(57)【要約】  本発明は、治療のために用いられる、馴化細胞培養培地を含む組成物であって、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の集団（ここで、細胞数にして前記集団の少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％は、イヌ属に属する哺乳動物から得られたＭＳＣである）を、細胞培養用に調製された栄養豊富な液体、好ましくは基礎培地において培養すること；及び前記馴化細胞培養培地を収集することを含むプロセスによって入手されるか又は入手可能である馴化細胞培養培地を含む組成物に関するものであり、好ましくは、前記栄養豊富な液体は、ＭＳＣを増殖させるように設計された動物／ヒト血清不含有の培地又は化学的に規定された動物／ヒト血清不含有かつ異種不含有の培地であるものとする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
馴化細胞培養培地を含む組成物であって、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）又はそこから得られた不死化細胞の集団（ここで、細胞数にして前記集団の少なくとも約５０％は、イヌ属に属する哺乳動物から得られたＭＳＣ又はそこから得られた不死化細胞である）を、イヌＭＳＣを増殖させるのに適した栄養豊富な液体又は基礎培地において培養すること；及び前記馴化細胞培養培地を収集することを含むプロセスによって入手されるか又は入手可能である馴化細胞培養培地を含む組成物であり、
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まず、
かつヒト対象におけるアトピー性皮膚炎の異種処置のために用いられる、組成物。
【請求項２】
前記ＭＳＣが、イヌ種に属する哺乳動物から得られる、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記間葉系間質細胞が、臍帯由来間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、拡大間葉系間質細胞、拡大脂肪組織由来間質細胞、骨髄由来間質細胞、拡大骨髄由来間質細胞又は前述の供給源のいずれかから得られた不死化間葉系間質細胞である、請求項１又は２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
細胞培養のために調製された前記栄養豊富な液体が、ピルビン酸ナトリウム及びグルタミンを補充したアミノ酸及びビタミンを含む緩衝食塩水溶液である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
細胞培養のために調製された前記栄養豊富な液体が、補充を伴うか又は伴わない基礎培地である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、最適な処置を達成するために、必要な量の馴化培地を適切な間隔で送達するように構成され得る、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、次の投与経路：静脈内、経口及び局所経路のいずれかによって対象に投与するために構成され得る、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記投与経路が局所的であり、前記組成物が液体又は半固体形態で製剤化される局所製剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記投与経路が局所的であり、前記組成物が、以下のもの：液体、流体、発泡体、クリーム、ゲル、ペースト、バルサム、スプレー、軟膏、ローション、コンディショナー、トニック、ミルク、ムース、エマルジョン、血清、油、スティック、シャンプー、ゼリー、懸濁液、分散液、ラッカー、ペイント、エリキシル、ドロップ又はエアロゾルのいずれかで製剤化された局所製剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記投与経路が局所的であり、前記組成物がリポソーム調製物で製剤化された局所製剤である、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発達、細胞生物学、分子生物学及び遺伝学の分野に関する。より具体的には、本発明は、イヌ属に属する哺乳動物から得られた間葉系幹細胞から馴化培地を誘導する方法、及び乾癬又はアトピー性皮膚炎などの皮膚炎症性障害の処置のための前述の培地の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
かつては免疫学的に体から隔絶されていると考えられていた皮膚は、現在、多臓器系炎症軸の不可欠な部分であると見なされている。
【０００３】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）と乾癬は、特に最も重症の場合、様々な全身性炎症性障害と併存疾患に結び付いてしまう。これらの併存疾患は、小児期の炎症性皮膚疾患が単なる美容上の状態ではなく、深刻な慢性多臓器疾患であることを強調している。
【０００４】
アトピー性皮膚炎の併存疾患は、年齢や罹患期間の長さによって異なる。最も一般的な併存疾患のいくつかは、ＨａｎｉｆｉｎとＲａｊｋａによるゴールドスタンダードのＡＤ診断基準に含まれている（Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  Ｓｕｐｐｌ（Ｓｔｏｃｋｈ）１９８０；９２：４４−４７）。これらの基準には、そう痒症、慢性又は再発性皮膚炎、年齢別の特定の分布（例：小児の屈曲性疾患）、並びにアトピー、すなわち食物アレルギー、喘息及びアレルギー性鼻結膜炎の個人歴及び／又は家族歴が含まれる。小さな特徴には、尋常性魚鱗癬；細菌及びウイルス感染；免疫グロブリンＥ及び皮膚プリックテストが陽性であるアレルギー素因；白内障などの眼の所見；並びに食品への接触、圧力及び環境要因に対する過度の皮膚反応性を含む、１２を超える併存疾患が含まれる。これらの主要な基準と小基準は、実際に、併存疾患の概念がアトピー性皮膚炎とアトピー体質の定義の骨子であるものとして、ほぼ４０年間我々にとっては明白なものであった。
【０００５】
最近、小児乾癬とアトピー性皮膚炎は両方とも、皮膚感染症と、罹患した子供たちとその親たちの不安、うつ病及び活動亢進などの心理社会的障害に結び付けられている。白斑や円形脱毛症などの皮膚の自己免疫との関連は、両方の疾患で認められる可能性がある。
【０００６】
これら２つの疾患に共通する最も重要で十分に説明が為された一連の併存疾患は、肥満とメタボリック症候群、すなわち心臓病、脳卒中、糖尿病のリスクの増加を特徴とする一群の状態との関連性である。幼児期の肥満は、アトピー性皮膚炎の発症と重症度に関連している。乾癬では、腹部の周囲の増加と肥満が数年ほど病気に先行する可能性があり、病気の誘因としてのそれらの役割を示唆している。乾癬性疾患の１つの興味深い特徴は、減量手術を受け、乾癬性疾患の改善を経験した成人から得られる有望なデータである。
【０００７】
多くの共通した併存疾患にもかかわらず、小児アトピー性皮膚炎と小児乾癬には多くの顕著な特徴がある。
【０００８】
アトピー性皮膚炎では、皮膚バリアが弱く、かつ炎症によって弱められるため、一連の異常なアレルギーの特徴、すなわち、アトピックマーチや感染性合併症が起こり得る。あるいは、乾癬では、皮膚の肥厚が誘発され、関節が炎症を起こす可能性がある。
【０００９】
臨床症状にはさらなる相違が見られる。乾癬では、関節炎が主要な併存疾患であり、連鎖球菌性疾患によって引き起こされることもある。また、高血圧、高脂血症及びインスリン抵抗性などのメタボリック症候群の特徴との非常に明確な関連性がある。乾癬の一般的な性質と疾患の頻度にもかかわらず、アトピー性皮膚炎は、乳児脂漏性皮膚炎、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）感作、ほこりアレルギー、喘息、食物アレルギー、環境アレルゲン、接触性皮膚炎（例えば、ラノリン、香料）、掻痒症、睡眠障害、上気道感染症、いぼ、コクサッキーの全身化（例えば、湿疹コクサッキウム（ｃｏｘｓａｃｋｉｕｍ））及び白内障を含む、より広範な一連の併存疾患を発症する。
【００１０】
いずれにせよ、乾癬やアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患を患うあらゆる年齢の患者のためのスクリーニングツールと有効な薬理学的介入の開発は進行中の研究であり、今日では極めて必要なことである。この意味で、本発明は馴化培地の使用を提供するもので、イヌ属に属する哺乳動物に由来するＭＳＣ（間葉系幹細胞）を培養することにより、乾癬又はアトピー性皮膚炎などの皮膚炎症性障害の処置に適した馴化培地が得られる。本発明で開示される組成物が、ヒトとイヌとの間に高い系統発生的相違があるとしても、ヒトアトピー性皮膚炎の異種処置において特に有効であることを強調することは特に重要である（図７〜図９を参照）。
【００１１】
これに関して、国際公開第２００８１５５６５９号は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からの馴化細胞培地を含む、皮膚欠損を予防又は処置するための組成物を開示している。さらに、この文書は、ＭＳＣが、ヒト、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、その他の哺乳動物から入手できることを示している。しかしながら、この文書は「アトピー性皮膚炎」又は「乾癬」について具体的に言及しておらず、またイヌから得られた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からの馴化細胞培地を含む組成物でこれらの疾患を処置できることにも言及していない。この意味で、本発明の実施例２は、異なる起源からのＭＳＣが、定性的及び定量的観点の下で異なる馴化培地を提供することを示している。実際、図に示されているように（図１、図３及び図４と比較した図２）、イヌの脂肪ＭＳＣからの馴化培地は、ヒト、ネコ又はウマの脂肪組織から得られた馴化培養培地とはかなり異なる。前記と同様、国際公開第２００８１５５６５９号は、特にイヌの脂肪ＭＳＣから得られた馴化培養培地が、ヒトにおけるアトピー性皮膚炎や乾癬などの皮膚炎の有効な処置に特に有用であることを示していない。
【００１２】
さらに、本発明が好ましくはヒトアトピー性皮膚炎の異種処置に焦点を合わせているという事実は、以下の記述が見出され得る国際公開第２０１７０４１１３３号などの文書に照らして確かに直観と相容れないものである：「脂肪組織は、ヒトの脂肪組織又はイヌ、ウマ若しくはネコなどの哺乳動物の脂肪組織であり得る。典型的には、脂肪組織の供給源は、ＭＳＣの意図されたレシピエントと同じ種のものとなる・・・」
【００１３】
さらに、Ｍｏｈｄ  Ｍａｔｉｎ  Ａｎｓａｒｉ、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ＆ｔｈｅｒａｐｙ（幹細胞研究及び治療ジャーナル）、第３巻、第３号、２０１３年１月１日（２０１４−０１−０１）、ＸＰ０５５４０６８１５は、糖尿病ラットなどの異なる種での創傷の処置におけるイヌ細胞又はその馴化培地の潜在的有効性を開示しており、かかる創傷は、ラットの皮膚に全層切除を行うことによって作成される。それどころか、アトピー性皮膚炎の発疹を引き起こす皮膚の炎症は、アレルギー反応の一種と考えられている。したがって、Ｍｏｈｄ  Ｍａｔｉｎ  Ａｎｓａｒｉらが発生させた創傷の処置と、アトピー性皮膚炎の処置は完全に無関係である。
【００１４】
最後に、国際公開第２０１７１４４５５２号は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を強制的に含ませた組成物を明確に対象としており、事実、ＤＭＳＯは、国際公開第２０１７１４４５５２号に詳述されている疾患の処置を促進するため、その重要な特徴となっている。しかしながら、国際公開第２０１７１４４５５２号は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の集団を培養することを含むプロセスによって入手されるか又は入手可能な馴化細胞培養培地を用いることにより、特にＤＭＳＯ不含有組成物という状況において、ヒトアトピー性皮膚炎又は乾癬の異種処置を対象としておらず、細胞数による前記集団の少なくとも５０％は、イヌ属に属する哺乳動物から得られたＭＳＣである。
【００１５】
したがって、本発明は、我々が知る限り、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の集団を培養することを含むプロセスによって入手されるか又は入手可能である馴化細胞培養培地を含む組成物を提供する最初のものであり、細胞数による前記集団の少なくとも５０％は、ヒトアトピー性皮膚炎の異種処置に使用するために、イヌ属に属する哺乳動物から得られたＭＳＣである。
【発明の概要】
【００１６】
本発明によれば、幹細胞を使用する代わりに、損傷組織又は失われた組織は、ＭＳＣそれ自体の代わりに、又はＭＳＣそれ自体に加えて、ＭＳＣからの分泌物を適用することによる内因性組織修復の増強を通じて再生又は修復され得る。具体的には、本発明者らは、イヌ属に属する哺乳動物に由来するＭＳＣが培養される馴化培地の使用を実現させ、それは、乾癬やアトピー性皮膚炎などの皮膚炎症性疾患の処置に適した前述の馴化培地を得ることを目的としている。
【００１７】
特に、表ＩＩ（説明を参照）では、イヌ属に属する哺乳動物からのＭＳＣによって分泌されるポリペプチドと、ネコ又はヒトからのＭＳＣなど他の哺乳動物から分泌されるポリペプチドの定性的及び定量的比較を示す。さらに、本明細書に開示される実施例は、イヌ属に属する哺乳動物に由来するＭＳＣの培養から得られる馴化培地の使用に関連する治療効果、特にアトピー性皮膚炎又は乾癬の処置に関連する治療効果を明確に示す。
【００１８】
このアプローチにより、細胞ベースの治療に付随する現在の交絡問題、すなわち免疫適合性、腫瘍形成性、異種感染症、コスト、及び自家細胞調製物が使用される場合の待機時間が排除されることになる。このようなアプローチには、手頃な価格で、より優れた品質管理と一貫性を備えた「容易に入手可能な」ＭＳＣベースの治療法の開発を実現させる可能性がある。
【００１９】
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の慣用的技術を使用することになる。このような手法は、文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ブック１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５年及び定期的補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９、１３、及び１６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６年、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ及びＪａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩｒＩ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ、Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（編）、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）によるＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２）、１８５５；並びにＬａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ及びＬｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ編集、２００２年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｙ、ＩＳＢＮ０−８７９６９−６３０−３参照。これらの一般的なテキストはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
したがって、本発明の第１の実施態様は、治療のために用いられる、馴化細胞培養培地を含む組成物であって、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の集団（ここで、細胞数にして前記集団の少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％は、イヌ属に属する哺乳動物から得られたＭＳＣ又はそこから得られた不死化間葉系間質細胞である）を、細胞培養用に調製された栄養豊富な液体、好ましくは、血清含有培地、無血清培地、無タンパク質培地及び化学的規定培地など補給剤含有又は不含有のＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、又はＨＡＭ’Ｓなどの基礎培地において培養すること；及び前記馴化細胞培養培地を収集することを含むプロセスによって入手されるか又は入手可能である馴化細胞培養培地を含む組成物に関するものであり、
好ましくは、前記栄養豊富な液体は、ＭＳＣを増殖させるように設計された動物及びヒトの無血清培地であるものとし、
好ましくは、前記組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まないものとする。
【００２１】
なお、好ましくは本発明の第１の実施態様の組成物は、全体として、ヒト及び動物の血清成分を含まないことが好ましいものとする。
【００２２】
本発明の第１の実施態様又はその好ましい実施形態のいずれかの好ましい実施形態において、ＭＳＣは、イヌ種に属する哺乳動物から得られる。
【００２３】
本発明の第１の実施態様又はその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態において、間葉系間質細胞は、臍帯由来間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、拡大間葉系間質細胞、拡大脂肪組織由来間質細胞、骨髄由来間質細胞、拡大骨髄由来間質細胞又は前述の供給源のいずれかから得られた不死化間葉系間質細胞である。
【００２４】
本発明の第１の実施態様又はその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態において、細胞培養のために調製される栄養豊富な液体は、ピルビン酸ナトリウム及びグルタミンが補充されたアミノ酸及びビタミンを含む緩衝食塩水である。好ましくは、細胞培養のために調製される栄養豊富な液体は、血清含有培地、無血清培地、無タンパク質培地及び化学的規定培地などの補給剤含有又は不含有の基礎培地ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、又はＨＡＭ’Ｓである。
【００２５】
本発明の第２の実施態様において、本発明の第１の実施態様の医療用組成物は、ヒト又は動物の対象における皮膚炎の処置又は予防のために用いられる。好ましくは、前記皮膚炎は、アトピー性皮膚炎、湿疹及び乾癬からなる群より選択される。より好ましくは、本発明の第１の実施態様の医療用組成物は、ヒト対象におけるアトピー性皮膚炎、湿疹及び／又は乾癬の異種処置のために用いられる。
【００２６】
本発明の第３の実施態様は、本発明の第１の実施態様の医療用組成物、又は本発明の第２の実施態様に従って使用するための組成物を指し、このような組成物は、最適な処置を達成するために、適切な間隔で必要な量の馴化培地を送達するように構成され得る。
【００２７】
本発明の第３の実施態様の好ましい実施形態では、そのような組成物は補形薬を含む。好ましい補形薬は、局所組成物に含まれるのに適したものである（すなわち、皮膚科学的に許容され得る補形薬）。下記で述べる以下の補助剤は、かかる組成物中に互いに独立して存在することができる：ゲル化剤、油、ワックス、増粘剤、親水性又は疎水性ポリマー、乳化剤、皮膚軟化剤、脂肪酸、有機溶媒、酸化防止剤、安定剤、金属イオン封鎖剤、酸性化剤又は塩基性化剤、乳化剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、フィルム形成剤、アミノ酸、タンパク質、バニラ、アロエ抽出物又はバイオフラビノイドなどの性能及び／又は消費者アピールを高めるための生物学的添加剤、緩衝剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）若しくはシュウ酸などのキレート剤、着色剤、染料、推進剤、消泡剤、湿潤剤、ビタミン、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、香料、防腐剤、不透明化剤、水並びに／又はアルコール。組成物のための前述の補助剤は、当業者によって知られている通常の量で使用される。組成物に適した油は、動物油又は植物油又は合成油から選択される。特に好ましい油は、流動ワセリン、流動パラフィン、揮発性及び非揮発性のシリコーン油、イソパラフィン、ポリアルファオレフィン、フッ素化及び過フッ素化油を含む群から選択される。本発明の組成物に適した安定剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両親媒性の性質のものであり得る。好ましい安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその誘導体、トゥイーン、トリトン、スパン、ポリグリセリン（ｐｏｌｙｇｙｃｅｒｉｎ）、ポリアルキルグリセリド、アルキルスルホナート、アリールスルホナート、アルキルホスファート、アルキルベタインの誘導体及びホスファチジルグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｅ）を含む群から選択される。
【００２８】
本発明の第３の実施態様の別の好ましい実施形態において、組成物は、以下の投与経路：静脈内、経口及び局所経路のいずれかによって、対象、好ましくはヒト対象に投与するのに適している。本発明の第３の実施態様の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、液体又は半固体形態で、好ましくは液体、流体、発泡体、クリーム、ゲル、ペースト、バルサム、スプレー、軟膏、ローション、コンディショナー、トニック、ミルク、ムース、エマルジョン、血清、油、スティック、シャンプー、ゼリー、懸濁液、分散液、ラッカー、ペイント、エリキシル、ドロップ又はエアロゾルとして製剤化され得る局所製剤である。特定の実施形態において、本発明の活性化合物は、リポソーム調製物で局所的に投与された。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒト脂肪由来の間葉系幹細胞からの馴化培養培地とハイブリデートした（ｈｙｂｒｉｄａｔｅｄ）、ヒトＸＬサイトカインアレイ座標の代表的な画像。
【図２】イヌ脂肪由来の間葉系幹細胞からの馴化培養培地とハイブリデートした（ｈｙｂｒｉｄａｔｅｄ）、ヒトＸＬサイトカインアレイ座標の代表的な画像。
【図３】ネコ脂肪由来の間葉系幹細胞からの馴化培養培地とハイブリデートした（ｈｙｂｒｉｄａｔｅｄ）、ヒトＸＬサイトカインアレイ座標の代表的な画像。
【図４】ウマ脂肪由来の間葉系幹細胞からの馴化培養培地とハイブリデートした（ｈｙｂｒｉｄａｔｅｄ）、ヒトＸＬサイトカインアレイ座標の代表的な画像。
【図５】イヌ馴化培地で処置されたペキニーズ。画像は、４つの異なる時点での創傷の進展を示している。処置中の紅斑と皮膚の剥離は減少し、６週目に完全に寛解する。
【図６】イヌ馴化培地で処置されたシャムネコ。画像は、５週目の治療の開始時と終了時の創傷の進展を示している。比較重ね合わせで示されるように、創傷のサイズは減少した。
【図７】イヌ馴化培地で処置された７９歳の男性。画像は、脚と手の処置が続く３５日間の乾癬性創傷の進展を示している。剥離や鱗屑は著しく皮膚から減少する。
【図８】イヌ馴化培地で処置された３７歳の女性。画像は、腕と足の処置が続く２１日間の乾癬性創傷の進展を示している。剥離や鱗屑は著しく皮膚から減少する。
【図９】イヌの馴化培地で処置された５８歳の男性。画像は、脚と手の処置が続く３６日間の乾癬性創傷の進展を示している。剥離や鱗屑が皮膚から消える。
【発明の詳細な説明】
【００３０】
（定義）
本明細書で使用される場合、以下の用語及び句は、以下に記載される意味を有するものとする。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００３１】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語の１つ又はそれ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００３２】
値に関連して使用される「約」という用語は、値±１０％に関するものである。
【００３３】
「脂肪組織」とは、あらゆる脂肪組織を意味する。脂肪組織は、例えば、皮下、大網／内臓、乳腺、性腺、又は他の脂肪組織部位に由来する、褐色又は白色の脂肪組織であり得る。好ましくは、脂肪組織は皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、初代細胞培養又は不死化細胞株を含み得る。脂肪組織は、脂肪組織を有するあらゆる生物に由来し得る。いくつかの実施形態において、脂肪組織は哺乳動物に由来し、さらなる実施形態では、脂肪組織はヒトに由来する。脂肪組織の好都合な供給源は脂肪吸引手術によるものである。しかしながら、脂肪組織の供給源も脂肪組織の単離方法も本発明にとって重要ではないことが理解されよう。本明細書に記載の細胞が対象への自家移植に関して所望される場合、脂肪組織はその対象から単離されることになる。
【００３４】
「脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）」は、脂肪組織、一般にヒト脂肪組織（ｈＡＳＣ）に由来するＭＳＣを指す。これらの細胞は、本発明を再現するために本発明において使用されてきた。
【００３５】
本明細書で使用される「細胞／ｋｇ」という用語は、患者の体重１キログラムあたりに投与される細胞（例、ＭＳＣ）の数を意味するものと解釈されるべきである。
【００３６】
「培養」という用語は、培地中における細胞、生物、多細胞実体、又は組織の成長を指す。「培養すること」という用語は、そのような成長を達成するための任意の方法を指し、複数の段階を含み得る。「さらなる培養（をすること）」という用語は、細胞、生物、多細胞実体、又は組織をある特定の成長段階まで培養し、次に別の培養方法を使用して、前記の細胞、生物、多細胞実体、又は組織を別の成長段階に到達させることを指す。「細胞培養」は、インビトロでの細胞の増殖を指す。このような培養では、細胞は増殖するが、組織自体に組織化されることはない。「組織培養」は、組織の維持又は成長を指し、例えば、その構造及び機能を保存するための、インビトロでの始原臓器又は成体臓器の外植片の維持又は成長を指す。「単層培養物」は、細胞が、主に互いに及び基質に付着しながら、適切な培地中で増殖する培養物を指す。さらに、「懸濁培養物」は、適切な培地に懸濁されている間に細胞が増殖する培養物を指す。同様に、「連続フロー培養」は、細胞増殖、例えば生存能力を維持するために、新鮮な培地の連続フローで細胞又は外植片を培養することを指す。「馴化培地」という用語は、培地を、細胞によって産生され、培養物中に分泌されるある特定のパラクリン因子及び／又はオートクリン因子を含むよう改変させるために、培養細胞とある一定期間接触させた後に得られる、例えば培養細胞／組織を含まない、上清を指す。「コンフルエント培養」とは、すべての細胞が接触した状態であることから、培養容器の表面全体が覆われている細胞培養であり、細胞がその最大密度に到達したことも意味するが、コンフルエンスは必ずしも分裂が止まることや、集団のサイズが増大しないことを意味する訳ではない。
【００３７】
「培養培地」又は「培地」という用語は、当技術分野で認識されており、一般に、生細胞の培養に使用されるあらゆる物質又は調製物を指す。細胞培養に関して使用される「培地」という用語は、細胞を取り巻く環境の構成要素を含む。培地は、固体、液体、気体、又は相と材料の混合物であり得る。培地には、液体増殖培地と、細胞増殖を維持しない液体培地が含まれる。培地には、寒天、アガロース、ゼラチン及びコラーゲンマトリックスなどのゼラチン状培地も含まれる。具体例としての気体培地には、ペトリ皿又は他の固体若しくは半固体支持体上で増殖する細胞が曝露される気相が含まれる。「培地」という用語はまた、細胞とまだ接触していない場合でも、細胞培養での使用を目的とした材料を指す。言い換えれば、細菌培養用に調製された栄養豊富な液体が培地である。同様に、水又は他の液体と混合されたときに細胞培養に適したものになる粉末混合物は、「粉末培地」と呼ばれ得る。「規定培地」とは、化学的に規定された（通常は精製された）成分でできている培地を指す。「規定培地」には、酵母エキスや肉汁などの特性確認が不十分な生物学的抽出物は含まれていない。「富栄養培地」には、特定の種のほとんど又はすべての生存可能な形態の成長を支えるように設計された培地が含まれる。富栄養培地には、複雑な生物学的抽出物が含まれていることが多い。「基礎培地」という用語は、特別な栄養補給剤を必要としない多くのタイプの微生物の増殖を促進する培地を指す。ほとんどの基礎培地は、一般に、アミノ酸、炭水化物、無機塩、及びビタミンの４つの基本的な化学基を含んでいる。基礎培地は、一般に、血清、緩衝液、成長因子、脂質などの補給剤が添加される、より複雑な培地の基礎としての役割を果たす。基礎培地の例には、Ｅａｇｌｅｓ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（イーグル基礎培地）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（最小必須培地）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地）、Ｍｅｄｉｕｍ（培地）１９９、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０及びＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２（栄養混合物ハムＦ−１０及びハムＦ−１２）、ＭｃＣｏｙ’ｓ（マッコイ）５  Ａ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ（ダルベッコ）ＭＥＭ／ＦＩ  ２、ＲＰＭＩ  １６４０、並びにＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（イスコフ改変ダルベッコ培地）が含まれるが、これらに限定されない。元の製剤が文献に登場して以来、イーグル培地の多くの改変培地が開発されてきたことに留意されたい。これらの改変培地の中で最も広く使用されているものの中には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）がある。ＤＭＥＭは、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）の改変版であり、４倍高い濃度のアミノ酸とビタミン、及び追加の補足成分が含まれている。元のＤＭＥＭ配合物には、１０００  ｍｇ／Ｌのグルコースが含まれており、マウス胚細胞の培養で最初に報告された（低グルコースＤＭＥＭ）。４５００ｍｇ／Ｌグルコースによるさらなる変更は、ある特定の細胞型の培養に最適であることが証明されている（高グルコースＤＭＥＭ）。ＤＭＥＭは、本発明の文脈において好ましい基礎培地である。なお、本発明で言及される基礎培地は、イーグル基礎培地又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などのＭＳＣを増殖させるように設計された動物／ヒト無血清培地又は化学的に規定された無血清かつ異種不含有の培地であるものとする。
【００３８】
本発明の文脈において、動物及びヒトの無血清培地は、動物又はヒト由来の血液又は血清成分を含まない培地として理解される。特に、前記培地は、アルブミン又はウシ（ｂｏｖｉｎｅ）胎児血清又はウシ（ｃａｌｆ）胎児血清などのヒト又は動物の血液中に存在するヒト又は動物のタンパク質を含まない培地を指す（すなわち、前記培地は動物又はヒト由来の血液又は血清成分を含まない）。動物及びヒトの無血清培地の一例はＤＭＥＭである。
【００３９】
「含む」及び「含んでいる」という用語は、包括的でオープンな意味で使用され、追加の要素が含まれる場合があることを意味する。
【００４０】
細胞を指すときに本明細書で使用される「拡大（された）」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有する、すなわち、インビトロで増殖された細胞を指すと解釈されるべきである。ＭＳＣは、標準的な培養条件下で、ＭＳＣの少なくとも１つの生物学的機能、典型的にはプラスチック表面に付着する能力を保持する細胞の集団を提供するべく拡大され得る。拡大した細胞集団は、１つ以上の細胞型に分化する能力を保持している可能性がある。
【００４１】
「含む」という用語は、本明細書では「含むがこれに限定される訳ではない」ことを意味するために使用される。「含む」と「含むがこれに限定される訳ではない」は同じ意味で使用される。
【００４２】
「間葉系間質細胞（本明細書では「ＭＳＣ」とも呼ばれる）は、多能性間質細胞であり、すなわち、それらは、複数の異なる型の細胞を生じさせることができる細胞である。これらの細胞型は、特定の培養条件下でのそれらのプラスチック付着性増殖及びそれに続く拡大、並びにそれらのインビトロ及びインビボ分化能によって定義される（Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ（ジャーナル・オブ・オルソペディック・リサーチ）、１９９１，９：６４１−６５０；Ｚｕｋ  ＰＡ、Ｚｈｕ  Ｍ、Ｍｉｚｕｎｏ  Ｈ、Ｈｕａｎｇ  Ｊ、Ｆｕｔｒｅｌｌ  ＪＷ、Ｋａｔｚ  ＡＪ、Ｂｅｎｈａｉｍ  ＡＪ、Ｌｏｒｅｎｚ  ＨＰ、Ｈｅｄｒｉｃｋ  ＭＨ：Ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ（組織工学）、２００１、７：２１１−２２８；Ｈｕａｎｇ  ＪＩ、Ｂｅａｎｅｓ  ＳＲ、Ｚｈｕ  Ｍ、Ｌｏｒｅｎｚ  ＨＰ、Ｈｅｄｒｉｃｋ  ＭＨ、Ｂｅｎｈａｉｍ  Ｐ：Ｒａｔ  ｅｘｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ（形成再建外科学）、２００２、１０９：１０３３−１０４１；Ｄｅｎｎｉｓ  ＪＥ、Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ａ  Ｈ−２Ｋｂ−ｔｓＡ５８  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（細胞生理学誌）、１９９６、１６７（３）：５２３−５３８；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  Ｂ、Ｈｅｒｉｎｇ  ＴＭ、Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＶＭ、Ｙｏｏ  ＪＵ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（エクスペリメンタル・セル・リサーチ）、１９９８，２３８（１）：２６５−２７２；Ｄｅｎｎｉｓ  ＪＥ、Ｍｅｒｒｉａｍ  Ａ、Ａｗａｄａｌｌａｈ  Ａ、Ｙｏｏ  ＪＵ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  Ｂ、Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ：Ａ  ｑｕａｄｒ−ｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ（ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ）、１９９９、１４（５）：７００−７０９；Ｋｏｐｅｎ  ＧＣ、Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ、Ｐｈｉｎｎｅｙ  ＤＧ：Ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｇｒａｔｅ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ，ａｎｄ  ｔｈｅｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎｓ．米国科学アカデミ��紀要、１９９９、９６：１０７１１−１０７１６；Ｔｏｍａ  Ｃ、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦ、Ｃａｈｉｌｌ  ＫＳ、Ｂｙｒｎｅ  ＢＪ、Ｋｅｓｓｌｅｒ  ＰＤ：Ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｔｏ  ａ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（循環系）、２００２、１０５：９３−９８）。ＭＳＣは、上に示されるように文献でよく知られており、それ自体、当業者による共通した一般知識の一部を形成する。
【００４３】
ＭＳＣは、本発明を実施するために多数の哺乳動物から単離されてきた。例えば、ＭＳＣは、骨髄（Ａｒｎｈｏｌｄ  ＳＪ、Ｇｏｌｅｔｚ  Ｉ、Ｋｌｅｉｎ  Ｈ、Ｓｔｕｍｐｆ  Ｇ、Ｂｅｌｕｃｈｅ  ＬＡ、Ｒｏｈｄｅ  Ｃ、Ａｄｄｉｃｋｓ  Ｋ、Ｌｉｔｚｋｅ  ＬＦ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｑｕｉｎｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ）２００７、６８、１０９５−１１０５；Ｋｉｓｉｄａｙ  ＪＤ、Ｋｏｐｅｓｋｙ  ＰＷ、Ｅｖａｎｓ  ＣＨ、Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｙ  ＡＪ、ＭｃＩｌｗｒａｉｔｈ  ＣＷ、Ｆｒｉｓｂｉｅ  ＤＤ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｅｑｕｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ａｎｄ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．ジャーナル・オブ・オルソペディック・リサーチ（Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ）２００８、２６、３２２−３３；Ｓｍｉｔｈ  ＲＫＷ、Ｋｏｒｄａ  Ｍ、Ｂｌｕｎｎ  ＧＷ、Ｇｏｏｄｓｈｉｐ  ＡＥ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｑｕｉｎｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｆｌｅｘｏｒ  ｔｅｎｄｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．イークァイン・ベテリナリー・ジャーナル（Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔ  Ｊ）２００３、３５、９９−１０２）、脂肪組織（Ｖｉｄａｌ  ＭＡ、Ｋｉｌｒｏｙ  ＧＥ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＪＲ、Ｌｏｐｅｚ  ＭＪ、Ｍｏｏｒｅ  ＲＭ、Ｇｉｍｂｌｅ  ＪＭ．Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｅｑｕｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ．獣医外科学（Ｖｅｔ  Ｓｕｒｇ）２００６、３５、６０１−６１０．）、末梢血、臍帯血、臍帯マトリックス、及び羊水を含む、様々なウマ組織に由来している。しかしながら、本発明は、特に骨髄及び脂肪組織から単離されたイヌＭＳＣの使用を対象としていることに留意されたい。このようなイヌＭＳＣは、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｍｉｔｓｕら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ獣医学研究、２０１２、８：１５０に詳しく記載されている。最後に、ＭＳＣは、ヒトにおける骨髄及び脂肪組織（Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．ジャーナル・オルソペディック・リサーチ（Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ）１９９１、９：６４１−６５０．Ｚｕｋ  ＰＡ、Ｚｈｕ  Ｍ、Ｍｉｚｕｎｏ  Ｈ、Ｈｕａｎｇ  Ｊ、Ｆｕｔｒｅｌｌ  ＪＷ、Ｋａｔｚ  ＡＪ、Ｂｅｎｈａｉｍ  ＡＪ、Ｌｏｒｅｎｚ  ＨＰ、Ｈｅｄｒｉｃｋ  ＭＨ：Ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．組織工学（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ）２００１，７：２１１−２２８．Ｈｕａｎｇ  ＪＩ、Ｂｅａｎｅｓ  ＳＲ、Ｚｈｕ  Ｍ、Ｌｏｒｅｎｚ  ＨＰ、Ｈｅｄｒｉｃｋ  ＭＨ、Ｂｅｎｈａｉｍ  Ｐ：Ｒａｔ  ｅｘｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．形成再建外科学（Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ）２００２、１０９：１０３３−１０４１。）から有効な形で分離された。
【００４４】
対象の方法によって処置される「患者」、「対象」又は「宿主」は、ヒト又はヒト以外の動物のいずれかを意味し得る。
【００４５】
「医薬組成物」という用語は、それがヒト又は動物の治療用であるかどうかに関係なく、治療での使用を目的とする組成物を指し、したがって、本発明の医薬組成物という用語には獣医学組成物が含まれる。本発明の組成物は、患者又は宿主の処置に使用することを目的とした医薬組成物である。
【００４６】
「医薬的に許容され得る」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った形で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題や合併症を伴うことなくヒト及び動物の組織と接触した状態での使用に適している化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために本明細書で使用される。
【００４７】
本明細書で使用される「医薬的に許容され得る担体」という句は、体の１つの臓器又は一部から体の別の臓器又は一部への対象化合物の運搬又は輸送に関与する、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、補形薬、又は溶媒封入材料などの医薬的に許容され得る材料、組成物又は賦形剤を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に害を及ぼさないという意味で「許容し得る」ものでなければならない。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、本発明で使用されるＭＳＣが生存可能なままである、医薬的に許容され得る担体又は希釈剤を含む。
【００４９】
ＭＳＣ集団に関して「実質的に純粋な」という用語は、細胞の数にして少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％がＭＳＣである細胞の集団を指す。言い換えれば、ＭＳＣ集団に関して「実質的に純粋な」という用語は、分化系列決定細胞を、数にして約５０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、又は約５％未満の割合で含む細胞の集団を指す。本明細書で使用される「支持体」は、脂肪組織由来間質細胞の増殖のための基礎又はマトリックスとしての役割を果たし得る任意の装置又は材料を指す。
（説明）
【００５０】
本発明の第１の実施態様は、治療に使用するための馴化細胞培養培地を含む組成物であって、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の集団（ここで、細胞数にして前記集団の少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％は、イヌ属に属する哺乳動物から得られたＭＳＣである）を、細胞培養用に調製された栄養豊富な液体、好ましくは基礎培地において培養すること；及び前記馴化細胞培養培地を収集することを含むプロセスによって入手されるか又は入手可能である馴化細胞培養培地を含む組成物に関するものであり、好ましくは、前記栄養豊富な液体は、ＭＳＣを増殖させるように設計された動物及びヒトの無血清培地であるものとし、また好ましくは、前記組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まないものとする。
【００５１】
本発明の第１の実施態様のＭＳＣは、他の細胞に分化する能力を有する未分化間質細胞であり、典型的には結合組織に由来し、したがって非造血細胞である。「結合組織」という用語は、間葉に由来する組織を指し、それらの細胞が細胞外マトリックス内に含まれることを特徴とするいくつかの組織を含む。種々のタイプの結合組織の中には、脂肪組織と軟骨組織が含まれる。一実施形態において、ＭＳＣは、脂肪組織の間質画分に由来する。別の実施形態において、ＭＳＣは、軟骨細胞から、例えば硝子軟骨から得られる。別の実施形態において、ＭＳＣは皮膚から得られる。また、別の実施形態において、ＭＳＣは骨髄から得られる。ＭＳＣの代替供給源には、骨膜、歯髄、脾臓、膵臓、靭帯、腱、骨格筋、臍帯及び胎盤が含まれるが、これらに限定される訳ではない。他の供給源には、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞がある。
【００５２】
本発明の第１の実施態様の組成物を得るために使用されるＭＳＣは、イヌ属に属する哺乳動物から得られ、特にこれらの細胞はイヌのＭＳＣであることに留意することが重要である。典型的には、イヌＭＳＣは、脂肪組織の間質画分から得られる、すなわち、それらは、イヌ脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）又はそれから得られる不死化ＭＳＣである。イヌＭＳＣは、標準的な培養条件下でプラスチックへの付着性を示す。イヌＭＳＣは未分化の多能性細胞であり、中胚葉細胞（脂肪、軟骨細胞、骨芽細胞など）などの体細胞に、又はそれらに向かって分化する能力、また場合によっては内胚葉及び／若しくは外胚葉の細胞型若しくは系列に、又はそれらに向かって分化することもある能力を有する。典型的には、細胞は、脂肪細胞、軟骨芽細胞及び骨芽細胞の系列からなる群より選択される少なくとも２つ若しくはすべての細胞型に、又はそれらの細胞型に向かって分化する能力を有する。
【００５３】
本発明の第１の実施態様の一実施形態において、イヌＭＳＣは、インビトロ培養拡大イヌＭＳＣ又はそのインビトロ培養拡大子孫（以下、両方とも拡大ＭＳＣ又は「ｅＭＳＣ」と称す）である。ｅＭＳＣを調製するための方法は、例えば、国際公開第２００７０３９１５０号に記載されているように、当技術分野で知られている。ｅＭＳＣは、ＭＳＣのいくつかの表現型の特徴を保持しており、例えば、ｅＭＳＣは、標準的な培養条件下でプラスチックに付着し、未分化の表現型を保持している。
【００５４】
ｅＭＳＣは未分化の多能性細胞であり、中胚葉細胞などの体細胞に分化する能力を有する。ＭＳＣは、限定される訳ではないが、脂肪細胞、軟骨芽細胞及び骨芽細胞の系列など、少なくとも１つ以上の特化された細胞系列に向かって分化する能力を有しており、典型的には、ｅＭＳＣでは、この分化能力が低下するか、又は存在すらしない場合もあり、例えば、ＭＳＣは、少なくとも骨形成系列及び脂肪細胞系列に向かって分化し得、そこから派生したｅＭＳＣは、脂肪細胞系列に向かってのみ分化する可能性がある。これは、ｅＭＳＣの予期せぬ潜在的に有害な分化が起こりにくいと合理的に予想できるため、細胞が患者に投与され得る場合の細胞の治療適用に有利である可能性がある。
【００５５】
一実施形態において、イヌのｅＭＳＣは、幹細胞の子孫であり得る。典型的には、イヌｅＭＳＣは、（ｉ）ＡＰＣからの固有のマーカーを発現することはなく、（ｉｉ）ＩＤＯを構成的に発現することはなく、（ｉｉｉ）ＭＨＣＩＩを構成的に顕著に発現することはない。通常、ＩＤＯ又はＭＨＣ  ＩＩの発現は、ＩＦＮ−γによる刺激によって誘導される可能性がある。
【００５６】
さらに、本発明の第１の実施態様で言及される細胞集団は、「本発明の細胞集団」とも呼ばれることにさらに留意されたい。典型的には、イヌＭＳＣは拡大ＡＳＣであり、典型的には同種又は自己由来の拡大ＡＳＣである。典型的には、本発明の細胞集団は、イヌＭＳＣ及び／又はイヌｅＭＳＣの均質又は実質的に均質な集団である。本発明の細胞集団は、本質的にイヌＭＳＣ及び／又はイヌｅＭＳＣを含むが、本発明の細胞集団はまた、他の細胞型を含み得る。したがって、一実施形態において、本発明は、細胞の少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも細胞の約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％が、イヌＭＳＣ及び／又はイヌｅＭＳＣである、本発明の細胞集団を提供する。
【００５７】
一実施形態では、ｅＭＳＣは、ｅＡＳＣ、例えば、ヒトｅＡＳＣである。特定の実施形態では、細胞は、処置される対象に関して同種異系である。別の特定の実施形態では、細胞は、処置される対象に関して自己由来である。
【００５８】
典型的には、本発明の細胞集団は、限定される訳ではないが、脂肪細胞、軟骨芽細胞及び骨芽細胞の系列などの少なくとも１つ以上の特化された細胞系列に向かって分化する能力を有し得る。一実施形態では、本発明の細胞集団は、脂肪細胞、軟骨芽細胞及び骨芽細胞の系列からなる群より選択される少なくとも２つ又はすべての細胞型に、またはそれらに向かって分化する能力を有し得る。しかしながら、これに代わる実施形態において、分化するこの能力は低下するか、又は存在しない場合さえあり得、例えば、ＭＳＣは少なくとも骨形成系列及び脂肪細胞系列に向かって分化し得るが、そこから派生したｅＭＳＣ集団は脂肪細胞系列にのみ分化する可能性がある。これは、ｅＭＳＣの予期せぬ潜在的に有害な分化が起こりにくいと合理的に予想できるため、細胞が患者に投与され得る場合の細胞の治療適用に有利である可能性がある。
【００５９】
本発明の第１の実施態様で言及し、実施例で具体的に示すように、本発明者らは、イヌ属に属する哺乳動物から得られた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養によって条件付けされた培地を提供する。そのような馴化培地は、独特の遺伝子産物を含む、そのようなＭＳＣによって分泌される分子を含む。前述の馴化培地、及び特にタンパク質又はポリペプチドを含む、そこに含まれる分子のいずれかの組み合わせは、疾患の処置に使用され得る。それらは、例えば疾患を処置又は予防する目的で、ＭＳＣの活性を補足するために、又はＭＳＣの代わりに使用され得る。
【００６０】
本発明の第１の実施態様の馴化培地は、細胞培養用に調製された栄養豊富な液体、好ましくは基礎培地などの培地中でイヌＭＳＣを培養することによって作製され得、ここで、前記栄養豊富な液体は、好ましくは、ＭＳＣを所定の長さの時間成長させるように設計された動物及びヒト血清不含有の培地である。したがって、馴化培地は、実施例に記載されているように、イヌＭＳＣによって分泌されるポリペプチドを含むことになる。
【００６１】
好ましい実施形態において、無血清培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含む。
【００６２】
上記にかかわらず、本発明の第１の実施態様の馴化培地は、イヌＭＳＣを増殖させるのに適した任意の培地によって作製され得、したがって、得られた細胞が所望の特性を有し、さらに増殖することができる限り、いくつかの異なる配合物のいずれかを有することができる。適切な供給源は、次のとおりである：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃ｌ  １９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；ベータ−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。具体例としての血清含有胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％ＤＭＥＭ（典型的にはＫＯ  ＤＭＥＭ）、熱不活化なしの２０％規定ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び０．１ｎｉＭベータ−メルカプトエタノールにより作製される。培地をろ過し、４℃で２週間以下の期間保存する。無血清胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清代替品、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールにより作製される。有効な血清代替品はＧｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。培地をろ過し、４℃で２週間以下の期間保存する。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを最終濃度４ｎｇ／ｎｉＬになるように添加する（Ｂｏｄｎａｒら、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ、国際特許公開第９９／２０７４１号）。
【００６３】
好ましい実施形態において、培地は、１０％血清置換培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク、グランドアイランド）、５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、グランドアイランド、ニューヨーク）及び５ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー）を補った、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク、グランドアイランド）を含む。
【００６４】
本発明の馴化培地を得るためにイヌＭＳＣを培養するための条件は、実施例１に明確に示されているが、ただし、これらの条件は適切に最適化され得る。
【００６５】
本発明の馴化培地は、そのまま、又は１つ以上の処置段階の後に治療に使用され得る。例えば、馴化培地に対し、ＵＶ処理、濾過滅菌などが行われ得る。１つ以上の精製段階が使用され得る。
【００６６】
特に、馴化培地は、例えば、透析又は限外濾過によって濃縮され得る。例えば、培地は、例えば３Ｋの公称分子量限界（ＮＭＷＬ）を有する膜限外濾過を使用して濃縮され得る。
【００６７】
本発明者らはまた、そのような馴化培地の代わりに、又はそのような馴化培地を補足するために、実施例に記載のポリペプチドの１つ以上、好ましくはすべてを含む組成物を提供する。
【００６８】
本明細書に記載の方法及び組成物によって作製されたものなどの間葉系幹細胞からの馴化培地は、様々な商業的に重要な研究、診断、及び治療の目的に使用され得る。
【００６９】
間葉系幹細胞からの馴化培地は、特に、疾患の処置のための医薬組成物の調製に使用され得る。そのような疾患は、皮膚疾患、火傷、乾癬又はアトピー性皮膚炎を含む、再生療法によって処置可能な疾患を含み得る。この意味で、本明細書では、実施例に示されるように、イヌＭＳＣによる培養培地への分泌タンパク質の分析（表ＩＩを参照）は、発現されたタンパク質が、血管新生、造血及び骨格発達を含む組織分化を含むいくつかの生物学的プロセスに関与することを示すことに留意されたい。したがって、本発明者らは、概してイヌ属に属する哺乳動物から得られる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又はイヌ属に属する哺乳動物から得られる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）によって条件付けされた培地の使用をこれらの生物学的プロセスのいずれかの調節において実現させる。
【００７０】
さらに、イヌ属に属する哺乳動物から得られた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、これらの生物学的プロセスがある一定の役割を果たす可能性がある疾患、又はその修復若しくは処置がこれらの生物学的プロセスのいずれか１つ以上を含む疾患を処置するために使用され得る。同様に、イヌ属に属する哺乳動物から得られた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）によって、単独で又は組み合わせて、好ましくは馴化培地の形態で発現されたタンパク質を使用して、例えば前述の疾患を処置又は予防する目的で、イヌ属に属する哺乳動物から得られた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の活性を補足するか、又はその代わりに使用することができる。
【００７１】
したがって、そのような馴化培地は、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、いぼ、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーセット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及び潰瘍を処置するために使用され得る。特に、そのような馴化培地は、乾癬又はアトピー性皮膚炎を処置するために使用され得る。さらに、馴化培地は、個体における創傷治癒又は瘢痕減少を助けるために使用され得る。
【００７２】
特に、馴化培地は、血管新生、血液学（特に免疫過程）又は筋骨格の発達などに関与するプロセスを調節するために使用され得る。
【００７３】
好ましくは、前記馴化培地又はそれを含有するか若しくは含む組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まず、ヒト対象におけるアトピー性皮膚炎、湿疹及び／又は乾癬の異種処置に使用される。
【００７４】
さらに、馴化培地の形態を含む、本明細書に記載のＭＳＣから分泌される任意の１つ以上のタンパク質を、本明細書に記載のＭＳＣと同じ目的で使用することができる。したがって、本発明者らは、馴化培地中に存在する１つ以上、好ましくは実質的にすべてのポリペプチドを含む組成物を提供する。具体的には、本発明者らは、特にイヌの脂肪組織に由来するＭＳＣの場合、表ＩＩに記載のポリペプチドの１つ以上、好ましくは実質的にすべてを含む組成物を提供する。
【００７５】
このような組成物は、馴化培地が使用され得るあらゆる目的に使用することができる。文脈において別段の指示がない限り、「馴化培地」という用語については、ＭＳＣに曝露された細胞培養培地だけでなく、馴化培地に存在する１つ以上、好ましくは実質的にすべてのポリペプチドを含む組成物も含むものとして捉えるべきである（表ＩＩ参照）。
【００７６】
本明細書に記載されている方法及び組成物が、間葉系幹細胞からの馴化培地の生産を可能にすることは明らかとなるはずである。したがって、間葉系幹細胞を使用した場合、いずれも間葉系幹細胞からの馴化培地に等しく付着することになる。
【００７７】
この文書に記載されている馴化培地は、任意の適切な手段によってヒト又は動物の体に送達され得る。
【００７８】
したがって、本明細書に記載されている馴化培地を標的細胞、組織、臓器、動物の体又は人体に送達するための医薬若しくは化粧品の組成物又は送達システム、及び医薬若しくは化粧品の組成物又は送達システムを使用して標的に馴化培地を送達する方法について説明する。送達システムは、馴化培地を含む容器などの馴化培地の供給源を含み得る。送達システムは、馴化培地を標的に分配するためのディスペンサーを含み得る。
【００７９】
したがって、本発明者らは、本明細書に記載の馴化培地の供給源と、馴化培地を標的に送達するように機能し得るディスペンサーとを含む、馴化培地を送達するための送達システムを提供する。
【００８０】
本発明者らは、さらに馴化培地を標的に送達する方法におけるそのような送達システムの使用を提供する。
【００８１】
流体を体内に送達するための送達システムは当技術分野で知られており、注射、外科的点滴、米国特許第６，１３９，５２４号に記載されているものなどのカテーテル（灌流カテーテルを含む）、例えば、米国特許第７，１２２，０１９号に記載されているものなどの薬物送達カテーテルを含む。
【００８２】
最適な処置を達成するために、特定の送達は、適切な間隔で必要な量の馴化培地を送達するように構成され得るべきであることが明らかとなるはずである。馴化培地の好ましい送達又は投与は、局所送達又は投与である。この目的のために、組成物又は送達システムは、補形薬を有し得る。本明細書で定義される補形薬は、組成物に含まれる馴化培地の担体又は賦形剤として使用される不活性物質である。本発明の組成物は、好ましくは局所組成物に含まれるのに適した任意の補形薬（すなわち、皮膚科学的に許容され得る補形薬）を含み得る。下記で述べる以下の補助剤は、本発明の組成物中に互いに独立して存在することができる：ゲル化剤、油、ワックス、増粘剤、親水性若しくは疎水性ポリマー、乳化剤、皮膚軟化剤、脂肪酸、有機溶媒、酸化防止剤、安定剤、金属イオン封鎖剤、酸性化剤又は塩基性化剤、乳化剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、フィルム形成剤、アミノ酸、タンパク質、バニラ、アロエ抽出物又はバイオフラビノイドなどの性能及び／又は消費者アピールを高めるための生物学的添加剤、緩衝剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）若しくはシュウ酸などのキレート剤、着色剤、染料、推進剤、消泡剤、湿潤剤、ビタミン、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、香料、防腐剤、不透明化剤、水並びに／又はアルコール。本発明の組成物のための前述の補助剤は、当業者に知られている通常の量で使用される。本発明の組成物に適した油は、動物油又は植物油又は合成油から選択される。特に好ましい油は、流動ワセリン、流動パラフィン、揮発性及び非揮発性のシリコーン油、イソパラフィン、ポリアルファオレフィン、フッ素化及び過フッ素化油を含む群から選択される。本発明の組成物に適した安定剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両親媒性の性質のものであり得る。好ましい安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその誘導体、トゥイーン、トリトン、スパン、ポリグリセリン（ｐｏｌｙｇｙｃｅｒｉｎ）、ポリアルキルグリセリド、アルキルスルホナート、アリールスルホナート、アルキルホスファート、アルキルベタインの誘導体及びホスファチジルグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｅ）を含む群から選択される。
【００８３】
乳化剤は、本発明の組成物において、前記組成物の成分の均一な混合を提供するのに有効な量で使用され得る。適切な乳化剤には、脂肪酸石鹸、例えば、ステアリン酸カリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸アンモニウム、及びステアリン酸トリエタノールアミン；脂肪酸石鹸を含むポリオール脂肪酸モノエステル、例えば、カリウム塩又はナトリウム塩のいずれかを含むグリセロールモノステアレート；硫酸エステル（ナトリウム塩）、例えば、ラウリル５硫酸ナトリウム、及びアセチル硫酸ナトリウム；及び硫酸エステルを含むポリオール脂肪酸モノエステル、例えば、ラウリル硫酸（ｓｕｒｆａｔｅ）ナトリウムを含むモノステアリン酸グリセリルなどのアニオン性物質；（ｉｉ）Ｎ（ステアロイルコラーミノホルミルメチル）ピリジウム；Ｎ−ソヤ−Ｎ−エチルモルホリニウムエトサルフェート；アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ジイソブチルフェノキシセオキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；及びアセチルピリジウムクロリドなどのカチオン性塩化物；並びに（ｉｉｉ）ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、例えば、モノステアレート；ポリオキシエチレンラウリルアルコール；ポリオキシプロピレン脂肪アルコールエーテル、例えば、プロポキシル化オレイルアルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンステアレート；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート；ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ソルビタン；ポリオキシエチレングリコール脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート；及びポリオール脂肪酸エステル、例えば、グリセリルモノステアレート及びプロピレングリコールモノステアレート；及びエトキシル化ラノリン誘導体、例えば、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ラノリンアルコール及び／又はエトキシル化コレステロールなどの非イオン性物質が含まれる。
【００８４】
皮膚軟化剤はまた、乾燥を防止又は緩和するような量で本発明の組成物に使用され得る。適切な皮膚軟化剤には、炭化水素油及びワックス；シリコーン油；トリグリセリドエステル；アセトグリセリドエステル；エトキシル化グリセリド；アルキルエステル；アルケニルエステル；脂肪酸；脂肪アルコール；脂肪アルコールエーテル；エーテルエステル；ラノリン及び誘導体；多価アルコール（ポリオール）及びポリエーテル誘導体；多価アルコール（ポリオール）エステル；ワックスエステル；蜜蝋誘導体；植物性ワックス；リン脂質；ステロール；並びに／又はアミドが含まれるが、これらに限定される訳ではない。
【００８５】
さらに界面活性剤は、本発明の組成物においても使用することができる。適切な界面活性剤は、例えば、一般にクレンジング剤、乳化剤、泡ブースター、ハイドロトロープ、可溶化剤、懸濁剤及び非界面活性剤として分類される界面活性剤であり、これらは液体中の固体の分散を促進する。
【００８６】
好ましくは本発明の組成物に使用され得るフィルム形成剤は、組成物を滑らかかつ均一に保つべきであり、好ましくは、限定されない。適切なフィルム形成剤は、アクリルアミド／アクリル酸ナトリウムコポリマー；アクリル酸アンモニウムコポリマー；ペルーバルサム；セルロースガム；エチレン／無水マレイン酸コポリマー；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ポリアクリルアミド；ポリエチレン；ポリビニルアルコール；ｐｖｍ／ＭＡコポリマー（ビニルメチルエーテル／無水マレイン酸コポリマー）；ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）；無水マレイン酸ポリマー、ビニルピロリドン／ヘキサデセンコポリマー；アクリルアクリレート（ａｃｒｙｌｉｃｌａｃｒｙｌａｔｅ）コポリマーなどを含む群から選択される。ＰＨ調整剤はまた、本発明の組成物において使用され得る。これらのｐＨ調整剤は、好ましくは、水酸化アンモニウム、トリエタノールアミン又はクエン酸から選択される。
【００８７】
本発明の組成物に使用される増粘剤は、好ましくは、カンデリラ、カルナウバ、及び微晶性ワックス、架橋アクリル酸ポリマー、カルボマー、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロース及びポリエチレン増粘剤から選択される。
【００８８】
本発明の組成物に好ましい有機溶媒の例には、低級脂肪族アルコール及びポリオールが含まれる。
【００８９】
本発明で使用される組成物に適した酸化防止剤は、好ましくは、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ナトリウム−Ｌ−アスコルビン酸塩、カルシウム−Ｌ−アスコルビン酸塩、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、カルシウム−二ナトリウム−ＥＤＴＡ、イソアスコルビン酸、レシチン、乳酸、ポリホスフェート、トコフェロール（ビタミンＥ）、例えばアルファ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、プロピルガレート、オクチルガレート、ドデシルガレート、イソアスコルビン酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム及び塩化錫（ＩＩ）を含む群から選択される。好ましくは本発明の組成物において使用されるゲル化剤は、天然又は合成ポリマーであり得る。天然ポリマーは、好ましくは、寒天、アルギネート、ペクチン、カルボマー、カラギーナン、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、アラビアガム、ケラチン、ローカストビーンガム、キサンタンガムなどから選択される。本発明の組成物に使用することができる好ましい合成ポリマーは、アクリル酸（ａｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）ポリマー、ポリアクリルアミド、及びアルキレンオキシドポリマーから選択される。
【００９０】
すでに示したように、本発明の組成物を対象に投与するために任意の投与経路を使用することができ、静脈内、経口及び局所投与経路が好ましい投与経路である。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、液体又は半固体形態で、好ましくは液体、流体、発泡体、クリーム、ゲル、ペースト、バルサム、スプレー、軟膏、ローション、コンディショナー、トニック、ミルク、ムース、エマルジョン、血清、油、スティック、シャンプー、ゼリー、懸濁液、分散液、ラッカー、ペイント、エリキシル、ドロップ又はエアロゾルとして製剤化され得る局所製剤である。特定の実施形態において、本発明の活性化合物は、リポソーム調製物で局所的に投与された。本発明で使用される場合、「リポソーム」は、１つ以上の同心円層から構成される人工小胞であり、特に物質（すなわち、馴化培地）を体細胞に送達するために使用される。
【００９１】
本発明の組成物の局所投与は、馴化培地の活性化合物の高い生物学的利用能をもたらす。薬理学において、生物学的利用能は、薬物の主要な薬物動態特性の１つである、全身循環系に到達する未変化の薬物の投与量の割合を表すために使用される。したがって、生物学的利用能は薬物動態学において不可欠なツールの１つであり、非静脈内投与経路の投与量を計算する際に考慮されなければならない。
【００９２】
送達方法は、馴化培地が送達されるべき特定の臓器によって異なることは明らかであり、当業者であれば、それに応じてどの手段を使用するかを決定することができるはずである。
【００９３】
以下の実施例は、単に説明を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９４】
実施例１  本発明の馴化培地の入手
一般的に、本発明の馴化培地は、好ましくはイヌ脂肪組織に由来するＭＳＣ（間葉系幹細胞）を、適切な細胞培地、好ましくは１０％ＦＢＳ及びＰＳＧを補充したＤＭＥＭ中で、７０％〜８０％のコンフルエンスに達するまで培養することによって得ることができ、このようなレベルのコンフルエンスには通常、継代３で到達する。
【００９５】
脂肪組織を、１人又は数人の健康なドナーから入手する。各ドナーからの約１０〜５００ｇの脂肪組織により、マスター細胞バンクの１つのバッチが生成されることになる。ドナーの年齢は、細胞のインビトロ寿命に影響を与える可能性があるため、元のドナーは２歳未満ということになる。ドナーの病歴と良好な全身状態が評価されることになる。常用手順及び疾病検査を実施し、病原体が存在しないことを証明するために、いくつかの試料を収集することになる。脂肪組織の抽出は、獣医の基準に従って、手術室又は抽出用の安定した設定で実行される。組織の抽出は、動物福祉の条件下で資格のある獣医によって行われることになる。
【００９６】
脂肪組織抽出のための領域は、好ましくは肝かま状間膜となるが、脂肪組織はまた、他の腹腔内脂肪又は皮下（すなわち、ドック領域）から得ることができる。脂肪組織の収集手順は次のとおりである：簡単に述べると、その領域に対し、標準的な外科的手法に従って徹底的に洗浄、剃毛、及び消毒を行うことになる。次に、局所又は全身麻酔下で切開を行う。抽出された脂肪組織を無菌受容器に入れ、それに応じて処理する。
【００９７】
そのようなコンフルエンスのレベルに達したら、培地を廃棄し、細胞をＰＢＳなどの生理食塩水で、好ましくは３回すすぐべきである。次に、細胞を、ＤＭＥＭなどの血清不含有及び抗生物質不含有の培地で少なくとも約２４時間培養するべきである。次に、馴化培地を集め、０．２ｍｍフィルターでろ過して、細胞屑を除去するべきである。
【００９８】
特に、本実施例で使用される馴化培地は、以下のようにして得られた：
脂肪組織は、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓｆａｍｉｌｉａｒｉｓ  Ｌ．）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ  ｃａｔｕｓ  Ｌ．）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ  Ｌ．）から、またヒトからも、外科的切除により動物とヒトの腹部から前記組織を無菌的に集めることによって得られた。次に、そのような脂肪組織から得られたＭＳＣを、１０％ＦＢＳ及びＰＳＧを補充したＤＭＥＭ中で、７０％〜８０％のコンフルエンスに達するまで培養したところ、前述のレベルのコンフルエンスには、継代３で到達した。次に培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで３回すすいだ。次に、細胞を血清不含有で抗生物質不含有の培地で２４〜７２時間の範囲の期間培養した。次に、馴化培地を集め、０．２ｍｍフィルターで濾過して細胞屑を除去した。前述の４つの馴化培地（イヌ、ウマ、ヒト及びネコから得られる）について、以下の実施例２に示す要領で特性評価したことに留意されたい。
【００９９】
細胞を剥離し、フローサイトメトリーによって同定された表面マーカーによって、ＭＳＣとして特性評価した。
【０１００】
実施例２  実施例１で得られた馴化培地の特性評価
馴化培地の特性評価には、プロテオームプロファイラーアレイを使用した。
【０１０１】
Ｈｕｍａｎ  ＸＬ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（ヒトＸＬサイトカイン・アレイ・キット）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＲＹ０２２Ｂ）を、製造元の使用説明書に従って使用した。これは、試料間のサイトカインの違いを同時に検出するための迅速で感度の高いツールである。このキットは、最大１０５の可溶性ヒトタンパク質の相対的な発現レベルを測定するために使用できる。
【０１０２】
馴化培地の特性評価を行うために、捕捉抗体と対照抗体をニトロセルロース膜に２回スポットした。実施例１で得られた細胞培養上清を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｈｕｍａｎ  ＸＬ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ（プロテオーム・プロファイラー・ヒトＸＬサイトカイン・アレイ）と共に一晩直接インキュベートした。膜を洗浄して未結合の物質を除去した後、ビオチン化検出抗体のカクテルとインキュベートした。次に、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及び化学発光検出試薬を適用し、結合したタンパク質の量に対応するシグナルを各捕捉スポットで発生させた。
【０１０３】
検出された１０５種類のタンパク質のリストを表Ｉに示す。４つの異なる種に関する結果は、図１（ヒト）、図２（イヌ）、図３（ネコ）及び図４（ウマ）に示されている。
【０１０４】
【表１】
2021528489.tif 000002
2021528489.tif 000003
2021528489.tif 000004
【０１０５】
平均ピクセル密度の比較結果を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
2021528489.tif 000005
【０１０７】
したがって、これらの結果を考慮すると、異なる起源のＭＳＣが、定性的及び定量的な観点から異なる馴化培地を提供することは明らかである。
【０１０８】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、イヌから得られた馴化培地が、動物だけでなくヒトにおいても、アトピー性皮膚炎や乾癬などの皮膚疾患の処置に特に有効であることを見出した。イヌからヒトへの異種使用の成果は明らかではない。さらに、２つの種の間に存在する高い系統発生的相違を考えると、成果は明らかではない。
【０１０９】
実施例３  本発明の組成物による臨床的及び獣医学的結果
第１の症例  イヌのアトピー性皮膚炎の処置
本発明の処置のための候補として、皮膚疾患、すなわち精巣の疾患を引き起こし、多くのかゆみを引き起こすアトピー性皮膚炎を患う８歳のペキニーズを採用した。この個体では、通常のコルチコステロイド処方への反応が頻繁に再発した。前述の皮膚疾患に対し、イヌの馴化培地を傷口の皮膚ローションとして使用し、それを１日２回６週間にわたって広げて処置した。
【０１１０】
馴化培地で処置してから１か月半後、図５に示すように、Ｐａｎｃｈｏは完全に寛解する。
【０１１１】
第２の症例  重度の皮膚熱傷を負ったシャムネコの処置
５年前、シャムネコ対象は沸騰した油のフライパンに落とされた。体の３０％、主に脚と脇腹の１つが冒された。初期の処置は、スルファジアジド銀、軟膏及び液体で構成された。
【０１１２】
ネコは最初の１年間で病変を回復したが、約１０×５ｃｍの領域は回復せず、過去３年間にわたって安定した病変を生じ、滲出液とかゆみが続いた。
イヌの馴化培地を創傷上の皮膚ローションとして使用して、前述の安定した病変を処置し、６週間にわたって１日２回それを広げた。
【０１１３】
馴化培地で処置してから１か月半後、図６に示すように、創傷のサイズは減少した。
【０１１４】
第３の症例  ヒトにおける乾癬の処置
男性。７９歳。１９７５年に乾癬と診断された。患部はひじと右足で、膝からほぼ足首までの大きなスポットがはっきりと見えた。約８年又は１０年の間、手に小さな患部があった。
【０１１５】
ヒト対象は、コルチコステロイド処置を含む多くの処置を受けた。
【０１１６】
前述の安定した病変をイヌの馴化培地で３５日間、１日２回処置した。
【０１１７】
気化器を使用して脚と手の皮膚病変に直接適用される馴化培養の使用後、剥離と鱗屑が皮膚から消えた。
【０１１８】
手の小さな患部はほぼ完全に消えた。図７を参照。
【０１１９】
第４の症例  ヒトにおける乾癬の処置
女性。３７歳。乾癬性関節炎として１０年を超える期間診断されている。
【０１２０】
サラゾピリンによる処置（４錠／日）。重篤な危機の場合、処置は少量のメトトレキサートで構成された。そのような処置は非効率的であると考えられた。
【０１２１】
乾癬によって生じた病変をイヌの馴化培地で処置した。
【０１２２】
馴化培地を使用して２１日後、図８に示すように、皮膚の剥離と鱗屑が著しく減少した。
【０１２３】
第５の症例  ヒトにおける乾癬の処置
５８歳の男性。１９８０年春に乾癬と診断され、患部は肘にある。
【０１２４】
主要な関連領域でのクリームステロイドの処置を行うも、著しい改善は伴わず。鉱油／ヨウ素調製物による処置へ変更するも、プラス効果は伴わず（１９８１）。
何年にもわたってアセチルサリチル酸の使用に変更するも、落屑性にさらなる影響を及ぼさず。（１９８２）
現れたり消えたりし、決して重篤又は不快な状態にはならない頭皮の点状の外観。（１９９０−・・・）
【０１２５】
アセチルサリチル酸の放棄と肘、手の領域での保湿剤の使用（１９９６年〜現在）。
【０１２６】
乾癬によって生じた病変をイヌの馴化培地で処置した。
【０１２７】
馴化培地を使用して３６日後、図９に示すように、皮膚の剥離と鱗屑は著しく減少した。
【図１】
2021528489.tif 000006
【図２】
2021528489.tif 000007
【図３】
2021528489.tif 000008
【図４】
2021528489.tif 000009
【図５】
2021528489.tif 000010
【図６】
2021528489.tif 000011
【図７】
2021528489.tif 000012
【図８−１】
2021528489.tif 000013
【図８−２】
2021528489.tif 000014
【図９−１】
2021528489.tif 000015
【図９−２】
2021528489.tif 000016
【国際調査報告】
2021528489.tif 000017
2021528489.tif 000018
2021528489.tif 000019
2021528489.tif 000020