(57)【要約】  ポリヌクレオチド分子、毒素、ポリヌクレオチド分子または他の薬学的に活性なペイロードを含有するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン−ナノ粒子または直接コンジュゲート複合体は、ＦＮ３ドメインライブラリーを目的のタンパク質またはヌクレオチドでパニングし、ＦＮ３ドメインを回収し、ＦＮ３ドメインを毒素またはＡＳＯもしくはｓｉＲＮＡ分子などの活性ポリヌクレオチドを含有するナノ粒子にコンジュゲートすることにより得られる。フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン−核酸コンジュゲートは、ＦＮ３ドメインライブラリーを目的のタンパク質またはヌクレオチドでパニングし、ＦＮ３ドメインを回収し、ＦＮ３ドメインを核酸（例えば、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡ）にコンジュゲートすることにより得られる。ナノ粒子複合体、核酸コンジュゲートまたはＦＮ３ドメイン毒素コンジュゲートは、疾患および状態、例えば、腫瘍学または自己免疫徴候の処置において使用しうる。
2021506802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン−ナノ粒子複合体を含む組成物であって、ナノ粒子の表面にコンジュゲートされたＦＮ３ドメインを含む、前記組成物。
【請求項２】
前記表面が前記ナノ粒子の外表面である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ナノ粒子が脂質ナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ナノ粒子がポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノ粒子がシクロデキストリンポリマーナノ粒子（ＣＤＰ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ナノ粒子がペグ化されている、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノ粒子がポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ナノ粒子がポリヌクレオチドをカプセル化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが化学修飾されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡ、Ｕ１アダプター、および免疫賦活性ポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、アンドロゲン受容体、ＥＧＦＲおよび／またはＫＲａｓを標的としたｓｉＲＮＡ分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ナノ粒子が、タンパク質、ペプチド、小分子化合物、および免疫賦活性剤からなる群から選択される追加の活性剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＦＮ３ドメインが、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ７１および／またはＣＤ８に結合する、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＦＮ３ドメインが、ＰＳＭＡまたはＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ７１および／もしくはＣＤ８に結合し、ナノ粒子が、ＡＲ、ＥＧＦＲおよび／またはＫＲａｓを標的としたｓｉＲＮＡ分子であるポリヌクレオチドを含む、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、ＣＤＰもしくは改変ＣＤＰ、脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子であり、前記ＦＮ３ドメインがＰＳＭＡに結合するＦＮ３ドメインであり、前記ｓｉＲＮＡ分子がＡＲを標的にする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、ＣＤＰもしくは改変ＣＤＰ、脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子であり、前記ＦＮ３ドメインがＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインであり、前記ｓｉＲＮＡ分子がＥＧＦＲまたはＫＲａｓを標的にする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、前記ＦＮ３が、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ７１および／またはＣＤ８に結合するＦＮ３ドメインである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＦＮ３ドメインが、クリックタイプの環化付加またはマレイミドコンジュゲーションを通じて前記ナノ粒子にコンジュゲートされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＡＳＯがＭＡＬＡＴ１に対して特異的である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
ＭＡＬＡＴ１に対して特異的である前記ＡＳＯが、配列番号４７または４８のポリヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のＦＮ３ドメイン−ナノ粒子複合体の組成物。
【請求項２１】
組成物が、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
（ｉ）目的のタンパク質またはヌクレオチドを用いてＦＮ３ドメインライブラリーをパニングする：
（ｉｉ）目的の前記タンパク質またはヌクレオチドに結合する前記ＦＮ３ドメイン分子を回収する：
（ｉｉｉ）前記ＦＮ３ドメインをナノ粒子とコンジュゲートする
ことを含む、ＦＮ３ドメイン−ナノ粒子複合体を調製する方法。
【請求項２３】
ＦＮ３ドメイン−ナノ粒子複合体を調製する方法であって、ＦＮ３ドメインをナノ粒子に、前記ＦＮ３ドメインを前記ナノ粒子にコンジュゲートして前記ナノ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で、接触させることを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記ナノ粒子がポリヌクレオチドを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡ、Ｕ１アダプター、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが治療的に活性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
コンジュゲートにコンジュゲートしているフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む組成物。
【請求項２８】
前記コンジュゲートが毒素である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記毒素がＭＭＡＦまたはＭＭＡＥである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＦＮ３ドメインが、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ７１および／またはＣＤ８に結合する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＦＮ３ドメインがＥｐＣＡＭに結合する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ＥｐＣＡＭに結合する前記ＦＮ３ドメインが、Ｔｙｒ２５、Ａｒｇ２６、Ｐｒｏ２７、Ｌｅｕ８１、Ｐｒｏ８２、およびＴｙｒ８５からなる群から選択される１つまたは複数の位置に置換を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３４】
配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６の配列を有するペプチドに少なくとも９０％の相同性を有する配列を含むペプチド。
【請求項３５】
配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６の配列を含む、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３６】
配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６の配列からなる、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３７】
配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６の配列を含むペプチドであって、少なくとも１つの残基が、６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、および９３の位置の残基に対応する位置でシステインで置換されている、ペプチド。
【請求項３８】
６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、および９３の位置の残基に対応する位置でシステインを含む、請求項３７に記載のペプチド。
【請求項３９】
ＥｐＣＡＭを発現する細胞を標的にする方法であって、細胞をＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインに接触させることを含む、前記方法。
【請求項４０】
ＥｐＣＡＭに結合する前記ＦＮ３ドメインがコンジュゲートにコンジュゲートされている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１４〜３８の配列、またはその変異体を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記コンジュゲートが前記ナノ粒子の表面である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ナノ粒子の表面にコンジュゲートした前記ナノ粒子が、活性剤またはポリヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記表面が前記ナノ粒子の外表面である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ナノ粒子が脂質ナノ粒子である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ナノ粒子がポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ナノ粒子がシクロデキストリンポリマーナノ粒子（ＣＤＰ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ナノ粒子がペグ化されている、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ナノ粒子がポリヌクレオチドを含む、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ナノ粒子がポリヌクレオチドをカプセル化する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドが化学修飾されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡ、Ｕ１アダプター、および免疫賦活性ポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリヌクレオチドが、ＡＲ、ＥＧＦＲおよび／またはＫＲａｓを標的としたｓｉＲＮＡ分子である、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ナノ粒子が、タンパク質、ペプチド、小分子化合物、および免疫賦活性剤からなる群から選択される追加の活性剤を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記コンジュゲートが毒素である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
前記コンジュゲートがタンパク質分解を標的にする複合体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５７】
前記コンジュゲートが、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する結合部分である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５８】
前記結合部分が、Ｅ３ユビキチンリガーゼおよびリンカーにより結合された標的タンパク質に結合するＰＲＯＴＡＣドメインである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５９】
ＥｐＣＡＭを発現する前記細胞が、乳房細胞、肺細胞、結腸細胞、卵巣細胞である、請求項４０〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
患者においてがんまたは自己免疫疾患を処置する方法であって、先行する請求項のいずれかの組成物またはペプチドを前記患者に投与して前記がんまたは前記自己免疫疾患を処置することを含む、前記方法。
【請求項６１】
前記がんが、乳がん、肺がん、結腸がん、または卵巣がんである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記がんが上皮がんである、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１４日提出の米国特許仮出願第６２／５９８，６５２号明細書の優先権を主張するものであり、これにより前記特許文献は参照によりその全体を組み込む。
【０００２】
電子的に提出される配列表への言及
本出願は配列表を含有し、これはＡＳＣＩＩ定型配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出され、ファイル名「６８９３０３．７ＷＯ配列表」、作成日付２０１８年１２月１３日、サイズ５８ｋｂを有する。ＥＦＳ−Ｗｅｂによって提出される配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【０００３】
本実施形態は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型様（ＦＮ３）ドメイン分子および／またはＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメイン分子を使用する治療薬の標的化送達に関する。一部の実施形態では、実施形態は、核酸ペイロード（コンジュゲート）または他の薬学的に活性なペイロードの送達のためのＦＮ３ドメイン分子の使用を対象とする。核酸または他のペイロードは、細胞特異的送達を可能にするＦＮ３ドメイン分子に会合しているナノ粒子にカプセル化されているもしくは会合している、またはＦＮ３ドメイン分子に直接コンジュゲートしている。
【背景技術】
【０００４】
核酸治療薬は、小分子、タンパク質およびワクチンに続く次の主要な治療法になる見込みのある新しい種類の医薬品である。核酸治療薬は、種々のオリゴ−およびポリヌクレオチドペイロードを必要な送達技術と共に含む。遺伝子ノックダウン（例えば、短干渉ＲＮＡ、ダイサー基質ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｕ１アダプター、等）、遺伝子編集（例えば、スプライス調節オリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ）および遺伝子発現または上方調節（例えば、ｍＲＮＡ、ｐＤＮＡ、ｍｃＤＮＡ、等の送達）を誘導する複数の核酸ペイロードがこれまでに開発されてきた。標的細胞の細胞質または核中への核酸ペイロードの送達に成功することが、モダリティがその治療可能性に到達するために必要とされることは、当技術分野では一般に認識されている。続く内部移行のために細胞表面抗原をそのようなペイロードの標的とすることは、効果的な細胞内送達への有望なアプローチである。短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、数え切れないほどの疾患を処置し予防する大きな可能性がある核酸治療薬の例である。ｓｉＲＮＡは、細胞内のいかなる遺伝子でも適合し発現停止させるように設計することが可能である点で他に類がない。遺伝子を発現停止すれば、患部組織において抗炎症効果から腫瘍細胞の完全除去までに及ぶ著しい治療効果をもたらすことが可能である。臨床前データによれば、ｓｉＲＮＡは疾患を処置する強力な新しい方法になることが示唆されるが、患部組織へのこれらのｓｉＲＮＡ分子のインビボ送達はこれまで難問であり治療有効性に対する大きな制約になっていた。
【０００５】
少数の重要なキーとなる属性：（１）不十分な血清安定性、（２）膜透過性の欠如、および（３）免疫原性が、核酸治療薬のインビボ送達を制限する。これらの制約のせいで、核酸は相補的送達プラットフォームと対になっていることが多い。例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡなどの核酸とナノ粒子を対にすることは、患部組織へのその送達を改善しつつ核酸ペイロードをインビボで保護するための広く採択されている戦略になっており、ｓｉＲＮＡ臨床試験のために著しい増加が見られている（Drug Discov Today Technol. 2012 Summer; 9(2):e71-e174.）
【０００６】
ナノ粒子−ｓｉＲＮＡ複合体は、臨床前および初期臨床試験において見込みをいくらか示したが、標的細胞の細胞内空間へのｓｉＲＮＡ送達の効率が悪かったせいでその有効性は限られる。ｓｉＲＮＡ−ナノ粒子の送達をさらに増強する新しいアプローチは、ナノ粒子を標的結合リガンドで装飾してｓｉＲＮＡ−ＮＰの特異性を上昇させ細胞内部移行を加速することである。そのようなアプローチは、小分子積載ナノ粒子の送達に効果的であることが判明しており（Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Apr 18;103(16) 6315-20）、ｓｉＲＮＡ送達において類似する利点をもたらす可能性がある。
【０００７】
もっと最近では、体循環でのペイロードの分解からの保護を提供するナノ粒子にカプセル化されたｍＲＮＡの送達を用いる臨床候補は臨床試験へと進んでいる。しかし、これまでのこのアプローチは、主に肝臓送達に限られており、肝外組織中へのｍＲＮＡの送達を可能にする次世代のターゲティングプラットフォームの必要性が強調されている。
【０００８】
あるいは、生体液中での安定性が実証されている化学修飾された一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド分子を、ターゲティングドメインとの直接コンジュゲートを調製するために使用してもよい。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにマイクロＲＮＡ模倣物およびアンタゴニストを含む、そのようなコンジュゲートの送達は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＥｐＣＡＭ）（J. Am.Chem. Soc. 2014 Dec 10; 136(49) 16958-16961）またはペプチド（Nucl. Acids Res. 2014 Oct; 42(18) 11805-11817）に特異的に結合する糖分子であるＧａｌＮＡｃを使用して実証されてきた。最近、抗体ＲＮＡコンジュゲートは、細胞表面受容体を介して結合し内部移行する一連の抗体を用いて調査されてきた（Nucl. Acids. Res. 2014 Dec 30 ePub）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
核酸−コンジュゲートまたは核酸−ナノ粒子複合体の送達のための理想的なターゲティングリガンドは、高親和性、高特異性、高安定性、効率的および部位特異的化学コンジュゲーションならびに小サイズを含むがこれらに限定されないいくつかの重要なキーとなる属性を有する。したがって、核酸−コンジュゲートまたは核酸−ナノ粒子複合体の送達のために細胞を標的にする改善された工程および／または組成物の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前述の概要、ならびに本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図と併せて読むとよりよく理解される。しかし、本出願は、図に示される正確な実施形態に限定されないことは理解されるべきである。
【００１１】
特許または出願ファイルは、カラーで作成される少なくとも１つの図を含有する。カラーの図（複数可）付きの本特許または特許出願のコピーは、請求および必要料金の支払いがあり次第特許局により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ−１Ｄ】は、Ｈ２９２細胞におけるＴｅｎｃｏｎ２５（対照）−超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）８３ｖ１０−ＳＰＩＯＮ、８３ｖ１２−ＳＰＩＯＮおよび８３ｖ１５−ＳＰＩＯＮの結合、ならびにｔｅｎｃｏｎ２５（対照）またはブランク細胞と比べて正方向にシフトしている８３ｖ１０、８３ｖ１２および８３ｖ１５に対応したピークの右へのシフトを示すフローサイトメトリーヒストグラムを示している。
【図２】は、４つの試料すべて（Ｔｅｎｃｏｎ２５−ＳＰＩＯＮ、８３ｖ１０−ＳＰＩＯＮ、８３ｖ１２−ＳＰＩＯＮおよび８３ｖ１５−ＳＰＩＯＮ）の結合の定量的比較を示している。
【図３】は、ナノ粒子に結合しているＦＮ３ドメイン分子によるＥＧＦＲリン酸化の阻害を示している。
【図４】は、ヨードアセトアミドＰＥＧ−ＭＭＡＦの構造を示している。
【図５】は、細胞株であるＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂおよびＰＣ３への抗ＰＳＭＡ抗体の結合を示すフローサイトメトリーヒストグラムを示している。
【図６】は、ＮＣＩ−Ｈ２９２（上）およびＮＣＩ−Ｈ１５７３（下）腫瘍細胞における１分子あたり１、２、３または４薬物を有する抗ＥＧＦＲ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎ薬物コンジュゲートのインビトロ細胞傷害性を示している。
【図７】は、非標的化または標的化Ｃｅｎｔｙｒｉｎ薬物コンジュゲートまたは溶媒を用いた投与に続くＨ２９２−腫瘍異種移植片についての増殖動態を示している。
【図８】は、ＳＥＣ精製後のＡＦ６４７標識ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子のサイズ分布を示している。
【図９】は、ＡＦ６４７標識８３−Ｃｅｎｔｙｒｉｎ標的化ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰの受容体密度依存性および用量依存性結合および内部移行を示している。
【図１０】は、ＥＧＦＲ発現細胞株である、ＨＣＣ８２７へのＡＦ６４７標識８３−Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（６０×）の細胞結合および内部移行を示している。
【図１１】は、ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯ−ＣｅｎｔｙｒｉｎコンジュゲートについてのＬＣＭＳ特徴付け結果を示している。
【図１２】は、フリー取込み（free uptake）によりＡＳＯまたはＣｅｎｔｒｙｉｎ−ＡＳＯで処置したＡ４３１細胞におけるｒｔ−ＰＣＲにより測定されたＭＡＬＡＴ１遺伝子発現を示している。
【図１３】は、ＭＡＬＡＴ１−ＣＤ８  ３６８  ＣｅｎｔｙｒｉｎコンジュゲートのＬＣ−ＭＳを示している。
【図１４】は、フリー取込みによりＡＳＯまたはＣｅｎｔｒｙｉｎ−ＡＳＯコンジュゲートで処置した一次Ｔ細胞におけるｒｔ−ＰＣＲにより測定されたＭＡＬＡＴ１遺伝子発現を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本実施形態は、例えば、核酸治療ペイロードまたは他のペイロードの送達のために使用できる細胞会合標的リガンドへのＦＮ３ドメイン分子を含む組成物およびそのようなＦＮ３ドメイン分子を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、活性部分は核酸分子を含有するナノ粒子であり、ＦＮ３ドメイン分子は、共有結合を通じてなどの、直接的または間接的にナノ粒子に結合されている。別の実施形態では、活性部分は、ＦＮ３ドメイン分子へ共有結合するよう操作された化学修飾核酸分子である。
【００１４】
ＦＮ３ドメイン分子はヒトテネイシン由来（参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許第８，２７８，４１９号明細書に記載されているｔｅｎｃｏｎ  ＦＮ３ドメイン由来、参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許第８，５６９，２２７号明細書に記載される安定化したｔｅｎｃｏｎＦＮ３ドメイン由来、または参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許第９，２００，２７３号明細書に記載される別の結合表面を有するｔｅｎｃｏｎ分子由来）、または他のフィブロネクチンドメイン由来（参照によりその全体を本明細書に組み込む米国特許第８，２９３，４８２号明細書に記載されるコンセンサスＦＮ３ドメイン）のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいていてよい。
【００１５】
一部の実施形態では、ナノ粒子はシクロデキストリンまたは改変シクロデキストリンを含有するポリマーを含むシクロデキストリンナノ粒子を含む。他の実施形態では、ナノ粒子は、２つまたはそれよりも多いポリマーで構成されたポリマーマトリックスで構成されている。さらに別の実施形態では、コポリマーはＰＬＧＡまたはＰＬＡおよびＰＥＧのコポリマーである。さらに別の実施形態では、ポリマーマトリックスは、ＰＬＧＡまたはＰＬＡならびにＰＬＧＡまたはＰＬＡおよびＰＥＧのコポリマーを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子である。一部の実施形態では、ナノ粒子はリポソームを含み、そこではリポソーム二分子層膜は、親水性ポリマーで誘導体化された小嚢形成脂質を含有する。別の実施形態では、ナノ粒子は、親水性ポリマーで被覆された超常磁性酸化鉄コアを含む。別の実施形態では、ナノ粒子はデンドリマーを含む。さらなる実施形態では、ナノ粒子は少なくとも１つの脂質および乳化剤を含む固体脂質ナノ粒子である。
【００１６】
別の実施形態では、ＦＮ３ドメイン分子は、システイン操作フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（米国特許出願第１４／５１２，８０１号明細書に記載されており、前記特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込む）。
【００１７】
本発明の別の態様は、細胞標的に対して結合特異性を有するＦＮ３ドメイン分子を治療活性のあるｓｉＲＮＡ分子を含有するナノ粒子と連結させることにより細胞リガンドを標的にし、組成物を対象または患者に投与する方法である。
【００１８】
一部の実施形態では、ナノ粒子はＣＤＰもしくは改変ＣＤＰまたは固体脂質ナノ粒子であり、ＦＮ３ドメイン分子は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的にし、ｓｉＲＮＡは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＥＧＦＲ、ＫＲａｓまたはＰＬＫ−１に対して活性である。１つの特定の実施形態では、ナノ粒子はＣＤＰもしくは改変ＣＤＰまたは固体脂質ナノ粒子であり、ＦＮ３ドメイン分子はＰＳＭＡを標的にし、ｓｉＲＮＡはＡＲに対して活性である。別の特定の実施形態では、ナノ粒子はＣＤＰもしくは改変ＣＤＰまたは固体脂質ナノ粒子であり、ＦＮ３ドメイン分子はＥＧＦＲまたはＰＳＭＡを標的にし、ｓｉＲＮＡはＥＧＦＲ、ＫＲａｓまたはＡＲに対して活性である。さらに別の特定の実施形態では、コンジュゲートは化学修飾ｓｉＲＮＡであり、ＦＮ３ドメインはＥＧＦＲまたはＰＳＭＡを標的にし、ｓｉＲＮＡはＰＬＫ−１に対して活性である。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ７１および／またはＣＤ８に結合するドメインである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、異なる分子に対して特異的である複数のドメインを含有する。
【００１９】
ＦＮ３ドメイン分子は、システイン残基を含有しないのでコンジュゲーションには好適である。したがって、独特のシステインを部位特異的変異誘発によりＦＮ３ドメイン分子に付加し、簡単で確立した化学を使用する部位特異的コンジュゲーションのために使用することができる。ナノ粒子ターゲティングまたは核酸コンジュゲートでは、部位特異的カップリングは、適切な標的結合に極めて重要であるターゲティングリガンドの配向を保証するので、キーとなる重要な利点である。標的化ナノ粒子では、ここに記載される３種の技術（ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子、ＦＮ３ドメイン分子）の混合は、遺伝子発現抑制または遺伝子送達のための高度に特異的で強力な治療薬を創造すると予想される。標的核酸コンジュゲートでは、最適化ＲＮＡ化学とＦＮ３ドメイン分子の組合せは、遺伝子発現抑制のための高度に特異的で強力な治療薬を創造すると予想される。
【００２０】
詳細な説明
本明細書で使用される用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）様ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）とは、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体および原核生物酵素を含むタンパク質中に頻繁に存在するドメインのことである（Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990）。例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣに存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、および、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号明細書に記載されている非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号およびタンパク質名により言及される。例えば、テネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、またはフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）などである。
【００２１】
本明細書で使用される用語「置換する（substituting）」もしくは「置換された（substituted）」または「突然変異する（mutating）」もしくは「突然変異した（mutated）」とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列において１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドを変更する、欠失するまたは挿入してその配列の変異体を作製することである。
【００２２】
本明細書で使用される用語「無作為化する（randomizing）」もしくは「無作為化された（randomized）」または「多様化された（diversified）」もしくは「多様化する（diversifying）」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列において少なくとも１つの置換、挿入または欠失を作ることである。
【００２３】
本明細書で使用される「変異体」とは、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドとは１つまたは複数の改変、例えば、置換、挿入または欠失で異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのことである。
【００２４】
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」または「特異的結合」とは、所定の抗原に解離定数（ＫＤ）１×１０−６Ｍもしくはそれ未満、例えば、１×１０−７Ｍもしくはそれ未満、１×１０−８Ｍもしくはそれ未満、１×１０−９Ｍもしくはそれ未満、１×１０−１０Ｍもしくはそれ未満、１×１０−１１Ｍもしくはそれ未満、１×１０−１２Ｍもしくはそれ未満、または１×１０−１３Ｍもしくはそれ未満で結合する本発明のＦＮ３ドメインの能力のことである。典型的には、本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用する表面プラズモン共鳴により測定した場合、所定の抗原に非特異的抗原（例えば、ＢＳＡまたはカゼイン）に対するそのＫＤの少なくとも１０分の１であるＫＤで結合する。
【００２５】
用語「ライブラリー」とは、変異体のコレクションのことである。ライブラリーは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド変異体で構成されていてもよい。
【００２６】
本明細書で使用される用語「安定性」とは、分子がその正常な機能活性、例えば、所定の抗原への結合、の少なくとも１つを保持するように、生理的条件下で折り畳まれた状態を維持する能力のことである。
【００２７】
本明細書で使用される「Ｔｅｎｃｏｎ」とは、米国特許第８，２７８，４１９号明細書に記載される配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのことである。
【００２８】
用語「ベクター」は、生物学的システム内で複製可能なまたはそのようなシステム間で移動させることができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的には、複製起点、ポリアデニル化シグナルまたは生物学的システムにおいてこれらのポリヌクレオチドの複製もしくは維持を促進するように機能する選択マーカーなどのエレメントを含有する。そのような生物学的システムの例は、細胞、ウイルス、動物、植物、およびベクターを複製することができる生物学的成分を利用する再構成された生物学的システムを含みうる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはこれらのハイブリッドでもよい。
【００２９】
用語「発現ベクター」は、生物学的システムでまたは再構成された生物学的システムで利用されて、発現ベクターに存在するポリヌクレオチド配列にコードされているポリペプチドの翻訳を指示することができるベクターを意味する。
【００３０】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格または他の等価な共有化学により共有結合されているヌクレオチドの鎖を含む分子を意味する。二本および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡはポリヌクレオチドの典型的な例である。
【００３１】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０アミノ酸未満の小ポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合がある。
【００３２】
本明細書で使用される「価」とは、分子中の抗原に対して特異的な結合部位の特定の数の存在を指す。したがって、用語「一価」、「二価」「四価」、および「六価」とは、分子中の抗原に対して特異的な、それぞれ１つ、２つ、４つおよび６つの結合部位の存在を指す。
【００３３】
本明細書で使用される「混合物」とは、互いに共有結合されていない２つまたはそれよりも多いＦＮ３ドメインの試料または調製物のことである。混合物は、２つまたはそれよりも多い同一のＦＮ３ドメインまたは異なったＦＮ３ドメインからなってもよい。
【００３４】
本発明の目的では、ナノ粒子はポリマーマトリックスを含む場合がある。一実施形態では、ポリマーマトリックスは２つまたはそれよりも多いポリマーを含む。別の実施形態では、ポリマーマトリックスは、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、フマル酸ポリプロピル（polypropylfumerates）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、もしくはポリアミン、またはそれらの組合せを含む。さらに別の実施形態では、ポリマーマトリックスは、１つまたは複数のポリエステル、ポリ酸無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、またはポリシアノアクリレートを含む。別の実施形態では、少なくとも１つのポリマーはポリアルキレングリコールである。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのポリマーはポリエステルである。別の実施形態では、ポリエステルはＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡおよびポリカプロラクトンからなる群から選択される。別の実施形態では、ポリマーマトリックスは、ＣＤＰまたは改変ＣＤＰ  ＰＥＧポリマーからなっていてもよい。別の実施形態では、ナノ粒子は脂質分子を含んでいてもよい。別の実施形態では、ナノ粒子は固体脂質ナノ粒子を含んでいてもよい。
【００３５】
組成物
本発明は、細胞標的に対する結合特異性を有し、活性ｓｉＲＮＡ分子を含有するもしくは化学修飾されたｓｉＲＮＡ分子に直接コンジュゲートされたＣＤＰもしくは改変ＣＤＰまたは固体脂質ナノ粒子に結合している単一特異性および多特異性（例えば、二重特異性）ＦＮ３ドメインを提供する。
【００３６】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリーからのＦＮ３ドメインの単離
Ｔｅｎｃｏｎは、ヒトテネイシンＣ由来の１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された天然には存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Jacobs et al.,  Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; U.S. Pat. Publ. No. 2010/0216708）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特徴的である７つのベータ鎖を接続する６つの表面露出ループを示しており、ベータ鎖はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと呼ばれ、ループはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループと呼ばれる（Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992; 米国特許第６，６７３，９０１号明細書）。これらのループ、またはそれぞれのループ内の選択された残基は、ｓｉＲＮＡを含有するＣＤＰもしくは改変ＣＤＰ  ＰＥＧまたは固体脂質ナノ粒子などの、活性剤のターゲティングに有用である細胞タンパク質およびヌクレオチドに結合する新規の分子を選択するのに使用可能であるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するために、無作為化することができる。
【００３７】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリー設計は、したがって、下に記載されるライブラリーＴＣＬ１またはＴＣＬ２などの、無作為化ＦＧループ、または無作為化ＢＣおよびＦＧループを有しうる。ＴｅｎｃｏｎＢＣループは７アミノ酸長であり、したがって、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸を、ＢＣループで多様化されたライブラリーにおいて無作為化し、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計しうる。ＴｅｎｃｏｎＦＧループは７アミノ酸長であり、したがって、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸を、ＦＧループで多様化されたライブラリーにおいて無作為化し、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計しうる。Ｔｅｎｃｏｎライブラリーにおけるループでのさらなる多様性は、ループでの残基の挿入および／または欠失により達成しうる。例えば、ＦＧおよび／またはＢＣループは１〜２２アミノ酸延長する、または１〜３アミノ酸減らしうる。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは７アミノ酸長であり、抗体重鎖における対応するループは４〜２８残基の範囲に及ぶ。最大多様性を与えるためには、ＦＧループを配列においてならびに長さにおいて多様化して、４〜２８残基の抗体ＣＤＲ３長範囲に対応させうる。例えば、ＦＧループは、追加の１、２、３、４または５アミノ酸ループを延長させることにより長さにおいてさらに多様化することができる。
【００３８】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリー設計は、ＦＮ３ドメインの側で形成され、２つまたはそれよりも多いベータ鎖および少なくとも１つのループを含む無作為化された代わりの表面も有しうる。１つのそのような別の表面は、ＣおよびＦベータ鎖中のアミノ酸ならびにＣＤおよびＦＧループにより形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。
【００３９】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリー設計は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３または８６位に置換を有し、その変異体が改善された熱安定性を示すＴｅｎｃｏｎ変異体などのＴｅｎｃｏｎ変異体に基づいて設計されるライブラリーも含む。例示的なＴｅｎｃｏｎ変異体は、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号明細書に記載されており、ベースＴｅｎｃｏｎ配列と比べた場合、置換Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉを有するＴｅｎｃｏｎ２７を含む。
【００４０】
【表１】
2021506802.tif 000003
【００４１】
Ｔｅｎｃｏｎおよび他のＦＮ３配列ベースのライブラリーは、無作為なまたは限定されたセットのアミノ酸を使用して選択された残基位置で無作為化することができる。例えば、無作為な置換を有するライブラリー中の変異体は、２０個の天然に存在するアミノ酸すべてをコードする、ＮＮＫコドンを使用して作製することが可能である。他の多様化スキームでは、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＣｙｓをコードするＤＶＫコドンを使用可能である。あるいは、２０個のアミノ酸残基すべてを生じ、同時に終止コドンの頻度を減らすＮＮＳコドンを使用可能である。多様化することになる位置に偏ったアミノ酸分布のあるＦＮ３ドメインのライブラリーを、例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（http:_//www_sloning_com）を使用して合成することができる。この技術は、何千もの遺伝子合成過程に十分な普遍的構成単位として作用する予め作られた二本鎖トリプレットのライブラリーを使用する。トリプレットライブラリーは、任意の所望のＤＮＡ分子を作るのに必要な考えられるあらゆる配列組合せを表す。コドン命名は周知のＩＵＢコードに従っている。
【００４２】
ターゲティングのために細胞タンパク質またはヌクレオチドに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、スキャフォールドタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片にライゲートして、それぞれのタンパク質がそれをコードするＤＮＡと安定的に会合しているインビトロ翻訳後に形成されるタンパク質−ＤＮＡ複合体のプールを作製するシスディスプレイを使用してＴｅｎｃｏｎライブラリーなどのＦＮ３ライブラリーを作製し（米国特許第７，８４２，４７６号明細書; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2806-2810, 2004）、当技術分野で公知であり実施例に記載される任意の方法により目的のタンパク質またはヌクレオチドへの特異的結合についてライブラリーをアッセイすることにより、単離することができる。使用可能な例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫アッセイ、ならびに競合および非競合アッセイである（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York参照）。目的のタンパク質またはヌクレオチドに特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメインは、その活性についてさらに特徴付けられる。
【００４３】
目的のタンパク質またはヌクレオチドに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、任意のＦＮ３ドメインを鋳型として使用してライブラリーを作製し、内部で提供される方法を使用して目的のタンパク質またはヌクレオチドに特異的に結合する分子を求めてライブラリーをスクリーニングして、作製することができる。使用可能な例示的なＦＮ３ドメインは、テネイシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン、Ｆｉｂｃｏｎ、およびフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメインである。標準クローニングおよび発現技法を使用して、ライブラリーをベクター中にクローニングするまたはライブラリーの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成して、ライブラリーをインビトロで発現する、または翻訳する。例えば、リボソームディスプレイ（Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997）、ｍＲＮＡディスプレイ（Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997）、または他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号明細書）が使用可能である。ＦＮ３ドメイン変異体のライブラリーは、例えば、任意の適切なバクテリオファージの表面に表示される融合タンパク質として発現させてもよい。バクテリオファージの表面に融合ポリペプチドを表示するための方法は周知である（米国特許出願公開第２０１１／０１１８１４４号明細書；国際公開第２００９／０８５４６２号パンフレット；米国特許第６，９６９，１０８号明細書；米国特許第６，１７２，１９７号明細書；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書；米国特許第６，４７２，１４７号明細書）。
【００４４】
目的のタンパク質またはヌクレオチドに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱フォールディングとアンフォールディングの熱安定性および可逆性を改善するなどのその特性を改善するように改変することができる。高度に類似する熱安定性の配列との比較に基づく合理的な設計、ジスルフィド架橋を安定化させる設計、アルファらせん傾向を増加させる突然変異、塩架橋の操作、タンパク質の表面電荷の変更、定向進化およびコンセンサス配列の組成物を含む、タンパク質および酵素のはっきりした熱安定性を増加するいくつかの方法が適用されてきた（Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001）。高い熱安定性は、発現されるタンパク質の収量を増やし、可溶性または活性を改善し、免疫原性を減らし、製造中のコールドチェーンの必要性を最小限に抑える可能性がある。Ｔｅｎｃｏｎの熱安定性を改善するよう置換することができる残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３または８６位であり、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号明細書に記載されている。これらの残基に対応する置換は、ＦＮ３ドメインまたは二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子に組み込むことができる。
【００４５】
タンパク質安定性およびタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性の同じまたは異なる面として見ることができる。タンパク質は、熱により、紫外線もしくは電離放射線により引き起こされる変性、液体溶液中の場合は環境浸透圧およびｐＨの変化、小孔サイズ濾過により加わる機械的剪断力、紫外線照射、ガンマ線照射によるなどの電離放射線、化学的もしくは熱脱水、またはタンパク質構造崩壊を引き起こしうる他の任意の作用もしくは力に対して感受性または「不安定性（ｌａｂｉｌｅ）」である。分子の安定性は、標準法を使用して決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準法を使用して、熱融解（「ＴＭ」）温度、分子の半分がアンフォールドされる摂氏（℃）温度を測定することにより決定することができる。典型的には、ＴＭが高くなるにしたがって、分子はそれだけ安定する。熱に加えて、化学的環境も、特定の三次元構造を維持するタンパク質の能力を変化させる。
【００４６】
一実施形態では、目的のタンパク質またはヌクレオチドに結合するＦＮ３ドメインは、ＴＭの増加により測定される操作に先立つ同じドメインと比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％またはそれよりも多い安定性の増加を示す。
【００４７】
化学的変性も同様に種々の方法により測定することができる。化学変性剤は、塩酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）；還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、および水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性およびイオン性界面活性剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質（phosopholipids））、ならびに標的化変性剤を含む。変性の程度の定量化は、標的分子に結合する能力などの機能的特性の喪失に頼る、または凝集する傾向、もとは溶媒が到達しにくい残基の露出、またはジスルフィド結合の崩壊もしくは形成などの物理化学的特性によることが可能である。
【００４８】
一実施形態では、目的のタンパク質またはヌクレオチドに結合するＦＮ３ドメインは、化学変性剤として塩酸グアニジウムを使用することにより測定される操作に先立つ同じスキャフォールドと比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％またはそれよりも多い安定性の増加を示す。増加した安定性は、周知の方法を使用して漸増する濃度の塩酸グアニジウムでの処理による減少するトリプトファン蛍光の関数として測定できる。
【００４９】
ＦＮ３ドメインは、例えば、標的分子結合の結合価、したがって、結合活性を高めるためのまたは２つもしくはそれよりも多い異なる標的分子に同時に結合する二重特異性もしくは多特異性スキャフォールドを作製するための手段として、モノマー、ダイマー、またはマルチマーとして作製してもよい。ダイマーおよびマルチマーは、例えば、アミノ酸リンカー、例えば、ポリグリシン、グリシンとセリン、またはアラニンとプロリンを含有するリンカーを包含することにより、単一特異的、二重特異的または多特異的タンパク質スキャフォールドを連結することにより作製しうる。例示的なリンカーは、（ＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）５、（ＡＰ）２、（ＡＰ）５、（ＡＰ）１０、（ＡＰ）２０、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ、リンカーを含む。ダイマーおよびマルチマーは、ＮからＣ方向に互いに連結しうる。ポリペプチドを連結して新規の連結融合ポリペプチドにするための天然に存在するならびに人工的なペプチドリンカーの使用は文献で周知である（Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; 米国特許第５，８５６，４５６号明細書）。さらに、ＦＮ３ドメインは、当技術分野で公知であるのと同じまたは類似する材料および方法を使用してｓｉＲＮＡを含有するナノ粒子に連結してもよい。
【００５０】
ＦＮ３ドメイン含有分子の変異体は本発明の範囲内である。例えば、得られた変異体が、親分子と比べた場合、目的のタンパク質またはヌクレオチドに対する類似する選択性および効力を保持している限り、ＦＮ３ドメイン含有分子において置換を行うことができる。例示的な改変は、例えば、親分子の特徴と類似する特徴を有する変異体をもたらす保存的置換である。保存的置換は、その側鎖において関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は４つのファミリー：（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；および（４）非電荷極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）に分けることができる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは芳香族アミノ酸として一緒に分類されることもある。あるいは、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、セリンとスレオニンは任意選択により、脂肪族ヒドロキシルとして別々にグループ分けされる；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；および（６）硫黄含有（システインおよびメチオニン）としてグループ分けすることができる（Stryer (ed.), Biochemistry, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981）。二重特異性分子の特性を改善するため異なるクラスのアミノ酸間でのアミノ酸残基の置換を含む非保存的置換をＦＮ３ドメイン含有分子に行うことが可能である。ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列の変化が機能的な相同体を生じるかどうかは、本明細書に記載されるアッセイを使用して、非改変ポリペプチドまたは断片に類似する形で応答を生じる改変ポリペプチドまたは断片の能力を評価することにより、容易に決定することができる。１つよりも多い置換が起きたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、同じ様式で容易に試験することができる。
【００５１】
半減期延長部分
ＦＮ３ドメイン含有分子は、例えば、共有結合相互作用により他のサブユニットを組み込んでもよい。本発明の一態様では、ＦＮ３ドメイン含有分子は半減期延長部分をさらに含む。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン結合タンパク質および／またはドメイン、トランスフェリンまたはトランスフェリン結合ドメインおよび断片およびその類似物、ならびにＦｃ領域である。
【００５２】
抗体定常領域のすべてまたは一部を本発明の分子に結合させて、抗体様の特性、特に、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方調節（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）などのＦｃエフェクター機能などの、Ｆｃ領域に関連する特性を分け与えてもよく、これらの活性の原因であるＦｃにおいて残基を改変することによりさらに改変することができる（概説については、Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691, 2009参照）。
【００５３】
所望の特性のために、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、異なる鎖長の脂肪酸および脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、アラキデート（arachidate）、ベヘン酸、オレイン酸、アラキドン酸、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸、および同類の物、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖または多糖）などの追加の部分を本発明の二重特異性分子に組み込んでもよい。これらの部分は、タンパク質スキャフォールドコード配列との直接融合物でもよく、標準クローニングおよび発現技法により作製してもよい。あるいは、周知の化学カップリング方法を使用して、部分を本発明の組換え的に産生された分子に結合させてもよい。
【００５４】
ＰＥＧ部分は、例えば、システイン残基を分子のＣ終端に組み込み、周知の方法を使用してペジル（pegyl）基をシステインに結合させることによりＦＮ３ドメイン分子に付加してもよい。
【００５５】
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
本発明は、ＦＮ３ドメインをコードする核酸を、インビトロ転写／翻訳のために使用される線形ＤＮＡ配列、原核生物、真核生物もしくは繊維状ファージ発現、組成物の分泌および／もしくはディスプレイ、またはその定方向突然変異原と適合性のベクターを含め、単離されたポリヌクレオチドとしてまたは発現ベクターの一部としてまたは線形ＤＮＡ配列の一部として提供する。
【００５６】
一部の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるＦＮ３ドメインをコードする。一部の実施形態では、ＦＮ３はＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書に記載される配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６またはその変異体のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、１４〜３８の配列、またはその変異体を含む。
【００５７】
ポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成装置上で固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により作製し、完全な一本鎖または二本鎖分子に組み立てうる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ＰＣＲとそれに続くルーチン的なクローニングなどの他の技法により作製してもよい。所与の分かっている配列のポリヌクレオチドを作製するまたは得るための技法は、当技術分野では周知である。
【００５８】
ポリヌクレオチドは、プロモーターまたはエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するシス配列、および同類の物などの少なくとも１つの非コード配列を含みうる。ポリヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質の精製もしくは検出を促進するためのヒスチジンタグもしくはＨＡタグなどのマーカーもしくはタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡなどの融合タンパク質パートナー、ＦｃまたはｐＩＸもしくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質をコードする追加のアミノ酸をコードする追加の配列も含みうる。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現のためのベクター、トランスポゾンベースのベクターまたは任意の手段による所与の生物もしくは遺伝的背景中へのポリヌクレオチドの導入に適した他の任意のベクターでもよい。そのようなベクターは、そのようなベクターによりコードされるポリペプチドの発現を制御する、調節する、引き起こすまたは可能にすることができる核酸配列エレメントを含む発現ベクターでもよい。そのようなエレメントは、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、および所与の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含みうる。そのような発現系は、細胞ベースのまたは当技術分野で周知の無細胞系でもよい。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。本発明のＦＮ３ドメイン含有分子は、当技術分野では周知であるように、任意選択で、細胞株、混合細胞株、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団により産生することができる。例えば、Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)を参照されたい。
【００６１】
発現のために選択される宿主細胞は、哺乳動物起源でもよく、またはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫もしくは植物細胞、またはその任意の派生的、不死化されたもしくは形質転換された細胞から選択してもよい。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化できない種または生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、および天然のまたは操作された大腸菌（E. coli）種、クリブシエラ（Klebsiella）種、もしくはシュードモナス（Pseudomonas）種系統のいずれかなどの原核細胞または生物から選択してもよい。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、ＦＮ３ドメイン含有分子が発現されるような条件下で単離された宿主細胞を培養すること、およびドメインまたは分子を精製することを含む、ＦＮ３ドメイン含有分子を産生する方法である。
【００６３】
ＦＮ３ドメイン含有分子は、周知の方法により、例えば、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、組換え細胞培養物から精製することができる。
【００６４】
投与／医薬組成物
治療用途では、ＦＮ３ドメイン含有分子は、薬学的に許容される担体中に活性成分としてドメインまたは分子の有効量を含有する医薬組成物として調製しうる。用語「担体」とは、活性化合物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒のことである。そのような溶媒は、水ならびにピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油および同類の物などの石油、動物、植物または合成起源の油を含む油などの液体が可能である。例えば、０．４％の生理食塩水および０．３％のグリシンを使用できる。これらの溶液は無菌であり、一般的に微粒子状物質がない。これらの溶液は、従来の周知の殺菌技法（例えば、濾過）により無菌化してもよい。組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤ならびに着色料、等などの生理的条件に近似するのに必要な薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。そのような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は、幅広く、すなわち、約０．５％重量％未満、通常は、約１％重量％または少なくとも約１重量％から１５または２０重量％にまでも異なることがあり、選択された特定の投与様式に従って、主に、必要とされる用量、液量、粘度、等に基づいて選択される。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、を含む適切な溶媒および製剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092（特にpp. 958-989を参照されたい）に記載されている。
【００６５】
ＦＮ３ドメイン含有分子の治療用途のための投与様式は、非経口投与などの、薬剤を宿主に送達するいかなる適切な経路、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内もしくは皮下、肺；経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）；製剤を錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子で使用する；ならびに注射器、体内埋め込み装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに含有される；または当技術分野で周知である、当業者が認識している他の手段でもよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（intracavitary）、腔内（intracelial）、小脳内、側脳室内、結腸内、子宮頚部内、胃内、肝内、心臓内、骨内（intraosteal）、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、または経皮送達により達成されうる。
【００６６】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍｌの無菌緩衝水、および約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇまたはさらに好ましくは、約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のＦＮ３ドメインを含有するように調製しうる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの無菌リンゲル液、および約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、例えば、約５ｍｇ〜約２５ｍｇのＦＮ３ドメイン含有分子を含有するように調合しうる。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知であり、さらに詳細には、例えば、"Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PAに記載されている。
【００６７】
ＦＮ３ドメイン含有分子は、貯蔵のために凍結乾燥させ、使用に先立って適切な担体で復元することができる。この技法は、従来のタンパク質調製物に効果的であることが明らかにされており、当技術分野で公知の凍結乾燥および復元技法を用いることができる。
【００６８】
ＦＮ３ドメイン含有分子は、単一用量で対象に投与してもよく、または投与は、例えば、１日、２日、３日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１カ月、５週間、６週間、７週間、２カ月もしくは３カ月後に繰り返してもよい。反復投与は同じ用量でも異なる用量でも可能である。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれよりも多く繰り返すことが可能である。
【００６９】
ＦＮ３ドメイン含有分子は、第２の治療薬と組み合わせて同時に、逐次または別々に投与してもよい。第２の治療薬は、化学療法薬、抗血管新生薬、または細胞傷害性薬物でもよい。がんを処置するために使用される場合、ＦＮ３ドメイン含有分子は、手術、放射線療法、化学療法またはそれらの組合せなどの従来のがん療法と組み合わせて使用してもよい。
【００７０】
一部の実施形態では、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン−ナノ粒子複合体を含む組成物が提供され、組成物はナノ粒子の表面にコンジュゲートされたＦＮ３ドメインを含む。コンジュゲーションは、共有結合または静電相互作用を通じてなどの非共有結合が可能である。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインはナノ粒子の外部表面と会合している、結合している、または他の方法で連結している。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン分子は、膜貫通タンパク質に類似して、ナノ粒子の表面を通じて会合している。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン分子はナノ粒子の表面を交差し（横切っ）てはいない。ナノ粒子は、脂質ナノ粒子などの、本明細書で提供されるままで可能である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、シクロデキストリンポリマーナノ粒子（ＣＤＰ）などのシクロデキストリンナノ粒子である。一部の実施形態では、ナノ粒子はペグ化されている。ここでのあるタイプのナノ粒子の記述は、実例目的のみをめざしており、本明細書で開示されるまたは公知である他のナノ粒子は、ＦＮ３ドメイン分子ナノ粒子複合体において使用可能である。
【００７１】
一部の実施形態では、ナノ粒子はポリヌクレオチドを含む（含有する）ことができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドによりカプセル化することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むＦＮ３ドメイン−ナノ粒子複合体は、ＦＮ３ドメインとの相互作用を通じて細胞に結合し、ポリヌクレオチドを、例えば、細胞内に内部移行されることにより細胞に送達することができる。ポリヌクレオチドは、化学修飾ポリヌクレオチドなどの、いかなるタイプのポリヌクレオチドでも可能である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡ、Ｕ１アダプター、もしくは免疫賦活性ポリヌクレオチド、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、アンチセンス、またはｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００７２】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、活性剤を含む（含有する）またはカプセル化する。活性剤は、本明細書で提供される場合、ポリヌクレオチドに付け加えられるまたはポリヌクレオチドに取って代わることも可能である。一部の実施形態では、活性剤は、タンパク質、ペプチド、小分子化合物、もしくは免疫賦活性剤、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、小分子は、ＦＮ３ドメイン分子に結合している細胞型に送達することができる治療薬または毒素である。
【００７３】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ７１および／もしくはＣＤ８、またはそれらの任意の組合せに結合する。ＰＳＭＡ  ＦＮ３ドメインの例は、例えば、米国特許出願第１５／１４８３１２号明細書に見出すことができ、前記特許文献はこれによって参照によりその全体を組み込む。ＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメインの例は、例えば、米国特許出願第１４／０８５３４０号明細書および米国特許出願第１４／０８６２５０号明細書に見出すことができ、前記特許文献のそれぞれはこれによって参照によりその全体を組み込む。ＥｐＣＡＭ  ＦＮ３ドメインの例は、例えば、本明細書に提供されている。ＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメインの例は、例えば、米国特許出願第１４／０８５３４０号明細書および米国特許出願第１４／０８６２５０号明細書に見出すことができ、前記特許文献のそれぞれはこれによって参照によりその全体を組み込む。ＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメインの例は、例えば、米国特許出願第１５／８３９９１５号明細書に見出すことができ、前記特許文献のそれぞれはこれによって参照によりその全体を組み込む。他のＦＮ３ドメインも使用することが可能である。
【００７４】
本明細書で提供されるように、ＦＮ３ドメインはナノ粒子にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、クリックタイプの環化付加またはマレイミドコンジュゲーションを通じてＦＮ３にコンジュゲートされる。
【００７５】
一部の実施形態では、組成物は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分も含むことができる。
【００７６】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン−ナノ粒子複合体を調製する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、（ｉ）目的のタンパク質またはヌクレオチドでＦＮ３ドメインライブラリーをパニングすること：（ｉｉ）目的のタンパク質またはヌクレオチドに結合するＦＮ３ドメイン分子を回収すること；および（ｉｉｉ）ＦＮ３ドメイン分子をナノ粒子とコンジュゲートすることを含む。
【００７７】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン−ナノ粒子複合体を調製する方法が提供される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインをナノ粒子にコンジュゲートしてナノ粒子複合体を形成するのに十分な条件下でＦＮ３ドメインをナノ粒子に接触させることを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子はポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡ、Ｕ１アダプター、および免疫賦活性ポリヌクレオチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは治療的に活性である。一部の実施形態では、複合体は本明細書で提供される活性剤を含む。
【００７８】
一部の実施形態では、コンジュゲートにコンジュゲートされたフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む組成物が提供される。コンジュゲートは細胞に送達されるペイロードと呼ぶこともできる。送達は、例えば、細胞へのＦＮ３ドメインの内部移行を通じて内部的に行うことが可能であり、または外部的に行うことも可能であり、コンジュゲートはＦＮ３ドメインが結合する細胞と相互作用することができる。一部の実施形態では、コンジュゲート（ペイロード）が本明細書で提供される。一部の実施形態では、コンジュゲートは毒素である。一部の実施形態では、毒素はＭＭＡＦまたはＭＭＡＥである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ７１および／またはＣＤ８に結合する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインはＥｐＣＡＭに結合する。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、Ｔｙｒ２５、Ａｒｇ２６、Ｐｒｏ２７、Ｌｅｕ８１、Ｐｒｏ８２、およびＴｙｒ８５からなる群から選択される１つまたは複数の位置に置換を含む。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインである。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書に記載される配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６のアミノ酸配列またはそれらの変異体を含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、１４〜３８の配列、またはそれらの変異体を含む。
【００７９】
一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインを含むペプチドが提供される。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインはＥｐＣＡＭに特異的に結合する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６の配列を含むまたはからなる。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書に記載される配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６のアミノ酸配列またはそれらの変異体を含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、１４〜３８の配列またはそれらの変異体を含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６のアミノ酸配列の１つに６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性であるアミノ酸配列を含む。パーセント同一性は、ＮＣＢＩウェブサイトを通じて入手可能であるＢｌａｓｔＰを使用して２つの配列を整列させるためのデフォルトパラメータを使用して判定することができる。
【００８０】
一部の実施形態では、配列は以下の通りである。
【００８１】
【表Ａ−１】
2021506802.tif 000004
【００８２】
【表Ａ−２】
2021506802.tif 000005
【００８３】
【表Ａ−３】
2021506802.tif 000006
【００８４】
【表Ａ−４】
2021506802.tif 000007
【００８５】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書で提供される配列の１〜５個の置換または突然変異を含有する。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６の配列を含み、少なくとも１つの残基が、６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、および９３の位置の残基に対応する位置でシステインで置換されている。一部の実施形態では、ペプチドは、６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、および９３の位置の残基に対応する位置でシステインを含む。
【００８６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭまたは他のＦＮ３ドメインを発現する細胞を標的にする方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、細胞を、本明細書で提供されるＥｐＣＡＭまたは他のＦＮ３ドメインに結合するＦＮ３ドメインに接触させることを含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭまたは他のＦＮ３ドメインに結合するＦＮ３ドメインはコンジュゲート（ペイロード）にコンジュゲートされている。本明細書に記載されるコンジュゲート（ペイロード）に加えて、コンジュゲートは異種分子にコンジュゲートされたＦＮ３ドメインも含むことができる。一部の実施形態では、異種分子は、検出可能な標識または細胞傷害性薬などのしかしこれに限定されない治療薬である。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは検出可能な標識にコンジュゲートされている。検出可能な標識の非限定的例は本明細書で提供される。
【００８７】
一部の実施形態では、治療薬にコンジュゲートされているＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインが提供される。細胞傷害性薬などのしかしこれに限定されない治療薬、ポリヌクレオチド、または本明細書で提供される治療薬などのしかしこれに限定されない他のタイプの治療薬の非限定的例。
【００８８】
検出可能な標識にコンジュゲートされているＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインを使用して、腫瘍組織などの試料上でＥｐＣＡＭの発現をインビボまたはインビトロで評価することができる。
【００８９】
検出可能な標識は、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインにコンジュゲートしている場合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または他の化学的方法によって、ＥｐＣＡＭを検出可能にする組成物を含む。
【００９０】
例示的な検出可能な標識は、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素（fluorescent dyes）、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されているような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素（fluorochromes）、フルオロフォア、蛍光消光剤、着色分子、放射性同位元素、シンチラント（scintillants）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、フラグタグ（Flag tags）ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、および比色原基質（colorimetric substrates）を含むがこれらに限定されない。
【００９１】
検出可能な標識は、検出可能な標識が放射性同位元素である場合などの、シグナルを同時に発してもよい。一部の実施形態では、検出可能な標識は、磁場もしくは電場、または電磁場などの、外的刺激により刺激される結果としてシグナルを発する。
【００９２】
例示的な放射性同位元素は、γ−放出、オージェ放出、β−放出、アルファ−放出または陽電子放出放射性同位元素でもよい。例示的な放射性同位元素は、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃおよび２２７Ａｃを含む。
【００９３】
例示的な金属原子は、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタニウム原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジウム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユーロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バークリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルニウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、またはローレンシウム原子などの２０を超える原子番号の金属である。
【００９４】
一部の実施形態では、金属原子は２０を超える原子番号のアルカリ土類金属である。
【００９５】
一部の実施形態では、金属原子はランタニドである。
【００９６】
一部の実施形態では、金属原子はアクチニドである。
【００９７】
一部の実施形態では、金属原子は遷移金属である。
【００９８】
一部の実施形態では、金属原子は貧金属である。
【００９９】
一部の実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、およびガドリニウム原子でもよい。
【０１００】
一部の実施形態では、金属原子は、原子番号５３（すなわち、ヨウ素）から８３（すなわち、ビスマス）までの金属でもよい。
【０１０１】
一部の実施形態では、金属原子は磁気共鳴画像法に適した金属でよい。
【０１０２】
金属原子は、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、およびＺｎ２＋などの＋１、＋２、または＋３酸化状態の形態の金属イオンでもよい。金属原子は、酸化鉄、酸化マンガン、または酸化ガドリニウムなどの金属酸化物を含んでいてもよい。
【０１０３】
適切な色素は、例えば、５（６）−カルボキシフルオセイン、ＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤマレイミドまたはＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル染料、および同類の物などの、任意の市販の染料を含む。
【０１０４】
適切なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅｓ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４；Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（ＮＩＲ）（７００〜９００ｎｍ）蛍光色素、およびカルボシアニンおよびアミノスチリル色素である。
【０１０５】
検出可能な標識にコンジュゲートされたＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、例えば、イメージング剤として使用して、腫瘍分布、腫瘍細胞の存在および／または腫瘍の再発についての診断を評価してもよい。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、細胞傷害性薬などのしかしこれに限定されない治療薬にコンジュゲートされている。
【０１０７】
一部の実施形態では、治療薬は、化学療法薬、薬物、増殖阻害薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素またはその断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート（radioconjugate））である。
【０１０８】
本明細書に開示される治療薬にコンジュゲートされたＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、ＥｐＣＡＭ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）、およびそこでの細胞内蓄積への治療薬の標的化送達に使用してもよい。いかなる特定の理論にも縛られていないが、このタイプの送達は、これらの非コンジュゲート剤の全身投与が正常細胞に受け入れられないレベルの毒性をもたらす可能性があるところでは助けになることができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、治療薬は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、トポイソメラーゼ阻害、ＤＮＡ架橋結合、キレート化、スプライソソーム阻害、ＮＡＭＰＴ阻害、およびＨＤＡＣ阻害などのしかしこれらに限定されない機構によりその細胞傷害性および／または細胞分裂停止効果を誘発することができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、治療薬は、スプライソソーム阻害薬、ＮＡＭＰＴ阻害薬、またはＨＤＡＣ阻害薬である。一部の実施形態では、薬剤は、免疫系アゴニスト、例えば、ＴＬＲ７，８，９、ＲＩＧ−Ｉ（ｄｓＲＮＡ）、およびＳＴＩＮＧ（ＣｐＧ）アゴニストである。一部の実施形態では、薬剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイドまたはカリケアマイシンである。
【０１１１】
一部の実施形態では、治療薬は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ダイアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、またはトリコテセンなどの酵素的に活性な毒素である。
【０１１２】
一部の実施形態では、治療薬は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、または１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
【０１１３】
一部の実施形態では、治療薬は、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチド性類似物および誘導体、オーリスタチンまたはモノメチルオーリスタチンフェニルアラニンである。例示的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号明細書および米国特許第５，７８０，５８８号明細書に開示されている。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞分裂を妨害し（Woyke et al (2001) Antimicrob Agents and Chemother. 45(12):3580-3584）、抗がんおよび抗真菌活性を有することが明らかにされている。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）終端またはＣ（カルボキシル）終端を通じて（国際公開第０２／０８８１７２号パンフレット）またはＦＮ３ドメイン中に操作され入れられた任意のシステインを介してＦＮ３ドメインに結合させてもよい。
【０１１４】
一部の実施形態では、治療薬は、例えば、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシンおよびマイタンシノイド、タキサン、ベンゾジアゼピンもしくはベンゾジアゼピン含有薬物（例えば、ピロロ［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）またはビンカアルカロイドが可能である。
【０１１５】
一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、治療化合物にコンジュゲートされており、これは、例えば、がん、腸の自己免疫疾患、肺疾患、および同類の物の処置のために使用することができる。自己免疫疾患の例は、免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎、１型糖尿病、移植、またはＧＶＨＤを含むがこれらに限定されず、その方法は、請求項１に記載のいずれかの治療化合物を対象に投与して、自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎、１型糖尿病、移植、またはＧＶＨＤを処置することを含む。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎を含むがこれらに限定されない。自己免疫疾患の他の例は、１型糖尿病、多発性硬化症、心筋炎（Cardiomyositis）、白斑、脱毛、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、シェーグレン症候群、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、強皮症／全身性硬化症（ＳＳｃ）または関節リウマチおよび同類の物を含むがこれらに限定されない。
【０１１６】
一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、乳がん、肺がん、結腸がん、または卵巣がんである。一部の実施形態では、がんは上皮がんである。
【０１１７】
「処置する（treat）」または「処置（treatment）」とは、治療処置および予防処置のことであり、目的は、がんの発症または転移などの望ましくない生理的変化または障害を予防するまたは速度を落とす（速度を緩める）ことである。一部の実施形態では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であれ検出不可能であれ、症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の安定化状態（すなわち、悪化していない）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の寛解または緩和、および軽快（部分的であれ全体的であれ）を含むがこれらに限定されない。「処置」は、処置を受けない場合の予想される生存と比べて生存を延長することも意味することができる。処置を必要とするヒトは、状態もしくは障害をすでに持つヒトならびに状態もしくは障害を抱えやすいヒトまたは状態もしくは障害を予防するべきであるヒトを含む。
【０１１８】
「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに、投与量でおよび必要な期間で効果的な量のことである。本明細書に記載されるＥｐＣＡＭまたは他のタンパク質に結合するＦＮ３ドメインの治療有効量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因に従って変動することがある。本明細書に記載されるＥｐＣＡＭまたは他のタンパク質に結合する効果的なＦＮ３ドメインの例示的な指標は、患者の改善された健康状態、腫瘍サイズの減少もしくは縮小、腫瘍の停止したもしくは減速された増殖、および／またはがん細胞の身体の他の場所への転移がないことである。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書に提供される疾患または状態を処置するための化合物は、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ干渉分子、またはアンチセンス構築物などのしかしこれらに限定されない核酸分子である。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉分子は、低分子干渉ＲＮＡ分子または低分子ヘアピン型ＲＮＡ干渉分子である。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉分子は、例えば、宿主において複製するウイルスの能力を妨害することによる抗ウイルス薬、または本明細書に記載される他のポリヌクレオチドである。
【０１２０】
ＥｐＣＡＭに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、公知の方法を使用して検出可能な標識にコンジュゲートしてもよい。一部の実施形態では、検出可能な標識はキレート剤と複合体化される。一部の実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介してＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインにコンジュゲートされている。
【０１２１】
検出可能な標識、治療化合物、または細胞傷害性化合物は、公知の方法を使用してＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインに直接的に、または間接的に連結してもよい。適切なリンカーは当技術分野では公知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ−スクシンイミジルベンゾエート（succimidyl-benzoates）の誘導体；ドデカボラート（dodecaborate））、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナートベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、および１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体などのマクロサイクリックス（macrocyclics）と非環式キレート剤の両方のキレート化部分、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（iminothiolane）（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなどの）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベリン酸塩などの）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなどの）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどの）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどの）、ジイソシアン酸（トルエン２，６−ジイソシアン酸などの）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどの）、ならびに他のキレート部分を含む。適切なペプチドリンカーは周知である。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、腎クリアランスにより血液から取り除かれる。
【０１２３】
本明細書に提供されるように、一部の実施形態では、コンジュゲート（ペイロード）はナノ粒子の表面に連結される。ナノ粒子は、本明細書に提供される方法のいずれかにおいて使用するための本明細書に記載されるいかなるナノ粒子でも可能である。一部の実施形態では、コンジュゲートは、タンパク質分解を標的にする複合体である。一部の実施形態では、コンジュゲートは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する結合部分である。一部の実施形態では、結合部分は、Ｅ３ユビキチンリガーゼおよびリンカーにより結合された標的タンパク質に結合するＰＲＯＴＡＣドメインである。
【０１２４】
一部の実施形態では、標的にされる細胞はＥｐＣＡＭを発現する細胞である。一部の実施形態では、細胞は、乳房細胞、肺細胞、結腸細胞、卵巣細胞である。一部の実施形態では、細胞は上皮細胞である。
【０１２５】
一部の実施形態では、患者においてがんを処置する方法が提供され、方法は本明細書に記載される組成物またはペプチドを患者に投与してがんを処置することを含む。一部の実施形態では、がんは、乳がん、肺がん、結腸がん、または卵巣がんである。一部の実施形態では、がんは上皮がんである。一部の実施形態では、がんは、ＥｐＣＡＭまたは本明細書に記載される他のＦＮ３ドメインを発現するまたは過剰発現するがんである。
【０１２６】
一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭまたは本明細書で提供される複合体に結合するＦＮ３ドメインを含むキットが提供される。キットは、治療用途のためにおよび診断用キットとして使用してもよい。
【０１２７】
一部の実施形態では、キットは、ＥｐＣＡＭまたは本明細書に記載される他のタンパク質に結合するＦＮ３ドメインおよびＦＮ３ドメインを検出するまたはＦＮ３に標的にされた細胞に複合体もしくはＦＮ３ドメインを送達するための試薬を含む。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、キレート化、または他の方法でのカップリングに有用である薬剤、放射線防御組成物；撮像、診断または治療目的のための投与用にＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインを調製するための装置または他の材料；薬学的に許容される担体；および対象への投与のための装置または他の材料を含む１つまたは複数の他の要素を含むことができる。
【０１２８】
一部の実施形態では、キットは、配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６の１つのアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、本明細書に記載される配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６のアミノ酸配列またはその変異体を含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは１４〜３８の配列、またはその変異体を含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物または方法において使用されるＦＮ３ドメインは、配列番号１〜６、８〜１１、１４〜３８および４０〜４６のアミノ酸配列または変異体を含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合するＦＮ３ドメインは、１４〜３８の配列、またはその変異体を含む。
【０１３０】
本明細書で提供される配列は、タンパク質のＮ−またはＣ−終端にＨＩＳタグまたはＨＩＳ−Ｃタグを含んでもよい。これらのＮ−またはＣ−終端配列は、取り除かれ含まれないことが可能である。例えば、配列番号４０は、ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＣＤＳＡＲＬＳＷＤＤＰＷＡＦＹＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＭＲＧＬＰＬＳＡＩＦＴＴＧＧＨＨＨＨＨＨとして示され、一部の実施形態では、６個のＨｉｓタグが取り除かれて、ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＣＤＳＡＲＬＳＷＤＤＰＷＡＦＹＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＭＲＧＬＰＬＳＡＩＦＴＴＧＧ（配列番号４９）となる。Ｃ終端タグは含まれないことが可能であるまたは精製もしくは検出目的で使用することができる。
【０１３１】
ある特定の用語で実施形態を記載してきたが、実施形態は以下の実施例も含み、これは特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３２】
[実施例１]Ｔｅｎｃｏｎライブラリーの構築
Ｔｅｎｃｏｎは、ヒトテネイシンＣ由来の１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された免疫グロブリン様スキャフォールド、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのベータ鎖を接続する６つの表面露出ループを示す。これらのループ、またはそれぞれのループ内の選択された残基は、特定の標的に結合する新規の分子を選択するのに使用することができるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するために無作為化することができる。
Ｔｅｎｃｏｎ：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ：（配列番号３９）
【０１３３】
ＴＣＬ１ライブラリーの構築
ＴｅｎｃｏｎのＦＧループのみを無作為化するように設計されたライブラリー、ＴＣＬ１は、シス−ディスプレイシステムを用いて使用するために構築された（Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012）。このシステムでは、Ｔａｃプロモーター、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーコード配列、ＲｅｐＡコード配列、シス−エレメント、およびｏｒｉエレメントについての配列を組み込んでいる一本鎖ＤＮＡが作製される。インビトロ転写／翻訳システムにおいて発現すると、それがコードされているＤＮＡにシスで結合しているＴｅｎｃｏｎ−ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体が産生される。次に、下に記載されるように、標的分子に結合する複合体は単離され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される。
【０１３４】
シス−ディスプレイを用いて使用するためのＴＣＬ１ライブラリーの構築は、最終線形二本鎖ＤＮＡ分子を半分に分けて作製するＰＣＲの連続ラウンドにより達成された；５’断片はプロモーターおよびＴｅｎｃｏｎ配列を含有し、３’断片はｒｅｐＡ遺伝子ならびにシス−およびｏｒｉエレメントを含有する。半分に分けたこれらの部分は、全構築物を作製するために制限消化により組み合わされる。ＴＣＬ１ライブラリーは、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号５０）でのみ無作為アミノ酸を組み込むように設計された。ＮＮＳコドンはこのライブラリーの構築において使用され、２０のアミノ酸すべておよび１つの停止コドンのＦＧループ中への考えられる組込みが生じた。ＴＣＬ１ライブラリーは６つの別々のサブライブラリーを含有し、多様性をさらに増やすために、それぞれが、７〜１２残基の異なる無作為化ＦＧループ長を有する。ｔｅｎｃｏｎベースのライブラリーの設計は表２に示されている。
【０１３５】
【表２】
2021506802.tif 000008
【０１３６】
ＴＣＬ１ライブラリーを構築するため、ＰＣＲの連続ラウンドを実施して、Ｔａｃプロモーターを付加し、Ｆ：Ｇループ中に縮重を築き、最終的な組み立てのために必要な制限部位を加えた。先ず、プロモーター配列およびＦＧループのＴｅｎｃｏｎ配列５’を含有するＤＮＡ配列をＰＣＲにより２ステップで作製した。完全Ｔｅｎｃｏｎ遺伝子配列に対応するＤＮＡは、プライマーＰＯＰ２２２０およびＴＣ５’からＦＧと一緒にＰＣＲ鋳型として使用した。この反応から得られたＰＣＲ産物を、プライマー１３０マーおよびＴＣ５’からＦＧと一緒に次のラウンドのＰＣＲ増幅のための鋳型として使用して、Ｔｅｎｃｏｎへの５’およびプロモーター配列の付加を完了した。次に、最初のステップで作製されたＤＮＡ産物を、フォワードプライマーＰＯＰ２２２２および縮重ヌクレオチドを含むリバースプライマーＴＣＦ７、ＴＣＦ８、ＴＣＦ９、ＴＣＦ１０、ＴＣＦ１１、またはＴＣＦ１２を用いて増幅することによりＦ：Ｇループ中に多様性を導入した。少なくとも８つの１００μＬ  ＰＣＲ反応をサブライブラリーごとに実施し、ＰＣＲサイクルを最小限に抑えライブラリーの多様性を最大にした。少なくとも５μｇのこのＰＣＲ産物は、ゲル精製し、それに続くＰＣＲステップにおいてプライマーＰＯＰ２２２２およびＰＯＰ２２３４と一緒に使用し、Ｔｅｎｃｏｎ配列の３’末端に６×ＨｉｓタグおよびＮｏｔＩ制限部位を結合させた。このＰＣＲ反応は、１５のＰＣＲサイクルおよび少なくとも５００ｎｇの鋳型ＤＮＡのみを使用して実行した。得られたＰＣＲ産物はゲル精製し、ＮｏｔＩ制限酵素で消化し、Ｑｉａｇｅｎカラムにより精製した。
【０１３７】
ライブラリーの３’断片は、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、ならびにシス−およびｏｒｉエレメントを含む、ディスプレイのためのエレメントを含有する一定のＤＮＡ配列である。ＰＣＲ反応は、Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを用いて、このＤＮＡ断片を含有するプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。得られたＰＣＲ産物はＰｓｐＯＭＩにより一晩消化し、ゲル精製した。ｒｅｐＡ遺伝子を含有する３’ＤＮＡにライブラリーＤＮＡの５’部分をライゲートするため、ＮｏｔＩおよびＰｓｐＯＭＩ酵素ならびにＴ４リガーゼの存在下で２ｐｍｏｌの５’ＤＮＡを等モル量の３’ｒｅｐＡ  ＤＮＡにライゲートした。３７℃での一晩のライゲーション後、少量のライゲートされたＤＮＡをゲル上に流しライゲーション効率を調べた。ライゲートされたライブラリー産物は、１２のＰＣＲ増幅に分割し、１２サイクルのＰＣＲ反応は、プライマー対ＰＯＰ２２５０とＤｉｇＬｉｇＲｅｖで実行した。ＴＣＬ１ライブラリーのサブライブラリーごとのＤＮＡ収量は３２〜３４μｇの範囲に及んだ。
【０１３８】
ライブラリーの品質を評価するため、少量の作業ライブラリーをプライマーＴｃｏｎ５ｎｅｗ２およびＴｃｏｎ６で増幅し、リガーゼ非依存性クローニングにより改変ｐＥＴベクター中にクローニングした。プラスミドＤＮＡはＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、９６の無作為選抜コロニーをＴ７プロモータープライマーを使用して配列決定した。二重配列は見出されなかった。全体として、クローンのおおよそ７０〜８５％が完全プロモーターおよびＴｅｎｃｏｎコード配列を有し、フレームシフト突然変異はなかった。機能的配列率は、停止コドンを持つクローンを排除するが、５９％〜８０％であった。
【０１３９】
ＴＣＬ２ライブラリーの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣとＦＧループの両方が無作為化されそれぞれの位置でのアミノ酸の分布が厳格に制御されているＴＣＬ２ライブラリーを構築した。表３は、ＴＣＬ２ライブラリーにおける所望のループ位置でのアミノ酸分布を示している。設計されたアミノ酸分布は２つの目的があった。第１に、ライブラリーは、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の分析に基づいておよび／またはホモロジーモデリングから、Ｔｅｎｃｏｎフォールディングおよび安定性に構造的に重要であると予想される残基の方に偏っていた。例えば、２９位は疎水性アミノ酸のサブセットのみであるように固定されていた。なぜならば、この残基はＴｅｎｃｏｎフォールドの疎水性コアに埋もれていたからであった。設計の第２層は、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に優先的に見出される残基の分布の方へアミノ酸分布を偏らせて、高親和性バインダーを効率的に産生することを含んでいた（Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007）。この目標に向けて、表３の「設計された分布」とは、以下の：６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フェニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％スレオニン、４％トリプトファン、１７．３％チロシン、および４％バリンの分布のことである。この分布はメチオニン、システイン、および停止コドンがない。
【０１４０】
【表３】
2021506802.tif 000009
【０１４１】
ＴＣＬ２ライブラリーの５’断片は、プロモーターおよびＴｅｎｃｏｎのコード領域を含有しており、このコード配列はライブラリープールとして化学的に合成された（Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＤＮＡのこのプールは少なくとも１×１０１１の異なるメンバーを含有していた。断片の終端では、ＢｓａＩ制限部位はＲｅｐＡへのライゲージョンのための設計に含まれていた。
【０１４２】
ライブラリーの３’断片は、６×Ｈｉｓタグ、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、およびシスエレメントを含む、ディスプレイのためのエレメントを含有する一定のＤＮＡ配列であった。ＤＮＡは既存のＤＮＡ鋳型（上記）およびプライマーＬＳ１００８およびＤｉｇＬｉｇＲｅｖを使用してＰＣＲ反応により調製した。完全ＴＣＬ２ライブラリーを集合させるため、全部で１μｇのＢｓａＩ消化５’ＴｅｎｃｏｎライブラリーＤＮＡを、同じ酵素を用いた制限消化により調製された３．５μｇの３’断片にライゲートさせた。一晩のライゲーション後、ＤＮＡはＱｉａｇｅｎカラムにより精製し、ＤＮＡは２６０ｎｍで吸光度を測定することにより定量化した。ライゲートされたライブラリー産物は、プライマー対ＰＯＰ２２５０とＤｉｇＬｉｇＲｅｖを用いた１２サイクルＰＣＲ反応により増幅させた。全部で７２の反応を実施し、それぞれが鋳型として５０ｎｇのライゲートされたＤＮＡ産物を含有していた。ＴＣＬ２作業ライブラリーＤＮＡの全収量は約１００μｇであった。少量の作業ライブラリーを、ライブラリーＴＣＬ１について上に記載される通りに、サブクローニングし配列決定した。二重配列は見出されなかった。配列の約８０％が、完全プロモーターおよびＴｅｎｃｏｎコード配列を含有し、フレームシフト突然変異はなかった。
【０１４３】
ＴＣＬ１４ライブラリーの構築
上（ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧ）および下（ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦ）ループ、例えば、ＦＮ３ドメインにおける報告されている結合表面は、ＦＮ３構造の中心部を形成するベータ鎖により分離されている。ループのみで形成される表面とは異なる形状を有するＦＮ３ドメインの２つの「側面」に存在する別の表面は、２つの逆平行ベータ鎖、ＣおよびＦベータ鎖、ならびにＣＤおよびＦＧループによりＦＮ３ドメインの１つの側面で形成され、本明細書ではＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼ばれる。
【０１４４】
Ｔｅｎｃｏｎの別の表面を無作為化するライブラリーは、ＣおよびＦ鎖の選別された表面露出残基、ならびにＣＤおよびＦＧループの一部を無作為化することにより作製された。Ｔｅｎｃｏｎと比べた場合、以下の置換を有するＴｅｎｃｏｎ変異体、Ｔｅｎｃｏｎ２７を使用して、ライブラリー；Ｅ１１Ｒ  Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉを作製した。このライブラリーを構築するのに使用される方法の完全な記述は米国特許出願第１３／８５２，９３０号明細書に記載されている。
【０１４５】
[実施例２]細胞標的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ライブラリースクリーニング
種々の方法を使用して、本明細書に記載されるＦＮ３ドメインライブラリーのいずれかを選別し本発明におけるターゲティング使用のための目的のタンパク質またはヌクレオチドに結合するＦＮ３ドメインを得ることができる。例えば、シスディスプレイを使用して、ＴＣＬ１およびＴＣＬ２ライブラリーからＦＮ３ドメインを選択することができる。組換えヒトタンパク質は、おそらくＩｇＧ１  Ｆｃに融合されているが、パニングのための標準方法を用いて使用することができる。
【０１４６】
抗ｈＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメイン分子Ｇ３の選択
シスディスプレイを使用して、米国特許出願第１３／８５２，９３０号明細書に記載されるＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン分子を選択した。手短に言えば、残基２５〜６４５を包含しヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合している組換えヒトＥＧＦＲ−ＥＣＤをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、選択のためにビオチン化した。インビトロ転写および翻訳（ＩＴＴ）では、２〜３μｇのＴＣＬ１４  ＤＮＡを、０．１ｍＭの完全アミノ酸、１×Ｓ３０プレミックス成分、および１５μＬのＳ３０エキストラ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と一緒に全容量５０μＬでインキュベートし、３０℃でインキュベートした。１時間後、４５０μＬのブロッキング液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、２％のウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍＬのニシン精液ＤＮＡ、および１ｍｇ／ｍＬのヘパリンで補充された）を添加し、反応は氷上で１５分間インキュベートさせておいた。ＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ複合体は、組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とビオチン化組換えＥＧＦＲ−Ｆｃをブロッキング液において室温で１時間混合することにより、モル比１対１のＥＧＦＲ対ＥＧＦで組み立てた。結合では、５００μＬのブロックされたＩＴＴ反応を１００μＬのＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ複合体と混合して、室温で１時間インキュベートし、その後結合した複合体は、磁気ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）でプルダウンした。結合していないライブラリーメンバーは、ＰＢＳＴおよびＰＢＳでの連続洗浄により取り除いた。洗浄後、ＤＮＡは、１０分間で７５℃まで加熱することにより結合した複合体から溶出させ、ＰＣＲにより増幅し、さらなるラウンドのパニングのために制限消化およびライゲーションによりＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片に結合させた。高親和性バインダーは、それぞれのラウンド中標的ＥＧＦＲ−Ｆｃの濃度を５００ｎＭから２．５ｎＭにまで連続して下げ、洗浄厳密性を増やすことにより単離した。ラウンド６および７では、結合していない、または弱い結合のＣｅｎｔｙｒｉｎｓは、２００倍モル過剰な非ビオチン化ＥＧＦＲ−Ｆｃの存在下でＰＢＳＴにおいて１時間洗浄することにより取り除いた。ラウンド８および９では、結合していない、または弱い結合のＣｅｎｔｙｒｉｎｓは、２０００倍モル過剰な非ビオチン化ＥＧＦＲ−Ｆｃの存在下でＰＢＳＴにおいて１時間洗浄することにより取り除いた。ＦＮ３ドメインは発現ベクターにクローニングし、記載されるｈＥＧＦＲへの結合についてスクリーニングした。
【０１４７】
[実施例３]ＦＮ３ドメインの操作
ＦＮ３ドメインを操作して、それぞれの分子の立体構造安定性を増やすことができる。突然変異Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、およびＥ８６Ｉ（米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号明細書に記載されている）をＤＮＡ合成により分子中に組み込むことができる。ＰＢＳ中での示差走査熱量測定を使用して、突然変異を対応する親分子の安定性と比較するために、それぞれの突然変異の安定性を評価することができる。
【０１４８】
[実施例４]ＦＮ３ドメインのシステイン操作
ＦＮ３ドメインのシステイン突然変異は、システイン残基を持たないベースＴｅｎｃｏｎ分子およびその変異体から作られる。これらの突然変異は、小分子薬物、蛍光タグ、ポリエチレングリコール、または任意の数の他の化学的実体の化学的コンジュゲーション用の部位の役割をするためにベースＴｅｎｃｏｎ配列または他のＦＮ３ドメイン中に独特のシステイン残基を組み込む当技術分野で公知の標準分子生物学技法を使用して作ってもよい。選択される突然変異の部位はある特定の基準を満たすべきである。例えば、遊離のシステインを含有するように突然変異されたＴｅｎｃｏｎ分子は、（ｉ）大腸菌（E.coli）中で高度に発現される、（ｉｉ）高いレベルの可溶性および熱安定性を維持する、および（ｉｉｉ）コンジュゲーションすることによる標的抗原への結合を維持するべきである。Ｔｅｎｃｏｎスキャフォールドは約９０〜９５アミノ酸だけなので、単一システイン変異体は、化学的コンジュゲーションに理想的な位置（複数可）を厳密に決定するためにスキャフォールドのすべての位置で容易に構築することができる。
【０１４９】
[実施例５]独特のシステイン配置によりＦＮ３ドメイン分子でナノ粒子をターゲティングする
標的化ナノ医療におけるＦＮ３ドメインの有用性を確立するため、標的エンゲージメントおよびナノ粒子−ＦＮ３ドメインカップリング反応に対してＦＮ３ドメイン分子が提供する利点を示す実験を実施した。開始コンジュゲーションおよびターゲティング実験では、単一の独特なシステインを、米国特許公開第１４／５１２，８０１号明細書に記載されるナノ粒子とカップリングするためにタンパク質内の異なる場所に置かれるＥＧＦＲ−ターゲティングＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２）の６つの変異体を作り出した。これらのタンパク質は、８３ｖ１０、８３ｖ１１、８３ｖ１２、８３ｖ１３、８３ｖ１４および８３ｖ１５と名付けられた。これらのタンパク質ごとのアミノ酸配列は以下の通りであり：
８３ｖ１０＝Ｅ１５Ｃ（配列番号４０）
【０１５０】
【化１】
2021506802.tif 000010
８３ｖ１１＝Ｅ１２Ｃ（配列番号４１）
【０１５１】
【化２】
2021506802.tif 000011
８３ｖ１２＝Ｒ１９Ｃ（配列番号４２）
【０１５２】
【化３】
2021506802.tif 000012
８３ｖ１３＝Ｅ５４Ｃ（配列番号４３）
【０１５３】
【化４】
2021506802.tif 000013
８３ｖ１４＝Ｋ６３Ｃ（配列番号４４）
【０１５４】
【化５】
2021506802.tif 000014
８３ｖ１５＝Ｃ−終端（配列番号４５）
【０１５５】
【化６】
2021506802.tif 000015
Ｇ３＝Ｃ−終端（配列番号４６）
【０１５６】
【化７】
2021506802.tif 000016
【０１５７】
コンジュゲーション
超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）を合成し、表面はターゲティングエレメントとの下流コンジュゲーションのためにアミン化学ハンドルで官能基を持たせた。このナノ粒子ストックから、５０μＬの１ｍｇＦｅ／ｍＬ  ＳＰＩＯＮを６個の別々のエッペンドルフチューブ中にアリコートした。それぞれのＦＮ３ドメイン分子は、最終５０対１モル比のＦＮ３ドメイン分子対ＳＰＩＯＮが達成されるように、ＳＰＩＯＮ試料に添加した。試料は、室温で４時間、１２５０ｒｐｍのサーモミキサー上で反応させておいた。試料は、ＭＡＣＳ  ＬＳカラム上で磁気精製により、４時間に続いて精製した。次に、試料は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のｍｉｃｒｏｃｏｎ３０ｋＤａカラムを使用して単回５分回転（５５００×ｒｃｆ）で濃縮した。
【０１５８】
上のコンジュゲーション反応を始めたすぐ後で、２〜３のコンジュゲート試料が沈澱していたことに注目した。特に、８３ｖ１１および８３ｖ１４が沈澱した。これにより、潜在的に安定なコンジュゲートとして３つの試料、８３ｖ１０、８３ｖ１２および８３ｖ１５が残された。
【０１５９】
残った可溶性試料では、鉄濃度アッセイを実施した。特に、１０μＬのＳＰＩＯＮ試料は、１０μＬの３％Ｈ２Ｏ２および１ｍＬの６Ｍ  ＨＣｌと一緒に暗所で１０分間インキュベートした。次に、試料は４１０ｎｍでのその吸光度について評価した。吸光度測定は、溶解鉄についての標準曲線と比べて、ｍｇ／ｍＬ濃度を決定した。さらに、５ｎｍの平均鉄コアサイズおよび略球状粒子を仮定して、鉄のｍｇ／ｍＬ濃度は、ＳＰＩＯナノ粒子の推定分子量として１１３，００８ｇ／モルを使用してモル濃度に変換した。濃度は表４に示される通りに計算した。
【０１６０】
【表４】
2021506802.tif 000017
【０１６１】
細胞結合アッセイ
最近作製されたＦＮ３ドメイン分子−ＳＰＩＯＮの活性を決定するため、細胞ターゲティングアッセイをインビトロで開始した。Ｈ２９２細胞を、ハンクス酵素遊離解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−１３１５０−０１６）を使用してＴ−１５０細胞培養フラスコから分離した。細胞および解離バッファーは細胞インキュベーターにおいて１５分間インキュベートした。フラスコは穏やかに叩き、残っているすべての結合細胞を分離させ、バッファーおよび細胞は１５ｍＬのコニカルチューブに移した。細胞は１，０００ｒｃｆで２分間回転させた。上澄みは、ペレット化した細胞を破壊しないように慎重に配慮して穏やかに取り除いた。残された細胞ペレットは、１０％のＦＢＳを含む１．５ｍＬのフェノールレッドなしＲＰＭＩ１６４０培地で復元した。懸濁液はおおよそ１．５×１０６細胞を含有することが判定された。１００μＬのこの懸濁液を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。ＦＮ３ドメイン分子−ＳＰＩＯＮ試料濃度は上に収載されている。これらの既知の濃度から、ＦＮ３ドメイン分子−ＳＰＩＯＮを、細胞と一緒のＦＮ３ドメイン分子−ＳＰＩＯＮの最終濃度が１００μｇ／ｍＬ  Ｆｅになるようにそれぞれのウェルに添加した。試料は３通り蒔き、３０分間インキュベートし、次に、１，０００×ｒｃｆでの３×遠心分離により精製し、ｄＰＢＳ  ｐＨ７．２に再懸濁した。試料は最終容量３００μＬで懸濁し、Ｇｕａｖａ  ＨＴＳフローサイトメータ上での分析のために透明な平底９６ウェルプレートに移した。全体で８，０００細胞を試料ごとに計数した。フローに続いて、集団試料はＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。それぞれの試料は、生きた細胞だけが蛍光について評価されるようにゲート開閉された。黒色ピーク（グラフの左側の方にピーク）が非標識Ｈ２９２細胞から得られる自己蛍光であるヒストグラムが得られた。青色ピーク（グラフの右側の方にピーク）は、ヒストグラムの上の試料タイトルに対応する。８３ｖ１０、８３ｖ１２および８３ｖ１５は、ｔｅｎｃｏｎ２５対照またはブランク細胞と比べてプラスに移っている（図１Ａ〜１Ｄ）。棒グラフは、すべての試料の単一定量比較を示している（図２）。すべての試料は、それぞれの試料の平均蛍光強度からブランク細胞自己蛍光を引くことにより正規化した。統計的有意（ｐ＜０．００５）は、ＴｅｎＣｏｎ２５−ＳＰＩＯＮ試料と比べた場合、８３ｖ１０−ＳＰＩＯＮ、８３ｖ１２−ＳＰＩＯＮおよび８３ｖ１５−ＳＰＩＯＮについて見出された。
【０１６２】
ＦＮ３ドメイン分子−ナノ粒子細胞結合評価
標的特異的結合に加えて、リガンド結合を阻害することにより生物学的経路を遮断するいくつかのＦＮ３ドメイン分子が選択された。ナノ粒子へのコンジュゲーションに続いてＦＮ３ドメイン分子活性が保持されているかどうかを評価するため、以下のプロトコールおよび設定を使用してＥＧＦＲ標的化ナノ粒子について活性評価を用意した。
【０１６３】
細胞調製
Ａ４３１細胞を９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２０ｋで蒔いた。２４時間のインキュベーションに続いて、プレート培地は無血清ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸに交換した。細胞は一晩インキュベートした。次の日、細胞プレートは、設定２で振盪させながら室温で１時間ブロッカーＡバッファーを使用して遮断した。次に、細胞は２０〜２４時間枯渇させ、細胞培地は吸引により細胞から取り除いた。
【０１６４】
ＦＮ３ドメイン分子−ＳＰＩＯＮ細胞処置
阻害因子（８３ｖ１１−ＳＰＩＯＮ、Ｂｌａｎｋ  ＳＰＩＯＮおよび８３ｖ２）は、無血清培地で最終アッセイ濃度まで希釈した。１００μＬのそれぞれの阻害因子を、下のプレートマップに指示される希釈度で細胞に添加した。細胞は阻害因子と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。
【０１６５】
ＥＧＦ刺激
溶解バッファーはＭＳＤプロトコールに従って調製し、氷上で保存した。成長因子も無血清培地中２×濃度で調製した。最終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦをそれぞれの細胞ウェルに添加した。枯渇対象については、無血清培地を使用した。
【０１６６】
全体では、１００μｌのＥＧＦを、阻害因子インキュベーション終了時にそれぞれのウェルに添加し、枯渇対照は例外で、これは１００μｌの無血清培地を受ける。試料は３７℃で１５分間インキュベートした。
【０１６７】
細胞溶解
１５分間のインキュベーションに続いて、培地は吸引により細胞から取り除いた。１００μＬの予め調製したＭＳＤ溶解バッファーを細胞プレートのそれぞれのウェルに添加した。プレートは、室温で１０分間振盪させておいた。細胞が溶解されている間、ＭＳＤプレートは、１５０μＬのＴｒｉｓ洗浄バッファーで４回洗浄することにより調製した。ＭＳＤプレートを洗浄後、３０μＬの溶解された細胞を洗浄されたＭＳＤプレートに移した。
【０１６８】
抗体の添加
抗体溶液を調製し、暗所に冷して保存し、ＭＳＤプレートを１５０μＬのＴｒｉｓ洗浄バッファーで４回洗浄し、吸引性タオルの上で叩いて洗浄バッファーのすべての痕跡を取り除いた。２５μｌの抗体溶液をそれぞれのウェルに添加した。ＭＳＤプレートは１５０μｌのＴｒｉｓ洗浄バッファーで４回洗浄し、吸引性タオルの上で叩いて洗浄バッファーのすべての痕跡を取り除いた。
【０１６９】
読取りプレート
ＭＳＤ読取りバッファーを調製する：３０ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏ中に１０ｍｌの読取りバッファー
１５０μｌの読取りバッファーを、泡を出さないように注意しながらそれぞれのウェルに添加する
【０１７０】
ＭＳＤセクターイメージャー上の読取りプレート
プレート読取りに続いて、データを収集し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。特に、標的化８３ｖ１１−ＳＰＩＯＮをその親ＦＮ３ドメイン分子（８３ｖ２）および非標的化ＳＰＩＯＮに対してプロットした。図３のプロットグラフに図示されるように、ＦＮ３ドメイン分子は、ナノ粒子に結合された後でもその活性を維持している。なぜならば、８３ｖ１１−ＳＰＩＯＮは、非結合８３ｖ２  ＦＮ３ドメイン分子に類似してＥＧＦＲリン酸化を効率的に阻害することができるからである。
【０１７１】
[実施例６]ＥＧＦＲまたはＰＳＭＡ結合Ｃｅｎｔｙｒｉｎを介した細胞傷害性ペイロードの細胞内送達
試薬および構築物：
黄色ブドウ球菌（S. aureus）ソルターゼＡをコードする遺伝子はＤＮＡ２．０により作製し、Ｔ５プロモーター下での発現のためにｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０）にサブクローニングした。可溶性発現のためのソルターゼ構築物は、２５アミノ酸からなる天然タンパク質のＮ終端ドメインを欠いている。なぜならば、このドメインは膜結合性だからである（Ton-That et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96: 12424-12429, 1999）。ソルターゼは、精製用のＮ終端Ｈｉｓ６タグ、続いてタグ除去用のＴＥＶプロテアーゼ部位で修飾した（ＥＮＬＹＦＱＳ、配列番号１２）。遺伝子は、酵素の触媒効率を増やすことが報告されている天然配列由来の５つの突然変異も含む（Chen et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108: 11399-11404, 2011）（配列番号１３）。プラスミドは、発現のために大腸菌（E.coli）ＢＬ２１Ｇｏｌｄ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）中に形質転換した。単一コロニーを選択し、カナマイシンを補充したＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）で増殖させ、３７℃で１８時間、２５０ｒｐｍでインキュベートした。２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）に、カナマイシンを補充して、これらの継代培養から接種し、振盪しながら３７℃で約４時間増殖させた。タンパク質発現は１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、タンパク質は３０℃で１８時間発現させた。細胞は遠心分離により６０００ｇで収穫し、精製まで−２０℃で保存した。凍結細胞ペレットは室温で３０分間解凍し、３０ｍＬの組換えリゾチーム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あたり１μＬを補充したＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴタンパク質抽出試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に１グラムの細胞ペーストあたり５ｍｌで懸濁させ、室温で振盪器上３０分間インキュベートした。ライセートは、遠心分離により７４６００ｇで３０分間浄化した。
【０１７２】
上澄みは、バッファーＡ（０．５ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのイミダゾールを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０）で予め平衡させた３ｍＬのＱｉａｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を充填した重力カラム上に注いだ。負荷後、カラムは１００ｍＬのバッファーＡで洗浄した。タンパク質は２５０ｍＭのイミダゾールを補充したバッファーＡで溶出させ、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡させた調製用ゲル濾過カラム、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ  ２１．５×６００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ）上に負荷した。ゲル濾過クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ−ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを使用して、流速１０ｍｌ／分、ＰＢＳ中室温で実施した。次に、精製したソルターゼはＴＥＶプロテアーゼで消化し、Ｈｉｓ６タグを取り除いた。２８ｍｇのソルターゼは、１ｍＭのＤＴＴを補充した供給されたバッファー中、３０℃で２時間、３０００ユニットのＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に１０ｍＬでインキュベートした。タグなしソルターゼをＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製した。反応は、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＴＢＳバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に交換し、バッファーＡで予め平衡させた０．５ｍＬのＱｉａｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を充填した重力カラム上に注いだ。通過画分を収集し、樹脂は３ｍＬのバッファーＡで洗浄し、通過画分に添加した。ソルターゼを含有する通過画分は、１０ｋＤａカットオフ付きのＡｍｉｃｏｎ１５濃縮器において（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）約０．５ｍＬまで濃縮した。追加のＴＢＳバッファーを添加し、試料は再び濃縮して（２回繰り返す）バッファーをＴＢＳに交換した。４０％グリセロールの３分の１容積を添加し（最終濃度１０％グリセロール）、ソルターゼは短期間使用では−２０℃でまたは長期間では−８０℃で保存した。
【０１７３】
Ｃｅｎｔｙｒｉｎの大規模発現、精製およびコンジュゲーション
ＰＳＭＡまたはＥＧＦＲに結合するＣｅｎｔｙｒｉｎは以前記載されたまたは上記（米国特許出願公開第２０１４／０１５５３２６号明細書）の通りに発見された。これらを、Ｔ７プロモーター下での発現のためにｐＥＴ１５ｂベクター中にクローニングし、またはＤＮＡ２．０により作製し、Ｔ５プロモーター下での発現のためにｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０）中にサブクローニングした。得られたプラスミドは、発現のために大腸菌（E.coli）ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ）またはＢＬ２１ＤＥ３  Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ）中に形質転換した。単一コロニーを選択し、カナマイシンを補充したＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）で増殖させ、３７℃で１８時間、２５０ｒｐｍでインキュベートした。１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）に、カナマイシンを補充して、これらの継代培養から接種し、振盪しながら３７℃で４時間増殖させた。タンパク質発現は、６００ｎｍでの光学密度が１．０に到達したのち、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。タンパク質は３７℃で４時間または３０℃で１８時間発現させた。細胞は遠心分離により６０００ｇで収穫し、精製まで−２０℃で保存した。凍結細胞ペレット（約１５〜２５ｇ）は室温で３０分間解凍し、０．２ｍｇ／ｍｌの組換えリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を補充したＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴタンパク質抽出試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に１グラムの細胞ペーストあたり５ｍｌで懸濁させ、室温で振盪器上１時間インキュベートした。ライセートは、遠心分離により７４６００ｇで２５分間浄化した。上澄みは、ＡＫＴＡ−ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを使用して、流速４ｍｌ／分で氷に浸した５ｍＬのＱｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡカートリッジ上に注いだ。他のＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーステップはすべて流速５ｍｌ／分で実施した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムは、０．５ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのイミダゾールを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（バッファーＡ）、ｐＨ７．０、２５．０ｍｌにおいて平衡させた。負荷後、カラムは１００ｍｌのバッファーＡ、続いて１０ｍＭのイミダゾール、１％ＣＨＡＰＳおよび１％のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド洗剤を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０を１００ｍｌ、ならびに１００ｍｌのバッファーＡで洗浄した。タンパク質は２５０ｍＭのイミダゾールを補充したバッファーＡで溶出させ、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡させた調製用ゲル濾過カラム、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ  ２１．５×６００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ）上に負荷した。ゲル濾過クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ−ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを使用して、流速１０ｍｌ／分、ＰＢＳ中室温で実施した。
【０１７４】
受容体媒介細胞内送達の基準として、微小管破壊薬をＰＳＭＡまたはＥＧＦＲ結合Ｃｅｎｔｙｒｉｎに連結することにより、Ｃｅｎｔｙｒｉｎコンジュゲートを調製した。微小管破壊薬は細胞質で活性であるため、効率的細胞内送達は細胞傷害性アッセイを使用して評価することができる。抗ＰＳＭＡ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎは、ソルターゼタグを通じてｖｃ−ＭＭＡＦにコンジュゲートした。ソルターゼタグへのコンジュゲーションでは、細菌ペレットを解凍し、組換えヒトリゾチーム（ＥＭＤ、カタログ番号７１１１０）を補充したＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴ（ＥＭＤ、カタログ番号７０９２２）に再懸濁し溶解させた。溶解は室温で穏やかに攪拌しながら進行し、その後、プレートは４２℃まで移して宿主タンパク質を沈澱させた。デブリは遠心分離によりペレット化し、上澄みは、ソルターゼ触媒標識化のために新しいブロックプレートに移した。Ｇｌｙ３−ｖｃ−ＭＭＡＦ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）、タグなしソルターゼＡ、およびソルターゼバッファー（Ｔｒｉｓ、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウム）を含有するマスター混合物を２×濃度で調製し、等容量で溶解物上澄みに添加した。標識化反応は室温で２時間進行し、その後、タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡマルチトラップＨＰプレート（ＧＥ  カタログ番号２８−４００９−８９）を使用して精製した。タンパク質コンジュゲートは、イミダゾール含有溶出バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール）を用いてステップ溶出により回収し、濾過殺菌し、細胞ベースの細胞傷害性アッセイのために直接使用した。
【０１７５】
二価抗ＥＧＦＲ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎは、ペプチドリンカーで隔てられた抗ＥＧＦＲ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎ、Ｐ１５５Ｒ８−Ｇ３（配列番号１）の２つのコピーを、１〜４個のシステイン残基を用いてアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤｃｏｎ１２、配列番号７）（米国特許出願公開第２０１３／０３１６９５２号明細書）に遺伝的に連結することによりコードした。Ｃｅｎｔｙｒｉｎは、表５に収載されているが、ヨドアセチルＰＥＧ４−ＭＭＡＦ（ＩＡＡ−ＭＭＡＦ、図４、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）にコンジュゲートした。コンジュゲーションでは、ＣｅｎｔｙｒｉｎをＰＢＳ中１００μＭまで希釈し、１０ｍＭのＴＣＥＰで還元した。次に、タンパク質は硫酸アンモニウムで沈澱させ、追加の硫酸アンモニウムで洗浄し、ＴＣＥＰを確実に除去し、ＰＢＳに再溶解させた。還元されたタンパク質は、室温で４．５時間、１００ｍＭのホウ酸バッファー（ｐＨ＝９．０）中システインあたり４または８倍過剰なＩＡＡ−ＭＭＡＦと反応させた。反応はＮ−エチルマレイミドを添加することによりクエンチして、未反応のシステインはどれもキャップし、タンパク質は重力流によりニッケルＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製し、Ｚｅｂａカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）でＰＢＳ中に交換し；エンドトキシンはＥｎｄｏＢｉｎｄＲ樹脂（ＢｉｏＤＴｅｃｈ）を用いて取り除いた。
【０１７６】
【表５】
2021506802.tif 000018
【０１７７】
細胞株におけるＰＳＭＡ発現の定量化
前立腺がん細胞株（ＬＮＣａＰ、ＶＣＡＰ、ＭＤＡ−ＰＣａ−２Ｂ、およびＰＣ３）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手して、推奨される増殖培地を使用して培養した。ＰＳＭＡ発現レベルはフローサイトメトリーにより定量化した。細胞はＡｃｃｕｔａｓｅ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）を用いて基質から持ち上げ、ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ  ＧＣＰ−０５、２０μｇ／ｍＬ、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）またはアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）にコンジュゲートした飽和レベルの抗ＰＳＭＡ抗体で１時間染色した。過剰な抗体はすすいで流し、蛍光はＢＤ  ＦＡＣｓ  Ｃａｌｉｂｕｒを使用して記録した。抗体結合は、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して製造業者の指示通りに定量化した。ＰＳＭＡ発現は、ＰＳＭＡ特異的抗体（それぞれの抗体は２つのＰＳＭＡ受容体に結合することができると仮定する）について測定されたシグナルからアイソタイプ対照由来のバックグランドシグナルを引くことにより決定した。図５は、代表的なヒストグラムを示し、表６は４つの細胞株によるＰＳＭＡ定量化をまとめている。
【０１７８】
【表６】
2021506802.tif 000019
【０１７９】
ＰＳＭＡ＋細胞上の抗ＰＳＭＡ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎ薬物コンジュゲートの選択的細胞傷害性
Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートの細胞傷害性は、ＬＮＣａＰ、ＶＣＡＰ、ＭＤＡ−ＰＣａ−２Ｂ、およびＰＣ３細胞においてインビトロで評価した。細胞は、９６ウェル黒色プレートに２４時間蒔き、次に、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートの可変用量で処置した。細胞は、６６〜７２時間Ｃｅｎｔｙｒｉｎ薬物コンジュゲート（ＣＤＣ）と一緒にインキュベートさせておいた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、製造業者の説明書に従って使用して毒性を評価した。発光値をＥｘｃｅｌに取り込み、グラフ解析のためにＰｒｉｓｍ中にペーストした。データはＸ＝Ｌｏｇ（ｘ）を使用して変換し、次に、３パラメータモデルを適用し非線形回帰を使用して解析してＩＣ５０を決定した。
【０１８０】
表７は、細胞株のパネルによるｖｃＭＭＡＦにコンジュゲートされたいくつかのＣｅｎｔｙｒｉｎについてのＩＣ５０値を示している。ＣＤＣは、高レベルのＰＳＭＡを発現することが知られている株であるＬＮＣａＰ細胞で最も強力であった。ＣＤＣは、もっと低いレベルのＰＳＭＡを有する前立腺がん株である、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ＢおよびＶＣＡＰ細胞でも活性であった。ＰＳＭＡ陰性細胞株である、ＰＣ３細胞では活性は観察されず、選択性を示していた。ＩＣ５０は、それぞれの細胞上に存在する抗原の数と相関しており、最大のＰＳＭＡ発現を有する細胞株である、ＬＮＣａＰ上で最良の活性が観察された。
【０１８１】
【表７】
2021506802.tif 000020
【０１８２】
ＥＧＦＲ＋細胞上の抗ＥＧＦＲ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎ薬物コンジュゲートの細胞傷害性
Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ＰＥＧ４−ＭＭＡＦコンジュゲートの細胞傷害性は、ＮＣＩ−Ｈ２９２およびＮＣＩ−Ｈ１５７３細胞においてインビトロで評価した。細胞は、９６ウェル黒色プレートに２４時間蒔き、次に、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ＰＥＧ４−ＭＭＡＦコンジュゲートの可変用量で処置した。細胞は、６６〜７２時間Ｃｅｎｔｙｒｉｎ薬物コンジュゲート（ＣＤＣ）と一緒にインキュベートさせておいた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを使用して毒性を評価した。発光値をＥｘｃｅｌに取り込み、グラフ解析のためにＰｒｉｓｍ中にペーストした。データはＸ＝Ｌｏｇ（ｘ）を使用して変換し、次に、３パラメータモデルを適用し非線形回帰を使用して解析した。
【０１８３】
表６は、Ａ）ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞またはＢ）ＮＣＩ−Ｈ１５７３細胞における１、２、３、または４つの薬物分子を有するＣｅｎｔｙｒｉｎ−薬物コンジュゲートの処置に続く相対的細胞生存を示している。すべてのコンジュゲートが細胞死をもたらし、毒性の程度は、分子あたりの薬物の数に相関していた。
【０１８４】
Ｈ２９２腫瘍異種移植片におけるインビボ有効性
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳにおいて増殖させ、メスＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＳＣＩＤベージュマウス（ｎ＝８／群）の皮下に移植した（５０％マトリゲルに希釈させた２×１０６細胞）。腫瘍が約２００ｍｍ３に達すると、マウスに、４．７ｍｇ／ｋｇ  ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣｅｎｔｙｒｉｎ−薬物コンジュゲートを静脈内投与した。それぞれのＣｅｎｔｙｒｉｎは半減期延長のためのアルブミン結合ドメインを含有していた。全部で３つの用量は、１週間にわたって１、３、６日目にマウスに注射された。腫瘍はキャリパーを使用して週２回測定し、腫瘍が２０００ｍｍ３を超えた時点で屠殺した。群腫瘍測定は、４頭を超えるマウスが残った場合に報告される。
【０１８５】
図７は、処置群ごとの平均腫瘍量を示している。非標的化Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−薬物コンジュゲートも非コンジュゲートＣｅｎｔｙｒｉｎも腫瘍量には有意な影響を与えなかった。これとは対照的に、著明な腫瘍増殖抑制が、抗ＥＧＦＲ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−薬物コンジュゲートで処置したマウスで見られた。腫瘍後退または増殖抑制は、抗ＥＧＦＲ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−薬物コンジュゲートで処置した群に対する投与開始後４週よりも長く観察された。
【０１８６】
[実施例７]ＥＧＦＲ結合Ｃｅｎｔｙｒｉｎを用いたターゲティングによるＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の細胞内送達
ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子（ＮＰ）は、感染症およびがんの処置に成功したことで、生物的適合性および有効性を示している［１〜７］。ＰＬＧＡは、ポリ（ガンマグルタミン酸）（ＰＧＡ）またはポリ乳酸（ＰＬＡ）と比べて、大きな加水分解安定性およびより速い分解速度を示している。ＰＬＧＡ−ＮＰによるｓｉＲＮＡノックダウンおよび治療有効性にはある程度成功したが、効力を改善するためには克服しなければならない特異的ターゲティングおよび細胞内エンドソーム脱出についての障壁がまだ存在する。ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰは、小分子化学療法薬ならびに核酸の送達に使用されてきた［８、１０］。ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰについてのターゲティングの適用を使用して、薬物および核酸カーゴを送達することができ、これにより、事実上システムの用途が広くなる［１１、１２］。
【０１８７】
Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−官能化ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰの合成
Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−官能化ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰを合成するステップは以下の通りである。
１）ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子上のわずかな割合のアミンをフルオロフォア−ＡＦ６４７で官能化する
２）残りのアミンをアジドで官能化する
３）残りのすべての（未反応）アミンを無水コハク酸で消費する
４）脱塩カラムを経てＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子を精製し未反応のフルオロフォアおよびアジドを取り除く
５）ＣｅｎｔｙｒｉｎをＭａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯとコンジュゲートし、クリックケミストリーによりＣｅｎｔｙｒｉｎをＰＥＧ−ＰＬＧＡ−Ｃｅｎｔｙｒｉｎナノ粒子の表面にコンジュゲートする
６）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを経て最終産物を精製し未反応のＣｅｎｔｙｒｉｎを取り除く
【０１８８】
以下は上のステップの詳細な概要である。
１）アミンをフルオロフォアで官能化する。３０ｍｏｌ％  ＮＨ２−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｘ、Ｉｎｃ．）を１対１で５０ｍＭの炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５に希釈する。アミン反応性フルオロフォアを、アミン対フルオロフォアの最終モル比が１対１になるように添加する。１．４ｍｇ／ｍｌで１ｍｌのＰＥＧ−ＰＬＧＡには、１．４ｍｇのまたは９３．３ナノモルのＮＰが存在する。試料中のアミンのパーセントは、試料中２８ナノモルのアミン（９３．３ｎモル＊３０％アミノ化）である。２０ｍＭのストックから２８ナノモルのＡＦ６４７を達成するには、１．４μＬを１ｍＬの懸濁液に添加する。反応は、室温で３０分間、９００ｒｐｍで振盪しながらサーモミキサー上でインキュベートした。
２）残りのアミンをＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドで官能化する。ステップ１からのこの反応は、アジドを添加する前に精製する必要はない。反応の完了を保証するため、アジドは最初のアミン含有量の１０倍モル過剰に添加する。アジド付加の計算は：
２８ナノモル＊１０倍モル過剰＝必要なアジドの２８０ナノモル
２８０ナノモル／１００ｍＭ＝ナノ粒子懸濁液に直接添加される２．８μＬのアジド試料
２．８μＬのアジド架橋剤をナノ粒子反応に添加し反応は室温で１時間、９００ｒｐｍで振盪しながら進めておく。
３）無水コハク酸を添加して残りのアミンをすべて取り除く。１μＬのＩＭ無水コハク酸をＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＡＦ６４７−Ｃｅｎｔｙｒｉｎ反応に添加し、室温で３０分間、９５０ｒｐｍで振盪しながらサーモミキサー上でインキュベートする。
４）脱塩によるＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＡＦ６４７−Ｃｅｎｔｙｒｉｎ精製。現在ＧＥ  ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムを有するＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔがこのステップのために使用される。
５）ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−マレイミドを用いたＣｅｎｔｙｒｉｎ官能化、続いてＣｅｎｔｙｒｉｎ−ＤＢＣＯおよびＮＰ−アジドとのクイック反応
ａ．ルーチンな還元、沈澱および架橋剤との反応に続くＣｅｎｔｙｒｉｎ官能化ステップ。Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ＤＢＣＯコンジュゲートは１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ上で７〜１０ｍｇ／ｍＬ最終濃度まで濃縮される。このステップについての計算では、十分なＣｅｎｔｙｒｉｎ−ＤＢＣＯが添加されることを保証するため３０モル％のアジドが存在すると仮定されている。さらに、ナノ粒子の約３倍モル過剰なＤＢＣＯ産物を添加することが推奨される。２８ナノモルのアジドが存在する（１．４ミリグラムｐｒｅｐから３０モル％のアジド）。Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ＤＢＣＯが７ｍｇ／ｍＬ（約５７０μＭ）である場合、８４ナノモルのＣｅｎｔｙｒｉｎが添加されて３倍モル過剰を達成する（８４ナノモル／５７０μモル＝１４７μＬのＣｅｎｔｙｒｉｎが添加される）。コンジュゲートＣｅｎｔｙｒｉｎからの過剰なＤＢＣＯ架橋剤の精製のためにＧＥ  ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムが使用される。
ｂ．Ｃｅｎｔｙｒｉｎ／ＰＥＧ−ＰＬＧＡクリック反応。５０〜１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎを使用して、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子をその元の容積に戻す（５〜１０分間で２５００×ｒｃｆ回転で通常は十分である）。１ｍＬのナノ粒子試料を取り、新しいエッペンドルフチューブに移す。反応は室温で約４時間または４〜１０℃で一晩実行することができる。前の選択肢を選んだ。
６）最終産物の精製
小ｐｒｅｐグレードＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを使用して、標的化ＮＰの混合物の成分を未反応Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ＤＢＣＯから分離する。ＮＰを含有する画分を収集し、プールして、直接実験に使用した。ＮＰ収率の２０％の消失を想定した。すべてのＮＰの蛍光を比較し正規化して蛍光が濃度を正確に示すことを保証する。
（図８：ＳＥＣ精製後のＡＦ６４７標識ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＮＰのサイズ分布）
【０１８９】
Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−標的化ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰの結合および内部移行の定量的評価
ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子は８３−Ｃｅｎｔｙｒｉｎで官能化した。ＮＰ完全性およびサイズは動的光散乱法により確認される（図８）。ＮＰサイズ範囲は１００〜１２０ｎｍ（ｚ−平均径）であった。
【０１９０】
受容体に結合する標的化ＮＰの特異性は、変動する受容体密度での、ＥＧＦＲ発現細胞株のパネルへの８３−標的化ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰの相対的結合を測定することにより評価した（パネルは陰性細胞株Ｈ５２０を含む）。対照ＮＰは、非標的化（Ｃｅｒｔｙｒｉｎなし）ＮＰを含む。ＡＴＣＣから入手した細胞株は、類表皮癌Ａ４３１（＞１，０００，０００受容体／細胞）、Ｈ３５８気管支肺胞上皮癌（約１００ｋ受容体／細胞）、肺腺癌ＨＣＣ８２７（約８００ｋ受容体／細胞）、Ｈ２９２肺腺癌（約２００ｋ受容体／細胞）、およびＨ５２０肺癌（陰性細胞株）であった。その手順は、細胞をＲＰＭＩ培地１００μｌ中１ｅ６細胞／ｍｌで入手し、３７℃、１時間のインキュベーションでＮＰを添加することを含む。プレートは回転下に置いた。インキュベーションに続いて、試料を洗浄し、フローサイトメトリーによる分析のためにＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。細胞株のそれぞれはＦＳＣ／ＳＳＣによりゲートを開閉した。細胞株ごとにゲート（生存可能で分析に適していると見なされる細胞の領域）は同じであった。細胞はＦＬ−４チャネルによりＡＦ６４７について分析した。ＡＦ６４７シグナルの増加は、より大きな結合および内部移行事象を示している。図９は、ＥＧＦＲ発現細胞株への８３−Ｃｅｎｔｙｒｉｎ標的化ＮＰの用量依存結合および内部移行を示している。さらに、この用量依存結合はＥＧＦＲ受容体密度と相関している。標的化ＮＰは、陰性非ＥＧＦＲ発現細胞株、Ｈ５２０への結合は示さない。さらに、非標的化ＮＰは細胞株へのいかなる結合も示さない。
【０１９１】
図９は、ＥＧＦＲ発現細胞株のパネルでの３７℃、１時間のインキュベーション後のＡＦ６４７標識８３−Ｃｅｎｔｙｒｉｎ標識ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰの受容体密度依存性ならびに用量依存性結合および内部移行を示している。ＦＡＣＳを使用して、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ＮＰからのＡＦ６４７シグナルを定量的に測定した。
【０１９２】
撮像によるＣｅｎｔｙｒｉｎ標的化ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰの結合および内部移行の定性的評価
本実験の目的は、Ｏｐｅｒａ共焦点画像処理システムを使用してＥＧＦＲ＋細胞株を撮像することを介してＣｅｎｔｙｒｉｎ標識ＮＰの内部移行を調べることである。特に、蛍光８３ｖ２−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ  ＮＰを、Ａ４３１、ＨＣＣ８２７、Ｈ２９２、Ｈ３５８およびＨ５２０と一緒にインキュベートする（ＦＡＣＳベースの定量化のためには同じパネルの細胞を使用する）。５つの細胞株のそれぞれをＴ１５０フラスコで培養し、３７℃インキュベーターから引き出した。細胞用の培地は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳであった。細胞培地は取り除いてフラスコは１×ｄＰＢＳで静かにすすいだ。これに続いて、細胞は、Ｔ１５０フラスコ底から取り外されたことが分かるまで、５ｍＬの０．２５％トリプシンへのクイック曝露を使用して引き離された（おおよそ２〜７分間）。ゆるんだ細胞を観察すると、８ｍＬの細胞培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＢＳ）をフラスコに添加した。細胞は１５ｍＬのコニカルチューブに移し、室温で５分間、１０００ｒｐｍで回転させた。チューブ中の上澄みは吸引し、残りの細胞は計数するために５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０バッファーに再懸濁した。細胞計数を実施し、細胞は９６ウェルプレートにおいて種々の濃度に希釈した。１００００細胞／ウェルの細胞密度は、細胞が、処置前の２０時間のインキュベーション後表面の７０％を覆うように選択した。次の日、培地は吸引し、希釈試料は最初にそのウェルに添加し、容積はＲＰＭＩ  １６４０細胞培地を使用して１００μＬに合わせた。試料は、光脱色を防ぐために蓋をして、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション時間に続いて、プレートは４℃で３分間、１５００ｒｐｍで回転させ、冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。細胞は約２０分間ヘキスト染色し、核染色させておいた。これに続いて、細胞は１回洗浄し、１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁して、次に撮像した。
【０１９３】
図１０：ＡＦ６４７標識８３−Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（６０×）の細胞結合および内部移行は、ＥＧＦＲ発現細胞株である、ＨＣＣ８２７へのＣｅｎｔｙｒｉｎ特異的結合を示している。２０ｘ：Ｃ２ｆ３、Ｃ５ｆ１、Ｃ８ｆ２；６０ｘ：Ｃ２ｆ７、Ｃ５ｆ２、Ｃ８ｆ
青色＝１００〜２０００（０．５）、赤色＝１０〜１００（０．５）、赤色還元＝１０〜２０００（０．５）
【０１９４】
画像データにより、ＥＧＦＲ発現細胞株、ＨＣＣ８２７への８３Ｃｅｎｔｙｒｉｎ標的化ＮＰの結合および内部移行が確かめられる。標的化ＮＰは、陰性細胞株、Ｈ５２０への結合を示さず、特異性が確かめられる。さらに、非標的化ＮＰは、ＨＣＣ８２７細胞株へも陰性細胞株へも結合を示さない。より少ない受容体数の細胞株であるＨ２９２が示すＡＦ６４７シグナルははるかに少ない。
【０１９５】
[実施例８]ＥＧＦＲＣｅｎｔｙｒｉｎコンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の調製および選択的細胞内送達
Ｃｅｎｔｙｒｉｎを使用して、受容体媒介取込みにより、目的の標的細胞をオリゴヌクレオチドの特異的な標的とすることができる。本明細書に記載されるように、いくつかのＣｅｎｔｙｒｉｎが第２世代２’ＯメチルギャップマーＡＳＯにコンジュゲートされており、得られたコンジュゲートはインビトロ遺伝子ノックダウンについて特徴付けられている。Ｃｅｎｔｙｒｉｎは、ＥＧＦＲ受容体およびＣＤ８受容体への標的を含む。Ｃｅｎｔｙｒｉｎを用いたＡＳＯの標的化取込みの目標は、非特異的ＰＳ−ＡＳＯ媒介取込みを減らし、受容体媒介取込みによるＡＳＯの効力を増強することになる。
【０１９６】
方法：
Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ＡＳＯコンジュゲートの合成および特徴付け
【表８】
2021506802.tif 000021
【０１９７】
コンジュゲートは、ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯの５’末端のＤＢＣＯ末端基およびＣ終端にアジド官能基を有するＣｅｎｔｙｒｉｎを用いてクリックケミストリーコンジュゲーションにより合成された。ギャプマー構成中の２’Ｏメチル  ＰＳ  ＡＳＯは、統合化ＤＮＡ技術（ＩＤＴ）から得られ、ＣｅｎｔｙｒｉｎはGoldberg et al［１］に従って表現し精製した。タンパク質のそれぞれに付加されたＡＳＯの量は、開始ＡＳＯ質量約２．０ｍｇを用いて単一ＡＳＯ対２つのＣｅｎｔｙｒｉｎモル比に基づいて計算した。Ｔｅｎｃｏｎ−ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯでは、アニオン交換ＣａｐｔｏＱカラムを精製のために使用した。１ｍＬのＣａｐｔｏＱカラムはＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ（ＨｉＴｒａｐ  ＣａｐｔｏＱ  １ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７−５４７０−５１）上で調製した。詳細は、カラム容量０．９６２ｍｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．５のバッファーＡ、および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．５、２ＭのＮａＣｌのバッファーＢである。精製のために使用される方法：ａ．５ＣＶのバッファーＡを使用して１ｍｌ／分でカラムを平衡する、ｂ．サンプルポンプを使用して試料を注入する、ｃ．２０％Ｂ（５ＣＶ）のステップ勾配、３５ｃｖにわたる７０％Ｂまでの線形勾配、１００％（５ＣＶ）でのステップ勾配および最後に０％（８ＣＶ）でのステップ勾配を使用してサンプルを溶出する、ｄ．９６ウェルプレートにおいてすべての画分を１ｍＬ収集する。画分は、分析してＡＳＯ単独、ＡＳＯコンジュゲートおよびＣｅｎｔｙｒｉｎ画分を決定するために陰イオンＬＣ−ＭＳにより分析した。コンジュゲート物質に関連する画分はプールし、１ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に対して４時間の透析によりバッファー交換し、−８０℃で一晩凍結し、２〜３日間凍結乾燥した。８３−ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯでは、２ステップの精製方法を用い、最初はアニオン交換ＣａｐｔｏＱカラム、続いてｈｉｓ−トラップ精製方法で、高イミダゾール濃度で溶出させた。アニオン精製方法は、Ｔｅｎｃｏｎ−ＭＡＬＡＴ１コンジュゲートについてと同じである。ｈｉｓ−トラップ精製方法は、ＨｉＴｒａｐブルーＨＰ  １ｍｌ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７−０４１２−０１）を利用し、カラム容量０．９６２ｍｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールのバッファーＡ、および２５０ｍＭのイミダゾールのバッファーＢであった。溶出プロトコールは、２０ＣＶにわたる１００％バッファーＢ、続いて５ＣＶにわたる１００％Ｂのステップ勾配を含み、１．０ｍｌの画分を９６ウェルディーププレートにおいて収集した。収集した画分の分析、透析、および凍結乾燥法は上で詳述されている。ＣＤ８−３６８−ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯでは、ｈｉｓトラップによる１ステップ精製を用い、詳細な点は上に収載されている。このコンジュゲートでは、画分を上に記載される通りに、プールし、透析し、凍結乾燥した。
【０１９８】
粗生成物、精製からの画分、および最終精製物質は、分子量の精度についてＬＣ−ＭＳ陰イオンにより特徴付けた。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  Ｇ６２３０  ＭＳ−ＴＯＦ質量分析計上で実施した。装置は陰電子スプレーイオン化モード（negative electro-spray ionization mode）で操作し、ｍ／ｚ  ７００〜３２００までをスキャンした。ＬＣ条件は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  １２９０装置上で実施し、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ８、２．５μｍの粒子、２．１×５０ｍｍ；カラム温度７５℃、バッファーＡ＝２５ｍＭのトリエチルアミン、５７０ｍＭの１，１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、１０％メタノール、バッファーＢ＝アセトニトリル；流速＝０．３ｍＬ／分；勾配０〜２分  １％Ｂ、２〜１２分  １  ５０％Ｂ、１２〜１５分  ７５％Ｂを含んだ。質量分析装置設定は、負極性、７００〜３２００ａｍｕ質量範囲；スプレー電圧３７５０Ｖ；ソース温度３５０℃；乾燥ガス流  １２ｌ／分；噴霧器３５ｐｓｉ；シースガス３００℃；シースガス流  １１ｌ／分；ノズル電圧１２００Ｖ；フラグメンター（fragmentor）２５０Ｖを含んだ。ＭＳスペクトルは、７０００〜３３０００Ｄａの最大エントロピーアルゴリズムを使用して相互にデコンボリュート（de-convolute）した。タンパク質コンジュゲートはすべて陰イオンＬＣ−ＭＳ上で分析した。ＬＣ−ＭＳスペクトルは、Ｔｅｎｃｏｎ−ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯでは、５．６５９分で質量１９１２１．２９Ｄａ（６．５ｅ６）、８３−ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯでは６．０２分で質量１９２１４．４５Ｄａ（３．２ｅ６）、およびＣＤ８−３６８ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯでは４．８５１分で質量７５７４．０５Ｄａ（２ｅ４）および６．０９４分で質量１８３１８．５Ｄａ（１ｅ７）を示した。
【０１９９】
図１１：Ａ）１９２１４Ｄａで正確な分子量および単一種を示すＭＡＬＡＴ１−８３コンジュゲートのＬＣ−ＭＳ、Ｂ）１９１２１．３ＤａでのＭＡＬＡＴ１−ＴｅｎｃｏｎコンジュゲートのＬＣ−ＭＳ
図１３：１８３１８．５Ｄａ（理論的質量＝１８３２０Ｄａ）でのＭＡＬＡＴ１−ＣＤ８  ３６８コンジュゲートのＬＣ−ＭＳ
【０２００】
Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯコンジュゲートを使用するＡ４３１細胞におけるＭＡＬＡＴ１  ｍＲＮＡサイレンシング
Ａ４３１はＪａｎｓｓｅｎ細胞バンキングシステムから入手し、Ｈｅｐｅｓおよび１０％のＦＢＳを備えたＲＰＭＩで増殖させた。細胞は、ＡＳＯおよびＣｅｎｔｙｒｉｎ−ＡＳＯコンジュゲートでの処置前に、２４時間２５００細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートに播種した。９０％よりも大きな生存率を有する継代６および７の細胞を使用した。ＰＣＲでは、細胞はＰＬＡキット（タンパク質クワント（Quant）試料溶解キット（ＰＬＡ）、２５ｍＬ．部品番号４４４８５３６、ロット番号００３５８２５４、有効期限：２０１７−０２−０２）を使用して溶解した。ｃＤＮＡ合成では、２μｌのライセートを１８μｌのｃＤＮＡ合成ミックス（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：１０×ＲＴ（部品番号４３６８８１３、ロット番号００２８３７））と混合した。ｃＤＮＡが得られたのち、４℃で保存し、ＰＣＲステップのために使用した。ＰＣＲでは、試料は、ｖｉｉＡ７を使用して３８４ウェルプレートにおいて２通り分析した。ＰＣＲでは、２．５μｌのｃＤＮＡを７．５μｌのＰＣＲミックス（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｆａｓｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  番号４４４４５５７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロット１５０４０６５、有効期限２４Ａｐｒ１６）およびＰＰＩＢ用のプライマー（２０×ＰＰＩＢ  Ｖｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  番号Ｈｓ００１６８７１９  ＰＮ４４４８４９０  ７５０μｌ  ２０×、ロット１５０７１５−００１  Ｈ０３、有効期限０７／２０１７）と混合し、ハウスキーピング遺伝子、および標的遺伝子であるＭＡＬＡＴ１（２０×ＭＡＬＡＴ１  ＦＡＭ標識プライマー、ＰＮ  ４３５１３７０、有効期限０１／２０２２  ６８Ｇ１２、ロットＰ１７０１１３−００３  Ｇ１１）を増幅した。ｑＰＣＲサイクリングパラメータは、１サイクル５０℃で１２０秒間、９４．５℃で１０分間、９５℃で１５秒間、続いて６０℃で１分間の順に４０サイクルであった。デルタデルタＣｔ法を使用して、ＭＡＬＡＴ１の遺伝子ノックダウンを測定し、技術的複製物には３０％ＣＶ基準を提供した。閾値は０．２に設定した（増幅曲線の対数期）。
【０２０１】
図１２：自由取込みによりＡＳＯまたはＣｅｎｔｙｒｉｎ−ＡＳＯで処置したＡ４３１細胞においてｒｔ−ＰＣＲによって測定されたＭＡＬＡＴ１遺伝子発現。ＰＣＲは処置７２時間後に測定した。２つの生物学的実験からの複製物は平均をとった。
【０２０２】
ＣＤ８−３６８標的化Ｃｅｎｔｙｒｉｎを有するＭＡＬＡＴ１  ＫＤでは、活性化された初代Ｔ細胞を使用した。Ｔ細胞は、Ｊａｎｓｓｅｎ細胞バンキングシステムから入手し、Ｈｅｐｅｓおよび１０％の熱不活化ＦＢＳを備えたＲＰＭＩで増殖させた。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（ｈｅｍａ  Ｃａｒｅから入手、カタログＰＢ０８ＮＣ−３、ロット１７０４１５６０）は、ＩＬ−２を使用して１〜２週間ごとに活性化した（最終濃度２０Ｕ／ｍｌ）。９０％の生存率の細胞を播種し同じ日に処置した（懸濁細胞以降）。１００，０００細胞／ウェルの細胞播種密度を使用して、十分なＰＣＲシグナルを保証した（Ｔ細胞中のｍＲＮＡ含有量は他の細胞株と比べて低い）。ＰＣＲの方法は、Ａ４３１細胞の方法と類似しており、例外はハウスキーピング遺伝子がｇａｐｄｈ（２０×ｇａｐｄｈ  ２０×ＧａｐＤＨ  ＶＩＣ標識プライマーＨｓ０２７５８９９１＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。
【０２０３】
図１４：自由取込みによりＡＳＯまたはＣｅｎｔｙｒｉｎ−ＡＳＯで処置した一次Ｔ細胞においてｒｔ−ＰＣＲによって測定されたＭＡＬＡＴ１遺伝子発現。ＰＣＲは処置９６時間後に測定した。データは単一実験から捕らえた。
【０２０４】
[実施例９]ヒトＥｐＣＡＭおよびそのコンジュゲートに結合するＣｅｎｔｙｒｉｎの選択および特徴付け
ヒトＥｐＣＡＭに結合するＣｅｎｔｙｒｉｎについてのパニング
ＣＩＳディスプレイを使用して、ＴＣＬ７、ＴＣＬ９、およびＴＣＬ１４ライブラリーからＥｐＣＡＭ結合Ｃｅｎｔｙｒｉｎを選択した。インビトロ転写および翻訳（ＩＴＴ）では、３μｇのライブラリーＤＮＡを、全容量５０μＬで、０．１ｍＭの完全アミノ酸、１×Ｓ３０プレミックス成分、および１５μＬのＳ３０抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と一緒に３０℃でインキュベートした。１時間後、３７５μＬのブロッキング液（１×ＴＢＳ  ｐＨ７．４、０．０１％のＩ−ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号Ｔ２０１５）、１００μｇ／ｍｌのニシン精液ＤＮＡ）を添加し、反応は氷上で１５分間インキュベートした。ＩＴＴ反応は、Ｆｃドメインに融合させたビオチン化組換えヒトＥｐＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＸＸＸ）と一緒にインキュベートした。ビオチン化組換えタンパク質および結合ライブラリーメンバーは、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上で捕捉した。結合していないライブラリーメンバーは、ＴＢＳＴおよびＴＢＳを用いた連続洗浄により取り除いた。洗浄後、ＤＮＡは１０分間で８５℃まで加熱することにより標的タンパク質から溶出させ、パニングのさらなるラウンドのためにＰＣＲにより増幅させた。高親和性バインダーは、それぞれのラウンド中４００ｎＭから１００ｎＭまで標的ＥｐＣＡＭの濃度を連続して下げ、洗浄厳密性を高めることにより単離した。
【０２０５】
パニングに続いて、選択されたＦＮ３ドメインはＰＣＲにより増幅し、リガーゼ非依存性クローニング部位を含むように改変されたｐＥＴベクター中にサブクローニングし、標準分子生物学技法を使用する大腸菌（E.coli）における可溶性発現のためにＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換した。Ｃ終端ポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列をそれぞれのＦＮ３ドメインに付加し、精製および検出を可能にした。培養物は、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加する前に３７℃、１ｍＬの９６ウェルブロックにおいて１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充したＴＢ培地で０．６〜０．８の光学密度まで増殖させ、その時点で温度は３０℃まで下げた。細胞は遠心分離によりおおよそ１６時間後に収穫し、−２０℃で凍結させた。細胞溶解は、それぞれのペレットを０．６ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解バッファー（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で振盪させながら室温で４５分間インキュベートすることにより達成した。
【０２０６】
細胞ベースのスクリーニング
パニングで同定されたＣｅｎｔｙｒｉｎは、ＥｐＣＡＭを高レベルで発現する癌細胞株である、Ａ４３１細胞への結合についてもスクリーニングした。Ｃｅｎｔｙｒｉｎライセートは、２％ＦＢＳ−ＰＢＳにおいて１対１００で希釈し、８×１０４の解離させたＡ４３１細胞を含有する９６ウェルプレートに添加した。氷上での１時間インキュベーション後、培地を取り除き、細胞は１００μＬの２％ＦＢＳ−ＰＢＳに再懸濁した。次に、抗Ｃｅｎｔｙｒｉｎウサギ抗体ｐＡｂ２５を１０μｇ／ｍＬまで添加し、氷上で１時間インキュベートした。培地を取り除き、細胞は１００μＬの２％ＦＢＳ−ＰＢＳに再懸濁し、ロバ抗ウサギ−Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１１−１１６−１５２）を１対２００希釈で添加した。氷上での１時間インキュベーション後、培地を取り除き、細胞は２５０μＬの２％ＦＢＳ−ＰＢＳに再懸濁した。結合はＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置上でフローサイトメトリーにより分析した。バックグランド（ｐＡｂ２５および二次抗体のみを有する細胞）より１０×を超えるＭＦＩを有するＣｅｎｔｙｒｉｎを細胞バインダーと分類した。
【０２０７】
標的化送達における評価のために、スクリーニングデータ、タンパク質発現、および生物物理学的特徴付けの組合せに基づいて（表Ｘ）、ＥｐＣＡＭに対するパニングからＣｅｎｔｙｒｉｎを３つ選択した。
【０２０８】
Ｃ終端システインで修飾されている３つのＣｅｎｔｙｒｉｎをコードする遺伝子は、ＤＮＡ２．０から入手し、これを使用して上に記載される通りにタンパク質を発現し精製した。Ｃｅｎｔｙｒｉｎは、システイン−マレイミド化学反応を通じてｖｃ−ＭＭＡＦにコンジュゲートした（Brinkley, Bioconjugate Chemistry 3: 2-13, 1992）。Ｃｅｎｔｙｒｉｎ−ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートの細胞傷害性は、Ａ４３１、ＨＴ２９、およびＬＮＣａＰ細胞においてインビトロで評価した。細胞を９６ウェル黒色プレートに２４時間蒔き、次に種々の用量のＣｅｎｔｙｒｉｎ−ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートで処置した。細胞は、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ薬物コンジュゲート（ＣＤＣ）と一緒に６６〜７２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを使用して、上記の通りに、毒性を評価した。蛍光値はＥｘｃｅｌに取込み、そこから蛍光値を取り込んでグラフ解析のためにＰｒｉｓｍ中にペーストした。データはＸ＝Ｌｏｇ（ｘ）を使用して変換し、次に３パラメータモデルを適用し非線形回帰を使用して解析してＩＣ５０を決定した。
【０２０９】
【表９】
2021506802.tif 000022
【０２１０】
４５のＣｅｎｔｙｒｉｎの追加のパネルは後に、ＣＤＣとしての活性について評価した。Ｃ終端ソルターゼタグを有するＣｅｎｔｙｒｉｎをコードする遺伝子を得て、タンパク質を発現させ精製した。Ｃｅｎｔｙｒｉｎは、ソルターゼ酵素およびＧｌｙ３−ｖｃＭＭＡＦを使用してハイスループットコンジュゲーションによりｖｃＭＭＡＦにコンジュゲートした。ＣＤＣの細胞傷害性は、上に記載されるＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを使用してＣＯＬＯ２０５細胞において評価した。それぞれのＣＤＣは３つの濃度（２０、２、および０．２ｎＭ）で試験した。ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６に匹敵するまたはそれよりも強力な活性を有する６つのＣＤＣが同定された。これらは、総投与量応答でさらに特徴付けた（表Ｙ）。Ｃｅｎｔｙｒｉｎ  ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ｆ０１およびＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ７＿Ｇ０２は、ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６よりも強力であると判定された。これらは、ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ｅ０８と共に、融解温度を決定する示差走査熱量測定でも特徴付けた。
【０２１１】
【表１０】
2021506802.tif 000023
【０２１２】
抗ＥｐＣＡＭ  Ｃｅｎｔｙｒｉｎの操作
代表的なＥｐＣＡＭ結合Ｃｅｎｔｙｒｉｎ  ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６の「アラニンスキャン」変異体をコードする遺伝子は、ＤＮＡ２．０から入手し、これを使用して上に記載される通りにタンパク質を発現し精製した。単一アラニン変異体をＢＣおよびＦＧループの非アラニン位置のそれぞれで、全部で１５作製した。Ｃｅｎｔｙｒｉｎは、上記の通りにソルターゼ反応を介してｖｃＭＭＡＦにコンジュゲートし、精製した。ＣＯＬＯ２０５細胞は約７２時間コンジュゲートを用いて処置し、細胞傷害性はＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを用いてモニターした。
【０２１３】
【表１１】
2021506802.tif 000024
【０２１４】
試験された位置の多くがアラニンへの突然変異に寛容であり、活性に対してほとんど効果を示さなかった。最大の効果は位置Ｔｙｒ２５、Ａｒｇ２６、Ｐｒｏ２７、Ｌｅｕ８１、Ｐｒｏ８２、およびＴｙｒ８５で見られ、これらのアミノ酸がＥｐＣＡＭ結合において重要な役割を果たしていることが示唆される。これらの残基は大部分が、同定されたＥｐＣＡＭバインダーにおいて保存されており、ＥｐＣＡＭへの結合におけるその役割がさらに支持される。
【０２１５】
配列番号
配列番号１＝Ｐ１５５Ｒ８−Ｇ３
【０２１６】
【化８】
2021506802.tif 000025
【０２１７】
配列番号２＝ＥＥＢ８
【０２１８】
【化９】
2021506802.tif 000026
【０２１９】
配列番号３＝ＥＥＢ９
【０２２０】
【化１０】
2021506802.tif 000027
【０２２１】
配列番号４＝ＥＥＢ１１
【０２２２】
【化１１】
2021506802.tif 000028
【０２２３】
配列番号５＝ＥＥＢ１０
【０２２４】
【化１２】
2021506802.tif 000029
【０２２５】
配列番号６＝ＥＣＢ１６６
【０２２６】
【化１３】
2021506802.tif 000030
【０２２７】
配列番号７＝ＡＢＤｃｏｎ１２
【０２２８】
【化１４】
2021506802.tif 000031
【０２２９】
配列番号８＝Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｈ３−１
【０２３０】
【化１５】
2021506802.tif 000032
【０２３１】
配列番号９＝Ｐ２３４ＣＲ９＿Ｈ０１
【０２３２】
【化１６】
2021506802.tif 000033
【０２３３】
配列番号１０＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０
【０２３４】
【化１７】
2021506802.tif 000034
【０２３５】
配列番号１１＝Ｐ２２９ＣＲ５Ｐ８１９＿Ｈ１１
【０２３６】
【化１８】
2021506802.tif 000035
【０２３７】
配列番号１２＝ソルターゼＡ
【０２３８】
【化１９】
2021506802.tif 000036
【０２３９】
配列番号１３＝タグなしソルターゼＡ
【０２４０】
【化２０】
2021506802.tif 000037
【０２４１】
配列番号１４＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿ｃｙｓ
【０２４２】
【化２１】
2021506802.tif 000038
【０２４３】
配列番号１５＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ７＿Ｇ０４＿ｃｙｓ
【０２４４】
【化２２】
2021506802.tif 000039
【０２４５】
配列番号１６＝ＩＳＯ１２４Ｒ５ＡＢ＿Ｄ６＿ｃｙｓ
【０２４６】
【化２３】
2021506802.tif 000040
【０２４７】
配列番号１７＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ７＿Ｇ０２ｓｒｔ
【０２４８】
【化２４】
2021506802.tif 000041
【０２４９】
配列番号１８＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ｅ０８ｓｒｔ
【０２５０】
【化２５】
2021506802.tif 000042
【０２５１】
配列番号１９＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６ｓｒｔ
【０２５２】
【化２６】
2021506802.tif 000043
【０２５３】
配列番号２０＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ｆ０１ｓｒｔ
【０２５４】
【化２７】
2021506802.tif 000044
【０２５５】
配列番号２１＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ｆ０２ｓｒｔ
【０２５６】
【化２８】
2021506802.tif 000045
【０２５７】
配列番号２２＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ７＿Ｆ１１ｓｒｔ
【０２５８】
【化２９】
2021506802.tif 000046
【０２５９】
配列番号２３＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０２ｓｒｔ
【０２６０】
【化３０】
2021506802.tif 000047
【０２６１】
配列番号２４＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｋ２３Ａ
【０２６２】
【化３１】
2021506802.tif 000048
【０２６３】
配列番号２５＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｈ２４Ａ
【０２６４】
【化３２】
2021506802.tif 000049
【０２６５】
配列番号２６＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｙ２５Ａ
【０２６６】
【化３３】
2021506802.tif 000050
【０２６７】
配列番号２７＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｒ２６Ａ
【０２６８】
【化３４】
2021506802.tif 000051
【０２６９】
配列番号２８＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｐ２７Ａ
【０２７０】
【化３５】
2021506802.tif 000052
【０２７１】
配列番号２９＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｇ２８Ａ
【０２７２】
【化３６】
2021506802.tif 000053
【０２７３】
配列番号３０＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｒ３０Ａ
【０２７４】
【化３７】
2021506802.tif 000054
【０２７５】
配列番号３１＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｖ７８Ａ
【０２７６】
【化３８】
2021506802.tif 000055
【０２７７】
配列番号３２＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｔ７９Ａ
【０２７８】
【化３９】
2021506802.tif 000056
【０２７９】
配列番号３３＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｌ８１Ａ
【０２８０】
【化４０】
2021506802.tif 000057
【０２８１】
配列番号３４＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｐ８２Ａ
【０２８２】
【化４１】
2021506802.tif 000058
【０２８３】
配列番号３５＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｓ８３Ａ
【０２８４】
【化４２】
2021506802.tif 000059
【０２８５】
配列番号３６＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｙ８４Ａ
【０２８６】
【化４３】
2021506802.tif 000060
【０２８７】
配列番号３７＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｙ８５Ａ
【０２８８】
【化４４】
2021506802.tif 000061
【０２８９】
配列番号３８＝ＩＳＯＰ１３０Ｒ５ＣＰ６＿Ａ０６＿Ｓ８６Ａ
【０２９０】
【化４５】
2021506802.tif 000062
【図１Ａ−１Ｄ】
2021506802.tif 000063
【図２】
2021506802.tif 000064
【図３】
2021506802.tif 000065
【図４】
2021506802.tif 000066
【図５】
2021506802.tif 000067
【図６】
2021506802.tif 000068
【図７】
2021506802.tif 000069
【図８】
2021506802.tif 000070
【図９】
2021506802.tif 000071
【図１０】
2021506802.tif 000072
【図１１】
2021506802.tif 000073
【図１２】
2021506802.tif 000074
【図１３】
2021506802.tif 000075
【図１４】
2021506802.tif 000076
【配列表】
2021506802000001.app
【国際調査報告】
2021506802.tif 000077
2021506802.tif 000078
2021506802.tif 000079
2021506802.tif 000080