(57)【要約】  ムスカリン受容体M3活性を阻害することができるペプチドおよびそのようなペプチドを含む製品、特にムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態、たとえば、過剰な発汗、炎症、皮脂産生、ならびに細胞接着、細胞運動性、細胞成長、細胞分化および細胞増殖などを改善するのに有用な医薬品および化粧品。【特許請求の範囲】
【請求項１】
20アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜10のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩であって、該誘導体が、化学的に修飾されるか、または有機化合物で保護されるペプチドのN末端または/およびC末端を含み、ただし、該ペプチドは、ペプチドALWMRLとは異なる、ペプチド。
【請求項２】
該ペプチドが、15アミノ酸以下の長さを有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
該ペプチドが、配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
該ペプチドが、配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
該有機化合物が、ホスホリル、グリコシル、アシル、アルキル、カルボキシル、ヒドロキシル、ビオチニル、ユビキチニル、およびアミド基からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
アシル基が、アセチル、ラウロイル、ミリストイル、およびパルミトイル基からなる群から選択される、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドの該N末端が、アセチルまたはパルミトイル基で化学的に修飾または保護される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
該塩が、該ペプチドまたはその誘導体と、適切な酸または塩基との塩を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
該酸が、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、および乳酸からなる群から選択される、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
該酸が、塩酸、酢酸およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１１】
該塩基が、モノ-、ジ-およびトリアルキルアミン、たとえば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン、モノ-、ジ-およびトリアルカノールアミン、たとえば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン；グアニジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、1-ブチルピペリジン、1-エチル-2-メチル-ピペリジン、N-メチルピペラジン、1,4-ジメチルピペラジン、N-ベンジルフェニルエチルアミン、N-メチルグルコサミン、およびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンからなる群から選択される、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１２】
該配列番号：1〜10のいずれか1つの、以下の表の左欄に記載のアミノ酸の少なくとも1つが、以下の表の右欄に記載のアミノ酸で置換される、請求項１に記載のペプチドであって、ただし、得られる配列が、それぞれ該配列番号：1〜10のいずれか1つと、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する、ペプチド。
【表１】
2021528390.tif 000012
【請求項１３】
該配列番号：1〜10のいずれか1つの、以下の表の左欄に記載のアミノ酸の少なくとも1つが、以下の表の右欄に記載のアミノ酸で置換される、請求項１に記載のペプチドであって、ただし、得られる配列が、それぞれ該配列番号：1〜10のいずれか1つと、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する、ペプチド。
【表２】
2021528390.tif 000013
【請求項１４】
(i)請求項１〜１３のいずれか1つに記載のペプチド、およびその誘導体または塩；および(ii)少なくとも1つの化粧品的に許容される成分；を含む、化粧品組成物。
【請求項１５】
(i)請求項１〜１３のいずれか1つに記載のペプチド、およびその誘導体または塩；および(ii)少なくとも1つの薬学的に許容される成分；を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態の改善における使用のための、請求項１〜１３のいずれか1つに記載のペプチド、およびその誘導体または塩。
【請求項１７】
該ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態が、過剰な発汗、炎症、皮脂産生、ならびに細胞接着、細胞運動性、細胞成長、細胞分化および細胞増殖からなる群から選択される、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
(i)請求項１〜１３のいずれか1つに記載のペプチド、およびその誘導体または塩；および(ii)少なくとも1つの薬学的または化粧品的に許容される成分；を含む、医薬組成物または化粧品組成物の局所適用を含む、ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態を改善するための治療または非治療的方法。
【請求項１９】
ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態が、過剰な発汗、炎症、皮脂産生、ならびに細胞接着、細胞運動性、細胞成長、細胞分化および細胞増殖からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムスカリン受容体M3活性を阻害することができるペプチドおよびそのようなペプチドを含む製品、特にムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態、たとえば、過剰な発汗、炎症、皮脂産生、ならびに細胞接着、細胞運動性、細胞成長、細胞分化および細胞増殖などのを改善するのに有用な医薬品および化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリン(ACh)は、中枢(CNS)神経系および末梢(PNS)神経系の両方でコリン作動性伝達に関与する古典的なよく知られた神経伝達物質である。CNSレベルでは、コリン作動性受容体は、ニューロン、神経節、介在ニューロンおよび運動終板での化学的神経伝達を媒介するAChの結合およびエフェクタータンパク質として認識される。PNSに関しては、神経伝達物質AChは、その受容体を介して作用し、心拍数を調節し、平滑筋の収縮を調節し、腺分泌を刺激する(Wesslerら、Br. J. Pharmacol. 2008、154、1558-1571; Wesslerら、Handb. Exp. Pharmacol. 2012、(208):469-491)。最近、非神経性コリン作動系(NNCS)の概念が出現し、AChに、作用の自己およびパラクリンメカニズムを備えたホルモン機能を付与した。これらのシステムは、多種多様な細胞タイプおよび非神経組織に現れ、それらのほとんどはコリン作動性ニューロンによって直接神経支配されない(Kurzenら、Horm. Metab. Res. 2007、39、125-135)。これらの組織は、Achシステムに必要なACh合成酵素、トランスポーター、受容体および分解酵素などのすべての受容体サブタイプとシグナル伝達経路を発現する(Beckmanら、Pharmacology、2013、92、286-302)。
【０００３】
アセチルコリンは、エクリン腺のコリン作動性受容体への結合を介して発汗させる主な神経伝達物質である。それにもかかわらず、アセチルコリンは、多種多様な細胞において神経外でも生じることが最近認識されている典型的な神経伝達物質である(Kurzenら、Horm. Metab. Res.、2007、39(2)、125-135)。新たな証拠は、胎盤などの非神経組織のコリン作動系が神経組織のそれとは異なって調節されていることを示唆する。たとえば、ACh分子は、神経細胞と非神経細胞の間で異なって放出され、神経小胞のエキソサイトーシスとは対照的に、ACh放出の主要なプレーヤーとして有機カチオントランスポーターを提案する。さらに、非神経系におけるコリン作動性受容体の発現パターンは、細胞の分化および活性の状態、ならびに細胞の環境条件に応じて、同じ細胞型内で変化する。したがって、コリン作動性システムおよびその非神経状況の調節を理解することは、生理学的および病態生理学的条件下でのアセチルコリン回路調節に関する新しい側面を明らかにするであろう。
【０００４】
皮膚は最もよく知られているNNCS器官の1つであり、コリン作動系が、成長および分化、接着および運動性、バリア形成、汗および皮脂分泌などの多くの機能に関与する(Hanaら、Life Sci. 2007、80(24-25)、2214-2220)。AChは、ケラチノサイト、内皮細胞、および最も顕著には、炎症部位で皮膚に侵入する免疫コンピテント細胞で産生される。たとえば、アトピー性皮膚炎では、AChレベルは表皮および真皮上部で14倍、ならびに下層の真皮および皮下組織で3倍に上昇し、非神経性AChが重大に関与している。したがって、この皮膚状態における非神経性コリン作動系の役割を明らかにすることは、アトピー性皮膚炎を治療するための新しい戦略を開発するのに役立つ(Wesslerら、Life Sci. 2003; 72 (18-19)、2169-2172; Beckmanら、Pharmacology、2013、92、286-302)。
【０００５】
皮膚のNNCSは、外部環境、ホルモン、成長因子、サイトカインおよび神経系との細胞相互作用において役割を果たし、中間的な役割を果たす。これに関して、コリン作動性受容体の発現は、これらの細胞から放出される非神経性AChの自己およびパラクリン調節ループの一部である。神経系に関しては、AChは、外皮系で広く発現しているニコチン性およびムスカリン性受容体を介して皮膚細胞に作用する。特に、ニコチン性受容体は、皮膚細胞の種類、分化過程、ならびに年齢、アトピー素因および外的要因などの推定上の影響因子とともに変化し、表皮で高い変動性で発現するように思われる(Hanaら、Life Sci. 2007; 80(24-25)、2214-2220)。対照的に、ムスカリン受容体の発現パターンは、この特定の組織で明確に定義されているように思われる。ムスカリン受容体は、2つのサブグループに細分された5つのメンバーのGタンパク質共役受容体のグループである：M2およびM4受容体は、アデニル酸シクラーゼ活性に影響を及ぼし、非選択的カチオンチャネル、一過性受容体電位チャネルおよびカリウムチャネルを阻害するGi/oに共役した阻害受容体である。M1、M3およびM5受容体は、Gq/11に共役し、イノシトール1,4,5-三リン酸および1,2-ジアシルグリセロールの生成を介して細胞内カルシウムを増加させるので、興奮性受容体であるとみなされる。ムスカリン受容体の5つのサブタイプはすべて、すべての皮膚細胞タイプ、すなわちケラチノサイト、毛包脂腺単位、汗腺、メラノサイト、および線維芽細胞に出現する。特に、ヒト表皮のケラチノサイトは、M1およびM4が上部棘および顆粒層に存在し、M2、M3およびM5受容体が基底層に現れる、ムスカリン受容体を発現する(Kurzenら、Horm. Metab. Res. 2007、39、125-135)。AChの多くのオートクリン機能では、Gq共役ムスカリン受容体が関与しており、データの大部分はM1、M3、およびM4に関連している。特に、最終分化したケラチノサイトにおけるM1受容体の活性化は、局所的に放出されたアセチルコリンに応答して皮膚表面に保湿物質の分泌を誘発し、M1受容体が皮膚の恒常性調節の重要な候補であることを示す(Nguyenら、J. Cell. Sci. (2001) 114、1189-1204)。
【０００６】
一方、M3とM4は表皮バリアの維持に関連するプレーヤーである。M3受容体刺激は、細胞外マトリックスタンパク質への細胞接着の増加に関連するβ1-インテグリンの結合活性をアップレギュレートする(Quigleyら、Chest. 1998、114(3):839-846; Williamsら、Life Sci. (2003)、72、2173-2182; Varkerら、Biochem Pharmacol. 2002、63(4)：597-605)。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるM3受容体阻害は、細胞の剥離および細胞の遊走を促進するE-カドヘリンならびにβ-およびγ-カテニンの発現レベルの変化をもたらした。相互に、M4の活性化は移動を刺激し、移動性インテグリンの発現を誘発し、阻害は、移動性の低いインテグリンのアップレギュレーションを引き起こした(Chernyavskyら、J. Cell. Biol. 2004、166(2)：261-272)。したがって、M3およびM4受容体は、ケラチノサイトの側方移動に対して相互作用を示した。これらの結果は、選択的ムスカリン受容体調節が、創傷治癒障害などの異常なケラチノサイト遊走を調節するのに役立つ可能性があることを示した(Ubertiら、Cells Tissues Organs、2017、203：215-230)。
【０００７】
皮膚状態のムスカリン受容体を標的とする新規化合物を設計することは、神経受容体および非神経受容体の両方が関与するので、幅広い用途を開く。AChの神経状況放出から、M3の活性化は、エクリン腺によって生成される発汗および分泌の主な原因であるとみなされている。エクリン腺は、心理的または熱的刺激のいずれかによって引き起こされる生理学的発汗の主な原因である。全身の表面に存在して、M3は、手のひらおよび足の裏で高い発現レベルを示し、感情的な発汗の患部に相当する。主にコリン作動性線維によって神経支配され、エクリン腺活性化におけるアセチルコリンM3活性化は、発汗を誘発する。
【０００８】
ムスカリン受容体は、多汗症治療の標的として使用されてきた。実際、ムスカリン拮抗薬アトロピンの局所投与は、発汗を軽減または無効にする(Shibasakiら、Front Biosci. 2010、2：685-696;2010; Kolkaら、Aviat Space Environ Med. 1987、58(6)：545-549; Fosterら、J Physiol. 1970、210(4)：883-895)。たとえば、認可外の抗コリン作動性グリコピロレートの局所塗布は、限局性多汗症の効果的な治療である(Baker DM、J Eur Acad Dermatol Venereol. 2016、30(12)、2131-2136 ; Pariserら、Dermatol Clin. 2014、32(4)、485-490)。さらに、抗ムスカリン療法の経口投与も、現在、多汗症の治療に使用されている(Gordonら、Dermatol. Ther. 2013、26(6)：452-461)。しかしながら、既存の化合物の収集にもかかわらず、市場に出回っている治療法のほとんどは、主にムスカリン受容体間の分子の選択性が低いために、刺激および尿閉などの望ましくない副作用を患者に引き起こす(Baker DM、J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2016、30(12)、2131-2136; Pariserら、Dermatol. Clin. 2014、32(4):485-490)。したがって、多汗症治療の従来技術における既存の化合物の代替物の開発は、多汗症治療における有効性を改善し、副作用を低減させるか、またはスキンケア条件のための潜在的な制汗特性を有する革新的な有効成分を得るための、化粧品および製薬部門の焦点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
全体として、ムスカリン受容体サブタイプを特異的に標的とする新規な選択的化合物が、皮膚状態に対する効果的な治療法を開発するために必要である。選択的化合物の設計における主な問題の1つは、5つのムスカリンサブタイプすべての間の強い配列類似性である。具体的には、オルソステリック結合部位からのアミノ酸は、5つのサブタイプすべてにおいて完全に保存されており、効果的なサブタイプ選択的リガンドを得るのを妨げる。したがって、受容体の新しい領域は、アロステリック調節に関与する配列、サブユニットのオリゴマー化、またはタンパク質間相互作用などの新規なムスカリンモジュレーターを設計するために考慮されるべきである。この点において、M3受容体の高解像度X線構造は、受容体の特定の領域に選択的に結合する化合物を特定するための有望なツールである。
【００１０】
結論として、本発明は、既存の必要性に対する代替物を提供し、M3活性化を阻害することができる新規なペプチド配列およびそのようなペプチドを含む製品、特に、たとえば、創傷治癒、ニキビ、および皮膚炎などの、細胞接着、運動性、成長、分化、バリア形成、皮脂分泌、炎症をもたらす予測可能な非治療的スキンケア適用を有する化粧品の発見を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概略
出願人は、驚くべきことに、M3細胞内領域と相互作用することにより、ムスカリン受容体M3サブタイプのアセチルコリン誘発性活性を阻害するか、または少なくとも低減することができるペプチドを発見した。このメカニズムは、受容体を活性化するために必要なタンパク質内の構造的再配列および/またはタンパク質間相互作用に影響を及ぼす。これらの化合物は、たとえば、創傷治癒障害、過剰な発汗および多汗症などのM3受容体阻害によって改善または予防される皮膚状態、障害および/または疾患の治療および/またはケアに有用である。
【００１２】
出願人は、以下の配列番号を有するペプチドを発見した。1〜10は、アセチルコリン-M3活性化を阻害する。正確な分子メカニズムがまだ完全に解明および確認されていなくても、理論に拘束されないが、本発明者らは、アセチルコリン-M3活性化に対する阻害効果は、特に、M3-Gq-αタンパク質複合体のアンタゴニスト競合物質として作用することにより、下流のカスケードシグナル伝達を損なうことによって、M3の細胞質ゾル領域に対して作用するペプチドの能力によると考える。
【００１３】
具体的には、本発明のM3活性を阻害する配列番号：1〜10のペプチドを以下に詳述する：
配列番号：1      WMRL
配列番号：2      WMRLK
配列番号：3      WMRLKA
配列番号：4      WMNLKT
配列番号：5      WMFLK
配列番号：6      RMYKMMAGMYLR
配列番号：7      RVMYKMNKRDY
配列番号：8      RVMFKMFKRDY
配列番号：9      RMTMLMLDFKYMKWW
配列番号：10      KMTMRMLYFKYMMWW
【００１４】
出願人は、また、M3阻害が、20アミノ酸以下の長さを有し、上記配列番号：1〜10の配列を含むか、または配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む配列でも得られることも発見している。
【００１５】
出願人は、また、M3阻害が、上記配列番号：1〜10のN末端に、たとえば、アセチル基、パルミトイル基、またはミリストイル基などのアルキルカルボニル基を結合させることによって、ならびに、たとえば、クロリド、酢酸またはトリフルオロ酢酸などの適当なアニオンと、上記配列番号：1〜10の塩を形成することによって、調節されうることも発見している。
【００１６】
したがって、本発明の第1の態様は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜10のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００１７】
本発明の第2の態様は、(i)20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜10のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩；および(ii)少なくとも1つの薬学的または化粧品的に許容される成分；を含む、医薬組成物または化粧品組成物に関する。
【００１８】
本発明の第3の態様は、ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態を改善するための、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜10のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩の使用に関する。
【００１９】
本発明の第4の態様は、(i)20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜10のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩；および(ii)少なくとも1つの薬学的または化粧品的に許容される成分；を含む、医薬組成物または化粧品組成物の局所適用を含む、ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態を改善するための治療または非治療的方法に関する。
【００２０】
より具体的には、本発明の非治療的方法によって改善することができるムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態は、過剰な発汗、皮脂産生、局所的炎症、および/または細胞接着、運動性、成長、分化および増殖に関する。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜10のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な記載
第1の態様によれば、本発明は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜10のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜10のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００２３】
好ましくは、本発明は、15アミノ酸以下、より好ましくは10アミノ酸以下、最もより好ましくは6アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜5のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜5のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００２４】
より好ましくは、本発明は、ペプチドALWMRL以外の、15アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1〜5のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：1〜5のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００２５】
有利には、本発明は、ペプチドALWMRL以外の、15アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1、または配列番号：1と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、15アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：1、または配列番号：1と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列から開始するペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００２７】
もう1つの態様では、本発明は、15アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：2、または配列番号：2と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、15アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：3、または配列番号：3と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００２９】
もう1つの態様では、本発明は、15アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：4、または配列番号：4と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３０】
もう1つの態様では、本発明は、15アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：5、または配列番号：5と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３１】
好ましくは、本発明は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：6〜10のいずれか1つの配列を含むか、または配列番号：6〜10のいずれか1つと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３２】
好ましい態様によれば、本発明は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：6、または配列番号：6と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３３】
好ましい態様によれば、本発明は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：7、または配列番号：7と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３４】
好ましい態様によれば、本発明は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：8、または配列番号：8と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３５】
好ましい態様によれば、本発明は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：9、または配列番号：9と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３６】
好ましい態様によれば、本発明は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下の長さを有し、配列番号：10、または配列番号：10と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、およびより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３７】
本願の発明者および出願人の知る限りでは、本明細書に記載のペプチドは、ペプチドALWMRLを除いて、本出願の優先日より前に当技術分野で知られていない。しかしながら、本発明の範囲内にある本出願の優先日より前に当技術分野で知られているペプチドは、本明細書において適切に放棄される。
【００３８】
本明細書で使用されるアミノ酸配列の略語は、以下の表Aに記載されているように、IUPAC-IUBの命名法に従っている。
【００３９】
【表１】
2021528390.tif 000002
【００４０】
ペプチド配列に関する「配列同一性パーセント」は、2つの配列において同一である残基のパーセンテージを意味する。配列同一性パーセント(％SI)は、次の式で計算される：
%SI＝(nt-nd)x100/nt
[式中、ntは、塩基配列中の残基の数であり、ndは、最大数のアミノ酸が同一になるように整列させたときの、対峙する配列中の同一でない残基の総数である]。したがって、配列WMNLKSは、配列番号：4のWMNLKTと83.3%の配列同一性を有する(nd=およびnt=6)。
【００４１】
本発明のペプチドは、最適に整列させたときに、参照配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90% and 少なくとも95%の配列同一性を有することができる。配列の最適なアラインメントは、さまざまな既知の方法および既知のアルゴリズム(たとえば、Wisconsin Genetics Software Package、Release 7.0のBLAST、TFASTA、BESTFITなど、Genetics Computer Group、マディソン、WI)のコンピューター制御の導入によって実施することができる。国立バイオテクノロジー情報センター(www.ncbi.nlm.nih.gov/)からソフトウェアを入手することができる、BLASTアルゴリズム(Altschulら、(1990)、Mol. Biol. 215:403-10)を使用することもできる。
【００４２】
本発明の配列番号：1〜10を含むペプチド中のアミノ酸配列の変化は、ペプチド活性に影響を及ぼさないアミノ酸の保存的置換を含む。ペプチド活性を維持することができる置換は、(a)シートまたはらせん状の三次元構造などの置換領域におけるペプチド骨格の構造を維持することにおける有効性；(b)標的領域における分子の電荷または疎水性を維持することにおける有効性；または(c)側鎖の大部分を維持することの有効性；に基づいて選択される。
【００４３】
アミノ酸は、次の表Bに記載されるように、一般的な側鎖の特性にしたがって分類される。
【００４４】
【表２】
2021528390.tif 000003
【００４５】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リシンおよびヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸、アスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミンおよびアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン)、および小アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、およびスレオニン)からなる群に属する。
【００４６】
一般に比活性度を変化させないアミノ付加置換は、本発明の技術分野で知られている。
【００４７】
最も一般的に発生する変更は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly、ならびに反対の変更である。保存的置換の別の例を次の表Cに示す。
【００４８】
【表３】
2021528390.tif 000004
【００４９】
本発明のペプチドは、そのN末端または/およびC末端が化学的に修飾されるか、または有機化合物で保護される修飾ペプチドの形態でありうる。
【００５０】
本発明のペプチドに関して本明細書で使用される「誘導体」または「その誘導体」という用語は、そのN末端および/またはC末端が有機化合物で化学的に修飾または保護されるペプチドを意味する。
【００５１】
修飾の例として、リン酸化、グリコシル化、アシル化(アセチル化、ラウロイル化、ミリストイル化、パルミトイル化を含む)、アルキル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、糖化(glycation)、ビオチン化、ユビキチン化、およびアミド化が挙げられる。
【００５２】
好ましくは、本発明のペプチドは、そのN末端で、より好ましくは、アセチル化、ラウロイル化、ミリストイル化、およびパルミトイル化などのアシル化によって修飾されうる。N末端アセチルおよびパルミトイルペプチド誘導体は、本発明の好ましい態様である。
【００５３】
本発明のペプチドに関して本明細書で使用される「塩」または「その塩」という用語は、適切な酸または塩基と、ペプチドまたはその誘導体との塩を意味する。
【００５４】
酸の代表的な例として、たとえば、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、および乳酸などが挙げられる。
【００５５】
塩基の典型的な例として、たとえば、モノ-、ジ-およびトリアルキルアミン、たとえば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン；モノ-、ジ-およびトリアルカノールアミン、たとえば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン；グアニジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、1-ブチルピペリジン、1-エチル-2-メチル-ピペリジン、N-メチルピペラジン、1,4-ジメチルピペラジン、N-ベンジルフェニルエチルアミン、N-メチルグルコサミン、およびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが挙げられる。
【００５６】
ペプチドの酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩、またはその誘導体が、本発明の下で好ましくは使用される。
【００５７】
その長さに応じて、本発明のペプチドは、当技術分野で周知の方法によって、たとえば、自動化されたペプチド合成器によって合成されうるか、または遺伝子工学技術によって生成されうる。たとえば、融合パートナーおよび本発明のペプチドを含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、遺伝子工学によって調製され、次いで、宿主細胞に形質転換されて融合タンパク質を発現する。その後、本発明のペプチドは、プロテアーゼまたは化合物を使用して融合タンパク質から切断および単離されて、所望のペプチドを生成する。この目的のために、第Xa因子またはエンテロキナーゼなどのプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸残基をコードするDNA配列、またはCNBrまたはヒドロキシルアミンなどの化合物を、融合パートナーをコードするポリヌクレオチドと本発明のペプチドとの間に挿入することができる。
【００５８】
本発明のペプチドは、立体異性体、または立体異性体の混合物として存在しうる；たとえば、それらを構成するアミノ酸は、L-配置、D-配置を有するか、または互いに独立してラセミでありうる。したがって、不斉炭素の数および存在する異性体または異性体混合物に応じて、異性体混合物ならびにラセミ体またはジアステレオマー混合物または純粋なジアステレオマーまたはエナンチオマーを得ることが可能である。本発明のペプチドの好ましい構造は、純粋な異性体、すなわち、エナンチオマーまたはジアステレオマーである。本発明の最も好ましい構造は、L-配置を有するアミノ酸を含む。特に明記しない限り、一方のアミノ酸がAlaでありうることが示される場合、それは、L-Ala-、D-Ala-または両方のラセミまたは非ラセミ混合物から選択されることが理解される。
【００５９】
本発明の化粧品組成物は、少なくとも1つの化粧品的に許容される成分とともに少なくとも1つの上記ペプチドを含む。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される成分とともに少なくとも1つの上記ペプチドを含む。
【００６１】
本発明の医薬組成物または化粧品組成物は、0.00000001重量%〜20重量%、好ましくは0.000001重量%〜15重量%、より好ましくは0.0001重量%〜10重量%、およびさらにより好ましくは0.0001重量%〜5重量%の範囲の量のペプチド、またはその誘導体および/または塩を含むことができる。
【００６２】
本発明の化粧品組成物は、そのような組成物をより化粧品的または美容的に許容されるようにするか、またはそれらに追加の使用上の利点を提供するために適したさまざまな他の任意の構成要素を含むことができる。そのような従来の任意の成分は、当業者によく知られている。これらは、CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook、第7版、Wenninger and McEwen編、(The Cosmetic、Toiletry、and Fragrance Association、Inc.、Washington、D. C.、1997)に見られるような任意の化粧品的に許容される成分を包含する。本明細書で使用される場合、「化粧品的に許容される」とは、皮膚、毛髪、または本明細書で以下に定義される他の適切な基質(substrate)と接触して使用するのに適した材料(たとえば、化合物または組成物)を意味する。
【００６３】
本発明において有用な化粧品的に許容される成分として、化粧品的に許容される担体、揮発性および非揮発性溶媒、水、ならびに界面活性剤、防腐剤、吸収剤、キレート剤、滑沢剤、保湿剤、撥水剤、抗酸化剤、UV吸収剤、抗刺激剤、ビタミン、微量金属、抗菌剤、香料、染料および着色成分、および/または構造化剤などの他の追加成分が挙げられる。
【００６４】
本明細書で使用される「化粧品的に許容される担体」という表現は、上記で定義されるような、化粧品的に許容される1つ以上の適合性のある固体または液体充填剤、希釈剤、増量剤などを意味する。本明細書で使用される「適合性」という用語は、本発明の組成物の成分が、本発明の一次活性物質と、通常の使用状況下での組成物の効力を実質的に低下させる相互作用がないような方法で互いに組み合わせることができることを意味する。
【００６５】
本発明で利用される担体の種類は、所望の製品の種類に依存する。本発明において有用な組成物は、多種多様な製品形態でありうる。これらには、ローション、クリーム、ジェル、スティック、スプレー、軟膏、ペースト、ムースおよび化粧品(たとえば、ファンデーションなどの、固体、半固体、または液体メイクアップを含む)が包含されるが、これらに限定されない。
【００６６】
これらの製品形態は、溶液、エアロゾル、エマルジョン(水中油型または油中水型を含む)、ゲル、固体、およびリポソームを含むがこれらに限定されないいくつかのタイプの担体を含みうる。
【００６７】
本発明の組成物は、組成物の形態に応じて異なる量の水を含みうる。水の量は、存在する場合、全組成物の重量に対して1%未満〜99重量%を超える範囲でありうる。本発明の水性組成物は、特に、水性ローションとして、または油中水型もしくは水中油型エマルジョンとして、または多重エマルジョン(油中水中油型または水中油中水型トリプルエマルジョン)として製剤される。そのようなエマルジョンは、たとえば、C. FOXによって、「Cosmetics and Toiletries」-November 1986-Vol. 101-pp 101-112に記載されている。
【００６８】
固体組成物、スプレー組成物、および油中水型クリームは、通常、組成物の総重量に対する重量%として、10%未満、より好ましくは5%未満の量の水を含む。ロールオン式組成物、水性組成物、おおびデオドラントは、通常、組成物の総重量に対する重量%として、約15%〜約99%、より好ましくは約30%〜約90%、さらにより好ましくは約50%〜約80%の量の水を含む。
【００６９】
本発明の組成物は、また、シリコーンを含んでもよい。存在する場合、シリコーンは、一般に、組成物の総重量に対する重量%として約30%〜約85%、より好ましくは約40%〜約75%、さらにより好ましくは約50%〜約65%のレベルである。
【００７０】
本明細書で有用なシリコーンは、好ましくは、2〜7個のシリコーン原子を有する線状または環状シリコーンであり、これらのシリコーンは、任意選択で、1〜10個の炭素原子のアルキルまたはアルコキシ基で置換される。適切なシリコーンとして、ドデカメチルシクロヘキサシロキサン、シクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、シクロテトラシロキサン、ヘプタメチルオクチルトリシロキサン、ヘキサメチルジシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、ドデカメチルペンタシロキサンオクタメチルテトラシロキサンおよびそれらの混合物が挙げられる。
【００７１】
本発明の組成物は、1つ以上の揮発性溶媒を含んでもよい。存在する場合、本発明の揮発性溶媒は、一般に、組成物の総重量に対する重量%として、約10%〜約90%、より好ましくは約25%〜約75%、さらにより好ましくは約35%〜約65%のレベルである。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「揮発性」は、当技術分野の人々によって理解されるように、周囲条件下でかなりの量の蒸気圧を有する物質を意味する。
【００７３】
本明細書で使用するための揮発性溶媒は、好ましくは、25℃にて、約2kPa以上、より好ましくは約6kPa以上の蒸気圧を有する。本明細書で使用するための揮発性溶媒は、好ましくは、通常大気(1気圧)下で、約150℃未満、より好ましくは約100℃未満、さらにより好ましくは約90℃未満、さらにより好ましくは約80℃未満の沸点を有する。
【００７４】
本明細書で使用するための揮発性溶媒は、比較的無臭であり、ヒトの皮膚に使用するのに安全であるのが好ましい。適切な揮発性溶媒として、C1-C4アルコール、揮発性シリコーンおよびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい揮発性溶媒は、C1-C4アルコールおよびそれらの混合物である。本明細書での使用のために、より好ましいのはエタノールである。
【００７５】
本発明の組成物は、また、1つ以上の非揮発性溶媒を含んでもよい。存在する場合、本発明の非揮発性溶媒または溶媒混合物は、一般に、組成物の総重量に対する重量%として、組成物の総重量に対する重量%として、約1%〜約20%、より好ましくは約2%〜約10%、さらにより好ましくは約3%〜約5%のレベルである。適切な非揮発性溶媒として、安息香酸ベンジル、セテアリルアルコール、セチルアルコール、フタル酸ジエチル、ミリスチン酸イソプロピル、ジメチコン、カプリリルメチコン、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
いくつかの他の追加成分が、本発明の組成物中に存在することができる。これらには、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン(PVP)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)およびポロキサマーから選択される親水性ポリマー；ベンゾフェノン-3などのUV安定剤；酢酸トコフェリルなどの抗酸化剤；フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベンなどの防腐剤；乳酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、リン酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのpH調整剤；ファルネソール、フェノールスルホン酸亜鉛、エチルヘキシルグリセリンなどのデオドラントおよび抗菌剤；トリベヘニン、グリセリンなどの保湿剤；アラントインなどのスキンコンディショニング剤；トリメチルイソプロピルブタンアミドおよびメントールなどの冷却剤；パンテノール、パンテチン、パントテイン、パンテニルエチルエーテル、およびそれらの組み合わせなどのヘアコンディショニング成分；プロパン、イソプロパン、ブタン、およびイソブテンなどの噴射剤；酢酸カリウムおよび塩化ナトリウムなどの一般的な塩およびそれらの混合物；香料および染料；が包含されるが、これらに限定されない。
【００７７】
存在する場合、これらの追加の成分は、好ましくは、組成物の総重量に対する重量%として、10%未満、より好ましくは5%未満のレベルで存在する。
【００７８】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、有効量の少なくとも1つの上記ペプチドとともに少なくとも1つの薬学的に許容される成分を含む適切な剤形で調製される。
【００７９】
適切な剤形の例は、経口投与用の錠剤、カプセル、コーティング錠、顆粒、溶液およびシロップ；局所投与用の溶液、ポマードおよび軟膏；経皮投与用の薬用パッチ；直腸投与用の坐剤および注射可能な無菌溶液；である。他の適切な剤形は、持続放出のもの、および経口、注射、または経皮投与用のリポソームに基づくものである。
【００８０】
本明細書に記載されるように、本発明の医薬組成物は、本明細書で使用されるように、少なくとも1つの上記ペプチドとともに、任意およびすべての所望の特定の剤形に適した、溶媒、希釈剤、または他のビヒクル、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む、薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００８１】
薬学的に許容される賦形剤として役立つことができる材料のいくつかの例には、乳糖、ブドウ糖およびショ糖などの糖；コーンスターチおよび馬鈴薯澱粉などの澱粉；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油などの油；ベニバナ油; 胡麻油; オリーブ油；コーン油および大豆油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝液、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性適合性滑沢剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、防腐剤および抗酸化剤が包含されるが、これらに限定されない。
【００８２】
「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」という用語は、特定の制限なしに、生物に投与される医薬組成物を調製するのに適した任意の材料を定義することを意図する。
【００８３】
剤形は、また、防腐剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧を調節するための塩、乳化剤、甘味料、着色剤、香味料などの他の伝統的な成分を含むことができる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸的に、鼻腔的に、頬側に、膣内に、または埋め込まれたリザーバーを介して投与されうる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨下、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
【００８５】
本発明の医薬組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与されるか、またはステントのような埋め込み可能または留置装置を用いるなどの埋め込みに(たとえば、外科的に)よって送達されうる。
【００８６】
本発明の医薬組成物の剤形は、薬剤師によく知られており、混合、造粒、圧縮、溶解、滅菌などを含む技術によって調製することができる。
【００８７】
本発明のペプチドは、アセチルコリンとM3受容体サブタイプとの相互作用を阻害するか、または少なくとも減少させる-ことができる。
【００８８】
したがって、本発明のさらなる態様は、ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態を改善するための、少なくとも1つの上記のペプチド、およびその誘導体または塩の使用に関する。
【００８９】
さらに、本発明は、また、ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態を改善するための、(i)少なくとも1つの上記ペプチド、およびその誘導体または塩、ならびに(ii)少なくとも1つの薬学的または化粧品的に許容される成分を含む治療または非治療的方法に関する。
【００９０】
特に、ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態として、過度の発汗、炎症、皮脂産生、および細胞接着、運動性、成長、分化および増殖が挙げられる。
【００９１】
さらに詳しくは、ムスカリン受容体M3活性によって媒介される皮膚状態として、(i)アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎およびその他の湿疹性障害などのその他の湿疹性障害などの丘疹性および湿疹性皮膚炎、(ii)天疱瘡、類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、表皮水疱症、線状IgA皮膚症およびその他の水疱性障害などの小水疱水疱性疾患、(iii)尋常性ざ瘡、酒さ(酒さ)(acne rosacea (rosacea))、口囲皮膚炎、毛嚢炎、過汗症、グローバー病などの付属疾患、(iv)皮膚筋症、全身性硬化症、混合性結合組織病、リウマチ性障害の皮膚症状(cutaneous manifestations)などのリウマチ性障害の皮膚症状(skin symptoms)、(v)紫外線などの照射などの物理的作用物質への曝露および日焼け、熱、寒さ、摩擦および外傷性損傷、しわなどの皮膚の正常または異常な老化、(vi)蕁麻疹および血管浮腫などの蕁麻疹および紫斑、多形紅斑、遠心性環状紅斑およびその他の紅斑性障害、皮膚の薬物反応、皮膚の血管炎および紫斑、好中球性皮膚症および妊娠性皮膚症、および(vii)かゆみ、神経痛、灼熱感などの異常な感覚または痛みの状態、または皮膚の浮腫などの他の皮膚障害が挙げられる。
【００９２】
本発明のさらなる態様は、少なくとも1つの上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００９３】
上記のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドの大量生産を可能にする。たとえば、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの培養は、ペプチドの大量生産を可能にする。
【００９４】
ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれかの、自発的または人工のDNAまたはRNA分子でありうる核酸分子である。核酸分子は、1つ以上の同じタイプ(たとえば、同じヌクレオチド配列を有する)の核酸、または異なるタイプの核酸でありうる。核酸分子は、1つ以上のDNA、cDNA、デコイDNA、RNA、siRNA、miRNA shRNA、stRNA、snoRNA、snRNA PNA、アンチセンスオリゴマー、プラスミドおよび他の修飾核酸を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
以下の実施例は、本発明を限定することなく、本発明をよりよく説明することを意図している。
【実施例１】
【００９６】
化学合成
すべてのペプチドは、標準のFmoc固相法を使用してアミド化されたC末端で合成された(Perez de la Vegaら、Molecules 2010、15(7):4924-4933; Behrendtら、J. Pept. Sci. 2016、22(1):4-27; Madeら、Beilstein J. Org. Chem. 2014、10:1197-1212)。本発明のペプチド、混合物および/またはそれらの化粧品的または薬学的に許容される塩の合成は、固相ペプチド合成法、酵素合成または任意の組み合わせなど、従来技術で知られている従来の方法に従って実施することができる(Bondazkyら、Int. J. Pept. Protein Res。1993、42(1):10-3)。
【００９７】
すべての合成プロセスは、Kromasil-C18-HPLC (5μm、4.6 x 250 mm)を使用して行われた。その後、トリフルオロ酢酸(TFA)を含むアセトニトリル(CH3CN)の直線勾配でペプチドを溶出した(勾配：2分で5-55％B、流量：1mL/分、溶離液A：100% H2O+0.1% TFA；溶離液B：100% CH3CN+0.1% TFA)。ペプチドの検出は、220nmでの吸光度を測定することによって行った。20%ピペリジン/DMF溶液で30分間反応させてFmoc基を除去した。段階間の洗浄をDMF(5回)で行った。すべての合成反応と洗浄は、25℃にて行った。得られたペプチドのHPLC分析は、すべての場合において80%を超える純度を示した。得られたペプチドの同一性は、ESI-MSによって確認した。
【００９８】
Nt-アセチル基をペプチジル樹脂に導入するためのプロセス：1ミリモル(1当量)のペプチジル樹脂を、溶媒として5mLのDMFを使用して、25当量のDIEAの存在下で25当量の予め溶解した無水酢酸で処理した。30分の反応後、ペプチド樹脂をDMF(1分×5)、DCM(1分×4)、およびジエチルエーテル(1分×4)で洗浄した。最後に、ペプチジル樹脂を真空下で乾燥させた。
【００９９】
Nt-パルミトイル基をペプチジル樹脂に導入するためのプロセス：3ミリモル(3当量)の予め溶解したパルミチン酸を、3当量のHTBUおよび6当量のNMMの存在下でペプチジル樹脂に組み込んだ。それらを試薬としてDMFを使用して30〜60分間反応させた。その後、樹脂をDMFで3回洗浄した。Nt-ミストイルペプチドのための同等のプロセス。
【０１００】
ペプチジル樹脂のポリマー支持体からの切断プロセス：乾燥したペプチジル樹脂をTFA：TIS：H2O(95：2.5：2.5)で、振動下で25℃にて、2時間処理した。
【実施例２】
【０１０１】
本発明のペプチドによるM3-アセチルコリン活性化の阻害
ヒトムスカリン受容体M3を構成的に発現する上皮安定細胞株を使用して、ペプチド活性を評価した。細胞を96ウェルプレートに、100μLの完全Ham’s F-12培地中、50％の細胞コンフルエンスで播種した。24時間後、培地を除去し、細胞を、90μL/ウェルの100、50または10μMの本発明のペプチドの溶液、またはビヒクルとしてのDMSOと共にインキュベートした。製造元の指示に従って、CO2インキュベーター内で37℃にて50分間、Probenecidを含むFluo-4NW(Invitrogen)蛍光カルシウムプローブアッセイバッファーにペプチドを溶解した。その後、M3活性を、FLUOstar Galaxyリーダー(BMG LabTechnologies)で、励起用に485 nmフィルター、発光用に520 nmを使用して蛍光を読み取り、10nMアセチルコリンによるM3活性化の前後のシグナルを記録することによって決定した。蛍光測定値を、ビヒクル処理細胞におけるアセチルコリン最大蛍光シグナルに対して正規化した。アトロピン(100nM)を阻害の陽性対照として使用した。M３活性の阻害値を、アセチルコリン-M3活性化に対応する最大蛍光を考慮し、非刺激細胞として最小を考慮することにより、パーセンテージとして計算した。表Dは、本発明のペプチドについて得られたM3活性阻害の阻害値を詳述している。
【０１０２】
【表４】
2021528390.tif 000005
【０１０３】
ペプチドは、50μMで13〜74％および100μMで60〜95％の範囲でアセチルコリン誘発M3活性を阻害することができた。配列番号：2、3、および8のペプチドは、10μMで40〜60％の範囲でM3活性を有意に阻害した。
【実施例３】
【０１０４】
M3活性の時間依存性阻害。
本発明のペプチドは、M3の細胞内領域を標的とするように設計された。したがって、M3活性に対する阻害効果を検出するために必要な最小時間を評価した。この目的のために、配列番号：1〜8のペプチドの阻害効果は、それらが最も強い阻害効果を示したので、時間とともに特徴付けられた。ヒトムスカリン受容体M3を構成的に発現する上皮安定細胞株を使用して、ペプチド活性を評価した。細胞を96ウェルプレートに、100μLの完全Ham’s F-12培地中、50％の細胞コンフルエンスで播種した。24時間後、培地を除去し、製造元の指示に従って、細胞を、CO2インキュベーター内で37℃にて、90μL/ウェルのFluo-4 NW(Invitrogen)蛍光カルシウムプローブアッセイバッファー(プロベネシドを含む)とともに、インキュベートした。ペプチド(50μM)、ビヒクルおよびアトロピンを、プローブとともに(1時間のプレインキュベーション)または蛍光読み取り中(直接効果)のいずれかで、インキュベートした。その後、M3活性を20サイクルについて記録し、ベースライン評価後のサイクル3に直接効果ペプチドを追加した。アセチルコリンをサイクル13で加えた。したがって、ペプチドの直接効果を25分間モニターした。M3活性の阻害値は、ビヒクルまたは未処理細胞のアセチルコリン-M3活性化に対応する最大蛍光および非刺激細胞としての最小蛍光を考慮して、パーセンテージとして計算した。表Eは、本発明のペプチドについて得られたM3活性阻害の阻害値を詳述する。
【０１０５】
【表５】
2021528390.tif 000006
【０１０６】
M3応答の定量化により、配列番号：1〜8のペプチドは、1時間のプレインキュベーション後に50μMで有効であることが示された。
【実施例４】
【０１０７】
用量-反応阻害効果
配列番号：1、3-8のペプチドの効率の特性は、半分最大阻害濃度(IC50)を計算することによって得られた。この目的のために、細胞培養および蛍光カルシウムプローブアッセイに関する実験手順を、実施例２に記載のように行った。ペプチドを0.1〜100μMの濃度で評価し、Fluo-4NWプローブと一緒に1時間インキュベートした。その後、M3活性を、FLUOstar Galaxyリーダー(BMG LabTechnologies)で、励起用に485 nmフィルター、発光用に520 nmを使用して蛍光を読み取り、アセチルコリンによるM3活性化の前後のシグナルを記録することによって決定した。蛍光測定値を、ビヒクル処理細胞におけるアセチルコリン刺激で検出された最大蛍光シグナルに対して正規化した。M３活性の阻害値を、アセチルコリン-M3活性化に対応する最大蛍光を考慮し、非刺激細胞として最小を考慮することにより、パーセンテージとして計算した。阻害パーセンテージデータをシグモイド曲線に適合させて、IC50を得た。表Fは、IC50についての阻害値の詳細を示す。
【０１０８】
【表６】
2021528390.tif 000007
【０１０９】
すべてのペプチドは同じ濃度範囲内で有効であり、約10〜60μMの間で50％の有効性を示した。得られたIC50による最も強力なペプチドは、配列番号：2、4、8および3、続いて、1、6、7および5であった。
【実施例５】
【０１１０】
ヒトケラチノサイトおよび線維芽細胞における細胞生存率アッセイ
この実施例は、ヒト表皮ケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞の生存率に対する試験ペプチドの効果を評価した。3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを使用して、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素の、MTTのテトラゾリウム環を破壊し、変換する能力に基づいて、細胞増殖および生存率をモニターした。
【０１１１】
表皮ケラチノサイトを、100μLの補充培地において50〜60％のコンフルエンスで、以前にコーティングされた96ウェルプレートに播種した。皮膚線維芽細胞を、100μLの補充培地において70％のコンフルエンスで96ウェルプレートに播種した。播種の24時間後、培地を、0.1〜100μMの濃度範囲で溶解したペプチドを含む新鮮な補充培地、または100％毒性の基準としてのSDS、またはペプチドのビヒクルとしてのDMSOと交換した。すべての試験物質を37℃および5％CO2にて24時間インキュベートした。その後、培地を完全培地中の0.5mg/mLのMTT溶液に4時間交換した。次に、培地を注意深く除去し、150μL/ウェルのDMSOを加えてホルマザン結晶を可溶化した。プレートを光から保護し、60秒間振とうし、620nmの参照フィルターを用いて570nmで光学密度を測定した。毒性値を、SDS処理細胞に対する最大の細胞毒性効果を考慮してパーセンテージとして計算し、最小は未処理細胞として計算した。表Gは、細胞生存率阻害のパーセンテージとして、ケラチノサイトおよび線維芽細胞に対する配列番号：1、5、6および7のペプチドの効果を詳述する。
【０１１２】
【表７】
2021528390.tif 000008
【０１１３】
配列番号：1、5、6および7のペプチドは、TFAおよび/または酢酸塩として評価した。一般に、酢酸塩としてのペプチドは、50μM未満の濃度で試験した場合、細胞の生存率を損なわなかった。むしろ、Nt-パルミトイル-配列番号：1、Nt-パルミトイル-配列番号：5、Nt-アセチル-配列番号：6およびNt-アセチル-配列番号：7は、評価されたいずれの濃度でも、TFA-塩として細胞増殖に影響を与えなかった。
【実施例６】
【０１１４】
汗分泌のマウスモデルにおける急性投与に対する制汗効果の評価
本実施例は、ピロカルピンによって誘発されたインビボ発汗モデルにおいて、配列番号：2、パミトイル化形態の本発明のペプチドの急性効果を評価した。このモデルは、11週齢のC57BL6/Rcc雄性マウスにおいて、ムスカリン受容体の非選択的アゴニストであるピロカルピンを使用して確立された。
【０１１５】
試験化合物は、以下の配列(配列番号：2)を有する本発明のペプチドである：
Palm-WMRLK-NH2
【０１１６】
試験化合物を、発汗刺激の30分前に、右後足(10、30、100μg)に足底内注射した。ビヒクルは食塩水であった。
【０１１７】
発汗を、ヨウ素/デンプン反応を使用した皮膚表面のアミラーゼ活性検出によってモニターした。各条件における足あたりの滴の数を数える5分間の誘導後に、濃い色の発汗滴を定量化した。データは、平均±平均の標準誤差(SEM)として表す。生データは、注射されていない刺激された個体(対照、100%)および生理食塩水を注射された刺激されていない個体(ビヒクル、0%)に対するパーセンテージとして正規化された。統計分析は、一元配置分散分析、続いて、各条件を対応する対照群と比較するダネットの事後多重比較検定であった、****p<0.0001、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【０１１８】
結果を、次の表Gに要約する。
【０１１９】
【表８】
2021528390.tif 000009
【０１２０】
試験化合物は、10、30および100μgで発汗を有意に減少させた。
【実施例７】
【０１２１】
汗分泌のマウスモデルにおける慢性投与に対する制汗効果の評価
本実施例は、インビボ発汗モデルにおいて、配列番号：2、パルミトイル化形態の本発明ペプチドの慢性効果を評価した。このモデルは、11週齢のC57BL6/Rcc雄性マウスにおいて、ムスカリン受容体の非選択的アゴニストであるピロカルピンを使用して確立された。試験化合物を、週3回4週間、局所投与した(治療)。表Hでは、1、2および4週目に、右後足(発汗)にピロカルピン(3μg/足)を足底内(i.pl)注射することにより発汗を誘発した。
【０１２２】
【表９】
2021528390.tif 000010
【０１２３】
試験化合物は、以下の配列(配列番号：2)を有する本発明のペプチドである：
Palm-WMRLK-NH2
【０１２４】
試験化合物を、右後足(10、10、100μg)に足底内注射した。ビヒクルは食塩水であった。
【０１２５】
発汗を、ヨウ素/デンプン反応を使用した皮膚表面のアミラーゼ活性検出によってモニターした。各条件における足あたりの滴の数を数える5分間の誘導後に、濃い色の発汗滴を定量化した。サンプルは、グループあたりn=5〜6であった。データは、平均±平均の標準誤差(SEM)として表す。生データは、注射されていない刺激された個体(対照、100%)に対するパーセンテージとして正規化された。統計分析は、一元配置分散分析、続いて、各条件を対応する対照群と比較するダネットの事後多重比較検定であった、****p<0.0001、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【０１２６】
結果を、次の表Iに要約する。
【表１０】
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【０１２７】
Palm-配列番号：2は、10および100μg/足で試験した場合、4週間の治療中に有意な発汗抑制を示した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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