(57)【要約】以下の式（Ｉ）の化合物が開示される：【化１】2021512865.tif 000102  （式中、変数Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｗ、Ｖ、Ｒ１−Ｒ５、及びｍのそれぞれは、本明細書で定義される）。ナノ複合体を含む医薬組成物（ナノ複合体は、化合物の１つ、及びタンパク質、核酸、または低分子から形成される）ならびに医薬組成物の１つで病状を処置する方法も開示される。【選択図】なし
2021512865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2021512865.tif 000070
（式中、
親水性頭部であるＡは、
【化２】
2021512865.tif 000071
であり、
Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、及びＲａ”’のそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｚは、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１−Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり、
Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール、または
【化３】
2021512865.tif 000072
であり、
Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり、
Ｒ３及びＲ４のそれぞれは独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している原子と共に、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルを形成し、
Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、
Ｖは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、
リンカーであるＸは、
【化４】
2021512865.tif 000073
であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｇは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｑは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり；ｒ及びｔのそれぞれは独立して、１〜６であり、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、及びＲｉのそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ｍは、０または１であり、但し、ＶがＳである場合、ｍは、１である）。
【請求項２】
Ａが、
【化５】
2021512865.tif 000074
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｂが、
【化６】
2021512865.tif 000075
である、請求項１〜２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘが、
【化７】
2021512865.tif 000076
であり、
Ｒｃ及びＲｄのそれぞれが独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキルである、請求項１〜３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれが、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれが独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ５がＣ１−Ｃ２０アルキルである、請求項１〜４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｗが、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；Ｖが結合である、請求項１〜５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｗ及びＶのそれぞれが独立して、ＯまたはＳｅであり、ｍが０である、請求項１〜５に記載の化合物。
【請求項８】
Ｗ及びＶのそれぞれが、ＯまたはＳであり；ｍが１である、請求項１〜５に記載の化合物。
【請求項９】
Ａが、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である、請求項１〜８に記載の化合物：
【化８】
2021512865.tif 000077
【請求項１０】
Ａが、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である、請求項１〜８に記載の化合物。
【化９−１】
2021512865.tif 000078
【化９−２】
2021512865.tif 000079
【請求項１１】
Ａが、
【化１０】
2021512865.tif 000080
であり、
Ｂが、
【化１１】
2021512865.tif 000081
であり、
Ｒ１及びＲ２のそれぞれが、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれが独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ５がＣ１−Ｃ２０アルキルである、請求項１〜１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ａが、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物：
【化１２】
2021512865.tif 000082
【請求項１３】
Ａが、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物：
【化１３−１】
2021512865.tif 000083
【化１３−２】
2021512865.tif 000084
【請求項１４】
Ｗが、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；Ｖが結合である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｗ及びＶのそれぞれが独立して、ＯまたはＳｅであり、ｍが０である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｗ及びＶのそれぞれがＯであり、ｍが１である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
式（Ｉ）の化合物
【化１４】
2021512865.tif 000085
（式中、
親水性頭部であるＡは、
【化１５】
2021512865.tif 000086
であり、
Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、及びＲａ”’のそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｚは、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１−Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり、
Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール、または
【化１６】
2021512865.tif 000087
であり、
Ｒ１が、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり、
Ｒ２が、結合またはＣ１〜Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり、
Ｒ３及びＲ４のそれぞれは独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している原子と共に、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルを形成し、
Ｒ５が、
【化１７】
2021512865.tif 000088
であり、
Ｒ６は、結合またはＣ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒｂ及びＲｂ’はそれぞれ、Ｆであるか、またはＲｂ及びＲｂ’は、それらが結合している原子と共に、Ｃ＝Ｏを形成し；Ｒ７は、Ｆまたは脂肪族脂質部分であり；Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり、Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｎは、１〜２０であり；
Ｗ及びＶのそれぞれが独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、
リンカーであるＸは、
【化１８】
2021512865.tif 000089
であり、
Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｇは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｑは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり；ｒ及びｔのそれぞれは独立して、１〜６であり、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、及びＲｉのそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ｍが０または１である）。
【請求項１８】
Ａが、
【化１９】
2021512865.tif 000090
であり、
Ｂが、
【化２０】
2021512865.tif 000091
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれが、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれが独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項１７または１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｌ１及びＬ２のそれぞれが結合であり、Ｒｂ、Ｒｂ’、及びＲ７のそれぞれがＦである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ２、Ｗ、及びＶのそれぞれが結合であり、ｍが０である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ａが、
【化２１】
2021512865.tif 000092
であり、
Ｂが、
【化２２】
2021512865.tif 000093
である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１が、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり；Ｘが、
【化２３】
2021512865.tif 000094
であり、
Ｒｃ及びＲｄのそれぞれが独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキルである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ａが、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である、請求項２３に記載の化合物：
【化２４】
2021512865.tif 000095
【請求項２５】
Ａが、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である、請求項２３に記載の化合物：
【化２５−１】
2021512865.tif 000096
【化２５−２】
2021512865.tif 000097
【請求項２６】
Ｒ６が、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり、Ｌ１及びＬ２のそれぞれが独立して、ＯまたはＮＲｃであり、Ｒｃが、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキルであり；Ｒｂ及びＲｂ’が、それらが結合している原子と共に、Ｃ＝Ｏを形成し；ｎが１または２であり；Ｒ７が脂肪族脂質部分である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ７が、コレステロールから形成される脂肪族脂質部分である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれが、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり；Ｘが、
【化２６】
2021512865.tif 000098
であり、
Ｒｃ及びＲｄのそれぞれが独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキルであり；Ｗ及びＶのそれぞれが独立して、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；ｍが０である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２９】
Ａが、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である、請求項２７に記載の化合物：
【化２７】
2021512865.tif 000099
【請求項３０】
Ａが、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である、請求項２７に記載の化合物：
【化２８−１】
2021512865.tif 000100
【化２８−２】
2021512865.tif 000101
【請求項３１】
ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物及びタンパク質または核酸から形成され、前記ナノ複合体が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して前記タンパク質または核酸に結合する、医薬組成物。
【請求項３２】
前記タンパク質が、ＧＦＰ−ＣｒｅまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の化合物及びタンパク質または核酸から形成され、前記ナノ複合体が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して前記タンパク質または核酸に結合する、医薬組成物。
【請求項３４】
前記タンパク質が、ＧＦＰ−ＣｒｅまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項３１または３２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３６】
病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項３３または３４に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３７】
ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物及び低分子から形成され；前記ナノ複合体が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して、前記低分子に結合する、医薬組成物。
【請求項３８】
前記低分子が、抗真菌剤または化学療法剤である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記低分子が、ボルテゾミブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、シタラビン、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、メトトレキサート、パクリタキセル、ビンクリスチン硫酸塩、エピルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、レナリドマイド、イブルチニブ、アビラテロン酢酸エステル、エンザルタミド、ペメトレキセド、パルボシクリブ、ニロチニブ、エベロリムス、ルキソリチニブ、エピルビシン、ピリルビシン、イダルビシン、バルルビシン、アムルビシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ストレプトゾテシン、ペントスタチン、ミトサン（Ｍｉｔｏｓａｎｅｓ）マイトマイシンＣ、エンジインカリケアマイシン、グリコシドレベッカマイシン、マクロライドラクトンエポチヒロン（ｅｐｏｔｉｈｉｌｏｎｅｓ）、イクサベピロン、ペントスタチン、サリノスポラミドＡ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシド、ビノレルビン、ドセタキセル、カンプトテシン、ハイカムチン、ペデリン、テオペデリン（Ｔｈｅｏｐｅｄｅｒｉｎｓ）、アナミド（Ａｎｎａｍｉｄｅｓ）、トラベクテジン、アプリジン、及びエクテイナシジン７４３（ＥＴ７４３）からなる群より選択される、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記低分子が、アムホテリシンＢまたはドキソルビシンである、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
ナノ複合体を含む医薬組成物であって、前記ナノ複合体が、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の化合物及び低分子から形成され；前記ナノ複合体が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒径を有し、前記化合物が、非共有結合相互作用、共有結合、またはその両方を介して、前記低分子に結合する、医薬組成物。
【請求項４２】
前記低分子が、抗真菌剤または化学療法剤である、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記低分子が、ボルテゾミブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、シタラビン、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、メトトレキサート、パクリタキセル、ビンクリスチン硫酸塩、エピルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、レナリドマイド、イブルチニブ、アビラテロン酢酸エステル、エンザルタミド、ペメトレキセド、パルボシクリブ、ニロチニブ、エベロリムス、ルキソリチニブ、エピルビシン、ピリルビシン、イダルビシン、バルルビシン、アムルビシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ストレプトゾテシン、ペントスタチン、ミトサンマイトマイシンＣ、エンジインカリケアマイシン、グリコシドレベッカマイシン、マクロライドラクトンエポチヒロン、イクサベピロン、ペントスタチン、サリノスポラミドＡ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシド、ビノレルビン、ドセタキセル、カンプトテシン、ハイカムチン、ペデリン、テオペデリン、アナミド、トラベクテジン、アプリジン、及びエクテイナシジン７４３（ＥＴ７４３）からなる群より選択される、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記低分子が、アムホテリシンＢまたはドキソルビシンである、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４６】
病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１８年２月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６２５，１５３号に対する優先権の利益を主張し、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【政府の支援】
【０００２】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより授与された研究費１４５２１２２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された研究費ＥＢ０２７１７０及びＴＲ００２６３６、ならびにＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｖｙにより授与された研究費Ｎ０００１４−１６−１−２５５０に基づき、政府支援と共に行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質ベースの治療薬は、高い特異性及び低いオフターゲット効果のために、細胞機能の一過性の正確な操作に使用される。例えば、クラスター化された規則的な間隔の短い回文構造反復に関連するタンパク質９、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、遺伝子欠失、挿入、活性化、及び抑制を介するか、または後成的修飾を介する編集ゲノムのための高い柔軟性及び特異性を実証する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、疾患のモデリングならびに様々な遺伝性疾患及び感染症に対する新しい処置の特定を容易にする。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのタンパク質は、治療効果を達成するために、その標的部位、すなわち、細胞内標的、に送達する必要がある。さらに、治療用タンパク質の細胞内送達のための安全で効率的な担体を開発することは、長年の課題であった。
【０００５】
タンパク質を送達するための従来の方法は、機械的／物理的手法（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び流体力学的注射）ならびに担体ベースの生化学的修飾（例えば、核局在化シグナルペプチド、脂質、または脂質様ナノ複合体、及びポリマーアセンブリー）を含む。機械的／物理的手法は、担体を必要としないが、侵襲性であることが判明して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用に実用的な問題が生じる。他方では、生化学的修飾に使用される担体は、タンパク質を細胞内に送達することが可能であるが、大きな制限、例えば、低いトランスフェクション効率及び高い細胞毒性、を示す。
【０００６】
標的部位にタンパク質を送達するための上記の制限なしに新しい担体を開発する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、その標的部位に、タンパク質、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を送達するために使用することができる脂質様ナノ複合体を形成するための特定の親油性化合物に関する。予想外に、これらの脂質様ナノ複合体は、タンパク質を送達するために一般に使用される市販の薬剤であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｐｆ２ｋ）よりも高いトランスフェクション効率及び低い細胞毒性を実証する。
【０００８】
本発明の一態様では、それは、以下の式（Ｉ）の脂質様化合物の２つのセットを網羅する：
【化１】
2021512865.tif 000003
【０００９】
１つのセットでは、式（Ｉ）に関して、Ａは、
【化２】
2021512865.tif 000004
から選択される親水性頭部であり、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、及びＲａ”’のそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｚは、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１−Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり、Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール、または
【化３】
2021512865.tif 000005
であり、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは独立して、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれは独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している原子と共に、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルを形成し；Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；Ｖは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、リンカーであるＸは、
【化４】
2021512865.tif 000006
であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｇは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｑは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり；ｒ及びｔのそれぞれは独立して、１〜６であり、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、及びＲｉのそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｍは、０または１であり、但し、ＶがＳである時に、ｍは、１である。
【００１０】
他のセットでは、さらに、式（Ｉ）に関し、Ａは、
【化５】
2021512865.tif 000007
から選択される親水性頭部であり、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、及びＲａ”’のそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｚは、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１−Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり、Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール、または
【化６】
2021512865.tif 000008
であり、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ２は、結合またはＣ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれは独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している原子と共に、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルを形成し；Ｒ５は、
【化７】
2021512865.tif 000009
であり、Ｒ６は、結合またはＣ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒｂ及びＲｂ’のそれぞれは、Ｆであるか、またはＲｂ及びＲｂ’は、それらが結合している原子と共に、Ｃ＝Ｏを形成し；Ｒ７は、Ｆまたは脂肪族脂質部分であり；Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり、Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｎは、１〜２０であり；Ｗ及びＶのそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；リンカーであるＸは、
【化８】
2021512865.tif 000010
であり、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｇは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｑは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり；ｒ及びｔのそれぞれは独立して、１〜６であり、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、及びＲｉのそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｍは、０または１である。
【００１１】
通常は、上記の脂質様化合物は、
【化９】
2021512865.tif 000011
のいずれかのような変数Ａを有し、Ｒａ及びＲａ’のそれぞれは独立して、Ｃ１−Ｃ１０一価脂肪族ラジカル、Ｃ１−Ｃ１０一価ヘテロ脂肪族ラジカル、一価アリールラジカル、または一価ヘテロアリールラジカルであり；Ｚは、Ｃ１−Ｃ１０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１−Ｃ１０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルである。これらの化合物は、好ましくは、
【化１０】
2021512865.tif 000012
のような変数Ｂを有する。
【００１２】
本明細書における「脂質様化合物」という用語は、１つ以上の親水性（または極性）アミン含有頭部基及び１つ以上の疎水性（または無極性）炭化水素含有尾部を含有する化合物を指す。例えば、以下を参照のこと、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１０，１０７（５），１８６４−１８６９。「脂質様ナノ複合体」という用語は、脂質様化合物のうちの１つを含有するナノ複合体を指す。例えば、以下を参照のこと、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１４，５３（１１），２８９３−２８９８。
【００１３】
本明細書における「脂肪族」という用語は、飽和または不飽和、直鎖状または分枝状、非環式、環式、または多環式炭化水素部分を指す。例としては、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、シクロアルキニル、及びシクロアルキニレン部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書における「脂肪族脂質部分」という用語は、長鎖、飽和または不飽和、直鎖状または分枝状、非環式、環式、または多環式炭化水素、アルコール、アルデヒド、またはカルボン酸を含有する疎水性部分を指す。例としては、コレステロール、デスモステロール、及びラノステロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
「アルキル」または「アルキレン」という用語は、メチル、メチレン、エチル、エチレン、プロピル、プロピレン、ブチル、ブチレン、ペンチル、ペンチレン、ヘキシル、ヘキシレン、ヘプチル、ヘプチレン、オクチル、オクチレン、ノニル、ノニレン、デシル、デシレン、ウンデシル、ウンデシレン、ドデシル、ドデシレン、トリデシル、トリデシレン、テトラデシル、テトラデシレン、ペンタデシル、ペンタデシレン、ヘキサデシル、ヘキサデシレン、ヘプタデシル、ヘプタデシレン、オクタデシル、オクタデシレン、ノナデシル、ノナデシレン、イコシル、イコシレン、トリアコンチル、及びトリアコチレンなどの飽和、直鎖状または分枝状炭化水素部分を指す。「アルケニル」または「アルケニレン」という用語は、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−などの、少なくとも１つの二重結合を含有する直鎖状または分枝状炭化水素部分を指す。「アルキニル」または「アルキニレン」という用語は、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３及び−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−などの少なくとも１つの三重結合を含有する直鎖状または分枝状炭化水素部分を指す。「シクロアルキル」または「シクロアルキレン」という用語は、シクロヘキシル及びシクロヘキシレンなどの飽和環状炭化水素部分を指す。「シクロアルケニル」または「シクロアルケニレン」という用語は、シクロヘキセニルシクロヘキセニレンなどの、少なくとも１つの二重結合を含有する非芳香族環状炭化水素部分を指す。「シクロアルキニル」または「シクロアルキニレン」という用語は、少なくとも１つの三重結合を含有する非芳香族環状炭化水素部分であるシクロオクチニル及びシクロオクチニレンを指す。
【００１６】
本明細書における「ヘテロ脂肪族」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓ、Ｓｉ、Ｓｂ、Ａｌ、Ｓｎ、Ａｓ、Ｓｅ、及びＧｅから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する脂肪族部分を指す。
【００１７】
本明細書における「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキルを指す。アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、及びｔｅｒｔ−ブトキシが挙げられる。
【００１８】
本明細書における「アリール」という用語は、Ｃ６単環式、Ｃ１０二環式、Ｃ１４三環式、Ｃ２０四環式、またはＣ２４五環式芳香環系を指す。アリール基の例としては、フェニル、フェニレン、ナフチル、ナフチレン、アントラセニル、アントラセニレン、ピレニル、及びピレニレンが挙げられる。「ヘテロアリール」という用語は、本明細書では、１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＳｅ）を有する芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、１１〜１４員三環式、及び１５〜２０員四環式環系を指す。ヘテロアリール基の例としては、フリル、フリレン、フルオレニル、フルオレニレン、ピロリル、ピロリレン、チエニル、チエニレン、オキサゾリル、オキサゾリレン、イミダゾリル、イミダゾリレン、ベンズイミダゾリル、ベンズイミダゾリレン、チアゾリル、チアゾリレン、ピリジル、ピリジレン、ピリミジニル、ピリミジニレン、キナゾリニル、キナゾリニレン、キノリニル、キノリニレン、イソキノリル、イソキノリレン、インドリル、及びインドリレンが挙げられる。
【００１９】
別途明記のない限り、本明細書で言及される脂肪族、ヘテロ脂肪族、アルコキシ、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、シクロアルキニル、シクロアルキニレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、置換及び非置換部分の両方を含む。シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、シクロアルキニル、シクロアルキニレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニレン、アリール、及びヘテロアリールの可能な置換基は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ２０アルコキシ、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ２−Ｃ２０ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホンアミノ、アリールスルホンアミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルイミノ、アリールイミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホンイミノ、アリールスルホンイミノ、ヒドロキシル、ハロ、チオ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、アリールチオ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アシルアミノ、アミノアシル、アミノチオアシル、アミド、アミジノ、グアニジン、ウレイド、チオウレイド、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、アシル、チオアシル、アシルオキシ、カルボキシル、及びカルボン酸エステルを含むが、これらに限定されない。他方では、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、及びアルキニレンの可能な置換基は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル以外の上記の置換基の全てを含む。シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニレン、アリール、及びヘテロアリールも互いに融合することができる。
【００２０】
上記の脂質様化合物は、化合物自体、ならびに該当する場合、それらの塩及び溶媒和物を含む。例えば、塩は、アニオン及び脂質様化合物の正荷電基（例えば、アミノ）間で形成することができる。好適なアニオンとしては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、トシル酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、乳酸塩、グルタル酸塩、及びマレイン酸塩が挙げられる。同様に、塩はまた、カチオン及び脂質様化合物の負荷電基（例えば、カルボン酸塩）間で形成することができる。好適なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、及びテトラメチルアンモニウムイオンなどのアンモニウムカチオンが挙げられる。脂質様化合物は、４級窒素原子を含有する塩も含む。溶媒和物は、脂質様化合物及び薬学的に許容される溶媒間で形成される複合体を指す。薬学的に許容される溶媒の例としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミンが挙げられる。
【００２１】
本発明の別の態様は、上述の脂質様化合物から形成されたナノ複合体及びタンパク質または核酸を含有する医薬組成物に関する。この組成物では、ナノ複合体は、５０〜１０００ｎｍ（例えば、５０〜５００ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、及び５０〜１８０ｎｍ）の粒径を有する。脂質様化合物は、非共有相互作用、共有結合、またはその両方を介してタンパク質または核酸に結合する。
【００２２】
「タンパク質」という用語は、アミド結合により互いに連結されており且つ８００ダルトン以上の分子量を有する天然または非天然アミノ酸のポリマーを指す。「核酸」という用語は、８００ダルトン以上の分子量を有する、ホスホジエステル結合により互いに連結されているヌクレオチドのポリマーを指す。これらのポリマーの両方は、化学修飾することができる。タンパク質修飾の例としては、そこに含有されるリジン残基のアミン基のＰＥＧ化及びカルボキシル化が挙げられる。より具体的には、タンパク質またはペプチドのカルボキシル化は、ｃｉｓ−アコニット酸無水物を使用することにより達成することができる。以下を参照のこと、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００９，４８，５３０９−５３１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１０，４９，２５５２−２５５５；及びＭａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１２，１３４，１０１６９−１０１７３。
【００２３】
「非共有相互作用」という用語は、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、及び疎水性相互作用を含む、任意の非共有結合を指す。
【００２４】
医薬組成物は通常は、薬学的に許容される担体を含有する。医薬組成物中の担体は、それが組成物の活性成分と適合し（好ましくは、活性成分を安定化することが可能な）、処置されるべき対象に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。１つ以上の可溶化剤は、活性グリコシド化合物の送達のための医薬賦形剤として利用することができる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、及びＤ＆Ｃイエロー＃１０が挙げられる。
【００２５】
病状、例えば、肺疾患の処置方法は、本発明によりさらに網羅される。方法は、それを必要とする対象に、有効量の上記医薬組成物を投与するステップを含む。
【００２６】
本発明の詳細は、以下の明細書に記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明から、また特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】脂質様化合物（リピドイド）の合成及びリピドイドナノ粒子へのタンパク質のカプセル化の概略図である。（ａ）細胞内タンパク質の送達及びゲノム編集のための、合成カチオン性リピドイドナノ粒子（ＬＮＰ）への負荷電ＧＦＰ−Ｃｒｅ及びＣａｓ９：ｓｇＲＮＡのカプセル化。（ｂ）合成経路及びリピドイドの命名法。（ｃ）リピドイド合成のためのアミン頭部の化学構造。
【図２】リピドイド及びＬＮＰの特性決定の概略図である。（ａ）及び（ｂ）７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅ（以下の例示的な脂質様化合物を参照のこと）の１ＨＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳスペクトル。（ｃ）ＬＮＰの平均流体力学的直径（＜Ｄｈ＞）分布の統計分析。（ｄ）７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰの代表的な流体力学的直径分布。
【図３】リピドイド及びＬＮＰの別の特性決定の概略図である。（ａ）及び（ｂ）７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰの代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像及び相対的なサイズ変動（スケールバーは１００ｎｍである）。（ｃ）保存中のＤｉＯ／ＤｉＩ搭載７６−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰの蛍光発光強度及びＦＲＥＴ比。
【図４】タンパク質送達のためのＬＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの概略図である。（ａ）（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質ならびに（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰで処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞の代表的な画像。スケールバー＝２００μｍ。（ｂ）試験された５１のＬＮＰに対して示されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ。ＬＮＰで誘導された高レベルのトランスフェクションに対して赤色で示されたデータポイント。（ｃ）尾部（Ｏ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、及びＯ１７Ｓｅ）は、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質トランスフェクション活性に影響を与えた。
【図５】ＬＮＰの構造活性相関の概略図である。（ａ）及び（ｂ）見かけのｐＫａ値及びリン脂質二重層膜破壊能は、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質送達効率に影響を与えた。（ｃ）特性がない、１つまたは２つの特性を有する効果的なＬＮＰの相対的なヒット率。（ｄ）Ｏ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、またはＯ１７Ｓｅ尾部を有する効果的なＬＮＰの相対ヒット率。
【図６】ＬＮＰを用いる（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ送達の効率を示す。（ａ）（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載ＬＮＰで処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞のＤｓＲｅｄ発現。（ｂ）（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載ＬＮＰで処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞の細胞生存率。
【図７】ＰＢＳ及びＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰで処置されたＡｉ１４マウスから得られた肺の切片の代表的な蛍光画像の概略図である（１列目は、４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールまたはＤＡＰＩであり；２列目は、ｔｄＴｏｍａｔｏであり；３列目は、１列目及び２列目のマージを示し、スケールバーは、１００μｍである）。
【図８】ＬＮＰを用いるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達の効率を示す。（ａ）Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ／ＬＮＰで処置されたＧＦＰ−ＨＥＫ細胞のＧＦＰノックアウト。（ｂ）Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ／ＬＮＰで処置されたＧＦＰ−ＨＥＫ細胞の細胞生存率。
【図９】細胞内送達のためのコレステロール系及び還元応答性コンビナトリアルリピドイドの概略表現である。（Ａ）カチオン性リピドイド及びアミン頭部基の化学構造。（Ｂ）抗がん剤、ｍＲＮＡ、及びタンパク質送達のための多機能プラットフォームとしてのリピドイドナノ粒子。
【図１０】リピオイド及びナノ粒子の特性決定を示す。（Ａ）リピドイドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。（Ｂ）ＤＬＳで測定されたリピドイドナノ粒子の流体力学的直径及び多分散性。（Ｃ）リピドイドナノ粒子のＴＥＭ画像。スケールバー＝２００ｎｍ。（Ｄ）保存中のブランクナノ粒子の相対的なサイズ変化。（Ｅ）ＯｃｈｏｌＢ、Ｏ１６Ｂ、及びＬｐｆ２ｋナノ粒子の細胞毒性試験。Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【図１１−１】チオール誘発性形態学的変動及びカーゴ放出を示す。（Ａ）ＤＴＴ及びシステイン処理を用いるリピドイドナノ粒子の時間依存性相対的なサイズ変動。（Ｂ）ＤＴＴで処理されたリピドイドナノ粒子のＴＥＭ画像。スケールバー＝６００ｎｍ。（Ｃ）２４時間のＤＴＴ処理後のリピドイドナノ粒子の相対的なサイズ変化。
【図１１−２】チオール誘発性形態学的変動及びカーゴ放出を示す。（Ｄ）カーゴ搭載ナノ粒子の蛍光発光スペクトル。（Ｅ）時間依存性ＮＲ放出プロファイル。（Ｆ）ＤＴＴまたはシステインで処理されたカルセインカプセル化リピドイドナノ粒子の蛍光強度。（Ｇ）ＤＴＴ処理あり及びＤＴＴ処理なしのリピドイドナノ粒子のＲＮＡ結合テスト。
【図１２】カーゴ搭載リピドイドナノ粒子の内在化研究を示す。（Ａ）ＤｉＯ−ＤｉＩ搭載ナノ粒子の時間依存性ＦＲＥＴ比の変動。（Ｂ）ＮＲ搭載ナノ粒子で処置されたＨｅＬａ細胞の時間依存性ＮＲ＋細胞の割合。（Ｃ）８時間の曝露後のリピドイドナノ粒子のＮＲ＋細胞の割合。（Ｄ）ＮＲ搭載ナノ粒子で処置されたＨｅＬａ細胞の蛍光画像。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）遊離またはナノ粒子カプセル化カルセインで処置されたＨｅＬａ細胞の平均蛍光強度。（Ｆ）ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞に対するリピドイドナノ粒子による（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質のトランスフェクション効率。（Ｇ）平均蛍光強度。（Ｈ）フローサイトメトリーヒストグラム。（Ｉ）蛍光画像。（Ｊ）（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰで処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞の明視野画像。スケールバー＝１１０μｍ。
【図１３】抗がん剤の細胞内送達を示す。（Ａ）ＣＰＴ及びＤｏｘ搭載ナノ粒子の吸収及び蛍光発光スペクトル。（Ｂ）遊離及びナノ粒子カプセル化Ｄｏｘで処置されたＨｅＬａ細胞の平均蛍光強度。（Ｃ）遊離Ｄｏｘ及びブランク及びＤｏｘ搭載ナノ粒子の用量依存性細胞毒性。（Ｄ）遊離及びナノ粒子カプセル化ＣＰＴ及びＯｘａの細胞毒性。
【図１４】ｍＲＮＡの細胞内送達を示す。（Ａ）ＬＮＰ／ｍＲＮＡ重量比トランスフェクション効果。（Ｂ）ｍＲＮＡ用量依存性トランスフェクション効果。（Ｃ）ｍＲＮＡ／ＬＮＰで処置されたＨｅＬａ細胞の蛍光画像。スケールバー＝１００μｍ。（Ｄ）トランスフェクション効率。（Ｅ）ｍＲＮＡ／ＬＮＰの細胞毒性。（Ｆ）ｍＲＮＡ／ＬＮＰで処置されたＨｅＬａ細胞の明視野画像。スケールバー＝１１０μｍ。（Ｇ）ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰによるＣｒｅ  ｍＲＮＡ送達。（Ｈ）ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰによるＣａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ送達。
【図１５】ゲノム編集タンパク質の細胞内送達を示す。（Ａ）内在化機序の研究。（Ｂ）ゲノム編集効率。（Ｃ）フローサイトメトリーヒストグラム。（Ｄ）細胞毒性。（Ｅ）（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰで処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞の明視野画像。スケールバー＝２００μｍ。（Ｆ）ゲノム編集効果を、各試験条件について細胞生存率に対してプロットした。
【図１６】ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性試験を示す。（Ａ）時間依存体重。（Ｂ）ブランクＬＮＰが注射されたＢａｌｂ／ｃマウスに対する生化学的血液分析。
【図１７】成体Ａｉ１４マウスを使用した、ｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集のためのｍＲＮＡ及びタンパク質送達を示す。（Ａ）Ｃｒｅ媒介性遺伝子組み換え。（Ｂ）筋肉内に使用されたプロトコール。（Ｃ）静脈内注射に使用されたプロトコール。（Ｄ）筋肉内タンパク質／ＬＮＰ（スケールバー＝２７０μｍ）が注射された骨格筋の蛍光画像。元の画像の赤色チャネル、ｔｄＴｏｍａｔｏ；元の画像の青色チャネル、ＤＡＰＩ。上パネルの画像は、ナノ粒子を注射されたマウス由来のものであり、下パネルの画像は、未処置の対照マウス由来のものである。（Ｅ）筋肉内ｍＲＮＡ／ＬＮＰ（スケールバー＝２７０μｍ）が注射された骨格筋の蛍光画像。元の画像の赤色チャネル、ｔｄＴｏｍａｔｏ；元の画像の青色チャネル、ＤＡＰＩ。上パネルの画像は、ナノ粒子を注射されたマウス由来のものであり、下パネルの画像は、未処置の対照マウス由来のものである。（Ｆ）対照及びタンパク質／ＬＮＰが静脈内注射されたマウス由来の肺（スケールバー＝１３５μｍ）の蛍光画像。元の画像の赤色チャネル、ｔｄＴｏｍａｔｏ；元の画像の青色チャネル、ＤＡＰＩ。上パネルの画像は、ナノ粒子を注射されたマウス由来のものであり、下パネルの画像は、未処置の対照マウス由来のものである。（Ｇ）ｍＲＮＡ／ＬＮＰが静脈内注射されたマウス由来の脾臓（スケールバー＝１９０μｍ）の蛍光画像。元の画像の赤色チャネル、ｔｄＴｏｍａｔｏ；元の画像の青色チャネル、ＤＡＰＩ。上パネルの画像は、ナノ粒子を注射されたマウス由来のものであり、下パネルの画像は、未処置の対照マウス由来のものである。
【図１８】（ａ）合成カチオン性リピドイドナノ粒子へのＡｍＢのカプセル化及び真菌細胞への効果を示す概略図である。（ｄ）四級化リピドイドは、アミン及びアルキル−エポキシド分子のコンビナトリアル合成されたものであった。リピドイドは、以下の通り呼ばれる（尾部の炭素数）−（アミン数）。
【図１９】調製後に視覚的な安定状態を示し；ＡｍＢ／（７５−Ｏ４Ｂ，７８−Ｏ１４Ｂ，８７−Ｏ１４Ｂ）カプセル化物は、不透明な懸濁を実証し、全ては、１週間以内に沈殿し、ＡｍＢ／（７５−Ｏ１４Ｂ，７８−Ｏ１４Ｂ，８７−Ｏ１４Ｂ）−Ｆカプセル化物は、調製後に半透明溶液を示し、２週間の終わりに均質化せず、ＡｍＢ／（Ｑ７５−Ｏ１４Ｂ，Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ，Ｑ８７−Ｏ１４Ｂ）及びＡｍＢ／（Ｑ７５−Ｏ１４Ｂ，Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ，Ｑ８７−Ｏ１４Ｂ）−Ｆカプセル化物は、均質の透明黄色溶液を実証し、続く２週間で安定であった。
【図２０】（ａ）調製後及び続く２週間でＡｍＢカプセル化物及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）の流体力学的サイズ（ｎ＝９）を示す。（ｂ）ＤＬＳで決定された調製後及び続く２週間でのＡｍＢカプセル化物の多分散性インデックス（ｎ＝９）を示す。調製後の粒径及びＰＤＩに対して＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００１。
【図２１】（ａ）ＡｍＢカプセル化物及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のＤＬＣを示す（ｎ＝３）。（ｂ）１４．０〜０．１０９３７５μｇ／ｍＬの２４時間及び４８時間のインキュベーション後のＣａｎｄｉｄａ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＳＣ５３１４）に対する種々のＡｍＢカプセル化物、遊離ＡｍＢ、及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のＭＩＣ（ｎ＝９）、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）に対して＊Ｐ＜０．０５。
【図２２】（ａ）３７℃で１時間インキュベートした後のＡｍＢ濃度（２５、５０、１００、２００μｇ／ｍＬ）と同等のＡｍＢカプセル化物、遊離ＡｍＢ、及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）によるヒトＲＢＣの溶血を示す（ｎ＝９）。（ｂ）２４時間のインキュベーション後のＡｍＢ濃度（２５、５０、１００、２００μｇ／ｍＬ）と同等のＨＥＫ２９３細胞株に対する種々のＡｍＢカプセル化物、遊離ＡｍＢ、及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＴＴ試験。全てのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝９）として存在する、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）に対して＊Ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００１。
【図２３】（ａ）ＳＤラットに２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの用量でＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆ及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）を静脈内注射した後のＡｍＢの血漿濃度を示す。ＨＰＬＣによるＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆ（それぞれ１０ｍｇ、５ｍｇ、２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇ）及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇ）の４８時間及び７２時間の静脈内処置後のマウス組織のＡｍＢ濃度を示す；（ｂ）肝臓、（ｃ）脾臓、（ｄ）肺、（ｅ）腎臓；Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）に対して＊ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２４】１０ｍｇ、５ｍｇ、及び２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの用量のＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆならびに２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの用量のＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）を静脈内投与された４８時間及び７２時間後の健常ＢＡＬＢ／ｃマウスの（ａ）クレアチニンレベル、（ｂ）ＢＵＮレベル、（ｃ）ＡＬＴレベル、（ｄ）ＡＳＴレベルのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性（ｎ＝３）を示す、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）に対して＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００１。
【図２５】タンパク質送達に使用されるフッ素含有リピドイドの関数としてのＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図２６】タンパク質送達に使用されるフッ素含有リピドイドの関数としてのＤｓＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図２７】タンパク質の送達に使用されるリピドイド（種々の疎水性尾部を有する脂質から誘導され、アミン２００から合成された）の関数としてのＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図２８】タンパク質送達に使用されるリピドイド（種々の環状アミンアナログから合成された脂質から誘導された）の関数としてのＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図２９】リピドイド（種々のイミダゾール含有アミンアナログから合成された脂質から誘導された）の関数としてのＣＤ８＋Ｔ細胞へのｍＲＮＡ送達から生じる観察された発光を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の脂質様化合物は、本明細書では、詳細に開示される。より具体的には、２つの実施形態は、以下の順序で記載される。
【００２９】
第１の実施形態では、上に示される式（Ｉ）に関して、Ａは、
【化１１】
2021512865.tif 000013
から選択される親水性頭部であり、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、及びＲａ”’のそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｚは、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１−Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり、Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール、または
【化１２】
2021512865.tif 000014
であり、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは独立して、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれは独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している原子と共に、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルを形成し；Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；Ｖは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、リンカーであるＸは、
【化１３】
2021512865.tif 000015
であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｇは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｑは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり；ｒ及びｔのそれぞれは独立して、１〜６であり、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、及びＲｉのそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｍは、０または１であり、但し、ＶがＳである場合に、ｍは、１である。
【００３０】
この実施形態は、好ましくは、通常、
【化１４】
2021512865.tif 000016
のような変数Ａ及び
【化１５】
2021512865.tif 000017
のような変数Ｂを有する化合物を含む。例示化合物は、以下の通り、変数Ａ、Ｂ、及びＲ１−Ｒ５を有し：Ａは、
【化１６】
2021512865.tif 000018
であり；Ｂは、
【化１７】
2021512865.tif 000019
であり；Ｒ１及びＲ２のそれぞれは独立して、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれは独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ２０アルキルである。
【００３１】
好ましくは、Ａは、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分である：
【化１８】
2021512865.tif 000020
【００３２】
上記のように、Ｘは、リンカーである。Ｘの例としては、
【化１９】
2021512865.tif 000021
が挙げられるが、これらに限定されず、Ｒｃ及びＲｄのそれぞれは独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキルである。これらの化合物は、好ましくは、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルとして独立してＲ１及びＲ２のそれぞれを；ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルとして独立してＲ３及びＲ４のそれぞれを；Ｃ１−Ｃ２０アルキルとしてＲ５を有する。
【００３３】
変数Ｗ、Ｖ、及びｍを参照すると、本実施形態は、これらの３つの変数に基づいて、化合物の以下の３つのサブセットを含み得る。
【００３４】
サブセット（ｉ）は、式（Ｉ）の化合物を含み、Ｗ及びＶのそれぞれは独立して、ＯまたはＳｅであり；ｍは、０である。
【００３５】
化合物のこのサブセットは、以下の分子
【化２０】
2021512865.tif 000022
のうちの１つから形成される部分
【化２１】
2021512865.tif 000023
を有することができ、ｑは８〜１２の整数である。
【００３６】
サブセット（ｉｉ）は、式（Ｉ）の化合物を含み、Ｗは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；Ｖは、結合であり；ｍは、０または１である。
【００３７】
化合物のこのサブセットは、以下の分子：
【化２２】
2021512865.tif 000024
のうちの１つから形成される部分
【化２３】
2021512865.tif 000025
を有することができ、ｑは８〜１２の整数である。
【００３８】
サブセット（ｉｉｉ）は、式（Ｉ）の化合物を含み、Ｗ及びＶのそれぞれは、ＯまたはＳであり、ｍは、１である。
【００３９】
化合物のこのサブセットは、以下の分子
【化２４】
2021512865.tif 000026
のうちの１つから形成される部分
【化２５】
2021512865.tif 000027
を有することができ、ｑは、８〜１２の整数である。
【００４０】
あるいは、化合物のこのサブセットは、以下の分子
【化２６】
2021512865.tif 000028
のうちの１つから形成される部分
【化２７】
2021512865.tif 000029
を有することができ、ＸはＯ、Ｓ、またはＮＨであり；ＲはＨまたはＭｅであり；ｐは０〜３の整数であり；ｑは１〜１６の整数であり；ｖは１〜１０の整数である。
【００４１】
第２の実施形態では、さらに上記の式（Ｉ）に関して、Ａは、
【化２８】
2021512865.tif 000030
から選択される親水性頭部であり、Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、及びＲａ”’のそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｚは、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１−Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり、Ｂは、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール、または
【化２９】
2021512865.tif 000031
であり、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ２は、結合またはＣ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれは独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ１０アルキルであるか、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している原子と共に、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルを形成し；Ｒ５は、
【化３０】
2021512865.tif 000032
であり、Ｒ６は、結合またはＣ１−Ｃ２０二価脂肪族ラジカルであり；Ｒｂ及びＲｂ’のそれぞれは、Ｆであるか、またはＲｂ及びＲｂ’は、それらが結合している原子と共に、Ｃ＝Ｏを形成し；Ｒ７は、Ｆまたは脂肪族脂質部分であり；Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり、Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｎは、１〜２０であり；Ｗ及びＶのそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；リンカーであるＸは、
【化３１】
2021512865.tif 000033
であり、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６のそれぞれは独立して、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｃであり；Ｇは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲｄであり；Ｑは、ＯＲｆ、ＳＲｇ、またはＮＲｈＲｉであり；ｒ及びｔのそれぞれは独立して、１〜６であり、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ、及びＲｉのそれぞれは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；ｍは、０または１である。
【００４２】
第１の実施形態と同様に、第２の実施形態は、
【化３２】
2021512865.tif 000034
のような変数Ａ、及び
【化３３】
2021512865.tif 000035
のような変数Ｂを有する化合物も含み得る。
【００４３】
本実施形態の例示化合物は、以下の通り変数Ａ、Ｂ、及びＲ１−Ｒ４を有し：Ａは、
【化３４】
2021512865.tif 000036
であり；Ｂは、
【化３５】
2021512865.tif 000037
であり；Ｒ１及びＲ２のそれぞれは独立して、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり；Ｒ３及びＲ４のそれぞれは独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００４４】
さらに、Ａは、以下のアミンのうちの１つから形成されるアミノ部分であり得る：
【化３６−１】
2021512865.tif 000038
【化３６−２】
2021512865.tif 000039
【化３６−３】
2021512865.tif 000040
【００４５】
第２の実施形態では、Ｘの例としては、
【化３７】
2021512865.tif 000041
が挙げられるが、これらに限定されず、Ｒｃ及びＲｄのそれぞれは独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキルである。これらの化合物は、好ましくは、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルとしてＲ１及びＲ２のそれぞれを；ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルとしてＲ３及びＲ４のそれぞれを独立して；Ｃ１−Ｃ２０アルキルとしてＲ５を有する。
【００４６】
変数Ｗ、Ｖ、及びｍに関して、第２の実施形態は、結合としてＲ２、Ｗ、及びＶのそれぞれを、０としてｍを有する化合物を含み得る。
【００４７】
変数Ｒ５、すなわち、
【化３８】
2021512865.tif 000042
に関して、本実施形態における化合物は、結合としてＬ１及びＬ２のそれぞれを、ＦとしてＲｂ、Ｒｂ’、及びＲ７のそれぞれを有し得る。例示化合物は、以下の分子
【化３９】
2021512865.tif 000043
のうちの１つから形成される部分
【化４０】
2021512865.tif 000044
を有し、ｊは０〜１０の整数であり、ｋは１〜２０の整数である。
【００４８】
あるいは、本実施形態は、化合物を含み、Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ４二価脂肪族ラジカルであり；Ｌ１及びＬ２のそれぞれは独立して、ＯまたはＮＲＣであり、Ｒｃは、ＨまたはＣ１−Ｃ１０アルキルであり；Ｒｂ及びＲｂ’は、それらが結合している原子と共に、Ｃ＝Ｏを形成し；ｎは、１または２であり；Ｒ７は、脂肪族脂質部分である。脂肪族脂質部分は、コレステロールであり得る。例示化合物は、以下の分子
【化４１】
2021512865.tif 000045
のうちの１つから形成される部分
【化４２】
2021512865.tif 000046
を有し、ＸはＯまたはＮＨであり、ＷはＯ、Ｓ、またはＳｅである。
【００４９】
本発明の脂質様化合物は、当該技術分野で周知の方法で調製することができる。例えば、以下を参照のこと、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１，４０３−４０７；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ２００８／０４２９７３；及びＺｕｇａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許８，０７１，０８２。
【００５０】
以下に示される合成経路は、上述の特定の脂質様化合物の合成を例示し：
【化４３】
2021512865.tif 000047
変数Ｒａ、Ｒ２−Ｒ５、Ｘ、Ｗ、Ｖ、及びｍのそれぞれは、上で定義される。
【００５１】
この例示的な合成経路では、アミン化合物、すなわち、化合物Ｄは、ビニルカルボニル化合物Ｅと反応して、最終生成物、すなわち、化合物Ｆを得る。アミノ化合物Ｄは、上記の化合物１０、１７、６３、７５〜７８、８０〜８２、８７、９０、９３、１０３、３０４、３０６、及び４００のうちの１つであり得る。
【００５２】
本発明の他の脂質様化合物は、上記の合成経路及び当該技術分野で既知の他のものを介して、他の好適な出発物質を使用して調製することができる。上記の方法は、最終的に脂質様化合物の合成を可能にするために、好適な保護基を追加または除去する追加のステップ（複数可）を含み得る。加えて、様々な合成ステップは、所望の材料を得るために、別の配列または順序で実施することができる。例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（２ｎｄ  Ｅｄ．，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  １９９９）；Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ２００７）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ２００９）及びそれの後続の版を含む、適用可能な脂質様化合物の合成に有用な合成化学変換及び保護基の方法論（保護及び脱保護）は、当該技術分野で既知である。
【００５３】
特定の脂質様化合物は、非芳香族二重結合及び１つ以上の不斉中心を含有してもよい。従って、それらは、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、ならびにシスまたはトランス異性体の形態として生じ得る。そのような異性体が全て、企図される。
【００５４】
上述のように、これらの脂質様化合物は、タンパク質または核酸の送達に有用である。それらは、予めｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで医薬品を送達する効果についてスクリーニングし、次に、動物実験及び臨床試験で確認することができる。他の方法もまた、当業者らには明らかであろう。
【００５５】
いかなる理論にも束縛されるものではないが、脂質様化合物は、複合体、例えば、ナノ複合体及びマイクロ粒子、を形成することによりタンパク質または核酸の送達を促進する。正荷電または負荷電の、そのような脂質様化合物の親水性頭部は、反対に荷電したタンパク質または核酸の部分に結合し、その疎水性部分は、タンパク質または核酸の疎水性部分に結合する。いずれの結合も、共有結合または非共有結合であり得る。
【００５６】
上記の複合体は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１，４０３−４０７などの刊行物に記載される手順を使用して調製することができる。一般に、それらは、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）などの緩衝液中で、脂質様化合物及びタンパク質または核酸をインキュベートすることにより得られる。
【００５７】
さらに、上述の脂質様化合物から形成されるナノ複合体及びタンパク質または核酸を含有する医薬組成物は、本発明により網羅される。さらに、脂質様化合物は、非共有相互作用、共有結合、またはその両方を介してタンパク質または核酸に結合する。
【００５８】
タンパク質または核酸の例としては、クラスター化された規則的な間隔の短い回文構造反復に関連するタンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、Ｃｒｅリコンビナーゼ（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ）、及びＣａｓ９：単一ガイドＲＮＡ（Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）またはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
さらに、上記の医薬組成物を用いる、病状、例えば、肺疾患の処置方法は、本発明の範囲内にある。方法は、それを必要とする対象（例えば、患者）に、有効量の医薬組成物を投与することを含む。
【００６０】
「有効量」という用語は、処置対象に治療効果を与えるのに必要な複合体の量を指す。当業者らにより認識されるような有効用量は、処置される疾患のタイプ、投与経路、賦形剤の使用、及び他の治療的処置との併用の可能性に応じて変動するであろう。
【００６１】
本発明の方法を実施するために、上記の複合体を有する組成物は、非経口的、経口的、経鼻的、直腸的、局所的、または口腔的に投与することができる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、または頭蓋内注射、及び任意の好適な注入手法を指す。
【００６２】
無菌の注射可能な組成物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液、であり得る。用いることができる許容可能なビヒクル及び溶媒の中には、マンニトール、水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体（例えば、合成モノグリセリドまたはジグリセリド）として従来用いられる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、注射可能薬物の調製において有用であり、特に、ポリオキシエチル化バージョンにおける、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油も同様である。これらの油性溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、カルボキシメチルセルロース、または同様の分散剤を含み得る。ＴｗｅｅｎｓもしくはＳｐａｎｓなどの他の一般に使用される界面活性剤、または薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造に一般に使用される他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティーエンハンサーは、製剤のために使用することもできる。
【００６３】
経口投与のための組成物は、カプセル剤、錠剤、エマルション及び水性懸濁液、分散液、ならびに液剤を含む経口的に許容される任意の剤形であり得る。錠剤の場合、一般に使用される担体は、ラクトース及びコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も通常添加される。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤は、ラクトース及び乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液またはエマルションが経口投与される時、有効成分は、乳化剤または懸濁剤と組み合わせた油相に懸濁または溶解することができる。必要に応じて、特定の甘味剤、香味剤、または着色剤を添加することができる。
【００６４】
経鼻エアゾールまたは吸入組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の手法に従って調製することができる。例えば、そのような組成物を生理食塩水中の溶液として調製して、ベンジルアルコールまたは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティーを促進する吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／または当該技術分野で既知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いることができる。
【００６５】
ナノ複合体を含有する組成物はまた、直腸投与用の坐剤の形態で投与することができる。
【実施例】
【００６６】
さらに詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。それ故、以下の特定の例は、単なる例示であると解釈されるべきであり、いかなる方法でも、本開示の残りの部分を限定するものではない。
【００６７】
方法及び材料
概要
リピドイド合成に使用される全ての化学物質を、別途記載のない限り、さらに精製せずに、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）、及びｓｇＲＮＡを、Ｗａｎｇ  ａｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１６，１１３，２８６８−２８７３（“Ｗａｎｇ”）に報告されるプロトコールに従って生成した。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ及びＧＦＰ−ＨＥＫ細胞を培養した。全ての１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、フーリエ変換モードで動作するＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＩＩＩ  ５００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計で記録された。ナノ粒子の流体力学的サイズ及び多分散性指数を、ゼータ−ＰＡＬＳ粒径分析器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５，１０７，２７６−２８７に報告されるプロトコールに従って、蛍光プローブとして２−（ｐ−トルイジニナフタレン−６−スルホン酸）（ＴＮＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、リピドイドの見かけのｐＫａ値を決定した。ＴＥＭ測定をＦＥＩ  Ｔｅｃｈｎａｉ透過型電子顕微鏡で実施した。ＢＺ−Ｘ分析器蛍光顕微鏡を使用して、組織スライスの蛍光画像を取得した。
【００６８】
脂質様化合物（すなわち、リピドイド）の合成
ねじ蓋式テフロンライニングガラスバイアル中で、頭部アミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をアクリラート尾部（例えば、Ｏ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、及びＯ１７Ｓｅ）と１：２．４のモル比、７０℃で４８時間混合した。Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏクロマトグラフィーシステムを使用して、粗生成物を精製した。
【００６９】
式（Ｉ）の脂質様化合物の１つのクラスは、以下に示される合成経路に従って合成された。
【化４４】
2021512865.tif 000048
【００７０】
上記のスキームに示される頭部アミンＲａ−ＮＨ２を、化合物１０、１７、６３、７５〜７８、８０〜８２、８７、９０、９３、１０３、３０４、３０６、及び４００から選択した。
【化４５】
2021512865.tif 000049
【００７１】
式（Ｉ）の５１の例示的な脂質様化合物（「リピドイド」）のコード、化学式、及び分析データ（ＥＳＩ−ＭＳ）が下表に示される。各リピドイドが、Ｘ−Ｏ１７Ｙとしてコード化され、Ｘが、アミノ化合物の数を表し、Ｙが、Ｏ、Ｓ、またはＳｅを表すことに留意すべきである。コードＸ−Ｏ１７Ｙは、リピドイドが、化合物Ｘのアミン及びＯ１７Ｙ（Ｙは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅである）の脂質分子から形成されることを示す。
【００７２】
例えば、リピドイド１０−Ｏ１７Ｏは、以下の通り、アミン化合物１０及び脂質分子Ｏ１７Ｏから形成される。
【化４６】
2021512865.tif 000050
【００７３】
下表の各コードは、Ｏ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、またはＯ１７Ｓｅを含有し、これは、以下の３つの分子のうちの１つを表す。
【化４７】
2021512865.tif 000051
2021512865.tif 000052
2021512865.tif 000053
【００７４】
式（Ｉ）の脂質様化合物の別のクラスは、以下に示される合成経路に従って合成された。
【化４８】
2021512865.tif 000054
【００７５】
さらに、上記のスキームに示される頭部アミンＲａ−ＮＨ２を、化合物１０、１７、６３、７５〜７８、８０〜８２、８７、９０、９３、１０３、３０４、３０６、及び４００から選択した。
【００７６】
式（Ｉ）の脂質様化合物のさらに別のクラスは、以下に示される合成経路に従って合成された。
【化４９】
2021512865.tif 000055
【００７７】
上記のスキームに示される頭部アミンＲａ−ＮＨ２を、化合物１０、１７、６３、７５〜７８、８０〜８２、８７、９０、９３、１０３、３０４、３０６、及び４００から選択した。
【００７８】
リピドイド及びタンパク質からのナノ複合体の作製。
リピドイドを、タンパク質または核酸を送達するためのナノ粒子に加工した。要約すると、リピドイドを酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．２）と混合し、超音波浴中で３０分間超音波処理し、続いて、さらに３０分間激しくボルテックスして、脂質様ナノ粒子またはＬＮＰに形成した。こうして得られたＬＮＰを４℃で保存した。タンパク質／ＬＮＰ複合体化のために、ＰＢＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）中でＬＮＰを、Ｗａｎｇに報告されるプロトコールに従って（−３０）ＧＦＰ−ＣｒｅまたはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡと混合し、室温で３０分間インキュベートした。
【００７９】
リン脂質二重層膜破壊の評価
ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、回収した。得られた貯蔵液（約１０％ｖ／ｖのｈＲＢＣ）をＰＢＳ緩衝液中で３倍に希釈して、アッセイ溶液を得た。９０μＬのアッセイ溶液を１０μＬのＬＮＰ溶液（リピドイドの最終濃度＝３．３ｍｇ／Ｌ）と混合し、３７℃で６０分間インキュベートした。次に、試料を再度１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１０μＬの上清を９０μＬのＰＢＳ緩衝液にさらに希釈し、マイクロプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０５）が記録された。ＰＢＳ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１％ｖ／ｖ）を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。
【００８０】
（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰの細胞内送達
細胞内取り込み研究では、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞を２×１０４細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした後、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰナノ粒子を細胞に添加し、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア）分析（ＧＦＰの緑色発光）前に６時間インキュベートした。最終（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質濃度は、２５ｎＭであり、リピドイド濃度は、３．３ｍｇ／Ｌである。遺伝子組み換え機能研究のために、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞を同じ条件で処置し、送達の２４時間後にフローサイトメトリーにより、ＤｓＲｅｄの赤色蛍光発光を分析した。
【００８１】
Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ／ＬＮＰの細胞内送達
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウト研究では、ＧＦＰ−ＨＥＫ細胞を２×１０４細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種した。２４時間のインキュベーション後、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ／ＬＮＰナノ粒子を細胞に添加し、４時間インキュベートし、続いて、培地を交換した。４８時間のインキュベーション後、ＧＦＰからの緑色発光をフローサイトメトリーで分析した。最終Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ濃度は、２５ｎＭであり、リピドイド濃度は、３．３ｍｇ／Ｌであった。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ。
細胞生存率を標準ＭＴＴアッセイで測定した。ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄまたはＧＦＰ−ＨＥＫ細胞を５×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰまたはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ／ＬＮＰナノ粒子を、２４時間のインキュベーション後に添加した。タンパク質の最終濃度は、２５ｎＭであり、ＬＮＰは、３．３ｍｇ／Ｌである。２４時間または４８時間インキュベートした後、ＭＴＴ試薬（３０μＬのＰＢＳ緩衝液中の５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートした。次に、細胞培地を慎重に除去し、２００μＬのＤＭＳＯを添加した。ＤＭＳＯ溶液を別の９６ウェルプレートに移し、５７０ｎｍでの吸光度がマイクロプレートリーダーで記録された。全ての実験を４回ずつ実施した。
【００８３】
Ａｉ１４マウスへのｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質送達
配合されたＬＮＰ（リピドイド／コレステロール／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ＝１６／４／１／４、重量比）をタンパク質の搭載及びマウスへの注射のために調製した。１２時間の明／暗サイクルの、温度及び湿度が制御された施設に、Ａｉ１４マウスを収容した。各群の２匹のマウスに、０日目及び５日目に（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ製剤を注射した（各注射に対して１００μｇのタンパク質）。全ての群から心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓を含む器官を注射の２０日後に収集した。組織を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で一晩固定した後、１０μｍのスライスに切断した。スライスを収集し、蛍光イメージングのためにＤＡＰＩで染色した。
【００８４】
実施例１：脂質様ナノ粒子（ＬＮＰ）の調製及び特性決定
下記の手順に従って、式（Ｉ）の脂質様化合物、すなわち、リピドイドから、特定の脂質様ナノ粒子（ＬＮＰ）を調製した。
【００８５】
Ｏ１７Ｏの合成
Ｏ１７Ｏを合成するために、以下のスキームに従った。
【化５０】
2021512865.tif 000056
【００８６】
水素化ナトリウム（０．７２ｇ、３０ｍｍｏｌ）をエチレングリコール（５．６ｇ、９０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液に添加し、０℃で１０分間撹拌した。次に、１−ブロモテトラデカン（６．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）及びＫＩ（３．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を９５℃でさらに４時間維持した。室温に冷却した後、混合物を冷水で希釈し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。移動相としてｎ−ヘキサン／酢酸エチルを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製の後、化合物１（３．３ｇ、収率約６５％）を得た。次に、化合物１（３．３ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ、１．９ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶解させた。塩化アクリロイル（１．４ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を０℃で滴加し、反応混合物を一晩撹拌した。カラムクロマトグラフィー精製後、Ｏ１７Ｏを無色油として得た（３．２ｇ、収率約８２％）。Ｏ１７Ｏの構造をＣＤＣｌ３中で記録された１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで確認した。
【００８７】
Ｏ１７Ｓの合成
Ｏ１７Ｓを合成するために、以下のスキームに従った。
【化５１】
2021512865.tif 000057
【００８８】
２−メルカプトエタノール（１．１ｇ、１４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）溶液に、１−ブロモテトラデカン（５．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（３．６ｇ、２６ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を４０℃で一晩撹拌し、濾過し、濃縮した。移動相としてｎ−ヘキサン／酢酸エチルを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製の後、化合物２（１．８ｇ、収率約４８％）を得た。Ｏ１７Ｏの調製と同様の方法で、Ｏ１７Ｓを合成し、油状液体として精製した（３．５ｇ、収率約７５％）。Ｏ１７Ｓの構造をＣＤＣｌ３中で記録された１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで確認した。
【００８９】
Ｏ１７Ｓｅの合成
Ｏ１７Ｓｅを合成するために、以下のスキームに従った。
【化５２】
2021512865.tif 000058
【００９０】
セレノシアン酸カリウム（１．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２−ブロモエタノール（１．６ｇ、１３ｍｍｏｌ）のアセトン（５０ｍＬ）溶液に室温で少しずつ添加した。溶液を２時間加熱還流した。室温に冷却した後、白色沈殿物を濾別し、アセトンを真空下のロータリーエバポレーションで除去した。次に、化合物３をエタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、水素化ホウ素ナトリウム（０．９ｇ、２４ｍｍｏｌ）を０℃で徐々に添加した。反応液が無色になった後、滴下ロートを通して、１−ブロモテトラデカン（４．１ｇ、１５ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後にＤＩ水（１０ｍＬ）を添加することにより、反応を停止させた。次に、エタノールを減圧下で除去し、反応混合物を飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出した。溶出液としてｎ−ヘキサン／酢酸エチルを使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィー精製後に、化合物５（１．５ｇ、収率約４６％）を得た。Ｏ１７Ｏ及びＯ１７Ｓの調製と類似の方法で、Ｏ１７Ｓｅを油状液体として得た（２．７ｇ、収率約７２％）。Ｏ１７Ｓｅの構造をＣＤＣｌ３中で記録された１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで確認した。
【００９１】
リピドイド合成
市販のアミン頭部、例えば、化合物１０、１７、及び６３を化学量論的にアクリラート尾部Ｏ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、またはＯ１７Ｓｅと混合した。こうして得られた混合物を７０℃で４８時間撹拌した。図１を参照のこと。リピドイドをＴｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏクロマトグラフィーシステムで精製し、１Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより特性決定し、上表に示されるように、アミン価（Ｘ）及びＯ１７Ｙ（Ｒ−Ｏ１７Ｙ、Ｙは、Ｏ、ＳまたはＳｅである）としてコード化した。７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ−１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅの代表的な１Ｈ  ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、図２ａ及び２ｂに示される。
【００９２】
リピドイドナノ粒子の作製及び特性決定。
上記の簡単な超音波処理及びボルテックス手順に従って、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．２）中で、リピドイドナノ粒子（ＬＮＰ）を作製した。ＬＮＰの流体力学的サイズ及び多分散性指数（ＰＤＩ）を動的レーザー散乱（ＤＬＳ）分析で測定した。図２ｃに示されるように、Ｏ、Ｓ、及びＳｅエーテル含有ＬＮＰのほとんどは、１００〜３００ｎｍの平均された流体力学的直径（＜Ｄｈ＞）及び細胞内タンパク質送達用途に適する０．１〜０．３の範囲のＰＤＩを有した。さらに、図２ｃにも示されるように、取り込まれたカルコゲン原子が水溶液中での超分子自己集合挙動に及ぼす影響に起因して、Ｏ１７Ｏ尾部を含むＬＮＰの約５３％、Ｏ１７Ｓ  ＬＮＰの約８２％、及びＯ１７Ｓｅ  ＬＮＰの約６５％が、２００ｎｍ未満の＜Ｄｈ＞を有することが判明した。７６−Ｏ１７Ｏ（＜Ｄｈ＞は１７０．１ｎｍであり、μ２／Г２は０．３７である）、７６−Ｏ１７Ｓ（＜Ｄｈ＞は１１４．３ｎｍであり、μ２／Г２は０．２４である）、及び７６−Ｏ１７Ｓｅ（＜Ｄｈ＞は１２９．４ｎｍであり、μ２／Г２は０．１８である）ＬＮＰの代表的なサイズ分布プロファイルは、図２ｄに示される。
【００９３】
さらに、ＬＮＰの形態を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で研究した。図３ａに示されるように、球状粒子は、７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰの画像で観察され、測定された数平均サイズ（７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅに対してそれぞれ１４５ｎｍ、９４ｎｍ、及び１３３ｎｍ）は、ＤＬＳで決定されるような流体力学的直径に相当する。図２ｄを参照のこと。８０−Ｏ１７Ｏ、８０−Ｏ１７Ｓ、及び８０−Ｏ１７Ｓｅを含む他のＬＮＰの形態をＴＥＭ画像でも調査し、これは、球形微粒子の存在を示す。続いて、こうして調製されたＬＮＰの安定性をＤＬＳ及び蛍光測定で調査した。図３ｂに示されるように、時間依存性のＤＬＳ測定により、７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰの明らかな凝集が室温での５日間の保管中に生じず、相対的なサイズの変化は、±１５％未満であることが明らかになった。図３ｃに示されるように、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペア、ＤｉＯ、及びＤｉＩ、搭載された７６−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰはまた、５日間の保管で、ＦＲＥＴ比（Ｉ５７５／（Ｉ５７５＋Ｉ５０５））のわずかな変動も示し、これは、ＬＮＰの構造完全性及び長期保存安定性を示した。
【００９４】
実施例２：タンパク質送達のためのＬＮＰの評価
以下のように、タンパク質送達への実施例１で調製されたＬＮＰの影響を評価する研究を実施した。
【００９５】
タンパク質送達のためのＬＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
負に過剰に荷電したＧＦＰ多様体に融合しているＣｒｅリコンビナーゼタンパク質（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ）をモデルカーゴタンパク質として使用した。（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質は、静電引力及び他のタイプの超分子相互作用を介して、カチオン性ＬＮＰと複合体化することが可能であった。ＬＮＰの細胞取り込みは、Ｗａｎｇで報告されるような細胞内ＧＦＰ蛍光強度の直接分析で決定することができる。ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞をこの研究で使用し、これは、以下の研究で送達されたタンパク質の機能研究を容易にするために、Ｃｒｅ媒介性組み換えによる赤色蛍光ＤｓＲｅｄを発現した。
【００９６】
最初に、周囲条件で、事前に計算された量のＬＮＰ及びタンパク質の水溶液を単純に混合することにより（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質搭載ＬＮＰ（ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ）を調製した。細胞内送達の場合、ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰナノ粒子と６時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡を使用して、ＧＦＰ陽性細胞を観察し、採取し、フローサイトメトリーで計数した。図４ａに示されるように、対照群、すなわち、未処置のＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞と比較すると、鮮緑色蛍光発光が、ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋ（Ｌｐｆ２ｋは、市販のトランスフェクション剤であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）、ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−Ｏ１７Ｏ、ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−Ｏ１７Ｓ、及びＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−Ｏ１７Ｓｅで処置された細胞から観察された。しかし、ネイキッドタンパク質（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅで処置された細胞は、脂質促進送達システムと比較して、ごくわずかな蛍光発光を示し、これは、ネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質がＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞に効率的に入ることができないことを示した。さらに、細胞内（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質送達効率をフローサイトメトリーで定量した。図４ｂに示されるように、ネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質及び対照群の両方が、ＧＦＰ陽性細胞の低い割合を示した。これは、図４ａにされる蛍光顕微鏡の結果と一致する。
【００９７】
他方では、ＬＮＰの存在下では、ＧＦＰ陽性細胞の割合が増加し、４〜４２％の範囲にあり、それらのほとんどが約１２〜１８％であった。ＬＮＰの送達効率は、Ｌｐｆ２ｋのものに相当した（ＧＦＰ陽性細胞の約３１％）。例えば、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質搭載４００−Ｏ１７Ｓｅ、８０−Ｏ１７Ｓｅ、及び７７−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰで処置されたＧＦＰ陽性細胞の割合は、それぞれ４２％、３９％、及び３７％であることが判明した。
【００９８】
構造活性相関の調査。
こうして調製された５１のＯ、Ｓ、及びＳｅエーテル含有リピドイドのライブラリーを利用して、ＬＮＰ及び細胞内タンパク質送達効果間の構造活性相関を研究した。
【００９９】
より具体的には、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質／ＬＮＰナノ粒子で処置された２０％を超えるＧＦＰ陽性細胞を有するリピドイドが、バルクＬＮＰ（黒色データポイント）と比較した効果的なＬＮＰ（図４ｂの赤色データポイント）と定義された。次に、リピドイドライブラリーは、疎水性尾部構造（Ｏ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、及びＯ１７Ｓｅ）に従って３つの群に分類され；各尾部は、ライブラリーの３３．３％を占めていた。効果的なＬＮＰ群では、リピドイドの２１．４％、２８．６％、及び５０％が、それぞれＯ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、及びＯ１７Ｓｅ尾部を有していた。それ故、Ｏ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、及びＯ１７Ｓｅ尾部を有するＬＮＰの相対ヒット率は、初期ライブラリーに対して、それぞれ−１１．９％、−４．７％、及び１６．７％であった（図４ｃ）。換言すれば、２０％を超える送達効果を有するＯ１７Ｏ及びＯ１７Ｓ尾部を有するリピドイドは、ＬＮＰ間で有意に過小に表示されたが、Ｏ１７Ｓｅ尾部を有するリピドイドは、過大に表示され、Ｏ１７Ｓｅ尾部が効果的なＬＮＰと関連していたことを示唆した。
【０１００】
ＬＮＰの送達効率は、アミン頭部の化学構造、疎水性尾部、置換数、及び見かけのｐＫａ値に関連していることが判明した。この研究では、Ｏ、Ｓ、Ｓｅエーテル含有リピドイドの構造活性相関をさらに解明するために、ＬＮＰの見かけのｐＫａ値及びリン脂質二重層膜破壊能の影響をさらに分析した。蛍光プローブとして２−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−６−スルホン酸（ＴＮＳ）を使用する以前に報告された手順に従って、見かけのｐＫａ値を測定した。
【０１０１】
モデルとしてのヒト赤血球（ｈＲＢＣ）及び発色団レポーター剤としてのヘモグロビンを使用して、ＬＮＰのリン脂質二重層膜破壊能を評価した。それぞれ陰性対照及び陽性対照としてＰＢＳ緩衝液及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１％ｖ／ｖ）を使用して、放出されたヘモグロビンの量を評価するために、４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０５）が記録された。より高いＯＤ４０５値は、より強い膜破壊能を示す。図５ａ及び５ｂに示されるように、ＬＮＰの見かけのｐＫａ及びＯＤ４０５値を、各ＬＮＰについて、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージに対してプロットし、効果的なナノ粒子（２０％を超えるＧＦＰ陽性細胞を有する）のほとんどが、ｐＫａ＞５．１及びＯＤ４０５＞０．２の領域にあることが判明した（図５ａ及び５ｂにおいて青色破線で導かれる）。さらなる試験の後、これらの２つの特性が、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞における（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質トランスフェクション効率に顕著な影響を与えることが判明した。図５ｃに示されるように、ＬＮＰが特性の両方（すなわち、ｐＫａ＞５．１及びＯＤ４０５＞０．２）を有する時、高いトランスフェクション効率を媒介することができる相対ヒット率は、７７％であった。特性の１つまたは２つがＬＮＰから除去された時、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞への（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質の高いトランスフェクション効率を達成する可能性は、８〜３３％に大幅に低下した。
【０１０２】
さらに、構造活性相関については、Ｏ１７Ｏ、Ｏ１７Ｓ、及びＯ１７Ｓｅ尾部を有するＬＮＰの場合、上記の効果基準の相対ヒット率は、それぞれ−１．９％／−１４．６％、０．９９％／４．２％、及び０．９９％／１０．５％であることが判明した（ｐＫａ＞５．１／ＯＤ４０５＞０．２）。図５ｄを参照のこと。２つの特性の両方が、Ｏ１７Ｏ尾部を有するＬＮＰの群において過小評価され（これは、図４ｃに示される結果と一致する）、Ｏ１７Ｏ尾部が効果的なリピドイドにおいて過少評価されたことが明らかであった。高いｐＫａ値及びＯＤ４０５値の両方の特性は、Ｏ１７Ｓ及びＯ１７Ｓｅ尾部を有するＬＮＰの群において過大に表示された。
【０１０３】
さらに、図５ｃ及び５ｄに示される結果によると、これらのＬＮＰの膜破壊能は、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質送達効率を決定する際に、見かけのｐＫａ値と比較して、より影響力のある要因であるようにみえた。
【０１０４】
実施例３：遺伝子組み換え及び細胞毒性のための（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質送達
以下のように、遺伝子組み換え及び細胞毒性について、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質送達への実施例１で調製されたＬＮＰの影響を評価する研究を実施した。
【０１０５】
さらに、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄモデル細胞を使用して、細胞内送達スクリーニング実験を通して同定されたＬＮＰの上位１２を遺伝子組み換えについて試験した。遊離（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質及びタンパク質搭載ＬＮＰと共に２４時間共インキュベートした後に、Ｃｒｅタンパク質媒介性遺伝子組み換えからのＤｓＲｅｄの発現を分析した。図６ａに示されるように、ネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質は、内在化能が低いために、ＤｓＲｅｄの発現を誘導しなかった。これは、図４ａで実証された蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメトリー分析と一致する。他方では、試験ＬＮＰのほとんどは、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質を効率的に送達し、遺伝子組み換えを誘発し、細胞の１４〜４６％が、ＤｓＲｅｄ陽性であった。
【０１０６】
より具体的には、特定のＬＮＰは、高いタンパク質トランスフェクション効率、すなわち、７６−Ｏ１７Ｓ（４０．８％）、７６−Ｏ１７Ｓｅ（３６．１％）、７７−Ｏ１７Ｓ（３８．６％）、７７−Ｏ１７Ｓｅ（３１．０％）、７８−Ｏ１７Ｓｅ（３７．８％）、及び８０−Ｏ１７Ｓ（４５．６％）を示した。これらのＬＮＰは、Ｌｐｆ２ｋ（３３．５％）と比較した場合に、より高いまたは同様のトランスフェクション効率を示した。
【０１０７】
ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞に対するＭＴＴアッセイを通じて、７６−Ｏ１７Ｓ、７６−Ｏ１７Ｓｅ、７７−Ｏ１７Ｓ、及び７７−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰは、Ｌｐｆ２ｋ、４００−Ｏ１７Ｓｅ、７８−Ｏ１７Ｓｅ、８０−Ｏ１７Ｓ、及び８０−Ｏ１７Ｓｅと比較して、８０％を超える細胞が生存していたので、低い細胞毒性を示し、細胞生存率は、６７〜７７％であった。図６ｂを参照のこと。
【０１０８】
これらの結果は、７６−Ｏ１７Ｓ、７６−Ｏ１７Ｓｅ、７７−Ｏ１７Ｓ、及び７７−Ｏ１７Ｓｅが高い細胞内タンパク質送達及びＣｒｅ媒介性ゲノム組み換え効果を示し、細胞毒性がＬｐｆ２ｋよりも低いことを示す。
【０１０９】
実施例４：Ａｉ１４マウスにおける遺伝子組み換えのためのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＧＦＰ−Ｃｒｅ送達
以下のように、Ａｉ１４マウスにおける遺伝子組み換えのためのＧＦＰ−Ｃｒｅ送達への実施例１で調製されたＬＮＰの影響を評価する研究を実施した。
【０１１０】
ゲノム編集タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで送達することは、広範な遺伝性疾患を処置するための治療上の可能性を有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの結果に基づいて、Ｃｒｅ媒介性遺伝子組み換えのためのｉｎ  ｖｉｖｏでの（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質の送達への、上記のＯ、Ｓ、及びＳｅエーテル含有ＬＮＰの効果を評価するために、この研究を行った。
【０１１１】
研究は、Ａｉ１４マウスモデルを使用し、これは、赤色蛍光タンパク質であるｔｄＴｏｍａｔｏの転写を妨げる遺伝的に統合されたｌｏｘＰが側面に位置するＳＴＯＰカセットを有した。Ｃｒｅ媒介性遺伝子組み換え時に、ＳＴＯＰカセットを除去して、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現を生じさせた。カーゴ搭載ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの異なる性能を考慮して、同じアミン頭部及び異なる尾部（７６−Ｏ１７Ｏ、７６−Ｏ１７Ｓ、及び７６−Ｏ１７Ｓｅ）を有する３つのＬＮＰをこの研究で試験した。配合されたＬＮＰ（リピドイド／コレステロール／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ＝１６／４／１／４、重量比）を調製した。０日目及び５日目に、マウスに（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載配合ＬＮＰ（ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−Ｏ１７Ｏ、ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−Ｏ１７Ｓ、及びＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−Ｏ１７Ｓｅ）を注射（静脈内注射）した（各注射に対して１００μｇのタンパク質）。ｔｄＴｏｍａｔｏの発現を測定及び分析するために、心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓を含む器官を２０日目に収集した。図７に示されるように、同じ調製及びイメージング条件下で、ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−Ｏ１７Ｓ及びＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−Ｏ１７Ｓｅが注射されたマウス由来の肺の切片において、強いｔｄＴｏｍａｔｏシグナルが観察された。より低い倍率及びより大きな実視野の蛍光画像が得られた。ＧＦＰ／７６−Ｏ１７Ｓ及びＧＦＰ／７６−Ｏ１７Ｓｅ注射は、対照群及びＧＦＰ／７６−Ｏ１７Ｏで処置された群と比較して、肺でＣｒｅ媒介性ゲノム組み換えを効率的に誘導することが予想外に観察された。それ故、本発明のＬＮＰを含有する組成物は、肺疾患の処置に有用である。
【０１１２】
特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング結果及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験の両方は、同じアミン頭部及び異なる疎水性尾部を有するリピドイドが非常に異なる物理化学的特性、細胞内送達効果、及びゲノム組み換えプロファイルを有することを示した。
【０１１３】
実施例５：ゲノム改変のためのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達
以下のように、ゲノム改変のためのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰの送達への実施例１で調製されたＬＮＰの影響を評価する研究を実施した。
【０１１４】
この研究では、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰターゲティングゲノムＧＦＰレポーター遺伝子及びＧＦＰ−ＨＥＫ細胞を使用した。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ搭載ＬＮＰの形態をＴＥＭで調査し、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ搭載７６−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰ（Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ／７６−Ｏ１７Ｓｅ）の代表的な画像を得た。細胞内送達では、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ／ＬＮＰナノ複合体で４８時間処置した後、ＧＦＰ−ＨＥＫ細胞を採取した。さらに、ＧＦＰ遺伝子ノックアウト効果をフローサイトメトリーで評価した。図８ａに示されるように、ネイキッドＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰは、ＧＦＰ遺伝子ノックアウトを誘発しなかったが、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ／Ｌｐｆ２ｋのノックアウト効率は比較的高く、ＧＦＰ陰性細胞の６３％であった。Ｏ、Ｓ、及びＳｅエーテル含有ＬＮＰを送達ビヒクルとして使用する時、ＧＦＰ−ＨＥＫ細胞は、１４％〜５８％のＧＦＰ発現の損失を示した。特に、細胞を、７６−Ｏ１７Ｓｅ、８０−Ｏ１７Ｓｅ、８１−Ｏ１７Ｓｅ、及び４００−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰ搭載Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡで処置した時、ＧＦＰノックアウトの５０．２％、５７．７％、５４．７％、及び５７．４％が観察された。これらのリピドイドは、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞におけるＣｒｅタンパク質の遺伝子組み換え及びＧＦＰ−ＨＥＫ細胞におけるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ送達のＧＦＰ遺伝子ノックアウトの結果に基づいて、ゲノム編集タンパク質を異なる哺乳動物細胞株にｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率的に送達することができる。
【０１１５】
さらに、ＧＦＰ−ＨＥＫ細胞に対するＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ／ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性をＭＴＴアッセイで評価した。図８ｂに示されるように、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ／ＬＮＰと３７℃で４８時間インキュベートした後に、細胞生存率を６７％〜１１９％であると決定して、特定のＬＮＰがＧＦＰ−ＨＥＫ細胞に対して非細胞毒性であったが、一部が、同じ実験条件下で、Ｌｐｆ２ｋ（細胞生存率約６６％）と同じ細胞生存率を示すことが示された。高いＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達効率を有する２つのＬＮＰ、すなわち、８０−Ｏ１７Ｓｅ及び４００−Ｏ１７Ｓｅは、Ｌｐｆ２ｋの細胞生存率と同様の細胞生存率、すなわち、８０−Ｏ１７Ｓｅ及び４００−Ｏ１７Ｓｅに対してそれぞれ６８．２％及び６６．７％の細胞生存率を示すことも観察された。予想外に、７６−Ｏ１７Ｓｅ及び８１−Ｏ１７Ｓｅ  ＬＮＰは、高いＣａｓ９：ｓｇＲＮＡトランスフェクション効率（５０．２％及び５４．７％）ならびに低い細胞毒性（４８時間のインキュベーション後の細胞生存率が７６．３％及び９７．７％）を示した。
【０１１６】
式（Ｉ）の脂質様化合物から形成されるＬＮＰが、高いタンパク質トランスフェクション効率及び低い細胞毒性を示したことをこれらの結果は示す。
【０１１７】
方法及び材料
ブランク及びカーゴ搭載リピドイドナノ粒子の調製
リピドイドを全ての送達用途のためのナノ粒子に加工した。要約すると、リピドイドを酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．２）と混合し、超音波浴中で３０分間超音波処理し、続いて、さらに３０分間激しくボルテックスした。調製したままのブランクＬＮＰを４℃で保存した。Ｃｙ５−ＲＮＡ／ＬＮＰ、ｍＲＮＡ／ＬＮＰ、及びタンパク質／ＬＮＰの複合体化では、本発明者らが以前に報告した手順に従って、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ブランクリピドイドナノ粒子をＲＮＡ分子または（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質と混合し、使用前にさらに３０分間、室温でインキュベートした。ナイルレッドのカプセル化の代表的な手順は、以下の通りである：アセトン中の５μＬのナイルレッド貯蔵液を空のバイアルに添加し、次に、これを真空オーブンに入れて、有機溶媒を完全に除去した。次に、所定量のブランクＬＮＰ貯蔵液（１．０ｍｇ／ｍＬ）をバイアルに添加した。混合物を超音波浴中で４０分間超音波処理し、室温で一晩撹拌した。必要に応じてＰＢＳで希釈することにより、チオール誘発放出研究及び細胞インキュベーションのために、ナイルレッドの最終濃度を、それぞれ６．６×１０−７ｍｏｌ  Ｌ−１及び６×１０−７ｍｏｌ  Ｌ−１に調整した。ＣＰＴ及びＤｉＯ／ＤｉＩ  ＦＲＥＴペアのカプセル化の代表的な手順は、以下の通りである：ＭｅＯＨ中の１００μＬのＤｉＯ／ＤｉＩ貯蔵液を空のバイアルに入れ、真空オーブンに入れて有機溶媒を除去した。次に、２００μＬのメタノール中のリピドイド（２．０ｍｇ）をバイアルに添加し、撹拌して均質溶液を生成した。次に、継続的に撹拌しながら、６００μＬのＤＩ水を１０分滴加した。得られた混合物をＤＩ水に対して２４時間透析し（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット、ＭＷＣＯ＝３５００Ｄａ）、新しい水を４時間毎に交換した。カルセイン及びドキソノルビシン塩酸塩のカプセル化のための代表的な手順は、次の通りである：事前に計算された量のカルセインまたはＤＩ水中のＤｏｘ貯蔵液を酢酸ナトリウム緩衝液で８００μＬに希釈し、それぞれ、メタノール（５ｍｇ／ｍＬ）中でリピドイドの自己組織化プロセスを誘発するために選択溶媒として使用した。搭載されなかったカルセインまたはＤｏｘを、ＤＩ水に対する透析により除去した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット、ＭＷＣＯ＝３５００Ｄａ）。
【０１１８】
カーゴ搭載リピドイドナノ粒子の細胞内送達
細胞内取り込み研究では、ＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞を、２×１０４細胞／ウェルの初期播種密度で４８ウェルプレートに播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした後、ＮＲまたは（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載ナノ粒子を細胞に添加し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ分析器）観察及びフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア）分析（ＮＲの赤色蛍光発光及びＧＦＰの緑色蛍光発光）前に一定時間（１〜８時間）インキュベートした。ＮＲの最終濃度は、６×１０−７ｍｏｌ  Ｌ−１である。（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質濃度の最終濃度は、２５〜１００×１０−９ｍｏｌ  Ｌ−１である。低分子抗がん剤送達では、ＨｅＬａ細胞を、５×１０３細胞／ウェルの初期播種密度で９６ウェルプレートに播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした後、Ｄｏｘ、ＣＰＴ、またはＯｘａ搭載ナノ粒子を細胞に添加し、８時間インキュベートし、続いて、培地交換を行った。次に、細胞生存率分析の前に、細胞をさらに４０時間インキュベートした。ｍＲＮＡ送達では、ＨｅＬａ、Ｂ１６Ｆ１０、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、またはＪｕｒｋａｔ細胞を、２×１０４細胞／ウェルの初期播種密度で４８ウェルプレートに播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした後、ｍＲＮＡ搭載ナノ粒子を細胞に添加し、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー分析の前にさらに２４時間インキュベートした。タンパク質送達では、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞を、２×１０４細胞／ウェルの初期播種密度で４８ウェルプレートに播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした後、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質搭載ナノ粒子を細胞に添加し、８時間インキュベートし、続いて、完全培地交換を行った。次に、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー分析前に、細胞をさらに１６時間（合計２４時間のインキュベーション）インキュベートした。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ毒性アッセイ
標準のＭＴＴアッセイを使用して、ＨｅＬａ及びＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄの細胞生存率を測定した。９６ウェルプレート中で、ブランクまたはカーゴ搭載ナノ粒子と共にＨｅＬａ細胞またはＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞をインキュベートした後、ＭＴＴ試薬（３０μＬのＰＢＳ緩衝液中の５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートした。次に、細胞培養培地を慎重に除去し、２００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。次に、ＤＭＳＯ溶液を清浄な９６ウェルプレートに移し、５７０ｎｍでの吸光度がマイクロプレートリーダーで記録された。全ての実験を４回ずつ実施した。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性研究では、１、３、５、７、９、１１、１３、及び１４日目に、未処置の及びナノ粒子が注射されたＢａｌｂ／ｃマウス（１２時間の明／暗サイクルの、温度及び湿度が制御された施設に収容された）を測定した。製造業者のプロトコールに従って、対応する検出キット（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用して、腎臓及び肝臓の生物学的機能を血清生化学試験で調査し、クレアチニン、尿素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の濃度を測定した。
【０１２１】
Ａｉ１４マウスへのｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質及びｍＲＮＡの送達
ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション研究と同様に、ｍＲＮＡまたはタンパク質の搭載及びｉｎ  ｖｉｖｏでの送達のためのリピドイドナノ粒子を調製した。１２時間の明／暗サイクルの、温度及び湿度が制御された施設に、Ａｉ１４マウスを収容した。各群の３匹のマウスに、Ｃｒｅ  ｍＲＮＡ搭載または（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質搭載ＬＮＰ製剤を（静脈内または筋肉内）注射した。注射後１０日目（筋肉内注射）または１４日目（静脈内注射）に、全ての群由来の心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓を含む臓器を収集した。組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定し、３０％スクロースで脱水した後、ＯＣＴで凍結し、１０〜１５μｍのスライスに切断した。次に、蛍光イメージングのために、スライスを収集して、ＤＡＰＩで染色した（ＢＺ−Ｘアナライザー蛍光顕微鏡法）。
【０１２２】
実施例６：コレステリルリピドイド合成、ナノ粒子の作製及び特性決定。
【化５３】
2021512865.tif 000059
【０１２３】
Ｐｙ−ＳＳ−Ｃｈｏｌの合成
コレステリルクロロホルメート（１０．７１ｇ、２３．８５ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させ、ＰＹ−ＳＳ−ＮＨ２（４．４７ｇ、２３．９９ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（３．７１ｇ、３６．６９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液に０℃で滴加した。反応混合物を一晩撹拌し、移動相として酢酸エチル、ジクロロメタン、及びｎ−ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製の後、Ｐｙ−ＳＳ−Ｃｈｏｌを淡黄色粘性固体（４．８９ｇ、収率約３４．２６％）として得た。
【０１２４】
ＯＨ−ＳＳ−Ｃｈｏｌの合成
Ｐｙ−ＳＳ−Ｃｈｏｌ（３．５５ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）及び酢酸（６００μＬ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解させた。次に、２−メルカプトエタノール（０．５１ｇ、６．５２ｍｍｏｌ）を滴加し、連続的に撹拌しながら、反応混合物をさらに２４時間３５℃に維持した。移動相として酢酸エチル及びｎ−ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ＯＨ−ＳＳ−Ｃｈｏｌを精製し、無色固体を得た（２．７４ｇ、収率約８１．６３％）。
【０１２５】
ＯＣｈｏｌＢの合成
ＯＨ−ＳＳ−Ｃｈｏｌ（２．４１ｇ、４．２６ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．６５ｇ、６．３９ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解させた。塩化アクリロイル（０．４６ｇ、５．１１ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。反応混合物を一晩撹拌し、移動相として、酢酸エチル、ジクロロメタン、及びｎ−ヘキサンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製の後に、ＯＣｈｏｌＢを無色固体（２．５２ｇ、収率約９５．６８％）として得た。
【０１２６】
リピドイドの合成
上に示されたコレステロール含有アクリラート尾部を、頭部アミンＲａ−ＮＨ２（すなわち、化合物７５〜７８、８０、８１、８７、９０、及び３０４）と反応させて、以下の脂質様化合物を得た。
【化５４−１】
2021512865.tif 000060
【化５４−２】
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【化５４−３】
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【化５４−４】
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【化５４−５】
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【０１２７】
ブランク及びカーゴ搭載リピドイドナノ粒子の調製
リピドイドを全ての送達用途のためのナノ粒子に加工した。図１０Ｂに示されるように、ほとんどのナノ粒子は、７０〜３００ｎｍの範囲の平均直径及びＰＤＩ０．１〜０．３を示した。ＯＣｈｏｌＢ尾部を有するリピドイドから自己組織化されたＬＮＰのサイズは、本発明者らが以前に報告したアルキル鎖を有するＬＮＰライブラリーと同様である。比較的低いＰＤＩ値は、これらのナノ粒子の均一性を示した。
【０１２８】
次に、ＯＣｈｏｌＢで完全に置換されたＬＮＰの形態を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で調査した。図１０Ｃに示されるように、親水性の内部コロナ及び外部コロナに挟まれた疎水性の二重層壁を有する中空球状物である球状小胞状構造が、７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、７７−ＯＣｈｏｌＢ、７８−ＯＣｈｏｌＢ、８０−ＯＣｈｏｌＢ、８１−ＯＣｈｏｌＢ、及び３０４−ＯＣｈｏｌＢから観察された。対照的に、小胞構造は、それらの対応物と比較して、８７−ＯＣｈｏｌＢ及び９０−ＯＣｈｏｌＢによく形成されておらず、その代わりに、非晶質の凝集体が観察された。ＴＥＭイメージングにより、最大粒子が８１−ＯＣｈｏｌＢ（２１６．９ｎｍ）及び３０４−ＯＣｈｏｌＢ（３９４．０ｎｍ）であることが明らかになった。これは、図１０Ｂに示されるように、ＤＬＳ測定結果と一致する。
【０１２９】
ＯＣｈｏｌＢで完全に置換されたＬＮＰ（７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢ）ならびにＯ１６Ｂ  ＬＮＰ（７５−Ｏ１６Ｂ、７６−Ｏ１６Ｂ、及び７７−Ｏ１６Ｂ）の細胞毒性を種々の条件下、すなわち、標準のＭＴＴアッセイを使用した、ＨｅＬａ細胞株に対して少ない投薬量／短い曝露時間及び多い投薬量／長い曝露時間、で並べて試験した。図１０Ｅに示されるように、少ない投薬量／短い曝露時間条件（すなわち、［リピドイド］＝１．０または３．３μｇ  ｍＬ−１、曝露時間＝８時間）で、全てのＯＣｈｏｌＢ及びＯ１６Ｂ  ＬＮＰは、わずかな細胞毒性を示し、８３％を超える細胞生存率が全てのリピドイドについて報告された（例えば、［リピドイド］＝３．３μｇ  ｍＬ−１の場合、７５−ＯＣｈｏｌＢ及び７５−Ｏ１６Ｂで処置された細胞の生存率は、それぞれ８６．５％及び８７．７％である）。投薬量及び曝露期間が両方とも増加した時（すなわち、［リピドイド］＝４７または９１μｇ  ｍＬ−１、曝露時間＝２４時間）、ＯＣｈｏｌＢで完全に置換されたＬＮＰで処置された細胞は、Ｏ１６Ｂ  ＬＮＰで処置されたものと比較して、有意により高い生存率を示した（［リピドイド］＝４７μｇ  ｍＬ−１の場合、細胞生存率は、７５−ＯＣｈｏｌＢ／７５−Ｏ１６Ｂ＝５７．４％／４１．９％、７６−ＯＣｈｏｌＢ／７６−Ｏ１６Ｂ＝６５．５％／３２．８％、７７−ＯＣｈｏｌＢ／７７−Ｏ１６Ｂ＝７９．６％／２９．０％であり；［リピドイド］＝９１μｇ  ｍＬ−１の場合、細胞生存率は、７５−ＯＣｈｏｌＢ／７５−Ｏ１６Ｂ＝５５．１％／２９．５％、７６−ＯＣｈｏｌＢ／７６−Ｏ１６Ｂ＝６０．２％／２４．３％、７７−ＯＣｈｏｌＢ／７７−Ｏ１６Ｂ＝６４．１％／２１．９％である）。これらの結果は、コレステリルリピドイドが、線形アルキル鎖を有するリピドイドと比較して、より低い細胞毒性を有することを示す。さらに、本発明者らは、本発明者らの新たに開発されたＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの生体適合性を、市販の広く使用されるカチオン性トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｐｆ２ｋ）と比較した。Ｌｐｆ２ｋは、タンパク質及び核酸の両方の送達に非常に効率的であることが示されるが；特に、標的細胞が比較的高い投薬量と長いインキュベーション期間を受ける時、その細胞毒性が多くの場合主要な懸念である。図１０Ｅに示されるように、ＨｅＬａ細胞を４７及び９１μｇ  ｍＬ−１のＬｐｆ２ｋで２４時間処置した時、それらの生存率を８．９％及び６．８％と決定し、これは、同じ条件で、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰで処置された細胞の生存率よりもはるかに低い。とりわけ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験は、新たに開発されたコレステリル含有（ＯＣｈｏｌＢ）ＬＮＰの優れた生体適合性を実証した。
【０１３０】
実施例７：ゲスト分子のチオール応答性、搭載、及び誘発放出。
ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰのチオール誘発性分解及び解離を時間依存性ＤＬＳ測定及びＴＥＭ観察で研究した。通常、図１１Ａに示されるように、細胞内還元条件に類似する以前の研究に広く使用される１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１０ｍＭの存在下で、２５本発明者らは、７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢの相対サイズの増加が、インキュベーション期間に応じて漸進的に増加した（最初の２時間で、それぞれ５６６．４％、４９８．５％、及び１５９１．４％）ことを観察した。次に、ナノ粒子のサイズは通常、７５−ＯＣｈｏｌＢを除いて、次の４時間にわたって維持され、これは、６時間でサイズが１３１５．７％増加したことを示した。次に、ＤＴＴで処理されたＬＮＰの代表的な形態をＴＥＭで調査し、画像は図１１Ｂに示される。図１０Ｃに示されるような適切に形成された小胞構造の不存在及びアモルファス構造を有するマイクロメートルスケールの大きな凝集体（ＤＬＳ測定から得られた結果と一致する；図１１Ａ）が、７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰについて観察された。小胞構造の破壊は、ＯＣｈｏｌＢリピドイドのチオール交換及びジスルフィド結合開裂反応に起因すると考えられる。次に、本発明者らは、血清中のチオール含有分子（例えば、アルブミン、システイン、ホモシステイン、システイニルグリシンなど）が、これらのジスルフィド結合含有ＬＮＰの構造的崩壊を誘導し得るかどうかを調査した。血清中に存在した低分子及び高分子の遊離チオールに類似する２０μＭのＬ−システイン（Ｃｙｓ）の存在下でのＬＮＰの安定性を調査した。図１１Ａに示されるように、本発明者らは、全ての３つの試験ＬＮＰのためのこの研究の範囲にわたって１時間間隔のいずれかで、流体力学的直径の２５％未満の変化を観察し、実際には、６時間のインキュベーション後の７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢに対して、それぞれ、１２．２％、１４．６％、及び７．２％のサイズ減少が観察された。システインで処理されたＬＮＰのサイズ変化は、未処理の対照群と比較した場合、わずかな差異を示し（図１１Ａ）、血清中の遊離チオール濃度に類似する条件下でのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの良好な安定性を示した。さらに、１０ｍＭのＤＴＴまたは２０μＭのＣｙｓのいずれかの存在下で２４時間インキュベートした後のＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの相対的なサイズ変動を決定した。結果が、図１１Ｃに示される。１０ｍＭのＤＴＴで及び２４時間の処理後、７５−ＯＣｈｏｌＢ、７８−ＯＣｈｏｌＢ、及び３０４−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰは、最大のサイズ変化を示し、平均流体力学的直径の２８７２．４％、４６４２．８％、及び３８４９．６％の増加が観察され；７６−ＯＣｈｏｌＢ、７７−ＯＣｈｏｌＢ、８０−ＯＣｈｏｌＢ、及び８１−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰについて、７６６．９％〜１２６６．４％の中程度のサイズ増加が記録されたが；８７−ＯＣｈｏｌＢ（２１０．３％）及び９０−ＯＣｈｏｌＢ（１７９．５％）の両方は、ＴＥＭ画像に基づいて一貫した小胞を形成できず（図１０Ｃ）、２４時間にわたり最小のサイズ増加を示した。他方では、２０μＭのシステインと共に２４時間インキュベートされた全てのＬＮＰは、未処置の対照群と同様に、最小のサイズ変化を示した（図１１Ｃ）。これらの結果は、細胞内及び細胞外の還元可能な環境に関連してこれらのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの分解の動態を実証した。サイズ変化の程度は、種々のアミン頭部群を有するリピドイド間で変動し、全てのリピドイドは、システイン（血清中のモデリング条件）よりもＤＴＴ（細胞内条件のモデリング）により応答した。さらに、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰは、低濃度のチオール（２０μＭのシステイン処理に類似する）の存在下で比較的良好な安定性を示し、これは、これらの新しいＬＮＰが全身薬物送達に使用することができることを示す。
【０１３１】
実施例８：ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用する薬物カプセル化：
次に、様々な物理的特性を有するカーゴ分子をカプセル化するナノキャリアとしてのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの機能を研究した。この文脈では、代表的な低分子疎水性カーゴとしてのクマリン（励起（Ｅｘ．）３５０ｎｍ、発光（Ｅｍ．）４４８ｎｍ）及びナイルレッド（ＮＲ；Ｅｘ．５２０ｎｍ、Ｅｍ．６１３ｎｍ）、代表的な低分子親水性カーゴとしてのカルセイン（Ｅｘ．４７５ｎｍ、Ｅｍ．５２９ｎｍ）、ならびに代表的な高分子親水性カーゴとしての（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ組み換え蛍光タンパク質（Ｅｘ．４２０ｎｍ、Ｅｍ．５１０ｎｍ）及び二本鎖Ｃｙ５標識ＲＮＡ（Ｃｙ５−ＲＮＡ、１３ｋＤａ；Ｅｘ．６２５ｎｍ、Ｅｍ．６７２ｎｍ）をモデルカーゴとして使用した。研究では、モデル脂質担体として７５−ＯＣｈｏｌＢを選択した。図１１Ｄは、全てのカーゴを７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰにうまく搭載することができることを示した。疎水性相互作用（クマリン及びＮＲ）、静電相互作用（カルセイン、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ、及びＣｙ５−ＲＮＡ）、または物理的カプセル化のいずれかにより、カーゴ分子をＬＮＰに搭載した。さらに、図３Ｄに示されるように、モデルとして、疎水性蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペア、ＤｉＯ、及びＤｉＩ（Ｅｘ．４２５ｎｍ、Ｅｍ．５０４ｎｍ（ＤｉＯ）、及び５７８ｎｍ（ＤｉＩ））を使用して、カーゴ分子の同時カプセル化を行うこともでき、これは、併用療法のために、これらのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用して複数のタイプの生物活性分子を同時に搭載する可能性を実証する。３０超分子相互作用（例えば、静電相互作用及び水素結合）を利用すること、ならびに／または自己組織化プロセス中にカーゴをカプセル化することにより、低分子及び高分子親水性分子の両方（例えば、ゲノム編集プラットフォーム及び細胞シグナル阻害剤）は、新たに開発されたＬＮＰで、容易に搭載及び送達することができる。
【０１３２】
次に、ナイルレッドの微環境極性に感受性のある光物理特性を利用するナイルレッド搭載７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰ（ＮＲ／７５−ＯＣｈｏｌＢ）を使用することにより、カプセル化カーゴの還元誘発性放出挙動を研究した。図１１Ｅに示されるように、１ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭのＤＴＴの存在下で、カプセル化されたナイルレッドの３３．５％、６１．７％、及び６７．４％が、２時間以内にナイルレッド／７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰから放出され、６時間のインキュベーションで、それぞれ４４．０％、８４．２％、及び８６．４％が放出された。その間に、２０μＭのシステインで処置されたＮＲ／７５−ＯＣｈｏｌＢは、２時間で４．２％及び６時間で６．９％のナイルレッドを放出し、これは、低濃度のチオールの刺激下で、ＬＮＰの上述した最小構造的及び形態学的変化に起因することができる（図１１Ａ及び１１Ｃ）。さらに、高濃度で自己消光特性を有する親水性蛍光色素であるカルセインの誘発性放出を研究した。３１ＤＴＴ（１ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭ）で処置されたカルセイン／７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの蛍光強度は、未処置の対照ＬＮＰ及び２０μＭのシステインで処置された群の４．７〜６．４倍に、１２時間のインキュベーション後に増加した（図１１Ｆ）。さらに、負荷電高分子カーゴであるＣｙ５−ＲＮＡとＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの結合親和性を調査した。１０／１の重量比（リピドイド／Ｃｙ５−ＲＮＡ）で、ＲＮＡ分子の８２．９％が７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰと効率的に複合化することができるが、結合効果は、ＤＴＴ（１０ｍＭ、２４時間）で処理されたナノ粒子を使用する時に、１５．５％に劇的に低減する（８４．５％の未結合Ｃｙ５−ＲＮＡが決定された場合；図１１Ｇ）ことが判明した。さらに、応答性研究と同様に、カーゴ放出プロファイルは、チオール含有試薬の種類及び濃度の両方に依存することができることが合理的である。とりわけ、カーゴが搭載されたＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰは、低濃度のチオールの存在下で比較的安定しており、種々の物理化学的特性（疎水性／親水性、低／高分子量など）を有するカーゴ分子の誘発性放出挙動を予想することができる。
【０１３３】
実施例９：内在化研究。
低分子疎水性（ナイルレッド）及び親水性（カルセイン）蛍光色素及び高分子蛍光組み換えタンパク質（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ）搭載ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用して、細胞（ＨｅＬａ及びＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞株）の内在化研究を行った。最初に、時間依存性ＤＬＳ及び蛍光測定を使用して、カーゴ搭載ＬＮＰの安定性を調査した。図１２Ａに示されるように、ＦＲＥＴペアＤｉＯ及びＤｉＩカプセル化ＬＮＰ（ＤｉＯ−ＤｉＩ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、ＤｉＯ−ＤｉＩ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及びＤｉＯ−ＤｉＩ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）の蛍光強度は、７日間の保管後にＦＲＥＴ比（Ｉ５７５／Ｉ５７５＋Ｉ５０５）のわずかな変動を示した。
【０１３４】
次に、ＮＲ搭載ＬＮＰ及びＨｅＬａ細胞を使用して、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの内在化動力学及び効率を研究した。図１２Ｂに示されるように、未処置の対照細胞と比較して、ＮＲ／ＬＮＰ（ＮＲ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、ＮＲ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及びＮＲ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）と共にインキュベートされた全ての細胞は、経時的に徐々に増加するＮＲ陽性（ＮＲ＋）細胞のパーセンテージを示し、これは、ＮＲ／ＬＮＰの内在化プロセスが、この研究の時間スケールにわたって曝露時間に依存することを意味する。さらに、ＮＲ／７５−ＯＣｈｏｌＢ及びＮＲ／７７−ＯＣｈｏｌＢの両方は、同様のＮＲ＋集団成長パターンを示し、４時間の曝露後に成長率を減少させたが（４時間で、ＮＲ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、ＮＲ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及びＮＲ／７７−ＯＣｈｏｌＢで処置された細胞に対するＮＲ＋パーセンテージは、それぞれ、８５．２％、６５．０％、及び９０．３％である）、一般に、ＮＲ／７６−ＯＣｈｏｌＢは、ＮＲ／７５−ＯＣｈｏｌＢ及びＮＲ／７７−ＯＣｈｏｌＢと比較して、８時間後に、一定の増加率及びより低いＮＲ＋パーセンテージを示した。次に、８時間の曝露後、８つのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの全てのＮＲ送達効率を決定した。図１２Ｃに示されるように、ＮＲ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、ＮＲ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、ＮＲ／７７−ＯＣｈｏｌＢ、ＮＲ／７８−ＯＣｈｏｌＢ、及びＮＲ／８０−ＯＣｈｏｌＢは、細胞の８５．２％、６５．０％、９０．３％、９２．３％、及び７１．４％がＮＲ＋と判定される最大送達効率を示し；ＮＲ＋細胞の２７．０％、１２．９％、及び２２．８％が、ＮＲ／８１−ＯＣｈｏｌＢ、ＮＲ／９０−ＯＣｈｏｌＢ、及びＮＲ／３０４−ＯＣｈｏｌＢに対して記録され；ＮＲ／８７−ＯＣｈｏｌＢは、未処置の対照群に匹敵する最小トランスフェクション効果を示し、これは、８７−ＯＣｈｏｌＢが試験条件下でＨｅＬａ細胞にＮＲを効率的に送達することができないことを意味する。ＮＲ／ＬＮＰ（ＮＲ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、ＮＲ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及びＮＲ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）で処置されたＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像は、図１２Ｄに示され、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰにより、ＮＲが細胞に送達され、主に、細胞質に分布したことが容易に観察される。次に、負荷電親水性蛍光色素であるカルセインの内在化を研究した。図１２Ｅに示されるように、８時間の曝露後、遊離カルセイン分子は、効率的に細胞に入ることができず、これは、以前に報告された結果と一致する。遊離カルセインで処置された細胞と比較した場合、平均蛍光強度の約９．４倍が記録されたので、カルセイン／７５−ＯＣｈｏｌＢで処置された細胞は、比較的高い緑色蛍光強度を示した。これらの結果は、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰが親水性及び疎水性の両方のカーゴ分子の細胞内送達のための効率的なナノキャリアとして役立ち得ることを証明した。次に、モデルシステムとして蛍光組み換え（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質及びＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞を使用して、高分子カーゴの細胞内送達のためのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの使用を調査した。図１２Ｆに示されるように、ネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質が細胞に入ることができず、Ｌｐｆ２ｋが（−��０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ送達に非常に効率的であることが実証されているので、ネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載Ｌｐｆ２ｋ（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋ）を陰性対照及び陽性対照として使用した。一定の脂質／タンパク質比（すなわち、それぞれ、１．７、３．３、及び６．６μｇ  ｍＬ−１の最終脂質濃度を有する送達）を有する広範な（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質濃度（２５、５０、及び１００ｎＭ）で、送達効率を試験した。３３．２％、４３．８％、及び７４％のＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）細胞は、それぞれ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ濃度２５ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭで（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋで処置された細胞について記録された。２５ｎＭで（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ濃度、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ（６６．４％）、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢ（６６．４％）、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／８０−ＯＣｈｏｌＢ（５４．７％）、及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／８１−ＯＣｈｏｌＢ（４０．９％）は全て、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋよりも高いトランスフェクション効率を示した。より高い（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ濃度（すなわち、５０ｎＭ及び１００ｎＭ）では、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７５−ＯＣｈｏｌＢ（５０ｎＭ及び１００ｎＭで、それぞれ、４２．３％及び９３．１％のＧＦＰ＋細胞）、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ（９６．３％及び９８．７％）、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢ（９０．７％及び９７．９％）、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７８−ＯＣｈｏｌＢ（４６．１％及び９０．１％）、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／８０−ＯＣｈｏｌＢ（８８．９％及び９７．０％）、ならびに（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／８１−ＯＣｈｏｌＢ（８７．４％及び９１．５％）は、Ｌｐｆ２ｋと同等のまたはそれより高いトランスフェクション効果を示し、ＧＦＰ＋細胞の４８．８％を、タンパク質濃度１００ｎＭの（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／３０４−ＯＣｈｏｌＢで処置された細胞から得たが、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載８７−ＯＣｈｏｌＢ及び９０−ＯＣｈｏｌＢの両方は、他のＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰと比較して、最小送達効率を示した。この結果は、図１２Ｃに示されるような低分子ＮＲ送達結果と一致して、これらの２つのナノ粒子が細胞内送達用途にはおそらく非効率的であることを示す。図１２Ｇ（［リピドイド］＝６．６μｇ  ｍＬ−１及び［（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ］＝１００ｎＭ）に示されるように、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの多く及びＬｐｆ２ｋが、同様のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを有した（図４Ｆ）が、さらなる分析は、より多くの量の（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質を表すより高い平均蛍光強度がうまく細胞に送達されたので、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載ナノ粒子で処理された細胞の平均蛍光強度が大幅に変動したことを明らかにした。これは、ＬＮＰ（７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、７７−ＯＣｈｏｌＢ、８０−ＯＣｈｏｌＢ、及び８１−ＯＣｈｏｌＢ）の一部が、他のもの（Ｌｐｆ２ｋ及び７８−ＯＣｈｏｌＢ）よりもはるかに効率的であることを示す。ネイキッ��（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載ナノ粒子（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢ、及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋ）で処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルは、図１２Ｈに示され（［リピドイド］＝６．６μｇ  ｍＬ−１及び［（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ］＝１００ｎＭ）、これは、図１２Ｇに示される統計結果と一致する。さらに、タンパク質及びタンパク質／ナノ粒子で処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞の代表的な蛍光画像も図１２Ｉに示される。（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢ、及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋ由来の強い緑色蛍光シグナル、ならびに（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅで処置された細胞及び未処置の細胞由来のわずかなシグナルを検出し、これはまた、フローサイトメトリー分析の結果と一致する。図１２Ｊは、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）で処置された細胞の代表的な明視野画像を示し（［リピドイド］＝６．６μｇ  ｍＬ−１及び［（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ］＝１００ｎＭ）、明らかな形態学的変化は、未処置の細胞と比較して観察されなかった。これはさらに、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの生体適合性を実証する。総合すると、このデータは、新たに開発された完全置換ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰのほとんどが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞への低分子の疎水性及び親水性カーゴならびに高分子カーゴの送達に効率的であることを示す。
【０１３５】
実施例１０：低分子抗がん剤の細胞内送達。
ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用して、疎水性及び親水性の両方の低分子薬物を送達する可能性を調査した。ドキソルビシン塩酸塩（Ｄｏｘ）（水溶性）、ならびにカンプトテシン（ＣＰＴ）及びオキサリプラチン（Ｏｘａ）（非水溶性）をＬＮＰにカプセル化し（実験のセクションを参照のこと）、ＨｅＬａ細胞に対して試験した。Ｄｏｘ（Ｅｘ．４９５ｎｍ、Ｅｍ．５９４ｎｍ）及びＣＰＴ（Ｅｘ．３６０ｎｍ、Ｅｍ．４４６ｎｍ）搭載７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの吸収及び蛍光発光スペクトルを試験することにより、低分子薬物の良好なカプセル化を実証し、Ｄｏｘ及びＣＰＴの特徴的な吸光度及び発光ピークが、図１３Ａに示されるように観察された。対応する標準曲線を使用して、薬物搭載含有量（ＤＬＣ％＝［Ｗ搭載薬物］／［Ｗ搭載薬物＋Ｗリピドイド］＊１００％）を、Ｄｏｘ及びＣＰＴに対してそれぞれ１９．２％及び５．２％と決定した。次に、フローサイトメトリーを使用して８時間曝露した後、Ｄｏｘ搭載７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰ（Ｄｏｘ／７５−ＯＣｈｏｌＢ）の内在化を研究した。図１３Ｂに示されるように、カルセイン（図１２Ｅ）及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ（図４ｆ）とは際立って対照的に、遊離Ｄｏｘは、８時間のインキュベーション後にＨｅＬａ細胞に容易に内在化することができる。Ｄｏｘ／７５−ＯＣｈｏｌＢで処置されたＨｅＬａ細胞はまた、遊離Ｄｏｘで処置された細胞と同等の平均蛍光強度を示し、未処置の対照細胞と比較して約２８．９倍大きく、Ｄｏｘ／７５−ＯＣｈｏｌＢナノ粒子がこの条件下でＤｏｘの細胞内送達に効率的であり得ることが示された。
【０１３６】
次に、用量依存性細胞毒性を調査した。図１３Ｃから、Ｄｏｘ／７５−ＯＣｈｏｌＢは、ＨｅＬａ細胞に対する遊離Ｄｏｘと同様の濃度依存性細胞毒性プロファイルを示した（８時間の曝露、４８時間のインキュベーション後のＭＴＴアッセイ）。一方で、ブランク７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰは、同じ条件下でわずかな毒性を示した。ブランクＬＮＰで処置された細胞生存率は、８０％超に維持され、これはさらに、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの安全性を確認する。次に、疎水性抗がん剤、ＣＰＴ、及びＯｘａを７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰ（ＣＰＴ／７５−ＯＣｈｏｌＢ及びＯｘａ／７５−ＯＣｈｏｌＢ）にカプセル化し、４８時間のインキュベーション後のＣＰＴ／７５−ＯＣｈｏｌＢ及びＯｘａ／７５−ＯＣｈｏｌＢで処置されたＨｅＬａ細胞の細胞生存率（両方とも８時間の曝露；［ＣＰＴ］＝１．８μｇ  ｍＬ−１；［Ｏｘａ］＝２．４μｇ  ｍＬ−１）を４２．４％及び６６．９％と決定した（図１３Ｄ）。全体的に、Ｄｏｘ及びＯｘａでカプセル化された７５−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰは、それらの遊離の同等物と同等またはそれより高い毒性を示したが、ＣＰＴ搭載７５−ＯＣｈｏｌＢは、遊離ＣＰＴよりも効率が悪かった。これは、カーゴ薬物の物理化学的特性がＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの送達性能に大きな影響を与え得ることを示し、原則は、他の担体システムにも当てはまり得る。
【０１３７】
実施例１１：ｍＲＮＡの細胞内送達。
メッセンジャーＲＮＡ送達は、がん治療、タンパク質補充療法、及び神経障害の処置に大きな可能性を有する。４２ＧＦＰ  ｍＲＮＡ及び種々の細胞株（ＨｅＬａ、Ｂ１６Ｆ１０、ＨＥＫ−２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、及びＪｕｒｋａｔ）を使用して、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用したｍＲＮＡの細胞内送達を研究した。最初に、ＨｅＬａ細胞を使用して、ＬＮＰ／ｍＲＮＡの重量比を最適化した。図１４Ａに示されるように、０．８６μｇ  ｍＬ−１でのｍＲＮＡの最終濃度を固定すること及びＬＮＰ／ｍＲＮＡ重量比を０／１（すなわち、遊離ｍＲＮＡ、ＬＮＰなし）から１５／１に増加させることにより、ＬＮＰ／ｍＲＮＡ比が１／１未満である場合、２４時間の曝露後に、最小ＧＦＰ＋細胞を決定した（ＬＮＰ／ｍＲＮＡ＝０／１、０．５／１、及び１／１に対して、それぞれ、０．７％、０．８％、及び１．４％のＧＦＰ＋細胞を決定した）。ＧＦＰ＋集団における漸増は、比が２／１から１５／１に増加する時に観察され、２／１、５／１、１０／１、及び１５／１のＬＮＰ／ｍＲＮＡ比に対して、２４．３％、３９．２％、６４．７％、及び６８．９％のＧＦＰ＋細胞が記録された。次に、ＬＮＰ／ｍＲＮＡの重量比＝１０／１を、以下のｍＲＮＡ送達研究のために選択した。ｍＲＮＡ／ＬＮＰの投薬量を増加させる時、ＧＦＰ＋細胞の継続的な増加（３．３％〜７６．３％）が観察されたので、ＧＦＰ  ｍＲＮＡの細胞内送達はまた、０．０２７〜１．５μｇ  ｍＬ−１のｍＲＮＡの濃度範囲に用量依存することが判明した（図１４Ｂ）。次に、全ての完全置換ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの細胞内送達効率をＨｅＬａ細胞に対して試験し、Ｌｐｆ２ｋ及びネイキッドＧＦＰ  ｍＲＮＡを対照として使用した（ＬＮＰ／ｍＲＮＡ＝１０／１；［ｍＲＮＡ］＝０．８６μｇ  ｍＬ−１；２４時間の曝露）。図１４Ｄに示されるように、ネイキッドｍＲＮＡは、わずかなＧＦＰ＋細胞を誘導し、これは、未処置の細胞に匹敵するが、Ｌｐｆ２ｋは、９８．１％のＧＦＰ＋ＨｅＬａ細胞と共に、ｍＲＮＡ送達に非常に効率的である。ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰに関して、７５−ＯＣｈｏｌＢ（ＧＦＰ＋細胞の６２．０％）、７６−ＯＣｈｏｌＢ（７９．８％）、７７−ＯＣｈｏｌＢ（７３．５％）、７８−ＯＣｈｏｌＢ（６７．１％）、８０−ＯＣｈｏｌＢ（５５．６％）、８１−ＯＣｈｏｌＢ（５１．６％）、及び３０４−ＯＣｈｏｌＢ（５２．１％）は全て、有効であると決定される。ｍＲＮＡ／ＬＮＰ（ｍＲＮＡ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、ｍＲＮＡ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及びｍＲＮＡ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）で処置されたＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光画像は、図１４Ｃに示される。未処置のＨｅＬａ細胞と比較すると、ナノ粒子がインキュベートされた細胞から、強い緑色蛍光シグナルが記録され、これは、図１４Ｄに示されるようなフローサイトメトリーデータと一致する。一方で、８７−ＯＣｈｏｌＢ（６．１％）及び９０−ＯＣｈｏｌＢ（２．５％）の両方は、ＨｅＬａ細胞へのＧＦＰｍＲＮＡ送達に非効率的であることが判明し、これは、蛍光レポーターとしてのＮＲ（図１２Ｃ）及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質（図１２Ｆ）を使用した内在化研究と一致する。送達性能の一貫性が、これらのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰに存���し得ることが明らかであり、非活性ＬＮＰの内在化効果は、搭載カーゴの特性に関係なく最小のままであった。
【０１３８】
次に、新たに開発されたＬＮＰの送達スペクトルを調査するために、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ搭載ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを他の４種類の細胞株に対してチャレンジした。Ｂ１６Ｆ１０（マウスメラノーマ細胞）、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胚性線維芽細胞）及びＪｕｒｋａｔ（ヒトＴリンパ球細胞）細胞を試験した（ＬＮＰ／ｍＲＮＡ＝１０／１；［ｍＲＮＡ］＝０．８６μｇ  ｍＬ−１；２４時間の曝露）、結果は、図１４Ｄに示される。陽性対照として、Ｌｐｆ２ｋは、ＧＦＰ  ｍＲＮＡをＢ１６Ｆ１０（ＧＦＰ＋細胞の６３．２％）、ＨＥＫ２９３（８０．１％）、及びＮＩＨ３Ｔ３（７０．１％）細胞に送達するのに非常に効率的であることがわかったが、Ｊｕｒｋａｔ細胞への送達はわずかに効率が悪く（２８．７％）、これは通常、トランスフェクションが最も難しい細胞株の１つと考えられている。ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰに関して、一般に、８７−ＯＣｈｏｌＢ、９０−ＯＣｈｏｌＢ、及び３０４−ＯＣｈｏｌＢは、これら全ての細胞株にｍＲＮＡを送達する効率が低いことが証明されたが、他の６つのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰは、はるかに効率的であることが判明した。例えば、ＧＦＰ＋細胞の６３．０％、６０．９％、５４．１％、及び５０．１％を、ｍＲＮＡ／７５−ＯＣｈｏｌＢで処置されたＢ１６Ｆ１０、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、及びＪｕｒｋａｔ細胞から決定し；ｍＲＮＡ／７６−ＯＣｈｏｌＢで処置された細胞についての数値は、それぞれ、７０．７％、７５．８％、２４．１％、及び７．７％であった。リピドイドの種類だけでなく、標的細胞株も、送達効果に大きな影響を与え得ることが明らかであった。全体的に、陽性対照であるＬｐｆ２ｋは、比較的大きな活性の広域スペクトルのトランスフェクション試薬であり；ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰのほとんど（９つのうち６つ）はまた、試験条件下で有効な広域スペクトルのトランスフェクション試薬である。ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの一部（例えば、７５−ＯＣｈｏｌＢ、７７−ＯＣｈｏｌＢ、及び７８−ＯＣｈｏｌＢ）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞への送達の効果に関して、Ｌｐｆ２ｋに優る特定の利点を示した。さらなる製剤最適化、例えば、賦形剤（ヘルパー脂質様低分子リン脂質（例えば、ＤＯＰＥ及びＤＳＰＣ）ならびに高分子脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ及びＰＥＧ−セラミド））をＬＮＰに添加すること、ならびに／またはより制御可能な自己組織化手順を使用することを通して、完全置換ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰのトランスフェクション効率の改善を達成することができることが予想された。
【０１３９】
次に、ＭＴＴアッセイを実行して、ＨｅＬａ細胞に対するｍＲＮＡ搭載ナノ粒子の細胞毒性を調査した。図１４Ｅに示されるように、２４時間の曝露後（リピドイド／ｍＲＮＡ＝１０／１；［ｍＲＮＡ］＝０．８６μｇ  ｍＬ−１）、最高のＧＦＰ＋細胞パーセンテージがｍＲＮＡ／Ｌｐｆ２ｋで処置された群から得られた場合（図１４Ｄ）であっても、ｍＲＮＡ／Ｌｐｆ２ｋ複合体は、３７．５％の細胞生存率が記録されたように、ＨｅＬａ細胞に対して有意な細胞毒性を示したことが明らかであった。他方では、ＧＦＰｍＲＮＡ搭載ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの全ては、同じ条件下でわずかな細胞毒性を示し（例えば、ｍＲＮＡ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、ｍＲＮＡ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及びｍＲＮＡ／７７−ＯＣｈｏｌＢがインキュベートされた試料に対して、細胞生存率を８４．７％、９４．５％、及び１００．１％と決定し）、これは、ブランクＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの以前の毒性研究と一致する（図１０Ｅ）。この結果は、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの優れた適合性ならびにｍＲＮＡ／ＬＮＰ複合体の合計投薬量及び／または露出時間を増加させることにより、さらに細胞内送達効率を増加させる可能性を示す。図１４Ｆに示される明視野画像から、２４時間の曝露後、有意な形態学的変化が、ｍＲＮＡ／Ｌｐｆ２ｋで処置された細胞から観察されたが、明らかな変動は、未処置の対照群と比較して、ｍＲＮＡ／ＬＮＰ（ｍＲＮＡ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、ｍＲＮＡ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及びｍＲＮＡ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）ならびにネイキッドｍＲＮＡで処置された細胞の両方に対して観察された。この結果は、図１４Ｅに示されるような細胞生存率の研究と一致し、さらに比較的安全なトランスフェクションナノキャリアとしてのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの利点を確認した。
【０１４０】
次に、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用して、ゲノム編集（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）目的でｍＲＮＡを送達する可能性を調査した。最初に、Ｃｒｅ  ｍＲＮＡをＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰと複合化し、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞に対して試験した。ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞は、Ｃｒｅタンパク質媒介性組み換えによってのみ、赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄを発現する。ｍＲＮＡ／ＬＮＰ（リピドイド／ｍＲＮＡ＝１０／１；［ｍＲＮＡ］＝０．８６μｇ  ｍＬ−１）との２４時間のインキュベーション後、ＤｓＲｅｄ＋細胞の割合を、フローサイトメトリーで測定した。図１４Ｇに示されるように、７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢは全て、それぞれ、ＤｓＲｅｄ＋細胞の６７．２％、４８．７％、及び７２．８％が記録されたので、有効であった。次に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＳＦ３７０  Ｃａｓ９タンパク質のバージョンをＮ末端及びＣ末端核局在化シグナル（ＮＬＳ）で発現するＣａｓ９  ｍＲＮＡを、ＧＦＰ遺伝子の配列を標的とする単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と共にＬＮＰに搭載した。この場合、ＧＦＰタンパク質を着実に発現するＧＦＰ−ＨＥＫ細胞を細胞モデルとして使用した。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ発現の良好なＣａｓ９媒介性ノックダウンを示すＧＦＰ−細胞を分析した。４８時間のインキュベーション後（リピドイド／ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ＝１０／１／１；［ｍＲＮＡ］＝［ｓｇＲＮＡ］＝０．８６μｇ  ｍＬ−１）、３つ試験ＬＮＰ全て（７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢ）が、この条件下で任意の明らかなＧＦＰノックアウトを誘導することができないことが判明した。ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ搭載７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰで処置されたＧＦＰ−ＨＥＫに対して記録されたＧＦＰ−細胞の割合は、それぞれ６．１％、７．７％、及び４．４％であった。これは、未処置の対照細胞のもの（７．０％）に匹敵する。図１４Ｄ及び１４Ｇに示されるように、ＧＦＰ、Ｃｒｅ、及びＣａｓ９  ｍＲＮＡ分子の細胞内送達結果は、ｍＲＮＡ／ＬＮＰの効果が、カーゴｍＲＮＡ分子により発現されるタンパク質の試験細胞型及び機能の両方に依存することを示した。これにより、本発明者らの以前の研究においてタンパク質送達に適用可能であることも判明した。
【０１４１】
さらに、細胞内送達用途における、新たに開発されたＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰライブラリーの可能性を実証するために、ゲノム編集のためのＣａｓ９  ｍＲＮＡ送達の改善のために、製剤最適化を調査した。この文脈では、２つの方策を試験し、すなわち、完全置換ではなく単一の尾部を有する新しいＯＣｈｏｌＢ尾部のリピドイドを合成し、完全置換ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰにヘルパー脂質（リン脂質）を添加する。以前に説明されたような同様のプロトコールに従って、最初に、単一尾部のリピドイド、７５−ＯＣｈｏｌＢ−１、７６−ＯＣｈｏｌＢ−１、及び７６−ＯＣｈｏｌＢ−１を合成し、ＥＳＩ−ＭＳで特性決定した（［７５−ＯＣｈｏｌＢ−１＋Ｈ］＋、７３６．５５；［７６−ＯＣｈｏｌＢ−１＋Ｈ］＋、７３４．６４；［７７−ＯＣｈｏｌＢ−１＋Ｈ］＋、７４８．７３）。次に、同じ超音波処理／ボルテックス手順を使用して、ナノ粒子を作製し、得られたＬＮＰをＤＬＳで測定した（７５−ＯＣｈｏｌＢ−１、＜Ｄｈ＞＝３０２．６ｎｍ、μ２／Г２＝０．３０；７６−ＯＣｈｏｌＢ−１、＜Ｄｈ＞＝２９４．５ｎｍ、μ２／Г２＝０．３０；７７−ＯＣｈｏｌＢ−１、＜Ｄｈ＞＝２５４．２ｎｍ、μ２／Г２＝０．３３）。最初に、ＨｅＬａ細胞に対してＧＦＰ  ｍＲＮＡを使用して、単一尾部のＬＮＰの送達効果を試験した（リピドイド／ｍＲＮＡ＝１０／１；［ｍＲＮＡ］＝０．８６μｇ  ｍＬ−１；２４時間の曝露）。ｍＲＮＡ／７５−ＯＣｈｏｌＢ−１、ｍＲＮＡ／７６−ＯＣｈｏｌＢ−１、及びｍＲＮＡ／７７−ＯＣｈｏｌＢ−１で処置されたＨｅＬａ細胞に対して、それぞれ、６９．４％、７２．５％、及び６８．９％のＧＦＰ＋細胞を決定した。Ｃｒｅ  ｍＲＮＡはまた、２４時間の曝露後に、細胞の８７．３％（ｍＲＮＡ／７５−ＯＣｈｏｌＢ−１）、８２．８％（ｍＲＮＡ／７６−ＯＣｈｏｌＢ−１）、及び８１．５％（ｍＲＮＡ／７７−ＯＣｈｏｌＢ−１）をＤｓＲｅｄ＋であると決定したので、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞に効率的に送達することができる（図１４Ｇ）。しかし、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ複合化単一尾部のＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰはまた、ＧＦＰ−ＨＥＫ細胞に対してわずかなＧＦＰノックアウトを誘導することが判明した。単一尾部のＯＣｈｏｌＢリピドイドは、ＧＦＰ及びＣｒｅ  ｍＲＮＡに関して、同等またはわずかに高い送達効果を示したが、２つの尾部の対応物と同様に、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ送達に失敗した。次に、本発明者らは、元の２つの尾部のＯＣｈｏｌＢリピドイドナノ粒子製剤にヘルパー脂質を添加しようとした。概念実証として、ＤＯＰＥをＯＣｈｏｌＢリピドイドと混合し（リピドイド／ＤＯＰＥ＝１／１、重量比）、ナノ粒子を作製し（７５−ＯＣｈｏｌＢ−Ｆ、７６−ＯＣｈｏｌＢ−Ｆ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢ−Ｆと表され）、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを搭載した（ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ＝１／１、重量比）。図１４Ｈに示されるように、４８時間の曝露後（ＯＣｈｏｌＢリピドイド／ｍＲＮＡ＝１０／１；［ｍＲＮＡ］＝０．８６μｇ  ｍＬ−１）、７６−ＯＣｈｏｌＢ−Ｆは、未処置の（６．３％）及びネイキッドＣａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡで処置された（５．６％）細胞と同様のＧＦＰ−の割合（６．４％）を示した。しかし、細胞の１５．３％及び１２．９％がＧＦＰ−であると判定されたように、７５−ＯＣｈｏｌＢ−Ｆ及び７７−ＯＣｈｏｌＢ−Ｆで処置されたＧＦＰ−ＨＥＫ細胞について、ＧＦＰノックアウト細胞の量の増加が記録された。これらの結果は、ナノ粒子製剤の最適化が、性能の改善を達成するための有効な方策であり得ることを示した。全体的に、ｍＲＮＡ搭載ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰのＧＦＰノックアウト効果は、本発明者らが以前に報告したリボ核タンパク質（ＲＮＰ）送達結果と比較した場合に、比較的低いことが認められたが；さらなる分子設計（例えば、コンビナトリアルライブラリーを拡大するカチオン性アミン頭部基の新しいタイプを組み込むこと）ならびに超分子構造の最適化（例えば、種々の種のスクリーニングならびに賦形剤の組成、カーゴ／担体比の最適化、及び曝露期間のようなインキュベーション条件、及び投薬量）により、最適化された細胞内送達及びその後のゲノム編集性能を予想することができる。
【０１４２】
実施例１２：ゲノム編集タンパク質の細胞内送達。
タンパク質及びペプチドベースの治療法は、特異性が比較的高く、オフターゲット効果が低いため、過去３０年間に多大な注目を集めている。がん、感染症、炎症、及び変性疾患の処置のための製剤が開発されている。タンパク質及びペプチドの有効な細胞内送達方法はさらに、それらの治療法を拡大し得る。ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用したタンパク質の細胞内送達が、カーゴとしての（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質及び蛍光レポーターとしてのＧＦＰを使用して、以前の内在化研究においてうまく実証されており、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞株及び蛍光レポーターとしてのＤｓＲｅｄタンパク質を使用して、機能性研究を実行した。
【０１４３】
この文脈では、最初に、本発明者らが以前に報告した手順に従って、種々のエンドサイトーシス阻害剤、すなわち、スクロース（クラスリン媒介性エンドサイトーシス阻害剤）、メチル−β−シクロデキストリン（Ｍ−β−ＣＤ、コレステロール枯渇剤）、ダイナソール（ダイナミンＩＩ阻害剤）、及びナイスタチン（カベオリン媒介性エンドサイトーシス阻害剤）を誘導することにより、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ複合体の内在化機序を研究した。図１５Ａに示されるように、３つ全ての試験タンパク質／ＬＮＰ（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）の内在化効率（［リピドイド］＝６．６μｇ  ｍＬ−１、［（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ］＝１００ｎＭ；曝露期間＝６時間）は、スクロース及びダイナソールで有意に抑制された。他方では、Ｍ−β−ＣＤ及びナイスタチンは、これらのナノ粒子の細胞取り込みの明らかな抑制を誘導しなかった。これは、クラスリン及びダイナミンがこれらの（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質複合化ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの細胞取り込みに重要な役割を果たすことを示す。他のコンビナトリアルライブラリー研究と比較すると、同じカーゴが搭載され、同じ細胞株に対して試験されたとしても、種々の化学構造を有する種々のリピドイドは、非常に異なる経路を介して内在化することができることが明らかである。次に、２４時間のインキュベーション後に、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰのゲノム編集効率をフローサイトメトリーで測定した（８時間の（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ複合体曝露で）。３つの異なる濃度のタンパク質／リピドイド複合体（２５ｎＭ／１．７μｇ  ｍＬ−１、５０ｎＭ／３．４μｇ  ｍＬ−１、及び１００ｎＭ／６．６μｇ  ｍＬ−１）を、各リピドイドナノ粒子について試験した。図１５Ｂに示されるように、ネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質は、タンパク質濃度に関係なく、わずかなゲノム編集効果を誘導するが、Ｌｐｆ２ｋを含む全ての試験ナノ粒子は、用量依存的なＤｓＲｅｄ＋細胞パーセンテージパターンを示し、すなわち、より高いタンパク質濃度は、より高いゲノム編集及びＤｓＲｅｄ発現レベルと相関する。３つの脂質、すなわち、８７−ＯＣｈｏｌＢ、９０−ＯＣｈｏｌＢ、及び３０４−ＯＣｈｏｌＢは、送達時に効率が低いことが判明した（ＮＲ及びｍＲＮＡ送達に対して非効率的であることも示される）。他の全ての完全置換ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰ（７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、７７−ＯＣｈｏｌＢ、７８−ＯＣｈｏｌＢ、８０−ＯＣｈｏｌＢ、及び８１−ＯＣｈｏｌＢ）は、陽性対照であるＬｐｆ２ｋと同等のまたはそれよりはるかに高いＤｓＲｅｄ＋細胞を示した。例えば、ＤｓＲｅｄ＋細胞は、２５、５０、及び１００ｎＭのタンパク質濃度で、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢに対して、それぞれ、１０．５％／２４．９％／８８．９％、１３．５％／５５．４％／８８．８％、及び２７．７％／４７．８％／９４．７％と記録された。特に、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの６つ（７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−��ＣｈｏｌＢ、７７ＯＣｈｏｌＢ、７８−ＯＣｈｏｌＢ、８０−ＯＣｈｏｌＢ、及び８１−ＯＣｈｏｌＢ）は、１００ｎＭの（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅで試験した時、Ｌｐｆ２ｋを上回り、これは、さらに、新たに開発されたＬＮＰの利点を示した。さらに、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋ、及びネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ）で処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルは、図１５Ｃに示され、ナノ粒子系送達システムに対して、ＤｓＲｅｄ蛍光シグナル強度の増強が観察され、これは、図１５Ｂに示される結果と一致する。次に、ＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞に対する種々の濃度の（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋ、及びネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅの細胞毒性プロファイルは、２４時間のインキュベーション後に、ＭＴＴアッセイを使用して測定される（８時間の曝露；（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ＝２５ｎＭ／１．７μｇ  ｍＬ−１、５０ｎＭ／３．４μｇ  ｍＬ−１、及び１００ｎＭ／６．６μｇ  ｍＬ−１）。図１５Ｄに示されるように、一般に、試験された全試料について、より高い（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ濃度は、より低い細胞生存率を誘導した。タンパク質が搭載された完全置換ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの９つ全てが、比較的高い細胞生存率を示した。（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７５−ＯＣｈｏｌＢで処置された細胞では、２５、５０、及び１００ｎＭのタンパク質濃度の生存率は、それぞれ、９５．５％、９１．８％、及び８３．１％であると決定し；（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢの数値は、９７．８％／９８．２％／９７．２及び１００．９％／９６．６％／９８．６％である。（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載７８−ＯＣｈｌＢ、８０−ＯＣｈｌＢ、及び３０４−ＯＣｈｌＢで処置された細胞は、１００ｎＭのタンパク質で７９．１〜８１．４％の生存率を示したが、他の全ての試料は、試験条件下でＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞に対して非毒性であることが実証された。際立って対照的に、Ｌｐｆ２ｋは、同じ条件下で細胞毒性を示し、２５ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭの（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ濃度で、それぞれ、細胞生存率５８．９％、５６．７％、及び５１．２％を決定した。一方で、種々のナノ粒子製剤で処置されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞の形態変化を研究し、結果が、図１５Ｅに示される。ＧＦＰ  ｍＲＮＡ搭載Ｌｐｆ２ｋで処置されたＨｅＬａ細胞（図１４Ｆ）と同様に、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋに曝露されたＨｅＬａ−ＤｓＲｅｄ細胞は、不健康で収縮していたことが明らかであるが；ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰ（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７５−ＯＣｈｏｌＢ、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７７−ＯＣｈｏｌＢ）で処置されたものは、未処置の及びネイキッドタンパク質で処置された対照群と比較して影響が少なかった。次に、図１��Ｆに示されるように、全ての試験条件（３つの異なる濃度で１１の試料）について、ＤｓＲｅｄ＋細胞パーセンテージを、対応する細胞生存率に対してプロットした。点線は、それぞれ、細胞生存率８０％及びゲノム編集効果５０％（ＤｓＲｅｄ＋細胞の割合）表す。左上象限にある試料は、無毒で、送達には非効率的であり；左下象限の試料は、有毒で、非効率的であり；右下象限の試料は、効率的であるが毒性があり；右上象限の試料は、非毒性で、効率的であり、これは、さらなる研究の最有力候補となるであろう。高濃度のＬｐｆ２ｋ（点線の紫色の円で示される）は、ゲノム編集には比較的効率的であるが、標的細胞にも毒性があることは明らかである。他方では、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ搭載ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰのほとんどは、ネイキッド（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質と同様に、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／Ｌｐｆ２ｋと比較した場合、ほとんど非毒性である。８７−ＯＣｈｏｌＢ、９０−ＯＣｈｏｌＢ、及び３０４−ＯＣｈｏｌＢ（点線濃青色円で示される）は、ゲノム編集効率が低いが；７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢ（点線緑色円で示される）を使用することにより、高いゲノム編集効果及び優れた忍容性を達成した。とりわけ、これらの結果は、新たに開発されたＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰがｉｎ  ｖｉｔｒｏゲノム編集用のＣｒｅリコンビナーゼタンパク質送達のための非常に効率的で安全なナノキャリアとして機能し得ることを示した。
【０１４４】
実施例１３：ｉｎ  Ｖｉｖｏ毒性研究。
ブランク（図１０Ｅ及び１３Ｃ）とカーゴ（ＧＦＰ  ｍＲＮＡ及びゲノム編集タンパク質）搭載（図１４Ｅ及び１５Ｄ）ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの両方は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで比較的高い生体適合性を示した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用する血清生化学的試験を通じて、体重変化ならびに腎臓及び肝臓の生物学的機能を測定することにより、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性をさらに調査した。１日目及び５日目に、４−６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に、ブランク７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを尾静脈経由で注射した（各注射に対して５０μｇのＬＮＰ）。体重を１４日間監視し、１４日目に、血液を収集及び分析した。図１６Ａに示されるように、未処置の対照群と比較して、ＬＮＰ（７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、及び７７−ＯＣｈｏｌＢ）が注射されたマウスの体重は、研究全体にわたってわずかな差異を示した。ＬＮＰが注射されたマウスのクレアチニン、尿素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清濃度は、対照マウスと非常に類似していた（図１６Ｂ）。
【０１４５】
これらの結果は、これらのＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰが、試験条件下で全身投与により有意な体重変化を誘発するか、または臓器損傷を引き起こさないことを示した。これは、これらのＬＮＰがｉｎ  ｖｉｖｏ送達目的の安全な担体として使用することができることを示す。
【０１４６】
実施例１４：ゲノム編集のためのｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質及びｍＲＮＡ送達。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム及びトランスジェニックＡｉ１４マウスモデルをｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集研究で使用した。図１７Ａに示されるように、このマウスモデルは、赤色蛍光タンパク質であるｔｄＴｏｍａｔｏの転写を防止する、遺伝的に統合されたｌｏｘＰ隣接ＳＴＯＰカセットを有する。Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性遺伝子再編成が生じた時、ＳＴＯＰカセットを除去して、蛍光ｔｄＴｏｍａｔｏレポータータンパク質の発現を生じさせ得る。
【０１４７】
（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質及びＣｒｅ  ｍＲＮＡ搭載７６−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用する、筋肉内注射（ＩＭ注射、後脚）による局所送達（図１７Ｂ）。Ａｉ１４マウス（ｎ＝３）は、１日目に（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰの単回用量（５０μｇのタンパク質）またはｍＲＭＡ／ＬＮＰ（１０μｇのｍＲＮＡ）注射を受け、１０日目に死亡させた。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現解析のために、骨格筋を、収集、固定、凍結切断、及びイメージングした（実験セクションを参照のこと）。図１７Ｄ及び１７Ｅ（青色チャネル、ＤＡＰＩ；赤色チャネル、ｔｄＴｏｍａｔｏ）に示されるように、未処置の対照筋肉とは対照的に、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／ＬＮＰ及びｍＲＮＡ／ＬＮＰの両方が注射された筋肉の強いｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光シグナルが記録された。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の大部分は、ｍＲＮＡ／ＬＮＰの対応物よりも、タンパク質／ＬＮＰが注射された筋肉試料で見出された。
【０１４８】
全身投与経路を介してｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子編集をうまく誘導し得る場合、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰをさらに調査した。最初に、Ａｉ１４マウス（ｎ＝３）に、１日目及び５日目に（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質搭載ＬＮＰを尾静脈経由で（静脈内（ＩＶ）注射）注射した（各注射に対して５０μｇのタンパク質、合計１００μｇ）、次に、分析のために１４日目に死亡させた（図１７Ｃ）。この場合、図１７Ｆに示されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効であることが実証されている上位ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの５つ、すなわち、７５−ＯＣｈｏｌＢ、７６−ＯＣｈｏｌＢ、７７−ＯＣｈｏｌＢ、７８−ＯＣｈｏｌＢ、８０−ＯＣｈｏｌＢを試験した。各群から心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓を収集して分析した。図１７Ｆに示されるように、（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／８０−ＯＣｈｏｌＢ及び（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅ／７６−ＯＣｈｏｌＢが注射されたＡｉ１４マウスの肺及び脾臓で、それぞれ、相対的に高いゲノム編集効果を達成した。ほとんどの静脈内ナノ治療薬と同様に、尾静脈経由で注射された（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質複合化ＯＣｈｏｌＢナノ粒子は、最初に心臓に、そこから肺に直接移動するであろう。ナノ粒子製剤（血清タンパク質と複合化していることがある）は、肺の毛細血管床の血管系構造中に容易に補足されて、肝臓、脾臓、及び他の臓器へのＬＮＰの再分布を遅延または阻害することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの輸送及び再分配プロセス中に、タンパク質搭載ＬＮＰの一部は、肺または脾臓の細胞にうまく入り、正常ゲノム編集及びｔｄＴｏｍａｔｏ発現カスケードを誘導し得る。カーゴタンパク質及び担体ＬＮＰの分解、凝集、及び／または免疫細胞の隔離が劇的に低減させるか、またはおそらくゲノム編集イベントをさらに妨げるであろう。それにもかかわらず、８０−ＯＣｈｏｌＢ及び７６−ＯＣｈｏｌＢは、全身投与によるｉｎ  ｖｉｖｏでの肺及び脾臓への（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質送達に、それぞれ効率的であることが実証された。
【０１４９】
次に、類似の静脈内注射プロトコールを使用して、ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ全身ｍＲＮＡ送達を試験した（図１７Ｃ）。１日目及び５日目に、Ｃｒｅ  ｍＲＮＡ搭載７６−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを注射し（各注射に対して１０μｇのｍＲＮＡ；合計２０μｇ）、マウスを１４日目に死亡させた。全ての主要な臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）を収集して分析した。図１７Ｇに示されるように、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の有意な量は、脾臓で記録され、陽性シグナルは、他の臓器中に見出されなかった。（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質及びＣｒｅ  ｍＲＮＡ搭載７６−ＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰの両方は、ゲノ無編集を誘導したことが認められ、これは、担体リピドイドが、送達系全体の代謝及び生体内分布を影響を与え得ることを示した。全体的に、全身投与されたナノ粒子（（−３０）ＧＦＰ−Ｃｒｅタンパク質及びＣｒｅ  ｍＲＮＡ搭載ＬＮＰの両方）のゲノム編集効果は、局所注射よりもはるかに低くみえた。これは、静脈を介して注射された製剤がはるかに多くの物理的及び生化学的障壁に遭遇するので理解できる。しかし、それは、全身投与がヒト状態または疾患の処置に幅広い可能性を提供するので、依然として追求する価値がある。とりわけ、これらのｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集の結果は、ナノキャリアとしてＯＣｈｏｌＢ  ＬＮＰを使用して、ゲノム編集目的で全身及び局所の両方の投与経路を介して、ｍＲＮＡ同様に機能タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで送達する可能性を示唆した。
【０１５０】
材料及び方法
概要
リピドイド合成に使用される化学物質であるアムホテリシンＢならびに肝毒性及び腎毒性の評価に使用される市販のキットをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００アミン）をアバンティに注文した。１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、ＨＥＫ２９３細胞を培養した。ＡｍＢナノ粒子の流体力学的サイズ及び多分散性指数（ＰＤＩ）を、Ｚｅｔａ−ＰＡＬＳ粒径分析器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。ＡｍＢカプセル化物の濃度、ＲＢＣ溶血、及び細胞生存率をｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅマイクロプレートリーダーで測定した。ＡｍＢカプセル化物を凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）で凍結乾燥した。ヒト全血を、Ｒｅａｓｅｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ＬＬＣに注文した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの株（ＳＣ５３１４）を、Ｔｕｆｔｓ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｅｎｔｅｒの分子生物学及び微生物部門のＣａｒｏｌ  Ａ．Ｋｕｍａｍｏｔｏ教授の研究室から入手した。組織試料（１００ｍｇ）をＢｅａｄＢｕｇマイクロチューブホモジナイザー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で粉砕した。ＡｍＢの血漿及び組織濃度を、Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの化学学科の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００）で測定した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６−８週齢、体重２０〜３０ｇ）及び雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（８〜１０週齢、体重２００〜２５０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒに注文した。この研究の動物プロトコールは、Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）に承認され（Ｂ２０１８−７３）、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は全て、承認された動物ケアガイドラインに基づいて実施された。
【０１５１】
ＡｍＢナノ粒子の調製。
ＡｍＢカプセル化物を以下の通り調製した：要約すると、１ｍｇの各リピドイドを、既に３００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた１ｍｇのＡｍＢと混合した。混合物を３０分間超音波処理し、次に、それぞれが完全に溶解するまで、１０分間ボルテックスした。次に、ＡｍＢナノ粒子を、エタノールに溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＥ−ＰＥＧを１：６．８のモル比（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ対リピドイド）と共に製剤化した。対照群として、ＡｍＢナノ粒子を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧと共に製剤化しなかった。７００ｒｐｍで連続的に均質化しながら、６００μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を含有するガラス瓶に、各溶液を滴下した。次に、透析バッグ（ＭＷＣＯ：３５００Ｄａ）を４時間使用して、蒸留水に対して溶液をさらに透析し、６００ｒｐｍ／分の撹拌速度でＤＭＳＯ及び酢酸ナトリウム緩衝液を除去した。ＡｍＢカプセル化物を２ｍｌのガラス瓶に移して、２週間の視覚的な透明性を観察した。記録されたデータは、独立して実施された３つの実験の平均である。
【０１５２】
安定性及び粒径
ＡｍＢナノ粒子の安定性を評価するために、１及び２週間のエンドポイントに、粒径及びＰＤＩを動的光散乱（ＤＬＳ）で分析した。数のサイズ分布に基づいて、平均サイズ（ｎｍ）及びＰＤＩを決定した。測定前に、ＡｍＢナノ粒子を脱イオン水中に１０倍希釈で分散させた。同じ条件で、試料当たり６０ｓの３回の実施を、９０°の検出角度で行った。全てのナノ粒子を調製し、３回ずつ測定した。
【０１５３】
薬物搭載含有量
搭載されたＡｍＢの量を定量するために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅで、ＤＭＳＯに溶解させた種々のＡｍＢ濃度（０．００１〜１．０ｍｇ／ｍＬ）の吸光度を研究することにより、ＡｍＢ濃度の回帰検量線を計算した。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルのために、３００〜４５０ｎｍの範囲の波長を選択した。ＤＭＳＯにナノ粒子を溶解させることにより、リポソームにカプセル化されたＡｍＢの量を測定し、次に、波長３９２ｎｍでの吸光度を測定した。線形回帰検量線、次に、以下の等式：薬物搭載含有量（％）＝Ｗ搭載×１００／Ｗポリマー＋Ｗ搭載（式中、Ｗ搭載は、カプセル化後にリポソーム中に搭載されたＡｍＢの重量であり、Ｗポリマーは、リピドイドの重量である）に従って、ＡｍＢの薬物搭載含有量（ＤＬＣ）を計算した。記録されたデータは、独立して実施された３つの実験の平均である。
【０１５４】
ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ抗真菌活性
酵母の培養液希釈抗真菌感受性試験のための標準的方法に従って、最小阻止濃度（ＭＩＣ）及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＳＣ５３１４）株を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡｍＢカプセル化物の抗真菌効果を試験した。要約すると、酵母をサブローデキストロース寒天（ＳＤＡ）プレート上で成長させ、水に接種して、１〜５×１０６の酵母細胞／ｍＬの最終接種濃度を得た。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞懸濁液を、ＲＰＭＩ−ＭＯＰＳ成長培地中に１：２０で希釈し、１００μｌを０．１２５〜３２μｇ／ｍＬ及び０．１０９３７５μｇ／ｍＬ〜１４．０μｇ／ｍＬの範囲の連続濃度のＡｍＢを含有するマイクロリットルのトレイに分注した。薬物不含培地及び接種物を含有する３つのウェルを、陽性対照及び陰性対照として使用した。接種させたプレートを３５℃で４８時間インキュベートした。各ウェル中の成長を、２４時間及び４８時間で視覚的に推定した。ＭＩＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの視覚的な成長を妨げるＡｍＢの最低濃度であると記録され、μｇ／ｍＬで表された。記録されたデータは、独立して実施された３つの実験の平均である。
【０１５５】
ヒト赤血球の溶血試験
最適化されたＡｍＢカプセル化物をスクリーニングするために、高用量のＡｍＢカプセル化物が、毒性評価に必要とされた。ＡｍＢカプセル化物を凍結防止剤で凍結乾燥し、次に、濾過された脱イオン水で適切な容量に再構成し、続いて、振とうして、均質なリポソーム分散液を得た。上述のように溶血を実施した。６±２℃で保存された健康なボランティアから入手した静脈血。全血を遠心分離し（１６００×ｇで３０分）、上清をピペッティングして、廃棄した。次に、ＲＢＣをｐＨ７．４の等張ＰＢＳで３回洗浄し、２％の貯蔵液で、ＰＢＳ中に細かく分散させた。続いて、９０μｌのＲＢＣ懸濁液を、種々のＡｍＢカプセル化物、遊離ＡｍＢ、及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）を含有するＰＢＳ  １０μｌと３回混合した。最終のＡｍＢの濃度は、全てのナノ粒子中に、それぞれ、２００、１００、５０、及び２５μｇ／ｍＬであった。次に、各試料を３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、溶血を停止させ、溶解しなかったＲＢＣを遠心分離（５０００ｘｇで５分）で除去した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅで、５４０ｎｍでのヘモグロビンの吸収を読み取ることにより、溶血の程度を決定する分析のために、上清を収集した。溶血（％）＝（Ａｂｓ−Ａｂｓ０）×１００／（Ａｂｓ１００−Ａｂｓ０）（式中、Ａｂｓは、ＡｍＢカプセル化物の吸光度であり、Ａｂｓ１００は、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００試料で処理された１００％の溶解試料の吸光度であり、Ａｂｓ０は、ＰＢＳで処理された未溶解試料の吸光度である。
【０１５６】
哺乳動物細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性
ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞を使用して、ＡｍＢカプセル化物の細胞生存率を評価した。細胞をウェル当たり５×１０３の細胞で９６ウェル組織培養プレートに移し、薬物処置前に３７℃で２４時間インキュベートし、これは、種々の濃度のＡｍＢカプセル化物、遊離ＡｍＢ、及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（ＡｍＢ２００、１００、５０、及び２５μｇ／ｍＬに相当する）を含有する。３０μＬのＭＴＴ貯蔵液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。培地を捨てた後、２００μｌのＤＭＳＯを添加して、ＭＴＴから変換された青色ホルマザン結晶を溶解させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅで、５７０ｎｍでの吸光度を測定することにより、細胞生存率を評価した。細胞生存率は、以下の等式：細胞生存率（％）＝Ａｂｓｔ／Ａｂｓｃ×１００％（式中、Ａｂｓｔは、薬物処置ウェルの吸光度であり、Ａｂｓｃは、薬物処置なしの対照の吸光度である）を使用して、薬物処置なしの対照ウェルから得られた吸光度で計算されたパーセンテージとして表された。
【０１５７】
薬物動態分析研究
この実験では、６匹の雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットは、水の入手は自由にして約１２時間一晩絶食させ、２群に無作為に分けた。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）の最大耐量（ＭＴＤ）が２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇであることを考慮して、スクリーニングされたＡｍＢカプセル化物またはＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のいずれかを、ラットに、ＡｍＢ  ２ｍｇ／ｋｇに相当する単回用量で尾静脈経由で静脈内投与した。各群の血液試料（約０．５ｍｌ）を、投与後の各時点（１０、３０分間、及び１、２、４、６、８、１２、２４、３６時間）で、眼窩穿刺によりヘパリン処理チューブ中に収集した。各血液試料を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血漿をＡｍＢ濃度の決定のために収集した。２部のメタノールを１部の血漿に添加した。混合物を５分間ボルテックスし、続いて、遠心分離した（１３０００ｇ、４℃、及び３０分）。上述のように、上清をＨＰＬＣ用に収集した。各試料のＨＰＬＣ分析を、モジュール式液体クロマトグラフシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ（商標））で実施した。移動相は、アセトニトリル及び１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０（４０：６０、ｖ／ｖ）で構成され、流速は、１ｍＬ／分に維持した。４．６×１００ｍｍ、３．５μｍサイズのｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  Ｃ１８逆相カラムで、化合物を分離させた。ＡｍＢの相対保持時間は、４分であった。流出液を、４０８ｎｍで監視した。血漿ＡｍＢ濃度を線形回帰検量線から計算した。Ｚｈａｎｇにより設計されたＰｋｓソフトウェアの非コンパートメント薬物動態分析を使用して、ＡｍＢ血漿中濃度対時間データを評価した。
【０１５８】
組織生体内分布試験
組織分布研究のために、２４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを４群（ｎ＝６）に無作為に分けた。３つの群に、それぞれ、１０ｍｇ、５ｍｇ、２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの単回用量で、スクリーニングされたＡｍＢカプセル化物を尾静脈経由で注射した。１つの群に、２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの単回用量でＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）を静脈内注射した。各群の３匹のマウスをＣＯ２吸入で死亡させ、組織（肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、及び脳）を、それぞれ、投与の４８時間及び７２時間後に取り出し、それらがさらに処理されるまで−８０℃に維持する。組織試料（１００ｍｇ）を粉砕し、ＢｅａｄＢｕｇ組織ホモジナイザー（２分、４０００ｒｐｍ）で、高速で２００μｌのＤＩ水で均質化した。２部のメタノールを１部のホモジネートに添加した。得られた混合物を、２分間ボルテックスし、続いて、遠心分離した（１３０００ｇ、４℃、及び３０分）。ＨＰＬＣ分析用に、薬物動態分析と同じ方法で、上清を使用した。
【０１５９】
肝毒性及び腎毒性試験
１５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを５群（ｎ＝３）に無作為に分けた。３つの群に、それぞれ、１０ｍｇ、５ｍｇ、２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの単回用量のスクリーニングされたＡｍＢカプセル化物を尾静脈経由で注射した。１つの群を、２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの単回用量のＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）を用いる同じ方法で投与した。対照群にＰＢＳを注射した。注射の４８時間及び７２時間後に、血液試料（約０．２ｍＬ）を下顎静脈穿刺により収集し、４℃で凝固させ、次に、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、血清を収集する。腎臓及び肝臓の生化学的パラメータを、製造者のガイドラインに従って実施して、クレアチニン（Ｃｒ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む腎毒性及び肝毒性調査を分析した。濃度を各キットの回帰検量線に基づいて計算した。
【０１６０】
統計分析
平均±標準偏差（ＳＤ）として表された全てのデータ。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐｒｉｓｍ７．０  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．米国カリフォルニア州）を使用して、３群以上を比較するための二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いて、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較検定、及び２群を比較するためのｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定で、群間の差異を評価した。差異は、ｐ＜０．０５の時に、有意であるとみなされた。一方、凡例に記載される対照群に対して、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００１。
【０１６１】
実施例１５：ＡｍＢリピドイドカプセル化物の最適化及び安定性評価
ＡｍＢは、水性及び有機溶媒に可溶でない。生理学的ｐＨでの水溶性は、１ｍｇ／Ｌ未満である。両親媒性の特性は、効率的で経済的な送達の課題とした。両親媒性の特徴は、ラクトン環の無極性側及び極性側から生じるが、両性特性は、イオン化可能なカルボキシル基及びアミン基の存在によるものである（図１８ａ）。最初に、ＡｍＢを種々のリピドイド７５−Ｏ１４Ｂ、７８−Ｏ１４Ｂ、または８７−Ｏ１４Ｂで製剤化し、不透明な懸濁液を得たが、全てが、図２に示されるように１週間未満に沈殿した。粒径は、劇的に増加した。ＰＤＩは、２週間の終わりに０．７超まで増加する。言うまでもなく、粒径は、薬物動態及び毒性に重要な役割を果たす。直径が１００ｎｍを超える粒径が、血漿タンパク質と容易に相互作用するので、ＲＥＳで容易に認識し、Ａｍｐｈｏｃｉｌ（登録商標）などの血液からより迅速に排除することができる。しかし、粒径が小さすぎると、糸球体濾過及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）などの薬物腎排泄を増加させ得る。ナノ粒子の最適化可能なサイズは、５０〜１００ｎｍである。
【０１６２】
溶解性及び安定性を増加させるために、ＡｍＢを、ＤＳＰＥ−ＰＥＧと共に製剤化したか、またはＱＬＤｓにカプセル化した。その結果、ナノ粒子は、より明確な黄色がかった半透明の溶液で、より優れた薬物溶解性を実証したが、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００で製剤化された時に、依然として、わずかに濁っていた（図１９）。２週間の終わりに、粒径は、５００〜９００ｎｍに増加し、ＰＤＩは、０．５超に増加した（図２０ａ及び２０ｂ）。しかし、ＡｍＢをＱＬＤｓで搭載した時、均質な透明な黄色溶液を得、次の２週間、安定したままであった（図２）。粒径を、１００〜１６０ｎｍに減少させたが、依然として、ナノ粒子の最適化可能なサイズよりも少し大きい（図２０ａ及び２０ｂ）。それ故、本発明者らはさらに、ＱＬＤと共にＤＳＰＥ−ＰＥＧを製剤化した。ＡｍＢ／Ｑ７５−Ｏ１４Ｂ−Ｆ及びＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆの粒径は、７０〜１００ｎｍに減少した（図２０ａ）。ＡｍＢ／Ｑ８７−Ｏ１４Ｂ−Ｆの粒径が少し高かった（１１０〜１２０ｎｍ）が、依然として、ＡｍＢ／Ｑ８７−Ｏ１４Ｂと比較して減少した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧで製剤化されたまたは製剤化されていない４級化リポソーム小胞は全て、２週間後であっても、均質であり、調製後の粒径及びＰＤＩに関して性質が似ていた（図２０ｂ）。
【０１６３】
ＱＬＤ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧは、安定したＡｍＢカプセル化物の形成を可能にし、ＡｍＢが脂質二重層間に挿入された、より小さな凝縮構造の生成を促進した（図１８ａ）。リポソームの安定性は、構造に含有されリン脂質分子の性質に依存した。ＱＬＤは、より高い溶解性、より簡単で経済的なコンビナトリアル合成、及びより高い送達効率を特徴とする２つの４級化アミン頭部を有し、これは、ＱＬＤを魅力的なものにする。ＰＥＧは、生体適合性であるが、水溶性ＡｍＢ複合体には、大量が必要である。ＱＬＤは、ＡｍＢ溶解度特性を増加させ、１：６．８のＰＥＧ対リピドイドのモル比を有するＤＳＰＥ−ＰＥＧの量を減少させた。ＴＨＦに溶解させて、過剰量のヨウ化メチルと暗所室温で一晩反応させることにより、リピドイドを４級化した。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄して、次に、真空で乾燥させた（図１８ａ）。本明細書で記載のＡｍＢカプセル化物の別の優れた態様は、Ａｍｂｉｓｏｍｅ（登録商標）と比較して、より安価な賦形剤及びより容易な調製である。Ａｍｂｉｓｏｍｅ（登録商標）は、牛海綿状脳症／伝染性海綿状脳症の薬剤及び関連する分析手順のために、注射可能な適正製造基準（ＧＭＰ）グレードのコレステロールを用いて製剤化されており、これにより、最終製品が高価になる。
【０１６４】
実施例１６：薬物搭載含有量
以前に報告されるように、ＤＭＳＯに溶解したＡｍＢは、ＵＶ範囲で３つの主要な分光光度ピークを示した。ＡｍＢ濃度を３９２ｎｍでの適切に希釈した比の吸光度で測定し、０．９９８５と同等の相関係数を用いる検量線で計算した。ＡｍＢカプセル化物のＤＬＣは、３８．９〜４９．９％であり、図２１ａに示されるように、リポソームとのＡｍＢの優れた会合が示された。ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆは、これらのカプセル化物の中で約４９．９％の最高のＤＬＣを示した。極性及び分配係数に依存するＤＬＣ効率は、リポソーム膜における局在を決定した。ＡｍＢが両親媒性であるので、水−脂質界面に隣接するアシル炭化水素鎖に属する（図１８ａ）。
【０１６５】
実施例１７：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗真菌活性
ＡｍＢは、真菌細胞膜中のエルゴステロールに高い親和性を有し、細孔形成、細胞間イオンの漏出、最終的に、真菌細胞死がもたらされる。２４及び４８時間のインキュベーションを用いるＭＩＣ試験は、酵母菌株Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＳＣ５３１４）に対する遊離ＡｍＢ及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）と比較した場合、全てのＡｍＢカプセル化物のＭＩＣが低いことが示された（図２１ｂ）。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のＭＩＣは、０．８７５μｇ／ｍＬであり、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して、４８時間のインキュベーション後の遊離ＡｍＢは、１．７５μｇ／ｍＬであった（図２１ｂ）。全てのＡｍＢカプセル化物の中では、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆは、最も低いＭＩＣ（０．２９±０．１３μｇ／ｍＬ）を示し、これは、図２１ｂに示されるように、遊離ＡｍＢのほぼ６分の１であり、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）の３分の１であった（ｐ＜０．０５）。４級アミノ基に特徴的な構造は、真菌細胞膜におけるＡｍＢ濃度の増加及びＡｍＢとの相乗的な抗真菌効果により、より高い抗真菌効果に寄与し得る。
【０１６６】
実施例１８：ヒト赤血球（ＲＢＣ）の溶血試験
ＡｍＢカプセル化物の毒性を評価するために、種々の濃度のＡｍＢにより誘導される溶血を、遊離ＡｍＢ及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）と比較した。遊離ＡｍＢは、１００及び２００μｇのＡｍＢ／ｍＬで、それぞれ、ほぼ８０．６９±２．３９％及び１０２．４７±１．０４％の溶血を示した（図２２ａ）。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）は、同じ濃度のＡｍＢで、ほぼ５２．０５±９．８３％及び６８．８４±１０．２８％の溶血を示した。図２２ａに示されるように、ＡｍＢカプセル化物の溶血特性は、ＡｍＢ／Ｑ７５−Ｏ１４Ｂ−Ｆカプセル化物を除いて、２００μｇのＡｍＢ／ｍＬまでは、ほとんど影響を受けなかった。これは、２００μｇのＡｍＢ／ｍＬで２１．３９±３．５８％を示す（ｐ＜０．０５）。従って、二重層の単層から放出されたＡｍＢは、ミセル製剤よりも低かったので、ＡｍＢカプセル化物は、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）よりも血液毒性が低かった。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のミセルは、脂質二重層に比べて比較して、比較的弱い障壁があり、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）の薬剤は、ＡｍＢカプセル化物よりも入手しやすく、ヘモグロビン及びカリウムの漏出が早くなる。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）の溶血が増加する別の理由は、界面活性剤として作用するデオキシコール酸ナトリウムの構成成分が、溶血自体を誘導し得ることである。
【０１６７】
実施例１９：哺乳動物細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性
図２２ｂは、２５〜２００μｇのＡｍＢ／ｍＬの範囲の濃度のＡｍＢカプセル化物、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）、及び遊離ＡｍＢの細胞生存率を示す。遊離ＡｍＢ及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）は、低濃度でも、２４時間のインキュベーション後にのみ、ＨＥＫ２９３に対して明らかな細胞毒性を示した。ＱＬＤと共に製剤化された後、ＡｍＢ／（Ｑ７５−Ｏ１４Ｂ，Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ，Ｑ８７−Ｏ１４Ｂ）カプセル化物の細胞生存率は、ＡｍＢ／（７５−Ｏ１４Ｂ，７８−Ｏ１４Ｂ  ８７−Ｏ１４Ｂ）−Ｆカプセル化物と比較して、わずかに減少した。同時に、全てのＡｍＢナノ粒子の細胞生存率は、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）及び遊離ＡｍＢと比較した場合、劇的に増加した（ｐ＜０．０５）。ＤＳＰＥ−ＰＥＧで製剤化した後、ＡｍＢ／（Ｑ７５−Ｏ１４Ｂ，Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ，Ｑ８７−Ｏ１４Ｂ）−Ｆカプセル化物の細胞生存率は、２００μｇのＡｍＢ／ｍＬまでは、７０〜８０％のままであった。これはおそらく、生体適合性であり比較的毒性のないＤＳＰＥ−ＰＥＧに寄与し、これは、ＡｍＢの正のアミノ基と相互作用して、二重層のイオン複合体を形成することが可能である。別の理由は、ＱＬＤが、ＡｍＢを有効にカプセル化して、ゆっくりと持続的なＡｍＢの放出及び毒性の低減をもたらすことである。
【０１６８】
最終的に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのさらなる分析に最も有効な送達システムであるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価の結果に基づいて、最小限の毒性、ＭＩＣ、及びほとんどの安定性を示すＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆをスクリーニングした。
【０１６９】
実施例２０：薬物動態分析研究
薬物動態は、組織内の薬物の蓄積に影響を与える。薬物動態プロファイルを比較するために、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆ及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）を、ラットに２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇ体重の用量で静脈内注射した。推定された血漿濃度対時間プロファイルは、図２３ａに示され、対応する平均薬物動態パラメータは、表１にまとめられた。
【０１７０】
結果は、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆ及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）の両方の血漿濃度プロファイルが、迅速な初期分布相を示したことを実証した。一方で、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆは、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）よりも高い最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）を生じた（それぞれ、２５．１３±７．０５及び２．６６±０．８１μｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０５）（表１）。２４時間に全てのラットで及び１２時間に１匹のラットで、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のＡｍＢ濃度は、検出できなかった。ＡｍＢは依然として、投与の２４時間後に検出可能であり（０．７４±０．１２μｇ／ｍＬ）、ＭＩＣ（０．３９±０．１３μｇ／ｍＬ）を超えたままであった。ＡｍＢは、濃度がＭＩＣの０．５〜１倍未満である場合、静真菌活性を示し、ＭＩＣの濃度の０．５〜１倍超である場合、強力な殺真菌活性を発揮するであろう。結果は、２４時間の投与後に、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆが依然として、播種性カンジダ症などの血液による感染症に有益な殺真菌活性を有することを示した。
【０１７１】
さらに、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆは、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（１０．９８±５．０２ｍｇ＊ｈ／Ｌ）の４倍を上回るＡＵＣ（４６．５８±６．２８ｍｇ＊ｈ／Ｌ）及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（２９６．８６±１２．０２Ｌ／ｋｇ）のほぼ半分の分布容積（Ｖｄ）（１７７．０８±４６．０５Ｌ／ｋｇ）を示した（ｐ＜０．０５）（表１）。ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆの薬物動態学的挙動は、高いＣｍａｘ、ＡＵＣ、遅いＣＩ、及び小さいＶｄも示すＡｍｂｉｓｏｍｅ（登録商標）と同様であると思われる。１つの説明は、正荷電を有するＡｍＢのアミノ基がＱＬＤとイオン複合体を形成することである。それにより、この機序は、リポソーム二重層内でのＡｍＢの保持が促進され、徐々に放出され、血液中の循環が長くなった。別の理由は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧが、生体適合性の特性及び変化した立体配座の柔軟性を有することであり、これは、アニオン性脂質の表面に付着することにより血液循環時間を延長し、それにより、さらに二重層内のＡｍＢの保持を促進する。
【０１７２】
感染した標的が肝臓及び脾臓以外の組織である時に、分布及び効果を向上させるために、ＲＥＳによる取り込みを回避して、血症循環時間を延長することは、非常に重要である。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）は、以前に報告された結果と一致する低いＡＵＣ、Ｃｍａｘ、大きいＣＩ、及び広いＶｄ（表１）を示した。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）の低いＡｍＢ血漿中濃度は、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のミセル製剤からのＡｍＢの迅速放出ならびに肝臓及び脾臓のＲＥＳによるＡｍＢの高い取り込みにより説明することができる。本発明者らはまた、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）が、Ｓｗｅｎｓｏｎ及びＳｅｒｒａｎｏが以前にそれぞれ報告している、投与の４時間後の血漿レベルに第２のピークを示したという興味深い現象を観察した（図６ａ）。これは、肝臓などの組織からの再分布に関連し得る。
【表１】
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【０１７３】
実施例２１：組織の生体内分布試験
ナノ粒子が血液循環を離れると、薬剤がどこに行き、特定の組織にどれだけ留まるかを知ることが非常に重要である。その理由は、組織が全身性真菌感染症の主要な部位でもあるからである。４８時間及び７２時間の静脈内投与後の組織分布の結果は、図２３ｂ〜２３ｅに示された。ＡｍＢ  ５ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇと同等の単回用量のＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆを投与した場合、全てのマウスは生存していた。ＡｍＢ  １０ｍｇ／ｋｇのＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆ及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）２ｍｇ／ｋｇと同等の用量で投与された場合、各群は、１匹の死亡したマウスを有する。
【０１７４】
結果は、２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの単回用量の４８時間の注射後に、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆが、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（肝臓で５．８０±１．４３μｇ／ｍＬ及び脾臓で６．２５±１．３０μｇ／ｍＬ）と比較して、肝臓（２．０７±０．３０μｇ／ｇ）及び脾臓（５．１０±０．９７μｇ／ｇ）でより低い濃度を示したことを示した（図２３ｂ及び２３ｃ）。その理由は、回避されたＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆが、ＲＥＳにより即座に認識されて、血漿中の循環の延長がもたらされるからである。粒子の認識は、粒子及びオプソニン間の距離に応じて、血液中のオプソニン化により仲介される。Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）のように距離が短い場合、オプソニンは、粒子の表面に結合し、次に、ＲＥＳで認識することができる。さらに、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−ＦのＡｍＢ濃度は、７２時間の注射後に、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（それぞれ、１．８０±０．１０及び１．２３±０．１４μｇ／ｍＬ）と比較して、肝臓（１．４６±０．０６μｇ／ｇ）及び脾臓（１．３７±０．０６μｇ／ｇ）での同等レベルまで低下し、依然として、ＭＩＣを上回ったままである（図２３ｂ及び２３ｃ）。長期の組織保持は、薬が、効果を失うことなく、毎日ではなく断続的に与えることができることを示唆し、これは、コスト及び起こり得る毒性の副作用を低減させるであろう。残念ながら、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆは、脳組織中のＡｍＢの分布を示さず、これは、クリプトコッカス髄膜炎などの頭蓋内真菌感染症には有益ではなかった。
【０１７５】
本発明者らは、ＡｍＢ濃度が、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（４８時間、１．９３±０．２３μｇ／ｇ；７２時間、０．８３±０．７４μｇ／ｇ）と比較して、腎臓では低い（４８時間、０．７９±０．７０μｇ／ｇ、７２時間、０．４５±０．３９μｇ／ｇ）ことがわかった（図２３ｅ）。これは、腎臓へのＡｍＢの分布の低減を示す。説明は、リポソームが、糸球体濾過及び薬物の腎排泄を回避するのに十分大きく、ＡｍＢのカプセル化物の腎毒性の低減がもたらされたことである。
【０１７６】
ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆが、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）よりも高濃度で肺に蓄積する（それぞれ、１．４５±０．２４μｇ／ｇに対して２．９６±１．０６、ｐ＜０．０５）このナノ粒子の別の優れた属性があった（図２３ｄ）。７２時間の注射後、ＡｍＢカプセル化物の肺内濃度は、２．１２±０．２７μｇ／ｇであったが、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）で処置されたマウスの肺では、低ＡｍＢ濃度が検出された（ｐ＜０．０５）（図２３ｄ）。ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆの標的が侵襲性アスペルギルス症などの肺部位である場合、肺真菌感染症に有益である。残念ながら、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆは、脳組織にいかなる分布も示さず、これは、クリプトコッカス髄膜炎などの頭蓋内真菌感染症には有益でなかった。
【０１７７】
ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆで処置されたマウスの組織では、用量依存的応答の増加が認められた（図２３ｂ〜２３ｅ）。注射用量が５ｍｇのＡｍＢ／Ｋｇに増加させた場合、マウスの全ての臓器組織で高濃度が検出された。実験で全てのマウスが生存し、後続のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性試験では、毒性は確認されなかった。しかし、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆの用量を１０ｍｇのＡｍＢ／ｋｇに増加させた場合、１匹のマウスが１２時間で死亡した。それは、投与後に高濃度のＡｍＢが組織に蓄積する場合、毒性が増加することを意味する。１０ｍｇのＡｍＢ／ｋｇの用量で４８時間投与した後、低濃度のＡｍＢが心臓組織で見出された。１匹のマウスが、２ｍｇのＡｍｂ／ｋｇの単回用量の静脈内投与のＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）で死亡した。これらの結果は、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆが、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）と比較して、より広く、より安全な治療ウィンドウを有することを示し、これは、以下のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性試験で確認された。
【０１７８】
実施例２２：ｉｎ  Ｖｉｖｏ毒性試験
ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性評価の結果は、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆが、対照群と比較して、２ｍｇまたは５ｍｇのＡｍＢ／ｋｇのいずれかの用量で処置されたマウスで、肝臓（ＡＬＴ及びＡＳＴ）ならびに腎臓（Ｃｒ及びＢＵＮ）機能に影響を与えなかったことを示唆した（図２４）。結果は、２ｍｇまたは５ｍｇのＡｍＢ／ｋｇのＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆで処置されたマウスの腎臓におけるＡｍＢ濃度蓄積の低減と一致した（図２３ｅ）。従って、糸球体濾過が低減し、腎毒性が最小限に抑えられる。しかし、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆは、用量を１０ｍｇのＡｍＢ／ｋｇに上昇させた場合、Ｃｒ及びＢＵＮレベルまたは肝臓酵素ＡＳＴ及びＡＬＴを増加させた。全てが対照群と比較して有意差がある（ｐ＜０．０５）（図２４）。
【０１７９】
肝毒性及び腎毒性は、用量投与を増加させた後に、腎臓及び肝臓でのＡｍＢ保持に関連し得る。比較すると、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）は、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆと比較した場合、同様の用量２ｍｇのＡｍＢ／ｋｇで７２時間投与された後に、Ｃｒ、ＢＵＮ、ＡＬＴ、及びＡＳＴにおいて有意な増加を引き起こした（ｐ＜０．０５）（図２４）。結果は、ＡｍＢ／Ｑ７８−Ｏ１４Ｂ−Ｆが、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）と比較して、毒性の大幅な低減及び治療ウィンドウの増加をもたらすことを実証した。
【０１８０】
実施例２３：フッ素鎖を有する脂質
【化５５】
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【０１８１】
合成
清浄なガラスバイアル中で、フッ素含有尾部（２．５当量）をアミン頭部（１当量）と混合した。４８時間継続的に撹拌しながら、混合物を７０℃未満に維持した。次に、反応を停止させ、移動相としてメタノール及びジクロロメタンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、粗生成物を精製した。
【０１８２】
アッセイ
上記の種々のフッ素鎖を有する脂質のＧＦＰ陽性細胞及びＤｓＲｅｄ陽性細胞のパーセンテージの結果は、図２５及び図２６の棒グラフにまとめられる。
【０１８３】
実施例２４：新しいライブラリー１−異なる疎水性尾部を有するアミン２００
【化５６】
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上記の種々の疎水性尾部を有する脂質（アミン２００から合成された）に対するＧＦＰ＋細胞のパーセンテージの結果は、図２７の棒グラフにまとめられる。
【０１８４】
実施例２５：新しいライブラリー２−環状アミンアナログ
【化５７】
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種々の環状アミンアナログから合成された脂質に対するＧＦＰ＋細胞のパーセンテージの結果は、図２８の棒グラフにまとめられる。
【０１８５】
実施例２６：新しいライブラリー３−イミダゾール含有アミンアナログ
【化５８】
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種々のイミダゾール含有アミンアナログから合成された上記の脂質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞へのｍＲＮＡ送達効率の結果は、図２９の棒グラフにまとめられる。
【０１８６】
追加の実施形態
本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで、組み合わせてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替の特徴で置き換えられてもよい。従って、別途明記のない限り、開示の各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の例示にすぎない。
【０１８７】
上記の説明から、当業者は、記載の実施形態の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件に適合させるように実施形態の様々な変更及び修正を行い得る。従って、他の実施形態も、特許請求の範囲内である。開示の実施形態に対して、様々な修正及び変形を行うことができることは、当業者らには明らかであろう。本明細書及び実施例は、単に例示と考えられることが意図され、本開示の真の範囲は、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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