(57)【要約】本発明は、一般に、５’末端に５’‐ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ  ＣＡＵＧＵＵＵ‐３’の共有配列を含有するｍｉＲ‐３０２状のｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｓおよび／またはｓｉＲＮＡを使用して、さらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／線維芽細胞増殖因子2（ＦＧＦ−２）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ホメオボックスタンパク質（ＨＯＸ）、ノッチ、ＧＳＫ、Ｗｎｔ／ｂｅｔａ‐カテニンシグナル、インターロイキン、および／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むがこれに限定されていないいくつかの創傷治癒関連の特定の因子と併せて、成体幹細胞（ＡＳＣ）の拡大および／または誘導をインビトロで誘発する組成物とその使用方法に関する。本発明の原理は、最近生体内での皮膚創傷治癒モデルで見つかった誘導性の対称的なＡＳＣ分裂の新たなメカニズムに関連する。これにより得られた増幅されたＡＳＣは、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ストローク、糖尿病、骨粗鬆症、心筋梗塞、血友病、貧血、ＡＩＤＳ、白血病、リンパ腫、多くの種類の癌と老化を含むがこれに限定されない、様々の老化と細胞障害関連のヒトの疾患の治療に役立つ。
2021528984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくともＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡを提供することと、
（ｂ）少なくともＬＩＦとｂＦＧＦ／ＦＧＦ２を含む創傷治癒関連の特定の因子を提供することと、
（ｃ）インビトロでの細胞培養条件下、（ａ）のＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡと（ｂ）のＬＩＦとｂＦＧＦ／ＦＧＦ２を含む創傷治癒関連の特定の因子を混合させてＣＤ３４+ＡＳＣの拡大と誘導を誘発し維持することとを含む、ＣＤ３４‐陽性の成体幹細胞（ＣＤ３４+ＡＳＣ）の拡大と誘導をインビトロで誘発する組成物と方法。
【請求項２】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは皮膚成体幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは神経幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは、生体内で成体幹細胞ニッチまたはポーチを形成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは、造血、神経、皮膚、髪、甲状腺の組織細胞のタイプに分化できる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは多能性を持つ、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡは、少なくともヘアピン状のステムループ構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡは、少なくともヘアピン状のマイクロＲＮＡ前駆体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡはｍｉＲ‐３０２前駆体（ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡはＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３、またはＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.４、あるいはその組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡはｍｉＲ‐３０２擬似ｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡは、ＣＤ３４+ＡＳＣにおいて、さらにＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.８、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１０、またはＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１１に加工することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡは、ＡＯＦ２（ＫＤＭ１アールまたはＬＳＤ１とも呼ばれる）、ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ２またはＨＤＡＣ４を下方制御することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡはＤＮＡ脱メチル化を引き起こすことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７を含む小分子ＲＮＡは、ＣＤ３４+ＡＳＣの多能性を強化し維持することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＬＩＦとｂＦＧＦ／ＦＧＦ２を含む創傷治癒関連の特定の因子は、さらに少なくとも、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ホメオボックスタンパク質（ＨＯＸ）、ノッチ、ＧＳＫ、Ｗｎｔ／ｂｅｔａ‐カテニンシグナル、インターロイキン、および／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）から選択される任意の因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記インビトロでの細胞培養条件は、３７℃でのフィーダーフリーＭＳＣ拡大培養媒質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記インビトロでの細胞培養条件は、さらにマトリゲルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは創傷治癒に役立つ、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは新しい薬の発見に役立つ、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは医薬および／または治療応用の開発に役立つ、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣは、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ストローク、糖尿病、骨粗鬆症、心筋梗塞、血友病、貧血、ＡＩＤＳ、白血病、リンパ腫、脱毛、多くの種類の癌と老化の治療に有用な治療法の開発に役立つ、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤ３４+ＡＳＣ拡大は、誘導性の対称的な成体幹細胞分裂メカニズムである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権：
本発明は、２０１８年７月２日に出願された米国仮出願第６２／６９２，８６２号の「ＣＤ３４‐陽性成体幹細胞の拡大のインビトロでの誘発」の優先権を主張する。その内容全体は、参照としてここに組み込まれる。
【０００２】
発明の分野：
本発明は、一般に、いくつかの特定のタンパク質因子と併せてある小分子の非コードＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を使用して、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ‐２）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ホメオボックスタンパク質（ＨＯＸ）、ノッチ、ＧＳＫ、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル、インターロイキン、および／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）からなる一つ以上の特定の因子と併せて小分子のヘアピン状のＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ）および／または短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、成体幹細胞（ＡＳＣ）の拡大および／または誘導をインビトロで誘発する組成物とその使用方法に関する。特に、本発明は、５’‐ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ  ＣＡＵＧＵＵＵ‐３’と相同な共有配列を含有するｍｉＲ‐３０２‐擬似ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡを使用して、さらにｂＦＧＦ／ＦＧＦ‐２、ＬＩＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ、ＳＣＦ、ＨＯＸ、ノッチ、ＧＳＫ、Ｗｎｔ／β‐カテニン、インターロイキンおよび／またはＢＭＰから選択した一つ以上の特定の因子と併せて使用して、ＣＤ３４‐陽性成体幹細胞（ＣＤ３４+ＡＳＣ）の拡大および／または誘導をインビトロで誘発する組成物とその使用方法に関する。誘発されたＡＳＣの拡大と誘導の原理は、最近生体内での皮膚創傷治癒モデルに見つけた誘導性の成体幹細胞の対称分裂の新たなメカニズムに関係がある。得られた増幅されたＡＳＣは、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ストローク、糖尿病、骨粗鬆症、心筋梗塞、血友病、貧血、ＡＩＤＳ、白血病、リンパ腫および多くの種類の癌を含むがこれに限定されていない、様々な老化と細胞障害関連の疾患の治療に役立つ。特に、本発明は、損傷および／または老化した組織と臓器を生体内で修復し、活性化させるように、無制限的に増幅した自身のＡＳＣを体に提供することにより老化を防ぐと共に、老化関連の変性疾患の治療にも役立つ。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、新しい細胞／組織の再生を促進し、損傷／老化した組織を修復および／または活性化させ、変性疾患を治療し、腫瘍／癌の発生及び進行を防ぐことに役立つ多数の有効成分を含有する生命の宝箱である。そのため、これらの幹細胞を新規薬物スクリーニング、識別、単離、および生産のツールとして使用することが考えられる。その結果、このように得られた薬物は、生物医学上の利用、研究用のデバイスおよび／または装置、診断および／または治療、およびその組み合わせなどの製薬・治療への応用を開発することに役立つ。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）における主な有効成分の一つである。主要なｈＥＳＣ固有のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ‐２００、ｍｉＲ‐２９０〜２９５、ｍｉＲ‐３０２、ｍｉＲ‐３７１〜３７３、およびｍｉＲ‐５２０ファミリーの内のものを含むが、それらに限定されていない。なかでも、ｍｉＲ‐３０２ファミリーは、多能性維持と腫瘍抑制に重要な役割を果たすことが見出しされた（ＬｉｎとＹｉｎｇ、２００８；Ｌｉｎ他、２００８、２０１０と２０１１）。ＭｉＲ‐３０２は、四つ（４）のセンスｍｉＲ‐３０２（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）と四つ（４）のアンチセンスｍｉＲ‐３０２*（ａ*、ｂ*、ｃ*、ｄ*）配列を含む八つ（８）のファミリーメンバーを含有する。これらのセンスとアンチセンスメンバーは、部分的に相補的で、それぞれ二重らせん構造の形成が可能である。例えば、ｍｉＲ‐３０２の前駆体は、それぞれ、ｍｉＲ‐３０２ａとａ*（ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２ａ；ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１）、ｍｉＲ‐３０２ｂとｂ*（ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２ｂ；ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２）、ｍｉＲ‐３０２ｃとｃ*（ｍｉＲ‐３０２ｃ；ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３）、およびｍｉＲ‐３０２ｄとｄ*（ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２ｄ；ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.４）のデュプレックス（ステムアーム）で形成されるヘアピン状の小分子ＲＮＡであり、その一端（ステムループ）に塩基配列が連結される。ｍｉＲ‐３０２の機能を有効にするために、ｍｉＲ‐３０２の前駆体（ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２）は、まず、細胞ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ型ダイサーによって成熟したｍｉＲ‐３０２とｍｉＲ‐３０２*に処理され、さらに、あるアルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質でＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成し、そして、標的遺伝子転写（ｍＲＮＡ）、特に発生遺伝子と癌遺伝子のｍＲＮＡのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）向けの分解と翻訳抑制のいずれか一方につながる（Ｌｉｎなど、２００８、２０１０と２０１１）。
【０００５】
ＭｉＲ‐３０２は、ｈＥＳＣと誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）における最も豊富な非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）種である。本発明者らの先行研究から、ｈＥＳＣに見つかるレベルを超えるｍｉＲ‐３０２の異所性過剰発現が桑実期の初期の人間受精卵と同様な比較的遅い細胞サイクル速度（２０〜２４時間／サイクル）で人間の正常と癌組織細胞をｈＥＳＣ状のｉＰＳＣに再プログラム可能であることがわかっている（Ｌｉｎなど、２００８、２０１０と２０１１；ＬｉｎのＥＰ２１９８０２５、Ｕ.Ｓ.９，５６７，５９１、Ｕ.Ｓ.９，３９４，５３８、および米国特願第１２／３１８，８０６号）。相対休止は、これらのｍｉＲ‐３０２誘導型ｉＰＳＣの特定の特性であるが、ｈＥＳＣと他の既報四因子誘導型（Ｏｃｔ４-Ｓｏｘ２-Ｋｌｆ４-ｃ‐ＭｙｃまたはＯｃｔ４-Ｓｏｘ２-Ｎａｎｏｇ-Ｌｉｎ２８）ｉＰＳＣは、腫瘍／癌細胞と同様な増殖性が高い細胞サイクル速度（１２〜１５時間／サイクル）を示す（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、２００６；Ｙｕ他、２００７；Ｗｅｒｎｉｇ他、２００７；Ｗａｎｇ他、２００８）。ｍｉＲ‐３０２の腫瘍抑制の効果を研究するために、本発明者らは、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）とサイクリンＤを含む二つのｍｉＲ‐３０２標的されたＧ１‐チェックポイントレギュレータの関与を確認した（Ｌｉｎ他、２０１０；ＬｉｎのＵ.Ｓ.  ９，３９４，５３８とＵ.Ｓ.  ９，４２２，５５９）。細胞サイクルの進行は、陰性のレギュレータ、ＣＤＫ抑制剤の外に、陽性の調節サブユニット、サイクリンと機能複合体を形成するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性化によって駆動されることが知られている（ＣＫＩ、例えば、ｐ１４／ｐ１９Ａｒｆ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ２１Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１、ｐ２７Ｋｉｐ１など）。哺乳動物において、異なるサイクリン‐ＣＤＫ複合体は、異なる細胞サイクル転換の調節に関与し、例えば、Ｇ１相進行のためのサイクリン‐Ｄ‐ＣＤＫ４／６、Ｇ１からＳへの転換のためのサイクリン‐Ｅ‐ＣＤＫ２、Ｓ相進行のためのサイクリン‐Ａ‐ＣＤＫ２、およびＭ相への入りためのサイクリン‐Ａ／Ｂ‐ＣＤＣ２（サイクリン‐Ａ／Ｂ‐ＣＤＫ１）。その結果、本発明者らの研究は、ｍｉＲ‐３０２の腫瘍抑制の機能がＧ１からＳへの転換におけるサイクリン‐Ｅ‐ＣＤＫ２とサイクリン‐Ｄ‐ＣＤＫ４／６の経路の共抑制に由来することを実証していた。
【０００６】
ｍｉＲ‐３０２は新規な抗癌薬物／ワクチンの設計と開発に役立つが、天然ｍｉＲ‐３０２とその前駆体が人間の多能性幹細胞、特にｈＥＳＣのみに見つかっており、そのリソースが非常に限られるため、その生産性に問題がある。あるいは、合成小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、天然のｉＲ‐３０２の前駆体（ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２）の擬似に用いられてもよいが、ヘアピン状のｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２構造のステムアーム領域がセンスｍｉＲ‐３０２とアンチセンスｍｉＲ‐３０２*の二つの不完全に相補的な鎖から形成されるため、完全に一致した合成ｓｉＲＮＡ‐３０２擬似では、配列がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖から異なる天然ｍｉＲ‐３０２*の機能を置き換えることができない。例えば、ｓｉＲＮＡ‐３０２ａ擬似のアンチセンス鎖が５’‐ＵＣＡＣＣＡＡＡＡＣ  ＡＵＧＧＡＡＧＣＡＣ  ＵＵＡ‐３’（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５）である一方で、天然ｍｉＲ‐３０２ａ*は５’‐ＡＣＵＵＡＡＡＣＧＵ  ＧＧＡＵＧＵＡＣＵＵ  ＧＣＵ‐３’（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.６）である。ｍｉＲ‐３０２の完全な機能がそのセンスｍｉＲ‐３０２とアンチセンスｍｉＲ‐３０２*鎖の両方に由来するので、それらのｓｉＲＮＡ擬似を使用した先行報告は、実際の天然ｍｉＲ‐３０２の機能と異なる結果を示すことが多かった。さらに、センスｍｉＲ‐３０２とアンチセンスｍｉＲ‐３０２*配列の間に存在する高度（２３%〜４６%）の不一致ヌクレオチドのために、合成ｍｉＲ‐３０２とｍｉＲ‐３０２*は、特に、ステムループ構造の助け無しでは自然に正しい二重構造を形成する見込みがない。ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡのステムループ構造の機能は、二つの不一致のセンスとアンチセンスｍｉＲＮＡ配列を十分に近く、長くして安定した正しい二重構造を形成させる。一方、本発明者らの最近のｉＰＳＣに関する発見は、ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２の生産に対して代替ソースを提供し得る（ＬｉｎのＥＰ２１９８０２５、Ｕ.Ｓ.９，５６７，５９１と米国特願第１２／３１８，８０６号）。しかし、ｉＰＳＣを成長させるための費用は、工業生産にとってやはり高すぎである。
【０００７】
ｉＰＳＣの生成に加えて、本発明者らの最近の研究は、さらに、ｍｉＲ‐３０２が生体内でＣＤ３４‐陽性の成体幹細胞（ＣＤ３４+ＡＳＣ）の拡大と誘導も誘発できることを発見した（ＬｉｎのＵ.Ｓ.９，８７９，２６３と米国特願第１５／６６１，３４６号）。成体幹細胞（ＡＳＣ）集団の拡大を試みる先行技術は、ＧＳＫ-3を使用したＭｏｏｎの米国特許第７，８５０，９６０号、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路を使用したＭｏｏｎの米国特許第８，３７２，３９７号と欧州特許第ＥＰ２４１５４８０Ａ２号、Ｇ‐ＣＳＦ／ＧＭ‐ＣＳＦとＳＣＦを使用したＲｕｄｄの米国特願第１１／６１４，３４５、およびＷｎｔ７ａを使用したＲｕｄｎｉｃｋｉの米国特願第１３／２６６，４２８号。なお、人間のＣＤ３４‐陽性の造血幹細胞（HSC）の拡大を生体外で誘発することへのＨＯＸＢ４とノッチ１／４の関与を示す科学報告も存在する（Ａｎｔｏｎｃｈｕｋなど、Ｃｅｌｌ  １０９：  ３９‐４５、２００２；Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｓ.  Ｂｌｏｏｄ  １０４：  ２２１０‐２２１１、２００４；Ｓｃｈｉｅｄｌｍｅｉｅｒなど、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０４：  １６９５２‐１６９５７、２００７）。また、Ｍｉｌｌｅｒなどは、（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：  １３６４８‐１３６５３、１９９７）は、さらに、ＩＬ‐６／１１、ｆｌｔ３-配位子とスチール因子（SF）を使用してインビトロでマウス（ＣＤ３４‐陰性）のＨＳＣ拡大を誘発することを実証している。しかし、Ｗａｌａｓｅｋなどがまとめた最近のレビューに記載されているように（Ａｎｎ.  Ｎ.Ｙ.  Ａｃａｄ.  Ｓｃｉ.  １２６６：  １３８‐１５０、２０１２）、「生体外で拡大された造血幹細胞と前駆細胞（ＨＳＰＣ）の造血再構成と移植可能性を向上する試みは、十分な幹細胞量を生成できないことと開始細胞集団の過度の分化のために、ほとんど成功しなかった。造血幹細胞（ＨＳＣ）が生体内での移植の後急速に拡大するが、インビトロでの研究の経験は、培養におけるＨＳＰＣの自己複製と分化の制御がまだ難しいことを示す。造血サイトカインに基づくプロトコルは、培養において未成熟の幹細胞が信頼性のある増幅をすることを支持することはできず、付加的な因子が必要であることを示す。」ことを明記する。特に、拡大されたＡＳＣを多数の継代のためにインビトロまたは生体外で繰り返し培養することができないことに注意すべきである。その結果、すべての先行技術は、最大で数十から数百倍までの開始ＡＳＣ集団の増幅しか提供できなく、臨床治療への適用にとって十分でない。
【０００８】
従来のＡＳＣ拡大の方法の低増幅率と乏しい多能性を考慮して、以上の問題を克服する新しい解決策が望まれる。明らかに、Ｗａｌａｓｅｋが言うように、この目的を達成するため、付加的な重要な因子が必要であるものの、その因子について誰も知らない。そこで、本発明者らの最近の研究において、タンパク質ではなく小分子のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲ‐３０２を使用して先行技術のすべての問題を克服できる新しい重要な因子を確認した。細胞のゲノムにおいて、遺伝子のメチル化とヒストンのアセチル化などの天然バリアを解除することで様々のインビトロ、生体外と生体内条件でＡＳＣ拡大および／または誘導を誘発するのに必要な遺伝子調節工程の完全なメカニズムを有効にするのに必要なＤＮＡ脱メチル化の機能が知られていないために、先行技術においてｍｉＲＮＡが見落とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２１９８０２５号明細書
【特許文献２】米国特許第９，５６７，５９１号明細書
【特許文献３】米国特許第９，３９４，５３８号明細書
【特許文献４】米国特許第９，４２２，５５９号明細書
【特許文献５】米国特許第９，８７９，２６３号明細書
【特許文献６】米国特許第７，８５０，９６０号明細書
【特許文献７】米国特許第８，３７２，３９７号明細書
【特許文献８】欧州特許出願公開第２４１５４８０号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Lin SL and Ying SY. (2008) Role of mir-302 microRNA family in stem cell pluripotency and renewal. Ying SY. (Ed.) Current Perspectives inMicroRNAs. Springer Publishers press, New York, pp 167-185
【非特許文献２】Lin SL, Chang D, Chang-Lin S, Lin CH, Wu DTS, Chen DT, and Ying SY. (2008) Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA 14, 2115-2124
【非特許文献３】Lin SL, Chang D, Ying SY, Leu D, and Wu DTS. (2010) MicroRNA miR-302 inhibits the tumorigenecity of human pluripotent stem cells by coordinate suppression of CDK2 and CDK4/6 cell cycle pathways. Cancer Res. 70, 9473-9482
【非特許文献４】Lin SL, Chang D, Lin CH Ying SY, Leu D, and Wu DTS. (2011) Regulation of somatic cell reprogramming through inducible mir-302 expression. Nucleic Acids Res. 39, 1054-1065
【非特許文献５】Takahashi et al. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676
【非特許文献６】Yu et al. (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920
【非特許文献７】Wemig et al. (2007) In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448, 318-324
【非特許文献８】Wang et al. (2008) Embryonic stem cell-specific microRNAs regulate the G1-S transition and promote rapid proliferation. Nat. Genet. 40, 1478-1483
【非特許文献９】Antonchuk et al. (2002) Cell 109: 39‐45
【非特許文献１０】Karlsson S. (2004) Blood 104: 2210‐2211
【非特許文献１１】Schiedlmeier et al. (2007) PNAS USA 104: 16952‐16957
【非特許文献１２】Miller et al. (1997) PNAS USA 94: 13648‐13653
【非特許文献１３】Walasek et al. (2012) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1266: 138‐150
【発明の概要】
【００１１】
本発明の原理は、主としてｍｉＲ‐３０２のＤＮＡ脱メチル化機能に基づく。細胞においてＤＮＡ脱メチル化を誘発し、またＡＳＣ拡大および／または誘導をインビトロ、生体外と生体内で有効にする同様な目的で、他の小分子ＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡとヘアピン状のｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ、または同様な機能があるタンパク質因子と化学物質を使用してｍｉＲ‐３０２を置き替えることが考えられる。幹細胞が、多分化能（すなわち、ｈＥＳＣとｉＰＳＣ）または多能性（すなわち、ＡＳＣ）を保持と維持するために、高度に脱メチル化されたゲノムを含有することはよく知られている。細胞のゲノムにおいて、ＤＮＡメチル化は、ロックとしてあらゆる種類の細胞型固有の遺伝子の発現プロファイルを設定するので、すべての可能な体細胞から幹細胞に戻る逆の発達または再プログラムを禁止する。その結果、ＤＮＡ脱メチル化は、幹細胞の再生および／または再プログラムにおいて多分化能または多能性を誘発し維持するように、ゲノムをロック解除し遺伝子発現のパターンを特有の幹細胞固有のプロファイルにリセットするのに必要な最も重要なステップである。このＤＮＡ脱メチル化工程を研究するために、本発明者らは、ｈＥＳＣとｉＰＳＣにおけるｍｉＲ‐３０２を媒介としてのＤＮＡ脱メチル化のメカニズムを始めて発見した（ＬｉｎとＹｉｎｇ、２００８；Ｌｉｎなど、２００８と２０１１；Ｙｉｎｇなど、２０１８）。本発明者らの先行研究は、ｍｉＲ‐３０２がＭＥＣＰ１／２、ＡＯＦ１／２（ＫＤＭ１ｂ／１ａまたはＬＳＤ２／１とも呼ばれる）、ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ２／４とＭＢＤ２のような多数の重要なエピジェネティックレギュレータを下方制御して、ゲノムＤＮＡ脱メチル化とｉＰＳＣの再プログラムを容易にする可能であることを明らかにしている（ＬｉｎとＹｉｎｇ、２００８；Ｌｉｎなど、２００８、２０１１と２０１３）。同じ理由で、ｍｉＲ‐３０２は、すべてまたは一部のこれらの重要なエピジェネティックレギュレータを下方制御してＡＳＣの再生と拡大を誘発し維持できる可能性がある。
【００１２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を媒介としての遺伝子調節の強度は、ｍｉＲＮＡの濃度およびｍｉＲＮＡとその標的遺伝子の間の親和性に依存する。言い換えれば、強い標的遺伝子は、ｍｉＲＮＡに対してより高い親和性を示すので、抑制されるにはｍｉＲＮＡ濃度をより低くする必要があるが、逆もまた同様とする。その結果、異なる標的遺伝子は、使用するｍｉＲＮＡ濃度の異なるレベルで下方制御されえる。例えば、より高いｍｉＲ‐３０２濃度（ｈＥＳＣのＨ１とＨ９系におけるｍｉＲ‐３０２レベルより高い）を使用することにより、体細胞の再プログラムを誘導してｈＥＳＣ状のｉＰＳＣを形成できることが発見した一方で（Ｌｉｎなど、２００８、２０１０と２０１１；ＬｉｎのＥＰ２１９８０２５、Ｕ.Ｓ.９，５６７,５９１、Ｕ.Ｓ.９，３９４，５３８、米国特願第１２／３１８，８０６号）、本発明者らの最近の発明は、また、相対的に濃度の低いｍｉＲ‐３０２（ｈＥＳＣのＨ１とＨ９におけるｍｉＲ‐３０２レベルの約１０%〜５０%）を使用することにより、生体内でのＣＤ３４+ＡＳＣの拡大を誘発できることを示す（ＬｉｎのＵ.Ｓ.９，８７９，２６３と米国特願第１５／６６１，３４６号）。このことは、その二つの個別の現象のメカニズムは互いに異なる可能性が高く、僅かに異なるセットのｍｉＲ‐３０２の標的にされた遺伝子を含み得ることの根拠を示す。特に、ｍｉＲ‐３０２のみを使用することは、インビトロでの細胞培養ではなく、生体内で創傷治癒の条件下においてＣＤ３４+ＡＳＣの拡大のみを誘発し得るので、創傷治癒に関与する他の特定の因子は、インビトロでＡＳＣの拡大および／または誘導を誘発するのに必要なＡＳＣ固有の遺伝子プロファイルを設定するように、ｍｉＲ‐３０２とともに機能する必要があることが考えられる。創傷治癒関連の特定の因子としては、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ‐２）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ホメオボックスタンパク質（ＨＯＸ）、ノッチ、ＧＳＫ、Ｗｎｔ／β-カテニン経路シグナル、インターロイキン、および／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が挙げられるが、これらに限定されていない。
【００１３】
ｍｉＲ‐３０２ファミリーは、ｈＥＳＣとｉＰＳＣにおいて最も豊富なｍｉＲＮＡの種である。すべてのセンスｍｉＲ‐３０２ファミリーメンバーは、５’末端の十七（１７）のヌクレオチド、つまり、５’‐ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ  ＣＡＵＧＵＵＵ‐３’（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７）に同一なコンセンサス配列を共有し、全長の２３-ヌクレオチドの成熟した配列に８２%以上の相同性がある。オンラインの計算プログラムＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ（http://www.targetscan.org/）とＰＩＣＴＡＲ‐ＶＥＲＴ（http://pictar.mdc-berlin.de/）により予測された分析結果に基づいて、これらのセンスｍｉＲ‐３０２メンバーは、ｍｉＲ‐３０２ａ（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.８）、ｍｉＲ‐３０２ｂ（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９）、ｍｉＲ‐３０２ｃ（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１０）、およびｍｉＲ‐３０２ｄ（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１１）を有し、それらすべてが６００以上の人間の遺伝子を含む同じ遺伝子の約９８%以上に対して同時に標的することができる。また、ｍｉＲ‐３０２は、類似の機能があるｍｉＲ‐９２、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐２００、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３７１、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐３７３、ｍｉＲ‐３７４、およびｍｉＲ‐５２０ファミリーメンバーと多くの重複の標的遺伝子を共有する。その標的遺伝子の大半は、初期の胚形成において細胞系譜固有の分化の開始または確立に関与する開発シグナルおよび／または転写因子である（Ｌｉｎ他、２００８と２０１１；Ｙｉｎｇ他、２０１８）。また、その標的遺伝子の多くは癌遺伝子であるので、ｍｉＲ‐３０２とその関連するｍｉＲＮＡは、さらに腫瘍抑制因子として機能して正常の幹細胞が腫瘍／癌細胞発生への再生または拡大という誤ったずれを防ぎ得る。
【００１４】
幹細胞研究は、新規な再生医療を開発する鍵を握る。そこで、本発明者らは、様々の人類の疾患を治療するため、幹細胞から新しい薬を選別、発見と分離することに研究の焦点を当てる。ｉＰＳＣの登場により、この研究方向の進展は大きく推進した。本発明者らは、ｉＰＳＣを使用して、ｍｉＲ‐３０２を含めて胚性幹細胞固有のｍｉＲＮＡ（ＥＳＣ‐ｍｉＲＮＡ）が分解されるのを防ぎｉＰＳＣとＥＳＣの多分化能を維持する機能を保持する新規な砂糖様の化学物質群として、「グリシルグリセリン」を分離し確認する（Ｌｉｎの米国特許第９，３８７，２５１号）。本発明者らの最近の研究（Ｌｉｎ ＳＬ、２０１８）は、さらに、一部の分離されたグリシルグリセリン結合したＥＳＣ-ｍｉＲＮＡ、特にｍｉＲ‐３０２を使用して、生体内でＣＤ３４‐陽性の成体幹細胞（ＣＤ３４+ＡＳＣ）の拡大を誘発することにより無傷（完璧）な創傷治癒を強化できることを実証した。以前に類似のメカニズムの報告がないので、ここで、本発明は、（１）生体内とインビトロでのＡＳＣ拡大のメカニズムに関与するｍｉＲ‐３０２と他の創傷治癒関連の特定の因子の新規な機能、（２）インビトロでＣＤ３４+ＡＳＣの拡大を誘発する最初の再構成モデル、および（３）得られた誘発されたＣＤ３４+ＡＳＣ（ｉＣＤ３４+ＡＳＣ）から由来する可能な体細胞組織の細胞型について、初の証拠付けを行う。本発明の誘発されたＣＤ３４+ＡＳＣのインビトロでの拡大と誘導は、無制限且十分な患者自身の成体幹細胞に対しインビトロで、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ストローク、糖尿病、骨粗鬆症、心筋梗塞、血友病、貧血、ＡＩＤＳ、白血病、リンパ腫、多くの種類の癌、および老化などを含むがそれに制限されない様々の人間の疾患を治療するための生体内で自家移植治療法を行う能力を与える。自家移植は、免疫拒絶を防ぐ幹細胞治療法の最良の方法である。その結果、本発明は、確かに、新規な幹細胞治療法の革新的な開発の推進について確固たる基盤を築き、将来の再生医療に大きな影響をもたらす。
【００１５】
誘発された生体内のＡＳＣ拡大モデル
発明者らの最初の誘発性の生体内のＡＳＣ拡大モデルは、ｉＰＳＣから分離されたｍｉＲ‐３０２の前駆体（ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２）を使用して２０１１年に確立された。マウスの皮膚創傷治癒モデルを使用して、ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２の治療の後、生体内でＡＳＣ状の拡大ポーチ（まだＣＤ３４陰性）の発生が観察された（Ｃｈｅｎ他、２０１３；Ｌｉｎ ＳＬ、２０１８）。ＣＤ３４がマウスのＡＳＣではなく人間と豚のＡＳＣに対して有効な幹細胞標識であるので、本発明者らは、同じ治療方法を使用して、２０１４年に豚の皮膚創傷治癒モデルを確立し、生体内における類似のポーチ状のＣＤ３４+ＡＳＣ拡大を示した（図１〜図５）。その結果、現在、生体内、生体外とインビトロでのＡＳＣ拡大と誘導のメカニズムを研究するための豚（ＣＤ３４‐陽性）とマウス（ＣＤ３４‐陰性）の両方のＡＳＣ拡大モデルがある。
【００１６】
創傷治癒は、ＡＳＣの作用を研究する最も良い生体内モデルである。以前の理論において、ＡＳＣは、不対称的に分裂して一方に自身のコピー（ＡＳＣ）と他方の分化された娘細胞（前駆細胞と呼ばれる）を生成でき、その前駆細胞がさらに損傷した組織を修復する様々な新しい組織細胞に分裂し分化することができる。そのため、完璧（無傷）な創傷治癒には、十分なＡＳＣによりすべての創傷された組織領域を完全に修復し復元するための豊富且つ新しい組織細胞を提供する必要がある。この場合、生体内の十分なＡＳＣ集団の恒常性を維持することは重要なステップである。しかし、以前の「不対称的な幹細胞分裂」という理論は、汚染、毒物、放射線、ストレス、損傷、病気、ひいては老化を含むがこれらに限定されない、ＡＳＣを損傷する恐れのある多くの内部と環境的リスクのため、このようなＡＳＣ恒常性を維持することができない。この問題を克服するように、ｍｉＲ‐３０２のＤＮＡ脱メチル化の機能を使用して対称的なＡＳＣ分裂を誘発および／または強化することを試みた。
【００１７】
生体内の豚皮膚創傷治癒の治療モデル（図１と図３）を使用して、治療されないコントロールとｍｉＲ‐４３４‐擬似ｓｉＲＮＡ（ｍｉＲ‐４３４）の他のコントロール治療の結果に対比して、分離されたｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２（ｍｉＲ‐３０２）とｉＰＳＣの両方の溶解液の治療は、生体内ですべての試験された試料に速く無傷な創傷治癒を誘発できる（各組についてｎ＝１２／１２）ことがわかった。より詳しくは、図５は、さらに、治療されないコントロール（すなわち試料１９０‐ＣＲ３）に対する、ｍｉＲ‐３０２の治療（すなわち試料１９０‐ＢＲ２）後の無傷な創傷治癒の組織学的な結果を示す。すべての定量測定の後、図４の折れ線グラフは、それぞれ、図３の異なる治療組の経時的創傷癒合率をまとめて示す。ｉＰＳＣ溶解液が大量のｍｉＲ‐３０２も含むので、ｍｉＲ‐３０２とｉＰＳＣの両方の溶解液の治療は第１１日目に９０%と高い創傷癒合率を達成しているが、他のコントロール治療は、同じ治癒結果を達成するためにさらに６日も必要である（第１７日目）ことをしている。もっとも重要なことは、最初の３日間の創傷治癒期間において、ｍｉＲ‐３０２とｉＰＳＣの溶解液で治療された試料が既に１０%以上〜２０%の創傷収縮を示しているが、それは無傷な創傷治癒に必要な最も重要なステップである。創傷収縮が治癒中の組織修復の重要な段階として知られるので、創傷収縮の遅れは、治癒された組織の外観損傷と傷発生につながる。
【００１８】
緑色蛍光の抗ＣＤ３４抗体による免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を使用して（図５）、ｍｉＲ‐３０２とｉＰＳＣの両方の溶解液で治療された皮膚に、拡大されたＣＤ３４+ＡＳＣのポーチの規則的な分布パターンが確認されたが、治療されない試料またはｍｉＲ‐４３４で治療された試料には確認されなかった。各々の拡大ポーチは、およそ２０以上〜１２００のＣＤ３４+ＡＳＣを含む。非対称的な幹細胞分裂ではこのような多くのＡＳＣ拡大ポーチを生成できないので、ｍｉＲ‐３０２治療で誘発される「対称的な幹細胞分裂」のメカニズムに起因するはずである。特に、これらのＣＤ３４+ＡＳＣポーチは、真皮層と表皮層の接合領域にわたってランダムではなく規則的に分布され、通常、互いに約２４０〜２９０μｍの距離をあけ、誘発されたＣＤ３４+ＡＳＣが皮膚組織における元のＡＳＣから特別に繁殖し拡大されており、ランダムな体細胞再プログラムではないことを示す。治療されない試料においても二つのＣＤ３４+ＡＳＣの間に同じ距離を示すが、治癒された組織領域にＡＳＣ拡大の兆候がない。この二つのＡＳＣの間の規則的な距離は、皮膚組織における修復と復元システムの完全なネットワークを示し得る。
【００１９】
図１〜図５の結果から、本発明者らの研究は、（１）ｍｉＲ‐３０２治療が従来の抗生物質軟膏の治療より創傷癒合率を７０以上〜９０％増加し（図３と図４）、（２）ｍｉＲ‐３０２治療がすべての試験された試料に非常に少ない傷または無傷な創傷治癒につながり（ｎ＝１２／１２）（図３〜図５）、および（３）ｍｉＲ‐３０２治療がすべての治療された試料に生体内でＣＤ３４+ＡＳＣ拡大を２０以上〜１０００倍増加し誘発する（ｎ＝１２／１２）（図５）ことを確認した。以上の発見に基づいて、ここで、生体内でＣＤ３４+ＡＳＣ拡大を誘発し維持するために、創傷治癒条件でのｍｉＲ‐３０２の使用が必要であり、完璧な創傷治癒の結果を得られるという結論を出した。ｍｉＲ‐３０２と特定の創傷治癒関連の因子の併用は、インビトロでＡＳＣ拡大を誘発し維持することを可能にすると考えられる。しかし、生体内創傷治癒関連の因子はたくさんあるので、ＡＳＣ拡大のメカニズムにおける各々の機能的役割の重要性がまだ判明していない。そこで、本発明は、特定の因子の一部を明らかにする。
【００２０】
ＡＳＣ拡大に関与する特定の因子を確認するために、さらに、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）と遺伝子マイクロアレイ分析を行って分離されたＣＤ３４+ＡＳＣの遺伝子プロファイルと生体内でのＡＳＣ拡大の関連する遺伝子調節メカニズムを研究した（図１と図２）。確認された遺伝子プロファイルに基づいて、誘発されたＡＳＣ拡大と誘導の工程（スデップ）は、（１）ｍｉＲ‐３０２がいくつかの重要なエピジェネティックな遺伝子、特にＭＥＣＰ１／２とＨＤＡＣ２／４を下方制御して、細胞ゲノムにおいて特定のＤＮＡ脱メチル化のパターンを設定し、（２）特定のＤＮＡ脱メチル化のパターンが、そして、特定のセットの対称的な幹細胞分裂（ＳＳＣＤ）に関連した遺伝子の発現を誘発してそれらの下流のシグナル伝達経路を有効にし、（３）誘発されたＳＳＣＤ関連の遺伝子と創傷治癒関連の特定の因子が共同でＡＳＣ拡大を促進し維持することを含むことがわかった；しかしながら、もっとも重要なことは、特定のＤＮＡ脱メチル化条件下において、共同で作用し続けてＡＳＣ拡大と誘導のメカニズム全体を完成させることである。この新しく確立されたメカニズムから、すべての先行技術の方法は、明らかに、インビトロまたは生体外でＡＳＣ拡大を維持するためのこのような特定のＤＮＡ脱メチル化条件を提供できないので、臨床治療に必要な十分な増幅されるＡＳＣを生成できない。この問題を克服するために、本発明は、インビトロでのＡＳＣ拡大と誘導の全工程を完了するように、ｍｉＲ‐３０２を媒介としたＤＮＡ脱メチル化を使用して創傷治癒関連の特定の因子と共同作用するのに必要な条件を設定する初の方法である。
【００２１】
誘発されたインビトロでのＣＤ３４+ＡＳＣ拡大モデル
ＬＣＭとマイクロアレイ分析（図１、図２と図６）を用いて、インビトロでＣＤ３４+ＡＳＣ拡大を誘発するいくつかの特定の因子を確認した。開始ＣＤ３４+ＡＳＣは、酵素解離されたヒトまたは豚からの皮膚細胞から分離することができる（図６、上方パネル）。確認された特定の因子（例えば、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、ＬＩＦ、および他の任意な創傷治癒関連の因子）を補充されるフィーダーフリーＭＳＣ拡大培養条件下で、ｍｉＲ‐３０２またはそのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ擬似の治療は、インビトロでの治療毎に、分離された皮膚ＣＤ３４+ＡＳＣの増殖を２０以上〜１００倍（一つの細胞培養継代において約≧６〜８の細胞分裂）に誘発できることが確認した。３〜４日毎に、新たなｍｉＲ‐３０２、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および／または他の任意な特定の因子で補充される細胞培養媒質を更新することにより、５〜６代以上の誘発されたＣＤ３４+ＡＳＣ（ｉＣＤ３４+ＡＳＣ）を繰り返し培養でき、最終的にインビトロでの１０以上〜１０億倍のＣＤ３４+ＡＳＣの純増になる。ＬＩＦはＡＳＣ拡大に必要であると確認されたＳＳＣＤ関連の遺伝子の一つであるが、他の任意な治癒関連の特定の因子は、必須ではなく、ｍｉＲ‐３０２-誘発されたＡＳＣ拡大の効果を強化可能であり、それらには、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ、ＳＣＦ、ＨＯＸ、ノッチ、ＧＳＫ、Ｗｎｔ／β-カテニン、インターロイキンおよび／またはＢＭＰがある。
【００２２】
最も興味深いことに、すべての拡大されたｉＣＤ３４+ＡＳＣが薄層のＣＤ３４+ＡＳＣ誘導された膜により囲まれ（ＣＤ３４発現は微弱または無し）、他のＣＤ３４‐陰性の組織細胞と直接接触することがない（図６、左下パネル）。その結果、さらなる増殖のための純粋なｉＣＤ３４+ＡＳＣコロニーを容易に分離し収集することができる。今まで、核型分析に検出可能な変化なしで１０代以上の拡大されたｉＣＤ３４+ＡＳＣの培養及び維持に成功していた。その後、ｍｉＲ‐３０２の細胞培養媒質からの除去は、ｉＣＤ３４+ＡＳＣの分裂を中止するが、細胞の生存率に影響を与えない（図６、右下パネル）。培養媒質においてある特定の因子を欠くことによる異なる細胞培養条件で、ｉＣＤ３４+ＡＳＣは、特にインビトロ外胚葉系譜において、さらに数種の異なる組織細胞型に分化し得る（図６、神経と皮膚細胞型を含む右下パネル）。例えば、ｍｉＲ‐３０２とｂＦＧＦ／ＦＧＦ２の両方を除去したとき、神経細胞に分化される。あるいは、ｍｉＲ‐３０２とＬＩＦの両方を除去したとき、皮膚型組織細胞に分化される。分離されたｉＣＤ３４+ＡＳＣのヌードマウスへのさらなる移植は、特に外胚葉と中胚葉系譜において、生体内で様々な組織細胞型を形成する（図７）。以上の発見から、ｍｉＲ‐３０２とある特定の因子の併用は、インビトロでＡＳＣ拡大と誘導を誘発し維持でき、増幅されたＡＳＣとＡＳＣ分化された組織細胞のいずれかまたはその両方を使用する様々の細胞治療法に有用な誘発されたＣＤ３４+ＡＳＣを豊富且十分に生成する新規な方法の確立につながると結論付けた。
【００２３】
マウスとラットのＥＳＣ再生の先行研究は、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３とＢＭＰ４／Ｉｄタンパク質を使用することにより血清またはフィーダを必要とすることなくインビトロでのＥＳＣ再生を維持できることが報告されているので（Ｙｉｎｇ他、２００３；Ｘｕ他、２００５）、ＣＤ３４+ＡＳＣ拡大を誘導するＬＩＦ機能という最近の発見は、ＥＳＣとＡＳＣ再生システムの両方に共有される類似または平行なメカニズムを示す。この状況に基づいて、ＬＩＦがＣＤ３４+ＡＳＣの中胚葉系譜への分化を遮断する一方で、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２がＣＤ３４+ＡＳＣの神経外胚葉系譜への分化を防ぐことが発見した。その結果、ＬＩＦとｂＦＧＦ／ＦＧＦ２の相乗的作用は、ＣＤ３４+ＡＳＣのすべての分化可能性を遮断し、幹細胞多能性を維持する。しかし、ＥＳＣとは異なり、ほとんどのＡＳＣは、複製老化を回避するように強いＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇを共発現することがない。したがって、ここで、ＡＳＣがどのように複製老化を回避して長く無制限のライフサイクルを達成するかが重要な問題である。そこで、先行研究（Ｌｉｎ他、２０１１；ＬｉｎとＹｉｎｇ、２０１３）は、さらに、ｍｉＲ‐３０２が直接ＡＯＦ２／ＫＤＭ１、ＤＮＭＴ１とＨＤＡＣ２／４を抑制してテロメラーゼの逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の活動を強化しており、ｉＰＳＣ老化を防ぐことを示すので、ここで、ＡＯＦ２／ＫＤＭ１、ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ２／４とそれらの下流ＴＥＲＴを含むがそれに制限されない、本発明におけるマイクロアレイで確認されたＳＳＣＤ遺伝子は、ｉＣＤ３４+ＡＳＣ老化を防ぐ機能があり、インビトロでの細胞培養においてｉＣＤ３４+ＡＳＣの複製ライフと継代を延長する可能性が高いことを示唆する。
【００２４】
ｉＣＤ３４+ＡＳＣの多能性誘導を示す生体内での移植モデル
異なる組織／臓器における内在環境が生体内のｉＣＤ３４+ＡＳＣ分化の細胞の運命を案内し影響を与えると考えている。ｉＣＤ３４+ＡＳＣ分化を測定するために、ＮＯＤ‐ＳＣＩＤマウス（ｎ=３）を使用した生体内移植モデルを利用した。また、生体内の細胞分布と分化を追跡するために、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発現レンチウイルスベクターのｐＬＶＸ‐ＥＦ１ａ‐ＨｃＲｅｄ‐Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でこれらのｉＣＤ３４+ＡＳＣを標識した後、得られたＲＦＰ-陽性のＣＤ３４+ＡＳＣをフローサイトメトリーにより選択した。その後、ほぼ５×１０５のＲＦＰ標識されたｉＣＤ３４+ＡＳＣをそれぞれＮＯＤ‐ＳＣＩＤマウスの尾静脈に注射することにより移植が完成した。移植から３週間後、数多くのＲＦＰ‐陽性のＣＤ３４+ＡＳＣとその分化された細胞が骨髄、脳、心臓、肺、脾臓、甲状腺などの多くの生体内組織と臓器に生存し、成長続けることが観察され、ほとんどが外胚葉と中胚葉のいずれに由来するが、内胚葉系譜に由来するものは少ない。その結果、図７は、移植されたＣＤ３４+ＡＳＣとその分化された組織細胞が生体内の骨髄、脳、および甲状腺組織に大量に存在することを明らかに示す。
【００２５】
とりわけ、移植されたｉＣＤ３４+ＡＳＣは、生き残ることができ、さらに造血幹細胞（ＨＳＣ）も存在する骨髄に多くの幹細胞ポーチ／ニッチを形成する。しかし、この二つタイプのＣＤ３４+ＡＳＣの関連の有無、またはその方法はまだ不明である。分化されたＲＦＰ‐陽性の血液細胞は、蛍光顕微鏡で血液塗抹検査によって確認されるように、移植から３週間経っても周辺の血流から見つかっているので、移植されたｉＣＤ３４+ＡＳＣが生体内で少なくともいくつかのタイプの血液細胞に分化できることを示唆している。生体内で体に様々な造血細胞タイプを提供する点で、ＨＳＣと移植されたｉＣＤ３４+ＡＳＣの生理的機能が交換可能であれば、患者自身のｉＣＤ３４+ＡＳＣを使用して、特にストローク、心筋梗塞、ＡＩＤＳ、白血病、リンパ腫、および鎌状赤血球貧血を含むがこれらに限定されない多くの血液関連の疾患を治療できることが考えられる。また、このような自家移植は免疫拒絶を防ぐ治療法の最良の方法である。
【００２６】
さらに、図７に示すように、脳におけるｉＣＤ３４+ＡＳＣポーチと関連するＲＦＰ‐陽性の神経細胞の発見は、様々の退行性神経関連の疾患の治療に役立つ新規な治療法を開発するもう一つの重要な根拠であり、その疾患は特にストローク、糖尿病、認知症、アルツハイマー、パーキンソン病と運動ニューロン疾患を含むが、これに限定されない。
【００２７】
ＡＳＣ寿命とその特有な細胞分裂調節方法（すなわち、非対称的な幹細胞分裂ｖｓ対称的な幹細胞分裂）について、現在の知識は非常に限られている。また、ＨＳＣと他のＣＤ３４+ＡＳＣタイプとの間にどれだけ相違点および／または類似点があるか否かについては不明である。これらの問題を解決するように、本発明に示す現在のインビトロと生体内でのＣＤ３４+ＡＳＣ拡大モデルは、これらの問題を研究する有用なツールになる。新しく確立されたこれらのｉＣＤ３４+ＡＳＣ拡大モデルを使用して、（１）ｍｉＲ‐３０２は生体内でＣＤ３４+ＡＳＣ拡大を誘発する機能があり、完璧な創傷治癒に重要な役割を果たし、（２）ｍｉＲ‐３０２とｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、ＬＩＦなどのある特定の因子の使用は、インビトロでＣＤ３４+ＡＳＣ拡大を誘発でき、多くの研究と医療用の増幅ｉＣＤ３４+ＡＳＣを提供し、（３）拡大されたｉＣＤ３４+ＡＳＣの生体内移植は、多くの臓器／組織において様々な分化された組織細胞を成長並びに形成することが可能であり、これらのｉＣＤ３４+ＡＳＣは特に外胚葉と中胚葉系譜における多能性を示し、（４）移植されたｉＣＤ３４+ＡＳＣは、骨髄、脳、脾臓と甲状腺においてポーチ状の幹細胞ニッチを成長並びに形成させ、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ストローク、糖尿病、骨粗鬆症、心筋梗塞、血友病、貧血、ＡＩＤＳ、白血病、リンパ腫と多くの種類の癌とともに老化の治療に役立つ新規な再生医療と治療法を開発する大きな可能性を示すことがわかった。
【００２８】
Ａ.定義
本発明の理解を容易にするため、多くの用語が以下に定義される。
ヌクレオチド：糖鎖部分（ペントース）と、リン酸塩と、含窒素複素環塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位である。塩基がグリコシド炭素（ペントースの１’の炭素）を介して糖鎖部分に連結され、その塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ペントースの３’または５’の位置に結合する少なくとも一つのリン酸塩基を含むヌクレオシドがヌクレオチドである。ＤＮＡとＲＮＡは、それぞれデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドと呼ばれる異なるタイプのヌクレオチド単位から構成される。
【００２９】
オリゴヌクレオチド：二つ以上、好ましくは三つ以上、通常は十つ以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む分子である。１３つのヌクレオチド単量体より長いオリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドとも呼ばれる。正確なサイズが多くの因子に依存し、その因子がオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、逆転写、またはその組合せを含むいずれかの方式で生成され得る。
【００３０】
ヌクレオチドアナログ：アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）によって構造が異なるが、核酸分子における通常のヌクレオチドを置き換えるほど十分に類似しているプリンまたはピリミジンヌクレオチドである。
【００３１】
核酸組成物：核酸組成物は、一本鎖または二本鎖の分子構造におけるＤＮＡまたはＲＮＡ配列、あるいは混合型ＤＮＡ／ＲＮＡ配列などのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドという。
【００３２】
遺伝子：オリゴヌクレオチドまたはポリ塩基配列がＲＮＡおよび／またはポリペプチド（タンパク質）をコードする核酸組成物である。遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。遺伝子は、小分子のヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびそのＲＮＡ前駆体と誘導体などの非コードＲＮＡをコードしてもよい。あるいは、遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびそのＲＮＡ前駆体と誘導体など、タンパク質／ペプチド合成に重要なタンパク質コードＲＮＡをコードしてもよい。遺伝子は、少なくともマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列を含むタンパク質コードＲＮＡをコードする場合もある。
【００３３】
ＲＮＡ転写一次産物：ＲＮＡ処理または修飾することなく遺伝子から直接転写されるＲＮＡ配列であり、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡおよびそのＲＮＡ前駆体と誘導体からなる群から選択されてもよい。
【００３４】
前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ‐ｍＲＮＡ）：タンパク質コード遺伝子のＲＮＡ転写一次産物であり、転写という細胞内メカニズムを介して真核生物において真核生物のＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ‐ＩＩ）メカニズムにより生成される。ｐｒｅ‐ｍＲＮＡ配列は、５’‐非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’‐ＵＴＲ、エクソンとイントロンを含む。
【００３５】
イントロン：非タンパク質読み取りフレームをコードする遺伝子転写配列の一部であり、例えば、インフレームイントロン、５’‐ＵＴＲと３’‐ＵＴＲがある。
エクソン：タンパク質読み取りフレーム（ｃＤＮＡ）をコードする遺伝子転写配列の一部であり、例えば、細胞遺伝子のｃＤＮＡ、増殖因子、インスリン、抗体およびそのアナログ／ホモログと誘導体がある。
【００３６】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：ｐｒｅ‐mＲＮＡエクソンの集合体であり、イントロン除去の後に細胞内ＲＮＡスプライシングメカニズム（スプライソソーム）により形成され、ペプチド／タンパク質合成用のタンパク質コードＲＮＡとして働く。ｍＲＮＡでコードされるペプチド／タンパク質は、酵素、増殖因子、インスリン、抗体およびそれらアナログ／ホモログと誘導体を含むが、これに限定されない。
【００３７】
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）：ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、イントロン配列を含まない一本鎖または二本鎖ＤＮＡである。
センス：ホモログｍＲＮＡと同じ配列順序と組成物を有す核酸分子である。センス構造は、「＋」、「ｓ」または「センス」の符号で示す。
【００３８】
アンチセンス：それぞれのｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子である。アンチセンス構造は、「−」または「*」の符号として示し、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの前の「ａ」または「アンチセンス」で示し、例えば、「ａＤＮＡ」または「ａＲＮＡ」とする。
【００３９】
塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の組合である。ＲＮＡにおいて、ウラシル（Ｕ）がチミンに置換される。一般に、この組合が水素結合を介して形成する。
【００４０】
塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の組合である。ＲＮＡにおいて、ウラシル（Ｕ）がチミンに置換される。一般に、この組合が水素結合を介して達成する。例えば、センス塩基配列「５’‐Ａ‐Ｔ‐Ｃ‐Ｇ‐Ｕ‐３’」は、そのアンチセンス配列「５’‐Ａ‐Ｃ‐Ｇ‐Ａ‐Ｔ‐３’」とともに完全な塩基対を形成することができる。
【００４１】
５’末端：一つのヌクレオチドの５’‐水酸基がホスホジエステル連鎖で次のヌクレオチドの３’‐水酸基に結合される連続的ヌクレオチドの５’位置にヌクレオチドがない末端である。一つ以上のリン酸塩などの他の基が末端に存在することがある。
【００４２】
３’末端：一つのヌクレオチドの５’-水酸基がホスホジエステル連鎖で次のヌクレオチドの３’-水酸基に結合される連続的ヌクレオチドの３’位置にヌクレオチドがない末端である。他の基、通常は水酸基が末端に存在することがある。
【００４３】
鋳型：核酸ポリメラーゼにより複製されている核酸分子である。鋳型は、ポリメラーゼによっては、一本鎖でもよく、二本鎖または部分的に二本鎖でもよい。合成された複製物は、鋳型、あるいは二本鎖または部分的に二本鎖鋳型の少なくとも一本の鎖に相補的になる。ＲＮＡとＤＮＡはどちらも、５’から３’への方向に合成される。二重鎖核酸の二本の鎖は、二本の鎖の５’末端（また、必要に応じて、そしては３’末端）が二重鎖と相対する末端にあるように、常に揃っている。
【００４４】
保存される：塩基配列は、事前選択された配列に対し厳密な補体に非ランダムにハイブリッド化すると、この事前選択された（参照された）配列に対して保存される。
ホモログまたはホモロジー：ポリヌクレオチドと遺伝子またはｍＲＮＡ配列の間の類似性を示す用語である。核酸配列は、例えば遺伝子またはｍＲＮＡ配列と部分的にまたは完全に相同(ホモログ)であってもよい。ホモロジーは、ヌクレオチドの合計数に対する類似のヌクレオチドの数量により決定される割合として示すことがある。
【００４５】
相補的または相補性または相補：上記「塩基対（ｂｐ）」ルールによって言及される二つのポリヌクレオチド（すなわち、ｍＲＮＡとｃＤＮＡの配列）の間の一致した塩基対のことを指す用語である。例えば、配列「５’‐Ａ‐Ｇ‐Ｔ‐３’」は、配列「５’‐Ａ‐Ｃ‐Ｔ‐３’」と相補的であり、「５’‐Ａ‐Ｃ‐Ｕ‐３’」とも相補的である。相補は、二つのＤＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖、または二つのＲＮＡ鎖に存在することがある。相補性は、「部分的」、あるいは「完全的」または「全面的」であってもよい。部分的な相補性または相補は、塩基対形成ルールに応じて一部の核酸塩基のみが一致したときに起こる。完全的または全面的な相補性または相補は、核酸鎖の間に塩基が完全または完璧に一致するときに起こる。核酸鎖の間の相補性の度合いは、核酸鎖の間のハイブリッド化の効率と強度に重要な影響を及ぼす。これは、核酸の間の結合に依存する増幅反応と検出方法にとって特に重要である。百分率の相補性または相補は、核酸の一つの鎖における塩基全体に対する不一致の塩基の数量である。よって、５０％の相補は、半数の塩基が不一致であり、他の半数の塩基が一致であることを意味する。核酸の二つの鎖について、塩基の数が異なる場合でも、この二つの鎖が相補的であり得る。この場合、より短い鎖の塩基と対を形成する鎖における塩基に対応するより長い鎖の部分に相補が起こる。
【００４６】
相補塩基：通常、ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖構造を採るときに対を形成するヌクレオチドである。
相補ヌクレオチド配列：他の一本鎖におけるヌクレオチドの配列と十分に相補であって、結果として生じる水素結合でこの二つの鎖の間に特定的にハイブリッド化する、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子におけるヌクレオチドの配列である。
【００４７】
ハイブリッド化するとハイブリッド化：塩基対形成を介して複合体を形成するのに十分に相補的であるヌクレオチド配列間のデュプレックスの形成である。プライマー（またはスプライス鋳型）が標的（鋳型）と「ハイブリッド化」するところ、このような複合体（またはハイブリッド）が十分に安定になって、ＤＮＡ合成を開始させるＤＮＡポリメラーゼにより要求されるプライミング機能を達成する。競合的に抑制される二つの相補的なポリヌクレオチドの間に、特定の、すなわちランダムでない相互作用がある。
【００４８】
転写後遺伝子サイレンシング：ｍＲＮＡの分解または翻訳抑制のレベルでの標的遺伝子のノックアウトまたはノックダウン効果であり、通常、外来／ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの導入遺伝子あるいは小分子の抑制性ＲＮＡのいずれかにより引き起こされる。
【００４９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）：真核生物における転写後遺伝子サイレンシングのメカニズムであり、小分子の抑制性ＲＮＡ分子、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子のヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と小分子の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により引き起こされる。これらの小分子ＲＮＡ分子は、通常、遺伝子のサイレンサーとして機能し、小分子ＲＮＡに対して完全または部分的な相補性がある細胞内遺伝子の発現に干渉する。
【００５０】
遺伝子サイレンシング効果：遺伝子機能が抑制された後の細胞応答であり、細胞サイクル減衰、Ｇ０／Ｇ１‐チェックポイント捕らえ、腫瘍抑制、抗造腫瘍能、癌細胞アポトーシス、およびその組合せからなるが、これに限定されない。
【００５１】
非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）：細胞内翻訳メカニズムを介してペプチドまたはタンパク質を合成するのに用いられないＲＮＡ転写物である。非コードＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子のヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小分子の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの長い調節ＲＮＡ分子と短い調節ＲＮＡ分子を含む。これらの調節ＲＮＡ分子は、通常、遺伝子のサイレンサーとして機能し、非コードＲＮＡと完全または部分的に相補性がある細胞内遺伝子の発現に干渉する。
【００５２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：マイクロＲＮＡの配列と部分的な相補性がある標的遺伝子転写物（ｍＲＮＡ）に結合可能な一本鎖ＲＮＡである。成熟したマイクロＲＮＡは、通常、長さについて約１７〜２７のオリゴヌクレオチドのサイズであり、マイクロＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの間の相補性に応じて、直接細胞内ｍＲＮＡ標的を分解又はその標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を抑制可能である。天然マイクロＲＮＡは、ほぼすべての真核生物に見られ、ウイルス感染に対する防御として機能し、植物と動物の発育において特定の遺伝子発現の調節を可能にする。原則として、一つのマイクロＲＮＡは複数の標的ｍＲＮＡを標的として完全な機能性を実現することが多い一方、複数のｍｉＲＮＡは、同じ遺伝子転写物を標的として遺伝子サイレンシングの効果を強化することも可能である。
【００５３】
マイクロＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ）：細胞内ＲＮａｓｅＩＩＩ型ダイサーエンドリボヌクレア−ゼと相互作用して、成熟したマイクロＲＮＡ配列と完全または部分的な相補性がある標的遺伝子または特定の群の標的遺伝子をサイレンシングできる一つまたは複数の成熟したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を生成するためのステムアームとステムループ領域を有するヘアピン状の一本鎖ＲＮＡである。ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡのステムアームは完璧に（１００％）または部分的に（不一致の）二重鎖ハイブリッドを形成し得るが、ステムループが二重鎖ステムアームの一端を接続して、アルゴノートタンパク質（ＡＧＯ）でＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込むのに必要な円形またはヘアピンループの構造を形成する。
【００５４】
小分子の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：約１８〜２７の完璧に塩基対形成された二重鎖リボヌクレオチドのサイズであり、ほぼ完璧な相補性がある標的遺伝子転写物を分解可能な短い二本鎖ＲＮＡである。
【００５５】
小分子または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）：不一致のループオリゴヌクレオチドで分裂されてヘアピン状の構造を形成する一対の部分的または完全に一致するステムアームヌクレオチド配列を含む一本鎖ＲＮＡである。多くの天然ｍｉＲＮＡは、ヘアピン状のＲＮＡ前駆体、すなわち前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ）により誘導される。
【００５６】
ベクター：異なる遺伝環境での運動と滞在が可能である組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）のような組換え核酸組成物である。一般に、他の核酸がそこに連動的に連結される。ベクターは、ベクターとその接続されたセグメントが複製される細胞における自律的な複製が可能である。一つのタイプの好ましいベクターは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能である核酸分子である。好ましいベクターは、核酸の自律的な複製と発現を可能とするものである。ここで、一つ以上のポリペプチドおよび／または非コードＲＮＡに対して遺伝子エンコーディングの発現を誘導可能なベクターを「発現ベクター」または「発現可能ベクター」という。特に重要なベクターは、逆転写酵素によって生成されるｍＲＮＡからのｃＤＮＡのクローニングを可能にする。ベクターは、ウイルスまたはＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ‐ＩＩまたはｐｏｌ‐２）プロモーター、あるいはその両方、コザックコンセンサス翻訳開始部位、ポリアデニル化シグナル、複数の制限／クローニング部位、複製のｐＵＣ起源、複製可能な原核細胞において少なくとも薬剤耐性菌遺伝子を発現するＳＶ４０初期プロモーター、哺乳動物細胞における複製用の任意なＳＶ４０起源、および／またはテトラサイクリン応答性エレメントからなる成分を含んでも良い。ベクターの構造は、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ＤＮＡ導入遺伝子、ジャンプ遺伝子、およびその組合せからなる群から選ばれる線形または円形の一本または二本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００５７】
プロモーター：ポリメラーゼ分子が認識もしくは結合し、ＲＮＡ転写を開始する核酸である。本発明の目的では、プロモーターは、既知のポリメラーゼまたはその補因子結合部位、促進剤など、所望のポリメラーゼでＲＮＡ転写物の合成を開始できるあるゆる配列であってもよい。
【００５８】
シストロン：アミノ酸残基配列をコードし、上流と下流のＤＮＡ発現制御要素を含むＤＮＡ分子におけるヌクレオチド配列である。
イントロン切除：ＲＮＡスプライシング、エキソソーム消化、ナンセンス媒介腐敗（ＮＭＤ）プロセシング、およびその組合せを含むＲＮＡプロセシング、成熟と分解を担う細胞メカニズムである。
【００５９】
ＲＮＡプロセシング：ＲＮＡスプライシング、イントロン切除、エキソソーム消化、ナンセンス媒介腐敗（ＮＭＤ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡプロセシング、およびその組合せを含むＲＮＡ成熟、修飾と分解を担当する細胞メカニズムである。
【００６０】
標的細胞：体細胞、組織、幹細胞、生殖細胞、奇形腫細胞、腫瘍細胞、癌細胞、およびその組合せからなる群から選択される一つまたは複数の人類の細胞である。
癌組織：皮膚癌、前立腺癌、乳腺癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍／癌、リンパ腫、白血病およびその組合せからなる群に由来する腫瘍性組織である。
【００６１】
遺伝子輸送：ポリソームトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、化学トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ＤＮＡ組み換え、トランスポゾン挿入、ジャンプ遺伝子挿入、マイクロ注入、遺伝子銃侵入、およびその組合せからなる群から選択される遺伝子工学の方法である。
【００６２】
遺伝子工学：ＤＮＡ制限と連結、ホモログ組み換え、導入遺伝子組み込み、トランスポゾン挿入、ジャンプ遺伝子統合、レトロウイルス感染、およびその組合せからなる群から選択されるＤＮＡ組み換え方法である。
【００６３】
細胞サイクルレギュレータ：細胞分裂と増殖速度の制御に関与する細胞遺伝子であり、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリン、ＢＭＩ‐１、ｐ１４／ｐ１９Ａｒｆ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ２１Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、およびその組合せを含むが、それに限定されない。
【００６４】
腫瘍抑制効果：細胞抗腫瘍および／または抗癌メカニズムと応答であり、細胞サイクル減衰、細胞サイクル停止、腫瘍細胞成長抑制、細胞造腫瘍能抑制、腫瘍／癌細胞変換抑制、腫瘍／癌細胞アポトーシス誘発、正常細胞復元誘導、高悪性度癌細胞のより良性な低悪性度状態への再プログラム（腫瘍退行）、およびその組合せを含むが、それに限定されない。
【００６５】
癌治療効果：薬物治療から得られた細胞応答および／または細胞メカニズムであり、癌遺伝子発現の抑制、癌細胞増殖の抑制、癌細胞浸潤および／または移動の抑制、癌転移の抑制、癌細胞死の誘発、腫瘍／癌発生の防止、癌再発の防止、癌進行の抑制、損傷した組織細胞の修復、高悪性度癌のより良性な低悪性度状態への再プログラム（癌退行／寛解）、およびその組合せを含むが、それに限定されない。
【００６６】
遺伝子サイレンシング効果：遺伝子機能が抑制された後の細胞応答であり、癌遺伝子発現の抑制、細胞増殖の抑制、細胞サイクル停止、腫瘍抑制、癌退行、癌防止、細胞アポトーシス、細胞修復および／または活性化、細胞再プログラム、疾患細胞の相対正常状態への再プログラム（自然治癒）、およびその組合せからなるが、それに限定されない。
【００６７】
癌復帰：インビトロ、生体外または生体内で高悪性度癌の悪性特性を相対的に正常な低悪性度状態にリセットする再プログラムメカニズムである。
抗体：事前選択された配位子を結合可能な受容体をコードする、事前に選択、保存されるドメイン構造を有するペプチドまたはタンパク質分子である。
【００６８】
ヒト変性疾患（ＨＤＤ）：ＨＤＤは、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ストローク、糖尿病、骨粗鬆症、心筋梗塞、血友病、貧血、白血病、リンパ腫、多くの種類の癌および老化関連の疾患を含むが、それに限定されない。
【００６９】
医薬および／または治療応用：診断、幹細胞生成、幹細胞研究および／または治療法開発、組織／臓器修復および／または活性化、創傷治癒治療、腫瘍抑制、癌治療および／または防止、疾患治療、薬物生産、およびその組合せに役立つ生物医学上の利用、デバイスおよび／または機器である。
【００７０】
Ｂ.組成物と応用
５’末端に５’‐ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ  ＣＡＵＧＵＵＵ‐３’（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７）の共有配列があるｍｉＲ‐３０２状のｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡを使用して、さらに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）／線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ‐２）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ホメオボックスタンパク質（ＨＯＸ）、ノッチ、ＧＳＫ、Ｗｎｔ／ｂｅｔａ‐カテニンシグナル、インターロイキン、および／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むがそれに制限されていない創傷治癒関連の特定の因子と併せて使用して、インビトロで成体幹細胞（ＡＳＣ）の拡大および／または誘導を誘発する組成物とその使用方法である。その結果得られた増幅されたＡＳＣは、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ストローク、糖尿病、骨粗鬆症、心筋梗塞、血友病、貧血、ＡＩＤＳ、白血病、リンパ腫、多くの種類の癌と老化を含むがそれに限定されない様々な老化と細胞障害関連のヒトの疾患の治療に役立つ。
【００７１】
原則として、本発明は、生体内皮膚創傷治癒モデルにおいて最近発見された誘導性対称ＡＳＣ分裂の新規なメカニズムに関する（ＬｉｎのＵ.Ｓ.９，８７９，２６３号と米国特許出願第１５／６６１，３４６号）。しかし、本発明者らの以前の発明は、インビトロでＡＳＣ拡大を誘発するためにｍｉＲ‐３０２とともに使用する必要がある特定の因子を明らかにしない。この問題を克服するように、本発明は、さらに、インビトロでの誘導されたＡＳＣ拡大のメカニズムに関与するすべての必須及び任意な特定の因子を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
本特許または出願は、少なくとも一つの着色図面を含む。着色図面付き本特許または特許公報のコピーは、希望に応じて必要な経費を支払うことでＵＳＰＴＯにより提供される。
【００７３】
特に、制限ではなく例示のためのみの図面は、以下の通りである。
【図１】図１は、ｍｉＲ‐３０２を媒介とした生体内の完璧（無傷）な創傷治癒メカニズムの提案モデルを示す。
【図２】図２は、生体内で分離された二つの異なる組織試料において差動的に発現された遺伝子を見つける為のＬＣＭ-マイクロアレイ分析の技術を示す。例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション機器（ＬＣＭ）を使用して、異なる試料領域から得られた二つの異なるタイプの組織細胞を収集することができる。その後、各々のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡライブラリーは、ＬＣＭにより細分化された各々の組織細胞試料から別々に増幅し、収集された後、さらに、それぞれマイクロアレイ分析に用いられる。このＬＣＭマイクロアレイ手段を利用して、生体内分離ＣＤ３４+ＡＳＣ、インビトロ誘発ｉＣＤ３４+ＡＳＣと他の非ＡＳＣ組織細胞の間にある差動遺伝子発現パターンを研究し対比する。
【図３】図３は、抗生物質軟膏のみによる治療（最上行）、抗生物質軟膏と１ｍｇ／ｍＬのｍｉＲ‐４３４‐擬似ｓｉＲＮＡによる治療（２行目）、抗生物質軟膏と１ｍｇ／ｍＬの分離されたｍｉＲ‐３０２前駆体による治療（３行目）、および抗生物質軟膏と５ｍｇ／ｍＬの分離されたｉＰＳＣ溶解液（最下行）の間の生体内創傷治癒速度の対比を示す。試料数量について、ｍｉＲ‐３０２とｉＰＳＣ溶解液治療組においてｎ＝１２であり、空白コントロール（軟膏のみ）とｍｉＲ‐４３４治療組においてｎ＝６である。
【図４】図４は、（Ａ）ｉＰＳＣ溶解液（青いダイヤモンド）、（Ｂ）ｍｉＲ‐３０２前駆体（ｍｉＲ‐３０２；赤い正方形）、（Ｃ１）抗生物質軟膏のみ（空白コントロール；緑色の三角形）、および（Ｃ２）ｍｉＲ‐４３４‐擬似ｓｉＲＮＡ（紫色のクロス）の治療後の創傷癒合率（％）の経時的結果を示す。この結果は、ｉＰＳＣ溶解液とｍｉＲ‐３０２治療はいずれもが生体内で快速創傷治癒率を大きく向上させるが（ｐ<０．０１）、他のコントロールでは向上することができないことを実証している。
【図５】図５は、治療されない（最上部、１９０‐ＣＲ３）とｍｉＲ‐３０２により治療された（最下部；１９０‐ＢＲ２）生体内での皮膚試料の間の創傷治癒結果の対比を示す。分離されたｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２（２０〜１０００μｇ／ｍＬ）は、抗生物質軟膏とともに配合され、生体内で直接豚の背中の皮膚における２ｃｍ×２ｃｍの開いた傷に塗られる。治療から約２〜３週間後、治癒された傷試料の一部は、細分化されてさらに組織学的検査用の組織切片にする。この結果は、ｍｉＲ‐３０２により治療された試料（完璧な治癒レートｎ＝６／６）に傷跡がないか非常に少ない（無傷）である一方、ほとんどの治療されない（抗生物質軟膏のみで治療された）傷は大きな傷跡を残すことを示している。注目すべきは、治療されないコントロール傷と比較して、ｍｉＲ‐３０２により治療された試料（ｎ＝６／６）には非常に多量（≧４０〜１０００倍より多い）のＣＤ３４‐陽性の成体幹細胞集団（緑色蛍光抗体でラベル化されたＣＤ３４+ＡＳＣ）が見つかっている。これらの結果は、ｍｉＲ‐３０２がＣＤ３４+ＡＳＣ拡大と誘導を引き起こして組織修復と再生を強化する機能を持ち、ヒト変性疾患（ＨＤＤ）に起因する病変に特に有利な治療効果があることを示している。
【図６】図６は、誘発されたインビトロでのＣＤ３４+ＡＳＣ拡大と誘導の結果を示す。皮膚細胞解離とさらなる順次希釈をして単独の細胞コロニーを取得した後、ＣＤ３４+ＡＳＣは、抗ＣＤ３４による抗体蛍光免疫細胞化学染色を使用して確認された（最上部のパネル；緑色）。さらに、ｍｉＲ‐３０２と確認された特定の因子（例えば、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、ＬＩＦ、および他の任意な創傷治癒の関連因子）を含む確立された培養条件で、これらの分離されたＣＤ３４+ＡＳＣを繰り返しインビトロで培養し増幅させる（左下の写真）。このように得られた増幅ＣＤ３４+ＡＳＣ（ｉＣＤ３４+ＡＳＣと呼ばれる）をさらに皮膚と神経外胚葉系譜におけるいくつかの異なる組織細胞タイプに分化してもよい（右下の写真）（ｎ＝２５、ｐ<０．００１）。
【図７】図７は、生体内でｉＣＤ３４+ＡＳＣをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植した結果を示す（ｎ＝3）。５×１０５個のｉＣＤ３４+ＡＳＣを尾静脈注射により各々のマウスに移植した。ｉＣＤ３４+ＡＳＣは、ｐＬＶＸ‐ＥＦ１ａｌｐｈａ‐ＨｃＲｅｄ‐Ｎ１レンチウイルスベクターにより搬送された赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で全てラベル化された。移植から約３週間後、すべての主要な臓器と組織を別々に収集し組織切片スライドにした後、ＩＨＣ染色と顕微鏡検査に使用して生体内で移植されたｉＣＤ３４+ＡＳＣ拡大ポーチとｉＣＤ３４+ＡＳＣにより分化された組織細胞（すべてが赤色でラベル化された）を確認した。ここで三つの主要な分化された組織タイプを示すが、最新の結果に見られるｉＣＤ３４+ＡＳＣにより分化された組織細胞のタイプは、骨髄、脳、心臓、肺、脾臓、甲状腺、腎臓、および肝臓を含むが、それに限定されておらず、その中で、ほとんどが外胚葉または中胚葉から由来し、内胚葉系譜から由来することは少ない。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
以下の実験開示において、下記の略語を適用する。Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μｍ（マイクロモル）、ｍｏｌ（モル）、ｐｍｏｌ（ピコモル）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、℃（摂氏度）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチドトリリン酸塩）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ‐２‐ヒドロキシエチルピペラジン‐Ｎ‐２‐エタンスルホン酸）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝液）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、トリスＨＣｌ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩）、ＡＴＣＣ（米国タイプの培養収集、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ｈＥＳＣ（ヒト胚性幹細胞）、および ｉＰＳＣ（誘導性多能性幹細胞）である。
【００７５】
１.インビトロでのＣＤ３４+ＡＳＣの単離、培養と拡大
開始ＣＤ３４+ＡＳＣは、本発明者らのプロトコルに従って毛包から（Ｌｉｎ他、２０１１）、またはＡａｓｅｎのプロトコルを使用して酵素解離皮膚細胞から（Ｎａｔ.Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５、３７１〜３８２、２０１０）得られても良いし、単にヘパリンにより治療された周辺血液細胞のバフィーコート部分から得られてもよい。組織試料は新鮮に保持し、すぐに４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩと０．２５％のＴｒｙｐＬＥの混合物で細胞密度に応じて１５〜４５分間処理し、ＨＢＳＳ含有トリプシン抑制剤で２回洗浄した後、０．３ｍＬのフィーダーフリーＭＳＣ拡大ＳＦＭ培養媒質（ＡＳＣ培養媒質、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）を含有する新しい滅菌されたマイクロチューブに転送しなければならない。その後、マイクロチューブインキュベータに３７℃で１分間振ることにより細胞をさらに解離し、配合されたｍｉＲ‐３０２／ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２、ＬＩＦ、およびｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、または他の任意な特定の因子を補充した、１ｍＬのフィーダーフリーＭＳＣ拡大ＳＦＭ培養媒質を含有する３５ｍｍのマトリゲルで被覆した培養皿に０．３ｍＬの細胞懸濁液全体を転送した。利用するｍｉＲ‐３０２／ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および他の任意な特定の因子の濃度はそれぞれ０．００１マイクログラム／ｍＬ〜５００マイクログラム／ｍＬ（０．００１〜５００μｇ／ｍＬ）であり、最も好ましくは、ＡＳＣ培養媒質における利用する濃度は、ｍｉＲ‐３０２／ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２について１０〜２００マイクログラム／ｍＬ（１０〜２００μｇ／ｍＬ）であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および／または他の任意な特定の因子について２〜２０ナノグラム／ｍＬ（２〜２０ｎｇ／ｍＬ）である。ＡＳＣ培養媒質とすべての補充物を３〜４日あたり更新する必要がある。ＣＤ３４+ＡＳＣを多くのポーチ状の拡大コロニーに成長させ、別々に収集し、さらに、細胞をＴｒｙｐＬＥに１分間曝してＨＢＳＳ含有トリプシン抑制剤で２回洗浄することにより約５０％〜６０％が合流するように継代させることができる。より多くのＡＳＣ拡大のため、配合されたｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および／または他の任意な特定の因子を補充した新たなＡＳＣ培養媒質に分離されたＣＤ３４+ＡＳＣを１：５〜１：５００の希釈度で再配置した。
【００７６】
２.マイクロＲＮＡとＰｒｅ-ｍｉＲＮＡの単離と調製
Ｌｉｎ  ＳＬのプロトコルに従って、天然ｍｉＲ‐３０２とｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２をｈＥＳＣとｉＰＳＣのいずれかまたはその両方の細胞質から抽出することができる（Ｌｉｎ  ＳＬ、２０１８）。細胞質を収集するために、超遠心分離によりＥＳＣまたはｉＰＳＣを４℃で３０分間かけて１７，５００ｇで分断し、さらに、製造者の指示に従って、懸濁液を０．０１のミクロンの超フィルターカラム（３０ｋＤａ／１００ヌクレオチド‐カットオフ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ‐０．５  ３０Ｋ）に通すことによりろ過する（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）。それぞれ１０〜１２億個のＥＳＣまたはｉＰＳＣからほぼ０．８〜１ｍＬのＥＳＣまたはｉＰＳＣの細胞質を復元することができる。ｍｉＲ‐３０２とｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２を抽出するために、さらに、ＥＳＣまたはｉＰＳＣの細胞質を０．００１ミクロンのナノフィルターカラム（３ｋＤａ／１０ヌクレオチド‐カットオフ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ‐０．５  ３Ｋ）で純化し通液部分から復元される一方、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるさらなる純化をするために、すべての小分子ＲＮＡをナノフィルターに収集し二重オートクレーブによりＤＥＰＣで処理されたｄｄＨ２Ｏ（ｐＨ５．５〜５．６）に溶解する。このように得られた小分子ＲＮＡのサイズは、ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡといくつかのｔＲＮＡを含めて約１０〜１１０のヌクレオチド（または３〜３０ｋＤａ）の範囲にある。ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析を使用して、９０％以上の分離された小分子ＲＮＡがｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２とｍｉＲ‐３０２であることを確認し、これがＥＳＣとｉＰＳＣにおける最も豊富で安定した小分子ＲＮＡである。あるいは、天然ｍｉＲＮＡs／ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡの代わりに、合成のｍｉＲ‐３０２-擬似ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを使用してもよい。さらに、ｍｉＲ‐３０２／ｐｒｅ‐ｍｉＲ‐３０２の生産と抽出に、ＥＳＣとｉＰＳＣの代わりに細菌性細胞を使用してもよい。
【００７７】
３.ｍｉＲＮＡマイクロアレイとＲＴ−ｑＰＣＲ分析
まず、分離された小分子ＲＮＡの純度と量をＵＶ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで２％〜３％の低融点アガロースゲル電気泳動と分光光度計により評価した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。そして、各々の試料から分離された約１０μｇの小分子ＲＮＡを使用して、ＬＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によりマイクロ配列分析をそれぞれ行った。各々のマイクロアレイチップをＣｙ３またはＣｙ５染料でラベル化された単一試料によりハイブリッド化した。製造者のプロトコルに従って背景差分、データ正規化と統計計算を行った。デュアル試料測定について、ｐ値計算を行って３倍以上の差をつけて発現した転写物の一覧（黄色‐赤シグナル）を作成した。ＲＴ−ｑＰＣＲについて、製造者の指示に従って、ｈｓａ‐ｍｉＲ‐３０２ａに対する一連のＴａｑＭａｎプライマーとそれに関連するＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用した。ＡＢＩ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムでシグナルを検出した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００７８】
４.免疫染色測定
既報の通り、組織試料を埋め込み、切片し免疫染色した（Ｌｉｎなど、２００８と２０１０）。主な抗体は、緑色蛍光染料でラベル化したＣＤ３４の抗体である（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ＆Ｓｉｇｍａ）。あるいは、蛍光染料でラベル化したヤギの抗ウサギ抗体または馬の抗マウス抗体を二次抗体として使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ‐Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ撮像プログラム（Ｎｉｋｏｎ）で蛍光８０ｉ顕微鏡の定量システムに１００倍または２００倍の倍率で陽性結果を検査し分析した。
【００７９】
５.バイサルファイトＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して２，０００，０００個以下の細胞からゲノムのＤＮＡを分離し、１μｇの分離されたＤＮＡをさらに製造者の示唆に従って、バイサルファイト（ＣｐＧｅｎｏｍｅＤＮＡ修飾キット、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）で処理した。バイサルファイト処理は、すべてのメチル化されないシトシンをウラシルに変換した一方、メチル化されたシトシンをシトシンとして残した。バイサルファイトＤＮＡ配列決定について、ＰＣＲプライマーの５’‐ＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧ  ＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴ  ＧＣＴＴＴＧＧ‐３’（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１２）と５’‐ＣＣＣＴＣＣＴＧＡＣ  ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣ  ＣＡＣＣＡＣＣ‐３’（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１３）で遺伝子Ｏｃｔ４のプロモーター領域を増幅させた。ＰＣＲについて、バイサルファイト修飾したＤＮＡ（５０ｎｇ）を１ｘＰＣＲ緩衝液にプライマー（総計１００ｐｍｏｌ）と混合し、２分間かけて９４℃に加熱した後、すぐに、氷で冷やした。次に、高精度拡大ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）により９４℃で１分間、７０℃で３分間のように、ＰＣＲを２５サイクル行った。正しいサイズのＰＣＲ産物をさらに３％のアガロースゲル電気泳動で分留し、ゲル抽出フィルタ（Ｑｉａｇｅｎ）で純化して、ＤＮＡ配列決定に用いた。その後、変換したＤＮＡ配列における変化しないシトシンを未変換のＤＮＡ配列と比較することにより、ＤＮＡメチル化部位の詳しいプロファイルを作成した。
【００８０】
６.フローサイトメトリー
１ｍｌの事前冷却されたメタノールの７０％のＰＢＳにおいて−２０℃で再懸濁により１時間かけて細胞のトリプシン化、顆粒化、固定を行った。それらの細胞を顆粒化し、１ｍｌのＰＢＳで１度洗浄した後、再度顆粒化し、１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、０．５μｇ／ｍｌのＰＢＳにおけるＲＮＡｓｅに３７℃で３０分間再懸濁した。その後、約１５，０００個の細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）上で分析した。パルス面積に対しるパルス幅をプロットし単一細胞をゲーティングすることにより、細胞ナダブレットを排除した。「Ｗａｔｓｏｎ  Ｐｒａｇｍａｔｉｃ」アルゴリズムによるソフトウェアパッケージＦｌｏｗｊｏを使用して収集されたデータを分析した。
【００８１】
７.皮膚創傷治癒モデルと生体内ＣＤ３４+ＡＳＣ拡大
ランドレースは、中東欧諸国に最も多く存在する垂れ耳の白い豚の品種である。皮膚創傷モデルの確立に用いられた雄のランドレース豚は、特別に指定された人員と充分な資格のある獣医師に監督されるＡＴＩＴにより提供しケアをした。それらの監視の下、台湾の動物愛護法に従った適切なケアをした上でこれらの動物を提供した。これらの豚は、平均３カ月の年齢があり、それぞれ１８〜２３ｋｇの体重を持つ。研究の最後に、すべての動物を安楽死させた。
【００８２】
Ｚｏｌｅｔｉｌ５０（６ｍｇ／ｋｇ）を使用して動物を安楽死させ、後で背中を剃った。滅菌された手術用メスで六つ（６）の全層正方形の傷（各々が２ｃｍ×２ｃｍまたは４ｃｍ２）を生成し、各動物の右側と左側にそれぞれ三つの傷を付けた。各傷は、それぞれ、（Ａ）ｉＰＳＣ溶解液（５ｍｇ／ｍＬ）、（Ｂ）配合されたｍｉＲ‐３０２前駆体（１ｍｇ／ｍＬ）と（Ｃ１）空白、または（Ｃ２）ｍｉＲ‐４３４ｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する０．５ｍＬの抗生物質軟膏で局所処置を受けた。０、１、２、３、４、５、７、９、１１、１４と１７日目に処置を行った。０、１、２、３、４、５、７、９、１１、１４、１７と２０日目にソニーのＤＳＣ−Ｈ９カメラで各傷の写真を撮った。各時点の傷の面積は、画像処理ソフトウェアのＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ７．０を用いて決定した。各処置時点の創傷治癒または癒合の割合は式（０日目の傷面積−Ｎ日目の傷面積）／０日目の傷面積×１００に従って計算された。また、各傷から組織試料を収集し、Ｈ＆Ｅ染色用の組織学切片の準備に用いられる前に、１０％（ｖ／ｖ）のホルマリン溶液に浸した。
【００８３】
８.統計分析
すべてのデータを平均と標準偏差（ＳＤ）として示した。各試験組の平均値はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌのＡＶＥＲＡＧＥで計算した。ＳＤはＳＴＤＥＶで計算が行われた。データの統計分析を一元配置ＡＮＯＶＡにより行った。ＴｕｋｅｙとＤｕｎｎｅｔｔのｔ事後測定を利用して各組のデータ差異の顕著さを確認した。ｐ<０．０５の場合、顕著であると考えられる（ＳＰＳＳ  ｖ１２．０、Ｃｌａｒｉｔａｓ  Ｉｎｃ）。
【００８４】
参考文献：
１．Ａａｓｅｎなど、（２０１０）誘発された多能性幹細胞の生成用の皮膚または引き抜いた髪からの人間ケラチノサイトの単離と培養、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５、３７１〜３８２。
２．Ｃｈｅｎ  ＳＫＪとＬｉｎ  ＳＬ、（２０１３）マイクロＲＮＡ誘導型多能性幹細胞生成についての最近特許、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ｏｎ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：５〜１６。
３．Ｌｉｎ  ＳＬ、Ｃｈａｎｇ  Ｄ、Ｃｈａｎｇ‐Ｌｉｎ  Ｓ、Ｌｉｎ  ＣＨ、Ｗｕ  ＤＴＳ、Ｃｈｅｎ  ＤＴとＹｉｎｇ  ＳＹ、（２００８）Ｍｉｒ‐３０２が人間の皮膚癌細胞を多能性ＥＳ細胞様の状態に再プログラムする、ＲＮＡ  １４、２１１５〜２１２４。
４．Ｌｉｎ  ＳＬとＹｉｎｇ  ＳＹ、（２００８）ｍｉｒ‐３０２マイクロＲＮＡファミリーの幹細胞多能性と再生における役割、Ｙｉｎｇ  ＳＹ、（Ｅｄ.）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ、スプリンガー出版社、ニューヨーク、ｐｐ１６７〜１８５。
５．Ｌｉｎ  ＳＬ、Ｃｈａｎｇ  Ｄ、Ｙｉｎｇ  ＳＹ、Ｌｅｕ  ＤとＷｕ  ＤＴＳ、（２０１０）マイクロＲＮＡｍｉＲ‐３０２がＣＤＫ２とＣＤＫ４／６細胞サイクル経路の連携抑制により人間の多能性幹細胞の造腫瘍能を抑制する、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７０、９４７３〜９４８２。
６．Ｌｉｎ  ＳＬ、Ｃｈａｎｇ  Ｄ、Ｌｉｎ  ＣＨ、Ｙｉｎｇ  ＳＹ、Ｌｅｕ  ＤとＷｕ  ＤＴＳ、（２０１１）誘導性ｍｉｒ‐３０２発現を介した体細胞再プログラムの調節、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３９、１０５４〜１０６５。
７．Ｌｉｎ  ＳＬとＹｉｎｇ  ＳＹ、（２０１３）イントロンのマイクロＲＮＡｍｉＲ‐３０２の誘発により腫瘍無きｉＰＳ細胞を生成するメカニズムと方法、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ.９３６、２９５〜３１２。
８．Ｌｉｎ  ＳＬ、（２０１８）新規な砂糖様ＲＮＡ保護材料の識別と単離：多能性幹細胞からのグリシルグリセリン、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ.１７３３、３０５〜３１６。
９．Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎ  ＳとＧｕｒｄｏｎ  Ｊ、（２００４）ＤＮＡ脱メチル化は体細胞核のエピジェネティックな再プログラムに必要である、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.６、９８４〜９９０。
１０．Ｔａｋａｈａｓｈｉなど（２００６）マウスの胚性と成体繊維芽細胞培養からの特定の因子による多能性幹細胞の誘発、Ｃｅｌｌ、１２６、６６３〜６７６。
１１．Ｗａｎｇなど（２００８）胚性幹細胞固有のマイクロＲＮＡはＧ１からＳへの転換を調節し高速な増殖を促進する、Ｎａｔ. Ｇｅｎｅｔ.４０、１４７８〜１４８３。
１２．Ｗｅｒｎｉｇなど（２００７）繊維芽細胞の多能性ＥＳ細胞様状態へのインビトロ再プログラム、Ｎａｔｕｒｅ、４４８、３１８〜３２４。
１３．Ｘｕ  ＲＨ、Ｐｅｃｋ  ＲＭ、Ｌｉ  ＤＳ、Ｆｅｎｇ  Ｘ、Ｌｕｄｗｉｇ  ＴとＴｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ（２００５）塩基性ＦＧＦとヒトＥＳ細胞のＢＭＰシグナル維持の未分化増殖の抑制、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２、１８５〜１９０。
１４．Ｙｉｎｇ  ＱＬ、Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｊ、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＩとＳｍｉｔｈ  Ａ、（２００３）、Ｉｄタンパク質のＢＭＰ誘発は、ＳＴＡＴと共同で分化を抑制し胚性幹細胞の自己複製を継続させる、Ｃｅｌｌ、１１５、２８１〜２９２。
１５．Ｙｉｎｇ  ＳＹ、Ｆａｎｇ  ＷとＬｉｎ  ＳＬ、（２０１８）ｍｉＲ‐３０２を媒介とした誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）：複数の相乗的再プログラムメカニズム、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ.１７３３、２８３〜３０４。
１６．Ｙｕ他（２００７）、ヒト体細胞由来の誘性多能性幹細胞株、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８、１９１７〜１９２０。
１７．Ｌｉｎの欧州特許ＥＰ２１９８０２５。
１８．Ｌｉｎの米国特許第９，３８７，２５１号。
１９．Ｌｉｎの米国特許第９，３９４，５３８号。
２０．Ｌｉｎの米国特許第９，４２２，５５９号。
２１．Ｌｉｎの米国特許第９，５６７，５９１号。
２２．Ｌｉｎの米国特許第９，８７９,２６３号。
２３．Ｌｉｎの米国特願第１２／３１８，８０６号。
２４．Ｌｉｎの米国特願第１３／５７２，２６３号。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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