(57)【要約】  本発明は、エンドセリン受容体サブタイプAに対する抗体、特にモノクローナル抗体、その断片又は誘導体に関する。本発明はまた、がん、特に膠芽腫の分野における該抗体の治療用若しくは診断用、又は研究ツールとしての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)少なくとも1つの軽鎖可変領域であって、
-  CDR1Lのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列SQSIVYSNGKIYL (配列番号2)と少なくとも60%の同一性を有し、
-  CDR2Lのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列KVSと少なくとも60%の同一性を有し、
-  CDR3Lのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列FQGSHLPLT (配列番号4)と少なくとも60%の同一性を有する、軽鎖可変領域と、
ii)少なくとも1つの重鎖可変領域であって、
-  CDR1Hのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列GFTFNIYA (配列番号6)と少なくとも60%の同一性を有し、
-  CDR2Hのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列IRSKSNNYAT (配列番号8)と少なくとも60%の同一性を有し、
-  CDR3Hのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列VSSYYSGSFFAY (配列番号10)と少なくとも60%の同一性を有する、重鎖可変領域と
を有する、エンドセリン受容体サブタイプAに対する抗体、その断片又は誘導体。
【請求項２】
少なくとも1つの軽鎖可変領域を含み、
-  CDR1Lのアミノ酸配列がSQSIVYSNGKIYL (配列番号2)であり、
-  CDR2Lのアミノ酸配列がKVSであり、
-  CDR3Lのアミノ酸配列がFQGSHLPLT (配列番号4)である
ことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
少なくとも1つの軽鎖可変領域を含み、アミノ酸配列が以下の配列
【化１】
2021513345.tif 000006
(配列番号12)
と少なくとも60%の同一性を有することを特徴とする、請求項1又は2に記載の抗体。
【請求項４】
少なくとも1つの重鎖可変領域を含み、
-  CDR1Hのアミノ酸配列がGFTFNIYA (配列番号6)であり、
-  CDR2Hのアミノ酸配列がIRSKSNNYAT (配列番号8)であり、
-  CDR3Hのアミノ酸配列がVSSYYSGSFFAY (配列番号10)である
ことを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
少なくとも1つの重鎖可変領域を含み、アミノ酸配列が以下の配列
【化２】
2021513345.tif 000007
(配列番号14)
と少なくとも60%の同一性を有することを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
IgG2b/カッパ型の免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナルであることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
2017年10月18日にCNCMにCNCM番号I-5250として登録されたハイブリドーマから得られたモノクローナルマウス抗体であることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
キメラ化抗体であることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
2017年10月18日にCNCM番号I-5250としてCNCMに登録したハイブリドーマ。
【請求項１２】
以下の種々のポリヌクレオチド:
α)請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、
β)ポイント(α)に規定のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、
γ)ポイント(α)及び(β)に規定のポリヌクレオチドに高度に厳密な条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも18ヌクレオチドのポリヌクレオチド
から選ばれる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
少なくとも1つの、請求項12に記載のポリヌクレオチドを含むクローニング及び/又は発現のためのベクター。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチド又は請求項13に記載のベクターによってトランスフォームされた、又はこれらを含む宿主生命体。
【請求項１５】
細胞毒性基、易検出基、又はエフェクター基からなる群から選ばれる要素とコンジュゲートした請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体を含む化合物。
【請求項１６】
薬物としての使用のための、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体、請求項12に記載のポリヌクレオチド、又は請求項15に記載の化合物。
【請求項１７】
活性成分として請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体、請求項12に記載のポリヌクレオチド、又は請求項15に記載の化合物、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項１８】
エンドセリン及び特にエンドセリン受容体サブタイプA等の少なくとも1つのエンドセリン受容体を含む軸の、直接の又は別の生理学的経路を伴う機能不全が関与する病気又は病変の治療及び/又は予防における使用のための、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体、請求項12に記載のポリヌクレオチド、請求項15に記載の化合物、又は請求項17に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記病気又は前記病変ががんであることを特徴とする、請求項18に規定の使用のための抗体、ポリヌクレオチド、化合物、又は医薬組成物。
【請求項２０】
膠芽腫等のがんをインビトロで診断するための方法であって、
a1') 対象の生物学的試料を請求項15に記載の化合物と接触させる工程、
b1') 易検出基によって放射されるシグナルを検出する工程、
c1') 工程(b1')で検出され、任意選択で対照シグナルと比較したシグナルに基づいて前記対象におけるがんの存在又は非存在を決定する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体、その治療用及び診断用の使用、並びにその研究ツールとしての使用の技術分野に属する。
【０００２】
より詳細には、本発明はエンドセリン受容体サブタイプA(ETA-R)及び特に神経膠腫又は膠芽腫細胞等のグリア細胞の表面に発現するヒトエンドセリン受容体の天然の及び機能性のコンフォメーションに特異的な抗体、有利にはモノクローナル抗体を提案する。
【０００３】
本発明はまた、治療及び診断の目的、並びに研究目的のためのこれらの抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
種々のエンドセリン(ヒトではET1、ET2、及びET3と指定される)の受容体は、7つの膜貫通ドメインを有し、「Gタンパク質共役受容体」の略であるGPCRとも称される受容体のファミリーに属している。エンドセリン受容体はヒトでは2つの主要なサブタイプ、即ちサブタイプA(ETA-R)及びサブタイプB(ETB-R)を有する。これらの受容体がGPCRファミリーに分類されるという事実は、これらの受容体が、それらが置かれている膜の環境に密接に関連する複雑な三次元構造をもつことを意味する。
【０００５】
更に、そのリガンドが固定された後のGPCRのコンフォメーションの改変が文献に広く記載されている。種々の細胞内タンパク質の結合に伴って新規なシグナル伝達カスケードを惹起するこれらのコンフォメーションの改変の記載により、LefkowitzとKobilka両博士は2012年にノーベル賞を受けた[1-3]。もっと最近では、Doi教授及びNureki教授による仕事により、そのエンドセリン1リガンドが固定された後のエンドセリンBのコンフォメーション変化が示された。[4]
【０００６】
後者の研究はBagnato教授のチームによる発表と比較されるべきものである。これは、A型受容体、B型受容体、及びその主要な1つがエンドセリン1(ET-1)であるそれらのリガンドからなる「エンドセリン軸」が存在することを示した[5,6]。これらの研究によって、いくつかの腫瘍の型(B受容体については黒色腫、A受容体については膠芽腫)がエンドセリンA及び/又はBの受容体を過剰発現していること、及びこれらの同じ腫瘍細胞がET-1を分泌でき、又は腫瘍に栄養を供給している腫瘍血管の壁を構成する内皮細胞によって腫瘍の微小環境に分泌されるET-1を捕捉できることが示されている。
【０００７】
換言すれば、エンドセリン受容体を過剰発現している腫瘍細胞がET-1の多い微小環境に置かれており、これが次にエンドセリンA又はBの受容体に固定され、これらの同じ腫瘍細胞の表面上に過剰に提示された「活性化」構造においてそのコンフォメーションの変化を引き起こす。
【０００８】
本発明者らがこれらの受容体の種々のコンフォメーションを区別することを可能にする抗体を既に生成していたことに注目されたい。Shihoyaら、2016[4]によって記載されたエンドセリンタイプB受容体に関する結晶学的研究により、本発明者らによって生成された抗体による黒色腫細胞について行われた観察が確認されている[7,8]。
【０００９】
エンドセリン受容体サブタイプAについては、これも特に結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、膠芽腫(脳腫瘍)、及び膀胱がんの例において同じ発現レベルの改変が示されている[9]。
【００１０】
更に、エンドセリン軸及びその受容体は、いくつかの生理病理学的機能及び機能不全に関与している。非限定的な例として、動脈性高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、腎機能不全、脳血管系疾患、クローン病、肺線維症、喘息、その他(Shah、2007による総説[10]を参照されたい)について述べることができる。
【００１１】
したがって、エンドセリン受容体、より詳細にはエンドセリン受容体サブタイプAを標的とすることは、ヒトの臨床生物学に特に意味があると思われる[6,11]。
【００１２】
特に治療目的で受容体をブロックするために、種々の戦略、たとえばペプチド又は非ペプチドのアンタゴニストの使用、及びこれらの受容体を標的とするモノクローナル抗体の使用が存在する。
【００１３】
しかし、モノクローナル抗体を用いる利用可能な、がんの受動免疫療法(現在のところ約60種を超える抗体が承認されている)の中でGPCRを標的とするものはない。それは、天然型であろうと機能型であろうと、膜の環境の外でこれらの同じ受容体を得ることに関連する問題の結果として、特異的なモノクローナルGPCR抗体を得ることが困難であるためである。
【００１４】
Kondohら、1990[12]は、ラット肺膜の表面上に存在するエンドセリン受容体の可溶化された複合体に対する4種のモノクローナル抗体(A2、G9、E7、及びG10)の結合特性を記載している。G9及びG10の抗体はタイプG及びアイソタイプ2aの免疫グロブリン(IgG2a)であり、A2及びE7の抗体はIgG1免疫グロブリンである。これら4種の抗体はまさに可溶化エンドセリン受容体に特異的であるが、Kondohら、1990[12]はヒト起源の受容体の認識についても、その特性についても、これらの抗体(ETA-R及び/又はETB-R)の精細な特異性に関しては何ら情報を提供していない。
【００１５】
特許出願CA第2971491号[13]は、A-1〜A-12と指定されるヒトエンドセリン受容体サブタイプAに対する12種の特異抗体について記載している。これらの抗体はアンタゴニスト特性を有し、ET1が関与するシグナル伝達チャネルを阻害することができる。この理由により、特許出願CA第2971491号はこれらの抗体を肺動脈性高血圧症の治療に用いることを想定している。
【００１６】
したがって本発明者らは、がん細胞の表面上、特にヒトがん細胞の表面上に発現するエンドセリン受容体サブタイプAの特定のコンフォーマーを標的とすることができる抗体を得ることを目指した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】WO  2017/220739
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は上で定義した技術的課題を解決すること、及び本発明者らが目指した目的を達成することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らはまさに、エンドセリン受容体サブタイプBに対する特異抗体を調製するために既に公開された特定の免疫及び選択の戦略を開発し、用いた(国際出願WO第2012/045776号[14]及びWO第2017/220739号[15])。この戦略により、ELISA-細胞及び続くフローサイトメトリーによってハイブリドーマをスクリーニングする手順と組み合わせて、その天然のコンフォメーションにおけるエンドセリン受容体に対する特異的モノクローナル抗体を得ることができる。このアプローチは、現在でもなお対応困難な課題を構成している抽出され精製された目的の受容体を必要としないという利点を更に有する。
【００２０】
この戦略を通して、本発明者らは、エンドセリン受容体サブタイプA、特にこれ以降Rendomab-A63又はRA63と称するヒトサブタイプAに対する直接のモノクローナル抗体を選択することができた。この抗体はエンドセリン受容体サブタイプA(ETA-R)の薬学的特性に関するアンタゴニスト性を有しない。換言すれば、本発明による抗体はETA-Rの1つ(又は複数)の生物学的活性を低減し、阻害し、又はブロッキングすることができない。一方、本発明による抗体は、がん細胞、特に膠芽腫細胞の表面上に発現するエンドセリン受容体サブタイプAの特定のコンフォーマーを認識することができる。
【００２１】
本発明は、エンドセリン受容体サブタイプAに対する抗体、又はその断片若しくは誘導体に関する。
【００２２】
本発明の説明においてさらなる詳細に入る前に、以下の定義を述べ、又は提案する。
【００２３】
用語「抗体」と「免疫グロブリン」は等価であり、本発明において相互交換可能に用いることができる。
【００２４】
抗体は1つ又は複数のジスルフィド架橋によって連結された少なくとも2つの重鎖(H)及び少なくとも2つの軽鎖(L)を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は可変領域(又は可変ドメイン)(VH)と、通常CH1、CH2、及びCH3と称される3つのドメインを含む定常領域とを含む。それぞれの軽鎖は、可変領域(又は可変ドメイン)(VL)と、通常CLと称される単一のドメインを含む定常領域とを含む。抗原の認識に関与する重鎖及び軽鎖の可変領域は、フレームワーク領域(FR)とも称される4つのより保存された領域によって囲まれた「相補性決定領域」(CDR)とも称される3つの超可変領域に更に再分割することができる。それぞれの重鎖(又は軽鎖)の可変領域の構成はN末端からC末端に向かって以下の通りである。FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4。本発明の文脈において、用いたCDR及びFRの定義はIMGT(International ImMunoGeneTics database、http://imgt.cines.fr:8104)のものである。したがって、以下に記述し、特許を請求するCDR配列の同一性百分率の計算は、この注記を基にして考慮すべきである。
【００２５】
更に、用語「抗体」は、本発明の文脈において、完全な抗体分子のみでなく、その断片及び誘導体をも含む。
【００２６】
「抗体断片」は、本発明の文脈において、単一の抗原結合部位を有する一価の断片及び2つの抗原結合部位を有する二価の断片の両方を意味する。したがって、本発明による断片は少なくとも1つの抗原結合部位を有する。これらの断片の中で、Fab、F(ab')2、及びFv断片、並びに抗原結合部位を保存した他の断片(scFv及びダイアボディ)について述べることができる。Fab断片は軽鎖の全体及び既に定義したVH及びCH1のドメインを含む重鎖の一部(Fd)からなる一価の断片である。F(ab')2断片は、定常ドメインCH1及びCH2の間に位置する免疫グロブリンのヒンジ領域に存在するジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片の会合に対応する二価の断片である。Fv断片は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域VL及びVHのみからなる一価の断片である。scFv断片は、遺伝子操作のみによって得られ、ペプチド結合によって連結された可変ドメインに対応する一価のポリペプチド断片である。ダイアボディは、短すぎて1つのscFvを形成することができないペプチド結合のために対向した配置にある2つのscFv分子からなる組み換え二価抗体分子である。本発明による断片は、その半減期が化学的改変によって、特にリポソームへの組み込み又はポリエチレングリコール(PEG)等のポリアルキレングリコールの導入によって増大した既述の断片をも包含する。この手法は「PEG化」と称され、Fab-PEG、F(ab')2-PEG、又はFv-PEG等の断片を生じる。組み換え法によって、固形腫瘍への浸透性の特性及びより効率的でより良く制御された薬物動態を有する本発明による抗体の単一又は融合した断片を産生することも可能である。本発明の文脈において有用な抗体断片は、天然でも組み換えでもよい。
【００２７】
「抗体誘導体」は、本発明の文脈において、一本鎖Fv(scFv)及び単一ドメイン抗体(dAb)等の、遺伝子操作によって得られる抗体断片を意味する。この用語には、ファージディスプレイ手法又はエンドセリン受容体サブタイプA若しくはこのサブタイプの特定の領域に結合する分子のための他のランダム選択手法を用いて生成することができる抗体型の分子も含まれる。
【００２８】
したがって、「抗体断片」及び「抗体誘導体」には、本発明による抗体の認識部位(即ち、エピトープ又は抗原に結合し又はこれと組み合わされる抗体の一部)の一部を形成する構造、有利にはペプチドの構造を含む全ての分子が包含される。更に、本発明による抗体の断片及び誘導体は、がん細胞、特に膠芽腫細胞の表面上に発現するエンドセリン受容体サブタイプAの特定のコンフォーマーを認識することができる。
【００２９】
本発明は、
i)少なくとも1つの軽鎖可変領域であって、
-  CDR1Lのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列SQSIVYSNGKIYL (配列番号2)と少なくとも60%の同一性を有し、
-  CDR2Lのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列KVSと少なくとも60%の同一性を有し、
-  CDR3Lのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列FQGSHLPLT (配列番号4)と少なくとも60%の同一性を有する、軽鎖可変領域と、
ii)少なくとも1つの重鎖可変領域であって、
-  CDR1Hのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列GFTFNIYA (配列番号6)と少なくとも60%の同一性を有し、
-  CDR2Hのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列IRSKSNNYAT (配列番号8)と少なくとも60%の同一性を有し、
-  CDR3Hのアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列VSSYYSGSFFAY (配列番号10)と少なくとも60%の同一性を有する、重鎖可変領域と
を有する、エンドセリン受容体サブタイプAに対する抗体、この抗体の断片、又はこの抗体の誘導体に関する。
【００３０】
本発明の文脈において、アミノ酸配列は1文字国際コードに従って与えられる。
【００３１】
特許出願CA第2971491号[13]に記載された抗体の中で、A-7、A-8、及びA-9と指定された抗体は、アミノ酸配列に関しては本発明による抗体の軽鎖可変領域に近い少なくとも1つの軽鎖可変領域を有しているが、A-7、A-8、及びA-9抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、特にCDR2H及びCDR3Hのアミノ酸配列は、本発明による抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列とは極めて異なっている。
【００３２】
本発明による抗体は少なくとも1つの軽鎖可変領域を有し、そのCDR1(即ちCDR1L)は以下のアミノ酸配列SQSIVYSNGKIYL (配列番号2)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００３３】
本発明による抗体は少なくとも1つの軽鎖可変領域を有し、そのCDR2(即ちCDR2L)は以下のアミノ酸配列KVSと少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００３４】
本発明による抗体は少なくとも1つの軽鎖可変領域を有し、そのCDR3(即ちCDR3L)は以下のアミノ酸配列FQGSHLPLT (配列番号4)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００３５】
本発明による抗体において、軽鎖可変領域の種々のCDRの同一性百分率は互いに独立であることに注目されたい。たとえば、CDR2Lは以下のアミノ酸配列KVSと少なくとも65%の同一性を有してよく、一方CDR3Lは以下のアミノ酸配列FQGSHLPLT (配列番号4)と少なくとも70%の同一性を有してよい。したがって本発明では軽鎖可変領域の3つのCDRについての同一性百分率に関する全ての組合せが想定される。
【００３６】
特定の例として、本発明による抗体は少なくとも1つの軽鎖可変領域を含み、
-  そのCDR1Lのアミノ酸配列はSQSIVYSNGKIYL (配列番号2)であり、
-  そのCDR2Lのアミノ酸配列はKVSであり、
-  そのCDR3Lのアミノ酸配列はFQGSHLPLT (配列番号4)である。
【００３７】
典型的には、本発明による抗体は少なくとも1つの軽鎖可変領域を含み、そのアミノ酸配列は以下の配列
【００３８】
【化１】
2021513345.tif 000002
【００３９】
(配列番号12)
と少なくとも60%の同一性を有する。
【００４０】
特に、本発明による抗体は、少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んでよく、そのアミノ酸配列は配列番号12と少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００４１】
より詳細には、本発明による抗体は1つの軽鎖可変領域を含んでよく、そのアミノ酸配列は配列番号12に対応する。
【００４２】
本発明による抗体は少なくとも1つの重鎖可変領域を有し、そのCDR1(即ちCDR1H)は以下のアミノ酸配列GFTFNIYA (配列番号6)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００４３】
本発明による抗体は少なくとも1つの重鎖可変領域を有し、そのCDR2(即ちCDR2H)は以下のアミノ酸配列IRSKSNNYAT (配列番号8)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００４４】
本発明による抗体は少なくとも1つの重鎖可変領域を有し、そのCDR3(即ちCDR3H)は以下のアミノ酸配列VSSYYSGSFFAY (配列番号10)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００４５】
本発明による抗体において、重鎖可変領域の種々のCDRの同一性百分率は互いに独立であることに注目されたい。たとえば、CDR2Hは以下のアミノ酸配列IRSKSNNYAT (配列番号8)と少なくとも75%の同一性を有してよく、一方CDR3Lは以下のアミノ酸配列VSSYYSGSFFAY (配列番号10)と少なくとも65%の同一性を有してよい。したがって本発明では重鎖可変領域の3つのCDRについての同一性百分率に関する全ての組合せが想定される。
【００４６】
特定の例として、本発明による抗体は少なくとも1つの重鎖可変領域を含み、
-  そのCDR1Hのアミノ酸配列はGFTFNIYA (配列番号6)であり、
-  そのCDR2Hのアミノ酸配列はIRSKSNNYAT (配列番号8)であり、
-  そのCDR3Hのアミノ酸配列はVSSYYSGSFFAY (配列番号10)である。
【００４７】
典型的には、本発明による抗体は少なくとも1つの重鎖可変領域を含み、そのアミノ酸配列は以下の配列
【００４８】
【化２】
2021513345.tif 000003
【００４９】
(配列番号14)
と少なくとも60%の同一性を有する。
【００５０】
特に、本発明による抗体は少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでよく、そのアミノ酸配列は配列番号14と少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００５１】
より詳細には、本発明による抗体は少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでよく、そのアミノ酸配列は配列番号14に対応する。
【００５２】
有利には、本発明による抗体は既に定義した少なくとも1つの軽鎖可変領域と少なくとも1つの重鎖可変領域を有する。
【００５３】
したがって、本発明による抗体は既に定義したCDR1L、CDR2L、及びCDR3Lを含む少なくとも1つの軽鎖可変領域と、既に定義したCDR1H、CDR2H、及びCDR3Hを含む少なくとも1つの重鎖可変領域とを有する。
【００５４】
本発明による抗体の軽鎖は典型的にはカッパ軽鎖である。
【００５５】
本発明による抗体の重鎖は特にガンマ2b重鎖である。
【００５６】
特に、本発明による抗体はG型免疫グロブリンである。
【００５７】
より詳細には、本発明による抗体はIgG2b/カッパ型の免疫グロブリンである。
【００５８】
本発明の目的であるエンドセリン受容体サブタイプAに対する抗体は、ETA-Rの細胞外セグメントと選択的に結合する。ETA-R、特にヒトETA-Rの少なくとも1つの特定されたドメイン又は領域と「選択的に結合する抗体」は、本発明の文脈においては、いかなる他のETA-Rの領域よりも大きな親和性で特定のドメインと結合する抗体を意味する。有利には、抗体はいかなる他のETA-Rの領域に対するよりも少なくとも2倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも50倍大きな親和性でETA-Rの特定されたドメインと結合する。この結合は当分野で周知の方法、たとえばフローサイトメトリー、放射免疫アッセイ(RIA)、共焦点顕微鏡、試験すべき抗体(ELISA)を直接又は間接に明らかにすることによる酵素免疫アッセイ(EIA)によって決定することができる。
【００５９】
本発明の目的である抗体は、エンドセリン受容体サブタイプAに対して、又は本発明による抗体によって認識されるエピトープを含むこの受容体の断片に対して免疫された動物から得ることができる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ウマ、又はラクダ若しくはラマ等のラクダ科動物等の、抗体を生成するために通常用いられる任意の動物であってよい。本発明の目的である抗体は、エンドセリン受容体サブタイプAに対して、又は本発明による抗体によって認識されるエピトープを含むこの受容体の断片に対して選択される抗体又は抗体断片のバンクから得ることもできる。抗体又は抗体断片のバンクは、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ウマ、又はラクダ若しくはラマ等のラクダ科動物等の、抗体を生成するために通常用いられる任意の動物から、また非ヒト霊長類若しくはヒトから産生してもよい。
【００６０】
このようにして得られた抗体は、エンドセリン受容体サブタイプA又は本発明による抗体によって特異的に認識される配列の1つが既に固定されているアフィニティカラムの上で精製することができる。この精製には、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーも伴いうる。
【００６１】
本発明の文脈においては、抗体は多特異性又は単一特異性のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。
【００６２】
有利には、本発明の抗体はモノクローナルである。「モノクローナル抗体」は、免疫学の標準的な定義によって、実質的に均一な抗体の集団、即ちそのうちの比較的少量が任意選択で変異を有することもできる同一の抗体の集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ等の単一の細胞のクローンの増殖から得られる。
【００６３】
より詳細には、本発明による抗体は、2017年10月18日にCNCM(「Collection Nationale de Cultures de Microorganismes」Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15の略)にCNCM番号I-5250(Rendomab-A63)として寄託されたハイブリドーマから得られたモノクローナルマウス抗体である。本発明は該ハイブリドーマにも関する。
【００６４】
変形例では、本発明による抗体はキメラ抗体、即ち所与の種の抗体から誘導された重鎖及び軽鎖の可変領域並びに超可変領域と、この種とは異なる別の種の抗体から誘導された重鎖及び軽鎖の定常領域との組合せを含む抗体であってよい。
【００６５】
本発明の第1の変形例はキメラ化抗体、特にキメラ化モノクローナル抗体、即ち上述のマウス抗体に由来する可変ドメインがヒト起源の定常ドメインと会合している抗体に対応する。ヒトに用いられるいくつかの治療用抗体はキメラ化抗体であると言える。
【００６６】
第2の特に興味ある変形例はヒト化抗体、特にヒト化モノクローナル抗体であってよい。それは、抗体をヒト対象に繰り返し投与しなければならない場合にはヒト化抗体を用いることが好ましいからである。
【００６７】
本発明によるヒト化モノクローナル抗体の場合には、これはマウス抗体、特に2017年10月18日にCNCM番号I-5250としてCNCMに寄託したハイブリドーマに由来するマウス抗体のCDRを、そのアイソタイプ(IgG、IgA、IgM)が何であろうとヒト抗体に挿入することによって調製することができる。ヒト化抗体は、Verhoeyenら  1988 [16]及び米国特許第4,816,567号[17]に記載されている手法及びアプローチを用いて調製することができる。
【００６８】
抗体は、ヒトのワクチン接種を必要としない当分野で公知の調製法による抗ETA-Rヒト抗体のアミノ酸の配列を有するヒト抗体であってもよい。たとえば、そのような抗体は、利用可能で本質的にヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの遺伝子免疫/細胞免疫ブースターによって得ることができる(Vaughanら、1998 [18]を参照されたい)。変形例では、そのような抗体はETA-Rに対するヒトBリンパ球からのコーディングcDNAをクローニングすることによって得られうる。
【００６９】
本発明は、以下の種々のポリヌクレオチドから選ばれる単離されたポリヌクレオチドにも関する。
α)既に定義した抗体をコードするポリヌクレオチド、
β)ポイント(α)で定義したポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、
γ)ポイント(α)及び(β)で定義したポリヌクレオチドに高度に厳密な条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも18ヌクレオチドのポリヌクレオチド。
【００７０】
「ポリヌクレオチド」は、本発明の文脈においては、核酸、核配列、核酸配列、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列、一本鎖DNA、二本鎖DNA、又はRNAを意味する。本発明によるポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチド及び非天然のヌクレオチドを含んでよい。
【００７１】
本発明によるポリヌクレオチドは、その天然の状態における、即ちその天然の染色体環境におけるヌクレオチド配列には対応しない。それとは逆に、本発明によるポリヌクレオチドは単離され、任意選択で精製されており、したがってその環境は改変されている。本発明によるポリヌクレオチドは遺伝子組み換えによって、又は化学合成によって得ることもできる。
【００７２】
高度に厳密な条件は、2つの相補的なヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションを得ることを可能にする温度及びイオン力の条件に対応する。当業者であれば、特にヌクレオチド配列の大きさに従い、また、Sambrookら、1989[19]の教示を参照して、最も好適な高度に厳密な条件を決定することができる。
【００７３】
本発明によるポリヌクレオチドは、
i')軽鎖可変領域をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列であって、
-  CDR1Lをコードし、以下のヌクレオチド配列AGT CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAA ATC TAT TTA (配列番号1)と少なくとも60%の同一性を有する第1の配列、
-  CDR2Lをコードし、以下のヌクレオチド配列AAA GTT TCCと少なくとも60%の同一性を有する第2の配列、
-  CDR3Lをコードし、以下のヌクレオチド配列TTT CAA GGT TCA CAT CTT CCG CTC ACG (配列番号3)と少なくとも60%の同一性を有する第3の配列、
を含むヌクレオチド配列と、
ii')重鎖可変領域をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列であって、
-  CDR1Hをコードし、以下のヌクレオチド配列GGA TTC ACC TTC AAT ATC TAC GCC (配列番号5)と少なくとも60%の同一性を有する第1の配列、
-  CDR2Hをコードし、以下のヌクレオチド配列ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA (配列番号7)と少なくとも60%の同一性を有する第2の配列、
-  CDR3Hをコードし、以下のヌクレオチド配列GTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTC TTT GCT TAC (配列番号9)と少なくとも60%の同一性を有する第3の配列、
を含むヌクレオチド配列と
を含む。
【００７４】
本発明によるポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードし、CDR1Lをコードする第1の配列を有する少なくとも1つのヌクレオチド配列を有し、前記第1の配列は以下のヌクレオチド配列AGT CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAA ATC TAT TTA (配列番号1)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００７５】
本発明によるポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードし、CDR2Lをコードする第2の配列を有する少なくとも1つのヌクレオチド配列を有し、前記第2の配列は以下のヌクレオチド配列AAA GTT TCCと少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００７６】
本発明によるポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードし、CDR3Lをコードする第3の配列を有する少なくとも1つのヌクレオチド配列を有し、前記第3の配列は以下のヌクレオチド配列TTT CAA GGT TCA CAT CTT CCG CTC ACG (配列番号3)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００７７】
本発明によるポリヌクレオチドにおいて、軽鎖可変領域における種々のCDRをコードする配列の同一性百分率は互いに独立であることに注目されたい。たとえば、CDR2Lをコードする配列は以下のヌクレオチド配列AAA GTT TCCと少なくとも65%の同一性を有してよく、一方CDR3Lをコードする配列はヌクレオチド配列(配列番号3)と少なくとも70%の同一性を有してよい。したがって本発明では軽鎖可変領域の種々のCDRをコードする3つの配列についての同一性百分率に関する全ての組合せが想定される。
【００７８】
特定の例として、本発明によるポリヌクレオチドは軽鎖可変領域をコードし、
-  そのヌクレオチド配列がAGT CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAA ATC TAT TTA (配列番号1)であるCDR1Lをコードする第1の配列、
-  そのヌクレオチド配列がAAA GTT TCCであるCDR2Lをコードする第2の配列、
-  そのヌクレオチド配列がTTT CAA GGT TCA CAT CTT CCG CTC ACG (配列番号3)であるCDR3Lをコードする第3の配列
を含む、少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
【００７９】
列挙した上記3つの配列(即ち配列番号1、AAA GTT TCC、及び配列番号3)は、本発明によるポリヌクレオチドの翻訳の後で得られるポリペプチドが既に定義した軽鎖可変領域のCDR1L、CDR2L、及びCDR3Lと少なくとも60%の同一性、有利には100%の同一性を有する3つのペプチド配列を含むように相互に組織化されなければならないことは明らかである。
【００８０】
典型的には、本発明によるポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が以下の配列
GAT GTT TTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCG TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAA ATC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTA ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT CTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG (配列番号11)
と少なくとも60%の同一性を有する軽鎖可変領域をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
特に、本発明によるポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が配列番号11と少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する軽鎖可変領域をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
より詳細には、本発明によるポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が配列番号11に対応する軽鎖可変領域をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
本発明によるポリヌクレオチドはまた、重鎖可変領域をコードし、CDR1Hをコードする第1の配列を有する少なくとも1つのヌクレオチド配列を有し、前記第1の配列は以下のヌクレオチド配列GGA TTC ACC TTC AAT ATC TAC GCC (配列番号5)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００８４】
本発明によるポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードし、CDR2Hをコードする第2の配列を有する少なくとも1つのヌクレオチド配列を有し、前記第2の配列は以下のヌクレオチド配列ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA (配列番号7)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００８５】
本発明によるポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードし、CDR3Hをコードする第3の配列を有する少なくとも1つのヌクレオチド配列を有し、前記第3の配列は以下のヌクレオチド配列GTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTC TTT GCT TAC (配列番号9)と少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する。
【００８６】
本発明によるポリヌクレオチドにおいて、重鎖可変領域における種々のCDRをコードする配列の同一性百分率は互いに独立であることに注目されたい。たとえば、CDR2Hをコードする配列はヌクレオチド配列番号7と少なくとも75%の同一性を有してよく、一方CDR3Hをコードする配列はヌクレオチド配列(配列番号9)と少なくとも65%の同一性を有してよい。したがって本発明では重鎖可変領域の種々のCDRをコードする3つの配列についての同一性百分率に関する全ての組合せが想定される。
【００８７】
特定の例として、本発明によるポリヌクレオチドは重鎖可変領域をコードし、
-  そのヌクレオチド配列がGGA TTC ACC TTC AAT ATC TAC GCC (配列番号5)であるCDR1Hをコードする第1の配列、
-  そのヌクレオチド配列がATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA (配列番号7)であるCDR2Hをコードする第2の配列、
-  そのヌクレオチド配列がGTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTC TTT GCT TAC (配列番号9)であるCDR3Lをコードする第3の配列
を含む、少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
列挙した上記3つの配列(即ち配列番号5、配列番号7、及び配列番号9)は、本発明によるポリヌクレオチドの翻訳の後で得られるポリペプチドが既に定義した重鎖可変領域のCDR1H、CDR2H、及びCDR3Hと少なくとも60%の同一性、有利には100%の同一性を有する3つのペプチド配列を含むように相互に組織化されなければならないことは明らかである。
【００８９】
典型的には、本発明によるポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が以下の配列
GAG GTG CAG CTT GTT GAG TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG TCA TTG AAA CTC TCA TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT ATC TAC GCC ATG AAC TGG ATC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG ATT GCT CGC ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA TAT TAT GCC GAT TCA GTG AAA GAC AGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT GAT TCA CAG AAT ATG GTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA (配列番号13)
と少なくとも60%の同一性を有する重鎖可変領域をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
特に、本発明によるポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が配列番号13と少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性を有する重鎖可変領域をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
より詳細には、本発明によるポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が配列番号13に対応する重鎖可変領域をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
2つのアミノ酸配列の間(又は2つのヌクレオチド配列の間)の「同一性百分率」は、本発明の文脈においては、比較する2つの配列の間で同一であるアミノ酸残基の(又はヌクレオチドの)百分率を意味し、この百分率は2つの配列の間の最良の整列(最適整列)を実行した後で得られる。当業者には、そのような同一性百分率を得るための種々の手法、たとえばホモロジーアルゴリズム又はBLASTプログラム等のコンピュータープログラムが知られている。
【００９３】
同一性百分率は統計的なものであり、2つの配列の間の相違はこれらの配列に沿ってランダムに分布している。2つの配列の間の相違は種々の型の配列の改変、即ちアミノ酸残基の(又はヌクレオチドの)欠失、置換、又は付加からなり得る。
【００９４】
第1の実施形態では、配列の改変は等価のアミノ酸、即ち構造的相同性を有するか、対応する抗体の生物学的活性を実質的に改変しないアミノ酸の間の置換をもたらす。
【００９５】
第2の実施形態では、配列の改変は非等価のアミノ酸、即ち構造的相同性を有しないアミノ酸による置換をもたらす。これらの改変によって抗体の生物学的特性を改善すること、即ち親和性及び/又は特異性の改善、認知スペクトルの拡大、安定性の増大、免疫原性の低減等が可能になる。
【００９６】
既に開示した2つの実施形態に先立って、これらの改変、挿入、又は欠失は、本発明による抗体の特性に必須な又は必須でないCDRを標的にしてよい。
【００９７】
上で開示した2つの実施形態に適用する場合、これらの改変、挿入、又は欠失はFR領域を標的としてもよい。FR領域も抗体の可変ドメインにおいて抗体に応じて本発明による抗体の特性の発現に役割を果たしている可能性があることが知られているからである。
【００９８】
本発明はまた、本発明による少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むクローニング及び/又は発現のためのベクターに関する。そのようなベクターは特に、宿主生命体をトランスフォームし、本発明による抗体をその中に発現させるために有用である。
【００９９】
本発明によるベクターは、本発明によるポリヌクレオチドの発現及び/又は本発明によるポリヌクレオチドの翻訳によって得られる生成物の分泌を可能にする1つ(又は複数)の要素を更に含む。これらの要素の中で、構造的な若しくは誘導可能なプロモーター、転写を開始するシグナル若しくは転写を停止するシグナル、翻訳を開始する配列若しくは翻訳終止シグナルについて述べることができる。
【０１００】
有利には、本発明によるベクターは、相互に操作上連結されたプロモーター、本発明のポリヌクレオチド、及びターミネーター要素を含む。「相互に操作上連結された」は、本発明によれば、1つの要素の機能が別の要素の機能によって影響されるように相互に連結された要素を意味する。例として、プロモーターは、それがコーディング配列の発現に影響することができる場合には、コーディング配列と操作上連結されている。ベクターが含み得るペプチドの転写、翻訳、及び成熟を制御する要素は当業者には公知であり、ベクターは、その中で発現又はクローニングが実施されなければならない宿主生命体に従って選ぶことができる。
【０１０１】
本発明によるベクターは、有利にはプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、及びバキュロウイルス等のウイルスから選ばれる。特に、本発明のベクターは、それが複製の起源として宿主生命体の中で維持され複製されることを可能にする要素を含む自立的複製ベクターである。更に、ベクターは、宿主生命体の中でそれを選択することを可能にする要素、たとえば宿主生命体のゲノムの中に個別の遺伝子との相補性が欠失していることを確実にする抗生剤耐性遺伝子又は選択遺伝子を含んでよい。そのようなクローニング及び/又は発現のためのベクターは当業者には周知であり、文献に広く記載されている。
【０１０２】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチド又は本発明によるベクターによってトランスフォームされた、又はこれらを含む宿主生命体に関する。
【０１０３】
「宿主生命体」は、任意の単離された単細胞又は多細胞の下等又は高等生命体を意味し、本発明による抗体を生成するために本発明のポリヌクレオチドが導入される。
【０１０４】
宿主生命体にポリヌクレオチドを効果的に導入して前記ポリヌクレオチドによってコードされた抗体を宿主生命体に生成させる種々の方法は、当業者には既知である。例として網羅的ではなく、この方法として電気穿孔法、リポフェクション、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefasciens)を用いる植物の生物学的トランスフォーメーション、熱ショック、又は化学的方法が挙げられ得る。
【０１０５】
有利には、宿主生命体は酵母、細菌、又は真菌等の微生物である。そのような微生物をトランスフォームすることによって、本発明の抗体を半工業的又は工業的なスケールで生成することが可能になる。
【０１０６】
変形例では、宿主生命体は哺乳類細胞等の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、ヒトを例外とする動物、又は植物である。
【０１０７】
そのような宿主生命体を用いて本発明による抗体を生成することができる。本発明による抗体を生成するための方法は、
a) 本発明による宿主生命体、特に単細胞宿主生命体を培地中、適切な条件下で培養する工程、
b) 前記培養された宿主生命体の培地から、又は前記培養された宿主生命体から前記抗体を回収する工程
を含む。
【０１０８】
本発明による抗体はまた、a)放射性同位元素、プロドラッグ、酵素、又は毒素によって標識された抗体を産生するため、及びb)前記抗体の結合の特異性及び/若しくは親和性、及び/又は安定性、及び/又は免疫原性を改変してETA-Rを過剰発現している細胞、特に膠芽腫等のがん細胞のターゲティングを確実にするために改変することができる。
【０１０９】
本発明による抗体はまた、これをペプチド分子、タンパク質分子、DNA、RNA、RNAi、アプタマー、PNA、又はLNA等の核分子、脂質分子、炭水化物分子、又は化学分子に化学的に又は遺伝子的に連結させるために改変することができる。
【０１１０】
したがって本発明は、細胞毒性基、易検出基、又はエフェクター基からなる群から選ばれる要素とコンジュゲートした本発明による抗体を含む化合物に関する。
【０１１１】
「細胞毒性基」は、本発明による抗体が標的とする細胞に対して直接又は間接に毒性の基を意味する。「直接細胞毒」は、それ自体が細胞毒である基を意味する。「間接細胞毒」は、それ自体は細胞毒ではないが、たとえば別の分子に対する作用を通して、又はそれに対する補助的な作用を通して細胞毒性を引き起こす可能性のある基を意味する。
【０１１２】
第1の実施形態では、細胞毒性基は細胞毒性の化学療法剤である。本発明の文脈において用いることができる種々の細胞毒性化学療法剤は当業者には既知である。これらの薬剤の活性は照射下に増大させることができる。説明的で非限定的な例として、メクロレタミン若しくはクロラムブシル等のアルキル化剤、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、ビンブラスチン、ゲムシタビン、フルダラビン、ニコチンアミド、ドキソルビシン、マイトマイシン、L-アスパラギナーゼ、シスプラチン、タキソール、及びそれらの類似体/誘導体について述べることができる。
【０１１３】
第2の実施形態では、細胞毒性基はリシン、アブリン、シュードモナス(Pseudomonas)のエクソトキシン、TNFα、及びインターロイキン2等の細胞毒性(ポリ)ペプチド基である。
【０１１４】
第3の実施形態では、細胞毒性基は間接的細胞毒性化学療法剤である。そのような薬剤はプロドラッグとも称され、そのままでは非細胞毒性又は僅かに細胞毒性であるが、特に酵素反応又は照射の後で、特に第1の実施形態で定義される細胞毒性物質(又は薬物)を生じることができる。説明的で非限定的な例として、メトトレキセート-アラニン、マイトマイシンホスフェート、5-フルオロシトシン、ホトフリン、及びカペシタビンについて述べることができる。
【０１１５】
第4の実施形態では、細胞毒性基は間接的細胞毒性(ポリ)ペプチド基である。間接的細胞毒性(ポリ)ペプチド基は、酵素活性を有し、特に第3の実施形態で定義した比較的非毒性のプロドラッグを特に第1の実施形態で定義した細胞毒性物質に変換することができる(ポリ)ペプチドを意味する。そのような間接的細胞毒性(ポリ)ペプチド基の中では、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、又はエンドペプチダーゼ等のペプチダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、アミダーゼ、キナーゼ、グリコシダーゼ、デアミナーゼ、リダクターゼ、及びオキシダーゼについて述べることができる。
【０１１６】
第5の実施形態では、細胞毒性基は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアプタマー等の直接又は間接に細胞毒性の核酸分子である。
【０１１７】
第6の実施形態では、細胞毒性基はヨウ素131、イットリウム90、ルテチウム177、銅67、又は鉛212等の放射性同位元素である。
【０１１８】
本発明による抗体が得られ又は生成されれば、その抗体にこれらの基をコンジュゲートする種々の手法は、当業者には既知である。
【０１１９】
これらの手法により、本発明による抗体及び細胞毒性基が有する特定の化学基を利用して、本発明による抗体と細胞毒性基との間の共有結合による連結が可能になる。これらの特定の化学基の中では、チオール基、エステル基、アミノ基、酸基、及びクリック化学反応において用いることができる任意の化学要素について述べることができる。
【０１２０】
変形例では、特に細胞毒性基がペプチド性の基である場合には、このコンジュゲート化は本発明による化合物を遺伝子組み換え手法によって融合化合物の形態で生成する工程からなり、ポリヌクレオチドは、相互に隣接し、並置され、又は最終のハイブリッド化合物の必要な特性を破壊しないペプチドリンカーをコードする領域によって分離された、本発明による抗体と細胞毒性基とをコードするそれぞれの領域を含む。
【０１２１】
本発明の抗体と細胞毒性基をコンジュゲートするために用いる手法が何であろうと、このコンジュゲート化に関して従うべき唯一の制約は、コンジュゲートされた抗体がETA-Rに対する結合の特異性、即ち細胞毒性基の特性に関連する特性を保っているということである。
【０１２２】
「易検出基」は、本発明の文脈においては、顕微鏡、シンチグラフィー、及び磁気共鳴イメージング(MRI)等の有利には非侵襲的な、好適な検出手法を用いて検出することができる基を意味する。そのような易検出基を含む本発明による化合物は、イメージング及び診断の分野に好適である。この化合物の中に存在する抗体のETA-Rに対する結合の特異性により、特にETA-Rが過剰発現している部位を同定し位置を決めることが可能になる。
【０１２３】
第1の実施形態では、易検出基は、好適な基質の存在等の特定の条件下で検出可能でおそらく定量も可能なシグナルを産生することができる酵素又は分子であってよい。説明的で非限定的な例として、ビオチン、ジゴキシゲニン、5-ブロモデオキシウリジン、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)、グルコースアミラーゼ、及びリゾチームについて述べることができる。
【０１２４】
第2の実施形態では、易検出基は、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、GFP(「緑色蛍光タンパク質」の略)及びその誘導体、ウムベリフェロン及びその誘導体、ルミノール、ルシフェラーゼ及びルシフェリン等の蛍光マーカー、化学蛍光マーカー、又は生物発光マーカーであってよい。
【０１２５】
第3の実施形態では、易検出基は、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素126、ヨウ素133、インジウム111、インジウム113m、臭素77、ガリウム67、ガリウム68、ルテニウム95、ルテニウム97、テクネチウム99m、フッ素18、炭素13、窒素15、酸素17、スカンジウム47、テルリウム122m、ツリウム165、及びイットリウム199等の放射性ラベル又は同位元素であってよい。易検出基として用いられるいくつかの放射性原子は、それらが送達することができる放射性の量によって、細胞毒性基を構成してもよいことに注目されたい。
【０１２６】
本発明による抗体と細胞毒性基とのコンジュゲーションに関連する上記の説明の全ては、本発明による抗体と易検出基とのコンジュゲーションにも、必要に応じて変更して適用される。本発明による抗体と易検出基とのコンジュゲーションは、その濃度を高め、したがって放射されるシグナル、コントラスト、又は毒性を改善するために、ナノ目的物に関しても達成することができる。
【０１２７】
この易検出基が放射性ラベルである場合には、これを本発明による抗体のペプチド配列に導入してもよい。この導入は、1つ又は複数の標識したアミノ酸を用いる抗体の合成の間に行ってよい。変形例では、この導入は合成した抗体のペプチド配列の残基に放射性ラベルを固定することによって、この合成の後に行ってよい。たとえば、リジン残基を介してイットリウム90を固定することができる。変形例ではまた、公知の手段によって放射性ラベルを抗体に直接固定してよい。たとえば、EDTA又は別のキレート化剤を本発明による抗体に結合して、インジウム111を固定するために用いてもよい。
【０１２８】
本発明は、医用イメージングにおいて極めて効率的な診断用、予測用、及びインビボモニタリング用のツールとしての抗体及び易検出基を含む化合物の使用に関する。抗体のフォーマットは、最良のシグナル対ノイズ比及び最良の薬物動力学を産生するように選ばれる。
【０１２９】
換言すれば、本発明は
a) 生物学的試料を本発明による化合物と接触させる工程、
b) 前記化合物と前記エンドセリン受容体サブタイプAとの複合体を検出する工程
を含む、エンドセリン受容体サブタイプAの発現又は過剰発現をインビボ又はインビトロで検出し定量するための方法に関する。
【０１３０】
本方法は、エンドセリン受容体サブタイプAが過剰発現している状態を検出し、診断し、予測し、又はモニタリングするため、特にがんの状態(がん腫瘍の存在、大きさ、及び進展)を検出し、診断し、予測し、又はモニタリングするために用いることができる。膠芽腫等のがんを診断するための方法の場合には、本方法は、
a1') 対象の生物学的試料を本発明による化合物と接触させる工程、
b1') 易検出基によって放射されるシグナルを検出する工程、及び
c1') 工程(b1')で検出され、任意選択で対照シグナルと比較したシグナルに基づいて前記対象におけるがんの存在又は非存在を決定する工程
を含む。
【０１３１】
「対照シグナル」は、本発明の文脈においては、健常な対象について得られたシグナル若しくは平均シグナル値、又は一方、がんの対象について得られたシグナル若しくは平均シグナル値を意味する。
【０１３２】
特定の実施形態では、本発明による診断方法は、工程(a1')を実行する前に生検等の生物学的試料を対象から採取するインビトロで実施する方法である。変形例では、本方法は、有効量の本発明による化合物が前もって対象に投与されているインビボイメージング法に対応し得る。「有効量」は、がんをイメージングするのに十分な化合物の量を意味する。この量は、投与モード、投与される製剤、賦形剤、及び診断すべきがんによって異なる。しかし、この有効量を決定することは当業者には日常の仕事である。
【０１３３】
「エフェクター基」は、本発明の文脈においては、がんマーカーを特異的に認識することができ、又は(i)免疫系のエフェクター細胞、即ちNK細胞、細胞毒性T細胞、又はマクロファージ、又は(ii)補体系の動員を可能にする基を意味する。「がんマーカーを特異的に認識することができる基」は、本発明の文脈においては、がんマーカーのリガンド、本発明による抗体と同一の又は異なる抗体、タンパク質、ペプチド、又はDNA、RNA、RNAi、アプタマー、PNA、若しくはLNA等の核分子を意味する。「がんマーカー」としては、ETA-R及び別の膜マーカーの両方が想定される。
【０１３４】
第1の実施形態では、エフェクター基は、がん細胞の表面に発現するETA-Rと同一又は異なるがんマーカーを認識し、より良い認識特異性及びしたがって増大したがん細胞のターゲティングを提供する。
【０１３５】
第2の実施形態では、エフェクター基は、免疫系のエフェクター細胞、即ちNK若しくはマクロファージ細胞、又は細胞毒性T細胞の表面上に特異的に存在するマーカーについて認識特異性を有する。そのような動員は、本発明の抗体によって認識されるがん細胞の標的溶解を提供する。
【０１３６】
第3の実施形態では、エフェクター基は、補体系、特にC1タンパク質又はその切断された形態のC1qについて認識特異性を有し、これは標的細胞の死をもたらす分子事象のカスケードを開始する。そのような動員は、本発明の抗体によって認識されるがん細胞の標的溶解を提供する。
【０１３７】
第4の実施形態では、エフェクター基は、補体系、特にC3タンパク質及びその切断された形態のC3bについて認識特異性を有し、それにより免疫系のエフェクター細胞、即ち標的細胞の死を引き起こす細胞の動員を提供する。そのような動員は、本発明の抗体によって認識されるがん細胞の標的溶解を提供する。
【０１３８】
本発明は、薬物としての使用のための、本発明による抗体、本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による化合物に関する。
【０１３９】
したがって、本発明は、活性成分として本発明による抗体、本発明によるポリヌクレオチド、又は本発明による化合物、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物に関する。
【０１４０】
「薬学的に許容されるビヒクル」は、本発明によれば、本発明による抗体、ポリヌクレオチド、又は化合物に添加されてその輸送を助け、前記組成物中におけるそれらの実質的な分解を防止し、及び/又はその半減期を増大させる物質を意味する。有利には、そのような薬学的に許容されるビヒクルは無菌であり、発熱性がない。これは本発明の医薬組成物の適用の種類に従って、特にその投与方法に従って選ばれる。
【０１４１】
したがって、本発明による医薬組成物は、遊離型又は付加塩の型の本発明による少なくとも1つの抗体、若しくはポリヌクレオチド、若しくは化合物と、純粋な状態若しくは他の任意の薬学的に適合性の製品と会合した組成物の形態の薬学的に許容される酸とからなっている。本発明による医薬組成物は、非経口経路、たとえば静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、若しくは皮下の経路によって全身的に、局所的、経口、経直腸、鼻内、又は吸入によって採用することができる。
【０１４２】
経口投与のための固体組成物として、その中で本発明による抗体、ポリヌクレオチド、又は化合物が1つ又は複数の従来使用されている不活性な希釈剤及び任意選択で他の物質、たとえば滑剤、色素、コーティング、その他と混合される錠剤、ピル、粉末、その他を用いることができる。
【０１４３】
経口又は眼科用投与のための液体組成物として、従来使用されている不活性な希釈剤及び任意選択で湿潤剤、甘味剤、増粘剤、その他の他の物質を含む薬学的に許容される懸濁液、溶液、エマルジョン、又はシラップを用いることができる。
【０１４４】
非経口投与のための無菌組成物は、水性若しくは非水性の溶液、懸濁液、又はエマルジョンでよい。溶媒又はビヒクルとして、水、プロピレングリコール、植物油、又はその他の好適な有機溶媒を用いることができる。これらの組成物は、湿潤剤、等浸透圧剤、乳化剤等のアジュバントを含んでもよい。
【０１４５】
局所投与のための組成物は、たとえばクリーム、ローション、咽喉スプレー、点鼻剤若しくは点眼剤、又はエアロゾルであってよい。
【０１４６】
本発明による抗体、ポリヌクレオチド、又は化合物の日用量は通常、単一又は分割の用量で投与して成人1人あたり1〜1000mg(即ち約0.015〜15mg/kg)である。これらの用量は説明のためのみのものである。医師は全ての場合に所与の個別の患者に最も適した実際の用量を決定することができ、これは患者の年齢、体重、及び応答によって変化する。
【０１４７】
本発明は、エンドセリン及び特にエンドセリン受容体サブタイプA等の少なくとも1つのエンドセリン受容体を含む軸の、直接の又は別の生理学的経路を伴う機能不全が関与する病気又は病変の治療及び/又は予防における使用のための、本発明による抗体、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による化合物、又は本発明による医薬組成物に関する。
【０１４８】
有利には、そのような病気又は病変はがんである。がんとして、黒色腫、結腸直腸がん、結腸がん、カポジ肉腫、膠芽腫、卵巣がん、及び膀胱がんについて述べることができる。典型的には、この病気は膠芽腫である。
【０１４９】
再び換言すれば、本発明は、エンドセリン及び特にエンドセリン受容体サブタイプA等の少なくとも1つのエンドセリン受容体を含む軸の直接の又は別の生理学的経路を伴う機能不全が関与する病気又は病変に罹患した又は罹患しやすい患者におけるこれらの病気又は病変の治療及び/又は予防のための方法に関する。本方法は、本発明による抗体、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による化合物、又は本発明による医薬組成物の有効量を前記患者に投与する工程を含む。
【０１５０】
最後に、本発明は、エンドセリン/エンドセリン受容体軸に関連するシグナリング法についてのこの研究に特に適した、並びにこの受容体のファミリーの構造的及び機能的な特徴の理解の進展のための研究用ツールとしての、本発明による抗体又は本発明による化合物の使用に関する。
【０１５１】
本発明のその他の特徴及び利点は、添付した図面を参照し、説明のため非制限的に提供する以下の実施例を読むことによって、当業者には明白になる。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】エンドセリン1(ET1)の存在下又は非存在下に、ETA-Rを過剰発現しているCHO細胞(CHO-ETAR)又はETA-Rを発現していないCHO(CHO-WT)へのRendomab-A63の結合の曲線を提示する図である。
【図２】ETA-Rを過剰発現している膠芽腫細胞株GLI-7へのRendomab-A63の結合曲線を提示する図である。
【図３】非腫瘍神経細胞(非腫瘍と注記)と比較した、患者の膠芽腫細胞(GBMと注記)におけるエンドセリンA受容体をコードするEDNRAトランスクリプトの発現のレベルの差を提示する図である。
【図４Ａ】1μMのET1-FAMの存在下における膠芽腫細胞株GLI-7の免疫蛍光の結果を提示する図である。核はDRAQ5によって染色している。
【図４Ｂ】30nMのRendomab-A63(RA63)の存在下における膠芽腫細胞株GLI-7の免疫蛍光の結果を提示する図である。核はDRAQ5によって染色している。
【図４Ｃ】30nMの対照抗体(NC)の存在下における膠芽腫細胞株GLI-7の免疫蛍光の結果を提示する図である。核はDRAQ5によって染色している。
【図５】エンドセリンタイプA受容体をトランスフェクトしたCHO細胞(CHO ETAR)(黒色の連続線)への、及び100nMのエンドセリン1(ET1)の存在下(灰色の破線)におけるRendomab Axx抗体(これは本発明の一部を形成しない)の結合の曲線を提示する図である。
【図６】Alexa fluor 488 (Raxx-AF488)でラベルした二次抗体によって明らかになった、30nMのRendomab-Axx(RAxx)の存在下における膠芽腫細胞株GLI-7における免疫蛍光によるマーキングを提示する図である。核はDRAQ5によって染色している。2つの画像はマージしてある(融合)。
【図７】図７Ａは、GLI-7細胞を同じ位置に異種移植した前臨床ヌードマウスモデルにおけるインビボ蛍光イメージングの結果を提示する図である。Rendomab A63-AF680及び対照のAF750の検出の陽性対照を提示する。図７Ｂは、GLI-7細胞を同じ位置に異種移植した前臨床ヌードマウスモデルにおけるインビボ蛍光イメージングの結果を提示する図である。移植したマウス及び対照マウスにおけるインビボ蛍光の検出を提示する。図７Ｃは、GLI-7細胞を同じ位置に異種移植した前臨床ヌードマウスモデルにおけるインビボ蛍光イメージングの結果を提示する図である。移植した脳及び対照の脳におけるエクスビボ蛍光の検出を提示する。
【図８】Rendomab-A63の軽鎖及び重鎖の可変ドメインから推定したヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を提示する図である。
【発明を実施するための形態】
【０１５３】
I. 装置及び方法
本発明において用いた免疫及びハイブリドーマの選択の戦略は、国際出願WO第2012/045776号[14]及びWO第2017/220739号[15]において用いられたものと同一である。
【０１５４】
II. 生化学的特徴解析
Rendomab-A63をプロテインA-PropSep高容量(Millipore社)で精製した後に、その生化学的特性の特徴解析を行った。
【０１５５】
Rendomab-A63の重鎖及び軽鎖のアイソタイプ決定は、Piercell社の「Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping」キットを用いて行った。これはG型免疫グロブリンであり、重鎖のアイソタイプは2b、軽鎖のアイソタイプはカッパである。したがってRendomab-A63はIgG2b/カッパ型の免疫グロブリンである。
【０１５６】
細胞環境におけるETA-R(CHO-ETAR及びGli-7細胞)のRendomab-A63による認識は、フローサイトメトリー及び免疫蛍光細胞マーキングによって確立した。
【０１５７】
Rendomab-A63についての結合曲線を、
i) ETA-Rを発現していないCHO(「チャイニーズハムスター卵巣」の略)細胞株(CHO-WT)で、
ii) 安定な様式でトランスフェクトしてETA-Rの強い発現を可能にしたCHO-ETAR株、CHO細胞で、及び
iii) 患者の膠芽腫の切除の後の生検からJean-Philippe Hugnot博士によって確立された膠芽腫細胞株Gli-7の株で、
生成した。
【０１５８】
蛍光はFACSCalibur(商標)(BD Bioscience社)を用いるフローサイトメトリーによって定量する。最大で1μM、最小で5pMの間の濃度範囲の抗体を100nMのET1(4℃で30分プレインキュベートした)の存在下又は非存在下に、4℃で2時間インキュベートした。90%のコンフルエンスで、ヴェルセンの存在下に細胞を剥離し、4℃で保存した飽和緩衝液(PBS-SNC 5%-BSA 0.1%)の存在下にチューブに分注(300μl/細胞300,000個)する。PBS緩衝液で3回洗浄した後、Alexa Fluor(商標)488(AF-488)でラベルして400倍に希釈した300μlの二次抗体を加え、4℃で60分インキュベートした(ヤギ抗マウスIgG、Invitrogen社ref A10684)。それぞれの抗体濃度の点について、PBSで3回洗浄した後、10,000個の細胞をフローサイトメトリーで計数した。
【０１５９】
データはGraphPad Prismソフトウェアで解析し、曲線をパラメーター:特異的結合部位に従ってモデル化した。計算した見かけの解離定数は、ET1の存在下又は非存在下でCHO-ETARの曲線において0.5nMに近いKd値を与えた(図1)。したがってRA63の結合はET1の存在によって改変されていなかった。更に、CHO-WT細胞にはRendomab-A63の結合は存在しないことが分かり、ETA-Rについての結合特異性が実証された。
【０１６０】
図2に示すように、Gli-7細胞の表面上に発現したETA-Rに対するRA63の親和性は、1ナノモル濃度(15nM)程度である。
【０１６１】
III. 膠芽腫Gli-7細胞株の免疫蛍光
III.1. 序言
膠芽腫腫瘍細胞は、図3に提示するGliovis社の公衆ベース(http://gliovis.bioinfo.cnio.es/)のトランスクリプトデータによって示されるように、ET-1[20]及びエンドセリンタイプA受容体(ETAR)を過剰発現していることが公知である。これらのデータは、患者の膠芽腫細胞におけるEDNRAトランスクリプトの過剰発現を明らかに示している。
【０１６２】
III.2. 結果
図4は、以下の操作条件:
-  1μMのET1-FAM(Phoenix Pharmaceuticals社FG-023-01A)の存在下(図4A)、
-  30nMのRendomab-A63の存在下(図4B)、及び
-  30nMの対照抗体(NC)の存在下で同じ二次抗体を400倍に希釈(図4C)
における膠芽腫Gli-7細胞株の免疫蛍光の結果を提示する。
【０１６３】
核は供給元のプロトコルに従い、DRAQ5(Abcam社、ab108410)によって染色する。Gli-7細胞は1μMのET1FAM、又は最終30nMのRA63、又は最終30nMのNCのいずれかとともに4℃で12時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、抗体でラベルするために、AF488を連結して400倍に希釈した二次抗体(Invitrogen社、ref A10684)を4℃で2時間、細胞に加える。PBSで3回洗浄した後、共焦点顕微鏡(ZEISS)で観察するために水性媒体Aquatex(登録商標)(VWR 1 08562 0050)中で細胞をプレート上でマウントした。
【０１６４】
図4Aにより、エンドセリン1と結合することが可能なエンドセリン受容体がGli-7細胞の上に存在することが確認できる。図4Bがエンドセリン受容体Aを認識するRA63抗体によるGli-7細胞の極めて強い免疫標識を示す一方、RA63(IgG2bカッパ)と同じアイソタイプの陰性対照抗体(NC)はGli-7細胞の上でシグナルを何ら産生しない(図4C)。これら全ての結果から、ETA-Rに対して特異的なRA63抗体の結合によって明らかにされるGli-7細胞の表面上のETA-Rの強い発現があると結論付けることが可能である。対照抗体を用いたときにシグナルがないことによって示されるように、この結合はRA63抗体の可変領域によってよく媒介されている。
【０１６５】
III.3. 比較結果
本発明によるRA63抗体を産生することができた免疫プロセスにおいて、複数のモノクローナル抗体が得られた。
【０１６６】
特に、ETARに対するRendomab-Axx抗体はnMの親和性を有しているが、そのエンドセリン受容体Aへの結合はET1の濃度100nmだけシフトしている(図5)。したがって、この抗体は特許出願CA第2971491号[13]に記載された抗体の特性と同程度の特性を有している。
【０１６７】
この同じ抗体Raxxは、図6に提示する免疫蛍光実験によって示されるように、膠芽腫細胞に結合することができない。この実験は、Raxx抗体によって認識されないがRA63抗体によって認識される膠芽腫細胞の表面上に存在するETAR受容体のコンフォメーションが実在することを実証している。
【０１６８】
IV. 前臨床動物モデルにおける蛍光トモグラフィーによるインビボイメージング
図7に、Gli-7細胞を同じ位置に異種移植した前臨床ヌードマウスモデルにおけるインビボ蛍光イメージングの結果を提示する。
【０１６９】
図7Aでは、蛍光を検出するために用いたフィルターの特異性を実証するために、固体FMT 1500支持体(Perkin Elmer社)の上で、i) RA63-AF680のみが検出可能な蛍光シグナルを放射する680nm、又はii) NC-AF750のみが検出可能な蛍光シグナルを放出する750nmで、RA-AF680及びNC-AF750のトレーサーの量の範囲をイメージングした。
【０１７０】
図7Bでは、異種移植の後D0+3か月でマウスをイメージングした。異種移植したヌードマウス及び正常のヌードマウス(対照マウス)で、腹腔内経路(IP)により、RA63-AF680トレーサー(14nmolのRA63を8nmolのAF680と連結)及びNC-AF750(17nmolの対照抗体を7nmolのAF750と連結)の共注射を行った。
【０１７１】
IP注射して血液循環からトレーサーを除去するために必要な10日の後に、FMT 1500(Perkin Elmer社)でマウスをイメージングした。それぞれのマウスについて、680nm及び750nmでの同時取得を行った。異種移植したマウスの頭部で680nmの強い蛍光が観察された一方、この同じマウスでNC-AF750トレーサーは750nmに蛍光を産生しない。したがって、GLI-7株の異種移植した生存マウスではRA63-AF680トレーサーのみが検出された。正常マウスに注射したRA63-AF680及びNC-AF750の検出が存在しないことも注目された。
【０１７２】
図7Cでは、マウスを屠殺し、その脳を取り出して4%のパラホルムアルデヒド溶液(PFA 4%)で、4℃で1時間固定した。以前と同様に脳をイメージングした。腫瘍細胞を移植した脳ではRA63-AF680トレーサーによる強い蛍光が再び観察された一方、NC-AF750トレーサーでは信号は検出されない。対照マウスの脳では2つのトレーサーRA63-AF680及びNC-AF750で蛍光が存在しないことも見出される。
【０１７３】
結論として、RA63抗体はイメージングの用途で膠芽腫腫瘍細胞(Gli-7)の存在を診断するためのトレーサー(RA63-AF680)として用いることができる。
【０１７４】
V. 分子クローニング
Rendomab-A63の重鎖及び軽鎖をコードする核トランスクリプトのクローニングを、キット「GenElute/Total RNA」(Sigma-Aldrich社)及び「RACE-PCR」(Invitrogen社)を用いて実施した。
【０１７５】
Rendomab-A63の軽鎖(VL)及び重鎖(VH)の可変ドメインの推定した核アミノ酸配列を図8に提示する。
［参考文献］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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