(57)【要約】  本発明では、スフィンゴミエリン型のスフィンゴ脂質、及び任意に、リン脂質、コレステロール、オクタデシルアミン、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−サルフェート）、及びＰＥＧ化誘導体（ポリエチレングリコールを含む誘導体）等のその他の脂質によって安定化された、好ましくはビタミンＥ又はオレイン酸から選択される、ナノテクビヒクルとして用いるための、特に癌及び転移性疾患の管理のための油相又は油コアを含む様々な水中油（Ｏ／Ｗ）型ナノエマルジョンの開発が本明細書に記載される。上記ナノエマルジョンは、腫瘍細胞の細胞膜上で発現される受容体と相互作用又は結合することができる、特に原発性及び／又は播種性若しくは転移性の腫瘍細胞の膜上で発現される受容体と相互作用又は結合することができるリガンドで機能付与することができる。また、抗腫瘍薬又は治療用生体分子を上記ナノエマルジョンに封入することができ、最後に、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断で使用する造影剤を上記ナノエマルジョンに組み込むことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油（ｏ／ｗ）型ナノエマルジョンであって、
ａ．水相と、
ｂ．α−トコフェロール（ビタミンＥ）のみからなる油性核と、
ｃ．スフィンゴミエリンと、
を含む、ナノエマルジョン。
【請求項２】
前記ナノエマルジョンが、
ａ．治療分子、及び／又は、
ｂ．造影剤、
の要素の少なくとも１つで機能付与されている、請求項１に記載のナノエマルジョン。
【請求項３】
前記治療分子が、カルモフール、エトポシド、ドセタキセル、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、ゲムシタビン、エデルフォシン、及び／又はそれらの誘導体等の抗腫瘍薬；クルクミン、ベルテポルフィン、及び／又はレスベラトロール等の抗炎症又は抗血管新生薬；ｐＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡ等の核酸；ペプチド、抗体又はそのフラグメント、及びアプタマー等の生体分子；並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項２に記載のナノエマルジョン。
【請求項４】
前記造影要素が、蛍光体、ＳＰＩＯＮ又はその誘導体、放射性同位体、パーフルオロヘキサン及びオクタフルオロプロパンと並んで、それらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載のナノエマルジョン。
【請求項５】
前記ナノエマルジョンが、細胞輸送に適したリガンドで機能付与されている、請求項１〜４のいずれかに記載のナノエマルジョン。
【請求項６】
前記リガンドが、ＴＡＳ１Ｒ３受容体に結合することができるリガンドである、請求項５に記載のナノエマルジョン。
【請求項７】
前記リガンドが、ブラゼイン由来ペプチド又はラクチゾール甘味料からなる群より選択される、請求項６に記載のナノエマルジョン。
【請求項８】
前記ナノエマルジョンが、レプチン受容体に対するリガンド、グアニリルシクラーゼに対するリガンド、又はウログアニリン、リジンで修飾されたウログアニリン、インテグリンの細胞外画分、又はＲＰＭで機能付与されている、請求項５に記載のナノエマルジョン。
【請求項９】
前記ナノエマルジョンが、前記ナノエマルジョンの界面に配置された、他の膜脂質、及び／又はカチオン性脂質、及び／又はポリアミン、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び／又は他の界面活性剤若しくはコーティングポリマーを更に含む、請求項１〜８のいずれかに記載のナノエマルジョン。
【請求項１０】
治療法及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでの診断に使用される、請求項１〜９のいずれかに記載のナノエマルジョン。
【請求項１１】
乳癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、肉腫、神経膠芽腫、神経芽種、結腸及び直腸の癌、頭頸部の癌、腎臓癌及び膀胱癌、又は肝癌の治療に使用される、請求項１〜９のいずれかに記載のナノエマルジョン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野に属し、特にナノセラノスティックの可能性を有する薬理学的ビヒクル、特に癌へのアプローチ、並びに原発性腫瘍及び転移性疾患の管理、抗腫瘍薬の封入及び／又は、最終的にはｉｎ  ｖｉｖｏ診断で使用するための造影剤の組み込みに対するナノセラノスティックの可能性を有する薬理学的ビヒクルの分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ナノセラノスティックの可能性を持つ新たな薬理学的ツールを提供する。
【０００３】
ナノテクノロジーは、同じナノ構造の中に治療法及び撮像の要素を併せ持つシステムであり、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）等の非侵襲的撮像技術を用いた薬物の体内分布及び蓄積の研究を促進することに加えて、中でも、治療をリアルタイムで監視可能であるため、患者ごとに薬物の種類及び投与量を調整することができるという、一連の利点を提供する。ＰＥＴは放射性元素を必要とするが、ＭＲＩは強度が大きな一定磁場を発生させることができる磁石を使用する。したがって、この技術は、例えば、ＭＲＩによる画像撮影におけるその機能がネガティブ（暗）コントラストを与えることである超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ：superparamagnetic iron oxide nanoparticles）等の磁性粒子、又はガドリニウム若しくはパーフルオロカーボン等の他の分子に適用される。
【０００４】
要するに、造影剤、適切なリガンド及び／又は指定の薬物と会合したナノメトリックシステムを使用して、できるだけ早く診断に達し、単一ユニットによる治療、すなわちナノセラノスティクスに成功することを意図している。
【０００５】
この単一ユニットによる治療、すなわちナノセラノスティックについて、このタイプの構造は腫瘍の治療に特に有用となる可能性がある。この意味で、原発性腫瘍は様々な種類の癌の引き金ではあるが、主に患者の罹患率及び死亡率を決定するのは後に続く腫瘍播種及び転移形成といった事象であり、ヒトの癌による死因の９０％であることに留意されたい。転移は、癌細胞が元の（原発性）腫瘍から離れて、血液又はリンパ系を通って、新たな臓器に定着し、身体の他の臓器又は組織に新たな腫瘍を引き起こすことで起こる。転移性腫瘍細胞は、一般的には原発性腫瘍の細胞とは異なる表現型を呈し、一般的により耐性であり、場所が遠位であることとあいまって、それらのモニタリング及び治療を特に複雑にしている。可能性のある解決策は、腫瘍細胞が制御不能に増殖する前に、この細胞のタイプを特定し、それらを排除することである。このために、ナノ粒子を腫瘍細胞、特に拡散してしまった細胞に対して非常に選択的で特異的なものとするようにナノ粒子を機能付与する（functionalizing：官能化する）可能性が提案される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、原発性腫瘍に由来する細胞だけでなく、播種性の細胞の早期の検出及び根絶も促進し得て、癌に対する有効な治療法を提供する、正しく機能付与されたナノセラノスティックシステムを提供することにより、この側面にアプローチする。このシステムはまた、造影剤、リガンド及び／又は特定の薬物と会合した後、できるだけ早く診断に達することを可能にし、及び／又は単一ユニットにより治療を成功させる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、スフィンゴミエリン型のスフィンゴ脂質、及び任意に、リン脂質、コレステロール、オクタデシルアミン、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−サルフェート）、及びＰＥＧ化誘導体（ポリエチレングリコールを含む誘導体）等のその他の脂質によって安定化された、好ましくはビタミンＥ又はオレイン酸から選択される、ナノテクビヒクルとして用いるための、特に癌及び転移性疾患の管理のための油相又は油コアを含む様々な水中油（Ｏ／Ｗ）型ナノエマルジョンの開発が本明細書に記載される。上記ナノエマルジョンは、腫瘍細胞の細胞膜上で発現される受容体と相互作用又は結合することができる、特に原発性及び／又は播種性若しくは転移性の腫瘍細胞の膜上で発現される受容体に相互作用又は結合することができるリガンドで機能付与することができる。また、抗腫瘍薬又は治療用生体分子を上記ナノエマルジョンに封入することができ、最後に、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断で使用する造影剤を上記ナノエマルジョンに組み込むことができる。
【０００８】
さらに、本発明の著者らは、ＣＴＣ（循環腫瘍細胞）及び腫瘍において、例えば、これらのナノエマルジョンを方向づけることが可能なレプチン受容体、グアニリルシクラーゼ受容体、又は腫瘍若しくは腫瘍微小環境の他の分子、例えばインテグリン及びラミニンのナノ構造の選択的方向の対象となる幾つかの受容体を同定し、選択的相互作用を媒介することができるリガンドによる事前の機能付与により、好ましくはビタミンＥ又はオレイン酸、スフィンゴミエリン型のスフィンゴ脂質、並びに任意に、リン脂質、コレステロール、オクタデシルアミン、ＤＯＴＡＰ及びＰＥＧ化誘導体等の他の脂質から選択される油相を含む本発明の水中油型ナノエマルジョン（Ｏ／Ｗ）がこの受容体に対するリガンドで機能付与されると、原発性、播種性及び転移性の腫瘍細胞において、好ましくはこれらの受容体及び／又は分子を有する転移性細胞において、より効率的な上記ナノエマルジョンの細胞内蓄積が観察されることを示した。この発見は、腫瘍細胞に対する、特にＣＴＣ（循環腫瘍細胞）に対する、及び原発性、播種性又は転移性の腫瘍細胞に対する、薬理学的ビヒクル及び／又は診断薬としての使用のための、抗体、抗体のフラグメント、アプタマー、ペプチド、又はラクチゾール等の低分子量の疎水性若しくは親水性の分子と並んで、これらの受容体及び／又は分子に結合することができるリガンド薬物若しくはリガンド−放射性同位体のコンジュゲートからなる群より選択される一群の化合物による任意のタイプのナノシステムの機能付与への扉を開く。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｖ：ＳＭ  １：０．１の比率で調製された、スフィンゴミエリン（ＳＭ）及びビタミンＥ（Ｖ）のナノエマルジョン（Ａ）、並びにオクタデシルアミン（ＯＣＴ）も組み込んだナノエマルジョンの集団Ｖ：ＳＭ：ＯＣＴ  １：０．１：０．０１（Ｂ）の透過型電子顕微鏡法で取得した画像を示す図である。
【図２】室温で６ヶ月間、及び４℃で１年間に亘る、粒子径（Ａ）及び表面電荷（Ｂ）に関する、Ｖ：ＳＭ  １：０．１の比率のスフィンゴミエリン（ＳＭ）及びビタミンＥ（Ｖ）に基づくナノエマルジョンの安定性。この同じ配合物を、培養培地、並びにＦＢＳ（Ｃ）及びヒト血漿（Ｄ）で補足した培養培地でインキュベーションした後の安定性。
【図３】幾つかのインキュベーション時間（４時間及び２４時間）で、ＳＷ４８０細胞における、異なる組成のＶＳＭ（ビタミンＥ及びスフィンゴミエリン１：０．１）を有するナノエマルジョンの細胞生存率アッセイ（ＭＴＴ）（Ａ及びＢ）、４８時間のインキュベーションの後のＳＷ６２０細胞における、リガンドを含まない（ＯＡ：ＳＭ  １：０．１）及びラクチゾールを含む（ＯＡ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１）、オレイン酸及びスフィンゴミエリンのエマルジョンのＭＴＴ試験（Ｃ及びＤ）。２つの濃度（１０ｍｇ／ｍｌ及び２０ｍｇ／ｍｌ）のナノエマルジョンＶＳＭ（ビタミンＥ及びスフィンゴミエリン、１：０．１）及びＤＯＴＡＰを含むＶＳＭ（ＶＤＯＴＡＰ１％）の一連の静脈内注射を受けたマウスの体重に基づく耐用量の研究。観察期間中に急性毒性又は生理学的若しくは明らかな行動の変化を示し得るような体重変化はない（Ｅ）。
【図４】Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄを封入したビタミンＥ及びスフィンゴミエリン（Ｖ：ＳＭ  １：０．１）のナノエマルジョンを異なる起源の腫瘍細胞（結腸、肺、前立腺及び膵臓）と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡下で観察した（Ｄａｐｉチャネルは核に対応し、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄチャネルはナノエマルジョンに対応する）（Ａ）。ＤｉＲを封入したＶ：ＳＭ  １：０．１及びＶ：ＳＭ：ＤＯＴＡＰ  １：０．１：０．１を結腸腫瘍細胞（ＨＴＣ１１６）と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡下で観察した（ナノエマルジョンは細胞核の周りの白色点として観察することができる）（Ｂ）、並びにＤｉＲが封入されたＶ：ＳＭ  １：０．１を、ＧＦＰを発現させるために予め形質転換されている子宮内膜腫瘍細胞（ＨＥＣ１Ａ）及び結腸（ＳＷ４８０）と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡下で観察した（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄチャネルはナノエマルジョンに対応し、ＧＦＰは細胞の細胞質に対応する）（Ｃ）。
【図５】蛍光ＲＮＡ（Ｃｙ５−ＲＮＡ）を封入するスフィンゴミエリンナノエマルジョン（Ｖ：ＳＭ  １：０．１）を、ＧＦＰを発現させるために予め形質転換されている結腸腫瘍細胞（ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ）と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡下で観察した（ＧＦＰのチャネルは細胞に対応し、Ｃｙ５のチャネルはナノエマルジョンによって輸送されるＲＮＡに起因する）（Ａ）。磁気ナノ粒子を封入する、ラクチゾールで機能付与したオレイン酸及びスフィンゴミエリンのナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１）で処理したＳＷ６２０細胞の透過型電子顕微鏡法の画像では、細胞の細胞質レベルで発生した液胞内の対応するコントラストシグナルが観察され（右側の画像、矢印は位置を示す）、これはコントロール細胞（未処理、左側の画像）には見られない（Ｂ）。
【図６】フローサイトメトリーにより評価される蛍光ナノエマルジョンの内部移行。オレイン酸及びスフィンゴミエリンのナノエマルジョンに封入されたＮｉｌｅ  Ｒｅｄに陽性の結腸腫瘍細胞（ＳＷ６２０）の蛍光強度は、ＬＡＰＩで機能付与されたナノエマルジョン（ＯＳＭ−ＬＡＰＩ；Ｏ：ＳＭ：ＬＡＰＩ  １：０．１：０．０１、薄い線）の場合、非機能付与ナノエマルジョン（ＯＳＭ、Ｏ：ＳＭ  １：０．１、濃い線）と比べてより強い（Ａ）。サイトメーターで得られた平均蛍光強度の棒グラフ図表示（Ｂ）。
【図７】オレイン酸及びＮＢＤで標識されたスフィンゴミエリンの誘導体のナノエマルジョン（これもＤｉＲを封入する）（ＯＬＭ；Ｏ：ＳＭ  １：０．１）で処理した結腸腫瘍細胞（ＳＷ６２０）、並びにラクチゾールを含む機能付与ナノエマルジョン（ＯＬＭ−Ｌ；Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１）で同じく処理されたＳＷ６２０の共焦点顕微鏡画像。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔで染色されている。より強いシグナル強度（ＮＢＤで標識されたスフィンゴミエリン及び封入されたＤｉＤに対応する）が、機能付与ナノエマルジョンの場合に観察される。
【図８】標識されたｍｉＲＮＡがＣｙ５蛍光体と会合しているＲＰＭで機能付与された、ビタミンＥ、スフィンゴミエリン及びオアクタデシルアミン（Ｖ：ＳＭ：ＯＣＴ  １：０．１：０．０１）のナノエマルジョン（ＶＳＭＳＴＲＰＭ）及び非機能付与コントロール配合物（ＶＳＭＳＴＳＨ）で処理した、結腸腫瘍細胞（ＳＷ４８０及びＳＷ６２０）の共焦点顕微鏡画像。両方の細胞系統（Ｈｏｅｃｈｓｔチャネルは細胞核に対応し、Ｃｙ５のチェネルはナノエマルジョンと会合したｍｉＲＮＡに対応する）で、機能付与された配合物（ＶＳＭＳＴＲＰＭｍｉＲＮＡ）について、ｍｉＲＮＡの内部移行によってより強い蛍光強度が観察された。
【図９】４８時間のインキュベーション後、空（blanks）の又は抗腫瘍薬であるエトポシドを封入する、オレイン酸及びスフィンゴミエリンのナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ  １：０．１、ＮＥ）及びラクチゾールで機能付与されたナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ  １：０．１、Ｆ−ＮＥ）で処理された後の結腸腫瘍細胞（ＳＷ６２０）の細胞生存率（ＭＴＴアッセイ）（Ａ）。トランスフェクトから２４時間後の、スフィンゴミエリン、ビタミンＥ及びＤＯＴＡＰ（Ｖ：ＳＭ：ＤＯＴＡＰ  １：０．１：０．１）のナノエマルジョンと会合したｐＤＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙでトランスフェクトしたＨＴＣ１１６細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ（明るい白色スポット）の発現（左の画像）、並びにスフィンゴミエリン、ビタミンＥ及びプトレシン（Ｖ：ＳＭ：Ｐ  １：０．１：０．１）のナノエマルジョンと会合したｐＤＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙでトランスフェクトしたＳＷ６２０細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現（右の画像）（Ｂ）。ＧＡＰＤＨ（２＾−ｄｄｃｔ）に対して正規化した、ナノエマルジョンＶ：ＳＭ：ＤＯＴＡＰ（Ｖ：ＳＭ：ＤＯＴＡＰ−ｐＴＧ１）と会合したｐＴＧ１でトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞におけるＰ５３ＴＧ１  ＬｎｃＲＮＡの発現（Ｃ）。ＨＴＣ１１６−ＬＵＣ細胞におけるルシフェラーゼの発現。サイレンシングは、リポフェクタミン及びｓｉＲＮＡ抗ルシフェラーゼ（Ｌｉｐｏ＿ＧＬ３）でトランスフェクトした細胞の場合、及びＶ：ＳＭ：ＤＯＴＡＰ（ＶＤＯＴＡＰ＿ＧＬ３）でトランスフェクトした細胞の場合には観察されるが、非特異的ｓｉＲＮＡ配列（Ｎｏ  Ｅｓｐ）では観察されない（Ｄ）。
【図１０】両脇腹に結腸直腸癌細胞ＳＷ６２０を接種した後、腫瘍を発症したマウスにおける、ウログアニリンで修飾されＤｉＲを充填したスフィンゴミエリンナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ：ＵＲＯＧ  １：０．１：０．０１）の体内分布研究。静脈内注射の２４時間後、動物を屠殺し、光学撮像装置（ＩＶＩＳ）で観察するために臓器を切除した（Ａ）。結腸直腸癌細胞ＳＷ６２０を皮下に移植したマウスにおける腫瘍増殖。マウスを無作為に２群に分けた。群１：治療を受けていないコントロール動物（薄い線）。群２：静脈内投与（１日目、４日目、８日目及び１１日目の４回の注射）、用量：０．２ｍｇのエトポシド／Ｋｇ）により、ウログアニリンで修飾したスフィンゴミエリンナノエマルジョン（ＮＥ  ＵＲＯＧ、濃い線）に封入されたエトポシドで治療した動物（Ｂ）。
【図１１】ＤｉＲで標識され、ＴＡＳ１Ｒ３の発現が上昇したＳＷ６２０腫瘍細胞において４時間インキュベートされた、スフィンゴミエリンナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ  １：０．１）及びラクチゾールで機能付与されたスフィンゴミエリンナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１）の内部移行。蛍光強度は、ラクチゾールで機能付与されたナノエマルジョンの場合よりも高い。細胞核はＤＡＰＩで染色され、最も明確なシグナルは、ナノエマルジョン内に封入されたＤｉＤに起因する。
【図１２】非腫瘍コントロール組織に対する、転移性肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の腫瘍組織におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現（ｎ＝６）（Ａ）。様々な種類の腫瘍の様々な細胞系統、結腸（ＳＷ６２０及びＳＷ４８０）、肺（Ａ５４９及びＨ１７５５）、神経膠芽腫（Ｕ８７及びＵ１１８）、及び膵臓（ＭｉａＰａＣａ２）におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体（ｍＲＮＡ）の相対発現（Ｐ値＝０．０００１）（Ｂ）。起源が異なる腫瘍細胞、結腸癌ＳＷ６２０、肺Ａ５４９及び乳房ＭＣＦ７のパネルにおける免疫蛍光（鮮明なシグナル）による種々の受容体（ＧＣＣ、ＬＥＰＲ、ＴＡＳ１Ｒ３及びラミニン−５）の発現に関する研究（Ｃ）。
【図１３】本発明のナノエマルジョンの細胞生存率／毒性を示す図である。ビタミンＥ＋スフィンゴミエリン（ＶＳＭ）を含むナノエマルジョンをビタミンＥ＋セラミド（ＶＣｅｒ６）を含むナノエマルジョンと比較する、比較アッセイを示す。この図に見られるように、セラミドを含むナノエマルジョンの毒性は有意に高い。Ｖ：ビタミンＥ；ＳＭ：スフィンゴミエリン；Ｃｅｒ６：セラミドＣ６。
【図１４】本発明のナノエマルジョンの細胞生存率／毒性を示す図である。全ての油性核が非毒性のセラノスティックナノエマルジョンを得るのに等しく適しているわけではないことを示す。スフィンゴミエリンとリノール酸（Ｌ）又はオレイン酸（Ｏ）との組み合わせは、リノール酸（Ｌ）又はオレイン酸（Ｏ）等の油性核の使用が非常に毒性であることを実証している。ビタミンＥを使用すると、このような毒性が有意に減少される。Ｖ：ビタミンＥ；ＳＭ：スフィンゴミエリン；Ｏ：オレイン酸；Ｌ：リノール酸。
【図１５】本発明のナノエマルジョンの安定性を示す図である。種々のナノエマルジョンの安定性を示す比較試験を示す。特に、異なる条件での、次のナノエマルジョン：ビタミンＥ＋ホスファチジルコリン（Ｖ：ＰＣ）、ビタミンＥ＋セラミド（Ｖ：Ｃｅｒ６）、トリグリセリド＋スフィンゴミエリン＋コレステロール（ＴＯＧ：ＳＭ：ＣＨ）、ビタミンＥ＋スフィンゴミエリン（Ｖ：ＳＭ）の安定性を比較した。図１５Ａ（安定性４℃）。図１５Ｂ（安定性３７℃）。図１５Ｃ（安定性ＰＢＳ１０ｍＭ）。図１５Ｄ（安定性血漿）。この図に見られるように、スフィンゴミエリンを含むナノエマルジョンは、セラミドのような他のスフィンゴ脂質、又はホスファチジルコリンのようなリン脂質を含むナノエマルジョンと比較して、貯蔵中、並びに生理食塩水及び血漿培地の両方においてより安定である。ビタミンＥ＋ホスファチジルコリン（ＶＰＣ）。ビタミンＥ＋セラミド（ＶＣｅｒ６）。トリグリセリド＋スフィンゴミエリン＋コレステロール（ＴＯＧＳＭＣＨ）。ビタミンＥ＋スフィンゴミエリン（ＶＳＭ）。
【図１６】本発明のナノエマルジョンの安定性を示す図である。いずれもスフィンゴミエリン及び種々の油性核を含む種々のナノエマルジョンの安定性に関する比較試験を示す。図１６Ａ（安定性ＰＢＳ１００ｍＭ）。図１６Ｂ（安定性ＰＢＳ５０ｍＭ）。図１６Ｃ（安定性ＰＢＳ１０ｍＭ）。興味深いことに、リノール酸又はオレイン酸の核を含むナノエマルジョンの安定性は、ビタミンＥが使用される場合に示される安定性と比較して明らかに減少する。Ｖ：ビタミンＥ；ＳＭ：スフィンゴミエリン；Ｏ：オレイン酸；Ｌ：リノール酸。
【図１７】本発明のナノエマルジョンの安定性を示す図である。４０℃及び湿度７５％のストレス条件（規制承認に必要な条件又は必須条件）下で、オレイン酸核（ＯＳＭ：oleic acid nucleus）又は異なる油性核（ミグリオール（Migliol））及び界面活性剤（ホスファチジルコリン）を有するナノエマルジョンが明らかに不安定であるのに対し、ビタミンＥ及びスフィンゴミエリンを含むナノエマルジョンは安定であることを示している。Ｖ：ビタミンＥ；ＳＭ：スフィンゴミエリン；Ｏ：オレイン酸；ＰＣ：ホスファチジルコリン；Ｍ：ミグリオール。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本発明では、「ナノエマルジョン」は、油又は油の混合物で構成される構造であって、ナノメートルサイズの液滴として水中に分散され、そして液滴の凝集又は合体を防止する共重合体又は界面活性剤によって安定化されるものと理解される。このタイプのナノエマルジョンは、液滴の大きさ及び分布によって判断され、またマイクロエマルジョンとは異なり、動力学的に安定であるが熱力学的には安定ではないナノメートルのエマルジョンである。したがって、平均液滴径を考慮すると、ナノエマルジョンは、平均液滴径２０ｎｍ〜５００ｎｍを有するエマルジョンであり、マイクロ又はマクロエマルジョンは０．５μｍ〜１００μｍの平均液滴径を有することを意味すると理解される。好ましくは、平均液滴径に基づいて、ナノエマルジョンは、３００ｎｍ未満の平均液滴径を有するエマルジョンを意味すると理解される。
【００１１】
本発明では、「ナノ粒子」は、１ｎｍ〜５００ｎｍに含まれる平均径を有する、任意のタイプの粒子又は一群の粒子又は成分、また同様に、コロイド懸濁液の分散相の１ｎｍ〜５００ｎｍに含まれる平均径を有する成分又は粒子又は一群の粒子と理解される。
【００１２】
本発明では、「ナノ構造組成物」は、ナノ粒子を生じさせる材料及び／又はコンジュゲートの組み合わせとして理解される。
【００１３】
本発明では、「ナノシステム」は、任意のタイプのナノ粒子、ナノエマルジョン、コロイド構造（例えば、リポソーム、ナノカプセル等）及び／又はリガンド−薬物若しくはリガンド−放射性同位体タイプのコンジュゲートであると理解され、水性懸濁液中では、ナノエマルジョンの上記ナノ粒子若しくは平均液滴径、又はリガンド−薬物若しくはリガンド−放射性同位体タイプのコロイド構造若しくはコンジュゲート構造は、１ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは３００ｎｍ未満、及び最適には１００ｎｍ前後で構成される平均径を有する。
【００１４】
「平均径」とは、同じ速度で拡散する粒子の流体力学的径を意味する。この平均粒子径は、レーザーがそれらの粒子に当たると、より小さな粒子が大きな粒子よりも速く拡散するという事実に基づいて、ナノ粒子のブラウン運動を測定し、それを粒子のサイズと関連付ける動的光拡散（Dynamic Light Diffusion）（ＤＬＳ）技術を使用して計算される。
【００１５】
本発明では、「機能付与」は、治療用途の薬物、診断用途の造影要素（contrast elements）、分子／標的細胞との相互作用を媒介するリガンド、また電荷を帯びた化合物、それらの物理化学的特性（サイズ、分散及び表面特性）を変化させる界面活性剤又は溶媒であるかどうかに関わらず、ナノシステムに機能性を提供する分子の化学的相互作用（例えば、共有結合性、静電気的、疎水性等）による結合体（union）として理解される。
【００１６】
本発明では、「スフィンゴミエリン」は、スフィンゴ脂質ファミリーの脂質を意味すると理解され、細胞膜に最も一般的に見られるリン脂質である唯一のスフィンゴ脂質は、以下の化学的構造を有する。
【化１】
2021510735.tif 000002
【００１７】
本発明では「スフィンゴ脂質」は、生理学的には、重要な生物学的機能を示し、生体膜の形成において重要な役割を果たす、一般的にはホスホスフィンゴ脂質（phosphoesphingolipids）及びグリコスフィンゴ脂質に分類される、両親媒性の特性を有する脂質を意味すると理解される。
【００１８】
本発明では、「油性核」は、界面活性剤、好ましくはスフィンゴ脂質によって安定化された油又は油の混合物と理解され、薬物、蛍光体、放射性同位体、造影剤等のそれらの油に、又は懸濁液に可溶性の他の種類の分子を持つこともできる。
【００１９】
本発明では、「リガンド」は、ナノシステムの表面に向かって配置され、腫瘍細胞の細胞膜のレベルで発現される受容体である標的分子とのその相互作用を支援する分子として理解される。それらの性質に応じて、リガンドは、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、親水性又は疎水性の低分子量の分子と並んで、両親媒性分子を生成するそれらの誘導体であり得る。
【００２０】
本発明では、「ＴＡＳ１Ｒ３受容体」は、味覚のＧタンパク質に結合した膜貫通受容体として理解され、これは味蕾で発現されるが、肝臓及び膵臓等の他の組織においても、また腫瘍細胞においても発現される。ＨＧＮＣ：１５６６１；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：８３７５６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６９９６２；ＯＭＩＭ：６０５８６５；ｏ  ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ７ＲＴＸ０等、このレシーバー（receiver）に関する参照は複数ある。
【００２１】
本発明では、ＴＡＳ１Ｒ３受容体のためのリガンドは、単糖及び二糖、スクラロース、シクラメート、ネオエスペリジン、ジヒドロカルコン等の人工甘味料、ラクチゾール等の甘味阻害剤、ブラゼイン等のタンパク質、並びに抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー、小分子、タンパク質等の選択系によって特に設計された他の分子等のＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用することができる分子であると理解される。
【００２２】
本発明では、「リガンドとのコンジュゲート」は、溶解物及び治療活性を有する分子（薬物、放射性医薬品等）又は診断用分子（放射性同位体、キレート剤、ガドリニウム等）を含む化学的コンジュゲートである。
【００２３】
本発明では、「比率（重量／重量）油／スフィンゴ脂質」は０．００５〜１：１０であって、質量比を意味し、ここでは、油の量を１としてスフィンゴ脂質の割合をその単位に対し決定する。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明では、特に、局在化した及び／又は転移性の腫瘍疾患の治療及び／又はモニタリングのためにナノテクノロジービヒクルとして使用する配合物の開発を解説する。上記配合物は、腫瘍細胞の細胞膜上で発現される受容体と相互作用又は結合することができる、特に原発性、播種性又は転移性の腫瘍細胞の膜上で発現される受容体に相互作用又は結合することができるリガンドで機能付与することができる。また、抗腫瘍薬又は治療用生体分子を上記ナノエマルジョンに封入することができ、最後に、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断で使用する造影剤を上記ナノエマルジョンに組み込むことができる。
【００２５】
この目的のため、本発明者らは、本発明の実施例に示される手順を用いて、好ましくはビタミンＥ又はオレイン酸から選択される油相又は油コアを含み、スフィンゴミエリン型のスフィンゴ脂質によって安定化された水中油型の様々なナノエマルジョン（それらの特性評価については、本発明の第１の態様で詳述されている）を開発し、任意に上記ナノエマルジョンは、リン脂質、コレステロール、オクタデシルアミン、ＤＯＴＡＰ、及びペグ化誘導体と並んで、ポリアミンと脂質鎖のコンジュゲート等の他の脂質を含むことができる。例として、上記化合物に基づいて調製された上記ナノエマルジョンの物理化学的性質を示す（表１）。
【００２６】
【表１】
2021510735.tif 000003
【００２７】
さらに、本発明者らは、このタイプのナノエマルジョンを透過型電子顕微鏡法で解析して、それらの形態及びサイズ分布を決定することを進めた。図１では、均質な分布を有する丸みを帯びたナノ粒子の集団を見ることができる。また、図２に示すように、開発されたナノエマルジョンは、保存の間及び生物学的流体の存在下の両方で、それらのコロイド特性の観点から、非常に安定していることに留意されたい。
【００２８】
一方、本発明のナノエマルジョンのナノセラノスティックの価値（nanotheranostic value）を判断するため、それらをＴＡＳ１Ｒ３、グアニリルシクラーゼＣ、レプチン受容体、又はインテグリン及びラミニン等の他の分子等の対象となる或る特定の受容体を発現する腫瘍細胞に対するそれらの相互作用又は結合を増強することができる分子で機能付与した。これらの研究は、転移性腫瘍細胞におけるこれらの標的受容体／分子の同定を伴った。上記機能付与を行うため、表２に記載のリガンドを取得して、スペーサー（ＰＥＧ）の有無にかかわらず、共有結合によって疎水性残基（例えばＣ１６、Ｃ１８等）に結合した。その他の場合（ＵＲＯＧＬｙｓ、ＢＲＡ、ＩＮＴ及びＬＥＰＴ）には、予備形成ナノエマルジョンに対してインキュベーションを行った。使用したペプチドの配列（表２）、及び得られたナノエマルジョンの物理化学的性質を以下に記載する（表３）。
【００２９】
【表２】
2021510735.tif 000004
【００３０】
【表３】
2021510735.tif 000005
【００３１】
上記機能付与は、実施例３に記載されるとおりに行われたことに留意されたい。このため、リガンド密度の異なるナノエマルジョンを最適化し、全ての場合において、それらのコロイド安定性を、保存の間及び生物学的手段の存在下で判断した。さらに、この報告を通して記載される低分子量の分子によるスフィンゴミエリンを含むナノシステムの機能付与は、生産及び規模拡大（scale）が容易なリガンドであり、抗体、ペプチド、及びタンパク質等の従来のリガンドと比べて非常に安価であるため、ラクチゾールの場合と同様に、非常に興味深いと言及することは重要である。このタイプの配合物はまた、特許記録（the patent memory）全体に記載されている一連の利点を有するＴＡＳ１Ｒ３受容体に向けられているため、高い関心を提示する。
【００３２】
本発明のナノシステムを機能付与する可能性を知って、治療活性を有する数種類の分子を、それらの物理化学的性質と潜在的活性の両方を判断するために、本発明のナノエマルジョンと会合させた。これらの分子を充填したナノエマルジョンの幾つかの例、及びそれらの特性評価を、下記表（表４）に示す。上記例は、本発明の実施例で提供される情報と併せて、本発明のナノエマルジョンの治療可能性を示す。
【００３３】
【表４】
2021510735.tif 000006
【００３４】
幾つかの種類の治療活性を有する分子を会合させることとは別に、またナノセラノスティクスを開発することを目的として、本発明者らは、光学イメージング（ＩＶＩＳ）及び分子システム（ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＭＲＩ）を用いてナノエマルジョンの可視化／追跡を可能にする幾つかの要素を会合させた。表５は、本発明者らが使用する要素を示し、本発明のナノエマルジョンが潜在的な診断価値を有することを実証する。
【００３５】
【表５】
2021510735.tif 000007
【００３６】
【表６】
2021510735.tif 000008
【００３７】
上記に加えて、本発明のナノエマルジョンの毒性を細胞培養物及びマウスで調べた（図３）。細胞培養物では毒性をほとんど誘発しないことが観察された（Ａ）。毒性は、ナノエマルジョンの表面にリガンドを組み込むことによっては変わらず、例として、ナノエマルジョンの毒性は、リガンドラクチゾールによる機能付与の有無にかかわらず提示される（Ｂ）。また、９６時間のインキュベーション後、ゼブラフィッシュ胚の試験でコントロール（水）と比較して死亡の増加はなかった。そして更に重要なことに、健康なマウスに１０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬの濃度でナノエマルジョンを数回連続して静脈内注射した後、明らかな毒性は認められない（Ｃ）。したがって、本発明のナノエマルジョンは、主要成分が天然脂質であるため毒性が低いということを立証している。
【００３８】
一方、本発明のナノエマルジョン、特にスフィンゴミエリンナノエマルジョンの有効性を判断するため、起源が異なる腫瘍細胞における上記エマルジョンの内部移行を評価した。この点に関して、一般に、本発明のスフィンゴミエリンナノエマルジョンは、内部移行される能力が大きいと判断された（図４）。本発明者らは、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ蛍光体を充填したＶ：ＳＭ  １：０．１配合物は、その起源（例えば、結腸、肺）、前立腺及び膵臓）に関係なく、ＤＡＰＩで対比染色された細胞の核の周りに強い赤色シグナルを生じさせたことを共焦点顕微鏡法により観察することができた（Ａ）。さらに、例えばカチオン性ナノエマルジョンＶ：ＳＭ：ＤＯＴＡＰ（１：０．１：０．１）は、ナノエマルジョン中性Ｖ：ＳＭと比較すると結腸細胞でより効果的に内部移行されたことから（Ｂ）、内部移行効率は可変的であり、組成によって制御可能である。実際に、ナノエマルジョンに対応するシグナルは、緑色タンパク質（ＧＦＰ）を発現するために形質転換された腫瘍細胞を使用したことから緑色でマークをつけられた細胞の細胞質にあることが確認され、ナノエマルジョンに対応するマーカー及び細胞の細胞質の緑色の共局在が観察される（Ｃ）。この効果的な内部移行は、会合した治療用分子の効果的な細胞内放出を生じさせる（図５）。例えば、蛍光体Ｃｙ５で標識された核酸を用いることにより、この場合にＧＦＰで形質転換した腫瘍細胞の細胞質におけるシグナルは標識ＲＮＡに対応することから、ナノエマルジョンがどのようにして細胞の細胞質にそれを輸送することができるのかを観察することが可能であった（Ａ）。磁性ナノ粒子を組み込んだナノエマルジョンの場合、透過型電子顕微鏡法により、この配合物と共にインキュベートされた細胞の液胞においてそれらのコントラストを観察することができる（Ｂ）。
【００３９】
一方、機能付与ナノエマルジョンの場合には、本発明者らは、より大きな内部移行を観察した。これは、例えば、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄでマークをつけ、ＬＡＰＩで機能付与したＯ：ＳＭ  １：０．１ナノエマルジョンの場合に当てはまり、リガンドのないコントロールと比べると、この配合物の場合にはＮｉｌｅ  Ｒｅｄに陽性の細胞数が多かった（曲線の変位が大きく、平均強度がより高いことが観察される）（図６）。この事実は、ラクチゾールで機能付与されたＯ：ＳＭ  １：０．１ナノエマルジョンの場合に繰り返される（図７）。まず、ナノエマルジョンに封入されたＤｉＤシグナルは、機能付与ナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１）（下の写真）でより強く、コントロールナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ  １：０．１）の場合より内部移行の程度が大きいことを確認する（Ａ）。さらに、腫瘍細胞が標的受容体を発現する強度が弱い場合（この場合、正常条件下（低発現）又は低グルコース含量（高発現）で培養したＳＷ６２０細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３）、シグナルの強度が観察された（Ｂ）。
【００４０】
さらに、細胞培養物における本発明のスフィンゴミエリンナノエマルジョンの有効性を評価した（図９）。細胞毒性アッセイは、ナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ  １：０．１）が抗腫瘍薬（この場合はエトポシド）を効率的に放出し、細胞生存率の低下をもたらすことができ、リガンドで機能付与されたナノエマルジョン（この場合、ラクチゾールＯ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１）の場合では効果がより顕著であることを明らかにする（Ａ）。これは、遺伝子治療等の標的療法の場合にも確認される。ナノエマルジョンＶ：ＳＭ：ＤＯＴＡＰ  １：０．１：０．１及びＶ：ＳＭ：Ｐ  １：０．１：０．１は、赤色タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードするプラスミドで腫瘍細胞を効率的にトランスフェクトすることができ、細胞の細胞質にてシグナルが観察される（Ｂ）。ｌｎｃＲＮＡをコードするプラスミドの場合、ＲＴ−ＰＣＲによって定量される、その発現（ＴＧ１）の有意な増加が観察された（Ｃ）。ｓｉＲＮＡの場合、形質転換細胞におけるルシフェラーゼの発現を低下させるものを用いて、このタンパク質（ＶＤＯＴＡＰ−ＣＬ３）の発現の低下が観察され、これは市販の参照ベクターであるリポフェクタミンにより得られ得る低下に匹敵する（Ｄ）。スフィンゴミエリンナノエマルジョンの有効性を、動物モデル（結腸癌の腫瘍細胞ＳＷ６２０を用いて異種移植した動物）でも評価した（図９）。ナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ：ＵＲＯＧ  １：０．１：０．０１）を静脈内投与した後、コントロール（生理食塩水の注射を受けた動物）に比べて、腫瘍増殖がより少ないことが観察される。
【００４１】
上で検討された全ての結果に基づいて、油コアを含み、好ましくはスフィンゴミエリン型のスフィンゴ脂質で安定化された水中油型ナノエマルジョンの可能性が、特に早期に、より詳しくは転移性疾患に関して、疾患腫瘍の管理に対するナノテクノロジービヒクルとしての使用について、実証されている。この意味で、本発明は、腫瘍細胞の細胞膜、特に播種性及び転移性の腫瘍細胞の膜に発現される受容体に対するリガンドによる上記ビヒクルの機能付与が、該ビヒクルを、その中での抗腫瘍薬の封入及びｉｎ  ｖｉｖｏ診断での使用に対する造影剤の組み込みの両方に有用な強い治療可能性を有するユニットとすることを実証する。
【００４２】
したがって、本発明の第１の態様は、水中油（ｏ／ｗ）型のナノエマルジョン（以下、「本発明のナノエマルジョン」）であって、
水相と、
油を含む油相又は油コアと、
スフィンゴミエリン、セラミド、スフィンゴシン、ガングリオシド、グロボース、サイコシン、及びセレブロシドからなる群より選択されるスフィンゴ脂質と、
を含み、比率（ｐ／ｐ）スフィンゴ脂質／油が０．００５〜１０である、ナノエマルジョンに関する。
【００４３】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、スフィンゴ脂質はスフィンゴミエリンである。
【００４４】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、好ましくはスフィンゴミエリン型のスフィンゴ脂質の濃度は、ナノエマルジョンの総体積に対して１重量％〜６重量％の濃度（重量／体積）である。
【００４５】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、油相又は油コアの油は、αトコフェロール（ビタミンＥ）、ひまわり油、落花生油、アボカド油、アルガン油、アーモンド油、カレンジュラ油、ココナッツ油、小麦胚芽油、アルニカ油、ルリジサ油、ゴマ油、綿実油、オリーブ油（オレイン酸）、トウゴマ油、大豆油、紅花油、パーム油、小麦胚芽油、チャノキ油、ホホバ油、亜麻仁油、シリコーン、グリセロール、トリグリセリドオイル、オトギリソウ油、ロザ・モスクエタ油、ミリスチン酸イソプロピル、トリブチリン、スクアレン、又はそれらの任意の組合せからなる群より選択される。好ましくは、油相は、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、オレイン酸、リノール酸及び／又はトリグリセリドのみからなる。
【００４６】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、上記ナノエマルジョンは、他の膜脂質（リン脂質、ステロール及び糖脂質）、及び／又はＤＯＴＡＰ若しくはオクタデシルアミン等のカチオン性脂質、及び／又はポリアミン若しくは誘導体、並びにポリエチレングリコールを有するその誘導体を更に含む。
【００４７】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、前記ナノエマルジョンは、
治療分子；又は、
造影要素、
の要素の少なくとも１つで機能付与されている。
【００４８】
ここで、治療分子は、
薬物、好ましくはカルモフール、エトポシド、ドセタキセル、パクリタキセル、ゲムシタビン、又はそれらの誘導体等の抗腫瘍薬、
核酸、
ペプチド、
タンパク質、
抗体又はそのフラグメント、
アプタマー、
小有機分子、
エデルフォシン等の抗腫瘍活性を有する脂質、
クルクミン又はレスベラトロール等の抗腫瘍特性を有する天然起源の化合物、及び、
それらの任意の組合せ、
からなる群より選択されるのが好ましく、
ここで、造影要素は、
緑色インディアンシアニン（ＩＣＧ：indiancyanine）、１，１−ジオクダデシル−３，３，３，３−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＲ）、１，１−ジオクタデシル−３，３，３，３−テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＤ）、ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ等の蛍光体、
超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯＮ）等の無機ナノ粒子、
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）又は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ−ＰＥ）若しくは１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＥ）、又はガドリニウム、若しくはガリウム若しくはインジウム等の放射性同位体の錯体化用に脂質で修飾されたＮＯＴＥ等のキレート剤、
フッ素（１８Ｆ）、ガリウム（６８Ｇａ）、ヨウ素（１２５Ｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、及び誘導体等のその他の放射性同位体、
パーフルオロヘキサン及びオクタフルオロプロパン等のパーフルオロカーボン、並びに、
それらの任意の組み合わせ、
からなる群より選択されるのが好ましい。
【００４９】
一方、本発明の著者らは、ＣＴＣ（循環腫瘍細胞）、並びに原発性及び播種性又は転移性の両方の腫瘍において、新たな受容体、具体的にはＴａｓ１Ｒ３受容体（味覚受容体である）を同定した。上記受容体の発現は、グルコースの存在、並びにその系統（line）及び場所（より転移性の高い発現）によって異なる。
【００５０】
ナノ粒子等の分子の選択的方向に対するこの受容体の大きな可能性により、また本発明者らはこの受容体と相互作用し、内因性ではないため競合現象を生じない分子の存在を知っていることを考慮に入れることにより、本発明者らは、受容体の幾つかのリガンド、特に幾つかの甘味料を選択し、上記リガンドで本発明のナノシステムを機能付与することで、ＣＴＣ（循環する（腫瘍細胞）及び転移性の細胞として、原発性腫瘍又は播種性腫瘍細胞等の腫瘍に対して上記ナノシステムを方向づけることができるという仮説を検証した（実施例及び図を参照されたい）。
【００５１】
ナノエマルジョンが機能付与されると、本発明者らは、これらの機能付与されたナノ粒子が受容体を発現する細胞内でより効率的に蓄積することを観察した（図６〜図１１）。
【００５２】
したがって、本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、本発明のナノエマルジョンは、炭素鎖、タンパク質、ペプチド又はアプタマーに結合しているか否かにかかわらず、細胞輸送（cellular vehiculization）に適した低分子等のリガンドで機能付与されている。好ましくは、上記本発明のナノエマルジョンは、ＴＡＳ１Ｒ３、グアニリルシクラーゼＣ、レプチン受容体、又はインテグリン及びラミニン等の分子等の対象となる或る特定の受容体を発現する腫瘍細胞に対するリガンドにより機能付与されている。特に、上記リガンドは、ペプチドであるラクチゾール又はブラゼインからなる群より選択される。より好ましくは、上記本発明のナノエマルジョンは、グアニリルシクラーゼ、レプチン、又はＴＡＳ１Ｒ３受容体に対するリガンドで機能付与されており、リガンドは、ペプチド、タンパク質若しくはフラグメント、抗体若しくはそのフラグメント、アプタマー、小サイズの有機分子、それらと相互作用し得ると説明される分子、又は誘導体からなる群より選択される。
【００５３】
本発明の第１の態様の更に別の好ましい実施形態では、本発明のナノエマルジョンは、ウログアニリン、リジンで触媒されたウログアニリン、インテグリンＩＮＴの細胞外画分、又はＲＰＭ（ＲＰＭペプチドのペプチド配列：ＣＰＩＥＤＲＰＭＣ）で機能付与されている。
【００５４】
本発明の第１の態様の更に別の好ましい実施形態では、本発明のナノエマルジョンは、上で定義された細胞輸送に適したリガンド、及び少なくとも１つの治療分子又は造影要素で二重に機能付与されている。
【００５５】
本発明の第２の態様は、本発明のナノエマルジョンを得る方法であって、ｉ）油及び／又はスフィンゴ脂質をエタノール、好ましくは、又は必要に応じて水を含む他の混和性有機溶媒、又は混合物に溶解することと、ｉｉ）穏やかな磁気撹拌のもと、又は任意に均質化すること若しくは超音波を適用しながら、水相、水、生理食塩水、緩衝液、又は糖溶液にこの相を加えることと、ｉｉｉ）任意に、ナノエマルジョンを機能付与しようとする化合物及びその溶解特性に応じて、化合物、造影剤、治療分子又はリガンドを２つの先の相のうち１つに加えることとを含み、ｉｖ）代替的には、マイクロ流体システムを成分の混合に使用することができ、ｖ）ナノエマルジョンはまた、均質化又は超音波処理等の両方の相を混合するための種々の物理的方法を使用して調製することもでき、ｖｉ）ナノエマルジョンは、化学反応又は物理的プロセスを通じて、調製時に全ての成分を加えるか、又は予備形成ナノエマルジョンに異なる要素を組み込むことによって機能付与され得る、方法に関する。
【００５６】
本発明の第３の態様は、治療法に使用される、特に、癌、特に、乳癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、肉腫、神経膠芽腫、神経芽種、結腸及び直腸の癌、頭頸部の癌、腎臓癌及び膀胱癌、並びに肝癌の治療に使用される、より詳しくは、癌転移の治療に使用される、より詳しくは、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断に使用される、本発明のナノエマルジョンに関する。
【００５７】
本発明の第４の態様は、本発明のナノエマルジョンと、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【００５８】
最後に、既に言及しているように、本発明の著者らは、ＣＴＣ（循環腫瘍細胞）及び腫瘍において、新たな受容体、特にＴａｓ１Ｒ３受容体（実施例６を参照されたい）を同定した。さらに、本発明では、本発明のナノエマルジョンがこの受容体に対するリガンドによって機能付与されると、上記ナノエマルジョンの細胞内蓄積が、受容体を発現する細胞、すなわち腫瘍細胞においてより効率的に観察される（実施例７を参照されたい）ことが実証されている（図７を参照されたい）。
【００５９】
したがって、本発明の第５の態様は、腫瘍細胞に対する（in front of）、好ましくは、原発性、播種性又は循環性の腫瘍細胞に対するナノシステム又はコンジュゲートの機能付与に使用される、ＴＡＳ１Ｒ３受容体に結合することができる抗体、抗体フラグメント、アプタマー又はペプチドからなる群より選択される一群の化合物に関する。
【００６０】
本発明の第５の態様の好ましい実施形態では、上記化合物はレプチン又はブラゼイン由来のペプチドからなる群より選択され、好ましくはブラゼインである。
【００６１】
特に好ましい実施形態では、本発明は、水中油（ｏ／ｗ）型ナノエマルジョンであって、ａ）水相と、ｂ）α−トコフォロールのみからなる油性核（すなわち、油性核の油はα−トコフロールのみからなる）と、ｃ）スフィンゴミエリン（安定剤又は界面活性剤として）とを含む、ナノエマルジョンに関する。
【００６２】
この特定の組み合わせ（すなわち、水相と、α−トコフェロールのみからなる油性核と、スフィンゴミエリンとの組み合わせ）は、治療及び診断の両方の目的で使用されて、毒性が低く、また生理食塩水及び血漿培地で保管する間の安定性も高い、多目的なナノエマルジョンを得る機会を本発明に与える。
【００６３】
本発明のナノエマルジョンの毒性に関して、本発明は、本発明のナノエマルジョンの毒性が細胞培養物及びマウスで研究されたことを既に説明した（図３）。この図３では、ＶＳＭ（ビタミンＥ及びスフィンゴミエリン  １：０．１）の異なる組成を有するナノエマルジョンの細胞生存アッセイ（ＭＴＴ）を行う。これらのナノエマルジョンは、細胞培養物では毒性をほとんど誘発しないことが観察された（図３Ａ）。毒性は、ナノエマルジョンの表面にリガンドを組み込んでも変わらず、例として、ナノエマルジョンの毒性は、リガンドラクチゾールによる機能付与の有無にかかわらず提示される（図３Ｂ）。また、９６時間のインキュベーション後、ゼブラフィッシュ胚の試験でコントロール（水）と比較して死亡の増加はなかった。更に重要なことは、健康なマウスに１０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬの濃度でナノエマルジョンを数回連続して静脈内注射した後、明らかな毒性は認められない（図３Ｃ）。したがって、本発明のナノエマルジョンは、主要成分が天然及び中性の脂質であるため毒性が低いということを示している。さらに、ビタミンＥ＋スフィンゴミエリン（ＶＳＭ）を含むナノエマルジョンをビタミンＥ＋セラミド（ＶＣｅｒ６）を含むナノエマルジョンと比較する比較アッセイを示す図１３を参照されたい。例えば、セラミドを含むナノエマルジョンの毒性が有意に高いことが図１３からわかる。
【００６４】
これは、実際にはセラミドを含むナノエマルジョンは明らかに有毒であり、したがって診断目的には適切ではないか又は推奨されないことから、全てのスフィンゴ脂質が非毒性のセラノスティックナノエマルジョンを得るのに等しく適しているわけではないことを示すものである。そこで、本発明では、その毒性が低いことから、スフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリンをセラノスティックナノエマルジョンの取得のため特に選出した。
【００６５】
さらに、図１４に示すように、全ての油性核が非毒性のセラノスティックナノエマルジョンを得るのに等しく適しているわけではない。図１４に示すように、スフィンゴミエリンとリノール酸（Ｌ）又はオレイン酸（Ｏ）との組み合わせは、リノール酸（Ｌ）又はオレイン酸（Ｏ）等の油性核の使用が非常に毒性であることを示している。ビタミンＥを使用すると、このような毒性が有意に減少される。
【００６６】
安定性に関して、スフィンゴミエリン及びビタミンＥに基づくナノエマルジョンの安定性を扱う出願時の図２に示すように、本発明のナノエマルジョンは、保存の間及び生物学的流体の存在下の両方において、そのコロイド特性の観点から、非常に安定していることに留意することが重要である。実際、例えば図１５からわかるように、スフィンゴミエリンを含むナノエマルジョンは、セラミドのような他のスフィンゴ脂質、又はホスファチジルコリンのようなリン脂質を含むナノエマルジョンと比較して、保存の間、並びに生理食塩水及び血漿培地中の両方においてより安定である。
【００６７】
さらに、本発明の発明者らは、いずれもスフィンゴミエリン及び異なる油性核を含む種々のナノエマルジョンの安定性を示す比較試験を実施した（図１６を参照されたい）。興味深いことに、リノール酸又はオレイン酸の核を含むナノエマルジョンの安定性は、ビタミンＥが使用される場合に示される安定性と比較して明らかに減少する。
【００６８】
さらに、図１７に説明されるように、４０℃及び湿度７５％のストレス条件（規制承認に必要な条件又は必須条件）下で、オレイン酸核（ＯＳＭ）又は種々の油性核（ミグリオール）及び界面活性剤（ホスファチジルコリン）を有するナノエマルジョンが明らかに不安定であるのに対し、ビタミンＥ及びスフィンゴミエリンを含むナノエマルジョンは安定であることを示している。
【００６９】
上記のデータは、全ての脂質又はスフィンゴ脂質が安定で非毒性のナノエマルジョンを得るのに等しく適しているわけではないことを示している。したがって、本発明では、保存の間、生理食塩水及び血漿培地中で高い安定性を有する非毒性のナノエマルジョンを得るため、スフィンゴ脂質であるスフィンゴミエリンと油性核であるビタミンＥとの組み合わせを特に選出した。
【００７０】
以下の実施例は、単に本発明の説明する機能を果たし、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００７１】
実施例１．本発明のナノエマルジョンの調製
ナノ粒子の調製をエタノール注入手法（ethanol injection technique）によって行い、これについては、それぞれの場合に必要な油：界面活性剤の比率（他の界面活性剤と組み合わせた、又は組み合わせていないスフィンゴ脂質）で原液を調製し（有機相、ＦＯ）、２ｍＬ容の小さなバイアルに入れたＨ２Ｏ  ９００μＬ（水相、ＦＡ）に、磁気撹拌しながら、１００μＬ（０．５ｍＬ容のインスリンＭｙｊｅｃｔｏｒ、Ｕ−１００インスリンの注射器を使用、Terumo）を注入した。これらの条件下で、水中油（Ｏ／Ｗ）型ナノエマルジョンの形成は自然に起こり、球形の形態を示し、均質な集団となった（図１）。構造は、スフィンゴミエリン及び時には他の脂質によって安定化された油コアからなり、原理的には疎水性分子の核における封入に適した系であり、また好ましくは界面に配置されるか、又はナノエマルジョンの表面で会合される別のタイプの両親媒性又は親水性の分子を会合することができる。
【００７２】
配合物の特性評価のため、動的光散乱（ＤＬＳ）によって粒子径及び多分散指数（ＰｄＩ）を決定し、同様にドップラーレーザー血流計（ＬＤＡ：Doppler laser anemia）によって電位（Ｚ）を決定することを可能にする、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（商標）（イングランドのNanoZS Malvern Instruments）を使用した。全ての試料をＭｉｌｌｉＱ水で希釈した後、室温で、９０℃の検出角度で分析する。各試料を３回測定し、平均値を提供する。また、このタイプの測定は、図２に示すように、保存の間又はより複雑な媒質中でのインキュベーション後のいずれかに、配合物のコロイド安定性を決定するためにも使用される。
【００７３】
実施例２．ＨＰＬＣ法の最適化
会合したリガンド及び対象となる治療分子の両方の開発されたナノ構造体に対する会合を判断するため、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用した。
【００７４】
方法の最適化のため、各分子の特徴を考慮した。リガンドに関しては、表２に記載の化合物が企図され、これは、配合物に組み込まれた後、表３に示されるもののように機能付与ナノエマルジョンを生じさせる。ペプチドの場合、分析を２２０ｎｍで行い、水及びアセトニトリルを移動相として組み合わせ、通常６０％未満のアセトニトリルであれば溶出に十分である。また、揮発性が高いため非常に使用されている（Agilent, 2013）イオン対試薬であるＴＦＡをわずかに（０．２％）移動相に追加することも重要であり、保持及び選択性を制御することによって逆の位相のＨＰＬＣカラムでイオン物質の分離を可能にする。また、幾つかの両親媒性分子の場合、ラクチゾール誘導体の場合と同様に、脂肪酸に類似した構造を有し、既に述べた支援を提供することから、ＴＦＡをわずかに（０．０５％）加えた。場合によっては、ＵＶ／Ｖｉｓ  ＤＵ−７３０分光光度計（Beckman Coulter）を用いてＵＶ−Ｖｉｓスキャンを行い、分析に適した波長を調整することも必要であった。
【００７５】
同様に、対象となる化合物の封入効率を分析するため、ドセタキセル及びパクリタキセル等の表４に列挙されているような薬物を充填したナノエマルジョンの特性評価をＨＰＬＣにより行った。これを行うため、より親水性の化合物がより極性の移動相（より多くの水）で溶出する一方で、より疎水性の化合物は、それらの溶出にはより無極性の移動相を必要とすることから、本発明者らは、疎水性（ＬｏｇＰ）等の各々の特徴を考慮した。調整したその他のパラメーターは、温度及び注入量であった。温度の場合、ピークの出口を加速又は遅延させることができ、ピークが溶媒の前に近づきすぎて出現する場合、カラムを冷却して溶出を遅らせることができるが、ピークが長い時間に現れて、クロマトグラム及び分析を遅らせる場合、温度を上げてカラムを通る化合物の排出を加速させることができる。注入量の場合、これはピークの高さを増すため、検出の限界（ＬＯＤ）及び定量の限界（ＬＯＱ）を改善することができる。該方法が最適化されると、ナノ粒子成分との相互作用がないことを確認して、クロマトグラムを変更することが重要である。全ての場合において、本発明者らは、ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０ＥＣ−Ｃ１８カラム（Agilent、４．６×１００ｍｍ、孔径４μｍ）を用いて、Ｇ７１１１Ａポンプ、Ｇ７１２９Ａオートサンプラー、及びＧ７１１４Ａ  ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を備えたＨＰＬＣシステム（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ、Agilent）を使用した。
【００７６】
核酸の場合、会合効率を決定する分析をアガロースゲル電気泳動により行った。
【００７７】
実施例３．ナノシステムの機能付与
開発したナノシステムを、表３に記載されるリガンドで機能付与した。上記開発されたナノシステムの特性評価を、機能付与されていないナノエマルジョンの場合と同様に、サイズ、分散、及び表面電荷の観点から行った（実施例１）。次に、続く手順を、４つの場合の調製タイプによって分類する。
【００７８】
３．１．ペプチドの脂質コンジュゲートによる機能付与、ＬＡＰＩ、ＵＲＯＧ及び（y）ＲＰＭ（Ｖ：ＳＭ：ＬＡＰＩ  １：０．１：０．０１、Ｏ：ＳＭ：ＵＲＯＧ  １：０．２：０．０１、及びＶ：ＳＭ：ＲＰＭ  １：０．１：０．０５）
ナノエマルジョンに対するこのリガンドの会合を、エタノール中に溶解した後の各誘導体の原液５０μＬを加えることによって行った（有機相に対して、ＬＡＰＩ及びＵＲＯＧの場合は１ｍｇ／ｍｌ又はＲＰＭの場合は０．５ｍｇ／ｍｌの濃度であり、次いで１ｍｌの水を撹拌しながら注入して、機能付与エマルジョンを得た）。
【００７９】
３．２．親水性ペプチド（ウログアニリン由来のカチオン性ペプチドＯ：ＳＭ：ＵＲＯＧＬｙｓ  １：０．２：０．０１、及びブラゼイン由来のペプチドＯ：ＳＭ：ＰＣ：ＢＲＡ  １：０．１：０．１：０．００５）による機能付与
両方のペプチドで機能付与を行うため、本発明者らは、予備形成した白色配合物（Ｏ：ＳＭ  １：０．２及びＯ：ＳＭ：ＰＣ  １：０．１：０．１）を用いて開始した。２００ｒｐｍで磁気撹拌しているこれらのナノエマルジョン１００μＬに、更に１００μＬのペプチド水溶液を徐々に滴加した。添加が完了すると、撹拌を２０分間維持し、予備形成したナノエマルジョンの表面へのペプチドの吸着を支援した。種々の濃度のペプチドを試験し、実施例１に記載したとおりに特性評価し、それらのコロイド安定性を２４時間で決定した。
【００８０】
３．３．ラクチゾールリガンドの脂質コンジュゲートよる機能付与（Ｏ：ＳＭ：ＬＡＣＴ  １：０．１：０．１）
ナノエマルジョンに対するこのリガンド（Ｃ１６〜Ｃ１８鎖に共有結合したラクチゾール）の会合を、１０ｍｇ／ｍｌの原液５０μＬを有機相（Ｏ：ＬＭ  １：０．１、エタノール５０μｌ中）に加えることで行い、次いで、これにＭｉｌｌｉ−Ｑ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）システム）を磁気撹拌下でＭｉｌｌｉ−Ｑ水１ｍｌを注入し、機能付与ナノエマルジョンを得た。
【００８１】
３．４．タンパク質による機能付与（インテグリンＶ：ＳＭ：ＩＮＴ  １：０．１：０．０１、及びレプチンＶ：ＳＭ：ＬＥＰＴ  １：０．１：０．０１）
両方のタンパク質で機能付与を行うため、本発明者らは、白色配合物（Ｖ：ＬＭ、１：０．１）を用いて開始した。第１の例では、磁気撹拌している予備形成ナノエマルジョン５０μＬに対し、インテグリン溶液２５μＬを添加し、第２の例では、その体積は、予備形成ナノエマルジョン及びレプチンについてそれぞれ１００μＬ及び５０μＬであった。
【００８２】
ＬＡＰＩ、ラクチゾール、及びＲＰＭの誘導体で機能付与されたナノエマルジョンの細胞内部移行と関連する結果は、図６、図７、図８、及び図１８に示され、ここでは、機能付与されているナノエマルジョンに対する受容体を発現する腫瘍細胞において、ナノシステムの強い蓄積を見ることができる。
【００８３】
実施例４．機能付与粒子に対する造影剤分子の会合
オレイン酸で被覆した疎水性超常磁性ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）をナノエマルジョン中に封入することを、実施例１に記載した方法に軽微な修正を行って実施した。８０ｍｇ／ｍＬの濃度でクロロホルムに溶解したＳＰＩＯＮ  １５μＬを有機相に加え、リガンドを含む、又は含まないナノエマルジョンの調製のために水に注入する前に氷浴中で５分間超音波処理した。懸濁液をオービタルシェーカーで１０分間撹拌した。最後に、それらのサイズ、ＰｄＩ及びゼータ電位に応じてナノエマルジョンを特性評価した。また、ＤＴＰＡ−ＰＥを、６８Ｇａによるナノエマルジョンのその後のマーキングのために加え、ＰＥＴにて可視化した。この場合、ＤＴＰＡ−ＰＥを、２０ｍｇ／ｍＬの濃度でエタノールに事前に溶解し、脂質（１．２５μＬ、２．５μＬ又は５μＬ）と共に、製造される前に有機相に組み込んだ。この有機相を水性媒質に注入すると、ナノエマルジョンが形成される。
【００８４】
この種の会合から導き出された結果は表６及び図５に示され、この図ではＳＰＩＯＮを組み込む上記ナノエマルジョンをエンドサイクルした（endocycled）細胞の画像を示す。
【００８５】
実施例５．薬物の封入
本実験の作業では、表４の治療分子を封入した。疎水性分子の封入のため、それらの溶液を有機溶媒、好ましくはエタノールに調製し、少量を脂質と共に、有機相に組み込み、ナノエマルジョンの事前の調製を行った。例えば、パクリタキセルの場合、ＤＭＳＯ中に４０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、有機相に１．２５μＬ（エタノール中の脂質１００μＬ）を加えた。配合物の特徴を表４に詳述する。ＨＰＬＣを用い、コロイド懸濁液中の薬物の濃度を決定した（実施例２）。
【００８６】
核酸の会合については、核酸は予備形成ナノエマルジョンと会合していた。例えば、表４に記載されるプトレシンナノエマルジョン（Ｖ：ＳＭ：Ｐ  １：０．１：０．１）の場合、磁気撹拌しているナノエマルジョン１００μＬに対してｐｍＣｈｅｒｒｙ（５μｇ）の溶液１００μＬである。２０分間のインキュベーションの後、ナノエマルジョンを特性評価した。アガロース電気泳動ゲルを用いることによって、先にナノエマルジョンに会合したｐＤＮＡに対応する泳動バンドの不在が観察されたため、その会合の有効性を確認した。該手法の検出限界を考慮すると、効率が９０％を超えると結論付けることができる。
【００８７】
実施例６．腫瘍細胞におけるバイオマーカーの発現
対象の幾つかのバイオマーカーの発現を、腫瘍細胞に対するナノエマルジョンの機能付与及び選択的方向について分析した（図１２）。一方で、腫瘍の組織及び健康なパラフィンの試料に対してＴＡＳ１Ｒ３の発現解析を行った。これを行うために、本発明者らは、パラフィン包埋された試料用の特定の抽出キット（ＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥキット、QIAGEN社）を使用して、それぞれ１４ミクロンの５つのパラフィン切片からＲＮＡ抽出を行った。その濃度を知るために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ機器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００Ｃ、Thermoscientific社）を使用した。これらのデータを用いて、各試料におけるＲＮＡ濃度の正規化を行い、合計２μｇをヌクレアーゼフリー水で１０μｌの最終容量にした。次いで、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Appliesbiosystems社）を使用し、ＲＮＡからｃＤＮＡへの経過のためにサーマルサイクラー（ｐｅｑ  ＳＴＡＲ  ９６ＨＰＬ、VWR（商標）社）を使用した。ｃＤＮＡを取得したら、Ｔａｓ１Ｒ３に特異的なプローブと共にＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘと一緒に混合を行った。ＧＡＰＤＨをコントロール又はハウスキーピングとして使用し、ポリメラーゼ連鎖反応をＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ−Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（AppliedBiosystems（商標）社）において実施した。
【００８８】
細胞培養物における発現の評価に関しては、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）から入手した幾つかの型の細胞系統を使用した。リンパ節由来の転移性結腸細胞（ＳＷ６２０、ＣＣＬ−２２７）、結腸直腸腺癌上皮細胞（ＳＷ４８０、ＣＣＬ−２２８及びＨＴ−２９、ＨＴＢ−３８）、肺癌上皮細胞（Ａ５４９、ＣＣＬ−１８５）及び肝臓転移性肺細胞（Ｈ１７５５、ＣＲＬ−５８９２）、膵臓癌細胞（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ＣＲＬ−１４２０）及び膠芽腫細胞（Ｕ１１８、ＨＴＢ−１５及びＵ８７ＭＧ、ＨＴＢ−１４）を使用した。ＳＷ６２０系統、ＳＷ４８０系統、Ａ５４９系統、Ｕ１１８系統及びＵ８７ＭＧ系統を、ＤＭＥＭ  ＨＧ培地（ダルベッコ改変イーグル培地−高グルコース、Sigma-Aldrich社）中で維持し、Ｈ１７５５系統を、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、LifeTecnologies社）中で維持し、両者ともウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ（商標）、LifeTecnologies社）が１０％まで補充され、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン、Sigma-Aldrich社）が１％まで補充されている。これらは全て、マイコプラズマについて検査した。
【００８９】
ＴＡＳ１Ｒ３の発現の定量的分析のために、培養物中の全ての細胞系統から抽出されたＲＮＡから出発して、逆転写酵素を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った（ＲＴ−ＰＣＲ）。最初に、細胞を定型的にトリプシン処理した後に、ノイバウエルチャンバーを使用してそれらの細胞を計数することで、各系統から５００万個の細胞を分離して、同等の細胞数から開始することができた。ＲＮＡ抽出を、抽出キット（ＧｅｎｅＪＥＴ  ＲＮＡ精製キット、ThermoScientic社）を使用して実施し、分析を前段落で説明されたのと同様に実施した。手順が完了すると、データを分析した。転移性起源の結腸直腸癌の細胞系統は、リンパ節（ＳＷ６２０）から単離され、ＴＡＳ１Ｒ３より大きな発現を示すものである。
【００９０】
免疫蛍光研究については、試験が行われる１日前に、８ウェルμ−チャンバー（ＰＬＣ３０１０８、SPL LifeSciences）又はカバーガラスに細胞を播種した。２４時間後、培養培地を吸引により除去し、１×ＰＢＳで洗浄し、室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒドによる細胞の固定を進めた。それらを１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞を室温にて１０分間０．２％ｔｒｉｔｏｎ  １００Ｘで透過処理した。ｔｒｉｔｏｎを洗浄した後、下記表に記載される一次抗体及び二次抗体と共に細胞をインキュベートした。
【００９１】
【表７】
2021510735.tif 000009
【００９２】
次いでＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ThermoFisher（商標）社）（１：１０００希釈）を加え、１時間インキュベートすることで、考えられる光劣化から蛍光体を保護した。インキュベート時間が経過したら、撹拌しながら再度１×ＰＢＳで３回洗浄した後に、μ−チャンバーの壁を取り外し、Ｍｏｗｉｏｌ封入剤（Calbiochem社）を適用し、試料上にカバースリップを置いた。それを暗所から遮って室温で一晩放置して乾燥させ、翌日、共焦点顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８（商標））で観察するまで−２０℃で貯蔵した。
【００９３】
実施例７．ナノエマルジョンと腫瘍細胞との相互作用及び会合分子の細胞内放出に関する研究
ナノエマルジョンと腫瘍細胞との相互作用を研究するため、エタノールに溶解した少量の蛍光色素（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ、ＤｉＤ又はＤｉＲ）をナノエマルジョンの形成後に有機相に加えて、蛍光エマルジョンを調製した。蛍光色素の割合を、０．００１重量％〜０．５重量％に設定した。例えば、０．１％Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄで調製されたＶ：ＳＭ  １：０．１ナノエマルジョンに対して８５％〜９５％の会合効率が達成された。いずれの培養培地にも蛍光体の放出が存在しないことが確認された（インキュベーションの４時間後、ＦＢＳで補足したＤＭＥＭでは３％未満、又は冷蔵庫に４日間保存した後で１０％未満）。ＧＦＰを発現させるため事前に形質転換された子宮内膜腫瘍細胞（ＨＥＣ１Ａ）及び結腸（ＳＷ４８０）とのナノエマルジョンの４時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。Ｍｏｗｉｏｌ（Calbiochem）で調製物をマウントした後、共焦点顕微鏡（共焦点Ｌｅｉｃａレーザー顕微鏡ＳＰ８（商標））下で観察した。図４に示すように、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ標識ナノエマルジョンに対応する赤色蛍光は、主に結腸細胞において細胞の細胞質で観察された。同様の実験を、ＤｉＤ標識ナノエマルジョンで行い、４時間に亘って種類の異なる腫瘍細胞（結腸、肺、前立腺及び膵臓）上でインキュベートしたところ、Ｖ：ＳＭ  １：０．１のナノエマルジョンが細胞内部にアクセスする能力が細胞系統タイプとは無関係に確認された（図４Ａ）。ナノエマルジョンの組成については、相互作用の程度を調節することを可能にする。例えば、０．０３％のＤｉＲ蛍光体を充填した中性（Ｖ：ＳＭ  １：０．１）及びカチオン性（Ｖ：ＳＭ：ＤＯＴＡＰ  １：０．１：０．１）のナノエマルジョンの細胞内部移行を比較すると、結腸細胞ＨＣＴ１１６における４時間のインキュベーションの後、正に帯電したナノエマルジョンの場合により強い蛍光強度が観察され、おそらくは、細胞膜との静電気的相互作用の確立に電荷が寄与していることに起因する。
【００９４】
一方、ナノエマルジョンは、標的細胞と相互作用し得るのみならず、結腸細胞における４時間のインキュベーションの後に、Ｃｙ５  Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１でマークが付けられた二本鎖で非特異的配列の細胞内部ヌクレオチド（ＧＵＣ  ＣＡＧ  ＵＵＵ  ＵＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＵＣＣ  ＣＵ）に会合した分子／薬物を輸送できることも確認された。
【００９５】
実施例８．機能付与ナノエマルジョンと標的受容体を発現する細胞との相互作用の研究
異なるリガンドによるナノエマルジョンの機能付与を、実施例３に記載されるとおりに行った。対象となる受容体を発現する細胞と相互作用するナノエマルジョンの能力の観点から機能付与の効果を研究するため、フローサイトメトリー及び共焦点顕微鏡法の手法を用いた。
【００９６】
図６は、３７℃で４時間のインキュベーションの後に内部移行したＮｉｌｅ  Ｒｅｄで充填されるナノエマルジョンに起因して陽性蛍光を示す細胞の数及びそれらの強度を決定するために、フローサイトメトリーで解析したＳＷ６２０細胞の分析によるデータを示す。分析を、ＰＢＳで細胞を十分に洗浄した後、次いで、通常のトリプシン処理のプロトコルに従って、その懸濁液を調製した後に行った。２４ウェルプレートに１ウェル当たり１０００００個の細胞を播き、ナノシステムを３７℃で４時間に亘って加えた。この時間の後、細胞を洗浄し、トリプシン処理して、室温にて５分間１５０ＲＣＦで遠心分離し（ＣｅｎｔｒｉｇｕｇａＳＬ  １６Ｒ、ローターＴＸ−４００、ThermoScientific（商標））、培地から細胞を分離した。吸引によって上清を除去し、ペレットを１×ＰＢＳで再懸濁し、特殊なサイトメトリーチューブに移した。１５０ＲＣＦで更に遠心分離した後、上清を吸引し、残ったペレットを容量５００μｌの０．４％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、細胞を付着させた。分析を、BectonDickinson（商標）のＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ  ｔｅａｍで行った。図６では、ＬＡＰＩで機能付与したナノエマルジョンがレプチン受容体を過剰発現する細胞でどれほど効果的に、より効率的に内部移行されるかを観察することができる。
【００９７】
ラクチゾールで機能付与されたナノエマルジョンの内部移行を研究するため、ＳＷ６２０細胞を使用し、共焦点顕微鏡法を用いた。これらの実験のために、８ウェルのμ−チャンバー（ＰＬＣ３０１０８、SPL LifeSciences社）に１ウェル当たり８００００個の細胞を播種した。２４時間後に細胞を、オレイン酸及びスフィンゴミエリン誘導体から調製された、ＮＢＤで標識され、更にＤｉＲが封入されたナノエマルジョン（ＯＬＭ；Ｏ：ＳＭ  １：０．１）及びラクチゾールで機能付与されたこれらの同じナノエマルジョン（ＯＬＭ−Ｌ；Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１）と一緒に、０．１２ｍｇ／ｍＬのナノエマルジョンのウェル中の最終濃度でインキュベートした。３７℃で４時間インキュベートした後に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した後に、ウェルを１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Thermo Fisher（商標）社）で染色した。封入剤（Ｍｏｗｉｏｌ、Calbiochem社）を適用し、試料を共焦点顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８（商標））下で観察した。類似の実験を実施し、この場合に、高濃度又は低濃度のグルコースを有する培地で培養されたため、実施例６に見られるように異なるレベルの受容体の発現を有するＳＷ６２０細胞における、ラクチゾールで機能付与され（Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１）、ＤｉＤで標識されたナノエマルジョンのインキュベート後の内部移行を比較した。図１１から分かるように、ラクチゾールのためのＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現が低いＳＷ６２０細胞でインキュベートした場合に、ナノエマルジョンによる蛍光強度が効果的に減少することが判明した。
【００９８】
同様の結果が、ＲＰＭを用いた機能付与ナノエマルジョンについて得られた（図８）。このより大きな内部移行は、実施例７で検討されているように、エトポシドを充填したナノエマルジョンＯ：ＳＭ：Ｌａｃｔ  １：０．１：０．１（Ｆ−ＮＥ）を用いた細胞生存率試験に関して、会合した細胞内治療分子を放出するためのより大きな有効性に関係する。同様に、図８はＣｙ５標識マイクロＲＮＡの観察を示し、該Ｃｙ５標識マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡがＣｙ５蛍光体でタグ付けされているＲＰＭで機能付与された、ビタミンＥ、スフィンゴミエリン及びオアクタデシルアミン（Ｖ：ＳＭ：ＯＣＴ  １：０．１：０．０１）のナノエマルジョン（ＶＳＭＳＴＲＰＭｍｉＲＮＡ）、並びにコントロールナノエマルジョン（ＳＭＳＴＳＨｍｉＲＮＡ）を用いて３７℃で４時間トランスフェクトされた後の細胞系統ＳＷ４８０及びＳＷ６２０において内部移行されている。共焦点顕微鏡法による蛍光の分析の後、細胞内レベルで会合した治療分子を放出する優れた能力を持つＲＰＭを有するナノエマルジョンについて、はるかに大きなシグナルが見られる。
【００９９】
実施例９．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ治療有効性アッセイ
細胞の生存率を判断するアッセイを使用して、残りの成分に対して１重量％のエトポシドを充填したナノエマルジョン１：０．１：０．１（Ｆ−ＮＥ）を、９６ウェルプレートに播いた（１ウェル当たり１００００細胞）。２４時間の培養後に、濃度の増加順に２０μｌの試験配合物を１１０μｌの培養培地に適用し、ナノシステムが溶解されるビヒクル（大部分の場合に水）を加えているポジティブコントロール及び６％のＴｒｉｔｏｎ  １００Ｘの希釈が適用されたネガティブコントロールすなわち全死滅を、コントロールとして設定した。４８時間後に、プレートの培養培地を吸引して、１×ＰＢＳで洗浄し、その後に、ＭＴＴ試薬を１×ＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍＬの濃度で、補充を有しないＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈した後に適用し、０．２２μｍフィルターで濾過した。１ウェル当たり１１０μｌを適用した。インキュベーター中で４時間後に、培地をプレートから除去し、１１０μｌの容量の１×ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、９９．７％、AcrosOrganics社）を添加して、ミトコンドリア酵素により生成されたホルマザン結晶を溶解させた。遮光して、プレートを３７℃で１５分間インキュベートした後に、分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸ、ThermoLabsystems（商標）社）において５７０ナノメートルで吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５プログラムを使用して各配合物のＥＣ５０値を取得した。抗腫瘍薬の封入のために、エトポシドを選択し、１３．７５μｌの４０ｍｇ／ｍＬの溶液（５５０μｇの薬物）を有機相に加えた。全てのナノエマルジョンを、１４０００×ｇ、１５℃で３０分間遠心分離（Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｒ、ローターＦ４５２４１１  Eppendorf（商標）社）することによって単離して、ナノエマルジョンの一部ではなく全てを排除した。図９Ａに示されるように、薬物のナノエマルジョンで処理された細胞の場合に（白色は殆ど活性を示さなかった）、特に機能付与されたナノエマルジョンの場合に、より大きな細胞傷害活性が観察された。
【０１００】
実施例１０．マウスモデルにおける治療有効性アッセイ
マウスモデルにおける有効性を判定するため、光学イメージングによる体内分布研究を最初に行った。ナノエマルジョンＯ：ＳＭ  １：０．１及びＯ：ＳＭ：ＵＲＯＧ  １：０．１：０．０１を、該ナノエマルジョンの調製後に有機相にＤｉＲを添加することで（０．１％）、標識した。これらのナノエマルジョンを体重約２５ｇ〜３０ｇの雌性ヌードマウスの尾静脈に静脈内注射し、事前に（生後６週齢〜８週齢）、両脇腹の細胞にＳＷ６２０（平均培養混合物：マトリゲル３：１で１００μｌ中５００万個；２週間で、ほとんどの腫瘍は触知可能であり、１５０ｍｍ３の平均体積を有する）を接種した。この実験の腫瘍の平均体積は５００ｍｍ３であった。ＤｉＲを充填した機能付与ナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ：ＵＲＯＧ  １：０．１：０．０１）を注射してから２４時間後、マウスを屠殺し、臓器を切除して、光学イメージング（ＩＶＩＳ（商標）イメージングシステムによって観察した。図１０Ａに示すように、蛍光は主に肝臓及び腫瘍において検出された。さらに、同一マウスモデルで治療有効性の試験を行った。腫瘍が平均体積２５０ｍｍ３に達すると、マウスを２群に分類し、そのうちの１群は治療を受けていないコントロールであり、もう１群はエトポシドを充填した機能付与ナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ：ＵＲＯＧ  １：０．１：０．０１）で治療された。全容量が１００μＬのナノエマルジョンの４回の注射を、１日目、４日目、８日目及び１１日目に尾静脈内に静脈内投与した（エトポシドの用量０．２ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍体積を経時的にモニターし、評価時間ごとに相対的な体積の増加を表した（Ｖｔ／Ｖｏ＝その時点での体積／研究開始時の体積）。研究期間中、毒性効果は認められなかった。図１０Ｂはまた、治療マウス群では腫瘍体積の増加がより小さいことを示し、新たな抗腫瘍療法の開発に対するこれらのナノエマルジョンの可能性を明らかにする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2021510735.tif 000021
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
2021510735.tif 000024
【図１４】
2021510735.tif 000025
【図１５−１】
2021510735.tif 000026
【図１５−２】
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【図１６−１】
2021510735.tif 000028
【図１６−２】
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【図１７】
2021510735.tif 000030
【配列表】
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【国際調査報告】
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