(57)【要約】【課題】  ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１とのその融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び用途を提供する。【解決手段】  胃抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）抗体及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）とのその融合タンパク質、及びその医薬組成物が、本明細書において提供される。非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、２型糖尿病又は肥満の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するために、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１とのその融合タンパク質を使用するための方法も、本明細書において提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸配列を含む、ヒトＧＩＰＲに特異的に結合する抗体であって、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１５；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、及び配列番号１６；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１７；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８、配列番号２３、及び配列番号２６；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号２９；及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３０
から選択される、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８、配列番号２３、及び配列番号２６
から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、及び配列番号１６；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号２９
から選択される、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１７；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３０
から選択される、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７から選択される、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含むか又はさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０から選択される、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号１及び配列番号１８、配列番号４及び配列番号１８、配列番号７及び配列番号２３、配列番号１０及び配列番号２６、配列番号１３及び配列番号２６、及び配列番号１５及び配列番号２６から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号２及び配列番号１９、配列番号５及び配列番号２１、配列番号８及び配列番号２４、配列番号１１及び配列番号２７、及び配列番号１６及び配列番号２９から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号３及び配列番号２０、配列番号６及び配列番号２２、配列番号９及び配列番号２５、配列番号１２及び配列番号２８、配列番号１４及び配列番号２８、及び配列番号１７及び配列番号３０から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖可変ドメイン配列：配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１；及びいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；及び
ｂ．重鎖可変ドメイン配列：配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０；及びいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
から選択される、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドコード配列が、１又は２つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：
ａ．軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、及び配列番号９１；及びいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列；及び
ｂ．重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１００；及びいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号６１及び配列番号７２、配列番号６２及び配列番号７３、配列番号６３及び配列番号７４、配列番号６４及び配列番号７４、配列番号６５及び配列番号７５、配列番号６６及び配列番号７６、配列番号６７及び配列番号７７、配列番号６８及び配列番号７７、配列番号６９及び配列番号７８、配列番号７０及び配列番号７９、及び配列番号７１及び配列番号８０から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、及び配列番号７７から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号６２及び配列番号７３、配列番号６３及び配列番号７４、配列番号６４及び配列番号７４、配列番号６６及び配列番号７６、配列番号６７及び配列番号７７、及び配列番号６８及び配列番号７７から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む、請求項１〜請求項１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖定常アミノ酸配列：配列番号１０１及び配列番号１０２；及び
ｂ．重鎖定常アミノ酸配列：配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１２４
から選択される、請求項１〜請求項１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、マウスＧＩＰＲ抗体又はヒト化ＧＩＰＲ抗体である、請求項１〜請求項１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、ＧＩＰＲモノクローナル抗体である、請求項１〜請求項１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、以下のリスト：配列番号６１及び配列番号７２、配列番号６２及び配列番号７３、配列番号６３及び配列番号７４、配列番号６４及び配列番号７４、配列番号６５及び配列番号７５、配列番号６６及び配列番号７６、配列番号６７及び配列番号７７、配列番号６８及び配列番号７７、配列番号６９及び配列番号７８、配列番号７０及び配列番号７９、及び配列番号７１及び配列番号８０から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含むモノクローナル抗体である、請求項１〜請求項１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体から選択される、請求項１〜請求項２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、ヒトＧＩＰのシグナル伝達を低減する際に、約１ｎＭ〜２００ｎＭ又は１ｎＭ〜１００ｎＭのＩＣ５０を有する、請求項１〜請求項２１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
ＧＬＰ−１融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＩＰＲ抗体、及び１、２、３、４、５、６、７又は８つのＧＬＰ−１フラグメント又は逆ＧＬＰ−１フラグメントを含み；前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合するか、又は逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、前記ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合するという構造的特徴を有するＧＬＰ−１融合タンパク質。
【請求項２４】
前記融合タンパク質が、ＧＩＰＲ抗体及び１、２、３又は４つのＧＬＰ−１フラグメントを含み；前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記融合タンパク質が、ＧＩＰＲ抗体及び１、２、３又は４つの逆ＧＬＰ−１フラグメントを含み；前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合する、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記融合タンパク質が、ＧＩＰＲ抗体及び２つのＧＬＰ−１フラグメントを含み；前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記融合タンパク質が、ＧＩＰＲ抗体及び２つの逆ＧＬＰ−１フラグメントを含み；前記融合タンパク質が、ペプチドリンカーを介して、逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端と結合する、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記ＧＩＰＲ抗体、ＧＬＰ−１フラグメント及びペプチドリンカーが、以下の方法のうちの１つにおいて融合されて前記融合タンパク質を形成し：
ペプチドリンカーを介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端が、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖のアミノ末端に融合され：Ｎ’−ＧＬＰ−１−リンカー−Ｒ−Ｃ’；
ペプチドリンカーを介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端が、ＧＩＰＲ抗体の重鎖のアミノ末端に融合され：Ｎ’−ＧＬＰ−１−リンカー−Ｒ−Ｃ’；
ここで：Ｎ’が、前記融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、前記融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、ＧＬＰ−１が、ＧＬＰ−１フラグメントを表し、Ｒが、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＩＰＲ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ポリペプチドリンカーを表す、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２から独立して選択される、完全長、部分的、又は反復アミノ酸配列を含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質。
【請求項３０】
前記ＧＬＰ−１フラグメントが、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか；又は前記逆ＧＬＰ−１フラグメントが、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、及び配列番号１２３から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＩＰＲ抗体、又は請求項２３〜３０のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
薬学的に許容できる担体と混合された、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＩＰＲ抗体又は請求項２３〜３０のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項３５】
非アルコール性脂肪肝疾患を予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＩＰＲ抗体又は請求項２３〜２９のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項３６】
２型糖尿病を予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＩＰＲ抗体又は請求項２３〜２９のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項３７】
肥満及び肥満関連疾患を予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＩＰＲ抗体又は請求項２３〜２９のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項３８】
非アルコール性脂肪肝疾患、肥満、又は２型糖尿病のうちの２つ以上の疾患を同時に予防又は処置するための薬剤の調製における、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＩＰＲ抗体又は請求項２３〜２９のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項３９】
前記医薬組成物が、静脈内に又は皮下に投与されるものである、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
胃抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）抗体及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）とのその融合タンパク質、及びその医薬組成物が、本明細書において提供される。非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、２型糖尿病又は肥満の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するために、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１とのその融合タンパク質を使用するための方法も、本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００２】
消化管抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）は、摂食後に腸管Ｋ細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンであり、４２−及び３０−アミノ酸ペプチドの２つのアイソフォームを含む。ＧＩＰは、膵β細胞の表面における胃抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）を活性化することによってインスリン分泌の生理学的過程に関与する（非特許文献１；非特許文献２）。ＧＩＰの古典的な生物学的機能は、ＧＬＰ−１に類似しているため、これらのペプチドホルモンは、インクレチンと総称される。ＧＩＰＲは、膵臓、骨、心臓、胃、腸及び脂肪組織を含む多くの組織に広く分布しており（非特許文献３）、この多様な分布は、ＧＩＰ／ＧＩＰＲ経路が、血糖調節を超える生物学的機能を有することを示唆している。実験的証拠は、ＧＩＰ／ＧＩＰＲシグナル伝達経路が、これらの組織における脂質代謝に少なくとも密接に関係していることを示す（非特許文献４）。実験データはまた、肥満又は糖尿病患者において血液循環ＧＩＰ濃度の増加があることも示す（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。ＧＩＰＲシグナルをＧＩＰＲ阻害剤でブロックした後、有意な体重減少、インスリン抵抗性の低下及びさらに２型糖尿病の改善が、高脂肪食によって誘導された肥満マウスにおいて観察された（非特許文献２）。
【０００３】
長時間作用型グルカゴン様ペプチド−１類似体（ＧＬＰ−１類似体）は、新世代の２型糖尿病薬である（非特許文献９；非特許文献１０）。長時間作用型ＧＬＰ−１薬はまた、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療のための臨床試験において試験されている。研究は、長時間作用型ＧＬＰ−１薬が、ＮＡＦＬＤの患者において、肝組織モルホロジーの改善、アラニンアミノトランスフェラーゼ／グルタチオンアミノトランスフェラーゼ比及び肝臓脂肪含量の低下に有意な効果を与えることを示す（非特許文献１１；非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６，８４６，６３４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６９６，２４５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２０２５１２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０２０２９９５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／００３８２９１号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００４／０００９５０７号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３／００３９９５８号明細書
【特許文献８】米国特許第６７０３１９９号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号明細書
【特許文献１０】米国特許第４９４６７７８号明細書
【特許文献１１】米国特許第４３３１６４７号明細書
【特許文献１２】米国特許第４５１８５８４号明細書
【特許文献１３】米国特許第４７３７４６２号明細書
【特許文献１４】米国特許第５０１１９１２号明細書
【特許文献１５】ＰＣＴ出願国際公開第９３／１０１５１号パンフレット
【特許文献１６】米国特許第５４５７０３５号明細書
【特許文献１７】米国特許第４７５１１８０号明細書
【特許文献１８】米国特許第４９３５２３３号明細書
【特許文献１９】ＰＣＴ出願国際公開第９４／１０３０８号パンフレット
【特許文献２０】米国特許第４６４０８３５号明細書
【特許文献２１】米国特許第４４９６６８９号明細書
【特許文献２２】米国特許第４３０１１４４号明細書
【特許文献２３】米国特許第４６７０４１７号明細書
【特許文献２４】米国特許第４７９１１９２号明細書
【特許文献２５】米国特許第４１７９３３７号明細書
【特許文献２６】米国特許第６１３３４２６号明細書
【特許文献２７】米国特許第６２１０９２４号明細書
【特許文献２８】国際公開第００／１６７９７号パンフレット
【特許文献２９】国際公開第９８／０８５３１号パンフレット
【特許文献３０】国際公開第９８／１９６９８号パンフレット
【特許文献３１】米国特許出願公開第２０１７／０２７５３７０Ａ１号明細書
【特許文献３２】米国特許第６，００６，７５３号明細書
【特許文献３３】国際公開第９９／６４０６０号パンフレット
【特許文献３４】国際公開第００／０７６１７号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２４４０−２４４５
【非特許文献２】Ｒａｖｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８：１９７６０−７２
【非特許文献３】Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８：１９７６０−７２
【非特許文献４】Ｙｉｐ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｅ，２０００，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６６：９１−１０３
【非特許文献５】Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １４：１５−２４
【非特許文献６】Ｆｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０１：２４９−２５６
【非特許文献７】Ｓａｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５５：３２９−３３６
【非特許文献８】Ｖｉｌｓｂｏｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８：２７０６−２７１３
【非特許文献９】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ２５：１７４４−７６５８
【非特許文献１０】Ｇａｌｌｗｉｔｚ，２０１５，Ｅｕｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．１１：２１−２５
【非特許文献１１】Ｓａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２７：４０１−６
【非特許文献１２】Ｐｏｒｔｉｌｌｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ａｎｄ  Ｃｕｓｉ，２０１６，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：９
【非特許文献１３】Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５３：１２１−１２９
【非特許文献１４】Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４
【非特許文献１５】Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｃｈ．７（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐａｕｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）
【非特許文献１６】Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１
【非特許文献１７】Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６
【非特許文献１８】Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６
【非特許文献１９】Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−８３
【非特許文献２０】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−４８
【非特許文献２１】Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−２３
【非特許文献２２】Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
【非特許文献２３】Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６
【非特許文献２４】Ｄｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．３：１５３−６５
【非特許文献２５】Ｓｋａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．１８：８４７−８５４
【非特許文献２６】Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１２６−１１３６
【非特許文献２７】Ｈａｒｒｉｓ，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４
【非特許文献２８】Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１−２．７．１２  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３
【非特許文献２９】Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）”，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）
【非特許文献３０】Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７
【非特許文献３１】Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）
【非特許文献３２】Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）
【非特許文献３３】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３
【非特許文献３４】Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３
【非特許文献３５】Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５０−３６８
【非特許文献３６】Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：７２４−７３３
【非特許文献３７】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：７−８８
【非特許文献３８】Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１
【非特許文献３９】Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９
【非特許文献４０】Ｌｕｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００−０６
【非特許文献４１】Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３
【非特許文献４２】Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８
【非特許文献４３】Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０
【非特許文献４４】Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３
【非特許文献４５】Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９
【非特許文献４６】Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４
【非特許文献４７】ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７
【非特許文献４８】Ｎｉｓｏｎｏｆｆｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０
【非特許文献４９】Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９
【非特許文献５０】Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）
【非特許文献５１】Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｔｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００３），ｐａｇｅｓ  ２．８．１−２．８．１０  ａｎｄ  ２．１０Ａ．１−２．１０Ａ．５
【非特許文献５２】Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６
【非特許文献５３】Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）
【非特許文献５４】Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５
【非特許文献５５】Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４２：１３３
【非特許文献５６】Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ  ３７：７３
【非特許文献５７】Ｃｒａｉｋ，１９８５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３：１２−１９
【非特許文献５８】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献５９】Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４
【非特許文献６０】Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５
【非特許文献６１】Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７
【非特許文献６２】Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ  １０．１９．１−１０．１９．１１
【非特許文献６３】Ｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１
【非特許文献６４】Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９
【非特許文献６５】Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１
【非特許文献６６】Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８
【非特許文献６７】Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７
【非特許文献６８】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−２４５
【非特許文献６９】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２
【非特許文献７０】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８
【非特許文献７１】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６
【非特許文献７２】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４
【非特許文献７３】Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７
【非特許文献７４】Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６
【非特許文献７５】Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７
【非特許文献７６】Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９
【非特許文献７７】Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０
【非特許文献７８】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９
【非特許文献７９】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４３５５−４３５８
【非特許文献８０】Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））
【非特許文献８１】Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，Ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））
【非特許文献８２】Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５
【非特許文献８３】Ｎｙｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：４６３−４６９
【非特許文献８４】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６
【非特許文献８５】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１
【非特許文献８６】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４
【非特許文献８７】Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７
【非特許文献８８】Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７
【非特許文献８９】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３１
【非特許文献９０】Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０
【非特許文献９１】Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５
【非特許文献９２】ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１
【非特許文献９３】Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５
【非特許文献９４】Ｆｕｒｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３：ｅ３１６３
【非特許文献９５】Ｄｅｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｓｕｒｇ  Ｎｕｔｒ  ５：５１５−５１８
【非特許文献９６】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＢＭＪ  Ｏｐｅｎ  ３：ｅ００３９９５
【非特許文献９７】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄ．（１９８０）ａｎｄ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
例えば、融合タンパク質として２つを合わせた組合せを含め、ＧＬＰ−１薬及びＧＩＰＲ阻害剤を、一緒に使用することができる場合、この組合せは、血糖を低下させ、また脂質代謝に干渉しながら、インスリン抵抗性を改善すると同時に、過剰な脂肪蓄積（肥満）を減少させる効果を達成し得る。これに関して、ＧＬＰ−１部分が、耐糖能を改善し、食欲を減退させ、血糖を低下させ、体重を減少させるのに使用され得る一方；ＧＩＰＲ抗体部分は、脂肪のさらなる蓄積を減少させ、肝機能を改善するのに使用され得る。ＧＩＰＲ抗体の脂肪減少効果及びＧＬＰ−１の体重減少効果を用いて、非アルコール性脂肪肝疾患／非アルコール性脂肪性肝炎を相乗的に処置し得る。本開示は、非アルコール性脂肪肝疾患／非アルコール性脂肪性肝炎、２型糖尿病及び肥満のうちの１つ又は複数の疾患に罹患した患者に利益を与える融合タンパク質薬剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体であって、ＧＩＰＲの阻害剤である抗体が、本明細書において提供される。
【０００８】
１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸配列を含む、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体であって、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１５；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、及び配列番号１６；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１７；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８、配列番号２３、及び配列番号２６；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号２９；
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３０
から選択される、抗体も、本明細書において提供される。
【０００９】
ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体、及び１、２、３、４、５、６、７又は８つのＧＬＰ−１フラグメントを含むＧＬＰ−１融合タンパク質であって；融合タンパク質が、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合するか、又はＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖のカルボキシ末端と結合する、ＧＬＰ−１融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【００１０】
ＧＩＰＲ抗体及び２つのＧＬＰ−１フラグメントを含むＧＬＰ−１融合タンパク質であって；融合タンパク質が、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖のアミノ末端と結合し：Ｎ’−ＧＬＰ−１−リンカー−Ｒ−Ｃ’；又はＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端が、ＧＩＰＲ抗体重鎖のアミノ末端に結合し：Ｎ’−ＧＬＰ−１−リンカー−Ｒ−Ｃ’；ここで：Ｎ’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、ＧＬＰ−１が、ＧＬＰ−１フラグメントを表し、Ｒが、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列であり、リンカーが、ペプチドリンカーを表す、ＧＬＰ−１融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【００１１】
本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。
【００１２】
本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。
【００１３】
本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、本明細書において提供される。
【００１４】
本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、本明細書において提供される。
【００１５】
本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００１６】
本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
【００１７】
本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。非アルコール性脂肪性肝炎疾患の処置、予防又は改善のための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体の使用が、本明細書においてさらに提供される。
【００１８】
非アルコール性脂肪肝疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【００１９】
２型糖尿病を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体の使用が、本明細書において提供される。
【００２０】
２型糖尿病を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【００２１】
体重を減少させるか、又は肥満及び肥満関連疾患を処置、予防若しくは改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体の使用が、本明細書において提供される。
【００２２】
体重を減少させるか、又は肥満及び肥満関連疾患を処置、予防若しくは改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【００２３】
非アルコール性脂肪肝疾患、肥満、又は２型糖尿病のうちの２つ以上の疾患を同時に処置するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体の使用が、本明細書において提供される。
【００２４】
非アルコール性脂肪肝疾患、肥満、又は２型糖尿病のうちの２つ以上の疾患を同時に処置するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【００２５】
非アルコール性脂肪性肝炎の１つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００２６】
非アルコール性脂肪性肝炎の１つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００２７】
２型糖尿病の１つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００２８】
２型糖尿病の１つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００２９】
肥満の１つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００３０】
肥満の１つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ｈＧＩＰＲへの組み換え発現ｈＧＩＰＲ抗体Ｌ１０Ｈ８（配列番号７０及び配列番号７９を含む）の特異的結合のＦＡＣＳ試験の結果を示す。灰色のピーク及び点線のピークは、陰性対照であり、灰色のピークは、ブランク細胞ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−のバックグラウンドピークを表し、点線のピークは、ブランク細胞ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−に対するＬ１０Ｈ８の負の結合ピークを表し、実線のピークは、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＩＰＲに対するＬ１０Ｈ８の特異的結合ピークを表す。
【図２】直接のｃＡＭＰアッセイ（ＩＣ５０＝７．６ｎＭ、Ｒ２＝０．９９）によって決定した際の、ｈＧＩＰＲシグナル伝達経路のＧＩＰ活性化に拮抗するｈＧＩＰＲ抗体Ｌ７Ｈ６（配列番号６７及び配列番号７７を含む）の濃度阻害曲線を示す。
【図３】直接のｃＡＭＰアッセイ（ＩＣ５０＝１４．９ｎＭ、Ｒ２＝０．９９）によって決定した際の、ｈＧＩＰＲシグナル経路のＧＩＰ活性化に拮抗するＧＩＰＲ抗体／ＧＬＰ−１融合タンパク質ＧＬＰ−１−リンカー−Ｌ７Ｈ６（配列番号６７、配列番号７７、配列番号１０６、配列番号１１１を含む）の阻害曲線を示す。
【図４】レポーター遺伝子アッセイ（ＥＣ５０＝０．０４ｎＭ、Ｒ２＝０．９９）によって決定した際の、ｈＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達経路を活性化するＧＩＰＲ抗体／ＧＬＰ−１融合タンパク質ＧＬＰ−１−リンカー−Ｌ７Ｈ６を試験するためのレポーター遺伝子実験の活性化曲線を示す。
【図５】有効性試験期間中に高脂肪食によって誘導されるＣ５７ＢＬ／６肥満マウスの異なる群における体重変化率の時間曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
本明細書において特に定義されない限り、科学用語及び技術用語は、当業者によって理解される意味を有するものとする。一般に、薬理学、生物学、生化学、細胞及び組織培養、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連する命名法及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
【００３３】
本発明は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示すために標準的な一文字又は三文字略語を使用した。ポリペプチド配列が記載される場合、アミノ基を有する第１のアミノ酸残基（Ｎ’）は、左端にあり、カルボキシル基を有する最後のアミノ酸残基（Ｃ’）は、右端にある、例えば、本発明に係るＧＬＰ−１フラグメント配列：配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９。逆ポリペプチド配列は、アミノ酸がオリジナルに対して逆の順序で配置されたポリペプチド配列、例えば、上記のＧＬＰ−１フラグメント配列から変換された逆ＧＬＰ−１フラグメント配列：配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、及び配列番号１２３を指す。一本鎖及び二本鎖核酸配列の上鎖（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｃｈａｉｎ）の５’末端が左側にあり、それらの３’末端が右側にある。ポリペプチドの特定の部分は、アミノ酸８０〜１３０などのアミノ酸残基数によって表されるか、又はＬｙｓ８０〜Ｌｙｓ１３０などの、その部位の実際の残基によって表され得る。特定のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、参照配列とのその相違を示すことによって表すこともできる。
【００３４】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む分子を指す。これらの用語は、例えば、天然及び人工タンパク質及びタンパク質配列のペプチド類似体（突然変異タンパク質、変異体及び融合タンパク質など）並びに翻訳後、或いは共有結合的に又は非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、モノマー又はポリマーであり得る。
【００３５】
「ポリペプチドフラグメント」という用語は、対応する完全長タンパク質からのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端欠失を有するポリペプチドを指す。例えば、フラグメント長さは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００アミノ酸であり得る。フラグメント長さは、例えば、最大で１０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、又は１０アミノ酸であり得る。フラグメントは、一方の末端又は両方において１つ又は複数のさらなるアミノ酸、例えば、異なる天然タンパク質からのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃ又はロイシンジッパードメイン）又は人工アミノ酸配列（例えば、人工結合配列）をさらに含み得る。
【００３６】
本発明のペプチドは、任意の理由で及び任意の手段によって、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するように親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、（５）他の物理化学的又は機能的特性を与えるか又は調節することによって修飾されたペプチドを含む。類似体は、ポリペプチドの突然変異タンパク質を含む。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然配列中で行われ得る（例えば、分子内接触を形成するポリペプチドのドメインの外部）。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないものである（例えば、アミノ酸の置換は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、又は親配列にその特性又は機能を与えるために必要とされる他の二次的な構造タイプに干渉すべきでない）。
【００３７】
ポリペプチドの「突然変異体」は、アミノ酸配列が、別のポリペプチド配列と比べてアミノ酸配列中の１つ又は複数の残基の挿入、欠失、及び／又は置換を含む。本発明の変異体は、融合タンパク質を含んでいた。
【００３８】
ポリペプチドの「誘導体」は、ポリエチレングリコール、アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、リン酸化、及びグリコシル化などの、例えば他の化学部分への結合によって化学修飾されたポリペプチドである。
【００３９】
特に記載しない限り、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含む抗体、並びにそれらの誘導体、変異体、フラグメント、及び突然変異タンパク質を含み、その例は後述される。
【００４０】
「抗体」という用語は、抗原結合部分、及び任意選択的に、抗原への抗体の結合を促進する立体配座を抗原結合部分が取るのを可能にする足場又はフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗体の例としては、完全抗体、抗体フラグメント（抗体の抗原結合部分など）、抗体誘導体、及び抗体類似体が挙げられる。例えば、抗体は、グラフトされたＣＤＲ又はＣＤＲの誘導体を含む、代替的なタンパク質足場又は人工足場を含み得る。足場としては、限定はされないが、導入される抗体由来の足場、例えば、抗体の三次元構造を安定させるもの、及び例えば、生体適合性ポリマーのための完全に合成の足場が挙げられる。例えば、（非特許文献１３）；（非特許文献１４）を参照されたい。さらに、抗体は、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）又は足場としてフィブリンリガンドを用いる抗体模倣体を含む足場のいずれかであり得る。
【００４１】
抗体は、天然免疫グロブリンなどの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端は、主に抗原認識に関連している約１００〜１１０のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシル末端は、主にエフェクターの効果に関連している定常領域を画定する。ヒト抗体軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、α、又はεに分類され、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥなどの同じタイプの抗原を画定した。軽鎖及び重鎖内で、可変及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。（非特許文献１５）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成し、このようにして完全な免疫グロブリンが、２つの結合部位を有する。
【００４２】
天然免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域又はＣＤＲとしても知られている、３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ基本構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖及び重鎖は、構造ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。全ての構造ドメイン中のアミノ酸の分布は、（非特許文献１６）と一致していた。
【００４３】
特に規定されない限り、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、又は特異的結合についてインタクトな抗体と競合し得る、その抗原結合部分のいずれかを意味する。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術、インタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断によって産生され得る。抗原結合部分としては、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、構造ドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられ、相補性決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重鎖抗体（二重特異性抗体）、三重鎖抗体（三重特異性抗体）、四重鎖抗体（四重特異性抗体）及びポリペプチド特異的抗原に結合する免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
【００４４】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであり；Ｆｖフラグメントは、ＶＨ及びＶＬドメインを有し；ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＶＨ若しくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する（特許文献１及び特許文献２；特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、及び特許文献７；非特許文献１７）。
【００４５】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して結合されて、連続タンパク質抗体を形成する融合タンパク質であり、ここで、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体で折り畳まれて、一価抗原結合部位を形成するのを可能にするのに十分に長い（例えば、非特許文献１８；及び非特許文献１９を参照）。
【００４６】
二重鎖抗体は、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ポリペプチド鎖はそれぞれ、同じ鎖上の２つのドメインの対形成を可能にしないほど短いリンカーによって結合されたＶＨ及びＶＬ領域を含む。したがって、各ドメインが、別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成するのを可能にする（例えば、非特許文献２０；非特許文献２１を参照）。二重鎖抗体の２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から生じる二重鎖抗体は、同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、異なる抗原結合部位を有する二重鎖抗体を作製することができる。同様に、三本鎖及び四重鎖抗体は、３つ及び４つのポリペプチド鎖を含み、同じか又は異なり得る３つ及び４つの抗原結合部位を形成する抗体である。
【００４７】
本明細書では、（非特許文献１６）においてＫａｂａｔらが説明している方法を用いて、所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を同定する。１つ又は複数のＣＤＲを、共有結合的又は非共有結合的に分子中に組み込んで、それを抗体にし得る。抗体は、より大きいポリペプチド鎖をＣＤＲに組み込むことができる。ＣＤＲは、別のポリペプチド鎖に共有結合することができ、又はＣＤＲに非共有結合的に組み込むことができる。ＣＤＲは、抗体が、該当する特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００４８】
抗体は、１つ又は複数の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であっても又は異なっていてもよい。例えば、天然ヒト免疫グロブリンは、通常、２つの同一の結合部位を有する一方、「二重特異性」又は「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００４９】
「マウス抗体」という用語は、マウス免疫グロブリン配列に由来する１つ又は複数の可変及び定常領域を有する抗体を含む。
【００５０】
「ヒト化抗体」という用語は、マウス抗体分子の相補性決定領域の配列を、ヒト抗体可変領域のフレームワークにグラフトすることによって作製される抗体である。
【００５１】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、又は「抗原結合部位」という用語は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗体の特異性及び親和性に寄与するアミノ酸残基を含む抗体の部分である。それらの抗原に特異的に結合する抗体については、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。
【００５２】
「エピトープ」という用語は、抗体に（例えば、抗体によって）結合する分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列において隣接していないが、ポリペプチドの三次及び四次構造において、抗体によって互いに結合されるのに十分に近いアミノ酸残基）を含み得る。
【００５３】
２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部）のデフォルトパラメータ比較配列を用いて決定される。
【００５４】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、全文を通して同義的に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸及び非天然ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡ又はＲＮＡ類似体並びにそれらのハイブリッドを含み得る。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。一実施形態において、本発明に含まれる核酸分子は、抗体又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体隣接オープンリーディングフレームをコードする。
【００５５】
２つの一本鎖ヌクレオチドは、それらの配列が逆平行であり得る場合、互いに「相補的」であり、一方のポリヌクレオチド中の各ヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと反対であり、ギャップが導入されず、各配列の５’又は３’末端に対形成しないヌクレオチドが見られないようになっている。２つのポリヌクレオチドが、中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズし得る場合、一方のポリヌクレオチドは、他方のポリヌクレオチドと「相補的」である。したがって、一方のポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに相補的であり得るが、その相補配列でない。
【００５６】
「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語は、それに連結された別の核酸を細胞内に導入するのに使用され得る核酸である。担体の１つのタイプは、「プラスミド」であり、さらなる核酸セグメントに結合可能な直鎖状又は環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。担体の別のタイプは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム内に導入され得る。一部の担体は、それらが導入された宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を含む細菌担体及び遊離型（ｆｒｅｅ−ｔｙｐｅ）哺乳動物担体）。他の担体（例えば、非遊離型哺乳動物担体）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。「発現担体」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指令し得る担体のタイプである。
【００５７】
制御配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、時間、又は部位）に影響を及ぼす場合、ヌクレオチド配列は、制御配列に「操作可能に連結される」。「制御配列」は、それが操作可能に連結される核酸の発現（例えば、発現のレベル、時間、又は部位）に影響を及ぼす核酸である。制御遺伝子は、例えば、制御される核酸に対して直接、又は１つ又は複数の他の分子（例えば、制御配列及び／又は核酸に結合するポリヌクレオチド）を介して作用する。制御配列の例としては、プロモータ、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列のさらなる例が、（非特許文献２２）；及び（非特許文献２３）などに記載され得る。
【００５８】
「宿主細胞」という用語は、本明細書において提供されるものなどの核酸を発現するのに使用される細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得るか、又はそれは、真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母又は他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコ又はトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、細胞、サル、ハムスター細胞、ラット及びマウスの細胞又は昆虫細胞）又はハイブリドーマであり得る。通常、宿主細胞は、宿主細胞において後に発現され得るペプチドコード核酸で形質転換又はトランスフェクトされ得る培養細胞である。「組み換え宿主細胞」という語句は、予測される発現の核酸で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を示すのに使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、制御配列が、核酸と操作可能に連結されるように宿主細胞中に導入されない限り、所望のレベルでその核酸を発現しない細胞であり得る。「宿主細胞」という用語が、特定の被験体の細胞だけでなく、その細胞の子孫又は潜在的な子孫も指すことが理解されるべきである。続く世代で起こる特定の修飾、例えば、突然変異又は環境的影響のため、このような子孫は、実際に、親細胞と異なり得るが、なお、本発明において使用されるこの用語の範囲内に含まれる。
【００５９】
消化管抑制ペプチド受容体
消化管抑制ペプチド受容体は、７−膜貫通Ｇタンパク質で結合される受容体のファミリーのタイプＢに属する。受容体は、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）によって１つ又は複数の細胞内シグナル伝達経路に結合される（非特許文献２４）。これまで、研究は、ＧＩＰＲが、主に、膵β細胞及び脂肪細胞の表面で発現され（非特許文献２）、ヒトにおいてグルコース及び脂質代謝の両方に関与し、したがって糖尿病、肥満及び関連疾患に密接に関連していることを示す（非特許文献２５）。本明細書において使用される「ヒトＧＩＰＲ」及び「ｈＧＩＰＲ」は両方とも、ヒト腸抑制ペプチド受容体を指し、同義的に使用され得る。本明細書において使用される「マウスＧＩＰＲ」及び「ｍＧＩＰＲ」は両方とも、マウス胃抑制ペプチド受容体を指し、これらも同義的に使用され得る。
【００６０】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトＧＩＰＲに特異的に結合する抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、細胞膜においてＧＩＰＲに特異的に結合する抗体であり、この抗体は、これらの細胞においてＧＩＰシグナルの伝達を阻害又は阻止し得る。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトＧＩＰＲに特異的に結合する抗体であり、他の種（例えば、サル又はマウス）のＧＩＰＲに結合し、これらの種においてＧＩＰシグナル伝達を阻止し得る。さらなる実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトＧＩＰＲに結合し、他の種（例えば、サル）のＧＩＰＲに結合し得るマウス抗体である。
【００６１】
一実施形態において、ＧＩＰＲのアミノ酸及びポリヌクレオチド配列が、以下に列挙され、配列データは、アメリカ国立生物工学情報センター（ＵＳ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｅ−Ｂａｎｋデータベース及び欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＵｎｉｐｒｏｔデータベースから入手される：
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））ポリヌクレオチド（配列番号１１４）；受託番号：Ｓ７９８５２；
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））アミノ酸（配列番号１１３）；受託番号：ＡＡＢ３５４１９．２；
サル（アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ））ポリヌクレオチド（配列番号１１６）；受託番号：ＸＭ＿０１５１２４２８９．１；
サル（アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ））アミノ酸（配列番号１１５）；受託番号：ＸＰ＿０１４９７９７７５；
マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ポリヌクレオチド（配列番号１１８）；受託番号：ＣＣＤＳ３９７９５；及びマウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））アミノ酸（配列番号１１７）；受託番号：Ｑ０Ｐ５４３。
【００６２】
消化管抑制ペプチド受容体（ＧＩＰＲ）抗体
一実施形態において、ＧＩＰＲ抗体が、本明細書において提供される。別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、完全ＧＩＰＲ抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、ＧＩＰＲ抗体フラグメントである。別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、ＧＩＰＲ抗体の誘導体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、ＧＩＰＲ抗体突然変異タンパク質である。さらなる実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、ＧＩＰＲ抗体の変異体である。
【００６３】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１、２、３、４、５、又は６つのアミノ酸配列を含み、これらはそれぞれ、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１５；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、及び配列番号１６；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１７；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８、配列番号２３、及び配列番号２６；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号２９；及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３０
から選択される。
【００６４】
表１は、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、並びに対応するポリヌクレオチドコード配列を列挙している。表２は、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、並びに対応するポリヌクレオチドコード配列を列挙している。
【００６５】
【表１】
2021518132.tif 000002
【００６６】
【表２】
2021518132.tif 000003
【００６７】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、５、４、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、４、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。
【００６８】
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。
【００６９】
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、２又は１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。
【００７０】
さらなる実施形態において、本明細書において提供される抗体は、１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。
【００７１】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８、配列番号２３、及び配列番号２６
から選択される。
【００７２】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、及び配列番号１６；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号２９
から選択される。
【００７３】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１、２、３、又は４つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１７；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３０
から選択される。
【００７４】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１、２、３、又は４つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１５；
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８、配列番号２３、及び配列番号２６；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、及び配列番号１６；及び
ｄ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号２９
から選択される。
【００７５】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１、２、３、又は４つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１５；
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８、配列番号２３、及び配列番号２６；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１７；及び
ｄ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３０
から選択される。
【００７６】
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１、２、３、又は４つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、及び配列番号１６；
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号２９；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１７；及び
ｄ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号３０
から選択される。
【００７７】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１、２、又は３つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７から選択される。
【００７８】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１、２、又は３つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０から選択される。
【００７９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下のリスト：配列番号１及び配列番号１８、配列番号４及び配列番号１８、配列番号７及び配列番号２３、配列番号１０及び配列番号２６、配列番号１３及び配列番号２６、及び配列番号１５及び配列番号２６から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せを含む。
【００８０】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下のリスト：配列番号２及び配列番号１９、配列番号５及び配列番号２１、配列番号８及び配列番号２４、配列番号１１及び配列番号２７、及び配列番号１６及び配列番号２９から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せを含む。
【００８１】
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下のリスト：配列番号３及び配列番号２０、配列番号６及び配列番号２２、配列番号９及び配列番号２５、配列番号１２及び配列番号２８、配列番号１４及び配列番号２８、及び配列番号１７及び配列番号３０から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含む。
【００８２】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１及び配列番号１８、配列番号４及び配列番号１８、配列番号７及び配列番号２３、配列番号１０及び配列番号２６、配列番号１３及び配列番号２６、及び配列番号１５及び配列番号２６から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せ；及び
ｂ．以下のリスト：配列番号２及び配列番号１９、配列番号５及び配列番号２１、配列番号８及び配列番号２４、配列番号１１及び配列番号２７、及び配列番号１６及び配列番号２９から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せ
を含む。
【００８３】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１及び配列番号１８、配列番号４及び配列番号１８、配列番号７及び配列番号２３、配列番号１０及び配列番号２６、配列番号１３及び配列番号２６、及び配列番号１５及び配列番号２６から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せ；及び
ｂ．以下のリスト：配列番号３及び配列番号２０、配列番号６及び配列番号２２、配列番号９及び配列番号２５、配列番号１２及び配列番号２８、配列番号１４及び配列番号２８、及び配列番号１７及び配列番号３０から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せ
を含む。
【００８４】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号２及び配列番号１９、配列番号５及び配列番号２１、配列番号８及び配列番号２４、配列番号１１及び配列番号２７、及び配列番号１６及び配列番号２９から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せ；及び
ｂ．以下のリスト：配列番号３及び配列番号２０、配列番号６及び配列番号２２、配列番号９及び配列番号２５、配列番号１２及び配列番号２８、配列番号１４及び配列番号２８、及び配列番号１７及び配列番号３０から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せ
を含む。
【００８５】
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１及び配列番号１８、配列番号４及び配列番号１８、配列番号７及び配列番号２３、配列番号１０及び配列番号２６、配列番号１３及び配列番号２６、及び配列番号１５及び配列番号２６から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せ；
ｂ．以下のリスト：配列番号２及び配列番号１９、配列番号５及び配列番号２１、配列番号８及び配列番号２４、配列番号１１及び配列番号２７、及び配列番号１６及び配列番号２９から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せ；及び
ｃ．以下のリスト：配列番号３及び配列番号２０、配列番号６及び配列番号２２、配列番号９及び配列番号２５、配列番号１２及び配列番号２８、配列番号１４及び配列番号２８、及び配列番号１７及び配列番号３０から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せ
を含む。
【００８６】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、
ａ．軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０の組合せ；
ｂ．軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１８、配列番号２１、及び配列番号２２の組合せ；
ｃ．軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５の組合せ；
ｄ．軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８の組合せ；
ｅ．軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８の組合せ；又は
ｆ．軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号３０の組合せ
を含む。
【００８７】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１；及びいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；及び
ｂ．重鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０；及びいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
から選択される。
【００８８】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体のポリヌクレオチドコード配列は、１又は２つのポリヌクレオチドコード配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチドコード配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：
ａ．軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、及び配列番号９１；及びいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列；及び
ｂ．重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１００；及びいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される。
【００８９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下のリスト：配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号７１から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９０】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下のリスト：配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９１】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下に列挙される軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号６１及び配列番号７２、配列番号６２及び配列番号７３、配列番号６３及び配列番号７４、配列番号６４及び配列番号７４、配列番号６５及び配列番号７５、配列番号６６及び配列番号７６、配列番号６７及び配列番号７７、配列番号６８及び配列番号７７、配列番号６９及び配列番号７８、配列番号７０及び配列番号７９、及び配列番号７１及び配列番号８０から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む。
【００９２】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下のリスト：配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、及び配列番号７７から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９３】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下に列挙される軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号６１及び配列番号７２（Ｌ１Ｈ１）、配列番号６２及び配列番号７３（Ｌ２Ｈ２）、配列番号６３及び配列番号７４（Ｌ３Ｈ３）、配列番号６４及び配列番号７４（Ｌ４Ｈ３）、配列番号６５及び配列番号７５（Ｌ５Ｈ４）、配列番号６６及び配列番号７６（Ｌ６Ｈ５）、配列番号６７及び配列番号７７（Ｌ７Ｈ６）、配列番号６８及び配列番号７７（Ｌ８Ｈ６）、配列番号６９及び配列番号７８（Ｌ９Ｈ７）、配列番号７０及び配列番号７９（Ｌ１０Ｈ８）、及び配列番号７１及び配列番号８０（Ｌ１１Ｈ９）から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む。
【００９４】
「ＬｘＨｙ」という記号を用いて、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体を示すこともでき、ここで、「ｘ」が、軽鎖可変領域配列コードに対応し、「ｙ」が、重鎖可変領域配列コードに対応する。例えば、Ｌ２Ｈ２は、配列番号６２（Ｌ２）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号７３（Ｈ２）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する完全抗体である。
【００９５】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖定常アミノ酸配列：配列番号１０１及び配列番号１０２；及び
ｂ．重鎖定常アミノ酸配列：配列番号１０３及び配列番号１０４、及び配列番号１２４
から選択される。
【００９６】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙される軽鎖及び重鎖定常アミノ酸配列の組合せ：配列番号１０１及び配列番号１０３、配列番号１０１及び配列番号１０４、配列番号１０２及び配列番号１０３、及び配列番号１０２及び配列番号１０４から選択される。別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙される軽鎖及び重鎖定常アミノ酸配列の組合せ：配列番号１０１及び配列番号１２４、及び配列番号１０２及び配列番号１２４から選択される。
【００９７】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ、及びＦＲ（フレームワーク）のアミノ酸配列を含む。ＦＲのアミノ酸配列は、軽鎖又は重鎖可変ドメインに含まれ、別個に示されていない。一実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ４配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ３配列を含む。さらなる実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ４配列を含む。
【００９８】
一実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、上に示される軽鎖ＣＤＲ３配列の配列番号６、配列番号１２、及び配列番号１４と異なる。別の実施形態において、抗体の重鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、上に示される重鎖ＣＤＲ３配列の配列番号２２及び配列番号２８と異なる。さらなる実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、上に示される軽鎖ＣＤＲ３配列の配列番号６、配列番号１２、及び配列番号１４と異なり、抗体の重鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、上に示される重鎖ＣＤＲ３配列の配列番号２２及び配列番号２８と異なる。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５又は６つの組合せをさらに含む。
【００９９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、本明細書に列挙されるＬ２（配列番号６２）、Ｌ３（配列番号６３）、Ｌ４（配列番号６４）、Ｌ６（配列番号６６）、Ｌ７（配列番号６７）、及びＬ８（配列番号６８）軽鎖可変ドメイン配列から選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸の相違が、Ｌ２（配列番号６２）、Ｌ３（配列番号６３）、Ｌ４（配列番号６４）、Ｌ６（配列番号６６）、Ｌ７（配列番号６７）、及びＬ８（配列番号６８）の１つの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と異なり、ここで、各配列の相違は、独立して、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖可変ドメインは、Ｌ２（配列番号６２）、Ｌ３（配列番号６３）、Ｌ４（配列番号６４）、Ｌ６（配列番号６６）、Ｌ７（配列番号６７）、及びＬ８（配列番号６８）の１つの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ２（配列番号６２）、Ｌ３（配列番号６３）、Ｌ４（配列番号６４）、Ｌ６（配列番号６６）、Ｌ７（配列番号６７）、及びＬ８（配列番号６８）の１つのポリヌクレオチドコード配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ２（配列番号６２）、Ｌ３（配列番号６３）、Ｌ４（配列番号６４）、Ｌ６（配列番号６６）、Ｌ７（配列番号６７）、及びＬ８（配列番号６８）の１つの相補的ポリヌクレオチドコード配列と中程度の条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ２（配列番号６２）、Ｌ３（配列番号６３）、Ｌ４（配列番号６４）、Ｌ６（配列番号６６）、Ｌ７（配列番号６７）、及びＬ８（配列番号６８）の１つの軽鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１００】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、本明細書に列挙されるＨ２（配列番号７３）、Ｈ３（配列番号７４）、Ｈ５（配列番号７６）、及びＨ６（配列番号７７）重鎖可変ドメイン配列から選択される重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体の重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸が、Ｈ２（配列番号７３）、Ｈ３（配列番号７４）、Ｈ５（配列番号７６）、及びＨ６（配列番号７７）の１つの重鎖可変ドメイン配列と異なり、ここで、各配列の相違は、独立して、１つのアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体の重鎖可変ドメインは、Ｈ２（配列番号７３）、Ｈ３（配列番号７４）、Ｈ５（配列番号７６）、及びＨ６（配列番号７７）の１つの重鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体の重鎖可変ドメインは、Ｈ２（配列番号７３）、Ｈ３（配列番号７４）、Ｈ５（配列番号７６）、及びＨ６（配列番号７７）の１つの重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ２（配列番号７３）、Ｈ３（配列番号７４）、Ｈ５（配列番号７６）、及びＨ６（配列番号７７）の１つの重鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ＧＩＰＲ抗体重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ２（配列番号７３）、Ｈ３（配列番号７４）、Ｈ５（配列番号７６）、及びＨ６（配列番号７７）の１つの重鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１０１】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、Ｌ１Ｈ１（配列番号６１及び配列番号７２）、Ｌ２Ｈ２（配列番号６２及び配列番号７３）、Ｌ３Ｈ３（配列番号６３及び配列番号７４）、Ｌ４Ｈ３（配列番号６４及び配列番号７４）、Ｌ５Ｈ４（配列番号６５及び配列番号７５）、Ｌ６Ｈ５（配列番号６６及び配列番号７６）、Ｌ７Ｈ６（配列番号６７及び配列番号７７）、Ｌ８Ｈ６（配列番号６８及び配列番号７７）、Ｌ９Ｈ７（配列番号６９及び配列番号７８）、Ｌ１０Ｈ８（配列番号７０及び配列番号７９）、又はＬ１１Ｈ９（配列番号７１及び配列番号８０）、又はその所望の表現型（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ、若しくはＩｇＤ）、又はそのＦａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの組合せを含む抗体である。
【０１０２】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、Ｌ２Ｈ２（配列番号６２及び配列番号７３）、Ｌ３Ｈ３（配列番号６３及び配列番号７４）、Ｌ４Ｈ３（配列番号６４及び配列番号７４）、Ｌ６Ｈ５（配列番号６６及び配列番号７６）、Ｌ７Ｈ６（配列番号６７及び配列番号７７）、又はＬ８Ｈ６（配列番号６８及び配列番号７７）、又はその所望の表現型（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ、若しくはＩｇＤ）、又はそのＦａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの組合せを含む抗体である。
【０１０３】
本明細書において提供される抗体は、当該技術分野において公知の定常領域のいずれかを含み得る。軽鎖定常領域は、例えば、κ又はλ軽鎖定常領域、例えば、マウスκ又はλ軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、α、δ、ε、γ、又はμ重鎖定常領域、例えば、マウスα、δ、ε、γ、又はμ重鎖定常領域であり得る。一実施形態において、軽鎖又は重鎖定常領域は、天然定常領域のフラグメント、誘導体、変異体、又は突然変異体である。
【０１０４】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒト軽鎖κ又はλ定常ドメイン又はそのフラグメントをさらに含む。軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ヒト軽鎖κ定常ドメインアミノ酸配列：（配列番号１０１）；及び
ヒト軽鎖λ定常ドメインアミノ酸配列：（配列番号１０２）。
【０１０５】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒト重鎖定常ドメイン又はそのフラグメントをさらに含む。
【０１０６】
重鎖定常領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列（ｈＩｇＧ２）：（配列番号１０３）；
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列（ｈＩｇＧ４）：（配列番号１０４）；及び
ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列（ｈＩｇＧ４）：（配列番号１２４）。
【０１０７】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、マウス由来抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）ｘフラグメント、構造ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧｌ抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体から選択される。
【０１０８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、ＧＩＰＲモノクローナル抗体である。
【０１０９】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、以下のリスト：配列番号６１及び配列番号７２、配列番号６２及び配列番号７３、配列番号６３及び配列番号７４、配列番号６４及び配列番号７４、配列番号６５及び配列番号７５、配列番号６６及び配列番号７６、配列番号６７及び配列番号７７、配列番号６８及び配列番号７７、配列番号６９及び配列番号７８、配列番号７０及び配列番号７９、及び配列番号７１及び配列番号８０から選択されるアミノ酸配列の組合せを含むモノクローナル抗体である。
【０１１０】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、マウスＧＩＰＲ抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、ヒト化ＧＩＰＲ抗体である。
【０１１１】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体は、約１ｎＭ〜２００ｎＭ又は約１ｎＭ〜１００ｎＭのＩＣ５０値を有し、ヒトＧＩＰシグナル伝達を低減する。
【０１１２】
抗体及び抗体フラグメント
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、完全長抗体（完全長重鎖及び／又は軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む）である。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、又はＦｄフラグメントであり、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、非特許文献２６を参照）。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、フィブロネクチンポリペプチド単一特異性抗体（ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ）を含む、（特許文献８）に開示されるものなどの抗体ポリペプチドも含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、一本鎖ポリペプチドである、（特許文献９）に開示される他の抗体ポリペプチドも含む。
【０１１３】
一実施形態において、ハイブリドーマ中の該当するモノクローナル抗体を発現するＩｇＧ遺伝子の可変領域は、ヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成され得るか、又は中でも特に、ＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ領域のためのプライマーを含む、マウス及びヒト可変領域のためのプライマーを合成する市販業者から購入され得る。これらのプライマーは、それぞれＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（商標）Ｈ又はＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクターに後に挿入され得る重鎖又は軽鎖可変領域を増幅するのに使用され得る。次に、これらのベクターは、発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、又は哺乳動物に基づく系に導入され得る。ＶＨ及びＶＬ領域の融合を含む大量の一本鎖タンパク質が、これらの方法を用いて産生され得る（非特許文献１８を参照）。
【０１１４】
抗体などの特定のタンパク質が、様々な翻訳後修飾を受けることができることが、当業者によって理解されるべきである。これらの修飾のタイプ及び程度は、タンパク質を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に左右されることが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン（ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒｉｚｉｎｅ）形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン脱アミド化の変化を含み得る。高頻度の修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシル末端塩基性残基（リジン又はアルギニンなど）の損失である（非特許文献２７に記載されるように）。
【０１１５】
マウスモノクローナル抗体の産生のための一般的な方法は、ハイブリドーマ細胞による。モノクローナル抗体は、様々な確立した技術によって単離及び精製され得る。このような単離技術としては、プロテイン−Ａセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、非特許文献２８；非特許文献２９を参照）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖又は軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択される適切なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体担体上に固定される好適なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖又は重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、及びＴＧＦ−β結合タンパク質、又はそのフラグメント若しくは変異体が挙げられる。
【０１１６】
（非特許文献３０）によって記載されるように、抗体結合部位の中心における相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化も、増加した親和性を有する抗体、例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する増加した親和性を有する抗体を単離するのに使用されている。したがって、このような技術は、ＧＩＰＲに対する抗体を調製するのに有用である。
【０１１７】
ヒトＧＩＰＲに対する抗体が、例えば、インビトロ又はインビボのいずれかで、ＧＩＰＲの存在を検出するアッセイにおいて使用され得る。
【０１１８】
抗体はまた、従来の技術のいずれかによって調製され得る。例えば、抗体は、それらを天然で発現する細胞から精製され得るか（例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製され得る）又は当該技術分野において公知の任意の技術を用いて組み換え発現系において産生され得る。例えば、（非特許文献３１）；及び（非特許文献３２）。これは、以下の核酸の節において説明されている。
【０１１９】
抗体は、任意の公知の技術によって、調製され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。いくつかの技術は、関連する抗体（例えば、抗ＧＩＰＲ抗体）のポリペプチド鎖（又はその部分）をコードする核酸の単離及び核酸の操作に関連する。核酸は、別の関連する核酸と融合されるか、又は１つ又は複数のアミノ酸残基を付加、削除又は置換するための組み換えＤＮＡ技術（例えば、誘発突然変異又は他の従来の技術）によって修飾され得る。
【０１２０】
上述されるＣＤＲの１つ又は複数を含有する本発明に係る抗体の親和性を向上させることが必要とされる場合、このような抗体は、ＣＤＲの維持（非特許文献３３）、鎖シャッフリング（非特許文献３４）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異株の使用（非特許文献３５）、ＤＮＡシャッフリング（非特許文献３６）、ファージディスプレイ（非特許文献３７）及びさらなるＰＣＲ技術（非特許文献３８）を含む、いくつかの親和性成熟プロトコルによって得られる。これらの方法又は親和性成熟の全ては、（非特許文献３９）に記載されている。
【０１２１】
一実施形態において、ＧＩＰＲ抗体のフラグメントが、本明細書において提供される。このようなフラグメントは、全体的に、抗体に由来する配列又はさらなる配列を含み得る。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及びドメイン抗体が挙げられる。他の例が、（非特許文献４０）において提供されている。
【０１２２】
一本鎖抗体は、単一ポリペプチド鎖を生じるように、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）によって重鎖及び軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントを連結することによって形成され得る。このような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬ及びＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードする融合ＤＮＡによって調製されている。得られるポリペプチドは、それ自体で折り畳まれて、抗原結合モノマーを形成し得るか、又はそれらは、２つの可変ドメイン間のフレキシブルリンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体、又は四量体）を形成し得る（非特許文献４１；非特許文献４２）。様々なＶＬ及びＶＨ含有ポリペプチドを組み合わせることによって、様々なエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖが形成され得る（非特許文献４３）。一本鎖抗体の産生のために開発された技術としては、（特許文献１０）；（非特許文献４４）；（非特許文献４５）；（非特許文献４６）；（非特許文献４７）に記載されるものが挙げられる。限定はされないが、可変ドメイン組合せＬ１Ｈ１を含むｓｃＦｖを含む、本明細書において提供される抗体に由来する一本鎖抗体が、本発明によって包含される。
【０１２３】
１つの抗体に由来する複数の抗体はまた、従来の方法にしたがって、例えば、抗体のタンパク質分解的加水分解、例えば、全抗体のペプシン又はパパイン消化によって得られる。例として、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれるＳＳフラグメントを生じる、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって、生成され得る。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断されて、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを生じ得る。任意選択的に、切断反応は、ジスルフィド結合の切断から得られるスルフヒドリル基のブロッキング基を用いて行われ得る。代替例として、パパインを用いた酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂフラグメント及びＦｃフラグメントを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇらの（特許文献１１）、（非特許文献４８）；（非特許文献４９）；（非特許文献５０）；及び（非特許文献５１）によって記載されている。重鎖を分離して一価軽鎖−重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成するなどの、抗体を切断するための他の方法、フラグメントの他の切断、又は他の酵素的、化学的、又は遺伝子学的技術も、フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
【０１２４】
抗体フラグメントの別の形態は、抗体の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲは、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得られる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、鋳型としてｍＲＮＡ又は抗体産生細胞を用いて可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって調製される（例えば、非特許文献５２；非特許文献５３；及び非特許文献５４を参照）。抗体フラグメントは、本明細書に記載される抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインをさらに含み得る。したがって、例えば、Ｖ領域ドメインは、モノマー及びＶＨ又はＶＬドメインであり得、これは、後述されるように１×１０−７Ｍ以下の親和性でＧＩＰＲに結合し得る。
【０１２５】
可変領域ドメインは、任意の天然可変ドメイン又はその操作された形態であり得る。操作された形態とは、組み換えＤＮＡ操作技術を用いて生成された可変領域ドメインを意味する。このような操作された形態は、例えば、特定の抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失、又は変化によって、特定の抗体可変領域から生成されるものを含む。具体的な例は、第１の抗体からの少なくとも１つのＣＤＲ及び任意選択的に１つ又は複数のフレームワークアミノ酸を含有する操作された可変領域ドメイン、及び第２の抗体からの可変領域ドメインの残りの部分を含む。
【０１２６】
可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも１つの他の抗体ドメイン又はそのフラグメントに共有結合され得る。したがって、例えば、可変領域ドメイン中に存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン又はそのフラグメントに連結され得る。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメイン又はそのフラグメントに連結され得る。このように、例えば、抗体は、Ｆａｂフラグメントであり得、ここで、抗原結合ドメインは、それらのＣ末端において、それぞれＣＨ１及びＣκドメインに共有結合的に連結される関連するＶＨ及びＶＬドメインを含有する。ＣＨ１ドメインは、さらなるアミノ酸で拡張されて、例えば、Ｆａｂ’フラグメントに見られるようなヒンジ領域又はヒンジ領域ドメインの部分を生じるか、又は抗体ＣＨ２及びＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを生じ得る。
【０１２７】
抗体の誘導体及び変異体
Ｌ１及びＨ１のヌクレオチド配列が、例えば、ランダム突然変異誘発によって又は部位特異的突然変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的突然変異）によって改変されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の特定のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入を含む改変ポリヌクレオチドを生成し得る。このような改変を行うための技術の例が、（非特許文献５５）；（非特許文献５６）；（非特許文献５７）；（非特許文献５８）；並びに（特許文献１２）及び（特許文献１３）に記載されている。これらの及び他の方法が、非誘導体化抗体と比較して、所望の特性、例えば、ＧＩＰＲに対する親和性、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）、若しくは特異性又はインビボ若しくはインビトロ安定性の向上、又は生体内副作用の減少を有する、例えば、ＧＩＰＲ抗体の誘導体を作製するのに使用され得る。
【０１２８】
本発明の範囲内のＧＩＰＲ抗体の他の誘導体は、Ｎ末端若しくはＣ末端又は抗ＧＩＰＲ抗体ポリペプチドに融合された異種ポリペプチドを含む発現又は組み換え融合タンパク質などによって、他のタンパク質又はポリペプチドとともに、共有結合的又は凝集性コンジュゲート又は抗ＧＩＰＲ抗体、又はそのフラグメントを含む。例えば、共役ペプチドは、異種シグナル（又はリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母α−因子リーダー又はエピトープタグなどのペプチドであり得る。融合タンパク質を含有する抗体は、抗原結合タンパク質（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の精製又は同定を促進するために加えられるペプチドを含み得る。抗体はまた、（非特許文献５９）、及び（特許文献１４）に記載されるように、ＦＬＡＧペプチドに連結され得る。ＦＬＡＧペプチドは、高度に抗原性であり、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組み換えタンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合された融合タンパク質を調製するのに有用な試薬は市販されている（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）。別の実施形態において、１つ又は複数の抗体を含有するオリゴマーが、ＧＩＰＲアンタゴニストとして用いられ得る。オリゴマーは、共有結合的に連結された又は非共有結合的に連結された二量体、三量体、又はより高次のオリゴマーの形態であり得る。２つ以上の抗体を含むオリゴマーの使用が想定され、一例はホモ二量体である。他のオリゴマーとしては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
【０１２９】
一実施形態は、抗体に融合されたペプチド部分間の共有結合的又は非共有結合的相互作用を介して結合された複数の抗体を含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサ）、又はオリゴマー形成を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー及び抗体に由来する特定のポリペプチドは、以下により詳細に記載されるように、それに結合された抗体のオリゴマー形成を促進し得るペプチドである。
【０１３０】
特定の実施形態において、オリゴマーは、２〜４つの抗体を含む。オリゴマーの抗体は、上述される形態のいずれか、例えば、変異体又はフラグメントなどの任意の形態であり得る。好ましくは、オリゴマーは、ＧＩＰＲ結合活性を示す抗体を含む。
【０１３１】
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来ポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製が、例えば、（非特許文献６０）；（非特許文献６１）；及び（非特許文献６２）によって記載されている。本明細書において提供される一実施形態は、抗ＧＩＰＲ抗体のＧＩＰＲ結合フラグメントを、抗体のＦｃ領域に融合することによって生成された２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を、適切な発現ベクターに挿入し、組み換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞において遺伝子融合を発現させ、発現された融合タンパク質によく似た抗体分子を組み立てさせることによって作製され得、その直後に、鎖間ジスルフィド結合が、Ｆｃ部分間に形成されて、二量体が得られる。
【０１３２】
本明細書において使用される際の「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然及び突然変異タンパク質形態を含む。二量化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態も含まれる。Ｆｃ部分（及びそれから形成されたオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡ又はプロテインＧカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。
【０１３３】
（特許文献１５）（参照により本明細書に援用される）に記載される１つの好適なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域からＦｃ領域の天然Ｃ末端まで伸びる一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、（特許文献１６）及び（非特許文献６３）に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化されており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化されており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化されていることを除いて、（特許文献１５）に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する低下した親和性を示す。他の実施形態において、抗ＧＩＰＲ抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変部分が、抗体重鎖及び／又は軽鎖の可変部分と置換され得る。
【０１３４】
或いは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサペプチド）を伴うか又は伴わずに複数の抗体を含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中には、（特許文献１７）及び（特許文献１８）に記載されるものがある。
【０１３５】
オリゴマー抗体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（非特許文献６４）、それ以来、様々な異なるタンパク質において見出されている。公知のロイシンジッパーの中には、二量化又は三量化する天然ペプチド及びその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに好適なロイシンジッパードメインの例が、（特許文献１９）に記載され、肺表面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、（非特許文献６５）（参照により本明細書に援用される）に記載される。それに融合された異種タンパク質の安定した三量化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用が、（非特許文献６６）に記載される。一方法において、ロイシンジッパーペプチドに融合された抗ＧＩＰＲ抗体フラグメント又は誘導体を含む組み換え融合タンパク質が、好適な宿主細胞において発現され、形成された可溶性オリゴマー抗ＧＩＰＲ抗体フラグメント又は誘導体が、培養上清から回収される。
【０１３６】
別の実施形態において、抗体誘導体は、本明細書に開示されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。例えば、１つ又は複数のＣＤＲは、公知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）に組み込まれるか、又はその半減期を増加させるために好適なビヒクルに共役され得る。好適なビヒクルとしては、限定はされないが、Ｆｃ、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられる。これらの及び他の好適なビヒクルは、当該技術分野において公知である。このような共役ＣＤＲペプチドは、モノマー、二量体、四量体、又は他の形態であり得る。一実施形態において、１つ又は複数の水溶性ポリマーが、１つ又は複数の特定の位置で、例えば、結合剤のアミノ末端で結合される。一例において、抗体誘導体は、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、又はポリプロピレングリコールを含む、１つ又は複数の水溶性ポリマー結合を含む。例えば、（特許文献２０）、（特許文献２１）、（特許文献２２）、（特許文献２３）、（特許文献２４）及び（特許文献２５）を参照されたい。特定の実施形態において、誘導体は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール、並びにこのようなポリマーの混合物のうちの１つ又は複数を含む。特定の実施形態において、１つ又は複数の水溶性ポリマーは、１つ又は複数の側鎖にランダムに結合される。特定の実施形態において、ＰＥＧは、抗体などの結合剤の治療的能力を向上させるように働き得る。いくつかのこのような方法が、例えば、任意の目的のために参照により本明細書に援用される（特許文献２６）において説明されている。
【０１３７】
抗体が結合特異性を保持する限り、本明細書において提供される抗体が、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得ることが理解されよう。したがって、抗体構造への修飾が、本発明の範囲内に包含される。これらは、抗体のヒトＧＩＰＲ結合能を破壊しない、保存的又は非保存的であり得るアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これは、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分の他の逆又は反転形態を含む。保存的アミノ酸置換はまた、その位置においてアミノ酸残基の極性又は電荷に対する影響がほとんど又は全くないように、標準的残基による天然アミノ酸残基の置換を含み得る。非保存的置換は、アミノ酸又はアミノ酸模倣体のあるクラスのメンバーを、異なる物理的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラスからのメンバーと交換することを含み得る。
【０１３８】
さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む、試験される変異体を生成し得る。次に、変異体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。このような変異体は、好適な変異体についての情報を収集するのに使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊された、望ましくないほど低下した、又は不適切な活性をもたらすことが発見された場合、このような変化を有する変異体は、回避され得る。言い換えると、このような日常的な実験から収集される情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独で又は他の突然変異と組み合わせて回避されるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【０１３９】
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載されるポリペプチドの好適な変異体を決定することができる。特定の実施形態において、当業者は、活性にとって重要でない領域を標的にすることによって、活性を破壊せずに変化され得る分子の好適な領域を特定し得る。特定の実施形態において、類似のポリペプチドの中で、残基及び保存される分子の部分を特定することができる。特定の実施形態において、生物学的活性又は構造にとって重要であり得る領域でも、生物学的活性を破壊せずに、又はポリペプチド構造に悪影響を与えずに保存的アミノ酸置換に供され得る。さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である、類似のポリペプチドにおける残基を特定する構造−機能試験を検討することができる。このような比較を考慮して、類似のタンパク質における活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測される重要なアミノ酸残基の代わりに化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【０１４０】
当業者は、類似のポリペプチドにおける該当する構造に関連する三次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアライメントを予測し得る。特定の実施形態において、当業者は、タンパク質の表面にあることが予測されるアミノ酸残基に根本的な変更を行わないことを選択してもよく、これは、このような残基が、他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。いくつかの科学出版物が、二次構造の予測をテーマにしている。（非特許文献６７）；（非特許文献６８）；（非特許文献６９）；（非特許文献７０）；（非特許文献７１）及び（非特許文献７２）を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを支援するコンピュータプログラムが、現在入手可能である。例えば、３０％超の配列同一性、又は４０％超の類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の折り畳みの潜在的な数を含む、二次構造の向上した予測可能性を提供した。（非特許文献７３）を参照されたい。所与のポリペプチド又はタンパク質中に限られた数の折り畳みがあること、及び臨界数の構造が決定された後、構造予測が著しく正確になることが示唆されている（非特許文献７４）。
【０１４１】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（非特許文献７５；非特許文献７６）、「プロファイル分析」（非特許文献７７；非特許文献７８；非特許文献７９）、及び「進化学的関連性（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（非特許文献７３、及び非特許文献７４を参照）が挙げられる。特定の実施形態において、抗体の変異体は、グリコシル化変異体を含み、ここで、グリコシル化部位の数及び／又はタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して改変されている。特定の実施形態において、変異体は、天然タンパク質より多い又は少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。或いは、置換によるこのような配列の除去は、存在するＮ−結合炭水化物鎖を除去する。Ｎ−結合炭水化物鎖の再配列も提供され、ここで、１つ又は複数のＮ−結合グリコシル化部位（典型的に、天然に存在するもの）が削除され、１つ又は複数の新しいＮ−結合部位が生成される。さらなる好ましい抗体変異体は、システイン変異体を含み、ここで、１つ又は複数のシステイン残基は、親アミノ酸配列と比較して、欠失されるか、又は別のアミノ酸（例えば、セリン）と置換される。システイン変異体は、抗体が、例えば不溶性封入体の単離の後、生物学的に活性な立体配座に再度折り畳まれなければならない場合に有用であり得る。システイン変異体は、一般に、天然タンパク質より少ないシステイン残基を有し、典型的に、不対システインから生じる相互作用を最小限に抑えるために偶数を有する。
【０１４２】
（保存的か又は非保存的かにかかわらず）所望のアミノ酸置換が、このような置換が所望されるときに当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、アミノ酸置換が、ヒトＧＩＰＲに対する抗体の重要な残基を同定するため、又は本明細書に記載されるヒトＧＩＰＲに対する抗体の親和性を増大若しくは低下させるために使用され得る。
【０１４３】
特定の実施形態によれば、好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するように結合親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、及び／又は（４）このようなポリペプチドにおける他の物理化学的又は機能的特性を与えるか又は調節するものである。特定の実施形態によれば、単一又は複数のアミノ酸置換（特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換）は、天然配列中で行われ得る（特定の実施形態において、分子間接触を形成するドメインの外部のポリペプチドの部分において）。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的に、親配列の構造的特徴を実質的に変更することができない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊すべきでない）。当該技術分野において認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例が、（非特許文献８０）；（非特許文献８１）；及び（非特許文献８２）に記載され、これらのそれぞれが、参照により本明細書に援用される。
【０１４４】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ポリマー、脂質、又は他の部分と化学結合され得る。
【０１４５】
抗原結合剤は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれる本明細書に記載されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。一実施形態において、生体適合性フレームワーク構造は、局在化した表面領域における抗原（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）に結合するアミノ酸の１つ又は複数の配列を提示することができる、立体配座的に安定した構造的支持体、又はフレームワーク、又は足場を形成するのに十分なポリペプチド又はその部分を含む。このような構造は、天然ポリペプチド又はポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であり得るか、又は天然ポリペプチド又は折り畳みと比べて、アミノ酸の付加、欠失又は置換などの１つ又は複数の修飾を有し得る。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌又はウイルスなどの任意の種の（又は２つ以上の種の）ポリペプチドに由来し得る。
【０１４６】
典型的に、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメイン及びテンダミスタットドメインに基づくものが使用され得る（例えば、非特許文献８３を参照）。
【０１４７】
さらに、当業者は、好適な結合剤が、本明細書に具体的に開示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のうちの１つ又は複数などの、これらの抗体の部分を含むことを認識するであろう。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の領域の少なくとも１つは、抗体が非置換ＣＤＲの結合特異性を保持する限り、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク分子であり得、ここで、結合剤は、ヒトＧＩＰＲに対する本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、及び／又は受容体を介したＧＩＰシグナル伝達の活性を阻害する。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク分子であり得、ここで、抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトＧＩＰＲペプチドへの、抗体Ｌ２Ｈ２／Ｌ６Ｈ５の少なくとも１つによって示されるものと類似の結合パターンを示し、及び／又はＧＩＰの活性を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え結合タンパク質又は合成ペプチドであり、組み換え結合タンパク質は、ヒトＧＩＰＲへの本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、及び／又はインビトロ若しくはインビボでＧＩＰの活性を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え抗体であり、組み換え抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトＧＩＰＲペプチドへの、抗体Ｌ２Ｈ２／Ｌ６Ｈ５の少なくとも１つによって示されるものと類似の結合パターンを示し、及び／又はＧＩＰの活性を中和する。
【０１４８】
ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１又は逆ＧＬＰ−１の融合タンパク質
一実施形態において、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体、及び１、２、３、４、５、６、７、又は８つのＧＬＰ−１フラグメント又は逆ＧＬＰ−１フラグメントを含む、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列（リンカー）を介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端に結合するか、又は逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１４９】
別の実施形態において、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体、及び１、２、３、４、５、６、７、又は８つのＧＬＰ−１フラグメントを含む、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質であって；融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列（リンカー）を介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシル末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合するか、又は逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５０】
別の実施形態において、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体、及び１、２、３、４、５、６、７、又は８つの逆ＧＬＰ−１フラグメントを含む、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質であって；融合タンパク質が、逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５１】
別の実施形態において、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体、及び１、２、３、又は４つのＧＬＰ−１フラグメントを含む、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質であって；融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列（リンカー）を介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシル末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５２】
別の実施形態において、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体、及び１、２、３、又は４つの逆ＧＬＰ−１フラグメントを含む、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質であって；融合タンパク質が、逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５３】
別の実施形態において、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体、及び２つのＧＬＰ−１フラグメントを含む、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質であって；融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列（リンカー）を介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシル末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５４】
別の実施形態において、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗体、及び２つの逆ＧＬＰ−１フラグメントを含む、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質であって；融合タンパク質が、逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合する、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５５】
別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体及び２つのＧＬＰ−１フラグメントを含むＧＬＰ−１融合タンパク質であって；融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列（リンカー）を介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシル末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のアミノ末端と結合し：Ｎ’−ＧＬＰ−１−リンカー−Ｒ−Ｃ’；又はＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端を、ＧＩＰＲ抗体重鎖のアミノ末端に結合し：Ｎ’−ＧＬＰ−１−リンカー−Ｒ−Ｃ’；ここで：Ｎ’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、ＧＬＰ−１が、ＧＬＰ−１フラグメントを表し、Ｒが、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ペプチドリンカー配列を表す、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５６】
別の実施形態において、ＧＩＰＲ抗体及び２つの逆ＧＬＰ−１フラグメントを含むＧＬＰ−１融合タンパク質であって；融合タンパク質が、逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖若しくは重鎖のカルボキシ末端に結合し：Ｎ’−Ｒ−リンカー−逆ＧＬＰ−１−Ｃ’；又はペプチドリンカー配列（リンカー）を介して、逆ＧＬＰ−１フラグメントのアミノ末端を、ＧＩＰＲ抗体重鎖のカルボキシ末端に結合し：Ｎ’−Ｒ−リンカー−逆ＧＬＰ−１−Ｃ’；ここで：Ｎ’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、逆ＧＬＰ−１が、逆ＧＬＰ−１フラグメントを表し、Ｒが、ＧＩＰＲ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ペプチドリンカー配列を表す、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５７】
さらなる実施形態において、ＧＩＰＲ抗体及び２つのＧＬＰ−１フラグメントを含むＧＬＰ−１融合タンパク質であって；融合タンパク質が、ペプチドリンカー配列（リンカー）を介して、ＧＬＰ−１フラグメントのカルボキシ末端を、ＧＩＰＲ抗体軽鎖のアミノ末端に結合し：Ｎ’−ＧＬＰ−１−リンカー−Ｒ−Ｃ’；ここで：Ｎ’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、融合タンパク質のポリペプチド鎖のカルボキシ末端を表し、ＧＬＰ−１が、ＧＬＰ−１フラグメントを表し、Ｒが、ＧＩＰＲ抗体軽鎖のアミノ酸配列を表し、リンカーが、ペプチドリンカー配列を表す、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１５８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＬＰ−１融合タンパク質において、ＧＬＰ−１フラグメントが、独立して、以下のアミノ酸配列：配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９のうちの１つから選択される。一実施形態において、本明細書において提供されるＧＬＰ−１融合タンパク質において、逆ＧＬＰ−１フラグメントが、独立して、以下のアミノ酸配列：配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、及び配列番号１２３のうちの１つから選択される。
【０１５９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＧＬＰ−１融合タンパク質において、ペプチドリンカー（リンカー）配列が、独立して、１〜２００のアミノ酸残基、２〜１００のアミノ酸残基、５〜５０のアミノ酸残基、６〜２５のアミノ酸残基、又は１０〜２０のアミノ酸残基を含む。
【０１６０】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＧＬＰ−１融合タンパク質において、ペプチドリンカー（リンカー）配列が、独立して、以下のアミノ酸配列：配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２から選択される。
【０１６１】
核酸
一態様において、本発明は、本明細書において提供される抗体をコードする単離核酸分子を提供する。核酸は、例えば、抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質の全て又は部分、例えば、本発明の抗体、又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体の一方又は両方の鎖をコードするポリヌクレオチド；ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、又は増幅するためのＰＣＲプライマー又はシーケンシングプライマー；ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及び上記のものの相補的配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００又はそれ以上のヌクレオチド長であり得、及び／又は１つ又は複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含み得、及び／又はより大きい核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチド、及びその人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。
【０１６２】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖又は軽鎖、可変ドメインのみ、又は完全長）をコードする核酸は、ＧＩＰＲ抗原で免疫付与されたマウスのＢ細胞から単離され得る。抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によって単離され得る。
【０１６３】
重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする核酸配列が上に示される。当業者は、遺伝暗号の縮重により、本明細書に開示されるポリペプチド配列のそれぞれが、多数の他の核酸配列によってコードされることを理解するであろう。本発明は、本明細書において提供される各抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質をコードする各縮重ヌクレオチド配列を提供する。
【０１６４】
本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸（例えば、Ｌ２Ｈ２／Ｌ６Ｈ５のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸）にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、（非特許文献８４）を参照されたい。本明細書において定義されるように、例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％のホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６×ＳＳＣを含有する予洗（ｐｒｅｗａｓｈｉｎｇ）溶液、及び５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は４２℃のハイブリダイゼーション温度で、約５０％のホルムアミドを含有するものなどの他の類似のハイブリダイゼーション溶液）、及び０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で、６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で６×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、続いて、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳで１回以上洗浄する。さらに、当業者は、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的に、互いにハイブリダイズされたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大又は低下させるように、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的パラメータ及び好適な条件を考案するための指針は、例えば、（非特許文献８５）；及び（非特許文献８６）によって記載されており、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。変化が、突然変異によって、核酸に導入され得、それによって、それがコードするポリペプチド（例えば、抗体）のアミノ酸配列の変化をもたらす。突然変異が、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて導入され得る。一実施形態において、１つ又は複数の特定のアミノ酸残基が、例えば、部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。別の実施形態において、１つ又は複数のランダムに選択された残基が、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。それがいかに作製されても、突然変異ポリペプチドは、発現され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。
【０１６５】
突然変異が、それがコードするポリペプチドの生物学的活性をそれほど変更せずに、核酸に導入され得る。例えば、ヌクレオチド置換を行って、非必須アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすことができる。一実施形態において、Ｌ１〜Ｌ１１及びＨ１〜Ｈ９、又はＧＬＰ−１融合タンパク質について本明細書において提供されるヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、変異体、若しくは誘導体は、それらが、２つ以上の異なるアミノ酸残基を有する配列を生じるように、アミノ酸残基の１つ又は複数の欠失又は置換を含む、Ｌ１〜Ｌ１１及びＨ１〜Ｈ９について本明細書において提供されるアミノ酸配列をコードするように突然変異される。別の実施形態において、突然変異誘発は、２つ以上の異なるアミノ酸残基を有する配列を生じるように、Ｌ１〜Ｌ１１及びＨ１〜Ｈ９又はＧＬＰ−１融合タンパク質について本明細書に示される１つ又は複数のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸を挿入する。或いは、１つ又は複数の突然変異が、核酸に導入され得、この核酸が、それがコードするポリペプチドの生物学的活性（例えば、ＧＩＰＲへの結合）を選択的に変化させる。例えば、突然変異が、生物学的活性を定量的に又は定性的に変化させ得る。定量的変化の例は、活性を増大させ、低下させ、又はなくすことを含む。定性的変化の例は、抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質の抗原特異性を変化させることを含む。
【０１６６】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸配列の検出のためのプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用され得るフラグメント又は本発明のポリペプチドの活性部分（例えば、ＧＩＰＲ結合部分）をコードするフラグメントを含み得る。
【０１６７】
本発明の核酸の配列に基づくプローブを用いて、核酸又は類似の核酸、例えば、本発明のポリペプチドをコードする転写産物を検出することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子を含み得る。このようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定することができる。
【０１６８】
別の態様において、本明細書において提供されるベクターは、本発明のポリペプチド又はその一部をコードする核酸を含む。ベクターの例としては、限定はされないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターが挙げられる。
【０１６９】
本明細書において提供される組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得る。組み換え発現ベクターは、発現される核酸配列に操作可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ又は複数の制御配列を含む。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモータ及びサイトメガロウイルスプロモータ）、特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的制御配列、（非特許文献８７）、（非特許文献８８）を参照、これらのそれぞれの開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される）、及び特定の処理又は条件に応答して、ヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、哺乳類細胞におけるメタロチオネインプロモータ、及び原核生物細胞系及び真核生物細胞系の両方におけるｔｅｔ−応答性及び／又はストレプトマイシン応答性プロモータ（同文献参照）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に左右され得ることが、当業者によって理解されよう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質又はペプチドを含む、タンパク質又はペプチドを産生し得る。
【０１７０】
別の態様において、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞又は真核生物細胞であり得る。原核生物宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバシラス属（ｂａｃｉｌｌｉ）を含む。より高等な真核細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物由来の樹立細胞系を含む。好適な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯなどのそれらの誘導体及び無血清培地中で増殖する関連する細胞系（（非特許文献８９）を参照）又はＤＨＦＲが欠乏したＣＨＯ株ＤＸＢ−１１（（非特許文献９０）を参照）を含む。さらなるＣＨＯ細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）、ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１８６１）、及びＷ２０（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１８６２）を含む。さらなる宿主細胞は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１６５１）（（非特許文献９１）を参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１６３）、ＡＭ−１／Ｄ細胞（（特許文献２７）に記載される）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）（（非特許文献９２）を参照）、２９３、２９３  ＥＢＮＡ又はＭＳＲ  ２９３などのヒト胚腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常な２倍体細胞、初代組織、初代移植のインビトロ培養物に由来する細胞株、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞を含む。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニング及び発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓら（非特許文献９３）によって記載されている。
【０１７１】
ベクターＤＮＡが、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって、原核生物又は真核生物細胞に導入され得る。哺乳類細胞の安定したトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、細胞のごく一部のみが、外来性ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの成分を同定し、選択するために、（例えば、抗生物質に対する耐性のために）選択可能なマーカーをコードする遺伝子が、一般に、該当する遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与えるものを含む。導入された核酸が安定的にトランスフェクトされた細胞が、他の方法の中でも特に、薬剤選択によって同定され得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は、生存するであろうが、他の細胞は死亡する）。
【０１７２】
形質転換された細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養され得、ポリペプチドは、従来のタンパク質精製手順によって回収される。１つのこのような精製手順が、以下の実施例に記載されている。本明細書において使用することが想定されたポリペプチドは、汚染性内因性物質を実質的に含まない実質的に均一な組み換え哺乳動物ＧＩＰＲ抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチドを含む。
【０１７３】
ＧＩＰＲ抗体の活性
ＧＩＰＲ抗体の活性は、ＧＩＰＲに特異的に結合し、ＧＩＰシグナル伝達を阻害又は阻止し、その後、治療的生物学的効果を示し、例えば、肥満、Ｔ２ＤＭ及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置する際の、本明細書において提供される抗体の効果を指す。「ＧＩＰシグナル伝達の生物学的活性を低下させる」又は「ＧＩＰシグナル伝達の生物学的活性を阻害又は阻止する」という用語は、インビボでＧＩＰＲに結合することによって、ＧＩＰに対する下流の細胞応答を阻害又は阻止する際の、ＧＩＰＲ抗体又はそのＧＬＰ−１融合タンパク質の効果を指す。それらの応答としては、限定はされないが、インスリン分泌促進作用、脂肪蓄積の促進、及び脂肪分解の阻害が挙げられる。一実施形態において、本明細書において提供されるマウス抗体又はヒト化抗体は、ヒトＧＩＰＲに特異的に結合する。このような抗体は、ＧＩＰシグナル伝達を低減又は中和する拮抗又は中和抗体を含む。
【０１７４】
一実施形態において、ヒトＧＩＰＲに結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭ、０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５ｎＭ〜２００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ、又は１０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である。ＧＩＰＲに結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１ｎＭ〜２００ｎＭである。さらに別の実施形態において、ＧＩＰＲに結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１０ｎＭ〜１００ｎＭである。さらに別の実施形態において、ＧＩＰＲに結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、又は１００ｎＭである。
【０１７５】
一実施形態において、ＧＩＰシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のＩＣ５０は、約０．０１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．１ｎＭ〜２００ｎＭ、０．５ｎＭ〜２００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ、又は１０ｎＭ〜１００ｎＭである。別の実施形態において、ＧＩＰシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のＩＣ５０は、約１ｎＭ〜２００ｎＭである。さらに別の実施形態において、ＧＩＰシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のＩＣ５０は、約１０ｎＭ〜１００ｎＭである。さらに別の実施形態において、ＧＩＰシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のＩＣ５０は、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、又は１００ｎＭである。
【０１７６】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ＧＩＰＲに特異的に結合し、１つ又は複数の以下の特性を有する：
ａ．ＧＩＰＲに結合する際に、参照抗体と実質的に同様のＫｄを提供すること；
ｂ．ＧＩＰによって活性化されるＧＩＰＲに拮抗する際に、参照抗体と実質的に同様のＩＣ５０を提供すること；及び
ｃ．ヒトＧＩＰＲに対する参照抗体との交差競合的結合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ）。
【０１７７】
一実施形態において、参照抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列  配列番号６６及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列  配列番号７６の組合せを含む。別の実施形態において、参照抗体は、モノクローナル抗体Ｌ２Ｈ２、Ｌ６Ｈ５、又はＬ１０Ｈ８である。
【０１７８】
本明細書において使用される際、「実質的に同様」という用語は、参照抗体のＩＣ５０若しくはＫｄと同等であるか、又はその約２００％、１８０％、１６０％、１５０％、１４０％、１２０％、１１０％、１００％、９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、若しくは５０％であることを意味する。一実施形態において、参照抗体は、例えば、重鎖配列番号７６及び軽鎖組合せ配列番号６６を含む抗体である。別の実施形態において、参照抗体は、Ｌ２Ｈ２、Ｌ６Ｈ５、又はＬ１０Ｈ８を含む。
【０１７９】
ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の生物学的活性
ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の生物学的活性は、ＧＬＰ−１の生物学的活性及びＧＩＰＲ抗体の活性を含む。ＧＩＰＲ抗体の活性は、上述されるとおりである。「ＧＬＰ−１の生物学的活性」は、ＧＬＰ−１受容体にインビボで結合し、それを活性化し、細胞内シグナル伝達応答を引き起こし、肥満、２型糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎などの治療効果を示す、ＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の生物学的活性を指す。シグナル伝達応答は、限定はされないが、インスリン分泌の増加、グルカゴン分泌の抑制、食欲の抑制、体重減少、満腹感の誘発、アポトーシスの阻害、膵β細胞増殖の誘発、及び膵β細胞分化を含む。ＧＬＰ−１及びＧＩＰＲ抗体の生物学的活性を組み合わせて、本明細書において提供されるＧＬＰ−１融合タンパク質を用いて、ＧＬＰ−１Ｒ及びＧＩＰＲに関連する様々な疾患及び障害を処置することができる。融合タンパク質は、ＧＬＰ−１Ｒ及び／又はＧＩＰＲに作用することによってその生物学的効果を発揮するため、本明細書において提供されるＧＬＰ−１融合タンパク質処置を用いて、疾患又は症状が「ＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達の増加」又は「ＧＩＰＲシグナル伝達の低減」から利益を得る被験体を処置することができる。これらの被験体は、「ＧＬＰ−１Ｒ刺激療法を必要とする」又は「ＧＩＰＲ刺激を低減する必要がある」被験体と呼ばれ、このような対照は、非インスリン依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、脳卒中（ＧＬＰ−１Ｒ、（特許文献２８）を参照）、心筋梗塞（ＧＬＰ−１Ｒ、（特許文献２９）を参照）、肥満（ＧＬＰ−１Ｒ、（特許文献３０）を参照；ＧＩＰＲ、（非特許文献９４）；（特許文献３１）を参照）、外科手術後の異化変化（ＧＬＰ−１Ｒ、（特許文献３２）を参照）、機能性ディスペプシア及び過敏性腸症候群（ＧＬＰ−１Ｒ、（特許文献３３）を参照）、脂肪肝（ＧＩＰＲ、（特許文献３１）を参照）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＧＬＰ−１Ｒ、（非特許文献９５）を参照；ＧＩＰＲ、（特許文献３１）を参照）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＧＬＰ−１、（非特許文献９６）を参照；ＧＩＰＲ、（特許文献３１）を参照）を含み、また、非インスリン依存性糖尿病を発症するリスクのある被験体（特許文献３４を参照）、耐糖能異常又は空腹時血糖異常の被験体、体重が標準体重より約２５％多い被験体、及び膵部分切除を有する被験体も含む。
【０１８０】
一実施形態において、ＧＩＰＲ抗体又はＧＬＰ−１とのその融合タンパク質の生物学的活性の変化が、インビトロでＧＩＰＲを阻害する際の、ＧＩＰＲ抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質の機能を定量する、直接のｃＡＭＰアッセイを用いて検出される。
【０１８１】
医薬組成物
一実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体と、１つ又は複数の薬学的に許容できる担体とを含む。
【０１８２】
別の実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質と、１つ又は複数の薬学的に許容できる担体とを含む。
【０１８３】
本明細書において使用される際の「担体」という用語は、細胞又は哺乳動物を、使用される投与量及び濃度でそれに曝すことによって無害である、担体、医薬品賦形剤、又は安定剤を含む。
【０１８４】
処置の方法
一実施形態において、２型糖尿病を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１８５】
別の実施形態において、非アルコール性脂肪肝疾患を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１８６】
別の実施形態において、非アルコール性脂肪肝疾患を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１８７】
別の実施形態において、非アルコール性脂肪性肝炎を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１８８】
別の実施形態において、非アルコール性脂肪性肝炎を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１８９】
別の実施形態において、２型糖尿病を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１９０】
別の実施形態において、２型糖尿病を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質、又はその薬剤組合せを被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１９１】
別の実施形態において、肥満を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１９２】
さらなる実施形態において、肥満を処置、予防、又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１９３】
本明細書において提供される使用のいずれかにおいて、本明細書において提供される医薬組成物は、静脈内又は皮下注入用である。
【０１９４】
本明細書において使用される際、「被験体」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を指し、「患者」という用語と同義的に使用される。
【０１９５】
「処置」という用語は、疾患の少なくとも１つの症状又は他の側面の軽減若しくは予防、又は疾患重症度の低下を含む。本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体又はＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質は、有効な治療剤であるために、完治を提供し、又は疾患の全ての症状又は兆候を根絶する必要はない。関連分野において認識されるように、治療剤は、所与の病態の重症度を低下させ得るが、有効であるために、疾患の全ての兆候をなくす必要はない。同様に、予防薬は、有効であるために、病態の発生を完全に予防する必要はない。疾患の影響を単に低減すること（例えば、その症状の数若しくは重症度を低減することによって、又は別の処置の有効性を増加させることによって、又は別の有益な効果を生じることによって）、又は疾患が被験体において発生又は悪化する可能性を低下させることで十分である。本発明の一実施形態は、特定の疾患の重症度を反映する指標のベースラインに対する持続的改善を誘発するのに十分な量及び時間で抗体を患者に投与することを含む方法に関する。
【０１９６】
ＧＩＰＲ抗体又はＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の医薬組成物は、限定はされないが、非経口で、局所的に、又は吸入によるなどの任意の好適な技術によって投与され得る。注入される場合、医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内又は皮下経路を介して、ボーラス注入又は持続注入によって投与され得る。例えば、経皮投与及び埋め込み型製剤（ｉｍｐｌａｎｔ）の持続放出などの疾患又は損傷部位における局部的な投与が考えられる。吸入による送達としては、例えば、経鼻又は経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態の抗体の吸入などが挙げられる。他の代替例としては、丸薬、シロップ、又はトローチ剤を含む経口製剤が挙げられる。
【０１９７】
有利には、本明細書において提供されるＧＩＰＲ抗体又はＧＩＰＲ抗体の融合タンパク質は、生理学的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤などの１つ又は複数のさらなる成分を含む組成物中で投与される。組成物は、後述される１つ又は複数の生理学的に活性な薬剤をさらに含む。多くの特定の実施形態において、組成物は、本明細書において提供される１つ又は複数の抗体（例えば、マウス抗体又はヒト化抗体）又はＧＬＰ−１融合タンパク質に加えて、１、２、３、４、５、又は６つの生理学的に活性な薬剤を含む。
【０１９８】
一実施形態において、医薬組成物は、好適なｐＨで抗体に好適な緩衝液、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド（１０個未満のアミノ酸を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、デキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、安定剤、及び賦形剤からなる群から選択される１つ又は複数の物質と一緒に、本明細書において提供されるマウス抗体又はヒト化抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質を含む。適切な業界標準にしたがって、防腐剤も加えられ得る。組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得る。好適な成分は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無害である。医薬製剤に用いられ得る成分のさらなる例が、（非特許文献９７）に示されている。本発明の１つ又は複数の抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質及びラベル又は本明細書に記載される病態のいずれかを処置する際の他の使用説明書を含む、医師による使用のためのＭａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙキットが提供される。一実施形態において、キットは、１つ又は複数のヒト抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質の滅菌製剤を含み、これは、上に開示される組成物の形態であり得、１つ又は複数のバイアル中にあり得る。
【０１９９】
投与量及び投与の頻度は、投与経路、用いられる具体的な抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質、処置される疾患の性質及び重症度、病態が急性か慢性か、及び被験体の大きさ及び全身状態などの要因に応じて変化し得る。適切な投与量は、関連技術において公知の手順によって、例えば用量漸増試験を含み得る臨床試験において決定され得る。
【０２００】
本明細書において提供される抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質は、例えば、所定の期間にわたって一定の間隔で、例えば、１回又は２回以上投与され得る。特定の実施形態において、マウス抗体又はヒト化抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質は、少なくとも１ヶ月又はそれ以上の期間で１回、例えば、１、２、又は３ヶ月間にわたって、或いは無期限に投与される。慢性疾患を処置するために、長期処置が、一般に最も有効である。しかしながら、急性疾患を処置するために、例えば、１〜６週間のより短い期間にわたる投与で、十分であり得る。一般に、ヒト化抗体は、１つ又は複数の選択された指標についてベースラインに対する医学的に関連する改善の程度が患者に見られるまで投与される。
【０２０１】
本明細書において提供される処置計画の一例は、２型糖尿病、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝炎によって引き起こされる症状を処置するために、適切な投与量で、１週間又はそれ以上につき１回の、抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質の皮下注入を含む。抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質は、所望の結果が得られるまで、例えば、患者の症状が治まるまで、週に１回又は月に１回投与され得る。処置は、必要に応じて再開してもよく、或いは、維持量が投与され得る。
【０２０２】
患者の血糖濃度及び体重は、患者の圧力の変化を検出するために、ヒト抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質などの抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質による処置の前、その間、及び／又はその後にモニターされ得る。いくつかの疾患については、血糖の変化は、疾患の進行などの要因により変化し得る。血糖濃度は、公知の技術を用いて決定され得る。
【０２０３】
本明細書における方法及び組成物の特定の実施形態は、例えば、抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質及び１つ又は複数のＧＩＰアンタゴニスト、本明細書において提供される２つ以上の抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質、又は本明細書において提供される抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質及び１つ又は複数の他のＧＩＰアンタゴニストの使用を含む。さらなる実施形態において、抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質は、単独で、又は患者が罹患している症状を処置するのに使用される他の薬剤と組み合わせて投与される。これらの薬剤の例は、タンパク性及び非タンパク性薬剤を含む。複数の薬剤が組み合わせて投与される場合、投与量は、当該技術分野において周知であるように、それ相応に調整されるべきである。「併用投与」併用療法は、同時投与に限定されず、少なくとも１つの他の治療剤を患者に投与することを含む投与過程の間に抗原及びタンパク質が少なくとも１回投与される処置計画も含む。
【０２０４】
一方、２型糖尿病、肥満及び非アルコール性脂肪性肝炎及び関連疾患を処置するための薬剤を調製するための方法であって、薬剤が、上記の疾患の関連疾患の処置のために、本明細書において提供される抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質及び薬学的に許容できる賦形剤の混合物を含む方法が、本明細書において提供される。薬剤の調製方法は、上述されるとおりである。
【０２０５】
ヒトＧＩＰＲに特異的に結合する抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質に関連する組成物、キット、及び方法が、本明細書においてさらに提供される。ＧＩＰＲに結合するポリペプチドの全て又は一部をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子並びにその誘導体及びフラグメント、例えば、ＧＩＰＲ抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、又はＧＬＰ−１融合タンパク質の全て又は一部をコードする核酸も提供される。このような核酸を含むベクター及びプラスミド、並びにこのような核酸及び／又はベクター及びプラスミドを含む細胞及び細胞系が、本明細書においてさらに提供される。本明細書において提供される方法は、例えば、ヒトＧＩＰＲに結合する抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質を調製、同定又は単離するための方法、抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質がＧＩＰＲに結合するかどうかを決定するための方法、及びＧＩＰＲに結合する抗体又はＧＬＰ−１融合タンパク質を動物モデルに投与する方法を含む。
【０２０６】
本明細書に記載される技術的解決法は、以下の実施例によってさらに理解されよう。
【実施例】
【０２０７】
規定されない場合、本明細書に記載される出発材料及び機器は、市販されているか、又は当該技術分野において一般的に使用されるものである。以下の実施例における方法は全て、特に規定されない限り、当該技術分野における従来の方法である。
【０２０８】
１：免疫付与のための抗原の調製
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞を、６ウェルプレート中に播種した。２４時間後、細胞に、ｈＧＩＰＲ遺伝子（ヌクレオチド配列については配列番号１１４、及びアミノ酸配列については配列番号１１３を参照）を含むｐＴＭ１５プラスミドをトランスフェクトした。製造業者の推奨するプロトコルにしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、培地を、３００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する完全培地と交換し、安定したクローンが現れるまで、約２週間の培養の間、３日ごとに培地を交換した。分散された細胞群体を、プレートから取り出し、細胞が１００％コンフルエンスに達するまで連続的に継代培養した。構築された安定した細胞系を、圧力選択後に陽性クローンを確認するために、Ｖ５タグに対するモノクローナル抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＦＡＣＳによって分析した。大量の細胞表面ｈＧＩＰＲ発現が、選択されたＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＩＰＲ細胞において検出された。最後に、３つの高ｈＧＩＰＲ発現の安定した細胞系が、サブクローニング及びさらなる確認によって同定された。これらの細胞系を、抗体調製のための免疫原を産生するのに使用した（実施例２を参照）。さらに、ある実施形態において、ｈＧＩＰＲ及びｈＩｇＧ  Ｆｃの細胞外ドメインの融合タンパク質も、抗体調製のための免疫原として使用され得る。調製方法は、以下のとおりである：ｈＧＩＰＲ細胞外ドメイン、ｈＩｇＧ  Ｆｃ及びペプチドリンカー（リンカー）の融合タンパク質遺伝子を、ｐＴＭ５プラスミド中にサブクローニングする。細胞上清を、懸濁されたＨＥＫ２９３細胞を用いて大量一過性発現（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって生成し、次に、ｈＧＩＰＲ細胞外ドメイン融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー精製によって得た。
【０２０９】
２：抗体の調製
ｈＧＩＰＲに対する抗体が、以下のいずれかを含む免疫原を用いて産生され得る。例えば、特定の実施形態において、ｈＧＩＰＲを発現する全細胞が、ｈＧＩＰＲに対する抗体を産生するための免疫原として使用される。さらに、特定の実施形態において、ｈＧＩＰＲ及びｈＦｃのＮ末端細胞外ドメインを含む融合タンパク質が、ｈＧＩＰＲに対する抗体を産生するための免疫原として使用される。免疫原及び水酸化アルミニウムアジュバントを混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の皮下に注入し、週に１回追加免疫した。合計６回の免疫付与後、血液試料を、尾静脈から採取し、血清を遠心分離によって分離し、次に、血清力価をＦＡＣＳによって分析した。最も高い力価が得られた後、マウスを殺処分し、その脾臓細胞を、無菌状態で採取した。対数増殖期のＳＰ２／０細胞を収集し、遠心分離し、細胞ペレットを、無血清培地で再度懸濁させ、次に、遠心分離し、再度二度目の懸濁を行い、計数した。脾臓細胞及びＳＰ２／０細胞を、ＳＰ２／０細胞：脾臓細胞≧１：１の比率で混合した後、３回の洗浄−遠心分離を行った。最後の遠心分離からペレットを取り出した後、１ｍＬの予め温めたＰＥＧ−１５００を滴下して加え、１分間にわたってピペット混合し、３０ｍＬの予め温めた無血清培地をゆっくりと加えて、ＰＥＧ融合を停止させた。細胞ペレットを、融合培地中で再度懸濁させた。１００μＬ中の脾臓細胞及び支持細胞層細胞を、９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。融合されたハイブリドーマ細胞及び支持細胞層細胞を、ＨＡＴ（サルシン、アメトプテリン及びチミジン）選択を用いて、９６ウェルプレート中で共培養して、非融合細胞を除去した。１０日後、培養プレート中のハイブリドーマ細胞の上清を、ＥＬＩＳＡ分析のために収集した。
【０２１０】
３：抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング
ｈＧＩＰＲを過剰発現するＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＩＰＲ細胞及びＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ブランク細胞を、９６ウェルプレート中に別々に移し、９０％コンフルエンスに到達させた。培地の上清を除去し、付着した細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、１００％のメタノールを加えて、４℃で細胞を固定した。次に、１００μＬの、作製したばかりの０．６％のＨ２Ｏ２−ＰＢＳを加え、室温で２０分間にわたるインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。１％のＢＳＡ溶液（ＰＢＳに溶解された）でブロックした後、ハイブリドーマ上清を加え、４℃で９０分間インキュベートした。数回の洗浄後、１００μＬの希釈されたヤギ抗マウスＦｃ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。５回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ発色性基質を加え、３７℃で１５分間インキュベートし、次に、５０μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させてから、４５０ｎｍで読み取った。さらに、特定の実施形態において、ｈＧＩＰＲ及びｈＦｃのＮ末端細胞外ドメインの融合タンパク質が、コーティング抗原として使用される。１％のＢＳＡ（ＰＢＳに溶解された）でブロックした後、ハイブリドーマ細胞の上清を加え、４℃で９０分間インキュベートした。後続の工程は、抗ｈＧＩＰＲモノクローナル抗体をスクリーニングする上記のＥＬＩＳＡ方法と同じである。陽性対照は、免疫付与されたマウスの血清であり；陰性対照は、細胞培地である。ＥＬＩＳＡによる予備スクリーニングの後、ｈＧＩＰＲ抗体を分泌するいくつかの陽性ハイブリドーマ細胞系が得られた。ｈＧＩＰＲ抗体を分泌するこれらのハイブリドーマ細胞系を選択し、限界希釈法によってサブクローニングした。最後に、陽性ハイブリドーマ細胞の上清を、ＦＡＣＳ分析によって確認した（実施例１０を参照）。
【０２１１】
４：抗体遺伝子のクローニング及びサブクローニング
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集した。ハイブリドーマｍＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  ｍＲＮＡ抽出キットの製造業者のプロトコルにしたがって抽出した。次に、抽出されたｍＲＮＡを、ｃＤＮＡに逆転写した。逆転写プライマーは、マウスの軽鎖及び重鎖定常領域に対して特異的なプライマーであり、特に、重鎖逆転写プライマーは、（５’−ＴＴＴＧＧＲＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ−３’）であり、軽鎖逆転写プライマーは、（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）及び（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）であった。ＲＴ−ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりに指定されていた：２５℃で５分、５０℃で６０分、及び７０℃で１５分。逆転写されたｃＤＮＡを、５００μＬになるまで０．１ｍＭのＴＥで希釈し、限外ろ過遠心分離管（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５）に加え、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離した。ろ液を除去し、５００μＬの０．１ｍＭのＴＥを加え、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離した。ろ液を除去し、調製管を、新しい遠心分離管に逆さに入れ、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離して、精製されたｃＤＮＡを得た。精製されたｃＤＮＡ（１０μＬ）を鋳型として取った後、４μＬの５倍のテーリングバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４μＬのｄＡＴＰ（１ｍＭ）及び１０Ｕ末端トランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、均一に混合し、３７℃で５分間、次に、６５℃で５分間インキュベートした。ポリＡテイルｃＤＮＡを、鋳型として使用し、抗体の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を増幅するために、ＰＣＲを行った。上流プライマーは全て、オリゴｄＴであり、重鎖下流プライマーは、（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ−３’）及び（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣ−３’）であり、軽鎖下流プライマーは、（５’−ＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＧ−３’）であった。ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった：９５℃で５分；９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分、４０サイクル；及び７２℃で７分。ＰＣＲ産物を、配列決定のためにＰＭＤ  １８−Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）に連結した。ＰＣＲプライマーを、抗体のＤＮＡ配列に基づいて設計し、したがって、完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチド及び可変ドメイン及びマウスＩｇＧ１定常領域を、発現ベクターｐＴＭ５に連結した。
【０２１２】
５：抗体のヒト化及び最適化
最初に、マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の配列を、ＮＣＢＩオンライン抗体可変領域配列アライメントツール（Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ）を用いた検索において入力として使用して、ヒト化のためのマウス抗体可変領域配列と相同のヒト抗体の生殖系列遺伝子配列（Ｉｇ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅ配列）を検索し、ＣＤＲ配列を除いて最も高い相同性を有するヒト遺伝子配列を、ＣＤＲグラフト化のための鋳型として使用して、ヒト化抗体可変領域配列を得た。ヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を合成し、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４定常領域配列と組み合わせて、完全長組み換えヒト化抗体配列を得た。組み換え抗体を、実施例８にしたがって発現させ、ＧＩＰＲに対するそれらの親和性を、実施例１０に記載されるようにＦＡＣＳによって分析して、最良の親和性を有する抗体を選択した。ヒト化抗体の可変領域配列を、部位特異的突然変異によって操作して、ＧＩＰＲに対するその親和性をさらに改善した。
【０２１３】
６：ヒト化ｈＧＩＰＲ抗体の遺伝子のサブクローニング
最適化ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を、アウトソーシングによって合成した。このプロセス中、２つの制限部位、５’末端におけるＮｈｅＩ及び３’末端におけるＳａｌＩを、重鎖可変領域配列に導入した。完全な重鎖可変領域を、ｐＴＭ５の発現ベクターにおける重鎖定常領域と連結した。同様に、ＮｈｅＩを５’末端に及びＢｓｉｗＩを３’末端に導入することによって、軽鎖可変領域を、ｐＴＭ５の発現ベクターにおける軽鎖定常領域と連結した。
【０２１４】
７：ヒト化ｈＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１の融合タンパク質の構築物
最適化ヒト化抗体を、軽鎖のＮ末端又はＣ末端を介して、ＧＬＰ−１又はその誘導体配列と融合して、ＧＬＰ−１融合タンパク質を形成し、２つの配列を架橋としてのペプチドリンカー配列（リンカー）によって連結した。シグナルペプチド−ＧＬＰ−１−リンカーのヌクレオチド配列が、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄによって合成される。合成遺伝子を鋳型として用いて、「シグナルペプチド−ＧＬＰ１−リンカー」部分の配列を、ＰＣＲを用いて増幅した。さらに、ヒト化抗体のヌクレオチド配列を鋳型として用いて、融合タンパク質配列の抗体の配列を増幅する。次に、オーバーラップＰＣＲによって、融合タンパク質の核酸配列の「シグナルペプチド−ＧＬＰ−１−ペプチドリンカー」部分を、抗体部分と連結して、２つの制限酵素部位Ｎｈｅ１及びＮｏｔ１を、プライマーの両端に導入し、それによって、完全融合タンパク質配列及び発現ベクターｐＴＭ５が一緒に連結される。
【０２１５】
８：ｈＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１融合タンパク質の一過性発現
ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ浮遊細胞（５×１０５／ｍＬ）を、振とうフラスコに接種した。３７℃で２４時間回転させた後、細胞密度は、１×１０６／ｍＬに達し、これをトランスフェクションに使用した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、トランスフェクション試薬として使用し、それをＤＮＡと混合する。ＰＥＩ／ＤＮＡの混合物を、１５分間のインキュベーションの後、細胞培養物に加えた。ＰＥＩ／ＤＮＡの混合物を与えた後、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間にわたって連続的に培養した。次に、トリプトンを、発現のための補助として細胞培養物に加えた。最後に、タンパク質の発現が完了した（９６時間超）後、細胞上清を、抗体精製のために収集した。
【０２１６】
９：ｈＧＩＰＲ抗体及びＧＬＰ−１融合タンパク質の精製及び分離
細胞及び細胞残屑を、遠心分離（８０００ｒｐｍ）後に培養物から除去し、上清を、０．２２μｍフィルタに通してろ過した。清澄化された上清が、精製に使用される。精製プロセスを、クロマトグラフによって完了させた。上清が、まず、プロテインＡ／Ｇアフィニティーカラムを通って流れ、その間、抗体が、プロテインＡ／Ｇに結合され、カラムに残っていた。次に、抗体を、低ｐＨ（３．０以下）を有する溶出緩衝液を用いてクロマトグラフィーカラムから溶離した。低ｐＨ溶離剤を、１Ｍのトリス−ＨＣｌで直ぐに中和した。次に、精製された抗体を、ＰＢＳ又は他の緩衝系に対して透析した。
【０２１７】
１０：機能性ｈＧＩＰＲ抗体の結合活性を確認するためのＦＡＣＳ
１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＩＰＲ細胞を取り出し、管当たり１０５個の細胞を、１．５ｍＬのＥＰ管中に分配し、上清を、遠心分離後に除去した。陰性対照試料を、ローディングバッファー（ＰＢＳ、２％のＦＢＳ）で再度懸濁させた。陽性対照については、特定の濃度の２００μＬのＧＩＰＲ抗体溶液を、細胞に加え、室温でインキュベートし；インキュベーションの後、次に、細胞を、１５００ｒｐｍで遠心分離して、上清を除去し、ＦＡＣＳローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離した。細胞を、１：５０の希釈率でのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス蛍光抗体又はＰＥ標識ヤギ抗ヒト蛍光抗体の添加（２００μＬ／ウェル）により再度懸濁させ、暗所で３０分間にわたって室温でインキュベートした。上清を、遠心分離後に除去し、細胞を、ＦＡＣＳローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離し、ＦＡＣＳ分析のためにローディングバッファーで再度懸濁させた。組み換え抗ｈＧＩＰＲ機能性抗体は、ＧＩＰＲ発現ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ＧＩＰＲ細胞に特異的に結合する。図１に示される実験結果において、灰色のピーク及び点線のピークは、陰性対照であり；１μＭの抗体Ｌ１０Ｈ８に対応する実線のピークは、著しい右への移動を示して、Ｌ１０Ｈ８及びＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ＧＩＰＲの特異的結合を証明する。
【０２１８】
１１：ＧＩＰＲのそのインビトロ拮抗作用についてのｈＧＩＰＲ抗体又はｈＧＩＰＲ抗体／ＧＬＰ−１融合タンパク質のｃＡＭＰアッセイ試験
ヒトＧＩＰＲを安定的に発現するＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞を、ウェル当たり３０，０００個の細胞で９６ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ２の培養器に一晩入れた。翌日、上清を除去し、４５μＬ／ウェルのハイブリドーマ上清又は連続希釈された抗体を加えた。細胞を３０分間にわたって室温にしておき、次に、ＧＩＰペプチドを、４５μＬ／ウェルで加えた（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、５０ｐＭ）。次に、９６ウェルプレートを、３７℃、５％のＣＯ２の培養器に３０分間入れ、１０μＬ／ウェルの１０％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて、細胞を室温で溶解させ、溶解物をピペットで均一に混合した。ｃＡＭＰキット（ＣｉｓＢｉｏ）を用いて、実験において産生されたｃＡＭＰを検出した。１０μＬ超／ウェルの細胞溶解物を、白色の３８４ウェルプレートに移し、５μＬ／ウェルの１：２０で希釈されたｃＡＭＰ−ｄ２を加え、最後に、５μＬ／ウェルの１：２０で希釈された抗ｃＡＭＰ−Ｅｕ３±クリプテートを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。時間分解蛍光６６５ｎｍ／６２０ｎｍシグナル比を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０３マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、Ｐｒｉｓｍ５．０を用いて、ＩＣ５０値を計算した。図２は、Ｌ７Ｈ６が、ＩＣ５０＝７．６ｎＭで、ＧＩＰＲに拮抗することを示す。図３は、ＧＬＰ−１−リンカー−Ｌ７Ｈ６が、ＩＣ５０＝１４．９ｎＭで、ＧＩＰＲに拮抗することを示す。
【０２１９】
１２：ＧＬＰ−１Ｒのそのインビトロ活性化についてのｈＧＩＰＲ抗体／ＧＬＰ−１融合タンパク質のレポーター遺伝子アッセイ試験
ｈＧＬＰ１Ｒ及びＣＲＥ−ルシフェラーゼを共発現するＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞を、ウェル当たり２００００個の細胞で９６ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、培養上清を除去した。細胞を無血清培地で２回洗浄し、残液を同様に除去した。次に、連続希釈された抗体又はＧＬＰ−１を含有する１００μＬの無血清培地を加え、３７℃で４時間インキュベートした。刺激の後、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ化学発光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。最後に、細胞溶解物を、白色の９６ウェルプレートに移し、相対光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において記録した。図４は、ＧＬＰ−１−リンカー−Ｌ７Ｈ６が、ＥＣ５０＝０．０４ｎＭで、ｈＧＬＰ−１Ｒを活性化することを示す。
【０２２０】
１３：高脂肪食誘導性Ｃ５７ＢＬ／６肥満マウスにおけるｈＧＩＰＲ抗体のインビボ有効性試験
６０％の高脂肪食誘導性Ｃ５７ＢＬ／６マウス肥満モデル（ＤＩＯマウス）を確立した。マウスを購入し、１週間にわたって普通食を与えた後、通常のマウスの餌を与える正常対照群として一定数のマウスをランダムに選択し、残りの動物に高脂肪食を与えた。全ての動物に、８週間にわたって連続的に給餌し、体重及び食物摂取を週に１回評価した。その後、高脂肪食を与えられたマウスを、その体重に応じて、Ｌ１０Ｈ８群（１０ｍｇ／ｋｇ）及びモデル群にランダムに分けた。薬剤を、６週間にわたって２日ごとに皮下注入した。正常対照群は投与されず、モデル群は、同じ量のブランク製剤を与えられる。体重、食物摂取及び行動観察のデータを、実験期間中に収集した。実験の最終日に、１２時間の絶食（水の摂取は自由）の後、血清を分離するために、動物の眼窩血液を採取し、次に、安楽死させ、肝臓を切開し、秤量し、肝臓の形態を観察した。血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＬＵ、ＴＣ及びＴＧ、並びに肝臓中のＴＧを調べた（表３中の結果を参照）。
【０２２１】
【表３】
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【０２２２】
Ｌ１０Ｈ８の６週間の投与の後、Ｌ１０Ｈ８群の重量増加は、モデル群の重量増加よりわずかに低いに過ぎなかったが、肝重量は、モデル群の肝重量より有意に低く、正常対照群の肝重量に近かった。Ｌ１０Ｈ８群の肝臓ＴＧは、モデル群の肝臓ＴＧより有意に低く、血清ＴＧは、モデル群の血清ＴＧより優位に高かった。これらの結果は、Ｌ１０Ｈ８が、肝臓脂肪の吸収及び蓄積を著しく遅くすることを示す。図５は、各群の体重変化のパーセンテージを示す。表３は、６週間にわたってＬ１０Ｈ８抗体を与えた後の各群における肝臓分析データを要約している。
【０２２３】
１４：カニクイザルにおけるＧＩＰＲ抗体／ＧＬＰ−１融合タンパク質の薬物動態試験
合計６匹のカニクイザル（３匹の雄及び３匹の雌）に、２ｍｇ／ｋｇの用量でＧＬＰ−１／ｈＧＩＰＲ抗体融合タンパク質の単回の皮下注入を与え、０．６ｍＬの全血試料を、投与部位と同じ体側の前肢の静脈を介して、投与前（０分）、投与後２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１８日、２８日の時点でそれぞれ採取し、氷上の遠心分離管に入れ、自然な凝固の後、次に、血液試料を遠心分離して、血清を分離し、使用するまで低温（−８０℃）で貯蔵した。血清試料中のＧＬＰ−１／ｈＧＩＰＲ抗体融合タンパク質のＧＬＰ−１部分及びｈＧＩＰＲ抗体部分を、ＥＬＩＳＡによって別々に定量し、カニクイザルにおける両方の半減期を、ソフトウェア解析によって決定した。
【０２２４】
１５：高脂肪食誘導性カニクイザルにおけるｈＧＩＰＲ抗体／ＧＬＰ−１融合タンパク質のインビボ有効性試験
６０％の高脂肪食誘導性カニクイザルが、肥満カニクイザルモデル（ＤＩＯカニクイザル）を確立し、次に、皮下投与によるＧＬＰ−１−リンカー−Ｌ７Ｈ６のインビボ有効性を評価するために使用される。高脂肪食誘導性サルを、その体重に応じて、ＧＬＰ−１−リンカー−Ｌ７Ｈ６（１０ｍｇ／ｋｇ）群及びモデル群にランダムに分けた。薬剤を、合計８週間にわたって２日ごとに皮下注入し、モデル群に、等体積のブランク製剤を与えた。体重、食物摂取及び行動観察のデータを、実験期間中に収集した。実験が完了した後、動物を安楽死させ、肝臓を切開し、秤量し、肝臓の形態を観察した。血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＬＵ、ＴＣ及びＴＧ、並びに肝臓中のＴＧを調べた。
【０２２５】
上記の実施形態は、権利請求される実施形態を作製及び使用する方法を、当業者に十分に開示及び説明することが意図され、本開示の範囲を限定することは意図されていない。当業者に明らかな変更は、特許請求の範囲内である。本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それらのそれぞれが具体的に且つ独立して参照により本明細書に援用されているかのように、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月10日(2020.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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