(57)【要約】  本発明は、医薬品または造影剤を含む容積を取り囲む１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートからなる膜を含むリポソームベシクルに関する。このベシクルは、体温および生理学的または病態生理学的に妥当な剪断応力において、機械的感受性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜と前記膜により境界が画定される容積とを含む、または本質的にこれらからなるベシクルであって、前記膜は、本質的に１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートからなる、ベシクル。
【請求項２】
前記膜は二重層構造である、請求項１に記載のベシクル。
【請求項３】
前記膜は単層構造である、請求項１に記載のベシクル。
【請求項４】
前記二重層構造は指組み相を含み、指組み相は４２℃〜４６℃の温度範囲、具体的には４３℃〜４５℃の範囲、より具体的には４４．５℃〜４６．０℃の範囲、または約４４．７℃において形成される、請求項１または２のいずれか１項に記載のベシクル。
【請求項５】
前記ベシクルは、医薬剤もしくは医薬品または診断剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のベシクル。
【請求項６】
前記医薬品または診断剤は、
・線維素溶解剤、
・抗凝固剤、
・抗凝集剤、
・アテローム硬化性プラーク安定化剤、具体的にはスタチン、
・血管拡張剤、具体的には、直接または間接作用型の血管拡張薬から選択される血管拡張剤、より具体的には、酸化窒素遊離剤、アルファアドレナリン受容体拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）、直接型レニン阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリン受容体拮抗薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、カリウムチャネル開口薬から選択される血管拡張剤、
・抗不整脈薬、具体的には、ナトリウムチャネル遮断薬、ベータ遮断薬、カリウムチャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬から選択される抗不整脈薬、
・イノトロープ陽性薬（ｉｎｏｔｒｏｐｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）、具体的には、カテコールアミンまたは非カテコールアミンから選択される医薬品、
・心筋リモデリング薬、具体的には、ＡＣＥ阻害剤またはＡＲＢから選択される医薬品、
・拡張障害処置のための薬物、具体的には、ベータ遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、またはＡＲＢから選択される医薬品、
・鬱血解消のための薬物、具体的には、脳性ナトリウム利尿ペプチドまたは窒素放出薬（ｎｉｔｒｏ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｄｒｕｇｓ）から選択される医薬品、
・放射線造影マーカー、具体的には、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴画像法、陽電子放射断層撮影、シンチグラフィー、または経皮的冠動脈形成術において使用するための放射線造影マーカー、
・化学療法剤、
・凝固因子剤、および
・抗炎症剤から選択されるいずれか１つである、請求項５に記載のベシクル。
【請求項７】
前記製薬学的活性剤、医薬品、または診断剤は、アルテプラーゼ（ａｌｔｅｐｌａｓｕｍ）、ヘパリン、アセチルサリチル酸、クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌｕｍ）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ロスバスタチン（ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｕｍ）、酸化窒素遊離剤、ニトロプルシド、モルシドミン、フェントラミン、エナラプリル、カンデサルタン、ジルチアゼム、ボセンタン、ミルリノン、レボシメンダン、ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌｕｍ）、アリスキレン（ａｌｉｓｋｉｒｅｎｕｍ）、キニジン、メトプロロール、アミオダロン、ベラパミル、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、ドブタミン、イソプレナリン（ｉｓｏｐｒｅｎａｌｉｎ）、レボシメンダン、バソプレシン、グリプレシン（ｇｌｙｐｒｅｓｓｉｎ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド、ネシリチド（ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｕｍ）、ニトログリセリン、アルテプラーゼ（ａｌｔｅｐｌａｓｕｍ）、エプタコグアルファ（ｅｐｔａｃｏｇｕｍ  ａｌｆａ）、遺伝子組換え第ＶＩＩ因子（ノボセブン）、ヨウ素またはヨウ素含有造影剤、ガドリニウム含有造影剤、心筋細胞、および幹細胞から選択される、請求項５〜６のいずれか１項に記載のベシクル。
【請求項８】
ベシクルの調製方法であって、
ｉ．  １，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを、有機溶媒中に溶解させた状態で提供し、
不活性雰囲気下において前記有機溶媒を除去することによって、脂質シートを得る工程と、
ｉｉ．  生理的ｐＨを有する第１の水性緩衝溶液中に前記脂質シートを溶解する工程と、
ｉｉｉ．  少なくとも１回の凍結工程と少なくとも１回の解凍工程とを適用する工程と、
ｉｖ．  前記懸濁液を、具体的には、孔径が５０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲、より具体的には８０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲、さらにより具体的には孔径が１００ｎｍであるフィルターを通して、押し出すことによって、
押出物を得る工程と、
ｖ．  生理的ｐＨを有する第２の緩衝溶液中に前記押出物を透析して、低分子量成分を除去する工程とを含む、方法。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって得られるベシクル。
【請求項１０】
・心血管疾患、
・皮膚科疾患の処置において使用するための医薬品であって、
前記医薬品は、請求項１〜７のいずれか１項に記載のベシクル、もしくは請求項８に記載の方法によって提供されるベシクルの形態にて、または請求項９に記載のベシクルとして投与されることを特徴とする、請求項７に記載の医薬品。
【請求項１１】
血管疾患の処置において使用するための医薬品であって、前記血管疾患は、急性冠症候群（ＡＣＳ）、心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全、脳血管発作（ＣＶＡ）、脳卒中、アテローム性動脈硬化、血管攣縮、腫瘍処置、喀血、肺塞栓症、肺動脈性肺高血圧症、腸管虚血、腸管出血、腎梗塞、腎出血、高血圧処置のための腎自己調節、自己免疫性糸球体腎炎、間質性腎炎、胎児疾患、胎盤梗塞、胎盤出血、網膜虚血、網膜出血、および網膜血管新生から選択される、請求項１０に記載の医薬品。
【請求項１２】
請求項１０に記載の皮膚科疾患の処置において使用するための化合物であって、前記皮膚科疾患は、
・ざ瘡、
・ナプキン皮膚炎、
・アトピー性皮膚炎、
・脂漏性皮膚炎、
・乾癬、
・疣贅、
・足白癬、
・脂漏性角化症、
・蕁麻疹、
・酒さ、
・皮膚科性ウイルス感染、および
・皮膚科性細菌感染から選択される、化合物。
【請求項１３】
モニタリングまたは診断方法において使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のベシクル、または請求項８に記載の方法によって提供されるベシクル、または請求項９に記載のベシクル。
【請求項１４】
１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のジアミドリン脂質１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）、ならびにこれにより形成される単層膜、二重層膜、および機械的感受性ベシクルに関する。こうした機械的感受性ベシクルは、人間の体温における薬物ターゲティングを可能とする薬物送達ビヒクルとして使用できる。
【背景技術】
【０００２】
記載
機械的感受性薬物送達という新たな分野において、健康な組織と疾患組織との間の物理的特性の違いを薬物ターゲティングの誘発要因として利用することが求められている。剪断力は、血管中における誘発要因である。マレイの法則によれば、体内血液運搬に必要な仕事量を最小限とするために、血管系全体にわたって剪断力が１．５Ｐａ未満で平衡に保たれている。狭窄部位においては剪断力が少なくとも１０倍高くなるため、このような力の変化を用いて、ナノ粒子凝集体またはレンズ型ベシクルからの薬物放出を活性化することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
天然リン脂質１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ、図１の式１を参照）と比べると、１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリン（Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ、図１の式２を参照）は、２つの大きな違いを有する。すなわち、ｉ）脂肪酸アシルエステルが、分子間のＨ結合ネットワークを形成できるアミド部位で置き換えられていることと、ｉｉ）天然には存在しない１，３配置によって末端同士が離れており、これによって指組み（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ）構造の二重層膜となっていることである（図１）。こうした２つの作用が組み合わさることにより、ベシクルの幾何学的形状がくびれて、レンズ型またはｄ型のベシクルが形成される。こうしたベシクルは、そのままの状態では締まっているが、たとえば振とうなどにより機械的刺激を受けると、内容物を放出する。言い換えると、このベシクルは機械的感受性を有している。
【０００４】
人工リン脂質１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリンを含有する自己集合ベシクルは、毒性を有さず、一般的には補体系を活性化しない。したがって、１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリンを含むベシクルは、機械的感受性ベシクルによる薬物送達のための候補となり得る。しかしながら、１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリンの主相転移温度（Ｔｍ）は３７℃であり、このベシクルを当該温度に加熱すると、液晶膜の易漏性のために、ベシクル中に封入されていた内容物の全量がすぐに放出される。したがって、膜の機械的感受性を維持しながらＴｍを増大させることが望まれる。
【０００５】
従来技術の上述されるような状況に鑑みて、本発明の目的は、機械的感受性薬物送達のための改善されたベシクルの提供である。当該目的は、本明細書の請求項によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
用語および定義
本明細書の文脈において、用語「ファセット形態」は、レンズ型（レンズ豆形状）または非球状、多くの場合は多面体の形状を有するベシクルに関し、かつ、非球状のベシクル形状を特徴とし得る。リポソームがレンズ型形状を有することによって、その表面領域が、障害および／または欠陥に関連した異なる湾曲を有することになる。そのため、湾曲が大きく規則性が小さい領域では、すなわち中心線に沿った領域では、破壊点となり得る箇所が生じる。こうしたレンズ型形態は、球状ベシクルと平坦表面との間のエネルギーが最小値をとる準安定状態であるとみなされる。冷却速度などのカイネティック因子およびベシクル調製法の選択が、ファセット形態の形成に影響を及ぼす。
【０００７】
本明細書の文脈において、用語「指組み（構造）」は、各脂質単層中のアシル鎖が脂質二重層の中心線を横切り、向かい合う単層中に侵入して、向かい合う脂質単層のアシル鎖と相互作用しているような脂質二重層に関する。完全な指組みとは、二重層中の各アシル鎖が二重層の幅全体にわたって伸びている、すなわち１つの頭部の表面領域に４本のアシル鎖のある脂質二重層である。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、膜と、膜により境界が画定される水溶液の容積とを含む、または本質的にこれらからなるリポソームベシクルに関する。この膜は、本質的に１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）からなる。
【０００９】
【化１】
2021512945.tif 000002
【００１０】
特定の実施形態において、膜は、二重層構造を特徴とする。
リポソームベシクルは、ファセット形態を有する。
【００１１】
特定の実施形態において、二重層構造は指組み相を含み、指組み相は、４１℃〜４６℃の温度範囲、具体的には４２℃〜４６℃の範囲、より具体的には４３℃〜４５．０℃の範囲、より具体的には４３．７℃〜４４．７℃の範囲、または約４３．７℃もしくは約４４．７℃において形成される。
【００１２】
特定の実施形態において、ベシクルは医薬品を含む。
特定の実施形態において、医薬品または活性剤は、
・線維素溶解剤、
・血栓溶解剤、
・抗凝固剤、
・抗凝集剤、
・抗血栓性剤、
・アテローム硬化性プラーク安定化剤、具体的にはスタチン、または他の関連もしくは非関連のプラーク安定化剤、
・肝臓Ｘ受容体作動薬、
・血管拡張剤、具体的には、直接または間接作用型の血管拡張薬から選択される血管拡張剤、より具体的には、酸化窒素遊離剤、アルファアドレナリン受容体拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）、直接型レニン阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリン受容体拮抗薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、カリウムチャネル開口薬から選択される血管拡張剤、
・抗不整脈薬、具体的には、ナトリウムチャネル遮断薬、ベータ遮断薬、カリウムチャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬から選択される抗不整脈薬、
・イノトロープ陽性薬（ｉｎｏｔｒｏｐｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）、具体的には、カテコールアミンまたは非カテコールアミンから選択される医薬品、
・心筋リモデリング薬、具体的には、ＡＣＥ阻害剤またはＡＲＢから選択される医薬品、
・拡張障害処置、具体的には、ベータ遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、またはＡＲＢから選択される医薬品、
・鬱血解消、具体的には、脳性ナトリウム利尿ペプチドまたは窒素放出薬（ｎｉｔｒｏ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｄｒｕｇｓ）から選択される医薬品、
・放射線造影マーカー、具体的には、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴画像法、陽電子放射断層撮影、シンチグラフィー、経皮的冠動脈形成術において使用するための放射線造影マーカー、
・化学療法剤、
・凝固因子剤、
・抗炎症剤から選択されるいずれか１つである。
【００１３】
特定の実施形態において、医薬品は、アルテプラーゼ（ａｌｔｅｐｌａｓｕｍ）、ヘパリン、アセチルサリチル酸、クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌｕｍ）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ロスバスタチン（ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｕｍ）、酸化窒素遊離剤、ニトロプルシド（ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉａｔｅ）、モルシドミン、フェントラミン、エナラプリル、カンデサルタン、ジルチアゼム、ボセンタン、ミルリノン、レボシメンダン、ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌｕｍ）、アリスキレン（ａｌｉｓｋｉｒｅｎｕｍ）、キニジン、メトプロロール、アミオダロン、ベラパミル、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、ドブタミン、イソプレナリン（ｉｓｏｐｒｅｎａｌｉｎ）、レボシメンダン、バソプレシン、グリプレシン（ｇｌｙｐｒｅｓｓｉｎ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド、ネシリチド（ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｕｍ）、ニトログリセリン、アルテプラーゼ（ａｌｔｅｐｌａｓｕｍ）、エプタコグアルファ（ｅｐｔａｃｏｇｕｍ  ａｌｆａ）、遺伝子組換え第ＶＩＩ因子（ノボセブン）、ペルリンガニット（ｐｅｒｌｉｎｇａｎｉｔ）から選択される。特定の実施形態において、本発明に係るベシクルは、ヨウ素またはヨウ素含有造影剤、およびガドリニウム含有造影剤を含む。
【００１４】
特定の実施形態において、リポソームベシクルは、心筋細胞または幹細胞を含む。
本発明の別の一態様は、ベシクルの調製方法であって、
ｉ．  １，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを、有機溶媒中、具体的には揮発性有機溶媒（ｓｏｌｇｅｎｔ）中、より具体的にはメタノールまたはエタノールまたはエタノールアセテート、またはジクロロメタンまたはクロロホルム中に溶解させた状態で提供する工程と、
ｉｉ．  不活性雰囲気下（真空下または窒素気流下）において有機溶媒を除去することによって、脂質シートを得る工程と、
ｉｉｉ．  生理的ｐＨを有する第１の水性緩衝溶液（具体的には１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳを含む）中に脂質シートを懸濁する工程であって、第１の緩衝溶液が、
・クロリド塩を含む、具体的にはＮａＣｌを約５ｍｍｏｌ／Ｌ〜約１５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、具体的には約１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む、および／または
・２００ｍＯｓｍ／Ｌ〜４００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲、具体的には２８０ｍＯｓｍ／Ｌ〜３２０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の容量オスモル濃度を有する、より具体的には３０８ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度を有する、工程と、
ｉｖ．  少なくとも１回の凍結工程と少なくとも１回の解凍工程とを適用する工程であって、
具体的には、凍結工程が、液体窒素などの低温貯蔵用の剤によって行なわれ、解凍工程が、試料の温度を急速に５５℃〜７０℃の範囲、具体的には６５℃にして、懸濁液にすること（ベシクル断片化）によって行なわれる、工程と、
ｖ．  押出工程において、懸濁液を、具体的には、孔径が５０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲、より具体的には８０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲、さらにより具体的には孔径が１００ｎｍであるフィルターを通してろ過することによって、押し出し、
任意に、この押出工程を、具体的には５〜１５回繰り返すことによって、
押出物を得る工程と、
ｖｉ．  生理的ｐＨおよび重量オスモル濃度を有する第２の緩衝溶液中に押出物を透析して、低分子量成分を除去する工程とを含む、方法に関する。
【００１５】
特定の実施形態において、第２の（透析用）緩衝液は、クロリド塩、具体的にはＮａＣｌを、約８０ｍｏｌ／Ｌ〜１２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、具体的には１０７ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む。特定の実施形態において、緩衝液は、約１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳで緩衝されている。他の生理的および製薬学的に許容される緩衝系が、当技術分野において周知されている。
【００１６】
透析は、分子量１５００Ｄａ以下の分子を除去するために選択される。その手段の例は、セファデックスＧ−５０カラム、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ、またはＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）を含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明に係るベシクルは、当技術分野において周知の技術に従って得ることができる（たとえば、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第９巻，ｐｐ．４３−７９（３７）の、Ｐｅｔｅｒ  Ｗａｌｄｅによる「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）」）。特定の実施形態において、ベシクルは、薄膜水和、および／もしくは１回以上の凍結−解凍サイクル、超音波処理、もしくは／および押し出しによって、または電気形成（ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｍａｔｉｏｎ）法によって、または噴霧乾燥させた脂質を含水させることによって、または超音波処理によって、または凍結および解凍を繰り返すことによって、または脱水および再含水によって、または押し出し技術によって、または多重層ベシクルの懸濁液をマイクロフルイダイザーで処理することによって、または多重層ノバソーム（ｎｏｖａｓｏｍｅｓ）の調製もしくは多重層球晶の調製によって、または「気泡法（ｂｕｂｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｔａｌｓｍａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８３，２７６（１９９４））による多重層ベシクルの調製によって、または「渦巻きシリンダ法（Ｃｏｃｈｌｅａｔｅ  ｃｙｌｉｎｄｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｃｒｉｔｅ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻，第２版，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９３），ｐ．６７）による調製によって、または「逆相蒸発技術（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」による調製によって、または水／油および水／油／水エマルションからの調製によって、または「溶媒−小球体（ｗ／ｏ／ｗエマルション）法（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｓｐｈｅｒｕｌｅ（ｗ／ｏ／ｗ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ）ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｋｉｍら．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８１２．７９３（１９８５））もしくは「デポフォーム技術（ＤｅｐｏＦｏａｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｍａｎｔｒｉｐｒａｇａｄａ，Ｐｒｏｇｒ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４１，３９２（２００２））による調製によって、または有機水性二相系からの調製によって、または「エタノール注入法（ｅｔｈａｎｏｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｄｏｍａｚｏｕ  ａｎｄ  Ｌｕｉｓｉ，１．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２，２０５（２００２））による調製によって、または「プロリポソーム法（ｐｒｏ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ／Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｅｖｃ  ａｎｄ  Ｐａｌｔａｕｆ編，ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ  ＩＬ（１９９５）．ｐ．１８１）による調製によって、または多重層エソソーム（ｅｔｈｏｓｏｍｅｓ）の調製によって、または「指組み融合法（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｏｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｃｈｅｎら  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９５，２３７（１９９４））による調製によって、または「コアセルベーション技術（ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」（Ｉｓｈｉｉら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １１，４８３（１９９５））による調製によって、または「超臨界リポソーム法（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６，９２１（１９９７））による調製によって、または初期油／水エマルションからの調製によって、または「エーテル注入法（ｅｔｈｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｄｅａｍｅｒ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３０８，２５０（１９７８））による調製によって、または「急速溶媒交換法（ｒａｐｉｄ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｂｕｂｏｌｔｚ  ａｎｄ  Ｆｅｉｇｅｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４１７，２３２（１９９９））による調製によって、または「界面活性剤枯渇法（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）」（Ｐａｒｅｎｔｅ  ａｎｄ  Ｌｅｎｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３，２３５３（１９８４）；Ａｌｌｅｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６０１，３２８（１９８０））による調製によって、または二重層形成両親媒性物質とミセル形成両親媒性物質の混合による調製によって、またはカオトロピック性イオン溶液中の脂質からの調製によって、または界面活性剤の使用により水／油エマルションから調製したベシクルの調製によって製造される。
【００１８】
本発明の別の一態様は、上述されるプロセスによって得られるベシクルに関する。
本発明のさらに別の一態様は、
・血管疾患、または
・皮膚科疾患、または
・関節症の処置における、上述される化合物の使用であって、
当該化合物は本発明に係るベシクルの形態で投与されることを特徴とする、使用に関する。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明に係る化合物によって処置される疾患は、急性冠症候群（ＡＣＳ）、心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全、脳血管発作（ＣＶＡ）、脳卒中、アテローム性動脈硬化、血管攣縮、腫瘍処置、喀血、肺塞栓症、肺動脈性肺高血圧症、腸管虚血、腸管出血、腎梗塞、腎出血、高血圧処置のための腎自己調節、自己免疫性糸球体腎炎、間質性腎炎、胎児疾患、胎盤梗塞、胎盤出血、網膜虚血、網膜出血、および網膜血管新生から選択される血管疾患である。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明に係る化合物によって処置される疾患は、皮膚科疾患であり、ざ瘡、ナプキン皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、乾癬、疣贅、足白癬、脂漏性角化症、蕁麻疹、酒さ、皮膚科性ウイルス感染、および皮膚科性細菌感染から選択される。
【００２１】
本発明の別の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載のベシクルの、モニタリングまたは診断方法における使用に関する。
【００２２】
別の一態様において、本発明は、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）に関する。
【００２３】
【化２】
2021512945.tif 000003
【００２４】
（４）の単層は、有機溶媒、具体的には揮発性有機溶媒、たとえばクロロホルム、ＤＣＭ、またはメタノール、またはエタノール中に（４）を溶解することによって得ることができる。この溶液を水または水溶液の静止面上に滴下すると、溶媒が穏やかに除去される。
【００２５】
脂質単層を、たとえば、乳児サーファクタント欠乏により引き起こされる乳児呼吸窮迫症候群の処置または予防において使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、天然リン脂質１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ならびに、Ｃ１６脂肪酸を有する１，３−ジアミドリン脂質（１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリン）、Ｃ１７脂肪酸を有する１，３−ジアミドリン脂質（１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート、およびＣ１８脂肪酸を有する１，３−ジアミドリン脂質（１，３−ジステアラミドプロパン−２−ホスホコリン）の式である。
【図２】図２は、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを含む単層の、ラングミュア−ポッケルストラフ上の空気−水界面での異なる水性部分相の温度における表面圧／１分子あたりの面積の等温線を示す。ウィルヘルミーの紙秤（精度０．２ｍＮ／ｍ）を用いて表面圧を記録した。
【図３】図３は、空気−水界面に広がった１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを含む単層の主相転移における主相転移圧力Πｔの温度依存性（左）およびエントロピー変化（ΔＳ）の温度依存性（右）を示す。
【図４】図４は、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）について、２０℃および異なる表面圧π（左から右：１４ｍＮ／ｍ、１８ｍＮ／ｍ、２２ｍＮ／ｍ、２６ｍＮ／ｍ、３６ｍＮ／ｍ）における、散乱ベクトルＱの面内Ｑｘｙ要素および面外Ｑｚ要素の関数としての回折強度のＧＩＸＤヒートマップを示す。
【図５】図５は、１／ｃｏｓ（ｔ）として表されるアルキル鎖の傾斜角（ｔ）の、２０℃での、側方表面圧（π）に対する依存性を示す。
【図６】図６は、測定した膜断面が強調され（左、膜を通る白色のすじとして強調される）、かつ球状／ファセット状比率の統計学的評価のためにベシクルが着色された（オレンジ色、ファセット状；緑色、球状）、ｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像を示す（スケールバーは２００ｎｍ）。
【図７】図７は、画像全体のうち異なる区画が拡大され、ベシクル構造が強調された、ｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像を示す（スケールバーは２００ｎｍ）。
【図８】図８は、１００ｎｍのトラックエッチド（ｔｒａｃｋ−ｅｄｇｅｄ）フィルター膜（ＬＵＶＥＴ１００）を通す押し出しによって得られた、５（６）−カルボキシフルオレセインを含む大きな単層の、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）を含むベシクルを使用した、放出実験を示す。引き起こされた放出は、ボルテックス振とう器を用いて試料を特定時間にわたって振とうすることにより誘発された。１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリン（２）は、３７℃において、振とう無しで、内容物の全量をすぐに放出した。
【図９】図９は、ＮａＣｌ水溶液中における（４）のカロリグラムを示す。曲線は、例示的な試料について生じたベシクルの形状およびサイズの分布を表す。
【図１０】図１０は、Ｎ＝５０９個の膜切断片についての、Ｒａｄ−ＰＣ−Ｒａｄ含有ベシクル膜の膜厚の分布、およびガウスのフィッティングを示す。
【図１１】図１１は、静的条件下におけるＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（黒い点、上ダイアグラム）およびＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ（黒い四角、下ダイアグラム）の散乱シグナルの積分値を示す。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧシグナルのフィッティングを、薄い球状のシェルモデルおよび二重層ガウス電子密度プロファイルモデルを使用して行ない（灰色線、上パネル）、２つのリン脂質頭部の頭部間距離ｄｈｈ＝２．４ｎｍ、および２σ＝３．０ｎｍであった。Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ散乱シグナルのフィッティングを、薄い楕円シェルモデルおよび二重層ガウス電子密度プロファイルモデルを使用して行ない（灰色線、下パネル）、偏心量εは０．４３、２つのリン脂質頭部の頭部間距離ｄｈｈ＝３．３ｎｍ、および２σ＝１．４ｎｍであった。
【図１２】図１２は、ｑ範囲０．０９６〜０．１０２ｎｍ−１における、３通りの流速ｖでの、平均散乱強度の２Ｄマップを示す。流速ｖ＝０：００２μＬ／ｓでは、入口側における強度がわずかに高いものの、くびれの両側において強度はどちらかと言えば均質である。これより大きい流速（ｖ＝０．０２；０．２μＬ／ｓ）では、強度が高く明確なプルーム様の形状を有するシグナルがくびれ出口の直後に見られるが、くびれ入口では、シグナルは、中程度の流速において強度が高く、最も大きい流速においてはデバイス壁の停滞区域にて強度が低くなっている。
【図１３】図１３は、左上に示すマイクロ流体デバイスの概略図は、選択した７つの領域を示す。各領域について、３通りの流速（ｖ＝０．００２μＬ／ｓ、青色；ｖ＝０：０２μＬ／ｓ、緑色；およびｖ＝０．２μＬ／ｓ、オレンジ色）について、半径方向に積分した散乱シグナルがプロットされている。高いｑ値での差異がくびれの前と後との領域において明らかであり（これは二重層の厚さの変化を示す）、より大きい流速において顕著となる。
【図１４】このグラフは、３通りの流速について、Ｉの差分を規格化したもの（ＩＢ−ＩＡ）／（ＩＢ＋ＩＡ）を、領域ＡおよびＢにおけるｑ曲線（図１３を参照）に対して示す。特に、最も大きい流速について、散乱シグナルの著しい差異がみられ、これは高いｑについて顕著であり、頭部間距離が変化したことを示す。選択した３通りのｑ範囲（Δｑ１＝０．０４〜０．０５ｎｍ−１、Δｑ２＝０．１６〜０．１７ｎｍ−１、およびΔｑ３＝０．８３〜１．１２ｎｍ−１）についての平均散乱強度の２Ｄマップが示される。図１２と同様に、流速増大につれて流れ場が確立されていることが観察できる。
【図１５】図１５は、くびれよりも前（青い点）および後（赤い点）においてＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ（上）およびＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（下）に対して同じ最大剪断力が作用した際の散乱強度曲線の比較を示す。くびれよりも前および静的条件下における散乱シグナル（暗色の点）と比較して、くびれよりも後に、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの二重層ピークの顕著なシフトが観察される。
【図１６】ＤＰＰＣリポソームについてのＳＡＮＳデータのｑプロットは、選択した温度について、小さな差異しか示さなかった。加熱サイクル前（塗りつぶした点）と後（中あきの丸）とで、散乱シグナルはほとんど同じである。ＳＡＮＳ測定後に得られたｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像はサイズ約１００ｎｍのファセット状のリポソームを示し、スケールバーは１００ｎｍに対応する。
【図１７】転移温度Ｔｍよりも低温および高温においてそれぞれ得られたＰａｄ−ＰＣ−ＰａｄリポソームについてのＳＡＮＳデータのｑプロットは、ナノメートル域の全体にわたって温度依存性の構造変化を明らかに示す。２つめのダイアグラム中のグラフに示されるように、ＳＡＮＳ実験中の加熱が、二重層の厚さの周期性に対応する構造変化を誘発した。ｃｒｙｏ−ＴＥＭ顕微鏡写真の２つの選択した部分は、ＳＡＮＳ測定の前と後とに記録したものであるが、これらは、リポソーム調製物の構造変化を特徴とする。スケールバーの長さは１００ｎｍ。
【図１８】Ｒａｄ−ＰＣ−ＲａｄリポソームのＳＡＮＳ散乱シグナルは、調べた温度範囲にわたってほぼ同じである。ＳＡＮＳ測定後に記録したｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像中にみられるリポソームは、長さ１００ｎｍを示すスケールバーよりも大きかった。
【図１９】温度を上昇させると、Ｐｅｓ−ＰＣ−Ｐｅｓリポソームの中性子散乱シグナルが実質的に変化した。加熱サイクルの後、ｑ＝０．８３ｎｍ−１におけるピークがほぼ消えた。ｃｒｙｏ−ＴＥＭ顕微鏡写真は、長さ１００ｎｍを示すバーの長さよりも十分に大きいサイズを有する、特徴的な構造を示す。
【図２０】Ｐａｄ−Ｐａｄ−ＰＣリポソームのｑプロットは、２２〜４２℃の温度範囲内において同じである。この懸濁液は、長さ１００ｎｍを示すスケールバーよりも大きいリポソーム因子を含有する。
【図２１】Ｓｕｒ−ＰＣ−Ｓｕｒリポソームのｑプロットは、調べた温度範囲内において一定である。選択されたｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像区画から分かる通り、リポソーム懸濁液は不均質である。バーの長さは１００ｎｍに対応する。
【図２２】本研究で考慮した温度範囲内において、ｑプロットはほとんど変化せず、このことは、Ｓａｄ−ＰＣ−Ｓａｄリポソームが構造上安定であることを意味する。ＳＡＮＳ測定後に記録したｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像は、様々な形状およびサイズのリポソームを示すが、平均サイズは長さ１００ｎｍを示すスケールバーの範囲内である。
【図２３】このダイアグラムは、選択した３通りの温度についての中性子散乱の実験データ（色つきの点）を、選択したモデル（色つき線）を用いてどこまで近似できるかを示す。差異を見やすくするために、３５℃および３９℃での結果を、３２℃での結果を基準として、縦軸に沿ってそれぞれ３倍および１０倍シフトさせた。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
実施例
実施例１：１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートの合成
１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを、スキーム１に示される合成経路に従って合成した。オキシ三塩化リンを１，３−ジクロロプロパノールで置換することにより、ホスホロクロリデートを得た。さらにＢｏｃ保護エタノールアミンで置換することにより、適度に安定なホスホロアミデート（５）を得た。この中間体をジアジドに変換し、続いて還元してジアミンとした。ヘプタデカン酸と塩化チオニルとから調製したヘプタデカン酸クロリド（６）を用いてヘプタデカノイル鎖を得て、これをジアミンと反応させて、頭部が保護されたホスホロアミデート（７）を得た。酸性の頭部を脱保護し、硫酸ジメチルで４級化して、最終産物であるジアミドリン脂質１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）を得た。頭部保護ジクロロプロピルホスホロアミデート（５）から開始して５つの工程の後に得られた全収量は、３７％であった。次いで、この化学的に純粋なジアミドリン脂質１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを、空気−水界面において単層として（２Ｄモデル）、およびバルク系として（３Ｄモデル）、分子レベルで特徴づけた。
【００２８】
【化３】
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【００２９】
実施例２：表面圧／１分子あたり面積の等温線
表面圧／１分子あたり面積の等温線の測定を、ウィルヘルミーの紙秤（精度０．２ｍＮ／ｍ）を備えたラングミュア−ポッケルストラフ上で、空気−水界面にて行なった。部分相の温度を５℃〜２５℃の間で変えて、等温線を測定した（図２）。
【００３０】
１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを含む単層は、液体膨張−液体凝縮という相挙動を示した。１０℃より高温において、膨張と凝縮の相転移が混在するプラトーが観察された。プラトーの出現と共に、１分子あたりの面積が初期に持ち上がって高値にシフトしている。このプラトーは、液体膨張（ＬＥ）相から液体凝縮（ＬＣ）相への一次相転移を表す。プラトーは完全な水平ではなく、特に、温度が上昇するにつれて傾斜が急になっている。単層自体は、表面圧測定範囲の全体（機器の限界のため、上限５１ｍＮ／ｍまで）にわたって安定である。プラトーの始まりから、温度依存性の主転移圧力Πｔを求めることができる。１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートについて、この依存性を１次関数で表すことができる（図３）。実験データは、最低転移温度Ｔ０近傍のみにおいて当該１次関数からずれており、この温度未満では、凝縮相への転移が、気体に似た状態から直接開始する（再昇華過程）。１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートについて、この温度は２８４．４Ｋである。
【００３１】
Πｔでの一次相転移の始まりにおける１分子あたりの面積（Ａ０）と、膨張−凝縮の相共存状態の終わりにおける面積（Ａｃ）とから、２次元のクラウジウス・クラペイロンの式の変形を用いて、相転移のエンタルピー変化（ΔＨ）を計算できる。
【００３２】
【数１】
2021512945.tif 000005
【００３３】
このエントロピー変化の依存性が、ΔＳ＝ΔＨ／Ｔによって表され、図３中に示される。ΔＳをゼロに外挿することによって、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを含む単層の臨界温度が３０６．３Ｋであると求められる。これより高温においては、単層が圧縮されて凝縮状態になる現象は起こり得ない。
【００３４】
実施例３：微小角入射Ｘ線回折（ＧＩＸＤ）
ＧＩＸＤ実験により、凝縮単層の格子構造についてのオングストロームスケールでの洞察が得られる。異なる測定値について、散乱ベクトルの面内要素（ＱＸＹ）および面外要素（ＱＺ）の各最大値が表１中に示され、ヒートマップの例が図４中に示される。１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートについては、測定したすべての温度／表面圧の組み合わせに対して、２つのブラッグピークが観察された。高いＱＺにおけるシグナルは、２つの等しいシグナルからなる縮重シグナルである。１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）の単層は、歪んだ矩形の単位胞で描かれる斜方格子構造を有し、ＮＮ（最近接）方向に歪んでおり、脂質尾部の同ＮＮ方向への傾斜角ｔが相当大きい（２７°〜３８°）。２０℃において、鎖の断面積（Ａ０）は約１９．３Å２であり、したがって、これより低温における観察値（１０℃にて１９．０Å２、および１５℃にて１９．１Å２）よりもわずかに大きいだけである。これは、ヘリンボーン型（ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ）充填様式の鎖に典型的な値である。この充填様式は、歪みとｓｉｎ２（ｔ）の外挿により得られる歪み値によって裏付けられる。ｄ０値は−０．０７７５に達し、格子の歪みの原因が傾斜のみである場合に予期され得るゼロ値とは明らかに異なる。ここに提示される場合において、ヘリンボーン型充填は、さらなる原因であり、頭部と頭部との間の水素結合ネットワークによって生じている可能性がある。
【００３５】
表面圧の増加につれて、傾斜角ｔが１ｍＮ／ｍあたり０．４１°減少する（図５）。凝縮相では断面積が一定であると仮定すると、１／ｃｏｓ（ｔ）対側圧のプロットから傾斜相転移圧力を求めることができる。１／ｃｏｓ（ｔ）＝１への外挿によって、傾斜圧力が６２．３ｍＮ／ｍであると求められる（図５）。このような相転移は、通常は、二次相転移について予期されるように表面圧面積等温線の屈曲によって特徴づけ得る。しかしながら、予期される転移表面圧は高すぎて、使用した設定では観察できない。傾斜相転移圧力は、ジアミドリン脂質のＣ１８アナログである１，３−ジステアラミドプロパン−２−ホスホコリン（３）のような他の脂質の値に匹敵し得る。目に見える傾向として、脂肪酸アシル鎖が長いほど傾斜相転移圧力が高い。３０℃において、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）の断面積２０．２Å２は、回転相について予期される範囲内である（表１および図３）。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
表１：１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）を含む単層の、異なる温度および表面圧における微小角入射Ｘ線回折測定により得られたデータの概要。Ａｘｙ：鎖１本あたりの面内面積、Ａ０：Ａ０＝Ａｘｙｃｏｓτである鎖１本あたりの断面積。
【００３８】
実施例４：クライオ透過電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）
本発明者らは、以前に記載されたプロトコール（Ｉｓｈｉｋａｗａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００７，３６８（５），１２４９−１２５８）に従って、ｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像を測定した。Ｒａｄ−ＰＣ−Ｒａｄのみからなる大きな単層ベシクル（ＬＵＶ）について記録したｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像は、膜の膜主相転移温度よりも低温において、相当数の強ファセット状の形状を示す（Ｔｍ≒４５℃）（図６および図７）。図６から計算した、ファセット状ベシクルと球状ベシクルとの比率は、２１：４である。依然として球状の形状が生じているが、これは、調製した脂質膜中の小さな不純物によるものと考えられる、というのは、少量の界面活性化合物が膜の形状および挙動に対して既に相当な影響を及ぼしている可能性があるためである。
【００３９】
膜中における小葉の指組みを、ｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像中において膜を横方向に切断したものから直接測定できる（図６）。統計学的に妥当なデータを収集するために、本発明者らは、平均膜厚が３．２０ｎｍ±０．０２ｎｍである膜切断片５０９個（図６）について測定した（Ｎ＝５０９）。疎水性層の厚さは、０．７ｎｍである頭部の２倍であって、１．８ｎｍである。１６個のＣ原子を有する全トランス型アルキル鎖は、長さが２．０５ｎｍである。したがって、このアルキル鎖は傾斜角６４°を有し得るが、これは物理的に不合理である。したがって、完全な二重層指組み構造になっていると仮定できる。
【００４０】
実施例５：示差走査熱量測定
膜の小葉の指組みは、膜の主相転移温度にも影響を及ぼす。加熱および冷却の速度を０．５℃／分として行なった、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを含有するＬＵＶからの示差走査熱量測定実験の結果、主相転移温度は４４．７℃で、エンタルピー変化は２４．１６ｋＪ／ｍｏｌであることが分かる。主相転移温度は、マルガリン酸鎖を有する天然１，２−ジエステルリン脂質の４８．６℃よりも低い。また、二重層の主相転移温度の値は、指組みが起こり得ない単層実験から計算した臨界温度よりも、１１．５Ｋ高い。
【００４１】
１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを含有するベシクルの主相転移温度は人間の体温よりも十分に高いため、その機械的感受性リポソームの、標的薬物放出における使用に、関心が持たれている。この点において使用できそうなリポソームを調べるために、放出実験を行なった。
【００４２】
実施例６：放出実験
以前に、本発明者らは、１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリン（２）を含有するベシクルからの５（６）−カルボキシフルオレセインの放出について報告している（Ｈｏｌｍｅら，Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，７，５３６−５４３）。１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリン（２）が、その主相転移温度（Ｔｍ＝３７℃）よりもわずかに高いだけの温度において強い自発性放出を示すことから、この脂質を人間の平均体温である３７℃で使用することは理想的ではない。Ｔｍを上げることにより放出特性が改善されることが見込まれる。１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートは、１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリンよりも長い鎖を有するため、主相転移温度も４４．７℃と高い。このことにより、２２℃（室温）および３７℃（人間の平均体温）におけるベシクルからの漏れは小さくなる（図８）。アシル鎖を、人工Ｃ１８リン脂質１，３−ステアロイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリンまで伸ばすと、Ｔｍが５２℃に上がるが、このリン脂質はリポソームをほとんど形成しない。
【００４３】
各試料をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理して、５（６）−カルボキシフルオレセインの完全な放出を誘発した。温度２２℃において、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを含むベシクルは、７日後に５（６）−カルボキシフルオレセインの９％の自発放出、および６０秒間のボルテックス後に２４％の機械的誘発放出を示す。１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリンを含むベシクルは、６０秒間のボルテックス後に４３．４％の機械的誘発放出、７日後に１５．５％の自発放出を示す。１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を含むベシクルは、６０秒間のボルテックス後に１．１％の機械的誘発放出、および７日後に４．５％の自発放出を示す。３７℃において、６０秒間のボルテックス後における１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（Ｒａｄ−ＰＣ−Ｒａｄ）を含むベシクルの機械的誘発放出は３４％であり、一方、１，３−パルミトイルアミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリン（Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ）を含むベシクルはボルテックス無しで１００％の放出を示し、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含むベシクルは６０秒間のボルテックス後に１７．９％の放出を示す（表２）。
【００４４】
この放出実験は、１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを含有するベシクルを、体温における機械的感受性の標的薬物放出に使用できる可能性があることを示す。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
表２：異なるリン脂質からなるリポソームの放出速度。
実施例７：ベシクルの調製
１，３−ジヘプタデカンアミドプロパン−２−イル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（４）の、直径１００ｎｍ（ＬＵＶＥＴ１００）の大きな単層ベシクルを、押し出しプロトコールに従って調製した。２５ｍｌの丸底フラスコ中において、この脂質１０ｍｇをＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した。有機溶媒を蒸発させた後、得られたフィルムを高真空（４０ｍｂａｒ）にて一晩、さらに乾燥させた。次いで、内部緩衝液（１ｍｌ、純水に５０ｍＭ  ５（６）−カルボキシフルオレセイン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）、１０ｍＭ  ＮａＣｌを溶解したもの、ｐＨ７．４）を用いて、３０分間かけてこのフィルムを含水させた。そして、少なくとも５回の凍結−解凍サイクル（液体Ｎ２から６５℃）を行なった後、Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、米国）を使用し、メッシュサイズ１００ｎｍのトラックエッチド（ｔｒａｃｋ−ｅｄｇｅｄ）フィルター(Ｗｈａｔｍａｎ、米国)を使用して、懸濁液を１１回押し出した。次いで、外部緩衝液（１０７ｍＭ  ＮａＣｌを超純水に溶解したもの、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を用いたサイズ排除カラム（１．５×２０ｃｍ  セファデックスＧ−５０カラム）を使用して、外部緩衝液の交換を行なった。
【００４７】
実施例８：リポソームの特徴づけ
Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの最終濃度は（１９．６＋／−１．３）ｍｇ／ｍＬであり、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧの最終濃度は（２０．２＋／−６．５）ｍｇ／ｍＬであった。
【００４８】
ＤＬＳの結果は、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄについて平均直径が（１３１．６＋／−０．９）ｎｍ、多分散指数（ＰＤＩ）が（０．１０３＋／−０．００９）であることを示し、一方、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧについては、平均直径が（１０１．３＋／−０．５）ｎｍ、ＰＤＩが（０．２５６＋／−０．００５）であることが分かった。
【００４９】
実施例９：静的条件下におけるＳＡＸＳ測定
調べたｑ範囲０：０２ｎｍ−１〜１：６５ｎｍ−１は、実空間距離ｄにして３１４〜３ｎｍに対応し、したがって、リポソームの特徴づけに関連するナノメートル域のほぼ全体をカバーする。図１１のダイアグラムは、好適なガラスキャピラリ中に得たＤＰＰＣ−ＤＳＰＥ／ＰＥＧ（上パネル）リポソームおよびＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ（下パネル）リポソームの散乱シグナルの半径方向の積分である。
【００５０】
ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧについて、１：１ｎｍ−１付近における強度のピーク（実空間では５：７ｎｍに対応する）は、二重層の厚さに関する。
【００５１】
Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄについて、二重層の厚さに関するピークは、検出可能なｑ範囲の端に位置し、さらにノイズが増加しているため、明確に特徴づけることはできない。
【００５２】
好適なモデルが、しばしば、調べる対象である系の散乱シグナルを解釈するために利用される。ここでは、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧおよびＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄの両方の散乱曲線を、全体形状因子を長辺寸法の断面項と短辺寸法の断面項との積として因数分解できる分離（ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ）アプローチを使用して、フィッティングする（Ｐｏｒｏｄら，ＩＶ．Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｃａ  Ａｕｓｔｒｉａｃａ  １９４８，２，２５５−２９２）。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧの全体的形状に関する形状因子のフィッティングには薄い球状のシェルモデルを使用し（Ｂｒｅｙ：ｌｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２０１５，４８，１５８７−１５９８）、一方、二重層に関する強度のピークを、ガウスの電子密度プロファイル（Ｐａｂｓｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２００３，３６，１３７８−１３８８；Ｐａｂｓｔら，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｅ  ２０００，６２，４０００）を有する二重層についての関数を使用してフィッティングした。二重層のフィッティングに使用したモデルによって、２つのリン脂質頭部の頭部間距離ｄｈｈとして二重層の厚さが得られ、およびこれらリン脂質頭部にわたる標準偏差が得られた。
【００５３】
多分散の理由を説明するために、半径Ｒおよびｄｈｈは正規分布であり、平均はＲ＝４４．６ｎｍおよびｄｈｈ＝２．４ｎｍであると仮定した。
【００５４】
ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧリポソームの平均直径８９．２ｎｍは、ＤＬＳから得られた平均値（１０１．３ｎｍ）よりも小さい。報告によれば、ＳＡＸＳでは溶媒のコントラストのばらつきのためにリポソーム表面に結合したＰＥＧの流体力学的なサイズを検出することができないため、ＤＬＳはＳＡＸＳよりも最大２０％高い値を与える。図１１中に示されるように、最も低いｑ値におけるＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧの散乱曲線の強度の急降下は、粒子間の干渉に起因する。報告によれば、ＰＥＧの付加によってリポソームの凝集が防止される、すなわち、粒子間に反発作用が生じる。使用したモデルにおいては、ＰＥＧの寄与は含まれなかった。
【００５５】
ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧの頭部間距離ｄｈｈが２．４ｎｍであることは、２つのリン脂質頭部にわたって計算された標準偏差２σ＝３：０ｎｍを含めた場合、報告（Ｗａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，４４５，８４−９２）されている二重層の厚さの値５．６ｎｍに見合う。
【００５６】
Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄの全体的形状に関する形状因子のフィッティングを行なうために、薄い楕円シェルモデルを使用した（Ｏｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １９７９，５５７，９−２３）。偏心量εが０．４３であることが分かった。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧについては、リン脂質頭部間距離ｄｈｈに関する強度のピークのフィッティングを、ガウスの電子密度プロファイル（Ｐａｂｓｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２００３，３６，１３７８−１３８８；Ｐａｂｓｔら，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｅ  ２０００，６２，４０００）とｄｈｈにわたる正規分布とを有する二重層についての関数を用いて行なった。結果から、２つのリン脂質頭部について、平均ｄｈｈ値＝３．３ｎｍおよび標準偏差２σ＝１：４ｎｍであることが示された。
【００５７】
Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄの散乱曲線の低いｑ値において、Ｇｕｉｎｉｅｒ近似（Ｇｕｉｎｉｅｒ，Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｐｈｙｓｉｑｕｅ  １９３９，１１，１６１−２３７）を使用して旋回半径（Ｒｇ）を求め、Ｒｇ＝６０．３ｎｍでありかつ標準偏差σＲｇ＝０．４ｎｍであることが分かったが（表４参照）、これは、ＤＬＳから得られた平均直径値（１３１．６ｎｍ）に見合うものであった。
【００５８】
実施例９：動的条件下におけるＰａｄ−ＰＣ−ＰａｄのＳＡＸＳ測定
ガラスキャピラリ中での測定により、静的条件においてＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄのリポソーム構造のフィンガープリントが得られた。剪断応力勾配などの外部摂動下におけるＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの挙動を調べるために、マイクロ流体デバイス中に作った流れ条件下でのＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの２ＤラスターＳＡＸＳスキャンを記録した。
【００５９】
３通りの流動速度ｖ（ｖ＝０．００２、０．０２、および０．２μＬ／ｓ）について試験した。等式１（Ｅｑ．１）を用いて、対応する剪断速度を求めた。最も小さい流速から最も大きい流速について、くびれ（ｈ＝２５０μｍ、ｗ＝１２５μｍ）における剪断速度は１．５４、１５．４、および１５４．０ｓ−１であり、一方、広い領域（ｈ＝２５０μｍ、ｗ＝１０００μｍ）においては０．２ｓ−１、２．０ｓ−１、および２０．０ｓ−１に対応していた。
【００６０】
全体的なサイズとリン脂質頭部間距離の大きさとの間の実空間範囲Δｄ＝６５．４〜６１．６ｎｍに対応するΔｑ＝０：０９６〜０：１０２ｎｍ−１の範囲における平均散乱強度の２Ｄマップが、図１２中に示される。
【００６１】
２Ｄマップにおいて観察された非対称の強度分布は、変動する流れ条件下におけるリポソームの複雑な挙動を示唆しており、流速と、その結果としての剪断応力とがリポソームに影響を及ぼし、デバイス内での位置に依存する散乱シグナルの変動を誘発することが明らかである。最も小さい流速では、入口側において強度がわずかに増加したことが観察された。
【００６２】
中程度の流速においては、くびれのために流れ場が相当に変化し、この変化はくびれに近づくにつれて加速し、くびれの直後にはプルーム様の形状に発散して、最後には、くびれから離れた位置で減速した。予想外にも、くびれの内部および全長における散乱シグナルは、入口でのものより減少していた。
【００６３】
最も大きい流速においても、類似の挙動が観察され、違いとして、入口における強度分布が「反転」、すなわちデバイスの壁に沿って強くなっていた。デバイスの壁においてこのように強度が強くなる現象は、停滞域を示唆するものであり、これは中程度の流速において既に始まっていた。くびれの直後には、中程度の流速におけるものと類似する高強度の「プルーム」が観察された。
【００６４】
図１２の２Ｄ走査ＳＡＸＳマップにおいて観察された平均散乱強度分布の局所変化は、図１３の概略図中に示されるマイクロ流体デバイスの７つの領域の選択を裏付けるものであった。くびれよりも前で３つの領域を選択した（遠いもの（＃１）、近づきつつあるもの（＃２）、非常に近いもの（Ａ））。対称的に、出口側においても、３つの領域を選択した（非常に近いもの（Ｂ）、近いもの（＃４）、くびれから遠いもの（＃５））。領域＃３は、デバイスの端を避けて、くびれ内部にて選択した。各領域について、各流速ｖにおける散乱ベクトルｑの関数としての散乱強度Ｉの半径方向の積分が示される。
【００６５】
入口側においては（領域＃１および＃２）、低いｑおよび中程度のｑにおける顕著な変化は、ｖの関数として観察できない。
【００６６】
中程度のｑにおいて観察されるＩ（ｑ）の振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ）が重なっているが、このことは、リポソームの形状およびサイズ分布が類似することを示す。対照的に、流れが増大するにつれて頭部間距離ｄｈｈがわずかに減少しており、これは、ｑの位置が最小値から高い方へシフトしていることによって示される（表３を参照）。
【００６７】
領域Ａにおいて、最も小さい流速にて、散乱シグナルは、全ｑ範囲にわたり、領域＃１および＃２において観察されたものと同等であった。中程度の流速および中程度のｑにおいて、振動が不鮮明（ｓｍｅａｒ）になった。この不鮮明化は、リポソームの全体的形状の変化を示すものであり得る。
【００６８】
ｖ＝０：２μＬ／ｓにおいて、振動が再度、最も小さい流速におけるものに類似して、より顕著に表れ、最小値の位置が右にシフトしており、このことはｄｈｈの減少に見合う。
【００６９】
くびれ内部において（領域＃３）、リポソームの散乱曲線は、流速の変化による顕著な差異を示さなかった。しかしながら、静的条件およびくびれよりも前の領域に関し、３通りの流速においてＲｇ値の増加が観察された（表４を参照）。ｄｈｈ値の顕著な変化は検出されなかった。しかしながら、くびれに由来するシグナルはデバイスの壁からの残存エッジ散乱があるために信頼性が低いということに注目すべきである。
【００７０】
くびれの出口において（領域Ｂ）、振動は、最も小さい流速においては依然として顕著であるが、中程度および大きい流速においては完全に不鮮明になった。実際、表４中において報告されるＲｇ値は、静的条件下で見られた値と同等であったが、流速が上がると約１３％の減少を示した。さらに、最小値が０．５０から０：４５ｎｍ−１に、さらに低いｑ値へとシフトし、このことは、この領域において、流れ場によって、静的条件と比較して約３０％のｄｈｈの増加が引き起こされたことを示す（表３を参照）。
【００７１】
Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄの二重層の厚さの増加は、液晶相（転移温度よりも高温）とコレステロール存在下におけるゲル相（転移温度よりも低温）とにおいて通常観察される機械的誘発によるリン脂質アミド鎖の完全な指組みの喪失に見合うものである。領域＃４において、散乱シグナルが徐々に減少した。中程度および大きい流速については、領域Ｂでの場合と同様に振動が不鮮明となったが、最も小さい流速については、領域＃２での場合と同様に振動を十分に視認できた。３通りの流速の間で、最小値の位置に顕著な差はなく、このことは、二重層の厚さに顕著な変化がなかったことを示す。
【００７２】
領域＃５において、３通りの流速について、振動が、領域＃１における場合と類似していた。一方、最小値の位置は、最も大きい流速において、中程度および最も小さい流速と比較して、０．５５から０：６ｎｍ−１へと、わずかに右にシフトしていた。
【００７３】
流速を変えたことによって低いｑ（たとえば、領域＃５）または高いｑ（たとえば、領域＃１、＃２）のいずれかにおいて変化が観察された他の領域と比較して、局所的な流れ場の影響を受けて、領域ＡおよびＢにおいて、高いｑおよび低いｑの両方にてリポソーム形態の変化が検出される（図１３を参照）。
【００７４】
３通りの流速における領域Ａ（くびれよりも前）および領域Ｂ（くびれよりも後）での変化（図１３を参照）を明らかに示すために、これらの２つの領域における散乱曲線を、散乱強度の差分を規格化したものとして示した（図１４中のグラフを参照）。
【００７５】
ここでは、リポソームの全体的なサイズの平均（Δｑ１＝０．０４〜０．０５ｎｍ−１）、二重層の厚さの周りのサイズ（Δｑ３＝０．８３〜１．１２ｎｍ−１）、およびこれらの間の範囲（Δｑ２＝０．１６〜０．１７ｎｍ−１）を含む、３つのΔｑ範囲を選択した。各流速における、選択した各Δｑ以内の、散乱強度の積分値の２Ｄマップが示される。
【００７６】
最も小さい流速および範囲Δｑ３における２Ｄマップ（図１４、下右を参照）は、くびれの前と後とに垂直のすじを示しており、これは、マイクロ流体デバイス中に物体が存在することを明らかに示すものである。選択した３つのΔｑ範囲において、２Ｄマップ中（図１４を参照）、図１２中に示されるものと同等の傾向が観察された。
【００７７】
流れ場に対するＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの反応を、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧの場合と比較して、図１５中に示す。ここでは、図１５のデバイス概略図中に示される２つのエリア（青い四角および赤い四角）におけるＰａｄ−ＰＣ−ＰａｄおよびＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧの散乱シグナルを半径方向に積分した。
【００７８】
動的条件におけるＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧの測定を、Ｐａｄ−Ｐａｄ−Ｐａｄに使用したものの２倍のくびれ幅（ｗくびれ＝２５０μｍ）を有するマイクロ流体デバイスにおいて行なった。公正な比較を期すために、かつ等式１（Ｅｑ．１）を考慮して、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧリポソームについての流速を、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームを供した流速の２倍に設定することによって、くびれ位置における剪断条件を同じにした。
【００７９】
散乱曲線は（二重層ピークのシフトを含む）、くびれ前後のＰａｄ−ＰＣ−ＰａｄリポソームのＳＡＸＳシグナルと相当に異なるが、静的条件下と動的条件下とでの（くびれ前後での）散乱シグナルが重なっているため、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧリポソームの変化は証明できなかった。
【００８０】
ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧリポソームとの比較は、くびれよりも前に既にかつここで調べた剪断速度においてＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームが機械的感受性を有するという本発明者らの仮説を裏付けるものである。
【００８１】
表３：マイクロ流体デバイスの７つの領域（図１３の概略図を参照）における静的条件下（ガラスキャピラリ）および動的条件下でのＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの頭部間距離ｄｈｈ。データは、正規分布の平均値を表す（標準偏差に由来する関連誤差を含む）。
【００８２】
【表３】
2021512945.tif 000008
【００８３】
表４：図１３の概略図中に示されるマイクロ流体デバイス内の位置に応じた、静的条件下（ガラスキャピラリ）および動的条件下におけるＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの旋回半径Ｒｇ。データは、正規分布の平均値を表す（標準偏差に由来する関連誤差を含む）。
【００８４】
【表４】
2021512945.tif 000009
【００８５】
動的光散乱によるリポソームの特徴づけ
人工リン脂質のライブラリを合成した。表５に、温度依存性ＳＡＮＳ測定の前および後における、流体力学的なサイズおよび多分散に関連した、リポソーム調製物の特徴づけの概要を示す。ＤＰＰＣリポソームおよびＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームのサイズは（１２０±２）ｎｍであり、多分散指数は０．０１〜０．２０である。Ｒａｄ−ＰＣ−Ｒａｄ、Ｐｅｓ−ＰＣ−Ｐｅｓ、およびＳａｄ−ＰＣ−Ｓａｄのリポソーム調製物は、平均サイズ１５０〜１７０ｎｍ、多分散指数０．５７および０．２３を示した。Ｐａｄ−Ｐａｄ−ＰＣおよびＳｕｒ−ＰＣ−Ｓｕｒのリポソームは、サイズが４００〜１，５００ｎｍ、多分散指数が０．５７であった。ＳＡＮＳ実験において、リポソームを４２℃に加熱した後に室温としたところ、流体力学的なサイズおよび多分散指数が実質的に変化した。概して、リポソームはサイズの増大を示した。唯一の例外がＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームについてみられ、２分の１に減少した。このＤＬＳ測定結果を、ｃｒｙｏ−ＴＥＭを用いて確認した。
【００８６】
中性子小角散乱測定
ＳＡＮＳ実験は、ｑ範囲０．０１〜３ｎｍ−１が実空間での周期性２〜６００ｎｍに対応するため、ナノメートル域の全体をカバーする。したがって、リポソームのサイズだけでなく、その脂質二重層の厚さについても求めることができた。半径および偏心量は、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームについてのみ計算した。
【００８７】
図１６は、選択した温度についてのＤＰＰＣリポソームのｑプロットを示す。散乱曲線は非常によく類似しており、唯一の違いは低いｑ範囲で、この域では温度上昇につれて強度が減少している。注意すべきは、こうした変化が３５〜３９℃において特に明白であり、ＤＰＰＣリポソームの前転移温度（３３．５℃〜３５．８℃でばらつき、Ｄ２Ｏ使用の場合にはさらに高く３７．４℃である）に関連するということである。加熱前後で二重層の厚さに差異は観察されず、このことは、右下のダイアグラムにおいて曲線が重なっていることによって示される。
【００８８】
ｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像から得られ図１６中に例示されるように、ＤＰＰＣリポソームの平均サイズは（８７±２０）ｎｍであり、これはＤＬＳで得られる平均直径の７分の１〜８分の１であった。本発明者らは、この差異が、熱処理および８か月間の保管によるリポソームのクラスタ形成に起因すると考える。リポソームの約１６％が多重層であることが、ｃｒｙｏ−ＴＥＭによって分かった。
【００８９】
図１７は、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームについての一連のｑプロットを含む。温度上昇につれて、低ｑ範囲の強度がほぼ２分の１に低下し、これはリポソームの分割を示す。このＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの崩壊は、ＤＬＳ測定結果に見合う（表５を参照）。
【００９０】
左の顕微鏡写真は、Ｔｍよりも高温に加熱したＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームのｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像である。直径約５０ｎｍの平らなリポソームおよび／またはバイセル（ｂｉｃｅｌｌｅｓ）が非常に多く存在していることが明らかに分かる。転移温度より高温に加熱しないこと以外は同じ方法で調製したＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームは、これより大幅に大きく、容積も大幅に大きいことを、図１７中の右のｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像を用いて確認した。ｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像より、こうしたＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの平均サイズは（９２±１４）ｎｍであると推定したが、これは、表５中に示すように、ＤＬＳで得られる値よりも２５％小さい。ＤＬＳでの検出値が高い原因は、リポソームのクラスタ形成にもあると考えられる。
【００９１】
ｑプロットは、さらに、二重層の厚さに関連する低いｑ値でのシフトも特徴とする。図１７の右のダイアグラムは、二重層の厚さが不可逆的に増大していることをはっきりと示す。Ｔｍより高温への温度上昇と、これに続く室温への冷却とによって、指組みの喪失が生じる。
【００９２】
Ｒａｄ−ＰＣ−Ｒａｄリポソームから得られるｑプロットが、図１８中に示される。予期されるように、転移温度Ｔｍ＝４５℃は調べた範囲の外にあるため、４２℃への温度上昇によって際立った変化は生じなかった。
【００９３】
図１８中のｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像区画は１つの球状リポソームのみを示すが、懸濁液は多分散系であった。このｃｒｙｏ−ＴＥＭ顕微鏡写真は、球状リポソームに加えて、本発明者らがファセット状の単層および多重層リポソームを観察したことを示す。ＤＬＳデータは、約１５０ｎｍの大きさのリポソームの顕著なピークを示すが、５μｍの大きなリポソームも見られた。
【００９４】
Ｐｅｓ−ＰＣ−Ｐｅｓリポソームの場合、２２℃から４２℃への温度上昇によって、中性子散乱シグナルにおける重要な変化が誘発された（図１９中に示す）。低いｑ値では、ナノメートルサイズのリポソームから知られるようなプラトーが見られず、ＤＬＳ測定によりサイズ約１００ｎｍおよび１μｍの２つのポソーム集団の存在が示されるため、プラトーが存在しないということは、現行のＳＡＮＳの設定では解像不可能な巨大リポソームが存在することを示す。
【００９５】
ｑ＝０．８３ｎｍ−１における顕著なブラッグピークは、積層された脂質二重層の存在に起因する。温度上昇につれて、このピークは徐々に小さくなるため、積層された脂質層を有するリポソームが高温において崩壊するという結論に達し得る。図１９の右のダイアグラムは、このプロセスが不可逆であることを示す。
【００９６】
Ｐｅｓ−ＰＣ−Ｐｅｓのｃｒｙｏ−ＴＥＭ顕微鏡写真は、このような説明と一致する。図１９中のｃｒｙｏ−ＴＥＭデータを詳細に示す写真は、代表的なリポソームを示す。
【００９７】
図２０は、ここで調べた温度範囲において変化しないＰａｄ−Ｐａｄ−ＰＣリポソームのｑプロットを示す。先程と同様に、低いｑ値でプラトーが存在しないことは、マイクロメートルサイズのリポソームが存在することを示し、これはｃｒｙｏ−ＴＥＭ顕微鏡写真と一致する。多くの凝集体がナノメートルサイズのリポソームからなるサブユニットを呈しており、この観察もまた、ＤＬＳを用いて検出された二峰性のサイズ分布と一致する。ここで、本発明者らは、サイズ約１５０ｎｍにピークを有する集団と３μｍにピークを有する別の集団とを観察した。
【００９８】
図２１は、生理学的に妥当な温度範囲内におけるＳｕｒ−ＰＣ−Ｓｕｒリポソームのｑプロットを含む。このｃｒｙｏ−ＴＥＭデータの際だった特徴として、プラトーが存在しないことは、サイズ分布が広いことの結果であると考えられ、このことは、マイクロメートル域のリポソームについての二峰性のサイズ分布を示すＤＬＳデータによって裏付けられる。不均質に凝集したリポソームは、実験温度範囲内において安定である。
【００９９】
図２２に、Ｓａｄ−ＰＣ−Ｓａｄリポソームから得た結果の概要を示すが、このｑプロットの形状は従来のリポソームについて予期されるものである。また、考慮した温度範囲よりも転移温度が十分に高いため、これらの曲線は互いによく似ている。
【０１００】
こうしたｃｒｙｏ−ＴＥＭ実験から、幾通りかのサイズを呈する球状および非球状のリポソームの存在が明らかとなった（図２２中の画像区画を参照）。ＤＬＳから得られた最も可能性の高いサイズは１６０ｎｍであり、これはｃｒｙｏ−ＴＥＭデータと一致する。
【０１０１】
選択されたリポソーム調製物の二重層の厚さを含む構造パラメータを求めるために、データフィッティングのための好適なモデルを特定する必要がある。ここでは、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄについて、本発明者らは、構造因子にサイズ平均形状因子を乗ずるアプローチを用い、同時に、リポソーム間相互作用ポテンシャルは球対称を呈しかつリポソームサイズとは独立していると仮定することによって、ｑプロットのフィッティングを行なった。構造因子のフィッティングは、ｓｔｉｃｋｙ  ｈａｒｄ  ｓｐｈｅｒｅモデルを用いて行なった（Ｂａｘｔｅｒら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １９６８，４９（６），２７７０−２７７４；Ｍａｙｓ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９８９，５，４２２−４２８）。形状因子をリポソームの全体的形状に調整するために、均一の断面を有する楕円シェルモデル（Ｇｕｉｎｉｅｒ，Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｐｈｙｓｉｑｕｅ，１９３９；ｐｐ１６１−２３７）を用いた。この楕円シェルモデルは、長さａ＝Ｒ、ｂ＝Ｒ、およびｃ＝εＲである３本の直交軸によって境界が画定され、偏心量はε＞０である（ε＜１：扁円、ε＝１：球状、ε＞１：扁長）。また、このモデルは、二重層の厚さおよびリポソームのサイズにおけるばらつきを説明するものでもある。この楕円シェルの使用によっては温度３５℃におけるＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの散乱データを十分近似できなかったため、本発明者らは均質な断面を有するディスクを含めた（ｃｒｙｏ−ＴＥＭの結果を動機とするアプローチ）。選択した３通りの温度におけるＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの実験データと共に、得られたフィッティングが図２３中に示される。
【０１０２】
表６は、本研究において適用した温度におけるＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームについての曲線フィッティング結果のリストである。リポソームの半径およびリン脂質二重層の厚さについてのフィッティング値は一定で、標準偏差により得られるエラーバーの範囲内であった。しかしながら、Ｔｍより上のデータと下のデータとを比較したところ、リポソーム偏心量が１０分の１に低下していた。ＤＬＳおよびｃｒｙｏ−ＴＥＭデータによれば、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの形状がファセット状から平らなディスク様に変化している。
【０１０３】
本発明者らが認識するところによれば、この研究における人工脂質の形状およびサイズの点で、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ以外のリポソーム調製物が不均質であることは、ただ、二重層の厚さに対応するｑ範囲の妥当なフィッティングを可能とするものである。この目的のために、本発明者らは、Ｇｕｉｎｉｅｒの法則を拡張したものを適用し（Ｈｊｅｌｍら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  ２０００，１０４（２），１９７−２１１；Ｆｒａｔｚｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １９９４，７７（１−２），１２５−１４３）、これによって二重層の厚さを得た。起こり得る多重層現象について説明するために、本発明者らは、準晶質積層モデル（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  １９７５，１５（１２），１２０１−１２３３；ＦｒｕＥ｀ｈｗｉｒｔｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２００４，３７（５），７０３−７１０）を、構造因子として含めた。表７は、フィッティングの結果を示す。
【０１０４】
予想された通り、ＤＰＰＣリポソームは、温度とは独立した二重層の厚さを示し、但し熱サイクル中にリポソームのクラスタ形成が観察された。同じことが、Ｓｕｒ−ＰＣ−Ｓｕｒ、Ｐａｄ−Ｐａｄ−ＰＣ、およびＲａｄ−ＰＣ−Ｒａｄのリポソームにも観察され、これらも、実験した温度についてほぼ一定の二重層の厚さを呈し、この挙動は相転移温度と整合するものであった。Ｓａｄ−ＰＣ−Ｓａｄについての相転移温度もまた、熱処理に用いた最高温度よりも高く、したがって、二重層の厚さのばらつきは１０％の域内であった。しかしながら、Ｐｅｓ−ＰＣ−Ｐｅｓについては、転移温度が調査範囲内であった。加えて、室温への冷却を含む温度サイクルによって、二重層の厚さの２４％の増大がそれぞれ引き起こされた。
【０１０５】
表５．この研究において使用したリポソーム調製物に対する動的光散乱測定の結果。主相転移温度（Ｔｍ）は以前に報告されている。流体力学的なサイズおよび多分散指数（ＰＤＩ）を、ＳＡＮＳ実験の前（ｎ＝５）および後（ｎ＝３）で分析した。誤差は、独立した測定から得た標準偏差に対応する。
【０１０６】
【表５】
2021512945.tif 000010
【０１０７】
表中、「ｎ．ａ．」は、凝集体のサイズが原因でデータ抽出できなかったことを意味する。
【０１０８】
表６．Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄについては、平均の半径および二重層の厚さと、それらの標準偏差およびこれらから得た偏心量も示されている。３５℃において、均質な断面を有するディスクについての寄与が説明された。
【０１０９】
【表６】
2021512945.tif 000011
【０１１０】
表７．温度の関数としての、最も可能性の高いリポソームの二重層の厚さ。
【０１１１】
【表７】
2021512945.tif 000012
【０１１２】
材料および方法
リポソームの調製
２種のリン脂質、すなわち、市販のモル濃度５％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む天然１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）（Ｌｉｐｏｉｄ、Ｚｕｇ、スイス）と、近年報告されたプロトコール（Ｆｅｄｏｔｅｎｋｏら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１０，５１，５３８２−５３８４）に従って合成した１，３−パルミトイル−アミド−１，３−デオキシ−ｓｎ−グリセロ−２−ホスファチジルコリン（Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ）とを使用して、リポソームを調製した。簡潔には、標準的な薄膜法（Ｗａｌｄｅら，Ｅｎｃｙｃｌ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，９，４３−７９；Ｏｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  （ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １９７９，５５７，９−２３）によってリポソームを調製して、超純水を用いて含水させた。得られた各懸濁液は、脂質含有量が２０ｍｇ／ｍＬであり、これは、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄを使用して達成できる最高濃度に対応する。液体窒素冷却および水浴加熱（６０℃）からなる１２工程を連続して行なうことによって、懸濁液を凍結／解凍した。直径約１００ｎｍでサイズ分布の狭いリポソームを得るために、Ｌｉｐｏｓｏｆａｓｔ  ＬＦ−５０（Ａｖｅｓｔｉｎ社、カナダ）を使用し、トラックエッチド（ｔｒａｃｋ−ｅｄｇｅｄ）ポリカーボネートフィルター膜（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を通して、複数回のバレル押し出しを行なった。
【０１１３】
孔サイズを、４００ｎｍ（５回）から、２００ｎｍ（５回）を経て、１００ｎｍ（１５回）まで小さくした。
【０１１４】
リポソームの特徴づけ
２種の調製物の脂質濃度を、リン酸塩試験によって求めた（Ｓｔａｌｄｅｒ  ａｎｄ  Ｚｕｍｂｕｅｈｌ．ＣＨＩＭＩＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３，６７，８１９−８２１）。リポソームのサイズおよびサイズ分布を、Ｄｅｌｓａ  Ｎａｎｏ  Ｃ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によって定量した。ＤＬＳ測定は、温度２５℃において、波長６５８ｎｍで作動する２つのレーザダイオードを使用して行なった。散乱角度は１６５度に設定した。リポソーム懸濁液をグロー放電孔あき炭素グリッド上に載せ、Ｃｒｙｏｐｌｕｎｇｅ  ＣＰ３システム（Ｇａｔａｎ、米国）を用いて迅速に凍結させ、Ｇａｔａｎ６２６クライオホルダーを用いてＪＥＭ２２００ＦＳ透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、日本）に移すことによって、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソーム懸濁液のＣｒｙｏ−ＴＥＭ画像を得た。Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ顕微鏡写真は、加速電圧２００ｋＶ、倍率２０，０００、４〜８μｍ不足焦点、および線量として電子１０個＝Å２において、Ｆ４１６  ＣＭＯＳ検出器（ＴＶＩＰＳ、ドイツ）を使用して記録した。
【０１１５】
マイクロ流体デバイスの作製
Ｘ線に対応したマイクロ流体デバイスを、以前に報告されている通りに準備した（Ｌｕｔｚ−Ｂｕｅｎｏら，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ  ２０１６，１６，４０２８−４０３）。簡潔には、Ｓｉウェハ上のＳＵ−８ネガティブレジスト（Ｎａｎｏ  ＳＵ−８  １００、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ社、ＭＡ、米国）のフォトリソグラフィを使用してマスターを作製した。厚さ２５０μｍのフォトレジストの層を、マイクロ流体設計を有するフォトマスクを通して紫外光に曝露した後、現像した。このマイクロ流体デバイス設計は、１０００μｍ幅の水平な流路と、中程にある長さ２０００μｍのくびれとからなるものであった。くびれ幅が１２５μｍのものと２５０μｍのものとの、２通りの設計を作製した。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｍｉｄｌａｎｄ、米国）と架橋剤とを１０：１の比率で混合して、可撓性のレプリカスタンプを形成した。このＰＤＭＳ混合液をフォトリソグラフィマスター上に注ぎ、温度８０℃において一晩硬化させた。その後、ＰＤＭＳスタンプをマスターから剥がした。Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  ８１（Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、Ｃｒａｎｂｕｒｙ、米国）を、厚さ２５μｍのポリイミドフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）上に注いだ。ＮＯＡ  ８１で被覆したポリイミドフィルム上にＰＤＭＳスタンプを載せ、ＮＯＡ  ８１被覆中にマイクロ流体構造の跡をつけた。λ＝３６６ｎｍの紫外光に１分間曝露してＮＯＡ  ８１を架橋させた後、可撓性のＰＤＭＳスタンプを剥がした。直径０：７５ｍｍの穴あけ器を使用して、入口および出口の孔をあけた。次いで、マイクロ流体ＮＯＡ  ８１／ポリイミドフィルムを、厚さ２５μｍの第２のポリイミドフィルムで封止した。
【０１１６】
ＳＡＸＳ測定
空間分解ＳＡＸＳ測定を、スイスの放射光施設Ｓｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＰＳＩ、Ｖｉｌｌｉｇｅｎ、スイス）のｃＳＡＸＳビームラインで行なった。試料の位置においてＸ線ビームの焦点を２５μｍ×５０μｍ（垂直×水平）のスポットサイズに設定し、光子エネルギーを１１：２ｋｅＶ（λ＝１：１Å）に設定し、かつ、試料と検出器との間の距離を７：１０２ｍに設定し、ベヘン酸銀試料の第１散乱次数（ｆｉｒｓｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｒｄｅｒ）によって求めた。Ｐｉｌａｔｕｓ  ２Ｍ検出器（Ｋｒａｆｔら，Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ．２００９，１６，３６８−３７５）（ピクセルサイズ：１７２μｍ×１７２μｍ）を使用して、散乱シグナルを記録した。アルミニウム／ポリエーテルエーテルケトン／アルミニウム試料ホルダー上に載せたマイクロ流体デバイスを使用して、リポソーム懸濁液の動的空間分解ＳＡＸＳ測定を行なった。デバイスを絶えず水平方向に動かしながら検出器でバーストモードでデータを記録することによって、１列毎に２次元（２Ｄ）スキャンを実現した。マイクロ流体デバイスの予め選択した領域において、１ポイントあたりの曝露時間を１：５秒として、ステップサイズ（ｓｔｅｐ  ｓｉｚｅ）２５μｍ（ｖ）×５０μｍ（ｈ）にて４８（ｖ）×９６（ｈ）ポイントを得た。ビームラインから入手できるＭａｔｌａｂパッケージを使用して（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｓｉ．ｃｈ／ｓｌｓ／ｃｓａｘｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）、データ処理を行なった。実験中、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）チューブを用いてマイクロ流路に接続したシリンジポンプシステム（Ｎｅｍｅｓｙｓ、Ｃｅｔｏｎｉ  ＧｍｂＨ、Ｋｏｒｂｕｓｓｅｎ、ドイツ）を使用して、流速を調整した。ポイントに関するバックグラウンド補正のために、リポソーム懸濁液のＳＡＸＳシグナルを取得するよりも前に、測定したすべての流速について、マイクロ流体デバイス中における超純水の散乱シグナルを記録した。矩形の流路断面を有するマイクロ流体デバイスについては、下記等式により、体積流量ｖから壁剪断速度を計算した：（Ｍｏｌｌｏｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２０１６，１５，９７２−９８２）
λ＝６ｖ＝ｈ２ｗ        （１）
剪断速度は［ｓ−１］、ｖは体積流量［μＬ／ｓ］、かつｗおよびｈはそれぞれ流路の幅および高さ［μｍ］。
【０１１７】
これに加えて、２種のリポソーム懸濁液および超純水の静的ＳＡＸＳ測定を、外径１．５ｍｍおよび壁厚０．０１ｍｍのホウケイ酸塩ガラスキャピラリ（Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ、Ｍａｌｓｆｅｌｄ、ドイツ）中において、上述されるパラメータを用いて行なった。
【０１１８】
ＳＡＮＳ用のリポソームの調製
以前に報告されたプロトコール（Ｈｏｌｍｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２，７（８），５３６−５４３；Ｎｅｕｈａｕｓら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２０１８，３４（１０），３２１５−３２２０；Ｎｅｕｈａｕｓら，Ｓｏｆｔ  ｍａｔｔｅｒ  ２０１８，１４（１９），３９７８−３９８６；Ｎｅｕｈａｕｓら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ２０１７，１２９（２３），６６１５−６６１８）に従って脂質を配合し、標準的な押し出しプロトコール（Ｈｏｌｍｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２，７（８），５３６−５４３）に従ってリポソームを調製した。要約すると、脂質１０ｍｇをＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した。有機溶媒を蒸発させた後、得られた薄いフィルムをさらに真空条件下（４０ｍｂａｒ）において一晩乾燥させた。このフィルムを、Ｄ２Ｏを用いて、３０分間かけて含水させた。凍結−解凍サイクル（液体Ｎ２から６５℃水浴へ）を５回行ない、続いて、Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、米国）および孔サイズ１００ｎｍのトラックエッチド（ｔｒａｃｋ−ｅｄｇｅｄ）フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ、米国）を使用して押し出しサイクルを１１回行なった。得られたリポソーム調製物の脂質濃度は約１０ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１９】
中性子小角散乱（ＳＡＮＳ）
スイスのスパレーション中性子源施設（Ｓｗｉｓｓ  Ｓｐａｌｌａｔｉｏｎ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）ＳＩＮＱ（Ｐａｕｌ  Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｖｉｌｌｉｇｅｎ、スイス）のＳＡＮＳ−Ｉビームラインにて、ＳＡＮＳ測定を行なった。経路長２ｍｍのホウ素非含有石英ガラスセル中に試料を入れ、温度制御ホルダー中に入れた。このシステムは、試料の温度を１Ｋより良い精度で制御できるものである。３〜４Ｋステップにおいて２２〜４２℃にて、リポソーム懸濁液の測定を行なった。続いて、この懸濁液を室温（２２℃）に冷却し、再度測定した。１．６、６．０、および１８．０ｍの３通りの検出器距離を用い、散乱ベクトル範囲０．０１ｎｍ−１＜ｑ＜１０ｎｍ−１、中性子波長（λ）０．４５および１．２Åにて、データを採取した。１２８×１２８ピクセルのアレイを有する２次元３Ｈｅ検出器を用いてデータを採取し、１次元のＩ（ｑ）散乱曲線にして、その結果、２次元画像を半径方向に平均化した。標準的な手順に従い、ＢｅｒＳＡＮＳソフトウェアパッケージを使用して、透過、バックグラウンド散乱、および検出器効率についてデータを補正した（Ｋｅｉｄｅｒｌｉｎｇ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ａ  ２００２，７４（１），ｓ１４５５−ｓ１４５７；Ｓｔｒｕｎｚら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２０００，３３（３  Ｐａｒｔ  １），８２９−８３３）。
【０１２０】
クライオ透過電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）
このリポソーム懸濁液を、Ｄ２Ｏで１：２の比率で希釈して、最終濃度５ｍｇ／ｍＬとした。次に、各懸濁液の４μＬを孔あき炭素被覆グリッド（Ｌａｃｅｙ、Ｔｅｄｐｅｌｌａ、米国）に吸着させ、ワットマン１ろ紙を用いてブロッティングして、Ｌｅｉｃａ  ＧＰプランジャ（Ｌｅｉｃａ、オーストリア）を使用して、液体エタン中において温度−１７８℃でガラス化した。凍結させたグリッドを、Ｇａｔａｎ  ６２６クライオホルダーを使用して、Ｔａｌｏｓ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）上に移した。低線量系（２０ｅ−／Å２）を使用し、試料を液体窒素の温度に保ちながら、加速電圧２００ｋＶおよび公称倍率４５，０００倍にて、電子顕微鏡写真を記録した。顕微鏡写真の記録はＣＥＴＡカメラによって行なった。試料レベルでのピクセルサイズは（３．２６Å）２であった。ｃｒｙｏ−ＴＥＭ顕微鏡写真のいくつかが、ゆっくりと変動する明るさのばらつきを呈したため、この不均質性を、ｆｕｚｚｙ  Ｃ−ｍｅａｎｓアルゴリズムの変形（Ｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１２，２，８２６；Ａｈｍｅｄら，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００２，２１（３），１９３−９）を使って補填した。
【０１２１】
動的光散乱（ＤＬＳ）
ＤＬＳ測定を、ＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国）を用いて、室温で、Ｄ２Ｏ中の脂質濃度０．３ｍｇ／ｍＬにて行なった。加熱サイクルよりも前に行なった５回の独立した測定で得たデータと、加熱サイクルを適用して８か月後に行なった３回の測定で得たデータとを平均した。データ処理は、キュムラント分析法によって行なった。
【０１２２】
ＳＡＮＳデータ分析に使用したモデル
ＳＡＳｆｉｔソフトウェア（Ｂｒｅｓｓｌｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２０１５，４８（５），１５８７−１５９８）および対応するモデルを使用して、ＳＡＮＳデータを分析した。Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ試料を、測定した全ｑ範囲にわたってフィッティングしたが、他の試料についてのフィッティングを、脂質二重層の厚さに対応するｑ範囲に限定した。Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄについて、本発明者らは、厚さと半径との両方の観点において均質な断面（Ｇｕｉｎｉｅｒ，Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｐｈｙｓｉｑｕｅ，１９３９；ｐｐ１６１−２３７）およびサイズ分布を有する楕円シェルモデルを使用した。また、本発明者らは、粒子間相互作用を説明するために、ｓｔｉｃｋｙ  ｈａｒｄ  ｓｐｈｅｒｅモデル（Ｂａｘｔｅｒら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １９６８，４９（６），２７７０−２７７４；Ｍａｙｓ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９８９，５，４２２−４２８）を含めた。残りの調製物について、本発明者らは、一般化されたＧｕｉｎｉｅｒ近似（Ｈｊｅｌｍら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  ２０００，１０４（２），１９７−２１１；Ｆｒａｔｚｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １９９４，７７（１−２），１２５−１４３）を使用して、二重層の厚さを調べ、さらに、本発明者らは、適宜、多重層の寄与を追加した（準晶質理論）（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  １９７５，１５（１２），１２０１−１２３３；ＦｒｕＥ｀ｈｗｉｒｔｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２００４，３７（５），７０３−７１０）。
【０１２３】
考察
Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームは、Ｔｍ未満において、脂質二重層の指組みに関連するファセット状の形態を呈し得る。ＳＡＸＳを使用して、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームの層間隔を測定したところ、Ｔｍよりも高温においてリン脂質鎖の指組みが外れていることが示された。ＳＡＸＳデータから、Ｐａｄ−ＰＣ−Ｐａｄ二重層内の脂質分子の頭部間距離が（３．３±０．８）ｎｍに対応することが明らかになった。指組みの喪失は、加熱サイクル後の二重層の厚さにおける２１％の増加を説明する。明らかに、冷却しても元の状態にはならず、リポソームが崩壊して、加熱サイクル前に測定した元のサイズの半分のナノ構造になった。生理学的に妥当な温度においてＰａｄ−ＰＣ−Ｐａｄリポソームが不安定であるということから、これを人体内での標的薬物送達のためのキャリアとして使用することは示唆されない。
【０１２４】
Ｐａｄ−ＰＣ−ＰａｄのＣ１７ホモログとしてのＲａｄ−ＰＣ−Ｒａｄリン脂質は、Ｔｍ＝４５℃というさらに高い転移温度を特徴とし、これによって、人体内における剪断力感受性の薬物送達が可能となり得る。本研究によって、Ｒａｄ−ＰＣ−Ｒａｄリポソームが上限４２℃まで熱安定的であって、生理学的に妥当な温度範囲である２２〜４２℃において構造変化を全く示さないことが確認される。
【０１２５】
また、Ｐｅｓ−ＰＣ−Ｐｅｓは、ＤＰＰＣのｂ−ＤＰＰＣアナログとして知られている。ゲル相において、ｂ−ＤＰＰＣは六角形の鎖充填構造および二重層指組みを呈したが、液晶相においては二重層鎖指組みが消えていた。相転移は、二重層の厚さの２０％の増加を伴うが、この値は本研究と一致しており、本発明者らは、Ｐｅｓ−ＰＣ−Ｐｅｓリポソームの二重層の厚さが１８％増加したことを観察した。
【０１２６】
Ｐａｄ−Ｐａｄ−ＰＣリポソームの熱挙動は複雑で、このリン脂質の１，２−配置が膜の指組みを妨げていることが示される。転移温度４６℃は実験した温度よりも十分に高いため、本発明者らが構造変化を全く検出しなかったことは驚くべきことではなく、同じ概念が、Ｓａｄ−ＰＣ−ＳａｄおよびＳｕｒ−ＰＣ−Ｓｕｒ脂質から構成されるリポソームにも当てはまる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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