(57)【要約】本発明は、細胞を組織エフェクター細胞に変換して、細胞療法で使用するのに適した活性化誘導組織エフェクター細胞（例えば、特定の組織タイプ向けの細胞療法に適した活性化特化組織エフェクター細胞（ＡＳＴＥＣ））を産生するように、強力でないまたは十分に強力でない細胞の活性化を誘導する方法を提供する。本発明はさらに、それによって産生された活性化誘導組織エフェクター細胞と、当該エフェクター細胞（例えば、ＡＳＴＥＸ）に由来する細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を提供する。本発明はさらに、強力でないまたは十分に強力でない細胞を、細胞療法に適した効力が増加した活性化誘導組織エフェクター細胞に変換することにより、細胞療法の有効性を改善する方法を提供する。本発明はさらに、それを必要とする対象における細胞療法に適用可能な疾患または状態を治療するための方法であって、活性化誘導組織エフェクター細胞または当該エフェクター細胞に由来する細胞外小胞の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞療法で使用するのに適した哺乳類細胞の治療効力を増加させる方法であって、前記哺乳類細胞を十分に強力な組織エフェクター細胞に変換して活性化誘導組織エフェクター細胞（ＡＩＴＥＣ）を産生する程度まで、前記細胞の目的転写因子の発現レベルを増加させる外因的な作用物質に、前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
細胞療法で使用するのに適した、強力でないまたは十分に強力でない哺乳類細胞の活性化を誘導する方法であって、前記強力でない細胞を十分に強力な組織エフェクター細胞に変換してＡＩＴＥＣを産生する程度まで、前記細胞の目的転写因子のレベルを増加させる外因的な作用物質を、前記強力でない細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項３】
細胞療法で使用するのに適した、強力でないまたは十分に強力でない哺乳類細胞の活性化を誘導する方法であって、前記強力でない細胞を十分に強力な組織エフェクター細胞に変換してＡＩＴＥＣを産生する程度まで、前記細胞の目的転写因子のレベルを外因的に増加させるステップを含む、方法。
【請求項４】
前記ＡＩＴＥＣを細胞療法での使用に選択するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＩＴＥＣを細胞療法での使用に選択する前記ステップが、遺伝子送達システム内に選択遺伝子を含めることと、前記細胞を抗生物質で処置することと、前記遺伝子送達システムの送達を首尾よく達成しない細胞を間引くこととによって実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的転写因子がβ−カテニンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト細胞が、強力でないカルディオスフィア由来細胞（ＣＤＣ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤＣが不死化ＣＤＣである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記不死化ＣＤＣが、
（ａ）  ＳＶ４０のスモールＴ抗原及びラージＴ抗原をＣＤＣの培養液中で過剰発現させるステップと、
（ｂ）  少なくとも１５回の倍増を継続することができるＣＤＣ培養液を選択するステップと、を含む方法によって産生される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記不死化ＣＤＣが、
（ａ）  ＣＤＣの培養液中でｃ−Ｍｙｃを過剰発現させるステップと、
（ｂ）  少なくとも１５回の倍増を継続することができるＣＤＣ培養液を選択するステップと、を含む方法によって産生される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類細胞が、フィブロネクチンコーティング培養容器で平板培養される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳類細胞における別の目的転写因子のレベルを増加させるステップをさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記別の目的転写因子がＧＡＴＡ４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＩＴＥＣが、心臓損傷後の心臓回復を改善可能である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記心臓損傷が心筋梗塞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＩＴＥＣが、左室駆出分画の増加による測定において、心筋梗塞後の心臓回復を改善可能である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
強力でない細胞のβ−カテニンのレベルが、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、Ｗｎｔ３ａ、またはＣＨＩＲを前記哺乳類細胞に投与することによって増加する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって産生される、ＡＩＴＥＣ。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって産生されたＡＩＴＥＣに由来する細胞外小胞の治療有効量を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
前記細胞外小胞がエクソソームである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
それを必要とする対象における疾患または状態を治療するための方法であって、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法によって産生されたＡＩＴＥＣの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
強力でない細胞を効力が増加したＡＩＴＥＣに変換することにより、細胞療法の有効性を改善し、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法によって産生されたＡＩＴＥＣを標的細胞に投与することにより、疾患または状態を治療するための細胞療法を必要とする対象を治療する、方法。
【請求項２４】
ＡＩＴＥＣの前記投与が、前記標的細胞におけるβ−カテニン／Ｗｎｔ経路の活性化を誘導する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＡＩＴＥＣの前記投与が、抗炎症、再生、線維化の減弱、及び血管新生のうちの少なくとも一つを含めたより遠位の経路の活性化を誘導する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＷＯ２００６／０５２９２５（表題「ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」）及びＵＳ２０１２／０３１５２５２（表題「ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｅｒａｔｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ」）は、カルディオスフィア由来細胞（ＣＤＣ）と、それらのカルディオスフィアからの誘導と、哺乳類の損傷または罹患した心臓の機能を増加させることにおけるそれらの治療的有用性とについて説明している。ＷＯ２００５／０１２５１０（表題「ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｐｓｙ」）は、カルディオスフィアと、心臓組織生検試料からのそれらの誘導と、心筋の細胞移植及び機能的修復におけるそれらの治療的有用性とについて説明している。ＷＯ２０１４／０２８４９３（表題「ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」）は、ＣＤＣに由来するエクソソームと、損傷または罹患した心臓組織の修復または再生におけるそれらの有用性とについて説明している。ＷＯ２０１４／０６６５４５（表題「ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」）は、ＣＤ９０を発現する細胞のサブ集団が除去されたＣＤＣ、すなわち、ＣＤ９０枯渇ＣＤＣが、損傷または罹患した心臓組織を治療する効力を増加させたことを説明している。
【０００２】
しかし、何がＣＤ９０枯渇ＣＤＣの細胞効力増加を駆動するのかについては依然として不明であり、したがって、現在の最新技術は、細胞効力の増加を期待してＣＤ９０枯渇ＣＤＣを使用することに限定されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、ある特定の強力でないまたは十分に強力でない細胞のβ−カテニンのレベルを外因的に増加させることにより、このような細胞が活性化し組織エフェクター細胞に変換されて、細胞療法で使用するのに適した活性化誘導組織エフェクター細胞を産生するように誘導されるという、本発明者らによる驚くべき発見に基づいている。本発明者らはさらに、ある特定の強力でないまたは十分に強力でない細胞が、例えば、心臓組織の疾患または状態を治療するために、特定の組織系統向けの細胞療法で使用するのに適した活性化特化組織エフェクター細胞（ＡＳＴＥＣ：ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）となるためには、β−カテニンレベルを外因的に増加させることに加えて、一つ以上のさらなる目的転写因子レベル（例えば、ＧＡＴＡ４）を外因的に増加させる必要があることを発見した。したがって、本明細書で説明される本発明は、ＡＳＴＥＣ及びＡＳＴＥＣ（ＡＳＴＥＸ）に由来する細胞外小胞を調製し、患者における特定の組織または臓器の特定の疾患または障害を治療するように構成された画期的な細胞療法モダリティーを提供する。
【０００４】
本発明の第一の態様は、細胞または細胞集団の治療効力を増加させる方法であって、細胞または細胞集団の転写因子β−カテニンの細胞レベルを増加またはブーストして活性化誘導組織エフェクター細胞または活性化誘導組織エフェクター細胞の特定の集団を産生するための外因的な作用物質に、細胞または細胞集団を接触させるステップを含む、方法を提供する。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞であり、細胞集団は、哺乳類細胞集団、より好ましくはヒト細胞集団である。細胞集団の非限定的な例としては、カルディオスフィア、ＣＤＣ、ＵＳ２０１２／０３１５２５２で説明されているような外植片由来細胞（ＥＤＣ）、イモリＡ１細胞、線維芽細胞（例えば、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ））、その他の間質細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、周皮細胞、及び筋サテライト細胞）が挙げられる。細胞または細胞集団のβ−カテニンのレベルを増加する作用物質の非限定的な例としては、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）の阻害物質、Ｗｎｔシグナリング経路の活性化物質、例えば、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、Ｗｎｔ３ａ、及びＣＨＩＲ（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）が挙げられる。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、細胞または細胞集団の転写因子β−カテニンの細胞レベルを増加させて、例えば、Ｔ細胞極性、神経抑制、組織再生、抗癌、抗加齢、軸索再ミエリン化、マクロファージ極性、血管新生、及び心臓ペーシングに関して治療効果を有するＡＳＴＥＣまたは特定のＡＳＴＥＣ集団を産生するための外因的な作用物質を、細胞または細胞集団に接触させるステップの前または後に、一つ以上のさらなる転写因子のレベルを増加させる一つ以上のさらなる外因的な作用物質に、細胞または細胞集団を接触させるステップを含む。当該さらなる転写因子の非限定的な例としては、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、Ａｓｃｌ１、Ｐｔｆ１ａ、Ｐａｘ６、ＭＣＰＩＰ、ＰＰＡＲｙ、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ１０、Ｈｅｙ１／２、中胚葉特異的転写物（ｍｅｓｔ）、及びＴｂｘ１８が挙げられる。例えば、哺乳類細胞は、最初に、細胞のβ−カテニンレベルを増加させるための外因的な作用物質に接触させ、次いで、細胞のＧＡＴＡ４レベルを増加させるための別の外因的な作用物質と接触させ、代替的に、哺乳類細胞は、最初に、細胞のＧＡＴＡ４レベルを増加させるための外因的な作用物質と接触させ、次いで、細胞のβ−カテニンレベルを増加させるための外因的な作用物質と接触させて、心臓組織の疾患または障害を治療するのに適したＡＳＴＥＣを産生する。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、得られた活性化誘導組織エフェクター細胞を細胞療法で使用するために選択するステップを含む。いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団は、強力でない、ボーダーライン程度に強力な、わずかに強力な、または十分に強力でないが、活性化誘導組織エフェクター細胞または活性化誘導組織エフェクター細胞の特定の集団に変換すれば十分な効力を獲得する。いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団は、���に強力であるが、活性化誘導組織エフェクター細胞または活性化誘導組織エフェクター細胞の特定の集団に変換すればさらにあらゆる強力な効力を獲得する。いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団は、不死化細胞または不死化細胞集団である。例えば、不死化ＣＤＣは、シミアンウイルス４０及びスモールＴ抗原（ＳＶ４０  Ｔ＋ｔ）、またはｃ−ＭｙｃをＣＤＣの培養液中で過剰発現させ、例えば、少なくとも１０回、または好ましくは少なくとも１５回の倍増を継続することができるＣＤＣ培養液を選択することによって産生される。いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団は、フィブロネクチンコーティング培養容器上で平板培養する。
【０００５】
本発明の第二の態様は、心臓の疾患または障害を治療するのに適している、β−カテニン及びＧＡＴＡ４のレベルが増加した活性化誘導組織エフェクター細胞または活性化誘導組織エフェクター細胞の特定の集団（例えば、不死化ＣＤＣまたはＮＨＤＦ）を提供し、このような細胞または細胞集団は、本発明の第一の態様に従う方法によって調製される。
【０００６】
本発明の第三の態様は、活性化誘導組織エフェクター細胞に由来する細胞外小胞を提供し、このとき活性化誘導組織エフェクター細胞は、本発明の第一または第二の態様に従う方法によって調製される。例えば、不死化ＣＤＣまたはＮＨＤＦは、本発明の第一または第二の態様に従う方法でβ−カテニン及びＧＡＴＡ４のレベルを増加させることによってＡＳＴＥＣに変換され、そのＡＳＴＥＣから細胞外小胞が採取される。一部の実施形態において、細胞外小胞は、無血清及び／または低酸素条件下で採取される。活性化誘導組織エフェクター細胞に由来する細胞外小胞の非限定的な例としては、主にエクソソーム及び微小胞が挙げられ、また、膜粒子、膜小胞、エクソソーム様小胞、エクトソーム、エクトソーム様小胞、エクソベシクル、エピディディモソーム、プロミニノソーム、プロスタソーム、テクソソーム、アルケオソーム、及びオンコソームも挙げられる。
【０００７】
本発明の第四の態様は、本発明の第一または第二の態様に従う方法によって調製された活性化誘導組織エフェクター細胞及び／または本発明の第三の態様に従う活性化誘導組織エフェクター細胞に由来する細胞外小胞の治療有効量を含む、医薬組成物、製剤、または調製物を提供する。
【０００８】
本発明の第五の態様は、特定の組織または臓器に関連する疾患または障害の治療を必要とする対象における、特定の組織または臓器に関連する疾患または障害を治療する方法であって、本発明の第一の態様に従う方法によって調製された活性化誘導組織エフェクター細胞、本発明の第三の態様に従う活性化誘導組織エフェクター細胞に由来する細胞外小胞、及び／または本発明の第四の態様に従う医薬組成物、製剤、もしくは調製物の治療有効量を対象に投与することを含む、方法を提供する。当該疾患または状態の非限定的な例としては、自己免疫疾患、神経障害、加齢、脊髄損傷、血管疾患、神経筋障害、癌、線維性疾患、心不整脈、心不全、心筋梗塞、ならびに原発性及び続発性悪性腫瘍が挙げられる。いくつかの実施形態において、当該投与は、皮下注射、経皮注射、皮内注射、局所投与（例えば、点眼の形態）、心筋内注射、リンパ組織内への注射、リンパ系内への注射、全身投与（例えば、経口、静脈内、非経口内（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌ））などを介する。
【０００９】
非限定的な例として、本発明に従う「強力な」または「十分に強力な」細胞とは、このような細胞が、急性心筋梗塞マウスモデルによる測定において、特定の疾患状態を明らかな程度で改善可能であることを意味する。例えば、梗塞マウスの心臓における「強力な」ＡＳＴＥＣの投与は、左室駆出分画を少なくとも２％（ΔＥＦ≧２％）、より好ましくは少なくとも４％増加させる（１日目と比較した２１日目におけるΔＥＦ≧４％の改善）と考えられる。例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｅｎｄｏｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｂｉｏｐｓｙ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００７  Ｆｅｂ  ２０；１１５（７）：８９６−９０８を参照。
【００１０】
本発明に従う「強力でない」細胞とは、このような細胞が特定の疾患状態を改善不可能であることを意味する。例えば、梗塞マウスにおける「強力でない」細胞の投与は、未処置動物と同様の駆出分画の変化（ΔＥＦ≦０％）をもたらすと考えられる。同上。
【００１１】
本発明に従う「ボーダーライン程度に強力な」または「わずかに強力な」細胞とは、このような細胞が、特定の疾患状態をいくらか改善可能であるため、本発明の方法に従う「強力な」活性化誘導組織エフェクター細胞に変換することができることを意味する。例えば、梗塞マウスにおける「ボーダーライン程度に強力な」または「わずかに強力な」細胞の投与は、左室駆出分画を最大２％増加させる（すなわち、ΔＥＦ＝０〜２％）と考えられる。同上。
【００１２】
細胞内の目的転写因子レベルを「外因的に」増加させるという用語は、細胞療法の分野において明白かつ通例的な意味を有し、すなわち、細胞の外部から生じる分子的因子の作用によって細胞内の転写因子のレベルまたは濃度を増加することを意味する。非限定的な例としては、ＧＳＫ３β、アキシン１／２、β−カテニン、及びＡＫＴ１などの一つ以上の主要な経路因子を（強化または阻害により）妨害するための小分子の使用が挙げられる。加えて、この外因的増加は、（遺伝子送達機構を通じて）転写因子の可用性を増加させる一過性または安定性の遺伝子物質の導入によって達成することもできると考えられる。非限定的な例としては、プラスミドもしくはその他の遺伝子物質またはウイルスベクターの使用による形質移入が挙げられる。これに対し、特定の目的転写因子レベルが既にまたは本来的に高いことに基づいて、様々な細胞効力レベルを有する異質な細胞集団から単に細胞または同質な細胞集団の一群を選択することは、このような目的転写因子レベルを「外因的に」増加させることにはならない。例えば、強力でないまたは十分に強力でない細胞の目的転写因子（例えば、β−カテニン）のレベルを「外因的に」増加させるとは、その細胞の目的転写因子のレベルまたは濃度が既にまたは本来的に低く、そのため、活性化誘導組織エフェクター細胞を産生するために本発明に従う方法に供される前は、その細胞が既に強力でないまたは十分に強力でないことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の一つの実施形態に従う、活性化特化組織エフェクター細胞（ＡＳＴＥＣ）を作製する方法の概略図を示している。
【図２】図２は、カノニカルＷｎｔシグナリング経路の活性化によってＣＤＣのＣＤ９０レベルが減少することを示している。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、カノニカルＷｎｔシグナリング経路の活性化により、フィブロネクチン（ＦＮ）コーティング培養容器上で平板培養した不死化ＣＤＣのＣＤ９０レベルが減少し、一方、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）（ＣＢ）コーティング培養容器上で平板培養した不死化ＣＤＣに関しては、このような効果が観察されないことを示している。
【図４】図４は、図３Ｂに示されているデータの生成に使用したＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）表面処理の化学的構造を示している。
【図５】図５は、図３に示されているデータを生成するための、Ｗｎｔ３ａを用いた不死化ＣＤＣの処置を示している。
【図６】図６は、継代数の増加によってＣＤＣのβ−カテニンレベルが減少することを示している。
【図７】図７は、図３〜６で示されている結果を概略的に示している。
【図８】図８は、ＣＤＣの不死化によってＣＤＣのβ−カテニンレベルが低減することを示している。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、ＢＩＯが初代ＣＤＣのＣＤ９０レベルを減少させ、またβ−カテニンレベルを減少させていることを示しており、これによりＣＤ９０の減少がβカテニンの増加と結び付いていることを示している。
【図９Ｂ】同上。
【図１０】図１０は、ＢＩＯ処置の効果が、ＢＩＯのウォッシュアウト後少なくとも２４時間持続することを示している。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、球体形成がβ−カテニンを上方制御することを示している。
【図１２】図１２は、ＢＩＯによるβ−カテニンの活性化、またはＪＷ６７によるβ−カテニンの不活性化により、急性心筋梗塞マウスモデルにおいて心臓回復が改善することを示している。
【図１３】図１３は、急性心筋梗塞マウスモデルにおける左室駆出分画の変化（ΔＥＦ）による測定において、β−カテニンレベルが細胞の効力の正の指標であることを示している。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び１４Ｂは、強力でないＣＤＣのβ−カテニンレベルを増加させることにより、急性心筋梗塞マウスモデルにおける治療効力が回復することを示している。
【図１４Ｂ】同上。
【図１５Ａ】図１５Ａ及び１５Ｂは、強力でないＣＤＣのβ−カテニンレベルを増加させることにより、急性心筋梗塞マウスモデルにおける治療効力が回復することを示している。
【図１５Ｂ】同上。
【図１６Ａ】図１６Ａ及び１６Ｂは、強力でない不死化ＣＤＣのβ−カテニンレベルを増加させることにより、急性心筋梗塞マウスモデルにおける治療効力が回復することを示している。
【図１６Ｂ】同上。
【図１７Ａ】図１７Ａ及び１７Ｂは、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）のβ−カテニンレベルを増加させることにより、急性心筋梗塞マウスモデルにおける治療効力が誘導されることを示している。
【図１７Ｂ】同上。
【図１８】図１８Ａは、腎皮質細胞が、腎髄質細胞または近位尿細管細胞よりも高いレベルのベースラインβ−カテニンを発現することを示している。  図１８Ｂは、ＢＩＯによって腎皮質細胞のβ−カテニンレベルがさらに増加することを示している。
【図１９】図１９は、転写因子ｍｅｓｔの下方制御と対にしたＳＶラージＴ及びスモールＴ抗原（Ｔ＋ｔ）の安定性の形質導入を用いて不死化した初代ＣＤＣ系統のフローデータを示しており、三つの群、すなわち、初代（未形質転換）ＣＤＣの第一群、早期継代（第８継代）不死化ＣＤＣの第二群、及び後期継代（第１７継代）ＣＤＣの第三群を比較して経時的な変化を示している。
【図２０】図２０は、遺伝子標的ｍｅｓｔの下方制御が成功し持続しているｑＰＣＲデータを示しており、三つの群、すなわち、初代（未形質転換）ＣＤＣの第一群、早期継代（第７継代）不死化ＣＤＣの第二群、及び後期継代（第１２継代）ＣＤＣの第三群を比較して経時的な変化を示している。
【図２１】図２１は、転写因子ｍｅｓｔの下方制御と対にした不死化ＣＤＣの数継代にわたってβ−カテニンレベルの上方制御が持続しているＥＬＩＳＡデータを示している。
【図２２】図２２は、転写因子ｍｅｓｔの下方制御と対にした不死化ＣＤＣのβ−カテニンレベルを増加させることにより、急性心筋梗塞マウスモデルにおける治療効力が増加することを示している。
【図２３Ａ】図２３Ａ及び図２３Ｂは、ＣＤ１０５及びＣＤ９０の表面発現のフローデータ、ならびにそれぞれＮＨＤＦと、中間ステップとしてのβ−カテニンレベルが外因的に増加したＮＨＤＦ（ＮＨＤＦβｃａｔ）と、β−カテニン及びＧＡＴＡ４のレベルが外因的に増加したＮＨＤＦ（ＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４）の位相差画像を示している。
【図２３Ｂ】同上。
【図２４】図２４は、ＮＨＤＦ、ＮＨＤＦβｃａｔ、及びＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４においてβ−カテニンレベルの上方制御が成功しているＥＬＩＳＡデータを示している。
【図２５】図２５は、ＮＨＤＦ、ＮＨＤＦβｃａｔ、及びＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４におけるＧＡＴＡ４、テロメラーゼ、β−カテニンシグナリング及び制御ならびに効力関連シグナルにおけるＷｎｔ関連遺伝子の発現レベルが増加したｑＰＣＲデータを示している。
【図２６】図２６は、ＮＨＤＦ、ＮＨＤＦβｃａｔ、及びＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４から単離した細胞外小胞のサイズ分布のＮａｎｏｓｉｇｈｔトラッキングデータを示している。
【図２７】図２７は、ＮＨＤＦ、ＮＨＤＦβｃａｔ、及びＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４から単離した細胞外小胞のプロファイルがｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２２、及びｍｉＲ−２１０の上方制御とｍｉＲ−１９９ｂの下方制御とを含むＣＤＣ様プロファイルに移行しているｑＰＣＲデータを示している。
【図２８】図２８は、ＮＨＤＦβｃａｔ及びＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４で処置した心筋梗塞マウスモデルにおいて生存率が顕著に改善していることを示している。
【図２９】図２９は、ＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４またはＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４に由来する細胞外小胞が、心筋梗塞マウスモデルにおいて治療効力を機能的に増加させることを示している。
【図３０】図３０は、ＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４またはＮＨＤＦβｃａｔ／ｇａｔａ４に由来する細胞外小胞が、心筋梗塞マウスモデルにおいて治療効力を構造的に増加させることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ａ）カルディオスフィア
カルディオスフィアは、ＷＯ２００５／０１２５１０及びＭｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｈｅａｒｔ，”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９５：９１１−９２１（２００４）（これらの開示内容はその全体が参照により本明細書に援用される）で説明されているように、自己接着性クラスターとして成長する未分化の心臓細胞である。
【００１５】
簡潔に述べると、心臓組織は、手術中または心臓生検中に患者から収集することができる。心臓組織は、左室、右室、中隔、左房、右房、分界稜、右室心内膜、中隔壁もしくは心室壁、心耳、またはこれらの組合せから採取することができる。生検は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１２４２２号及び第２０１２／００３９８５７号（これらの開示内容はその全体が参照により本明細書に援用される）で説明されている経皮的バイオトームを使用することにより、得ることができる。その場合、組織は直接培養することができ、または代替的に、心臓組織を凍結し、解凍し、次いで培養することができる。組織は、プロテアーゼ酵素（例えば、コラゲナーゼ、トリプシンなど）を用いて消化することができる。心臓組織は、外植片として培養し、外植片から線維芽細胞様細胞及びカルディオスフィア形成細胞を含めた細胞を成長させることができる。一部の場合において、外植片は、細胞外マトリックス（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、またはその他の細胞外マトリックスタンパク質）のうちの一つ以上の構成成分でコーティングされた培養容器で培養される。組織外植片は、約１、２、３、４週間、またはそれ以上の間培養してからカルディオスフィア形成細胞を収集することができる。一部の実施形態において、線維芽細胞様細胞の層は、カルディオスフィア形成細胞が出現する外植片から成長することができる。カルディオスフィア形成細胞は、位相差顕微鏡下では小さな円形の明位相（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）細胞として見える。外植片周囲のカルディオスフィア形成細胞を含む細胞は、手動の方法または酵素消化により収集することができる。収集したカルディオスフィア形成細胞は、カルディオスフィアの形成を促進するための条件下で培養することができる。一部の態様において、細胞は、緩衝培地、アミノ酸、栄養素、血清または血清代替物、成長因子（ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含むがこれに限定されない）、サイトカイン（カルディオトロフィンを含むがこれに限定されない）、及びその他のカルディオスフィア促進因子（例えば、これに限定されないがトロンビン）を含む、カルディオスフィア成長培地中で培養される。カルディオスフィア形成細胞は、カルディオスフィア形成に必要となる適切な密度、例えば、約２０，０００〜１００，０００細胞／ｍＬで平板培養することができる。細胞は、ポリ−Ｄ−リジンで、または細胞が皿の表面に付着するのを妨げるその他の天然もしくは合成の分子でコーティングされた無菌皿で培養することができる。カルディオスフィアは、カルディオスフィア形成細胞を平板培養してから約２〜７日またはそれ以上後に自然発生的に出現し得る。
【００１６】
Ｂ）カルディオスフィア由来細胞（ＣＤＣ）
ＣＤＣは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３１５２５２号（当該文献の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）で説明されているような方法で、カルディオスフィアを操作することによって生成される細胞集団である。例えば、ＣＤＣは、培養容器の固体表面への細胞の接着を促す物質（例えば、フィブロネクチン、ヒドロゲル、ポリマー、ラミニン、血清、コラーゲン、ゼラチン、またはポリ−Ｄ−リジン）でコーティングされた固体表面上でカルディオスフィアを平板培養し、接着単層培養と同じように増やすことにより、産生することができる。ＣＤＣは、標準的な細胞培養法に従って、繰り返し継代（例えば、２回以上継代）させることができる。
【００１７】
Ｃ）エクソソーム
エクソソームは、細胞の形質膜の多小胞体またはエンドソーム関連領域を伴う特異的な細胞内経路を介して形成された小胞である。エクソソームのサイズは、直径およそ２０〜１５０ｎｍの範囲をとり得る。一部の事例において、エクソソームは、およそ１．１〜１．２ｇ／ｍＬの特徴的な浮上密度と、特徴的な脂質組成とを有する。エクソソームの脂質膜は、典型的にはコレステロールに富み、スフィンゴミエリン、セラミド、脂質ラフト、及び露出したホスファチジルセリンを含有する。エクソソームは、ある特定のマーカータンパク質（例えば、インテグリン及び細胞接着分子）を発現するが、概してリソソーム、ミトコンドリア、またはカベオラのマーカーが欠如している。一部の実施形態において、エクソソームは、細胞由来の構成成分、例えば、以下に限定されないが、タンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ及びノンコーディングＲＮＡ）を含有する。一部の実施形態において、エクソソームは、エクソソームのレシピエントに対し同種、自己由来、異種、または同系である供給源から得られた細胞から得ることができる。
【００１８】
ある特定のタイプのＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、エクソソームによって運搬されることが知られている。ｍｉＲＮＡは、しばしば標的メッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）上の相補的配列との結合を通じて、転写後制御因子として機能し、翻訳抑制、標的ｍＲＮＡ分解、及び／または遺伝子サイレンシングをもたらす。例えば、ＷＯ２０１４／０２８４９３で説明されているように、ｍｉＲ１４６ａは、正常なヒト真皮線維芽細胞から単離されたエクソソームと比較して、ＣＤＣにおいて２５０倍超の発現増加を示し、ｍｉＲ２１０は、およそ３０倍上方制御される。
【００１９】
カルディオスフィア及びＣＤＣに由来するエクソソームは、例えばＷＯ／２０１４／０２８４９３で説明されており、当該文献の開示内容はその全体が参照により本明細書に援用される。エクソソームを調製するための方法は、条件培地中でカルディオスフィアまたはＣＤＣを培養するステップと、条件培地から細胞を単離するステップと、（例えば、連続遠心分離により）エクソソームを精製するステップと、任意選択で、密度勾配（例えば、スクロース密度勾配）でエクソソームを清澄化するステップとを含むことができる。一部の場合において、単離及び精製されたエクソソームは、非エクソソーム構成成分（例えば、カルディオスフィアまたはＣＤＣの構成成分）を実質的に含まない。エクソソームは、０．０１〜１％ヒト血清アルブミンを含有する無菌ＰＢＳ緩衝液などの緩衝液に再懸濁することができる。エクソソームは冷凍し、将来使用するために保管することができる。
【００２０】
エクソソームは、市販のキットを用いて、例えば、以下に限定されないが、ＥｘｏＳｐｉｎ（商標）エクソソーム精製キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）全エクソソーム精製キット、ＰｕｒｅＥｘｏ（登録商標）エクソソーム単離キット、及びＥｘｏＣａｐ（商標）エクソソーム単離キットを用いて、調製することができる。幹細胞からエクソソームを単離するための方法は、例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，２：２２６１４（２０１３）；Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ，７（３３２）：ｒａ６３（２０１４）ならびに米国特許出願公開第２０１２／００９３８８５号及び第２０１４／０００４６０１号で見出される。カルディオスフィア由来細胞からエクソソームを単離するための方法は、例えば、Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４で見出される。収集したエクソソームは、当技術分野で公知の方法を用いて濃縮及び／または精製することができる。具体的な方法論としては、超遠心分離、密度勾配、ＨＰＬＣ、親和性に基づいた基質への接着、またはサイズ排除に基づいた濾過が挙げられる。
【００２１】
例えば、分画超遠心分離は、培養細胞の上清から分泌されたエクソソームを単離する有力な技法となっている。このアプローチは、非膜状粒子の比較的低い浮上密度を活用することにより、非膜状粒子からのエクソソームの分離を可能にする。サイズ排除は、生化学的に類似するが生物物理学的には異なる微小胞（最大１，０００ｎｍのより大きい直径を有する）からの分離を可能にする。浮遊速度の違いが、差別的なサイズのエクソソームの分離をさらに可能にする。概して、エクソソームのサイズは、３０〜２００ｎｍ（４０〜１００ｎｍのサイズを含む）を範囲とする直径を有する。さらに、精製は、特定の目的エクソソームの特異的な特性に依存し得る。これは、外形質のまたは外向きの方向性を有する特異的な小胞を選択するために、例えば、目的タンパク質と共に免疫吸着を使用することを含む。
【００２２】
現在ある方法の中では、例えば、分画遠心分離、不連続密度勾配、免疫親和性、限外濾過、及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分画超遠心分離が、エクソソーム単離に使用されている。この技法は、遠心力の２０００ｘｇから１０，０００ｘｇへの増加を利用して、１００，０００ｘｇにてエクソソームペレットから中型及び大型サイズの粒子と細胞デブリとを分離する。遠心分離単独で条件培地からエクソソームを顕著に分離／収集することが可能であるが、一般的な混入物である様々なタンパク質凝集物、遺伝子物質、培地からの粒子、及び細胞デブリを除去するには不十分である。エクソソーム精製の特異性強化は、限外濾過と組み合わせた連続遠心分離、またはスクロース密度勾配における平衡密度勾配遠心分離を活用して、より高い純度のエクソソーム調製物（浮遊密度１．１〜１．２ｇ／ｍＬ）、または調製における離散した糖クッションの適用をもたらすことができる。
【００２３】
重要なことには、限外濾過を使用して、ＸＯの生物学的活性を損なうことなくエクソソームを精製することができる。中性でないｐＨまたは生理的でない塩濃度の使用を回避するために、異なる孔径（例えば、小さな粒子を除去するための１００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜及びゲル濾過）が使用されている。現在利用可能なタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムはスケーラブル（１０，０００Ｌ超まで）であり、エクソソーム画分の精製だけでなく濃縮も可能であり、このようなアプローチは、分画遠心分離よりも時間の消費が少ない。また、ＨＰＬＣも使用して、エクソソームを均質なサイズの粒子に精製し、調製物が生理的なｐＨ及び塩濃度で維持されながらエクソソームの生物学的活性を保持することができる。
【００２４】
その他の化学的方法は、沈殿技法におけるエクソソームの差別的溶解度や、体積排除ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））への添加を活用しており、場合によっては追加ラウンドの遠心分離または濾過と組み合わせる。例えば、沈殿試薬ＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）を条件細胞培地に添加して、速やかかつ迅速にエクソソーム集団を沈殿させることができるが、この技法によって調製したペレットの再懸濁は困難な可能性がある。流動場分画法（ＦＩＦＦＦ）は溶離ベースの技法であり、これは、巨大分子（例えば、タンパク質）及びナノ〜マイクロサイズの粒子（例えば、細胞小器官及び細胞）を分離し特徴づけるために使用され、培地からエクソソームを分画するために首尾よく適用されている。
【００２５】
一般的な生化学的及び生物物理学的な特徴に依存するこれらの技法以外では、対象を絞った技法を適用して特定の目的エクソソームを単離することができる。これは、ある特定のエクソソーム関連抗原の認識に対する抗体免疫親和性に依存することを含む。説明されているように、エクソソームはさらに、膜の表面で膜結合受容体の細胞外ドメインを発現する。これは、共有された抗原プロファイルに基づいて、親細胞の起源と関連させてエクソソームを単離及び隔離するための機会が熟していることを示す。磁気ビーズ、クロマトグラフィーマトリックス、プレート、またはマイクロ流体デバイスとの結合体化は、目的親細胞からの生成または関連する細胞制御状態に関し得る、特異的な目的エクソソーム集団の単離を可能にする。その他の親和性捕捉法は、エクソソーム表面上の特異的な糖類残基に結合するレクチンを使用する。
【００２６】
Ｃ１）１０ｋＤａ法及び１０００ＫＤａ法
ＣＤＣ−ＥＶ（１０ｋＤａまたは１０００ｋＤａ）原薬は、ＥＶを含有するＣＤＣ条件培地（ＣＭ）を１０ｋＤａまたは１０００ｋＤａ孔径フィルターで濾過した後に得られ、分泌ＥＶ及び濃縮ＣＭから構成された最終産物は、透析濾過によってＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａに製剤化され、凍結保存される。
【００２７】
Ｃ２）ＭＳＣ−ＥＶ
ヒト骨髄間葉幹細胞起源のＥＶ（ＭＳＣ−ＥＶ）は、ＣＤＣ−ＥＶ生成の場合と同様のプロセスの後に、ＥＶを含有するＭＳＣ  ＣＭを１０ＫＤａ孔径フィルターで濾過した後に得られる。ＭＳＣ−ＥＶは、規定の無血清条件下で培養したヒトＭＳＣから得られる非細胞性の濾過滅菌産物である。分泌されたＥＶ及び濃縮されたＣＭから構成された最終生成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａで製剤化し、凍結して保管する。凍結した最終生成物は、解凍後、結膜下注射用に「すぐに使用可能」である。
【００２８】
Ｃ３）イモリＥＶ
イモリＡ１細胞株起源のＥＶは、ＣＤＣ−ＥＶ生成の場合と同様のプロセスの後に、ＥＶを含有するＡ１細胞株ＣＭを１０ＫＤａ孔径フィルターで濾過した後に得られる。イモリＥＶは、規定された無血清条件下で培養したイモリＡ１細胞から得られる非細胞性の濾過滅菌された生成物である。分泌されたＥＶ及び濃縮されたＣＭから構成された最終生成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａで製剤化し、凍結して保管する。凍結した最終生成物は、解凍後、結膜下注射用にすぐに使用可能である。
【００２９】
Ｄ）実施例
本発明はさらに、以下の限定されない実施例を参照しながら説明する。
【実施例】
【００３０】
実施例１：ＣＤＣ培養液
米国特許出願公開第２０１２／０３１５２５２号（当該文献の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）で説明されているように、ＣＤＣを調製した。
【００３１】
簡潔に述べると、心臓生検を刻んで小さな断片とし、コラゲナーゼにより短時間で消化させた。次いで、外植片を２０ｍｇ／ｍＬフィブロネクチンコーティング皿上で培養した。組織断片からストローマ様扁平細胞及び相の鮮明な（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）円形細胞が自発的に成長し、２〜３週間までにコンフルエントに達した。０．２５％トリプシンを用いてこれらの細胞を採取し、２０ｍｇ／ｍＬポリ−ｄ−リジン上で浮遊状態で培養して自己凝集性のカルディオスフィアを形成した。接着単層培養としてフィブロネクチンコーティングフラスコ上でカルディオスフィアを平板培養し増やすことにより、ＣＤＣを得た。全ての培養物は、１０％  ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び０．１ｍＬの２−メルカプトエタノールを追加したＩＭＤＭ基本培地を用いて、３７℃にて５％  Ｏ２、５％  ＣＯ２で維持した。ＣＤＣをフィブロネクチンコーティングフラスコ上で第５継代まで１００％コンフルエントに成長させた。
【００３２】
実施例２：ＣＤＣ不死化
ＣＤＣに対し、テロメラーゼ（ｈＴｅｒｔ）の遺伝子、サルウイルス血清型４０のラージ及びスモールＴ抗原（ＳＶ４０  Ｔ＋ｔ）または細胞骨髄球腫症（ｃ−Ｍｙｃ）遺伝子を含むレンチウイルスを形質導入した。簡潔に述べると、２４ウェルプレート形式のフィブロネクチンコーティングプレート上で５×１０４  ＣＤＣ（第２継代）を平板培養した。次いで、完全培地（１０％  ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ｌ−グルタミン、及びβ−メルカプトエタノール）中で、細胞を２０のＭＯＩの上記ウイルスで処置した。形質導入試薬（すなわち、ポリブレン）は以前の観察で細胞の増殖を妨害することが示されているため、形質導入試薬の不在下で細胞を形質導入した。（完全培地を用いて）細胞がコンフルエントになったら継代した。第５継代で細胞をＴ７５フラスコからＴ２５フラスコに継代し、このときには選択因子ピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）の存在下で実施した。細胞を回収しフラスコ内にコロニーが形成されたら細胞を継代し、成長の挙動は、ＣＤＣの老化期（第７〜１０継代）を経て十分に特徴づけられた。
【００３３】
各継代における細胞数を係数して細胞の倍加速度を導き出すことにより、ＣＤＣの成長をモニターした。簡潔に述べると、Ｔ１７５フラスコ形式で細胞を１：２に継代した。細胞が視覚的にコンフルエントになったら、細胞をトリプシン処理し、平板培養の直前に計数した。細胞数を以前の細胞数と比較した。細胞は、第１０継代を超えて成長を継続した場合、不死であるものとみなした。
【００３４】
実施例３：不死化ＣＤＣからのエクソソームの調製
本明細書の説明と同じ方法で、不死化ｉＣＤＣからエクソソームを誘導した。簡潔に述べると、細胞をＴ１７５フラスコ内で成長させた。コンフルエントになったら、細胞を３０ｍｌのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で２回洗浄した。次いで、細胞を３２ｍｌのＩＭＤＭ中で１５日間馴化させた。条件設定の１５日に培地を採取し、３０００ｇで１５分間スピンさせることにより洗浄した。条件培地（ＣＭ）を分取し、−８０℃で保管した。
【００３５】
Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ装置を用いた拡散光散乱を用いて、エクソソームのサイズ及び濃度を測定した。簡潔に述べると、ＣＭをリン酸緩衝食塩水中で１：１０に希釈した。正確な測定値を確保するため、各試料に対し５つの６０秒動画を撮影し一緒にバッチ処理し、同じ試料の５つの動画全てからデータをプールした。
【００３６】
Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ尿エクソソーム単離キットを用いて、エクソソームからのＲＮＡを開始体積１０ｍｌのＣＭで単離した。５０μｌの分子グレード水中でＲＮＡを溶離した。
【００３７】
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ製のＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡキットを用いてｃＤＮＡを作製した。１８Ｓプライマーを用いてＣｔ値を標準化し、空ベクター対照に基づいて倍数変化を計算した。
【００３８】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
図２に関連して、ドナー２例（ドナー１及びドナー１２）からのＣＤＣを本明細書で説明されているように調製した。付着したＣＤＣを３０μＭのＣＨＩＲ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ１２６３）（ＧＳＫ３β阻害物質）で処置し、または処置をせずに７２時間置いた。次いで細胞を採取し、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で洗浄し、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ９０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５５９５）で染色した。次いで、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏｎ（商標）ＩＩマシンでフローサイトメトリーを行って細胞内のＣＤ９０発現を測定した。図２に示されているように、カノニカルＷｎｔシグナリング経路の活性化によってＣＤＣのＣＤ９０レベルが減少した。
【００３９】
図３〜５に関連して、不死化ドナー２からのＣＤＣをフィブロネクチン（ＦＮ、ＶＷＲ、カタログ番号３５６００９）コーティングまたはＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）（ＣＢ）コーティングフラスコ上で平板培養した。付着した細胞をＷｎｔ３ａまたはＰＢＳビヒクル（ｄｄＨ２Ｏ）で７２時間処置した。次いで、本明細書で説明されているものと同じプロトコルにより、フローサイトメトリーを用いて細胞のＣＤ９０発現を解析した。図３Ａ及び３Ｂに示されているように、カノニカルＷｎｔシグナリング経路の活性化によって、フィブロネクチン（ＦＮ）コーティング培養容器上で平板培養した不死化ＣＤＣのＣＤ９０レベルは減少したが、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）（ＣＢ）コーティング培養容器上で平板培養した不死化ＣＤＣに関しては、このような効果が観察されていない。
【００４０】
図９Ａに関連して、ドナー５からのＣＤＣのフローデータは、ＢＩＯ濃度の増加と共にＣＤ９０レベルが減少することを示している。図９Ｂに関連して、ドナー５からのＣＤＣを、異なる濃度のＢＩＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄａｉｃｈ、カタログ番号Ｂ１６８５）（ＧＳＫ３β阻害物質）で７２時間処置した。次いで、細胞を収集し、１×溶解緩衝液を追加した完全β−カテニンＥＬＩＳＡ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡ、カタログ番号８５−８６１４１−１１）を用いて溶解した。完全β−カテニンＥＬＩＳＡは、アッセイで０．０１ｍｇ／ｍＬ最終タンパク質濃度を使用したことを除き、製造業者の指示に従って実施した。同時に、β−カテニンレベルは、ＢＩＯ濃度の増加と共に増加した。
【００４１】
図１０に関連して、ＢＩＯの効果（ＥＬＩＳＡに従った持続性β−カテニン活性化による測定における効果）を、ドナー１０からのＣＤＣで測定した。ゼロ時間は、７２時間の５μＭ  ＢＩＯ処置期間後の薬物ウォッシュオフ時点付近である。結果から、ピーク活性化は薬物がウォッシュアウトされてから２４時間後であることが示されており、これは細胞内で内在化した薬物の活性を示すものである。
【００４２】
図１１Ａ及び１１Ｂに関連して、ドナー２例（ドナー１及びドナー１２）からのＵｌｔｒａＬｏｗフラスコ内での外植片由来細胞（ＥＤＣ）の球体形成は、７２時間の球体形成及び分解プロセス全体にわたり（ＥＬＩＳＡによる測定において）β−カテニンレベルを変化させることを示した。ＢＩＯを用いた７２時間の処置は、β−カテニン発現を同等以上に強化した。
【００４３】
実施例５：急性心筋梗塞のマウスモデル
確立した前臨床モデルにおける治療有効性を評価するため、例えば、Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４で説明されているものと同じ方法で免疫不全マウスで急性心筋梗塞（ＭＩ）を誘導した。簡潔に述べると、８週齢のオスの重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスをイソフルランで麻酔した。外科的準備の後、側方開胸のために鎖骨中線において２ｃｍの垂直切開を実施した。左前下行枝は７−０シルクを用いて結紮した。次いで、動物に心筋内注射を行い、二つの梗塞周囲に合計２０μｌ（１０μｌ／部位）で１０５細胞（またはビヒクルとしてのリン酸緩衝食塩水）を注射した。梗塞から１日後及び３週間後に、（左室駆出分画の変化を測定するために）心エコー測定値を取得した。
【００４４】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
図６に戻るが、Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ）ラット由来のＣＤＣを継代し、第１８継代及び第２１継代におけるネイティブβ−カテニンを測定したところ、ＣＤＣは、細胞継代数が増加すると共に（ＥＬＩＳＡによる測定において）β−カテニンレベルの低減を示した。このことは、細胞の加齢または老化も効力の低減につながることを実証するものである。
【００４５】
図１２に関連して、急性心筋梗塞マウスを、０．１ｍｇのβ−カテニン活性化薬物（ＢＩＯ）またはβ−カテニン阻害物質（ＪＷ６７）のいずれかで処置した。心臓の駆出分画の変化を３週間の手術で測定した。結果は、β−カテニンが梗塞後の心臓回復で担う役割を実証するものである。
【００４６】
図１３に関連して、ＣＤＣのネイティブβ−カテニンレベルとその効力との間の正の相関（急性心筋梗塞マウスモデルにおけるＣＤＣ注射から３週間後の心臓の左室駆出分画の変化［ΔＥＦ］による測定において；１０５細胞、二つの梗塞周囲部位における心筋内注射）が観察された。
【００４７】
表１は図１３に対応しており、各ドナーの名称（例えば、ドナー１）は、本明細書で説明されているものと同じ方法で特定の個別の心臓から誘導した特定のＣＤＣを示す。同じドナー心臓からの異なるロットは、さらなるダッシュ番号名称によって示される（例えば、ドナー６−１、２、３、４は全て、同じドナー心臓の異なるロットに由来するものである）。
【表１】
2021512595.tif 000003
【００４８】
図１４Ａに関連して、ドナー５からのＣＤＣ（１０５細胞、二つの梗塞周囲部位における心筋内注射）を、０μＭまたは１０μＭのＢＩＯで７２時間処置したところ、１０μＭのＢＩＯはβ−カテニンを首尾よく回復させた。図１４Ｂに関連して、ドナー５からのＢＩＯ処置ＣＤＣを急性心筋梗塞マウスに注射した。結果は、マウスＭＩモデルにおける心臓の駆出分画の増加（９５％信頼区間（スチューデントのｔ検定））によって示されるように、ＢＩＯ処置細胞の効力を実証している。
【００４９】
図１５Ａに関連して、ドナー６−２からのＣＤＣを、対照ビヒクルまたは５μＭのＢＩＯで７２時間処置したところ、５μＭのＢＩＯはβ−カテニンを首尾よく回復させた。図１５Ｂに関連して、ドナー６−２からのＢＩＯ処置ＣＤＣ（１０５細胞、二つの梗塞周囲部位における心筋内注射）を急性心筋梗塞マウスに注射した。結果は、マウスモデルにおける心臓の駆出分画の増加（９５％信頼区間（スチューデントのｔ検定））によって示されるように、ＢＩＯ処置細胞の効力を実証している。
【００５０】
図１６Ａに関連して、ドナー２からのＣＤＣ（１０５細胞、二つの梗塞周囲部位における心筋内注射）をＳＶ４０  Ｔ＋ｔレンチウイルスで不死化し、ドナー２からの不死化ＣＤＣを０μＭまたは５μＭのＢＩＯで７２時間処置したところ、５μＭのＢＩＯはβ−カテニンを首尾よく回復させた。図１６Ｂに関連して、ドナー２からのＢＩＯ処置不死化ＣＤＣを急性心筋梗塞マウスに注射した。結果は、マウスモデルにおける心臓の駆出分画の増加（９５％信頼区間（スチューデントのＴ検定））によって示されるように、ＢＩＯ処置細胞の効力を実証している。
【００５１】
図１７Ａに関連して、ＮＨＤＦに、構成的発現プロモーターの制御下でβ−カテニン遺伝子及び（選択用の）ピューロマイシンに対する耐性遺伝子を保有するレンチウイルスを形質導入した（ＮＨＤＦ＋レンチβ−ｃａｔ細胞）ところ、ＮＨＤＦ＋レンチβ−ｃａｔ細胞は、空ベクターを形質導入した対照ＮＨＤＦよりも顕著に高いレベルのβ−カテニンを示した。コンストラクトはピューリーマイシン耐性遺伝子を含むため、今度は、完全培地へのピューロマイシン抗生物質追加を用いて形質導入細胞を選択した。５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを５日間使用して選択を行った。選択期間中、最初の３日間の各日に培地交換を行った。図１７Ｂに関連して、ＮＨＤＦ＋レンチβ−ｃａｔ細胞（１０５細胞、二つの梗塞周囲部位における心筋内注射）を急性心筋梗塞マウスに注射した。結果は、ＮＨＤＦ＋レンチβ−ｃａｔ細胞によって、空ベクターを形質導入した対照ＮＨＤＦよりも心臓の駆出分画が大きく増加する（９５％信頼区間（スチューデントのＴ検定））ことを実証している。そのため、図１７Ａ及び１７Ｂに提示されたデータは、強力でないＮＨＤＦのβ−カテニンレベルを増加させることにより、強力でないＮＨＤＦが強力な活性化誘導組織エフェクター細胞に変換されることを実証している。
【００５２】
実施例７：図１９〜３０の実験方法
細胞及び試薬。減少した組織ドナーの健康な心臓から心室中隔の右室側面からの心内膜心筋生検を得た。先に説明したようにしてカルディオスフィア由来細胞を誘導した。簡潔に述べると、心臓生検を刻んで小さな１ｍｍ２断片とし、コラゲナーゼにより短時間で消化させた。次いで、外植片を２０μｇ／ｍｌフィブロネクチン（ＶＷＲ）コーティングフラスコ上で培養した。組織断片からストローマ様扁平細胞及び相の鮮明な円形細胞が自発的に成長し、２〜３週間までにコンフルエントに達した。次いで、０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ）を用いてこれらの細胞を採取し、２０μｇ／ｍｌポリ−ｄ−リジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で浮遊状態で培養して自己凝集性のカルディオスフィアを形成した。カルディオスフィアをフィブロネクチンコーティング皿に播種し継代させることにより、ＣＤＣを得た。全ての培養液は、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ゲンタマイシン、及び０．１ｍｌの２−メルカプトエタノールを追加したＩＭＤＭ基本培地（ＧＩＢＣＯ）を用いて、３７℃、５％  Ｏ２／ＣＯ２で維持した。ヒト対象研究からの機関審査委員会による承認を得たプロトコルの下、ＣＤＣを成長させるためのヒト心臓生検標本を得た。
【００５３】
ＣＤＣエクソソームの調製及び収集。形質移入した細胞からの第５継代以降の初代ＣＤＣからエクソソームを採取した。細胞を３７℃、５％  Ｏ２／ＣＯ２でコンフルエントになるまで成長させ、無血清培地で３回洗浄し、無血清培地中で１５日間馴化させた。条件培地を収集し、０．４５μｍフィルターで濾過してアポトーシス小体及び細胞デブリを除去し、後で使用するために−８０℃で凍結した。動物試験用のエクソソームを調製するため、４℃のローテーター上で１０ｍｌの条件培地に２ｍｌのＰＥＧを添加して終夜置き、翌日、沈殿したエクソソームを単離した。
【００５４】
遺伝子修飾／細胞の形質導入。ＣＤＣまたはＮＨＤＦをＴ２５上で平板培養し、細胞が付着して２０のＭＯＩを達成したら、所望の数のレンチウイルス粒子を通常完全培地と共にフラスコに適用した。２４時間の形質導入後、通常完全培地をフラスコに適用してさらに２４時間細胞を鎮静化した。次いで、選択培地（所望の抗体を伴う完全培地）をフラスコにおよそ１週間添加して、形質導入細胞を選択した。十分な細胞が得られたら、形質導入細胞ＲＮＡを収集し単離した。ｑＲＴ−ＰＣＲを実施して形質導入の成功を確認した。
【００５５】
ＲＮＡ単離及びｑＲＴ−ＰＣＲ。細胞にｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、またはエクソソームに尿エクソソームＲＮＡ単離キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．）を用いて完全ＲＮＡを単離した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＴａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写を実施した。Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及び適切なＴａｑｍａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムで反応を実施し、各反応を、鋳型なし対照と共に標的遺伝子及びハウスキーピング遺伝子（ＲＮＡに対しＨＰＲＴ１、マイクロＲＮＡに対しｍｉＲ２３ａ）において３連の試料で実施した。
【００５６】
細胞ライセート及びタンパク質アッセイ。４×１０５細胞を収集し、４℃、１，０００ｒｐｍで５分間ペレット化した。細胞ペレット及び１×溶解緩衝液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ  ＥＬＩＳＡキット）を、室温で１０分間ボルテックス及び回転させることにより、徹底的に混合した。４℃、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、細胞ライセート混合物からタンパク質ライセートを単離した。ＤＣ（商標）タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によってタンパク質濃度を決定した。
【００５７】
細胞の薬物処置。細胞内のβ−カテニンシグナリングを増加させるため、６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル（ＣＨＩＲ９９０２１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄａｉｃｈ）、または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄａｉｃｈ）（小分子競合阻害物質ＧＳＫ３β）を使用した。３０μＭのＣＨＩＲまたはＢＩＯの系列希釈で４８〜７２時間処置した後、細胞を所望の実験用に採取した。一方、β−カテニンシグナリングを減少させるために、同じ方法で細胞処置用にＴｒｉｓｐｉｒｏ［３Ｈ−インドール−３，２’−［１，３］ジオキサン−５’５”−［１，３］ジオキサン−２”，３”’−［３Ｈ］インドール］−２，２”’（１Ｈ，１”’Ｈ）−ジオン（９Ｃｌ）（ＪＷ６７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄａｉｃｈ）を適用した。
【００５８】
ＥＬＩＳＡ。タンパク質収集及びタンパク質濃度決定は上記の通りとした。０．０１ｍｇ／ｍｌ最終試料濃度及び０．１ｍｇ／ｍｌの陽性対照について説明されたプロトコルに従って、完全β−カテニンＥＬＩＳＡを実施した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡ）。
【００５９】
フローサイトメトリー。細胞を採取し計数した（条件当たり２×１０５細胞）。細胞を１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で洗浄し、適切な抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて４℃で１時間染色した。次いで細胞を再び洗浄し、１×ＰＢＳ中１％  ＢＳＡに再懸濁させた。染色（例えば、ＬＲＰ５／６染色）の前の細胞透過処理用にＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを使用した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩマシンでフローサイトメトリーを実施した。
【００６０】
動物試験。全ての動物実験は、施設内の動物実験委員会プロトコルの承認下で行った。先に説明したように、３ヵ月齢のオスの重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスに急性心筋梗塞を適用させた。１×１０５所望細胞または２０μｌの１４ｍＭ薬物（ＢＩＯもしくはＪＷ６７）またはエクソソームをレスキュー用にＳＣＩＤ心臓に注射した。
【００６１】
心エコー。説明されているように８、手術から２４時間後（ベースライン）及び３週間後のＳＣＩＤベージュにおいて、Ｖｅｖｏ  ３１００または７７０  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ）を用いて心エコー試験を実施した。複数の左室拡張終期及び左室収縮終期の測定値から、左室駆出分画の平均を解析した。
【００６２】
組織診断。ＭＩから３週間後に動物を屠殺した。心臓を採取し、ＭＩ縫合のわずかに上方で横方向切開を行った。次いで、先端部分を、ベース成形／埋込みリングブロック（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ）内の最適切断温度の溶液に包埋した。低温の２−メチルブタンに浸漬することにより、ブロックを直ちに凍結した。心臓を５ｍＭの厚さで切片作成した。
【００６３】
マッソントリクローム染色。マッソントリクローム染色を用いて、心臓当たり合計四つの切片を含む二つのスライドを染色した。簡潔に述べると、切片をブアン固定液で終夜処置した。次いで、スライドを流水下で１０分間すすぎ、ワイゲルトヘマトキシリンで５分間染色した。次いで、スライドをすすぎ、深紅色の酸であるフクシンで５分間染色し、再びすすいだ。次いで、スライドをリンタングステン酸／リンモリブデン酸、アニリンブルー、及び２％酢酸でそれぞれ５分間染色した。次いでスライドをすすぎ、乾燥し、ＤＰＸマウント培地を用いてマウントした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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