(57)【要約】  本発明は、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）種、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）及びキャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ）から選択される少なくとも１つの芝の病原性真菌の真菌ＤＮＡのプライマーを含むループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイを用いて、芝草サンプル中の真菌ＤＮＡを検出するための方法であって、芝サンプルをＬＡＭＰ反応に供する工程を含み、ＬＡＭＰ反応は、セット中の各プライマーが１５〜５０の核酸を有する、４つ以上の核酸配列のプライマーセットを使用する、方法を提供する。本方法に有用なプライマーは、改善されたアッセイ結果を得るために、標的真菌の特異的に選択された内部転写スペーサー領域又は遺伝子から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）種、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）及びキャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ）から選択される少なくとも１つの芝の病原性真菌の真菌ＤＮＡ用のプライマーを含むループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイを用いて、芝草サンプル中の真菌ＤＮＡを検出するための方法であって、
前記芝サンプルをＬＡＭＰ反応に供する工程を含み、前記ＬＡＭＰ反応は、セット中の各プライマーが１５〜５０の核酸を有する、４つ以上の核酸配列のプライマーセットを使用し、前記プライマーのセットが、
（ａ）配列番号１４、１５、１６及び１７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｂ）配列番号２０、２１、２２及び２３と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択されるか、或いは配列番号６２、６３．６６及び６７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｃ）配列番号２６、２７、２８、及び２９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｄ）配列番号３２、３３、３６、及び３７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｅ）配列番号３８、３９、４２及び４３と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット、
（ｆ）配列番号４４、４５、４８及び４９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｇ）配列番号５０、５１、５４及び５５と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｈ）配列番号７４  ７５、７８及び７９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；
（ｉ）配列番号８０、８１、８４及び８５と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット；及び
（ｊ）配列番号８６、８７、９０及び９１と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、キャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．Ｕｌｔｉｍｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセット
から選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む、方法。
【請求項２】
ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号１４、１５、１６、１７、１８及び１９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号６２、６３、６４、６５、６６及び６７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び３７と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号６８、６９、７０、７１、７２及び７３と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号３８、３９、４０、４１、４２及び４３と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号５６、５７、５８、５９、６０及び６１と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号４４、４５、４６、４７、４８及び４９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、及び５５と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号７４、７５、７６、７７、７８及び７９と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号８０、８１、８２、８３、８４及び８５と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
キャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．Ｕｌｔｉｍｕｍ）ＤＮＡを検出するための前記プライマーセットが、配列番号８６、８７、８８、８９、９０及び９１と少なくとも９０％同一である配列を各々がそれぞれ有するプライマーを含むか又はそれらから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４において同定される前記プライマーセットの１つ又は２つ以上を含む、ＬＡＭＰアッセイを用いた芝草サンプル中の真菌ＤＮＡの検出のためのキット。
【請求項１６】
緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上の真菌に由来する核酸を検出するために、芝草のサンプルのループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイを用いて、真菌病原体によって引き起こされるこのような芝草における病害を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、米国特許第６４１０２７８号明細書（Ｅｉｋｅｎ）に記載されているＬＡＭＰ又はループ介在等温増幅は、標的遺伝子上の６つの異なる領域を認識するように特異的に設計された少なくとも４つ以上の異なるプライマー（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｅ／ｌａｍｐ／ｐｒｉｍｅｒ．ｈｔｍｌを参照）の使用によって特徴付けられるＤＮＡ増幅方法であり、反応プロセスは、鎖置換反応を用いて一定温度で進行する。対象とする標的核酸の増幅及び検出は、生物サンプル又はその核酸抽出物、プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び基質の混合物を一定温度（約６５’Ｃ）でインキュベートすることによって、単一工程で完了され得る。それは、高い増幅効率を提供し、ＤＮＡが、１５〜６０分間で多数回増幅される。この高い特異性のため、増幅産物の存在は、標的遺伝子の存在を示し得る（ｈｔｔｐ：／／ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｅ／ｌａｍｐ／ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ．ｈｔｍｌ）。
【０００３】
芝草管理者が使用者によって予測される品質基準に芝草を維持する際に直面する多くの課題がある。課題は多いが、病害（真菌病原体によって引き起こされる病害を含む）に関するものが、管理及び制御するのが特に難しい。例えば、病害は、ゴルフ場の芝草植物を侵して、プレーのしやすさ（ｐｌａｙａｂｉｌｉｔｙ）を含む品質の低下による収益の低下を引き起こし得る。ゴルフ場管理者に共通の課題の一例は、適切且つ適時な管理法を取ることができるようにどの病害が存在するかを知ることである。芝の病原微生物によって引き起こされる関連する芝の病害としては、例えば、炭疽病、テイクオールパッチ、サマーパッチ病、雪腐病、赤焼病、葉腐病及びダラースポット病が挙げられる。
【０００４】
殺真菌剤などの病原体を防除するための農業的に有効な薬品は、典型的に、病害圧力の程度、病原体集団、天候などに応じて、必要に応じてゴルフ場において施用される。しかしながら、殺真菌剤の施用は、ゴルフ場の予算（ｃｏｕｒｓｅ  ｂｕｄｇｅｔ）、適切な設備の利用可能性、及び農業的に有効な薬品を施用するための資格のある人員の利用可能性によって高度に制御される。
【０００５】
これらの課題を考慮して、芝の病原性真菌の検出のための迅速で且つ信頼性の高いアッセイは、極めて有用であろう。公知のＰＣＲアッセイは、ゴルフ場又は他の集中的に管理された芝草又は専門的な景観環境において使用するのに実用的でないが、これは、ＰＣＲが、特殊な実験技能及び機器を必要とするためである。芝草における真菌病害を検出するための他の分子生物学方法が公知であり、例えば、ＴＲＦＬＰ方法に関する国際公開第２００９１４７０１７号に記載されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、例えば、炭疽病、テイクオールパッチ、サマーパッチ病、雪腐病、赤焼病、葉腐病及びダラースポット病を含む、関連する芝の病害を引き起こす選択された真菌病原体に関連する、芝サンプル中のＤＮＡの存在を検出するためのＬＡＭＰアッセイに関する。
【０００７】
芝草病害病原体の適時な且つ効率的な検出を促進するため、並びに芝草病害処置のコスト及び有効性を改善するために、本発明に係るＬＡＭＰアッセイが、関連する芝の病害を引き起こす真菌病原体に関連するＤＮＡを早期に検出するのに用いられ得る。本発明によれば、ＬＡＭＰ方法は、標的病害病原体に由来する少なくとも４つ、好ましくは６つ以上の核酸配列のプライマーセットを好適に使用する。より特定的には、本発明に係る方法は、ＬＡＭＰアッセイのための選択されたプライマーセットにおいて使用される各プライマーが１５〜５０の核酸を有し、セット中のプライマーが、標的真菌中の特異的なＤＮＡ遺伝子座から選択されると規定する。
【０００８】
本発明によれば、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）種、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）及びキャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ）（標的真菌）からなる群から選択される芝の病原性真菌の真菌ＤＮＡ（核酸）のプライマーを含むループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイを用いて、芝草サンプル中の真菌ＤＮＡを検出するための方法が提供される。本発明のＬＡＭＰアッセイは、セット中の各プライマーが１５〜５０の核酸を有する、少なくとも４つ、好ましくは６つ以上の核酸配列のプライマーセットを使用し、検出される真菌ＤＮＡは、標的真菌病原体から得られる。本ＬＡＭＰアッセイ方法に有用なプライマーは、改善されたアッセイ結果を得るために、標的真菌の特異的な内部転写スペーサー領域又は遺伝子から選択される。
【０００９】
特定の実施形態において、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種の標的真菌は、紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ）及び紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ）から選択される。別の実施形態において、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種の標的真菌は、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）及びコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ）から選択される。さらなる実施形態において、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）種の標的真菌は、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２−２ＩＶ及び紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２−２ＩＩＩＢから選択される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に関連して、芝サンプルにおける本発明に係るＬＡＭＰアッセイを用いた真菌ＤＮＡの検出は、真菌病原体の存在を示すことができ、以下のような芝の病害状態の開始又は存在を評価するのにも役立つことができる。
【００１１】
【表１】
2021512609.tif 000002
【００１２】
一実施形態において、
（ａ）ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）ＤＮＡのプライマーセットが、配列番号１のＤＮＡ中から選択され；
（ｂ）紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡのプライマーセットが、配列番号２又は配列番号９のＤＮＡ中から選択され；
（ｃ）紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種ＤＮＡ（好ましくは、紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ））のプライマーセットが、配列番号３のＤＮＡ中から選択され；
（ｄ）ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡのプライマーセットが、配列番号４又は配列番号１０のＤＮＡ中から選択され；
（ｅ）立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種ＤＮＡ（好ましくは、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）又はコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ））のプライマーセットが、配列番号５又は配列番号８のＤＮＡ中から選択され；
（ｆ）紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種ＤＮＡ（好ましくは、紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ））のプライマーセットが、配列番号６のＤＮＡ中から選択され；
（ｇ）マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）ＤＮＡのプライマーセットが、配列番号７のＤＮＡ中から選択され；
（ｈ）コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＤＮＡのプライマーセットが、配列番号１１のＤＮＡ中から選択され；
（ｉ）コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）ＤＮＡのプライマーセットが、配列番号１２のＤＮＡ中から選択され；
（ｊ）キャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．Ｕｌｔｉｍｕｍ）ＤＮＡのプライマーセットが、配列番号１３のＤＮＡ中から選択される。
【００１３】
好ましくは、本発明にしたがって芝サンプル中の真菌ＤＮＡを検出するのに使用するのに好適なＬＡＭＰプライマーセットは、フォワード（ＦＩＰ）及びリバース（ＢＩＰ）インナープライマーの対、並びにフォワード（Ｆ３）及びリバース（Ｂ３）アウタープライマーの対を含む４つのプライマーを含む。より好ましくは、本発明に使用するのに好適なＬＡＭＰプライマーセットは、芝サンプル中に存在する核酸の増幅を加速させ、このような芝サンプル中に存在し得る何らかの標的真菌の検出時間を減少させるために、ループフォワード（ＬＦ）及び／又はループバック（ＬＢ）プライマーの追加を含む。以下に列挙されるＬＡＭＰプライマーセットの実施形態は、本発明の方法に係る芝サンプル中の標的真菌ＤＮＡの検出に関する。
【００１４】
本発明に係る、配列番号１４〜９１のプライマーに関連する、以下の実施形態の説明において、本発明において有用なプライマーが、各々独立して及びそれぞれ、１４〜９１の配列番号のプライマーと、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、さらにより好ましくは、少なくとも９７％同一である配列を有することが理解されるであろう。
【００１５】
特に好ましい実施形態において、本発明において有用なプライマーが、各々独立して及びそれぞれ、１４〜９１の配列番号のプライマーと、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％同一である配列を有する。最も好ましくは、本発明において有用なプライマーが、各々独立して及びそれぞれ、１４〜９１の配列番号と同一である配列を有する。
【００１６】
したがって、本発明は、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）種、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）及びキャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ）から選択される少なくとも１つの芝の病原性真菌の真菌ＤＮＡのプライマーを含むループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイを用いて、芝草サンプル中の真菌ＤＮＡを検出するための方法であって、芝サンプルをＬＡＭＰ反応に供する工程を含み、ＬＡＭＰ反応は、セット中の各プライマーが１５〜５０の核酸を有する、４つ以上の核酸配列のプライマーセットを使用し、プライマーのセットが、以下に記載される少なくとも１つのプライマーセットを含む、方法を提供する。
【００１７】
一実施形態において、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号１５及び２７を含むか又はそれらから選択される。
【００１８】
別の実施形態において、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号１４、１５、１６及び１７を含むか又はそれらから選択される。
【００１９】
さらなる実施形態において、ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号１４、１５、１６、１７、１８及び１９を含むか又はそれらから選択される。
【００２０】
さらなる実施形態において、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号２３を含むか又はそれから選択される。
【００２１】
別の実施形態において、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号６３、６４及び６５を含むか又はそれらから選択される。
【００２２】
別の実施形態において、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号２０、２１、２２及び２３を含むか又はそれらから選択される。
【００２３】
別の実施形態において、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号６２、６３．６６及び６７を含むか又はそれらから選択される。
【００２４】
さらに別の実施形態において、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号６２、６３、６４、６５、６６及び６７を含むか又はそれらから選択される。
【００２５】
別の実施形態において、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５を含むか又はそれらから選択される。
【００２６】
別の実施形態において、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種（好ましくは、紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号２７、２８及び２９を含むか又はそれらから選択される。
【００２７】
別の実施形態において、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種（好ましくは、紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号２６、２７、２８、及び２９を含むか又はそれらから選択される。
【００２８】
さらなる実施形態において、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種（好ましくは、紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１を含むか又はそれらから選択される。
【００２９】
一実施形態において、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号３３、３６及び３７を含むか又はそれらから選択される。
【００３０】
別の実施形態において、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号３２、３３、３６、及び３７を含むか又はそれらから選択される。
【００３１】
別の実施形態において、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び３７を含むか又はそれらから選択される。
【００３２】
別の実施形態において、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号６９、７０及び７１を含むか又はそれらから選択される。
【００３３】
別の実施形態において、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号６８、６９、７２及び７３を含むか又はそれらから選択される。
【００３４】
別の実施形態において、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号６８、６９、７０、７１、７２及び７３を含むか又はそれらから選択される。
【００３５】
一実施形態において、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種（好ましくは、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）又はコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号６０を含むか又はそれから選択される。
【００３６】
別の実施形態において、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種（好ましくは、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）又はコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号４２及び４３を含むか又はそれらから選択される。
【００３７】
さらなる実施形態において、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種（好ましくは、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）又はコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号３８、３９、４２及び４３を含むか又はそれらから選択される。
【００３８】
さらなる実施形態において、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種（好ましくは、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）又はコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号５６、５７、６０及び６１を含むか又はそれらから選択される。
【００３９】
別の実施形態において、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種（好ましくは、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）又はコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号３８、３９、４０、４１、４２及び４３を含むか又はそれらから選択される。
【００４０】
別の実施形態において、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種（好ましくは、ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）、日本シバ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）又はコムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号５６、５７、５８、５９、６０及び６１を含むか又はそれらから選択される。
【００４１】
一実施形態において、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種（好ましくは、紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号４８及び４９を含むか又はそれらから選択される。
【００４２】
さらなる実施形態において、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種（好ましくは、紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号４４、４５、４８及び４９を含むか又はそれらから選択される。
【００４３】
さらに別の実施形態において、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種（好ましくは、紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ））ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号４４、４５、４６、４７、４８及び４９を含むか又はそれらから選択される。
【００４４】
別の実施形態において、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号５４及び５５を含むか又はそれらから選択される。
【００４５】
さらなる実施形態において、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号５０、５１、５４及び５５を含むか又はそれらから選択される。
【００４６】
別の実施形態において、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、及び５５を含むか又はそれらから選択される。
【００４７】
一実施形態において、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号７４、７６及び７７を含むか又はそれらから選択される。
【００４８】
さらなる実施形態において、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号７４  ７５、７８及び７９を含むか又はそれらから選択される。
【００４９】
別の実施形態において、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号７４、７５、７６、７７、７８及び７９を含むか又はそれらから選択される。
【００５０】
別の実施形態において、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号８０、８２及び８３を含むか又はそれらから選択される。
【００５１】
さらなる実施形態において、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号８０、８１、８４及び８５を含むか又はそれらから選択される。
【００５２】
別の実施形態において、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号８０、８１、８２、８３、８４及び８５を含むか又はそれらから選択される。
【００５３】
一実施形態において、キャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．Ｕｌｔｉｍｕｍ）ｌｄｉｎ−ｒｃ  ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号８６、８８及び８９を含むか又はそれらから選択される。
【００５４】
さらなる実施形態において、キャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．Ｕｌｔｉｍｕｍ）ｌｄｉｎ−ｒｃ  ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号８６、８７、９０及び９１を含むか又はそれらから選択される。
【００５５】
別の実施形態において、キャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．Ｕｌｔｉｍｕｍ）ｌｄｉｎ−ｒｃ  ＤＮＡを検出するためのプライマーセットが、配列番号８６、８７、８８、８９、９０及び９１を含むか又はそれらから選択される。
【００５６】
本発明のＬＡＭＰアッセイは、芝サンプル中のダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）種、紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）種、マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）、コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）及びキャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．Ｕｌｔｉｍｕｍ）からなる群から選択される芝真菌に由来するＤＮＡの早期の検出を含む検出に使用され得、これは、入手しやすく、芝草の管理及び／又は維持が相応に調整されるのを可能にする。
【００５７】
本発明によれば、「芝草」とは、一年生又は多年生イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）であると理解される。前記イネ科（ｇｒａｍｉｎｅａｅ）は、好ましくは、コムギダマシ属（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）、ヌカボ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、アクソノプス属（Ａｘｏｎｏｐｕｓ）、スズメノチャヒキ属（Ｂｒｏｍｕｓ）、ブフロエ属（Ｂｕｃｈｌｏｅ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、ムカデシバ属（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、スズメノヒエ属（Ｐａｓｐｕｌｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、イヌシバ属（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ）又はシバ属（Ｚｏｙｓｉａ）の１つ以上に属する。より好ましくは、前記イネ科（ｇｒａｍｉｎｅａｅ）は、ヌカボ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ブフロエ属（Ｂｕｃｈｌｏｅ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、ムカデシバ属（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、スズメノヒエ属（Ｐａｓｐｕｌｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、イヌシバ属（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ）又はシバ属（Ｚｏｙｓｉａ）の１つ以上に属する。
【００５８】
一実施形態において、本発明によれば、「芝」とは、地面の表面積を覆い、定期的な手入れがなされる、芝草の群であると理解される。
【００５９】
本発明は、寒地型芝草及び暖地型芝草を含む全ての芝草に実施することができる。
【００６０】
寒地型芝草の例は、イチゴツナギ（ポアＬ．（Ｐｏａ  Ｌ．））、例えば、ナガハグサ（ポア・プラテンシスＬ．（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｌ．））、オオスズメノカタビラ（ポア・トリビアリスＬ．（Ｐｏａ  ｔｒｉｖｉａｌｉｓ  Ｌ．））、コイチゴツナギ（ポア・コンプレッサＬ．（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ  Ｌ．））及びスズメノカタビラ（ポア・アンヌアＬ．（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ  Ｌ．））；ベントグラス（アグロスティスＬ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  Ｌ．））、例えば、クリーピングベントグラス（アグロスティス・パルストリスＨｕｄｓ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｈｕｄｓ．））、イトコヌカグサ（アグロスティス・テニウスＳｉｂｔｈ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｎｉｕｓ  Ｓｉｂｔｈ．））、ヒメヌカボ（アグロスティス・カニナＬ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ  Ｌ．））及びコヌカグサ（アグロスティス・アルバＬ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ  Ｌ．））；ウシノケグサ（フェスツカＬ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  Ｌ．））、例えば、オオウシノケグサ（フェスツカ・ルブラＬ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  Ｌ．））、ハイウシノケグサ（フェスツカ・ルブラ変種コミュタタＧａｕｄ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  ｖａｒ．ｃｏｍｍｕｔａｔａ  Ｇａｕｄ．））、ウシノケグサ（フェスツカ・オビナＬ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｖｉｎａ  Ｌ．））、コウライウシノケグサ（フェスツカ・ロンギホリア（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ））、オニウシノケグサ（フェスツカ・アルンディナセアＳｃｈｒｅｂ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  Ｓｃｈｒｅｂ．））、ヒロハノウシノケグサ（フェスツカ・エラチオルＬ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ  Ｌ．））；ライグラス（ロリウムＬ．（Ｌｏｌｉｕｍ  Ｌ．））、例えば、ペレニアルライグラス（ロリウム・ペレネＬ．（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ  Ｌ．））、一年生（イタリアン）ライグラス（ロリウム・マルチフロラムＬａｍ．（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．））；ウィートグラス（アグロピロンＧａｅｒｔｎ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  Ｇａｅｒｔｎ．））、例えば、フェアウェイウィートグラス（アグロピロン・クリスタツム（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｃｒｉｓｔａｔｕｍ（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．））、ウェスタンウィートグラス（アグロピロン・スミチイＲｙｄｂ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｍｉｔｈｉｉ  Ｒｙｄｂ．））である。他の寒地型芝草としては、スズメノチャヒキ（ブロムス・イネルミスＬｅｙｓｓ．（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ  Ｌｅｙｓｓ．））及びオオアワガエリ（フレウムＬ．（Ｐｈｌｅｕｍ  Ｌ．））が挙げられる。
【００６１】
暖地型芝草の例は、バミューダグラス（シノドンＬ．Ｃ．リッチ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  Ｌ．Ｃ．Ｒｉｃｈ））、ノシバ（ゾイシアＷｉｌｌｄ．（Ｚｏｙｓｉａ  Ｗｉｌｌｄ．））、セントオーガスチングラス（ステノタフラム・セクンダツム（Ｗａｌｔ．）クンツ（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ（Ｗａｌｔ．）Ｋｕｎｔｚｅ））、チャボウシノシッペイ（エレモクロア・オフィウロイデス（Ｍｕｎｒｏ．）Ｈａｃｋ．（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ  ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ（Ｍｕｎｒｏ．）Ｈａｃｋ．））、カーペットグラス（アクソノプスＢｅａｕｖ．（Ａｘｏｎｏｐｕｓ  Ｂｅａｕｖ．））、アメリカスズメノヒエ（パスパルム・ノタツムＦｌｕｇｇｅ．（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ  Ｆｌｕｇｇｅ．））、キクユグラス（ペニセツム・クランデスティナムチヌムＨｏｃｈｓｔ．ｅｘ  Ｃｈｉｏｖ．（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｃｌａｎｄｅｓｔｉｎｕｍ  Ｈｏｃｈｓｔ．ｅｘ  Ｃｈｉｏｖ．））、バッファローグラス（ブフロー・ダクチロイデス（Ｎｕｔｔ．）Ｅｎｇｅｌｍ．（Ｂｕｃｈｌｏｅ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ（Ｎｕｔｔ．）Ｅｎｇｅｌｍ．））及びサワスズメノヒエ（パスパルム・バギナツム・スワルツ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｖａｇｉｎａｔｕｍ  ｓｗａｒｔｚ））である。
【００６２】
ＬＡＭＰ方法の発明は、ＬＡＭＰアッセイを用いた芝草サンプル中の真菌の検出のためのキットも想定している。本明細書に記載されるプライマーセットの１つ又は２つ以上を含む試験片が用いられ得る。一実施形態において、複数のプライマーセットが、特定の場所から収集された芝草サンプルからの複数の病害の検出のために試験片において多重化される（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）。
【００６３】
例えば、玉軸受けを備えた、好適な量の溶解緩衝液を含むビジューチューブ（ｂｉｊｏｕ  ｔｕｂｅ）に、１立方ｃｍの均質化された芝サンプルを供給し、１分間にわたって激しく振とうする。サンプルウェルを含む試験片は全て、再懸濁緩衝液を含有し、数滴のこの試験溶液が、試験片におけるサンプルウェルに入れられ、ここで、ウェルは、ＬＡＭＰ反応を行うのに必要な全ての成分を有する（例えば、プライマーセット及びＯｐｔｉｇｅｎｅから入手可能な等温マスターミックスカタログ番号ｉｓｏ−００１などの試薬）。一実施形態において、試験片は多重化される。別の実施形態において、試験片は、８つのウェル（２つの対照及び対象とする芝の病害について６つ）を含む。一実施形態において、試験片は、ＯｐｔｉＧｅｎｅから入手可能なＧｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩ又はＩＩＩなどの診断用機器と結合される。
【００６４】
プライマー設計
高度に保存された遺伝子を、選択された芝草病原体（表３の第１列）に由来するＤＮＡの検出のためのＬＡＭＰプライマーの設計に使用した。対象とする全ての真菌に由来する純粋なゲノムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて得た。ＰＣＲ技術を用いて、対象とする配列を、公開されたプライマー対を用いて増幅した後、サンガーシーケンシングを行った。以下のＤＮＡ遺伝子座（遺伝子及び領域）をシーケンシングした：内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、伸長因子１−α（ＥＦ）、β−チューブリン（Ｔｕｂ）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット１（Ｃｏｘ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）及び大サブユニット核リボソームＲＮＡ（ＬＳＵ）。生配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法（ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてアラインメントした。ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）からの配列とのＢＬＡＳＴ比較を用いて、遺伝子ホモログを同定した。理想的には、良好な配列が、上首尾のＰＣＲ増幅によって、全ての標的分類群について定義され、他の分類群との相同性を有さない。
【００６５】
次に、シーケンシングされたＤＮＡ遺伝子座からの最良の配列（配列番号１〜１３）を、ＬＡＭＰ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  １．１４（ＰＲＥＭＩＥＲ  Ｂｉｏｓｏｆｔ）を用いて、選択された芝草病原体のそれぞれのＬＡＭＰプライマーの設計に使用した。したがって、異なるパラメータを試験して、生物及び遺伝子座ごとに異なるプライマーセットを得た（芝病原体、選択された遺伝子座及びプライマー設計に使用される最良の配列の配列番号の相関については表３を参照されたい）。次に、表１に示される設計されたプライマーセットを、それらの特異性（表３）及び感受性（表４）について試験した。
【００６６】
【表２−１】
2021512609.tif 000003
【表２−２】
2021512609.tif 000004
【００６７】
特異性
反応の特異性を調べるために（以下の文献を参照）、設計されたプライマーセットを用いたアッセイを、表２に記載される真菌分離株からの純粋なゲノムＤＮＡ抽出物を用いて試験する。異なる地理的起源からの様々な芝草病原体の包括的なコレクションを収集し、様々な培地（ジャガイモデキストロース／麦芽／コーンミール／サクランボ／Ｖ８）上で増殖させた。１０日齢の真菌培養物を用いて、菌糸体からＤＮＡを抽出した（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  ＩＩ−ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）。ゲノムＤＮＡを、ヌクレアーゼフリー水で５ｎｇ／μｌになるまで希釈し、２．５μｌの一部を特異性試験に使用した。
【００６８】
ＬＡＭＰ特異性試験を、５５分間にわたって６４℃で、９６ウェルプレート中のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）において行った。アンプリコン特異的アニーリング温度を、−０．１℃／秒の上昇速度での９８℃から６５℃への冷却中に決定した。リアルタイムＬＡＭＰアッセイを、５μｌの１倍濃度の等温マスターミックス（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）、０．４μＭの各エクスターナルプライマー、１．６μＭの各インターナルプライマー、及び０．８μＭの各ループプライマー（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈによって合成される）及び２．５μｌのゲノムＤＮＡを含有する１０μｌの反応混合物中で行った。
【００６９】
全ての反応を、デュプリケートで及び２つの異なる日に行った。
【００７０】
特異性を実施するための文献：
Ｂｅｓｕｓｃｈｉｏ，Ｓ．Ａ．，Ｍｕｒｃｉａ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｅｎａｔａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｍｏｎｎｅｒａｔ，Ｓ．，Ｃｒｕｚ，Ｉ．，Ｐｉｃａｄｏ，Ａ．，Ｓｃｈｉｊｍａｎ，Ａ．Ｇ．（２０１７）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ｋｉｔ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅｓ．ＰＬＯＳ  Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１１（７），ｅ０００５７７９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００５７７９
Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｍ．，Ａｒａｇａｎｅ，Ｍ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，＆  Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．（２０１６）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，３９（７），１１４４−１１４９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４８／ｂｐｂ．ｂ１６−０００９０
Ｓｅｋｉ，Ｍ．，Ｋｉｌｇｏｒｅ，Ｐ．Ｅ．，Ｋｉｍ，Ｅ．Ｊ．，Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｍ．，Ｈａｙａｋａｗａ，Ｓ．，＆  Ｋｉｍ，Ｄ．Ｗ．（２０１８）．Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｐｅｄ．２０１８．０００５７
Ｗａｎｇ，Ｄ．−Ｇ．，Ｂｒｅｗｓｔｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｐａｕｌ，Ｍ．，＆  Ｔｏｍａｓｕｌａ，Ｐ．Ｍ．（２０１５）．Ｔｗｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０（４），６０４８−６０５９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２００４６０４８
【００７１】
【表３−１】
2021512609.tif 000005
【表３−２】
2021512609.tif 000006
【００７２】
結果の解釈：
表３に要約されているように、ＬＡＭＰアッセイの特異性を、表２に列挙される真菌株について、設計された特異的標的に対して調べた。特異性のさらなる確認として、８２．６〜８９．９℃±０．５℃の整合する溶融温度を、同様に表３に示されるように、異なる増幅産物について観察した。
【００７３】
【表４】
2021512609.tif 000007
【００７４】
配列番号１〜１３のＤＮＡ（表１）に対応する記載されるプライマーセットの感受性を、対象とする全ての真菌のゲノムＤＮＡの連続希釈（１ｎｇから１００ｆｇ）を用いて決定し、各反応を、２つの異なる日にデュプリケートで行った。全ての真菌に由来する純粋なゲノムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて得た。ＬＡＭＰ感受性試験を、５５分間にわたって６４℃で、９６ウェルプレート中のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）において行った。アンプリコン特異的アニーリング温度を、−０．１℃／秒の上昇速度での９８℃から６５℃への冷却中に決定した。リアルタイムＬＡＭＰアッセイを、５μｌの１倍濃度の等温マスターミックス（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）、０．４μＭの各エクスターナルプライマー、１．６μＭの各インターナルプライマー、及び０．８μＭの各ループプライマー（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈによって合成される）及び２．５μｌのゲノムＤＮＡを含有する１０μｌの反応混合物中で行った。
【００７５】
【表５】
2021512609.tif 000008
【００７６】
芝草サンプル中の真菌病原体を検出する方法
サンプル収集
芝の根を含む芝サンプルの芝を、真菌病原体が予想される場所において収集する。芝草も症状を示すことがある。芝サンプルを、透明な５０ｍｌのチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れ、使用するまで−２０℃で貯蔵する。ＤＮＡを、Ｐｌａｎｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）を用いて抽出する。芝サンプルの１ｃｍ3の立方体を、１ｍｌの溶解緩衝液（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）を含むビジューチューブに入れる。ビジューチューブを１分間にわたって振とうすることによって、芝サンプルの均質化を行う。１０μｌの体積の溶解物を、備えられた希釈チューブ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）に移し、振とうすることによって激しく混合する。その後、希釈された溶解物を、鋳型として定義する。
【００７７】
ＬＡＭＰ反応
ある実施形態において、ＬＡＭＰ反応を、約６０℃〜約７０℃、例えば、約６４℃〜約６７℃、又は約６４℃〜約６６℃で行う。特定の例において、ＬＡＭＰ反応を、６４℃で行う。
【００７８】
ある実施形態において、ＬＡＭＰ反応を、約１５〜約４５分間、例えば、約２０分間〜約４０分間、又は約２５分間〜約３５分間にわたって進行させる。
【００７９】
ある実施形態において、本発明に係るＬＡＭＰ反応におけるプライマーの濃度は、フォワード（ＦＩＰ）及びリバース（ＢＩＰ）インナープライマーについて、１．４〜１．８μＭ、より特定的に、１．６μＭ、フォワード（Ｆ３）及びリバース（Ｂ３）アウタープライマーについて、０．２〜０．４μＭ、より特定的に、０．４μＭ、及び０．４〜０．８μＭ、より特定的に、０．８μＭのループフォワード（ＬＦ）及び／又はループバック（ＬＢ）プライマーであり、これらは、芝サンプル中に存在する核酸の増幅を加速させ、このような芝サンプル中に存在し得る何らかの標的真菌ＤＮＡの検出時間を減少させるのに有用である。
【００８０】
ＬＡＭＰアッセイの反応に有用な好適な緩衝系としては、以下が挙げられる：
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製の１倍等温増幅緩衝液パック（１Ｘ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐａｃｋ）
２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ
１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4
５０ｍＭのＫＣｌ
２ｍＭのＭｇＳＯ4
０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０
（ｐＨ８．８（２５℃））
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製の１倍等温増幅緩衝液パック（１Ｘ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ  Ｐａｃｋ）
２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ
１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4
１５０ｍＭのＫＣｌ
２ｍＭのＭｇＳＯ4
０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０
（ｐＨ８．８（２５℃））
【００８１】
ＬＡＭＰアッセイの反応に有用な好適な酵素系（ＤＮＡポリメラーゼなど）としては、以下が挙げられる：
【００８２】
【表６】
2021512609.tif 000009
【００８３】
一実施形態において、ＬＡＭＰ反応を、乾燥した試薬（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）を用いて試験片中でＧｅｎｉｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）において行う。一実施形態において、試験片は、８つの１５０μｌのウェル（アッセイのために２つの対照及び６つ）を有する。リアルタイムＬＡＭＰアッセイを、１５μｌの１倍濃度の等温マスターミックス（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）、０．４μＭの各エクスターナルプライマー、１．６μＭの各インターナルプライマー、及び０．８μＭの各ループプライマー（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈによって合成される）（表１のプライマーセットの少なくとも１つから選択される）を含有する２５μｌの反応混合物中で行う。鋳型を加える前に、凍結乾燥された反応片を、２２μｌの再懸濁緩衝液（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）中で再懸濁させる。全ての試験片は、Ｏｐｔｉｇｅｎｅによって提供される陰性対照及び陽性植物対照プライマーセットを含む。全てのアッセイについて、反応及びウェル当たり３μｌの鋳型を加える。反応を３０〜５５分間にわたって６４℃に保持した後、アニールプログラムを行う。アニールプログラムの温度プロファイルを、−０．１℃／秒の上昇速度で９８℃から６５℃への冷却中に決定する。
【００８４】
等温マスターミックスは、アンプリコンのリアルタイム検出を可能にするために蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素を含有する。アッセイを、反応時間、温度、及び反応当たりに加えられるＤＮＡの体積について最適化する。
【００８５】
６４℃での増幅段階中に取得される蛍光データが、増幅時間として報告される。アニール段階中に取得される蛍光微分データ（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｄａｔａ）が、アニーリング温度として報告される。
【００８６】
或いは、ＬＡＭＰアッセイ反応は、アニールプログラムを含まず、その場合、ｐＨ感受性指示色素を用いて、標的真菌ＤＮＡの存在を評価することができる。いくつかの例において、ｐＨ感受性指示色素は、可視光中で検出可能な有色色素である。特定の例において、有色色素は、クレゾールレッド、フェノールレッド、ｍ−クレゾールパープル、ブロモクレゾールパープル、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、チモールブルー又はナフトールフタレインを含む。他の例において、ｐＨ感受性指示色素は、蛍光指示色素である。特定の例において、蛍光色素は、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、３，６−ジアセトキシフタロニトリル、６，８−ジヒドロキシ−ｌ，３−ピレンジスルホン酸、又は５−（及び−６）−カルボキシルセミナフトローダフルオル（ｓｅｍｉｎａｐｈｔｈｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ）を含む。
【００８７】
上記の手順にしたがって、芝サンプル中の真菌病原体ＤＮＡ（表３）の存在の検出は、関連する芝の病害（例えば、炭疽病、テイクオールパッチ、サマーパッチ病、雪腐病、赤焼病、葉腐病及びダラースポット病を含む）を引き起こし得る芝真菌病原体の存在を示し得る。早期の及び効率的な検出により、好適な芝草病害管理の決定を行うことができる。
【００８８】
配列表
＜２１０＞    １
＜２１１＞    ９１２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    ダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）
＜４００＞    １
【化１】
2021512609.tif 000010
＜２１０＞    ２
＜２１１＞    ６２９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２−２ＩＩＩＢ
＜４００＞    ２
【化２】
2021512609.tif 000011
＜２１０＞    ３
＜２１１＞    ６１３
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    紅色雪腐病菌変種ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｎｉｖａｌｅ）
＜４００＞    ３
【化３】
2021512609.tif 000012
＜２１０＞    ４
＜２１１＞    ４５５
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）
＜４００＞    ４
【化４】
2021512609.tif 000013
＜２１０＞    ５
＜２１１＞    ５１８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）
＜４００＞    ５
【化５】
2021512609.tif 000014
＜２１０＞    ６
＜２１１＞    ５５０
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    紅色雪腐病菌変種マジュス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ  ｖａｒ．ｍａｊｕｓ）
＜４００＞    ６
【化６】
2021512609.tif 000015
＜２１０＞    ７
＜２１１＞    ４８５
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    マグナポルテ・ポアエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｐｏａｅ）
＜４００＞    ７
【化７】
2021512609.tif 000016
＜２１０＞    ８
＜２１１＞    ５３９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    ベントグラス立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ａｖｅｎａｅ）
＜４００＞    ８
【化８】
2021512609.tif 000017
＜２１０＞    ９
＜２１１＞    ２３６
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２−２ＩＶ
＜４００＞    ９
【化９】
2021512609.tif 000018
＜２１０＞    １０
＜２１１＞    ６０４
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）
＜４００＞    １０
【化１０】
2021512609.tif 000019
＜２１０＞    １１
＜２１１＞    ６５７
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）
＜４００＞    １１
【化１１】
2021512609.tif 000020
＜２１０＞    １２
＜２１１＞    ６６３
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    コレトトリカム・セレアレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｒｅａｌｅ）
＜４００＞    １２
【化１２】
2021512609.tif 000021
＜２１０＞    １３
＜２１１＞    ７０３
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    キャベツピシウム腐敗病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ  ｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ）
＜４００＞    １３
【化１３】
2021512609.tif 000022
＜２１０＞    １４
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    １４
ｇｃｔｃａｇｃｃｔｔ  ｃａａｃｔｔｇｔ            １８
＜２１０＞    １５
＜２１１＞    ４５
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    １５
ｇｃｃｔｔｔｃｃａｇ  ａａｔｃｃｃｔｔｔｇ  ｃｔｔｔｔｔｇａａｇ  ｇａａｃｃｃｔｔｔｃ  ｃｃａｔｃ            ４５
＜２１０＞    １６
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    １６
ｇｇｔｇｇａａｔｔｇ  ａｃａａｇｃｇｔａ            １９
＜２１０＞    １７
＜２１１＞    ４３
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    １７
ａｔｇｃｔｃｃｇｃｇ  ｃａｔｇａｇａｇｔｔ  ｔｔｃｔｔｃｔｃａｔ  ｃｇａｇａｔｃａｇｔ  ｇｔｃ            ４３
＜２１０＞    １８
＜２１１＞    ２１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    １８
ｃｃｇｔｔａａｔａｇ  ｇａａｇｃｃａａｇｇ  ａ            ２１
＜２１０＞    １９
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    １９
ｔｃｃａｔｃａｇｃａ  ｃｃａａｇａｔｃｇ            １９
＜２１０＞    ２０
＜２１１＞    ２０
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２０
ａｔｔｔａｃｃｔｔｇ  ｇｃｃａａｃｃｔｔｔ            ２０
＜２１０＞    ２１
＜２１１＞    ４１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２１
ｇｃｔｔｃａｃａｃｇ  ｃｔｇｃｔｃｃｔｔｔ  ｔｔｇｇａｇｔｃｃｔ  ｃａｇｃｇａｔａｇａ  ｔ            ４１
＜２１０＞    ２２
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２２
ｔｇｔａｇｃｔｇｇｃ  ｔｃｃａｔｔａｇｔ            １９
＜２１０＞    ２３
＜２１１＞    ４１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２３
ｇｇｇｇｔａｇｇｇｇ  ｔｃｃｃａａｔｃａｔ  ｔｔｔｔｇｃａｃａｃ  ｃｔｔｔｔｇｃｔｃｔ  ｔ            ４１
＜２１０＞    ２４
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２４
ｔａｇｃｔｇｇａｔｃ  ｔｃａｇｔｇｔｔａｔ  ｇｃ            ２２
＜２１０＞    ２５
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２５
ｃｔｃｃｃａｔｃｃａ  ｔｇｔｃｔｃｔｇｃ            １９
＜２１０＞    ２６
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２６
ａａｔｇｔｇｔｇａａ  ｇｃｃｃｇａａｇ            １８
＜２１０＞    ２７
＜２１１＞    ４２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２７
ｇｃｔｔｃｃｃｔｇａ  ｃｇｇｃｔｔｃｔｃｔ  ｔｔｔｃｔｃａｇａｇ  ｔｔｇｃｃｇｔｔｇｔ  ａｇ            ４２
＜２１０＞    ２８
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２８
ｇｔｃｇｃａｇａｇｇ  ａａｔｃｔａａｃａｔ  ａａ            ２２
＜２１０＞    ２９
＜２１１＞    ４４
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ２９
ａｇｇａａｃｔｇｃｇ  ａｇｔｃｇｇｔｔａｔ  ｔｇｔｔｔｔｔａｃａ  ｇｇｃａｇａｃｃａｔ  ｃｔｃｃ            ４４
＜２１０＞    ３０
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３０
ａｃａｇｔａｃｔｇａ  ｃａｔｔｃｔｇｃｃａ  ａｔ            ２２
＜２１０＞    ３１
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３１
ａｃａｃｔｃｃａｔｃ  ｇｃｔｇｔｃａａｇ            １９
＜２１０＞    ３２
＜２１１＞    ２０
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３２
ｔｇａａｃｔｃｃａｔ  ｃｔｃｇｔｃｃａｔａ            ２０
＜２１０＞    ３３
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３３
ｔｃｇｔａｔｇａｇｃ  ａｃｃａａｇｇａ            １８
＜２１０＞    ３４
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３４
ｇａｔｇｔｔｃａａｇ  ｃｇｔｇｔｃａｇｃ            １９
＜２１０＞    ３５
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３５
ｇｃｔｇｇｃｃｔｔｇ  ａｔｇｔｔｇｔｔｃ            １９
＜２１０＞    ３６
＜２１１＞    ４２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３６
ｃｇｇｔａａｃｔｃｇ  ａｃｔｇｃｃａｔｃｃ  ｔｔｔｔｃｃｔｔａｃ  ｇａｃｇｇａａｃａｔ  ｇｇ            ４２
＜２１０＞    ３７
＜２１１＞    ４４
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３７
ｃｃｃｔｔｔｇｇｔｇ  ｇｇａｔｇｔｃａｃａ  ａｔｔｔｔｃｔｃｇｔ  ｃｇｔａｃｔｔｃｇｔ  ｔｇａｇ            ４４
＜２１０＞    ３８
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３８
ｔｔｇａａｇｔａｇａ  ｃｇｃｔｃａｔｇｃ            １９
＜２１０＞    ３９
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ３９
ｇｔｇｃｔｇｃｔｔｔ  ｃｔｇｇｔａｔｇａ            １９
＜２１０＞    ４０
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４０
ｃｇｔｔｃａｃｃｇｃ  ｔｃｔｇａｃａｔ            １８
＜２１０＞    ４１
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４１
ｃｇｃｔａｇａａａｔ  ｇｇｔｃｔｇｃｃｔ            １９
＜２１０＞    ４２
＜２１１＞    ４３
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４２
ｔｔｃｇｔｃｃｔｇｃ  ｔｔｇｔｇｇｃｔｃｔ  ｔｔｔｇｃｃｇｔｔｇ  ｔａｃｃｔｇｔａｔｃ  ａａｔ            ４３
＜２１０＞    ４３
＜２１１＞    ４１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４３
ｔｔｇｃｔｇｔｃｇａ  ｇａｃｃｇｔｇｃｔｔ  ｔｔｔｇａｃｃｃｇｔ  ａｃｔｇａｃｔｔｃｔ  ｔ            ４１
＜２１０＞    ４４
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４４
ｇｇｔａａｃｃａａａ  ｔｃｇｇｔｇｃｔ            １８
＜２１０＞    ４５
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４５
ｇｃｇａｇｔｃｇｇｔ  ｔａｔｔｇａａｃｔ            １９
＜２１０＞    ４６
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４６
ｔｔｔｃｇｔｃｇｃａ  ａａｇｇｔｃａｃｔ            １９
＜２１０＞    ４７
＜２１１＞    ２１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４７
ａａｃａａｇｃａａｇ  ｇｃｔａａｃａｃｔｃ  ｔ            ２１
＜２１０＞    ４８
＜２１１＞    ４１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４８
ｇｇｇｔｔｔｇａｃｃ  ｇｃｃｇａｇｔｔｔｔ  ｔｔｇｃｇｔａｃａａ  ｃｔｃｃｇａｔａｃｔ  ｃ            ４１
＜２１０＞    ４９
＜２１１＞    ４３
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ４９
ｇｇａａｔｃｔｇｇｃ  ａａａａｇｇｇｔｇｇ  ａｔｔｔｔｔｇｃｔｃ  ａｃｔｇｇａｇａｔｇ  ｇｔｔ            ４３
＜２１０＞    ５０
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５０
ｔｔｇａａｇｔａｇａ  ｃｇｃｔｃａｔｇｃ            １９
＜２１０＞    ５１
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５１
ｇｃｔｇｃｔｔｔｃｔ  ｇｇｔａｃｇａａ            １８
＜２１０＞    ５２
＜２１１＞    ２０
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５２
ｔｃａｃｃｇｃｔｃｔ  ｇａｃａｔａｔｔｇｇ            ２０
＜２１０＞    ５３
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５３
ｇｃｔｇｇａｇａｔｇ  ｇｔｔｔｇｃｃｔ            １８
＜２１０＞    ５４
＜２１１＞    ４２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５４
ｇｇａｇａｔｃｃｔｃ  ｇｇｃｃａｃａｔｇｔ  ｔｔｔｃｇａｇｇｔａ  ｃｃｇｔｔｇｔａａｃ  ｔｇ            ４２
＜２１０＞    ５５
＜２１１＞    ４２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５５
ｔｔｇｃｔｇｔｃｇａ  ｇａｃｃｇｔｇｃｔｔ  ｔｔａｃｃｇｔｇａｔ  ｃａｔｃｃａｔｃａｔ  ｔｇ            ４２
＜２１０＞    ５６
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５６
ｇａｃｇａａｇｔａｃ  ｇａｃｇａｇｔｔｃ            １９
＜２１０＞    ５７
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５７
ｃｔｃｃａｃｔｔｃｔ  ｔｃａｔｇｇｔｃｇ            １９
＜２１０＞    ５８
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５８
ｃｇａｔａｇｃｃｇｔ  ｇｇｔａａｇｇｔｃ            １９
＜２１０＞    ５９
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ５９
ａｇｇｃａｇｃｃａｔ  ｃａｔｇｔｔｃｔｔ            １９
＜２１０＞    ６０
＜２１１＞    ４４
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６０
ｇｃｃｃａａｃｃｔａ  ｇａａｇｇｃａｃｔａ  ａｃｔｔｔｔｔｃｃｔ  ｃｇａｃｃｔｃｃｔｔ  ｃａｔｇ            ４４
＜２１０＞    ６１
＜２１１＞    ４１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６１
ｇｇｔｃａｇｇｔａｇ  ｃｇａｃｃｇｔｔｇｔ  ｔｔｔｇａｇｔｔｇａ  ｃｃｃａｇｃａｇａｔ  ｇ            ４１
＜２１０＞    ６２
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６２
ｔｔｇｔａｇｇｇｃｔ  ｃａａｃａａｃｃ            １８
＜２１０＞    ６３
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６３
ｇａｃｇｃａｇｔｔｃ  ｔｃｇａｔｇｔｃ            １８
＜２１０＞    ６４
＜２１１＞    ４４
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６４
ｇｇｃａｃｃｃｔｔｔ  ｔｇａｔｃｔｃｃａａ  ｇａｔｔｔｔｇｇａａ  ｃｇａｃｃｇａｇａａ  ｔｇｔｇ            ４４
＜２１０＞    ６５
＜２１１＞    ４０
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６５
ａｔａｃｃｇｇｃａｃ  ｃｇｇｔｔｃｃｔｔｔ  ｔｔｇａｔｇｃｇａｇ  ｔｇｔｃｔｔｃａｇｇ            ４０
＜２１０＞    ６６
＜２１１＞    ２０
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６６
ｃｃｇｔｇａａｇａａ  ｔａｃｃｃｃｇａｔｃ            ２０
＜２１０＞    ６７
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６７
ｃｃｇａｇｃｇａｇｔ  ｇｇｇｔａａｔｃ            １８
＜２１０＞    ６８
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６８
ａａｔｔａｇｃａｃａ  ａｃｃｔｇｇｔａａｔ  ｃａ            ２２
＜２１０＞    ６９
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ６９
ａｃｔｔａａｔｃｃａ  ｇｇａｇｃｔｃｔｃａ  ｔａ            ２２
＜２１０＞    ７０
＜２１１＞    ４８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７０
ｇｃｃａｔａｔｃｔｇ  ｇａｇｃａｃｃａａｔ  ｃａｔｔｔｔａａｔｇ  ｔｔｇｔｔｇｔａａｃ  ａｇｃａｃａｔｇ            ４８
＜２１０＞    ７１
＜２１１＞    ４７
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７１
ａａｔｃａｇｇｔｇｃ  ｔｇｇｔａｃａｇｇｔ  ｔｇｔｔｔｔａａｔｃ  ｔａｃｔｇａａｇｇｔ  ｃｃｔｇａｇｔ            ４７
＜２１０＞    ７２
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７２
ａａｃｃａｃｃａａｔ  ｔａａｔａｃａｇｇｃ  ａｔ            ２２
＜２１０＞    ７３
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７３
ａｃｃａｔｔａｔｃａ  ａｇｔｇｔａｃａａｇ  ｃａ            ２２
＜２１０＞    ７４
＜２１１＞    ２１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７４
ｔｇｔａｃｇａｔｃａ  ｃｔｇｔｔａｇｃａｔ  ｃ            ２１
＜２１０＞    ７５
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７５
ｃｔｃｇａｃｃａｇｔ  ｔｃａａｇｃａｇ            １８
＜２１０＞    ７６
＜２１１＞    ４１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７６
ｇｇｃｇｔｇｃｃｃａ  ｔｃｔｔｔｇｇｔａｔ  ｔｔｔｇｔｇｔｃｃａ  ｃｇａａｃｃｔｇａａ  ｇ            ４１
＜２１０＞    ７７
＜２１１＞    ４３
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７７
ｇｇｔｇａｃａｇｇｇ  ｔｃｃｔｇｇｔｃｔｔ  ｔｔｔｇｔｇｇｃｔｔ  ｇｔｔａａｇｇａｔｇ  ａｃａ            ４３
＜２１０＞    ７８
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７８
ｔｔｇａｃａｔｇｔｇ  ｇｇａｇｃａｃｇ            １８
＜２１０＞    ７９
＜２１１＞    ２０
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ７９
ｔｃｇｔｃｇｔｇａｔ  ａａｔｇｃｔｇａｇｇ            ２０
＜２１０＞    ８０
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８０
ｃｇｔｔｃｃａｇａｔ  ｇｔｔｃｔｃｇａｃ            １９
＜２１０＞    ８１
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８１
ｇｔｃａａｇｇａｃｇ  ａｃｇｔａａｃｇ            １８
＜２１０＞    ８２
＜２１１＞    ４７
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８２
ｇｃｇｔａｃｔａｃｃ  ｔｃｃａｇｇｔｔｃｇ  ｔａｔｔｔｔｇａｇｃ  ａｔｔｇｔｔａｇｔａ  ｃｃｔｔｃｃａ            ４７
＜２１０＞    ８３
＜２１１＞    ４１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８３
ａｔｇｔｃｃａｃｇｃ  ｃｇａａｇａｔｇｇｔ  ｔｔｔｃｔｇａｇｃａ  ｔｃａｔｃａｃｇａｃ  ｇ            ４１
＜２１０＞    ８４
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８４
ａａｃａｃｔｇａｃｇ  ｇａｔｃｔｇｃｔｔ            １９
＜２１０＞    ８５
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８５
ｔｇａｃａｇｇｇｔｃ  ｃｔｇｇｔｃｔｔ            １８
＜２１０＞    ８６
＜２１１＞    １８
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８６
ｃａａａｃｇａｇａｇ  ｔｃｃｃａａａｃ            １８
＜２１０＞    ８７
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８７
ａｔｃｃａｇｔｇｔｃ  ｔａｔａａｔｃｔｇｔ  ａｇ            ２２
＜２１０＞    ８８
＜２１１＞    ４４
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８８
ｇａｇｔｃａｇｔｔｃ  ｇｔａｔｇｃｔｇｔｇ  ａｇｔｔｔｔｔａａｃ  ａｇｃｃａａｇａｇｃ  ａａｇｃ            ４４
＜２１０＞    ８９
＜２１１＞    ４４
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ８９
ｃｇｃａａｃａｃａｇ  ｇｇｃａｃｃａａｃｔ  ｔｔｔｇｔｇｃａｇｔ  ａｔｇｔａａｇａａｇ  ｔｇｇｔ            ４４
＜２１０＞    ９０
＜２１１＞    １９
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ９０
ｇｇｃｔａｃｔｇａｇ  ｇａｇｇｔａｇｇｔ            １９
＜２１０＞    ９１
＜２１１＞    ２０
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列
＜２２０＞
＜２２３＞    真菌検出用のプライマー
＜４００＞    ９１
ａｇａａｃａｇｃａｃ  ａａａｇａｇｃａｇａ            ２０
【配列表】
2021512609000001.app
【国際調査報告】
2021512609.tif 000023
2021512609.tif 000024
2021512609.tif 000025
2021512609.tif 000026
2021512609.tif 000027
2021512609.tif 000028
2021512609.tif 000029
2021512609.tif 000030
2021512609.tif 000031