(57)【要約】  本発明は、薬剤合成の分野、特にヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法、ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の中間体およびその調製方法に関する。当該調製方法は、ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、アミン化合物との反応、還元閉環反応（Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃｐ１、ＣL、Ｃｆ）の工程を含む。ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製プロセスでは、酵素学的方法によってキラリティーが構築され、このような技術的手段によって、非常に高い光学純度で生成物を調製することが可能である。当該調製方法は、ダルナビルの重要な中間体である、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールを商業的に製造するために使用でき、工業生産に適した非常に経済的な経路である。【化１】2021517903.tif 000058  （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素またはヒドロキシ保護基であり、Ｒ４、Ｒ５は同じであるか、又は異なり、フェニル、アルキル又は置換フェニルである。）
2021517903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造式を有する、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式ＣまたはＣｆの化合物。
【化１】
2021517903.tif 000043
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素またはヒドロキシ保護基であり、Ｒ４、Ｒ５は同じであるか、又は異なり、フェニル、アルキル又は置換フェニルである。）
【請求項２】
上記ヒドロキシ保護基は、アルキル、シリル、Ｃ２−１１のアシル、Ｃ４−９のシクロアルケニル、アリール、アラルキル、アロイル、フェニル、置換フェニルであり、
上記シリルは、テトラメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリブチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルであり、
上記アルキルはＣ１〜Ｃ８のアルキルであり、
上記アリール基は、フェニル、フラニル、チエニルまたはインドリルであり、
上記置換フェニルは、アルキル置換フェニル、アルコキシアルキル置換フェニル、ニトロアルキル置換フェニルまたはハロゲン置換フェニルであり、
上記アルキル置換フェニルは、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチルであり、
上記アルコキシアルキル置換フェニルは、ｐ−メトキシベンジルであり、
上記ニトロアルキル置換フェニルは、ｐ−ニトロベンジルであり、
上記ハロゲン置換フェニルは、ｐ−クロロフェニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式Ｃｐの化合物をアミン化合物と反応させることによって調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式ＣＬの化合物の調製方法。
【化２】
2021517903.tif 000044
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は請求項１と同じである。）
【請求項４】
式Ｃｐの化合物をＮ−メチルアニリン化合物と反応させることによって調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式Ｃ−１の化合物の調製方法。
【化３】
2021517903.tif 000045
（式中、Ｒ１、Ｒ２の定義は請求項１と同じである。）
【請求項５】
（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体の調製方法であって、
上記中間体は、酵素還元反応によって調製されてキラリティーを構築し、
【化４】
2021517903.tif 000046
式中、Ｒ１は水素またはヒドロキシ保護基であり、
上記酵素は、アミノ酸配列が配列番号１に示されるタンパク質であるアルド−ケトレダクターゼであるか、配列番号１の１つ以上のアミノ酸残基を置換、欠失もしくは付加した後の配列から得られるアルド−ケト還元活性を有するタンパク質であるか、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％相同性を有し、かつアルド−ケト還元活性を有するタンパク質である、調製方法。
【請求項６】
（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体の調製方法であって、
上記中間体は、酵素還元反応によって調製されてキラリティーを構築し、さらに保護基を導入することによって調製され、
【化５】
2021517903.tif 000047
式中、Ｒ１の定義は請求項１と同じであり、Ｒ２は水酸基の保護基であり、
上記酵素は、請求項５のものと同じである、調製方法。
【請求項７】
上記式Ｂの化合物は、以下に示すアシル化反応によって、式Ａ２の化合物から調製される、請求項５または６に記載の調製方法。
【化６】
2021517903.tif 000048
（式中、Ｘはハロゲンであり、Ｒ１の定義は請求項１と同じである。）
【請求項８】
上記式Ａ２の化合物は、以下に示すハロゲン化反応によって、式Ａ１の化合物から調製される、請求項７に記載の調製方法。
【化７】
2021517903.tif 000049
（式中、Ｘはハロゲンである。）
【請求項９】
脱保護反応によって、式Ｃ−１の化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式Ｃ−ｉの化合物の調製方法。
【化８】
2021517903.tif 000050
（式中、Ｒ１、Ｒ２の定義は請求項１と同じである。）
【請求項１０】
還元反応によって、式ＣＬの化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式Ｃｆの化合物の調製方法。
【化９】
2021517903.tif 000051
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は請求項１と同じである。）
【請求項１１】
還元反応によって、式Ｃ−ｉの化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式Ｃｆ−１の化合物の調製方法。
【化１０】
2021517903.tif 000052
【請求項１２】
閉環反応によって、式Ｃｆの化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法。
【化１１】
2021517903.tif 000053
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は請求項１と同じである。）
【請求項１３】
閉環反応によって、式Ｃｆ−１の化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法。
【化１２】
2021517903.tif 000054
【請求項１４】
ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、アミン化合物との反応、還元閉環反応によって調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法。
【化１３】
2021517903.tif 000055
（式中、Ｘはハロゲンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は請求項１と同じである。）
【請求項１５】
ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、アミン化合物との反応、脱保護反応、還元閉環反応によって調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法。
【化１４】
2021517903.tif 000056
【請求項１６】
上記アルド−ケトレダクターゼ遺伝子の塩基配列が配列番号２である、請求項５に記載の調製方法。
【請求項１７】
上記アルド−ケトレダクターゼは、遺伝子操作された細菌の全細胞、破砕酵素液、凍結乾燥粉末、または固定化酵素もしくは固定化細胞である、請求項５に記載の調製方法。
【請求項１８】
上記反応系に供給される上記アルド−ケトレダクターゼである遺伝子操作された細菌の全細胞の量が、１０〜１００ｇ／Ｌの範囲であり、転化温度が２５〜３７℃である、請求項５に記載の調製方法。
【請求項１９】
上記反応は、溶媒の存在下で行われる、請求項５に記載の調製方法。
【請求項２０】
上記溶媒は、水または緩衝液と有機溶媒とからなる混合溶媒である、請求項１９に記載の調製方法。
【請求項２１】
上記緩衝液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、Ｔｒｉ−ＨＣｌ緩衝液、クエン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２０に記載の調製方法。
【請求項２２】
上記有機溶媒は、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロパノール、ＤＭＦ、ＴＢＭＥ、ジクロロメタンおよび酢酸ビニルのうちの１つまたは複数から選択される、請求項２０に記載の調製方法。
【請求項２３】
閉環反応によって、式ＣＬの化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体の調製方法。
【化１５】
2021517903.tif 000057
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は請求項１と同じである。）
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０１８年４月１２日に中華人民共和国の国家知的財産管理局に提出された、出願番号２０１８１０３２５８４２．２、「ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法、ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の中間体、およびその調製方法」と題する中国特許出願の優先権を主張するものである。その内容の全ては、参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
＜技術分野＞
本発明は、薬剤合成の分野に関し、特にヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法、ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の中間体、およびその調製方法に関する。
【０００３】
＜背景技術＞
下記の式Ｚの構造を有する化合物の化学名は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールである。
【０００４】
【化１】
2021517903.tif 000003
【０００５】
これは、ヘキサヒドロフロフラノールの誘導体の１つであり、抗ＨＩＶ薬であるダルナビルの中間体である。
【０００６】
ダルナビルのオリジナル製薬の製造元であるティボテック・ファーマシューティカルズ株式会社（Tibotec Pharmaceuticals Co., Ltd.）の、出願番号０２８１７６３９．１（出願日２００２年９月６日）および２００５８００１０４００．Ｘの中国特許は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法を提供している。原料は、下記式（３）の化合物である。
【０００７】
【化２】
2021517903.tif 000004
【０００８】
式（３）の化合物は式（１）の出発原料から調製されている。
【０００９】
【化３】
2021517903.tif 000005
【００１０】
ダルナビルのジェネリック製薬の製造元である住友化学株式会社の出願番号２００３８０１０９９２６．４の中国特許では、上記（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法が提供されている。原料は、下記式（ＶＩＩＩ）の化合物である。
【００１１】
【化４】
2021517903.tif 000006
【００１２】
日本の住友化学株式会社は、キラル立体配座を生じさせるためにキラル触媒の使用を選択した。これは、現にキラル立体配座を構築するための方法であるが、これは工業化には適していない。
【００１３】
ダルナビルのジェネリック製薬の製造元である、スイスのロンザ・リミテッド（Lonza Ltd.）による欧州特許出願ＥＰ２６３４１８０Ａ１（出願日２０１２年１月３日）には、カルボニルレダクターゼポリペプチドまたはカルボニルレダクターゼポリペプチドを含有する微生物を用いて、カルボニル基を水酸基に還元し、ダルナビルの中間体のキラリティーを構築することが開示されている。この特許は、明細書において、多数の商業的に入手可能な酵素、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(saccharomyces cerevisiae)由来のＹＮＬ３３１Ｃなどを列挙している。また、この特許では、以下の式Ｉａに示す化合物がより適切な立体配置であることが言及されている。
【００１４】
【化５】
2021517903.tif 000007
【００１５】
（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールがダルナビルの調製において重要な中間体であることを考慮すると、この重要な中間体の調製のためのより有益な方法として、高い収率および高いＤＥ値で重要な中間体を得ることができるだけでなく、低コストで反応条件が穏やかであり、工業化に適している方法を開発することが必要である。
【００１６】
＜概要＞
本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法は、出発物質の選択およびキラル構成の構築から始まる。また、上記の先行特許文献とは異なる出発物質を用いて、ダルナビルの重要な中間体を調製する方法が開発されている。本発明の調製方法は、キラリティーを構築するために低コストで反応条件が穏やかな酵素学的方法を採用し、ダルナビルの重要な中間体の調製のための工業化に適した代替経路を提供する。
【００１７】
本発明の技術的目的を達成するために、本発明によって、以下の技術的解決策が提供される。
【００１８】
すなわち、本発明の第一の態様は、以下の構造式を有する、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体化合物を提供する。
【００１９】
【化６】
2021517903.tif 000008
【００２０】
ここで、式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３は水素またはヒドロキシ保護基であり；Ｒ４、Ｒ５は同じであるか、又は異なり、フェニル、アルキル又は置換フェニルである。ヒドロキシ保護基は、アルキル、シリル、Ｃ２−１１のアシル、Ｃ４−９のシクロアルケニル、アリール、アラルキル、アロイル、フェニル、置換フェニルであり；上記シリルは、テトラメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリブチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルであり；上記アルキルはＣ１〜Ｃ８のアルキルであり；上記アリール基は、フェニル、フラニル、チエニルまたはインドリルであり；上記置換フェニルは、アルキル置換フェニル、アルコキシアルキル置換フェニル、ニトロアルキル置換フェニルまたはハロゲン置換フェニルであり；上記アルキル置換フェニルは、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチルであり；上記アルコキシアルキル置換フェニルは、ｐ−メトキシベンジルであり；上記ニトロアルキル置換フェニルは、ｐ−ニトロベンジルであり；上記ハロゲン置換フェニルは、ｐ−クロロフェニルである。
【００２１】
本発明の第二の態様は、式Ｃｐの化合物をアミン化合物と反応させることによって調製される、上述の中間化合物の調製方法を提供する。
【００２２】
【化７】
2021517903.tif 000009
【００２３】
ここで、式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は上記と同じである。
【００２４】
より好ましくは、式Ｃｐの化合物は、Ｎ−メチルアニリン化合物と反応させることによって調製される。
【００２５】
【化８】
2021517903.tif 000010
【００２６】
ここで、式中のＲ１、Ｒ２の定義は上記と同じである。
【００２７】
キラリティーを構築するために、酵素還元反応によって式Ｂの化合物が調製される。
【００２８】
【化９】
2021517903.tif 000011
【００２９】
ここで、式中のＲ１の定義は上記と同じである。
【００３０】
酵素は、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）株に由来する、アルド−ケトレダクターゼなどの生物学的酵素である。酵素のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるタンパク質であるか、配列番号１の１つ以上のアミノ酸残基を置換、欠失もしくは付加した後の配列から得られるアルド−ケト還元活性を有するタンパク質であるか、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％相同性を有し、かつアルド−ケト還元活性を有するタンパク質である。酵素の塩基配列は、配列表の配列番号２に示される。アルド−ケトレダクターゼは、遺伝子操作された細菌の全細胞、破砕酵素液、凍結乾燥粉末、または固定化酵素もしくは固定化細胞に由来し得る。
【００３１】
反応系に供給される酵素の量は、１０〜１００ｇ／Ｌの範囲内であってよく、反応温度は２５〜３７℃の範囲内であってよい。
【００３２】
酵素還元反応には補酵素を選択的に添加することができ、このような補酵素は、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤＰＨである。
【００３３】
酵素還元反応には、グルコースデヒドロゲナーゼを選択的に添加してもよい。
【００３４】
酵素還元反応は溶媒の存在下で行われ、溶媒は水または緩衝液と有機溶媒とからなる混合溶媒である。
【００３５】
緩衝液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、Ｔｒｉ−ＨＣｌ緩衝液、クエン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液のうちの１つまたは複数から選択される。
【００３６】
有機溶媒は、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロパノール、ＤＭＦ、ＴＢＭＥ、ジクロロメタンおよび酢酸ビニルのうちの１つまたは複数から選択される。
【００３７】
本発明の酵素還元反応の生物学的変換プロセスでは、基質が完全に利用されるまでモニタリングするため、ＨＰＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣが使用される。
【００３８】
上述の酵素還元反応の後、式Ｃｐの化合物を調製するために、保護基がさらに導入され得る。
【００３９】
【化１０】
2021517903.tif 000012
【００４０】
ここで、式中のＲ１の定義は上記と同じであり、Ｒ２は水酸基の保護基である。酵素は上記と同じである。
【００４１】
また、上記式Ｂの化合物は、アシル化によって式Ａ２の化合物から調製され、反応式は以下の通りである。
【００４２】
【化１１】
2021517903.tif 000013
【００４３】
ここで、式中のＸはハロゲンであり、Ｒ１の定義は上記と同じである。
【００４４】
また、上記式Ａ２の化合物は、ハロゲン化反応によって式Ａ１の化合物から調製され、反応式は以下の通りである。
【００４５】
【化１２】
2021517903.tif 000014
【００４６】
ここで、式中のＸはハロゲンである。
【００４７】
本発明はさらに、脱保護反応によって、式Ｃ−１の化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式Ｃ−ｉの化合物の調製方法を提供する。
【００４８】
【化１３】
2021517903.tif 000015
【００４９】
ここで、式中のＲ１、Ｒ２の定義は上記と同じである。
【００５０】
本発明の第三の態様は、還元反応によって、式ＣＬの化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式Ｃｆの化合物の調製方法を提供する。
【００５１】
【化１４】
2021517903.tif 000016
【００５２】
ここで、式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は上記と同じである。
【００５３】
より好ましくは、還元反応によって、式Ｃ−ｉの化合物から調製される。
【００５４】
【化１５】
2021517903.tif 000017
【００５５】
還元反応において、還元剤は、ホウ素還元剤、アルミニウム還元剤またはケイ素−リチウム還元剤であってもよい。水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム、Ｒｅｄ−Ａｌ（登録商標）、水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムヘキサメチルジシラジドなどを使用してもよい。
【００５６】
上述の還元反応の前に、まず脱保護反応を行うことができ、反応式は以下の通りである。
【００５７】
【化１６】
2021517903.tif 000018
【００５８】
あるいは、環化反応をまず行ってもよく、反応式は以下の通りである。
【００５９】
【化１７】
2021517903.tif 000019
【００６０】
調製された式Ｃｐ３の化合物および式Ｃｐ４の化合物は、上記の方法に従ってカルボニル還元反応に供される。このとき、還元試薬は上記と同じである。
【００６１】
すなわち、本発明は、閉環反応によって、式ＣＬの化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの中間体である、式Ｃｐの化合物を調製するための代替的方法を提供する。
【００６２】
【化１８】
2021517903.tif 000020
【００６３】
ここで、式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は上記と同じである。
【００６４】
本発明の第四の態様は、閉環反応によって、式Ｃｆの化合物から調製される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法を提供する。
【００６５】
【化１９】
2021517903.tif 000021
【００６６】
ここで、式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は上記と同じである。
【００６７】
より好ましくは、閉環反応によって、式Ｃｆ−１の化合物から調製される。
【００６８】
【化２０】
2021517903.tif 000022
【００６９】
閉環反応のための試薬は当技術分野で一般的な酸または塩基である。
【００７０】
上述した、本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法は、ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、アミン化合物との反応、還元閉環反応の工程を含み、反応式は以下の通りである。
【００７１】
【化２１】
2021517903.tif 000023
【００７２】
ここで、式中のＸはハロゲンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の定義は上記と同じである。
【００７３】
より好ましくは、ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、アミン化合物との反応、脱保護反応、還元閉環反応によって調製される。
【００７４】
【化２２】
2021517903.tif 000024
【００７５】
ここで、還元反応によるキラリティーの構築方法は酵素学的方法であり、酵素の定義は上記と同様である。
【００７６】
本発明により提供される（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法は、キラリティーを構築するために酵素学的方法を採用し、高い収率および高い光学純度で生成物を調製することができる。上述の欧州出願のような従来技術は、カルボニル基から水酸基への還元が、カルボニルレダクターゼポリペプチドまたはカルボニルレダクターゼポリペプチドを含有する微生物によって達成されることを開示しているが、本発明において使用される酵素は、得られる生成物の光学純度がより高いこと、および反応条件がより適していることから分かるように、より有意な利点を有する。本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］−３−オールの調製方法は、工業生産に適している。
【００７７】
＜発明を実施するための形態＞
本発明をさらに理解するために、本発明によって提供されるヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法、ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の中間体、およびその調製方法について、以下の実施形態と組み合わせて詳細に説明する。これらの実施形態の記載は、本発明の範囲または本発明の特許請求の範囲を限定するものではなく、本発明の特徴を詳細にさらに説明するためだけのものであることを理解されたい。
【００７８】
（実施例１）
【００７９】
【化２３】
2021517903.tif 000025
【００８０】
反応フラスコに式Ａ１の化合物とジクロロメタンとを加え、冷却した。臭素を秤量し、ジクロロメタンを加えて希釈した。希釈した臭素を漏斗に移してゆっくりと滴下し、内部温度を制御した。滴下後、温度を保ちながら反応を続け、内部温度を制御した。水を加え、温度を制御し、溶液を静置して分液した。下層の有機相を別の反応フラスコに入れ、抽出のために水を添加して分液した。下層の有機相を別の容器に入れ、抽出のために５％ＮａＨＣＯ３水溶液を添加して分液した。下層の有機相を別の反応フラスコに入れ、上層の水相を混ぜ合わせ、抽出のためにジクロロメタンを添加して分液した。水相を捨て、有機相を混ぜ合わせ、抽出のために水を添加して分液した。水相を捨て、下層の有機相をロータリーエバポレーターに入れ、溶媒が流出しなくなるまで濃縮した。収率は９０〜９５％であった。
【００８１】
（実施例２）
【００８２】
【化２４】
2021517903.tif 000026
【００８３】
アセトン、式Ａ２の化合物（Ｘは臭素）、安息香酸を反応フラスコに入れ、混合物を撹拌し、冷却した。トリエチルアミンをタンクに添加し、ゆっくりと滴下し始め、内部温度を制御した。滴下後、混合物を室温まで昇温させ、反応のために撹拌した。反応終了後、吸引濾過を行い、その後、濾液を蒸留フラスコに移して減圧蒸留し、蒸留フラスコ内にペースト状の固体が出現するまで５０〜６０℃に温度制御した後、酢酸エチルを加えた。酢酸エチルを蒸留フラスコに加えてペースト状の固体が溶解するまで撹拌し、蒸留フラスコ中の原料液を反応フラスコに移した。反応フラスコに飽和塩水を加えて洗い、溶液を静置して分液した。水層を混ぜ合わせ、抽出のために酢酸エチルを加え、溶液を静置して層状に分離させた。水層を捨て、有機層を混ぜ合わせ、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて撹拌して乾燥させ、吸引濾過を行った。濾液を反応フラスコに移し、減圧下で蒸留し、反応溶液中にペースト状の固体が現れるまで温度を５０〜６０℃に制御し、酢酸エチルの一部を添加し、撹拌し、透明になるまで還流し、温度を５０〜６０℃に制御した。ｎ−ヘプタンをタンクに添加し、ボトルに完全に添加されるまで反応ボトルにゆっくりと滴下した。ゆっくり冷却した後、温度を保持しながら反応溶液を撹拌し、吸引濾過を行い、標的生成物である固体の粗製生成物を乾燥させた。収率は７０〜７５％であった。
【００８４】
（実施例３）
アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞
組換えアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の具体的な調製方法は、以下の通りである。すなわち、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）株に由来するアルド−ケトレダクターゼの遺伝子配列を選択し、人工的に設計し、全遺伝子（Genscript Biotechnology Co.,Ltd.により合成された）により人工的に設計した配列を合成し、発現ベクターｐＥＴ２８ａのＮｄｅ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ酵素の切断部位においてクローニングし、宿主Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。形質転換した細胞をポジティブセレクションによって選別し、配列決定し、同定して組換え発現ベクターを得た。組み換え発現ベクターをＥｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株で形質転換し、組換えアルド−ケトレダクターゼの発現を誘導できる、組換えアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌を得た。
【００８５】
遺伝子組換えアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌を、カナマイシンを含むＬＢ媒体に播種し、３７℃で一晩培養して種培養液を得た。種培養液を、カナマイシンを含むＴＢ媒体に播種した。播種量はカナマイシンを含むＴＢ媒体の体積の１％であった。その後、３７℃で２〜５時間培養した。誘導のために滅菌ＩＰＴＧを添加し、ＩＰＴＧの最終濃度は０．１ｍＭであり、播種した細菌を２５℃で２０時間培養し続けた。最後に、高速遠心分離により、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ株に由来するアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を得た。遺伝子操作された細菌の全細胞を超音波法で破壊し、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ株に由来するアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を得た。遺伝子操作された細菌の全細胞の破砕酵素液を得た。アルド−ケトレダクターゼは、タンパク質であり、そのアミノ酸配列が配列番号１に示される。アルド−ケトレダクターゼ遺伝子の塩基配列は、配列表において配列番号２として示される。
【００８６】
発現の誘導後、４５ｋＤａの位置に明確なタンパク質バンドが存在し、これは、アルド−ケトレダクターゼが、組換え細菌において高度に発現したことを示す。
【００８７】
アルド−ケトレダクターゼの純タンパク質の酵素活性を測定した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤＰＨ（ｐＨ８．０）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ基質、
【００８８】
【化２５】
2021517903.tif 000027
【００８９】
および適量の酵素を含む、体積０．２５ｍＬの反応系を使用し、３４０ｎｍでの吸光度の減少を測定した。酵素活性単位（Ｕ）は、上記条件下で１分間当たり１ｕｍｏｌのＮＡＤＰＨの酸化を触媒するのに必要な酵素と定義した。
【００９０】
結果から、組み換え遺伝子操作されたアルド−ケトレダクターゼの活性は、欧州特許（ＥＰ２６３４１８０Ａ１）に開示された配列のものより２０％以上高く、野生型アルド−ケトレダクターゼのものより５０％以上高いことが分かった。
【００９１】
本発明の実施例で使用したアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞は、全てこの方法によって調製した。
【００９２】
本発明の実施例および比較例で使用したグルコースデヒドロゲナーゼはすべて、シグマ−アルドリッチから購入した市販の酵素であった。
【００９３】
エナンチオマー過剰発現のｅｅ値のアルゴリズム：
ee(syn)=([R,R]-[S,S])/([R,R]+[S,S])
ee(anti)=([R,S]-[S,R])/([R,S]+[S,R])
de={([R,S]+[S,R])-([R,R]+[S,S])}/{([R,S]+[S,R])+([R,R]+[S,S])}
酵素還元反応：
【００９４】
【化２６】
2021517903.tif 000028
【００９５】
工程１：１Ｌ振盪フラスコ内で反応を行い、反応系の体積を３００ｍＬに制御した。振盪フラスコ内で、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の破砕酵素液を、滅菌リン酸カリウム緩衝溶液２６０ｍＬに懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを振盪フラスコに添加し、５０分間の超音波により細胞を破壊し、次いでグルコース２５ｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．４２ｇを振盪フラスコに添加した。次いで、反応物質８ｇを秤量し、ＤＭＳＯ４０ｍＬに溶解し、基質が溶解したＤＭＳＯ溶液をゆっくりと振盪フラスコに注いだ。２時間反応後、さらにグルコース１２ｇを加え、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の供給量は７５ｇ／Ｌとし、グルコースデヒドロゲナーゼの供給量は２５ｍｇ／Ｌとし、転化システムの温度は３７℃に制御した。振盪機で転化反応を行い、回転速度を２００ｒ／分に制御し、転化時間を１２時間とし、標的生成物の転化液を９７．８％の転化率で得た。
【００９６】
工程２：工程１で得られた標的生成物の転化液を精製し、反応系に等容量の酢酸エチルを添加し、３７℃で１５分間抽出し、３回繰り返した。酢酸エチル層を遠心分離により回収し、回収した酢酸エチル層に５％無水硫酸マグネシウムを加えて１５分間振盪した後、濾過により硫酸マグネシウムを除去した。次いで、水を除去した後の酢酸エチル層を減圧高温下で濃縮した。標的生成物７．４１ｇが得られ、ｄｅ値は９６．２％、ｅｅ(ａｎｔｉ)値は９９．５％であった。
【００９７】
（実施例４）
【００９８】
【化２７】
2021517903.tif 000029
【００９９】
ＤＣＭ８０ｍＬおよびＡｌＣｌ３  ５．６ｇを２５０ｍＬ四つ口フラスコに連続的に添加し、Ｎ−メチルアニリン１７．１ｇを滴下した後、式Ｃｐ１の化合物の溶液（８０ｍＬのＤＣＭ８０ｍＬに溶解したＣｐ１  ８．０ｇ）を滴下した。滴下後、温度を保持した。反応溶液を希硫酸（水２００ｍＬに溶解した硫酸１０．１ｇ）に滴下し、滴下しながら撹拌した。滴下後、ｐＨを測定した。反応混合物を撹拌し、層状に分離した後、分液を行った。酸性水層をＤＣＭ１００ｍＬで抽出した。混合液を層状に分離し、有機層を混ぜ合わせ、５％ＮａＨＣＯ３溶液で洗った。分液し、有機層を水１００ｍＬで洗った。分液し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機層を吸引濾過し、濾液を５０℃で減圧濃縮して黄色の油状物質とし、ＥＡ２７ｍＬおよびヘプタン２７ｍＬを加え、６０℃で溶解して透明になるまで撹拌した。温度をゆっくり０℃に下げて結晶化させ、得られた結晶を吸引濾過し、混合物（ＥＡ：ヘプタン＝１：１）２０ｍＬでリンスし、乾燥させて、１０ｇの白色様固体、式Ｃｐ２の化合物（純度＞９８％）を得た。
【０１００】
（実施例５）
【０１０１】
【化２８】
2021517903.tif 000030
【０１０２】
反応フラスコに式Ｃｐ２の化合物３．５７ｇとメタノール１５．００ｍＬを順次加え、撹拌しながら苛性ソーダ液０．１５ｇを滴下し、温度を−２０〜３０℃に保持した後、５％硫酸を滴下してｐＨを調整し、重炭酸ナトリウム０．１ｇを加え、３０〜３５℃の水浴中で減圧濃縮してメタノールを除去した。減圧後、水を加え、次いでＤＣＭを加えて抽出し、有機相を混ぜ合わせ、減圧下４０℃で濃縮して、生成物２．５０ｇを収率約９９％で得た。
【０１０３】
（実施例６）
【０１０４】
【化２９】
2021517903.tif 000031
【０１０５】
式Ｃｐ３の化合物２．５０ｇおよびＴＨＦ２０．００ｍＬを反応フラスコに連続的に添加し、内部温度を下げ、ＬｉＡｌＨ４  １．５０ｇを一回でゆっくり添加した。添加後、混合物を室温（２０〜２５℃）までゆっくり昇温し、温度を保持しながら撹拌した。反応後、内部温度を下げ、１０％希塩酸をゆっくり滴下してｐＨを調整した。添加後、室温（２０〜２５℃）までゆっくりと昇温して撹拌した。内部温度を下げ、４％ＮａＯＨ水溶液をゆっくり加えて反応液のｐＨを調整した。ｐＨ調整後、トルエンを添加し、抽出のために撹拌し、トルエン層を混ぜ合わせ、水層を取り出し、抽出のために撹拌しながら水層にＤＣＭを添加した。ＤＣＭ層を混ぜ合わせ、混ぜ合わせたＤＣＭ層を取り出し、適量の無水硫酸ナトリウムを添加してＤＣＭ層を乾燥させた。減圧下、４０℃で濃縮乾固した後、無色の油状物質１．０ｇを収率８０．０％で得た。
【０１０６】
（実施例７）
【０１０７】
【化３０】
2021517903.tif 000032
【０１０８】
式Ｃｐ２の化合物３．５７ｇ、ＴＨＦ２５．００ｍＬ、テトラメチルジシロキサン１．３４ｇ、およびチタンテトライソプロポキシド２．８４ｇを反応フラスコに連続的に添加し、２０〜３０℃で６〜２４時間撹拌した。次いでＥＡ５０ｍＬを添加し、５％硫酸を滴下してｐＨを調整し、混合物を静置して層状に分離させた。ＥＡ２０ｍＬでさらに一度水層を抽出し、有機層を混ぜ合わせ、５％重炭酸ナトリウムを加え、３０〜４５℃の水浴中で減圧濃縮してＥＡを除去した。減圧後、ＥＡ５ｍＬを添加してスラリーを調製し、次いで溶液を濾過し、乾燥させて、白色または白色様固体の式Ｃｐ４の化合物２．２０ｇを収率約９０％で得た。
【０１０９】
（実施例８）
【０１１０】
【化３１】
2021517903.tif 000033
【０１１１】
式Ｂの固体化合物（Ｒ１はベンゾイル）２０．００ｇを汚れていない乾燥した５００ｍＬ四つ口フラスコに添加し、トルエンを添加して撹拌し、窒素保護下で真空置換を行った。混合物を窒素保護下で冷却し、窒素保護下で定圧漏斗にトルエンを添加し、窒素保護下で７０％Ｒｅｄ−Ａｌ溶液（２６．５０ｇ、２６．００ｍＬ）を定圧漏斗に添加した。調製が終了したら、反応液を−１５〜−１０℃に冷却した後、Ｒｅｄ−Ａｌを添加し、温度を制御した。滴下後、温度を保持した。汚れていない１０００ｍＬ四つ口フラスコに純水および酢酸エチルを順次加え、当該汚れていない１０００ｍＬ４つ口フラスコに硫酸を撹拌しながら加え、溶液を冷却した後、温度を一定に保持した。反応液を硫酸溶液に滴下し、反応液の温度を制御し、硫酸溶液の温度を０〜１０℃に制御した。滴下後、酢酸エチルを加えて撹拌した。汚れていない１０００ｍＬ四つ口フラスコに１０％重炭酸ナトリウム水溶液を加えて冷却し、撹拌を停止し、反応液を静置して層状に分離させた。上層の有機層を１０％重炭酸ナトリウム水溶液に移し、撹拌した。酢酸エチルを加えることで下層の酸性水層を抽出し、静置して層状に分離させ、酸性水層を捨てた。第２の酢酸エチル層を１０％重炭酸ナトリウム水溶液に移し、撹拌した。温度を制御し、溶液を静置して層状に分離させた。抽出のために塩基性水層に酢酸エチルを加えて撹拌し、温度を制御し、アルカリ洗浄した有機層に純水を加えて洗い、撹拌した。温度を制御し、静置して層状に分離させ、さらなる使用のために、水で洗浄した有機層を得た。水で洗浄した水層を酢酸エチルでさらに抽出し、静置して層状に分離させ、水層を捨てた。有機層を混ぜ合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、吸引濾過し、酢酸エチルでリンスした。濾液を減圧下、４０〜７０℃で濃縮し、油状物質約１７ｇを収率８４．３３％で得た。
【０１１２】
（実施例９）
【０１１３】
【化３２】
2021517903.tif 000034
【０１１４】
メタノール１０．００ｍＬおよび式Ｃの化合物（Ｒ１はベンゾイル）１．００ｇを反応フラスコに連続的に加え、−１５〜−５℃に冷却し、水酸化ナトリウム水溶液１０．００ｍＬを滴下した。滴下後、原料が完全に反応するまで温度を保持しながら撹拌した。１０％硫酸水溶液４．００ｇを滴下し、滴下後、温度を保持して反応を続けた。温度変化を開始した後、飽和炭酸ナトリウム水溶液を添加してｐＨを調整した。高温減圧下で蒸留することでメタノールを除去した後、抽出のためにメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加え、有機層を分離した。水層に塩化ナトリウムを加えて飽和させ、抽出のためにさらにジクロロメタンを加え、回収するために水層を分離した。有機層を減圧蒸留してジクロロメタンを除去し、生成物０．３８ｇを収率７３．７７％で得た。
【０１１５】
（実施例１０）
【０１１６】
【化３３】
2021517903.tif 000035
【０１１７】
式Ｃｐ２の化合物３．５０ｇおよびＴＨＦ２０．００ｍＬを反応フラスコに連続的に添加し、内部温度を下げ、ＬｉＡｌＨ４  １．５０ｇを一回でゆっくり添加した。添加後、混合物を室温（２０〜２５℃）までゆっくり昇温させ、温度を保持しながら撹拌した。反応後、内部温度を下げ、１０％希塩酸をゆっくり滴下してｐＨを調整した。添加後、室温（２０〜２５℃）までゆっくりと温めて撹拌した。内部温度を下げ、４％  ＮａＯＨ水溶液をゆっくり加えて反応液のｐＨを調整した。ｐＨ調整後、トルエンを添加し、抽出のために撹拌し、トルエン層を混ぜ合わせ、水層を取り出した。抽出のために撹拌しながら水層にＤＣＭを添加し、ＤＣＭ層を混ぜ合わせ、混ぜ合わせたＤＣＭ層を取り出し、ＤＣＭ層に適量の無水硫酸ナトリウムを添加して乾燥させた。減圧下、４０℃で濃縮乾固した後、無色の油状物質１．０ｇを収率８０．０％で得た。
【０１１８】
（実施例１１）
【０１１９】
【化３４】
2021517903.tif 000036
【０１２０】
酵素の調製は、実施例３と同様に行った。
【０１２１】
工程１：５Ｌ振盪フラスコ内で反応を行い、反応系の体積を２Ｌに制御した。振盪フラスコ内で、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を、滅菌リン酸カリウム緩衝溶液１．７Ｌに懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを振盪フラスコに添加し、５０分間の超音波により細胞を破壊し、次いでグルコース２５ｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．４２ｇを振盪フラスコに添加した。次いで、基質８ｇを秤量し、ＤＭＳＯ３００ｍＬに溶解し、基質が溶解したＤＭＳＯ溶液をゆっくりと振盪フラスコに注いだ。２時間反応後、さらにグルコース１２ｇを加え、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の供給量は７５ｇ／Ｌとし、グルコースデヒドロゲナーゼの供給量は２５ｍｇ／Ｌとし、転化システムの温度は３７℃に制御した。振盪機で転化反応を行い、回転速度を２００ｒ／分に制御し、転化時間を１２時間とし、標的生成物の転化液を９７．８％の転化率で得た。
【０１２２】
工程２：工程１で得られたダルナビルの中間体である、式ＶＩＩＩの化合物を含む転化液を精製した。精製工程は、実施例３と同様にし、標的生成物７７．１０ｇが得られた。精製した標的化合物のｄｅ値は９３．４％、ｅｅ(ａｎｔｉ)値は９９．６％であった。
【０１２３】
（実施例１２）
【０１２４】
【化３５】
2021517903.tif 000037
【０１２５】
工程１：１Ｌ振盪フラスコ内で反応を行い、反応系の体積を３００ｍＬに制御した。振盪フラスコ内で、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を、滅菌イオン交換水２５０ｍＬに懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを振盪フラスコに添加し、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１０ｍＬ、ＮＡＤＰ＋  ０．２６ｇを添加した。次いで、基質１０ｇを秤量し、酢酸ブチル３０ｍＬに溶解し、基質が溶解した酢酸ブチル溶液をゆっくりと振盪フラスコに注いだ。１時間反応後、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１０ｍＬをさらに加え、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の供給量は７５ｇ／Ｌとし、グルコースデヒドロゲナーゼの供給量は２５ｍｇ／Ｌとし、転化システムの温度は３７℃に制御した。振盪機で転化反応を行い、回転速度を２００ｒ／分に制御し、転化時間を１２時間とし、標的生成物の転化液を９７．８％の転化率で得た。
【０１２６】
工程２：工程１で得られた標的化合物の転化液を精製し、反応系に等容量の酢酸エチルを添加し、３７℃で１５分間抽出し、３回繰り返した。酢酸エチル層を遠心分離により回収し、回収した酢酸エチル層に５％無水硫酸マグネシウムを加えて１５分間振盪した後、濾過により硫酸マグネシウムを除去した。次いで、水を除去した後の酢酸エチル層を減圧高温下で濃縮した。標的化合物９．５５ｇが得られ、得られた標的化合物のｄｅ値は９９．１％、エナンチオマーのｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．７％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ２．２６９〜２．３０１（ｍ、１Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、２．３６７〜２．４０４（ｍ、１Ｈ）、２．９５４〜２．９９３（ｍ、１Ｈ、J＝６Ｈｚ）、３．４３８〜３．４６６（ｍ、１Ｈ）、３．５２０〜３．５４９（ｍ、１Ｈ）、４．２２７〜４．２６９（ｍ、１Ｈ）、４．２９８〜４．３２６（ｍ、１Ｈ）、４．３９１〜４．４２０（ｍ、１Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ２１０．０３［ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２７】
（実施例１３）
【０１２８】
【化３６】
2021517903.tif 000038
【０１２９】
工程１：５Ｌ振盪フラスコ内で反応を行い、反応系の体積を２Ｌに制御した。振盪フラスコ内で、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を、滅菌イオン交換水１．５Ｌに懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを添加し、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１００ｍＬ、ＮＡＤＰ＋  ３ｇを添加した。次いで、基質１００ｇを秤量し、酢酸ブチル３００ｍＬに溶解し、基質が溶解した酢酸ブチル溶液をゆっくりと振盪フラスコに注いだ。１時間反応後、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１００ｍＬをさらに加え、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の供給量は１００ｇ／Ｌとし、グルコースデヒドロゲナーゼの供給量は２５ｍｇ／Ｌとし、転化システムの温度は２８℃に制御した。振盪機で転化反応を行い、回転速度を２００ｒ／分に制御し、転化時間を１２時間とし、標的生成物の転化液を９７．８％の転化率で得た。
【０１３０】
工程２：工程１で得られた標的物の転化液を精製した。精製工程は、実施例３と同様にし、標的物９．４２ｇが得られた。精製した標的物のｄｅ値は９６．９％、ｅｅ(ａｎｔｉ)値は９９．４％であった。
【０１３１】
（実施例１４）
【０１３２】
【化３７】
2021517903.tif 000039
【０１３３】
工程１：５Ｌ振盪フラスコ内で反応を行い、反応系の体積を３００ｍＬに制御した。振盪フラスコ内で、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を、滅菌イオン交換水２５０ｍＬに懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを添加し、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１０ｍＬ、ＮＡＤＰ＋  ０．２６ｇを添加した。次いで、基質１０ｇを秤量し、酢酸ブチル３０ｍＬに溶解し、基質が溶解した酢酸ブチル溶液をゆっくりと振盪フラスコに注いだ。１時間反応後、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１０ｍＬをさらに加え、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の供給量は７５ｇ／Ｌとし、グルコースデヒドロゲナーゼの供給量は２５ｍｇ／Ｌとし、転化システムの温度は３７℃に制御した。振盪機で転化反応を行い、回転速度を２００ｒ／分に制御し、転化時間を１２時間とし、標的生成物の転化液を９７．８％の転化率で得た。
【０１３４】
工程２：工程１で得られた標的物の転化液を精製した。精製工程は、実施例３と同様にし、標的物９．３７ｇが得られた。精製した標的物のｄｅ値は９７．１％、ｅｅ(ａｎｔｉ)値は９９．５％であった。
【０１３５】
（実施例１５）
【０１３６】
【化３８】
2021517903.tif 000040
【０１３７】
工程１：５Ｌ振盪フラスコ内で反応を行い、反応系の体積を２Ｌに制御した。振盪フラスコ内で、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を、滅菌イオン交換水１．６Ｌに懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを添加し、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１００ｍＬ、ＮＡＤＰ＋  ２．５ｇを添加した。次いで、基質１００ｇを秤量し、酢酸ブチル２００ｍＬに溶解し、基質が溶解した酢酸ブチル溶液をゆっくりと振盪フラスコに注いだ。１時間反応後、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１００ｍＬをさらに加え、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の供給量は５０ｇ／Ｌとし、グルコースデヒドロゲナーゼの供給量は２５ｍｇ／Ｌとし、転化システムの温度は２５℃に制御した。振盪機で転化反応を行い、回転速度を２００ｒ／分に制御し、転化時間を１２時間とし、標的生成物の転化液を９７．８％の転化率で得た。
【０１３８】
工程２：工程１で得られた標的化合物の転化液を精製した。精製工程は、実施例３と同様にし、標的化合物９３．１ｇが得られた。精製した標的化合物のｄｅ値は９５．６％、ｅｅ(ａｎｔｉ)値は９９．６％であった。
【０１３９】
（実施例１６：比較例）
【０１４０】
【化３９】
2021517903.tif 000041
【０１４１】
工程１：１Ｌ振盪フラスコ内で反応を行い、反応系の体積を３００ｍＬに制御した。振盪フラスコ内で、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を、滅菌イオン交換水２５０ｍＬに懸濁した。使用したアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞のアルド−ケトレダクターゼ遺伝子のコード配列は、欧州特許ＥＰ２６３４１８０（すなわち、特許ＥＰ２６３４１８０に示される配列番号１２）に公開されている配列と同様であり、配列は全遺伝子（Genscript Biotechnology Co.,Ltd.により合成された）により合成し、調製方法は実施例３と同様にした。グルコースデヒドロゲナーゼを添加し、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１０ｍＬ、ＮＡＤＰ＋  ０．２６ｇを添加した。次いで、基質１０ｇを秤量し、酢酸ブチル３０ｍＬに溶解し、基質が溶解した酢酸ブチル溶液をゆっくりと振盪フラスコに注いだ。１時間反応後、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１０ｍＬをさらに加え、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の供給量は７５ｇ／Ｌとし、グルコースデヒドロゲナーゼの供給量は２５ｍｇ／Ｌとし、転化システムの温度は３７℃に制御した。振盪機で転化反応を行い、回転速度を２００ｒ／分に制御し、転化時間を１２時間とした。
【０１４２】
精製工程は、実施例３と同様にし、標的化合物８．１１ｇが得られた。精製した標的化合物のｄｅ値は８５．１％、ｅｅ(ａｎｔｉ)値は９３．３％であった。
【０１４３】
（実施例１７：比較例）
【０１４４】
【化４０】
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【０１４５】
工程１：１Ｌ振盪フラスコ内で反応を行い、反応系の体積を３００ｍＬに制御した。振盪フラスコ内で、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ株のアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞を、滅菌イオン交換水２５０ｍＬに懸濁した。使用したアルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞のアルド−ケトレダクターゼ遺伝子のコード配列は、配列番号３に示す。配列は全遺伝子（Genscript Biotechnology Co.,Ltd.により合成された）により合成し、調製方法は実施例３と同様にした。グルコースデヒドロゲナーゼを添加し、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１０ｍＬ、ＮＡＤＰ＋  ０．２６ｇを添加した。次いで、基質１０ｇを秤量し、酢酸ブチル３０ｍＬに溶解し、基質が溶解した酢酸ブチル溶液をゆっくりと振盪フラスコに注いだ。１時間反応後、２．５ｍｏｌ／Ｌグルコース１０ｍＬをさらに加え、アルド−ケトレダクターゼの遺伝子操作された細菌の全細胞の供給量は７５ｇ／Ｌとし、グルコースデヒドロゲナーゼの供給量は２５ｍｇ／Ｌとし、転化システムの温度は３７℃に制御した。振盪機で転化反応を行い、回転速度を２００ｒ／分に制御し、転化時間を１２時間とした。
【０１４６】
精製工程は、実施例３と同様にし、標的化合物７．７３ｇが得られた。精製した標的化合物のｄｅ値は７９．６％、ｅｅ(ａｎｔｉ)値は８８．７であった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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