(57)【要約】本発明は、カップリング剤としてのO-ジカルボキシイミドウロニウム塩の存在下で、以下の式のGalNAcクラスター化合物またはその対応する塩、鏡像異性体、および/もしくは立体異性体を、オリゴヌクレオチドとカップリングする段階を含む、GalNAcオリゴヌクレオチド結合体を調製するための方法を含む。2021512082.tif 000036
2021512082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カップリング剤としてのO-ジカルボキシイミドウロニウム塩の存在下で、以下の式
2021512082.tif 000033
のGalNAcクラスター化合物またはその対応する塩、鏡像異性体、および/もしくは立体異性体を、オリゴヌクレオチドとカップリングする段階を含む、GalNAcオリゴヌクレオチド結合体を調製するための方法。
【請求項２】
前記GalNAcクラスター結合体が、中央分岐点に連結された3つのガラクトサミン部分を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ガラクトサミン部分が、アルキレンリンカー、エチレングリコールリンカー、またはアルキレン鎖中に1つもしくはそれ以上のペプチド官能基 (-CO-NH-)を含むアルキレンリンカーを介して、但し好ましくはエチレングリコールリンカーを介して、前記中央分岐点に連結されている、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記GalNAcクラスター結合体が、下記式Ib
2021512082.tif 000034
、その対応する塩、鏡像異性体、および/または立体異性体を有し、式中、R1は水素またはヒドロキシ保護基でありかつnは0〜10の整数である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記GalNAcクラスター結合体が、下記式Ic
2021512082.tif 000035
を有し、式中、M+/++は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のカチオンである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記O-ジカルボキシイミドウロニウム塩が、O-ジカルボキシイミドウロニウムヘキサフルオロリン酸塩またはO-ジカルボキシイミドウロニウムテトラフルオロホウ酸塩であり、好ましくは、N, N, N', N'-テトラメチル-O-(ビシクロ[2.2.1]ヘプト-5-エン-2,3-ジカルボキシイミド)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩 (TNTU)またはN, N, N, N-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩 (TSTU)である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記カップリング剤が、N, N, N', N'-テトラメチル-O-(ビシクロ[2.2.1]ヘプト-5-エン-2,3-ジカルボキシイミド)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩 (TNTU)である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Mがナトリウムまたはカリウム、好ましくはナトリウムである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが5'アミノ修飾オリゴヌクレオチドである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
5'アミノ修飾基が、アミノ基保護されていてもよいアミノC2〜12-アルキルリンカー、または1〜10個のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコールリンカーより選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ基保護されていてもよいアミノC2〜12-アルキルリンカー、好ましくはアミノ基保護されていてもよいアミノC4〜8-アルキルリンカーが選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、修飾されていてもよいDNA、RNA、もしくはLNAヌクレオシドモノマーまたはその組み合わせからなり、かつ7〜30ヌクレオチド長、好ましくは10〜25ヌクレオチド長である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
(a) 1.0〜1.5当量の式IのGalNacクラスター結合体を極性非プロトン性溶媒中に懸濁させ、1.0〜1.5当量の前記カップリング剤を加えかつこの懸濁液が0℃〜40℃の反応温度にある、活性化段階、および
(b) 段階(a)からの反応混合物を、8.0〜10.0のpH、0℃〜40℃の反応温度で、10％G〜25％Gの前記オリゴヌクレオチドを含む水溶液と混合する、カップリング段階
を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記極性非プロトン性溶媒が、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、またはN-メチルピロリジン、好ましくはN,N-ジメチルホルムアミドである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
精製段階(c)をさらに含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記精製段階が
(a) アルコール溶媒を用いた沈殿、または、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィーより選択されるクロマトグラフィー、続いて
(b) タンジェンシャルフローろ過より選択される濃縮段階、および
(c) 凍結乾燥、ろ過、噴霧乾燥、またはアルコール溶媒を用いた沈殿より選択される、単離段階
を含む、請求項15に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カップリング剤としてのO-ジカルボキシイミドウロニウム塩の存在下で、以下の式
2021512082.tif 000003
のGalNAcクラスター化合物またはその対応する塩、鏡像異性体、および/もしくは立体異性体を、オリゴヌクレオチドとカップリングする段階を含む、GalNAcオリゴヌクレオチド結合体を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カップリング法は、原則として、アミンとカルボン酸との間のペプチド結合の形成について周知かつ広く説明されている方法に従い、かつ、通例、カルボン酸の活性化およびその後のアミンとのカップリングを含む。
【０００３】
GalNAcクラスターとオリゴヌクレオチドとのカップリング反応もまた、本技術分野で十分に説明されている。最近の例示的な刊行物は、米国特許出願公開第2011/0207799号（特許文献1）、公表された該米国特許出願を実施例11において参照するPCT公報WO2017/021385（特許文献2）、またはPCT公報WO2018/215391（特許文献3）である。
【０００４】
最先端の方法は、通例、DCC、DIC、もしくはEDCなどのジイミドカップリング試薬、またはPyBOPなどのホスホニウム塩を使用し、有機塩基の追加使用を必要とし、通常、DMFまたはDMSOなどの極性非プロトン性溶媒中で行われる。オリゴヌクレオチドのカップリングは水性条件が好ましく; それゆえに、最先端の条件を適用することは好ましくない。
【０００５】
また、これらの試薬を使用するには、活性化に先立ってGalNAcの金属塩をプロトン化する必要がある。この目的のための最も有益な酸はH3PO4であることが判明していた。しかし、H3PO4の使用は、結合体生成物中のGalNAc糖単位のリン酸化に繋がることが観察された。これらのリン酸化副生成物は、通常の精製方法では分離できない。
【０００６】
最先端の方法は、実験室規模の合成の要件を満たす。GalNAcオリゴヌクレオチドが臨床段階に入る有望な薬物候補になるにつれて、より効率的で、より経済的かつ商業的に適用可能なより大規模な製造方法が必要とされる。
【０００７】
リン酸化副生成物を回避するために、H3PO4によるGalNAcの金属塩の事前のプロトン化を必要としない特定の方法が望まれる。
【０００８】
さらには、限定的なオリゴヌクレオチドの完全な結合を確実にするために通常3倍またはそれ以上過剰に用いられる過剰なGalNAcクラスターを最小限に抑える必要がある。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、本技術分野で既知の方法を実質的に改善すること、とりわけ活性化およびカップリング段階の両方について反応条件およびパラメーターを最適化し、副生成物の形成を最小限にすることであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第2011/0207799号
【特許文献２】WO2017/021385
【特許文献３】WO2018/215391
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、カップリング剤としてのO-ジカルボキシイミドウロニウム塩の存在下で、以下の式
2021512082.tif 000004
のGalNAcクラスター化合物またはその対応する塩、鏡像異性体、および/もしくは立体異性体を、オリゴヌクレオチドとカップリングする段階を含む、GalNAcオリゴヌクレオチド結合体を調製するための新規な方法で達成できることが見出された。
【００１２】
以下の定義は、本明細書において本発明を説明するために用いられる様々な用語の意味および範囲を例示し、かつ定義するために示す。
【００１３】
キラル炭素が化学構造中に存在する場合は常に、そのキラル炭素に関連するすべての立体異性体が、純粋な立体異性体ならびにその混合物として構造に含まれることが意図される。
【００１４】
「アルキル」なる用語は、1〜12個の炭素原子の一価直鎖または分枝飽和炭化水素基を意味する。具体的態様において、アルキルは1〜7個の炭素原子、より具体的態様において、1〜4個の炭素原子を有する。アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、またはtert-ブチルが含まれる。
【００１５】
同様に「C2〜12アルキル」なる用語は、2〜12個の炭素原子、より具体的態様において、4〜8個の炭素原子の一価直鎖または分枝飽和炭化水素基を意味する。アルキルの例には、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、またはtert-ブチルおよびペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルおよびドデシルならびにその異性体が含まれる。
【００１６】
「ヒドロキシ保護基」なる用語および「エステル保護基」なる用語は、ヒドロキシ基を保護することを意図した基を意味し、エステルおよびエーテル形成基、具体的にはテトラヒドロピラニル、アシル基、カルバモイル、ベンジルおよびシリルエーテル (例えば、TBS、TBDPS)基を含む。これらの基のさらなる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapters 2-3; E. Haslam, ''Protective Groups in Organic Chemistry'', J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5、およびT.W. Greene, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', John Wiley and Sons, New York, NY, 1981において見出される。好ましくは、アシル基、具体的にはC1〜12-アルキルカルボニル基、より具体的にはC1〜6-アルキルまたはフェニルによって置換されていてもよいC1〜6-アルキルカルボニル基である。より好ましくは、ヒドロキシ保護基は、アセチル、ピバロイル、またはベンゾイルより選択することができ、アセチルが最も好ましいヒドロキシ保護基である。
【００１７】
「アルカリ」なる用語は、アルカリ金属のリチウム、ナトリウムおよびカリウム、特にナトリウムおよびカリウムを含み、ナトリウムが好ましい。
【００１８】
「アルカリ土類」なる用語は、アルカリ土類金属のカルシウムおよびマグネシウムを含むが、特にカルシウムを含む。
【００１９】
GalNAcクラスター結合体なる用語は、オリゴヌクレオチド化合物を肝細胞に標的化し、その結果、肝疾患を処置するために使用され得るアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を表す。典型的には、この部分はガラクトサミン、好ましくはN-アセチルガラクトサミンを含む。
【００２０】
好ましい態様において、GalNAcクラスター結合体なる用語は、適切なリンカーを介して中央分岐点に連結されている3つのガラクトサミン部分、より好ましくは3つのN-アセチルガラクトサミン部分を含む。
【００２１】
長さ、親水性-疎水性バランス、および空間配置が異なり得る適切なリンカーは、例えば、Huang et al., Bioconjugate Chem. 2017, 28, 283-295に記載されている。
【００２２】
好ましいリンカーは、アルキレンリンカー、エチレングリコールリンカーまたはアルキレン鎖中に1つまたはそれ以上、好ましくは1つのペプチド官能基 (-CO-NH-)を含むアルキレンリンカーである。
【００２３】
3つのN-アセチルガラクトサミン部分が中央分岐点に連結されている好ましい態様の場合など、複数のリンカーの場合、個々のリンカーは、異なり得るが、好ましくは同じである。
【００２４】
好ましいリンカーは、エチレングリコールリンカーである。
【００２５】
本文脈におけるアルキレンリンカーなる用語は、「C2〜12-アルキレン架橋」を意味し、具体的には2〜12個の炭素原子、より具体的な態様では4〜8個の炭素原子、さらにより具体的な態様では6個の炭素原子の2価の直鎖または分岐飽和炭化水素基を意味する。特定の例は、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、またはオクチレン、およびその異性体であるが、好ましくはn-ヘキシレンである。
【００２６】
「エチレングリコールリンカー」なる用語は、架橋単位として、1〜10個のエチレングリコール単位、好ましくは2〜6個のエチレングリコール、より好ましくは3個のエチレングリコール単位を含むことができる、-(CH2)2-O-単位を表す。
【００２７】
本文脈における「分岐点」なる用語は、通常、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、さらには該分岐点のオリゴマーへの結合を可能にする小分子を意味する。好ましい分岐点分子はジ-リジンである。ジ-リジンは、3つのガラクトサミンリンカー誘導体が結合できる3つのアミン基と、GalNAcクラスターがオリゴヌクレオチドに結合できるカルボキシル基を含む。
【００２８】
好ましい態様において、GalNacクラスター結合体は、下記式Ib
2021512082.tif 000005
、その対応する塩、鏡像異性体、および/または立体異性体を有し、式中、R1は水素またはヒドロキシ保護基、好ましくは水素またはアセチル、より好ましくは水素であり、かつnは0〜10、好ましくは1〜5、より好ましくは2の整数である。
【００２９】
さらにより好ましい態様において、GalNacクラスター結合体は、下記式Ic
2021512082.tif 000006
を有し、式中、M+/++は、上に定義されるとおりのアルカリ金属またはアルカリ土類金属のカチオン、好ましくはアルカリ金属のカチオン、より好ましくはナトリウムである。
【００３０】
GalNAcクラスター結合体は、例えば、PCT公報WO2017/021385に記載され、以下のスキームに示される方法に従って調製することができる。
スキーム1：
2021512082.tif 000007
【００３１】
5'アミノ修飾なる用語は、5'アミノ修飾オリゴヌクレオチドなる用途に関連して使用され、アミノリンカーとしてオリゴヌクレオチドの5'末端基に結合しているリンカーに共有結合する反応性アミノ基を決定する。リンカーは、好ましくは、2〜12個の炭素原子の脂肪族アルキル基または1〜10個のエチレングリコール単位を含むエチレングリコールリンカーである。
【００３２】
好ましい5'アミノ修飾基は、したがって、アミノ基保護されていてもよいアミノC2〜12-アルキルリンカー、好ましくはアミノ基保護されていてもよいアミノC4〜8-アルキルリンカー、より好ましくはC6-アルキルリンカーである。
【００３３】
5'アミノ修飾オリゴヌクレオチドに対する適切なアミノ保護基は、トリフルオロアセチル (TFA)またはモノメトキシトリチル (MMT)である。
【００３４】
通例、アミノリンカーは、例えばSigma AldrichからのTFA-もしくはMMT-C6-リンカーホスホロアミダイトを介してまたはGlen Researchからの5'アミノ修飾基TEG (トリエチレングリコール) CEホスホロアミダイトを介してなどの、市販のアミノリンカーホスホロアミダイトを介して導入される。
【００３５】
本明細書において用いられるオリゴヌクレオチドなる用語は、2つまたはそれ以上の共有結合したヌクレオチドを含む分子として当業者に一般に理解されるものとして定義される。治療上有用なオリゴヌクレオチドとして使用するために、オリゴヌクレオチドは典型的には7〜30ヌクレオチド長、好ましくは10〜25ヌクレオチド長として合成される。
【００３６】
オリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよいDNA、RNA、もしくはLNAヌクレオシドモノマーまたはその組み合わせからなってもよい。
【００３７】
LNAヌクレオシドモノマーは、ヌクレオチドのリボース糖環のC2'とC4'との間のリンカー基(ビラジクルまたは架橋と呼ばれる)を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも呼ばれる。
【００３８】
本明細書において用いられる、修飾されていてもよいとは、糖部分または核酸塩基部分の1つまたは複数の修飾の導入により、同等のDNA、RNA、またはLNAヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを意味する。好ましい態様において、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含み、例えば1つもしくは複数の2'置換ヌクレオシドおよび/または1つもしくは複数のLNAヌクレオシドを含んでもよい。修飾ヌクレオシドなる用語は、本明細書において「ヌクレオシド類縁体」または修飾された「単位」または修飾された「モノマー」なる用語と交換可能に使用してもよい。
【００３９】
DNA、RNA、またはLNAヌクレオシドは通例、2つのヌクレオシドを合わせて共有結合する、ホスホジエステル (P=O)および/またはホスホロチオエート (P=S)ヌクレオシド間結合によって結合される。
【００４０】
したがって、いくつかのオリゴヌクレオチドでは、すべてのヌクレオシド間結合はホスホジエステル (P=O)からなり得、他のオリゴヌクレオチドでは、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート (P=S)からなり得、またはさらに他のオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオシド間結合の配列は多様で、ホスホジエステル (P=O)とホスホロチオエート (P=S)ヌクレオシド間の両方を含む。
【００４１】
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基の文字コード、例えばA、T、G、CまたはUによって示してもよく、ここで各文字は、任意に同等の機能の修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示するオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、LNAヌクレオシドに対して大文字A、T、G、およびMeC (5-メチルシトシン)、ならびにDNAヌクレオシドに対して小文字a、t、g、c、およびMeCで記載する。修飾核酸塩基には、tert.ブチルフェノキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、アセチル、イソブチリル、またはジメチルホルムアミジノなどの保護基を有する核酸塩基が含まれるが、それらに限定されない(Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese of March 24, 2016参照)。
【００４２】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよいDNA、RNA、もしくはLNAヌクレオシドモノマーまたはその組み合わせからなり、かつ10〜25ヌクレオチド長である。
【００４３】
オリゴヌクレオチド合成の原理は、本技術分野に周知であり、文献に詳しく記載され、ウィキペディアなどで公表されている（例えば、Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis, of March 15, 2016参照）。
【００４４】
今日では、より大規模なオリゴヌクレオチド合成が、コンピュータ制御された合成機を用いて自動的に行われる。
【００４５】
通例、オリゴヌクレオチド合成は固相合成であり、組み立てられるオリゴヌクレオチドは、その3'末端ヒドロキシ基を介して、固体支持体材料に共有結合され、鎖の組み立て過程の全体にわたってそれに結合したままである。適切な支持体は、GE HealthcareからのPrimer support 5GまたはKinovateからのNittoPhase (登録商標) HL supportのような市販のマクロ多孔性ポリスチレン支持体である。
【００４６】
オリゴヌクレオチド合成は、原則として、所望の配列が組み立てられるまでの、伸長鎖の5'末端へのヌクレオチド残基の段階的付加である。
【００４７】
通例、各付加は合成サイクルと呼ばれ、原則として、以下の化学反応からなる：
(a1) 固体支持体上の保護ヒドロキシル基を脱保護する段階；
(a2) 活性化ホスホラミダイトとして第1のヌクレオシドを固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングする段階；
(a3) それぞれのP結合ヌクレオシドを酸化または硫化して、それぞれのホスホトリエステル (P=O)またはそれぞれのホスホロチオエート (P=S)を生成する段階；
(a4) 任意で、固体支持体上の任意の未反応ヒドロキシル基をキャッピングする段階；
(a5) 固体支持体に結合した第1のヌクレオシドの5'ヒドロキシル基を脱保護する段階；
(a6) 活性化ホスホラミダイトとして第2のヌクレオシドをカップリングして、それぞれのP結合二量体を生成する段階；
(a7) それぞれのP結合ジヌクレオシドを酸化または硫化して、それぞれのホスホトリエステル (P=O)またはそれぞれのホスホロチオエート (P=S)を生成する段階；
(a8) 任意で、任意の未反応5'ヒドロキシル基をキャッピングする段階；
(a9) 所望の配列が組み立てられるまで、前の段階a5〜a8を繰り返す段階。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
上で概説したように、本発明の方法は、カップリング剤としてのO-ジカルボキシイミドウロニウム塩の存在下で、以下の式
2021512082.tif 000008
のGalNAcクラスター化合物またはその対応する塩、鏡像異性体、および/もしくは立体異性体を、オリゴヌクレオチドとカップリングする段階によって特徴付けられる。
【００４９】
O-ジカルボキシイミドウロニウム塩は、通例、市販されているか、または文献既知の方法、例えば、Knorr et al, Tetrahedron Letters, Vol. 30, No.15, 1927-1930 (1989)に従って合成できる。
【００５０】
好ましくは、O-ジカルボキシイミドウロニウム塩は、O-ジカルボキシイミドウロニウムヘキサフルオロリン酸塩またはO-ジカルボキシイミドウロニウムテトラフルオロホウ酸塩である。
【００５１】
それらは、N, N, N', N'-テトラメチル-O-(ビシクロ[2.2.1]ヘプト-5-エン-2,3-ジカルボキシイミド)ウロニウムテトラフルオロウロニウムテトラフルオロホウ酸塩 (TNTU)またはN, N, N, N-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩 (TSTU)より選択され、より好ましくはN, N, N', N'-テトラメチル-O-(ビシクロ[2.2.1]ヘプト-5-エン-2,3-ジカルボキシイミド)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩 (TNTU)より選択される。
【００５２】
あるいは、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロリン酸塩 (HBTU)または[O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N, N, N′, N′-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロリン酸塩］(HATU)などのアリールトリアゾールウロニウム塩を適用することができる。しかしながら、それらはより好ましくない。
【００５３】
前記方法は、最初の活性化段階(a)とそれに続くカップリング段階(b)によって特徴付けられる。
【００５４】
活性化段階：
活性化段階において、GalNAc結合体はカップリング剤と反応して、活性化されたGalNAc結合体を生成する。この活性化中間体は単離できるが、通例、そのままカップリング段階でさらに処理される。
【００５５】
GalNac結合体は、上で概説したように、好ましくはアルカリ土類金属塩またはアルカリ金属塩、より好ましくはナトリウム塩の形態で適用される。
【００５６】
カルボン酸の形態のGalNacから出発することも可能である。その場合、ジイソプロピルエチルアミン塩基のような第三級アミンなどの適切な塩基による事前の脱プロトン化を考慮しなければならない。
【００５７】
通常、1.0〜1.5当量、好ましくは1.0〜1.3、より好ましくは1.0〜1.1当量のGalNac結合体を、極性非プロトン性溶媒中、適切にはN,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、またはN-メチルピロリジン中、好ましくはN,N-ジメチルホルムアミド中に懸濁させる。
【００５８】
次に1.0〜1.5当量、好ましくは1.0〜1.3当量、より好ましくは1.0〜1.1当量のカップリング剤を加えることができる。
【００５９】
活性化反応は、0 ℃〜40 ℃、好ましくは20 ℃〜25 ℃の反応温度で、0.5〜3時間、好ましくは0.5〜1.5時間、より好ましくは1時間行われ得る。
【００６０】
カップリング段階：
活性化段階から得られた反応混合物に、5 ％G〜40 ％G、好ましくは10 ％G〜20 ％Gのオリゴヌクレオチドを含む水溶液を加えることができる。あるいは、反応混合物をオリゴヌクレオチドの水溶液に添加することができる。
【００６１】
反応混合物のpHは、7.0と10.0の間、好ましくは8.3と9.3の間で適切に制御される。
【００６２】
pH制御は、水酸化アルカリもしくは適切な塩基性塩またはそれらの混合物を添加することによって達成することができる。
【００６３】
典型的には、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウムのようなアルカリ炭酸水素塩、またはリン酸水素ナトリウムのようなアルカリリン酸水素塩を使用することができる。
【００６４】
反応温度は、通例、0 ℃〜40 ℃、好ましくは20 ℃〜25 ℃の範囲である。
【００６５】
1〜4時間後に完全な変換に到達することができる。
【００６６】
その後、得られたGalNAcオリゴヌクレオチド結合体を分離し、さらに精製することができる。
【００６７】
前の段階から得られたGalNAc-クラスターオリゴヌクレオチド結合体の精製は、本質的に、沈殿またはクロマトグラフィー、濃縮、および単離の段階を含む。
【００６８】
好ましい態様において、精製は以下を含む：
(a) アルコール溶媒を用いた沈殿、または、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィーより選択されるクロマトグラフィー、続いて
(b) タンジェンシャルフローろ過より選択される濃縮段階、および
(c) 凍結乾燥、ろ過、もしくは噴霧乾燥、またはアルコール溶媒を用いた沈殿より選択される、単離段階。
【００６９】
さらに好ましい態様において、精製は以下を含む：
(a) 任意で陰イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせた逆相クロマトグラフィー、続いて
(b) タンジェンシャルフローろ過、および
(c) 凍結乾燥。
【００７０】
上記の精製方法は一般的なものであり、本発明の分野の当業者に周知である。
【００７１】
沈殿なる用語は、通常、適切な溶媒の援助を受けて溶液から固体を生成することを意味する。本発明の文脈において、適切な溶媒は、アルコール、好ましくはエタノールまたは1-プロパノールなどの低級アルコールである。
【００７２】
クロマトグラフィーなる用語は、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーおよびそれらの組み合わせの方法を含む。
【００７３】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、試料溶液の荷電イオンと用いる緩衝液媒体との競合的相互作用に基づく。これは、従来の市販の陰イオン交換樹脂、好ましくはトリメチルアンモニウム官能基化されたものを用いて行うことができる。これらの相材料は、例えば、GE Healthcare、Tosoh Bioscience、Bio-RadまたはMerckから入手できる。Tosoh Bioscienceから入手可能な陰イオン交換樹脂 TSKgel Super Q-5PW (QAE)を用いて、特に良好な結果が得られた。
【００７４】
逆相クロマトグラフィーは、固定相としての修飾シリカゲル吸着剤などの従来の市販の相材料と、アセトニトリルなどの適切な有機溶媒、および該当する場合には緩衝液を用いて実施できる。適切な修飾シリカゲルタイプの相材料は、Kromasil (商標) C18、Kromasil (商標) C8、YMC Triart C18、およびYMC Triart C8より選択できる。YMCからのTriart Prep C8-Sを用いて、特に良好な結果が得られた。
【００７５】
濃縮なる用語は、タンジェンシャルフローろ過または蒸発およびそれらの組み合わせの方法を含む。
【００７６】
タンジェンシャルフローろ過またはクロスフローろ過では、供給物は、透過側に対して陽圧で(接線方向に)ろ過膜を通過する。膜の孔径より小さい物質の一部は、透過物またはろ液として膜を通過し; 他のすべては残余物として膜の供給物側に保持される。タンジェンシャルフローろ過の原理は、ナノろ過、限外ろ過、透析ろ過、およびマイクロろ過の方法にも用いられる。適切な膜は、例えば、Pellicon (商標)の商品名でMerck Milliporeから市販されている。適切な膜は、≦3kDAの分子量カットオフ (MWCO)を有する。それぞれ1 kDAまたは3 kDAのMWCOを有するMerck Millipore Pellicon 2および3膜が好ましい。
【００７７】
単離なる用語は、凍結乾燥、沈殿、噴霧乾燥、および蒸発の方法を含む。これらの用語はすべて当業者に周知である。
【００７８】
例として、オリゴヌクレオチドは、
2021512082.tif 000009
からなる群より選択され得、
ここで、AM-C6はC6アミノリンカーを意味し; *はホスホロチオエート架橋を表し; A、G、T、およびMeC (5-メチルシトシン)はLNAヌクレオシドモノマーであり、かつa、t、c、gはDNAヌクレオシドモノマーである。
【００７９】
非限定の態様において、GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体は、
2021512082.tif 000010
からなる群より選択され得、
ここで、AM-C6はC6アミノリンカーを意味し; *はホスホロチオエート架橋を表し; A、G、T、およびMeC (5-メチルシトシン)はLNAヌクレオシドモノマーであり、かつa、t、c、gはDNAヌクレオシドモノマーであり、かつGN2はGalNAcクラスター部分であり、これは、以下の式の立体異性体GN2aもしくはGN2b、またはその混合物の形態で出現し得、式中、RはAM-C6-オリゴヌクレオチドテールを示す。
2021512082.tif 000011
【００８０】
本明細書に開示される化合物は、以下の核酸塩基配列
2021512082.tif 000012
を有する。
【実施例】
【００８１】
略語：
DMF  N, N'-ジメチルホルムアミド
DMSO  ジメチルスルホキシド
EtOH  エタノール
MeCN  アセトニトリル
NaCl  塩化ナトリウム
NaOAc  酢酸ナトリウム
NaOH  水酸化ナトリウム
TNTU  N,N,N',N'-テトラメチル-O-(ビシクロ[2.2.1]ヘプト-5-エン-2,3-ジカルボキシイミド)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
TSTU  N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
HCTU  O-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N,N-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
PyOAP  (7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
HBTU  2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
HATU  1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロリン酸塩
【００８２】
実施例1
2021512082.tif 000013
限外ろ過により脱塩された、配列
2021512082.tif 000014
を有する5'アミノ修飾オリゴヌクレオチド9.8 g (1.53 mmol, 理論値)を、NaHCO3水溶液(0.1 M, 60 ml, pH 8.3)に溶解し、発泡を避けるためにEtOH (1 ml)を加えた。
【００８３】
M+/++ =ナトリウム (ナトリウム (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート) を伴う式1cのGalNAcクラスター結合体2.71 g (1.84 mmol, 当量:1.2)をDMF (12.7 g, 13.5 ml)に懸濁させ、TNTU (676 mg, 1.85 mmol, 当量:1.21)を加えた。白色懸濁液を20〜25℃で1時間撹拌して、透明な溶液 (15.4 g)を得た。
【００８４】
上で調製した活性化GalNAc溶液 (12.8 g, 9.8 g理論的オリゴについて1.0当量)をワンポットでオリゴヌクレオチド水溶液に加え、撹拌を1.5時間続け、HPLCが完全な変換を示した。
【００８５】
反応混合物を分取RP-HPLC (YMC Triart C8-S 10マイクロメーター, H2O中MeCN/0.2M NaOAc, 45℃）で直接精製した。生成物を含む画分を合わせ、限外ろ過し、凍結乾燥して、HPLC純度80.6％ (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN）の白色凍結乾燥粉末(7.5 g, 50％)として生成物を得た。生成物を、UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm. 勾配A: 95％ 水/2.5% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmolトリメチルアミン, B: 17.5％水/80％ CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmolトリエチルアミン)で同定した。 UPLC-MS: m/z 7447.7 (予測値 7445.9)。
【００８６】
実施例2
2021512082.tif 000015
配列
2021512082.tif 000016
を有する5'アミノ修飾オリゴヌクレオチド13.9 g (1.89 mmol, 純度87 ％)を、NaOH溶液からの濃縮によって脱塩し、NaHCO3水溶液 (0.1 M, 55 ml)に溶解し、EtOH (2.5 ml)を加えた。pHは9.8と測定された。
【００８７】
M+/++ =ナトリウム (ナトリウム (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート) を伴う式1cのGalNAcクラスター結合体3.35 g (2.27 mmol, 当量: 1.2)をDMF (15.6 g, 16.5 ml)に懸濁させ、TNTU (834 mg, 2.28 mmol, 当量:1.21)を加えた。白色懸濁液を20〜25℃で1時間撹拌して、透明な溶液を得た。
【００８８】
上で調製した活性化GalNAc溶液をワンポットでオリゴヌクレオチド水溶液に加え、撹拌を1時間続け、HPLCが完全な変換を示した。
【００８９】
反応混合物を1-プロパノール (150 ml)でトリチュレートし、懸濁液を20〜25℃で30分間撹拌し、次いで30分間放置した。液体をデカントして油状物を残し、そこに1-プロパノール (100 ml)を加え、撹拌を16時間続けた。懸濁液をろ過し、黄色固体を1-プロパノール (25 ml)で2回洗浄し、真空乾燥して、生成物をHPLC純度57.1％ (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN) の黄色固体として得た(14.8 g, 99％回収)。生成物をUPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 勾配A: 95% 水/2.5% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリメチルアミン, B: 17.5% 水/80% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリエチルアミン)で同定した。UPLC-MS: m/z 7447.7 (予測値 7445.9)。
【００９０】
実施例3
2021512082.tif 000017
配列
2021512082.tif 000018
を有する5'アミノ修飾オリゴヌクレオチド12.2 g (1.9 mmol 理論値)を、IEX-HPLCによって脱塩および精製し、NaHCO3水溶液 (0.1 M, 55 ml)に溶解し、加えた。pHは8.6と測定された。
【００９１】
M+/++ =ナトリウム (ナトリウム (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート) を伴う式1cのGalNAcクラスター結合体3.37 g (2.28 mmol, 当量: 1.2)をDMF (15.6 g, 16.5 ml)に懸濁させ、TNTU (839 mg, 2.30 mmol,当量:1.21)を加えた。白色懸濁液を20〜25℃で1時間撹拌して、透明な溶液を得た。
【００９２】
上で調製した活性化GalNAc溶液をオリゴヌクレオチド水溶液に5分かけて加え、撹拌を2時間続けた。HPLCは不完全な変換を示し、追加の活性化GalNAcクラスター結合体 (GalNAcナトリウム塩 (561 mg, 0.38 mmol, 0.2当量)、DMF (2.6 ml)およびTNTU (146 mg, 0.4 mmol, 0.21当量 1時間)から調製)を反応混合物に加えた。追加の30分後、反応混合物を1-プロパノール (110 ml)でトリチュレートし、懸濁液を20〜25℃で30分間撹拌し、次いで30分間放置した。液体をデカントして油状物を残し、そこに1-プロパノール (100 ml)を加え、撹拌を16時間続けた。懸濁液をろ過し、黄色固体を1-プロパノール (25 ml)で2回洗浄し、真空乾燥して、生成物をHPLC純度75.4％ (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN) の黄色固体として得た(14.9 g, 100％回収)。生成物をUPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 勾配A: 95% 水/2.5% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリメチルアミン, B: 17.5% 水/80% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリエチルアミン)で同定した。UPLC-MS: m/z 7447.6 (予測値 7445.9)。
【００９３】
実施例4
2021512082.tif 000019
配列
2021512082.tif 000020
を有する5'アミノ修飾オリゴヌクレオチド200 mg (0.027 mmol, 純度87%)を、NaOH溶液からの濃縮によって脱塩し、pH 9.0のNaHCO3水溶液 (0.1 M, 0.79 ml)に溶解した。
【００９４】
M+/++ =ナトリウム (ナトリウム (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート) を伴う式1cのGalNAcクラスター結合体40 mg (0.027 mmol, 当量: 1.0)をDMF (0.2 ml)に懸濁させ、TNTU (10 mg, 0.027 mmol, 当量: 1.0)を加えた。白色懸濁液を20〜25℃で1時間撹拌して、透明な溶液を得た。
【００９５】
上で調製した活性化GalNAc溶液をワンポットでオリゴヌクレオチド水溶液に加え、撹拌を1.5時間続けた。
【００９６】
反応混合物を1-プロパノール (4 ml)でトリチュレートし、懸濁液を20〜25℃で10分間撹拌した。液体をデカントして油状物を残し、そこに1-プロパノール (4 ml)を加え、撹拌を17時間続けた。懸濁液をろ過し、黄色固体を1-プロパノール (1 ml)で2回洗浄し、真空乾燥して、生成物をHPLC純度45.8％ (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN) の黄色固体として得た(150 mg, 70%回収)。生成物をUPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 勾配A: 95% 水/2.5% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリメチルアミン, B: 17.5% 水/80% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリエチルアミン)で同定した。UPLC-MS: m/z 7447.8 (予測値 7445.9)。
【００９７】
実施例5
2021512082.tif 000021
実施例4の手法に従い、TNTUに代えてTSTU (9.9 mg, 0.027 mmol, 1.0 当量)を使用して、HPLC純度56％ (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN)の黄色固体(160 mg, 75％回収)として生成物を得た。生成物をUPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 勾配A: 95% 水/2.5% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリメチルアミン, B: 17.5% 水/80% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリエチルアミン)で同定した。UPLC-MS: m/z 7447.5 (予測値 7445.9)。
【００９８】
実施例6
2021512082.tif 000022
配列
2021512082.tif 000023
を有する5'アミノ修飾オリゴヌクレオチド0.5 g (0.08 mmol, 純度 92%)を、NaOH溶液からの濃縮によって脱塩し、NaHCO3水溶液 (0.1 M, 1.98 ml, pH 8.3)に溶解した。
【００９９】
M+/++ =ナトリウム (ナトリウム (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート) を伴う式1cのGalNAcクラスター結合体 147 mg (99.8 μmol, 1.2当量)をDMF (0.8 ml)に懸濁させ、TNTU (36.7 mg, 0.10 mmol, 当量:1.21)を加えた。白色懸濁液を20〜25℃で1時間撹拌して、透明な溶液を得た。
【０１００】
上で調製した活性化GalNAc溶液をオリゴヌクレオチド水溶液に1分かけて加え、撹拌を1時間続け、HPLCが完全な変換を示した。
【０１０１】
反応混合物を1-プロパノール (5 ml)でトリチュレートし、懸濁液を20〜25℃で30分間撹拌し、次いで30分間放置した。液体をデカントして油状物を残し、そこに1-プロパノール (2.5 ml)を加え、撹拌を16時間続けた。懸濁液をろ過し、黄色固体を1-プロパノール (0.9 ml)で2回洗浄し、真空乾燥して、生成物をHPLC純度60.9％ (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN) の黄色固体として得た(560 mg, 96%)。生成物をUPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 勾配A: 95% 水/2.5% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリメチルアミン, B: 17.5% 水/80% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリエチルアミン)で同定した。UPLC-MS: m/z 6639.2 (予測値 6637.3)。
【０１０２】
実施例7
2021512082.tif 000024
配列
2021512082.tif 000025
を有する5'アミノ修飾オリゴヌクレオチド0.5 g (0.07 mmol 理論値)を、NaOH溶液からの濃縮によって脱塩し、NaHCO3水溶液 (0.1 M, 2.0 ml, pH 8.3)に溶解した。
【０１０３】
M+/++ =ナトリウム (ナトリウム (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート) を伴う式1cのGalNAcクラスター結合体131 mg (88.5 μmol, 1.2 当量)をDMF (0.65 ml)に懸濁させ、TNTU (32.6 mg, 0.09 mmol, 当量:1.21)を加えた。白色懸濁液を20〜25℃で1時間撹拌して、透明な溶液を得た。
【０１０４】
上で調製した活性化GalNAc溶液をオリゴヌクレオチド水溶液に1分かけて加え、撹拌を2.5時間続けると、HPLCは不完全な変換を示し、追加の活性化GalNAcクラスター結合体(GalNAcナトリウム塩(32.7 mg, 0.02 mmol, 0.3 当量)、DMF(0.15 ml)およびTNTU (8.3 mg, 0.02 mmol, 0.31 当量 1時間) から調製)を反応混合物に加えた。追加の1時間後、反応混合物を1-プロパノール (5 ml)でトリチュレートし、懸濁液を20〜25℃で30分間撹拌し、次いで30分間放置した。液体をデカントして油状物を残し、そこに1-プロパノール (2.5 ml)を加え、撹拌を16時間続けた。懸濁液をろ過し、黄色固体を1-プロパノール (0.9 ml)で2回洗浄し、真空乾燥して、生成物をHPLC純度65.6％ (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN) の黄色固体として得た(470 mg, 77.6%)。生成物をUPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 勾配A: 95% 水/2.5% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリメチルアミン, B: 17.5% 水/80% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmol トリエチルアミン)で同定した。UPLC-MS: m/z 7799.6 (予測値 7798.2)。
【０１０５】
実施例8 (ラージスケール例)
2021512082.tif 000026
限外ろ過によって脱塩した、配列
2021512082.tif 000027
を有する5'アミノ修飾オリゴヌクレオチドからなる20% w/w水溶液の1.77 kgを、NaHCO3によりpH 8.3〜8.5に調節した。
【０１０６】
M+/++ =ナトリウム (ナトリウム (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート) を伴う式1cのGalNAcクラスター結合体89.8 g (当量: 1.1)をDMF (450 ml)に懸濁させ、TNTU (22.2 g, 当量: 1.1)を加えた。黄色がかった溶液を20〜25℃で1時間撹拌した。
【０１０７】
上で調製した活性化GalNAc溶液をオリゴヌクレオチド水溶液に5分かけて加え、撹拌を2時間続けた。HPLCが不完全な変換を示し、追加の活性化GalNAc溶液を上のとおりに、M+/++ =ナトリウム (ナトリウム (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート) を伴う式1cのGalNAcクラスター結合体(8.2 g)、DMF (41 ml)中のTNTU (2.0 g)から調製した。この溶液をワンポットでオリゴヌクレオチド水溶液に加え、撹拌を追加の1時間、20〜25 ℃で継続した。
【０１０８】
反応混合物を分取RP-HPLC (YMC Triart C8-S 10マイクロメーター, H2O中MeCN/0.2M NaOAc, 45℃)により直接精製した。生成物を含む画分を合わせ、限外ろ過し、凍結乾燥して、HPLC純度91.34% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN）の白色凍結乾燥粉末(210 g, 27%)として生成物を得た。生成物を、UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm. 勾配A: 95％ 水/2.5% CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmolトリメチルアミン, B: 17.5％水/80％ CH3OH/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmolトリエチルアミン)で同定した。 UPLC-MS: m/z 7447.7 (予測値 7445.9)。
【０１０９】
精製した
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を高分解能質量分析で分析したところ、GalNAc糖リン酸化に関連した副生成物は検出されなかった。
【０１１０】
比較例 (WO2018/215391の実施例3Aと同様)
2021512082.tif 000029
GalNAc活性化: 
50.3 g (34.1 mmol, 1.6当量)のGalNAc-クラスターナトリウム塩を250 mlのDMFに20〜25℃で懸濁させ、250 mlのDMF中の1.63 ml (24.1 mmol, 1.13 当量)のリン酸85％水溶液の溶液を加えた。20〜25℃で5分後、5.88 g (51.1 mmol、2.40 当量)のN-ヒドロキシスクシンイミドを無色溶液に加え、続いて9.80 g (51.1 mmol, 2.40 当量)のEDC.HCl (N-(3-ジメチルアミノプロピル)- N'-エチルカルボジイミド-塩酸塩)1を加えた。無色のわずかに濁った溶液を20〜25℃で4時間撹拌し、カップリング段階に用いた。
【０１１１】
GalNAcカップリング:
136.4 g (21.3 mmol, 1.0当量)の
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をそのナトリウム塩として理論的に含む溶液2.27 kgに、42.8 ml (245 mmol, 11.3当量)のN-エチルジイソプロピルアミンおよび900 mLのDMSOを加え、溶液を40〜45℃に加温し、1分で上の活性化GalNAc溶液に加えた。黄色溶液を40℃で0.5時間撹拌して、そのナトリウム塩としての
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の粗溶液を得た。HPLCは、粗溶液において53.0 ％の面積を示した (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配 A: 水/CH3OH/MeCN/0.2M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/0.05 M ヘキシルアミン/0.04 M トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN 9:1)。この溶液を精製するまで4℃で保管した。上記のカップリング法を同じ規模で2回繰り返し、精製のために3つの個々の反応混合物を合わせた。
【０１１２】
反応混合物を分取RP-HPLC (YMC Triart C8-S 10マイクロメーター, H2O中MeCN/0.2M NaOAc, 45℃）で直接精製した。生成物を含む画分を合わせ、限外ろ過し、凍結乾燥して、HPLC純度90.35% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm, 260 nm, 勾配A: 水/CH3OH/MeCN M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/ヘキシルアミン/トリエチルアミン, B: CH3OH/MeCN）の白色凍結乾燥粉末 (355 g, 30%)として生成物を得た。生成物を、UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, カラム: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50 mm. 勾配A: 95％ 水/2.5% CH3OH/0.2 M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmolトリメチルアミン, B: 17.5％ 水/80％ CH3OH/0.2 M ヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3 mmolトリエチルアミン)で同定した。 UPLC-MS: m/z 7447.7 (予測値 7445.9)。
【０１１３】
精製した
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を高分解能質量分析で分析した。3個のGalNAc糖単位の1個がPO2-フラグメントで修飾されたリン酸ジエステル修飾生成物に起因する、質量7503.27984の副生成物が0.67％の存在量で検出された。また、3個のGalNAc糖単位の1個がHPO3-で修飾された構造Yのリン酸モノエステル修飾生成物に起因する、質量7521.32758の副生成物が0.79％の存在量で検出された。
【配列表】
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【国際調査報告】
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