(57)【要約】  本発明は頻脈又は頻脈性不整脈の治療に使用される選択的ＰＤＥ２阻害剤である化合物を提供する。このような化合物は以下の症状、すなわち、心房頻脈、心房細動、心房粗動、発作性上室性頻脈、心室性期外収縮（ＰＶＣ）、心室細動及び心室頻脈のうちのいずれかの治療に使用することに特に適しており、且つ、単独で使用されても他の従来の心臓血管薬、例えばβ遮断薬との併用治療で使用されてもよい。具体的には、本発明は心不全、ＣＰＶＴ、又はＱＴ延長症候群に罹患している、又は罹患するリスクがある患者での心室頻脈の治療に使用される選択的ＰＤＥ２阻害剤である化合物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心室頻脈の治療又は予防に使用される選択的ＰＤＥ２阻害剤である化合物。
【請求項２】
前記化合物にＰＤＥ２（例えばヒトＰＤＥ２）活性の阻害について少なくとも１種類の他のＰＤＥタイプ（例えば少なくとも１種類の他のヒトＰＤＥタイプ）と比較して少なくとも１０倍の選択力がある、請求項１に記載される使用化合物。
【請求項３】
前記化合物にＰＤＥ２（例えばヒトＰＤＥ２）活性の阻害について他の全てのＰＤＥタイプ（例えば他の全てのヒトＰＤＥタイプ）と比較して少なくとも１０倍の選択力がある、請求項２に記載される使用化合物。
【請求項４】
前記選択力が少なくとも２０倍、好ましくは少なくとも３０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍である、請求項２又は請求項３に記載される使用化合物。
【請求項５】
前記化合物が約１００ｎＭ未満、好ましくは約５０ｎＭ未満、例えば約１０ｎＭ未満のＩＣ50値でＰＤＥ２、例えばヒトＰＤＥ２を阻害する、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載される使用化合物。
【請求項６】
前記化合物が以下の化合物、それらの薬学的に許容可能な塩、又はそれらのプロドラッグのうちのいずれかより選択される、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載される使用化合物。
【表１−１】
2021504466.tif 000011
【表１−２】
2021504466.tif 000012
【表１−３】
2021504466.tif 000013
【表１−４】
2021504466.tif 000014
【表１−５】
2021504466.tif 000015
【請求項７】
前記化合物がＴＡＫ−９１５（Ｎ−（（１Ｓ）−１−（３−フルオロ−４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−２−メトキシエチル）−７−メトキシ−２−オキソ−２，３−ジヒドロピリド［２，３−ｂ］ピラジン−４−（１Ｈ）−カルボキサミド）、ＮＤ−７００１（３−（８−メトキシ−１−メチル−２−オキソ−７−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］−［１，４］ジアゼピン−５−イル）ベンズアミド）、請求項６において規定されるＰＦ−０５１８０９９９又はＬｕ  ＡＦ６４２８０、及びそれらの薬学的に許容可能な塩、及びそれらのプロドラッグから選択される、請求項１に記載される使用化合物。
【請求項８】
前記化合物がＴＡＫ−９１５（Ｎ−（（１Ｓ）−１−（３−フルオロ−４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−２−メトキシエチル）−７−メトキシ−２−オキソ−２，３−ジヒドロピリド［２，３−ｂ］ピラジン−４−（１Ｈ）−カルボキサミド）又は請求項６において規定されるＰＦ−０５１８０９９９、又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである、請求項１に記載される使用化合物。
【請求項９】
前記化合物がＢＡＹ６０−７５５０（２−（３，４−ジメトキシベンジル）−７−［（２Ｒ，３Ｒ）−２−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン−３−イル］−５−メチルイミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４（３Ｈ）−オン）、ＮＤ−７００１（３−（８−メトキシ−１−メチル−２−オキソ−７−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］−［１，４］ジアゼピン−５−イル）ベンズアミド）、請求項６において規定されるＰＦ−０５１８０９９９、又は請求項６において規定されるＬｕ  ＡＦ６４２８０、又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグである、請求項１に記載される使用化合物。
【請求項１０】
以前に心筋梗塞に罹患したことがある対象、心不全を発症している対象、又は頻脈になりやすい対象、例えばカテコールアミン誘発性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）の遺伝的素因を有する対象の治療において使用される請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載される化合物。
【請求項１１】
心不全、ＣＰＶＴ、又はＱＴ延長症候群に罹患している、又は罹患するリスクがある対象の治療において使用される請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載される化合物。
【請求項１２】
前記対象が以下、すなわち
以前に心不整脈であると診断され、且つ／又は心不整脈の治療を受けている対象、例えばβ遮断薬などの不整脈治療薬による治療を受けている対象、
植え込み型除細動器（ＩＣＤ）を有する対象、及び
心不整脈の長期治療を受けている対象、例えば少なくとも６か月にわたってβ遮断薬による治療を受けている対象
のうちのいずれかより選択される、請求項１０又は請求項１１に記載される使用化合物。
【請求項１３】
前記対象が植え込み型除細動器（ＩＣＤ）を有しており、且つ、不整脈治療薬、例えばβ遮断薬による治療を受けている、請求項１２に記載される使用化合物。
【請求項１４】
前記β遮断薬がβ1選択性β遮断薬、例えばメトプロロールである、請求項１３に記載される使用化合物。
【請求項１５】
前記対象が哺乳類対象、好ましくはヒトである、請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載される使用化合物。
【請求項１６】
１種類以上の心臓血管薬、好ましくは高血圧、心不全、不整脈、及び／又は心筋梗塞後再灌流症候群の治療用の薬品であって、例えば以下の薬品、すなわち、β遮断薬、カルシウム拮抗薬、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴＩＩ／ブロッカー、及び不整脈治療薬のうちのいずれかより選択される前記薬品との併用治療において使用される請求項１〜請求項１５のいずれか一項に記載される化合物。
【請求項１７】
前記β遮断薬がβ1選択性β遮断薬、例えばメトプロロールである、請求項１６に記載される使用化合物。
【請求項１８】
請求項１〜請求項９のいずれか一項に規定される選択的ＰＤＥ２阻害剤を１種類以上の心臓血管薬、例えば不整脈治療薬と共に、且つ、所望により少なくとも１種類の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記不整脈治療薬がβ遮断薬、好ましくはβ1選択性β遮断薬、例えばメトプロロールである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
治療を必要とする対象（好ましくは哺乳類対象、例えばヒト）における心室頻脈の治療方法であって、請求項１〜請求項９のいずれか一項に規定される選択的ＰＤＥ２阻害剤、又は請求項１８若しくは請求項１９に記載の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記対象が以前に心筋梗塞に罹患したことがある、心不全を発症している、又は頻脈になりやすく、例えば前記対象がカテコールアミン誘発性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）の遺伝的素因を有する、請求項２０に記載される治療方法。
【請求項２２】
前記対象が心不全、ＣＰＶＴ、又はＱＴ延長症候群に罹患している、又は罹患するリスクを有する、請求項２０に記載される治療方法。
【請求項２３】
前記対象が以下、すなわち
以前に心不整脈であると診断され、且つ／又は心不整脈の治療を受けている対象、例えばβ遮断薬などの不整脈治療薬による治療を受けている対象、
植え込み型除細動器（ＩＣＤ）を有する対象、及び
心不整脈の長期治療を受けている対象、例えば少なくとも６か月にわたってβ遮断薬による治療を受けている対象
のうちのいずれかより選択される、請求項２０〜請求項２２のいずれか一項に記載される治療方法。
【請求項２４】
前記対象が植え込み型除細動器（ＩＣＤ）を有しており、且つ、不整脈治療薬、好ましくはβ遮断薬、例えばメトプロロールなどのβ1選択性β遮断薬による治療を受けている、請求項２３に記載される治療方法。
【請求項２５】
前記方法が１種類以上の心臓血管薬、好ましくは高血圧、心不全、不整脈、及び／又は心筋梗塞後再灌流症候群の治療用の薬品であって、例えば以下の薬品、すなわち、β遮断薬、カルシウム拮抗薬、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴＩＩ／ブロッカー、及び不整脈治療薬のうちのいずれかより選択される前記薬品を（例えば、同時に、別々に、又は連続して）前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項２０〜請求項２４のいずれか一項に記載される治療方法。
【請求項２６】
前記β遮断薬がβ1選択性β遮断薬、例えばメトプロロールである、請求項２５に記載される治療方法。
【請求項２７】
対象の心室頻脈の治療に使用される医薬品の製造における請求項１〜請求項９のいずれか一項に規定される選択的ＰＤＥ２阻害剤又は請求項１８若しくは請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２８】
前記対象が請求項２１〜請求項２４のいずれか一項に規定されるとおりである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記治療が１種類以上の心臓血管薬、好ましくは高血圧、心不全、不整脈、及び／又は心筋梗塞後再灌流症候群の治療用の薬品であって、例えば以下の薬品、すなわち、β遮断薬、カルシウム拮抗薬、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴＩＩ／ブロッカー、及び不整脈治療薬のうちのいずれかより選択される前記薬品の前記対象への（例えば、同時の、別々の、又は連続した）投与をさらに含む、請求項２７又は請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記β遮断薬がβ1選択性β遮断薬、例えばメトプロロールである、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して頻脈又は頻脈性不整脈の治療及び／又は予防に関する。具体的には、本発明はそのような症状、特に心室頻脈の治療法及び／又は予防法におけるホスホジエステラーゼ２（ＰＤＥ２）阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不整脈は心臓リズムが異常で速すぎるか遅すぎるかのどちらかである一群の症状である。速すぎる心拍数は成人では毎分１００回を超えることが典型であり、「頻脈」として知られており、遅すぎる心拍数は毎分６０回未満であることが典型であり、「徐脈」として知られている。正常心臓リズムの異常に関連する頻脈は「頻脈性不整脈」として知られる場合がある。しかしながら、「頻脈」及び「頻脈性不整脈」という用語は当技術分野では互換的に使用されることが多く、実用的には心拍数の増加に関連するあらゆる心臓リズム障害を説明するために臨床医によって使用される場合がある。多くの不整脈は深刻ではないが、中にはその対象を心不全、心臓発作、又は心停止などの合併症にかかりやすくするものもある。
【０００３】
不整脈は刺激生成異常（自動能の上昇及び活動の誘発）、刺激伝導異常（リエントリー機構）、及び心臓電気刺激伝導系関連の問題に起因して生じる。不整脈は二軸に従って、すなわち遅いか速いか（徐脈であるか頻脈であるか）及び心房性であるか心室性であるかで分類され得る。
【０００４】
上室性頻脈には心房頻脈、心房細動、心房粗動、及び発作性上室性頻脈が含まれる。心室頻脈性不整脈には心室性期外収縮（ＰＶＣ）、心室細動、及び心室頻脈が含まれる。心室頻脈は心室での誤った電気的活動より生じる多くの場合に心拍数が規則的で速いタイプの頻脈である。心室頻脈は心筋梗塞時又は心筋梗塞後に、心不全又は心肥大時に、心筋症時に、又は構造的に正常な心臓に生じる場合があり、結果として心停止を引き起こす可能性がある。
【０００５】
頻脈を含む大半の不整脈は薬品を用いて、ペースメーカーなどの医療手技を用いて、又は手術（例えばアブレーション）によって効果的に治療可能である。心室頻脈性不整脈向けの現行の薬理学的治療戦略にはβアドレナリン作動性受容体の遮断薬並びにＣａ2+チャネル、Ｎａ+チャネル、及びＫ+チャネルの遮断薬等が含まれる。しかしながら、これらの薬剤は心室頻脈性不整脈の患者には最適治療にもかかわらず無効果であると判明することが多い。β遮断薬の最適投与は副作用（例えば徐脈、低血圧、疲労等）のために制限されることが多く、一方でＣａ2+遮断薬は収縮能に対する負の効果のために心不全時には一般に使用されない。特にＮａ+遮断薬と一部のＫ+遮断薬も不整脈誘発性作用のために構造的心疾患を有する患者には禁忌とされている（Ｐｒｉｏｒｉ，  Ｓ．Ｇ．ら著、心室性不整脈患者の管理と心臓突然死の予防に関するＥＳＣガイドライン２０１５年版、欧州心臓病学会（ＥＳＣ）心室性不整脈患者の管理と心臓突然死の予防に関する特別委員会編、欧州小児先天性心疾患学会（ＡＥＰＣ）承認、Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ誌、２０１５年、第３６巻（第４１号）：２７９３〜８６７頁、及びＡｌ−Ｋｈａｔｉｂら著、ＡＨＡガイドライン、２０１７年）。
【０００６】
メトプロロールなどのβ遮断薬は心室頻脈を含む大半の種類の頻脈性不整脈の標準治療である。深刻な（致命的であり得る）心臓リズム異常（心室頻脈、発作性上室性頻脈、及び心房細動等）の治療に使用される他の薬品にはプロパフェノン塩酸塩（リスモル）が挙げられる。これは正常な心臓リズムを復元し、且つ、規則的で安定した心拍を維持するために使用される。プロパフェノンは局所的麻酔作用と心筋膜に対する直接的安定化作用を有するクラス１Ｃ不整脈治療薬である。リスモルに付随する悪性副作用は胃腸管系、心血管系、及び中枢神経系において最も頻繁に生じる。有害反応のために患者の約２０％においてリスモルによる治療を中止する必要がある。
【０００７】
したがって、頻脈、特に心室頻脈の治療又は予防のための新しい薬品の必要性が残されている。我々は本明細書においてＰＤＥ２の阻害によるＮａ+／Ｋ+−ＡＴＰアーゼ（ナトリウムカリウムアデノシントリホスファターゼ又は「ＮＫＡ」、Ｎａ+／Ｋ+ポンプ又はナトリウム・カリウムポンプとしても知られれる）の局所的及び選択的活性化をこのような障害の新規治療戦略として提唱する。この機序はβアドレナリン作動性受容体、カルシウムチャネル、Ｎａ+チャネル、又はＫ+チャネルを標的とすることにより心室頻脈を治療するために使用されるβ遮断薬及びクラス１不整脈治療薬などの従来の薬品の機序と異なる。
【０００８】
ＰＤＥ２は哺乳類動物にみられる多種多様なホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のうちの１つである。ＰＤＥ酵素ファミリーは加水分解による制御を介して二次伝達物質である環状ヌクレオチドｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰの細胞内レベルを調節する。これらの環状ヌクレオチドは全ての哺乳類細胞で細胞内シグナル伝達分子として機能する。ＰＤＥ酵素はホスホジエステル結合を切断することによりｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰを加水分解して対応するモノリン酸体を形成する。
【０００９】
種々のＰＤＥが基質特異性、阻害剤感受性、及びさらに近年になって配列相同性に基づいて１１ファミリー（ＰＤＥ１からＰＤＥ１１）に細分されている。これらの１１ファミリーは２１遺伝子によってコードされ、幾つかのファミリーに複数のメンバーが含まれることになる。同じファミリーのＰＤＥは機能的に関連がある。ＰＤＥは異なる基質特異性を有し、幾つかのものはｃＡＭＰ選択的加水分解酵素であり（ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、及びＰＤＥ８）、他のものはｃＧＭＰ選択的加水分解酵素である（ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、及びＰＤＥ９）。ＰＤＥ２を含むその他のものはｃＡＭＰとｃＧＭＰの両方の加水分解を行う二重基質ＰＤＥである。
【００１０】
幾つかのＰＤＥ阻害剤、具体的にはＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＰＤＥ５阻害剤は臨床使用について承認されている。ミルリノンなどのＰＤＥ３阻害剤は心臓血管治療に使用される。ＰＤＥ２は脳において最も高い発現を示すが他の組織にも認められる。ＰＤＥ２の阻害によってｃＡＭＰレベルとｃＧＭＰレベルの上昇が引き起こされ、これが認知機能を改善する可能性がある。現在までにＰＤＥ２阻害剤は主に様々な認知障害、例えば神経発生、学習、及び記憶に関する障害の治療、神経障害及び認知症、アルツハイマー病などの神経変性障害の治療等での使用についての文献で文書化されてきた。幾つかのＰＤＥ２阻害剤は認知障害について第Ｉ相治験を受け、それらの阻害剤にはＴＡＫ−９１５（武田薬品）、ＮＤ−７００１（Ｎｅｕｒｏ３ｄ／Ｅｖｏｔｅｃ）、及びＰＦ−０５１８０９９９（ファイザー）が含まれる。例えば、Ｍｉｋａｍｉら著、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．誌、２０１７年、第６０巻（第１８号）：７６７７〜７７０２頁においてＴＡＫ−９１５の経口投与がマウスの脳において３’，５’−環状グアノシンモノリン酸（ｃＧＭＰ）レベルを上昇させること、及びラットにおいて認知パフォーマンスを改善することが示されている。これらの研究の結果としてこの化合物はヒト治験に進んだ。
【００１１】
ＰＤＥ２阻害剤について記述している他の文献には欧州特許出願公開第３０２６０５１号明細書、国際公開第２００５／０２１０３７号パンフレット及び国際公開第２０１２／１６８８１７号パンフレットが挙げられる。欧州特許出願公開第３０２６０５１号明細書では前記化合物がＰＤＥ２Ａ阻害活性を有しており、精神分裂病、アルツハイマー病等の予防薬又は治療薬として有用であることが示唆されている。国際公開第２００５／０２１０３７号パンフレットでは公知のＰＤＥ２阻害剤が肺病変、具体的にはＡＲＤＳ（成人呼吸促迫症候群）、ＩＲＤＳ（新生児呼吸窮迫症候群）、ＡＬＩ（急性肺障害）、及び気管支喘息の治療に使用される公知の肺サーファクタントと組み合わせられている。国際公開第２０１２／１６８８１７号パンフレットでは様々な化合物をＰＤＥ２阻害剤及び／又はＣＹＰ３Ａ４阻害剤として使用することについて記載されており、且つ、中枢神経系障害、認知障害、精神分裂病、及び認知症の治療に使用することが提唱されている。これらの文献の中にはいずれかのＰＤＥ２阻害剤をいずれかの心臓関連障害の治療に使用することを提唱しているものはない。
【００１２】
ＰＤＥ２は心臓組織でも発現しており、裏付けられてはいないが心不整脈の治療又は予防にＰＤＥ２阻害剤を使用することに関して幾らか考察されている（例えば国際公開第２００６／０７２６１２号パンフレット、国際公開第２００４／０８９９５３号パンフレット、国際公開第２０１６／０７３４２４号パンフレット及び国際公開第２００６／０２４６４０号パンフレットを参照されたい）。例えば、国際公開第２００４／０８９９５３号パンフレットと国際公開第２００６／０２４６４０号パンフレットは、肺炎、関節炎、網膜盲、アルツハイマー病等を含む極めて広範囲の症状の治療又は予防に有効であり得ると主張されている新規ＰＤＥ２阻害剤に関する。心筋でＰＤＥ２が見られることに基づくと、これらの文献は前記化合物が「心不整脈」の防止能力を有し得ることを提唱しているが、これを裏付ける証拠はない。これらの文献において開示されている前記化合物が心室頻脈はもちろんのこと、あらゆる特定の分類の心不整脈の治療又は予防に適切であり得るか示唆するものもない。こうした背景に反し、これらのＰＤＥ２阻害剤が本明細書において明示されるように頻脈の治療に必然的に適していることを予測できていなかった。
【００１３】
「心不整脈」という用語により異なる治療アプローチを必要とする一連の様々な心臓リズム障害が広く定義される。不整脈の発生源（心房性か心室性か）と種類（頻脈性不整脈か徐脈性不整脈か）の両方を治療開始前に決定することが重要である。心房性不整脈は心室性不整脈と完全に異なる方法で治療されることが多い。例えば、アデノシンと強心配糖体（例えばジゴキシン）が様々な心房性不整脈の治療のために使用されるが、これらは心室性不整脈を誘発又は悪化させる可能性がある。同様に、頻脈性不整脈に適切な治療法は徐脈性不整脈の場合には概して禁忌である。例えば、メトプロロールなどのβ遮断薬は頻脈性不整脈の治療法であるが徐脈性不整脈の原因となる。したがって、β遮断薬（例えばメトプロロール）は全ての種類の徐脈性不整脈には禁忌である。不整脈の治療は潜在的な原因又は基礎的な症状にも左右され得る。心不全時又は心筋梗塞後の心室頻脈性不整脈の治療はＣＰＶＴ及びＱＴ延長症候群などの遺伝疾患での心室頻脈性不整脈の治療とは異なる。例えば、フレカイニド（クラス１不整脈治療薬であるＮａ+チャネル遮断薬）はＣＰＶＴ及びＱＴ延長症候群で一般的に使用されるが、心不全時及び心筋梗塞後には禁忌である。したがって、心不整脈は発生源と種類に応じて異なる治療アプローチを必要とする異なるグループに分類され得る。「心不整脈」の治療全般への言及はどの種類の不整脈が治療される可能性があるのか示唆するには充分ではない。
【００１４】
先行技術文献とは対照的に本発明は頻脈の治療又は予防、特に心室頻脈の治療又は予防に関連する。他の技術文献の教示は本明細書において提示される知見とは肯定的な意味で異なっている。例えば、Ｖｅｔｔｅｌ，  Ｃ．ら（Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ誌、２０１７年、第１２０巻（第１号）：１２０〜１３２頁）はＰＤＥ２量が多くなるほど不整脈から防護され、且つ、重篤な虚血発作後の心筋収縮力が改善されることを示唆している。したがって、これらの文献は不整脈と心収縮不全から心臓を防護するための治療戦略としてのＰＤＥ２の活性化を提唱している。さらに国際公開第２００５／０３５５０５号パンフレットはＰＤＥ阻害剤が心拍数を上昇させ、且つ、不整脈の原因にすらなり得ることに留意を促している。これは頻脈の治療でのＰＤＥ２阻害剤の使用を支持する本明細書において提示される我々の知見とは反対である。
【００１５】
数種類の不整脈の重要な上流寄与因子としてＮＫＡ活性の低下が特定されているが（Ｆａｇｇｉｏｎｉ，  Ｍ．及びＢ．Ｃ．  Ｋｎｏｌｌｍａｎｎ著、Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｙｐｏｋａｌｅｍｉａ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃａ２＋−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋ＋  Ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ誌、２０１５年、第１３２巻（第１５号）：１３７１〜３頁）、我々の知る限りではＮＫＡの特異的活性化因子は存在しない。本明細書において提示される知見よりＰＤＥ２阻害が強力にＮＫＡを活性化し、且つ、心不全及び遺伝性不整脈症候群のマウス（一種のＱＴ延長症候群のアンキリン+/-マウス、及びカテコールアミン誘発性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）マウス）において心室頻脈性不整脈を防止することが示される。不整脈を防止するＰＤＥ２阻害の能力は、ＡＫＡＰからＲＩＩ−ＰＫＡを脱離させる高い特異性を有するペプチドであるｓｕｐｅｒＡＫＡＰの添加によって低下した。このことは、ｓｕｐｅｒＡＫＡＰがＮＫＡ電流に対するＰＤＥ２阻害の効果を無効にすることを示すデータと共に、ＰＤＥ２がＮＫＡを調節し、且つ、局所領域におけるｃＡＭＰレベルを調節することにより心室頻脈性不整脈を防止することを示唆している。
【００１６】
本明細書において記載される抗不整脈治療法としてのＰＤＥ２阻害は２つの点、すなわち（１）ＮＫＡの活性化因子としての点、及び（２）個々の領域でのｃＡＭＰレベルを標的とすることによるという点で新しい治療戦略である。本明細書に付随している実施例において提示されるデータより、我々が心筋細胞特異的細胞核におけるＰＤＥ２のｍＲＮＡの発現上昇を見出したようにヒトの臓器肥大と加齢でＰＤＥ２が上方制御されることも示唆されている。これは以前のデータ（Ｍｅｈｅｌ，  Ｈ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−２  ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｅａｒｔｓ  ａｎｄ  ｂｌｕｎｔｓ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ誌、２０１３年、第６２巻（第１７号）：１５９６〜６０６頁）と合っており、ＰＤＥ２阻害がヒト慢性心臓疾患における望ましい抗不整脈標的であり得ることを示している。
【００１７】
我々は、頻脈の治療及び／又は予防、特に心室頻脈の治療及び／又は予防のための新規治療戦略、すなわちＰＤＥ２阻害を本明細書において報告する。具体的に我々は、ＮＫＡ及びＰＫＡ−ＲＩＩとの相互作用を介してＮＫＡ活性がＰＤＥ２によって局所的に調節される新規ＮＫＡ調節機構を見出した。我々は、理論に捉われることを望むものではないが、抗心不全、アンキリンＢ+/-マウス、及びＣＰＶＴに関してインビボと単離心室筋細胞の両方において見られる不整脈作用の根底にこの機構が存在することを提唱する。このことは、主にＮＣＸを介したＣａ2+放出の増加（ＮＫＡ活性上昇の下流効果）により細胞内Ｃａ2+負荷がＰＤＥ２阻害によって減少するという知見、及びその領域のＡＫＡＰ結合ＰＫＡ−ＲＩＩを分断するｓｕｐｅｒＡＫＡＰによって抗不整脈作用がインビボで消失することから裏付けられている。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は対象の頻脈又は頻脈性不整脈の治療に使用される選択的ＰＤＥ２阻害剤を提供する。
【００１９】
本発明は、治療を必要とする対象における頻脈又は頻脈性不整脈の治療方法であって、選択的ＰＤＥ２阻害剤の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む前記方法をさらに提供する。
【００２０】
本発明は、対象の頻脈又は頻脈性不整脈の治療に使用される医薬品の製造における選択的ＰＤＥ２阻害剤の使用をさらに提供する。
【００２１】
本発明は、（ｉ）選択的ＰＤＥ２阻害剤又は選択的ＰＤＥ２阻害剤を含む医薬組成物、及び（ｉｉ）対象の頻脈又は頻脈性不整脈の治療における（ｉ）の使用に関する指示書及び／又はラベルを含むパッケージも提供する。
【００２２】
本発明は、治療を必要とする対象における頻脈又は頻脈性不整脈の治療のための併用治療方法であって、選択的ＰＤＥ２阻害剤の治療有効量と同時又は別々に（例えば連続して）１種類以上の心臓血管薬、例えば不整脈治療薬を前記対象に投与する工程を含む前記方法をさらに提供する。
【００２３】
本発明は、選択的ＰＤＥ２阻害剤と１種類以上の心臓血管薬、例えば不整脈治療薬を所望により少なくとも１種類の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物も提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は対象の頻脈又は頻脈性不整脈の治療に使用される選択的ＰＤＥ２阻害剤を提供する。本明細書において定義される場合、「治療」には予防的治療、すなわち予防も含まれる。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「頻脈」という用語は心拍数の増加、すなわち速すぎる心拍のことを指す。典型的には、この用語は成人では毎分１００回を超える心拍数のことを指す場合がある。「頻脈性不整脈」という用語は正常心臓リズムの異常（すなわち心臓リズム異常）に関連する頻脈のことを指す。幾つかの事例ではこれらの用語は心拍数の増加に関連するあらゆる心臓リズム障害を説明するために当技術分野において互換的に使用される場合もある。
【００２６】
本発明は特に心室頻脈の治療及び／又は予防、例えば心室頻脈を予防するための治療に関する。本明細書において使用される場合、「心室頻脈」という用語は心室で始まり、且つ、心臓の電気系の機能不全によって引き起こされる異常で非常に速い心臓リズムのことを指す。さらに具体的には、この用語は両心室より発生する一度に少なくとも３回連続する異常心拍を含む毎分１００回を超える心拍数のことを指す。
【００２７】
一実施形態では本発明は、副作用が少ない心室頻脈の治療又は予防に関する。副作用の減少には以下の有害事象、すなわち、疲労、めまい、運動耐性の低下、徐脈、吐き気、下痢、心不全の悪化、頭痛、肺毒性（間質性肺炎、急性呼吸窮迫症候群、びまん性肺胞出血）、甲状腺機能不全、肝毒性、眼症状、及びＱＴ延長症のうちの１種類以上の減少が含まれるがこれらに限定されない。
【００２８】
本発明において使用される前記化合物は本明細書において規定されるように選択的ＰＤＥ２阻害剤、好ましくは選択的ヒトＰＤＥ２阻害剤である。「ＰＤＥ２阻害剤」はホスホジエステラーゼ２（ＰＤＥ２）の分解作用を阻害する効果を有するあらゆる化合物である。「ヒトＰＤＥ２阻害剤」はこれに従って解釈されるべきである。１つの実施形態では本発明において使用される前記化合物は選択的ＰＤＥ２Ａ阻害剤、例えば選択的ヒトＰＤＥ２Ａ阻害剤である。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「選択的ＰＤＥ２阻害剤」という用語は他のＰＤＥタイプよりも選択的にＰＤＥ２を阻害する化合物、すなわち他のＰＤＥタイプ、具体的には次のＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５、及びＰＤＥ１０のうちの１種類以上よりもＰＤＥ２を強力に阻害する化合物のことを指す。具体的には、この化合物はＰＤＥ１０を阻害するよりも強力にＰＤＥ２を阻害し得る。さらに具体的には、この化合物は他の全てのＰＤＥタイプを阻害するよりも強力にＰＤＥ２を阻害し得る。
【００３０】
本発明において使用されることが好ましい化合物は選択的ヒトＰＤＥ２阻害剤である化合物、すなわち他のヒトＰＤＥタイプよりもヒトＰＤＥ２を選択的に阻害する化合物、例えば次のヒトＰＤＥ１、ヒトＰＤＥ３、ヒトＰＤＥ４、ヒトＰＤＥ５、及びヒトＰＤＥ１０のうちの１種類以上よりもヒトＰＤＥ２を強力に阻害する化合物である。具体的には、この化合物はヒトＰＤＥ１０を阻害するよりも強力にヒトＰＤＥ２を阻害し得る。さらに具体的には、この化合物は他の全てのヒトＰＤＥタイプを阻害するよりも強力にヒトＰＤＥ２を阻害し得る。
【００３１】
本発明において使用されるＰＤＥ２阻害剤にはＰＤＥ２（例えばヒトＰＤＥ２）活性の阻害について少なくとも１種類の他のＰＤＥタイプ（例えばヒトＰＤＥタイプ）と比較して、好ましくはＰＤＥ１０（例えばヒトＰＤＥ１０）と比較して、例えば他の全てのＰＤＥタイプ（例えば他の全てのヒトＰＤＥタイプ）と比較して少なくとも１０倍の選択力があってよい。幾つかの実施形態では（例えば他の全てのＰＤＥタイプ又は他の全てのヒトＰＤＥタイプと比較した）選択力の程度が少なくとも２０倍、例えば少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍になる。他の実施形態では（例えば他の全てのＰＤＥタイプ又は他の全てのヒトＰＤＥタイプと比較した）選択力の程度が少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍であってよい。
【００３２】
本発明において使用されるＰＤＥ２活性の阻害剤は、通常、約１００ｎＭ未満、好ましくは約５０ｎＭ未満、例えば約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、又は約１０ｎＭ未満のＩＣ50値（基質の加水分解を５０％阻害する濃度）でＰＤＥ２、例えばヒトＰＤＥ２を阻害することになる。幾つかの実施形態では前記化合物は５ｎＭ未満又は１ｎＭ未満のＩＣ50値でＰＤＥ２、例えばヒトＰＤＥ２を阻害してよい。ＰＤＥ活性の測定方法とＩＣ50値の決定方法はよく知られており、当技術分野において、例えば、参照により内容全体を本明細書に援用するＷｅｅｋｓら著、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｉｍｐｏｔ．  Ｒｅｓ．誌、第１７巻：５〜９頁、２００５年、及びＳｏｕｎｅｓｓら著、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ誌、第１１８巻：６４９〜６５８頁、１９９６年に記載されている。
【００３３】
多岐にわたるＰＤＥ２阻害剤が知られており、それらの製造方法と共に文献及び先行特許出願公開に記載されている。本発明では所望のＰＤＥ２阻害活性を有するどの化合物を使用してもよく、参照により内容全体を本明細書に援用する以下の刊行物、すなわちＢｏｅｓｓら（Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ誌、第４７巻：１０８１〜１０９２頁、２００４年）、Ｍａｅｈａｒａら（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ誌、第８１１巻：１１０〜１１６頁、２０１７年）、Ｇｏｍｅｚら（Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．誌、第６０巻：２０３７〜２０５１頁、２０１７年）、及びＲｏｍｂｏｕｔｓら（ＡＣＳ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．誌、第６巻：２８２〜２８６頁、２０１５年）のうちのいずれかに記載されるアッセイなど、当技術分野においてよく知られているＰＤＥ阻害アッセイと選択性アッセイを用いてそのような化合物を容易に決定することができる。
【００３４】
本発明において使用するのに適切なＰＤＥ２阻害剤の例には参照により内容全体を本明細書に援用する以下の文書、すなわち、Ｔｒａｂａｎｃｏら著、Ｔｏｗａｒｄｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２Ａ  （ＰＤＥ２Ａ）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ  ｐａｔｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗ  （２０１０  −  ｐｒｅｓｅｎｔ）、  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ誌、第２６巻（第８号）：９３３〜９４６頁、２０１６年、国際公開第２００２／０５００７８号パンフレット（バイエル）、国際公開第２００４／０８９９５３号パンフレット（アルタナファーマ社）、国際公開第２００６／０２４６４０号パンフレット（アルタナファーマ社）、国際公開第２００６／０７２６１２号パンフレット（アルタナファーマ社）、国際公開第２００６／０７２６１５号パンフレット（アルタナファーマ社）、国際公開第２００４／４１２５８号パンフレット（Ｎｅｕｒｏ３ｄ）、欧州特許出願公開第１５４８０１１号明細書（Ｎｅｕｒｏ３ｄ）、欧州特許出願公開第１７４９８２４号明細書（Ｎｅｕｒｏ３ｄ）、国際公開第２００５／０４１９５７号パンフレット（ファイザー・プロダクツ社）、国際公開第２００５／０６１４９７号パンフレット（ファイザー・プロダクツ社）、国際公開第２０１０／０５４２５３号パンフレット（バイオティー・セラピース社及びワイス）、国際公開第２０１２／１０４２９３号パンフレット（ベーリンガーインゲルハイム・インターナショナル社）、国際公開第２０１４／０１９９７９号パンフレット（ベーリンガーインゲルハイム・インターナショナル社）、国際公開第２０１３／０００９２４号パンフレット（ヤンセンファーマ社）、米国特許出願公開第２０１２／０２１４７９１号明細書（ファイザー）、国際公開第２０１２／１６８８１７号パンフレット（ファイザー）、国際公開第２０１４／０１０７３２号パンフレット（武田薬品）、欧州特許出願公開第３０２６０５１号明細書（武田薬品）、国際公開第２００５／０２１０３７号パンフレット（ファイザー）、Ｍｉｋａｍｉら著、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．誌、第６０巻：７６７７〜７７０２頁、２０１７年、Ｍｉｋａｍｉら著、Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．誌、第６５巻（第１１号）：１０５８〜１０７７頁、２０１７年、Ｍａｓｏｏｄら著、ＪＰＥＴ誌、第３３１巻（第２号）：６９０〜６９９頁、２００９年、Ｇｏｍｅｚら著、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．誌、第２３巻：６５２２〜６５２７頁、２０１３年、Ｍａｅｈａｒａら著、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ誌、第８１１巻：１１０〜１１６頁、２０１７年、Ｇｏｍｅｚら著、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．誌、第６０巻：２０３７〜２０５１頁、２０１７年、Ｒｏｍｂｏｕｔｓら著、ＡＣＳ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．誌、第６巻：２８２〜２８６頁、２０１５年、Ｒｅｄｒｏｂｅら著、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ誌、第２３１巻：３１５１〜３１６７頁、２０１４年、及びＢｕｉｊｎｓｔｅｒｓら著、ＡＣＳ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．誌、第５巻：１０４９〜１０５３頁、２０１４年のうちのいずれかに記載される阻害剤が含まれる。あらゆるこのような化合物の薬学的に許容可能な塩又はプロドラッグも使用可能である。
【００３５】
本発明において使用される選択的ＰＤＥ２阻害剤の具体例には以下の化合物、それらの薬学的に許容可能な塩及びプロドラッグが含まれる。
【００３６】
【表１−１】
2021504466.tif 000002
【表１−２】
2021504466.tif 000003
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【００３７】
本発明において使用することが好ましいものは以下の選択的ＰＤＥ２阻害剤、すなわちＴＡＫ−９１５、ＮＤ−７００１、ＰＦ−０５１８０９９９、Ｌｕ  ＡＦ６４２８０、及びそれらの薬学的に許容可能な塩又はプロドラッグである。本発明において使用することが特に好ましいものはＰＦ−０５１８０９９９、ＴＡＫ−９１５、それらの薬学的に許容可能な塩、及びそれらのプロドラッグである。
【００３８】
このような化合物のＰＤＥ阻害活性は、参照により内容全体を本明細書に援用する以下の文書、すなわち、Ｂｏｅｓｓら著、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ誌、第４７巻：１０８１〜１０９２頁、２００４年、Ｍａｅｈａｒａら著、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ誌、第８１１巻：１１０〜１１６頁、２０１７年、Ｇｏｍｅｚら著、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．誌、第６０巻：２０３７〜２０５１頁、２０１７年、Ｒｏｍｂｏｕｔｓら著、ＡＣＳ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．誌、第６巻：２８２〜２８６頁、２０１５年、及びＲｅｄｒｏｂｅら著、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ誌、第２３１巻：３１５１〜３１６７頁、２０１４年のうちのいずれかに記載される方法を含む当技術分野において公知の方法により試験され得る。様々なＰＤＥに対する化合物の特異性の決定には特定のＰＤＥファミリーを単離し、ｃＧＭＰ／ｃＡＭＰの分解に関するＰＤＥ活性を測定し、そして当該化合物その活性を阻害する程度を調べるアッセイが含まれる場合がある。
【００３９】
本明細書において記載される前記ＰＤＥ２阻害剤化合物のうちのいずれも薬学的に許容可能な塩の形で使用され得る。「薬学的に許容可能な塩」という用語は本明細書において使用される場合に本明細書において記載される前記化合物のうちのいずれかのあらゆる薬学的に許容可能な有機塩又は無機塩を指す。薬学的に許容可能な塩は対イオンなどの１種類以上の追加分子を含む場合がある。これらの対イオンは親化合物の電荷を安定させるあらゆる有機基又は無機基であってよい。
【００４０】
本発明において使用される前記ＰＤＥ２阻害剤化合物が塩基である場合に適切な薬学的に許容可能な塩は有機酸又は無機酸とこの遊離塩基の反応によって調製され得る。この目的のために使用され得る酸の非限定的な例には塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、及びアスコルビン酸が挙げられる。本発明において使用される前記ＰＤＥ２阻害剤化合物が酸である場合に適切な薬学的に許容可能な塩は有機塩基又は無機塩基とのこの遊離酸の反応によって調製され得る。この目的のために適切であり得る塩基の非限定的な例にはアルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、又は水酸化セシウム、アンモニア、並びにジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、及びジシクロヘキシルアミンなどの有機アミンが挙げられる。塩形成のための手法は当技術分野において常用されている。
【００４１】
適切な塩の例には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、及びスルホン酸、例えばメタンスルホン酸との塩が挙げられる。他の適切な塩には酢酸塩、クエン酸塩、及びフマル酸塩などの有機塩が挙げられる。
【００４２】
代わりに、本明細書において記載される前記ＰＤＥ２阻害剤化合物のうちのいずれもプロドラッグの形で提供され得る。「プロドラッグ」という用語は使用条件下で、例えば体内において変換を起こして活性薬品を放出する活性化合物の誘導体のことを指す。プロドラッグは、必ずというわけではないが、この活性薬品に変換されるまで薬学的に不活性であってよい。本明細書において使用される場合、「プロドラッグ」という用語は本明細書において記載される前記活性ＰＤＥ２阻害剤化合物のうちのいずれかに生理的条件下で変換されるあらゆる化合物にまで及ぶ。適切なプロドラッグには生理的条件下で前記所望のＰＤＥ２阻害剤に加水分解される化合物が含まれる。
【００４３】
通常、プロ基を使用して活性のために少なくとも部分的に必要であると考えられる親分子内の１つ以上の官能基をマスクすることによりプロドラッグを得ることができる。本明細書において使用される「プロ基」は、活性薬品内の官能基をマスクするために使用され、且つ、官能基を脱離させて前記活性薬品を提供するために特定の使用条件下（例えば、体にへの投与）で切断などの変換を起こす基を意味する。通常、プロ基は使用条件下、例えばインビボで切断可能な結合又は複数の結合を介してこの活性薬品の官能基に結合している。このプロ基の切断は使用条件下で自然に、例えば加水分解により起こる場合があり、或いは他の物理的又は化学的手段、例えば酵素により、温度変化に曝すことにより、又はｐＨ変化に曝すこと等により触媒又は誘導される場合がある。他の物理的又は化学的手段によって切断が誘導される場合、これらは使用条件、例えば標的部位のｐＨ条件に内因的なものであってよく、又はこれらは外因的に与えられてもよい。
【００４４】
プロドラッグを提供するために活性化合物内の官能基をマスクするのに適切な多種多様なプロ基が当技術分野においてよく知られている。例えばヒドロキシ官能基は、親ヒドロキシ基を生み出すためにインビボで加水分解され得るエステル、リン酸エステル、又はスルホン酸エステルとしてマスクされ得る。アミド官能基は、親アミノ基を生み出すためにインビボで加水分解され得る。カルボキシル基は、親カルボキシル基を生み出すためにインビボで加水分解され得るエステル又はアミドとしてマスクされ得る。適切なプロ基の他の例が当業者に明らかになる。このプロ基の正確な性質は必要に応じて、例えばこのプロドラッグの所望の油又は水への溶解性、このプロドラッグの意中の投与モード、及び／又は前記活性薬品化合物を生じさせるための標的部位におけるこのプロドラッグの意中の代謝モードに応じて選択され得る。このプロ基は、例えば、所望により水溶解性を増減させるために親水性でも親油性でもよい。プロ基の選択によって胃腸管からの吸収性の向上、薬品安定性の改善等の他の望ましい特質が付与される場合もある。
【００４５】
本明細書において記載される前記ＰＤＥ２阻害剤は頻脈又は頻脈性不整脈の治療で使用するのに適切である。例えば、これらの阻害剤は以下の障害、すなわち心房頻脈、心房細動、心房粗動、発作性上室性頻脈、心室性期外収縮（ＰＶＣ）、心室細動、及び心室頻脈のうちのいずれかの治療に使用され得る。好ましい実施形態では前記化合物は心室頻脈の治療に使用され得る。不整脈に関連する症状、例えば頻脈性不整脈の治療は本発明の好ましい態様を形成する。
【００４６】
したがって、１つの実施形態では本明細書において記載される前記化合物は以下の症状、すなわち、心房頻脈、心房細動、心房粗動、発作性上室性頻脈、心室性期外収縮（ＰＶＣ）、心室細動、及び心室頻脈のうちのいずれかの治療又は予防、例えば不整脈に関連するあらゆるこのような症状の治療又は予防に使用され得る。
【００４７】
１つの実施形態では本明細書に記載される前記ＰＤＥ２阻害剤は心室頻脈の治療又は予防を目的としたものである。心室頻脈を予防するための対象の治療は本発明の好ましい実施形態である。治療に適切な対象（例えば患者）には心室頻脈になりやすいと診断された対象、及び以前に少なくとも１回の心室頻脈の発生を経験したことがあり、したがってさらに発作を起こしやすい対象が含まれる。このような対象の治療はさらなる心室頻脈イベントの発生を減少させる、好ましくは解消することを目的としている。
【００４８】
頻脈又は頻脈性不整脈（例えば、心室頻脈）は後天性でも先天性でもあり得る。例えば、これらの不整脈は以下の障害、すなわち、先天性心不全、高血圧、心筋梗塞（心筋梗塞の最中又は心筋梗塞後）、うっ血性心不全、再灌流障害又は再灌流損傷、虚血、狭心症、拡張型心筋症、心筋梗塞後心不全、動脈硬化性末梢動脈疾患、糖尿病、肥大型心筋症、心筋炎、チャネル病（例えばＱＴ延長症候群、カテコールアミン誘発性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）、又はブルガダ症候群）、拘束型心筋症、浸潤性心疾患（例えばアミロイドーシス）、及び肺性高血圧と右心室不全を引き起こす肺胞性低酸素症のうちのいずれかを含むがこれらに限定されない心臓に関連する様々な障害に付随する、又はそのような障害から生じる場合がある。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「治療」、「治療すること」、及び「治療する」という用語は対象の前記所定の疾患又は障害に向けた治療方法と予防方法の両方を含む。具体的には、これらの用語は、（ｉ）前記障害の発生防止、又は前記障害が発生するリスクの軽減、特に前記障害になる素因が存在する可能性が前記対象にあるがその障害を発症しているとまだ診断されていないときのリスクの軽減、（ｉｉ）前記障害の抑制、特にその障害のさらなる発生（進行）の停止又はその障害の発症の遅延化、及び（ｉｉｉ）前記障害の軽減、特に所望の転帰に達するまでの前記障害の退行の誘発を含む。
【００５０】
本発明による治療方法から利益を受ける可能性がある対象（例えば患者）には以下の対象、すなわち、以前に心筋梗塞に罹患したことがある対象、心不全を発症している対象、及び本明細書において記載される頻脈症状のうちのいずれかにになる素因が存在する可能性がある対象、例えばそのような症状、例えば身体活動又は精神的ストレスに応答して異常に速く、且つ、不規則な心拍（頻脈）が引き起こされるカテコールアミン誘発性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）の遺伝的素因を有する対象のうちのいずれかが含まれるがこれらに限定されない。以下の症状、すなわち、心不全、心筋梗塞後心筋炎、肥大性心筋症、ＣＰＶＴ、ＱＴ延長症候群、及びブルガダ症候群のうちのいずれかに罹患している、又はその症状の素因が存在する可能性がある対象は、本明細書において記載される前記方法による治療に特に適している。本発明に従って治療される可能性がある好ましい対象（例えば患者）群には心不全、ＣＰＶＴ、又はＱＴ延長症候群に罹患している対象、又はそのリスクがある対象が含まれる。
【００５１】
一実施形態では本発明は、以下の症状、すなわち、心不全、心筋梗塞後心筋炎、肥大性心筋症、ＣＰＶＴ、ＱＴ延長症候群、及びブルガダ症候群のうちのいずれかに罹患している、又はその症状の素因が存在する可能性がある対象（例えばヒト患者）における心室頻脈の治療及び／又は予防に関する。
【００５２】
ＣＰＶＴ及びＱＴ延長症候群は心室頻脈のリスクが高い遺伝的症候群である。これらの症状を有するほぼ全ての患者が現在のところ何らかの抗不整脈治療を受けている。心不全には様々な症状が含まれるが、心室頻脈の付随リスクが多くの場合に存在し得る。特に本発明は、心不全、ＣＰＶＴ、又はＱＴ延長症候群に罹患している対象、又はそのリスクがある対象における心室頻脈の治療及び／又は予防に関する。
【００５３】
頻脈（例えば心室頻脈）の素因が存在する可能性がある対象には以前に心不整脈（例えば心室頻脈）の診断及び／又は治療を受けたことがある対象、例えば心臓リズム異常に対処するためのβ遮断薬などの不整脈治療薬を処方されたことがある対象又は対象植え込み型除細動器（ＩＣＤ）を有する対象が含まれる。ＩＣＤを有する有症状心不全患者は特に本明細書において開示される治療方法から利益を受ける可能性がある。
【００５４】
ＩＣＤは心室頻脈及び／又は心臓突然死のリスクが高い患者、例えば心不全又はＱＴ延長症候群の患者に移植されることが典型である。この装置の移植から１〜３年以内は患者の２０〜３５％が適切なショックを受けることになる。すなわち、ＩＣＤが致死的となり得る心室頻脈を正常な心臓リズムに転換する。しかしながら、患者の３分の１が不適切なショックを受ける場合もある。すなわち、ＩＣＤが不必要なショックを与える。ＩＣＤがショックを与えるときは常に心臓機能の低下による２〜５倍の死亡率の上昇がこれに付随する。したがって、患者に加えられる可能性がある不適切なＩＣＤショックの量を減少可能であることが重要である。基礎心疾患、例えば心室頻脈を治療又は予防するための有効な薬物治療の利用によりこれを達成することができる。したがって、１つの実施形態では本明細書において記載される前記方法は、ＩＣＤが移植されている患者で心室頻脈を治療又は予防するため、特に患者に加えられる可能性がある不適切なＩＣＤショックの数を減少させる、又は最少にするために使用される場合がある。
【００５５】
心室頻脈などの心不整脈の長期治療を受けている対象（例えば、β遮断薬を少なくとも６か月又は少なくとも１２か月にわたって処方されている対象）は特に本明細書において記載される治療方法から利益を受ける可能性がある。β遮断薬は一般的に心室頻脈の第一選択治療であり得るが、それらの効力は症状及び患者の間で異なる。本明細書において記載される前記方法は、従来の治療（例えばβ遮断薬を使用する治療）が心不整脈（特に心室頻脈）を治療するのに充分ではない患者の治療に、又は従来の薬品（例えばβ遮断薬）が禁忌（例えばＡＶブロック）であるか、若しくはこの対象によって忍容されない場合に特に使用される。
【００５６】
１つの実施形態ではＶＡ誘発症状を最小限に抑えるため、及び／又は（例えばＣＰＶＴにおいて特に一般的な）不適切なＩＣＤショックを減少させるために本治療方法を用いてＩＣＤを有する患者を治療する場合がある。
【００５７】
１つの実施形態では心室頻脈などの心不整脈に対する従来の治療も受けているＩＣＤを有する患者を治療するために本治療方法を用いる場合がある。このような患者にはＩＣＤを有し、且つ、β遮断薬を用いる治療を受けている患者（例えば、β遮断薬を少なくとも６か月又は少なくとも１２か月にわたって処方されている患者）が含まれる。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「治療有効量」は所望の薬理効果及び／又は治療効果を引き起こす量、すなわち意図する目的を達成するために有効である前記ＰＤＥ２阻害剤の量に関連する。個々の患者の必要量が異なる場合がある一方で前記活性薬剤の最適な範囲の有効量の決定は当業者の能力の範囲内である。本明細書に記載される前記化合物のいずれかを使用して疾患又は障害を治療するための薬剤投与計画は、病状の性質及びその重症度を含む様々な因子に応じて選択されることが一般的である。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「対象」は通常では哺乳類動物である。「哺乳類動物」という用語には例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、及びヒトが含まれる。前記対象はヒトであることが好ましい。
【００６０】
本明細書において記載される前記ＰＤＥ２阻害剤は医薬組成物の形で投与されることが典型である。医薬組成物は、すぐに利用可能な成分を用いる従来法で製剤可能である。したがって、前記ＰＤＥ２阻害剤は、錠剤、丸剤、粉剤、ロゼンジ剤、サッシェ剤、カシェー剤、エリキシル剤、懸濁剤（注射液又は点滴液としてのもの）、乳剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固形剤としてのもの、又は液体媒体中のもの）、軟膏、軟質及び硬質ゼラチンカプセル剤、坐剤、無菌注射液、無菌パッケージ粉剤等の従来のガレヌス製剤などの医薬組成物を作製するための１種類以上の従来の担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と混合されてよい。
【００６１】
適切な賦形剤、担体、又は希釈剤はラクトース、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、コーンスターチ、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、ミクロクリスタリンセルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水飴、水、水／エタノール、水／グリコール、水／ポリエチレン、グリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油若しくは固形脂肪などの脂肪質、又はそれらの適切な混合物である。カルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、フタル酸酢酸セルロース、又はポリ酢酸ビニルなどの持続放出製剤を得るための薬剤を使用してもよい。前記組成物はその他に滑沢剤、湿潤剤、増粘剤、着色剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、浸透圧活性剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、甘味剤、着香剤、例えば経鼻送達のための吸着増強剤（胆汁塩、レシチン、界面活性剤、脂肪酸、キレート剤）等を含んでもよい。前記医薬組成物は、当技術分野においてよく知られている手法を用いることにより患者への投与後に前記ＰＤＥ２阻害剤を即時放出、持続放出、又は遅延放出するように製剤され得る。
【００６２】
このような組成物中の有効成分（すなわち前記ＰＤＥ２阻害剤）は前記製剤の約０．０１重量％〜約９９重量％の割合、好ましくは約０．１〜約５０重量％、例えば１０重量％の割合で含まれてよい。
【００６３】
前記投与は、例えば経口投与、非経口投与（例えば筋肉内投与、皮下投与、腹膜内投与、又は静脈内投与）、経皮投与、バッカル投与、直腸投与、又は局所投与、又は吸入による投与を含む医療分野で知られているあらゆる適切な方法によるものであり得る。好ましい投与経路は経口経路と非経口経路（例えば静脈内経路又は腹膜内経路）である。したがって、本発明において使用される好ましい製剤は錠剤、カプセル剤、又は静注液である。
【００６４】
錠剤は直接打錠法、又は標準流動床技術等を用いる造粒法により調製されることが典型である。錠剤はフィルム被覆層又は腸溶被覆層などの別の被覆層で被覆されていることが好ましい。カプセル剤はゼラチンカプセル剤であることが好ましい。注射用組成物は調製済み溶液又は投与前に溶解される乾燥物質であり得る。全ての静注用組成物は滅菌されている。加熱滅菌及び無菌的調製などのあらゆる滅菌方法が用いられてよい。
【００６５】
単位用量は選択したＰＤＥ２阻害剤及び治療される疾患又は障害に応じて異なる。単位用量は０．１ｍｇ〜５００ｍｇの間、より好ましくは１ｍｇ〜３００ｍｇの間で変化することが典型である。典型的な一日用量は０．１ｍｇ〜２ｇまで、より好ましくは１ｍｇ〜１ｇまで、例えば１ｍｇ〜６００ｍｇまでであり得る。
【００６６】
対象の体重ｋｇ当たりの典型的な一日用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの間、例えば１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間で変化し得る。
【００６７】
投与計画は臨床状態に応じて変化する。典型的な平均的投与は１日に１回、２回、又は３回であり、好ましくは１日に１回又は２回である。
【００６８】
投与される前記活性化合物の正確な投与量と治療期間の長さは、対象の年齢と体重、治療を必要とする具体的な症状とその重症度、及び投与経路等を含む多数の因子に左右される。当業者は適切な投与量を容易に決定することができる。
【００６９】
本明細書において記載されるような抗不整脈治療法としてのＰＤＥ２阻害は、例えば既知の治療選択肢（例えばβ遮断薬を使用する治療）よりも効果的である場合、及び／又は現行の治療が適切ではない場合、例えばこれらの治療選択肢がいずれかの所与の患者群で禁忌である場合に単独で用いられる場合がある。あるいは、本明細書において記載される前記治療方法のうちのいずれも、治療対象の前記障害又は疾患の治療に有効である１種類以上の追加活性薬剤の投与（すなわち現行の体制への追加療法としての投与）と都合よく併用される場合がある。このような治療方法は前記ＰＤＥ２阻害剤又は前記ＰＤＥ２阻害剤を含む医薬組成物と前記追加活性薬剤の同時投与、個別投与、又は連続投与を包含し得る。前記活性薬剤が同時に投与される場合、これらの薬剤は混合製剤の形で提供されてよい。したがって、本明細書において記載される前記医薬組成物はそのような活性薬剤のうちの１種類以上をさらに含む場合がある。
【００７０】
前記ＰＤＥ２阻害剤と共投与される可能性がある他の活性薬剤には心臓血管薬が含まれ得る。例えば、前記ＰＤＥ２阻害剤は高血圧、心不全、不整脈、及び／又は心筋梗塞後再灌流症候群を治療する１種類以上の薬品と共投与される場合がある。そのような薬品の例にはβ遮断薬、カルシウム拮抗薬、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴＩＩ／ブロッカー、及び不整脈治療薬が挙げられる。１つの実施形態ではこの心臓血管薬はβ遮断薬、例えばアセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、メトプロロール、ネビボロール、又はエスモロールなどのβ1選択性β遮断薬であり得る。特定の実施形態ではメトプロロールは、本明細書において記載される症状のうちのいずれかの治療又は予防、特に心室頻脈の治療又は予防においてＰＤＥ２阻害剤と共投与される場合がある。
【００７１】
以下の実施例を単なる例示として、且つ、次の添付図面を参照して提示する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ｃＡＭＰと局所的なＡＫＡＰ結合ＰＫＡによってＮＫＡ電流が調節されていることを示す図である。（Ａ）ＮＫＡ電流測定のプロトコルの概要である。単離された心筋細胞を−２０ｍＶで電圧固定し、対称的なＮａ+濃度の溶液で外部より灌流し、且つ、内部で透析した（左側のパネル）。その灌流液からのＫ+の除去によりＮＫＡ電流が測定された（右側のパネル）。（Ｂ）ｃＡＭＰ濃度の上昇のＮＫＡ電流に対する効果を示す図である。*＝０のｃＡＭＰに対してｐ＜０．０５。２〜５匹のラットに由来する６〜１３ＡＲＶＭ。（Ｃ）２０μＭのｓｕｐｅｒＡＫＡＰのＮＫＡ電流に対する効果を示す図である。２匹のラットに由来する６〜７ＡＲＶＭ。*＝１００μＭのｃＡＭＰに対してｐ＜０．０５。
【００７３】
【図２】ＰＤＥ２によってＮＫＡ活性が調節されていることを示す図である。（Ａ）３種類の異なるＰＤＥ２阻害剤のＮＫＡ電流に対する効果を示す図である。３匹のラットに由来する５〜８ＡＲＶＭ。対照に由来するＮＫＡ電流とＢａｙ６０−７５５０に由来するＮＫＡ電流、及び対照に由来するＮＫＡ電流とＰＦ０５１８０９９９に由来するＮＫＡ電流がペアになっている。*＝対照に対してｐ＜０．０５。（Ｂ）ＰＤＥ２ＫＯマウスとＷＴマウスでのＮＫＡ電流を示す図である。３匹のマウスに由来する７〜８筋細胞。*＝ＷＴに対してｐ＜０．０５。（Ｃ）ＰＤＥ３阻害とＰＤＥ４阻害のＮＫＡ電流に対する効果を示す図である。（Ｄ）イソプレナリン及びＰＤＥ阻害剤を用いる処理後のホスホレマン（ＰＬＭ）上のセリン６８におけるリン酸化を示す図である。
【００７４】
【図３】ＮＫＡとＰＤＥ２が共局在し、相互作用することを示す図である。（Ａ〜Ｂ）ＡＲＶＭにおけるＮＫＡとＰＤＥ２の近接ライゲーションアッセイを示す図である。*＝抗体を含まない、又は単一の抗体を含む実験に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）ＨＥＫ２９３細胞におけるＮＫＡとＰＤＥ２の共免疫沈降を示す図である。
【００７５】
【図４】ＰＤＥ２阻害によりＣａ2+トランジェントの振幅と筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量が減少することを示す図である。（Ａ）ＡＲＶＭにおけるＣａ2+トランジェントの振幅（左）（３匹のラットに由来する１２ＡＲＶＭ）、Ｃａ2+放出速度（中央）（３匹のラットに由来する１２ＡＲＶＭ）、及び筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量（右）（３匹のラットに由来する１１ＡＲＶＭ）に対するＢａｙ６０−７５５０の効果を示す図である。*＝対照に対してｐ＜０．０５。（Ｂ〜Ｃ）Ｃａ2+トランジェントに対するＢａｙ６０−７５５０の効果（Ｂ）と通常のカフェイン応答（Ｃ）の代表的なトレースを示す図である。（Ｄ）ＰＤＥ２ＫＯとＷＴにおけるＣａ2+トランジェントの振幅（左）（３匹のマウスに由来する１４〜１６筋細胞）、Ｃａ2+放出速度（中央）（３匹のマウスに由来する１４〜１６筋細胞）、及び筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量（右）（３匹のマウスに由来する１１〜１４筋細胞）を示す図である。*＝ＷＴに対してｐ＜０．０５。
【００７６】
【図５】ＰＤＥ２阻害によりＮＣＸ依存性Ｃａ2+放出が増加することを示す図である。（Ａ）主要Ｃａ2+放出タンパク質の活性を測定するためのプロトコルを示す代表的トレースを示す図である。（Ｂ）ＳＥＲＣＡ２活性（左）（３匹のラットに由来する１０ＡＲＶＭ）、ＮＣＸ活性（中央）（３匹のラットに由来する１１ＡＲＶＭ）、及び非ＳＥＲＣＡ２／非ＮＣＸ性Ｃａ2+放出（右）（２匹のラットに由来する５ＡＲＶＭ）に対するＢａｙ６０−７５５０の効果を示す図である。*＝対照に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）ＰＤＥ２ＫＯとＷＴにおけるＳＥＲＣＡ２活性（左）（３匹のマウスに由来する１０〜１４筋細胞）、ＮＣＸ活性（中央）（３匹のマウスに由来する１０〜１４筋細胞）、及び非ＳＥＲＣＡ２／非ＮＣＸ性Ｃａ2+放出（右）（３匹のマウスに由来する４〜５筋細胞）を示す図である。*＝ＷＴに対してｐ＜０．０５。（Ｄ）ＳＢＦＩを用いて測定された細胞内Ｎａ+を示す図である。代表的トレース（左）と平均データ（右）。３匹のラットに由来する６ＡＲＶＭ。
【００７７】
【図６】ＰＤＥ２阻害がＬＴＣＣとＲｙＲ活性に対して効果を持たないことを示す図である。（Ａ〜Ｂ）Ｂａｙ６０−７５５０処理によるＬＴＣＣの代表的トレース（Ａ）と平均データ（Ｂ）を示す図である。３匹のラットに由来する５ＡＲＶＭ。（Ｃ〜Ｄ）Ｂａｙ６０−７５５０処理によるＣａ2+スパーク頻度の代表的トレース（Ｃ）と平均データ（Ｄ）を示す図である。２匹のラットに由来する６ＡＲＶＭ。（Ｅ）Ｂａｙ６０−７５５０によるＮａ+電流の平均データを示す図である。３匹のラットに由来する６〜７ＡＲＶＭ。
【００７８】
【図７】ＰＤＥ２阻害により結紮後ＨＦ及びＡｎｋＢ+/-において細胞性不整脈が減少することを示す図である。（Ａ）結紮後ＨＦに由来する筋細胞（３匹のマウスに由来する６筋細胞）とシャムに由来する筋細胞（１匹のマウスに由来する２筋細胞）におけるＢａｙ６０−７５５０によるＮＫＡ電流を示す図である。*＝対照に対してｐ＜０．０５。（Ｂ）結紮後ＨＦ筋細胞におけるＣａ2+トランジェントの振幅（左）（３匹のマウスに由来する１１〜１２筋細胞）とＣａ2+放出速度（右）（３匹のマウスに由来する１０〜１２筋細胞）に対するＢａｙ６０−７５５０の効果を示す図である。*＝対照に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）結紮後ＨＦ筋細胞に由来するＣａ2+ウェーブを検出するためのプロトコルの代表的トレースを示す図である。（Ｄ）結紮後ＨＦマウスに由来する単離筋細胞（３匹のマウスに由来する１１〜１２筋細胞）、ＡｎｋＢ+/-マウスに由来する単離筋細胞（３匹のマウスに由来する１８筋細胞）、及びＷＴ（ＡｎｋＢ+/+）マウスに由来する単離筋細胞（３匹のマウスに由来する１１〜１３筋細胞）におけるＣａ2+ウェーブの頻度を示す図である。*＝対照に対してｐ＜０．０５。
【００７９】
【図８】結紮後ＨＦマウスにおいてＰＤＥ２阻害により心室頻脈と死が防止されることを示す図である。（Ａ）結紮後ＨＦマウスにおけるインビボ不整脈のためのプロトコルを示す図である。（Ｂ）ＶＴ（両方向ＶＴ及び多源性ＶＴ）の例と洞調律の例を示すＨＦマウスに由来する代表的なＥＣＧトレースを示す図である。（Ｃ）ＨＦマウス（両群においてｎ＝５）におけるＢａｙ６０−７５５０による心室頻脈と死（左）及びＱＴ時間（右）を示す図である。*＝ベヒクルに対してｐ＜０．０５。（Ｄ）ＨＦマウス（両群においてｎ＝５）におけるＰＦ０５１８０９９９による心室頻脈（左）及びＱＴ間隔（右）を示す図である。
【００８０】
【図９】ＡｎｋＢ+/-マウスにおいてＰＤＥ２阻害により心室頻脈が防止されることを示す図である。（Ａ）ＡｎｋＢ+/-マウスにおけるインビボ不整脈のプロトコルを示す図である。（Ｂ）ＡｎｋＢ+/-マウス（両群においてｎ＝８）におけるＢａｙ６０−７５５０による心室頻脈（左）及びＱＴ間隔（右）を示す図である。*＝ベヒクルに対してｐ＜０．０５。（Ｄ）ＡｎｋＢ+/-マウス（両群においてｎ＝５）におけるＰＦ０５１８０９９９による心室頻脈（左）及びＱＴ間隔（右）を示す図である。*＝ベヒクルに対してｐ＜０．０５。
【００８１】
【図１０】ＰＤＥ２阻害によりｃＡＭＰの局所的プールを介してＮＫＡ電流が増加し、細胞性不整脈が抑制されることを示す図である。（Ａ）Ｂａｙ６０−７５５０を用いる処理後のマウス（２マウス、マウス当たり２回反復）に由来する心室筋細胞における全体的細胞内ｃＡＭＰレベルを示す平均データ（左）と代表的トレース（右）を示す図である。陽性対照としてイソプレナリンを使用した。（Ｂ）ＮＫＡとＰＫＡ触媒部位及びＰＫＡ−ＲＩＩとの間の共免疫沈降を示す図である。（Ｃ）ｓｕｐｅｒＡＫＡＰ／ＲＩＡＤを用いる処理（３匹のラットに由来する５〜８ＡＲＶＭ）の後のＥＨＮＡによるＮＫＡ電流を示す図である。*＝ＲＩＡＤに対してｐ＜０．０５。（Ｄ）ｓｕｐｅｒＡＫＡＰを用いる前処理後の結紮後ＨＦマウスに由来する筋細胞（３匹のマウスに由来する１０〜１４筋細胞）及びＡｎｋＢ+/-マウスに由来する筋細胞（２マウスに由来する１０〜１３筋細胞）におけるＢａｙ６０−７５５０によるＣａ2+ウェーブを示す図である。*＝ｓｕｐｅｒＡＫＡＰに対してｐ＜０．０５。
【００８２】
【図１１】結紮後ＨＦマウス及びＡｎｋＢ+/-マウスにおいてｓｕｐｅｒＡＫＡＰを用いる前処理の後ではそれ以上ＰＤＥ２阻害により心室頻脈が防止されないことを示す図である。（Ａ）結紮後ＨＦマウス及びＡｎｋＢ+/-マウスにおけるＢａｙ６０−７５５０及びｓｕｐｅｒＡＫＡＰ／スクランブルを使用するインビボ不整脈のプロトコルを示す図である。（Ｂ）ＨＦマウス（両群においてｎ＝６）におけるＢａｙ６０−７５５０及びｓｕｐｅｒＡＫＡＰ／スクランブルによる心室頻脈（左）及びＱＴ間隔（右）を示す図である。*＝ベヒクルに対してｐ＜０．０５。（Ｄ）ＡｎｋＢ+/-マウス（両群においてｎ＝５）におけるＢａｙ６０−７５５０及びｓｕｐｅｒＡＫＡＰ／スクランブルによる心室頻脈（左）及びＱＴ間隔（右）を示す図である。
【００８３】
【図１２】提唱されているＰＤＥ２による局所的なＮＫＡの調節機構を示す図である。（Ａ）ＰＤＥ２とＮＫＡが共通の領域で集合し、そこでＰＤＥ２が局所的にｃＡＭＰレベルとＡＫＡＰ結合ＰＫＡ−ＲＩＩ活性を調節すると提唱する。ＰＫＡ−ＲＩＩはホスホレマンをリン酸化し、それによりＮＫＡ活性が調節される。（Ｂ）ＡＫＡＰからＰＫＡ−ＲＩＩを脱離させるｓｕｐｅｒＡＫＡＰを使用するとＰＤＥ２はこれ以上ＮＫＡを調節することができない。
【００８４】
【図１３】ヒト心臓肥大症及び加齢において、並びにラット結紮後ＨＦにおけるＰＤＥ２−ｍＲＮＡの発現上昇を示す図である。単離され、選別された心筋細胞核に由来するｍＲＮＡシーケンシングデータを示す。
【００８５】
【図１４】結紮後ＨＦマウスにおいてＰＤＥ２阻害により心室頻脈が防止されることを示す図である。ＨＦマウスにおける歴史的対照（ｎ＝１５）、ＮＤ−７００１（ｎ＝５）、及びＬｕＡＦ６４２８０（ｎ＝３）による心室頻脈を示す。*＝対照に対してｐ＜０．０５。
【００８６】
【図１５】Ｃａ2+誘発性心室性不整脈の防止においてβ遮断薬よりもＰＤＥ２阻害が優れていることを示す図である。（Ａ）ＡｎｋＢ+/-マウスにおける長期基準研究のプロトコルを示す図である。（Ｂ）４処理群におけるＥＣＧレコーディングの代表的トレースを示す図である。（Ｃ）４処理群における心室頻脈性不整脈と心室頻脈の存在を示す平均データを示す図である。対照は１１マウス、メトプロロールは１５マウス、Ｂａｙ６０−７５５０は１３マウス、Ｂａｙ６０−７５５０＋メトプロロールは１５マウスである。（Ｄ）処理対象（左）又はカフェイン（右）の注射による４処理群におけるＱＴ時間を示す図である。*＝ｐ＜０．０５。#＝ｐ＜０．０１。
【００８７】
【図１６】ＰＤＥ２阻害がＲｙＲ活性に対して効果を持たないことを示す図である。（Ａ）フィールド刺激ＡＲＶＭにおけるＣａ2+スパーク頻度、Ｃａ2+トランジェントの振幅、及び筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量に対するＰＤＥ２阻害の代表的トレースと平均データを示す図である。３匹のラットに由来する１８ＡＲＶＭ。*＝対照に対してｐ＜０．０５。（Ｂ）非刺激ＡＲＶＭにおけるＣａ2+スパーク頻度及び筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量に対するＰＤＥ２阻害の代表的トレースと平均データを示す図である。３匹のラットに由来する１９ＡＲＶＭ（Ｂａｙ６０−７５５０）と２２ＡＲＶＭ（対照）。（Ｃ）サポニン透過処理後のＡＲＶＭにおけるＣａ2+スパーク頻度に対するＰＤＥ２阻害の代表的トレースと平均データを示す図である。３匹のラットに由来する２５ＡＲＶＭ（Ｂａｙ６０−７５５０）と２４ＡＲＶＭ（対照）。
【００８８】
【図１７】ＰＤＥ２阻害が他の抗不整脈標的に対して効果を持たないことを示す図である。（Ａ）ＬＴＣＣに対するＰＤＥ２阻害の効果を示す図である。３匹のラット（両群）に由来する８ＡＲＶＭ（対照）と１０ＡＲＶＭ（Ｂａｙ６０−７５５０）。（Ｂ）バックグラウンドＫ+電流に対するＰＤＥ２阻害の効果を示す図である。３匹のラットに由来する７ＡＲＶＭ（両群）。（Ｃ）Ｎａ+電流に対するＰＤＥ２阻害の効果を示す図である。３匹のラットに由来する７ＡＲＶＭ（対照）と８ＡＲＶＭ（Ｂａｙ６０−７５５０）。（Ｄ）活動電位持続時間に対するＰＤＥ２阻害の効果を示す図である。*＝対照に対してｐ＜０．０５。
【００８９】
【図１８】ＣＰＶＴマウスにおいてＰＤＥ２阻害により心室頻脈が防止されることを示す図である。ＣＰＶＴマウスにおける対照（ｎ＝６）及びＢａｙ６０−７５５０（ｎ＝７）による心室頻脈を示す。*＝対照に対してｐ＜０．０５。
【実施例】
【００９０】
実施例１
ホスホジエステラーゼ２Ａの阻害によりＮａ+／Ｋ+−ＡＴＰアーゼが活性化され、且つ、心室頻脈が防止されることを実証するために以下の方法を実施した。
【００９１】
方法
動物モデル
米国立衛生研究所により出版された実験動物の管理と使用に関する指針（ＮＩＨ出版番号第８５−２３号、１９９６年改訂）に従って動物実験を実施した。プロジェクトはノルウェー国立動物実験委員会によっての承認された（ＦＤＵ２１４６、７０１６及び７０４０）。１２時間：１２時間の昼夜サイクルの温度制御室の中で体重約３００ｇの雄ウィスターラット（メルガード、デンマーク）をケージ当たり２匹ずつ飼育し、自由に飲食させた。同様の条件下でマウスを飼育し、ケージ当たり最大で６匹のマウスの飼育を認めた。上行大動脈の標準的緊縛によりＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおいて大動脈結紮を実施し、１４〜１６週間にわたってこれらのマウスを追跡した。以前に説明されたように（Ａｒｏｎｓｅｎ，  Ｊ．Ｍ．ら著、Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｒａｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ誌、２０１７年、第３１２巻（第５号）：Ｈ９３２〜Ｈ９４２頁）心エコー検査及び死後検査によりうっ血性心不全の発症を確定した。以前に説明されたように（Ｍｏｈｌｅｒ，  Ｐ．Ｊ．ら著、Ａｎｋｙｒｉｎ−Ｂ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｙｐｅ  ４  ｌｏｎｇ−ＱＴ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  ｓｕｄｄｅｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅａｔｈ．  Ｎａｔｕｒｅ誌、２００３年、第４２１巻（第６９２３号）：６３４〜９頁）アンキリンＢ+/-マウスを飼育した。以前に説明された方法で（Ｈｏｕｇｅｎ，  Ｋ．ら著、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ｏｎｌｙ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  Ｔｇ（ａｌｐｈａ  ＭＨＣ−ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ）  ｍｉｃｅ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ誌、２０１０年、第２９９巻（第５号）：Ｈ１６７１〜Ｈ１６７８頁）ＰＤＥ２Ａ−ｆｌｏｘマウスをａｌｐｈａ−ＭＨＣ  ＭｅｒＣｒｅＭｅｒマウスと交配、且つ、使用してＰＤＥ２Ａの心筋細胞特異的な役割を調べた。
【００９２】
細胞の単離
雄ウィスターラットを４％イソフルラン、６５％Ｎ2Ｏ、及び３１％Ｏ2内で麻酔し、挿管し、そして２％イソフルラン、６６％Ｎ2Ｏ、及び３２％Ｏ2を通気した。痛みへの反射作用の消失により外科的深麻酔を確認した。切開後の血栓症予防のために１５０ＩＥのヘパリンを静脈内投与した。心臓を切除し、すぐに４℃の０．９％ＮａＣｌ中で冷却した。大動脈にカニューレを装着し、改変ランゲンドルフ法により冠動脈に３７℃で２〜４分間にわたって緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２２ｍＭ  Ｄ−グルコース、ｐＨ７．４）を逆行的に灌流し、その後で０．８ｇ／ＬコラゲナーゼＩＩ（ワージントン・バイオケミカル社、米国）及び６．７μＭのＣａＣｌ2を含有する緩衝液Ａを１８〜２２分間にわたって灌流した。心房及び右心室自由壁を除去した後に５００μＬの２％ＢＳＡを添加した８〜１０ｍＬの前記灌流液の中にＬＶを小片に切断して入れ、１分間にわたってパスツールピペットを使用して注意深くピペット操作することにより機械的にＬＶを単離した。心筋細胞懸濁液をナイロンメッシュ（２００μｍ、ブルマイスター、ロレンスコグ、ノルウェー）に通して濾過し、室温で放置して沈降させた。沈降（約５分間）の直後に上清を除去した。単細胞実験とｃＡＭＰ測定のための初代培養物の作製のために（１）０．１％ＢＳＡと０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、（２）０．１％ＢＳＡと０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2、及び（３）０．０５％ＢＳＡと０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2を含有する緩衝液Ａでこれらの心筋細胞を３回洗浄した。近接ライゲーションアッセイ用の初代培養物の作製のためにＢＳＡの濃度を低下させた（０．１％、０．０５％、及び０％）緩衝液Ａ中でこれらの心筋細胞を３回洗浄した。
【００９３】
近年に説明されたものと同様のプロトコル（Ａｃｋｅｒｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｍ．ら著、Ａ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ，  Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉａｂｌｅ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｍｙｏｃｙｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｄｕｌｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｒｔ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ誌、２０１６年、第１１９巻（第８号）：９０９〜２０頁）に基づいてシャム手術又はＡＢ手術の後にＰＤＥ２欠損マウス、アンキリン+/-マウス、及びＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスから左心室筋細胞を単離した。マウスを５％イソフルランと９５％Ｏ2の混合物の中で麻酔し、そして５％イソフルランと９５％Ｏ2の混合物を人工換気により通気した。痛みへの反射作用の消失により外科的深麻酔を確認した。開胸した後に下行大動脈と下大静脈を切断した。右心室に５ｍＭのＥＤＴＡを含む７ｍＬの緩衝液Ａを注入した。その後、大動脈を鉗子で固定し、心臓を切除した。左心室に１０ｍＬの前記緩衝液とその後で３ｍＬのＥＤＴＡを含まない前記緩衝液を２〜５分間にわたって注入した。その後、０．８ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩを含有する予備加熱済みの溶液Ａを約２０分間にわたって左心室に注入した。心房及び右心室を除去した。残りの手順は上記のランゲンドルフベースの単離法について説明された手順と同様であった。
【００９４】
近接ライゲーションアッセイ
単離された心筋細胞を室温のＰＢＳの中で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に移し、そして３０分間にわたって穏やかに振盪し、その後で再びＰＢＳの中で２回洗浄した。次にこの心筋細胞懸濁液をそれぞれ８μｇのラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で被覆された０．８ｃｍ2のウェルに移し、そして３７℃で２時間にわたってインキュベートした。ＰＢＳをＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ１００溶液と交換し、そして３７℃で１０分間にわたってインキュベートした。その後、製造業者のプロトコル（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ，  Ｏ．ら著、Ｄｉｒｅｃｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｂｙ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、２００６年、第３巻（第１２号）：９９５〜１０００頁）に従ってＤｕｏｌｉｎｋ  ＩＩプロプライエタリシステム（Ｏｌｉｎｋバイオサイエンス、ウプサラ、スウェーデン）を用いて近接ライゲーションアッセイを実施した。
【００９５】
Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーで励起、ＭＢＳ４８８／５４３ダイクロイックミラーを通過、５６５〜５８９ｎｍで放射光を収集）で心筋細胞をスキャンした。ホールセル平均濃淡値を測定することによる単一細胞内蛍光強度の分析のためにＩｍａｇｅＪ  １．４４ｐソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を使用した。バックグラウンド蛍光シグナルについて結果を補正した。
【００９６】
ホールセル電圧クランプ実験
Ａｘｏｃｌａｍｐ  ２Ｂ又は２Ａ増幅器とｐＣＬＡＭＰソフトウェア（両方ともアクソン・インスツルメンツ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用してホールセル連続電圧クランプを単離された心筋細胞に行った。シグナルを１０ｋＨｚで収集し、分析前にローパスフィルターでフィルタリングした。実験中及び実験間で全ての増幅器設定とプログラム設定を一定にした。これらの細胞を３７℃で灌流し、且つ、溶液の迅速な切り換えができるように灌流システムを調整した。
【００９７】
ＮＫＡ電流
広口タイプのパッチピペット（１．５〜２．５ＭΩ）に内液（Ｄｅｓｐａ，  Ｓ．及びＤ．Ｍ．  Ｂｅｒｓ著、Ｎａ／Ｋ  ｐｕｍｐ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ［Ｎａ］（ｉ）  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ：ｌｏｃａｌ  ［Ｎａ］（ｉ）  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ誌、２００３年、第８４巻（第６号）：４１５７〜６６頁より改変して１７ｍＭ  ＮａＣｌ、１３ｍＭ  ＫＣｌ、８５ｍＭアスパラギン酸カリウム、２０ｍＭ  ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ2（スタンフォード大学のＭａｘｃｈｅｌａｔｏｒを使用すると遊離Ｍｇ2+は約１．０ｍＭ）、３ｍＭ  ＢＡＰＴＡ、１．１５ｍＭ  ＣａＣｌ2（１５０ｎＭの遊離Ｃａ2+）、ｐＨ＝７．２（ＫＯＨで調節））を充填した。ホールセルアクセスの達成後にこれらの細胞を少なくとも４分間にわたって−２０ｍＶにおいて透析した。残りの実験での保持電位は−２０ｍＶであった。ほとんどの細胞で直列抵抗は３〜６ＭΩであり、９ＭΩを超える直列抵抗を有する細胞を全て廃棄した。
【００９８】
溶液Ａ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、及び０．４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4）中で前記細胞をパッチした。ｐＨを７．４に調節した。ホールセルアクセスの達成後に溶液Ｂ（１０８ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、１７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＮｉＣｌ2、２ｍＭ  ＢａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ＨＣｌでｐＨを７．４に調節）で細胞を灌流した。実験当日に５μＭのｃＡＭＰとペプチド（１μＭ若しくは２０μＭのｓｕｐｅｒＡＫＡＰ又は１μＭのＲＩＡＤ）を前記内液に添加した。細胞外ＫＣｌの急速除去（等量のＴｒｉｓＣｌで置換）によりＮＫＡ電流を誘起した。ＮＫＡ電流に対する細胞内Ｎａ+濃度勾配の影響を減少させるために対称的なＮａ+濃度の溶液（すなわち、前記灌流液と前記内液の両方でＮａ+濃度が同じ）を使用した。実験当日に１００ｎＭのＢａｙ６０−７５５０、１００ｎＭのＰＦ０５１８０９９９、又は１０μＭのＥＨＮＡを前記灌流液に添加してＮＫＡ電流に対するＰＤＥ２阻害の効果を測定した。ペアードレコーディングとアンペアードレコーディングの両方を実施したが、１つのデータセット内では一致するようにした。ペアードレコーディングでは対照条件時及びＰＤＥ２阻害剤を使用したときのＮＫＡ電流を同じ細胞で測定するが、レコーディング間で少なくとも５分間を空けた。望ましくない時間依存性効果を最小限に抑えるためにＰＤＥ２阻害剤を使用するレコーディングと使用しないレコーディングの間で１つの細胞での最初のＮＫＡ電流のレコーディングを交互に行った。細胞の静電容量にＮＫＡ電流を関連付けて細胞サイズの違いを考慮した。
【００９９】
Ｌ型Ｃａ2+電流（ＬＴＣＣ）
広口タイプのパッチピペット（１．４〜１．８ＭΩ）に内液（Ｌｅｒｏｙ，  Ｊ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ誌、２０１１年、第１２１巻（第７号）：２６５１〜６１頁より改変して１２２ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ2（約０．６ｍＭの遊離Ｍｇ2+）、５ｍＭ  Ｎａ2ホスホジクレアチニン、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2（３ｎＭの遊離Ｃａ2+）、ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調節）を充填した。全てのレコーディングで直列抵抗は４〜８ＭΩの間であった。保持電位は−４５ｍＶであり、０．１２５Ｈｚにおいて−４５〜０ｍＶまでの１００ｍｓ二乗電圧ステップによりＣａ2+トランジェントを誘発した。前記細胞を溶液Ａ中でパッチしたが、ホールセルアクセスの達成後に溶液Ｃ（Ｌｅｒｏｙ，  Ｊ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ誌、２０１１年、第１２１巻（第７号）：２６５１〜６１頁より改変して１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭＣｓＣｌ、５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１．８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．８ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）を適用した。レコーディングを開始する前に少なくとも４分間にわたって前記内液を平衡化させた。ＬＴＣＣが完全に安定になった後でレコーディングを開始した。対照レコーディングとＢａｙ６０−７５５０を使用するレコーディングを同じ細胞に行った。
【０１００】
Ｎａ+電流
低抵抗性ピペット（１．４〜２．５ＭΩ）に内液（Ｌｅｒｏｙ，  Ｊ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ誌、２０１１年、第１２１巻（第７号）：２６５１〜６１頁より改変して１２２ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ2（約０．６ｍＭの遊離Ｍｇ2+）、５ｍＭ  Ｎａ2ホスホジクレアチニン、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2（３ｎＭの遊離Ｃａ2+）、ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調節）を充填した。全てのレコーディングで直列抵抗は４〜７．５ＭΩの間であった。前記細胞を溶液Ａ中でパッチしたが、ホールセルアクセスの達成後に溶液Ｄ（１２５ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＮｉＣｌ2、ＣｓＯＨでｐＨ７．４に調節）を適用した。実験当日に２０μＭのニフェジピンを添加してＬ型Ｃａ2+チャネルを阻害した。保持電位は−８０ｍＶであった。１Ｈｚにおいて保持電位−８０ｍＶ〜−１０ｍＶまでの５０ｍｓ二乗電圧ステップを適用することにより非連続モード（９ｋＨｚのスイッチングレート）でＮａ+電流を測定した。対称的なＮａ+溶液と低い直列抵抗によって良好な電圧対照を維持した。これらの実験の前に−７０ｍＶ〜＋５０ｍＶまでの範囲で一段毎に−１０ｍＶずつ上昇させる多段階プロトコル（全てが−８０ｍＶの保持電位より）を行って最大のピーク電流を生み出すテスト電位を決定したところ、対照とＢａｙ６０−７５５０の間で差が存在しなかった。レコーディングを開始する前に少なくとも４分間にわたって前記内液を平衡化させた。Ｎａ+電流が完全に安定になった後でレコーディングを開始した。対照レコーディングとＢａｙ６０−７５５０を使用するレコーディングの大部分を別々の細胞に行った。しかしながら、一部の細胞集団では対照とＢａｙ６０−７５５０の両方を同じ細胞でレコーディングした。
【０１０１】
フィールド刺激実験
ホールセルＣａ2+トランジェント
１０〜１５分間にわたって５μＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、米国）を負荷し、続いて５分間にわたって脱エステル化を行ったフィールド刺激筋細胞においてＣａ2+トランジェントを記録した。同じ細胞（ラット心室筋細胞）又はＰＤＥ２ＫＯ若しくはＷＴの心室筋細胞に１００ｎＭのＢａｙ６０−７５５０を使用して、又は使用せずに実験を行った。ペプチドを使用する実験では１μＭのどちらかのＴＡＴ結合ペプチド（ｓｕｐｅｒＡＫＡＰ又は対応するスクランブルペプチド）と筋細胞を２０分間にわたってインキュベートした。その後、レコーディング時には同じペプチドを含有する溶液Ａで筋細胞を灌流した。
【０１０２】
Ｃａｉｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈオプトスキャンモノクロメータ（４８５ｎｍ励起、５１５ｎｍ放射のロングパス）（Ｃａｉｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、フェイヴァシャム、英国）を使用して細胞蛍光を得た。各実験の後に無細胞時の蛍光を得て、前記トレースから減算してバックグラウンド蛍光について補正を行った。レコーディングを開始する前に少なくとも３分間にわたって、又はＣａ2+トランジェントが安定化するまで０．５Ｈｚで細胞を刺激した。Ｃａ2+トランジェント（ベースラインＣａ2+レベルとピークＣａ2+レベルの両方）が安定しない細胞を廃棄した。その後、フィールド刺激を停止し、１０ｍＭのカフェインによる短時間のパルス刺激を加えた。筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+含量をカフェインで誘起されたＣａ2+上昇のピークとして記録した。ＮＣＸ活性を抑止するために１０ｍＭのＮｉ2+を前記灌流液に添加した後に同じ実験を行った。通常のトランジェント（τ）、カフェインによるトランジェント（τcaff）、及びカフェインとＮｉ2+によるトランジェント（τNi）からＣａ2+放出相を単一指数関数にあてはめることによりＴａｕ値を得た。フィールド刺激Ｃａ2+トランジェントとカフェイン誘起Ｃａ2+上昇との間の速度定数の差としてＳＥＲＣＡ２速度定数を計算し（Ｔｒａｆｆｏｒｄ，  Ａ．Ｗ．、Ｍ．Ｅ．  Ｄｉａｚ、及びＤ．Ａ．  Ｅｉｓｎｅｒ著、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｆｌｕｘｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  Ｃａ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃａｆｆｅｉｎｅ．  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ誌、１９９８年、第８５３巻：３６８〜７１頁）、一方でτNiにどのような差も存在しない場合のＮＣＸを介したＣａ2+放出としてτcaffを解釈した。
【０１０３】
細胞性不整脈の検出プロトコル
結紮後ＨＦマウス、ＡｎｋＢ+/-マウス、及びＷＴ（ＡｎｋＢ+/+）に由来する単離心室筋細胞を０．５Ｈｚでは３分間、１Ｈｚでは１分間にわたって事前調整した後、各刺激頻度の後に１５秒間にわたって刺激を停止した。以前に説明されたように（Ａｒｏｎｓｅｎ，  Ｊ．Ｍ．ら著、Ｈｙｐｏｋａｌａｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃａ（２＋）  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｃａ（２＋）  ｗａｖｅｓ  ｉｎ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｎａ（＋），Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ誌、２０１５年、第５９３巻（第６号）：１５０９〜２１頁）休止中にＣａ2+ウェーブ及び／又は自発性収縮を検出した。試験対象基準は電気刺激の１０秒前の目視検査にて棒状で条線がある心筋細胞であること、及びＣａ2+ウェーブが存在しないことであった。１００ｎＭのＢａｙ６０−７５５０を使用して、及び使用せずに細胞性不整脈を記録した。一部の実験では１μＭのＴＡＴ結合スクランブルペプチド又はｓｕｐｅｒＡＫＡＰと１００ｎＭのＢａｙ６０−７５５０を使用して細胞性不整脈を検出した。ペプチドを使用する実験ではこのプロトコルの開始前に２０分間にわたって細胞をこれらのペプチドと共にインキュベートした。
【０１０４】
ホールセルＮａ+測定
細胞質Ｎａ+濃度を測定するため、室温で１２０分間にわたって０．０５％プルロニックＦ−１２７の存在する１０μＭのＳＢＦＩの中に単離されたラット心室筋細胞を入れておき、その後で２０分間にわたって脱エステル化を行った。溶液Ａを灌流し、且つ、０．５Ｈｚでフィールド刺激を与えている筋細胞において光電子増倍管（フォトン・テクノロジー・インターナショナル、ニュージャージー州、米国）を使用してＳＢＦＩ比を検出した。以前に説明されたように（Ｂａａｒｔｓｃｈｅｅｒ，  Ａ．、Ｃ．Ａ．  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、及びＪ．Ｗ．  Ｆｉｏｌｅｔ著、Ｓｍａｌｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｉｎ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ＳＢＦＩ  ｉｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｍｏｄｅ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ誌、１９９７年、第２９巻（第１２号）：３３７５〜８３頁）単独励起（３４０ｎｍ）と二元レシオメトリック放射（４１０ｎｍ／５９０ｎｍ）を使用した。シグナルを１Ｈｚで収集し、安定化させた後で記録を開始した（通常１０分間）。細胞質Ｎａ+に対するＰＤＥ２阻害の効果を試験するために１００ｎＭのＢａｙ６０−７５５０を適用した。
【０１０５】
０ｍＭと２０ｍＭのＮａ+を含む溶液で各細胞を灌流することによりその細胞を調整した。以前に説明されたように（Ｄｅｓｐａ，  Ｓ．ら著、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ［Ｎａ＋］  ａｎｄ  Ｎａ＋  ｐｕｍｐ  ｒａｔｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ誌、２００２年、第５３９巻（第１号）：１３３〜４３頁）この範囲ではＳＢＦＩシグナルは細胞内Ｎａ+レベルと比例すると考えられた。２種類の異なる校正溶液を作製し、それらの溶液を混合して所望のＮａ+濃度を達成した。両方の校正溶液が０．０１ｍＭ  グラミシジン、０．１ｍＭ  ウアバイン、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５．５ｍＭ  グルコース、２ｍＭ  ＥＧＴＡを含み、トリス塩基でｐＨ７．２に調節された。１４５ｍＭのＮａ+を含む校正溶液は１１５ｍＭのグルコン酸Ｎａ、３０ｍＭのＮａＣｌ、０ｍＭのＫＣｌも含んだ。１４５ｍＭのＫ+を含む校正溶液は１１５ｍＭのグルコン酸Ｋ、３０ｍＭのＫＣｌ、０ｍＭのＮａＣｌも含んだ。
【０１０６】
共焦点Ｃａ2+測定
以前に記載されているように（Ｌｏｕｃｈ，  Ｗ．Ｅ．ら著、Ｔ−ｔｕｂｕｌｅ  ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ  ｏｆ  Ｃａ２＋  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ誌、２００６年、第５７４巻（第２号）：５１９〜３３頁）共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  Ｌｉｖｅ７）を使用してラインスキャンモードでＣａ2+スパークを記録した。簡単に説明すると、細胞の長軸方向に沿って５１２ピクセルの線を描画した。スキャン時間は１．５ミリ秒であった。ラット心室筋細胞を１Ｈｚで３分間にわたってフィールド刺激した後、Ｃａ2+スパークを刺激停止直後に記録した。数秒後、１０ｍＭのカフェインを適用して筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量を測定した。スパーク頻度に対する負荷量依存性効果を防止するため、筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量にＣａ2+スパーク頻度を関連付けた。同じ細胞でＢａｙ６０−７５５０を使用して、及び使用せずにＣａ2+スパークを測定した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）内のＳｐａｒｋＭａｓｔｅｒ（Ｐｉｃｈｔ，  Ｅ．ら著、ＳｐａｒｋＭａｓｔｅｒ：ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｐａｒｋ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＩｍａｇｅＪ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ誌、２００７年、第２９３巻（第３号）：Ｃ１０７３〜８１頁）を使用してＣａ2+スパークを検出、及び分析した。
【０１０７】
不整脈のインビボレコーディング
結紮後ＨＦマウス、ＡｎｋＢ+/-マウス、及びＷＴ（ＡｎｋＢ+/+）マウスを４％イソフルラン、６５％Ｎ2Ｏ、及び３１％Ｏ2内で麻酔し、そして２％イソフルラン、６６％Ｎ2Ｏ、及び３２％Ｏ2を通気した。痛みへの反射作用の消失により外科的深麻酔を確認した。無作為に１匹おきにマウスを治療群のうちの１つに分け、次のマウスを他の群に割りあてた。１つの比較の中（例えば、ベヒクル対Ｂａｙ６０−７５５０）で同腹仔対照を使用することを確実にするように努力した。体温を安定に維持するために４０℃に予熱した手術台上でマウスの四肢に付属のＥＣＧ電極を取り付けて１リードＥＣＧレコーディングを行った。このプロトコル全体の中でＶＥＶＯ２１００ソフトウェア（Ｖｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ、トロント、カナダ）によりＥＣＧを連続的に記録した。シグナルをフィルタリングしなかった。このプロトコルの開始前に３〜５分間にわたってベースラインＥＣＧを記録し、この期間で稀にマウスに心室性期外収縮があった場合にこれらのマウスを除外し、薬品の注射の前にこのプロトコルを停止した。これらのマウスにＢａｙ６０−７５５０又はベヒクル（３ｍｇ／ｋｇ）又はＰＦ０５１８０９９９（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを最初に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、１０分間にわたって作用させた（Ｖｅｔｔｅｌ，  Ｃ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ誌、２０１７年、第１２０巻（第１号）：１２０〜１３２頁）後に１回目のカフェインの（１２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内）注射を行った。ペプチドを使用する実験では５ｍＭ（割合が全体重の０．７と推定される体の液相中にペプチドが自由に分布すると仮定することにより算出された）のＴＡＴ結合ｓｕｐｅｒＡＫＡＰ又はスクランブルペプチドを５分間にわたってカフェイン注射の前に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＡｎｋＢ+/-マウスを使用する実験では１回目の注射の１０分後に２回目のカフェイン（１２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行った。このプロトコルの終了後に心臓を切除してこれらの動物を殺処理し、肺と心臓の重量を量り、左心室をエッペンドルフチューブに移し、ただちに液体窒素に移し、そして−８０℃で保存した。このプロトコル全体の中でＥＣＧを記録した。ＶＥＶＯソフトウェアを使用してＥＣＧを分析した。
【０１０８】
イムノブロッティング用の心筋細胞溶解物の調製
１０ｍＭのＢＤＭを含む非滅菌溶液Ａを３７℃まで予熱し、そして溶液Ａ／ＢＤＭ中の４％ラミニンで１時間にわたってプラスチックウェルを被覆した。先に説明したようにラット心室筋細胞を単離し、溶液Ａ／ＢＤＭ中に再懸濁し、前記ラミニン被覆ウェルに播種し、そして３７℃で１時間にわたってインキュベートした。その後、これらの細胞を溶液Ａ／ＢＤＭ中で穏やかに洗浄し、再び３７℃で１時間にわたってインキュベートした。その後、表示どおりにペプチド、イソプレナリン、又は阻害剤を添加し、１０分間にわたって平衡化させた。最後に細胞を高温の（９０〜１００℃）溶解緩衝液（１％  ＳＤＳ、２ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＦ、ｄＨ2Ｏ、ｐＨ７、４）の中に回収し、液体窒素に移し、そして−８０℃で保存した。
【０１０９】
免疫沈降
ＨＥＫ２９３形質移入細胞の溶解物を抗体と２時間にわたってインキュベートし、その後で５０μＬのプロテインＡ／Ｇ  ＰＬＵＳアガロースビーズ（ｓｃ−２００３、サンタクルーズバイオテクノロジー）を４℃で一晩にわたって添加した。免疫複合体を冷ＩＰ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  トリトンＸ−１００）中で３回洗浄し、４℃で１分間にわたって３０００ｇで遠心分離にかけ、ＳＤＳ負荷緩衝液中で煮沸し、そしてイムノブロッティングにより分析した。ＦＬＡＧ−ＰＤＥ２を形質移入していないＨＥＫ２９３細胞を対照に使用した。
【０１１０】
イムノブロッティング
４〜１５％又は１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＰＶＤＦ膜へのブロッティングで免疫沈降物を分析した。それらのＰＶＤＦ膜とペプチド膜をＴＢＳＴ中の１％カゼイン又は５％ミルク中で６０分間にわたって室温でブロックし、一次抗体と４℃で一晩にわたってインキュベートし、ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間にわたって３回洗浄し、そしてＨＲＰ結合一次抗体又は二次抗体とインキュベートした。ブロットをＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア、ＲＰＮ２２３２）中でインキュベートし、そしてＬＡＳ−４０００（富士フィルム、東京、日本）によって化学発光シグナルを検出した。
【０１１１】
抗体
Ｓｅｒ６８−ＰＬＭはウィリアム・フラーから贈られた。ＨＥＫ２９３細胞からの免疫沈降物ではＦＬＡＧ−ＰＤＥ２とＧＦＰ−ＮＫＡをブロットするために抗ＦＬＡＧ抗体と抗ＧＦＰ抗体を使用した。ＰＤＥ２抗体とＮＫＡα1抗体を近接ライゲーションアッセイ実験に使用した。
【０１１２】
ｃＡＭＰ測定
ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を含有するアデノウイルス・タイプ５を成体マウス心室筋細胞に形質移入し、ｃＡＭＰ測定の前に４８時間にわたって培養した。このセンサーはｃＡＭＰに結合し、ｃＡＭＰにするとｃＡＭＰレベルに比例する光シグナルを発する。
【０１１３】
核の単離と選別／ｍＲＮＡシーケンシング
以前に説明されたように（Ｔｈｉｅｎｐｏｎｔ，  Ｂ．ら著、Ｔｈｅ  Ｈ３Ｋ９  ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＥＨＭＴ１／２  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ誌、２０１７年、第１２７巻（第１号）：３３５〜３４８頁）核の単離／選別とｍＲＮＡシーケンシングを実施した。
【０１１４】
統計学
データを平均値±Ｓ．Ｅ．として提示する。電圧クランプ実験とフィールド刺激実験についてはスチューデントの両側ｔ検定を使用し、一方で細胞性不整脈とインビボ不整脈についての全ての実験ではフィッシャーの正確確率検定を使用した。ｐ＜０．０５を有意とした。
【０１１５】
結果
ＰＤＥ２はＮＫＡ活性を調節する
細胞内Ｎａ+濃度勾配の望ましくない効果を低減させるため、単離されたラット心室筋細胞を対称的な濃度のＮａ+（すなわち、前記灌流液と前記内液でＮａ+濃度が同じ）に曝露する電圧クランププロトコルを実施した。飽和濃度の細胞外Ｋ+の除去（１５ｍＭから０ｍＭの［Ｋ+e］まで）の後にＮＫＡ電流がＫ+感応性電流として測定された（図１Ａ参照）。ＮＫＡ電流は濃度応答依存的に増加し（図１Ｂ）、一方でＡＫＡＰからＰＫＡ−ＲＩとＰＫＡ−ＲＩＩの両方を脱離させる高用量のｓｕｐｅｒＡＫＡＰ（Ｇｏｌｄら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ＡＫＡＰ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ＰＫＡ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．誌、２００６年１１月３日、第２４巻（第３号）：３８３〜９５頁）によりＮＫＡ電流が減少した（図１Ｃ）。このことは局所的なｃＡＭＰの調節によってＮＫＡ活性が調節されること、及びｃＡＭＰ分解性ホスホジエステラーゼであるＰＤＥ２〜４を阻害することによるｃＡＭＰの増加がＮＫＡ電流を増加させる可能性があることを示唆しており、次にこのことを試験することにした。
【０１１６】
３種類の異なる薬理学的阻害剤（ＥＨＮＡ、ＰＦ０５１８０９９９、及びＢａｙ６０−７５５０）を使用するＰＤＥ２阻害によりＮＫＡ電流がしっかりと増加し（図２Ａ）、一方でシロスタミドを使用するＰＤＥ３阻害もロリプラムを使用するＰＤＥ４阻害も検出可能などのような効果も有さなかった（図２Ｃ）。ＰＤＥ２欠損マウスモデルにおけるＮＫＡ電流の増加も見られ（図２Ｂ）、ＰＤＥ２がＮＫＡ活性を調節するという発見をさらに強めることになった。
【０１１７】
前記機能レコーディングと合致して、ＰＤＥ２の阻害後にホスホレマン（ＰＬＭ）のリン酸化がそのＰＫＡリン酸化の主要部位であるセリン６８において増加することも発見した。ＰＤＥ４阻害によりＰＬＭのセリン６８リン酸化が増加する一方でＰＤＥ３阻害は何の効果もないことも発見した（図２Ｄ）。
【０１１８】
ＰＤＥ２とＮＫＡは共局在し、相互作用する
ＰＤＥ２はＮＫＡ活性を調節する主要ｃＡＭＰ−ＰＤＥであると考えられる。ＰＤＥ２が局所的な調節作用を介してＮＫＡを調節している場合、この相互作用は治療目的のために特異的に標的とされる可能性がある。３０〜４０ｎｍの解像度でタンパク質間の細胞内共局在を検出するために使用される近接ライゲーションアッセイ（Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標））（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ，  Ｏ．ら著、Ｄｉｒｅｃｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｂｙ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、２００６年、第３巻（第１２号）：９９５〜１０００頁）を実施してＰＤＥ２とＮＫＡが同じ細胞内区画に存在するか調べた。図３Ａ（右の画像）の光点は完全なラット心室筋細胞中でのＰＤＥ２とＮＫＡとの共局在を示唆しており、一方で他方の画像は陰性対照である。図３Ｂはそれらの光点の定量を示しており、右側の３本のバーはＮＫＡ抗体とＰＤＥ２抗体の両方が存在したときにはるかに高いレベルの光点が存在したことを示している。次にＦＬＡＧタグ付きＰＤＥ２とＧＦＰタグ付きＮＫＡ又はＧＦＰ−ＮＫＡだけをＨＥＫ２９３細胞内で共発現させ、ＦＬＡＧを免疫沈降した。ＦＬＡＧ−ＰＤＥ２と共発現させるとＧＦＰタグ付きＮＫＡのレベルが高くなり、ＰＤＥ２とＮＫＡが共免疫沈降することが示された（図３Ｃ）。これらの結果はＰＤＥ２とＮＫＡが細胞内で共局在することを示しており、提唱されたＰＤＥ２によるＮＫＡ活性の局所的調節の構造的な基礎を提供する。
【０１１９】
ＰＤＥ２阻害によりＣａ2+トランジェントの振幅と筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量が減少する
ＰＤＥ２がＮＫＡ活性を調節し、且つ、ＮＫＡと共局在することを示したので次にＰＤＥ２が心室筋細胞におけるＣａ2+ホメオスタシスに影響を与えるか調査することにした。最初にＦｌｕｏ４−ＡＭが負荷され、フィールド刺激を受けたラット心室筋細胞におけるＣａ2+トランジェントを測定し、Ｂａｙ６０−７５５０の適用後にＣａ2+放出速度が変化することなくＣａ2+トランジェントの振幅が減少することが観察された（図４Ａ〜Ｂ）。カフェインの短時間のパルス刺激を用いて筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量を測定し（図４Ｃ）、観察されたＣａ2+トランジェントの振幅の減少と一致してＰＤＥ２阻害後に筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量が減少すること（図４Ａ、右側のパネル）を発見した。ＰＤＥ２ＫＯマウスから単離された心室筋細胞でも同じ実験を行い、Ｃａ2+放出速度には何の効果も無く、Ｃａ2+トランジェントの振幅と筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量を減少させる同様の結果が得られた（図４Ｄ）。
【０１２０】
ＰＤＥ２阻害はＮＣＸ介在性Ｃａ2+放出を増加させる
ＰＤＥ２阻害後のＣａ2+トランジェントの振幅と筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量の減少は心室筋細胞中の主要なＣａ2+処理タンパク質、すなわちＬ型Ｃａ2+チャネル、ＲｙＲ、ＮＣＸ、ＳＥＲＣＡ、又は非ＳＥＲＣＡ／非ＮＣＸ性Ｃａ2+放出タンパク質（ＰＭＣＡ及びミトコンドリアユニポーター）の活性変化によって説明可能であった。ＰＤＥ２阻害後のＣａ2+ホメオスタシスにおける様々なＣａ2+処理タンパク質の役割を解明するために一連の実験を行い、その中でＢａｙ６０−７５５０の適用後のそれらのタンパク質の活性を測定した。ＰＤＥ２阻害後のラット心室筋細胞でＳＥＲＣＡ機能又は非ＳＥＲＣＡ／非ＮＣＸ活性にたいするどのような効果も見られなかったが、一方でＮＣＸを介したＣａ2+放出が著しく増加した（図５Ａ〜Ｂ）。ＰＤＥ２ＫＯマウスにおいて実施した実験でも同じパターンが見られ、ＮＣＸを介したＣａ2+放出が増加し、ＳＥＲＣＡと非ＳＥＲＣＡ／非ＮＣＸ性Ｃａ2+処理タンパク質の活性は変化しなかった（図５Ｃ）。ＮＫＡ活性の変化はＮａ+の局所的な変化又は全体的な変化を介してＮＣＸ活性に影響する可能性があったが（Ｄｅｓｐａ，  Ｓ．、Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｎｇｒｅｌ、及びＤ．Ｍ．  Ｂｅｒｓ著、Ｎａ（＋）／Ｋ）＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２−ｉｓｏｆｏｒｍ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｃａ２（＋）  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２（＋）  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ誌、２０１２年、第９５巻（第４号）：４８０〜６頁）、ＳＢＦＩを使用しても全体的な細胞内Ｎａ+にどのような差異も検出することができず（図５Ｄ）、局所的Ｎａ+濃度勾配が関与することが示唆された。
【０１２１】
電圧固定したラット心室筋細胞ではＬ型Ｃａ2+電流（図６Ａ〜Ｂ）又はＮａ+電流（図６Ｅ）に対するＰＤＥ２阻害のどのような効果も見られなかった。また、共焦点顕微鏡観察でラインスキャンモードを用いてＦｌｕｏ４−ＡＭ負荷ラット心室筋細胞におけるＣａ2+スパークを測定し、これにより、対照とＰＤＥ２阻害との間でＣａ2+スパーク頻度に差が存在しないことが明らかになり、ＲｙＲ活性が変わらないことが示唆された（図６Ｃ〜Ｄ）。
【０１２２】
このようにＰＤＥ２阻害はＮＫＡ電流の増加、ＮＣＸを介したＣａ2+放出の増加、及びＣａ2+トランジェントの振幅と筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量の減少を引き起こし、これらの結果は以下の推論に合う。すなわち、（１）ＮＫＡ活性の上昇により局所的細胞内Ｎａ+の減少が引き起こされる。（２）その減少した細胞内Ｎａ+によりＮＣＸを介したＣａ2+流出の原動力が増強され、すなわち、ＮＣＸを介してより多くのＣａ2+が筋細胞から放出される。最後に、（３）ＮＣＸを介したより多くの筋細胞膜Ｃａ2+の放出とはＳＥＲＣＡを介した細胞内Ｃａ2+循環に利用可能なＣａ2+が少なくなることを意味し、細胞からＣａ2+が除去され、それによりＣａ2+トランジェントと筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ2+負荷量が減少することが最終的な効果である。
【０１２３】
ＰＤＥ２阻害は細胞性頻脈を防止する
Ｃａ2+過剰負荷は充分に確立された不整脈の原因であり（Ｐｏｇｗｉｚｄ，  Ｓ．Ｍ．及びＤ．Ｍ．  Ｂｅｒｓ著、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ誌、２００４年、第１４巻（第２号）：６１〜６頁、並びにＫｒａｎｉａｓ，  Ｅ．Ｇ．及びＤ．Ｍ．  Ｂｅｒｓ著、Ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ．  Ｓｕｂｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ誌、２００７年、第４５巻：５２３〜３７頁）、Ｃａ2+ウェーブ（Ａｒｏｎｓｅｎ，  Ｊ．Ｍ．ら著、Ｈｙｐｏｋａｌａｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃａ（２＋）  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｃａ（２＋）  ｗａｖｅｓ  ｉｎ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｎａ（＋），Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ誌、２０１５年、第５９３巻（第６号）：１５０９〜２１頁）と有害な副次効果（Ｐｅｚｈｏｕｍａｎ，  Ａ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｙｐｏｋａｌｅｍｉａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ誌、２０１５年、第１３２巻（第１６号）：１５２８〜１５３７頁）を引き起こし、逆に細胞内Ｃａ2+を減少させる薬剤、例えばＣａ2+チャネル遮断薬は不整脈を防止する可能性がある。心不全は大きな心室性不整脈のリスクを有する疾患（Ｐｏｇｗｉｚｄ，  Ｓ．Ｍ．及びＤ．Ｍ．  Ｂｅｒｓ著、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ誌、２００４年、第１４巻（第２号）：６１〜６頁）であり、一方でアンキリンＢ症候群は４型ＱＴ延長症候群の原因となる遺伝疾患（Ｍｏｈｌｅｒ，  Ｐ．Ｊ．ら著、Ａｎｋｙｒｉｎ−Ｂ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｙｐｅ  ４  ｌｏｎｇ−ＱＴ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  ｓｕｄｄｅｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅａｔｈ．  Ｎａｔｕｒｅ誌、２００３年、第４２１巻（第６９２３号）：６３４〜９頁）である。ＰＤＥ２阻害によりＣａ2+トランジェントの振幅が減少するため、ＰＤＥ２阻害により心室筋細胞におけるＣａ2+ウェーブが心不全マウス及びアンキリンＢ+/-マウス（ＱＴ延長症候群）で防止されるという仮説を立てた。まず、結紮後心不全マウスに由来する心室筋細胞においてＰＤＥ２阻害によりＮＫＡ電流が増加し、且つ、Ｃａ2+トランジェントが減少することを確認した（図７Ａ〜Ｂ）。心不全マウスとアンキリンＢ+/-マウス（ＱＴ延長症候群）の両方に由来する筋細胞でかなりの量のＣａ2+ウェーブが検出されたが、ＰＤＥ２阻害によりＣａ2+ウェーブは大いに減少又は消失した（図７Ｃ〜Ｄ）。ＷＴマウス（アンキリンＢ+/-マウスの同腹仔）ではＣａ2+ウェーブの頻度に差が存在せず、これは対照条件時の低頻度のＣａ2+ウェーブを考慮して予期されたとおりである（図７Ｄ、右側のパネル）。
【０１２４】
結論として、公知の心不整脈モデルではＰＤＥ２阻害により細胞性頻脈が防止される。
【０１２５】
ＰＤＥ２阻害は心不全マウス及びアンキリンＢ+/-症候群（ＱＴ延長症候群）マウスにおいて心室頻脈を防止する
ＰＤＥ２阻害によりインビボで心室頻脈が防止されるか試験するため、麻酔された結紮後ＨＦマウスとＡｎｋＢ+/-マウスに１２０ｍｇ／ｋｇの用量でカフェインを急速注入するプロトコル（Ｋａｎｎａｎｋｅｒｉｌ，  Ｐ．Ｊ．ら著、Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｒ１７６Ｑ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｙａｎｏｄｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ誌、２００６年、第１０３巻（第３２号）：１２１７９〜８４頁）を実施し、１リードＥＣＧで心臓リズムをモニタリングした（図８Ａ及び図９Ａにプロトコルが概説される）。このプロトコルをＷＴ動物でも試し、その場合は１回のカフェイン注射は不整脈を誘発するのに充分ではなく（データを示さず）、一方で結紮後ＨＦマウスとＡｎｋＢ+/-マウスの両方は心室性不整脈を示した。正常な洞調律の例と心室頻脈の例が図８Ｂに示されており、観察された典型的な心室頻は両方向心室頻拍と多源性心室頻拍であった。Ｂａｙ６０−７５５０を使用する実験ではベヒクル注射（対照）を受けた５匹のうち４匹（８０％）の心不全マウスで心室頻脈と心停止が発生し、一方でこの結果は３ｍｇ／ｋｇの用量でＢａｙ６０−７５５０の注射（Ｖｅｔｔｅｌ，  Ｃ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ誌、２０１７年、第１２０巻（第１号）：１２０〜１３２頁）を受けた５匹のうち０匹（０％）の心不全マウスで見られた（図８Ｃ）。Ｂａｙ６０−７５５０群の１匹のマウスで心室性不整脈が発生したが、注目すべきことにこれは心停止にまで至らなかった。ＰＦ０５１８０９９９を使用する実験ではベヒクル注射（対照）を受けた５匹のうち４匹（８０％）の心不全マウスで心室頻脈が発生し、一方でこの結果は１ｍｇ／ｋｇの用量でＰＦ０５１８０９９９の注射を受けた５匹のうち１匹（２０％）の心不全マウスで見られた（図８Ｄ）。
【０１２６】
アンキリンＢ+/-マウス（ＱＴ延長症候群）に対してＢａｙ６０−７５５０を使用する実験では対照群（ベヒクル注射）の８匹のうち５匹（６３％）で心室頻脈が発生した（図８Ｄ）。さらに、２匹のマウスで上室性頻脈が発生した（データを示さず）。一方、介入群（Ｂａｙ６０−７５５０注射）の８匹のうち０匹（０％）で心室頻脈（図９Ｃ）又は上室性頻脈（データを示さず）が発生した。ＰＦ０５１８０９９９を使用する実験では対照群（ベヒクル注射）の５匹のうち５匹（１００％）で心室頻脈が発生し、一方で１ｍｇ／ｋｇの用量のＰＦ０５１８０９９９により５匹のうち１匹（２０％）で心室頻脈が発生した（図９Ｄ）。
【０１２７】
ＱＴ延長症は心室頻脈の公知のリスク因子である（Ｏｓａｄｃｈｉｉ，  Ｏ．Ｅ．著、Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｈｙｐｏｋａｌｅｍｉａ  ｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｗｉｎｄｏｗ，  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ−ｐｉｇ  ａｎｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｈｅａｒｔｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ誌、２０１４年、第９巻（第８号）：ｅ１０５５９９頁）。カフェイン後注射に対するベースラインＥＣＧからＱＴ間隔の延長が結紮後ＨＦマウスとＡｎｋＢ+/-マウスの両方のベヒクル群で観察され、一方でＢａｙ６０−７５５０群及びＰＦ０５１８０９９９群ではＱＴ間隔に差が存在しなかった（図８Ｃ〜Ｄ及び図９Ｃ〜Ｄ、右側のパネル）。
【０１２８】
まとめると、確立された心不整脈のマウスモデルでＰＤＥ２阻害により有害な心室頻脈とＱＴ延長症が防止されることが見られている。このことはＰＤＥ２阻害が様々な臨床背景、例えば心不全患者における心臓頻脈治療の新しい標的であることを示している。
【０１２９】
ＮＫＡのＰＤＥ２調節は局所的ＰＫＡ−ＲＩＩ活性に依存する
ＰＤＥ２とＮＫＡは完全な心室筋細胞内で共局在するため、興味深い可能性としてＮＫＡのＰＤＥ２調節が局所的ｃＡＭＰ濃度勾配及び局所的ＰＫＡ活性に依存することが挙げられる。この考えに合致してＢａｙ６０−７５５０を用いる処理後にｃＡＭＰレベルのどのような全体的な増減も検出されなかった。イソプレナリンが陽性対照使用され、２０ｎＭのイソプレナリンを適用することでｃＡＭＰレベルが大いに上昇した（図１０Ａ）。低用量のＲＩＡＤ及びｓｕｐｅｒＡＫＡＰ（１μＭ）が非常に特異的なＡＫＡＰ結合ＰＫＡ−ＲＩの解離因子（ＲＩＡＤ）とＡＫＡＰ結合ＰＫＡ−ＲＩＩの解離因子（ｓｕｐｅｒＡＫＡＰ）であることが確定されており、一方でより高濃度のｓｕｐｅｒＡＫＡＰ（２０μＭ）によってＰＫＡ−ＲＩとＰＫＡ−ＲＩＩの両方が脱離する（Ｇｏｌｄら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ＡＫＡＰ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ＰＫＡ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．誌、２００６年１１月３日、第２４巻（第３号）：３８３〜９５頁）。電圧固定した筋細胞へのｓｕｐｅｒＡＫＡＰ（高用量と低用量の両方）の透析後にＮＫＡ電流はＰＤＥ２阻害によって変化しなかった。しかしながら、それでもＰＤＥ２阻害によってＲＩＡＤ（ＰＫＡ−ＲＩ解離因子）の存在下でＮＫＡ電流が増加し、ＮＫＡのＰＤＥ２調節が専らＡＫＡＰに結合した局所的なＰＫＡ−ＲＩではなくＰＫＡ−ＲＩＩの活性に依存することが示唆された（図１０Ｃ）。ＮＫＡα２とＰＫＡ上の触媒部位及びＰＫＡ−ＲＩＩαの両方との間の正の共免疫沈澱（ＩＰ）も見られた（図１０Ｂ）。これはＮＫＡ、ＰＤＥ２、及びＡＫＡＰ結合ＰＫＡ−ＲＩＩから構成される局所的調節複合地という考えを裏付けるものである（提唱モデルについては図１２参照）。
【０１３０】
ＰＤＥ２阻害の抗不整脈作用はＡＫＡＰ結合ＰＫＡ−ＲＩＩに依存する
我々はＰＤＥ２阻害が局所的ｃＡＭＰプールの調節を介してＮＫＡを活性化し、且つ、心室性不整脈を防止することを提唱しており、そこでＰＤＥ２阻害により防止される細胞性不整脈とインビボ不整脈の両方がｓｕｐｅｒＡＫＡＰの適用後に再発するだろうという仮説を立てた。図１０Ｃに示されているように、ＴＡＴ−スクランブルペプチドと比較してＴＡＴ−ｓｕｐｅｒＡＫＡＰと共に細胞をインキュベートし、且つ、灌流したとき、Ｂａｙ６０−７５５０が存在するとＣａ2+ウェーブの頻度が増加する。結紮後ＨＦとＡｎｋＢ+/-の両方において、且つ、調査した両方の刺激頻度においてＣａ2+ウェーブ量の増加が見られた（図１０Ｄ）。
【０１３１】
インビボでＰＤＥ２阻害の抗不整脈作用を元に戻すｓｕｐｅｒＡＫＡＰの能力も図１１Ａに概説されるように調査した。結紮後ＨＦマウス（６匹のうちの４匹）とＡｎｋＢ+/-マウス（５匹のうちの３匹）の両方でＴＡＴ−ｓｕｐｅｒＡＫＡＰが注射されると心室性不整脈がＢａｙ６０−７５５０処理時に再発した。しかしながら、結紮後ＨＦマウス（６匹のうちの０匹）とＡｎｋＢ+/-マウス（５匹のうちの０匹）ではＴＡＴ−スクランブルが注射されるとＢａｙ６０−７５５０処理時に不整脈が観察されなかった。ＰＤＥ２阻害によりＮＫＡを活性化する局所的シグナル伝達ドメインの調節を介して細胞性頻脈とインビボ頻脈が防止されることがこれらの結果から確認される。
【０１３２】
ＰＤＥ２はヒト心臓肥大症及び加齢時に心筋細胞において上方制御される
ＰＤＥ２阻害を将来の抗不整脈治療選択肢とするため、ＰＤＥ２がヒト心臓組織に存在し、且つ、疾患時に存在することを確定する必要がある。ヒト心不全時にＰＤＥ２が上方制御されることが以前に報告されているが（Ｍｅｈｅｌ，  Ｈ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−２  ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｅａｒｔｓ  ａｎｄ  ｂｌｕｎｔｓ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ誌、２０１３年、第６２巻（第１７号）：１５９６〜６０６頁）、これらの分析は他の細胞種も含む左心室組織に対して行われた（Ｔｈｉｅｎｐｏｎｔ，  Ｂ．ら著、Ｔｈｅ  Ｈ３Ｋ９  ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ＥＨＭＴ１／２  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ誌、２０１７年、第１２７巻（第１号）：３３５〜３４８頁）。単離、且つ、選別された心筋細胞核に対してｍＲＮＡシーケンシングを実施し、ＰＤＥ２Ａ−ｍＲＮＡ発現がヒト左心室心臓肥大症時、及び加齢個体において上方制御されることを発見した。ＰＤＥ２Ａ−ｍＲＮＡ発現は結紮後ＨＦラットに由来する心筋細胞核でも上昇した（図１３）。したがって、適切な疾患モデルの心筋細胞でＰＤＥ２Ａが上方制御されること、すなわち、ヒトにおいて不整脈治療目的でＰＤＥ２Ａを標的とすることが可能であることがわかる。
【０１３３】
結論
ＰＤＥ２阻害により局所的ＰＫＡ活性の調節を介してＮＫＡ活性を増大し、最終的には筋細胞Ｃａ2+負荷の減少及び催細胞性不整脈性と催インビボ不整脈性の減少を引き起こす新しい抗不整脈機構によりＰＤＥ２阻害が結紮後ＨＦマウスとヘテロ接合性アンキリンＢ+/-マウス（ＱＴ延長症候群）において心室頻脈を強力に防止することが示された。ＰＤＥ２阻害後にＮＣＸを介したＣａ2+放出が増加し、それにより筋細胞のＣａ2+負荷の減少についての機序が提議され、一方で我々の知る限りではＰＤＥ２阻害により調節されるＣａ2+処理タンパク質はＬＴＣＣ、ＲｙＲ、ＳＥＲＣＡ２、及び非ＳＥＲＣＡ２／非ＮＣＸ性Ｃａ2+放出タンパク質を含んで他に存在しなかった。ＮＣＸを介したＣａ2+放出の増加はＮＣＸに対する直接的なＰＤＥ２介在性作用又は細胞内Ｎａ+の改変に至る下流効果のどちらかにより説明可能であった。βアドレナリン作動性シグナル伝達の活性化とその後のＰＬＭのリン酸化がＮＣＸを負に調節することが以前に示されている（Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｊ．Ｙ．ら著、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｎａ＋／Ｃａ２＋  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｅｍｍａｎ．  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ誌、２００７年、第１０９９巻：１１９〜３４頁、及びＷａｎｉｃｈａｗａｎ，  Ｐ．ら著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｅｍｍａｎ  （ＰＬＭ）  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ／ｃａｌｃｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  １  （ＮＣＸ１）．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ誌、２０１６年、第４７３巻（第１５号）：２４１３〜２３頁）。したがって、ＰＤＥ２阻害がＰＬＭに対する作用によりＮＣＸを介したＣａ2+放出を増加させることはありそうにない。ＮＫＡ活性化が細胞内Ｎａ+の減少を引き起こし、それが我々と他のグループによって以前に示されたようにＮＣＸに対する下流効果を有する可能性があった（Ａｒｏｎｓｅｎ，  Ｊ．Ｍ．ら著、Ｈｙｐｏｋａｌａｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃａ（２＋）  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｃａ（２＋）  ｗａｖｅｓ  ｉｎ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｎａ（＋），Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ誌、２０１５年、第５９３巻（第６号）：１５０９〜２１頁、並びにＤｅｓｐａ，  Ｓ．、Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｎｇｒｅｌ、及びＤ．Ｍ．  Ｂｅｒｓ著、Ｎａ（＋）／Ｋ）＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２−ｉｓｏｆｏｒｍ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｃａ２（＋）  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２（＋）  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ誌、２０１２年、第９５巻（第４号）：４８０〜６頁）。ＮＫＡとＮＣＸは局所的Ｎａ+領域内で相互作用することが示されており，その領域では全体的細胞内Ｎａ+の変化によるＣａ2+ホメオスタシスと収縮能に対する下流効果はほとんど予測されていない（Ｄｅｓｐａ，  Ｓ．、Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｎｇｒｅｌ、及びＤ．Ｍ．  Ｂｅｒｓ著、Ｎａ（＋）／Ｋ）＋）−ＡＴＰａｓ���  ａｌｐｈａ２−ｉｓｏｆｏｒｍ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｃａ２（＋）  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２（＋）  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ誌、２０１２年、第９５巻（第４号）：４８０〜６頁）。本研究ではＳＢＦＩを使用する細胞内Ｎａ+測定は感度が低いが全体的な細胞内Ｎａ+の変化は見られず（Ｂａａｒｔｓｃｈｅｅｒ，  Ａ．、Ｃ．Ａ．  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、及びＪ．Ｗ．  Ｆｉｏｌｅｔ著、Ｓｍａｌｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｉｎ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ＳＢＦＩ  ｉｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｍｏｄｅ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ誌、１９９７年、第２９巻（第１２号）：３３７５〜８３頁、及びＳｗｉｆｔ，  Ｆ．ら著、Ｔｈｅ  Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２−ｉｓｏｆｏｒｍ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ誌、２００７年、第７５巻（第１号）：１０９〜１７頁）、観察されたＮＣＸに対する効果は限られた領域における局所的Ｎａ+プールのＮＫＡ調節によるものであることが示唆された。
【０１３４】
古典的なジギタリス誘発性不整脈によって明らかなようにＮＫＡ活性低下は新たな不整脈誘発経路であるが、最近になってＮＫＡ活性低下は我々のグループ（Ａｒｏｎｓｅｎ，  Ｊ．Ｍ．ら著、Ｈｙｐｏｋａｌａｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃａ（２＋）  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｃａ（２＋）  ｗａｖｅｓ  ｉｎ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｎａ（＋），Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ誌、２０１５年、第５９３巻（第６号）：１５０９〜２１頁）とＰｅｚｈｏｕｍａｎら（Ｐｅｚｈｏｕｍａｎ，  Ａ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｙｐｏｋａｌｅｍｉａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ誌、２０１５年、第１３２巻（第１６号）：１５２８〜１５３７頁）によって低カリウム血症誘発性不整脈に役割を有する（Ｆａｇｇｉｏｎｉ，  Ｍ．及びＢ．Ｃ．  Ｋｎｏｌｌｍａｎｎ著、Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｙｐｏｋａｌｅｍｉａ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃａ２＋−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋ＋  Ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ誌、２０１５年、第１３２巻（第１５号）：１３７１〜３頁）ことも強調されている。このことはＮＫＡ活性の上昇が抗不整脈作用を有する可能性があることを意味しているが、そのようなＮＫＡ活性化因子は存在せず、この機会は未開拓のまま残されている。我々は本明細書においてＰＤＥ２阻害がＮＫＡ活性を３０〜５０％増大させることを報告している。我々と他のグループは同様のＮＫＡ活性の低下が強い不整脈誘発性作用を有することを以前に報告している。全体的なＮＫＡ活性のわずかな変化がＮＫＡアイソフォーム及びＮＣＸとの共局在に依存的に収縮能に関する大きな下流効果に転化し得ることも以前に示されている（Ｄｅｓｐａ，  Ｓ．、Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｎｇｒｅｌ、及びＤ．Ｍ．  Ｂｅｒｓ著、Ｎａ（＋）／Ｋ）＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２−ｉｓｏｆｏｒｍ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｃａ２（＋）  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２（＋）  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ誌、２０１２年、第９５巻（第４号）：４８０〜６頁）。
【０１３５】
以前の研究からＰＤＥ２の過剰発現がカテコールアミン誘発性不整脈を防止することが見いだされたが（Ｖｅｔｔｅｌ，  Ｃ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ誌、２０１７年、第１２０巻（第１号）：１２０〜１３２頁）、これは明らかに我々の発見とは対照的である。ＰＤＥ２は二重特異性ＰＤＥであり、ｃＧＭＰとｃＡＭＰの両方を分解するが、異なる親和性と最大速度を有する（Ｂｅｎｄｅｒ，  Ａ．Ｔ．及びＪ．Ａ．  Ｂｅａｖｏ著、Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ誌、２００６年、第５８巻（第３号）：４８８〜５２０頁）。重要なことに、ＰＤＥ２活性は高度に区分化されていることが示されており、特定の領域でｃＡＭＰレベルが調節され、このことはＰＤＥ２が様々な領域において高度に分化した役割を有する可能性があることを示唆している（Ｚａｃｃｏｌｏ，  Ｍ．及びＭ．Ａ．  Ｍｏｖｓｅｓｉａｎ著、ｃＡＭＰ  ａｎｄ  ｃＧＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ誌、２００７年、第１００巻（第１１号）：１５６９〜７８頁）。βアドレナリン作動性受容体のカテコールアミン誘発性活性化後にＰＤＥ２の過剰発現によりｃＡＭＰの細胞内上昇が限定されることが予期される（Ｖｅｔｔｅｌ，  Ｃ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ誌、２０１７年、第１２０巻（第１号）：１２０〜１３２頁）。しかしながら、特定の区画においてｃＡＭＰが変化するか、又は観察された有益な効果がｃＡＭＰレベルの全体的な低下によるものであるのかは明らかではない。本研究で我々はＰＤＥ２阻害によりＮＫＡ電流が増加し、細胞内Ｃａ2+負荷が減少し、且つ、βアドレナリン作動性受容体を事前に活性化することなく細胞性頻脈とインビボ頻脈が防止されることを報告する。βアドレナリン作動性受容体を活性化しないでＰＤＥ２阻害後にｃＡＭＰレベルが全体的に上昇（又は低下）することは見られておらず、ＰＤＥ２阻害が特定の領域のｃＡＭＰレベルを調節することで利益を与えることが示唆される。我々は、ＰＤＥ２阻害がＣａ2+処理タンパク質に対してほとんど、又は全く他の効果を持たずにＮＫＡを特異的に活性化すると提唱する。我々のアプローチは２つの重要な部分で以前の研究と異なっている。すなわち、（１）βアドレナリン作動性受容体の活性化により細胞内ｃＡＭＰの全体的増加が引き起こ���れ、（２）ＰＤＥ２の過剰発現は必ずしも特定の領域におけるｃＡＭＰを変えないが、ｃＡＭＰレベルの全体的低下を反映する可能性がある。ＰＤＥ２阻害後の心臓肥大症に対する有益な作用が以前の研究によって発見されたが、局所的ＰＫＡ活性の毀損後にこの作用は抑制された（Ｚｏｃｃａｒａｔｏ，  Ａ．ら著、Ｃａｒｄｉａｃ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  Ｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｌｏｃａｌ  Ｐｏｏｌ  ｏｆ  ｃＡＭＰ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ誌、２０１５年、第１１７巻（第８号）：７０７〜１９頁）。本研究での我々の発見と共にこのことは、ＰＤＥ２阻害が特定の領域におけるｃＡＭＰの増加に起因して利益を与え、一方で提唱されたＰＤＥ２過剰発現の有益な作用は全体的なｃＡＭＰ分解を含む非特異的な作用に起因する可能性があることを示唆する。
【０１３６】
実施例２
マウスにおける心室頻脈の防止に関する他の公知のＰＤＥ２阻害剤の活性を実証するためにそれらの阻害剤を使用して実施例１の方法を繰り返した。
【０１３７】
不整脈のインビボレコーディング
実施例１において説明された設定と同じ実験設定を用いてＡＢから１週間後のＨＦマウスにおいてＮＤ−７００１（１０ｍｇ／ｋｇ）とＬｕＡＦ６４２８０（２０ｍｇ／ｋｇ）を試験した。対照注射にＤＭＳＯを使用した。前記ＰＤＥ２阻害剤の注射とその後のカフェイン注射の前に全てのマウスにおいて顕著な心筋リモデリングが確認された。
【０１３８】
結果
ＰＤＥ２阻害は心不全マウスにおいて心室頻脈を防止する
ＮＤ−７００１とＬｕＡＦ６４２８０の両方によりＨＦマウスでＶＴが防止され、ＮＤ−７００１では５匹のうち０匹（０％）でＶＴが発生し、ＬｕＡＦ６４２８０では３匹のうち０匹（０％）でＶＴが発生した（図１４）。まとめると、Ｂａｙ６０−７５５０、ＰＦ０５１８０９９９、ＮＤ−７００１、及びＬｕＡＦ６４２８０の４種類のＰＤＥ２阻害剤によりＨＦマウスでＶＴが防止された。
【０１３９】
結論
確立されたモデルにおいてさらに２種類のＰＤＥ２阻害剤により心室頻脈が防止されることが示された。
【０１４０】
実施例３
一般的に使用される不整脈治療薬であるメトプロロールと比較して、且つ、メトプロロールと組み合わせて前記ＰＤＥ２阻害剤Ｂａｙ６０−７５５０の抗不整脈作用を調べた。
【０１４１】
不整脈のインビボレコーディング
実施例１において説明された方法と同じ方法で前記ＰＤＥ２阻害剤Ｂａｙ６０−７５５０の抗不整脈作用をメトプロロールと比較して調べた。対照注射を受ける群とＢａｙ６０−７５５０とメトプロロールの組合せを受ける群も含めた。無作為に、しかし群のサイズを予め決めてマウスを処理群に割り当てた。全ての群を５日間にわたって処理し、５．５ｍｇ／ｋｇのメトプロロール（Ｚｈｏｕ，  Ｑ．ら著、Ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｎｅｗ  ａｎａｌｏｇｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ａｒｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｔｏｒｅ  ｏｖｅｒｌｏａｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃａ２＋  ｒｅｌｅａｓｅ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．誌、２０１１年、第１７巻（第８号）：１００３〜９頁参照）を毎日１回（午前中に）注射し、一方で３ｍｇ／ｋｇのＢａｙ６０−７５５０と対照を毎日２回（午前午後に）注射した。長期注射のためにＢａｙ６０−７５５０を５％エタノールと９５％ヒマワリ油の混液中に溶解し、対照群は同じベヒクルを受けた。メトプロロールのみの群に５％エタノールを注射に加えてエタノール依存性効果を最小限に抑えた。５日目に最後の注射の前に全ての動物のベースラインＥＣＧをレコーディングした。前記不整脈プロトコルの１０〜２０分前に最後の注射を行った。実施例１において説明されたように最後の注射、麻酔、不整脈誘発、ＥＣＧ記録、及びＥＣＧ分析を実施した。
【０１４２】
結果
ＰＤＥ２阻害はＣａ2+誘発性心室性不整脈の防止についてβ遮断薬よりも優れている
臨床的にはβ遮断薬がＨＦと遺伝的不整脈症候群の両方の場合で心室頻脈性不整脈を防止するために最も一般的に使用される不整脈治療薬である（Ａｌ−Ｋｈａｔｉｂ，  Ｓ．Ｍ．ら著、２０１７  ＡＨＡ／ＡＣＣ／ＨＲＳ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｄｄｅｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｄｅａｔｈ：Ａ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｒｈｙｔｈｍ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ誌、２０１７年参照）。この抗不整脈作用機序は主にβアドレナリン作動性受容体の下流でｃＡＭＰ／ＰＫＡ依存性効果を抑止することであり、一方でＰＤＥ２阻害の抗不整脈作用はＮＫＡの特異的活性化と細胞内Ｃａ２＋レベルの低下に起因すると我々は提唱している。我々は以下の疑問について調査を行った。第１に、Ｃａ２＋誘発性心室性不整脈の防止に関してＰＤＥ２阻害はβ遮断薬よりも優れているのか。第２に、ＰＤＥ２阻害の抗不整脈作用はβ遮断薬と組み合わせられたときもあるのか。これらの疑問に答えるために５５匹のＡｎｋＢ＋／−マウスを４群、すなわちベヒクル群、メトプロロール（５．５ｍｇ／ｋｇ）群、Ｂａｙ６０−７５５０（３ｍｇ／ｋｇ）群、又はＢａｙ６０−７５５０（３ｍｇ／ｋｇ）とメトプロロール（５．５ｍｇ／ｋｇ）の組合せの群に無作為に割り当てた。全てのマウスが５日間にわたって注射を受け、最終日にこれらのマウスにカフェイン（１２０ｍｇ／ｋｇ）を注射して心室性不整脈を誘発させた（図１５Ａ）。ベヒクル群では１１匹のうち８匹でＶＴが発生し、且つ、１１匹のうち１１匹で心室性不整脈（ＶＴ、心室性二段脈、又は連結期の長い心室性期外収縮（ＶＥＳ））が発生した。メトプロロール群では１５匹のうち５匹でＶＴが発生し、且つ、１５匹のうち１４匹で心室性不整脈（ＶＴ、心室性二段脈、及び連結期の長いＶＥＳ）が発生した。一方、Ｂａｙ６０−７５５０で処理されたマウスでは心室性不整脈が著しく少なく（１３匹のうち４匹がＶＴ及び心室性二段脈）、一方で１３匹のうち２匹でＶＴが発生した。メトプロロールとＢａｙ６０−７５５０の組合せを受けた群では１５匹のうち０匹でマウスＶＴがあり、１５匹のうち２匹で心室性不整脈（心室性二段脈）があった（図１５Ｂ及びＣ）。メトプロロール単独とＢａｙ６０−７５５０との組合せの両方でメトプロロール注射後にＱＴ延長症があった。メトプロロール群及びベヒクル群と対照的にＢａｙ６０−７５５０を受けた群ではどちらもカフェイン注射後にＱＴ延長症が発生しなかった（図１５Ｄ）。
【０１４３】
β遮断薬は現代の抗不整脈治療の基礎であるが、我々の結果からＰＤＥ２阻害はこの治療方式を補完し、且つ、相加的効果すら提供することが可能であると示唆される。
【０１４４】
結論
ＰＤＥ２阻害単独によって、又はメトプロロールとの併用によって対照又はメトプロロール単独よりも効率的にＣａ2+誘発性心室性不整脈が防止されたことが前記結果から明らかに示唆されている。多くの心臓病患者が既にβ遮断薬を使用しているため、ＰＤＥ２阻害剤とβ遮断薬の併用がβ遮断薬単独よりも優れているということは重要な発見である。このことは、ＰＤＥ２阻害が追加療法として有効であり、幾つかの臨床背景で非常に適切である可能性があることを示唆している。
【０１４５】
実施例４
実施例１の実験を拡大してＢＡＹ６０−７５５０に関してＣａ2+電流、Ｎａ+電流、Ｋ+電流、及び活動電位（ＡＰ）も調査した。
【０１４６】
Ｌ型Ｃａ2+電流（ＬＴＣＣ）
広口タイプのパッチピペット（１．４〜１．８ＭΩ）に内液（Ｌｅｒｏｙ，  Ｊ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．誌、２０１１年、第１２１巻（第７号）：２６５１〜６１頁 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA より改変して１２２ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ2（０．６ｍＭの遊離Ｍｇ2+）、５ｍＭ  Ｎａ2ホスホジクレアチニン、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2（３ｎＭの遊離Ｃａ2+）、０．００５ｍＭ  ｃＡＭＰ、ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調節）を充填した。全てのレコーディングで直列抵抗は４〜８ＭΩの間であった。−４５ｍＶ〜５５ｍＶまでの範囲の（１０ｍＶ毎の）ステップで１００ｍｓの電圧ステップを−４５ｍＶの保持電位から様々な試験電位まで実施した。
【０１４７】
Ｎａ+電流
低抵抗性ピペット（１．４〜２．５ＭΩ）に内液（Ｌｅｒｏｙ，  Ｊ．ら著、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｃａ（２）（＋）  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．誌、２０１１年、第１２１巻（第７号）：２６５１〜６１頁より改変して１２２ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ2（０．６ｍＭの遊離Ｍｇ2+）、５ｍＭ  Ｎａ2ホスホジクレアチニン、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ2（３ｎＭの遊離Ｃａ2+）、０．００５ｍＭ  ｃＡＭＰ、ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調節）を充填した。全てのレコーディングで直列抵抗は４〜７．５ＭΩの間であった。前記細胞を溶液Ａ中でパッチしたが、ホールセルアクセスの達成後に溶液Ｄ（１２５ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＮｉＣｌ2、ＣｓＯＨでｐＨ７．４に調節）を適用した。実験当日に２０μＭのニフェジピンを添加してＬ型Ｃａ2+チャネルを阻害した。保持電位は−８０ｍＶであった。−８０ｍＶ〜７０ｍＶまでの範囲の（１５ｍＶ毎の）ステップで５０ｍｓの電圧ステップを−８０ｍＶの保持電位から様々な試験電位まで実施した。
【０１４８】
バックグラウンドＫ+電流
以前に説明されたように（Ａｒｏｎｓｅｎ，  Ｊ．Ｍ．ら著、Ｈｙｐｏｋａｌａｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃａ（２＋）  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｃａ（２＋）  ｗａｖｅｓ  ｉｎ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｎａ（＋），Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ誌、２０１５年、第５９３巻（第６号）：１５０９〜２１頁参照）Ｋ+電流を測定した。簡単に説明すると、−１７０ｍＶ〜５０ｍＶまでの範囲の（１０ｍＶ毎の）ステップで５００ｍｓの電圧ステップを−８０ｍＶの保持電位から様々な試験電位まで実施した。パルスの終末近くの安定期で電流を分析した。対照レコーディングとＢａｙ６０−７５５０を使用するレコーディングを同じ細胞に行った。ピペット抵抗は２〜２．５ＭΩであり、直列抵抗は４〜８ＭΩであった。
【０１４９】
活動電位（ＡＰ）
３ｍｓの閾値上電流注入によりＡＰを誘発した。ピペット液は１３０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．００５ｍＭ  ｃＡＭＰを含み、ＫＯＨでｐＨ７．２に調節した。溶液Ａで前記細胞を灌流した。ピペット抵抗は２〜２．５ＭΩであり、直列抵抗は４．８〜９．３ＭΩであった。０％がピーク電位であり、且つ、１００％が休止膜電位である２０％（ＡＰＤ２０）、５０％（ＡＰＤ５０）、７０％（ＡＰＤ７０）、及び９０％（ＡＰＤ９０）でＡＰを分析し、所与の相対電位において実際の膜電位を測定した。対照レコーディングとＢａｙ６０−７５５０を使用するレコーディングを同じ細胞に行った。
【０１５０】
結果
ＰＤＥ２阻害は高い標的特異性を有する
現在の抗不整脈治療薬は、Ｎａ+チャネル、Ｋ+チャネル、及びＣａ2+チャネルの阻害剤を含むクラス１〜クラス４の不整脈治療薬に分類可能である。我々は図１６ｃにおいてＰＤＥ２阻害がＣａ2+電流に対して何の効果も無いことを示した。我々はここでＰＤＥ２阻害が電圧固定したＡＲＶＭにおいてＣａ2+電流（図１７ａ）、Ｋ+電流（図１７ｂ）、又はＮａ+電流（図１７ｃ）に対して何の効果も無いことも示した。Ｎａ+電流、Ｋ+電流、及びＣａ2+電流の抑制により活動電位持続時間（ＡＰＤ）が延長されることが予期される。一方、ＰＤＥ２阻害はＮａ+電流、Ｋ+電流、及びＣａ2+電流に影響せずにＮＫＡ活性を選択的に増大させるというモデルと合致して、ＡＰがＡＰＤ５０、ＡＰＤ７０、及びＡＰＤ９０においてＰＤＥ２阻害により短くなること（図１７ｄ）が観察された。これらの結果は、ＰＤＥ２阻害が他の以前に知られている抗不整脈標的に何の効果も無く、非常に特異的にＮＫＡを活性化することを示している。
【０１５１】
結論
現在の心室性不整脈に対する薬理学的治療戦略にはクラスＩ〜クラスＩＶの不整脈治療薬が含まれる。しかしながら構造的心疾患の患者には不整脈誘発性作用のために禁忌とされている不整脈治療薬もある。新しい不整脈治療戦略は、あまり多くの標的外効果を有さず、特定の不整脈の機構を標的とするものであることが好ましい。ＰＤＥ２阻害剤は、ＳＥＲＣＡ、ＲｙＲ、非ＳＥＲＣＡ／非ＲｙＲ性Ｃａ2+放出タンパク質、Ｃａ2+電流、Ｎａ+電流、及びＫ+電流（内向き整流チャネルと遅延整流チャネル）を含むＣａ2+処理タンパク質及びイオンチャネルに対して効果を有さずにＮＫＡを活性化することが我々の結果から示唆される。この高レベルの特異性はＮＫＡとＰＤＥ２との間の密接な相互作用に由来すると考えられる。
【０１５２】
多種多様な分子生物学及び画像撮影の技術を使用することにより、ＮＫＡとＰＤＥ２が心筋細胞において相互作用し、且つ、共局在すること、及びＰＤＥ２阻害がｃＡＭＰを全体的に増加させるのではなくＮＫＡの周囲でｃＡＭＰを局所的に増加させることが示されている。さらに、非常に特異的にＡＫＡＰからＲＩＩ−ＰＫＡを脱離させるペプチドであるｓｕｐｅｒＡＫＡＰが存在するとＮＫＡのＰＤＥ２調節が鈍くなる。このことと合致して、ｓｕｐｅｒＡＫＡＰが存在すると心不全又はＡｎｋＢ+/-でＰＤＥ２阻害によりＶＴが防止されず、このことはこの抗不整脈作用が局所的なｃＡＭＰ領域に左右されることを示している。したがって、抗不整脈治療法としてのＰＤＥ２阻害は２つの点、すなわち（１）ＮＫＡの活性化因子としての点、及び（２）個々の領域でのｃＡＭＰレベルを標的とすることによるという点で新しい治療戦略である。
【０１５３】
実施例５
不整脈のインビボレコーディング
以前に説明されたように（Ｌｅｈｎａｒｔ  ＳＥら著、Ｌｅａｋｙ  Ｃａ２＋  ｒｅｌｅａｓｅ  ｃｈａｎｎｅｌ／ｒｙａｎｏｄｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｃａｕｓｅｓ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｄｄｅｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｍｉｃｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ誌、２００８年６月、第１１８巻（第６号）：２２３０〜４５頁）ＣＰＶＴマウスを飼育した。ＣＰＶＴマウスにおいてＢａｙ６０−７５５０（３ｍｇ／ｋｇ）を試験した。心室頻脈を誘発させるためにこれらのマウスに６０ｍｇ／ｋｇのカフェインと５０ｎｇ／ｋｇのイソプレナリンを注射した。対照注射として５０％エタノールを使用した。
【０１５４】
結果
ＰＤＥ２阻害はＣＰＶＴマウスにおいて心室頻脈を防止する
Ｂａｙ６０−７５５０はＣＰＶＴマウスにおいてＶＴを防止し、対照での１００％（６匹のうち６匹）と対照的にＢａｙ６０−７５５０では７匹のうち２匹（２８％）でＶＴが発生した（図１８）。まとめると、ＰＤＥ２阻害は３種類の異なるマウスモデルであるＨＦ、アンキリンＢ+/-（ＱＴ延長症候群）、及びＣＰＶＴにおいて心室頻脈を防止する。
【０１５５】
結論
心室頻脈のリスクを上昇させる別の心疾患がＰＤＥ２阻害により防止されることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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