(57)【要約】  新規ＰＤ−Ｌ１抗体、その抗原結合フラグメント、及びその製薬学的使用。ＰＤ−Ｌ１抗体のＣＤＲを含むヒト化抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体及びその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、並びに薬物としてのＰＤ−Ｌ１抗体の使用。ＰＤ−Ｌ１と関連する疾患又は障害を治療するための薬物の調製におけるヒト化ＰＤ−Ｌ１抗体の使用。
2021510078.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントはヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（Ｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１０、１２及び１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、そして前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、配列番号１２のＨＣＤＲ２において、Ｘ１はＦ又はＭであり、Ｘ２はＲ又はＶであり、そしてＸ３はＮ又はＨである、又は
（ｉｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１１、１２及び１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、そして前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、配列番号１２のＨＣＤＲ２において、Ｘ１はＦ又はＭであり、Ｘ２はＲ又はＶであり、Ｘ３はＮ又はＨである、又は
（ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２０、２１及び２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、そして前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、２４及び２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、それぞれ、同時に配列番号３０、３８、２２、２３、４０及び２５ではなく、
前記配列番号２０及び２１において、Ｘ４はＳ又はＤであり、Ｘ５はＹ又はＫであり、Ｘ６はＨ又はＭであり、Ｘ７はＴ、Ｓ、Ｈ又はＧであり、Ｘ８はＳ、Ｎ又はＧであり、Ｘ９はＳ、Ｌ又はＧであり、Ｘ１０はＦ、Ｌ、Ｗ又はＭであり、Ｘ１１はＡ、Ｐ又はＴであり、Ｘ１２はＭ、Ｖ、Ｌ又はＳであり、Ｘ１３はＦ又はＹであり、配列番号２４のＬＣＤＲ２において、Ｘ１４はＶ又はＡであり、Ｘ１５はＹ又はＮであり、Ｘ１６はＡ、Ｌ又はＶであり、Ｘ１７はＥ、Ｆ、Ｙ、又はＡである、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントはヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２８又は２９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、又は、
前記重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２８又は２９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、又は、
前記重鎖可変領域が、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号３２〜３７のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号３９、４０、４１、６７及び６９のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、並びに配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、又は、
前記重鎖可変領域が、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号３２〜３７のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号３９、４０、４１、６７及び６９のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、並びに配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号１０、配列番号２８及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号１１、配列番号２８及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号１１、配列番号２９及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号３９及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３０、配列番号３３及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３０、配列番号３４及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号６７及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号６９及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号４１及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３０、配列番号３５及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３０、配列番号３６及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、又は、
前記重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号３０、配列番号３７及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、請求項２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、
配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、又は、
配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、を含む、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５，５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５，５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、を含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体が完全長抗体であり、ヒト抗体定常領域を更に含み、好ましくは、前記ヒト抗体定常領域の重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４ならびにその通常のバリアントの定常領域から選択され、前記ヒト抗体定常領域の軽鎖定常領域が、ヒト抗体ならびにその通常のバリアントのκ及びλ鎖定常領域から選択され、更に好ましくは、前記完全長抗体が、配列番号５８、６０又は６５のヒト抗体重鎖定常領域と配列番号５９のヒト軽鎖定常領域とを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二量化ドメインＶ（ダイアボディ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲ含有ペプチドからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
治療上有効な量の請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、一つ以上の製薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１１】
原核細胞及び真核細胞、好ましくは真核細胞、更に好ましくは哺乳動物細胞から選択される、請求項１０に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを製造するための方法であって、請求項１１に記載の宿主細胞を培地中で培養して請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを産生し蓄積させ、そして前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを培養物から収集することを含む、方法。
【請求項１３】
ヒトＰＤ−Ｌ１の免疫検出又は決定のための方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを使用することを含む、方法。
【請求項１４】
ヒトＰＤ−Ｌ１に関連する疾患用の診断用薬の調製における請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１５】
ヒトＰＤ−Ｌ１に関連する疾患を治療するための方法であって、ヒトＰＤ−Ｌ１に関連する疾患を治療するために、対象に対して製薬学的に有効な量の請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント又は請求項８に記載の医薬組成物又は請求項９に記載の核酸分子を投与することを含み、前記疾患が、好ましくは腫瘍又はがんであり、更に好ましくはＰＤ−Ｌ１陽性扁平上皮がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部非扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｌｉａ）−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多型性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞性腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん、咽喉がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞がん、精巣がん及び皮膚がんである、方法。
【請求項１６】
前記疾患が、好ましくは腫瘍又はがんであり、更に好ましくはＰＤ−Ｌ１陽性扁平上皮がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部非扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多型性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞性腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん、咽喉がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞がん、精巣がん及び皮膚がんである、ヒトＰＤ−Ｌ１に関連する疾患用治療薬の調製における、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくは抗原結合フラグメント、又は、請求項８に記載の医薬組成物、或いは、請求項９に記載の核酸分子の使用。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの、若しくは、請求項８に記載の医薬組成物又は請求項９に記載の核酸分子を含む薬剤。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの、又は請求項８に記載の医薬組成物或いは請求項９に記載の核酸分子を含む薬剤であって、前記薬剤は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍若しくはがんを治療するために使用され、好ましくは、前記がんが、扁平上皮がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部非扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多型性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞性腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん、咽喉がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞がん、精巣がん及び皮膚がんから選択される、薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その内容が全体として本明細書中で援用される、２０１８年１月１０日に出願された前記２０１８１００２３２６７．０の優先権を請求する。
【０００２】
（技術分野）
本開示はＰＤ−Ｌ１抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。更に、本開示はまた、前記ＰＤ−Ｌ１抗体のＣＤＲを含むキメラ抗体及びヒト化抗体にも関し、本開示はまた、前記ＰＤ−Ｌ１抗体及びその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、並びに、ＰＤ−Ｌ１に関連する疾患の診断薬及び治療薬としてのその使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中の記述は、単に、本発明に関する背景情報を提供するものであり、先行技術を構成するとは限らない。
【０００４】
腫瘍免疫療法は、Ｔ細胞腫瘍免疫療法がコアである腫瘍治療の分野における長期ホットスポットである。腫瘍免疫療法は、腫瘍患者のキラーＴ細胞を充分に利用し、動員して、腫瘍を殺滅することである。腫瘍免疫療法は、腫瘍を治療するための前記最も有効かつ最も安全な方法であり得る。一方、腫瘍回避は、腫瘍免疫療法にとって大きな障害である。腫瘍細胞は、免疫系に対してそれら自身の抑制効果を及ぼすことによって腫瘍の急成長を促進する。
【０００５】
腫瘍免疫回避メカニズムと腫瘍に対する生体免疫反応との間の関係は非常に複雑である。腫瘍免疫療法の初期段階では、腫瘍特異的キラーＴ細胞は生物学的に活性であったが、腫瘍成長の後期段階においてそれらの殺滅機能を失った。したがって、腫瘍免疫療法は、腫瘍に対するに患者自身の免疫系応答を最大化することである。腫瘍免疫療法のカギは、本来の生体免疫系応答を活性化させるだけでなく、前記免疫系応答の持続期間及び強度を維持することである。
【０００６】
人体においては、Ｔ細胞の活性化のシグナリング経路系が二つある。抗原提示細胞によってＴ細胞に対してＭＨＣ−抗原ペプチドを提示することにより第一シグナルを提供することに加えて、Ｔ細胞が正常な免疫応答を起こすために第二シグナルを提供するために、一連の同時刺激分子も必要である。この二重シグナリング経路系は身体の免疫系のバランスにおいて極めて重要な役割を果たし、身体を厳密に制御して、自己抗原及び外来性抗原に対する異なる免疫応答を引き起こす。同時刺激分子によって提供される第二シグナルが存在しないと、無応答となるか、又は、Ｔ細胞の特異的免疫応答が維持され、したがって、寛容性がもたらされる。したがって、第二シグナリング経路は、免疫応答の全過程において重要な制御機能を果たす。
【０００７】
１９９２年に、プログラム死１（ＰＤ−ｌ）分子は、細胞のアポトーシスに関与する、Ｔ細胞の表面上で発現されるタンパク質受容体であることが見いだされた。ＰＤ−１はＣＤ２８ファミリーに属し、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）と２３％のアミノ酸相同性を有するが、その発現は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄性細胞において主に発現され、ＣＴＬＡの発現とは異なる。ＰＤ−１に二つのリガンド、それぞれＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２がある。ＰＤ−Ｌ１は、主に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）で発現され、その発現は活性化された細胞上でアップレギュレーションされ得る。ＰＤ−Ｌ２の発現は、主に、活性化されたマクロファージ及び樹状細胞などの抗原提示細胞上に比較的限定される。
【０００８】
ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１及びＢ７−１と結合することによって免疫系を阻害する。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍組織微小環境における多くの腫瘍細胞及び免疫細胞で発現される。新しい研究によって、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の高い発現が、乳がん、肺がん、胃がん、腸がん、腎臓がん、黒色腫、非小細胞肺がん、結腸がん、膀胱がん、卵巣がん、膵臓がん及び肝臓がんなどのヒト腫瘍組織において検出されたこと、そしてＰＤ−Ｌ１の発現レベルが患者の臨床及び予後と密接に関連することが判明している。
【０００９】
ＰＤ−Ｌ１は第二シグナリング経路におけるＴ細胞の増殖の阻害に関与するので、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の結合をブロックすることは、腫瘍免疫療法の非常に有望な新規標的となっている。
【００１０】
現在のところ、多くの多国籍製薬会社がＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体を開発している。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の結合をブロックすることによって、腫瘍に対する患者自身の免疫系応答を最大化することができ、かくして、腫瘍細胞を殺滅する目的を達成することができる。以下は、関連特許である。ＷＯ０１３９７２２（特許文献１）、ＷＯ２０１３１７３２２３（特許文献２）、ＷＯ２０１４１９５８５２（特許文献３）、ＷＯ２０１３１８１６３４（特許文献４）、ＷＯ２０１５０４８５２０（特許文献５）、ＷＯ２０１５０３６５１１（特許文献６）、ＵＳ２０１４３３５０９３（特許文献７）、ＷＯ２０１４１０００７９（特許文献８）、ＷＯ２０１４０５５８９７（特許文献９）、ＵＳ６８０３１９２Ｂ１（特許文献１０）、ＷＯ２０１４０２２７５８（特許文献１１）、ＵＳ８６１７５４６Ｂ２（特許文献１２）及びＷＯ２０１００８９４１１Ａ２（特許文献１３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０１３９７２２号
【特許文献２】国際公開第２０１３１７３２２３号
【特許文献３】国際公開第２０１４１９５８５２号
【特許文献４】国際公開第２０１３１８１６３４号
【特許文献５】国際公開第２０１５０４８５２０号
【特許文献６】国際公開第２０１５０３６５１１号
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１４３３５０９３号
【特許文献８】国際公開第２０１４１０００７９号
【特許文献９】国際公開第２０１４０５５８９７号
【特許文献１０】米国特許第６８０３１９２号
【特許文献１１】国際公開第２０１４０２２７５８号
【特許文献１２】米国特許第８６１７５４６号
【特許文献１３】国際公開第２０１００８９４１１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
（発明の概要）
本開示は、ＰＤ−Ｌ１の前記細胞外領域の前記アミノ酸配列又は三次元構造と結合するモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント（ヒトＰＤ−Ｌ１結合分子とも称する）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
いくつかの別の実施形態において、本開示は、ヒトＰＤ−Ｌ１と結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
（ｉ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１０、１２及び１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、配列番号１２のＨＣＤＲ２において、Ｘ１はＦ若しくはＭであり、Ｘ２はＲ若しくはＶであり、Ｘ３はＮ若しくはＨである、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は、
（ｉｉ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１１、１２及び１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、配列番号１２のＨＣＤＲ２において、Ｘ１はＦ若しくはＭであり、Ｘ２はＲ若しくはＶであり、Ｘ３はＮ若しくはＨである、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は
（ｉｉｉ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号２０、２１及び２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、そして前記軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号２３、２４及び２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、それぞれ、同時に配列番号３０、３８、２２、２３、４０及び２５ではなく、
配列番号２０及び２１において、Ｘ４はＳ若しくはＤであり、Ｘ５はＹ若しくはＫであり、Ｘ６はＨ若しくはＭであり、Ｘ７はＴ、Ｓ、Ｈ若しくはＧであり、Ｘ８はＳ、Ｎ若しくはＧであり、Ｘ９はＳ、Ｌ若しくはＧであり、Ｘ１０はＦ、Ｌ、Ｗ若しくはＭであり、Ｘ１１はＡ、Ｐ若しくはＴであり、Ｘ１２はＭ、Ｖ、Ｌ若しくはＳであり、Ｘ１３はＦ若しくはＹであり、配列番号２４のＬＣＤＲ２において、Ｘ１４はＶ若しくはＡであり、Ｘ１５はＹ若しくはＮであり、Ｘ１６はＡ、Ｌ若しくはＶであり、Ｘ１７はＥ、Ｆ、Ｙ、若しくはＡである、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、を含む、ヒトＰＤ−Ｌ１と結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなヒトＰＤ−Ｌ１と結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２８又は２９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなヒトＰＤ−Ｌ１と結合するモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２８又は２９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなヒトＰＤ−Ｌ１と結合するモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号３２〜３７のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号３９、４０、４１、６７及び６９のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、並びに配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなヒトＰＤ−Ｌ１と結合するモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び３７のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、並びに配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号３９、４０、４１、６７及び６９のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、並びに配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１０、配列番号２８及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４〜１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１１、配列番号２８及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４〜１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１１、配列番号２９及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４〜１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号３９及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３３及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３４及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号６７及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号６９及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号４１及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３５及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３６及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、あるいは、
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３７及び配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２３、配列番号４０及び配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する、上記の定義のようなモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントの親和性ＫＤ値は、１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍ未満である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、カニクイザル若しくはアカゲザルＰＤ−Ｌ１及び／又はマウスＰＤ−Ｌ１と交差結合する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５及び５７のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５７、７０及び７２のいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、上記の定義のようなモノクローナル抗体は、完全長抗体であり、更にヒト抗体定常領域を含み、好ましくは、前記ヒト抗体定常領域の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４ならびにその従来型のバリアントの定常領域から選択され、前記ヒト抗体定常領域の軽鎖定常領域は、ヒト抗体ならびにその従来型のバリアントのκ及びλ鎖定常領域から選択され、好ましくは、配列番号５８、６０又は６５のアミノ酸配列を有するヒト抗体重鎖定常領域、並びに、配列番号５９のアミノ酸配列を有するヒト軽鎖定常領域を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、上記の定義のような前記モノクローナル抗体は、完全長抗体であり、更にヒト抗体定常領域を含み、ここで、配列番号５８のヒト抗体重鎖定常領域、及び配列番号５９のヒト軽鎖定常領域を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態において、上記の定義のような前記モノクローナル抗体は、完全長抗体であり、更にヒト抗体定常領域を含み、配列番号６０のヒト抗体重鎖定常領域、及び配列番号５９のヒト軽鎖定常領域を含む、ヒト抗体定常領域を更に含む、完全長抗体である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、上記の定義のような前記モノクローナル抗体は、完全長抗体であり、更にヒト抗体定常領域を含み、配列番号６５のヒト抗体重鎖定常領域、及び配列番号５９のヒト軽鎖定常領域を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二量化ドメインＶ（ダイアボディ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲ含有ペプチドからなる群から選択される。
【００５３】
別の態様では、本開示は、治療上有効な量の、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント、及び一つ以上の製薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供し、好ましくは、前記治療上有効な量のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、０．１〜３０００ｍｇ／ｋｇの単位用量の上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００５４】
いくつかの態様において、本開示は、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。
【００５５】
いくつかの態様において、本開示は、上記の定義のような核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００５６】
いくつかの態様において、本開示は、上記の定義のような組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞、好ましくは真核細胞、更に好ましくは哺乳動物細胞から選択される。
【００５７】
いくつかの態様において、本開示は、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを産生する方法を提供し、前記方法は、上記の定義のような前記宿主細胞を、培地中で培養して、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを産生し蓄積させ、培養物からモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを収集することを含む。
【００５８】
いくつかの態様において、本開示は、ヒトＰＤ−Ｌ１の免疫検出又は決定のための方法を提供し、前記方法は、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを使用することを含む。
【００５９】
いくつかの態様において、本開示は、ヒトＰＤ−Ｌ１関連疾患用の診断用薬の調製における、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【００６０】
いくつかの態様において、本開示は、ヒトＰＤ−Ｌ１に関連する疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、ヒトＰＤ−Ｌ１に関連する疾患を治療するために、対象に対して、製薬学的に有効な量の上記の定義のような、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は、上記定義のような医薬組成物、又は、上記定義のような核酸分子を投与することを含み、前記疾患は好ましくは腫瘍又はがんであり、更に好ましくは扁平上皮がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部非扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｌｉａ）１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成候群（ＭＤＳ）、消化（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ急芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多型性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞性腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん、咽喉がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞がん、精巣がん及び皮膚がん、最も好ましくは、ＰＤ−Ｌ１−陽性細胞がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部非扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多型性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞性腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん、咽喉がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞がん、精巣がん及び皮膚がん��ある。
【００６１】
いくつかの態様において、本開示は、上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント、又は、上記の定義のような医薬組成物、又は、上記の定義のような核酸分子の、ヒトＰＤ−Ｌ１に関連する疾患の治療薬の調製における使用を提供し、前記疾患は、好ましくは腫瘍又はがんであり、更に好ましくは、扁平上皮がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部非扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多型性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞性腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん、咽喉がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞がん、精巣がん及び皮膚がん、最も好ましくはＰＤ−Ｌ１−陽性細胞がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部非扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多型性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞性腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん、咽喉がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞がん、精巣がん及び皮膚がんである。
【００６２】
上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの薬剤、又は、上記の定義のような医薬組成物、若しくは、上記の定義のような核酸分子を含む薬剤である。
【００６３】
上記の定義のようなモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの薬剤、又は、上記の定義のような医薬組成物、若しくは、上記の定義のような核酸分子を含む薬剤であり、前記薬剤は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍又はがんを治療するために用いられ、好ましくは、前記がんは、扁平上皮がん、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部非扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多型性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞性腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頚部がん、咽喉がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞がん、精巣がん及び皮膚がんから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＢＭＣ−Ｔリンパ球活性化アッセイにおいて細胞のＩＦＮγ分泌を促進する。
【図２Ａ】異なるＰＤ−Ｌ１抗体のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態のＡＤＣＣ効果の比較であって、図２Ａは、ＨＲＰ０００４９のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態の比較である。
【図２Ｂ】異なるＰＤ−Ｌ１抗体のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態のＡＤＣＣ効果の比較であって、図２Ｂは、Ｈ５Ｌ１１のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態の比較である。
【図２Ｃ】異なるＰＤ−Ｌ１抗体のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態のＡＤＣＣ効果の比較であって、図２Ｃは、ＨＲＰ０００５２のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態の比較である。
【図２Ｄ】異なるＰＤ−Ｌ１抗体のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態のＡＤＣＣ効果の比較であって、図２Ｄは、Ｈ６Ｌ１１のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態の比較である。
【図２Ｅ】異なるＰＤ−Ｌ１抗体のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態のＡＤＣＣ効果の比較であって、図２Ｅは、Ｈ１８Ｌ６１のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態の比較である。
【図２Ｆ】異なるＰＤ−Ｌ１抗体のＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態のＡＤＣＣ効果の比較であって、図２Ｆは、Ｈ１２Ｌ６４の前記ＩｇＧ１及びＩｇＧ４形態の比較である。
【図３】マウスＡ３７５異種移植片モデルの腫瘍体積に対するＰＤ−Ｌ１抗体の効果。
【図４】マウス結腸がんモデルの腫瘍体積に対するＰＤ−Ｌ１抗体の効果。
【図５】マウス異種移植片モデルの腫瘍体積に対するＰＤ−Ｌ１抗体の効果。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
Ｉ．専門用語
本開示をよりよく理解するために、ある科学技術用語を以下で具体的に定義する。本明細書中で特に別段の定めのない限り、本明細書中で使用するすべての他の科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味を有する。
【００６６】
本開示で使用するアミノ酸の三文字コード及び一文字コードはＪ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載されている。
【００６７】
本開示で記載する「抗体」は、鎖間ジスルフィド結合を介して二本の同一の重鎖及び二本の同一の軽鎖を結合することによって形成されるテトラペプチド鎖構造であるイムノグロブリンを指す。前記イムノグロブリン重鎖の定常領域のアミノ酸組成及び配列順は異なり、したがってそれらの抗原性も異なる。このため、イムノグロブリンは五つのカテゴリー、すなわちイムノグロブリンのアイソタイプと呼ばれるもの、つまりＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに分類することができ、対応する重鎖は、それぞれμ、δ、γ、α及びε鎖である。同じクラスのＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成ならびに重鎖ジスルフィド結合の数及び位置における相違に従って異なるサブクラスに分けることができる。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分けることができる。軽鎖は、定常領域の前記差によってκ鎖又はλ鎖に分けることができる。前記五種類のＩｇの各々はκ鎖又はλ鎖を有し得る。
【００６８】
本開示において、本開示で記載する抗体軽鎖は、ヒト若しくはマウスκ、λ鎖、又はそれらのバリアントを含む軽鎖定常領域を更に含んでもよい。
【００６９】
本開示において、本開示で記載する前記抗体重鎖は、ヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はそれらのバリアントを含む重鎖定常領域を更に含んでもよい。
【００７０】
抗体の重鎖及び軽鎖のＮ末端付近の約１１０個のアミノ酸の配列は大きく異なり、したがって、可変領域（Ｆｖ領域）と呼ばれ、Ｃ末端付近の残りのアミノ酸配列は比較的安定であり、したがって定常領域と呼ばれる。前記可変領域は、三つの超可変領域（ＨＶＲ）及び四つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。前記三つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られる抗体の特異性を決定する。軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の各々は、三つのＣＤＲ領域及び四つのＦＲ領域から構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ連続して配置されている、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。軽鎖の三つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と称され、重鎖の三つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と称される。本開示で記載する抗体又はその抗原結合フラグメントのＬＣＶＲ及びＨＣＶＲのＣＤＲアミノ酸残基の数及び位置は、公知Ｋａｂａｔナンバリング則（ＬＣＤＲ１−３、ＨＣＤＲ１−３）に準拠する。
【００７１】
本開示の抗体としては、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体が挙げられ、好ましくはヒト化抗体である。
【００７２】
「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、前記集団を構成する個々の抗体は、可能性のあるバリアント抗体（例えば、自然発生突然変異又はモノクローナル抗体調製物の製造の間に形成される変異を含み、これらのバリアント体は、通常、少量で存在する）を除いて、同じである、及び／又は同じエピトープと結合する。通常異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、モノクローナル抗体調製物（製剤）の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を標的とする。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一の抗体の集団から得られる抗体の特性を意味し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本開示のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒトイムノグロブリン遺伝子座の全部もしくは一部を含むトランスジェニック動物を使用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技術によって調製することができ、そのような種類の方法並びにモノクローナル抗体を調製するための他の例示的な方法が本明細書中で記載されている。
【００７３】
本開示において、「マウス抗体」という用語は、当該技術分野における知識及び技能に従って調製された抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体である。試験対象に、調製の間、ＰＤ−Ｌ１抗原を注射し、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。本開示の好ましい実施形態において、抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖若しくはそれらのバリアントを含む軽鎖定常領域を更に含み得るか、又はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはそれらのバリアントの重鎖定常領域を更に含み得る。
【００７４】
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって得られる抗体であり、これは、マウス抗体によって誘発される免疫応答を低減することができる。キメラ抗体を構築するためには、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立させ、次に、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、次に、必要に応じて、ヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングする。マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と連結させて、キメラ遺伝子を形成し、続いて発現ベクターに挿入する。最後に、キメラ抗体分子を真核細胞系又は原核細胞系において発現させる。本開示の好ましい実施形態において、前記ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ、λ鎖を含む軽鎖定常領域又はそのバリアントを更に含む。前記ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖定常領域若しくはそれらのバリアント、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４重鎖定常領域、又はアミノ酸変異（例えば、ＹＴＥ変異若しくは逆突然変異）を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４のバリアントを更に含む。
【００７５】
ＣＤＲグラフト抗体とも呼ばれる「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体可変領域のフレームワークにマウスＣＤＲ配列をグラフトすることによって産生される抗体、すなわち、異なる種類のヒト生殖系列抗体フレームワーク配列から産生される抗体を指す。それは、多量のマウスタンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘発される異種応答（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を回避することができる。そのようなフレームワーク配列は生殖系列抗体遺伝子配列又は公開された文献を含む公開ＤＮＡデータベースから入手することができる。例えば、ヒト重及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、前記「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（ウェブサイト：ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）、及びＫａｂａｔ，ＥＡ，ｅｔｃ．，１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎから入手することができる。免疫原性の低下によって引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域の前記フレームワーク配列を最小限の復帰突然変異又は逆突然変異に供して活性を保持することができる。本開示のヒト化抗体はまた、ファージディスプレイによるＣＤＲの親和性成熟を有するヒト化抗体も含む。本開示の好ましい実施形態において、前記ヒト抗体可変領域フレームワークを設計し選択し、ここで、抗体重鎖可変領域上の重鎖ＦＲ配列は、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ３−２３＊０４及びｈＪＨ４．１の組み合わせ配列並びにヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ１−１２＊０１及びｈＪＫ４．１の前記組み合わせ配列から誘導される。免疫原性の低下により引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域を最小限の復帰突然変異（逆突然変異、すなわち、前記ヒト抗体からのＦＲにおけるアミノ酸残基を、本来の抗体の対応する位置でアミノ酸残基に変異させる）に供して活性を保持することができる。
【００７６】
ＣＤＲのグラフティングの結果、抗原と接触しているフレームワーク残基のために、産生されたＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性が減少する可能性がある。そのような相互作用は高度に変異した体細胞の結果であり得る。したがって、そのようなドナーフレームワークアミノ酸をヒト化抗体の前記フレームワークに対してグラフトする必要性が依然としてあり得る。非ヒトＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントからの抗原結合に関与するアミノ酸残基は、マウスモノクローナル抗体の前記可変領域の配列及び構造を調べることによって特定することができる。生殖系列とは異なるＣＤＲドナーフレームワーク中の残基は関連すると考えることができる。最も近接している生殖系列を決定することができなければ、配列を、サブクラスのコンセンサス配列又は高い類似性パーセンテージを有するマウス配列のコンセンサス配列と比較することができる。希少なフレームワーク残基は、体細胞の高頻度変異の結果であり得、したがって結合において重要な役割を果たすと考えられる。
【００７７】
抗体の「抗原結合フラグメント」又は「機能的フラグメント」という用語は、抗原（例えば、ＰＤ−Ｌ１）と特異的に結合する能力を保持する抗体の一つ以上のフラグメントを指す。完全長抗体のフラグメントを使用して、抗体の抗原結合機能を果たすことができることが示された。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語で示される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域中のジスルフィドブリッジ（複数可）によって結合される二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＨドメイン及びＶＬドメインから構成されるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから構成される単一ドメイン若しくはｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又は（ｖｉｉ）任意選択的に、合成リンカーによって結合された二つ以上の独立したＣＤＲの組み合わせが挙げられる。加えて、Ｆｖフラグメントの二つのドメインＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコード化されるが、これらの遺伝子は組換え法を使用して合成リンカーを介して組み合わせることができ、かくしてＶＬ及びＶＨ領域を対合させることによって形成される一価分子である単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称する、例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）を産生することができる。そのようなｓｃＦｖｓはまた、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることも意図される。そのような抗体フラグメントは、当業者に公知の従来型技術を使用して得られ、インタクトな抗体と同じ方法でそれらの機能性によりスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡテクノロジー又はインタクトなイムノグロブリンの酵素若しくは化学的切断によって産生することができる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であり得る。
【００７８】
本開示の抗原結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二量化ドメインＶ（ダイアボディ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ＣＤＲ含有ペプチドなどが含まれる。
【００７９】
Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体分子をプロテアーゼ、例えばパパイン（Ｈ鎖の位置２２４でアミノ酸残基を切断する）で処理することによって得られる約５０，０００の分子量を有する抗体フラグメントであって、フラグメントの抗原結合活性を有し、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分及び全Ｌ鎖がジスルフィド結合によって結合されている。
【００８０】
本開示のＦａｂは、ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外領域のアミノ酸配列又はその三次元構造を特異的に認識し結合する本開示のモノクローナル抗体をパパインで処理することによって産生することができる。加えて、前記Ｆａｂは、抗体の前記ＦａｂをコードするＤＮＡを原核発現ベクター又は真核発現ベクター中に挿入し、前記ベクターを原核生物又は真核生物に形質変換して前記Ｆａｂを発現することによって産生することができる。
【００８１】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧヒンジ領域中の二つのジスルフィド結合の下部を酵素ペプシンで切断することによる約１００，０００の分子量を有する抗体フラグメントであって、抗原結合活性とヒンジ位置で結合した二つのＦａｂ領域とを有する。
【００８２】
本開示のＦ（ａｂ’）２は、ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外領域のアミノ酸配列又はその三次元構造を特異的に認識し結合する本開示のモノクローナル抗体をペプシンで処理することによって産生することができる。加えて、Ｆ（ａｂ’）２は、後述するＦａｂ’をチオエーテル結合（複数可）又はジスルフィド結合（複数可）で結合させることによって産生することができる。
【００８３】
Ｆａｂ’は、前述のＦ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる約５０，０００の分子量を有する抗体フラグメントであって、抗原結合活性を有する。本開示のＦａｂ’は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外領域のアミノ酸配列又はその三次元構造を特異的に認識し結合する本開示のＦ（ａｂ’）２をジチオトレイトールなどの還元剤で処理することによって産生することができる。
【００８４】
加えて、Ｆａｂは、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを原核発現ベクター又は真核発現ベクター中に挿入し、前記ベクターを原核生物又は真核生物に形質変換して前記Ｆａｂ’を発現することによって産生することができる。
【００８５】
「単鎖可変フラグメント」、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによってコンジュゲートされた抗体重鎖可変ドメイン（又は領域；ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（又は領域；ＶＬ）を含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有し得る。先行技術の好適なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体から構成され、例えば１〜４の反復変異体を使用する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８）。本開示に使用できる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：７２５−７３１、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４−１０６、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６、及びＲｏｏｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．により記載されている。
【００８６】
本開示のｓｃＦｖは、以下のステップを使用して産生することができる。ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外領域のアミノ酸配列又はその三次元構造を特異的に認識し結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを得、そしてｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、前記ＤＮＡを原核又は真核発現ベクターに挿入し、次いで前記発現ベクターを原核生物又は真核生物に形質転換して、前記ｓｃＦｖを発現させる。
【００８７】
ダイアボディは、ｓｃＦｖが二量化され、二価抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。二つの抗原は、二価抗原結合活性において同じであっても、異なっていてもよい。
【００８８】
本開示のダイアボディは以下のステップを用いて産生することができる。ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外領域のアミノ酸配列又はその三次元構造を特異的に認識し結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを得、そしてペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、前記ＤＮＡを原核又は真核発現ベクターに挿入し、次いで前記発現ベクターを原核生物又は真核生物に形質転換して、前記ダイアボディを発現させる。
【００８９】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬの各々における一つのアミノ酸残基がシステイン残基で置換されているポリペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結することによって得られる。システイン残基で置換されたアミノ酸残基は、公知方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））に従い、抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる。
【００９０】
本開示のｄｓＦｖは、以下のステップを用いて産生することができる。ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外領域のアミノ酸配列又はその三次元構造を特異的に認識し結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを得、そしてｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、ＤＮＡを原核又は真核発現ベクターに挿入し、次いで前記発現ベクターを原核生物又は真核生物に形質変換して、前記ｄｓＦｖを発現させる。
【００９１】
ＣＤＲ含有ペプチドはＶＨ又はＶＬから誘導される一つ以上のＣＤＲを含む。ペプチドを含む複数のＣＤＲを、直接又は好適なペプチドリンカーを介してコンジュゲートさせることができる。
【００９２】
本開示のＣＤＲ含有ペプチドは以下のステップを用いて産生することができる。ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外領域のアミノ酸配列又はその三次元構造を特異的に認識し結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬから誘導されるＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、前記ＤＮＡを原核又は真核発現ベクターに挿入し、次いで前記発現ベクターを原核生物又は真核生物に形質転換して、ペプチドを発現させる。前記ＣＤＲ含有ペプチドは、Ｆｍｏｃ法又はｔＢｏｃ法などの化学的合成法によって産生することもできる。
【００９３】
「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合に主に寄与する抗体の可変ドメイン中の六つの超可変領域のうちの一つを指す。六つのＣＤＲの最も通常用いられる定義の一つは、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２）によって提供されている。本明細書中で用いられる場合、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３又はＬ１、Ｌ２、Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３又はＨ２、Ｈ３）に適用される。
【００９４】
「抗体フレームワーク」という用語は、本明細書中で使用する場合、可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のスカフォールドとしての役割を果たす、可変ドメインＶＬ又はＶＨの一部を指す。本質的に、それはＣＤＲのない可変ドメインである。
【００９５】
ヒト抗体重鎖定常領域及びヒト抗体軽鎖定常領域の「通常のバリアント」は、先行技術で開示されている、抗体の可変領域の構造及び機能を変更しないヒト由来の重鎖定常領域又は軽鎖定常領域のバリアントを指す。典型的なバリアントは、重鎖定常領域の部位特異的修飾及びアミノ酸置換、先行技術で公知のものなどの特異的置換、ＹＴＥ変異、Ｌ２３４Ａ及び／若しくはＬ２３５Ａ変異、又はＳ２２８Ｐ変異、又は（前記抗体重鎖がノブ−Ｆｃ及びホール−Ｆｃの組み合わせを有するような）ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構造、又は上記した変異体の組み合わせを得るための変異を受けるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域変異体を含む。これらの変異は、抗体が新しい特性を有するようにするが、抗体の可変領域の機能を変更しないことが確認されている。
【００９６】
「エピトープ」又は「抗原決定因子」という用語は、イムノグロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部分（例えば、ＰＤ−Ｌ１分子上のある部分）を指す。エピトープは、典型的には、独自の空間コンフォメーションで少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の連続若しくは非連続アミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照。
【００９７】
「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄ、ｂｉｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」及び「特異的に結合する（ｂｉｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」という用語は、所定の抗原上のエピトープに対する抗体の結合を指す。概して、抗体は、約１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ以下の親和性（ＫＤ）で抗原と結合する。
【００９８】
「ＫＤ」又は「Ｋｄ」という用語は、特異的抗体・抗原相互作用の平衡解離定数を指す。概して、本開示の抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）テクノロジーを使用するＢＩＡＣＯＲＥ機器で測定して、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＰＤ−Ｌ１と結合する。
【００９９】
同じエピトープ（例えば、中和抗原結合タンパク質又は中和抗体）について競合する抗原結合タンパク質の場合で「競合」という用語を使用する場合、抗原結合タンパク質間の競合を意味し、これは、以下のアッセイによって決定される。アッセイでは、試験する抗原結合タンパク質（例えば、抗体若しくはその免疫学的に機能的なフラグメント）は、参考抗原結合タンパク質（例えば、リガンド若しくは参考抗体）の共通抗原（例えば、ＰＤ−Ｌ１抗原又はそのフラグメント）に対する結合を防止若しくは阻害（例えば低減）する。固相直接若しくは間接的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接若しくは間接的酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３を参照）、固相直接的ビオチン・アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｉ−１２５を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照）、固相直接的ビオチン・アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：５４６−５５２）、及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）などの多様な競合的結合アッセイを、抗原結合タンパク質が互いに競合するかどうかを判定するために使用できる。概して、アッセイは、非標識検出抗原結合タンパク質又は標識参考抗原結合タンパク質のいずれかを有する固体表面又は細胞と結合した精製抗原の使用を必要とする。競合的阻害は、試験する抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合する標識の数を測定することによって測定される。通常、試験される抗原結合タンパク質は過剰にある。競合的アッセイ（競合的抗原結合タンパク質）によって同定される抗原結合タンパク質には、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープと結合する抗原結合タンパク質、及び参照抗原結合タンパク質の結合エピトープに対して充分近接した隣接エピトープと結合し、その一方で、二つのエピトープが互いの結合を空間的に妨害する抗原結合タンパク質が含まれる。競合的結合を決定するために用いられる方法に関するさらなる詳細を本明細書中の実施形態に提示する。通常、過剰の競合する抗原結合タンパク質が存在する場合、共通抗原に対する参照抗原結合タンパク質の特異的結合の少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％又は７５％以上を阻害（例えば、低減）する。場合によっては、結合は、少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％又は９７％以上阻害される。
【０１００】
「核酸分子」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方を指す。核酸分子は一本鎖又は二本鎖、好ましくは二本鎖ＤＮＡであってよい。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合に「効果的に連結」されている。例えば、プロモータ又はエンハンサがコーディング配列の転写に影響を及ぼすならば、前記プロモータ又はエンハンサはコーディング配列と効果的に連結される。
【０１０１】
「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一実施形態では、前記ベクターは「プラスミド」であり、これは、他のＤＮＡセグメントと連結させることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態では、前記ベクターは、他のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターである。本明細書中で開示されるベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製が可能であるか（例えば、細菌複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）、又は宿主細胞にトランスフェクトされた後に宿主細胞のゲノムに統合され、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製することができる（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）。
【０１０２】
抗体及び抗原結合フラグメントを産生し精製するための方法は先行技術において、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５−８  ａｎｄ  １５，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒで周知である。例えば、マウスはヒトＰＤ−Ｌ１又はそのフラグメントで免疫化することができ、結果として得られる抗体を変性させ精製することができ、アミノ酸は通常の方法を用いて配列決定することができる。抗原結合フラグメントも、通常の方法によって調製することができる。抗体又はその抗原結合フラグメントを、本発明で規定されるように、遺伝子操作して、一つ以上のヒトＦＲ領域を非ヒトＣＤＲ領域に付加する。ヒトＦＲ生殖系列配列は、ＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖系列遺伝子データベース及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ、又はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１からのＭＯＥソフトウェアを整列させることによって得ることができる。
【０１０３】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物又は動物細胞が含まれ得る。形質転換されやすい細菌としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｓｃｅａｅのメンバー、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａの菌株；Ｂａｃｉｌｉｌｌａｃｅａｅ、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。好適な微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。好適な動物宿主細胞株としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）及びＮＳ０細胞が挙げられる。
【０１０４】
本開示の操作された抗体又はその抗原結合フラグメントは、通常の方法を用いて調製し精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をＧＳ発現ベクターにクローニングし組換えることができる。組換えイムノグロブリン発現ベクターはＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクトすることができる。更に推奨される先行技術として、哺乳動物発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存されるＮ末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こし得る。安定なクローンは、ヒトＰＤ−Ｌ１と特異的に結合する抗体を発現させることによって得られる。陽性クローンは、バイオリアクター中無血清培地において増殖させて抗体を産生した。抗体が分泌される培養培地を、従来型技術により、例えば、Ａ又はＧセファロースＦＦカラムにより、調節した緩衝液を用いて精製することができる。非特異的に結合した成分を洗浄することによって除去する。次に、結合した抗体を、ｐＨ勾配法によって溶出させ、抗体フラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、プールした。抗体は、通常の方法を用いてろ過により濃縮することができる。可溶性混合物及びポリマーはまた、モレキュラシーブ又はイオン交換などの通常の方法によって除去することができる。結果としての産物は、−７０℃などで直ちに凍結、又は凍結乾燥する必要がある。
【０１０５】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器又は体液に適用される場合、「投与する」及び「処理する」は、外因性薬物、治療薬、診断用薬又は組成物の動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器又は体液に対する接触を指す。「投与する」及び「処置する」は、例えば、処置、薬物動態、診断、研究及び実験法を指す可能性がある。細胞の処置は、試薬の細胞との接触、及び試薬の流体との接触を含み、流体は細胞と接触している。「投与する」及び「処置する」はまた、例えば、細胞をインビトロ及びエクスビボで薬剤、診断、結合組成物、又は別の細胞によって処置することを意味する。ヒト、動物又は研究対象に適用される場合、「処置する」とは、治療的処置、予防又は予防的方策、研究及び診断適用を指す。
【０１０６】
「療法」は、本開示の結合化合物のいずれかを含む組成物などの内用又は外用治療薬の、治療薬が治療効果を有することが知られている一つ若しくは様々な疾患症状を有する患者への投与を意味する。概して、治療薬は、処置を受けている患者又は集団における一つ以上の疾患症状を効果的に軽減してそのような症状の低下を誘導するか又はそのような症状の発展を臨床的に測定可能な程度まで阻害する量で投与される。任意の特定の疾患の症状の軽減に有効な治療薬の量（「治療有効量」とも称する）は、患者の疾患状態、年齢、及び体重、並びに薬物が患者において望ましいように有効である能力などの様々な因子に応じて変化し得る。疾患の症状が軽減されたか否かは、医者又は他の医療関係者が症状の重篤度又は進行を評価するために通常使用する任意の臨床試験法によって評価することができる。本開示の実施形態（例えば、処置方法又は物品）は標的疾患の各症状の軽減に有効でない場合もあるが、それらはスチューデントｔ試験、Χ二乗試験、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙのＵ試験、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験（Ｈ試験）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ試験及びＷｉｌｃｏｘｏｎ試験などの当該技術分野で公知の任意の統計的試験法で確認された統計的に有意な数の患者において標的疾患の症状を軽減するはずである。
【０１０７】
「保存的修飾」又は「保存的置換若しくは交換」とは、タンパク質のアミノ酸を、類似した特徴（例えば電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖コンフォメーション及び剛性など）を有する他のアミノ酸と置換して、多くの場合、タンパク質の生物学的活性を変えることなく変化をもたらせることを指す。当該技術分野の当業者には、概して、ポリペプチドの非必須領域における一アミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変更しないことが分かっている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｐ２２４（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。加えて、構造的又は機能的に類似しているアミノ酸の置換は、生物学的活性を妨害する可能性が低い。
【０１０８】
「有効量」は、医学的疾患の症状又は状態を改善又は予防するために充分な量を含む。有効量はまた、診断を可能にするか又は容易にするために充分な量も意味する。特定の患者又は動物対象にとっての有効量は、処置される状態、患者の健康全般、投与経路及び用量、並びに副作用の重篤度など因子に応じてさまざまであり得る。有効量は、著しい副作用又は毒性効果を回避する最大投与量又は投薬レジメンであり得る。
【０１０９】
「外因性」は、必要に応じて生命体、細胞又は人体の外側で産生される物質を指す。「内因性」は、必要に応じて細胞、生命体又は人体中で産生される物質を指す。
【０１１０】
「相同性」は、二つのポリヌクレオチド配列間又は二つのポリペプチド間の配列類似性を指す。同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットが二つの比較配列中の位置を占めている場合、例えば、アデニンが二つのＤＮＡ分子の各位置を占めているならば、分子はその位置で一致している。二つの配列間の相同性の存在は、一致数又は二つの配列によって共有される相同位置を比較位置の数で除したもの×１００の関数である。例えば、配列が最適に比較される場合、二つの配列における１０の位置のうち六つが一致するか又は相同性であるならば、二つの配列は６０％相同性であり、二つの配列における１００の位置のうち９５が一致するか又は相同性であるならば、二つの配列は９５％相同性である。概して、二つの配列を最大相同性パーセンテージについて比較して比較がなされる。
【０１１１】
本明細書中で使用する場合、「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養」という用語は交換可能に使用され、そのような名称はすべてそれらの子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、初代試験細胞及び継代数に関係なくそれから誘導される培養物を含む。意図的若しくは非意図的変異のために、すべての子孫はちょうど同じＤＮＡ含有量を有し得ないことも理解すべきである。形質転換細胞においてもともとスクリーニングされるものと同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。異なる名称が意図される場合、意味は文脈から明らかに理解される。
【０１１２】
本明細書中で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、特定量の核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号で記載されているようにして増幅される手順又は技術を指す。概して、増幅されるテンプレートの対応するストランドと同一又は類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように標的領域の末端又は外側から配列情報を得る必要がある。二つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される材料の末端と一致していてもよい。ＰＣＲを使用して、全ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡから誘導される特定のＲＮＡ配列、特定のＤＮＡ配列、全細胞性ＲＮＡから転写されるファージ又はプラスミド配列を増幅することができる。概して、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｏｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅｒｌｉｃｈ，（１９８９）ＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照。本明細書中で使用するＰＣＲは、核酸の特定部分を増幅又は産生するための、プライマーとしての公知核酸及び核酸ポリメラーゼの使用を含む、核酸の試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法であるが、例にすぎないと考えられる。
【０１１３】
「任意選択的な」又は「任意選択的に」とは、後述する事象又は環境が起こり得るが、必ずしも起こる必要はなく、記載は、事象又は環境が起こる場合又は起こらない場合を包含することを意味する。例えば、「任意選択的に１〜３の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在し得るが、存在する必要はないことを意味する。
【０１１４】
「医薬組成物」とは、本明細書中に記載する一つ以上の化合物又はその生理学的／製薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと他の化学成分、例えば生理学的／製薬学的に許容される担体及び賦形剤を含有する混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生命体への投与を促進し、かくして活性成分の吸収を容易にし、生物学的活性を発揮させることである。
【０１１５】
加えて、本開示は、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞と関連する疾患を処置するための薬剤であって、本開示のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを活性成分として含む、薬剤を包含する。
【０１１６】
ＰＤ−Ｌ１と関連する疾患がＰＤ−Ｌ１に関連する疾患である限り、この疾患に関する制限はなく、例えば、本開示で開示する分子によって誘導される治療反応は、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合、したがって、ＰＤ−Ｌ１のそのリガンドＰＤ−１及びＢ７−１に対する結合のブロック、又はＰＤ−Ｌ１を過剰発現する腫瘍細胞の殺滅を含む。したがって、本開示の分子は、治療用途に適した調製物及び配合物中の場合、腫瘍又はがん、好ましくは黒色腫、結腸がん、乳がん、肺がん、胃がん、腸がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、膀胱がんなどに罹患している者に非常に有用である。
【０１１７】
更に、本開示は、ＰＤ−Ｌ１の免疫検出又は決定のための方法、ＰＤ−Ｌ１の免疫検出又は決定のための試薬、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の免疫検出又は決定のための方法、及びＰＤ−Ｌ１陽性細胞と関連する疾患を診断するための診断用薬であって、ヒトＰＤ−Ｌ１を特異的に認識し、細胞外領域又は三次元構造のアミノ酸配列と結合するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを活性成分として含む診断用薬に関する。
【０１１８】
本開示において、ＰＤ−Ｌ１の量を検出又は決定するための方法は、任意の公知方法であってよい。例えば、免疫学的検出又は測定法が含まれる。
【０１１９】
免疫検出又は決定法は、標識された抗原又は抗体を使用して抗体又は抗原の量を検出又は決定する方法である。免疫検出又は決定法の例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、物理化学的方法などを使用するラジオイムノアッセイが挙げられる。
【０１２０】
ＰＤ−Ｌ１−陽性細胞と関連する疾患は、本開示のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを用いて、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を検出又は測定することによって、診断することができる。
【０１２１】
ポリペプチドを発現する細胞を検出するために、公知免疫検出法、好ましくは免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織化学法などを使用することができる。加えて、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用する蛍光抗体染色法も使用することができる。
【０１２２】
本開示において、ＰＤ−Ｌ１の検出又は測定用生体サンプルに関しては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、便、組織液又は培養液など、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を含む可能性を有する限り、特に制限はない。
【０１２３】
本開示のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを含む診断用薬は、抗原抗体反応を実施するための試薬又は必要とされる診断法に従って反応を試験するための試薬を更に含んでもよい。抗原抗体反応を実施するための試薬には、緩衝液、塩などが含まれる。検出用試薬には、免疫検出又は決定法で通常用いられる試薬、例えばモノクローナル抗体、抗体フラグメント又はそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体及び標識に対応する基質などが含まれる。
【０１２４】
改変により、本開示では、より高い親和性、より強力な殺腫瘍活性、及びより低い免疫原性を有するＰＤ−Ｌ１抗体が得られる。
【実施例】
【０１２５】
ＩＩ．実施形態及び試験例
本開示を、実施形態を参照して以下で更に説明するが、これらの実施形態は本開示の範囲を制限することを意図するものではない。本開示の実施形態における特定の条件を明記しない実験法は、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、又は原料若しくは商品の製造業者によって提案される条件などの通常の条件におおむね従う。試薬は特に明記しない限り市販されている通常の試薬である。
【０１２６】
実施形態１．ＰＤ−Ｌ１抗体の親和性成熟酵母ライブラリの構築及びライブラリの検証
より良好な抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体を得るために、そこから新しいヒトＰＤ−Ｌ１抗体をスクリーニングするｓｃＦｖ抗体の親和性成熟酵母ライブラリを、ＨＲＰ０００５２及びＨＲＰ０００４９抗体に基づいて設計し調製した。ＨＲＰ０００５２及びＨＲＰ０００４９のＣＤＲ、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列は、すべて国際公開第２０１７０８４４９５Ａ１号に由来する。具体的配列は以下の通りである。
【０１２７】
ＨＲＰ０００４９：９−２（Ｈ２／Ｌ１０）ＩｇＧ４（ＡＡ）（Ｓ２２８Ｐ）
【０１２８】
2021510078.tif 000003
【０１２９】
2021510078.tif 000004
【０１３０】
2021510078.tif 000005
【０１３１】
2021510078.tif 000006
【０１３２】
HRP00052: 24D5(GF)IgG4(AA) (S228P)
【０１３３】
2021510078.tif 000007
【０１３４】
2021510078.tif 000008
【０１３５】
2021510078.tif 000009
【０１３６】
2021510078.tif 000010
【０１３７】
上記抗体配列中の下線部分は、抗体の可変領域部分を意味し、他の標準化形態は抗体の定常領域部分を表す。
【０１３８】
酵母ライブラリの構築：縮重プライマーを設計し、設計された変異体アミノ酸をＰＣＲによってＨＲＰ０００４９及びＨＲＰ０００５２抗体のライブラリに導入した。次に、１０９のキャパシティーを有する７つの抗体酵母ライブラリを前記ＨＲＰ０００４９及びＨＲＰ０００５２配列に基づいて構築する、第二世代シーケンシングの方法によって、前記ライブラリのＱＣを検証した。
【０１３９】
実施形態２：抗原の調製
ヒトＰＤ−Ｌ１−ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を設計し合成し、そしてタンパク質Ａ親和性カラムで精製して、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の抗原に対する前記結合を検出するための高純度の組換えＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質を得た。
【０１４０】
2021510078.tif 000011
【０１４１】
実施形態３  抗体のスクリーニング
ＨＲＰ０００５２ライブラリはビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗原を使用し、二ラウンドのＭＡＣＳスクリーニング（ストレプトマイシン磁気ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び二ラウンドのＦＡＣＳスクリーニング（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＦＵＳＩＯＮ）を行った。次いで約４００の酵母モノクローナル培養物を選択し、発現するように誘導させた。ＦＡＣＳ（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ）を使用して、酵母モノクローナルのヒトＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗原に対する結合を検出し、野生型ＨＲＰ０００５２抗体よりも高い親和性を有する酵母モノクローナルを配列検証のために選択した。配列決定したクローンを比較し分析し、そして冗長配列を除去した後、非冗長配列を哺乳動物細胞発現のために完全長ＩｇＧ（γ１、κ）に変換した。親和性精製後の完全長抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｘ−１００（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する親和性決定に供した。
【０１４２】
ＨＲＰ０００４９ライブラリはビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗原及びビオチン化マウスＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃを使用し、三ラウンドのＭＡＣＳスクリーニング及び三ラウンドのＦＡＣＳスクリーニングを行った。次いで、約４００の酵母モノクローナル培養物を選択し、発現するように誘導した。ＦＡＣＳを使用して、酵母モノクローナルのヒトＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗原及びマウスＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗原に対する結合を検出し、ヒトＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗原及びマウスＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗原を組み合わせる酵母モノクローナルを配列検証のために選択した。冗長配列を除去した後、非冗長配列を哺乳動物細胞発現のために完全長ＩｇＧ（γ１、κ）に変換した。親和性精製後の完全長抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｘ−１００（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する親和性決定に供した。
【０１４３】
スクリーニング後、抗体ＣＤＲ領域の配列を選択した。
【０１４４】
ＨＲＰ０００４９変異体ライブラリからの抗体
ＨＲＰ０００４９変異体ライブラリの配列に基づいて選択されたクローンはＨＲＰ０００４９とはＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２において異なる。関連ＣＤＲ配列又は一般式及びそれらの対応する重鎖可変領域を以下に記載する。
【０１４５】
HCDR1はDGSAYWS（配列番号１０）又はNDYWT（配列番号１１）である
HCDR2   X1ISX2AGSTYX3TPSLKG             配列番号１２
HCDR3   SGGWLAPFDY                     配列番号１３
LCDR1   KSSQSLFYHSNQKHSLA              配列番号１４
LCDR2   GASTRES                        配列番号１５
LCDR3   QQYYGYPYT                      配列番号１６
【０１４６】
関連重鎖可変領域配列の一般式は以下のように得られる。
【０１４７】
2021510078.tif 000012
又は
2021510078.tif 000013
【０１４８】
上記した配列番号１２のＨＣＤＲ２及び配列番号１７又は１８の重鎖可変領域においてＸ１はＦ又はＭから選択され、Ｘ２はＲ又はＶから選択され、Ｘ３はＮ又はＨから選択される。
【０１４９】
関連軽鎖可変領域配列は以下のように得られる（配列番号１９）。
【０１５０】
2021510078.tif 000014
【０１５１】
ＨＲＰ０００５２変異体ライブラリからの抗体
ＨＲＰ０００５２変異体ライブラリの配列に基づいて選択されるクローンは、ＨＲＰ０００５２とはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ２において異なる。関連ＣＤＲ配列又は一般式及びそれらの対応する重鎖可変領域を以下に記載する。
【０１５２】
HCDR1   X4X5WMX6                                配列番号２０
HCDR2   RIX7PX8X9GX10X11X12YNEKX13KN      配列番号２１
HCDR3   GGSSYDYFDY                     配列番号２２
LCDR1   RASESVSIHGTHLMH                配列番号２３
LCDR2   X14ASX15X16X17S                  配列番号２４
LCDR3   QQSFEDPLT                      配列番号２５
【０１５３】
関連重鎖可変領域配列の前記一般式は以下のように得られる（配列番号２６）。
【０１５４】
2021510078.tif 000015
【０１５５】
上記した配列番号２０及び２１のＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２並びに配列番号２６の重鎖可変領域において、Ｘ４はＳ及びＤから選択され、Ｘ５はＹ及びＫから選択され、Ｘ６はＨ及びＭから選択され、Ｘ７はＴ、Ｓ、Ｈ及びＧから選択され、Ｘ８はＳ、Ｎ及びＧから選択され、Ｘ９はＳ、Ｌ及びＧから選択され、Ｘ１０はＦ、Ｌ、Ｗ及びＭから選択され、Ｘ１１はＡ、Ｐ及びＴから選択され、Ｘ１２はＭ、Ｖ、Ｌ及びＳから選択され、Ｘ１３はＦ及びＹから選択される。
【０１５６】
関連軽鎖可変領域配列の一般式は以下のように得られる（配列番号２７）。
【０１５７】
2021510078.tif 000016
【０１５８】
上記した配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２７の軽鎖可変領域において、Ｘ１４はＶ及びＡから選択され、Ｘ１５はＹ及びＮから選択され、Ｘ１６はＡ、Ｌ及びＶから選択され、Ｘ１７はＥ、Ｆ、Ｙ及びＡから選択される（Ｘ１７がＥ、Ｆ及びＡから選択され、Ｘ１７がＹから選択されることを含む）。得られた具体的な関連配列は、表１及び表２に記載するものを含むが、これらに限定されない。
【０１５９】
【表１】
2021510078.tif 000017
【０１６０】
【表２】
2021510078.tif 000018
【０１６１】
ＨＲＰ０００４９抗体変異ライブラリから誘導される抗体軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の具体的配列
【０１６２】
2021510078.tif 000019
【０１６３】
2021510078.tif 000020
【０１６４】
2021510078.tif 000021
【０１６５】
2021510078.tif 000022
【０１６６】
ＨＲＰ０００５２抗体変異ライブラリから誘導される抗体軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の具体的配列
【０１６７】
2021510078.tif 000023
【０１６８】
2021510078.tif 000024
【０１６９】
2021510078.tif 000025
【０１７０】
2021510078.tif 000026
【０１７１】
2021510078.tif 000027
【０１７２】
2021510078.tif 000028
【０１７３】
2021510078.tif 000029
【０１７４】
2021510078.tif 000030
【０１７５】
2021510078.tif 000031
【０１７６】
２４Ｄ５  Ｈ２１重鎖可変領域（配列番号６６）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDKWMMWVRQAPGQGLEWMGRITPSSGFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS
【０１７７】
2021510078.tif 000032
【０１７８】
2021510078.tif 000033
【０１７９】
2021510078.tif 000034
【０１８０】
２４Ｄ５  Ｌ６７軽鎖可変領域（配列番号７０）
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
【０１８１】
２４Ｄ５  Ｌ６８軽鎖可変領域（配列番号７１）
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVWSGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
【０１８２】
２４Ｄ５  Ｌ６９軽鎖可変領域（配列番号７２）
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVYSGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK
【０１８３】
上記した抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域について、ヒト重鎖ＩｇＧ１／軽鎖κの定常領域を選択し、各重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と組み合わせて、完全抗体重鎖及び完全抗体軽鎖を形成する。定常領域及び軽鎖定常領域の配列は以下のとおりである。
【０１８４】
ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号５８）
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０１８５】
κ軽鎖定常領域（配列番号５９）
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０１８６】
【表３】
2021510078.tif 000035
【０１８７】
【表４−１】
2021510078.tif 000036
【０１８８】
【表４−２】
2021510078.tif 000037
【０１８９】
本開示の具体的な実施形態において、表５−１及び表５−２に記載するようなＨＲＰ０００４９及びＨＲＰ０００５２変異体抗体ライブラリから誘導される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のすべては、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域に連結されて完全抗体を形成する場合、上記したヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号５８）及びκ軽鎖定常領域（配列番号５９）と結合することによって形成される完全抗体である。例えば、Ｈ１５Ｌ６１は、重鎖がＨ１５をＩｇＧ１重鎖定常領域と結合させることによって形成され、軽鎖がＬ６１をκ軽鎖定常領域と結合させることによって形成され、前記軽鎖及び前記重鎖を連結させて完全抗体を形成することを指し、他の抗体は類似性によって命名した。
【０１９０】
ＨＲＰ０００５２−ＩｇＧ１は、完全抗体がＨＲＰ０００５２の重鎖定常領域（ＩｇＧ４サブクラス）をＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号５８）で置換することによって形成されることを指す。
【０１９１】
【表５−１】
2021510078.tif 000038
【０１９２】
【表５−２】
2021510078.tif 000039
【０１９３】
ヒトＩｇＧ１の重鎖の定常領域と結合する完全抗体と比較するために、いくつかの具体的実施形態では、表６−１及び表６−２中の完全長抗体は、それぞれ、上記したＨＲＰ０００４９及びＨＲＰ０００５２から誘導されるライブラリからスクリーニングされた重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、以下のヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号６０の、Ｓ２２８Ｐ及び２３４Ａ２３５Ａ変異を含む）及びκ軽鎖定常領域（配列番号５９と同じ）と結合することによって形成される完全抗体である。例えば、Ｈ１５Ｌ６１−ＩｇＧ４は、前記重鎖を軽鎖と結合することによって形成される完全抗体を指し、重鎖はＨ１５をＩｇＧ４重鎖定常領域と結合することによって形成され、軽鎖はＬ６１をκ軽鎖定常領域と結合することによって形成され、他の抗体は類似性によって命名した。
【０１９４】
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域：（配列番号６０）
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
【０１９５】
【表６−１】
2021510078.tif 000040
【０１９６】
【表６−２】
2021510078.tif 000041
【０１９７】
いくつかの具体的実施形態では、表７−１及び表７−２中の完全長抗体は、それぞれ、ＨＲＰ０００４９及びＨＲＰ０００５２から誘導されるライブラリからスクリーニングされた重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、以下のヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ重鎖定常領域（配列番号６５の、Ｓ２２８Ｐ変異を含む）及びκ軽鎖定常領域（配列番号５９と同じ）と結合することによって形成される完全抗体である。例えば、Ｈ１５Ｌ６１−ＩｇＧ４は、重鎖を軽鎖と組み合わせることによって形成される完全抗体を指し、前記重鎖はＨ１５をＩｇＧ４重鎖定常領域と結合することによって形成され、前記軽鎖はＬ６１をκ軽鎖定常領域と結合することによって形成され、他の抗体は類似性によって命名した。
【０１９８】
ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐの重鎖定常領域の配列は以下のとおりである。（配列番号６５）
【０１９９】
2021510078.tif 000042
【０２００】
【表７−１】
2021510078.tif 000043
【０２０１】
【表７−２】
2021510078.tif 000044
【０２０２】
特定の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域は本開示の抗体定常領域を限定することを意図せず、当該技術分野で公知の他の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域並びにそれらの変異体もそれらの性能を改善するために選択することができる。
【０２０３】
ＭｅｒｃｋのＰＤ−Ｌ１抗体Ａｖｅｌｕｍａｂ（Ａ０９）及び／又はＧｅｎｅｔｅｃｈの３２８０Ａをここではポジティブコントロールとして使用し、Ａ０９の軽鎖アミノ酸配列及び重鎖のアミノ酸配列（米国特許出願公開第２０１４０３４１９１７号から引用）は以下のとおりである。
【０２０４】
2021510078.tif 000045
【０２０５】
2021510078.tif 000046
【０２０６】
３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ，ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．４，２０１４，Ｐ４８８）の軽鎖アミノ酸配列及び重鎖のアミノ酸配列は以下のとおりである。
【０２０７】
2021510078.tif 000047
【０２０８】
2021510078.tif 000048
【０２０９】
上記したＰＤ−Ｌ１抗体を通常の方法によって精製した。
【０２１０】
以下の実施例における抗体はすべて完全長抗体である。
【０２１１】
実施形態４  抗体のリガンドブロッキング試験
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ１の結合に対する製品のブロッキング効果を更に研究する一方で、製品を臨床試験で類似の製品と比較した。方法は、国際公開第２０１７０８４４９５Ａ１号試験例２及び３を参照し、ヒトＰＤ−Ｌ１抗体を使用して、マウスＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１結合ブロッキング試験においてマウスＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の結合をブロッキングした。データの詳細については以下の表８を参照のこと。
【０２１２】
【表８】
2021510078.tif 000049
【０２１３】
リガンドブロッキング試験は、本開示のＰＤ−Ｌ１抗体が、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ１、並びにＰＤ−Ｌ１及びＢ７−１の結合をブロッキングできること、及びＨＲＰ０００４９から変異したＨ５Ｌ１１抗体及びＨ６Ｌ１１抗体が、マウスＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１に対する結合能力をブロックできるマウスＰＤ−Ｌ１の交差結合活性を有することを証明する。
【０２１４】
実施形態５  典型的抗体のＢＩＡｃｏｒｅ抗体親和性試験
ヒトａｎｔｉ−ｃａｐｔｕｒｅキット（カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ）のマニュアルの方法に従って、ある量のヒトＰＤ−Ｌ１（カタログ番号１００８４−Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、サルＰＤ−Ｌ１（カタログ番号９０２５１−Ｃ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、マウスＰＤ−Ｌ１（カタログ番号５００１０−Ｍ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）が親和性捕獲されるように前記ヒトａｎｔｉ−ｃａｐｔｕｒｅ抗体をバイオセンサチップＣＭ５（カタログ番号ＢＲ−１０００−１２、ＧＥ）に共有結合させた。ＰＤ−Ｌ１と反応するＰＤ−Ｌ１抗体の親和性をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００、ＧＥ機器で測定した。この試験では、Ｄ．Ｉ．水で１×に希釈したＨＢＳ−ＥＰ＋１０×緩衝溶液（カタログ番号ＢＲ−１００６−６９、ＧＥ）（ｐＨ７．４）を使用し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ第４．１版、ＧＥソフトウェアを使用してデータを（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに適合させて親和性値を得た。結果を表９に示す。
【０２１５】
【表９−１】
2021510078.tif 000050
【０２１６】
【表９−２】
2021510078.tif 000051
【０２１７】
結果は、ＨＲＰ０００５２変異体抗体ライブラリ（Ｈ２１Ｌ６８を除く）からスクリーニングされた抗体のヒトＰＤ−Ｌ１に対する親和性がＨＲＰ０００５２よりも高く、上記した二者はどちらもポジティブコントロール抗体よりも高かったことを示し、その一方で、ＨＲＰ０００４９変異体抗体ライブラリからスクリーニングされた抗体Ｈ５Ｌ１１、Ｈ６Ｌ１１及びＨ７Ｌ１１はマウスＰＤ−Ｌ１の強力な交差親和性活性を示した。
【０２１８】
実施形態６  ＰＢＭＣ−Ｔリンパ球活性化試験におけるＰＤ−Ｌ１抗体の細胞性ＩＦＮγの分泌
ヒト一次Ｔリンパ球の機能に対するＰＤ−Ｌ１抗体の効果を研究するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を集め、精製した。ツベルクリン（ＴＢ）でのin vitro刺激の５日後に、サイトカインＩＦＮγの分泌レベルが検出された。実験過程を以下で簡単に説明する。
【０２１９】
ＰＢＭＣを、新鮮な血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって得、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、続いて３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
【０２２０】
新たに単離され精製されたＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２×１０６／ｍｌの密度で細胞懸濁液に調製し、２５μｌのツベルクリンをすべての２０ｍＬの細胞懸濁液に添加し、続いてインキュベータ中、３７℃及び５％ＣＯ２で５日間培養した。第６日目に、培養した細胞を遠心分離し、ＰＢＳで一回洗浄し、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁させ、１×１０６／ｍｌの密度に調節し、９６ウェル細胞培養プレート中に１ウェルあたり９０μｌの容量で播種した。勾配希釈した抗体サンプル（ＰＢＳで希釈）又は等量のアイソタイプＩｇＧを１ウェルあたり１０μｌの容量でブランクコントロールとして同時に添加した。細胞培養プレートをインキュベータ中に入れ、３７℃及び５％ＣＯ２で三日間インキュベートし、次いで取り出し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）して、細胞培養上清を集めた。ＥＬＩＳＡ（ヒトＩＦＮ−γ試験キット、Ｘｉｎｂｏｓｈｅｎｇ、ＥＨＣ１０２ｇ．９６）を使用して、ＩＦＮ−γのレベルを検出した。具体的な操作については試薬マニュアルを参照のこと。
【０２２１】
結果（図１を参照）は、Ｈ１８Ｌ６１、Ｈ１２Ｌ６４、Ｈ５Ｌ１１及びＨ６Ｌ１１がＩＦＮγの細胞内分泌を強力に刺激できることを示す。なかでも、Ｈ１２Ｌ６４、Ｈ５Ｌ１１及びＨ６Ｌ１１は、細胞内ＩＦＮγ分泌を促進する場合、用量依存的傾向を示す。上記した四つの抗体はすべて、一部の用量又はすべての用量でＨＲＰ０００５２−ＩｇＧ１よりも優れている。
【０２２２】
実施形態７  ＰＤ−Ｌ１＋細胞の例示的な抗体媒介ＡＤＣＣ効果
等量のＰＢＳ緩衝液で希釈したヒト全血を、適量のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，０７８５１）を入れたＳｅｐＭａｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，１５４６０）チューブの底部に添加し、室温にて１０分間１２００ｇで遠心分離した。チューブ内の上部の液体を新しい５０ｍｌ遠心管に注ぎ、細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、３００ｇで８分間遠心分離して、ＰＢＭＣを得た。ＰＢＭＣを次いで、５％の低ＩｇＧ  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＢＩＯＳＵＮ、ＢＳ−０００７−５００）中に再懸濁させ、細胞計数を実施した。
【０２２３】
ＣＨＯ−Ｓ／ＰＤ−Ｌ１細胞を、５％の低ＩｇＧ  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁させ、計数し、９６ウェルプレート中に１ウェル当たり１０，０００細胞の密度で播種し、勾配希釈したＰＤ−Ｌ１抗体とともに１５分間インキュベートし、次いで３００，０００個のヒトＰＢＭＣ細胞を各ウェルに添加し、抗体と４時間相互作用させた。培地コントロール、例えばＣＨＯ−Ｓ／ＰＤ−Ｌ１細胞自発遊離コントロール、ＰＢＭＣ細胞自発遊離コントロール及びＣＨＯ−Ｓ／ＰＤ−Ｌ１細胞最大溶解コントロールを設定した。４時間後、９６ウェルプレートを遠心分離し、各ウェルから５０μｌの上清を別の９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を各ウェルに添加し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。ストップ溶液を添加し、４９０ｎｍの吸光度を読み取った。データを以下の式に従って解析して、溶解率を算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、抗体濃度及び対応する溶解率に従って抗体のＡＤＣＣ効果のＥＣ５０値を算出した。
【０２２４】
溶解率％＝（サンプルウェル４９０ｎｍ−ＰＢＭＣ細胞自発遊離４９０ｎｍ−ＣＨＯ−Ｓ／ＰＤ−Ｌ１細胞自発遊離４９０ｎｍ）／（ＣＨＯ−Ｓ／ＰＤ−Ｌ１細胞最大溶解４９０ｎｍ−ＣＨＯ−Ｓ／ＰＤ−Ｌ１細胞自発遊離４９０ｎｍ）×１００
【０２２５】
結果は（図２Ａ〜２Ｆに示すように）、異なるＰＤ−Ｌ１抗体ＨＲＰ０００４９−ＩｇＧ１、Ｈ５Ｌ１１、ＨＲＰ０００５２−ＩｇＧ１、Ｈ６Ｌ１１、Ｈ１８Ｌ６１及びＨ１２Ｌ６４のすべてのＩｇＧ１形態が強力なＡＤＣＣ効果を有し、これらの分子のＡＤＣＣ効果はすべて、様々なＰＤ−Ｌ１抗体のＩｇＧ４形態よりも有意に優れていることを示す。
【０２２６】
実施形態８  ヒト黒色腫Ａ３７５異種移植片モデルにおける例示的な抗体の効果
培養されたＡ３７５細胞及びＰＢＭＣを混合し、ＮＯＧマウスに皮下接種した。実験を、ＰＢＭＣ＋ＰＢＳ群、ＰＢＭＣ＋Ｈ１２Ｌ６４  ２０ｍｇ／ｋｇ群、ＰＢＭＣ＋Ｈ１２Ｌ６４−ＩｇＧ４−２０ｍｇ／ｋｇ群及びＰＢＭＣ＋ＨＲＰ０００５２  ２０ｍｇ／ｋｇ群に分類した。各群中の六匹のマウスに、二日おきに一回、連続１１回、腹腔内投与した。投与が完了した後、腫瘍成長阻害率ＴＧＩ（％）及び相対的腫瘍成長率Ｔ／Ｃ（％）を用いて治療効果を評価した。
【０２２７】
結果を図３及び表１０に示す。Ｈ１２Ｌ６４  ２０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩは９８．１５％であり、これはＰＢＭＣ＋ＰＢＳ群とは有意に異なっていた（ｐ＝０．００１８）。Ｈ１２Ｌ６４−ＩｇＧ４  ２０ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍阻害率ＴＧＩは８２．１５％であり、これはＰＢＭＣ＋ＰＢＳ群とは有意に異なっていた（ｐ＝０．００６４）。ＨＲＰ０００５２  ２０ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍阻害率ＴＧＩは６８．８４％であり、これはＰＢＭＣ＋ＰＢＳ群とは有意に異なっていた（ｐ＝０．０２９１）。結果は、Ｈ１２Ｌ６４  ２０ｍｇ／ｋｇ群、Ｈ１２Ｌ６４−ＩｇＧ４  ２０ｍｇ／ｋｇ及びＨＲＰ０００５２  ２０ｍｇ／ｋｇがＡ３７５の成長を効果的に阻害できることを示す（ｐ＜０．０５）。実験全体を通して、Ｈ１２Ｌ６４、Ｈ１２Ｌ６４−ＩｇＧ４及びＨＲＰ０００５２腫瘍担持マウスは体重減少又は動物死を示さず、この用量で、Ｈ１２Ｌ６４、Ｈ１２Ｌ６４−ＩｇＧ４及びＨＲＰ０００５２に対してマウスは良好な耐容性を示したことを意味する。
【０２２８】
【表１０】
2021510078.tif 000052
【０２２９】
実施形態９  マウス結腸がんモデルＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−Ｌ１抗体の効果
１００μｌのＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１細胞を５０匹のＣ５７マウスの右肋骨に接種し（ｈＰＤ−Ｌ１は、ｈＰＤ−Ｌ１をマウス結腸がん細胞ＭＣ３８に変換した後に細胞表面上で発現させることができる、４×１０５細胞）、腫瘍の体積が大きすぎるか又は小さすぎる動物を除外した。約５２ｍｍ３の平均腫瘍体積に従って、マウスを三つのＰＤ−Ｌ１抗体単回使用群とネガティブコントロール群と、合計四群で各群十匹のマウスにランダムに分けた。グループ分けの後、各薬物を１日に三回、合計１２回腹腔内投与した（等量のＰＢＳをコントロール群のマウスに注射した）。投与期間は２８日であり、腫瘍担持マウスのモニタリングは服用中止の二日後に終了した。腫瘍体積を測定し、重量を秤量し、データを週に二回記録した。グループ分け及び投与については下記表を参照のこと。各群の動物の体重、腫瘍体積及び腫瘍重量は平均±標準偏差（平均±ＳＥＭ）によって特徴づけられた。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５  ａｎｄ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアをプロッティングのために使用し、スチューデントｔ試験を統計分析のために使用した。
【０２３０】
腫瘍体積（ＴＶ）＝１／２×Ｌｌｏｎｇ×Ｌｓｈｏｒｔ２
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ−Ｔ０）／（Ｃ−Ｃ０）×１００％
腫瘍成長阻害率％ＴＧＩ＝１−Ｔ／Ｃ％
【０２３１】
2021510078.tif 000053
【０２３２】
実験結果（図４参照）は、Ｈ６Ｌ１１及びＡ０９がどちらもＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１皮下移植腫瘍の前記成長を有意に阻害することができることを示す。ネガティブコントロール照群と比較して、二群の腫瘍体積は投与の三日後に統計学的差異を示した（ｐ＜０．０５）。実験の最後で（投与後２７日）、二群の腫瘍成長阻害値は、それぞれ、１０６．７４％及び１０３．４７％であり、これはネガティブコントロール群とは非常に著しく異なっていた（ｐ＜０．００１）。腫瘍の約８０％〜９０％は完全に退縮し、Ｈ６Ｌ１１はＡ０９よりも良好な腫瘍抑制効果を有するが、これら二者の間に統計学的差異はない（図４参照）。実験の最後で、ＨＲＰ０００５２−ＩｇＧ１の腫瘍成長阻害率は２９．１０％であった。
【０２３３】
実験後、腫瘍担持マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離し秤量した。腫瘍秤量結果は、腫瘍体積のサイズと基本的に一致し、三つの薬物群において、Ｈ６Ｌ１１群の平均腫瘍重量が最も小さく、次いでＡ０９群であり、ＨＲＰ０００５２−ＩｇＧ１の平均腫瘍重量が最大であり、Ｈ６Ｌ１１及びＡ０９及びコントロール群の二群の各々の間に有意差があった（ｐ＜０．００１）。腫瘍担持マウスは様々な薬物に対して良好な耐容性を示し、薬物によって引き起こされる体重減少などの症状はなかった。
【０２３４】
実施形態１０  マウス結腸がんモデルＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−Ｌ１抗体の効果
ＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１細胞を５．８×１０５細胞／１００μｌ／マウスの密度でＣ５７／ＢＬ−６マウスに皮下接種した。腫瘍担持モデルを構築した後、腫瘍体積を測定し、体重及び腫瘍が大きすぎるか又は小さすぎる動物を除去した。腫瘍担持マウスを、腫瘍のサイズに応じて二群（ｎ＝７）：ＩｇＧ−ＰＢＳ（Ｃ２５−ＩｇＧ４）コントロール群、Ｈ５Ｌ１１−ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ実験群にランダムに分け、グループ分け及び投与の日付をＤ０とした。グループ分け後、各薬物を週に三回で合計１０回、腹腔内投与した。投与期間は１８日であり、腫瘍担持マウスのモニタリングは服用中止の二日後に終了した。腫瘍体積を測定し、重量を秤量し、データを週に二回記録した。グループ分け及び投与については下記表を参照のこと。各群の動物の体重、腫瘍体積及び腫瘍重量は、平均±標準偏差（平均±ＳＥＭ）によって特徴づけられた。プロッティングのためにＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５  ａｎｄ  Ｅｘｃｅｌ  ソフトウェアを使用し、スチューデントｔ試験を統計分析のために使用した。
【０２３５】
腫瘍体積（ＴＶ）＝１／２×Ｌｌｏｎｇ×Ｌｓｈｏｒｔ２
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ−Ｔ０）／（Ｃ−Ｃ０）×１００％
腫瘍成長阻害率％ＴＧＩ＝１−Ｔ／Ｃ％
【０２３６】
結果を図５に示し、マウスＰＤ−Ｌ１と交差反応したＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（Ｈ５Ｌ１１−ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ群）の実験群の腫瘍体積は、コントロール群の腫瘍体積よりも有意に小さく、投与後約一週間から実験群とコントロール群との間で統計学的差異がある。
【０２３７】
実験後、腫瘍担持マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離し秤量した。腫瘍重量の結果は腫瘍体積と類似していた。実験の間、投与群とコントロール群との間で体重の有意差はなく、投与された抗体それぞれに対してマウスは良好な耐容性を示した。
【０２３８】
明確に理解できるよう図面及び実施形態を用いて本発明を詳細に説明してきたが、説明及び実施形態は本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書中で言及したすべての特許及び科学文献の開示は参照により全体的かつ明確に組み込まれるものである。
【図１】
2021510078.tif 000054
【図２Ａ】
2021510078.tif 000055
【図２Ｂ】
2021510078.tif 000056
【図２Ｃ】
2021510078.tif 000057
【図２Ｄ】
2021510078.tif 000058
【図２Ｅ】
2021510078.tif 000059
【図２Ｆ】
2021510078.tif 000060
【図３】
2021510078.tif 000061
【図４】
2021510078.tif 000062
【図５】
2021510078.tif 000063
【配列表】
2021510078000001.app
【国際調査報告】
2021510078.tif 000064
2021510078.tif 000065
2021510078.tif 000066
2021510078.tif 000067
2021510078.tif 000068
2021510078.tif 000069
2021510078.tif 000070
2021510078.tif 000071