(57)【要約】  ペプチドリンカーにより、ヒトＩＬ‐７タンパク質またはその断片に融合されたＰＤ‐Ｌ１阻害剤を有する融合分子が提供される。開示された融合分子は、抗腫瘍相乗効果を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ‐７レセプタに結合可能なヒトＩＬ‐７タンパク質またはその断片に、ペプチドリンカーにより融合されたＰＤ‐Ｌ１阻害剤を含む、融合分子。
【請求項２】
前記ペプチドリンカーは、５から１００のアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の融合分子。
【請求項３】
前記ペプチドリンカーは、１０から７５のアミノ酸を有する、請求項２に記載の融合分子。
【請求項４】
前記ペプチドリンカーのアミノ酸残基の少なくとも２０％は、アラニン、グリシン、システインおよびセリンから成る群から選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載の融合分子。
【請求項５】
前記ペプチドリンカーのアミノ酸残基の少なくとも４０％は、アラニン、グリシン、システインおよびセリンから成る群から選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載の融合分子。
【請求項６】
前記ペプチドリンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１‐５から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合分子。
【請求項７】
前記ＰＤ‐Ｌ１阻害剤は、デコイＰＤ‐１タンパク質、または、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、または、その抗原結合断片である、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項８】
前記デコイＰＤ‐１タンパク質は、ＰＤ‐Ｌ１に結合する不活性ＰＤ‐１である、請求項７に記載の融合分子。
【請求項９】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体の前記抗原結合断片は、単一鎖断片、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ断片のペアである、請求項７に記載の融合分子。
【請求項１０】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体は、単一特異性抗体またはさらに二次特異性を有する二重特異性抗体である、請求項７に記載の融合分子。
【請求項１１】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体はＡＤＣＣ有効化されている、請求項１０に記載の融合分子。
【請求項１２】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその前記抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基３１‐３５、残基５０‐６６、および残基９９‐１０８の前記アミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の残基２４‐３４、残基５０‐５６、および残基８９‐９７の前記アミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の融合分子。
【請求項１３】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその前記抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の前記アミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の前記アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の融合分子。
【請求項１４】
前記ＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の前記アミノ酸配列、または、ＩＬ‐７レセプタアルファに結合可能でありつつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも７５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列は、前記野生型ヒトＩＬ‐７タンパク質と比較して、前記ＩＬ‐７レセプタアルファへの低減された結合親和性を有する、請求項１３に記載の融合分子。
【請求項１６】
前記ＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９による位置１４２において、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから選択されるアミノ酸残基を有する、請求項１５に記載の融合分子。
【請求項１７】
前記ＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９による位置１４２において、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから選択されるアミノ酸残基を有する、請求項１５に記載の融合分子。
【請求項１８】
前記ＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の前記アミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の融合分子。
【請求項１９】
前記ＩＬ‐７タンパク質の断片を含有する融合分子であって、前記断片が、少なくとも４つの前記アルファヘリックスモチーフを含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項２０】
ペプチドリンカーは、前記ＰＤ‐Ｌ１阻害剤の前記Ｃ端残基に融合され、且つ、前記ＩＬ‐７タンパク質の前記断片の前記ＩＬ‐７タンパク質の前記Ｎ端残基に融合される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項２１】
ペプチドリンカーは、前記ＰＤ‐Ｌ１阻害剤の前記Ｎ端残基に融合され、且つ、前記ＩＬ‐７タンパク質の前記Ｃ端残基に融合される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項２２】
前記ペプチドリンカーは、前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその断片の軽鎖の前記Ｎ端残基に融合される、請求項２１に記載の融合分子。
【請求項２３】
前記ペプチドリンカーは、前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその断片の重鎖の前記Ｎ端残基に融合される、請求項２１に記載の融合分子。
【請求項２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の前記アミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを有する分離されたタンパク質であって、前記ペプチドはＩＬ‐７レセプタアルファに結合可能であるが、前記野生型ヒトＩＬ‐７タンパク質と比較して、前記ＩＬ‐７レセプタアルファへの低減された結合親和性を有する、分離されたタンパク質。
【請求項２５】
前記ペプチドは、位置１４２においてＴｒｐ以外のアミノ酸残基を有する、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記ペプチドは、位置１４２において、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから成る群から選択されるアミノ酸残基を有する、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記ペプチドは、位置１４２において、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから成る群から選択されるアミノ酸残基を有する、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記ペプチドは、位置１４２において、アラニンを有する、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２９】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の分子、または、請求項２４から２８のいずれか一項に記載のタンパク質、および、薬学的に許容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項３０】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の分子、または、請求項２４から２８のいずれか一項に記載のタンパク質をエンコードする１または複数のポリヌクレオチドを含む、分離された細胞。
【請求項３１】
癌の治療を必要する患者を治療する方法であって、前記患者に、請求項１から２３のいずれか一項に記載の分子を投与する段階を備える、方法。
【請求項３２】
癌の治療を必要する患者を治療する方法であって、前記患者に、請求項２４から２８のいずれか一項に記載のタンパク質を投与する段階を備える、方法。
【請求項３３】
前記患者にＰＤ‐Ｌ１阻害剤を投与する段階をさらに備える、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質および前記ＰＤ‐Ｌ１阻害剤は、約２：１から１：２のモル比を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌は、膀胱癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、消化器癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、メラノーマ、前立腺癌および甲状腺癌から成る群から選択される、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
インターロイキン７（ＩＬ‐７）は、骨髄および胸腺内の間質細胞によって分泌される造血成長因子である。ＩＬ‐７は、多能性造血幹細胞の、リンパ球前駆細胞への分化を刺激する。また、ＩＬ‐７は、リンパ球系列（Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞）のすべての細胞の増殖も刺激する。ＩＬ‐７とは、Ｂ細胞およびＴ細胞の成長に重要なサイトカインである。このサイトカインおよび肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、ｐｒｅ‐ｐｒｏ‐Ｂ細胞増殖刺激因子として機能するヘテロダイマーを形成する。このサイトカインは、初期のＴ細胞成長中のＴ細胞レセプタベータ（ＴＣＲβ）のＶ（Ｄ）Ｊ再配置のための補因子であることが判明している。このサイトカインは、腸管上皮細胞および上皮杯細胞によって局所的に生成され得、腸粘膜リンパ球のための制御因子として機能し得る。
【０００２】
組換え体ＩＬ‐７は、いくつかのフェーズＩおよびフェーズＩＩの臨床試験で患者に安全に投与されてきた。ＩＬ‐７の癌患者への人体実験により、このサイトカインの投与が、細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方のホメオスタシスを一時的に混乱させ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ調節細胞の比率において相応の減少を生じさせ得ることを示した。しかしながら、目的とする癌の消失は観察されなかった。
【０００３】
分化クラスタ２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７‐Ｈ１）としても知られるＰＤ‐Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−Ｌｉｇａｎｄ  １）は、妊娠、組織異糸移植片、自己免疫疾患および肝炎等の他の病状といった特定のイベント中に、免疫系の抑制において大きな役割を果たすと考えられている４０ｋＤａタイプ１膜貫通タンパク質である。ＰＤ‐Ｌ１が、ＰＤ‐１またはＢ７．１に結合すると、リンパ節におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を低減する阻害シグナルが伝達される。これに加えて、ＰＤ−１は、Ｂｃｌ−２遺伝子の下向き調節によってさらに媒介されるアポトーシスを通して、リンパ節における外来抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を制御することもできる。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１の上向き調節は、癌が宿主の免疫系を回避することを可能にし得ることが実証されている。腎細胞癌の患者からの腫瘍標本の解析から、ＰＤ−Ｌ１の高い腫瘍発現は、腫瘍の攻撃性の増大および死亡リスクの増加に関連することが判明した。癌免疫療法として多くのＰＤ−Ｌ１阻害剤が開発中であり、それらは臨床試験において良好な結果を示している。
【０００５】
癌の治療に加え、ＰＤ−Ｌ１阻害は、感染症を治療する可能性も示している。細胞内感染のマウスモデルにおいて、Ｌ．モノサイトゲネスがＴ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ内にＰＤ‐Ｌ１タンパク質発現を誘発させた。ＰＤ‐Ｌ１ブロッキング（例えば、ブロッキング抗体を用いる）は、感染したマウスの死亡率の増加をもたらした。ブロッキングは、マクロファージによるＴＮＦαと一酸化窒素の生成を低減させ、ＮＫ細胞によるグランザイムＢ生成を低減させ、Ｌ．モノサイトゲネス抗原特異性ＣＤ８Ｔ細胞（しかしながら、ＣＤ４Ｔ細胞ではなく）の増殖を低下させた。このエビデンスは、ＰＤ‐Ｌ１が細胞内感染において正の共刺激分子として機能することを示唆する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤がペプチドリンカーにより、ＩＬ‐７タンパク質に融合される場合、当該融合分子は、両方の成分の結合活性を維持できることを実証する。さらに、融合分子は、両方のタンパク質のみの組み合わせと同等の活性を示した。さらに、改善された結果は、低減された活性を有するミュータントＩＬ‐７タンパク質を用いて達成され得る。
【０００７】
従って、本開示の一実施形態により、ペプチドリンカーにより、ヒトＩＬ‐７タンパク質またはその断片に融合されたＰＤ‐Ｌ１阻害剤を含む融合分子が提供される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、５から１００のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、１０から７５のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸残基の少なくとも２０％は、アラニン、グリシン、システインおよびセリンから成る群から選択されるアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸残基の少なくとも４０％は、アラニン、グリシン、システインおよびセリンから成る群から選択されるアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ：ＮＯ：１‐５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤は、ＰＤ‐Ｌ１に結合する不活性ＰＤ‐１等のデコイＰＤ‐１タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体の断片の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのアイソタイプである。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体の断片は、単一鎖断片、Ｆａｂ断片またはＦａｂ断片のペアである。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体は、単一特異性抗体またはさらに二次特異性を有する二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体はＡＤＣＣ有効である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基３１‐３５、残基５０‐６６および残基９９‐１０８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の残基２４‐３４、残基５０‐５６、および残基８９‐９７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をそれぞれ有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその断片は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有する重鎖可変領域およびアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を有する軽鎖可変領域を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７タンパク質は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはＩＬ‐７レセプタアルファに結合可能でありつつ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９による位置１４２において、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｃｙｃ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＰｈｅから選択されるアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９による位置１４２において、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから選択されるアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、野生型ヒトＩＬ‐７タンパク質と比較して、ＩＬ‐７レセプタアルファへの低減された結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７タンパク質の断片が融合分子に含まれる。いくつかの実施形態において、当該断片は、少なくとも１つ、２つ、３つまたはすべての４つのアルファヘリックスモチーフを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤のＣ端残基に融合され、ＩＬ‐７タンパク質のＮ端残基に融合される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤のＮ端残基に融合され、ＩＬ‐７タンパク質のＣ端残基に融合される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその断片の軽鎖のＮ端残基に融合される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその断片の重鎖のＮ端残基に融合される。
【００１２】
また、一実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と少なくとも９５％の配列同一性を有するペプチドを含む分離されたタンパク質が提供され、ペプチドは、ＩＬ‐７レセプタアルファに結合可能であるが、野生型ヒトＩＬ‐７タンパク質と比較して、ＩＬ‐７レセプタアルファへの低減された結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、位置１４２において、Ｔｒｐ以外のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、位置１４２において、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＶａｌから成る群から選択されるアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、位置１４２において、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＶａｌから成る群から選択されるアミノ酸残基を有する。
【００１３】
癌治療を必要とする患者に、癌の治療方法も提供する。いくつかの実施形態において、方法は、本開示の分子を患者に投与する段階を伴う。いくつかの実施形態において、方法は、開示されたＩＬ‐７バリアント投与する段階を伴い、オプションでＰＤ‐Ｌ１阻害剤も投与する段階を伴う。いくつかの実施形態において、癌は、膀胱癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病リンパ腫、膵臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、消化器癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、メラノーマ、前立腺癌および甲状腺癌から成る群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】パネルＡ〜Ｄで、２、３の融合分子構造を示す。
【００１５】
【図２】ＩＬ‐７タンパク質活性を低減させるＷ１４２Ａ突然変異の同定を示す。
【００１６】
【図３】Ｗ１４２Ａ突然変異が実際に、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子のＩＬ７効力を低減させたことを示す。
【００１７】
【図４】パネルＡ〜Ｃで、ＳＴＡＴ５シグナリングを刺激する融合分子の能力（Ａ）、ＩＬ７Ｒに結合する融合分子の能力（Ｂ）、ＩＬ７Ｒ内在化を促進する融合分子の能力（Ｃ）の結果を示す。
【００１８】
【図５】細胞結合性ＰＤＬ１タンパク質への融合分子の結合能力を示す。
【００１９】
【図６】すべての試験された融合分子が、抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体への同様の結合を示したことを示す。
【００２０】
【図７】抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２Ａが、低減されたＩＬ７Ｒａへの結合性を有しており、それは抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２Ａの低減されたＩＬ‐７効力と整合していたことを示す。
【００２１】
【図８】抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７および抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２Ａは、ヒトＴ細胞機能の向上において、抗ＰＤＬ１  ｍＡｂまたはＩＬ７よりも優れた効果を有していたことを示す。
【００２２】
【図９】抗ＰＤＬ１抗体と同様に、試験された融合分子は、腫瘍部位においてエンリッチ化可能であったことを示す。
【００２３】
【図１０】様々な試験された分子の腫瘍増殖阻止の効果を示す。
【００２４】
【図１１】ｉｎ  ｖｉｖｏ研究の終了時の、各動物の腫瘍の重さを示す。
【００２５】
【図１２】ｉｎ  ｖｉｖｏ研究の終了時の、各動物の脾臓および腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を示すデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
［定義］
「ａ（１つ）」または「ａｎ（１つ）」のエンティティという用語は、そのエンティティうちの１または複数を指す。例えば、「ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１つの抗体）」は、１または複数の抗体を表わすと理解されることに留意されたい。そのため、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１または複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で交換可能に用いられてよい。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含する意図であり、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により線形に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２または２より多いアミノ酸の任意の鎖（複数を含む）を指し、生成物の特定の長さを指していない。故に、用いられるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または、任意の他の用語は、２または２より多いアミノ酸の鎖を指し、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または、これらの用語のいずれかと交換可能に使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、これらに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または、非天然に発生するアミノ酸による改変を含む、ポリペプチドの発現後改変の生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的ソースに由来し得るか、または、組換え技術によって生成され得るが、必ずしも、指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の方式で生成されてよい。
【００２８】
本明細書で用いられる細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸に関連して「分離された」という用語が使用される場合、高分子の天然のソースに存在する、他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。本明細書で用いられる「分離された」という用語は、組換えＤＮＡ技法により生成される場合に細胞物質、ウイルス物質若しくは培地を実質的に含まない、あるいは、化学的に合成された場合に前駆的化学物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指すこともある。さらに、「分離された核酸」は、天然では断片として発生しない、天然の状態で見られない核酸断片を含めることを意味している。「分離された」という用語は、本明細書において、他の細胞タンパク質または組織から分離された細胞またはポリペプチドを指すためにも使用される。分離されたポリペプチドとは、精製されたポリペプチド、および、組換えのポリペプチドの両方を包含することを意味している。
【００２９】
本明細書で用いられる「組換え」という用語は、それがポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する場合、天然に存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意図し、それらの非限定的な例は、通常は共に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって作成できる。
【００３０】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間、または、２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的で位置揃え可能な各配列における位置を比較することによって決定できる。比較される配列内のある位置が、同一の塩基またはアミノ酸によって占められるとき、分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される、一致する位置数または相同的な位置数によって決まる。「関連のない」、または、「非相同的」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
【００３１】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が別の配列と特定の割合（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有することは、位置揃えされた状態で２つの配列を比較した際、その割合の塩基（またはアミノ酸）が同一であることを意味する。この位置揃えおよび百分率相同性または配列同一性は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ内で説明されているソフトウェアプログラム等の本技術分野で知られているソフトウェアプログラムを使用して決定できる。好ましくは、既定のパラメータが位置揃えに使用される。１つの位置揃えプログラムは、既定のパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下の既定のパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ  ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に同等のポリヌクレオチドとは、上記の指定の百分率相同性を有し、且つ、同一または同様の生物学的活性を有するポリペプチドをエンコードするものである。
【００３２】
「同等の核酸またはポリヌクレオチド」という用語は、核酸のヌクレオチド配列またはその相補的配列と、一定程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸のホモログとは、ヌクレオチド配列またはその相補的配列と一定程度の相同性を有する抜くレオチド配列を有する核酸を含むことを意図している。一態様において、核酸のホモログは、核酸またはその補体にハイブリダイズ可能である。同様に、「同等のポリペプチド」は、基準ポリペプチドのアミノ酸配列と、一定程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％である。いくつかの態様において、同等のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較したとき、１、２、３、４または５個の追加、欠失、置換およびこれらの組み合わせを有している。いくつかの態様において、同等の配列は、基準配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）を保持する。
【００３３】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシ」の条件下で実行できる。一般に、低ストリンジェンシハイブリダイゼーション反応は、約１０倍のＳＳＣ、または、同等のイオン強度／温度の溶液において約４０℃で実行される。中程度のストリンジェンシハイブリダイゼーションは、典型的には、約６倍のＳＳＣにおいて約５０℃で実行される。一般的に高ストリンジェンシハイブリダイゼーション反応は約１倍のＳＳＣにおいて約６０℃で実行される。ハイブリダイゼーション反応は、当業者に周知である「生理的条件」下で実行することもできる。生理的条件の非限定的な例は、細胞において通常見られる温度、イオン強度、ｐＨ、およびＭｇ２＋濃度である。
【００３４】
ポリヌクレオチドは、４個のヌクレオチド塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）の特定配列（ポリヌクレオチドがＲＮＡであるとき、チミンの代わりにウラシル（Ｕ））から構成される。故に、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は、中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力でき、機能ゲノミクスおよび相同性検索等のバイオインフォマティクスの用途に使用できる。「ポリモーフィズム」という用語は、２以上の遺伝子の形態のまたはその部分が共存することを指す。少なくとも２つの異なる形態、すなわち、２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部が遺伝子のポリモーフィック（多型）領域」と呼ばれる。多型領域は単一のヌクレオチドであってよく、その同定は、異なる対立遺伝子において異なる。
【００３５】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかである、任意の長さの高分子形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を実行し得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造への修飾は、もしそれがある場合、ポリヌクレオチドの構築の前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは重合後、標識成分へのコンジュゲート等により、さらに修飾され得る。また、この用語は、二本鎖および一本鎖の分子両方を指す。別途の指定または要求がない限り、本開示の任意の実施形態のポリヌクレオチドは、二本鎖形と、二本鎖形を形成することが知られている、または、予想される、２つの相補的な一本鎖形の各々との両方を含む。
【００３６】
ポリヌクレオチドに適用される「エンコード」という用語は、ポリヌクレオチドが天然型の状態において、または、当業者によく知られている方法によって操作されるとき、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを生成できる場合、ポリペプチドを「エンコード」すると言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補鎖であり、エンコード配列はそれから推測できる。
【００３７】
本明細書で用いられる「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識してそれに結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体および任意の抗原結合断片、または、それらの単一本鎖であってよい。故に、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含む任意のタンパク質またはペプチドを含む。このような例として、これらに限定はされないが、重鎖若しくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそれらのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、または、それらの任意の部分、または、結合性タンパク質の少なくとも１つの一部が含まれる。
【００３８】
本明細書で用いられる「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等の抗体の一部である。構造に関わらず、抗体断片は、インタクトの抗体によって認識される同一の抗原に結合する。「抗体断片」という用語は、アプタマー、スピゲルマーおよび二重特異性抗体を含む。「抗体断片」という用語は、特異性抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように機能する、任意の合成タンパク質または遺伝子組み換えタンパク質も含む。
【００３９】
「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様において、この領域は１０〜約２５アミノ酸から成る短いリンカーペプチドと接続される。リンカーは、柔軟性のためのグリシン、および、溶解性のためのセリンまたはスレオニンが豊富であり得、ＶＨのＮ端、または、ＶＬのＣ端のいずれかに接続され得る（逆も成立する）。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているにも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。本技術分野において、ＳｃＦｖ分子が知られており、例えば、米国特許第５,８９２,０１９号において説明されている。
【００４０】
抗体という用語は、生化学的に区別可能な広範のクラスのポリペプチドを包含する。当業者であれば、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、また、それらの中のいくつかのサブクラス（例えば、γ１−γ４）に分類されることを理解するであろう。この鎖の性質によって、抗体の「クラス」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥとして決定される。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５等は十分特徴付けられており、機能的な特化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の改変版は、当業者が本開示を参照して容易に認識でき、従って本開示の範囲内にある。すべての免疫グロブリンのクラスが本開示の範囲内にあることは明確であり、以下の説明は一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象としている。ＩｇＧについては、標準の免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００デルトンの２つの同一の軽鎖状ポリペプチド、および、分子量５３,０００−７０,０００の２つの同一の重鎖状ポリペプチドを含む。通常、４つの鎖は「Ｙ」構成におけるジスルフィド結合で結合され、「Ｙ」構成には、軽鎖が、「Ｙ」の口から開始する重鎖をブラケットし、可変領域まで継続する。
【００４１】
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、それらのバリアントまたは誘導体には、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性、ヒト型、ヒト化、霊長類化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成される断片および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書において開示されるＬＩＧＨＴ抗体への抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれる。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。
【００４２】
軽鎖はカッパまたはラムダ（Κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダのいずれかの軽鎖に結合し得る。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または、遺伝子操作した宿主細胞のいずれかによって生成されるとき、２つの重鎖の「テール」部分は、共有結合性ジスルフィド連結または非共有結合性連結によって互いに結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ形状の分岐端におけるＮ端から、各鎖の底部におけるＣ端まで続いている。
【００４３】
軽鎖および重鎖は両方とも、構造的および機能的に相同の複数の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は機能について使用される。この点において、軽鎖（ＶＫ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインは、抗原認識および特異性を決定することを理解されたい。逆に、軽鎖（ＣＫ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合および相補的結合等の重要な生物学的特性を付与する。慣習的に、定常領域ドメインの番号は、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるにつれて増加する。Ｎ端部分は可変領域であり、Ｃ端部分は定常領域であり、ＣＨ３およびＣＫドメインはそれぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を実際に含む。
【００４４】
上記のように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し且つ特異的に結合することを可能にする。つまり、抗体のＶＫドメインおよびＶＨドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが結合して、３次元の抗原結合部位を画定する可変領域を形成する。この４要素抗体構造は、Ｙの各腕の末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＫ鎖の各々における３個のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）によって画定される。いくつかの場合において、例えば、ラクダ科に由来する、または、ラクダ科免疫グロブリンをベースにしてエンジニアリングされた特定の免疫グロブリン分子および完全な免疫グロブリン分子は、軽鎖が無く重鎖のみから成ることがあり得る。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８  （１９９３）を参照されたい。
【００４５】
天然に発生する抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６個の「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、アミノ酸の短い不連続配列であり、これらは、抗体が水性環境において３次元構成をとるときに、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される。抗原結合ドメインにおける残りのアミノ酸は、「フレームワーク」領域と呼ばれ、分子間のより少ない可変性を示す。フレームワーク領域は主に、βシートの形態を取り、ＣＤＲは、βシート構造を接続する、および、場合により、βシート構造の一部を形成するループを形成する。故に、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってＣＤＲを正しい向きに位置決めするため足場を形成するように機能する。位置決めされたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を画定する。この相補的表面は、同族エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、正確に定義されているので（"Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，"  Ｋａｂａｔ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  （１９８３）、および、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−９１７（１９８７）を参照）、当業者によって、任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定されることができる。
【００４６】
当分野において使用および／または受け入れられている用語に２つ以上の定義がある場合、本明細書で用いられる用語の定義は、別途明示の反対の記載がない限り、そのような意味をすべて含むことが意図されている。具体的な例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域において見られる不連続抗原結合部位を説明するために、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という語句を使用する場合である。この特定の領域についてはＫａｂａｔらにより、アメリカ合衆国保健福祉省の「免疫学的興味のタンパク質配列」（１９８３）に説明され、且つ、Ｃｈｏｔｈｉａらにより、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１‐９１７（１９８７）に説明されており、これらは参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義は、互いに比較したときに、アミノ酸残基の重複するまたはサブセットを含む。にかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すために、いずれかの定義を適用することは、本明細書において定義および使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記の引用文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を下の表において比較として説明する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変動する。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮することで、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかを定型的に決定できる。
【表１】
2021506748.tif 000002
【００４７】
また、Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用される可変ドメイン配列のためにナンバリングシステムを定義した。当業者であれば、配列自体以外のいかなる実験データにも頼ることなく、この「Ｋａｂａｔナンバリング」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で用いられる「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔらにより、アメリカ合衆国保健福祉省の「免疫学的興味のタンパク質配列」（１９８３）に記載のナンバリングシステムを指す。
【００４８】
上の表に加えて、Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、ＣＤＲ領域を以下のように説明する。ＣＤＲ−Ｈ１は、約３１番目のアミノ酸（すなわち、最初のシステイン残基の後の約９残基）から開始し、約５〜７のアミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終了する。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の末端の後の第１５の残基から開始し、約１６〜１９アミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリジン残基で終了する。ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の末端の後の約３３番目のアミノ酸残基から開始し、３〜２５アミノ酸を含み、配列Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇにおいて終了し、Ｘは任意のアミノ酸である。ＣＤＲ−Ｌ１は、約２４番目の残基（すなわち、システイン残基の後）から開始し、約１０〜１７残基を含み、次のトリプトファン残基で終了する。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の末端の後の約１６番目の残基から開始し、約７残基を含む。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の末端の後の約３３番目の残基（すなわち、システイン残基の後）から開始し、約７〜１１残基を含み、ＦまたはＷ−Ｇ−Ｘ−Ｇの配列で終了し、Ｘは任意のアミノ酸である。
【００４９】
本明細書において開示される抗体は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物起源であってよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、または、ニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域は（例えばサメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）が起源であってよい。
【００５０】
本明細書で用いられる「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上、中央、および／または、下のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、または、それらのバリアント若しくは断片のうち少なくとも１つを含む。例えば、本開示において用いられる抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、または、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含んでよい。別の実施形態において、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示で用いられる抗体には、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）が無いことがあり得る。上記のように、当業者であれば、天然に発生する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように重鎖定常領域が改変され得ることを理解するであろう。
【００５１】
本明細書において開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来してよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメイン、および、ＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖定常領域は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
【００５２】
本明細書で用いられる、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインのうち少なくとも１つを含む。
【００５３】
「軽鎖−重鎖ペア」は、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合を通して二量体を形成できる軽鎖および重鎖の組を指す。
【００５４】
上述のように、様々な免疫グロブリンのクラスの定常領域のサブユニット構造および３次元構成は周知である。本明細書で用いられる「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１（最アミノ端）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域へのアミノ端である。
【００５５】
本明細書で用いられる「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来のナンバリング方式を使用すると、抗体の約２４４番目の残基から３６０番目の残基まで延在する重鎖分子の部分を含む（Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは残基２４４〜３６０、ＥＵナンバリングシステムでは残基２３１〜３４０、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，アメリカ合衆国保健福祉省，"Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ"  （１９８３）を参照）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密に対になっていないという点でユニークである。むしろ、２つのＮ結合型分岐炭水化物鎖は、インタクトな天然型ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在する。また、ＣＨ３ドメインがＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ端へ延在し、約１０８残基を含むことが十分に文書化されている。
【００５６】
本明細書で用いられる「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結させる重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５の残基を含み、柔軟であり、故に２つのＮ端抗原結合領域が独立に移動することを可能にする。ヒンジ領域は、３つの区別されるドメイン、すなわち、上、中央および下ヒンジドメインに細分割され得る（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：４０８３（１９９８））。
【００５７】
本明細書で用いられる「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子の間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基との間にジスルフィド結合またはブリッジを形成できるチオール基を含む。天然に発生する大部分のＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＫ領域はジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用したときの２３９および２４２（ＥＵナンバリングシステムの場合、位置２２６または２２９）に対応する位置において２つのジスルフィド結合によって連結される。
【００５８】
本明細書で用いられる「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第１の種から取得され、または、それに由来し、且つ、定常領域（本開示によれば、インタクト、部分的、または、改変されたものであり得る）が第２の種から取得される、任意の抗体を意味するものとして維持される。特定の実施形態おいて、標的結合領域または部位は、非ヒトのソースに由来し（例えば、マウスまたは霊長類）、定常領域はヒト型である。
【００５９】
本明細書で用いられる「ヒト化率」は、ヒト化ドメインと生殖細胞系ドメインとの間のフレームワークアミノ酸の数の差（すなわち、非ＣＤＲの差）を決定し、その数を総アミノ酸数から減算し、それを総アミノ酸数で除算し、１００で乗算することによって算出される。
【００６０】
「特異的に結合」または「特異性を有する」は、一般的に、抗体が抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および、結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくらかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、ランダムな関連のないエピトープに結合する場合より容易に、抗体が抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するとき、そのエピトープに「特異的に結合」すると言われる。「特異性」という用語は、本明細書において、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対的な親和性を認めるために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、特定のエピトープに対し抗体「Ｂ」より高い特異性を有するとみなされてよく、または、抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」について有する特異性より高い特異性でエピトープに結合すると言われてよい。
【００６１】
本明細書で用いられる「治療」または「治療法」という用語は、治療処置および予防または防止措置の両方を指し、ここで、その目的は癌の進行等の、望ましくない生理的変化または障害を防止または遅延（緩和）させることである。有利な、または、望ましい臨床結果には、これらに限定されないが、検出可能かどうかを問わず、症状の軽減、疾患の程度の減弱、病状の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行の遅延または鈍化、病状の改善または緩和および寛解（完全または部分的を問わず）が含まれる。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延ばすことも意味し得る。治療を必要とする者には、既に病態または障害を有する者、および、病態または障害を有する傾向がある者、または、病態または障害を予防されるべき者が含まれる。
【００６２】
「対象」または「個人」または「動物」または「患者」または「哺乳類」は、任意の対象、特に、診断、予後または治療が望ましい哺乳類対象を意味する。哺乳類対象には、ヒト、家畜動物、農業用の動物、およびイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛等の動物園、スポーツ、またはペット用の動物などが含まれる。
【００６３】
本明細書で用いられる、「治療を必要とする患者に」または「治療を必要とする対象」等の文言は、例えば、検出、診断手順および／または治療に用いられる本開示の抗体または組成物の投与から恩恵を受けるであろう、哺乳類対象等の対象を含む。
［融合分子］
【００６４】
本開示は、ＰＤ‐Ｌ１阻害またはブロッキングを、効果および安全性をさらに最大化させる相乗的な態様でＩＬ‐７サイトカイン活性と組み合わせる融合分子を提供する。
【００６５】
一実施形態において、融合分子は、ヒトＩＬ‐７タンパク質またはその断片に、好ましくはペプチドリンカーにより融合されたＰＤ‐Ｌ１阻害剤（例えば、デコイＰＤ‐１タンパク質または抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその断片）を含む。概して、ペプチドリンカーは、５から１００のアミノ酸残基を有するペプチドである。リンカーは、その柔軟性を保証すべく、より小さなアミノ酸を十分含むことが好ましい。例えば、リンカーの長さは、５から１００のアミノ酸、１０から９０のアミノ酸、１０から８０のアミノ酸、１０から７５のアミノ酸、１５から９０のアミノ酸、１５から８０のアミノ酸、１５から７０のアミノ酸、２０から８０のアミノ酸、２０から７０のアミノ酸、２０から６０のアミノ酸、２５から９０のアミノ酸、２５から８０のアミノ酸、２５から７５のアミノ酸、２５から７０のアミノ酸、２５から６０のアミノ酸、３０から８０のアミノ酸、３０から７０のアミノ酸、３０から６０のアミノ酸、または４０から７０のアミノ酸であってよいが、これらに限定はされない。 
【００６６】
リンカーの柔軟性は、より小さいアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、システインおよびセリンを最小割合で組み込むことで達成されてよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、アラニン、グリシン、システインまたはセリンから選択されるアミノ酸を少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％含む。ペプチドリンカーの非限定的な例は、ＳＥＱ  ＩＤ：ＮＯ：１‐５に示されている。
【００６７】
ヒトＩＬ‐７タンパク質は、アクセッション番号ＮＰ＿０００８７１．１でＧｅｎＢａｎｋに預けられたタンパク質配列を持つものとして知られており、成熟配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されている。計算および試験を通して、野生型ＩＬ７と比較して、低減されたＩＬ‐７活性を持つＩＬ‐７タンパク質の突然変異型は、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体との相乗効果を維持し、全体的に安全性が改善されていると決定された。このような突然変異体の非限定的な例には、ＩＬ７Ｗ１４２の位置で、アミノ酸置換を有するものが含まれる。置換は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦ等の非極性アミノ酸で行われてよい。
【００６８】
本明細書で用いられる「ヒトＩＬ‐７タンパク質」という用語は、野生型ヒトＩＬ‐７およびそれと生物学的同等のものを指し、すなわち、野生型ヒトＩＬ‐７の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ、ＩＬ‐７レセプタ（例えば、レセプタアルファ）への結合性等の野生型の活性を維持するものであり、これは容易に測定可能である。いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ‐７タンパク質は、野生型と比較して、低減されたＩＬ‐７活性を有する。いくつかの実施形態において、低減されたＩＬ‐７活性は、野生型ＩＬ‐７と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のＩＬ‐７レセプタへの結合活性である。いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７活性は、野生型ＩＬ‐７の活性よりも、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％低い。いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７活性は、ＩＬ‐７Ｗ１４２Ａと野生型ＩＬ‐７の活性の間である。いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７タンパク質は、ＩＬ‐７レセプタに結合可能な合成類似体である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ‐７タンパク質は、野生型と比較して、Ｗ１４２の位置における突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、非極性アミノ酸に対するものである。突然変異の非限定的な例として、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＰｈｅまたはＶａｌに対する突然変異が含まれる。いくつかの実施形態において、突然変異は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａに対するものである。好ましい実施形態において、突然変異はＷ１４２Ａ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）である。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７タンパク質の断片もまた使用されてよい。いくつかの実施形態において、断片は、野生型タンパク質と比較して、ＩＬ‐７レセプタ（例えば、レセプタアルファ）に結合可能であるが、低減されたＩＬ‐７活性を有するものが好ましい。ＩＬ‐７レセプタと複合されたＩＬ‐７の３次元構造が示されている。例えば、ＭｃＥｌｒｏｙらのＳｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００９  Ｊａｎ１４；１７（１）：５４−６５を参照されたい。ＩＬ‐７は、２つのクロスオーバーループを持つｕｐ‐ｕｐ‐ｄｏｗｎ‐ｄｏｗｎの４つのヘリックスバンドルトポロジを使用する。αヘリックスＡ‐Ｄは、１３から２２の残基で長さが変わる。いくつかの実施形態において、断片は、アルファヘリックスの少なくとも１つ、２つまたは３つを含む。いくつかの実施形態において、断片は、アルファヘリックスの４つすべてを含む。いくつかの実施形態において、断片は、Ｓ１９、Ｄ７４およびＫ８１を含む界面アミノ酸残基を保持する。
【００７１】
ＩＬ‐７タンパク質は、さらに、他のアミノ酸の位置における追加、欠失および／または置換等の改変も可能にしてよい。このような改変は、１つ、２つ、または３つの箇所における置換であってよい。一実施形態において、改変は、これらの位置のうちの１つにおける置換である。いくつかの実施形態においてにおいて、このような置換は保存的置換である。
【００７２】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐型側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。故に、免疫グロブリンポリペプチドにおける非本質的なアミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基に好ましく置換される。別の実施形態において、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる、構造的に同様の鎖に置き換えることができる。
【００７３】
保存的アミノ酸置換の非限定的な例を以下の表に示す。ここでは、０またはそれより高い類似性スコアは、２つのアミノ酸の間の保存的置換を示す。
【表２】
2021506748.tif 000003
【表３】
2021506748.tif 000004
【００７４】
本明細書で用いられる、用語「ＰＤ‐Ｌ１阻害剤」は分子を指し、例えば、ＰＤ‐Ｌ１に結合可能であり、且つ、ＰＤ‐１とＰＤ‐Ｌ１との間の相互作用をブロッキング可能であり、故にＰＤ‐Ｌ１の活性を阻害可能なタンパク質またはタンパク質含有複合体を指す。ＰＤ‐Ｌ１阻害剤の非限定的な例は、デコイＰＤ‐１タンパク質、例えば、ＰＤ‐Ｌ１を結合する能力を維持する不活性ＰＤ‐１バリアントである。このようなＰＤ‐１バリアントの例が、ＭａｕｔｅらによるＰＮＡＳ  ２０１５  １１２（４７）Ｅ６５０６‐Ｅ６５１４（２０１５）中の「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤ−１  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ」に示されている。別の非限定的な例は、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体である。
【００７５】
本開示の融合分子に含有されるものとして好適な既知の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体およびそれらの断片が多く存在する。例示的な抗ＰＤ‐Ｌ１抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６および７に示されている。例示的な抗体のＣＤＲ領域を含むバリアント抗ＰＤ‐Ｌ１抗体も、本技術の範囲内に属する。例えば、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基３１‐３５、残基５０‐６６および残基９９‐１０８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の残基２４‐３４、残基５０‐５６および残基８９‐９７のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含んでよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのアイソタイプであり、その断片は、単一鎖断片、Ｆａｂ断片またはＦａｂ断片のペア等の任意の形態を取ってよい。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体はＡＤＣＣ有効である。
【００７７】
融合分子のいくつかの例示的構造は、図１のパネルＡ‐Ｄに示されている。パネルＡでは、融合分子は、完全なＩｇＧ抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、および、リンカーにより抗体のＣＨ３のＣ端にそれぞれ融合された２つのＩＬ‐７タンパク質を含む。この融合ポリペプチドは、２つの別個のＤＮＡ構築物で作成されてよい。パネルＢでは、融合分子はまた、ＩｇＧ抗ＰＤ‐Ｌ１抗体および２つのＩＬ‐７タンパク質を含むが、ＩＬ‐７タンパク質はリンカーにより軽鎖可変領域のＮ端に融合されている。
【００７８】
図１中のパネルＣでは、パネルＣ中、ＩＬ‐７タンパク質がリンカーにより、重鎖のＮ端に融合されている点が異なる。パネルＤに別の例示的構造が示されており、これは、各ＩＬ‐７タンパク質がリンカーにより抗体のＣＨ２のＮ端に融合されており、そこでは、ＣＨ２‐ＣＨ３断片がＶＨ‐ＣＨ２部分の上流側に配置されている。 
【００７９】
これらの図面中に示されていないさらに多くの構造も作成されてよく、それは、単一特異性抗体またはさらに二次特異性を有する二重特異性抗体であってよい。
【００８０】
特定の実施形態において、デコイＰＤ‐１タンパク質または抗体は、抗体に通常関連付けられないアミノ酸配列または１または複数の部分を含む。以下に、例示的改変について詳しく説明する。例えば、本開示の抗体は、柔軟なリンカー配列を含んでよく、または、官能基（例えば、ＰＥＧ、薬剤、毒物、または、標識）を追加するように改変されてよい。
【００８１】
本開示の抗体、バリアントまたはその誘導体は、改変された誘導体、すなわち、任意のタイプの分子を抗体に共有結合することで改変され、共有結合によって、抗体がエピトープに結合することを妨げられないような誘導体を含む。例えば、抗体は、これらに限定されないが、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結等によって改変されてよい。多数の化学改変のいずれもが特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む、既知の技法によって実行されてよく、これらに限定されない。また、抗体は、１または複数の非従来型のアミノ酸を含んでよい。
【００８２】
いくつかの実施形態において、デコイＰＤ‐１タンパク質または抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物反応調節剤、医薬品、またはＰＥＧとコンジュゲートされてよい。
【００８３】
デコイＰＤ‐１タンパク質または抗体は、放射性標識等の検出可能な標識を含み得る治療剤、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤または光活性診断剤、薬物または毒物であり得る細胞毒性剤、超音波造影剤、非放射性標識、これらの組み合わせ、および、本技術分野において既知である他のこのような物質にコンジュゲートまたは融合されてよい。
【００８４】
デコイＰＤ‐１タンパク質または抗体は、自身を化学発光化合物に結合することで検出可能に標識化されてよい。その後、化学発光タグ付き抗原結合ポリペプチドの存在は、化学反応の過程において生じる発光の存在を検出することで判定される。特定の有用な化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。
【００８５】
デコイＰＤ‐１タンパク質または抗体は、１５２ＥＵまたはランタニド系列の他のもの等の蛍光放射金属を使用しても検出可能に標識できる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート基を使用して、抗体に結合することができる。様々な部分を抗体にコンジュゲートする技法は周知である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）のＡｒｎｏｎらによる，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ"、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）のＨｅｌｌｓｔｒｏｍらによる，"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ"、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  '８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）のＴｈｏｒｐｅによる，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ"、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）の"Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ"、および、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（５２：１１９−５８（１９８２））のＴｈｏｒｐｅらによる，"Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ"を参照されたい。
［ＩＬ‐７バリアント］
【００８６】
野生型タンパク質と比較して、低減された活性を有するヒトＩＬ‐７タンパク質の突然変異体を作成した。これらの突然変異体は、このような活性の低減が所望される状況、例えば安全面が懸念される状況において有用であることが実証されている。従って、一実施形態において、本開示はまた、このような突然変異体を含む分離されたポリペプチドも提供する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、当該ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドを含み、ペプチドは、ＩＬ‐７レセプタアルファに結合可能であるが、野生型ヒトＩＬ‐７タンパク質と比較して、ＩＬ‐７レセプタアルファへの低減された結合親和性を有する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ‐７タンパク質は、野生型と比較して、低減されたＩＬ‐７活性を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７活性の低減は、ＩＬ‐７レセプタへの結合活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ‐７タンパク質は、野生型と比較して、Ｗ１４２の位置に突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、非極性アミノ酸に対するものである。当該突然変異の非限定的な例として、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＰｈｅまたはＶａｌに対する突然変異が含まれる。いくつかの実施形態において、突然変異は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａに対するものである。好ましい実施形態において、突然変異はＷ１４２Ａである。いくつかの実施形態において、Ｗ１４２における突然変異は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＰｈｅまたはＶａｌから選択される。 
【００９０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ‐７タンパク質の断片も使用されてよい。いくつかの実施形態において、当該断片はＩＬ‐７レセプタ（例えば、レセプタアルファ）に結合可能であるが、野生型タンパク質と比較して、低減されたＩＬ‐７活性を有することが好ましい。いくつかの実施形態において、断片は、少なくとも１つ、２つ、３つのアルファヘリックスを含む。いくつかの実施形態において、断片は、アルファヘリックスの４つすべてを含む。いくつかの実施形態において、断片は、Ｓ１９、Ｄ７４およびＫ８１を含む界面アミノ酸残基を保持する。
【００９１】
ＩＬ‐７タンパク質は、他のアミノ酸の位置において、追加、欠失、および／または、置換等のさらなる改変を可能にしてよい。このような改変は、１つ、２つまたは３つの位置における置換であってよい。一実施形態において、改変は、当該位置のうち１つの位置における置換である。いくつかの実施形態において、このような置換は保存的置換である。
［ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリペプチドを作成する方法］
【００９２】
本開示は、本開示のデコイＰＤ‐１タンパク質、抗体、融合分子、そのバリアントまたは誘導体をエンコードする、分離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子も提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチド分子上または別個のポリヌクレオチド分子上の、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の全体をエンコードしてよい。また、本開示のポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチド分子上、または別個のポリヌクレオチド分子上の、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の一部をエンコードしてよい。
【００９３】
デコイタンパク質および抗体の作成方法は、当該分野で周知であり、ここに説明する。特定の実施形態においては、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域および定常領域の両方は完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当該分野において説明される技術および本明細書で説明される技術を用いて作成されてよい。例えば、特異性抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原をトランスジェニック動物に投与することで作成でき、トランスジェニック動物は抗原攻撃に応答してかかる抗体を生成するように改変されているが、その内因性遺伝子座は無効にされている。このような抗体を作成するために使用可能な例示的な技術については、米国特許６，１５０，５８４号、６，４５８，５９２号、６，４２０，１４０号に説明されており、これらは、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
［癌治療］
【００９４】
ここで実証するように、本開示の融合分子は癌の治療において相乗効果を示した。当該融合分子は、特定の治療方法および診断方法に用いられてよい。
【００９５】
本開示は、さらに、本開示の融合分子を、本明細書に説明される障害または病状のうちの１または複数を治療するために、動物、哺乳類および人間等の患者に投与することを含む治療法を対象とする。本開示の治療用化合物としては、限定ではないが、本開示の融合分子（本明細書に記載されるそのバリアントおよび誘導体を含む）および本開示の融合分子（本明細書に記載されるそのバリアントおよび誘導体を含む）をエンコードする核酸またはポリヌクレオチドが含まれる。
【００９６】
治療法は、また、本明細書に開示されるＩＬ‐７バリアントを投与することを含んでよく、オプションで本明細書に開示されるＰＤ‐Ｌ１阻害剤の投与と組み合わせられる。いくつかの実施形態において、投与されるＩＬ‐７バリアントおよび投与されるＰＤ‐Ｌ１阻害剤は、少なくとも５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１、１：１または１：２のモル比を有する。いくつかの実施形態において、投与されるＩＬ‐７バリアントおよび投与されるＰＤ‐Ｌ１阻害剤は、２：１、１．５：１、１：１、１：２、１：３、１：４または１：５を超えないモル比を有する。いくつかの実施形態において、投与されるＩＬ‐７バリアントおよび投与されるＰＤ‐Ｌ１阻害剤は、２：１から１：２の範囲内、または、１．５：１から１：１．５の範囲内のモル比を有する。 
【００９７】
キメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療等の細胞治療法も、本開示に示される。好適な細胞が用いられてよく、細胞は、本開示の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体と接触させられる（あるいは代替的に、本開示の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体を発現するようエンジニアリングされる）。このような接触またはエンジニアリングがなされると、その後、細胞は治療を必要とする癌患者に導入されてよい。癌患者は、本明細書で開示されたタイプの任意の癌を有してよい。細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば腫瘍湿潤Ｔ細胞療法（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはこれらの組み合わせであってよいが、これらに限定はされない。
【００９８】
いくつかの実施形態において、細胞は癌患者自身から分離された。いくつかの実施形態において、細胞はドナーまたは細胞バンクから提供された。細胞が癌患者から分離される場合、望ましくない免疫反応が最小化されてよい。
【００９９】
本開示の融合分子、バリアントまたはその誘導体を用いて、治療、予防、診断および／または予後されてよい細胞生存の増加に関連する追加の病気または病状として、限定ではないが、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む））および慢性リンパ性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒状）白血病および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、重鎖病および固形腫瘍（限定ではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索種、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、メラノーマ、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上脾腫、胎児性癌、ウイルムス腫痘、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が含まれる）等の悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が含まれる。
【０１００】
任意の特定の患者に対する特定の投与量および治療計画は、様々な要因によって決まり、これらには、使用する特定の融合分子、そのバリアントまたは誘導体、患者の年齢、体重、健康全般、性別および食事、投与時間、排泄率、薬物の組み合わせ、並びに治療される特定の病気の深刻さが挙げられる。医療従事者が考慮するこのような要因の判定は、当業者に想定される範囲である。投与量も、治療すべき個々の患者、投与経路、調合タイプ、使用する化合物の特徴、病気の深刻さおよび所望の効能により決まる。使用する量は、本技術分野で周知の薬学的および薬物動態的原理によって判定されてよい。
【０１０１】
融合分子またはバリアントの投与方法には、限定ではないが、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および口腔経路が含まれる。抗原結合ポリペプチドまたは組成物は、任意の好都合な経路で投与されてよく、例えば、注入またはボーラス注入により、上皮または皮膚粘膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜等）を通した吸収によって投与されてよく、他の生物学的活性剤と共に投与されてよい。故に、本開示の抗原結合ポリペプチドを含有する医薬組成物は、経口、経直腸、非経口、嚢内、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして）、口腔内に、または、口腔若しくは鼻腔スプレーとして投与されてよい。
【０１０２】
本明細書で用いられる「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与方式を指す。
【０１０３】
投与は全身投与であっても、または、局所的投与であってもよい。また、本開示の融合分子を、脳室内注射およびくも膜下腔内注射を含む任意の好適な経路により、中枢神経系に導入することが所望されてよい。脳室内注射は、例えば、オマヤリザーバー等のリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易に行うことができる。例えば、吸入器または噴霧器およびエアロゾル化剤の調合を用いた肺投与も採用されてよい。
【０１０４】
本開示の融合分子または組成物を、治療の必要な領域に局所的に投与することが所望されてよい。これは、例えば、非限定的な例ではあるが、外科手術中の局所注入、局所塗布（例えば、手術後の創傷包袋と組み合わせて）によって、注射によって、カテーテルを用いて、座薬を用いて、または、インプラントを用いて達成されてよく、上記インプラントは、多孔性、非多孔性、またはシラスティック膜等の膜を含むゼラチン状物質または線維である。好ましくは、抗体を含む本開示のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するよう考慮する必要がある。
【０１０５】
炎症、免疫性疾患または悪性疾患、障害または病状の治療、阻害および予防で効果的となる本開示の融合分子の量は、標準的な臨床技術で判定されてよい。また、オプションで、最適な投与量範囲を識別すべく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが採用されてよい。調合において用いられるべき正確な用量は、投与経路および病気の深刻さ、障害または病状にも依存し、医師の判断により、および各患者の状況により決定されるべきである。効果的な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験システムまたは動物モデル試験システムから導かれた用量反応曲線から外挿法で推定されてよい。
【０１０６】
一般的な提案として、本開示の抗原結合ポリペプチドの患者への投与量は通常、患者の体重に対して０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、患者の体重に対して０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの範囲内、または、患者の体重に対して１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。一般的に、ヒト抗体は、他の種に由来する抗体と比べて、ヒトの身体内における半減期が長い。これは、外来ポリペプチドに対する免疫反応に起因する。故に、ヒト抗体の投与量をより少なくすること、および、投与の頻度をより少なくすることが、しばしば可能である。さらに、例えば、脂質化等の改変により、融合分子の接種と組織浸透（例えば、脳への）を向上させることによって、本開示の融合分子の投与の投与量および頻度は低減されてよい。
［組成物］
【０１０７】
本開示は、医薬組成物も提供する。このような組成物は、有効量の融合分子および許容可能なキャリアを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、さらに、第２の抗癌剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）を含む。
【０１０８】
特定の実施形態において、「薬学的に許容可能」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されていること、または、動物およびより具体的には人間への使用が、米国薬局方若しくは他の一般的に認知された薬局方に記載されていることを意味する。さらに、「薬学的に許容可能なキャリア」とは、一般的に、非毒性の固体、半固体、または、液体のフィラー、希釈剤、封入材、または、任意のタイプの配合助剤である。
【０１０９】
「キャリア」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬キャリアは水および油等の滅菌液であってよく、油には、石油、動物油、植物油またはピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油等の合成起源のものが含まれる。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合に好ましいキャリアである。また、生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体キャリア、特に注射溶液として採用されてよい。好適な医薬品添加物としては、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノール等が含まれる。所望される場合は、組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいは、アセテート、クエン酸塩若しくはリン酸塩等のｐＨ緩衝剤も含有してよい。ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化物質、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、および、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧調整剤も想定される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、タブレット、錠剤、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態を取ってよい。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセライド等のキャリアを用いて座薬として調合されてよい。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的なキャリアを含んでよい。好適な医薬品キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されており、当該文献は本明細書に参照により組み込まれる。このような組成物は、患者への適切な投与形態を提供すべく、好適な量のキャリアと組み合わされた、好ましくは精製形態における治療に有効な量の抗原結合ポリペプチドが含まれる。製剤は、投与の方式に適するものであるべきである。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多回投与バイアルの中に封入されてよい。
【０１１０】
一実施形態において、組成物は、人間への静脈内投与に適合された医薬組成物として、定型的な手順に従って調合される。通常、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカイン等の局所麻酔薬も含んでよい。一般的に、成分は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋等の密封容器内の凍結乾燥粉末または無水濃縮物等の単位投与量形態で、別個に供給されるか、または、混合されるかのいずれかである。組成物が注入によって投与されるべき場合、組成物は、医薬品グレードの無菌水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて分注できる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルが提供されてよい。
［実施例］
実施例１：抗ＰＤＬ１およびヒトＩＬ７の融合分子の設計と生成
【０１１１】
抗ＰＤＬ１抗体の重鎖遺伝子または軽鎖遺伝子（表１の可変領域シーケンスを参照）が、表３のペプチドリンカーを用いて、ヒトＩＬ７遺伝子（表２）と融合するように設計された。その後、得られた遺伝子は、哺乳類発現ベクターにクローニングされ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。抗体とサイトカインとの融合タンパク質（図１のパネルＡ中の構造）がプロテインＡにより、トランスフェクトされた細胞の上清から精製された。
【表４】
2021506748.tif 000005
【表５】
2021506748.tif 000006
【表６】
2021506748.tif 000007
実施例２：抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子のＩＬ７サイトカインの効力
【０１１２】
以下の実施例中のすべての抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子は、図１中のフォーマットＡを用いた。これらの二機能性分子は、ＰＤＬ１拮抗とＩＬ７細胞活性とを組み合わせたものである。抗ＰＤＬ１とＩＬ７との固定モル比（１：１）を条件とすると、異なる活性レベルを持つＩＬ７バリアントは、抗ＰＤＬ１機能とのより優れた相乗作用を有する可能性がある。
【０１１３】
ＩＬ７／ＩＬ７Ｒの結晶構造は解明されている（構造２００９、１７：５４‐６５）。当該データから、アミノ酸Ｋ１２０、Ｒ１３３、Ｌ１３５、Ｑ１３６、Ｅ１３７、Ｋ１３９、Ｔ１４０、Ｗ１４２、Ｎ１４３およびＫ１４４は、ＩＬ７および共通γ鎖（ＩＬ７シグナルトランダクションレセプタ）（図２）の界面に存在することが示されている。これら１０個のアミノ酸の各々は、Ａｌａに対して突然変異がなされており、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣにより純度について、２Ｅ８細胞増殖アッセイ（ＩＬ７は、２Ｅ８の増殖を駆動できる）によりＩＬ７活性について評価された。図２に示される通り、突然変異体Ｗ１４２Ａが、大きく低減されたＩＬ７の効力および優れた純度を示した。
【０１１４】
ＩＬ７は、ＳＴＡＴ５リン酸化（ｐＳＴＡＴ５）および後のＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を誘発できるので、プライマリヒトＴ細胞上での野生型（ＷＴ）およびＷ１４２Ａ  ＩＬ７のＩＬ‐７効力をさらに評価すべく、ｐＳＴＡＴ５アッセイおよびＣＤ４増殖アッセイが行われた。簡潔に言うと、ｐＳＴＡＴ５アッセイでは、ヒトＰＢＭＣが、指定の濃度で１５分間、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７および抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２Ａで処理された。ＣＤ４増殖アッセイでは、精製されたＣＤ４  Ｔ細胞が、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７および抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２Ａで１週間、処理された。図３に示される通り、実際にＷ１４２Ａ突然変異は、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子のＩＬ７効力を低減させた。
【０１１５】
抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子のＩＬ活性を微調整すべく、ＩＬ７のＷ１４２での一連の単一部位の突然変異が生成された。極性、アミノ数およびヒドロキシル数に基づき、２０個のアミノ酸は、非極性（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＷおよびＦ）グループ、極性（Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＮおよびＱ）グループ、正に帯電した（Ｋ、ＲおよびＨ）グループおよび負に帯電した（ＤおよびＥ）グループの４つのカテゴリに分割できる。各グループからの２、３の典型的なアミノ酸が選択されて、以下（表４）に示されるようなミュータント抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７分子が構築された。プロリン（Ｐ）以外の非極性アミノ酸のすべてがＷ１４２と置換されて、高ＳＥＱ純度（＞９６．８％）のミュータント抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７が生成可能であることが示された。これに対し、他の３つのタイプのアミノ酸に対するＷ１４２の突然変異は、分子安定性の低減およびＳＥＱ純度の低減（＜８４％）をもたらした。次に、２Ｅ８増殖アッセイによりＩＬ活性の検証を行うために（表５）、非極性アミノ酸サブタイプ内の各アミノ酸を用いてＷを置換し、一連のミュータント抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７分子を生成した。Ｗとの置換アミノ酸がより少ない類似性を持つにつれ、突然変異がなされた分子はより低いＩＬ７活性を有することが示された（Ｗ＞Ｆ＞Ｍ＞Ｉ＞Ｌ＞Ｖ＞Ａ）。
【０１１６】
上記のように、プライマリＣＤ４＋Ｔ細胞の抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７ミュータント分子のＩＬ活性の減衰を確認すべく、ＳＴＡＴ５シグナリングアッセイが行われた。図４のＡに示される通り、ヒトプライマリＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５シグナリングを刺激する融合分子の能力は徐々に減少し（Ｗ＞Ｉ＞Ｖ＞Ａ）、これは、２Ｅ８増殖アッセイにおけるこれらの対応する活性と関連する。一連のミュータント抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７分子の減衰されたＩＬ活性のメカニズムについて説明するために、ＩＬ７レセプタ（ＩＬ７Ｒ）結合性およびライゲーションを介した内在化が評価された。簡潔に言うと、ＩＬ７Ｒ結合アッセイについては、ヒトプライマリＣＤ４＋Ｔ細胞が様々な抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子と共に４℃にて３０分間インキュベートされた。ＰＥ‐コンジュゲート抗ヒトＦｃ二次抗体を用いて、ＦＡＣＳによりＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ７Ｒに結合した融合分子を検出した。図４のＢに示される通り、低下されたＩＬ活性を持つ３つの抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子（Ｗ１４２Ｉ、ＶおよびＡ）のすべてが低減されたＩＬ７Ｒ結合性を有していた。ライゲーションを介したレセプタ内在化アッセイについては、ヒトプライマリＣＤ４＋Ｔ細胞が融合分子と共に３７℃にて１５分間共培養された。ＰＥ‐ｃｙ７‐コンジュゲート‐抗ＣＤ１２７（ＩＬ７Ｒａ）抗体を用いて、ＦＡＣＳにより表面ＩＬ７Ｒを検出した。ＩＬ７Ｒ結合性の傾向と同様、低減されたＩＬ７レセプタ結合効力を持つこれらの融合分子は、ＩＬ７Ｒ内在化を損ない（図４のＣ）、減退したＩＬ７シグナリングトランスダクションを示している。結論として、我々は、Ｗ１４２の単一部位の突然変異を修飾することで、減衰された、異なるＩＬ活性を持つ一連の抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７分子を開発した。
【表７】
2021506748.tif 000008
【表８】
2021506748.tif 000009
実施例３：抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子のＰＤＬ１結合特性
【０１１７】
この実施例では、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により、ヒト化抗体の完全な運動親和性を検査した。
【０１１８】
抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子の組換えＰＤ‐Ｌ１タンパク質（ヒトＰＤ‐Ｌ１‐ｈｉｓ  ｔａｑ）への結合性が捕捉方法を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）で試験された。ＣＭ５チップ上でコーテイングされた抗ヒトＦｃ抗体を用いて、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子が捕獲された。捕獲された抗体に対して、ヒトＰＤ−Ｌ１−ｈｉｓ  ｔａｑタンパク質の希釈系列を、流速２５μｇ／ｍｌで３分間注入した。抗原は、９００秒間の間、分離することを可能にされた。すべての実験が、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で行われた。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて、データ解析が行われた。データは、融合分子においてＰＤＬ１結合親和性は損なわれていないことを示す（表６）。
【表９】
2021506748.tif 000010
【０１１９】
抗原の結合特性を評価するために、ＦＡＣＳにより，融合分子は、哺乳類に発現されたＰＤ‐Ｌ１へのその結合性について分析された。簡潔に言うと、まずＰＤＬ１ラジ細胞が３段階希釈されたヒト化抗体と共に、１５μｇ／ｍｌから開始して室温にて１時間インキュベートされた。ＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）による洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８抗ヒトＩｇＧ抗体が各ウェルに加えられ、室温にて１時間インキュベートされた。Ａｌｅｘａ４８８のＭＦＩがＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩにより評価された。図５に示される通り、すべての融合分子が、抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体への同様の結合性を示した。
実施例４：抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子のＰＤＬ１拮抗薬活性
【０１２０】
ＰＤＬ１拮抗薬を評価すべく、ＰＤ１／ＰＤＬ１  Ｊｕｒｋａｔアッセイが行われた。ラジ細胞の存在下、ラジ上のＭＨＣＩＩおよびＪｕｒｋａｔ上のＴＣＲ分子のライゲーションを介して、スーパー抗原ブドウ球菌（ＳＥＥ）がＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によるＩＬ２生成を刺激した。ラジ細胞上に外因性発現したＰＤＬ１は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞により過剰発現したＰＤ１に結合し、ＪｕｒｋａｔによるＩＬ２生成を阻害した。抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＰＤ１／ＰＤＬ１経路により抑制されたＩＬ２生成を逆行させた。図６に示される通り、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子および抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２Ａ融合分子は、抗ＰＤＬ１  ｍＡｂと同等のＰＤＬ１拮抗薬機能を示した。
実施例５：抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子の二重特異的結合
【０１２１】
ＰＤＬ１およびＩＬ７レセプタアルファ（ＩＬ７Ｒａ）との二重特異的結合特性を持つ融合分子を検証すべく、この実施例では、Ｂｉｏ‐ｌａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）を用いて、二重特異的結合性を測定した。簡潔に言うと、まず、ビオチン標識されたＩＬ７Ｒａがストレプトアビジンセンサによって捕獲された。抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子が、ＩＬ７Ｒａによって捕獲された。ｈｉｓ‐ＰＤＬ１の飽和濃度（１００ｎＭ）を用いて、ＰＤＬ１結合性を評価した。すべての融合分子が、ＰＤＬ１およびＩＬ７Ｒａ（図７）との二重特異的結合性を示した。また、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２ＡはＩＬ７Ｒａへの低減された結合性を示し、これは、その低減されたＩＬ‐７効力と整合している（図７）。
実施例６：抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子のヒトＴ細胞機能の相乗的促進
【０１２２】
融合分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能を評価すべく、ヒトＴ細胞の応答が、混合リンパ球反応の環境において評価された。ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４の存在下、７日間にわたり、ＣＤ１４＋モノサイトからヒトＤＣが分化された。その後、別のドナーから分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞がＤＣおよび段階希釈された融合分子と共に共培養された。
【０１２３】
植付から５日目、培養上清がＩＦＮγ生成について分析された。結果は、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７および抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２ＡはヒトＴ細胞機能の向上に対し、抗ＰＤＬ１  ｍＡｂまたはＩＬ７よりも、優れた効果を呈することが示された（図８）。低減されたＩＬ‐７効力を持つ抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７Ｗ１４２Ａは、ヒトＴ細胞反応においてＬ１Ｉ７と同等の効力を呈した。従って、融合分子は、ＰＤＬ１拮抗と、ＩＬ７効果と、完全なＩＬ活性との必要十分な相乗効果を有していた。低減されたＩＬ活性を持つ抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７分子および免疫刺激への強力な相乗効果は、将来の臨床において、より優れた安全プロファイルを有するであろう。
実施例７：抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７のｉｎ  ｖｉｖｏ追跡
【０１２４】
抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子の分布をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ追跡アッセイが行われた。簡潔に言うと、腫瘍サイズが５００ｍｍ３に到達した時点で、ＩＣＧ標識された抗ＰＤＬ１  ｍＡｂ、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７またはＦｃ‐ＩＬ７が、ＨＣＣ８２７が移植されたＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を持つヒト化マウスに静脈内注射された。イメージングシステムを用いて、異なる時間間隔において、蛍光シグナルが捕獲された。図９に示される通り、抗ＰＤＬ１  ｍＡｂと同様、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７が腫瘍部位において著しくエンリッチ化したのに対し、Ｆｃ‐ＩＬ７はとりわけ投与後の１日目に広範囲に広がった。これらのデータは集約的に、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７の選択的且つ特異的な分布を示し、融合分子におけるＩＬ７の低減された全身作用を実証する。
実施例８：ＰＤＬ１治療耐性Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおける抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
【０１２５】
抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価するために、ＰＤＬ１抗体耐性Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ同系マウスモデルが、マウスＰＤＬ１と交差反応された抗ＰＤＬ１抗体と融合された２つのマウスＩＬ７から成る分子であるサロゲート抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７と共に用いられた。この時点で、（ｈＩｇＧ１Ｎ２９７Ａ）を持つ、または、（ｍＩｇＧ２ａ）を持たないＩｇＧのＡＤＣＣ機能の２つのアイソフォームが用いられ、ＡＤＣＣの当該効果への寄与を評価した。簡潔に言うと、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞の移植の日を含み４日おきに反復的に、等モルの抗ＰＤＬ１、ｍｌＬ７‐Ｆｃ、これら２つの分子の組み合わせまたは融合分子が、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに皮下投与された。
【０１２６】
図１０に示される通り、ｍｌＬ７‐ＦｃおよびＡＤＣＣ無効の抗ＰＤＬ１‐ｈＩｇＧ１Ｎ２９７Ａ単剤療法が、腫瘍増殖阻止において非常に弱い効果を示した（それぞれ、腫瘍増殖インデックス（ＴＧＩ）＝２２．５％および２１％）。これに対し、ＡＤＣＣ機能が有効にされた抗ＰＤＬ１‐ｍｌｇＧ２ａが、腫瘍増殖の中程度の減衰を示した（ＴＧＩ＝５２．０％）。抗ＰＤＬ１ｍＡｂおよびｍＩＬ７の組み合わせは、ＡＤＣＣ無効化グループおよびＡＤＣＣ有効化グループの両方において、それぞれの単剤療法と比較して、相乗効果を示し、ＡＤＣＣ有効化グループにおいて腫瘍増殖がより厳格に阻害された（ＴＧＩ＝４２．３％および７３．４％）。より重要なことには、コンボグループと比較して、両方の融合分子（ＡＤＣＣ機能を持つおよび持たない）は、腫瘍増殖の防止においてより優れた効果を示し（ＴＧＩ＝８２．０％および８６．３％）、このことは腫瘍の成長に対する部位特異的制御における二機能性分子のメカニズム利点を実証している。実験の終わりに、各動物の腫瘍の重さが測定された。腫瘍の重さのばらつき傾向は、腫瘍の容積の変化のばらつきと同様であった（図１１）。これらのデータは、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７分子の腫瘍増殖制御に対するＡＤＣＣの寄与を示す。
【０１２７】
次に、脾臓腫瘍湿潤ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数がＦＡＣＳによって分析された。モノ治療、コンボ治療あるいは融合分子治療であれ、ｍＩＬ−７治療関連グループにおいては、脾臓腫瘍湿潤ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が観察され、周辺環境および腫瘍内環境の両方において、ＩＬ７がＴ細胞増殖を向上させる機能を発揮することが示された（図１２）。これらのデータは、抗ＰＤＬ１‐ＩＬ７融合分子が、ＰＤＬ１拮抗効果とＩＬ７‐駆動のＴ細胞増殖とが相まって、優れた効果を呈し、抗腫瘍微環境の強化をもたらすことを示している。
【０１２８】
本開示は、本開示の個々の態様の単一例を意図して説明された特定の実施形態によって範囲を限定されることはなく、機能的に均等であるあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内に属する。当業者には、本開示の精神または範囲を逸脱することなく、本開示の方法および組成物に様々な修正および変形を加え得ることが自明であろう。故に、本開示はこれら修正および変形が添付の特許請求の範囲およびその均等技術の範囲内に属する限り、本開示の修正および変形に及ぶ意図である。
【０１２９】
本明細書で言及されたすべての文献および特許出願は、それらの各文献または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
【図１】
2021506748.tif 000011
【図２】
2021506748.tif 000012
【図３】
2021506748.tif 000013
【図４】
2021506748.tif 000014
【図５】
2021506748.tif 000015
【図６】
2021506748.tif 000016
【図７】
2021506748.tif 000017
【図８】
2021506748.tif 000018
【図９】
2021506748.tif 000019
【図１０】
2021506748.tif 000020
【図１１】
2021506748.tif 000021
【図１２】
2021506748.tif 000022
【配列表】
2021506748000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月16日(2020.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ‐７レセプタに結合可能なヒトＩＬ‐７タンパク質またはその断片に、ペプチドリンカーにより融合されたＰＤ‐Ｌ１阻害剤を含む、融合分子。
【請求項２】
前記ペプチドリンカーは、５から１００のアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の融合分子。
【請求項３】
前記ペプチドリンカーは、１０から７５のアミノ酸を有する、請求項２に記載の融合分子。
【請求項４】
前記ペプチドリンカーのアミノ酸残基の少なくとも２０％は、アラニン、グリシン、システインおよびセリンから成る群から選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載の融合分子。
【請求項５】
前記ペプチドリンカーのアミノ酸残基の少なくとも４０％は、アラニン、グリシン、システインおよびセリンから成る群から選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載の融合分子。
【請求項６】
前記ペプチドリンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１‐５から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合分子。
【請求項７】
前記ＰＤ‐Ｌ１阻害剤は、デコイＰＤ‐１タンパク質、または、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、または、その抗原結合断片である、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項８】
前記デコイＰＤ‐１タンパク質は、ＰＤ‐Ｌ１に結合する不活性ＰＤ‐１である、請求項７に記載の融合分子。
【請求項９】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体の前記抗原結合断片は、単一鎖断片、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ断片のペアである、請求項７に記載の融合分子。
【請求項１０】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体は、単一特異性抗体またはさらに二次特異性を有する二重特異性抗体である、請求項７に記載の融合分子。
【請求項１１】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体はＡＤＣＣ有効化されている、請求項１０に記載の融合分子。
【請求項１２】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその前記抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基３１‐３５、残基５０‐６６、および残基９９‐１０８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の残基２４‐３４、残基５０‐５６、および残基８９‐９７の前記アミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の融合分子。
【請求項１３】
前記抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその前記抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の前記アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の融合分子。
【請求項１４】
前記ヒトＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列、または、ＩＬ‐７レセプタアルファに結合可能でありつつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも７５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列は、野生型ヒトＩＬ‐７タンパク質と比較して、ＩＬ‐７レセプタアルファへの低減された結合親和性を有する、請求項１４に記載の融合分子。
【請求項１６】
前記ヒトＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９による位置１４２において、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから選択されるアミノ酸残基を有する、請求項１５に記載の融合分子。
【請求項１７】
前記ヒトＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９による位置１４２において、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから選択されるアミノ酸残基を有する、請求項１５に記載の融合分子。
【請求項１８】
前記ヒトＩＬ‐７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の前記アミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の融合分子。
【請求項１９】
前記ヒトＩＬ‐７タンパク質の断片を含有する融合分子であって、前記断片が、少なくとも４つのアルファヘリックスモチーフを含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項２０】
前記ペプチドリンカーは、前記ＰＤ‐Ｌ１阻害剤のＣ端残基に融合され、且つ、前記ヒトＩＬ‐７タンパク質またはその断片のＮ端残基に融合される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項２１】
前記ペプチドリンカーは、前記ＰＤ‐Ｌ１阻害剤のＮ端残基に融合され、且つ、前記ヒトＩＬ‐７タンパク質のＣ端残基に融合される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項２２】
前記ペプチドリンカーは、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその断片の軽鎖の前記Ｎ端残基に融合される、請求項２１に記載の融合分子。
【請求項２３】
前記ペプチドリンカーは、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体またはその断片の重鎖の前記Ｎ端残基に融合される、請求項２１に記載の融合分子。
【請求項２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを有する分離されたタンパク質であって、前記ペプチドはＩＬ‐７レセプタアルファに結合可能であるが、野生型ヒトＩＬ‐７タンパク質と比較して、前記ＩＬ‐７レセプタアルファへの低減された結合親和性を有する、分離されたタンパク質。
【請求項２５】
前記ペプチドは、位置１４２においてＴｒｐ以外のアミノ酸残基を有する、請求項２４に記載の分離されたタンパク質。
【請求項２６】
前記ペプチドは、位置１４２において、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから成る群から選択されるアミノ酸残基を有する、請求項２４に記載の分離されたタンパク質。
【請求項２７】
前記ペプチドは、位置１４２において、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＦから成る群から選択されるアミノ酸残基を有する、請求項２４に記載の分離されたタンパク質。
【請求項２８】
前記ペプチドは、位置１４２において、アラニンを有する、請求項２４に記載の分離されたタンパク質。
【請求項２９】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の融合分子、または、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の分離されたタンパク質、および、薬学的に許容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項３０】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の融合分子、または、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の分離されたタンパク質をエンコードする１または複数のポリヌクレオチドを含む、分離された細胞。
【国際調査報告】
2021506748.tif 000023
2021506748.tif 000024
2021506748.tif 000025
2021506748.tif 000026
2021506748.tif 000027
2021506748.tif 000028
2021506748.tif 000029
2021506748.tif 000030