(57)【要約】  植物タンパク質加水分解物および安定したグルコース濃度を含有する培養培地における哺乳動物の細胞培養物を培養することによるHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生するための流加プロセスが提供され、ここで前期方法は、増大した力価および非フコシル化のパーセンテージを有するHu14.18K322Aモノクローナル抗体の集団を産生する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物宿主細胞培養においてHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生するための流加プロセスであって、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体をコードする核酸を内包し、および実質的に非フコシル化されているHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生するために選択される哺乳動物宿主細胞を、植物タンパク質加水分解物および０．５ｇ／Ｌ〜１．５ｇ／Ｌの安定したグルコース濃度を含む細胞培養培地中で培養すること、それによって哺乳動物の細胞培養中でHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生することを含む、前記流加プロセス。
【請求項２】
Hu14.18K322Aモノクローナル抗体を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の流加プロセス。
【請求項３】
Hu14.18K322Aモノクローナル抗体が、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体を含む細胞培養培地とプロテインＡ樹脂を接触させること、およびHu14.18K322Aモノクローナル抗体を溶出することによって精製される、請求項２に記載の流加プロセス。
【請求項４】
Hu14.18K322Aモノクローナル抗体が、少なくとも５５％非フコシル化されている、請求項１に記載の流加プロセス。
【請求項５】
請求項１に記載の方法によって産生された、実質的に非フコシル化されたHu14.18K322Aモノクローナル抗体の集団。
【請求項６】
該抗体が、少なくとも５５％非フコシル化されている、請求項５に記載の実質的に非フコシル化されたHu14.18K322Aモノクローナル抗体の集団。
【請求項７】
該集団が、少なくとも約４００ｍｇ／Ｌの抗体力価を有する、請求項5に記載のHu14.18K322Aモノクローナル抗体の集団。
【請求項８】
該Hu14.18K322Aモノクローナル抗体が、増強されたADCC活性を示す、請求項５に記載のHu14.18K322Aモノクローナル抗体の集団。
【請求項９】
請求項5に記載のHu14.18K322Aモノクローナル抗体の集団を、生理学的に許容し得る希釈剤、担体、または賦形剤と混和して含む、医薬組成物。
【請求項１０】
Hu14.18K322Aモノクローナル抗体をコードし、および実質的に非フコシル化されたHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生するために選択される核酸を内包する、哺乳動物宿主細胞。
【請求項１１】
該抗体が、少なくとも５５％非フコシル化されている、請求項１０に記載の哺乳動物宿主細胞。
【請求項１２】
２０１９年２月１３日にAmerican Type Culture Collectionの受託番号XXXXXで寄託された、哺乳動物宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
導入
本出願は、２０１８年２月１５日に出願された米国特許出願第６２／６３０，９７１号の一部継続出願であり、この内容は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
背景
産物の品質特質は、治療用抗体の機能性および製造可能性にとって重大である。それらは、細胞培養培地などの数多の産生プロセスのパラメータによって有意に影響され得る。成長および流加培地の組成物は、アンモニア、グルタミン、グルコース、および金属イオンの濃度を包含し、抗体のグリコシル化に影響を与え得る。よって、培地の開発および最適化の間に、グリコシル化に対する培養培地の影響をモニタリングし、および考慮することは重大なことである。その作用の機序が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を包含する治療用抗体については、ＡＤＣＣ活性に影響を与えることが知られている、Ｎ−グリカンのフコシル化を低減させるために特に重要である。例として、Shinkawa, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(5):3466-73；Niwa et al. (2004) Cancer Res. 64:2127-2133；Jefferis, et al. (1998) Immunol Rev. 163:59-76；Shields、et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740を参照されたい。したがって、治療用抗体の有効性を増加させるために適切なフコシル化を有する高い抗体力価を得ることにかなりの関心がある。
【０００３】
フコシル化に取り組むための１つのアプローチは、脱フコシル化抗体を産生する最適化された宿主細胞株の使用に焦点を合わせている。例として、Kanda, et al. (2006) Biotechnol. Bioeng. 94:680-688；Yamane-Ohnuki, et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614-622；ＷＯ２０１７／０７９１６５およびＵＳ２００９／０２１４５２８を参照されたい。加えて、ｐＨ、浸透圧、温度、およびアミノ酸、脂質およびイオン（例として、マンガン）の補充などのプロセスのパラメータは、抗体のグリコシル化を調整し得る。例として、Konno, et al. (2012) Cytotechnology 64:249-26；Hossler, et al. (2009) Glycobiology 19:936-949；Trummer, et al. (2006) Biotechnol. Bioeng. 94:1033-44；Miller, et al. (1988) Biotechnol. Bioeng. 32:947-965；ＷＯ２０１３／１１４１６５；ＷＯ２０１５／１４０７００；ＵＳ２０１６／０３６２７１４；ＷＯ２００７／０７０３１５；ＵＳ２０１５／０３４４５７９；およびＷＯ２０１７／１２０３４７を参照されたい。
【０００４】
特定のフコシル化プロファイルを提供する細胞培養プロセスについての必要性が存在する一方で、より重要なことには、特定の組み換えタンパク質についてのフコシル化グリカンの含量を調整するために使用される条件は、いずれか他のグリカンプロファイルの量またはレベルに影響を及ぼさないかまたは大きく変更しないように選択されるべきである。加えて、特定のフコシル化プロファイルを得るための条件の組み合わせは、プロセスの力価および／または生産性に大きな影響は有さないべきである。よって、本発明は、抗体の分量および抗体の非フコシル化の両方を増大させるための細胞培養プロセスを提供する。
【０００５】
本発明の概要
哺乳動物の細胞培養における実質的に非フコシル化されたHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生するための流加プロセスが、提供される。この方法は、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体をコードする核酸を内包し、および植物タンパク質加水分解物および０．５ｇ／Ｌ〜１．５ｇ／Ｌの安定したグルコース濃度を含む細胞培養培地において、実質的に非フコシル化Hu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生するために選択された哺乳動物宿主細胞を培養するステップを含み、それによって哺乳動物の細胞培養においてHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生する。一態様において、流加プロセスは、例として、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体を含む哺乳動物の細胞培養とプロテインＡ樹脂を接触させること、およびHu14.18K322Aモノクローナル抗体を溶離されることによって、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体を精製するステップをさらに包含する。例として、少なくとも約４００ｍｇ／Ｌの抗体力価を有するHu14.18K322Aモノクローナル抗体の集団もまた提供され、ここで前記抗体は、非フコシル化されており（例として、少なくとも５５％非フコシル化されている）、および増強されたＡＤＣＣ活性を示す。ある態様において、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体の集団は、医薬組成物中に提供され、ここで前記抗体は、生理学的に許容し得る希釈剤、担体、または賦形剤と混和されている。本発明はまた、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体をコードする核酸を内包し、および実質的に非フコシル化Hu14.18K322Aモノクローナル抗体（例として、少なくとも５５％の非フコシル化）を産生するために選択された哺乳動物宿主細胞、および２０１９年２月１３日にAmerican Type Culture Collectionの受託番号ＸＸＸＸＸで寄託された哺乳動物宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図面の簡単な記載
【図１】図１は、従来の調製のHu14.18K322Aモノクローナル抗体と比較した、本発明の方法によって産生されたHu14.18K322Aモノクローナル抗体のグリカン分布を示す。試料１および試料２は、Hu14.18K322A抗体の２つの個々の澄明にされた採取物を表す。
【０００７】
【図２】図２は、ch14.18（キメラ抗ＧＤ２抗体）と比較した、モノクローナル抗体Hu14.18K322AのＡＤＣＣ活性対％非フコシル化（％ＡＦ）のプロットを示す。
【０００８】
本発明の詳細な記載
Hu14.18K322Aは、免疫グロブリンのＧ１重鎖およびカッパ軽鎖について完全ヒトアミノ酸配列を含有する抗体であり、および相補性決定領域は、マウス１４．１８抗体の抗原結合配列に対応する。その結果得られるHu14.18抗体は、およそ９８％ヒト遺伝子に由来しており、それによってより少ない免疫原性をなしている。加えて、Hu14.18K322Aは、補体カスケードの活性化を妨げるように設計された単一の点突然変異（Ｋ３２２Ａ）を有する（ＵＳ７，４３２，３５７、ＵＳ８，８３５，６０６およびＵＳ９，６１７，３４９を参照し、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、Hu14.18K322Aが、ch14.18の結合特異性およびＡＤＣＣ能力を保持し、事実上補体依存性の溶解を伴わないことを示している。さらにまた、ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ分析は、Hu14.18K322Aがch14.18よりも少ない感覚異常を有することを実証した。よって、Hu14.18K322Aは、ch14.18よりも少ない補体媒介の疼痛および少ない過敏症反応を引き起こす潜在力を有する。
【０００９】
同等であるかまたはよりよいｉｎ  ｖｉｖｏ活性を有する高い抗体濃度をもたらすHu14.18K322A抗体の産生のためのプロセスが、現在開発されている。開発された流加プロセスは、植物タンパク質加水分解物中で産生クローンを培養すること、およびグルコースの濃度を制御することを包含し、その組み合わせは、産物の分量（すなわち、力価および最も高いＡＤＤＣ活性）および産物の品質（すなわち、非フコシル化抗体の最も低いパーセンテージ、例として、少なくとも５５％が非フコシル化）の両方における増加を提供する。
【００１０】
結果的に、本発明は、細胞培養、具体的には哺乳動物の細胞培養におけるHu14.18K322A抗体の発現を改善するための方法および組成物を提供する。とりわけ、本発明は、培養培地サプリメント、例として、植物タンパク質加水分解物を、基本培養培地に添加することによって、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体の産生を促進するための改善された流加方法および組成物を包含する。具体的に言うと、本発明は、Hu14.18K322Aをコードする組み換え核酸を内包する哺乳動物宿主細胞を植物タンパク質加水分解物およびHu14.18K322A発現の間中の０．５〜１．５ｇ／Ｌの安定したグルコース濃度を含有する細胞培養培地または基本培地中で培養することによる流加プロセスにおけるHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生するための方法を提供し、それによって哺乳動物の細胞培養においてHu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生する。本発明は、この抗体の精製および処方もまた包含する。
【００１１】
本明細書に記載のとおり、「Hu14.18K322A」は、補体カスケードの活性化を妨げるように設計された単一の点突然変異（Ｋ３２２Ａ）を有する14.18抗体を指す（ＵＳ７，４３２，３５７、ＵＳ８，８３５，６０６およびＵＳ９，６１７，３４９を参照されたい）。本発明のHu14.18K322A抗体は、グリコシル化された、または非グリコシル化された免疫グロブリンのいずれかのイソタイプまたはサブクラスであり得、および特異的結合について無傷の抗体と競合するその抗原結合領域を包含する。Hu14.18K322A抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト化されたものであり、およびキメラ、多特異性、およびモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを包含する。本発明の目的のために、用語「抗体」は、これらに限定されないが、Hu14.18K322A抗体をコードする核酸を用いてトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの、組み換え手段によって調製、発現、作製または単離されたそれらを包含する。具体的な態様において、Hu14.18K322A抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００１２】
様々な宿主細胞が、Hu14.18K322A抗体を産生するために使用され得る一方で、哺乳動物宿主細胞が好ましく、およびヒト、サル等などの霊長目の動物に由来する動物細胞、またはマウス、ラット、ハムスター等などの齧歯類の動物に由来する動物細胞がより好ましい。哺乳動物に属する細胞は、好ましくは、骨髄腫細胞、卵巣細胞、腎細胞、血液細胞、子宮細胞、結合組織細胞、乳腺細胞、胚性網膜芽腫細胞、またはそこに由来する細胞、およびより好ましくは、骨髄腫細胞、骨髄腫細胞由来の細胞、卵巣細胞、および卵巣細胞由来の細胞から選択される細胞である。
【００１３】
哺乳動物宿主細胞の例は、ＨＬ−６０（ATCC No. CCL-240）、ＨＴ−１０８０（ATCC No. CCL-121）、ＨｅＬａ（ATCC No. CCL-2）、２９３（ECACC No. 85120602）、Ｎａｍａｌｗａ（ATCC CRL-1432）、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１（Hosoi, et al. (1988) Cytotechnology 1:151）、ＮＭ−Ｆ９（DSM ACC2605、ＷＯ２００５／０１７１３０）およびＰＥＲ．Ｃ６（ECACC No. 96022940、ＵＳ６，８５５，５４４）などのヒト細胞株；ＶＥＲＯ（ATCC No. CCL-1651）およびＣＯＳ−７（ATCC No. CRL-1651）などのサル細胞株；Ｃ１２７１（ATCC No. CRL-1616）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ATCC No. CRL-1581）、およびＮＩＨ３Ｔ３（ATCC No. CRL-1658）、ＮＳ０（ATCC No. CRL-1827）などのマウス細胞株；Ｙ３  Ａｇ  １．２．３．（ATCC No. CRL-1631）、ＹＯ（ECACC No. 85110501）およびＹＢ２／０（ATCC No. CRL-1662)などのラット細胞株；ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC No. CCL-61）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ATCC No. CRL-9096）、ＣＨＯ／ＤＧ４４（Urlaub & Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216）およびＢＨＫ２１（ATCC No. CRL-10）などのハムスター細胞株；ＭＤＣＫ（ATCC No. CCL-34）などのイヌ細胞株等を包含する。
【００１４】
骨髄腫細胞または骨髄腫細胞由来の細胞の例は、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＮＳ０、Ｙ３  Ａｇ  １．２．３．、Ｙ０またはＹＢ２／０等を包含してもよい。卵巣細胞または卵巣細胞由来の細胞の例は、ＣＨＩ−Ｋ１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４等を包含してもよい。さらに、腎細胞の例は、２９３、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ２１、ＭＤＣＫ等を包含してもよい。血液細胞の例は、ＨＬ−６０、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１、ＮＭ−Ｆ９等を包含してもよい。子宮細胞の例は、ＨｅＬａ等を包含してもよい。結合組織細胞の例は、ＨＴ−１０８０、ＮＩＨ３Ｔ３等を包含してもよい。乳腺細胞の例は、Ｃ１２７１１等を包含してもよい。胚性網膜芽腫細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６等を包含してもよい。
【００１５】
本発明の抗体を産生する能力を有する哺乳動物宿主細胞は、抗体または同種のものを産生するために調製された融合細胞を包含してもよい。さらに、抗体を産生するように突然変異されている哺乳動物の細胞、抗体または同種のものの増大した発現レベルを有するように突然変異されている哺乳動物の細胞もまた、本発明の哺乳動物の細胞に包含される。
【００１６】
本発明の抗体を産生する哺乳動物宿主細胞は、好ましくは、Hu14.18K322A抗体をコードする組み換え核酸（例として、ベクター）を用いて形質転換されている組み換え哺乳動物宿主細胞を包含する。Hu14.18K322A抗体をコードする組み換え核酸は、当該技術分野において知られており、および例として、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，４３２，３５７において開示された発現プラスミドpdHL7s-hu14.18を包含する。抗体を発現するために形質転換された細胞は、従来の方法による、哺乳動物宿主細胞内への組み換えベクターの導入によって得られるであろう。例として、Kaufman (1990) Large Scale Mammalian Cell Culture, pp. 15-69を参照されたい。カチオン性脂質試薬であるLIPOFECTAMINE（商標）、LIPOFECTAMINE（商標）-2000、またはLIPOFECTAMINE（商標）-plusなどの市販の試薬を使用した追加のプロトコルが、細胞をトランスフェクトするために使用され得る（Feigner, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417）。加えて、電気穿孔法または核酸でコーティングされたマイクロプロジェクタイルを用いた照射は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Pressにおけるそれらなどの手順を使用した哺乳動物の細胞をトランスフェクトするために使用され得る。安定した形質転換体の選択は、例えば、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなどの化合物への耐性などの、当該技術分野において知られている方法を使用して実施され得る。
【００１７】
Hu14.18K322Aモノクローナル抗体をコードする核酸を内包し、および実質的に非フコシル化Hu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生するために選択される哺乳動物宿主細胞もまた、本発明によって提供される。ある態様において、哺乳動物宿主細胞によって産生される抗体は、少なくとも５５％が非フコシル化されている。例示の哺乳動物宿主細胞株（クローン１３４）は、２０１９年２月１３日に、ＡＴＣＣ受託番号ＸＸＸＸＸの下、American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110に寄託されている。
【００１８】
指し示されるとおり、本方法は、流加プロセスを使用して実行される。本明細書に使用されるとき、「流加プロセス」は、培養が細胞培養培地または基本培地中に細胞を播種することによって開始され、および様々な添加剤の添加が、培養の間に実施されるプロセスである。流加培養は、哺乳動物の細胞からのタンパク質の大規模産生のために幅広く実践されている培養方法である。例として、Chu & Robinson (2001) Current Opin. Biotechnol. 12:180-87を参照されたい。哺乳動物の細胞の流加培養は、絶え間なく、または定期的にのいずれかで、濃縮された基本培地および様々な添加剤を供給される培養の１つである。供給は、例えば、毎日、２日に１回、３日に１回等々の予め決められたスケジュールで起こり得る。供給が起こらない、バッチ培養と比較すると、流加培養は、より大きなタンパク質の量を産生し得る。例として、ＵＳ５，６７２，５０２を参照されたい。ある態様において、本方法の流加培養は、少なくとも１．５ｇ／Ｌの抗体力価を産生する。別の態様において、少なくとも２ｇ／Ｌの力価が、産生される。別の態様において、少なくとも４ｇ／Ｌの抗体が、産生される。さらに別の態様において、少なくとも５ｇ／Ｌの抗体が、産生される。さらなる態様において、本発明は、約６ｇ／Ｌの抗体を産生するための方法を提供する。
【００１９】
本発明に従った方法は、単一フェーズのプロセスまたは複数フェーズのプロセスで実行されてもよい。単一フェーズのプロセスと比較して、複数フェーズのプロセスは、２以上の別個のフェーズで細胞を培養することを指す。例えば、細胞は、細胞増殖および生存率を最大化する環境条件下である、１以上の成長フェーズで最初に培養されてもよく、次いでタンパク質産生を最大化する条件下である産生フェーズへと移されてもよい。本明細書に使用されるとき、「成長フェーズ」は、その間に培養された細胞が、迅速に分裂し、および数を増加させる期間を指す。成長フェーズの間に、細胞は、一般には培地中で、および細胞増殖を最大化するように設計された条件下で、培養されるであろう。「産生フェーズ」は、その間に細胞が、最大量の組み換えタンパク質を産生する期間を指す。産生フェーズは、成長フェーズの間よりも少ない細胞分裂によって特徴付けられ、およびポリペプチドの産生を最大化するよう設計された培地および培養条件の使用もまた包含してもよい。
【００２０】
哺乳動物の細胞によるタンパク質の産生のための商業的プロセスにおいて、一般的には、最終的な産生フェーズに先行して異なる培養槽で起こる複数の、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の成長フェーズがある。成長および産生フェーズは、１以上の移行フェーズによって、先行されても、または分離されてもよい。複数のフェーズのプロセスにおいて、本発明に従った方法は、少なくとも産生フェーズの間に用いられ得るが、先行する成長フェーズにおいてもまた用いられてもよい。産生フェーズは、大規模で行われ得る。典型的には、細胞培養は、バイオリアクター中で滅菌され、制御された温度および大気の条件下で実施される。バイオリアクターは、モニタリング、調節および制御され得る温度、雰囲気、撹拌、および／またはｐＨなどの環境条件において細胞を培養するために使用されるデバイスである。大規模プロセスは、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００リットルの体積において行われ得る。
【００２１】
いくつかの態様において、成長フェーズは、約３３℃〜約３８℃（好ましくは約３７℃）の範囲にある温度で実行される。同様に、産生フェーズは、約２８℃〜約３８℃の範囲にある、好ましくは約３３℃〜約３７℃の範囲にある温度で実行される。具体的な態様において、培養の温度は、３７℃である。
【００２２】
培養するステップは、任意には、例えば、カフェイン、ブチラート、およびヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などのタンパク質産生の化学誘導物質を包含していてもよい。誘導物質が添加される場合、それらは産生フェーズの開始後１時間から５日までに添加され得る。
【００２３】
本流加プロセスに従って、哺乳動物の細胞は、基本培地、グルコース、および植物タンパク質加水分解物の組み合わせを包含する、組み合わせ供給溶液を最小限提供される。本発明の目的のために、「基本培地」または「細胞培養培地」は、哺乳動物の細胞などの動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養における成長に好適な培地である。基本培地の処方は、当該技術分野において周知である。典型的には、基本培地は、亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウムおよびカリウムなどの標準的な無機塩、ならびに微量元素、ビタミン、エネルギー供給源、バッファー系、および必須アミノ酸を供給する。基本培地は、血清、ペプトン、および／またはタンパク質を含有していても、またはしていなくてもよい。血清フリーおよび定義された培養培地を包含する、様々な基本培地は、市販のものである。例えば、以下の細胞培養培地のいずれか１つかまたは組み合わせが使用され得る：数ある中でも、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、イーグル最小必須培地、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２またはＦ−１０培地、ＤＭＥ／Ｆ１２、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、ＰＦ  ＣＨＯ（SAFC Biosciences）、ＰＯＷＥＲＣＨＯ（商標）２（Lonza）、ＺＡＰ−ＣＨＯ（Invitria）、ＣＤ  ＣＨＯ、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）およびＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Invitrogen）、ＰｒｏＣＨＯ（商標）（Lonza）、ＣＤＭ４ＣＨＯ（Hyclone）、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、およびハイブリドーマ血清フリー培地（ＨＳＦＭ）およびＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（JRH Biosciences、Lenexa、KS）などの血清フリー培地。
【００２４】
基本培地は、培養される細胞の要件および／または所望される細胞培養のパラメータに応じて追加のまたは増大した成分の濃度を補充されてもよい。用語「成分」は、化学的または生物学的な起源であるか否かにかかわらず、細胞の増殖の成長を維持または促進するために細胞培養培地で使用され得るいずれかの化合物を指す。用語「構成要素」、「栄養素」および「成分」は、互換的に使用され、およびすべてかかる化合物を指すことを意味する。細胞培養培地で使用される典型的な成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質等を包含する。細胞の培養をｅｘ  ｖｉｖｏで促進または維持する他の成分は、当業者によって本発明の範囲内、および具体的な必要性に従って選択され得る。
【００２５】
好ましい態様において、本発明の細胞培養培地は、血清フリー、タンパク質フリー、および／またはペプトンフリーである。細胞培養培地は、前記培地が、血清（例として、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、または当業者に既知であるいずれかの他の動物由来の血清）を含有しないとき「血清フリー」であると考えられる。「タンパク質フリー」は、トランスフェリン、タンパク質成長因子ＩＧＦ−１、またはインスリンなどの外因的に添加されたタンパク質のない細胞培養培地に適用する。タンパク質フリー培地は、ペプトンを含有していてもしていなくともよい。「ペプトンフリー」は、動物および／または植物タンパク質加水分解物などの外来性タンパク質加水分解物の含有しない基本培地に適用する。
【００２６】
いくつかの態様において、基本培地は、様々な無機および有機のバッファー、界面活性剤（単数または複数）、および塩化ナトリウムなどの標準的なまたは従来の基本培地中に見られるある非栄養構成要素を取り除くために改変されている。基本細胞培地からかかる構成要素を取り除くことは、残存する栄養構成要素の増大した濃度を可能とし、および細胞成長およびタンパク質発現全体を改善するであろう。いくつかの態様において、改変された基本培地は、以下の成分のいずれかを、全てではないが、除いている：重炭酸ナトリウム、バッファー、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、および界面活性剤。ＵＳ９，２３４，０３２を参照されたい。これらの成分は、一般的に商業用の基本細胞培地中に見られ、およびＳＡＦＣ（以前はJRH Bioscienceであった）、Invitrogen、Atlanta Biologicals、およびLonzaなどの商業用の培地サービスによって取り除かれてもよい。代替的に、当業者は、基本細胞培地を作製するための標準的な方法に従って改変された基本細胞培地を調製することができ、ここで重炭酸ナトリウム、バッファー、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、、および界面活性剤の１以上が除外される。
【００２７】
改変された基本培地を使用するとき、基本培地から除外された１以上の構成要素は、成長および／または産生フェーズの間に細胞培養培地に戻されることが好ましい。改変された基本培地に添加されるとき、好ましくは構成要素の以下の量が使用される：約１〜３ｇ／ｋｇの重炭酸ナトリウム；約１〜３ｇ／ｋｇのバッファー（例として、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ′−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ））；約０．０１〜０．１ｇ／ｋｇのＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ；約０．１〜０．１ｇ／ｋｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ；および約０．１〜２ｇ／ｋｇの界面活性剤（例として、商標ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−６８の下販売されているエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに基づくブロックコポリマー）。
【００２８】
特に、バッファーは、細胞培養培地が所望されるｐＨで維持されるのを助けるために包含される。一態様において、細胞培養培地のｐＨは、６．０〜８．０；６．５〜７．５；または６．８〜７．３の範囲をとる。これらのｐＨの値の中間にある数、例として、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、および８．０、ならびに本明細書に列挙されるすべての他の数もまた、本発明の一部であると意図される。本明細書に開示の範囲のいずれかに適用される場合、上に列挙される値のいずれかの組み合わせを上限および／または下限として使用する前記値の範囲は、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００２９】
ある態様において、基本培地は、モル浸透圧濃度の調節因子を除外する。用語「モル浸透圧濃度」は、本明細書に使用されるときは、溶媒１キログラムあたりの溶質のオスモルの尺度（ｍＯｓｍ／ｋｇ）として定義され、およびイオン化または非イオン化分子を包含していてもよい。モル浸透圧濃度は、細胞培養プロセスの間に、例として、供給、塩、添加剤または代謝体の添加によって、変わってもよい。好ましくは、抗体産生のとき（すなわち、産生フェーズの間）での細胞培養培地は、約３００〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇまたはより好ましくは約４００〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、ならびにその中間にある数をとるモル浸透圧濃度を有する。いくつかの態様において、モル浸透圧濃度の調節因子は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＫＮＯ３である。ある態様において、モル浸透圧濃度の調節因子は、ＮａＣｌである。一態様において、モル浸透圧濃度の調節因子は、０ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの間の最終的な濃度で細胞培養培地に添加される。別の態様において、モル浸透圧濃度の調節因子の最終的な濃度は、０ｇ／Ｌ〜６．５ｇ／Ｌである。上限および／または下限として上に列挙される値のいずれかの組み合わせを使用する値の範囲は、本発明の範囲内に包含することが意図される。
【００３０】
本発明に従うと、流加プロセスは、少なくとも１の植物タンパク質加水分解物の基本培地への添加を包含する。用語「加水分解物」は、いずれかの酵素消化物、具体的には、より単純な形態への（例として、単糖類または二糖類および／またはモノ−、ジ−またはトリペプチドを含む調製物への）植物の構成要素の分解を可能とする少なくとも１の酵素で植物構成要素を処理することによって調製される特殊なタイプの抽出物を包含する。「加水分解物」は、さらに、例えばパパインによって酵素的に消化され得、および／または自己分解、熱分解および／または原形質分解によって形成され得る。ある態様において、植物タンパク質加水分解物は、大豆、小麦、綿花、乳清、エンドウ、ヒヨコマメまたは綿花の酵素的に加水分解されたタンパク質加水分解物である。本発明の培地において使用される加水分解物は、市販のものであり、例えば、商標ＨＹＰＥＰ（登録商標）１５１０またはQuest International（Norwich、NY）などの供給源からのＨＹ−ＳＯＹ（登録商標）、SAFC BiosciencesからのSoy Hydrolysate UF、HyClone MediaからのHYQ（登録商標）Soy Hydrolysateの下販売されているタンパク質加水分解物、またはソイトン（soytone）、フィトン（phytone）、フィトンペプトン、またはそれらの組み合わせなどの大豆ペプトン（大豆あら粉（meal）／細粉（flour）の酵素消化物）を包含する。好ましくは、植物タンパク質加水分解物は、細胞培養培地において約６〜１２ｇ／Ｌ、例として、約８〜１０ｇ／Ｌの量で包含される。一態様において、細胞培養培地は、約６〜１２ｇ／Ｌの大豆タンパク質加水分解物、例として、約８〜１０ｇ／Ｌの大豆タンパク質加水分解物を包含する。いくつかの態様において、植物タンパク質加水分解物は、供給において２５ｇ／Ｌを超えない量で細胞培養培地に添加される。具体的な態様において、最初の成長培地は、２％ソイトンおよび２％フィトンを包含する。さらなる態様において、産生フェーズの間に添加される培養培地は、８〜１０％ソイトンおよび８〜１０％フィトンを包含する。
【００３１】
本発明に従うと、流加プロセスはまた、システインまたは、Ｎ−アセチルシステインなどのシステイン誘導体の、基本培地への添加を包含してもよい。具体的な態様において、システインは、約０．１〜１０ｍＭ、またはより好ましくは約１〜７ｍＭのシステインの量で細胞培養培地に包含される。
【００３２】
いくつかの態様において、植物タンパク質加水分解物および任意のシステインは、独立した供給として提供される。他の態様において、植物タンパク質加水分解物およびシステインは、独立した供給として添加される加水分解物濃縮溶液において一緒に提供される。独立した植物タンパク質加水分解物およびシステイン供給または加水分解物濃縮溶液は、抗体の産生フェーズの開始の直前、または開始時に始まり得る。独立した供給は、基本培地と同じまたは異なる日における細胞培養培地への流加によって成し遂げられ得る。独立した供給は、１以上の日の後に細胞培養培地へと添加され得、および産生フェーズの過程においてもまた繰り返して添加され得る。例えば、産生フェーズは、７日から８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日またはそれ以上の間まで継続させることが可能であり、および産生フェーズの即時におよび／または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目に、および／またはその日後に独立した供給を補充され得る。
【００３３】
エネルギー供給源もまた、本発明の細胞培養培地へと添加される。好ましくは、エネルギー供給源は、単糖類である。細胞培養培地で使用されてもよい単糖類の例は、グルコース（例として、Ｄ−グルコース）、マルトース、マンノース、ガラクトースおよびフルクトースを包含する。一態様において、グルコースは、０．５〜４．０ｇ／Ｌの範囲をとる最終的な濃度で細胞培養培地へと添加される。別の態様において、グルコースは、４．０ｇ／Ｌ以下の最終的な濃度で細胞培養培地へと添加される。ある態様において、グルコースは、約０．５〜１．５ｇ／Ｌ、および最も好ましくは１．０ｇ／Ｌの最終的な濃度で細胞培養培地へと添加される。列挙されるグルコース濃度の中間にある数、例として、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、および４．０、ならびにその中間にある数もまた、本発明の一部であると意図される。上限および／または下限として上に列挙される値のいずれかの組み合わせを使用する値の範囲もまた、本発明の範囲内に包含されると意図される。好ましくはグルコース濃度は、リアルタイムにモニタリングされ、および抗体産生を促進し、および細胞生存率を維持するために、産生フェーズの間中約０．５ｇ／Ｌ〜１．５ｇ／Ｌの範囲にある、またはより好ましくは約１ｇ／Ｌ±０．１ｇ／Ｌでの安定した濃度で維持される。「安定したグルコース濃度」は、グルコース濃度が、約０．５ｇ／Ｌを下回るか、または約１．５ｇ／Ｌを上回ることのないことを意味する。特に、４〜５ｇ／Ｌのグルコース濃度は、Hu14.18K322A抗体の生存率および生産性に悪影響を与えることが見出された。理想的には、培養の種々のフェーズの間の既知のグルコース消費率に基づく、フィードフォワードアルゴリズムが使用され、所望されるグルコース濃度が維持される。好ましくは、フィードフォワードアプローチは、グルコース消費の１００％、およびグルコース制御系のトリガーとなり、および１ｇ／Ｌで維持する≦０．５ｇ／Ｌのグルコース下限設定値を伴うバックアップ閉ループグルコース制御系を占める。グルコース制御系は、随時オンまたはオフにすることができる。
【００３４】
本発明の細胞培養培地は、グルタミン、例として、Ｌ−グルタミンをさらに包含してもよい。好適なＬ−グルタミンの供給源は、GIBCOなどの様々な商業的供給源から入手可能である。いくつかの態様において、グルタミンは、約０．１〜０．５ｇ／ｋｇの量で細胞培養培地において提供される。
【００３５】
本発明の細胞培養培地は、グルタチオンをさらに包含してもよい。一態様において、０．４ｍｇ／Ｌ〜１．６５ｍｇ／Ｌのグルタチオンが、細胞培養培地に添加される。
【００３６】
別の態様において、細胞培養培地は、インスリンまたは組み換え類似体などの組み換え成長因子、ＩＧＦ−１、またはインスリンおよびＩＧＦ−１の組み合わせを包含する。一態様において、４ｍｇ／Ｌ〜１３ｍｇ／Ｌのインスリンまたは組み換え類似体が添加される。別の態様において、２５ｎｇ／Ｌ〜１５０ｎｇ／ＬのＩＧＦ−１が添加される。もう１つの態様において、５０ｎｇ／Ｌ〜１００ｎｇ／ＬのＩＧＦ−１が添加される。さらに別の態様において、２５ｎｇ／Ｌ〜１５０ｎｇ／ＬのＩＧＦ−１が、インスリンに補充される。一態様において、５０ｎｇ／Ｌ〜１００ｎｇ／ＬのＩＧＦ−１が、インスリンに補充される。
【００３７】
さらに別の態様において、細胞培養培地は、無機鉄の供給源、例として、クエン酸酸化鉄を包含する。一態様において、１０ｍＬ／Ｌまたは１２２ｍｇ／Ｌのクエン酸酸化鉄が添加される。もう１つの態様において、クエン酸酸化鉄は、１２２ｍｇ／Ｌの濃度に保持される。
【００３８】
本発明の細胞培養培地はまた、非鉄金属イオンを包含してもよい。非鉄金属イオンの例は、これらに限定されないが、塩化物および硫酸塩、カリウム、マグネシウム、銅、セレン、亜鉛、ニッケル、マンガン、スズ、カドミウム、モリブデート、バナデート、およびシリケートを包含する。
【００３９】
本発明の細胞培養培地はまた、ビタミンおよび酵素補因子を包含してもよい。かかるビタミンおよび酵素補因子の例は、これらに限定されないが、ＰＡＢＡ（ｐ−アミノ安息香酸）、ビタミンＫ（ビオチン）、ビタミンＢ５（Ｄ−カルシウムパントテン酸塩）、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド（ニコチン酸アミド）、ビタミンＢ６（ピリドキシンＨＣｌ）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ１（チアミン）、およびビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を包含する。代替的に、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）が、培地に添加されてもよい。コリン塩化物もまた添加されてもよく、それは大抵はビタミンとみなされるが、脂質因子とみなされてもよい。
【００４０】
加えて、本発明の細胞培養培地はまた、脂質様因子を包含してもよい。脂質因子の例は、コリン塩化物およびホスファチジルコリンを包含する。脂質産生における補助剤、例として、エタノールアミンのようなアルコールアミンもまた包含されてもよい。
【００４１】
任意に、細胞培養培地は、メトトレキサートを包含してもよい。細胞培養培地において使用されるメトトレキサートの量の例は、約１００ｎＭ〜５０００ｎＭのメトトレキサートを包含する。列挙されているメトトレキサートのモル濃度の中間にある数、例として、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、および５０００ｎＭ、ならびにその中間にある数もまた、本発明の一部であると意図される。上限および／または下限として上に列挙される値のいずれかの組み合わせを使用する値の範囲もまた、本発明の範囲内に包含されると意図される。
【００４２】
本発明の方法を使用して、Hu14.18K322A抗体の力価が増大することが見出された。具体的な態様において、Hu14.18K322A抗体を産生する方法は、対照の哺乳動物の細胞培養よりも少なくとも１０％大きな抗体の力価を提供する。いくつかの態様において、哺乳動物の細胞培養の抗体力価は、対照の哺乳動物の細胞培養と比較して少なくとも２５％、４０％、５０％、７５％、または９０％改善される。他の態様において、哺乳動物の細胞培養の抗体力価は、対照の哺乳動物の細胞培養よりも少なくとも９０％、１５０％または２５０％大きい。さらに他の態様において、抗体力価は、少なくとも約４００ｍｇ／Ｌ、約６００ｍｇ／Ｌ、約８００ｍｇ／Ｌまたはそれより高い。
【００４３】
本発明の方法を使用して、非フコシル化Hu14.18K322A抗体のパーセンテージが、従来の産生方法と比べて増大していることが見出された。特に、非フコシル化Hu14.18K322A抗体は、２Ｆ−ペルアセチル−フコースまたはベタインなどの流加培地インヒビターの存在または不在下で産生される。「非フコシル化Hu14.18K322A抗体」は、その定常領域のグリコシル化においてフコースを欠くHu14.18K322A抗体を指す。ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３のグリコシル化は、Ａｓｎ２９７で生じ、コアフコシル化二分枝複合体オリゴ糖類のグリコシル化は、最大２Ｇａｌ残基で終了する。いくつかの態様において、非フコシル化抗体は、Ａｓｎ２９７でフコースを欠いている。例示の非フコシル化された種は、ＧＯグリカン、Ｇｌａグリカン、Ｇｉｂグリカン、Ｇ２グリカン、Ｍａｎ３グリカン、Ｍａｎ４グリカン、Ｍａｎ５グリカン、Ｍａｎ６グリカン、Ｍａｎ７グリカン、Ｍａｎ８グリカン、および／またはＭａｎ９グリカン、またはいずれかそれらの組み合わせを包含する。好ましくは、非フコシル化された種は、ＧＯグリカンである。具体的な態様において、Hu14.18K322A抗体を産生する本方法は、対照の哺乳動物の細胞培養において産生されたHu14.18K322A抗体と比較して、増大したパーセンテージの非フコシル化Hu14.18K322A抗体を提供し、ここで前記非フコシル化Hu14.18K322A抗体における増加は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％または２５％である。他の態様において、複数のHu14.18K322A抗体を含有する組成物は、細胞によって発現される抗体の総量の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％が、非フコシル化されている場合に、「実質的に非フコシル化されている」とみなされる。フコースを測定する方法は、当該技術分野において知られているいずれかの方法を包含する。例として、Wuhrer, et al. (2005) J. Chromatog. B 825(2):124-133；Ruhaak (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3457-3481;およびGeoffrey, et al. (1996) Anal. Biochem. 240:210-226を参照されたい。
【００４４】
本発明の目的のために、「対照の哺乳動物の細胞培養」は、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体をコードする核酸を内包する哺乳動物の細胞を、植物タンパク質加水分解物およびシステインの不在下での培養条件および浸透圧において従来の細胞培養培地中で培養することを包含する。
【００４５】
理想的には、本方法に従って産生されたHu14.18K322A抗体は、増強された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。「増強されたＡＤＣＣ活性」を有する抗体は、抗体および親抗体が、少なくとも１の構造上の側面において異なり、およびアッセイにおいて使用されるかかる抗体および親抗体の量が、本質的に同じであるときに、親抗体と比べてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＡＤＣＣを媒介するのにより有効である抗体を指す。いくつかの態様において、抗体および親抗体は、同じアミノ酸配列を有するが、抗体が非フコシル化されている一方で親抗体はフコシル化されている。いくつかの態様において、ＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを使用して決定されるであろうが、ＡＤＣＣ活性を決定するための他のアッセイまたは方法、例として、動物モデル等々においてが企図される。
【００４６】
Hu14.18K322Aモノクローナル抗体を産生した後、抗体は、既知のプロセスを使用して培養物から（例として、培養培地または細胞抽出物から）回収または収集され、および精製または部分的に精製される。分画手順は、これらに限定されないが、濾過、遠心分離、沈殿、相分離、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルなどの樹脂を使用する）、ＨＰＬＣ、または上記のいくつかの組み合わせの１以上のステップを包含し得る。
【００４７】
例えば、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体の生成は、ポリペプチドに結合するだろうプロテインＡまたはタンパク質Ｇ樹脂；溶離を伴う１以上のステップ、を包含し得る。ポリペプチドは、従来の技法、例として、高塩溶離バッファーおよび次いでより低い塩バッファー内へと透析して使用する、または利用される親和性マトリックスに応じてｐＨまたは他の構成要素を変更することによるもの、を使用して親和性カラムから取り除かれ得、または天然に存在する基質の親和性部分を使用して競合的に取り除かれ得る。最終的な純度の所望される程度は、意図される使用に依存する。本発明の方法および組成物は、治療的な使用に好適である。よって、抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されることになっているとき、相対的に高い純度が所望される。かかるケースにおいて、抗体は、他のポリペプチドに対応するポリペプチドバンドが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の際に検出可能でないように精製される。抗体に対応する複数のバンドが、差異的グリコシル化、差異的翻訳後プロセシング等に起因して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化され得ることが、関連する分野において技能を有するものにより認識されるであろう。最も好ましくは、本発明の抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の際に単一のポリペプチドバンドによって指し示されるように、実質的に均一になるまで精製される。ポリペプチドバンドは、銀染色、クマシーブルー染色によって、または（ポリペプチドが、放射性標識されている場合には）オートラジオグラフィによって、可視化され得る。
【００４８】
本発明はまた、医薬組成物においてHu14.18K322Aモノクローナル抗体をさらに処方することを任意に網羅する。用語「処方すること」は、抗体が、バッファー交換され、滅菌され、バルク包装され、および／または最終的な使用者のために包装され得ることを意味する。かかる医薬組成物は、有効量のHu14.18K322Aモノクローナル抗体を、生理学的に許容し得る希釈剤、担体、または賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて包含し得る。用語「生理学的に許容し得る」は、活性成分（単数または複数）の生物活性の有効性に干渉しない非毒性の材料を意味する。
【００４９】
Hu14.18K322Aモノクローナル抗体の産生について本明細書に提示されている知見の観点から、当業者は、本発明の方法がまた、Hu14.18K322Aモノクローナル抗体のものと同様の特徴を有する他の抗体を産生するにも有用であることを理解するであろう。
【００５０】
以下の非限定例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【００５１】
例１：Hu14.18K322A抗体の発現
Hu14.18K322Aの重鎖および軽鎖を発現する発現プラスミドは、ＵＳ７，４３２，３５７に記載される。手短に言えば、Hu14.18K322A発現プラスミドpdHL7-hu14.18:pdHL7は、pdHL2（Gillies, et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202）に由来し、および免疫グロブリンの軽鎖および重鎖両方の遺伝子の転写のためのサイトメガロウイルスエンハンサー−プロモーターを使用した。
【００５２】
電気穿孔法は、上に記載のHu14.18K322A抗体をコードするＤＮＡを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはラットハイブリドーマ細胞ＹＢ２／０内に導入するために使用される。電気穿孔法を実施するために、細胞を、１０％の熱失活したウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたダルベッコ改変イーグル培地中で成長させる。約５×１０６の細胞を、一度ＰＢＳで洗浄して、および０．５ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。１０マイクログラムの改変されたHu14.18K322A抗体をコードする線状化プラスミドＤＮＡを、次いで氷上でＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベット（０．４ｃｍ電極ギャップ、BioRad、Hercules、CA）内で細胞と１０分間インキュベートする。電気穿孔法は、０．２５Ｖおよび５００μＦに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（BioRad、Hercules、CA）を使用して実施される。細胞は、氷上で１０分間回復させて、その後それらを、成長培地に再懸濁し、および２つの９６ウェルプレート上に蒔いた。
【００５３】
安定的にトランスフェクトされたクローンは、メトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下でのそれらの成長によって選択される。具体的に言うと、親クローン＃１０８−３３４は、限界希釈によるサブクローニングから同定された。サブクローニングを、１０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、および５０ｎＭのＭＴＸで補充されたＤＭＥＭを含有する９６−ウェルプレートにおいて８、４、２、１、０．５および０．２５細胞／ウェルで細胞を蒔くことによって実行した。０．２５細胞／ウェル、０．５細胞／ウェルおよび１細胞／ウェルを含有するプレート上でサブクローンが現れたとき、少なくとも２細胞／ウェルを含有するプレートを処分した。ウェル中のサブクローンを、顕微鏡下で検査し、ウェル中にただひとつ目に見えるクローンがあることを保証した。０．２５細胞／ウェル含有する６の９６−ウェルプレート、０．５細胞／ウェル含有する６の９６−ウェルプレートおよび１細胞／ウェル含有する６の９６−ウェルプレートからの合計で１１２のサブクローンを選び取り、および上清中での抗体発現レベルを、抗ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡによりアッセイした。最良のサブクローンは、＃１０８−４および＃１０８−３３４であり、夫々７５−ｃｍ２  Ｔフラスコ中でおよそ８９μｇ／ｍｌおよび１０６μｇ／ｍｌ産生した（ｒＰＡ分析による）。クローン＃１０８−３３４は、血清の漸減により、血清フリー培地、すなわち、ＨＳＦＭおよび５２ｎＭのＭＴＸに適合した。マスターセルバンクを、５２ｎＭのＭＴＸを含むＨＳＦＭ培地中でクローン＃１０８−３３４を継代し、およびRecovery（商標） Cell Culture Medium中で細胞を１×１０７細胞／ｍＬに処方し、液体窒素の蒸気相中での保管することによって産生した。
【００５４】
ＹＢ２／０をベースとしたクローン＃１３４の産生を、ＭＴＸの濃度の１，０００ｎＭの最終的な濃度までの４週間にわたる段階的な増加で親クローン＃１０８−３３４を処置することによって得た。クローンを、１，０００ｎＭのＭＴＸを含有する培養培地でさらに４〜５週間維持し、および随時培地を供給した。１，０００ｎＭのＭＴＸを生き残る、この集団の細胞の試料を、クローン選択の次のラウンドのために使用した。
【００５５】
次のステップで、３，３６０の個々の１，０００ｎＭのＭＴＸ耐性クローンを１０００ｎＭのＭＴＸ中に６ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、２ｇ／Ｌのソイトンおよび２ｇ／Ｌのフィトンを含むＨＳＦＭ中で単一細胞選択を生き残るそれらの能力をスクリーニングした。この選択プロセスにより、産生クローン＃１３４が結果として生じた。
【００５６】
産生クローン＃１３４のマスターセルバンクを、１０００ｎＭのＭＴＸ中に６ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、２ｇ／Ｌのソイトンおよび２ｇ／Ｌのフィトンを含むＨＳＦＭ中で細胞を成長させることによって産生した。細胞を解凍し、遠心分離し、成長培地中で際懸濁し、および２〜３×１０５細胞／ｍＬで懸濁フラスコ内へ播種した。細胞密度が１〜２×１０６細胞／ｍＬに到達したら細胞を継代し、および１〜２×１０９細胞となるまで継代を続けた。細胞を遠心分離し、および１０００ｎＭのＭＴＸおよび５％ＤＭＳＯ中に６ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、２ｇ／Ｌのソイトンおよび２ｇ／Ｌのフィトンを含む新たなＨＳＦＭ中で１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を、続いてＣｒｙｏＭｅｄ（商標）コントロールレートフリーザーを使用して冷凍し、および液体窒素の蒸気相中で保管した。
【００５７】
例２：流加プロセスによるHu1418 K322Aの産生
Hu14.18K322A産生細胞を、６ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（商標）、２ｇ／Ｌのソイトンおよび２ｇ／Ｌのフィトン加水分解物および親クローン＃１０８−３３４についての５２ｎＭのＭＴＸまたは産生クローン＃１３４についての１０００ｎＭのＭＴＸのいずれかで補充されたＨＳＦＭ中で維持した。Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａの産生における最初のステップは、産生リアクターに接種する細胞を生成するための標準的な接種シードトレイン（seed train）であった。マスターセルバンクからのバイアルを解凍し、および細胞を懸濁液中０．２〜０．３×１０６細胞／ｍＬの生存細胞密度で接種した。１〜１．５×１０６細胞／ｍＬの生存細胞密度に到達した後に、これらの細胞を使用して、０．２〜０．３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度でこれに続くバイオリアクターに接種した。産生バイオリアクターに播種する細胞を生成するためのバイオリアクターは、ＣＯ２インキュベーター内の小さな５０ｍＬ振とうフラスコから完全に制御されたバイオリアクターまでの範囲をとった。産生バイオリアクターに０．２〜０．３×１０６細胞／ｍＬで接種すると、流加フェーズを開始する前に、リアクターを７２時間培養した。すべての接種種培養を、３７℃で成長させ、および溶存酸素（ＤＯ）レベルを、空気飽和の５０％に設定した。ｐＨを６．９±０．０３で維持した。
【００５８】
抗体産生に対するソイトンおよびフィトンの影響。７２時間の後に、供給をパルス調整供給（pulsed modulated feeding）を介して開始した。供給は、ＨＳＦＭ培地および６ｍＭのGlutamax（商標）のみから構成され（すなわち、ソイトンまたはフィトンのない）、およびバイオリアクターの開始体積の３．５〜４．５ｍＬの供給／時間／Ｌの一定速度で提供された。グルコースを、細胞代謝を介して１ｇ／Ｌまで減少させ、および別のグルコース供給によってこの値で維持した；供給およびグルコース両方の添加を、バイオリアクター制御システムアルゴリズムによって制御した接種材料が産生バイオリアクター内に移されたときに開始された２１０時間の合計経過培養時間（total elapse culture time）（ＴＥＣＴ）の後に、１３０ｍｇ／Ｌのhu14.18K322A力価が、クローン＃１０８−３３４についての５４％の非フコシル化パーセンテージ（％ＡＦ）とともに達成された。リアクターを深層濾過とこれに続く滅菌（０．２ｍｍ）濾過を介して澄明にし、および下流のプロセシングのために使用した。
【００５９】
hu14.18K322Aの収率、％ＡＦおよびＴＥＣＴに対するソイトンのｇ／Ｌおよびフィトンのｇ／Ｌの（供給およびクローンにおける）効果を、表１中に要約する。
【表１】
2021517805.tif 000002
【００６０】
バイオリアクターの実行は、細胞生存率が１×１０６細胞／ｍＬを下回ったときに終了した。これらの結果は、供給中のソイトンおよびフィトンの量を増加させることがhu14.18K322Aの収率および品質に対して直接効果を有したことを示す。細胞培養上清のアミノ酸分析は、より低いソイトン／フィトン濃度、すなわち、≦６ｇ／Ｌが、システインなどの数個の必須アミノ酸が不十分である一方で、８ｇ／Ｌを上回るソイトン／フィトンレベル、すなわち、１０ｇ／Ｌおよび１５ｇ／Ｌが、実行の終わりで適正なレベルの必須アミノ酸を有することを示した。結果は、hu14.18K322A産生についてのソイトン／フィトンの最適レベルがあったことを示した。
【００６１】
抗体産生に対する温度シフトの影響。バイオリアクターの温度を４日目、５日目、および６日目のＴＥＣＴに対して２４時間にわたって３７℃から３３℃まで低減させた。流加培地を１０ｇ／Ｌのソイトンおよびフィトンで設定し、および抗体産生をクローン＃１３４を使用して達成した。抗体産生に対する温度シフトの効果を、表２中に要約する。
【表２】
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【００６２】
例３：グリカン分布
グリコプロファイリングを、流加培養から採取する際の抗体産物のオリゴ糖分布を調査して実施した。澄明にした試料のＮ−グリカンプロファイルを従来の方法、例として、タンパク質分解性の消化およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）またはエレクトロスプレイイオン化−質量分析ＥＳＩ−ＭＳによって決定した。例として、Reusch, et al. (2013) Anal. Biochem. 432:82-9；Selman, et al. (2010) Anal. Chem. 82:1073-81；Shah, et al. (2014) J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25:999-1011；Wuhrere, et al. (2005) Anal Chem. 77:886-94；Chevreux, et al. (2011) Anal. Biochem. 415(2):212-4を参照されたい。Ｎ−グリカンアイソフォームＧ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ０＋ＧｌｃＮａｃ、Ｇ１＋ＧｌｃＮａｃ、Ｇ１（１，６）、Ｇ１（１，３）、Ｇ１Ｆ（１，６）、Ｇ１Ｆ（１，３）、Ｇ１Ｆ＋ＧｌｃＮａｃ、Ｇ２（ＮＡ２）、Ｇ２Ｆに対応する質量を有するＦｃフラグメントシグナルを調査し、およびそれらの相対的な存在量を、シグナルの強度から推定した。この分析の結果を、図１に提示する。
【００６３】
例４：Hu14.18K322Aの精製および処方
Hu14.18K322A抗体の精製を、深層濾過フィルター（例として、Sartorius Sartoclear（登録商標）ＰＢ１  Ｄｒｕｍ  Ｌ  フィルター）を使用して細胞培養の培養液を澄明にすることによって、または遠心分離して（バッチまたは連続的に）細胞および細胞片を取り除くことによって達成する。澄明にした培養液を、次いで第一カラムである、プロテインＡカラム（例として、MabSelect（商標）PrismA）上にローディングする。ローディングのステップの後に、プロテインＡカラムを、１．５ＭのＮａＣｌ、および０．１Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ６．０を包含するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、宿主タンパク質および宿主核酸を溶離させる。Hu14.18K322Aを、０．５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．０で溶離する。Hu14.18K322Aの溶離ピークを収集し、および３０分間室温にて保持（すなわち、低ｐＨウイルスの不活性化ステップ）し、および次いで３５Ｍｍの酢酸Ｎａ（ＮａＡｃ）、ｐＨ４．５で１倍に希釈する。産物をCapto（商標）SP ImpResカラム上にローディングし、３５ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５および３５ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５＋２２５ｍＭのＮａＣｌで洗浄して、およびHu14.18K322Aを３５ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５＋６００ｍＭのＮａＣｌで溶離する。Hu14.18K322A産物プールを２０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ６．８で７ｍｇ／ｍＬまで希釈し、およびバッファーを分子量３０，０００のカットオフ限外濾過膜を使用した一定体積のタンジェント流濾過（ＴＦＦ）によって２０ｍＭのビス−トリスプロパン、ｐＨ６．８に交換する。Hu14.18K322Aを、商標Viresolve（登録商標）NFP（ウイルス除去）の下販売されているものなどのナノフィルターを通して濾過し、および次いで商標Sartobind（登録商標）Qの下販売されているものなどのイオン交換膜で濾過して残留宿主核酸および宿主細胞タンパク質を取り除く。Hu14.18K322A産物プールを、最終的な製剤化バッファーである、１００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含むＰＢＳ（ｐＨ６．０）内に８ダイアフィルトレーション（diafiltration）体積でダイアフィルトレーションし（diafiltered）、および１０．５ｍｇ／Ｌまで濃縮する。ポリソルベート８０を、０．０３パーセントｗ／ｗの最終的な濃度まで添加した。hu14.18K322Aの濃度をＵＶ２８０ｎｍによって測定し、および１０．０ｍｇ／Ｌまで希釈する。続いて、希釈した抗体を、商標Sartopore（登録商標）の下販売されている０．１ｍｍ滅菌グレードフィルターを通してバイオプロセスバッグ内に濾過し、および２〜８℃で保管した。
【００６４】
例５：Hu14.18K322A抗体のＡＤＣＣ活性
抗体調製。PROMEGA ADCC reporter bioassayを使用してＡＤＣＣ活性を査定する。希釈した抗体のストックを、ＡＤＣＣアッセイバッファーを使用して１：１０００に抗体を希釈することによって調製する。試験するために、希釈したストックを、ＡＤＣＣアッセイバッファーを使用して１μｇ／ｍＬまでさらに希釈する。
【００６５】
細胞調製。播種の２０時間後、Ｍ２１細胞を組織培養インキュベーターから取り除く。各ウェルから、９５μＬの培地を取り除き、および２５μＬの予め加温したＡＤＣＣアッセイバッファーに置き換える。標的Ｍ２１細胞を含有する各ウェルに、２５μＬの希釈した抗体を添加する。
【００６６】
エフェクター細胞。エフェクター細胞を、２〜３分間３７℃の水浴にて解凍し、これに続き３．６ｍＬの予め加温したＡＤＣＣアッセイバッファー内に６３０μＬの細胞をピペットで移す。細胞を、穏やかに１〜２回アッセイバッファー中でピペッティングすることにより混合する。エフェクター細胞を、滅菌試薬リザーバに移し、および続いて標的細胞±抗体を含有するウェル内に２５μＬをピペットで移した。プレートを組織培養インキュベーターに戻し、および６時間インキュベートする。
【００６７】
Ｂｉｏ−Ｇｌｏｗルシフェラーゼ試薬の調製。ルシフェラーゼアッセイバッファーを室温にて解凍し、およびルシフェラーゼ試薬粉末の再構成に使用する。６時間のインキュベーションの後に、プレートを組織培養インキュベーターから取り除き、および室温にて１５分間置く。ウェルの各々に、７５μＬの室温の再構成されたＢｉｏ−Ｇｌｏｗ試薬を添加する。細胞を、Ｂｉｏ−Ｇｌｏｗ試薬とともに室温にて１５分間インキュベートする。プレートを、暗所でインキュベートする。
【００６８】
データの取得。発光データ（ＲＬＵ）を、Spectromax L SOFTMAX Pro 5.4プログラムによる発光ＥＬＩＳＡを使用して５２７ｎｍで取得する。ＲＬＵを、試験された抗体用量（ｎｇ／ｍＬ）に対してプロットする。バックグラウンド除去の後に、データを、SOFTMAX PRO中でグラフで示し、および４パラメータロジスティックモデルの方程式に当てはめた。ＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ）を、該方程式から算出し、および該方程式中の「Ｃ」フィットパラメータによって表される。
【００６９】
かかるアッセイを使用して、ＡＤＣＣデータは、９６％フコシル化hu14.18K322A（ＮＳＯ細胞から発現した）が、１４６ｎｇ／ｍＬのＡＤＣＣ活性を有すると示す。比較すると、９２〜９４％フコシル化ch14.18（キメラの抗ＧＤ２抗体）が、８〜１０ｎｇ／ｍＬの間のＡＤＣＣ活性を有する。この同じアッセイにおいて、７５〜８５％非フコシル化を有する抗体は、１．２〜１．５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０を有する；５５〜６０％非フコシル化は、２．１〜２．３ｎｇ／ｍＬのＡＤＣＣ活性を表すことを示した；および２２％〜３０％非フコシル化を有する抗体は、３．５〜４ｎｇ／ｍＬのＡＤＣＣ活性を表すことを示した。ＡＤＣＣ活性対％非フコシル化のプロットを、図２に提示する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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