペプチドは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各ポリペプチドは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。
【０２５８】
ポリペプチドを作製する方法は、当技術分野においてルーティンである。一般的に、Ｓｍａｌｅｓ＆Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ＆Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
【０２５９】
ポリペプチドを作製する方法は、植物細胞での発現を含むが、適切なプロモータの制御下、昆虫細胞、酵母、細菌、哺乳動物細胞又は他の細胞を用いて、組換えタンパク質を作製することもできる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点などの非転写エレメント、好適なプロモータ及びエンハンサー並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列及び必要なリボソーム結合部位などの５’若しくは３’非転写配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、早期プロモータ、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を用いて、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを提供することもできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と一緒に使用するのに適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
【０２６０】
様々な哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えポリペプチド薬剤を発現させて、製造することができる。哺乳動物発現系の例としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬＡ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主細胞培養の方法は、例えば、Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。タンパク質の精製については、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。タンパク質治療薬の製剤化については、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
【０２６１】
一部の例では、病原体防除組成物は、抗体又はその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書に記載される薬剤は、病原体の１要素の活動及び／若しくは機能を遮断又は増強する抗体であり得る。抗体は、病原体中のポリペプチド（例えば、酵素若しくは細胞受容体）のアンタゴニスト又はアゴニストとして作用し得る。病原体の標的抗原に対する抗体の作製及び使用は、当技術分野において公知である。例えば、抗体操作、変性オリゴヌクレオチドの使用、５’−ＲＡＣＥ、ファージディスプレイ及び突然変異誘発；抗体試験及び特性決定；抗体薬物動態及び薬物力学；抗体精製及び保存；並びにスクリーニング及び標識技法を含む、組換え抗体を作製する方法については、以下を参照されたい：Ｚｈｉｑｉａｎｇ  Ａｎ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，２００９、さらにはＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（Ｅｄ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３。
【０２６２】
本明細書に記載の病原体防除組成物は、バクテリオシンを含み得る。一部の例では、バクテリオシンは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）又は乳酸菌（ＬＡＢ、例えばラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ））などのグラム陽性細菌によって天然に生産される。一部の例では、バクテリオシンは、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、セラチア・プリミチクム（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｉｔｈｉｃｕｍ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのグラム陰性細菌によって天然に生産される。例示的バクテリオシンとしては、限定はされないが、クラスＩ〜ＩＶ  ＬＡＢ抗生物質（ランチビオティックなど）、コリシン、ミクロシン及びピオシンが挙げられる。
【０２６３】
本明細書に記載の病原体防除組成物は、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）を含み得る。微生物を阻害するのに好適な任意のＡＭＰを使用することができる。ＡＭＰは、様々な群の分子であり、これらは、そのアミノ酸の組成及び構造に基づいて亜群に分けられる。ＡＭＰは、天然にＡＭＰを産生する任意の生物に由来するか又はそれらから産生され、そうしたものとして、植物由来（例えば、コプシン）、昆虫由来（例えば、マストパラン、ポネラトキシン、セクロピン、モリシン、メリッチン）、カエル由来（例えば、マガイニン、デルマセプチン、アウレイン）及び哺乳動物由来（例えば、カテリシジン、デフェンシン及びプロテグリン）のＡＭＰが挙げられる。
【０２６４】
ｉｉ．核酸
本明細書に記載される組成物及び方法において多数の核酸が有用である。本明細書に開示される組成物は、任意の数又は種類（例えば、クラス）の核酸（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）若しくは阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ）又はハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子）、例えば少なくとも約１クラス又は変異体の核酸、２、３、４、５、１０、１５、２０若しくはそれを超えるクラス又は変異体の核酸を含み得る。組成物中の各核酸の好適な濃度は、核酸の有効性、安定性、個別の核酸の数、配合、組成物の適用方法などの要因に応じて変動する。本発明で有用な核酸の例として、ダイサー基質低分子干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、（非対称干渉ＲＮＡ）ａｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ｐｉｗｉ−干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボザイム、デオキシリボザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）、アプタマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はＤＮＡ分子を含む。
【０２６５】
本明細書に記載される核酸を含む病原体防除組成物は、（ａ）標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の核酸濃度を達成し；且つ（ｂ）病原体を低減又は排除するのに十分な量及び時間で病原体又はそのベクターと接触させることができる。一部の例では、本明細書に記載される核酸を含む病原体防除組成物は、（ａ）標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の核酸濃度を達成し；且つ（ｂ）病原体を低減又は排除するのに十分な量及び時間で、病原体による感染を有するか又はそのリスクがある動物に投与することができる。本明細書に記載の核酸は、本明細書に記載の方法のいずれかのために病原体防除組成物に配合され得、特定の例ではそのＰＭＰと結合され得る。
【０２６６】
（ａ）ポリペプチドをコードする核酸
一部の例では、病原体防除組成物は、ポリペプチドをコードする核酸を含む。ポリペプチドをコードする核酸は、約１０〜約５０，０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約２５〜約１００ｎｔ、約５０〜約１５０ｎｔ、約１００〜約２００ｎｔ、約１５０〜約２５０ｎｔ、約２００〜約３００ｎｔ、約２５０〜約３５０ｎｔ、約３００〜約５００ｎｔ、約１０〜約１０００ｎｔ、約５０〜約１０００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ、約１０００〜約２０００ｎｔ、約２０００〜約３０００ｎｔ、約３０００〜約４０００ｎｔ、約４０００〜約５０００ｎｔ、約５０００〜約６０００ｎｔ、約６０００〜約７０００ｎｔ、約７０００〜約８０００ｎｔ、約８０００〜約９０００ｎｔ、約９０００〜約１０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約１５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約２０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約２５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約３０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約４０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約４５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約５０，０００ｎｔ又はこれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
【０２６７】
病原体防除組成物は、目的の核酸配列の機能的に活性の変異体も含み得る。一部の例では、核酸の変異体は、例えば、目的の核酸の配列と、指定領域にわたって又は配列全体にわたって少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。一部の例では、本発明は、本明細書に記載される通りの核酸変異体によりコードされる機能的に活性のポリペプチドを含む。一部の例では、核酸変異体によりコードされる機能的に活性のポリペプチドは、例えば、目的のポリペプチドの配列又は天然由来のポリペプチド配列と、指定領域にわたって又はアミノ酸配列全体にわたって少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０２６８】
タンパク質をコードする核酸を発現させるいくつかの方法は、適切なプロモータの制御下において、昆虫、酵母、植物、細菌又は他の細胞をはじめとする細胞における発現を含み得る。発現ベクターは、複製起点などの非転写エレメント、好適なプロモータ及びエンハンサー並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列及び必要なリボソーム結合部位などの５’若しくは３’非転写配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、早期プロモータ、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を用いて、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを提供することもできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と一緒に使用するのに適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２に記載されている。
【０２６９】
組換え方法を用いた遺伝子修飾は、当技術分野で公知である。所望の遺伝子をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を用いて、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリのスクリーニング、それを含むことが分かっているベクターからのその遺伝子の誘導又は標準技術を用いた、それを含む細胞及び組織からの直接単離などによって取得することができる。代わりに、目的の遺伝子をクローニングではなく、合成により作製することもできる。
【０２７０】
天然又は合成核酸の発現は、典型的に、目的の遺伝子をコードする核酸をプロモータと作動可能に連結して、構築物を発現ベクターに組み込むことにより、達成される。発現ベクターは、細菌内での複製及び組込みに好適であり得る。発現ベクターは、真核生物内での複製及び発現にも好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネータ、開始配列並びに所望の核酸配列の発現に有用なプロモータを含む。
【０２７１】
さらなるプロモータエレメント、例えばエンハンサーが、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の３０〜１１０塩基対（ｂｐ）上流に位置するが、近年、いくつかのプロモータは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが判明している。プロモータエレメント同士の間隔は、多くの場合、柔軟であり、エレメントが互いに対して反転又は移動した場合も、プロモータ機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータの場合、プロモータエレメント同士の間隔は、活性が低減し始めるまで最大５０ｂｐに増加することができる。プロモータに応じて、個別のエレメントは、転写を活性化するために、共同又は独立のいずれかで機能し得ると思われる。
【０２７２】
好適なプロモータの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、そこに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモータ配列である。好適なプロモータの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかし、他の構成的プロモータ配列を使用することもでき、限定はされないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス前初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ並びにヒト遺伝子プロモータ、例えば、限定はされないが、アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ及びクレアチンキナーゼプロモータが挙げられる。
【０２７３】
代わりに、プロモータは、誘導性プロモータであり得る。誘導性プロモータの使用は、そのような発現が要望される場合、それが作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現が求められない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモータの例として、限定はされないが、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ及びテトラサイクリンプロモータが挙げられる。
【０２７４】
導入しようとする発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させようとする細胞の個体群からの発現細胞の同定及び選択を促進するために、選択性マーカ遺伝子若しくはリポータ遺伝子のいずれか又はその両方を含有し得る。他の態様では、選択性マーカをＤＮＡの個別の部分に担持させて、同時トランスフェクション法に使用し得る。宿主細胞での発現を可能にするために、選択性マーカ及びリポータ遺伝子の両方を適切な調節配列とフランキングさせ得る。有用な選択性マーカとして、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子がある。
【０２７５】
潜在的に形質転換された細胞を同定するため及び調節配列の機能性を評価するために、リポータ遺伝子を用いることができる。一般に、リポータ遺伝子は、レシピエント供給源に存在しないか、又はそれにより発現される遺伝子であり、何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって発現が呈示されるポリペプチドをコードする。リポータ遺伝子の発現は、ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後、好適な時点でアッセイする。好適なリポータ遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２，２０００）。好適な発現系は、よく知られており、公知の技術を用いて調製することができるか又は市販のものを取得し得る。一般に、リポータ遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物は、プロモータとして同定される。こうしたプロモータ領域は、リポータ遺伝子に連結することができ、プロモータ駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用することができる。
【０２７６】
一部の例では、生物を遺伝子修飾して、１つ以上のタンパク質の発現を改変することができる。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の時点、例えば生物の発育又は分化状態について改変することができる。一例では、本発明は、１つ以上のタンパク質、例えば活性、構造又は機能の発現に影響するタンパク質の発現を改変するための組成物を含む。１つ以上のタンパク質の発現を特定の位置に限定することも又は生物全体に広げることもできる。
【０２７７】
（ｂ）合成ｍＲＮＡ
病原体防除組成物は、合成ｍＲＮＡ分子、例えばポリペプチドをコードする合成ｍＲＮＡ分子を含み得る。合成ｍＲＮＡ分子は、例えば、化学的に修飾することができる。ｍＲＮＡ分子は、例えば、化学的に合成するか又はインビトロで転写することができる。ｍＲＮＡ分子は、プラスミド、例えばウイルスベクター、細菌ベクター又は真核生物発現ベクターに配置することができる。一部の例では、ｍＲＮＡ分子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション又は形質導入（例えば、アデノウイルス若しくはレンチウイルス形質導入）により、細胞に送達することができる。
【０２７８】
一部の例では、本明細書に記載される目的の修飾ＲＮＡ薬剤は、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを有する。こうした修飾は、公知であり、例えば国際公開第２０１２／０１９１６８号パンフレットに記載されている。さらなる修飾は、例えば国際公開第２０１５／０３８８９２号パンフレット；同第２０１５／０３８８９２号パンフレット；同第２０１５／０８９５１１号パンフレット；同第２０１５／１９６１３０号パンフレット；同第２０１５／１９６１１８号パンフレット及び同第２０１５／１９６１２８  Ａ２号パンフレットに記載されている。
【０２７９】
一部の例では、目的のポリペプチドをコードする修飾ＲＮＡは、１つ以上の末端修飾、例えば５’キャップ構造及び／又はポリＡテール（例えば、１００〜２００ヌクレオチド長）を有する。５’キャップ構造は、ＣａｐＯ、Ｃａｐｌ、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎｌ−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン及び２−アジド−グアノシンからなる群から選択され得る。一部のケースでは、修飾ＲＮＡは、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む５’ＵＴＲと、３’ＵＴＲとを含有する。こうした修飾は、公知であり、例えば国際公開第２０１２／１３５８０５号パンフレット及び同第２０１３／０５２５２３号パンフレットに記載される。さらなる末端修飾は、例えば、国際公開第２０１４／１６４２５３号パンフレット及び同第２０１６／０１１３０６号パンフレット、国際公開第２０１２／０４５０７５号パンフレット及び同第２０１４／０９３９２４号パンフレットに記載されている。少なくとも１つの化学修飾を含み得るキャップＲＮＡ分子（例えば、修飾ｍＲＮＡ）を合成するためのキメラ酵素は、国際公開第２０１４／０２８４２９号パンフレットに記載されている。
【０２８０】
一部の例では、修飾ｍＲＮＡを環状化又はコンカテマー化して、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との相互作用を補助する翻訳コンピテント分子を作製することができる。環状化又はコンカテマー化のメカニズムは、少なくとも３つの異なる経路：１）化学、２）酵素、及び３）リボザイム触媒を通して起こり得る。新たに形成される５’−／３’−結合は、分子内又は分子間のいずれでもあり得る。こうした修飾は、国際公開第２０１３／１５１７３６号パンフレットに記載されている。
【０２８１】
修飾ＲＮＡを作製及び精製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、修飾ＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）酵素合成のみを用いて作製される。ＩＶＴポリヌクレオチドを作製する方法は、当技術分野で公知であり、国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、同第２０１３／１５１６６８号パンフレット、同第２０１３／１５１６６３号パンフレット、同第２０１３／１５１６６９号パンフレット、同第２０１３／１５１６７０号パンフレット、同第２０１３／１５１６６４号パンフレット、同第２０１３／１５１６６５号パンフレット、同第２０１３／１５１６７１号パンフレット、同第２０１３／１５１６７２号パンフレット、同第２０１３／１５１６６７号パンフレット及び同第２０１３／１５１７３６．Ｓ号パンフレットに記載されている。精製方法には、複数のチミジン若しくはその誘導体及び／又は複数のウラシル若しくはその誘導体（ポリＴ／Ｕ）に連結させた表面とサンプルを、ＲＮＡ転写物が表面に結合するような条件下で接触させた後、表面から精製ＲＮＡ転写物を溶出させることにより、ポリＡテールを含むＲＮＡ転写物を精製する方法（国際公開第２０１４／１５２０３１号パンフレット）；スケーラブルな方法で１０，０００ヌクレオチド長までの長いＲＮＡの分離を可能にするイオン（例えば、アニオン）交換クロマトグラフィーを用いる方法（国際公開第２０１４／１４４７６７号パンフレット）；並びに修飾ｍＲＮＡサンプルをＤＮＡｓｅ処理に付す方法（国際公開第２０１４／１５２０３０号パンフレット）を含む。
【０２８２】
修飾ＲＮＡの製剤は公知であり、例えば国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレットに記載されている。例えば、製剤は、限定はされないが、ナノ粒子、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポドイド、リポプレクス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンハイドロゲル、フィブリングルー、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、トロンビン、急速排出脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）及びこれらの組合せであり得る。
【０２８３】
ヒトの疾患、抗体、ウイルス及び様々なインビボ環境の分野におけるポリペプチドをコードする修飾ＲＮＡは、公知であり、例えば国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、同第２０１３／１５１６６８号パンフレット、同第２０１３／１５１６６３号パンフレット、同第２０１３／１５１６６９号パンフレット、同第２０１３／１５１６７０号パンフレット、同第２０１３／１５１６６４号パンフレット、同第２０１３／１５１６６５号パンフレット、同第２０１３／１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３／１５１６７２号パンフレットの表６及び表７；国際公開第２０１３／１５１６７１号パンフレットの表６、表１７８及び表１７９；国際公開第２０１３／１５１６６７号パンフレットの表６、表１８５及び表１８６に開示されている。前述のいずれかは、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド又は環状ポリヌクレオチドとして合成され得、それぞれ１つ以上の修飾ヌクレオチド又は末端修飾を含み得る。
【０２８４】
（ｃ）阻害性ＲＮＡ
一部の例では、病原体防除組成物は、阻害性ＲＮＡ分子、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して作用する阻害性ＲＮＡ分子を含む。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、病原体又はそのベクターにおける遺伝子発現のレベルを低減させる。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、病原体又はそのベクターにおけるタンパク質のレベルを低減させる。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、病原体遺伝子の発現を阻害する。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、病原体のベクターにおける遺伝子の発現を阻害する。例えば、阻害性ＲＮＡ分子は、病原体の１遺伝子をターゲティングする低分子干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡを含み得る。特定のＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、１５〜５０塩基対（例えば、約１８〜２５塩基対）を含むＲＮＡ又はＲＮＡ様構築物を含み、細胞内の発現された標的遺伝子中のコード配列と同一（相補的）であるか又はほぼ同一（実質的に相補的）なヌクレオ塩基配列を有する。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、ダイサー基質低分子干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、部分二重鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）、ダイサー基質及び多価ＲＮＡ干渉（米国特許第８，０８４，５９９号明細書、同第８，３４９，８０９号明細書、同第８，５１３，２０７号明細書及び同第９，２００，２７６号明細書）が挙げられる。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを介して標的遺伝子の発現を低減するヘアピンターンを含むＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション又は形質導入により）、プラスミド、例えばウイルス若しくは細菌ベクターの形態で細胞に送達することができる。マイクロＲＮＡは、典型的に、約２２ヌクレオチド長を有するノンコーディングＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子上の標的部位に結合し、例えばｍＲＮＡの切断、ｍＲＮＡの不安定化又はｍＲＮＡの翻訳の阻害を引き起こすことにより、ｍＲＮＡを抑制する。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、機能の負調節因子のレベル及び／又は活性を低減させる。他の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、機能の正調節因子のレベル及び／又は活性を低減させる。阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、化学的に合成するか又はインビトロで転写することができる。
【０２８５】
一部の例では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡである。一部の例では、ＲＮＡは、阻害性ＲＮＡである。一部の例では、阻害性ＲＮＡは、病原体における遺伝子発現を阻害する。一部の例では、核酸は、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ又は病原体において酵素（例えば、代謝リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ又はユビキチン化タンパク質）の発現を増大するＤＮＡ分子、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。一部の例では、核酸は、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ又は酵素（例えば、代謝酵素、リコンビナーゼ酵素、ヘリカーゼ酵素、インテグラーゼ酵素、ＲＮＡｓｅ酵素、ＤＮＡｓｅ酵素又はユビキチン化タンパク質）の発現を増大するＤＮＡ分子、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。一部の例では、病原体における発現の増大は、参照レベル（例えば、非処置病原体における発現）に対して約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超の発現増大である。一部の例では、病原体における発現の増大は、参照レベル（非処置病原体における発現）に対して約２倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍又は約１００倍以上の発現増大である。
【０２８６】
一部の例では、核酸は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、ＬＮＡ、ｐｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、アプタマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ又は病原体において酵素（代謝酵素、リコンビナーゼ酵素、ヘリカーゼ酵素、インテグラーゼ酵素、ＲＮＡｓｅ酵素、ＤＮＡｓｅ酵素、ポリメラーゼ酵素、ユビキチン化タンパク質、スーパーオキシド管理酵素若しくはエネルギー生産酵素）の発現を低減するＤＮＡ分子（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）、転写因子、分泌タンパク質、構造因子（アクチン、キネシン若しくはチューブリン）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、シャペロン、受容体、シグナル伝達リガンド又は輸送因子である。一部の例では、病原体における発現の低減は、参照レベル（非処置病原体における発現）に対して約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超の発現低減である。一部の例では、病原体における発現の低減は、参照レベル（例えば、非処置病原体における発現）に対して約２倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍又は約１００倍以上の発現低減である。
【０２８７】
ＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子の全部又は断片と実質的に相補的であるか又は完全に相補的な配列を含む。ＲＮＡｉ分子は、イントロンとエキソンとの間の境界における配列を補足して、転写のためにｍＲＮＡへの特定の遺伝子の新しく生成されたＲＮＡ転写物の成熟を阻止し得る。特定の遺伝子と相補的なＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズして、その翻訳を阻止することができる。アンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導体若しくはハイブリッドであり得る。こうした誘導体分子の例として、限定はされないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）又はリボ核酸グアニジン（ＲＮＧ）などのホスホロチオエートベースの分子が挙げられる。
【０２８８】
ＲＮＡｉ分子は、インビトロで合成された直ちに使用可能なＲＮＡとして又は転写時にＲＮＡｉ分子を産生する細胞にトランスフェクトされたアンチセンス遺伝子として提供することができる。ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、ＲＮＡｓｅ  Ｈによるハイブリダイズ分子の分解及び／又は翻訳複合体の形成の阻害が起こる。いずれによっても、起源遺伝子の産物の生産ができなくなる。
【０２８９】
目的の転写物にハイブリダイズするＲＮＡｉ分子の長さは、約１０ヌクレオチド、約１５〜３０ヌクレオチド又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド若しくはそれを超える長さであり得る。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５であり得る。
【０２９０】
ＲＮＡｉ分子は、オーバーハング、即ち典型的に不対の突出したヌクレオチドも含み得、これらは、本明細書で定義するセンス鎖対及びアンチセンス鎖対のコア配列によって通常形成される二重螺旋構造に直接関与しない。ＲＮＡｉ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々とは独立に、約１〜５塩基の３’及び／又は５’オーバーハングを含有し得る。一部の例では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が、３’及び５’オーバーハングを含有する。一部の例では、一方の鎖塩基の１つ以上の３’オーバーハングヌクレオチドは、他方の鎖の１つ以上の５’オーバーハングヌクレオチドと対合する。他の例では、一方の鎖塩基の１つ以上の３’オーバーハングヌクレオチドは、他方の鎖の１つ以上の５’オーバーハングヌクレオチドと対合しない。ＲＮＡｉ分子のセンス及びアンチセンス鎖は、同数のヌクレオチド塩基を含んでも又は含まなくてもよい。アンチセンス及びセンス鎖は、５’末端のみが平滑末端を有するか、３’末端のみが平滑末端を有するか、５’及び３’末端の両方が平滑末端であるか、又は５’及び３’末端のいずれも平滑末端ではないデュプレックスを形成し得る。別の例では、オーバーハング中の１つ以上のヌクレオチドは、チオリン酸エステル、ホスホロチオエート、デオキシヌクレオチド逆位（３’−３’結合）ヌクレオチドを含むか、又は修飾リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドである。
【０２９１】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、標的ｍＲＮＡの約１５〜約２５の連続的ヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。一部の例では、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０〜７０％（約３０〜６０％、約４０〜６０％又は約４５〜５５％）のＧＣ含量を含み、例えば標準的ＢＬＡＳＴ検索により決定される通り、それを導入しようとするゲノム中の標的以外のいずれのヌクレオチド配列に対しても高い同一性パーセンテージを含まない。
【０２９２】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子のプロセシング経路における中間体と類似している（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ  １１６：２８１−２９７，２００４）。一部の例では、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、逆も同様である（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３，２００２；Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：４３８−４４２，２００３）。外性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに対してシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御する（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：１９９−２０４，２００６）。３’ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強力な下方制御をもたらす（Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：４３８−４４２，２００３）。
【０２９３】
既知の有効なｓｉＲＮＡ配列及び同種結合部位も関連文献に詳細に記載されている。ＲＮＡｉ分子は、容易に設計され、当技術分野において公知の技術により作製される。加えて、有効且つ特異的な配列モチーフを見出す機会を高める計算ツールもある（Ｐｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３（９）：６７０−６７６，２００６；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（３）：３２６−３３０，２００４；Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０（９）：７０８−７１２，２００３；Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１５（２）：１９９−２０８，２００３；Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（３）：９３６−９４８，２００４；Ｈｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３（３）：ｅ３０，２００５；Ｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１９（１）：２６４−２７４，２００４；及びＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１６（４）：１０５０−１０５８，２００４）。
【０２９４】
ＲＮＡｉ分子は、遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を調節する。複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有できることから、一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的とするように設計することができる。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、異なる遺伝子標的の間で共有されるか、又は特定の遺伝子標的についてユニークな配列に対して相補性を有する配列を含み得る。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、いくつかの遺伝子同士で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的とし、それにより遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異体、突然変異遺伝子など）を標的とするように設計することができる。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に対してユニークな配列を標的とするように設計することができる。
【０２９５】
阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、修飾ヌクレオチド、例えば２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−デオキシ、アンロックド核酸、２’−ヒドロキシ、ホスホロチオエート、２’−チオウリジン、４’−チオウリジン、２’−デオキシウリジンを含有するように修飾することができる。理論に拘束されるわけではないが、こうした修飾は、ヌクレアーゼ抵抗性及び／又は血清安定性を増大し得るか、又は免疫原性を低減させ得ると考えられる。
【０２９６】
一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、生理的に不安定な結合又はリンカーを介して送達ポリマーに連結される。生理的に不安定なリンカーは、それが特定の生理的条件下で存在するとき、化学変換（例えば、切断）を被るように選択される（例えば、ジスルフィド結合は、細胞質の還元的環境で切断される）。生理的に不安定な結合の切断によるポリマーからの分子の放出は、活動のために適切な細胞構成要素とその分子の相互作用を促進する。
【０２９７】
ＲＮＡｉ分子−ポリマーコンジュゲートは、ポリマーと分子を共有結合させることによって形成され得る。ポリマーは、それが反応性基Ａを含有するように重合又は修飾される。ＲＮＡｉ分子は、それが反応性基Ｂを含有するようにも重合又は修飾される。反応性基Ａ及びＢは、当技術分野で公知の方法を用いて、それらが可逆的共有結合を介して連結され得るように選択される。
【０２９８】
ＲＮＡｉ分子とポリマーの共役は、過剰のポリマーの存在下で実施することができる。ＲＮＡｉ分子とポリマーは、共役の間に反対電荷となり得るため、過剰ポリマーの存在により、コンジュゲートの凝集を低減又は排除することができる。代わりに、ポリカチオンなどの過剰の担体ポリマーを使用することもできる。過剰ポリマーは、コンジュゲートの投与前に共役ポリマーから除去することができる。代わりに、過剰ポリマーは、コンジュゲートと一緒に同時投与することもできる。
【０２９９】
母昆虫への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の注入により、胚形成中のそれらの子孫の遺伝子発現を効率的に抑制する。例えば、Ｋｈｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．５（７）：ｅ１０００５８３，２００９；及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１（７）：１５１５−１５２７，２００４を参照されたい。Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  １１２（３０）：９３７６−９３８１，２０１５）は、Ｕｂｘの抑制により、バクテリオサイト及びバクテリオサイトの共生体局在化が排除されることを明らかにしている。
【０３００】
リボザイム、ＲＮＡｓｅ  Ｐ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡに基づく阻害剤の作製及び使用も、例えば、Ｓｉｏｕｄ，ＲＮＡ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されているように、当技術分野で公知である。
【０３０１】
（ｄ）遺伝子編集
本明細書に記載の病原体防除組成物は、遺伝子編集系の１要素を含み得る。例えば、薬剤は、病原体における１遺伝子に改変（例えば、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転座、反転、単一点突然変異又は他の突然変異）を導入することができる。例示的な遺伝子編集系として、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベータ様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びクラスター化され規則的に間隔を置いた短鎖回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系が挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７−４０５，２０１３に記載されている。
【０３０２】
典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ配列を標的とする配列特異的、ノンコーディングガイドＲＮＡにより、エンドヌクレアーゼは、標的ヌクレオチド配列（例えば、配列編集しようとするゲノム内の部位）に向けられる。３つのクラス（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が同定されている。クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ系は、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質ではなく）を使用する。１つのクラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス−活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、即ち典型的には標的ＤＮＡ配列に対応する約２０ヌクレオチドＲＮＡ配列を含有する。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合する領域も含んで、ＲＮａｓｅＩＩＩにより切断される部分的二本鎖構造を形成し、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをもたらす。ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を指令して、スペーサ配列に応じて、特定のＤＮＡ／ＲＮＡ配列を抑制するガイドの役割を果たす。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０，２０１０；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  １：７，２００６；Ｐｅｎｎｉｓｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：８３３−８３６，２０１３を参照されたい。標的ＤＮＡ配列は、一般に、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに対して特異的なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接していなければならないが；ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体を通して出現する。種々の原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ配列要件を有し；ＰＡＭ配列の例として、５’−ＮＧＧ（配列番号７８）（化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’−ＮＮＡＧＡＡ（配列番号７９）（ストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’−ＮＧＧＮＧ（配列番号８０）（ストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）及び５’−ＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号８１）（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧリッチＰ（の５’側）ＡＭ部位、例えば５’−ＮＧＧ（配列番号７８）と結合して、ＰＡＭ部位から３ヌクレオチド上流の位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｖ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含み、これは、Ｃａｓ９より小さく；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｓｐ．）由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１結合ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡの要件なしに成熟型ｃｒＲＮＡにプロセシングされ；言い換えれば、Ｃｐｆ１系は、標的ＤＮＡ配列を切断するために、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡのみを必要とする。Ｃｐｆ１エンドヌクレアー��は、ＴリッチＰＡＭ部位、例えば５’−ＴＴＮと結合している。Ｃｐｆ１は、５’−ＣＴＡ  ＰＡＭモチーフも認識する。Ｃｐｆ１は、４’−若しくは５−ヌクレオチド５’オーバーハングを含むオフセット又はスタッガード二本鎖切断を導入することによりＤＮＡを切断し、例えばコーディング鎖のＰＡＭ部位（の３’側）から１８ヌクレオチド下流及び相補鎖のＰＡＭ部位から２３ヌクレオチド下流に位置する５−ヌクレオチドオフセット又はスタッガード切断で標的ＤＮＡを切断し、こうしたオフセット切断から生じる５−ヌクレオチドオーバーハングは、相同組換えによるＤＮＡ挿入により、平滑末端切断ＤＮＡでの挿入によるものよりも正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６３：７５９−７７１，２０１５を参照されたい。
【０３０３】
遺伝子編集の目的で、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含有するように、ＣＲＩＳＰＲアレイを設計することができる；例えば、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３，２０１３；Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８：２２８１−２３０８，２０１３を参照されたい。Ｃａｓ９によりＤＮＡ切断を起こすためには、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが必要であり；Ｃｐｆ１の場合、検出可能なＤＮＡ切断を実施するために、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドが必要である。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、概して、１７〜２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０若しくは２１ヌクレオチド）の長さと、標的とされる遺伝子又は核酸配列との相補性とを有するように設計される。カスタムｇＲＮＡ作製装置及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用するために市販されている。遺伝子編集は、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、即ち天然のｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合のため）と少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集の標的とされる配列にヌクレアーゼを誘導するため）との両方を含有する操作（合成）単一ＲＮＡ分子を用いても達成されている。また、化学修飾ｓｇＲＮＡも、ゲノム編集に有効であることが実証されており；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８５−９９１，２０１５を参照されたい。
【０３０４】
野生型Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡが標的とする特定のＤＮＡ配列で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するが、修飾された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが利用可能であり、例えば：Ｃａｓ９のニッカーゼバージョンは、一本鎖切断のみを生成し；触媒能のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、標的ＤＮＡを切断しないが、立体障害によって転写を妨害する。ｄＣａｓ９は、エフェクターとさらに融合させて、標的遺伝子の発現を抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）することもできる。例えば、Ｃａｓ９を転写リプレッサ（例えば、ＫＲＡＢドメイン）又は転写アクチベータ（例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合）と融合させることができる。Ｆｏｋｌヌクレアーゼと融合した触媒能のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）（ｄＣａｓ９−Ｆｏｋｌ）を用いて、２つのｇＲＮＡと相同性の標的配列でＤＳＢを生成することができる。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅリポジトリ（Ａｄｄｇｅｎｅ，７５  Ｓｉｄｎｅｙ  Ｓｔ．，Ｓｕｉｔｅ  ５５０Ａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  ０２１３９；ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／）に開示され、そこから一般に入手可能な多数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを参照されたい。各々が個別のガイドＲＮＡにより指令される２つの個別の二本鎖切断を導入するダブルニッカーゼＣａｓ９は、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４：１３８０−１３８９，２０１３により、より正確なゲノム編集を達成するものとして記載されている。
【０３０５】
真核生物の遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ技術は、米国特許出願公開第２０１６／０１３８００８  Ａ１号明細書及び同第２０１５／０３４４９１２  Ａ１号明細書並びに米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書及び同第８，９０６，６１６号明細書に開示されている。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ及び対応するガイドＲＮＡ並びにＰＡＭ部位は、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３  Ａ１号明細書に開示されている。
【０３０６】
一部の例では、所望のゲノム修飾は、相同組換えを含み、この場合、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡにより、標的ヌクレオチド配列に１つ以上の二本鎖ＤＮＡ切断が生成された後、相同組換え機構を用いた切断の修復（相同組換え修復）が起こる。こうした例では、二本鎖切断において挿入又はノックインしようとする所望のヌクレオチド配列をコードするドナーテンプレートが、細胞又は対象に提供され；好適なテンプレートの例として、一本鎖ＤＮＡテンプレート及び二本鎖ＤＮＡテンプレート（例えば、本明細書に記載のポリペプチドに連結される）が挙げられる。一般に、約５０ヌクレオチド未満の領域にわたってヌクレオチド変更をコードするドナーテンプレートは、一本鎖ＤＮＡの形態で提供され；より大きいドナーテンプレート（例えば、１００ヌクレオチド超）は、多くの場合、二本鎖ＤＮＡプラスミドとして提供される。一部の例では、ドナーテンプレートは、所望の相同組換え修復を達成するのに十分であるが、所与の期間後（例えば、１つ以上の細胞分裂周期後）、細胞又は対象において持続しない量で細胞又は対象に供給される。一部の例では、ドナーテンプレートは、少なくとも１つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０又はそれを超えるヌクレオチドだけ標的ヌクレオチド配列と異なるコアヌクレオチド配列（例えば、相同的内在性ゲノム領域）を有する。このコア配列は、標的ヌクレオチド配列と高い配列同一性の相同性アーム又は領域によってフランキングされ；一部の例では、高い配列同一性の領域は、コア配列の両側に少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７５０又は少なくとも１０００ヌクレオチドを含む。ドナーテンプレートが一本鎖ＤＮＡの形態である一部の例では、コア配列は、コア配列の両側で、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０又は少なくとも１００ヌクレオチドを含む相同性アームによりフランキングされる。ドナーテンプレートが二本鎖ＤＮＡの形態である一部の例では、コア配列は、コア配列の両側で、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００又は少なくとも１０００ヌクレオチドを含む相同性アームによりフランキングされる。一例では、ダブルニッカーゼＣａｓ９を用いて、２つの個別の二本鎖切断を細胞又は対象の標的ヌクレオチド配列に導入した（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４：１３８０−１３８９，２０１３を参照されたい）後、ドナーテンプレートの送達が行われる。
【０３０７】
一部の例では、組成物は、ｇＲＮＡと標的ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、例えば野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１若しくはＣ２Ｃ３又はこうしたヌクレアーゼをコードする核酸を含む。ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの選択は、標的突然変異が、ヌクレオチドの欠失、置換又は付加、例えば標的配列へのヌクレオチドの欠失、置換又は付加であるかどうかによって決定される。（１つ以上の）エフェクタードメインの全部又は一部（例えば、生物学的に活性の部分）とテザリングした触媒能のないエンドヌクレアーゼ、例えば不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、例えばＤ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）の融合により、キメラタンパク質を作出し、これをポリペプチドと連結させて、１つ以上のＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）により組成物を特定のＤＮＡ部位に誘導して、１つ以上の標的核酸配列の活性及び／又は発現を調節することができる。
【０３０８】
複数の例では、薬剤は、遺伝子編集の目的でＣＲＩＳＰＲ系に使用するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の例では、薬剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は病原体における１遺伝子の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）をターゲティング（例えば、切断）するＺＦＮをコードするｍＲＮＡを含む。一部の例では、薬剤は、ＴＡＬＥＮ又は病原体における１遺伝子の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）をターゲティング（例えば、切断）するＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡを含む。
【０３０９】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ系にｇＲＮＡを使用して、病原体における遺伝子の改変を操作することができる。他の例では、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮを用いて、病原体における遺伝子の改変を操作することができる。例示的な改変として、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転座、反転、単一点突然変異又は他の突然変異が挙げられる。改変は、細胞の遺伝子に例えばインビトロ、エクスビボ又はインビボで導入することができる。一部の例では、改変は、病原体における遺伝子のレベル及び／又は活性を増大する。他の例では、改変は、病原体における遺伝子のレベル及び／又は活性を低減させる（例えば、ノックダウン若しくはノックアウトする）。また別の例では、改変は病原体における遺伝子の欠陥（例えば、欠陥を引き起こす突然変異）を修正する。
【０３１０】
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、病原体における標的遺伝子を編集する（例えば、塩基対を付加するか又は欠失させる）。他の例では、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、未成熟終止コドンを導入し、例えばこれにより標的遺伝子の発現を低減する。また別の例では、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、例えばＲＮＡ干渉と同様に、可逆的方法で標的遺伝子をオフにする。一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、Ｃａｓを遺伝子のプロモータに向け、これによりＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断する。
【０３１１】
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書、Ｃｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３，２０１３；Ｔｓａｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：６  ５６９−５７６，２０１４；米国特許第８，８７１，４４５号明細書；同第８，８６５，４０６号明細書；同第８，７９５，９６５号明細書；同第８，７７１，９４５号明細書；及び同第８，６９７，３５９号明細書に記載される技術を用いて、病原体における遺伝子を編集するように生成することができる。
【０３１２】
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）技術は、病原体の特定の遺伝子の転写抑制のために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲｉの場合、操作Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ−ヌルｄＣａｓ９又はｄＣａｓ９融合タンパク質、例えばｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ若しくはｄＣａｓ９−ＳＩＤ４Ｘ融合物）を配列特異的ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と対合させることができる。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、ＲＮＡポリメラーゼを遮断することができ、それにより、転写伸長を妨害する。この複合体は、転写因子結合を妨害することにより、転写開始も遮断することができる。ＣＲＩＳＰＲｉ法は、最小オフターゲット効果を固有に有し、且つマルチプレクサブル（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ）であり、例えば同時に２つ以上の遺伝子を抑制することができる（例えば、複数のｇＲＮＡを用いて）。また、ＣＲＩＳＰＲｉ方法は、可逆的遺伝子抑制も可能にする。
【０３１３】
一部の例では、病原体の遺伝子の転写活性化のために、ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）を用いることができる。ＣＲＩＳＰＲａ技術では、ｄＣａｓ９融合タンパク質が、転写アクチベータを動員する。例えば、ｄＣａｓ９をＶＰ６４又はｐ６５活性化ドメイン（ｐ６５Ｄ）などのポリペプチド（例えば、活性化ドメイン）と融合させ、ｓｇＲＮＡ（例えば、単一のｓｇＲＮＡ又は複数のｓｇＲＮＡ）と一緒に用いて、病原体の１つ又は複数の遺伝子を活性化することができる。複数のｓｇＲＮＡを用いることにより、複数のアクチベータを動員することができ、これは、活性化効率を高め得る。様々な活性化ドメイン及び単一又は複数の活性化ドメインを使用することができる。アクチベータを動員するためにｄＣａｓ９を操作する以外に、ｓｇＲＮＡも、アクチベータを動員するように操作することができる。例えば、ＲＮＡアプタマーをｓｇＲＮＡに組み込むことにより、ＶＰ６４などのタンパク質（例えば、活性化ドメイン）を導入することができる。一部の例では、転写活性化のために相乗的活性化メディエータ（ＳＡＭ）系を用いることができる。ＳＡＭでは、ＭＳ２アプタマーをｓｇＲＮＡに付加する。ＭＳ２は、ｐ６５ＡＤ及びヒートショック因子１（ＨＳＦ１）と融合したＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）を動員する。
【０３１４】
ＣＲＩＳＰＲｉ及びＣＲＩＳＰＲａ技術について、さらに詳細には、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：５−１５，２０１６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。加えて、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，に記載されているように、ｄＣａｓ９媒介性のエピジェネティクス修飾並びに同時活性化及びＣＲＩＳＰＲ系による抑制を用いて、病原体における遺伝子を調節することができる。
【０３１５】
ｉｉｉ．小分子
一部の例では、病原体防除組成物は、小分子、例えば生体小分子を含む。本明細書に記載される方法及び組成物において多数の小分子剤が有用である。
【０３１６】
小分子としては、限定されないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣薬（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、合成ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、一般に、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機及び無機化合物（ヘテロ有機及び有機金属化合物を含む）、例えば１モル当たり約２，０００グラム未満の分子量を有する有機及び無機化合物、例えば１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機及び無機化合物、例えば１モル当たり約５００グラム未満の分子量を有する有機及び無機化合物並びにこうした化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容可能な形態を含む。
【０３１７】
本明細書に記載される小分子は、本明細書に記載の病原体防除組成物又はその関連方法のいずれかのために、組成物に配合するか又はＰＭＰと結合させることができる。本明細書に開示される組成物は、任意の数又は種類（例えば、クラス）の小分子、例えば少なくとも約１つの、２、３、４、５、１０、１５、２０若しくはそれを超える小分子を含み得る。組成物中の各小分子の好適な濃度は、小分子の有効性、安定性、個別の小分子の数、配合及び組成物の適用方法などの要因に応じて変動する。組成物が少なくとも２種類の小分子を含有する一部の例では、各種小分子の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０３１８】
本明細書に記載の小分子を含む病原体防除組成物は、（ａ）病原体又はそのベクター内部又は上で標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の小分子濃度を達成し；且つ（ｂ）病原体の適応度を低減させるのに十分な量及び時間で病原体又はそのベクターと接触させることができる。
【０３１９】
一部の例では、本明細書に記載の小分子を含む病原体防除組成物は、（ａ）動物体内で標的レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の小分子濃度を達成し；且つ（ｂ）病原体を低減又は排除するのに十分な量及び時間で、病原体による感染を有するか又はそのリスクがある動物に投与することができる。
【０３２０】
一部の例では、本明細書に記載される組成物及び方法の病原体防除組成物は、二次代謝物を含む。二次代謝物は、生物により産生される有機分子に由来する。二次代謝物は、（ｉ）細菌、真菌、アメーバ、植物、昆虫及び大型動物に対して使用される競合物質として；（ｉｉ）金属輸送剤として；（ｉｉｉ）微生物と植物、昆虫及び高等動物との間の共生用物質として；（ｉｖ）性ホルモンとして；並びに（ｖ）分化エフェクターとして作用し得る。
【０３２１】
本明細書で使用される二次代謝物は、二次代謝物の任意の既知群からの代謝物を含み得る。例えば、二次代謝物は、次の群に分類することができる：アルカロイド、テルペノイド、フラボノイド、グリコシド、天然フェノール（例えば、ゴシポール酢酸）、エナール（例えば、トランス−シンナムアルデヒド）、フェナジン、ビフェノール及びジベンゾフラン、ポリケチド、脂肪酸シンターゼペプチド、非リボソームペプチド、リボソームにより合成されて、翻訳後修飾されたペプチド、ポリフェノール、多糖（例えば、キトサン）及びバイオポリマー。二次代謝物の詳細な論評については、例えば、Ｖｉｎｉｎｇ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３９５−４２７，１９９０を参照されたい。
【０３２２】
ＶＩ．キット
本発明は、動物病原体に起因する疾患の防除、予防若しくは処置又はそうした病原体のベクターの防除のためのキットも提供し、このキットは、本明細書に記載の病原体防除組成物を有する容器を含む。キットは、本発明の方法に従って感染を防除、予防又は処置するための病原体防除組成物を適用又は送達する（例えば、動物、動物病原体又は動物病原体のベクターに）ための教材をさらに含み得る。当業者は、本発明の方法で病原体防除組成物を適用する上での説明が任意の形態の説明であり得ることを理解するであろう。こうした指示として、限定されないが、文書教材（例えば、ラベル、冊子、パンフレット）、口述教材（例えば、カセットテープ若しくはＣＤ）又はビデオ教材（例えば、ビデオテープ若しくはＤＶＤ）が挙げられる。
【実施例】
【０３２３】
以下は、本発明の方法の例である。上に提供した概説を考慮して、他の様々な実施形態が実施され得ることが理解される。
【０３２４】
実施例１：植物からの植物メッセンジャーパックの単離
この実施例は、葉アポプラスト、種子アポプラスト、根、果実、野菜、花粉、師管液、木部樹液及び植物細胞培地を含め、様々な植物起源からの粗植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の単離を説明する。
【０３２５】
実験計画：
ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）葉のアポプラストからのＰＭＰ単離
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｌ−０））種子を５０％漂白剤で表面滅菌した後、０．８％寒天を含有する０．５３ムラシゲスクーグ培地上に平板培養する。これらの種子を４℃で２日間春化処置した後、短日条件（明期９ｈ、２２℃、１５０μＥｍ−２）に移す。１週間後、苗をＰｒｏ−Ｍｉｘ  ＰＧＸに移す。植物を４〜６週間成長させた後、収穫する。
【０３２６】
Ｒｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  ＩｎｎｅｓによりＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載されているように、４〜６週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ロゼットのアポプラスト洗浄液からＰＭＰを単離する。手短には、全ロゼットを根から収穫し、小胞単離バッファー（２０ｍＭ  ＭＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．１  Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）と一緒に真空浸潤する。浸潤した植物を注意深くブロットして、余剰の液体を除去し、３０ｍＬシリンジ内に導入してから、５０ｍＬ円錐チューブにおいて２℃で２０分間遠心分離することにより、ＥＶを含有するアポプラスト細胞外液を収集する。次に、アポプラスト細胞外液を０．８５μｍフィルタで濾過することにより、大きい粒子を除去した後、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
【０３２７】
ｂ）ヒマワリ種子のアポプラストからのＰＭＰ単離
インタクトなヒマワリ種子（ヒマワリ（Ｈ．ａｎｎｕｕｓ  Ｌ．）に水を２時間吸収させ、皮を剥いで、果皮を除去した後、Ｒｅｇｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８３：３３６３−３３６６，２００９から改変した修正真空浸潤−遠心分離手順によりアポプラスト細胞外液を抽出する。手短には、種子を小胞単離バッファー（２０ｍＭ  ＭＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．１  Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に浸潤させてから、３回の１０秒の真空パルスに付し、３０秒間隔の４５ｋＰａの圧力により分離する。浸潤した種子を回収し、濾紙上で乾燥させ、フリットガラス濾過器に配置し、４℃、４００ｇで２０分間遠心分離する。アポプラスト細胞外液を回収し、０．８５μｍフィルタで濾過することにより、大きい粒子を除去した後、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
【０３２８】
ｃ）根生姜からのＰＭＰ単離
新鮮な生姜（ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ））根茎根を現地の供給者から購入し、ＰＢＳで３回洗浄する。計２００グラムの洗浄済の根をミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ  １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕した後、Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．４（１）：２８７１３，２０１５に記載されているように、ＰＭＰを単離する。手短には、生姜汁を１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
【０３２９】
ｄ）グレープフルーツ果汁からのＰＭＰ単離
新鮮なグレープフルーツ（グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ×ｐａｒａｄｉｓｉ））を現地の供給者から購入し、その皮を除去し、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２２（３）：５２２−５３４，２０１４に記載されているように（若干の修正を加えた）、果実を手で圧搾するか、又はミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ  １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕することにより、果汁を収集する。手短には、果汁／果汁パルプを１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
【０３３０】
ｅ）ブロッコリーヘッドからのＰＭＰ単離
ブロッコリー（ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ））ＰＭＰは、以前記載されている（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２５（７）：１６４１−１６５４，２０１７）ように単離する。手短には、新鮮なブロッコリーを現地の供給者から購入し、ＰＢＳで３回洗浄してから、ミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ  １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕する。次に、ブロッコリー汁を１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
【０３３１】
ｆ）オリーブ花粉からのＰＭＰ単離
オリーブ（オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ））花粉ＰＭＰは、Ｐｒａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ．７（３）：５７３−５７７，２０１４に以前記載されているように単離する。手短には、オリーブ花粉（０．１ｇ）を室温の加湿チャンバー内で３０分間水和した後、２０ｍｌの発芽培地：１０％ショ糖、０．０３％Ｃａ（ＮＯ３）２、０．０１％ＫＮＯ３、０．０２％ＭｇＳＯ４及び０．０３％Ｈ３ＢＯ３を含有するペトリ皿（直径１５ｃｍ）に移す。花粉を３０℃の暗所において１６ｈ発芽させる。花粉粒は、チューブが花粉粒の直径より長くなったときに初めて発芽したとみなされる。ＰＭＰを含有する培地を収集し、遠心分離による０．８５ｕｍフィルタでの２回の連続濾過によって花粉残屑を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
【０３３２】
ｇ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）師管液からのＰＭＰ単離
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌ−０））種子を５０％漂白剤で表面滅菌した後、０．８％寒天を含有する０．５３ムラシゲスクーグ培地上に平板培養する。これらの種子を４℃で２日間春化処置した後、短日条件（明期９ｈ、２２℃、１５０μＥｍ−２）に移す。１週間後、苗をＰｒｏ−Ｍｉｘ  ＰＧＸに移す。植物を４〜６週間成長させた後、収穫する。
【０３３３】
Ｔｅｔｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．により、ＪｏＶＥ．８０，２０１３に記載されているように、４〜６週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ロゼット葉からの師管液を収集する。手短には、葉柄の基部から葉を切断し、重ねてから、創傷の封止を防ぐために、２０ｍＭ  Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する反応チューブ内に暗所で１時間配置する。葉を容器から穏やかに取り出し、蒸留水で入念に洗浄し、全てのＥＤＴＡを除去して、清浄なチューブ内に配置した後、暗所において師管液を５〜８時間かけて収集する。葉を廃棄し、師管液を０．８５μｍフィルタで濾過して、大きい粒子を除去してから、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
【０３３４】
ｈ）トマト植物木部樹液からのＰＭＰ単離
トマト（トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））種子をＳｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇａｗａｍ，ＭＡ）などの有機質土壌の入った単一ポットに植え、２２℃〜２８℃の温室内に維持する。発芽から約２週間後、即ち２本葉期（ｔｗｏ  ｔｒｕｅ−ｌｅａｆ  ｓｔａｇｅ）に、９０％砂及び１０％有機物ミックスを含む滅菌砂質土を充填したポット（直径１０ｃｍ、深さ１７ｃｍ）に苗を個別に移植する。２２℃〜２８℃の温室内に植物を４週間維持する。
【０３３５】
Ｋｏｈｌｅｎ  ｅｔ  Ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１５５（２）：７２１−７３４，２０１１に記載されているように、４週齢のトマト植物からの木部樹液を収集する。手短には、トマト植物の胚軸から上を切断し、プラスチックリングを茎の周りに取り付ける。切断から９０分にわたって蓄積する木部樹液を収集する。木部樹液を０．８５μｍフィルタで濾過して、大きい粒子を除去してから、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
【０３３６】
ｉ）タバコＢＹ−２細胞培地からのＰＭＰ単離
３０ｇ／Ｌショ糖、２．０ｍｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、０．１ｇ／Ｌのミオ−イノシトール、０．２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及び１ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌを補充したＭＳ塩（Ｄｕｃｈｅｆａ，Ｈａａｒｌｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、♯Ｍ０２２１）を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２）ＢＹ−２培地（ｐＨ５．８）中で、１８０ｒｐｍのシェーカに載せ、タバコＢＹ−２（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ  ｃｖ．）ブライトイエロー２）細胞を２６℃の暗所において培養する。７日齢細胞培養物の５％（ｖ／ｖ）を１００ｍＬの新鮮な液体培地に移すことにより、ＢＹ−２細胞を毎週二次培養する。７２〜９６時間後、ＢＹ−２培地を収集し、４℃、３００ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞を除去する。ＰＭＰを含有する上清を収集し、０．８５ｕｍフィルタでの濾過により、残屑を除去する。実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
【０３３７】
実施例２：精製植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の生成
この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）と組み合わせて限外濾過及び沈殿又はサイズ排除クロマトグラフィーによる凝集体の除去を用いた、実施例１に記載の粗ＰＭＰ画分から精製ＰＭＰの生成を説明する。
【０３３８】
実験計画：
ａ）サイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせて限外濾過を用いた精製グレープフルーツＰＭＰの生成
１００−ｋＤＡ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ａｍｉｃｏｎスピンフィルタ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、実施例１ａからの粗グレープフルーツＰＭＰ画分を濃縮する。次に、濃縮した粗ＰＭＰ溶液をＰＵＲＥ−ＥＶサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ）にロードし、製造者の指示に従って単離する。精製済ＰＭＰ含有画分を、溶出後プールする。任意選択で、１００−ｋＤＡ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎスピンフィルタを用いて又はタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により、ＰＭＰをさらに濃縮することもできる。実施例３に記載のように、精製ＰＭＰを分析する。
【０３３９】
ｂ）イオジキサノール勾配を用いた精製シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰの生成
実施例１ａに記載のように、粗シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）葉アポプラストＰＭＰを単離し、Ｒｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載されているように、イオジキサノール勾配を使用することにより、ＰＭＰを精製する。不連続イオジキサノール勾配（ＯｐｔｉＰｒｅｐ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を調製するために、小胞単離バッファー（ＶＩＢ；２０ｍＭ  ＭＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．１  Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）で水性６０％ＯｐｔｉＰｒｅｐストック溶液を希釈することにより、４０％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）及び５％（ｖ／ｖ）イオジキサノールの溶液を作製する。勾配は、３ｍｌの４０％溶液、３ｍＬの２０％溶液、３ｍＬの１０％溶液、２ｍＬの５％溶液を積層することにより形成する。実施例１ａからの粗アポプラストＰＭＰ溶液を４℃、４０，０００ｇで６０分間遠心分離する。ペレットを０．５ｍｌのＶＩＢに再懸濁させてから、勾配の上部に重ねる。４℃、１００，０００ｇで１７ｈ遠心分離を実施する。勾配の上部の最初の４．５ｍｌを廃棄した後、アポプラストＰＭＰを含有する０．７ｍｌの３容量を収集し、ＶＩＢを用いて３．５ｍＬにして、４℃、１００，０００ｇで６０分間遠心分離する。ペレットを３．５ｍｌのＶＩＢで洗浄した後、同じ遠心分離条件を用いて再ペレット化する。実施例３に記載の通り、次の分析のために精製ＰＭＰペレットを合わせる。
【０３４０】
ｃ）ショ糖勾配を用いた精製グレープフルーツＰＭＰの生成
実施例１ｄに記載のように粗グレープフルーツ果汁ＰＭＰを単離し、１５０，０００ｇで９０分間遠心分離した後、記載されている（Ｍｕ  ｅｔ  Ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ＆Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５８（７）：１５６１−１５７３，２０１４）ように、ＰＭＰ含有ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させる。再懸濁させたペレットをショ糖ステップ勾配（８％／１５％／３０％／４５％／６０％）に移し、１５０，０００ｇで１２０分間遠心分離して、精製ＰＭＰを生成する。３０％／４５％界面から精製グレープフルーツＰＭＰを収集し、後に実施例３に記載のように分析する。
【０３４１】
ｄ）グレープフルーツＰＭＰからの凝集体の除去
実施例１ｄに記載の通り生成したグレープフルーツＰＭＰ又は実施例２ａ〜ｃからの精製ＰＭＰからタンパク質凝集体を除去するために、追加的な精製ステップを加えることができる。生成したＰＭＰ溶液を様々なｐＨに通過させて、溶液中にタンパク質凝集体を沈殿させる。ｐＨは、水酸化ナトリウム又は塩酸の添加により３、５、７、９若しくは１１に調節する。較正ｐＨプローブを用いてｐＨを測定する。溶液が指定のｐＨに達したら、濾過して粒子を除去する。代わりに、単離したＰＭＰ溶液をＰｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ  ２６４０などの荷電ポリマーの添加により凝結させることもできる。手短には、１Ｌ当たり２〜５ｇのＰｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ  ２６４０を溶液に添加し、インペラで混合する。次に、溶液を濾過して、粒子を除去する。代わりに、塩濃度を高めることにより、凝集体を可溶化する。ＮａＣｌを、１ｍｏｌ／Ｌに達するまでＰＭＰ溶液に添加する。次に、溶液を濾過して、ＰＭＰを精製する。代わりに、温度を上昇させることにより、凝集体を可溶化する。単離したＰＭＰ混合物を、５０℃の均質温度に達するまで混合しながら５分加熱する。次に、ＰＭＰ混合物を濾過して、ＰＭＰを単離する。代わりに、ＰＭＰ溶液からの可溶性混入物は、標準的方法に従うサイズ排除クロマトグラフィーカラムにより分離するが、その場合、ＰＭＰは、第１画分に溶出するのに対して、タンパク質及びリボ核タンパク質及び一部のリポタンパク質は、遅れて溶出される。タンパク質凝集体除去の効率は、ＢＣＡ／Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量により、タンパク質凝集体の除去前及び後のタンパク質濃度を測定し、比較することにより決定される。生成したＰＭＰは、実施例３に記載のように分析する。
【０３４２】
実施例３：植物メッセンジャーパックの特性決定
この実施例は、実施例１又は実施例２に記載の通りに生成されたＰＭＰの特性決定を説明する。
【０３４３】
実験計画：
ａ）ＰＭＰ濃度の決定
ＰＭＰ粒子濃度は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔを用いるナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＮＴＡ）又はｉＺｏｎ  ｑＮａｎｏを用いる調整可能抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）により、製造者の指示に従って決定する。精製ＰＭＰのタンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の使用により決定する。精製ＰＭＰの脂質濃度は、Ｒｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  ＩｎｎｅｓによりＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載のように、ＤｉＯＣ６（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）などの蛍光親油性色素を用いて決定する。手短には、実施例２からの精製ＰＭＰペレットをＭＥＳバッファー（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６）で希釈した１００ｍｌの１０ｍＭ  ＤｉＯＣ６（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）並びに１％植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２ｍＭ  ２，２９−ジピリジルジスルフィドに再懸濁させる。再懸濁ＰＭＰを３７℃で１０分間インキュベートし、３ｍＬのＭＥＳバッファーで洗浄し、再ペレット化し（４℃で、４００，０００ｇ、６０分）、新鮮なＭＥＳバッファーに再懸濁させる。ＤｉＯＣ６蛍光強度を４８５ｎｍ励起及び５３５ｎｍ発光で測定する。
【０３４４】
ｂ）ＰＭＰの生物物理学的及び分子特性決定
Ｗｕ  ｅｔ  Ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ．１４０（２）：３８６−４０６，２０１５のプロトコルに従い、ＪＥＯＬ  １０１０透過型電子顕微鏡での電子及び低温電子顕微鏡法によりＰＭＰを特性決定する。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ又はｉＺｏｎ  ｑＮａｎｏを用い、製造者の指示に従ってＰＭＰのサイズ及びゼータ電位も測定する。クロロホルム抽出を用いて、ＰＭＰから脂質を単離し、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．２２（１０）：３１９３−３２０５，２０１０に説明されているように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで特性決定する。グリコシルイノシトールホスホリルセラミド（ＧＩＰＣ）脂質を抽出し、Ｃａｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１７０：３６７−３８４，２０１６に記載のように精製した後、前述したようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析する。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製のＱｕａｎｔ−Ｉｔキットを用いて、指示に従い、全ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質を特性決定する。Ｒｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載のプロトコルに従い、ＰＭＰのタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特性決定する。トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を用いて、ＲＮＡ及びＤＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  Ｐｌａｎｔキット及びＮｅｘｔｅｒａ  Ｍａｔｅ  Ｐａｉｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、ＴｒｕＳｅｑ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを含むライブラリに調製した後、製造者の指示に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑでシーケンシングする。
【０３４５】
実施例４：植物メッセンジャーパック安定性の特性決定
この実施例は、様々な保存及び生理学的条件下でのＰＭＰの安定性の測定を実証する。
【０３４６】
実験計画：
実施例１及び２に記載通りに生成したＰＭＰを様々な条件に付す。水、５％ショ糖若しくはＰＢＳにＰＭＰを懸濁させ、−２０℃、４℃、２０℃及び３７℃で１、７、３０及び１８０日間放置する。また、ＰＭＰを水に懸濁させ、ロータリエバポレータ装置を用いて乾燥させ、４℃、２０℃及び３７℃で１、７及び３０並びに１８０日間放置する。また、ＰＭＰを水又は５％ショ糖溶液に懸濁させ、液体窒素で急速冷凍後、凍結乾燥させた。１、７、３０及び１８０日後、乾燥及び凍結乾燥ＰＭＰを水に再懸濁させる。０℃を超える温度での条件を含む３つの先行実験物は、模擬屋外ＵＶ条件での満足な安全性を決定するために、人工太陽光シミュレータにも曝露する。さらには、１単位のトリプシンが添加された若しくは添加されていないｐＨ１、３、５、７及び９の緩衝溶液又は他の人工胃液中で３７℃、４０℃、４５℃、５０℃及び５５℃の温度に１、６及び２４時間ＰＭＰを曝露する。
【０３４７】
これら各々の処理後、ＰＭＰを２０℃に戻し、ｐＨ７．４に中和した後、実施例３に記載の方法の一部又は全部を用いて特性決定する。
【０３４８】
実施例５：植物メッセンジャーパックによる真菌の処理
この実施例は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ロゼットから産生されるＰＭＰが病原真菌の適応度を低減させる能力を実証する。この実施例では、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をモデル病原真菌として使用する。
【０３４９】
カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種のような病原真菌は、世界的な日和見真菌感染の主要原因であり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（「パン用イースト」としても知られる）は、ほとんどが偶発的消化性片利共生生物であると考えられている。しかし、１９９０年以降、侵襲性感染の病原物質としてのその関与に関する報告が増えている。病原真菌による感染は、主として既存の抗真菌薬の効果が限定されているために、一般的に高い罹患率及び致死率を伴う。
【０３５０】
治療計画：
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰ溶液には、１０ｍｌのＰＢＳ中０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇの実施例１ａからのＰＭＰタンパク質／ｍｌを配合した。
【０３５１】
実験計画：
ａ）親油性膜色素によるアポプラストＰＭＰの標識
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）アポプラストＰＭＰを単離し、実施例１〜２に記載の通りに精製した後、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）で、製造者の指示に従い（一部変更して）標識する。手短には、１ｍＬの希釈物Ｃ又はＰＫＨ２６キット中の５０ｍｇのアポプラストＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡの添加により標識を停止する。１５０，０００ｇで９０分間の遠心分離により全ての非標識色素を洗い流し、標識ＰＭＰペレットを滅菌水に再懸濁させる。
【０３５２】
ｂ）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるアポプラストＰＭＰの取込み
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ＡＴＣＣ（＃９７６３）から取得し、これを製造者の指示に従い、酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）において３０℃で維持する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰの取込みを決定するために、酵母細胞を選択培地中で０．４〜０．６のＯＤ６００まで増殖させ、０（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識アポプラスト由来ＰＭＰと一緒にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照以外に、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートする。室温で５分、３０分及び１ｈのインキュベーション後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。細胞質中に赤色のＰＭＰが観察されるか、又は酵母細胞の細胞質が、ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的染色に対して赤く変化すれば、アポプラスト由来ＰＭＰは、酵母により取り込まれている。ＰＭＰ取込みを評価するために、ＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素単独対照との間において、膜のみの染色に対して、赤色細胞質／細胞質中の赤色ＰＭＰを有する酵母細胞のパーセンテージを比較する。
【０３５３】
ｃ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰ溶液によるインビトロでのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の処理
酵母細胞の適応度に対するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰ処理の効果を決定するために、変更を加えた薬剤感受性試験を実施する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞（１０５細胞／ｍｌ）を溶融ＹＰＤ寒天（約４０℃）と混合し、ペトリ皿に注ぎ込む。寒天の凝固後、５μｌの０（ＰＢＳ、陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇのＰＭＰタンパク質／ｍｌの溶液をプレートにスポッティングする。プレートを３０℃でインキュベートし、２及び３日後に阻害ゾーン（濃い円）を評点する。
【０３５４】
さらに、酵母増殖に対するＰＭＰの効果を評価するために、スポット試験を実施する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をＹＰＤ培地上で一晩培養する。次に、細胞を０．１のＯＤ６００まで通常の塩水中に懸濁させる（Ａ６００）。各酵母培養物の５倍連続希釈物の５マクロリットルをＰＭＰの非存在下（ＰＢＳ対照）及び１、１０、５０、１００又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌの存在下でＹＰＤプレート上にスポッティングする。３０℃で４８ｈにわたるプレートのインキュベーション後、増殖の差を記録する。
【０３５５】
ＰＢＳ対照とＰＭＰ処理真菌細胞との間で阻害ゾーン及び増殖の差を比較することにより、真菌適応度に対するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰの全体的効果を決定する。
【０３５６】
実施例６：植物メッセンジャーパックによる細菌の処理
この実施例は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ロゼットからの精製アポプラストＰＭＰが、細菌により取り込まれ、且つ病原菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の適応度を低減させる能力を実証する。この実施例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をモデル病原菌として使用する。
【０３５７】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの病原菌によりトリガーされるヒト及び動物疾患は、既存の抗真菌薬の効果が限定されており、且つそれらに対する耐性が増大しているため、相当の罹患率及び致死率を招く。
【０３５８】
治療計画：
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰ溶液には、１０ｍｌの滅菌水中０（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇのＰＭＰタンパク質／ｍｌを配合する。
【０３５９】
ａ）親油性膜色素によるアポプラストＰＭＰの標識
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）アポプラストＰＭＰは、実施例１〜２に記載の通りに生成したＰＭＰであり、これらをＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）で製造者の指示に従って（一部変更して）標識する。手短には、１ｍＬの希釈物Ｃで５０ｍｇのＰＭＰを希釈し、２ｍｌの１ｍＭ  ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡの添加により標識を停止する。１５０，０００ｇで９０分間の遠心分離により非標識色素を全て洗い流し、標識ＰＭＰペレットを滅菌水に再懸濁させた後、実施例３に記載の通り分析する。
【０３６０】
ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるアポプラストＰＭＰの取込み
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＡＴＣＣ（＃２５９２２）から取得し、これを製造者の指示に従って３７℃においてトリプチケースソイ寒天培地／ブロス上で増殖させる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるＰＭＰ取込みを決定するために、１ｍｌの一晩細菌懸濁液１０ｕｌを０（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識アポプラスト由来ＰＭＰと一緒にスライドガラス上で直接インキュベートする。水対照以外に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートする。室温で５分、３０分及び１ｈのインキュベーション後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。細菌の細胞質が、ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的染色に対して赤く変化すれば、アポプラストＰＭＰは、細菌により取り込まれている。ＰＭＰ取込みを判定するために、ＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素単独による対照処理と比較して、赤色の細胞質を有するＰＫＨ２６−ＰＭＰ処理細菌のパーセンテージを比較する。
【０３６１】
ｃ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰ溶液によるインビトロでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の処理
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖に作用する能力は、変更を加えた標準的ディスク拡散感受性法を用いて決定する。手短には、非選択性培地上での一晩増殖（１６〜２４ｈのインキュベーション）からいくつかの形態学的に類似するコロニーを、滅菌ループ又は綿棒を用いて選択した後、コロニーを滅菌塩水（水中０．８５％  ＮａＣｌ  ｗ／ｖ）中にＭｃＦａｒｌａｎｄ０．５標準の密度（約１〜２×１０８ＣＦＵ／ｍｌに相当）まで懸濁させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）接種材料懸濁液を調製する。滅菌綿棒を接種材料懸濁液に浸漬し、綿棒から余剰の液体を除去した後、綿棒で３方向に塗布することにより、細菌を寒天プレートの表面全体に均一に広げることにより、ミュラー−ヒントン寒天培地プレート（直径１５０ｍｍ）に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）懸濁液を接種する。次に、３ｕｌの水（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇのＰＭＰタンパク質／ｍｌをプレートにスポッティングし、乾燥させる。プレートを３５℃で１６〜１８時間インキュベートし、撮影した後、スキャンする。スポッティングした領域周囲の溶解ゾーン（細菌が存在しない領域）の直径を測定する。対照（水）及びＰＭＰ処理溶解ゾーンを比較して、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰの殺菌効果を決定する。
【０３６２】
実施例７：ＰＭＰによる寄生昆虫の処理
この実施例は、根生姜などの植物から産生されたＰＭＰの溶液でそれらを処理することにより、トコジラミなどの寄生昆虫を殺傷するか又はその適応度を低減させる能力を実証する。この実施例では、トコジラミを寄生昆虫のモデル生物として使用する。
【０３６３】
トコジラミ（キメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ））は、吸血性の外部寄生虫であり、世界的に重要な新興の公衆衛生有害生物である。有効な残留殺虫剤が利用できないこと及びトコジラミ個体群のピレスロイド殺虫剤に対する耐性増大は、有効且つ環境因子的に安全な処理オプションの開発に正当な根拠を与えるものである。
【０３６４】
治療計画：
根生姜ＰＭＰ溶液に１０ｍｌのＰＢＳ中の０（陰性対照）、１、１０、５０、１００及び２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌを配合する。
【０３６５】
実験計画：
ａ）トコジラミ（キメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ））の培養
キメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）は、Ｓｉｅｒｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）から取得する。トコジラミコロニーを、段ボール製隠れ場所を含むガラス製ケージ内に維持し、２５℃及び４０〜４５％（周囲）湿度の１２：１２光周期で維持する。脱線維ウサギ血液（Ｈｅｍｏｓｔａｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉｘｏｎ，ＣＡ）を含有するパラフィルム膜給餌器で毎週１回コロニーに血液を給餌する。
【０３６６】
ｂ）根生姜ＰＭＰ溶液によるキメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）の処理
実施例１に記載のように根生姜ＰＭＰを単離し、トコジラミ生存率、繁殖力及び発生に対するＰＭＰ処理の効果を決定する。処理前に、４日間血液を給餌していない０〜２週齢のトコジラミ成虫を単離し、ガラス製ジャー内に配置して、２日間交配させる。雄を選別して取り出し、雌トコジラミは、一緒に収容される１０〜１５匹の実験コホートに分ける。雌トコジラミは、最終濃度０（ＰＢＳ、陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌを添加した脱線維ウサギ血液をそれらに十分に膨張するまで給餌することによって処理する。ＰＭＰ処理後、産卵に好適な基質（Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＭＦＳ，Ｉｎｃ．，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）を提供する滅菌パッドを含むペトリ皿内において１０〜１５匹のトコジラミのコホートを２５℃及び４０〜４５％（周囲）湿度で維持する。生存率アッセイのために、１０日間毎日死んだ虫を計数、記録した後、それらのケージから除去し、ＰＢＳ対照と比較して、ＰＭＰ処理トコジラミの平均生存率を計算する。
【０３６７】
その後、上に示す通りに、ＰＭＰ添加血液を１０日間毎日トコジラミに給餌した後、トコジラミを新しいペトリ皿に移す。十分な孵化時間を確保するために、卵を含むペトリ皿を生育チャンバー内で２週間維持する。産卵された卵は、１６倍率の双眼実体顕微鏡下で観察し、給餌期間毎に雌トコジラミが産卵した卵の平均数を３０日にわたって計算し、卵から出る幼虫の平均数を評価し、トコジラミの平均生存率を計算する。根生姜ＰＭＰ処理コホートをＰＢＳ処理対照コホートと比較することにより、トコジラミの生存率、繁殖力及び発育に対する根生姜ＰＭＰの効果を決定する。
【０３６８】
実施例８：ＰＭＰによる寄生線虫の処理
この実施例は、根生姜などの植物から産生されたＰＭＰの溶液でそれらを処理することにより、ヘリグモソモイデス・ポリギルス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）などの寄生線虫を殺傷するか又はその適応度を低減させる能力を実証する。
【０３６９】
慢性蠕虫感染は、依然として甚大な世界規模の健康問題であり、ヒト及び家畜の両方で高い罹患率の原因となっている。最も優勢な寄生蠕虫の多くは、それらの固有宿主種と共進化すると共に、密接に適応していることから、実験室内で研究するのは困難である。この実施例では、天然のネズミ寄生体である、モデル病原体蠕虫Ｈ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）を使用して、その適応度に対する根生姜ＰＭＰの効果を証明する。
【０３７０】
治療計画：
根生姜ＰＭＰ溶液に１０ｍｌの滅菌水中の０（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌ（実施例１ａ）を配合する。
【０３７１】
実験計画：
ａ）寄生線虫ヘリグモソモイデス・ポリギルス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）の培養
Ｈ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）の培養は、Ｋｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｅｓ＆Ｖｅｃｔｏｒｓ．９（１）：３７６，２０１６に記載のように実施する。４週齢の雌ＮＭＲＩマウス及びＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）Ｌ３は、現地の供給者から購入する。雌ＮＭＲＩマウスを８０匹のＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）Ｌ３線虫に経口感染させる。感染した糞から、Ｈ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）卵を取得する。
【０３７２】
ｂ）根生姜ＰＭＰ溶液によるＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）のインビトロでの処理
卵の孵化に対する根生姜ＰＭＰ溶液の殺線虫活性を評価するために、感染したマウスの糞から、Ｈ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）卵を取得し、洗浄した後、０（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇ根生姜ＰＭＰタンパク質／ｍｌを含有する溶液に３０分、１時間又は２時間浸漬する。次に、卵を２４℃の暗所内の寒天上に１４日間配置し、６日後から孵化したＬ３幼虫の数を記録する。ＰＭＰ処理有り及びなしで孵化したＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）のパーセンテージを比較することにより、卵の孵化に対する根生姜ＰＭＰの効果を決定する。
【０３７３】
ｃ）根生姜ＰＭＰ溶液によるＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）Ｌ３幼虫のインビトロでの処理
Ｈ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）Ｌ３幼虫に対するＰＭＰ溶液の殺線虫活性を評価するために、感染したマウスの糞から、Ｈ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）卵を取得し、寒天上に配置すると、２４℃の暗所内で９日後にＬ３幼虫が孵化する。ＰＭＰ処理のために、４０匹のＬ３幼虫を９６ウェルプレートの各ウェルに配置する。０．６３μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、５００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン並びに０（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌを添加したＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌの存在下で蠕虫をインキュベートする。各処理を２回反復して試験する。１００μＭレバミソール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした蠕虫を陽性対照として使用する。プレートを室温で７２ｈ維持する。Ｌ３の適応度に対するＰＭＰ処理の効果を評価するために、ウェル毎のＬ３幼虫の総数を計数し、１００μｌの熱湯（約８０℃）で刺激した後に動いている幼虫を記録する。ＰＭＰ処理と陽性及び陰性対照との間において、動いているＬ３幼虫の相対パーセンテージを比較して、根生姜ＰＭＰの殺幼体線虫効果を決定する。
【０３７４】
ｄ）根生姜ＰＭＰ溶液によるＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）成虫のインビトロでの処理
雌ＮＭＲＩマウスを８０匹のＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）に経口感染させる。感染から２週間後、マウスを解剖し、３匹の成体蠕虫を２４ウェルプレートの各ウェルに配置する。蠕虫を培地及び０（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇ根生姜ＰＭＰタンパク質／ｍｌと一緒にインキュベートする。各処理を３回反復して試験する。培地のみ及び５０μＭレバミソールとインキュベートした成体蠕虫は、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用する。蠕虫を３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベータ内に７２ｈ維持した後、３（活動）〜０（動かない）までの生存性等級を用いて、顕微鏡で評価する。ＰＭＰ処理と陽性及び陰性対照との間において、Ｈ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）成虫の平均生存性スコアを比較することにより、根生姜ＰＭＰの殺成体線虫効果を決定する。
【０３７５】
ｅ）マウス内の根生姜ＰＭＰ溶液によるＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）のインビボでの処理
根生姜ＰＭＰ処理のインビボでの殺線虫効果を試験するために、ＮＭＲＩマウスを８０匹のＨ．ポリギルス（Ｈ．ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）Ｌ３に経口感染させる。感染から１４日後、用量１０、１００、３００若しくは４００ｍｇＰＭＰタンパク質／ｋｇの試験薬剤又はレバミソール対照でマウスを経口処理する。４〜６匹の非処置マウスを対照として使用する。処理から１０日後、動物をＣＯ２法により死なせ、消化管を採取する。腸を切断し、成体蠕虫を収集し、計数する。陽性及び陰性対照処理マウスコホートに対して、ＰＭＰ処理コホートの成体蠕虫の平均数を比較することにより、経口投与した根生姜ＰＭＰの殺線虫活性を決定する。
【０３７６】
実施例９：ＰＭＰによる寄生原虫の処理
この実施例は、根生姜などの植物から産生されたＰＭＰの溶液で処理することにより、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）などの寄生原虫を殺傷するか又はその適応度を低減させる能力を実証する。この実施例では、膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）をモデル寄生原虫として使用する。
【０３７７】
膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）は、世界的に最も一般的な非ウイルス性の性感染症（ＳＴＤ）の１つである。前鞭毛及び波動膜を用いて運動性であるこの嫌気性原虫は、控え目に見積もって世界で推定１憶８千万人の女性に感染し、これは、米国で毎年６百万人が感染していることを示す。メトロニダゾールファミリーの古典的な薬剤に対する寄生虫の耐性の増大を考慮して、新規の非関連薬剤に対する必要性が高まっている。
【０３７８】
治療計画：
根生姜ＰＭＰ溶液に１０ｍｌの滅菌水中の０（陰性対照）、１、１０、５０、１００又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌを配合する。
【０３７９】
実験計画：
ａ）寄生原虫膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の培養
膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）は、ＡＴＣＣ（＃５０１６７）から取得し、製造者の指示に従い、且つＴｉｗａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，６２（３）：５２６−５３４，２００８に記載のように培養する。１５ｍＬのネジ式栓付きガラスチューブ中、３７℃の１０％ＦＣＳ、ビタミン混合物及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトグラミンを添加した標準ＴＹＩ−Ｓ３３培地（ｐＨ６．８）中で原虫を増殖させる。培地は、常用の方法において４８ｈで濃度２×１０７細胞／ｍＬを達成する。培養物維持のために、１チューブ当たり１×１０４細胞の接種材料を使用する。
【０３８０】
ｂ）根生姜ＰＭＰ溶液による膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の処理
根生姜ＰＭＰは、実施例１に記載のように生成する。膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）適応度に対する根生姜ＰＭＰの効果を決定するために、以前記載されている（Ｔｉｗａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，６２（３）：５２６−５３４，２００８）ように、薬物感受性アッセイを実施する。手短には、３７℃の２４ウェルプレート内のＴＹＩ−Ｓ３３培地中で、０（滅菌水、陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌ又は陽性対照としての１〜１２ｍＭメトロニダゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、１ｍＬ当たり５×１０３個のトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）栄養体をインキュベートする。２０倍率の顕微鏡下、３ｈから４８ｈまで間の様々な時間間隔で生存性について細胞を調べる。膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の生存性は、トリパンブルー排除アッセイにより決定する。血球計数板を用いて、細胞を計数する。全ての細胞の死滅が判明したＰＭＰ溶液の最小濃度をその最小阻止濃度（ＭＩＣ）とみなす。ＭＩＣを確認するために、実験を３回繰り返す。膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）適応度に対する根生姜ＰＭＰの効果は、陰性及び陽性対照に対して、ＰＭＰ処理の平均ＭＩＣを比較することにより決定する。
【０３８１】
実施例１０：低分子核酸をロードした植物メッセンジャーパックによる真菌の処理
この実施例は、ＰＭＰ脂質を単離し、低分子核酸を含有する小胞にそれらを合成することにより、低分子核酸を送達するＰＭＰの能力を実証する。この実施例では、病原真菌であるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の病原性因子をノックダウンするために、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ロードＰＭＰを使用する。また、低分子核酸ロードＰＭＰが、様々なプロセシング及び環境条件にわたって安定しており、それらの活性を保持することも実証する。この実施例では、ｄｓＲＮＡをモデル核酸として使用し、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）をモデル病原真菌として使用する。
【０３８２】
カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種は、世界的に日和見真菌感染の主な原因であり、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）は、現在、３番目から４番目の一般的な院内感染である、カンジダ症の最も一般的な病原体である。これらの感染は、一般に、主として既存の抗菌薬の効果が限定的であるために、高い罹患率及び致死率を伴う。Ｃ．アルビカン（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の場合、酵母及びフィラメント形態からバイオフィルム形成への形態形成変換は、２つの重要な生物学的プロセスを呈示し、これらは、この真菌の生物学と密接に関連し、またカンジダ症の発症中に重要な役割を果たす。
【０３８３】
治療用量：
ｄｓＲＮＡをロードしたＰＭＰを、滅菌水中０、５０、５００又は１０００ｎＭの有効なｓｉＲＮＡ用量の当量を送達する濃度まで水に配合した。
【０３８４】
実験プロトコル：
ａ）単離したグレープフルーツＰＭＰ脂質からのＥＦＧ１  ｄｓＲＮＡロードグレープフルーツＰＭＰの合成
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．，４：１８６７，２０１３から変更を加えたプロトコルに従って低分子核酸をＰＭＰにロードする。手短には、実施例１〜２に記載の通り、グレープフルーツから、精製ＰＭＰを生成し、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２２（１０）：３１９３−３２０５，２０１０から改変して、グレープフルーツＰＭＰ脂質を単離する。手短には、３．７５ｍＬの２：１（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３をＰＢＳ中の１ｍｌのＰＭＰに添加し、ボルテックスする。ＣＨＣｌ３（１．２５ｍｌ）及びｄｄＨ２Ｏ（１．２５ｍｌ）を順次添加し、ボルテックスする。次に、混合物をガラスチューブ内において２２℃、２，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分遠心分離して、混合物を２相（水相及び有機相）に分離する。有機相の収集のために、水相からガラスピペットを弱い正圧で挿入し、底の相（有機相）を吸引して、新しいガラスチューブ内に注入する。有機相サンプルをアリコートに分け、窒素下（２ｐｓｉ）加熱することにより乾燥させる。
【０３８５】
Ｍｏａｚｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ．１７４（３）：１７７−１８５，２０１２に記載されている配列：アンチセンス：５’ＡＣＡＵＵＧＡＧＣＡＡＵＵＵＧＧＵＵＣ−３’及びセンス：５’−ＧＡＡＣＣＡＡＡＵＵＧＣＵＣＡＡＵＧＵ−３’並びにスクランブルｓｉＲＮＡ対照５’−ＡＵＡＵＧＣＧＣＡＡＣＡＵＵＧＡＣＡ−３’は、ＩＤＴから取得する。記載されている（Ｍｏａｚｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ．１７４（３）：１７７−１８５，２０１２）通りのアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び５０ｍＭ  ＮＨ４  Ａｃ中でセンス／アンチセンスアニーリングを実施して、ｓｉＲＮＡ二重螺旋（ｄｓＲＮＡ）を実施する。ｄｓＲＮＡロードＰＭＰは、脂質と低分子核酸を混合し、これらを乾燥させて薄膜を形成することにより、標的及び対照ｓｉＲＮＡの両方から合成する。この膜をＰＢＳに分散させ、超音波処理して、ロードされたリポソーム製剤を形成する。実施例２に記載のショ糖勾配を用いて、ＰＭＰを精製し、使用前に、超遠心分離により洗浄して、非結合核酸を除去する。実施例３の方法を用いて、両サンプルの小部分を特性決定し、Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡアッセイキットを用いて、ＲＮＡ含量を測定し、実施例４に記載のようにそれらの安定性を試験する。
【０３８６】
実施例１０ａからのｓｉＲＮＡロードＰＭＰを用いて、真菌遮断効率を決定するために、滅菌水中０、５０、５００及び１０００ｎＭの有効ｓｉＲＮＡ用量を含むＰＭＰ溶液でカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）を処理する。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）野生型株（ＡＴＣＣ＃１４０５３）を酵母抽出物ペプトン／デキストロース（ＹＰＤ）培地プレート上で培養し、３７℃で２４ｈインキュベートした後、使用まで４℃で維持する。ＥＦＧ１  ｄｓＲＮＡロードＰＭＰによる処理の効果及び効率をスクランブル及び陰性対照と比較する。
【０３８７】
ｂ）真菌バイオフィルムを低減するためのＥＦＧ１  ｓｉＲＮＡロードグレープフルーツＰＭＰによるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の処理
Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）バイオフィルム形成に対するｓｉＲＮＡロードＰＭＰの効果を測定するために、１５０ｍＬフラスコ内において２０ｍＬの酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）（１％［ｗｔ／ｖｏｌ］酵母エキス、２％［ｗｔ／ｖｏｌ］ペプトン、２％［ｗｔ／ｖｏｌ］デキストロース）液体培地にＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の一晩培養物を接種し、３０℃のオービタルシェーカ内でインキュベートする。これらの条件下、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）は、出芽酵母として成長する。Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  Ａｌ．，Ｐａｔｈｏｇ  Ｄｉｓ．Ａｐｒ；７０（３）：４２３−４３１，２０１４により記載される通り、９６ウェルマイクロタイタープレートモデルを用いて、バイオフィルムを形成する。手短には、一晩ＹＰＤ培養物から細胞を採取し、洗浄後、Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁させてから、最終濃度１．０×１０６細胞／ｍＬで、１６５ｍＭモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）で緩衝化する。市販の滅菌済みポリスチレン平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上でＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）バイオフィルムを形成する。１ウェル当たり２５０ｕｌの１．０×１０６細胞／ｍＬのＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）細胞を分配し、ＥＦＧＲ１  ｓｉＲＮＡロードＰＭＰ又はスクラブル対照を最終濃度０（水、陰性対照）、５０、５００又は１０００ｎＭまで添加する。処理を３回反復して実施し、プレートを３７℃で２４ｈインキュベートする。バイオフィルム形成後、ウェルを２回洗浄して、非付着細胞を除去し、光学顕微鏡法により視覚化した後、２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホ−フェニル）−２Ｈ−テトラ−ゾリウム−５−カルボキサニリド（ＸＴＴ，Ｓｉｇｍａ）の還元に基づく半定量的比色分析法を用いて処理する。（ＰＭＰの非存在下で）形成された対照バイオフィルムのＯＤを任意で１００％に設定し、対照との比較で吸光度の減少率によりｓｉＲＮＡロードＰＭＰの阻害効果を決定した。対照ウェルの平均と比較したバイオフィルム阻害率としてデータを計算する。
【０３８８】
ＥＦＧＲ１発現の変化を定量するために、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のＥＦＧ１ｍＲＮＡのレベルを定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定する。Ｆｉｓｈｅｒ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ（商標）ＳｕｒｅＰｒｅｐ（商標）Ｐｌａｎｔ／Ｆｕｎｇｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いたｃＤＮＡ合成後、定量的ＲＴ−ＰＣＲ定量を実施する。合成ＥＦＧＲ１−ｄｓＲＮＡの処理後、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）において、ＥＦＧ１（ＸＭ＿７０９１０４．１）及びハウスキーピング遺伝子βアクチンＡＣＴ１（ＸＭ＿７１７２３２．１）を決定し、以下のプライマー：ＥＦＧ１−Ｆｗ：ＴＧＣＣＡＡＴＡＡＴＧＴＧＴＣＧＧＴＴＧ、ＥＦＧ１−Ｒｅｖ：ＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＡＣＣＡＣＧＴＧＴＣ、ＡＣＴ１−Ｆｗ：ＡＣＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧ、ＡＣＴ１−Ｒｅｖ：ＴＧＧＡＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧ（Ｍｏａｚｅｎｉ  ｅｔ  Ａｌ．，Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ．１７４（３）：１７７−１８５，２０１２）を用いて、スクランブル対照を測定する。次のプロトコル：９５℃で３分の変性、９５℃で２０秒、６１℃で２０秒及び７２℃で１５秒の４０回反復に従う３回の技術的反復で、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施する。
【０３８９】
ＥＦＧ１の存在量を植物由来ＰＣＲ産物のＡＣＴ１存在量に対して正規化して、ノックダウン効率を決定するが、これは、ΔΔＣｔ値を算出し、陰性ＰＢＳ対照の正規化真菌増殖をｄｓ−ＲＮＡロードＰＭＰ処理サンプルの正規化真菌増殖と比較することにより決定される。
【０３９０】
ｃ）真菌適応度を低減するためのＥＦＧ１  ｓｉＲＮＡロードグレープフルーツＰＭＰによるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の処理
真菌増殖に対するＥＦＧ１  ｓｉＲＮＡロードＰＭＰの効果を評価するために、Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  Ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．４（５）：ｅ６１９，２０１３により記載されている通り、寒天に埋め込んだ酵母を用いたＰＭＰ活性アッセイを実施した。グルコース（２％、ｗ／ｖ）を含有する最小培地の一晩培養物を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）で２回洗浄した後、ＴＥに再懸濁させる。ＯＤ６００を測定してから、これを用いて、ガラクトースを含有する７．５ｍｌの最小培地に５×１０７コロニー形成単位の酵母を導入し、これを３７℃まで平衡させる。各酵母懸濁液を、ガラクトース（２％、ｗ／ｖ）を含有する７．５ｍｌの最小培地寒天（５０℃まで事前に平衡させる）と混合し、反転によって速やかに混合した後、１５ｍｌのガラクトース含有最小培地寒天を含む、事前に作製した１０ｃｍプレート上に注ぎ込む。プレートを１時間にわたって室温で静置する。５マイクロリットルのＥＦＧＲ１  ｓｉＲＮＡロードＰＭＰ又は０（水、陰性対照）、５０、５００若しくは１０００ｎＭのスクラブル対照を、埋め込まれた酵母を含むプレート上にピペットで移し、室温で乾燥させて、３０℃で３日間インキュベートした後、撮影する。濃い円は、ＰＭＰ媒介による酵母増殖の抑制を明らかにする。
【０３９１】
実施例１１：ペプチド核酸ロードＰＭＰによる昆虫の処理
この実施例は、トコジラミ（キメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ））のｖＡＴＰａｓｅ−Ｅをノックダウンすることにより昆虫の適応度を低減させる目的でＰＭＰにペプチド核酸構築物をロードすることを実証するものであり、これは、ｓｉＲＮＡにより、生存及び生殖に作用することが実証されている（Ｂａｓｎｅｔ  ａｎｄ  Ｋａｍｂｌｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，５５（３）：５４０−５４６．２０１８）。この実施例は、ＰＮＡロードＰＭＰが多様な処理及び環境条件にわたって安定しており、且つその活性を保持することも実証する。この実施例では、ＰＮＡをモデルタンパク質として使用し、キメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）をモデル病原昆虫として使用する。
【０３９２】
治療用量：
ＲＮＡをロードしたＰＭＰを、滅菌水中０、０．１、１、５又は１０μＭの有効ＰＮＡ用量の当量を送達する濃度まで水に配合した。
【０３９３】
実験プロトコル：
ａ）ペプチド核酸によるグレープフルーツＰＭＰのローディング
キメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）ｖＡＴＰａｓｅ−Ｅ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ♯ＬＯＣ１０６６６７８６５）に対するＰＮＡを適切な供給業者により設計及び合成させる。グレープフルーツ由来のＰＭＰを実施例１に従って単離する。ＰＭＰを、ＰＢＳ中ＰＮＡを含む溶液に導入する。次に、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．，４：１８６７，２０１３からのプロトコルに従って溶液を超音波処理して、ＰＭＰにポレーション及び拡散を誘導する。代わりに、Ｈａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０７：１８−３０，２０１５からのプロトコルに従って溶液を脂質エキストルーダに通過させることもできる。代わりに、Ｗａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．４０（１７）：ｅ１３０，２０１２からのプロトコルに従ってこれらをエレクトロポレートし得る。１時間後、ショ糖勾配を用いて、ＰＭＰを精製してから、使用前に、実施例２に記載の通り超遠心分離により洗浄して、非結合核酸を除去する。
【０３９４】
実施例３に記載の方法を用いて、サイズ、ゼータ電位及び粒子計数を測定し、実施例４に記載のようにそれらの安定性を試験する。Ｎｉｋｒａｖｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５（８）：１５３７−１５４２，２００７に記載のプロトコルに従う電気泳動ゲルシフトアッセイを用いて、ＰＭＰ中のＰＮＡを定量する。手短には、ＰＮＡに対するアンチセンスＤＮＡを、デタージェントで処理したＰＮＡ−ＰＭＰと混合して、ＰＮＡを放出する。ＰＮＡ−ＤＮＡ混合物をゲル上に泳動させ、ｓｓＤＮＡ色素で視覚化する。次に、蛍光イメージングにより二重螺旋を定量する。ロード及び非ロードＰＭＰを比較して、ロード効率を決定する。
【０３９５】
ｂ）昆虫の適応度を低減させるためのｖＡＴＰａｓｅ−Ｅ  ＰＮＡロードグレープフルーツＰＭＰによるキメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）の処理
上で同定されたｖＡＴＰａｓｅ−Ｅ  ＰＮＡをロードしたＰＭＰ及びスクランブルＰＮＡ対照を、前述した方法に従ってＰＭＰにロードする。キメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）は、Ｓｉｅｒｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）から取得する。トコジラミコロニーを、段ボール製隠れ場所を含むガラス製ケージ内に維持し、２５℃及び４０〜４５％（周囲）湿度の１２：１２光周期で維持する。脱線維ウサギ血液（Ｈｅｍｏｓｔａｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉｘｏｎ，ＣＡ）を含有するパラフィルム膜給餌器で毎週１回コロニーに血液を給餌する。
【０３９６】
ＰＮＡロードＰＭＰ処理前に、４日間血液を給餌していない０〜２週齢のトコジラミ成虫を単離し、ガラス製ジャー内に配置して、２日間交配させる。雄を選別して取り出し、雌トコジラミは、一緒に収容される１０〜１５匹の実験コホートに分ける。雌トコジラミを、最終濃度０、０．１、１、５若しくは１０μＭのｖＡＴＰａｓｅ−Ｅ  ＰＮＡロードＰＭＰ又は０、０．１、１、５若しくは１０μＭのスクランブルＰＮＡロードＰＭＰを添加した脱線維ウサギ血液を、１５分にわたってそれらに十分に膨張するまで給餌することにより処理する。脱線維ウサギ血液のみを給餌したトコジラミを給餌実験の対照として使用する。ＰＮＡロードＰＭＰ処理後、産卵に好適な基質（Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＭＦＳ，Ｉｎｃ．，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）を提供する滅菌パッドを含むペトリ皿内において１０〜１５匹のトコジラミのコホートを２５℃及び４０〜４５％（周囲）湿度で維持する。生存率アッセイのために、１０日間毎日死んだ虫を計数、記録した後、それらのケージから除去し、スクランブルＰＮＡロードＰＭＰ及び水対照と比較して、ｖＡＴＰａｓｅ−Ｅ  ＰＮＡロードＰＭＰトコジラミの平均生存率を計算する。
【０３９７】
その後、ＰＮＡロードＰＭＰを添加した血液を１０日間毎日トコジラミに給餌した後、トコジラミを新しいペトリ皿に移す。十分な孵化時間を確保するために、卵を含むペトリ皿を生育チャンバー内で２週間維持する。産卵された卵は、１６倍率の双眼実体顕微鏡下で観察し、給餌期間毎に雌トコジラミが産卵した卵の平均数を３０日にわたって計算し、卵から出る幼虫の平均数を評価し、トコジラミの平均生存率を計算する。ｖＡＴＰａｓｅ−Ｅ  ＰＮＡ  ＰＭＰ処理コホートを、スクランブルＰＮＡロードＰＭＰ及びＰＢＳ処理対照コホートと比較することにより、トコジラミ生存率、繁殖力及び発生に対する根生姜ＰＭＰの効果を決定する。
【０３９８】
処理から３及び３０日後、処理毎に３匹のトコジラミを液体窒素でスナップ冷凍した後、−８０℃で保存して、リアルタイム定量的ＰＣＲ  ＲＴ−ｑＰＣＲによりＰＮＡ  ｖＡＴＰａｓｅ−Ｅ  ｍＲＮＡノックダウンを評価する。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてｃＤＮＡを合成する。以前報告されたプライマー：ｖ−ＡＴＰａｓｅ−Ｅ−フォワード：ＡＧＧＴＣＧＣＣＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＣ、ｖ−ＡＴＰａｓｅ−Ｅ−リバース：ＧＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＣ及びハウスキーピング遺伝子ｒｐＬ８−フォワード：ＡＧＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧ、ｒｐＬ８−リバース：ＴＣＧＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣ（Ｂａｓｎｅｔ  ａｎｄ  Ｋａｍｂｌｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，５５（３）：５４０−５４６．２０１８）を用い、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＲＴ−ｑＰＣＲを実施する。ｖ−ＡＴＰａｓｅ−Ｅの存在量をリボソームタンパク質Ｌ８存在量に対して正規化し、ΔΔＣｔ値を算出し、ｖ−ＡＴＰａｓｅ−Ｅ  ＰＮＡロードＰＭＰ処理サンプル中の正規化したｖ−ＡＴＰａｓｅ−Ｅ発現をスクランブルＰＮＡロードＰＭＰ処理対照と比較することにより、相対ｖ−ＡＴＰａｓｅ−Ｅノックダウン効率を決定する。
【０３９９】
実施例１２：小分子ロードＰＭＰによる細菌の処理
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の適応度を低減させる目的でＰＭＰに小分子、この実施形態ではストレプトマイシンをロードする方法を実証するものである。この実施例は、小分子ロードＰＭＰが多様な処理及び環境条件にわたって安定しており、且つその活性を保持することも実証する。この実施例では、ストレプトマイシンをモデル小分子として使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をモデル病原菌として使用する。
【０４００】
治療用量：
小分子をロードしたＰＭＰを、０、２．５、１０、５０又は２００ｍｇ／ｍｌの有効なストレプトマイシン硫酸塩用量の当量を送達する濃度まで水に配合した。
【０４０１】
ａ）ストレプトマイシンによるグレープフルーツＰＭＰのローディング
ＰＭＰを前述の通り生成し、可溶化ストレプトマイシンを含むＰＢＳ溶液に導入する。Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．Ｓｅｐ；１８（９）：１６０６−１４，２０１０に記載のプロトコルに従って溶液を２２℃で１時間放置する。代わりに、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．，４：１８６７，２０１３からのプロトコルに従って溶液を超音波処理して、ポレーション及び拡散をエキソソーム中に誘導する。代わりに、Ｈａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０７：１８−３０，２０１５からのプロトコルに従って溶液を脂質エキストルーダに通過させることもできる。代わりに、Ｗａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．４０（１７）：ｅ１３０，２０１２からのプロトコルに従ってこれらをエレクトロポレートし得る。１時間後、ショ糖勾配を用いて、ロードＰＭＰを精製してから、実施例２に記載の通り超遠心分離により洗浄して、使用前に非結合小分子を除去する。実施例３に記載の方法を用いて、サイズ及びゼータ電位について、ストレプトマイシンロードＰＭＰを特性決定する。少量のＰＭＰは、ストレプトマイシン含量であり、標準曲線を用いた１９５ｎｍで、ＵＶ−Ｖｉｓを用いて評価する。手短には、目的とする様々な濃度のストレプトマイシンのストック溶液を作製し、１００マイクロリットルの溶液を平底の透明９６ウェルプレート内に導入する。ＵＶ−Ｖプレートリーダを用いて、１９５ｎｍでの吸光度を測定する。また、サンプルをプレートに載せ、回帰を用いて、その濃度が標準に一致し得るかを決定する。不十分な高さの濃度の場合、Ｋｕｒｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３４３：３７９−３８５，１９８５からのプロトコルを用いて、ＨＰＬＣによりストレプトマイシン含量を測定する。ストレプトマイシンロードＰＭＰ安定性は、実施例４に記載のように試験する。
【０４０２】
ｂ）細菌の適応度を低減させるためのストレプトマイシンロードグレープフルーツＰＭＰによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の処理
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＡＴＣＣ（＃２５９２２）から取得し、製造者の指示に従い、３７℃でトリプチケースソイ寒天／ブロス上で増殖させる。有効濃度のストレプトマイシン、ＰＭＰ及びストレプトマイシンロードＰＭＰを、変更を加えた標準的ディスク拡散感受性法に従い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖を阻止する能力について試験する。
【０４０３】
非選択性培地上で一晩増殖したもの（１６〜２４ｈのインキュベーション）からいくつかの形態学的に類似するコロニーを、滅菌ループ又は綿棒を用いて選択した後、ＭｃＦａｒｌａｎｄ０．５標準の密度（約１〜２×１０８ＣＦＵ／ｍｌに相当）までコロニーを滅菌塩水（水中０．８５％  ＮａＣｌ  ｗ／ｖ）に懸濁させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）接種材料懸濁液を調製する。滅菌綿棒を接種材料懸濁液に浸漬し、綿棒から余剰の液体を除去した後、綿棒で３方向に塗布することにより、細菌を寒天プレートの表面全体に均一に広げることにより、ミュラー−ヒントン寒天培地プレート（直径１５０ｍｍ）に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）懸濁液を接種する。次に、３ｕｌのＰＢＳ（陰性対照）、０（ＰＭＰ対照）、２．５、１０、５０、１００又は２００ｍｇ／ｍｌの有効用量のストレプトマイシンロードＰＭＰ並びに２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン単独（＋対照）をプレートにスポッティングし、乾燥させる。プレートを３５℃で１６〜１８時間インキュベートし、撮影した後、スキャンする。スポッティングした領域周囲の溶解ゾーン（細菌が存在しない領域）の直径を測定する。対照（ＰＢＳ）、ストレプトマイシン、ＰＭＰ及びストレプトマイシンロードＰＭＰ処理溶解ゾーンを比較して、殺菌効果を決定する。
【０４０４】
実施例１３：タンパク質／ペプチドロード植物メッセンジャーパックによる線虫の処理
この実施例は、寄生線虫の適応度を低減させる目的でペプチド構築物をＰＭＰにロードすることを実証する。この実施例は、ＧＦＰをロードしたＰＭＰが、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の消化管に取り込まれることを実証し、またペプチドロードＰＭＰが、多様な処理及び環境条件にわたって安定しており、且つその活性を保持することも実証する。この実施例では、ＧＦＰをモデルペプチドとして使用し、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）をモデル線虫として使用する。
【０４０５】
治療用量：
ＧＦＰをロードしたＰＭＰを、ＰＭＰにロードされた０（非ロードＰＭＰ対照）、１０、１００又は１０００μｇ／ｍｌのＧＦＰタンパク質を送達する濃度まで水に配合した。
【０４０６】
実験プロトコル：
ａ）タンパク質又はペプチドによるグレープフルーツＰＭＰのローディング
ＰＭＰは、実施例１に従ってグレープフルーツ果汁から生成する。緑色蛍光タンパク質は商業的に合成されており、これをＰＢＳに溶解させる。ＰＢＳ中タンパク質を含む溶液にＰＭＰを導入する。タンパク質又はペプチドが不溶性であれば、それが可溶性になるまでｐＨを調節する。タンパク質又はペプチドが、依然として不溶性であれば、不溶性タンパク質又はペプチドを使用する。次に、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２２（３）：５２２−５３４，２０１４からのプロトコルに従って溶液を超音波処理して、エキソソーム中にポレーション及び拡散を誘導する。代わりに、Ｈａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０７：１８−３０，２０１５に従って溶液を脂質エキストルーダに通過させることもできる。代わりに、Ｗａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．４０（１７）：ｅ１３０，２０１２からのプロトコルに従ってＰＭＰをエレクトロポレートし得る。１時間後、ショ糖勾配を用いて、ＰＭＰを精製してから、非結合タンパク質を除去するために、使用前に実施例１に記載のように超遠心分離により洗浄する。ＰＭＰ由来リポソームを実施例３に記載のように特定決定し、実施例４に記載のようにそれらの安定性を試験する。ウエスタンブロット又は蛍光により、ＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。
【０４０７】
ｂ）線虫へのモデルタンパク質の送達
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）野生型Ｎ２ブリストル（Ｂｒｉｓｔｏｌ）株（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）は、線虫増殖培地（ＮＧＭ）寒天プレート（３ｇ／ｌＮａＣｌ、１７ｇ／ｌの寒天、２．５ｇ／ｌのペントン、５ｍｇ／ｌのコレステロール、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）上の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（菌株ＯＰ５０）菌叢上に、Ｌ１からＬ４期まで維持する。
【０４０８】
１日齢Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を新しいプレートに移し、Ｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１０９：２６．３．１−３０  ２０１５に記載の給餌プロトコルに従って０（非ロードＰＭＰ対照）、１０、１００又は１０００ｕｇ／ｍｌのＧＦＰロードＰＭＰを給餌する。次に、緑色蛍光のための蛍光顕微鏡を用いることにより、非ロードＰＭＰ処理及び滅菌水対照と比較して、消化管内のＧＦＰロードＰＭＰ取込みについて蠕虫を検査する。
【０４０９】
実施例１４：超遠心分離及びショ糖勾配精製を用いたブレンド果汁からのＰＭＰ生成
この実施例は、果実をブレンドし、残屑を除去するための連続的遠心分離、粗ＰＭＰをペレット化するための超遠心分離の組合せを用い、さらにはＰＭＰ精製のためのショ糖密度勾配を用いることにより、ＰＭＰを果実から生成することができることを実証する。この実施例では、グレープフルーツをモデル果実として使用した。
【０４１０】
ａ）超遠心分離及びショ糖密度勾配精製によるグレープフルーツＰＭＰの生成
ブレンダ、超遠心分離及びショ糖勾配精製を用いたグレープフルーツＰＭＰ生成のためのワークフローを図１Ａに示す。１個のレッドグレープフルーツを現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から購入し、アルベド、フラベド及びセグメント膜を除去して、砂じょうを収集し、これらを、最大速のブレンダを１０分使用してホモジナイズした。１００ｍＬの果汁をＰＢＳで５倍希釈した後、１０００×ｇで１０分、３０００×ｇで２０分及び１０，０００×ｇで４０分間の遠心分離に付すことにより、大きい残屑を除去した。２８ｍＬの清澄化した果汁を、Ｓ５０−ＳＴ（４×７ｍＬ）スイングバケットロータを用い、４℃において、１５０，０００×ｇのＳｏｒｖａｌｌ（商標）ＭＸ  １２０  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ−Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅで９０分間超遠心分離して、粗ＰＭＰペレットを取得し、これをＰＢＳ  ｐＨ７．４に再懸濁させた。次に、ショ糖勾配をトリス−ＨＣＬ  ｐＨ７．２中に調製し、粗ＰＭＰをショ糖勾配（上から下に：８、１５、３０、４５及び６０％ショ糖）の上部に重ねてから、Ｓ５０−ＳＴ（４×７ｍＬ）スイングバケットロータを用い、４℃、１５０，０００×ｇで１２０分間の超遠心分離によりスピンダウンした。１ｍＬの画分を収集し、ＰＭＰを３０〜４５％界面で単離した。ＰＢＳを用いて、４℃、１５０，０００×ｇで１２０分間の超遠心分離により、画分を洗浄し、ペレットを最小量のＰＢＳに溶解させた。
【０４１１】
ＴＳ−４００カートリッジ（図１Ｂ）を用い、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ  ｎＣＳ１（商標）粒径分析装置を使用して、ＰＭＰ濃度（１×１０９ＰＭＰ／ｍＬ）及びメジアンＰＭＰ粒径（１２１．８ｎｍ）を決定した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｕｌｔｒａを用いてゼータ電位を測定したところ、−１１．５＋／−０．３５７ｍＶであった。
【０４１２】
この実施例は、ショ糖勾配精製法と組み合わせた超遠心分離を用いて、グレープフルーツＰＭＰを単離することができることを実証する。しかし、この方法は、全てのＰＭＰ生成ステップ及び最終ＰＭＰ溶液中においてサンプルの著しいゲル化を誘導した。
【０４１３】
実施例１５：超遠心分離及びショ糖勾配精製を用いたメッシュ圧搾果汁からのＰＭＰ生成
この実施例は、より穏やかな搾汁法（メッシュストレイナ）を使用することによりＰＭＰ生成工程中に細胞壁及び細胞膜混入物を減少させることができることを実証する。この実施例では、グレープフルーツをモデル果実として使用した。
【０４１４】
ａ）穏やかな搾汁により、グレープフルーツＰＭＰからのＰＭＰ生成中のゲル化を低減する
実施例１４に記載の通りにレッドグレープフルーツから砂じょうを単離した。ＰＭＰ生成中のゲル化を低減するために、破壊的ブレンド法を用いるのではなく、茶漉しメッシュに砂じょうを軽く押し付けて、果汁を収集し、細胞壁及び細胞膜混入物を低減した。分画遠心分離後、果汁は、ブレンダの使用後よりも清澄になり、ショ糖密度勾配遠心分離後に３０〜４５％インターセクションで１つの純粋ＰＭＰ含有ショ糖バンドを観察した（図２）。全体としてＰＭＰ生成中及び後のゲル化は少なかった。
【０４１５】
本発明者らのデータは、穏やかな搾汁ステップを使用すると、ブレンドを含む方法に比べ、ＰＭＰ生成中の混入物に起因するゲル化が低減することを証明している。
【０４１６】
実施例１６：超遠心分離及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いたＰＭＰ生成
この実施例は、超遠心分離（ＵＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用による果実からのＰＭＰの生成を記載する。この実施例では、グレープフルーツをモデル果実として使用する。
【０４１７】
ａ）ＵＣ及びＳＥＣを用いたグレープフルーツＰＭＰの生成
実施例１４ａに記載の通りにレッドグレープフルーツから砂じょうを単離し、茶漉しメッシュに軽く押し付けて、２８ｍｌの果汁を収集した。ＵＣ及びＳＥＣを用いるグレープフルーツＰＭＰ生成のワークフローを図３Ａに描く。手短には、果汁を、１０００×ｇで１０分、３０００×ｇで２０分及び１０，０００×ｇで４０分の分画遠心分離に付すことにより、大きい残屑を除去した。２８ｍｌの清澄化した果汁を、Ｓ５０−ＳＴ（４×７ｍＬ）スイングバケットロータを用い、４℃において、１００，０００×ｇのＳｏｒｖａｌｌ（商標）ＭＸ  １２０  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ−Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅで６０分間超遠心分離して、粗ＰＭＰペレットを取得し、これをＭＥＳバッファー（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ＮａＣｌ、ｐＨ６）に再懸濁させた。ペレットをＭＥＳバッファーで２回洗浄した後、最終ペレットを１ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４に再懸濁させた。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出した。製造者により提供される濃度及び粒径標準を用いて、ＰＭＰ粒径及び濃度を決定するために、ＮａｎｏＦＣＭを用いたナノ−フローサイトメトリーによりＳＥＣ溶出画分を分析した。さらに、どの画分にＰＭＰが溶出されているかを識別するために、ＳＥＣ画分について、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を決定した（図３Ｂ〜３Ｄ）。ＰＭＰ含有画分として、ＳＥＣ画分２〜４を識別した。早期及び後期溶出画分の分析から、ＳＥＣ画分３が、主要ＰＭＰ含有画分であることがわかり、濃度は、２．８３×１０１１ＰＭＰ／ｍＬ（全粒子の５７．２％が、５０〜１２０ｎｍ粒度範囲にある）、メジアン径は、８３．６ｎｍ＋／−１４．２ｎｍ（ＳＤ）であった。後期溶出画分８〜１３は、ＮａｎｏＦＣＭにより示される通り、非常に低い濃度の粒子を有したが、これらの画分には、ＢＣＡ分析によりタンパク質混入物が検出された。
【０４１８】
本発明者らのデータは、ＴＦＦ及びＳＥＣを使用して、後期溶出混入物から精製ＰＭＰを単離することができること並びに本実施例で使用した分析方法の組合せにより、後期溶出混入物からＰＭＰ画分を識別することができることを証明している。
【０４１９】
実施例１７：混入物を低減するためにＥＤＴＡ／透析と組み合わせてタンジェンシャルフロー濾過及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いたスケール化ＰＭＰ生成
この実施例は、ペクチン高分子の形成を低減するためのＥＤＴＡインキュベーション及び混入物を低減するための一晩の透析と組み合わせて、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いることによる、果実からのＰＭＰのスケール化生成（ｓｃａｌｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を説明する。この実施例では、グレープフルーツをモデル果実として使用する。
【０４２０】
ａ）ＴＦＦ及びＳＥＣを用いたグレープフルーツＰＭＰの生成
レッドグレープフルーツを現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から購入し、果汁絞り機で１０００ｍｌの果汁を単離した。ＴＦＦ及びＳＥＣを用いたグレープフルーツＰＭＰの生成のためのワークフローを図４Ａに描く。果汁を、１０００×ｇで１０分、３０００×ｇで２０分及び１０，０００×ｇで４０分の分画遠心分離に付すことにより、大きい残屑を除去した。清澄化したグレープフルーツ果汁を、ＴＦＦ（孔径５ｎｍ）を用いて、２ｍＬ（１００×）まで１回濃縮及び洗浄した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＰＭＰ含有画分を溶出した。製造者により提供される濃度及び粒径標準を用いて、ＰＭＰ濃度を決定するために、ＮａｎｏＦＣＭを用いたナノ−フローサイトメトリーによりＳＥＣ溶出画分を分析した。さらに、どの画分にＰＭＰが溶出されているかを識別するために、ＳＥＣ画分について、タンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を決定した。１リットルの果汁（１００倍濃縮）からのスケール化生成では、ＢＣＡアッセイにより後期ＳＥＣ画分中にやはり濃縮された多量の混入物を検出することができる（図４Ｂ、上方パネル）。全体の合計ＰＭＰ収量（図４Ｂ、下方パネル）は、単回グレープフルーツ単離と比較して、スケール化生成の方が低かったが、これは、ＰＭＰの喪失を示し得る。
【０４２１】
ｂ）ＥＤＴＡインキュベーション及び透析による混入物の低減
レッドグレープフルーツを現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から購入し、果汁絞り機を用いて８００ｍｌの果汁を単離した。果汁を、１０００×ｇで１０分、３０００×ｇで２０分及び１０，０００×ｇで４０分の分画遠心分離に付すことにより、大きい残屑を除去した後、１μｍ及び０．４５μｍフィルタで濾過して、大きい粒子を除去した。清澄化したグレープフルーツ果汁を、各々１２５ｍｌの果汁を含有する４つの異なる処理群に分割した。処理群１は、実施例１７ａに記載のように処理し、最終濃度６３×まで濃縮及び洗浄（ＰＢＳ）し、ＳＥＣに付した。ＴＦＦ前に鉄をキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を低減するために、４７５ｍｌの果汁を、最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．１５と一緒にＲＴで１．５ｈｒインキュベートした。その後、果汁を３つの処理群に分け、これらをＰＢＳ（カルシウム／マグネシウムを含まない）ｐＨ７．４、ＭＥＳ  ｐＨ６又はトリスｐＨ８．６洗浄液のいずれかと一緒に最終果汁濃度６３×までＴＦＦ濃縮に付した。次に、３００ｋＤａ膜を用い、同じ洗浄バッファー中で、サンプルを４℃で一晩透析した後、ＳＥＣに付した。２８０ｎｍの吸光度（図４Ｃ）及びＢＣＡタンパク質分析（これは糖及びペクチンの存在に対して感受性である）（図４Ｄ）により示されるように、ＴＦＦ単独の対照の後期溶出画分中の高い混入物ピークと比較して、ＥＤＴＡインキュベーション後に一晩透析すると、混入物を大幅に低減した。使用した透析バッファー（カルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ  ｐＨ７．４、ＭＥＳ  ｐＨ６、トリスｐＨ８．６）に差はなかった。
【０４２２】
本発明者らのデータは、ＥＤＴＡインキュベーション及びそれに続く透析は、同時精製した混入物の量を低減し、スケール化ＰＭＰ生成を促進することを示している。
【０４２３】
実施例１８：ＰＭＰ安定性
この実施例は、ＰＭＰが、様々な環境条件で安定していることを実証する。この実施例では、グレープフルーツ及びレモンＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用する。
【０４２４】
ａ）ＳＥＣと組み合わせてＴＦＦを用いるグレープフルーツＰＭＰの生成
レッドオーガニックグレープフルーツ（Ｆｌｏｒｉｄａ）は、現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。ＰＭＰ生成のワークフローを図５Ａに描く。果汁絞り機を用いて１リットルのグレープフルーツ果汁を収集した後、３０００×ｇで２０分、続いて１０，０００×ｇで４０分遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６を最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７まで添加し、カルシウムをキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を防止するために、溶液を３０分間インキュベートした。続いて、果汁を１１μｍ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）（孔径５ｎｍ）により４００ｍｌ（２．５×）まで濃縮及び洗浄（５００ｍｌのＰＢＳ）した後、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４中で一晩透析して（１回の培地交換を含む）、混入物を除去した。その後、透析した果汁をＴＦＦにより５０ｍｌの最終濃度（２０×）まで濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した（図５Ｂ及び５Ｃ）。ＳＥＣ画分４〜６は、精製ＰＭＰを含有しており（画分８〜１４は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールして、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、合わせた滅菌ＰＭＰ含有画分の最終ＰＭＰ濃度（１．３２×１０１１ＰＭＰ／ｍＬ）及びメジアンＰＭＰ粒径（７１．９ｎｍ＋／−１４．５ｎｍ）を決定した。
【０４２５】
ｂ）ＳＥＣと組み合わせてＴＦＦを用いるレモンＰＭＰの生成
レモンは、現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。果汁絞り機を用いて１リットルのレモン果汁を収集した後、３０００ｇで２０分、続いて１０，０００ｇで４０分遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６を最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７まで添加し、カルシウムをキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を防止するために、溶液を３０分間インキュベートした。続いて、果汁をコーヒーフィルタ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）（孔径５ｎｍ）により４００ｍｌ（２．５×濃縮）まで濃縮した後、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４中で一晩透析して、混入物を除去した。その後、透析した果汁をＴＦＦにより、５０ｍｌの最終濃度（２０×）までさらに濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分及び混入物を含有する後期画分を確認した（図５Ｄ及び５Ｅ）。ＳＥＣ画分４〜６は、精製ＰＭＰを含有しており（画分８〜１４は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールして、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、合わせた滅菌ＰＭＰ含有画分の最終ＰＭＰ濃度（２．７×１０１１ＰＭＰ／ｍＬ）及びメジアンＰＭＰ粒径（７０．７ｎｍ＋／−１５．８ｎｍ）を決定した。
【０４２６】
ｃ）４℃でのグレープフルーツ及びレモンＰＭＰの安定性
実施例１８ａ及び１８ｂに記載のように、グレープフルーツ及びレモンＰＭＰを生成した。ＮａｎｏＦＣＭを用いた、サンプル中の総ＰＭＰの濃度（ＰＭＰ／ｍｌ）の経時的測定により、ＰＭＰの安定性を評価した。安定性試験は、４℃の暗所において４６日間実施した。ＰＭＰのアリコートを４℃で保存し、所定の日にＮａｎｏＦＣＭにより分析した。サンプル中の総ＰＭＰの濃度を分析した（図５Ｈ）。４６日の実験の開始及び終了点の間のレモン及びグレープフルーツＰＭＰの相対測定ＰＭＰ濃度は、それぞれ１１９％及び１０７％であった。本発明者らのデータは、ＰＭＰが４℃で少なくとも４６日間にわたって安定していることを示している。
【０４２７】
ｄ）レモンＰＭＰの凍結融解安定性
ＰＭＰの凍結融解安定性を決定するために、現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）で購入した有機レモンからレモンＰＭＰを生成した。果汁絞り機を用いて１リットルのレモン果汁を収集した後、３０００ｇで２０分、続いて１０，０００ｇで４０分遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６を最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５まで添加し、カルシウムをキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を防止するために、３０分間インキュベートした。続いて、果汁を１１μｍ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により４００ｍｌの最終濃度（２．５×濃縮）まで濃縮すると共に４００ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した後、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４中で一晩透析して、混入物を除去した。その後、透析した果汁をＴＦＦにより、６０ｍｌの最終濃度（約１７×）までさらに濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した。ＳＥＣ画分４〜６は、精製ＰＭＰを含有しており（画分８〜１４は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールして、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用いて、ＮａｎｏＦＣＭにより、合わせた滅菌ＰＭＰ含有画分の最終ＰＭＰ濃度（６．９２×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）を決定した。
【０４２８】
レモンＰＭＰを−２０℃又は−８０℃で１週間凍結し、室温で解凍した後、ＮａｎｏＦＣＭにより濃度を測定した（図５Ｉ）。データは、レモンＰＭＰが、−２０℃又は−８０℃で１週間の保存後、１回の凍結融解サイクル後に安定していることを示している。
【０４２９】
実施例１９：植物細胞培地からのＰＭＰ生成
この実施例は、植物細胞培地からＰＭＰを生成することができることを実証する。この実施例では、ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）細胞株をモデル植物細胞株として使用する。
【０４３０】
ａ）ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ＢＭＳ細胞株ＰＭＰの生成
ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）細胞株をＡＢＲＣから購入し、２４℃で、４．３ｇ／Ｌのムラシゲスクーグ塩基塩混合物（Ｓｉｇｍａ  Ｍ５５２４）、２％ショ糖（Ｓ０３８９，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）、１×ＭＳビタミン溶液（Ｍ３９００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（Ｄ７２９９，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）及び２５０ｕｇ／ＬのチアミンＨＣＬ（Ｖ−０１４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）を含有するムラシゲスクーグ塩基培地ｐＨ５．８中で、攪拌（１１０ｒｐｍ）しながら増殖させ、７日おきに、２０％容積／容積で継代培養した。
【０４３１】
継代から３日後、１６０ｍｌのＢＭＳ細胞を収集し、５００×ｇで５分スピンダウンして、細胞を除去し、続いて１０，０００×ｇでスピンダウンして、大きい残屑を除去した。培地を０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去し、濾過した培地をＴＦＦ（孔径５ｎｍ）により４ｍＬ（４０×）まで濃縮及び洗浄（１００ｍｌ  ＭＥＳバッファー、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣＬ、ｐＨ６）した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した（図６Ａ〜６Ｃ）。ＳＥＣ画分４〜６は、精製ＰＭＰを含有しており（画分９〜１３は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールした。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、合わせたＰＭＰ含有画分の最終ＰＭＰ濃度（２．８４×１０１０ＰＭＰ／ｍｌ）及びメジアンＰＭＰ粒径（６３．２ｎｍ＋／−１２．３ｎｍ  ＳＤ）を決定した。
【０４３２】
これらのデータは、植物液体培地からＰＭＰを単離、精製及び濃縮することができることを示している。
【０４３３】
実施例２０：細菌及び真菌によるＰＭＰの取込み
この実施例は、細菌及び真菌と結合し、且つそれらに取り込まれるＰＭＰの能力を実証する。この実施例では、グレープフルーツ及びレモンＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をモデル病原菌として使用し、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をモデル病原真菌として使用する。
【０４３４】
ａ）ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒによるグレープフルーツ及びレモンの標識
グレープフルーツ及びレモンＰＭＰは、実施例１８ａ及び１８ｂに記載のように生成した。ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃４６４２１）共有結合膜色素（ＤｙＬ８００）でＰＭＰを標識した。手短には、ＤｙＬ８００をＤＭＳＯに最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまで溶解させてから、２００μｌのＰＭＰを５μｌの色素と混合し、室温のシェーカ上で１ｈインキュベートした。４℃、１００，０００×ｇで１ｈｒの超遠心分離により、標識ＰＭＰを２〜３回洗浄した後、ペレットを１．５ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水で再懸濁させた。潜在的な色素凝集体の存在を照査するために、ＰＭＰの代わりに２００μｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水を添加して、同じ手順に従い、色素単独の対照サンプルを調製した。最終ＤｙＬ８００標識ＰＭＰペレット及びＤｙＬ８００色素単独対照を最小量のＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させ、ＮａｎｏＦＣＭにより特性決定した。グレープフルーツＤｙＬ８００標識ＰＭＰの最終濃度は、４．４４×１０１２ＰＭＰ／ｍｌで、メジアンＤｙＬ８００−ＰＭＰ粒径は、７２．６ｎｍ＋／−１４．６ｎｍ（図７Ａ）であり、レモンＤｙＬ８００標識ＰＭＰの最終濃度は、５．１８×１０１２ＰＭＰ／ｍｌで、平均ＤｙＬ８００−ＰＭＰ粒径は、６８．５ｎｍ＋／−１４ｎｍ（図７Ｂ）であった。
【０４３５】
ｂ．酵母によるＤｙＬ８００標識グレープフルーツ及びレモンＰＭＰの取込み
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡＴＣＣ、＃９７６３）を酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）上で増殖させ、３０℃で維持した。酵母によりＰＭＰが取り込まれ得るか否かを決定するために、新鮮な５ｍｌの酵母培養物を３０℃で一晩増殖させ、細胞を１５００×ｇで５分ペレット化した後、１０ｍｌの水に再懸濁させた。酵母細胞を１０ｍｌの水で１回洗浄し、１０ｍｌの水に再懸濁させ、振盪しながら３０℃で２ｈインキュベートすることにより、細胞を栄養飢餓にした。次に、９５ｕｌの酵母細胞を５ｕｌの水（陰性対照）、ＤｙＬ８００色素単独対照（色素凝集体対照）又はＤｙＬ８００−ＰＭＰのいずれかと、１．５ｍｌチューブ内に最終濃度５×１０１０ＤｙＬ８００−ＰＭＰ／ｍｌまで混合した。サンプルを振盪しながら３０℃で２ｈインキュベートした。次に、処理した細胞を１ｍｌの洗浄バッファー（０．５％トリトンＸ−１００を補充した水）で洗浄し、５分インキュベートした後、１５００×ｇで５分スピンダウンした。上清を除去し、酵母細胞をさらに３回洗浄して、細胞により取り込まれていないＰＭＰを除去し、最後に水でデタージェントを除去した。酵母細胞を１００ｕｌの水に再懸濁させ、透明底の９６ウェルプレートに移し、８００ｎｍ励起での相対蛍光強度（Ａ．Ｕ．）をＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）で測定した。
【０４３６】
酵母によるＤｙＬ８００−ＰＭＰ取込みを評価するために、サンプルをＤｙＬ８００色素単独対照に対して正規化し、グレープフルーツ及びレモンＤｙＬ８００−ＰＭＰ相対蛍光強度を比較した。本発明者らのデータは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がＰＭＰを取り込むことを示し、レモン及びグレープフルーツＤｙＬ８００−ＰＭＰの間に取込みの差は見られなかった（図７Ｃ）。
【０４３７】
ｃ）細菌によるＤｙＬ８００標識グレープフルーツ及びレモンＰＭＰの取込み
細菌及び酵母株を供給者の指示の通りに維持した：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｅｃ、ＡＴＣＣ、＃２５９２２）は、３７℃においてトリプチケースソイ寒天培地／ブロス上で増殖させ、及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｐａ，ＡＴＣＣ）は、３７℃において５０ｍｇ／ｍｌのリファンピシンを含むトリプチックソイ寒天培地／ブロス上で増殖させた。
【０４３８】
細菌によってＰＭＰが取り込まれ得るか否かを決定するために、新鮮な５ｍｌの細菌培養物を一晩で増殖させ、細胞を３０００×ｇで５分ペレット化した後、５ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に再懸濁させ、５ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で１回洗浄してから、５ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に再懸濁させた。インキュベータを約２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃（Ｅｃ）又は３０℃（Ｐａ）で２ｈインキュベートすることにより、細胞を栄養飢餓にした。ＯＣ６００を測定して、細胞密度を約１０×１０９ＣＦＵ／ｍｌに調節した。次に、９５ｕｌの細菌細胞を５ｕｌの水（陰性対照）、ＤｙＬ８００色素単独対照（色素凝集体対照）又はＤｙＬ８００−ＰＭＰのいずれかと、１．５ｍｌチューブ内に最終濃度５×１０１０ＤｙＬ８００−ＰＭＰ／ｍｌにおいて混合した。サンプルを振盪しながら３０℃で２ｈインキュベートした。次に、処理した細胞を１ｍｌの洗浄バッファー（０．５％トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で洗浄し、５分インキュベートした後、３０００×ｇで５分スピンダウンした。上清を除去し、酵母細胞をさらに３回洗浄して、細胞により取り込まれていないＰＭＰを除去し、１ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２でもう１回デタージェントを除去した。細菌細胞を１００ｕｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に再懸濁させ、透明底の９６ウェルプレートに移し、８００ｎｍ励起での相対蛍光強度（Ａ．Ｕ．）をＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）で測定した。
【０４３９】
細菌によるＤｙＬ８００−ＰＭＰ取込みを評価するために、サンプルをＤｙＬ８００色素単独対照に対して正規化し、グレープフルーツ及びレモンＤｙＬ８００−ＰＭＰ相対蛍光強度を比較した。本発明者らのデータは、試験した全ての細菌種がＰＭＰを取り込むことを示す（図７Ｃ）。一般に、レモンＰＭＰが優先的に取り込まれた（グレープフルーツＰＭＰより高いシグナル強度）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が、最も高いＤｙＬ８００−ＰＭＰ取込みを示した。
【０４４０】
実施例２１：昆虫細胞によるＰＭＰ取込み
この実施例は、昆虫細胞と結合し、それによって取り込まれるＰＭＰの能力を実証する。この実施例では、ｓｆ９ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（昆虫）細胞及びＳ２キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（昆虫）細胞株をモデル昆虫細胞として使用し、レモンＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用する。
【０４４１】
ａ）レモンＰＭＰの生成
現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）からレモンを取得した。果汁絞り機を用いてレモン果汁（３．３Ｌ）を収集した後、ＮａＯＨでｐＨをｐＨ４に調節し、０．５Ｕ／ｍｌのペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ，１７３８９）と一緒にインキュベートして、ペクチン混入物を除去した。攪拌しながら、果汁を室温で１時間インキュベートし、４℃で一晩保存した後、３０００ｇで２０分、続いて１０，０００ｇで４０分遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、カルシウムをキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を防止するために、処理果汁を、最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５まで５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６と一緒に室温で３０分インキュベートした。続いて、ＥＤＴＡ処理果汁を１１μｍ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁を洗浄し（ＴＦＦ工程中、３００ｍｌのＰＢＳ）、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により総体積１３５０ｍｌまで２×濃縮した後、３００ｋＤａ透析膜を用いて一晩透析した。続いて、透析した果汁をさらに洗浄し（ＴＦＦ工程中、５００ｍｌのＰＭＳ）、ＴＦＦにより、１６０ｍｌの最終濃度（約２０×）まで濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））を分析して、混入物を含有する後期溶出画分からのＰＭＰ含有画分を決定する。精製ＰＭＰを含有するＳＥＣ画分４〜７を一緒にプールして、０．８５μｍ、０．４μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌し、４０，０００×ｇで１．５ｈｒにわたりＰＭＰをペレット化することによりさらに濃縮し、最後にペレットをＵｌｔｒａｐｕｒｅ水に再懸濁させる。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用いて、ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により、最終ＰＭＰ濃度（１．５３×１０１３ＰＭＰ／ｍｌ）及びメジアンＰＭＰ粒径（７２．４ｎｍ＋／−１９．８ｎｍ  ＳＤ）（図８Ａ）を決定し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によりＰＭＰタンパク質濃度（１２．３１７ｍｇ／ｍｌ）を決定した。
【０４４２】
ｂ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ＮＨＳ  ＥｓｔｅｒによるレモンＰＭＰの標識
レモンＰＭＰをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、共有結合膜色素（ＡＦ４８８）で標識した。手短には、ＡＦ４８８を最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまでＤＭＳＯに溶解させ、２００μｌのＰＭＰ（１．５３×１０１３ＰＭＰ／ｍｌ）を５μｌの色素と混合し、室温において、シェーカ上で１ｈインキュベートした後、４℃で１ｈｒの１００，０００×ｇの超遠心分離により、標識ＰＭＰを２〜３回洗浄した後、ペレットを１．５ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させた。潜在的な色素凝集体の存在を照査するために、ＰＭＰの代わりに２００ｕｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水を添加して、同じ手順に従い、色素単独の対照サンプルを調製した。最終ＡＦ４８８標識ＰＭＰペレット及びＡＦ４８８色素単独対照を最小量のＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させ、ＮａｎｏＦＣＭにより特性決定した。ＡＦ４８８標識ＰＭＰの最終濃度は、１．３３×１０１３ＰＭＰ／ｍｌで、メジアンＡＦ４８８−ＰＭＰ粒径は、７２．１ｎｍ＋／−１５．９ｎｍ  ＳＤであり、９９％の標識効率が達成された（図８Ｂ）。
【０４４３】
ｃ）レモンＡＦ４８８−ＰＭＰによる昆虫細胞の処理
実施例２１ａ及び２１ｂに記載のように、レモンＰＭＰを生成及び標識した。ｓｆ９ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（＃Ｂ８２５０１）から取得し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したＴＮＭ−ＦＨ昆虫培地（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ１０３２）に維持した。Ｓ２キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞株は、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−１９６３）から取得し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したシュナイダー昆虫培地（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｄｉｕｍ）に維持した。両細胞株を２６℃で増殖させた。ＰＭＰ処理のために、２ｍｌの完全培地の入った２４ウェルプレート内の滅菌０．０１％ポリ−ｌ−リシン塗布ガラスカバースリップ上にＳ２／Ｓｆ９細胞を５０％密集において接種し、一晩かけてカバースリップに接着させた。次に、１０ｕｌのＡＦ４８８色素単独（色素凝集物対照）、レモンＰＭＰ（ＰＭＰ単独対照）又はＡＦ４８８−ＰＭＰを添加することにより細胞を処理して、サンプルを２回反復して調製し、これらを２６℃で２ｈインキュベートした。最終濃度は、１ウェル当たり１．３３×１０１１ＰＭＰ／ＡＦ４８８−ＰＭＰであった。次に、細胞を１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで１５分固定した。続いて、細胞をＰＢＳ＋０．０２％トリトンＸ−１００で１５分間透過処理した後、核を１：１０００  ＤＡＰＩ溶液で３０分染色した。細胞をＰＢＳで１回洗浄してから、光退色を低減するために、カバースリップをＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にスライドガラスに載せた。樹脂を一晩配置し、１００×対物レンズを用いるＯｌｙｍｐｕｓ落射蛍光顕微鏡で細胞を検査し、０．２５ｕｍインクリメントで１０ｕｍのＺ−ｓｔａｃｋイメージを撮影した。Ｓ２キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）及びＳ９Ｌ．フルギペルダ（Ｌ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の双方について類似の結果が得られた。ＡＦ４８８色素単独対照及びＰＭＰ単独対照には緑色蛍光輝点は観察されなかったが、ＡＦ４８８−ＰＭＰで処理した昆虫細胞のほぼ全てが、昆虫細胞内に緑色蛍光輝点を示した。エンドソームコンパートメント上に複数の明るく、より大きい輝点の徴候を有する細胞質に強いシグナルがあった。４８８チャネル内のＤＡＰＩの漏れ込み（ｂｌｅｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）のために、核内のＡＦ４８８−ＰＭＰの存在を評価することは不可能であった。ｓｆ９細胞の場合、試験細胞の９４．４％（ｎ＝３８）が緑色蛍光輝点を示したが、これは、対照サンプルであるＡＦ４８８色素単独（ｎ＝６８）又はＰＭＰ単独（ｎ＝４２）対照には観察されなかった。
【０４４４】
本発明者らのデータは、ＰＭＰが、昆虫細胞膜と結合することができ、且つ昆虫細胞により効率的に取り込まれ得ることを示している。
【０４４５】
実施例２２：小分子によるＰＭＰのローディング
この実施例は、様々なＰＭＰ供給源及び封入方法を用いて、薬剤を送達する目的でモデル小分子をＰＭＰにロードすることを実証する。この実施例では、ドキソルビシンをモデル小分子として使用し、レモン及びグレープフルーツＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用する。
【０４４６】
本発明者らは、ドキソルビシンをＰＭＰに効率的にロードすることができること及びロードＰＭＰが４℃で少なくとも８週間にわたって安定していることを証明する。
【０４４７】
ａ）ＳＥＣと組み合わせてＴＦＦを用いるグレープフルーツＰＭＰの生成
ホワイトグレープフルーツ（Ｆｌｏｒｉｄａ）は、現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。果汁絞り機を用いて１リットルのグレープフルーツ果汁を収集した後、３０００×ｇで２０分、続いて１０，０００×ｇで４０分遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６を最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７まで添加し、カルシウムをキレート化すると共に、ペクチン高分子の形成を防止するために、３０分間インキュベートした。続いて、果汁をコーヒーフィルタ並びに１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ、孔径５ｎｍ）により４００ｍｌまで濃縮した後、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４中で一晩透析して、混入物を除去した。その後、透析した果汁をＴＦＦにより、５０ｍｌの最終濃度（２０×）までさらに濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍ吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した（図９Ａ）。精製ＰＭＰを含有するＳＥＣ画分４〜６を一緒にプールして、１．５ｈｒの４０，００００×ｇでＰＭＰをペレット化し、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水にペレットを再懸濁させることによりさらに濃縮した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用いて、ＮａｎｏＦＣＭにより、最終ＰＭＰ濃度（６．３４×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）及びメジアンＰＭＰ粒径（６３．７ｎｍ＋／−１１．５ｎｍ（ＳＤ））を決定した（図９Ｂ及び９Ｃ）。
【０４４８】
ｂ）ＳＥＣと組み合わせてＴＦＦを用いるレモンＰＭＰの生成
レモンは、現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。果汁絞り機を用いて１リットルのレモン果汁を収集した後、３０００ｇで２０分、続いて１０，０００ｇで４０分遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６を最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７まで添加し、カルシウムをキレート化し、ペクチン高分子の形成を防止するために、３０分間インキュベートした。続いて、果汁をコーヒーフィルタ、１ｕｍ及び０．４５ｕｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ、孔径５ｎｍ）により４００ｍｌまで濃縮した後、３００ｋＤａ透析膜を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４中で一晩透析して、混入物を除去した。その後、透析した果汁をＴＦＦにより、５０ｍｌの最終濃度（２０×）までさらに濃縮した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した（図９Ｄ）。精製ＰＭＰを含有するＳＥＣ画分４〜６を一緒にプールして、４０，００００×ｇでＰＭＰを１．５ｈｒペレット化し、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水にペレットを再懸濁させることによりさらに濃縮した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用いて、ＮａｎｏＦＣＭにより、最終ＰＭＰ濃度（７．４２×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）及びメジアンＰＭＰ粒径（６８ｎｍ＋／−１７．５ｎｍ（ＳＤ））を決定した（図９Ｅ及び９Ｆ）。
【０４４９】
ｃ）レモン及びグレープフルーツＰＭＰへのドキソルビシンのパッシブローディング
ドキソルビシン（ＤＯＸ）をロードするために、グレープフルーツ（実施例２２ａ）及びレモン（実施例２２ｂ）ＰＭＰを使用した。ドキソルビシン（ＤＯＸ，Ｓｉｇｍａ  ＰＨＲ１７８９）のストック溶液を、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１０９７７０２３）中１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、濾過滅菌（０．２２μｍ）した後、４℃で保存した。０．５ｍＬのＰＭＰを０．２５ｍＬのＤＯＸ溶液と混合した。混合物中の最終ＤＯＸ濃度は、３．３ｍｇ／ｍＬであった。グレープフルーツ（ＧＦ）ＰＭＰの初期粒子濃度は、９．８×１０１２ＰＭＰ／ｍＬであり、レモン（ＬＭ）ＰＭＰについて１．８×１０１３ＰＭＰ／ｍＬであった。暗所において、混合物を２５℃、１００ｒｐｍで４時間攪拌した。次に、混合物をＵｌｔｒａｐｕｒｅ水で３．３倍希釈し（混合物中のＤＯＸの最終濃度は１ｍｇ／ｍｌ）、２つの等量部分（パッシブローディングのための１．２５ｍＬと、アクティブローディングのための１．２５ｍＬ）に分割した（実施例２２ｄ）。両方のサンプルを暗所において、２５℃、１００ｒｐｍでさらに２３ｈインキュベートした。ステップは全て、滅菌条件下で実施した。
【０４５０】
ＤＯＸのパッシブローディングのために、非ロード又は結合の弱いＤＯＸを除去するためにサンプルを超遠心分離により精製した。混合物を６つの等量部分（各々２００ｕＬ）に分割し、滅菌水（１．３ｍＬ）を添加した。１．５ｍＬ超遠心機用チューブ内でサンプルをスピンダウン（４０，０００×ｇ、１．５ｈ、４℃）した。ＰＭＰ−ＤＯＸペレットを滅菌水に再懸濁させてから、２回スピンダウンした。サンプルを４℃で３日間維持した。使用前に、ＤＯＸロードＰＭＰを超遠心分離（４０，０００×ｇ、１．５ｈ、４℃）によりもう１回洗浄した。最終ペレットを滅菌ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させた後、後の使用まで４℃で保存した。ＰＭＰ中のＤＯＸの濃度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５５０ｎｍ）により決定し、粒子の総数の濃度は、ナノフローサイトメトリー（ＮａｎｏＦＣＭ）により決定した。
【０４５１】
ｄ）レモン及びグレープフルーツＰＭＰへのドキソルビシンのアクティブローディング
ドキソルビシン（ＤＯＸ）のローディングのために、グレープフルーツ（実施例２２ａ）及びレモン（実施例２２ｂ）ＰＭＰを使用した。ドキソルビシン（ＤＯＸ，Ｓｉｇｍａ  ＰＨＲ１７８９）のストック溶液を、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１０９７７０２３）中１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、滅菌（０．２２ｕｍ）した後、４℃で保存した。０．５ｍＬのＰＭＰを０．２５ｍＬのＤＯＸ溶液と混合した。混合物中の最終ＤＯＸ濃度は、３．３ｍｇ／ｍＬであった。グレープフルーツ（ＧＦ）ＰＭＰの初期粒子濃度は、９．８×１０１２ＰＭＰ／ｍＬであり、レモン（ＬＭ）ＰＭＰについて１．８×１０１３ＰＭＰ／ｍＬであった。暗所において、混合物を２５℃、１００ｒｐｍで４時間攪拌した。次に、混合物をＵｌｔｒａｐｕｒｅ水で３．３倍希釈し（混合物中のＤＯＸの最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであった）、２つの等量部分（パッシブローディング（実施例２２ｃ）のための１．２５ｍＬと、アクティブローディングのための１．２５ｍＬ）に分割した。両方のサンプルを暗所において、２５℃、１００ｒｐｍでさらに２３ｈインキュベートした。全てのステップを滅菌条件下で実施した。
【０４５２】
２５℃で１日のインキュベーション後、混合物を４℃で４日間維持した。次に、混合物を４２℃の超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎ  ２８００）で３０分超音波処理し、ボルテックスした後、もう１回２０分超音波処理した。次に、混合物を滅菌水で２倍に希釈し、Ａｖａｎｔｉ  Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて押し出した。脂質二重層の数及び全体の粒径を低減するために、漸減方式：グレープフルーツ（ＧＦ）ＰＭＰの場合、８００ｎｍ、４００ｎｍ及び２００ｎｍ；及びレモン（ＬＭ）ＰＭＰの場合、８００ｎｍ、４００ｎｍで、ＤＯＸロードＰＭＰを押し出した。非ロード又は結合の弱いＤＯＸを除去するために、サンプルを超遠心分離アプローチにより洗浄した。具体的には、サンプル（１．５ｍＬ）を滅菌ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水（計６．５ｍＬ）で希釈し、７ｍＬ超遠心機用チューブにおいて、４℃、４０，０００×ｇで１ｈ、２回スピンダウンした。最終ペレットを滅菌ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させた後、後の使用まで４℃で保存した。
【０４５３】
ｅ）パッシブ及びアクティブローディングにより調製されたＤＯＸロードＰＭＰのロード能力の決定
ＰＭＰにおけるＤＯＸのロード能力を評価するために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計を用いた蛍光強度測定（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５５０ｎｍ）により、ＤＯＸ濃度を評価した。０〜８３．３ｕｇ／ｍＬの遊離ＤＯＸの較正曲線を使用した。ＤＯＸロードＰＭＰ及びＤＯＸ複合体（π−πスタッキング）を解離するために、蛍光測定前に、サンプル及び標準を１％ＳＤＳと一緒に３７℃で３０分間インキュベートした。ロード能力（１０００粒子当たりのｐｇ  ＤＯＸ）は、ＤＯＸの濃度（ｐｇ／ｍＬ）をＰＭＰの総濃度（ＰＭＰ／ｍＬ）で割った商として計算した（図９Ｇ）。パッシブロードされたＰＭＰのロード能力は、１０００ＰＭＰについて０．５５ｐｇ  ＤＯＸ（ＧＦ  ＰＭＰ−ＤＯＸ）及び０．２５ｐｇ  ＤＯＸ（ＬＭ  ＰＭＰ−ＤＯＸ）であった。アクティブロードされたＰＭＰのロード能力は、１０００ＰＭＰにつき、０．２３ｐｇ  ＤＯＸ（ＧＦ  ＰＭＰ−ＤＯＸ）及び０．２７ｐｇ  ＤＯＸ（ＬＭ  ＰＭＰ−ＤＯＸ）であった。
【０４５４】
ｆ）ドキソルビシンロードグレープフルーツ及びレモンＰＭＰの安定性
ＤＯＸロードＰＭＰの安定性は、ＮａｎｏＦＣＭを用いて、サンプル中の総ＰＭＰの濃度（ＰＭＰ／ｍｌ）の経時的測定により評価した。安定性試験を４℃の暗所で８週間実施した。ＰＭＰ−ＤＯＸのアリコートを４℃で保存し、所定の日にＮａｎｏＦＣＭにより分析した。ＰＭＰ−ＤＯＸの粒径は、有意に変化しなかった。従って、パッシブロードＧＦ  ＰＭＰの場合、平均粒径の範囲は、２ヶ月にわたって７０〜８０ｎｍであった。サンプル中の総ＰＭＰの濃度を分析した（図９Ｈ）。パッシブロードＧＦ  ＰＭＰの濃度範囲は、４℃で８週間にわたり、２．０６×１０１１〜３．０６×１０１１ＰＭＰ／ｍｌであり、アクティブロードＧＦ  ＰＭＰについて５．５５×１０１１〜９．９７×１０１１ＰＭＰ／ｍｌであり、パッシブロードＬＭ  ＰＭＰについて８．５２×１０１１〜１．７６×１０１２ＰＭＰ／ｍｌであった。本発明者らのデータは、ＤＯＸロードＰＭＰが、４℃で８週間にわたって安定していることを示す。
【０４５５】
実施例２３：小分子ロードＰＭＰによる細菌及び真菌の処理
この実施例は、病原菌及び病原真菌の適応度を低減させる目的で小分子をロードし得るＰＭＰの能力を実証する。この実施例では、グレープフルーツＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をモデル病原菌として使用し、酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をモデル病原真菌として使用し、ドキソルビシンをモデル小分子として使用する。ドキソルビシンは、ストレプトマイセス・ペウセティウスｖａｒ．カエシウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ  ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ）の培養物から単離した細胞傷害性アントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンは、インターカレーションによりＤＮＡと相互作用し、ＤＮＡ複製及びＲＮＡ転写の両方を阻害する。ドキソルビシンは、抗生物質活性を有することが明らかにされている（Ｗｅｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１９（１０）：１２５５−１２６４，２０１２）。
【０４５６】
ａ）ＳＥＣと組み合わせてＴＦＦを用いるグレープフルーツＰＭＰの生成
レッドオーガニックグレープフルーツは、現地のＷｈｏｌｅ  Ｆｏｏｄｓ  Ｍａｒｋｅｔ（登録商標）から取得した。ＰＭＰ生成のワークフローの概要を図１０Ａに記載する。果汁絞り機を用いて４リットルのグレープフルーツ果汁を収集し、ＮａＯＨでｐＨ４にｐＨ調節し、１Ｕ／ｍｌのペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ，１７３８９）と一緒にインキュベートして、ペクチン混入物を除去した後、３，０００ｇで２０分、続いて１０，０００ｇで４０分遠心分離することにより、大きい残屑を除去した。次に、カルシウムをキレート化し、ペクチン高分子の形成を防止するために、処理した果汁を５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６（最終濃度５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７まで）と一緒に３０分間インキュベートした。続いて、ＥＤＴＡ処理した果汁を１１μｍ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁を、３００ｋＤａ  ＴＦＦを用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により洗浄及び濃縮した。果汁を５×濃縮した後、ＰＢＳを用いた６容量交換洗浄を実施し、最終濃度１９８ｍＬ（２０×）までさらに濾過した。次に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＭＰ含有画分を溶出し、これを、２８０ｎｍでの吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  ａｓｓａｙ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により分析して、ＰＭＰ含有画分と、混入物を含有する後期画分を確認した（図１０Ｂ及び１０Ｃ）。ＳＥＣ画分３〜７は、精製ＰＭＰを含有しており（画分９〜１２は、混入物を含有した）、これらを一緒にプールして、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを用いた連続濾過により濾過滅菌した後、ＰＭＰを４０，０００×ｇで１．５ｈｒにわたってペレット化し、４ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１０９７７０２３）にペレットを再懸濁させることにより、さらに濃縮した。製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用い、ＮａｎｏＦＣＭにより、最終ＰＭＰ濃度（７．５６×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）及び平均ＰＭＰ粒径（７０．３ｎｍ＋／−１２．４ｎｍ  ＳＤ）を決定した（図１０Ｄ及び１０Ｅ）。生成されたグレープフルーツＰＭＰは、ドキソルビシンをロードするために使用した。
【０４５７】
ｂ）グレープフルーツＰＭＰへのドキソルビシンのローディング
実施例２３ａで生成したグレープフルーツＰＭＰをドキソルビシン（ＤＯＸ）のローディングに使用した。ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ  ＰＨＲ１７８９）のストック溶液を、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水中１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、濾過滅菌（０．２２μｍ）した。滅菌グレープフルーツＰＭＰ（粒子濃度７．５６×１０１２ＰＭＰ／ｍｌで３ｍＬ）を１．２９ｍＬのＤＯＸ溶液と混合した。混合物中の最終ＤＯＸ濃度は、３ｍｇ／ｍＬであった。４０℃まで昇温させながら、混合物を超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎ  ２８００）で２０分超音波処理した後、超音波のない浴中でさらに１５分維持した。暗所において混合物を２４℃、１００ｒｐｍで４時間攪拌した。次に、混合物を、Ａｖａｎｔｉ  Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて押し出した。脂質二重層の数及び全体の粒径を低減するために、漸減方式：８００ｎｍ、４００ｎｍ及び２００ｎｍで、ＤＯＸロードＰＭＰを押し出した。押し出したサンプルを、ＴＣフード内において、０．８μｍ及び０．４５μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、直径１３ｍｍ）に順次通過させることにより、濾過滅菌した。非ロード又は結合の弱いＤＯＸを除去するために、超遠心分離アプローチを用いて、サンプルを精製した。具体的には、１．５ｍＬ超遠心機用チューブにおいて、１００，０００×ｇ、４℃で１ｈスピンダウンした。上清をさらなる分析のために収集し、４℃で保存した。ペレットを滅菌水に再懸濁させ、同じ条件下で超遠心分離させた。このステップを４回繰り返した。最終ペレットを滅菌ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水に再懸濁させた後、次の使用まで４℃で保存した。
【０４５８】
次に、粒子の濃度及びＰＭＰのロード能力を決定した。ＮａｎｏＦＣＭを用いて、サンプル中のＰＭＰの総数（４．７６×１０１２ＰＭＰ／ｍｌ）及びメジアン粒径（７２．８ｎｍ＋／−２１ｎｍ  ＳＤ）を決定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計を用いた蛍光強度測定（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５５０ｎｍ）により、ＤＯＸ濃度を評価した。０〜５０ｕｇ／ｍＬの遊離ＤＯＸの較正曲線を滅菌水中で作製した。ＤＯＸロードＰＭＰ及びＤＯＸ複合体（π−πスタッキング）を解離するために、蛍光測定前に、サンプル及び標準を１％ＳＤＳと一緒に３７℃で４５分間インキュベートした。ロード能力（１０００粒子当たりのｐｇ  ＤＯＸ）は、ＤＯＸの濃度（ｐｇ／ｍｌ）をＰＭＰの総数（ＰＭＰ／ｍｌ）で割った商として計算した。ＰＭＰ−ＤＯＸロード能力は、１０００ＰＭＰにつき１．２ｐｇ  ＤＯＸであった。しかし、ロード効率（ＰＭＰの総数に対するＤＯＸロードＰＭＰの％）は、ＤＯＸ蛍光スペクトルをＮａｎｏＦＣＭで検出することができなかったため、評価できなかったことに留意すべきである。
【０４５９】
本発明者らの結果は、ＰＭＰが、小分子を効率的にロードすることができることを示している。
【０４６０】
ｃ）ＤｏｘロードグレープフルーツＰＭＰによる細菌及び酵母の処理
ＰＭＰが、細胞傷害性薬剤を送達することができることを立証するために、いくつかの微生物種を実施例２３ｂからのドキソルビシンロードグレープフルーツＰＭＰ（ＰＭＰ−ＤＯＸ）で処理した。
【０４６１】
供給者により指示される通りに、細菌及び酵母株を維持した：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ、＃２５９２２）は、３７℃においてトリプチケースソイ寒天培地／ブロス上で増殖させ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ）は、３７℃において５０ｍｇ／ｍｌのリファンピシンを含むトリプチックソイ寒天培地／ブロス上で増殖させ、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡＴＣＣ、＃９７６３）は、酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）上で増殖させ、３０℃で維持した。処理前に新鮮な１日培養物を一晩増殖させ、使用前の培地でＯＤ（６００ｎｍ）を０．１ＯＤに調節し、細菌／酵母を処理のための９６ウェルプレートに移した（サンプルを２回反復して調製、１００μｌ／ウェル）。細菌／酵母を０（陰性対照）、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭの有効ＤＯＸ濃度までのＵｌｔｒａｐｕｒｅ水中の５０μｌのＰＭＰ−ＤＯＸ溶液（１ウェル当たりの最終体積は、１５０μｌであった）で処理した。プレートをアルミニウムホイルで被覆し、３７℃（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））又は３０℃（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））でインキュベートし、２２０ｒｐｍで攪拌した。
【０４６２】
６００ｎｍでのキネティック吸光度測定をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計で実施して、ｔ＝０ｈ、ｔ＝２ｈ、ｔ＝３ｈ、ｔ＝４．５ｈ、ｔ＝１６ｈ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））又はｔ＝０．５ｈ、ｔ＝１．５ｈ、ｔ＝２．５ｈ、ｔ＝３．５ｈ、ｔ＝４ｈ、ｔ＝１６ｈ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））において培養物のＯＤをモニターした。ドキソルビシンは、高ＤＯＸ濃度で６００ｎｍ吸光度に一部が漏れ込む（ｂｌｅｅｄ  ｉｎｔｏ）広域蛍光スペクトルを有することから、処理用量毎の全てのＯＤ値をまず、その用量の最初の時点（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）についてｔ＝０、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）についてｔ＝０．５）のＯＤに対して正規化した。各処理群内において、様々な細菌及び酵母株に対するＰＭＰ−ＤＯＸ処理の細胞傷害作用を比較するために、非処置対照（１００％に設定）と比較して、相対ＯＤを決定した。試験した全ての微生物種は、変動する程度の、ＰＭＰ−ＤＯＸにより誘導される細胞傷害性を示し（図１０Ｆ〜１０Ｉ）、これは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を除き、用量依存性であった。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ＰＭＰ−ＤＯＸに対して最も感受性が高く、処理から２．５ｈｒ後に細胞傷害性応答を示し、処理から１６時間後には、試験した最も低い有効用量（５ｕＭ）でＩＣ５０に達し、これは、このシリーズで試験した他の全ての微生物に対し１０倍超感受性が高い。処理から３時間後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、１００μＭについてのみＩＣ５０に達した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、ＰＭＰ−ＤＯＸに対して最も感受性が低く、５０及び１００μＭの有効ＤＯＸ用量で３７％の最大増殖低減を示した。本発明者らは、遊離ドキソルビシンも試験し、同じ用量を用いて、細胞傷害性は、ＰＭＰ−ＤＯＸ送達よりも早期に誘導されることを見出した。これは、小さいドキソルビシン分子が、脂質膜ＰＭＰと比較して、単細胞生物中に容易に拡散することを示しており、脂質膜ＰＭＰは、そのカーゴを放出するために、微生物の細胞壁を通過して、原形質膜と直接結合するか、又は細胞内取込み後にエンドソーム膜を介して、標的細胞膜と融合する必要がある。
【０４６３】
本発明者らのデータは、小分子をロードしたＰＭＰが、多様な細菌及び酵母の適応度にマイナスの影響を与え得ることを示している。
【０４６４】
実施例２４：タンパク質ロードＰＭＰによる微生物の処理
この実施例は、ＰＭＰにタンパク質を外因的にロードすることができ、ＰＭＰが、そのカーゴを分解から保護すると共に、ＰＭＰが、その機能性カーゴを生物に送達することができることを実証する。この実施例では、グレープフルーツＰＭＰをモデルＰＭＰとして使用し、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細菌をモデル生物として使用し、ルシフェラーゼタンパク質をモデルタンパク質として使用する。
【０４６５】
タンパク質及びペプチドベースの薬剤は、抵抗性であるか、又は処理しにくい多様な病原菌及び病原真菌の適応度に影響を与える大きい可能性を有するが、そうした薬剤の不安定性及び製剤化の課題のために、それらの普及は成功していない。
【０４６６】
ａ）グレープフルーツＰＭＰへのルシフェラーゼタンパク質のローディング
グレープフルーツＰＭＰは、実施例１０ａに記載したように生成した。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）タンパク質は、ＬＳＢｉｏ（ｃａｔ．ｎｏ．ＬＳ−Ｇ５５３３−１５０）から購入し、最終濃度３００μｇ／ｍＬまでＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解させた。濾過滅菌したＰＭＰに、Ｒａｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｓｉｒｉａｎｎｉ  ａｎｄ  Ｂａｈａｒｅｈ  Ｂｅｈｋａｍ（ｅｄｓ．），Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８３１から改変したプロトコルを用いて、エレクトロポレーションによりルシフェラーゼタンパク質をロードした。ＰＭＰ単独（ＰＭＰ対照）、ルシフェラーゼタンパク質単独（タンパク質対照）又はＰＭＰ＋ルシフェラーゼタンパク質（タンパク質ロードＰＭＰ）を４．８×エレクトロポレーションバッファー（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ水中１００％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ１５５６））と混合して、反応混合物中で最終２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ濃度を得た（表３を参照されたい）。最終ＰＭＰ−Ｌｕｃペレットは水で希釈したため、Ｏｐｔｉｐｒｅｐの代わりにＵｌｔｒａＰｕｒｅ水とルシフェラーゼタンパク質を混合することにより、タンパク質対照を調製した（タンパク質対照）。サンプルを冷却キュベット内に移し、０．４００ｋＶ、１２５μＦ（０．１２５ｍＦ）、Ｂｉｏｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（登録商標）を用いて２つのパルス（４〜１０ｍｓ）を有する抵抗低１００Ω〜高６００Ωで、エレクトロポレートした。反応物を氷上に１０分配置し、予め氷冷した１．５ｍｌ超遠心機用チューブに移した。ＰＭＰを含有する全てのサンプルを、１．４ｍｌの超純水の添加により３回洗浄した後、超遠心分離（４℃、１００，０００×ｇで１．５ｈ）を実施した。最終ペレットを最小量のＵｌｔｒａＰｕｒｅ水（５０μＬ）に再懸濁させ、使用まで４℃で維持した。エレクトロポレーション後、ルシフェラーゼタンパク質のみを含むサンプルは遠心分離により洗浄せずに、使用まで４℃で保存した。
【０４６７】
ＰＭＰロード能力を決定するために、１マイクロリットルのルシフェラーゼロードＰＭＰ（ＰＭＰ−Ｌｕｃ）と、１マイクロリットルの非ロードＰＭＰを使用した。ＰＭＰにロードされたルシフェラーゼタンパク質の量を決定するために、ルシフェラーゼタンパク質（ＬＳＢｉｏ，ＬＳ−Ｇ５５３３−１５０）標準曲線を作製した（１０、３０、１００、３００及び１０００ｎｇ）。ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ６１１０）を使用し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計を用いて発光を測定して、全てのサンプル及び標準のルシフェラーゼ活性を検定した。ＰＭＰにロードされたルシフェラーゼタンパク質の量は、ルシフェラーゼタンパク質（ＬＳＢｉｏ，ＬＳ−Ｇ５５３３−１５０）の標準曲線を用いて決定し、非ロードＰＭＰサンプル中の発光に対して正規化した。ロード能力（１Ｅ＋９粒子当たりのｎｇルシフェラーゼタンパク質）は、ルシフェラーゼタンパク質濃度（ｎｇ）をロードＰＭＰ（ＰＭＰ−Ｌｕｃ）の数で割った商として計算した。ＰＭＰ−Ｌｕｃロード能力は、２．７６ｎｇルシフェラーゼタンパク質／１×１０９ＰＭＰであった。
【０４６８】
本発明者らの結果は、ＰＭＰが、封入後に活性を保持するモデルタンパク質でロードされ得ることを示している。
【０４６９】
2021528484.tif 000005
【０４７０】
ｂ）ルシフェラーゼタンパク質ロードグレープフルーツＰＭＰによる緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の処理
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ）は、供給者の指示に従い、５０ｕｇ／ｍｌのリファンピシンを補充したトリプチックソイブロスで３０℃において一晩増殖させた。３，０００×ｇで５分間の遠心分離により、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（総量５ｍｌ）を収集した。細胞を１０ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で２回洗浄した後、５ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に再懸濁させた。ＯＤ６００を測定し、０．５に調節した。
【０４７１】
処理は、３ｎｇのＰＭＰ−Ｌｕｃ（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水で希釈）、３ｎｇの遊離ルシフェラーゼタンパク質（タンパク質単独対照；Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水で希釈）又はＵｌｔｒａｐｕｒｅ水（陰性対照）のいずれかを補充した５０μｌの再懸濁緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞を含有する１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で２回反復して実施した。Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ水を７５μｌまで全てのサンプルに添加した。サンプルを混合し、室温で２ｈインキュベートした後、アルミホイルで被覆した。次に、サンプルを６，０００×ｇで５分遠心分離した後、７０μｌの上清を回収し、ルシフェラーゼ検出のために取っておいた。続いて、０．５％トリトンＸ−１００を含有する５００μｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で細菌ペレットを３回洗浄して、取り込まれていないＰＭＰを除去／バーストした。１ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２による最終洗浄を実施して、残留トリトンＸ−１００を除去した。９７０μｌの上清を除去した（３０ｕｌ洗浄バッファー中にペレットを残して）後、２０μｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２５μｌのＵｌｔｒａｐｕｒｅ水を添加して、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ペレットを再懸濁させた。ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ６１１０）を用いて、製造者の指示に従い、ルシフェラーゼタンパク質を測定した。サンプル（細菌ペレット及び上清サンプル）を１０分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）分光光度計で発光を測定した。
【０４７２】
ルシフェラーゼタンパク質ロードグレープフルーツＰＭＰで処理した緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、遊離ルシフェラーゼタンパク質単独又はＵｌｔｒａｐｕｒｅ水対照（陰性対照）による処理に対して１９．３倍高いルシフェラーゼ発現を有し、これは、ＰＭＰがそのタンパク質カーゴを細菌中に効率的に送達し得ることを示している（図１１）。さらに、上清及び細菌ペレット中の両方で遊離ルシフェラーゼタンパク質レベルは非常に低いため、ＰＭＰは、ルシフェラーゼタンパク質を分解から保護すると思われる。処理用量が３ｎｇのルシフェラーゼタンパク質であったことを考慮し、ルシフェラーゼタンパク質標準曲線に基づき、水中で２時間のＲＴインキュベーション後の上清又は細菌ペレット中の遊離ルシフェラーゼタンパク質は、＜０．１ｎｇのルシフェラーゼタンパク質に相当し、これは、タンパク質分解を示している。
【０４７３】
本発明者らのデータは、ＰＭＰが、タンパク質カーゴを生物に送達することができること並びにＰＭＰは、そのカーゴを環境による分解から保護し得ることを示している。
【０４７４】
他の実施形態
本発明の一部の実施形態は、以下の番号のパラグラフに含まれる。
１．複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物であって、複数のＰＭＰの各々は、異種病原体防除剤を含み、組成物は、農業若しくは獣医学対象動物病原体又はそれらのベクターへの送達のために製剤化される、病原体防除組成物。
２．異種病原体防除剤は、抗菌剤、抗真菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫剤又は昆虫忌避剤である、パラグラフ１に記載の病原体防除組成物。
３．抗菌剤は、ドキソルビシンである、パラグラフ２に記載の病原体防除組成物。
４．抗菌剤は、抗生物質である、パラグラフ２に記載の病原体防除組成物。
５．抗生物質は、バンコマイシンである、パラグラフ４に記載の病原体防除組成物。
６．抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、マクロライド、アミノグリコシド、キノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、グリコペプチド、リポグリコペプチド、オキサゾリジノン、リファマイシン、ツベルアクチノマイシン、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、チニダゾール、ニトロフラントイン、テイコプラニン、テラバンシン、リネゾリド、シクロセリン２、バシトラシン、ポリミキシンＢ、バイオマイシン又はカプレオマイシンである、パラグラフ４に記載の病原体防除組成物。
７．抗真菌剤は、アリルアミン、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール、ポリエン又はエキノカンジンである、パラグラフ２に記載の病原体防除組成物。
８．殺虫剤は、クロロニコチニル、ネオニコチノイド、カルバメート、有機リン酸エステル、ピレトロイド、オキサジアジン、スピノシン、シクロジエン、有機塩素、フィプロール、メクチン、ジアシルヒドラジン、ベンゾイル尿素、有機スズ、ピロール、ジニトロテルペノール、ＭＥＴＩ、テトロン酸、テトラミン酸又はフタルアミドである、パラグラフ２に記載の病原体防除組成物。
９．異種病原体防除剤は、小分子、核酸又はポリペプチドである、パラグラフ１に記載の病原体防除組成物。
１０．小分子は、抗生物質又は二次代謝物である、パラグラフ９に記載の病原体防除組成物。
１１．核酸は、阻害性ＲＮＡである、パラグラフ９に記載の病原体防除組成物。
１２．異種病原体防除剤は、複数のＰＭＰの各々によって封入される、パラグラフ１〜１１のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
１３．異種病原体防除剤は、複数のＰＭＰの各々の表面に埋め込まれる、パラグラフ１〜１１のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
１４．異種病原体防除剤は、複数のＰＭＰの各々の表面に共役される、パラグラフ１〜１１のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
１５．複数のＰＭＰの各々は、追加的な病原体防除剤をさらに含む、パラグラフ１〜１４のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
１６．病原体は、細菌、真菌、寄生昆虫、寄生線虫又は寄生原虫である、パラグラフ１〜１５のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
１７．細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である、パラグラフ１６に記載の病原体防除組成物。
１８．シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、パラグラフ１７に記載の病原体防除組成物。
１９．エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、パラグラフ１７に記載の病原体防除組成物。
２０．真菌は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種である、パラグラフ１６に記載の病原体防除組成物。
２１．寄生昆虫は、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種である、パラグラフ１６に記載の病原体防除組成物。
２２．寄生線虫は、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種である、パラグラフ１６に記載の病原体防除組成物。
２３．寄生原虫は、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種である、パラグラフ１６に記載の病原体防除組成物。
２４．ベクターは、昆虫である、パラグラフ１に記載の病原体防除組成物。
２５．ベクターは、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである、パラグラフ２４に記載の病原体防除組成物。
２６．室温で少なくとも１日間にわたって安定しており、且つ／又は４℃で少なくとも１週間にわたって安定している、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
２７．ＰＭＰは、４℃で少なくとも２４時間、４８時間、７日間又は３０日間にわたって安定している、パラグラフ１〜２６のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
２８．ＰＭＰは、少なくとも２０℃、２４℃又は３７℃の温度で安定している、パラグラフ２７に記載の病原体防除組成物。
２９．組成物中の複数のＰＭＰは、動物病原体の適応度を低減させるのに有効な濃度である、パラグラフ１〜２３又は２６〜２８のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３０．組成物中の複数のＰＭＰは、動物病原体ベクターの適応度を低減させるのに有効な濃度である、パラグラフ１〜１５又は２４〜２８のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３１．組成物中の複数のＰＭＰは、病原体に感染した動物の感染を処置するのに有効な濃度である、パラグラフ１〜２３又は２６〜３０のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３２．組成物中の複数のＰＭＰは、病原体への感染のリスクがある動物において感染を予防するのに有効な濃度である、パラグラフ１〜２３又は２６〜３０のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３３．組成物中の複数のＰＭＰは、少なくとも０．０１ｎｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇ、２ｎｇ、３ｎｇ、４ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、７５０ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ又は２５０μｇＰＭＰタンパク質／ｍｌの濃度である、パラグラフ１〜３２のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３４．農業的に許容可能な担体を含む、パラグラフ１〜３３のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３５．薬学的に許容可能な担体を含む、パラグラフ１〜３４のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３６．ＰＭＰを安定化するために製剤化される、パラグラフ１〜３５のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３７．液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化される、パラグラフ１〜３６のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３８．少なくとも５％のＰＭＰを含む、パラグラフ１〜３７のいずれか１つに記載の病原体防除組成物。
３９．複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物であって、ＰＭＰは、
（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；
（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプル中のレベルに対して、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベルを有する、ステップ；
（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分中のレベルに対して、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低減したレベルを有する、ステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）の複数の純粋なＰＭＰに病原体防除薬剤をロードするステップ；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）のＰＭＰを農業若しくは獣医学対象動物病原体又はそのベクターへの送達のために製剤化するステップ
を含むプロセスによって植物から単離される、病原体防除組成物。
４０．パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載の病原体防除組成物を含む動物病原体。
４１．パラグラフ１〜４０のいずれか１つに記載の病原体防除組成物を含む動物病原体ベクター。
４２．動物に病原体防除組成物を送達する方法であって、パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載の組成物を動物に投与するステップを含む方法。
４３．感染の処置を、それを必要とする動物において行う方法であって、有効量の、パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載の組成物を動物に投与するステップを含む方法。
４４．感染を、そのリスクがある動物において予防する方法であって、有効量の、パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載の組成物を動物に投与するステップを含み、非処置動物に対して動物の感染の可能性を低減させる方法。
４５．感染は、病原体によって引き起こされ、且つ病原体は、細菌、真菌、ウイルス、寄生昆虫、寄生線虫又は寄生原虫である、パラグラフ４２〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である、パラグラフ４５に記載の方法。
４７．真菌は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種である、パラグラフ４５に記載の方法。
４８．寄生昆虫は、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種である、４５に記載の方法。
４９．寄生線虫は、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種である、パラグラフ４５に記載の方法。
５０．寄生原虫は、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種である、パラグラフ４５に記載の方法。
５１．病原体防除組成物は、動物に経口、静脈内又は皮下投与される、パラグラフ４２〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．病原体防除組成物を病原体に送達する方法であって、病原体を、パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載の組成物と接触させるステップを含む方法。
５３．病原体の適応度を低減させる方法であって、パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載の組成物を病原体に送達するステップを含み、非処置病原体に対して病原体の適応度を低減させる方法。
５４．病原体が成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達するステップを含む、パラグラフ５２又は５３に記載の方法。
５５．組成物は、病原体による摂取のための病原体摂食可能組成物として送達される、パラグラフ５２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．病原体は、細菌、真菌、寄生昆虫、寄生線虫又は寄生原虫である、パラグラフ５２〜５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である、パラグラフ５６に記載の方法。
５８．真菌は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種である、パラグラフ５６に記載の方法。
５９．寄生昆虫は、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種である、５６に記載の方法。
６０．寄生線虫は、ヘリグモソモイデス属（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種である、パラグラフ５６に記載の方法。
６１．寄生原虫は、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）種である、パラグラフ５６に記載の方法。
６２．組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される、パラグラフ５２〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．動物病原体ベクターの適応度を低減させる方法であって、有効量の、パラグラフ１〜３９のいずれか１つに記載の組成物をベクターに送達するステップを含み、非処置ベクターに対してベクターの適応度を低減させる方法。
６４．ベクターが成長、生息、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達するステップを含む、パラグラフ６３に記載の方法。
６５．組成物は、ベクターによる摂取のための摂食可能組成物として送達される、パラグラフ６３又は６４に記載の方法。
６６．ベクターは、昆虫である、パラグラフ６３〜６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．昆虫は、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである、パラグラフ６６に記載の方法。
６８．組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される、パラグラフ６３〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．真菌感染を有する動物を処置する方法であって、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含む方法。
７０．真菌感染を有する動物を処置する方法であって、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗真菌剤を含む、方法。
７１．抗真菌剤は、真菌感染を引き起こす真菌の遺伝子の発現を阻害する核酸である、パラグラフ７０に記載の方法。
７２．遺伝子は、フィラメント成長促進タンパク質（ＥＦＧ１）である、パラグラフ７１に記載の方法。
７３．真菌感染は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）によって引き起こされる、パラグラフ７０〜７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＰＭＰを含む、パラグラフ７０〜７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．真菌感染を低減するか又は実質的に排除する、パラグラフ７０〜７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．細菌感染を有する動物を処置する方法であって、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を記動物に投与するステップを含む方法。
７７．細菌感染を有する動物を処置する方法であって、有効量の、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を動物に投与するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗菌剤を含む、方法。
７８．抗菌剤は、アムホテリシンＢである、パラグラフ７７に記載の方法。
７９．細菌は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種である、パラグラフ７７又は７８に記載の方法。
８０．組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＰＭＰを含む、パラグラフ７７〜７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．細菌感染を低減するか又は実質的に排除する、パラグラフ７７〜８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．動物は、獣医学対象動物又は家畜動物である、パラグラフ６９〜８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．寄生昆虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生昆虫に送達するステップを含む方法。
８４．寄生昆虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生昆虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む、方法。
８５．殺虫剤は、ペプチド核酸である、パラグラフ８４に記載の方法。
８６．寄生昆虫は、トコジラミである、パラグラフ８３〜８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．非処置寄生昆虫に対して寄生昆虫の適応度を低減させる、パラグラフ８３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．寄生線虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生線虫に送達するステップを含む方法。
８９．寄生線虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生線虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺線虫剤を含む、方法。
９０．寄生線虫は、ヘリグモソモイデス・ポリギルス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）である、パラグラフ８８又は８９に記載の方法。
９１．非処置寄生線虫に対して寄生線虫の適応度を低減させる、パラグラフ８８〜９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．寄生原虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生原虫に送達するステップを含む方法。
９３．寄生原虫の適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物を寄生原虫に送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、抗寄生虫剤を含む、方法。
９４．寄生原虫は、膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）である、パラグラフ９２又は９３に記載の方法。
９５．非処置寄生原虫に対して寄生原虫の適応度を低減させる、パラグラフ９２〜９４のいずれか１つに記載の方法。
９６．動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物をベクターに送達するステップを含む方法。
９７．動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低減させる方法であって、複数のＰＭＰを含む病原体防除組成物をベクターに送達するステップを含み、複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む、方法。
９８．非処置ベクターに対してベクターの適応度を低減させる、パラグラフ９６又は９７に記載の方法。
９９．昆虫は、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである、パラグラフ９６〜９８のいずれか１つに記載の方法。
【０４７５】
前述の本発明は、理解を明確にするために説明及び例としてある程度詳細に記載されているが、そうした記載及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、全体として参照により明示的に援用される。
【０４７６】
他の実施形態は、発明の特許請求の範囲に含まれる。
【０４７７】
2021528484.tif 000006
【０４７８】
2021528484.tif 000007
【０４７９】
2021528484.tif 000008
【０４８０】
2021528484.tif 000009
【０４８１】
2021528484.tif 000010
【０４８２】
2021528484.tif 000011
【０４８３】
2021528484.tif 000012
【０４８４】
2021528484.tif 000013
【０４８５】
2021528484.tif 000014
【０４８６】
2021528484.tif 000015
【０４８７】
2021528484.tif 000016
【０４８８】
2021528484.tif 000017
【０４８９】
2021528484.tif 000018
【０４９０】
2021528484.tif 000019
【０４９１】
2021528484.tif 000020
【０４９２】
2021528484.tif 000021
【０４９３】
2021528484.tif 000022
【０４９４】
2021528484.tif 000023
【０４９５】
2021528484.tif 000024
【０４９６】
2021528484.tif 000025
【０４９７】
2021528484.tif 000026
【０４９８】
2021528484.tif 000027
【０４９９】
2021528484.tif 000028
【０５００】
2021528484.tif 000029
【０５０１】
2021528484.tif 000030
【０５０２】
2021528484.tif 000031
【０５０３】
2021528484.tif 000032
【０５０４】
2021528484.tif 000033
【０５０５】
2021528484.tif 000034
【０５０６】
2021528484.tif 000035
【０５０７】
2021528484.tif 000036
【０５０８】
2021528484.tif 000037
【０５０９】
2021528484.tif 000038
【０５１０】
2021528484.tif 000039
【０５１１】
2021528484.tif 000040
【０５１２】
2021528484.tif 000041
【０５１３】
2021528484.tif 000042
【０５１４】
2021528484.tif 000043
【０５１５】
2021528484.tif 000044
【０５１６】
2021528484.tif 000045
【０５１７】
2021528484.tif 000046
【０５１８】
2021528484.tif 000047
【０５１９】
2021528484.tif 000048
【０５２０】
2021528484.tif 000049
【０５２１】
2021528484.tif 000050
【０５２２】
2021528484.tif 000051
【０５２３】
2021528484.tif 000052
【０５２４】
2021528484.tif 000053
【０５２５】
2021528484.tif 000054
【０５２６】
2021528484.tif 000055
【図１Ａ】
2021528484.tif 000056
【図１Ｂ】
2021528484.tif 000057
【図２】
2021528484.tif 000058
【図３Ａ】
2021528484.tif 000059
【図３Ｂ】
2021528484.tif 000060
【図３Ｃ】
2021528484.tif 000061
【図３Ｄ】
2021528484.tif 000062
【図４Ａ】
2021528484.tif 000063
【図４Ｂ】
2021528484.tif 000064
【図４Ｃ】
2021528484.tif 000065
【図４Ｄ】
2021528484.tif 000066
【図５Ａ】
2021528484.tif 000067
【図５Ｂ】
2021528484.tif 000068
【図５Ｃ】
2021528484.tif 000069
【図５Ｄ】
2021528484.tif 000070
【図５Ｅ】
2021528484.tif 000071
【図５Ｆ−５Ｇ】
2021528484.tif 000072
【図５Ｈ】
2021528484.tif 000073
【図５Ｉ】
2021528484.tif 000074
【図６Ａ】
2021528484.tif 000075
【図６Ｂ】
2021528484.tif 000076
【図６Ｃ】
2021528484.tif 000077
【図６Ｄ】
2021528484.tif 000078
【図６Ｅ】
2021528484.tif 000079
【図０７Ａ−７Ｂ】
2021528484.tif 000080
【図７Ｃ】
2021528484.tif 000081
【図０８Ａ−８Ｂ】
2021528484.tif 000082
【図９Ａ】
2021528484.tif 000083
【図９Ｂ】
2021528484.tif 000084
【図９Ｃ】
2021528484.tif 000085
【図９Ｄ】
2021528484.tif 000086
【図９Ｅ】
2021528484.tif 000087
【図９Ｆ】
2021528484.tif 000088
【図９Ｇ】
2021528484.tif 000089
【図９Ｈ】
2021528484.tif 000090
【図１０Ａ】
2021528484.tif 000091
【図１０Ｂ】
2021528484.tif 000092
【図１０Ｃ】
2021528484.tif 000093
【図１０Ｄ】
2021528484.tif 000094
【図１０Ｅ】
2021528484.tif 000095
【図１０Ｆ】
2021528484.tif 000096
【図１０Ｇ】
2021528484.tif 000097
【図１０Ｈ】
2021528484.tif 000098
【図１１】
2021528484.tif 000099
【配列表】
2021528484000001.app
【国際調査報告】
2021528484.tif 000100
2021528484.tif 000101
2021528484.tif 000102