(57)【要約】  ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２など、核局在性ポリペプチドのアセチル化部位に対応するタンパク質性分子、ならびに核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害または低減するそれらの使用が開示される。本発明はまた、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）上皮間葉転換（ＥＭＴ）；または（ｖ）間葉上皮転換（ＭＥＴ）のうちの少なくとも１つを変更し、対象におけるがんを治療または防止するための、タンパク質性分子の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核局在性ポリペプチドの核局在化（核局在性ポリペプチドのアセチル化部位のアセチル化は細胞内におけるその核局在化を増大させる）を阻害または低減する方法であって、細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項２】
ポリペプチドが、ＰＤ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞内における核局在化を阻害または低減する方法であって、細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項６】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞が、がん幹細胞またはがん幹細胞以外の腫瘍細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞が、がん幹細胞腫瘍細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）上皮間葉転換（ＥＭＴ）；（ｖ）間葉上皮転換（ＭＥＴ）；または（ｖｉ）生存率のうちの少なくとも１つを変更する方法であって、前記細胞を、形成、増殖、維持、ＥＭＴ、ＭＥＴ、または生存率をモジュレートする量の、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項９】
ＥＭＴが阻害または低減される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞が、がん幹細胞またはがん幹細胞以外の腫瘍細胞である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞が、がん幹細胞腫瘍細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
がん幹細胞腫瘍細胞の形成が阻害または低減される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
がん幹細胞腫瘍細胞の増殖が阻害または低減される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
がん幹細胞腫瘍細胞の生存率が阻害または低減される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子を対象に投与するステップを含む、対象におけるがんを治療または防止する方法であって、前記がんが、少なくとも１つの、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞を含む、前記方法。
【請求項１６】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞が、がん幹細胞またはがん幹細胞以外の腫瘍細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞が、がん幹細胞腫瘍細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、膀胱がん、膵臓がん、結腸がん、肝臓がん、もしくは脳がん、または黒色腫もしくは網膜芽細胞腫から選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上の、さらなるがん治療を投与するステップをさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
さらなるがん治療が化学療法剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質性分子が、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
核局在性ポリペプチドの核局在化（前記核局在性ポリペプチドのアセチル化部位のアセチル化は細胞内における前記核局在性ポリペプチドの核局在化を増大させる）を阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、核局在化の正常レベルまたは参照レベルと比べた、核局在性ポリペプチドの細胞内における核局在化の低減または阻害を検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２３】
タンパク質性分子が、核局在性ポリペプチドの断片である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質性分子が、５０アミノ酸残基以下を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
アセチル化部位に対応するアミノ酸配列が、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質性分子が、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つなど）のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
核局在性ポリペプチドの核局在化（前記核局在性ポリペプチドのアセチル化部位のアセチル化は細胞内における前記核局在性ポリペプチドの核局在化を増大させる）を阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）細胞を、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、核局在化の正常レベルまたは参照レベルと比べた、核局在性ポリペプチドの細胞内における核局在化の低減または阻害を検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２８】
タンパク質性分子が、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つなど）のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
がん幹細胞の形成、増殖、生存率、またはＥＭＴのうちの少なくとも１つを阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）がん幹細胞を、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、細胞の形成、増殖、生存率、またはＥＭＴの正常レベルまたは参照レベルと比べた、がん幹細胞の形成、増殖、またはＥＭＴの低減または阻害を検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３０】
タンパク質性分子が、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つなど）のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
式Ｉ：
Ｚ1Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｚ2  （Ｉ）
［式中、
Ｚ1およびＺ2は、独立に、存在しないか、または、独立に、約１つ〜約５０のアミノ酸残基（および間の全ての整数の残基）、および保護部分を含むタンパク質性部分のうちの少なくとも１つから選択され；
Ｘ1は、存在しないか、または、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ2は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基から選択され；
Ｘ3は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ4は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ5は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ6は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ7は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ8は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｋ、Ｒ、Ｏｒｎ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基、ならびにＮ、Ｑ、Ｏｒｎ（Ａｃ）、Ｋ（Ａｃ）、およびこれらの修飾形態を含む、アミド含有側鎖を伴うアミノ酸残基から選択され；
Ｘ9は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ10は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ11は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ12は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ13は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ14は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ15は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ16は、Ｋ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される］
により表される、単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子。
【請求項３２】
Ｚ1が存在しない、請求項３１に記載のタンパク質性分子。
【請求項３３】
Ｚ2が存在しない、請求項３１または３２に記載のタンパク質性分子。
【請求項３４】
Ｘ1が、ＬおよびＡから選択される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項３５】
Ｘ1が存在しない、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項３６】
Ｘ2が、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項３７】
Ｘ2が、ＡおよびＫから選択される、請求項３６に記載のタンパク質性分子。
【請求項３８】
Ｘ2が、Ｋである、請求項３７に記載のタンパク質性分子。
【請求項３９】
Ｘ3が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＦ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む芳香族アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項４０】
Ｘ3が、Ｆ、Ｅ、およびＫから選択される、請求項３９に記載のタンパク質性分子。
【請求項４１】
Ｘ3が、Ｆである、請求項４０に記載のタンパク質性分子。
【請求項４２】
Ｘ4が、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基、ならびにＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｎｌｅ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項４３】
Ｘ4が、Ｉ、Ｌ、およびＥから選択される、請求項４２に記載のタンパク質性分子。
【請求項４４】
Ｘ4が、Ｉである、請求項４３に記載のタンパク質性分子。
【請求項４５】
Ｘ5が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜４４のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項４６】
Ｘ5が、Ｒ、Ｅ、およびＶから選択される、請求項４５に記載のタンパク質性分子。
【請求項４７】
Ｘ5が、Ｖである、請求項４６に記載のタンパク質性分子。
【請求項４８】
Ｘ6が、Ｌ、Ｅ、Ｋ、Ｆ、およびＶから選択される、請求項３１〜４７のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項４９】
Ｘ6が、ＬまたはＦである、請求項４８に記載のタンパク質性分子。
【請求項５０】
Ｘ6が、Ｆである、請求項４９に記載のタンパク質性分子。
【請求項５１】
Ｘ7が、Ｒ、Ｅ、およびＬから選択される、請求項３１〜５０のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項５２】
Ｘ7が、Ｌである、請求項５１に記載のタンパク質性分子。
【請求項５３】
Ｘ8が、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、Ｏｒｎ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜５２のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項５４】
Ｘ8が、ＡまたはＫである、請求項５３に記載のタンパク質性分子。
【請求項５５】
Ｘ8が、Ａである、請求項５４に記載のタンパク質性分子。
【請求項５６】
Ｘ9が、Ｇ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜５５のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項５７】
Ｘ9が、Ｇ、Ｄ、またはＶである、請求項５６に記載のタンパク質性分子。
【請求項５８】
Ｘ10が、Ｋ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜５７のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項５９】
Ｘ10が、ＲおよびＶから選択される、請求項５８に記載のタンパク質性分子。
【請求項６０】
Ｘ10が、Ｒである、請求項５９に記載のタンパク質性分子。
【請求項６１】
Ｘ11が、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基、ならびにＤ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜６０のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項６２】
Ｘ11が、Ｍ、Ｎｌｅ、Ａ、およびＥから選択される、請求項６１に記載のタンパク質性分子。
【請求項６３】
Ｘ11が、Ａである、請求項６２に記載のタンパク質性分子。
【請求項６４】
Ｘ12が、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基、ならびにＤ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜６３のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項６５】
Ｘ12が、Ｍ、Ｎｌｅ、またはＥである、請求項６４に記載のタンパク質性分子。
【請求項６６】
Ｘ12が、Ｅである、請求項６５に記載のタンパク質性分子。
【請求項６７】
Ｘ13が、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基、ならびにＤ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜６６のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項６８】
Ｘ13が、Ａ、Ｄ、またはＶである、請求項６７に記載のタンパク質性分子。
【請求項６９】
Ｘ13が、Ａである、請求項６８に記載のタンパク質性分子。
【請求項７０】
Ｘ14が、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜６９のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項７１】
Ｘ14が、ＶまたはＫである、請求項７０に記載のタンパク質性分子。
【請求項７２】
Ｘ14が、Ｋである、請求項７１に記載のタンパク質性分子。
【請求項７３】
Ｘ15が、Ｋ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基、ならびにＦ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む芳香族アミノ酸残基から選択される、請求項３１〜７２のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項７４】
Ｘ15が、Ｒ、Ｋ、またはＹである、請求項７３に記載のタンパク質性分子。
【請求項７５】
Ｘ15が、Ｋである、請求項７４に記載のタンパク質性分子。
【請求項７６】
Ｘ16が、Ｋである、請求項３１〜７５のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項７７】
式Ｉのタンパク質性分子が、配列番号１〜１８：
LTFIFRLRKGRMMDVKK      ［配列番号１］；
LTFIFRLRQGRMMDVKK      ［配列番号２］；
LTFIFRLRK(Ac)GRMMDVKK  ［配列番号３］；
ATFIFRLRKGRMMDVKK      ［配列番号４］；
LKFIFRLRKGRMMDVKK      ［配列番号５］；
AFIFRLRKGRMMDVKK       ［配列番号６］；
LTFIFVLRKGRMMDVKK      ［配列番号７］；
LTFIFRFRKGRMMDVKK      ［配列番号８］；
LTFIFRLLKGRMMDVKK      ［配列番号９］；
TFIFRLRAGRMMDVKK       ［配列番号１０］；
LTFIFRLRKDRMMDVKK      ［配列番号１１］；
LTFIFRLRKVRMMDVKK      ［配列番号１２］；
TFIFRLRKGRAMDVKK       ［配列番号１３］；
LTFIFRLRKGREMDVKK      ［配列番号１４］；
LTFIFRLRKGRMEDVKK      ［配列番号１５］；
TFIFRLRKGRMMAVKK       ［配列番号１６］；
LTFIFRLRKGRMMVVKK      ［配列番号１７］；または
LTFIFRLRKGRMMDKKK      ［配列番号１８］
のうちのいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になる、請求項３１に記載のタンパク質性分子。
【請求項７８】
式Ｉのタンパク質性分子が、配列番号１、４、９、１０、１３、１６、または１８により表されるアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になる、請求項７７に記載のタンパク質性分子。
【請求項７９】
（ｉ）細胞死を増大させる活性；（ｉｉ）ＭＥＴを増大させる活性；（ｉｉｉ）ＥＭＴを低減または阻害する活性；（ｉｖ）維持を阻害または低減する活性；（ｖ）増殖を阻害または低減する活性；（ｖｉ）分化を増大させる活性；（ｖｉｉ）形成を阻害または低減する活性；または（ｖｉｉｉ）ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の生存率を低減する活性、からなる群から選択される、任意の１つ以上の活性を有する、請求項３１〜７８のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項８０】
細胞が、ＰＤ−Ｌ１過剰発現細胞である、請求項７９に記載のタンパク質性分子。
【請求項８１】
細胞が、がん幹細胞またはがん幹細胞以外の腫瘍細胞である、請求項７９または請求項８０に記載のタンパク質性分子。
【請求項８２】
細胞が、がん幹細胞である腫瘍細胞である、請求項８１に記載のタンパク質性分子。
【請求項８３】
式Ｉのタンパク質性分子が、少なくとも１つの膜透過性部分をさらに含む、請求項３１〜８２のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項８４】
膜透過性部分が脂質部分である、請求項８３に記載のタンパク質性分子。
【請求項８５】
膜透過性部分がミリストイル基である、請求項８４に記載のタンパク質性分子。
【請求項８６】
膜透過性部分がＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基へとカップリングされた、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載のタンパク質性分子。
【請求項８７】
膜透過性部分がＮ末端のアミノ酸残基へとカップリングされた、請求項８６に記載のタンパク質性分子。
【請求項８８】
タンパク質性分子が、請求項３１〜８７のいずれか１項に記載の単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年１月１５日に出願された、「タンパク質性分子およびその使用」と題する、豪州仮出願第２０１８９００１０８号に対する優先権を主張する。
本発明は、一般に、アセチル化部位に対応するタンパク質性分子、ならびにＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２など、核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害または低減するそれらの使用に関する。本発明はまた、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）上皮間葉転換（ＥＭＴ）；または（ｖ）間葉上皮転換（ＭＥＴ）のうちの少なくとも１つを変更し、対象におけるがんを治療または防止するための、タンパク質性分子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における、任意の先行する刊行物（またはこれに由来する情報）、または公知である、任意の対象物への言及は、この先行する刊行物（またはこれに由来する情報）、または公知の対象物が、本明細書が関係する試みの分野における、共通の一般的知見の一部を形成することの、認識もしくは容認、または任意の形態の示唆としては理解されず、このように理解されるべきではない。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞の活性化を調節し、免疫応答を低減する、その能力を介して、免疫系の調節において、重要な役割を果たす。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞（免疫抑制性ＣＤ４＋  Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および疲弊ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む）、Ｂ細胞、骨髄樹状細胞（ＭＤＣ）、単球、胸腺細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において発現される（Gianchecchi et al. (2013) Autoimmun. Rev., 12: 1091-1100）。
【０００３】
ＰＤ−１によるシグナル伝達経路は、正常個体の、中枢および末梢における寛容の維持に寄与し、これにより、正常宿主組織の破壊の回避に寄与する。胸腺では、ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用が陽性選択を抑制し、これにより、ＣＤ４−  ＣＤ８−二重陰性細胞の、ＣＤ４＋  ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞への形質転換を阻害する（Keir et al. (2005) J. Immunol., 175: 7329-7379）。陰性選択を免れて免疫媒介性組織損傷を回避する、自己反応性Ｔ細胞および炎症性エフェクターＴ細胞の阻害は、ＰＤ−１によるシグナル伝達経路に依存する（Keir et al. (2006) J. Exp. Med., 203: 883-895）。
ＰＤ−１には、２つのリガンド：プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１；Ｂ７−Ｈ１；ＣＤ２７４）およびプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２；Ｂ７−ＤＣ；ＣＤ２７３）が結合する。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、上皮細胞、および内皮細胞を含む、多様な細胞型において発現される（Chen et al. (2012) Clin Cancer Res, 18(24): 6580-6587; Herzberg et al. (2016) The Oncologist, 21: 1-8）。ＰＤ−Ｌ１の発現はまた、局所腫瘍環境にある、多種類の腫瘍細胞および他の細胞においても上方調節される（Herzberg et al. (2016) The Oncologist, 21: 1-8）。ＰＤ−Ｌ２は、主に、単球、マクロファージ、および樹状細胞など、抗原提示細胞において発現されるが、発現はまた、微小環境からの刺激に応じて、多種多様な他の免疫細胞および非免疫細胞においても誘導されうる（Herzberg et al. (2016) The Oncologist, 21: 1-8; Kinter et al. (2008) J. Immunol., 181: 6738-6746; Zhong et al. (2007) Eur. J. Immunol., 37: 2405-2410; Messal et al. (2011) Mol. Immunol., 48: 2214-2219; Lesterhuis et al. (2011) Mol. Immunol., 49: 1-3）。
【０００４】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２は、局所腫瘍環境における、悪性細胞および他の細胞により過剰発現される。ＰＤ−１は、多くの異なる腫瘍型に由来する大部分の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）において高度に発現され、局所エフェクター免疫応答を抑制する。ＴＩＬにおけるＰＤ−１の発現は、エフェクター機能（サイトカインの産生および腫瘍細胞に対する細胞傷害性効率）の障害、および／または多数の腫瘍型における転帰不良と関連する（Thompson et al. (2007) Clin Cancer Res, 13(6): 1757-1761; Shi et al. (2011) Int. J. Cancer, 128: 887-896）。ＰＤ−Ｌ１の発現は、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、尿路上皮がん、胃がん、および膵臓がんを含む、多くの腫瘍型における転帰不良と、強く相関することが見出されている（Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol., 26: 677-704; Shi et al. (2011) Int. J. Cancer, 128: 887-896）。ＰＤ−Ｌ２は、腫瘍のサブセットにおいて上方調節されることが示されており、また、転帰不良とも関連付けられている。
【０００５】
興味深いことに、核におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、前立腺がん、結腸直腸がん、および乳がんを含む、いくつかの腫瘍型における生存期間の短縮および化学療法耐性と関連することが示されている（Satelli, et al. (2016) Scientific Reports, 6: 28910; Ghebeh, et al. (2010) Breast Cancer Res., 12: R48）。
したがって、ＰＤ−１シグナル伝達経路のメンバーは、がんの治療のための重要な治療標的であり、この経路、特に、ＰＤ−１シグナル伝達経路のメンバーの核局在化をターゲティングする新たな治療剤が所望される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＰＤ−Ｌ１のアセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質性分子が、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、およびＰＤ−１の核局在化を阻害または低減するという発見に部分的に基づく。したがって、本発明者らは、アセチル化部位のアセチル化が細胞内におけるその核局在化を増大させる核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害するのに、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質性分子が使用されうると考えた。本発明者らはまた、タンパク質性分子が対象におけるがんを治療するために使用されうるとも考えた。
したがって、本発明の一態様では、アセチル化部位のアセチル化が細胞内におけるその核局在化を増大させる核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害または低減する方法であって、細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む方法が提供される。
【０００７】
さらに別の態様では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞内における核局在化を阻害または低減する方法であって、細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む方法が提供される。
さらに別の態様では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ；（ｖ）ＭＥＴ；または（ｖｉ）生存率のうちの少なくとも１つを変更する方法であって、前記細胞を、形成、増殖、維持、ＥＭＴ、ＭＥＴ、または生存率をモジュレートする量の、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む方法が提供される。
さらなる態様では、少なくとも１つの、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞を含む、対象におけるがんを治療または防止する方法であって、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子を対象へ投与するステップを含む方法が提供される。
【０００８】
なおさらなる態様では、本発明は、核局在性ポリペプチドの核局在化（前記核局在性ポリペプチドのアセチル化部位のアセチル化は細胞内における前記核局在性ポリペプチドの核局在化を増大させる）を阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、核局在化の正常レベルまたは参照レベルと比べた、核局在性ポリペプチドの、細胞内における核局在化の低減または阻害を検出するステップ
を含む方法を提供する。
【０００９】
さらに別の態様では、核局在性ポリペプチドの核局在化（前記核局在性ポリペプチドのアセチル化部位のアセチル化は細胞内における前記核局在性ポリペプチドの核局在化を増大させる）を阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）細胞を、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、核局在化の正常レベルまたは参照レベルと比べた、核局在性ポリペプチドの細胞内における核局在化の低減または阻害を検出するステップ
を含む方法が提供される。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、がん幹細胞の形成、増殖、生存率、またはＥＭＴのうちの少なくとも１つを阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）がん幹細胞を、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、細胞の形成、増殖、生存率、またはＥＭＴの正常レベルまたは参照レベルと比べた、がん幹細胞の形成、増殖、またはＥＭＴの低減または阻害を検出するステップ
を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、式Ｉ：
Ｚ1Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｚ2  （Ｉ）
［式中、
Ｚ1およびＺ2は、独立に存在しないか、または、独立に、約１つ〜約５０のアミノ酸残基（および間の全ての整数の残基）、および保護部分を含むタンパク質性部分のうちの少なくとも１つから選択され；
Ｘ1は、存在しないか、または、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ2は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基から選択され；
Ｘ3は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ4は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ5は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ6は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ7は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ8は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｋ、Ｒ、Ｏｒｎ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基、ならびにＮ、Ｑ、Ｏｒｎ（Ａｃ）、Ｋ（Ａｃ）、およびこれらの修飾形態を含む、アミド含有側鎖を伴うアミノ酸残基から選択され；
Ｘ9は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ10は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ11は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ12は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ13は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ14は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ15は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ16は、Ｋ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される］
により表される、単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子も想定する。
【００１２】
一部の実施形態では、本タンパク質性分子は、（ｉ）細胞死を増大させる活性；（ｉｉ）ＭＥＴを増大させる活性；（ｉｉｉ）ＥＭＴを低減または阻害する活性；（ｉｖ）維持を阻害または低減する活性；（ｖ）増殖を阻害または低減する活性；（ｖｉ）分化を増大させる活性；（ｖｉｉ）形成を阻害または低減する活性；または（ｖｉｉｉ）ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の生存率を低減する活性からなる群から選択される、任意の１つ以上の活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】転移性乳がん患者の液体生検から単離された転移開始細胞（ＭＩＣ）における、ＰＤ−Ｌ１および細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）の局在化についての、写真（図１Ａ）およびグラフ（図１Ｂ〜１Ｄ）による表示である。試料は、１０例の患者（Ｐ１〜Ｐ１０）の各々について、１週間、３週間、および６週間の間隔で、患者から採取した。図１Ａは、６週間後の患者Ｐ１〜Ｐ１０における、ＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についての写真による表示である。データは、回収の時点へと群分けされた、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。
【図１Ｂ】転移性乳がん患者の液体生検から単離された転移開始細胞（ＭＩＣ）における、ＰＤ−Ｌ１および細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）の局在化についての、写真（図１Ａ）およびグラフ（図１Ｂ〜１Ｄ）による表示である。試料は、１０例の患者（Ｐ１〜Ｐ１０）の各々について、１週間、３週間、および６週間の間隔で、患者から採取した。図１Ｂは、１、３、および６週間後において採取された試料について、ＰＤ−Ｌ１の全核蛍光（ＴNＦＩ）を描示する。データは、回収の時点へと群分けされた、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。
【図１Ｃ】転移性乳がん患者の液体生検から単離された転移開始細胞（ＭＩＣ）における、ＰＤ−Ｌ１および細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）の局在化についての、写真（図１Ａ）およびグラフ（図１Ｂ〜１Ｄ）による表示である。試料は、１０例の患者（Ｐ１〜Ｐ１０）の各々について、１週間、３週間、および６週間の間隔で、患者から採取した。図１Ｃは、１、３、および６週間後において採取された試料について、ＰＤ−Ｌ１の核蛍光の、細胞質蛍光に対する比（ＦＣ／ｃ）を描示する。データは、回収の時点へと群分けされた、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。
【図１Ｄ】転移性乳がん患者の液体生検から単離された転移開始細胞（ＭＩＣ）における、ＰＤ−Ｌ１および細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）の局在化についての、写真（図１Ａ）およびグラフ（図１Ｂ〜１Ｄ）による表示である。試料は、１０例の患者（Ｐ１〜Ｐ１０）の各々について、１週間、３週間、および６週間の間隔で、患者から採取した。図１Ｄは、１、３、および６週間後において採取された試料について、ＣＳＶの全細胞質蛍光（ＴＣＦＩ）を描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０）。データは、回収の時点へと群分けされた、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。
【図２Ａ】６例の黒色腫患者（Ｐ１〜Ｐ６）の液体生検から単離されたＭＩＣにおける、ＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についての写真（図２Ａ）による表示である。図２Ａは、１週間後の患者Ｐ１〜Ｐ６におけるＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についての写真による表示である。
【図２Ｂ】６例の黒色腫患者（Ｐ１〜Ｐ６）の液体生検から単離されたＭＩＣにおける、ＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についてのグラフ（図２Ｂ）による表示である。図２Ｂは、１週間後において採取された試料についてＣＳＶのＴＣＦＩ、１週間後において採取された試料についてＰＤ−Ｌ１のＴＮＦＩ、および１週間後において採取された試料についてＰＤ−Ｌ１のＦｎ／ｃを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０）。データは平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。
【図３Ａ】乳がん細胞における、ＰＤ−Ｌ１の局在化を提示する図である。図３Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＭＤＡ）、ならびに刺激ＭＣＦ７細胞（ＭＣＦ７ＳＴ）および非刺激ＭＣＦ７細胞（ＭＣＦ７ＮＳ）における、ＰＤ−Ｌ１のＴＮＦＩおよびＴＣＦＩを提示する。データは、平均値±ＳＥとして示す。試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激ありである。各状態についての代表的画像を示す。
【図３Ｂ】乳がん細胞における、ＰＤ−Ｌ１の局在化を提示する図である。図３Ｂは、６０ｍｇ／ｋｇのアブラキサンまたは１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセル（Ｄｏｘ）で３５日間にわたり処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１マウス異種移植細胞におけるＰＤ−Ｌ１についてのＴＮＦＩを描示する。切出し前の腫瘍体積もまた提示する。試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激ありである。各状態についての代表的画像を示す。
【図３Ｃ−１】乳がん細胞における、ＰＤ−Ｌ１の局在化を提示する図である。図３Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＰＤ−Ｌ１、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＴＮＦＩおよびピアソンの相関係数（ＰＣＣ（ｒ））を提示する。データは、平均値±ＳＥとして示す。試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激ありである。各状態についての代表的画像を示す。
【図３Ｃ−２】図３C-1の続き
【図４】ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミドおよびＫ２６３Ｑ突然変異を伴うＰＤ−Ｌ１プラスミド（Ｍｕｔ１プラスミド）についての概略表示を提示する図である。野生型プラスミドにおけるリシン２６３およびＭｕｔ１プラスミドにおけるグルタミン２６３に下線を付す。
【図５Ａ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についての写真（図５Ａ）による表示である。
【図５Ｂ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についてのおよびグラフ（図５Ｂ〜５Ｅ）による表示である。図５Ｂは、ＣＳＶのＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図５Ｃ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についてのグラフ（図５Ｂ〜５Ｅ）による表示である。図５Ｃは、ＰＤ−Ｌ１のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図５Ｄ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についての（図５Ｂ〜５Ｅ）による表示である。図５Ｄは、ＰＤ−Ｌ１のＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図５Ｅ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶの局在化についてのグラフ（図５Ｂ〜５Ｅ）による表示である。図５Ｅは、ＰＤ−Ｌ１のＦｎ／ｃを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図６Ａ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１３３、およびＳＮＡＩ１の局在化についての写真（図６Ａ）による表示である。
【図６Ｂ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１３３、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図６Ｂ〜６Ｈ）による表示である。図６Ｂは、ＥＧＦＲのＴＮＦＩを描示し、図６Ｃは、ＥＧＦＲのＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図６Ｃ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１３３、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図６Ｂ〜６Ｈ）による表示である。図６Ｃは、ＥＧＦＲのＴＣＦＩを描示（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図６Ｄ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１３３、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図６Ｂ〜６Ｈ）による表示である。図６Ｄは、ＥＧＦＲのＦｎ／ｃを描示し、図６Ｅは、ＳＮＡＩ１のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図６Ｅ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１３３、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図６Ｂ〜６Ｈ）による表示である。図６Ｅは、ＳＮＡＩ１のＴＮＦＩを描示し、図６Ｆは、ＳＮＡＩ１のＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図６Ｆ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１３３、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図６Ｂ〜６Ｈ）による表示である。図６Ｆは、ＳＮＡＩ１のＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図６Ｇ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１３３、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図６Ｂ〜６Ｈ）による表示である。図６Ｇは、ＳＮＡＩ１のＦｎ／ｃを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図６Ｈ】空ベクター（ＶＯ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＰＤＬ１−ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（ＰＤＬ１−Ｍｕｔ１）をトランスフェクトされた、刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１３３、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図６Ｂ〜６Ｈ）による表示である。図６Ｈは、ＣＤ１３３のＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧５〜１０；ＮＳ＝ＰＭＡによる刺激なし；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激あり）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図７】空ベクター（ベクターのみ）、ＰＤ−Ｌ１野生型プラスミド（ＷＴ）、およびＰＤ−Ｌ１  Ｍｕｔ１プラスミド（Ｍｕｔ−１）をトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞であって、プラスミドと共に、２４または４８時間にわたりインキュベートされ、ＷＳＴ−１試薬で、２、３、または４時間にわたり処理されたＭＣＦ７細胞の増殖についての、グラフによる表示である。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図８Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図８Ａ）における、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１の、リシン２６３におけるトリメチル化（ＰＤＬ１ｍｅ３；「トリメチル化ＰＤ−Ｌ１」）、およびＰＤ−Ｌ１の、リシン２６３におけるアセチル化（ＰＤＬ１（Ａｃ）；「アセチル化ＰＤ−Ｌ１」）の局在化についての写真およびグラフによる表示である。図８Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるトリメチル化ＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１ならびに天然ＰＤ−Ｌ１の核局在化（Ｆｎ／ｃ）を提示する。
【図８Ｂ】転移性黒色腫患者および転移性乳がん患者の細胞（図８Ｂおよび８Ｃ）における、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１の、リシン２６３におけるトリメチル化（ＰＤＬ１ｍｅ３；「トリメチル化ＰＤ−Ｌ１」）、およびＰＤ−Ｌ１の、リシン２６３におけるアセチル化（ＰＤＬ１（Ａｃ）；「アセチル化ＰＤ−Ｌ１」）の局在化についての写真およびグラフによる表示である。図８Ｂは、免疫療法に応答する転移性黒色腫患者から単離されたＣＴＣ（レスポンダー）、免疫療法に対する一次耐性を呈する転移性黒色腫患者から単離されたＣＴＣ（一次耐性）、転移性乳がん患者から単離されたＣＴＣ（ＭＢＣ  ＣＴＣ  Ｓ２）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、トリメチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化を提示する。トリメチル化ＰＤ−Ｌ１のＴＣＦＩを提示する。ＣＳＶ（細胞表面ビメンチン）は、対照として使用する。データは、平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図８Ｃ】転移性黒色腫患者および転移性乳がん患者の細胞（図８Ｂおよび８Ｃ）における、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１の、リシン２６３におけるトリメチル化（ＰＤＬ１ｍｅ３；「トリメチル化ＰＤ−Ｌ１」）、およびＰＤ−Ｌ１の、リシン２６３におけるアセチル化（ＰＤＬ１（Ａｃ）；「アセチル化ＰＤ−Ｌ１」）の局在化についての写真およびグラフによる表示である。図８Ｃは、免疫療法に応答する転移性黒色腫患者から単離されたＣＴＣ（レスポンダー）、免疫療法に対する二次耐性を呈する転移性黒色腫患者から単離されたＣＴＣ（二次耐性）、転移性乳がん患者から単離されたＣＴＣ（ＭＢＣ  ＣＴＣ  Ｓ１）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、アセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化を描示する。アセチル化ＰＤ−Ｌ１のＴＮＦＩを提示する。ＣＳＶ（細胞表面ビメンチン）は、対照として使用する。データは、平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図９Ａ】Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（それぞれ、ＰＤＬ１−Ｐ１、ＰＤＬ１−Ｐ２、およびＰＤＬ１−Ｐ３と称する）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化に対する効果である。図９Ａは、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３による処置に応答したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＴＮＦＩ、ＴＣＦＩ、およびＦｎ／ｃを提示する。データは、平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図９Ｂ】Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（それぞれ、ＰＤＬ１−Ｐ１、ＰＤＬ１−Ｐ２、およびＰＤＬ１−Ｐ３と称する）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化に対する効果である。図９Ｂは、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３による処置に応答したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、アセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＴＮＦＩ、ＴＣＦＩ、およびＦｎ／ｃを提示する。データは、平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１０Ａ】Ｐ４（ＰＤＬ１−Ｐ４と称する）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化に対する効果についての写真およびグラフによる表示である。図１０Ａは、アセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化を提示する。ＴＮＦＩ、ＴＣＦＩ、およびＦｎ／ｃを提示する。データは、平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１０Ｂ】Ｐ４（ＰＤＬ１−Ｐ４と称する）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化に対する効果についての写真およびグラフによる表示である。図１０Ｂは、Ｐ４による処置に応答したＰＤ−Ｌ１の局在化を提示する。ＴＮＦＩ、ＴＣＦＩ、およびＦｎ／ｃを提示する。データは、平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１１Ａ】Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４high／ＣＤ２４low）に対する効果を提示する図である。図１１Ａは、Ｐ１で処置された細胞についてのＦＡＣＳ解析を描示する。
【図１１Ｂ】Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４high／ＣＤ２４low）に対する効果を提示する図である。図１１Ｂは、Ｐ２で処置された細胞についてのＦＡＣＳ解析を描示する。
【図１１Ｃ】Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４high／ＣＤ２４low）に対する効果を提示する図である。図１１Ｃは、Ｐ３で処置された細胞についてのＦＡＣＳ解析を描示する。
【図１１Ｄ】Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４high／ＣＤ２４low）に対する効果を提示する図である。図１１Ｄは、Ｐ１（ペプチド１と称する）で処置された細胞についてのＦＡＣＳ解析のグラフによる表示である。
【図１１Ｅ】Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４high／ＣＤ２４low）に対する効果を提示する図である。図１１Ｅは、Ｐ２（ペプチド２と称する）で処置された細胞についてのＦＡＣＳ解析のグラフによる表示である。
【図１１Ｆ】Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４high／ＣＤ２４low）に対する効果を提示する図である。図１１Ｆは、Ｐ３（ペプチド３と称する）で処置された細胞についてのＦＡＣＳ解析のグラフによる表示である。
【図１２】Ｐ１（ペプチド１と称する；図１２Ａ）、Ｐ２（ペプチド２と称する；図１２Ｂ）、およびＰ３（ペプチド３と称する；図１２Ｃ）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖に対する効果についてのグラフによる表示である。細胞を、ペプチドで７２時間にわたり処置するのに続き、ＷＳＴ−１試薬による、２時間にわたるインキュベーションを行った。
【図１３Ａ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＰＤ−Ｌ１、およびＳＮＡＩ１の局在化についての写真（図１３Ａ）による表示である。
【図１３Ｂ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＰＤ−Ｌ１、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図１３Ｂ〜１３Ｄ）による表示である。図１３ＢはＣＳＶのＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１３Ｃ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＰＤ−Ｌ１、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図１３Ｂ〜１３Ｄ）による表示である。図１３ＣはＰＤ−Ｌ１のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１３Ｄ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＰＤ−Ｌ１、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図１３Ｂ〜１３Ｄ）による表示である。図１３Ｄは、ＮＡＩ１のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１４Ａ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＥＧＦＲ、およびＳＮＡＩ１の局在化についての写真（図１４Ａによる表示である
【図１４Ｂ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＥＧＦＲ、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図１４Ｂ〜１４Ｄ）による表示である。図１４ＢはＣＳＶのＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１４Ｃ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＥＧＦＲ、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図１４Ｂ〜１４Ｄ）による表示である。図１４ＣはＥＧＦＲのＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１４Ｄ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＥＧＦＲ、およびＳＮＡＩ１の局在化についてのグラフ（図１４Ｂ〜１４Ｄ）による表示である。図１４ＤはＳＮＡＩ１のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１５−１】Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、またはＰ４で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＥＨＭＴ２、ＤＭＮＴＩ、およびＳＥＴＤＢ１の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＴＮＦＩを提示する。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０である。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１５−２】図１５−１続き。
【図１６Ａ】媒体（対照）またはＰ３で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（図１６Ａ）の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＡＢＣＢ５は化学療法耐性についてのマーカーとして含める。ＴＮＦＩおよびＴＦＩを呈する。データは、平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１６Ｂ】媒体（対照）またはＰ３で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、５−メチルシトシン（図１６Ｂ）の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＡＢＣＢ５は化学療法耐性についてのマーカーとして含める。ＴＮＦＩおよびＴＦＩを呈する。データは、平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１７−１】免疫療法処置に応答する転移性黒色腫患者（レスポンダー）、または免疫療法処置に対する一次耐性または二次耐性を提示する転移性黒色腫患者（耐性）から単離されたＣＴＣにおける、アセチル化ＰＤ−Ｌ１およびｐ３００の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＴＮＦＩおよびＰＣＣ（r）を提示する。データは平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１７−２】図１７−１続き。
【図１８−１】マッチさせ、透過処理した、ナイーブのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、および４Ｔ１細胞（４Ｔ１群Ａ）、ドセタキセル耐性透過処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＸＴ５０）、ドセタキセル耐性透過処理ＭＣＦ７細胞（ＭＣＦ７  ＴＸＴ５０）、およびドセタキセル耐性透過処理Ｔ−４７Ｄ細胞（Ｔ−４７Ｄ  ＴＸＴ５０）、ならびにアブラキサン耐性透過処理４Ｔ１細胞（４Ｔ１群Ｂ）における、アセチル化ＰＤ−Ｌ１およびｐ３００の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＴＮＦＩおよびＰＣＣ（r）を提示する。データは平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１８−２】図１８−１続き。
【図１９−１】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、Ｐ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）、Ｐ４（ＰＤＬ１−Ｐ４）、または媒体（対照）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、アセチル化ＰＤ−Ｌ１およびｐ３００の局在化についての写真およびグラフによる表示である。ＴＮＦＩおよびＰＣＣ（r）を提示する。データは平均値±ＳＥとして示す（試料１例当たりの細胞のｎ＝２０）。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図１９−２】図１９−１続き。
【図２０Ａ】Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞またはＯＴ１由来Ｔ細胞における、ＰＤ−１の局在化についての写真（図２０Ａ）による表示である。各状態についての代表的画像を示す。Ｄ０＝０日目；Ｄ１＝１日目；Ｄ６＝６日目；ＮＳ＝非刺激；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激；ＲＳＴ＝ＰＭＡによる再刺激；ＳＷ＝ＰＭＡによる刺激および洗浄；ナイーブ＝ＯＴ１細胞をナイーブＴ細胞から得た；Ｅ１、Ｅ２、またはＥ３＝ＯＴ１細胞は、ウイルス特異的エフェクターＴ細胞から単離した。
【図２０Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞またはＯＴ１由来Ｔ細胞における、ＰＤ−１の局在化についてのグラフ（図２０Ｂ）による表示である。図２０Ｂは、ＰＤ−１のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。Ｄ０＝０日目；Ｄ１＝１日目；Ｄ６＝６日目；ＮＳ＝非刺激；ＳＴ＝ＰＭＡによる刺激；ＲＳＴ＝ＰＭＡによる再刺激；ＳＷ＝ＰＭＡによる刺激および洗浄；ナイーブ＝ＯＴ１細胞をナイーブＴ細胞から得た；Ｅ１、Ｅ２、またはＥ３＝ＯＴ１細胞は、ウイルス特異的エフェクターＴ細胞から単離した；****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図２１Ａ】Ｐ１（ＰＥＰ１）、Ｐ２（ＰＥＰ２）、およびＰ３（ＰＥＰ３）で処置されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞における、ＰＤ−１の局在化についての写真（図２１Ａ）による表示である。
【図２１Ｂ】Ｐ１（ＰＥＰ１）、Ｐ２（ＰＥＰ２）、およびＰ３（ＰＥＰ３）で処置されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞における、ＰＤ−１の局在化についてのグラフ（図２１Ｂ〜２１Ｄ）による表示である。図２１Ｂは、ＰＤ−１のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図２１Ｃ】Ｐ１（ＰＥＰ１）、Ｐ２（ＰＥＰ２）、およびＰ３（ＰＥＰ３）で処置されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞における、ＰＤ−１の局在化についてのグラフ（図２１Ｂ〜２１Ｄ）による表示である。図２１Ｃは、ＰＤ−１のＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図２１Ｄ】Ｐ１（ＰＥＰ１）、Ｐ２（ＰＥＰ２）、およびＰ３（ＰＥＰ３）で処置されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞における、ＰＤ−１の局在化についてのグラフ（図２１Ｂ〜２１Ｄ）による表示である。図２１Ｄは、ＰＤ−１のＦｎ／ｃを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図２２Ａ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、およびＣＳＶの局在化についての写真（図２２Ａ）による表示である。
【図２２Ｂ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、およびＣＳＶの局在化についてのグラフ（図２２Ｂ〜２２Ｄ）による表示である。図２２Ｂは、ＰＤ−Ｌ２のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図２２Ｃ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、およびＣＳＶの局在化についてのグラフ（図２２Ｂ〜２２Ｄ）による表示である。図２２Ｃは、ＰＤ−Ｌ１のＴＮＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【図２２Ｄ】Ｐ１（ＰＤＬ１−Ｐ１）、Ｐ２（ＰＤＬ１−Ｐ２）、およびＰ３（ＰＤＬ１−Ｐ３）で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、およびＣＳＶの局在化についてのグラフ（図２２Ｂ〜２２Ｄ）による表示である。図２２Ｄは、ＣＳＶのＴＣＦＩを描示する（試料１例当たりの個別の細胞のｎ≧２０）。データは、平均値±ＳＥとして示す。各状態についての代表的画像を示す。****＝≦０．０００１のｐ値；***＝≦０．００１のｐ値；**＝≦０．０１のｐ値；*＝≦０．０５のｐ値；非有意＝＞０．０５のｐ値である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書で記載される方法および材料と同様または同等な、任意の方法および材料も使用されうるが、好ましい方法および材料について記載される。本発明の目的では以下の用語が下記に規定される。
【００１５】
本明細書で使用される「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」という冠詞は、その冠詞の、１つまたは１つを超える（例えば、少なくとも１つの）文法的目的語を指す。例を目的として述べると、「ある要素」とは、１つの要素、または１つを超える要素を意味する。
【００１６】
「約」とは、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、質量、または長さに照らして、最大で１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％変動する、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、質量、または長さを意味する。
【００１７】
本明細書では、「アセチル化部位」という用語は、例えば、アセチルトランスフェラーゼ；とりわけ、その非限定例が、ＧＣＮ５、Ｈａｔ１、ＡＴＦ−２、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＨＢＯ１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１、ＡＣＴＲ、ＴＩＦ−２、ＳＲＣ−３、ＴＡＦ１、ＴＦＩＩＩＣ、および／またはＣＬＯＣＫ、最もとりわけ、ｐ３００を含む、ヒストンアセチルトランスフェラーゼによりアセチル化されうる、任意のアミノ酸配列を指すように使用される。「アセチル化部位」という用語は、リシン残基、ならびにアセチルトランスフェラーゼなどの酵素による基質認識に関与しうる、周囲および／または近傍のアミノ酸残基など、アセチル化基質を含む配列を指す。アセチル化部位は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２２を超える残基の長さ、好ましくは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１残基の長さなど、任意の適する長さのアミノ酸配列でありうる。
【００１８】
「薬剤」という用語は、所望される薬理学的効果および／または生理学的効果を誘導する化合物を含む。用語はまた、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性の代謝物、類似体などを含むがこれらに限定されない、本明細書で具体的に言及される化合物の、薬学的に許容され、薬理学的に有効な成分も包含する。上記の用語が使用される場合、これは、活性薬剤自体のほか、薬学的に許容され、薬理学的に活性の塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝物、類似体なども含むことを理解されたい。「薬剤」という用語は、狭義に理解されるものではなく、低分子、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質などのタンパク質性分子のほか、それらを含む組成物、ならびにＲＮＡ、ＤＮＡ、およびこれらの模倣体および化学的類似体などの遺伝子性分子のほか、細胞薬剤へも拡張される。
【００１９】
本明細書で使用される「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上の、任意および全ての組合せ、ならびに、代替的に解釈される場合における、組合せの欠如（「または」）を指す。
【００２０】
「がん幹細胞」（ＣＳＣ）という用語は、腫瘍開始能および腫瘍維持能を有する細胞、広範に増殖し、新たな腫瘍を形成し、がんの発生を維持する能力を含む、すなわち、腫瘍の形成および増殖を駆動する、無際限の増殖力を伴う細胞を指す。ＣＳＣは、バルク腫瘍細胞と、生物学的に顕著に異なり、幹細胞に関連する特徴、具体的には、自己再生し、繁殖し、特定のがん試料中に見出される、全ての細胞型をもたらす能力を有する。「がん幹細胞」という用語は、幹細胞（ＳＣ）における遺伝子変更、およびＣＳＣとなる細胞における遺伝子変更の両方を含む。具体的な実施形態では、ＣＳＣは、適切には、その例示的な例が、ＣＤ４４high  ＣＤ２４lowを含む、ＣＤ２４＋  ＣＤ４４＋である、乳腺ＣＳＣである。
【００２１】
本明細書および後続の特許請求の範囲を通して、文脈によりそうでないことが要求されない限りにおいて、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を含むこと」などの変化形は、言明された整数またはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を含意し、他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外は含意しないように理解される。こうして、「〜を含むこと」という用語などの使用は、列挙された整数は、要求されるか、または必須であるが、他の整数は、任意であり、存在しても、存在しなくてもよいことを指し示す。「〜からなること」とは、「〜からなること」という語句に後続するいかなるものも含み、かつ、これらに限定されることを意味する。こうして、「〜からなること」という語句は、列挙された要素が、要求されるか、または必須であり、他のいかなる要素も、存在しえないことを指し示す。「〜から本質的になること」とは、この語句の後に列挙された任意の要素を含み、かつ、列挙された要素について、本開示で指定された活性または作用に干渉しないか、またはこれらに寄与する、他の要素に限定されることを意味する。こうして、「〜から本質的になること」という語句は、列挙された要素は、要求されるか、または必須であるが、他の要素は、それらが列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすのかどうかに応じて任意であり、存在しても、存在しなくてもよいことを指し示す。具体的な実施形態では、本明細書で開示される、特異的アミノ酸配列の文脈では、「〜から本質的になること」という用語は、その範囲内に、特異的アミノ酸配列の上流における、約１〜約５０の任意のアミノ酸（およびこれらの間の全ての整数の任意のアミノ酸）、および／または特異的アミノ酸配列の下流における、約１〜約５０の任意のアミノ酸（およびこれらの間の全ての整数の任意のアミノ酸）を含む。
【００２２】
「〜に対応する」または「〜に対応すること」とは、参照配列（例えば、参照核酸配列の全部または一部に対する、少なくとも約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、なおまたは最大で１００％の配列同一性）に対する、実質的な配列同一性を呈する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または参照アミノ酸配列（例えば、参照アミノ酸配列の全部または一部に対する、少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、なおまたは最大で１００％の配列類似性または配列同一性）に対する、実質的な配列類似性もしくは配列同一性を呈するアミノ酸配列などの配列を意味する。
【００２３】
「誘導体」とは、基本分子から、修飾により、例えば、他の化学的部分とのコンジュゲーションもしくは複合体化により、または当技術分野で理解される翻訳後修飾法により派生させたポリペプチドなどの分子を意味する。「誘導体」という用語はまた、その範囲内に、親配列へと施される変更であって、機能的に同等な分子をもたらす付加または欠失を含む変更も含む。
本明細書で使用される、「単位剤形」という用語は、単位投与量として、治療される対象に適する、物理的に個別の単位であって、各単位が、要求される、薬学的に許容される媒体と会合して、所望される治療的効果をもたらすように計算された、所定数量の活性物質を含有する単位を指す。
【００２４】
状態の治療または防止の文脈における「有効量」とは、この状態の症状を被ることの防止、このような症状の監視、および／または既存の症状の治療に有効な量の、このような治療または予防を必要とする個体への薬剤または組成物の、単回投与による、または一連の投与の一部としての投与を意味する。有効量は、治療される個体の健康状態および全身状態、治療される個体の分類群、組成物の製剤化、治療状況の評価、および他の関連する因子に応じて変動するであろう。量は、規定の試験を介して決定されうる、比較的広い範囲内に収まることが期待される。
【００２５】
本明細書で使用される、「上皮間葉転換」（ＥＭＴ）という用語は、胚発生の正常過程である、上皮細胞から、間葉表現型への転換を指す。ＥＭＴはまた、イオンおよび体液の輸送体として機能する上皮細胞が損傷を受けたものが、癌腫において、マトリックスをリモデリングする間葉細胞となる過程でもあり、この形質転換は典型的に細胞形状の変更、間葉タンパク質の発現、および浸潤性の増大を結果としてもたらす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＥＭＴを規定するための基準は、上皮細胞極性の喪失、個別の細胞への分離、および細胞移動性の獲得の後における、その後の拡散を伴う（Vincent-Salomon and Thiery (2003), Breast Cancer Res., 5(2): 101-6を参照されたい）。ＥＭＴ時に、発現、分布、および／または機能が変化し、因果的に関与する分子のクラスは、増殖因子（例えば、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β、ｗｎｔ）、転写因子（例えば、ＳＮＡＩ、ＳＭＡＤ、ＬＥＦ、および核β−カテニン）、細胞間接着軸の分子（カドヘリン、カテニン）、細胞骨格モジュレーター（Ｒｈｏファミリー）、および細胞外プロテアーゼ（マトリックスメタロプロテイナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子）（Thompson and Newgreen, Cancer Res. 2005; 65(14):5991-5を参照されたい）を含む。
本明細書で使用される、「上皮」という用語は、体内の内部表面および外部表面の被覆であって、血管および他の小腔の内膜を含む被覆を指す。上皮は、構成細胞が、細胞間結合により、横方向において、互いに、かつ、広範に接着性であることに起因して、比較的薄いシートまたは層を形成する、上皮細胞の集合体からなる。層は極性化しており頂端側と基底側とを有する。上皮細胞の緊密な組織化にもかかわらず、上皮は、ある程度の可塑性を有し、上皮層における細胞は扁平形状から柱状形状に変化したり、一方の末端において縮み、他方の末端において広がったりするなど、形状を変更しうる。しかし、これらは、個別にではなく、細胞群において生じる傾向がある（Thompson and Newgreen, Cancer Res. 2005; 65(14):5991-5を参照されたい）。
【００２６】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、コード配列の場合、発現は、コード配列の、ｍＲＮＡへの転写と、ｍＲＮＡの、１つ以上のポリペプチドへの翻訳とを伴う。逆に、非コード配列の発現は、非コード配列の転写物への転写だけを伴う。本明細書では、「発現」という用語はまた、タンパク質または分子の存在、特に位置を指すのにも使用され、したがって、「局在化」と互換的に使用されうる。
「発現ベクター」とは、ベクター内に含有されるポリヌクレオチドの転写を方向付けること、適切には、ポリヌクレオチドによりコードされるペプチドまたはポリペプチドの合成を指令することが可能な、任意の遺伝子エレメントを意味する。当業者には、このような発現ベクターが公知である。
【００２７】
本明細書で使用される、「高度の」という用語は、正常の尺度を超える尺度、所定の尺度もしくは亜群の尺度など、標準の尺度を超える尺度、または別の亜群の尺度を相対的に超える尺度を指す。例えば、ＣＤ４４highとは、正常のＣＤ４４尺度を超えるＣＤ４４の尺度を指す。結果として、「ＣＤ４４high」は常に、対象の体内の関連する部分、または対象の体内に由来する関連する試料において、少なくとも検出可能なＣＤ４４に対応する。正常の尺度は、当業者に利用可能な、任意の方法に従い決定されうる。「高度の」という用語はまた、所定カットオフなど、所定の尺度以上の尺度も指す場合がある。特定のマーカーについて「高度」でない場合、対象は、このマーカーについて「低度」である。一般に、対象が、「高度」であるのか「低度」であるのかを決定するために使用されるカットオフは、分割が、臨床的関連性をもつように選択されるべきである。
【００２８】
「ホルモン受容体陰性（ＨＲ−）腫瘍」という用語は、標準的な方法（例えば、患者の生物学的試料中の核の免疫組織化学染色）により決定した場合、ある特定の閾値を上回って、腫瘍の増殖、生存、または生存率を刺激するホルモンに対する受容体を発現しない腫瘍を意味する。閾値は、例えば、Ａｌｌｒｅｄスコアまたは遺伝子の発現を使用して測定されうる。例えば、Harvey et al. (1999, J Clin Oncol, 17: 1474-1481) and Badve et al. (2008, J Clin Oncol, 26(15): 2473-2481)を参照されたい。一部の実施形態では、腫瘍は、エストロゲン受容体を発現せず（ＥＲ−）、かつ／またはプロゲステロン受容体を発現しない（ＰＲ−）。
「ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）腫瘍」という用語は、標準的な方法（例えば、患者の生物学的試料中の核の免疫組織化学染色）により決定した場合、ある特定の閾値を上回って、腫瘍の増殖、生存、または生存率を刺激するホルモンに対する受容体を発現する腫瘍を意味する。閾値は、例えば、Ａｌｌｒｅｄスコアまたは遺伝子の発現を使用して測定されうる。例えば、Harvey et al. (1999, J Clin Oncol, 17: 1474-1481) and Badve et al. (2008, J Clin Oncol, 26(15): 2473-2481)を参照されたい。一部の実施形態では、腫瘍は、エストロゲン受容体を発現し（ＥＲ）、かつ／またはプロゲステロン受容体を発現する（ＰＲ）。
【００２９】
「宿主細胞」という用語は、任意の組換えベクター、または本発明の単離ポリヌクレオチドのレシピエントでありうるか、またはこのようなレシピエントであった、個別の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含むが、後代は、天然の突然変異および／もしくは変化、偶発的な突然変異および／もしくは変化、または意図的な突然変異および／もしくは変化に起因して、元の親細胞と、必ずしも、完全に同一（形状または全ＤＮＡ相補体において）ではない場合がある。宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドをトランスフェクトするか、または感染させた細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞である。
【００３０】
本明細書では、「ハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ間ハイブリッド体またはＤＮＡ−ＲＮＡ間ハイブリッド体をもたらす、相補的なヌクレオチド配列の対合を描示するのに使用される。相補的な塩基配列とは、塩基対合規則により関連する配列である。ＤＮＡでは、ＡはＴと対合し、ＣはＧと対合する。ＲＮＡでは、ＵはＡと対合し、ＣはＧと対合する。この点で、本明細書で使用される、「マッチ」および「ミスマッチ」という用語は、相補的な核酸鎖における、対合したヌクレオチドのハイブリダイゼーション可能性を指す。上記で言及された、古典的なＡ−Ｔ塩基対およびＧ−Ｃ塩基対など、マッチしたヌクレオチドは効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしないヌクレオチドの他の組合せである。本発明では、対合の好ましい機構は、オリゴマー化合物の鎖の、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（ヌクレオ塩基）の間の水素結合であって、ワトソン−クリック型水素結合の場合もあり、フーグスティーン型水素結合の場合もあり、またはリバースフーグスティーン型水素結合の場合もある水素結合を伴う。例えば、アデニンとチミンとは水素結合の形成を介して対合する相補的なヌクレオ塩基である。ハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多様な状況下で生じうる。
【００３１】
本明細書で使用される、「阻害剤」という用語は、標的分子の少なくとも１つの機能または生物学的活性を減少させ、または阻害する薬剤を指す。
【００３２】
本明細書で使用される、「単離」という用語は、通常、その天然の状態では付随する成分を実質的に、または本質的に含まない物質を指す。例えば、「単離タンパク質性分子」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、タンパク質性分子の、その天然の細胞環境、および細胞の他の成分との会合からの単離および／または精製を指す。「実質的に含まない」とは、タンパク質性分子の調製物が、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％純粋であることを意味する。好ましい実施形態では、タンパク質性分子の調製物は、約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満の（乾燥質量で）、本発明の対象ではない分子（本明細書ではまた、「夾雑分子」とも称される）を有する。組換えにより作製される場合、本タンパク質性分子はまた、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地が、調製物の体積のうちの、約２０、１５、１０、５、４、３、２、または１％未満を表すことも所望される。本発明は、乾燥質量で、少なくとも０．０１、０．１、１．０、および１０ミリグラムの、単離または精製された調製物を含む。
【００３３】
本明細書で使用される、「間葉上皮転換」（ＭＥＴ）という用語は、移動性であるか、多極性であるか、または紡錘形である間葉細胞から、上皮と呼ばれる極性化細胞の平面状の配置への転換を伴う、可逆性の生物学的過程である。ＭＥＴは、ＥＭＴの逆過程である。ＭＥＴは、正常の発生、がんの転移、および人工多能性幹細胞の再プログラム化において生じる。
本明細書で使用される、「間葉」という用語は、そこから、結合組織、骨、軟骨、ならびに循環系およびリンパ系が発生する、ゼラチン性の基質中の、疎に充填された、非特化細胞のセットからなる、中胚葉の一部を指す。間葉とは、比較的広汎性の組織ネットワークを形成する、細胞の集合体である。間葉は、完全な細胞層ではなく、典型的には、細胞が、近隣細胞との接着に関与して有するのはそれらの表面上の点だけである。これらの接着はまた、カドヘリン会合も伴いうる（Thompson and Newgreen (2005), Cancer Res.,65(14):5991-5を参照されたい）。
「〜をモジュレートすること」とは、標的分子のレベルまたは機能活性を、直接的に、または間接的に、上昇または低下させることを意味する。例えば、薬剤は、標的分子以外の分子と相互作用することによりレベル／活性を間接的にモジュレートしうる。この点で、標的ポリペプチドをコードする遺伝子の間接的なモジュレーションは、第１の核酸分子の発現のモジュレーションをその範囲内に含み、この場合、第１の核酸分子の発現産物は、標的ポリペプチドをコードする核酸分子の発現をモジュレートする。
【００３４】
本明細書で使用される、「〜を過剰発現する」、「過剰発現」、「〜を過剰発現すること」、または「過剰発現した」という用語は、互換的に、通例、正常細胞と比較して、がん細胞において、検出可能な高レベルで転写または翻訳される遺伝子（例えば、ＰＤ−１遺伝子、ＰＤ−Ｌ１遺伝子、またはＰＤ−Ｌ２遺伝子）を指す。したがって、過剰発現とは、タンパク質およびＲＮＡ両方の過剰発現（転写、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、安定性の変更、およびタンパク質分解の変更の増大に起因する）のほか、タンパク質輸送パターンの変更に起因する局所過剰発現（核局在化の増大）、および機能活性の強化を指す。過剰発現はまた、正常細胞または比較細胞（例えば、乳腺細胞）と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上でもありうる。
【００３５】
本明細書で使用される、「作動可能に連結された」という用語は、構造遺伝子を、プロモーターを含むがこれに限定されない調節エレメントによる調節的制御下に置き、その調節エレメントは遺伝子の転写を制御し、また遺伝子の翻訳を制御してもよいことを意味する。異種プロモーター／構造遺伝子の組合せを構築するときには、一般に、遺伝子配列またはプロモーターをその天然の環境、すなわち、遺伝子配列またはプロモーターが由来する遺伝子におけるこの遺伝子配列またはプロモーターとそれが制御する遺伝子との距離とほぼ同じ、遺伝子転写開始部位からの距離に配置することが好ましい。当技術分野で公知の通り、この距離のある程度の変動は、機能を喪失させずに適応されうる。同様に、その制御下に置かれる異種遺伝子に対する調節的配列エレメントの好ましい配置も、その天然の環境、すなわち、それが由来する遺伝子におけるエレメントの配置により規定される。
【００３６】
本明細書で使用される、「ＰＤ−１過剰発現細胞」、「ＰＤ−Ｌ１過剰発現細胞」、および「ＰＤ−Ｌ２過剰発現細胞」という用語は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を、正常細胞より検出可能な高レベルで発現する脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞または鳥類（ａｖｉａｎ（ｂｉｒｄ））細胞、とりわけ、哺乳動物細胞を指す。細胞は、霊長動物細胞などの脊椎動物細胞；鳥類（ａｖｉａｎ（ｂｉｒｄ））細胞；ヒツジ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、シカ細胞、ロバ細胞、およびブタ細胞などの家畜細胞；ウサギ細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞およびハムスター細胞などの実験動物細胞；ネコ細胞およびイヌ細胞などの愛玩動物細胞；ならびにキツネ細胞、シカ細胞、およびディンゴ細胞などの捕獲野生動物細胞でありうる。特定の実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞はヒト細胞である。具体的な実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞は、がん幹細胞またはがん幹細胞以外の腫瘍細胞；好ましくは、がん幹細胞である腫瘍細胞である。過剰発現はまた、正常細胞または比較細胞（例えば、乳腺細胞）と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上でもありうる。
【００３７】
「薬学的に許容される担体」とは、生物学的に、または他の形で望ましくないものではない材料を含む医薬媒体を意味する、すなわち、材料が、有害反応または実質的な有害反応を引き起こさずに、選択された活性薬剤と共に、対象へと投与されうる。担体は、賦形剤、および希釈剤、デタージェント、着色剤、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、トランスフェクション剤など、他の添加剤を含みうる。
同様に、本明細書で提示される、化合物の、「薬理学的に許容可能な」塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または誘導体とは、生物学的に、または他の形で望ましくないものではない塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または誘導体である。
【００３８】
本明細書で使用される、「ポリペプチド」、「タンパク質性分子」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマー、ならびにこの変種および合成の類似体を指すように、互換的に使用される。こうして、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体など、合成の、天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーのほか、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語は、修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを除外しない。対象のタンパク質性分子の可溶性形態は、特に有用である。例えば、連結を置換された非天然アミノ酸またはポリペプチドを含む、アミノ酸の１つ以上の類似体を含有するポリペプチドが、定義内に含まれる。
本明細書で使用される、「〜を防止する」、「防止された」、または「〜を防止すること」という用語は、疾患もしくは状態を発症することに対する対象の抵抗性を増大させるか、または、言い換えれば、対象が、疾患もしくは状態を発症する可能性を低下させる予防的処置のほか、疾患または状態が発生した後で、それを軽減するか、または完全に消失させるか、またはそれが増悪することを防止するための処置を指す。これらの用語はまた、それらの範囲内に、疾患または状態に対する素因がありうるが、それを有すると未だ診断されていない対象において疾患または状態が生じることを防止することも含む。
【００３９】
第２の試料と比べた、第１の試料における物質および／または現象のレベルに言及して使用される場合の、「〜を低減する」、「〜を阻害する」、「〜を抑制する」、「〜を低下させる」という用語、およびこれらの文法的同等物は、物質および／または現象の第１の試料中の数量が、第２の試料中より、当技術分野で許容される任意の統計学的解析法を使用して統計学的に有意である任意の量だけ少ないことを意味する。一実施形態では、低減は、例えば、患者が、疼痛、疲労感などの疾患症状についてのそれらの主観的な知覚に言及する場合、主観的に決定されうる。別の実施形態では、低減は、例えば、患者に由来する試料中のＣＳＣおよび／またはＣＳＣ以外の腫瘍細胞の数が、患者に由来する早期の試料より少ない場合に客観的に決定されうる。別の実施形態では、物質および／または現象の第１の試料中の数量は、同じ物質および／または現象の第２の試料中の数量より少なくとも１０％少ない。別の実施形態では、物質および／または現象の第１の試料中の数量は、同じ物質および／または現象の第２の試料中の数量より、少なくとも２５％少ない。さらに別の実施形態では、物質および／または現象の第１の試料中の数量は、同じ物質および／または現象の第２の試料中の数量より、少なくとも５０％少ない。さらなる実施形態では、物質および／または現象の第１の試料中の数量は、同じ物質および／または現象の第２の試料中の数量より、少なくとも７５％少ない。さらに別の実施形態では、物質および／または現象の第１の試料中の数量は、同じ物質および／または現象の第２の試料中の数量より、少なくとも９０％少ない。代替的に、差違は、「ｎ倍」の差違としても表されうる。
【００４０】
本明細書で使用される、「塩」および「プロドラッグ」という用語は、レシピエントへと投与されると、本発明のタンパク質性分子、またはその活性の代謝物もしく残基を、（直接的に、または間接的に）もたらすことが可能な、薬学的に許容される、任意の塩、エステル、水和物、または他の任意の化合物を含む。適切な、薬学的に許容される塩は、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、および臭化水素酸など、薬学的に許容される無機酸塩、または酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、ムチン酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸、および吉草酸など、薬学的に許容される有機酸塩を含む。塩基塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびアルキルアンモニウムなど、薬学的に許容されるカチオンと共に形成される塩基塩を含むがこれらに限定されない。塩基性窒素含有基もまた、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの、塩化物、臭化物、およびヨウ化物など、低級アルキルのハロゲン化物；硫酸ジメチルおよび硫酸ジエチルなどの硫酸ジアルキル；その他などの薬剤と共に、四級化されうる。しかし、薬学的に許容されない塩もまた、薬学的に許容される塩の調製において有用でありうるので、本発明の範囲内に収まることが理解されるであろう。塩およびプロドラッグの調製は、当技術分野で公知の方法により実行されうる。例えば、金属塩は、本発明の化合物の、金属の水酸化物との反応により調製されうる。酸塩は、適切な酸を本発明のタンパク質性分子と反応させることにより調製されうる。
【００４１】
本明細書で使用される、「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーション手順および洗浄手順における、温度およびイオン強度の条件、ならびにある特定の有機溶媒の存在または非存在を指す。ストリンジェンシーが高度であるほど、固定化された標的ヌクレオチド配列と、洗浄の後でもなお標的とハイブリダイズしている標識付けされたプローブポリヌクレオチド配列との相補性の程度も高度になる。「高度のストリンジェンシー」という用語は、高頻度の相補的塩基を有するヌクレオチド配列だけがハイブリダイズする温度およびイオンの条件を指す。要求されるストリンジェンシーは、ヌクレオチド配列依存的であり、ハイブリダイゼーション時に存在する多様な成分に依存する。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける、特異的配列の熱融解点（Ｔm）より約１０〜２０℃低温となるように選択される。Ｔmとは、標的配列のうちの５０％が相補的なプローブとハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。
【００４２】
本明細書で使用される、「対象」という用語は、治療または予防が所望される脊椎動物対象、特に、哺乳動物対象または鳥類（ａｖｉａｎ（ｂｉｒｄ））対象を指す。適切な対象は、霊長動物；鳥類（ａｖｉａｎ（ｂｉｒｄ））；ヒツジ、ウシ、ウマ、シカ、ロバ、およびブタなどの家畜；ウサギ、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの実験動物；ネコおよびイヌなどの愛玩動物；ならびにキツネ、シカ、およびディンゴなどの捕獲野生動物を含むがこれらに限定されない。特に、対象は、ヒトである。しかし、前述の用語は、症状が存在することを含意しないことが理解されるであろう。
【００４３】
本明細書で使用される、「治療」、「〜を治療すること」などの用語は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくは状態のための部分的治癒もしくは完全な治癒の点で、治療的な場合もあり、かつ／または疾患もしくは状態に帰せられる有害な効果の場合もある。これらの用語はまた、哺乳動物、特に、ヒトにおける、状態または疾患の任意の治療も対象とし、（ａ）疾患もしくは状態を阻害すること、すなわち、その発生を止めること；または（ｂ）疾患もしくは状態を緩和すること、すなわち、疾患もしくは状態の退縮を引き起こすことを含む。
【００４４】
本明細書で使用される、「腫瘍」という用語は、悪性であれ、良性であれ、任意の新生物性細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈおよびｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を指し、全ての前がん性細胞および前がん性組織ならびにがん性細胞およびがん性組織を指す。「がん」および「がん性」という用語は、調節不能の細胞増殖により、部分的に特徴付けられることが典型的な、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはこれについて記載する。本明細書で使用される、「がん」という用語は、早期がんおよび後期がんを含む、非転移性がんおよび転移性がんを指す。「前がん性」という用語は、典型的に、がんに先行するか、またはがんへと発展する、状態または増殖を指す。「非転移性」という用語は、良性であるか、原発部位に留まり、リンパ管系もしくは血管系または原発部位以外の組織へと浸潤していないがんを指す。一般に、非転移性がんは、病期０、Ｉ、またはＩＩのがんである、任意のがんである。「早期がん」とは、浸潤性でないもしくは転移性でないか、または病期０、Ｉ、またはＩＩのがんとして分類されるがんを意味する。「後期がん」という用語は、一般に、病期ＩＩＩまたはＩＶのがんを指すが、また、病期ＩＩのがん、または病期ＩＩのがんのサブステージも指す場合がある。当業者は、病期ＩＩのがんの、早期がんまたは後期がんとしての分類が、がんの特定の種類に依存することを理解するであろう。がんの例示的な例は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、肝細胞がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、甲状腺がん、腎臓（ｒｅｎａｌ（ｋｉｄｎｅｙ））がん、癌腫、網膜芽細胞腫、黒色腫、脳がん、非小細胞肺がん、頭頸部扁平上皮がん、子宮内膜がん、多発性骨髄腫、中皮腫、直腸がん、および食道がんを含むがこれらに限定されない。例示的な実施形態では、がんは、乳がんまたは黒色腫である。
【００４５】
本明細書で使用される、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドが挿入またはクローニングされうる、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、酵母、またはウイルスに由来するポリヌクレオチド分子、適切にはＤＮＡ分子を指す。ベクターは、１つ以上の固有の制限部位を含有することが可能であり、標的細胞もしくは標的組織、または前駆細胞もしくはその組織を含む、規定された宿主細胞における自己複製が可能な場合もあり、クローニングされた配列が再現可能であるように、規定された宿主のゲノムで組込み可能な場合もある。したがって、ベクターは、自己複製型ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外実体として存在するベクター、例えば、直鎖状または閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体でありうる。ベクターは、自己複製を確保するための、任意の手段を含有しうる。代替的に、ベクターは、宿主細胞へと導入されるとゲノムへと組み込まれ、それが組み込まれた染色体と併せて複製されるベクターでありうる。ベクター系は、併せて、宿主細胞のゲノムへと導入される全ＤＮＡを含有する、単一のベクターもしくはプラスミド、２つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含みうる。ベクターの選択は、典型的に、ベクターの、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。この場合、ベクターは、好ましくは、真菌細胞、細菌細胞、または動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞において作動可能に機能的な、ウイルスベクターまたはウイルス由来ベクターである。このようなベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルス、または酵母に由来しうる。ベクターはまた、適切な形質転換体を選択するために使用されうる、抗生剤耐性遺伝子などの選択マーカーも含みうる。当業者には、このような耐性遺伝子の例が公知であり、抗生剤であるカナマイシンに対する耐性を付与する、ｎｐｔＩＩ遺伝子、およびＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））、および抗生剤であるハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する、ｈｐｈ遺伝子を含む。
【００４６】
本明細書で記載される各実施形態は、そうでないことが具体的に言明されない限りにおいて、変更すべき部分は変更して、各実施形態およびあらゆる実施形態へと適用されるものとする。
【００４７】
２．略号
以下の略号は、本明細書を通して使用される。
2021510538.tif 000002
【００４８】
３．タンパク質性分子
本発明は、ＰＤ−Ｌ１の部位など、アセチル化部位に対応するタンパク質性分子が、アセチル化部位のアセチル化が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を含む、免疫チェックポイントタンパク質などのポリペプチドの核局在化を増大させる、ポリペプチドの核局在化を阻害または低減することの同定に部分的に基づく。１つ以上の実施形態では、このようなタンパク質性分子は、がん幹細胞およびがん幹細胞以外の腫瘍細胞の形成、維持、および／もしくは生存率、を阻害もしくは減少させ、かつ／またはＥＭＴを阻害し、かつ／またはがん幹細胞である腫瘍細胞のＭＥＴを誘導する。こうして、本発明者らは、本発明のタンパク質性分子が、がんを治療または防止するために使用されうると考えた。
【００４９】
したがって、本発明の一態様では、式Ｉ：
Ｚ1Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｚ2  （Ｉ）
［式中、
Ｚ1およびＺ2は、独立に、存在しないか、または、独立に、約１つ〜約５０のアミノ酸残基（および間の全ての整数の残基）、および保護部分を含むタンパク質性部分のうちの少なくとも１つから選択され；
Ｘ1は、存在しないか、または、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ2は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基から選択され；
Ｘ3は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ4は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ5は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ6は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ7は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ8は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｋ、Ｒ、Ｏｒｎ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基、ならびにＮ、Ｑ、Ｏｒｎ（Ａｃ）、Ｋ（Ａｃ）、およびこれらの修飾形態を含む、アミド含有側鎖を伴うアミノ酸残基から選択され；
Ｘ9は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ10は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ11は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ12は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ13は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ14は、任意のアミノ酸残基から選択され；
Ｘ15は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択され；
Ｘ16は、Ｋ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される］
により表される、単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子が提供される。
【００５０】
一部の実施形態では、Ｚ1は、存在しない。他の実施形態では、Ｚ1は、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つのアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、Ｚ1におけるアミノ酸残基は、独立に、任意のアミノ酸残基から選択される。
一部の実施形態では、Ｚ2は、存在しない。他の実施形態では、Ｚ2は、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つのアミノ酸残基からなる。一部の実施形態では、Ｚ2におけるアミノ酸残基は、独立に、任意のアミノ酸残基から選択される。
【００５１】
一部の実施形態では、Ｘ1は、存在しないか、または、ＬおよびＡから選択される。一部の実施形態では、Ｘ1は、Ａである。
一部の実施形態では、Ｘ2は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ2は、Ｔ、Ａ、およびＫ；とりわけ、ＡまたはＫ；最もとりわけ、Ｋから選択される。
一部の実施形態では、Ｘ3は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＦ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む芳香族アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ3は、Ｆ、Ｅ、およびＫ；とりわけ、Ｆから選択される。
一部の実施形態では、Ｘ4は、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基、ならびにＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｎｌｅ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ4は、Ｉ、Ｌ、およびＥ；とりわけ、Ｉから選択される。
一部の実施形態では、Ｘ5は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む荷電アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ5は、Ｒ、Ｅ、およびＶ；とりわけ、ＲまたはＶ；最もとりわけ、Ｖから選択される。
【００５２】
一部の実施形態では、Ｘ6は、Ｌ、Ｅ、Ｋ、Ｆ、およびＶ；とりわけ、ＬまたはＦ；最もとりわけ、Ｆから選択される。
一部の実施形態では、Ｘ7は、Ｒ、Ｅ、およびＬ；とりわけ、ＲまたはＬ；最もとりわけ、Ｌから選択される。
一部の実施形態では、Ｘ8は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、Ｏｒｎ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ8は、ＫまたはＡ；最もとりわけ、Ａである。
一部の実施形態では、Ｘ9は、Ｇ、Ｄ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ9は、Ｇ、Ｄ、またはＶ；とりわけ、ＤまたはＶである。
【００５３】
一部の実施形態では、Ｘ10は、Ｋ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基、ならびにＭ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ10は、ＲまたはＶ；とりわけ、Ｒである。
一部の実施形態では、Ｘ11は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、F、Y、W、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基、ならびにＤ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ11は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ａ、およびＥ；とりわけ、ＥまたはＡ；最もとりわけ、Ａから選択される。
一部の実施形態では、Ｘ12は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、F、Y、W、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基、ならびにＤ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ12は、Ｍ、Ｎｌｅ、またはＥ；とりわけ、Ｅである。
【００５４】
一部の実施形態では、Ｘ13は、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびこれらの修飾形態を含む小型アミノ酸残基、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、F、Y、W、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基、ならびにＤ、Ｅ、およびこれらの修飾形態を含む酸性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ13は、Ａ、Ｄ、またはＶ；とりわけ、ＡまたはＶ；最もとりわけ、Ａである。
一部の実施形態では、Ｘ14は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、F、Y、W、およびこれらの修飾形態を含む疎水性アミノ酸残基、ならびにＫ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ14は、ＶまたはＫ；とりわけ、Ｋである。
一部の実施形態では、Ｘ15は、Ｋ、Ｒ、およびこれらの修飾形態を含む塩基性アミノ酸残基、ならびにＦ、Ｙ、Ｗ、およびこれらの修飾形態を含む芳香族アミノ酸残基から選択される。特定の実施形態では、Ｘ15は、Ｒ、Ｋ、またはＹ；とりわけ、ＫまたはＹ；最もとりわけ、Ｋである。
一部の実施形態では、Ｘ16は、ＫまたはＲ；とりわけ、Ｋである。
【００５５】
一部の実施形態では、式Ｉの単離または精製タンパク質性分子は、配列番号１〜２１：
LTFIFRLRKGRMMDVKK      ［配列番号１］；
LTFIFRLRQGRMMDVKK      ［配列番号２］；
LTFIFRLRK(Ac)GRMMDVKK  ［配列番号３］；
ATFIFRLRKGRMMDVKK      ［配列番号４］；
LKFIFRLRKGRMMDVKK      ［配列番号５］；
AFIFRLRKGRMMDVKK       ［配列番号６］；
LTFIFVLRKGRMMDVKK      ［配列番号７］；
LTFIFRFRKGRMMDVKK      ［配列番号８］；
LTFIFRLLKGRMMDVKK      ［配列番号９］；
TFIFRLRAGRMMDVKK       ［配列番号１０］；
LTFIFRLRKDRMMDVKK      ［配列番号１１］；
LTFIFRLRKVRMMDVKK      ［配列番号１２］；
TFIFRLRKGRAMDVKK       ［配列番号１３］；
LTFIFRLRKGREMDVKK      ［配列番号１４］；
LTFIFRLRKGRMEDVKK      ［配列番号１５］；
TFIFRLRKGRMMAVKK       ［配列番号１６］；
LTFIFRLRKGRMMVVKK      ［配列番号１７］；
LTFIFRLRKGRMMDKKK      ［配列番号１８］；
TFIFRLRKGRMMDVKK       ［配列番号１９］；
TFIFRLRQGRMMDVKK       ［配列番号２０］；または
TFIFRLRK(Ac)GRMMDVKK   ［配列番号２１］
のうちのいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になる。
【００５６】
一部の実施形態では、式Ｉのタンパク質性分子は、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になる。特定の実施形態では、式Ｉのタンパク質性分子は、配列番号１、４、９、１０、１３、１６、１８、または１９により表されるアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になる。
好ましい実施形態では、式Ｉのタンパク質性分子は、（ｉ）細胞死を増大させる活性（ｉｉ）ＭＥＴを増大させる活性（ｉｉｉ）ＥＭＴを低減または阻害する活性（ｉｖ）維持を阻害または低減する活性（ｖ）増殖を阻害または低減する活性（ｖｉ）分化を増大させる活性（ｖｉｉ）形成を阻害または低減する活性または（ｖｉｉｉ）ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞、とりわけ、ＰＤ−Ｌ１過剰発現細胞の生存率を低減する活性からなる群から選択される、任意の１つ以上の活性を有する。一部の実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞は、がん幹細胞またはがん幹細胞以外の腫瘍細胞；とりわけ、がん幹細胞である腫瘍細胞である。
【００５７】
一部の実施形態では、式Ｉのタンパク質性分子は、配列番号１のアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列類似性を有する。一部の実施形態では、式Ｉのタンパク質性分子は、配列番号１のアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、メチオニンを含まない。メチオニン残基は、溶液中の純度および活性の喪失の低減を結果としてもたらす、酸化への傾向がある。メチオニン残基に適する置きかえアミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、グリシン、またはアラニン；とりわけ、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、またはノルバリン；最もとりわけ、ノルロイシンを含みうるがこれらに限定されない。
【００５８】
本発明のタンパク質性分子がＮ末端および／またはＣ末端を含む一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、Ｃ末端における一級アミド、二級アミド、もしくは三級アミド、ヒドラジド、ヒドロキサミド、または遊離カルボキシル基、および／あるいはＮ末端における一級アミンまたはアセトアミドを有する。一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、環状ペプチドであるために、Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸残基を含まない場合がある。
本発明はまた、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つの変種であるタンパク質性分子も想定する。このような「変種」タンパク質性分子は、タンパク質性分子のＮ末端および／もしくはＣ末端への、１つ以上のアミノ酸の欠失もしくは付加、タンパク質性分子内の、１つ以上の部位における、１つ以上のアミノ酸の欠失もしくは付加、またはタンパク質性分子内の、１つ以上の部位における、１つ以上のアミノ酸の置換により、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つから派生させたタンパク質性分子を含む。
【００５９】
本発明により包含される変種タンパク質性分子は、生物学的に活性である、すなわち、それらは、天然タンパク質性分子の、所望される生物学的活性を有し続ける。このような変種は、例えば、遺伝子多型から生じる場合もあり、人為的操作から生じる場合もある。
【００６０】
配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのタンパク質性分子は、アミノ酸の置換、欠失、切断、および挿入を含む、多様な形で変更されうる。当技術分野では一般に、このような操作のための方法が公知である。例えば、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列の変種は、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードする核酸の突然変異誘発により調製されうる。当技術分野では、突然変異誘発およびヌクレオチド配列の変更のための方法が周知である。例えば、Kunkel (1985, Proc. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)、Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)、米国特許第４，８７３，１９２号、Watson, J. D. et al.(“Molecular Biology of the Gene”, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)、およびこれらの中で引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質性分子の生物学的活性に影響を及ぼさない、適切なアミノ酸置換についての指針は、Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)によるモデルにおいて見出されうる。当技術分野では、点突然変異または切断により作られたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための方法、およびｃＤＮＡライブラリーを、選択された特性を有する遺伝子産物についてスクリーニングするための方法が公知である。このような方法は、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのタンパク質性分子の、コンビナトリアル突然変異誘発により作出された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。ライブラリー内の機能的突然変異体の頻度を増強する技法である、再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）は、活性の変種を同定するように、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用されうる（Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al., (1993) Protein Engineering, 6: 327-331）。下記で、より詳細に論じられる通り、１つのアミノ酸を、類似の特性を有する、別のアミノ酸と交換する保存的置換などの保存的置換が所望されうる。
【００６１】
配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つなど、本発明の変種タンパク質性分子は、親アミノ酸配列（例えば、天然に存在するアミノ酸配列または参照アミノ酸配列）と比較して、それらの配列に沿った多様な位置において保存的アミノ酸置換を含有しうる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえられたアミノ酸置換である。下記で詳細に論じられる通り、当技術分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。
【００６２】
酸性：残基は、生理学的ｐＨにおける、プロトンの喪失に起因して、陰性電荷を有し、残基は、ペプチドが、生理学的ｐＨの水性媒質中にある場合に、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおける表面位置に向かうように、水溶液により誘引される。酸性側鎖を有するアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸を含む。
塩基性：残基は、生理学的ｐＨにおける、プロトンとの会合に起因して、陽性電荷を有するか、またはその１もしくは２ｐＨ単位以内にあり（例えば、ヒスチジン）、残基は、ペプチドが、生理学的ｐＨの水性媒質中にある場合に、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおける表面位置に向かうように、水溶液により誘引される。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。
【００６３】
荷電：残基は、生理学的ｐＨでは、荷電しており、したがって、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジンなど、酸性または塩基性の側鎖を有するアミノ酸を含む。
疎水性：残基は、生理学的ｐＨでは、帯電しておらず、残基は、ペプチドが、生理学的ｐＨの水性媒質中にある場合に、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおける内部位置に向かうように、水溶液により排斥される。疎水性側鎖を有するアミノ酸は、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、ノルロイシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンを含む。
中性／極性：残基は、生理学的ｐＨでは、帯電しておらず、残基は、ペプチドが、生理学的ｐＨの水性媒質中にある場合に、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおける内部位置に向かうように、水溶液により、十分に排斥されない。中性／極性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン、およびトレオニンを含む。
【００６４】
本記載はまた、ある特定のアミノ酸を、極性基が欠如している場合であってもなお、それらの側鎖が、疎水性を付与するのに十分には大きくないので、「小型」としても特徴付ける。プロリンを例外として、「小型」アミノ酸とは、少なくとも１つの極性基が、側鎖にある場合は、４つ以下の炭素を伴い、極性基が、側鎖にない場合は、３つ以下の炭素を伴うアミノ酸である。小型側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンを含む。遺伝子によりコードされる二級アミノ酸であるプロリンは、ペプチド鎖の二次コンフォメーションに対する、その公知の効果に起因して、特殊な場合である。プロリンの構造は、その側鎖が、αアミノ基の窒素、ならびにα炭素に結合しているという点で、他の全ての天然に存在するアミノ酸と異なる。しかし、いくつかのアミノ酸類似性行列（例えば、Dayhoff et al., (1978), A model of evolutionary change in proteins. Matrices for determining distance relationships In M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC；およびGonnet et al., (1992), Science, 256(5062): 1443-1445により開示されている、例えば、ＰＡＭ１２０行列およびＰＡＭ２５０行列）は、プロリンを、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンと同じ群に含む。したがって、本発明の目的では、プロリンは、「小型」アミノ酸として分類される。
【００６５】
極性または非極性としての分類に要求される誘引または排斥の程度は、任意のものであり、したがって、本発明により具体的に想定されるアミノ酸は、一方または他方として分類されている。具体的に名指されていない大半のアミノ酸は、公知の挙動に基づき分類されうる。
アミノ酸残基は、残基の側鎖置換基に関する、自己説明的分類である、環状または非環状として、かつ、芳香族または非芳香族としてさらに亜分類される場合があり、小型または大型としてさらに亜分類されうる。残基は、さらなる極性置換基が存在することを条件として、カルボキシル炭素を含む、合計４つ以下の炭素原子を含有する場合；さらなる極性置換基が存在せず、３つ以下の炭素原子を含有する場合に、小型であると考えられる。小型のアミノ酸残基は、当然ながら、常に、非芳香族である。それらの構造的特性に応じて、アミノ酸残基は、２つ以上のクラスに収まりうる。天然に存在するタンパク質のアミノ酸については、このスキームに従う下位分類が、表１に提示される。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づく群分けも含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびノルロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンの、イソロイシンまたはバリンによる置きかえ、アスパラギン酸の、グルタミン酸による置きかえ、トレオニンの、セリンによる置きかえ、またはアミノ酸の、構造的に類縁のアミノ酸による、類似する置きかえは、結果として得られる、本発明の変種ペプチドの特性に対して、大きな影響を及ぼさないと期待することが妥当である。アミノ酸変化が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２など、核局在性ポリペプチドの局在化を阻害または低減するタンパク質性分子を結果としてもたらすのかどうかは、その活性をアッセイすることにより、たやすく決定されうる。保存的置換は、例示的な好ましい置換の標題下で、表２に示される。本発明の範囲内に収まるアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換領域における、ペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における、分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの影響において、それほど異ならない置換を選択することにより達せられる。置換が導入された後で、変種が、生物学的活性についてスクリーニングされる。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
代替的に、保存的置換を施すための、類似するアミノ酸は、側鎖の同一性に基づき、３つの類型へと群分けされうる。Zubay, Biochemistry, third edition, Wm.C. Brown Publishers (1993)において記載されている通り、第１の群は、全てが荷電側鎖を有する、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含み；第２の群は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、およびアスパラギンを含み；第３の群は、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、およびノルロイシンを含む。
【００７０】
こうして、本発明のタンパク質性分子における、予測される非必須アミノ酸残基は、典型的に、同じ側鎖ファミリーに由来する、別のアミノ酸残基で置きかえられる。代替的に、突然変異は、飽和突然変異誘発などにより、本発明のタンパク質性分子のコード配列の全部または一部にわたってランダムに導入される場合もあり、結果として得られる突然変異体は、例えば、本明細書で記載される通り、親ポリペプチドの活性についてスクリーニングして、この活性を保持する突然変異体を同定しうる。コード配列の突然変異誘発に続き、コードされたタンパク質性分子は、組換えにより発現させ、その活性を決定しうる。「非必須」アミノ酸残基とは、本発明の、ある実施形態によるタンパク質性分子の野生型配列から、その活性の１つ以上を失効化させたり、またはこれを実質的に変更したりせずに変更されうる残基である。適切には、変更は、これらの活性のうちの１つを実質的に変更しない、例えば、活性は、野生型の活性の、少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％、または８０％である。これに対して、「必須」アミノ酸残基とは、本発明の、ある実施形態によるタンパク質性分子の野生型配列から変更されると、存在する野生型活性が、２０％未満となるように、親分子の活性の失効化を結果としてもたらす残基である。
【００７１】
したがって、本発明はまた、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのタンパク質性分子の変種であって、１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換により、親配列から区別される変種も想定する。一般に、変種は、デフォルトのパラメータを使用して、本明細書の別の箇所で記載される、配列アライメントプログラムにより決定される、例えば、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つに記載される親または参照のタンパク質性分子配列に対する、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性を呈するであろう。変種は、デフォルトのパラメータを使用して、本明細書で記載される、配列アライメントプログラムにより決定される、例えば、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つに記載される親または参照のタンパク質性分子配列に対する、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有することが所望される。本発明の変種タンパク質性分子の範囲内に収まる、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つの変種は、一般に、少なくとも１つであるが、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つ未満のアミノ酸残基が、親分子と異なりうる。一部の実施形態では、本発明の変種タンパク質性分子は、少なくとも１つであるが、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つ未満のアミノ酸残基が、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つにおける対応する配列と異なる。一部の実施形態では、本発明の変種タンパク質性分子のアミノ酸配列は、式Ｉのタンパク質性分子を含む。特定の実施形態では、本発明の変種タンパク質性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２など、核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害または低減する。
【００７２】
配列比較が、アライメントを要求する場合、配列は、典型的に、最大の類似性または同一性についてアライメントされる。欠失もしくは挿入、またはミスマッチ由来の、「ループ」として除外された配列は、一般に、差違であると考えられる。差違は、適切には、非必須残基または保存的置換における、差違または変化である。
一部の実施形態では、配列の間の配列類似性または配列同一性の計算は、以下の通りに実施される。
【００７３】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適の比較を目的として、配列がアライメントされる（例えば、最適のアライメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に、ギャップが導入される場合があり、非相同配列は、比較を目的として無視されうる）。一部の実施形態では、比較を目的としてアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも４０％、より通例では、少なくとも５０％、または６０％であり、なおより通例では、少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置における、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有されていれば、分子は、この位置において同一である。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置における、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有されていれば、分子は、この位置において同一である。アミノ酸配列の比較では、第１の配列内の位置が第２の配列内の対応する位置における、同じであるか、または類似のアミノ酸残基により占有されていれば（すなわち、保存的置換）、分子は、この位置において類似する。
【００７４】
２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適のアライメントのために導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、個々の位置で配列により共有される、同一なアミノ酸残基の数の関数である。これに対して、２つの配列の間の類似性パーセントとは、２つの配列の最適のアライメントのために導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、個々の位置で配列により共有される、同一なアミノ酸残基および類似するアミノ酸残基の数の関数である。
【００７５】
配列の比較、および配列の間の同一性パーセントまたは類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達せられうる。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列の間の同一性パーセントまたは類似性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列またはＰＡＭ２５０行列、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Devereaux, et al. (1984) Nucleic Acids Research, 12: 387-395）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wuensch（1970, J. Mol. Biol., 48: 444-453）によるアルゴリズムを使用して決定される。一部の実施形態では、アミノ酸配列の間の同一性パーセントまたは類似性パーセントは、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）へと組み込まれた、Meyers and Miller（1989, Cabios, 4: 11-17）によるアルゴリズムを使用して決定されうる。
【００７６】
本発明はまた、本明細書で規定されたストリンジェンシー条件下で、とりわけ、中程度、高度、または極めて高度のストリンジェンシー条件下で、好ましくは、高度または極めて高度のストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列、またはその非コード鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされる、単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子も想定する。本発明はまた、本明細書で規定されたストリンジェンシー条件下で、とりわけ、中程度、高度、または極めて高度のストリンジェンシー条件下で、好ましくは、高度または極めて高度のストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つのタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、またはその非コード鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も想定する。
【００７７】
本明細書で使用される、「ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件について記載し、低度のストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、高度のストリンジェンシー条件、および極めて高度のストリンジェンシー条件を包含しうる。
【００７８】
ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、Ausubel, et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc.), in particular Sections 6.3.1-6.3.6において見出されうる。水性法および非水性法のいずれもが使用されうる。本明細書における、低度のストリンジェンシー条件への言及は、４２℃におけるハイブリダイゼーションのために、少なくとも約１質量／質量％〜少なくとも約１５質量／質量％のホルムアミド、および少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、ならびに４２℃における洗浄のために、少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩を含み、これらを包含する。低度のストリンジェンシー条件はまた、６５℃におけるハイブリダイゼーションのための、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、７％の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、ならびに室温における洗浄のための、（ｉ）２倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．１％のＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳも含みうる。低度のストリンジェンシー条件についての一実施形態は、６倍濃度のＳＳＣ中、約４５℃におけるハイブリダイゼーションに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、少なくとも５０℃（低度のストリンジェンシー条件のための洗浄温度は、５５℃へと上昇させうる）における２回にわたる洗浄を含む。中程度のストリンジェンシー条件は、４２℃におけるハイブリダイゼーションのための、少なくとも約１６質量／質量％〜少なくとも約３０質量／質量％のホルムアミド、および少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、ならびに５５℃における洗浄のための、少なくとも約０．１Ｍ〜少なくとも約０．２Ｍの塩を含み、これらを包含する。中程度のストリンジェンシー条件はまた、６５℃におけるハイブリダイゼーションのための、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳ、ならびに６０〜６５℃における洗浄のための、（ｉ）２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳも含みうる。中程度のストリンジェンシー条件についての一実施形態は、６倍濃度のＳＳＣ中、約４５℃におけるハイブリダイズさせることに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６０℃における１回または複数回にわたる洗浄を含む。高度のストリンジェンシー条件は、４２℃におけるハイブリダイゼーションのための、少なくとも約３１質量／質量％〜少なくとも約５０質量／質量％のホルムアミド、および約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの塩、ならびに５５℃における洗浄のための、約０．０１Ｍ〜約０．０２Ｍの塩を含み、これらを包含する。高度のストリンジェンシー条件はまた、６５℃におけるハイブリダイゼーションのための、１％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳ、ならびに６５℃を超える温度における洗浄のための、（ｉ）０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、��ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、１％のＳＤＳも含みうる。高度のストリンジェンシー条件についての一実施形態は、６倍濃度のＳＳＣ中、約４５℃におけるハイブリダイズさせることに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６５℃における１回または複数回にわたる洗浄を含む。
【００７９】
本発明の一部の態様では、高度のストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列、またはその非コード鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされる、本発明の単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子は、極めて高度のストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列、またはその非コード鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされる。極めて高度のストリンジェンシー条件についての一実施形態は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳ中、６５℃でハイブリダイズさせることに続き、０．２倍濃度のＳＳＣ、１％のＳＤＳ中、６５℃で１回または複数回にわたる洗浄を含む。一部の実施形態では、本発明の変種タンパク質性分子のアミノ酸配列は、式Ｉのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の変種タンパク質性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２など、核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害または低減する。
【００８０】
当技術分野では、他のストリンジェンシー条件も周知であり、当業者は、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するのに、多様な因子が操作されうることを認識するであろう。最終回の洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを確保するのに用いられうる。詳細な例については、Ausubel, et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc.), in particular pages 2.10.1 to 2.10.16；およびSambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Press), in particular Sections 1.101 to 1.104を参照されたい。
【００８１】
ストリンジェントな洗浄は、典型的に、約４２℃〜６８℃の温度で実行されるが、当業者は、他の温度も、ストリンジェントな条件に適しうることを理解するであろう。最大のハイブリダイゼーション速度は、典型的に、ＤＮＡ間ハイブリッド体の形成のためのＴmを下回る、約２０℃〜２５℃で生じる。当技術分野では、Ｔmが、融解温度、または２つの相補的なポリヌクレオチド配列が解離する温度であることが周知である。当技術分野では、Ｔmを推定するための方法が周知である（Ausubel, et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc.) at page 2.10.8を参照されたい）。一般に、ＤＮＡの完全にマッチした二重鎖のＴmは、式：
Ｔm＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ10Ｍ）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）−０．６３（ホルムアミド％）−（６００／長さ）
［式中、Ｍは、好ましくは、０．０１Ｍ〜０．４Ｍの範囲の、Ｎａ+の濃度であり；Ｇ＋Ｃ％は、３０％〜７５％のＧ＋Ｃの間の範囲内の、塩基総数に対する百分率としての、グアノシン塩基と、シトシン塩基との合計であり；ホルムアミド％は、ホルムアミドの容量濃度パーセントであり；長さは、ＤＮＡ二重鎖における塩基対の数である］による近似として予測されうる。二重鎖ＤＮＡのＴmは、ランダムなミスマッチ塩基対の数が、１％増大するごとに、約１℃ずつ低下する。洗浄は一般に、高度のストリンジェンシーのためのＴm−１５℃、または中程度のストリンジェンシーのためのＴm−３０℃で実行される。
【００８２】
ハイブリダイゼーション手順の一例では、固定化されたＤＮＡを含有する膜（例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜）を、標識付けされたプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（５０％の脱塩ホルムアミド、５倍濃度のＳＳＣ、５倍濃度のデンハルト溶液（０．１％のＦｉｃｏｌｌ、０．１％のポリビニルピロリドン、および０．１％のＢＳＡ）、０．１％のＳＤＳ、および２００ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で、一晩にわたりハイブリダイズさせる。次いで、膜を、２回連続の、中程度のストリンジェントな洗浄（すなわち、４５℃で、１５分間にわたる、２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳに続く、５０℃で、１５分間にわたる、２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）に続く、２回連続の、高度のストリンジェントな洗浄（すなわち、５５℃で、１２分間にわたる、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳに続く、６５〜６８℃で、１２分間にわたる、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる溶液）にかける。
【００８３】
本発明のタンパク質性分子はまた、修飾側鎖を伴うアミノ酸、ペプチド合成時における、非天然アミノ酸残基および／またはそれらの誘導体の組込み、ならびに本発明のタンパク質性分子に対して、コンフォメーション拘束を付与する、架橋剤および他の方法の使用を含むタンパク質性分子も包含する。側鎖修飾の例は、無水酢酸を伴うアシル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を伴う、アミノ基のアシル化；アセトイミド酸メチルを伴うアミジン化；シアン酸塩を伴う、アミノ基のカルバモイル化；ピリドキサール−５−リン酸塩を伴う、リシンのピリドキシル化に続く、水素化ホウ素ナトリウムを伴う還元；アルデヒドを伴う反応を伴う還元的アルキル化に続く、水素化ホウ素ナトリウムを伴う還元；ならびに２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を伴う、アミノ基のトリニトロベンジル化などによる、アミノ基の修飾を含む。
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成を介するカルボジイミドの活性化に続く、後続の、例えば、対応するアミドへの誘導体化により修飾されうる。
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールなどの試薬を伴う、複素環の縮合生成物の形成により修飾されうる。
【００８４】
ペプチド合成時における、非天然アミノ酸および誘導体の組込みの例は、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、Ｎδ−アセチル−Ｌ−オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニン、Ｎε−アセチル−Ｌ−リシン、Ｎε−メチル−Ｌ−リシン、Ｎε−ジメチル−Ｌ−リシン、Ｎε−ホルミル−Ｌ−リシン、および／またはアミノ酸のＤ異性体の使用を含むがこれらに限定されない。本発明により想定される非天然アミノ酸のリストは、表３に示される。
【００８５】
【表３】
2021510538.tif 000005
2021510538.tif 000006
【００８６】
一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。特定の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、少なくとも１つのノルロイシン残基を含む。
本発明のタンパク質性分子の、存在する場合、Ｎ末端またはＣ末端へと、さらなるアミノ酸または他の置換基が付加されうる。例えば、本発明のタンパク質性分子は、さらなるアミノ酸を、Ｎ末端およびＣ末端の一方または両方へと付加した、より長い配列の一部を形成しうる。
【００８７】
本発明の特定の使用および方法のために、例えば、対象におけるタンパク質性分子の半減期を延長する、高レベルの安定性を伴うタンパク質性分子が所望されうる。こうして、一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、安定化部分または保護部分を含む。安定化部分または保護部分は、ペプチド上の任意の点においてカップリングされうる。適切な安定化部分または保護部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリカン、またはアセチル基、ピログルタミン酸、もしくはアミノ基を含むキャッピング部分を含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、アセチル基および／またはピログルタミン酸は、タンパク質性分子のＮ末端のアミノ酸残基へとカップリングされる。特定の実施形態では、タンパク質性分子のＮ末端は、アセトアミドである。好ましい実施形態では、アミノ基は、タンパク質性分子のＣ末端のアミノ酸残基へとカップリングされる。特定の実施形態では、本タンパク質性分子は、Ｃ末端における一級アミド、二級アミド、もしくは三級アミド、ヒドラジド、またはヒドロキサミド；特に、Ｃ末端における一級アミドを有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧは、タンパク質性分子のＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸残基と、またはリシン側鎖もしくは他の適切に修飾された側鎖のアミノ基を介して、とりわけ、残基のアミノ基を介して、もしくはリシン側鎖のアミノ基を介してなど、Ｎ末端のアミノ酸残基を介してカップリングされる。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、Ｃ末端における一級アミドまたは遊離カルボキシル基（遊離カルボン酸）と、Ｎ末端における一級アミンまたはアセトアミドとを有する。
本発明のタンパク質性分子は、本来、膜を透過しうるが、膜の透過は、膜透過性部分の、タンパク質性分子へのコンジュゲーションによりさらに増大されうる。したがって、一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は膜透過性部分を含む。膜透過性部分は、タンパク質性分子上の任意の点においてカップリングされうる。適切な膜透過性部分は、脂質部分、コレステロール、細胞透過性ペプチドおよびポリカチオン性ペプチドなどのタンパク質；とりわけ、脂質部分を含む。
【００８９】
適切な細胞透過性ペプチドは、例えば、米国特許出願公開第２００９００４７２７２号、米国特許出願公開第２０１５０２６６９３５号、および米国特許出願公開第２０１３０１３６７４２号において記載されているペプチドを含みうる。したがって、適切な細胞透過性ペプチドは、塩基性ポリ（Ａｒｇ）ペプチドおよび塩基性ポリ（Ｌｙｓ）ペプチド、ならびにＹＧＲＫＫＲＰＱＲＲＲ（ＨＩＶ  ＴＡＴ47-57；配列番号２２）、ＲＲＷＲＲＷＷＲＲＷＷＲＲＷＲＲ（Ｗ／Ｒ；配列番号２３）、ＣＷＫ18（ＡｌｋＣＷＫ18；配列番号２４）、Ｋ18ＷＣＣＷＫ18（Ｄｉ−ＣＷＫ18；配列番号２５）、ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（トランスポルタン；配列番号２６）、ＧＬＦＥＡＬＥＥＬＷＥＡＫ（ＤｉｐａＬｙｔｉｃ；配列番号２７）、Ｋ16ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＡＫ16ＲＧＤ（Ｋ16ＲＧＤ；配列番号２８）、Ｋ16ＧＧＣＭＦＧＣＧＧ（Ｐ１；配列番号２９）、Ｋ16ＩＣＲＲＡＲＧＤＮＰＤＤＲＣＴ（Ｐ２；配列番号３０）、ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲｂＡＫ（Ｂ）ｂＡ（Ｐ３；配列番号３１）、ＶＡＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴＲＱＫＹＮＫＲＡ（Ｐ３ａ；配列番号３２）、ＩＧＲＩＤＰＡＮＧＫＴＫＹＡＰＫＦＱＤＫＡＴＲＳＮＹＹＧＮＳＰＳ（Ｐ９．３；配列番号３３）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（Ｐｅｐ−１；配列番号３４）、ＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＴＹ（Ｐｌａｅ；配列番号３５）、Ｋ16ＧＧＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＧＡ（Ｋｐｌａｅ；配列番号３６）、Ｋ16ＧＧＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＣＡ（ｃＫｐｌａｅ；配列番号３７）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ（ＭＧＰ；配列番号３８）、ＷＥＡＫ（ＬＡＫＡ）2−ＬＡＫＨ（ＬＡＫＡ）2ＬＫＡＣ（ＨＡ２；配列番号３９）、（ＬＡＲＬ）6ＮＨＣＨ3（ＬＡＲＬ４6；配列番号４０）、ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＷＬＬＫＬＬＬ（Ｈｅｌ−１１−７；配列番号４１）、（ＫＫＫＫ）2ＧＧＣ（ＫＫ；配列番号４２）、（ＫＷＫＫ）2ＧＣＣ（ＫＷＫ；配列番号４３）、（ＲＷＲＲ）2ＧＧＣ（ＲＷＲ；配列番号４４）、ＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＶ４０  ＮＬＳ７；配列番号４５）、ＰＥＶＫＫＫＲＫＰＥＹＰ（ＮＬＳ１２；配列番号４６）、ＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰ（ＮＬＳ１２ａ；配列番号４７）、ＧＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（ＳＶ４０  ＮＬＳ１３；配列番号４８）、ＧＧＧＦＳＴＳＬＲＡＲＫＡ（ＡＶ  ＮＬＳ１３；配列番号４９）、ＣＫＫＫＫＫＫＳＥＤＥＹＰＹＶＰＮ（ＡＶ  ＲＭＥ  ＮＬＳ１７；配列番号５０）、ＣＫＫＫＫＫＫＫＳＥＤＥＹＰＹＶＰＮＦＳＴＳＬＲＡＲＫＡ（ＡＶ  ＦＰ  ＮＬＳ２８；配列番号５１）、ＬＶＲＫＫＲＫＴＥＥＥＳＰＬＫＤＫＤＡＫＫＳＫＱＥ（ＳＶ４０  Ｎ１  ＮＬＳ２４；配列番号５２）、およびＫ9Ｋ2Ｋ4Ｋ8ＧＧＫ5（Ｌｏｌｉｇｏｍｅｒ；配列番号５３）；ＨＳＶ−１テグメントタンパク質である、ＶＰ２２；核移出シグナル（ＮＥＳ）と融合させた、ＨＳＶ−１テグメントタンパク質である、ＶＰ２２ｒ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのエンテロトキシンの突然変異体Ｂサブユニットである、ＥｔｘＢ（Ｈ５７Ｓ）；解毒された外毒素Ａ（ＥＴＡ）；ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５４）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａドメインである、Ａｎｔｐ（アミノ酸４３〜５８）である、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５５）；ブフォリンＩＩである、ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ（配列番号５６）；ｈＣｌｏｃｋ（アミノ酸３５〜４７）（ヒト時計タンパク質ＤＮＡ結合性ペプチド）である、ＫＲＶＳＲＮＫＳＥＫＫＲＲ（配列番号５７）；ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）である、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号５８）；Ｋ−ＦＧＦである、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号５９）；ＶＰＭＬＫＥ（配列番号６０）、ＶＰＭＬＫ（配列番号６１）、ＰＭＬＫＥ（配列番号６２）、またはＰＭＬＫ（配列番号６３）を含む群から選択されるペプチドを含む、Ｋｕ７０由来ペプチド；プリオンである、マウスＰｒｐｅ（アミノ酸１〜２８）である、ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ（配列番号６４）；ｐＶＥＣである、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号６５）；Ｐｅｐ−Ｉである、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６）；ＳｙｎＢｌである、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号６７）；トランスポルタンである、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号６８）；トランスポルタン１０である、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号６９）；ＣＡＤＹである、Ａｃ−ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ−システアミド（配列番号７０）；Ｐｅｐ−７である、ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ（配列番号７１）；ＨＮ−１である、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号７２）；ＶＴ５である、ＤＰＫＧＤＰＫＧＶＴＶＴＶＴＶＴＶＴＧＫＧＤＰＫＰＤ（配列番号７３）；またはｐＩＳＬである、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号７４）など、Ａｒｇ残基およびＬｙｓ残基の非天然類似体を含有する、塩基性ポリ（Ａｒｇ）ペプチドおよび塩基性ポリ（Ｌｙｓ）ペプチドを含みうるがこれらに限定されない。
【００９０】
好ましい実施形態では、膜透過性部分は、Ｃ10−Ｃ20脂肪アシル基、とりわけ、ステアロイル（オクタデカノイル；Ｃ18）、パルミトイル（ヘキサデカノイル；Ｃ16）またはミリストイル（テトラデカノイル；Ｃ14）などの脂質部分；最もとりわけ、ミリストイルである。好ましい実施形態では、膜透過性部分は、タンパク質性分子のＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸残基へとカップリングされ、またはリシン側鎖もしくは他の適切に修飾された側鎖のアミノ基を介して、とりわけ、タンパク質性分子のＮ末端のアミノ酸残基を介して、またはリシン側鎖のアミノ基を介してカップリングされる。特定の実施形態では、膜透過性部分は、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基を介してカップリングされる。
したがって、本発明の別の態様では、式ＩＩ：
Ｍ−Ｐ  （ＩＩ）
［式中、
Ｍは、膜透過性部分であり；
Ｐは、式Ｉにより表される、単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子である］
により表される、単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子が提供される。
【００９１】
一部の実施形態では、Ｍは、タンパク質性分子上の任意の点において；とりわけ、タンパク質性分子のＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸残基へと、またはリシン側鎖もしくは他の適切に修飾された側鎖のアミノ基を介して、さらにとりわけ、タンパク質性分子のＮ末端のアミノ酸残基を介して、またはリシン側鎖のアミノ基を介して；最もとりわけ、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基を介してカップリングされる。本明細書では、式Ｉにより表されるタンパク質性分子の、適切な膜透過性部分および実施形態が記載される。
一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、環状分子である。理論に束縛されることを望まずに述べると、ペプチドの環化はペプチドの分解しやすさを低下させると考えられる。特定の実施形態では、本タンパク質性分子は、Ｎ−Ｃ環化（頭尾環化）を使用して、好ましくは、アミド結合を介して環化される。このようなタンパク質性分子は、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸残基を有さない。特定の実施形態では、本タンパク質性分子はアミド環化されたペプチド骨格を有する。他の実施形態では、ペプチドは、側鎖間環化を使用して、好ましくは、ジスルフィド結合、ジセレニド結合、セレノ硫黄結合、ランチオニン結合、セレノエーテル結合などのチオエーテル結合、トリアゾール結合、ラクタム結合、またはジメチレン結合を介して；とりわけ、ジスルフィド結合を介して環化される。
【００９２】
一部の実施形態では、Ｎ末端とＣ末端とは、連結部分を使用して連結される。連結部分は、環化がアミド環化されたペプチド骨格をもたらすように、ペプチドリンカーでありうる。連結部分が修飾されて、タンパク質性分子の物理化学的特性を変更し、本発明のタンパク質性分子の副作用を潜在的に低減するか、または、例えば、安定性を改善することにより、分子治療的使用を、他の形で改善するような、連結部分のペプチド配列内の変動が可能である。連結部分は、タンパク質性分子の構造的コンフォメーションを実質的に変更せずに、タンパク質性分子の、Ｎ末端とＣ末端との距離を取るのに適する長さである、例えば、ペプチド連結部分は、２〜１０アミノ酸残基の間の長さでありうる。一部の実施形態では、より長いか、または短いペプチド連結部分も要求されうる。
【００９３】
本発明のタンパク質性分子は、塩またはプロドラッグの形態でありうる。本発明のタンパク質性分子の塩は薬学的に許容されることが好ましいが、薬学的に許容されない塩もまた本発明の範囲内に収まることが理解されるであろう。
本発明のタンパク質性分子は、結晶形態の場合もあり、かつ／または溶媒和物、例えば、水和物の形態の場合もある。溶媒和は、当技術分野で公知の方法を使用して実施されうる。
本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ法を使用して調製される場合もあり、化学合成により調製される場合もある。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、組換えＤＮＡ法を使用して調製される。例えば、本発明のタンパク質性分子は、（ａ）本発明のタンパク質性分子をコードし、調節エレメントに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含む構築物を調製するステップ；（ｂ）構築物を、宿主細胞へと導入するステップ；（ｃ）宿主細胞を培養して、ポリヌクレオチド配列を発現させ、これにより、コードされる本発明のタンパク質性分子を作製するステップ；および（ｄ）本発明のタンパク質性分子を、宿主細胞から単離するステップを含む手順により調製されうる。本発明のタンパク質性分子は、例えば、それらの全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Klint, et al. (2013) PLOS One, 8(5): e63865; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Press), in particular Sections 16 and 17; Ausubel, et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc.), in particular Chapters 10 and 16; Coligan, et al. (1997) Current Protocols in Protein Science (John Wiley and Sons, Inc.), in particular Chapters 1, 5 and 6；および米国特許第５，９７６，５６７号において記載されている、標準的なプロトコールを使用して、組換えにより調製されうる。
【００９５】
こうして、本発明はまた、本発明のタンパク質性分子をコードする核酸分子も想定する。こうして、本発明のさらなる態様では、本明細書で記載される、式Ｉのタンパク質性分子、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、または変種タンパク質性分子など、本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列と相補的である単離核酸分子が提供される。
本発明の単離核酸分子は、ＤＮＡの場合もあり、またはＲＮＡの場合もある。核酸分子がＤＮＡ形態である場合、それは、ゲノムＤＮＡの場合もあり、またはｃＤＮＡの場合もある。本発明の核酸分子のＲＮＡ形態は、一般に、ｍＲＮＡである。
核酸分子は、典型的に、単離されているが、一部の実施形態では、核酸分子は発現ベクターなど、他の遺伝子分子へと組み込まれる場合もあり、これとライゲーションされる場合もあり、他の形でこれと融合される場合もあり、これと会合される場合もある。一般に、発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された、転写調節核酸および翻訳調節核酸を含む。したがって、本発明の別の態様では、本明細書で記載される、式Ｉのタンパク質性分子、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、または変種タンパク質性分子など、本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。
【００９６】
典型的なベクターは、転写および翻訳のターミネーター、転写および翻訳の開始配列、ならびに核酸の発現を調節するために有用なプロモーターを含有する。ベクターは、少なくとも１つの独立のターミネーター配列、真核細胞、原核細胞、またはこれらの両方において、カセットの複製を可能とする配列（例えば、シャトルベクター）、ならびに原核系および真核系の両方のための選択マーカーを含有する包括的発現カセットを含んでもよい。ベクターは、原核細胞、真核細胞、またはこれらの両方における複製および組込みに適しうる。それらの全内容が、参照により組み込まれる、Giliman and Smith (1979), Gene, 8: 81-97；Roberts et al. (1987) Nature, 328: 731-734；Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger)；Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning - a Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；およびAusubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (Supplement)を参照されたい。
【００９７】
レトロウイルスなど、真核ウイルスに由来する調節エレメントを含有する発現ベクターは、典型的に、真核細胞における、核酸配列の発現のために使用される。ＳＶ４０ベクターは、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。ウシパピローマウイルスに由来するベクターは、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン−バーウイルスに由来するベクターは、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５を含む。他の例示的なベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であると示された、他のプロモーターの指令の下にタンパク質の発現を可能とする、他の任意のベクターを含む。
【００９８】
様々なベクターが使用されうるが、ウイルス発現ベクターは、高効率でウイルスベクターが標的細胞へのトランスフェクションを生じ標的細胞ゲノムへと組み込まれるので、真核細胞を改変するのに有用であることに注目されたい。この種類の例示的な発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ならびにＢ、Ｃ、およびＤ型のレトロウイルスなどのレトロウイルスのほか、スプマウイルスおよび改変レンチウイルスを含むがこれらに限定されない、ウイルスＤＮＡ配列に由来しうる。動物細胞のトランスフェクションに適する発現ベクターについては、例えば、それらの全内容が、参照により組み込まれる、Wu and Ataai (2000) Curr. Opin. Biotechnol., 11(2): 205-208；Vigna and Naldini (2000) J. Gene Med., 2(5): 308-316；Kay et al. (2001) Nat. Med., 7(1): 33-40；Athanasopoulos et al. (2000) Int. J. Mol. Med., 6(4): 363-375；およびWalther and Stein (2000) Drugs, 60(2): 249-271により記載されている。
【００９９】
発現ベクターのポリペプチドコード部分またはペプチドコード部分は、天然に存在する配列、または組換え法を使用して操作されたその変種を含みうる。変種の一例では、本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチドのコドン組成は、例えば、国際公開第９９／０２６９４号および国際公開第００／４２２１５号に記載されている通り、特異的な哺乳動物細胞型または哺乳動物組織型における、コドン使用頻度のバイアスまたはコドンの翻訳効率を利用する方法を使用して、哺乳動物宿主における、本発明のタンパク質性分子の発現の増強を可能とするように改変される。略述すると、これらの後者の方法は、異なるコドンの翻訳効率が、異なる細胞または組織の間で変動し、これらの差違が、特定の細胞型または組織型におけるタンパク質の発現を調節するのに、遺伝子のコドン組成と併せて利用されうるという観察に基づく。こうして、コドン最適化ヌクレオチドを構築するために、親ポリヌクレオチドの、少なくとも１つの既存のコドンが、それが置きかえる既存のコドンより、標的細胞または標的組織における高翻訳効率を有する同義語コドンで置きかえられる。親核酸分子の、全ての既存のコドンを、この高翻訳効率を有する同義語コドンで置きかえることが好ましいが、発現の増大は、部分的な置きかえによってもなお、達せられうるため、これは必要ではない。適切には、置きかえステップは、親ポリヌクレオチドの既存のコドンのうちの、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、より好ましくは、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％以上に影響を及ぼす。
【０１００】
発現ベクターは、本発明のタンパク質性分子が、細胞により発現可能であるように、それが導入される細胞と適合性である。発現ベクターは、用いられる発現ベクターおよび細胞の特定の選択に依存する、任意の適切な手段により、細胞へと導入される。当業者には、このような導入の手段が周知である。例えば、導入は、接触（例えば、ウイルスベクターの場合）、電気穿孔、形質転換、形質導入、コンジュゲーション、または三親交配、トランスフェクション、カチオン性脂質との感染膜融合、ＤＮＡコーティング微粒子銃による高速衝撃、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物を伴うインキュベーション、単一細胞への直接的なマイクロインジェクションなどの使用によりなされうる。他の方法もまた利用可能であり、当業者に公知である。代替的に、ベクターは、カチオン性脂質、例えば、リポソームによっても導入される。このようなリポソームは、市販されている（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．により供給されている、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）など）。
一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターなど、１つ以上の発現構築物の導入により、細胞の内部で作製されうる。
【０１０１】
本発明は、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞）、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ細胞、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、またはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞）、または細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞）などの宿主細胞の内部で、本発明のタンパク質性分子を、組換えにより作製することを想定する。
治療適用のために、本発明はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、対象の細胞、例えば、脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞または鳥類細胞、とりわけ、哺乳動物細胞など、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の内部で、本発明のタンパク質性分子を作製することも想定する。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、溶液合成または固相合成など、標準的なペプチド合成法を使用して調製される。本発明のタンパク質性分子の化学合成は、手作業により実施される場合もあり、または自動式合成器を使用して実施される場合もある。例えば、直鎖状ペプチドは、それらの全内容が、参照により組み込まれる、Merrifield (1963) J Am Chem Soc, 85(14): 2149-2154；Schnolzer, et al. (1992) Int J Pept Protein Res, 40: 180-193；およびCardoso, et al. (2015) Mol Pharmacol, 88(2): 291-303において記載されている、Ｂｏｃ化学反応またはＦｍｏｃ化学反応を使用する固相ペプチド合成を使用して合成されうる。脱保護および固体支持体からの切断に続き、直鎖状ペプチドは、調製用クロマトグラフィーなどの適切な方法を使用して精製される。
【０１０３】
他の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は環化されうる。環化は、例えば、その全内容が、参照により組み込まれる、Davies (2003) J Pept Sci, 9: 471-501において記載されている、いくつかの技法を使用して実施されうる。特定の実施形態では、直鎖状ペプチドは、Ｎ末端におけるシステイン残基で始まり、Ｃ末端におけるチオエステルで終わる、Ｂｏｃ化学反応を伴う固相ペプチド合成を使用して合成される。脱保護および樹脂からの切断に続き、ペプチドは、その後、アミン環化ペプチドへと再編成される、チオラクトン中間体を介して環化される。
【０１０４】
４．医薬組成物
本発明に従い、タンパク質性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２など、核局在性ポリペプチドの核局在化を伴う状態、例えば、がんを、治療または防止するための組成物および方法において有用である。
こうして、一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、本発明のタンパク質性分子と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物の形態でありうる。
本発明のタンパク質性分子は、中性形態または塩形態として医薬組成物へと製剤化されうる。
【０１０５】
当業者により理解される通り、薬学的に許容される担体または希釈剤の選択は、投与経路、ならびに治療される状態および対象の性格に依存する。特定の担体または送達系および投与経路は、当業者によりたやすく決定されうる。担体または送達系および投与経路は、タンパク質性分子の活性が、製剤の調製時に枯渇せず、タンパク質性分子が、作用部位に、無傷で到達しうることを確保するように、注意深く選択されるべきである。本発明の医薬組成物は、経口投与、直腸内投与、局所投与、鼻腔内投与、眼内投与、経粘膜投与、経腸投与、腸内投与、筋内投与、皮下投与、髄内投与、髄腔内投与、脳室内投与、脳内投与、膣内投与、膀胱内投与、静脈内投与、または腹腔内投与を含むがこれらに限定されない、様々な経路を介して投与されうる。
注射用の使用に適する医薬形態は、滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液、および滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末を含む。このような形態は、製造条件下および保管条件下で安定であるべきであり、還元、酸化、および微生物汚染に対して保存されうる。
当業者は、従来の手法を使用して、本発明のタンパク質性分子に適切な製剤を、たやすく決定することが可能であろう。製剤化および投与のための技法は、例えば、それらの全内容が、参照により組み込まれる、Remington (1980) Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest edition；およびNiazi (2009) Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations, Informa Healthcare, New York, second editionにおいて見出されうる。
【０１０６】
当技術分野では、好ましいｐＨ範囲および抗酸化剤など、適切な賦形剤の同定が、例えば、Katdare and Chaubel (2006) Excipient Development for Pharmaceutical, Biotechnology and Drug Delivery Systems (CRC Press)において記載されている通り、規定である。緩衝液系は、所望の範囲のｐＨ値をもたらすように、規定通りに使用されており、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、乳酸緩衝液、酒石酸緩衝液、およびコハク酸緩衝液など、カルボン酸緩衝液；グリシン緩衝液；ヒスチジン緩衝液；リン酸緩衝液；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液；アルギニン緩衝液；水酸化ナトリウム緩衝液；グルタミン酸緩衝液；および炭酸緩衝液を含みうるがこれらに限定されない。適切な抗酸化剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびブチル化ヒドロキシアニソールなどのフェノール化合物；ビタミンＥ；アスコルビン酸；メチオニンまたは亜硫酸塩などの還元剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート剤；システイン塩酸塩；亜硫酸水素ナトリウム；メタ重亜硫酸ナトリウム；亜硫酸ナトリウム；パルミチン酸アスコルビル；レシチン；没食子酸プロピル；およびアルファ−トコフェロールを含みうるがこれらに限定されない。
【０１０７】
注射のために、本発明のタンパク質性分子は、水溶液中で製剤化され、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液など、生理学的に適合性の緩衝液中で、適切に製剤化されうる。経粘膜投与のために、浸透させる障壁に適切な浸透剤が、製剤中で使用される。当技術分野では一般に、このような浸透剤が公知である。
本発明の組成物は、許容可能な希釈剤（生理食塩液および滅菌水など）を含有する、液体の形態による投与のために製剤化される場合もあり、所望される触感、中密度、粘度、および外見を付与する、許容可能な希釈剤または担体を含有する、ローション、クリーム、またはゲルの形態の場合もある。当業者は、許容可能な希釈剤および担体に精通しており、これらは、エトキシル化界面活性剤および非エトキシル化界面活性剤、脂肪アルコール、脂肪酸、炭化水素油（パーム油、ヤシ油、および鉱物油など）、ココアバター蝋、シリコン油、ｐＨ平衡剤、セルロース誘導体、非イオン性の有機塩基および無機塩基などの乳化剤、保存剤、蝋エステル、ステロイドアルコール、トリグリセリドエステル、レシチンおよびセファリンなどのリン脂質、多価アルコールエステル、脂肪アルコールエステル、親水性ラノリン誘導体、および親水性の蜜蝋誘導体を含むがこれらに限定されない。
代替的に、本発明のタンパク質性分子は、当技術分野で周知の、薬学的に許容される担体を使用して、本発明の実施にもまた想定される、経口投与に適する投与量へと、たやすく製剤化されうる。このような担体は、本発明の生物活性剤が、治療される患者による経口摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などの剤形に製剤化されることを可能とする。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、滑石、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張性生理食塩液、および発熱物質非含有水から選択されうる。
【０１０８】
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性形態にある、本発明のタンパク質性分子の水溶液を含む。加えて、本発明のタンパク質性分子の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として調製されうる。適切な親油性溶媒または媒体は、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルを含む。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有しうる。懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能とするように、適切な安定化剤または化合物の可溶性を増大させる薬剤を含有する場合がある。
【０１０９】
滅菌溶液は、適切な溶媒中に、要求される量の活性化合物を、要求される、上記で記載した他の賦形剤と組み合わせることに続く、濾過などの滅菌処理により調製されうる。一般に、分散液は、多様な滅菌活性化合物を、基本分散媒と、上記で記載した、要求される賦形剤とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製される。滅菌乾燥粉末は、活性化合物と、上記で記載した、要求される他の賦形剤とを含む滅菌溶液を、真空乾燥または凍結乾燥することにより調製されうる。
【０１１０】
経口使用のための医薬調製物は、本発明のタンパク質性分子を、固体賦形剤と組み合わせ、顆粒の混合物を加工した後で、所望の場合、適切な補助剤を添加して、錠剤または糖衣錠コアを得ることにより得られうる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの充填剤である。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなど、その塩などの崩壊剤が添加されうる。このような組成物は、薬学法のうちのいずれかにより調製されうるが、全ての方法は、上記で記載した、１つ以上の治療剤を、１つ以上の必要な成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方式で、例えば、従来の混合工程、溶解工程、顆粒化工程、糖衣錠作製工程、粉末化工程、乳化工程、カプセル化工程、封入工程、または凍結乾燥工程により製造されうる。
【０１１１】
糖衣錠コアには、適切なコーティングが施される。この目的で、アラビアガム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／もしくは二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい、濃縮糖溶液が使用されうる。粒子用量の異なる組合せを同定するか、または特徴付けるために、染料または顔料が、錠剤または糖衣錠のコーティングへと添加されうる。
経口使用されうる医薬は、ゼラチンから作られた押込み型カプセルのほか、ゼラチンと、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作られた軟質封入型カプセルを含む。押込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／または滑石またはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに任意の安定化剤と混合した有効成分を含有しうる。軟質カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなど、適切な液体中に溶解または懸濁されうる。加えて、安定化剤も添加されうる。
【０１１２】
本発明のタンパク質性分子は、徐放調製物および徐放製剤、例えば、ポリマーマイクロスフェア製剤、および油ベースの製剤またはゲルベースの製剤へと組み込まれうる。
特定の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、タンパク質性分子の、好ましくは、皮下組織または大綱組織である組織への、しばしば、デポ製剤または持続放出製剤における直接的注射によるなど、全身的ではなく局所的に投与されうる。
さらに、本発明のタンパク質性分子は、細胞または組織へと適切にターゲティングされ、これらにより、選択的に取り込まれる粒子などのターゲティング薬物送達系により投与されうる。一部の実施形態では、本発明のタンパク質性分子は、リポソーム、ミセル、デンドリマー、生体分解性粒子、人工ＤＮＡによるナノ構造、脂質ベースのナノ粒子、および炭素または金のナノ粒子から選択される媒体に含有されるか、またはこれらと他の形で会合する。この種類の例示的な例では、媒体は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ＰＬＡ−ＰＥＧコポリマー、およびこれらの組合せから選択される。
【０１１３】
局所投与または選択的取込みの場合、薬剤の有効局所濃度は血漿濃度と関連しない場合がある。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、組成物を単位剤形により製剤化することが有利である。本発明の、新規の単位剤形の決定は、活性物質の固有の特徴、達成される特定の治療効果、および本明細書で詳細に開示される、身体健康が損なわれる罹患状態を有する生存対象における疾患を治療するために活性物質を組み合わせる技術分野において固有の限界により決定され、これらに直接依存する。
本発明のタンパク質性分子は、対象へと投与される唯一の有効成分でありうるが、他のがん治療の、前記タンパク質性分子との共時的投与も本発明の範囲内にある。例えば、本明細書で記載される、式Ｉのタンパク質性分子、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、または変種は、それらの非限定例が、放射線療法、手術、化学療法、ホルモン除去治療、アポトーシス促進療法、および免疫療法を含む、１つ以上のがん治療と共時的に投与されうる。本発明のタンパク質性分子は、がん治療による治療の前に、治療的に使用される場合もあり、がん治療の後で、治療的に使用される場合もあり、がん治療と併せて、治療的に使用される場合もある。
【０１１４】
適切な放射線療法は、ＤＮＡ損傷を誘導する放射線および波、例えば、γ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放射、および放射性同位元素を含む。典型的に、治療は、位置特定された腫瘍部位を、上記の放射形態で照射することにより達成されうる。これらの因子の全ては、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリーおよび維持に対して、広範にわたる損傷を引き起こす可能性が極めて高い。
Ｘ線の線量範囲は、３〜４週間などの長期間にわたる、１日５０〜２００レントゲンの投与から、２０００〜６０００レントゲンの単回投与の範囲である。放射性同位元素についての線量範囲は、広範に変動し、同位元素の半減期、発せられ、新生物性細胞により取り込まれる放射線の強度および種類に依存する。適切な放射線療法は、原体外照射放射線療法（分割放射線として施される、５０〜１００グレイずつ、４〜８週間にわたる）、シングルショットまたは高線量分割による近接照射療法、恒久的組織内近接照射療法、およびストロンチウム８９など、全身への放射性同位元素を含みうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、放射線療法は、放射線増感剤と共に投与されうる。適切な放射線増感剤は、エファプロキシアル、エタニダゾール、フルオゾール、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン、およびチラパザミンを含みうるがこれらに限定されない。
【０１１５】
適切な化学療法剤は、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、およびニトロソウレア）、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシルおよびテガフールなどのフルオロピリジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシウレアなどの抗葉酸剤）、抗腫瘍抗生剤（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシンなどのアントラサイクリン）、抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、ならびにパクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキソイド）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロ毒素、アムサクリン、トポテカン、ならびにカンプトテシン）を含む、抗増殖薬／抗新生物薬およびこれらの組合せ；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、およびイドキシフェン）、エストロゲン受容体下方調節剤（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および酢酸シプロテロン）、ＵＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、リュープロレリン、およびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、およびエキセメスタン）、およびフィナステリドなどの５α−レダクターゼ阻害剤などの細胞増殖抑制剤；がん細胞の浸潤を阻害する薬剤（例えば、マリマスタットなどのメタロプロテイナーゼ阻害剤、およびウロキナーゼのプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）；増殖因子機能の阻害剤、例えば、このような阻害剤は、増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂｂ２抗体であるトラスツズマブ［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）］および抗ｅｒｂｂ１抗体であるセツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、表皮増殖因子ファミリーの他の阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＡＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）、および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ  １０３３））など、他のＥＧＦＲファミリーのチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤、ならびに、例えば、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤；血管内皮増殖因子の作用を阻害する抗血管新生剤（例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体である、ベバシズマブ［Ａｖａｓｔｉｎ（商標）］、国際特許出願で��る国際公開第９７／２２５９６号、国際公開第９７／３００３５号、国際公開第９７／３２８５６号、および国際公開第９８／１３３５４号）において開示されている化合物、および他の機構を介して作用する化合物（例えば、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤であるリノミド、およびアンギオスタチン）などの化合物などの抗血管新生剤；パルボシクリブ、アベマシクリブ、リボシクリブ、およびアルボシクリブなどのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤；コンブレタスタチンＡ４、ならびに国際特許出願である国際公開第９９／０２１６６号、国際公開第００／４０５２９号、国際公開第００／４１６６９号、国際公開第０１／９２２２４号、国際公開第０２／０４４３４号、および国際公開第０２／０８２１３号において開示されている化合物などの血管損傷剤；アンチセンス療法、例えば、抗ｒａｓアンチセンス剤であるＩＳＩＳ  ２５０３など、上記で列挙された標的へと方向付けられたアンチセンス療法；ならびに例えば、異常なｐ５３または異常なＧＤＥＰＴなど、異常な遺伝子を置きかえる手法（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）、シトシンデアミナーゼ酵素、チミジンキナーゼ酵素、または細菌性ニトロレダクターゼ酵素を使用する手法などの手法、および多剤耐性遺伝子療法など、化学療法または放射線療法に対する患者の忍容性を増大させる手法を含む遺伝子療法の手法を含みうるがこれらに限定されない。
【０１１６】
適切な免疫療法の手法は、インターロイキン２、インターロイキン４、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含む、サイトカインのトランスフェクションなど、患者腫瘍細胞の免疫原性を増大させる、ｅｘ  ｖｉｖｏ法およびｉｎ  ｖｉｖｏ法；Ｔ細胞アネルギーを減少させる手法；サイトカインをトランスフェクトされた樹状細胞など、トランスフェクトされた免疫細胞を使用する手法；サイトカインをトランスフェクトされた腫瘍細胞系を使用する手法；ならびに抗イディオタイプ抗体を使用する手法を含みうるがこれらに限定されない。これらの手法は一般に、がん細胞をターゲティングし、破壊する、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。免疫エフェクターは、例えば、悪性細胞の表面における、一部のマーカーに特異的な抗体でありうる。抗体単独が、治療のエフェクターとして用いられる場合もあり、他の細胞を動員して、細胞の殺滅を実際に容易とする場合もある。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）へとコンジュゲートされ、ターゲティング剤としてだけ用いられる場合もある。代替的に、エフェクターは、悪性細胞標的と、直接的に、または間接的に相互作用する、表面分子を保有するリンパ球でありうる。多様なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、免疫エフェクターは、その非限定例が、アテゾリズマブ、アベルマブ、ドュルバルマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＢＭＳ−９３５５５９、国際公開第２０１３／１７３２２３号、国際公開第２０１３／０７９１７４号、国際公開第２０１０／０７７６３４号、国際公開第２０１１／０６６３８９号、カナダ特許出願公開第１０１１０４６４０号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２００７／００５８７４号、国際公開第２００４／００４７７１号、国際公開第２００６／１３３３９６号、国際公開第２０１３／１８１６３４号、国際公開第２０１２／１４５４９３号において記載されている抗体、クローンＥＨ１２、およびクローン２９Ｅ．２Ａ３；ＣＡ−１７０；ＣＡ−３２７；ＢＭＳ−２０２（Ｎ−［２−［［［２−メトキシ−６−［（２−メチル［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メトキシ］−３−ピリジニル］メチル］アミノ］エチル］−アセトアミド）；ＢＭＳ−８（１−［［３−ブロモ−４−［（２−メチル［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メトキシ］フェニル］メチル］−２−ピペリジンカルボン酸）；Chang et al. (2015) Angew Chem Int Ed Engl, 54(40): 11760-11764において記載されているペプチド、とりわけ、（Ｄ）ＰＰＡ−１；ＡＵＮＰ−１２；ならびにその全内容が、参照により組み込まれる、国際公開第２０１４／１５１６３４号において記載されているペプチドを含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、ＰＤ−Ｌ１をターゲティングする分子である。
【０１１８】
一部の実施形態では、免疫エフェクターは、その非限定例が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＢＧＢ−Ａ３１７、国際公開第２０１６／１０６１５９号において記載されている抗体、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２００４／００４７７１号、国際公開第２０１３／１７３２２３号、国際公開第２０１５／１１２９００号、国際公開第２００８／１５６７１２号、国際公開第２０１１／１５９８７７号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、国際公開第２００６／１３３３９６号、国際公開第２０１２／１４５４９３号、国際公開第２００２／０７８７３１号、抗マウスＰＤ−１抗体クローンＪ４３、抗マウス抗体クローンＲＭＰ１−１４、ＡＮＢ０１１（ＴＳＲ−０４２）、ＡＭＰ−５１４（ＭＥＤＩ０６８０）、国際公開第２００６／１２１１６８号、国際公開第２００１／０１４５５７号、国際公開第２０１１／１１０６０４号、国際公開第２０１１／１１０６２１号、国際公開第２００４／０７２２８６号、国際公開第２００４／０５６８７５号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０２９４３４号、および国際公開第２０１３／０２２０９１号；ＡＭＰ−２２４；国際公開第２０１１／０８２４００号において記載されている化合物；米国特許第６，８０８，７１０号において記載されている分子および抗体；国際公開第２０１３／０１９９０６号において記載されている分子および抗体；国際公開第２００３／０１１９１１号において記載されている分子；ならびにその全内容が、参照により組み込まれる、国際公開第２０１３／１３２３１７号において記載されている化合物を含む、抗ＰＤ−１抗体を含むがこれらに限定されない、ＰＤ−１をターゲティングする分子である。
【０１１９】
一部の実施形態では、免疫エフェクターは、その非限定例が、その全内容が、参照により組み込まれる、国際公開第２０１０／０３６９５９号において記載されている抗体；およびｒＨｉｇＭ１２Ｂ７を含む、抗ＰＤ−Ｌ２抗体を含むがこれらに限定されない、ＰＤ−Ｌ２をターゲティングする分子である。
一部の実施形態では、免疫エフェクターは、イピリムマブ、トレメリムマブ、それらの全内容が、参照により組み込まれる、国際公開第００／３７５０４号において記載されている抗体、国際公開第０１／１４４２４号、米国特許出願公開第２００３／００８６９３０号；および国際公開第２００６／０５６４６４号において記載されている化合物など、抗ＣＴＬＡ−４抗体を含むがこれらに限定されない、ＣＴＬＡ−４をターゲティングする分子である。
【０１２０】
他のがん治療の例は、光線療法、細胞療法、毒素療法、またはアポトーシス促進療法を含む。当業者ならば、このリストが、がんおよび他の過形成性病変に利用可能な治療モダリティーの網羅的な種類ではないことを理解するであろう。
【０１２１】
化学療法および放射線療法は、分裂細胞を迅速にターゲティングし、かつ／または細胞周期もしくは細胞分裂を破壊することが周知である。これらの治療は、がんのいくつかの形態を治療し、治癒的処置により、それらの進行の緩徐化または疾患の症状の抑制を目的とすることの一部として施される。しかし、これらのがん治療は、免疫障害状態、および後続の病原性感染をもたらしうるので、本発明はまた、本明細書で記載される式Ｉのタンパク質性分子、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、または変種と、がん治療と、がん治療から生じる免疫障害状態から発症するか、または発症する危険性を増大させる感染症に対して有効な抗感染剤とを用いる組合せ療法へも拡張される。抗感染症薬は、ウイルス、細菌、酵母、真菌、原虫などの微生物を死滅させるか、またはこれらの増殖を阻害する化合物を含みうるがこれらに限定されない抗微生物剤から適切に選択され、したがって、抗生剤、抗アメーバ剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗マラリア剤、抗結核剤、および抗ウイルス剤を含む。抗感染症薬はまた、それらの範囲内に、抗蠕虫剤および殺線虫剤も含む。例示的な抗生剤は、キノロン（例えば、アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ロメフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、オキソリン酸、ペフロキサシン、ロソキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、スパルフロキサシン、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン；ゲミフロキサシン；およびガレノキサシン）、テトラサイクリン、グリシルサイクリン、およびオキサゾリジノン（例えば、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲサイクリン；リンゾリド、エペレゾリド）、グリコペプチド、アミノグリコシド（例えば、アミカシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォルチミシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、メノマイシン、ネチルミシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン）、β−ラクタム（例えば、イミペネム、メロペネム、ビアペネム、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフトキシム、セフゾナム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セフィネタゾール、セフォキシチン、セフォテタン、アズトレオナム、カルモナム、フロモキセム、モキサラクタム、アミジノシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、ベンジルペニシリン、カルフェシリン、ク���キサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ピペラシリン、スルベニシリン、テモシリン、チカルシリン、セフジトレン、ＳＣ００４、ＫＹ−０２０、セフジニル、セフチブテン、ＦＫ−３１２、Ｓ−１０９０、ＣＰ−０４６７、ＢＫ−２１８、ＦＫ−０３７、ＤＱ−２５５６、ＦＫ−５１８、セフォゾプラン、ＭＥ１２２８、ＫＰ−７３６、ＣＰ−６２３２、Ｒｏ０９−１２２７、ＯＰＣ−２００００、ＬＹ２０６７６３）、リファマイシン、マクロリド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、ロキタマイシン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン）、ケトリド（例えば、テリスロマイシン、セスロマイシン）、クメルマイシン、リノコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）、およびクロラムフェニコールを含む。
【０１２２】
例示的な抗ウイルス剤は、アバカビル硫酸塩、アシクロビルナトリウム、アマンタジン塩酸塩、アンプレナビル、シドフォビル、デラビルジンメシル酸塩、ジダノシン、エファビレンツ、ファムシクロビル、フォミビルセンナトリウム、フォスカルネットナトリウム、ガンシクロビル、インジナビル硫酸塩、ラミブジン、ラミブジン／ジドブジン、ネルフィナビルメシル酸塩、ネビラピン、オセルタミビルリン酸塩、リバビリン、リマンタジン塩酸塩、リトナビル、サキナビル、サキナビルメシル酸塩、スタブジン、バラシクロビル塩酸塩、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジンを含む。
【０１２３】
適切な抗アメーバ剤または抗原虫剤は、アトバコン、クロロキン塩酸塩、クロロキンリン酸塩、メトロニダゾール、メトロニダゾール塩酸塩、およびペンタミジンイセチオン酸塩を含むがこれらに限定されない。抗蠕虫剤は、メベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、アルベンダゾール、イベルメクチン、およびチアベンダゾールから選択される少なくとも１つでありうる。例示的な抗真菌剤は、アムホテリシンＢ、アムホテリシンＢ硫酸コレステリル複合体、アムホテリシンＢ脂質複合体、リポソーム型アムホテリシンＢ、フルコナゾール、フルシトシン、マイクロサイズグリセオフルビン、ウルトラマイクロサイズグリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ナイスタチン、およびテルビナフィン塩酸塩から選択されうる。適切な抗マラリア剤は、クロロキン塩酸塩、クロロキンリン酸塩、ドキシサイクリン、ヒドロキシクロロキン硫酸塩、メフロキン塩酸塩、プリマキンリン酸塩、ピリメタミン、およびスルファドキシンを伴うピリメタミンを含むがこれらに限定されない。抗結核剤は、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、エタンブトール塩酸塩、イソニアジド、ピラジナミド、リファブチン、リファムピン、リファペンチン、およびストレプトマイシン硫酸塩を含むがこれらに限定されない。
【０１２４】
既に記載された通り、本タンパク質性分子は、簡便かつ有効な投与のために、単位剤形中の有効量で、適切な、薬学的に許容される担体と組み合わされうる。一部の実施形態では、単位剤形は、本発明の活性ペプチドを、約０．２５μｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量で含みうる。本発明の活性ペプチドは、担体１ｍＬ当たり約０．２５μｇ〜約２０００ｍｇの量で存在しうる。医薬組成物が、１つ以上のさらなる有効成分を含む実施形態では、投与量は、前記成分の、通例の用量および投与方式を参照することにより決定される。
【０１２５】
５．方法
本発明者らは、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質性分子が、アセチル化部位のアセチル化が細胞内におけるその核局在化を増大させる核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害または低減することを決定した。特に、本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１内のアセチル化部位に対応するタンパク質性分子、とりわけ、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するタンパク質性分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２の核局在化を低減または阻害することを見出した。本発明者らは、本発明のタンパク質性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の形成、増殖、維持、ＥＭＴ、ＭＥＴ、または生存率のうちの少なくとも１つを変更するための方法において有用であることが可能であり、がんなど、対象におけるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の核局在化を伴う状態を治療または防止するために有用であると考えた。
【０１２６】
理論に束縛されることを望まずに述べると、本発明者らは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を含む免疫チェックポイントタンパク質など、特定の核局在性ポリペプチドのアセチル化が前記ポリペプチドの核局在化を増大させることを決定したので、核局在性ポリペプチドのアセチル化の阻害もまた、そのようなポリペプチドの核局在化を阻害または低減することが提起される。さらに、アセチル化部位に対応するタンパク質性分子が、核局在性ポリペプチドのアセチル化を競合的に阻害するので、そのようなポリペプチドの核局在化を減少させることも提起される。
したがって、本発明の別の態様では、アセチル化部位のアセチル化が細胞内における核局在化を増大させる核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害または低減する方法であって、細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む方法が提供される。本発明はまた、アセチル化部位のアセチル化が細胞内におけるその核局在化を増大させる核局在性ポリペプチドの核局在化を阻害または低減するための、アセチル化部位に対応するアミノ酸を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子の使用；およびアセチル化部位のアセチル化が細胞内における核局在化を増大させる核局在性ポリペプチドの核局在化の阻害または低減における使用のための、アセチル化部位に対応するアミノ酸を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子も提供する。
【０１２７】
一部の実施形態では、核局在性ポリペプチドは、免疫チェックポイントタンパク質、とりわけ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、および／またはＰＤ−１である。好ましい実施形態では、核局在性ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１である。
アセチル化部位に対応するアミノ酸配列は、例えば、アセチルトランスフェラーゼ；とりわけ、ＧＣＮ５、Ｈａｔ１、ＡＴＦ−２、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＨＢＯ１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１、ＡＣＴＲ、ＴＩＦ−２、ＳＲＣ−３、ＴＡＦ１、ＴＦＩＩＩＣ、および／またはＣＬＯＣＫ；とりわけ、ｐ３００を含むがこれらに限定されない、ヒストンアセチルトランスフェラーゼによりアセチル化されうるアミノ酸配列に対応する、任意のアミノ酸配列でありうる。
特定の実施形態では、タンパク質性分子のアミノ酸配列は、リシンアセチル化部位（すなわち、リシン残基がアセチル化される、アセチル化部位）；とりわけ、ＰＤ−Ｌ１のリシンアセチル化部位；最もとりわけ、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応する。
ＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＮＺＱ７）は、配列番号７５に提示される。ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列は、リシン２６３におけるε−アミノ基がアセチル化される、潜在的なアセチル化部位を含む。残基２５５〜２７１は、下記の配列において、下線を付される。
【０１２８】
MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERTH LVILGAILLC LGVALTFIFR LRKGRMMDVK KCGIQDTNSK KQSDTHLEET［配列番号７５］
【０１２９】
一部の実施形態では、本タンパク質性分子は、本明細書で記載される式Ｉにより表される、単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子；特に、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つのタンパク質性分子、または変種タンパク質性分子である。
【０１３０】
好ましい実施形態では、本タンパク質性分子は、Kumarasinghe and Woster (2014) ACS Med. Chem. Lett., 5:29-33; Culhane, et al. (2010) J. Am. Chem. Soc., 132(9):3164-3176; Culhane, et al. (2006) J. Am. Chem. Soc., 128(14):4536-4537; Szewczuk, et al. (2007) Biochemistry, 46(23): 6892-6902; Yang, et al. (2007) Nature Structural and Molecular Biology, 14(6): 535-539; Forneris, et al. (2007) J. Biol. Chem., 282(28): 20070-20074; Forneris, et al. (2005) J. Biol. Chem., 280(50): 41360-41365；および米国特許第９，１８６，３９１号において記載されているタンパク質性分子など、ヒストン３におけるアセチル化部位、とりわけ、ヒストン３の残基１〜２１など、リシン４が、アセチル化される場合（Ｈ３Ｋ４）の部位に対応するタンパク質性分子以外のタンパク質性分子である。特定の実施形態では、本タンパク質性分子は、以下の分子：
【０１３１】
【化１】
2021510538.tif 000007
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA  ［配列番号７６］；
ARTMQTARKSTGGKAPRKQLA  ［配列番号７７］；
AKTMQTARKSTGGEAPRKQLA  ［配列番号７８］；
ARTMKTARKETGGKAPRKQLA  ［配列番号７９］；
AKTMQTARKETGGKAPRKQLA  ［配列番号８０］；
AKTMQTARKSTEGKAPRKQLA  ［配列番号８１］；
AKTMETARKSTGGKAPRKQLA  ［配列番号８２］；
ARTMQTARKSTGGEAPRKQLA  ［配列番号８３］；
あるいはこれらのフラビンコンジュゲートもしくはビオチンコンジュゲート、または塩もしくはプロドラッグに対応するタンパク質性分子以外のタンパク質性分子である。
【０１３２】
本発明の別の態様では、本明細書で記載される、本発明の単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子、特に、式Ｉのタンパク質性分子、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、または変種タンパク質性分子の、治療のための使用、または治療のための医薬の製造における使用が提供される。本発明はまた、治療における使用のための、本明細書で記載される、本発明の単離タンパク質性分子または精製タンパク質性分子、特に、式Ｉのタンパク質性分子、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、または変種タンパク質性分子も提供する。
【０１３３】
本発明はまた、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞内における核局在化を阻害または低減する方法であって、細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む方法も提供する。本発明はまた、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞内における核局在化を阻害または低減するための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子の使用；ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞内における核局在化の阻害または低減における使用のための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子；およびこのような使用のための医薬の製造における使用も想定する。
【０１３４】
本発明の、さらに別の態様では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ；（ｖ）ＭＥＴ；または（ｖｉ）生存率のうちの少なくとも１つを変更する方法であって、前記細胞を、形成、増殖、維持、ＥＭＴ、ＭＥＴ、または生存率をモジュレートする量の、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップを含む方法が提供される。本発明はまた、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ；（ｖ）ＭＥＴ；または（ｖｉ）生存率のうちの少なくとも１つを変更するための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子の使用も想定する。本発明はまた、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ；（ｖ）ＭＥＴ；または（ｖｉ）生存率のうちの少なくとも１つの変更における使用のための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子；およびこの使用のための医薬の製造における使用へも拡張される。
【０１３５】
上記の態様のうちのいずれか１つについての、一部の実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞は、がん幹細胞またはがん幹細胞以外の腫瘍細胞、とりわけ、がん幹細胞である腫瘍細胞である。
一部の実施形態では、本タンパク質性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ；もしくは（ｖｉ）生存率の低減、減損、失効化、阻害、または防止；および／またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞の、（ｖ）ＭＥＴの増強を結果としてもたらす。
【０１３６】
タンパク質性分子についての適切な実施形態は、本明細書で記載される通りである。
本明細書で記載される、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子、とりわけ、式Ｉのタンパク質性分子、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、または変種タンパク質性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の核局在化の阻害に有用である。したがって、本発明者らは、タンパク質性分子が、対象におけるがんを治療または防止するために有用であると考えた。こうして、別の態様では、少なくとも１つの、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞を含む、対象におけるがんを治療または防止するための方法であって、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子を対象へ投与するステップを含む方法が提供される。本発明はまた、少なくとも１つの、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞を含む、対象におけるがんを治療または防止するための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子の使用；およびこの目的のための医薬の製造における使用へも拡張される。少なくとも１つの、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞を含む、対象におけるがんの治療または防止における使用のための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子もまた想定される。
【０１３７】
がんは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の過剰発現を伴う、任意のがんでありうる。適切ながんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、膀胱がん、膵臓がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、腎臓がん、もしくは脳がん、または黒色腫もしくは網膜芽細胞腫；とりわけ、乳がん、肺がん、または黒色腫；最もとりわけ、乳がん、または黒色腫；さらにとりわけ、乳がんを含みうるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書で記載される、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子は、悪性腫瘍、特に、転移性がんの症状を、治療、防止、および／または緩和するために有用である。好ましい実施形態では、本タンパク質性分子は、転移性がんの症状を、治療、防止、および／または緩和するために使用される。適切な種類の転移性がんは、転移性の乳がん、前立腺がん、肺がん、膀胱がん、膵臓がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、腎臓がん、もしくは脳がん、または黒色腫もしくは網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、脳がんは、神経膠腫である。好ましい実施形態では、転移性がんは、転移性乳がん、肺がん、または黒色腫；とりわけ、転移性乳がん、または黒色腫；最もとりわけ、転移性乳がんである。
【０１３８】
本タンパク質性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞を伴う方法において有用である。特定の実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞は、乳腺、前立腺、精巣、肺、膀胱、膵臓、結腸、黒色腫、白血病、網膜芽細胞腫、肝臓、卵巣、腎臓または脳の細胞；とりわけ、乳腺、肺、または黒色腫の細胞；最もとりわけ、乳腺または黒色腫の細胞；さらにとりわけ、乳腺細胞から選択される。好ましい実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞は、乳腺上皮細胞、とりわけ、乳管上皮細胞である。
一部の実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を過剰発現する細胞は、がん幹細胞またはがん幹細胞以外の腫瘍細胞；とりわけ、がん幹細胞である腫瘍細胞；最もとりわけ、乳がん幹細胞である腫瘍細胞である。一部の実施形態では、がん幹細胞である腫瘍細胞は、ＣＤ２４およびＣＤ４４、特に、ＣＤ４４high、ＣＤ２４lowを発現する。
一部の実施形態では、方法は、対象から得られた腫瘍試料中の、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の遺伝子の過剰発現を検出するステップをさらに含み、この場合、腫瘍試料は、タンパク質性分子を、対象へと投与する前に、がん幹細胞である腫瘍細胞を含んでおり、またがん幹細胞以外の腫瘍細胞を含んでもよい。
【０１３９】
本明細書で記載される、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子は、がんを伴うと診断された個体、がんを有することが疑われる個体、がんにかかりやすいことが公知である個体およびがんを発症する可能性が高いと考えられる個体、または既に治療されたがんを再発すると考えられる個体を治療するのに適する。がんは、ホルモン受容体陰性でありうる。一部の実施形態では、がんは、ホルモン受容体陰性であり、したがって、ホルモン療法または内分泌療法に対して耐性である。がんが乳がんである一部の実施形態では、乳がんは、ホルモン受容体陰性である。一部の実施形態では、乳がんはエストロゲン受容体陰性であり、かつ／またはプロゲステロン受容体陰性である。
【０１４０】
本明細書で記載される、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子が有用でありうる、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の過剰発現を伴う、多数の状態が存在する。したがって、本発明の別の態様では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の核局在化の阻害または低減が有効な治療と関連する、対象における状態を治療または防止する方法であって、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子を対象へ投与するステップを含む方法が提供される。本発明はまた、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の核局在化の阻害または低減が、有効な治療と関連する、対象における状態を治療または防止するための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子の使用；ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の核局在化の阻害または低減が、有効な治療と関連する、対象における状態の治療または防止における使用のための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子；およびこの目的のための医薬の製造における、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子の使用も提供する。
【０１４１】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の過剰発現を伴う状態の非限定例は、がん、感染、自己免疫障害、および呼吸器障害を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、感染は、病原性感染である。感染は、ウイルス感染、細菌感染、酵母感染、真菌感染、蠕虫感染、または原虫感染から選択されうるがこれらに限定されない。本発明により想定されるウイルス感染は、ＨＩＶ、肝炎、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、フィロウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス、ヒトレトロウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、エボラウイルス、西ナイルウイルス、およびＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）ウイルスにより引き起こされる感染；とりわけ、ＨＩＶ、肝炎、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよびＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）ウイルスにより引き起こされる感染を含むがこれらに限定されない。細菌感染は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属種、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ属種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ属種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属種、Ａｎａｂａｅｎａ属種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属種、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ属種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属種、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｃｈｌｒｏｒｂｉｕｍ属種、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属種、Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ属種、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属種、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属種、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属種、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ属種、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属種、Ｐｒｏｔｅｕｓ属種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属種、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属種、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属種、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属種、Ｖｉｂｒｉｏ属種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属種、Ｎｏｃａｒｄｉａ属種、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種により引き起こされる細菌感染；とりわけ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属種、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ属種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ属種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属種、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種により引き起こされる感染を含むがこれらに限定されない。本発明により包含される原虫感染は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属種、Ｅｎｔａｍ���ｅｂａ属種、およびＧｉａｒｄｉａ属種により引き起こされる原虫感染を含むがこれらに限定されない。蠕虫感染は、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ属種により引き起こされる感染を含みうるがこれらに限定されない。本発明により想定される真菌感染は、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属種およびＣａｎｄｉｄａ属種により引き起こされる感染を含むがこれらに限定されない。
【０１４３】
適切な自己免疫障害は、自己免疫性リウマチ性障害（例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびループス腎炎などのループス、多発性筋炎−皮膚筋炎、寒冷グロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、および乾癬性関節炎など）、自己免疫性の消化器障害および肝臓障害（例えば、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病、自己免疫胃炎および悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ならびにセリアック病など）、血管炎（例えば、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陰性血管炎、ならびにチャーグ−シュトラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、および顕微鏡的多発血管炎を含むＡＮＣＡ関連血管炎など）、自己免疫性神経障害（例えば、多発性硬化症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、および自己免疫性多発ニューロパシーなど）、腎障害（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、およびバージャー病など）、自己免疫性皮膚障害（例えば、乾癬、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ、ｈｉｖｅｓ）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および皮膚エリテマトーデスなど）、血液障害（例えば、血小板減少性紫斑症、血栓性血小板減少性紫斑症、輸血後紫斑症、および自己免疫性溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば、内耳疾患および難聴など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、および自己免疫性内分泌障害（例えば、Ｉ型糖尿病、アジソン病などの糖尿病関連自己免疫疾患、自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス病および甲状腺炎）など）を含むがこれらに限定されない。
【０１４４】
適切な呼吸器障害は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息、とりわけ、アレルギー性喘息を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、方法は、対象から得られた腫瘍試料中の、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２の遺伝子の過剰発現を検出するステップをさらに含み、この場合、本発明のタンパク質性分子を対象へ投与する前に、腫瘍試料はがん幹細胞である腫瘍細胞を含んでおり、またがん幹細胞以外の腫瘍細胞を含んでもよい。
特定の実施形態では、上記で記載した方法のうちのいずれか１つは、さらなるがん治療および／または抗感染剤、とりわけ、さらなるがん治療など、上記の第４節で記載された、１つ以上のさらなる活性薬剤の投与を伴う。
【０１４５】
本発明のタンパク質性分子、特に、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するタンパク質性分子、とりわけ、本明細書で記載される、式Ｉのタンパク質性分子、配列番号１〜２１のうちのいずれか１つ、とりわけ、配列番号１〜１８のうちのいずれか１つ、または変種タンパク質性分子は、ポリペプチドのアセチル化を阻害または低減するために有用である。一部の実施形態では、アセチル化は、アセチルトランスフェラーゼ；とりわけ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼにより触媒される。一部の実施形態では、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ＧＣＮ５、Ｈａｔ１、ＡＴＦ−２、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＨＢＯ１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１、ＡＣＴＲ、ＴＩＦ−２、ＳＲＣ−３、ＴＡＦ１、ＴＦＩＩＩＣ、および／またはＣＬＯＣＫ；とりわけ、ｐ３００である。
【０１４６】
こうして、本発明のさらなる態様では、対象におけるアセチルトランスフェラーゼの触媒活性を阻害する方法であって、その実施形態について、本明細書で記載される、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子を投与するステップを含む方法が提供される。本発明はまた、対象におけるアセチルトランスフェラーゼの触媒活性を阻害するための、本明細書で記載されるタンパク質性分子の使用、および対象におけるアセチルトランスフェラーゼの触媒活性の阻害における使用のための、本明細書で記載されるタンパク質性分子へも拡張される。好ましい実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、その実施形態について、上記で記載された、ヒストンアセチルトランスフェラーゼである。
【０１４７】
本発明はまた、核局在性ポリペプチドの核局在化（前記核局在性ポリペプチドのアセチル化部位のアセチル化は細胞内における前記核局在性ポリペプチドの核局在化を増大させる）を阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、核局在化の正常レベルまたは参照レベルと比べた、核局在性ポリペプチドの、細胞内における核局在化の低減または阻害を検出するステップ
を含む方法も想定する。
【０１４８】
一部の実施形態では、本タンパク質性分子は核局在性ポリペプチドの断片である。特定の実施形態では、タンパク質性分子は、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、または１７（およびこれらの間の各整数）アミノ酸残基以下を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
一部の実施形態では、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列はＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列である。特定の実施形態では、タンパク質性分子は、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つなど）のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される。一部の実施形態では、タンパク質性分子は、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、１つ〜８つ、１つ〜７つ、１つ〜６つ、１つ〜５つ、１つ〜４つ、１つ〜３つ、または１つ〜２つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される。
【０１４９】
別の態様では、本発明は、核局在性ポリペプチドの核局在化（前記核局在性ポリペプチドのアセチル化部位のアセチル化は細胞内における前記核局在性ポリペプチドの核局在化を増大させる）を阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）細胞を、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、核局在化の正常レベルまたは参照レベルと比べた、核局在性ポリペプチドの、細胞内における核局在化の低減または阻害を検出するステップ
を含む方法を提供する。
【０１５０】
一部の実施形態では、本タンパク質性分子は、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つなど）のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される。一部の実施形態では、本タンパク質性分子は、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、１つ〜８つ、１つ〜７つ、１つ〜６つ、１つ〜５つ、１つ〜４つ、１つ〜３つ、または１つ〜２つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される。
【０１５１】
核局在性ポリペプチドの核局在化の低減または阻害は、その非限定例が、免疫蛍光、免疫組織化学染色、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ、その全内容が、参照により組み込まれる、Satelli, et al. (2016) Sci Rep, 6:28910; Bajetto, et al. (2000) Brain Research Protocols, 5(3): 273-281; and Sung, et al. (2014) BMC Cancer, 14:951において記載されているアッセイなどの、ＤＮアーゼ−ｓｅｑアッセイ、ＦＡＩＲＥ−ｓｅｑアッセイ、およびＡＴＡＣ−ｓｅｑアッセイなどのクロマチンアクセシビリティーアッセイを含む、当技術分野において標準的な技法を使用して決定されうる。
さらに別の態様では、がん幹細胞の形成、増殖、生存率、またはＥＭＴのうちの少なくとも１つを阻害または低減するタンパク質性分子を作製する方法であって、
ａ）がん幹細胞を、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１に対応するアミノ酸配列を含むか、前記配列からなるか、または前記配列から本質的になるタンパク質性分子と接触させるステップ；および
ｂ）タンパク質性分子の非存在下における、細胞の形成、増殖、生存率、またはＥＭＴの正常レベルまたは参照レベルと比べた、がん幹細胞の形成、増殖、またはＥＭＴの低減または阻害を検出するステップ
を含む方法が提供される。
【０１５２】
一部の実施形態では、本タンパク質性分子は、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つなど）のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される。一部の実施形態では、本タンパク質性分子は、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１における、１つ〜８つ、１つ〜７つ、１つ〜６つ、１つ〜５つ、１つ〜４つ、１つ〜３つ、または１つ〜２つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換により、ＰＤ−Ｌ１から区別される。
本タンパク質性分子のアミノ酸配列は、天然のアセチル化部位に対応する場合もあり、デザインされたアセチル化部位に対応する場合もあり、または合成のアセチル化部位に対応する場合もある。一部の実施形態では、アセチル化部位は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２などであるがこれらに限定されない、核局在性ポリペプチドの部位である。適切なアセチル化部位は、本明細書で既に記載された通りである。他の実施形態では、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列は、核局在性ポリペプチド、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列である。
デザインされたアセチル化部位に対応するアミノ酸配列を伴うタンパク質性分子は、当技術分野において標準的な医薬化学法を使用して同定されうる。
【０１５３】
ポリペプチドのアセチル化部位は、Hake and Janzen (2013) Protein Acetylation: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 981；Li, et al. (2014) Sci Rep, 4:5765；Hou, et al. (2014) PLoS One, 9(2):e89575；およびWuyun, et al. (2016) PLoS One, 11(5):e0155370（その全内容が、参照により組み込まれる）において記載されているコンピュータ法などのコンピュータ法を使用して同定される場合もあり；または、例えば、予測される残基の突然変異誘発を、例えば、アセチル化されたリシンなど、アセチル化されたアミノ酸残基へと方向付けられた抗体を使用する、アセチル化のレベルの検出と組み合わせて使用して、実験により決定される場合もある。周囲および／または近傍の残基の関与は、当技術分野において標準的な医薬化学法を使用して決定されうる。
【０１５４】
当業者であれば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２などのポリペプチドの核局在化を評価し、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２などのポリペプチドの核局在化を阻害または低減するタンパク質性分子を同定するのに使用される適切なアッセイについて、十分に承知しているであろう。本発明に従う活性薬剤についてのスクリーニングは、任意の適切な方法により達成されうる。例えば、この方法は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２など目的のポリペプチドをコードする遺伝子に対応するポリヌクレオチドを発現する細胞を、阻害活性を有することが推測される薬剤と接触させるステップと、細胞の核における、目的のポリペプチドのレベルの阻害または低減についてスクリーニングするステップとを含みうる。代替的に、目的のポリペプチドの機能活性の阻害、またはポリヌクレオチドによりコードされる転写物のレベルの低下、またはポリペプチドもしくは転写物の、細胞における下流の標的の活性もしくは発現の阻害についても、スクリーニングされうるが、この場合、その活性は、目的のポリペプチドの核局在化と関連する。このような阻害の検出は、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫染色、スロットアッセイまたはドットブロットアッセイ、シンチレーション近傍アッセイ、抗原結合性分子コンジュゲート、またはフルオレセインもしくはローダミンなどの蛍光物質による抗原コンジュゲートを使用する蛍光イムノアッセイ、ＲＩＡ、オクタロニー二重拡散解析、アビジン−ビオチン検出系またはストレプトアビジン−ビオチン検出系を用いるイムノアッセイ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む核酸検出アッセイ、ＷＳＴ−１増殖アッセイなどの細胞増殖アッセイ、およびＰＤ−Ｌ１  Ｈａｌｆ−Ｗａｙ  ＣｈＩＰで処理された細胞についての免疫ブロット解析を含むがこれらに限定されない技法を利用して達成されうる。ポリペプチドのアセチル化は、アセチル化されたリシン残基へと方向付けられた抗体など、アセチル化されたポリペプチドへと方向付けられた抗体を使用して決定されうる。
【０１５５】
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２など、目的のポリペプチドがそれにより調節されるか、またはそこから発現されるポリヌクレオチドは、試験の対象である細胞において、天然に存在する場合もあり、試験を目的として宿主細胞へと導入されている場合もあることが理解されるであろう。
アセチラーゼの触媒活性の阻害は、当技術分野において標準的な技法を使用して決定されうる。例えば、アセチルトランスフェラーゼの阻害は、Ａｂｃａｍ製のアセチルトランスフェラーゼ活性アッセイキット（型番：ａｂ２０４５３６）、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のｐ３００蛍光発生アッセイキット（型番：５００９２）、もしくはＡｂｃａｍ製のｐ３００阻害剤スクリーニングアッセイキット（蛍光分析）（型番：ａｂ１９６９９６）などの蛍光アッセイ；Ａｂｃａｍ製のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性アッセイキット（型番：ａｂ６５３５２）などの熱量測定アッセイ；またはＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のｐ３００化学発光アッセイキット（型番：５００７７）などの化学発光アッセイを使用して評価されうる。
【０１５６】
これらの方法は、タンパク質性薬剤など、推定の調節性薬剤のハイスループットスクリーニングを実施するための機構であって、合成ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、化学ライブラリー、および天然ライブラリーを含む機構をもたらす。
最も強力なｉｎ  ｖｉｖｏ効果を有する分子を同定するために、活性分子は、動物モデルでもさらに調べられうる。これらの分子は、例えば、化合物を逐次的改変にかけること、分子的モデル構築、および合理的な薬物デザインにおいて用いられる、他の規定の手順による、医薬剤のさらなる開発のためのリード分子としての役割を果たしうる。
本発明がたやすく理解され実行されうるように、ここで、以下の非限定的実施例により特定の好ましい実施形態が記載される。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）
乳がん患者および黒色腫患者に由来する転移開始細胞（ＭＩＣ）における、ＰＤ−Ｌ１の局在化
共焦点レーザー走査顕微鏡法を、転移性乳がん患者および転移性黒色腫患者に由来する液体生検から単離されたＭＩＣに対して実施した。ＰＤ−Ｌ１は、大きなＴＮＦＩスコアおよび１を超えるＦｎ／ｃスコアにより指し示される通り、乳がん細胞（図１Ａ〜１Ｄ）および黒色腫細胞（図２Ａおよび２Ｂ）の両方において顕著な核局在化を示した。
【０１５８】
（実施例２）
乳がん細胞における、ＰＤ−Ｌ１の局在化
共焦点レーザー走査顕微鏡法を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ）細胞、および上皮ＭＣＦ７細胞（ＭＣＦ７  ＮＳ）または間葉ＭＣＦ７細胞（ＭＣＦ７  ＳＴ）に対して実施して、ＰＤ−Ｌ１の局在化について検討した。ＰＤ−Ｌ１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ならびに上皮ＭＣＦ７細胞および間葉ＭＣＦ７細胞において検出可能であり、特に、間葉ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、高度の核局在化を示した（図３Ａ）。
【０１５９】
共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、アブラキサン（６０ｍｇ／ｋｇ）またはドセタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）で３５日間にわたり処置されたマウスＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片における、ＰＤ−Ｌ１の発現について調べた。アブラキサンまたはドセタキセルで治療された、耐性の生存ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植細胞は非処置細胞と比較して、核において高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現した（図３Ｂ）。
共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１の局在化、ならびに鍵となるヒストンマーカーである、セチル化Ｈ３Ｋ２７（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）、トリメチル化Ｈ３Ｋ４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）、およびトリメチル化Ｈ３Ｋ９（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）について調べた。ＰＤ−Ｌ１は、細胞の核において、活性マーカーであるＨ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ４ｍｅ３とは共局在化したが、抑制性マーカーであるＨ３Ｋ９ｍｅ３とは共局在化しなかった（図３Ｃ）。
【０１６０】
（実施例３）
ＰＤ−Ｌ１の局在化および腫瘍細胞マーカーの発現に対する、Ｋ２６３Ｑ突然変異の効果
Wen, et al. (2016) Bioinformatics, 32(20): 3107-3115において記載されている、高ストリンジェンシーメチル化予測ソフトウェアと、Li, et al. (2014) Sci Rep, 4:5765において記載されている高ストリンジェンシーアセチル化予測ソフトウェアとを使用して、ＰＤ−Ｌ１の残基２５５〜２７１を、メチル化部位およびアセチル化部位として同定し、リシン２６３は、メチル化／アセチル化残基であった。この部位のアセチル化の、ＰＤ−Ｌ１の局在化および腫瘍細胞マーカーの発現における役割を決定するために、ＭＣＦ７細胞に、野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミドおよびＰＤ−Ｌ１［Ｋ２６３Ｑ］突然変異体配列を含有するプラスミド（Ｍｕｔ１）をトランスフェクトした（図４）。リシン２６３はグルタミンで置きかえて、この位置におけるアセチル化を防止した。
【０１６１】
野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミドをトランスフェクトされた細胞における、ＰＤ−Ｌ１の過剰発現は、空ベクターをトランスフェクトされた細胞と比較して、浸潤性腫瘍細胞についてのマーカーである細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）（図５Ａおよび５Ｂ）、化学療法耐性がん幹細胞についてのマーカーであるＣＤ１３３（図６Ａおよび６Ｈ）、ならびに間葉マーカーであるＥＧＦＲ（図６Ａ〜６Ｄ）およびＳＮＡＩ１（図６Ａおよび６Ｅ〜６Ｇ）の発現の増大を結果としてもたらした。野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミドをトランスフェクトされた細胞では、ＰＤ−Ｌ１の核局在化もまた増大した（図５Ａおよび５Ｃ〜５Ｅ）。Ｍｕｔ１プラスミドをトランスフェクトされた細胞は、空ベクターをトランスフェクトされた細胞と比較してＣＳＶの発現の顕著な増大、ならびに空ベクターをトランスフェクトされた細胞、および野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミドをトランスフェクトされた細胞と比較して、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、およびＳＮＡＩ１の発現の顕著な増大を呈した（図５Ａ、５Ｂ、および６Ａ〜６Ｈ）。驚くべきことに、Ｍｕｔ１プラスミドをトランスフェクトされた細胞は、空ベクターをトランスフェクトされた細胞、または野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミドをトランスフェクトされた細胞と比較して、ＰＤ−Ｌ１の核局在化の    顕著な増大を呈した（図５Ａおよび５Ｃ〜５Ｅ）。
【０１６２】
全ての被験間葉マーカーの発現の顕著な増大に加えて、野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミドをトランスフェクトされた細胞、およびＭｕｔ１プラスミドをトランスフェクトされた細胞はまた、強い転移潜在力を指し示す、移動性表現型の獲得も示唆した。これは、Ｍｕｔ１プラスミドをトランスフェクトされた細胞について特に明白であった。
ＷＳＴ−１増殖アッセイを使用して、ＰＤ−Ｌ１［Ｋ２６３Ｑ］突然変異の、細胞増殖に対する効果について調べた。ＭＣＦ７細胞への、野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミドのトランスフェクションは、細胞増殖の顕著な阻害を引き起こした（図７）。この阻害は、細胞に、Ｍｕｔ１プラスミドをトランスフェクトした場合に増大した（図７）。顕微鏡法によるデータと組み合わせて、これは、トランスフェクトされた細胞が、転移性、間葉性、非増殖性の状態を獲得しつつあることを示唆する。
こうして、リシン２６３が、ＰＤ−Ｌ１の核局在化において極めて重要な役割を果たし、ＰＤ−Ｌ１の核局在化が、浸潤性、および間葉性、がん幹細胞様、化学療法耐性、非増殖性の状態についての腫瘍マーカーを調節するために重要であることが明白である。
【０１６３】
（実施例４）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ならびに乳がん患者および黒色腫患者に由来する循環腫瘍細胞における、トリメチル化ＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化
共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、ＰＤ−Ｌ１（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚから入手）、リシン２６３においてアセチル化されたＰＤ−Ｌ１、およびリシン２６３においてトリメチル化されたＰＤ−Ｌ１、に特異的な抗体を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内の、リシン２６３においてトリメチル化されたＰＤ−Ｌ１（「トリメチル化ＰＤ−Ｌ１」）、およびリシン２６３においてアセチル化されたＰＤ−Ｌ１（「アセチル化ＰＤ−Ｌ１」）の局在化について検討した。アセチル化ＰＤ−Ｌ１（ＰＤＬ１−２６３ＫＡｃｅｔｙｌ）が、高Ｆｎ／ｃ（核蛍光の細胞質蛍光に対する比）により証拠立てられる明確な核における存在を裏付けたのに対し、トリメチル化ＰＤ−Ｌ１（ＰＤＬ１−２６３ＫＭｅ３）は、主にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞質に位置した（低Ｆｎ／ｃにより指し示される）（図８Ａ）。
【０１６４】
次いで、トリメチル化ＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化について、非透過処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、転移性乳がん患者から単離された循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）（ＭＢＣ  ＣＴＣ  Ｓ１またはＭＢＣ  ＣＴＣ  Ｓ２）、化学療法による治療に応答する黒色腫患者から単離されたＣＴＣ（レスポンダー）、および化学療法による治療に対する一次耐性を伴う黒色腫患者から単離されたＣＴＣ（一次耐性）、または化学療法による治療に対する二次耐性を伴う黒色腫患者から単離されたＣＴＣ（二次耐性）において検討した。これらの細胞において明確に標識されたのはトリメチル化ＰＤ−Ｌ１だけであり（図８Ｂ、一方、アセチル化ＰＤ−Ｌ１は結合をほとんど示さなかった（図８Ｃ）ことから、アセチル化ＰＤ−Ｌ１が主に核に位置するのに対し、トリメチル化ＰＤ−Ｌ１は主に細胞質または細胞表面に位置することが指し示される。
【０１６５】
（実施例５）
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の合成
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（表４を参照されたい）は、ＰＤ−Ｌ１のメチル化部位に基づきデザインされた。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３は、自動式の最新型固相ペプチド合成と、例えば、Ensenat-Waser, et al. (2002) IUBMB Life, 54:33-36および国際公開第２００２／０１０１９３号において記載されている、マイルドなＦｍｏｃ化学法を使用する精製技術とを使用して合成した。カップリングは、標準的なＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）カップリングを使用して実施した。脱保護の後、自動式調製用逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して、ペプチドを精製した。解析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析を使用して画分を解析した。純度が９８％以上の画分を組み合わせて最終生成物をもたらした。
【０１６６】
Ｎ末端アミノ酸のＮ末端アミノ基を介して、全ての被験ペプチドをミリストイル化した。ミリストイル化は、ペプチドの脱保護および精製の前に、上記で記載した、標準的なＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリングを使用して、ミリスチン酸をＮ末端残基へと共有結合的にカップリングすることにより実行した。
【表４】
2021510538.tif 000008
【０１６７】
（実施例６）
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の、核におけるＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１の発現に対する効果
共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（実施例５に従い合成した）の、核におけるＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１（ＰＤＬ１−Ａｃ）の発現に対する効果について調べた（図９）。低Ｆｎ／ｃにより指し示される通り、ＰＤ−Ｌ１の局在化は、細胞質へと、顕著にバイアスがかかっていた（図９Ａ）。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３は、核におけるＰＤ−Ｌ１の発現を阻害した。アセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化は、主に、核へと制約された（図９Ｂ）。驚くべきことに、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３で処置された細胞では、全核蛍光強度（ＴＮＦＩ）が、顕著に低減され、これらの細胞は、細胞質におけるアセチル化ＰＤ−Ｌ１の発現を呈した。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３で処置された細胞では、Ｆｎ／ｃが、顕著に低減されたことから、アセチル化ＰＤ−Ｌ１は、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３による処置の結果として細胞質へとバイアスがかかっていることが指し示される。
可能な核局在化シグナルに対応するＮ末端を切断したペプチドが、ＰＤ−Ｌ１の核局在化を阻害するのかどうかを調べるためにＰ４をデザインし、実施例５の手順に従い合成した。
【０１６８】
【表５】
2021510538.tif 000009
Ｐ４は、ＰＤ−Ｌ１またはアセチル化ＰＤ−Ｌ１の局在化に対して、効果を及ぼさなかった（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０１６９】
（実施例７）
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２４ｌｏｗ）に対する効果
ＦＡＣＳ解析を用いて、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（実施例５に従い合成した）による処置の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４high／ＣＤ２４low）（多くのがん幹細胞表現型を有する）に対する効果を決定した。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３による処置はがん幹細胞表現型を顕著に阻害し、Ｐ３はがん幹細胞表現型の最大の阻害を引き起こした（図１１Ａ〜１１Ｆ）。
【０１７０】
（実施例８）
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖に対する効果
ＷＳＴ−１増殖アッセイを使用して、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（実施例５に従い合成した）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖に対する効果を評価した。化学療法耐性で非増殖性である表現型を促進するＰＤ−Ｌ１の過剰発現にもかかわらず、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の全ては、それぞれ、１０２．８μＭ、５６４．１μＭ、および５４２．１μＭのＩＣ50値で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を阻害した（図１２Ａ〜１２Ｃ）。
【０１７１】
（実施例９）
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、腫瘍細胞マーカーおよび後成的酵素の発現に対する効果
共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（実施例５に従い合成した）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１、ＣＳＶ、ＳＮＡＩ１、およびＥＧＦＲの発現に対する効果を評価した。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３について、ＰＤ−Ｌ１の核局在化は、顕著に阻害された（図１３Ａおよび１３Ｃ）。加えて、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３は、浸潤性腫瘍細胞についてのマーカーであるＣＳＶ（図１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、および１４Ｂ）、ならびに間葉マーカーであるＥＧＦＲ（図１４Ａおよび１４Ｃ）およびＳＮＡＩ１（図１３Ａ、１３Ｄ、１４Ａ、および１４Ｄ）の発現を一様に阻害した。これらの結果は、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３が、ＰＤ−Ｌ１の核局在化を顕著に阻害することを確認し、間葉性転移開始がん細胞の核ＰＤ−Ｌ１の重要性を裏付ける。
【０１７２】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４（実施例５に従い合成した）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＥＨＴＭ２、ＤＭＮＴＩ、およびＳＥＴＤＢ１の発現に対する効果は、共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して決定した。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３は、がん進行に関与する後成的酵素である、ＥＨＴＭ２、ＤＭＮＴＩ、およびＳＥＴＤＢ１の発現を、顕著に失効化させた（図１５）。Ｐ４はまた、ＤＭＮＴＩおよびＳＥＴＤＢ１の核局在化も阻害したが、ＥＨＴＭ２の局在化に対して顕著な効果をもたらさなかった。
これらの結果に続き、共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、Ｐ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（ＳＥＴＤＢ１の標的）、５−メチルシトシン（ＤＮＡのメチル化の指標としての）、およびＡＢＣＢ５（耐性についてのマーカー）の発現に対する効果について調べた。Ｐ３は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、５−メチルシトシン、およびＡＢＣＢ５の発現を強く阻害した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。
【０１７３】
（実施例１０）
アセチル化ＰＤ−Ｌ１およびｐ３００の、黒色腫および乳がんにおける共発現
共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、転移性黒色腫患者に由来するＣＴＣにおける、アセチル化ＰＤ−Ｌ１およびアセチルトランスフェラーゼである、ｐ３００の発現について調べた。アセチル化ＰＤ−Ｌ１は、転移性黒色腫ＣＴＣの核において濃縮されることから、免疫療法に対する一次耐性および二次耐性を呈する（図１７）。転移性黒色腫ＣＴＣは、ｐ３００の発現がわずかに増大したことから、免疫療法に対する耐性を呈する。興味深いことに、耐性ＣＴＣでは、ｐ３００と、アセチル化ＰＤ−Ｌ１とのピアソン相関係数（ＰＣＣ（ｒ））が顕著に増大するが、免疫療法に応答するＣＴＣでは、ＰＣＣ（ｒ）がほとんどまたは全く増大しないことから、アセチル化ＰＤ−Ｌ１とｐ３００とが、耐性ＣＴＣに共局在化することが指し示される。
【０１７４】
共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、ドセタキセル耐性転移性乳がん細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７、およびＴ−４７Ｄ）、およびアブラキサン耐性転移性乳がん細胞系（４Ｔ１細胞）における、ｐ３００およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１の発現について、さらに調べた。耐性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＸＴ５０、ＭＣＦ７  ＴＸＴ５０、Ｔ−４７Ｄ  ＴＸＴ５０、および４Ｔ１群Ｂ）では、核におけるアセチル化ＰＤ−Ｌ１の発現が、非耐性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７、Ｔ−４７Ｄ、および４Ｔ１群Ａ）と比較して顕著に増大した（図１８）。アセチル化ＰＤ−Ｌ１と同様に、耐性細胞では、核におけるｐ３００の発現も、非耐性細胞と比較して、顕著に増大した（図１８）。アセチル化ＰＤ−Ｌ１およびｐ３００は細胞の核内に強く共局在化し、これは、耐性細胞で顕著に増大した（図１８）。
【０１７５】
（実施例１１）
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４の、ｐ３００の局在化に対する効果
共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４（実施例５に従い合成した）の、ｐ３００の局在化に対する効果について検討した。アセチル化ＰＤ−Ｌ１に対する効果と同様に、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３は核におけるｐ３００の発現を顕著に減少させ、Ｐ３は最大の効果を及ぼした（図１９）。これらのペプチドはまた、アセチル化ＰＤ−Ｌ１と、ｐ３００との共局在化も顕著に減少させた。Ｐ４は、核におけるｐ３００の発現をわずかに減少させたが、アセチル化ＰＤ−Ｌ１とｐ３００との共局在化に対する効果を及ぼさなかった。
（実施例１２）
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞またはＯＴ１由来Ｔ細胞における、ＰＤ−１の局在化
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞またはＯＴ１由来Ｔ細胞におけるＰＤ−１の局在化は共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して決定した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（白血病性細胞系）では、ＰＤ−１の核局在化が明白であった（図２０Ａおよび２０Ｂ）。しかし、炎症経路が活性化すると、発現は低減された。核におけるＰＤ−１局在化はまた、ＯＴ１由来のナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞においても明白であったが、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞におけるより低強度であった。
【０１７６】
（実施例１３）
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１の局在化に対する効果
共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（実施例５に従い合成した）の、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１の局在化に対する効果を評価した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の核における、ＰＤ−１の局在化は、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３により、対照と比べて、顕著に阻害された（図２１Ａ〜２１Ｄ）。
（実施例１４）
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ２の局在化に対する効果
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（実施例５に従い合成した）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＰＤ−Ｌ２の局在化に対する効果は、共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して決定した。核におけるＰＤ−Ｌ２の局在化は、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３により、対照と比べて顕著に阻害された（図２２Ａおよび２２Ｂ）。ここでもまた、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３は、ＰＤ−Ｌ１の核局在化（図２２Ａおよび２２Ｃ）、および浸潤性腫瘍細胞についてのマーカーである、ＣＳＶの発現（図２２Ａおよび２２Ｄ）を、対照と比べて顕著に阻害した。
【０１７７】
（実施例１５）
Ｐ１類似体の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞に対する効果
Ｐ１の類似体（表６）は、実施例５の手順に従い、デザインおよび合成した。これらの類似体が、がん幹細胞を阻害する能力は、ペプチドで処置された、約９０％のＣＤ４４hiＣＤ２４loがん幹細胞を構成的に含有する、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についてのＦＡＣＳ解析を使用して決定した。
【０１７８】
【表６】
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ＦＡＣＳの結果を、表７および８に提示する。
【０１７９】
【表７】
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【表８】
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点突然変異は、一般に、良好に忍容され、ペプチドの大部分は、がん幹細胞（ＣＤ４４hiＣＤ２４loＣＳＣ）を阻害する能力を保持した（表７）。興味深いことに、リシンアセチル化標的の、アラニンへの突然変異（Ｐ１2-17［Ｋ９Ａ］）が、がん幹細胞を阻害する能力を保持したことから、周囲の残基もまた、ペプチドの活性に寄与することが指し示される。
【０１８０】
加えて、ペプチド２８５３８０５（Ｐ１［Ｔ２Ｋ］）、２８５３８２５（Ｐ１［Ｒ８Ｌ］）、２８５３８３９（Ｐ１［Ｖ１５Ｋ］）、２８１５３０９（Ｐ１2-17［Ｋ９Ａ］）、２８１５３１２（Ｐ１2-17［Ｍ１２Ａ］）、および２８１５３１４（Ｐ１2-17［Ｄ１４Ａ］）は、ＣＳＣだけでなく、全ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の大部分も死滅させた（表７および８）。
【０１８１】
これらのペプチドの細胞傷害作用についてさらに調べるために、非ＣＳＣ上皮乳がん細胞である、ＭＣＦ７細胞に対するそれらの効果を決定した（表９）。ペプチド２８５３８２５（Ｐ１［Ｒ８Ｌ］）だけがＭＣＦ７細胞に対して細胞傷害性であったことから、このペプチドは、ＣＳＣおよび非ＣＳＣがん細胞の両方をターゲティングする可能性が高いことが示唆される。残りのペプチドは、非誘導ＭＣＦ７細胞では細胞傷害性でないが、誘導ＭＣＦ７細胞ではＣＳＣの形成を阻害した（表１０）。
【０１８２】
【表９】
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【表１０】
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【０１８３】
材料および方法
使用される、全ての材料および試薬は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｂｃａｍなど、市販品の供給元からたやすく入手可能である。
【０１８４】
細胞培養物
ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。細胞は、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１％のペニシリン−ストレプトマイシン−ネオマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養した。刺激ＭＣＦ７細胞は、１．３２ｎｇ／ｍｌのフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で、６０時間にわたり処理することにより作出した。４Ｔ１細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏの、４Ｔ１転移性がんマウスモデルから得、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１％のペニシリン−ストレプトマイシン−ネオマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。Ｔ−４７Ｄ細胞は、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１％のペニシリン−ストレプトマイシン−ネオマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ドセタキセル耐性細胞系は研究協力者から得た。アブラキサン耐性４Ｔ１細胞（４Ｔ１群Ｂ）は、３０ｍｇ／ｋｇのアブラキサンで処理することにより作出した。
【０１８５】
転移性乳がん患者または黒色腫患者の液体生検からの、ＣＴＣの単離
ＳｅｐＭａｔｅ（商標）−１５（ＩＶＤ）密度勾配チューブ（８５４２０、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）密度勾配媒質（型番：０７８６１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による密度勾配遠心分離を使用して、ＣＤ４５＋細胞および赤血球を除去するのに、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４５  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（１５１６２、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることにより、ＣＴＣを単離する、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）法を使用して、黒色腫生検または乳がん生検を、あらかじめ濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、ポリ−Ｌ−リシンで前処理されたカバースリップへと、サイトスピン処理し、次いで、固定し、染色のために、ＰＢＳ中で保管した。
【０１８６】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ならびに刺激ＭＣＦ７細胞および非刺激ＭＣＦ７細胞における、ＰＤ−Ｌ１、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、およびＨ３Ｋ９ｍｅ３についての免疫蛍光解析
１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に、２０分間にわたりインキュベートすることにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、または刺激ＭＣＦ７細胞あるいは非刺激ＭＣＦ７細胞を透過処理した。ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１を使用して、細胞をプローブし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８へとコンジュゲートされた、ロバ抗ウサギ二次抗体で可視化するか、またはウサギ抗ＰＤＬ１、およびマウス抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ、マウス抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、もしくはマウス抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を使用してプローブし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８へとコンジュゲートされた、ロバ抗ウサギ二次抗体、もしくはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８へとコンジュゲートされた、ロバ抗マウス二次抗体で標識した。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、顕微鏡用スライドガラスにマウントした。タンパク質標的は、共焦点レーザー走査顕微鏡法により位置特定した。単一の０．５μｍ切片は、１００倍の油浸レンズを作動させるＬＡＸソフトウェアを使用する、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ８顕微鏡を使用して得た。最終画像は、同じ切片についての４つの連続画像を平均することにより得た。デジタル画像は、全核蛍光強度（ＴＮＦＩ）または全細胞質蛍光強度（ＴＣＦＩ）を決定するのに、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して解析した。自動式閾値設定および細胞核に特異的な対象領域（ＲＯＩ）の手動式選択を伴う、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、抗体の各対について、ピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を計算した。ＰＣＣ値は、−１＝共局在化の逆、０＝共局在化なし、＋１＝完全な共局在化の範囲にわたる。最小の細胞個数ｎ＝２０を、各試料セットに使用した。マン−ホイットニーのノンパラメトリック検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、データセット間の有意差を決定した。
【０１８７】
アブラキサンまたはドセタキセルで処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１マウス異種移植片、およびその免疫蛍光解析
５週齢の雌ヌードマウスを得、実験の前に、動物施設において１週間にわたり慣らした。全ての実験手順は、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｅｔｈｉｃｓ  ＩＤ  Ａ２０１４／３０）により評価および承認された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、右乳腺へと、皮下注射した（１：１のＰＢＳおよびＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ中の細胞２×１０6個）。腫瘍は、外部キャリパーを使用して測定し、改変楕円体式：１／２（ａ／ｂ2）［式中、ａ＝最長径であり、ｂ＝最短径である］を使用して計算した。治療を開始する前に、腫瘍を、約５０ｍｍ3まで増殖させた（約１５日間）。アブラキサン（６０ｍｇ／ｋｇ）またはドセタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ｉ．ｐ．注射により投与した。腫瘍を切り出し、２．５％のＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中に回収した。次いで、手術用メスを使用して、腫瘍を、細かく切り刻み、ＤＭＥＭ、２．５％のＦＣＳ、および４型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ−Ｂｉｏｃｈｅｍ）（腫瘍１ｇ当たりのコラゲナーゼ１ｍｇ）中、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。消化された腫瘍をスピンし、ＤＭＥＭ、２．５％のＦＣＳ中に再懸濁させてから、０．２μｍのフィルターに通し、上記で記載した通りに、免疫蛍光顕微鏡法を使用して、ＰＤ−Ｌ１の核局在化を評価した。
【０１８８】
転移性乳がん患者または黒色腫患者の液体生検から単離されたＭＩＣにおける、ＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶについての免疫蛍光解析
ＭＩＣを、３．７％のホルムアルデヒドで固定し、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、次いで、ＣＳＶに対する一次マウス抗体またはＰＤ−Ｌ１に対する一次ヤギ抗体に続き、抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５６８または抗ヤギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６３３へとコンジュゲートされた、対応する二次抗体でプローブした。共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、上記で記載した通りに、ＴＮＦＩ、ＴＣＦＩ、およびＦｎ／ｃ（式：Ｆｎ／ｃ＝（Ｆｎ−Ｆｂ）／Ｆｃ−Ｆｂ）［式中、Ｆｎは、核蛍光であり、Ｆｃは、細胞質蛍光であり、Ｆｂは、バックグラウンド蛍光である］を使用して計算される核／細胞質蛍光比であり；１を超える値は、核へのバイアスを指し示す）を測定した。試料１例当たり、少なくとも５〜１０個の個別の細胞を解析した。
【０１８９】
野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミド、およびＰＤ−Ｌ１［Ｋ２６３Ｑ］突然変異体配列を含有するプラスミドの調製
ＰＤ−Ｌ１配列（野生型またはＰＤ−Ｌ１［Ｋ２６３Ｑ］突然変異体）を、ベクターである、ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ＢＳＤへとライゲーションし、エレクトロコンピテントのＤＨ１０Ｂ  ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；型番：１８２９００１５）を形質転換するのに使用した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＮＶ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；型番：１２１８３）を使用して精製／抽出されたプラスミドの大規模なストックを増大させるために、形質転換された細菌を使用した。ＮＥＯＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ電気穿孔トランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；型番：ＭＰＫ５０００）を用いて、ＭＣＦ７細胞に、野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミド、ＰＤ−Ｌ１［Ｋ２６３Ｑ］突然変異体を含有するプラスミド（Ｍｕｔ１）、またはベクターだけ（ＶＯ）をトランスフェクトした。
【０１９０】
野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミド、およびＰＤ−Ｌ１［Ｋ２６３Ｑ］突然変異体配列を含有するプラスミドをトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞における、ＰＤ−Ｌ１についての免疫蛍光解析
ＮＥＯＮ電気穿孔トランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＭＣＦ７細胞に、野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミド、ＰＤ−Ｌ１［Ｋ２６３Ｑ］突然変異体を含有するプラスミド（Ｍｕｔ１）、またはベクターだけ（ＶＯ）をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、媒体だけ（非刺激）、または１．３２ｎｇ／ｍＬのフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を伴う刺激により、６０時間にわたり処理した。細胞を、３．７％のホルムアルデヒドで固定し、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、２０分間にわたり透過処理し、ＣＳＶもしくはＣＤ１３３に対する一次マウス抗体、ＳＮＡＩ１に対する一次ヤギ抗体、またはＰＤ−Ｌ１もしくはＥＧＦＲに対する一次ウサギ抗体に続き、抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５６８、抗ヤギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６３３、または抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８へとコンジュゲートされた、対応する二次抗体でプローブした。共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、上記で記載した通りに、ＴＮＦＩ、ＴＣＦＩ、およびＦｎ／ｃを測定した。試料１例当たり、少なくとも５〜１０個の個別の細胞を解析した。
【０１９１】
ＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ
ＮＥＯＮ電気穿孔トランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＭＣＦ７細胞に、野生型ＰＤ−Ｌ１配列を含有するプラスミド、ＰＤ−Ｌ１［Ｋ２６３Ｑ］突然変異体を含有するプラスミド（Ｍｕｔ１）、またはベクターだけ（ＶＯ）をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を熱量測定ベースのＷＴＳ−１細胞増殖アッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のために使用して、トランスフェクションの、ＭＣＦ７細胞の増殖に対する効果について検討した。ＷＴＳ−１細胞増殖アッセイはまた、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３（実施例５に従い合成した）による処置の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖に対する効果を決定するのにも使用した。安定的なテトラゾリウム塩であるＷＳＴ−１は、主に細胞表面において生じる、複雑な細胞機構により、可溶性のホルマザンへと切断される。この生体内還元は、大部分、生存細胞内の、解糖によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成に依存する。したがって、形成されるホルマザン色素の量は、培養物中の代謝的に活性な細胞の数と直接相関する。９６ウェル組織培養プレート内で増殖させた細胞は、加湿式ＣＯ2インキュベーター内、３７℃で、７２時間にわたり、媒体だけ、または６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、もしくは４００μＭの、Ｐ１、Ｐ２、もしくはＰ３で処置した。次いで、細胞をＷＳＴ−１試薬と共に０．５〜４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、形成されたホルマザン色素を、走査型マルチウェル分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）で定量する。測定された吸光度は、生存細胞の数と直接相関する。
【０１９２】
リシン２６３においてトリメチル化されたＰＤ−Ｌ１、およびリシン２６３においてアセチル化されたＰＤ−Ｌ１、に特異的な抗体の作出
抗体は、ペプチド２８０３２０１、２８０３２０４、および２８０３２１３に対して作出した（表１１）。短いペプチドは、一般にそれら自体では免疫原性ではないので、免疫原性の担体タンパク質へとカップリングさせることが必要である。このカップリングを容易とするために、システインをペプチドのＣ末端に組み込み、ペプチドを、免疫原性担体タンパク質であるスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）へとコンジュゲートさせるように反応させる。抗トリメチル化ペプチド抗体または抗アセチル化ペプチド抗体を作出するのに、特殊な免疫化プロトコールは要求されなかった。各ペプチド配列について、２匹ずつのウサギを、数週間おきに免疫化した。初回の免疫化は、完全フロイントアジュバントを伴う、ペプチドコンジュゲートのエマルジョンによる免疫化であり、２回目の免疫化は、不完全フロイントアジュバントを使用する免疫化である。数週間後に、強力な抗ペプチド血清が得られた（Palfreyman, et al. (1984) J Immunol Meth, 75:383を参照されたい）。
【０１９３】
【表１１】
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【０１９４】
トリメチル化ペプチドおよびアセチル化ペプチドに対する抗血清についての試験は、非トリメチル化ペプチドおよびトリメチル化ペプチド、または非アセチル化ペプチドおよびアセチル化ペプチドでコーティングされたマイクロ滴定プレートにおいて、血清を滴定する、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して実施される。
【０１９５】
抗体の増強は、製造元の指示書に従い、免疫化のために使用されたペプチドの、非トリメチル化類似体、非アセチル化類似体を、利用可能なシステイン残基を使用してゲルであるＳｕｌｆｏ  Ｌｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番：２０４０１）へとカップリングさせることにより実施される。結果として得られるゲルを、抗血清のアリコートと共にインキュベートして、非トリメチル化ペプチド、非アセチル化ペプチドに特異的な抗体を吸着させる。結果として得られる抗血清は、トリメチル化ペプチド配列またはアセチル化ペプチド配列に対する特異性が増強されているであろう。
【０１９６】
トリメチル化ペプチドまたはアセチル化ペプチドだけに特異的なアフィニティー精製抗体を作製するためには、まず、増強手順を実施して、血清から非トリメチル化ペプチドおよび非アセチル化ペプチドに特異的な抗体を除去することが必要である。アフィニティー精製抗体の特異性は、再び、プレートにコーティングした非トリメチル化ペプチドおよびトリメチル化ペプチドの両方、または非アセチル化ペプチドおよびアセチル化ペプチドの両方へのＥＬＩＳＡにより調べる。作出された抗体は、残基２６３においてトリメチル化されたＰＤ−Ｌ１およびアセチル化されたＰＤ−Ｌ１に対して高特異性を示した。
【０１９７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、非透過処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、転移性乳がん患者から単離されたＣＴＣ、および黒色腫患者から単離されたＣＴＣにおける、リシン２６３においてアセチル化されたＰＤ−Ｌ１（アセチル化ＰＤ−Ｌ１）、およびリシン２６３においてトリメチル化されたＰＤ−Ｌ１（トリメチル化ＰＤ−Ｌ１）についての免疫蛍光解析
透過処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に、２０分間にわたりインキュベートすることにより作出した。処置後の複数の時点において測定された、充実性腫瘍のサイズの、ＲＥＣＩＳＴ  １．１ＣＴスキャンによる測定値に基づき、黒色腫患者試料を、レスポンダーコホート、一次耐性コホート、および二次耐性コホートへと分類した。レスポンダーとは、腫瘍が退縮しつつあることを意味し、一次耐性とは、腫瘍が退縮せず、サイズが増大しつつあることを意味するのに対し、二次耐性は、当初、レスポンダー応答を有した後、耐性および腫瘍の増殖が続く。黒色腫ＣＴＣおよび転移性乳がんＣＴＣは、ＣＤ４５枯渇式Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｐｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）細胞単離キットを使用して単離された、患者液体生検から得た。細胞を、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗アセチル化ＰＤ−Ｌ１、またはウサギ抗トリメチル化ＰＤ−Ｌ１（上記で記載した通りに作出された）でプローブし、ロバ抗ウサギＡＦ  ４８８で可視化した。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、顕微鏡用スライドガラスにマウントした。タンパク質標的は、共焦点レーザー走査顕微鏡法により位置特定した。単一の０．５μｍ切片は、１００倍の油浸レンズを作動させるＬＡＸソフトウェアを使用する、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ８顕微鏡を使用して得た。最終画像は、同じ切片についての４つの連続画像を平均することにより得た。デジタル画像は、上記で記載した通りＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して解析した。
【０１９８】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４で処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ１およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１についての免疫蛍光解析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞１×１０4個を、ＤＭＥＭ培地を伴う１２ウェルプレート内のカバースリップへと、一晩にわたり播種した。細胞は、５０μＭのＰ１、Ｐ２、Ｐ３、もしくはＰ４、または媒体（水）で、７２時間にわたり処置した。処置された細胞を、３．７％のホルムアルデヒドで固定し、次いで、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に、２０分間にわたりインキュベートすることにより透過処理した。次いで、細胞を、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはウサギ抗アセチル化ＰＤ−Ｌ１（上記で記載した通りに作出された）でプローブし、ロバ抗ウサギＡＦ  ４８８で可視化した。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、顕微鏡用スライドガラスにマウントした。タンパク質標的は、共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して位置特定した。単一の０．５μｍ切片は、１００倍の油浸レンズを作動させるＬＡＸソフトウェアを使用する、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ８顕微鏡を使用して得た。最終画像は、同じ切片についての４つの連続画像を平均することにより得た。デジタル画像は、上記で記載した通り、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して解析した。
【０１９９】
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３による処置に応答した、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、がん幹細胞表現型（ＣＤ４４  ｈｉｇｈ／ＣＤ２４  ｌｏｗ）についてのＦＡＣＳ解析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞５×１０4個を、１ｍＬの完全ＤＭＥＭと共に、１２ウェルプレートに、一晩にわたり播種した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、または４００μＭのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３（実施例５に従い合成した）、または媒体だけで、７２時間にわたり処置した。試料は、トリプシン処理に続く、２％のＨＩ−ＦＢＳを含有するＤＰＢＳを伴う洗浄により採取した。抗ヒトＣＤ４４−ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ２４−ＰＥ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、および抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体によるカクテルを使用して、ＦＡＣＳ染色を実施した。データは、ＢＤ−ＦＡＣＳＬＳＲ−ＩＩフローサイトメーターから収集した。Ｔｒｅｅｓｔａｒ  ＦｌｏｗＪｏを、データ解析のために使用した。
【０２００】
Ｐ１類似体による処置に応答した、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＭＣＦ７細胞における、がん幹細胞表現型および細胞生存率についてのＦＡＣＳ解析
Ｐ１類似体は、実施例５の手順に従い合成した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞４×１０4個、または誘導ＭＣＦ７細胞もしくは非誘導ＭＣＦ７細胞１×１０4個を、１ｍＬの完全培地と共に、１２ウェルプレートに、一晩にわたり播種した。誘導ＭＣＦ７細胞は、細胞をＰＭＡ／ＴＧＦ−βで刺激し、１２時間にわたりインキュベートすることにより調製した。細胞は、５０μＭの被験ペプチド（水中に溶解させた）で４８時間にわたり処置した。次いで、細胞を１ｍＬのＰＢＳで、２回にわたり洗浄し、トリプシン処理により採取した。非接着細胞は洗浄ステップ時に除去した。接着細胞を回収し、その後、抗ヒトＣＤ４４抗体、抗ヒトＣＤ２４抗体、およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２抗体で３０分間にわたり氷上で染色した。ＣＤ４４hiＣＤ２４loイベントを、全生細胞カウントで除することにより、ＣＤ４４hiＣＤ２４loＣＳＣ（Ｈｏｅｃｈｓｔ陰性集団）の百分率を測定するように、ＦＡＣＳを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＬＳＲＩＩにおいて実施した（Fillmore and Kuperwasser (2007) Breast Cancer Res, 9: 303において記載されている通り）。生存細胞の百分率は、既に記載されている（Siemann and Keng (1986), Cancer Res, 46: 3556-3559）通り、全生細胞イベントを、全単一細胞で除することにより計算した。
【０２０１】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４による処置に応答したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＣＳＶ、ＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＳＮＡＩ１、ＥＨＴＭ２、ＤＭＮＴＩ、ＳＥＴＤＢ１、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、５−メチルシトシン、およびＡＢＣＢ５についての免疫蛍光解析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞１×１０4個を、ＤＭＥＭ培地を伴う１２ウェルプレート内のカバースリップへと播種した。細胞は、５０μＭのＰ１、Ｐ２、Ｐ３、もしくはＰ４（実施例５に従い合成した）、または媒体（水）で７２時間にわたり処置した。細胞を３．７％のホルムアルデヒドで固定し、２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過処理し；ＣＳＶ、ＤＭＮＴ１、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、もしくは５−メチルシトシンに対する一次マウス抗体；ＳＮＡＩ１、ＳＥＴＤＢ１、もしくはＡＢＣＢ５に対する一次ヤギ抗体；またはＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＥＨＭＴ２に対する一次ウサギ抗体に続き、抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５６８、抗ヤギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６３３、または抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８へとコンジュゲートされた、対応する二次抗体でプローブした。共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、上記で記載した通りに、ＴＦＩ、ＴＮＦＩ、およびＴＣＦＩを測定した。試料１例当たり、少なくとも２０個の個別の細胞を解析した。
【０２０２】
転移性黒色腫患者に由来するＣＴＣ、および転移性乳がん細胞における、ｐ３００およびアセチル化ＰＤ−Ｌ１についての免疫蛍光解析
ＣＴＣは、上記で記載した通り転移性黒色腫生検から単離した。液体生検から単離された黒色腫ＣＴＣは、免疫療法に対する応答に基づき、３つのコホート：レスポンダー（免疫療法に応答する）、耐性（免疫療法に対する応答がなく、がんは、不応性であるか、または初期の応答に続く、不応性疾患であり、がんは、もはや応答しない）へと分けた。黒色腫ＣＴＣを、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に、２０分間にわたりインキュベートすることにより透過処理し、ウサギ抗アセチル化ＰＤ−Ｌ１（上記で記載した通りに調製された）またはマウス抗ｐ３００でプローブし、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８または抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５６８で可視化した。マッチさせたナイーブ（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ−４７Ｄ、および４Ｔ１群Ａ）、ドセタキセル耐性（ＭＣＦ７  ＴＸＴ５０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＸＴ５０、およびＴ−４７Ｄ  ＴＸＴ５０）、およびアブラキサン耐性（４Ｔ１群Ｂ）転移性乳がん細胞を、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に、２０分間にわたりインキュベートすることにより透過処理し、ウサギ抗アセチル化ＰＤ−Ｌ１（上記で記載した通りに調製された）またはマウス抗ｐ３００でプローブし、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８または抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５６８で可視化した。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、顕微鏡用スライドガラスにマウントした。タンパク質標的は、上記で記載した通り、共焦点レーザー走査顕微鏡法により位置特定した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、上記で記載した通りに、ＰＣＣ（ｒ）、ＴＮＦＩ、ＴＣＦＩ、またはＴＦＩを決定した。
【０２０３】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４による処置に応答した、ｐ３００の局在化についての免疫蛍光解析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、５０μＭのＰ１、Ｐ２、Ｐ３、もしくはＰ４、または媒体で処置した。細胞を３．７％のホルムアルデヒドで固定し、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で、２０分間にわたり透過処理し、ウサギ抗アセチル化ＰＤ−Ｌ１（上記で記載した通りに調製された）、マウス抗ｐ３００でプローブし、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８または抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５６８で可視化した。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡用スライドガラスにマウントした。タンパク質標的は、上記で記載した通り、共焦点レーザー走査顕微鏡法により位置特定した。ＴＮＦＩおよびＰＣＣ（ｒ）は、既に記載した通り、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計算した。
【０２０４】
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞またはＯＴ１由来Ｔ細胞における、ＰＤ−１についての免疫蛍光解析
ナイーブＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ＰＭＡ／Ｉにより刺激されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ナイーブＯＴ１由来Ｔ細胞、またはウイルス処理されたインフルエンザ特異的ＯＴ１エフェクター細胞を、３．７％のホルムアルデヒドで固定し、２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過処理し、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６４７へと直接コンジュゲートされた、ＰＤ−１に対する一次マウス抗体でプローブした。共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、ＴＮＦＩを測定した。試料１例当たり、少なくとも２０個の個別の細胞を解析した。
【０２０５】
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３による処置に応答した、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞における、ＰＤ−１についての免疫蛍光解析
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞１×１０4個を、ＤＭＥＭ培地を伴う１２ウェルプレート内のカバースリップへと播種した。細胞は、５０μＭのＰ１、Ｐ２、Ｐ３（実施例５に従い合成した）、または媒体（水）で、７２時間にわたり処置した。細胞を、３．７％のホルムアルデヒドで固定し、２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過処理し、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６４７へと直接コンジュゲートされた、ＰＤ−１に対する一次マウス抗体でプローブした。共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、上記で記載した通り、ＴＮＦＩ、ＴＣＦＩ、およびＦｎ／ｃを測定した。試料１例当たり、少なくとも２０個の個別の細胞を解析した。
【０２０６】
Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３による処置に応答した、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１およびＣＳＶについての免疫蛍光解析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞１×１０4個は、５０μＭのＰ１、Ｐ２、Ｐ３（実施例５に従い合成した）、または媒体（水）で、７２時間にわたり処置した。細胞を３．７％のホルムアルデヒドで固定し、２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過処理し、ＰＤ−Ｌ２に対する一次ウサギ抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する一次ヤギ抗体、およびＣＳＶに対する一次マウス抗体に続き、抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５６８、抗ヤギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６３３、または抗ウサギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８へとコンジュゲートされた、対応する二次抗体でプローブした。共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、上記で記載した通り、ＴＮＦＩおよびＴＣＦＩを測定した。試料１例当たりの個別の細胞、少なくとも２０個を解析した。
【０２０７】
本明細書で引用された、あらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
本明細書における、いかなる参考文献の引用も、このような参考文献が、本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの容認として見なされるべきではない。
【０２０８】
本明細書を通して、目的は、本発明を、いかなる１つの実施形態または特徴の特定の集合へも限定せずに、本発明の好ましい実施形態について記載することであった。したがって、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、例示される特定の実施形態において、多様な改変および変化が施されうることを理解するであろう。全てのこのような改変および変化は、付属の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本発明を規定する特許請求の範囲は、以下の通りである。
【図１Ａ】
2021510538.tif 000023
【図１Ｂ】
2021510538.tif 000024
【図１Ｃ】
2021510538.tif 000025
【図１Ｄ】
2021510538.tif 000026
【図２Ａ】
2021510538.tif 000027
【図２Ｂ】
2021510538.tif 000028
【図３Ａ】
2021510538.tif 000029
【図３Ｂ】
2021510538.tif 000030
【図３Ｃ−１】
2021510538.tif 000031
【図３Ｃ−２】
2021510538.tif 000032
【図４】
2021510538.tif 000033
【図５Ａ】
2021510538.tif 000034
【図５Ｂ】
2021510538.tif 000035
【図５Ｃ】
2021510538.tif 000036
【図５Ｄ】
2021510538.tif 000037
【図５Ｅ】
2021510538.tif 000038
【図６Ａ】
2021510538.tif 000039
【図６Ｂ】
2021510538.tif 000040
【図６Ｃ】
2021510538.tif 000041
【図６Ｄ】
2021510538.tif 000042
【図６Ｅ】
2021510538.tif 000043
【図６Ｆ】
2021510538.tif 000044
【図６Ｇ】
2021510538.tif 000045
【図６Ｈ】
2021510538.tif 000046
【図７】
2021510538.tif 000047
【図８Ａ】
2021510538.tif 000048
【図８Ｂ】
2021510538.tif 000049
【図８Ｃ】
2021510538.tif 000050
【図９Ａ】
2021510538.tif 000051
【図９Ｂ】
2021510538.tif 000052
【図１０Ａ】
2021510538.tif 000053
【図１０Ｂ】
2021510538.tif 000054
【図１１Ａ】
2021510538.tif 000055
【図１１Ｂ】
2021510538.tif 000056
【図１１Ｃ】
2021510538.tif 000057
【図１１Ｄ】
2021510538.tif 000058
【図１１Ｅ】
2021510538.tif 000059
【図１１Ｆ】
2021510538.tif 000060
【図１２】
2021510538.tif 000061
【図１３Ａ】
2021510538.tif 000062
【図１３Ｂ】
2021510538.tif 000063
【図１３Ｃ】
2021510538.tif 000064
【図１３Ｄ】
2021510538.tif 000065
【図１４Ａ】
2021510538.tif 000066
【図１４Ｂ】
2021510538.tif 000067
【図１４Ｃ】
2021510538.tif 000068
【図１４Ｄ】
2021510538.tif 000069
【図１５−１】
2021510538.tif 000070
【図１５−２】
2021510538.tif 000071
【図１６Ａ】
2021510538.tif 000072
【図１６Ｂ】
2021510538.tif 000073
【図１７−１】
2021510538.tif 000074
【図１７−２】
2021510538.tif 000075
【図１８−１】
2021510538.tif 000076
【図１８−２】
2021510538.tif 000077
【図１９−１】
2021510538.tif 000078
【図１９−２】
2021510538.tif 000079
【図２０Ａ】
2021510538.tif 000080
【図２０Ｂ】
2021510538.tif 000081
【図２１Ａ】
2021510538.tif 000082
【図２１Ｂ】
2021510538.tif 000083
【図２１Ｃ】
2021510538.tif 000084
【図２１Ｄ】
2021510538.tif 000085
【図２２Ａ】
2021510538.tif 000086
【図２２Ｂ】
2021510538.tif 000087
【図２２Ｃ】
2021510538.tif 000088
【図２２Ｄ】
2021510538.tif 000089
【配列表】
2021510538000001.app
【国際調査報告】
2021510538.tif 000090
2021510538.tif 000091
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