(57)【要約】痙縮、緊張亢進またはジストニアを処置するための方法およびシステムが開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
痙縮、緊張亢進、またはジストニアを処置する方法であって、治療有効量の、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する少なくとも１つの薬剤またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベルおよび／もしくはタンパク質発現レベルを減少させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
前記薬剤が、医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記医薬化合物が、スルホンアミド、スルホニル尿素ループ利尿薬、チアジド、およびチアジド様利尿薬からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記スルホンアミドまたはスルホニル尿素ループ利尿薬が、アセタゾールアミド、アゾセミド、ブメタニド、クロルタリドン、クロパミド、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、ピレタニド、トリパミド、キシパミド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、エトクスゾラミド、スルタメ、ゾニサミド、トルセミド、フェノキシ酢酸誘導体（エタクリン酸、ムゾリミン）、それらの類似体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記チアジドまたはチアジド様利尿薬が、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、キネサゾン、それらの類似体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、修飾または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分解抵抗性のポリヌクレオシドアミド、アプタマー、トランスポゾン、導入遺伝子、および遺伝子工学用のベクターからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、ヒト化抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、組換え抗体（ｒＡｂ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ビス−ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ラクダ／サメ抗体、およびナノボディからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質またはタンパク質と核酸との組合せが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ｓｃＣａｓ９、合成ｓｐＣａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子工学のためのツールを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
治療有効量の、ボツリヌス毒素、短時間作用型の血清型Ｅ型ボツリヌス毒素、バクロフェン、ガバペンチン、チザニジン、ジアゼパム、クロナゼパム、ダントロレン、フェノール、クロニジン、ケタゼパム、ＭＤＬ２８１７０、リルゾール、カンナビノイド、エンドカンナビノイドまたはそれらの組合せを投与する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記カンナビノイドまたはエンドカンナビノイドが、ドロナビノール、ナビロン、ナビキシモルス、エンドカンナビノイドＶＮＳ１６Ｒ、カンナビジオール（ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
脊椎動物における障害を処置する方法であって、
直流源の第１の電極と第２の電極との間に直流刺激を適用する工程であって、前記第１の電極は、脊椎動物の脊髄の背側面またはその近傍にあるか、または前記第１の電極は、脊椎動物の頭蓋上にある、工程；および
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるのに十分な強度および期間で直流刺激を適用する工程
を含み、
前記第２の電極は、前記第１の電極から離れた位置に設置され、前記第１および第２の電極は逆に帯電されており、
前記直流は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流の少なくとも１つである、上記方法。
【請求項１２】
脊椎動物における障害を処置する方法であって、
直流源の第１の電極と第２の電極との間に第１の直流刺激を適用する工程であって、前記第１の電極は脊椎動物の脊髄の背側面またはその近傍にある工程；
直流源の第３の電極と第４の電極との間に第２の直流刺激を適用する工程であって、前記第３の電極は脊椎動物の末梢神経またはその近傍にある工程；および
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるのに十分な強度および期間で直流刺激を適用する工程
を含み、前記第２の電極は前記第１の電極から離れた位置に設置され、前記第１および第２の電極は逆に帯電されており、前記第４の電極は前記第３の電極から離れた位置に設置され、前記第３および第４の電極は逆に帯電されており、前記直流は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流の少なくとも１つである、上記方法。
【請求項１３】
前記第１および第２の刺激が、同時に、または順次適用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
直流源の第５の電極と第６の電極との間に第３の刺激を適用する工程であって、前記第５の電極は脊椎動物の頭蓋上である工程
をさらに含み、前記第６の電極は前記第５の電極から離れた位置に設置され、前記第５および第６の電極は逆に帯電されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１、第２、および第３の刺激が、同時に、または順次適用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記末梢神経が、骨格筋を刺激する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記期間が、１日またはそれより多くの日における一連の刺激セッションを含み、この日は、連続または不連続である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記障害が、痙縮、緊張亢進、およびジストニアからなる群から選択される筋緊張障害である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記障害が、副腎白質ジストロトフィー（ＡＤＬ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、ハラーホルデン−スパッツ症候群、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、ハンチントン病、フェニルケトン尿症、卒中、脳性麻痺、多発性硬化症、パーキンソン病、パーキンソン症候群を伴う神経変性疾患、新生児発作、てんかん、自閉症、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、虚血性および外傷性脳損傷後の脳浮腫、酸欠または一酸化炭素への曝露に起因する脳損傷、脳炎、髄膜炎、慢性疼痛、急性疼痛、ならびに耳鳴りからなる群から選択される神経障害または状態である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の前記生物学的活性または前記レベルが、減少される、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
治療有効量の、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する少なくとも１つの薬剤またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベルおよび／もしくはタンパク質発現レベルを減少させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が、医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬化合物が、スルホンアミド、スルホニル尿素ループ利尿薬、チアジド、およびチアジド様利尿薬からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記スルホンアミドまたはスルホニル尿素ループ利尿薬が、アセタゾールアミド、アゾセミド、ブメタニド、クロルタリドン、クロパミド、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、ピレタニド、トリパミド、キシパミド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、エトクスゾラミド、スルタメ、ゾニサミド、トルセミド、フェノキシ酢酸誘導体（エタクリン酸、ムゾリミン）、それらの類似体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記チアジドまたはチアジド様利尿薬が、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、キネサゾン、それらの類似体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、修飾または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分解抵抗性のポリヌクレオシドアミド、アプタマー、トランスポゾン、導入遺伝子、および遺伝子工学用のベクターからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、ヒト化抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、組換え抗体（ｒＡｂ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ビス−ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ラクダ／サメ抗体、およびナノボディからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質またはタンパク質と核酸との組合せが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ｓｃＣａｓ９、合成ｓｐＣａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子工学のためのツールを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
治療有効量の、ボツリヌス毒素、短時間作用型の血清型Ｅ型ボツリヌス毒素、バクロフェン、ガバペンチン、チザニジン、ジアゼパム、クロナゼパム、ダントロレン、フェノール、クロニジン、ケタゼパム、ＭＤＬ２８１７０、リルゾール、カンナビノイド、エンドカンナビノイド、またはそれらの組合せを投与する工程をさらに含む、請求項１１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記カンナビノイドまたはエンドカンナビノイドが、ドロナビノール、ナビロン、ナビキシモルス、エンドカンナビノイドＶＮＳ１６Ｒ、カンナビジオール（ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
治療有効量の、ＫＣＣ２の生物学的活性を増加させる少なくとも１つの薬剤またはＫＣＣ２の遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質発現レベルを増加させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤が、医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記医薬化合物が、Ｎ−エチルマレイミドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸が、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、修飾または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分解抵抗性のポリヌクレオシドアミド、アプタマー、トランスポゾン、導入遺伝子、および遺伝子工学用のベクターからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、ヒト化抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、組換え抗体（ｒＡｂ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ビス−ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ラクダ／サメ抗体、およびナノボディからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質またはタンパク質と核酸との組合せが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ｓｃＣａｓ９、合成ｓｐＣａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子工学のためのツールを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
脊椎動物における痙縮、緊張亢進、またはジストニアを処置するためのシステムであって、
脊椎動物における痙縮、緊張亢進、またはジストニアに関連する末梢神経の末梢直流刺激を提供するように構成された第１の刺激要素であって、前記末梢神経を刺激するように構成された神経刺激電極を有する神経刺激回路を含む、第１の刺激要素；
前記末梢神経の調節に関連する脊髄の場所に、脊髄直流刺激を提供するように構成された第２の刺激要素であって、前記第２の刺激要素は、活性脊髄刺激電極および脊髄参照電極を有する脊髄刺激回路を画定し、前記脊髄刺激回路は、前記脊髄刺激電極と前記脊髄参照電極との間に、前記脊髄の場所を刺激するための経皮脊髄直流刺激を提供するように構成されており、前記活性脊髄刺激電極は、相対的に前記脊髄の場所の近位にあり、前記脊髄参照電極は、相対的に前記脊髄の場所の遠位にある、第２の刺激要素；および
前記活性脊髄電極および前記近位神経電極を逆の極性で動作させ、結果として分極回路が形成されることを確定するように構成されたコントローラー要素であって、得られた分極回路は、分極電流フローに従って、標的分子の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるために、前記逆の極性に従って、前記活性脊髄電極と前記近位神経電極との間に分極電流フローを提供するように構成される、コントローラー要素、
を含み、
前記コントローラー要素はまた、予め決定された期間にわたる末梢直流刺激および脊髄直流刺激、ならびに予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激を提供するように構成される、上記システム。
【請求項３８】
前記コントローラー要素が、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流フローの少なくとも１つを含む前記電流フローを提供するように構成される、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記コントローラー要素がさらに、第１および第２の刺激要素によって供給される電流の範囲を同時に制御するように構成される、請求項３７または３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記第１の刺激要素が、前記末梢神経の刺激のために配置された刺激電極に刺激電流を提供するための正極および負極を含み、前記正極および負極は、前記正極に１つの電極が作動可能に接続され、前記負極に別の電極が作動可能に接続されるように配置されている、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記第２の刺激要素が、前記脊髄の場所にわたり刺激を送達するために配置された刺激電極に刺激電流を提供するための正極および負極を含み、前記正極および負極は、前記正極に１つの電極が作動可能に接続され、前記負極に別の電極が作動可能に接続されるように配置されている、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４２】
前記刺激電極の少なくとも１つが、埋め込まれている、請求項４０または４１に記載のシステム。
【請求項４３】
コントローラー要素および電源のうち少なくとも１つが、ウェアラブルなハウジング中に配置されている、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
前記予め決定された期間、前記予め決定された回数および前記予め決定された日数が、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるように選択される、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の前記生物学的活性または前記レベルが、減少される、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
脊髄、脳、または末梢神経のうちの１つに関連する生物学的活性を調節するための刺激デバイスであって、
複数の端子を有する直流電圧源；
第１の電極を前記直流電圧源に接続するための、前記端子のうち第１の端子であって、前記第１の電極は、脊椎動物の脊髄の背側面もしくはその近傍にあるか、脊椎動物の頭蓋上にあるか、または脊椎動物の末梢神経もしくはその近位にある、第１の端子；
第２の電極を前記直流電圧源に接続するための、前記端子のうち第２の端子であって、前記第２の電極は、前記第１の電極から離れた位置に設置されており、前記第１および第２の電極は逆に帯電されており、前記脊髄、前記頭蓋、または前記末梢神経を刺激するための電流経路を形成するように構成される、第２の端子；および
前記電流経路を通じて前記電極間の電流フローを制御するように構成されたコントローラー要素であって、予め決定された期間にわたる、前記脊髄を通過する、前記頭蓋を通過する、または前記末梢神経を通過する前記電流経路の刺激のための前記直流のフロー、および予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激を提供するようにも構成される、コントローラー要素
を含む、上記刺激デバイス。
【請求項４７】
前記コントローラー要素が、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流フローの少なくとも１つを含む前記電流フローを提供するように構成される、請求項４６に記載の刺激デバイス。
【請求項４８】
第１および第２の電極の少なくとも１つが、埋め込まれている、請求項４６または４７に記載の刺激デバイス。
【請求項４９】
コントローラー要素および直流電圧源の少なくとも１つが、ウェアラブルなハウジング中に配置されている、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の刺激デバイス。
【請求項５０】
前記予め決定された期間、前記予め決定された回数および前記予め決定された日数が、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるように選択される、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の刺激デバイス。
【請求項５１】
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の前記生物学的活性または前記レベルが、減少される、請求項５０に記載の刺激デバイス。
【請求項５２】
脊椎動物におけるＡＬＳを処置する方法であって、
直流源のＡ電極とＢ電極との間に刺激を適用する工程であって、前記Ａ電極は脊椎動物の脊髄の背側面の第１の場所またはその近傍にあるか、または前記Ａ電極は脊椎動物の頭蓋上の第１の場所にある工程；および
神経細胞の寿命を延長するのに十分な強度および期間で、直流刺激を適用する工程
を含み、
前記Ｂ電極は前記Ａ電極から離れた第１の位置に設置され、前記ＡおよびＢ電極は逆に帯電されており、前記直流は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流の少なくとも１つである、上記方法。
【請求項５３】
前記Ａ電極を、脊椎動物の脊髄の背側面の第２の場所に、または脊椎動物の頭蓋上の第２の場所に移動させる工程；
任意に、前記Ａ電極から離れた第２の位置に前記Ｂ電極を設置する工程；および
神経細胞の寿命を延長するのに十分な強度および期間で、直流刺激を適用する工程
をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記工程を１回またはそれより多くの回数繰り返すことをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
複数のＡ電極が脊髄の背側面に沿って複数の位置またはその近傍に配置され、複数のＢ電極が前記複数のＡ電極から離れた位置に設置される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
複数のＡ電極が運動制御に関連する頭蓋上の複数の位置に配置され、複数のＢ電極が前記複数のＡ電極から離れた位置に設置される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数のＡ電極およびＢ電極の間に適用される前記刺激が、同時に、または順次適用される、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
脊椎動物におけるＡＬＳを処置する方法であって、
直流源のＡ電極とＢ電極との間に第１の刺激を適用する工程であって、前記Ａ電極は脊椎動物の脊髄の背側面の第１の場所またはその近傍にある工程；
直流源のＣ電極とＤ電極との間に第２の刺激を適用する工程であって、前記Ｃ電極は脊椎動物の頭蓋上の第１の場所にある工程；および
神経細胞の寿命を延長するのに十分な強度および期間で、直流刺激を適用する工程
を含み、前記Ｂ電極は前記Ａ電極から離れた位置に設置され、前記ＡおよびＢ電極は逆に帯電されており、前記Ｄ電極は前記Ｃ電極から離れた位置に設置され、前記ＣおよびＤ電極は逆に帯電されており、前記直流は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流の少なくとも１つである、方法。
【請求項５９】
前記第１および第２の刺激が、同時に、または順次適用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ａ電極を、脊椎動物の脊髄の背側面の第２の場所に移動させる工程；
任意に、前記Ａ電極から離れた第２の位置に前記Ｂ電極を設置する工程；および
神経細胞の寿命を延長するのに十分な強度および期間で、直流刺激を適用する工程
をさらに含む、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｃ電極を、脊椎動物の頭蓋上の第２の場所に移動させる工程；
任意に、前記Ｃ電極から離れた第２の位置に前記Ｄ電極を設置する工程；および
神経細胞の寿命を延長するのに十分な強度および期間で、直流刺激を適用する工程
をさらに含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記工程を１回またはそれより多くの回数繰り返すことをさらに含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
複数のＡ電極が脊髄の背側面に沿って複数の位置またはその近傍に配置され、複数のＢ電極が前記複数のＡ電極から離れた位置に設置される、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６４】
複数のＣ電極が運動制御に関連する頭蓋上の複数の位置に配置され、複数のＤ電極が該複数のＣ電極から離れた位置に設置される、請求項５８、５９または６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記複数のＡ電極およびＢ電極の間および前記複数のＣ電極およびＤ電極の間に適用される前記刺激が、同時に、または順次適用される、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
直流源のＥ電極とＦ電極との間に第３の刺激を適用する工程であって、前記Ｅ電極は脊椎動物の第１の末梢神経の第１の場所またはその近傍にある工程
をさらに含み、
前記Ｆ電極は、前記Ｅ電極から離れた位置に設置され、前記ＥおよびＦ電極は、逆に帯電されている、請求項５８〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１、第２、および第３の刺激が、同時に、または順次適用される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｅ電極を、前記第１の末梢神経もしくはその近傍の第２の場所に、または第２の末梢神経もしくはその近傍の場所に移動させる工程；
任意に、前記Ｅ電極から離れた第２の位置に前記Ｆ電極を設置する工程；および
神経細胞の寿命を延長するのに十分な強度および期間で、直流刺激を適用する工程
をさらに含む、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記工程を１回またはそれより多くの回数繰り返すことをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
複数のＥ電極が、前記末梢神経に沿って複数の位置に配置されているか、または複数の末梢神経またはその近傍に配置されており、複数のＦ電極が、前記複数のＥ電極から離れた位置に設置される、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記複数のＥ電極およびＦ電極の間に適用される前記刺激が、同時に、または順次適用される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記末梢神経が、骨格筋を刺激する、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記期間が、１日またはそれより多くの日における一連の刺激セッションを含み、この日は、連続または不連続である、請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるのに十分な強度および期間で直流刺激を適用する工程をさらに含む、請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の前記生物学的活性または前記レベルが、減少される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
治療有効量の、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する少なくとも１つの薬剤またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベルおよび／もしくはタンパク質発現レベルを減少させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項６６〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記薬剤が、医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記医薬化合物が、スルホンアミド、スルホニル尿素ループ利尿薬、チアジド、およびチアジド様利尿薬からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記スルホンアミドまたはスルホニル尿素ループ利尿薬が、アセタゾールアミド、アゾセミド、ブメタニド、クロルタリドン、クロパミド、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、ピレタニド、トリパミド、キシパミド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、エトクスゾラミド、スルタメ、ゾニサミド、トルセミド、フェノキシ酢酸誘導体（エタクリン酸、ムゾリミン）、それらの類似体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記チアジドまたはチアジド様利尿薬が、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、キネサゾン、それらの類似体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記核酸が、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、修飾または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分解抵抗性のポリヌクレオシドアミド、アプタマー、トランスポゾン、導入遺伝子、および遺伝子工学用のベクターからなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記抗体が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、ヒト化抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、組換え抗体（ｒＡｂ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ビス−ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ラクダ／サメ抗体、およびナノボディからなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記タンパク質またはタンパク質と核酸との組合せが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ｓｃＣａｓ９、合成ｓｐＣａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子工学のためのツールを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
治療有効量の、ボツリヌス毒素、短時間作用型の血清型Ｅ型ボツリヌス毒素、バクロフェン、ガバペンチン、チザニジン、ジアゼパム、クロナゼパム、ダントロレン、フェノール、クロニジン、ケタゼパム、ＭＤＬ２８１７０、リルゾール、カンナビノイド、エンドカンナビノイド、またはそれらの組合せを投与する工程をさらに含む、請求項６６〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記カンナビノイドまたはエンドカンナビノイドが、ドロナビノール、ナビロン、ナビキシモルス、エンドカンナビノイドＶＮＳ１６Ｒ、カンナビジオール（ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
治療有効量の、ＫＣＣ２の生物学的活性を増加させる少なくとも１つの薬剤またはＫＣＣ２の遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質発現レベルを増加させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項６６〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記薬剤が、医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記医薬化合物が、Ｎ−エチルマレイミドである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記核酸が、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、修飾または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分解抵抗性のポリヌクレオシドアミド、アプタマー、トランスポゾン、導入遺伝子、および遺伝子工学用のベクターからなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記抗体が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、ヒト化抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、組換え抗体（ｒＡｂ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ビス−ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ラクダ／サメ抗体、およびナノボディからなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記タンパク質またはタンパク質と核酸との組合せが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ｓｃＣａｓ９、合成ｓｐＣａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子工学のためのツールを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
脊椎動物におけるＡＬＳを処置するためのシステムであって、
脊椎動物において、末梢神経に沿って複数の場所に末梢神経の末梢直流刺激を提供するか、または複数の末梢神経の末梢直流刺激を提供するように構成された複数のＡ刺激要素であって、前記Ａ刺激要素のそれぞれは、前記末梢神経または複数の末梢神経を刺激するように構成された神経刺激電極を有する神経刺激回路を含む、Ａ刺激要素；
複数の前記末梢神経または複数の末梢神経の調節に関連する脊髄の場所に、脊髄直流刺激を提供するように構成された複数のＢ刺激要素であって、前記Ｂ刺激要素のそれぞれは、活性脊髄刺激電極および脊髄参照電極を有する脊髄刺激回路を画定し、前記脊髄刺激回路は、前記脊髄刺激電極と前記脊髄参照電極との間に、前記脊髄の場所を刺激するための経皮脊髄直流刺激を提供するように構成されており、前記活性脊髄刺激電極は相対的に前記脊髄の場所の近位にあり、前記脊髄参照電極は相対的に前記脊髄の場所の遠位にある、Ｂ刺激要素；および
前記活性脊髄電極および前記近位神経電極を逆の極性で動作させ、結果として分極回路が形成されることを確定するように構成されるコントローラー要素であって、得られた分極回路は、分極電流フローに従って、標的分子の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるために、前記逆の極性に従って、前記活性脊髄電極と前記近位神経電極との間に分極電流フローを提供するように構成される、コントローラー要素
を含み、
前記コントローラー要素はまた、予め決定された期間にわたる末梢直流刺激および脊髄直流刺激、ならびに予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激を提供するように構成される、上記システム。
【請求項９３】
前記コントローラー要素が、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流フローの少なくとも１つを含む前記電流フローを提供するように構成される、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９４】
前記コントローラー要素がさらに、前記ＡおよびＢ刺激要素によって供給される電流の範囲を同時に制御するように構成される、請求項９２または９３に記載のシステム。
【請求項９５】
前記Ａ刺激要素が、末梢神経または複数の末梢神経の前記複数の場所の刺激のために配置された刺激電極に刺激電流を提供するための正極および負極を含み、前記正極および負極は、前記正極に１つの電極が作動可能に接続され、前記負極に別の電極が作動可能に接続されるように配置されている、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９６】
前記Ｂ刺激要素が、前記複数の脊髄の場所にわたり刺激を送達するために配置された刺激電極に刺激電流を提供するための正極および負極を含み、前記正極および負極は、前記正極に１つの電極が作動可能に接続され、前記負極に別の電極が作動可能に接続されるように配置されている、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９７】
前記刺激電極の少なくとも１つが、埋め込まれている、請求項９５または９６に記載のシステム。
【請求項９８】
コントローラー要素および電源のうち少なくとも１つが、ウェアラブルなハウジング中に配置されている、請求項９２〜９７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９９】
前記予め決定された期間、前記予め決定された回数および前記予め決定された日数が、神経細胞の寿命を延長するように、および／またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるように選択される、請求項９２〜９８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１００】
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の前記生物学的活性または前記レベルが、減少される、請求項９９に記載のシステム。
【請求項１０１】
ＡＬＳを処置するための刺激デバイスであって、
複数の端子を有する直流電圧源；
複数のＡ電極を前記直流電圧源に接続するための、複数のＡ端子であって、前記複数のＡ電極は、脊椎動物の脊髄の背側面の複数の場所または脊椎動物の頭蓋上の複数の場所にある、複数のＡ端子；
複数のＢ電極を前記直流電圧源に接続するための、複数のＢ端子であって、前記複数のＢ電極は前記複数のＡ電極から離れた位置に設置され、前記ＡおよびＢ電極は逆に帯電されている、複数のＢ端子；および
電極間の電流フローを制御するように構成されるコントローラー要素であって、予め決定された期間にわたる直流刺激、および予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激も提供するように構成されるコントローラー要素
を含む、上記刺激デバイス。
【請求項１０２】
前記コントローラー要素が、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流フローの少なくとも１つを含む前記電流フローを提供するように構成される、請求項１０１に記載の刺激デバイス。
【請求項１０３】
前記ＡおよびＢ電極の少なくとも１つが、埋め込まれている、請求項１０１または１０２に記載の刺激デバイス。
【請求項１０４】
コントローラー要素および直流電圧源の少なくとも１つが、ウェアラブルなハウジング中に配置されている、請求項１０１〜１０３のいずれか一項に記載の刺激デバイス。
【請求項１０５】
神経細胞の寿命が延長されるように、および／またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるように、前記予め決定された期間、前記予め決定された回数および前記予め決定された日数が選択される、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の刺激デバイス。
【請求項１０６】
ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の前記生物学的活性または前記レベルが、減少される、請求項１０５に記載の刺激デバイス。
【請求項１０７】
痙縮、緊張亢進、またはジストニアの処置における使用のための、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する薬剤、またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質発現レベルを減少させる薬剤。
【請求項１０８】
医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０７に記載の薬剤。
【請求項１０９】
前記医薬化合物が、スルホンアミド、スルホニル尿素ループ利尿薬、チアジド、およびチアジド様利尿薬からなる群から選択される、請求項１０８に記載の薬剤。
【請求項１１０】
前記スルホンアミドまたはスルホニル尿素ループ利尿薬が、アセタゾールアミド、アゾセミド、ブメタニド、クロルタリドン、クロパミド、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、ピレタニド、トリパミド、キシパミド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、エトクスゾラミド、スルタメ、ゾニサミド、トルセミド、フェノキシ酢酸誘導体（エタクリン酸、ムゾリミン）、それらの類似体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０９に記載の薬剤。
【請求項１１１】
前記チアジドまたはチアジド様利尿薬が、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、キネサゾン、それらの類似体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０９に記載の薬剤。
【請求項１１２】
前記核酸が、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、修飾または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分解抵抗性のポリヌクレオシドアミド、アプタマー、トランスポゾン、導入遺伝子、および遺伝子工学用のベクターからなる群から選択される、請求項１０８に記載の薬剤。
【請求項１１３】
前記抗体が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、ヒト化抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、組換え抗体（ｒＡｂ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ビス−ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ラクダ／サメ抗体、およびナノボディからなる群から選択される、請求項１０８に記載の薬剤。
【請求項１１４】
前記タンパク質またはタンパク質および核酸の１つもしくは複数の組合せが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ｓｃＣａｓ９、合成ｓｐＣａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子工学のためのツールを含む、請求項１０８に記載の薬剤。
【請求項１１５】
ボツリヌス毒素、短時間作用型の血清型Ｅ型ボツリヌス毒素、バクロフェン、ガバペンチン、チザニジン、ジアゼパム、クロナゼパム、ダントロレン、フェノール、クロニジン、ケタゼパム、ＭＤＬ２８１７０、リルゾール、カンナビノイド、エンドカンナビノイド、またはそれらの組合せの１つまたはそれより多くと組み合わせた、請求項１０７〜１１４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１１６】
前記カンナビノイドまたはエンドカンナビノイドが、ドロナビノール、ナビロン、ナビキシモルス、エンドカンナビノイドＶＮＳ１６Ｒ、カンナビジオール（ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１５に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
[001]本出願は、２０１８年３月２２日付けで出願された６２／６４６，５７４号の優先権を主張し、これはすべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
[002]本発明は、痙縮（spasticity）、緊張亢進（hypertonia）、またはジストニア（dystonia）を処置するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
[003]脊髄の興奮性亢進は、脊髄損傷（ＳＣＩ）後によくみられ、患者の少なくとも３分の１において問題となる（Holtzら、2017）。脊髄の興奮性亢進はまた、様々な神経学的状態および障害においても存在する。痙縮は、筋肉の伸張により誘発される感覚入力後の筋肉の不随意収縮の一形態であり、伸張の速度に対して高度な感受性を有する一次的な終結（BrownおよびMatthews、1966）に起因する速度依存性の現象として特徴付けられている（Lance、1990）。速度依存性の痙縮は、ＳＣＩ後のラット（Bennettら、1999；Boseら、2002；Vlarsalaら、2005）およびマウス（Ahmed、2014）でも発症する。痙縮は、その特徴のために、機能的運動に負に干渉する（KnutssonおよびRichards、1979；Lamontagneら、2001）。痙縮は、疼痛や疲労、睡眠障害を引き起こす可能性があり、歩くこと、座ること、および風呂に入ることなどの日常的な活動を制限する可能性があり、リハビリテーションの努力をくじけさせる可能性がある。したがって、痙縮は、個体の生活の質に負の影響を与え、新規の治療的介入が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
[004]本発明は、１つまたはそれより多くの実施態様において、ヒトおよび他の生物などの動物における１つまたはそれより多くの場所に直流源を適用することによって、痙縮、緊張亢進またはジストニアを処置するための方法、デバイスおよびシステムを対象とする。直流適用のための場所としては、脊柱、末梢神経および頭蓋が挙げられる。
【０００５】
[005]痙縮の永続的な低減は、脊髄反射の速度依存性抑制（rate-dependent depression）の増強との関連が示され、アノード経皮脊髄直流刺激（trans-spinal direct current stimulation：ｔｓＤＣＳ）後、地上および巧緻運動が改善された。本明細書において、ＳＣＩ誘発後に痙縮を呈示するマウスにおいて、ニューロンＮａ−Ｋ−Ｃｌ共輸送体アイソフォーム１（ＮＫＣＣ１）が有意にアップレギュレーションされることが示される。マウスをアノードｔｓＤＣＳで処置した場合、ＮＫＣＣ１のダウンレギュレーションが検出され、このダウンレギュレーションは、傷害を受けていない対照マウスと有意に異ならないレベルへのダウンレギュレーションであった。したがって、１つまたはそれより多くの実施態様において、本発明は、少なくとも、本明細書で開示される方法、システムおよびデバイスを介したＮＫＣＣ１のダウンレギュレーションおよび／またはＮＫＣＣ１活性の阻害による痙縮の長期にわたる低減を対象とする。
【０００６】
[006]本開示の他の特徴および利点は、以下に示すそれらの好ましい実施態様の説明、および特許請求の範囲から明らかであると予想される。別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本開示が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の開示の実施または試験において、以下では好適な方法および材料を後述するが、本明細書に記載されたものに類似のまたは均等な方法および材料を使用できる。本明細書において引用された全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用された全ての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することは意図されない。
【０００７】
[007]適用可能な場合、または具体的に権利放棄しない限り、本明細書に記載されるいずれの実施態様も、たとえ実施態様が本開示の異なる側面で記載されていたとしても、他のいずれか１つ以上の実施態様と組み合わせることができることが意図されている。
【０００８】
[008]これらおよび他の実施態様は、以下の詳細な説明に開示され、および／または含まれる。
[009]以下の詳細な説明は、一例として示され、記載された具体的な実施態様のみに本開示を限定することは意図されない。以下の詳細な説明は、以下に示す添付の図面との組み合わせで最もよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[010]図１Ａ〜１Ｄは、マウスにおいて痙縮を試験するための機構および手順を示す。図１Ａ（左）は、ステッパーモーター、運動アーム、等尺性力変換器、およびマウスホルダーで構成される伸張器具を描写する。システムをコンピューターソフトウェアによって制御した。図１Ａ（右）は、どのように肢がマウスホルダーに配置されるのかを示す。図１Ｂは、速度１＝１８度／秒；速度２＝１８０度／秒；および速度３＝１８００度／秒で記録された筋肉抵抗のトレースの代表例である。左側のトレースは、覚醒している動物からのものであり、一方で右側のトレースは、イソフルラン投与により眠っている動物から得た。図１Ｃの下の２つのトレースは、ＥＭＧとＥＭＧの二乗平均平方根を示す。＊は、深い麻酔中のＥＭＧを意味する。図１Ｄは、覚醒しているおよび眠っているマウスで記録された速度１での力のトレースを重ね合わせることにより、測定された活性抵抗、上昇スロープ、およびピークに対するイソフルランの作用を示す。
【図２】[011]図２Ａ〜２Ｄは、ｔｓＤＣＳでの繰り返しの処置が、ＳＣＩを有するマウスにおいて痙縮の経時的な低減をもたらすことを表す。動物を４つのグループ：アノードｔｓＤＣＳグループ（ｎ＝１６）；カソードｔｓＤＣＳグループ（ｎ＝１５）；偽処置グループ（ｎ＝１０）、および無傷対照グループ（ｎ＝８）に分けた。Ａ〜Ｃ、アノードｔｓＤＣＳは、ピーク筋肉抵抗（図２Ａ）、上昇スロープ（図２Ｂ）、ＥＭＧ面積（図２Ｃ）、およびＥＭＧ振幅（図２Ｄ）において有意な低減を引き起こした。図２Ｂ〜２Ｄについて、カソードおよび偽処置は、有意に異なっていなかった。“ｐ＜０．０５、ホルム−シダック（Holm-Sidak）法。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図３】[012]図３Ａ〜３Ｅは、ｔｓＤＣＳでの繰り返しの処置が、歩行パターンにおける変化を引き起こすことを描写する。図３Ａは、ＤｉｇｉＧａｉｔシステムの一般的な機構を表す。歩行を２つの速度：１０ｃｍ／秒および２０ｃｍ／秒で試験した。右上に典型的な記録と、それに対応する上昇スロープ、ピークの肢面積、および標識された下降スロープデータを示す。下の記録は、各グループの代表的な動物からの立脚期を表す。図３Ｂは、どのように対照の健康な動物を、２週間のインターバルを挟んだ２回の試験で評価したかを示す。灰色のバーは、左後肢（ＬＨＬ）のデータを表し、青色のバーは、右後肢（ＲＨＬ）のデータを表す。Ｅ１、Ｅ２：方法を参照されたい。対照動物は、どちらの肢についても、Ｅ１とＥ２との間で肢面積、上昇スロープ、または下降スロープにおける差を呈示しなかった。図３Ｃは、どのように偽処置動物が、遅い速度でＥ１〜Ｅ３の間にＬＨＬの肢面積の有意な減少を呈示したかを示す（ｐ＝０．００９）。ＲＨＬの肢面積は減少しなかった。ＬＨＬの場合、肢面積は、Ｅ１〜Ｅ３の間により速い速度で有意に減少したが（ｐ＝０．００５）、ＲＨＬは有意に変化しなかった。ＬＨＬの場合、上昇スロープは、Ｅ１において遅い速度で有意に減少し（ｐ＝０．０３９）、ＲＨＬの場合は有意に減少しなかった。より速い速度で、上昇スロープは、いずれの後肢でも有意に変化しなかった。遅い速度で、下降スロープは、いずれの後肢でも有意に減少しなかった。その一方で、より速い速度で、ＬＨＬの場合、下降スロープは、Ｅ１〜Ｅ３の間に有意に減少し（ｐ＝０．０１２）、ＲＨＬの場合は有意に減少しなかった。＊ｐ＜０．０５、ホルム−シダック法。図３Ｄは、どのようにアノードｔｓＤＣＳ処置動物が、ＬＨＬについて、遅い速度で、Ｅ１〜Ｅ３の間に肢面積において有意な増加を示し、一方でＲＨＬについて、Ｅ１およびＥ２の間のみ有意な増加を示したかを示す（両方の後肢について、ｐ＜０．００１）。肢面積は、ＬＨＬとＲＨＬの両方で、より速い速度でＥ１中に有意に増加した（それぞれｐ＜０．００１）。上昇スロープは、ＲＨＬの場合、遅い速度でＥ１およびＥ２中に有意に増加したが（ｐ＝０．００２）、ＬＨＬの場合は増加しなかった。上昇スロープは、ＲＨＬの場合のみ、より速い速度でＥ１中に有意に増加した（ｐ＝０．０１１）。下降スロープは、ＬＨＬおよびＲＨＬの場合、遅い速度でＥ１およびＥ２中に有意に増加した（それぞれｐ＜０．００１）。下降スロープは、ＲＨＬの場合のみ、より速い速度でＥ１中に有意に増加した（ｐ＜０．００１）。＊ｐ＜０．０５、ホルム−シダック法。最後に図３Ｅは、どのようにカソードｔｓＤＣＳ処置動物が、遅い速度で、ベースラインと比較してＥ１中に肢面積において有意な増加を示したが（ＬＨＬ：ｐ＜０．００１；ＲＨＬ：ｐ＜０．００１）、Ｅ２またはＥ３中に有意な増加を示さなかったかを描写する。Ｅ１〜Ｅ３において、より速い速度で、肢面積における有意な変化は観察されなかった。上昇スロープも両方の速度において不変のままであった。下降スロープは、ＬＨＬの場合、Ｅ１およびＥ２中に有意に増加し（ｐ＜０．００１）、ＲＨＬについては、Ｅ１の間のみ有意に増加した（ｐ���０．０２５）。＊ｐ＜０．０５、ホルム−シダック法。より速い速度で、下降スロープにおける有意な変化はなかった。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図４】[013]図４Ａ〜４Ｃは、繰り返しのアノード処置後の運動制御の回復の強化を呈示する。図４Ａの左の部分は、ラダー−ホイールの画像を示し、図４Ｂの右の部分は、左後肢による全体のミスを示す連続したフレーム（１〜３）を示す。図４Ｂは、評価した４つのタイムポイントの巧緻運動の平均スコアを示す棒グラフを描写する（方法を参照）。偽処置した、偽ＳＣＩグループ；アノードｔｓＤＣＳで７日にわたり１日１回処置したアノードＳＣＩグループ；カソードｔｓＤＣＳで７日にわたり１日１回処置したカソードＳＣＩグループ；健康、傷害なし／処置なし；図４Ｃは、Ｅ２〜Ｅ４にわたる評価前または健康対照についての最初の評価（評価前（Pre-eval））からの変化パーセントの棒グラフを示す。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。評価前と比較して、＊ｐ＜０．０５。
【図５】［０１４］図５Ａ〜５Ｆは、ｔｓＤＣＳ刺激の繰り返しのセッション後のホフマン反射のＲＤＤを要約する。図５Ａの左の部分は、ＳＣＩを有する動物における痙縮の観察可能な特徴（足指の開扇現象）を示す。右：記録のセットアップ：ＳＥ、刺激電極；ＲＥ、記録電極。一番右側に示される２つの記録トレースは、測定したままのトレース（上）および二乗平均平方根で計算したトレース（下）を表す。図５Ｂは、深い麻酔中（青色）および麻酔注射の４５分後（オレンジ色）の呼吸数（ＲＲ）を示す。図５Ｃの上のセクションは、深い麻酔中（青色）および麻酔注射の４５分後（オレンジ色）の心拍数（ＨＲ）を示す。図５Ｃの下のセクションは、ＲＤＤ試験が行われた際のＨＲを示す、中断を含む全記録を示す。図５Ｂは、深い麻酔（深）とそれに対する軽い麻酔（軽）でＲＤＤを試験したときに生じた変化を描写する。Ｅ、左：示されたグループからの代表的な記録。図５Ｆの左の部分は、示された各グループの平均ＲＤＤの棒グラフを示す。ＲＤＤは、対照グループ（ｎ＝１２）において、レート０．１Ｈｚと比較して、レート１〜５Ｈｚでより有意に高かった（ｐ＜０．００１）。図５Ｆの右の部分は、５ＨｚにおけるＲＤＤの示されたグループの累積確率分布を示す。“同じグループにおける０．１ＨｚにおけるＲＤＤからの有意差；＊＊偽グループにおけるそれぞれのＲＤＤからの有意差。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図６】[015]図６Ａ〜６Ｂは、繰り返しのｔｓＤＣＳ後にＫＣＣ２、ｐ−ＫＣＣ２、ＮＫＣＣ１、およびｐ−ＮＫＣＣ１に関して検出された発現における変化を示す。実験グループからの代表的な動物をランダムに選択して、これらの分子の変化を調査した。図６Ａの左の部分は、対照グループと比較して、どのように偽処置グループにおいて、ＫＣＣ２発現が不変であり、アノードおよびカソード処置グループにおいてわずかに低減したかを示す。図６Ａの右の部分は、対照グループと比較して、どのように偽処置グループにおいてｐＫＣＣ２発現が中程度に増加し、カソード処置およびアノード処置グループにおいてわずかに低減したかを示す。図６Ｂは、どのように偽処置およびカソード処置グループにおいてＮＫＣＣ１発現が有意に増加したが、アノード処置グループにおけるレベルが、対照グループのレベルと異なっていなかったかを示す。ｐ−ＮＫＣＣ１発現はグループ間で変化しなかった。ｌｉ−アクチンの検出は、ローディングコントロールとして行われた。＊ｐ＜０．０５。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図７】[016]図７Ａおよび７Ｂは、無傷マウスにおける１回の刺激セッション後のＮＫＣＣ１およびｐ−ＮＫＣＣ１発現を要約する。図７Ａは、ＮＫＣＣ１およびｐ−ＮＫＣＣ１を検出するために刺激の２時間後に収集されたサンプルで実行されたウェスタンブロットのカラーマップ（上）および元のブロット（下）を示す。カソード対アノード刺激それぞれの後に、偽サンプルと比較して、より高いレベルおよびより低いレベルのＮＫＣＣ１が検出された。１−アクチンの検出は、ローディングコントロールとして行われた。図７Ｂは、ｐ−ＮＫＣＣＩ／全ＮＫＣＣ１の比率の計算を含む図７Ａからのバンド密度データの棒グラフを示す。＊ｐ＜０．０５。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図８】[017]図８Ａ〜８Ｃは、アノードｔｓＤＣＳによって誘発されたＨＳＰ７０応答を示す。アノードｔｓＤＣＳは、ＮＫＣＣ１タンパク質レベルにおける低減をもたらしたが、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡレベルにおける低減はもたらさなかったため、ＨＳＰ７０がＮＫＣＣ１の分解を媒介する可能性を調査した。偽処置した無傷動物から組織サンプルを収集し（図８Ａ）、２時間後、無傷の麻酔した動物にアノードｔｓＤＣＳの１回のセッションを受けさせた（図８Ｂ）。次いでこれらのサンプルをＨＳＰ７０について染色した（緑色）。上、運動ニューロンの核；下、運動ニューロンの拡大画像。アスタリスクは、細胞核を示す。スケールバーが示されている。図８Ｃにおいて、ウェスタンブロットは、偽処置サンプルと比べてアノード処置動物サンプルにおけるＨＳＰ７０発現において有意な矛盾のない増加を示した（＊ｐ＝０．０３）。Ｉ３−アクチンの検出をローディングコントロールとして実行した。カラーマップと元のブロットの両方が示されている。下：１０３７の偽およびアノードサンプルにおけるｊ３−アクチンに対するＨＳＰ７０の平均バンド密度を表す棒グラフ。
【図９】[018]図９Ａ〜９Ｆは、どのようにＮＫＣＣ１ブロッカーであるブメタニドがＳＣＩを有する動物において痙縮を低減させたかを要約する。低速（図９Ａ）および高速（図９Ｂ）での筋肉抵抗（左）および併発のＥＭＧ（右）の代表的なトレースを示す。図９Ｂ／９Ｃおよび図９Ｅ／９Ｆにおいて、棒グラフは、ブメタニド注射後の、各場合における、それぞれ低速および高速での筋肉抵抗および併発のＥＭＧにおける減少を示す（ｎ＝９匹のマウス）。ＥＭＧの負の値は、伸長前のバックグラウンド活性に対する、伸張により生じたＥＭＧの抑制を示す。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。ベースライン２と比較して、＊ｐ＜０．０５（ＢＬ２は、第１のベースライン（ＢＬ１）の５分後に測定された）。
【図１０】[019]図１０は、現行の研究で試験された実験モデルの細胞内塩化物濃度に関係したＫＣＣ２およびＮＫＣＣ１のタンパク質発現におけるｔｓＤＣＳによって媒介される変化を示す図解を含む。健康対照において、ＮＫＣＣ１のレベルは、ＫＣＣ２のレベルより低く、それによってＣｌのより低い細胞内濃度がもたらされた。しかしながら、偽およびカソード処置グループに含まれるＳＣＩを有する痙縮の動物において、ＮＫＣＣ１はアップレギュレーションされ、それによって細胞内Ｃｌの増加および脱抑制が起こることが見出された。対照的に、アノードｔｓＤＣＳ処置動物は、より低いレベルのＮＫＣＣ１を有し、抑制は回復した。
【図１１】[020]図１１は、標的領域のアノードによる経頭蓋直流刺激の代表例の図解である。アノードおよびカソードの正確な場所は、処置される疾患のタイプおよび標的化される頭蓋領域に依存する。
【図１２】[021]図１２は、深い脳構造のための提唱される刺激の処方（例えば、基底核を刺激するための）のグラフ表示である。提唱される様式は、約１０秒の持続時間にわたる、刺激間に約３０秒のインターバルを有する約１０ｍＡの強度でのロングパルスの単極直流（ＤＣ）である。処置時間は、約２０〜３０分であることが提唱される。
【図１３Ａ】[022]図１３Ａは、脊髄に（背側から腹側に）経皮脊髄直流刺激（ｔｓＤＣＳ）を適用するように構成された本発明の刺激システムの実施態様を示す。
【図１３Ｂ】[023]図１３Ｂは、本発明の刺激システムの態様の実施における電極列を示す。
【図１４】[024]図１４Ａは、患者に貼り付けたウェアラブルなｔｓＤＣＳデバイスの実施態様を示す。図１４Ｂおよび１４Ｃは、それぞれ、図１４Ａのウェアラブルなデバイスの実施態様の平面図および側面図を示す。
【図１５】[026]図１５は、高い筋緊張で長期間握った手指をほどくための正中神経を調節するための、これらの教示の実施態様を例示する。
【図１６】[027]図１６は、これらの教示の例示的な実施態様のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[028]以下の記載は、限定的な意味で解釈されず、単にこれらの教示の一般原則を例示する目的のためになされたものであり、これらの教示の範囲は添付の特許請求の範囲によって最もよく定義される。
【００１１】
[029]上記の例示的及びさらなる実施態様は、以下の図面と共に後述され、図面では、具体的に番号付けされた要素が記載され、本開示の全ての図面に記載されていると認識されるだろう。
【００１２】
[030]本明細書で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含む。
[031]用語「刺激」は、本明細書で使用される場合、神経線維の興奮または抑制のいずれかを指し、これはまた、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションとも称される。
【００１３】
[032]用語「電気刺激」は、本明細書で使用される場合、電圧を適用するかまたは電流を磁気的に誘発させるかにかかわらず、脊髄神経、ニューロン、回路（circuit）もしくは経路（pathway）への電流の生成または導入を指す。
【００１４】
[033]直流刺激（ＤＣＳ）は、直流を使用して、哺乳動物における疾患および障害、特定には脊椎動物の神経系に影響を及ぼす疾患および障害を処置することを包含する非侵襲的方法である。ＤＣＳとしては、経皮脊髄直流刺激（ｔｓＤＣＳ）、経頭蓋直流刺激（trans-cranial direct current stimulation：ｔｃＤＣＳ）および経末梢神経直流刺激（trans-peripheral nerve direct current stimulation：ｔｐｎＤＣＳ）が挙げられる。
【００１５】
[034]経皮脊髄直流刺激（ｔｓＤＣＳ）は、直流を使用して脊髄ニューロンを調節する非侵襲的方法である。ｔｓＤＣＳは、脊髄細胞内の特定のタンパク質の発現を誘導または抑制することができる。特定のタンパク質の発現の調節は、痙縮、緊張亢進およびジストニアを低減または緩和することができる。
【００１６】
[035]本発明の実施態様によれば、ｔｓＤＣＳは、標的とする脊髄の１つまたは複数の場所の刺激を含む。刺激は、標的とする脊髄の１つまたは複数の場所を含む画定された電流経路に沿って直流を適用することを含む。１つの例示的な実施態様における刺激は、実質的に連続的であり、閾値下のレベルで不変である。別の例示的な実施態様において、刺激は、全体的または部分的に変化する。別の例示的な実施態様において、刺激は、可変の刺激と不変の刺激の組合せを含む。別の例示的な実施態様において、刺激は、刺激のパルスを含む。さらに別の例示的な実施態様において、電流フローが一方向性ではない場合、刺激は、連続的な電流刺激のパルスを含む。
【００１７】
[036]経頭蓋直流刺激（ｔｃＤＣＳ）は、直流を使用して、脳の細胞を調節（modulate）する非侵襲的方法である。ｔｃＤＣＳは、脳細胞内の特異的なタンパク質の発現を誘導または抑制することができる。特異的なタンパク質の発現の調節は、副腎白質ジストロトフィー（ＡＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、ハラーホルデン−スパッツ症候群、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、ハンチントン病、フェニルケトン尿症、卒中、脳性麻痺、多発性硬化症、パーキンソン病、パーキンソン症候群を伴う神経変性疾患、新生児発作、てんかん、自閉症、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、虚血性および外傷性脳損傷後の脳浮腫、酸欠または一酸化炭素への曝露に起因する脳損傷、脳炎、髄膜炎、慢性疼痛、急性疼痛、ならびに耳鳴りなどの疾患および障害を処置するための治療に役立つ可能性がある。
【００１８】
[037]本発明の実施態様によれば、ｔｃＤＣＳは、標的となる頭蓋の１つまたは複数の場所の刺激を含む。刺激は、標的となる頭蓋の１つまたは複数の場所を含む画定された電流経路に沿って直流を適用することを含む。１つの例示的な実施態様における刺激は、実質的に連続的であり、閾値下のレベルで不変である。別の例示的な実施態様において、刺激は、全体的または部分的に変化する。別の例示的な実施態様において、刺激は、可変の刺激と不変の刺激の組合せを含む。別の例示的な実施態様において、刺激は、刺激のパルスを含む。さらに別の例示的な実施態様において、電流フローが一方向性ではない場合、刺激は、連続的な電流刺激のパルスを含む。
【００１９】
[038]経末梢神経直流刺激（ｔｐｎＤＣＳ）は、直流を使用して、末梢神経を調節する非侵襲的方法である。ｔｐｎＤＣＳは、末梢神経細胞内の特異的なタンパク質の発現を誘導または抑制することができる。特異的なタンパク質の発現の調節は、痙縮、緊張亢進およびジストニアを低減または緩和することができる。
【００２０】
[039]本発明の実施態様によれば、ｔｐｎＤＣＳは、標的となる末梢神経の１つまたは複数の場所の刺激を含む。刺激は、標的となる末梢神経の１つまたは複数の場所を含む画定された電流経路に沿って直流を適用することを含む。１つの例示的な実施態様における刺激は、実質的に連続的であり、閾値下のレベルで不変である。別の例示的な実施態様において、刺激は、全体的または部分的に変化する。別の例示的な実施態様において、刺激は、可変の刺激と不変の刺激の組合せを含む。別の例示的な実施態様において、刺激は、刺激のパルスを含む。さらに別の例示的な実施態様において、電流フローが一方向性ではない場合、刺激は、連続的な電流刺激のパルスを含む。
【００２１】
[040]本発明の実施において、電極または電極のアレイは、直流源に接続され、目的の領域に設置され、例えば脊髄の背側の面の真上にもしくはその近く、頭蓋上、または末梢神経もしくはその近くのいずれかに設置される。リターン電極または電極のアレイは、それから遠位に設置されて、電流フローの経路を画定する。それらは実行中に体の腹側の面上に存在するが、必ずしも目的の領域に配置された電極と真向いでなくてもよい。直流は、機能および望ましい刺激に応じて、アノードまたはカソードのいずれかとして、目的の領域に配置された処置電極に適用される。
【００２２】
[041]以下の用語は、本明細書で提供される本発明の実施態様の説明を限定するものではなく、様々な例示において少なくとも以下の定義を有すると理解されるだろう。
[042]「カソード刺激」は、処置の目的の望ましい領域にカソードが設置されているＤＣＳを指す。
【００２３】
[043]「アノード刺激」は、処置の目的の望ましい領域にアノードが設置されているＤＣＳを指す。
[044]「痙縮」は、伸張反射の速度依存性の過活動と定義される。したがって、痙縮は、特定の筋肉が連続的に収縮している状態を指す。この収縮は、筋肉の硬直または緊張を引き起こし、正常な運動、発話、および歩行を妨げる可能性がある。痙縮は通常、脳または脊髄の随意運動を制御する部分への損傷によって引き起こされる。損傷は、神経系と筋肉との間のシグナルの均衡に変化を引き起こす。この不均衡により、筋肉における活動の増大が生じる。
【００２４】
[045]「緊張亢進」は、損傷を受けた運動ニューロンの、無秩序な脊髄反射、筋紡錘の興奮性の増加、およびシナプス抑制の減少を引き起こす下行経路を調節する能力が損なわれていることを指す。これらの結果は、症状のある筋肉の異常に増加した筋緊張をもたらす。緊張亢進は、伸張反射の過活動がなくても筋緊張の増加を呈示する患者を含み、したがって緊張亢進は痙縮とは区別される。
【００２５】
[046]「ジストニア」は、人の筋肉が制御不能に収縮する運動障害を指す。収縮は、罹患した体の部分の不随意なねじれを引き起こし、結果として繰り返しの運動または異常な姿勢が生じる。ジストニアは、１つの筋肉、筋肉群、または全身に影響を与える可能性がある。ジストニアは、筋肉収縮の開始に関与する脳の一部である基底核における問題に関連するようである。
【００２６】
[047]「タンパク質発現」は、細胞または組織中に含有されるまたはそれらによって生産されたタンパク質またはペプチド（例えば排出されたタンパク質またはペプチド）のレベルまたは量を指す。「差次的な発現」、「差次的なタンパク質発現」および「差次的に発現される」は、細胞または組織中に含有されるまたはそれらによって生産されたタンパク質またはペプチドのレベルまたは量における変化を指す。タンパク質発現における変化は、特定の外来のシグナル、例えば化学的なシグナル、機械的なシグナル、または直流刺激に応答して起こり得る。このような発現における変化は、細胞または組織中に含有されるまたはそれらによって生産されたタンパク質またはペプチドのレベルまたは量における増加または減少であり得る。またタンパク質またはペプチドのレベルまたは量における増加は、「アップレギュレーション」とも称され、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量における減少は、「ダウンレギュレーション」とも称される。
【００２７】
[048]「メッセンジャーＲＮＡ発現」（「ｍＲＮＡ発現」）は、細胞または組織中に含有されるｍＲＮＡのレベルまたは量を指す。「差次的な発現」、「差次的なｍＲＮＡ発現」、「差次的な遺伝子発現」および「差次的に発現される」は、細胞または組織中に含有されるｍＲＮＡのレベルまたは量における変化を指す。ｍＲＮＡまたは遺伝子発現における変化は、特定の外来のシグナル、例えば化学的なシグナル、機械的なシグナルまたは直流刺激に応答して起こり得る。このような発現における変化は、細胞または組織中に含有されるｍＲＮＡのレベルまたは量における増加または減少であり得る。またｍＲＮＡのレベルまたは量における増加は、「アップレギュレーション」とも称され、ｍＲＮＡのレベルまたは量における減少は、「ダウンレギュレーション」とも称される。用語「ｍＲＮＡ発現」および「遺伝子発現」は、この開示にわたり同義的に使用される。
【００２８】
[049]以前の研究では、マウスにおける下腿三頭筋の筋緊張への経皮脊髄直流刺激（ｔｓＤＣＳ）の短期作用が検査された（Ahmed、2014）。脊髄刺激は、カソードｔｓＤＣＳが筋緊張を増加させ、アノードｔｓＤＣＳが筋緊張を低減させる筋緊張への有意な調節作用をもたらした。しかしながら、これらは麻酔した動物で実行された急性実験であった。それゆえに、例えばどれほど長く脊髄−坐骨ＤＣＳによって誘発された脊髄興奮性のリセットを維持できるか、どれほど長くこの手法が筋緊張に影響を与えることになるのか、どのように脊髄−坐骨ＤＣＳが、ＳＣＩ後の非巧緻および巧緻運動の回復に影響を与えるのかという重大な問題が残ったままである。
【００２９】
[050]本発明は、脊髄から坐骨へのＤＣＳ（アノードｔｓＤＣＳ）が、脊髄興奮性の長期の正常化を引き起こし、それによってＳＣＩを有する脊椎動物における筋緊張の低減の維持と、非巧緻および巧緻運動の回復の改善を促進するという仮説を裏付けるものである。
【００３０】
[051]Ｋ−Ｃｌ共輸送体アイソフォーム２（ＫＣＣ２）およびＮａ−Ｋ−Ｃｌ共輸送体アイソフォーム１（ＮＫＣＣ１）は、神経細胞膜を通過する塩化物イオン（Ｃｌ）濃度の確立に関与する（Misgeldら、1986）。ＧＡＢＡ−Ａおよびグリシン受容体によって媒介される抑制の強さの決定における電気化学的なＣｌ勾配の重要性により、ＫＣＣ２およびＮＫＣＣ１のタンパク質レベルまたは活性における不均衡は、興奮性亢進および筋肉の機能不全、特に痙縮を引き起こすと予測されている（Boulenguezら、2010：Modolら、2014）。脊髄または脳の興奮性への直流刺激の長期作用の基礎となる作用機序は、ほとんどわかっていない。ｔｓＤＣＳは、脊髄回路の興奮性における長期変化を引き起こす可能性があると提言されている（Ahmed、2013；Ahmed、2017；BolzoniおよびJankowska、2015；Samaddarら、2016；Songら、2016；WieraszkoおよびAhmed、2016）。それゆえに、本発明は、刺激された脊髄組織におけるＮＫＣＣ１および／またはＫＣＣ２のタンパク質発現における変化によって媒介される筋緊張へのｔｓＤＣＳの作用を調査した。
【００３１】
[052]痙縮を試験するための電気生理学の電動システムと運動器官分析との組合せを使用して、覚醒マウスにおけるＳＣＩ後の痙縮に対するｔｓＤＣＳの長期影響を解明した。加えて、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ウェスタンブロッティング、および免疫組織染色を実行して、刺激された脊髄組織におけるＮＫＣＣ１およびＫＣＣ２のタンパク質および／または遺伝子発現における変化を確認した。
【００３２】
[053]本発明の例示的な実施態様は、痙縮、緊張亢進またはジストニアの症状を含む、または上昇したＮＫＣＣ１発現に関連する疾患または障害を処置することを含む。このような疾患および障害の代表例としては、副腎白質ジストロトフィー（ＡＤＬ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、ハラーホルデン−スパッツ症候群、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、ハンチントン病、フェニルケトン尿症、卒中、脳性麻痺、多発性硬化症、パーキンソン病、パーキンソン症候群を伴う神経変性疾患、新生児発作、てんかん、自閉症、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、虚血性および外傷性脳損傷後の脳浮腫、酸欠または一酸化炭素への曝露に起因する脳損傷、脳炎、髄膜炎、慢性疼痛、急性疼痛、ならびに耳鳴りが挙げられる。
【００３３】
[054]本発明の例示的な実施態様は、痙縮、緊張亢進またはジストニアを処置する方法であって、治療有効量の、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する少なくとも１つの薬剤またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベルおよび／もしくはタンパク質発現レベルを減少させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程を含む、方法を含む。
【００３４】
[055]一部の実施態様において、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する少なくとも１つの薬剤またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベルおよび／もしくはタンパク質発現レベルを減少させる少なくとも１つの薬剤は、医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸またはそれらの組合せの少なくとも１つである。
【００３５】
[056]一部の実施態様において、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する医薬化合物は、スルホンアミド、スルホニル尿素ループ利尿薬、チアジドまたはチアジド様利尿薬の少なくとも１つである。
【００３６】
[057]スルホンアミドまたはスルホニル尿素ループ利尿薬の代表例は、アセタゾールアミド、アゾセミド、ブメタニド、クロルタリドン、クロパミド、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、ピレタニド、トリパミド、キシパミド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、エトクスゾラミド、スルタメ（sultame）、ゾニサミド、トルセミド、フェノキシ酢酸（phenoxyacetic acid）誘導体（エタクリン酸、ムゾリミン）、それらの類似体およびそれらの組合せである。
【００３７】
[058]チアジドまたはチアジド様利尿薬の代表例は、ベンドロフルメチアジド（bendoflumethiazide）、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド（methylclothiazide）、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、キネサゾン、それらの類似体およびそれらの組合せである。
【００３８】
[059]本明細書で開示される様々な実施態様で使用可能な、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する追加の医薬化合物、加えて、上記で列挙したスルホンアミド、スルホニル尿素ループ利尿薬、チアジドまたはチアジド様利尿薬の類似体は、ＷＯ２０１３／０８７０９０およびＷＯ２０１４／１９１４７１に開示されており、両方ともあらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【００３９】
[060]標的分子の遺伝子発現を変更するのに使用することができる核酸の代表例としては、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、修飾または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分解抵抗性のポリヌクレオシドアミド、アプタマー、トランスポゾン、導入遺伝子および遺伝子工学のためのベクターが挙げられる。一部の実施態様において、本明細書に記載される核酸は、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現のレベルを低下または減少させるのに使用され、これが順に、ＮＫＣＣ１タンパク質発現の低下または減少をもたらすことになる。
【００４０】
[061]標的分子の生物学的活性または発現を変更するのに使用可能な抗体（そのフラグメントを含む）の代表例としては、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）、ヒト化抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、組換え抗体（ｒＡｂ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ビス−ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ラクダ／サメ抗体およびナノボディが挙げられる。一部の実施態様において、本明細書に記載される抗体またはそのフラグメントは、ＮＫＣＣ１の生物学的活性をブロックまたは阻害するのに使用される。
【００４１】
[062]標的分子の生物学的活性または発現を変更するのに使用可能な分子の代表例としては、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ｓｃＣａｓ９、合成ｓｐＣａｓ９およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどの、遺伝子工学のためのツールであるタンパク質またはタンパク質と核酸との組合せが挙げられる。一部の実施態様において、タンパク質またはタンパク質と核酸との組合せは、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現のレベルを低下または減少させるのに使用され、これが順に、ＮＫＣＣ１タンパク質発現の低下または減少をもたらすことになる。
【００４２】
[063]痙縮、緊張亢進またはジストニアを処置するための上述の治療剤と組み合わせて使用可能な治療剤の代表例としては、ボツリヌス毒素、短時間作用型の血清型Ｅ型ボツリヌス毒素、バクロフェン、ガバペンチン、チザニジン、ジアゼパム、クロナゼパム、ダントロレン、フェノール、クロニジン、ケタゼパム（ketazepam）、ＭＤＬ２８１７０、リルゾール、カンナビノイド、エンドカンナビノイドおよびそれらの組合せが挙げられる。カンナビノイドおよびエンドカンナビノイドの代表例としては、ドロナビノール、ナビロン、ナビキシモルス、エンドカンナビノイドＶＮＳ１６Ｒ、カンナビジオール（ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）およびそれらの組合せが挙げられる。
【００４３】
[064]本発明の例示的な実施態様は、脊椎動物における障害を処置する方法であって、直流源の第１の電極と第２の電極との間に刺激を適用する工程であって、第１の電極は、脊椎動物の脊髄の背側の面またはその近傍にあるか、または第１の電極は、脊椎動物の頭蓋上にある工程；およびＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるのに十分な強度および期間で直流刺激を適用する工程を含み、第２の電極は、第１の電極から離れた位置に設置され、第１および第２の電極は逆に帯電されており、直流は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠（intermittent）電流、可変および不変の電流の少なくとも１つである、上記方法を含む。
【００４４】
[065]本発明の例示的な実施態様は、脊椎動物における障害を処置する方法であり、これは二重刺激方法であり、直流源の第１の電極と第２の電極との間に第１刺激を適用する工程であって、第１の電極は、脊椎動物の脊髄の背側面またはその近傍にある工程；直流源の第３の電極と第４の電極との間に第２の刺激を適用する工程であって、第３の電極の１つは、脊椎動物の末梢神経またはその近傍にある工程；およびＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるのに十分な強度および期間で直流刺激を適用する工程を含み、第２の電極は、第１の電極から離れた位置に設置され、第１および第２の電極は逆に帯電されており、第４の電極は、第３の電極から離れた位置に設置され、第３および第４の電極は逆に帯電されており、直流は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流の少なくとも１つである、上記方法を含む。
【００４５】
[066]二重刺激方法の一部の実施態様において、第１および第２の刺激は、同時に、または順次適用される。
[067]本発明の例示的な実施態様は、脊椎動物における障害を処置する方法であり、これは三重刺激方法であり、直流源の第１の電極と第２の電極との間に第１刺激を適用する工程であって、第１の電極は、脊椎動物の脊髄の背側面またはその近傍にある工程；直流源の第３の電極と第４の電極との間に第２の刺激を適用する工程であって、第３の電極の１つは、脊椎動物の末梢神経またはその近傍にある工程；およびＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるのに十分な強度および期間で直流刺激を適用する工程を含み、第２の電極は、第１の電極から離れた位置に設置され、第１および第２の電極は逆に帯電されており、第４の電極は、第３の電極から離れた位置に設置され、第３および第４の電極は逆に帯電されており、直流は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流の少なくとも１つであり、本方法はさらに、直流源の第５の電極と第６の電極との間に第３の刺激を適用する工程であって、第５の電極は、脊椎動物の頭蓋上である工程をさらに含み、第６の電極は、第５の電極から離れた位置に設置され、第５および第６の電極は逆に帯電されている、上記方法を含む。
【００４６】
[068]三重刺激方法の一部の実施態様において、第１、第２および第３の刺激は、同時に、または順次適用される。
[069]末梢神経が刺激される本発明の例において、末梢神経は、骨格筋を刺激する。一部の末梢神経の代表例としては、脚の神経または腕の神経、例えば、これらに限定されないが、坐骨神経、腓骨神経、足底指神経、大腿神経、伏在神経、腓腹神経、脛骨神経、正中神経、筋皮神経、掌側指神経、橈骨神経、および尺骨神経などが挙げられる。
【００４７】
[070]単一、二重および三重刺激方法の一部の実施態様において、刺激は、１日またはそれより多くの日における一連の刺激セッションを含む期間にわたり実行され、刺激する日は、連続または非連続である。
【００４８】
[071]単一、二重および三重刺激方法の一部の実施態様において、処置される障害は、筋緊張障害、例えば痙縮、脊髄損傷後の痙縮、緊張亢進およびジストニアである。
[072]単一、二重および三重刺激方法の一部の実施態様において、処置される障害は、副腎白質ジストロトフィー（ＡＤＬ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、ハラーホルデン−スパッツ症候群、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、ハンチントン病、フェニルケトン尿症、卒中、脳性麻痺、多発性硬化症、パーキンソン病、パーキンソン症候群を伴う神経変性疾患、新生児発作、てんかん、自閉症、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、虚血性および外傷性脳損傷後の脳浮腫、酸欠または一酸化炭素への曝露に起因する脳損傷、脳炎、髄膜炎、慢性疼痛、急性疼痛、ならびに耳鳴りなどの神経障害または状態である。
【００４９】
[073]単一、二重および三重刺激方法の一部の実施態様において、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルが、減少される。
[074]単一、二重および三重刺激方法の一部の実施態様において、本方法はさらに、治療有効量の、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する少なくとも１つの薬剤またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベルおよび／もしくはタンパク質発現レベルを減少させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程を含む。
【００５０】
[075]単一、二重および三重刺激方法の一部の実施態様において、本方法はさらに、治療有効量の、ＫＣＣ２の生物学的活性を増加させる少なくとも１つの薬剤またはＫＣＣ２の遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質発現レベルを増加させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程を含む。
【００５１】
[076]一部の実施態様において、薬剤は、医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸またはそれらの組合せである。
[077]一部の実施態様において、ＫＣＣ２の生物学的活性を増加させる医薬化合物は、Ｎ−エチルマレイミドである。
【００５２】
[078]標的分子の遺伝子発現を変更するのに使用することができる核酸の代表例は、上述されている。一部の実施態様において、本明細書に記載される核酸は、ＫＣＣ２の遺伝子発現のレベルを上昇または増加させるのに使用され、これが順に、ＫＣＣ２タンパク質発現の上昇または増加をもたらすことになる。
【００５３】
[079]標的分子の生物学的活性または発現を変更するのに使用可能な抗体（そのフラグメント含む）の代表例は、上述されている。一部の実施態様において、本明細書に記載される抗体またはそのフラグメントは、ＫＣＣ２活性を上昇または増加させる活性化抗体またはそのフラグメントである。
【００５４】
[080]標的分子の生物学的活性または発現を変更するのに使用可能な分子の代表例としては、上述したような遺伝子工学のためのツールであるタンパク質またはタンパク質と核酸との組合せが挙げられる。一部の実施態様において、タンパク質またはタンパク質と核酸との組合せは、ＫＣＣ２の遺伝子発現のレベルを上昇または増加させるのに使用され、これが順に、ＫＣＣ２タンパク質発現の上昇または増加をもたらすことになる。
【００５５】
[081]本発明の例示的な実施態様は、脊椎動物におけるＡＬＳを処置する方法を含む。本明細書に記載される非侵襲的な電気刺激方法は、運動および皮質ニューロンを死から保護することによってＡＬＳの進行を止めるように設計され、すなわち本明細書に記載される方法は、神経細胞の寿命を延長するか、または少なくとも運動および皮質ニューロンの細胞死の速度を遅くする。理論に縛られることは意図しないが、脊髄および皮質ニューロンにおけるＮＫＣＣ１発現および／または活性の抑制が、運動および皮質ニューロンの細胞寿命を延長することによる、このＡＬＳの進行の停止をもたらすと考えられる。
【００５６】
[082]一部の実施態様において、ＡＬＳを処置する方法は、直流源のＡ電極とＢ電極との間に刺激を適用する工程であって、Ａ電極は、脊椎動物の脊髄の背側の面またはその近傍にあるか、またはＡ電極は、脊椎動物の頭蓋上である工程；およびＡＬＳの病態に関連する神経細胞の寿命を延長するのに十分な強度および期間で、直流刺激を適用する工程を含み、Ｂ電極は、Ａ電極から離れた位置に設置され、ＡおよびＢ電極は逆に帯電されており、直流は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流の少なくとも１つである。
【００５７】
[083]ＡＬＳ患者を処置する場合、複数の場所で神経細胞の寿命を延長するために、脊髄の長さに沿って複数の脊髄の場所が処置されることが想定される。したがって、一部の実施態様において、ＡＬＳを処置する方法は、脊髄の背側の面に沿って複数の位置またはその近傍に配置された複数のＡ電極、および複数のＡ電極から離れた位置に設置された複数のＢ電極を含む。他の実施態様において、一連の処置で、１セットのＡおよびＢ電極が使用され、電極は、脊髄の長さに沿った異なる場所に動かされる。
【００５８】
[084]また、ＡＬＳ患者を処置する場合、運動野（一次運動野としても公知である６野および４野）、基底核および小脳などの運動制御に関連する脳の複数の領域が処置されることも想定される。したがって、一部の実施態様において、ＡＬＳを処置する方法は、運動制御に関連する頭蓋上の複数の位置に配置された複数のＡ電極を含み、複数のＢ電極は、複数のＡ電極から離れた位置に設置される。他の実施態様において、一連の処置で、１セットのＡおよびＢ電極が使用され、電極は、運動制御に関連する異なる頭蓋の位置に動かされる。
【００５９】
[085]ＡＬＳを処置する方法の一部の実施態様において、複数のＡ電極およびＢ電極の間に適用される刺激は、同時に、または順次適用される。
[086]一部の実施態様において、ＡＬＳ患者を処置する方法は、直流源のＡ電極とＢ電極との間に第１の刺激を適用する工程であって、Ａ電極は、脊椎動物の脊髄の背側の面またはその近傍にある工程；直流源のＣ電極とＤ電極との間に第２の刺激を適用する工程であって、Ｃ電極は、脊椎動物の頭蓋上である工程；および神経細胞の寿命を延長するのに十分な強度および期間で、直流刺激を適用する工程を含み、Ｂ電極は、Ａ電極から離れた位置に設置され、ＡおよびＢ電極は逆に帯電されており、Ｄ電極は、Ｃ電極から離れた位置に設置され、ＣおよびＤ電極は逆に帯電されており、直流は、定電流またはパルス電流である。一部の実施態様において、第１および第２の刺激は、同時に、または順次適用される。
【００６０】
[087]一部の実施態様において、ＡＬＳを処置する方法は、脊髄の背側の面に沿って複数の位置またはその近傍に配置された複数のＡ電極、および複数のＡ電極から離れた位置に設置された複数のＢ電極を含む。他の実施態様において、一連の処置で、１セットのＡおよびＢ電極が使用され、電極は、脊髄の長さに沿った異なる場所に動かされる。
【００６１】
[088]一部の実施態様において、ＡＬＳを処置する方法は、運動制御に関連する頭蓋上の複数の位置に配置された複数のＣ電極を含み、複数のＤ電極は、複数のＣ電極から離れた位置に設置される。他の実施態様において、一連の処置で、１セットのＣおよびＤ電極が使用され、電極は、運動制御に関連する異なる頭蓋の位置に動かされる。
【００６２】
[089]一部の実施態様において、複数のＡ電極およびＢ電極の間および複数のＣ電極およびＤ電極の間に適用される刺激は、同時に、または順次適用される。
[090]一部の実施態様において、ＡＬＳを処置する方法はさらに、直流源のＥ電極とＦ電極との間に第３の刺激を適用する工程であって、Ｅ電極は、脊椎動物の末梢神経またはその近傍にある工程を含み、Ｆ電極は、Ｅ電極から離れた位置に設置され、ＥおよびＦ電極は、逆に帯電されている。一部の実施態様において、第１、第２および第３の刺激は、同時に、または順次適用される。
【００６３】
[091]一部の実施態様において、ＡＬＳを処置する方法は、複数のＥ電極を含み、複数のＥ電極は、末梢神経に沿って複数の位置またはその近傍に配置されているか、または複数の末梢神経またはその近傍に配置されており、複数のＦ電極は、複数のＥ電極から離れた位置に設置されている。他の実施態様において、１セットのＣおよびＤ電極が使用され、電極は、末梢神経に沿った異なる位置に動かされるか、または異なる末梢神経に動かされる。一部の実施態様において、複数のＥ電極およびＦ電極の間に適用される刺激は、同時に、または順次適用される。末梢神経が刺激される一部の実施態様において、末梢神経は、骨格筋を刺激する。一部の末梢神経の代表例は、上記で開示されている。
【００６４】
[092]ＡＬＳを処置する方法の一部の実施態様において、期間は、１日またはそれより多くの日における一連の刺激セッションを含み、刺激する日は、連続または不連続である。
【００６５】
[093]ＡＬＳを処置する方法の一部の実施態様において、本方法は、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるのに十分な強度および期間で直流刺激を適用する工程を含む。一部の実施態様において、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルが、減少される。
【００６６】
[094]ＡＬＳを処置する方法の一部の実施態様において、非侵襲的なＤＣＳ方法は、治療有効量の、ＮＫＣＣ１の生物学的活性を阻害する少なくとも１つの薬剤またはＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベルおよび／もしくはタンパク質発現レベルを減少させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程と組み合わされる。特定の実施態様において、薬剤は、上記に記載した医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸またはそれらの組合せである。
【００６７】
[095]ＡＬＳを処置する方法の一部の実施態様において、非侵襲的なＤＣＳ方法はさらに、治療有効量の、ＫＣＣ２の生物学的活性を増加させる少なくとも１つの薬剤またはＫＣＣ２の遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質発現レベルを増加させる少なくとも１つの薬剤を投与する工程と組み合わされる。特定の実施態様において、薬剤は、上記に記載した医薬化合物、タンパク質、抗体、核酸またはそれらの組合せである。
【００６８】
[096]動物、特にヒトを含む哺乳動物は、本明細書で論じられるＤＣＳ処置の対象である。例示的で非限定的な実施態様において、本発明の実施におけるヒトの処置は、例えば、一般的に１ｍＡより高く６ｍＡ未満の範囲、より特定には、約３．５〜４ｍＡの範囲でのｔｓＤＣＳの適用を含んでいてもよく、約２０〜４０分／日適用してもよい。他の例示的で非限定的な実施態様において、本発明の実施におけるヒトの処置は、経頭蓋ＤＣＳ（ｔｃＤＣＳ）の適用を含んでいてもよい。図１２に描写されるように、深い脳構造のための提唱される刺激の処方（例えば、基底核を刺激するための処方）は、持続時間が約１０秒間であり、刺激間に約３０秒の休止期間を有する約１０ｍＡの強度でのロングパルス単極直流（ＤＣ）を含む。処置の時間は、約２０〜３０分であることが提唱される。ＤＣＳ処置は、計画された日もしくは１日おきに、または修復または回復に影響を与えるように意図された他のあらゆる処置計画に示された通りの頻度でなされてもよい。
【００６９】
[097]本明細書で開示された本発明の方法の実施において、以下のシステムまたはデバイスが使用される。
[098]本発明の例示的な実施態様は、脊椎動物における痙縮、緊張亢進またはジストニアを処置するためのシステムであって、このシステムは：脊椎動物における痙縮、緊張亢進またはジストニアに関連する末梢神経の末梢直流刺激を提供するように構成された第１の刺激要素を含み；第１の刺激要素は、前記末梢神経を刺激するように構成された神経刺激電極（stimulation pole）を有する神経刺激回路を含み；前記末梢神経の調節に関連する脊髄の場所に、脊髄直流刺激を提供するように構成された第２の刺激要素を含み、前記第２の刺激要素は、活性脊髄刺激電極および脊髄参照電極を有する脊髄刺激回路を画定し、前記脊髄刺激回路は、前記脊髄刺激電極と前記脊髄参照電極との間に、前記脊髄の場所を刺激するための定電流の経脊髄直流刺激を提供するように構成されており；前記活性脊髄刺激電極は、相対的に前記脊髄の場所の近位にあり；前記脊髄参照電極は、相対的に前記脊髄の場所の遠位にあり；前記活性脊髄電極および前記近位神経電極を逆の極性で動作させ、結果として分極回路（polarization circuit）が形成されるように構成されるコントローラー要素を含み、得られた分極回路は、分極電流フローに従って標的分子の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるために、前記逆の極性に従って前記活性脊髄電極と前記近位神経電極との間に分極電流フローを提供するように構成され；また、前記コントローラー要素は、予め決定された期間にわたる末梢直流刺激および脊髄直流刺激、ならびに予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激を提供するようににも構成されている、上記システムを含む。
【００７０】
[099]システムの一部の実施態様において、コントローラー要素は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流フローの少なくとも１つを含む前記電流フローを提供するように構成される。
【００７１】
[0100]システムの一部の実施態様において、コントローラー要素はさらに、第１および第２の刺激要素によって供給される電流の範囲を同時に制御するように構成される。
[0101]システムの一部の実施態様において、第１の刺激要素は、前記末梢神経の刺激のために配置された刺激電極に刺激電流を提供するための正極および負極を含み、前記正極および負極は、正極に１つの電極が作動可能に接続され、負極に別の電極が作動可能に接続されるように配置されている。システムの一部の実施態様において、第２の刺激要素は、前記脊髄の場所にわたって刺激を送達するために配置された刺激電極に刺激電流を提供するための正極および負極を含み、前記正極および負極は、正極に１つの電極が作動可能に接続され、負極に別の電極が作動可能に接続されるように配置されている。
【００７２】
[0102]システムの一部の実施態様において、刺激電極の少なくとも１つは、埋め込まれている。
[0103]システムのさらに他の実施態様において、コントローラー要素および電源のうち少なくとも１つは、ウェアラブルなハウジング中に配置されている。
【００７３】
[0104]システムの一部の実施態様において、予め決定された期間、予め決定された回数および予め決定された日数は、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるように選択される。システムの特定の実施態様において、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルが減少される。
【００７４】
[0105]本発明の例示的な実施態様は、脊髄または脳のうちの１つに関連する生物学的活性を調節するための刺激デバイスであって：複数の端子を有する直流電圧源を含み；第１の電極を直流電圧源に接続するための端子のうちの第１の端子を含み；前記第１の電極は、脊椎動物の脊髄の背側の面の１つにあるかまたは脊椎動物の頭蓋上にあり；第２の電極を直流電圧源に接続するための端子のうち第２の端子を含み；前記第２の電極は第１の電極から離れた位置に設置されており；前記第１および第２の電極は、逆に帯電されており；および前記電極間の電流フローを制御するように構成されたコントローラー要素を含み；前記コントローラー要素は、予め決定された期間にわたる直流刺激、および予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激を提供するようにも構成されている、上記刺激デバイスを含む。
【００７５】
[0106]刺激デバイスの一部の実施態様において、コントローラー要素は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流フローの少なくとも１つを含む前記電流フローを提供するように構成される。
【００７６】
[0107]刺激デバイスの一部の実施態様において、第１および第２の電極の少なくとも１つは、埋め込まれている。
[0108]刺激デバイスのさらに他の実施態様において、コントローラー要素および直流電圧源の少なくとも１つは、ウェアラブルなハウジング中に配置されている。
【００７７】
[0109]刺激デバイスの一部の実施態様において、予め決定された期間、予め決定された回数および予め決定された日数は、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるように選択される。刺激デバイスの特定の実施態様において、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性または前記レベルが減少される。
【００７８】
[0110]本発明の例示的な実施態様は、脊椎動物におけるＡＬＳを処置するためのシステムであって、前記システムは：脊椎動物において、末梢神経に沿って複数の場所に末梢神経の末梢直流刺激を提供するかまたは複数の末梢神経の末梢直流刺激を提供するように構成された複数のＡ刺激要素を含み；前記Ａ刺激要素のそれぞれは、前記末梢神経または複数の末梢神経を刺激するように構成された神経刺激電極を有する神経刺激回路を含み；複数の前記末梢神経または複数の末梢神経の調節に関連する脊髄の場所に、脊髄直流刺激を提供するように構成された複数のＢ刺激要素を含み、前記Ｂ刺激要素のそれぞれは、活性脊髄刺激電極および脊髄参照電極を有する脊髄刺激回路を画定し、前記脊髄刺激回路は、前記脊髄刺激電極と前記脊髄参照電極との間に、前記脊髄の場所を刺激するための定電流経皮脊髄直流刺激を提供するように構成されており；前記活性脊髄刺激電極は、相対的に前記脊髄の場所の近位にあり；前記脊髄参照電極は、相対的に前記脊髄の場所の遠位にあり；および前記活性脊髄電極および前記近位神経電極を逆の極性で動作させ、結果として分極回路が形成されるように構成されたコントローラー要素を含み、得られた分極回路は、分極電流フローに従って、標的分子の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるために、前記逆の極性に従って、前記活性脊髄電極と前記近位神経電極との間に分極電流フローを提供するように構成されており；前記コントローラー要素はまた、予め決定された期間にわたる末梢直流刺激および脊髄直流刺激、ならびに予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激を提供するように構成されている、上記システムを含む。
【００７９】
[0111]システムの一部の実施態様において、コントローラー要素は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流フローの少なくとも１つを含む前記電流フローを提供するように構成される。
【００８０】
[0112]システムの一部の実施態様において、コントローラー要素はさらに、ＡおよびＢ刺激要素によって供給される電流の範囲を同時に制御するように構成される。
[0113]システムの一部の実施態様において、Ａ刺激要素は、末梢神経または複数の末梢神経の前記複数の場所の刺激のために配置された刺激電極に刺激電流を提供するための正極および負極を含み、前記正極および負極は、正極に１つの電極が作動可能に接続され、負極に別の電極が作動可能に接続されるように配置されている。
【００８１】
[0114]システムの一部の実施態様において、Ｂ刺激要素は、前記複数の脊髄の場所にわたり刺激を送達するために配置された刺激電極に刺激電流を提供するための正極および負極を含み、前記正極および負極は、正極に１つの電極が作動可能に接続され、負極に別の電極が作動可能に接続されるように配置されている。
【００８２】
[0115]システムの一部の実施態様において、刺激電極の少なくとも１つは、埋め込まれている。
[0116]システムのさらに他の実施態様において、コントローラー要素および電源のうち少なくとも１つは、ウェアラブルなハウジング中に配置されている。
【００８３】
[0117]システムの一部の実施態様において、予め決定された期間、予め決定された回数および予め決定された日数は、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるように選択される。システムの特定の実施態様において、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルが減少される。
【００８４】
[0118]本発明の例示的な実施態様は、ＡＬＳを処置するための刺激デバイスであって：複数の端子を有する直流電圧源を含み；複数のＡ電極を直流電圧源に接続するための複数のＡ端子を含み；前記複数のＡ電極は、脊椎動物の脊髄の背側面の複数の場所または脊椎動物の頭蓋上の複数の場所にあり；複数のＢ電極を直流電圧源に接続するための複数のＢ端子を含み；前記複数のＢ電極は、複数のＡ電極から離れた位置に設置されており；ＡおよびＢ電極は、逆に帯電されており；および電極間の電流フローを制御するように構成されたコントローラー要素を含み；前記コントローラー要素はまた、予め決定された期間にわたる直流刺激、および予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激を提供するように構成されている、上記刺激デバイスを含む。
【００８５】
[0119]刺激デバイスの一部の実施態様において、コントローラー要素は、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流フローの少なくとも１つを含む前記電流フローを提供するように構成される。
【００８６】
[0120]刺激デバイスの一部の実施態様において、ＡおよびＢ電極の少なくとも１つは、埋め込まれている。
[0121]刺激デバイスのさらに他の実施態様において、コントローラー要素および直流電圧源の少なくとも１つは、ウェアラブルなハウジング中に配置されている。
【００８７】
[0122]刺激デバイスの一部の実施態様において、予め決定された期間、予め決定された回数および予め決定された日数は、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルを変化させるように選択される。刺激デバイスの一部の実施態様において、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現および／またはタンパク質発現の生物学的活性またはレベルが減少される。
【００８８】
[0123]本発明のシステムおよび刺激デバイスを、図面を参照しながらさらに後述する。
[0124]図１３Ａは、対象の脊髄面１０５における背面１０６への電極１０４の適用を介して脊髄１０２（断面で示される）に、さらに、反対側の腹側面１１０における電極１０８の場所に、または他の遠位場所に、例えば腹部に、ｔｓＤＣＳ刺激を適用するように構成された、本発明の刺激システム１００の実施態様を示す。単なる例証として示されるように、電極１０４および１０８が示され、これらはそれぞれアノードおよびカソードとして提供される。他の実施態様において、電極１０４および１０８は、それぞれカソードおよびアノードとして提供される。本発明の様々な適用において、主要な場所に、例えば、目的の場所における背側面１０５に適用された電極の極性は、「アノード」または「カソード」のいずれかとして回路構成を画定する。
【００８９】
[0125]図１３Ａの本発明の例示的な実施態様において、システム１００は、端子１２２、１２４を有する直流源１１４を含む。第１の電極１０４は、端子のうち第１の端子と脊椎動物の背側面１０５とに付着している。第２の電極１０８は、端子のうち第２の端子と脊椎動物の標的となる腹側の場所１１０とに付着している。刺激は、背側の電極１０４と腹側の電極１０８との間を進む。電流は、割り当てられた通りに、アノードからカソードに進むと予想される。インテリジェントコントローラー１１２は、このような付着させた電極に適用されたシグナルを制御し、したがって電流フローの方向を制御し、したがって第１の電極１０４と第２の電極１０８との間のフローの経路１２５を画定する。
【００９０】
[0126]本発明の１つの例示的な実施において、アノードｔｓＤＣＳの構成は、図１３Ａで示されるように、対象の脊髄１０２で確立され、この場合、電極１０４は、ユーザーインターフェース１１６の指示で、コントローラー１１２によって正電流源１２４に接続されているためアノードとなり、リターン電極１０８は、コントローラー１１２によって負電流源１２２に接続されているため、カソードである。例えばこのような刺激の活性領域１２７を配置する図１３Ａで示されるように、リターン電極は、好ましくは、対応する腹側面に適用されるが、意図される電流フローの経路１２５に応じて、リターン電極は、オフセットされていてもよいし、またはより遠位であってもよい。
【００９１】
[0127]当業者に理解されるであろうように、一実施態様において、インテリジェントコントローラー１１２は、内部指示セットを含み、メモリー１１７からのデータを介して、またはインターフェース１１６におけるユーザーの介入によってさらに情報を得ることができる。インテリジェントコントローラー１１２は、ＤＣ源１１４からの電流を電極１０４、１０８に適用することを可能にする。１つの例示的な実施態様において、ＤＣ源１１４の負電流源１２２は、リード１１８を介して電極１０８（ここではカソードとして機能する）に接続され、ＤＣ源１１４の正電流源１２４は、リード１２０を介して電極１０４（ここではアノードとして機能する）に接続されている。一実施態様において、ＤＣ源１１４は、電池１１５を含む。本発明の実施において、電池は、容量性の記憶デバイス、再充電可能なデバイス、リチウム−イオン電池、および他の電源の少なくとも１つを含むことが理解されるだろう。
【００９２】
[0128]当業者に理解されるであろうように、本発明の例示的な実施態様において、システム１００はさらに、第１および第２の端子１２２、１２４にわたり検出された電圧における変化に応答し、電極１０４、１０８間における定電流のｔｓＤＣＳの電流フローを維持するための、電極および直流源の少なくとも１つと電気的に連通するシグナルコントローラー回路１１１を含む。本発明の実施態様において、シグナルコントローラー回路１１１はさらに、コントローラー１１２による指示に応じて、定電流、連続電流、パルス電流、間欠電流、可変および不変の電流の少なくとも１つとして刺激シグナル１２６を提供するようにＤＣシグナルを調節するように構成される。当業者に理解されるであろうように、本発明の様々な実施態様において、これらのバリエーションのいくつかを本発明の望ましいｔｓＤＣＳ刺激の一部としてまたはそれに加えて実行して、望ましい刺激性能を達成する。
【００９３】
[0129]本発明の例示的な実施態様において、本発明のシステムは、シグナルコントローラー回路１１１、インテリジェントコントローラー回路１１２、ＤＣ源１１４、電池１１５、ユーザーインターフェース１１６、およびメモリー１１７を含む制御回路を有し、これはハウジング１３０中に支持され、ハウジングは、本発明の実施態様の実施の全てにおいて、卓上使用のためであってもよいし、またはウェアラブルな、もしくは埋め込み可能なデバイスとして使用するためであってもよく、耐水性であってもよい。
【００９４】
[0130]図１４Ａ〜Ｃの例示的な実施態様において、ウェアラブルなハウジングシステム２００は、ウェアラブルな付着システム１３２を有するウェアラブルなハウジング１３１中に、システム１００を含む。ウェアラブルな付着システム１３２は、スリムでウェアラブルなパッケージ１３４としてのハウジング１３１の提供を可能にする。本発明の１つの実施において、パッケージ１３４の裏面１３８それ自体が、標的の背側の場所１０５に適用され、一実施態様において、表面１４０によって画定される導電性電極１０４と共に提供され、内部ＤＣ源１１４に接続されている。表面１４０はさらに、導電性接着剤１４１を含んでいてもよく、これらは全て、脊椎動物患者に付着させたときに、電極１０４で望ましいシグナルを提供するためである。
【００９５】
[0131]図１４Ａ〜Ｃで示されるように、１つの例において、付着システム１３２はさらに、さらにシステム１００を患者に固定するために、ウェアラブルな材料１３３、例えばストラップ１４２、１４４（接続用のベルクロ（登録商標）（Velcro）、バックルなどと共に）を含む。リターン電極１０８は、リード１１８を介してＤＣ源１１４に接続され、この例示的な実施態様において、リード１１８はハウジング１３１のシールされた通し穴またはポート１４５を介して電流源に接続され、次いでストラップ１４２の皮膚側に貼り付けて、そこに沿わせることにより、電極１０８を介して電気接点を形成して、患者への望ましい腹側の電気的な接続を提供する。電極リードは、ウェアラブルな材料１３３に付着させてもよいし、またはその中に含有させてもよい。図１２Ｂに示されるさらなる例示的な実施態様において、ユーザーインターフェース１１６は、ユーザーコントロールパッド１１９を含み、これは、オペレーションのモード切り換えとその表示の提供を可能にするオペレーターコントロール１１９Ａおよびインジケーターライト１１９Ｂを含む。
【００９６】
[0132]ウェアラブルな材料１３３は、ストラップ、クロス、伸縮性材料、ハーネス、または電極表面が脊椎動物の皮膚と接触できるように構成された他のウェアラブルな材料であり得る。代替として、電極表面は、接着剤を載せること、または磁石の埋め込みによって、皮膚表面に付着させたりまたは貼り付けたりすることができる。本発明の様々な実施態様において、ウェアラブルな材料は、脊椎動物のサイズ（例えば、成人または子供）に応じて、さらに、処置される脊髄の場所に応じて、サイズおよび形状といった要素を変化させて提供することができる。代替として、ウェアラブルな材料は、様々なサイズの対象および処置される脊髄の場所に適合するように調整することができる。ウェアラブルな材料は、対象の背側の面の領域中の皮膚上に、電極１０４表面を配置することを可能にする。ウェアラブルなｔｓＤＣＳデバイスは、再充電可能であってもよく、充電や睡眠の快適性のために夜間は外すことができる。ウェアラブルなｔｓＤＣＳデバイスは、処置しようとする部位に応じて、頸部、胸部、腰部または仙骨の位置の脊椎の皮膚表面に付着させることができる。
【００９７】
[0133]当業者は、アノードかまたはカソードかにかかわらず、実現しようとする所与の処置プロトコールに従って、例えばヒューマンインターフェース１１６から、または内部的にメモリー１１７に保存されたデータを使用することにより、インテリジェントコントローラー１１２を制御して、電極１０４、１０８と源１１４の端子１２２、１２４との回路の接続を確立すること理解するだろう。
【００９８】
[0134]メモリー１１７は、当業者に理解されるであろうように、アクセスしてコントローラー１１２に通知することができる１つのまたは一連のデータマトリックスを含んでいてもよい。例えば、システム１００は、ヒトに適用することができ、次いでスイッチをオンにしてルーチンを実行し、そのコマンド（脈動または経時的な処置期間など）がメモリー１１７に保存され、望ましい刺激処置を提供するために、コントローラー１１２で開始されるルーチンによって時々アクセスされる。しかしながら、本発明の簡単な実施において、刺激デバイスは、刺激システム１００のインテリジェントコントロール要素を必要としないアノードまたはカソードシステムとして設定できることが理解されると予想される。
【００９９】
[0135]さらなる例示的な実施態様において、カソードおよびアノード電極の少なくとも１つは、構成要素としての電極のアレイで構成される。その１つの例示的な実施において、図１３Ａの刺激システム１００は、電極１０４および１０８を含み、この場合、図１３Ｂに例示されるように、電極１０８は、電極１０８Ａ〜Ｄのアレイ１０９で構成される。このような実施態様の１つの例示的な実施において、アレイ１０９の各電極は、別々に刺激されて、望ましい刺激目標を達成するように、刺激されるセルを都合よく偏らせるかまたはステアリングすることが可能である。
【０１００】
[0136]本発明の１つの例示的な実施態様において、パターンコントローラー１１３が提供され、インテリジェントコントローラー１１２により指示される通り、電極のアレイ１０８Ａ〜Ｄのための望ましい刺激パターンを駆動させる。例えばこの実施態様の１つの実施において、アレイ１０９の電極１０８Ａ〜Ｄは、標的セルに回転要素を与えるように順次刺激される。またはこの実施態様の別の実施において、電極の１または２つは、必要に応じて標的セルの動きをステアリングし、標的場所においてその値に到達できるように、標的セルに角度要素を与えるように刺激される。ここでの目的は、患者内の様々なセルをステアリングすることであるが、当業者が理解するであろうように、このステアリングは、例えばオーディオ分野で使用されるＤＳＰビームステアリングを用いてなされるバーチャルステアリングの使用に類似する。一実施態様において、パターンコントローラー１１３は、図１２Ｂで示されるように、ウェアラブルなデバイス１３４に組み込まれる。
【０１０１】
[0137]ここで、本発明の実施において、アノードｔｓＤＣＳは、脊髄の背側の面に関連するアノードでの刺激、および腹側の面に関連するカソードでの刺激を指すことが理解されるであろう。カソードｔｓＤＣＳは、脊髄の背側の面に関連するカソードでの刺激、および腹側の面に関連するアノードでの刺激を指す。
【０１０２】
[0138]本発明の別の例示的な実施において、図１３Ａのシステムを使用するカソードｔｓＤＣＳの構成において、電極１０４は、負電流源１２２に接続されており、望ましい背側の場所１０５で適用され、アノードの電極は、腹側に適用され、コントローラー１１２によって正電流源１２４に接続される。カソードｔｓＤＣＳ刺激下における望ましい脊髄の活性領域１２７での細胞におけるタンパク質の増加は、図９で示されるように、ＨＳＰ７０の増加によって実証される。１つの例示的な実施態様において、刺激セッションの継続時間は、この肯定的な結果を達成するために、２０から４０分にわたる。患者の必要に応じて追加の肯定的な結果のために、複数のセッションが示される。
【０１０３】
[0139]リターン電極１０８は、好ましくは、対応する腹側の面に適用されるが、意図される電流フローの経路１２５に応じて、オフセットされていてもよいし、またはより遠位であってもよいことを当業者は理解するだろう。本発明の例示的な実施において、リターン電極１０８は、意図される電流フローの経路１２５および意図される活性領域１２７に応じて、背骨で、または頭蓋、頸部、胴もしくは四肢の面で、遠位の刺激電極１０４と反対側に適用される。本発明は、マウスモデルにおけるｔｓＤＣＳの以下の具体的な実施例によってさらに例示される。実施例は、例証のためにのみ提供され、いかなる方法でも本発明の範囲または内容を限定するものとして解釈されない。
【０１０４】
[0140]一実施態様において、システムは、第１の刺激要素、第２の刺激要素およびコントローラーを含む。
[0141]１つの例において、第１の刺激要素は、刺激電極に刺激電流を提供する正および負端子を有する第１の電源を含み、刺激電極は標的効果器に関連する神経の刺激のために配置された２つの電極を含み；１つの電極は、正端子に作動可能に接続され、別の電極は、負端子に作動可能に接続され；２つの電極のそれぞれは、２つの電極のもう一方から電気的に絶縁されている。一実施態様において、２つの電極は、非侵襲的に配置され、皮膚表面電極である。別の実施態様において、２つの電極は、埋め込み電極である。１つの例において、第１の電源も埋め込まれており、コントローラー要素は、第１の電源にワイヤレス接続によって作動可能に接続される。
【０１０５】
[0142]１つの例において、第２の刺激要素は、第２の正端子および第２の負端子を有する第２の電源を含み、第１の電極は、脊髄の場所に置かれるように配置され、第２の電極は、脊柱における別の場所または背骨から遠位の場所から選択される場所に置かれるように配置される。第１および第２の電極の一方は、第２の正端子に作動可能に接続され、第１および第２の電極の他方は、第２の負端子に作動可能に接続される。
【０１０６】
[0143]一実施態様において、第１および第２の電源は、同じ源である。別の実施態様において、第１および第２の電源ならびにコントローラー要素は、ウェアラブルなハウジング中に配置される。一実施態様において、源は、ＤＣ源である。注目すべきことに、第１の電源が、パルス源、例えばパルスＤＣ源である実施態様も、これらの教示の範囲内である。使用される頻度は低いが、源がパルスＡＣ源である実施態様もこれらの教示の範囲内である。
【０１０７】
[0144]一実施態様において、これらの２つの回路は、それぞれの電極間に画定された得られた分極回路（a resulting polarization circuit）を画定する。図１５に、脊髄回路１２のアノード電極２０と神経回路１６のカソード電極２６との間の場合の例示的な実施態様を示す。得られた分極回路３３は、背骨を刺激し、脊髄の運動ニューロンおよび介在ニューロンに実行された興奮性の望ましい調節を達成し、筋緊張調節の望ましい結果を可能にする。
【０１０８】
[0145]筋緊張のダウンレギュレーションおよびアップレギュレーションは、脊髄のこれらの隣接電極および分極回路３３を画定する神経回路１２、１６間の相互作用の方向によってガイドされる。ダウンレギュレーションの場合、脊髄電極２０は、正（「アノード」）であり、近位末梢神経電極２６は、負（「カソード」）でなければならない。これは、ダウンレギュレーション用に、２つの極回路１２、１６のこれら２つの電圧印加された電極間で、必要な背骨から神経への分極回路３３（分極電流フローの経路）を画定する。アップレギュレーションの場合、近位神経電極２６は、正（「アノード」）であり、脊髄電極は、負（「カソード」）でなければならない。いくつかの実施態様において、これは、アップレギュレーション用に、２つの極回路のこれら２つの電圧印加された電極間で神経から背骨への分極回路３３（分極電流フローの経路）を画定する。
【０１０９】
[0146]図１６に、一実施態様のブロック図を示す。コントローラー回路９０は、ＤＣ源９４をモニターし、電流の方向に応じて、アノード−脊髄のダウンレギュレーションモードまたは逆のアップレギュレーションモードのいずれかを確立し、ダウンレギュレーションインジケーター９６、または逆の場合はアップレギュレーションインジケーター９８のいずれかを点灯させる。コントローラー９０は、メモリー９１および通信リンク９９を有する。メーター１５／１７は、刺激中に供給された電力の表示を提供する。コントローラー要素９０はさらに、刺激を開始させるように構成され、刺激の開始は、感知された値が、具体的な状況を示す予め決定された値未満かまたはそれを超えるのかによって決定される。コントローラー要素はまた、予め決定された期間にわたる末梢直流刺激および脊髄直流刺激、ならびに予め決定された日数にわたる予め決定された回数の繰り返しの刺激を提供するように構成される。予め決定された期間、予め決定された回数および予め決定された日数は、タンパク質発現レベル、および細胞の挙動の少なくとも１つを含む生物学的活性を調節するように選択して、増殖、分化、移動および発現の少なくとも１つを促進することができる。
【０１１０】
[0147]上述された実施態様は、各刺激要素によって適用される電極対を例示するが、１つの刺激要素と共に複数の電極対が適用される実施態様もこれらの教示の範囲内である。例えば、一部の実施態様において、複数の電極対が、第１の刺激要素と共に適用され、この場合、各電極対のそれぞれは、脊髄または頭蓋の異なる場所に適用される。
【０１１１】
[0148]これらの教示は、具体的な実施態様に関して記載されたが、前述の説明を考慮して、多数の代替物、改変およびバリエーションが当業者に理解されるであろうことは明らかである。したがって、これらの教示は、本発明の教示および請求の範囲と本質に当てはまるような全ての代替物、改変およびバリエーションを包含することが意図されている。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：材料および方法
動物
[0149]成体雌ＣＤ−１マウス（ｎ＝１２０、体重２７〜３７ｇ）を実行された動物実験の全てに使用した。４つのグループを含む長期刺激研究に、合計５１匹の動物を使用した。ＳＣＩを有する動物を、ランダムに、３つのグループ：ａ−ｔｓＤＣＳ処置グループ（ｎ＝１６）、ｃ−ｔｓＤＣＳ処置グループ（ｎ＝１５）、および偽処置グループ（ｎ＝１０）、ならびに損傷を受けていない対照グループ（ｎ＝１０）に分けた。これらの動物のサブグループも使用して、ＫＣＣ２、ｐＫＣＣ２、ＮＫＣＣ１、およびｐＮＫＣＣ１の発現における長期変化を研究した。損傷を受けた痙縮を有する動物を使用して、速度依存性抑制（ＲＤＤ）に対するｔｓＤＣＳの即時作用を試験し（ｎ＝６）、一方で、損傷を受けていない動物（ｎ＝１０）において、ＮＫＣＣ１およびｐＮＫＣＣ１の発現に対するｔｓＤＣＳの相対的に短期の作用を研究した。ブメタニド（ＮＫＣＣ１ブロッカー）を含む薬理学的な研究を、ＳＣＩを有する動物（ｎ＝９）および損傷を受けていない対照動物（ｎ＝３）を用いて実行した。その一方で、ｑＰＣＲ研究を、損傷を受けていない対照動物（ｎ＝４１）を用いて実行した。研究プロトコールの全ては、ニューヨーク市立大学スタテンアイランド校（College of Staten Island）のＩＡＣＵＣ委員会によって承認された。
【０１１３】
脊髄挫傷傷害
[0150]深い麻酔を達成するためのケタミン／キシラジンカクテル（９０／１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の投与の後、胸部Ｔ１０椎骨での椎弓切除術を実行して、Ｔ１３脊髄分節を露出させた。無限ホライズン（infinite horizon；ＩＨ）脊髄インパクター（ＩＨ−０４００、プレシジョンシステムズ＆インスツルメンテーション（Precision Systems & Instrumentation）、米国バージニア州）を使用して、挫傷を負わせるＳＣＩ力を誘発させた。衝撃力レベルは、６０ｋｄｙｎであり、これは、このインパクターを用いて実行された予備的な実験から収集したデータに基づき選択された。これらの予備的な研究において、痙縮発症マウスを生産するのに必要なＳＣＩ挫傷力を最適化するために衝撃力を増加させて挫傷傷害を誘発させた。６０ｋｄｙｎで衝撃を受けたマウスは、傷害後およそ２〜３週間で理想的な痙縮挙動を生じた。標準的なマウスチップ（直径＝１．３ｍｍ）を使用することによって衝撃を適用した。挫傷手順後、覆っている筋肉と皮膚を縫合し、感染を防止するために外科処置部位を硫酸ゲンタマイシン軟膏の層で覆った。その後、各マウスに番号を付け、次いで回復させるために保温パッド（３０℃）上に置いた。
【０１１４】
伸張器具
[0151]本発明者らの実験室において、コンピューター制御された伸張デバイスを、ステッパーモーター（ＤＭＸ−ＵＭＤ−２３ｍ、ＡＲＣＵＳテクノロジー社（ARCUS Technology Inc.）、米国カリフォルニア州）、ブリッジ増幅器（ＡＤインスツルメンツ（ADInstruments）、米国コロラド州コロラドスプリングス）に接続された力変位変換器（force-displacement transducer）（ＦＴ０３、ＧＲＡＳＳテクノロジーズ（GRASS Technologies）／ＮＡＴＵＳ、米国カリフォルニア州）に搭載されたフットプレッサー、およびマウスホルダーから組み立てた（図１）。変換器を、線形レールガイドを有するキャリッジ（ＳＧＢ１５ＮＵＵ、ＺＮＴオートマティックテクノロジー社（ZNT Automatic Technology Co）、中国浙江省）に永続的に固定した。ステッパーモーターの回転運動は、スイベルハブベアリングと接続される接合した平坦なアルミニウムロッドのセットを使用することによってキャリッジで線形変位に変換される。２つのコンピューターソフトウェアプログラムを利用して、ステッパーモーターを制御し、オンライン伸張（中）および筋電図（ＥＭＧ）の記録を実行した。最初に、ステッパー運動制御ソフトウェア（ＤＭＸ−ＵＭＤ  ＧＵＩ、ＡＲＣＵＳテクノロジー社）を、各伸張を２回の１０秒の回復インターバルによって分離した３回の連続的に時間を定めた伸張の実行をさせるようにリライトした。ステッパーモーターも、それぞれ３ＲＰＭ、３０ＲＰＭ、および３００ＲＰＭに対応する３回の異なる伸張速度：１８／秒、１８０／秒、および１８００／秒が提供されるようにプログラム化した。使用された第２のソフトウェアパッケージは、パワーラボ（PowerLab）データ収集システムソフトウェアと一括販売されたラボチャート（LabChart）−７（ＡＤインスツルメンツ）であり、これを使用して、データを集め分析した。
【０１１５】
マウスホルダー
[0152]本発明者らの実験室で、マウス拘束システムを、３つの要素から製作した（図１）。１）マウスを保持するチャンバーとして役立つ、透明なプレキシガラスアクリルチューブ。２）透明なアクリルの凹面安定化プレートで作製された、内部調整可能な支持システム。プレートの場所は、チューブの全長に沿ったカットアウトを通って突き出たハンドルを介して、チャンバーの長さに沿って直線的に調整することが可能であった。加えて、プレートの凹面は、動物の背中の外形に合うように設計され、それによって動物を背部で固定した。この表面は、様々なサイズのマウスを受容するように外部的に調整することも可能であった。３）それぞれガーゼで覆った１ｃｍ×１．５ｃｍのステンレス鋼プレートで構成された４つの皮膚の上の刺激電極。電極の１つを保持チャンバーの床に永続的に固定し（腹部参照電極用）、一方で第２の電極を、安定化プレートの中央に永続的に固定した（背側の活性脊髄電極用）。このプレートの場所は調整可能であった。残りの２つの電極は、安定化プレートの長辺上に存在するカットアウトに沿ってそれをスライドさせることによって直線的に調整可能であり、これらはそれぞれ左および右の坐骨神経導体として機能した。保持チャンバーの腹部表面は、それぞれ動物の後肢に対応する２つの開口部を有していた。各開口部にひざスタビライザーパッドを取り付けて、試験中にひざを十分に伸長できるようにした。試験前、呼吸とイソフルラン投与のために、保持チャンバーの前端に、中心に開口部を有するふたを設置した。伸張中に後肢の運動を足首関節に限定するために、別のアクリルスタンドを作って遠位の脚を固定した。スタンドは、ｘ、ｙ、およびｚ軸で動かすことができる調整可能なステンレス鋼製足首スタビライザークランプを有しており、プレッサー下の足の適切な配列を達成し、伸張前に動物の臀部の角度を調整した。
【０１１６】
回路および電力源
[0153]末梢神経に電流を通すことは、筋緊張を弱めるのに必要である（Ahmed、2014）。さらに、この電流の方向および分布は、調節することができる（Ahmed、2017）。本発明の研究のｔｓＤＣＳプロトコールは、麻酔した動物を用いて使用できるように、本発明者らの実験室で元々設計された経脊髄回路の改変を必要とした（Ahmed、2014）。簡単に言えば、皮膚上の電極を使用することによって、脊髄および最も影響を受けた肢の坐骨神経に直流（ＤＣ）を非侵襲的に通すように回路を改変した。神経活動の喚起を防止するために、坐骨神経電極に通される電流を、参照源を２つの分岐に分けることによって減衰した。ここで第１の分岐は、腹部電極に直接接続されて、減衰されていない電流を運搬し、一方で第２の分岐は、３００ＫＯ抵抗器を通過させて、坐骨神経への電流を減衰した。電流を、専用のＤＣ単位（Ｓ８８、ＧＲＡＳＳテクノロジー／ＮＡＴＵＳ）を備えたＧＲＡＳＳ刺激装置によって供給した。電流源の極性を切り換えることによって、この回路設計は、アノードからカソードへの、およびその逆の電流方向の即時の逆転を提供することができた。坐骨神経電流を減衰させることにおいて、回路設計も有効であった。例えば、各１．５ｍＡを脊髄−腹部電極に通過させた場合、坐骨神経回路に３００ｐＡが通過した。電流パラメーターのモニターおよびＤＣ減衰の検証は、卓上型デジタルマルチメーター（３４４０１Ａ、アジレント（Agilent）／キーサイト・テクノロジー（Keysight Technologies）、米国カリフォルニア州）を使用することによって、各実験の開始時、その間、および完了時に実行された。
【０１１７】
繰り返しのセッションのｔｓＤＣＳ（長期）手順
[0154]処置の１週間前、動物の全てが最初のベースライン試験を受け、以下のデータを記録した：３つの異なる伸張速度におけるピーク抵抗、併発のＥＭＧ活性、および巧緻および地上歩行試験。刺激を適用するために、９つのマウスホルダーを製作して、複数の動物にｔｓＤＣＳを同時に提供した。アノードおよびカソードグループの動物は、７日にわたり１日１回、２０分のｔｓＤＣＳ（１．５ｍＡ）処置を受けた。偽処置グループの動物を並行して処置したが、これらの動物はｔｓＤＣＳ介入を受けなかった。その一方で、無傷対照グループは試験手順のみ行われた。７日のｔｓＤＣＳ処置期間の直後に動物を再評価し、次いで処置の２週間および４週間後にも再評価した。最後の評価の後、動物を、ホフマン反射のＲＤＤに関して試験した。
【０１１８】
地上歩行試験
[0155]ＤｉｇｉＧａｉｔシステム（マウススペシフィックス社（Mouse Specifics Inc）、米国マサチューセッツ州フラミンガム）を使用して、ＳＣＩおよびｔｓＤＣＳ処置後における運動器官の回復を定量した。グループの全てを、ｔｓＤＣＳ介入の前に、その直後、ならびにその後の２および３週間後に、ＤｉｇｉＧａｉｔシステムで４回試験した。対照グループを、試験間に２週間のインターバルを設けて２回試験した。
【０１１９】
[0156]試験中に、最低２０ステップを、２つの速度：１０ｃｍ／秒および２０ｃｍ／秒で収集した。３つのパラメーターは、歩行中の下腿三頭筋における痙縮：ピーク面積ならびに肢面積の上昇および下降スロープに対して感受性であると考えられた。ピークの肢面積を、ＤｉｇｉＧａｉｔトレッドミルベルトを用いたマウスの足の最大限の接触面積に基づき計算した。上昇スロープは、マウスの歩行サイクルの立脚期の第１の半分における移行の速度のインジケーターとみなされ、一方で下降スロープは、マウスの歩行サイクルの立脚期の第２の半分における移行の速度のインジケーターとみなされた。立脚期は、歩行サイクルのうち、マウスの肢がトレッドミルベルトと接触しているセグメントである。
【０１２０】
巧緻運動試験
[0157]本発明者らの実験室で、ステッパーモーター、ドライバー、およびコントローラー（ＤＭＸ−ＵＭＤ−２３、ＡＲＣＵＳテクノロジー社）からラダー−ホイールを組み立てた。ホイールの速度および方向を、カスタムライティングされたソフトウェアで制御した。ホイールをプレキシガラスから作製して、側面を可視化し、学習を防止するために横木の間のスペースを可変にした。足の誤りを記録するために、カメラを各動物の下側に設置した。刺激の前、および刺激終了後から３週間にわたり週１回、動物を試験した。記録されたセッションそれぞれにつき、連続的な９０秒のビデオをフレームごとに、これまでに記載された足の誤りのスコアリングシステムに従って分析した（Farrら、2006：MetzおよびWhishaw、2002；MetzおよびWhishaw、2009）（表１）。動物の後肢それぞれのスコアを、表１に従って、足の誤りの総数に各基準の対応するスコアを掛けることによって、各基準に合わせて計算した。その後、基準の全てのスコアを加えて、後肢それぞれの総スコアを得た。
【０１２１】
ホフマン反射のＲＤＤ
[0158]最後の評価の後、マウスをケタミンおよびキシラジンの混合物（９０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。次いで動物の後肢および骨盤領域の毛を剃り、２セットの記録電極を適用して、ＥＭＧ、心拍数、および呼吸活動を記録した。脛骨神経の刺激を、同軸針刺激電極を使用することによって達成した。記録ステーション上に動物の位置決めをした後、心拍数（ＨＲ）および呼吸数（ＲＲ）をオンラインでモニターした。動物を深く麻酔したとき、それらのＨＲとＲＲの両方は全般的により速くなるが、それらの呼吸は浅くなった。この麻酔レベルで、反射の誘発は困難であった。さらに、反射が誘発された場合、重度の痙縮を現す動物においてさえもＲＤＤは非常に高かった。それゆえに、実行された予備的な実験において、ＨＲとＲＲの両方および動物の覚醒レベルとＲＤＤの関係をモニターすることによって、手順を標準化した。例えば、動物が覚醒していると、それらのＨＲは、２Ｈｚで規則的になり、次いで２Ｈｚ〜４Ｈｚでより不規則になるが、ｒＲＲは、より深く、より遅くなる。不規則なＨＲおよびより深いＲＲ相が最初に観察された場合、ＲＤＤプロトコールを開始した。これは、５回のパルスの５回の訓練からなっていた。訓練の頻度は、０．１Ｈｚ、０．５Ｈｚ、１Ｈｚ、２Ｈｚ、および５Ｈｚであった。訓練間の待機インターバルは１分の長さであった。両方の後肢に試験を実行した。刺激強度を、Ｍ波に対して最大限のＨ波が観察されるまで次第に増加させ、続いてＲＤＤプロトコールを行った。パワーラボシステム（ＡＤインスツルメンツ）を使用することによってデータを収集し、１０ＫＨｚのサンプルレートおよびラボチャートソフトウェア（ＡＤインスツルメンツ）で記録した。平均Ｈ波のピークを測定し、ベースライン値に対する変化のパーセントを計算した。訓練中に第５のパルスと第１のパルスとにより誘導されたＨ波の振幅間で計算された差を−１で割って値の逆数を得ることに基づく低減パーセンテージとして、ＲＤＤを計算した。
【０１２２】
ウェスタンブロット
[0159]脊髄組織を収集し、即座にドライアイス中に入れた。その後サンプルを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＳＣ−２９１３１、サンタクルーズバイオテクノロジー、米国テキサス州ダラス）、ホスファターゼ阻害剤カクテル１１（カタログ番号：ＢＰ−４８０、ボストンバイオプロダクト）、１００ｍＭのＰＭＳＦ（カタログ番号：ＢＰ−４８１、ボストンバイオプロダクト）、および５００ｍＭのＥＤＴＡを含有するＲＩＰＡ緩衝液（カタログ番号：ＢＰ−１１５、ボストンバイオプロダクト（Boston Bio Products）、米国マサチューセッツ州アシュランド）中でホモジナイズした。各サンプルにＲＩＰＡカクテルを添加した後（１００ｍｇ／ｍｌ）、溶解物を氷上で１５分インキュベートし、その後、０．５〜１分超音波処理して、ソニックディスメンブレーター（Sonic Dismembrator）（フィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）、米国ニュージャージー州スプリングフィールド、タウンシップ）を使用して完全な均質化を達成した。次いでサンプルを、ソーバルレジェンドマイクロ（Sorvall Legend Micro）２１Ｒ遠心分離機中で、１３０００ｒｐｍで３０分遠心分離して、各サンプルの上清画分を収集した。総タンパク質濃度を、ｉＭａｒｋ（商標）マイクロプレート吸光度リーダー（バイオ−ラッド、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用することによって決定した。２０マイクログラムの各サンプルを等しい体積の２×サンプル緩衝液と混合し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（バイオ−ラッド（Bio-Rad））に移した後、膜を５％スキムミルク緩衝液中で２時間ブロックし、次いで適切な一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。使用された一次抗体は、ウサギポリクローナルヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）／ＨＳＣ−７０（Ｈ−３００）抗体（１：１０００；ＳＣ−３３５７５、サンタクルーズバイオテクノロジー）；抗ＫＣＣ２抗体（１：１０００；ａｂ４９９１７、Ａｂｅａｍ社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）；ウサギポリクローナル抗ホスホ−Ｓｅｒ９４０塩化カリウム共輸送体（ＫＣＣ２）抗体（１：１０００；ｐ１５５１−９４０、ホスホソリューションズ（PhosphoSolutions）、米国コロラド州オーロラ）；マウスモノクローナルＮＫＣＣ１（Ａ−６）抗体（１：１０００；ＳＣ−５１４７７４．サンタクルーズバイオテクノロジー）；およびウサギポリクローナル抗ホスホＮＫＣＣ１  Ｔｈｒ２１２／Ｔｈｒ２１７抗体（１：１０００；ＡＢＳ１００４、ＥＭＤミリポア（EMD Millipore）、米国マサチューセッツ州バーリントン）を含んでいた。膜をその後、１×ＴＴＢＳで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中で適切な二次抗体と共にインキュベートした。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体（１：５０００；ＳＣ−２００４、サンタクルーズバイオテクノロジー）およびヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（１：５０００；ＳＣ−２００５、サンタクルーズバイオテクノロジー）を含んでいた。室温で１時間の後、膜を１×ＴＴＢＳで３回洗浄した。結合した抗体を、ルミノール／酸化溶液、ＨＲＰベースの化学発光基質（ボストンバイオプロダクト）で可視化し、イ��ージＪ（Image J）ソフトウェア（ImageJ、米国立衛生研究所、米国メリーランド州ベセスダ）を用いて定量した。その後ブロットを、１×ストリッピング緩衝液、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、および１×ＴＴＢＳと共に３０分インキュベートし、次いでブロッキング緩衝液中で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中のマウスモノクローナルＩｇＧ（ｉ−アクチン（Ｃ４）ＨＲＰ抗体（１：２５００；ＳＣ−４７７７８、サンタクルーズバイオテクノロジー）と共に１時間、追加のインキュベーションを行った後、ブロットを１×ＴＴＢＳで３回洗浄し、次いでルミノール（Luminal）／酸化溶液（ボストンバイオプロダクト）を用いて画像化した。イメージＪソフトウェアを用いてバンドを定量した。
【０１２３】
免疫組織染色
[0160]ＨＳＰ７０免疫組織染色：アノードおよびカソード刺激後の運動ニューロンにおけるＨＳＰ７０発現を検査するために、動物をケタミン／キシラジン溶液で麻酔し、次いで、室温で、ＰＢＳ、続いて４％パラホルムアルデヒドで灌流した。解剖した脊髄分節を同じ固定剤中で一晩後固定し、次いで低温保護（cryoprotection）のために３０％スクロースに移した。脊髄分節をドライアイスで凍結し、切り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で収集した。トリスＡ緩衝液中での３回の洗浄後、断片をトリスＢで１５分にわたり１回洗浄し、次いでトリスＢで希釈した１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中でブロックした。１時間後、一次マウスモノクローナルＨＳＰ７０（Ｆ−３）抗体を添加し（１：５００、ｓｃ−３７３８６７、サンタクルーズバイオテクノロジー）、断片を、振盪機で、４Ｃで一晩インキュベートした。次の日、断片を３回洗浄し、次いでビオチン化ヤギ抗マウス抗体（１：５００：ＢＡ−９２００、ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories）、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）と共にインキュベートした。１時間後、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８（１：２０００：ＳＡ−５４８８、ベクターラボラトリーズ）を添加した。さらに３０分後、断片をトリスＡで２回洗浄し、その後、切片を、ＤＡＰＩ（Ｈ−１２００：ベクターラボラトリーズ）を含有する媒体と共にマウントした。
【０１２４】
[0161]コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫組織染色：脊髄断片をＰＢＳで３回洗浄し、その後、１０％ウサギ血清／０．１’Ｙ°トリトン（Triton）Ｘ−１００／０．１ＭのＰＢＳと共に室温で１時間インキュベートした。次いで断片を、０．１％トリトンＸ−１００／０．１ＭのＰＢＳ中の抗ＣｈＡＴ一次抗体（１：５００、ＡＢ１４４Ｐ、ＥＭＤミリポア社）と共に４Ｃで４８〜７２時間インキュベートした。断片を徹底的にＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．１％トリトンＸ−１００／０．１ＭのＰＢＳ中のウサギ抗ヤギ５６８ｎｍ抗体（１：５００）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳを用いた追加の３回の洗浄の後、断片をＤＡＰＩ（Ｈ−１２００；ベクターラボラトリーズ）を含有する媒体と共にマウントした。
【０１２５】
ｑ−ＰＣＲ
[0162]ＲＮＡを、トリゾールベースの方法（Rioら、2010）を使用することによって脊髄サンプルから単離し、続いてクロロホルムおよびイソプロピルアルコールで抽出した。簡単に言えば、各ＲＮＡサンプルを、ジエチルジカーボネート（ＤＥＰＣ）水中に溶解させ、次いで、キアゲン（Qiagen）ＲＮＡイージー（RNAeasy）キット（キアゲン（Qiagen）、ヒルデン、ドイツ）を製造元の指示に従って用いて精製した。ＲＮＡ濃度を、ナノドロップ（Nanodrop）２０００ｃ機器（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて測定した。ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写スーパーミックス（バイオ−ラッド、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、全ＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。各反応につき、２ｐｇの全ＲＮＡを遺伝子特異的なプライマー（プライムＰＣＲ（PrimePCR）アッセイＳｌｃｌ２ａ２）と合わせた。刺激された、および刺激されていない動物から得たサンプルは常に、同じプレート上でアッセイされた。各サンプルにつき、ＳＹＢＲグリーンケミストリーベースの検出を使用することによって、各転写の増幅した生成物の差を３回の複製から測定した。内因性参照遺伝子として、ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）を使用し、これらの遺伝子の増幅のために使用されたプライマーは、それぞれプライムＰＣＲアッセイＡＣＴＢ、プライムＰＣＲアッセイＴＢＰ、およびプライムＰＣＲアッセイＨＰＲＴ１であった。得られた３つの転写物を、中枢神経系におけるそれらの安定な発現の従前の実証に基づく分析のために選択した（Valenteら、2014；Walderら、2014）。総反応体積は１０μｌであり、これは、５μｌのスーパーミックス、プライマー、ｃＤＮＡテンプレート、およびヌクレアーゼ非含有水を含んでいた。ＣＦＸ３８４リアルタイムシステム（バイオ−ラッド）およびＳｓｏＡＤＶＡＮＣＥＤユニバーサル（SsoADVANCED Universal）ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（バイオ−ラッド）を用いて、ｑＰＣＲ反応を３８４−ウェルプレートで行った。ＣＦＸマネージャーソフトウェア（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を、選択された自動ベースラインおよび閾値検出オプションと共に使用した。得られたデータをマイクロソフトエクセル（Microsoft Excel）にエクスポートし、各サンプルにつき、正規化因子としての内因性参照遺伝子に対する３連の相乗平均を使用することによって、相対的な正規化された発現を計算した。
【０１２６】
実験設計および統計的分析
[0163]実行された予備的な実験に基づき、足首を、１０９°の底屈の最初の角度から８１°の背屈に伸張させて（２８°伸張した）、筋肉を傷つけずに伸張反射を誘発させた。対応するひざ関節の角度は完全に伸張した状態であり、これは測定の全てにわたり一貫して維持された。器具を使用して試験された各伸張パラメーターにつき、２セットのデータを収集した：１セットのデータは、動物が覚醒している間に収集し、第２のセットのデータは、動物が完全なイソフルラン麻酔下にある間に収集した。筋肉および結合組織の受動的な抵抗性の力を表すために、動物が麻酔されている間にデータを収集した。伸張抵抗のニューロンで生産された要素を、受動組織に起因する要素から単離するために、麻酔中に収集された試験されたパラメーターの値を、動物が覚醒している間に収集された値から引いた。この方法は、伸張応答のニューロンの寄与率のみが分析されることを確実にした。テールピンチおよびペダル反射の減算を使用して、伸張が実行された麻酔レベルを標準化した。しかしながら、イソフルラン麻酔は、速い速度の伸張の間、反射応答を完全に除去しなかった。以下の伸張パラメーター：活性抵抗、ピーク振幅および活性スロープ（active slope）ならびに二乗平均ＥＭＧ（ＲＭＳ  ＥＭＧ）面積および振幅（図１）を収集した。ベースライン（伸張前）に対する抵抗トレースの高さとして活性ピーク抵抗を計算した。伸張に応答した筋肉抵抗の上昇期の第１の導関数に基づき、活性スロープを計算した。ベースラインに対するＥＭＧトレースの高さに基づき、ＲＭＳ  ＥＭＧ振幅を計算した。濃度曲線下面積に基づき、ＲＭＳ  ＥＭＧ面積を計算した。
【０１２７】
[0164]４人の研究者は、ラボチャートソフトウェアで収集された伸張器具のデータをエクセルシートに移し、埋め込まれたエクセルシートの式を使用して各動物につきスコアを計算した。１人の研究者は、ＤｉｇｉＧａｉｔ（歩行）およびラダーホイール（巧緻運動）のビデオを分析し、一方で別の研究者は、埋め込まれたエクセルシートの式を用いてデータを分析して、動物のスコアを計算した。全６人の研究者が研究の仮説に対して盲検化された。ラボチャート中にＲＭＳ方程式を０．５ｍｓのウィンドウと共に埋め込み、ＥＭＧのためのＲＭＳを生成した。
【０１２８】
[0165]筋緊張への繰り返しのｔｓＤＣＳの作用を研究するために、処置（カソード、アノード、または偽）が対象間の独立変数であり、時間および速度が対象内の独立変数である混合型要因反復測定実験設計を使用した。混合型要因ＡＮＯＶＡ（分割プロットＡＮＯＶＡ）を使用して、グループ間のピーク抵抗、スロープ、ＥＭＧ振幅、および面積における差を評価した。ボンフェローニの信頼区間の調整も適用された。混合型要因ＡＮＯＶＡを使用して、ＲＤＤデータを分析した。グループ間の比較を、テューキーの事後検定を使用して実行し、一元配置反復測定ＡＮＯＶＡ（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ）を使用して、地上歩行データにおける肢面積および上昇および下降スロープを分析した。反復測定ＡＮＯＶＡ用の全ての仮定が満たされた。ホルム−シダック事後補正を使用して、伸張応答および巧緻運動に関する速度間の差を試験した。両側ｔ検定を使用して、対照グループの２つの評価間の巧緻運動における差を分析した。ＳＰＳＳソフトウェアを使用して、統計的検定（ＩＢＭスタティスティックス（IBM Statistics）、ＳＰＳＳバージョン２３）の全てを実行した。球面性を試験するために、ＳＰＳＳにおけるモークリーの検定を適用した（ｐ＞０．０５）。有意性の臨界レベルをｐ＜０．０５に設定した。データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示される。
【０１２９】
痙縮アウトカム尺度に対するＤＣＳの長期作用
[0166]混合型要因ＡＮＯＶＡを使用することによって、活性筋肉抵抗の振幅における差を評価した。ここで、時間（４つのレベル：事前、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）および速度（３つのレベル：速度１、２、および３）は対象内変数であり、処置（３つのレベル：アノード、カソード、および偽）は、対象間変数である。処置と速度との間に有意な相互作用は観察されなかった（Ｆ＝０．４、ｐ＝０．８１）。対照的に、処置と評価の時間との間に有意な相互作用が観察された（Ｆ＝２．３６、ｐ＝０．０３）。多重比較（ボンフェローニ）のために調整した後、アノードおよびカソード処置動物間（ｐ＜０．００１）、加えてアノードおよび偽処置グループ間（ｐ＜０．００１）に有意なわずかな平均の差が確認された。しかしながら、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４中、カソードおよび偽処置グループ間に有意差はなかった（ｐ＝０．１３）。Ｅ１でも、アノード、カソード、および偽処置動物間に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。図２で示されるように、グループ内分析は、アノードｔｓＤＣＳ処置動物が、活性筋肉抵抗の振幅における有意な低減を呈示したことを示した。速度による前処置スコアに対する異なる時間間隔での平均スコアは有意であった：それぞれホルム−シダックの方法に従って、速度１（Ｅ１、ｐ＜０．００１；Ｅ２、ｐ＝０．００３；Ｅ３、ｐ＝０．００２）、速度２（Ｅ１、ｐ＜０．００１：Ｅ２，ｐ＝０．０３８；Ｅ３、ｐ＝０．０２７）、および速度３（Ｅ１、ｐ＜０．００１；Ｅ２、ｐ＝０．００４；Ｅ３，ｐ＝０．０４６）。
【０１３０】
[0167]活性スロープにおける差を、混合型要因ＡＮＯＶＡを使用することによって評価した（図２Ｂ）。分析から、時間と処置との間に有意な相互作用が示されたが（Ｆ＝３．５９、ｐ＝０．０３）、速度と処置との間に相互作用は示されなかった（Ｆ＝１．０２、ｐ＝０．４１）。グループ間分析はさらに、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４中に、アノードおよびカソード処置グループ間（ｐ＝０．０１５）、ならびにアノード処置および偽処置グループ間（ｐ＝０．０４）における有意差を示した。しかしながら、偽処置およびカソード処置動物間に差はなかった（ｐ＝０．８２９）。また対象内分析も、アノード処置グループが、経時的に活性スロープにおける減少を経験したことを解明し（ｐ＜０．０１）、これは、他のグループでは観察されなかった（ｐ＞０．０５）。ＥＭＧ面積における差を、混合型要因ＡＮＯＶＡを使用することによって評価した（図２Ｃ）。
【０１３１】
[0168]時間と処置との間に有意な相互作用があったが（Ｆ＝４．４、ｐ＝０．０００２）、速度と処置との間に相互作用はなかった（Ｆ＝０．６、ｐ＝０．８）。また時間、速度、および処置の間にも相互作用はなかった（Ｆ＝１．１、ｐ＝０．３４）。事後分析から、アノード処置およびカソード処置グループ間（ｐ＝０．００１）、ならびにアノード処置および偽処置グループ間（ｐ＝０．０００１）に有意差が確認された。対照的に、カソード処置および偽処置グループ間に差はなかった（ｐ＝０．３４）。対象内分析はさらに、アノード処置グループが、経時的にＥＭＧ面積における減少を呈示したことを解明し（ｐ＜０．０１）、これは、他のグループでは観察されなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１３２】
[0169]ＥＭＧ振幅（覚醒からイソフルランを引いた値）における差を、混合型要因ＡＮＯＶＡを使用することによって評価した（図２Ｄ）。時間と処置との間に有意な相互作用が観察された（Ｆ＝３．６３、ｐ＝０．００７）。その一方で、速度と処置との間にも（Ｆ＝０．６１、ｐ＝０．６６）、速度、時間、および処置の間にも相互作用はなかった（Ｆ＝０．１９、ｐ＝０．９）。事後分析により、アノード処置およびカソード処置グループ間（ｐ＜０．００１）、およびアノード処置および偽処置動物間（ｐ＝０．００１）で有意差が確認された。対照的に、カソード処置および偽処置動物間に差はなかった（ｐ＝０．９６）。対象内分析はさらに、アノード処置グループが、経時的にＥＭＧ振幅における減少を呈示したことを確認し（ｐ＜０．０１）、これは、他のグループでは観察されなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１３３】
アノードｔｓＤＣＳの繰り返しの処置が地上歩行パターンを変化させる
[0170]歩行運動の特徴を、ＤｉｇｉＧａｉｔシステムを使用することによって調査した（図３）。動物の評価は、２つの速度、１０ｃｍ／秒および２０ｃｍ／秒で、損傷の前（事前）、次いで処置後３つのインターバル：処置の直後（Ｅ１）ならびに処置の２週間後（Ｅ２）および４週間後（Ｅ３）に行われた。これらのタイムポイントのそれぞれに、３つの関連パラメーター：上昇スロープ、ピークの肢面積、および下降スロープを分析した。対照動物は、２つの後肢のそれぞれに実行された２つの評価間で、肢面積、上昇スロープ、または下降スロープにおける差を示さなかった（ｐ＞０．０５：対応のある両側ｔ検定）。対照的に、偽処置動物は、Ｅ１〜Ｅ３評価中、より遅い速度で、左後脚（ＬＨＬ）の肢面積において有意な減少を呈示したが、右後脚（ＲＨＬ）では呈示しなかった（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝４．７５、ｐ＝０．００９）。より速い速度で、肢面積は、ＬＨＬの場合、評価の全て（Ｅ１〜Ｅ３）において有意に減少したが（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝５．５４、ｐ＝０．００５）、ＲＨＬの肢面積は有意に変化しなかった。ＬＨＬの場合、上昇スロープは、Ｅ１の中に、遅い速度で有意に減少したが（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝３．２０、ｐ＝０．０３９）、ＲＨＬの場合は減少しなかった。対照的に、上昇スロープは、両方の後肢について、より速い速度で有意に変化しなかった。同様に、下降スロープは、遅い速度で、いずれの後肢でも有意に減少しなかったが、ＬＨＬの場合、評価ポイントの全ての間で、より速い速度で有意に減少し（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝４．４７、ｐ＝０．０１２）、ただしＲＨＬでは減少しなかった（＊ｐ＜０．０５、ホルム−シダックの方法）。アノードｔｓＤＣＳ処置動物は、ＬＨＬの場合、肢面積において、遅い速度では評価の全ての間（Ｅ１〜Ｅ３）有意な増加を呈示し、Ｅ１およびＥ２の間のみであった（ＬＨＬの場合、反復測定（ＲＭ）ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝１２．７０、ｐ＜０．００１；ＲＨＬの場合、ＲＭ  ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝１７．３２、ｐ＜０．００１）。肢面積も、より速い速度でＥ１中にＬＨＬ（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝７．０４、ｐ＜０．００１）およびＲＨＬ（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝１３．３２、ｐ＜０．００１）の両方で有意に増加した。上昇スロープは、ＲＨＬの場合、Ｅ１およびＥ２中に、遅い速度で、有意に増加したが（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝６．０６、ｐ＝０．００２）、ただしＬＨＬでは有意に増加しなかった。その一方で、ＲＨＬの場合、より速い速度で、上昇スロープのみがＥ１中に有意に増加した（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝４．１９、ｐ＝０．０１１）。下降スロープは、遅い速度でＥ１およびＥ２中にＬＨＬ（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝１０．０３、ｐ＜０．００１）およびＲＨＬ（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝１３．４８、ｐ＜０．００１）の両方で有意に増加した。その一方で、下降スロープは、ＲＨＬの場合のみ、より速い速度でＥ１中に有意に増加した（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝９．０６、ｐ＜０．００１）（＊ｐ＜０．０５、ホルム−シダックの方法）。カソードｔｓＤＣＳ処置動物において、ベースラインと比較して遅い速度で、Ｅ１中に、肢面積における有意な増加が観察されたが（ＬＨＬの場合、ＲＭ  ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝７．９���、ｐ＜０．００１；ＲＨＬの場合、ＲＭ  ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝８．４６、ｐ＜０．００１）、Ｅ２またはＥ３中に、肢面積における変化は観察されなかった。評価ポイントのいずれにおいても、より速い速度で、肢面積における有意な変化はなかったが、上昇スロープは、遅い速度とより速い速度の両方において不変のままであった。対照的に、下降スロープは、ＬＨＬの場合、Ｅ１およびＥ２中に有意に増加した（遅い速度の場合、ＲＭ  ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝６．７２、ｐ＜０．００１）、ＲＨＬの場合、Ｅ１の間のみ有意に増加した（遅い速度の場合、ＲＭ  ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝３．４７、ｐ＝０．０２５）（＊ｐ＜０．０５、ホルム−シダックの方法）。より速い速度で、下降スロープにおける有意な変化はなかった。
【０１３４】
アノード処置は巧緻運動の回復を強化する
[0171]コンピューター制御されたラダーホイール（図４Ａ）を使用して、巧緻運動に対する繰り返しのｔｓＤＣＳの作用を調査した。混合型二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ（変数：時間および肢の側）を、巧緻運動における改善を評価するのに適用した。アノード処置したグループで検査された４つのタイムポイントにわたり、巧緻運動における有意差が観察された（Ｆ＝６．４９、ｐ＝０．００２）。アノード処置グループのＲＨＬは、Ｅ２中に、Ｅ１と比較して、より有意に高い平均スコアを有していたが（ｐ＝０．００１、ボンフェローニ）、ＬＨＬは、Ｅ２およびＥ３中に、Ｅ１と比較して、より有意に高いスコアを有していた（ｐ＜０．０１、ボンフェローニ）（図４Ａ）。しかしながら、４つのタイムポイントにわたり、他のグループのいずれにおいても有意差は観察されなかった（ｐ＞０．０５、ボンフェローニ）。
【０１３５】
[0172]次に、グループ間の変化パーセント（評価前からの）を比較した（図４Ｂ）。混合型二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、グループ間で有意な主要作用を検出した（Ｆ＝５．９７、ｐ＝０．０１６）。例えば、アノード処置グループは、それらのスコアにおいて、カソード処置グループ（ｐ＝０．０２７、ボンフェローニ）および健康グループ（ｐ＝０．０４８、ボンフェローニ）と比較して、より有意に高い変化パーセントを呈示した。アノード処置グループの場合、偽グループと比較して、より高い変化パーセントが観察されたが、変化は有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。他のグループ間で有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。総合すると、これらの発見から、アノードｔｓＤＣＳで処置した動物で起こった巧緻運動の運動制御の回復が強化されたことが明らかとなる。
【０１３６】
ｔｓＤＣＳ処置後のＨ反射のＲＤＤ
[0173]ＲＤＤにおける変化を評価するために、混合型二元配置反復測定ＡＮＯＶＡも実行した。処置条件（例えば、独立した因子、４つのレベル：対照、偽、アノード、およびカソード）は、異なるレベルの処置間で主要作用における有意差をもたらした（Ｆ＝３．０、ｐ＝０．０３８）。加えて、有意な主要作用として頻度を確認した（対象内の繰り返しの因子、５つのレベル：０．１、０．５、１、２、および５Ｈｚ）、（Ｆ＝１３．８、ｐ＜０．００１）。しかしながら、頻度および処置条件の間に統計学的に有意な相互作用は観察されなかった（Ｆ＝１．３５、ｐ＝０．１９２）。したがって、異なる処置レベルによる作用は、どのレベルの頻度が存在するかに依存していなかった。
【０１３７】
[0174]多重比較試験（テューキー）を適用して、どのグループが他と異なるのかを確認した。図５で示されるように、１Ｈｚ、２Ｈｚ、および５Ｈｚの頻度におけるＲＤＤの平均スコアは、０．１ＨｚにおけるＲＤＤスコアと比較して、より有意に高かった（５Ｈｚ対１Ｈｚ、ｐ＜０．００１：４Ｈｚ対１Ｈｚ、ｐ＝０．００６；３Ｈｚ対１Ｈｚ、ｐ＝０．０２４）。偽グループ内で、頻度の全てにおけるＲＤＤの平均スコアは、０．１ＨｚでのＲＤＤスコアと比較して有意に異なっていなかった（ｐ＞０．０５）。アノード処置グループ内で、２Ｈｚおよび５Ｈｚの頻度におけるＲＤＤの平均スコアは、０．１ＨｚにおけるＲＤＤスコアと比較して、より有意に高かったが（５Ｈｚ対１Ｈｚ、ｐ＜０．００１：４Ｈｚ対１Ｈｚ、ｐ＜０．００１）、カソード処置したグループ内の１Ｈｚにおける平均ＲＤＤスコアは、０．１Ｈｚにおける平均ＲＤＤと比較して、より有意に高かった（ｐ＝０．０１７）。グループ間比較（テューキー）を実行したところ、５ＨｚにおけるＲＤＤスコアにおける有意差が観察された。例えば、５ＨｚにおけるＲＤＤスコアは、アノード処置グループにおいて、偽およびカソード処置したグループのスコアと比較して、より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。その一方で、対照グループは、５Ｈｚにおいて、カソード処置したグループと比較して、より有意に高いＲＤＤスコアを有していた（ｐ＝０．０１６）。総合すると、これらの発見は、繰り返しのアノード刺激後に観察された痙縮において観察された低減の基礎となる生理学的なメカニズムの裏付けを提供する。痙縮を有する動物のうち６匹において、ＲＤＤに対するアノードおよびカソードｔｓＤＣＳの短期作用を試験した。それぞれカソードおよびアノードｔｓＤＣＳにおいてＲＤＤにおける即時で有意な増加または減少が観察された（データは示されない）。これらのデータは、上記で報告したＲＤＤに対するｔｓＤＣＳの長期作用と一致する。
【０１３８】
実施例２：繰り返しのｔｓＤＣＳ処置後のＫＣＣ２、p-ＫＣＣ２、ＮＫＣＣ１、およびｐ−ＮＫＣＣ１の発現
[0175]動物が７日間の繰り返しのｔｓＤＣＳ処置受けてから４週間後に、損傷部位の下の脊髄の腰仙部におけるＫＣＣ２タンパク質レベルにおける変化を調査した。カソードおよびアノードｔｓＤＣＳ処置後に、対照健康グループと比較して、ＫＣＣ２およびｐＫＣＣ２タンパク質レベルにおける低減が観察された（図６Ａ）。しかしながら、グループ間で、タンパク質レベル間に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。共輸送体であるＮＫＣＣ１のレベルも検査した（図６Ｂ）。クラスカル−ウォリス一元配置ＡＮＯＶＡは、ＮＫＣＣ１に関して、処置グループ間で、中央値間における有意差を検出した（Ｈ＝３１．４、ｐ＜０．００１）。対照の健康な動物において、それらの腰仙髄部で低いレベルのＮＫＫＣ１発現が検出された。対照的に、ＳＣＩおよび痙縮を有する偽処置動物における、ならびにカソード処置グループにおけるＮＫＣＣ１タンパク質のレベルは、対照グループと比較して、より有意に高かった（ｐ＜０．０５、ダンの方法）。アノード処置グループにおいて、より低いレベルのＮＫＣＣ１タンパク質が検出され、このレベル間の差および対照グループの差は有意ではなかった（ｐ＞０．０５、ダンの方法）。
【０１３９】
[0176]次に、リン酸化ＮＫＣＣ１（ｐ−ＮＫＣＣ１）のレベルを調査した。グループ間で検査したところ、ｐ−ＮＫＣＣ１レベルにおける差はなかった。しかしながら、総ＮＫＣＣ１に対するｐ−ＮＫＣＣ１の比率を計算したところ、一元配置ＡＮＯＶＡは、処置グループ間で統計学的に有意な差を検出し（Ｆ＝１６．４、ｐ＜０．００１）、アノード処置グループ（０．１７±０．０１、ｐ＜０．００１）、カソード処置グループ（０．１２±０．０１、ｐ＜０．００１）、および偽処置グループ（０．１４±０．０１、ｐ＜０．００１）は、対照グループと比較して、より有意に低い比率を呈示した（０．３１±０．０４）（ホルム−シダックの方法）。刺激とＮＫＣＣ１の発現との間の一時的な関連を確立するために、無傷動物で、ＮＫＣＣ１発現に対する刺激の即時作用を調査した。簡単に言えば、３つの動物グループは、アノード、カソードまたは偽ｔｓＤＣＳ処置のいずれかを受け、次いで２．５時間後に刺激された部位からの脊髄サンプルを収集した。ＮＫＣＣ１発現における刺激によって誘発された変化は、上述したように繰り返しの処置を受けた動物で観察されたものと類似していた（図７）。さらに、偽処置グループと比較して、ｐ−ＮＫＣＣ１の絶対値が、カソード処置グループにおいてわずかに増加し、アノード処置グループにおいてわずかに低減した。総ＮＫＣＣ１に対するｐ−ＮＫＣＣ１の比率を計算したところ、一元配置ＡＮＯＶＡは、処置グループ間で統計学的に有意な差を検出した（Ｆ＝５．９６、ｐ＝０．００６）。例えば、アノード処置およびカソード処置グループに関する比率は、それぞれ０．７７±０．１８（ｐ＝０．０１）および０．２８±０．５（ｐ＝０．８）であった。比較において、偽処置グループに関する比率は、０．３１±３．６であった（ホルム−シダックの方法）。総合すると、これらのデータは、アノードｔｓＤＣＳが脊髄興奮性における長期変化を引き起こす可能性がある可能性のあるメカニズムを示す。
【０１４０】
実施例３：ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡの検出
[0177]ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡレベルに対するｔｓＤＣＳの作用も、刺激の２．５時間後に収集した脊髄組織において検査した。一元配置ＡＮＯＶＡによれば、処置グループ間の平均値は有意に異なっていた（Ｆ＝３．８、ｐ＝０．０３）。偽処置グループと比較して（０．７４±０．２２；ｎ＝１２）、アノードｔｓＤＣＳは、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡレベルにおける有意な変化を引き起こさなかったが（０．８５±０．３７、ｐ＝０．４５、ｎ＝１４）、一方でカソードｔｓＤＣＳは、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡレベルにおける有意な増加をもたらした（１．１４±０．４９、ｐ＝０．０３、ｎ＝１５）ことが観察された。これらの結果は、上述したタンパク質発現データと一致する。
【０１４１】
実施例４：アノードｔｓＤＣＳはＨＳＰ７０応答を誘発する
[0178]上述したように、アノードｔｓＤＣＳは、ＮＫＣＣ１タンパク質の発現を低減したが、ＮＫＣＣＣ１のｍＲＮＡのレベルに影響を与えなかった。これらの結果は、分解プロセスの関与を示唆しており、ＨＳＰ７０は、タンパク質分解のプロテアソームおよびリソソーム経路を強化することが示されている（Reegら、2016）。それゆえに、ＮＫＣＣ１レベルに関するｑＰＣＲおよびウェスタンブロットデータを強化および説明するために、アノードｔｓＤＣＳ後にＨＳＰ７０の発現を調査した。これらの実験のために、無傷の麻酔した動物にアノードｔｓＤＣＳの１回のセッションを受けさせ、２時間後に標的組織を収集した。アノード処置グループにおいて、偽処置グループと比較して、ＨＳＰ７０発現におけるロバストで有意な増加が誘発された（ｐ＝０．０３、ｔ検定）（図８）。運動ニューロンの免疫蛍光染色はさらに、ＨＳＰ７０発現における全体の増加が、アノード処置後に起こったことを実証した。これらの染色は、核中およびその周辺、細胞質中、および樹状突起中におけるＨＳＰ７０の局在化を示した。加えて、ＣｈＡＴでの染色を実行して、脊髄運動ニューロンを確認し、ＤＡＰＩ染色により核を確認した（データは示されない）。
【０１４２】
実施例５：ＮＫＣＣ１ブロッカーであるブメタニドがＳＣＩを有する動物における痙縮を低減した
[0179]上述したように、ＮＫＣＣ１は、痙縮を有する動物において過剰発現されたことが見出され、ＮＫＣＣ１のレベルは、繰り返しのアノードｔｓＤＣＳの後に正常化した。それゆえに、ＳＣＩ後に痙縮を有する動物に対するＮＫＣＣ１特異的なブロッカーであるブメタニドの作用を調査した。ブメタニドを、２つの濃度、３０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇで試験した。３０ｍｇ／ｋｇでのブメタニド投与の１時間後に（ｎ＝５）、痙縮における中程度の低減が観察された（データは示されない）。６０ｍｇ／ｋｇのブメタニドの投与後、ピークの筋肉抵抗およびＥＭＧを測定した。一元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡは、アッセイされた様々なタイムポイント間（例えば、注射の５、２０、３０、および４５分後）で有意差を検出した（Ｆ＝８３．８、ｐ＜０．００１）。また多重比較試験（ホルム−シダックの方法）も、ベースラインの測定値と比較して、アッセイされたタイムポイントのＩにおけるピーク抵抗および対応するＥＭＧにおける有意な低減を示した（３４％）（ｐ＜０．００１）（図９）。またブメタニド注射の３０分後、遅い伸張が、バックグラウンド活性を低減し、筋緊張を和らげることも観察されたが、これらの形態は、痙縮動物では増加した（図９ＡおよびＣ）。総合すると、これらの発見は、高レベルのＮＫＣＣ１発現と痙縮との強い関連を確立する。さらに、傷害を受けていない対照動物に６０ｍｇ／ｋｇブメタニドを注射した場合、動物の２１％が、反射的な伸張応答の低減を呈示した。したがって、ＮＫＣＣ１は、正常マウスにおいても同様に脊髄に関する機能的な結果を有し得る。
【０１４３】
[0180]ここで、ＳＣＩにより誘発された痙縮のマウスモデルにおいて、７日にわたる１日２０分のｔｓＤＣＳ投与の長期作用を調査した。さらに、痙縮は速度依存性であるため、本発明者らのマウスモデルにおいて、下腿三頭筋を３つの異なる速度で伸張させた。痙縮を評価する場合に重要とみなされる４つのパラメーター：１）活性抵抗ピーク、２）活性スロープ、３）ＥＭＧの振幅、および４）ＥＭＧの面積がある。アノードｔｓＤＣＳで処置したマウスは、他のグループと比較して、全ての４つのこれらのパラメーターにおける有意な低減を呈示した（図２）。アノードｔｓＤＣＳ処置において、地上および巧緻運動も処置後に有意に改善された。さらに、これらの機能的な改善は、ＲＤＤの増加、すなわち痙縮の低減、およびＮＫＣＣ１タンパク質発現の低減の指標である歩行パラメーターの増加と類似の時間スケールで起こった。これらの結果は、ブメタニド処置後に痙縮が低減され、アノードｔｓＤＣＳの１回のセッションの後にＮＫＣＣ１レベルが低減されたという観察と組み合わせて、ＮＫＣＣ１が、アノードｔｓＤＣＳの痙縮を低減する能力において重要な役割有することを示唆する。痙縮は、歩行の有効性に対して大きな影響を有し、歩行異常のパターンを予測することができる（KrawetzおよびNance、1996）。痙縮はまた、歩行を遅くし、共収縮（Dyerら、2011）および連合運動（Mayer、2002）により巧緻運動に干渉する。ＣＮＳ傷害の後、伸張反射の調節は、歩行サイクルの適した進行を維持するのに必須であり（CapadayおよびStein、1986；CrennaおよびFrigo、1987）、痙縮の程度と傷害の原因（例えば、脳か脊髄か）に応じて様々なレベルの障害を被る（Faistら、1999）。
【０１４４】
[0181]歩行に対するｔｓＤＣＳの作用を評価するために（図８）、３つの歩行関連のパラメーター：上昇スロープ、ピークの肢面積、および下降スロープを調査した。これらのパラメーターを、歩行サイクルの立脚期における変化に対するそれらの感受性に基づき検査した。例えば、上昇スロープの始まりは、動物のかかとが地面を打つときである立脚期開始を示す。上昇スロープの残りは、動物がその体重をその足に移動させるときに足が地面に連続して下降すること（荷重応答）に対応する。体重移動は、立脚期の中間に到達する地点である中間スタンスまで続けられ、足は地上でフラットになる。中間スタンスはまた、第２のパラメーターであるピークの肢面積が測定されるときでもある。次いで中間スタンスの最後に下降スロープが続き、下降スロープは、かかとが上昇し始める（かかとが離れる）ときに始まり、それと並行して足は次第に蹴り出す準備をして、動物を前方へ推し進める。立脚期のほとんどの期間中に、ＴＳ筋肉は、足首が曲がり、体が前方へ移動するときに進行性の伸長を受ける（Lamontagneら、2001）。痙縮動物において、この伸長は、痙縮に関連して反射調節の機能が損なわれているために、歩行を妨害する反射的な収縮のきっかけになる（Faistら、1999）。それゆえに、アノード処置後に観察された下降および上昇スロープにおける有意な増加（図４Ｄ、中央および下のグラフ）は、移行の強化および移行時間の減少が生じたことを示す。加えて、これらの動物のサブセットのピークの肢面積は、中間スタンス中に、偽処置動物（図４０、上）と比較して、試験された速度の両方において増加した（図４ｄ、上）。
【０１４５】
[0182]アノード処置動物がいかなる運動器官訓練も受けなかったことを考慮すると、これらの発見は、行動が本当に回復したことを反映する。巧緻運動をラダーホイールを用いて試験したところ、巧緻運動は、アノードｔｓＤＣＳで処置した動物において有意に改善した（図４）。対照的に、無傷対照動物の巧緻運動スコアは、経時的に改善しなかったことから、このタスクにおいて学習は不可能であったことが示される。したがって、アノード処置動物のスコアにおける有意な増加は、巧緻運動が本当に回復したことを反映し、これは訓練と無関係であった。さらに、マウスにおける巧緻運動は脳を要することを考えれば（Farrら、2006）、電流の結果は、アノードｔｓＤＣＳ処置が、潜在的に特定の皮質脊髄の関連を明らかにする、および／または強化する可能性があることを示す。ＲＤＤは、繰り返しの刺激後、Ｈ反射振幅の減衰を伴い（Ishikawaら、1966；LloydおよびWilson、1957；Meinck、1976）、痙縮に罹ったヒト（Aymardら、2000；Nielsenら、1993）および動物（Hedegaardら、2015；Leeら、2014b）において低減される。
【０１４６】
[0183]活性化後抑制の基礎となるメカニズムは、その事前の活性化によりｌａ求心性部分からの神経伝達物質の量子的放出が起こる見込みの減少を含むという仮説が立てられている（Hirstら、1981；Kuno、1964a；Kuno、1964ｂ；Lev-TovおよびPinco、1992）。本発明のＲＤＤ研究において、偽グループにおける異なる頻度間のＲＤＤ低減において有意差はなかった。対照的に、５Ｈｚにおいて、無傷対照と偽グループとの間に有意差があり（図１０Ｆ）、これらの発見は、以前の研究のものと一致する（Leeら、2014b）。活性化後抑制は、ｌａ求心性部分のシナプスの効能を低下させ、それによってクローヌスおよび振動を防ぐため、随意運動中において機能的に有益である（HultbornおよびNielsen、1998）。しかしながら、活性化後抑制の減少は、潜在的にシナプス効能を増加させる可能性があり、これは次に、一般的に痙縮に関連する興奮性亢進を引き起こす可能性がある（HultbornおよびNielsen、1998）。短期ｔｓＤＣＳ（データは示されない）および長期ｔｓＤＣＳ（図６）後に、偽グループと比較して、ＲＤＤにおける有意な増加がアノードグループで観察された。短期作用は、シナプスレベルにおけるＤＣ電流の機能的な調節と一致する。アノードＤＣ電流は、脊髄の背部に適用されると、ｌａ求心性部分のシナプス前終末を脱分極させ、運動ニューロンの興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を減少させる。逆に言えば、カソードＤＣ電流は、ｌａ求心性部分のシナプス前終末を過剰に再分極させ、運動ニューロンのＥＰＳＰを増加させる（Ecclesら、1962）。アノード電流はまた、自発放出の強化により微小終板電位の頻度も増加させ（Del CastilloおよびKatz、1954）、これは、シナプス前部の神経伝達物質の枯渇を引き起こす可能性がある。本発明の研究で観察された長期の結果は、アノードｔｓＤＣＳ後におけるシナプス強度の持続的な改変によって説明が可能であり、これは、ＮＫＣＣ１の発現を低減させることによる脊髄の抑制の回復により達成することができる。ＳＣＩ後、ＫＣＣ２およびＮＫＣＣ１の発現レベルは変更されることが見出されている（Cramerら、2008；Hasbargenら、2010；Leeら、2014a）。さらに、これらの共輸送体間の不均衡は、脊髄の興奮性亢進、したがって痙縮、痙攣、および／または疼痛に至る可能性がある（D’Amicoら、2014；Hasbargenら、2010）。ラットにおいて、ＳＣＩはＫＣＣ２のダウンレギュレーションを引き起こし、これは、痙縮と相関することが示されている（Boulenguezら、2010）。
【０１４７】
[0184]本発明の研究において、ＫＣＣ２またはｐ−ＫＣＣ２の発現における有意ではない低減が、偽処置した傷害を受けた動物で観察された。この結果はこれまで公開されたデータ（Boulenguezら、2010）と矛盾するため、サンプルの全てを用いてウェスタンブロットを２回実行した。全体的に、本発明者らのＫＣＣ２の結果は、これまでに報告された結果（Modalら、2014）に一致する。注目すべきことに、本発明の研究では、抗リン酸−セリン９４０ＫＣＣ２抗体が使用された。この部位におけるリン酸化は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）によって媒介され、これは、細胞表面におけるＫＣＣ２の安定性を強化し、イオン輸送を増加させる（Leeら、2007）。その一方で、本発明者らのＳＣＩ動物において、ｐ−ＮＫＣＣ１の絶対レベルにおける有意な変化を起こすことなく、ＮＫＣＣ１の発現は著しく上昇した。これらの結果は、ＣＤ−１マウスにおいて、上昇したＮＫＣＣ１発現のレベルが、ＳＣＩ後に脊髄興奮性を調節することにおいて重要な要因である可能性があることを示す。この結論は、ＮＫＣＣ１特異的なブロッカーであるブメタニドでの処置後に痙縮が低減したという観察によって裏付けられる（図８）。繰り返しのアノードｔｓＤＣＳは、ＳＣＩを有するＣＤ−１マウスにおいて痙縮パラメーターの有意な低減をもたらし（図２）、ＮＫＣＣ１のレベルにおける永続的な低減をもたらした（図６Ｂ）。逆に言えば、逆の極性を受けたマウスは、偽処置動物と比較して、痙縮および巧緻運動においてわずかな悪化を呈示し、ＮＫＣＣ１のレベルにおいて永続的な増加を呈示した。ＮＫＣＣ１発現に対するｔｓＤＣＳの同時発生作用を実証するために、単一の刺激セッションを麻酔した対照動物に適用してから２．５時間後に短期実験を実行した。ｔｓＤＣＳのロバストな極性依存性作用が観察され（図７）、この作用にとって傷害も覚醒状態も重要ではなかった。さらに、アノード刺激後に、ＮＫＣＣ１のレベルにおける有意な低減が検出され、これは、ＮＫＣＣ１のｍＲＮＡのレベルにおける有意な変化をまったく伴っていなかった。これらの結果は、タンパク質分解を含むメカニズムを考慮に入れるべきであり、これはＣａ＋２依存性プロセスであり得ることを示唆する（Reynoldsら、2007）。さらに、本発明者らの以前の研究において、Ｃａ＋２蓄積が、アノード刺激後に神経組織においてを有意に増加すること見出され（WieraszkoおよびAhmed、2016）、これは、脊髄組織におけるグルタミン酸の放出の増加に起因する可能性がある（AhmedおよびWieraszko、2012）。本発明の研究において、カルシウム蓄積とＮＫＣＣ１分解との直接的な関連を示す証拠は観察されていないが、アノード刺激後の２つの事象の同時出現は強い関連を示唆する。これまでに、カルシウム依存性ＮＫＣＣ１分解（Reynoldsら、2007）に加えて、グルタミン酸処置後のタンパク質分解（GuoおよびWang、2007）が観察された。この関連を強化するために、分解のためのプロテアソームまたはリソソーム経路を介した基質の流れを強化することがわかっているタンパク質であるＨＳＰ７０を調査した。本発明の研究において、アノードｔｓＤＣＳは、有意なＨＳＰ７０応答を誘発することが見出された（図９）。したがって、アノードｔｓＤＣＳがグルタミン酸放出���増加させ、カルシウム蓄積を増加させ、ＨＳＰ７０応答を誘発し、ＮＫＣＣ１タンパク質をダウンレギュレーションするが、そのｍＲＮＡはダウンレギュレーションしないという観察は、アノードｔｓＤＣＳがタンパク質分解プロセスを誘発することを強く示唆する。
【０１４８】
[0185]しかしながら、アノードｔｓＤＣＳの作用を媒介することに関与する可能性があるシグナル伝達メカニズムの詳細を調査するために、さらなる研究が必要である。その一方で、カソードｔｓＤＣＳがＮＫＣＣ１タンパク質およびｍＲＮＡのレベルを増加させたという観察は、カソードｔｓＤＣＳが、デノボタンパク質合成を含む別個のメカニズムを媒介することを示す。ｐ−ＮＫＣＣ１は、約２５０ｋＤａの分子量を有するＮＫＣＣ１の成熟形態の二量体である。この形態は、分子量に基づきＮＫＣＣ１と異なることから（ＭＷ、１３５／１７０ｋＤａ）、ｐ−ＮＫＣＣ１は、ＮＫＣＣ１の一部ではない。現在のところ、神経組織におけるＮＫＣＣ１の活性に関するリン酸化の役割は不明のままである。脳組織におけるＮＫＣＣ１のアップレギュレーションは、リン酸化によって上昇したＮＫＣＣ１活性の非存在下で虚血性傷害に寄与することが実証されており（Yan al.、2003）、それによって、ＮＫＣＣ１は活性型であることが示される。それに相応して、本研究で検知されたＮＫＣＣ１のアップレギュレーションは、脊髄の脱抑制に関与する可能性がある。さらに、ｐ−ＮＫＣＣ１の絶対レベルは、検査されたグループ間で不変のままであり、反射的な筋肉抵抗における３４％の低減が、ＳＣＩを有する動物で観察され、それに対してブメタニド注射後の対照では２１％の低減であった。これらの結果は、ＮＫＣＣ１が、リン酸化の非存在下で活性であるという仮説を裏付ける。別の研究において、ＰＫＣ（セリン−スレオニンキナーゼ）によるＮＫＣＣ１のリン酸化は、ＮＫＣＣ１の内部移行を誘発することが見出され、これは、側底膜からのＮＫＣＣ１ユニットの喪失を伴っていた（Tangら、201C）。したがって、本発明の研究においてアノードグループで観察されたｐ−ＮＫＣＣ１における相対的な増加は、その分解に関連する可能性がある。図１０は、脊髄興奮性に対するｔｓＤＣＳの作用を媒介する可能性がある作用機序、および含まれるｐ−ＮＫＣＣ１Ｉの可能性のある役割を例示する。
【０１４９】
[0186]まとめると、本発明の結果は、アノードｔｓＤＣＳが、ＳＣＩを有するＣＤ−１マウスの痙縮において永続的な低減をもたらす可能性があることを実証する。加えて、追加の訓練を行わずに、地上および巧緻運動が改善され、一方でＮＫＣＣ１の増加した発現が、痙縮に関連していた。ＮＫＣＣ１の具体的な役割は、アノードｔｓＤＣＳによる、ＮＫＣＣ１の薬理学的な阻害およびＮＫＣＣ１のダウンレギュレーションによりさらに実証され、これらはどちらも、痙縮の低減をもたらした。総合すると、本発明の研究の結果は、アノードｔｓＤＣＳの作用を媒介することにおいて、ＮＫＣＣ１発現のダウンレギュレーションが重要な役割を有するという強い証拠を提供する。
【符号の説明】
【０１５０】
１２  脊髄回路
２０  アノード電極、脊髄電極
１５／１７  メーター
１６  神経回路
２６  カソード電極、近位末梢神経電極
３３  分極回路
９０  コントローラー回路
９０  メモリー
９４  ＤＣ源
９６  ダウンレギュレーションインジケーター
９８  アップレギュレーションインジケーター
９９  通信リンク
１００  刺激システム
１０２  脊髄
１０４、１０８  電極
１０５  脊髄面、背側面
１０６  背面
１０９  アレイ
１１０  腹側面
１１１  シグナルコントローラー回路
１１２  インテリジェントコントローラー
１１３  パターンコントローラー
１１４  直流源
１１５  電池
１１６  ユーザーインターフェース
１１７  メモリー
１１８  リード
１１９  ユーザーコントロールパッド
１１９Ａ  オペレーターコントロール
１１９Ｂ  インジケーターライト
１２０  リード
１２２  負電流源
１２４  正電流源
１２５  電流フローの経路
１２６  刺激シグナル
１２７  活性領域
１３０  ハウジング
１３１  ウェアラブルなハウジング
１３２  ウェアラブルな付着システム
１３３  ウェアラブルな材料
１３４  ウェアラブルなパッケージ
１３４  ウェアラブルなデバイス
１３８  裏面
１４０  表面
１４１  導電性接着剤
１４２、１４４  ストラップ
１４５  通し穴またはポート
２００  ウェアラブルなハウジングシステム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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