(57)【要約】  本開示の実施形態は、調製された線維芽細胞及び／又はそれからの調整培地の使用のための方法及び組成物を含む。特定の実施形態において、調製された線維芽細胞は増強された再生を有し、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子の分泌の増加を有し得る；抗アポトーシス活性の増加を有し得る；及び／又は調節された免疫原性を有し得る。特定の実施形態において、線維芽細胞は、低酸素及び／又は一酸化炭素への曝露によって調製される。【選択図】図１
2021506303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞におけるネイティブヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）−１発現の刺激、外因的に提供されたＨＯ−１への線維芽細胞の曝露、及び／又は線維芽細胞における外因的に提供されたベクターからのＨＯ−１の発現を含む、１つ以上の薬剤及び／又は条件の有効量を線維芽細胞に提供する工程
を含む、複数の線維芽細胞の治療活性を増強する方法。
【請求項２】
治療活性が、線維芽細胞の再生活性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
線維芽細胞が、１つ以上のサイトカイン及び／又は成長因子の分泌の増加を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
線維芽細胞が抗アポトーシス活性の増加を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
線維芽細胞の免疫原性が調節される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上の薬剤及び／又は状態が、低酸素、一酸化炭素、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
一酸化炭素が、低酸素に続いて線維芽細胞に提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
一酸化炭素が低酸素と同時に線維芽細胞に提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
線維芽細胞及び／又はそこからの馴化培地の有効量が個体に提供される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
個体が、自己免疫疾患、変性疾患、炎症性疾患、及び／又は線維性疾患を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
馴化培地が、１つ以上の成長因子及び／又は１つ以上のサイトカインを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
低酸素が、０．１％〜１０％、０．１％〜５％、０．１％〜２．５％、又は０．１％〜１％の酸素である、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
低酸素が、３０分〜３日の間以上又は以下などの期間にわたって起こる、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
線維芽細胞が、低酸素、一酸化炭素、又はそれらの組み合わせへの曝露の前に、１つ以上の成長因子に曝露される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
線維芽細胞を、低酸素、一酸化炭素、又はその両方の有効量に曝露する工程を含む、線維芽細胞を調製する方法。
【請求項１６】
線維芽細胞が、低酸素及び一酸化炭素に同時に曝露される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
線維芽細胞が、異なる時点で低酸素及び一酸化炭素に曝露される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
線維芽細胞が、一酸化炭素への曝露前に低酸素に曝露される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
線維芽細胞及び／又はそこからの馴化培地が、それを必要とする個体に有効量で提供される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
個体が、自己免疫疾患、変性疾患、炎症性疾患、及び／又は線維性疾患を有する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、生物化学、細胞療法、及び医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞の主要な機能の１つは、細胞外マトリックスの前駆体を連続的に分泌することによって結合組織の構造的完全性を維持することである。線維芽細胞は、細胞外マトリックスの全ての成分の前駆体、主に基質及び種々の繊維又は構造タンパク質を分泌する。それらはまた、組織応答を増強するために、隣接する細胞の機能及び産物に影響を及ぼし調整する、低分子量の拡散性因子を分泌する。細胞外マトリックスの組成は、結合組織の物理的性質を顕著に決定する。線維芽細胞は体内の多くのプロセスに関与している。創傷治癒は、線維芽細胞活性の調節を含む多数のプロセスの組み合わせの活性化を必要とする複雑なプロセスである。皮膚線維芽細胞は、創傷治癒プロセス中に創傷床に移動し、そこで創傷細胞が分泌するトランスフォーミング増殖因子−１マトリックス分子（例えば、フィブロネクチンスプライスバリアント）及び機械的な合図（すなわち、マトリックス張力）が筋線維芽細胞へのそれらの分化を開始する。筋線維芽細胞は、平滑筋αアクチンを発現し、収縮性ミクロフィラメントの束を含み、広範な細胞間接着部位を有することから、皮膚線維芽細胞と区別することができる。筋線維芽細胞は、細胞外マトリックスを合成し、蓄積、再構築して肉芽組織を形成し、それによって創傷を収縮させる。治癒過程で形成される結合組織は、しばしば線維性であることが多く、一般的には線維化として知られる過程によって結合組織瘢痕が形成される。自己線維芽細胞（すなわち、培養線維芽細胞のレシピエントでもあるドナーから得られる線維芽細胞）を使用する治療方法は、当該分野で公知である。このような線維芽細胞の公知の用途の中には、培養線維芽細胞を投与することによって、上皮創傷又は瘻孔などの創傷の治癒を促進する方法；声帯欠損に亜隣接（sub-adjacent）する組織の増強による矯正手術の方法；並びに声帯瘢痕の治療、及び、皮膚及び軟組織欠損の修復の方法がある。再生医療における線維芽細胞の利用に関する多数の可能性にもかかわらず、現在線維芽細胞治療的利用を制限している要因は、線維芽細胞の再生活性を最適化する手段が欠如していることである。本開示は、この必要性に対する解決策を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示の実施形態は、線維芽細胞がそのように調製されていない線維芽細胞に欠けている１つ以上の属性を有するような、線維芽細胞の調製に関する方法及び組成物を含む。特定の実施形態において、線維芽細胞は、増強された再生特性を有するように調製される。特定の実施形態において、線維芽細胞は１つ以上のサイトカイン及び／又は１つ以上の成長因子の分泌が増加し、それらは、抗アポトーシス活性が増加し、及び／又は線維芽細胞の免疫原性が調節される。特定の実施形態において、線維芽細胞は、低酸素及び／又は一酸化炭素に同様に曝露されていない線維芽細胞と比較して線維芽細胞の再生能力が十分なレベルで増強されるように、十分なレベルで低酸素及び／又は一酸化炭素に曝露される。
【０００４】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞及び／又はそれから調整された培地は、それを必要とする個体に提供される。特定の実施形態では、個体は、医学的状態に続いて、場合によっては局所部位を含む、細胞又は組織の補充を必要とする医学的状態を有する。馴化培地は、１つ以上の増殖因子、１つ以上のサイトカイン、１つ以上のペプチド、１つ以上のタンパク質及び／又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０００５】
本開示の実施形態は、線維芽細胞におけるネイティブヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）−１発現の刺激、線維芽細胞の外因的に提供されるＨＯ−１への曝露、及び／又は線維芽細胞における外因的に提供されるベクターからのＨＯ−１の発現を含む、有効量の１つ以上の薬剤及び／又は１つ以上の条件を線維芽細胞に提供する工程を包含する、複数の線維芽細胞の治療活性を増強する方法を包含する。特定の実施形態において、治療活性は、線維芽細胞の再生活性を含む。線維芽細胞は、１つ以上のサイトカイン及び／又は１つ以上の成長因子の分泌の増加を有し得る；線維芽細胞は、抗アポトーシス活性の増加を有し得る；及び／又は線維芽細胞の免疫原性が、例えば、減少又は増加するように調節される。特定の実施形態では、１つ以上の薬剤及び／又は状態は、低酸素、一酸化炭素、又はそれらの組み合わせを含む。一酸化炭素は、低酸素に続いて線維芽細胞に提供され得る。一酸化炭素は、低酸素と同時に線維芽細胞に供給されてもよい。
【０００６】
特定の実施形態では、有効量の線維芽細胞及び／又はそこからの馴化培地が個体に提供される。個体は線維芽細胞及び／又はそこからの調整培地が治療的である医学的状態を有し得、例えば、少なくとも１つの症状の改善を可能にする。特定の実施形態では、医学的状態が自己免疫疾患、変性疾患、炎症性疾患、及び／又は線維性疾患である。馴化培地は、１つ以上の増殖因子及び／又は１つ以上のサイトカインを含み得る。低酸素は、例えば、０．１％〜１０％、０．１％〜５％、０．１％〜２．５％、又は０．１％〜１％の酸素であり得る。特定の実施形態では、低酸素は、３０分〜３日以上又は以下の間にわたって起こるが、場合によっては３０分未満又は３日を超えてもよい。線維芽細胞は低酸素、一酸化炭素、又はそれらの組み合わせへの曝露の前及び／又は曝露中に、１つ以上の増殖因子に曝露され得る。
【０００７】
一実施形態として、線維芽細胞を有効量の低酸素、一酸化炭素、又はその両方に曝露する工程を含む、線維芽細胞を調製する方法が挙げられる。特定の実施形態において、線維芽細胞は、低酸素及び一酸化炭素に同時に曝露される。特定の実施形態において、線維芽細胞は、異なる時点で低酸素及び一酸化炭素に曝露される。場合によっては、線維芽細胞が一酸化炭素に曝露される前に低酸素に曝露される。特定の場合において、線維芽細胞及び／又はそれからの馴化培地は、それを必要とする個体に有効量で提供される。個体は、自己免疫疾患、変性疾患、炎症性疾患、及び／又は線維性疾患を有していてもよい。
【０００８】
上記は以下の詳細な説明がより良く理解され得るように、本開示の特徴及び技術的利点をかなり広く概説した。本明細書の特許請求の範囲の主題を形成する追加の特徴及び利点を以下に説明する。開示された概念及び特定の実施形態は本設計の同じ目的を実行するために他の構造を修正又は設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されるべきである。また、そのような同等の構成は、添付の特許請求の範囲に記載される精神及び範囲から逸脱しないことが当業者によって理解されるべきである。本明細書に開示される設計の特徴であると考えられる新規な特徴はさらなる目的及び利点とともに、動作の構成及び方法の両方に関して、添付の図面と関連して考慮される場合、以下の説明からより良く理解される。しかしながら、各図は、例示及び説明の目的のためだけに提供され、本開示の限定の定義として意図されないことが明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本開示をより完全に理解するために、添付の図面と併せて以下の説明を参照する：
【００１０】
【図１】図１は、低酸素、一酸化炭素、又は一酸化炭素の後の低酸素による、線維芽細胞の培養によるＶＥＧＦ産生の刺激を示す。
【００１１】
【図２】図２は、低酸素、一酸化炭素、又は一酸化炭素と同時の低酸素による、線維芽細胞の培養によるＶＥＧＦ産生の刺激を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において用いられているように、「ａ」又は「ａｎ」は１つ又はそれ以上のものを意味することがある。本明細書において用いられているように、「含む」という用語とともに用いられている場合、「ａ」又は「ａｎ」という用語は１つ又は複数を意味することもある。本文中で用いられているように、「もう一つの」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味し得る。特定の実施形態において、本開示の態様は、例えば、本開示の１つ又はそれ以上の順序から「本質的になる」こともある。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／又は方法から構成されてもよく、又はそれらから本質的になっていてもよい。本明細書中に記載されるいずれの方法又は組成物も、本明細書中に記載される任意の他の方法又は組成物に関して使用され得ることが意図される。本開示の方法及び／又は組成物の文脈において議論される実施形態は、本明細書に記載される任意の他の方法又は組成物に関して採用されてもよい。従って、１つの方法又は組成物に関連する実施形態は、本開示の他の方法及び組成物にも適用され得る。
【００１３】
本開示は少なくとも細胞療法の分野に関し、より具体的には、本開示が線維芽細胞自体の再生活性を増強するための、特定の培養条件下での培養による線維芽細胞の再生活性の増強に関する。本開示は、さらに、線維芽細胞の治療活性を増加させることができる細胞プログラムを誘導するための、１つ以上の細胞培養条件の改変に関する。本明細書中で使用される場合、用語「再生活性」は、いくつかの実施形態において、細胞及び組織を新たに（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生成する能力として定義される。
【００１４】
特定の実施形態では、線維芽細胞に対する再生活性などの活性又は活性を増強する１つ又は複数の薬剤又は条件の有効量を線維芽細胞に提供することによって、複数の線維芽細胞の１つ又は複数の治療活性を増強する方法がある。次いで、改変されていない場合の活性と比較してより大きな再生活性を有する改変された線維芽細胞は、種々の目的、例えば、細胞（哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなど）内におけるものを含む）の治療的使用のために利用され得る。
【００１５】
Ｉ．線維芽細胞、その改変、及び産生方法
【００１６】
再生能力における線維芽細胞の治療活性の増強に関する方法及び組成物を開示する。特定の実施形態では、線維芽細胞が１つ以上の薬剤及び／又は状態によるヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）−１発現の刺激によって増強され、刺激は直接的であってもなくてもよい。このような増強は、（１）ＨＯ−１の内在的発現を増加させる１つ以上の剤及び／又は条件への線維芽細胞の曝露、（２）外来的に供給されたＨＯ−１に対する線維芽細胞の曝露、及び／又は（３）例えばＨＯ−１を発現する線維芽細胞において外来的に提供されたベクターからＨＯ−１が発現した場合における、線維芽細胞の外来性ＨＯ−１に対する曝露、によって起こる可能性がある。特定の実施形態では、１つ以上の薬剤は、一酸化炭素（ＣＯ）、低酸素、又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、ＣＯ及び低酸素の両方が線維芽細胞に提供される場合、それらの曝露の順序は特定である。ある場合には、それらは同時に線維芽細胞に供給されるが、他の場合にはそれらは異なる時期に線維芽細胞に供給され、そしてある場合には別々の時期にそれら両方が同時に細胞に供給される。ある場合には、ＣＯは低酸素の前に線維芽細胞に供給されるが、他の場合には、ＣＯは低酸素の後に線維芽細胞に供給される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞を処理して、それらの再生活性を増強する方法があり、これは以下のステップを含む：ａ）任意選択で、線維芽細胞集団を得るステップ（線維芽細胞は、別の者によって入手されてもよく、又は貯蔵したものから入手されてもよく、又は商業的に入手されてもよい）、ｂ）例えば低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αのアップレギュレーションを誘導するために十分な時間低酸素に曝露することによって、線維芽細胞集団をプライミングするステップ、及びｃ）任意選択で、低酸素に曝露した後、ＨＯ−１のアップレギュレーションを誘導するために十分な濃度及び時間で、線維芽細胞をＣＯで処理するステップ。
【００１８】
特定の実施形態において、線維芽細胞は、サイトカイン分泌、抗アポトーシス活性のアップレギュレーション、及び／又は免疫原性の調節についてのそれらの活性において、本明細書中に包含される方法によって増強される。特定の実施形態において、再生活性は、ａ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−１；ｂ）ＦＧＦ−２；ｃ）ＦＧＦ−５；ｄ）ＦＧＦ−１２；ｅ）ＩＬ−１０；ｆ）白血病阻害因子；ｆ）インスリン成長因子；ｇ）上皮成長因子；ｈ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；及びｉ）それらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインなどの、１つ以上のサイトカインの産生を増強することを含む。
【００１９】
再生活性は任意の種類であり得るが、特定の実施形態において、再生活性は、線維芽細胞が少なくとも軟骨細胞；脂肪細胞；及び／又は骨細胞を含む任意の他の型の細胞に分化する能力を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、再生活性は、例えば、少なくとも線維芽細胞；間葉系幹細胞；脊索細胞；及び／又は軟骨細胞前駆細胞を含む、任意のタイプの細胞に対して分裂促進性である馴化培地を産生する線維芽細胞の能力を含む。
【００２１】
特定の実施形態において、線維芽細胞は１つ以上の特定の条件（特定の期間の間の条件の曝露又はその条件のための他の形態のパラメーターを含む）への曝露後に、増強された再生活性を有する。特定の実施形態において、線維芽細胞は、低酸素環境に曝露される。一例として、低酸素環境における線維芽細胞のインキュベーションは、０．１％〜１０％酸素；０．１％〜９％；０．１％〜８％；０．１％〜７％；０．１％〜６％；０．１％〜５％；０．１％〜４％；０．１〜３％；０．１％〜２％；０．１〜１％；０．１％〜０．７５％；０．１％〜０．５％；０．２５％〜１０％；０．２５％〜９％；０．２５％〜８％；０．２５％〜７％；０．２５％〜６％；０．２５％〜５％；０．２５％〜４％；０．２５％〜３％；０．２５％〜２％；０．２５％〜１％；０．２５％〜０．７５％；０．２５％〜０．５％；０．５％〜１０％；０．５％〜９％；０．５％〜８％；０．５％〜７％；０．５％〜６％；０．５％〜５％；０．５％〜４％；０．５％〜３％；０．５％〜２％；０．５％〜１％；０．５％〜０．７５％；０．７５％〜１０％；０．７５％〜９％；０．７５％〜８％；０．７５％〜７％；０．７５％〜６％；０．７５％〜５％；０．７５％〜４％；０．７５％〜３％；０．７５％〜２％；０．７５％〜１％；１％〜９％；１％〜８％；１％〜７％；１％〜６％；１％〜５％；１％〜４％；１％〜３％；１％〜２％；２％〜９％；２％〜８％；２％〜７％；２％〜６％；２％〜５％；２％〜４％；２％〜３％；３％〜９％；３％〜８％；３％〜７％；３％〜６％；３％〜５％；３％〜４％；４％〜９％；４％〜８％；４％〜７％；４％〜６％；４％〜５％；５％〜９％；５％〜８％；５％〜７％；５％〜６％；６％〜９％；６％〜８％；６％〜７％；７％〜９％；７％〜８％；又は８％〜９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２５％、１．５％、１．７５％、２．０％、２．２５％、２．５％、２．７５％、３％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９％、又は１０％以上又は以下の条件で行われる。
【００２２】
場合によっては、線維芽細胞の低酸素環境への曝露は、特定の期間起こり、この時間は継続的であっても、継続的でなくてもよい。特定の実施形態では、低酸素環境における線維芽細胞のインキュベーションは、例えば、３０分〜３日；３０分〜２日；３０分〜１日；３０分〜１８時間；３０分〜１２時間；３０分〜８時間；３０分〜６時間；３０分〜４時間；３０分〜２時間；３０分〜１時間；４５分〜３日；４５分〜２日；４５分〜１日；４５分〜１８時間；４５分〜１２時間；４５分〜８時間；４５分〜６時間；４５分〜４時間；４５分〜２時間；４５分〜１時間；６０分〜３日；６０分〜２日；６０分〜１日；６０分〜１８時間；６０分〜１２時間；６０分〜８時間；６０分〜６時間；６０分〜４時間；６０分〜２時間；６０分〜１時間；２時間〜３日；２時間〜２日；２時間〜１日；２時間〜１８時間；２時間〜１２時間；２時間〜８時間；２時間〜６時間；２時間〜４時間；２時間〜３時間；６時間〜３日；６時間〜２日；６時間〜１日；６時間〜１８時間；６時間〜１２時間；６時間〜８時間；８時間〜３日；８時間〜２日；８時間〜１日；８時間〜１８時間；８時間〜１２時間；８時間〜１０時間；１２時間〜３日；１２時間〜２日；１２時間〜１日；１２時間〜１８時間；１８時間〜３日；１８時間〜２日；１８時間〜１日；１日〜３日；又は２日〜３日、の期間以上又は以下で行われる。特定の実施形態では、インキュベーションは、例えば、１〜８；１〜７；１〜６；１〜５；１〜４；１〜３；１〜２；２〜８；２〜７；２〜６；２〜５；２〜４；２〜３；３〜８；３〜７；３〜６；３〜５；３〜４；４〜８；４〜７；４〜６；４〜５；５〜８；５〜７；５〜６；６〜８；６〜７；又は７〜８時間行われる。
【００２３】
特定の実施態様において、繊維芽細胞は、特定のレベルのＣＯに曝露される。特定の実施形態では、線維芽細胞のＣＯとのインキュベーションは、例えば、１〜５００ｐｐｍ（１００万分の１）；１〜４００ｐｐｍ；１〜３００ｐｐｍ；１〜２５０ｐｐｍ；１〜２００ｐｐｍ；１〜１７５ｐｐｍ；１〜１５０ｐｐｍ；１〜１２５ｐｐｍ、１〜１００ｐｐｍ；１〜７５ｐｐｍ；１〜５０ｐｐｍ；１〜２５ｐｐｍ；１〜１０ｐｐｍ；１０〜５００ｐｐｍ；１０〜４００ｐｐｍ；１０〜３００ｐｐｍ；１０〜２５０ｐｐｍ；１０〜２００ｐｐｍ；１０〜１５０ｐｐｍ；１０〜１２５ｐｐｍ；１０〜１００ｐｐｍ；１０〜７５ｐｐｍ；１０〜５０ｐｐｍ；１０〜２５ｐｐｍ；２５〜５００ｐｐｍ；２５〜４００ｐｐｍ；２５〜３００ｐｐｍ；２５〜２５０ｐｐｍ；２５〜２００ｐｐｍ；２５〜１７５ｐｐｍ；２５〜１５０ｐｐｍ；２５〜１２５ｐｐｍ；２５〜１００ｐｐｍ；２５〜７５ｐｐｍ；２５〜５０ｐｐｍ；５０〜５００ｐｐｍ；５０〜４００ｐｐｍ；５０〜３００ｐｐｍ；５０〜２００ｐｐｍ；５０〜１７５ｐｐｍ；５０〜１５０ｐｐｍ；５０〜１２５ｐｐｍ；５０〜１００ｐｐｍ；５０〜７５ｐｐｍ；７５〜５００ｐｐｍ；７５〜４００ｐｐｍ；７５〜３００ｐｐｍ；７５〜２５０ｐｐｍ；７５〜２２５ｐｐｍ；７５〜２００ｐｐｍ；７５〜１７５ｐｐｍ；７５〜１５０ｐｐｍ；７５〜１２５ｐｐｍ；７５〜１００ｐｐｍ；１００〜５００ｐｐｍ；１００〜４００ｐｐｍ；１００〜３００ｐｐｍ；１００〜２００ｐｐｍ；１００〜１５０ｐｐｍ；１００〜１２５ｐｍ；１２５〜５００ｐｐｍ；１２５〜４００ｐｐｍ；１２５〜３００ｐｐｍ；１２５〜２７５ｐｐｍ；１２５〜２００ｐｐｍ；１２５〜１７５ｐｐｍ；１２５〜１５０ｐｐｍ；１５０〜５００ｐｐｍ；１５０〜４００ｐｐｍ；１５０〜３００ｐｐｍ；１５０〜２００ｐｐｍ；１５０〜１７５ｐｐｍ；１７５〜５００ｐｐｍ；１７５〜４００ｐｐｍ；１７５〜３００ｐｐｍ；１７５〜２７５ｐｐｍ；１７５〜２５０ｐｐｍ；１７５〜２２５ｐｐｍ；１７５〜２００ｐｐｍ；２００〜５００ｐｐｍ；２００〜４００ｐｐｍ；２００〜３００ｐｐｍ；２００〜２５０ｐｐｍ；２５０〜５００ｐｐｍ；２５０〜４００ｐｐｍ；２５０〜３００ｐｐｍ；２５０〜２７５ｐｐｍ；３００〜５００ｐｐｍ；３００〜４００ｐｐｍ又は４００〜５００ｐｐｍの濃度以上又は以下で行われる。特定の場合において、線維芽細胞のＣＯとのインキュベーションは、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５ｐｐｍ又はそれ以上のｐｐｍ（１００万分の１）の濃度で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０時間又はそれ以上行われる。
【００２４】
特定の実施形態において、線維芽細胞は上記のように特定の期間、例えば、３０分〜３日；３０分〜２日；３０分〜１日；３０分〜１８時間；３０分〜１２時間；３０分〜８時間；３０分〜６時間；３０分〜４時間；３０分〜２時間；３０分〜１時間；４５分〜３日；４５分〜２日；４５分〜１日；４５分〜１８時間；４５分〜１２時間；４５分〜８時間；４５分〜６時間；４５分〜４時間；４５分〜２時間；４５分〜１時間；６０分〜３日；６０分〜２日；６０分〜１日；６０分〜１８時間；６０分〜１２時間；６０分〜８時間；６０分〜６時間；６０分〜４時間；６０分〜２時間；６０分〜１時間；２時間〜３日；２時間〜２日；２時間〜１日；２時間〜１８時間；２時間〜１２時間；２時間〜８時間；２時間〜６時間；２時間〜４時間；２時間〜３時間；６時間〜３日；６時間〜２日；６時間〜１日；６時間〜１８時間；６時間〜１２時間；６時間〜８時間；８時間〜３日；８時間〜２日；８時間〜１日；８時間〜１８時間；８時間〜１２時間；８時間〜１０時間；１２時間〜３日；１２時間〜２日；１２時間〜１日；１２時間〜１８時間；１８時間〜３日；１８時間〜２日；１８時間〜１日；１日〜３日；又は２日〜３日、の期間以上又は以下で行われる。特定の実施形態では、インキュベーションは、例えば、１〜８；１〜７；１〜６；１〜５；１〜４；１〜３；１〜２；２〜８；２〜７；２〜６；２〜５；２〜４；２〜３；３〜８；３〜７；３〜６；３〜５；３〜４；４〜８；４〜７；４〜６；４〜５；５〜８；５〜７；５〜６；６〜８；６〜７；又は７〜８時間行われる。
【００２５】
特定の実施形態では、細胞は、ＣＯでの処置の前に低酸素で処置されるが、他の実施形態では、細胞がＣＯでの処置の間及び／又は後に低酸素で処置される。特定の実施形態では、ＣＯ処理に続いて、低酸素に細胞を連続的に曝露すると、線維芽細胞に相乗効果（例えば、線維芽細胞による相乗的な成長因子の産生）がある。
【００２６】
特定の実施形態では、本開示は、線維芽細胞の培養条件の改変によって線維芽細胞の治療活性を増大させる方法を提供する。特定の実施形態において、低濃度の一酸化炭素と共に、低酸素下での線維芽細胞の培養による再生活性の刺激に関して以前には開示されていない相乗効果が存在する。一実施形態において、線維芽細胞は、治療用途のための１つ以上の因子及び／又は他の薬剤を含む馴化培地を産生する目的のために、１つ以上の薬剤及び／又は１つ以上の培養条件に曝露される。
【００２７】
特定の場合において、線維芽細胞（１つ以上の特定の剤及び／又は培養条件への曝露後）は馴化培地の供給源として利用される；特定の場合において、馴化培地は１つ以上の特定の成長因子又は他の薬剤を含む。特定の実施形態において、線維芽細胞によって産生された馴化培地は将来の使用のために保存されるか、又は培地は最初に保存されることなく使用され得る。いくつかの場合において、線維芽細胞は馴化培地を産生し、そしてこの培地は、線維芽細胞が得られた個体に提供される。他の場合において、線維芽細胞は馴化培地を産生し、そしてこの培地は、線維芽細胞が得られたもの以外の個体に提供される。馴化培地は、患者特異的コンテクスト（自己線維芽細胞を使用）又はユニバーサルドナーコンテクスト（同種線維芽細胞を使用）で生成することができる。
【００２８】
特定の実施形態では、線維芽細胞馴化培地は、例として、創傷治癒の促進、血管新生の誘導を含む任意の適用のために、及び／又は美容手段のために利用されてもよい。特定の実施形態において、線維芽細胞は、再生特性を増強する条件に曝露され、間葉系幹細胞を含む幹細胞の補充物又は代替物として個体に投与される。一実施形態において、線維芽細胞は、椎間板再生の刺激のために椎間板内を含む、個体の特定の部位に注射される。本明細書中に開示されるような線維芽細胞再生活性の増強は、低酸素への最初の曝露に続いてＨＯ−１を刺激する条件（特定の場合において、例えば、ＣＯ）への曝露を含む２工程プロセスによって達成され得る。
【００２９】
本開示の一態様では、線維芽細胞からの馴化培地産物の力価を分析することができる。特定の実施形態において、馴化培地は、例えば、タンパク質産生を評価するために分析され得る。このようなアッセイは、当業者に周知である。
【００３０】
馴化培地は抗炎症活性について分析され得、例えば、馴化培地は抗炎症剤として、又は１つ以上の他の抗炎症剤と共に使用され得るように、抗炎症活性を有し得る。抗炎症活性の定量化のために、用語「炎症」は物理的外傷、感染、慢性疾患、及び／又は外部刺激に対する化学的及び／又は生理学的反応（例えば、アレルギー応答の一部として）によって誘発され得る、局所的又は全身的保護応答によって特徴付けられる任意の状態を含むことが、当業者によって理解される。傷害物質と傷害組織の両方を破壊、希釈又は隔離するのに役立つ任意のそのような反応は、例えば、熱、腫脹、痛み、発赤、血管の拡張及び／又は血流の増加、白血球による患部への侵入、機能の喪失及び／又は炎症状態と関連することが知られている任意の他の症状によって発現され得る。従って、用語「炎症」はまた、任意の炎症性疾患、障害又は状態自体、それに関連する炎症成分を有する任意の状態、及び／又は症状として炎症を特徴とする任意の状態（とりわけ、急性、慢性、潰瘍性、特異的、アレルギー性及び壊死性炎症、並びに当業者に公知の他の形態の炎症を含む）を含むと理解される。従って、この用語はまた、本開示の目的のために、炎症性疼痛及び／又は炎症によって引き起こされる発熱を含む。
【００３１】
一実施形態では、馴化培地は、エクスビボ体外環境で生成される。具体的には、目的の線維芽細胞は、体外で、（例えば、１つ以上の基質上及び／又は中）で増殖される。特定の実施形態では、細胞は、例えば、連続体外システムに接続された中空繊維フィルターの外側で増殖される。中空繊維系は、宿主細胞を線維芽細胞と交換することなく、循環血液細胞と中空繊維の外側の培養細胞との間のタンパク質の交換を可能にするのに十分なサイズの孔を中空繊維中に有する。一実施形態において、線維芽細胞馴化培地は、その活性を増大させるために、１つ以上の免疫抑制剤と組み合わせて使用される。
【００３２】
線維芽細胞馴化培地は疾患寛解の処置及び／又は維持のために単独で使用されてもされなくてもよいが、いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫抑制剤の投与が特定の方法において利用されてもよい。さらに、免疫抑制剤は、「誘導療法」に有用であり得る。所望の疾患及び応答に依存して、種々の免疫抑制剤から選択することが当業者に公知である。例えば、いくつかの免疫抑制剤（例えば、抗ＣＤ５２抗体）は、Ｔ細胞及びＢ細胞の全身的な枯渇が所望される場合に使用され得る。他の場合には、制御性Ｔ細胞活性を同時に刺激する薬剤（例えば、ラパマイシン）が望ましい場合がある。当業者は、シクロスポリン、ラパマイシン、カンパス−１Ｈ、ＡＴＧ、プログラフ、抗ＩＬ−２ｒ、ＭＭＦ、ＦＴＹ、ＬＥＡ、シクロスポリンＡ、ジフチトックス、デニロイキン、レバミソール、アザチオプリン、ブレキナール、グスペリムス、６−メルカプトプリン、ミゾリビン、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、葉酸類似体（例えば、デノプテリン、エダトレキサート、メトトレキサート、ピリトレキシム、プテロプテリン、トムデクス（登録商標）、及びトリメトレキサート）、プリン類似体（例えば、クラドリビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、及びチアグアニン）、ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフル、エノシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、及びテガフール）、フルオシノロン、トリアミノロン、アネコルタブ酢酸塩、フルオロメトロン、メドリゾン、プレドニゾロン等を含む、免疫抑制を引き起こすためのいくつかの薬剤の例を導きうる。別の実施形態において、幹細胞馴化培地の使用は、既存の抗炎症剤を増強するために使用され得る。抗炎症剤は、ＮＳＡＩＤ、インターロイキン−１アンタゴニスト、ジヒドロオロテートシンターゼ阻害剤、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＮＦ−α阻害剤、ＴＮＦ−α隔離剤、及びメトトレキサートを含む１以上の薬剤を含み得る。より具体的には、抗炎症剤は、例えば、抗ＴＮＦ−α、リゾフィリン、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ペントキシフィリン、ＣＯＸ−２阻害剤、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメタゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコルト、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコルト、フルオロクロニド、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルプレドニデン酢酸塩、フルプレドニソロン、フルランドレノリド、フルチカゾンプロピオン酸エステル、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロベタゾールプロピオン酸エステル、ハロメタゾン、ハロプレドン酢酸エステル、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、ロテプレドノールエタボン酸エステル、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチル��レドニソロン、モメタゾンフランカルボン酸エステル、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２５−ジエチルアミノ−酢酸エステル、プレドニゾン、プレドニバール、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、チアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、トリアムシノロンヘキサアセトニド、アミノアリールカルボン酸誘導体（例えば、エンフェナム酸、エトフェナマート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナミン酸、メフェナム酸、ニフルム酸、タルニフルマート、テロフェナマート、トルフェナム酸）、アリール酢酸誘導体（例えば、アセクロフェナク、アセマタシン、アルクロフェナク、アムフェナク、アムトルメチングアシル、ブロムフェナク、ブフェキサマク、シンメタシン、クロピラク、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロジン酸、フェンチアザック、グルカメタシン、イブフェナック、インドメタシン、イソフェゾラク、イソクセパック、ロナゾラク、メチアジン酸、モフェゾラク、オキサメタシン、ピラゾラク、プログルメタシン、スリンダク、チアラミド、トルメチン、トロペシン、ゾメピラク）、アリール酪酸誘導体（例えば、ブマジゾン、ブチブフェン、フェンブフェン、ゼンブシン）、アリールカルボン酸（例えば、クリダナク、ケトロラク、チノリジン）、アリールプロピオン酸誘導体（例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン、ブクロキシン酸、カルプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルビプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、スプロフェン、チアプロフェン酸、キシモプロフェン、ザルトプロフェン）、ピラゾール（例えば、ジフェナミゾール、エピリゾール）、ピラゾロン（例えば、アパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾン、チアゾリノブタゾン）、サリチル酸誘導体（例えば、アセトアミノサロール、アスピリン、ベノリラート、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、ジフルニサル、エテルサル酸、フェンドサール、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、サリチル酸１−ナフチル、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミド−Ｏ−酢酸、サリチル硫酸、サルサラート、スルファサラジン）、チアジンカルボキサミド（例えば、アンピロキシカム、ドロキシカム、イソキシカム、ロルノキシカム、ピロキシカム、テノキシカム）、ε−アセトアミドカプロン酸、ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、α−ビサボロール、ブコローム、ジフェピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、フェプラジノール、グアヤズレン、ナブメトン、ニメスリ���、オキサセプロール、パラニリン、ペリソキサール、プロクアゾン、スーパーオキシドジスムターゼ、テニダップ、ジロイトン（ｚｉｌｅｕｔｏｎ）、カンデリラワックス、αビサボロール、アロエベラ、マンジスタ、グッガル、コーラエキス、カモミール、シーホイップエキス、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸、油溶性甘草エキス、グリチルリチン酸一アンモニウム、グリチルリチン酸一カリウム、グリチルリチン酸二カリウム、１−ベータ−グリチルリチン酸、ステアリルグリチルリチン酸、及び、３−ステアリルオキシ−グリチルレチン酸、３−スクシニルオキシ−ベータ−グリチルレチン酸二ナトリウム、又はそれらの組み合わせを含みうる。
【００３３】
本開示において利用される線維芽細胞は、一実施形態では、レシピエント自身の皮膚（自己調製物の場合）、又は１人以上の健康なドナーの皮膚（同種調製物の場合）の生検からの増殖によって生成され得る。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、若いドナーから使用されるが、ドナーは新生児、乳児、小児、青年、成人、又は高齢者を含む任意の年齢であり得る。別の実施形態において、線維芽細胞は、１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされる。特定の例において、線維芽細胞は、増強された増殖及びヘイフリック限界の克服を可能にするために、１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされる。このような遺伝子の例には、テロメラーゼ、ｈＴＥＲＴ、及び／又はＲＡＳ、ｃ−ｍｙｃ、ＲＡＦ、若しくはｂｃｒ−ａｂｌｅなどの１つ以上の癌遺伝子が含まれる。細胞の誘導に続いて、線維芽細胞は、標準的な細胞培養技術を使用して培養物中で増殖され得る。皮膚組織（真皮及び表皮層）は、いくつかの場合において、被験体の耳介後領域から生検され得る。一実施形態では、出発材料が標準的な無菌実施を使用して収集された複数の３ｍｍパンチ皮膚生検からなる。生検は、医師によって収集され、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むバイアルなどの適切な緩衝液を含む容器に配置され得る。生検材料は使用前に輸送することができ、例えば、適切な温度（例えば、２〜８℃）で輸送することができる。生検材料は、製造施設に適切に輸送することができる。一実施形態では、製造施設に到着した後、生検材料を検査し、受け入れられると、製造エリアに直接移送することができる。
【００３４】
細胞を調製するプロセスの開始時に、生検組織は酵素消化の前に洗浄され得る（例えば、洗浄され得る）。洗浄後、コラゲナーゼ及び／又は中性プロテアーゼ酵素の混合物（例えば、LiberaseTM Digestive Enzyme Solution（Lonza Walkersville, Inc.（Walkersville,Md）又はRoche Diagnostics Corp.（(Indianapolis, Ind.））を、細切かどうかを問わず、組織に添加し、次いで、生検組織を、適切な温度及び持続時間（例えば、３７．０±２℃）で１時間インキュベートし得る。生検組織消化の時間は、培養中の細胞の生存率及び増殖速度に影響を及ぼし得るプロセスパラメータである。LiberaseTMの代わりに、Serva Collagenase NB6（ハイデルベルク，ドイツ）のような他の市販のコラゲナーゼを使用してもよい。消化後、酵素を中和するために添加され得る、開始増殖培地（ＩＭＤＭ、ＧＡ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））などの適切な培地が、消化された材料に提供され得る。細胞は遠心分離などによってペレット化され、５．０ｍＬの開始増殖培地に再懸濁することができる。あるいは、遠心分離は行われず、酵素の完全な不活性化は、培地（例えば、開始増殖培地）のみの添加によっても生じる。細胞増殖及び増殖の開始のために、細胞懸濁液を適切な容器（例えば、Ｔ−１７５細胞培養フラスコ）に播種する前に、増殖開始培地を添加し得る。場合によっては、Ｔ−７５フラスコの代わりにＴ−７５フラスコ、Ｔ−１５０フラスコ、Ｔ−１８５フラスコ又はＴ−２２５フラスコを使用することができる。細胞を３７±２．０℃で５．０±１．０％ＣＯ２と共にインキュベートし、３〜５日毎などの適当な間隔で完全増殖培地などの新鮮な培地を供給する。プロセスにおける供給は培地（完全増殖培地など）の一部（約半分など）を除去し、同じ容量の新鮮な培地で置き換えることによって行うことができる。あるいは、完全なフィードを行うことができる。一実施形態において、細胞は、継代前の特定の日数（例えば、約３０日）を超えてフラスコ中に残されず、そして継代の少なくとも２４時間前に残され得る。プロセス全体を通して、培養分裂の間の適切な播種密度を確実にするために、コンフルエンスがモニターされる。細胞コンフルエンスが容器中の特定のパーセンテージ（約４０％〜約７０％など）以上である場合、使用済み培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡで処理して、フラスコ中の接着細胞を溶液中に放出させることによって、細胞を継代することができる。次いで、細胞をトリプシン処理し、適切な容器（例えば、Ｔ−５００フラスコ）に播種して、細胞増殖を続けることができる。あるいは、１つ又は２つのＴ−３００フラスコ、１層セルスタック（１ＣＳ）、１層セルファクトリ（１ＣＦ）又は２層セルスタック（２ＣＳ）を、Ｔ−５００フラスコの代わりに使用することができる。形態は、各継代において、及び採取の前に評価されて、プロセス全体を通して培養物純度をモニターし得る。形態は、例えば、観察された検体を、細胞培養物の形態学的試験のための視覚的標準と比較することによって評価され得る。細胞は、培養単層中で増殖する場合、典型的な線維芽細胞形態を示す。細胞は、細長い延長部を有する細長い紡錘形又は紡錘形の外観を示すか、又は細胞質の前縁を有し得る、より大きく平坦な星状細胞として��れ得る。これらの形態の混合物も観察され得る。よりコンフルエントでない領域の線維芽細胞は同様の形状であり得るが、ランダムに配向し得る。細胞培養物中のケラチノサイトの存在も評価することができる。ケラチノサイトは丸く不規則な形状に見え、そしてより高いコンフルエンスでは、それらは玉石のフォーメーションで組織化されて見える。より低いコンフルエンスでは、ケラチノサイトが小さなコロニーで観察され得る。細胞を３７±２．０℃で５．０±１．０％ＣＯ２と共にインキュベートし、Ｔ−５００フラスコ中では３〜５日毎に、１０層セルスタック（１０ＣＳ）では５〜７日毎に継代する。いくつかの実施形態では、細胞は、継代前に１０日を超えてＴ−５００フラスコ中に留まるべきではない。原薬の安全性に関する品質管理（ＱＣ）放出試験には、無菌試験及びエンドトキシン試験が含まれる。Ｔ−５００フラスコ中の細胞コンフルエンスが約９５％になると、細胞は、１０ＣＳ培養容器に継代される。あるいは、２つの５層セルスタック（５ＣＳ）又は１０層セルファクトリ（１０ＣＦ）が１０ＣＳの代わりに使用され得る。１０ＣＳへの継代は、使用済み培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡで処理して、フラスコ中の接着細胞を溶液中にリリースことによって行われる。その後、細胞を１０ＣＳに移す。追加の完全増殖培地を加えてトリプシンを中和し、Ｔ−５００フラスコからの細胞を、新鮮な完全増殖培地を含む２Ｌボトルにピペットで移す。２Ｌボトルの内容物を１０ＣＳに移し、全ての層に播種する。次に、細胞を３７±２．０℃で５．０±１．０％ＣＯ２と共にインキュベートし、５〜７日毎に新鮮な完全増殖培地を供給する。特定の実施形態において、細胞は、継代の前に２０日を超えて１０ＣＳ中に留まるべきではない。一実施形態では、継代された皮膚線維芽細胞は、タンパク質を含まない培地であるＰｒｉｍａｒｙ  ｈａｒｖｅｓｔに増殖した線維芽細胞を一定期間インキュベートすることによって、培養培地中に存在する免疫原性タンパク質を実質的に含まないようにされる。１０ＣＳ中の細胞集密度が９５％以上である場合、細胞が収穫される。回収は使用済み培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡで処理して接着細胞を溶液中にリリースさせ、追加の完全増殖培地を添加してトリプシンを中和することによって行うことができる。細胞は、遠心分離によって収集され、再懸濁され、そしてインプロセスＱＣ試験を実施して、全生存細胞数及び細胞生存率が決定される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、一次１０ＣＳ採取からの細胞計数結果を受け取った後に多数の細胞が必要とされる場合、複数の細胞スタック（最大４つの１０ＣＳ）へのさらなる継代が行われてもよい。さらなる継代のために、初代採取物からの細胞を、新鮮な完全増殖培地を含有する２Ｌ培地ボトルに添加する。再懸濁した細胞を多重細胞スタックに添加し、５．０±１．０％ＣＯ２と共に３７±２．０℃でインキュベートする。特定の実施形態において、細胞コンフルエンスが細胞採取の前に８０％以上であることを除いて、細胞スタックは、上記のように供給され、そして採取される。採取手順は、上記の一次採取について記載したものと同じであってもよい。細胞及び使用済み培地からのマイコプラズマ試料を採取し、細胞計数及び生存率を、上記の一次採取について記載したように実施する。この方法は、動物由来の試薬からの免疫原性タンパク質の導入を回避することによって、免疫原性タンパク質を減少又は排除する。工程残留物を減らすために、細胞は、タンパク質を含まない凍結培地中に凍結保存し、次いで解凍し、洗浄してから、残留物をさらに減らすために、最終注入の前処理を行う。さらなる継代からの細胞の採取及び凍結保存が完了した後に、さらなる薬物物質が必要な場合、凍結薬物物質のアリコート凍結バイアルを解凍し、５ＣＳ又は１０ＣＳ培養容器に播種するために使用する。あるいは、５ＣＳ又は１０ＣＳの代わりに、４層セルファクトリ（４ＣＦ）、２つの４ＣＦ、又は２つの５ＣＳを使用することができる。細胞の凍結した凍結バイアルを解凍し、洗浄し、新鮮な完全増殖培地を含有する２Ｌ培地ボトルに添加し、上記のように培養し、回収し、凍結保存する。細胞懸濁液は、細胞コンフルエンスが細胞採取前に８０％以上になるよう添加される。
【００３６】
培養増殖の完了時に、細胞を回収し、洗浄し、次いで、２．２×１０7細胞／ｍＬを目標に、１．０〜２．７×１０7細胞／ｍＬを含有するように処方する。あるいは、目標は、異なる適応用量を調節して、製剤範囲内で調整される。原薬は、Iscove社のModified Dulbecco’s Medium(IMDM)及びProfreeze-CDM.TM（Lonza, Walkerville,Md）＋７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる凍結保存培地のような適切な培地中に懸濁された、生存可能な自家繊維芽細胞の集団を含む。あるいは、７．５％の代わりにより低いＤＭＳＯ濃度を使用してもよく、又はCryoStorTMCS5又はCryoStorTMCS10（BioLife Solutions, Bothell, WA）を、IMDM/Profreeze/DMSOの代わりに使用してもよい。細胞数及び生存率に加えて、薬物物質の純度／同一性が実施され、懸濁液が９８％以上の線維芽細胞を含有することを確認しなければならない。通常の細胞汚染物質には、ケラチノサイトが含まれる。純度／同定アッセイは、線維芽細胞集団のパーセント純度を定量するために、ＣＤ９０及びＣＤ１０４（それぞれ、線維芽細胞及びケラチノサイト細胞についての細胞表面マーカー）に対する蛍光タグ化抗体を使用する。ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）は、３５ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ９０タンパク質に対する抗体は、ヒト線維芽細胞に対して高い特異性を示すことが示されている。ＣＤ１０４、インテグリンβ４鎖は、インテグリンα６鎖（ＣＤ４９ｆ）と会合してアルファ６／ベータ４複合体を形成する２０５ｋＤａ膜貫通糖タンパク質である。この複合体は、ケラチノサイト細胞の分子マーカーとして作用することが示されている（Adams and Watt 1991）。
【００３７】
ＣＤ１０４タンパク質に対する抗体は、ヒト線維芽細胞の１００％に結合する。細胞数及び生存率はViacount Dye Reagentと共に検体をインキュベートし、Guava PCAシステムを使用して検体を分析することによって決定される。この試薬は２つの色素、すなわち、全ての有核細胞を染色する膜透過性色素、及び損傷細胞又は死細胞のみを染色する膜不透過性色素から構成される。この色素組み合わせを使用することで、Guava PCAシステムでサンプル中に存在する細胞の総数を推定すること、及びどの細胞が生存可能であるか、アポトーシス性であるか、又は死んでいるかを決定することができる。この方法は、自家培養線維芽細胞の純度／同一性を決定する際に使用するために特別にカスタム開発された。あるいは、細胞がＴ−１７５フラスコ（又は代替品）又はＴ−５００フラスコ（又は代替品）のいずれかから、細胞増殖表面としてマイクロキャリアを含むスピナーフラスコに継代され得る。マイクロキャリアは、懸濁培養における足場依存性細胞の増殖表面として使用される小さなビーズ様構造である。それらは、小さな体積で大きな細胞収率を生じるように設計される。この装置において、５０ｍＬ〜３００ｍＬの範囲の体積の完全増殖培地を、５００ｍＬ、ＩＬ又は２Ｌの滅菌使い捨てスピナーフラスコに添加する。滅菌マイクロキャリアをスピナーフラスコに添加する。培養物を静置させるか、又は５．０±１．０％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７±２．０℃で短時間（１〜２４時間）低回転数（１５〜３０ＲＲＭ）の撹拌プレート上に置き、細胞を担体に接着させる。アタッチメント期間が終了すると、スピンプレートの速度が上がる（３０〜１２０ＲＰＭ）。細胞には、１〜５日毎に、又は色の変化によって培地が消費されたように見える場合に、新鮮な完全増殖培地を供給する。マイクロキャリアをサンプリングし、細胞を単離し、そして細胞計数及び生存率分析を行うことによって、規則的な間隔で細胞を収集する。キャリア当たりの細胞濃度を用いて、培養物をスケールアップする時期を決定する。十分な細胞が産生されたら、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いてマイクロキャリアから回収し、より多量のマイクロキャリア及びより多量の完全増殖培地（３００ｍＬ〜２Ｌ）中のスピナーフラスコに播種して戻す。あるいは、既存のマイクロキャリア培養物を含むスピナーフラスコに、追加のマイクロキャリア及び完全増殖培地を直接添加して、トリプシン処理及び再播種を使用することなく、細胞の直接的なビーズ間移動を可能にすることができる。あるいは最初のＴ−１７５又はＴ−５００フラスコから十分な細胞が産生される場合、細胞はスケールアップした量のマイクロキャリアに直接播種され得る。アタッチメント期間が終了すると、スピンプレートの速度を上げる（３０ 〜１２０ＲＰＭ）。細胞には、１〜５日毎に、又は色の変化によって培地が消費されたように見える場合に、新鮮な完全増殖培地を供給する。濃度が意図された指示のための所望の細胞数に達したとき、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して回収する。使い捨てスピナーフラスコ内で使用されるマイクロキャリアは、BioNOC II（商標）（Cesco Bioengineering, distributed by Bellco Biotechnology, Vineland, N.J.）及���FibraCel（商標）（New Brunswick Scientific, Edison, N.J.）、Cultispher-G（Percell Biolytica, Astrop, Sweden）等のゼラチン,、CytoporeTM（GE Healthcare, Piscataway, N.J.）等のセルロース、又は2D MicroHexTM（Nunc, Weisbaden, Germany）、Cytodex（商標)（GE Healthcare, Piscataway, NJ）又はHy−QSphereTM（Thermo Scientific Hyclone, Logan,UT）等のコーティングされた／コーティングされていないポリスチレンから作られる。
【００３８】
別の実施形態では、細胞がスピナーフラスコ器具の代わりに、FibraStageTM（New Brunswick Scientific, Edison, N.J.）又はBelloCell（商標）（Cesco Bioengineering, distributed by Bellco Biotechnology, Vineland, N.J.)などの自動ベローズシステムを使用して、BioNOC II（商標）及びFibraCel（商標）などのポリブレンド２Ｄマイクロキャリア上で処理することができる。Ｔ−１７５（又は代替品）又はＴ−５００フラスコ（又は代替品）からの細胞を、適切な量の完全増殖培地を有するマイクロキャリアを含有するベローズボトルに継代し、システムに入れてもよい。そして反復的な固定サイクルにおいて、このシステムは細胞に供給するためにマイクロキャリア上に培地をポンピングし、酸素化を可能にするために培地を引き出す。細胞を上記と同じ順序でモニターし、給餌し、洗浄し、そして回収する。あるいは、細胞が自動化システムを使用して処理され得る。生検組織の消化後、又は最初の継代が完了した後（Ｔ−１７５フラスコ又は代替品）、細胞を自動装置に播種することができる。１つの方法は、自動細胞増殖（ＡＣＥ）システムであり、これは、細胞がヒトの介入なしに増殖され得る細胞増殖プラットフォームを形成するために、一緒に連結された一連の商業的に入手可能な、又はカスタムの製作コンポーネントである。細胞は、足場依存性細胞付着を支持することができるディスクのスタックからなるセルタワー中で増殖される。システムは、自動的に培地を循環させ、細胞増殖段階の完了時に採取のためにトリプシン処理を行う。
【００３９】
あるいは、ＡＣＥシステムは、細胞増殖表面、送達チューブ、培地及び試薬からなるディスポーザブルコンポーネント、並びに加熱／冷却、培地移動及び自動プログラミングサイクルの実行のための機構及びコンピュータ処理能力を収容する永久ベースからなる、スケールダウンした単一ロットユニットバージョンであり得る。受領後、各滅菌照射済みＡＣＥ使い捨てユニットは、その包装から開封され、プレフィルドバッグを吊り下げ、バッグを無菌コネクタを介して既存のチューブに接続することによって、培地及び試薬が装填される。プロセスは次のように続く：
ａ）生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内で、酵素的に消化された生検からの細胞の懸濁液がすでに抗生物質を含む開始増殖培地で満たされている「前増殖チャンバー」（セルタワーの上部の小ユニット）に導入される。ＢＳＣから、使い捨て部品はすでに定位置にある恒久的なＡＣＥユニットに移される；
ｂ）約３日後に、前増殖チャンバー内の細胞は、トリプシン処理され、完全増殖培地で予め満たされているセルタワー自体に導入される。ここで、ＣＯ２注入によって引き起こされる「気泡作用」は細胞が下方に螺旋状に移動し、均一に分布した様式でディスクの面上に定着するような速度で培地を循環させる；
ｃ）約７日間、細胞は増殖させる。このとき、コンフルエンスを確認し（記載時の方法は不明）、培養物が増殖していることを確認する。また、この時点で、完全増殖培地は、新鮮な完全増殖培地と置き換えられる。ＣＧＭは適切な間隔で、例えば、７日毎に３〜４週間、交換され得る。培養期間の終わりに、コンフルエンスをもう一度チェックして、意図した処理のために所望の量の細胞をおそらく産生するのに十分な増殖があることを確認する；
ｄ）培養物が十分にコンフルエントである場合、それを回収する。使用済み培地（上清）を容器から排出する。次いで、ＰＢＳは（培地を洗浄するために、細胞からＦＢＳを）容器にポンプ輸送され、ほぼ直ちに排出される。トリプシン−ＥＤＴＡは、成長表面から細胞を切り離すために容器に吸入される。トリプシン／細胞混合物は、容器から排出され、スピンセパレーターに入る。凍結保存剤を容器にポンプで送り込んで、ディスクの表面から残留細胞をリンスし、スピンセパレータにも送る。スピンセパレーターは細胞を収集し、次いで、輸送／注入培地中に細胞を均一に再懸濁する。スピンセパレーターから、細胞は、インライン自動化細胞計数デバイス、又は実験室分析による細胞計数及び生存率試験のために収集されたサンプルを通って送られる。特定の数の細胞がカウントされ、適切な細胞濃度に達したら、採取された細胞は、低温凍結のために試料をアリコートするために除去することができる、収集バイアルに送達される。
【００４０】
別の実施形態では、自動化ロボットシステムを使用して、プロセスの全長又は一部の間、細胞供給、継代、及び採取を行ってもよい。細胞は、消化の直後にロボットデバイスに導入されてＴ−１７５フラスコ（又は代替）に播種されてもよい。このデバイスは、細胞をインキュベートし、細胞計数及び生存率分析を行い、そして供給及びより大きな培養容器への移送を行う能力を有し得る。システムはまた、個々のロットを追跡するためのコンピュータ化されたカタログ機能を有する可能性がある。既存の技術又はカスタマイズされたシステムが、ロボットオプションのために使用されてもよい。
【００４１】
一実施形態では、線維芽細胞は、成長因子含有混合物を含む混合物などの１つ又は複数の成長因子と接触させることによって、低酸素／一酸化炭素に曝露する前に予備活性化される。混合物は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来内皮増殖因子（ＰＤＥＧＦ）、血小板由来血管新生因子（ＰＤＡＦ）、血小板因子４（ＰＦ−４）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びこれらの混合物からなる群から選択される成長因子を含み得る。特定の実施形態では、成長因子がトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、又はそれらの混合物である。特定の実施形態では、成長因子は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子ＢＢ(ＰＤＧＦ−ＢＢ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、及びそれらの混合物からなる群より選択される。本開示の別の実施形態では、成長因子含有組成物は、線維芽細胞の送達と同時に、又はその後に提供され、そのいずれか又は両方が注射され得る。線維芽細胞は、自己、同種、又は異種であり得る。いくつかの実施形態において、血小板血漿組成物は、線維芽細胞と一緒に、又は線維芽細胞とは別個に、例えば、線維芽細胞の投与後に投与される。血小板血漿組成物は、血小板及び血漿を含むか、本質的にそれらからなるか、又はこれらからなり得、そして例えば、骨髄又は末梢血に由来し得る。本開示はこれらの供給源のいずれか又は両方からの血小板血漿組成物を使用し得、そしていずれかの血小板血漿組成物が、それを必要とする核（nucleus）又は輪部（annulus）のいずれかを再生するために使用され得る。さらに、血小板血漿組成物は、濃縮骨髄（ＢＭＡＣ）を伴って、又は伴わずに使用され得る。例として、輪部に挿入される場合、０．０５〜２．０ｃｃの血小板血漿組成物が使用され得、そして核に挿入される場合、０．０５〜３．０ｃｃの血小板血漿組成物が使用され得る。血小板は、前述のように骨髄及び末梢血中に認められる非有核の血液細胞である。それらは、出血や組織治癒をコントロールするなど、いくつかの重要な機能を有する。当業者が知っているように、組織治癒を促進する能力は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、それらが産生する多くの成長因子による。
【００４２】
ＩＩ．線維芽細胞の使用方法
【００４３】
本開示の実施形態は個体の治療目的のために調製された線維芽細胞を含み、いくつかの場合には、線維芽細胞からの馴化培地は、調製された線維芽細胞に加えて、又はその代わりに個体に提供される。
【００４４】
再生活性が増強されるような本明細書に包含される線維芽細胞の調製に続いて、適切な数の線維芽細胞が、必要な場合には複数の送達を含む、それを必要とする１つ以上の個体に提供される。本開示は、液体培地中での線維芽細胞集団の増殖を介して治療産物を生成し、それを必要とする１つ以上の個体にそれを提供する方法を含む。一実施形態では、少なくとも炎症性、自己免疫性、及び／又は変性状態を含む、少なくとも１つの医学的状態の処置に有用な、調製された線維芽細胞及び／又は馴化培地を含む薬剤を生成する方法がある。特定の実施形態において、線維芽細胞は、線維芽細胞が適切なレベル及び適切な曝露で低酸素及び／又はＣＯに曝露されるように、線維芽細胞の培養を通して調製される。いくつかの場合において、例えば、特定の場合においてＨＩＦ−１α及びヘムオキシゲナーゼをそれぞれ刺激するのに十分な曝露の濃度及び時間の両方で、低酸素が最初に線維芽細胞に提供され、その後、続いて一酸化炭素が提供され得る。
【００４５】
馴化培地を調製するために、多くのタイプの培地が当業者によって使用され得る。一実施形態では、培地は、アルファＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、及びＡＩＭ−Ｖを含む群から選択される。細胞はウシ胎仔血清又は他の増殖因子を含んでも含まなくてもよい増殖のための種々の培地中で培養され得る；しかし、治療用上清の収集のために、特定の実施形態において、細胞は、実質的に血清を欠く培地に移される。いくつかの実施形態において、馴化培地は、処置を必要とする個体に直接提供され得る。投与前の馴化培地の調製は様々な手段によって行うことができ、例えば、馴化培地を濾過滅菌することができ、又はいくつかの条件で濃縮することができることは、当技術分野で周知である。特定の実施形態において、馴化培地は、単独で、又は再生特性を有する細胞と組み合わせて、再生活性の誘導のために投与される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、調製された細胞及び／又は馴化培地は、培養された線維芽細胞及び／又はそこからの馴化培地を投与することによって創傷の治癒を促進する方法のために利用される。創傷の例には、上皮創傷及び／又は瘻孔が含まれる。特定の実施形態では、培養線維芽細胞及び／又はそこからの馴化培地を投与することによって、個体の声帯欠損に亜隣接する組織を増強する方法が存在する。特定の実施形態では、調製された細胞及び／又は馴化培地は、声帯瘢痕の治療、並びに／又は線維性損傷、炎症損傷、萎縮、及び／又は熱傷損傷などの皮膚及び軟組織欠損の修復の方法に利用される。
【００４７】
調製された線維芽細胞は、特定の実施形態ではＨＯ−１が増強されており、間葉系幹細胞を含む幹細胞が有用であろう多くの状況において、様々な治療適応症に有用である。個体に提供され得る細胞の量の例としては、１０，０００／ｋｇ〜３億／ｋｇの範囲が挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、調整培地は、単独で、又は線維芽細胞と共に、医薬製剤のための活性成分として使用される。これは低酸素／一酸化炭素線維芽細胞馴化培地治療剤単独の投与を含み得るが、いくつかの場合には、経口投与のための錠剤、カプセル又はエリキシル、直腸投与のための座薬、非経口又は筋肉内投与のための滅菌溶液又は懸濁液、リポソーム又はカプセル化製剤、治療剤が単独であるか又は送達剤又はビヒクルに結合された製剤などを含む、公知の医薬製剤による投与を含む。本開示の治療実体（調製された線維芽細胞を含む）は、適切なキャリア、賦形剤、及び／又は改善された送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤と共に投与され得ることが理解される。多くの適切な製剤が、すべての製剤化学者に知られている処方に見出される：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1975)),特にChapter 87 by Blaug, Seymourの中。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えば、リポフェクチンＴＭ）、ＤＮＡ結合体、無水吸着ペースト、油中水型及び水中油型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカルボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が投与経路と生理学的に適合性であり、許容可能であるという条件で、前述の混合物のいずれも、本開示による治療及び治療において適切であり得る。Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol 52:238-311 （1998）及び医薬化学者に周知の賦形剤及び担体に関するさらなる情報についてのその中の引用も参照されたい。本開示の一実施形態では、本開示の１つ以上の薬剤は、送達のためにナノ粒子にナノカプセル化される。ナノカプセル化材料は、生分解性であっても非分解性であってもよい。ナノカプセル化材料は、合成ポリマー、天然ポリマー、オリゴマー、又はモノマーから作製され得る。合成ポリマー、オリゴマー、及びモノマーには、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、並びにポリ（プロピレンオキシド）（ＰＥＧ−ｃｏ−ＰＰＯ）とのコポリマーなどのポリアルキレンオキシド前駆体分子から誘導されるもの、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチルオキサゾリン）（ＰＥＯＸ）、ポリアミノ酸、及び擬似ポリアミノ酸、並びにこれらのポリマーのコポリマーなどが含まれる。Sawhney et al., Macromolecules 26:581-587 (1993)。共重合体はまた、コンジュゲートが水溶性であるという条件で、他の水溶性ポリマー又は水不溶性ポリマーで形成されてもよい。水溶性コンジュゲートの一例は、ポリエチレングリコールとポリプロピレンオキシドとのブロック共重合体であり、PluronicTM界面活性剤（ＢＡＳＦ）として市販されている。天然ポリマー、オリゴマー及びモノマーとしては、天然又は組換え供給源から生成されるかにかかわらず、タンパク質（例えば、フィブリノーゲン、フィブリン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、ゼイン、及びアルブミン、並びに多糖（例えば、アガロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、キトサン、ゲランガム、キサンタンガム、グアーガム、水溶性セルロース誘導体、及びカラギーエン（carrageen））が挙げられる。これらのポリマーは利用可能なナノカプセル化材料のタイプの単なる例示であり、カプセル化可能なナノカプセル化材料の全てを表すことを意図するものではない。一実施形態では、治療剤が局所製剤で投与される。局所製剤は、皮膚疾患に関連する状態の治療に有用である。例えば、線維芽細胞馴化培地及び／又は調製された線維芽細胞の局所投与は、乾癬、強皮症、又は座瘡の処置のために行われ得る。局所投与形態は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、皮膚パッチ、炭化水素基剤及び粉末からなり得、可溶化剤、浸透増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸）、並びに親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含有し得る。一実施形態において、薬学的に受容可能な担体は、リポソーム又は経皮エンハンサーである。本発明の局所製剤は、皮膚科学的に許容される担体、例えば、製剤の他の成分を皮膚に送達することができ、皮膚によるこれらの成分の許容される適用又は吸収を可能にする物質を含むことができる。担体は、典型的には治療薬を溶解又は分散させるための溶媒、及び任意選択で１つ又は複数の賦形剤又は他のビヒクル成分を含む。本発明の局所製剤に従って有用な担体は、非限定的な例として、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、アクリレートコポリマー、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミネラルオイル、バター、アロエ、タルク、植物油、植物ジュース、植物抽出物、植物粉末、他の植物誘導体、ラノリン、尿素、石油製剤、タール製剤、植物又は動物脂肪、植物又は動物油、石鹸、トリグリセリド、及びケラチンを含み得る。本発明の局所製剤は当技術分野で周知の方法、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 1577-1591, 1672-1673, 866-885 (Alfonso R. Gennaro ed. 19th ed. 1995); and Ghosh et al., Transdermal and Topical Drug Delivery Systems (1997)によって提供される方法に従って、本発明の化合物を局所担体と混合することによって調製される。他の実施形態において、保湿剤又は保湿剤、日焼け止め剤、香料、染料、及び／又は増粘剤、例えばパラフィン、ホホバ、ＰＡＢＡ、及びワックス、界面活性剤、閉塞剤、吸湿剤、乳化剤、皮膚軟化剤、無脂質クレンザー、抗酸化剤及び親油性剤を、所望であれば、本発明の局所製剤に添加してもよい。本開示の媒体及び／又は細胞の局所処方物は、皮膚上に残留し、適用後すぐに洗浄されないように設計され得る。あるいは、局所製剤が適用後、所与の時間内にすすぎ落とされるように設計されてもよい。
【００４９】
一実施形態において、１つ以上の免疫学的疾患の処置は、低酸素／一酸化炭素線維芽細胞処置馴化培地及び／又は調製された線維芽細胞を、多くの免疫疾患の場合にはリンパ節にある治療活性のその部位に直接投与することによって行われる。例えば、治療剤は、リンパ節に直接注射され得る。Ｔ細胞依存性活性化阻害剤のリンパ節内注入に好まれるリンパ節は、鼠径部、わきの下及び頸部の領域に位置する主要なリンパ節である。別の実施形態では、治療剤がその治療活性の部位の遠位に投与される。
【００５０】
特定の実施形態では、調製された線維芽細胞及び／又はそれからの馴化培地で治療される医学的状態には、自己免疫疾患、変性疾患、炎症性疾患、及び線維性疾患が含まれる。自己免疫疾患の例は、グレーブス病、ループス、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチなどである。変性疾患の例は、変性椎間板疾患、アルツハイマー病、癌、シャルコー−マリー−トゥース病、ＩＩ型糖尿病、心疾患、筋ジストロフィー、パーキンソン病、ハンチントン病、黄斑変性症、脊髄性筋萎縮症、炎症性腸疾患、骨粗鬆症、変形性関節症、テイ−サックス病、原発性肺高血圧症などである。炎症性疾患（慢性又は急性の可能性がある）の例としては、喘息、結核、潰瘍性大腸炎、慢性消化性潰瘍、歯周炎、クローン病、副鼻腔炎などが挙げられる。線維性疾患の例としては、肺線維症、放射線誘発性肺損傷、肝硬変、心房線維症、心内膜心筋線維症、グリア瘢痕、ケロイド、骨髄線維症、強皮症などが含まれる。
【００５１】
以下の実施例は本発明の好ましい具体例を示すために含める。以下の実施例に開示される技術は本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、本発明の実施のための好ましい形態を構成すると考えることができることを、当業者には理解されたい。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮して、開示されかつ同様の結果を得られる特定の実施例において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であることは理解できるのであろう。
【実施例】
【００５２】
［実施例１：低酸素、一酸化炭素、又は一酸化炭素に続く低酸素、における線維芽細胞の培養によるＶＥＧＦ産生の相乗的刺激］
ＡＴＣＣから購入した包皮線維芽細胞を、ＡＴＣＣの線維芽細胞基礎培地を用いてＴ−７５フラスコ中で培養した。細胞が７５％コンフルエンスに達したとき、以下に曝露した：ａ）正常酸素；ｂ）低酸素（２％酸素で４時間）；ｃ）一酸化炭素（２５０ｐｐｍ）４時間；又はｄ）低酸素、続いて一酸化炭素。細胞を、トリプシン処理によって、平底の９６ウェルプレート上に再度プレーティングした。再度プレーティングした細胞の濃度は、ウェル当たり０、１０，０００、２０，０００及び４０，０００細胞であった。培養２４時間後に培養培地を抽出し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＶＥＧＦ産生について分析した。図１に見られるように、ＶＥＧＦ産生の相乗的増加が、組み合わせた処理によって観察された。正常酸素コントロールの線維芽細胞からはＶＥＧＦ産生は認められなかった。
【００５３】
［実施例２：低酸素、一酸化炭素、又は一酸化炭素と同時に低酸素、の場合における線維芽細胞の培養によるＶＥＧＦ産生の刺激］
ＡＴＣＣから購入した包皮線維芽細胞を、ＡＴＣＣの線維芽細胞基礎培地を用いてＴ−７５フラスコ中で培養した。細胞が７５％コンフルエンスに達したとき、以下に曝露した；ａ）正常酸素；ｂ）低酸素（２％酸素で４時間）；ｃ）一酸化炭素（２５０ｐｐｍ）で４時間；又はｄ）一酸化炭素と同時に低酸素。トリプシン処理によって平底の９６ウェルプレート上に細胞を再度プレーティングした。再度プレーティングした細胞の濃度は、ウェル当たり０、１０，０００、２０，０００及び４０，０００細胞であった。培養２４時間後に培養培地を抽出し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＶＥＧＦ産生について分析した。図２に見られるように、ＶＥＧＦ産生の相乗的増加が、組み合わせた処理によって観察された。正常酸素コントロールの線維芽細胞からはＶＥＧＦ産生は認められなかった。これらのデータは、一酸化炭素曝露がＶＥＧＦ産生の増強のために低酸素と相乗作用することを示唆する。
【００５４】
本開示及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される設計の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、及び変更を本明細書で行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、及びステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。当業者であれば、本開示から容易に理解するように、本明細書で説明される対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行するか、又は実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか又は後に開発されるプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、又はステップを、本開示に従って利用することができる。従って、添付の特許請求の範囲はその範囲内に、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、又はステップを含むことが意図される。
【図１】
2021506303.tif 000003
【図２】
2021506303.tif 000004
【国際調査報告】
2021506303.tif 000005
2021506303.tif 000006