(57)【要約】  抗ＰＤ−１／抗ＶＥＧＦ天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造である。天然ＩｇＧの特徴を有し、重鎖および軽鎖のミスマッチがなく、高度に安定したヘテロ二量体型抗ＰＤ−１／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体及びその製造方法を提供する。その二重特異性抗体は、２つの標的分子を同時に結合でき、複雑な疾患の治療により効果的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−１に特異的に結合できる第１の抗原結合領域及びＶＥＧＦに特異的に結合できる第２の抗原結合領域を含むヘテロ二量体型二重特異性抗体において、前記二重特異性抗体は、１つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合によって連結された第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域を含み、その第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、それぞれ共有結合又はリンカーを介してＰＤ−１抗原結合領域及びＶＥＧＦ抗原結合領域に連結され、或いは、その第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、それぞれ共有結合又はリンカーを介してＶＥＧＦ抗原結合領域及びＰＤ−１抗原結合領域に連結され、且つ、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、以下の部位に５つのアミノ酸の置換を含み、
第１のＦｃ領域の３６６番目及び３９９番目のアミノ酸の置換、第２のＦｃ領域の３５１番目、４０７番目及び４０９番目のアミノ酸の置換、
前記のアミノ酸の置換を含む第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、それぞれホモ二量体を形成する傾向よりも、互いにヘテロ二量体を形成する傾向があり、
ここで、アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付けシステムに従って番号付けされている、ヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項２】
第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のアミノ酸の置換は、以下の通りであり、
ａ）３５１番目のアミノ酸の置換は、グリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン又はトリプトファンであり、
ｂ）３６６番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、プロリン、トリプトファン又はバリンであり、
ｃ）３９９番目のアミノ酸の置換は、システイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニン又はアラニンであり、
ｄ）４０７番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン又はヒスチジンであり、及び
ｅ）４０９番目のアミノ酸の置換は、システイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミン又はアルギニンである、請求項１に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項３】
アミノ酸の置換は、
ａ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖの置換；
ｂ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃの置換；
ｃ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐの置換；
ｄ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換；
ｅ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換；
ｆ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆの置換；
ｇ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑの置換；
ｈ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒの置換を含む、請求項１又は２に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項４】
第１のＦｃ領域のアミノ酸の置換は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒであり、第２のＦｃ領域のアミノ酸の置換は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖである、請求項１に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項５】
Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項６】
ＰＤ−１及びＶＥＧＦ抗原結合領域は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片及びＶＨＨ断片から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項７】
ＰＤ−１及びＶＥＧＦ抗原結合領域は、いずれもＦａｂ断片である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項８】
ＰＤ−１及びＶＥＧＦ抗原結合領域は、一方が、Ｆａｂ断片であり、他方がｓｃＦｖである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項９】
Ｆａｂ断片は、異なる第１の重鎖可変領域及び第２の重鎖可変領域、並びに異なる第１の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項１０】
第１のＦｃ領域及びその連結されたＰＤ−１抗原結合領域と第２のＦｃ領域及びその連結されたＶＥＧＦ抗原結合領域と、又は第１のＦｃ領域及びその連結されたＶＥＧＦ抗原結合領域と第２のＦｃ領域及びその連結されたＰＤ−１抗原結合領域とは、単独で存在し、還元剤が存在する場合には、形成されたホモ二量体の重量比はいずれも５０％未満である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項１１】
二重特異性抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２から選ばれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１から選ばれる請求項１２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
発現ベクターは、ｐＣＤＮＡに基づいて改造されたプラスミドベクターＸ０ＧＣである、請求項１４に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１２又は１３に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は請求項１４又は１５に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づいて改造されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づいて改造されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセニューラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞Ｈｉｇｈ５、ＳＦ９；植物細胞；哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体又は請求項１２又は１３に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項１４又は１５に記載の組換え発現ベクター又は請求項１６又は１７に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容されるベクターを含む、組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体を産生する方法であって、
１）請求項１２又は１３に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項１４又は１５に記載の組換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させるステップと、
２）宿主細胞内でそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
３）還元されたタンパク質を混合し、その後、混合物を酸化するステップとを含む、方法。
【請求項２０】
宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づいて改造されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｆ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づいて改造されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセニューラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞Ｈｉｇｈ５、ＳＦ９；植物細胞；哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
還元工程は、１）還元反応は、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン又は他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で行うステップと、２）還元剤を除去するステップとを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
酸化工程は、空気中で酸化することであり、酸化剤の存在下で酸化反応を行うことも含み、前記酸化剤はＬ−デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、単離精製のステップを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び／又は請求項１２又は１３に記載の単離されたポリヌクレオチド及び／又は請求項１４又は１５に記載の組換え発現ベクター及び／又は請求項１６又は１７に記載の宿主細胞及び／又は請求項１８に記載の組成物の、対象の疾患を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における用途。
【請求項２５】
対象の疾患を予防及び／又は治療するための医薬品として用いられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び／又は請求項１２又は１３に記載の単離されたポリヌクレオチド及び／又は請求項１４又は１５に記載の組換え発現ベクター及び／又は請求項１６又は１７に記載の宿主細胞及び／又は請求項１８に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び／又は請求項１２又は１３に記載の単離されたポリヌクレオチド及び／又は請求項１４又は１５に記載の組換え発現ベクター及び／又は請求項１６又は１７に記載の宿主細胞及び／又は請求項１８に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与すること、を含む、疾患を予防及び／又は治療する方法。
【請求項２７】
対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである、請求項２４に記載の用途、請求項２５に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、或いは請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫から選ばれる、請求項２４に記載の用途、請求項２５に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞又は組成物、或いは請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＰＤ−１／抗ＶＥＧＦ天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造に関する。具体的には、本発明は、天然ＩｇＧの特徴を有しながら、重鎖および軽鎖のミスマッチがない高度に安定なヘテロ二量体型の抗ＰＤ−１／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、単一のエピトープにのみ作用する高度に特異的な抗体であり、例えば、癌、炎症及び自己免疫疾患、感染症などの多くの疾患の治療に広く使用されている。しかし、このような治療用分子は、単独で使用すると、どれにも十分な薬効を発揮できなく、これは、疾患の複雑性によるものである。例えば、癌や炎症性疾患は、通常、複数の疾患で媒介される分子経路及びシグナル経路間のクロストークに関する。これらの場合、単一ターゲット分子は最良の治療効果を与えることができないが、複数のターゲット又は同一のターゲットの複数部位を同時にブロックする分子は、治療効果を改善させることができる。複数の単一特異性分子を使用する薬物の併用と比較しては、多重特異性、例えば、二重特異性分子を使用するマルチターゲット療法は、新しい作用メカニズムを導入することにより薬効を高め、毒性や副作用を軽減することができるとともに、単一分子として、新薬開発プロセスを簡単化し、患者及び医療従事者が使用するのに便利である。
この分野では、多くの異なる形態の二重特異性抗体または二機能性分子が報告されている。最初の二重特異性抗体は、化学的方法により二機能性カップリング試薬を使用して２つの既存のＩｇＧ分子、Ｆａｂ’又は（Ｆａｂ’）２断片を連結したものである。但し、このような化学的にカップリングされた二重特異性抗体は、例えば、生産の作業強度、ヘテロコンジュゲートの精製、ホモコンジュゲート及びオリジナルの単一特異性抗体又は断片の除去の複雑性及び低収率など多くの制限がある。
二重特異性抗体を作製するための他の方法は、ハイブリッドハイブリドーマ（又はクアドローマ、ｑｕａｄｒｏｍａ）技術を使用し、異なる抗体を分泌する２つのハイブリドーマ細胞株の体細胞融合により生成される。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダムなペアリングにより、抗体混合物の１／１０のみが必要な機能的二重特異性抗体であり、精製プロセスが複雑になり、生産収率が低下するようにする。
【０００３】
国際公開２０１３／０６０８６７号は、まず２種の混合されているホモ二量体型抗体を還元し、その後、このような２種のホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称アミノ酸突然変異を導入することにより異なる抗体のＦａｂアーム交換を促進し、最後にヒンジ領域の鎖間ジスルフィド結合を酸化して安定な二重特異性抗体を形成する、テロ二量体二重特異性抗体の大規模生産方法を記載している。
国際公開２００９／０８９００４号は、ＣＨ３−ＣＨ３接合部分のアミノ酸を電荷を持つアミノ酸として突然変異させることにより、静電気力によりヘテロ二量体の形成を促進するが、ホモ二量体の形成に不利である、ヘテロ二量体タンパク質の調製方法を記載している。
米国特許５７３１１６８号は、「空隙への突起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）」戦略によるヘテロ二量体ＩｇＧの製造方法を記載している。その方法は、第１の鎖のＣＨ３領域境界での小さいアミノ酸を大きいアミノ酸に置き換えて「突起」を形成するとともに、第２の鎖のＣＨ３領域境界での対応する大きいアミノ酸を小さいアミノ酸に突然変異させて「空隙」を形成する。突起と空隙の相互作用は、ヘテロ二量体ＩｇＧの形成を促進するが、ホモ二量体の形成に不利である。
【０００４】
国際公開２０１２／０５８７６８号は、安定で高特異的なヘテロ二量体ＩｇＧの調製方法を記載している。その方法は、負及び正の両方の設計と、コンピューターモデルに基づくタンパク質工学技術とを組み合わせて、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの複数のアミノ酸を突然変異させることにより、安定したホモ二量体の不純物の含有量が低いヘテロ二量体ＩｇＧを形成する。
プログラム細胞死−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１、ＰＤ−１）は、近年大きな注目を集めている免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）となり、ＣＤ２８ファミリーメンバーに属する。ＣＤ２８ファミリーの他のメンバー、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合二量体を形成できるＣＴＬＡ４と異なり、ＰＤ−１は、単量体として存在する。ＰＤ−１の構造は、主に細胞外免疫グロブリン可変領域様ドメイン、疎水性膜貫通領域、及び細胞内領域を含み、その細胞内領域は、独立した２つのリン酸化部位を含み、それぞれ免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）である。ＰＤ−１は、主に活性化Ｔ細胞の表面に誘導的に発現し、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、ＤＣ細胞にも発現し、Ｔ細胞活性化の負の調節に主に関与し、免疫応答の強さ及び持続期間を調節することができる。ＰＤ−１のリガンドは、ＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｌｉｇａｎｄ  １）、ＰＤ−Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｌｉｇａｎｄ  ２）を含み、そのリガンドは、Ｂ７ファミリーに属し、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＤＣ細胞、及び内皮細胞、表皮細胞などを含む複数種の免疫細胞の表面に誘導的に発現するが、ＰＤ−Ｌ２は、マクロファージ、ＤＣ細胞、Ｂ細胞を含む幾つかの免疫細胞にのみ誘導的に発現する。ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１のリガンドとして機能することに加えて、ＣＤ８０のリガンドとしても機能し、Ｔ細胞に負の調節シグナルを伝達し、Ｔ細胞による免疫寛容を誘導することができる（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｒｅｖ、２０１３、１２（１１）：１０９１−１１００．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１３、４：４８１．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１２、１２（４）：２５２−２６４．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｊａｎ；２１（１）：２４−３３．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｄｅｃ  １５；１８（２４）：６５８０−７．）。正常な状態には、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１は、生体組織の自己免疫寛容を仲介して維持し、炎症反応中の免疫系の過剰な活性化による自己組織の損傷を防止し、自己免疫疾患の発生を回避するのに積極的な役割を果たし、病理学的状態には、腫瘍免疫および種々の自己免疫疾患の発生及び進行に関与する。多くの文献には、ＰＤ−Ｌ１は複数の腫瘍組織で高度に発現し、ＰＤ−１は腫瘍浸潤リンパ球で高度に発現し、且つＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１の過剰発現は腫瘍の臨床的予後不良と密接に関連していることが報告されている。（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１５；１５（３）：３０７−１３．Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｍａｒ；７（１）：１−１７．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｊａｎ；２１（１）：２４−３３．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３  Ｊｕｌ  ２５；３９（１）：６１−７３．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５  Ｊｕｎ  １０；３３（１７）：１９７４−８２．）。ＰＤ−１モノクローナル抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２のブロック又はＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ８０／ＰＤ−Ｌ１のブロックは、臨床的に優れた抗腫瘍効果を示す。現在、ＰＤ−１モノクローナル抗体は、非小細胞肺癌、黒色腫、頭頸部癌などを含む複数の腫瘍の治療のために米国ＦＤＡによって承認されている。ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、非小細胞肺癌及び尿路上皮癌の治療にも承認されている。しかしながら、このようなモノクローナル抗体療法から恩恵を受けることができるのは、ごく一部の癌患者のみであり、ほとんどの患者はこのようなモノクローナル抗体に反応しない（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１４  Ｄｅｃ；１８（１２）：１４０７−２０．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ  Ｐａｒｋ）．２０１４  Ｎｏｖ；２８  Ｓｕｐｐｌ  ３：１５−２８．）。
【０００５】
血管新生は、血管新生は腫瘍の進行及び転移の重要な要素であり、治療の予後に深刻な影響を及ぼす（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、２００７、６：２７３−２８６．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９、５９：８５６−８６１）。ＶＥＧＦシグナル伝達経路は、主に６種類のリガンド（ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ及びＰＧＦ）及び３種類の受容体（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３）を含み、ＶＥＧＦ−Ａ、即ち、いわゆるＶＥＧＦ及びその主要な受容体であるＶＥＧＦＲ２は、腫瘍の血管新生における最も重要な調節因子である（Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００３、９：６６９−６７６、２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：１１９４７−１１９５４）。ＶＥＧＦは、血管新生促進因子として、血管の透過性を高め、内皮細胞の増殖及び移動を刺激し、腫瘍の血管新生を促進し、腫瘍の成長、浸潤、転移に関与することができる。ＶＥＧＦは、複数種のヒト腫瘍で発現が亢進していることが発見されているが、その発現の亢進は、腫瘍組織の血管新生の数に直接関係し、腫瘍の臨床的予後不良と密接に関連し、これらの腫瘍は、乳がん、大腸がん、非小細胞性肺癌、卵巣がんなどを含む（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９５、３３３：１７５７−１７６３．Ｇａｓｐａｒｉｎｉ  Ｇ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９５、１３：７６５−７８２．）。ＶＥＧＦシグナル伝達経路の遮断は、前臨床、臨床試験でも良好な抗腫瘍効果が示されている。現在、ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、非小細胞肺癌、大腸がんなどを含む複数の腫瘍の治療に承認されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００２、１０２：１０２−１０８．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００１、８５：５８４−５８９．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、６０：５１１７−５１２４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２００３；２１：６０−６５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２００４、２２：２１８４−２１９１．）
最近の研究により、ＶＥＧＦは腫瘍免疫と密接に関連していることが分かった（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３、３９（１）：６１−７３．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ、２０１１、３０（１）：８３−９５．）。腫瘍微小環境では、アップレギュレートされたＶＥＧＦは内皮細胞に作用して接着分子の発現を阻害することにより、Ｔ細胞の接着及び浸潤を阻害し、さらに、ＶＥＧＦは、複数種の免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＩＤＯなどをアップレギュレートし、エフェクターＴ細胞の活性化を阻害する。ＰＤ−１シグナルとＶＥＧＦシグナルを同時に阻害すると、より良い抗腫瘍効果を有し、文献で報告されている動物実験データ及び臨床データがこの戦略を初期にサポートしている（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１３、１７２（３）：５００−６．Ｓｚｎｏｌ  ｅｔ  ａｌ、ＡＳＣＯ、ＧＵ  ２０１５）。ＰＤ−１モノクローナル抗体とＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体の併用、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体とＶＥＧＦモノクローナル抗体の併用は、優れた相乗効果を示している。
【０００６】
併用投与は、２つ又は複数の抗体を順次注入するか、又は抗体を同じ剤形に作製する必要がある。しかしながら、一方、抗体を順次注入すると患者のコンプライアンスを低減させ、痛みを増加させる。他方、異なる抗体の物理的および化学的性質の違いにより、異なる抗体を同じ剤形にすることは困難またはほとんど不可能である。
上記の状況を鑑みて、依然としてもＰＤ−１及びＶＥＧＦシグナル伝達経路を同時に遮断する新規な治療薬を研究する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、天然ＩｇＧの構造特徴を有し、重鎖および軽鎖のミスマッチがない高度に安定なヘテロ二量体型である、ＰＤ−１及びＶＥＧＦを同時に阻害できる、新規な二機能性抗体及びその製造方法を提供し、その二機能性抗体は、ＰＤ−１及びＶＥＧＦを同時に高発現する腫瘍細胞に選択的に結合する傾向があるため、高効率で特異的な殺傷効果を発揮しつつ、毒性及び副作用が低く。
【０００８】
本発明に係る第１の側面は、ＰＤ−１に特異的に結合できる第１の抗原結合領域とＶＥＧＦに特異的に結合できる第２の抗原結合領域とを含むヘテロ二量体型二重特異性抗体において、前記二重特異性抗体は、１つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合によって連結された第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域を含み、その第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、それぞれ共有結合又はリンカーを介してＰＤ−１抗原結合領域及びＶＥＧＦ抗原結合領域に連結され、又はその第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、それぞれ共有結合又はリンカーを介してＶＥＧＦ抗原結合領域及びＰＤ−１抗原結合領域に連結され、且つ、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、以下の部位に５つのアミノ酸の置換を含み、即ち
第１のＦｃ領域の３６６番目及び３９９番目のアミノ酸の置換、第２のＦｃ領域の３５１番目、４０７番目及び４０９番目のアミノ酸の置換を含み、上記アミノ酸の置換を含む第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、それぞれホモ二量体を形成する傾向よりも、互いにヘテロ二量体を形成する傾向があり、
ここで、アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付けシステムに従って番号付けされている、ヘテロ二量体型二重特異性抗体に関する。
幾つかの実施形態において、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域アミノ酸の置換は、以下の通りである。
ａ）３５１番目のアミノ酸の置換は、グリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン又はトリプトファンであり、
ｂ）３６６番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、プロリン、トリプトファン又はバリンであり、
ｃ）３９９番目のアミノ酸の置換は、システイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニン又はアラニンであり、
ｄ）４０７番目のアミノ酸の置換は、ロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン又はヒスチジンであり、及び
ｅ）４０９番目のアミノ酸の置換は、システイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミン又はアルギニンである。
【０００９】
幾つかの実施形態において、アミノ酸の置換は、
ａ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖの置換、
ｂ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃの置換、
ｃ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐの置換、
ｄ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換、
ｅ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓの置換、
ｆ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆの置換、
ｇ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑの置換、
ｈ）第１のＦｃ領域のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａの置換、第２のＦｃ領域のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒの置換、を含む。
幾つかの実施形態において、第１のＦｃ領域のアミノ酸の置換は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒであり、第２のＦｃ領域のアミノ酸の置換は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖである。
幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来する。
幾つかの実施形態において、ＰＤ−１及びＶＥＧＦ抗原結合領域は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、可変領域断片Ｆｖ、及び重鎖抗体の重鎖可変領域断片ＶＨＨから選ばれる。
【００１０】
幾つかの実施形態において、ＰＤ−１及びＶＥＧＦ抗原結合領域は、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ断片である。
幾つかの実施形態において、ＰＤ−１及びＶＥＧＦ抗原結合領域は、いずれもＦａｂ断片である。
幾つかの実施形態において、ＰＤ−１及びＶＥＧＦ抗原結合領域は、一方がＦａｂ断片であり、他方がｓｃＦｖである。
幾つかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、異なる第１の重鎖可変領域及び第２の重鎖可変領域、並びに異なる第１の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を含む。
幾つかの実施形態において、第１のＦｃ領域及びその連結されたＰＤ−１抗原結合領域と第２のＦｃ領域及びその連結されたＶＥＧＦ抗原結合領域と、又は第１のＦｃ領域及びその連結されたＶＥＧＦ抗原結合領域と第２のＦｃ領域及びその連結されたＰＤ−１抗原結合領域とは、単独で存在し、還元剤が存在する場合には、形成されたホモ二量体の重量比はいずれも５０％未満である。
幾つかの実施形態において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２から選ばれる。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の対応する組み合わせである。
【００１１】
本発明に係る第２の側面では、第１の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体コードする、単離されたポリヌクレオチドに関する。
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１から選ばれる。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１の対応する組み合わせである。
本発明に係る第３の側面は、第２の側面に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。
幾つかの実施形態において、発現ベクターは、ｐＣＤＮＡに基づいて改造されたプラスミドベクターＸ０ＧＣである。
本発明に係る第４の側面は、第２の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は第３の側面に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１２】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づいて改造されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｅ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づいて改造されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセニューラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞Ｈｉｇｈ５、ＳＦ９；植物細胞；哺乳動物の乳腺細胞、体細胞から選ばれる。
本発明に係る第５の側面は、第１の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体又は第２の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド又は第３の側面に記載の組換え発現ベクター又は第４の側面に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容されるベクターを含む組成物に関する。
【００１３】
本発明に係る第６の側面は、第１の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体を産生する方法であって、
１）第２の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド又は第３の側面に記載の組換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させるステップと、
２）宿主細胞内でそれぞれ発現されたタンパク質を還元するステップと、
３）還元されたタンパク質を混合し、その後、混合物を酸化するステップと、を含むヘテロ二量体型二重特異性抗体の製造方法に関する。
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞に基づいて改造されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｆ；ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ又はＣＨＯ細胞に基づいて改造されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ；大腸菌又は大腸菌に基づいて改造された大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉ；酵母菌又は酵母に基づいて改造されたピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセニューラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；昆虫細胞又は昆虫細胞に基づいて改造された細胞Ｈｉｇｈ５、ＳＦ９；植物細胞；哺乳動物の乳腺細胞、体細胞ステップから選ばれる。
【００１４】
幾つかの実施形態において、還元工程は、１）還元反応は、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン又は他の化学誘導体から選ばれる還元剤の存在下で行うステップと、２）還元剤を除去し、例えば、還元反応は、０．１ｍＭ又はそれ以上のジチオスレイトールの存在下、４℃で少なくとも３時間行うステップと、を含む。
幾つかの実施形態において、気化工程は、空気下で酸化することであり、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸又はその化学誘導体から選ばれる酸化剤の存在下で酸化反応を行うことも含み、例えば、酸化反応は、０．５ｍＭ又はそれ以上のＬ−デヒドロアスコルビン酸の存在下、４℃で少なくとも５時間行う。
幾つかの実施形態において、前記方法は、さらに、単離精製のステップを含む。
本発明に係る第７の側面は、第１の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び／又は第２の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド及び／又は第３の側面に記載の組換え発現ベクター及び／又は第４の側面に記載の宿主細胞及び／又は第５の側面に記載の組成物の、対象の疾患を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における用途に関する。
【００１５】
本発明に係る第８の側面は、第１の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び／又は第２の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド及び／又は第３の側面に記載の組換え発現ベクター及び／又は第４の側面に記載の宿主細胞及び／又は第５の側面に記載の組成物は、対象の疾患を予防及び／又は治療するための医薬品として用いられることに関する。
本発明に係る第９の側面は、第１の側面に記載のヘテロ二量体型二重特異性抗体及び／又は第２の側面に記載の単離されたポリヌクレオチド及び／又は第３の側面に記載の組換え発現ベクター及び／又は第４の側面に記載の宿主細胞及び／又は第５の側面に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む疾患を予防及び／又は治療する方法に関する。
幾つかの実施形態において、対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
【００１６】
幾つかの実施形態において、前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫から選ばれる。
本発明は、天然ＩｇＧの特徴を有し、重鎖および軽鎖のミスマッチがなく、高度に安定したヘテロ二量体型抗ＰＤ−１／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である、新規な抗ＰＤ−１／抗ＶＥＧＦ天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体を設計している。該二重特異性抗体は、ＰＤ−１及びＶＥＧＦという２つの標的分子を同時に結合でき、複雑な疾患の治療により効果的である。本発明で調製される二重特異性抗体は、ＰＤ−１シグナル経路及びＶＥＧＦシグナル経路を同時に遮断し、患者及び医療従事者が使用するのに便利であり、新薬開発のプロセスを簡単化する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）−Ｆｃ１の溶出ピークのクロマトグラムを示す。
【図２】図２は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の分子構造を示す。
【図３】図３は１本の重鎖及び１本の軽鎖を含む不完全抗体の分子構造を示す。
【図４】図４は１本の重鎖及び１本の軽鎖を含む不完全抗体のＳＥＣ分析結果を示す。ここで、Ａ図及びＢ図はそれぞれＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）−Ｆｃ１不完全抗体及びＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ２不完全抗体を示す。
【図５】図５はＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）−Ｆｃ１不完全抗体及びＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ２不完全抗体の酸化生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。
【図６】図６は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図７】図７は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のＲＰＣ−ＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図８−１】図８は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のＰＤ−１に対する結合活性、ＶＥＧＦに対する結合活性を示す。ここで、図Ａ、図ＢはヒトＰＤ−１に対する結合活性を示し、図Ｃ、図ＤはヒトＶＥＧＦに対する結合活性を示し、図Ｅは、マウスＶＥＧＦに対する結合活性を示す。
【図８−２】図８続き。
【図８−３】図８続き。
【図９】図９は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のＰＤ−１及びＶＥＧＦに同時に結合する活性を示す。
【図１０】図１０は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のＶＥＧＦに対する中和活性を示す。
【図１１】図１１は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体分子のサイトカイン分泌を促進する免疫調節活性を示す。
【図１２】図１２は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の薬物血中濃度−時間曲線を示す。
【図１３】図１３は抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義：
共有結合とは、ヘテロ二量体型二重特異性抗体において、２つのＦｃ領域の間で、任意のＦｃ領域及びそれに連結された抗原結合領域が共有結合によって連結されて分子を形成することを意味する。ここで、Ｆｃ領域は、１つ又は複数の共有結合（例えば、ジスルフィド結合）によって連結された第１の抗原結合領及び第２の抗原結合領域を含み、その第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、それぞれ共有結合（例えば、イミン結合又はアミド結合）によって抗原結合領域に連結されている。
抗原結合領域とは、抗原などの標的分子と特異的に相互作用できる領域であり、それは、選択性が高く、一般的に、ある標的分子の配列を認識できるが、他の分子の配列を認識できない。代表的な抗原結合領域は、抗体可変領域、抗体可変領域のバリアント、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン又は酵素結合ドメインが含まれる。
【００１９】
１つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合の連結とは、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域が１つ又は複数のジスルフィド結合を介して互いに連結され、ヘテロ二量体断片を形成することを意味する。本発明では、１つ又は複数のジスルフィド結合は、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域、或いは、第１のＦｃ領域、第２のＦｃ領域及びそれらに連結された抗原結合領域が同一の細胞内で合成される時に形成されてもよく、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域、或いは、第１のＦｃ領域、第２のＦｃ領域及びそれらに連結された抗原結合領域が異なる細胞内でそれぞれ合成され、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ還元酸化によって形成されてもよい。
第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とは、共有結合によって連結された結合断片を意味し、共有結合は、ジスルフィド結合を含み、各領域には少なくとも免疫グロブリン重鎖の定常領域の一部を含み、その第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、アミノ酸配列の違いがあり、少なくとも１つのアミノ酸が異なる。本発明に係る第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、同じ領域の間に強い反発力が存在するが、異なる領域の間に引力が存在するため、細胞内で共発現させると、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域、或いは、第１のＦｃ領域、第２のＦｃ領域及びそれらに連結された抗原結合領域はヘテロ二量体を形成する傾向がある。第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域、或いは、第１のＦｃ領域、第２のＦｃ領域及びそれらに連結された抗原結合領域がそれぞれ２つの宿主細胞内で発現される場合には、第１のＦｃ領域又は第１のＦｃ領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形式する傾向がなく、第２のＦｃ領域又は第２のＦｃ領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形成する傾向がない。本発明では、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域、或いは、第１のＦｃ領域、第２のＦｃ領域及びそれらに連結された抗原結合領域がそれぞれ２つの宿主細胞内で発現され、且つ還元剤が存在する場合には、ホモ二量体の比率は、５０％未満であり、即ち、単量体（１つのＦｃ領域、又は１つのＦｃ領域及びそれに連結された抗原結合領域）の比率は、５０％より高くなる。
【００２０】
免疫グロブリンは、４本のポリペプチド鎖を有する対称的な構造であり、そのうち、２つのより長い相対分子量が比較的大きい同じ重鎖は、４５０〜５５０個のアミノ酸残基を含み、相対分子量が５５０００〜７００００Ｄａであり、２つのより短い相対分子量が比較的小さい同じ軽鎖（Ｌ鎖）は約２１０個のアミノ酸残基を含み、相対分子量が約２４０００Ｄａである。異なる免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖において、Ｎ末端に近い約１１０個のアミノ酸配列の変化は大きく、可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ領域）と称されるが、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は相対的に安定になり、定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ領域）と称される。重鎖では、可変領域が重鎖の長さの約１／４を占め、定常領域が重鎖の長さの約３／４を占める。既知の５つのＩｇであるＩｇＧ（γ）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＭ（μ）及びＩｇＥ（ε）のうち、前の３類のＨ鎖には、３つの定常領域を有し、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。後の２類（ＩｇＭ及びＩｇＥ）のＨ鎖には、１つのＶＨ領域、及び４つの定常領域であるＣＨ１乃至ＣＨ４を有する。定常領域は、免疫グロブリン分子の骨格であるだけでなく、免疫応答を活性化する部位の１つでもある。本発明の実施例はＩｇＧに関するが、当業者は、必要に応じて、本発明に係る抗体のクラスを既知の方法により切り替えることができることを知っている。例えば、最初にＩｇＭである本発明に係る抗体は、本発明に係るＩｇＧ抗体にクラススイッチされることができる。さらに、クラススイッチにより１つのＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換し、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換することができる。従って、本発明に係る抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途のために、アイソタイプスイッチングにより、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体に変換することができる。一実施形態では、本発明に係る抗体は、ＩｇＧ１抗体、例えば、ＩｇＧ１，κである。
本発明に係る定常領域の一部は、少なくとも第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域が相互作用する領域を含み、ＩｇＧの場合、その領域は、ＣＨ３領域に位置するアミノ酸の一部であり、少なくともＧＬＮ３４７、ＴＹＲ３４９、ＴＨＲ３５０、ＬＥＵ  ３５１、ＳＥＲ  ３５４、ＡＲＧ  ３５５、ＡＳＰ  ３５６、ＧＬＵ  ３５７、ＬＹＳ  ３６０、ＳＥＲ  ３６４、ＴＨＲ  ３６６、ＬＥＵ  ３６８、ＬＹＳ  ３７０、ＡＳＮ３９０、ＬＹＳ３９２、ＴＨＲ３９４、ＰＲＯ３９５、ＶＡＬ  ３９７、ＡＳＰ３９９、ＳＥＲ４００、ＰＨＥ４０５、ＴＹＲ４０７、ＬＹＳ４０９、ＬＹＳ４３９を含む。
【００２１】
共有結合又はリンカーによる抗原結合領域への第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のそれぞれの連結とは、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域がそれぞれ共有結合又はリンカーを介して抗体の抗原結合断片、又は抗原を認識できる一本鎖抗体、又は抗原を認識できる他の抗体断片バリアント、又はリガンドを認識できる受容体、又は受容体を認識できるリガンドに連結されることを意味し、ここで、前記共有結合とは、化学結合の１つであり、２つ又は複数の原子が一緒になって外殻電子を利用して理想的な条件下で電子飽和状態になることにより形成された比較的安定した化学構造を共有結合と呼び、或いは、共有結合は原子間の共有電子対による相互作用である。同一の元素の原子又は異なる元素は、いずれも共有結合によって結合されてもよく、本発明に係る第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域の間の共有結合は、１分子のアミノ酸のアミノ基ともう１分子のアミノ酸のカルボキシル基が脱水反応によって形成されるアミド結合、又はエチレングリコールやポリエチレングリコールや他の化合物やそのポリマーのアルデヒド基が１分子のアミノ酸のアミノ基と形成されるアミド結合やイミン結合を含むが、これらに限定されない。ここで、リンカーは、２つのポリペプチド鎖を共有結合を介して連結できるアミノ酸配列又は化合物又は化合物的のポリマーであり、中でも、アミノ酸配列は、小さなペプチド、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含むが、これらに限定されなく、アミド結合を介して第１のＦｃ領域や第２のＦｃ領域、及び抗原を認識できる一本鎖抗体や抗原を認識できる他の抗体断片バリアントを連結する。
第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域が、それぞれホモ二量体を形成する傾向よりもヘテロ二量体を形成する傾向があるのは、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域において、同じポリペプチド鎖の間で相互に反発する作用が存在するが、異なるポリペプチド鎖の間で相互に吸引する作用が存在するので、細胞内で共発現すると、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域、或いは第１のＦｃ領域、第２のＦｃ領域及びそれらに連結された抗原結合領域は、ヘテロ二量体を形成する傾向があるためである。第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域、或いは、第１のＦｃ領域、第２のＦｃ領域及びそれらに連結された抗原結合領域をそれぞれ２つの宿主細胞内で発現すると、第１のＦｃ領域や第１のＦｃ領域及びそれに連結された抗原結合領域はホモ二量体を形成する傾向がなく、第２のＦｃ領域や第２のＦｃ領域及びそれに連結された抗原結合領域は、ホモ二量体を形成する傾向がない。
【００２２】
Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付けシステムとは、Ｋａｂａｔらが特定の方法により抗体配列の各アミノ酸に番号を付けることを意味し、このような各残基に番号を付ける方法は、当技術分野で標準的な方法になっている。Ｋａｂａｔのスキームは、彼の研究に存在しない他の抗体に拡張でき、保存的アミノ酸に基づいて、目的とする抗体をＫａｂａｔにより同定されたコンセンサス配列の１つと比較する。
Ｆｃ領域とは、結晶化可能フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）を指し、ＩｇのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに相当し、Ｉｇがエフェクター分子又は細胞と相互作用する部位である。
ＩｇＧは、免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ、ＩｇＧ）の略語であり、血清の主要な抗体成分であり、ＩｇＧ分子のｒ鎖の抗原性の違いにより、ヒトＩｇＧにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４という４つのサブタイプがある。
【００２３】
不完全抗体分子とは、抗体の１本の重鎖と１本の軽鎖からなる構造を意味し、ここで、重鎖と軽鎖は共有結合によって連結されてもよく、共有結合で連結されてなくてもよく、抗原を認識する一価抗体の構造である。
Ｆａｂ断片は、分子認識配列であって、抗原結合断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｆａｂ）であり、抗体分子の２本の腕に相当し、完全な軽鎖、重鎖のＶＨ領域及びＣＨ１ドメインからなる。
Ｆｖ断片は、抗体分子での抗原結合部位が保持される最小機能的断片であり、軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなり、両方が非共有結合によって結合されている。
【００２４】
ｓｃＦｖ断片は、分子認識配列であって、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が遺伝子工学で改造されて得られた抗体断片の構造異性体である。膜受容の細胞外領域は、分子認識配列であり、膜受容体は、一般的に、受容体を細胞表面の膜貫通領域にアンカーするように細胞外部に位置する対応する抗原又はリガンドを認識して結合できる細胞外領域、及び細胞内でキナーゼ活性又はシグナル伝達経路を持つことができる細胞内領域を含む。細胞膜受容体のリガンドとは、膜受容体の細胞外領域で認識されて結合されたタンパク質、小さなペプチド又は化合物を指す。サイトカインは、免疫原、マイトジェン又は他の刺激物質によって誘導されて複数種の細胞に産生した低分子量可溶性タンパク質であり、自然免疫及び適応免疫の調節、造血、細胞増殖、ＡＰＳＣ多能性細胞及び損傷組織の修復などの様々な機能がある。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子などに分けられる。プロテインタグとは、目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に組み込まれたアミノ酸配列を指し、小さなペプチドでも長鎖アミノ酸配列でもよく、タグが組み込まれると、タンパク質の正しい折りたたみ、タンパクの単離精製、細胞内タンパク質の分解の低減に有利であることができ、一般的なタグは、ＨＡ、ＳＵＭＯ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｆｌａｇを含むが、これらに限定されない。
【００２５】
ＶＨＨ断片は、重鎖抗体の単独した可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり、抗原結合能力を有する。
本発明に係るヘテロ二量体型双特性抗体に適用可能な抗体は、限定されない。好ましくは、疾患を治療及び／又は予防するために使用できる従来技術で既知の抗体は、いずれも本発明に適用できる。
本発明に係るヘテロ二量体型双特性抗体は、１つ又は複数の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有することができる。例えば、あるアミノ酸は、他のポリペプチド（例えば、抗原）又は細胞に結合する能力を大幅に失うことなく、タンパク質構造内の他のアミノ酸を置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性は、結合能力及びタンパク質の性質によって決定されるため、それらの生物学的効果または活性を大幅に失うことなく、タンパク質配列に特定のアミノ酸配列の置換を行うことができる。
【００２６】
多くの場合には、ポリペプチドのバリアントは、１つ又は複数の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、アミノ酸が類似する性質を有する他のアミノ酸で置換され、ペプチド化学の分野の当業者は、ポリペプチドの二次構造および親水性特性が実質的に変化しないことを期待できることを指す。
アミノ酸の置換は、通常、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくものである。前記の様々な特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。
【００２７】
本発明で使用される「同一性」という用語は、当技術分野でよく知られている意味を有し、当業者は、異なる配列の同一性を測定する規則、標準もよく知られており、配列アラインメント及びギャップの導入する（必要に応じて、最大パーセンテージ同一性を得る）後、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列バリアントの残基と非バリアント型配列が同一のパーセンテージであるを意味する。本発明では、同一性制限を満たす場合には、得られたバリアント配列も親配列の生物活性を有する必要がある。上記活性を利用してバリアント配列をスクリーニングする方法及び手段は当業者にとって周知である。当業者は、本出願の開示の教示の下でそのようなバリアント配列を容易に得ることができる。具体的な実施方式では、ポリヌクレオチド及びポリペプチドのバリアントは本明細書に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同一性を持つ。遺伝暗号の冗長性により、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列のバリアントが存在する。
【００２８】
本発明に係る他の実施形態において、中程度から高程度までのストリンジェントな条件下で本発明で提供されるポリヌクレオチド配列又はその断片又はその相補的配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野でよく知られている。説明を目的としては、本発明に係るポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するための適切な中程度のストリンジェントな条件には、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で予備洗浄し、５０〜６０℃、５×ＳＳＣ、一晩ハイブリダイズし、さらに、６５℃で２０分間をかけて０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣでそれぞれ２回洗浄した。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含有量及び／又はハイブリダイゼーション温度を変更することにより容易に制御できることを理解している。例えば、他の実施形態において、適切な高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、上記の条件を含むが、相違点は、ハイブリダイゼーション温度を高め、例えば、６０〜６５℃又は６５〜７０℃に達することにある。
本発明に係る宿主細胞は、外来遺伝子の発現のためのすべての細胞であってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明に係るベクターは、任意のタイプの細胞又は生物体内で複製できるベクターを含み、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及びミニ染色体を含む。幾つかの実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの増殖や複製に適したベクター、又は本発明に係るポリペプチドを発現するのに適したベクターである。そのようなベクターは、当技術分野で知られており、購入することができる。
【００３０】
「ベクター」は、シャトルベクターおよび発現ベクターが含まれる。通常、プラスミドコンストラクトは、細菌におけるプラスミドの複製及び選択のための複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１複製起点）及び選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性）も含む。「発現ベクター」とは、細菌又は真核細胞中で抗体断片を含む本発明の抗体を発現するのに必要とする制御配列又は調節要素を含むベクターを意味する。
本発明に係るベクターは、外来遺伝子の発現に使用されるすべてのベクターであってもよく、プラスミドベクターを含むが、これに限定されない。ここで、プラスミドベクターは、少なくとも複製開始部位、プロモーター、標的遺伝子、マルチクローニングサイト、選択マーカー遺伝子を含み、好ましくは、本発明に係るベクターは、Ｘ０ＧＣベクターのようなｐＣＤＮＡに基づいて改造されたプラスミドベクターを含むが、これに限定されない。
本発明に係る対象は、鳥類、爬虫類、哺乳類などが含まれる。好ましくは、哺乳動物はげっ歯類、霊長類を含み、好ましくは、霊長類はヒトを含む。
本発明に係る疾患は、腫瘍を含むが、これに限定されなく、好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫を含む。
【００３１】
薬学的に許容される担体とは、医薬分野における従来の医薬担体を指す、例えば、希釈剤、賦形剤および水など；デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶性セルロースなどの充填剤；セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどのバインダー；グリセリンなどの湿潤剤；カルボキシメチルスターチナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロース、寒天、炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；セチルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤；カオリンや石けん粘土などの吸着担体；タルク、ステアリン酸カルシウム、マグネシウム、微粉化シリカゲル、ポリエチレングリコールなどの潤滑剤である。また、フレーバー、甘味料などの他のアジュバントを組成物に加えることができる。
以下、本発明を非限定的な実施例によってさらに説明するが、当業者は、本発明の精神から逸脱することなく本発明に多くの変更を加えることができ、そのような変更も本発明の範囲内にあることを知っている。
以下の実験方法は、特に断りがない限り、いずれも常法であり、使用される実験材料は、特に断りがない限り、市販として容易に入手できる。本発明の下記の実施例で使用される様々な抗体は、いずれも市販としての標準的な抗体に由来する。
【実施例】
【００３２】
実施例１  抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のベクター構築
抗ヒトＰＤ−１抗体ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）の重鎖及び軽鎖を含むＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、抗体可変領域配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝９７９８に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で表され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４で表され、その重鎖配列は、ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）−Ｆｃ１と称された。ＰＣＲ法によりそれぞれ軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を増幅した。本願で使用される全てのＰＣＲ反応は、いずれもＮＥＢ社のＰｈｕｓｉｏｎ  ハイフィデリティ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｆ−５３０Ｌ）を使用した。ＰＣＲプライマーは、塩基対の相補性の原則及び酵素切断部位の要求に応じて一般的に設計された。反応系は、いずれも、Ｈ２Ｏ  ８．９μｌ、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ハイフィデリティ  ＤＮＡ  ポリメラーゼバッファー  ４μｌ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、上流プライマー  １μｌ、下流プライマー  １μｌ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ハイフィデリティ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．１μｌ、テンプレート１μｌである。可変領域及び定常領域のＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡ回収キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ９２８２、以下同じ）で対応する断片を回収した。回収された可変領域断片及び定常領域断片をテンプレートとし、可変領域の上流プライマー及び定常領域の下流プライマーを使用し、他のラウンドのＰＣＲ反応を実行し、その後、さらに対応する断片を回収し、重鎖及び軽鎖全長断片を得た。Ｘ０ＧＣベクター及び全長断片をＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、型番Ｒ３１０１Ｌ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ、型番Ｒ３１０４Ｌ）で消化し、消化反応系は、１０×バッファー３  ２μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれ０．５μｌ、ゲルから回収された全長断片３μｌ、Ｈ２Ｏ  １４．５μｌである。消化反応系は、３７℃の条件下で３時間反応した。消化産物は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、型番Ｍ０２０２Ｖ）で連結され（以下同じ）、反応系は、１０×リガーゼバッファー２μｌ、リガーゼ０．５μｌ、ゲルから回収された全長断片３μｌ、ゲルから回収されたＸ０ＧＣベクター３μｌ、Ｈ２Ｏ  １１．５μｌである。連結は、室温で反応を１２時間行った。連結した産物を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（天根、ＣＢ１０４、以下同じ）に形質転換した。抗体重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
【００３３】
本発明は、同時に、他の抗ヒトＰＤ−１抗体ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）の重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターを構築した。ここで、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で表され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４で表され、その重鎖配列は、ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）−Ｆｃ１と称された。抗ヒトＰＤ−１抗体ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）の重鎖可変領域配列を他の重鎖定常領域配列に連結し、ここで、その重鎖定常領域のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０で表され、その重鎖配列がＰＤ−１（ＢＪＨＭ）−Ｆｃ２と称された。抗体重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
抗ヒトＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、抗体可変領域配列は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ００１１２に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で表され、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４で表され、その重鎖配列は、ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ１と称された。抗ヒトＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）の重鎖可変領域配列を他の重鎖定常領域配列に連結し、ここで、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０で表され、その重鎖配列は、ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ２と称された。抗体重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
【００３４】
本発明は、同時に、他の抗ヒトＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）の重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターを構築した。ここで、抗体可変領域配列は、ＵＳ２００６０２８０７４７に由来した。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８で表され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で表され、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２で表され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９で表され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０で表され、その重鎖配列は、ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）−Ｆｃ２と称された。抗体重鎖及び軽鎖のＸ０ＧＣ発現ベクターが得られ、それぞれ真核細胞で抗体の重鎖及び軽鎖を発現するために適用された。
【００３５】
実施例２  抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の発現
抗ヒトＰＤ−１抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターを２９３Ｆ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３−Ｆ  Ｃｅｌｌｓ、型番Ｒ７９００７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にそれぞれトランスフェクトし、また、それぞれ抗ヒトＶＥＧＦ抗体の重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターを２９３Ｆ細胞にもトランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に細胞を接種し、トランスフェクション当日に細胞を遠心分離して細胞を収集し、新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、型番１２３３８００１、Ｇｉｂｃｏ）に細胞を細胞密度が２００×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで再懸濁した。最終濃度が３６．６７ｕｇ／ｍＬになるように、トランスフェクション容量に従ってプラスミドを加え、均一になるように軽く混合して、その後、線形ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、線形、Ｍ．Ｗ．２５０００、型番４３８９６、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を加え、最終濃度は５５ｕｇ／ｍＬであり、均一になるように軽く混合した。次いで、インキュベーターに入れ、１２０ｒｐｍのシェーカーにて３７℃で１時間インキュベートした。その後、トランスフェクション容量の１９倍の新鮮な培地を加えた。１２０ｒｐｍのシェーカーにて３７℃でインキュベートし続けた。５〜６日間トランスフェクトされた細胞培養上清を遠心収集した。
ＥＬＩＳＡ法により発現量を測定した。カラムクロマトグラフィーを使用して精製する前に、０．２μｍフィルターでろ過して沈殿を除去した。この工程は４℃で行った。
【００３６】
実施例３．抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体発現産物の精製
ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００型タンパク質精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びアフィニティークロマトグラフィー用カラムｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、２２ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して４℃で精製した。まず、カラムを移動相Ａ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ  ７．４）で平衡化し、ベースラインが安定したら、上記の処理後の細胞上清を５ｍｌ／ｍｉｎの流速でロードした後、移動相Ａで平衡化を行った。サンプルは、それぞれ実施例２で発現した抗ＰＤ−１発現産物及び抗ＶＥＧＦ発現産物である。その後、まず、移動相Ｂ１（０．５Ｍ  アルギニンを含む移動相Ａ）で５カラムボリュームを洗浄し、その後、移動相Ｂ２（１００ｍＭ  クエン酸、ｐＨ  ３．０）で５カラムボリュームを溶出し、目的タンパク質ピークである溶出ピークを収集し、以上の溶出ステップの流速は、いずれも５ｍｌ／ｍｉｎである。抗ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）−Ｆｃ１の溶出ピークのクロマトグラムは、図１に示され、抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）−Ｆｃ１、ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）−Ｆｃ２、ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）−Ｆｃ２、ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ１、ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ２の溶出ピークはそれに類似した（結果が含まれていない）。マークされた溶出ピーク（図中の灰色領域）を収集し、１Ｍ酢酸ナトリウム溶液を滴下してｐＨを５．０に調整した。
【００３７】
実施例４．抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の精製
抗ＰＤ−１／抗ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の分子構造は、図２に示された。
上記の実施例３においてｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、２２ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の方法により得られた抗ＰＤ−１及び抗ＶＥＧＦ発現産物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組換えを行ってヘテロ二量体を得た。まず、上記精製で收集されたタンパク質溶液は、限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し（公称分画分子量１０ｋＤａ）、溶液をリン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に置き換えた。得られた抗ＰＤ−１及び抗ＶＥＧＦ発現産物に、それぞれ前記ＰＢＳを加えて１ｍｇ／ｍｌに調整し、最終容量の１／２００の１Ｍ  ＤＴＴを加え、ＤＴＴの最終濃度はそれぞれ５ｍＭであり、４℃の条件下で還元を行い（３〜８時間）、還元プロセスによりジスルフィド結合が開かれ、抗ＰＤ−１及び抗ＶＥＧＦ発現産物に含まれている一部の抗体ホモ二量体分子のヒンジ領域ジスルフィド結合も開かれ、１本の重鎖と１本の軽鎖とを含む不完全抗体分子を形成し、その構造は図３に示した。還元されたサンプルが１ｍＭ  ＤＴＴ還元剤が含まれた移動相バッファーを用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析された結果は、図４の図Ａ及び図Ｂに示すように、抗ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）−Ｆｃ１及び抗ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ２を例として、ホモ二量体分子の重量比はいずれも１０％未満であり、それに対応して、不完全抗体分子の重量比は、いずれも９０％を超えた。
【００３８】
その後、還元された抗ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）−Ｆｃ１及び抗ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ２不完全抗体分子を等モル比で混合し、組換え反応は４℃の条件下で２４時間行い、組み換え中、抗ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）−Ｆｃ１及び抗ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ２不完全抗体分子は、ＣＨ２／ＣＨ３の非共有結合力により抗ＰＤ−１及び抗ＶＥＧＦ不完全抗体分子の両方を含むヘテロ二量体型二重特異性抗体を形成し、その後、タンパク質溶液を限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し（公称分画分子量１０ｋＤａ）、溶液をリン酸塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に置き換えて還元を終了し、空気又は酸化剤により酸化反応を行い、ヘテロ二量体型二重特異性抗体のジスルフィド結合を再形成した。酸化反応の条件は、酸化剤としてＬ−デヒドロアスコルビン酸  １００ｍＭを加え、タンパク質の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌであり、酸化剤の最終濃度が１ｍＭであり、４℃の条件下で酸化し、２４時間反応させた。上記酸化反応で得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果は、図５に示した。
上記抗ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）−Ｆｃ１及び抗ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）−Ｆｃ２不完全抗体分子が還元酸化を経て得られたヘテロ二量体分子は、限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し（公称分画分子量１０ｋＤａ）、溶液を１０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファーに置き換え、ｐＨ  ５．８であった。ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００型タンパク質精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びイオンクロマトグラフィー用カラムＳｏｕｒｃｅ  １５Ｓ（１６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、１７ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して４℃で精製した。まず、カラムを移動相Ａ（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．０）で平衡化し、ベースラインが安定したら、上記処理されたタンパク質溶液を流速３ｍｌ／ｍｉｎでロードし、ロードした後、移動相Ａで平衡化し、次いでＡ（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．８）からＢ（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．８）までの勾配で２０カラムボリュームを洗浄し（０％Ｂ〜１００％Ｂ、１７０ｍｉｎ、流速２ｍｌ／ｍｉｎ）、マークされた溶出した主ピークを収集し、收集されたタンパク質溶液を限外ろ過濃縮チューブにより限外ろ過して濃縮し（公称分画分子量１０ｋＤａ）、溶液をリン酸塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に置き換え、ろ過し、滅菌し、４℃で保存した。精製産物は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度の分析を行った結果を図６に示し、純度が９８．６％である。ＲＰＣ−ＨＰＬＣによる純度の分析を行った結果は図７に示し、純度は９８．８％である。
【００３９】
実施例５．抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の標的結合活性
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の単一の抗原と結合する能力を測定した。
ＥＬＩＳＡの具体的な実施手順は、ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液で９６ウェルプレートに組換えヒトＰＤ−１（北京義翹神州、型番１０３７７−Ｈ０８Ｈ）又はヒトＶＥＧＦ（北京義翹神州、型番１１０６６−ＨＮＡＨ）又はマウスＶＥＧＦ（北京義翹神州、型番５０１５９−ＭＮＡＢ）を被覆し、被覆濃度は１μｇ／ｍＬであり、１ウェル当たり１００μＬであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。５％スキムミルク及び１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴにて３００μＬ／ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加え、１ウェルあたり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに１：１００００で希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、型番ＡＰ３０９Ｐ）を加え、１ウェルあたり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１０分間発色させた。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで加え、発色を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【００４０】
結果は、図８のＡ及びＢに示すように、抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体、抗ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体、抗ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）／ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）ヘテロ二量体抗体、抗ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）／ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）ヘテロ二量体抗体は、いずれもヒトＰＤ−１に対する高親和力を持ち、ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）モノクローナル抗体、ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）モノクローナル抗体の抗原結合活性と同等またはわずかに弱くなり、中でも、ＰＤ−１（ＢＪＨＭ）によるヘテロ二量体は、ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）によるヘテロ二量体よりもわずかに強い親和力を有した。図８のＣ及びＤに示されるように、全ての抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体は、いずれもヒトＶＥＧＦに対する高親和力を有し、ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）モノクローナル抗体、ＶＥＧＦ（Ｂｅｖａｃｉ）モノクローナル抗体の抗原結合活性と同等である。図８のＥに示すように、抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体は、マウスＶＥＧＦに対する高親和力を有し、ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）モノクローナル抗体の抗原結合活性と同等である。
【００４１】
実施例６．抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の二標的同時結合活性
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の２つの異なる抗原と同時に結合する能力を測定した。
ＥＬＩＳＡの具体的な実施手順は、ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液で９６ウェルプレートに組換えヒトＶＥＧＦ（北京義翹神州、型番１１０６６−ＨＮＡＨ）を被覆し、被覆濃度は１μｇ／ｍＬであり、１ウェル当たり１００μＬであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴにて３００μＬ／ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加え、１ウェルあたり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに希釈されたビオチン標識ＰＤ−１−Ｆｃ（北京韓美薬品）を０．５μｇ／ｍＬで加え、１ウェル当たり１００μＬであり、２５℃で１時間インキュベートした。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに１：１０００で希釈されたストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、型番５５４０６６）、１ウェルあたり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１０分間発色させた。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで加え、発色を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図９に示すように、ＰＤ−１モノクローナル抗体とＶＥＧＦモノクローナル抗体の組み合わせがＰＤ−１、ＶＥＧＦに同時結合できなく、抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のみが２つの抗原に同時結合する活性を有することを示した。
【００４２】
実施例７．抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のＶＥＧＦ中和活性
ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣの増殖は、ＶＥＧＦによって調節され、その初代細胞を使用して抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のＶＥＧＦ中和活性を測定した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣは、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（型番：Ｃ−１２２０３）から入手した。ＨＵＶＥＣ細胞は、ＥＣＧＭ−２培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、型番：Ｃ−２２０１１）、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養された。分析用培地は、ＥＣＢＭ−２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、型番：Ｃ−２２２１１）培地であり、０．４％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、型番：ＳＨ３００８４．０３）を含む。トリプシン消化によりＨＵＶＥＣを収集し、ＥＣＢＭ−２培地で２回洗浄し、分析用培地に再懸濁し、細胞密度は１×１０５個／ｍＬであり、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、即ち、１ウェルあたり１００００個の細胞である。分析用培地で希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを５０μＬ／ウェルで加え、さらに、分析用培地で段階希釈されたヒトＶＥＧＦ（北京義翹神州、型番１１０６６−ＨＮＡＨ）を５０μＬ／ウェルで加え、最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬであった。細胞培養用プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて３日間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞培養用プレートの各ウェルにＭＴＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、型番：Ｇ３５８Ｂ）４０μＬを加えて細胞活力を検出した。細胞培養用プレートをインキュベーターで３〜４時間インキュベートし続け、その後、４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
図１０に示すように、抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体は、良好なＶＥＧＦ中和活性を有し、ＶＥＧＦモノクローナル抗体と同等であることを示した。
【００４３】
実施例８．抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体のＴ細胞調節活性
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によりＴ細胞免疫応答に対する抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の調節活性を測定した。
ヒト樹状細胞（ＤＣ）の取得：ヒトＰＢＭＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、型番ＣＣ−２７０２）を蘇生して収集した。ヒトＰＢＭＣ細胞を細胞密度５×１０６個／ｍＬで無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、型番：２２４００−０８９）に再懸濁し、細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ、型番：１５６３６７）に播種し、３７℃、ＣＯ２  インキュベーターで９０分間インキュベートした。培養上清及び浮遊細胞を捨て、壁付着性細胞を完全培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０）で培養し、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ（北京義翹神州、型番１００１５−ＨＮＡＨ）及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４（北京義翹神州、型番１１８４６−ＨＮＡＥ）を加えた。３日間インキュベートし、新しい培地に交換し、さらに３日間インキュベートした。次いで、培地を１００ｎｇ／ｍＬＧＭ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４及び２０ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−αを含む完全培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０）に交換し、１日間インキュベートした。ＤＣ細胞を得た。
【００４４】
ヒトＴ細胞の取得：このＰＢＭＣとＤＣ細胞を誘導するＰＢＭＣが異なる個体に由来することを保証するために、ヒトＰＢＭＣ細胞を蘇生して収集した。Ｐａｎ  Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、型番５１５０４１４８２０）の取扱説明書を参照してヒトＴ細胞を単離した。簡単に言えば、まず、ＰＢＭＣをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、型番：１４１９０−１３６）で１回洗浄し、さらにＰＢＭＣを１０７細胞あたり単離用バッファー（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ＝７．２）４０μＬで再懸濁し（以下、使用量はいずれも１０７細胞で計算され）、１０μＬ  Ｐａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを加え、４℃で５分間インキュベートした。さらに、単離用バッファー３０μＬ及びＰａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ２０μＬを加え、４℃で１０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ  カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、型番：１３０−０４２−４０１）を通過させ、Ｔ細胞を得た。
收集されたヒトＤＣ細胞及びヒトＴ細胞を完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０含１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、播種されたＤＣ細胞及びＴ細胞は、それぞれ１×１０４／ウェル、１×１０５／ウェルであり、混合培養された。完全培地で段階希釈されたヘテロ二量体抗体サンプル及びコントロールを加えた。培養プレートを３７℃、ＣＯ２  インキュベーターに置き５日間インキュベートした。インキュベートが完了した後、ウェルから上清を採取し、キットのマニュアルに従ってサイトカインＩＦＮ−γ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、型番ＥＬＨ−ＩＦＮｇ）を検出した。
【００４５】
図１１に示すように、ヒトＴ細胞は、同種異系ＤＣ細胞の刺激下で活性化されてＩＦＮ−γを分泌した。ＰＤ−１モノクローナル抗体を加えると、Ｔ細胞の活性化が促進され、サイトカインの分泌が促進されるが、ＶＥＧＦモノクローナル抗体には該活性を持たない。抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦ  ヘテロ二量体抗体も強いＴ細胞調節活性を示し、サイトカインＩＦＮ−γの分泌を著しく促進した。
【００４６】
実施例９．マウスにおける抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の薬物動態学研究
実験材料は、北京華阜康生物科技股ふん有限公司から購入された、６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを選択された。マウスを環境へ１週間適応させた後に、ランダムに群分けし、各群あたり１５匹である。各群は、ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）モノクローナル抗体、ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）モノクローナル抗体、抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体をそれぞれ投与し、用量はいずれも２０ｎｍｏｌ／ｋｇであり、腹腔内投与で単回投与した。０時間、投与後１時間、３時間、６時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、３３６時間、４０８時間で眼窩から０．２ｍＬ採血し、抗凝固処理なし、血液サンプルを室温で３０分間〜１時間放置し、血液凝固後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた血清サンプルを−８０℃で凍結保存し、測定のために用意した。
【００４７】
血清中のＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）モノクローナル抗体、ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）モノクローナル抗体、抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。簡単に言えば、組換えヒトＰＤ−１タンパク質（北京義翹神州、型番１０３７７−Ｈ０８Ｈ）又はヒトＶＥＧＦ（北京義翹神州、型番１１０６６−ＨＮＡＨ）をｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液にて一晩４℃でプレートに被覆した。ＰＢＳＴで洗浄した。非特異的結合を防ぐために、５％脱脂粉乳含有ＰＢＳＴでそのプレートをブロッキングし、ＰＢＳＴで洗浄した。次いで、１０％混合マウス血清、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴで希釈した被験血清サンプルを加え、２５℃で、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを洗浄した。５％脱脂粉乳含有ＰＢＳＴに希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、型番ＡＰ３０９Ｐ）を加え、２５℃で、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを洗浄した。最後、比色基質ＴＭＢを使用して発色させ、室温で１０分間発色させた。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加え、発色を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図１２に示すように、用量が２０ｎｍｏｌ／ｋｇの抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体を１回腹腔内投与すると、マウスの体内でＶＥＧＦモノクローナル抗体よりも優れたが、ＰＤ−１モノクローナル抗体よりも弱い薬物動態特性を示した。抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体の薬物動態パラメーターは、以下の通りである。即ち、半減期ｔ１／２は３５時間であり、薬物血中濃度−時間曲線下面積ＡＵＣｌａｓｔは２５８８３ｎＭ．ｈｒであり、Ｃｍａｘは２３１ｎＭであり、見かけ分布容積Ｖｄは３９ｍＬ／Ｋｇであり、クリアランスＣＬは０．７７ｍＬ／ｈｒ／ｋｇであり、平均滞留時間ＭＲＴｌａｓｔは７３時間である。
【００４８】
実施例１０．マウス腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−１／ＶＥＧＦヘテロ二量体抗体の抗腫瘍効果研究
実験材料は、雌性、６〜８週齢であるＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのヒトＰＤ−１遺伝子ノックインマウス（Ｂ６／ＪＮｊｕ−ｈＰＤＣＤ１ｅｍ１Ｃｉｎ（Ｅ２Ｅ３）／Ｎｊｕ、南京生物医薬研究院）を選択した。マウスを環境に１週間適応させた後、１匹のマウスあたり５ｘ１０６個のＭＣ３８マウス結腸癌細胞（基礎医学細胞センター、基礎医学研究所、中国医学科学院）を右側背中に皮下接種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３になる場合には、腫瘍体積に応じて群分けし、１群あたり担癌マウス６匹であり、溶媒（ＰＢＳ）、ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）モノクローナル抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（５ｍｐｋ）とＶＥＧＦ（Ｇ６３１）モノクローナル抗体３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（５ｍｐｋ）の組み合わせ、抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体７０ｎｍｏｌ／ｋｇ（１０ｍｐｋ）をそれぞれ投与し、週２回、２週間連続腹腔内投与した。投与日から週３回腫瘍体積を測定し、長径ａ及び短径ｂを測定し、腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａｘｂ２）／２である。腫瘍体積の測定期間は、３週間であり、投与を停止した後、さらに１週間観察した。
結果は、図１３に示すように、抗ＰＤ−１（Ｐｅｍｂｒｏ）／ＶＥＧＦ（Ｇ６３１）ヘテロ二量体抗体は、ＰＤ−１モノクローナル抗体とＶＥＧＦモノクローナル抗体の組み合わせよりも強い抗腫瘍効果を持ち、投与を停止した後、依然として良好な腫瘍制御効果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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