(57)【要約】本開示は、Ｔ細胞を活性化または抑制するように操作されている人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、特に、操作された赤血球系細胞および除核細胞（例えば、除核赤血球系細胞および血小板）に関する。本発明は、例えば、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、表１または表１４、１５および２０〜２４に開示の少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、表１または表１４、１５および２０〜２４に開示の少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項２】
前記少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫である、請求項１に記載のａＡＰＣ。
【請求項３】
前記少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、黒色腫抗原遺伝子−Ａ（ＭＡＧＥ−Ａ）抗原、好中球顆粒プロテアーゼ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原、テロメラーゼ抗原、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原からなる群から選択される、請求項１に記載のａＡＰＣ。
【請求項４】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含み、前記第１の外来性抗原ポリペプチドおよび前記第２の外来性抗原ポリペプチドが、少なくとも２アミノ酸が重複しているアミノ酸配列を有する、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項５】
前記重複が、２アミノ酸〜２３アミノ酸の間である、請求項４に記載のａＡＰＣ。
【請求項６】
前記第１の外来性抗原ポリペプチド、前記第２の外来性ポリペプチド、または前記第１および前記第２の外来性抗原ポリペプチドが、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫である、請求項４に記載のａＡＰＣ。
【請求項７】
前記第１の外来性抗原ポリペプチド、前記第２の外来性ポリペプチド、または前記第１および前記第２の外来性抗原ポリペプチドが、表１または表１４、１５および２０〜２４に開示のポリペプチドである、請求項４に記載のａＡＰＣ。
【請求項８】
前記第１の外来性抗原ポリペプチド、前記第２の外来性ポリペプチド、または前記第１および前記第２の外来性抗原ポリペプチドが、黒色腫抗原遺伝子−Ａ（ＭＡＧＥ−Ａ）抗原、好中球顆粒プロテアーゼ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原、テロメラーゼ抗原、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原からなる群から選択される、請求項３に記載のａＡＰＣ。
【請求項９】
外来性抗原提示ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項１０】
前記外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド、またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、請求項９に記載のａＡＰＣ。
【請求項１１】
前記ＭＨＣクラスＩポリペプチドが、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、およびＨＬＡ  Ｃからなる群から選択される、請求項１０に記載のａＡＰＣ。
【請求項１２】
前記ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドが、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される、請求項１０に記載のａＡＰＣ。
【請求項１３】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含み、前記外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項１４】
前記ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質が、α鎖およびβ２ｍ鎖を含む、請求項１０または請求項１３に記載のａＡＰＣ。
【請求項１５】
前記ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質が、膜アンカーをさらに含む、請求項１４に記載のａＡＰＣ。
【請求項１６】
前記外来性抗原ポリペプチドが、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合タンパク質にリンカーを介して接続されている、請求項１４または請求項１５に記載のａＡＰＣ。
【請求項１７】
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項１６に記載のａＡＰＣ。
【請求項１８】
前記ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質が、α鎖およびβ鎖を含む、請求項１０または請求項１３に記載のａＡＰＣ。
【請求項１９】
前記ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質が、膜アンカーをさらに含む、請求項１８に記載のａＡＰＣ。
【請求項２０】
前記外来性抗原ポリペプチドが、ＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合タンパク質にリンカーを介して接続されている、請求項１８または請求項１９に記載のａＡＰＣ。
【請求項２１】
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項２０に記載のａＡＰＣ。
【請求項２２】
前記アンカーが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質を含むか、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）の膜貫通ドメインを含む、請求項１５〜１７および１９〜２１のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項２３】
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合される、請求項９〜２２のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項２４】
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに非共有結合で結合される、請求項９〜２２のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項２５】
少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドが、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載のａＡＰＣ。
【請求項２７】
少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの外来性共刺激ポリペプチドを前記細胞表面に含む、請求項２５または請求項２６に記載のａＡＰＣ。
【請求項２８】
外来性サイトカインポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項２９】
前記外来性サイトカインポリペプチドが、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ−１５に融合された１５Ｒα、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ２３、ＩＬ２７、ＩＬ１７、ＩＬ１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２５からなる群から選択される、請求項２８に記載のａＡＰＣ。
【請求項３０】
前記ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を活性化することができる、前記請求項のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項３１】
活性化することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の細胞傷害活性の刺激、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の刺激、および／またはこれらの任意の組合せを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項３２】
Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、表７に開示の少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項３３】
Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、表１または表１６〜１９に開示の外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項３４】
代謝物を変化させるポリペプチドをさらに含む、請求項３２または請求項３３に記載のａＡＰＣ。
【請求項３５】
Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの代謝物を変化させるポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項３６】
外来性共阻害ポリペプチドをさらに含む、請求項３５に記載のａＡＰＣ。
【請求項３７】
前記外来性共阻害ポリペプチドが、ＩＬ−３５、ＩＬ−１０、ＶＳＩＧ−３またはＬＡＧ３アゴニストである、請求項３３または請求項３６に記載のａＡＰＣ。
【請求項３８】
前記代謝物を変化させるポリペプチドが、ＩＤＯ、Ａｒｇ１、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＴＤＯ、ＴＰＨ、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２またはＰＧＥシンターゼである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項３９】
前記ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を抑制することができる、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項４０】
前記抑制することが、Ｔ細胞の増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの誘導を含む、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項４１】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項４２】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項４３】
外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、請求項４２に記載のａＡＰＣ。
【請求項４４】
前記外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、請求項４２または請求項４３に記載のａＡＰＣ。
【請求項４５】
前記ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドが、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される、請求項４４に記載のａＡＰＣ。
【請求項４６】
前記ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質が、α鎖およびβ鎖を含む、請求項４４に記載のａＡＰＣ。
【請求項４７】
前記ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質が、膜アンカーをさらに含む、請求項４６に記載のａＡＰＣ。
【請求項４８】
前記外来性抗原ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている、請求項４６または請求項４７に記載のａＡＰＣ。
【請求項４９】
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項４８に記載のａＡＰＣ。
【請求項５０】
前記アンカーが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質を含むか、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）の膜貫通ドメインを含む、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項５１】
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合される、請求項４２〜５０のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項５２】
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに非共有結合で結合される、請求項５１に記載のａＡＰＣ。
【請求項５３】
前記外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドが、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ、抗ＤＲ３アゴニスト（ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ特異的）、４１ＢＢＬ、ＴＧＦβである、請求項４３に記載のａＡＰＣ。
【請求項５４】
前記外来性抗原ポリペプチドが、長さ８アミノ酸〜長さ２４アミノ酸である、前記請求項のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項５５】
前記除核細胞が、除核赤血球系細胞または血小板である、前記請求項のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項５６】
抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法であって、前記Ｔ細胞を請求項１〜３１のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法。
【請求項５７】
受容体分子を発現するＴ細胞の増殖を誘導するための方法であって、前記Ｔ細胞を請求項１〜３１のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、共刺激ポリペプチドが前記受容体分子と特異的に結合し、それによって前記Ｔ細胞の増殖を誘導する、方法。
【請求項５８】
Ｔ細胞集団のサブセットを拡大する方法であって、前記サブセットの少なくとも１つのＴ細胞を含むＴ細胞の集団を請求項１〜３１のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、前記ａＡＰＣの表面に含まれている外来性共刺激ポリペプチドが、前記サブセットの前記少なくとも１つのＴ細胞上の受容体分子と特異的に結合し、前記外来性共刺激ポリペプチドの前記受容体分子への結合が、前記サブセットの前記少なくとも１つのＴ細胞の増殖を誘導し、それによって前記Ｔ細胞集団の前記サブセットを拡大する、方法。
【請求項５９】
Ｔ細胞の活性を抑制する方法であって、前記Ｔ細胞を請求項３２〜４１のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記Ｔ細胞の活性を抑制する方法。
【請求項６０】
Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための方法であって、前記Ｔｒｅｇ細胞を請求項４２〜５３のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記Ｔｒｅｇ細胞を活性化する方法。
【請求項６１】
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象のＴ細胞を請求項１〜５５のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する方法。
【請求項６２】
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、
ａ）前記対象における細胞上での抗原の発現プロファイルを決定するステップと、
ｂ）抗原提示ポリペプチドと少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドとを細胞表面に含む操作された除核細胞である人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップと、
ｃ）前記ａＡＰＣを前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、前記免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する方法。
【請求項６５】
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、
ａ）前記対象のＨＬＡステータスを決定するステップと、
ｂ）少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドと少なくとも１つの抗原提示ポリペプチドとを細胞表面に含む操作された除核細胞である、前記対象と免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、選択するステップと、
ｃ）前記ａＡＰＣを前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、前記免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する方法。
【請求項６６】
前記対象が、免疫応答の増加を必要とする、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象が、がんまたは感染性疾患を有する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が、免疫応答の減少を必要とする、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象が、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
Ｔ細胞応答の誘導を必要とする対象の抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法であって、
Ｔ細胞を含む、細胞の集団を、前記対象から採取するステップと、
細胞の前記集団を請求項５〜２３のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、細胞の前記集団を前記ａＡＰＣと接触させるステップが、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドに特異的である抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する、ステップと、
前記抗原特異的Ｔ細胞を前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、Ｔ細胞応答の誘導を必要とする前記対象の前記抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法。
【請求項７１】
前記抗原特異的Ｔ細胞を細胞の前記集団から単離するステップをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団を拡大する方法であって、
Ｔｒｅｇ細胞を含む、細胞の集団を、対象から採取するステップと、
前記集団を請求項３４〜４４のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、前記集団を前記ａＡＰＣと接触させるステップが、前記Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、ステップと
を含み、それによってＴｒｅｇ細胞の前記集団を拡大する方法。
【請求項７３】
前記Ｔｒｅｇ細胞を、細胞の前記集団から単離するステップをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｔｒｅｇ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項７２または請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項１〜５５のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核におよび前記外来性抗原ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと
を含み、それによって前記ａＡＰＣを作製する、方法。
【請求項７６】
請求項９〜５５のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核におよび前記外来性抗原提示ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと、
前記除核細胞を少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと接触させるステップであって、前記少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、前記除核細胞の細胞表面に存在する前記外来性抗原提示ポリペプチドに結合する、ステップと
を含み、それによって前記ａＡＰＣを作製する、方法。
【請求項７７】
請求項９〜５５のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、
前記外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸を前記有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核に、ならびに前記外来性抗原ポリペプチドおよび前記外来性抗原提示ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと
を含み、それによって前記ａＡＰＣを作製する、方法。
【請求項７８】
前記外来性核酸が、ＤＮＡを含む、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記外来性核酸が、ＲＮＡを含む、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記導入するステップが、ウイルス形質導入を含む、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記導入するステップが、電子穿孔を含む、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記導入するステップが、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクション、およびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、前記ａＡＰＣが、外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む除核細胞を含み、前記方法が、
内在性核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと有核細胞を接触させて、内在性抗原提示ポリペプチド、内在性アンカーポリペプチドまたは内在性共刺激ポリペプチドの産生をもたらす、または内在性マイクロＲＮＡの発現の阻害をもたらすステップと、
前記外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を前記有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核に、ならびに前記内在性抗原提示ポリペプチドによる前記外来性抗原ポリペプチドの産生および提示に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと
を含み、それによって前記免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する、方法。
【請求項８４】
前記外来性核酸をヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと接触させる、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願  
本出願は、２０１７年１２月２３日に出願した米国特許仮出願第６２／６１０，１４９号、２０１８年３月２９日に出願した米国特許仮出願第６２／６５０，２５０号、２０１８年５月１日に出願した米国特許仮出願第６２／６６５，４４５号、２０１８年６月４日に出願した米国特許仮出願第６２／６８０，５４４号、２０１８年６月１８日に出願した米国特許仮出願第６２／６８６，６５６号、２０１８年６月２１日に出願した米国特許仮出願第６２／６８８，３２４号、２０１８年６月２９日に出願した米国特許仮出願第６２／６９２，６２３号、２０１８年１０月１２日に出願した米国特許仮出願第６２／７４５，２５３号、および２０１８年１１月８日に出願した米国特許仮出願第６２／７５７，７４１号の優先権を主張するものであり、これらの米国特許仮出願の各々についての全内容は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年１２月２１日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２９２６７−００１２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズは５８８，６８７バイトである。
【背景技術】
【０００３】
活性免疫応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原および共刺激シグナルの効率的提示に依存する。抗原が内在化すると、ＡＰＣは、共刺激シグナルとともに膜上に抗原クラスＩおよびＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を提示して抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができ、これらの抗原特異的Ｔ細胞が適応免疫応答に肝要な役割を果たす。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞応答の誘導は、例えば腫瘍特異的抗原を提示する、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に樹状細胞（ＤＣ）、との相互作用に大いに依存する。一般に、抗原特異的Ｔ細胞は、それらが移入により患者に戻される前に、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原刺激され、増幅され得る。例えば、養子細胞移入（ＡＣＴ）の場合、腫瘍特異的Ｔ細胞は単離され、次いで、移注用の多数の細胞を得るためにｅｘ  ｖｉｖｏで拡大される。ＡＰＣの１つとして、樹状細胞（ＤＣ）は、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴ細胞刺激を最大化するために、通常、使用される。しかし、ＤＣなどの天然ＡＰＣの使用は、最適抗原負荷ＤＣについての知識不足を含む、ある特定の課題に対峙しており、臨床試験で結論の一致が見られていない（Steenblock  E.R.  et  al.,  Expert  Opin.  Biol.  Ther.  2009;  9:  451-464；Melief  CMJ  Immunity.  2008;  29:  372-383；Palucka  K.  and  Banchereau  J.  Immunity.  2013;  39:  38-48）。加えて、自己ＤＣの単離およびｅｘ  ｖｉｖｏ刺激は、時間がかかり、費用がかかり、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成されたＤＣの質には、ばらつきがあり得る（Steenblock  E.R.  et  al.  2009；Kim  J.V.  et  al.  Nat.  Biotechnol.  2004;  22:  403-410）。したがって、患者由来の自己ＤＣの使用は、ＤＣに基づく処置プロトコールの標準化を制限する（Steenblock  E.R.  et  al.  2009；Kim  J.V.  et  al.  2004）。
【０００４】
人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は、上述の障害を回避する一方でＤＣとＴ細胞との相互作用を模倣することを目的とする、Ｔ細胞活性化および拡大のための操作されたプラットフォームである。それらは、望ましい免疫細胞集団（例えば、Ｔ細胞）を活性化および／または拡大するように操作された合成生体材料を含む、複数の系を含む。これらの系は、ＤＣとＴ細胞との相互作用を模倣することによって作用し得る。例えば、いくつかの細胞サイズの硬質ビーズ、例えば、ラテックスマイクロビーズ、ポリスチレン被覆磁気マイクロビーズおよび生分解性ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）微小粒子が開発された。免疫細胞の活性化および／または拡大を誘導する点でのこれらのビーズの有効性は、使用される材料の特性に大いに依存するようである。例えば、２００ｎｍより大きいビーズは、通常は接種部位に保持されるが、より小さい粒子は、ＤＣにより取り込まれることがある（例えば、Reddy  et  al.  (2006)  J.  Control.  Release  112:  26-34を参照されたい）。対照的に、天然ＡＰＣの膜は、これらのビーズの外面よりもはるかに動的である。
【０００５】
Ｔ細胞を刺激するための改善された方法、および養子免疫療法のための治療用Ｔ細胞の十分な数を普及するための改善された方法を提供することが、依然として必要とされている。本発明は、Ｔ細胞を刺激し、例えば抗腫瘍もしくは感染性疾患免疫応答を誘導するための、または例えば自己免疫障害を予防するためにＴ細胞活性を抑制するための、新規の独創的な赤血球治療薬（ＲＣＴ）、具体的には、樹状細胞（ＤＣ）などのＡＰＣの機能を模倣するａＡＰＣを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Steenblock  E.R.  et  al.,  Expert  Opin.  Biol.  Ther.  2009;  9:  451-464
【非特許文献２】Melief  CMJ  Immunity.  2008;  29:  372-383
【非特許文献３】Palucka  K.  and  Banchereau  J.  Immunity.  2013;  39:  38-48
【非特許文献４】Kim  J.V.  et  al.  Nat.  Biotechnol.  2004;  22:  403-410
【非特許文献５】Reddy  et  al.  (2006)  J.  Control.  Release  112:  26-34
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、Ｔ細胞を活性化または抑制するように操作されている人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、特に、赤血球系細胞および除核細胞（例えば、除核赤血球系細胞および血小板）に関する。操作された赤血球系細胞は、有核、例えば、赤血球先駆細胞であり得る。操作された赤血球系細胞はまた、除核赤血球系細胞、例えば、網状赤血球または赤血球であり得る。
【０００８】
本明細書に記載されるａＡＰＣは、硬質のビーズに基づくａＡＰＣなどの、球状ナノ粒子の使用に勝る非常に多くの利点を提供する。単なる一例として、ナノ粒子の外面は、硬質かつ不動であり、したがって、その表面でのポリペプチドの移動を制限するが、本明細書に記載のａＡＰＣ（すなわち、赤血球系細胞または除核細胞）の外膜は、動的かつ流動性である。それ故、本開示のａＡＰＣは、ナノ粒子と比較して大きい分子移動度および効率的な分子再構成を可能にし、これは、免疫学的シナプス形成およびＴ細胞刺激に非常に有利である。
【０００９】
したがって、一態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、除核細胞を含み、除核細胞が、表１または表１４、１５および２０〜２４に開示の少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫である。一部の実施形態では、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、黒色腫抗原遺伝子−Ａ（ＭＡＧＥ−Ａ）抗原、好中球顆粒プロテアーゼ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原、テロメラーゼ抗原、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原からなる群から選択される。
【００１０】
一態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、除核細胞を含み、除核細胞が、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含み、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドが、少なくとも２アミノ酸が重複しているアミノ酸配列を有する、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。一部の実施形態では、重複は、２アミノ酸〜２３アミノ酸の間である。
【００１１】
一部の実施形態では、第１の外来性抗原ポリペプチド、第２の外来性ポリペプチド、または第１および第２の外来性抗原ポリペプチドは、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫である。一部の実施形態では、第１の外来性抗原ポリペプチド、第２の外来性ポリペプチド、または第１および第２の外来性抗原ポリペプチドは、表１または表１４、１５および２０〜２４に開示のポリペプチドである。一部の実施形態では、第１の外来性抗原ポリペプチド、第２の外来性ポリペプチド、または第１および第２の外来性抗原ポリペプチドは、黒色腫抗原遺伝子−Ａ（ＭＡＧＥ−Ａ）抗原、好中球顆粒プロテアーゼ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原、テロメラーゼ抗原、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原からなる群から選択される。
【００１２】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性抗原提示ポリペプチドを細胞表面にさらに含む。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド、またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、およびＨＬＡ  Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される。
【００１３】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、除核細胞を含み、除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含み、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質は、α鎖およびβ２ｍ鎖を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質は、膜アンカーをさらに含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合タンパク質にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質は、α鎖およびβ鎖を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質は、膜アンカーをさらに含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合タンパク質にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、アンカーは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質を含むか、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに非共有結合で結合される。
【００１５】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドを細胞表面にさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの外来性共刺激ポリペプチドを細胞表面に含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性サイトカインポリペプチドを細胞表面にさらに含む。一部の実施形態では、外来性サイトカインポリペプチドは、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ−１５に融合された１５Ｒα、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ２３、ＩＬ２７、ＩＬ１７、ＩＬ１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２５からなる群から選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を活性化することができる。一部の実施形態では、活性化することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の細胞傷害活性の刺激、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の刺激、および／またはこれらの任意の組合せを含む。
【００１８】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、除核細胞を含み、除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、表７に開示の少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【００１９】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、除核細胞を含み、除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、表１または表１６〜１９に開示の外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、代謝物を変化させるポリペプチドをさらに含む。
【００２１】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、除核細胞を含み、除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの代謝物を変化させるポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性共阻害ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、ＩＬ−３５、ＩＬ−１０、ＶＳＩＧ−３またはＬＡＧ３アゴニストである。一部の実施形態では、代謝物を変化させるポリペプチドは、ＩＤＯ、Ａｒｇ１、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＴＤＯ、ＴＰＨ、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２またはＰＧＥシンターゼである。
【００２３】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を抑制することができる。一部の実施形態では、抑制することは、Ｔ細胞の増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの誘導を含む。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００２４】
別の態様では、本開示は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、除核細胞を含み、除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを細胞表面にさらに含む。一部の実施形態では、外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ、抗ＤＲ３アゴニスト（ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ特異的）、４１ＢＢＬ、ＴＧＦβである。
【００２６】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質は、α鎖およびβ鎖を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質は、膜アンカーをさらに含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、アンカーは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質を含むか、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに非共有結合で結合される。
【００２７】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、長さ８アミノ酸〜長さ２４アミノ酸である。
【００２８】
一部の実施形態では、除核細胞は、除核赤血球系細胞または血小板である。
【００２９】
別の態様では、本開示は、抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法であって、Ｔ細胞を上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法を提供する。
【００３０】
別の態様では、本開示は、受容体分子を発現するＴ細胞の増殖を誘導するための方法であって、Ｔ細胞を上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、共刺激ポリペプチドが受容体分子と特異的に結合し、それによって前記Ｔ細胞の増殖を誘導する、方法を提供する。
【００３１】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞集団のサブセットを拡大する方法であって、サブセットの少なくとも１つのＴ細胞を含むＴ細胞の集団を上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、ａＡＰＣの表面に含まれている外来性共刺激ポリペプチドが、サブセットの少なくとも１つのＴ細胞上の受容体分子と特異的に結合し、外来性共刺激ポリペプチドの受容体分子への結合が、サブセットの少なくとも１つのＴ細胞の増殖を誘導し、それによってＴ細胞集団のサブセットを拡大する、方法を提供する。
【００３２】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞の活性を抑制する方法であって、Ｔ細胞を上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによってＴ細胞の活性を抑制する方法を提供する。
【００３３】
別の態様では、本開示は、Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによってＴｒｅｇ細胞を活性化する方法を提供する。
【００３４】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、対象のＴ細胞を上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を提供する。
【００３５】
一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【００３６】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、ａ）対象における細胞上での抗原の発現プロファイルを決定するステップと、ｂ）抗原提示ポリペプチドと少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドとを細胞表面に含む操作された除核細胞である人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップと、ｃ）ａＡＰＣを対象に投与するステップとを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を提供する。
【００３７】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、ａ）対象のＨＬＡステータスを決定するステップと、ｂ）少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドと少なくとも１つの抗原提示ポリペプチドとを細胞表面に含む操作された除核細胞である、対象と免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、選択するステップと、ｃ）ａＡＰＣを対象に投与するステップとを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を提供する。
【００３８】
一部の実施形態では、対象は、免疫応答の増加を必要とする。一部の実施形態では、対象は、がんまたは感染性疾患を有する。一部の実施形態では、対象は、免疫応答の減少を必要とする。一部の実施形態では、対象は、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を有する。
【００３９】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞応答の誘導を必要とする対象の抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法であって、Ｔ細胞を含む、細胞の集団を、対象から採取するステップと；細胞の集団を上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、細胞の集団をａＡＰＣと接触させるステップが、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドに特異的である抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する、ステップと；抗原特異的Ｔ細胞を対象に投与するステップとを含み、それによって、Ｔ細胞応答の誘導を必要とする対象の抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、抗原特異的Ｔ細胞を細胞の集団から単離するステップをさらに含む。
【００４０】
別の態様では、本開示は、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団を拡大する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を含む、細胞の集団を、対象から採取するステップと；集団を上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、集団をａＡＰＣと接触させるステップが、よってＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、ステップとを含み、それによってＴｒｅｇ細胞の集団を拡大する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、Ｔｒｅｇ細胞を細胞の集団から単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、Ｔｒｅｇ細胞を対象に投与するステップをさらに含む。
【００４１】
別の態様では、本開示は、上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣを作製する方法であって、外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、有核細胞を、除核におよび外来性抗原ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップとを含み、それによってａＡＰＣを作製する、方法を提供する。
【００４２】
一実施形態では、有核細胞は、有核赤血球系先駆細胞である。一実施形態では、除核細胞（例えば、操作された除核細胞）は、除核赤血球系細胞、例えば、赤血球または網状赤血球である。一実施形態では、除核細胞（例えば、操作された除核細胞）は、血小板である。
【００４３】
別の態様では、本開示は、上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣを作製する方法であって、外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと；有核細胞を、除核におよび外来性抗原提示ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと；除核細胞を少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと接触させるステップであって、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、除核細胞の細胞表面に存在する外来性抗原提示ポリペプチドに結合する、ステップとを含み、それによってａＡＰＣを作製する、方法を提供する。
【００４４】
一実施形態では、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、除核細胞の細胞表面に存在する外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合する。
【００４５】
一実施形態では、有核細胞は、有核赤血球系先駆細胞である。一実施形態では、除核細胞（例えば、操作された除核細胞）は、除核赤血球系細胞、例えば、赤血球または網状赤血球である。一実施形態では、除核細胞（例えば、操作された除核細胞）は、血小板である。
【００４６】
別の態様では、本開示は、上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣを作製する方法であって、外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと；外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと；有核細胞を、除核に、ならびに外来性抗原ポリペプチドおよび外来性抗原提示ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップとを含み、それによってａＡＰＣを作製する、方法を提供する。
【００４７】
一実施形態では、有核細胞は、有核赤血球系先駆細胞である。一実施形態では、除核細胞（例えば、操作された除核細胞）は、除核赤血球系細胞、例えば、赤血球または網状赤血球である。一実施形態では、除核細胞（例えば、操作された除核細胞）は、血小板である。
【００４８】
一部の実施形態では、外来性核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、外来性核酸は、ＲＮＡを含む。
【００４９】
一部の実施形態では、導入するステップは、ウイルス形質導入を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、電子穿孔を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクション、およびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む。
【００５０】
別の態様では、本開示は、免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、ａＡＰＣが、外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む除核細胞を含み、方法が、内在性核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと有核細胞を接触させて、内在性抗原提示ポリペプチド、内在性アンカーポリペプチドまたは内在性共刺激ポリペプチドの産生をもたらす、または内在性マイクロＲＮＡの発現の阻害をもたらすステップと；外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと；有核細胞を、除核に、ならびに内在性抗原提示ポリペプチドによる外来性抗原ポリペプチドの産生および提示に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップとを含み、それによって免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する、方法を提供する。
【００５１】
一部の実施形態では、外来性核酸をヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと接触させる。
【００５２】
さらに別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞または除核細胞を含み、赤血球系細胞または除核細胞が、表１に開示の少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【００５３】
一部の実施形態では、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫である。
【００５４】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞または除核細胞を含み、赤血球系細胞または除核細胞が、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドが、少なくとも２アミノ酸が重複しているアミノ酸配列を有する、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【００５５】
一部の実施形態では、重複は、２アミノ酸〜２３アミノ酸の間である。
【００５６】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性抗原提示ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【００５７】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド、またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体である。
【００５８】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、およびＨＬＡ  Ｃからなる群から選択される。
【００５９】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される。
【００６０】
上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【００６１】
さらに別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞または除核細胞を含み、赤血球系細胞または除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体であり、例えば、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【００６２】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体は、アンカー、α鎖およびβ２ｍ鎖を含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。
【００６３】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体は、アンカー、α鎖およびβ鎖を含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、アンカーは、１型膜タンパク質である。一部の実施形態では、アンカーは、２型膜タンパク質である。一部の実施形態では、アンカーは、ＧＰＩ連結タンパク質である。一部の実施形態では、アンカーは、ＧＰＡまたはＳＭＩＭ１である。
【００６４】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに結合される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合されるまたは非共有結合で結合される。
【００６５】
一部の実施形態では、上記態様のいずれか１つに記載のａＡＰＣは、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【００６６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００６７】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの外来性共刺激ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む。
【００６８】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を活性化することができる。一部の実施形態では、活性化することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の細胞傷害活性の刺激、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の刺激、および／またはこれらの任意の組合せを含む。
【００６９】
上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【００７０】
さらに別の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞または除核細胞を含み、赤血球系細胞または除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、表７に開示の少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、例えば、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【００７１】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞または除核細胞を含み、赤血球系細胞または除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、表１に開示の外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、例えば、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【００７２】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、代謝物を変化させるポリペプチドをさらに含む。
【００７３】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞または除核細胞を含み、赤血球系細胞または除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの代謝物を変化させるポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、例えば、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【００７４】
一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドをさらに含むａＡＰＣ。一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、ＩＬ−３５、ＩＬ−１０、ＶＳＩＧ−３、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ３アゴニストである。
【００７５】
一部の実施形態では、代謝物を変化させるポリペプチドは、ＩＤＯ、Ａｒｇ１、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＴＤＯ、ＴＰＨ、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２またはＰＧＥシンターゼである。
【００７６】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を抑制することができる。
【００７７】
一部の実施形態では、抑制することは、Ｔ細胞の増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの誘導を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００７８】
上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【００７９】
別の態様では、本開示は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞または除核細胞を含み、赤血球系細胞または除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、例えば、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【００８０】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【００８１】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体は、アンカー、α鎖およびβ鎖を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。
【００８３】
一部の実施形態では、アンカーは、ＧＰＡまたはＳＭＩＭ１である。
【００８４】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに結合される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合されるまたは非共有結合で結合される。
【００８５】
一部の実施形態では、外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＩＬ−２、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ、抗ＤＲ３アゴニスト（ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ特異的）、４−１ＢＢＬ、ＴＧＦβである。
【００８６】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、長さ８アミノ酸〜長さ２４アミノ酸である。
【００８７】
一部の実施形態では、除核細胞は、赤血球系細胞または血小板である。
【００８８】
上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【００８９】
別の態様では、本開示は、抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法であって、Ｔ細胞を本明細書で開示されるａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法を特徴とする。
【００９０】
別の態様では、本開示は、受容体分子を発現するＴ細胞の増殖を誘導するための方法であって、Ｔ細胞を本明細書で開示されるａＡＰＣと接触させるステップを含み、共刺激ポリペプチドが受容体分子と特異的に結合し、それによって前記Ｔ細胞の増殖を誘導する、方法を特徴とする。
【００９１】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞集団のサブセットを拡大する方法であって、サブセットの少なくとも１つのＴ細胞を含むＴ細胞の集団を本明細書で開示されるａＡＰＣと接触させるステップを含み、ａＡＰＣ上に提示される外来性共刺激ポリペプチドが、サブセットの少なくとも１つのＴ細胞上の受容体分子と特異的に結合し、外来性共刺激ポリペプチドの受容体分子への結合が、サブセットの少なくとも１つのＴ細胞の増殖を誘導し、それによってＴ細胞集団のサブセットを拡大する、方法を特徴とする。
【００９２】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞の活性を抑制する方法であって、Ｔ細胞を本明細書で開示されるａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによってＴ細胞の活性を抑制する方法を特徴とする。
【００９３】
別の態様では、本開示は、Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を本明細書で開示されるａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによってＴｒｅｇ細胞を活性化する方法を特徴とする。
【００９４】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、対象のＴ細胞を本明細書で開示されるａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を特徴とする。
【００９５】
一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏである。
【００９６】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、ａ）対象における細胞上での抗原の発現プロファイルを決定するステップと；ｂ）抗原提示ポリペプチドと少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドとを発現する操作された赤血球系細胞である人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップと；ｃ）ａＡＰＣを対象に投与するステップとを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を特徴とする。
【００９７】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、ａ）対象のＨＬＡステータスを決定するステップと；ｂ）少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドと少なくとも１つの抗原提示ポリペプチドとを発現する操作された赤血球系細胞である、対象と免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップと；ｃ）ａＡＰＣを対象に投与するステップとを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を特徴とする。
【００９８】
一部の実施形態では、対象は、免疫応答の増加を必要とする。一部の実施形態では、対象は、がんまたは感染性疾患を有する。一部の実施形態では、対象は、免疫応答の減少を必要とする。一部の実施形態では、対象は、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を有する。
【００９９】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞応答の誘導を必要とする対象の抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法であって、Ｔ細胞を含む、細胞の集団を、対象から採取するステップと；細胞の集団を本明細書で開示されるａＡＰＣと接触させるステップであって、細胞の集団をａＡＰＣと接触させるステップが、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドに特異的である抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する、ステップと；抗原特異的Ｔ細胞を対象に投与するステップとを含み、それによって、Ｔ細胞応答の誘導を必要とする対象の抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法を特徴とする。
【０１００】
一部の実施形態では、方法は、抗原特異的Ｔ細胞を細胞の集団から単離するステップをさらに含む。
【０１０１】
別の態様では、本開示は、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団を拡大する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を含む、細胞の集団を、対象から採取するステップと；集団を本明細書で開示されるａＡＰＣと接触させるステップであって、集団をａＡＰＣと接触させるステップが、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、ステップとを含み、それによってＴｒｅｇ細胞の集団を拡大する方法を特徴とする。
【０１０２】
一部の実施形態では、方法は、Ｔｒｅｇ細胞を細胞の集団から単離するステップをさらに含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、方法は、Ｔｒｅｇ細胞を対象に投与するステップをさらに含む。
【０１０４】
上記方法の各々についての一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【０１０５】
別の態様では、本開示は、本発明のａＡＰＣを作製する方法であって、外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと；有核細胞を、外来性抗原ポリペプチドの発現および提示ならびに除核に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップとを含み、それによってａＡＰＣを作製する、方法を特徴とする。
【０１０６】
別の態様では、本開示は、本発明のａＡＰＣを作製する方法であって、外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、有核細胞を、外来性抗原提示ポリペプチドの発現および提示ならびに除核に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと、除核細胞を少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと接触させるステップであって、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、除核細胞上に提示される外来性抗原提示ポリペプチドに結合する、ステップとを含み、それによってａＡＰＣを作製する、方法を特徴とする。
【０１０７】
一部の実施形態では、外来性核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、導入するステップは、ウイルス形質導入を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、電子穿孔を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクション、およびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む。
【０１０９】
別の態様では、本開示は、免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、ａＡＰＣが、外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば細胞表面に含む、除核細胞を含み、方法が、内在性核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと有核細胞を接触させて、内在性抗原提示ポリペプチド、内在性アンカーポリペプチドまたは内在性共刺激ポリペプチドの発現をもたらす、または内在性マイクロＲＮＡの発現の阻害をもたらすステップと；外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと；有核細胞を、内在性抗原提示ポリペプチドによる外来性抗原ポリペプチドの発現および提示ならびに除核に好適な条件下で培養することによって、除核細胞を作製するステップとを含み、それによって免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する、方法を特徴とする。
【０１１０】
一部の実施形態では、外来性核酸をヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと接触させる。
【０１１１】
上記態様および実施形態のいずれかについての一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【０１１２】
図は、本発明の１つまたは複数の特徴、態様、または実施形態を例示するものであり、限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、赤血球系細胞においてＭＨＣＩ分子およびＭＨＣＩＩ分子を発現させるための種々の設計を示す概略図である。図１Ａは、一本鎖ペプチド−ＭＨＣＩＩ構築物を発現させるための設計の概略図を示す。図１Ａに示されている通り、ＧＰＡまたはＳＭＩＭなどの膜アンカーと連結したＭＨＣＩＩ  α鎖と連結したＭＨＣＩＩ  β鎖に、外来性ペプチドを連結する。図１Ｂは、一本鎖ペプチド−ＭＨＣＩ構築物を発現させるための設計の概略図を示す。図１Ｂに示されている通り、ＧＰＡまたはＳＭＩＭなどの膜アンカーと連結したＭＨＣＩ  αサブユニットと連結したＭＨＣＩ  β−２ｍサブユニットに、外来性ペプチドを連結する。
【図２】図２は、ＭＨＣ  Ｉ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示する操作されたマウス赤血球が、ｏｖａ特異的Ｔ細胞を活性化することを示すグラフである。
【図３】図３は、ＭＨＣ  Ｉ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示するマウス赤血球を用いて拡大させたｏｖａ特異的Ｔ細胞が、腫瘍細胞死滅に関して非常に強力かつ特異的であることを示すグラフである。
【図４−１】図４Ａは、リンパ節および脾臓におけるＯＴ１−Ｔ細胞の増殖を試験するための実験の設計を示す概略図である。図４Ｂは、ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  ＯＶＡがＯＴ１−Ｔ細胞を特異的に拡大および活性化させるが、オボアルブミンペプチドを細胞表面に提示するＭＨＣＩを伴わないｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬではＯＴ１−Ｔ細胞が拡大および活性化しないことを示す、代表的なデータの概略図である。本明細書全体を通して使用される場合、マウス治療用赤血球（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）（またはｍＲＣＴ）は、本明細書に記載の操作されたマウス赤血球系細胞（例えば、操作された除核細胞）を指す。本明細書全体を通して使用される場合、ＲＣＴ（治療用赤血球）は、本明細書に記載の操作されたヒト赤血球系細胞（例えば、操作された除核細胞）を指す。
【図４−２】図４Ｃは、循環、脾臓およびリンパ節におけるｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  ＯＶＡによるＯＴ１−Ｔ細胞の増殖および活性化のｉｎ  ｖｉｖｏにおける観察を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ用量応答ｏｖａ特異的Ｔ細胞を示すことを示すグラフである。
【図６】図６は、ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞の第２の用量により、リンパ節および脾臓のどちらにおいてもＣＤ８＋ＯＴ１  Ｔ細胞が劇的に追加免疫されることを示すグラフである。
【図７】図７は、ＭＨＣＩ（ｇｐ１００）および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇｐ１００特異的Ｔ細胞を活性化することを示すグラフである。
【図８−１】図８Ａは、ＲＣＴ上に発現される異なるバージョンのＨＬＡ−Ａ２（ＨＰＶ  Ｅ７）を示す概略図である。図８Ａは、「ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２」を配列番号８９５として、および「（Ｇ４Ｓ）４」を配列番号７３３として開示する。
【図８−２】図８Ｂおよび８Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＰＶ特異的Ｔ細胞の刺激下での、ＲＣＴ上に発現されたＨＬＡ−Ａ２（ＨＰＶ  Ｅ７）の活性を示すグラフである。
【図８−３】図８Ｂおよび８Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＰＶ特異的Ｔ細胞の刺激下での、ＲＣＴ上に発現されたＨＬＡ−Ａ２（ＨＰＶ  Ｅ７）の活性を示すグラフである。
【図９】図９は、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞注射後１日目、４日目および８日目に、マウスにｍＲＣＴ（対照）およびｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを投薬した場合の、腫瘍ランダム化後の経時的な平均腫瘍体積（ｍｍ３）の変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞注射後１日目、４日目および８日目に、マウスにｍＲＣＴ（対照）およびｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを投薬した場合の、腫瘍ランダム化後の経時的な個々の腫瘍体積（ｍｍ３）の変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞注射後１日目、４日目および８日目に、マウスにｍＲＣＴ（対照）およびｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを投薬した場合の、腫瘍ランダム化後の経時的なマウスのパーセント生存を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を決定するための、ＣＤ４４＋発現についてゲーティングしたフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１３】図１３は、ｍＲＣＴ（対照およびクリックしたもの）とＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞とを共インキュベートした後４日目の、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞計数を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａは、３重クリックしたｍＲＣＴ（ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ７、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１２、またはｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５）が、２重クリックしたｍＲＣＴ（ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ）と比較してＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の増大を示すことを示すグラフである。図１４Ｂは、２重クリックしたｍＲＣＴ（ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ）、または３重クリックしたｍＲＣＴ（ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ７、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１２、またはｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５）によって活性化したメモリーＴ幹細胞（Ｔｓｃｍ）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）のパーセンテージを示すグラフのパネルである。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬで処置したマウスでは、ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞で再チャレンジしてもＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍制御が実証されることを示すグラフである。
【図１６】図１６Ａは、ＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７２１））＋不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で再チャレンジされた（eing  re-challenged）マウスの時系列を示す概略図である。図１６Ｂは、ｍＲＣＴ−ＯＶＡで処置したマウスでは、ＯＶＡペプチド再チャレンジの際に、ｍＲＣＴのみを投薬したマウスと比較して、脾臓およびリンパ節のどちらにおいてもＯＴ１細胞計数が少なかったことを示すグラフである。図１６Ｃは、ＯＶＡペプチド再チャレンジの際に、ｍＲＣＴのみを投薬したマウスと比較して、脾臓およびリンパ節のどちらにおいても内在性ＣＤ８＋Ｔ細胞計数が影響を受けなかったことを示すグラフである。
【図１７】図１７Ａは、ＲＣＴの表面上にシグナル１および２を提示させるための、立体配置の異なる選択肢を示す概略図である。図１７Ｂは、ＲＣＴの表面上にシグナル１、２および３を提示させるための、立体配置の異なる選択肢を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
本開示は、効率的にシグナルを提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでａＡＰＣ免疫療法におよびｅｘ  ｖｉｖｏでＴ細胞拡大に使用することができる人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の開発に基づく。詳細には、本開示は、赤血球系細胞、特に、操作された赤血球系細胞を、とりわけ、Ｔ細胞を活性化、拡大もしくは分化／脱分化するように、Ｔ細胞活性を抑制するように、エフェクターＴ細胞を抑制するように、ならびに／または調節性Ｔ細胞を刺激および拡大するように操作することができるという、驚くべき発見に少なくとも一部は基づく。
【０１１５】
本明細書に記載の本発明についての多くの修飾形態および他の実施形態は、上述の説明の中で提示された教示および関連する図面を利用できる、これらの発明が属する技術分野の当業者には、容易に思い浮かぶであろう。したがって、本発明が、開示される特定の実施形態に限定されることにならないこと、ならびに修飾形態および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲に記載の範囲内に含まれるように意図されることを、理解されたい。特定の用語が本明細書で用いられるが、それらの用語は、単に一般的かつ説明的な意味で使用されるものであり、限定を目的として使用されるものではない。
【０１１６】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、複数の言及対象を含む。
【０１１７】
代替案（例えば「または」）の使用は、代替案のどちらか一方、両方、またはそれらの任意の組合せを意味すると理解するべきである。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、量、継続時間などのような測定可能な値に言及するときの用語「約」は、明記されている値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、よりいっそう好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動量を、そのような変動量が本開示の方法の実施に適切である場合には、包含するように意図されている。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、述べられている範囲内の任意の整数の値、および適宜、その分数（例えば、整数の十分の一および百分の一）を含むと理解されるものとする。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」ならびに「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であるように意図されており、後に続くもの、例えば、成分の存在を明記する、および当技術分野において公知のまたはそこで開示される追加の述べられていない成分、特徴、要素、メンバー、ステップの存在を排除も除外もしない、包括的または非限定的用語である。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「など」、「例えば」などは、例示的実施形態を指すことおよび本開示の範囲を限定しないことを意図したものである。
【０１２２】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を本発明の試験の実施の際に使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「投与」、「投与すること」およびこれらの異表記は、組成物または薬剤を対象に導入することを指し、組成物または薬剤の同時および逐次的導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬力学的、診断、研究、プラセボおよび実験的方法を指すことができる。「投与」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ処置も包含する。対象への組成物または薬剤の導入は、経口的に、経肺的に、鼻腔内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、または皮下に）、直腸に、リンパ内に、または局所的に、を含む、任意の好適な経路による。投与は、自己投与および他者による投与を含む。投与は、任意の好適な経路によって行うことができる。好適な投与経路によって、組成物または薬剤はその所期の機能を果たすことができる。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈に導入することにより投与される。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に関連する外来抗原をプロセシングし、その表面に提示することができる細胞を指す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、用語「人工抗原提示細胞」は、必要なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、免疫シナプス形成に必要な共刺激および／または接着事象をもたらす、１つまたは複数の分子（例えば、外来性ポリペプチド）を導入するために操作された細胞を指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、用語「自己免疫障害」は、対象の免疫系が自分の体の細胞を攻撃し、その結果、組織破壊を引き起こす状態を、一般に指す。自己免疫障害は、血液検査、脳脊髄液分析、筋電図（筋機能を測定する）、および脳の磁気共鳴画像法を使用して診断することができるが、血液での自己抗体（または自家抗体）についての抗体検査が特に有用である。通常は、ＩｇＧクラス抗体は、自己免疫疾患と関連付けられる。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、用語「生体試料」は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物およびタンパク質を含む、対象から単離された生体起源の任意のタイプの物質を指す。用語「生体試料」は、対象から単離された組織、細胞および生体液を含む。生体試料は、例えば、全血、血漿、血清、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、頬側のもの、皮膚、脳脊髄液、骨髄、胆汁、毛髪、筋生検材料、臓器組織、または当業者に公知の生体起源の他の物質を含むが、これらに限定されない。生体試料は、診断もしくは研究のために対象から採取されることがあり、または対照としてもしくは基礎研究のために健康対象から採取されることもある。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「がん」は、異常な細胞がとめどなく分裂して他の組織に浸潤し得る疾患を指す。１００を超える異なるタイプのがんがある。ほとんどのがんは、それらが開始する臓器または細胞型にちなんで名付けられており、例えば、結腸で始まるがんは、結腸がんと呼ばれ、皮膚のメラニン細胞で始まるがんは、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）と呼ばれる。がんのタイプは、より広いカテゴリーに分類され得る。がんの主要カテゴリーとしては、癌腫（皮膚でまたは臓器を裏打ちするもしくは覆う組織で始まるがん、ならびに腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌および移行上皮癌を含む、そのサブタイプを意味する）、肉腫（骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管または他の結合もしくは支持組織で始まるがんを意味する）、白血病（血液形成組織（例えば、骨髄）で開始するがんであって、多数の異常な血液細胞の産生およびそれらの血液への侵入を引き起こすがんを意味する）、リンパ腫および黒色腫（免疫系の細胞で始まるがんを意味する）、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）がん（脳および脊髄の組織で始まるがんを意味する）が、挙げられる。用語「骨髄異形成症候群」は、骨髄が十分に健康な血液細胞（白血球、赤血球および血小板）を生成せず、血液および／または骨髄中に異常な細胞がある、がんのタイプを指す。骨髄異形成症候群は、急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）になることもある。ある特定の実施形態では、がんは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明のがん、骨に転移するがん、脳に転移するがん、肝臓に転移するがん、肺に転移するがん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄系白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、妊娠性絨毛性腫瘍（ＧＴＴ）、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎がん、喉頭がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、男性のがん、奇胎妊娠、口腔および中咽頭がん、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、まれながん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん（非黒色腫）、軟部組織肉腫、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん、子宮がん、膣がんならびに外陰がんを含むがこれらに限定されない、がんから選択される。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、用語「クリック反応」は、連結された生成物をうまく生成するための、第１の部分と第２の部分を共有結合で連結させるために使用される様々な反応を指す。クリック反応は、次の特徴のうちの１つまたは複数を通常は有する：クリック反応は、迅速である；特異的である；高収率である；効率的である；自発的である；連結されている実体の生体適合性を有意に変化させない；高い反応速度を有する；安定した生成物を生成する；単一の反応生成物の生成に有利に働く；高いアトムエコノミーを有する；化学選択的である；モジュール式である；立体選択的である；酸素に対して非感受性である；水に対して非感受性である；高純度である；非クロマトグラフ方法（例えば、結晶化または蒸留）により除去することができる無害なもしくは比較的非毒性の副生成物のみを生じさせる；溶媒を必要としないか、または生理条件下で安定した、安全なもしくは生理学的に適合する溶媒、例えば水の中で行うことができる。例としては、アルキン／アジド反応、ジエン／ジエノフィル反応、またはチオール／アルケン反応が挙げられる。他の反応を使用してもよい。一部の実施形態では、クリック反応は、迅速であり、特異的であり、高収率である。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「クリックハンドル」は、クリック反応で第２のクリックハンドルと反応してクリックシグネチャーを生成することができる化学的部分を指す。一部の実施形態では、クリックハンドルは、カップリング試薬により構成され、カップリング試薬が基質反応性部分をさらに含むこともある。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「サイトカイン」は、他の細胞に様々な影響を及ぼす、細胞により分泌される小さい可溶性タンパク質物質を指す。サイトカインは、成長、発達、創傷治癒および免疫応答を含む、多くの重要な生理的機能を媒介する。サイトカインは、細胞膜上に位置するそれらの細胞特異的受容体に結合することによって作用し、この結合により、標的細胞の生化学的変化および表現型変化を最終的にもたらす、明確に異なるシグナル伝達カスケードの細胞内での開始が可能になる。サイトカインは、局所的に作用することも、放出部位から遠位で作用することもできる。サイトカインには、インターロイキンの多くを包含し、いくつかの造血性増殖因子も包含する、Ｉ型サイトカイン；インターフェロンおよびインターロイキン−１０を含む、ＩＩ型サイトカイン；ＴＮＦαおよびリンホトキシンを含む、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）関連分子；インターロイキン１（「ＩＬ−１」）を含む、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー；ならびに多種多様な免疫および炎症作用に肝要な役割を果たす分子のファミリーであるケモカインが含まれる。同じサイトカインが、細胞の状態に依存して細胞に対して異なる影響を及ぼすこともある。サイトカインは、他のサイトカインの発現を調節することおよび他のサイトカインのカスケードを誘発することが多い。サイトカインの非限定的な例としては、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３  Ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇｒｏα、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−αが挙げられる。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「内在性」は、化合物（例えば、小分子）またはプロセスのネイティブな形態を指すように意図されている。例えば、一部の実施形態では、用語「内在性」は、生物内または生物のゲノム内のその天然の位置にある核酸またはポリペプチドのネイティブな形態を指す。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される場合の用語「操作された細胞」は、遺伝子改変細胞またはその子孫である。一部の実施形態では、操作された細胞（例えば、操作された除核細胞）は、カップリング試薬を使用して（例えば、クリックケミストリーを使用して）外来性ポリペプチドを細胞の表面に連結させることによって産生され得る。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語「除核（された）」は、核を欠いている細胞、例えば、網状赤血球または成熟赤血球（エリスロサイト）を指す。ある実施形態では、除核細胞は、先駆細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、骨髄球性共通前駆体（ＣＭＰ）、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、前赤芽球、初期好塩基性赤芽球、後期好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、もしくは正染性赤芽球、または人工多能性細胞から、網状赤血球または成熟赤血球への分化によってその核を失った、細胞である。ある実施形態では、除核細胞は、先駆細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、骨髄球性共通前駆体（ＣＭＰ）、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、前赤芽球、初期好塩基性赤芽球、後期好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、もしくは正染性赤芽球、または人工多能性細胞から、網状赤血球または成熟赤血球へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化によってその核を失った、細胞である。ある実施形態では、除核細胞は、ＤＮＡを欠いている。ある実施形態では、除核細胞は、ポリペプチドを発現することができず、例えば、ＤＮＡをタンパク質に転写および／または翻訳することができず、例えば、ＤＮＡをタンパク質に転写および／または翻訳するために必要な細胞機構を欠いている。一部の実施形態では、除核細胞は、赤血球、網状赤血球、または血小板である。
【０１３５】
一部の実施形態では、除核細胞は、血小板でなく、したがって、「血小板を含まない除核された」細胞（「ＰＦＥ」細胞）である。血小板が核を有さないことおよびこの特定の実施形態では血小板が包含されるように意図されていないことを理解されたい。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「赤血球系細胞」は、有核赤血球、赤血球先駆体、除核成熟赤血球、および網状赤血球を含む。本明細書で使用される場合、赤血球系細胞は、網状赤血球または赤血球に分化することができる細胞である、赤血球系先駆細胞を含む。例えば、赤血球系先駆細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾コロニー形成（ＣＦＵ−Ｓ）細胞、骨髄球性共通前駆（ＣＭＰ）細胞、芽球コロニー形成細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球−赤血球系前駆（ＭＥＰ）細胞、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、網状赤血球、赤血球、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球のいずれかを含む。赤血球系細胞の調製物は、これらの細胞のいずれかまたはそれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、赤血球系先駆細胞は、不死または不死化細胞である。例えば、不死化赤芽球細胞をＣＤ３４＋造血前駆細胞のレトロウイルス形質導入により生成して、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃを発現させることおよびＴＰ５３を抑制することができる（例えば、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Huang  et  al.,  Mol  Ther  (2014)  Mol.  Ther.  22(2):  451-63に記載の通り）。加えて、細胞は、自家使用を目的とするものであることもあり、または同種血輸血の供給源になることもある。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、培養される。ある実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球である。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、核酸の文脈で使用されるときの用語「外来性」は、導入遺伝子および組換え核酸を含む。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、用語「外来性核酸」は、細胞に本来備わっているものでなく、細胞にまたは細胞の前駆体に導入される、核酸（例えば、遺伝子）を指す。外来性核酸は、細胞に本来備わっている内在性核酸と相同または同一である、領域またはオープンリーディングフレーム（例えば、遺伝子）を含み得る。一部の実施形態では、外来性核酸は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、外来性核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、外来性核酸は、細胞のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、外来性核酸は、外来性ポリペプチドを産生するように細胞機構によりプロセシングされる。一部の実施形態では、外来性核酸は、外来性核酸が導入された細胞によっても、またはそのような細胞の子孫である細胞によっても保持されない。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、用語「外来性ポリペプチド」は、その細胞型の野生型によって産生されないポリペプチド、または外来性ポリペプチドを含有する細胞に存在するより低レベルで野生型細胞に存在するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、細胞内もしくは細胞上に導入されるポリペプチド、または外来性ポリペプチドをコードする外来性核酸の細胞内へのもしくはその細胞の前駆体内への導入に起因してその細胞により発現されるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、細胞にまたはその細胞の前駆体に導入された外来性核酸であって、必要に応じてその細胞によって保持されない外来性核酸によりコードされるポリペプチドである。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、化学的または酵素的手段により細胞の表面にコンジュゲートされたポリペプチドである。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、用語「発現する」または「発現」は、転写および翻訳を含む、ポリペプチドを産生するためのプロセスを指す。発現は、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の数を増加させること、遺伝子の転写を（例えば、遺伝子を構成的プロモーターの制御下に置くことにより）増加させること、遺伝子の翻訳を増加させること、競合遺伝子をノックアウトすること、またはこれらのおよび／もしくは他の手法の組合せを含む、いくつかの手法により増加させることができる。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、外来性ポリペプチドまたは核酸に関して、用語「第１の」、「第２の」および「第３の」などは、１種より多くのタイプの外来性ポリペプチドまたは核酸があるとき、区別の便宜上、使用される。これらの用語の使用は、外来性ポリペプチドまたは核酸の特定の順序または配向を付与することを、明示的にそのように述べられていない限り、意図したものでない。
【０１４２】
本明細書で使用される場合の用語「フローサイトメトリー」は、細胞の表現型および特徴を調べるためのツールを指す。フローサイトメトリーは、細胞または粒子を、それらが液体ストリーム中で移動すると、感知領域を通過したレーザー（放射線の誘導放出による光増幅）／光ビームによって感知する。微細粒子の相対光散乱および色彩弁別蛍光が測定される。細胞のフロー分析および鑑別は、サイズ、粒度、および細胞が蛍光分子を抗体の形態で担持しているのか、色素の形態で担持しているのかに基づく。細胞がレーザービームを通過すると、光が全方向に散乱され、軸から低角度（０．５〜１０°）で順方向に散乱される光は、球体の半径の二乗に比例し、そのため細胞または粒子のサイズに比例する。光は、細胞に入射することができ、したがって、９０°光（直角の、側方）散乱を、蛍光色素連結抗体で標識することまたは蛍光膜、細胞質もしくは核染料で染色することができる。このようにして、細胞型、膜受容体および抗原の存在、膜電位、ｐＨ、酵素活性、およびＤＮＡ含量の鑑別を容易にすることができる。フローサイトメーターは、各細胞に関するいくつかの測定値を記録する多重パラメーターであり、したがって、不均一な集団内の均一な部分集団を同定することが可能である（Marion  G.  Macey,  Flow  cytometry:  principles  and  applications,  Humana  Press,  2007）。物理的特徴があまりにも似ていてサイズによっても密度によっても分離することができない別個の細胞集団の単離を可能にする、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、蛍光タグを使用して、異なって発現される表面タンパク質を検出し、その結果、物理的に均一な細胞集団間の細かい区別の実施を可能にする。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、所与のＲＮＡまたはタンパク質の発現に関連する核酸の任意のセグメントを指すために広く使用される。したがって、遺伝子は、発現されるＲＮＡ（通常は、ポリペプチドコード配列を含む）をコードする領域を含み、それらの発現に必要とされる調節配列をコードする領域を含むことが多い。遺伝子は、目的の供給源からクローニングすることまたは既知もしくは予測配列情報から合成することを含めて、様々な供給源から得ることができ、特に所望されるパラメーターを有するように設計された配列を含むこともある。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、用語「活性化する」、「刺激する」、「増強する」、「増加させる」および／または「誘導する」（およびこれらに類する用語）は、天然のもの、予想されるものもしくは平均値と比べて、または対照条件と比べて、濃度、レベル、機能、活性または挙動を、直接的にせよ、間接的にせよ、向上または増加させる作用を一般に指すために同義で使用される。「活性化する」は、細胞表面部分のライゲーションにより誘導される一次応答を指す。例えば、受容体の文脈でのそのような刺激は、受容体のライゲーションおよびその後のシグナル伝達事象を必然的に伴う。Ｔ細胞の刺激に関して、そのような刺激は、Ｔ細胞表面部分のライゲーションを指し、このライゲーションは、一部の実施形態では、その後、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を結合させることなどのシグナル伝達事象を誘導する。さらに、刺激事象は、細胞を活性化することもあり、分子の発現または分泌を上方制御するまたは下方制御することもある。したがって、細胞表面部分のライゲーションは、直接的なシグナル伝達事象の非存在下であっても、細胞骨格構造の再構成、または細胞表面部分の合体をもたらすことができ、これらの各々は、その後の細胞応答を増強、修飾または変更するように機能し得る。「活性化」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の細胞傷害活性の刺激、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の刺激、検出可能なエフェクター機能、Ｔ細胞の分化状態の修飾（例えば、エフェクターＴ細胞の拡大およびエフェクターＴ細胞のメモリーＴ細胞への分化を促進する）、および／またはこれらの任意の組合せを含む。用語「活性化Ｔ細胞」は、数ある中でも特に、細胞分裂しているＴ細胞を指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「免疫応答の変更」は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（細胞免疫応答）、ＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色アッセイ）および主要組織適合複合体（ＭＨＣ）四量体アッセイによって測定して抗原特異的Ｔ細胞を検出および定量して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の血中集団を定量したときの、もしくは測定可能な量により抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の血中集団を定量したときの、または増加が、好適な対照（例えば、樹状細胞に腫瘍特異的細胞が負荷されても、腫瘍特異的細胞に由来するペプチドが負荷されてもいない対照組成物）と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％増加である場合の、免疫応答の形態または特徴の変化、例えば、免疫応答の刺激または阻害を指す。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、本明細書で「組換え」と称されるポリペプチドは、人工組換え方法に依拠する手順、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および／または制限酵素を使用するベクターへのクローニングにより生成されるものを含む、組換えＤＮＡ方法論により産生されたポリペプチドを指す。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）」は、ＶＬ領域とＶＨ領域が、連続タンパク質鎖を形成するようにリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して連結されている、抗体を指す。リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体に折り重なることおよび一価抗原結合部位を形成することを可能にするのに十分な長さである（例えば、Bird  et  al.,  1988,  Science  242:423-26およびHuston  et  al.,  1988,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:5879-83を参照されたい）。
【０１４８】
本明細書で使用される場合の用語「特異的に結合する」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでリガンドを認識し、それに結合するが、周囲環境の他の分子を実質的に認識せず、そのような他の分子に実質的に結合もしない、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の能力を指す。一部の実施形態では、特異的結合は、少なくとも約１×１０６Ｍまたはそれ未満の平衡解離定数によって特徴付けられ得る（例えば、より小さい平衡解離定数は、より強固な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「対象」、「個体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書では同義で使用され、診断、処置または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載される方法は、ヒト治療応用と獣医学的応用の両方に適用可能である。一部の実施形態では、対象は哺乳動物であり、特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、句「必要とする対象」は、この句の文脈および慣用による別段の指示がない限り、（ｉ）記載される発明によるａＡＰＣ（またはａＡＰＣを含む医薬組成物）を投与されることになる対象、（ｉｉ）記載される発明によるａＡＰＣ（またはａＡＰＣを含む医薬組成物）を受けている対象、または（ｉｉｉ）記載される発明によるａＡＰＣ（またはａＡＰＣを含む医薬組成物）を受けたことがある対象を指す。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、用語「抑制する」、「減少させる」、「干渉する」、「阻害する」および／または「低下させる」（およびこれらに類する用語）は、天然のもの、予想されるものもしくは平均値と比べて、または対照条件と比べて、濃度、レベル、機能、活性または挙動を、直接的にせよ、間接的にせよ、低下させる作用を一般に指す。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、用語「免疫細胞を抑制すること」または「免疫細胞を阻害すること」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される、免疫細胞の１つもしくは複数の細胞応答もしくは活性の阻害もしくは抑制を引き起こす、もしくは生じさせる結果となる、または免疫細胞のアネルギー化もしくは免疫細胞のアポトーシスの誘導を生じさせる結果となる、プロセス（例えば、シグナル伝達事象）を指す。免疫細胞阻害または抑制の測定に好適なアッセイは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な医薬担体のいずれか、例えば、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水または水／油、および様々なタイプの湿潤剤を含む。この用語は、ヒトを含む動物での使用について米国連邦政府の監督機関により認可されているまたは米国薬局方に収載されている薬剤のいずれか、ならびに対象に有意な刺激をもたらさず、投与される化合物の生物活性および特性を消失させない、任意の担体または希釈剤も包含する。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、活性薬剤（例えば、本明細書に記載のａＡＰＣ）の「治療量」、「治療有効量」、「有効な量」または「薬学的有効量」という用語は、処置についての所期の恩恵をもたらすために十分である量を指すために同義で使用される。しかし、投薬量レベルは、傷害のタイプ、患者の年齢、体重、性別、病状、状態の重症度、投与経路、および利用される特定の活性薬剤を含む、様々な因子に基づく。したがって、投薬量レジメンは、大いに異なり得るが、標準的な方法を使用して医師により常例的に決定され得る。加えて、用語「治療量」、「治療有効量」および「薬学的有効量」は、記載される発明の組成物の発症予防または予防量を含む。記載される発明の発症予防応用または予防応用では、医薬組成物または医薬は、疾患、障害または状態の生化学的、組織学的および／または行動上の症状、その合併症、ならびに疾患、障害または状態の発症中に提示される中間的な病理学的表現型を含む、疾患、障害または状態のリスクをなくすもしくは低下させる、その重症度を低下させる、またはその開始を遅延させるのに十分な量で、疾患、障害もしくは状態に罹患しやすい、または別様に疾患、障害もしくは状態のリスクがある患者に投与される。最大用量、すなわち、何らかの医学的判断に従って最高安全用量が使用されることが、一般に好ましい。用語「用量」および「投薬量」は、本明細書では同義で使用される。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、用語「治療効果」は、その結果が望ましいおよび有益であると判断される、処置の帰結を指す。治療効果は、直接的にせよ、間接的にせよ、疾患発現の抑止、軽減または消失を含み得る。治療効果はまた、直接的にせよ、間接的にせよ、疾患発現の進行の抑止、軽減または消失を含み得る。
【０１５６】
本明細書に記載されるいずれの治療剤についても、治療有効量は、最初は予備的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究および／または動物モデルから決定され得る。治療有効用量は、ヒトデータから決定されることもある。適用される用量は、投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティおよび作用強度に基づいて調整され得る。上記の方法および他の周知の方法に基づいて最大有効性を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれるGoodman  and  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics,  10th  Edition,  McGraw-Hill  (New  York)  (2001)の第１章で見つけることができる、治療有用性を決定するための一般原則は、以下に要約される。
【０１５７】
薬物動態の原則は、受け入れ難い有害事象を最小限にして望ましい治療有効性度が得られるように投薬量レジメンを修正するための基礎となる。薬物の血漿濃度を測定して治療域に関連付けることができる状況で、投薬量修正のさらなる指針を得ることができる。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」、および／または「処置」は、状態の進行を妨げること、実質的に阻害すること、緩徐化することもしくは逆行させること、状態の臨床症状を実質的に改善すること、または状態の臨床症状の出現を実質的に防止すること、有益なまたは望ましい臨床結果を得ることを含む。処置することは、さらに、次の１つまたは複数を果たすことを指す：（ａ）障害の重症度を低下させること；（ｂ）処置される障害に特有の症状の発症を制限すること；（ｃ）処置される障害に特有の症状の悪化を制限すること；（ｄ）以前に障害を有していたことがある患者の障害の再発を制限すること；および（ｅ）障害について以前は無症状であった患者の症状の再発を制限すること。
【０１５９】
有益なまたは望ましい臨床結果、例えば、薬理学的および／または生理的効果は、疾患、障害または状態の素因がある可能性があるが、疾患の症状をまだ経験しても示してもいない対象において疾患、障害または状態が発生するのを予防すること（発症予防的処置）、疾患、障害または状態の症状の緩和、疾患、障害または状態の程度の低下、疾患、障害または状態の安定化（すなわち、悪化させないこと）、疾患、障害または状態の拡散を防止すること、疾患、障害または状態進行の遅延または緩徐化、疾患、障害または状態の改善または軽減、およびこれらの組合せ、ならびに処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを含むが、それらに限定されない。
【０１６０】
本明細書で使用される場合の用語「外来性抗原ポリペプチド」は、免疫応答を誘導することができる外来性ポリペプチドを指す。外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに結合することができる。
【０１６１】
本明細書で使用される場合の用語「外来性抗原提示ポリペプチド」は、抗原に結合し、それらの抗原を適切なＴ細胞による認識のために細胞表面に提示する、一連の細胞表面タンパク質を指す。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩという３つのサブグループに分けられる。ＭＨＣクラスＩ分子は、α鎖およびβ２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）鎖という２本のポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体である。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、β２サブユニットを有するため専らＣＤ８共受容体によって認識され得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子もまた、αおよびβポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体である。例えばα１、α２などのような、鎖についての副次的な名称は、ＨＬＡ遺伝子内の別々のドメインを指す。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、β１およびβ２サブユニットを有し、ＣＤ４共受容体によって認識され得る。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体とも呼ばれる。一部の実施形態では、「外来性抗原提示ポリペプチド」は、抗原に結合することおよびそれらの抗原を細胞表面に提示することができる細胞表面タンパク質ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１を指す。外来性抗原提示ポリペプチドは、下でより詳細に説明される。
【０１６２】
本明細書で使用される場合の用語「外来性Ｔ細胞共刺激ポリペプチド」は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ）上のポリペプチドであって、Ｔ細胞上のコグネイト共刺激分子（例えば、ＭＨＣ分子、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＣＤ２７２）、ならびにＴｏｌｌ様受容体）に特異的に結合し、それによって、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合によりもたらされる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルをもたらす、ポリペプチドを含む。共刺激ポリペプチドは、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含する。例示的な外来性共刺激ポリペプチドは、下でより詳細に説明される。
【０１６３】
本明細書で使用される場合の用語「外来性Ｔ細胞共阻害ポリペプチド」は、Ｔ細胞活性の阻害、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの誘導を含む、Ｔ細胞を抑制する任意のポリペプチドを指す。例示的な外来性共阻害ポリペプチドは、下でより詳細に説明される。
【０１６４】
本明細書で使用される場合の用語「代謝物を変化させる外来性ポリペプチド」は、細胞の代謝物の異化または同化に関与する任意のポリペプチドを指し、代謝物を変化させるポリペプチドは、Ｔ細胞の代謝に影響を与えることができる。例示的な代謝物を変化させるポリペプチドは、下でより詳細に説明される。
【０１６５】
本明細書で使用される場合の用語「Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド」は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を拡大する外来性ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞発生に関与する３つのシグナルのうちの少なくとも１つを刺激することによりＴｒｅｇ細胞を刺激する。例示的な外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、下でより詳細に説明される。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では同義で使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーに対してばかりでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在する対応するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに対しても適用される。天然に存在するアミノ酸のそのような類似体の本質的な性質は、タンパク質に組み込まれたとき、そのタンパク質が、天然に存在するアミノ酸からすべてがなること以外は同じタンパク質に対して惹起された抗体に特異的に反応するという性質である。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰリボシル化を含むがこれらに限定されない、修飾も含む。周知であるように、および上述のように、ポリペプチドが完全に直鎖状でないこともあることは、理解されるであろう。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐状であることがあり、ポリペプチドは、一般には翻訳後事象の結果として、分岐を伴うまたは伴わない、環状であることもあり、翻訳後事象は、天然のプロセシング事象、および天然には起こらないヒトによる操作によって引き起こされる事象を含む。環状、分岐状および分岐環状ポリペプチドを、非翻訳天然プロセスにより、および完全合成方法により、合成することもできる。一部の実施形態では、ペプチドは、任意の長さまたはサイズのものである。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。この用語は、組換えであってもよく、核酸が細胞に導入されたときに外来性ポリペプチドを発現することができる、染色体ＤＮＡおよび自己複製プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを含む。
【０１６８】
以下の用語は、２つまたはそれより多くの核酸またはポリヌクレオチドの間の配列関係を説明するために本明細書で使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性パーセンテージ」、および（ｅ）「実質的同一性」。（ａ）用語「参照配列」は、配列比較の基準として使用される配列を指す。参照配列は、例えば、完全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のような、指定配列のサブセットであることもあり、または全体であることもある。（ｂ）用語「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続する指定セグメントであって、ポリヌクレオチド配列を参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分が、２配列の最適なアラインメントのために参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある、セグメントを指す。一般に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチドの長さであり、必要に応じて、少なくとも３０の連続するヌクレオチドの長さ、少なくとも４０の連続するヌクレオチドの長さ、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの長さ、少なくとも１００の連続するヌクレオチドの長さであることがあり、またはそれより長いこともある。ポリヌクレオチド配列にギャップを含めることに起因する参照配列との高い類似性を回避するために、ギャップペナルティーが通常は導入され、マッチ数から減算されることは、当業者には理解される。比較のための配列アラインメント方法は、当技術分野において周知である。比較のための最適な配列アランメントは、Smith  and  Waterman,  Adv.  Appl.  Math.  2:482  (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman  and  Wunsch,  J.  Mol.  Biol.  48:443  (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  85:2444  (1988)の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーションによって行うことができ、インプリメンテーションは、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣａｌｉｆによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されず、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Higgins  and  Sharp,  Gene  73:237-244  (1988)、Higgins  and  Sharp,  CABIOS  5:151-153  (1989)、Corpet,  et  al.,  Nucleic  Acids  Research  16:10881-90  (1988)、Huang,  et  al.,  Computer  Applications  in  the  Biosciences,  8:155-65  (1992)、およびPearson,  et  al.,  Methods  in  Molecular  Biology,  24:307-331  (1994)によって十分に説明されている。データベース類似性検索に使用することができるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーは、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＮ、タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＸ、タンパク質データベース配列に対する���ンパク質問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ、およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸを含む。Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Chapter  19,  Ausubel,  et  al.,  Eds.,  Greene  Publishing  and  Wiley-Interscience,  New  York  (1995)を参照されたい。別段の記述がない限り、本明細書で提供される配列同一性／類似性値は、デフォルトパラメーターを使用してＢＬＡＳＴ  ２．０プログラム一式を使用して得られた値を指す。Altschul  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  25:3389-3402  (1997)。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、例えば、米国国立生物学−情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって公開されている。
このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときにマッチするか何らか正の値の閾値スコアＴを満たす、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul  et  al.、上掲）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果す。次いで、ワードヒットが、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（マッチする残基対についての報酬スコア、常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基についてのペナルティースコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコア行列が使用される。各方向のワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値からＸ量低下すると、１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因して累積スコアが０もしくはそれ未満になると、またはどちらかの配列の末端に達すると、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸが、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Henikoff  &  Henikoff  (1989)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:10915を参照されたい）。配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Karlin  &  Altschul,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90:5873-5787  (1993)を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより与えられる類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標となる、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。ＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質をランダム配列としてモデル化することができることを想定している。しかし、多くの実在するタンパク質は、非ランダム配列の領域を含み、これらは、ホモポリマートラクトであることもあり、短期リピートであることもあり、または１つもしくは複数のアミノ酸が濃縮された領域であることもある。そのような低複雑度領域は、無関係のタンパク質間で、たとえタンパク質の他の領域が全く異なっていたとしても、アラインメントされ得る。いくつかの低複雑度フィルタープログラムを利用して、そのような低複雑度アラインメントを低減させることができる。例えば、ＳＥＧ（Wooten  and  Federhen,  Comput.  Chem.,  17:149-163  (1993)）およびＸＮＵ（Claverie  and  States,  Comput.  Chem.,  17:191-201  (1993)）低複雑度フィルターを、単独でまたは組み合わせて利用することができる。（ｃ）２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈での用語「配列同一性」または「同一性」は、指定比較ウィンドウにわたって最大に一致するようにアライ��メントされたときに同じである２配列中の残基を指すために本明細書では使用される。配列同一性パーセンテージがタンパク質に関して使用されるとき、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なることが多いこと、すなわち、この場合、アミノ酸残基によって類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基が置換され、したがって、分子の機能的特性が変化しないことは、理解される。配列が保存的置換の点で異なる場合、配列同一性パーセントを上方調整して、置換の保存的性質について補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。通常は、これは、完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとして保存的置換をスコア化し、それによって配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０〜１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）に実装されているような、例えば、Meyers  and  Miller,  Computer  Applic.  Biol.  Sci.,  4:11-17  (1988)のアルゴリズムに従って、計算される。（ｄ）用語「配列同一性パーセンテージ」は、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分が、２配列の最適なアラインメントのために参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定される値を意味するように本明細書では使用される。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に出現する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることにより計算される。（ｅ）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを使用して記載されたアラインメントプログラムの１つを使用して参照配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、および少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの配置などを考慮に入れることによってこれらの値を適切に調整して、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができることは、当業者には分かるであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を通常は意味する。ヌクレオチド配列が実質的に同一であることのもう１つの指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。しかし、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリ��イズしない核酸は、それでも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝コードにより許される最大のコドン縮重を使用して作出された場合に起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標は、第１の核酸がコードするポリペプチドが、第２の核酸によりコードされたポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。コドン縮重を考慮に入れることを含めて、遺伝コードを参照することにより、存在するタンパク質のヌクレオチド配列に突然変異を生じさせることもできる。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入または他の修飾によって元のタンパク質と異なるポリペプチドを指す。これらの修飾は、元のタンパク質の生物活性を有意に変化させない。多くの場合、バリアントは、元のタンパク質の生物活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を保持する。バリアントの生物活性は、元のタンパク質のものより高いこともあり得る。バリアントは、対立遺伝子変異もしくは多型などにより自然に存在することもあり、または意図的に操作されることもある。
【０１７０】
バリアントのアミノ酸配列は、元のタンパク質のものと実質的に同一である。多くの実施形態では、バリアントは、元のタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより高い全体的配列同一性または類似性を共有する。配列同一性または類似性は、当技術分野において公知の様々な方法、例えば、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、ドットマトリックス解析、または動的計画方法を使用して決定することができる。一例では、配列同一性または類似性は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）プログラムＧＡＰ（ニードルマン−ブンシュアルゴリズム）を使用することにより決定される。バリアントのアミノ酸配列と元のタンパク質のアミノ酸配列は、１つまたは複数の領域では実質的に同一であり得るが、他の領域では相違し得る。バリアントは、断片（例えば、ポリペプチドの生物活性断片）を含み得る。一部の実施形態では、断片は、完全長ポリペプチドと比較して、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端または両末端における（各々独立して）最大約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０または１００アミノ酸残基を欠いていることがある。
【０１７１】
Ｉ．免疫系の細胞
免疫系を構成する多数の細胞相互作用がある。これらの相互作用は、両方向にシグナルを伝達する特異的受容体−リガンド対によって起こり、したがって、各細胞は、それらのシグナルの時間および空間分布に基づいた相互作用を受ける。
【０１７２】
マウスモデルは、免疫調節経路の発見に大いに役立ってきたが、これらの経路の臨床的有用性は、必ずしも近交系マウス系統から非近交系のヒト集団に移すことができるとは限らない。非近交系のヒト集団は、程度に差はあれど個々の免疫調節経路に依拠する個体を有し得るからである。
【０１７３】
免疫系の細胞は、リンパ球、単球／マクロファージ、樹状細胞、密接に関連するランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マスト細胞、好塩基球、および骨髄細胞系譜の他のメンバーを含む。加えて、一連の特殊化した上皮および間質細胞は、多くの場合、応答の誘導およびエフェクター相にも直接関与する、免疫系の細胞の成長および／または遺伝子活性化を調節する重要な因子を分泌することによって、免疫が発生する解剖学的環境を提供する。（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999),  at  p.  102）。
【０１７４】
免疫系の細胞は、末梢の器質化組織、例えば、脾臓、リンパ節、腸のパイエル板、および扁桃に見られる。リンパ球は、中枢リンパ臓器、胸腺および骨髄にも見られ、そこで、それらは、成熟免疫系の無数の応答を媒介する能力をそれらに備えさせる発達段階を経る。リンパ球およびマクロファージのかなりの部分は、血液およびリンパ液に見られる細胞の再循環プールを構成し、これは、免疫担当細胞をそれらが必要とされる部位に送達するための手段、および局所的に生じる免疫が全身性になることを可能にするための手段をもたらす。（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999),  at  p.  102）。
【０１７５】
用語「リンパ球」は、全身のリンパ組織に形成される小さい白血球であって、正常な成体では循環血中の白血球の総数の約２２〜２８％を構成し、疾患に対する身体の防御に大きな役割を果たすものを指す。個々のリンパ球は、それらが、それらの遺伝物質の組換えによって、構造的に関連する抗原の限られたセットに応答するように（例えば、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体を生成するように）拘束されるという点で、特殊化される。免疫系と所与の抗原との最初の接触前に存在するこの拘束は、リンパ球の表面膜上の抗原の決定基（エピトープ）に特異的な受容体の存在により発現される。各リンパ球は、すべての受容体が同一の結合部位を有する、特有の受容体集団を保有する。リンパ球のあるセット、またはクローンは、その受容体の結合領域の構造の点で別のクローンと異なり、したがって、それが認識することができるエピトープの点で異なる。リンパ球は、それらの受容体の特異性の点のみならず、それらの機能の点でも、互いに異なる。（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999),  at  p.  102）。
【０１７６】
抗体分泌細胞の先駆体であるＢリンパ球（Ｂ細胞）、およびＴリンパ球（Ｔ細胞）という、リンパ球の２つの広義のクラスが認知されている。
【０１７７】
Ｂリンパ球
Ｂリンパ球は、骨髄の造血細胞に由来する。成熟Ｂ細胞は、その細胞表面によって認識されるエピトープを発現する抗原で活性化され得る。活性化プロセスは、抗原による膜Ｉｇ分子の架橋に依存する、直接的なもの（架橋依存性Ｂ細胞活性化）であることもあり、またはコグネイトヘルプと称されるプロセスでの、ヘルパーＴ細胞との相互作用による、間接的なものであることもある。多くの生理的状況で、受容体架橋刺激およびコグネイトヘルプは、相乗効果を発揮して、より活発なＢ細胞応答を生じさせる（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１７８】
各Ｂ細胞は、同一の可変領域を有するＩｇ分子を発現するので、架橋依存性Ｂ細胞活性化は、抗原が、細胞表面受容体の結合部位に相補的なエピトープの複数のコピーを発現することを必要とする。そのような要件は、微生物の莢膜多糖またはウイルス外被タンパク質などの、反復エピトープを有する他の抗原により満たされる。架橋依存性Ｂ細胞活性化は、これらの微小生物に対して開始される主要防御免疫応答である（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction",  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１７９】
コグネイトヘルプは、Ｂ細胞が、受容体を架橋することができない抗原に対する応答を開始させることを可能にし、そして同時に、Ｂ細胞が弱い架橋事象によって刺激されたときにＢ細胞を不活性化から救う共刺激シグナルを提供する。コグネイトヘルプは、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）による抗原の結合、抗原の細胞内取り込み、および細胞のエンドソーム／リソソーム区画内でのペプチドへのその断片化に依存する。結果として生じるペプチドの一部は、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子として公知の一連の特殊化された細胞表面タンパク質の溝に負荷される。結果として生じるクラスＩＩ／ペプチド複合体は、細胞表面に発現され、ＣＤ４＋Ｔ細胞と呼ばれる一連のＴ細胞の抗原特異的受容体のリガンドとして作用する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、それらの表面に、Ｂ細胞のクラスＩＩ／ペプチド複合体に特異的な受容体を有する。Ｂ細胞活性化は、Ｔ細胞のそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による結合に依存するばかりでなく、この相互作用により、Ｔ細胞上の活性化リガンド（ＣＤ４０リガンド）が、Ｂ細胞上のその受容体（ＣＤ４０）に結合してＢ細胞活性化シグナルを伝達することも可能になる。加えて、ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞上のサイトカイン受容体への結合により刺激されたＢ細胞の成長および分化を調節するいくつかのサイトカインを分泌する（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,  "Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１８０】
抗体産生のためのコグネイトヘルプの間に、ＣＤ４０リガンドは、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に一過的に発現され、抗原特異的Ｂ細胞上のＣＤ４０に結合し、それによって第２の共刺激シグナルを伝達する。後者のシグナルは、Ｂ細胞成長および分化にとって、ならびに抗原と遭遇した胚中心Ｂ細胞のアポトーシスを防止することによるメモリーＢ細胞の生成にとって、不可欠である。Ｂ細胞とＴ細胞の両方におけるＣＤ４０リガンドの高発現は、ヒトＳＬＥ患者の病的な自家抗体産生に関係付けられている（Desai-Mehta,  A.  et  al.,  "Hyperexpression  of  CD40  ligand  by  B  and  T  cells  in  human  lupus  and  its  role  in  pathogenic  autoantibody  production,"  J.  Clin.  Invest.  Vol.  97(9),  2063-2073,  (1996)）。
【０１８１】
Ｔリンパ球
造血組織において先駆体から誘導されたＴリンパ球は、胸腺において分化し、その後、末梢リンパ系組織におよびリンパ球の再循環プールに播種される。Ｔリンパ球またはＴ細胞は、広範な免疫学的機能を媒介する。これらは、Ｂ細胞が抗体産生細胞に発達するのを助ける能力、単球／マクロファージの殺菌作用を増加させる能力、ある特定のタイプの免疫応答の阻害、標的細胞を直接死滅させること、および炎症応答の動員を含む。これらの効果は、特異的細胞表面分子のＴ細胞発現、およびサイトカインの分泌に依存する（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction",  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１８２】
Ｔ細胞は、それらの抗原認識機序の点でＢ細胞と異なる。Ｂ細胞の受容体である免疫グロブリンは、可溶性分子上のまたは微粒子表面の個々のエピトープに結合する。Ｂ細胞受容体には、ネイティブ分子の表面に発現されたエピトープが分かる。抗体およびＢ細胞受容体は、細胞外液中の微生物に結合するように、そして微生物から身を守るように進化した一方で、Ｔ細胞は、他の細胞の表面の抗原を認識し、それらの機能を、これらの抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用してＡＰＣの挙動を変化させることによって媒介する。Ｔ細胞を活性化することができる末梢リンパ臓器には、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞という、主要な３タイプのＡＰＣが存在する。これらのうち最も強力なのが樹状細胞であり、樹状細胞の唯一の機能は、外来抗原をＴ細胞に提示することである。未成熟樹状細胞は、皮膚、消化管および気道を含む、全身の組織に位置する。未成熟樹状細胞は、これらの部位で侵入微小生物に遭遇すると、病原体およびそれらの産物を取り込み、リンパ液によってそれらを局所リンパ節または消化管付随リンパ臓器に運ぶ。病原体との遭遇は、樹状細胞を、抗原捕捉細胞からＴ細胞を活性化することができるＡＰＣに成熟するように誘導する。ＡＰＣは、それらの表面に、エフェクター細胞になるようにＴ細胞を活性化する役割を担う次の３タイプのタンパク質分子を提示する：（１）外来抗原をＴ細胞受容体に提示するＭＨＣタンパク質、（２）Ｔ細胞表面の相補的受容体に結合する共刺激タンパク質、および（３）Ｔ細胞が、活性化されるのに十分な間、ＡＰＣに結合することを可能にする、細胞間接着分子（"Chapter  24:  The  adaptive  immune  system,"  Molecular  Biology  of  the  Cell,  Alberts,  B.  et  al.,  Garland  Science,  NY,  (2002)）。
【０１８３】
Ｔ細胞は、それらが発現する細胞表面受容体に基づいて２つの明確に異なるクラスに細分される。Ｔ細胞の大多数は、αおよびβ鎖からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。Ｔ細胞の小群は、γおよびδ鎖で構成された受容体を発現する。α／β  Ｔ細胞には、共受容体分子ＣＤ４を発現するもの（ＣＤ４＋Ｔ細胞）およびＣＤ８を発現するもの（ＣＤ８＋Ｔ細胞）という、２つの亜系譜がある。これらの細胞は、それらによる抗原の認識の仕方の点ならびにそれらのエフェクターおよび調節機能の点で異なる。
【０１８４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫系の主要調節細胞である。それらの調節機能は、Ｔ細胞が活性化されたときに発現が誘導されるＣＤ４０リガンドなどの、それらの細胞表面分子の発現と、それらが活性化されたときに分泌する多彩なサイトカインとの両方に依存する。
【０１８５】
Ｔ細胞はまた、重要なエフェクター機能を媒介し、そのような機能の一部は、それらが分泌するサイトカインのパターンによって決定される。サイトカインは、標的細胞に対して直接毒性であることもあり、強力な炎症機序を動員することもある。
【０１８６】
加えて、Ｔ細胞、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害姓Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に発達することができ、ＣＴＬは、ＣＴＬによって認識される抗原を発現する標的細胞を効率的に溶解することができる（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１８７】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、クラスＩＩまたはクラスＩ  ＭＨＣタンパク質の専用の溝に結合された抗原のタンパク質分解によって得られるペプチドからなる複合体を認識する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ペプチド／クラスＩＩ複合体のみを認識し、その一方でＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチド／クラスＩ複合体を認識する（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１８８】
ＴＣＲのリガンド（すなわち、ペプチド／ＭＨＣタンパク質複合体）は、ＡＰＣ内で作出される。一般に、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、細胞内取り込みプロセスによってＡＰＣに取り込まれたタンパク質に由来するペプチドに結合する。次いで、これらのペプチド負荷クラスＩＩ分子は、細胞の表面に発現され、そこで、それらは、発現された細胞表面複合体を認識することができるＴＣＲを有するＣＤ４＋Ｔ細胞による結合に利用され得る。このようにして、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞外供給源に由来する抗原と反応するように特殊化される（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１８９】
対照的に、クラスＩ  ＭＨＣ分子には、ウイルスタンパク質などの内部で合成されたタンパク質に由来するペプチドが主として負荷される。これらのペプチドは、プロテオソームによるタンパク質分解によりサイトゾルタンパク質から産生され、粗面小胞体に転位される。長さ９アミノ酸で一般に構成されるそのようなペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣ分子内に結合され、細胞表面に持って行かれ、そこで、それらは、適切な受容体を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識され得る。これにより、Ｔ細胞系、特にＣＤ８＋Ｔ細胞は、生物の残部の細胞のもの（例えば、ウイルス抗原）もしくは突然変異型抗原（例えば、活性癌遺伝子産物）とは異なる、またはそれらよりはるかに大量に産生される、タンパク質を発現する細胞を、たとえ無傷の形態のこれらのタンパク質が細胞表面に発現されも、分泌されもしない場合でも、検出することが可能になる（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１９０】
Ｔ細胞を、それらの機能に基づいて、ヘルパーＴ細胞；細胞免疫の誘導に関与するＴ細胞；抑制性Ｔ細胞；および細胞傷害性Ｔ細胞として分類することもできる。
【０１９１】
ヘルパーＴ細胞
ヘルパーＴ細胞は、タンパク質および他のＴ細胞依存性抗原に対する抗体応答を生じさせるようにＢ細胞を刺激するＴ細胞である。Ｔ細胞依存性抗原は、個々のエピトープが１回または限られた回数しか出現しない免疫原であり、したがって、それらは、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）を架橋させることができない、または効率的に架橋させない。Ｂ細胞は、それらの膜Ｉｇによって抗原に結合し、その複合体は、細胞内に取り込まれる。エンドソームおよびリソソーム区画内で、抗原は、タンパク質分解酵素によりペプチドへと断片化され、生成されたペプチドの１つまたは複数がクラスＩＩ  ＭＨＣ分子内に負荷され、それらがこの小胞区画を通って輸送される。その後、結果として生じるペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体は、Ｂ細胞表面膜に排出される。ペプチド／クラスＩＩ分子複合体に特異的な受容体を有するＴ細胞が、Ｂ細胞表面でこの複合体を認識する。（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia  (1999)）。
【０１９２】
Ｂ細胞活性化は、Ｔ細胞のそのＴＣＲによる結合にも、Ｔ細胞ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とＢ細胞上のＣＤ４０との相互作用にも依存する。Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌを構成的に発現しない。もっと正確に言えば、ＣＤ４０Ｌ発現は、Ｔ細胞のＴＣＲによって認識されるコグネイト抗原とＣＤ８０またはＣＤ８６とを両方とも発現するＡＰＣとの相互作用の結果として誘導される。ＣＤ８０／ＣＤ８６は、一般に、静止Ｂ細胞ではなく活性化Ｂ細胞により発現され、したがって、活性化Ｂ細胞およびＴ細胞が関与するヘルパー相互作用は、効率的な抗体産生をもたらすことができる。しかし、多くの場合、Ｔ細胞上でのＣＤ４０Ｌの初期誘導は、ＣＤ８０／８６を構成的に発現するＡＰＣ、例えば樹状細胞の表面の抗原のそれらの認識に依存する。そのような活性化ヘルパーＴ細胞は、その後、Ｂ細胞と効率的に作用し、Ｂ細胞を助けることができる。Ｂ細胞上の膜Ｉｇの架橋は、たとえ非効率的であっても、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用と相乗効果を発揮して活発なＢ細胞活性化を生じさせることができる。増殖、Ｉｇ分泌、および発現されるＩｇクラスのクラススイッチを含む、Ｂ細胞応答の後続の事象は、Ｔ細胞由来のサイトカインの作用に依存するか、またはそのような作用により増強される（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１９３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を主として分泌する細胞（ＴＨ２細胞）へと、またはＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびリンホトキシンを主として産生する細胞（ＴＨ１細胞）へと分化する傾向がある。ＴＨ２細胞は、Ｂ細胞が抗体産生細胞へと発達するのを助ける点で非常に有効であり、これに対してＴＨ１細胞は、単球およびマクロファージの殺菌活性の増強、ならびに結果として生じる細胞内小胞区画での微生物溶解効率の上昇を含む、細胞免疫応答の、有効なインデューサーである。ＴＨ２細胞の表現型（すなわち、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は、効率的なヘルパー細胞であるが、ＴＨ１細胞にもヘルパーになる能力がある（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,  "Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１９４】
細胞免疫誘導へのＴ細胞の関与
Ｔ細胞は、細胞内微生物を破壊する単球およびマクロファージの能力を増強するように作用することもできる。特に、ヘルパーＴ細胞により産生されるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、一酸化窒素の生成および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生の誘導を含む、単核食細胞が細胞内細菌および寄生を破壊するいくつかの機序を増強する。ＴＨ１細胞は、ＩＦＮ−γを産生するので、殺菌作用の増強に有効である。対照的に、ＴＨ２細胞により産生される２つの主要サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−１０は、これらの活性を阻止する（Paul,  W.  E.,  "Chapter  1:  The  immune  system:  an  introduction,"  Fundamental  Immunology,  4th  Edition,  Ed.  Paul,  W.  E.,  Lippicott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  (1999)）。
【０１９５】
調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞
免疫恒常性は、免疫応答の開始と下方制御の間のバランスの制御によって維持される。アポトーシスとＴ細胞アネルギー（Ｔ細胞が抗原遭遇後に本質的に機能的に不活性化される寛容機序（Scwartz,  R.  H.,  "T  cell  anergy",  Annu.  Rev.  Immunol.,  Vol.  21:  305-334  (2003)））の両方の機序が、免疫応答の下方制御に寄与する。第３の機序は、抑制性または調節性ＣＤ４＋Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞による活性化Ｔ細胞の能動抑制によりもたらされる（Kronenberg,  M.  et  al.,  "Regulation  of  immunity  by  self-reactive  T  cells",  Nature,  Vol.  435:  598-604  (2005)において概説されている）。ＩＬ−２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα）鎖を構成的に発現するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）は、アネルギー性かつ抑制性である、天然に存在するＴ細胞のサブセットである（Taams,  L.  S.  et  al.,  "Human  anergic/suppressive  CD4+CD25+  T  cells:  a  highly  differentiated  and  apoptosis-prone  population",  Eur.  J.  Immunol.  Vol.  31:  1122-1131  (2001)）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの枯渇は、マウスにおいて全身性自己免疫疾患を生じさせる結果となる。さらに、これらのＴｒｅｇの移入は、自己免疫疾患の発症を防止する。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇは、それらのマウス対応物に類似して、胸腺において生成され、細胞間接触依存性機序によりレスポンダーＴ細胞の増殖を抑制することができること、ＩＬ−２を産生できないこと、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアネルギー性表現型によって特徴付けられる。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、ＣＤ２５発現レベルに従って抑制性（ＣＤ２５ｈｉｇｈ）および非抑制性（ＣＤ２５ｌｏｗ）細胞に分けることができる。転写因子のフォークヘッドファミリーのメンバーであるＦＯＸＰ３は、マウスおよびヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇに発現されることが示されており、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ発生を制御するマスター遺伝子であるようである（Battaglia,  M.  et  al.,  "Rapamycin  promotes  expansion  of  functional  CD4+CD25+Foxp3+  regulator  T  cells  of  both  healthy  subjects  and  type  1  diabetic  patients",  J.  Immunol.,  Vol.  177:  8338-8347,  (2006)）。
【０１９６】
細胞傷害性Ｔリンパ球
標的細胞内で産生されたタンパク質からのペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらが標的細胞の溶解をもたらすことから細胞傷害特性を有する。ＣＴＬ誘導溶解の機序は、標的細胞膜に挿入してその細胞の溶解を促進することができる分子である、パーフォリンのＣＴＬによる産生を伴う。パーフォリン媒介溶解は、活性化ＣＴＬにより産生される一連の酵素であるグランザイムにより増進される。多くの活性ＣＴＬは、それらの表面に大量のｆａｓリガンドも発現する。ＣＴＬの表面のｆａｓリガンドと標的細胞の表面のｆａｓとの相互作用は、標的細胞のアポトーシスを開始させ、その結果、これらの細胞は死に至る。ＣＴＬ媒介溶解は、ウイルス感染細胞の破壊の主要機序であるようである。
【０１９７】
リンパ球活性化  
用語「活性化」または「リンパ球活性化」は、特異的抗原、非特異的マイトジェン、または同種異系細胞によるリンパ球の刺激であって、結果としてＲＮＡ、タンパク質およびＤＮＡの合成、ならびにリンホカインの産生を生じさせる刺激を指し、その後、様々なエフェクターおよびメモリー細胞の増殖および分化が生じる。Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、クラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の溝の中に結合されているペプチドである、そのコグネイトリガンドとの相互作用に依存する。受容体連結により引き起こされる分子事象は複雑である。最初期のステップには、チロシンキナーゼの活性化があるようであり、この活性化は、いくつかのシグナル伝達経路を制御する一連の基質のチロシンリン酸化をもたらす。これらは、ＴＣＲをｒａｓ経路に連結させる一連のアダプタータンパク質；そのチロシンリン酸化が、その触媒活性を増大させ、イノシトールリン脂質代謝経路を働かせて、細胞内遊離カルシウム濃度の上昇およびプロテインキナーゼＣの活性化をもたらす、ホスホリパーゼＣγ１；ならびに細胞成長および分化を制御する一連の他の酵素を含む。Ｔ細胞の完全な応答性は、受容体連結に加えて、アクセサリー細胞送達共刺激活性、例えば、ＡＰＣ上のＣＤ８０および／またはＣＤ８６によるＴ細胞上のＣＤ２８の連結を必要とする。
【０１９８】
メモリーＴ細胞
適応免疫応答による病原体の認識および根絶後、Ｔ細胞の圧倒的多数（９０〜９５％）は、アポトーシスを遂げ、残りの細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）およびレジデントメモリーＴ細胞（ＴＲＭ）（Clark,  R.A.,  "Resident  memory  T  cells  in  human  health  and  disease",  Sci.  Transl.  Med.,  7,  269rv1,  (2015)）と呼ばれる、メモリーＴ細胞のプールを形成する。ＣＤ４５ＲＡは、ナイーブＴ細胞に発現され、エフェクター細胞のＣＤ４とＣＤ８の両方にも発現される。抗原経験後、セントラルおよびエフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯの発現を獲得し、ＣＤ４５ＲＡの発現を喪失する。したがって、ＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ４５ＲＯのどちらかが、メモリー集団からナイーブ集団を一般に分化させるために使用される。ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌは、セントラルメモリーＴ細胞とエフェクターメモリーＴ細胞とを区別するために使用することができる２つの他のマーカーである。ナイーブおよびセントラルメモリー細胞は、二次リンパ臓器に遊走するためにＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌを発現する。したがって、ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であり、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であり、エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−である。
【０１９９】
標準的なＴ細胞と比較して、これらのメモリーＴ細胞は、長寿命であり、明確に異なる表現型、例えば、特異的表面マーカーの発現、異なるサイトカインプロファイルの迅速な生成、エフェクター細胞機能を指示する能力、および特有のホーミング分布パターンを有する。メモリーＴ細胞は、それらのそれぞれの抗原に再曝露されると素早い反応を示して、オフェンダーの再感染を除去し、それによって免疫系のバランスを迅速に回復させる。自己免疫疾患を処置または治癒しようとするほとんどの試みが自己免疫メモリーＴ細胞によって妨げられることを立証する証拠が増えている（Clark,  R.A.,  "Resident  memory  T  cells  in  human  health  and  disease",  Sci.  Transl.  Med.,  Vol.  7,  269rv1,  (2015)）。
【０２００】
ＩＩ．人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）
本開示は、Ｔ細胞を活性化または抑制するように操作されている赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）および除核細胞を特徴とする。一部の実施形態では、除核細胞は、例えば赤血球先駆細胞からの分化によってその核を喪失した、赤血球系細胞である。しかし、すべての除核細胞が赤血球系細胞であるとは限らないこと、したがって、本明細書で包含される除核細胞が、例えば血小板も含み得ることは、理解されるであろう。一部の実施形態では、除核細胞は、血小板でなく、したがって、血小板を含まない除核された細胞である。本開示のある特定の態様では、除核細胞は、網状赤血球または赤血球（完全成熟赤血球（ＲＢＣ））である。赤血球は、非自己である（例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を実質的に欠いている）こと、対象内でより長い（例えば、３０日より長い）循環時間を有すること、および大量の産生に適していることを含む、他の細胞に勝るいくつかの利点を提供する。
【０２０１】
本明細書で提供される教示を身に着けてしまえば、非常に多くの免疫制御分子を使用してほぼ無限の種類のａＡＰＣを産生することができることは、本明細書で提供される開示に基づいて、当業者には理解されるであろう。すなわち、Ｔ細胞の活性化および誘導に関与する事象および分子に関する幅広い知識が当技術分野にはある。
【０２０２】
一部の態様では、本開示は、外来性ポリペプチドを含む、例えば、外来性ポリペプチドを細胞表面に含むまたは提示する、操作された赤血球系細胞または除核細胞を提供する。本開示の外来性ポリペプチドは、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性代謝調節ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０２０３】
外来性抗原ポリペプチド  
外来性抗原ポリペプチドは、免疫応答を誘導することができるポリペプチドである。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、免疫応答を誘導することにより、がんを阻害する、例えば、がんの原因もしくは症状を軽減もしくは緩和する、またはがんに関連するパラメーターの値を向上させる、ポリペプチドである。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、免疫応答を誘導することにより、感染性疾患を阻害する、例えば、感染性疾患の原因もしくは症状を軽減もしくは緩和する、または感染性疾患に関連するパラメーターの値を向上させる、ポリペプチドである。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、免疫応答を誘導することにより、自己免疫疾患を阻害する、例えば、自己免疫疾患の原因もしくは症状を軽減もしくは緩和する、または自己免疫疾患に関連するパラメーターの値を向上させる、ポリペプチドである。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、表１から選択される抗原ポリペプチド、またはその断片もしくはバリアント、またはそれに対する抗体分子を含むか、またはそれからなる。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【０２０５】
他の実施形態では、抗原ポリペプチドは、本明細書で開示される抗原のいずれか１つからの抗原ポリペプチドである。例えば、一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表１および１４〜２４に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表１６に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表１７に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表１８に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表１９に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表２０に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表２１に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表２２に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表２３に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、表２４に開示の抗原から選択される抗原からの抗原ポリペプチドである。
【０２０６】
表１からまたは表１４〜２４から選択される、例示的な抗原ポリペプチド、例えば、ヒトポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ａ）天然に存在する形態のヒトポリペプチド、例えば、病態に関連しない、天然に存在する形態のヒトポリペプチド；
ｂ）２０１７年１２月２２日にデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに掲載されている配列を有するヒトポリペプチド、例えば、２０１７年１２月２２日にデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに掲載されている配列を有する、病態に関連しない、天然に存在する形態のヒトポリペプチド；
ｃ）最大１、２、３、４、５もしくは１０アミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｄ）そのアミノ酸残基の最大１、２、３、４、５もしくは１０％がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｅ）ａ）もしくはｂ）の配列と実質的に異ならない配列を有するヒトポリペプチド；または
ｆ）ａ）もしくはｂ）の配列を有するヒトポリペプチドと生物活性、例えば、酵素活性（例えば、特異性または代謝回転）もしくは結合活性（例えば、結合特異性または親和性）の点で実質的に異ならないｃ）、ｄ）もしくはｅ）の配列を有するヒトポリペプチド。ｆ）に記載の候補ペプチドを作製し、本明細書に記載されるのと同様の活性についてスクリーニングすることができ、候補ペプチドは、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞に発現された場合、本明細書のもとでは等価となる。
【０２０７】
実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片、例えば、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。ある実施形態では、外来性ポリペプチドは、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片と追加のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドを含む。ある実施形態では、追加のアミノ酸配列は、異なるヒトポリペプチドについての前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド上に提示され、例えば、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）に特異的に結合される。
【０２０９】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、長さ８アミノ酸〜長さ２４アミノ酸、例えば、長さ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸である。さらなる実施形態では、切断可能な部位が外来性抗原ポリペプチドに導入される。
【０２１０】
ＭＡＧＥ−Ａ
ＭＡＧＥ−Ａ抗原は、多様な組織起源の様々ながんおよび胚細胞に発現される。ＭＡＧＥ−Ａ抗原は、異なる組織起源のがんおよび胚細胞において発現が一貫して検出される、がん／精巣抗原（ＣＴＡ）のより大きいファミリーに属する（Simpson  et  al.  Nat  Rev  Cancer.  2005  Aug;  5(8):615-25）。ＭＡＧＥ−Ａ遺伝子ファミリーは、染色体Ｘｑ２８上に位置する１２のメンバー（ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２）を有する（Chomez  et  al.,  Cancer  Res.  2001  Jul  15;  61(14):5544-51；DePlaen  et  al.,  Immunogenetics.  1994;  40(5):360-9）。ＭＡＧＥ−Ａ１、−Ａ２、−Ａ３、−Ａ４、−Ａ６、−Ａ１０および−Ａ１２は、様々な組織型の原発性および転移性腫瘍のかなりの割合に発現され、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の標的である。個々のＭＡＧＥ−Ａ発現は、腫瘍型によって異なるが、全体的に見れば、大多数の腫瘍は、少なくとも１つのＭＡＧＥ−Ａ抗原を発現する。特異的遺伝子産物が、免疫組織化学的検査により、高いパーセンテージの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膀胱がん、食道および頭頸部がん、骨髄腫、骨肉腫、ならびにトリプルネガティブ乳がんを含む、異なる組織起源のがんにおいて、同定されている（Juretic  et  al.  Lancet  Oncol.  2003  Feb;  4(2):104-9；Curigliano  et  al.,  Ann  Oncol.  2011  Jan;  22(1):98-103；vanBaren  et  al.,  Ann  Oncol.  2011  Jan;  22(1):98-103；Antonescu  et  al.,  Hum  Pathol.  2002  Feb;  33(2):225-9）。
【０２１１】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ抗原である。さらなる実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１およびＭＡＧＥ−Ａ１２から選択される。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２１２】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ１抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ２抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ５抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ６抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ７抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ８抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ９抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ１０抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ１１抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ１２抗原である。別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１およびＭＡＧＥ−Ａ１２から選択される。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０およびＭＡＧＥ−Ａ１２から選択される。
【０２１３】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ１抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ１抗原は、
【化１】
2021506304.tif 000042
からなる群から選択される。
【０２１４】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ２抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ２抗原は、ＹＬＱＬＶＦＧＩＥＶ（配列番号１４１）、ＥＹＬＱＬＶＦＧＩ（配列番号１４５）、ＲＥＰＶＴＫＡＥＭＬ（配列番号１３１）、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ（配列番号１４６）およびＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ（配列番号１４７）からなる群から選択される。
【０２１５】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ３抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ３抗原は、
【化２】
2021506304.tif 000043
からなる群から選択される。
【０２１６】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原は、ＥＶＤＰＡＳＮＴＹＪ（配列番号１６７）およびＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１６８）からなる群から選択される。
【０２１７】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ５抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【０２１８】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ６抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ６抗原は、ＳＥＳＬＫＭＩＦ（配列番号１７０）、ＭＶＫＩＳＧＧＰＲ（配列番号１７１）、ＥＶＤＰＩＧＨＶＹ（配列番号１７２）、ＲＥＰＶＴＫＡＥＭＬ（配列番号１３１）、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ（配列番号１４６）、ＩＳＧＧＰＲＩＳＹ（配列番号１７３）、ＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ（配列番号１４７）からなる群から選択される。
【０２１９】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ７抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【０２２０】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ８抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【０２２１】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ９抗原（配列番号１７６）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ９抗原は、ＡＬＳＶＭＧＶＹＶである。
【０２２２】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ１０抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ１０抗原は、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ（配列番号７１５）およびＤＰＡＲＹＥＦＬＷ（配列番号１３３）からなる群から選択される。
【０２２３】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ１１抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【０２２４】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ１２抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ１２抗原は、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥ（配列番号１７９）、ＶＲＩＧＨＬＹＩＬ（配列番号１８０）、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ（配列番号１４６）、ＲＥＰＦＴＫＡＥＭＬＧＳＶＩＲ（配列番号１８１）およびＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡＲ（配列番号１８２）からなる群から選択される。
【０２２５】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＭＡＧＥ−Ａファミリーのいくつかの腫瘍抗原に共通するエピトープを含む少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１により提示される免疫原性ペプチドであって、すべてのＭＡＧＥ−Ａ抗原を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することができる免疫原性ペプチドである、エピトープｐ２４８ｖ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＶ（配列番号１２４））を含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ａ１０、Ａ１２を認識するＣＴＬを誘導することができる免疫原性ペプチドである、エピトープｐ２４８ｇ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ（配列番号１５６））を含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ１を認識するＣＴＬを誘導することができる免疫原性ペプチドである、エピトープｐ２４８ｄ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＤ（配列番号１２５））を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ｐ２４８ｖ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＶ（配列番号１２４））である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ｐ２４８ｇ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ（配列番号１５６））である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ｐ２４８ｄ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＤ（配列番号１２５））である。
【０２２７】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｐ２４８ｖ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＶ（配列番号１２４））である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｐ２４８ｇ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ（配列番号１５６））である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｐ２４８ｄ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＤ（配列番号１２５））である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ  ＨＬＡ−Ａ、例えば、ＭＨＣ  Ｉ  ＨＬＡ−Ａ＊２０１である。
【０２２８】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ＊２０１に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ｐ２４８ｖ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＶ（配列番号１２４））を提示する、例えば、細胞表面に含む。１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ＊２０１に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ｐ２４８ｇ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ（配列番号１５６））を提示する、例えば、細胞表面に含む。１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ＊２０１に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ｐ２４８ｄ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＤ（配列番号１２５））を提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、表１に収載のＭＡＧＥ−Ａ抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、表１に収載のＭＡＧＥ−Ａ抗原である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み；および４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、表１に収載されているＭＡＧＥ−Ａ抗原から選択されるＭＡＧＥ−Ａ抗原である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み；および外来性抗原提示ポリペプチドをさらに提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドは、特定のＭＡＧＥ−Ａ抗原について表１に収載されている対応するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡである。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、表１に収載されているＭＡＧＥ−Ａ抗原から選択されるＭＡＧＥ−Ａ抗原である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み；および外来性抗原ポリペプチドが特異的に結合される外来性抗原提示ポリペプチドであって、特定のＭＡＧＥ−Ａ抗原について表１に収載されている対応するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡである外来性抗原提示ポリペプチドと、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドとをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。別の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、表１に収載されているＭＡＧＥ−Ａ抗原から選択されるＭＡＧＥ−Ａ抗原である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み；および外来性抗原ポリペプチドが特異的に結合される外来性抗原提示ポリペプチドであって、特定のＭＡＧＥ−Ａ抗原について表１に収載されている対応するＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡである外来性抗原提示ポリペプチドと、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドとをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、
【化３】
2021506304.tif 000044
【化４】
2021506304.tif 000045
から選択されるＭＡＧＥ−Ａ抗原を含むか、またはそれからなる。
【０２３１】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、
【化５】
2021506304.tif 000046
【化６】
2021506304.tif 000047
から選択されるＭＡＧＥ−Ａ抗原を含むか、またはそれからなり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含む。
【０２３２】
さらなる実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ抗原（例えば、上述のＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１またはＭＡＧＥ−Ａ１２抗原）を含む外来性抗原ポリペプチドのいずれかを含む、本明細書に記載のａＡＰＣを、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含むように操作することができる。別のさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のＭＡＧＥ−Ａ抗原に共通のエピトープ（例えば、ｐ２４８ｖ９、ｐ２４８ｇ９および／またはｐ２４８ｄ９）を含む少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを含む、本明細書に記載のａＡＰＣを、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含むように操作することができる。
【０２３３】
ＭＡＧＥ−Ａ抗原（例えば、上述のＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１またはＭＡＧＥ−Ａ１２抗原）を含む外来性抗原ポリペプチドのいずれかを含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。ＭＡＧＥ−Ａ抗原（例えば、上述のＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１またはＭＡＧＥ−Ａ１２抗原）を含む外来性抗原ポリペプチドのいずれかを含み、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。さらに、１つまたは複数のＭＡＧＥ−Ａ抗原に共通のエピトープ（例えば、ｐ２４８ｖ９、ｐ２４８ｇ９および／またはｐ２４８ｄ９）を含む外来性抗原ポリペプチドを含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。さらに、１つまたは複数のＭＡＧＥ−Ａ抗原に共通のエピトープ（例えば、ｐ２４８ｖ９、ｐ２４８ｇ９および／またはｐ２４８ｄ９）を含む外来性抗原ポリペプチドを含み、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。
【０２３４】
好中球顆粒プロテアーゼ
好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３、およびカテプシンＧは、セリンプロテアーゼのキモトリプシンスーパーファミリーに属する３つの相同プロテアーゼである。それらは、ファゴリソソーム内の貪食された微生物の分解を助長するために活性酸素種との組合せで作用する。これらのプロテアーゼはまた、好中球活性化中に活性形態で炎症部位に外在化し、結果として炎症および免疫応答の調節に寄与する。好中球セリンプロテアーゼ（ＮＳＰ）は、病原体の破壊および炎症誘発プロセスの調節へのそれらの関与に加えて、慢性肺疾患（慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、急性肺損傷、および急性呼吸窮迫症候群）およびがんを含む、ヒトの様々な炎症状態にも関与する。例えば、プロテイナーゼ３は、急性骨髄性白血病の際におよび前立腺がん細胞に高度に発現される（Kolnin  et  al.,  Blood  2016  128:1025）。プロテイナーゼ３および好中球エラスターゼは、乳がん細胞に異常に発現されることが示されている（Desmedt  et  al.  Int  J  Cancer,  2006  Dec  1:119）。
【０２３５】
好中球エラスターゼは、ヒトにおけるＥＬＡＮＥ遺伝子によりコードされる酵素である。好中球エラスターゼは、炎症中に好中球およびマクロファージにより分泌され、それは、細菌および宿主組織を破壊する。プロテイナーゼ３は、ヒトにおけるＰＲＴＮ３遺伝子によりコードされる酵素である。ヒト好中球におけるプロテイナーゼ３は、抗菌ペプチドのタンパク質分解による生成に寄与する。それは、疾患多発血管炎性肉芽腫症に高頻度に見られる抗体の一種である、ｃ−ＡＮＣＡ（細胞質サブタイプ）クラスの抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）の、標的でもある。カテプシンＧは、ヒトにおけるＣＴＳＧ遺伝子によりコードされるタンパク質である。このコードされるプロテアーゼは、キモトリプシンＣに類似した特異性を有し、貪食された病原体の死滅および消化に、ならびに炎症部位での結合組織再構築に関与し得る。加えて、コードされるタンパク質は、抗菌性であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対して殺菌活性を有する。
【０２３６】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、好中球顆粒プロテアーゼ抗原である。さらなる実施形態では、好中球顆粒プロテアーゼは、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧから選択される。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２３７】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、好中球エラスターゼ抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、プロテイナーゼ３抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、カテプシンＧ抗原である。Ｉ
【０２３８】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、好中球エラスターゼ抗原であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、プロテイナーゼ３抗原であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、カテプシンＧ抗原であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２３９】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、好中球顆粒プロテアーゼ抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。さらなる実施形態では、好中球顆粒プロテアーゼは、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧから選択される。
【０２４０】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、好中球顆粒プロテアーゼ抗原であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。さらなる実施形態では、好中球顆粒プロテアーゼは、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧから選択される。
【０２４１】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、好中球顆粒プロテアーゼ抗原であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。さらなる実施形態では、好中球顆粒プロテアーゼは、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧから選択される。
【０２４２】
一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、好中球エラスターゼ抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、プロテイナーゼ３抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、カテプシンＧ抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【０２４３】
ＰＲ１（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号２２５））は、骨髄タンパク質であるプロテイナーゼ３および好中球エラスターゼに由来するＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドである。ＰＲ１は、骨髄系白血病細胞上で細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され、ＣＴＬは、白血病を優先的に鎮め、細胞遺伝学的寛解に寄与する。
【０２４４】
したがって、赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＰＲ１である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０２４５】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＰＲ１である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０２４６】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＰＲ１であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０２４７】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＰＲ１である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。
【０２４８】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＰＲ１であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。
【０２４９】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ＰＲ１を提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２５０】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ＰＲ１を提示し、例えば、細胞表面に含み、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２５１】
好中球顆粒プロテアーゼ抗原（例えば、好中球エラスターゼ抗原、プロテイナーゼ３抗原、またはカテプシンＧ抗原）を含む外来性抗原ポリペプチドのいずれかを含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。好中球顆粒プロテアーゼ抗原（例えば、好中球エラスターゼ抗原、プロテイナーゼ３抗原、またはカテプシンＧ抗原）を含む外来性抗原ポリペプチドのいずれかを含み、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。ＰＲ１を含む外来性抗原ポリペプチドを含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。ＰＲ１を含む外来性抗原ポリペプチドを含み、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。
【０２５２】
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２
がん／精巣（Ｃ／Ｔ）抗原は、正常な発現が、成体体細胞組織ではなく精巣の男性胚細胞に限定される、腫瘍抗原のカテゴリーである。一部の場合には、ＣＴ抗原は、卵巣および栄養膜にも発現される。悪性腫瘍の場合、この遺伝子調節が破壊され、様々なタイプの腫瘍の集団にＣＴ抗原が発現される結果となる。がん／精巣抗原１（自己免疫原性がん／精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１またはＬＡＧＥ−２としても公知）は、ヒトにおけるＣＴＡＧ１Ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質である。食道がんからＳＥＲＥＸ（組換え腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーの血清学的分析）手法によって最初にクローニングされた、がん−精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１は、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するがんに罹患している患者の高い割合において液性および細胞性免疫応答を惹起する（Stockert  et  al.,  J.  Exp.  Med.  1998;187:1349-1354；Jager  et  al.  J.  Exp.  Med.  1998;187:265-270）。
【０２５３】
一態様では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２５４】
一態様では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。
【０２５５】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＰ４ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２５６】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＰ４ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２５７】
一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、表１に収載のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原である。一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、表１に収載のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、表１に収載されているＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原提示ポリペプチドをさらに提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドは、特定のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原について表１に収載されている対応するＭＨＣクラスＩ／クラスＩＩ  ＨＬＡの、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体、またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、表１に収載されているＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原であり、赤血球系細胞は、外来性抗原提示ポリペプチドをさらに提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドは、特定のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原について表１に収載されている対応するＭＨＣクラスＩ／クラスＩＩ  ＨＬＡの、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体、またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２５８】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２由来のペプチドを含む少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２由来のペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２に由来するＨＬＡクラスＩ結合ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２に由来するＨＬＡクラスＩ結合ポリペプチドは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２に由来する少なくとも１つの外来性ＨＬＡクラスＩＩ結合ポリペプチドを含む少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２に由来するＨＬＡクラスＩＩ結合ポリペプチドは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４）である。
【０２５９】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４）である。
【０２６０】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。
【０２６１】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＰ４ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。
【０２６２】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−２４に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）を提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２６３】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩＩ  ＨＬＡ−ＤＰ４に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４）を提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２６４】
実施形態では、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、
【化７】
2021506304.tif 000048
【化８】
2021506304.tif 000049
から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原である。
【０２６５】
一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、
【化９】
2021506304.tif 000050
【化１０】
2021506304.tif 000051
から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２６６】
一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、
【化１１】
2021506304.tif 000052
から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原であり、赤血球系細胞は、外来性抗原提示ポリペプチドをさらに提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドは、特定のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原について表１に収載されている対応するＭＨＣクラスＩ／クラスＩＩ  ＨＬＡの、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体、またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２６７】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２６８】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４）であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２６９】
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原を含む外来性抗原ポリペプチドを含む（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原を含む外来性抗原ポリペプチドを含み（例えば、細胞表面に含み）、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含む（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。本明細書に記載の少なくとも１つの外来性のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２由来のペプチド（例えば、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）またはＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４））を含む（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。少なくとも１つの外来性のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２由来のペプチド（例えば、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）またはＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４））を含み（例えば、細胞表面に含み）、本明細書に記載の４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。
【０２７０】
テロメラーゼ／ｈＴＥＲＴ
テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ、またはヒトの場合はｈＴＥＲＴと略記される）は、ほとんどの真核生物における染色体末端の複製に必須のリボ核タンパク質酵素である。テロメラーゼは、テロメアリピートＴＴＡＧＧＧの付加によりテロメア末端を維持する。テロメラーゼ発現は、通常は出生後の体細胞では抑制され、その結果、テロメアの漸進的短縮が生じるので、細胞老化の一因となる。テロメラーゼ活性は、細胞が分裂することができる回数に関連し、がん細胞などの細胞系の不死性に重要な役割を果たす。
【０２７１】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、テロメラーゼ抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、テロメラーゼ抗原であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）抗原であり、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２７２】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、テロメラーゼ抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、テロメラーゼ抗原は、ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２７３】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、テロメラーゼ抗原であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、テロメラーゼ抗原は、ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２７４】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号６５９）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ（配列番号６６３）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＬＴＤＬＱＰＹＭＲＱＦＶＡＨＬ（配列番号６６４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号６５９）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ（配列番号６６３）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＬＴＤＬＱＰＹＭＲＱＦＶＡＨＬ（配列番号６６４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号６５９）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ（配列番号６６３）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＬＴＤＬＱＰＹＭＲＱＦＶＡＨＬ（配列番号６６４）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号６５９）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ（配列番号６６３）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、ＬＴＤＬＱＰＹＭＲＱＦＶＡＨＬ（配列番号６６４）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０２７５】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
【０２７６】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
【０２７７】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号６５９）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
【０２７８】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号６５９）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
【０２７９】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ（配列番号６６３）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ７ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ７一本鎖融合体である。
【０２８０】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ（配列番号６６３）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ７ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ７一本鎖融合体である。
【０２８１】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＬＴＤＬＱＰＹＭＲＱＦＶＡＨＬ（配列番号６６４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ１１ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ１１一本鎖融合体である。
【０２８２】
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＬＴＤＬＱＰＹＭＲＱＦＶＡＨＬ（配列番号６６４）であり、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ１１ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ１１一本鎖融合体である。
【０２８３】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞はＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）を提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２８４】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２に融合された少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）を提示し、例えば、細胞表面に含み、赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０２８５】
テロメラーゼ抗原、特にｈＴＥＲＴ抗原を提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。テロメラーゼ抗原、特にｈＴＥＲＴ抗原を提示し（例えば、細胞表面に含み）、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。上記のｈＴＥＲＴ抗原を提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。上記のｈＴＥＲＴ抗原を提示し（例えば、細胞表面に含み）、４−１ＢＢＬを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。
【０２８６】
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、オリゴデンドロサイト細胞表面およびミエリン鞘の最表面に発現される膜タンパク質である。この局在のため、ＭＯＧは、免疫介在性脱髄に関与する主要標的抗原である。ＭＯＧタンパク質は、ミエリン鞘の完成および維持に、ならびに細胞間情報伝達に関与し得る。
【０２８７】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＯＧ抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＯＧ抗原であり、赤血球系細胞は、共阻害ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＭＯＧ抗原であり、赤血球系細胞は、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＩＬ−２である。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２である。一部の実施形態では、ＭＯＧ抗原は、ヒトＭＯＧ抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２８８】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を阻害するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＯＧ抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を阻害するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＯＧ抗原であり、赤血球系細胞が、共阻害ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１である。別の態様では、本開示は、調節性Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＯＧ抗原であり、赤血球系細胞が、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２である。一部の実施形態では、ＭＯＧ抗原は、ヒトＭＯＧ抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０２８９】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号６９０）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０２９０】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号６９０）であり、赤血球系細胞が、共阻害ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１である。
【０２９１】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号６９０）であり、赤血球系細胞が、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２である。
【０２９２】
調節性Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号６９０）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０２９３】
Ｔ細胞を阻害するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号６９０）であり、赤血球系細胞が、共阻害ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１である。
【０２９４】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩＩに融合されるＭＯＧ抗原である。一部の実施形態では、ＭＯＧ抗原は、ヒトＭＯＧ抗原である。一部の実施形態では、ＭＯＧ抗原は、一本鎖融合体としてＧＰＡに融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩＩに融合される。
【０２９５】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩＩに融合されるＭＯＧ抗原であり、赤血球系細胞は、共阻害ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１である。一部の実施形態では、ＭＯＧ抗原は、ヒトＭＯＧ抗原である。一部の実施形態では、ＭＯＧ抗原は、一本鎖融合体としてＧＰＡに融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩＩに融合される。
【０２９６】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩＩに融合されるＭＯＧ抗原であり、赤血球系細胞は、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＩＬ−２である。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２である。一部の実施形態では、ＭＯＧ抗原は、ヒトＭＯＧ抗原である。一部の実施形態では、ＭＯＧ抗原は、一本鎖融合体としてＧＰＡに融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣＩＩに融合される。
【０２９７】
ＭＯＧ抗原を提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、多発性硬化症の処置に使用することができる。ＭＯＧ抗原を提示し（例えば、細胞表面に含み）、共阻害ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、多発性硬化症の処置に使用することができる。ＭＯＧ抗原を提示し（例えば、細胞表面に含み）、共阻害ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣであって、共阻害ポリペプチドがＰＤ−Ｌ１である、ａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、多発性硬化症の処置に使用することができる。ＭＯＧ抗原を提示し（例えば、細胞表面に含み）、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、多発性硬化症の処置に使用することができる。ＭＯＧ抗原を提示し（例えば、細胞表面に含み）、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する（例えば、細胞表面に含む）、本明細書に記載のａＡＰＣであって、Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドがＣＤ２５特異的ＩＬ−２である、ａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、多発性硬化症の処置に使用することができる。
【０２９８】
ｇｐ１００
糖タンパク質１００、ｇｐ１００またはメラニン細胞タンパク質ＰＭＥＬは、メラノソームに多く含まれるＩ型膜貫通糖タンパク質である。
【０２９９】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ｇｐ１００抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ｇｐ１００抗原であり、赤血球系細胞は、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、ｇｐ１００抗原は、ヒトｇｐ１００抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０３００】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ１００抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩである。別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ１００抗原であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩである。一部の実施形態では、ｇｐ１００抗原は、ヒトｇｐ１００抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０３０１】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＭＫＱＤＦＳＶ（配列番号３１４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＰＲＩＦＣＳＣ（配列番号３１５）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＬＩＹＲＲＲＬＭＫ（配列番号３１６）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＬＬＡＶＧＡＴＫ（配列番号３１７）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＩＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３１８）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＳＹＶＰＬＡＨＲ（配列番号３１９）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３２０）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３２０）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＶＹＦＦＬＰＤＨＬ（配列番号３２１）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＴＫＱＬＹＰＥＷ（配列番号３２２）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＨＴＭＥＶＴＶＹＨＲ（配列番号３２３）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＳＰＧＣＱＰＰＡ（配列番号３２４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹ（配列番号３２５）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＬＰＨＳＳＳＨＷＬ（配列番号３２６）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＮＤＧＰＴＬＩ（配列番号３２７）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹ（配列番号３２８）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３２９）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＴＴＥＷＶＥＴＴＡＲＥＬＰＩＰＥＰＥ（配列番号３３０）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号３３１）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹ（配列番号３２８）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０３０２】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＭＫＱＤＦＳＶ（配列番号３１４）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＰＲＩＦＣＳＣ（配列番号３１５）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＬＩＹＲＲＲＬＭＫ（配列番号３１６）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＬＬＡＶＧＡＴＫ（配列番号３１７）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＩＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３１８）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＳＹＶＰＬＡＨＲ（配列番号３１９）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３２０）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３２０）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＶＹＦＦＬＰＤＨＬ（配列番号３２１）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＴＫＱＬＹＰＥＷ（配列番号３２２）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＨＴＭＥＶＴＶＹＨＲ（配列番号３２３）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＳＰＧＣＱＰＰＡ（配列番号３２４）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹ（配列番号３２５）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＬＰＨＳＳＳＨＷＬ（配列番号３２６）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＮＤＧＰＴＬＩ（配列番号３２７）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹ（配列番号３２８）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３２９）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＴＴＥＷＶＥＴＴＡＲＥＬＰＩＰＥＰＥ（配列番号３３０）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号３３１）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹ（配列番号３２８）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。
【０３０３】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＲＬＭＫＱＤＦＳＶ（配列番号３１４）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＲＬＰＲＩＦＣＳＣ（配列番号３１５）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＬＩＹＲＲＲＬＭＫ（配列番号３１６）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＡＬＬＡＶＧＡＴＫ（配列番号３１７）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＩＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３１８）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＲＳＹＶＰＬＡＨＲ（配列番号３１９）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３２０）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３２０）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＶＹＦＦＬＰＤＨＬ（配列番号３２１）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＲＴＫＱＬＹＰＥＷ（配列番号３２２）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＨＴＭＥＶＴＶＹＨＲ（配列番号３２３）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＳＳＰＧＣＱＰＰＡ（配列番号３２４）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹ（配列番号３２５）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＬＰＨＳＳＳＨＷＬ（配列番号３２６）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＳＮＤＧＰＴＬＩ（配列番号３２７）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹ（配列番号３２８）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３２９）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＴＴＥＷＶＥＴＴＡＲＥＬＰＩＰＥＰＥ（配列番号３３０）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号３３１）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹ（配列番号３２８）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０３０４】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＲＬＭＫＱＤＦＳＶ（配列番号３１４）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体である外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＲＬＰＲＩＦＣＳＣ（配列番号３１５）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＬＩＹＲＲＲＬＭＫ（配列番号３１６）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＡＬＬＡＶＧＡＴＫ（配列番号３１７）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＩＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３１８）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＲＳＹＶＰＬＡＨＲ（配列番号３１９）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３２０）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＡＬＮＦＰＧＳＱＫ（配列番号３２０）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＶＹＦＦＬＰＤＨＬ（配列番号３２１）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＲＴＫＱＬＹＰＥＷ（配列番号３２２）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＨＴＭＥＶＴＶＹＨＲ（配列番号３２３）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＳＳＰＧＣＱＰＰＡ（配列番号３２４）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＶＰＬＤＣＶＬＹＲＹ（配列番号３２５）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＬＰＨＳＳＳＨＷＬ（配列番号３２６）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＳＮＤＧＰＴＬＩ（配列番号３２７）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹ（配列番号３２８）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ（配列番号３２９）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＴＴＥＷＶＥＴＴＡＲＥＬＰＩＰＥＰＥ（配列番号３３０）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＴＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹＨ（配列番号３３１）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、ＧＲＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶＴＶＹ（配列番号３２８）である少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。
【０３０５】
ｇｐ１００抗原を提示する、例えば、細胞表面に含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。ｇｐ１００抗原を提示し、例えば、細胞表面に含み、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。ｇｐ１００抗原を提示し、例えば、細胞表面に含み、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、本明細書に記載のａＡＰＣであって、共刺激ポリペプチドが４−１ＢＢＬである、ａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む、本明細書に記載のａＡＰＣであって、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドがｇｐ１００抗原である、ａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む、本明細書に記載のａＡＰＣであって、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドがｇｐ１００抗原であり、ａＡＰＣが、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示し、例えば、細胞表面に含み、共刺激ポリペプチドが４−１ＢＢＬである、ａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、がんの処置に使用することができる。ある特定の実施形態では、がんは、黒色腫である。
【０３０６】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）
ＥＢＶは、Ｂリンパ球指向性であるヒトガンマヘルペスウイルスである（Kieff  and  Liebowitz,  in  Virology,  eds.  Fields,  B.  N.,  Knipe,  D.  M.  et  al.,  p.  1889-1919,  Raven  Press,  Ltd.:  New  York,  1990）。ＥＢＶは、世界中の個体の８０〜１００パーセントに感染する極めて一般的な環境因子である。初期または初感染は、急性または不顕性であり得る。この後、長期間の間、ＥＢＶ感染は、循環血、リンパ節および脾臓に存在するＢリンパ球に潜伏している。
【０３０７】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＥＢＶ抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＥＢＶ抗原であり、赤血球系細胞は、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、ＥＢＶ抗原は、ヒトＥＢＶ抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０３０８】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＥＢＶ抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＥＢＶ抗原であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、ＥＢＶ抗原は、ヒトＥＢＶ抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０３０９】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ３５０抗原ペプチドである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＥＢＮＡ１抗原ポリペプチドである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号６９１）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号６９２）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ（配列番号６９３）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（配列番号６９４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＲＡＥＡＱＶＫ（配列番号６９５）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ（配列番号６９６）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＰＩＦＩＲＬＬ（配列番号６９７）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。
【０３１０】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ３５０抗原ポリペプチドであり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＥＢＮＡ１抗原ポリペプチドであり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号６９１）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号６９２）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ（配列番号６９３）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（配列番号６９４）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＲＡＥＡＱＶＫ（配列番号６９５）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ（配列番号６９６）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＰＩＦＩＲＬＬ（配列番号６９７）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。
【０３１１】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ３５０抗原ポリペプチドである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＥＢＮＡ１抗原ポリペプチドである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペ��チドが、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号６９１）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号６９２）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ（配列番号６９３）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（配列番号６９４）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに��異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＬＲＡＥＡＱＶＫ（配列番号６９５）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ３ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ３一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ（配列番号６９６）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ１１ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ１１一本鎖融合体である。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＲＰＰＩＦＩＲＬＬ（配列番号６９７）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ７ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ７一本鎖融合体である。
【０３１２】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ３５０抗原ペプチド、例えば、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
【０３１３】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＥＢＮＡ１抗原ペプチド、例えば、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）、ＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１）、または表１に収載されているＥＢＶ抗原ポリペプチドのうちの１つであり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
【０３１４】
ＥＢＶ抗原を提示する、例えば、細胞表面に含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、感染性因子に関連する自己免疫疾患の処置に使用することができる。ある特定の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド上に提示され、例えば、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、組織適合性分子（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合される。一部の実施形態では、感染性因子に関連する自己免疫疾患は、下でより詳細に説明されるように多発性硬化症（ＭＳ）である。ＥＢＶ抗原を提示し、例えば、細胞表面に含み、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、本明細書に記載のａＡＰＣは、感染性因子に関連する自己免疫疾患の処置に使用することができる。一部の実施形態では、感染性因子に関連する自己免疫疾患は、下でより詳細に説明されるように多発性硬化症（ＭＳ）である。ＥＢＶ抗原を提示し、例えば、細胞表面に含み、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、本明細書に記載のａＡＰＣであって、共刺激ポリペプチドが４−１ＢＢＬである、ａＡＰＣは、感染性因子に関連する自己免疫疾患の処置に使用することができる。一部の実施形態では、感染性因子に関連する自己免疫疾患は、下でより詳細に説明されるように多発性硬化症（ＭＳ）である。
【０３１５】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
パピローマウイルスは、高度に種特異的である、小さいＤＮＡ腫瘍ウイルスである。これまでに、７０を超える個々のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型が記載されている。ＨＰＶは、一般に、皮膚に対して特異的である（例えば、ＨＰＶ−１および−２）か、または粘膜表面に対して特異的であり（例えば、ＨＰＶ−６および−１１）、数ヶ月または数年間持続する良性腫瘍（疣贅）を通常は引き起こす。一部のＨＰＶは、ＨＰＶ陽性頭頸部および子宮頸がんなどの、がんにも関連する。ＨＰＶとヒトがんとの最も強い明らかな関連性は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８と子宮頸癌の間に存在する関連性である。
【０３１６】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＨＰＶ抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ７抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ６抗原である。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＨＰＶ抗原であり、赤血球系細胞は、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ７抗原であり、赤血球系細胞は、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ヒトＨＰＶ抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０３１７】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＨＰＶ抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＨＰＶ−Ｅ７抗原である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＨＰＶ抗原であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＨＰＶ−Ｅ７抗原であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ヒトＨＰＶ抗原である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０３１８】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号７１４）、またはＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（配列番号７１２）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）である。
【０３１９】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号７１４）、またはＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（配列番号７１２）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）である。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。
【０３２０】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＨＰＶ−Ｅ７である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号７１４）、またはＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（配列番号７１２）である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）である。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
【０３２１】
赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＨＰＶ−Ｅ７であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。赤血球系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号７１４）、またはＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（配列番号７１２）であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）も、本開示により包含される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）である。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドまたは一本鎖融合体である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２一本鎖融合体である。
【０３２２】
１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２に融合されたＨＰＶ抗原である。一部の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ヒトＨＰＶ抗原である。１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２に融合されたＨＰＶ−Ｅ７である。１つの特定の実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドは、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）に融合された外来性抗原提示ポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２に融合されたＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（配列番号７１２）である。
【０３２３】
ＨＰＶ抗原を提示する、本明細書に記載のａＡＰＣは、発癌ウイルス（例えば、ＨＰＶ）に関連するがんの処置に使用することができる。ＨＰＶ抗原を提示し、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、本明細書に記載のａＡＰＣは、発癌ウイルス（例えば、ＨＰＶ）に関連するがんの処置に使用することができる。ＨＰＶ抗原を提示し、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、本明細書に記載のａＡＰＣであって、共刺激ポリペプチドが４−１ＢＢＬである、ａＡＰＣは、下でより詳細に説明されるように、発癌ウイルス（例えば、ＨＰＶ）に関連するがんの処置に使用することができる。実施形態では、ＨＰＶに関連するがんは、ＨＰＶ陽性頭頸部がんである。一部の実施形態では、ＨＰＶに関連するがんは、ＨＰＶ陽性子宮頸がんである。
【０３２４】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＣＤ３３である。
【０３２５】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＣＤ１２３である。
【０３２６】
一部の実施形態では、本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、ＣＤ３８である。
【０３２７】
上述の態様の様々な実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０３２８】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）からのものである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。ａＡＰＣは、本明細書で開示の外来性共刺激ポリペプチドをさらに含み得る。
【０３２９】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ３５０またはその免疫原性ペプチドである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。特定の実施形態では、ｇｐ３５０の免疫原性ペプチドは、ＨＬＡ  Ａ２ペプチド（ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８））を含むか、またはそれからなる。ａＡＰＣは、本明細書で開示の外来性共刺激ポリペプチドをさらに含むこともある。特定の実施形態では、外来性共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。
【０３３０】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、ＥＢＮＡ１またはその免疫原性ペプチドである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。特定の実施形態では、ＥＢＮＡ１の免疫原性ペプチドは、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）、およびＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１）から選択されるペプチドを含むか、またはそれからなる。ａＡＰＣは、本明細書で開示の外来性共刺激ポリペプチドをさらに含むこともある。特定の実施形態では、外来性共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。
【０３３１】
別の態様では、本開示は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を拡大するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）からのものである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。ａＡＰＣは、本明細書で開示の外来性共刺激ポリペプチドをさらに含むこともある。
【０３３２】
別の態様では、本開示は、自己反応性Ｔ細胞を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）からのものである、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を特徴とする。ａＡＰＣは、本明細書で開示の外来性共阻害ポリペプチドをさらに含むこともある。
【０３３３】
別の態様では、本開示は、赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含む、病原体特異的Ｔ細胞を活性化するように操作されたａＡＰＣであって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、表２１〜２４に収載されている病原体もしくは感染性因子からの抗原ポリペプチド、またはその免疫原性ペプチドである、ａＡＰＣを特徴とする。ａＡＰＣは、本明細書で開示の外来性共刺激ポリペプチドをさらに含むこともある。
【０３３４】
別の態様では、本開示は、赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含む、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）特異的Ｔ細胞を活性化するように操作されたａＡＰＣであって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体であり、外来性抗原ポリペプチドが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からのものである、ａＡＰＣを特徴とする。ａＡＰＣは、本明細書で開示の外来性共刺激ポリペプチドを、例えば細胞表面に、さらに含むこともある。実施形態では、少なくとも１つの共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、およびこれらの任意の組合せ、例えば、ＩＬ−１２とＩＬ−１５、または４−１ＢＢＬとＩＬ−１５からなる群から選択される。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、追加の外来性ポリペプチドをさらに含み、追加の外来性ポリペプチドは、チェックポイント阻害剤を、例えば細胞表面に、含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１に対する抗体分子である。特定の実施形態では、ａＡＰＣは、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを、例えば細胞表面に、含み、１つまたは複数の外来性ポリペプチドは、ＨＢＶ特異的抗原を含む外来性抗原ポリペプチドまたはその免疫原性ペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合体と、外来性共刺激ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２または４−１ＢＢＬと、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ１に対する抗体とを含む。
【０３３５】
外来性抗原提示ポリペプチド
本開示の外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ遺伝子ファミリーのポリペプチドを含み、ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩという３つのサブグループに分けられる。
【０３３６】
ＭＨＣクラスＩ分子は、α鎖およびβ２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）鎖という２本のポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体である。クラスＩ  α鎖は、α１、α２およびα３と名付けられた３つの細胞外ドメインと、原形質膜内にそれを固定する膜貫通領域と、短い細胞質内テールとで構成されている、単一のポリペプチドからなる。ｂ２ｍは、α鎖に非共有結合で結合された単一の分子からなる。α鎖のみが多型性であり、ＨＬＡ遺伝子によりコードされ、その一方で、ｂ２ｍサブユニットは、多型性でなく、ベータ−２ミクログロブリン遺伝子によりコードされる。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、β２サブユニットを有するため専らＣＤ８共受容体によって認識され得る。
【０３３７】
本開示の一部の実施形態では、ａＡＰＣに含まれている外来性抗原提示ポリペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣ分子であり、シグナル配列を含む。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣ分子であり、シグナル配列を含まない。
【０３３８】
ＭＨＣクラスＩＩ分子もまた、αおよびβポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体である。例えばα１、α２、ならびにβ１およびβ２のような、鎖についての副次的な名称は、ＨＬＡ遺伝子およびβ遺伝子内の別々のドメイン（またはサブユニット）を指す。ＣＤ４は、β２領域に結合する。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子であり、シグナル配列を含む。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子であり、シグナル配列を含まない。
【０３３９】
本開示の外来性抗原提示ポリペプチドは、細胞表面複合体または細胞表面分子、例えばＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩのサブユニットを含むことができ、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ機能は、外来性抗原ポリペプチドを結合することである。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩＩのサブユニットであり、機能は、外来性抗原ポリペプチドを結合することである。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩのサブユニットであり、機能は、外来性抗原ポリペプチドを結合することである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、リーダー（シグナル）配列を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、リーダー（シグナル）配列を含まない。一部の実施形態では、リーダー配列は、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、そのリーダー（シグナル）配列を欠いているＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩポリペプチド）に融合されている。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、リーダー配列を含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、リーダー配列を含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。
【表２】
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【０３４０】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、機能的ＭＨＣ  Ｉであり、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ（アルファ鎖１〜３）およびベータ−２ミクログロブリン、またはそれらの断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、機能的ＭＨＣ  ＩＩであり、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩアルファ鎖（アルファ鎖１および２）およびＭＨＣ  ＩＩベータ鎖（ベータ鎖１および２）、またはそれらの断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ヒトＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ、例えば、ＭＨＣ  ＩＩアルファサブユニットおよびＭＨＣ  ＩＩベータサブユニットまたは両方のサブユニットを含む融合分子、またはそれらの抗原提示断片を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ  α鎖は、β鎖に共有結合されている（例えば、β鎖との融合タンパク質の状態である）か、または非共有結合で結合されている。
【０３４１】
本明細書に記載される抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ）を有する本明細書に記載の赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）または除核細胞を含むａＡＰＣは、一部の実施形態では、免疫誘導および／または抗原提示に使用される。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ＭＨＣ分子と抗原との融合体、例えば、ＭＨＣ  ＩまたはＭＨＣ  ＩＩポリペプチドと外来性抗原ポリペプチドとを含む一本鎖ペプチド−ＭＨＣ構築物である、単一のタンパク質を含む。他の実施形態では、複合体の非膜繋留成分、例えば、ペプチド、またはβ２ミクログロブリンは、表面への輸送前に細胞内に別の作用物質によって集められるか、細胞により分泌され、次いで、その表面に多量体の膜繋留成分により捕捉されるか、または精製形態でａＡＰＣに付加される。
【０３４２】
一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩ  α鎖とＭＨＣ  Ｉ  ｂ２ｍ鎖の両方を含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖のみを含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ  ｂ２ｍ鎖のみを含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩ  α鎖とＭＨＣ  Ｉ  ｂ２ｍ鎖の両方を含み、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖およびＭＨＣ  Ｉ  ｂ２ｍ鎖は、非共有結合で連結されている。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩ  α鎖とＭＨＣ  Ｉ  ｂ２ｍ鎖の両方を含み、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖およびＭＨＣ  Ｉ  ｂ２ｍ鎖は、共有結合で連結されているか、または融合されている。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、外来性抗原ポリペプチドがＭＨＣＩ  α鎖に連結されている、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合体を含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、外来性抗原ポリペプチドがＭＨＣ  Ｉ  ｂ２ｍ鎖に連結されている、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合体を含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＨＣＩ  αサブユニットに連結されているＭＨＣＩ  β２ｍサブユニットに連結されている、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合体を含む。
【０３４３】
一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖とＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の両方を含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖のみを含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩ  β鎖のみを含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖とＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の両方を含み、ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖およびＭＨＣ  ＩＩ  β鎖は、非共有結合で連結されている。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖とＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の両方を含み、ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖およびＭＨＣ  ＩＩ  β鎖は、共有結合で連結されているか、または融合されている。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、外来性抗原ポリペプチドがＭＨＣＩＩ  α鎖に連結されている、ＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合体を含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、外来性抗原ポリペプチドがＭＨＣ  ＩＩ  β鎖に連結されている、ＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合体を含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、外来性抗原ポリペプチドが、ＭＨＣＩＩ  α鎖に連結されているＭＨＣＩＩ  β鎖に連結されている、ＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合体を含む。
【０３４４】
一部の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合体またはＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合体は、アンカーを含む。一部の実施形態では、アンカーは、１型膜タンパク質である。一部の実施形態では、１型膜タンパク質アンカーは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）；グリコホリンＢ（ＧＰＢ）；ベイシジン（ＣＤ１４７としても公知）；ＣＤ４４；ＣＤ５８（ＬＦＡ３としても公知）；細胞間接着分子４（ＩＣＡＭ４）；基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ）；ＣＲ１；ＣＤ９９；赤芽球膜結合タンパク質（ＥＲＭＡＰ）；接合部接着分子Ａ（ＪＡＭ−Ａ）；ニューロプラスチン（ＮＰＴＮ）；ＡＭＩＧＯ２；およびＤＳ細胞接着分子様１（ＤＳＣＡＭＬ１）からなる群から選択される。一部の実施形態では、アンカーは、２型膜タンパク質である。一部の実施形態では、２型膜タンパク質アンカーは、小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、ＦａｓＬ膜貫通型；およびＫｅｌｌからなる群から選択される。一部の実施形態では、アンカーは、ＧＰＩ連結膜タンパク質である。一部の実施形態では、ＧＰＩ連結膜タンパク質アンカーは、ＣＤ５９；ＣＤ５５；およびセマフォリン７Ａ（ＳＥＭＡ７Ａ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、アンカーは、小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）である。一部の実施形態では、アンカーは、グリコホリンアンカー、特にグリコホリンＡ（ＧＰＡ）、またはその断片である。一部の実施形態では、アンカーは、表３に収載されているアミノ酸配列から選択される。
【表３−１】
2021506304.tif 000054
【表３−２】
2021506304.tif 000055
【０３４５】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体は、アンカー配列にリンカーを介して接続されている。一実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、表４に収載されているアミノ酸配列から選択される。
【表４】
2021506304.tif 000056
【０３４６】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣＩ分子上に負荷され、機能は、外来性抗原ポリペプチドを提示することである。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣＩＩ分子上に負荷され、機能は、外来性抗原ポリペプチドを提示することである。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド上に提示され、例えば、外来性抗原ポリペプチドは、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子に特異的に結合される。外来性抗原ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチドに共有結合されることもあり、または非共有結合で結合されることもある。一部の実施形態では、外来性抗原ペプチドは、遊離しており、外来性抗原ペプチドを、人工抗原提示細胞の細胞表面に存在する抗原提示ポリペプチドに特異的に結合させることができる。一部の実施形態では、カップリング試薬を使用して、外来性ポリペプチドを細胞表面に存在する抗原提示ポリペプチドに連結させることができる。一部の実施形態では、本明細書で詳細に説明されるようなクリックケミストリーを使用して、外来性ポリペプチドを細胞表面に存在する抗原提示ポリペプチドに連結させることができる。
【０３４７】
結合親和性を評定するためのおよび／または抗原ポリペプチドが特定のリガンド（例えば、ＭＨＣ分子）に特異的に結合するかどうかを決定するための複数のアッセイが、当技術分野において公知である。例えば、一部の実施形態では、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））を使用して、２つのポリペプチド間の複合体の結合定数を決定することができる。このアッセイでは、緩衝剤をチップ上に流しながら、時間に対する屈折率の変化をモニターすることにより、複合体の解離定数を決定することができる。あるポリペプチドの別のポリペプチドへの結合を測定するための他の好適なアッセイとしては、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの、イムノアッセイ；または蛍光、ＵＶ吸収、円偏光二色性もしくは核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用してタンパク質の分光学的もしくは光学的特性の変化をモニターすることによる結合の決定が挙げられる。他の例示的なアッセイとしては、ウエスタンブロット、分析超遠心分離法、および分光法が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Scatchard  et  al  (1949)  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.  51:660；Wilson  (2002)  Science  295:  2103；Woffi  et  al.  (1993)  Cancer  Res.  53:2560；米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号；および国際特許公開第ＷＯ２０１８／００５５５９号を参照されたい）。あるいは、抗原ポリペプチドの特定のリガンド（例えば、ＭＨＣ分子）への結合を、予測アルゴリズムを使用して決定することができる。例えば、ＭＨＣクラスＩＩおよびクラスＩＩエピトープを予測するための方法は、当技術分野において周知であり、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（例えば、Meister  et  al.  (1995)  Vaccine  13:  581-91を参照されたい）、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（De  Groot  et  al.  (1997)  AIDS  Res  Hum  Retroviruses  13:  529-31）、予測方法（Yu  et  al.  (2002)  Mol.  Med.  8:  137-48）、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ予測アルゴリズム（Schuler  et  al.  (2007)  Methods  Mol  Biol.  409:  75-93）、およびＲａｎｋｐｅｐ（Reche  et  al.  (2002)  Hum  Immunol.  63(9):  701-9）を含む。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを予測するためのさらなるアルゴリズムは、例えば、Kessler  and  Melief  (2007)  Leukemia  21(9):  1859-74に記載されている。
【０３４８】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、抗原に結合することおよびそれらを細胞表面に提示することができる、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１からなる群から選択される。
【０３４９】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体である。さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａである。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−Ａ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ一本鎖融合ポリペプチドは、膜アンカーを含む。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の膜アンカーから選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ一本鎖融合ポリペプチドは、リンカーを（例えば、抗原ペプチドとベータ鎖の間に、ベータ鎖とアルファ鎖の間に、またはアルファ鎖とアンカーの間に）含む。一部の実施形態では、リンカーは、表４に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ一本鎖融合ポリペプチドは、リーダー配列を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａリーダー配列は、膜アンカーに連結されている外来性抗原提示ポリペプチドに融合されている。
【０３５０】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体である。さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｂである。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｂポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−Ｂ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ一本鎖融合ポリペプチドは、膜アンカーを含む。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の膜アンカーから選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ一本鎖融合ポリペプチドは、リンカーを（例えば、抗原ペプチドとベータ鎖の間に、ベータ鎖とアルファ鎖の間に、またはアルファ鎖とアンカーの間に）含む。一部の実施形態では、リンカーは、表４に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ一本鎖融合ポリペプチドは、リーダー配列を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂリーダー配列は、膜アンカーに連結されている外来性抗原提示ポリペプチドに融合されている。
【０３５１】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体である。さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｃである。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｃポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｃポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−Ｃ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｃ一本鎖融合ポリペプチドは、膜アンカーを含む。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｃ一本鎖融合ポリペプチドは、リンカーを（例えば、抗原ペプチドとベータ鎖の間に、ベータ鎖とアルファ鎖の間に、またはアルファ鎖とアンカーの間に）含む。一部の実施形態では、リンカーは、表４に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｃ一本鎖融合ポリペプチドは、リーダー配列を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｃリーダー配列は、膜アンカーに連結されている外来性抗原提示ポリペプチドに融合されている。
【０３５２】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体である。さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲα、およびＨＬＡ−ＤＲβからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＰＡポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰＡポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＰＡ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＰＢポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰＢポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＰＢ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＭポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＭ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＯＡポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＯＡポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＯＡ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＯＢポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＯＢポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＯＢ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＱＡポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱＡポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＱＡ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＱＢポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱＢポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＱＢ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＡポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＡポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＲＡ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢポリペプチドが外来性抗原ポリペプチドに連結されている、ＨＬＡ−ＤＲＢ一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、一本鎖融合ポリペプチドは、膜アンカーを含む。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、一本鎖融合ポリペプチドは、リンカーを（例えば、抗原ペプチドとベータ鎖の間に、ベータ鎖とアルファ鎖の間に、またはアルファ鎖とアンカーの間に）含む。一部の実施形態では、リンカーは、表４に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、一本鎖融合ポリペプチドは、リーダー配列を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。
【０３５３】
ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子のタンパク質産物は、高多型性であることが公知であり、したがって、本開示は、ＭＨＣ多型も包含する。一部のヒトＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子についての２００を超える対立遺伝子がある。機能的単型性であるＤＲα遺伝子座を除いて、各遺伝子座は、多くの対立遺伝子を有し（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Janeway  CA  Jr,  Travers  P,  Walport  M,  et  al.  Immunobiology:  The  Immune  System  in  Health  and  Disease.  5th  edition.  New  York:  Garland  Science;  2001）、各対立遺伝子が集団内に比較的高頻度で存在する。
【０３５４】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａである。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、Ａ＊０１：０１、Ａ＊０２：０１、Ａ＊０３：０１、Ａ＊２４：０２、Ａ＊１１：０１、Ａ＊２９：０２、Ａ＊３２：０１、Ａ＊６８：０１、Ａ＊３１：０１、Ａ＊２５：０１、Ａ＊２６：０１、Ａ＊２３：０１、Ａ＊３０：０１からなる群から選択される、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を含む。
【０３５５】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｂである。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂポリペプチドは、Ｂ＊０８：０１、Ｂ＊０７：０２、Ｂ＊４４：０２、Ｂ＊１５：０１、Ｂ＊４０：０１、Ｂ＊４４：０３、Ｂ＊３５：０１、Ｂ＊５１：０１、Ｂ＊２７：０５、Ｂ＊５７：０１、Ｂ＊１８：０１、Ｂ＊１４：０２、Ｂ＊１３：０２、Ｂ＊５５：０１、Ｂ＊１４：０１、Ｂ＊４９：０１、Ｂ＊３７：０１、Ｂ＊３８：０１、Ｂ＊３９：０１、Ｂ＊３５：０３、Ｂ＊４０：０２からなる群から選択される、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を含む。
【０３５６】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｃである。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｃポリペプチドは、Ｃ＊０７：０１、Ｃ＊０７：０２、Ｃ＊０５：０１、Ｃ＊０６：０２、Ｃ＊０４：０１、Ｃ＊０３：０４、Ｃ＊０３：０３、Ｃ＊０２：０２、Ｃ＊１６：０１、Ｃ＊０８：０２、Ｃ＊１２：０３、Ｃ＊０１：０２、Ｃ＊１５：０２、Ｃ＊０７：０４、Ｃ＊１４：０２からなる群から選択される、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を含む。
【０３５７】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲα、およびＨＬＡ−ＤＲβからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＰαポリペプチドは、ＤＰＡ１＊０１：０３、ＤＰＡ１＊０２：０１、ＤＰＡ１＊０２：０７からなる群から選択される、ＨＬＡ−ＤＰα対立遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＰβポリペプチドは、ＤＰＢ１＊０４：０１、ＤＰＢ１＊０２：０１、ＤＰＢ１＊０４：０２、ＤＰＢ１＊０３：０１、ＤＰＢ１＊０１：０１、ＤＰＢ１＊１１：０１、ＤＰＢ１＊０５：０１、ＤＰＢ１＊１０：０１、ＤＰＢ１＊０６：０１、ＤＰＢ１＊１３：０１、ＤＰＢ１＊１４：０１およびＤＰＢ１＊１７：０１からなる群から選択される、ＨＬＡ−ＤＰβ対立遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＱαポリペプチドは、ＤＱＡ１＊０５：０１、ＤＱＡ１＊０３：０１、ＤＱＡ１＊０１：０２、ＤＱＡ１＊０２：０１、ＤＱＡ１＊０１：０１、ＤＱＡ１＊０１：０３およびＤＱＡ１＊０４：０１からなる群から選択される、ＨＬＡ−ＤＱα対立遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＱβポリペプチドは、ＤＱＢ１＊０３：０１、ＤＱＢ１＊０２：０１、ＤＱＢ１＊０６：０２、ＤＱＢ１＊０５：０１、ＤＱＢ１＊０２：０２、ＤＱＢ１＊０３：０２、ＤＱＢ１＊０６：０３、ＤＱＢ１＊０３：０３、ＤＱＢ１＊０６：０４、ＤＱＢ１＊０５：０３およびＤＱＢ１＊０４：０２からなる群から選択される、ＨＬＡ−ＤＱβ対立遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲβポリペプチドは、ＤＲＢ１＊０７：０１、ＤＲＢ１＊０３：０１、ＤＲＢ１＊１５：０１、ＤＲＢ１＊０４：０１、ＤＲＢ１＊０１：０１、ＤＲＢ１＊１３：０１、ＤＲＢ１＊１１：０１、ＤＲＢ１＊０４：０４、ＤＲＢ１＊１３：０２、ＤＲＢ１＊０８：０１、ＤＲＢ１＊１２：０１、ＤＲＢ１＊１１：０４、ＤＲＢ１＊０９：０１、ＤＲＢ１＊１４：０１、ＤＲＢ１＊０４：０７およびＤＲＢ１＊１４：０４からなる群から選択される、ＨＬＡ−ＤＲβ対立遺伝子を含む。
【０３５８】
一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、表５に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＨＬＡ対立遺伝子ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。他の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子ポリペプチドは、シグナルペプチドを含まない。したがって、一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、シグナルペプチドアミノ酸配列（表５の配列に下線を引いて示されている）を含まない、表５に示されている配列番号７４１〜８３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、シグナルペプチドアミノ酸配列（表５に下線を引いて示されている）を含む、表５に示されている配列番号７４１〜８３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【表５−１】
2021506304.tif 000057
【表５−２】
2021506304.tif 000058
【表５−３】
2021506304.tif 000059
【表５−４】
2021506304.tif 000060
【表５−５】
2021506304.tif 000061
【表５−６】
2021506304.tif 000062
【表５−７】
2021506304.tif 000063
【表５−８】
2021506304.tif 000064
【表５−９】
2021506304.tif 000065
【表５−１０】
2021506304.tif 000066
【表５−１１】
2021506304.tif 000067
【表５−１２】
2021506304.tif 000068
【表５−１３】
2021506304.tif 000069
【表５−１４】
2021506304.tif 000070
【表５−１５】
2021506304.tif 000071
【表５−１６】
2021506304.tif 000072
【表５−１７】
2021506304.tif 000073
【表５−１８】
2021506304.tif 000074
【表５−１９】
2021506304.tif 000075
【表５−２０】
2021506304.tif 000076
【０３５９】
さらなるＭＨＣ対立遺伝子アミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、例えば、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ワールドワイドウェブのｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／で入手可能；Robinson  et  al.  Nucl.  Acids  Res.  43:  D423-431  (2015)を参照されたい）で入手可能である。
【０３６０】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の外来性抗原提示ポリペプチドである。例示的な外来性抗原提示ポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ａ）天然に存在する形態のヒトポリペプチド；
ｂ）２０１７年１２月２２日にデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに掲載されている配列を有するヒトポリペプチド；
ｃ）最大１、２、３、４、５もしくは１０アミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｄ）最大１、２、３、４、５もしくは１０％のそのアミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｅ）ａ）もしくはｂ）の配列と実質的に異ならない配列を有するヒトポリペプチド；または
ｆ）ａ）もしくはｂ）の配列を有するヒトポリペプチドと生物活性、例えば、酵素活性（例えば、特異性または代謝回転）もしくは結合活性（例えば、抗原ペプチドに対する結合特異性または親和性）の点で実質的に異ならないｃ）、ｄ）もしくはｅ）の配列を有するヒトポリペプチド。ｆ）に記載の候補ペプチドを作製し、本明細書に記載されるのと同様の活性についてスクリーニングすることができ、候補ペプチドは、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞に発現された場合、本明細書の下では等価となる。
【０３６１】
実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片、例えば、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。ある実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片と追加のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドを含む。ある実施形態では、追加のアミノ酸配列は、異なるヒト外来性抗原提示ポリペプチドについての前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。
【０３６２】
本開示の一部の実施形態では、人工抗原提示細胞は、内在性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子）を含まない、赤血球系細胞または除核細胞を含む。一部の実施形態では、人工抗原提示細胞は、内在性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子）の発現を欠失させるおよび／または変更するように遺伝子改変されていない赤血球系先駆細胞から誘導された、赤血球系細胞または除核細胞を含む。
【０３６３】
外来性共刺激ポリペプチド
外来性共刺激ポリペプチドは、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ）上のポリペプチドであって、Ｔ細胞上のコグネイト共刺激分子（例えば、ＭＨＣ分子、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＣＤ２７２）ならびにＴｏｌｌリガンド受容体）に特異的に結合し、それによって、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する、ポリペプチドを含む。共刺激ポリペプチドは、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含する。そのような抗体は、好ましくは、Ｔ細胞上の共刺激分子に結合し、それに対してアゴニストとして作用する。
【０３６４】
一部の実施形態では、所望される応答は、例えば感染細胞の、細胞死である。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、複数のＴ細胞活性化経路を誘発して免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、とりわけ共刺激ポリペプチドを含む、ａＡＰＣは、Ｔ細胞増殖を促進する。実施形態では、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれより多く）の共刺激ポリペプチドは、下の表６の活性化ポリペプチド、またはそのＴ細胞活性化バリアント（例えば、断片）を含む。実施形態では、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つもしくは５つ、またはそれより多く）の共刺激ポリペプチドは、表６の標的受容体またはそのＴ細胞活性化バリアント（例えば、断片）に結合する、抗体分子（例えば、作動性抗体）を含む。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、Ｔ細胞を刺激するために、異なるＴ細胞活性化リガンド、例えば、表６の１つまたは複数の活性化ポリペプチドを、任意の組合せで含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌまたはそれらの断片もしくはバリアントを提示する、例えば、細胞表面に含む、赤血球系細胞（例えば、除核細胞）を含む。実施形態では、これらのタンパク質は、相補的活性化経路によってシグナルを伝達する。共刺激ポリペプチドは、内在性Ｔ細胞活性化リガンドから、または標的受容体に対する抗体分子に由来し得る。
【表６】
2021506304.tif 000077
【０３６５】
一部の実施形態では、４−１ＢＢＬを含むポリペプチドは、Ｎ末端切断型４−１ＢＢＬ（例えば、配列番号８５１）である。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬを含むポリペプチドは、完全長４−１ＢＢＬである。
【０３６６】
一部の実施形態では、１つまたは複数の共刺激ポリペプチドは、活性化サイトカイン、インターフェロン、もしくはＴＮＦファミリーメンバー、例えばＩＮＦα、ＩＬ２、ＩＬ６、またはこれらの任意の組合せを含む。本発明において有用である、活性化サイトカイン、インターフェロンおよびＴＮＦファミリーメンバーは、下でさらに論じられる。実施形態では、１つまたは複数の共刺激ポリペプチドは、１つまたは複数の活性化サイトカイン、インターフェロンまたはＴＮＦファミリーメンバーを含み、１つもしくは複数の活性化ポリペプチドもしくはリガンド（例えば、表６の）またはそのＴ細胞活性化バリアント（例えば、断片）、あるいは標的共刺激Ｔ細胞受容体（例えば、表６の）またはそのＴ細胞活性化バリアント（例えば、断片）に結合する１つまたは複数の抗体分子（例えば、作動性抗体）をさらに含む。
【０３６７】
Ｔ細胞拡大
ある特定の実施形態では、本開示は、公知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖を特異的に誘導するために使用することができるａＡＰＣを特徴とする。この方法は、拡大すべきＴ細胞と、Ｔ細胞により発現される共刺激分子と特異的に結合する外来性ポリペプチドを提示する（例えば、細胞表面に含む）ａＡＰＣとを接触させるステップを含む。したがって、Ｔ細胞と、数ある中でも特に、Ｔ細胞表面に発現されるコグネイト共刺激分子に特異的に結合する共刺激リガンドを含む、ａＡＰＣとを接触させるステップは、Ｔ細胞を刺激し、Ｔ細胞増殖を誘導し、その結果、多数の特異的Ｔ細胞を容易に産生することができる。ａＡＰＣは、特定の共刺激分子を発現するＴ細胞のみがａＡＰＣにより拡大されることから、Ｔ細胞を「特異的に」拡大する。したがって、細胞の一部または大部分が共刺激分子を発現しない、細胞の混合物中に、拡大すべきＴ細胞が存在する場合、目的のＴ細胞のみが、増殖して細胞数が拡大するように誘導されることになる。多種多様な細胞分離および精製技法、例えば、当技術分野において公知のものおよび／または本明細書の他の箇所に記載されるものを使用して、Ｔ細胞をさらに精製することができる。
【０３６８】
本明細書で提供される開示に基づいて、当業者には理解されるであろうが、ａＡＰＣを使用する拡大の前に目的のＴ細胞を同定する必要も単離する必要もない。これは、ａＡＰＣが、選択的であり、コグネイト共刺激分子を発現するＴ細胞のみを発現することになるからである。
【０３６９】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の外来性共刺激ポリペプチドである。例示的な共刺激ポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ａ）天然に存在する形態のヒトポリペプチド；
ｂ）２０１７年１２月２２日にデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに掲載されている配列を有するヒトポリペプチド；
ｃ）最大１、２、３、４、５もしくは１０アミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｄ）最大１、２、３、４、５もしくは１０％のそのアミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｅ）ａ）もしくはｂ）の配列と実質的に異ならない配列を有するヒトポリペプチド；または
ｆ）ａ）もしくはｂ）の配列を有するヒトポリペプチドと生物活性、例えば、酵素活性（例えば、特異性または代謝回転）もしくは結合活性（例えば、結合特異性または親和性）の点で実質的に異ならないｃ）、ｄ）もしくはｅ）の配列を有するヒトポリペプチド。ｆ）に記載の候補ペプチドを作製し、本明細書に記載されるのと同様の活性についてスクリーニングすることができ、候補ペプチドは、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞に発現された場合、本明細書の下では等価となる。
【０３７０】
実施形態では、外来性共刺激ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片、例えば、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。ある実施形態では、外来性共刺激ポリペプチドは、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片と追加のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドを含む。ある実施形態では、追加のアミノ酸配列は、異なるヒト共刺激ポリペプチドについての前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。
【０３７１】
実施形態では、ａＡＰＣ細胞は、組合せ（例えば、上の表６に記載されているような）で、例えば、ａＡＰＣ上に共発現される（または共提示される）リガンドもしくは抗体分子、または両方を使用して、複数のＴ細胞活性化経路を標的とする。
【０３７２】
一部の実施形態では、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１のリガンド、ＬＦＡ−１のリガンド、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドは、コグネイト共刺激リガンド受容体に対するアゴニスト抗体である。例えば、ある特定の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１−ＢＢ、ＬＩＧＨＴ受容体（ＨＶＥＭ）、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ４受容体（ＴＩＭ１）、ＳＬＡＭ受容体、ＣＤ４８受容体（ＣＤ２）、ＣＤ５８受容体（ＣＤ２）、ＣＤ  ８３受容体、ＣＤ１５５受容体（ＣＤ２２６）、ＣＤ１１２受容体（ＣＤ２２６）、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２）、ＩＬ−２１受容体、ＩＣＡＭ、およびこれらの組合せに対する、アゴニスト抗体である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ３８抗体およびこれらの組合せである。別の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの外来性共刺激ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む。一部の実施形態では、共刺激タンパク質は、互いに融合されており、例えば、ＩＬ−２に融合されたＩＬ−２１である。
【０３７３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の共刺激ポリペプチドは、膜アンカーを含むか、または膜アンカーに融合されている。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の共刺激ポリペプチドは、リーダー配列を含むか、またはリーダー配列に融合されている。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。
【０３７４】
外因性共阻害ポリペプチド
外来性共阻害ポリペプチドは、Ｔ細胞活性の阻害、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの誘導を含む、Ｔ細胞を抑制する任意のポリペプチドである。
【０３７５】
一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、Ｔ細胞上のコグネイト共阻害分子に特異的に結合する、抗原提示細胞上の阻害ポリペプチドリガンドである。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドリガンドは、表７に示されている阻害ポリペプチドである。
【０３７６】
一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、Ｔ細胞上の共阻害受容体に特異的に結合するアゴニスト（例えば、抗体）である。一部の実施形態では、アゴニストは、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、および２Ｂ４からなる群から選択される受容体に結合する抗体である。他の実施形態では、アゴニストは、表７に示されているＴ細胞上の標的受容体に結合する抗体である。
【表７】
2021506304.tif 000078
【０３７７】
一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、共刺激ポリペプチドのそのコグネイト共刺激受容体への結合を遮断する抗体である。様々な実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２８抗体の、その受容体への結合を遮断する、抗体である。
【０３７８】
他の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、ＩＬ−３５、ＩＬ−１０、またはＶＳＩＧ−３から選択される。
【０３７９】
一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、ＶＳＩＧ−３である。
【０３８０】
他の実施形態では、ａＡＰＣ細胞は、組合せ（例えば、上の表７に記載されているような）で、例えば、ａＡＰＣ上に共発現されるリガンドもしくは抗体分子または両方を使用して、複数のＴ細胞阻害経路を標的とする。
【０３８１】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の外来性共阻害ポリペプチドである。例示的な共阻害ポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ａ）天然に存在する形態のヒトポリペプチド；
ｂ）２０１７年１２月２２日にデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに掲載されている配列を有するヒトポリペプチド；
ｃ）最大１、２、３、４、５もしくは１０アミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｄ）最大１、２、３、４、５もしくは１０％のそのアミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｅ）ａ）もしくはｂ）の配列と実質的に異ならない配列を有するヒトポリペプチド；または
ｆ）ａ）もしくはｂ）の配列を有するヒトポリペプチドと生物活性、例えば、酵素活性（例えば、特異性または代謝回転）もしくは結合活性（例えば、結合特異性または親和性）の点で実質的に異ならないｃ）、ｄ）もしくはｅ）の配列を有するヒトポリペプチド。ｆ）に記載の候補ペプチドを作製し、本明細書に記載されるのと同様の活性についてスクリーニングすることができ、候補ペプチドは、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞に発現された場合、本明細書の下では等価となる。
【０３８２】
実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片、例えば、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。ある実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片と追加のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドを含む。ある実施形態では、追加のアミノ酸配列は、異なるヒト共阻害ポリペプチドについての前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。
【０３８３】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの外来性共阻害ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０３８４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の共阻害ポリペプチドは、膜アンカーを含むか、または膜アンカーに融合されている。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の共阻害ポリペプチドは、リーダー配列を含むか、またはリーダー配列に融合されている。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。
【０３８５】
Ｔ細胞活性化シグナル
Ｔ細胞増殖、活性化および拡大の効率的誘導のために、いくつかのシグナルをａＡＰＣからナイーブＴ細胞に伝達する必要がある。これらのシグナルは、シグナル１、シグナル２およびシグナル３と一般に称され、下で説明される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるａＡＰＣは、シグナル１を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチド、シグナル２を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチド、および／またはシグナル３を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチドを、下記の任意の組合せで含む。一部の実施形態では、シグナル１、シグナル２およびシグナル３に加えて、本明細書に記載のａＡＰＣは、Ｔ細胞とａＡＰＣとの相互作用をさらに助長するために１つまたは複数の細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドをさらに含む。ａＡＰＣが、シグナル１を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチド、および／またはシグナル２を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチド、および／またはシグナル３を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチド（および必要に応じて、細胞接着分子を含む１つまたは複数のポリペプチド）を含む場合、シグナル１および／またはシグナル２および／またはシグナル３および／または細胞接着分子を含む、外来性ポリペプチドがすべて同じａＡＰＣ上に含まれることを、理解されたい。
【０３８６】
本明細書に記載されるａＡＰＣは、硬質のビーズに基づくａＡＰＣなどの、球状ナノ粒子の使用に勝る非常に多くの利点を提供する。例えば、本明細書に記載のａＡＰＣ（すなわち、操作された赤血球系細胞または除核細胞）の膜は、硬質かつ不動であり、したがって、その表面でのポリペプチドの移動を制限する、ナノ粒子の外面と比べて、はるかに動的かつ流動性である。このａＡＰＣ膜の流動性は、より大きい分子移動度およびより効率的な分子再構成を可能にし、免疫学的シナプス形成およびＴ細胞刺激に有利である。一部の実施形態では、シグナル１を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチド、シグナル２を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチド、および／またはシグナル３を含む１つもしくは複数の外来性ポリペプチドを下記の任意の組合せで細胞の表面に含む、本明細書に記載されるａＡＰＣは、Ｔ細胞のより制御された刺激をもたらし、それによって、特異的表現型および活性を有するＴ細胞の増殖を可能にする。一部の実施形態では、シグナル１および／またはシグナル２および／またはシグナル３を細胞の表面に含むようにａＡＰＣを操作することにより、ａＡＰＣは、Ｔ細胞に与えられるシグナルを最適に制御する。
【０３８７】
シグナル１−抗原認識
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、本明細書に記載のａＡＰＣのＭＨＣ複合体上に提示された特異的ペプチド抗原を認識した後に起こる。一般に、ＭＨＣクラスＩＩ上に提示される外来性抗原ポリペプチドは、ＣＤ４  Ｔ細胞共受容体とともにＴＣＲによって認識される。ＭＨＣクラスＩ上に提示される外来性抗原ポリペプチドは、ＣＤ８  Ｔ細胞共受容体とともにＴＣＲによって認識される。ペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲのライゲーションは、Ｔ細胞の活性化に必要なシグナルの伝達をもたらす。
【０３８８】
一部の実施形態では、シグナル１は、抗原提示ポリペプチドを含む、もう１つのより外来性のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、シグナル１は、抗原ペプチドに特異的に結合（例えば、共有結合でまたは非共有結合で）されている（を提示する）抗原提示ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド、またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、およびＨＬＡ  Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される。
【０３８９】
シグナル２−共刺激
完全に活性化されるために、Ｔ細胞は、ＴＣＲ媒介抗原認識に加えて第２のシグナルを必要とする。この第２のシグナル、すなわち共刺激は、適正なＴ細胞活性化に重要である。一部の実施形態では、シグナル２は、１つまたは複数の外来性共刺激ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の外来性共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３抗体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、シグナル２は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、およびＣＤ３０Ｌからなる群から選択される、１つまたは複数の外来性共刺激ポリペプチドを含む。
【０３９０】
シグナル３−サイトカイン
Ｔ細胞のより効率的な拡大および特異的分化を誘導するために、第３のシグナル（シグナル３）を使用することができる。一部の実施形態では、シグナル３は、１つまたは複数のサイトカインを含む、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、シグナル３は、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ４；ＩＬ６、ＩＬ２３、ＩＬ２７、ＩＬ１７、ＩＬ１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、およびＩＬ−２５からなる群から選択される、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む。
【０３９１】
免疫刺激性サイトカインに加えて、免疫抑制性サイトカインは、免疫応答を減弱させることができ、または寛容をもたらすことができる。したがって、一部の実施形態では、シグナル３は、１つまたは複数の外来性共阻害ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の外来性共阻害ポリペプチドは、ＩＬ−３５、ＩＬ−１０、ＶＳＩＧ−３およびＬＡＧ３アゴニストからなる群から選択される。
【０３９２】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドを細胞表面に含む。
【０３９３】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル２を含む１つより多くの外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル２を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル３を含む１つより多くの外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル３を含む１つより多くの外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル２を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル２を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル３を含む１つより多くの外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。
【０３９４】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドとを含み、シグナル１およびシグナル２は、以下の組合せから選択される：ＭＨＣクラスＩおよび４−１ＢＢＬ；ＭＨＣクラスＩＩおよび４−１ＢＢＬ；ＭＨＣクラスＩおよびＣＤ８０；ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８０；ＭＨＣクラスＩおよびＣＤ８６；ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８６；ＭＨＣクラスＩおよびＣＤ８３；ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８３；ＭＨＣクラスＩおよびＣＤ７０；ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ７０；ＭＨＣクラスＩおよびＬＩＧＨＴ；ＭＨＣクラスＩＩおよびＬＩＧＨＴ；ＭＨＣクラスＩおよびＨＶＥＭ；ＭＨＣクラスＩＩおよびＨＶＥＭ；ＭＨＣクラスＩおよびＣＤ４０Ｌ；ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ４０Ｌ；ＭＨＣクラスＩおよびＯＸ４０Ｌ；ＭＨＣクラスＩＩおよびＯＸ４０Ｌ；ＭＨＣクラスＩおよびＴＬ１Ａ；ＭＨＣクラスＩＩおよびＴＬ１Ａ；ＭＨＣクラスＩおよびＧＩＴＲＬ；ＭＨＣクラスＩＩおよびＧＩＴＲＬ；ＭＨＣクラスＩおよびＣＤ３０Ｌ；またはＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ３０Ｌ。
【０３９５】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドとを含み、シグナル１、シグナル２およびシグナル３は、以下の組合せから選択される：
【０３９６】
ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ２；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１５；ＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１５；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ７；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１２；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１８；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ２１；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ２１；
ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ４；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ６；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ２３；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ２７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ２７；
ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１７；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ１０；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＴＧＦ−ベータ；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＦＮ−ガンマ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＦＮ−ガンマ；
ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ−１ベータ；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＧＭ−ＣＳＦ；ＭＨＣクラスＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ７０、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＩＧＨＴ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＶＥＭ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＬ１Ａ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＩＴＲＬ、およびＩＬ−２５；ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ−２５；またはＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３０ＬおよびＩＬ−２５。
【０３９７】
シグナル１、シグナル２および／またはシグナル３の上述の組合せのいずれについても、ＭＨＣクラスＩ分子が、本明細書に記載されるいずれのＭＨＣクラスＩ抗原提示ポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合ポリペプチドであってもよいことは、理解されるであろう。同様に、シグナル１、シグナル２および／またはシグナル３の上述の組合せのいずれについても、ＭＨＣクラスＩＩ分子が、本明細書に記載されるいずれのＭＨＣクラスＩＩ抗原提示ポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合ポリペプチドであってもよいことは、理解されるであろう。
【０３９８】
細胞接着分子
一部の実施形態では、シグナル１、シグナル２および／またはシグナル３に加えて、本明細書に記載されるａＡＰＣは、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドを細胞表面にさらに含む。細胞接着分子は、Ｔ細胞とａＡＰＣとの相互作用をさらに助長する。一部の実施形態では、細胞接着分子は、免疫学的シナプスの形成を媒介または助長する。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞接着分子は、ＩＣＡＭ４／ＬＷ、ＣＤ３６、ＣＤ５８／ＬＦＡ３、ＣＤ４７、ＶＬＡ４、ＢＣＡＭ／Ｌｕ、ＣＤ４４、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＩＣＡＭ１、ＪＡＭ１およびＣＤ１４７、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０３９９】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。
【０４００】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。
【０４０１】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル２を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル２を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。
【０４０２】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル１を含む外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル３を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。
【０４０３】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル２を含む外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル３を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。
【０４０４】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多く外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル２を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、シグナル３を含む外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。
【０４０５】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つより多くのシグナル１を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル２を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、１つより多くのシグナル３を含む１つより多くの外来性ポリペプチドと、細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドとを、細胞表面に含む。
【０４０６】
一部の実施形態では、シグナル１を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチド、シグナル２を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチド、シグナル３を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチド、および細胞接着分子を含む１つまたは複数の外来性ポリペプチドは、表８に示されている外来性ポリペプチドから選択される。
【表８−１】
2021506304.tif 000079
【表８−２】
2021506304.tif 000080
【０４０７】
ａＡＰＣが、シグナル１を含むポリペプチドとシグナル２を含むポリペプチドとを含む、実施形態では、ポリペプチドは、例えば図１７Ａに示されているような、異なる構成で、ａＡＰＣの表面に存在し得る。一部の実施形態では、シグナル１を含むポリペプチド、およびシグナル２を含むポリペプチドは、独立した別個のポリペプチド（例えば、アンカーを含む各ポリペプチド）として存在し、例えば、赤血球系先駆細胞に逐次的に形質導入または共形質導入するために使用される２つの別個のレンチウイルスベクター（２つのレンチ−ベクター）上に存在する核酸によってコードされる。
【０４０８】
一部の実施形態では、シグナル１を含むポリペプチド、およびシグナル２を含むポリペプチドは、各ポリペプチドがアンカーを含む融合ポリペプチド、例えば、リンカー配列により接続または繋留されている融合ポリペプチドとして存在する（融合体としてのシグナル１＋２）。これらの実施形態では、融合ポリペプチドは、赤血球系先駆細胞に形質導入するために使用される単一のレンチウイルスベクターによってコードされる。
【０４０９】
一部の実施形態では、シグナル１を含むポリペプチド、およびシグナル２を含むポリペプチドは、細胞の表面に存在し（例えば、アンカーを含む各ポリペプチド）、ポリペプチドは、ウイルス由来の２Ａエレメントにより隔てられている。Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａを含む、複数の２Ａエレメントが、当技術分野において公知であり、それらを、本明細書に記載されるように使用することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Liu    et  al.  (2017)  Sci.  Rep.  7(1):  2193を参照されたい）。一部の実施形態では、シグナル１を含むポリペプチド、およびシグナル２を含むポリペプチドは、Ｔ２Ａ（スキップＴ２Ａタグ）により隔てられている。これらの実施形態では、ポリペプチドは、赤血球系先駆細胞に形質導入するために使用される単一のレンチウイルスベクターによってコードされる。
【０４１０】
ａＡＰＣが、シグナル１を含むポリペプチドと、シグナル２を含むポリペプチドと、シグナル３を含むポリペプチドとを含む、実施形態では、ポリペプチドは、例えば図１７に示されているような、異なる構成で、ａＡＰＣの表面に存在し得る。一部の実施形態では、シグナル１を含むポリペプチド、およびシグナル２を含むポリペプチドは、例えばリンカーにより接続されている、融合ポリペプチドとして存在し、シグナル３を含むポリペプチドは、別個のポリペプチドである（選択肢１）。一部の実施形態では、シグナル１を含むポリペプチド、およびシグナル３を含むポリペプチドは、例えばリンカーにより接続されている、融合ポリペプチドとして存在し、シグナル２を含むポリペプチドは、別個のポリペプチドである（選択肢２）。一部の実施形態では、シグナル２を含むポリペプチド、およびシグナル３を含むポリペプチドは、例えばリンカーにより接続されている、融合ポリペプチドとして存在し、シグナル１を含むポリペプチドは、別個のポリペプチドである（選択肢３）。これらの実施形態では、ａＡＰＣを調製する場合、融合ポリペプチド（シグナル１および２、シグナル２および３、またはシグナル１および３を含む）が１つのレンチウイルスベクターによりコードされ得ること、および別個のポリペプチド（シグナル１、シグナル２またはシグナル３）が第２のレンチウイルスベクターによりコードされ得ることは、理解されるであろう。
【０４１１】
一部の実施形態では、シグナル１とシグナル２の間、シグナル１とシグナル３の間、またはシグナル２とシグナル３の間のテザーまたはリンカーは、ポリＧｌｙＳｅｒリンカーである。一部の実施形態では、シグナル１とシグナル２の間、シグナル１とシグナル３の間、またはシグナル２とシグナル３の間のテザーまたはリンカーは、シュノーケルリンカーである。
【０４１２】
シグナル１とシグナル２とを含む例示的な融合構築物の例は、下の表９に提供される。
【表９−１】
2021506304.tif 000081
【表９−２】
2021506304.tif 000082
【表９−３】
2021506304.tif 000083
【表９−４】
2021506304.tif 000084
【表９−５】
2021506304.tif 000085
【表９−６】
2021506304.tif 000086
【表９−７】
2021506304.tif 000087
【表９−８】
2021506304.tif 000088
【表９−９】
2021506304.tif 000089
【表９−１０】
2021506304.tif 000090
【表９−１１】
2021506304.tif 000091
【０４１３】
別の態様では、本開示は、表９に収載されている融合タンパク質に対応するポリペプチド配列のいずれか１つを提供する。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８４３で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー配列（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８４４で示される、Ｂ２ＭＬ−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８４５で示される、Ｂ２ＭＬ−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ｃを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号７２６で示される、Ｂ２ＭＬ−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−グリコホリンＡ（ＧＰＡ）を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８４６で示される、Ｂ２ＭＬ−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８４７で示される、Ｂ２ＭＬ−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ｃ−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８４８で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−Ｔ２Ａ−ＧＰＡシグナルペプチド−Ｎ末端切断型４−１ＢＢＬ−リンカーｖ１７−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８４９で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−Ｔ２Ａを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８７３で示される、ＳＭＩＭ１−リンカー−ＩＬ１２ｐ４０−リンカー−ＩＬ１２ｐ３５を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５０で示される、ＧＰＡシグナルペプチド−４−１ＢＢＬ−リンカーｖ１７−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５４で示される、ＧＰＡシグナルペプチド−Ｎ末端切断型４−１ＢＢＬ−リンカー−ＧＰＡ−Ｔ２Ａ−ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５５で示される、ＧＰＡシグナルペプチド−Ｎ末端切断型４−１ＢＢＬ−リンカー−ＧＰＡ−Ｔ２Ａを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５６で示される、Ｔ２Ａ−ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５７で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−リンカー−完全長４−１ＢＢＬを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５９で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−シュノーケルリンカー−リンカー−Ｎ末端切断型４−１ＢＢＬを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８６０で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−リンカー−ＳＭＩＭ１−リンカー−ＩＬ１２ｐ４０−リンカー−ＩＬ１２ｐ３５を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８６３で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−シュノーケルリンカー−ＳＭＩＭ１−リンカー−ＩＬ１２ｐ４０−リンカー−ＩＬ１２ｐ３５を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８６４で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−シュノーケルリンカー−リンカー−ＩＬ１２ｐ４０−リンカー−ＩＬ１２ｐ３５を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８６５で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−Ｔ２Ａ−ＧＰＡシグナルペプチド−ＩＬ７−リンカーｖ１４−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８４９で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−Ｔ２Ａを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８６６で示される、ＧＰＡシグナルペプチド−ＩＬ７−リンカーｖ１４−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８６８で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−Ｔ２Ａ−ＧＰＡシグナルペプチド−ＩＬ１５−リンカー−ＩＬ１５Ｒａ−リンカーｖ１４−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８６９で示される、ＧＰＡシグナルペプチ���−ＩＬ１５−リンカー−ＩＬ１５Ｒａ−リンカーｖ１４−ＧＰＡを含む。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８７２で示される、ベータ２ミクログロブリンリーダー（Ｂ２ＭＬ）−ＨＰＶ１６  Ｅ７１１〜１９ペプチド−リンカー−ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）−リンカー−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｙ８４Ａ−リンカー−ＧＰＡ−Ｔ２Ａ−−ＳＭＩＭ１−リンカー−ＩＬ１２ｐ４０−リンカー−ＩＬ１２ｐ３５を含む。
【０４１４】
一部の実施形態では、本開示は、表９に記載のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、表９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８４３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８４５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号７２６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８４６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８４７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８４８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８４９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８５０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８５４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８５５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８５６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８５７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８５９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８６０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８６３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８６４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８６５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８４９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８６６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８６８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８６９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、融合ポリペプチドをコードし、融合ポリペプチドは、配列番号８７２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０４１５】
一部の実施形態では、４−１ＢＢＬを含むポリペプチドは、Ｎ末端切断型４−１ＢＢＬ（配列番号８５１）である。一部の実施形態では、４−１ＢＢＬを含むポリペプチドは、完全長４−１ＢＢＬである。
【０４１６】
第１の外来性ポリペプチドおよび第２の外来性ポリペプチドを含むａＡＰＣであって、第１の外来性ポリペプチドが、外来性抗原ペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチドと、膜アンカーポリペプチドとを含む、融合タンパク質を含み、第２の外来性ポリペプチドが、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチド、および外来性サイトカインポリペプチドからなる群から選択される、１つまたは複数のポリペプチドを含み、ａＡＰＣが、第１の外来性ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞（例えば、有核赤血球系先駆細胞）に導入するステップ；第２の外来性ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞（例えば、有核赤血球系先駆細胞）に導入するステップ；ならびに有核細胞（例えば、有核赤血球系先駆細胞）を、除核に、および第１の外来性ポリペプチドと第２の外来性ポリペプチドの両方の産生に好適な条件下で培養するステップを含むプロセスにより産生される、ａＡＰＣも、本開示により包含される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、表１または表１４〜２４に開示の抗原ポリペプチドから選択される。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、膜アンカーポリペプチドに融合された外来性抗原提示ポリペプチドに融合された外来性抗原ペプチドを含む、融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、黒色腫抗原遺伝子−Ａ（ＭＡＧＥ−Ａ）抗原、好中球顆粒プロテアーゼ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原、テロメラーゼ抗原、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）抗原、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原からなる群から選択される。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、リーダー配列をさらに含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）リーダー配列またはＧＰＡシグナルペプチドである。一部の実施形態では、膜アンカーは、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、もしくはその断片、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）である。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド、またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲα、およびＨＬＡ−ＤＲβからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合体は、α鎖およびβ２ｍ鎖、ならびに必要に応じてアンカーポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体は、アンカー、α鎖、および必要に応じてβ鎖を含む。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、外来性サイトカインポリペプチドは、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ２３、ＩＬ２７、ＩＬ１７、ＩＬ１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２５からなる群から選択される。一部の実施形態では、外来性共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、ＩＬ−３５、ＩＬ−１０、ＶＳＩＧ−３およびＬＡＧ３アゴニストからなる群から選択される。一部の実施形態では、外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドは、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦα、抗ＤＲ３アゴニスト（ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ特異的）、４−１ＢＢＬ、ＴＧＦβ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、接着分子を含む外来性ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、接着分子は、ＩＣＡＭ４／ＬＷ、ＣＤ３６、ＣＤ５８／ＬＦＡ３、ＣＤ４７、ＶＬＡ４、ＢＣＡＭ／Ｌｕ、ＣＤ４４、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＩＣＡＭ１、およびＣＤ１４７からなる群から選択される。一部の実施形態では、外来性核酸がＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項９０に記載のａＡＰＣ。一部の実施形態では、導入するステップは、ウイルス形質導入または電子穿孔を含む。一部の実施形態では、導入するステップは、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクション、およびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む。一部の実施形態では、導入するステップは、第１の外来性ポリペプチドをコードする第１の外来性核酸と第２の外来性ポリペプチドをコードする第２の外来性核酸とをレンチウイルスベクターでの形質導入により導入することを含み、第１の外来性核酸および第２の外来性核酸は、同じレンチウイルスベクターに含有される。一部の実施形態では、導入するステップは、第１の外来性ポリペプチドをコードする第１の外来性核酸を第１のレンチウイルスベクターでの形質導入により導入すること、および第２の外来性ポリペプチドをコードする第２の外来性核酸を第２のレンチウイルスベクターでの形質導入により導入することを含む。一部の実施形態では、第１および／または第２の外来性核酸は、ベータグロビンプロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーター、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）プロモーター、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター、ＣＡＧ  ＣＭＶ最初期エンハン��ーおよびニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ならびにヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。
【０４１７】
免疫学的シナプス
本明細書に記載されるように、本開示の操作された赤血球系細胞（すなわち、ａＡＰＣ）は、硬質のビーズに基づくａＡＰＣなどの球状ナノ粒子の使用に勝る非常に多くの利点を提供する。分子移動度（例えば、細胞膜中のリガンドの移動）および分子クラスター形成は、免疫学的シナプス形成の重要な特徴である。本明細書に記載されるａＡＰＣの膜は、ナノ粒子の外面よりはるかに動的かつ流動性であり、それ故、免疫学的シナプスの形成中の、またはトロゴサイトーシスを媒介する際の、よりいっそう効率的な分子再構成およびＭＨＣクラスター形成を可能にする。さらに、ナノ粒子の小さいサイズとは対照的に、本発明のａＡＰＣは、免疫学的シナプスにおける機能的なマイクロメートル規模のクラスターの形成のためにより大きい表面積を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣは、Ｔ細胞活性化を助長する免疫学的シナプスを形成するように操作される。
【０４１８】
免疫学的シナプス（または免疫シナプス、またはＩＳ）は、抗原提示細胞と、Ｔ／Ｂ細胞またはＮＫ細胞などのリンパ球との接合部である。免疫学的シナプスは、活性化クラスターと呼ばれる典型的なパターンを構成する、Ｔ細胞活性化に関与する分子からなり得る。最もよく研究されたモデルによれば、免疫シナプスは、分離されたタンパク質クラスターを各々が含有する同心環（中心、末梢または遠位領域）で構成されている、超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Monks  et  al.,  Nature    1998,  395  (6697):  82-86）としても公知である。免疫学的シナプスにおける分子は、抗原提示分子（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子）、接着分子、共刺激分子、および共阻害分子を含む。
【０４１９】
免疫学的シナプスは、Ｔ細胞受容体が集まってマイクロクラスターの状態になった後に形成される動的構造であり、マイクロクラスターは、最終的に免疫学的シナプス中心の方に移動する。Ｔリンパ球とＡＰＣの接合部でのこれらの分子の空間的変化および経時変化によって、免疫シナプスの構造およびＴリンパ球免疫応答が調節される。一般に、効率的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、機能的な免疫学的シナプスの形成に関連する（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Y.  Kaizuka,  et  al.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  104  (2007),  pp.  20296-20301）。
【０４２０】
一部の実施形態では、本開示は、ａＡＰＣとＴ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞との間に免疫学的シナプスを形成することができるａＡＰＣを特徴とする。一部の実施形態では、本発明のａＡＰＣには、免疫学的シナプス内に１つより多くのＭＨＣ分子を集合させる能力がある。
【０４２１】
免疫学的シナプスでの最初の相互作用は、Ｔ細胞の末梢ＳＭＡＣ中に存在するリンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）とＡＰＣ上のインテグリン接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２）との間で起こる。ＡＰＣに結合されると、Ｔ細胞は、次いで仮足を伸ばし、標的細胞の表面をスキャンして、特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を見つけることができる。この形成プロセスは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、抗原提示細胞上のペプチド−ＭＨＣ複合体に結合してマイクロクラスター／脂質ラフトの形成によりシグナル伝達活性化を開始すると、始まる（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Varma  et  al.,  Immunity.  2006  Jul;25(1):117-27）。
【０４２２】
本発明の操作された赤血球系細胞または除核細胞（すなわち、ａＡＰＣ）が、それらの表面に内在性ＩＣＡＭ１が非存在であるにもかかわらず、活性免疫学的シナプスを開始させることおよび形成することができるということは、本開示の驚くべき発見である。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、赤血球系細胞の表面に天然に存在する他のインテグリン、例えば、ＪＡＭ１および／またはＩＣＡＭ−４は、機能的な免疫学的シナプスの形成におけるＩＣＡＭ−１の役割を代替することができると考えられる。
【０４２３】
したがって、一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、免疫学的シナプスの形成を媒介または助長するための１つまたは複数の外来性細胞接着ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞接着分子は、ＩＣＡＭ４／ＬＷ、ＣＤ３６、ＣＤ５８／ＬＦＡ３、ＣＤ４７、ＶＬＡ４、ＢＣＡＭ／Ｌｕ、ＣＤ４４、ＣＤ９９／ＭＩＣ２、ＩＣＡＭ１、ＪＡＭ１およびＣＤ１４７、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０４２４】
本明細書に記載される操作された赤血球系細胞（すなわち、ａＡＰＣ）が、動的分子移動を生じさせ、ひいてはＴ細胞刺激に必要とされる効率的な分子再構成およびＭＨＣクラスター形成を可能にする、流動性細胞膜を有することは、本発明の利点である。免疫学的シナプスの末梢に連続的に形成され、中心に輸送されて中心のＳＭＡＣを形成する、ＴＣＲマイクロクラスターにおいて、シグナル伝達が開始され、持続される。中心のＳＭＡＣの形成中、マイクロクラスターは、互いに独立して移動することができ、継続的に移動しながら融合してより大きいクラスターを形成することができる。活性免疫シグナル伝達を持続するためには閾値ＭＨＣＩクラスター密度が必要である（Anikeeva  et  al.,  PLoS  One.  2012;7(8):e41466；Bullock  et  al.,  J  Immunol.  2000  Mar  1;164(5):2354-61；Bullock  et  al.,  J  Immunol.  2003  Feb  15;170(4):1822-9；Jiang  et  al.,  Immunity.  2011  Jan  28;34(1):13-23；これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供されるａＡＰＣは、機能的な免疫学的シナプスの形成および免疫シグナル伝達の活性化に有効である密度でのＭＨＣ分子のクラスター形成を媒介することができる。
【０４２５】
免疫シナプス形成における分子再構成のもう１つの帰結は、ＡＰＣ膜タンパク質のＴ細胞への細胞内移行である。Ｔ細胞は、トロゴサイトーシスと称される機序により、共刺激分子および膜パッチとともに、ＡＰＣからＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ糖タンパク質を獲得する。本明細書に記載されるように、本明細書で提供されるａＡＰＣの膜は、その流動性に起因して効率的な分子再構成およびＭＨＣクラスター形成を可能にする。一部の実施形態では、本発明のａＡＰＣは、トロゴサイトーシスが起こるような免疫シナプス形成の際の分子再構成を可能にするまたは媒介する。
【０４２６】
免疫学的シナプスのサイズは、全内部反射蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦＭ）（Varma  et  al.,  2006）などの、顕微鏡法を含む、当技術分野において公知の非常に多くの方法により決定することができる。免疫学的シナプスはマイクロメートル規模のＳＭＡＣで構成されていることが、研究により示されている（それら全体が参照により本明細書に組み込まれる、Varma  et  al.,  2006；Dustin  et  al.,  Science.  2002,  298(5594):785-9）。一部の実施形態では、本発明のａＡＰＣは、約０．５μｍ〜５．０μｍの間の平均直径の免疫学的シナプスを形成することができる。一部の実施形態では、本発明のａＡＰＣは、少なくとも約０．５μｍの平均直径の免疫学的シナプスを形成することができる。一部の実施形態では、本発明のａＡＰＣは、約０．５μｍ〜４．５μｍの間、約０．５μｍ〜４．０μｍの間、約０．５μｍ〜３．５μｍの間、約０．５μｍ〜３．０μｍの間、約０．５μｍ〜２．５μｍの間、約０．５μｍ〜２．０μｍの間、約０．５μｍ〜１．５μｍの間、約０．５μｍ〜１．０μｍの間、約１．０μｍ〜５．０μｍの間、約１．０μｍ〜４．５μｍの間、約１．０μｍ〜４．０μｍの間、約１．０μｍ〜３．５μｍの間、約１．０μｍ〜３．０μｍの間、約１．０μｍ〜２．５μｍの間、約１．０μｍ〜２．０μｍの間、約１．０μｍ〜１．５μｍの間、約１．５μｍ〜５．０μｍの間、約１．５μｍ〜４．５μｍの間、約１．５μｍ〜４．０μｍの間、約１．５μｍ〜３．５μｍの間、約１．５μｍ〜３．０μｍの間、約１．５μｍ〜２．５μｍの間、約１．５μｍ〜２．０μｍの間、約２．０μｍ〜５．０μｍの間、約２．０μｍ〜４．５μｍの間、約２．０μｍ〜４．０μｍの間、約２．０μｍ〜３．５μｍの間、約２．０μｍ〜３．０μｍの間、約２．０μｍ〜２．５μｍの間、約２．０μｍ〜５．０μｍの間、約２．５μｍ〜４．５μｍの間、約２．５μｍ〜４．０μｍの間、約２．５μｍ〜３．５μｍの間、約２．５μｍ〜３．０μｍの間、約３．０μｍ〜５．０μｍの間、約３．０μｍ〜４．５μｍの間、約３．０μｍ〜４．０μｍの間、約３．０μｍ〜３．５μｍの間、約３．５μｍ〜５．０μｍの間、約３．５μｍ〜４．５μｍの間、約３．５μｍ〜４．０μｍの間、約４．０μｍ〜５．０μｍの間、約４．０μｍ〜４．５μｍの間、約４．５μｍ〜５．０μｍの間の平均直径の機能的な免疫学的シナプスを形成することができる。一部の実施形態では、本発明のａＡＰＣは、少なくとも０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．５μｍ、２．０μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４．０μｍまたは５μｍの平均直径の機能的な免疫学的シナプスを形成することができる。
【０４２７】
本明細書に記載されるように、本開示のａＡＰＣの利点は、効率的分子再構成を可能にするａＡＰＣ細胞膜の流動性である。特異的なシグナル伝達経路は、その中心体を免疫学的シナプス部位に配向させることによりＴ細胞の極性化をもたらす。アクチンの蓄積および極性化は、インテグリンおよび低分子量ＧＴＰａｓｅとのＴＣＲ／ＣＤ３の相互作用により誘発される。これらの相互作用は、アクチン重合を促進し、アクチンが蓄積され、再構成されると、ＴＣＲおよびインテグリンのクラスター形成を促進する。これらの非常に動的な接触は、接合部を構築するばかりでなく、免疫細胞への情報伝達にも免疫細胞からの情報伝達にも影響を及ぼす相当な量の機械力も発揮する、連続的細胞骨格再構築事象によって特徴付けられる（それら全体が参照により本明細書に組み込まれる、Basu  et  al.,  Trends  Cell  Biol.  2017  Apr;  27(4):  241-254；Hivroz  et  al.,  Front  Immunol.  2016;  7:  46）。免疫学的シナプス部位でのＴＣＲとインテグリン間の引張強度に対する接着力を、例えば、原子間力顕微鏡法、生体膜力プローブ（ＢＦＰ）技法、牽引力顕微鏡法などにより、決定することができる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hivroz  et  al.,  Front  Immunol.  2016;  7:  46）。
【０４２８】
一部の実施形態では、引張強度は、Ｔ細胞受容体と、ａＡＰＣにより形成される免疫学的シナプスの分子、例えばペプチド−ＭＨＣ複合体との間の接着力の尺度である。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、免疫細胞を活性化するのに十分な引張強度を有する免疫学的シナプスを形成することができる。一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、約１ｐＮ〜３０，０００ｐＮの間の引張強度を有するシナプスを形成することができる。一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、約１ｐＮ〜２０，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜１０，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜９，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜８，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜７，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜６，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜５，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜４，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜３，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜２，０００ｐＮの間、約１ｐＮ〜１，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜３０，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜２０，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜１０，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜９，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜８，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜７，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜６，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜５，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜４，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜３，０００ｐＮの間、約１，０００ｐＮ〜２，０００ｐＮの間の引張強度を有するシナプスを形成することができる。一部の実施形態では、免疫学的シナプスにおけるペプチド−ＭＨＣ複合体とＴＣＲの間の最適な機械力は、少なくとも１ｐＮ、１．５ｐＮ、２．０ｐＮ、３．０ｐＮ、４．０ｐＮ、５．０ｐＮ、６．０ｐＮ、７．０ｐＮ、８．０ｐＮ、９．０ｐＮ、１０ｐＮ、２０ｐＮ、３０ｐＮ、４０ｐＮ、５０ｐＮ、６０ｐＮ、７０ｐＮ、８０ｐＮ、９０ｐＮ、１００ｐＮ、５００ｐＮ、１，０００ｐＮ、２，０００ｐＮ、３，０００ｐＮ、４，０００ｐＮ、５，０００ｐＮ、６，０００ｐＮ、７，０００ｐＮ、８，０００ｐＮ、９，０００ｐＮ、１０，０００ｐＮ、１１，０００ｐＮ、１２，０００ｐＮ、１３，０００ｐＮ、１４，０００ｐＮ、１５，０００ｐＮ、または２０，０００ｐＮである。一部の実施形態では、本明細書に記載のａＡＰＣは、免疫学的シナプスにおけるペプチド−ＭＨＣ複合体とＴＣＲとの間の機械力を誘発して、免疫細胞を活性化することができる。
【０４２９】
Ｔｒｅｇ共刺激および共阻害ポリペプチド
調節性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）は、免疫系の活性化を抑制し、それによって自己抗原に対する寛容を維持する、Ｔ細胞の特殊化された部分集団である。Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトおよび齧歯動物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の５〜１０％を構成する。Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトおよび齧歯動物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の５〜１０％を構成し、ＣＤ４およびＣＤ２５、ならびにそれらの発生および機能に関与する転写因子ＦｏｘＰ３（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）を、構成的に発現する。ＩＬ−２もまた、Ｔｒｅｇ細胞の発生および恒常性に重要な役割を果たすようである。なぜなら、ＩＬ−２またはその受容体の成分が欠乏している動物には、Ｔ細胞過剰増殖および自己免疫疾患が発生し、これらの発生をナイーブ動物からのＴｒｅｇ細胞の養子移入により修正することができるからである。同様に、ＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用によるシグナル伝達の欠如は、Ｔｒｅｇ細胞の数および機能性の低下に関連し、したがって、この受容体／リガンド系がＴｒｅｇ細胞の発生および機能に重要な役割を果たすことを示唆する。
【０４３０】
ある特定の実施形態では、本開示は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞を拡大する外来性ポリペプチドである、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドを特徴とする。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞発生に関与する３つのシグナルのうちの少なくとも１つを刺激することによりＴｒｅｇ細胞を拡大する。シグナル１にはＴＣＲが関与するので、シグナル１を抗ＣＤ３抗体などの抗体で刺激することができ、またはＴＣＲによってシグナル伝達する抗原で刺激することができる。シグナル２は、ＣＤ８０および４−１ＢＢＬなどの免疫共刺激分子を含む、いくつかの異なる分子により媒介され得る。シグナル３は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２またはＴＧＦβを介して伝達される。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、これらのシグナルのうちの１つを刺激する。別の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、これらのシグナルのうちの２つを刺激する。さらに別の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、これらのシグナルうちの３つを刺激する。
【０４３１】
シグナル１
シグナル１を刺激するためのＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドとして有用な抗原は、標的疾患または状態に関連する抗原を含む。例えば、自家抗原およびインスリン（１型糖尿病の処置に特に好適）、コラーゲン（関節リウマチの処置に特に好適）、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症の処置に特に好適）およびＭＨＣ（外来移植片拒絶反応の処置および予防用）。抗原をコンジュゲートの一部として投与することができる。必要に応じて、抗原は、ＭＨＣ／抗原複合体の一部として提供される。この実施形態では、ＭＨＣおよび抗原は、独立して、外来のものであることもあり、または同系のものであることもある。例えば、ドナーＭＨＣおよび同種異系または同系抗原を使用することができる。
【０４３２】
シグナル２
シグナル２を刺激するための例示的なＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドとしては、Ｂ７およびＴＮＦファミリーのメンバー、例えば、下の表１０に示されている、Ｂ７およびＣＤ２８ファミリーメンバー、ならびに表１１に示されているＴＮＦファミリーメンバーが挙げられる。
【表１０】
2021506304.tif 000092
【表１１】
2021506304.tif 000093
【０４３３】
シグナル３
シグナル３を刺激するための例示的なＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドとしては、シグナル３を刺激するサイトカインおよび増殖因子、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３を含む）が挙げられる。免疫治療方法に有用なＩＬ−２およびＩＬ−４部分は、当技術分野において公知である。例えば、Earle  et  al.,  2005、上掲；Thorton  et  al.,  2004,  J.  Immunol.  172:  6519-23；Thorton  et  al.,  2004,  Eur.  J.  Immunol.  34:  366-76を参照されたい。一実施形態に従って、サイトカインの成熟部分が使用される。
【０４３４】
一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２である。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦである。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、抗ＤＲ３アゴニスト（ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ特異的）である。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、ＴＧＦベータである。
【０４３５】
他の実施形態では、本開示は、Ｔｒｅｇ細胞を阻害する外来性ポリペプチドである、Ｔｒｅｇ共阻害ポリペプチドを特徴とする。ある特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ阻害は、例えば、Ｔｒｅｇ輸送に関与するケモカインを標的とすることによる、がんの処置に有用である。他のＴｒｅｇ阻害剤は、表１０または１１に収載されている受容体のいずれか、例えば、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲもしくは抗ＣＴＬＡ４、またはＴＬＲリガンドを標的とすることができる。
【０４３６】
一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドまたはその活性断片を、本発明による使用のために結合対メンバーと連結させることができ、またはそのような結合対メンバーとの融合タンパク質として発現させることができる。例示的な結合対は、ビオチンとストレプトアビジン（ＳＡ）またはアビジンである。
【０４３７】
一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドまたはその活性断片は、Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドとＣＳＡなどの結合対メンバーとを含む融合タンパク質の一部である。融合タンパク質は、当技術分野において公知のいくつかの異なる方法のいずれかにより作製することができる。例えば、融合タンパク質の成分ポリペプチドの１つまたは複数を化学合成することができ、または周知の組換え核酸技術を使用して生成することができる。（本明細書で使用される場合、「核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡを指す。）本発明において有用な核酸配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得ることができる。様々なＰＣＲ方法が、例えば、PCR  Primer:  A  Laboratory  Manual,  Dieffenbach  7  Dveksler,  Eds.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1995に記載されている。融合体は、本明細書において下でより詳細に論じられる。
【０４３８】
コンジュゲートは、結合対メンバーと共刺激部分の間にペプチドリンカーなどのリンカーを含むこともある。リンカー長および組成は、その部分のどちらかの機能的末端の活性を増強するように選択することができる。リンカーは、２０アミノ酸長より長くてもよい。一部の実施形態では、リンカーは、一般に約３〜約３０アミノ酸長、例えば、約５〜約２０アミノ酸長、約５〜約１５アミノ酸長、約ａ〜約１０アミノ酸長である。しかし、より長いまたはより短いリンカーを使用してもよく、またはリンカーを全面的になしで済ませてもよい。一本鎖抗体の重鎖と軽鎖を接続するために使用されてきたものなどの柔軟性リンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１））を、このことに関して使用することができる。例えば、Huston  et  al.,  1988,  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA,  85:  5879-5883；米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、同第４，９５６，７７８号；同第５，２５８，４９８号および同第５，４８２，８５８号を参照されたく、これらの参考文献の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。他のリンカーは、ＦＥＮＤＡＱＡＰＫＳ（配列番号７１７）またはＬＱＮＤＡＱＡＰＫＳ（配列番号７１８）である。免疫グロブリンＦｃ領域の１つまたは複数のドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）もリンカーとして使用することができる。
【０４３９】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドである。例示的なＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ａ）天然に存在する形態のヒトポリペプチド；
ｂ）２０１７年１２月２２日にデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに掲載されている配列を有するヒトポリペプチド；
ｃ）最大１、２、３、４、５もしくは１０アミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｄ）最大１、２、３、４、５もしくは１０％のそのアミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｅ）ａ）もしくはｂ）の配列と実質的に異ならない配列を有するヒトポリペプチド；または
ｆ）ａ）もしくはｂ）の配列を有するヒトポリペプチドと生物活性、例えば、酵素活性（例えば、特異性または代謝回転）もしくは結合活性（例えば、結合特異性または親和性）の点で実質的に異ならないｃ）、ｄ）もしくはｅ）の配列を有するヒトポリペプチド。ｆ）に記載の候補ペプチドを作製し、本明細書に記載されるのと同様の活性についてスクリーニングすることができ、候補ペプチドは、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞に発現された場合、本明細書の下では等価となる。
【０４４０】
実施形態では、外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片、例えば、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。ある実施形態では、外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドは、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片と追加のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドを含む。ある実施形態では、追加のアミノ酸配列は、異なるヒトＴｒｅｇ共刺激ポリペプチドについての前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。
【０４４１】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０４４２】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＴｒｅｇ共刺激または共阻害ポリペプチドは、膜アンカーを含むか、または膜アンカーに融合されている。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＴｒｅｇ共刺激または共阻害ポリペプチドは、リーダー配列を含むか、またはリーダー配列に融合されている。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。
【０４４３】
代謝物を変化させる外来性ポリペプチド
本発明の一部の実施形態では、代謝物を変化させる外来性ポリペプチドは、細胞の代謝物の異化または同化に関与する任意のポリペプチドを指し、代謝物を変化させるポリペプチドは、Ｔ細胞の代謝に影響を与えることができる。本明細書に記載の、例示的な、代謝物を枯渇させるポリペプチドは、細胞の局所環境における代謝物のレベルを変化させる。例えば、一部の実施形態では、代謝物を枯渇させるポリペプチドは、トリプトファンの酸化的代謝を促進する。
【０４４４】
例示的な、代謝物を変化させるポリペプチドとしては、ＣＤ３９；ＣＤ７３；アルギニンの枯渇に使用され得るアルギナーゼ（Ａｒｇ１）；トリプトファンの枯渇に使用され得るインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）；トリプトファンの枯渇に使用され得るトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ−２）阻害剤；５−ＨＴ合成を低減させ、トリプトファンの枯渇に使用され得る、トリプトファン５−ヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）阻害剤；プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の生成に使用され得る、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）およびプロスタグランジン（ＰＧＥ）シンターゼ（ＰＧＥＳ）；ならびにＮＯの生成に使用され得る誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）が挙げられる。
【０４４５】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載の、代謝物を変化させる外来性ポリペプチドである。例示的な、代謝物を変化させるポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ａ）天然に存在する形態のヒトポリペプチド；
ｂ）２０１７年１２月２２日にデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに掲載されている配列を有するヒトポリペプチド；
ｃ）最大１、２、３、４、５もしくは１０アミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｄ）最大１、２、３、４、５もしくは１０％のそのアミノ酸残基がａ）もしくはｂ）の配列と異なる配列を有するヒトポリペプチド；
ｅ）ａ）もしくはｂ）の配列と実質的に異ならない配列を有するヒトポリペプチド；または
ｆ）ａ）もしくはｂ）の配列を有するヒトポリペプチドと生物活性、例えば、酵素活性（例えば、特異性または代謝回転）もしくは結合活性（例えば、結合特異性または親和性）の点で実質的に異ならないｃ）、ｄ）もしくはｅ）の配列を有するヒトポリペプチド。ｆ）に記載の候補ペプチドを作製し、本明細書に記載されるのと同様の活性についてスクリーニングすることができ、候補ペプチドは、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞に発現された場合、本明細書の下では等価となる。
【０４４６】
実施形態では、代謝物を変化させる外来性ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片、例えば、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。ある実施形態では、代謝物を変化させる外来性ポリペプチドは、前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片と追加のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドを含む。ある実施形態では、追加のアミノ酸配列は、代謝物を変化させる異なるヒトポリペプチドについての前段落のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヒトポリペプチドのすべてまたは断片を含む。
【０４４７】
一部の実施形態では、１つまたは複数の代謝物を変化させる外来性ポリペプチドは、膜アンカーを含むか、または膜アンカーに融合されている。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の代謝物を変化させる外来性ポリペプチドは、リーダー配列を含むか、またはリーダー配列に融合されている。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。
【０４４８】
サイトカイン／ケモカイン
加えて、本開示は、少なくとも１つのサイトカイン、少なくとも１つのケモカイン、または両方をコードする核酸が形質導入されたａＡＰＣを包含する。したがって、本開示は、サイトカインの完全長、断片、ホモログ、バリアントまたは突然変異体を含む、サイトカインを包含する。サイトカインは、別の細胞の生物学的機能に影響を与えることができるタンパク質を含む。サイトカインによる影響を受ける生物学的機能としては、細胞成長、細胞分化または細胞死を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、本開示のサイトカインは、細胞の表面の特異的受容体に結合することができ、それによって、細胞の生物学的機能に影響を与えることができる。
【０４４９】
好ましいサイトカインとしては、数ある中でも特に、造血性増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子ファミリー分子および／またはケモカインが挙げられる。本開示のより好ましいサイトカインとしては、数ある中でも特に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−３５（ＩＬ−３５）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、およびＩＧＩＦが挙げられる。
【０４５０】
そのホモログ、バリアント、突然変異体または断片を含めて、ケモカインは、Ｃ５ａ、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１α）、単球走化性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１β）、単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単球化学誘引タンパク質３（ＭＣＰ−３）、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−［３Ｈ］フェニルアラニン（ＦＭＬＰＲ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４Ｒ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、リンホタクチン、ＩＰ１０、１−３０９、ＥＮＡ７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２および／またはＭＧＳＡ／ｇｒｏを含むがこれらに限定されない、アルファ−ケモカインまたはベータ−ケモカインを包含する。本明細書で提供される教示を身に着けてしまえば、本開示が、ケモカインおよびサイトカイン、例えば、当技術分野において周知であるものはもちろん、将来発見されるあらゆるものも包含することは、当業者には理解されるであろう。
【０４５１】
一部の実施形態では、ａＡＰＣ上のサイトカインは、シグナル３を刺激するためのポリペプチドとしての機能を果たす。一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣが、Ｔ細胞発生に関与する３つすべてのシグナルを刺激することによってＴ細胞を拡大および／または活性化することができることは、理解されるであろう。シグナル１には、ＴＣＲが関与するので、シグナル１をＴＣＲによってシグナル伝達する抗原で刺激することができる。シグナル２は、４−１ＢＢＬなどの本明細書に記載される任意の免疫共刺激分子を含む、いくつかの異なる分子により媒介され得る。シグナル３は、ＩＬ−１５などのサイトカインを介して伝達され得る。理論に縛られるものではないが、第１および第２の外来性ポリペプチド、例えば本明細書に記載の抗原および共刺激ポリペプチド、それぞれからのシグナル１および２に加えて、例えばａＡＰＣ上の第３の外来性ポリペプチドからの、シグナル３の存在は、ａＡＰＣのメモリーＴ細胞集団を追加免疫する能力およびそれによってより長い有効性、例えば、腫瘍の再燃または感染性因子の再チャレンジに対する有効性をもたらす能力を増加させると考えられる。一部の実施形態では、シグナル３を刺激するためのポリペプチドは、ＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、シグナル３を刺激する第３の外来性ポリペプチドを含む。一実施形態では、シグナル３を刺激する第３の外来性ポリペプチドは、ＩＬ１５である。
【０４５２】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば、除核細胞は、表１２からの１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、またはそれより多く）のサイトカイン受容体サブユニットまたはそれらのサイトカイン結合バリアントもしくは断片を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、表１２の単一の横列からの２つもしくは３つ（例えばすべて）のサイトカイン受容体サブユニットまたはそれらのサイトカイン結合バリアントもしくは機能的断片を含む。サイトカイン受容体は、赤血球系細胞の表面に存在し得る。発現された受容体は、通常は、その標的リガンドに結合することおよびその標的リガンドを捕捉することができる、野生型ヒト受容体配列またはそのバリアントもしくは断片を有する。実施形態では、２つまたはそれより多くのサイトカイン受容体サブユニットが、例えば融合タンパク質として、互いに連結されている。
【０４５３】
実施形態では、サイトカインの１つまたは複数（例えば、２つまたはすべて）は、例えば、サイトカインが赤血球系細胞の表面に存在するように、膜貫通ドメイン（例えば、ＧＰＡ膜貫通ドメイン、または本明細書に記載される他の膜貫通ドメイン）に融合されている。実施形態では、赤血球系細胞は、標的化部分、例えば、ＷＯ２００７０３０７０８に、例えば、その中の３４〜４５頁に、記載されているアドレス部分または標的化部分をさらに含み、前記出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４５４】
一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、膜アンカーを含むか、または膜アンカーに融合されている。一部の実施形態では、膜アンカーは、表３に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、リーダー配列を含むか、またはリーダー配列に融合されている。一部の実施形態では、リーダー配列は、表２に記載の配列から選択される。
【表１２−１】
2021506304.tif 000094
【表１２−２】
2021506304.tif 000095
【０４５５】
操作された赤血球系細胞
一部の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞または除核細胞を含み、赤血球系細胞または除核細胞が、表１に開示の外来性抗原ペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。したがって、本開示は、表１に示されているような、目的の抗原をコードする核酸を含むａＡＰＣを包含する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドは、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原である。一部の実施形態では、除核細胞は、例えば赤血球先駆細胞からの分化によってその核を喪失した、赤血球系細胞である。しかし、すべての除核細胞が赤血球系細胞であるとは限らないこと、したがって、本明細書に包含される除核細胞が例えば血小板も含み得ることは、理解されるであろう。一部の実施形態では、除核細胞は、血小板でなく、したがって、血小板を含まない除核された細胞である。本開示のある特定の態様では、赤血球系細胞は、網状赤血球または赤血球（赤血球（ＲＢＣ））である。赤血球は、非自己である（例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を実質的に欠いている）こと、対象内でより長い（例えば、３０日より長い）循環時間を有することおよび大量の産生に適していることを含む、他の細胞に勝るいくつかの利点を提供する。本開示のある特定の態様では、操作された赤血球系細胞は、核を有している。
【０４５６】
赤血球系細胞は、第２の異なる外来性ポリペプチドを、必要に応じてさらに含む。赤血球系細胞は、第２および第３の異なる外来性ポリペプチドを、必要に応じてさらに含む。赤血球系細胞は、第２、第３および第４の異なる外来性ポリペプチドを、必要に応じてさらに含む。赤血球系細胞は、第２、第３、第４および第５の異なる外来性ポリペプチドを、必要に応じてさらに含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの異なる外来性ポリペプチドを、必要に応じてさらに含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、１〜１００の間の、１〜２００の、異なる外来性ポリペプチドを、必要に応じてさらに含む。
【０４５７】
ある特定の実施形態では、抗原（例えば、外来性抗原ポリペプチド）を含む、赤血球系細胞（例えば、操作された赤血球系細胞）は、外来性抗原ポリペプチドが外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合される、外来性抗原提示ポリペプチド、例えばＭＨＣ（この場合、細胞にＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子をコードする核酸も形質導入される）との関連で、抗原をプロセシングし、提示することができ、それによって、抗原特異的Ｔ細胞を産生し、その集団を拡大することができる。したがって、目的の抗原を、本開示のａＡＰＣに導入することができ、次いで、ａＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ複合体との（例えば、抗原ポリペプチドがＭＨＣクラスＩまたはＩＩ複合体に特異的に結合される）関連で抗原を提示し、すなわち、ＭＨＣ分子に抗原が「負荷」され、ａＡＰＣを使用して抗原特異的Ｔ細胞を産生することができる。したがって、一部の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、操作された赤血球系細胞を含み、操作された赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【０４５８】
他の実施形態では、赤血球系細胞は、ＭＨＣによりプロセシングおよび提示されない１つまたは複数の抗原を含み、すなわち、本開示は、ＭＨＣ拘束性を有さないＴ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ３に対する抗体（一本鎖抗体を含む）を含むａＡＰＣを提供する。一部の実施形態では、ＣＤ３に対する抗体（一本鎖抗体を含む）は、ａＡＰＣ表面に発現される。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ４およびＣＤ８に対する抗体を含むａＡＰＣを提供する。他の実施形態では、ＣＤ４およびＣＤ８に対する抗体は、ａＡＰＣ表面に発現されて、それらのそれぞれの免疫細胞集団を活性化する。
【０４５９】
他の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、操作された赤血球系細胞を含み、操作された赤血球系細胞が、外来性抗原ポリペプチドおよび外来性共刺激ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【０４６０】
一部の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチドに特異的に結合され、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合体である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
【０４６１】
他の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化および拡大するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、操作された赤血球系細胞を含み、操作された赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、外来性共刺激ポリペプチドと、外来性Ｔ細胞拡大ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【０４６２】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと接触したＴ細胞を活性化することができる。
【０４６３】
別の実施形態では、刺激することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の細胞傷害活性の刺激、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の刺激、および／またはこれらの任意の組合せを含む。
【０４６４】
上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。
【０４６５】
別の例として、外来性ポリペプチドは、Ｔ細胞活性化リガンドと、がん免疫療法の場で免疫阻害分子（例えば、免疫阻害受容体）を阻害する作用物質、例えばＣＤ８０および抗ＰＤ１とを含む。別の実施形態では、１つの作用物質は、活性化４−１ＢＢＬ、またはその断片もしくはバリアントであり、第２の作用物質は、ＰＤ１シグナル伝達を遮断する抗体分子（例えば、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体分子）である。したがって、実施形態では、標的Ｔ細胞は、活性化されもし、抑制されないようにもされる。
【０４６６】
一部の実施形態では、目的は、Ｔ細胞を活性化することまたは阻害することである。Ｔ細胞が、本明細書に記載の活性化受容体または阻害受容体のどちらかを同じく発現し得る他の免疫細胞より優先的に標的とされることを確実にするために、赤血球系細胞上の外来性ポリペプチドのうちの１つは、標的化部分、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または別のＴ細胞マーカーに結合する抗体分子を含むこともある。標的化部分は、下文にてより詳細に説明される。一部の実施形態では、特異的Ｔ細胞サブタイプまたはクローンを増強または阻害することができる。一部の実施形態では、赤血球系細胞上の外来性ポリペプチドのうちの１つまたは複数は、抗原特異的様式でＴ細胞受容体に選択的に結合することになるペプチド−ＭＨＣ分子である。
【０４６７】
一部の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、表７に開示の少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【０４６８】
他の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、表１に開示の外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【０４６９】
一部の態様では、本開示は、Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの代謝物を変化させるポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【０４７０】
他の態様では、本開示は、エフェクターＴ細胞を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、操作された赤血球系細胞を含み、操作された赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原と、外来性増殖阻害剤と、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチドとを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。
【０４７１】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと接触したＴ細胞を抑制することができる。他の実施形態では、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を抑制することができる。さらなる実施形態では、抑制することは、Ｔ細胞の増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの誘導を含む。
【０４７２】
一部の態様では、本開示は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、ａＡＰＣが、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合される、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドをさらに提示する、例えば、細胞表面に含む。
【０４７３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される態様および実施形態のいずれか１つについてのＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０４７４】
一部の実施形態では、赤血球系細胞は、外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を含み、赤血球系細胞は、本明細書に記載される外来性ポリペプチドである第２の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を、必要に応じてさらに含む。
【０４７５】
上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。
【０４７６】
本開示はまた、本明細書に記載される外来性ポリペプチドの（またはそれらをコードするＤＮＡの）「突然変異体」、「誘導体」および「バリアント」であって、結果として生じるペプチド（またはＤＮＡ）が、本明細書に列挙される配列と同一でないが、ペプチドが本発明の共刺激リガンド、サイトカイン、抗原などの生物学的／生化学的特性（例えば、タンパク質を発現するａＡＰＣをＴ細胞と接触させることがＴ細胞の増殖を媒介する、またはＴ細胞に別様に影響を与える、ａＡＰＣによる発現）を有する点で、本明細書で開示されるペプチドと同じ生物学的特性を有するように、１つまたは複数のアミノ酸が変更されている（または、それらをコードするヌクレオチド配列に言及する場合は、１つもしくは複数の塩基対が変更されている）、共刺激リガンド、サイトカイン、抗原（例えば、腫瘍細胞、ウイルス、および他の抗原）である、突然変異体、誘導体およびバリアントを包含するように解釈されるべきものである。例えば、Sambrook  and  Russell  (2001,  Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Approach,  Cold  Spring  Harbor  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.)およびAusubel  et  al.  (2002,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  NY)に記載されているものなどの、当技術分野において周知である組換えＤＮＡ方法論を使用する、本発明のタンパク質の突然変異体、誘導体またはバリアント形態の生成のために、任意の数の手順を使用することができる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変更することによるタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸変化の導入のための手順は、当技術分野において周知であり、これらのおよび他の協定書にも記載されている。
【０４７７】
本開示は、表１〜２４に収載されているタンパク質の機能的断片またはそのバリアントを作製し、本明細書に記載されるのと同様の活性についてスクリーニングすることができること、および機能的断片またはそのバリアントが、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞に発現された場合、本明細書のもとでは等価となることを企図している。
【０４７８】
本明細書で提供される教示を身に着けてしまえば、本開示のａＡＰＣが、いかなる点でも、いかなる特定の抗原、サイトカイン、共刺激リガンド、共刺激分子に特異的に結合する抗体などにも、限定されないことは、当業者には理解されるであろう。もっと正確に言えば、本開示は、非常に多くの分子を含むａＡＰＣを、分子のすべてが、単一のプロモーター／調節配列の制御下で発現されるにせよ、または１つより多くのそのような配列の制御下で発現されるにせよ、包含する。さらに、本開示は、様々なａＡＰＣが異なる分子をコードする場合の本開示の１つまたは複数のａＡＰＣの投与を包含する。すなわち、様々な分子（例えば、共刺激リガンド、抗原、サイトカインなど）は、シスで（すなわち、同じａＡＰＣで、および／または同じａＡＰＣ内の同じ連続する核酸によりもしくは別個の核酸分子上にコードされた状態で）作用することもあり、またはトランスで作用することもある（すなわち、様々な分子は、異なるａＡＰＣにより発現される）。
【０４７９】
３つまたはそれより多くの外来性ポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞
実施形態では、本明細書に記載される操作された赤血球系細胞は、３つまたはそれより多くの、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、２００、５００または１０００の外来性ポリペプチドを含む。実施形態では、本明細書に記載される赤血球系細胞の集団は、３つまたはそれより多くの、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００または５０００の外来性ポリペプチドを含み、例えば、集団内の異なる赤血球系細胞は、異なる外来性ポリペプチドを含み、または集団内の異なる赤血球系細胞は、異なる複数の外来性ポリペプチドを含む。
【０４８０】
タイリング
一部の実施形態では、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドは、重複しているアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ａＡＰＣは、Ｔ細胞を活性化するように操作され、ａＡＰＣは、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドを提示し、例えば、細胞表面に含み、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドは、少なくとも２アミノ酸が重複しているアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、重複は、２アミノ酸〜２３アミノ酸の間であり、例えば、重複は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３アミノ酸である。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、長さ８〜１０アミノ酸の間であり、重複は、６〜８アミノ酸の間である。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、長さ１４〜２０アミノ酸の間であり、重複は、１２〜１８アミノ酸の間である。このようにポリペプチドをタイリングすることは、より広い抗原認識を生じさせる。上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。
【０４８１】
ポリペプチドをタイリングするための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に基づく増殖アッセイで試験された、１２アミノ酸が重複している、１５ｍｅｒポリペプチドの開発および試験を記載しているHarding  et  al.（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Molecular  Cancer  Therapeutics,  November  2005,    Volume  4,  Issue  11）に記載されている。Ｓｔｉｃｋｅｒらは、任意のタンパク質中の機能的ＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープを同定するための、ヒト細胞に基づく方法を記載している（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、J  Immunol  Methods.  2003  Oct  1;281(1-2):95-108）。
【０４８２】
修飾
外来性タンパク質のうちの１つまたは複数は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に特有の翻訳後修飾を有し得る。一部の実施形態では、外来性タンパク質のうちの１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）は、グリコシル化されているか、リン酸化されているか、またはグリコシル化もリン酸化もされている。糖タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出は、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）方法の改良版を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロットで果たすことができる。糖タンパク質の細胞局在化は、当技術分野において公知のレクチン蛍光コンジュゲートを利用して果たすことができる。リン酸化は、抗リン酸化抗体を使用してウエスタンブロットにより評定することができる。
【０４８３】
翻訳後修飾は、疎水性基へのコンジュゲーション（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、またはグリピエーション）、補因子へのコンジュゲーション（例えば、リポイル化、フラビン部分（例えば、ＦＭＮまたはＦＡＤ）、ヘムＣ結合、ホスホパンテテイニル化、またはレチニリデンシッフ塩基形成）、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール結合、ヒプシン形成、アシル化（例えば、Ｏ−アシル化、Ｎ−アシル化、またはＳ−アシル化）、ホルミル化、アセチル化、アルキル化（例えば、メチル化またはエチル化）、アミド化、ブチリル化、ガンマ−カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ヌクレオチド付加、例えばＡＤＰ−リボシル化、酸化、リン酸エステル（Ｏ連結）もしくはホスホロアミド酸エステル（Ｎ連結）形成、（例えば、リン酸化またはアデニリル化）、プロピオニル化、ピログルタミン酸エステル形成、Ｓ−グルタチオニル化、Ｓ−ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、またはアミノ酸の化学修飾（例えば、シトルリン化、脱アミド、エリミニレーション、またはカルバミル化）、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化（例えば、プロリン、セリン、アラニン、またはメチオニンの）も含む。実施形態では、グリコシル化は、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリシン、セリン、トレオニン、チロシンまたはトリプトファンへのグリコシル基の付加を含み、この付加の結果、糖タンパク質が得られる。実施形態では、グリコシル化は、例えば、Ｏ連結グリコシル化またはＮ連結グリコシル化を含む。
【０４８４】
一部の実施形態では、外来性ポリペプチドのうちの１つまたは複数は、融合タンパク質であり、例えば、内在性赤血球タンパク質またはその断片、例えば、膜貫通タンパク質、例えば、ＧＰＡまたはその膜貫通断片との融合体である。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドのうちの１つまたは複数は、二量体化または多量体化を促進するドメインと融合されており、例えば、二量体化ドメインを必要に応じて含む第２の融合外来性ポリペプチドと融合されている。一部の実施形態では、二量体化ドメインは、抗体分子の一部分、例えば、ＦｃドメインまたはＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、第１および第２の二量体化ドメインは、ヘテロ二量体化を促進するためにノブ−イン−ホール突然変異（例えば、Ｔ３６６ＹノブおよびＹ４０７Ｔホール）を含む。
【０４８５】
コピー数
一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドおよび第２の外来性ポリペプチドは、重量でまたはコピー数で約１：１、約２：１〜１：２、約５：１〜１：５、約１０：１〜１：１０、約２０：１〜１：２０、約５０：１〜１：５０、約１００：１〜１：１００の存在量比を有する。
【０４８６】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドおよび第２の外来性ポリペプチドの各々の少なくとも少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、５，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、または１００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドのコピー数は、第２の外来性ポリペプチドのコピー数より最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％多い、または最大２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００もしくは１０００倍多い。一部の実施形態では、第２の外来性ポリペプチドのコピー数は、第１の外来性ポリペプチドのコピー数より最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％多い、または最大２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００もしくは１０００倍多い。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０４８７】
一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、第１の外来性ポリペプチドの約５０，０００〜約６００，０００の間のコピー、例えば、第１のポリペプチドの約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの約５０，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜５００，０００の間、約１００，０００〜４００，０００の間、約１００，０００〜１５０，０００の間、約１５０，０００〜３００，０００の間、または１５０，０００〜２００，０００の間のコピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約７５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約１００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約１２５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約１５０，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約１７５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約２００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約２５０，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約３００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約４００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第１の外来性ポリペプチドの少なくとも約５００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、第２の外来性ポリペプチドは、第２の外来性ポリペプチドの約５０，０００〜約６００，０００の間のコピー、例えば、第２のポリペプチドの約５０，０００、６０，０００、６０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１５５，０００、１６０，０００、１６５，０００、１７０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、１９５，０００、２００，０００、２０５，０００、２１０，０００、２１５，０００、２２０，０００、２２５，０００、２３０，０００、２３５，０００、２４０，０００、２４５，０００、２５０，０００、２５５，０００、２６０，０００、２６５，０００、２７０，０００、２７５，０００、２８０，０００、２８５，０００、２９０，０００、２９５，０００、３００，０００、３０５，０００、３１０，０００、３１５，０００、３２０，０００、３２５，０００、３３０，０００、３３５，０００、３４０，０００、３４５，０００、３５０，０００、３５５，０００、３６０，０００、３６５，０００、３７０，０００、３７５，０００、３８０，０００、３８５，０００、３９０，０００、３９５，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの約５０，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜６００，０００の間、約１００，０００〜５００，０００の間、約１００，０００〜４００，０００の間、約１００，０００〜１５０，０００の間、約１５０，０００〜３００，０００の間、または１５０，０００〜２００，０００の間のコピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約７５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約１００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約１２５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約１５０，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約１７５，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約２００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約２５０，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約３００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約４００，０００コピーを含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、第２の外来性ポリペプチドの少なくとも約５００，０００コピーを含む。
【０４８８】
上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。上記態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０４８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期
一部の実施形態では、本明細書に記載される外来性ポリペプチドは、操作された赤血球系細胞または除核細胞の中または上に含まれ、対象に投与される場合、単独で投与される（すなわち、本明細書に記載される細胞上にも細胞内にもない）対応する外来性ポリペプチドと比較して延長されたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示す。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、単独で投与される対応する外来性ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期より長い、または単独で投与される外来性ポリペプチドの対応するＰＥＧ化パージョンのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期より長い、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、約２４時間〜２４０日の間（例えば、２４時間、３６時間、４８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、６１日、６２日、６３日、６４日、６５日、６６日、６７日、６８日、６９日、７０日、７１日、７２日、７３日、７４日、７５日、７６日、７７日、７８日、７９日、８０日、８１日、８２日、８３日、８４日、８５日、８６日、８７日、８８日、８９日、９０日、９１日、９２日、９３日、９４日、９５日、９６日、９７日、９８日、９９日、１００日、１０１日、１０２日、１０３日、１０４日、１０５日、１０６日、１０７日、１０８日、１０９日、１１０日、１１１日、１１２日、１１３日、１１４日、１１５日、１１６日、１１７日、１１８日、１１９日、１２０日、１２１日、１２２日、１２３日、１２４日、１２５日、１２６日、１２７日、１２８日、１２９日、１３０日、１３１日、１３２日、１３３日、１３４日、１３５日、１３６日、１３７日、１３８日、１３９日、１４０日、１４１日、１４２日、１４３日、１４４日、１４５日、１４６日、１４７日、１４８日、１４９日、１５０日、１５１日、１５２日、１５３日、１５４日、１５５日、１５６日、１５７日、１５８日、１５９日、１６０日、１６１日、１６２日、１６３日、１６４日、１６５日、１６６日、１６７日、１６８日、１６９日、１７０日、１７１日、１７２日、１７３日、１７４日、１７５日、１７６日、１７７日、１７８日、１７９日、１８０日、１８１日、１８２日、１８３日、１８４日、１８５日、１８６日、１８７日、１８８日、１８９日、１９０日、１９１日、１９２日、１９３日、１９４日、１９５日、１９６日、１９７日、１９８日、９１９日、２００日、２０１日、２０２日、２０３日、２０４日、２０５日、２０６日、２０７日、２０８日、２０９日、２１０日、２１１日、２１２日、２１３日、２１４日、２１５日、２１６日、２１７日、２１８日、２１９日、２２０日、２２１日、２２２日、２２３日、２２４日、２２５日、２２６日、２２７日、２２８日、２２９日、２３０日、２３１���、２３２日、２３３日、２３４日、２３５日、２３６日、２３７日、２３８日、２３９日、または２４０日）のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、１日、２日、３日、５日、１０日、２５日、５０日、７５日、１００日、１２５日、１５０日、１７５日、２００日、２２５日、２３５日、または２５０日より長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、またはそれより長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。
【０４９０】
一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、対象への投与後、少なくとも約１日〜約２４０日にわたって（例えば、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、６１日、６２日、６３日、６４日、６５日、６６日、６７日、６８日、６９日、７０日、７１日、７２日、７３日、７４日、７５日、７６日、７７日、７８日、７９日、８０日、８１日、８２日、８３日、８４日、８５日、８６日、８７日、８８日、８９日、９０日、９１日、９２日、９３日、９４日、９５日、９６日、９７日、９８日、９９日、１００日、１０１日、１０２日、１０３日、１０４日、１０５日、１０６日、１０７日、１０８日、１０９日、１１０日、１１１日、１１２日、１１３日、１１４日、１１５日、１１６日、１１７日、１１８日、１１９日、１２０日、１２１日、１２２日、１２３日、１２４日、１２５日、１２６日、１２７日、１２８日、１２９日、１３０日、１３１日、１３２日、１３３日、１３４日、１３５日、１３６日、１３７日、１３８日、１３９日、１４０日、１４１日、１４２日、１４３日、１４４日、１４５日、１４６日、１４７日、１４８日、１４９日、１５０日、１５１日、１５２日、１５３日、１５４日、１５５日、１５６日、１５７日、１５８日、１５９日、１６０日、１６１日、１６２日、１６３日、１６４日、１６５日、１６６日、１６７日、１６８日、１６９日、１７０日、１７１日、１７２日、１７３日、１７４日、１７５日、１７６日、１７７日、１７８日、１７９日、１８０日、１８１日、１８２日、１８３日、１８４日、１８５日、１８６日、１８７日、１８８日、１８９日、１９０日、１９１日、１９２日、１９３日、１９４日、１９５日、１９６日、１９７日、１９８日、１９９日、２００日、２０１日、２０２日、２０３日、２０４日、２０５日、２０６日、２０７日、２０８日、２０９日、２１０日、２１１日、２１２日、２１３日、２１４日、２１５日、２１６日、２１７日、２１８日、２１９日、２２０日、２２１日、２２２日、２２３日、２２４日、２２５日、２２６日、２２７日、２２８日、２２９日、２３０日、２３１日、２３２日、２３３日、２３４日、２３５日、２３６日、２３７日、２３８日、２３９日、または２４０日にわたって）循環血液中に存在する。
【０４９１】
一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、ａＡＰＣが血管系を循環している間、抗原ポリペプチドを提示する。一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、脾臓において抗原ポリペプチドを提示する。
【０４９２】
遺伝子編集
一部の態様では、本開示は、免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、ａＡＰＣが、外来性抗原ポリペプチドを発現する操作された赤血球系細胞を含み、方法が、内在性ＭＨＣ核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡとａＡＰＣを接触させるステップであって、内在性ＭＨＣ核酸が、遺伝子編集経路により修復され、内在性ＭＨＣ核酸の発現レベルが低下する結果となる、ステップを含み、それによって免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する、方法を特徴とする。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０４９３】
一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の選択されたＤＮＡ配列を標的とするヌクレアーゼを使用して遺伝子改変される。そのような方法を使用して、内在性ゲノム遺伝子座における選択された部位での正確な切断を誘導することができる。標的化可能なヌクレアーゼを使用する、例えば目的の被定義位置での、ＤＮＡが挿入される、置き換えられるまたはゲノムから除去される遺伝子操作は、「ゲノム編集」と称されることもある。そのようなヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、操作されたメガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＲＮＡ依存性ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）関連（Ｃａｓ）ヌクレーゼ、例えば、ＩＩ型細菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｃａｓ９）に由来するものが挙げられる。
【０４９４】
一部の実施形態では、変更は、まず、ＣＲＩＳＰＲを使用して導入される（すなわち、ＭＨＣＩの内因性発現を増加させるステップ）。次いで、提示用の抗原もＣＲＩＳＰＲによって導入され、内部でプロセシングされる。
【０４９５】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断ドメインと、ヌクレアーゼを特定のＤＮＡ配列に標的化することによってヌクレアーゼを配列特異的様式でのゲノム変更の操作に使用することを可能にするＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とを含む。ＤＮＡ切断ドメインは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができ、またはそれが標的化される配列にもしくはその配列の付近に切れ目を入れることができる。ＺＦＮは、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質のＤＢＤに基づいて選択または設計されたＤＢＤを含む。ＺＦタンパク質のＤＢＤは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化されるアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーによって、配列特異的様式でＤＮＡに結合する。ＴＡＬＥＮは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．ＺＦＮの転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＢＤに基づいて選択もしくは設計されたＤＢＤを含み、またはＴＡＬＥＮ二量体は、ＤＮＡ損傷応答経路を刺激する標的化ＤＮＡ  ＤＳＢを誘導する。設計されたジンクフィンガードメインの結合特異性が、ＺＦＮを特異的ゲノム部位に方向付ける。ＴＡＬＥは、複数の３３〜３５アミノ酸リピートドメインを含有し、それらの各々が、単一の塩基対を認識する。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、標的化ＤＳＢを誘導し、この標的化ＤＳＢにより、ＤＮＡ損傷応答経路が活性化され、カスタム変更が可能になる。操作された部位特異的ヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインは、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼまたはそのバリアントなどの天然に存在するエンドヌクレアーゼからの触媒ドメインを含み得る。一部の実施形態では、切断特異性および／または切断活性を向上させるために設計された突然変異を有するＦｏｋｌ切断ドメインバリアントを使用することができる（例えば、Guo,  J.,  et  al.  (2010)  Journal  of  Molecular  Biology  400  (1):  96  -  107；Doyon,  Y.,  et  al.,  (2011)  Nature  Methods  8:  74-79を参照されたい）。メガヌクレアーゼは、大きい認識部位（１２〜約４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられる、配列特異的エンドヌクレアーゼである。この部位は、一般に、所与のゲノム内に１回しか出現しない。メガヌクレアーゼの特異性は、ヌクレアーゼの配列の変化を（例えば、ＤＮＡ結合ドメインに）導入すること、次いで、天然認識部位のバリアントを切断することができる機能的酵素を選択することにより、または異なるヌクレアーゼからのタンパク質ドメインを会合もしくは融合させることにより、変化させることができる。
【０４９６】
一部の実施形態では、ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼを使用して、ゲノム編集を行うことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく系の使用が企図される。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓもしくはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓのＣａｓ９、またはそのバリアント）は、目的の配列と相補的な配列を含むガイドＲＮＡ（このＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡと呼ばれることもある）とともに、細胞に導入される。相補性領域は、例えば、約２０ヌクレオチド長であり得る。Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９は、ガイドＲＮＡにより目的の特定のＤＮＡ配列に導かれる。ガイドＲＮＡを、ゲノム内の目的の標的配列、例えば、目的の任意の遺伝子または遺伝子間領域内の配列に対する相補性を有するように、操作することができる。Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９のヌクレアーゼ活性は、遺伝子を無効にし得るＤＮＡを切断し、またはそれを切り離すことができ、その結果、異なるＤＮＡ配列を挿入することが可能になる。一部の実施形態では、異なる遺伝子、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの遺伝子に相補的な配列を含む複数のｓｇＲＮＡが、同じ細胞に逐次的にまたは一緒に導入される。一部の実施形態では、それによって複数の遺伝子の変更を同じステップで生じさせることができる。
【０４９７】
一般に、遺伝子操作、例えばゲノム編集のためのヌクレアーゼに基づく系の使用は、ヌクレアーゼを細胞に導入すること、およびヌクレアーゼが細胞のＤＮＡを切断するために適切な条件下で、適切な時間、細胞を維持することを伴う。
【０４９８】
ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ系の場合、ガイドＲＮＡも導入される。ヌクレアーゼは、通常は、ヌクレアーゼをコードする核酸を導入することにより細胞に導入される。核酸を、細胞における発現を指令することができるプロモーターに作動可能に連結させることができ、プラスミドまたは他のベクターで細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを導入することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ自体を導入することができる。ｓｇＲＮＡを直接（トランスフェクションなどの方法により）導入することができ、または発現ベクターなどの核酸構築物からそれを発現させることにより導入することができる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、細胞に導入された単一の発現ベクターから発現され、または一部の実施形態では、異なる発現ベクターから発現される。一部の実施形態では、異なる遺伝子、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの遺伝子に相補的な配列を含む複数のｓｇＲＮＡが、同じ細胞に、個別にもしくは一緒にＲＮＡとして導入されるか、またはｓｇＲＮＡをコードする１つもしくは複数の核酸構築物を細胞内転写のために細胞に導入することにより導入される。
【０４９９】
ヌクレアーゼにより切断されると、標的遺伝子座（例えば、細胞のゲノム内の）は、ＤＮＡ損傷修復のための２つの主要経路、すなわち、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）の一方を経ることができる。ＨＤＲを刺激するために切断部位に隣接する配列（下記論述を参照されたい）との十分な相同性を有する好適な修復鋳型の非存在下では、ＤＳＢは、ＮＨＥＪによって再ライゲーションされ、挿入または欠失が生じる結果となり得る。ＮＨＥＪは、例えば、遺伝子ノックアウトを操作するために、または活性が変更されたタンパク質を生成するために、使用することができる。例えば、エクソンの挿入または欠失は、フレームシフト突然変異または未成熟停止コドンをもたらし得る。２つまたはそれより多くのＤＳＢを発生させて、ゲノムにより大きい欠失を生じさせることができる。
【０５００】
一部の実施形態では、ゲノム内の切断位置に挿入される目的の配列を含む核酸（例えば、プラスミドまたは直鎖状ＤＮＡ）が、ヌクレアーゼに加えて、細胞に導入される。一部の実施形態では、目的の配列は、遺伝子に挿入される。目的の配列は、遺伝子を少なくとも一部は置き換えることができる。一部の実施形態では、核酸は、相同組換え修復を刺激するために、切断部位に隣接する配列と相同である配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、細胞のゲノム内の切断部位にまたは切断部位の付近に存在する配列と比較して望ましい変更を含有する。ゲノムに少なくとも一部は導入される配列を含む核酸、例えば、相同配列と望ましい変更とを含む核酸配列は、「ドナー配列」と称されることもある。ドナー配列を、少なくとも一部はゲノムの切断部位に物理的に組み込むことができ、または切断の修復のために鋳型として使用し、その結果、ドナー中に存在するヌクレオチド配列のすべてもしくは一部を細胞のゲノムに導入することができる。このようにして、細胞のゲノムの配列を変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナー核酸中に存在する配列に変換することができる。一部の実施形態では、ドナー配列は、環状ＤＮＡ（例えば、プラスミド）に含有されることもあり、直鎖状二本鎖ＤＮＡ（例えば、直線化プラスミドまたはＰＣＲ産物）に含有されることもあり、または一本鎖ＤＮＡ、例えば一本鎖オリゴヌクレオチドに含有されることもある。一部の実施形態では、ドナー配列は、ゲノム内の標的部位のどちらかの側または各々の側に対して約１０〜２５ｂｐと約５０〜１００ｂｐの間の相同性を有する。一部の実施形態では、より長い相同配列、例えば、約１００〜５００ｂｐから約１〜２ｋＢまたはそれを超えるバイト数までの間の配列を使用することができる。一部の実施形態では、変更は、遺伝子の一方の対立遺伝子に導入される。一部の実施形態では、第１の変更が遺伝子の一方の対立遺伝子に導入され、異なる変更が他方の対立遺伝子に導入される。一部の実施形態では、同じ変更が両方の対立遺伝子に導入される。一部の実施形態では、２つの対立遺伝子または標的部位（またはそれより多く）を単一のステップで遺伝子改変することができる。一部の実施形態では、２つの対立遺伝子または標的部位（またはそれより多く）を別個のステップで遺伝子改変することができる。
【０５０１】
ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮを設計、生成および使用する方法は、例えば、ＷＯ２０１１０９７０３６；Urnov,  FD,  et  al.,  Nature  Reviews  Genetics  (2010),  11:  636-646；Miller  JC,  et  al.,  Nat  Biotechnol.  (2011)  29(2):  143-8；Cermak,  T.,  et  al.  Nucleic  Acids  Research  (2011)  39  (12):  e82、Sanjana,  N.  E.  et  al.  A  transcription  activator-like  effector  toolbox  for  genome  engineering.  Nat  Protoc  7,  171-192  (2012)  および前述のもののいずれかにおける参考文献に記載されている。ゲノム操作のためのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく方法は、Gaj,  T.,  et  al.,  Trends  Biotechnol.  2013  Jul;  31(7):397-405.  Epub  2013  May  9において概説されている。ゲノム操作におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用は、例えば、Cong  L,  et  al.  Multiplex  genome  engineering  using  CRISPR/Cas  systems.  Science.  2013;  339(6121):819-23；Mali  P,  et  al.,  RNA-guided  human  genome  engineering  via  Cas9.  Science.  2013;  339(6121):823-6；Wang,  H.  et  al.  One-step  generation  of  mice  carrying  mutations  in  multiple  genes  by  CRISPR/Cas-mediated  genome  engineering.  Cell  153,  910-918  (2013)；Ran,  F.  A.  et  al.  Double  Nicking  by  RNA-Guided  CRISPR  Cas9  for  Enhanced  Genome  Editing  Specificity.  Cell  154,  1380-1389  (2013)；Mali,  P.,  et  al.,  Nat  Methods.  2013;  10(10):957-63；Ran,  FA,  Nat  Protoc.  2013;8(11):2281-308に記載されている。一部の実施形態では、ｄｓＤＮＡの１本の鎖のみを切断するヌクレアーゼ（ニッカーゼ）を使用して、ＮＨＥＪ修復経路を活性化することなくＨＤＲを刺激することができる。ニッカーゼは、二本鎖切断に必要なＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ二量体中の１つのヌクレアーゼモノマーの触媒活性を不活性化することにより、またはＣａｓタンパク質の触媒ドメインの不活性化により、作出することができる。例えば、触媒残基のうちの１つ（ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインのＤ１０、およびＨＮＨヌクレアーゼドメインのＨ８４０）の、例えば、アラニンへの突然変異（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ）は、Ｃａｓ９をＤＮＡニッカーゼに変換する。
【０５０２】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓに基づく系を使用して、遺伝子発現をモジュレートすることができる。例えば、エンドヌクレアーゼ活性を欠いている触媒不活性Ｃａｓ９とガイドＲＮＡの共発現は、転写伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合または転写因子結合に特異的に干渉することができるＤＮＡ認識複合体を生じさせる。ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）と称されることもあるこの系は、哺乳動物細胞における標的化遺伝子の発現を効率的に抑制することができる（Qi,  S.,  et  al.,  Cell,  2013;152(5):  1173-83；Larson,  MH,  et  al,  Nat  Protoc.  2013;8(l  l):2180-96）。様々なエフェクタードメインのいずれかを触媒不活性Ｃａｓ９に結合させることにより、遺伝子発現および／またはＤＮＡ修飾に対する配列特異的制御を実現するために使用することができるキメラＣａｓ９タンパク質を作出することができる。好適なエフェクタードメインとしては、例えば、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６トランス活性化ドメインを含むもの、例えばＶＰ６４）、転写共活性化ドメイン、転写阻害または共阻害ドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、酵素ドメインなどを挙げることができる。ガイドＲＮＡは、ゲノム内の（例えば、プロモーターなどの発現制御エレメント内のまたはそのような発現制御エレメントの付近の）目的の部位にキメラＣａｓ９タンパク質を導き、それによって、エフェクタードメインは、転写活性の活性化または阻害などの効果を発揮する（例えば、Gilbert  LA,  et  al..  Cell.  2013;154(2):442-51；Maeder  ML,  et  a..,  Nat  Methods,  2013;  10(10):977-9を参照されたい）。適切なエフェクタードメインは、目的の機能（例えば、転写の阻害または活性化）を果たすことができる天然に存在するタンパク質中に存在するもののいずれかであり得る。
【０５０３】
遺伝子操作プロセスに付された細胞を選択または分析して、所望の組換え遺伝子産物を発現するもの、または遺伝子操作によって無効にされた内在性遺伝子の発現を欠いているもの、または任意の所望の遺伝的変更を有するものを、同定または単離することができる。例えば、一部の実施形態では、ドナー配列、またはドナー配列を送達するために使用されるベクターは、選択マーカーを含むことができ、選択マーカーを使用して、選択マーカーを含むドナー配列の少なくとも一部分がゲノムに組み込まれている細胞を選択することができる。一部の実施形態では、選択は使用されない。一部の実施形態では、細胞を、例えばサザンブロットにより、スクリーニングして、所望の遺伝的変更を有する細胞またはクローンを同定することができる。所望される場合には、細胞を、組換え遺伝子産物または内在性遺伝子産物の発現レベルまたは活性について、あるいは組換えもしくは内在性遺伝子産物に関連するまたはそれらの産物によって付与された１つまたは複数の機能的特性、あるいは目的の任意の他の基準について、試験することができる。好適な分析方法は、当業者に公知であり、例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＦＡＧＳ、免疫蛍光顕微鏡法、ＥＬＩＳＡアッセイ、タンパク質を発現する細胞を標識または保持する目的のタンパク質に結合することができる作用物質と細胞を接触させる親和性に基づく方法などを含む。機能アッセイは、組換え遺伝子産物、内在性遺伝子産物および／または目的の機能もしくは特性が何であるのかということに基づいて、選択することができる。例えば、機能的特性は、目的の抗原に結合する能力、または目的の抗原を発現する標的細胞に対して細胞傷害性を発揮する能力であり得る。細胞を、例えばＰＧＲ、サザンブロット法またはシーケンシングにより、分析して、挿入されたＤＮＡ配列の数を決定すること、それらの位置を決定すること、および／または所望のゲノム変更が起こったかどうかを決定することができる。所望の変更、発現レベルおよび／または機能的特性を有する１つまたは複数の細胞を、同定することができ、増殖させることができ、拡大することができる。細胞またはそれらの子孫を、細胞系を生成するために使用すること、ソルタギングに付すこと、および／または将来の使用のために保管することができる。
【０５０４】
操作された赤血球系細胞の集団
一態様では、本発明は、本発明の操作された赤血球系細胞を含む細胞集団、例えば、複数の操作された赤血球系細胞、または操作された赤血球系細胞の集団を特徴とする。様々な実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、主に除核細胞を含むか、主に有核細胞を含むか、または除核細胞と有核細胞の混合物を含む。そのような細胞集団では、除核細胞は、網状赤血球、赤血球、または網状赤血球と赤血球の混合物を含み得る。一部の実施形態では、除核細胞は、網状赤血球である。一部の実施形態では、除核細胞は、赤血球である。
【０５０５】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、除核細胞から本質的になる。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、主にまたは大いに除核細胞を含む。例えば、一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、少なくとも約８０％またはそれより多く除核細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される集団は、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９、または約１００％除核細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される集団は、約８０％より多く除核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％より多く除核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約８０％〜約１００％の間、除核細胞を含み、例えば、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約１００％、約８５％〜約９５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約１００％の間、除核細胞から構成されている。
【０５０６】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約２０％未満、有核細胞を含む。例えば、実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約１％、約２％、約３％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％未満、または約２０％未満、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約１％未満、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約２％未満、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約３％未満、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約４％未満、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約５％未満、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約１０％未満、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約１５％未満、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、０％〜２０％の間、有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、約０％〜２０％の間、有核細胞を含み、例えば、約０％〜１９％の間、約０％〜１５％の間、約０％〜１０％の間、約０％〜５％の間、約０％〜４％の間、約０％〜３％の間、約０％〜２％の間、有核細胞を含み、または約５％〜２０％の間、約１０％〜２０％の間、もしくは約１５〜２０％の間、有核細胞を含む。
【０５０７】
一部の実施形態では、本開示は、本発明の操作された赤血球系細胞の集団であって、２０％未満有核細胞および少なくとも８０％除核細胞を含む、または１５％未満有核細胞および少なくとも８５％除核細胞を含む、または１０％未満有核細胞および少なくとも９０％除核細胞を含む、または５％未満有核細胞および少なくとも９５％除核細胞を含む、操作された赤血球系細胞の集団を特徴とする。一部の実施形態では、本開示は、本発明の操作された赤血球系細胞の集団であって、約０％有核細胞および約１００％除核細胞、約１％有核細胞および約９９％除核細胞、約２％有核細胞および約９８％除核細胞、約３％有核細胞および約９７％除核細胞、約４％有核細胞および約９６％除核細胞、約５％有核細胞および約９５％除核細胞、約６％有核細胞および約９４％除核細胞、約７％有核細胞および約９３％除核細胞、約８％有核細胞および約９２％除核細胞、約９％有核細胞および約９１％除核細胞、約１０％有核細胞および約９０％除核細胞、約１１％有核細胞および約８９％除核細胞、約１２％有核細胞および約８８％除核細胞、約１３％有核細胞および約８７％除核細胞、約１４％有核細胞および約８６％除核細胞、約８５％有核細胞および約８５％除核細胞、約１６％有核細胞および約８４％除核細胞、約１７％有核細胞および約８３％除核細胞、約１８％有核細胞および約８２％除核細胞、約１９％有核細胞および約８１％除核細胞、または約２０％有核細胞および約８０％除核細胞を含む、操作された赤血球系細胞の集団を特徴とする。
【０５０８】
別の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、主にまたは大いに有核細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞集団は、有核細胞から本質的になる。様々な実施形態では、操作された赤血球系細胞集団内の有核細胞は、赤血球（または完全成熟赤血球）先駆細胞である。実施形態では、赤血球先駆細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）、複能性骨髄前駆細胞、ＣＦＵ−Ｓ細胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細胞、前正赤芽球、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球からなる群から選択される。
【０５０９】
一部の実施形態では、赤血球先駆細胞、例えば、造血幹細胞は、Ｏ型Ｒｈマイナスドナーからのものである。
【０５１０】
ある特定の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％、有核細胞を含む。
【０５１１】
本発明の操作された赤血球系細胞の調製中に、細胞の一部を外来性ポリペプチドとコンジュゲートしないことも、細胞の一部を外来性ポリペプチドを発現するように形質導入しないこともあることは、理解されるであろう。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される操作された赤血球系細胞の集団は、操作された赤血球細胞と未修飾赤血球系細胞の混合物を含み、すなわち、集団内の細胞の一部は、外来性ポリペプチドを含むことにも、提示することにも、発現することにもならない。例えば、操作された赤血球系細胞の集団は、様々な実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、操作された赤血球系細胞を含むことができ、集団内の残りの赤血球系細胞は、操作されない。実施形態では、操作された赤血球系細胞の単一単位用量は、様々な実施形態では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、操作された赤血球系細胞を含むことができ、用量中の残りの赤血球系細胞は、操作されない。
【０５１２】
ＩＩＩ．人工抗原提示細胞を作製する方法
ａＡＰＣを作製する様々な方法が本開示により意図されている。
【０５１３】
外来性作用物質（例えば、ポリペプチド）を含む除核赤血球系細胞を製造する方法は、例えば、そのそれぞれの全体が参照により組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０１５／０７３５８７号およびＷＯ２０１５／１５３１０２号に記載されている。
【０５１４】
一部の実施形態では、造血前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（例えば、ヒト（例えば、成体ヒト）またはマウス細胞）を、１つまたは複数の外来性ポリペプチドをコードする核酸（１つまたは複数）と接触させ、細胞を培養下で拡大および分化させる。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、不死化されている、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ；例えば、ＨＰＶ１６型）Ｅ６および／またはＥ７遺伝子を含む。一部の実施形態では、不死化ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、ＢＥＬ−Ａ細胞系細胞である（Trakarnasanga  et  al.  (2017)  Nat.  Commun.  8:  14750を参照されたい）。追加的な不死化ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、米国特許第９，９５１，３５０号、および同第８，９７５，０７２号に記載されている。一部の実施形態では、不死化ＣＤ３４＋造血前駆細胞を、１つまたは複数の外来性ポリペプチドをコードする核酸（１つまたは複数）と接触させ、細胞を培養下で拡大および分化させる。
【０５１５】
一態様では、本開示は、免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、ａＡＰＣが、外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、それを細胞表面に含む赤血球系細胞または除核細胞を含み、方法が、内在性核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと有核細胞を接触させて、内在性抗原提示ポリペプチド、内在性アンカーポリペプチドまたは内在性共刺激ポリペプチドの発現をもたらす、または内在性マイクロＲＮＡの発現の阻害をもたらすステップと、外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、有核細胞を、内在性抗原提示ポリペプチドによる外来性抗原ポリペプチドの発現および提示、ならびに除核に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップとを含み、それによって、免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する、方法を特徴とする。ａＡＰＣを作製する方法が本明細書に記載されているが、これらの方法は非限定的であることが理解されるべきである。
【０５１６】
操作された赤血球系細胞の物理的特性
一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、本明細書に記載の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の物理的特性、例えば、浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度、またはホスファチジルセリン含有量を有する。理論に制約されることを望むものではないが、一部の実施形態では、外来性タンパク質を発現する操作された赤血球系細胞は、野生型の処理されていない赤血球系細胞と似た物理的特性を有する。対照的に、低浸透圧性にローディングされた赤血球系細胞は、時には異常な物理的特性、例えば、浸透圧脆弱性の増大、細胞サイズの変更、ヘモグロビン濃度の低下、または細胞膜の外葉におけるホスファチジルセリンレベルの上昇などを示す。
【０５１７】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば除核細胞は、その細胞に保持されていなかった外来性核酸によってコードされた、精製されていない、または赤血球系細胞の完全に外側には存在していない外来性タンパク質を含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、安定剤を欠く組成物中に存在する。
【０５１８】
浸透圧脆弱性
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば除核細胞は、外来性ポリペプチドを含まない単離された無培養の赤血球系細胞と実質的に同じ浸透膜脆弱性を示す。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％ＮａＣｌで５０％未満の細胞溶解である浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例５９の方法を使用してアッセイすることができる。
【０５１９】
細胞サイズ
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば除核細胞は、野生型の処理されていない赤血球系細胞とほぼ同じ直径または体積を有する。一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、平均直径が約４、５、６、７、または８ミクロンであり、必要に応じて、集団の標準偏差は、１、２、または３ミクロン未満である。一部の実施形態では、１つまたは複数の赤血球系細胞の直径は、約４〜８、５〜７、または約６ミクロンである。一部の実施形態では、赤血球系細胞の直径は、約１ミクロン未満である、約２０ミクロンよりも大きい、約１ミクロンから約２０ミクロンの間である、約２ミクロンから約２０ミクロンの間である、約３ミクロンから約２０ミクロンの間である、約４ミクロンから約２０ミクロンの間である、約５ミクロンから約２０ミクロンの間である、約６ミクロンから約２０ミクロンの間である、約５ミクロンから約１５ミクロンの間である、または約１０ミクロンから約３０ミクロンの間である。細胞の直径は、一部の実施形態では、Ａｄｖｉａ１２０ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用して測定される。
【０５２０】
一部の実施形態では、赤血球系細胞の平均血球体積である体積は、１０ｆＬより大きい、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、または１５０ｆＬより大きい。一部の実施形態では、赤血球系細胞の平均血球体積は、３０ｆＬ未満、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ、または２００ｆＬ未満である。一部の実施形態では、赤血球系細胞の平均血球体積は、８０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、または４００〜５００フェムトリットル（ｆＬ）である。一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、本段落で詳述されている平均血球体積を有し、集団の標準偏差は、５０、４０、３０、２０、１０、５、または２ｆＬ未満である。平均血球体積は、一部の実施形態では、血液学的分析機器、例えばＣｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒを使用して測定される。
【０５２１】
ヘモグロビン濃度
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば除核細胞は、野生型の処理されていない赤血球系細胞と同様のヘモグロビン含有量を有する。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％よりも多く、または１０％よりも多くの胎児ヘモグロビンを含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、または３０ｐｇ、および必要に応じて最大約３０ｐｇの全ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、一部の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例３３のＤｒａｂｋｉｎ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄを使用して決定される。
【０５２２】
ホスファチジルセリン含有量
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞、例えば本明細書に記載の人工抗原提示細胞または除核細胞は、野生型の処理されていない赤血球系細胞とほぼ同じ、その細胞膜の外葉におけるホスファチジルセリン含有量を有する。ホスファチジルセリンは、野生型の処理されていない赤血球系細胞の細胞膜の小葉の内部に主に存在し、低浸透圧ローディングによりホスファチジルセリンの外葉への分布が引き起こされる可能性があり、そこでホスファチジルセリンが免疫応答の引き金になる可能性がある。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞の集団（例えば、本明細書に記載の人工抗原提示細胞）または除核細胞は、アネキシンＶ染色陽性の細胞を約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、６、５、４、３、２、または１％未満含む。ホスファチジルセリンへの曝露は、一部の実施形態では、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０７３５８７の実施例５４の方法を使用して、ＰＳに優先的に結合するアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣで染色し、ＦＩＴＣ蛍光をフローサイトメトリーにより測定することによって評価される。
【０５２３】
他の特性
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（例えば、操作された除核赤血球系細胞）もしくは操作された除核細胞、または操作された赤血球系細胞もしくは操作された除核細胞の集団は、内在性ＧＰＡ（Ｃ２３５ａ）、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、またはインテグリンアルファ４（Ｃ４９ｄ）のうちの１つまたは複数（例えば、全て）を含む。これらのタンパク質は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０１８／００９８３８号の実施例１０に記載の通り測定することができる。ＧＰＡ陽性細胞およびＢａｎｄ３陽性細胞のパーセンテージは、般には赤血球系細胞の成熟化の間に上昇し、インテグリンアルファ４陽性のパーセンテージは、一般には成熟化全体を通して高いままである。
【０５２４】
一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（および必要に応じて、最大で９０％または１００％）のＧＰＡ陽性細胞を含む。ＧＰＡの存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
【０５２５】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＧＰＡ＋（すなわち、ＣＤ２３５ａ＋）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約５０％から約１００％の間（例えば、約６０％から約１００％、約６５％から約１００％、約７０％から約１００％、約７５％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約８５％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、約７５％から約９９％まで、約８０％から約９９％まで、約８５％から約９９％まで、約９０％から約９９％まで、約９５％から約９９％まで、約７５％から約９５％まで、約８０％から約９５％まで、約８５％から約９５％まで、約９０％から約９５％まで、約９５％から約９８％まで）のＧＰＡ＋細胞を含む。ＧＰＡの存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
【０５２６】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ７１＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約８５％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、約７５％から約９９％まで、約８０％から約９９％まで、約８５％から約９９％まで、約９０％から約９９％まで、約９５％から約９９％まで、約７５％から約９５％まで、約８０％から約９５％まで、約８５％から約９５％まで、約９０％から約９５％まで、約９５％から約９８％まで）のＣＤ７１＋細胞を含む。ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
【０５２７】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ２３３＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約８５％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、約７５％から約９９％まで、約８０％から約９９％まで、約８５％から約９９％まで、約９０％から約９９％まで、約９５％から約９９％まで、約７５％から約９５％まで、約８０％から約９５％まで、約８５％から約９５％まで、約９０％から約９５％まで、約９５％から約９８％まで）のＣＤ２３３＋細胞を含む。ＣＤ２３３（Ｂａｎｄ３）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
【０５２８】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ４７＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約８５％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、約７５％から約９９％まで、約８０％から約９９％まで、約８５％から約９９％まで、約９０％から約９９％まで、約９５％から約９９％まで、約７５％から約９５％まで、約８０％から約９５％まで、約８５％から約９５％まで、約９０％から約９５％まで、約９５％から約９８％まで）のＣＤ４７＋細胞を含む。ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
【０５２９】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ３６−（ＣＤ３６陰性）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約８５％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、約７５％から約９９％まで、約８０％から約９９％まで、約８５％から約９９％まで、約９０％から約９９％まで、約９５％から約９９％まで、約７５％から約９５％まで、約８０％から約９５％まで、約８５％から約９５％まで、約９０％から約９５％まで、約９５％から約９８％まで）のＣＤ３６−（ＣＤ３６陰性）細胞を含む。ＣＤ３６の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
【０５３０】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ３４−（ＣＤ３４陰性）細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約８５％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、約７５％から約９９％まで、約８０％から約９９％まで、約８５％から約９９％まで、約９０％から約９９％まで、約９５％から約９９％まで、約７５％から約９５％まで、約８０％から約９５％まで、約８５％から約９５％まで、約９０％から約９５％まで、約９５％から約９８％まで）のＣＤ３４−（ＣＤ３４陰性）細胞を含む。ＣＤ３４の存在は、一部の実施形態では、ＦＡＣＳを使用して検出される。
【０５３１】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４７＋／ＣＤ２３３＋細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約８５％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、約７５％から約９９％まで、約８０％から約９９％まで、約８５％から約９９％まで、約９０％から約９９％まで、約９５％から約９９％まで、約７５％から約９５％まで、約８０％から約９５％まで、約８５％から約９５％まで、約９０％から約９５％まで、約９５％から約９８％まで）のＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４７＋／ＣＤ２３３＋細胞を含む。
【０５３２】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４７＋／ＣＤ２３３＋／ＣＤ３４−／ＣＤ３６−細胞を含む。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約７０％から約１００％の間（例えば、約７５％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約８５％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、約７５％から約９９％まで、約８０％から約９９％まで、約８５％から約９９％まで、約９０％から約９９％まで、約９５％から約９９％まで、約７５％から約９５％まで、約８０％から約９５％まで、約８５％から約９５％まで、約９０％から約９５％まで、約９５％から約９８％まで）のＣＤ２３５ａ＋／ＣＤ４７＋／ＣＤ２３３＋／ＣＤ３４−／ＣＤ３６−細胞を含む。
【０５３３】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または赤血球系細胞を含む操作された除核細胞の集団は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のエキノサイトを含む。
【０５３４】
一部の実施形態では、赤血球系細胞を含む操作された赤血球系細胞（例えば、本明細書に記載の人工抗原提示細胞）の集団は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のエキノサイトを含む。
【０５３５】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞（操作された除核赤血球系細胞）または操作された除核細胞の集団は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のピレノサイト（ｐｙｒｅｎｏｃｙｔｅ）を含む。
【０５３６】
一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核されており、例えば、本明細書に記載の治療用調製物として使用される赤血球系細胞を含む細胞の集団は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％よりも大きく除核されている。一部の実施形態では、細胞、例えば赤血球系細胞は、非機能性の核を含有する、例えば、不活化されている。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０５３７】
赤血球の単離
成熟赤血球は、例えば、細胞洗浄器、連続流細胞分離器、密度勾配分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ免疫磁気枯渇（ＭＡＣＳ）、またはこれらの方法の組合せなどの様々な方法を使用して単離することができる（例えば、van  der  Berg  et  al.,  Clin.  Chem.  33:  1081-1082  (1987)、Bar-Zvi  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  262:  17719-17723  (1987)、Goodman  et  al.,  Exp.  Biol.  Med.  232:  1470-1476  (2007)を参照されたい）。
【０５３８】
赤血球は、全血から単純な遠心分離によって単離することができる（例えば、van  der  Berg  et  al.,  Clin.  Chem.  33:  1081-1082  (1987)を参照されたい）。例えば、ＥＤＴＡにより抗凝固処理された全血を４℃、８００×ｇで１０分間遠心分離することができる。血小板に富む血漿および軟膜を除去し、赤血球を等張性生理食塩水溶液（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）で３回洗浄する。
【０５３９】
あるいは、赤血球は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｈｙｐａｑｕｅ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ、またはこれらの組合せなどの種々の分離媒体を用いた密度勾配遠心分離を使用して単離することができる。例えば、ある体積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を等体積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９の上面に重ねる。等体積の等張性生理食塩水溶液（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）中１：１に希釈した、ＥＤＴＡにより抗凝固処理された全血をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅの上面に重ね、試料を室温、７００×ｇで３０分間遠心分離する。これらの条件下で、顆粒細胞は１０７７／１１１９インターフェースに移動し、リンパ球、他の単核細胞および血小板は血漿／１０７７インターフェースに留まり、赤血球はペレット化する。赤血球を等張性生理食塩水溶液で２回洗浄する。
【０５４０】
あるいは、赤血球は、Ｐｅｒｃｏｌｌ段階勾配を使用した遠心分離によって単離することができる（例えば、Bar-Zvi  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  262:  17719-17723  (1987)を参照されたい）。例えば、新鮮な血液を、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび３８ｍＭのクエン酸を含有する抗凝固溶液と混合し、細胞をＨｅｐｅｓ緩衝食塩水で簡単に洗浄する。白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）および血小板をα−セルロースとＳｉｇｍａｃｅｌｌの混合物（１：１）を用いた吸着によって除去する。４５／７５％Ｐｅｒｃｏｌｌ段階勾配によりＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターにおいて２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、赤血球を網状赤血球および残留する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）からさらに単離する。赤血球はペレット中に回収され、一方、網状赤血球バンドは４５／７５％インターフェースにあり、残りの白血球バンドが０／４５％インターフェースにある。Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水で数回洗浄することによって、Ｐｅｒｃｏｌｌを赤血球から除去する。赤血球を単離するための密度勾配を生じさせるために使用することができる他の材料としては、イオジキサノールの水中６０％溶液であるＯＰＴＩＰＲＥＰ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手）が挙げられる。
【０５４１】
赤血球は、例えばフローサイトメトリーを使用して、網状赤血球から分離することができる（例えば、Goodman  et  al.,  Exp.  Biol.  Med.  232:  1470-1476  (2007)を参照されたい）。この場合、全血を遠心分離して（５５０×ｇ、２０分間、２５℃）、血漿から細胞を分離する。赤血球を白血球から分離するために、細胞ペレットをリン酸緩衝食塩水溶液に再懸濁させ、例えば遠心分離（４００×ｇ、３０分間、２５℃）により、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（１．０７７密度）でさらに分画する。得られた細胞ペレットを、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩに再懸濁させ、例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）などのＦＡＣＳ機器で、サイズおよび粒度に基づいて選別する。
【０５４２】
赤血球は、免疫磁気枯渇によって単離することができる（例えば、Goodman,  et  al.,  (2007)  Exp.  Biol.  Med.  232:  1470-1476を参照されたい）。この場合、細胞型特異的抗体を伴う磁気ビーズを使用して、非赤血球を排除する。例えば、本明細書に記載の密度勾配、その後の、あらゆる残留する網状赤血球の免疫磁気枯渇を使用して、赤血球を大多数の他の血液構成成分から単離する。細胞を、ヒト抗体血清を用いて２５℃で２０分にわたって前処理し、次いで、例えば、ＣＤ７１およびＣＤ３６などの網状赤血球特異的抗原に対する抗体で処理する。抗体は、磁気ビーズに直接付着させることもでき、例えば、抗ＰＥ抗体を伴う磁気ビーズが反応するＰＥとコンジュゲートすることもできる。抗体−磁気ビーズ複合体により、残留する網状赤血球を、例えば赤血球集団から選択的に抽出することができる。
【０５４３】
赤血球はまた、アフェレーシスを使用して単離することもできる。アフェレーシスのプロセスは、患者またはドナーから全血を取り出すこと、遠心分離または細胞選別を使用して血液構成成分を分離すること、分離された部分の１つまたは複数を引き出すこと、および残りの構成成分を患者またはドナーに輸血し戻すことを伴う。例えば、Ｂａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）からのＡｍｉｃｕｓ  ａｎｄ  Ａｌｙｘ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇａｍｂｒｏ  ＢＣＴ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）からのＴｒｉｍａ  Ａｃｃｅｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、およびＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）からのＭＣＳ＋９０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔなどの、いくつかの機器が現在この目的のために使用されている。適切な程度の細胞純度を実現するためには、追加的な精製方法が必要であり得る。
【０５４４】
網状赤血球は、未成熟の赤血球であり、ヒト体内の赤血球のおよそ１％を構成する。網状赤血球は骨髄において発達および成熟する。循環中に放出されたら、網状赤血球は成熟赤血球への最終分化を急速に受ける。成熟赤血球と同様に、網状赤血球は細胞核を有さない。成熟赤血球とは異なり、網状赤血球は、タンパク質合成を行う能力を維持する。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、除核赤血球を含む。
【０５４５】
末梢血から様々な経過時間（ａｇｅ）の網状赤血球を、網状赤血球が成熟するにしたがった細胞密度の差異に基づいて単離することができる。網状赤血球は、種々の密度勾配による分画遠心法を使用して末梢血から単離することができる。例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して網状赤血球を単離することができる（例えば、Noble  et  al.,  Blood  74:  475-481  (1989)を参照されたい）。Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を１０ｍＭのトリエタノールアミン、１１７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコース、および１．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の最終濃度まで希釈することにより、密度が１．０９６ｇ／ｍｌおよび１．０５８ｇ／ｍｌである滅菌等張性Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を作製する。これらの溶液の容量オスモル濃度は、２９５から３１０ｍＯｓｍの間である。例えば、第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０９６）５ミリリットルを滅菌１５ｍｌ円錐遠心管に添加する。例えば、第２のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０５８）２ミリリットルをより高い密度の第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液の上に重ねる。全血２〜４ミリリットルを管の上部に重ねる。管を、スイングアウトチューブホルダーを備えた冷却遠心分離機において２５０×ｇで３０分間遠心分離する。網状赤血球および一部の白色細胞が２つのＰｅｒｃｏｌｌ層間のインターフェースに移動する。インターフェースに存在する細胞を新しい管に移し、５ｍＭのグルコース、０．０３ｍＭのアジ化ナトリウムおよび１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを伴うリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。残留する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）を、サイズ排除カラム上でＰＢＳでのクロマトグラフィーによって除去する。
【０５４６】
あるいは、網状赤血球は、免疫磁気分離手法を使用した正の選択によって単離することができる（例えば、Brun  et  al.,  Blood  76:  2397-2403  (1990)を参照されたい）。この手法は、成熟化前の赤血球と比べて網状赤血球の表面に発現される多数のトランスフェリン受容体を利用する。トランスフェリン受容体に対する抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して、網状赤血球を混合血液細胞集団から選択的に単離することができる。ヒトを含めた種々の哺乳動物種のトランスフェリン受容体に対する抗体が商業的供給源（例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）から入手可能である。トランスフェリン抗体は、磁気ビーズに直接連結することができる。あるいは、トランスフェリン抗体は、磁気ビーズに二次抗体を介して間接的に連結することができる。例えば、ヒトトランスフェリンに対するマウスモノクローナル抗体１０Ｄ２（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）をヒツジ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）でコーティングされた免疫磁気ビーズと混合することができる。次いで、免疫磁気ビーズを、白血球を枯渇させた赤血球画分と一緒にインキュベートする。ビーズおよび赤血球を２２℃で穏やかに混合しながら６０〜９０分間インキュベートし、その後、網状赤血球が付着したビーズを、磁場を使用して単離する。単離された網状赤血球を、例えば、ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡから入手）によって磁気ビーズから取り出すことができる。あるいは、本明細書に記載の方法を使用したＣＤ３４＋造血幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける成長および成熟化により網状赤血球を単離することができる。
【０５４７】
最終分化した除核赤血球は、それらのＤＮＡ含有量に基づいて他の細胞から分離することができる。非限定的な例では、細胞をまずＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）などの生体ＤＮＡ色素で標識する。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、二本鎖ＤＮＡに結合すると青色蛍光を放出する細胞透過性核対比染色である。培養下の未分化前駆細胞、マクロファージまたは他の有核細胞はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって染色されるが、除核赤血球はＨｏｅｃｈｓｔ陰性である。蛍光励起セルソーターまたは他の細胞選別技法を使用することによって、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞を除核赤血球から分離することができる。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素は、透析または他の好適な方法によって単離された赤血球から除去することができる。
【０５４８】
本明細書に記載のポリペプチドのためのビヒクル
本発明の多くの実施形態では、１つまたは複数の（例えば、２つまたはそれよりも多くの）外来性ポリペプチドを除核赤血球系細胞上または除核赤血球系細胞内に位置させるが、本明細書に記載の任意のポリペプチドまたは外来性ポリペプチドの組合せを別のビヒクル上またはビヒクル内に位置させることもできることが理解される。ビヒクルは、例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソームを含んでいてもよい。例えば、一部の態様では、本開示は、例えば、その表面に、本明細書に記載の１つまたは複数の作用物質を含むビヒクル（例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソーム）を提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数の作用物質は、表１もしくは１４〜２４のいずれかのポリペプチド、またはその断片もしくはバリアント、またはそれに対する抗体分子から選択される作用物質を含む。一部の実施形態では、ビヒクルは、本明細書に記載の作用物質の２つまたはそれよりも多く、例えば、本明細書に記載の作用物質の任意の対を含む。
【０５４９】
不均一な細胞集団
本発明の多くの実施形態では、１つまたは複数の（例えば、２つまたはそれよりも多くの）外来性ポリペプチドを単一の細胞上または単一の細胞内に位置させるが、本明細書に記載の任意のポリペプチドまたはポリペプチドの組合せを複数の細胞上に位置させることもできることが理解される。例えば、一部の態様では、本開示は、複数の赤血球系細胞であって、複数のうちの第１の細胞が第１の外来性ポリペプチドを含み、複数のうちの第２の細胞が第２の外来性ポリペプチドを含む、複数の赤血球系細胞を提供する。一部の実施形態では、複数の細胞は、本明細書に記載のポリペプチドの２つまたはそれよりも多く、例えば、本明細書に記載のポリペプチドの任意の対を含む。一部の実施形態では、集団中の細胞の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％未満が、第１の外来性ポリペプチドと第２の外来性ポリペプチドの両方を含む。
【０５５０】
膜で包まれた細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞または他のビヒクルを膜、例えば半透膜で包む。一部の実施形態では、膜は、多糖、例えば、陰イオン性多糖であるアルギン酸を含む。一部の実施形態では、半透膜は、細胞の通過は許容しないが、小分子または巨大分子、例えば、代謝物、タンパク質、またはＤＮＡの通過は許容するものである。一部の実施形態では、膜は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるLienert  et  al.,  "Synthetic  biology  in  mammalian  cells:  next  generation  research  tools  and  therapeutics"  Nature  Reviews  Molecular  Cell  Biology  15,  95-107  (2014)に記載されているものである。理論に制約されることを望むものではないが、一部の実施形態では、膜は、細胞を免疫系から遮蔽し、かつ／または複数の細胞を近傍に保ち、それによって、互いとまたは互いの産物との相互作用を容易にするものである。
【０５５１】
赤血球先駆細胞
操作された赤血球先駆細胞、ならびに、操作された赤血球先駆細胞、網状赤血球および赤血球を作製する方法が本明細書に提示される。
【０５５２】
多能性幹細胞は、赤血球生成のプロセスによって赤血球を生じさせる。幹細胞は、小さなリンパ球のように見え、赤血球の機能的能力を欠く。幹細胞は、成熟細胞が欠く無限分裂能を有する。幹細胞から生じる娘細胞の一部は、世代および時間を経て赤血球特性を獲得する。骨髄中の赤血球系細胞の大部分は別個の形態を有するが、赤血球系列の示差的な形態学的特徴を獲得していない細胞であっても、赤血球成熟化への傾倒が見られる。これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてそれらの細胞が形成するコロニーの型によって認識される。そのような細胞が２種認識されている。赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）は、幹細胞から生じ、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）を生じさせる。ＣＦＵ−Ｅは、別個の形態を有する最も未成熟の赤血球系細胞である前正赤芽球を生じさせる。ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅは、骨髄細胞の非常に小さな画分を形成する。ロマノフスキー染色を用いて染色した骨髄において、形態学的に５種の赤血球先駆体が同定可能である。最も未成熟から最も成熟までの５段階は、前赤芽球、好塩基性正赤芽球（初期赤芽球）、多染性正赤芽球（中期赤芽球）、正染性正赤芽球（後期赤芽球）および網状赤血球である。ＢＦＵ−Ｅ（赤芽球バースト形成細胞）、ＣＦＵ−Ｅ（赤芽球コロニー形成細胞）、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球は、系列制限されている。
【０５５３】
以下の表１３に赤血球先駆体および赤血球細胞の形態学的特徴を要約する。
【表１３】
2021506304.tif 000096
【０５５４】
正常なヒト赤血球は、単球、血小板、および内皮細胞の接着分子であるＣＤ３６を発現する（van  Schravendijk  MR  et  al.,  Blood.  1992  Oct  15;80(8):2105-14）。したがって、一部の実施形態では、抗ＣＤ３６抗体を使用してヒト赤血球を同定することができる。
【０５５５】
赤血球に分化できることが当技術分野で公知の任意の細胞型、すなわち、任意の赤血球先駆細胞を、本明細書に記載の方法に従って改変して、操作された赤血球先駆細胞を産生することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って改変される赤血球先駆細胞は、赤血球に分化するプロセスにある細胞である、すなわち、哺乳動物の赤血球生成中に存在することが公知の型の細胞である。例えば、細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）またはＣＤ３４＋細胞、多分化能骨髄系前駆細胞、ＣＦＵ−Ｓ細胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細胞、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球であり得る。本明細書に提示される改変された赤血球先駆細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して、すなわち、本明細書において以下に記載する、赤血球生成を促進することが公知の分子、例えば、ＳＣＦ、エリスロポエチン、ＩＬ−３、および／またはＧＭ−ＣＳＦを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて操作された網状赤血球または赤血球に分化させることができる。あるいは、改変された赤血球先駆細胞は、本発明の組成物中に提供され、対象にｉｎ  ｖｉｖｏで投与されると、赤血球に分化することが可能である。
【０５５６】
一部の実施形態では、赤血球先駆細胞は、内在性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子）の発現が欠失し、かつ／または変更されるように遺伝子改変されていない。
【０５５７】
一部の実施形態では、赤血球先駆細胞、例えば造血幹細胞は、Ｏ陰性ドナー由来である。
【０５５８】
培養
本明細書に記載のａＡＰＣを生成するためにの給源としては、赤血球系細胞などの循環細胞が挙げられる。好適な細胞供給源は、本明細書に記載の対象から、患者由来の造血または赤血球前駆細胞から単離することもでき、不死化赤血球系細胞系から得ることもでき、誘導多能性幹細胞から得ることもでき、必要に応じて、培養し、分化させることができる。細胞培養技法を使用して赤血球を生成するための方法は当技術分野で周知である。例えば、Giarratana  et  al.,  Blood  2011,  118:  5071、Huang  et  al.,  Mol  Ther  2013,  epub  ahead  of  print  September  3、またはKurita  et  al.,  PLOS  One  2013,  8:e59890、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。プロトコールは、増殖因子、出発細胞系、培養期間、および得られた細胞を特徴付ける形態学的形質によって変動する。ドナー輸血のかわりになる血液産生のための培養系も確立されている（Fibach  et  al.  1989  Blood  73:  100）。最近、ＣＤ３４＋細胞を網状赤血球段階まで分化させ、その後、ヒト対象に輸血することが上首尾に行われた（Giarratana  et  al.,  Blood  2011,  118:  5071）。一部の実施形態では、患者由来の造血または赤血球前駆細胞、例えば造血幹細胞は、Ｏ陰性ドナーに由来することが理解されよう。
【０５５９】
赤血球系細胞および赤血球系細胞に由来するａＡＰＣの培養方法が本明細書に提示される。赤血球系細胞は、例えばＣＤ３４＋造血前駆細胞を含めた造血前駆細胞（Giarratana  et  al.,  Blood  2011,  118:5071）、誘導多能性幹細胞（Kurita  et  al.,  PLOS  One  2013,  8:e59890）、および胚性幹細胞（Hirose  et  al.  2013  Stem  Cell  Reports  1:499）から培養することができる。前駆細胞の拡大および分化に好適な増殖分化因子のカクテルは、当技術分野で公知である。好適な拡大および分化因子の例としては、これらに限定されないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ２、ＰＩＸＹ３２１、および白血病阻害因子（ＬＩＦ）が挙げられる。
【０５６０】
赤血球系細胞は、ＣＤ３４＋細胞などの造血前駆体から、当該前駆細胞を定義された因子と多ステップ培養プロセスで接触させることによって培養することができる。例えば、赤血球系細胞を造血前駆体から３ステッププロセスで培養することができる。
【０５６１】
第１のステップは、培養下の細胞を、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）、および０．１〜１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−３（ＩＬ−３）と接触させることを含み得る。第１のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、例えば、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、またはプレグナンｘ受容体などの核ホルモン受容体に結合し、それを活性化するリガンドと接触させることを含む。これらの受容体のリガンドとしては、例えば、コルチコステロイド、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのデキサメタゾンもしくは１０ｎＭ〜１００μＭのヒドロコルチゾンなど；エストロゲン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのベータ−エストラジオールなど；プロゲストーゲン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭのヒドロキシプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭの５ａ−ジヒドロプロゲステロン、１０ｎＭ〜１００μＭの１１−デオキシコルチコステロンなど、もしくは合成プロゲスチン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのクロルマジノン酢酸エステルなど；アンドロゲン、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのテストステロン、１０ｎＭ〜１００μＭのジヒドロテストステロンもしくは１０ｎＭ〜１００μＭのアンドロステンジオンなど；またはプレグナンｘ受容体リガンド、例えば、１０ｎＭ〜１００μＭのリファンピシン、１０ｎＭ〜１００のハイパーフォリン、１０ｎＭ〜１００μＭのセイヨウオトギリソウ（ヒペリシン）など、もしくはビタミンＥ様分子、例えば、１０ｎＭ〜１００のトコフェロールなどが挙げられる。第１のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、インスリン様分子、例えば、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、または１〜５０μｇ／ｍＬのメカノ増殖因子などと接触させることも含み得る。第１のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることをさらに含み得る。
【０５６２】
第１のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、１つまたは複数のインターロイキン（ＩＬ）または増殖因子、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−Ｂ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−Ａ）、巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、およびＦｌｔ３リガンドなどと接触させることを含み得る。各インターロイキンまたは増殖因子は、一般には０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で供給される。第１のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、血清タンパク質または非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラスマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、またはヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）などと接触させることも含み得る。
【０５６３】
第２のステップは、培養下の細胞を１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）および１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と接触させることを含み得る。第２のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、インスリン様分子、例えば、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、または１〜５０μｇ／ｍＬのメカノ増殖因子などと接触させることも含み得る。第２のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることをさらに含み得る。第２は、必要に応じて、培養下の細胞を、血清タンパク質または非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラスマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、またはヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）などと接触させることも含み得る。
【０５６４】
第３のステップは、培養下の細胞を、１〜１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と接触させることを含み得る。第３のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）と接触させることを含み得る。第３のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、インスリン様分子、例えば、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、１〜５０μｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、または１〜５０μｇ／ｍＬのメカノ増殖因子などと接触させることをさらに含み得る。第３のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、０．１〜５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンと接触させることも含み得る。第３のステップは、必要に応じて、培養下の細胞を、血清タンパク質または非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１〜２０％）、ヒト血漿（１〜２０％）、プラスマネート（１〜２０％）、ヒト血清（１〜２０％）、アルブミン（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、またはヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍＬ）などと接触させることも含み得る。
【０５６５】
一部の実施形態では、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）、赤血球系細胞、例えば除核細胞を含むａＡＰＣを拡大および分化させる方法は、ａＡＰＣを、骨髄増殖性受容体（ｍｐｌ）リガンドを含む培地中で培養することを含まない。
【０５６６】
培養プロセスは、必要に応じて、細胞を、１つまたは複数の遺伝子を活性化またはノックダウンする分子、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ホルモン、または小分子と、当技術分野で公知の方法によって接触させることを含み得る。標的遺伝子としては、例えば、これらに限定されないが、例えば、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＣＭｙｃ、ｈＴＥＲＴ、ｐ５３、ＥＰＯ、ＳＣＦ、インスリン、ＥＰＯ−Ｒ、ＳＣＦ−Ｒ、トランスフェリン−Ｒ、インスリン−Ｒを含めた、転写因子、増殖因子、または増殖因子受容体をコードする遺伝子を挙げることができる。
【０５６７】
一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、合計で２２日間にわたる３つの別々の分化段階で、様々な量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、およびエリスロポエチンを含有する培養物中に置く。
【０５６８】
一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、合計で１４日間にわたる３つの別々の分化段階で、様々な量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、およびトロンボポエチンを含有する培養物中に置く。
【０５６９】
一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、合計で１５日間にわたる３つの別々の分化段階で、様々な量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ＩＬ−３、ＳＣＦ、およびＧＣＳＦを含有する培養物中に置く。
【０５７０】
一部の実施形態では、赤血球系細胞を、少なくとも１００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、または１００，０００倍（および必要に応じて、最大１００，０００、２００，０００、または５００，０００倍まで）に拡大させる。細胞の数は、一部の実施形態では、自動細胞計数器を使用して測定される。
【０５７１】
一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９８％（および必要に応じて、最大約８０、９０、または１００％まで）の操作された赤血球系細胞を含む。除核は、一部の実施形態では、核染色を使用したＦＡＣＳによって測定される。一部の実施形態では、集団内の赤血球系細胞の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０％（および必要に応じて、最大約７０、８０、９０、または１００％まで）は、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多く）の外来性ポリペプチドを含む。ポリペプチドの発現は、一部の実施形態では、ポリペプチドに対する標識された抗体を使用し、赤血球系細胞によって測定される。一部の実施形態では、集団内の赤血球系細胞の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０％（および必要に応じて、最大約７０、８０、９０、または１００％まで）が除核されており、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の外来性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団は、約１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜２×１０１０、２×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、１×１０１１〜２×１０１１、２×１０１１〜５×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜２×１０１２、２×１０１２〜５×１０１２、または５×１０１２〜１×１０１３個の細胞を含む。
【０５７２】
一部の実施形態では、培養中、赤血球前駆細胞、例えば造血幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで部分的にだけ分化させ、それによって、対象にｉｎ  ｖｉｖｏで導入した際にさらなる分化、例えば、網状赤血球または完全に成熟した赤血球への分化が引き起こされることを可能にすることが望ましい場合がある（例えば、Neildez-Nguyen  et  al.,  Nature  Biotech.  20:467-472  (2002)を参照されたい）。本発明の種々の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける成熟化および／または分化を所望の任意の段階で停止させることができることが理解されよう。例えば、単離されたＣＤ３４＋造血幹細胞を、例えば、例えばインターロイキン３、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、トランスフェリン、およびインスリン増殖因子を含めた様々な因子を含有する培地中、所望の分化の段階に到達するまで、本明細書の他の箇所に記載の通りｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大することができる。得られた操作された赤血球系細胞は、ＣＤ３６およびＧＰＡの表面発現、ならびに特定の所望の細胞型に特異的な他の特性によって特徴付けることができ、対象に輸血し、そこで成熟赤血球への最終分化が起こるのを可能にすることができる。
【０５７３】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、赤血球前駆細胞から、除核は含めずに除核前の成熟化の任意の段階まで部分的に拡大させ、したがって、有核細胞、例えば赤血球先駆細胞を残す。ある特定の実施形態では、得られる細胞は、有核であり、赤血球系列に制限されたものである。ある特定の実施形態では、得られる細胞は、多分化能骨髄系前駆細胞、ＣＦＵ−Ｓ細胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細胞、前正赤芽球（前赤芽球）、好塩基性正赤芽球、多染性正赤芽球および正染性正赤芽球から選択される。除核を含めた最終的な分化ステップは、操作された赤血球系細胞が対象に投与された後にのみ起こる、すなわち、そのような実施形態では、除核ステップはｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。別の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて除核の段階まで拡大および分化させて、例えば、網状赤血球にする。操作された赤血球系細胞を網状赤血球の段階まで分化させる実施形態では、赤血球になる最終的な分化ステップは、操作された赤血球系細胞が対象に投与された後にのみ起こる、すなわち、最終分化ステップはｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。別の実施形態では、操作された赤血球系細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最終分化段階まで拡大および分化させて赤血球にする。
【０５７４】
一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞を赤血球前駆細胞、例えば造血幹細胞から拡大および分化させて、異なる系列の造血細胞にすること、例えば、血小板にすることができることがさらに認識されよう。血小板などの種々の系列の造血細胞を成熟および分化させるための方法は当技術分野において当業者に周知である。一部の実施形態では、本明細書に記載の外来性ポリペプチドを発現するそのような操作された血小板は、本発明に包含されるものとみなされる。
【０５７５】
上記の態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、除核細胞である。上記の態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、操作された赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０５７６】
一部の実施形態では、本明細書に提示される除核細胞は、血小板である。血小板をｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する方法は当技術分野で公知である（例えば、Wang  and  Zheng  (2016)  Springerplus  5(1):  787、および米国特許第９，５７４，１７８号を参照されたい）。外来性ポリペプチドを含む血小板を製造する方法は、例えば、そのそれぞれの全体が参照により組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０７３５８７号およびＷＯ２０１５／１５３１０２号に記載されている。血小板産生は、一部において、トロンボポエチン（ＴＰＯ）とその細胞受容体であるＴＰＯＲ／ＭＰＵｃ−ＭＰＬとの相互作用によって誘導されるシグナル伝達機構によって調節される。さらに、多数のサイトカイン（例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、キットリガンド、およびインターフェロン）が血小板生成活性を有することが示されている。
【０５７７】
一部の実施形態では、血小板を、ＣＤ３４＋造血幹細胞、誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞などの造血前駆細胞から生成する。一部の実施形態では、血小板を、前駆細胞を定義された因子と多ステップ培養プロセスで接触させることによって産生する。一部の実施形態では、多ステップ培養プロセスは、造血前駆細胞の集団を、巨核球前駆細胞の集団を産生するのに好適な条件下で培養し、巨核球前駆細胞の集団を、血小板を産生するのに好適な条件下で培養することを含む。前駆細胞を拡大および分化させ、血小板を産生するのに好適な増殖分化因子のカクテルは、当技術分野で公知である。好適な拡大および分化因子の例としては、これらに限定されないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド（ＦＬ）、ＴＰＯ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＩＬ−９が挙げられる。例えば、一部の実施形態では、血小板は、ＣＤ３４＋ＨＳＣを無血清培地中に１ｍＬ当たり細胞２〜４×１０４個で播種し、培養４日目に等体積の培地を添加することによって培地をリフレッシュすることによって産生することができる。培養６日目に、細胞を計数し、分析する：１．５×１０５個の細胞を洗浄し、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（７．５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−９（１３．５ｎｇ／ｍＬ）を含むサイトカインカクテルを補充した同じ培地１ｍＬに入れて、巨核球分化を誘導する。培養１０日目に、懸濁培養物の約４分の１から約半分までを新鮮な培地に置き換える。細胞を加湿雰囲気（１０％ＣＯ２）中、培養の最初の６日間は３９℃で培養し、培養の最後の８日間は３７℃で培養する。生存可能な有核細胞を、トリパンブルー染色後に血球計算器で計数する。培養物中の血小板の分化の状態を、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０７３５８７号の実施例４４および４５に記載されている通り、フローサイトメトリーまたは定量的ＰＣＲによって評価することができる。
【０５７８】
外来性ポリペプチドの発現
一部の実施形態では、好適な単離された細胞、例えば赤血球系細胞、網状赤血球、赤血球系細胞先駆体、血小板、または血小板先駆体を、本開示のポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする外来性核酸と接触させることにより、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する操作された赤血球系細胞または除核細胞を含むａＡＰＣを生成する。
【０５７９】
一部の実施形態では、外来性ポリペプチドはＤＮＡにコードされており、そのＤＮＡを有核赤血球先駆細胞または有核血小板先駆細胞と接触させる。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドはＲＮＡにコードされており、そのＲＮＡを血小板、有核赤血球系細胞、有核血小板先駆細胞、または網状赤血球と接触させる。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドを一次血小板、有核赤血球系細胞、有核血小板先駆細胞、網状赤血球、または赤血球と接触させる。
【０５８０】
外来性ポリペプチドは、電気穿孔、化学的もしくはポリマートランスフェクション、ウイルスによる形質導入、機械的膜破壊、または他の方法によって赤血球系細胞に導入された導入遺伝子から発現させることができる；電気穿孔、化学的もしくはポリマートランスフェクション、ウイルスによる形質導入、機械的膜破壊、または他の方法によって細胞に導入されるｍＲＮＡから発現される外来性ポリペプチド；外部因子、例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、または分泌経路エンハンサーを導入することによってネイティブな遺伝子座から過剰発現される外来性ポリペプチド；および／あるいは産生細胞または他の外部の系から合成されたか、抽出されたか、または産生され、赤血球系細胞に組み入れられたポリペプチド。
【０５８１】
外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）は、遺伝子の単一コピーもしくは多数のコピーのトランスフェクション、ウイルスを用いた形質導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの存在下での電気穿孔によって導入することができる。哺乳動物細胞において外来性タンパク質を発現させるための方法は当技術分野で周知である。例えば、造血細胞における外来性第ＩＸ因子の発現は、ＣＤ３４＋前駆細胞へのウイルスによる形質導入によって誘導される。Chang  et  al.,  Nat  Biotechnol  2006,  24:1017を参照されたい。
【０５８２】
一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのポリペプチドが、単一の核酸、例えば、単一のベクターにコードされる。複数の実施形態では、単一のベクターは、各遺伝子に対して別々のプロモーターを有するか、中央にプロテアーゼ切断部位を有する単一のポリペプチドに最初に転写される２つのタンパク質を有し、したがって、その後のタンパク質分解プロセシングにより２つのタンパク質がもたらされるか、または任意の他の好適な構成を有する。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのポリペプチドが２つまたはそれよりも多くの核酸にコードされ、例えば、各ベクターがポリペプチドのうちの１つをコードする。
【０５８３】
外来性ポリペプチドを産生するためのＤＮＡ発現ベクターまたはｍＲＮＡなどの核酸を、本明細書に記載の外来性ポリペプチドを産生するのに好適な前駆細胞（例えば、赤血球系細胞前駆体または血小板先駆体など）に導入することができる。前駆細胞は、元々の供給源から単離することもでき、拡大させた前駆細胞集団から本明細書に提示される常套的な組換え技術によって得ることもできる。一部の例では、発現ベクターは、当技術分野で公知の方法による相同または非相同組換えによって、細胞のゲノムに組み入れることができるように設計することができる。
【０５８４】
一部の実施形態では、造血前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血前駆細胞を、１つまたは複数の外来性ポリペプチドをコードする核酸（１つまたは複数）と接触させ、細胞を培養下で拡大および分化させる。
【０５８５】
一部の例では、例えば、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性Ｔ細胞拡大ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性増殖阻害物質、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、外来性調節性Ｔ細胞拡大ポリペプチド、外来性プレースホルダーポリペプチド）を含む赤血球系細胞であるａＡＰＣに対して、ゲノムを選択的に標的とし、カットすることができるポリペプチドをコードする核酸、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、外来性ポリペプチドをコードする発現ベクターの外来性核酸の、特定のゲノム位置、例えば、ＣＲ１遺伝子座（１ｑ３２．２）、ヘモグロビン遺伝子座（１１ｐ１５．４）への挿入を方向付ける。したがって、一態様では、本開示は、免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、ａＡＰＣが、外来性抗原ポリペプチドを発現する操作された赤血球系細胞を含み、方法が、内在性ＭＨＣ核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡとａＡＰＣを接触させるステップを含み、内在性ＭＨＣ核酸を遺伝子編集経路によって修復し、内在性ＭＨＣ核酸の発現のレベルの低下をもたらし、それによって、免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する方法を特徴とする。
【０５８６】
一部の実施形態では、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を、トランスフェクションのためにプラスミド構築物にクローニングすることができる。本明細書に記載のａＡＰＣを産生するのに好適な細胞に発現ベクターを移入するための方法としては、これらに限定されないが、ウイルス媒介性遺伝子移入、リポソーム媒介性移入、形質転換、遺伝子銃、トランスフェクションおよび形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターの使用などのウイルス媒介性遺伝子移入が挙げられる。遺伝子移入の方式の例としては、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクション、および細胞微量注射が挙げられる。
【０５８７】
一部の実施形態では、各外来性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを、赤血球系細胞への組込みのためにレンチウイルスベクタープラスミドにクローニングすることができる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、赤血球系細胞への組込みのための単一の外来性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、赤血球系細胞への組込みのための２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くの本明細書に記載の外来性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の外来性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを、抗生物質耐性遺伝子などの選択可能な形質をコードするプラスミドＤＮＡ構築物にクローニングすることができる。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを、赤血球系細胞において各組換えタンパク質を安定に発現するように適合させたプラスミド構築物にクローニングすることができる。
【０５８８】
一部の実施形態では、外来性ポリペプチド配列（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチド配列）を有する導入ベクター、エンベロープベクター、およびパッケージングベクターをそれぞれウイルス産生のための宿主細胞にトランスフェクトするレンチウイルス系を用いることができる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターをリン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、脂質に基づくトランスフェクション、または電気穿孔のいずれかによって宿主細胞にトランスフェクトし、終夜インキュベートすることができる。外来性ポリペプチド配列に蛍光レポーターを付随させることができる実施形態に関しては、終夜インキュベートした後に蛍光についての宿主細胞の検査を確認することができる。ウイルス粒子を含む宿主細胞の培養培地を８〜１２時間ごとに２〜３回、回収し、遠心分離して剥離した細胞およびデブリを沈降させることができる。次いで、培養培地を必要に応じて直接使用するか、凍結させるかまたは濃縮することができる。
【０５８９】
外来性ポリペプチドをコードする外来性核酸の移入に供される前駆細胞を、成熟除核赤血球への分化を可能にするために好適な条件下で、例えば、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養プロセスで培養することができる。得られた除核赤血球は、成熟赤血球に付随するタンパク質、例えば、ヘモグロビン、グリコホリンＡ、および、標準の方法（例えば、ウエスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ分析）によって検証および定量化することができる外来性ポリペプチドを示す。外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを含む単離された成熟除核赤血球ならびに外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを含む血小板が、本開示のａＡＰＣの２つの非限定的な例である。
【０５９０】
一部の実施形態では、抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸と網状赤血球を接触させることによって、ａＡＰＣを生成する。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＲＮＡによってコードされており、そのＲＮＡを網状赤血球と接触させる。一部の実施形態では、抗原ポリペプチドは、ポリペプチドであり、それを網状赤血球と接触させる。
【０５９１】
１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードするｍＲＮＡを、単離された網状赤血球にトランスフェクトして、ａＡＰＣを生成することができる。メッセンジャーＲＮＡは、１つまたは複数の外来性ポリペプチドに対応するコード配列を含有するｃＤＮＡプラスミド構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって得ることができる。例えば、外来性ポリペプチドに対応するｃＤＮＡ配列を、特定のＲＮＡポリメラーゼと適合するプロモーター配列を含有するクローニングベクターに挿入することができる。例えば、クローニングベクターＺＡＰ  ＥＸＰＲＥＳＳ  ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）は、それぞれＴ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと適合するＴ３プロモーター配列およびＴ７プロモーター配列を含有する。センスｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために、プラスミドを、外来性ポリペプチドのコード配列の末端に対応する停止コドン（複数可）の下流の制限部位において直線化する。例えば、ＲＮＡＭＡＸＸ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡから入手）などの市販のキットを使用し、ｍＲＮＡを直鎖ＤＮＡ鋳型から転写させる。一部の例では、５’−ｍ７ＧｐｐｐＧ−キャップ形成ｍＲＮＡを生成することが望ましい場合がある。そのように、直線化ｃＤＮＡ鋳型の転写を、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．、ＵＳＡ）から入手したｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｃａｐｐｅｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して行うことができる。転写は、反応体積２０〜１００μｌ、３７℃で３０分〜４時間にわたって行うことができる。反応ミックスから、ＤＮａｓｅ  Ｉで簡単に処理して直線化ＤＮＡ鋳型を排除し、その後、７０％エタノール中、塩化リチウム、酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムの存在下で沈殿させることにより、転写されたｍＲＮＡを精製する。転写されたｍＲＮＡの完全性を、アガロース−ホルムアルデヒドゲルまたは市販のＮｏｖｅｘ  ｐｒｅ−ｃａｓｔ  ＴＢＥ  ｇｅｌ（例えば、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を用いた電気泳動を使用して評価することができる。
【０５９２】
１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードするメッセンジャーＲＮＡを、例えば、リポフェクションおよび電気穿孔を含めた種々の手法を使用して網状赤血球に導入することができる（van  Tandeloo  et  al.,  Blood  98:49-56  (2001)）。リポフェクションに関しては、例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ  ５μｇを、カチオン性脂質ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に１：４の比で５〜１５分間インキュベートする。あるいは、例えば、ＤＯＴＡＰ、様々な形態のポリエチレンイミン、およびポリＬ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）、およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ；例えば、Bettinger  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  29:3882-3891  (2001)を参照されたい）を含めた種々の他のカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーを使用して、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトすることができる。得られたｍＲＮＡ／脂質複合体を、細胞（１ｍｌ当たり細胞１〜２×１０６個）と一緒に３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、培養物に戻す。電気穿孔に関しては、例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）５００μｌ中約５〜２０×１０６個の細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ約２０μｇと混合し、０．４ｃｍキュベット中、例えば、Ｅａｓｙｊｅｃｔ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｖｉｃｅ（ＥｑｕｉＢｉｏ、Ｋｅｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して電気穿孔する。一部の例では、特定のｍＲＮＡの網状赤血球へのトランスフェクションに有用な条件を決定するために、種々の電圧、静電容量および電気穿孔体積を試験することが必要であり得る。一般に、細胞にｍＲＮＡを効率的にトランスフェクトするために必要な電気穿孔パラメーターは、ＤＮＡの電気穿孔に必要とされるものよりも細胞に対して有害でないと思われる（van  Tandeloo  et  al.,  Blood  98:49-56  (2001)）。
【０５９３】
あるいは、ペプチド媒介性ＲＮＡ送達戦略を使用して、ｍＲＮＡを網状赤血球にトランスフェクトすることができる（例えば、Bettinger  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  29:3882-3891  (2001)を参照されたい）。例えば、特に有糸分裂後初代細胞におけるｍＲＮＡトランスフェクションの効率を上昇させるために、カチオン性脂質ポリエチレンイミン２ｋＤＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）をメリチンペプチド（Ａｌｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）と組み合わせることができる。例えば、ヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートなどのジスルフィド架橋剤を使用して、メリチンペプチドをＰＥＩとコンジュゲートすることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡをメリチン−ＰＥＩと一緒に５〜１５分間プレインキュベートして、ＲＮＡ／ペプチド／脂質複合体を形成させる。次いで、この複合体を無血清培養培地中の細胞に添加し、５％ＣＯ２加湿環境中、３７℃で２〜４時間置き、次いで、除去し、トランスフェクトされた細胞を培養下で成長させ続ける。
【０５９４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする外来性核酸に、好適な単離された赤血球系細胞先駆体または血小板先駆体を接触させることによって、ａＡＰＣを生成する。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドはＤＮＡによってコードされており、そのＤＮＡを有核赤血球先駆細胞または有核血小板先駆細胞と接触させる。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドはＲＮＡによってコードされており、そのＲＮＡを血小板、有核赤血球系細胞、または有核血小板先駆細胞と接触させる。
【０５９５】
１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を、赤血球系細胞先駆体、血小板先駆体、または有核赤血球系細胞に、最終分化前に、一過性または安定なトランスフェクションおよび遺伝子治療手法を含めた種々のＤＮＡ技法を使用して遺伝学的に導入することができる。外来性ポリペプチドを、成熟赤血球または血小板の表面および／または細胞質内で発現させることができる。
【０５９６】
ウイルス遺伝子移入を使用して、細胞に１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることができる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）などのレンチウイルス、および泡沫状ウイルスなどのスプーマウイルスを含めたいくつかのウイルスを、遺伝子移入ビヒクルとして使用することができる（例えば、Osten  et  al.,  HEP  178:177-202  (2007)を参照されたい）。例えば、レトロウイルスは、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞に効率的に形質導入し、染色体に組み入れ、安定な遺伝子移入を付与する。
【０５９７】
１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を、赤血球系細胞先駆体、血小板先駆体、または有核赤血球系細胞にトランスフェクトし、発現させ、その後、保持し、成熟赤血球または血小板において表示させることができる。好適なベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクター骨格である（Malik  et  al.,  Blood  91:2664-2671  (1998)）。ＭＭＬＶに基づくベクターである腫瘍形成レトロウイルスが、遺伝子治療臨床試験において現在使用されている（Hossle  et  al.,  News  Physiol.  Sci.  17:87-92  (2002)）。例えば、標準の分子生物学技法を使用して、外来性ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ構築物をＭＭＬＶベクター骨格で生成することができる。構築物を、例えば、ＰＡ３１７細胞などのパッケージング細胞系にトランスフェクトし、ウイルス上清を使用して、例えばＰＧ１３細胞などの産生細胞をトランスフェクトする。ＰＧ１３ウイルス上清を、単離され、培養された、または本明細書に記載の通り新鮮に単離された赤血球系細胞先駆体、血小板先駆体、または有核赤血球系細胞と一緒にインキュベートする。外来性ポリペプチドの発現を、例えば、外来性ポリペプチドがａＡＰＣの表面に位置する場合、外来性ポリペプチドに対して方向付けられた蛍光標識された抗体を用い、ＦＡＣＳ分析（蛍光活性化細胞選別）を使用してモニタリングすることができる。同様の方法を使用して、ａＡＰＣの内部に位置する外来性ポリペプチドを発現させることができる。
【０５９８】
必要に応じて、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光追跡用分子を、ウイルスに基づく手法を使用してトランスフェクトすることができる（Tao  et  al.,  Stem  Cells  25:670-678  (2007)）。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ）をコードするＤＮＡを含有するエコトロピックレトロウイルスベクターを、例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ細胞系（Ｏｒｂｉｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．により流通）などのパッケージング細胞を使用してパッケージングする。パッケージング細胞系は、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含めた、妥当なウイルスパッケージングに必要なウイルスタンパク質を安定に発現する。ウイルス粒子が入れられたＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ細胞由来の上清を使用して、例えば、赤血球系細胞先駆体、血小板先駆体、または有核赤血球系細胞に形質導入する。一部の例では、例えば、レトロウイルス媒介性遺伝子移入の効率を改善するために、組換えフィブロネクチンの断片などの特別にコーティングされた表面で形質導入を実施することができる（例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。細胞をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングされたプレート中でレトロウイルスＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ上清と、それに加えて好適な補因子と一緒にインキュベートする。翌日、形質導入を繰り返すことができる。この場合、ＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓを発現する細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって評価することができる。形質導入効率を評価するために使用することができる他のレポーター遺伝子としては、例えば、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびルシフェラーゼならびに低親和性神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、およびヒト細胞表面ＣＤ２４抗原が挙げられる（Bierhuizen  et  al.,  Leukemia  13:605-613  (1999)）。
【０５９９】
好適な赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞に遺伝子材料を導入してａＡＰＣを生成するために、非ウイルスベクターを使用することができる。非ウイルス媒介性遺伝子移入は、プラスミドベクターがタンパク質を含有せず、毒性が低く、スケールアップが容易であり、宿主細胞の選好性がないという点でウイルス媒介性遺伝子移入と異なる。プラスミドベクターの「ネイキッドＤＮＡ」は、ポリペプチドをコードする遺伝子材料の細胞への送達において、それだけでは非効率的であり、したがって、細胞への進入を可能にする遺伝子送達方法と組み合わされる。非ウイルスベクターを好適な赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞に移入するために、化学的方法および物理的方法を含めたいくつかの送達方法を使用することができる。
【０６００】
１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする非ウイルスベクターを、好適な赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞にカチオン性脂質およびポリマーなどの合成巨大分子を使用して導入することができる（Papapetrou  et  al.,  Gene  Therapy  12:S118-S130  (2005)）。カチオン性リポソームは、例えば、ＤＮＡと電荷相互作用によって複合体を形成する。正に荷電したＤＮＡ／脂質複合体は、負の細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。この手法を、例えば、造血細胞をトランスフェクトするために使用することができる（例えば、Keller  et  al.,  Gene  Therapy  6:931-938  (1999)を参照されたい）。赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞に関しては、プラスミドＤＮＡ（例えばＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）などの無血清培地２５〜１００μＬ中およそ０．５μｇ）を、市販のトランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）などのカチオン性リポソーム（無血清培地２５μＬ中およそ４μｇ）と混合し、少なくとも２０分間インキュベートして複合体を形成させる。ＤＮＡ／リポソーム複合体を好適な赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞に添加し、５〜２４時間インキュベートし、その後、ポリペプチドの導入遺伝子による発現をアッセイすることができる。あるいは、他の市販のリポソームトランスフェクション剤を使用することができる（例えば、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ．、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）。
【０６０１】
必要に応じて、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーを使用して、赤血球系細胞前駆細胞、例えば、造血および臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を効率的にトランスフェクトすることができる（例えば、Shin  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta  1725:377-384  (2005)を参照されたい）。ヒトＣＤ３４＋細胞をヒト臍帯血から単離し、２００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子および２０％熱失活ウシ胎仔血清を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地で培養する。外来性ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡを、０．８Ｋから７５０Ｋまでの様々なサイズの分枝または直鎖ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ；Ｆｅｒｍｅｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）と一緒にインキュベートする。ＰＥＩは４．２ｍｇ／ｍｌの蒸留水でストック溶液として調製し、ＨＣｌを使用してｐＨ５．０までわずかに酸性化させる。ＤＮＡ  １μｇは３ｎｍｏｌのリン酸を含有し、ＰＥＩストック溶液１μｌは１０ｎｍｏｌのアミン窒素を含有するという算出に基づいた種々の窒素／リン酸比でＤＮＡをＰＥＩと室温で３０分にわたって組み合わせることができる。単離されたＣＤ３４＋細胞をＤＮＡ／カチオン性複合体と共に播種し、２８０×ｇで５分間遠心分離し、ポリペプチドの遺伝子による発現を評価するまで、培養培地中で４時間またはそれよりも長くインキュベートする。
【０６０２】
プラスミドベクターを好適な赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞に粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃、または粒子衝撃技術などの物理的方法を使用して導入することができる（Papapetrou,  et  al.,  (2005)  Gene  Therapy  12:S118-S130）。この場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡを金粒子に吸収させ、パーティクルガンによって細胞に投与する。この手法は、例えば、赤血球前駆細胞、例えば臍帯血由来の造血幹細胞をトランスフェクトするために使用することができる（例えば、Verma  et  al.,  Gene  Therapy  5:692-699  (1998)を参照されたい）。そのように、臍帯血を単離し、リン酸緩衝食塩水中に３倍希釈する。ＣＤ３４＋細胞を、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を二次抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズおよび磁気分離系（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭｉｎｉＭａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）と組み合わせて使用して精製する。ＣＤ３４＋富化細胞を本明細書に記載の通り培養することができる。トランスフェクションのために、ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡを、粒子、例えば金ビーズ上に、塩化カルシウムおよびスペルミジンで処理することによって沈殿させる。ＤＮＡでコーティングされたビーズをエタノールで洗浄した後、ビーズを、例えば、微粒子銃ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して培養細胞に送達することができる。例えば、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用して、トランスフェクションの効率を評価することができる。
【０６０３】
必要に応じて、電気穿孔法を使用して、プラスミドベクターを好適な赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞に導入することができる。電気穿孔は、細胞膜に一過性の細孔を創出し、それによって、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡならびに抗体および薬物を含めた種々の分子を細胞に導入することを可能にするものである。そのように、ＣＤ３４＋細胞を本明細書に記載の通り単離し、培養する。電気穿孔の直前に、細胞を、室温、２５０×ｇで１０分間遠心分離することによって単離し、例えば、１．０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ  １０などの電気穿孔緩衝剤１ｍｌ中生存細胞０．２〜１０×１０６個で再懸濁させる。プラスミドＤＮＡ（１〜５０μｇ）を適切な電気穿孔キュベットに細胞懸濁液５００μｌと一緒に添加する。電気穿孔は、例えば、ＥＣＭ  ６００  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用し、２００Ｖ〜２８０Ｖまでにわたる電圧および２５〜７０ミリ秒までにわたるパルス幅で行うことができる。いくつかの代替的な電気穿孔機器が市販されており、この目的のために使用することができる（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸＣＥＬＬ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．；Ｃｅｌｌｊｅｃｔ  Ｄｕｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）。あるいは、単離されたＣＤ３４＋細胞の効率的な電気穿孔を、以下のパラメーターを使用して実施することができる：４ｍｍのキュベット、１６００μＦ、５５０Ｖ／ｃｍ、および１ｍｌ当たり１×１０５個の細胞５００μｌ当たり１０μｇのＤＮＡ（Oldak  et  al.,  Acta  Biochimica  Polonica  49:625-632  (2002)）。
【０６０４】
ヌクレオフェクションは、電気穿孔の一形態であり、これも同様に、好適な赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞をトランスフェクトするために使用することができる。この場合、トランスフェクションは、ＤＮＡ（または他の試薬）を核に直接輸送することを可能にし、したがって、細胞質における可能性のある分解のリスクを低下させる細胞型特異的な溶液中での電気パラメーターを使用して実施する。例えば、Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４  ＣＥＬＬ  ＮＹＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ  Ｋｉｔ（Ａｍａｘａ  Ｉｎｃ．から入手）を使用して、好適な赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞をトランスフェクトすることができる。この場合、Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４  Ｃｅｌｌ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中１〜５×１０６個の細胞をＤＮＡ  １〜５μｇと混合し、ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ機器で製造者によって決定される予めプログラムされた設定を使用してトランスフェクトする。
【０６０５】
赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞に、哺乳動物細胞において、ゲノムに組み込まれない限り自己複製することができない従来の発現ベクターを、ウイルスによらずにトランスフェクトすることができる。あるいは、赤血球系細胞、血小板またはその前駆細胞に、染色体へは組み込まれずに宿主核内で自律複製する遺伝子単位として持続できるエピソームベクターをトランスフェクトすることができる（Papapetrou  et  al.,  Gene  Therapy  12:S118-S130  (2005)）。これらのベクターは、例えば、ＥＢＶ、ヒトポリオーマウイルスＢＫ、ウシパピローマウイルス−１（ＢＰＶ−１）、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ）およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などの、通常は潜伏感染時に細胞において染色体外で複製するウイルスに由来する遺伝子エレメントを活用する。哺乳動物人工染色体も、非ウイルス遺伝子移入のために使用することができる（Vanderbyl  et  al.,  Exp.  Hematol.  33:1470-1476  (2005)）。
【０６０６】
１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする外来性核酸を、当技術分野で公知の標準の分子生物学的方法、例えば、制限酵素消化、オーバーラップ伸長ＰＣＲ、およびギブソンアセンブリによって発現ベクターにアセンブルすることができる。
【０６０７】
外来性核酸は、内在性またはネイティブな膜タンパク質をコードする遺伝子と融合した、通常は例えば赤血球系細胞の細胞表面に発現しない１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする遺伝子を含み得、したがって、外来性ポリペプチドが細胞表面に発現される。例えば、外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性遺伝子を、Ｎ末端において１型膜タンパク質のリーダー配列の後に、２型膜タンパク質のＣ末端に、またはＧＰＩ連結膜タンパク質のＧＰＩ付着部位の上流にクローニングすることができる。
【０６０８】
標準のクローニング方法を使用して、２つの融合した遺伝子間に柔軟なアミノ酸リンカーを導入することができる。例えば、柔軟なリンカーは、全長抗体から単鎖抗体断片を生成することに一般に使用される［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３＿（配列番号１）などのポリグリシンポリセリンリンカー（Antibody  Engineering:  Methods  &  Protocols,  Lo  2004）、または単鎖Ａｒｃリプレッサーを生成するために使用されるものなどのａｌａ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｔｈｒポリペプチド（Robinson  &  Sauer,  PNAS  1998）である。一部の実施形態では、柔軟なリンカーにより、柔軟なリンカーを有さない等価の構築物よりも柔軟かつ立体的に自由なポリペプチドがもたらされる。
【０６０９】
２つの融合した遺伝子間に、例えば、ＨＡエピトープタグ−−アミノ酸ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２）、ＣＭｙｃタグ−−アミノ酸ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号３）、またはＦｌａｇタグ−−アミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４）をコードする核酸配列など、エピトープタグを置くことができる。エピトープタグは、エピトープタグに対する抗体を使用したフローサイトメトリー、ウエスタンブロット、または免疫沈降による発現の容易な検出および定量化のために使用することができる。
【０６１０】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）ならびに少なくとも１つの他の異種ポリペプチドを含む。少なくとも１つの他の異種ポリペプチドは、蛍光タンパク質であってもよい。蛍光タンパク質は、形質導入効率を評価するためのレポーターとして使用することができる。一部の実施形態では、どちらも同じ転写物から作製される場合に、蛍光タンパク質を、外来性ポリペプチドの発現レベルを評価するためのレポーターとして使用する。一部の実施形態では、少なくとも１つの他のポリペプチドは、異種であり、機能、例えば、多数の抗原、多数の捕捉標的、酵素カスケードなどをもたらすものである。一部の実施形態では、組換え核酸は、抗原ポリペプチドをコードする遺伝子と第２の遺伝子とを含み、第２の遺伝子は、抗原ポリペプチドをコードする遺伝子からウイルス由来Ｔ２Ａ配列（ｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｔｃｔｔｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇｓｇｓｓｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔ（配列番号５））によって分離されており、これが翻訳後に切断されて２つの成熟タンパク質になる。
【０６１１】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸は、Ｋｅｌｌの配列の３’末端と融合しており、ＰＣＲを使用して増幅されるＭＨＣ細胞表面タンパク質の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸は、後にＫｅｌｌの配列の３’末端が続くポリグリシン／セリンリンカーと融合しており、ＰＣＲを使用して増幅されるＭＨＣ細胞表面タンパク質の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸は、以下のうちの１つまたはそれらの組合せであってもよいエピトープタグ配列と融合したＭＨＣ細胞表面タンパク質の遺伝子配列の３’末端を含む；ＨＡタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、Ｍｙｃ−タグ、キチン結合性タンパク質、マルトース結合性タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５−タグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリン−タグ、ポリグルタミン酸−タグ、Ｅ−タグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−３、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＴＣ−タグ、ＶＳＶ−タグ、Ｘｐｒｅｓｓ−タグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ビオチン  カルボキシル  担体タンパク質、Ｎｕｓ−タグ、Ｆｃ−タグ、またはＴｙ−タグ。構築物全体をＫｅｌｌの配列の３’末端と融合し、次いで、ＰＣＲを使用して増幅する。種々の外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性遺伝子構築物を、例えば、その後、レンチウイルスベクターにローディングし、細胞集団の形質導入に使用することができる。
【０６１２】
一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団を、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）をコードする外来性核酸を含むレンチウイルスベクターと一緒にインキュベートし、その特異的なプラスミドとして、ａＡＰＣを生成するためのｐＬＫＯ．１  ｐｕｒｏ、ＰＬＫＯ．１−−ＴＲＣクローニングベクター、ｐＳｉｃｏ、ＦＵＧＷ、ｐＬＶＴＨＭ、ｐＬＪＭ１、ｐＬｉｏｎ１１、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＣＩ−ＶＳＶＧ、ｐＣＭＶ−ｄＲ８．２  ｄｖｐｒ、ｐｓＰＡＸ２、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、およびｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥが挙げられる。ベクターを１０、１００、１，０００、１０，０００ｐｆｕで投与し、１２時間インキュベートすることができる。
【０６１３】
ある特定の実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドとコンジュゲートした外来性抗原提示ポリペプチドを提示する、例えば、それを細胞表面に含む赤血球系細胞である。他の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性抗原ポリペプチドおよびコンジュゲート対の一部である少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドを提示する、例えば、それを細胞表面に含む赤血球系細胞である。他の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性抗原ポリペプチドおよびコンジュゲート対の一部である少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドを提示する、例えば、それを細胞表面に含む赤血球系細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０６１４】
コンジュゲーションは、化学的にまたは酵素的に実現することができる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用を伴うまたは伴わない、外来性抗原提示ポリペプチドと１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドとの共有結合によって実現することができる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用を伴うまたは伴わない、共刺激ポリペプチドと結合対メンバーとの共有結合によって実現することができる。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用を伴うまたは伴わない、共阻害ポリペプチドと結合対メンバーとの共有結合によって実現することができる。そのようなコンジュゲートの形成は当業者の技術の範囲内にあり、コンジュゲーションを実現するための種々の技法が公知であり、特定の技法の選択は、コンジュゲートされる材料によりガイドされる。イオン化可能な側鎖を含有するアミノ酸、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、システイン、ヒスチジン、またはチロシンであり、ポリペプチド配列の活性部分に含有されないアミノ酸のポリペプチド（ＣまたはＮ末端）への付加は、それらのプロトン化されていない状態が、ポリマーに付着した反応性基、例えば、ホモ−またはヘテロ二官能性ＰＥＧとの種々のバイオコンジュゲーション反応における会合のための強力な求核試薬として機能する（例えば、Lutolf  and  Hubbell,  Biomacromolecules  2003;  4:713-22,  Hermanson,  Bioconjugate  Techniques,  London.  Academic  Press  Ltd；1996）。
【０６１５】
ある実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドを、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドとビオチン−ストレプトアビジン架橋を通じて結合させることができる。他の実施形態では、共刺激ポリペプチドと結合対メンバーを、ビオチン−ストレプトアビジン架橋を通じて結合させる。他の実施形態では、共阻害ポリペプチドと結合対メンバーを、ビオチン−ストレプトアビジン架橋を通じて結合させる。
【０６１６】
例えば、ビオチン化抗原ポリペプチドを、外来性抗原提示ポリペプチドの非特異的ビオチン化表面とストレプトアビジン架橋を通じて連結することができる。ビオチンコンジュゲーションは、いくつかの化学的手段によって行うことができる（例えば、Hirsch  et  al.,  Methods  Mol.  Biol.  295:  135-154  (2004)を参照されたい）。外来性抗原提示ポリペプチドは、例えば、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−−ＳＳ−ビオチン（スルホサクシニミジル２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプロピオネート、Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ、例えば、Jaiswal  et  al.,  Nature  Biotech.  21:47-51  (2003)を参照されたい）などのアミン反応性ビオチン化試薬を使用してビオチン化することができる。例えば、単離された赤血球系細胞を、リン酸緩衝食塩水中スルホ−ＮＨＳ−ＳＳの１ｍｇ／ｍｌ溶液中、４℃で３０分間インキュベートすることができる。細胞をトリス緩衝食塩水で洗浄することによって、過剰なビオチン試薬を除去する。次いで、ビオチン化細胞を、ビオチン化外来性抗原ポリペプチドとストレプトアビジンの存在下で反応させて、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドとビオチン−ストレプトアビジン架橋を通じて結合した外来性抗原提示ポリペプチドを提示するａＡＰＣを形成する。
【０６１７】
本明細書に記載の赤血球系細胞は、外来性ポリペプチドを細胞に連結するためのカップリング試薬を使用して産生することもできる。例えば、クリックケミストリーを使用することができる。例えば、外来性ポリペプチドが複合体である、または発現させるのが難しいポリペプチド、例えば、ポリペプチド、例えば、多量体ポリペプチド；大きなポリペプチド；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導体化されたポリペプチド；赤血球系細胞に対する毒性を有する可能性がある、または赤血球系細胞において効率的に発現されない外来性ポリペプチドである場合、外来性ポリペプチドと細胞をカップリングするためにカップリング試薬を使用することができる。赤血球系細胞を機能的なものにするためのクリックケミストリーおよび他のコンジュゲーション方法は、２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２１４２号の優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２号に記載されている。
【０６１８】
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、細胞当たり５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００もの数の、少なくとも５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００の、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００よりも多くの、または約５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００のカップリング試薬を含む。一部の実施形態では、ａ）第１のカップリング試薬を赤血球系細胞とカップリングし、それによって、医薬調製物、製品、または中間体を作製するステップを含む方法によって、赤血球系細胞を作製する。ある実施形態では、方法は、ｂ）細胞を、第２のカップリング試薬とカップリングした外来性ポリペプチドと、例えば、第１のカップリング試薬と第２のカップリング試薬の反応に好適な条件下で接触させるステップを含む。複数の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、細胞とカップリングさせること（例えば、クリックケミストリーを使用して）をさらに含む。複数の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドを細胞とカップリングさせ（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドは、外来性核酸から発現されるポリペプチドを含む。
【０６１９】
一部の実施形態では、１つまたは複数のカップリング試薬を使用して、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞とカップリングする。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのカップリング試薬を使用して、２つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞とカップリングする。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、同じカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、異なるカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、３つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、同じカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、３つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、異なるカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第３の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第３の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第３の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。
【０６２０】
ある実施形態では、１つまたは複数のカップリング試薬を使用して、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞とカップリングし、ここで、赤血球系細胞は、ヒト赤血球系細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、２つまたはそれよりも多くのカップリング剤を使用して、２つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを赤血球系細胞とカップリングする。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、２つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、同じカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、２つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、異なるカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、第１の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、３つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、同じカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、３つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを、異なるカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、第１の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第３の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、第１の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第３の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングする（例えば、クリックケミストリーを使用して）。一部の実施形態では、赤血球系細胞はヒト細胞であり、第１の外来性ポリペプチドを、第１のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第２の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）、第３の外来性ポリペプチドを、第２のカップリング試薬を使用して細胞とカップリングし（例えば、クリックケミストリーを使用して）。
【０６２１】
複数の実施形態では、２つの異なるカップリング試薬を用いて３つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを赤血球系細胞、特にヒト赤血球系細胞にクリックすることが本開示の利点である。理論に束縛されることなく、本開示は、異なるカップリング試薬を使用して細胞とカップリングした（例えば、クリックケミストリーを使用して）３つまたはそれよりも多くの外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞では、カップリング試薬に対する外来性ポリペプチド間の競合が低減し、結果として、外来性ポリペプチドのコピー数が最大化されることを意図している。
【０６２２】
一部の実施形態では、カップリング試薬は、アジドカップリング試薬を含む。一部の実施形態では、アジドカップリング試薬は、アジドアルキル部分、アジドアリール部分、またはアジドヘテロアリール部分を含む。例示的なアジドカップリング試薬としては、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル、アジド酢酸ＮＨＳエステル、アジド−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル、アジドプロピルアミン、アジド−ＰＥＧ−アミン、アジド−ＰＥＧ−マレイミド、ビス−スルホン−ＰＥＧ−アジド、またはそれらの誘導体が挙げられる。カップリング試薬は、アルケン部分、例えば、トランスシクロアルケン部分、オキサノルボルナジエン部分、またはテトラジン部分も含み得る。追加的なカップリング試薬は、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｃｋｃｈｅｍｉｓｔｒｙｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／）またはLahann,  J  (ed)  (2009)  Click  Chemistry  for  Biotechnology  and  Materials  Scienceに見いだすことができる。
【０６２３】
別の実施形態では、抗原ポリペプチドを細胞、例えば赤血球系細胞に共有結合による付着によって付着させて、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチド（例えば、第１の外来性抗原ポリペプチド、または第１の抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチド）を提示する赤血球系細胞を含むａＡＰＣを生成する。例えば、抗原ポリペプチドを誘導体化し、赤血球系細胞または血小板上の求核試薬と反応して相互結合した関係を形成する求電子基を含有するカップリング化合物を使用して、赤血球系細胞または血小板に結合させることができる。これらの求電子基の代表は、αβ不飽和カルボニル、ハロゲン化アルキルおよびチオール試薬、例えば、置換マレイミドなどである。さらに、カップリング化合物は、アミノ基、カルボキシル基およびトリオシン基などの、ポリペプチドの官能基の１つまたは複数を介して抗原ポリペプチドとカップリングすることができる。この目的のために、カップリング化合物は、遊離のカルボキシル基、遊離のアミノ基、芳香族アミノ基、および酵素官能基と反応することができる他の基を含有すべきである。例えば、赤血球系細胞または血小板に静電気による結合を通じて固定化してａＡＰＣを生成するために、高度に荷電した抗原ポリペプチドを調製することもできる。これらの誘導体の例としては、ポリリシルおよびポリグルタミル酵素が挙げられる。
【０６２４】
誘導体に具現化される反応性基の選択は、求電子試薬を赤血球系細胞または血小板上の求核基と固定化のためにカップリングするために用いられる反応条件に依存する。制御因子は、赤血球系細胞または血小板への付着によって固定化された外来性ポリペプチドのカップリング前にカップリング剤を不活化しないものであることが望まれる。そのようなカップリング固定化反応は、いくつかのやり方で進行させることができる。一般には、カップリング剤を使用して、外来性ポリペプチドと赤血球系細胞または血小板との間に橋を形成することができる。この場合、カップリング剤は、外来性ポリペプチドと反応させることができるカルボキシル基などの官能基を有するべきである。コンジュゲーションのための外来性ポリペプチドを調製する１つのやり方として、カップリング剤にカルボキシル基を利用して外来性ポリペプチドと反応する混合無水物を形成することが挙げられ、ここで、混合無水物を形成することができる活性化因子を使用する。そのような活性化因子の代表は、５，５’−（ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ＣＭＢ）、またはｍ−マレイミド安息香酸（ＭＢＡ）などのカップリング剤との混合無水物をもたらすクロロギ酸イソブチルまたは他のクロロギ酸エステルである。カップリング剤の混合無水物は、外来性ポリペプチドと反応して、反応性誘導体をもたらし、それが今度は赤血球系細胞または血小板上の求核基と反応して、外来性ポリペプチドを固定化することができる。
【０６２５】
カルボキシル基などの抗原ポリペプチド上の官能基をカルボジイミドなどの活性化因子を用いて活性化することができる。その後、アミノ基などの架橋試薬上の官能基が外来性ポリペプチド上の活性化された基と反応して反応性誘導体を形成する。さらに、カップリング剤は、赤血球系細胞または血小板上の適切な求核基と反応して架橋を形成する第２の反応性基を有するべきである。そのような反応性基の典型的なものは、アルキル化剤、例えばヨード酢酸など、αβ不飽和カルボニル化合物、例えばアクリル酸など、チオール試薬、例えば水銀など、置換マレイミドなどである。
【０６２６】
あるいは、架橋形成化合物の必要性をなくすために、抗原ポリペプチド上の官能基を、例えば赤血球系細胞または血小板上の求核試薬と直接反応するように活性化することができる。この目的のために、外来性ポリペプチドにカルボキシル基の形成をもたらし、混合無水物とは区別されるエノールエステルにするＷｏｏｄｗａｒｄ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋなどの試薬などの活性化因子を使用する。その後、外来性ポリペプチドのエノールエステル誘導体を、例えば、赤血球系細胞または血小板上の求核基と反応させて、抗原ポリペプチドの固定化をもたらし、それによって、ａＡＰＣを創出する。
【０６２７】
一部の実施形態では、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）赤血球系細胞を含むａＡＰＣを、赤血球系細胞を抗原ポリペプチドおよび必要に応じてペイロードと接触させることによって生成し、ここで、接触させることは、抗原ポリペプチドと赤血球系細胞を、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒ１ｉ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｌｉ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ｎｅｕｒｏｔｈｅｌｉｎ（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉａｎｎａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、またはＨ抗原（ＣＤ１７３）を含む付着部位を使用してコンジュゲートすることを含まない。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０６２８】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）赤血球系細胞を含み、ここで、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドは、酵素によりコンジュゲートしている。
【０６２９】
特定の実施形態では、抗原ポリペプチドを、例えば、赤血球系細胞または血小板の表面と、これに限定されないが、第一級アミン基を還元チオール基と接続するために二官能性架橋剤、例えば、ＮＨＳエステル−マレイミドヘテロ二官能性架橋剤などを用いた化学的コンジュゲーションを含めた種々の化学的および酵素的手段によってコンジュゲートすることができる。これらの方法は、酵素的戦略、例えば、アクセプター配列ＬＰＸＴＧ（配列番号６）またはＬＰＸＴＡ（配列番号７）を含有する１つのポリペプチドとＮ末端ドナー配列ＧＧＧを含有するポリペプチドと接続するためのソルターゼ酵素によって媒介されるトランスペプチダーゼ反応なども含む。例えば、Swee  et  al.,  PNAS  2013を参照されたい。方法は、例えば、それぞれ抗原および細胞に対するクリックケミストリーハンドル（アジドおよびアルキン）のソルターゼ媒介性コンジュゲーション、その後、抗原を細胞に化学的に結合させるための環化付加反応などの組合せ方法も含む。例えば、Neves  et  al.,  Bioconjugate  Chemistry,  2013を参照されたい。タンパク質のソルターゼ媒介性修飾は、どちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７５４５号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７５５４号に記載されている。
【０６３０】
一部の実施形態では、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、認識エレメント、小分子、脂質、リンカー、標識、エピトープ、抗原、治療剤、毒素、放射性同位元素、粒子、または反応性化学基を含む部分、例えば、クリックケミストリーハンドルを含むソルターゼ基質とのコンジュゲートによってタンパク質を修飾する。
【０６３１】
所望であれば、触媒により結合を形成するポリペプチドドメインを、例えば、赤血球系細胞または血小板上において、細胞内または細胞外のいずれかで発現させることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されたタンパク質であるＳｐｙ０１２８由来のものを含めたトランスペプチダーゼ、ソルターゼ、およびイソペプチダーゼを含め、触媒により結合を形成するポリペプチドが多く存在する。
【０６３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドのいずれも、ソルターゼを使用して細胞とコンジュゲートしない。
【０６３３】
Ｓｐｙ０１２８の自己触媒イソペプチド結合形成サブユニット（ＣｎａＢ２ドメイン）を分割することにより、互いに対する特異性を有する、触媒活性を保持する２つの別個のポリペプチドがもたらされることが実証されている。この系のポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと称される。混合すると、ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒでは、ＳｐｙＴａｇのＡｓｐ１１７とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＬｙｓ３１間のイソペプチド結合形成が生じる（Zakeri  and  Howarth,  JACS  2010,  132:4526）。反応は、細胞環境に適合性であり、タンパク質／ペプチドコンジュゲーションに高度に特異的である（Zakeri,  B.；Fierer,  J.  O.;  Celik,  E.;  Chittock,  E.  C.;  Schwarz-Linek,  U.;  Moy,  V.  T.;  Howarth,  M.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  2012,  109,  E690-E697）。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒにより、エラスチン様タンパク質における翻訳後の形態的修飾が方向付けられることが示されている。例えば、ＳｐｙＴａｇをＮ末端に置き、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをＣ末端に置くことにより、環状エラスチン様タンパク質の形成が方向付けられる（Zhang  et  al,  Journal  of  the  American  Chemical  Society,  2013）。
【０６３４】
構成成分ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは交換することができ、したがって、分子ＡがＳｐｙＴａｇと融合し、分子ＢがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合した系と、分子ＡがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合し、分子ＢがＳｐｙＴａｇと融合した系は、機能的に等価である。本文書の目的に関して、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを使用する場合、そのもとの場所において相補的な分子で置換することができることが理解されるべきである。
【０６３５】
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系などの、触媒により結合を形成するポリペプチドを、抗原ポリペプチドを例えば操作された赤血球系細胞などの赤血球系細胞の表面に付着させて、ａＡＰＣを生成するために使用することができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は、赤血球系細胞の細胞外表面に発現させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、例えば、１型または３型膜貫通タンパク質、例えばグリコホリンＡのＮ末端と融合することもでき、２型膜貫通タンパク質、例えばＫｅｌｌのＣ末端と融合することもでき、多重パス膜貫通タンパク質、例えばＢａｎｄ３の細胞外末端においてまたは細胞外ループ内にインフレームで挿入することもでき、ＧＰＩアクセプターポリペプチド、例えば、ＣＤ５５またはＣＤ５９と融合することもでき、脂質鎖アンカーポリペプチドと融合することもでき、表在性膜タンパク質と融合することもできる。ＳｐｙＴａｇ融合物をコードする核酸配列を、ａＡＰＣ内で発現させることができる。抗原ポリペプチドをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列を、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現する同じ赤血球系細胞から発現および分泌させることができる。あるいは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列を、外因的に、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳動物、または無細胞産生系において産生させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが反応すると、抗原ポリペプチドを赤血球系細胞の表面に付着させてａＡＰＣを形成する共有結合が形成される。抗原ポリペプチド融合物を含む赤血球系細胞は、コンジュゲートした抗原ポリペプチドを含む、ａＡＰＣの例である。
【０６３６】
一部の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、赤血球系細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下で、グリコホリンＡのＮ末端との融合物として発現させることができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列と融合した外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を、同じ赤血球系細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下で発現させることができる。両方の融合ポリペプチドが発現されると、ＳｐｙＴａｇペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドとの間でイソペプチド結合が形成され、それによって、赤血球系細胞表面と外来性ポリペプチドとの間で共有結合が形成される。
【０６３７】
別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドを、赤血球系細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下で、グリコホリンＡのＮ末端との融合物として発現させることができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列と融合した外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を、好適な哺乳動物細胞発現系、例えば、ＨＥＫ２９３細胞において発現させることができる。ＳｐｙＴａｇ融合ポリペプチドが赤血球系細胞上に発現されると、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合ポリペプチドが細胞と接触できるようになる。好適な反応条件下で、ＳｐｙＴａｇペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドとの間でイソペプチド結合が形成され、それによって、赤血球系細胞表面と抗原ポリペプチドとの間で共有結合が形成される。抗原ポリペプチド融合物を含む赤血球系細胞は、コンジュゲートした抗原ポリペプチドを含む、ａＡＰＣの例である。
【０６３８】
外来性ポリペプチド間で他の分子融合物を形成することができ、これは、直接または間接的なコンジュゲーションを含む。外来性ポリペプチドを互いと直接またはリンカーを通じて間接的にコンジュゲートすることができる。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマー、または核酸であってもよい。ポリマーは、例えば、天然、合成、直鎖、または分枝であってもよい。抗原ポリペプチドは、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを含む異種融合タンパク質を含んでいてもよく、ポリペプチドを含む融合タンパク質は、互いと直接接合していてもよく、一方の末端または両末端に介在性リンカー配列および／またはさらなる配列を有してもよい。リンカーとのコンジュゲーションは、共有結合によるものであっても、イオン結合によるものであってもよい。
【０６３９】
ある特定の実施形態では、赤血球系細胞を含むａＡＰＣに、ポリペプチドをローディングする。一部の実施形態では、除核細胞を含むａＡＰＣに、ポリペプチドをローディングする。一部の実施形態では、有核細胞を含むａＡＰＣに、ポリペプチドをローディングする。一部の実施形態では、例えば、赤血球系細胞または血小板に１つまたは複数の外来性ポリペプチドをローディングし、したがって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを赤血球系細胞または血小板に内部移行させることにより、赤血球系細胞または除核細胞を含むａＡＰＣを生成する。必要に応じて、赤血球系細胞または血小板にペイロード、例えば治療剤などをさらにローディングすることができる。
【０６４０】
例えば赤血球系細胞または血小板に外来性ポリペプチドをローディングするために、いくつかの方法を使用することができる。好適な方法としては、例えば、低浸透圧溶解、低浸透圧透析、浸透、浸透パルス、浸透圧ショック、イオン泳動、電気穿孔、超音波処理、微量注射、カルシウム沈殿、膜インターカレーション、脂質媒介性トランスフェクション、界面活性剤による処理、ウイルス感染、拡散、受容体媒介性エンドサイトーシス、タンパク質形質導入ドメインの使用、粒子発射、膜融合、凍結融解、機械的破壊、および濾過が挙げられる。そのような方法の任意の１つまたはこれらの組合せを使用して、本明細書に記載の１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を提示する（例えば、それを細胞表面に含む）操作された赤血球系細胞を含むａＡＰＣを生成することができる。
【０６４１】
低浸透圧溶解に関しては、例えば、赤血球系細胞を低イオン強度緩衝剤に曝露させ、それらのバーストを引き起こす。外来性ポリペプチドは細胞内に分布する。赤血球系細胞、特に赤血球は、単離された赤血球のペレットに５ｍＭのリン酸緩衝剤（ｐＨ８）を３０〜５０倍体積過剰で添加することにより、低浸透圧性に溶解させることができる。得られた溶解した細胞膜を遠心分離によって単離する。溶解した赤血球膜のペレットを低イオン強度緩衝剤中に再懸濁させ、外来性ポリペプチドの存在下で、例えば、３０分間インキュベートする。あるいは、溶解した赤血球膜を、外来性ポリペプチドと一緒に、赤血球系細胞への効率的なローディングのために決定される最良の条件に応じて、１分の短さまたは数日の長さにわたってインキュベートすることができる。
【０６４２】
あるいは、赤血球系細胞、特に赤血球（例えば、赤血球）に、細胞を膨潤させ、細胞膜に細孔を創出するための低張液に対する制御された透析を使用して、外来性ポリペプチドをローディングすることができる（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号、同第５，７５３，２２１号、および同第６，４９５，３５１号を参照されたい）。例えば、単離された赤血球のペレットを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４に再懸濁させ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭのグルコース、および４ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４を含有する低イオン強度緩衝剤に対して透析する。３０〜６０分後、赤血球を、外来性ポリペプチドを含有する１６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４溶液に対して、さらなる３０〜６０分にわたってさらに透析する。これらの手順は全て、４℃の温度で有利に実施することができる。一部の例では、大量の赤血球系細胞、特に赤血球を透析手法によってローディングすることが有益であり得、この目的のために設計された特定の器具を使用することができる（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号、同第６，１３９，８３６号および同第６，４９５，３５１Ｂ２号を参照されたい）。
【０６４３】
ローディングされた赤血球系細胞、特に赤血球を、例えば、０．９％生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、細胞培養培地、血漿またはリンパ液などの生理溶液の存在下で穏やかに加熱することにより、再密閉することができる。例えば、破壊された赤血球系細胞、特に赤血球を、例えば、１００ｍＭのリン酸（ｐＨ８．０）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムである１５０ｍＭの塩類溶液中、６０℃の温度で１〜２分間処理することにより、十分に密閉された膜を生成することができる。あるいは、細胞を２５〜５０℃の温度で３０分〜４時間にわたってインキュベートすることができる（例えば、米国特許出願第２００７／０２４３１３７Ａ１号を参照されたい）。あるいは、破壊された赤血球を、５ｍＭのアデニン、１００ｍＭのイノシン、２ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭのグルコース、１００ｍＭのＮａ−ピルビン酸、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１９４ｍＭのＮａＣｌ、１．６ＭのＫＣｌ、および３５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４中、３７℃の温度で２０〜３０分間インキュベートすることによって、再密閉することができる（例えば、米国特許第５，７５３，２２１号を参照されたい）。
【０６４４】
電気穿孔に関しては、例えば、赤血球系細胞または血小板を電場に曝露させることで、細胞膜に一過性の穴を引き起こし、それによって、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性Ｔ細胞拡大ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性増殖阻害物質、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、外来性調節性Ｔ細胞拡大ポリペプチド、外来性プレースホルダーポリペプチド）を細胞内に拡散させる（例えば、米国特許第４，９３５，２２３号を参照されたい）。赤血球系細胞、特に赤血球を、例えば、血小板を含まない血漿などの生理的かつ導電性媒体に懸濁させ、それに１つまたは複数の外来性ポリペプチドを添加する。０．２〜１．０ｍｌにわたる体積の混合物を電気穿孔キュベットに入れ、氷上で１０分間冷却する。キュベットを、例えばＥＣＭ８３０（ＢＴＸ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．から入手）などの電気穿孔器具に入れる。細胞を、長さおよそ２．４ミリ秒および磁界強度およそ２．０ｋＶ／ｃｍの単一のパルスで電気穿孔する。あるいは、赤血球系細胞、特に赤血球の電気穿孔を、６０％を超えるローディング能力を実現するために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓａｒ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用し、０．２５μＦで送達される２．２ｋＶの２重パルスを使用して行うことができる（Flynn  et  al.,  Cancer  Lett.  82:225-229  (1994)）。キュベットを氷浴に戻して１０〜６０分間置き、次いで、３７℃のウォーターバスに入れて、細胞膜の再密閉を誘導する。任意の好適な電気穿孔法を使用して、本明細書に記載のａＡＰＣを生成することができる。
【０６４５】
超音波処理に関しては、赤血球系細胞を、例えば、高強度の音波に曝露させることで、細胞膜の一過性の破壊を引き起こし、それによって、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を細胞内に拡散させる。任意の好適な超音波処理方法を使用して、本明細書に記載のａＡＰＣを生成することができる。
【０６４６】
界面活性剤による処理に関しては、例えば、赤血球系細胞を、マイルドな界面活性剤で処理し、それにより穴が創出されることによって細胞膜が一過性に損なわれ、その穴を通じて、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）を拡散させることができる。細胞のローディング後、界面活性剤を細胞から洗い出す。例えば、界面活性剤はサポニンであってもよい。任意の好適な界面活性剤による処理方法を使用して、本明細書に記載のａＡＰＣを生成することができる。
【０６４７】
受容体媒介性エンドサイトーシスに関しては、例えば、赤血球系細胞は、１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）が結合すると、受容体および付随する外来性ポリペプチドの内部移行を誘導する表面受容体を有し得る。任意の好適なエンドサイトーシス方法を使用して、本明細書に記載の１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）赤血球系細胞を含むａＡＰＣを生成することができる。
【０６４８】
機械的発射に関しては、例えば、赤血球系細胞に、例えば、金マイクロキャリアなどの、重いまたは荷電した粒子に付着させ、細胞膜を横断するように機械的にまたは電気的に加速した１つまたは複数の外来性ポリペプチド（例えば、外来性抗原ポリペプチド、外来性抗原提示ポリペプチド、外来性共刺激ポリペプチド、外来性共阻害ポリペプチド、外来性アミノ酸枯渇ポリペプチド、および外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチド）で衝撃を与えることができる。微小粒子衝撃は、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡから入手）を使用して実現することができる。任意の好適な微小粒子衝撃方法を使用して、本明細書に記載のａＡＰＣを生成することができる。
【０６４９】
濾過に関しては、赤血球系細胞または血小板および外来性ポリペプチドを、細胞よりも小さな孔径のフィルターに通すことで細胞膜の一過性の破壊を引き起こし、それによって、外来性ポリペプチドを細胞に進入させる。任意の好適な濾過方法を使用して、本明細書に記載の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）操作された赤血球系細胞を含むａＡＰＣを生成することができる。
【０６５０】
凍結融解に関しては、赤血球系細胞を数回の凍結解凍サイクルに供し、その結果、細胞膜の破壊をもたらす（例えば、米国特許出願第２００７／０２４３１３７Ａ１号を参照されたい）。この場合、濃厚赤血球のペレット（０．１〜１．０ｍｌ）を、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含有する等体積（０．１〜１．０ｍｌ）の等張性溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と混合する。赤血球を、細胞および１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含有する管を液体窒素中に浸漬することによって凍結させる。あるいは、細胞を、管を−２０℃または−８０℃の冷凍装置に入れることによって凍結させることができる。次いで、細胞を、例えば、２３℃のウォーターバス中で解凍し、必要であればローディングを増加させるためにこのサイクルを繰り返す。任意の好適な凍結融解方法を使用して、本明細書に記載の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）操作された赤血球系細胞を含むａＡＰＣを生成することができる。
【０６５１】
外来性ポリペプチドをａＡＰＣにおいて検出することができる。外来性ポリペプチドの存在は、標準の分子生物学方法、例えば、ウエスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ分析を使用して検証および定量化することができる。細胞内環境に存在する外来性ポリペプチドは、細胞溶解の際にまたは蛍光検出を使用して定量化することができる。
【０６５２】
上記の態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。上記の態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０６５３】
本明細書に記載のポリペプチドのためのビヒクル
一態様では、本明細書に記載の１つまたは複数のポリペプチドを、非細胞送達ビヒクルの表面にローディングする、付着させる（例えば、固定化またはコンジュゲートする）、かつ／またはその中に封入する。非細胞送達ビヒクルは、例えば、ナノ脂質ゲル、ポリマー粒子、アガロース粒子、ラテックス粒子、シリカ粒子、リポソーム、または多重膜小胞であってもよい。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、直径約１ｎｍから約９００ｎｍまでのナノ粒子を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、約０．１〜約２０ミクロン（例えば、約０．５ミクロンから約１０ミクロンまで、例えば、約５ミクロンまたはそれ未満（例えば、約２．５〜約５ミクロン）など）の平均直径を含む。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、約１μｍから約１０μｍまでの平均直径を含む。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、生分解性ポリマーを含む。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、天然ポリマーを含む。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、合成ポリマーを含む。代表的なポリマーとしては、これらに限定されないが、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（エステル）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、およびこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、非細胞送達ビヒクルは、アガロース、ラテックス、またはポリスチレンを含む。本明細書に記載のポリペプチドの１つまたは複数を、当技術分野で公知の標準の方法を使用して非細胞送達ビヒクルとコンジュゲートすることができる（例えば、Ulbrich  et  al.  (2016)  Chem  Rev.  116(9):5338-431を参照されたい）。コンジュゲーションは、共有結合性または非共有結合性のいずれであってもよい。例えば、非細胞送達ビヒクルがリポソームである実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドをリポソームにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を介して付着させることができる。ポリペプチドとリポソームとのコンジュゲーションは、例えばチオール基とマレイミド基との反応によるチオエステル結合を伴うものであってもよい。ポリペプチドを非細胞送達ビヒクルに付着させるためのスルフヒドリル基を創出するために、架橋剤を使用することができる（例えば、Paszko  and  Senge  (2012)  Curr.  Med.  Chem.  19(31):5239-77を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドの１つまたは複数を含む非細胞送達ビヒクルを、本明細書に提示される治療方法のいずれかにおいて使用することができる。
【０６５４】
ＩＶ．人工抗原提示細胞の使用方法
本開示は、本明細書に記載のａＡＰＣを使用する様々な方法を意図している。当業者には理解される通り、本明細書に提示される開示に基づいて、ａＡＰＣの投与の用量およびタイミングを、本明細書に記載の各適用に対して具体的に調整することができる。より詳細には、１つのａＡＰＣまたはいくつかのａＡＰＣによって発現されるある特定の分子を使用してＴ細胞に刺激をもたらし、その後、重複するとしても異なる分子のセットを発現する別のａＡＰＣまたはいくつかのａＡＰＣを使用した刺激をもたらすことが望ましい場合には、シス手法とトランス手法の組合せを利用することができる。本質的に、本開示のａＡＰＣ、および本明細書に開示される方法から、ほぼ無限数の変形形態がもたらされ、また、本開示はいかなる特定の組合せまたは手法にも多少なりとも限定されない。本明細書に提示される教示および当技術分野において利用可能な知見を有する当業者は、特定のＴ細胞それぞれに対する所望の手法を容易に決定することができる。
【０６５５】
一態様では、本開示は、抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法であって、Ｔ細胞を本明細書に記載のａＡＰＣと接触させ、それによって、抗原特異的Ｔ細胞を活性化するステップを含む方法を特徴とする。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を活性化するステップは、セントラルメモリー表現型を有する抗原特異的Ｔ細胞を活性化することを含む。ある特定の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を活性化するステップは、メモリーＴ細胞の拡大を促進することを含む。他の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を活性化するステップは、Ｔ細胞を分化または脱分化させることを含む。例えば、長寿命メモリーＣＤ８Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞のサブセットから脱分化のプロセスを通じて得られる。
【０６５６】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞の活性を抑制する方法であって、Ｔ細胞を、Ｔ細胞活性を抑制するように操作されたａＡＰＣと接触させ、それによって、Ｔ細胞の活性を抑制するステップを含む方法を特徴とする。
【０６５７】
別の態様では、本発明は、Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を活性化するように操作されたａＡＰＣと接触させ、それによって、Ｔｒｅｇ細胞を活性化するステップを含む方法を特徴とする。
【０６５８】
別の態様では、本開示は、受容体分子を発現するＴ細胞の増殖を誘導するための方法であって、Ｔ細胞を本明細書に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、共刺激ポリペプチドが受容体分子と特異的に結合し、それによって、前記Ｔ細胞の増殖が誘導される方法を特徴とする。
【０６５９】
本開示は、公知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖を特異的に誘導するための方法も包含する。方法は、公知の共刺激分子を発現するＴ細胞を少なくとも１つ含むＴ細胞の集団を、共刺激分子のリガンドを提示するように操作されたａＡＰＣと接触させるステップを含む。本明細書の他の箇所で開示されている通り、ａＡＰＣが、Ｔ細胞上の共刺激分子に特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドを発現する場合、共刺激分子がその同類共刺激リガンドに結合することにより、Ｔ細胞の増殖が誘導される。したがって、目的のＴ細胞が、最初に細胞を細胞の集団から精製する必要なく増殖するように誘導される。また、この方法では、細胞をａＡＰＣと接触させることにより、成長している細胞の増殖および検出が誘導され、それによって、目的の共刺激分子を発現するＴ細胞が試料中に存在することが同定されるので、集団内に特定の目的の共刺激分子を発現する細胞が存在するかどうかを決定するための迅速なアッセイがもたらされる。このように、細胞の表面の共刺激分子の少なくとも１つが公知である任意の目的のＴ細胞を、拡大および単離することができる。
【０６６０】
本開示は、Ｔ細胞集団サブセットを特異的に拡大させるための方法も含む。より詳細には、方法は、目的のサブセットのＴ細胞を少なくとも１つ含むＴ細胞の集団を、そのＴ細胞を拡大させることが可能なａＡＰＣ、または、少なくとも、Ｔ細胞の表面の同類共刺激分子と特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドを発現するａＡＰＣと接触させるステップを含む。共刺激分子とその結合パートナーである共刺激リガンドの結合により、Ｔ細胞の増殖が誘導され、それによって、Ｔ細胞集団サブセットが特異的に拡大する。本明細書に提示される開示に基づいて、Ｔ細胞サブセットが、Ｔヘルパー（ＴＨ１およびＴＨ２）ＣＤ４発現細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（Ｔｃ１またはＴｃ２）Ｔ調節性細胞（ＴＲＥＧ）、ＴＣ／Ｓ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、およびγΔＴ細胞を含むことが、当業者には理解されよう。したがって、特定のＴ細胞サブセットが富化された細胞集団を、本開示の方法を使用して容易に産生することができる。
【０６６１】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、約１００から約１，０００，０００倍の間、または約１，０００から約１，０００，０００倍の間、例えば、１，０００から約１００，０００倍の間まで拡大させる。
【０６６２】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大後のＴ細胞の適応度は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて機能するそれらの能力の優れた予測因子である。したがって、ある特定の実施形態では、重要な細胞生存遺伝子であるＢｃｌ−ｘＬを誘導するａＡＰＣの能力も測定する。拡大プロセスの間の培養物中のアポトーシス細胞のパーセンテージを使用して、細胞に基づくａＡＰＣのいずれかにより、拡大したＴ細胞に特定の生存優位性が付与されるかどうかを決定する。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大後の細胞のテロメアの長さを測定して、特定のａＡＰＣが、それが拡大させる細胞の複製に関わる潜在性の保存に関してより有効であるかどうかを決定することができる。
【０６６３】
本開示は、Ｔ細胞サブセットの活性化を特異的に誘導する共刺激リガンドまたはその組合せを同定するための方法も含む。簡単に述べると、方法は、Ｔ細胞の集団を、少なくとも１つの共刺激リガンドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）ａＡＰＣと接触させるステップと、ａＡＰＣと接触させたＴ細胞サブセットの増殖のレベルを、ａＡＰＣと接触させていない、他の点では同一のＴ細胞サブセットの増殖のレベルと比較するステップとを含む。ａＡＰＣと接触させたＴ細胞サブセットの増殖のレベルが、ａＡＰＣと接触させていない他の点では同一のＴ細胞サブセットの増殖のレベルと比較して高いことにより、共刺激リガンドによりそのＴ細胞が属するＴ細胞サブセットの活性化が特異的に誘導されることが示される。
【０６６４】
この方法により、いずれの因子（複数可）がそのＴ細胞サブセットを拡大させるかが以前は分かっていなかったＴ細胞サブセットを特異的に拡大させる共刺激リガンドを、同定することが可能になる。スクリーニングの数を最小限にするために、アッセイの数を減少できるような数の、共刺激リガンドをコードする核酸を形質導入することが好ましいことが、当業者には理解されよう。さらに、この方法では、種々のタンパク質（例えば、刺激リガンド、共刺激リガンド、抗原、サイトカインなど）を組み合わせることにより、いずれの因子の組合せ（複数可）により、Ｔ細胞サブセットを拡大させるために最も有効なａＡＰＣまたはａＡＰＣの組合せが作製されるかを評価することが可能になる。このように、各Ｔ細胞サブセットを成長および活性化させるための種々の要件を調査することができる。さらに、Ｔ細胞拡大を評価するために、ＣＦＳＥ染色を使用することができる。ａＡＰＣをＣＤ８Ｔ細胞（例えば、自己免疫疾患、感染性疾患またはがんなどの疾患または障害に罹患している対象由来のもの）と混合する。細胞拡大の最初の速度を比較するために、細胞をＣＦＳＥ染色に供して、各ａＡＰＣによっていかに良く全てのＴ細胞の増殖が誘導されたかを決定する。ＣＦＳＥ染色により、はるかに多くの定量的エンドポイントがもたらされ、拡大した細胞の同時表現型決定が可能になる。刺激後、毎日、一定分量の細胞を各培養物から取り出し、フローサイトメトリーによって分析する。ＣＦＳＥ染色により、細胞が高度に蛍光を発する。細胞分裂すると、蛍光が半減し、したがって、細胞の分裂回数が多いほど、蛍光が少なくなる。各ａＡＰＣのＴ細胞増殖を誘導する能力は、１回分裂した細胞の数、２回分裂した細胞の数、３回分裂した細胞の数などを測定することによって定量化される。特定の時点で最も多くの細胞分裂数を誘導するａＡＰＣを、最も強力な拡大因子とみなす。
【０６６５】
これらのａＡＰＣによりＴ細胞の長期間にわたる成長がいかによく促進されるかを決定するために、細胞成長曲線を作成する。これらの実験は、ＣＦＳＥ実験として正確に設定するが、ＣＦＳＥは使用しない。培養２〜３日ごとに、Ｔ細胞をそれぞれの培養物から取り出し、どのくらいの細胞が存在するか、および細胞の平均体積を測定するものであるＣｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒを使用して計数する。平均細胞体積は、いつ細胞を再刺激すべきかの最良の予測因子である。一般に、Ｔ細胞は、適正に刺激されると、細胞体積が３倍になる。この体積が最初の芽細胞の約半分よりも大きく低減した場合、対数線形拡大を維持するために、Ｔ細胞を再刺激することが必要であり得る（Levine  et  al.,  1996,  Science  272:1939-1943；Levine  et  al.,  1997,  J.  Immunol.  159:5921-5930）。各ａＡＰＣにより２０集団倍加が誘導されるのにかかる時間を算出する。このレベルのＴ細胞拡大を誘導する各ａＡＰＣの相対的差異は、いずれの特定のａＡＰＣを使用して臨床試験に進めるかに関する重要な判断基準である。
【０６６６】
各ａＡＰＣにより拡大した細胞の表現型を特徴付けて、特定のサブセットが優先的に拡大するかどうかを決定する。各再刺激の前に、Appay  et  al.（2002,  Nature  Med.  8,  379-385）によって提唱されたＣＤ２７およびＣＤ２８定義ならびにSallusto  et  al.（1999,  Nature  401:708-712）によって提唱されたＣＣＲ７定義を使用して、拡大したＴ細胞の分化の状態を定義するために、拡大しているＴ細胞集団の表現型分析を実施する。細胞溶解潜在性を推定するために、パーフォリンおよびグランザイムＢ細胞内染色を使用して肉眼測定を実施する。
【０６６７】
一態様では、方法は、種々のａＡＰＣを、Ｔ細胞サブセットと、Ｔ細胞サブセットの表面の共刺激分子を最初に特徴付けずに接触させるステップを含む。また、本開示は、Ｔ細胞サブセットの表面に存在する共刺激分子（複数可）を、ａＡＰＣと細胞を接触させる前に調査する方法を包含する。したがって、本開示は、種々のＴ細胞サブセットに対する成長要件を決定するための新規のアッセイを提供する。
【０６６８】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、対象のＴ細胞を、本明細書に記載のＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を特徴とする。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏである。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏである。
【０６６９】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、ａ）対象のＨＬＡステータスを決定するステップと、ｂ）対象と免疫学的に適合する、第１の外来性抗原ポリペプチドを発現する操作された赤血球系細胞である人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップと、ｃ）ａＡＰＣを対象に投与するステップとを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を特徴とする。
【０６７０】
別の態様では、本開示は、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、ａ）対象における抗原の発現プロファイルを決定するステップと、ｂ）第１の外来性抗原ポリペプチドを発現する操作された赤血球系細胞である人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップと、ｃ）ａＡＰＣを対象に投与するステップとを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法を特徴とする。
【０６７１】
本開示のａＡＰＣを投与することによって対象において誘導される免疫応答は、腫瘍および感染細胞を死滅させることができる、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答、およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含み得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞による活性化後に抗体を産生するＢ細胞によって主に媒介される体液性免疫応答も誘導され得る。本開示の組成物によって誘導される免疫応答の型を分析するために様々な技法を使用することができ、これらは、当技術分野において十分に記載されている；例えば、Coligan  et  al.,  Current  Protocols  in  Immunology,  John  Wiley  &  Sons  Inc.,  1994。
【０６７２】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ  Ｉ分子に伴う抗原に応答する。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣ  ＩＩ分子に伴う抗原に応答する。活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞により今度は、新しいＣＤ８＋Ｔ細胞および既存のＣＤ８＋Ｔ細胞（どちらも抗原特異的かつナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞）が活性化される。したがって、本発明の一部の実施形態では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させ、活性化するａＡＰＣ（ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を含むａＡＰＣ）を、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するａＡＰＣ（ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原を含むａＡＰＣ）と共に投与し、それによって、免疫応答を強化することができることが意図されている。一部の実施形態では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させ、活性化するａＡＰＣを、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するａＡＰＣと共に投与し、それによって、免疫応答の頑強性を相乗的に増大させることができる。一部の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を含むａＡＰＣおよび共刺激ポリペプチドを、ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原を含むａＡＰＣと共に投与することができる。他の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を含むａＡＰＣを、ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原を含むａＡＰＣおよび共刺激ポリペプチドと共に投与することができる。一部の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を含むａＡＰＣおよび共刺激ポリペプチドを、ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原を含むａＡＰＣおよび共刺激ポリペプチドと共に投与することができる。
【０６７３】
一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを含むａＡＰＣであって、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合物である、ａＡＰＣを、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを含むａＡＰＣであって、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合物である、ａＡＰＣと一緒に対象に投与する。ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を、ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原と組み合わせて投与することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の相補的役割がもたらされる。
【０６７４】
さらなる態様では、本開示は、Ｔ細胞の集団を細胞表面部分ライゲーションによって拡大するための方法も提供する。さらに、対象由来のＴ細胞の集団を、長期にわたって研究のために十分な数まで指数関数的に急速に増殖するように誘導する方法であって、Ｔ細胞の集団を対象から単離するステップと、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に一次活性化シグナルをもたらす少なくとも１つの外来性ポリペプチドとｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることによって、Ｔ細胞の集団を活性化するステップと、活性化Ｔ細胞を、共刺激シグナルをもたらす少なくとも１つの第２の外来性ポリペプチドで刺激し、その結果、一次活性化シグナルを受けたＴ細胞が急速に増殖するように刺激されるステップとを含む方法を提供することが１つの目的である。特に、対象がヒトである場合にそのような方法をもたらすことが１つの目的であり、ここで、方法は、活性化Ｔ細胞を使用して、対象における抗原を同定するステップをさらに含む。さらに、対象が疾患または状態に感染しており、それに関連する少なくとも１つの抗原を有する場合、提供される方法は、活性化Ｔ細胞を使用して、少なくとも１つの抗原を同定するステップをさらに含む。抗原は、例えば、これだけに限定することなく、腫瘍抗原、自己免疫障害もしくは状態、または感染性疾患もしくは病原体に関する抗原を含み得る。方法は、少なくとも１つの抗原を、研究のために、または少なくとも１つの抗原に基づくワクチンを開発するために、標的分子としてスクリーニングするステップをさらに含む。
【０６７５】
Ｔ細胞応答のモジュレーションが利益になる状態の処置
外来性作用物質（例えば、ポリペプチド）を含む（例えば、提示する）操作された赤血球系細胞を投与する方法は、例えば、そのそれぞれの全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１５／０７３５８７およびＷＯ２０１５／１５３１０２に記載されている。
【０６７６】
複数の実施形態では、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞を含むａＡＰＣを、対象、例えば哺乳動物、例えばヒトに投与する。処置することができる例示的な哺乳動物としては、これだけに限定することなく、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療および獣医学的適用のどちらにも適用可能である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０６７７】
一部の実施形態では、赤血球系細胞を、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、または６カ月ごとに患者に投与する。
【０６７８】
一部の実施形態では、赤血球系細胞の用量は、細胞約１×１０９〜２×１０９個、２×１０９〜５×１０９個、５×１０９〜１×１０１０個、１×１０１０〜２×１０１０個、２×１０１０〜５×１０１０個、５×１０１０〜１×１０１１個、１×１０１１〜２×１０１１個、２×１０１１〜５×１０１１個、５×１０１１〜１×１０１２個、１×１０１２〜２×１０１２個、２×１０１２〜５×１０１２個、または５×１０１２〜１×１０１３個を含む。
【０６７９】
一部の実施形態では、赤血球系細胞を、投与される赤血球系細胞の患者の血流中での機能を２週間〜１年、例えば、１カ月〜１年またはそれよりも長く、例えば、少なくとも２週間、４週間、６週間、８週間、３カ月、６カ月、１年、２年にわたって維持するために十分な投薬レジメン（投与の用量および周期性）で、患者に投与する。
【０６８０】
一部の実施形態では、赤血球系細胞（例えば、本明細書に記載のａＡＰＣ）を、２またはそれよりも多くの用量（例えば、２、３、４またはそれよりも多くの用量）で患者に投与する。さらなる実施形態では、赤血球系細胞（例えば、本明細書に記載のａＡＰＣ）を、２またはそれよりも多くの用量で患者に投与し、ここで、第２の用量は、第１の用量の後、Ｔ細胞増殖がピークであると決定された時点で投与される。一部の実施形態では、本開示のａＡＰＣを第１の用量で投与し、第１の用量によりＴ細胞増殖および活性化を刺激する。第１の用量の後、Ｔ細胞が活性化され、増殖がピークの時に、Ｔ細胞拡大を刺激するために、本開示のａＡＰＣを第２の用量で投与する。理論に束縛されることなく、本開示のａＡＰＣを２またはそれよりも多くの用量で投与することにより、ａＡＰＣのメモリーＴ細胞集団を追加免疫する能力が増大し、それによって、より長い有効性、例えば、腫瘍の再燃または感染因子による再チャレンジに対する有効性がもたらされる。
【０６８１】
ピークＴ細胞増殖は、当業者に公知の方法を使用して決定することができる。例えば、ピークＴ細胞増殖は、増殖しているＴ細胞による３Ｈ−チミジン組入れによって、または増殖しているＴ細胞を蛍光色素である５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識することによって決定することができる。
【０６８２】
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法であって、処置を必要とする対象に、本明細書に記載の組成物、例えば、本明細書に記載のａＡＰＣを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。一部の実施形態では、疾患または状態は、自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、感染因子に関連するまたはそれが引き金になる自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、感染性疾患である。
【０６８３】
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載の疾患または状態、例えば、がん、自己免疫疾患、例えば、感染因子が引き金になる自己免疫疾患、または感染性疾患を処置するための、本明細書に記載のａＡＰＣの使用を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載の疾患または状態、例えば、がん、自己免疫疾患、例えば、感染因子が引き金になる自己免疫疾患、または感染性疾患を処置するための医薬を製造するための、本明細書に記載のａＡＰＣの使用を提供する。
【０６８４】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の治療薬（例えば、抗がん治療薬、自己免疫治療薬、感染性疾患治療薬）を含む第１の外来性ポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、第１の治療薬は、抗原、例えば、腫瘍抗原、感染因子が引き金になる自己免疫疾患などの自己免疫障害もしくは状態に関する抗原、または感染性疾患もしくは病原体に関する抗原である。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、第２の外来性ポリペプチドをさらに含み、第２の外来性ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩを含む。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、第３の外来性ポリペプチドをさらに含み、第３の外来性ポリペプチドは、本明細書に開示される少なくとも１つの共刺激ポリペプチド、共阻害ポリペプチド、またはＴｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む。
【０６８５】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の治療薬（例えば、抗がん治療薬、自己免疫治療薬、感染性疾患治療薬）を含む第１の外来性ポリペプチドおよび第２の治療薬（例えば、抗がん治療薬、自己免疫治療薬、感染性疾患治療薬）を含む第２の外来性ポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、治療薬は、抗原ポリペプチド、例えば、腫瘍抗原、感染因子が引き金になる自己免疫疾患などの自己免疫障害もしくは状態に関する抗原、または感染性疾患もしくは病原体に関する抗原である。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、第３の外来性ポリペプチドをさらに含み、第３の外来性ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩを含む。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、第４の外来性ポリペプチドをさらに含み、第４の外来性ポリペプチドは、本明細書に開示される少なくとも１つの共刺激ポリペプチド、共阻害ポリペプチド、またはＴｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む。
【０６８６】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の治療薬（例えば、抗がん治療薬、自己免疫治療薬、感染性疾患治療薬）を含む第１の外来性ポリペプチド、第２の治療薬（例えば、抗がん治療薬、自己免疫治療薬、感染性疾患治療薬）を含む第２の外来性ポリペプチド、および第３の治療薬（例えば、抗がん治療薬、自己免疫治療薬、感染性疾患治療薬）を含む第３の外来性ポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、治療薬は、抗原ポリペプチド、例えば、腫瘍抗原、自己免疫障害もしくは状態に関する抗原、または感染性疾患もしくは病原体に関する抗原である。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、第４の外来性ポリペプチドをさらに含み、第４の外来性ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩを含む。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、第５の外来性ポリペプチドをさらに含み、第３の外来性ポリペプチドは、本明細書に開示される少なくとも１つの共刺激ポリペプチド、共阻害ポリペプチド、またはＴｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む。
【０６８７】
複数の実施形態では、第１の治療薬、第２の治療薬および第３の治療薬のうちの任意の２つまたはそれよりも多くは、同じ標的、例えば、細胞表面受容体および／または内在性ヒトタンパク質を認識し得る、それに結合し得る、および／または作用し得る。あるいは、第１の治療薬、第２の治療薬および第３の治療薬は、異なる標的に作用し得る。
【０６８８】
第１の標的、第２の標的または第３の標的は、同じ生物学的経路のメンバーであってもよく、必要に応じて、標的は、細胞表面受容体、内在性ヒトタンパク質である。本明細書で使用される場合、「経路」または「生物学的経路」という用語は、一緒に逐次的に作用する複数の生体分子、例えば、ポリペプチドを指す。経路の例としては、シグナルトランスダクションカスケードおよび補体カスケードが挙げられる。一部の実施形態では、経路は、細胞外シグナルの検出で始まり、標的遺伝子の転写の変化で終わる。一部の実施形態では、経路は、細胞質シグナルの検出で始まり、標的遺伝子の転写の変化で終わる。経路は、直鎖または分枝であり得る。分枝の場合、複数の入力（収束）、または複数の出力（発散）を有し得る。
【０６８９】
第１の標的、第２の標的または第３の標的は、同じ細胞型におけるものであっても、異なる細胞型におけるものであってもよい。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、第１の細胞、例えば第１の細胞型に結合し、第２の外来性ポリペプチドは、第２の細胞、例えば第２の細胞型に結合する。一部の実施形態では、第１の細胞型と第２の細胞型は同じである。一部の実施形態では、第１の細胞型と第２の細胞型は異なる。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、操作された赤血球系細胞を所望の部位、例えば、ヒト細胞に局在化させるものであり、第２の外来性ポリペプチドは、治療的活性、例えば、抗原提示活性を有する。
【０６９０】
ある特定の実施形態では、治療薬は、特異的な標的と相互作用するように選択される好適な外来性抗原である。好適な標的としては、特異的な疾患、障害、または状態（例えば、がん、自己免疫疾患、感染性疾患）に関連する実体が挙げられる。しかし、標的は、特異的な疾患、障害、または状態とは関係なく選択することもできる。
【０６９１】
一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドおよび第２の外来性ポリペプチド、または第１の外来性ポリペプチドおよび第２の外来性ポリペプチドおよび第３の外来性ポリペプチドの効果は、相乗的である。「相乗的」または「相乗作用」という用語は、２つまたはそれよりも多くの作用物質（例えば、操作された赤血球系細胞の一部であるポリペプチド）の組合せの効果が、それらの個々の効果と比較した相加効果よりも大きいことを意味する。ある特定の実施形態では、相乗的活性は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の、第１のポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞および第２のポリペプチドを含む操作された赤血球系細胞の効果と比較した相加効果よりも大きい。一部の実施形態では、相乗的活性は、第１の作用物質により検出可能なレベルの出力Ｘが生じ、第２の作用物質により検出可能なレベルの出力Ｘが生じ、第１の作用物質と第２の作用物質とを合わせて出力Ｘの相加レベルよりも大きなものが生じる場合に存在する。
【０６９２】
がん
ある特定の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）または除核細胞を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、がんを処置するための治療薬（抗がん治療薬）を含む、ａＡＰＣを提供する。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の抗がん治療薬を含む第１の外来性ポリペプチドおよび第２の抗がん治療薬を含む第２の外来性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の抗がん治療薬を含む第１の外来性ポリペプチド、第２の抗がん治療薬を含む第２の外来性ポリペプチド、および第３の抗がん治療薬を含む第３の外来性ポリペプチドを含む。第１の抗がん治療薬、第２の抗がん治療薬および第３の抗がん治療薬のうちの任意の２つまたはそれよりも多くは、同じ標的、例えば、細胞表面受容体および／または内在性ヒトタンパク質に作用し得る。あるいは、第１の抗がん治療薬、第２の抗がん治療薬および第３の抗がん治療薬は、異なる標的に作用し得る。第１の標的、第２の標的および第３の標的のうちの任意の２つまたはそれよりも多くは、同じ生物学的経路のメンバーであってもよく、必要に応じて、標的は、細胞表面受容体、内在性ヒトタンパク質である。第１の標的、第２の標的または第３の標的は、異なる細胞型におけるものであってもよい。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、操作された赤血球系細胞を所望の部位、例えばヒト細胞に局在化させるものであり、第２の外来性ポリペプチドは、治療的活性、例えば、抗原提示活性を有する。
【０６９３】
ある特定の好ましい実施形態では、第１の治療薬は、抗原、例えば腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、第１の治療薬および第２の治療薬は、抗原、例えば腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、第１の治療薬、第２の治療薬および第３の治療薬は、抗原、例えば腫瘍抗原である。
【０６９４】
複数の実施形態では、ａＡＰＣは、追加的な外来性ポリペプチドをさらに含み、追加的な外来性ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）を含む。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、追加的な外来性ポリペプチドをさらに含み、追加的な外来性ポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、抗原提示ポリペプチドを含む追加的な外来性ポリペプチドおよび少なくとも１つの共刺激ポリペプチドを含む追加的な外来性ポリペプチドをさらに含む。
【０６９５】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、抗原提示ポリペプチド、例えばＭＨＣ分子（例えばＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）を含む第１の外来性ポリペプチドを含み、第２の外来性ポリペプチドは、抗原（例えば腫瘍関連抗原）を含む。
【０６９６】
本発明の一部の実施形態では、腫瘍において抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大および活性化するａＡＰＣ（ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を含むａＡＰＣ）を、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するａＡＰＣ（ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原を含むａＡＰＣ）と共に投与し、それによって、腫瘍およびリンパ節における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を活性化し、それによって、頑強な抗腫瘍応答を強化することができることが意図されている。一部の実施形態では、腫瘍において抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大および活性化するａＡＰＣを、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するａＡＰＣと共に投与し、それによって、腫瘍およびリンパ節における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を活性化し、それによって、免疫応答の頑強性を相乗的に増大させることができる。
【０６９７】
一部の実施形態では、第１の外来性抗原提示ポリペプチドおよび抗原（例えば、第１の腫瘍関連抗原）を含む第２の外来性ポリペプチドを含むａＡＰＣであって、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合物であるａＡＰＣを、第１の外来性抗原提示ポリペプチドおよび抗原（例えば、第２の腫瘍関連抗原）を含む第２の外来性ポリペプチドを含むａＡＰＣであって、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合物であるａＡＰＣと一緒に対象に投与する。一部の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を含むａＡＰＣおよび共刺激ポリペプチドを、ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原を含むａＡＰＣと共に投与することができる。他の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を含むａＡＰＣを、ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原を含むａＡＰＣおよび共刺激ポリペプチドと共に投与することができる。一部の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉに伴う抗原を含むａＡＰＣおよび共刺激ポリペプチドを、ＭＨＣ  ＩＩに伴う抗原を含むａＡＰＣおよび共刺激ポリペプチドと共に投与することができる。
【０６９８】
理論に束縛されることなく、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ腫瘍抗原提示には、強力な共刺激と組み合わせると、持続的な腫瘍特異的死滅を生じさせる潜在性があることが考えられる。
【０６９９】
抗原は、これだけに限定することなく、表１に示されている抗原の任意の１つもしくは複数、またはその抗原性部分を含めた当技術分野で公知の任意の腫瘍抗原またはその抗原性部分であり得ることが、本発明に包含される。表１に示されている抗原を含むａＡＰＣを使用して、がん、例えば、表１に示されている特定の抗原または抗原性ペプチドに対応する特定のがんを処置することができることが、当業者には理解されよう。
【０７００】
したがって、一部の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、本明細書に記載のａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。
【０７０１】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、腫瘍関連抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。表１に一緒に示されている、当該方法で処置されるがんなどの特定のがん、およびａＡＰＣに提示される抗原などの腫瘍関連抗原の任意の組合せが、本発明により意図されている。
【０７０２】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ１抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ１抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ１抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ２抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ２抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ２抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ３抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ３抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ３抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ４抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ５抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ５抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ５抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ６抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ６抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ６抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ７抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ７抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ７抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ８抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ８抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ８抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ９抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ９抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ９抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ１０抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ１０抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ１０抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ１１抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ１１抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ１１抗原である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ１２抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ１２抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ１抗原である。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ２抗原は、表１に示されているＭＡＧＥ−Ａ１２抗原である。
【０７０３】
一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【０７０４】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａ抗原の免疫原性ペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＭＡＧＥ−Ａファミリーのいくつかの腫瘍抗原に共通するエピトープを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示され、ＭＡＧＥ−Ａ抗原の全てを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することが可能な免疫原性ペプチドであるｐ２４８ｖ９である。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、免疫原性ペプチドｐ２４８ｇ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ（配列番号１５６））である。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、免疫原性ペプチドｐ２４８ｄ９（ＹＬＥＹＲＱＶＰＤ（配列番号１２５））である。
【０７０５】
一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【０７０６】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、好中球顆粒プロテアーゼ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、好中球エラスターゼ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、プロテイナーゼ３抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、カテプシンＧ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。
【０７０７】
一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の実施形態では、がんは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。一部の実施形態では、がんは、乳がんである。一部の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【０７０８】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＰＲ１（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号２２５））を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。
【０７０９】
一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の実施形態では、がんは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。一部の実施形態では、がんは、乳がんである。一部の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【０７１０】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。
【０７１１】
一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺がんである。一部の実施形態では、がんは、卵巣がんである。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【０７１２】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２由来ペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２に由来する少なくとも１つの外来性ＨＬＡクラスＩ結合性ポリペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１０）である。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２に由来する少なくとも１つの外来性ＨＬＡクラスＩＩ結合性ポリペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号１１４）である。
【０７１３】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、
【化１２】
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から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原を含む。一部の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原は、表１に示されている１つまたは複数のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原である。
【０７１４】
一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺がんである。一部の実施形態では、がんは、卵巣がんである。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【０７１５】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ｇｐ１００ポリペプチドである、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ｇｐ１００ポリペプチドであり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、それを細胞表面に含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合し、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合物またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合物であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ１００抗原である、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合し、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドもしくは一本鎖融合物またはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドもしくは一本鎖融合物であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ１００抗原であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、それを細胞表面に含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、外来性抗原ポリペプチドが、外来性抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に特異的に結合し、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合物であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ１００抗原である、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩ−２Ｄｂである。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは一本鎖融合物であり、外来性抗原ポリペプチドが、ｇｐ１００抗原であり、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、それを細胞表面に含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬである。一部の実施形態では、外来性抗原提示ポリペプチドは、ＭＨＣＩ−２Ｄｂである。
【０７１６】
一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、
【化１３】
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から選択されるｇｐ１００抗原を含む。一部の実施形態では、ｇｐ１００抗原は、表１に示されている１つまたは複数のｇｐ１００抗原である。
【０７１７】
一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺がんである。一部の実施形態では、がんは、卵巣がんである。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【０７１８】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、テロメラーゼ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ヒトテロメラーゼを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【０７１９】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（配列番号６５８）を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。
【０７２０】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号６５９）を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。
【０７２１】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ（配列番号６６３）を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。
【０７２２】
別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＬＴＤＬＱＰＹＭＲＱＦＶＡＨＬ（配列番号６６４）を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。
【０７２３】
一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【０７２４】
別の態様では、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＰＲ１（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号２２５））を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。別の態様では、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＰＲ１（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号２２５））を含み、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、それを細胞表面に含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。別の態様では、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性抗原ポリペプチドの１つが、ＰＲ１（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号２２５））を含み、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、それを細胞表面に含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。別の態様では、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を処置する方法であって、対象に、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）と融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２と融合した少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ＰＲ１（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号２２５））を含むａＡＰＣであって、赤血球系細胞が、共刺激ポリペプチドを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、それを細胞表面に含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。別の態様では、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を処置する方法であって、対象に、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）と融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２と融合した少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチド、ＰＲ１（ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号２２５））を含むａＡＰＣであって、赤血球系細胞が、４−１ＢＢＬを含む少なくとも１つの外来性ポリペプチドをさらに提示する、例えば、それを細胞表面に含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。
【０７２５】
本開示は、ある特定の型のがんに限定されるのではなく、あらゆるがんが、本明細書に記載のａＡＰＣによって処置されることが意図されている。ある特定の実施形態では、がんとして、これらに限定されないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明のがん、骨に広がったがん、脳に広がったがん、肝臓に広がったがん、肺に広がったがん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮体がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、妊娠性絨毛性腫瘍（ＧＴＴ）、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎がん、喉頭がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫である皮膚がん、中皮腫、男性のがん、奇胎妊娠、口腔および中咽頭がん、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道がん、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、前立腺がん、稀ながん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん（非黒色腫）、軟部組織肉腫、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん、子宮がん、膣がん、および外陰がんから選択されるがんが挙げられる。
【０７２６】
ある特定の実施形態では、がんは、白血病、例えば、ＡＭＬまたはＡＬＬである。他の実施形態では、がんは、肝細胞癌である。さらに他の実施形態では、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん、リンパ腫、および腎明細胞癌から選択される。
【０７２７】
ネオ抗原は、ゲノムにコードされるタンパク質のアミノ酸配列が変更される腫瘍特異的突然変異（複数可）から生じる腫瘍抗原のクラスである。ネオ抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含み得る。突然変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフトインデル（挿入もしくは欠失）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位の変更、ゲノム再構成もしくは遺伝子融合、またはｎｅｏＯＲＦを生じる任意のゲノムもしくは発現の変更を含み得る。突然変異は、スプライスバリアントも含み得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常なリン酸化を含み得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、プロテアソームにより生成されたスプライスされた抗原も含み得る。Liepe  et  al.,  A  large  fraction  of  HLA  class  I  ligands  are  proteasome-generated  spliced  peptides;  Science.  2016  Oct.  21;  354  (6310):354-358を参照されたい。腫瘍ネオ抗原は、対象の腫瘍細胞または組織に存在するが、対象の対応する正常な細胞または組織には存在しないネオ抗原である。
【０７２８】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データセットの最近の解析により、腫瘍のゲノム分野と腫瘍免疫が結び付けられ、それによって、ネオ抗原負荷がＴ細胞応答の駆動（Brown  et  al.,  Genome  Res.  2014  May;  24(5):743-50,  2014）および免疫浸潤に関連する体細胞突然変異の同定（Rutledge  et  al.,  Clin  Cancer  Res.  2013  Sep  15;  19(18):4951-60,  2013）に関係付けられた。Rooney  et  al.（2015  Jan  15;  160(1-2):  48-61）により、ネオ抗原およびウイルスによって細胞溶解活性が駆動される可能性が高いことが示唆され、腫瘍が免疫攻撃に抵抗できるようにする公知のおよび新規の突然変異が明らかにされている。
【０７２９】
一部の実施形態では、抗原は、対象におけるがん細胞から同定されるネオ抗原である。一部の実施形態では、ネオ抗原は、共有されるネオ抗原である。ネオ抗原を同定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０５５，５４０号に記載されている。ネオ抗原ポリペプチドおよび共有されるネオ抗原ポリペプチドは、例えば、これら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３３４５２、米国特許出願公開第２０１８００５５９２２号、Schumacher  and  Hacohen  et  al.  (Curr  Opin  Immunol.  2016  Aug;41:98-103)、Gubin,  MM  et  al.  (Nature.  2014  Nov  27;515(7528):577-81)、Schumacher  and  Schreiber,  Science.  2015  Apr  3;348(6230):69-74)、Ott  PA.,  et  al.,  Nature.  2017  Jul  13;547(7662):217-221に記載されている。
【０７３０】
したがって、一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ネオ抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、ｂｉｏｐｈａｒｍ．ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｔｓｎａｄｂで入手可能なＴｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＴＳＮＡｄｂ  ｖ１．０）に記載されており、また、Wu  et  al.,  Genomics  Proteomics  Bioinformatics  16  (2018)  276-282に記載されているネオ抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、外来性抗原ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０５５，５４０号に記載されているネオ抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、ネオ抗原ポリペプチドは、表１４に列挙されているポリペプチドから選択される。
【表１４】
2021506304.tif 000099
【０７３１】
一部の実施形態では、ネオ抗原ポリペプチドは、表１５に列挙されているポリペプチドから選択される。
【表１５】
2021506304.tif 000100
【０７３２】
高度に侵攻性の正中神経膠腫に関しては、ヒストン３遺伝子における再発性点突然変異（Ｈ３Ｆ３Ａ）により、２７位におけるリシンからメチオニンへのアミノ酸の変化（Ｋ２７Ｍ）が引き起こされる。Ochs  et  al.  (Oncoimmunology.  2017;  6(7):e1328340、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により、Ｋ２７Ｍ突然変異体ヒストン３に対するペプチドワクチンによって、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）ヒト化マウスモデルにおいて有効な突然変異特異的な細胞傷害性Ｔ細胞媒介性免疫応答およびヘルパーＴ１細胞媒介性免疫応答を誘導することが可能であることが示された。したがって、一部の実施形態では、ネオ抗原ポリペプチドは、Ｈ３Ｆ３Ａ（Ｋ２７Ｍ）（配列番号８９０）である。
【０７３３】
一部の実施形態では、がんは、腫瘍形成ウイルス、例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎（ＨＢＶおよびＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）、ならびにポリオーマウイルスに関連するがんである。他のある特定の実施形態では、がんは、レトロウイルスエピトープが同定されるがんである。ウイルスに関連し、本発明の方法を使用して処置することができるがんとしては、これらに限定されないが、子宮頸がん、頭頸部がん、リンパ腫、および腎明細胞癌が挙げられる。
【０７３４】
腫瘍抗原は、Ｔ細胞受容体によって認識されるにはＨＬＡに制限された様式で提示されなければならないので、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子が、免疫系による免疫認識およびその後の新生細胞の死滅に必要である。一部の腫瘍細胞は、免疫認識からエスケープし、腫瘍免疫エスケープを容易にするために、免疫コンピテント細胞に対する阻害物質リガンドとして機能する非古典的ＨＬＡ−Ｉ分子（ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇ）の異所性発現を使用する（Moreau  et  al.,  Cell  Mol  Life  Sci.  2002  Sep；59(9):1460-6、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）は、アルファ１ドメイン、アルファ２ドメイン、およびアルファ３ドメインの１つまたは複数を含むα重鎖を含む非古典的ＭＨＣクラスＩ分子である。
【０７３５】
一部の実施形態では、人工抗原提示細胞は、細胞表面に外来性抗原ポリペプチドを含み、外来性抗原ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｇ由来ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｇ由来ポリペプチドは、以下に示すポリペプチドから選択される：
ＨＬＡ−Ｇ１４６−１５４−ＤＹＬＡＬＮＥＤＬ（配列番号８９１）
ＨＬＡ−Ｇ１９４−２０２−ＲＹＬＥＮＧＫＥＭ（配列番号８９２）
ＨＬＡ−Ｇ１３９−１４８−ＲＹＡＹＤＧＫＤＹＬ（配列番号８９３）
ＨＬＡ−Ｇ１４１−１５０−ＡＹＤＧＫＤＹＬＡＬ（配列番号８９４）
【０７３６】
一部の実施形態では、上に示したペプチド（配列番号８９１〜８９４）は、特異的なＨＬＡ−Ａ対立遺伝子：ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２：０１：０１）に結合する。一部の実施形態では、上に示したペプチド（配列番号８９１〜８９４）は、本明細書に記載の他のＨＬＡ対立遺伝子に結合する。
【０７３７】
特定の一実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）と融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２と融合した、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ２に制限されるペプチドである、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドＰＲ１（ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ）を提示する、例えば、それを細胞表面に含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０７３８】
ある特定の実施形態では、本開示のａＡＰＣを使用して、高度に新生血管形成した腫瘍を処置する。理論に束縛されることなく、新生血管形成が多いほど、腫瘍が本開示の除核細胞（例えば、赤血球系細胞）を含むａＡＰＣにより近づきやすくなる。腫瘍血管分布は、例えば、毛細血管間の距離（腫瘍酸素化を反映すると考えられる）および微小血管の密度（腫瘍血管新生の組織学的評価をもたらす）によって測定することができる。高度に血管形成された腫瘍は、血管起源のあらゆる腫瘍、例えば、血管腫、リンパ管腫、血管内皮腫、カポジ肉腫、血管肉腫、血管芽細胞腫であり得る。
【０７３９】
他の実施形態では、本開示のａＡＰＣを使用して、漏れやすい脈管構造を有する腫瘍を処置する。腫瘍における血管は異常であるという一般的な合意が存在する。この異常の１つの顕在化は、欠陥がある漏れやすい内皮である。血管の漏れやすさは、腫瘍の内部環境だけでなく、おそらく血管新生の速度にも影響を及ぼすが、治療薬の接近も支配する。理論に束縛されることなく、血管がより漏れやすいものであるほど、本開示の除核細胞（例えば、赤血球系細胞）を含むａＡＰＣへのより大きな接近がもたらされる。
【０７４０】
自己免疫疾患
過去２０年にわたり、様々な自己免疫障害の処置に関してかなりの進歩がなされ、結果として、多くの患者が生活の質の改善を享受してきた。それらの成功にもかかわらず、自己免疫疾患に対する現行の治療手法は、広くまたは特異的に免疫抑制性であり、ＪＡＫ阻害剤、抗ＴＮＦ抗体および抗ＣＤ２０標的化抗体を用いた場合のように、患者が日和見感染および血液がんのリスクの上昇にさらされる。症例の最大３分の１において、自己免疫障害を有する患者は、処置に応答することができず、応答する患者もその大多数が時間と共に最終的に応答を失う。
【０７４１】
大多数の自己免疫疾患の引き金は依然として不明であるが、臨床疾患は自身の細胞に対する寛容性が喪失した結果であることが一般に理解されている。許容される疾患のモデルにより、Ｔ細胞媒介性免疫抑制の崩壊を導く、環境事象が引き金になる遺伝的感受性が仮定される。原理上は、末梢性寛容の修復により、患者に完全なまたは部分的な治癒がもたらされるはずである。
【０７４２】
末梢性寛容修復のための種々の競合的手法が何年にもわたって調査されている。これらとしては、免疫抑制を伴ってまたは伴わずにタンパク質またはペプチドを経口投与および直接注射すること、ナノ粒子を有するペプチドを創出すること、および操作された調節性Ｔ細胞を養子移入することが挙げられる。これまで、これらの手法が後期臨床試験において上首尾であることは証明されていないが、当該分野は進歩し続けている。ペプチドおよびナノ粒子の直接投与には、細胞間シグナル伝達の効果を限定する、体内分布、安定性、提示および配向に関する課題が生じる。現在まで、養子移入手法は全て自己であり、他の細胞治療の適用を限定する同じ取扱いおよびスケーラビリティの問題のいくつかによって妨害されている。
【０７４３】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示のａＡＰＣは、自己免疫疾患を処置する新規かつ改善された方法を提供する。自己免疫疾患を処置するために提供される方法には、例えば、細胞（赤血球系細胞）の表面で抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣ  ＩまたはＩＩと共に抗原を有効に提示すること、および循環中のａＡＰＣの半減期が非常に長いことを含めた多数の利点があり、したがって、適正に提示された抗原への曝露の延長がもたらされる。
【０７４４】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、自己免疫疾患治療薬を含む、ａＡＰＣを提供する。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の自己免疫治療薬を含む第１の外来性ポリペプチドおよび第２の自己免疫治療薬を含む第２の外来性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の自己免疫治療薬を含む第１の外来性ポリペプチド、第２の自己免疫治療薬を含む第２の外来性ポリペプチド、および第３の自己免疫治療薬を含む第３の外来性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０７４５】
第１の自己免疫治療薬、第２の自己免疫治療薬および第３の自己免疫治療薬は、同じ標的、例えば、細胞表面受容体および／または内在性ヒトタンパク質に作用し得る。あるいは、第１の抗がん治療薬、第２の抗がん治療薬および第３の抗がん治療薬は、異なる標的に作用し得る。第１の標的、第２の標的または第３の標的は、同じ生物学的経路のメンバーであってもよく、必要に応じて、標的は、細胞表面受容体および／または内在性ヒトタンパク質である。第１の標的、第２の標的または第３の標的は、異なる細胞型におけるものであってもよい。複数の実施形態では、第１の自己免疫治療薬、第２の自己免疫治療薬および／または第３の自己免疫治療薬は、本明細書に記載の第１の外来性ポリペプチド、第２の外来性ポリペプチドおよび／または第３の外来性ポリペプチドである。例えば、一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、操作された赤血球系細胞を所望の部位、例えばヒト細胞に局在化させるものであり、第２の外来性ポリペプチドは、治療的活性、例えば、抗原提示活性を有する。
【０７４６】
一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）を含み、第２の外来性ポリペプチドは、抗原を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣＩは、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、およびＨＬＡ  Ｃから選択される。一部の実施形態では、ＭＨＣＩＩは、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβから選択される。好ましい実施形態では、抗原は、自己免疫障害に関連するまたは自己免疫障害の原因もしくは引き金であることが、当業者には認識されよう。例えば、抗原は、自己免疫応答が方向付けられる自己抗原であり得る。一部の実施形態では、抗原は、表１６に列挙されている抗原またはその抗原性部分から選択される。一部の実施形態では、抗原は、表１７に列挙されている抗原またはその抗原性部分から選択される。一部の実施形態では、抗原は、表１８に列挙されている抗原またはその抗原性部分から選択される。自己免疫障害を処置するための提供される方法では、ａＡＰＣが抗原提示ポリペプチドおよび表１６、１７または１８に列挙されている抗原またはその抗原性部分を含む場合、表１６、１７または１８に提示されている抗原に対応する自己免疫障害を処置するために、ａＡＰＣを対象に投与することができる。
【０７４７】
一態様では、ａＡＰＣを、自己免疫障害に関連するまたは自己免疫障害を駆動する望ましくないＴ細胞活性を抑制するように設計する。したがって、一部の実施形態では、ａＡＰＣは、本明細書に記載の少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、表７に列挙されている共阻害ポリペプチドから選択される。一部の実施形態では、外来性共阻害ポリペプチドは、ＩＬ−３５、ＩＬ−１０、ＶＳＩＧ−３およびＬＡＧ３アゴニストから選択される。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、自己反応性Ｔ細胞を抑制するものである。
【０７４８】
別の態様では、ａＡＰＣにより調節性Ｔ細胞が刺激され、それによって、免疫系がより寛容原性の状態に戻る方に偏るように、ａＡＰＣを設計する。したがって、一部の実施形態では、ａＡＰＣは、本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ポリペプチドをさらに含む。この態様では、好ましい実施形態では、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を拡大させる、例えば、本明細書に記載の外来性Ｔｒｅｇ共刺激ポリペプチドである。一部の実施形態では、外来性共刺激ポリペプチドは、表１０に列挙されている共刺激ポリペプチドから選択される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、表１１に列挙されている共刺激ポリペプチドから選択される。
【０７４９】
さらに別の態様では、ａＡＰＣにより、Ｔ細胞、例えば細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞が拡大し、刺激されるように、ａＡＰＣを設計する。この態様では、自己免疫障害は、感染因子によって引き起こされるまたはそれが引き金になる自己免疫障害であることが好ましい。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、本明細書に記載の少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドをさらに含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させるものである。一部の実施形態では、外来性共刺激ポリペプチドは、表６に列挙されている共刺激ポリペプチドから選択される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５と融合したＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。この態様は、以下でより詳細に記載する。
【０７５０】
一部の態様では、本開示は、自己免疫疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に、本明細書に記載の赤血球系細胞を有効数で投与するステップを含み、それによって、自己免疫疾患を処置する方法を提供する。種々の実施形態では、自己免疫疾患は、表１６、１７または１８に提示されている自己免疫疾患であり得る。そのような方法では、自己免疫障害を処置するために有用なａＡＰＣは、外来性抗原提示ポリペプチドおよび抗原ポリペプチドを含み、抗原ポリペプチドは、表１６、１７または１８に列挙されている抗原またはその抗原性部分であり得、表１６、１７または１８に提示されている抗原を含むａＡＰＣを使用して、表１６、１７または１８に列挙されている対応する自己免疫障害を処置する。
【０７５１】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患である多発性硬化症（ＭＳ）を有する対象を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＭＯＧである少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、それを細胞表面に含む赤血球系細胞を含む。特定の一実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＭＯＧである少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、それを細胞表面に含む赤血球系細胞と、ＭＨＣＩＩ一本鎖融合物である外来性抗原提示ポリペプチドとを含み、抗原提示ポリペプチドは、ＧＰＡと融合している（ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ）。一部の実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＭＯＧである少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、それを細胞表面に含む赤血球系細胞と、外来性抗原提示ポリペプチドであって、外来性抗原ポリペプチドと特異的に結合している、ＭＨＣＩＩ一本鎖融合物である外来性抗原提示ポリペプチドと、少なくとも１つのＴｒｅｇ拡大／共刺激ポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ拡大／共刺激ペプチドは、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２である。さらなる実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＭＯＧである少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、それを細胞表面に含む赤血球系細胞と、外来性抗原提示ポリペプチドであって、外来性抗原ポリペプチドと特異的に結合している、ＭＨＣＩＩ一本鎖融合物である外来性抗原提示ポリペプチドと、少なくとも１つの共阻害ポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、共阻害ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１である。
【０７５２】
一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０７５３】
一部の実施形態では、自己免疫疾患は、単一抗原疾患である。単一抗原疾患およびそれらの関連する抗原の例を以下の表１６に示す。
【表１６】
2021506304.tif 000101
【０７５４】
別の実施形態では、自己免疫疾患は、多抗原疾患である。自己免疫疾患が多抗原疾患である実施形態では、対象を、抗原のうちの１つよりも多く、例えば、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くを標的とするａＡＰＣを用いて処置することができる。多数の抗原が同じａＡＰＣに存在してもよく、別個のａＡＰＣに存在してもよく、この場合、単一抗原を含む２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くの別個のａＡＰＣの組合せを、障害を処置するために対象に投与することが、当業者には認識されよう。多抗原疾患およびそれらの関連する抗原の例を以下の表１７に示す。
【表１７】
2021506304.tif 000102
【０７５５】
ある特定の実施形態では、自己免疫疾患は、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、視神経脊髄炎、水疱性類天疱瘡、小児脂肪便症、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、および膜様糸球体腎炎からなる群から選択される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、以下の表１８に列挙されているものから選択される。
【表１８−１】
2021506304.tif 000103
【表１８−２】
2021506304.tif 000104
【０７５６】
ある特定の実施形態では、本発明のａＡＰＣを使用して、１型糖尿病を有する対象における寛容誘導を駆動する。特定の一実施形態では、人工抗原提示細胞は、赤血球系細胞を含み、赤血球系細胞は、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを提示する、例えば、細胞表面に含み、抗原性ペプチドは、インスリンＢ鎖、特にインスリンＢ鎖の一部である。ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖の一部は、インスリンＢ鎖のアミノ酸９〜２３である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核細胞である。
【０７５７】
免疫活性化に関する疾患は、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、小児脂肪便症、または他の特発性炎症性腸疾患などの炎症性疾患も含む。免疫活性化に関する疾患は、例えば、喘息、ピーナッツアレルギー、甲殻類アレルギー、花粉アレルギー、乳タンパク質アレルギー、昆虫刺傷アレルギー、およびラテックスアレルギー、動物鱗屑アレルギー、クログルミおよびペルシャグルミアレルギー、ブラジルナッツアレルギー、カシューナッツアレルギー、クリアレルギー、チリダニアレルギー、卵アレルギー、魚アレルギー、ヘーゼルナッツアレルギー、カビアレルギー、花粉アレルギー、イネ科植物アレルギー、甲殻類アレルギー、大豆アレルギー、木の実アレルギーならびに小麦アレルギーなどのアレルギー性疾患も含む。
【０７５８】
免疫活性化に関する疾患は、一次の状態を処置するために投与される治療用タンパク質、例えば、血友病Ａにおける凝固第ＶＩＩＩ因子、血友病Ｂにおける凝固第ＩＸ因子、関節リウマチおよび他の炎症性疾患における抗腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）抗体、ゴーシェ病におけるグルコセレブロシダーゼ、酵素補充療法に使用される任意の組換えタンパク質、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるアスパラギナーゼなどに応答した、治療用タンパク質の有効性を低下させる免疫活性化も含む。
【０７５９】
一部の実施形態では、患者は、患者の免疫系が内在性（自己）分子、例えば、タンパク質抗原に対して活性であり、その結果、免疫系により内在性分子が攻撃され、炎症が誘導され、組織が損傷を受け、他の点では、自己免疫性または自己抗体疾患または状態の症状が引き起こされる、自己免疫疾患もしくは状態または自己抗体媒介性疾患もしくは状態に罹患している。免疫応答は、内在性分子に結合する抗体によって駆動され得る、または内在性分子を発現する細胞を攻撃する過敏性Ｔ細胞によって駆動され得る、または調節性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、もしくはＢ細胞などの他の免疫細胞によって駆動され得る。これらの実施形態では、内在性（自己）分子に対応する抗原性タンパク質またはその断片を、本明細書に記載の１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）赤血球系細胞を含むａＡＰＣにおいて発現させることができる。ａＡＰＣは、疾患または状態に罹患している患者に１回または複数回投与されると、抗原性タンパク質に対する寛容性を誘導し、その結果、もはや抗原性タンパク質により免疫系の活性化が誘導されないようにするのに十分になり、したがって、基礎をなす疾患または状態の症状が処置されるまたは改善する。ある特定の実施形態では、ａＡＰＣを使用して調節性Ｔ細胞を刺激し、それによって、免疫系を、内在性（自己）分子に対してより寛容原性の状態に戻る方に偏らせる。
【０７６０】
一部の実施形態では、患者は、アレルギー性疾患、例えば、動物鱗屑、クログルミ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、チリダニ、卵、ペルシャグルミ、魚、ヘーゼルナッツ、昆虫毒液、ラテックス、乳、カビ、ピーナッツ、花粉、イネ科植物、甲殻類、大豆、木の実、または小麦に対するアレルギーに罹患している。アレルギーに罹患している患者では、例えば、食事、皮膚接触、注射、または環境曝露を通じてアレルゲンの抗原断片と接触すると、免疫応答が開始され得る。免疫応答は、ＩｇＥ抗体、感作肥満細胞、脱顆粒、ヒスタミンの放出、およびアナフィラキシー、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、調節性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好中球、およびＮＫＴ細胞のような標準的な免疫細胞を伴い得る。アレルギー反応により、不快感が引き起こされる可能性がある、またはアレルギー反応は死亡を引き起こすほど重症になる可能性があり、したがって、罹患者の一部ならびに彼または彼女の家族および世話人には一定の警戒が必要になる。これらの実施形態では、抗原性タンパク質またはその断片を、本開示のａＡＰＣの赤血球系細胞に提示させることができる。これらの細胞の集団は、アレルギー性疾患または状態に罹患している患者に１回または複数回投与されると、抗原性タンパク質に対する寛容性を誘導し、その結果、もはや抗原性タンパク質に曝露しても免疫系の活性化が誘導されないようにするのに十分になり、したがって、基礎をなすアレルギー性疾患または状態の症状が処置されるまたは改善する。
【０７６１】
感染因子に関連する自己免疫疾患
一部の実施形態では、本開示は、感染因子に関連するまたはそれが引き金になる自己免疫疾患または障害を処置するための方法を提供する。感染因子に関連するまたはそれが引き金になる例示的な自己免疫疾患または障害を表１９に提示する。
【表１９−１】
2021506304.tif 000105
【表１９−２】
2021506304.tif 000106
【０７６２】
これらに限定することなく、表１９に示されている障害を含めた、感染因子に関連する任意の自己免疫障害は、本発明のａＡＰＣを用いて処置されることが意図されている。
【０７６３】
本開示において提示される通り、感染因子に関連する自己免疫疾患を、抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩなどのＭＨＣ分子）を含む第１の外来性ポリペプチド、および感染因子由来の抗原またはその断片を含む第２の外来性ポリペプチド（すなわち、疾患の引き金になる特定の感染因子を標的化する）を含むａＡＰＣを対象に投与することによって処置することができる。
【０７６４】
特定の実施形態では、感染因子に関連する自己免疫障害を処置するために有用なａＡＰＣは、少なくとも１つの共刺激ポリペプチドを含む第３の外来性ポリペプチドをさらに含む。ある実施形態では、感染因子が感染した細胞を標的化し、排除するために、共刺激ポリペプチドにより細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。例えば、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞により、感染因子が感染した自己反応性Ｂ細胞を標的とすること、抑制すること、および／または排除することができる。共刺激ポリペプチドは、本明細書に記載の任意の共刺激ポリペプチドであってもよい。複数の実施形態では、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させるものである。一部の実施形態では、外来性共刺激ポリペプチドは、表６に列挙されている共刺激ポリペプチドから選択される。一部の実施形態では、共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５と融合したＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０７６５】
一部の実施形態では、感染因子に関連する自己免疫疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）である。いくつかの感染因子がＭＳに関連付けられている。ＭＳに関連する例示的な感染因子を表２０に提示する。複数の実施形態では、自己免疫障害に関連する感染因子は、ウイルスである。
【表２０−１】
2021506304.tif 000107
【表２０−２】
2021506304.tif 000108
【０７６６】
一部の実施形態では、本開示は、ＭＳを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、表２０に列挙されている感染因子由来の抗原またはその免疫原性ペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、ＭＳを処置する方法を提供する。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、ＭＨＣ分子、および必要に応じて、共刺激ポリペプチドをさらに含む。
【０７６７】
特定の実施形態では、ＭＳに関連する感染因子は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、一次感染の間に、ＥＢＶは、扁桃において自己反応性ナイーブＢ細胞に感染し、それにより当該細胞が胚中心に入るよう駆動され、そこで強く増殖し、潜在的に感染した自己反応性メモリーＢ細胞に分化し、次いでそれが扁桃から出て血液中を循環すると考えられる。ＥＢＶに感染したＢ細胞の数は、通常、増殖している溶解感染したＢ細胞を死滅させるＥＢＶ特異的細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって制御されるが、この防御機構に欠陥がある場合には制御されない。生存しているＥＢＶに感染した自己反応性メモリーＢ細胞はＣＮＳに入り、そこに居を定め、ミエリンおよびＣＮＳの他の構成成分を攻撃するオリゴクローナルＩｇＧおよび病原性自己抗体を産生する。普通の全身性感染によって末梢リンパ臓器において活性化された自己反応性Ｔ細胞は血液中を循環し、ＣＮＳに入り、そこで、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したＣＮＳペプチド（Ｃｐ）を提示するＥＢＶに感染した自己反応性Ｂ細胞によって再活性化される。これらのＥＢＶに感染したＢ細胞により、自己反応性Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体に共刺激生存シグナル（Ｂ７）がもたらされ、それによって、活性化誘導性Ｔ細胞アポトーシスが阻害されるが、これは通常、自己反応性Ｔ細胞がＣＮＳに入り、Ｂ７共刺激分子を発現しないアストロサイトおよびミクログリアなどの非プロフェッショナル抗原提示細胞と相互作用すると起こる。自己反応性Ｔ細胞は、ＥＢＶに感染した自己反応性Ｂ細胞によって再活性化された後、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインを産生し、ＣＮＳに対する自己免疫性攻撃を調整し、結果としてオリゴデンドロサイトおよびミエリン破壊が生じる。
【０７６８】
したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＭＳを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＥＢＶ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＭＳを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、表１のＥＢＶ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＭＳを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ｇｐ３５０またはＥＢＮＡ１抗原から選択されるＥＢＶ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＭＳを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８）、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）、ＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１）、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号６９１）、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号６９２）、ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ（配列番号６９３）、ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（配列番号６９４）、ＲＬＲＡＥＡＱＶＫ（配列番号６９５）、ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ（配列番号６９６）、ＲＰＰＩＦＩＲＬＬ（配列番号６９７）から選択されるＥＢＶ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。そのようなａＡＰＣにより、ＥＢＶに感染した自己反応性Ｂ細胞が排除され、それによって、ＭＳが処置されることが予測される。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、ＭＨＣ分子、および必要に応じて、共刺激ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、ＥＢＶ由来の抗原は、ｇｐ３５０またはその免疫原性ペプチド（例えば、ＨＬＡ  Ａ２ペプチドＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８））である。一部の実施形態では、ＥＢＶ由来の抗原は、ＥＢＮＡ１またはその免疫原性ペプチド（例えば、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）、またはＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１））である。一部の実施形態では、ＥＢＶ由来の抗原は、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）である。一部の実施形態では、ＥＢＶ由来の抗原は、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）である。一部の実施形態では、ＥＢＶ由来の抗原は、ＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１）である。
【０７６９】
一部の実施形態では、本開示は、ＭＳを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ｇｐ３５０またはその免疫原性ペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、ＭＳを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ｇｐ３５０の免疫原性ペプチドは、ＨＬＡ  Ａ２ペプチドＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８）を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｇｐ３５０の免疫原性ペプチドは、ｇｐ３５０抗原を認識する細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができるものである。
【０７７０】
一部の実施形態では、本開示は、ＭＳを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＥＢＮＡ１またはその免疫原性ペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、ＭＳを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＥＢＮＡ１の免疫原性ペプチドは、ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ（配列番号６９９）、ＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶ（配列番号７００）、およびＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬ（配列番号７０１）から選択されるペプチドを含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＢＮＡ１の免疫原性ペプチドは、ＥＢＮＡ１抗原を認識する細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができるものである。
【０７７１】
本明細書に提示される通り、対象における感染因子に関連するまたはそれが引き金になる自己免疫疾患を処置するためにａＡＰＣを設計し、使用することができる代替的なやり方がいくつか存在する。例えば、感染因子に関連する自己免疫疾患を、代わりに、対象に、抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩなどのＭＨＣ分子）を含む第１の外来性ポリペプチド、抗原またはその断片を含む第２の外来性ポリペプチド、および必要に応じて、少なくとも１つの共阻害ポリペプチド、または少なくとも１つのＴｒｅｇ共刺激ポリペプチド（本明細書ではＴｒｅｇ拡大ポリペプチドとも称される）を含む第３の外来性ポリペプチドを含むａＡＰＣを投与することによって処置することができる。一部の実施形態では、抗原またはその抗原断片は、感染因子に由来する（すなわち、疾患の引き金になる感染因子を標的化する）。一部の実施形態では、抗原またはその抗原断片は、感染により誘導される自己免疫障害に関連する抗原（例えば、自己ポリペプチド）である。
【０７７２】
一部の実施形態では、任意の自己免疫障害についてより一般的に上記した通り、感染因子に関連する自己免疫障害を処置するために有用なａＡＰＣは、Ｔｒｅｇ共刺激／拡大ポリペプチドを含む。Ｔｒｅｇ共刺激／拡大ポリペプチドは、本明細書に記載の任意のＴｒｅｇ拡大ポリペプチドであってもよい。ある実施形態では、Ｔｒｅｇ共刺激／拡大ポリペプチドによりＴｒｅｇが拡大し、それにより今度は、対象において感染因子に応答して生成されるＴ細胞が抑制される。
【０７７３】
一部の実施形態では、任意の自己免疫障害についてより一般的に上記した通り、感染因子に関連する自己免疫障害を処置するために有用なａＡＰＣは、共阻害ポリペプチドを含む。共阻害ポリペプチドは、本明細書に記載の任意の共阻害ポリペプチドであってもよい。ある実施形態では、共阻害ポリペプチドにより、対象において感染因子に応答して生成されるＴ細胞が抑制される。
【０７７４】
別の実施形態では、自己免疫疾患は、感染因子に関連しない。感染因子に関連しない自己免疫疾患に関しては、本明細書の他の箇所の開示に基づいて、対象に、抗原提示ポリペプチド（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩなどのＭＨＣ分子）を含む第１の外来性ポリペプチド、抗原またはその断片を含む第２の外来性ポリペプチド（例えば、自己免疫活性が方向付けられる内在性（自己）ポリペプチド由来の抗原ポリペプチド）および少なくとも１つの共阻害ポリペプチドまたは少なくとも１つのＴｒｅｇ拡大ポリペプチドを含む第３の外来性ポリペプチドを含むａＡＰＣを投与することによって自己免疫疾患を処置することができることが、当業者には認識されよう。これらの実施形態では、自己免疫応答の引き金になる抗原に対する末梢性寛容を誘導するために、ａＡＰＣを対象に投与する。
【０７７５】
感染性疾患
ある特定の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）または除核細胞を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、感染性疾患治療薬を含む、ａＡＰＣを提供する。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核赤血球系細胞である。
【０７７６】
「感染性疾患治療薬」は、本明細書で使用される場合、感染性疾患を阻害する、例えば、感染性疾患の原因もしくは症状を軽減もしくは緩和する、または感染性疾患に関連するパラメーター、例えば、ウイルス負荷量もしくは細菌負荷量に関する値を改善する外来性ポリペプチドを指す。複数の実施形態では、感染性疾患治療薬は、他方の外来性ポリペプチドと共に存在するまたは発現された場合に感染性疾患を阻害する、第１の外来性ポリペプチドまたは第２の外来性ポリペプチドである。ある実施形態では、第１の感染性疾患治療薬または第２の感染性疾患治療薬は、他方の不在下で活性を有する。複数の実施形態では、感染性疾患治療薬は、感染性疾患を直接、例えば、病原体を死滅させることによって阻害するものである。複数の実施形態では、例えば、ワクチンのように、感染性疾患治療薬は、対象の免疫応答を刺激することによって感染性疾患を阻害するものである。
【０７７７】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の感染性疾患治療薬を含む第１の外来性ポリペプチドおよび第２の感染性疾患治療薬を含む第２の外来性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、第１の感染性疾患治療薬を含む第１の外来性ポリペプチド、第２の感染性疾患治療薬を含む第２の外来性ポリペプチド、および第３の感染性疾患治療薬を含む第３の外来性ポリペプチドを含む。
【０７７８】
第１の感染性疾患治療薬、第２の感染性疾患治療薬および第３の感染性疾患治療薬は、同じ標的、例えば、細胞表面受容体および／または内在性ヒトタンパク質に作用し得る。あるいは、第１の抗がん治療薬、第２の抗がん治療薬および第３の抗がん治療薬は、異なる標的に作用し得る。第１の標的、第２の標的または第３の標的は、同じ生物学的経路のメンバーであってもよく、必要に応じて、標的は、細胞表面受容体、内在性ヒトタンパク質である。第１の標的、第２の標的または第３の標的は、異なる細胞型におけるものであってもよい。一部の実施形態では、第１の外来性ポリペプチドは、操作された赤血球系細胞を所望の部位、例えばヒト細胞に局在化させるものであり、第２の外来性ポリペプチドは、治療的活性、例えば、抗原提示活性を有する。
【０７７９】
ある特定の好ましい実施形態では、感染性疾患治療薬は、抗原、例えば、病原体または感染因子由来の抗原である（「病原体」および「感染因子」は、本明細書では互換的に使用される）。一部の実施形態では、第１の治療薬が、抗原、例えば、病原体由来の抗原である。一部の実施形態では、第１の治療薬および第２の治療薬が、抗原、例えば、病原体由来の抗原である。ある特定の実施形態では、第１の治療薬、第２の治療薬および第３の治療薬が、抗原、例えば、病原体由来の抗原である。
【０７８０】
複数の実施形態では、ａＡＰＣは、追加的な外来性ポリペプチドをさらに含み、追加的な外来性ポリペプチドは、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）を含む。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、追加的な外来性ポリペプチドをさらに含み、追加的な外来性ポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、抗原提示ポリペプチドを含む追加的な外来性ポリペプチドおよび少なくとも１つの共刺激ポリペプチドを含む追加的な外来性ポリペプチドをさらに含む。
【０７８１】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）を含む第１の外来性ポリペプチド、および抗原を含む第２の外来性ポリペプチドを含む。種々の実施形態では、抗原は、病原体、例えば、ウイルス病原体、細菌病原体、真菌病原体、または寄生虫病原体の抗原である。
【０７８２】
抗原は、当技術分野で公知の任意の病原性抗原またはその抗原性部分であってもよいことが本発明に包含される。１つまたは複数の抗原性ペプチドを本発明の赤血球系細胞に提示させることができる例示的な病原体を下に詳述するが、それらに限定するものではない。種々の実施形態では、抗原性ペプチドは、以下の表２１、２２、２３および２４のいずれか１つに提示されている病原体に由来するものである。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、表２１に提示されている病原体に由来するものである。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、表２２に提示されている病原体に由来するものである。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、表２３に提示されている病原体に由来するものである。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、表２４に提示されている病原体に由来するものである。特定の病原体または感染因子に由来する抗原を含む本明細書に提示されるａＡＰＣを対象に投与して、その病原体または感染因子によって引き起こされる対象における感染を処置することができることが、当業者には認識されよう。特定の病原体または感染因子に由来する抗原を含む本明細書に提示されるａＡＰＣを対象に投与して、対象における疾患または障害を処置することができ、ここで、疾患、障害は、その病原体または感染因子の感染によって直接または間接的に引きこされるものであることが、当業者にはさらに認識されよう。
【０７８３】
一部の態様では、本開示は、感染性疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に、本明細書に記載の赤血球系細胞を有効数で投与するステップを含み、それによって、感染性疾患を処置する方法を提供する。
【０７８４】
別の態様では、本開示は、感染性疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）または除核細胞を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、病原性抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、感染性疾患を処置する方法を提供する。
【０７８５】
ある特定の実施形態では、感染性疾患治療薬は、ＣＡＭＰ、ＣＡＭＰ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２（抗菌ペプチドの配列および構造のコレクション）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ａｐｓ．ｕｎｍｃ．ｅｄｕ／ＡＰ／ｍａｉｎ．ｐｈｐにおいて見いだされる）、ＬＡＭＰ、ＢｉｏＰＤ、およびＡＤＡＭ（抗微生物ペプチドのデータベース）（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｓ．ｎｔｏｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／ａｄａｍ／において見いだされる）などの公的に入手可能なバイオインフォマティクスデータベースに列挙されている抗菌ポリペプチドから選択される。抗菌ペプチドデータベースは、それが含有するペプチドの供給源に基づいて、２つのカテゴリー、特定のデータベースおよび一般的なデータベースに分けることができる。これらのデータベースには、抗菌ペプチドの解析および予測のための種々のツールがある。例えば、ＣＡＭＰは、ＡＭＰ予測、フィーチャ算出、ＢＬＡＳＴ検索、ｃｌｕｓｔａｌＷ、ＶＡＳＴ、ＰＲＡＴＴ、ヘリカルホイールなどを含有する。さらに、ＡＤＡＭでは、使用者がＡＭＰ配列−構造関係によって検索または閲覧することが可能になる。
【０７８６】
ある特定の実施形態では、感染性疾患治療薬は、ウイルスポリペプチドから選択される。これらの実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）または除核細胞を含み、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つは、抗原性ウイルスポリペプチドを含み、ａＡＰＣを対象に投与して、ウイルスによる感染を処置する。
【０７８７】
ウイルス感染は、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、および風疹ウイルスを含む。他のウイルス標的としては、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ニューモウイルス、モルビリウイルス、メタニューモウイルス、レスピロウイルスまたはルブラウイルス）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アデノウイルス）、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどのアレナウイルス）、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスまたはウマ動脈炎ウイルス）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、フレボウイルスまたはハンタウイルス）、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ノーウォークウイルス）、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルスまたはトロウイルス）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラ様ウイルス）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヘパシウイルスまたはフラビウイルス）、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（例えば、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、またはリンホクリプトウイルス）、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルスまたはソゴトウイルス）、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パルボウイルス）、Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エンテロウイルスまたはヘパトウイルス）、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（例えば、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、またはレポリポックスウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レンチウイルスまたはスプーマウイルス）、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ロタウイルス）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、またはベシクロウイルス）、およびＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アルファウイルスまたはルビウイルス）が挙げられる。これらのウイルスの特定の例として、ヒト呼吸器コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ〜Ｃ、肝炎ウイルスＡ〜Ｇ、および単純ヘルペスウイルス１〜９が挙げられる。
【０７８８】
例示的なウイルス病原体を以下の表２１に示す。ある特定の実施形態では、ウイルス病原体は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から選択される。
【表２１−１】
2021506304.tif 000109
【表２１−２】
2021506304.tif 000110
【表２１−３】
2021506304.tif 000111
【０７８９】
ある特定の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、レトロウイルス抗原、および精巣抗原から選択される。例えば、ある特定の実施形態では、ウイルスは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）、およびポリオーマウイルスから選択される。一部の実施形態では、ウイルスは、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）である。
【０７９０】
一部の実施形態では、本開示は、腫瘍形成ウイルス（例えば、ＨＰＶ）に関連するがんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、表１のＨＰＶ抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、腫瘍形成ウイルス（例えば、ＨＰＶ）に関連するがんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＨＰＶ−Ｅ７抗原を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、腫瘍形成ウイルス（例えば、ＨＰＶ）に関連するがんを有する対象を処置する方法であって、対象に、外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、外来性ポリペプチドが、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号７１４）、またはＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（配列番号７１２）を含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）を含む。一部の実施形態では、外来性ポリペプチドは、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号７１３）を含む。
【０７９１】
一部の実施形態では、本開示は、ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、表２１に列挙されている感染因子由来の抗原またはその免疫原性ペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、ウイルス感染を処置する方法を提供する。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、ＭＨＣ分子、および必要に応じて、共刺激ポリペプチドをさらに含む。
【０７９２】
一部の実施形態では、本開示は、Ｂ型肝炎感染、例えば、慢性ＨＢＶ感染を処置するための方法を提供する。主に子宮内でまたは分娩中に伝染する慢性Ｂ型肝炎を有する人が世界的に２億５千万人に至ると推定される。慢性ＨＢＶは、硬変症および肝細胞癌を引き起こす。ＨＢＶの病状は、肝損傷を引き起こすサイトカインを分泌する非抗原特異的Ｔ細胞のＢ型肝炎抗原特異的Ｔ細胞動員に起因し得る。慢性肝炎の病因には消耗したＴ細胞が重要であることが提唱されている。ＨＢＶ特異的Ｔ細胞は、例えば抗ＰＤ１および／またはＩＬ−１２によるＰＤ１遮断によって再活性化されることが報告されている（Schirdewahn  et  al.  J.  Infect.  Dis.  2017；Fisicaro  et  al  Gastroenterology  2010；およびSchurich  PLOS  Pathogens,  2013、そのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞を例えば細胞溶解性または非細胞溶解性抗ウイルス活性に関して再活性化することによって慢性ＨＢＶを処置するために、本明細書に提示されるａＡＰＣを使用することができることが、本発明により構想される。
【０７９３】
したがって、一部の実施形態では、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、例えば、慢性Ｂ型肝炎を有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）を含むａＡＰＣであって、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つが、ＨＢＶ特異的抗原またはその免疫原性ペプチドを含む、ａＡＰＣを有効数で投与するステップを含み、それによって、ＨＢＶ感染を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＨＢＶ感染は、慢性ＨＢＶ感染である。複数の実施形態では、ａＡＰＣは、外来性抗原提示ポリペプチド、すなわち、ＭＨＣ分子、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合物をさらに含む。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドをさらに含む。複数の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ポリペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、およびこれらの任意の組合せ、例えば、ＩＬ−１２とＩＬ−１５、または４−１ＢＢＬとＩＬ−１５からなる群から選択される。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、追加的な外来性ポリペプチドをさらに含み、追加的な外来性ポリペプチドは、チェックポイント阻害剤を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１に対する抗体分子である。特定の実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞を含み、１つまたは複数の外来性ポリペプチドは、ＨＢＶ特異的抗原またはその免疫原性ペプチドを含む外来性抗原ポリペプチドと、外来性抗原提示ポリペプチド、例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩ一本鎖融合物と、外来性共刺激ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２または４−１ＢＢＬと、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ１に対する抗体とを含む。
【０７９４】
ある特定の実施形態では、感染性疾患治療薬は、細菌ポリペプチドから選択される。これらの実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）または除核細胞を含み、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つは、抗原性細菌ポリペプチドを含み、ａＡＰＣを対象に投与して、細菌による感染を処置する。
【０７９５】
細菌感染としては、これらに限定されないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅｏｅａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、腸管毒素原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；ｓｈｉｇｅｌｌａ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ；Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ；Ｐｒｏｔｅｕｓ；およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが挙げられる。
【０７９６】
例示的な細菌病原体を以下の表２２に示す。
【表２２−１】
2021506304.tif 000112
【表２２−２】
2021506304.tif 000113
【表２２−３】
2021506304.tif 000114
【表２２−４】
2021506304.tif 000115
【０７９７】
ある特定の実施形態では、感染性疾患治療薬は、真菌ポリペプチドから選択される。これらの実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）または除核細胞を含み、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つは、抗原性真菌ポリペプチドを含み、ａＡＰＣを対象に投与して、真菌による感染を処置する。
【０７９８】
例示的な真菌病原体を以下の表２３に示す。
【表２３−１】
2021506304.tif 000116
【表２３−２】
2021506304.tif 000117
【０７９９】
ある特定の実施形態では、感染性疾患治療薬は、寄生虫ポリペプチドから選択される。これらの実施形態では、ａＡＰＣは、１つまたは複数の外来性ポリペプチドを含む赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞）または除核細胞を含み、１つまたは複数の外来性ポリペプチドの１つは、抗原性寄生虫ポリペプチドを含み、ａＡＰＣを対象に投与して、寄生虫による感染を処置する。
【０８００】
例示的な寄生虫病原体を以下の表２４に示す。
【表２４−１】
2021506304.tif 000118
【表２４−２】
2021506304.tif 000119
【表２４−３】
2021506304.tif 000120
【表２４−４】
2021506304.tif 000121
【０８０１】
一部の実施形態では、感染性疾患は、多剤耐性ブドウ球菌である。別の実施形態では、感染性疾患は、シュードモナスである。別の実施形態では、感染性疾患は、処置することが難しい院内感染（すなわち、感染因子または毒素による反応に起因するあらゆる全身性または局在する状態）、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって引き起こされる感染症である。
【０８０２】
その他
他の疾患および障害が本開示のａＡＰＣによる処置に関して意図されている。例としては、これらに限定されないが、心血管疾患および免疫疾患が挙げられる。
【０８０３】
対象
本明細書に記載の方法は、これらの方法の利益を受け得るあらゆる対象での使用が意図されている。したがって、「対象」、「患者」、および「個体」（互換的に使用される）は、ヒトおよび非ヒト対象、特に家畜を含む。
【０８０４】
一部の実施形態では、対象および／または動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、またはサル、チンパンジー、もしくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。他の実施形態では、対象および／または動物は、非哺乳動物である。一部の実施形態では、対象および／または動物は、ヒトである。一部の実施形態では、ヒトは、小児ヒトである。他の実施形態では、ヒトは、成体ヒトである。他の実施形態では、ヒトは、老齢ヒトである。他の実施形態では、ヒトを患者と称することができる。
【０８０５】
ある特定の実施形態では、ヒトの年齢は、月齢約０カ月から約６カ月まで、月齢約６カ月から約１２カ月まで、月齢約６カ月から約１８カ月まで、月齢約１８カ月から約３６カ月まで、約１歳から約５歳まで、約５歳から約１０歳まで、約１０歳から約１５歳まで、約１５歳から約２０歳まで、約２０歳から約２５歳まで、約２５歳から約３０歳まで、約３０歳から約３５歳まで、約３５歳から約４０歳まで、約４０歳から約４５歳まで、約４５歳から約５０歳まで、約５０歳から約５５歳まで、約５５歳から約６０歳まで、約６０歳から約６５歳まで、約６５歳から約７０歳まで、約７０歳から約７５歳まで、約７５歳から約８０歳まで、約８０歳から約８５歳まで、約８５歳から約９０歳まで、約９０歳から約９５歳まで、または約９５歳から約１００歳までの範囲である。
【０８０６】
他の実施形態では、対象は、非ヒト動物であり、したがって、本開示は、獣医学的使用に関する。具体的な実施形態では、非ヒト動物は、家庭で飼う愛玩動物である。別の具体的な実施形態では、非ヒト動物は、家畜動物である。ある特定の実施形態では、対象は、化学療法を受けることができないヒトがん患者であり、例えば、患者は、化学療法に対して不応答性であるまたは化学療法の好適な治療域を得るには状態が悪すぎる（例えば、用量を限定するまたはレジメンを限定する副作用をあまりに多く受ける）。ある特定の実施形態では、対象は、進行および／または転移性疾患を有するヒトがん患者である。
【０８０７】
一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）赤血球系細胞を含むａＡＰＣを用いた処置のために、対象を選択する。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）赤血球系細胞を含むａＡＰＣを用いたがんの処置のために、対象を選択する。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）赤血球系細胞を含むａＡＰＣを用いた自己免疫疾患の処置のために、対象を選択する。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）赤血球系細胞を含むａＡＰＣを用いた感染性疾患の処置のために、対象を選択する。
【０８０８】
上記の態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。上記の態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核赤血球系細胞である。
【０８０９】
Ｖ．医薬組成物
本開示は、本開示のａＡＰＣを活性成分として含む医薬組成物の調製および使用を包含する。そのような医薬組成物は、活性成分単独からなる場合もあり、対象への投与に好適な形態の少なくとも１つの活性成分（例えば、有効用量のａＡＰＣ）の組合せからなる場合もあり、あるいは、医薬組成物は、活性成分および１つもしくは複数の薬学的に許容される担体、１つもしくは複数の追加的な（活性および／もしくは不活性）成分、またはこれらのいくつかの組合せを含む場合もある。
【０８１０】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の複数のａＡＰＣ、および医薬担体を含む医薬組成物を特徴とする。他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のａＡＰＣの集団、および医薬担体を含む医薬組成物を特徴とする。本発明の医薬組成物中には、本明細書の他の箇所に記載の任意の単一のａＡＰＣ、複数のａＡＰＣ、またはａＡＰＣの集団が存在し得ることが理解されよう。
【０８１１】
一部の実施形態では、本明細書に提示される医薬組成物は、操作された（すなわち、改変された）赤血球系細胞および改変されていない赤血球系細胞を含む。例えば、種々の実施形態では、単回単位用量のａＡＰＣは、約１０％、少なくとも１０％、もしくは１０％以下、約２０％、少なくとも２０％、もしくは２０％以下、約３０％、少なくとも３０％、もしくは３０％以下、約４０％、少なくとも４０％、もしくは４０％以下、約５０％、少なくとも５０％、もしくは５０％以下、約６０％、少なくとも６０％、もしくは６０％以下、約７０％、少なくとも７０％、もしくは７０％以下、約７５％、少なくとも７５％、もしくは７５％以下、約８０％、少なくとも８０％、もしくは８０％以下、約８５％、少なくとも８５％、もしくは８５％以下、約９０％、少なくとも９０％、もしくは９０％以下、約９５％、少なくとも９５％、もしくは９５％以下、または約９９％、少なくとも９９％、もしくは９９％以下の操作された赤血球系細胞を含み得、組成物中の残りの赤血球系細胞は操作されていない。
【０８１２】
一部の実施形態では、本明細書に提示される医薬組成物は、操作された除核赤血球系細胞および有核赤血球系細胞を含むａＡＰＣを含む。例えば、種々の実施形態では、操作された赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞および有核赤血球系細胞）の単回単位用量は、約１０％もしくは少なくとも１０％、約２０％もしくは少なくとも２０％、約３０％もしくは少なくとも３０％、約４０％もしくは少なくとも４０％、約５０％もしくは少なくとも５０％、約６０％もしくは少なくとも６０％、約７０％もしくは少なくとも７０％、約７５％もしくは少なくとも７５％、約８０％もしくは少なくとも８０％、約８５％もしくは少なくとも８５％、約９０％もしくは少なくとも９０％、約９１％もしくは少なくとも９１％、約９２％もしくは少なくとも９２％、約９３％もしくは少なくとも９３％、約９４％もしくは少なくとも９４％、約９５％もしくは少なくとも９５％、約９６％もしくは少なくとも９６％、約９７％もしくは少なくとも９７％、約９８％もしくは少なくとも９８％、または約９９％もしくは少なくとも９９％の除核赤血球系細胞を含み得、組成物中の残りの赤血球系細胞は有核である。
【０８１３】
本開示の医薬組成物は、処置される（または予防される）疾患に適した様式で投与することができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重症度などの因子によって決定されるが、適切な投薬量は、臨床試験によって決定することができる。
【０８１４】
医薬組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋込みまたは移植を含めた任意の都合のよい様式で行うことができる。本開示の組成物を患者に対し、皮下に、皮内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与することができる。医薬組成物を、腫瘍またはリンパ節に直接注射することができる。
【０８１５】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、活性成分を組み合わせることができ、組合せ後に、活性成分を対象に投与するために使用することができる化学組成物を意味する。
【０８１６】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知の、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような予備的方法は、活性成分に担体または１つもしくは複数の他の副成分を付随させ、次いで、必要であるまたは望ましい場合、製品を所望の単回単位用量または多回単位用量に形づくるまたは包装するステップを含む。
【０８１７】
本明細書に提示される医薬組成物の説明は、ヒトへの倫理的投与に好適な医薬組成物を主に対象としているが、そのような組成物が、あらゆる動物への投与に一般に好適であることが、当業者には理解されよう。ヒトへの投与に好適な医薬組成物を、種々の動物への投与に好適なものにするために改変することはよく理解され、通常の技術を有する獣医薬理学者は、そのような改変を、実験を行う場合には単に通常の実験を用いて、設計および実施することができる。本開示の医薬組成物の投与が意図されている対象としては、これらに限定されないが、ヒトおよび他の霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌなどの商業的に妥当な哺乳動物を含めた哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、およびシチメンチョウなどの商業的に妥当な鳥類を含めた鳥類、養殖魚および水族館の魚を含めた魚、ならびに養殖甲殻類などの甲殻類が挙げられる。
【０８１８】
本開示の方法において有用な医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局部、肺、鼻腔内、病変内、頬側、点眼、静脈内、臓器内または別の投与経路に好適な製剤として調製、包装、または販売することができる。他の意図されている製剤としては、突出ナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再密閉された赤血球、および免疫学に基づく製剤が挙げられる。
【０８１９】
本開示の医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、または複数の単回単位用量として調製、包装、または販売することができる。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の別個の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与されることになる活性成分の投薬量またはそのような投薬量の都合のよい一部分、例えば、そのような投薬量の２分の１または３分の１などと等しい。
【０８２０】
本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、および任意の追加的な成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、および状態に応じて変動し、さらに、組成物を投与する経路に応じても変動する。例として、組成物は、活性成分を０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の間で含み得る。
【０８２１】
活性成分に加えて、本開示の医薬組成物は、１つまたは複数の追加的な薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。特に意図されている追加的な作用物質としては、制吐薬およびスカベンジャー、例えば、シアン化物およびシアン酸塩スカベンジャー、ならびにＡＺＴ、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターロイキン２、インターフェロン、サイトカインなどが挙げられる。
【０８２２】
本開示の医薬組成物の制御放出または持続放出製剤を、従来の技術を使用して作製することができる。
【０８２３】
本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織を物理的に突破することにより特徴付けられるあらゆる投与経路および突破口を通じた組織への医薬組成物の投与を含む。したがって、非経口投与としては、これらに限定されないが、医薬組成物の、組成物を注射することによる投与、組成物を外科的切開を通じて適用することによる投与、組成物を組織透過性の非手術創を通じて適用することによる投与などが挙げられる。特に、意図されている非経口投与としては、これらに限定されないが、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、および腎臓透析注入技法が挙げられる。
【０８２４】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、活性成分を、滅菌水または滅菌等張性生理食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。そのような製剤は、ボーラス投与または継続投与に好適な形態で調製、包装、または販売することができる。注射製剤は、例えば、保存剤を含有するアンプル中または複数回用量容器中の単位剤形として調製、包装、または販売することができる。非経口投与用の製剤としては、これらに限定されないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルション、ペスト剤、および埋込み型持続放出または生分解性製剤が挙げられる。そのような製剤は、これらに限定されないが、懸濁化剤、安定化剤、または分散剤を含めた１つまたは複数の追加的な成分をさらに含み得る。
【０８２５】
医薬組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液または溶液の形態で調製、包装、または販売することができる。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って製剤化することができ、活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁化剤などの追加的な成分を含み得る。そのような滅菌注射製剤は、例えば、水または１，３−ブタンジオールなどの無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を使用して調製することができる。他の許容される希釈剤および溶媒としては、これらに限定されないが、リンゲル液、等張食塩水、および合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの不揮発性油が挙げられる。他の有用な親として投与可能な製剤としては、活性成分を、微結晶性の形態で含む、リポソーム調製物中に含む、または生分解性ポリマー系の構成成分として含む製剤が挙げられる。持続放出または埋め込み用の組成物は、エマルション、イオン交換樹脂、やや難溶性のポリマー、またはやや難溶性の塩などの薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料を含み得る。
【０８２６】
本開示のａＡＰＣおよび／またはａＡＰＣを使用して拡大させたＴ細胞は、動物、好ましくはヒトに投与することができる。本開示のａＡＰＣを使用して拡大させたＴ細胞を投与する場合、投与する細胞の量は、細胞約１００万個から約３０００億個までにわたる可能性がある。ａＡＰＣ自体を投与する場合、それによって拡大させたＴ細胞を伴っても伴わなくても、細胞約１００，０００個から約１０億個までの量で投与することができ、ここで、細胞は、それを必要とする動物、好ましくは、ヒト患者に注入される。投与される正確な投薬量は、これらに限定されないが、処置される動物の型および病態の型、動物の年齢および投与経路を含めた任意の数の因子に応じて変動する。
【０８２７】
ａＡＰＣは、動物に、１日に数回もの頻度で投与することもでき、より低頻度で、例えば、１日に１回、週に１回、２週間に１回、１カ月に１回、あるいはさらに低頻度で、例えば、数カ月に１回またはさらには１年に１回もしくはそれ未満で投与することもできる。投薬の頻度は当業者には容易に明らかになり、これらに限定されないが、処置される疾患の型および重症度、動物の型および年齢などの任意の数の因子に依存する。
【０８２８】
ａＡＰＣ（またはそれによって拡大させた細胞）を、種々の他の化合物（他の多くの中でも、サイトカイン、化学療法薬および／または抗ウイルス薬）と同時投与することができる。あるいは、化合物（複数可）を、ａＡＰＣ（またはそれによって拡大させた細胞）の１時間前、１日前、１週間前、１カ月前、もしくはさらにはそれよりも前に、またはそれを任意に並べ替えて投与することができる。さらに、化合物（複数可）を、ａＡＰＣ（またはそれによって拡大させた細胞）の投与の１時間後、１日後、１週間後、またはさらにはその後に、またはそれを任意に並べ替えて投与することができる。頻度および投与レジメンは当業者には容易に明らかになり、これらに限定されないが、例えば、処置される疾患の型および重症度、動物の年齢および健康状態、投与される化合物（１つまたは複数）の同一性、様々な化合物およびａＡＰＣ（またはそれによって拡大させた細胞）の投与経路などの任意の数の因子に依存する。
【０８２９】
さらに、本明細書に提示される開示に基づいて、ａＡＰＣを哺乳動物に投与する場合、細胞を、「成長していない状態」になるように処理する、すなわち、細胞は哺乳動物に投与された際に分裂することができないことが、当業者には理解されよう。本明細書の他の箇所で開示されている通り、細胞を、哺乳動物に投与されたら成長または分裂することができないように、照射処理することができる。特にヒトに投与される細胞を成長することができないものにするための、ハプテン化（例えば、ジニトロフェニルおよび他の化合物を使用する）を含めた他の方法が当技術分野で公知であり、これらの方法を本明細書でさらに考察することはしない。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分裂することができないようにしたａＡＰＣの投与の安全性は、本明細書で考察している分子のいくつかをコードするプラスミドベクターをトランスフェクトしたａＡＰＣを使用した第Ｉ相臨床試験において確立されている。
【０８３０】
併用療法
一部の実施形態では、本開示は、追加的な作用物質を対象に投与するステップをさらに含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、同時投与および／または共製剤化に関する。
【０８３１】
一部の実施形態では、ａＡＰＣの投与は、別の作用物質と同時投与した場合に相乗的に作用し、そのような作用物質を単独療法として使用する場合に一般に用いられる用量よりも少ない用量で投与される。
【０８３２】
一部の実施形態では、本開示は、これに限定することなく、がんへの適用を含めて、追加的な作用物質として化学療法剤に関する。化学療法剤の例としては、これらに限定されないが、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮシクロホスファミドなど；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなど；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンを含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリースタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成アナログ、カルゼレシン合成アナログおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質など（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマ１ｌおよびカリチアマイシンオメガ１ｌ；ジネミシンＡを含めたジネミシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネートなど；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣなど、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなど；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メ���カプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド（minoglutethimide）、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸（frolinic  acid）など；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン（elformithine）；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えば、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬパクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒフリー、パクリタキセルのアルブミン操作されたナノ粒子製剤、およびＴＡＸＯＴＥＲＥドセタキセル；クロラムブシル（chloranbucil）；ＧＥＭＺＡＲゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ．ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサー、ＣＰＴ−１１）（イリノテカンと共に５−ＦＵおよびロイコボリンの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；  オキサリプラチン処置レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含めたオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；細胞増殖を低減するＰＫＣ−α．、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ））およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げら��る。さらに、処置の方法は、放射線の使用をさらに含み得る。
【０８３３】
一部のヒト腫瘍を患者の免疫系から排除することができる。例えば、免疫「チェックポイント」分子を標的とするモノクローナル抗体の投与により、完全奏効および腫瘍の寛解を導くことができる。そのような抗体の作用様式は、抗腫瘍免疫応答からの保護として腫瘍に取り込まれた免疫調節分子を阻害することによるものである。これらの「チェックポイント」分子を阻害すること（例えば、アンタゴニスト抗体を用いて）により、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が増殖し、腫瘍細胞を破壊することが可能になり得る。
【０８３４】
例えば、例として、これだけに限定することなく、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１を標的とするモノクローナル抗体を投与することにより、完全奏効および腫瘍の寛解を導くことができる。そのような抗体の作用様式は、抗腫瘍免疫応答からの保護として腫瘍に取り込まれたＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１を阻害することによるものである。これらの「チェックポイント」分子を阻害すること（例えば、アンタゴニスト抗体を用いて）により、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が増殖し、腫瘍細胞を破壊することが可能になり得る。
【０８３５】
したがって、本明細書に提示される１つまたは複数の外来性ポリペプチドを提示する（例えば、それを細胞表面に含む）除核細胞または赤血球系細胞を含むａＡＰＣを、免疫「チェックポイント」分子を標的とする１つまたは複数の遮断抗体と組み合わせて使用することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に提示される組成物を、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１などの分子を標的とする１つまたは複数の遮断抗体と組み合わせて使用することができる。例えば、本明細書に提示される組成物を、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２との結合を遮断、低減および／または阻害する作用物質（非限定的な例として、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥ  ＴＥＣＨ）、ＭＫ−３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ  ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ  ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）のうちの１つまたは複数）と組み合わせて使用することができる。ある実施形態では、本明細書に提示される組成物を、ＣＴＬＡ−４の活性および／またはＣＴＬＡ−４と１つまたは複数の受容体との結合を遮断、低減および／または阻害する作用物質（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＡＰ２Ｍ１、ＳＨＰ−２、およびＰＰＰ２Ｒ５Ａ）と組み合わせて使用することができる。例えば、一部の実施形態では、免疫モジュレート剤は、限定することなく、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｙｅｒｖｏｙ、ＢＭＳ）および／またはトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）などの抗体である。これらの分子に対する遮断抗体は、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｍｅｒｃｋ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎ．Ｊ．）、Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）、およびＰｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）から得ることができる。
【０８３６】
さらに、本明細書に提示されるａＡＰＣ組成物を、例えば、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬＳ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも称される）、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ガレクチン−９、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、ならびにＴＭＩＧＤ２などの免疫「チェックポイント」分子と、種々のＢ−７ファミリーリガンド（これらに限定されないが、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６およびＢ７−Ｈ７を含む）とを標的とする１つまたは複数の遮断抗体と組み合わせて使用することができる。
【０８３７】
上記の態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。上記の態様および実施形態のうちの一部の実施形態では、赤血球系細胞は、有核赤血球系細胞である。
【０８３８】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の複数の操作された赤血球系細胞と医薬担体とを含む医薬組成物を特徴とする。他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の操作された赤血球系細胞の集団と医薬担体とを含む医薬組成物を特徴とする。本明細書の他の箇所に記載の任意の単一の操作された赤血球系細胞、複数の操作された赤血球系細胞、または操作された赤血球系細胞の集団が、本発明の医薬組成物中に存在し得ることが理解されよう。
【０８３９】
一部の実施形態では、本明細書に提示される医薬組成物は、操作された（すなわち、改変された）赤血球系細胞および改変されていない赤血球系細胞を含む。例えば、種々の実施形態では、単回単位用量の赤血球系細胞（例えば、改変された赤血球系細胞および改変されていない赤血球系細胞）は、約１０％、少なくとも１０％、もしくは１０％以下、約２０％、少なくとも２０％、もしくは２０％以下、約３０％、少なくとも３０％、もしくは３０％以下、約４０％、少なくとも４０％、もしくは４０％以下、約５０％、少なくとも５０％、もしくは５０％以下、約６０％、少なくとも６０％、もしくは６０％以下、約７０％、少なくとも７０％、もしくは７０％以下、約７５％、少なくとも７５％、もしくは７５％以下、約８０％、少なくとも８０％、もしくは８０％以下、約８５％、少なくとも８５％、もしくは８５％以下、約９０％、少なくとも９０％、もしくは９０％以下、約９５％、少なくとも９５％、もしくは９５％以下、または約９９％、少なくとも９９％、もしくは９９％以下の操作された赤血球系細胞を含み得、組成物中の残りの赤血球系細胞は操作されていない。
【０８４０】
一部の実施形態では、本明細書に提示される医薬組成物は、操作された除核赤血球系細胞および有核赤血球系細胞を含む。例えば、種々の実施形態では、単回単位用量の操作された赤血球系細胞（例えば、除核赤血球系細胞および有核赤血球系細胞）は、約１０％もしくは少なくとも１０％、約２０％もしくは少なくとも２０％、約３０％もしくは少なくとも３０％、約４０％もしくは少なくとも４０％、約５０％もしくは少なくとも５０％、約６０％もしくは少なくとも６０％、約７０％もしくは少なくとも７０％、約７５％もしくは少なくとも７５％、約８０％もしくは少なくとも８０％、約８５％もしくは少なくとも８５％、約９０％もしくは少なくとも９０％、約９１％もしくは少なくとも９１％、約９２％もしくは少なくとも９２％、約９３％もしくは少なくとも９３％、約９４％もしくは少なくとも９４％、約９５％もしくは少なくとも９５％、約９６％もしくは少なくとも９６％、約９７％もしくは少なくとも９７％、約９８％もしくは少なくとも９８％、または約９９％もしくは少なくとも９９％の除核赤血球系細胞を含み得、組成物中の残りの赤血球系細胞は有核である。
【０８４１】
ＶＩ．キット
本開示は、本開示のａＡＰＣ、種々のタンパク質をコードする核酸、Ｔ細胞の表面の共刺激分子に特異的に結合する抗体、および／または本開示の抗体をコードする核酸、抗原、もしくはサイトカイン、アプリケーター、ならびに本開示の方法を実施するためのキットの使用に関して記載された説明用材料を含む種々のキットを含む。例示的なキットを下に記載するが、本開示に照らして他の有用なキットの内容が当業者には明らかになろう。これらのキットのそれぞれが本開示の範囲内に含まれる。
【０８４２】
本開示は、公知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖を特異的に誘導するためのキットを含む。これは、Ｔ細胞をａＡＰＣに接触させることにより、Ｔ細胞の増殖が特異的に誘導されるからである。キットは本開示に開示されている方法に準じて使用される。簡単に述べると、少なくとも１つの共刺激分子を発現するＴ細胞に、本開示のａＡＰＣを投与するために、キットを使用することができる。これは、本明細書の他の箇所でより詳細に開示されている通り、本明細書に開示されるデータから、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に存在する同類共刺激分子と特異的に結合する共刺激リガンドを含むａＡＰＣと接触させることにより、Ｔ細胞の刺激および活性化が媒介されることが実証されるからである。さらに、このキットを使用して産生されるＴ細胞を、治療結果を実現するために動物に投与することができる。
【０８４３】
キットは、ａＡＰＣをＴ細胞に投与するために有用なアプリケーターをさらに含む。キットに含まれる特定のアプリケーターは、例えば、ａＡＰＣを投与するために使用される方法、およびａＡＰＣによって拡大させるＴ細胞に依存し、そのようなアプリケーターは、当技術分野で周知であり、それらとして、とりわけ、ピペット、シリンジ、点滴器などを挙げることができる。さらに、キットは、キットの使用に関する説明用材料を含む。これらの使用説明書により、本明細書に提示される開示が簡単に具体化される。
【０８４４】
キットは、薬学的に許容される担体を含む。組成物は、本明細書の他の箇所に記載されている通り適量で提供される。さらに、投与経路および投与の頻度は、本明細書の他の箇所ですでに記載されている通りである。
【０８４５】
キットは、これらに限定されないが、本明細書に記載のものなどの、広範な多量の分子を含むａＡＰＣを包含する。しかし、本開示がこれらまたは任意の他の分子の組合せに決して限定されないことが、本明細書に提示される教示を有する当業者には容易に理解されよう。そうではなく、本明細書に記載の組合せは、例示目的のものであり、本開示に包含される組合せを決して限定するものではない。さらに、キットは、ａＡＰＣに形質導入される各分子が、分子をコードする単離された核酸、分子をコードする核酸を含むベクター、およびこれらの任意の組合せをとして提供される場合のキットを、少なくとも２つの分子が連続した核酸にコードされる、および／または同じベクターにコードされる場合を含め、含む。
【０８４６】
本明細書において引用されている全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願があらゆる目的に関して参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたものと同じく、あらゆる目的に関してそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察されている刊行物は、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書における全てが、本明細書に記載の本発明者らが、先行開示に基づいてまたは任意の他の理由でそのような開示に先行する権限がないことを容認するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０８４７】
（実施例１）
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質を発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成
結果
赤血球系細胞に、膜アンカーとしての機能を果たすＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）と融合した外来性抗原提示ポリペプチド、具体的にはＭＨＣＩＩと融合した外来性抗原性ペプチドであるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を含む融合タンパク質（ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ）を発現するように形質導入した。図１Ａは、ＭＯＧペプチドおよびＭＨＣＩＩを一本鎖融合物として発現させるための設計の概略図を示す。外来性ペプチド（ＭＯＧ）がＭＨＣＩＩ  β鎖と連結しており、ＭＨＣＩＩ  β鎖はＭＨＣＩＩ  α鎖と連結しており、ＭＨＣＩＩ  α鎖はＧＰＡ膜アンカーと連結している。細胞培養および形質導入を下の「方法」の節に記載の通り実施して、ＧＰＡ膜貫通ドメインをアンカーとして、ＭＨＣＩＩの細胞表面に提示されたＭＯＧを発現する赤血球系細胞を得る。
【０８４８】
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識されたまたはフィコエリトリン（ＰＥ）で標識された抗ＭＯＧ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における抗原性ペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。
【０８４９】
方法
レンチウイルスベクターの産生
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングする。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてレンチウイルスを産生させる。次いで、細胞を新鮮な培養培地に置く。培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ウイルス上清を収集する。上清を収集し、一定分量として−８０℃で凍結させる。
【０８５０】
赤血球系細胞の拡大および分化
正常なヒトドナー由来の動員された末梢血液細胞に由来するヒトＣＤ３４＋細胞を、ＡｌｌＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃから凍結した状態で購入する。拡大／分化手順は、３つの段階を含む。第１の段階では、解凍したＣＤ３４＋赤血球先駆体を、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、組換えヒト組換えヒト幹細胞因子、および組換えヒトインターロイキン３を含むイスコフＭＤＭ培地中で培養する。第２の段階では、赤血球系細胞を、ウシ血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、ヒト組換え幹細胞因子、ヒト組換えエリスロポエチン、およびＬ−グルタミンを補充したイスコフＭＤＭ培地中で培養する。第３の段階では、赤血球系細胞を、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト組換えエリスロポエチン、およびヘパリンを補充したイスコフＭＤＭ培地中で培養する。培養を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で維持する。
【０８５１】
赤血球先駆細胞への形質導入
上記の培養プロセスのステップ１の間に、赤血球先駆細胞への形質導入を行う。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと合わせる。プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間回転させ、スピノキュレーションによって感染を実現する。スピノキュレーション後、細胞を３７℃で終夜インキュベートする。
【０８５２】
抗体結合
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩＩ抗体（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ（ＨＬＡ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、Ｃｌｏｎｅ  Ｉｍｍｕ−３５７）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。抗体の結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０８５３】
（実施例２）
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質および共阻害ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検証
結果
実施例１に記載の通り、赤血球系細胞に、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）と融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩＩと融合した、外来性抗原性ペプチドＭＯＧを含む融合タンパク質（ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ）を発現するように形質導入する。赤血球系細胞に、外来性共阻害ペプチドＰＤ−Ｌ１をさらに発現するように同時形質導入する。細胞培養および形質導入を、下の「方法」の節に記載の通り実施して、ＧＰＡ膜貫通ドメインをアンカーとして、ＭＨＣＩＩの表面に提示されたＭＯＧを発現し、ＰＤ−Ｌ１を同時発現する赤血球系細胞を得る。
【０８５４】
同じく実施例１に記載の通り、ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を検証する。
【０８５５】
操作された赤血球系細胞（ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＰＤ−Ｌ１）の効果を、（１）Ｔ細胞活性の阻害、（２）Ｔ細胞増殖の阻害、および／または（３）Ｔ細胞のアポトーシスの誘導を含めたＴ細胞の抑制に対する１つまたは複数の効果を決定することによって評価する。
【０８５６】
方法
レンチウイルスベクターの産生
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質の遺伝子およびＰＤ−Ｌ１の遺伝子を構築する。当該タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングし、その結果、１つのベクターが両方の外来性タンパク質の遺伝子を含むようにする。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡの遺伝子およびＰＤ−Ｌ１の遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてレンチウイルスを産生させる。細胞を新鮮な培養培地に置く。培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ウイルス上清を収集する。上清を収集し、一定分量として−８０℃で凍結させる。
【０８５７】
赤血球先駆細胞への形質導入
赤血球系細胞の拡大および分化を、上記のレンチウイルスベクターを用い、実施例１に従って実施する。培養プロセスのステップ１の間に、赤血球先駆細胞への形質導入を行う。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと合わせる。プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間回転させ、スピノキュレーションによって感染を実現する。スピノキュレーション後、細胞を３７℃で終夜インキュベートする。
【０８５８】
抗体結合
操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩＩ抗原提示ペプチドの発現を検証するために、ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩＩ抗体の結合を、実施例１に記載の通り行う。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２７４（Ｂ７−Ｈ１、ＰＤ−Ｌ１）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を検証する。抗体の結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０８５９】
機能的検証アッセイ
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＰＤ−Ｌ１を同時発現する操作された赤血球系細胞の、Ｔ細胞抑制に対する効果を、（１）Ｔ細胞活性の阻害、（２）Ｔ細胞増殖の阻害、および（３）Ｔ細胞のアポトーシスの誘導のうちの１つまたは複数を決定することによって評価する。Ｔ細胞活性の阻害を、例えば、ヒトＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０に対する市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて上清のサイトカイン分析を行うことによって決定する。例えば、操作された赤血球系細胞を用いた処理後、活性化Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌の阻害の検出により、ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＰＤ−Ｌ１を同時発現する操作された赤血球系細胞の抗増殖効果が示される。Ｔ細胞増殖の阻害を、例えば、細胞を蛍光色素５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識することによってアッセイする。操作された赤血球系細胞に応答して増殖する細胞では、フローサイトメトリーによって直接測定されるＣＦＳＥ蛍光強度の低下が示される。あるいは、放射性チミジン組入れを使用して、ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質およびＰＤ−Ｌ１共阻害ポリペプチドを同時発現するように操作された赤血球系細胞で刺激されたＴ細胞の成長速度を評価することができる。ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＰＤ−Ｌ１を同時発現する操作された赤血球系細胞によるＴ細胞のアポトーシスの誘導を、例えば、蛍光色素とコンジュゲートしたアネキシンＶ染色を使用してアッセイする。ＢＡＴＦは、多くのリンパ球系列における分化および機能の調節において、重要な役割を果たすｂＺＩＰ転写因子である。ＣＤ８＋Ｔ細胞系列では、消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞においてＢＡＴＦの発現が増大することより、ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能が抑制される。ＢＡＦＴは、初期エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞分化の中心的な調節因子であることが示されている。したがって、塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様（ＢＡＴＦ）などの転写因子の発現の評価を使用して、ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＰＤ−Ｌ１のＴ細胞抑制に対する効果を決定することができる。
【０８６０】
（実施例３）
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質およびＴｒｅｇ拡大ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検証
結果
実施例１に記載の通り、赤血球系細胞に、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）と融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩＩと融合した、外来性抗原性ペプチドＭＯＧを含む融合タンパク質（ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ）を発現するように形質導入する。赤血球系細胞にまた、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦαポリペプチドである外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドをさらに発現するように形質導入する。細胞培養および形質導入を、下の「方法」の節に記載の通り実施して、ＧＰＡ膜貫通ドメインをアンカーとして、ＭＨＣＩＩの表面に提示されたＭＯＧを発現し、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦαポリペプチドを同時発現する赤血球系細胞を得る。
【０８６１】
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＴＮＦαの結合を使用して、操作された赤血球系細胞における抗原性ペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。操作された赤血球系細胞（ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦα）の効果の機能活性を、実施例２に記載の通り、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に基づく増殖アッセイを使用して評価する。
【０８６２】
方法
レンチウイルスベクターの産生
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質およびＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦαの遺伝子を構築する。当該タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングし、その結果、１つのベクターが両方の外来性タンパク質の遺伝子を含むようにする。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡの遺伝子およびＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦαの遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてレンチウイルスを産生させる。細胞を新鮮な培養培地に置く。培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ウイルス上清を収集する。上清を収集し、一定分量として−８０℃で凍結させる。
【０８６３】
赤血球先駆細胞への形質導入
赤血球系細胞の拡大および分化を、上記のレンチウイルスベクターを用い、実施例１に従って実施する。培養プロセスのステップ１の間に、赤血球先駆細胞への形質導入を行う。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと合わせる。プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間回転させ、スピノキュレーションによって感染を実現する。スピノキュレーション後、細胞を３７℃で終夜インキュベートする。
【０８６４】
抗体結合
操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩＩ抗原提示ペプチドの発現を検証するために、ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩＩ抗体の結合を、同じく実施例１に記載の通り行う。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識されたＴＮＦα抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦα突然変異体の発現を検証する。抗体のいずれか１つの結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０８６５】
機能的検証アッセイ
機能活性を、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に基づく増殖アッセイを使用して評価する。細胞を、蛍光色素５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。操作された赤血球に応答して増殖する細胞では、フローサイトメトリーによって直接測定されるＣＦＳＥ蛍光強度の低下が示される。あるいは、放射性チミジン組入れを使用して、ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質およびＣＤ２５特異的ＩＬ２  Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを同時発現するように操作された赤血球系細胞で刺激されたＴ細胞の成長速度を評価することができる。
【０８６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ抑制アッセイを使用した機能活性の評価も行う。そのようなアッセイは、Collinson  and  Vignali（Methods  Mol  Biol.  2011;  707:21-37、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０８６７】
（実施例４）
マウスＥＡＥモデルにおけるＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡ融合タンパク質および共阻害ポリペプチドまたはＴｒｅｇ拡大ポリペプチドを同時発現する除核赤血球系細胞の活性
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）を処置するための潜在的な薬物の有効性を試験するために最も一般的に使用されるモデルである。ＥＡＥは、ＭＳとの類似性が多いので、自己免疫、ＣＮＳ炎症、脱髄、細胞輸送および寛容誘導の病理発生を試験するために使用される。ＥＡＥは、麻痺（一部のモデルでは、麻痺は再発寛解型である）、ＣＮＳ炎症および脱髄によって特徴付けられる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥＡＥ誘導のためのＨｏｏｋｅ  Ｋｉｔｓ（商標）（Ｈｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥＡＥを誘導する。この方法を使用し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中ＭＯＧ３５−５５またはＭＯＧ１−１２５エマルションを用いて免疫化し、その後、ＰＢＳ中百日咳毒素をまず免疫化の日に投与し、次いで翌日に再度投与することにより、ＥＡＥを誘導する。各マウスについて、典型的なＥＡＥ発症は免疫化の９〜１４日後であり、疾患のピークは発症の３〜５日後である。ピークは１〜３日間続き、その後、部分的に回復する。マウスの約２５％で、最初の部分的回復後にＥＡＥ重症度の増大（再発）が示される。これは、通常、免疫化の２０〜２７日後に起こる。ケージ当たりマウス４〜６匹でマウス１０〜１２匹の群を使用する。
【０８６８】
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＰＤ−Ｌ１またはＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＣＤ２５特異的ＩＬ２を含む操作された除核赤血球系細胞を、除核赤血球系細胞に適した緩衝剤中に製剤化する。操作された除核赤血球系細胞を用いた処理を、ＥＡＥ発症時に開始する。操作された除核赤血球系細胞を、慢性ＥＡＥの経過を逆転させるそれらの能力について試験する場合、処置を疾患発症の７〜１４日後に開始する。マウスを、ＥＡＥが発生した都度処置群に割り当てるか（段階的な登録）、または免疫化後の固定した時間に処置群に割り当てるが、ＥＡＥ発症時間が同様であり、かつＥＡＥ発症スコアが同様である群が実現されるように、常に平衡するようにする。登録がＥＡＥ発症後の場合、マウスを、登録前の最大スコアについても平衡させる。
【０８６９】
以下の表２５に記載の通り、臨床スコア＝１で投薬を行う。
【０８７０】
動物への投薬は、１日当たり１〜３回行うことができる。投薬の頻度は、２〜１４日ごと、例えば、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごと、８日ごと、９日ごと、１０日ごと、１１日ごと、１２日ごと、１３日ごとまたは１４日ごとである。
【０８７１】
ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＰＤ−Ｌ１を発現する操作された除核赤血球系細胞またはＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＣＤ２５特異的ＩＬ２を含む赤血球系細胞の効果の評価を、下に詳細に記載されている通り、（１）ＥＡＥスコアリング、（２）体重の変化、および（３）組織学的分析の１つまたは複数を使用して決定する。
【０８７２】
ＥＡＥスコアリング
一般には、ＥＡＥは、臨床像が２つの定義されたスコアの間に入る場合の「中間」スコア（すなわち、０．５、１．５、２．５、３．５）を含めた０〜５の尺度でスコアリングされる。スコアリング方法は、個々のマウスそれぞれについて、疾患のステージ（発症／ピーク対回復）に応じてわずかに異なる。スコアリングにおける無意識の偏りを回避するために、いずれのマウスがいずれの処置を受けたかを知らない人により、マウスを盲検式でスコアリングする。
【表２５−１】
2021506304.tif 000122
【表２５−２】
2021506304.tif 000123
【０８７３】
ＥＡＥの回復期には、大多数のマウスが、もう引きずってはいないが、正常でもない尾部を有する；硬く感じ、「曲がって」いる。後肢を動かし始める（ペダリングする）ことはできるが、マウスは歩くことができない。いずれの変化によってもスコアリングが難しくなる。したがって、この場合、以下の表２６に示される、上記のスコアリング判断基準に対する以下の改変をこれらのマウスに対して使用することができる：
【表２６】
2021506304.tif 000124
【０８７４】
体重
ＥＡＥの経過中、体重の変化は、疾患の重症度を反映する。マウスは、多くの場合、免疫化の翌日にわずかに減量する。これは、投与されたアジュバントおよび百日咳毒素の影響に起因すると思われる。次いで、マウスの体重は、疾患が発症するまで着実に増加する。ＥＡＥ発症日に、マウスの体重は一貫して１〜２ｇ（体重の５〜１０％）減少する。体重減少はＥＡＥ重症度の進行と共に続き、疾患のピーク時には、減少が発症前体重の約２０％に達する。体重減少は、麻痺および食物摂取の減少の両方ならびに炎症の急性期の間のＴＮＦなどの炎症促進性サイトカインの高産生に起因する可能性が最も高い。疾患がピークに達した後、マウスは、臨床スコアは改善されなくとも、ゆっくりと増量する。この増量は、より低レベルの血中炎症促進性サイトカインをもたらす炎症の下方調節に起因する可能性がある。無処置またはビヒクルで処置したマウスは、通常、免疫化の２８日後に免疫化前体重の約９０％を有する。
【０８７５】
組織学的検査
試験終了時（通常は免疫化の約２８日後）またはビヒクル群が疾患のピークに達した時点（通常は免疫化の１４〜１８日後）のいずれかで、組織学的分析を実施する。ＥＡＥにおける炎症は、通常、脊髄の腰部において開始され、疾患のピークまでに脊髄全体に拡散する。
【０８７６】
疾患発症時に、炎症病巣の数は疾患の重症度と強力に相関する。病巣の数は疾患のピークまでいくらか増加し、一般には脊髄全体を通して６〜１５個の炎症病巣／切片が見いだされる。ＥＡＥの慢性期（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｓｔａｇｅ）（疾患のピークの数日後に始まる）では、多くの炎症病巣が消散し、一般には、その結果、免疫化のおよそ２８日後までに各脊髄切片における炎症病巣が３〜４個になる。
【０８７７】
疾患の経過の初期に最も多数の炎症病巣が存在するので、組織学的分析を試験終了時に実施する場合には、多くの場合、ＥＡＥ発症が遅いマウスは、脊髄に臨床スコアから予測され得るものよりも多くの炎症病巣を有する。例えば、２８日間の試験において、免疫化の２７日後にＥＡＥが発症し、最後の臨床スコアが２であるマウスは、免疫化の９日後にＥＡＥが発症し、最後のスコアが３．５であるマウスよりも多くの炎症病巣を有する可能性がある。同様に、試験終了の直前に再発するマウス（再発は、臨床スコアの１点またはそれよりも大きな増加と定義される）は、通常、試験終了時に、安定な慢性疾患を有するマウスと比して、この２匹のマウスが試験終了時に同じ臨床スコアを有したとしても、より多くの炎症病巣を有する。
【０８７８】
脱髄は、通常、疾患発症後最初の２日間は見いだされないが、疾患のピーク時（ＥＡＥ発症の４〜５日後）には見いだされ、ＥＡＥの慢性期の間継続する。脱髄スコアはピークと免疫化の２８日後との間で大きくは変化せず、通常、平均して１．２から２．５の間である。
【０８７９】
脱髄は、Ｌｕｘｏｌ  ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ染色切片（ＬＦＢ）およびＨ＆Ｅ切片の両方でスコアリングされる。ＬＦＢ切片では、脊髄白質は濃青色に染色され、脱髄領域はより明るい青色に染色され、大きな液胞を伴う。Ｈ＆Ｅ染色切片では、大きな液胞を伴う、正常な構造の破壊により、脱髄が示される。
【０８８０】
アポトーシス細胞はＨ＆Ｅ切片で同定され、通常、疾患発生の最初の２日間は見いだされない。アポトーシス細胞は、ピーク時およびＥＡＥの慢性期の間に見いだされる。アポトーシス細胞の平均数は、通常、切片当たり２個から４個の間である。
【０８８１】
複数の実施形態では、ＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＰＤ−Ｌ１を発現する除核赤血球系細胞またはＭＯＧ−ＭＨＣＩＩ−ＧＰＡおよびＣＤ２５特異的ＩＬ２を発現する赤血球系細胞の投与により、ビヒクルで処置した対照マウスと比較して、ＥＡＥスコアリングの改善または炎症病巣の数の減少のうちの１つまたは複数が導かれる。
【０８８２】
（実施例５）
ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質を発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成
結果
赤血球系細胞に、ＧＰＡ膜貫通ドメイン（ＧＰＡ）と融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２と融合した、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ２制限ペプチドであるＰＲ１を含む融合タンパク質（ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ）を発現するように形質導入する。図１Ｂは、ＰＲ１ペプチドおよびＭＨＣＩを一本鎖融合物として発現させるための設計の概略図を示す。細胞培養および形質導入を、下の「方法」の節に記載の通り実施して、ＧＰＡ膜貫通ドメインをアンカーとして、ＭＨＣＩの表面に提示されるＰＲ１を発現する赤血球系細胞を得る。
【０８８３】
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＰＲ１抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における抗原性ペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。
【０８８４】
方法
レンチウイルスベクターの産生
ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングする。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてレンチウイルスを産生させる。次いで、細胞を新鮮な培養培地に置く。培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ウイルス上清を収集する。上清を収集し、一定分量として−８０℃で凍結させる。
【０８８５】
赤血球系細胞の拡大および分化
正常なヒトドナー由来の動員された末梢血液細胞に由来するヒトＣＤ３４＋細胞を、ＡｌｌＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃから凍結した状態で購入する。拡大／分化手順は、３つの段階を含む。第１の段階では、解凍したＣＤ３４＋赤血球先駆体を、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、組換えヒト組換えヒト幹細胞因子、および組換えヒトインターロイキン３を含むイスコフＭＤＭ培地中で培養する。第２の段階では、赤血球系細胞を、ウシ血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、ヒト組換え幹細胞因子、ヒト組換えエリスロポエチン、およびＬ−グルタミンを補充したイスコフＭＤＭ培地中で培養する。第３の段階では、赤血球系細胞を、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト組換えエリスロポエチン、およびヘパリンを補充したイスコフＭＤＭ培地中で培養する。培養を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で維持する。
【０８８６】
赤血球先駆細胞への形質導入
上記の培養プロセスのステップ１の間に、赤血球先駆細胞への形質導入を行う。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと合わせる。プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間回転させ、スピノキュレーションによって感染を実現する。スピノキュレーション後、細胞を３７℃で終夜インキュベートする。
【０８８７】
抗体結合
アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識されたまたはフィコエリトリン（ＰＥ）で標識された抗ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２抗体（例えば、抗ＰＲ１／ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体Ｈｕ８Ｆ４）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質の発現を検証する。抗体の結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０８８８】
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体（例えば、ＨＬＡ−Ａ２抗体（ＭＡ１−８０１１７）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。抗体のいずれか１つの結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０８８９】
（実施例６）
ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および共刺激ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検証
結果
赤血球系細胞に、ＧＰＡ膜貫通ドメインと融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２と融合した、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ２制限ペプチドであるＰＲ１を含む融合タンパク質（ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ）を発現するように形質導入する。図１Ｂは、ＰＲ１ペプチドおよびＭＨＣＩを一本鎖融合物として発現させるための設計の概略図を示す。赤血球系細胞にまた、外来性共刺激ペプチド、４−１ＢＢＬをさらに発現するように形質導入する。細胞培養および形質導入を、下の「方法」の節に記載の通り実施して、ＧＰＡ膜貫通ドメインをアンカーとして、ＭＨＣＩの表面に提示されたＰＲ１を発現する赤血球系細胞を得る。
【０８９０】
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＰＲ１または抗４−１ＢＢＬ抗体の外来性ペプチドＰＲ１および４−１ＢＢＬへの結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるそれぞれのペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。
【０８９１】
操作された赤血球系細胞（ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ、４−１ＢＢＬ）の効果の機能活性を、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の活性化および増殖を刺激するそれらの能力について評価する。
【０８９２】
方法
レンチウイルスベクターの産生
ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質の遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を構築する。当該タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングし、その結果、１つのベクターが両方の外来性タンパク質の遺伝子を含むようにする。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡの遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてレンチウイルスを産生させる。細胞を新鮮な培養培地に置く。培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ウイルス上清を収集する。上清を収集し、一定分量として−８０℃で凍結させる。
【０８９３】
赤血球先駆細胞への形質導入
赤血球系細胞の拡大および分化を、上記のレンチウイルスベクターを用い、実施例５に従って実施する。培養プロセスのステップ１の間に、赤血球先駆細胞への形質導入を行う。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと合わせる。プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間回転させ、スピノキュレーションによって感染を実現する。スピノキュレーション後、細胞を３７℃で終夜インキュベートする
【０８９４】
抗体結合
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＰＲ１抗体の結合を使用して、実施例５に記載の通り、操作された赤血球系細胞におけるＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合物の発現を検証する。同じく実施例５に記載の通り、ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ポリペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗４−１ＢＢＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における４−１ＢＢＬの発現を検証する。抗体のいずれか１つの結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０８９５】
機能的検証アッセイ
ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬ共刺激ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞を、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の活性化および増殖を刺激するそれらの能力について試験する。Ｔ細胞を、操作された赤血球系細胞で刺激し、以下のパラメーターを評価する：（１）バルク培養物中で合成されたＤＮＡの総量を示す標準のチミジン組入れアッセイによって決定される、ａＡＰＣで刺激されたＴ細胞の成長速度、（２）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖および細胞分裂の誘導、（３）アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いた蛍光染色による、培養下で種々のａＡＰＣによって刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の生存能力、（４）それぞれＴ細胞の生存および増殖に関与する２つの遺伝子であるＢｃｌ−ｘＬおよびＩＬ−２の発現であって、Ｂｃｌ−ｘＬをコードするｍＲＮＡおよびＩＬ−２をコードするｍＲＮＡの定常状態のレベルを決定するために定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用する。
【０８９６】
サイトカイン産生
サイトカインは、重要なエフェクター分子であり、Ｔ細胞分化に関する洞察をもたらすものである。ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合物および共刺激ペプチド４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された赤血球系細胞の、ＣＤ８Ｔ細胞からある特定のサイトカイン、例えば、ＩＬ−２（ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大、および、長期にわたる成長の潜在性とよく相関するＩＬ−２を誘導する細胞の能力に重要なＴ細胞増殖因子）；ＩＬ−４（ＴＨ２分化についてのマーカー）；およびＩＬ−１０（調節性Ｔ細胞増生の代理になり得る免疫抑制性サイトカイン）を誘導する能力を定量化する。他のサイトカインとしては、これらに限定されないが、ＴＧＦ−β（ＩＬ−１０と同じ理論的根拠）；ＩＦＮ−γ（ＴＨ１分化についてのマーカーであり、重要なエフェクターサイトカイン）；およびＴＮＦα（重要なエフェクターサイトカイン）が挙げられる。抗原性刺激に応答して所与のサイトカイン（例えば、ガンマインターフェロン［ＩＦＮ−γ］）を分泌するＴ細胞を検出するＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）技法を使用して、定量化を行う。Ｔ細胞を、抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングされたウェル中、抗原提示細胞と共に培養する。分泌されたＩＦＮ−γを、コーティングされた抗体によって捕捉し、次いで、発色基質とカップリングした第２の抗体を用いて明らかにする。したがって、サイトカイン分子がスポットから局所的に分泌され、各スポットが、１つのＩＦＮ−γ分泌細胞に対応する。スポットの数により、分析される試料中の所与の抗原に特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度を決定することが可能になる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の検出に関しても記載されている。
【０８９７】
（実施例７）
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）マウスがんモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および共刺激ポリペプチドを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞の活性
ＰＲ１ペプチドは、ヒト白血病抗原であることが示されている。健康なドナーからｉｎ  ｖｉｔｒｏで引き出されたＰＲ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、患者由来のＰ３を発現するＡＭＬ細胞を溶解させることが示されている。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＰＲ１−ＣＴＬの養子移入がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬ細胞の減少に関連付けられることが示されている（Molldrem  et  al.,  Cancer  Res.  1999；59:2675-2681；Molldrem  et  al.,  Nat  Med.  2000;6:1018-1023；Rezvani  et  al.,  Blood.  2003;102:2892-2900；そのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０８９８】
十分に確立されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、ＰＲ１−ＣＴＬを受けたマウス由来の骨髄穿刺液が、ＰＲ１−ＣＴＬとそれに加えてＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞を受けているマウスと比較して、過形成骨髄中のＡＭＬ芽球をより多く有するかどうかを決定するためのモデルとして使用する。このモデルをまた、ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞を受けているマウスでは、除核赤血球系細胞を受けなかったマウスと比較して、ＰＲ１−ＣＴＬレベルがより高いかどうかを決定するためにも使用する。このモデルをまた、ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞を受けているマウスでは、除核赤血球系細胞を受けなかったマウスと比較して、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２８＋エフェクター表現型が維持されるかどうかを決定するためにも使用する。
【０８９９】
ＰＲ１−ＣＴＬ産生
ＰＲ１−ＣＴＬを、以前に記載されている方法をいくつかの改変を伴って使用して、バルク培養物中で拡大させる（Molldrem  et  al.,  Blood.  1996;88:2450-2457、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。自己樹状細胞（ＤＣ）を、ＨＬＡ−Ａ２．１＋健康なドナーから生成する。簡単に述べると、正常なドナー由来の接着性単球を、サイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（５００ＩＵ／ｍＬ）とインターフェロン（ＩＮＦ）−αの組合せを用いて７日間刺激する。活性化されたＤＣを収集し、細胞の画分を、ＣＤ８０およびＣＤ１４発現についてＦＡＣＳによって分析する。ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、ＤＣにＰＲ１、ＰＲ２またはｐｐ６５ペプチドをパルスする。ＰＲ２（ＲＬＦＰＤＦＦＴＲＶ（配列番号７２０））は、プロテイナーゼ３に由来する別のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドであるが、ＰＲ２−ＣＴＬは白血病細胞を死滅させることができない（Molldrem  et  al.,  Blood.  1996）。末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を、ペプチドパルスした自己ＤＣを用いて週に１回、３〜４週間にわたって刺激する。ＰＲ１−ＣＴＬの画分を回収し、特異的な溶解について以前に使用されたＣＴＬ細胞傷害アッセイを使用して試験する（Molldrem  et  al.,  Blood.  1996、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。バルク培養物由来の残りのＣＴＬを、ＣＤ４細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を同時に枯渇させるために抗体を使用し、選別機を用いて精製する。
【０９００】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＡＭＬ異種移植モデル
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ＨＬＡ−Ａ２．１マウスを、ＡＭＬ細胞を生着させるために使用する。ヒトＡＭＬ骨髄試料を得、患者由来のＡＭＬ細胞を、照射処置した（２００ｃＧｙ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの静脈内に移入する。ＡＭＬ骨髄試料を、移入の２週間後に様々な用量で骨髄において首尾よく生着する能力に基づいて選択する。少数のＰＲ１特異的Ｔ細胞を、ＡＭＬを生着させたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、単独でまたはＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞と共に、養子移入する。動物を、移入の２週間後に屠殺し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）および免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析のために組織を回収する。ヒトＣＤ４５  ＡｂおよびマウスＣＤ４５．２  Ａｂを使用して、ヒト起源の細胞を同定する。サイトスピン調製物および骨髄から調製されたスメアに対して示差的な細胞計数を実施する。回収した組織臓器のホルマリン固定パラフィン包埋切片を、ヘマトキシリン−エオシン染色で染色する。
【０９０１】
ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２８＋エフェクター表現型
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２８＋エフェクター表現型を検証する。抗体の結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０９０２】
複数の実施形態では、ＰＲ１−ＣＴＬを受けたマウス由来の骨髄穿刺液は、ＰＲ１−ＣＴＬとそれに加えてＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞を受けているマウスと比較して、過形成骨髄中のＡＭＬ芽球をより多く有する。他の実施形態では、ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞を受けているマウスでは、除核赤血球系細胞を受けなかったマウスと比較して、ＰＲ１−ＣＴＬレベルがより高い。他の実施形態では、ＰＲ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞を受けているマウスでは、除核赤血球系細胞を受けなかったマウスと比較して、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２８＋エフェクター表現型が維持される。
【０９０３】
（実施例８）
ｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ融合タンパク質および共刺激ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検証
結果
赤血球系細胞に、ＧＰＡ膜貫通ドメインと融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩ  Ｈ−２Ｄｂと融合した、黒色腫抗原であるｇｐ１００を含む融合タンパク質（ｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ）を発現するように形質導入する。赤血球系細胞にまた、外来性共刺激ペプチド、４−１ＢＢＬをさらに発現するように形質導入する。細胞培養および形質導入を、下の「方法」の節に記載の通り実施して、ＧＰＡ膜貫通ドメインをアンカーとして、ＭＨＣＩの表面に提示されたｇｐ１００を発現する赤血球系細胞を得る。
【０９０４】
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ｇｐ１００または抗４１−ＢＢＬ抗体の外来性ペプチドｇｐ１００および４−１ＢＢＬへの結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるそれぞれのペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。
【０９０５】
操作された赤血球系細胞（ｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ、４−１ＢＢＬ）の効果の機能活性を、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の活性化および増殖を刺激するそれらの能力について評価する。
【０９０６】
方法
レンチウイルスベクターの産生
ｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ融合タンパク質の遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を構築する。当該タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングし、その結果、１つのベクターが両方の外来性タンパク質の遺伝子を含むようにする。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂの遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてレンチウイルスを産生させる。細胞を新鮮な培養培地に置く。培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ウイルス上清を収集する。上清を収集し、一定分量として−８０℃で凍結させる。
【０９０７】
赤血球先駆細胞への形質導入
赤血球系細胞の拡大および分化を、上記のレンチウイルスベクターを用い、実施例５に従って実施する。培養プロセスのステップ１の間に、赤血球先駆細胞への形質導入を行う。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと合わせる。プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間回転させ、スピノキュレーションによって感染を実現する。スピノキュレーション後、細胞を３７℃で終夜インキュベートする。
【０９０８】
抗体結合
ビオチン化抗ｇｐ１００抗体（例えば、ＴＢ−Ｍ５０５−Ｍ、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ融合タンパク質の発現を検証する。ビオチン化抗体の結合を、細胞表面標識付けおよびフローサイトメトリー／蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）でアビジンコンジュゲートを用いて検出する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体（例えば、ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｄｂ）モノクローナル抗体（２８−１４−８）、ＰＥ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗４−１ＢＢＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における４−１ＢＢＬの発現を検証する。抗体のいずれか１つの結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０９０９】
機能的検証アッセイ
ｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬ共刺激ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞を、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の活性化および増殖を刺激するそれらの能力について試験する。Ｔ細胞を、操作された赤血球系細胞で刺激し、以下のパラメーターを評価する：（１）バルク培養物中で合成されたＤＮＡの総量を示す標準のチミジン組入れアッセイによって決定される、ａＡＰＣで刺激されたＴ細胞の成長速度、（２）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖および細胞分裂の誘導、（３）アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いた蛍光染色による、培養下で種々のａＡＰＣによって刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の生存能力、（４）それぞれＴ細胞の生存および増殖に関与する２つの遺伝子であるＢｃｌ−ｘＬおよびＩＬ−２の発現であって、Ｂｃｌ−ｘＬをコードするｍＲＮＡおよびＩＬ−２をコードするｍＲＮＡの定常状態のレベルを決定するために定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用する。
【０９１０】
サイトカイン産生
ｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ融合物および共刺激ペプチド４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された赤血球系細胞の、ＣＤ８Ｔ細胞からある特定のサイトカイン、例えば、ＩＬ−２（ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大、および、長期にわたる成長の潜在性とよく相関するＩＬ−２を誘導する細胞の能力に重要なＴ細胞増殖因子）；ＩＬ−４（ＴＨ２分化についてのマーカー）；およびＩＬ−１０（調節性Ｔ細胞増生の代理になり得る免疫抑制性サイトカイン）を誘導する能力を定量化する。他のサイトカインとしては、これらに限定されないが、ＴＧＦ−β（ＩＬ−１０と同じ理論的根拠）；ＩＦＮ−γ（ＴＨ１分化についてのマーカーであり、重要なエフェクターサイトカイン）；およびＴＮＦα（重要なエフェクターサイトカイン）が挙げられる。抗原性刺激に応答して所与のサイトカイン（例えば、ガンマインターフェロン［ＩＦＮ−γ］）を分泌するＴ細胞を検出するＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）技法を使用して、定量化を行う。Ｔ細胞を、抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングされたウェル中、抗原提示細胞と共に培養する。分泌されたＩＦＮ−γを、コーティングされた抗体によって捕捉し、次いで、発色基質とカップリングした第２の抗体を用いて明らかにする。したがって、サイトカイン分子がスポットから局所的に分泌され、各スポットが、１つのＩＦＮ−γ分泌細胞に対応する。スポットの数により、分析される試料中の所与の抗原に特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度を決定することが可能になる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の検出に関しても記載されている。
【０９１１】
（実施例９）
黒色腫のＢ−１６マウス腫瘍モデルにおける、ｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ融合タンパク質および共刺激ポリペプチドを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞の活性
転移性黒色腫を有する患者のサブセットは、組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）を、時にはｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させた自己黒色腫反応性リンパ球と共に投与することによって首尾よく処置することができる（Rosenberg,  1997；Rosenberg,  1999）。最近、いくつかの異なる研究室で、これらの抗腫瘍リンパ球が、ｇｐ１００（Overwijk  and  Restifo,  Curr  Protoc  Immunol.  2001  May;  CHAPTER:  Unit-20.1、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）を含む群である、一般に突然変異していないメラニン細胞分化抗原（ＭＤＡ）である黒色腫関連抗原をクローン化するために使用されている。
【０９１２】
Ｂ１６黒色腫を含めた多くの腫瘍モデルにおける治療の評価のために、皮下モデルが広く使用されている。皮下注射すると、Ｂ１６は５〜１０日で触知できる腫瘍を形成し、１４〜２１日で１×１×１ｃｍの腫瘍に成長する。より大きく成長させると、腫瘍は、多くの場合、中央が壊死性になり、潰瘍化または出血し始める；この時点よりも前にマウスを屠殺することを勧める。使用される典型的な用量は、マウス当たり細胞１×１０５個であり、これは、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスにおける最小腫瘍形成用量の１．５〜２倍である。
【０９１３】
ｇｐ１００−Ｈ−２Ｄｂ−ＧＰＡ融合物および共刺激ペプチド４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞により、マウスにおけるＢ１６黒色腫細胞を排除することができるかどうかを決定するためのモデルとして、Ｂ１６黒色腫マウスモデルを使用する。
【０９１４】
Ｂ−１６細胞の調製およびマウスへの接種の方法は、Overwijk  and  Restifo（Curr  Protoc  Immunol.  2001  May;  CHAPTER:  Unit-20.1、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。腫瘍が触知できるようになったら、操作された赤血球系細胞の投薬を開始する。細胞をＰＢＳまたは他の緩衝剤中に製剤化する。
【０９１５】
複数の実施形態では、操作された除核赤血球系細胞の投与により、改変されていない対照細胞と比較した、腫瘍細胞生着の阻害または腫瘍サイズの縮小の一方または両方が導かれる。
【０９１６】
（実施例１０）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｏｖａ特異的Ｔ細胞を活性化する
マウス赤血球系細胞を、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩおよび４−１ＢＢＬと、クリック方法体系を使用してコンジュゲートした（赤血球系細胞を機能性にするためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２１４２号の優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２号に記載されている）。簡単に述べると、マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、４０ｕＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカーと一緒に室温で１時間インキュベートし、４℃で終夜さらにインキュベートした。ｍＲＣＴ−ｍ４−１ＢＢＬを、１ｕＭの水溶性ＤＢＣＯビオチンと一緒に室温で１時間インキュベートし、その後、ニュートラアビジンと一緒に、ビオチンとニュートラアビジンとのモル比１：１でインキュベートすることによって、ビオチンとクリックした。次いで、ニュートラアビジンが結合した細胞を、ビオチン化Ｈ−２Ｋｂ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７２１）単量体と一緒に、ビオチンと単量体とのモル比１：１で、室温で１時間インキュベートした。
【０９１７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１ｕＭのＣＦＳＥで標識した。ＣＦＳＥ標識されたＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞２×１０５個を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。様々な量（細胞３×１０６個、１×１０６個、３．３×１０５個、または１．１×１０５個）のｍＲＣＴ、ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ、ｍＲＣＴ−ＭＨＣ（ｏｖａ）、またはｍＲＣＴ−ＭＨＣ（ｏｖａ）＋４−１ＢＢＬを、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するウェル中、ｃＲＰＭＩ培地にプレーティングし、３７℃で２日間インキュベートした。培養上清を収集して、ＩＬ２濃度およびＩＦＮ−γ濃度をサイトカインＥＬＩＳＡによって測定した。細胞を洗浄し、Ｔ細胞拡大および活性化を定量化するために、抗ＣＤ８、ｌｉｖｅｄｅａｄ色素、および抗ＣＤ４４で染色した。
【０９１８】
図２に示されている通り、ＭＨＣ  Ｉ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを細胞表面に提示するマウス赤血球系細胞、またはＭＨＣ  Ｉ（オボアルブミン）を単独で提示するマウス赤血球系細胞（ＲＣＴ−ａＡＰＣ（ｏｖａ））は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｏｖａ特異的Ｔ細胞を強力に活性化する。これらの結果から、本明細書に記載の操作された除核細胞を使用して、抗原特異的Ｔ細胞を強力かつ選択的に拡大および活性化することができることが実証される。
【０９１９】
上記のものと同様の試験において、クリック方法体系を使用してコンジュゲートするのではなく、ヒト赤血球系細胞に、ｏｖａおよび４−１ＢＢＬを同時発現するように形質導入した。これらの実験では、健康なヒトドナー由来のＣＤ３４＋細胞を拡大し、ＨＡ−ＧＰＡ濃縮レンチウイルス、ＧＰＡ−ｍ４−１ＢＢＬ濃縮レンチウイルス、またはｂ２ＭＬ−ＯＶＡＨ２Ｋｂ−ＧＰＡ濃縮レンチウイルスをＭＯＩ２０で用いて形質導入した。ｈＲＣＴ−ＭＨＣ（ｏｖａ）＋４−１ＢＢＬを、ＧＰＡ−ｍ４−１ＢＢＬ濃縮レンチウイルスおよびｂ２ＭＬ−ＯＶＡＨ２Ｋｂ−ＧＰＡ濃縮レンチウイルスをそれぞれＭＯＩ２０で用いた２重（同時）形質導入によって生成した。ｈＲＣＴを成熟化９日目に回収し、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過して、除核細胞を富化した。発現レベルおよびコピー数を、Ｈ２Ｋｂと結合した抗ｍ４−１ＢＢＬおよび抗ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７２１）を用いた染色によって決定し、Ｂａｎｇｓビーズ標準曲線に従って較正した。
【０９２０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１ｕＭのＣＦＳＥを用いて標識した。ＣＦＳＥ標識されたＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞３×１０５個を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングする。様々な量（細胞３×１０６個、６×１０５個、３×１０５個、または１．５×１０５個）のｈＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡ、ｈＲＣＴ−ｍ４−１ＢＢＬ、ｈＲＣＴ−ＭＨＣ（ｏｖａ）、またはｈＲＣＴ−ＭＨＣ（ｏｖａ）＋４−１ＢＢＬを、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するウェルにプレーティングした。各ウェル中のｈＲＣＴ−ｍ４−１ＢＢＬおよびｈＲＣＴ−ＭＨＣ（ｏｖａ）細胞の数を、ｍ４−１ＢＢＬおよびＭＨＣ（ｏｖａ）の分子の数が、対応するｈＲＣＴ−ＭＨＣ（ｏｖａ）＋ｍ４−１ＢＢＬのウェル中の総分子数と釣り合うように調整した。ｈＲＣＴおよびＯＴ１細胞を３７℃で３日間インキュベートした。培養上清を収集して、ＩＬ２濃度およびＩＦＮ−γ濃度をサイトカインＥＬＩＳＡによって測定した。細胞を洗浄し、Ｔ細胞拡大および活性化を定量化するために抗ＣＤ８、ｌｉｖｅｄｅａｄ色素、および抗ＣＤ４４で染色した。この試験の結果から、ｏｖａおよびｍ４−１ＢＢＬを同時発現するように形質導入されたヒト赤血球系細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｏｖａ特異的Ｔ細胞を強力に活性化することが示され、これにより、クリック技術を使用して構築されたｍＲＣＴを使用して得られた結果（上記および図２に示されている）と同様の高ＣＤ４４発現が実証される。
【０９２１】
（実施例１１）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示する赤血球系細胞によって拡大および活性化させたオボアルブミン特異的Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、オボアルブミンを発現する腫瘍細胞を選択的に死滅させる
マウス赤血球系細胞を、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩおよび４−１ＢＢＬと、クリック方法体系を使用してコンジュゲートした（赤血球系細胞を機能性にするためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に記載されている）。簡単に述べると、マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、４０ｕＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカーと一緒に室温で１時間インキュベートし、４℃で終夜さらにインキュベートした。ｍＲＣＴ−ｍ４−１ＢＢＬを、１ｕＭの水溶性ＤＢＣＯビオチンと一緒に室温で１時間インキュベートし、その後、ニュートラアビジンと一緒に、ビオチンとニュートラアビジンとのモル比１：１でインキュベートすることによって、ビオチンとクリックした。次いで、ニュートラアビジンが結合した細胞を、ビオチン化Ｈ−２Ｋｂ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７２１）単量体と一緒に、ビオチンと単量体とのモル比１：１で、室温で１時間インキュベートした。
【０９２２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１ｕＭのＣＦＳＥで標識した。ＣＦＳＥ標識されたＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞１．２×１０６個を、ａＡＰＣ（ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  Ｈ２Ｋｂ  ＯＶＡ）１．２×１０７個と一緒に、２４ウェルプレートの各ウェル中で培養した。３日間インキュベートした後にＯＴ１細胞を回収し、ＡＣＫ緩衝剤を用いて処理して、ｍＲＣＴを溶解させた。ＯＴ１細胞の腫瘍細胞に対する活性を試験するために、次いで、１×１０４個のｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｆａｒ  ｒｅｄ標識された腫瘍細胞、親腫瘍細胞ＥＬ４、またはオボアルブミンを発現する腫瘍細胞ＥＧ７．ＯＶＡのいずれか（それぞれ標的細胞）を９６ウェルＵ底プレートの各ウェルにプレーティングした。ＯＴ１細胞（エフェクター細胞）をウェルに、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１０：１、５：１、２：１、１：１または０：１で添加した。２２時間インキュベートした後、細胞をｌｉｖｅｄｅａｄ色素で染色し、２％パラホルムアルデヒドを用いて固定して、各ウェル中の生標的細胞を数え上げた。
【０９２３】
この実験の結果を図３に示す。著しいことに、ＭＨＣ  Ｉ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示するマウス赤血球系細胞によって拡大および活性化させたオボアルブミン特異的Ｔ細胞（ＯＴ１−Ｔ細胞）は、オボアルブミンを発現する腫瘍細胞、またはＥＧ７．ＯＶＡ細胞を選択的に死滅させることが観察されたが、オボアルブミンを発現しない親細胞（ＥＬ４細胞）は攻撃されず、死滅しなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて特定の腫瘍特異的Ｔ細胞集団を有意に拡大および活性化して、腫瘍を死滅させることができることには、患者において、時には制御されずに拡大し得る腫瘍特異的Ｔ細胞集団を投与するＣＡＲ  Ｔ手法との類似点がある。本発明の有意な利点は、本明細書に記載の操作された除核細胞の用量を制御することにより、腫瘍特異的Ｔ細胞の拡大および最終的に治療の安全性および有効性をより有効に制御できることである。
【０９２４】
（実施例１２）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、リンパ節に移動するｏｖａ特異的Ｔ細胞を活性化する
マウス赤血球系細胞を、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩおよび４−１ＢＢＬと、クリック方法体系を使用してコンジュゲートした（赤血球系細胞を機能性にするためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２１４２号に記載されている）。簡単に述べると、マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、４０ｕＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカーと一緒に室温で１時間インキュベートし、４℃で終夜さらにインキュベートした。ｍＲＣＴ−ｍ４−１ＢＢＬを、１ｕＭの水溶性ＤＢＣＯビオチンと一緒に室温で１時間インキュベートし、その後、ニュートラアビジンと一緒に、ビオチンとニュートラアビジンとのモル比１：１でインキュベートすることによって、ビオチンとクリックした。次いで、ニュートラアビジンが結合した細胞を、ビオチン化Ｈ−２Ｋｂ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７２１）単量体と一緒に、ビオチンと単量体とのモル比１：１で、室温で１時間インキュベートした。
【０９２５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＲＡＧ２−／−ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、蛍光色素（１０ｕＭのＣＦＳＥ）を用いて標識した。−１日目にＯＴ１細胞１．８×１０６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に注射した。０日目に、マウスにａＡＰＣ（ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬまたはｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  Ｈ２Ｋｂ  ＯＶＡ）１×１０８個を静脈内注射した。４日目に、マウスを屠殺し、それらの脾臓およびリンパ節由来の単一細胞懸濁液をＮＩＲ  Ｚｏｍｂｉｅ、ＡＰＣ  ４１ＢＢ、Ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ  ＣＤ４４、ＢＶ６５０  ＣＤ８およびＢＶ７８５  ＣＤ６２Ｌで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＯＴ１  Ｔ細胞の増殖を、リンパ節または脾臓における蛍光色素シグナルの希釈を追跡することによってモニタリングした。実験の設計を示す概略図が図４Ａに示されている。実験の結果が図４Ｂおよび４Ｃに示されており、図４Ｂは、代表的なデータの概略図であり、ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  ＯＶＡがＯＴ１−Ｔ細胞を特異的に拡大および活性化させるが、オボアルブミンペプチドを細胞表面に提示するＭＨＣＩを伴わないｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬでは、ＯＴ１−Ｔ細胞が拡大および活性化しないことが示されている。
【０９２６】
図４Ｃに示されている通り、このマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの実験の結果から、ＣＤ４４発現の増大によって証明される通り、ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  Ｈ２Ｋｂ  ＯＶＡがＯＴＩ−Ｔ細胞を特異的に拡大および活性化させることが実証された。さらに、活性化される大多数のＯＴ１−Ｔ細胞が、Ｔ細胞に基づく治療の効果を駆動する重要な集団であることが見いだされているセントラルメモリー表現型を示すことが見いだされた。結果から、これらのＯＴＩ−Ｔ細胞がリンパ節に移動し、そこで、さらなる拡大および活性化を受けることが予測され、これにより、それらが体内および腫瘍に有効に動員されて、頑強な抗腫瘍応答を支持するという潜在性が支持される。対照的に、オボアルブミンペプチドを細胞表面に提示するＭＨＣＩを伴わないｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬでは、ＯＴＩ−Ｔ細胞が拡大または活性化されず、それによって、ｍＲＣＴ−ａＡＰＣがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞の機能を模倣することが示される。
【０９２７】
（実施例１３）
ｇｐ３５０−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および共刺激ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞の生成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検証
結果
赤血球系細胞に、ＧＰＡ膜貫通ドメインと融合した外来性抗原提示ポリペプチドＭＨＣＩ  ＨＬＡ−Ａ２と融合した、（ＨＬＡ）−Ａ２制限エプスタイン・バーウイルスにコードされる糖タンパク質３５０（ｇｐ３５０）由来の免疫原性ペプチドを含む融合タンパク質（ｇｐ３５０−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ）を発現するように形質導入する。使用する例示的なｇｐ３５０免疫原性ペプチドは、ＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号６９８）である。赤血球系細胞にまた、外来性共刺激ペプチド、４−１ＢＢＬをさらに発現するように形質導入する。細胞培養および形質導入を、下の「方法」の節に記載の通り実施して、ＧＰＡ膜貫通ドメインをアンカーとして、ＭＨＣＩの表面に提示されたｇｐ３５０を発現する赤血球系細胞を得る。
【０９２８】
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ｇｐ３５０または抗４−１ＢＢＬ抗体の外来性ペプチドｇｐ３５０および４−１ＢＢＬへの結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるそれぞれのペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ペプチドの発現を検証する。
【０９２９】
操作された赤血球系細胞（ｇｐ３５０−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ、４−１ＢＢＬ）の効果の機能活性を、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の活性化および増殖を刺激するそれらの能力について評価する。
【０９３０】
方法
レンチウイルスベクターの産生
ｇｐ３５０−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質の遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を構築する。当該タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングし、その結果、１つのベクターが両方の外来性タンパク質の遺伝子を含むようにする。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびｇｐ３５０−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡの遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてレンチウイルスを産生させる。細胞を新鮮な培養培地に置く。培地交換の４８時間後に、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ウイルス上清を収集する。上清を収集し、一定分量として−８０℃で凍結させる。
【０９３１】
赤血球先駆細胞への形質導入
赤血球系細胞の拡大および分化を、実施例５に従って実施し、上記のレンチウイルスベクターを用いて形質導入する。培養プロセスのステップ１の間に、赤血球先駆細胞への形質導入を行う。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと合わせる。プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間回転させ、スピノキュレーションによって感染を実現する。スピノキュレーション後、細胞を３７℃で終夜インキュベートする。
【０９３２】
抗体結合
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ｇｐ３５０抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるｇｐ３５０−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合物の発現を検証する。抗体の結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。実施例５に記載の通り、ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ポリペプチドの発現を検証する。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗４−１ＢＢＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における４−１ＢＢＬの発現を検証する。抗体のいずれか１つの結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定する。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定する。
【０９３３】
機能的検証アッセイ
ｇｐ３５０−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬ共刺激ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された赤血球系細胞を、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の活性化および増殖を刺激するそれらの能力について試験する。Ｔ細胞を、操作された赤血球系細胞で刺激し、以下のパラメーターを評価する：（１）バルク培養物中で合成されたＤＮＡの総量を示す標準のチミジン組入れアッセイによって決定される、ａＡＰＣで刺激されたＴ細胞の成長速度、（２）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖および細胞分裂の誘導、（３）アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いた蛍光染色による、培養下で種々のａＡＰＣによって刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の生存能力、（４）それぞれＴ細胞の生存および増殖に関与する２つの遺伝子であるＢｃｌ−ｘＬおよびＩＬ−２の発現であって、Ｂｃｌ−ｘＬをコードするｍＲＮＡおよびＩＬ−２をコードするｍＲＮＡの定常状態のレベルを決定するために定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用する。
【０９３４】
サイトカイン産生
サイトカインは、重要なエフェクター分子であり、Ｔ細胞分化に関する洞察をもたらすものである。ｇｐ３５０−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合物および共刺激ペプチド４−１ＢＢＬを同時発現するように操作された赤血球系細胞の、ＣＤ８Ｔ細胞からある特定のサイトカイン、例えば、ＩＬ−２（ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大、および、長期にわたる成長の潜在性とよく相関するＩＬ−２を誘導する細胞の能力に重要なＴ細胞増殖因子）；ＩＬ−４（ＴＨ２分化についてのマーカー）；およびＩＬ−１０（調節性Ｔ細胞増生の代理になり得る免疫抑制性サイトカイン）を誘導する能力を定量化する。他のサイトカインとしては、これらに限定されないが、ＴＧＦ−β（ＩＬ−１０と同じ理論的根拠）；ＩＦＮ−γ（ＴＨ１分化についてのマーカーであり、重要なエフェクターサイトカイン）；およびＴＮＦα（重要なエフェクターサイトカイン）が挙げられる。抗原性刺激に応答して所与のサイトカイン（例えば、ガンマインターフェロン［ＩＦＮ−γ］）を分泌するＴ細胞を検出するＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）技法を使用して、定量化を行う。Ｔ細胞を、抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングされたウェル中、抗原提示細胞と共に培養する。分泌されたＩＦＮ−γを、コーティングされた抗体によって捕捉し、次いで、発色基質とカップリングした第２の抗体を用いて明らかにする。したがって、サイトカイン分子がスポットから局所的に分泌され、各スポットが、１つのＩＦＮ−γ分泌細胞に対応する。スポットの数により、分析される試料中の所与の抗原に特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度を決定することが可能になる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の検出に関しても記載されている。
【０９３５】
（実施例１４）
マウスＥＢＶモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＢＶ−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および共刺激ポリペプチドを同時発現するように操作された除核赤血球系細胞の活性
いくつかのＥＢＶペプチドが、ヒト白血病抗原であることが示されている。さらに、いくつかのマウス系がＥＢＶ感染および関連する疾患の疾患モデルとして使用されてきた。ＮＯＤ／ＮＳＧ  ＥＢＶ異種移植マウスモデルを、ＥＢＶにより活性化された自己反応性Ｂ細胞を妨害するこの系の能力を試験するために、ＲＴＸ−ａＡＰＣをＥＢＶ関連ＭＳ（元々、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるFujiwara  et  al.,  2013,  Pathogens,  Mar  14;2(1):153-76に記載されている）について試験するために使用することができる。ＮＯＤ／ＮＳＧ  ＥＢＶ異種移植モデルを、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ  ＩＬ−２ｒｇ−／−（ＮＳＧ）を使用して組み立てる。移植日に、２〜５日齢のマウスに１００ｃＧｙでの照射処理を受けさせ、胎児肝臓または臍帯血から単離されたヒトＣＤ３４＋細胞を肝内に移植する。ＥＢＶを腹腔内に接種する。次いで、マウスに、ａＡＰＣを、ＥＢＶペプチドを提示するＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかと共に、および共刺激分子（すなわち、４−１ＢＢＬ）と共に投与する。ａＡＰＣは、ＥＢＶペプチドをローディングしたＭＨＣ分子および共刺激分子をクリックしたマウスＲＢＣ、またはその代わりに、ＥＢＶペプチド−ＭＨＣクラスＩ−ＧＰＡ融合タンパク質および共刺激分子を発現するように操作されたヒト除核赤血球系細胞（例えば、実施例１３に記載のａＡＰＣ）のいずれかである。これらのａＡＰＣは、ＥＢＶペプチドに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞またはＣＤ４  Ｔ細胞を活性化し、それが今度はＭＨＣクラスＩまたはＩＩを通じてＥＢＶペプチドを提示する細胞を死滅させることが予測される。これは、リンパ球増殖性になったＢ細胞の枯渇を含み得る。移植の４〜１０週間後に動物を屠殺し、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞応答を、以前に記載されている通りＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して分析する（J  Exp  Med.  2009  Jun  8;206(6):1423-34、その内容が参照により本明細書に組み込まれる）。ａＡＰＣ投与後、ａＡＰＣを投与したマウスまたは投与していないマウスの間で表現型を評価するために、Ｔ細胞を、例えばＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４、および／または４１ＢＢを含めた活性化マーカーについても染色する。
【０９３６】
（実施例１５）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ用量応答ｏｖａ特異的Ｔ細胞を示す
マウス赤血球系細胞を、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩおよび４−１ＢＢＬと、クリック方法体系を使用してコンジュゲートした（赤血球系細胞を機能性にするためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２１４２号の優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２号に記載されている）。簡単に述べると、マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、４０ｕＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカーおよびＨ−２Ｋｂ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー（配列番号７２１）単量体と一緒に室温で１時間インキュベートし、４℃で終夜さらにインキュベートした。
【０９３７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、蛍光色素（１０ｕＭのＣＦＳＥ）で標識した。０日目にＯＴ１細胞２×１０６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に注射した。０日目、ＯＴ１注射の４時間後に、マウスに１×１０６個、１×１０７個または１×１０８個のａＡＰＣ（ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  Ｈ２Ｋｂ  ＯＶＡ）を静脈内注射した。４日目に、マウスを屠殺し、それらの脾臓およびリンパ節由来の単一細胞懸濁液を、ＰＥ  ｃｙ７  ＣＤ４４、ＡＰＣ  ＣＤ１２２、ａｄ  ＢＶ６５０  ＣＤ２７で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＯＴ１  Ｔ細胞の活性化および増殖を、リンパ節または脾臓における蛍光色素シグナルの希釈を追跡することによってモニタリングした。
【０９３８】
図５に示されている通り、ＭＨＣ  Ｉ（オボアルブミン）（ｍＲＣＴ−ａＡＰＣ（ｏｖａ）４−１ＢＢＬ）を提示するマウス赤血球系細胞は、ＣＦＳＥ蛍光強度の増大（図５Ａ）およびＣＤ４４発現（図５Ｂ）によって証明される通り、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｏｖａ特異的Ｔ細胞の活性化および増殖を用量依存的に、強力に誘導する。この結果から、活性化されたＯＴ１  Ｔ細胞は、重要なメモリーマーカーであるＣＤ１２２およびＣＤ２７の上方調節によって証明される通り（図５Ｃおよび５Ｄ）、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてメモリー表現型を示すことも示される。これらの結果から、本明細書に記載の操作された除核細胞を使用して抗原特異的Ｔ細胞を強力かつ選択的に拡大および活性化することができることが実証される。
【０９３９】
（実施例１６）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞の第２の用量により、リンパ節および脾臓のどちらにおいてもＣＤ８＋ＯＴ１  Ｔ細胞が劇的に追加免疫される。
マウス赤血球系細胞を、実施例１５に記載の通り生成した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、実施例１５に記載の通り精製した。簡単に述べると、０日目および３日目に、マウスにａＡＰＣ（ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬまたはｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  Ｈ２Ｋｂ  ＯＶＡ）１×１０９個を静脈内注射した。６日目に、マウスを屠殺し、それらの脾臓およびリンパ節由来の単一細胞懸濁液を、ＮＩＲ  Ｚｏｍｂｉｅ、ＦＩＴＣ  ＣＤ４４、ＢＶ６５０  ＣＤ８およびＢＶ７８５  ＣＤ６２Ｌで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０９４０】
ＯＴ１  Ｔ細胞の増殖を、リンパ節または脾臓における蛍光色素シグナルの希釈を追跡することによってモニタリングした。ＰＢＳ中に希釈したＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号７２１）（１０μｇ）およびアジュバントＬＰＳ（５０ｎｇ）を、ＯＴ−１  Ｔ細胞の増殖を誘導するための陽性対照として投与した。実験の結果を図６に示し、３日目のｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  ＯＶＡの第２の用量により、３日目のＬＰＳおよびペプチドの第２の用量と比べて、ＯＴ１−Ｔ細胞の細胞計数が劇的に増加したことが示されている。この時点での第２のａＡＰＣ用量の投与により、末梢血および二次リンパ臓器において、ＯＴ１細胞の＞２００倍の拡大がメモリー様表現型と共に駆動された。対照的に、７日目のｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ  ＯＶＡの第２の用量では、ＯＴ１−Ｔ細胞の細胞計数の劇的な増加はなかった（データは示していない）。Ｔ細胞計数がＲＣＴの最初の投与後３〜４日の間にピークにあることが観察される。したがって、理論に制約されることを望むものではないが、最初のＯＴ−１  Ｔ細胞計数のピークの間（３日目〜４日目）に第２の用量を投与することが、Ｔ細胞計数の劇的な変化を誘導するために最も有効であると考えられる。
【０９４１】
（実施例１７）
ＭＨＣＩ（ｇｐ１００）および４−１ＢＢＬを提示するように操作された赤血球系細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇｐ１００特異的Ｔ細胞を活性化する
マウス赤血球系細胞を、腫瘍ペプチドｇｐ１００を提示するＭＨＣＩおよび４−１ＢＢＬとクリック方法体系を使用してコンジュゲートした（赤血球系細胞を機能性にするためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２１４２号の優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２号に記載されている）。簡単に述べると、マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、４０ｕＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカーと一緒に室温で１時間インキュベートし、４℃で終夜さらにインキュベートした。ｍＲＣＴ−ｍ４−１ＢＢＬを、１ｕＭの水溶性ＤＢＣＯビオチンと一緒に室温で１時間インキュベートし、その後、ニュートラアビジンと一緒に、ビオチンとニュートラアビジンとのモル比１：１でインキュベートすることによって、ビオチンとクリックした。次いで、ニュートラアビジンが結合した細胞を、ビオチン化Ｈ−２Ｄｂ  ｇｐ１００（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号７２２））単量体と一緒に、ビオチンと単量体とのモル比１：１で、室温で１時間インキュベートした。
【０９４２】
ｇｐ１００に対するトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞集団であるＰｍｅｌ−１細胞を、二次リンパ臓器マウスから、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１ｕＭのＣＦＳＥを用いて標識した。ＣＦＳＥ標識された初代ＣＤ８＋Ｔ細胞２×１０５個を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。様々な量（細胞３×１０６個、１×１０６個、３．３×１０５個、または１．１×１０５個）のｍＲＣＴ、ｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ、ｍＲＣＴ−ｇｐ１００−Ｈ２Ｄｂ、またはｍＲＣＴ−ｇｐ１００−Ｈ２Ｄｂ＋４−１ＢＢＬを、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するウェル中、ｃＲＰＭＩ培地に、ｍＲＣＴ：Ｔ細胞比１０：１、３．３：１、１．１：１、および０．３７：１（図７の左から右）でプレーティングし、３７℃で２日間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ｔ細胞拡大および活性化を定量化するために抗ＣＤ８、ｌｉｖｅｄｅａｄ色素で染色した。
【０９４３】
図７に示されている通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＨＣ  Ｉ（ｇｐ１００）および４−１ＢＢＬを細胞表面に提示するマウス赤血球系細胞は、ＭＨＣ  Ｉ（ｇｐ１００）を単独で提示するマウス赤血球系細胞と比べて、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞を強力に活性化する。これらの結果から、本明細書に記載の操作された除核細胞を使用して、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞と比較して、別の型の抗原特異的Ｔ細胞を強力かつ選択的に拡大できることが実証される。
【０９４４】
（実施例１８）
ＲＣＴ上に発現される異なるバージョンのＨＬＡ−Ａ２（ＨＰＶ  Ｅ７）の生成
３つの異なるバージョンのＨＬＡ−Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２野生型、ＨＬＡ−Ａ２  Ｙ８４Ａ、およびＨＬＡ−Ａ２  Ｙ８４Ｃ＋Ｌ２Ｃ）のＤＮＡ構築物を、図８Ａに記載の通り、ＨＰＶ  Ｐ１（ＨＰＶ１６  Ｅ７  １１−２０）の発現のため、および同様にＨＰＶ  Ｐ１−２（ＨＰＶ１６  Ｅ７  １１−１９）の発現のために使用した。これらの構築物の配列を以下に記載する。例えば、Hansen  et  al.,  2010,  Trends  Immunol.  31(10):363-369を参照されたい。
【化１４】
2021506304.tif 000125
【化１５】
2021506304.tif 000126
【０９４５】
これらの３つのバージョンのＨＬＡ−Ａ２を使用して、一本鎖バリアントＨＰＶ  Ｐ１−２−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡを発現させた。
【化１６】
2021506304.tif 000127
【０９４６】
レンチウイルスベクターの産生
ＨＰＶ  Ｐ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質の遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を構築した。当該タンパク質をコードする遺伝子を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＭＳＣＶプロモーター配列を有するレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングし、その結果、１つのベクターが両方の外来性タンパク質の遺伝子を含むようにした。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨＰＶ  Ｐ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡの遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を含有するｐＣＤＨレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより、当該細胞においてレンチウイルスを産生させた。あるいは、ＨＰＶ  Ｐ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡの遺伝子および４−１ＢＢＬの遺伝子を含有する別々のベクターを利用することができる。細胞を新鮮な培養培地に置いた。培地交換の４８時間後に１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ウイルス上清を収集した。上清を収集し、一定分量として−８０℃で凍結させた。
【０９４７】
赤血球先駆細胞への形質導入
赤血球系細胞の拡大および分化を、上記のレンチウイルスベクターを用い、実施例５に従って実施した。培養プロセスのステップ１の間に、赤血球先駆細胞への形質導入を行った。培養培地中の赤血球系細胞を、レンチウイルス上清およびポリブレンと合わせた。プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間回転させ、スピノキュレーションによって感染を実現した。スピノキュレーション後、細胞を３７℃で終夜インキュベートした
【０９４８】
抗体結合
ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ベータ２ミクログロブリン抗体の結合を使用して、実施例５に記載の通り、操作された赤血球系細胞におけるＨＰＶ  Ｐ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合物の発現を検証した。同じく実施例５に記載の通り、ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗ＭＨＣＩ抗体の結合を使用して、操作された赤血球系細胞におけるＭＨＣＩ抗原提示ポリペプチドの発現を検証した。ＡＰＣで標識されたまたはＰＥで標識された抗４−１ＢＢＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の結合を使用して、操作された赤血球系細胞における４−１ＢＢＬの発現を検証した。抗体のいずれか１つの結合を、ＡＰＣ蛍光またはＰＥ蛍光についてのフローサイトメトリーによって測定した。染色された形質導入されていない細胞に基づいて、ゲーティングを設定した。
【０９４９】
（実施例１９）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の刺激におけるＲＣＴ上に発現されたＨＬＡ−Ａ２（ＨＰＶ  Ｅ７）の活性
４−１ＢＢＬ、ＨＬＡ−Ａ２  ＨＰＶ  Ｐ１、または４−１ＢＢＬとＨＬＡ−Ａ２  ＨＰＶ  Ｐ１の両方を発現するヒトＲＣＴを、本質的に実施例１８に記載の通り調製した。これらのＨＰＶ  Ｐ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＡ融合タンパク質および４−１ＢＢＬ共刺激ポリペプチドを同時発現するＲＣＴを、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の活性化および増殖を刺激するそれらの能力について、本質的に実施例６に記載の通り試験した。ＣＭＶペプチドまたはＨＰＶペプチドをパルスしたＴ２細胞を、陽性対照として利用した。
【０９５０】
一次ヒトＣＤ８＋細胞を、Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから購入した。様々な量のヒトＲＣＴを、４×１０４個または２×１０４個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するウェル中、ｃＲＰＭＩ培地に、ＲＣＴ：Ｔ細胞比１０：１、２：１および０．４：１（図８Ｂおよび８Ｃにおいて、各ＲＣＴについて左から右）でプレーティングし、３７℃で２日間インキュベートした。
【０９５１】
細胞内染色を利用して、Ｎｕｒ７７およびＩＦＮ−γの細胞レベルを測定した。簡単に述べると、細胞を、ＩＣ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬで固定し、暗所、室温で２０〜６０分間インキュベートした。試料を４００〜６００×ｇ、室温で５分間遠心分離した。上清を廃棄し、透過処理緩衝剤２００μＬを添加した。試料を４００〜６００×ｇ、室温で５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１×透過処理緩衝剤約１００μＬに再懸濁させた。洗浄せずに、直接コンジュゲートした抗体（抗Ｎｕｒ７７  ＰＥおよび抗ＩＦＮ−γ  ＡＰＣ）を添加し、その後、暗所、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。ＲＣＴを初代ＣＤ８＋Ｔ細胞と一緒に２時間インキュベートした後、６時間インキュベートした後、および２４時間インキュベートした後に、Ｎｕｒ７７およびＩＦＮ−γを分析した。
【０９５２】
フローサイトメトリー分析により、試験した全てのバージョンのＨＬＡ−Ａ２（ＨＰＶ  Ｅ７）がヒトＲＣＴの表面に十分に発現されたことが示唆された（データは示していない）。さらに、Ｎｕｒ７７発現（図８Ｂ）、およびＩＦＮγ分泌（図８Ｃ）によって決定された通り、３つのバージョン全てにより、ＨＰＶ  Ｅ７特異的Ｔ細胞の活性化が導かれた。これらの結果から、本明細書に記載の操作された除核細胞を使用して、抗原特異的Ｔ細胞、例えばＨＰＶ特異的Ｔ細胞を強力かつ選択的に活性化することができることが実証される。
【０９５３】
（実施例２０）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示する赤血球系細胞によって拡大および活性化させたオボアルブミン特異的Ｔ細胞は腫瘍体積を減少させる
マウス赤血球系細胞を、実施例１５に記載の通り、クリック方法体系を使用して、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩおよび４−１ＢＢＬとコンジュゲートした。簡単に述べると、マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、４０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカーおよび４０μＭのＨ−２Ｋｂ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー単量体（配列番号７２１）と一緒に室温で１時間インキュベートし、次いで、４℃で終夜さらにインキュベートした。
【０９５４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１０ｕＭのＣｅｌｌ−Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識した。
Ｂ６  Ｃｄ４５．１マウスに、投薬の７日前にオボアルブミンを発現する腫瘍細胞（ＥＧ７．ＯＶＡ）２×１０６個を皮下注射した（ｓ．ｃ．）。マウスの実験群（群当たり７匹）は以下の通りであった：
（１）ＯＴ１用量：ＯＴ１、２×１０６個（ｉ．ｖ．）；細胞用量：マウスＲＣＴ（ｍＲＣＴ）１×１０９個（ｉ．ｖ．）
（２）ＯＴ１用量：ＯＴ１、２×１０６個（ｉ．ｖ．）；細胞用量：ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬ（ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ）を提示するマウスＲＣＴ、１×１０９個（ｉ．ｖ．）。
【０９５５】
ＯＴ１およびｍＲＣＴの投薬１日目は、腫瘍体積に基づいて決定した。０日目に、腫瘍を６０〜１９３ｍｍ３の腫瘍体積でランダム化し、平均体積を１４１ｍｍ３とした。上記の群（１）および（２）に記載されている用量でのＯＴ１の養子Ｔ細胞移入を、野生型マウスへの静脈内注射によって行った（１日目）。次いで、１日目、４日目、および８日目に、マウスに、上記の群（１）および（２）に記載の通り、１×１０９個のｍＲＣＴまたはｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４１−ＢＢＬを投薬した。投薬の３〜４日後に、ＣＴＶ希釈によって測定された通り、有意なＯＴ１増殖が観察された。第２の用量を、最大ＯＴ１細胞拡大の時点に対応する、第１の用量の４日後に与えた。１日目から１４日目までにわたって腫瘍体積を測定し、腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えるまでに達したら、マウスを安楽死させた。
【０９５６】
この実験の結果を図９〜１１に示す。図９は、腫瘍ランダム化後の経時的な平均腫瘍体積（ｍｍ３）の変化を示し、ここで、投薬は、１日目、４日目および８日目に行った。図１０は、腫瘍ランダム化後の経時的な個々の腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、ここで、投薬は、１日目、４日目および８日目に行った。図９および図１０の結果から、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬは、ｍＲＣＴと比較したＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍体積の経時的な減少によって示される通り、２×１０６個の用量で腫瘍特異的Ｔ細胞（ＯＴ１）を活性化することができることが示される。ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにａＡＰＣ  ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを投与することにより、投薬の７日後までに、対照と比較して、６０％の腫瘍成長阻害が引き起こされ、これは、ＯＴ１の拡大の増大に対応した（図９）。図１１は、マウスの経時的なパーセント生存を示すグラフである。図１１に示されている通り、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを投薬したマウスは、７匹中７匹がランダム化の１４日後まで生存し、一方、ｍＲＣＴを投薬したマウスでは、ランダム化の１４日後まで生存したのは７匹中たった４匹だけであった。さらに、別の、同様の実験において、ａＡＰＣを投薬したマウス全てで、ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍へのＯＴ１の浸潤の増大が実証され、いくつかの腫瘍では、内在性ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の浸潤がさらに実証された（データは示していない）ことが観察された。
【０９５７】
この実験を、ＯＴ１の養子Ｔ細胞移入を５×１０５個のＯＴ１（ｉ．ｖ．）の用量で行い、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを投薬したマウスの群に加えて、以下の追加的な対照群を含めた（群当たりマウス１２匹）以外は、概ね上記の通り繰り返した：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号７２１）およびリポ多糖（ＬＰＳ）、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ、ならびにｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬ。この実験では、−９日目に、野生型マウスにオボアルブミンを発現する腫瘍細胞（ＥＧ７．ＯＶＡ）２×１０６個を皮下注射し（ｓ．ｃ．）、腫瘍ランダム化を、０日目に、腫瘍体積が５２〜１３０ｍｍ３になった時に、平均９７ｍｍ３で行い、ＯＴ１投薬を１日目に行い、ｍＲＣＴ投薬を１日目、５日目および９日目に行った。
【０９５８】
これらの実験からの結果（データは示していない）から、第１の実験と同様に、対照ｍＲＣＴ、ＰＢＳおよびペプチド＋ＬＰＳと比較したＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍体積の経時的な減少によって証明される通り、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬが腫瘍特異的Ｔ細胞（ＯＴ１）を活性化することが実証された。これらの対照の中で有意差は確認されなかった。さらに、ｍＲＣＴ−ＯＶＡおよびｍＲＣＴ−４−１ＢＢＬについては、対照ｍＲＣＴと比較して、腫瘍体積の減少は観察されなかった。これらの結果から、観察された腫瘍制御にはｍＲＣＴにおけるＯＶＡと４−１ＢＢＬの組合せが必要であったことが示される。
【０９５９】
（実施例２１）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬ＋ＩＬ１５）を提示する赤血球系細胞の生成
マウス赤血球系細胞を、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩ（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ）、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５のそれぞれと、クリック方法体系の改変を使用してコンジュゲートした（赤血球系細胞を機能性にするためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２１４２号の優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２号に記載されている）。ここで、マウス赤血球系細胞への３つのペプチドのコンジュゲーションは、２つの異なるハンドル、ジベンゾシクロオクチン基（ＤＢＣＯ）およびトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）を使用して実現させた。３重クリック細胞を、以下の試薬を用いて作製した：Ｆｃ−ｈＩＬ１５ＴＰ（ＴＣＯ標識されたもの）；Ｆｃ−ｈＩＬ−１５ＴＰ（ＤＢＣＯ標識されたもの）；ｍ４−１ＢＢＬ（ＤＢＣＯチオリンカー）およびＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ（ＤＢＣＯチオリンカー）。簡単に述べると、反応を以下の通り実施した：
【０９６０】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５（ＭＴＺ−ＴＣＯ）
マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、１×１０８個のｍＲＣＴを、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルおよび０．０４ｍＭのメチルテトラジン−ＰＥＧ−ＮＨＳ−エステル（ＭＴＺ）を用いて室温で３０分にわたって標識した。２０μＭのＦｃ−ｈＩＬ−１５ＴＰ（ＴＣＯ標識されたもの）５μｌおよび５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌを添加し、室温で１時間インキュベートした。５０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕμｌを細胞に添加し、混合物を４℃で終夜インキュベートした。
【０９６１】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５（ＡＺ−ＤＢＣＯ）
マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、１×１０８個のｍＲＣＴを、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、２０μＭのＦｃ−ｈＩＬ−１５ＴＰ−ＤＢＣＯ５μｌおよび５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌと一緒に室温で１時間インキュベートした。５０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌを細胞に添加し、混合物を４℃で終夜インキュベートした。
【０９６２】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ
マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、１×１０８個のｍＲＣＴを、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、５０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌおよび５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌと一緒にインキュベートし、混合物を４℃で終夜インキュベートした。
【０９６３】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＴＣＯ）またはＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＡＺ−ＤＢＣＯ）、およびＯＶＡ−４−１ＢＢＬを２重クリックしたｍＲＣＴについて、ＩＬ１５、ＯＶＡおよび４−１ＢＢＬのコピー数を決定した。ＯＶＡおよび４−１ＢＢＬのそれぞれについてのコピー数は３群で同様であったが、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＴＣＯ）では、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＡＺ−ＤＢＣＯ）と比較して、相当に高いＩＬ１５コピー数が示された（以下の表２７を参照されたい）。
【表２７−１】
2021506304.tif 000128
【表２７−２】
2021506304.tif 000129
【０９６４】
理論に制約されることを望むものではないが、代替クリックハンドルを３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＴＣＯ）は、ＤＢＣＯとの潜在的な競合を迂回して、より高いＩＬ−１５のコピー数を実現すると考えられる。
【０９６５】
（実施例２２）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬ＋ＩＬ１５）を提示する赤血球系細胞は、ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示する細胞（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬ）と比較してＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の増大を示す
マウスＲＣＴを実施例２０に記載の通り調製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの脾臓から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１０ｕＭのＣＦＳＥを用いて標識した。ＣＦＳＥ標識されたＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞２×１０５個を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。クリックしていないｍＲＣＴ、３重クリックしたｍＲＣＴ（ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５（ＭＴＺ−ＴＣＯ）およびＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５（ＡＺ−ＤＢＣＯ））、または２重クリックしたｍＲＣＴ（ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ、およびＯＶＡ−４−１ＢＢＬ＋可溶性ＩＬ−１５（２０ｎｇ／ｍｌ）ならびにＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、２５：１、１０：１、および４：１（ｍＲＣＴ：ＯＴ１）の比で共インキュベートし、３７℃および５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。４日目に、細胞をＰａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ  ＣＤ４４およびＢＶ７８５  ＣＤ６２Ｌで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４４をＣＤ８＋Ｔ細胞増殖のマーカーとして使用した。この実験の結果が図１２に示されている。結果から、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＴＣＯ）により、４日目までに、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ（２重クリックしたもの）と比較して、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の増大が駆動されたこと、およびＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＴＣＯ）により、４日目までに、ｍＲＣＴ  ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ（２重クリックしたもの）と可溶性ＩＬ１５の組合せと同様のＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が駆動されたことが実証される。図１２、左から２つめのパネルに示されている通り、代替クリックハンドルを３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＤＢＣＯ）によっても、４日目までにＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が駆動された。
【０９６６】
４日目におけるＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖も決定した。図１３に示されている通り、結果から、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＴＣＯ）により、実質的な、かつｍＲＣＴ  ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ（２重クリックしたもの）と可溶性ＩＬ−１５の組合せを用いて実現されるものと同様のレベルまでのＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が刺激されたことが実証される。さらに、ＯＶＡ＋４−１ＢＢＬ＋ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＴＣＯ）により、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が、ＤＢＣＯハンドル、ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬを３重クリックしたｍＲＣＴ（ＡＺ−ＤＢＣＯ）よりも大きなレベルまで増大した。表２７において上記の通り、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＭＴＺ−ＴＣＯ）では、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴ（ＡＺ−ＤＢＣＯ）と比較して、より高いＩＬ１５コピー数が示され、これにより、ここでは、観察されたＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の増大が、ＩＬ１５コピー数の増加に少なくとも一部起因したことが示される。さらに、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるエフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞のパーセンテージを決定した。エフェクターＴ細胞またはメモリーＴ細胞であったＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、２重クリックしたｍＲＣＴ群および３重クリックしたｍＲＣＴ群の間で有意には異ならないことが見いだされた（データは示していない）。
【０９６７】
要約すると、この実験の結果から、ＲＢＣにおけるシグナル１、２および３の組合せ、具体的にはＯＶＡ、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１５の組合せにより、シグナル１および２、すなわち、ＯＶＡおよび４−１ＢＢＬ単独よりも大きくＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が促進される。
【０９６８】
（実施例２３）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬ＋ＩＬ１２）を提示する赤血球系細胞の生成
マウス赤血球系細胞を、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩ（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ）、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−１２のそれぞれと、クリック方法体系の改変を使用してコンジュゲートした（赤血球系細胞を機能性にするためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２１４２号の優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２号に記載されている）。３重クリック細胞を、以下の試薬を用いて作製した：Ｆｃ−ｍＩＬ１２Ｆｃ（ＴＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル標識したもの）；ｍ４−１ＢＢＬ（ＤＢＣＯチオリンカー）およびＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ（ＤＢＣＯチオリンカー）。簡単に述べると、反応を以下の通り実施した：
【０９６９】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１２（ＭＴＺ−ＴＣＯ）
マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、１×１０８個のｍＲＣＴを、ｐＨ９のＰＢＳ中、０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルおよび０．０２ｍＭのメチルテトラジン−ＰＥＧ−ＮＨＳ−エステル（ＭＴＺ）を用いて室温で３０分にわたって標識した。２０μＭのＦｃ−ｍＩＬ１２Ｆｃ−ＴＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル５ｕｌおよび５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌを添加し、室温で１時間インキュベートした。５０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌを細胞に添加し、混合物を４℃で終夜インキュベートした。
【０９７０】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ
マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、１×１０８個のｍＲＣＴを、ｐＨ９のＰＢＳ中、０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルおよび０．０２ｍＭのメチルテトラジン−ＰＥＧ−ＮＨＳ−エステル（ＭＴＺ）を用いて室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、５０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌおよび５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌと一緒にインキュベートし、混合物を４℃で終夜インキュベートした。
【０９７１】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１２を３重クリックしたｍＲＣＴ、およびＯＶＡ−４−１ＢＢＬを２重クリックしたｍＲＣＴについて、ＩＬ１２、ＯＶＡおよび４−１ＢＢＬのコピー数を決定した（以下の表２８を参照されたい）。
【表２８】
2021506304.tif 000130
【０９７２】
（実施例２４）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−７（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬ＋ＩＬ７）を提示する赤血球系細胞の生成
マウス赤血球系細胞を、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩ（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ）、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−７のそれぞれと、クリック方法体系の改変を使用してコンジュゲートした（赤血球系細胞を機能性にするためのクリックケミストリーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０５８９号および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２１４２号の優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／００００４２号に記載されている）。３重クリック細胞を、以下の試薬を用いて作製した：Ｆｃ−ｍＩＬ−７（ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル標識したもの）；ｍ４−１ＢＢＬ（ＤＢＣＯチオリンカー）およびＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ（ＤＢＣＯチオリンカー）。簡単に述べると、反応を以下の通り実施した：
【０９７３】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ７（ＡＺ−ＤＢＣＯ）
マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、１×１０８個のｍＲＣＴを、ｐＨ９のＰＢＳ中、０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルおよび０．０２ｍＭのメチルテトラジン−ＰＥＧ−ＮＨＳ−エステル（ＭＴＺ）を用いて室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、２０μＭのＦｃ−ｍＩＬ−７−ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル５ｕｌおよび５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌと一緒に室温で１時間インキュベートした。５０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌを細胞に添加し、混合物を４℃で終夜インキュベートした。
【０９７４】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ
マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、１×１０８個のｍＲＣＴを、ｐＨ９のＰＢＳ中、０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルおよび０．０２ｍＭのメチルテトラジン−ＰＥＧ−ＮＨＳ−エステル（ＭＴＺ）を用いて室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、５０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌおよび５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌと一緒にインキュベートし、混合物を４℃で終夜インキュベートした。
【０９７５】
ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ７を３重クリックしたｍＲＣＴ、およびＯＶＡ−４−１ＢＢＬを２重クリックしたｍＲＣＴについて、ＩＬ７、ＯＶＡおよび４−１ＢＢＬのコピー数を決定した（以下の表２９を参照されたい）。
【表２９】
2021506304.tif 000131
【０９７６】
（実施例２５）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬをＩＬ−７（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬ＋ＩＬ７）、ＩＬ−１２（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬ＋ＩＬ１２）、またはＩＬ−１５（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４−１ＢＢＬ＋ＩＬ１５）と共に提示する赤血球系細胞は、４−１ＢＢＬを提示する細胞（ＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ＋４１−ＢＢｌ）と比較してＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の増大を示す
【０９７７】
マウスＲＣＴを、例えば実施例２１、２３および２４に記載の通り調製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの脾臓およびリンパ節から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１ｕＭのｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔを用いて標識した。ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ標識されたＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞２×１０５個を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。クリックしていないｍＲＣＴまたは３重クリックしたｍＲＣＴ（ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ７、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１２、またはＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５）、およびＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１：１．１、１：３．３、および１：１０（ｍＲＣＴ：ＯＴ１）の比で共インキュベートし、３７℃および５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。４日目に、ＯＴ１  Ｔ細胞の増殖、活性化およびメモリーマーカーを、多色フローサイトメトリーによって分析した。細胞をＦＩＴＣ  ＣＤ４４、ＡＰＣ  ＣＤ１２２、およびＢＶ７８５  ＣＤ６２Ｌで染色した。この実験の結果が図１４に示されている。結果から、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ７、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１２、またはＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴにより、４日目までに、ｍＲＣＴ  ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ（２重クリックしたもの）と同様にＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の増大が駆動されることが実証された（図１４Ａ）。さらに、ＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ幹細胞（Ｔｓｃｍ）表現型、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）表現型およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）表現型のパーセンテージを決定した。ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ７、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１２、またはＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５を３重クリックしたｍＲＣＴではＴｃｍ表現型の活性化の増大が駆動され、一方、ｍＲＣＴ  ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを２重クリックしたｍＲＣＴでは、Ｔｅｍ表現型とＴｃｍ表現型がほぼ等しく駆動されることが見いだされた（図１４Ｂ）。
【０９７８】
要約すると、この実験からの結果から、ＲＢＣにおけるシグナル１、２および３の組合せ、具体的にはＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ７、ＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１２、またはＯＶＡ−４−１ＢＢＬ−ＩＬ１５の組合せにより、シグナル１および２、すなわち、ＯＶＡおよび４−１ＢＢＬ単独よりも大きくＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が促進されることが示される。
【０９７９】
（実施例２６）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）および４−１ＢＢＬを提示する赤血球系細胞を用いて処置したマウスでは、ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞で再チャレンジしてもＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍制御が実証される
マウス赤血球系細胞を、実施例１５に記載の通り、クリック方法体系を使用して、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩおよび４−１ＢＢＬとコンジュゲートした。簡単に述べると、マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、ｐＨ９のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用いて室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、４０μＭのｍ４−１ＢＢＬ−ＤＢＣＯ−チオリンカーおよび５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカー５ｕｌと一緒に室温で１時間インキュベートし、次いで、４℃で終夜さらにインキュベートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１ｕＭのＣｅｌｌ−Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔを用いて標識した。
【０９８０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞２×１０６個を皮下注射した。腫瘍がおよそ１４０ｍｍ３に達したら、これらのマウスを７匹の群２つにランダム化した。次いで、これらのマウスに、ランダム化の１日後にＯＴ１  Ｔ細胞２×１０６個を移入し、ランダム化の１日後、４日後、および８日後に１×１０９個のｍＲＣＴまたはｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを投薬した。ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬで治癒したマウス（ｎ＝２）を、年齢を釣り合わせたナイーブなマウスと並行して、一次腫瘍注射の３７日後に、２×１０５個のＥＧ７．ＯＶＡで再チャレンジした。ナイーブなマウスは、腫瘍注射の７日後に５×１０５個のＯＴ１  ＣＤ８Ｔ細胞移入も受けた。腫瘍負荷を２〜３日ごとに測定した。図１５Ａに示されている通り、この実験の結果から、以前にｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬで処置されたマウスが、無処置のマウスと比較したＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍体積の経時的な減少によって証明される通り、ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞による再チャレンジを拒絶することができたことが実証される。
【０９８１】
独立した実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＧ７．ＯＶＡ細胞２×１０６個を皮下注射した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達したら、これらのマウスを１２匹の群２つにランダム化した。次いで、これらのマウスに５×１０５個のＯＴ１  Ｔ細胞を移入し、ランダム化の０日後、４日後、および８日後に、１×１０９個のｍＲＢＣまたはｍＲＢＣ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬを投薬した。ｍＲＢＣ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬで治癒したマウス（ｎ＝１）を、年齢を釣り合わせたナイーブなマウスと並行して、一次腫瘍注射の３５日後に２×１０５個のＥＧ７．ＯＶＡで再チャレンジした。ナイーブなマウスは、腫瘍注射の１１日後に４×１０５個のＯＴ１  ＣＤ８Ｔ細胞移入も受けた。腫瘍負荷を２〜３日ごとに測定した。図１５Ｂに示されている通り、この実験の結果から、ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞で再チャレンジしても、無処置のマウスと比較したＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍体積の経時的な減少によって証明される通り、ｍＲＣＴ−ＯＶＡ−４−１ＢＢＬにより腫瘍特異的Ｔ細胞（ＯＴ１）が活性化され続けることが実証される。
【０９８２】
全体として、これらの結果から、以前にｍＲＣＴ処置によってＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍が治癒したマウスが、ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞で再チャレンジされた際に、腫瘍成長を妨げることによりメモリー応答を維持することが実証される。
【０９８３】
（実施例２７）
ＭＨＣＩ（オボアルブミン）のみを提示する赤血球系細胞で処置したマウスでは、抗原＋アジュバントで再チャレンジすると抗原Ｔ細胞特異的アネルギーが実証される
マウス赤血球系細胞を、オボアルブミンペプチドを提示するＭＨＣＩと、実施例１５に記載の通りクリック方法体系を使用してコンジュゲートした。簡単に述べると、マウス末梢血を、ＰＡＬ白血球除去フィルターを通して濾過し、ｐＨ８のＰＢＳ中０．０４ｍＭの６’アジド−ＮＨＳ−エステルを用い、室温で３０分にわたって標識した。アジド標識されたｍＲＣＴを、５０μＭのＯＶＡ−Ｈ２Ｋｂ−ＤＢＣＯ−チオリンカーと一緒に室温で１時間インキュベートし、次いで、４℃で終夜さらにインキュベートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ１トランスジェニックマウスの二次リンパ臓器から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの負の選択キットを使用して精製し、１０ｕＭのＣｅｌｌ−Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔを用いて標識した。
【０９８４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に２×１０６個のＯＴ１  Ｔ細胞を移入し、０日目、４日目、および７日目に１×１０９個のｍＲＣＴまたはｍＲＣＴ−ＯＶＡを投薬した。１３日目に、図１６Ａに示されている通り、マウスをＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７２１））＋不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で再チャレンジした。図１６Ｂに示されている通り、ｍＲＣＴ−ＯＶＡで処置したマウスは、ＯＶＡペプチド再チャレンジの際に、ｍＲＣＴのみを投薬したマウスと比較して、脾臓およびリンパ節のどちらにおいてもＯＴ１細胞計数が少なかった。図１６Ｃにおいて実証されている通り、内在性ＣＤ８＋Ｔ細胞計数は、いずれの処置の影響も受けなかった。全体として、これらの結果から、ＯＴ１計数の減少によって示される通り、ｍＲＣＴ−ＯＶＡにより抗原特異的Ｔ細胞アネルギーまたは欠失を駆動することができたことが実証される。
【図１】
2021506304.tif 000132
【図２】
2021506304.tif 000133
【図３】
2021506304.tif 000134
【図４−１】
2021506304.tif 000135
【図４−２】
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【図５】
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【図６】
2021506304.tif 000138
【図７】
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【図８−１】
2021506304.tif 000140
【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
2021506304.tif 000144
【図１１】
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【図１２】
2021506304.tif 000146
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月13日(2020.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、表１または表１４〜２４に開示の少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項２】
外来性抗原提示ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、請求項１に記載のａＡＰＣ。
【請求項３】
前記外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド、またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、請求項２に記載のａＡＰＣ。
【請求項４】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含み、前記外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
【請求項５】
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合される、請求項４に記載のａＡＰＣ。
【請求項６】
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに非共有結合で結合される、請求項４に記載のａＡＰＣ。
【請求項７】
少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項８】
前記少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドが、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載のａＡＰＣ。
【請求項９】
前記除核細胞が、少なくとも１つの外来性サイトカインポリペプチドを含み、前記少なくとも１つの外来性サイトカインポリペプチドが、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ−１５に融合された１５Ｒα、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ２３、ＩＬ２７、ＩＬ１７、ＩＬ１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２５からなる群から選択される、請求項７に記載のａＡＰＣ。
【請求項１０】
前記除核細胞が、少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドを含み、前記少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドが、表７に開示のポリペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載のａＡＰＣ。
【請求項１１】
外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、請求項１に記載のａＡＰＣ。
【請求項１２】
前記除核細胞が、除核赤血球系細胞または血小板である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
【請求項１３】
抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣを含む組成物であって、前記方法は、前記Ｔ細胞を請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記抗原特異的Ｔ細胞を活性化する、組成物。
【請求項１４】
受容体分子を発現するＴ細胞の増殖を誘導するための方法において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣを含む組成物であって、前記方法は、前記Ｔ細胞を請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、共刺激ポリペプチドが前記受容体分子と特異的に結合し、それによって前記Ｔ細胞の増殖を誘導する、組成物。
【請求項１５】
Ｔ細胞集団のサブセットを拡大する方法において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣを含む組成物であって、前記方法は、前記サブセットの少なくとも１つのＴ細胞を含むＴ細胞の集団を請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、前記ａＡＰＣの表面に含まれている外来性共刺激ポリペプチドが、前記サブセットの前記少なくとも１つのＴ細胞上の受容体分子と特異的に結合し、前記外来性共刺激ポリペプチドの前記受容体分子への結合が、前記サブセットの前記少なくとも１つのＴ細胞の増殖を誘導し、それによって前記Ｔ細胞集団の前記サブセットを拡大する、組成物。
【請求項１６】
Ｔ細胞の活性を抑制する方法において使用するための、請求項１０に記載のａＡＰＣを含む組成物であって、前記方法は、前記Ｔ細胞を請求項１０に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記Ｔ細胞の活性を抑制する、組成物。
【請求項１７】
Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための方法において使用するための、請求項１１に記載のａＡＰＣを含む組成物であって、前記方法は、前記Ｔｒｅｇ細胞を請求項１１に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記Ｔｒｅｇ細胞を活性化する、組成物。
【請求項１８】
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣを含む組成物であって、前記方法は、前記対象のＴ細胞を請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する、組成物。
【請求項１９】
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法において使用するための、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む組成物であって、前記方法は、
ａ）前記対象における細胞上での抗原の発現プロファイルを決定するステップと、
ｂ）抗原提示ポリペプチドと少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドとを細胞表面に含む操作された除核細胞である前記ａＡＰＣを選択するステップと、
ｃ）前記組成物を前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、前記免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する、組成物。
【請求項２１】
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法において使用するための、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む組成物であって、前記方法は、
ａ）前記対象のＨＬＡステータスを決定するステップと、
ｂ）少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドと少なくとも１つの抗原提示ポリペプチドとを細胞表面に含む操作された除核細胞である、前記対象と免疫学的に適合する前記ａＡＰＣを、選択するステップと、
ｃ）前記組成物を前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、前記免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する、組成物。
【請求項２２】
前記対象が、がんまたは感染性疾患を有する、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｔ細胞応答の誘導を必要とする対象の抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法において使用するための、抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物であって、前記方法は、
Ｔ細胞を含む、細胞の集団を、前記対象から採取するステップと、
細胞の前記集団を請求項２〜５のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、細胞の前記集団を前記ａＡＰＣと接触させるステップが、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドに特異的である前記抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する、ステップと、
前記組成物を前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、Ｔ細胞応答の誘導を必要とする前記対象の前記抗原に対するＴ細胞応答を誘導する、組成物。
【請求項２４】
調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団を拡大する方法であって、
対象から採取された細胞の集団を請求項１１に記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、前記集団がＴｒｅｇ細胞を含み、前記集団を前記ａＡＰＣと接触させるステップが、前記Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、ステップと
を含み、それによってＴｒｅｇ細胞の前記集団を拡大する方法。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核におよび前記外来性抗原ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと
を含み、それによって前記ａＡＰＣを作製する、方法。
【請求項２６】
請求項２〜１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、
前記外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸を前記有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核に、ならびに前記外来性抗原ポリペプチドおよび前記外来性抗原提示ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと
を含み、それによって前記ａＡＰＣを作製する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
上記態様および実施形態のいずれかについての一部の実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球系細胞である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、表１または表１４、１５および２０〜２４に開示の少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
（項目２）
前記少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫である、項目１に記載のａＡＰＣ。
（項目３）
前記少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、黒色腫抗原遺伝子−Ａ（ＭＡＧＥ−Ａ）抗原、好中球顆粒プロテアーゼ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原、テロメラーゼ抗原、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原からなる群から選択される、項目１に記載のａＡＰＣ。
（項目４）
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、第１の外来性抗原ポリペプチドおよび第２の外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含み、前記第１の外来性抗原ポリペプチドおよび前記第２の外来性抗原ポリペプチドが、少なくとも２アミノ酸が重複しているアミノ酸配列を有する、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
（項目５）
前記重複が、２アミノ酸〜２３アミノ酸の間である、項目４に記載のａＡＰＣ。
（項目６）
前記第１の外来性抗原ポリペプチド、前記第２の外来性ポリペプチド、または前記第１および前記第２の外来性抗原ポリペプチドが、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫である、項目４に記載のａＡＰＣ。
（項目７）
前記第１の外来性抗原ポリペプチド、前記第２の外来性ポリペプチド、または前記第１および前記第２の外来性抗原ポリペプチドが、表１または表１４、１５および２０〜２４に開示のポリペプチドである、項目４に記載のａＡＰＣ。
（項目８）
前記第１の外来性抗原ポリペプチド、前記第２の外来性ポリペプチド、または前記第１および前記第２の外来性抗原ポリペプチドが、黒色腫抗原遺伝子−Ａ（ＭＡＧＥ−Ａ）抗原、好中球顆粒プロテアーゼ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２抗原、テロメラーゼ抗原、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原からなる群から選択される、項目３に記載のａＡＰＣ。
（項目９）
外来性抗原提示ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、項目１〜８のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目１０）
前記外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド、またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、項目９に記載のａＡＰＣ。
（項目１１）
前記ＭＨＣクラスＩポリペプチドが、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、およびＨＬＡ  Ｃからなる群から選択される、項目１０に記載のａＡＰＣ。
（項目１２）
前記ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドが、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される、項目１０に記載のａＡＰＣ。
（項目１３）
Ｔ細胞を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含み、前記外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
（項目１４）
前記ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質が、α鎖およびβ２ｍ鎖を含む、項目１０または項目１３に記載のａＡＰＣ。
（項目１５）
前記ＭＨＣクラスＩ一本鎖融合タンパク質が、膜アンカーをさらに含む、項目１４に記載のａＡＰＣ。
（項目１６）
前記外来性抗原ポリペプチドが、ＭＨＣ  Ｉ一本鎖融合タンパク質にリンカーを介して接続されている、項目１４または項目１５に記載のａＡＰＣ。
（項目１７）
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、項目１６に記載のａＡＰＣ。
（項目１８）
前記ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質が、α鎖およびβ鎖を含む、項目１０または項目１３に記載のａＡＰＣ。
（項目１９）
前記ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質が、膜アンカーをさらに含む、項目１８に記載のａＡＰＣ。
（項目２０）
前記外来性抗原ポリペプチドが、ＭＨＣ  ＩＩ一本鎖融合タンパク質にリンカーを介して接続されている、項目１８または項目１９に記載のａＡＰＣ。
（項目２１）
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、項目２０に記載のａＡＰＣ。
（項目２２）
前記アンカーが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質を含むか、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）の膜貫通ドメインを含む、項目１５〜１７および１９〜２１のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目２３）
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合される、項目９〜２２のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目２４）
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに非共有結合で結合される、項目９〜２２のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目２５）
少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目２６）
前記少なくとも１つの外来性共刺激ポリペプチドが、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、抗ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＩＬ−１５に融合されたＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１のリガンド、抗ＣＤ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目２５に記載のａＡＰＣ。
（項目２７）
少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの外来性共刺激ポリペプチドを前記細胞表面に含む、項目２５または項目２６に記載のａＡＰＣ。
（項目２８）
外来性サイトカインポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目２９）
前記外来性サイトカインポリペプチドが、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ−１５に融合された１５Ｒα、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ２３、ＩＬ２７、ＩＬ１７、ＩＬ１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２５からなる群から選択される、項目２８に記載のａＡＰＣ。
（項目３０）
前記ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を活性化することができる、前記項目のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目３１）
活性化することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の細胞傷害活性の刺激、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の刺激、および／またはこれらの任意の組合せを含む、前記項目のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目３２）
Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、表７に開示の少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
（項目３３）
Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、表１または表１６〜１９に開示の外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの外来性共阻害ポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
（項目３４）
代謝物を変化させるポリペプチドをさらに含む、項目３２または項目３３に記載のａＡＰＣ。
（項目３５）
Ｔ細胞活性を抑制するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドと、外来性抗原ポリペプチドと、少なくとも１つの代謝物を変化させるポリペプチドとを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
（項目３６）
外来性共阻害ポリペプチドをさらに含む、項目３５に記載のａＡＰＣ。
（項目３７）
前記外来性共阻害ポリペプチドが、ＩＬ−３５、ＩＬ−１０、ＶＳＩＧ−３またはＬＡＧ３アゴニストである、項目３３または項目３６に記載のａＡＰＣ。
（項目３８）
前記代謝物を変化させるポリペプチドが、ＩＤＯ、Ａｒｇ１、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＴＤＯ、ＴＰＨ、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２またはＰＧＥシンターゼである、項目３４〜３６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目３９）
前記ａＡＰＣと相互作用するＴ細胞を抑制することができる、項目３２〜３８のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目４０）
前記抑制することが、Ｔ細胞の増殖の阻害、Ｔ細胞のアネルギー化、またはＴ細胞のアポトーシスの誘導を含む、項目３２〜３９のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目４１）
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、前記項目のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目４２）
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を活性化するように操作された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記ａＡＰＣが、除核細胞を含み、前記除核細胞が、外来性抗原提示ポリペプチドおよび外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
（項目４３）
外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドを前記細胞表面にさらに含む、項目４２に記載のａＡＰＣ。
（項目４４）
前記外来性抗原提示ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質である、項目４２または項目４３に記載のａＡＰＣ。
（項目４５）
前記ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドが、ＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ  ＤＯＡ、ＨＬＡ  ＤＯＢ、ＨＬＡ  ＤＱα、ＨＬＡ  ＤＱβ、ＨＬＡ  ＤＲα、およびＨＬＡ  ＤＲβからなる群から選択される、項目４４に記載のａＡＰＣ。
（項目４６）
前記ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質が、α鎖およびβ鎖を含む、項目４４に記載のａＡＰＣ。
（項目４７）
前記ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合タンパク質が、膜アンカーをさらに含む、項目４６に記載のａＡＰＣ。
（項目４８）
前記外来性抗原ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ一本鎖融合体にリンカーを介して接続されている、項目４６または項目４７に記載のａＡＰＣ。
（項目４９）
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、項目４８に記載のａＡＰＣ。
（項目５０）
前記アンカーが、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質を含むか、または小型内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）の膜貫通ドメインを含む、項目４７〜４９のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目５１）
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに共有結合される、項目４２〜５０のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目５２）
前記外来性抗原ポリペプチドが、前記外来性抗原提示ポリペプチドに非共有結合で結合される、項目５１に記載のａＡＰＣ。
（項目５３）
前記外来性Ｔｒｅｇ拡大ポリペプチドが、ＣＤ２５特異的ＩＬ−２、ＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦ、抗ＤＲ３アゴニスト（ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ特異的）、４１ＢＢＬ、ＴＧＦβである、項目４３に記載のａＡＰＣ。
（項目５４）
前記外来性抗原ポリペプチドが、長さ８アミノ酸〜長さ２４アミノ酸である、前記項目のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目５５）
前記除核細胞が、除核赤血球系細胞または血小板である、前記項目のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
（項目５６）
抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法であって、前記Ｔ細胞を項目１〜３１のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記抗原特異的Ｔ細胞を活性化する方法。
（項目５７）
受容体分子を発現するＴ細胞の増殖を誘導するための方法であって、前記Ｔ細胞を項目１〜３１のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、共刺激ポリペプチドが前記受容体分子と特異的に結合し、それによって前記Ｔ細胞の増殖を誘導する、方法。
（項目５８）
Ｔ細胞集団のサブセットを拡大する方法であって、前記サブセットの少なくとも１つのＴ細胞を含むＴ細胞の集団を項目１〜３１のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、前記ａＡＰＣの表面に含まれている外来性共刺激ポリペプチドが、前記サブセットの前記少なくとも１つのＴ細胞上の受容体分子と特異的に結合し、前記外来性共刺激ポリペプチドの前記受容体分子への結合が、前記サブセットの前記少なくとも１つのＴ細胞の増殖を誘導し、それによって前記Ｔ細胞集団の前記サブセットを拡大する、方法。
（項目５９）
Ｔ細胞の活性を抑制する方法であって、前記Ｔ細胞を項目３２〜４１のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記Ｔ細胞の活性を抑制する方法。
（項目６０）
Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための方法であって、前記Ｔｒｅｇ細胞を項目４２〜５３のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって前記Ｔｒｅｇ細胞を活性化する方法。
（項目６１）
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象のＴ細胞を項目１〜５５のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、それによって、免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する方法。
（項目６２）
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｖｏである、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、
ａ）前記対象における細胞上での抗原の発現プロファイルを決定するステップと、
ｂ）抗原提示ポリペプチドと少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドとを細胞表面に含む操作された除核細胞である人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を選択するステップと、
ｃ）前記ａＡＰＣを前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、前記免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する方法。
（項目６５）
免疫応答の変更を必要とする対象を処置する方法であって、
ａ）前記対象のＨＬＡステータスを決定するステップと、
ｂ）少なくとも１つの第１の外来性抗原ポリペプチドと少なくとも１つの抗原提示ポリペプチドとを細胞表面に含む操作された除核細胞である、前記対象と免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、選択するステップと、
ｃ）前記ａＡＰＣを前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、前記免疫応答の変更を必要とする前記対象を処置する方法。
（項目６６）
前記対象が、免疫応答の増加を必要とする、項目６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記対象が、がんまたは感染性疾患を有する、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記対象が、免疫応答の減少を必要とする、項目６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記対象が、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を有する、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
Ｔ細胞応答の誘導を必要とする対象の抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法であって、
Ｔ細胞を含む、細胞の集団を、前記対象から採取するステップと、
細胞の前記集団を項目５〜２３のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、細胞の前記集団を前記ａＡＰＣと接触させるステップが、少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドに特異的である抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する、ステップと、
前記抗原特異的Ｔ細胞を前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、Ｔ細胞応答の誘導を必要とする前記対象の前記抗原に対するＴ細胞応答を誘導する方法。
（項目７１）
前記抗原特異的Ｔ細胞を細胞の前記集団から単離するステップをさらに含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団を拡大する方法であって、
Ｔｒｅｇ細胞を含む、細胞の集団を、対象から採取するステップと、
前記集団を項目３４〜４４のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップであって、前記集団を前記ａＡＰＣと接触させるステップが、前記Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、ステップと
を含み、それによってＴｒｅｇ細胞の前記集団を拡大する方法。
（項目７３）
前記Ｔｒｅｇ細胞を、細胞の前記集団から単離するステップをさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記Ｔｒｅｇ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目７２または項目７３に記載の方法。
（項目７５）
項目１〜５５のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核におよび前記外来性抗原ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと
を含み、それによって前記ａＡＰＣを作製する、方法。
（項目７６）
項目９〜５５のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核におよび前記外来性抗原提示ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと、
前記除核細胞を少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドと接触させるステップであって、前記少なくとも１つの外来性抗原ポリペプチドが、前記除核細胞の細胞表面に存在する前記外来性抗原提示ポリペプチドに結合する、ステップと
を含み、それによって前記ａＡＰＣを作製する、方法。
（項目７７）
項目９〜５５のいずれか一項に記載のａＡＰＣを作製する方法であって、
前記外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を有核細胞に導入するステップと、
前記外来性抗原提示ポリペプチドをコードする外来性核酸を前記有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核に、ならびに前記外来性抗原ポリペプチドおよび前記外来性抗原提示ポリペプチドの産生に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと
を含み、それによって前記ａＡＰＣを作製する、方法。
（項目７８）
前記外来性核酸が、ＤＮＡを含む、項目７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記外来性核酸が、ＲＮＡを含む、項目７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記導入するステップが、ウイルス形質導入を含む、項目７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記導入するステップが、電子穿孔を含む、項目７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記導入するステップが、リポソーム媒介移入、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに基づくベクター、リポフェクション、およびレンチウイルスベクターのうちの１つまたは複数を利用することを含む、項目７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
免疫学的に適合する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製する方法であって、前記ａＡＰＣが、外来性抗原ポリペプチドを細胞表面に含む除核細胞を含み、前記方法が、
内在性核酸を切断するヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと有核細胞を接触させて、内在性抗原提示ポリペプチド、内在性アンカーポリペプチドまたは内在性共刺激ポリペプチドの産生をもたらす、または内在性マイクロＲＮＡの発現の阻害をもたらすステップと、
前記外来性抗原ポリペプチドをコードする外来性核酸を前記有核細胞に導入するステップと、
前記有核細胞を、除核に、ならびに前記内在性抗原提示ポリペプチドによる前記外来性抗原ポリペプチドの産生および提示に好適な条件下で培養することによって除核細胞を作製するステップと
を含み、それによって前記免疫学的に適合するａＡＰＣを作製する、方法。
（項目８４）
前記外来性核酸をヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡと接触させる、項目８３に記載の方法。
【国際調査報告】
2021506304.tif 000152
2021506304.tif 000153
2021506304.tif 000154
2021506304.tif 000155