(57)【要約】本発明は、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された細菌の発酵によるグリシンまたはその塩を製造する方法を提供する。細菌は、例えば、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシンまたはその塩を製造する方法であって、
（i）グリシン生産細菌を培地で培養して培地もしくは菌体、またはその両者中にグリシンまたはその塩を生産および蓄積すること、
（ii）培地もしくは菌体、またはその両者からグリシンまたはその塩を回収すること
を含み、
前記細菌が、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、方法。
【請求項２】
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質がtdh遺伝子にコードされ、前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質がkbl遺伝子にコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記（A）、（B）、および（C）からなる群より選択され：
（A）配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（B）配列番号2に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（C）配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記（D）、（E）、および（F）からなる群より選択される、方法：
（D）配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（E）配列番号4に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質；
（F）配列番号4に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記（a）、（b）、および（c）からなる群より選択されるDNAにコードされ：
（a）配列番号1に示す塩基配列を含むDNA；
（b）配列番号2に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がL-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するものであるDNA；
（c）遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記（d）、（e）、および（f）からなる群より選択されるDNAにコードされる、方法：
（d）配列番号3に示す塩基配列を含むDNA；
（e）配列番号4に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質が2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するものであるDNA；
（f）遺伝子コードの縮重による配列番号3の変異体塩基配列であるDNA。
【請求項５】
L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子を導入することにより、該遺伝子のコピー数を増加させることにより、もしくは該遺伝子の発現制御領域を改変することにより、またはそれらの組み合わせにより過剰発現し、該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、コリネ型細菌または腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属またはブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属またはパントエア（Pantoea）属に属するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
グリシン生産細菌であって、
L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、細菌。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細菌であって、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記（A）、（B）、および（C）からなる群より選択され：
（A）配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（B）配列番号2に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（C）配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記（D）、（E）、および（F）からなる群より選択される、細菌：
（D）配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（E）配列番号4に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質；
（F）配列番号4に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
tdh遺伝子およびkbl遺伝子を過剰発現するように改変されている、請求項１１または１２に記載の細菌。
【請求項１４】
L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺
伝子が、該遺伝子を導入することにより、該遺伝子のコピー数を増加させることにより、もしくは該遺伝子の発現制御領域を改変することにより、またはそれらの組み合わせにより過剰発現し、該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されている、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１５】
前記細菌が、コリネ型細菌または腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１６】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属またはブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものである、請求項１５に記載の細菌。
【請求項１７】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１６に記載の細菌。
【請求項１８】
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属またはパントエア（Pantoea）属に属するものである、請求項１５に記載の細菌。
【請求項１９】
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、請求項１８に記載の細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産業に関し、特に、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ（L-threonine 3-dehydrogenase）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ（2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現し、非化学的技術によりグリシンを製造できるように改変された、コリネ型細菌または腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌であってよい細菌の発酵によりグリシンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸等のアミノ酸は自然源から得られた微生物株あるいはそれらの変異体を利用した発酵法によって工業的に製造されてきた。典型的には、そのような微生物はＬ−アミノ酸の生産収率が高まるように改変されている。
【０００３】
Ｌ−アミノ酸の生産収率を高めるための多くの技術が報告されており、組換えDNAによる微生物の形質転換（例えば、U.S. Patent No. 4,278,765 Aを参照）、プロモ−ター、リーダー配列及び／又はアテニュエーター、あるいはその他の当業者に知られた発現制御領域の改変（例えば、US20060216796 A1およびWO9615246 A1を参照）などがある。生産収率を高めるその他の技術としては、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は生成したＬ−アミノ酸による目的とする酵素のフィードバック阻害を解除すること（例えば、WO9516042 A1, EP0685555 A1, またはU.S. Patent Nos. 4,346,170 A, 5,661,012 A, および6,040,160 Aを参照）が挙げられる。
【０００４】
Ｌ−アミノ酸の生産収率を高める別の方法としては、１種または数種の、目的とするＬ−アミノ酸の分解に関与する遺伝子、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路から該Ｌ−アミノ酸の前駆体を別の経路に逸らせる遺伝子、炭素、窒素、及びリン酸の流れの再分配に関与する遺伝子、および毒素をコードする遺伝子などの発現を減少させることが挙げられる。
【０００５】
グリシンは、ヒトや他の動物における条件付き必須アミノ酸であり、すなわち、例えば、代謝障害に関連する疾患等の特定の生理条件下でグリシンの生合成が制限され得ることを意味する。グリシンは、中枢神経系と免疫系の維持のために体が必要とする。グリシンは、保存料、抗酸化剤、褐変剤、および調味剤として食品業界で使用されている。グリシンは甘味を有するため、サッカリンの呈味を増強することができ、強い甘味料の苦い後味をマスクすることができる。アミノ酸と還元糖の間のメイラード反応は、ローストおよびベークされた食品に独特の褐変とフレーバー発生をもたらすことが知られている。グリシンは、特にこの目的で使用される。グリシンは、培地中での自然酸化反応や細菌の増殖を抑制するために、金属イオンに対するキレート剤としても使用される。しかし、グリシンは、カビおよび酵母に対する防腐作用はほとんど示さない。
【０００６】
グリシンはアキラルであるため、独特なタンパク質構成アミノ酸である。したがって、グリシンは、主に化学的手段を使用して（つまり、合成的に）製造される。グリシンの製造方法は知られており、シアン化水素法（いわゆるHCN法、Streckerの反応）や、モノクロロ酢酸法（いわゆるMCA法）（Glycine From Japan and Korea; Investigation Nos. 731-TA-1112 and 1113 (Final); U.S. International Trade Commission, Publication 3980, Jan. 2008）が挙げられる。HCN法では、シアン化水素とホルムアルデヒドが出発原料として利用される。MCA法では、グリシンはモノクロロ酢酸とアンモニアから合成される。また、ニトリル基を加水分解する活性を有する、細菌または真菌種由来の微生物酵素の
作用下での加水分解反応によりグリシノニトリルからグリシンを製造する方法が知られている（EP1243657 B1）。
【０００７】
３つの純度等級のグリシン、すなわち、医薬品グレード、USP（米国薬局方）グレード、および工業グレードのグリシン、が市販されている。これらの純度等級のグリシンは化学的には同一であるが、純度等級によってグリシン製剤中の不純物の種類と量が異なる。グリシンは製薬業界や食品加工業界等の種々の産業分野で利用されるため、非化学的方法で製造された高純度でリーズナブルな価格のグリシンが求められている。
【０００８】
しかしながら、例えばコリネ型細菌や腸内細菌科に属する細菌等の細菌の発酵によるグリシンの製造方法は知られておらず、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された細菌の発酵によるグリシンの製造方法についてはなおさらである。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書は、細菌の発酵によりグリシンを生産する新規の方法を記載する。本明細書に開示される主題によれば、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌（例えば、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属およびエシェリヒア（Escherichia）属の細菌）は、同細菌の発酵によりグリシンを生産することが可能になり得る。具体的には、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌は、同細菌がL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された場合に、同細菌の発酵によりグリシンを生産することが可能になり得る。また、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌（例えば、コリネバクテリウム属およびエシェリヒア属の細菌）であってよい細菌の発酵によるグリシンの生産は、改変された細菌によるグリシンの生産が非改変株と比較して向上するように同細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現することにより向上し得る。したがって、グリシンは、本明細書に記載されるように改変された細菌の発酵による本明細書に記載される方法に従って製造できる。
【００１０】
コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌は、同細菌がL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A
ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された場合に、同細菌を培地で培養した際にグリシンが同細菌により生産され培地から回収できるように培地中にグリシンを生産できるようになり得る。例えば、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌は、同細菌がtdh遺伝子およびkbl遺伝子を過剰発現するように改変された場合に、同細菌を培地で培養した際にグリシンが同細菌により生産され培地から回収できるように培地中にグリシンを生産できるようになり得る。すなわち、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように細菌を改変することにより、細菌を培地で培養した際にグリシンが同細菌により生産され培地から回収できるようにグリシンを生産する能力を細菌に付与することができる。
【００１１】
本発明の１つの側面は、グリシンまたはその塩を製造する方法であって、
（i）グリシン生産細菌を培地で培養して培地もしくは菌体、またはその両者中にグリシンまたはその塩を生産および蓄積すること、
（ii）培地もしくは菌体、またはその両者からグリシンまたはその塩を回収すること
を含み、
前記細菌が、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる側面は、前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質がtdh遺伝子にコードされ、前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質がkbl遺伝子にコードされる、前記方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる側面は、前記方法であって、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記（A）、（B）、および（C）からなる群より選択され：
（A）配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（B）配列番号2に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（C）配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記（D）、（E）、および（F）からなる群より選択される、方法を提供することである：
（D）配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（E）配列番号4に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質；
（F）配列番号4に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、前記方法であって、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記（a）、（b）、および（c）からなる群より選択されるDNAにコードされ：
（a）配列番号1に示す塩基配列を含むDNA；
（b）配列番号2に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がL-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するものであるDNA；
（c）遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記（d）、（e）、および（f）からなる群より選択されるDNAにコードされる、方法を提供することである：
（d）配列番号3に示す塩基配列を含むDNA；
（e）配列番号4に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質が2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するものであるDNA；
（f）遺伝子コードの縮重による配列番号3の変異体塩基配列であるDNA。
【００１５】
本発明のさらなる側面は、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子を導入することにより、該遺伝子のコピー数を増加させることにより、もしくは該遺伝子の発現制御領域を改変することにより、またはそれらの組み合わせにより過剰発現し、該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されている、前記方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる側面は、前記細菌が、コリネ型細菌または腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌である、前記方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる側面は、前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属またはブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものである、前記方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる側面は、前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、前記方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属またはパントエア（Pantoea）属に属するものである、前記方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる側面は、前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、前記方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の側面は、グリシン生産細菌であって、
L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、細菌を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる側面は、前記細菌であって、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記（A）、（B）、および（C）からなる群より選択され：
（A）配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（B）配列番号2に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（C）配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記（D）、（E）、および（F）からなる群より選択される、細菌を提供することである：
（D）配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（E）配列番号4に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含み、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質；
（F）配列番号4に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質。
【００２３】
本発明のさらなる側面は、tdh遺伝子およびkbl遺伝子を過剰発現するように改変されている、前記細菌を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる側面は、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子を導入することにより、該遺伝子のコピー数を増加させることにより、もしくは該遺伝子の発現制御領域を改変することにより、またはそれらの組み合わせにより過剰発現し、該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強さ
れている、前記細菌を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる側面は、前記細菌が、コリネ型細菌または腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌である、前記細菌を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる側面は、前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属またはブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものである、前記細菌を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる側面は、前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、前記細菌を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる側面は、前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属またはパントエア（Pantoea）属に属するものである、前記細菌を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる側面は、前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、前記細菌を提供することである。
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、DNA断片<KBL> (A) および <TDH> (B)を示す。PrplK - rplK遺伝子のプロモーター, PgapA - gapA遺伝子のプロモーター, SD - Shine-Dalgarno配列。
【図２】図２は、pPK4-kbl-tdhプラスミドの構築手順を示す。
【図３】図３は、pPK4-kbl-tdhプラスミドの物理マップを示す。
【図４】図４は、pEL-kbl-tdhプラスミドの物理マップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
１．細菌
本明細書に記載の方法においては、改変された細菌が同細菌の発酵により培地中にグリシンを生産できるようになり得る限り、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変できるいずれの細菌でも使用できる。あるいは、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように細菌が改変された場合に発酵によりグリシンを生産できるようになる限り、いずれの細菌でも使用できる。本明細書に記載の細菌は、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されたグリシン生産菌であり得る。細菌の例は、後述する。
【００３３】
改変の導入後に「細菌がグリシンを生産できるようになり得る」とは、以前はグリシンを生産する能力を有しなかった細菌が改変の導入後にグリシンを生産する能力を取得し得ることを意味し得る。また、改変の導入後に「細菌がグリシンを生産できるようになり得る」とは、改変された細菌がグリシンを生産できるように改変を導入した後に細菌がグリシンを生産できるようになることを意味し得る。
【００３４】
「グリシン生産菌」とは、当該細菌を培地で培養した際に、培地及び／又は菌体中にグ
リシンを生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積できる細菌を意味し得る。「細菌を培地で培養（cultivate）する」とは、「細菌を培地で培養（culture）する」ことと同等であり得、これらの表現は当業者には公知である。また、「グリシン生産菌」とは、非改変株、例えば、Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) ATCC13032またはEscherichia coli (E. coli) K-12等の野生株または親株、と比較して、より多い量でグリシンを培地中に生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積できる細菌も意味し得る。細菌は、0.01 g/L以上のグリシン、例えば、0.1 g/L以上、0.5 g/L以上、あるいは1.0 g/L以上のグリシンを培地中に蓄積し得る。
【００３５】
「細菌がグリシンを生産できる」とは、当該細菌を培地で培養した際に、培地及び／又は菌体からグリシンを回収できる程度に当該細菌が培地及び／又は菌体中にグリシンを生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積できることを意味し得る。「細菌がグリシンを生産できる」とは、当該細菌を培地で培養した際に、培地及び／又は菌体中のグリシンの量が0.01 g/L以上となる程度に当該細菌が培地及び／又は菌体中にグリシンを生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積できることも意味し得る。
【００３６】
細菌は、グリシンもしくはその塩、またはそれらの混合物を生産し得る。よって、「グリシン」とは、フリー体のグリシンに限られず、グリシンの塩もしくは水和物、またはグリシンと他の有機もしくは無機化合物とで形成される付加体も包含してよい。細菌は、グリシンを単独で生産できてもよく、グリシンと他の１種またはそれ以上のアミノ酸（例えば、グリシン以外のL-アミノ酸）の混合物として生産できてもよい。「L-アミノ酸」とは、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等の、L-体のアミノ酸（アミノ酸のいわゆるL-エナンチオマー）を意味し得る。
【００３７】
また、グリシンを生産できる、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された細菌も使用できる。細菌は、本来的にグリシンを生産できてもよく、変異法またはDNA組み換え法によりグリシンを生産できるように改変されていてもよい。すなわち、細菌は、本来的にグリシンを生産できる細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現することにより取得できる。あるいは、細菌は、細菌がグリシンを生産できるようになるようにL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現することにより取得できる。すなわち、細菌は、改変された細菌がグリシンを生産できるように、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変され得る。
【００３８】
本明細書に記載の細菌は、例えば、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌であり得、具体的には、したがって、コリネ型細菌や腸内細菌科に属する細菌が挙げられる。以下の細菌についての説明は、本発明の方法で使用され得るいずれの細菌にも同等に準用できる。
【００３９】
本明細書に記載の方法において、コリネ型細菌は、好気性のグラム陽性杆菌であり、Corynebacterium属細菌、Brevibacterium属細菌、およびMicrobacterium属細菌等を包含する。コリネ型細菌は、かつてはBrevibacterium属に分類されていたがCorynebacterium属
に統合された細菌も包含する（Liebl W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, “Brevibacterium flavum” DSM 20411, “Brevibacterium lactofermentum” DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns, Int. J. Syst. Bacteriol., 1991, 41:255-260）。コリネ型細菌は、かつてはCorynebacterium ammoniagenesに分類されていたが16S rRNA塩基配列解析等により現在はCorynebacterium stationisに再分類されている細菌も包含する（Bernard K.A. et al., Assignment of Brevibacterium stationis (ZoBell and Upham 1944) Breed 1953 to the genus Corynebacterium, as Corynebacterium stationis comb. nov., and emended description of the genus Corynebacterium to include isolates that can alkalinize citrate, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60:874-879）。コリネ型細菌を使用する利点は、コリネ型細菌は細菌細胞壁に熱いペプチドグリカン層を有するグラム陽性細菌であり、それにより、例えば、温度や化学的活性剤（例えば、酸化的および毒性化学物質）等の種々の環境条件に耐性となることである。コリネ型細菌を使用する他の利点は、糖、アンモニア、およびミネラル塩等を含有する単純な培地でよく生育でき、よって、培地コスト、培養法、および培養生産性等の観点で優れていることである。
【００４０】
コリネ型細菌として、具体的には、以下の種が挙げられる：
Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium acetoglutamicum,
Corynebacterium alkanolyticum,
Corynebacterium callunae,
Corynebacterium glutamicum,
Corynebacterium lilium,
Corynebacterium melassecola,
Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens),
Corynebacterium herculis,
Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium immariophilum,
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum),
Brevibacterium roseum,
Brevibacterium saccharolyticum,
Brevibacterium thiogenitalis,
Corynebacterium ammonia genes (Corynebacterium stationis),
Brevibacterium album,
Brevibacterium cerinum,
Microbacterium ammoniaphilum.
Specific examples of coryneform bacteria include the following strains:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511,
Corynebacterium callunae ATCC 15991,
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734,
Corynebacterium lilium ATCC 15990,
Corynebacterium melassecola ATCC 17965,
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539),
Corynebacterium herculis ATCC 13868,
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020,
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205),
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068,
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869,
Brevibacterium roseum ATCC 13825,
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066,
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240,
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872,
Brevibacterium album ATCC 15111,
Brevibacterium cerinum ATCC 15112,
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354。
【００４１】
これらの株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC; Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）から入手することができる。すなわち、各菌株には対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して発注することができる（www.atcc.orgを参照）。各菌株の登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００４２】
本明細書に記載の方法において、腸内細菌科に属する細菌は、エンテロバクター、エルビニア、エシェリヒア、クレブシエラ、モルガネラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、イェルシニア等の属に属する細菌であり得、且つグリシンを生産でき得る。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を使用することができる。改変され得る腸内細菌科の株としては、エシェリヒア、エンテロバクターあるいはパントエア属の細菌が挙げられる。
【００４３】
ここに開示された主題に従ったエシェリヒア属細菌を得るために改変され得るエシェリヒア属細菌の株としては、特に限定されないが、具体的には、Neidhardtらの著書（Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, pp. 2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. （ed.）, Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nded., ASM Press, Washington, D.C.,
1996）に挙げられるものが使用できる。特にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli；E. coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリの具体例としては、プロトタイプ野生株であるエシェリヒア・コリK-12株由来のエシェリヒア・コリW3110（ATCC 27325）やエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）等が挙げられる。これらの株は、上述した通り、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から入手することができる。
【００４４】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられ、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）等が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスのいくつかの株は、近年、16S rRNAの塩基配列解析などによりパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、またはパントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されている。腸内細菌科に分類される細菌であれば、エンテロバクター属またはパントエア属のいずれに属するものであっても使用することができる。パントエア・アナナティス株を遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、及びそれらの派生株を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり最近16S rRNAの塩基配列解析等によりパントエア・アナ
ナティスに再分類されている。
【００４５】
本明細書に記載の細菌は、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている。
【００４６】
「L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質」とは、以下の反応を触媒するタンパク質を意味してよい：L-threonine + NAD+ ⇔ L-2-amino-3-oxobutanoate + NADH + 2 H+（Enzyme Commission (EC) number 1.1.1.103; Boylan S.A. and Dekker E.E., L-Threonine dehydrogenase. Purification and properties of the homogeneous enzyme
from E. coli K-12, J. Biol. Chem., 1981, 256(4):1809-1815）。例えば、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそのホモログであってNAD+依存的にL-スレオニン（L-threonine）をL-2-アミノ-3-オキソブタン酸（L-2-amino-3-oxobutanoate）に還元する反応を触媒するものを意味してよい。L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質の活性は、L-スレオニン（L-threonine）からのアミノアセトン（aminoacetone）の生成を比色分析で評価することにより、またはNADHの生成を分光光度計で観測することにより、決定できる（Boylan S.A. and Dekker E.E., 1981およびその参考文献を参照のこと）。
【００４７】
「2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質」とは、以下の反応を触媒するタンパク質を意味してよい：glycine + acetyl-coenzyme A ⇔L-2-amino-3-oxobutanoate + coenzyme A + H+（EC 2.3.1.29; acetyl-coenzyme AをAc-CoAともいう; Mukherjee J.J. and Dekker E.E., Purification, properties, and N-terminal amino
acid sequence of homogeneous E. coli 2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase, a pyridoxal phosphate-dependent enzyme, J. Biol. Chem., 1987, 262:14441-14447）。例えば、2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質は、配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそのホモログであって2-アミノ-3-オキソブタン酸（2-amino-3-oxobutanoate）をグリシン（glycine）とアセチルコエンザイムA（acetyl-coenzyme A）に開裂する反応を触媒するものを意味してよい。2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質の活性は、グリシン（glycine）とアセチルCoA（Ac-CoA）からのアミノアセトン（aminoacetone）の生成を比色分析で評価することにより、またはコエンザイムA（coenzyme A；CoAともいう）と5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)）間の縮合反応を412 nmで測定することにより、決定できる（例えば、Mukherjee J.J. and Dekker E.E., 1987およびその参考文献を参照のこと）。
【００４８】
タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（BSA）を標準物質として、クマシー色素を使用するブラッドフォードタンパク質分析またはローリー法によって決定することができる（Bradford M.M., Anal. Biochem., 1976, 72:248-254; Lowry O.H. et al., J. Biol. Chem., 1951, 193:265-275）。
【００４９】
L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質としては、tdh遺伝子に相当する配列番号1に示す塩基配列にコードされる配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。E. coliのtdh遺伝子は、L-threonine 3-dehydrogenase TDH, NAD(P)-binding（KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, entry No. b3616; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, accession No. P07913）をコードする。tdh遺伝子（GenBank, accession No. NC_000913.3; nucleotide positions: 3790320 to 3791345, complement; Gene ID: 948139）は、E. coli K-12株の染色体において同じ鎖上のkbl遺伝子とwaaH遺伝子の間に位置する。tdh遺伝子の塩基配列（配列番号1）、及びtdh遺伝子によりコードされるE. coliのTDHタンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）は公知である
。また、他の細菌種のTDHのアミノ酸ホモログ、例えば、配列番号2のTDHを有するE. coli
(同一性: 100%), Shigella flexneri (同一性: 99%), Salmonella enteric (同一性: 98%), Klebsiella pneumonia (同一性: 97%), Enterobacter cloacae (同一性: 96%), P. ananatis (同一性: 86%)種等の腸内細菌科の細菌; Burkholderia mallei (同一性: 77%), Paraburkholderia xenovorans (同一性: 76%)種等のBurkholderiaceae科の細菌; Rhizobium etli (同一性: 71%)種等のRhizobiaceae科の細菌; Xanthomonas axonopodis (同一性:
64%)種等のXanthomonadaceae科の細菌等に由来するホモログも公知である（例えば、the
NCBI database, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/を参照のこと）。よって、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質としては、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログであるタンパク質も挙げられる。
【００５０】
2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質としては、kbl遺伝子に相当する配列番号3に示す塩基配列にコードされる配列番号4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。E. coliのkbl遺伝子は、2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase KBL（別名: 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, 2-amino-3-oxobutanoate glycine-lyase (CoA-acetylating), glycine C-acetyltransferase, aminoacetone synthetase, aminoacetone synthase）（KEGG, entry No. b3617; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, accession No. P0AB77）をコードする。kbl遺伝子（GenBank, accession No. NC_000913.3; nucleotide positions: 3791355 to 3792551, complement; Gene ID: 948138）は、E. coli K-12株の染色体において同じ鎖上のyibB遺伝子とtdh遺伝子の間に位置する。kbl遺伝子の塩基配列（配列番号3）、及びkbl遺伝子によりコードされるE. coliのKBLタンパク質のアミノ酸配列（配列番号4）は公知である。また、他の細菌種のKBLのアミノ酸ホモログ、例えば、配列番号4のKBLを有するE. coli (同一性: 100%), Shigella dysenteriae (同一性: 99%), Citrobacter farmer (同一性: 97%), Salmonella enterica (同一性: 97%), P. ananatis (同一性: 82%)種等の腸内細菌科の細菌; Serratia marcescens (同一性: 88%)種等のYersiniaceae科の細菌; Xenorhabdus khoisanae (同一性: 83%)種等のMorganellaceae科の細菌; Erwinia sp. 9145 (同一性: 82%)種等のErwiniaceae科の細菌; Lysobacter spongiicola (同一性: 67%), Stenotrophomonas maltophilia (同一性: 66%)種等のXanthomonadaceae科の細菌等に由来するホモログも公知である（例えば、the NCBI databaseを参照のこと）。よって、2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質としては、配列番号4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログであるタンパク質も挙げられる。
【００５１】
「L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された細菌」とは、改変された細菌において、非改変株（例えば、野生株または親株）と比較して、NAD+依存的にL-スレオニン（L-threonine）をL-2-アミノ-3-オキソブタン酸（L-2-amino-3-oxobutanoate）に還元する反応を触媒する対応する遺伝子タンパク質産物の総活性および2-アミノ-3-オキソブタン酸（2-amino-3-oxobutanoate）をグリシン（glycine）とアセチルコエンザイムA（acetyl-coenzyme A）に開裂する反応を触媒する対応する遺伝子タンパク質産物の総活性が増加するように、またはL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルおよび2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルがより高くなるように、細菌が改変されていることを意味し得る。上記比較のための対照となる非改変株としては、C. glutamicum ATCC13032等のコリネ型細菌の野生株、E. coli MG1655株（ATCC 47076）やW3110株（ATCC 27325）等の腸内細菌科に属する細菌の野生株、またはP. ananatis AJ13355株（FERM BP-6614）等のPantoea属に属する細菌の野生株等が挙げられる。
【００５２】
L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された細菌は、例えば、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の導入および／またはコピー数増大により、またはそれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の分子あたりの活性（比活性ともいう）の増大により、非改変株（例えば、野生株または親株）と比較して、NAD+依存的にL-スレオニン（L-threonine）をL-2-アミノ-3-オキソブタン酸（L-2-amino-3-oxobutanoate）に還元する反応を触媒する対応する遺伝子タンパク質産物の総活性および2-アミノ-3-オキソブタン酸（2-amino-3-oxobutanoate）をグリシン（glycine）とアセチルコエンザイムA（acetyl-coenzyme A）に開裂する反応を触媒する対応する遺伝子タンパク質産物の総活性が増加した細菌であり得る。細菌は、細胞あたりのL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質および／または細胞あたりの2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質の活性が非改変株のそれらタンパク質の活性の150%以上、200%以上、あるいは300%以上に増大するように改変されてよい。細菌は、改変された細菌において、細胞あたりのL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質および細胞あたりの2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質の活性が非改変株の活性と比較して増大するように改変されてるのが好ましい。
【００５３】
「L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された細菌」は、非改変株（例えば、野生株または親株）と比較してL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルおよび2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが増強された細菌にも適用され得る。よって、「L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された細菌」とは、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルおよび／または2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが非改変株の発現レベルよりも高いことを意味し得る。細菌は、改変された細菌において、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルおよび2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが非改変株の発現レベルと比較して増大するように改変されてるのが好ましい。
【００５４】
L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように細菌を改変する方法、および本明細書に記載の細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強するために使用し得る方法は、改変すべき細菌に依存する。遺伝子の過剰発現が達成できる限り、遺伝子を過剰発現するいずれの方法でも利用してよい。よって、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子を過剰発現する単一の方法により過剰発現でき、または遺伝子を過剰発現する種々の方法により過剰発現できる。
【００５５】
本明細書に記載の細菌は、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の導入後にそれらの遺伝子を保持するように、それらの遺伝子を過
剰発現するように改変され得る。また、細菌は、改変された細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質の活性および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A
ligase活性を有するタンパク質の活性が検出されるように改変され得る。すなわち、改変された細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質の活性および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質の活性を検出でき、且つ改変された細菌が本明細書に記載するようにグリシンを生産できるように、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変され得る限り、本来的または天然にはL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有しないいずれの細菌でも使用され得る。
【００５６】
本明細書に記載の細菌は、細菌がL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を保持するように、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をそれらの遺伝子の導入前にはそれらの遺伝子を有しない細菌に導入することにより、取得できる。「L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を保持するように改変された細菌」とは、本来的または天然にはL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有さず、よって「受容細菌」（いわゆる宿主細菌）と称される第１の細菌種に属する細菌が、第１の種とは異なる第２の細菌種（いわゆる供与細菌）に由来するL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を保持するように改変されたことを意味し得る。供与細菌は、受容細菌でない限り、１つの種の細菌であってもよく、２つの異なる種の細菌であってもよい。よって、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、１つの種または２つの異なる種に由来してよい。受容細菌としては、Corynebacterium属またはBrevibacterium属に属する細菌等の、本明細書に記載のコリネ型細菌が挙げられる。供与細菌としては、Escherichia属やPantoea属に属する細菌等の、本明細書に記載の腸内細菌科に属する細菌が挙げられる。例えば、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が１つの種に由来する場合、受容細菌は例えばC. glutamicum種の細菌等のコリネ型細菌であってよく、供与細菌はE. coli種の細菌であってよい。
【００５７】
本明細書に記載の細菌は、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を保持するように改変されている。L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、異なる核酸分子上に存在するような態様で、細菌において過剰発現できる。あるいは、それらの遺伝子は、単一の核酸分子上に存在するような態様で細菌に導入できる。例えば、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、単一の発現ベクターまたは染色体上に存在してよい。あるいは、それらの遺伝子は、２つの異なる発現ベクター上に存在してよい。あるいは、或る遺伝子が単一の発現ベクター上に存在し、別の遺伝子が染色体上に存在してもよい。
【００５８】
受容細菌となるコリネ型細菌は本明細書に記載の細菌の一例であり得るため、コリネ型細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する方法を以下に記載する。
【００５９】
コリネ型細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する方法は、それらの遺伝子を輸する核酸（ＤＮＡ）をコリネ型細菌に導入することであり得る。核酸（例えば、遺伝子やベクター等）をコリネ型細菌に導入する方法としては、限定されるものではないが、当業者に公知の遺伝子工学的手法が挙げられ、それは特に制限されない。本明細書に記載の細菌において、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、染色体外で自律複製するベクター（プラスミド等）上に存在してもよく、染色体に組み込まれてもよい。また、上述の通り、本明細書に記載の細菌を構築するにあたり、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の導入、およびグリシンを生産する能力の付与または増強は、任意の順番で実施できる。
【００６０】
核酸は、例えば、ベクターを利用してコリネ型細菌に導入できる。ベクターは、コリネ型細菌において自律複製するものであれば特に制限されず、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。ベクターとしては、例えば、コリネ型細菌に由来するプラスミドを用いることができる。また、ベクターとしては、コリネ型細菌の菌体内で自律複製するベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであり得る。また、ベクターは、形質転換体の選抜のために抗生物質耐性遺伝子等のマーカーを含み得る。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。コリネ型細菌において自律複製するベクターとして、具体的には、pHM1519 (Miwa K. et al., Agric. Biol. Chem., 1984, 48:2901-2903); pAM330 (Miwa K. et al., 1984); これらを改良して得られた薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド; 特開平3-210184に記載のプラスミドpCRY30; 特開平2-72876およびU.S. Patent No. 5,185,262に記載のプラスミドpCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, およびpCRY3KX; 特開平1-191686に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3; 特開昭58-67679に記載のpAM330; 特開昭58-77895に記載のpHM1519; 特開昭58-192900に記載のpAJ655, pAJ611, およびpAJ1844; 特開昭57-134500に記載のpCG1; 特開昭58-35197に記載のpCG2; 特開昭57-183799に記載のpCG4およびpCG11; 特開平10-215883に記載のpVK7; 特開平9-070291に記載のpVC7等が挙げられる。
【００６１】
また、人工トランスポゾン等も核酸をコリネ型細菌に導入するために利用できる。トランスポゾンを利用する場合、相同組み換えまたはトランスポゾン自体の転移能によりタンパク質をコードする遺伝子を染色体に導入できる。相同組み換えを利用した導入法としては、他にも、例えば、線状ＤＮＡ、温度感受性複製起点を有するプラスミド、接合伝達可能なプラスミド、選択した宿主で機能しない複製起点を有しない自殺ベクター等を利用した方法が挙げられる。コリネ型細菌に導入する遺伝子は、そのまま利用してもよく、コリネ型細菌のコドン頻度に応じた最適コドンを有するように改変してもよい。具体的には、供与細菌に由来する遺伝子の受容細菌における発現は、レアコドン（宿主生物において使用度が低いコドン）を使用度が中程度または高い同義コドンに置換することにより、達成できる（ここで、コドン使用度は、コドンが生物の細胞において単位時間当たりに翻訳される回数（頻度）、または生物のタンパク質をコードする一連のリーディングフレームの
平均コドン頻度として定義され得る（Zhang S.P. et al., Gene, 1991, 105(1):61-72））。生物のコドン使用度は、CUTG（Codon Usage Tabulated from GenBank) (http://www.kazusa.or.jp/codon/; Nakamura Y. et al., Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000, Nucleic Acids Res., 2000, 28(1):292）の拡張web版であるCodon Usage Databaseで見られる。使用度が低いコドンを使用度が高い同義コドンに置換するのが好ましい場合がある。レアコドンまたは使用度が低いコドンの使用度が中程度または高い同義コドンへの置換は、レアコドンを認識するtRNAをコードする遺伝子の共発現と組み合わせてもよい。
【００６２】
本明細書に記載の細菌に導入する遺伝子は、プロモーター配列の下流に接続することができる。プロモーターは、コリネ型細菌で機能するものであれば特に制限されず、コリネ型細菌由来のプロモーターであってもよく、異種プロモーターであってもよい。「コリネ型細菌で機能するプロモーター」とは、コリネ型細菌でプロモーター活性を有するプロモーターを意味し得る。異種プロモーターとして、具体的には、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、およびaraBADプロモーター等のE. coli由来のプロモーターが挙げられる。これらの中でも、tacプロモーター等の強力なプロモーターを特に例示でき、またaraBADプロモーター等の誘導可能なプロモーターも特に例示できる。
【００６３】
プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、高活性である在来のプロモーターを取得してよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（WO0018935 A1）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldstein M.A.らの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に顕著に影響することが知られており、これらの配列を改変することもできる。
【００６４】
コリネ型細菌に遺伝子を導入する方法は、特に制限されず、一般的に利用される方法、例えば、プロトプラスト法（Miwa K. et al., Gene, 1985, 39:281-286）、エレクトロポレーション法（Dunican L.K. and Shivnan E., Nat. Biotechnol., 1989, 7:1067-1070）、および電気パルス法（特開平2-207791）等を利用できる。
【００６５】
腸内細菌科に属する細菌は本明細書に記載の細菌の一例であり得るため、腸内細菌科に属する細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する方法を以下に記載する。
【００６６】
遺伝子の発現を増強するために使用することができる方法としては、限定するものではないが、細菌ゲノム（細菌の染色体および／または自律複製するプラスミド）における遺伝子のコピー数を増加させること、および／または当業者に公知の遺伝子工学的手法に従って本明細書に記載の細菌において遺伝子のコピー数および／または発現レベルを増大させることができるベクターに所望の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することが挙げられる。
【００６７】
そのようなベクターの例としては、限定するものではないが、pMW118/119、pBR322、pUC19等の広宿主域プラスミドが挙げられる。多コピーのL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および／または2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、例えば、相同組換えまたはMuドリブンインテグレーション等によって細菌の染色体DNAに導入することもできる。相同組換え
は、染色体DNA中に複数のコピーを有する配列を標的として実施することができる。染色体DNA中に複数のコピーを有する配列としては、限定するものではないが、レペティティブDNAや転移因子の末端に存在するインバーテッドリピートが挙げられる。さらに、遺伝子をトランスポゾンに組み込んで転移させることにより、染色体DNAに多コピーの遺伝子を導入することができる。Muドリブンインテグレーションを使用することにより、一回の操作により3を超えるコピー数の遺伝子を染色体DNAに導入することができる（Akhverdyan
V.Z. et al., Biotechnol. （Russian）, 2007, 3:3-20）。
【００６８】
L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強するために利用できる別の方法としては、それらの遺伝子の近傍の制御領域の改変または生来（native）または外来の制御領域の導入により遺伝子の発現レベルを増大させることが挙げられる。L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および／または2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子はオペロン構造を形成してもよいため、それらの遺伝子の発現増強に利用できる方法としては、それらの遺伝子を含むオペロンの近傍の制御領域の改変または生来（native）または外来の制御領域の導入により同オペロンの発現レベルを増大させることも挙げられる。この方法においては、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現が同時に増強され得る。
【００６９】
発現制御領域または発現制御配列としては、プロモ−ター、エンハンサー、アテニュエーターと終結シグナル、抗終結シグナル、リボソーム結合部位（RBS）、及びその他の発現制御エレメント（例えば、リプレッサーまたはインデューサーが結合する領域、及び／又は、例えば転写されたmRNA中の転写及び翻訳の制御タンパク質の結合部位）が挙げられる。このような制御領域は、例えばSambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）に記載されている。遺伝子発現を制御する領域の改変は、公知の方法による細菌ゲノムにおける改変遺伝子のコピー数の増大と組み合せてもよい（例えば、Akhverdyan V.Z. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871; Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765を参照）。
【００７０】
L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強するのに適したプロモ−ターの例としては、それらの遺伝子の生来のプロモ−ターより強い強力なプロモ−ターが挙げられる。例えば、lacプロモーター、trpプロモ−ター、trcプロモ−ター、tacプロモ−ター、ラムダファージのPRあるいはPLプロモ−ターはいずれも強力なプロモ−ターとして知られている。腸内細菌科に属する細菌中で高いレベルの遺伝子発現を与える強力なプロモ−ターを使用することができる。あるいは、プロモ−ターの効果は、例えば、遺伝子のプロモーター領域に変異を導入してより強いプロモ−ター機能を得ることにより増強することができ、以て、該プロモ−ターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加させることができる。さらに、シャイン・ダルガルノ（SD）配列、及び／又はSD配列と開始コドンの間のスペーサー、及び／又はリボソーム結合部位中の開始コドンの直ぐ上流または下流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に大きく影響することが知られている。例えば、開始コドンに先行する3つのヌクレオチドの性質に依存して、20倍の範囲の発現レベルが見出されている（Gold L. et al., Annu. Rev. Microbiol., 1981, 35:365-403; Hui A. et al., EMBO J., 1984, 3:623-629）。
【００７１】
遺伝子のコピー数、遺伝子の存在あるいは不在は、例えば、染色体DNAを制限処理した
後、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッテイング、または蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）等を行うことにより、測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等の様々な周知の方法を使用して遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することにより決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEと、その後の免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）やタンパク質試料の質量分析等の公知の方法により測定することができる。
【００７２】
プラスミドDNAの調製、DNAの切断、DNAの結合、DNAの形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、変異の導入等の、DNAの組換え分子の操作及び分子クローニングのための方法は、当業者に周知の通常の方法であってよい。そのような方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、あるいはGreen M.R. and Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （2012）、Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak and
Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4th ed., Washington, DC, ASM Press （2009）に記載されている。
【００７３】
例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、接合、移行等の常法を含む、組み換えＤＮＡを操作するいずれの方法でも利用できる。タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換、トランスフェクション、感染、接合、または移行により、同ＤＮＡによりコードされるタンパク質を合成する能力を細菌に付与できる。形質転換、トランスフェクション、感染、接合、および移行の方法としては、公知の方法が挙げられる。例えば、効率的な形質転換およびトランスフェクションのために、受容細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡに対するE. coliK-12細胞の透過性を増大させる方法が報告されている（Mandel M. and Higa A., Calcium-dependent bacteriophage DNA infection, J. Mol. Biol., 1970, 53:159-162）。特化および／または一般化された形質導入の方法が記載されている（Morse M.L. et al., Transduction in Escherichia coli K-12, Genetics, 1956, 41(1):142-156; Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor,
N.Y.: Cold Spring Harbor La. Press, 1972）。宿主微生物へのランダムおよび／またはターゲットしたＤＮＡの組み込みのための他の方法、例えば、「Mu-driven組み込み／増幅」（Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871）や、「Red/ET-driven組み込み」または「λRed/ETを介した組み込み」（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(12):6640-45; Zhang Y., et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128）、を適用できる。また、所望の遺伝子の多数の挿入のためには、Mu-driven replicative transposition（Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871）および所望の遺伝子の増幅をもたらす化学的に誘導されるrecA依存的相同組み換えに基づく染色体の進化（Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765）に加えて、トランスポゾン、Red/ETを介した部位特異的および／または相同組み換え、および／またはP1を介した一般化形質導入の種々の組み合わせを含む他の方法を利用できる（例えば、Minaeva N. et al., BMC Biotechnology, 2008, 8:63; Koma D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, 93(2):815-829を参照のこと）。
【００７４】
コリネ型細菌および腸内細菌科に属する細菌以外の細菌種においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する方法は、コリネ型細菌および腸内細菌科に属する細菌について本明細書に記載の方法を参照して準用でき、当業者に公知の方法を利用できる。また、コリネ型細菌および腸内細菌科に属する細菌における遺伝子の過剰発現に適した通常の方法を利用できることは、通常の技能の範囲内であ
る。また、コリネ型細菌における遺伝子の過剰発現に適した方法は、適宜改変して腸内細菌科に属する細菌における遺伝子の過剰発現に利用でき、また、逆もそうである。よって、本明細書に記載の遺伝子を過剰発現する方法は、事実上、本明細書に記載のいずれの細菌にも適用してよい。
【００７５】
L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードするE. coli種の細菌由来の遺伝子の変異体（variant）についての以下の記載は、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードするE. coli以外の細菌種由来の遺伝子や2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase活性を有するタンパク質をコードする種々の細菌種由来の遺伝子等のいずれの遺伝子およびそれにコードされるいずれのタンパク質にも準用できる。
【００７６】
細菌の科、属、種、あるいは株間でDNA配列に相違があり得る。従って、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号1で示される遺伝子に限定されず、配列番号1の変異体塩基配列あるいは配列番号1に相同な遺伝子であって、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質の変異体をコードする遺伝子であってもよい。
【００７７】
「変異体タンパク質」とは、配列番号2に示すアミノ酸配列と比較して、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加のいずれであるにせよ、1つまたはそれ以上の変異を配列中に有するタンパク質であって、本明細書に記載のL-threonine 3-dehydrogenaseの活性を維持しているか、タンパク質の三次元構造が例えば配列番号2に示すアミノ酸配列を有する野生型TDHタンパク質等の非改変タンパク質に対して有意には変更されていないタンパク質を意味し得る。変異体タンパク質中の変異の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置あるいはアミノ酸残基の種類による。変異体タンパク質中の変更の数は、厳密に限定されるものではないが、配列番号2において1〜50、別の例では1〜30、別の例では1〜15、別の例では1〜10、あるいは別の例では1〜5であってよい。これは、アミノ酸が互いに高い相同性を有し、そのような変異によってもタンパク質の活性が影響されないか、タンパク質の三次元構造が例えば野生型タンパク質等の非改変タンパク質と比較して有意に変化しないために可能である。従って、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異体塩基配列によってコードされるタンパク質変異体は、タンパク質のL-threonine 3-dehydrogenase活性が維持されるか、タンパク質の三次元構造が例えば野生型タンパク質等の非改変タンパク質に対して有意に変更されない限り、配列番号2のアミノ酸配列全体に対して60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、あるいは99%以上の、コンピュータプログラムBLASTを使用する際のパラメーター「同一性」として定義される、相同性を有するものであってよい。
【００７８】
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例としては、保存的変異が挙げられる。保存的変異の代表的なものは保存的置換であり得る。保存的置換は、限定するものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ala、Leu、Ile、Val間で、置換部位が親水性アミノ酸である場合にはGlu、Asp、Gln、Asn、Ser、His、Thr間で、置換部位が極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合にはLys、Arg、His間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、置換部位がヒドロキシル基を有するアミノ酸である場合には、Ser、Thr間で、互いに置換する置換である。保存的置換の例としては、AlaからSerまたはThrへの置換、ArgからGln、HisまたはLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、HisまたはAspへの置換、AspからAsn、GluまたはGlnへの置換、CysからSerまたはAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、AspまたはArgへの置換、GluからAsn、Gln、LysまたはAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、ArgまたはTyrへの置換、IleからLeu、Met、ValまたはPheへの置換、Leuから
Ile、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、MetからIle、Leu、ValまたはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、SerからThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへの置換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、及びValからMet、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。
【００７９】
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例としては、非保存的変異も挙げられるが、ただし、その変異は、アミノ酸配列の異なる位置の1つまたはそれ以上の二次的な変異により、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質が維持されるか、あるいはタンパク質の三次元構造が例えば野生型タンパク質等の非改変タンパク質に対して有意に変更されないように、補償されるものである。
【００８０】
タンパク質またはDNAの相同性の程度を評価するためには、いくつかの計算方法、例えばBLAST検索、FASTA検索、及びClustalW法を使用することができる。BLAST（Basic Local
Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）検索は、プログラムblastp、blastn、blastx、megablast、tblastn、及びtblastxにより使用される発見的探索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin S.及びAltschul S.F.の統計学的方法 （“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features
by using general scoring schemes” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）を使用して、有意性を発見物に帰着させるものである。コンピュータプログラムBLASTは3つのパラメーター、すなわち、スコア、同一性、及び類似性、を計算する。FASTA検索法は、Pearson W.R.により記載されている（“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98）。ClustalW法は、Thompson J.D. et al.によって記載されている（“CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680）。
【００８１】
また、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、変異体塩基配列であってよい。「変異体塩基配列」とは、標準遺伝子暗号表（例えばLewin B., “Genes VIII”, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458を参照）による任意の同義のアミノ酸コドンを使用して変異体タンパク質をコードする塩基配列を意味し得る。従って、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝暗号の縮重による変異体塩基配列であり得る。
【００８２】
また、「変異体塩基配列」とは、限定するものではないが、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号1に示す配列に相補的な塩基配列と、または該塩基配列から調製し得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列も意味し得る。「ストリンジェントな条件」としては、特異的なハイブリッド、例えばコンピュータプログラムBLASTを使用する場合のパラメーター「同一性」として定義される相同性が60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、あるいは99%以上のハイブリッド、が形成され、非特異的なハイブリッド、例えば上記より相同性が低いハイブリッド、が形成されない条件が挙げられる。ストリンジェントな条件としては、例えば、1×SSC（標準クエン酸ナトリウムまたは標準塩化ナトリウム）の塩濃度で、0.1% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の塩濃度で60℃において、0.1×SSC、0.1% SDSの塩濃度で60℃において、または0.1×SSC、0.1% SDSの塩濃度で65℃において、１回以上、別の例においては２または３回洗浄する条件が挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用されたメンブレンの種類に依存し、一般的には製造者により推奨されるものとすべきである。例えば、Amersham HybondTM-N+
正荷電ナイロンメンブレン（GE Healthcare）のストリンジェントな条件下での推奨洗浄時間は15分である。洗浄工程は２または３回行うことができる。プローブとしては、配列番号1に示す配列に相補的な配列の一部を使用してもよい。そのようなプローブは、配列番号1に示す配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、該塩基配列を含むDNA断片を鋳型として使用するPCR（polymerase chain reaction; White
T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189を参照のこと）によって調製することができる。プローブの長さは、50 bpを超えることが推奨されるが、ハイブリゼーション条件により適切に選択することができ、通常100 bp 〜1
kbpである。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、例えば、50℃、60℃、あるいは65℃における2×SSC、0.1%SDSであり得る。
【００８３】
L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードするE. coli種由来の遺伝子は既に解明されている（上記参照）ので、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする腸内細菌科に属する他の細菌種由来の遺伝子およびL-threonine 3-dehydrogenase活性を有する変異体タンパク質をコードする遺伝子は、腸内細菌科の細菌と同細菌由来のtdh遺伝子の塩基配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプライマーを利用するPCR、野生型tdh遺伝子を含むDNAをin vitroで例えばヒドロキシルアミンで処理することによる部位特異的突然変異法、または微生物（例えば野生型tdh遺伝子を保持する腸内細菌科に属する細菌）を紫外線（UV）照射もしくはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）及び亜硝酸のような突然変異誘発に通常使用される変異剤で処理する方法により得ることができ、また、完全長の遺伝子構造物として化学合成することができる。L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質またはその変異体タンパク質をコードする他の細菌種からの遺伝子も同様にして得ることができる。
【００８４】
本明細書で遺伝子（例えば、「野生型遺伝子」）およびタンパク質（例えば、「野生型タンパク質」）について用いられる「野生型（“wild-type）」（これは「生来の（native）」および「天然の（natural）」と同等であり得る）とは、それぞれ、野生型細菌、例えば、C. glutamicum ATCC13032株等のコリネ型細菌の野生株またはE. coli MG1655株 (ATCC 47076)、E. coli W3110株 (ATCC 27325)、P. ananatis AJ13355株 (FERM BP-6614)等の腸内細菌科の細菌の野生株、に存在し、且つ／又は天然に発現し、且つ／又は生産される生来の遺伝子および生来のタンパク質を意味し得る。タンパク質は遺伝子にコードされるので、「野生型タンパク質」は、野生型細菌のゲノムに天然に生じる「野生型遺伝子」によりコードされ得る。
【００８５】
例えば細菌種等の特定の種に由来するタンパク質または核酸に関する「由来する（native to）」とは、その種に由来するタンパク質または核酸を意味し得る。すなわち、特定の種に由来するタンパク質または核酸は、それぞれ、その種に天然に存在し、且つ当業者に公知の方法でその種から単離し配列解析できるタンパク質または核酸を意味し得る。また、タンパク質または核酸が存在する種から単離されたタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列は、それぞれ、容易に決定できるから、タンパク質または核酸に関する「由来する（native to）」とは、例えば、組み換えＤＮＡ技術等の遺伝子工学技術または化学合成法により得られるタンパク質または核酸も、よって、そのようにして得られるタンパク質のアミノ酸配列または核酸の塩基配列がその種に天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列または核酸の塩基配列と同一である限り、意味し得る。特定の種に由来するタンパク質としては、限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド（タンパク質、特に酵素、を含む）等が挙げられる。特定の種に由来する核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられ、それらは、制御配列（プロモーター、アテニュアーター、ターミネーター等を含む）、遺伝子、遺伝子間配列、シグナルペプチド、タンパク質のプロ部位、および人工アミノ酸配列等をコードする
配列には限定されない。種由来のアミノ酸配列および塩基配列ならびにそれらのホモログの具体例は本明細書に記載されており、配列番号1および3に示す塩基配列を有する対応する遺伝子にコードされる、配列番号2および4に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するE. coli種の細菌由来のTDHおよびKBLが挙げられる。
【００８６】
細菌は、上記のような性質に加えて、様々な栄養要求性、薬物耐性、薬物感受性、薬物依存性等の特定の性質を有することができる。
【００８７】
２．方法
本明細書に記載の細菌を使用するグリシンまたはその塩を製造する方法は、細菌を培地で培養（cultivating； culturingともいう）してグリシンまたはその塩を培地もしくは菌体、またはその両者中に生成させ、排出もしくは分泌させ、且つ／又は蓄積させる工程と、培地及び／又は菌体からグリシンまたはその塩を回収する工程を含む。この方法は、任意で、培地及び／又は菌体からグリシンまたはその塩を精製する工程を含んでいてよい。グリシンは、遊離の形態もしくはその塩、またはそれらの混合物として生産されてよい。例えば、グリシンのナトリウム、カリウム、アンモニウム等の塩、または両性イオン等の内部塩を、前記方法により製造することができる。これは、アミノ酸が発酵条件下で、互いに、あるいは無機または有機の酸またはアルカリ性物質等の中和剤と、典型的な酸塩基中和反応により反応して塩を生成することができることから可能であり、これは当業者に明らかなアミノ酸の化学的特徴である。
【００８８】
細菌の培養、及び培地等からのグリシンまたはその塩の回収及び精製は、微生物を使用してグリシンまたはその塩を製造する従来の発酵法と同様の方法で行うことができる。培地は、炭素源、窒素源、硫黄源、リン源、無機イオン、並びにその他の有機及び無機成分を必要に応じて含む典型的な培地等の、合成培地あるいは天然培地でよい。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、澱粉加水分解物などの糖類、エタノール、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどのアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸などの有機酸、および脂肪酸などを使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、およびアンモニア水などを使用することができる。さらに、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、およびコーンスティープリカーなども使用することができる。培地は、これらの窒素源の1種またはそれ以上を含むことができる。硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンなどが挙げられる。培地は、炭素源、窒素源、及び硫黄源に加えて、リン源を含んでもよい。リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、ピロ燐酸などのリン酸ポリマーなどを使用することができる。ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチンアミド、ビタミンB12などのビタミンや、その他の必要物質、例えばアデニン、RNAなどの核酸、アミノ酸、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキスなどの有機栄養素などを、適当量（痕跡量であってもよい）存在させることができる。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオンなどを加えてもよい。
【００８９】
培養は、グリシンまたはその塩を製造する方法に用いるために選択した細菌の培養に適した条件で実施できる。例えば、コリネ型細菌を培養する場合、培養は好気的条件下で24〜96時間実施でき、温度は24〜42℃に維持することができ、pHは5〜9に維持することがでる。腸内細菌科に属する細菌（例えばEscherichia属に属する細菌等）を培養する場合、培養は好気的条件下で16〜72時間または32〜48時間実施でき、培養中の培養温度は30〜45℃または30〜37℃に制御することができ、pHは5〜8または6〜7.5に調節することができる。pHは、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等の、無機もしくは有機の酸またはアル
カリ性物質により調節することができる。
【００９０】
培養後、細胞をこの分野に公知の方法、例えば高周波音波を用いた超音波溶解等、で破砕することができ、例えば遠心分離や膜ろ過によって細胞及び細胞破砕懸濁物（細胞デブリともいう）等の固体を除去して取得した上清からグリシンまたはその塩を回収することができ、その後、グリシンまたはその塩を、例えば濃縮、晶析、イオン交換クロマトグラフィー、中圧または高圧液体クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせ等の慣用の技術により発酵液から回収することができる。
【実施例】
【００９１】
以下、下記の非限定的な実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００９２】
実施例１  L-threonineを添加した培地で培養したC. glutamicum株を用いたグリシンの生産
１．１  DNA断片<KBL>および<TDH>のデザインと合成
C. glutamicum株の構築に用いたDNA断片<KBL>および<TDH>の構造を図１に示す。DNA断片は、kblおよびtdh遺伝子の制御部位としてのプロモーターと、それらの遺伝子の構造部位を含む。DNA断片は、化学合成した（ATG Service Gene; Russian Federation, St. Petersburg, www.service-gene.spb.ru）。
【００９３】
配列番号5に示す塩基配列を有するDNA断片<KBL>は、以下を含む：
i)  rplK遺伝子のプロモーター（図１Ａ中、PrplKと示す）。プロモーターPrplKの塩基配列は、C. glutamicum R株の完全ゲノム配列（GenBank, accession No. AP009044.1）の638849〜639029の塩基に相当する；
ii)  配列番号3に示す塩基配列を有する、E. coli K-12株substr. MG1655由来のkbl遺伝子の構造部位。
【００９４】
配列番号6に示す塩基配列を有するDNA断片<TDH>は、以下を含む：
i)  gapA遺伝子のプロモーター（図１Ｂ中、PgapAと示す）。プロモーターPgapAの塩基配列は、C. glutamicum R株の完全ゲノム配列（上記参照）の1822219〜1821813の塩基に相当する；
ii)  配列番号1に示す塩基配列を有する、E. coli K-12株substr. MG1655由来のtdh遺伝子の構造部位。
【００９５】
１．２  C. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株の構築
pPK4-kbl-tdhプラスミドの構築手順を図２に示す。全ての酵素と手順はFermentas（Thermo Fisher Scientific）から取得した。pPK4-kbl-tdhプラスミドの構築のため、DNA断片<KBL>および<TDH>をそれぞれ制限酵素NheIとXbaIまたはSalIで消化し、制限酵素XbaIとNheIで消化したC. glutamicum/E. coliシャトルベクターpPK4（US6,090,597 A）にT4 DNA ligaseを用いてライゲーションした。E. coli JM109株（Promega, cat. No. P9751）をライゲーション後の混合物で形質転換した。取得したpPK4-kbl-tdhプラスミド（図３）は５〜２０個のランダムに選択したカナマイシン耐性（KnR）コロニーから単離したプラスミドから選抜した。プラスミドの構造は、制限解析と配列解析により確認した。その結果、C. glutamicum ATCC13032/pPK4-kbl-tdh株が構築された。対照株として、ベクターpPK4を保持するC. glutamicum ATCC13032/pPK4株を同一の手順で構築した。
【００９６】
１．３  C. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株の培養
１．３．１  MM*培地
以下のストック溶液を用いた：
A - Thiamine hydrochloride, 水溶液, 1.6 g/L;
B - Biotin, 水溶液, 1 g/L;
C - D,L-Methionine, 水溶液, 15 g/L;
D - Glucose, 1 N HCl溶液, 40% (w/v), 滅菌;
E - MgSO4, 水溶液, 1 M;
F - Kanamycin, 水溶液 (100 g/L)。
【００９７】
以下を用いて成分１を調製した：
(NH4)2SO4 - 3 g;
KH2PO4 - 0.3 g;
Yeast extract - 0.2 g;
FeSO4x7H2O - 30 mg;
MnSO4x7H2O - 30 mg;
L-Threonine - 27.8 g。
【００９８】
成分１の全成分を混合し、電子レンジで加熱しながら170 mLの水に溶解した。KOHで最終ｐＨを７に調整した。得られた溶液をオートクレーブ滅菌した。
【００９９】
MM*培地を調製するため、滅菌した170 mLの成分１にストック溶液A〜F（上記参照）: A, 90 μL; B, 90 μL; C, 2 mL; D, 10 mL; E, 10 mL; F, 200 μLを添加した。白亜（5 g）を添加し、滅菌水で最終容量を200 mLに調整した。
【０１００】
１．３．２  培養条件
2YT寒天プレート（2YT-broth with bacteriological agar-agar (American type, 1.6%
(w/w), Dia-m, Russian Federation, cat. No. 212303.0500f), kanamycin (50 mg/L)）で生育させたC. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株の菌体を、グルコース（1 g/L）とカナマイシン（50 mg/L）を添加した4 mLの2YT-broth（Thermo Fisher Scientific, cat. No. 22712020）にそれぞれ植菌し、３０℃で約６時間培養した。細胞培養物500 μLを4 mLのMM*培地にそれぞれ植菌し、50 mL試験管内で激しく振盪（250 rpm）しながら３０℃で９６時間培養した。
【０１０１】
１．３．３  グリシンおよびバイオマス蓄積に関する培養液の解析
実施例１．３．２で得られた培養液を入れた試験管に水40 mLを添加し、試験管を激しく振盪して懸濁液を得た。培養液中に蓄積したグリシンをTLC解析で決定した。懸濁液100
μLを水900 μLと混合して激しく振盪し、非溶解物を沈殿により除去した。得られた各溶液1 μLをシリカゲルプレートにアプライし、プレートをacetone : isopropanol : ammonia (25%) : H2O ＝ 50 : 50 : 24 : 16 (v/v)の混合物で展開した。
【０１０２】
培養液中に蓄積したバイオマス量をOD600で決定した。得られた上記懸濁液100 μLをそれぞれ900 μLの1.2 N HClと混合し、水に対する吸光度を600 nmで測定した。
【０１０３】
１．４  結果
L-threonineを添加した培地におけるC. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株の試験管発酵の結果を表１に示す。表１から分かるように、1.2 mM L-threonineを添加した培地で培養した改変株C. glutamicum ATCC13032/pPK4-kbl-tdhは、培養液中にグリシンを0.74 mM (収率62%)の量で蓄積した。親株C. glutamicum ATCC13032/pPK4は、培養液中にグリシンを蓄積できなかった。
【０１０４】
実施例２  L-threonineを添加しない培地で培養したC. glutamicum株を用いたグリシンの生産
２．１  MM1培地
以下のストック溶液を用いた：
NH4Cl (40 g/L), KH2PO4(10 g/L), およびK2HPO4 (30 g/L)を含有する10 x SS (salts solution);
FeSO4x7H2O (1 g), MnSO4x7H2O (1 g), ZnSO4x7H2O (0.1 g), CoCl2x6H2O (0.02 g), CuSO4 (0.02 g), およびNiSO4x6H2O (0.002 g) （100 mL中）を含有するTES (trace elements solution);
a) - FeSO4x7H2O, 0.1 N HCl溶液, 1% (w/v);
b) - MnSO4x7H2O, 水溶液, 1% (w/v);
c) - MgSO4, 水溶液, 1 M; 
d) - CaCl2, 水溶液, 1 M;
e) - Urea (Sigma), 水溶液, 400 g/L;
f) - Glucose, 1 N HCl溶液, 40% (w/v), sterile;
g) - Vitamin B1, 水溶液, 1.6 g/L;
h) - Vitamin B3, 水溶液, 1.6 g/L;
i) - Biotin, 70% (v/v) EtOH溶液, 1 g/L;
j) - Kanamycin, 水溶液, 100 g/L。
【０１０５】
10 x SS, TES, a), b), c), およびd)のストック溶液をオートクレーブ滅菌した。e), h), i), およびj)のストック溶液を0.22 μmメンブレンで濾過滅菌した。
【０１０６】
50 mLのMM1培地を調製するため、以下の成分を混合した：10 x SS, 5 mL; TES, 50 μL; a), 50 μL; b), 10 μL; c), 250 μL; d), 10 μL; e), 250 μL; f), 1.25 mL; g),
50 μL; h), 50 μL; i), 5 μL; j), 100 μL; 水を最終容量50 mLまで。
【０１０７】
２．２  培養条件
2YT寒天プレートで生育させたC. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株（実施例１．２）の菌体を、グルコース（1 g/L）とカナマイシン（50 mg/L）を添加した4 mLの2YT-brothにそれぞれ植菌し、３０℃で約６時間培養した。細胞培養物500 μLを4 mLのMM1培地にそれぞれ植菌し、50 mL試験管内で激しく振盪（250 rpm）しながら３０℃で２４時間培養した。培養液中に蓄積したグリシンを決められたＨＰＬＣ分析で決定した。
【０１０８】
２．３  結果
L-threonineを添加しない培地におけるC. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株の試験管発酵の結果を表２に示す。表２から分かるように、L-threonineを添加しない培地で培養した改変株C. glutamicum ATCC13032/pPK4-kbl-tdhは、培養液中にグリシンを蓄積した。親株C. glutamicum ATCC13032/pPK4は、培養液中にグリシンを蓄積できなかった。
【０１０９】
実施例３  L-threonineを添加した培地で培養したE. coli株を用いたグリシンの生産
３．１  E. coli MG1655/pET15(b+)株およびMG1655/pEL-kbl-tdh株の構築
E. coli MG1655の染色体を鋳型として、プライマーＰ１（配列番号７）とＰ２（配列番号８）を用いてE. coli MG1655株（ATCC 47076）の染色体のDNA断片を増幅した。得られたDNA断片（2277 bp）を制限酵素BamHIおよびNotIで消化し、pEL-IDO(Lys, 23)プラスミド（WO2009082029 A1）を同制限酵素で消化して得たベクターにクローニングした。その結果、E. coli MG1655由来の<kbl-tdh>オペロンが、多コピーベクター上のPlacUV5プロモーターの制御下に配置された（図４）。よって、E. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株が構築された。対照株として、pET-15(b+)ベクター（Novagen, Germany）を導入してE. coli MG1655株を構築した。
【０１１０】
３．２  E. coli MG1655/pET15(b+)株およびMG1655/pEL-kbl-tdh株の培養
Luria-Bertani（LB）寒天プレート（LB-broth Powder (Thermo Fisher Scientific, cat. No. 12780029), bacteriological agar-agar (American type, 1.6% (w/w)), kanamycin (50 mg/L)）で生育させたE. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株およびMG1655/pET15(b+)株（実施例３．１）の菌体を、グルコース（1 g/L）とカナマイシン（100 mg/L）を添加した4
mLの2YT-brothにそれぞれ植菌し、３７℃で約６時間培養した。細胞培養物40 μLをグルコース（4 g/L）とL-threonine（100 mM）を添加した4 mLのM9-salts培地（Sigma, M6030）にそれぞれ植菌し、50 mL試験管内で激しく振盪（250 rpm）しながら３７℃で４８時間培養した。培養液中に蓄積したグリシンを決められたＨＰＬＣ分析で決定した。
【０１１１】
３．３  結果
L-threonineを添加した培地におけるE. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株およびMG1655/pET15(b+)株の試験管発酵の結果を表３に示す。表３から分かるように、100 mM L-threonineを添加した培地で培養した改変株E. coli MG1655/pEL-kbl-tdhは、培養液中にグリシンを26 mM (収率26%)の量で蓄積した。非改変株E. coli MG1655/pET15(b+)は、培養液中にグリシンを蓄積できなかった。
【０１１２】
実施例４  L-threonineを添加しない培地で培養したE. coli株を用いたグリシンの生産
４．１  MM2培地
以下のストック溶液を用いた：
NH4Cl (40 g/L), KH2PO4 (10 g/L), およびK2HPO4 (30 g/L)を含有する10 x SS (salts solution);
A’ - FeSO4x7H2O, 0.1 N HCl溶液, 1% (w/v);
B’ - MnSO4x7H2O, 水溶液, 1% (w/v);
C’ - MgSO4, 水溶液, 1 M; 
D’ - CaCl2, 水溶液, 1 M;
E‘ - Glucose, 1 N HCl溶液, 40% (w/v), sterile;
F’ - Vitamin B1, 水溶液, 1.6 g/L;
G’ - Biotin, 70% (v/v) EtOH溶液, 1 g/L;
H’ - Kanamycin, 水溶液, 50 g/L;
I’ - 2-YT培養溶液;
J’ - L-Threonine, 水溶液, 1 M。
【０１１３】
10 x SS, A’, B’, C’, およびD’のストック溶液をオートクレーブ滅菌した。E’, F’, G’, H’, およびJ’のストック溶液を0.22 μmメンブレンで濾過滅菌した。
【０１１４】
50 mLのMM2培地を調製するため、以下の成分を混合した：10 x SS, 5 mL; A’, 50 μL; B’, 10 μL; C’, 250 μL; D’, 10 μL; E’, 1.25 mL; F’, 80 μL; G’, 5 μL;
H’, 100 μL; I’, 2.5 mL; J’, 5 mL; 水を最終容量50 mLまで。
【０１１５】
４．２  培養条件
2YT寒天プレートで生育させたE. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株およびMG1655/pET15(b+)株（実施例３．１）の菌体を、グルコース（1 g/L）とカナマイシン（50 mg/L）を添加した4 mLの2YT-brothにそれぞれ植菌し、３７℃で約６時間培養した。細胞培養物40 μLをMM2培地にそれぞれ植菌し、50 mL試験管内で激しく振盪（250 rpm）しながら３７℃で４８時間培養した。培養液中に蓄積したグリシンを決められたＨＰＬＣ分析で決定した。
【０１１６】
４．３  結果
L-threonineを添加しない培地におけるE. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株およびMG1655/pET15(b+)株の試験管発酵の結果を表４に示す。表４から分かるように、L-threonineを添加
しない培地で培養した改変株E. coli MG1655/pEL-kbl-tdhは、培養液中にグリシンを蓄積した。非改変株E. coli MG1655/pET15(b+)は、培養液中にグリシンを蓄積できなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明の方法は、グリシンを細菌の発酵で製造するのに有用である。
【０１１８】
本発明をその好ましい態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更や等価物の採用が可能であることは当業者に明らかであろう。
【０１１９】
【表１】
2021506331.tif 000002
【０１２０】
【表２】
2021506331.tif 000003
【０１２１】
【表３】
2021506331.tif 000004
【０１２２】
【表４】
2021506331.tif 000005
【図１】
2021506331.tif 000006
【図２】
2021506331.tif 000007
【図３】
2021506331.tif 000008
【図４】
2021506331.tif 000009
【国際調査報告】
2021506331.tif 000010
2021506331.tif 000011