(57)【要約】本発明は、ＰＭＶＫを有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用バイオマーカー組成物及びそれを用いた放射線抵抗性癌診断方法に関するものであって、ＰＭＶＫがノックダウンされる場合、放射線処理時に、癌細胞の生存率が減少することを確認し、これを基盤に癌に対する放射線治療抵抗性関連因子としての可能性を提示したので、ＰＭＶＫは、ヒトの癌細胞に対する放射線治療の効果を増進させる新規な標的として活用されうる。
2021504726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用バイオマーカー組成物。
【請求項２】
前記癌は、肺癌または膵臓癌であることを特徴とする請求項１に記載の放射線抵抗性癌診断用バイオマーカー組成物。
【請求項３】
ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用組成物。
【請求項４】
前記ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤は、前記ＰＭＶＫ遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブ、前記ＰＭＶＫタンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチド、アプタマーまたは化合物であることを特徴とする請求項３に記載の放射線抵抗性癌診断用組成物。
【請求項５】
前記癌は、肺癌または膵臓癌であることを特徴とする請求項３に記載の放射線抵抗性癌診断用組成物。
【請求項６】
請求項３から請求項５のうち何れか一項に記載の組成物を含む放射線抵抗性癌診断用キット。
【請求項７】
ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子を有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用バイオマーカー組成物。
【請求項８】
前記癌は、肺癌または膵臓癌であることを特徴とする請求項７に記載の癌患者の放射線治療予後予測用バイオマーカー組成物。
【請求項９】
ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤を有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用組成物。
【請求項１０】
前記ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤は、前記ＰＭＶＫ遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブ、前記ＰＭＶＫタンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチド、アプタマーまたは化合物であることを特徴とする請求項９に記載の癌患者の放射線治療予後予測用組成物。
【請求項１１】
前記癌は、肺癌または膵臓癌であることを特徴とする請求項９に記載の癌患者の放射線治療予後予測用組成物。
【請求項１２】
請求項９から請求項１１のうち何れか一項に記載の組成物を含む癌患者の放射線治療予後予測用キット。
【請求項１３】
ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質の発現または活性抑制剤を有効成分として含む癌細胞に対する放射線敏感性増進用薬学組成物。
【請求項１４】
前記ＰＭＶＫ発現抑制剤は、ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）で構成された群から選択された何れか１つであることを特徴とする請求項１３に記載の癌細胞に対する放射線敏感性増進用薬学組成物。
【請求項１５】
前記ＰＭＶＫ活性抑制剤は、ＰＭＶＫタンパク質に特異的に結合する低分子化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス、アプタマー、抗体、及び天然物で構成された群から選択された何れか１つであることを特徴とする請求項１３に記載の癌細胞に対する放射線敏感性増進用薬学組成物。
【請求項１６】
前記癌細胞は、肺癌細胞または膵臓癌細胞であることを特徴とする請求項１３から請求項１５のうち何れか一項に記載の癌細胞に対する放射線敏感性増進用薬学組成物。
【請求項１７】
（１）癌患者から分離された試料からＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを測定する段階と、
（２）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを対照群試料と比較する段階と、
（３）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合、放射線抵抗性癌であると判断する段階と、
を含む放射線抵抗性癌診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項１８】
（１）癌患者から分離された試料からＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを測定する段階と、
（２）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを対照群試料と比較する段階と、
（３）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合、放射線治療予後が良くないと判断する段階と、
を含む癌患者の放射線治療予後予測に必要な情報を提供する方法。
【請求項１９】
（１）癌細胞に試験物質を接触させる段階と、
（２）前記試験物質を接触した癌細胞でＰＭＶＫタンパク質の発現または活性程度を測定する段階と、
（３）対照群試料と比較して、前記ＰＭＶＫタンパク質の発現または活性程度が減少した試験物質を選別する段階と、
を含む癌細胞に対する放射線敏感性増進剤スクリーニング方法。
【請求項２０】
放射線抵抗性癌診断のためのバイオマーカーであって、ＰＭＶＫタンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の用途。
【請求項２１】
放射線抵抗性癌診断のためのＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤の用途。
【請求項２２】
癌患者の放射線治療予後予測のためのバイオマーカーであって、ＰＭＶＫタンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の用途。
【請求項２３】
癌患者の放射線治療予後予測のためのＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤の用途。
【請求項２４】
癌細胞に対する放射線敏感性の増進のための薬剤を製造するためのＰＭＶＫタンパク質の発現または活性抑制剤の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ；ＰＭＶＫ）タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用バイオマーカー組成物及びそれを用いた放射線抵抗性癌診断方法に関する。また、ＰＭＶＫを有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用バイオマーカー組成物及びそれを用いた癌患者の放射線治療予後予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療方法には、外科的手術、化学的薬物治療、放射線治療などがあり、最近、放射線治療の重要性がさらに大きくなっている。外科的手術が難しい場合、放射線治療のみでも腫瘍を効率的に完治した事例が報告されており、放射線を利用した腫瘍治療方法も、毎年発展しており、放射線治療は、患者に特別な苦痛や拒否感なしに体内の腫瘍を効率的に治療することができる方法として位置づけられている。
【０００３】
しかし、癌細胞の放射線耐性獲得、高線量の放射線治療時に、正常組織の損傷などが放射線治療の効率を低下させる問題点として指摘されており、放射線治療の効率を増進させるための放射線治療敏感剤についての研究が必要な実情である。現在まで報告された放射線治療敏感剤は、主に抗癌剤であって、例えば、タキソール（ｔａｘｏｌ）とシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）とが乳癌、子宮癌、肺癌、胃癌、大腸癌などの固形癌で放射線治療敏感剤として使われると報告されている。しかし、これらの放射線治療敏感剤は、それ自体が抗癌剤として使われる物質であって、高い副作用を示すので、その利用が制限的であるという問題点がある。
【０００４】
したがって、このような既存の放射線治療敏感剤の限界を超えて、放射線治療結果を予測するだけではなく、放射線抵抗性を有する細胞に敏感性を増加させるための分子信号についての研究が必要な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＰＭＶＫを有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用バイオマーカー組成物、ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、ＰＭＶＫを有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用バイオマーカー組成物、ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤を有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用組成物を提供することである。
【０００７】
本発明のさらに他の目的は、ＰＭＶＫタンパク質の発現または活性抑制剤を有効成分として含む癌細胞に対する放射線敏感性増進用薬学組成物を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、ＰＭＶＫタンパク質の発現及び活性レベルを利用した放射線抵抗性癌診断方法及び癌患者の放射線治療予後予測方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、ＰＭＶＫタンパク質の発現レベルの測定を通じた癌細胞に対する放射線敏感性増進剤スクリーニング方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、放射線抵抗性癌診断のためのバイオマーカーであって、ＰＭＶＫタンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の用途を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、放射線抵抗性癌診断のためのＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤の用途を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、癌患者の放射線治療予後予測のためのバイオマーカーであって、ＰＭＶＫタンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の用途を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、癌患者の放射線治療予後予測のためのＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤の用途を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、癌細胞に対する放射線敏感性の増進のための薬剤を製造するためのＰＭＶＫタンパク質の発現または活性抑制剤の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を果たすために、本発明は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用バイオマーカー組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用組成物及びそれを含む放射線抵抗性癌診断用キットを提供する。
【００１７】
前記他の目的を果たすために、本発明は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子を有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用バイオマーカー組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤を有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用組成物及びそれを含む癌患者の放射線治療予後予測用キットを提供する。
【００１９】
前記さらに他の目的を果たすために、本発明は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質の発現または活性抑制剤を有効成分として含む癌細胞に対する放射線敏感性増進用薬学組成物を提供する。
【００２０】
前記さらに他の目的を果たすために、本発明は、（１）癌患者から分離された試料からＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを測定する段階；（２）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを対照群試料と比較する段階；及び（３）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合、放射線抵抗性癌であると判断する段階；を含む放射線抵抗性癌診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、（１）癌患者から分離された試料からＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを測定する段階；（２）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを対照群試料と比較する段階；及び（３）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合、放射線治療予後が良くないと判断する段階；を含む癌患者の放射線治療予後予測に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００２２】
前記さらに他の目的を果たすために、本発明は、（１）癌細胞に試験物質を接触させる段階；（２）前記試験物質を接触した癌細胞でＰＭＶＫタンパク質の発現または活性程度を測定する段階；及び（３）対照群試料と比較して、前記ＰＭＶＫタンパク質の発現または活性程度が減少した試験物質を選別する段階；を含む癌細胞に対する放射線敏感性増進剤スクリーニング方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、放射線抵抗性癌診断のためのバイオマーカーであって、ＰＭＶＫタンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の用途を提供する。
【００２４】
また、本発明は、放射線抵抗性癌診断のためのＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤の用途を提供する。
【００２５】
また、本発明は、癌患者の放射線治療予後予測のためのバイオマーカーであって、ＰＭＶＫタンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の用途を提供する。
【００２６】
また、本発明は、癌患者の放射線治療予後予測のためのＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤の用途を提供する。
【００２７】
また、本発明は、癌細胞に対する放射線敏感性の増進のための薬剤を製造するためのＰＭＶＫタンパク質の発現または活性抑制剤の用途を提供する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用バイオマーカー組成物または放射線治療予後予測用バイオマーカー組成物に関するものであって、ヒト肺癌細胞であるＡ５４９細胞で放射線の敏感度を増進させるＰＭＶＫ遺伝子を究明し、ｓｈＲＮＡを用いてＡ５４９細胞及び膵臓癌細胞であるＭｉａｐａｃａ−２細胞を対象にして安定細胞株を構築した後、細胞と動物実験を通じて放射線敏感度の増進効果を検証し、さらに臨床的データ分析を通じてＰＭＶＫの過発現が放射線の抵抗性に寄与することを確認したので、人の肺癌及び膵臓癌でＰＭＶＫを放射線抵抗性の克服のための治療標的遺伝子として活用することができるので、ＰＭＶＫを標的に放射線敏感度を高める遺伝子治療剤またはその他の薬物を開発して、放射線治療の効果を一層増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施例において、ヒトキナーゼｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングを通じて放射線敏感度増進遺伝子ＰＭＶＫを確認した結果を示した図面である（Ａ：Ａ５４９ヒト肺癌細胞株でヒトキナーゼｓｉＲＮＡライブラリースクリーニングを通じて放射線敏感度増進遺伝子ＰＭＶＫを確認した結果、Ｂ：ＰＭＶＫ  ｓｉＲＮＡによるＰＭＶＫタンパク質の発現抑制及び放射線処理時に、細胞生存率の減少結果を確認した結果である）。
【図２】本発明の一実施例において、ＰＭＶＫ  ｓｈＲＮＡ安定細胞株を構築し、該構築された細胞に放射線を処理して集落形成生存分析法を施行した結果を示した図面である（Ａ：Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株でＰＭＶＫタンパク質の発現抑制効果を確認した結果、Ｂ：Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株で放射線が集落形成に及ぼす影響を確認した結果、Ｃ：Ｍｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株でＰＭＶＫタンパク質の発現抑制効果を確認した結果、Ｄ：Ｍｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株で放射線が集落形成に及ぼす影響を確認した結果である）。
【図３】３Ａ〜３Ｄは、本発明の一実施例において、Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ細胞移植マウスモデルでの放射線に対する効能評価に対する結果を示した図面である（図３Ａ：癌の成長を体積で示して比較したもの、図３Ｂ：マウスの体重を比較したもの、図３Ｃ：摘出された癌のサイズを比較したもの、図３Ｄ：摘出された癌の重量を比較したものである）。
【図４】本発明の一実施例において、肺癌患者群に放射線処理時に、ＰＭＶＫ発現による臨床的誘電体データの分析結果を示した図面である。
【図５】本発明の一実施例において、Ｍｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ細胞移植マウスモデルでの放射線に対する効能評価に対する結果を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００３１】
本発明は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用バイオマーカー組成物を提供する。
【００３２】
望ましくは、前記バイオマーカー組成物は、既存に知られた放射線抵抗性バイオマーカーを追加的にさらに含み、既存に知られた放射線抵抗性バイオマーカーは、ＣＤ１３３、ＣＤ１４４及びＣＤ２４などがあるが、これらに制限されるものではない。
【００３３】
本明細書において、用語「診断」は、特定疾病または疾患に対する一客体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、一客体が特定疾病または疾患を現在有しているか否かを判定すること、特定疾病または疾患にかかった一客体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定すること、またはセラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能についての情報を提供するために、客体の状態をモニタリングすること）を含む。
【００３４】
また、本発明は、ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤を有効成分として含む放射線抵抗性癌診断用組成物を提供する。
【００３５】
詳細には、前記ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤は、前記ＰＭＶＫ遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブ、前記ＰＭＶＫタンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチド、アプタマーまたは化合物であるが、これらに制限されるものではない。
【００３６】
前記癌は、肺癌または膵臓癌であるが、これらに制限されるものではない。
【００３７】
また、本発明は、前記組成物を含む放射線抵抗性癌診断用キットを提供する。
【００３８】
また、本発明は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子を有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用バイオマーカー組成物を提供する。
【００３９】
本明細書において、用語「予後予測」は、疾患の経過及び結果をあらかじめ予測する行為を意味する。より具体的に、予後予測とは、疾患の治療後、経過は患者の生理的または環境的状態によって変わり、このような患者の状態を総合的に考慮して、治療後、病の経過を予測するあらゆる行為を意味するものと解釈される。
【００４０】
本発明の目的上、前記予後予測は、癌患者の放射線治療後、疾患の経過及び完治の有無をあらかじめ予想して、癌患者の無病生存率または生存率を予測する行為として解釈される。例えば、「予後が良い」と予測することは、放射線治療後、癌患者の無病生存率または生存率が高いレベルを示して、癌患者が治療される可能性が高いということを意味し、「予後が悪い」と予測することは、放射線治療後、癌患者の無病生存率または生存率が低いレベルを示して、癌患者から癌が再発するか、または癌によって死亡する可能性が高いということを意味する。
【００４１】
また、本発明は、ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤を有効成分として含む癌患者の放射線治療予後予測用組成物を提供する。
【００４２】
この際、ＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤は、前記ＰＭＶＫ遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブ、前記ＰＭＶＫタンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチド、アプタマーまたは化合物である。
【００４３】
前記癌は、肺癌または膵臓癌であるが、これらに制限されるものではない。
【００４４】
また、本発明は、前記組成物を含む癌患者の放射線治療予後予測用キットを提供する。
【００４５】
本明細書において、用語「プライマー」は、短い自由３末端水酸基（ｆｒｅｅ  ３’−ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列であって、相補的なテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対を形成し、テンプレート鎖のコピーのための開始地点として作用する短い核酸配列を言う。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応のための試薬（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）及び異なる４種のヌクレオシド三リン酸の存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。ＰＣＲ条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業者に公知の技術によって適切に選択されうる。
【００４６】
本明細書において、用語「プローブ」は、ｍＲＮＡに特異的に結合をなしうる短くは数塩基ないし長くは数百塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、ラベリングされており、特定ｍＲＮＡの存否、発現量を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）プローブ、二本鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で製作することができる。適切なプローブの選択及び混成化条件は、当該技術分野に公知の技術によって適切に選択することができる。
【００４７】
本明細書において、用語「抗体」は、当該技術分野に公知の用語であって、抗原性部位に対して指示される特異的な免疫グロブリンを意味する。本発明での抗体は、本発明のＰＭＶＫに対して特異的に結合する抗体を意味し、当該技術分野の通常の方法によって抗体を製造することができる。前記抗体の形態は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み、あらゆる免疫グロブリン抗体が含まれる。前記抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する完全な形態を意味する。また、前記抗体は、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
【００４８】
本明細書において、用語「ペプチド」は、標的物質に対する結合力が高い長所があり、熱／化学処理時にも変性が起こらない。また、分子サイズが小さいために、他のタンパク質に結合させて融合タンパク質への利用が可能である。具体的に、高分子タンパク質鎖に結合させて利用可能なので、診断キット及び薬物伝達物質として用いられる。
【００４９】
本明細書において、用語「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」とは、それ自体で安定した三次構造を有しながら、標的分子に高い親和性と特異性とで結合することができる特徴を有した特別な種類の一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）で構成されたポリヌクレオチドの一種を意味する。前述したように、アプタマーは、抗体と同様に抗原性物質に特異的に結合することができながらも、タンパク質よりも安定性が高く、構造が簡単であり、合成が容易なポリヌクレオチドで構成されているので、抗体を代替して使われる。
【００５０】
また、本発明のキットは、マーカー成分に特異的に結合する抗体、基質との反応によって発色する標識体が接合された２次抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、前記標識体と発色反応する発色基質溶液、洗浄液及び酵素反応停止液などを含み、使われる試薬成分を含む多数の別途パッケージングまたはコンパートメントで製作することができる。
【００５１】
また、本発明は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＶＫ）タンパク質の発現または活性抑制剤を有効成分として含む癌細胞に対する放射線敏感性増進用薬学組成物を提供する。
【００５２】
詳細には、前記ＰＭＶＫ発現抑制剤は、ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）で構成された群から選択された何れか１つであり、前記ＰＭＶＫ活性抑制剤は、ＰＭＶＫタンパク質に特異的に結合する低分子化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス、アプタマー、抗体、及び天然物で構成された群から選択された何れか１つであるが、これらに制限されるものではない。
【００５３】
この際、前記癌細胞は、肺癌細胞または膵臓癌細胞である。
【００５４】
本発明の薬学組成物は、化学物質、ヌクレオチド、アンチセンス、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド及び天然物抽出物を有効成分として含みうる。本発明の薬学組成物または複合製剤は、有効成分の以外に薬剤学的に適し、生理学的に許容される補助剤を使用して製造可能であり、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤を使用することができる。本発明の薬学組成物は、投与のために、有効成分の以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで薬学組成物として望ましく製剤化することができる。液状溶液で製剤化される組成物において、許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち、１成分以上を混合して使用し、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液のような注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。
【００５５】
本発明の薬学組成物の薬剤の製剤形態は、顆粒剤、散剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、坐剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤、点滴剤または注射可能な液剤及び活性化合物の徐放出型製剤などになりうる。本発明の薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で投与することができる。本発明の薬学組成物の有効成分の有効量は、疾患の予防または治療時に要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤型の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使われる薬物を含めた多様な因子によって調節される。これらに制限されるものではないが、例えば、成人の場合、１日１回ないし数回投与時に、本発明の組成物は、１日１回ないし数回投与時に、化合物である場合、０．１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、ポリペプチド、タンパク質または抗体である場合、０．１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡである場合、０．０１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの容量で投与することができる。
【００５６】
しかも、本発明は、（１）癌患者から分離された試料からＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを測定する段階；（２）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを対照群試料と比較する段階；及び（３）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合、放射線抵抗性癌であると判断する段階；を含む放射線抵抗性癌診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００５７】
また、本発明は、（１）癌患者から分離された試料からＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを測定する段階；（２）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルを対照群試料と比較する段階；及び（３）前記ＰＭＶＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合、放射線治療予後が良くないと判断する段階；を含む癌患者の放射線治療予後予測に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００５８】
この際、前記癌は、肺癌または膵臓癌であるが、これらに制限されるものではない。
【００５９】
本明細書において、用語「癌患者から分離された試料」とは、放射線抵抗性癌診断用バイオマーカーである前記ＰＭＶＫ遺伝子またはＰＭＶＫタンパク質の発現レベルにおいて、対照群と差が出る組織、細胞、全血、血清、血しょう、唾液、喀痰、脳脊髄液、または尿のような試料を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
詳細には、前記ｍＲＮＡ発現レベルを測定する方法は、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及びＤＮＡチップを利用するが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
詳細には、前記タンパク質の発現レベルを測定する方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓａｙ）、放射線免疫分析（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免役電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ及びタンパク質チップを利用するが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
本明細書において、「放射線抵抗性癌診断」は、癌患者の放射線治療戦略及び放射線治療の効果に対する予測のために、癌細胞が放射線に抵抗性であるか、または敏感性であるかを確認するためである。
【００６３】
また、本発明は、（１）癌細胞に試験物質を接触させる段階；（２）前記試験物質を接触した癌細胞でＰＭＶＫタンパク質の発現または活性程度を測定する段階；及び（３）対照群試料と比較して、前記ＰＭＶＫタンパク質の発現または活性程度が減少した試験物質を選別する段階；を含む癌細胞に対する放射線敏感性増進剤スクリーニング方法を提供する。
【００６４】
本発明のスクリーニング方法を言及しながら使われる用語「試験物質」は、遺伝子の発現量に影響を及ぼすか、タンパク質の発現または活性に影響を及ぼすか否かを検査するために、スクリーニングで用いられる未知の候補物質を意味する。前記試料は、化学物質、ヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）及び天然物抽出物を含むが、これらに制限されるものではない。
【００６５】
また、本発明は、放射線抵抗性癌診断のためのバイオマーカーであって、ＰＭＶＫタンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の用途を提供する。
【００６６】
また、本発明は、放射線抵抗性癌診断のためのＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤の用途を提供する。
【００６７】
また、本発明は、癌患者の放射線治療予後予測のためのバイオマーカーであって、ＰＭＶＫタンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の用途を提供する。
【００６８】
また、本発明は、癌患者の放射線治療予後予測のためのＰＭＶＫの発現レベルを測定することができる製剤の用途を提供する。
【００６９】
また、本発明は、癌細胞に対する放射線敏感性の増進のための薬剤を製造するためのＰＭＶＫタンパク質の発現または活性抑制剤の用途を提供する。
【００７０】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００７１】
＜実施例１＞ヒトキナーゼｓｉＲＮＡライブラリー（ｈｕｍａｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｓｉＲＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ）スクリーニングを通じた放射線敏感度増進遺伝子ＰＭＶＫ確認
【００７２】
１．実験方法
【００７３】
Ａ５４９ヒト肺癌細胞（ＡＴＣＣから購入）でダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）ｓｉＧＥＮＯＭＥ(R)  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ(R)  ｓｉＲＮＡライブラリー（７１８個のヒトタンパク質キナーゼ：Ｇ−００３５０５）を用いて放射線に対する敏感度を増進させる遺伝子を３次にわたったスクリーニングを通じて掘り出した。
【００７４】
具体的に、ｓｉＲＮＡがそれぞれ５０ｎＭの濃度で存在する９６ウェルプレートにリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(R)）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１３７７８−１５０）０．５μlを添加し、Ａ５４９細胞を０．３×１０４個でシーディングした後、２４時間培養した。該培養された細胞に６−ＭＶ光子線線形加速器（６−ＭＶ  ｐｈｏｔｏｎ  ｂｅａｍ  ｌｉｎｅａｒ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）を用いて８Ｇｙの放射線を処理した。放射線処理後、９日目にＣＣＫ−８アッセイを通じて細胞の生存率を３次にわたって分析して、その結果、ＰＭＶＫ遺伝子が放射線に対する敏感度と関連がある候補遺伝子であるという情報を獲得した。また、ｓｉＲＮＡライブラリーに存在するダーマコンｓｉＧＥＮＯＭＥ(R)  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ(R)ヒトＰＭＶＫ  ｓｉＲＮＡ（標的シーケンス（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）：ＵＵＵＡＵＣＣＧＣＵＣＣＡＧＡＣＵＵＵ（配列番号１）、ＣＧＡＧＡＡＣＣＡＵＧＧＡＧＵＵＧＡＡ（配列番号２）、ＡＡＵＧＵＧＧＣＣＵＧＧＡＣＡＡＣＵＵ（配列番号３）、ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡ（配列番号４）；Ｃａｔ＃  Ｍ−００６７８２−０１）によるタンパク質のノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）の有無は、ＰＭＶＫ  ｓｉＲＮＡが５０ｎＭの濃度で存在する２４ウェルプレートにリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(R)）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１３７７８−１５０）１μlを添加し、Ａ５４９細胞を３×１０４個でシーディングした後、２４時間培養した後、１つのウェルでタンパク質を抽出した後、ＰＭＶＫ抗体を利用したウェスタンブロッティングを行うことで確認した。残った２４ウェルには、放射線を５Ｇｙ、１０Ｇｙ処理した後、ＣＣＫ−８アッセイを行って、細胞の生存率を再確認した。
【００７５】
２．実験結果
【００７６】
その結果、図１Ａに示されたように、ＰＭＶＫ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、放射線を処理した時、ｓｉＳｃｒａｍｂｌｅ（対照群、標的シーケンス：ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ（配列番号５）、ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡ（配列番号６）、ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡ（配列番号７）、ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＣＵＡ（配列番号８）；ダーマコン、非標的プール（Ｎｏｎ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｏｌ）、Ｃａｔ＃  Ｄ−００１８１０−１０−２０）に放射線を処理した時よりも細胞の生存率が著しく減少することを観察することができた。
【００７７】
また、図１Ｂに示されたように、ウェスタンブロッティング遂行結果、ＰＭＶＫ  ｓｉＲＮＡによってタンパク質がノックダウンされたことを確認し、この際、放射線処理時に細胞の生存率が減少することをもう一度確認した。
【００７８】
したがって、このような結果に基づいてＰＭＶＫ発現の減少が放射線の敏感度の増進に関与すると判断した。
【００７９】
＜実施例２＞ＰＭＶＫ  ｓｈＲＮＡ安定細胞株の構築及び集落形成生存分析
【００８０】
１．実験方法
【００８１】
安定したＰＭＶＫのノックダウンのために、ＰＭＶＫ  ｓｈＲＮＡ安定（ｓｔａｂｌｅ）細胞株をＡ５４９（肺癌）、Ｍｉａｐａｃａ−２（膵臓癌；ＡＴＣＣから購入）細胞に構築した。具体的に、ダーマコンＰＭＶＫ  ｓｈＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ：Ｖ３ＬＨＳ＿３５００８０、成熟アンチセンス（Ｍａｔｕｒｅ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）：ＴＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＣＡ；配列番号９）をＡ５４９細胞とＭｉａｐａｃａ−２細胞とにＦｕＧＥＮＥ(R)トランスフェクション試薬（Ｔａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｒｏｃｈｅ：ＲＥＦ  ０４  ７０９  ７１３  ００１）を使用してトランスフェクションさせた後、ピューロマイシン４μｇ／ｍｌで１５日間選択して、Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ細胞（２個のクローン；Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ＃１及びＡ５４９／ｓｈＰＭＶＫ＃３）とＭｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ細胞株（３個のクローン；Ｍｉａ／ｓｈＰＭＶＫ＃１、Ｍｉａ／ｓｈＰＭＶＫ＃２、Ｍｉａ／ｓｈＰＭＶＫ＃３）とを構築し、ウェスタンブロッティングを通じてＰＭＶＫタンパク質の発現量を確認した。
【００８２】
また、このように構築されたＡ５４９／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株とＭｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株とが放射線の敏感度を増進させるかを調べるために、２つの細胞株に放射線を処理した後、細胞集落形成生存分析法（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を行った。すなわち、６ウェルプレートに細胞を２００個または２０００個ずつシーディングした後、放射線を０、２、４、５、８、１０Ｇｙで処理し、７〜１４日後、２０％メタノールと０．５％クリスタルバイオレットとでコロニーを染色して個数をカウンティングすることにより、定量的に分析した。
【００８３】
２．実験結果
【００８４】
その結果、図２の（Ａ）及び図２の（Ｃ）に示されたように、親細胞（ｐａｒｅｎｔ；Ａ５４９、Ｍｉａｐａｃａ−２）と非沈黙対照群（Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ；Ａ５４９／ＮＳ、Ｍｉａｐａｃａ−２／ＮＳ）とに比較した時、新たに構築されたＡ５４９／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株とＭｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株とでＰＭＶＫタンパク質の発現が著しく減少したことを確認した。
【００８５】
また、図２の（Ｂ）及び図２の（Ｄ）に示されたように、このように構築されたＡ５４９／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株とＭｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ安定細胞株とを対象とした細胞集落形成生存分析法の結果、集落形成が著しく減少することが分かった。
【００８６】
＜実施例３＞Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ細胞移植マウスモデルで放射線に対する効能評価
【００８７】
１．実験方法
【００８８】
生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験のために、ヌードマウス右側ふくらはぎにＡ５４９、Ａ５４９／ＮＳ、Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ＃１（配列番号９のｓｈＲＮＡでトランスフェクションされた安定Ａ５４９細胞株）及びＡ５４９／ｓｈＰＭＶＫ＃３（配列番号９のｓｈＲＮＡでトランスフェクションされた安定Ａ５４９細胞株）細胞１×１０６個をそれぞれ移植して、癌組織を形成させた。以後、放射線５Ｇｙを二日間隔で２回照射し、一週間に３回キャリパーを用いてサイズを測定して、３０日間の癌成長の変化を観察し、同時にマウス体重も測定した後、３０日である時、癌組織を摘出して、サイズと重量とを確認した。この際、癌サイズは、下記式１に記載の通りに計算した。
【００８９】
【数１】
2021504726.tif 000003
【００９０】
２．実験結果
【００９１】
その結果、図３に示されたように、Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ＃１と＃３とに放射線を処理した時、Ａ５４９またはＡ５４９／ＮＳに放射線を処理したものよりも著しく癌成長を阻害していることを確認し（図３Ａ及び図３Ｃ）、この際、マウスの体重変化は見えなかった（図３Ｂ）。実験終了時点であらゆるマウスの癌組織を摘出して、癌重量を測定した時も、Ａ５４９／ｓｈＰＭＶＫ＃１と＃３とに放射線を処理した癌組織の重量が最も少ないことを確認した（図３Ｄ）。
【００９２】
＜実施例４＞臨床的誘電体データの分析
【００９３】
１．実験方法
【００９４】
ＰＭＶＫ発現と患者で生存率との関連性を調査するために、既存に報告された肺癌患者群誘電体データ（ＧＳＥ６８４６５；ＮＣＢＩ．ＧＥＯ、ｎ＝４４２）の分析を通じて生存率を調査した。放射線処理患者群（ｎ＝６５）とそうではない患者群（ｎ＝３６４）とにそれぞれ分けた後、患者生存率をＰＭＶＫの発現によって調査した。
【００９５】
２．実験結果
【００９６】
その結果、図４に示されたように、放射線処理患者群では、ＰＭＶＫの発現が高い患者群であるほど生存率が不良な一方、ＰＭＶＫの発現が低い患者群に放射線治療した結果、患者の生存率が向上することが分かった。しかし、放射線治療を行っていない患者群の場合、ＰＭＶＫの発現の有無と関係なく生存率に影響を与えないことを確認した。
【００９７】
このような結果を通じてＰＭＶＫの発現と放射線治療時に、患者の生存率が密接な関係があり、また、ＰＭＶＫの抑制を通じて放射線治療時に、患者の生存率の向上に役に立つことを確認した。
【００９８】
＜実施例５＞Ｍｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ細胞移植マウスモデルで放射線に対する効能評価
【００９９】
１．実験方法
【０１００】
生体内実験のために、ヌードマウス右側ふくらはぎにＭｉａｐａｃａ−２、Ｍｉａｐａｃａ−２／ＮＳ、Ｍｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ＃２（配列番号９のｓｈＲＮＡでトランスフェクションされた安定Ｍｉａｐａｃａ−２細胞株）及びＭｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ＃３（配列番号９のｓｈＲＮＡでトランスフェクションされた安定Ｍｉａｐａｃａ−２細胞株）細胞２×１０６個をそれぞれ移植して、癌組織を形成させた。以後、放射線２Ｇｙを二日間隔で３回照射し、一週間に３回キャリパーを用いてサイズを測定して、３０日間の癌成長の変化を観察し、同時にマウス体重も測定して確認した。この際、癌サイズは、下記式１に記載の通りに計算した。
【０１０１】
【数２】
2021504726.tif 000004
【０１０２】
２．実験結果
【０１０３】
その結果、図５に示されたように、Ｍｉａｐａｃａ−２／ｓｈＰＭＶＫ＃２と＃３とに放射線を処理した時、Ｍｉａｐａｃａ−２またはＭｉａｐａｃａ−２／ＮＳに放射線を処理したものよりも著しく癌成長を阻害していることを確認し（図５の（Ａ））、この際、マウスの体重変化は見えなかった（図５の（Ｂ））。
【０１０４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。すなわち、本発明の実質的な範囲は、下記の特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。
【図１】
2021504726.tif 000005
【図２】
2021504726.tif 000006
【図３Ａ】
2021504726.tif 000007
【図３Ｂ】
2021504726.tif 000008
【図３Ｃ】
2021504726.tif 000009
【図３Ｄ】
2021504726.tif 000010
【図４】
2021504726.tif 000011
【図５】
2021504726.tif 000012
【配列表】
2021504726000001.app
【国際調査報告】
2021504726.tif 000013
2021504726.tif 000014
2021504726.tif 000015
2021504726.tif 000016