(57)【要約】  透明化大型組織の免疫染色用組成物、及び該組成物を用いることによる透明化大型生体組織の免疫染色方法が開示される。透明化大型組織の免疫染色用組成物は、透明化生体組織、具体的には厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織における抗体浸透性を高めて、抗体を厚い組織に深く浸透させることにより、既存方法での抗体浸透の限界と関連する免疫染色の問題を克服し、大型組織の免疫染色に要する時間を短縮することにより、簡単かつ迅速に大型生体組織に対して高分解能の三次元バイオイメージングが可能となるとともに、構造画像を通じて、種々の疾患の原因特定、新たな治療法の開発、並びに薬剤の有効性及び毒性の予測に有益に用いることができる。さらに、透明化大型組織の免疫染色用組成物は、種々の医療機器と組み合わせて用いることができ、具体的には、キットとして作製することができ、体外診断用機器として有益に用いることができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化生体組織の免疫染色用組成物。
【請求項２】
前記組成物は、全組成物の１００容量部を基準として、５容量部〜５０容量部のＤＭＳＯを含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、全組成物の１００容量部を基準として、０．０１容量部〜１０容量部のトリトンＸ−１００を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、さらに、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、さらに、０．０１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の量のトリスを含有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記トリスは、ＤＭＳＯが前記一次抗体を消滅させるのを防ぐ、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記生体組織は、厚さ３ｍｍ以上の大型組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記生体組織は、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓又は腸から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、厚さ３ｍｍ以上の透明化大型生体組織における抗体浸透性を高め、免疫染色の分解能を向上させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
透明化生体組織の免疫染色方法であって、
前記透明化生体組織に対して請求項１に記載の透明化生体組織の免疫染色用組成物を処理する工程（工程１）と、
前記工程１において処理された透明化生体組織に対して二次抗体を処理する工程（工程２）と、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記一次抗体は、前記工程１を通じて前記生体組織に浸透する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、厚さ３ｍｍ以上の透明化大型生体組織の三次元イメージングを可能とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の免疫染色用組成物を含む、透明化生体組織の免疫染色用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透明化大型組織の免疫染色用組成物、及び該組成物を用いる透明化大型生体組織の免疫染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線による医療診断法は、ＣＴ又はＭＲＩ等の二次元スキャン後に、スキャンした画像を三次元画像に再構成して三次元観察する過程により、非常に精度の高い診断方法へと発展してきた。診断には、光源だけでなく超音波を用いて三次元画像を実現する技法が盛んに用いられている。しかしながら、現在の技法のほとんどは、ミリメートルレベルでの微小分解能を有しており、このことは、細胞レベルでの解析を可能とするマイクロレベルでの三次元観察には十分であり得ないことを示唆している。このため、今日の細胞レベルの解析のほとんどは、従来の二次元方法に依存している。すなわち、生検組織又は剖検組織等の生体組織を固定液によって固定した後、パラフィン又はポリマーによって包埋する。試料は、光又は電磁波が透過することができるように、数マイクロメートル又は数ナノメートルの厚さの切片に切断される。その後、透過像を光学顕微鏡又は電子顕微鏡を用いて観察することにより、微細構造を解析する。
【０００３】
このようなマイクロイメージング法を用いて三次元画像を得るには、共焦点顕微鏡が必要である。この場合、数十マイクロメートルレベルの厚さ情報を得ることができる。厚さはほぼ、光源が透過することができる深さによって制限される。生体組織内の有効な構造体のほとんどは、少なくとも数百マイクロメートルの大きさであり、上述した従来の方法では、情報の一部しか得ることができない。したがって、より厚い組織の画像を得るには、数十マイクロメートルの厚さの一連の切片を順次作製した後、それぞれの切片を顕微鏡により画像処理して再構成する必要がある。特に、脳組織のニューロン全体の画像処理では、１つのニューロンが軸索を数メートルまで伸ばすことがあるため、組織の切断及び再構成の過程において問題となる。
【０００４】
組織透明化法は、組織を傷つけずに、組織の内部構造及びタンパク質分布を調べることができる技法である。したがって、従来の方法の限界を克服して組織構造をより深く観察し、種々の系由来の構造体及び分子に関する全体的な情報にアプローチする多くの方法により、組織透明化法が進歩してきた。
【０００５】
上述の方法では、ヒドロゲル支持体を組織に浸透させる。ヒドロゲルの濃度が高くなると、タンパク質との結合度が増加するとともに、密な網目構造が形成されるため構造体が硬くなる。一方、組織が硬くなると、界面活性剤によって脂質が抜けていくことが困難になり、このため、透明化に要する時間が長くなる。加えて、上述の方法には、組織表面に空気及び黒色粒子を沈着させるか、組織を黄変させるという問題がある。さらに、一度に１つしか脳を透明化することができないため、経済的及び時間的に多くの損失が生じる。より大きな問題は、抗体による染色が、ネットワーク構造を形成するポリアクリルアミド間を浸透するのが困難なことである。
【０００６】
近年、本発明者らは、ＣＨＡＰＳ＋尿素をベースとしたソンヒョン（SunHyun）三次元画像キットを用いる新方法を開発した。この方法は、従来の方法が組織を透明化するのに有する、いかなる有害又は特別な技法、機器又はノウハウも必要とせず、プロトコールに示されている順序に従って溶液を用いることにより、組織を容易に透明化することができる。加えて、この方法では、従来の組織透明化方法よりも抗体浸透性が比較的高い透明化組織の免疫染色が可能である。
【０００７】
しかしながら、ソンヒョン三次元画像キットを用いる組織透明化方法、及びこれまでの方法の最大の問題は、抗体を用いて１ｍｍよりも大きい組織の免疫染色を可能とする方法に限界があることである。その理由は、透明化に用いられる溶液、ヒドロゲルハイブリッド形態（Hydrogel-hybridized form）、及び大型組織の厚さにより、抗体の拡散及び浸透が困難なことである。近年、免疫染色の限界を克服する試みがなされている。代表的には、ＣＬＡＲＩＴＹにおいて用いられたヒドロゲルハイブリッド形態の抗体の浸透性に大きな問題が提起され、２０１６年に、プロテオームの拡大解析（magnified analysis of the proteome）（ＭＡＰ）では、基本組織に比べて４倍近く大きさが増加することによって抗体浸透性が高まることが示された。しかしながら、この方法には致命的な欠点があり、それは、蛍光の明るさが従来の方法に比べて１／６４に大幅に低下し、９５℃超で組織を煮沸することによって透明化の過程が進行するため、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡがほとんど損傷して消失することである。有機溶媒使用の限界を克服するために開発されたｕＤｉｓｃｏ法の場合、１ｍｍの大きさの組織に抗体を浸透させて免疫染色を行うのに１か月よりも長くかかる。しかしながら、この方法は一般に、研究者によって利用されるものでも、研究結果から導き出されたものでもないし、商業化された方法でもない。二次元の薄切片試料に用いられる免疫染色方法は、三次元透明化大型組織への応用には限界がある。したがって、透明化大型組織において免疫染色を用いて三次元生体画像を得るには、透明化大型組織に適した免疫染色用組成物及び免疫染色方法を開発することが不可欠（inevitably necessary）である。
【０００８】
関連先行技術文献は、次のとおりである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１０８３５９号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Chung K, et al. (2013) Nature 497(7449): 332-337
【非特許文献２】Lee H, et al. BMC Developmental Biology 2014 14: 781
【非特許文献３】Taeyun Ku., et al. Nat Biotech. 2016, doi: 10.1038/nbt.3641
【非特許文献４】Pan C, et al. Nat Methods. (2016) 10 (13): 859-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、透明化大型組織の免疫染色用組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、透明化大型生体組織の免疫染色方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明の一態様において、本発明は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化大型生体組織の免疫染色用組成物を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様において、本発明は、透明化大型生体組織の免疫染色方法であって、
透明化大型生体組織に対して透明化大型生体組織の免疫染色用組成物を処理する工程（工程１）と、
工程１において処理された透明化大型生体組織に対して二次抗体を処理する工程（工程２）と、
を含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様において、本発明は、免疫染色用組成物を含む、透明化生体組織の免疫染色用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化生体組織の免疫染色用組成物は、透明化生体組織、具体的には厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織における抗体浸透性を高めて、抗体を厚い組織に深く浸透させることにより、既存方法での抗体浸透の限界と関連する免疫染色の問題を克服し、大型組織の免疫染色に要する時間を短縮することにより、簡単かつ迅速に大型生体組織に対して高分解能の三次元バイオイメージングが可能となるとともに、構造画像を通じて、種々の疾患の原因特定、新たな治療法の開発、並びに薬剤の有効性及び毒性の予測に有益に用いることができる。さらに、透明化大型組織の免疫染色用組成物は、種々の医療機器と組み合わせて用いることができ、具体的には、キットとして作製することができ、体外診断用機器として有益に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】作製例１において作製された透明化マウス脳の画像を示す、１組の写真である。
【図２】ＤＮＡがＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）によって染色された透明化脳組織の画像を示す、１組の写真である。
【図３】顕微鏡ライトシート（Lightsheet）Ｚ．１の５倍対物レンズを用いて、ニューロンのマーカーとして用いられるニューロン核染色抗体であるＮｅｕＮを一次抗体として、及びロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７を二次抗体として用いて行われた免疫染色の結果の染色画像を示す、１組の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の目的は、透明化大型生体組織の免疫染色用組成物を提供することにある。具体的には、本発明の目的は、抗体浸透性を高め、一次抗体の浸透性を向上させることにより、厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織の内部まで鮮明で高分解能の三次元イメージングが可能な免疫染色用組成物を提供することにある。
【００２０】
上記目的を達成するために、本発明の一態様において、本発明は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化生体組織の免疫染色用組成物を提供する。
【００２１】
組成物は、全組成物の１００容量部（parts by volume）を基準として、５容量部〜５０容量部のＤＭＳＯ、好ましくは１０容量部〜４０容量部のＤＭＳＯ、より好ましくは２０容量部のＤＭＳＯを含有し得る。
【００２２】
ＤＭＳＯが５容量部よりも少なく含まれている場合、一次抗体が透明化生体組織に十分深く浸透せず、その結果、厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織の内部まで鮮明で高分解能の三次元イメージングが可能な免疫染色用組成物が得られない。一方、ＤＭＳＯが５０容量部よりも多く含まれている場合、一次抗体の消滅（quenching）が生じ、免疫染色が困難になることがある。
【００２３】
組成物は、全組成物の１００容量部を基準として、０．０１容量部〜１０容量部のトリトンＸ−１００、好ましくは０．１容量部〜５容量部のトリトンＸ−１００、より好ましくは１容量部のトリトンＸ−１００を含有し得る。
【００２４】
トリトンＸ−１００が０．０１容量部よりも少なく含まれている場合、細胞膜に穴を開ける際に問題となることがある。一方、トリトンＸ−１００が１０容量部よりも多く含まれている場合、組織の大きさが小さくなりすぎて、抗体浸透性が低下する。
【００２５】
透明化生体組織の免疫染色用組成物は、さらに、過剰に含有するＤＭＳＯが一次抗体を消滅させるのを防ぐ目的で、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含有し得るが、必ずしもこれに限定されない。
【００２６】
トリスは、さらに、０．０１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で組成物中に含まれ得る。例えば、全組成物が１００ｍＬであるとき、トリスは０．０１ｇ〜１０ｇ含有していてもよい。
【００２７】
加えて、トリスは、さらに、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度、好ましくは１％（ｗ／ｖ）の濃度で組成物中に含まれ得る。トリスは、ＤＭＳＯが一次抗体を消滅させるのを防ぐことができる。トリスが０．０１％（ｗ／ｖ）よりも少なく含まれている場合、抗体の変性が生じることがある。一方、トリスが１０％（ｗ／ｖ）よりも多く含まれている場合、組織の大きさが小さくなることによって抗体浸透性が問題となることがある。
【００２８】
生体組織は、生体から分離された脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓及び腸に由来する細胞より得ることができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００２９】
加えて、生体組織は、厚さ３ｍｍ以上の大型組織であり得る。
【００３０】
組成物は、厚さ３ｍｍ以上の透明化大型生体組織における抗体浸透性を高め、免疫染色の分解能を向上させることができる。
【００３１】
透明化は組織の従来の透明化方法によって行うことができ、本発明の組成物は組織の透明化自体に特徴があるものではないため、透明化方法は特に限定されない。
【００３２】
透明化生体組織の免疫染色用組成物を用いて透明化生体組織の免疫染色を行った結果、厚さ３ｍｍ以上の透明化大型生体組織では、免疫染色の深さが３ｍｍ以上であることが確認された。加えて、顕微鏡ライトシートＺ．１の５倍対物レンズを用いて、免疫染色画像及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein））シグナルが確認された（実験例１及び図３を参照）。
【００３３】
上述の結果は、従来の組織透明化方法の問題である抗体浸透性の問題が解決されたことを示している。加えて、高解像度の免疫染色画像が実現し、その結果、高分解能の画像を得ることができる。
【００３４】
この理由により、本発明の透明化組織の免疫染色用組成物は、種々の疾患のマーカーの発見、及びリン酸化活性測定を用いた機構の研究に用いることができ、種々の脳マッピング研究に応用することができる。
【００３５】
したがって、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化生体組織の免疫染色用組成物は、透明化生体組織、具体的には厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織における抗体浸透性を高めて、抗体を厚い組織に深く浸透させることにより、既存方法での抗体浸透の限界と関連する免疫染色の問題を克服し、大型組織の免疫染色に要する時間を短縮することにより、簡単かつ迅速に大型生体組織に対して高分解能の三次元バイオイメージングが可能となるとともに、構造画像を通じて、種々の疾患の原因特定、新たな治療法の開発、並びに薬剤の有効性及び毒性の予測に有益に用いることができる。さらに、透明化大型組織の免疫染色用組成物は、種々の医療機器と組み合わせて用いることができ、具体的には、キットとして作製することができ、体外診断用機器として有益に用いることができる。
【００３６】
本発明の別の態様において、本発明は、透明化生体組織の免疫染色方法であって、
透明化生体組織に対して透明化生体組織の免疫染色用組成物を処理する工程（工程１）と、
工程１において処理された透明化生体組織に対して二次抗体を処理する工程（工程２）と、
を含む、方法を提供する。
【００３７】
本発明の免疫染色方法は、抗体浸透性を大幅に高める効果を有するＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化生体組織の免疫染色用組成物を用いる。
【００３８】
透明化生体組織の従来の免疫染色技術によれば、透明化に用いられる溶液、ヒドロゲルハイブリッド形態、及び大型組織の厚さにより、抗体を拡散及び浸透させることは困難であり、このため、厚さ１ｍｍ以上の組織の免疫染色を行うことは困難である。本発明は、この問題を解決して、本発明の組成物を用いることにより、厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織においても、抗体の拡散及び透過を促進することができる。したがって、一次抗体は生体組織の内部に深く浸透するため、二次抗体をその後処理したときに、組織深部（the deep inside of the tissue）の鮮明で高分解能の三次元画像が得られるという利点がある。
【００３９】
加えて、免疫染色に要する時間の点では、透明化生体組織の従来の免疫染色技術は、厚さ１ｍｍ以上の組織を免疫染色する際に、抗体浸透性を高めるための前処理工程を行うことが必要であった。組織が厚くなくても、長時間の前処理過程を行う必要があることが多く、本発明よりも方法の工程が増えるだけでなく、全体の方法実行時間が数か月かかるという問題がある。本発明は、この問題を解決して、本発明の組成物を用いることにより、いかなる前処理工程も行わずに免疫染色を行うことができるとともに、従来技術に比べて、厚さ３ｍｍ以上の大型組織の免疫染色時間を大幅に短縮することができるため、組織深部の鮮明で高分解能の三次元画像が得られるという利点がある。すなわち、本発明の方法は、いかなる前処理も必要とせず、本発明の組成物を用いることによって、簡単かつ容易に抗体浸透性を高めることができるという利点がある。
【００４０】
以下に、免疫染色方法を詳細に説明する。
【００４１】
免疫染色方法の工程１は、抗体浸透性を大幅に高める効果を有するＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化生体組織の免疫染色用組成物中に、生体組織を浸漬することによって、一次抗体を生体組織に浸透させる工程である。
【００４２】
特に、組成物は、全組成物の１００容量部を基準として、５容量部〜５０容量部のＤＭＳＯ、好ましくは１０容量部〜４０容量部のＤＭＳＯ、より好ましくは２０容量部のＤＭＳＯを含有し得る。
【００４３】
ＤＭＳＯが５容量部よりも少なく含まれている場合、一次抗体が透明化生体組織に十分深く浸透せず、その結果、厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織の内部まで鮮明で高分解能の三次元イメージングが可能な免疫染色用組成物が得られない。一方、ＤＭＳＯが５０容量部よりも多く含まれている場合、一次抗体の消滅が生じ、免疫染色が困難になることがある。
【００４４】
組成物は、全組成物の１００容量部を基準として、０．０１容量部〜１０容量部のトリトンＸ−１００、好ましくは０．１容量部〜５容量部のトリトンＸ−１００、より好ましくは１容量部のトリトンＸ−１００を含有し得る。
【００４５】
トリトンＸ−１００が０．０１容量部よりも少なく含まれている場合、細胞膜に穴を開ける際に問題となることがある。一方、トリトンＸ−１００が１０容量部よりも多く含まれている場合、組織の大きさが小さくなりすぎて、抗体浸透性が低下する。
【００４６】
組成物には、さらに、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）が含まれ得る。
【００４７】
したがって、本発明の免疫染色方法は、工程１を支障なく行うことによって、工程２を行うことができ、上述した範囲内のＤＭＳＯとトリトンＸ−１００とを含有する、透明化生体組織の免疫染色用組成物を用いるときにのみ、厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織の内部まで鮮明で高分解能の三次元イメージングが可能となる。
【００４８】
工程１において、透明化生体組織の免疫染色用組成物は、さらに、過剰に含有するＤＭＳＯが一次抗体を消滅させるのを防ぐ目的で、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含有し得るが、必ずしもこれに限定されない。
【００４９】
トリスは、さらに、０．０１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で組成物中に含まれ得る。例えば、全組成物が１００ｍＬであるとき、トリスは０．０１ｇ〜１０ｇ含有していてもよい。
【００５０】
加えて、トリスは、さらに、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度、好ましくは１％（ｗ／ｖ）の濃度で組成物中に含まれ得る。トリスは、ＤＭＳＯが一次抗体を消滅させるのを防ぐことができる。トリスが０．０１％（ｗ／ｖ）よりも少なく含まれている場合、抗体の変性が生じることがある。一方、トリスが１０％（ｗ／ｖ）よりも多く含まれている場合、組織の大きさが小さくなることによって抗体浸透性が問題となることがある。
【００５１】
加えて、工程１では、生体組織の透明化は従来の組織透明化によって行うことができ、本発明の方法は組織の透明化自体に特徴があるものではないため、透明化方法は特に限定されない。
【００５２】
免疫染色方法の工程２は、工程１の実行により一次抗体が組織に浸透した生体組織に対して二次抗体を処理する工程である。
【００５３】
本発明の免疫染色方法は工程１に特徴があるため、二次抗体を処理する工程は特定の方法に限定されず、当業者が用いる従来の方法によって行うことができる。
【００５４】
生体組織は、生体から分離された脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓及び腸に由来する細胞より得ることができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００５５】
加えて、生体組織は、厚さ３ｍｍ以上の大型組織であり得る。
【００５６】
組成物は、厚さ３ｍｍ以上の透明化大型生体組織における抗体浸透性を高め、免疫染色の分解能を向上させることができる。
【００５７】
透明化生体組織の免疫染色方法を用いて透明化生体組織の免疫染色を行った結果、厚さ３ｍｍ以上の透明化大型生体組織では、免疫染色の深さが３ｍｍ以上であることが確認された。加えて、顕微鏡ライトシートＺ．１の５倍対物レンズを用いて、免疫染色画像及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）シグナルが確認された（実験例１及び図３を参照）。
【００５８】
上述の結果は、従来の組織透明化方法の問題である抗体浸透性の問題が解決されたことを示している。加えて、高解像度の免疫染色画像が実現し、その結果、高分解能の画像を得ることができる。
【００５９】
この理由により、本発明の免疫染色方法は、種々の疾患のマーカーの発見、及びリン酸化活性測定を用いた機構の研究に用いることができ、種々の脳マッピング研究に応用することができる。
【００６０】
したがって、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化生体組織の免疫染色用組成物は、透明化生体組織、具体的には厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織における抗体浸透性を高めて、抗体を厚い組織に深く浸透させることにより、既存方法での抗体浸透の限界と関連する免疫染色の問題を克服し、大型組織の免疫染色に要する時間を短縮することにより、簡単かつ迅速に大型生体組織に対して高分解能の三次元バイオイメージングが可能となるとともに、構造画像を通じて、種々の疾患の原因特定、新たな治療法の開発、並びに薬剤の有効性及び毒性の予測に有益に用いることができる。さらに、透明化大型組織の免疫染色用組成物は、種々の医療機器と組み合わせて用いることができ、具体的には、キットとして作製することができ、体外診断用機器として有益に用いることができる。
【００６１】
本発明の別の態様において、本発明は、免疫染色用組成物を含む、透明化生体組織の免疫染色用キットを提供する。
【００６２】
これより、本発明を以下の実施例及び実験例によって詳細に説明する。
【００６３】
しかしながら、以下の実施例及び実験例は、本発明の例示のためであるにすぎず、本発明の内容は実施例及び実験例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
作製例１：透明化生体組織の作製
透明化生体組織を次の方法によって作製した。本明細書に記載されている動物試験はすべて、韓国毒性学研究所動物資源委員会（Committee for Animal Resources, Korea Institute of Toxicology）の指針（承認番号ＲＳ１７００３）に従って行った。
【００６５】
具体的には、成体マウス（８週齢）に、吸入麻酔薬であるイソフルランによって麻酔をかけた（１ｃｃ／分）。マウスの血管を染色するために、レクチン−４８８（カタログ番号ＤＬ１１７４）を尾静脈から注入した。レクチン注入の５分後に、５０ｍＬの氷冷１倍ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を灌流させ、次いで、４％ＰＦＡを含有する氷冷ＰＢＳを再び灌流させた。臓器を取り出し、４％パラホルムアルデヒド及びＰＦＡ溶液中に浸漬した後、４℃で１２時間インキュベートした。この時、氷冷条件の温度は、限定されないが、−２０℃〜−４０℃が好ましい。
【００６６】
次に、試料を５０ｍｌのＰＢＳによって２回洗浄した。固定化された試料を、ＣＨＡＰＳ（２０ｗ／ｖ％）と尿素（６０ｗ／ｖ％）とのＰＢＳ混合溶液中、３７℃、２２０ｒｐｍで３日間インキュベートした。
【００６７】
脳試料をＣＨＡＰＳと尿素との混合物から第三級蒸留水（tertiary distilled water）に移し、５０ｍｌの第三級蒸留水によって３回、１２時間洗浄した。マウント溶液（mounting solution）である、ＣＨＡＰＳと尿素との混合物に脳試料を移した後、脳の透明化が観察され、その結果を図１に示す。
【００６８】
図１は、作製例１において作製された透明化マウス脳の画像を示す、１組の写真である。
【００６９】
図１に示されているように、マウスの脳組織は十分に透明化されていることが確認された。
【００７０】
実施例１：透明化生体組織の免疫染色用組成物を用いる生体組織の免疫染色
本発明の透明化生体組織の免疫染色用組成物を用いて、作製例１において作製された透明化組織を次の方法によって免疫染色した。
【００７１】
工程１：透明化生体組織の免疫染色用組成物の作製
透明化生体組織の免疫染色用組成物は、２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯと１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００と５０ｍＭトリスと蒸留水とからなる組成物（２０ｍＬのＤＭＳＯ、７９ｍＬの蒸留水、１ｍＬのトリトンＸ−１００、及び０．６５ｇのトリス）に対して、ニューロンマーカー抗体であるＮｅｕＮ（カタログ番号ａｂ１７７４８７）を一次抗体として１：１００の比率で処理することによって作製した。
【００７２】
工程２：透明化生体組織の免疫染色用組成物の処理（一次抗体の処理）
作製例１において得られた透明化組織を、５０ｍＬの蒸留水を用いて３回交換することによって、１２時間インキュベートした。組織試料を工程１において得られた組成物中に浸漬し、一次抗体によって処理した。一次抗体によって処理した後、組織試料を４℃で７日間インキュベートした。
【００７３】
工程３：二次抗体の処理
工程２において一次抗体により処理した後、組織試料を再び蒸留水によって１２時間洗浄した。組織試料を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）と、０．１％トリトンＸ−１００と、ＤＡＰＩ（カタログ番号Ｄ５９４２、Sigma社）と、二次抗体としてのロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７とを含有する水溶液によって処理した後、４℃で振盪しながら７日間インキュベートした。７日後、試料中の非特異性の抗体結合を除去するために、組織試料を、ＰＢＳと０．１％トリトンＸ−１００とを含有する水溶液によって、４℃で振盪しながら１２時間〜２４時間洗浄した。洗浄された試料を、マウント溶液である、ＣＨＡＰＳと尿素との混合溶液に入れた後、１２時間インキュベートした。この時、ＤＡＰＩ処理群は化学染色群であり、免疫染色と化学染色との間の抗体浸透性を比較するための比較群である。
【００７４】
比較例１：トリトンＸ−１００を用いる生体組織の免疫染色
トリトンＸ−１００を用いて、次の方法により作製例１において作製された透明化生体組織を免疫染色した。
【００７５】
２０％ＤＭＳＯと１％トリトンＸ−１００と５０ｍＭトリスと蒸留水とからなる組成物の代わりに、１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳを用いたことを除いて、実施例１の記載と同様に、生体組織を免疫染色した。
【００７６】
実験例１：免疫染色された生体組織の蛍光の確認
実施例１及び比較例１において作製された、免疫染色された生体組織の蛍光を確認するために、顕微鏡ライトシートＺ．１の５倍対物レンズを用いて、マウス脳内でニューロンマーカーとして用いられる、ＤＡＰＩ及びＮｅｕＮ抗体の免疫染色蛍光シグナルを観察した。図２には、ＤＡＰＩ（カタログ番号Ｄ５９４２、Sigma社）（化学染色）を用いた免疫染色組織が示され、図３には、ロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７（抗体染色）を用いた免疫染色組織が示されている。
【００７７】
図２は、ＤＮＡがＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）によって染色された透明化脳組織の画像を示す、１組の写真である。
【００７８】
図２に示されているように、ＤＡＰＩによる化学染色の場合、２つの組成物間には大きな違いがないことが確認された。
【００７９】
図３は、顕微鏡ライトシートＺ．１の５倍対物レンズを用いて、ニューロンのマーカーとして用いられるニューロン核染色抗体であるＮｅｕＮを一次抗体として、及びロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７を二次抗体として用いて行われた免疫染色の結果の染色画像を示す、１組の写真である。
【００８０】
図３に示されているように、ロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７による抗体染色の場合、比較例１の組成物（１％トリトンＸ−１００と１倍ＰＢＳとからなる組成物）中に浸漬した試料では、０．５ｍｍの深さで免疫染色するが、本発明の透明化生体組織の免疫染色用組成物である、実施例１の組成物（蒸留水中２０％ＤＭＳＯと１％トリトンＸ−１００と５０ｍＭトリスの組成物）中に浸漬した試料では、３ｍｍ以上の深さで免疫染色することが確認された。
【００８１】
上述の結果は、従来の組織透明化方法の問題である抗体浸透性の問題が解決されたことを示している。加えて、高品質の免疫染色画像が実現し、このことは、高分解能の画像を得ることができることを示している。
【００８２】
加えて、図３では、顕微鏡ライトシートＺ．１の５倍対物レンズを用いて、免疫染色画像及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）シグナルが確認された。したがって、本発明の透明化組織の免疫染色用組成物は、種々の疾患のマーカーの発見、及びリン酸化活性測定を用いた機構の研究に用いることができ、種々の脳マッピング研究に応用することができる。
【００８３】
したがって、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とトリトンＸ−１００と一次抗体とが溶解した水溶液を含む、透明化生体組織の免疫染色用組成物は、透明化生体組織、具体的には厚さ３ｍｍ以上の大型生体組織における抗体浸透性を高めて、抗体を厚い組織に深く浸透させることにより、既存方法での抗体浸透の限界と関連する免疫染色の問題を克服し、大型組織の免疫染色に要する時間を短縮することにより、簡単かつ迅速に大型生体組織に対して高分解能の三次元バイオイメージングが可能となるとともに、構造画像を通じて、種々の疾患の原因特定、新たな治療法の開発、並びに薬剤の有効性及び毒性の予測に有益に用いることができる。さらに、透明化大型組織の免疫染色用組成物は、種々の医療機器と組み合わせて用いることができ、具体的には、キットとして作製することができ、体外診断用機器として有益に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の透明化大型組織の免疫染色用組成物、及び該組成物を用いる透明化大型生体組織の免疫染色方法は、大型生体組織に対して高分解能の三次元バイオイメージングが可能となるとともに、構造画像を通じて、種々の疾患の原因特定、新たな治療法の開発、並びに薬剤の有効性及び毒性の予測に有益に用いることができる。さらに、本発明の組成物は、種々の医療機器と組み合わせて用いることができ、具体的には、キットとして作製することができ、体外診断用機器として有益に用いることができる。
【図１】
2021512333.tif 000003
【図２】
2021512333.tif 000004
【図３】
2021512333.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月5日(2021.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含有する透明化生体組織の免疫染色方法であって、
ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）及び尿素の混合物を使用して１ｍｍ以上の厚さを有する生体組織を透明化し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、トリトンＸ−１００、及び一次抗体を含有する免疫染色用組成物で、該１ｍｍ以上の厚さを有する透明化生体組織を処理する工程１、及び
前記工程１において処理された透明化生体組織に対して二次抗体を処理する工程２、
を含む、方法。
【請求項２】
前記全組成物の１００容量部を基準として、５容量部〜５０容量部のＤＭＳＯを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全組成物の１００容量部を基準として、０．０１容量部〜１０容量部のトリトンＸ−１００を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物は、さらに、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、さらに、０．０１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の量のトリスを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記トリスは、ＤＭＳＯが前記一次抗体を消滅させるのを防ぐ、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記生体組織は、厚さ３ｍｍ以上の大型組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生体組織は、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓又は腸から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物は、厚さ３ｍｍ以上の透明化生体組織における抗体浸透性を高め、免疫染色の分解能を向上させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一次抗体は、前記工程１を通じて前記生体組織に浸透する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、厚さ３ｍｍ以上の透明化生体組織の三次元イメージングを可能とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）及び尿素の混合物を含有する、透明化生体組織のための組成物及び免疫染色用組成物を含み、該免疫染色用組成物は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、トリトンＸ−１００、及び一次抗体を含む、透明化生体組織の免疫染色用キット。
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月8日(2021.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含有する透明化生体組織の免疫染色方法であって、
ＣＨＡＰＳ（３ー[（３ーコラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]ー１ープロパンスルホネート）及び尿素の混合物を使用して１ｍｍ以上の厚さを有する生体組織を透明化し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、トリトンＸ−１００、及び一次抗体を含有する免疫染色用組成物で、該１ｍｍ以上の厚さを有する透明化生体組織を処理する工程１、及び
前記工程１において処理された透明化生体組織に対して二次抗体を処理する工程２、
を含む、方法。
【請求項２】
前記一次抗体は、前記工程１を通じて前記生体組織に浸透する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、厚さ３ｍｍ以上の透明化生体組織の三次元イメージングを可能とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＨＡＰＳ（３ー[（３ーコラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]ー１ープロパンスルホネート）及び尿素の混合物を含有する、透明化生体組織のための組成物及び免疫染色用組成物を含み、該免疫染色用組成物は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、トリトンＸ−１００、及び一次抗体を含む、透明化生体組織の免疫染色用キット。
【国際調査報告】
2021512333.tif 000006
2021512333.tif 000007
2021512333.tif 000008
2021512333.tif 000009