(57)【要約】本明細書において、オリゴヌクレオチド、キメラペプチド、およびペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが提供される。また、本明細書では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、キメラペプチド、およびペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における筋疾患、ウイルス感染、または細菌感染を治療する方法が提供される。一態様において、本明細書では、式Ｉのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。【選択図】なし
2021518361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１０１】
2021518361.tif 000041
のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であって、
式中、
Ａ’は、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１０２】
2021518361.tif 000042
から選択され、式中、
Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであって、式中、ｘは３〜１０であり、各アルキル基はそれぞれが独立してＣ２−６−アルキルであるか、
またはＲ５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−（Ｃ１−６−ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、および
【化１０３】
2021518361.tif 000043
から選択され、
式中、Ｒ６は、ＯＨ、ＳＨ、およびＮＨ２から選択され、またはＲ６は、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、それぞれが固体支持体に共有結合され；
各Ｒ１は独立してＯＨおよび−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）から選択され、式中、各Ｒ３およびＲ４は、独立して−Ｃ１−６−アルキルであり、
各Ｒ２は独立してＨ、核酸塩基、および化学的保護基で官能化された核酸塩基から選択され、前記核酸塩基は、それぞれ独立してピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、およびデアザプリンから選択されるＣ３−６複素環リングを含み、
ｚは８〜４０であり、
Ｅ’はＨ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化１０４】
2021518361.tif 000044
から選択され；
式中、
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ７は、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８は、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−Ｃ１−６−複素芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）であって、式中、ＬはＪのアミノ末端にアミド結合によって共有結合し；
Ｊは、２、３、４、または５つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり；
Ｇは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、式中、ＧはＪのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合し；
以下の条件のうち少なくとも一つが真である：
１）Ａ’は、
【化１０５】
2021518361.tif 000045
または
２）Ｅ’は、
【化１０６】
2021518361.tif 000046
である、キメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
Ｊは、２、３、４、または５つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、前記細胞膜透過ペプチドは独立して両親媒性ペプチドまたはオリゴアルギニンペプチドである、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
前記細胞膜透過ペプチドの一つは両親媒性ペプチドであり、前記細胞膜透過ペプチドの一つはオリゴアルギニンペプチドである、請求項１または２に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
前記細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは両親媒性ペプチドであり、前記細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つはオリゴアルギニンペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
Ｊは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドである、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項６】
Ｊは、二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、前記二つの細胞膜透過ペプチドは独立して両親媒性ペプチドまたはオリゴアルギニンペプチドである、請求項１〜３に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
Ｊは、二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、前記細胞膜透過ペプチドの一つは両親媒性ペプチドであり、前記細胞膜透過ペプチドの一つはオリゴアルギニンペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項８】
Ｊは、二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、前記二つの細胞膜透過ペプチドは一つの両親媒性ペプチドおよび一つのオリゴアルギニンペプチドを含み、前記オリゴアルギニンペプチドはＪのＣ末端であり、前記両親媒性ペプチドはＪのＮ末端である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項９】
Ｊは、アミド結合によって共有結合した二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１０】
前記オリガルギニン（ｏｌｉｇａｒｇｉｎｉｎｅ）ペプチドが配列［（ＲＹｚＲ）ｘ］を含み、式中、Ｒはアルギニンであり、Ｙは独立してアミノヘキサン酸（Ｘ）またはＢ−アラニン（Ｂ）であり、ｚは１であり、ｘは１、２、３、４、または５である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１１】
前記オリガルギニン（ｏｌｉｇａｒｇｉｎｉｎｅ）ペプチドが配列［（ＲＸＲ）（ＲＢＲ）］ｘまたは［（ＲＢＲ）（ＲＸＲ）］ｘを含み、式中、Ｒはアルギニンであり、Ｘはアミノヘキサン酸であり、ＢはＢ−アラニンであり、ｘは１または２である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１２】
前記オリゴアルギニンペプチドが、［（ＲＸＲ）（ＲＢＲ）］２（Ｂｐｅｐ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１３】
前記両親媒性ペプチドが、疎水性ペプチジルセグメントおよび親水性ペプチジルセグメントを含み、前記疎水性ペプチジルセグメントが、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンから独立して選択される２〜１０のアミノ酸の配列を含み、前記親水性ペプチジルセグメントが、荷電アミノ酸、非荷電の極性アミノ酸、または疎水性アミノ酸から独立して選択される２〜２０のアミノ酸の配列を含み、前記親水性ペプチジルセグメントが、少なくとも一つの非疎水性アミノ酸を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１４】
前記疎水性セグメントが、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンから独立して選択される２〜１０のアミノ酸の配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１５】
前記疎水性セグメントが、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、またはグリシンから独立して選択される２〜２０のアミノ酸の配列を含み、前記親水性ペプチジルセグメントが、少なくとも一つの非疎水性アミノ酸を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１６】
前記両親媒性ペプチドが、ｐＶＥＣ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎまたはメリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１７】
前記両親媒性ペプチドがＰｅｎｅｔｒａｔｉｎである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１８】
Ｊが、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲ  ＫＱＡＨＡＨＳＫＲＸ  ＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲ）、メリチン−Ｂｐｅｐ（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴ  ＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ  ＫＲＫＲＱＱＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、またはＢｐｅｐ−Ｂｐｅｐ（ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲＲＸ  ＲＲＢＲ）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１９】
Ｊが、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲ  ＫＱＡＨＡＨＳＫＲＸ  ＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲ）、またはメリチン−Ｂｐｅｐ（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴ  ＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ  ＫＲＫＲＱＱＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２０】
Ｊが、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２１】
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、および
【化１０７】
2021518361.tif 000047
から選択される、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２２】
Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１０８】
2021518361.tif 000048
から選択される、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２３】
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、４−メトキシトリチル、および
【化１０９】
2021518361.tif 000049
から選択される、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２４】
Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１１０】
2021518361.tif 000050
から選択され、
Ｅ’が、
【化１１１】
2021518361.tif 000051
である、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２５】
Ａ’が、
【化１１２】
2021518361.tif 000052
であり、
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２６】
前記式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、：
【化１１３】
2021518361.tif 000053
から選択されるペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、
式中、Ｅ’がＨ、Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２７】
前記ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、前記式（Ｉａ）のものである、請求項１または２６に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２８】
前記ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、前記式（Ｉｂ）のものである、請求項１または２６に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２９】
各Ｒ１がＮ（ＣＨ３）２である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３０】
各Ｒ２が核酸塩であり、それぞれ独立してアデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、およびヒポキサンチンから選択される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３１】
Ｌが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−トリアゾール−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３２】
Ｌが、
【化１１４】
2021518361.tif 000054
である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３３】
Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３４】
Ｇが、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３５】
Ｇが、Ｈである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３６】
Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３７】
前記キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートが、コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドと比較して、取込みにおける少なくとも２０倍の改善を示す、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３８】
前記キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートが、非キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートと比較して、取込みにおける少なくとも２倍の改善を示す、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３９】
前記キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートが、非キメラＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ペプチドコンジュゲートと比較して、取込みにおける改善を示す、請求項１に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、および少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む、キメラ組成物。
【請求項４１】
それを必要とする対象における疾患を治療する方法であって、請求項１に記載のキメラ組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４２】
前記疾患が神経筋疾患である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記神経筋疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１６日に出願された米国仮出願番号第６２／６４４，２０２号の優先権を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
アンチセンス技術は、選択的スプライシング産物を含む一つ以上の特定の遺伝子産物の発現を調節するための手段を提供し、多くの治療、診断、および研究用途において比類なく有用である。アンチセンス技術の背後にある原理は、標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物が、多くのアンチセンスメカニズムのうちのいずれか一つを通して転写、スプラシング、または翻訳などの遺伝子発現活性を調節することである。アンチセンス化合物の配列特異性は、疾患に関与する遺伝子の発現を選択的に調節する治療薬としてはもちろん、ターゲットバリデーションおよび遺伝子機能のためのツールとして魅力的である。
【０００３】
アンチセンス技術の分野における目覚ましい進歩が見られるが、改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能を有するペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートに対するニーズが残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書では、共有結合によってキメラペプチド（ＣＰ）に結合したオリゴヌクレオチドを含むキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートが提供される。また、本明細書では、本明細書に記載のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患を治療する方法が提供される。
【０００５】
したがって、一態様において、本明細書では、式Ｉ：
【化１】
2021518361.tif 000003
のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩が提供され、
式中、
Ａ’は、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化２】
2021518361.tif 000004
から選択され、式中、
Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであって、式中、ｘは３〜１０であり、各アルキル基はそれぞれが独立してＣ２−６−アルキルであるか、
またはＲ５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−（Ｃ１−６−ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、および
【化３】
2021518361.tif 000005
から選択され、
式中、Ｒ６は、ＯＨ、ＳＨ、およびＮＨ２から選択され、またはＲ６は、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、それぞれが固体支持体に共有結合され；
各Ｒ１は独立してＯＨおよび−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）から選択され、式中、各Ｒ３およびＲ４は、独立して−Ｃ１−６−アルキルであり、
各Ｒ２は独立してＨ、核酸塩基、および化学的保護基で官能化された核酸塩基から選択され、核酸塩基は、それぞれ独立してピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、およびデアザプリンから選択されるＣ３−６複素環リングを含み、
ｚは８〜４０であり、
Ｅ’はＨ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化４】
2021518361.tif 000006
から選択され；
式中、
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ(Ｏ）−であり；
Ｒ７は、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８は、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−Ｃ１−６−複素芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）であって、式中、ＬはＪのアミノ末端にアミド結合によって共有結合し；
Ｊは、２、３、４、または５つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり；
Ｇは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、式中、ＧはＪのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合し；
以下の条件のうち少なくとも一つが真である：
１）Ａ’は、
【化５】
2021518361.tif 000007
または２）Ｅ’は、
【化６】
2021518361.tif 000008
である。
【０００６】
一実施形態では、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ）２）１−６−トリアゾール−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【０００８】
特定の実施形態では、細胞膜透過ペプチドの一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【０００９】
一実施形態では、Ｊは、二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【００１０】
一実施形態では、式Ｉのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートは、式Ｉａ：
【化７】
2021518361.tif 000009
のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、Ｊは、上記で定義される通りである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【００１２】
特定の実施形態では、細胞膜透過ペプチドの一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【００１３】
特定の実施形態では、Ｊは、上記で定義される通り、二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドである。
【００１４】
別の実施形態では、式Ｉのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートは、式Ｉｂ：
【化８】
2021518361.tif 000010
のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、Ｊは、上記で定義される通りである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【００１６】
特定の実施形態では、細胞膜透過ペプチドの一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【００１７】
特定の実施形態では、上記で定義される通り、二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドである。
【００１８】
さらに別の態様では、本明細書において、本開示のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における筋疾患、ウイルス感染、神経筋疾患、または細菌感染症を治療する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】図１Ａ）は、本明細書に記載される四つの細胞膜透過ペプチドキメラのアミノ酸配列を示す。図１Ｂ）は、ＰＭＯ−キメラコンジュゲートの一般的構造を示す。図１Ｃ）は、各ＰＭＯ−ペプチドコンジュゲート５μＭでの２２時間にわたる連続的処置後、安定的にトランスフェクトされたＨｅＬａ  ６５４細胞群の平均ｅＧＦＰ蛍光を表すプロットを示す。
【図１−２】同上。
【図２−１】図２Ａ）は、ｅＧＦＰアッセイで測定されたＰＭＯ−ペプチドコンジュゲート、ならびに反転して各キメラの活性を示す。図２Ｂ）は、ＰＭＯ、ＰＭＯ−Ｐ１５、ＰＭＯ−ＢｐｅｐまたはＰＭＯ−Ｐ１５Ｂｐｅｐ  ５μＭで２２時間にわたって処置した細胞のｅＧＦＰの平均蛍光強度を示す。Ｐ１５は、１５個のプロリンアミノ酸残基からなるペプチドである。図２Ｃ）５μＭのＢｐｅｐあり・なしで、２２時間にわたって５μＭの各ベースＰＭＯ−ＣＰＰで処置したＨｅＬａ  ６５４細胞のｅＧＦＰ平均蛍光強度の比較を示す。
【図２−２】同上。
【図３】図３Ａ）は、３７℃または４℃で処置された細胞のｅＧＦＰ平均蛍光強度のプロットを示す。図３Ｂ）は、異なる濃度のクロルプロマジンで処置された細胞のｅＧＦＰ平均蛍光強度のプロットを示す。
【図４】図４Ａ）は、５μＭのＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ｐＶＥＣ、ＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−Ｂｐｅｐ、またはＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐで、３７℃で２２時間にわたって処置されたＨｅＬａ  ６５４細胞のｅＧＦＰおよびＳｕｌｆｏＣｙ５の各チャネルにおける平均蛍光強度を表すプロットを示す。図４Ｂ）は、処置後のＨｅＬａ  ６５４細胞の生細胞共焦点顕微鏡画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）は、遺伝性疾患のための魅力的な治療分子である。ワトソン−クリック塩基対の標的を認識するように設計されたＰＭＯは、その相補的なヌクレオチド配列について高レベルの特異性を呈する。標的化された配列の種類に応じて、ＰＭＯはタンパク質の翻訳の遮断、または遺伝子スプライシングの調節を含む様々な効果を媒介し得る。デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためにＦＤＡによって条件付きで承認されたＰＭＯのＥｔｅｐｌｉｒｓｅｎは、ジストロフィンをコードするＰｒｅ−ｍＲＮＡにおける突然変異含有エクソンを最終タンパク質転写物から除外し、タンパク質の機能性を回復させる。
【００２１】
構造の面では、ＰＭＯは、リボシル環がモルホリノ環で置換された中性オリゴヌクレオチド類似体であり、負電荷を有するホスホジエステル骨格は、非荷電ホスホロジアミデートで置換されている。変更した骨格構造は、血清および細胞内ヌクレアーゼの両方の分解を防止する。しかしながら、比較的大きなサイズおよび電荷中性のＰＭＯは、サイトゾルおよび核への非効率的な送達をもたらし得る。
【００２２】
細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）は、ＰＭＯの核への送達を改善するための有望な戦略である。ＣＰＰは、理想的にサイトゾルにアクセスし、カーゴの細胞内送達を促進し得る５〜４０のアミノ酸の比較的短い配列である。ＣＰＰは、その物理化学的特性に基づいて異なる群に分類され得る。一般的なＣＰＰクラスは、Ｒ１２およびおよびＢｐｅｐ（ＲＸＲＲβＲＲＸＲＲβＲ、式中Ｘは、アミノヘキサン酸であり、βはβ−アラニンである）などの反復性アルギニン系ペプチドからなる。これらのオリゴアルギニンペプチドは多くの場合、ランダムコイルである。ＰＭＯにコンジュゲートしたとき、オリゴアルギニンペプチドは、ＰＭＯ送達を促進する上で最も効果的なペプチドの一部である。Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ｐＶＥＣ、およびメリチンなどのその他のＣＰＰは、本質的により両親媒性である。これらの配列はカチオン性残基を含むが、荷電および疎水性残基の定義された分離は、両親媒性ヘリックス形成を促進し得る。しかしながら、両親媒性ＣＰＰは、ＰＭＯ有効性を著しく改善するとは認められていない。
【００２３】
ＣＰＰまたはＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートに対する細胞移入の普遍的機構は存在しない。機構は処置濃度および付着カーゴのタイプに大きく依存する場合が多い。特定の閾値濃度（一般的に低いマイクロモル濃度）を超えると、エネルギー依存性細胞質取込みは、エンドサイトーシスおよび細胞表面リサイクルの時間スケールよりも早く観察され得る。高速取込み速度により、小分子について観察されるものと類似した直接的な転位機構のエビデンスが得られる。しかしながら、低い生理学的に関連性のある濃度では、取込みは主にエンドサイトーシスである。エンドサイトーシスのカテゴリー内でさえも、ＣＰＰおよびＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートは、一つまたは複数のエンドサイトーシスメカニズムを用いて細胞移入できる。これらのエンドサイトーシスメカニズムには、微飲作用、クラスリン媒介エンドサイトーシス、カベオラ媒介性エンドサイトーシス、およびクラスリン／カベオラに依存しないエンドサイトーシスが含まれる。ＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートは主に低濃度でエンドサイトーシスされ、ＰＭＯ送達に不良なＣＰＰはエンドソームに捕捉されるか、または核コンパートメントから除外される可能性が高い。
【００２４】
本明細書において、ＰＭＯ送達を改善するためのキメラペプチド−ＰＭＯコンジュゲートが提供される。これらのキメラペプチド−ＰＭＯコンジュゲートは、相互に共有結合してＰＭＯでコンジュゲートされた二つまたは複数のＣＰＰからなる。特にコンジュゲートされていないＰＭＯと単一のＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートと比較される場合、オリゴヌクレオチドの細胞取込みの増加が本明細書に記載される。
【００２５】
定義
以下は、本開示を説明するために使用される様々な用語の定義である。これらの定義は、特定の場合において、個別にまたはより大きなグループの一部として限定されない限り、本明細書および請求項全体を通して使用される用語に適用される。
【００２６】
「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈においてある程度変化する。本明細書で使用される場合、量、持続時間、などの測定可能な値を参照するとき、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、そのような変化が開示された方法を実施するために適切であるため、±５％、±１％、および±０．１％を含む、±２０％または±１０％の変動を包含することを意味する。
【００２７】
「アルキル（ａｌｋｙｌ）」という用語は、特定の実施形態では、一つ〜六つ、または一つ〜八つの炭素原子を含む、飽和、直鎖−または分岐鎖の炭化水素部分を指す。Ｃ１−６−アルキル部分の例には、限定するものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル部分が含まれ；Ｃ１−８−アルキル部分の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、およびオクチル部分が含まれる。
【００２８】
アルキル置換基中の炭素原子の数は、「Ｃｘ−ｙ」によって示され得、式中、ｘは最小であり、ｙは置換基中の炭素原子の最大数である。同様に、Ｃｘ鎖は、ｘ炭素原子を含むアルキル鎖を意味する。
【００２９】
「ヘテロアルキル（ｈｅｔｅｒｏａｌｋｙｌ）」という用語は単独で、または別の用語との組み合わせで、特に明記しない限り、明記されている数の炭素原子、およびＯ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含む、安定な直鎖または分岐鎖アルキル基を指し、窒素および硫黄原子は酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよい。ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の残りの部分とそれが付着するフラグメントとの間を含む、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置され得、ならびにヘテロアルキル基中の最も遠位の炭素原子に付着し得る。例には以下が含まれる：−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、および−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ３。最大二つのヘテロ原子は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、または−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３のように連続し得る。
【００３０】
「アリール（ａｒｙｌ）」という用語は、単独でまたはその他の用語と組み合わせて用いられる場合、特に明記しない限り、一つまたは複数のリング（一般に、一つ、二つ、または三つのリング）を含む炭素環式芳香族系を指し、こうしたリングは、ビフェニルなどのペンダント様式で結合してもよく、またはナフタリンなどのように融合してもよい。アリール基の例は、フェニル、アントラシル（ａｎｔｈｒａｃｙｌ）、およびナフチルを含む。様々な実施形態では、アリール基の例は、フェニル（例えば、Ｃ６−アリール）およびビフェニル（例えば、Ｃ１２−アリール）を含む。いくつかの実施形態では、アリール基は６〜１６個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アリール基は６〜１２個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ６−１２−アリール）。いくつかの実施形態では、アリール基は６個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ６−アリール）。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）」または「ヘテロ芳香族（ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ）」という用語は、芳香族特性を有する複素環を指す。ヘテロアリール置換基は、例えば、Ｃ１〜９−ヘテロアリールが、ヘテロ原子の数を含まず、ヘテロアリール基に含有される炭素原子の数を示すように、炭素原子の数によって定義され得る。例えば、Ｃ１〜９−ヘテロアリールは、追加的な一個〜四個のヘテロ原子を含むことになる。多環式ヘテロアリールは、部分的に飽和した一つまたは複数のリングを含み得る。ヘテロアリールの非限定的な例は、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（例えば、２−および４−ピリミジニルを含む）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（例えば、２−ピロリルを含む）、イミダゾリル、チアゾリル、ピラゾリル（例えば、３−および５−ピラゾリルを含む）、イソチアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、テトラゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリルおよび１，３，４−オキサジアゾリルを含む。
【００３２】
多環性複素環およびヘテロアリールの非限定的な例は、インドリル（例えば、３−、４−、５−、６−および７−インドリル）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（例えば、１−および５−イソキノリルを含む）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キノキサリニル（例えば、２−および５−キノキサリニルを含む）、キナゾリニル、フサラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、１，８−ナフチリジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、１，５−ナフチリジニル、ベンゾフリル（例えば、３−，４−，５−，６−および７−ベンゾフリルを含む）、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，２−ベンジソキサゾリル（ｂｅｎｚｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ）、ベンゾチエニル（例えば、３−，４−，５−，６−，および７−ベンゾチエニル）、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル（例えば、２−ベンゾチアゾリルおよび５−ベンゾチアゾリル）、プリニル、ベンゾイミダゾリル（例えば、２−ベンゾイミダゾリルを含む）、ベンゾトリアゾリル、チオキサンチニル（ｔｈｉｏｘａｎｔｈｉｎｙｌ）、カルバゾリル、カルボニル、アクリジニル、ピロリジジニル（ｐｙｒｒｏｌｉｚｉｄｉｎｙｌ）、およびキノリジジニルを含む。
【００３３】
「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」または「化学保護基（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」という用語は、化合物の一部またはすべての反応部分を遮断して、保護基が除去されるまでそのような部分が化学反応に加わるのを防止する化学的部分を指し、例を挙げると、そのような部分は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９９）に記載されている。異なる保護基が用いられる場合、それぞれ（異なる）保護基が異なる手段によって除去可能であることが有利であり得る。完全に異なる反応条件下で切断された保護基は、こうした保護基の差分除去を可能にする。例えば、保護基は、酸、塩基、および水素化分解によって除去することができる。トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、アセタールおよびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどの基は酸不安定性であり、水素化分解で除去可能なＣｂｚ基、および塩基不安定性のＦｍｏｃ基で保護されたアミノ基の存在下でカルボキシおよびヒドロキシ反応部分を保護するために使用され得る。カルボン酸部分は、限定するものではないが、メチル、またはエチルなどの塩基不安定基で遮断されてもよく、またヒドロキシ反応部分は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメートなどの酸不安定基、または酸および塩基の両方で安定であるが加水分解的に除去可能なカルバメートによって遮断されたアミンの存在下で、アセチルなどの塩基不安定部分で遮断され得る。
【００３４】
カルボン酸およびヒドロキシル反応部分もまた、ベンジル基などの加水分解的に除去可能な保護基で遮断されてもよく、一方でアミン基はＦｍｏｃなどの塩基不安定基で遮断されてもよい。式（Ｉ）の化合物の合成に対する特に有用なアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応部分は、２，４−ジメトキシベンジルなどの酸化的に除去可能な保護基で遮断されてもよく、一方で既存のアミノ基はフッ化物不安定シリルカルバメートで遮断されてもよい。
【００３５】
アリル遮断基は、酸−および塩基−保護基の存在下で有用であるが、それは前者が安定であり、その後、金属又はｐｉ−酸触媒によって除去され得るためである。例えば、アリル遮断カルボン酸は、酸不安定ｔ−ブチルカルバメートまたは塩基不安定酢酸アミン保護基の存在下、パラジウム（０）−触媒反応で脱保護され得る。また別の形態の保護基は、化合物または中間体が付着され得る樹脂である。残基が樹脂に付着している限り、その官能基は遮断され、反応できない。樹脂から放出されると、官能基は反応可能になる。
【００３６】
「ヌクレオブーゼ（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」、「塩基対形成部分（ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）」、「核酸塩基対形成部分（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）」、または「基（ｂａｓｅ）」という用語は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および／またはモルホリノサブユニットの複素環リング部分を指す。核酸塩基は自然発生的であり得、またはこれらの自然発生的な核酸塩基の修飾もしくは類似体であり得、例えば、核酸塩基の一つまたは複数の窒素原子は、それぞれ独立して炭素によって置換され得る。例示的な類似体としては、ヒポキサンチン（ヌクレオチドイノシンの塩基構成要素）、２，６−ジアミノプリン；５−メチルシトシン；Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇ−クランプ）などが挙げられる。
【００３７】
塩基対形成部分のさらなる例には、限定するものではないが、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびアシル保護基、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、偽イソシトシンおよび偽ウラシルなどのピリミジン類似体ならびに８−置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチン（後者二つは自然分解生成物である）などの他の修飾核酸塩基によって保護されたそれらの各アミノ基を有するヒポキサンチンが挙げられる。Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ、ＲＮＡ、２００３、９、１０３４−１０４８、Ｌｉｍａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３−２１９６  ａｎｄ  Ｒｅｖａｎｋａｒ  ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ＮａｔｕｒａｌおよびＲｅｖａｎｋａｒ  ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示された修飾核酸塩基も意図され、その内容は参照により本明細書に援用される。
【００３８】
塩基対形成部分のさらなる例には、限定するものではないが、一つまたは複数のベンゼン環が加えられた拡張サイズの核酸塩基が含まれる。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔａｌｏｇ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）に記載された核酸塩基置換；Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＡＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１−１５０；Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６−９４３；Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３−５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３−７３３；Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２−６２７は、参照により本明細書に援用されるものであり、本明細書に記載されるオリゴマーの合成に有用であると考えられる。拡張サイズの核酸塩基の例を以下に示す。
【化９】
2021518361.tif 000011
【００３９】
「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「オリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）」という用語は、複数の連結されたヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方の組み合わせを含む化合物を指す。本明細書で提供される特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドはモルホリノオリゴヌクレオチドである。
【００４０】
「モルホリノオリゴヌクレオチド（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「ＰＭＯ」という語句は、一つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’−環外炭素に結合する、ホスホロアミダートまたはホスホロジアミダート結合によって結合したモルホリノサブユニットを有する修飾オリゴヌクレオチドを指す。各モルホリノサブユニットは、核酸塩基特異的水素結合によって、標的の核酸塩基に結合するのに有効な核酸塩基対部分を含む。
【００４１】
「アンチセンスオリゴマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ）」、「アンチセンス化合物（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」および「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は互換的に使用され、それぞれ塩基対部分を有し、塩基対形成部分にワトソン−クリック塩基対形成によって核酸中の標的配列（典型的にはＲＮＡ）にハイブリダイズさせ、核酸：標的配列内のオリゴマーヘテロ二本鎖を形成させるサブユニット間結合によって結合された、サブユニットの配列を指す。オリゴマーは、標的配列に対して正確な（完全な）または近似の（十分な）配列相補性を有し得、オリゴマーの末端近くの配列の変形は、一般的に内部における変形より好ましい。
【００４２】
こうしたアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断または阻害するように、または天然のまたは異常なＰｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングプロセシングを阻害／変化させるように設計されうるが、これがハイブリダイズする標的配列を「対象とする」または「標的化する」と言うことができる。標的配列は、典型的には、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、またはプロセシング前ｍＲＮＡのスプライシング部位、スプライシング抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含む領域である。スプライシング部位の標的配列は、プロセシングされたｍＲＮＡの通常のスプライシング受容体接合部の下流に、その５’末端１〜約２５塩基対を有するｍＲＮＡ配列を含み得る。様々な実施形態では、標的配列は、スプライシング部位を含むか、または完全にエクソンコード配列内に含まれるか、またはスプライシング受容体またはドナー部位にわたる、プロセシングされたｍＲＮＡの任意の領域であり得る。オリゴマーは、上述の方法で標的核酸に対して標的化される場合、より一般的に、タンパク質、ウイルス、または細菌などの生物関連標的を「標的とする（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ）」と言われる。
【００４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡは、各分子の対応する位置の十分な数が相互に水素結合できるヌクレオチドによって占有されている場合、互いに相補的であり、そのため、安定で特異的な結合がオリゴヌクレオチドと標的の間で発生する。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）」および「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、オリゴヌクレオチドと標的との間で安定で特異的な結合が発生するように、十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるその標的配列に対して１００％相補的である必要はないことが当業者には理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的分子への結合が標的ＲＮＡの正常な機能を妨害する場合、特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望まれる条件下、つまり、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合は生理学的条件下、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合は、アッセイが実施される条件下で、非標的配列へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。
【００４４】
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基（ｂａｓｅ）」と称される）修飾または置換を含み得る。修飾または置換塩基を含むオリゴヌクレオチドは、核酸中で最もよく見られる一つまたは複数のプリンまたはピリミジン塩基がそれほど一般的ではない、または非天然の塩基で置換されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、プリン塩基のＮ９原子、またはピリミジン塩基のＮ１原子で、ヌクレオチドはヌクレオシドのモルホリン環に共有結合されている。
【００４５】
プリン塩基は、一般式によって記載される通り、イミダゾール環に融合したピリミジン環を含む。
【化１０】
2021518361.tif 000012
【００４６】
アデニンおよびグアニンは、核酸中で最も一般的に見られる二つのプリン核酸塩基である。これらは、限定するものではないが、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、ヒポキサンチン、および７−メチルグアニンを含む、その他の自然発生的プリンで置換され得る。
【００４７】
ピリミジン塩基は、一般式によって記載される通り、６員ピリミジン環を含む。
【化１１】
2021518361.tif 000013
【００４８】
シトシン、ウラシル、およびチミンは、核酸中で最も一般的に見られるピリミジン塩基である。これらは、限定するものではないが、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、偽ウラシル、および４−チオウラシルを含む、その他の自然発生的ピリミジンで置換され得る。一実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドはウラシルの代わりにチミン塩基を含む。
【００４９】
その他の修飾または置換塩基は、限定するものではないが、２，６−ジアミノプリン、オロト酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇ−クランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパーＧ、スーパーＡ、およびＮ４−エチルシトシン、またはその誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、偽ウラシルまたはその誘導体；ならびに２，６−ジフロオロトルエンまたは非塩基部位などの無塩基のような、縮重またはユニバーサル塩基（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；または環酸素が窒素で置換されたピロリジン誘導体（アザリボース））を含む。偽ウラシルは、ウラシルの自然発生的異性化バージョンであり、ウリジンにおける通常のＮ−グリコシドというよりむしろＣ−グリコシドによる。
【００５０】
特定の修飾または置換核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を向上させるために特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトリンを含むＮ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリンを含む。様々な実施形態では、核酸塩基は、０．６〜１．２℃の核酸二重安定性を向上させること示される５−メチルシトシン置換基を含み得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、修飾または置換核酸塩基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製を容易にするために有用である。例えば、特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、三つ以上の（例えば、３、４、５、６つ以上）連続グアニン塩基を含み得る。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、三つ以上の連続グアニン塩基のストリングは、オリゴヌクレオチドの凝集をもたらし、精製を複雑にし得る。こうしたアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、連続したグアニンの一つまたは複数をヒポキサンチンで置換し得る。三つ以上の連続グアニン塩基のストリングにおける一つまたは複数のグアニンに対するのヒポキサンチン置換は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの凝集を減少させ、それによって精製を促進し得る。
【００５２】
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは合成され、生物起源のアンチセンス組成物を含まない。本開示の分子は、例えば、取込み、分布、または吸収を助けるため、混合、カプセル封入、コンジュゲートされるか、さもなくば、リポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所またはその他製剤などの、分子、分子構造または化合物の混合物、またはその組み合わせに関連し得る。
【００５３】
「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」および「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」という用語は、塩基対形成規則によって関連付けられるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’−３’）」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ（５’−３’）」に対して相補的である。相補性は、「部分（ｐａｒｔｉａｌ）」であってもよく、その中では一部の核酸塩基のみが塩基対形成規則に従って一致する。あるいは、核酸間に「完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」、「全体の」、または「完璧な（ｐｅｒｆｅｃｔ）」（１００％の）相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を与える。多くの場合、完全相補性が望ましいが、一部の実施形態は、標的ＲＮＡに対して一つまたは複数のミスマッチ、好ましくは６、５、４、３、２、または１つのミスマッチを含み得る。こうしたハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーの標的配列に対する「近似的（ｎｅａｒ）」または「実質的な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）」相補性、ならびに完全な相補性によって生じ得る。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の相補性で標的配列にハイブリダイズし得る。オリゴマー内の任意の位置における変動が含まれる。特定の実施形態では、内部における変形よりもオリゴマーの末端付近の配列の変形が一般的に好ましく、また存在する場合、典型的には、５’末端、３’末端、または両方の末端の約６、５、４、３、２、または１つのヌクレオチドである。
【００５４】
「ペプチド」という用語は、複数の結合したアミノ酸を含む化合物を指す。本明細書に提供されるペプチドは、細胞膜透過ペプチドと考えられ得る。
【００５５】
「細胞膜透過ペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」および「ＣＰＰ」という用語は互換的に使用され、輸送ペプチド、キャリアペプチド、またはペプチド形質導入ドメインとも称されるカチオン性細胞膜透過ペプチドを指す。本明細書で提供されるペプチドは、所与の細胞培養群の細胞の１００％以内の細胞膜透過を誘発する能力を有し、全身投与においてｉｎ  ｖｉｖｏでの複数の組織内の高分子転位を可能にする。様々な実施形態では、本開示のＣＰＰ実施形態は、以下にさらに記載されるアルギニンに富むペプチドを含み得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「キメラペプチド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、第三の部分に融合された異なるペプチドまたはそのフラグメントである、第二の部分に融合された第一のペプチドまたはそのフラグメントである第一の部分を含む、ポリペプチドを指す。キメラペプチドは、２、３、４、５つ、またはそれ以上の共有結合ペプチドを含み得る。ペプチドは、アミノ酸側鎖、Ｎ末端、Ｃ末端、またはそれらの任意の組み合わせを介して共有結合されてもよい。特定の実施形態では、ペプチドは、一つのペプチドのＮ末端を介して他方のＣ−ペプチドに共有結合している。特定の実施形態では、共有リンカーはアミド結合である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「両親媒性ペプチド（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、本質的に荷電したアミノ酸および本質的に非荷電のアミノ酸の分離領域を有するペプチドを指す。これらの領域は、それぞれ親水性ペプチジルセグメントおよび疎水性ペプチジルセグメントとして知られている。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「オリゴアルギニンペプチド（ｏｌｉｇｏａｒｇｉｎｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、ペプチドが全てアルギニン、またはほとんどアルギニンアミノ酸残基から成るペプチドを指す。特定の実施形態では、ペプチドは完全にアルギニンアミノ酸残基から成る。特定の実施形態では、ペプチドは、限定するものではないが、アミノヘキサン酸またはβ−アラニンなどのアミノ酸リンカーと間隙を介した５０〜９９％のアルギニンアミノ酸残基から成る。特定の実施形態では、ペプチドは、限定するものではないが、アミノヘキサン酸またはβ−アラニンなどのアミノ酸リンカーと間隙を介した７５％のアルギニンアミノ酸残基から成る。
【００５９】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患の改善に使用される一つまたは複数の特定の処置の適用を指す。特定の実施形態では、特定の処置は、一つまたは複数の医薬品の投与である。個人（例えば、ヒトなどの哺乳類）または細胞の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、個人または細胞の自然経過を変更する試みにおいて使用されるあらゆる種類の介入である。治療は、限定するものではないが、医薬組成物の投与を含み、予防的に、または病理学的事象の開始もしくは病原体との接触の後に、行い得る。治療は、疾患または状態の症状または病理おける任意望ましい効果を含み、例えば、治療される疾患または状態の一つまたは複数の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善を含み得る。また、治療される疾患または状態の進行度を低下させ、その疾患または状態の発症を遅延させる、またはその発症の重症度を低減することを対象とし得る「予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）」治療も含まれる。
【００６０】
「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」または「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、所望の治療効果を生じるのに有効な、単回投与または連続投与のうちの一部として、哺乳動物対象に投与される、アンチセンスオリゴマーなどの治療化合物の量を指す。
【００６１】
「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」という用語は、状態または疾患の少なくとも一つの指標の重症度の低下を指す。特定の実施形態では、改善は、状態または疾患の一つまたは複数の指標の進行における遅延または緩和を含む。指標の重症度は、当業者に公知の主観的または客観的尺度によって決定され得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｓａｌｔｓ）」とは、本開示のオリゴヌクレオチドの誘導体を指し、親オリゴヌクレオチドは、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって修飾される。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８  ａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２（１９７７）に記載されており、それぞれが参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００６３】
キメラペプチド−オリゴヌクレオチド−結合体
本明細書において、キメラ細胞膜浸透ペプチドに化学的に結合するオリゴヌクレオチドが提供される。キメラ細胞膜透過ペプチドはオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを強化する。特に、キメラ細胞膜透過ペプチドは、両親媒性ペプチドおよびオリゴアルギニンペプチドを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みをさらに強化する一つまたは複数のヘテロアルキル部分（例えば、ポリエチレングリコール）にさらに化学結合され得る。一つの例示的実施形態では、キメラ細胞膜透過ペプチドは、そのＮ末端残基またはＣ末端残基で、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両端に共有結合される。
【００６４】
したがって、一態様において、本明細書では、式Ｉ：
【化１２】
2021518361.tif 000014
のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
Ａ’は、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１３】
2021518361.tif 000015
から選択され、式中、
Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであって、式中、ｘは３〜１０であり、各アルキル基それぞれが独立してＣ２−６−アルキルであるか、
またはＲ５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−（Ｃ１−６−ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、および
【化１４】
2021518361.tif 000016
から選択され、
式中、Ｒ６は、ＯＨ、ＳＨ、およびＮＨ２から選択され、またはＲ６は、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、それぞれが固体支持体に共有結合され；
各Ｒ１は独立してＯＨおよび−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）から選択され、式中、各Ｒ３およびＲ４は、独立して−Ｃ１−６−アルキルであり、
各Ｒ２は独立してＨ、核酸塩基、および化学的保護基で官能化された核酸塩基から選択され、核酸塩基は、それぞれ独立してピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、およびデアザプリンから選択されるＣ３−６複素環リングを含み、
ｚは８〜４０であり、
Ｅ’はＨ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化１５】
2021518361.tif 000017
から選択され；
式中、
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ(Ｏ）−であり、
Ｒ７は、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８は、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−Ｃ１−６−複素芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）であって、式中、ＬはＪのアミノ末端にアミド結合によって共有結合し；
Ｊは、２、３、４、または５つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり；
Ｇは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、式中、ＧはＪのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合し；
以下の条件のうち少なくとも一つが真である：
１）Ａ’は、
【化１６】
2021518361.tif 000018
または２）Ｅ’は、
【化１７】
2021518361.tif 000019
である。
【００６５】
一実施形態では、Ｊは２、３、４、または５つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドは独立して両親媒性ペプチドまたはオリゴアルギニンペプチドである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【００６７】
特定の実施形態では、細胞膜透過ペプチドの一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【００６８】
さらに別の実施形態では、Ｊは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドである。
【００６９】
別の実施形態では、Ｊは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、二つの細胞膜透過ペプチドは独立して両親媒性ペプチドまたはオリゴアルギニンペプチドである。
【００７０】
さらに別の実施形態では、Ｊは、二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【００７１】
さらに別の実施形態では、Ｊは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、二つの細胞膜透過ペプチドは一つの両親媒性ペプチドおよび一つのオリゴアルギニンペプチドを含み、オリゴアルギニンペプチドはＪのＣ末端であり、両親媒性ペプチドはＪのＮ末端である。
【００７２】
別の実施形態では、Ｊは、アミド結合によって共有結合された二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドである。
【００７３】
一実施形態では、オリガニンペプチドは配列［（ＲＹｚＲ）ｘ］であり、式中、Ｒはアルギニンであり、Ｙは独立してアミノヘキサン酸（Ｘ）またはＢ−アラニン（Ｂ）、ｚは１であり、ｘは１、２、３、４、または５である。
【００７４】
さらに別の実施形態では、オリガニンペプチドは配列［（ＲＸＲ）（ＲＢＲ）］ｘまたは［（ＲＢＲ）（ＲＸＲ）］ｘであり、式中、Ｒはアルギニンであり、Ｘはアミノヘキサン酸であり、ＢはＢ−アラニンであり、ｘは１または２である。
【００７５】
別の実施形態では、オリゴアルギニンペプチドは、［（ＲＸＲ）（ＲＢＲ）］２（Ｂｐｅｐ）である。
【００７６】
一実施形態では、両親媒性ペプチドは疎水性ペプチジルセグメントおよび親水性ペプチジルセグメントを含み、疎水性ペプチジルセグメントが、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンから独立して選択される２〜１０のアミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントが、荷電アミノ酸、非荷電の極性アミノ酸、または疎水性アミノ酸から独立して選択される２〜２０のアミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントが、少なくとも一つの非疎水性アミノ酸を含む。
【００７７】
別の実施形態では、疎水性セグメントは、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンから独立して選択される２〜１０アミノ酸の配列を含む。
【００７８】
一実施形態では、親水性セグメントが、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、またはグリシンから独立して選択される２〜２０のアミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントが、少なくとも一つの非疎水性アミノ酸を含む。
【００７９】
別の実施形態では、両親媒性ペプチドはｐＶＥＣ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、またはメリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）である。
【００８０】
別の実施形態では、両親媒性ペプチドはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎである。
【００８１】
別の実施形態では、ＪはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲ  ＫＱＡＨＡＨＳＫＲＸ  ＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲ）、メリチン−Ｂｐｅｐ（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴ  ＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ  ＫＲＫＲＱＱＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、またはＢｐｅｐ−Ｂｐｅｐ（ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲＲＸ  ＲＲＢＲ）であり、式中、Ｘはアミノヘキサン酸であり、Ｂはβ−アラニンである。
【００８２】
さらに別の実施形態では、ＪはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲ  ＫＱＡＨＡＨＳＫＲＸ  ＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲ）、またはメリチン−Ｂｐｅｐ（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴ  ＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ  ＫＲＫＲＱＱＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）であり、式中、Ｘはアミノヘキサン酸であり、Ｂはβ−アラニンである。
【００８３】
さらに別の実施形態では、ＪはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）であり、式中、Ｘはアミノヘキサン酸であり、Ｂはβ−アラニンである。
【００８４】
さらなる一実施形態では、ＪはｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲ  ＫＱＡＨＡＨＳＫＲＸ  ＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲ）であり、式中、Ｘはアミノヘキサン酸であり、Ｂはβ−アラニンである。
【００８５】
一実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチルから選択される。
【化１８】
2021518361.tif 000020
【００８６】
別の実施形態では、Ａ’は、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１９】
2021518361.tif 000021
から選択される。
【００８７】
さらなる一実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、４−メトキシトリチルから選択される。
【化２０】
2021518361.tif 000022
【００８８】
一実施形態では、Ａ’は、Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化２１】
2021518361.tif 000023
から選択され、
Ｅ’は、
【化２２】
2021518361.tif 000024
である。
別の実施形態では、Ａ’は、
【化２３】
2021518361.tif 000025
であり、
Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【００８９】
一実施形態では、式Ｉのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートは、式Ｉａ：
【化２４】
2021518361.tif 000026
のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートである。
【００９０】
別の実施形態では、式Ｉのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートは、式Ｉｂ：
【化２５】
2021518361.tif 000027
のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであり、
式中、Ｅ’はＨ、Ｃ１−６−アルキル，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３，、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【００９１】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ１はＮ（ＣＨ）３）２である。
【００９２】
式  Ｉ、Ｉａ、およびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ２は核酸塩基であり、核酸塩基はそれぞれ独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、およびデアザプリンから選択されるＣ４−６−複素環リングを含む。
【００９３】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂの別の実施形態では、各Ｒ２は核酸塩基であり、核酸塩基はそれぞれ独立して、ピリミジン、プリン、およびデアザプリンから選択されるＣ４−６−複素環リングを含む。
【００９４】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ２は、アデニン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、およびヒポキサンチンから独立して選択される核酸塩基である。
【００９５】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ２は、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、およびヒポキサンチンから独立して選択される核酸塩基である。
【００９６】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂの別の実施形態では、Ｌは−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−トリアゾール−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−である。
【００９７】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂの別の実施形態では、Ｌは
【化２６】
2021518361.tif 000028
である。
【００９８】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂの別の実施形態では、Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される。
【００９９】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇは、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１００】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂのさらに別の実施形態では、ＧはＨである。
【０１０１】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１０２】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂのさらに別の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートは、コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドと比較して、取込みにおいて少なくとも２０倍の改善を呈する。
【０１０３】
一実施形態では、キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートは、非キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートと比較して、取込みにおいて少なくとも２倍の改善を呈する。
【０１０４】
別の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートは、対応する非キメラＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ペプチドコンジュゲートと比較して、取込みにおいて改善を呈する。
【０１０５】
本開示の代表的ペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートは、とりわけ、以下の構造：
【化２７】
2021518361.tif 000029
のキメラペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であり、式中、
ＧはＨまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、
Ｒ２は、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、およびヒポキサンチンから独立して選択される核酸塩基であり、
ｚは８〜４０であり、
ＣＰは、はＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲ  ＫＱＡＨＡＨＳＫＲＸ  ＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲ）、メリチン−Ｂｐｅｐ（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴ  ＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ  ＫＲＫＲＱＱＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、またはＢｐｅｐ−Ｂｐｅｐ（ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲＲＸ  ＲＲＢＲ）から独立して選択され、式中、Ｘはアミノヘキサン酸であり、Ｂはβ−アラニンである。
【０１０６】
一実施形態では、Ｇはペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合される。
【０１０７】
本開示のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートの一実施形態では、ＧはＨである。
【０１０８】
本開示のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートの別の実施形態では、Ｇは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１０９】
式Ｉ、Ｉａ、およびＩｂの一実施形態では、Ｌはペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合し、Ｇはペプチドのアミノ末端に共有結合する。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「ＧはＪのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合する」とは、Ｊのカルボキシ末端（−ＣＯＯＨ）が、Ｎ（Ｈ）基を介して可変Ｇに共有結合し、Ｊのカルボキシ末端のヒドロキシル基はＮ（Ｈ）で置換されていることを示す。たとえば、ＧがＨの場合、次の構造はＪおよびＧによって形成される。
【化２８】
2021518361.tif 000030
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートは、非溶媒和化される。別の実施形態では、キメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートのうちの一つまたは複数が溶媒和形態である。当該技術分野で公知のように、溶媒は、水、エタノール等の薬学的に許容可能な任意の溶媒であり得る。
【０１１２】
式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩａおよびＩＶのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートはそれらの中性形態で示されているが、いくつかの実施形態では、これらのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートは薬学的に許容可能な塩形態で使用される。
【０１１３】
オリゴヌクレオチド
モルホリノ系のサブユニットの重要な特性は、１）安定な、非荷電または正荷電のバックボーン鎖結合によってオリゴマー形態で結合する能力、２）形成されるポリマーが、比較的短いオリゴヌクレオチド（１０〜１５塩基）でＴＭ値約４５℃超の、標的ＲＮＡを含む、相補的塩基標的核酸とハイブリダイズできるように、ヌクレオチド基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、５−メチル−シトシン、およびヒポキサンチン）を支持する能力、３）オリゴヌクレオチドが哺乳類細胞に能動的または受動的に輸送される能力、および４）ＲＮＡｓｅおよびＲＮａｓｅ  Ｈ分解に抵抗するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖の能力を含む。
【０１１４】
オリゴマーと標的配列との間に形成された二本鎖の安定性は、結ＴＭの関数であり、細胞の酵素的切断に対する二本鎖の感受性を示す。相補的配列ＲＮＡに関するオリゴマーのＴＭは、Ｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐｐ．１０７−１０８によって、またはＭｉｙａｄａ  Ｃ．Ｇ．ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒ．Ｂ．，１９８７，Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  Ｖｏｌ．１５４  ｐｐ．９４−１０７に記載されるものなどの従来的方法により測定され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、相補的配列ＲＮＡに関して、体温より高い、結合ＴＭを有し得、いくつかの実施形態では、約４５℃または５０℃超である。６０〜８０℃の範囲のＴＭまたはそれより高い温度もまた含まれる。周知の原則によると、相補的塩基ＲＮＡハイブリッドに関するオリゴマーのＴＭは、二本鎖におけるＣ：Ｇ塩基対の比を増加することによって、またはヘテロ二本鎖の長さ（塩基対の）を増加することによって、または両方を増加させることにより増加させ得る。同時に、細胞取込みを最適化する目的で、オリゴマーのサイズを制限することが有利であり得る。この理由から、本開示の化合物は、２５塩基以下の長さで、高いＴＭ（４５〜５０℃以上）を示す化合物を含む。
【０１１５】
オリゴヌクレオチドの長さは、Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子内の意図された位置に選択的に結合することができる限り、長くなり変化し得る。こうした配列の長さは、本明細書に記載の選択手順に従って決定し得る。一般的に、オリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチド〜最大約５０ヌクレオチドの長さである。例えば、オリゴヌクレオチド（ｚ）の長さは、８〜３８、８〜２５、１５〜２５、１７〜２１、２０〜２５、２０〜３０、１８〜２３、１９〜２４、２１〜２６、２２〜２７、２３〜２８、２４〜２９、２５〜３０、２６〜３１、または約１８であり得る。いくつかの実施形態では、長さは、１０、１１、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１ヌクレオチドであり得る。しかしながら、これらの範囲内のヌクレオチドの任意の長さは、本明細書に記載の方法で使用され得ることが理解される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基修飾または置換を含む。例えば、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を向上させるために、特定の核酸塩基を選択し得る。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシンンおよび２，６−ジアミノプリンを含むＮ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させると示されており、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれてもよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのピリミジン塩基は、５−置換ピリミジン塩基を含み、ピリミジン塩基は、シトシン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される。一実施形態では、５−置換ピリミジン塩基は５−メチルシトシンである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのプリン塩基は、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基を含む。一実施形態では、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基は、２，６−ジアミノプリンである。
【０１１７】
（アンチセンスオリゴマーを含む）モルホリノ系オリゴマーおよびその合成は、例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；第５，２１７，８６６号；第５，１４２，０４７号；第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，５２１，０６３号；第５，５０６，３３７号および米国特許出願第１２／２７１，０３６号；第１２／２７１，０４０号；国際公開第２００９／０６４４７１号、国際公開第２０１２／０４３７３０号、国際公開第２０１７／２０５５１３号、国際公開第２０１７２０５８７９号、国際公開第２０１７／２０５８８０号、ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１８７−１９５に詳細が記載され、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１１８】
したがって、一態様において、本明細書では、式ＩＩ：
【化２９】
2021518361.tif 000031
のオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容可能な塩が提供され、
式中、
Ａは、ＯＨ、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化３０】
2021518361.tif 000032
からなる群から選択され、
Ｒ５は−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘＯＨであり、ｘは３〜１０であり、各アルキル基は独立して−Ｃ２−６−アルキルであり、またはＲ５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−Ｃ１−６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ１−６−ヘテロアルキル−Ｒ６，−アリール−Ｒ６，−ヘテロアリール−Ｒ６，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−６−アルキル−Ｒ６，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６からなる群から選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、ＳＨ、およびＮＨ２からなる群から選択され、またはＲ６は、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、固体支持体に共有結合され、
各Ｒ１は、独立してＯＨまたは−ＮＲ３Ｒ４であり、
各Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して−Ｃ１−６−アルキルであり、
各Ｒ２は、Ｈ、核酸塩基、および化学的保護基で官能化された核酸塩基からからなる群から独立して選択され、核酸塩基は独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、およびデアザプリンから選択されるＣ３−６複素環リングを含み、
ｚは８〜４０であり、
Ｅは、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチルからなる群から選択され、
【化３１】
2021518361.tif 000033
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ(Ｏ）−であり、
Ｒ７は−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、
式ＩＩの一実施形態では、Ａは
【化３２】
2021518361.tif 000034
であり、
Ｅは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、およびステアロイルからなる群から選択され、
Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであって、式中、各アルキル基はそれぞれ独立して−Ｃ２−６−アルキル、トリチル、および４−メトキシトリチルであり、
各Ｒ２は独立して核酸塩基であり、核酸塩基はそれぞれ独立して、ピリジン、ピリミジン、プリン、およびデアザプリンから選択されるＣ４−６−複素環リングを含む。
【０１１９】
式ＩＩの別の実施形態では、Ｒ５はＣ（Ｏ）（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＨであり、
各Ｒ２は独立して核酸塩基であり、核酸塩基はそれぞれ独立してピリミジンまたはプリンを含む。
【０１２０】
さらに別の実施形態では、式ＩＩのオリゴヌクレオチドは式ＩＩａのオリゴヌクレオチドである。
【化３３】
2021518361.tif 000035
【０１２１】
式ＩＩおよびＩＩａの一実施形態では、各Ｒ２は独立して、アデニン、２，６−ジアミノプリン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、およびヒポキサンチンであり、
各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１２２】
表１では、本明細書に記載されるヌクレオチド部分の様々な実施形態が提供される。
表１：ヌクレオチド部分の様々な実施形態。
【表１】
2021518361.tif 000036
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは非溶媒和化される。別の実施形態では、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドは溶媒和形態である。当該技術分野で公知のように、溶媒は、水、エタノール等の薬学的に許容可能な任意の溶媒であり得る。
【０１２４】
式ＩＩおよびＩＩａのオリゴヌクレオチドはそれらの中性形態で示されているが、いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは薬学的に許容可能な塩形態で使用される。
【０１２５】
キメラペプチド
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、キメラペプチドに結合したオリゴヌクレオチド部分を含む。特に、キメラペプチドは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、二つの細胞膜透過ペプチドは独立して両親媒性ペプチドまたはオリゴアルギニンペプチドである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、二つの細胞膜透過ペプチドは一つの両親媒性ペプチドおよび一つのオリゴアルギニンペプチドを含み、オリゴアルギニンペプチドはキメラペプチドのＣ末端であり、両親媒性ペプチドはキメラペプチドのＮ末端である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの少なくとも一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【０１２８】
特定の実施形態では、細胞膜透過ペプチドの一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【０１２９】
こうしたキメラペプチドの代表を以下に示す：
【化３４】
2021518361.tif 000037
【０１３０】
式中、Ｎ末端はオリゴヌクレオチドに共有結合する。
【０１３１】
特定の実施形態では、二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドは、アミド結合によって共有結合している。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、キメラペプチドは化合物の細胞への輸送を強化するのに有効であり得る。輸送部分は、一部の実施形態では、オリゴマーの末端に付着する。ペプチドは、所与の細胞培養群の細胞の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内の、その間のすべての整数を含む、細胞膜透過を誘発する能力を有し、全身投与においてｉｎ  ｖｉｖｏでの複数の組織内の高分子転位を可能にする。
【０１３３】
上述のような輸送部分は、付着した輸送部分が存在しない場合のオリゴマーの取込みに対し、付着したオリゴマーの細胞移入を大幅に強化することが示されている。取込みは、コンジュゲートされていない化合物に対して、少なくとも３倍、および一部の実施形態では５０倍強化され得る。いくつかの実施形態では取込みが強化され得るが、いくつかの実施形態では、非キメラオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートに対して、３倍強化され得る。
【０１３４】
キメラペプチドの使用は、本開示の実践において特に有用である。特定のキメラペプチドトランスポーターは、筋細胞を含む一次細胞へのアンチセンス化合物の送達時に非常に効果的であることが示されている。さらに、本明細書に記載されるキメラペプチドトランスポーターは、アンチセンスＰＭＯにコンジュゲートされたとき、いくつかの遺伝子転写物のスプライシングを変化させる強化された能力を呈する。
【０１３５】
したがって、一態様では、２、３、４、または５つの共有結合した細胞膜透過ペプチド、またはその薬学的に許容可能な塩であるキメラペプチドが本明細書に提供される。
【０１３６】
一実施形態では、各キメラペプチドは２、３、４、または５つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドは独立して両親媒性ペプチドまたはオリゴアルギニンペプチドである。
【０１３７】
別の実施形態では、各キメラペプチドは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドである。
【０１３８】
別の実施形態では、各キメラペプチドは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、二つの細胞膜透過ペプチドは独立して両親媒性ペプチドまたはオリゴアルギニンペプチドである。
【０１３９】
別の実施形態では、各キメラペプチドは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、両親媒性ペプチドであり、細胞膜透過ペプチドの一つは、オリゴアルギニンペプチドである。
【０１４０】
さらに別の実施形態では、各キメラペプチドは二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドであり、二つの細胞膜透過ペプチドは一つの両親媒性ペプチドおよび一つのオリゴアルギニンペプチドを含み、オリゴアルギニンペプチドはＪのＣ末端であり、両親媒性ペプチドはＪのＮ末端である。
【０１４１】
さらに別の実施形態では、各キメラペプチドは、アミド結合によって共有結合された二つの共有結合した細胞膜透過ペプチドである。
【０１４２】
別の実施形態では、オリガニンペプチドは配列［（ＲＹｚＲ）ｘ］であり、式中、Ｒはアルギニンであり、Ｙは独立してアミノヘキサン酸（Ｘ）またはＢ−アラニン（Ｂ）、ｚは１であり、ｘは１、２、３、４、または５である。
【０１４３】
さらに別の実施形態では、キメラペプチドのオリガニンペプチドは配列［（ＲＸＲ）（ＲＢＲ）］ｘまたは［（ＲＢＲ）（ＲＸＲ）］ｘであり、式中、Ｒはアルギニンであり、Ｘはアミノヘキサン酸であり、ＢはＢ−アラニンであり、ｘは１または２である。
【０１４４】
さらに別の実施形態では、キメラペプチドのオリゴアルギニンペプチドは、［（ＲＸＲ）（ＲＢＲ）］２（Ｂｐｅｐ）である。
【０１４５】
別の実施形態では、キメラペプチドの両親媒性ペプチドは疎水性ペプチジルセグメントおよび親水性ペプチジルセグメントを含み、疎水性ペプチジルセグメントが、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンから独立して選択される２〜１０のアミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントが、荷電アミノ酸、非荷電の極性アミノ酸、または疎水性アミノ酸から独立して選択される２〜２０のアミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントが、少なくとも一つの非疎水性アミノ酸を含む。
【０１４６】
特定の実施形態では、疎水性セグメントは、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンから独立して選択される２〜１０アミノ酸の配列を含む。
【０１４７】
特定の実施形態では、疎水性セグメントが、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、またはグリシンから独立して選択される２〜２０のアミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントが、少なくとも一つの非疎水性アミノ酸を含む。
【０１４８】
一実施形態では、キメラペプチドの両親媒性ペプチドはｐＶＥＣ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、またはメリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）である。
【０１４９】
一実施形態では、キメラペプチドの両親媒性ペプチドはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎである。
【０１５０】
一実施形態では、キメラペプチドはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲ  ＫＱＡＨＡＨＳＫＲＸ  ＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲ）、メリチン−Ｂｐｅｐ（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴ  ＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ  ＫＲＫＲＱＱＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、またはＢｐｅｐ−Ｂｐｅｐ（ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲＲＸ  ＲＲＢＲ）である。
【０１５１】
一実施形態では、キメラペプチドはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲ  ＫＱＡＨＡＨＳＫＲＸ  ＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲ）、またはメリチン−Ｂｐｅｐ（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴ  ＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩ  ＫＲＫＲＱＱＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）である。
【０１５２】
一実施形態において、キメラペプチドは、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫＲＸＲＲ  ＢＲＲＸＲＲＢＲ）である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるキメラペプチドは、非溶媒和化される。別の実施形態では、キメラペプチドのうちの一つまたは複数は溶媒和形態である。当該技術分野で公知のように、溶媒は、水、エタノール等の薬学的に許容可能な任意の溶媒であり得る。
【０１５４】
キメラペプチドはそれらの中性形態で示されているが、いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは薬学的に許容可能な塩形態で使用される。
【０１５５】
方法
本明細書において、式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂのペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における神経筋疾患、筋疾患、ウイルス感染、または細菌感染症を治療する方法が提供される。
【０１５６】
したがって、一態様では、本明細書において、本開示のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における筋疾患、ウイルス感染、神経筋疾患、または細菌感染症を治療する方法が提供される。
【０１５７】
一実施形態では、神経筋疾患はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。
【０１５８】
別の実施形態では、ウイルス感染は、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、およびデングウイルスからなる群から選択されるウイルスによって生じる。
【０１５９】
別の実施形態では、細菌感染は結核菌によって生じる。
【０１６０】
本明細書において考慮される対象は典型的にはヒトである。しかしながら、対象は治療が望まれる任意の哺乳類であり得る。したがって、本明細書に記載される方法は、ヒトおよび家畜用途の両方に適用し得る。
【０１６１】
投与／投薬
治療組成物の製剤化およびそれらのその後の投与（投薬）は、当業者の技能の範囲内である。投薬は、治療される病態の重症度および応答性に依存し、治療過程は数日〜数ヶ月継続されるか、または病態の十分な減退が達成されるまで継続される。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定値から計算され得る。
【０１６２】
当業者であれば、最適用量や投薬手法および繰り返し率を容易に決定し得る。最適用量は、個々のオリゴマーの相対的な有効性に応じて変化し得るが、一般的にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効的と見出されたＥＣ５０に基づいて推定され得る。一般的に、投与量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、毎日、毎週、毎月、毎年、またさらには２〜２０年に一回または複数回投与され得る。当業者であれば、体液または組織中の薬剤の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投与のための繰り返し率を容易に推定し得る。治療成功後、患者は病態の再発を防止するための維持療法を受療ことが望ましい場合があり、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で、１日〜２０年間に一回または複数回投与される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチド）が単独投与される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは治療有効量または投与量で投与される。「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、それ単独で患者に投与された時、筋疾患、ウイルス感染、または細菌感染症を効果的に治療する式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドの量である。特定の対象において「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」となる量は、その用量が当業者によって「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とみなされると考えられる場合でも、検討中の疾患または状態について同様に治療された対象の１００％に有効ではない場合がある。治療有効量に対応するオリゴヌクレオチドの量は、疾患、疾患のステージ、治療される患者の年齢、およびその他の要因に強く依存する。
【０１６５】
異なる実施形態では、式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチド、および使用される有効量に応じて、オリゴヌクレオチドは、筋疾患、ウイルス感染、または細菌感染に関与する遺伝子の発現を調節し得る。
【０１６６】
式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドの量が、筋疾患、ウイルス感染、または細菌感染の効果的治療をもたらしながら、分量は患者に対して過剰に毒性がないことが好ましい（すなわち、医療ガイドラインによって定められる用量毒性制限内であることが好ましい）。いくつかの実施形態では、筋疾患、ウイルス感染、または細菌感染の過剰な毒性を防止するか、もしくはより有効な治療を提供するか、またはその両方のために、総投与量の制限が提供される。典型的には、本明細書で検討される量は一日当たりの量であるが、半日および二日または三日サイクルも本明細書で検討される。
【０１６７】
筋疾患、ウイルス感染、または細菌感染症を治療するために異なる投与レジメンが使用され得る。いくつかの実施形態では、上述の例示的用量のいずれかなどの毎日の投与量が、三日、四日、五日、六日、七日、八日、九日、または十日間にわたって、一日一回、二回、三回、四回投与される。治療される疾患のステージおよび重症度に応じて、高用量でより短い治療期間（例えば、最大五日など）も採用され得、または低用量でより長い治療期間（例えば、十日以上、または数週間または一ヶ月以上など）も採用され得る。いくつかの実施形態では、一日一回または二回の投薬は、隔日投与される。
【０１６８】
純粋な形態または適切な医薬組成物での、式ＩＩおよびＩＩａのオリゴヌクレオチド、またはそれらの薬学的に許容可能な塩または溶媒形態は、当技術分野で公知の、認可された投与方法または薬剤のいずれかを介して投与され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、経口、鼻腔、非経口（静脈内、筋肉内、または皮下）、局所、経皮、膣内、膀胱内、大槽内、または直腸内に投与し得る。剤形は、正確な用量の簡単な投与に適した単位剤形での、例えば、錠剤、丸薬、軟質弾性または硬質ゼラチンカプセル、粉末、溶剤、懸濁液、坐剤、エアロゾルなどの、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体剤形とすることができる。特定の投与経路は経口であり、治療される疾患の重症度の程度によって、好都合に毎日の投与レジメンを調節し得る経路である。
【０１６９】
補助剤およびアジュバント剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、懸濁液、甘味剤、香味剤、香料、乳化剤、および調剤を含み得る。微生物の作用の防止は、一般的に、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など、様々な抗菌剤および抗真菌剤によって提供される。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤も含まれ得る。注射可能な医薬品の持続的吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど、吸収を遅延する薬剤の使用によってもたらされ得る。補助剤はまた、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および抗酸化剤を含み得る。
【０１７０】
固体剤形は、腸溶性コーティングおよび当技術分野で公知のその他のコーティングおよびシェルで調製され得る。これらは緩和剤（ｐａｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）を含むことができ、または、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを腸管のある一定の部分において遅延した方法で放出する組成物からなることができる。使用できる組み込まれた組成物の例は、高分子物質およびろうである。活性オリゴヌクレオチドはまた、適切な場合、上述の賦形剤のうちの一つまたは複数を有する、マイクロカプセル形態であってもよい。
【０１７１】
経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容可能な乳剤、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。このような剤形は、例えば、本明細書に記載されるコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩、および任意選択で水、塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの担体中の補助剤；例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミドなどの可溶化剤および乳化剤；特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油などの油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物などを溶解し、分散させて溶液または懸濁液を生成することによって調製される。
【０１７２】
一般的に、意図された投与方法に応じて、薬学的に許容可能な組成物は、薬学的に許容される組成物は、約１重量％〜約９９重量％の本明細書に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩、および９９重量％〜１重量％の薬学的に許容される賦形剤を含む。一例では、組成物は本明細書に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩約５重量％〜約７５重量％であり、残りは適切な医薬用賦形剤である。
【０１７３】
このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０）参照。
【０１７４】
キット
その他の実施形態では、キットが提供される。本開示によるキットは、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、または本開示の組成物を含むパッケージを含む。いくつかの実施形態では、キットは、式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂ、によるペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート、または薬学的に許容可能な塩を含む。いくつかの実施形態では、キットは、式ＩＩまたはＩＩａによるオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容可能な塩を含む。いくつかの実施形態では、キットは、式ＩＩＩによるペプチド、または薬学的に許容可能な塩を含む。
【０１７５】
「パッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）」という語句は、本明細書に提示されるオリゴヌクレオチドまたは組成物を含む任意の容器を意味する。いくつかの実施形態では、パッケージは箱または包装であり得る。包装医薬品で使用するための包装材料は、当業者に周知である。医薬用包装材料の例は、限定するものではないが、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、コンテナ、シリンジ、ボトル、ならびに選択された製剤および意図される投与方法および治療のために適切な任意の包装材料を含む。
【０１７６】
キットはまた、パッケージ内に含まれないが、例えばピペットのようにパッケージの外側に取り付けられる品目も含み得る。
【０１７７】
キットはさらに、本開示のオリゴヌクレオチドまたは組成物を患者に投与するための指示を含み得る。キットはまた、米国食品医薬品局などの規制当局により承認された本明細書のオリゴヌクレオチドの使用のための指示を含み得る。キットはまた、オリゴヌクレオチド用の標識または製品インサートを含み得る。パッケージまたは製品インサート、またはその両方は、それ自体が規制当局によって承認され得る。キットは、パッケージ内の固相中、または液相（提供されるバッファなど）中のオリゴヌクレオチドを含み得る。キットはまた、方法を実施するための溶液を調製するためのバッファ、および液体を一つの容器から別の容器に移すためのピペットを含み得る。
【実施例】
【０１７８】
実施例は、例示の目的で、本開示のある特定の実施形態を説明するために以下に記載される。しかしながら、特許請求の範囲は、決して本明細書に記載される実施例によって制限されるものではない。開示された実施形態に対する様々な変更および修正が当業者に明らかであり、そのような変更および修正は、限定するものではないが、本開示の化学構造、置換基、誘導体、製剤または方法に関するものを含み、本開示の精神および添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書のスキームにおける構造の変数の定義は、本明細書に提示される式の対応する位置のそれに等しい。
【０１７９】
ランダムコイルのオリゴアルギニンＣＰＰと両親媒性ＣＰＰからなるキメラペプチドは、ＰＭＯ活性を向上させ得る。各ＣＰＰがエンドサイトーシスの異なるメカニズムを利用している場合、キメラは細胞移入の複数のメカニズムにアクセスし得る。さらに、異なるＣＰＰは、エンドソーム脱出または核移入などの取込みの下流プロセスに有益な影響を与え得る。本明細書では、相加的というよりはむしろ相乗的な、生物学的アッセイでのＰＭＯ有効性における利益を呈する、両親媒性／オリゴアルギニンＣＰＰキメラが示される。ＣＰＰキメラは、このアッセイにおいて、ＰＭＯ活性の効果的なＣＰＰ標準（Ｂｐｅｐ）よりも優れた性能を示す。
【０１８０】
キメラＣＰＰがＰＭＯ有効性を改善するかどうかを評価するために、ＨｅＬａ−６５４  ｅＧＦＰアッセイでコンジュゲートを評価した。このアッセイでは、ＨｅＬａ細胞は、ヒトβ−グロビン遺伝子の突然変異イントロン（ＩＶＳ２−６５４）で中断されたｅＧＦＰ配列で安定的に形質移入される。突然変異は、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ配列中のβ−グロビンフラグメントの保持をもたらす暗号スプライス部位を生成する。翻訳時、ｅＧＦＰは非蛍光である。コンジュゲートで利用されるＩＶＳ２−６５４  ＰＭＯは、突然変異イントロンにハイブリダイズして、異常な遺伝子スプライシングを防止し、機能的な蛍光ｅＧＦＰをコードするｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ配列をもたらす。したがって、送達されるＰＭＯの量は、機能的ｅＧＦＰの量に相関する。
【０１８１】
ＨｅＬａ−６５４  ｅＧＦＰ細胞は、血清含有培地中で、各コンジュゲート５μＭで処置された。２２時間後、細胞の蛍光はフローサイトメトリーによって解析された（図１Ｃ）。四つのＣＰＰキメラすべてが、ＰＭＯ送達において一貫して高性能のＣＰＰである、Ｂｐｅｐより優れた性能を示した。最上位の性能のキメラであるＰＭＯ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐは、未処理細胞のバックグラウンド蛍光と比較して、ｅＧＦＰにおいて約７０倍の増加を有した。参考までに、これは、コンジュゲートされていないＰＭＯに対する２０倍超の改善であり、ＰＭＯ−Ｂｐｅｐに対する２倍の改善である。
【０１８２】
ＰＭＯ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＢｐｅｐおよびＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐの両方が相乗効果を示し、ＰＭＯ−キメラＣＰＰの活性はＰＭＯ−ＣＰＰの各々から個々に予想される活性の合計よりも大きかった。例えば、ＰＭＯ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎは７倍の増加、およびＰＭＯ−ＢｐｅｐはｅＧＦＰ蛍光において３５倍の増加を示した。相加効果は、ＰＭＯ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐに対するｅＧＦＰ蛍光の４２倍の増加をもたらすことになる。しかしながら、ＰＭＯ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−Ｂｐｅｐキメラは、ｅＧＦＰ蛍光のほぼ７０倍の増加を有したが、これは相加効果よりも約１．５倍優れた性能を示すことを意味する。同様の相乗効果がＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐについて観察されたが、ここで測定されたｅＧＦＰ蛍光は部分の合計よりも１．５倍大きかった。
【０１８３】
興味深いことに、相乗的キメラの両方（ＰＭＯ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＢｐｅｐおよびＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ）について、ペプチドの順序を切り替えると、観察される平均蛍光が減少した（図２Ａ）。この観察は、相乗効果を観察するためにはＣ末端構成要素としてＢｐｅｐを有することが重要であることを示唆する。
【０１８４】
ＰＭＯ活性の増加は、共有結合されるキメラの二成分ペプチドを必要とする、または必要としない場合がある。ｅＧＦＰアッセイを、５μＭ  Ｂｐｅｐの存在下および非存在下で、ＰＭＯ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ＰＭＯ−ｐＶＥＣ、ＰＭＯ−メリチンおよびＰＭＯ−Ｂｐｅｐを用いて繰り返した。（図２Ｃ）。すべての場合において、ＰＭＯ−ＣＰＰコンジュゲートは、Ｂｐｅｐの存在下および非存在下で同じ性能を示した。この結果は、二つのＣＰＰを共有結合することが、活性の改善を観察するために必要であることを示す。ｅＧＦＰ  ＨｅＬａ細胞は、ＰＭＯ活性に関する機能アッセイを提供し、さらに多くの機械的工程がこの最終的なリードアウトに貢献する。何らかの効果を生成するためには、ＰＭＯコンジュゲートのどれもが、細胞内に内在化され、エンドサイトーシスされた場合にはエンドソームを脱出し、核に局在化されねばならない。キメラの異なる部分は、これらの工程のうちの一つまたは複数における支援を受け得る。関与する生物学的プロセスの複雑さを考慮すると正確なメカニズムを決定的に示すことは困難であるが、追加の洞察を得るために徹底的に研究するために一つのモデルキメラが選択された。相乗効果を示し、血漿膜を破壊しなかったため、この目的のためにＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐが選択された。さらに、ＰＭＯ−ｐＶＥＣの不良な性能は、ＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐの強力な性能を驚くべき、かつ興味深い結果とならしめた。
【０１８５】
細胞取込み経路を評価するための実験によってメカニズム研究が実行された。エネルギー依存性経路が関与しているかどうかを調べるために、４℃対３７℃で処置後、ＰＭＯ活性を測定した。実験は、ＨｅＬａ  ｅＧＦＰ細胞を５μＭ  ＰＭＯ−ｐＶＥＣ、ＰＭＯ−Ｂｐｅｐ、またはＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐを用いて、４℃または３７℃のいずれかで３時間にわたってインキュベートした、パルス追跡形式で実行された（図３Ａ）。その後、処置培地を新鮮培地に交換し、追加で２２時間にわたって細胞を増殖させた。ＭＯ−Ｂｐｅｐを除くすべての化合物について、４℃で処置した場合にｅＧＦＰ蛍光の減少があった。この結果は、エネルギー依存性メカニズムがＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐキメラの取込みに関連することを示唆する。特にＰＭＯ−Ｂｐｅｐの結果は、４℃で処置中、細胞表面に結合するいずれかのコンジュゲートが、その後内部移行し、処置後に細胞が３７℃で追加的に２２時間にわたってインキュベートされたとき、ｅＧＦＰ発現を誘発し得ることが注目される。
【０１８６】
さらに、細胞へのＰＭＯ−ｐＶＥＣ、ＰＭＯ−Ｂｐｅｐ、およびＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐの内部移行に対する複数のエンドサイトーシス阻害剤の効果を研究した（図３Ｂ）。実験をパルス追跡形式で実施し、ｅＧＦＰ  ＨｅＬａ細胞を阻害剤でプレインキュベートした。３０分のプレインキュベート後、ペプチドを加え、三時間後に処理培地を新鮮培地と交換し、細胞をさらに２２時間増殖させた。大部分の阻害剤は効果を有しなかった。しかしながら、高濃度のクロルプロマジンでは、ＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐキメラで処置された細胞内でｅＧＦＰ蛍光が減少した。クロルプロマジンはクラスリン媒介エンドサイトーシスの阻害剤とみなされるが、それはプロセスの下流構成要素に影響を及ぼす可能性がある。
【０１８７】
キメラの取込みにおけるクラスリン媒介エンドサイトーシスの可能性のある役割を超えて、これらのデータは、ＰＭＯ−ｐＶＥＣまたはＰＭＯ−Ｂｐｅｐのいずれかでも明らかな減少は観察されなかったため、キメラが一意の内部移行メカニズムにアクセスすること示す。
【０１８８】
最後に、構築物をｅＧＦＰに直交する小分子有機染料で標識して、化合物の取込みと機能的なエクソンスキッピング活性を同時に監視できるようにした。この形式の実験は、ＰＭＯ有効性から細胞内部移行のデコンボリューションの助けとなり得る。これらの化合物を調製するために、ｐＶＥＣ、Ｂｐｅｐ、およびｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐを配列のＮ末端にシステイン残基で合成し、その後、前述のように、末端を４−ペンチン酸でキャップした。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製後、ペプチドを等モルのＳｕｌｆｏ−Ｃｙａｎｉｎｅ５マレイミドで水中に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより再度精製した。最後に、ＳｕｌｆｏＣｙ５−標識ペプチドはすべて、銅触媒クリックケミストリーを介してＰＭＯ−アジドにコンジュゲートされ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された。
【０１８９】
ＳｕｌｆｏＣｙ５−標識された構築物を使用して、ｅＧＦＰ  ＨｅＬａ細胞を用いたフローサイトメトリー実験を実施した。細胞を結成含有培地中で各コンジュゲート５μＭを用いて２２時間にわたって処置し、その後フローサイトメトリーで解析した（図４Ａ）。ｅＧＦＰ蛍光については、４８８ｎｍの励起レーザーおよび５３０ｎｍの放射フィルターを使用し、ＳｕｌｆｏＣｙ５については、５６１ｎｍの励起レーザーと６９５ｎｍの放射フィルターを使用した。チャネルの分離によって、両方のフルオロフォアからの蛍光が同時に記録可能となった。非標識化ＰＭＯ−ｐＶＥＣ、ＰＭＯ−Ｂｐｅｐ、およびＰＭＯ−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐを処置して、フルオロフォアが所与のコンジュゲートの効果を摂動したかどうかを判断した。すべての場合で、付着したフルオロフォアでｅＧＦＰ蛍光がわずかに減少したが、フルオロフォアがコンジュゲートの有効性に影響を与えながらも、それが極めて均一であることを示唆している。
【０１９０】
ＳｕｌｆｏＣｙ５蛍光の観点から言えば、ＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ＢｐｅｐはＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ｐＶＥＣまたはＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐよりも少ない蛍光を示した。しかしながら、ＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−Ｂｐｅｐは、ｅＧＦＰ発現を促進する比較的高い能力を有していた。この結果は、ＰＭＯ−Ｂｐｅｐの全体的な細胞取込みがＰＭＯ−ｐＶＥＣよりも小さい一方、Ｂｐｅｐは有益な下流効果を有することを示唆する。改善されたエンドソーム脱出、核移入、ＲＮＡ結合、またはスプライス修飾は、ＰＭＯ−Ｂｐｅｐに対する比較的高いｅＧＦＰ蛍光をもたらす可能性がある。一方、ＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ｐＶＥＣは高いＳｕｌｆｏＣｙ５蛍光を有したが、ｅＧＦＰ発現には乏しく、これは化合物が良好な細胞取込みを有するが、下流のどこかに限界を有することを示す。ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐキメラは最高のｅＧＦＰ発現および最高のＳｕｌｆｏＣｙ５蛍光の両方を示したが、ＳｕｌｆｏＣｙ５蛍光はｐＶＥＣと同様のスケールであった。したがって、キメラの相乗効果に基づく仮説は、ｐＶＥＣ成分が、Ｂｐｅｐの有益な下流効果を妨げることなく細胞取込みを改善することである。
【０１９１】
この仮説をさらに試験し、エンドソームに局在化した物質の範囲について検討するために、ＨｅＬａ  ｅＧＦＰ細胞における生細胞共焦点顕微鏡撮像実験を行った。Ｒａｂ５ａ−ＲＦＰ融合タンパク質を初期エンドソームを標識するために使用する以外、フローサイトメトリーアッセイと同じ処置条件を使用した。治療後かつ撮像の１６時間前に、ＨｅＬａ  ｅＧＦＰ細胞を、バキュロウイルスベクターを利用したＲａｂ５ａ−ＲＦＰ融合構築物で一過性にトランスフェクトした。ＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ｐＶＥＣが、エンドソームの混入によるｅＧＦＰ発現の誘発に不十分な有効性を有する場合、ＲＦＰ信号はＳｕｌｆｏＣｙ５の信号と共存すると推論された。
【０１９２】
撮像データは、フローサイトメトリーデータと非常に良好に相関する（図４Ｂ）。ＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ｐＶＥＣおよびＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐの両方を用いて、明るいＳｕｌｆｏＣｙ５信号を点状に濃縮する。一部のＳｕｌｆｏＣｙ５信号はＲＦＰ信号と共存し、初期エンドソームへの局在化を示す一方、他のＳｕｌｆｏＣｙ５の点は後期エンドソームおよびリソソームである可能性が高い。これらの画像は、内部移行の主要メカニズムがエンドサイトーシスであり、かつエンドソームの混入が、顕著な細胞取込みにも関わらず、特定の構築物についてＰＭＯ活性を制限できるというさらなる根拠を提供する。
【０１９３】
本明細書では、個別のＣＰＰが高分子送達の異なる要素に有用でありうるというメカニズム研究を示した。ＣＰＰからなるキメラペプチドは、ＰＭＯ送達およびエクソンスキッピング効果の相乗的改善を示し得ることも示した。配列の相対位置は、取込みの程度に影響し、両方のペプチドはＣＰＰでなければならず、それらは効果を観察するために共有結合していなければならない。
【０１９４】
実施例１：ペプチド調製および精製の一般的方法
高速フローペプチド合成
自動フローペプチド合成物を使用して０．１−ｍｍｏｌスケールでペプチドを合成した。ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＨＹＲ樹脂（２００ｍｇ）を９０℃で維持された反応器に装填した。すべての試薬を、反応器に導入する前に９０℃で維持されたステンレス鋼ループを通してＨＰＬＣポンプを用いて８０ｍＬ／分で流した。各結合について、ＤＭＦ中アミノ酸０．２ＭとＨＡＴＵ  ０．２Ｍを含む溶液１０ｍＬを、ジイソプロピルエチルアミン２００μＬと混合し、反応器に送液した。Ｆｍｏｃ除去は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン１０．４ｍＬを使用して達成された。それぞれの工程間で、ＤＭＦ１５ｍＬを使用して反応器を洗浄した。最終的な結合は、アミノ酸ではなく、４−ペンチン酸であったが、同じ条件を使用していた。合成の完了後、樹脂をＤＣＭを用いて３回洗浄し、真空下で乾燥させた。
【０１９５】
ペプチド切断および脱保護
各ペプチドは、試薬Ｋ  ６ｍＬ（トリフルオロ酢酸８２．５％、フェノール５％、水５％、チオアニソール５％、および１，２−エタンジオール（ＥＤＴ）２．５％）を用いた処置によって、同時グローバル側鎖脱保護および樹脂からの切断に供された。切断は、Ｐｂｆの完全な除去を確保するために、室温で１６時間放置された。切断カクテルを濾過して樹脂を除去し、混合物を通してＮ２を泡立てることによって蒸発させた。次いで、約３５ｍＬの低温エーテルを加え、粗生成物を三分間遠心分離によってペレット化した。このエーテルの粉砕および遠心分離をさらに二回繰り返した。三回目の洗浄後、ペレットを水５０％、アセトニトリル５０％中で再溶解し、凍結乾燥した。
【０１９６】
ペプチド精製
溶媒Ａ：ＴＦＡ  ０．１％を含有する水
溶媒Ｂ：ＴＦＡ  ０．１％を含有するアセトニトリル
凍結乾燥ペプチドを最小体積の移動相（Ａ  ９５％、Ｂ  ５％）に溶解した。溶液を質量ベースの精製システムに取付られた逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ１８カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍまたはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍ）に装填した。線形グラジエントは、０．５％  Ｂ／分で、５％  Ｂ〜５５％  Ｂで実行された。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度はＬＣ−ＭＳによって確認された。
【０１９７】
実施例１のプロトコルを使用して、図１Ａおよび表２のペプチドを合成した。
表２：細胞膜透過ペプチド
【表２】
2021518361.tif 000038
【０１９８】
実施例２：ペプチドコンジュゲート
【化３５】
2021518361.tif 000039
【０１９９】
５−アジドペンタンをＰＭＯに合成する手順
ＰＭＯ  ＩＶＳ−６５４（Ｒ２＝５’−ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ−３’；ｚ＝１８）（２００ｍｇ，３２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ  ６００μＬ中で溶解した。この溶液に、ＨＢＴＵ（ＤＭＦ中、０．４Ｍ  ＨＢＴＵ  ３２０μＬ、１２８μｍｏｌ）で活性化された４当量の５−アジドペンタン酸（１３．６μＬ、１２８μＬ）およびＤＦＡ  ２４４μＬ中のＤＩＥＡ（２２．３μＬ、１２８μｍｏｌ）を含む溶液を加えた（最終反応量＝１．２ｍＬ）。反応は、水１ｍＬ、および水酸化アンモニウム２ｍＬで急冷する前に２５分間にわたって行われた。水酸化アンモニウムは、反応の過程で形成されたエステルを加水分解する。１時間後、溶液を４０ｍＬに希釈し、逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：２１．２×１００ｍｍ、５μｍ）および線形グラジエント２〜６０％  Ｂ（溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：アセトニトリル）を用いて、５８分間にわたって精製した（１％  Ｂ／分）。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度はＬＣ−ＭＳによって確認された。凍結乾燥により、１７１ｍｇの乾燥粉末（収率８４％）を得た。
アジド／アルキンヒュスゲン環化付加によるＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートの一般的手順
セプタムキャップを有する２０ｍＬシンチレーションバイアルを、ペプチドアルキン（１．１μｍｏｌ）、ＩＳＶ２−６５４アジド（０．９５μｍｏｌ）、および臭化銅（０．０５ｍｍｏｌ）で充填した。バイアルを５分間にわたって窒素でパージして、セプタムを通したＤＭＦの約１ｍＬの添加前に酸素の除去を確実にした。反応混合物を１分間ボルテックスした。２時間後、反応混合物を５０Ｍｍトリス（ｐＨ８）１０ｍＬで希釈し、逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３  ９．４×５０ｍｍ、５μｍ）に装填した。クロマトグラフィーを、５〜４５％  Ｂから線状グラジエントを用いて２０分間にわたって実施した。溶媒Ａ：酢酸アンモニウム５ｍＭ  水中のｐＨ＝８、溶剤Ｂ：酢酸アンモニウム５ｍＭ  アセトニトリル９０％  水１０％中のｐＨ＝８。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度はＬＣ−ＭＳによって確認された。
【０２００】
実施例３：フルオロフォアコンジュゲート
フルオロフォア標識されたＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートについて、有機染料をＰＭＯへのコンジュゲート前に付着させた。等モルのＳｕｌｆｏＣｙ５マレイミドを、Ｈ２Ｏ  １ｍＬ中のシステイン含有ペプチドにコンジュゲートした。３０分後、反応物質は、ｐＶＥＣおよびｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐについて、８０分超にわたり５〜４５％  Ｂから線形グラジエントを用いて、またＢｐｅｐについて、６０分超にわたり１〜３１％  Ｂから線形グラジエントを用いて、逆相ＨＰＬＣによって精製された。移動相Ａ：ＴＦＡ  ０．１％を含む水。移動相Ｂ：ＴＦＡ  ０．１％を含むアセトニトリル。
【０２０１】
実施例４：フローサイトメトリー
キメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲートのライブラリを試験するため、ＧＦＰ蛍光のフローサイトメトリー分析を実施した。ＨｅＬａ  ６５４細胞は、３７℃および５％  ＣＯ２で、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリンストレプトマイシンで補充したＭＥＭ中で維持された。処置の１８時間前、細胞は、１０％  ＦＢＳおよび１％  ペニシリンスプレプトマイシンで補充したＭＥＭの９６ウェルプレート内に、ウェル当たり５，０００細胞の密度で播種された。実験日、各ＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートのストックをリン酸緩衝血清（ＰＢＳ）中で調製した。ストックの濃度は、２６０ｎｍで吸光度を測定して、かつ１６８，７００Ｌｍｏｌ−１  ｃｍ−１の減衰係数を使用して決定された。細胞を、３７℃および５％  ＣＯ２で２２時間にわたり、１０％  ＦＢＳおよび１％ペニシリンストレプトマイシンで補充されたＭＥＭ中の５μＭの濃度で、各々のコンジュゲートとインキュベートした。次に、処置培地を吸引し、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ  ０．２５％とともに１５分間、３７℃および５％  ＣＯ２でインキュベートし、ＰＢＳで１ｘ洗浄し、２％  ＦＢＳおよび２μｇ／ｍＬ  ヨウ化プロピジウムでＰＢＳ中に再懸濁した。ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上でフローサイトメトリー分析を実施した。細胞がヨウ化プロピオジウムに対して極めて陽性であるか、または主要な細胞群から十分に異なる前方／側方散乱測定値を有する細胞が確実に除外されるようにゲートがデータに適用された。各ヒストグラムは、ＰＭＯ−メリチン−Ｂｐｅｐで処置された細胞を除いて、少なくとも３，０００個のゲートイベントを含む。
【０２０２】
結果を図１Ｃ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび表３に示す。
表３：  コンジュゲートされていないＰＭＯおよび単一ＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートと比較したキメラペプチド−オリゴヌクレオチド−コンジュゲート。
【表３】
2021518361.tif 000040
【０２０３】
実施例５：阻害剤実験
多様なエンドサイトーシスのメカニズムを阻害するために、パルス追跡実験を実施した。手短に、ＨｅＬａ  ６５４細胞は、１０％  ＦＢＳおよび１％  ペニシリンスプレプトマイシンで補充したＭＥＭの９６ウェルプレート内に、ウェル当たり５，０００細胞の密度で播種された。翌日、各阻害剤を用いて指示された濃度で細胞を処置した。３０分後、ＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートを５μＭの濃度で各ウェルに添加した。３７℃および５％  ＣＯ２で約３時間インキュベーションした後、処置培地を新鮮な培地（阻害剤またはＰＭＯ−ペプチドなし）に置き換え、細胞を３７℃および５％  ＣＯ２でさらに２２時間にわたり増殖させた。４℃の実験について、播種後、細胞を４℃で３０分間プレインキュベートし、続いて、５μＭの濃度で各ウェルにＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートを添加した。４℃で約３時間インキュベーションした後、処置培地を新鮮な培地に置き換え、細胞を３７℃および５％  ＣＯ２でさらに２２時間にわたり増殖させた。次いで試料調製およびフローサイトメトリーを上述のように実施した。２０μＭ  サイトカラシンＤでの処置を除いて、各ヒストグラムは少なくとも３，０００個のゲートイベントを含む。
【０２０４】
結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。
【０２０５】
実施例６：生細胞共焦点撮像
ＨｅＬａ  ６５４細胞は、１０％  ＦＢＳおよび１％  ペニシリンスプレプトマイシンで補充したＭＥＭの＃１．５カバーガラスガラスボトム  ９６ウェルプレート内に、ウェル当たり５，０００細胞の密度で播種された。２４時間後、ＰＭＯ−ＳｕｌｆｏＣｙ５−ペプチドコンジュゲートを５μＭの濃度で各ウェルに添加した。その６時間後（撮像の１８時間前）、３μＬ  ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（ＴＭ）初期エンドソーム−ＲＦＰ、ＢａｃＭａｍ  ２．０を各ウェルに添加した（細胞当たり３０粒子に対応）。撮像準備のため、処置培地を吸引し、細胞をＰＢＳで二回洗浄し、細胞をＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ  ヘキスト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）で１０分間染色し、続いてさらに２回ＰＢＳで洗浄した。最後に、細胞をＲＰＩスピニングディスク共焦点顕微鏡上でＰＢＳ中で撮像した。
【０２０６】
結果を図４Ａおよび４Ｂに示す。
【０２０７】
参照による援用
本明細書全体を通して引用されるすべての参考文献（参考文献、交付済み特許、公開済特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の内容は、本明細書においてそれらの全体が本明細書に援用される。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、当業者に一般に公知の意味が付与される。
【０２０８】
均等物
当業者は、本明細書に記載される開示の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または通常の実験のみを用いて確認することができるだろう。または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。こうした均等物は、以下の請求項に包含されることが意図される。
【図１−１】
2021518361.tif 000055
【図１−２】
2021518361.tif 000056
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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