(57)【要約】  本発明は、核骨格−細胞骨格リンカー（ＬＩＮＣ）複合体を破壊し、核を細胞骨格との連結から分離させ、その結果、１つまたは複数のＬｍｎａ変異によって引き起こされる疾患、いわゆるラミノパチーの改善をもたらす方法における、発現ベクターおよび他の化合物の使用に関する。より詳細には本発明は、例えば、心筋細胞におけるＬＩＮＣ複合体を破壊する、拡張型心筋症（ＤＣＭ）における疾患進行を抑制するためのドミナントネガティブＳＵＮドメインタンパク質、および／またはドミナントネガティブＫＡＳＨドメインタンパク質の発現に関する。【選択図】図１９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、発現ベクターおよび導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、該発現ベクターに作動可能に連結しており、トランスフェクトされた細胞における該導入遺伝子の発現は、トランスフェクトされた細胞における核骨格−細胞骨格リンカー（ＬＩＮＣ）複合体の破壊をもたらす、前記核酸分子。
【請求項２】
発現ベクターが心臓または心筋細胞特異的発現ベクターである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
発現ベクターが心臓または心筋細胞特異的プロモーターを含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
発現ベクターが、心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）、α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）プロモーター、およびミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ｖ）プロモーターを含む群から選択される心臓または心筋細胞特異的プロモーターを含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
心筋細胞特異的プロモーターがニワトリ心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターである、請求項３または４に記載の核酸分子。
【請求項６】
発現ベクターがウイルス発現ベクターである、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
ウイルス発現ベクターが、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む群から選択される、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
アデノ随伴ウイルス発現ベクター（ＡＡＶ）が心臓に向性を有する／心臓向性である、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９（血清型９）、ＡＡＶ１（血清型１）、ＡＡＶ６（血清型６）、ＡＡＶ８（血清型８）、ＡＡＶ２ｉ８、およびＡＡＶ９．４５からなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ＡＡＶベクターがＡＡＶ９（血清型９）である、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
導入遺伝子が、ＳＵＮドメイン含有タンパク質の内腔ドメイン、Ｎ末端シグナル配列、シグナルペプチダーゼ切断部位、およびＣ末端ターゲティングペプチド配列を発現するための核酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
ＳＵＮドメイン含有タンパク質の内腔ドメインが、コイルドコイルドメインおよびＳＵＮドメインを含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
コイルドコイルドメインがＳＵＮドメインの上流にある、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
導入遺伝子が、Ｎ末端シグナル配列、シグナルペプチダーゼ切断部位、およびＣ末端ターゲティングペプチド配列を発現するための核酸配列をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
導入遺伝子が、Ｎ末端シグナル配列、シグナルペプチダーゼ切断部位、およびＣ末端ターゲティングペプチド配列、ならびにＳＵＮドメイン含有タンパク質の管腔ドメインまたはＳＵＮドメインのいずれかを発現するための核酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
ＳＵＮドメインタンパク質がＳＵＮ１またはＳＵＮ２である、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
Ｎ末端シグナル配列が、分泌タンパク質またはＩ型膜貫通タンパク質に由来する、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
分泌タンパク質またはＩ型膜貫通タンパク質が、ヒト血清アルブミン、プロインスリン、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、プレプロオピオメラノコルチン、膵臓消化酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、およびリパーゼ）、小胞体管腔タンパク質、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ＧＲＰ９４、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
Ｎ末端シグナル配列がヒト血清アルブミンに由来する、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
Ｎ末端シグナル配列が、そのＮ末端においていかなる他のタグも上流に存在しない、請求項１１から１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
シグナルペプチダーゼ切断部位が、ヒト血清アルブミン、プロインスリン、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、プレプロオピオメラノコルチン、膵臓消化酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、およびリパーゼ）、小胞体内腔タンパク質、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ＧＲＰ９４、ならびにそれらの組合せからなる群のうちの１つに由来するシグナルペプチダーゼ切断部位であるか、またはその群のうちの１つである、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２２】
シグナルペプチダーゼ切断部位が、ヒト血清アルブミンに由来するシグナルペプチダーゼ切断部位である、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
Ｃ末端ターゲティングペプチド配列が、請求項１から１９のいずれか一項に記載の導入遺伝子から発現したペプチドの分泌を妨げる、請求項１１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２４】
Ｃ末端ターゲティングペプチド配列がＫＤＥＬ配列である、請求項１１から２３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２５】
導入遺伝子がエピトープタグをさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
任意選択のエピトープタグが、Ｎ末端にあるか、またはＣ末端ターゲティングペプチド配列［例えばＫＤＥＬ］の下流（後）を除く核酸分子の任意の場所に位置するか、またはＮ末端シグナル配列の上流（前）を除く核酸分子の任意の場所に位置する、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
任意選択のエピトープタグが、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ルシフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ｃ−Ｍｙｃ、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、Ｔ７、チオレドキシン、Ｖ５、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
エピトープタグがヘマグルチニンＡ（ＨＡ）である、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
ベクターが、ニワトリ心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）および請求項１から２８のいずれか一項に記載の導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）であり、ＳＵＮドメイン含有タンパク質の管腔ドメインがＳＵＮ１に由来し、Ｎ末端シグナル配列およびシグナルペプチダーゼ切断部位がそれぞれヒト血清アルブミンに由来し、Ｃ末端ターゲティングペプチド配列がＫＤＥＬ配列であり、導入遺伝子がＮ末端エピトープタグとしてヘマグルチニン（ＨＡ）をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３０】
ベクターが、ニワトリ心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）および請求項１から２８のいずれか一項に記載の導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）であり、ＳＵＮドメイン含有タンパク質の管腔ドメインがＳＵＮ２に由来し、Ｎ末端シグナル配列およびシグナルペプチダーゼ切断部位がそれぞれヒト血清アルブミンに由来し、Ｃ末端ターゲティングペプチド配列がＫＤＥＬ配列であり、導入遺伝子がＮ末端エピトープタグとしてヘマグルチニン（ＨＡ）をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３１】
導入遺伝子が、ＫＡＳＨドメインおよびＮ末端安定化ポリペプチド配列を発現するための核酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３２】
ＫＡＳＨドメインが、膜貫通ドメインおよびＳＵＮ相互作用ペプチドを含む、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
ＫＡＳＨドメインが、ＫＡＳＨ１（Ｎｅｓｐｒｉｎ−１（ＳＹＮＥ１遺伝子）に由来する）、ＫＡＳＨ２（Ｎｅｓｐｒｉｎ−２（ＳＹＮＥ２遺伝子）に由来する）、ＫＡＳＨ３（Ｎｅｓｐｒｉｎ−３（ＳＹＮＥ３遺伝子）に由来する）、ＫＡＳＨ４（Ｎｅｓｐｒｉｎ−４（ＳＹＮＥ４遺伝子）に由来する）、およびＫＡＳＨ５（ＫＡＳＨ５／ＣＣＤＣ１５５（ＫＡＳＨ５遺伝子）に由来する）からなる群から選択される、請求項３１または３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
導入遺伝子が、内在性Ｓｕｎタンパク質のＳＵＮドメインまたは内在性Ｎｅｓｐｒｉｎタンパク質のＫＡＳＨドメインをコードする核酸を改変するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓまたは他の合成ヌクレアーゼ系を発現するための核酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３５】
導入遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを発現するための核酸配列を含む、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３６】
導入遺伝子がドミナントネガティブ構築物である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３７】
導入遺伝子がヒト化またはヒト導入遺伝子である、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３８】
導入遺伝子の発現が、ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮとＫＡＳＨとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の破壊をもたらす、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３９】
ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮとＫＡＳＨとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の破壊が、Ｓｕｎ１＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−１、Ｓｕｎ２＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−１、Ｓｕｎ１＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−２、Ｓｕｎ１＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−３、Ｓｕｎ２＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−２、およびＳｕｎ２＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−３からなる群から選択されるタンパク質相互作用間で生じる、請求項３８に記載の核酸分子。
【請求項４０】
ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮとＫＡＳＨとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の破壊が、Ｓｕｎ１とＮｅｓｐｒｉｎ−１との間で生じる、請求項３９に記載の核酸分子。
【請求項４１】
ＡＡＶベクターが対象の心筋への送達のために製剤化されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４２】
対象における１つまたは複数のＬｍｎａ変異によって引き起こされる疾患を処置することにおける使用のための、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４３】
疾患が、拘束性皮膚障害、家族性部分性リポジストロフィー（例えばダニガン型）、Ａ型リポジストロフィーを伴う下顎末端異形成症、メタボリックシンドローム、シャルコー・マリー・トゥース病２型、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ１型、および表１に通常のフォントで示される疾患からなる群から選択される、請求項４２に記載の核酸分子。
【請求項４４】
対象における心血管疾患を処置することにおける使用のための、先行する請求項のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４５】
疾患または心血管疾患が、少なくとも１つのＬｍｎａ変異の存在によって特徴付けられる、請求項４２または４３に記載の核酸分子。
【請求項４６】
心血管疾患が、ラミノパチー、心筋症、例えば拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拡張型心筋症１Ａ、伝導系障害を伴う拡張型心筋症、高度ＡＶブロックおよび不整脈を伴う心筋症、孤立性心房細動；筋ジストロフィー（多くの場合心筋症に関連する）、例えばエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体優性）に関連する心筋症、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体劣性）に関連する心筋症、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型に関連する心筋症、先天性筋ジストロフィーに関連する心筋症；早期老化症候群（主として血管性であるが、心病変を有する場合もあると考えられる）、例えば非定型ウェルナー症候群に関連する心筋症、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群に関連する心筋症等、ならびに表１に太字のフォントで示される疾患からなる群から選択される、請求項４４または４５に記載の核酸分子。
【請求項４７】
心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）、および請求項１１から３０または３４から３８のいずれか一項に記載の導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）。
【請求項４８】
請求項１から４１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項４９】
対象における疾患を処置する方法であって、薬学的有効量の請求項１から４１のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項４８に記載の医薬組成物の投与を含む、前記方法。
【請求項５０】
疾患が少なくとも１つのＬｍｎａ変異の存在によって特徴付けられる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｌｍｎａ変異が、Ｌｍｎａ遺伝子のラミンＡアイソフォームもしくはラミンＣアイソフォーム、またはラミンＡ／Ｃアイソフォームの両方に影響を及ぼす、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
疾患が、拘束性皮膚障害、家族性部分性リポジストロフィー（例えばダニガン型）、Ａ型リポジストロフィーを伴う下顎末端異形成症、メタボリックシンドローム、シャルコー・マリー・トゥース病２型、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ１型、および表１において通常のフォントである疾患からなる群から選択される、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
疾患が、ラミノパチー、心筋症、例えば拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拡張型心筋症１Ａ、伝導系障害を伴う拡張型心筋症、高度ＡＶブロックおよび不整脈を伴う心筋症、孤立性心房細動；筋ジストロフィー（多くの場合心筋症に関連する）、例えばエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体優性）に関連する心筋症、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体劣性）に関連する心筋症、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型に関連する心筋症、先天性筋ジストロフィーに関連する心筋症；早期老化症候群（主として血管性であるが、心病変を有する場合もあると考えられる）、例えば非定型ウェルナー症候群に関連する心筋症、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群に関連する心筋症；ならびに表１に太字のフォントで示される疾患からなる群から選択される心血管疾患である、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
対象が非ヒト哺乳動物またはヒトである、請求項４９から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
１つもしくは複数のＬｍｎａ変異によって引き起こされる疾患または心血管疾患を処置するための医薬の製造における、請求項４８に記載の医薬組成物または請求項１から４１のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項５６】
疾患が、拘束性皮膚障害、家族性部分性リポジストロフィー（例えばダニガン型）、Ａ型リポジストロフィーを伴う下顎末端異形成症、メタボリックシンドローム、シャルコー・マリー・トゥース病２型、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ１型、および表１に通常のフォントで示される疾患からなる群から選択される、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
心血管疾患が、ラミノパチー、心筋症、例えば拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拡張型心筋症１Ａ、伝導系障害を伴う拡張型心筋症、高度ＡＶブロックおよび不整脈を伴う心筋症、孤立性心房細動；筋ジストロフィー（多くの場合心筋症に関連する）、例えばエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体優性）に関連する心筋症、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体劣性）に関連する心筋症、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型に関連する心筋症、先天性筋ジストロフィーに関連する心筋症；早期老化症候群（主として血管性であるが、心病変を有する場合もあると考えられる）、例えば非定型ウェルナー症候群に関連する心筋症、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群に関連する心筋症等、ならびに表１に太字のフォントで示される疾患からなる群から選択される、請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
療法における使用のための、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
細胞におけるＬＩＮＣ複合体のタンパク質の相互作用を阻害することができる薬物候補をスクリーニングする方法であって、
（ａ）薬物の存在下で前記ＬＩＮＣ複合体のタンパク質を組み合わせて第１の複合体を形成するステップ、
（ｂ）前記薬物の非存在下でタンパク質を組み合わせて第２の複合体を形成するステップ、
（ｃ）前記第１の複合体および前記第２の複合体の量を測定するステップ、ならびに
（ｄ）前記第１の複合体の量を前記第２の複合体の量と比較するステップ
を含み、前記第１の複合体の量が前記第２の複合体の量よりも少ない場合、薬物が細胞における前記ＬＩＮＣ複合体のタンパク質の相互作用を阻害するための薬物候補である、前記方法。
【請求項６０】
薬物候補が、ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮとＫＡＳＨとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を破壊する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
薬物候補が、Ｓｕｎ１タンパク質とＮｅｓｐｒｉｎ−１タンパク質との間の相互作用を破壊する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
スクリーニングがｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングである、請求項５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
複合体がＥＬＩＳＡ法または蛍光異方性測定法によって測定される、請求項５９から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１の複合体の量が前記第２の複合体の量よりも少ない場合、前記薬物が前記タンパク質の相互作用を阻害するための薬物候補である、請求項５９から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
組換えＳＵＮおよびＫＡＳＨドメインが使用される、請求項５９から６４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核骨格−細胞骨格リンカー（ＬＩＮＣ）複合体を破壊し、核を細胞骨格との連結から分離させ、その結果、１つまたは複数のＬｍｎａ変異によって引き起こされる疾患、いわゆるラミノパチーの改善をもたらす方法における、発現ベクターおよび他の化合物の使用に関する。より詳細には本発明は、例えば心筋細胞におけるＬＩＮＣ複合体を破壊する、拡張型心筋症（ＤＣＭ）における疾患進行を抑制するためのドミナントネガティブもしくは変異型ＳＵＮドメインタンパク質、および／またはドミナントネガティブもしくは変異型ＫＡＳＨドメインタンパク質の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、心臓の筋肉に影響を及ぼす最も一般的な疾患であり、全ての心筋症のおよそ６０％を占める。ＤＣＭは、左室壁または場合によっては両心室の拡大および菲薄化のために低下した収縮期（収縮）機能によって特徴付けられる。ＤＣＭは突然の心不全および心臓死に関連し、高い入院率、心臓移植術の必要性、および結果的に高い費用負担をもたらす［Ｊ．Ｌ．ＪｅｆｆｅｒｉｅｓおよびＪ．Ａ．Ｔｏｗｂｉｎ、Ｌａｎｃｅｔ  ３７５：７５２〜７６２（２０１０）；Ｒ．Ｅ．Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １０：５３１〜５４７（２０１３）］。ＤＣＭの原因は多岐にわたるが、多様な外因子（ウイルス、自己免疫性浸潤、アルコール、および薬物）が含まれる。しかしながら、全ての症例の３０〜４０％は単一遺伝子に関する根拠を有し、４０個ほどの遺伝子における変異がＤＣＭに関連付けられている。ＤＣＭにおいて最も頻繁に変異する遺伝子は、巨大なサルコメアタンパク質であるタイチンをコードするＴＴＮであり、ＴＴＮの短縮型バリアントはＤＣＭの全ての先天性形態のほぼ１５〜２５％を占める［Ｄ．Ｓ．Ｈｅｒｍａｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：６１９〜６２８（２０１２）；Ｕ．Ｔａｙａｌ、Ｓ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ９：２０（２０１７）］。２番目に頻繁に変異する遺伝子はラミンＡ（ＬＭＮＡ）であり、先天性ＤＣＭ患者の６〜８％と多くを占める［Ｕ．Ｔａｙａｌ、Ｓ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ９：２０（２０１７）］。
【０００３】
ＬＭＮＡ誘導ＤＣＭは、房室ブロック、心室性不整脈、および細動を含む電気生理学的（ＥＣＧ）異常によって明らかとなる心伝導疾患によって特徴付けられる。突然の心臓死のリスクは、ＬＭＮＡ心筋症を有する患者の方が他の形態のＤＣＭを有する患者よりも大きい［Ｊ．Ｈ．Ｖａｎ  Ｂｅｒｉｏら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １４：２８３９〜２８４９（２００５）］。４５０ほどの異なる変異がＬＭＮＡ遺伝子において同定されているが、大半がミスセンスであり、その結果大多数のＤＣＭ症例が常染色体優性として遺伝し、変異のこの多様性がＬＭＮＡ誘導ＤＣＭを処置する遺伝学的手法を複雑にしている。限定的ではあるが、ＬＭＮＡ誘導ＤＣＭはペースメーカーを調整することによって処置することができる。しかしながら、最終的に、現時点での効果的な処置は心臓移植術によって達成される（Ｒ．Ｅ．ＨｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒおよびＡ．Ｍｏｒａｌｅｓ、ｉｎ  ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（登録商標）、Ｍ．Ｐ．Ａｄａｍら編（Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）、１９９３）；Ｇ．Ｃａｐｔｕｒら、Ｈｅａｒｔ  １０４：４６８〜４７９（２０１８）］。
【０００４】
Ｌｍｎａ変異を保有するマウス系は通例、生後数週間以内に死亡する［Ｔ．Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：９１３〜９２０（１９９９）；Ａ．Ｔ．Ｂｅｒｔｒａｎｄら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２１：１０３７〜１０４８（２０１２）；Ｖ．Ｎｉｋｏｌｏｖａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：３５７〜３６９（２００４）；Ａ．Ｓ．Ｗａｎｇら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ、（２０１５）］。Ｌｍｎａを欠くマウスにおける早期死亡の原因は、複数の組織が影響を受けているために不確かである。Ｌｍｎａ変異マウスは伝導異常および限局的な筋細胞変性を伴うＤＣＭを発病するため［Ｖ．Ｎｉｋｏｌｏｖａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：３５７〜３６９（２００４）；Ｌ．Ｃ．Ｍｏｕｎｋｅｓら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １４：２１６７〜２１８０（２００５）］、心筋障害は主要な一因であると考えられるが、まだ不明確な他の骨格筋に対する効果が出生後早期の死亡に寄与する可能性もある。
【０００５】
ラミンは、核中間径フィラメントタンパク質であり、核内膜（ＩＮＭ）の内側に位置するタンパク質マトリックスである核ラミナの主な構成要素である。ラミナは、２つの主たる形態であるラミンＡおよびラミンＣからなるＡ型ラミンからなり、Ａ型ラミンはＬＭＮＡの選択的スプライシングによって駆動するが、２種のＢ型ラミン（ＬＭＮＢ１および２）はそれぞれ、２種の遺伝子：ＬＭＮＢ１およびＬＭＮＢ２によってコードされる［Ｂ．ＢｕｒｋｅおよびＣ．Ｌ．Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：１３〜２４（２０１３）］。ラミナは、構造的および機械的完全性を核に付与し、細胞内における核の形状および位置を維持し、クロマチン形成の決定因子でもある［Ｔ．Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：９１３〜９２０（１９９９）；Ｉ．Ｓｏｌｏｖｅｉら、Ｃｅｌｌ  １５２：５８４〜５９８（２０１３）］。ラミンは、エメリン、ラミナ関連ポリペプチド（ＬＡＰ）、およびＳＵＮドメインタンパク質を含む多数のＩＮＭタンパク質と相互作用し［Ｂ．ｖａｎ  ＳｔｅｅｎｓｅｌおよびＡ．Ｓ．Ｂｅｌｍｏｎｔ、Ｃｅｌｌ  １６９：７８０〜７９１（２０１７）］、そのＩＮＭタンパク質の多くは、変異しているかまたはバリアントとして存在する場合、心臓疾患に関連付けられる［Ｈ．Ｊ．Ｗｏｒｍａｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：ａ０００７６０（２０１０）；Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１３：２１４４〜２１５６（２００７）］。さらに、これらのタンパク質はラミナを中心とした一体化したタンパク質ネットワークを構成し、ここでラミンの喪失または変異は、多くのラミナ関連タンパク質（エメリン、ＳＵＮ１、ＬＢＲ、およびＬａｐ２α）の誤局在または発現レベルの変化をもたらし得る［Ｔ．Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：９１３〜９２０（１９９９）；Ｉ．Ｓｏｌｏｖｅｉら、Ｃｅｌｌ  １５２：５８４〜５９８（２０１３）；Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）；Ｔ．Ｖ．Ｃｏｈｅｎら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２２：２８５２〜２８６９（２０１３）；Ｆ．Ｈａｑｕｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５：３４８７〜３４９８（２０１０）］。発現がＬｍｎａの喪失または変異の影響を受けるこれらのタンパク質のうちにはＳＵＮ１およびＬａｐ２があり、両者のレベルのどちらも増加する。ＳＵＮ１の場合、レベルの増加は、発現の増加よりもむしろ代謝回転の低下によるものであり、その結果高いレベルがゴルジに蓄積し、少なくともＬｍｎａ−／−およびＬｍｎａΔ９マウス疾患モデルにおいて細胞毒性となると考えられた［Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）；Ｃ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＢ．Ｂｕｒｋｅ、ＷＯ／２０１３／１５８０４６］。しかしながら、ＳＵＮ１レベルがＬｍｎａ変異を有するマウスにおいて遺伝子的に下がる場合、これは寿命を３倍に増加させ、病態の大部分を改善する［Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）；Ｃ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＢ．Ｂｕｒｋｅ、ＷＯ／２０１３／１５８０��６］。野生型またはＳｕｎ１−／−の生存中央値は７か月の追跡期間である２１０日を超え；Ｌｍｎａ−／−マウスは４１日の生存中央値を有し；Ｌｍｎａ−／−Ｓｕｎ１＋／−マウスは５４日の生存中央値を有し；Ｌｍｎａ−／−Ｓｕｎ１−／−マウスは１０４日の生存中央値を有した（Ｌｍｎａ−／−とＬｍｎａ−／−Ｓｕｎ１−／−とを比較するｐ＜０．０１）。同様に、全てのＬｍｎａΔ９マウスは生後３０日で死亡したが、そのＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１−／−同腹子はこの期間を超えて生育し、大半がこの存続期間の２倍超の生存期間を達成した［Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）］。細胞レベルでは、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｏｇｅｒｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）をもたらすＬＭＮＡ変異を包含するヒト線維芽細胞もまた、増加したＳｕｎ１レベルを呈した。これらの細胞においてＳｕｎ１を大きく減少させることは核形態異常を軽減し、このことはさらに、ＬＭＮＡ変異に起因する過剰なＳｕｎ１が細胞毒性であることを示唆した［Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）；Ｃ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＢ．Ｂｕｒｋｅ、ＷＯ／２０１３／１５８０４６］。
【０００６】
ＳＵＮ（Ｓａｄ１ｐ、ＵＮＣ−８４）ドメインタンパク質は、保存されたＣ末端ＳＵＮドメインを共有し、ＩＮＭに局在する［Ｃ．Ｊ．Ｍａｌｏｎｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６：３１７１〜３１８１（１９９９）］。哺乳動物において、ＳＵＮ１およびＳＵＮ２は実質的に全ての組織において広く発現する２種の主なＳＵＮタンパク質である。ＩＮＭと核外膜（ＯＮＭ）との間の核膜槽において、ＳＵＮ１および／または２のＣ末端は、ＯＮＭを横断する異なるＮｅｓｐｒｉｎ／ＳＹＮＥ／ＫＡＳＨタンパク質のＣ末端（ＫＡＳＨドメイン）に結合する。さらに、これら２つのタンパク質のファミリーは、間期核を細胞骨格に物理的にカップリングするＬＩＮＣ複合体を構成する［Ｍ．Ｃｒｉｓｐら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７２：４１〜５３（２００６）；Ｅ．Ｃ．ＴａｐｌｅｙおよびＤ．Ａ．Ｓｔａｒｒ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：５７〜６２（２０１３）］。ＳＵＮドメインタンパク質のＮ末端は核質に突出しており、ＳＵＮ１では、この領域はプレラミンＡおよび核膜孔複合体と相互作用する。ＳＵＮ２のＮ末端が任意の核質／ＮＥタンパク質と相互作用するか否かは明らかではない。対照的に、Ｎｅｓｐｒｉｎ／ＫＡＳＨドメインタンパク質の大部分は、ＯＮＭに隣接する細胞質に伸長する。そこで、特定のＮｅｓｐｒｉｎ／ＫＡＳＨタンパク質に応じて、３つの細胞骨格タンパク質ネットワーク（微小管、アクチンマイクロフィラメント、および中間径フィラメント）全てと直接的または間接的に相互作用する［Ｈ．Ｆ．Ｈｏｒｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０９：２８７〜３２１（２０１４）］。さらに、ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮおよびＫＡＳＨ／Ｎｅｓｐｒｉｎタンパク質は、細胞質の細胞骨格ネットワーク（およびその接続物質、例えば細胞膜における細胞接着複合体）と、間期核内部または核質との間の直接的な物理的接続を確立する。ＬＩＮＣ複合体は、核と細胞骨格との間の力の伝達を媒介し、その結果、機械的／物理的刺激に応答する遺伝子発現／クロマチン形成の変化を制御すると考えられる［Ｓ．Ｇ．Ａｌａｍら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ６：３８０６３（２０１６）］。ＳＵＮ１またはＳＵＮ２いずれかのみの喪失は出生後の成長および生存に対する明白な効果を有しないが、ＳＵＮ１ヌルマウスは不妊かつ難聴である。Ｓｕｎ１およびＳｕｎ２の同時喪失は、周産期致死性をもたらし、胚形成中のある程度の重複を示す［Ｋ．Ｌｅｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：１０２０７〜１０２１２（２００９）］。
【０００７】
Ｓｕｎ１の過剰蓄積がＬｍｎａ変異を保有する細胞に対して有する負の効果を改善する代替的方法を開発する必要がある。本開示はそのような方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、蓄積したＳｕｎ１タンパク質の除去よりもむしろＬＩＮＣ複合体の破壊が１つまたは複数のＬｍｎａ変異によって引き起こされる疾患を改善することができることを見出した。破壊を達成する１つの手段は、作動可能に連結した導入遺伝子を含む発現構築物／ベクターを介するものであり、導入遺伝子の発現は、ドミナントネガティブＳＵＮドメインタンパク質もしくは変異型内在性ＳＵＮドメインタンパク質、および／またはドミナントネガティブＫＡＳＨドメインタンパク質もしくは変異型内在性ＫＡＳＨドメインタンパク質を発生させる。外在性ドミナントネガティブＳＵＮドメインおよびＫＡＳＨドメインタンパク質は、ＬＩＮＣ複合体結合競合物質として作用し、それにより核を細胞骨格との連結から分離させる。変異型ＳＵＮドメインおよびＫＡＳＨドメインタンパク質は、それぞれＳＵＮまたはＫＡＳＨドメインが変異しており、自らの同族のＬＩＮＣ複合体パートナーに結合することができないためにＬＩＮＣ複合体を形成することができない内在性ＳｕｎおよびＮｅｓｐｒｉｎタンパク質である。これらの戦略は、ＬＩＮＣ複合体を破壊して、例えばラミノパチーを処置するために使用することができる。結果は、内在性ＳＵＮ１タンパク質レベルを積極的に低下させることなく達成された。本明細書に示す結果は、これらの主張を支持する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、単離された核酸分子であって、該核酸分子は、発現ベクターおよび導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、該発現ベクターに作動可能に連結しており、トランスフェクトされた細胞における該導入遺伝子の発現は、トランスフェクトされた細胞におけるＬＩＮＣ複合体の破壊をもたらす、前記核酸分子が提供される。
【００１０】
一部の実施形態では、発現ベクターは心臓または心筋細胞特異的発現ベクターである。
一部の実施形態では、発現ベクターは、心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）、α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）プロモーター、およびミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ｖ）プロモーターを含む群から選択される心臓または心筋細胞特異的プロモーターを含む。好ましくは、プロモーターは心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）である。
【００１１】
一部の実施形態では、心筋細胞特異的プロモーターはニワトリ心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）である。
一部の実施形態では、発現ベクターは心臓に向性を有する／心臓向性である。
【００１２】
一部の実施形態では、発現ベクターはウイルス発現ベクターである。
一部の実施形態では、ウイルス発現ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む群から選択される。好ましくは、ウイルス発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【００１３】
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９（血清型９）、ＡＡＶ１（血清型１）、ＡＡＶ６（血清型６）、ＡＡＶ８（血清型８）、ＡＡＶ２ｉ８、およびＡＡＶ９．４５からなる群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９（血清型９）である。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＳＵＮドメイン含有タンパク質の内腔ドメイン、Ｎ末端シグナル配列、シグナルペプチダーゼ切断部位、およびＣ末端ターゲティングペプチド配列を発現するための核酸配列を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、ＳＵＮドメイン含有タンパク質の内腔ドメインは、コイルドコイルドメインおよびＳＵＮドメインを含む。
好ましい一実施形態では、コイルドコイルドメインはＳＵＮドメインの上流にある。
【００１６】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、Ｎ末端シグナル配列、シグナルペプチダーゼ切断部位、およびＣ末端ターゲティングペプチド配列を発現するための核酸配列をさらに含む。
【００１７】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、Ｎ末端シグナル配列、シグナルペプチダーゼ切断部位、およびＣ末端ターゲティングペプチド配列、ならびにＳＵＮドメイン含有タンパク質の管腔ドメインまたはＳＵＮドメインのいずれかを発現するための核酸配列を含む。
【００１８】
好ましくは、ＳＵＮドメインタンパク質はＳＵＮ１またはＳＵＮ２である。
一部の実施形態では、Ｓｕｎ１の管腔ドメインは、全長マウスＳｕｎ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９Ｄ６６６）のアミノ酸４５８〜９１３、またはコイルドコイルドメインおよびＳＵＮドメインを含み、膜貫通ドメインを欠くそのヒト等価物を含む。Ｓｕｎ１のドミナントネガティブ形態の構造の概略図を図７に示す。
【００１９】
ＳＵＮドメイン構築物に関しては、ＳＵＮドメインがＫＡＳＨドメインに結合することができるため、管腔ドメイン全体（コイルドコイルドメインおよびＳＵＮドメイン）ではなくＳＵＮドメイン単独（ＫｕｔａｙおよびＳｃｈｗａｒｔｚの研究室によって解析された結晶構造［Ｓｏｓａら、Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０３５〜４７（２０１２）］は、ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を破壊するのに十分であると予期される。ヒトＳｕｎ１  ＳＵＮドメイン核酸配列は、配列番号８０に記載される。しかしながら、シグナル配列およびＫＤＥＬ配列の存在は、構築物を核膜槽にターゲティングするために重要である。
【００２０】
一部の実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は、分泌タンパク質またはＩ型膜貫通タンパク質に由来する。
好ましくは、分泌タンパク質またはＩ型膜貫通タンパク質は、ヒト血清アルブミン、プロインスリン、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、プレプロオピオメラノコルチン、膵臓消化酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、およびリパーゼ）、小胞体管腔タンパク質、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ＧＲＰ９４、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、Ｎ末端シグナル配列はヒト血清アルブミンに由来する。
【００２１】
一部の実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は、そのＮ末端においていかなる他のタグも上流に存在しない。
一部の実施形態では、シグナルペプチダーゼ切断部位は、ヒト血清アルブミン、プロインスリン、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、プレプロオピオメラノコルチン、膵臓消化酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、およびリパーゼ）、小胞体内腔タンパク質、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ＧＲＰ９４、ならびにそれらの組合せからなる群のうちの１つに由来するシグナルペプチダーゼ切断部位であるか、またはその群のうちの１つである。好ましくは、シグナルペプチダーゼ切断部位は、ヒト血清アルブミンに由来するシグナルペプチダーゼ切断部位である。
【００２２】
一部の実施形態では、Ｃ末端ターゲティングペプチド配列は、本発明の任意の態様に記載の導入遺伝子から発現したペプチドの分泌を妨げる。
一部の実施形態では、Ｃ末端ターゲティングペプチド配列はＫＤＥＬテトラペプチドゴルジ回収配列である。そのような構造の例を図１１および１２に示す。
【００２３】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、ヒト化Ｓｕｎ１ＤＮ核酸配列またはヒト化Ｓｕｎ２ＤＮ核酸配列を含む。好ましい一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号４に記載される、シグナル配列、ヒト化Ｓｕｎ１ＤＮ核酸配列、およびＫＤＥＬ配列を含むか、または導入遺伝子は、配列番号５に記載される、シグナル配列、ヒト化Ｓｕｎ２ＤＮ核酸配列、およびＫＤＥＬ配列を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、導入遺伝子はエピトープタグをさらに含む。好ましくは、エピトープタグは、Ｎ末端にあるか、またはＣ末端ターゲティングペプチド配列［例えばＫＤＥＬ］の下流（後）を除く核酸分子の任意の場所に位置するか、またはＮ末端シグナル配列の上流（前）を除く核酸分子の任意の場所に位置する。
【００２５】
一部の実施形態では、エピトープタグは、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、１つまたは複数のＦＬＡＧタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ルシフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ｃ−Ｍｙｃ、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、Ｔ７、チオレドキシン、Ｖ５、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、エピトープタグはヘマグルチニンＡ（ＨＡ）である。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、ニワトリ心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）、ならびにＳＵＮ１に由来するＳＵＮドメイン含有タンパク質の管腔ドメイン、それぞれがヒト血清アルブミンに由来するＮ末端シグナル配列およびシグナルペプチダーゼ切断部位、ＫＤＥＬ配列であるＣ末端ターゲティングペプチド配列を含む本発明の任意の態様に記載の導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含み、導入遺伝子は任意選択で、Ｎ末端エピトープタグとしてヘマグルチニン（ＨＡ）をさらに含む。
【００２７】
一実施形態によれば、そのようなベクターの一例は、図１０に示され、配列番号３に記載される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、ニワトリ心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）、ならびにＳＵＮ２に由来するＳＵＮドメイン含有タンパク質の管腔ドメイン、それぞれがヒト血清アルブミンに由来するＮ末端シグナル配列およびシグナルペプチダーゼ切断部位、ＫＤＥＬ配列であるＣ末端ターゲティングペプチド配列を含む本発明の任意の態様に記載の導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含み、導入遺伝子は任意選択で、Ｎ末端エピトープタグとしてヘマグルチニン（ＨＡ）をさらに含む。
【００２８】
一実施形態によれば、一例としての核酸分子は、図１０に示すベクター構造、および配列番号５に記載される導入遺伝子核酸配列を含み得る。
ＳＵＮドメイン含有タンパク質の内腔ドメインの成分を発現するのではなく、ＫＡＳＨドメインが発現して、ＳＵＮ１およびＳＵＮ２ドメインへの結合に関して内在性Ｎｅｓｐｒｉｎ（ＫＡＳＨドメインを含む）と競合することによってＬＩＮＣ複合体を破壊してもよい。
【００２９】
したがって、本発明の核酸分子の一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＫＡＳＨドメインおよびＮ末端安定化ポリペプチド配列を発現するための核酸配列を含む。
好ましくは、ＫＡＳＨドメインは、膜貫通ドメインおよびＳＵＮ相互作用ペプチドを含む。
【００３０】
好ましくは、導入遺伝子は、核外膜を横断するＫＡＳＨドメイン、Ｃ末端において核膜槽に伸長するＳＵＮ相互作用ＫＡＳＨペプチド、および細胞質におけるＮ末端安定化ポリペプチド配列を発現するための核酸配列を含む。
【００３１】
天然に存在するＫＡＳＨドメインの最後のＣ末端アミノ酸の後に伸長鎖を有するＫＡＳＨドメイン構築物は機能しないと予期される、すなわち、Ｃ末端タグ、またはカルボキシ末端の追加の単一アミノ酸でさえ、ＳＵＮとのＫＡＳＨ相互作用を破壊し得るということは理解されるだろう。加えて、ＳＵＮドメイン構築物のＮ末端におけるシグナル配列はいかなるタグも上流に存在し得ない。
【００３２】
一部の実施形態では、ＫＡＳＨドメインは、ＫＡＳＨ１（Ｎｅｓｐｒｉｎ−１（ＳＹＮＥ１遺伝子）に由来する）、ＫＡＳＨ２（Ｎｅｓｐｒｉｎ−２（ＳＹＮＥ２遺伝子）に由来する）、ＫＡＳＨ３（Ｎｅｓｐｒｉｎ−３（ＳＹＮＥ３遺伝子）に由来する）、ＫＡＳＨ４（Ｎｅｓｐｒｉｎ−４（ＳＹＮＥ４遺伝子）に由来する）、およびＫＡＳＨ５（ＫＡＳＨ５／ＣＣＤＣ１５５（ＫＡＳＨ５遺伝子）に由来する）からなる群から選択される。
【００３３】
好ましい実施形態では、ＫＡＳＨ１ドメインは配列番号７に記載されるヒトアミノ酸配列を含み、ＫＡＳＨ２ドメインは配列番号９に記載されるヒトアミノ酸配列を含み、ＫＡＳＨ３ドメインは配列番号１１に記載されるヒトアミノ酸配列を含み、ＫＡＳＨ４ドメインは配列番号１３に記載されるヒトアミノ酸配列を含み、ＫＡＳＨ５ドメインは配列番号１５に記載されるヒトアミノ酸配列を含む。５つのＫＡＳＨアミノ酸配列のアラインメントを図１４に示す。
【００３４】
一部の実施形態では、ＫＡＳＨドメイン核酸配列は、配列番号６に記載されるＫＡＳＨ１ドメインの核酸配列、配列番号８に記載されるＫＡＳＨ２ドメインの核酸配列、配列番号１０に記載されるＫＡＳＨ３ドメインの核酸配列、配列番号１２に記載されるＫＡＳＨ４ドメインの核酸配列、または配列番号１４に記載されるＫＡＳＨ５ドメインの核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する。
【００３５】
より好ましくは、臨床使用を目的とする場合、ＫＡＳＨドメインは、配列番号６に記載されるヒトＫＡＳＨ１ドメインの核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＳＹＮＥ１のヒトＫＡＳＨ１ドメインである。
【００３６】
遺伝暗号の重複のために、核酸配列は１００％未満の同一性を有しても依然として同じアミノ酸配列をコードし得るということは理解されるだろう。
一部の実施形態では、ＫＡＳＨドメインは、天然に存在するＫＡＳＨドメインと比較して最後のＣ末端アミノ酸の後にいかなる伸長鎖も含まない。
【００３７】
一部の実施形態では、Ｎ末端安定化ポリペプチド配列は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、チオレドキシン、ＤＨＦＲ、ならびにそれらの重複および組合せからなる群から選択される。
【００３８】
一部の実施形態では、Ｎ末端安定化ポリペプチド配列は、別々に折り畳まれたドメインを形成する。
一部の実施形態では、ベクターは心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）であり、導入遺伝子はＫＡＳＨドメインおよびＮ末端安定化ポリペプチド配列を発現するための核酸配列を含み、ＫＡＳＨドメインはＫＡＳＨ１、ＫＡＳＨ２、ＫＡＳＨ３、ＫＡＳＨ４、およびＫＡＳＨ５を含む群から選択される。
【００３９】
一部の実施形態では、Ｎ末端安定化ポリペプチド配列は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
ＳＵＮドメイン含有タンパク質の内腔ドメインまたはＫＡＳＨドメインの成分を発現して、内在性Ｎｅｓｐｒｉｎ（ＫＡＳＨドメインを含む）またはＳｕｎ１およびＳｕｎ２（ＳＵＮドメインを含む）との結合に関して競合することによってＬＩＮＣ複合体を破壊するのではない、ＬＩＮＣ複合体を破壊するための別の手法は、内在性ＳＵＮドメインまたはＫＡＳＨドメインを、自らの同族のＬＩＮＣ複合体結合パートナーに結合できないように、またはそのパートナーに関して低下した結合能を有するように、改変することである。
【００４０】
ＳＵＮドメインとＫＡＳＨドメインはどちらもそれぞれのタンパク質のＣ末端に位置するため、改変ＳＵＮまたはＫＡＳＨドメインを生成する１つの手段は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＳＵＮまたはＫＡＳＨドメインタンパク質をコードする遺伝子を改変し、ＣＲＩＳＰＲ誘導非相同末端結合後のそれぞれのタンパク質配列の３’末端に未成熟終止コドンを発生させることである。このことは、Ｃ末端ＳＵＮまたはＫＡＳＨドメインが変異した短縮型タンパク質を生じ得る。短縮型タンパク質は、発現して膜局在し得るが、自らの同族のＬＩＮＣ複合体パートナーと相互作用することができない。
【００４１】
したがって、本発明の核酸分子の一部の実施形態では、導入遺伝子は、内在性Ｓｕｎタンパク質のＳＵＮドメインまたは内在性Ｎｅｓｐｒｉｎタンパク質のＫＡＳＨドメインをコードする核酸を改変するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓまたは他の合成ヌクレアーゼ系を発現するための核酸配列を含む。
【００４２】
本明細書に示すデータ（実施例６）は、ＳＵＮ２ドメインまたはＫＡＳＨ２ドメインの改変はＬｍｎａ病態を改善しないことを示唆する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、Ｓｕｎ１タンパク質の内在性ＳＵＮドメインまたはＮｅｓｐｒｉｎ−１タンパク質の内在性ＫＡＳＨドメインを改変して、ＬＩＮＣ複合体を破壊する。それぞれの核酸はＳｕｎ１およびＳｙｎｅ１である。
【００４３】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、マウスＳｕｎ１のＳＵＮドメインを改変する、５’−ＧＣＡＣＡＡＴＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＧ−３’（配列番号６６）を含むｇＲＮＡ核酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを発現するための核酸配列を含む。
【００４４】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号８０に記載されるヒトＳＵＮ１ドメインを標的とするｇＲＮＡ核酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを発現するための核酸配列を含む。好ましくは、ｇＲＮＡ核酸配列は、配列番号８１に記載される核酸配列を含むエクソン２０の末端を標的とする。より好ましくは、ｇＲＮＡ核酸配列は、表３に記載される配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、および配列番号６５を含む群から選択されるＳＵＮ１核酸配列を標的とする。
【００４５】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、マウスＳｙｎｅ−１のＫＡＳＨドメインを改変する、５’−ＣＣＧＴＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴ−３’（配列番号３４）を含むｇＲＮＡ核酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを発現するための核酸配列を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号６に記載されるヒトＫＡＳＨドメインを標的とするｇＲＮＡ核酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを発現するための核酸配列を含む。好ましくは、ｇＲＮＡ核酸配列は、表３に記載される配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４を含む群から選択される核配列を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９またはそのバリアントを発現するための核酸配列を含む。
好ましい実施形態では、導入遺伝子はドミナントネガティブ構築物である。
【００４８】
一部の実施形態では、導入遺伝子はヒト化導入遺伝子である。
一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮドメインとＫＡＳＨドメインとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の破壊をもたらす。好ましくは、ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮとＫＡＳＨとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の破壊は、Ｓｕｎ１＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−１、Ｓｕｎ２＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−１、Ｓｕｎ１＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−２、Ｓｕｎ１＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−３、Ｓｕｎ２＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−２、およびＳｕｎ２＋Ｎｅｓｐｒｉｎ−３からなる群から選択されるタンパク質相互作用間で生じる。より好ましくは、ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮとＫＡＳＨとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の破壊は、Ｓｕｎ１とＮｅｓｐｒｉｎ−１とのタンパク質相互作用間で生じる。
【００４９】
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは対象の心筋への送達のために製剤化されている。
本発明の第２の態様によれば、対象における１つまたは複数のＬｍｎａ変異によって引き起こされる疾患を処置することにおける使用のための、本発明の任意の実施形態の核酸分子が提供される。
【００５０】
第２の態様の一部の実施形態では、疾患は、拘束性皮膚障害、家族性部分性リポジストロフィー（例えばダニガン型）、Ａ型リポジストロフィーを伴う下顎末端（ｍａｎｄｉｂｕｌｏａｃｒａｌ）異形成症、メタボリックシンドローム、シャルコー・マリー・トゥース病２型、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ１型、および表１に通常のフォントで示される疾患からなる群から選択される。
【００５１】
【表１−１】
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【００５２】
【表１−２】
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【００５３】
【表１−３】
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【００５４】
【表１−４】
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【００５５】
【表１−５】
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【００５６】
【表１−６】
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【００５７】
【表１−７】
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【００５８】
【表１−８】
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【００５９】
【表１−９】
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【００６０】
【表１−１０】
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【００６１】
【表１−１１】
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【００６２】
【表１−１２】
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【００６３】
【表１−１３】
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【００６４】
【表１−１４】
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【００６５】
【表１−１５】
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【００６６】
【表１−１６】
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【００６７】
【表１−１７】
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【００６８】
【表１−１８】
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【００６９】
【表１−１９】
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【００７０】
【表１−２０】
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【００７１】
【表１−２１】
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【００７２】
【表１−２２】
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【００７３】
【表１−２３】
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【００７４】
【表１−２４】
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【００７５】
【表１−２５】
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【００７６】
【表１−２６】
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【００７７】
【表１−２７】
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【００７８】
【表１−２８】
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【００７９】
【表１−２９】
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【００８０】
【表１−３０】
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【００８１】
【表１−３１】
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【００８２】
【表１−３２】
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【００８３】
【表１−３３】
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【００８４】
【表１−３４】
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【００８５】
【表１−３５】
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【００８６】
【表１−３６】
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【００８７】
【表１−３７】
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【００８８】
【表１−３８】
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【００８９】
【表１−３９】
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【００９０】
【表１−４０】
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【００９１】
【表１−４１】
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【００９２】
【表１−４２】
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【００９３】
【表１−４３】
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【００９４】
【表１−４４】
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【００９５】
【表１−４５】
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【００９６】
【表１−４６】
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【００９７】
【表１−４７】
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【００９８】
【表１−４８】
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【００９９】
【表１−４９】
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【０１００】
【表１−５０】
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【０１０１】
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【０１０２】
【表１−５２】
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【表１−５３】
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【０１０５】
【表１−５５】
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【０１０６】
【表１−５６】
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【０１０７】
【表１−５７】
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【０１０８】
【表１−５８】
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【０１０９】
【表１−５９】
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【０１１０】
【表１−６０】
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【０１１１】
【表１−６１】
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【０１１２】
【表１−６２】
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【０１１３】
【表１−６３】
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【０１１４】
【表１−６４】
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【０１１５】
【表１−６５】
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【０１１６】
【表１−６６】
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【０１１７】
【表１−６７】
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【０１１８】
【表１−６８】
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【０１１９】
【表１−６９】
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【０１２０】
【表１−７０】
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【０１２１】
【表１−７１】
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【０１２２】
【表１−７２】
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【０１２３】
【表１−７３】
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【０１２４】
【表１−７４】
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【０１２５】
【表１−７５】
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【０１２６】
【表１−７６】
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【０１２７】
【表１−７７】
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【０１２８】
【表１−７８】
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【０１２９】
【表１−７９】
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【０１３０】
【表１−８０】
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【０１３１】
【表１−８１】
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【０１３２】
【表１−８２】
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【０１３３】
【表１−８３】
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【０１３４】
一部の実施形態では、本発明の任意の態様に記載の核酸分子は、対象における心血管疾患を処置することにおける使用のためのものである。
一部の実施形態では、疾患または心血管疾患は、少なくとも１つのＬｍｎａ変異の存在によって特徴付けられる。
【０１３５】
好ましくは、心血管疾患は、ラミノパチー、心筋症、例えば拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拡張型心筋症１Ａ、伝導系障害を伴う拡張型心筋症、高度ＡＶブロックおよび不整脈を伴う心筋症、孤立性心房細動；筋ジストロフィー（多くの場合心筋症に関連する）、例えばエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体優性）に関連する心筋症、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体劣性）に関連する心筋症、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型に関連する心筋症、先天性筋ジストロフィーに関連する心筋症；早期老化症候群（主として血管性であるが、心病変を有する場合もあると考えられる）、例えば非定型ウェルナー症候群に関連する心筋症、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群に関連する心筋症等、ならびに表１に太字のフォントで示される疾患からなる群から選択される。
【０１３６】
本発明の第３の態様によれば、心筋トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）、および本発明の任意の態様に記載の導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が提供される。
【０１３７】
本発明の第４の態様によれば、本発明の任意の実施形態に記載の核酸分子を含む、疾患を処置するための医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、疾患はラミノパチーである。
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明に記載の核酸分子を含む医薬組成物は、対象における心血管疾患を処置することにおける使用のためのものである。
本発明の第５の態様によれば、対象における疾患を処置する方法であって、薬学的有効量の本発明の任意の実施形態に記載の核酸分子または本発明の医薬組成物の投与を含む、前記方法が提供される。
【０１３９】
対象における疾患を処置する方法の一部の実施形態では、疾患は少なくとも１つのＬｍｎａ変異の存在によって特徴付けられる。
対象における疾患を処置する方法の一部の実施形態では、方法は、
（ｉ）疾患を有すると疑われる対象から取得した試料を、少なくとも１つのＬｍｎａ変異の存在または非存在に関して試験するステップ
を含み、少なくとも１つのＬｍｎａ変異の存在は、対象が本発明の医薬組成物または本発明の核酸分子を投与されるべきであることを示す。
【０１４０】
対象における疾患を処置する方法の一部の実施形態では、Ｌｍｎａ変異は、Ｌｍｎａ遺伝子のラミンＡアイソフォームもしくはラミンＣアイソフォーム、またはラミンＡ／Ｃアイソフォームの両方に影響を及ぼす。
【０１４１】
対象における疾患を処置する方法の一部の実施形態では、疾患は、拘束性皮膚障害、家族性部分性リポジストロフィー（例えばダニガン型）、Ａ型リポジストロフィーを伴う下顎末端異形成症、メタボリックシンドローム、シャルコー・マリー・トゥース病２型、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ１型、および表１に通常のフォントで示される疾患からなる群から選択される。
【０１４２】
対象における疾患を処置する方法の一部の実施形態では、疾患は心血管疾患であり、心血管疾患は、ラミノパチー、心筋症、例えば拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拡張型心筋症１Ａ、伝導系障害を伴う拡張型心筋症、高度ＡＶブロックおよび不整脈を伴う心筋症、孤立性心房細動；筋ジストロフィー（多くの場合心筋症に関連する）、例えばエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体優性）に関連する心筋症、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体劣性）に関連する心筋症、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型に関連する心筋症、先天性筋ジストロフィーに関連する心筋症；早期老化症候群（主として血管性であるが、心病変を有する場合もあると考えられる）、例えば非定型ウェルナー症候群に関連する心筋症、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群に関連する心筋症；ならびに表１に太字のフォントで示される疾患からなる群から選択される。
【０１４３】
対象における疾患を処置する方法の一部の実施形態では、対象はマウス等の非ヒト哺乳動物またはヒトである。
方法の一部の実施形態では、マウスは、Ｎ１９５Ｋマウス（Ｌｍｎａ  Ｎ１９５Ｋ／Ｎ１９５Ｋ）、またはＬｍｎａコンディショナルノックアウト（Ｌｍｎａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）である。
【０１４４】
本発明の第６の態様によれば、１つまたは複数のＬｍｎａ変異によって引き起こされる疾患を処置するための医薬の製造における、本発明に記載の医薬組成物または本発明に記載の核酸分子の使用が提供される。
【０１４５】
一部の実施形態では、疾患はＬｍｎａ変異関連の心血管疾患である。
一部の実施形態では、疾患は、拘束性皮膚障害、家族性部分性リポジストロフィー（例えばダニガン型）、Ａ型リポジストロフィーを伴う下顎末端異形成症、メタボリックシンドローム、シャルコー・マリー・トゥース病２型、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ１型、および表１に通常のフォントで示される疾患からなる群から選択される。
【０１４６】
一部の実施形態では、心血管疾患は、ラミノパチー、心筋症、例えば拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拡張型心筋症１Ａ、伝導系障害を伴う拡張型心筋症、高度ＡＶブロックおよび不整脈を伴う心筋症、孤立性心房細動；筋ジストロフィー（多くの場合心筋症に関連する）、例えばエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体優性）に関連する心筋症、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（常染色体劣性）に関連する心筋症、肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型に関連する心筋症、先天性筋ジストロフィーに関連する心筋症；早期老化症候群（主として血管性であるが、心病変を有する場合もあると考えられる）、例えば非定型ウェルナー症候群に関連する心筋症、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群に関連する心筋症等、ならびに表１に太字のフォントで示される疾患からなる群から選択される。
【０１４７】
本発明の第７の態様によれば、細胞におけるＬＩＮＣ複合体を阻害または破壊することができる薬物候補をスクリーニングするための方法が提供される。
したがって、一部の実施形態では、細胞におけるＬＩＮＣ複合体のタンパク質の相互作用を阻害することができる薬物候補をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）薬物の存在下で前記ＬＩＮＣ複合体のタンパク質を組み合わせて第１の複合体を形成するステップ、
（ｂ）前記薬物の非存在下でタンパク質を組み合わせて第２の複合体を形成するステップ、
（ｃ）前記第１の複合体および前記第２の複合体の量を測定するステップ、ならびに
（ｄ）前記第１の複合体の量を前記第２の複合体の量と比較するステップ
を含み、前記第１の複合体の量が前記第２の複合体の量よりも少ない場合、薬物が細胞における前記ＬＩＮＣ複合体のタンパク質の相互作用を阻害するための薬物候補である、方法が提供される。
【０１４８】
一部の実施形態では、薬物候補は、ＬＩＮＣ複合体のＳＵＮとＫＡＳＨとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を破壊する。好ましくは、薬物候補は、Ｓｕｎ１タンパク質とＮｅｓｐｒｉｎ−１タンパク質との間の相互作用を破壊する。
【０１４９】
一部の実施形態では、前記スクリーニングはｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングである。
一部の実施形態では、前記複合体はＥＬＩＳＡ法によって測定される。
一部の実施形態では、組換えＳＵＮドメインは固体表面に固定化され、組換えＫＡＳＨドメインは比色または化学発光読み出しを生成することができる酵素により標識される。ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を阻害することができない化合物は、プレートにおいて、組換えＳＵＮが酵素連結ＫＡＳＨドメインに結合し得るウェルを生じることになる。洗浄ステップおよび比色または化学発光酵素基質とのインキュベーション後、ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用の存在は標準的なプレートリーダーにおいて検出することができる。化合物がＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を阻害することができる場合、洗浄ステップ後、ＫＡＳＨドメインは除去され、ウェルにおける酵素反応は低下しているかまたは存在しないと考えられる。
【０１５０】
一部の実施形態では、前記第１の複合体の量が前記第２の複合体の量よりも少ない場合、前記薬物は前記タンパク質の相互作用を阻害するための薬物候補である。
一部の実施形態では、前記複合体は蛍光異方性測定法によって測定される。
【０１５１】
一部の実施形態では、蛍光異方性測定法は組換えＳＵＮおよびＫＡＳＨドメインを用いる。一部の実施形態では、ＫＡＳＨドメインはフルオレセイン部分を用いて蛍光標識され、ＳＵＮドメインと相互作用するＫＡＳＨドメインの蛍光異方性は、蛍光分光計機能を組み込むプレートリーダー等の標準的な機器を使用して測定され得る。
【０１５２】
一部の実施形態では、前記第１の複合体の量が前記第２の複合体の量よりも少ない場合、蛍光ＫＡＳＨの蛍光異方性の点において差が存在すると考えられ、前記薬物が前記タンパク質の相互作用を阻害するための薬物候補となる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、ラミンＡ／Ｃ遺伝子であるＬＭＮＡにおける変異、および変異に起因するラミノパチーの概略図を示す。
【図２】図２は、核エンベロープ膜（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）および核ラミナの成分の配置の概略図を示す。
【図３】図３は、ＬＩＮＣ複合体を介した核と細胞外マトリックスとの間の接続、およびラミンＡ／Ｃにおける変異がいかにしてＤＣＭを生じ得るかに関する概略図を示す。形質膜、細胞骨格、および核は、機械的および物理的に連結した構成体（ｅｎｔｉｔｙ）を形成する。Ｌｍｎａ変異体では、核は構造的に弱い。その核は、細胞骨格の力からの機械的応力の影響をはるかに受けやすい。このことは筋細胞核に重度の損傷をもたらし、この損傷は、最終的にＤＣＭを生じるアポトーシスおよび線維化等の一連の事象をもたらす。
【図４】図４は、Ｌｍｎａ＋／＋およびＬｍｎａ−／−マウスの核への低圧力下でのデキストランのマイクロインジェクションの効果を示す。野生型細胞では、デキストランは核に留まるが、Ｌｍｎａ変異細胞では、デキストランは核から細胞質へ流出する。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＬＩＮＣ複合体（図５Ａ）、およびＫＡＳＨとＳＵＮとの間の相互作用（図５Ｂ）の概略図を示す。
【図６】図６は、Ｌｍｎａ−／−およびＬｍｎａΔ９マウスにおける体重および寿命に関する欠陥がホモ接合型Ｓｕｎ１ノックアウトＬｍｎａ−／−Ｓｕｎ１−／−およびＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１−／−動物において改善することを示す。（Ａ）体重は示された遺伝子型を有するマウスの平均である。使用した動物の数（ｎ）が示される。（Ｂ）Ｌｍｎａ−／−マウスと比較して増加したＬｍｎａ−／−Ｓｕｎ１−／−マウスの生存期間を示すカプラン・マイヤーのグラフである。野生型またはＳｕｎ１−／−の生存中央値は７か月の追跡期間である２１０日を超え；Ｌｍｎａ−／−マウスは４１日の生存中央値を有し；Ｌｍｎａ−／−Ｓｕｎ１＋／−マウスは５４日の生存中央値を有し；Ｌｍｎａ−／−Ｓｕｎ１−／−マウスは１０４日の生存中央値を有する（Ｌｍｎａ−／−とＬｍｎａ−／−Ｓｕｎ１−／−とを比較するｐ＜０．０１）。（Ｃ）Ｓｕｎ１欠損に関して野生型、ヘテロ接合型、またはホモ接合型であるＬｍｎａΔ９マウスの体重を示すグラフである。野生型およびＳｕｎ１−／−のコホートを比較のためにグラフ化する。値は各コホートにおける動物の平均±ＳＥＭである。動物の数（ｎ）が示される（ＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１＋／＋とＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１−／−とを比較するｐ＜０．０００１）。（Ｄ）ＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１＋／＋マウスと比較して増加したＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１−／−マウスの生存期間を示すカプラン・マイヤーのグラフである。ＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１＋／−マウスもまたグラフ化する（ＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１＋／＋とＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１−／−とを比較するｐ＜０．０００１）。（Ｅ）示されたＭＥＦの細胞増殖を示すグラフである。曲線は、平均±ＳＤであり、示された遺伝子型の胚からの４つ以上の独立した単離株を表す。（Ｆ）ＷＴ、Ｓｕｎ１−／−、ＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１＋／＋、およびＬｍｎａΔ９Ｓｕｎ１−／−マウスからのＭＡＦ（マウス成体線維芽細胞）の増殖曲線を示すグラフである。ＭＡＦは、ウェル１つ当たり細胞１０００個の密度で播種した。成長を測定し、正規化した細胞指数（平均±ＳＤ）を示す。
【図７】図７は、Ｓｕｎ１タンパク質の特徴、ならびにシグナル配列、コイルドコイル配列、ＳＵＮドメイン配列、およびＫＤＥＬ配列を含むドミナントネガティブＳＵＮ１タンパク質を発生させるために使用される成分の特徴の概略図を示す。
【図８】図８は、ＡＡＶ作製のために使用されるプラスミド（配列番号１）の概略図を示す。
【図９】図９は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９からの配列を含む、ＡＡＶ作製のためのプラスミド（配列番号２）の概略図を示す。
【図１０】図１０は、心臓特異的プロモーターおよびＳｕｎ１ドミナントネガティブ配列を含むＡＡＶ発現構築物（配列番号３）の概略図を示す。
【図１１】図１１は、シグナル配列、コイルドコイル配列、ＳＵＮドメイン配列、およびＫＤＥＬ配列（配列番号４）を含むドミナントネガティブＳｕｎ１タンパク質の特徴の概略図を示す。
【図１２】図１２は、シグナル配列、内腔ドメイン配列、およびＫＤＥＬ配列（配列番号５）を含むドミナントネガティブＳｕｎ２タンパク質の特徴の概略図を示す。
【図１３】図１３は、ドミナントネガティブ構築物において使用されるＳｕｎ１タンパク質の領域の概略図を示す。
【図１４】図１４は、保存された残基を有するＫＡＳＨ１〜ＫＡＳＨ５ドメインアミノ酸配列（それぞれ配列番号７、９、１１、１３、および１５）のアラインメントを示す。
【図１５】図１５は、野生型マウス、Ｓｕｎ１  ＫＯマウス、ＡＡＶドミナントネガティブＳＵＮマウス、および変化したＫＡＳＨドメインを有するマウスにおけるＬＩＮＣ複合体の概略図を示す。野生型マウスの概略図は、Ｂｒｉａｎ  Ｂｕｒｋｅ、２０１２から取得される。Ｓｕｎ１  ＫＯマウスの概略図は、Ｃｈｅｎら、２０１２の結果を表す。ＡＡＶドミナントネガティブＳＵＮドメインおよび変化したＫＡＳＨドメインの概略図は、ラミノパチーを改善するＬＩＮＣ複合体破壊のための方法に関する優先日における本発明者らの提示物を表し、その時に取得されたデータに基づいている。
【図１６】図１６は、平均２８日間生存するＬｍｎａ  ＫＯマウス、３００日を超えて生きるＳｕｎ１  ＫＯマウス、および３００日を超えて生きる心臓Ｌｍｎａ  ＫＯ／Ｓｕｎ１  ＫＯマウスのカプラン・マイヤー曲線を示す。
【図１７】図１７は、Ｓｕｎ１  ＫＯマウス、心臓Ｌｍｎａ  ＫＯマウス、および心臓Ｌｍｎａ  ＫＯ／Ｓｕｎ１  ＫＯマウスからの心臓のＨ＆Ｅ染色切片を示し、ＬｍｎａＫＯ／Ｓｕｎ１ＷＴ心臓は、ＷＴおよびＬｍｎａＫｏ／Ｓｕｎ１ＫＯ心臓と比較して左室の拡大（ＤＣＭ）を示す。
【図１８】図１８は、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１  ΔＫＡＳＨマウスにおけるＬＩＮＣ複合体の破壊の概略図を示す。ＬｍｎａＫＯ  Ｎｅｓｐｒｉｎ−１ＷＴマウスは約２０日の生存期間を有する。ＬｍｎａＫＯ  Ｎｅｓｐｒｉｎ−１−ΔＫＡＳＨは約４０日生存し、ＬｍｎａＫＯＳｕｎ１ＫＯマウスと同等である。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、予想されたＡＡＶ−ｃＴＮＴ−ＤＮ−ＳＵＮ発現の概略図、ならびにＫＡＳＨドメインへの結合に関する、１９Ｂ（上段のパネル）に示す外在性ＤＮ−ＳＵＮと天然Ｓｕｎ１との間の競合（図１９Ａ）、および真ん中のパネルにおける２個の核がＤＮ−ＳＵＮを発現し、マージパネルにおいて両者が核膜からのＮｅｓｐｒｉｎ２の喪失を示す、細胞における天然Ｎｅｓｐｒｉｎ２Ｇの配置に対するトランスフェクトしたＤＮ−ＳＵＮの効果（図１９Ｂ）を示す。
【図２０】図２０は、ＡＡＶ９−ｃＴＮＴドミナントネガティブＳｕｎ１（ＤＮＳｕｎ１）を使用したＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用のｉｎ  ｖｉｖｏでの破壊が、雄および雌マウスにおける心臓部特異的Ｌｍｎａ  ＫＯの寿命を延ばすことを示すカプラン・マイヤー曲線である。
【図２１】図２１は、Ｎｅｓｐｒｉｎ−２のＫＡＳＨドメイン（ＫＡＳＨ２）のＣ末端アミノ酸を示す。ＫＡＳＨ２  Ｃ末端からの１４または１８個のアミノ酸の配列はＳＵＮ２のＳＵＮドメインと物理的に相互作用することができる。ＫＡＳＨ２からの最後の４個のアミノ酸の喪失、またはＫＡＳＨ２のＣ末端における単一アラニンアミノ酸の付加は、ＫＡＳＨ２ドメインとＳＵＮドメインとの相互作用を破壊するのに十分である。
【図２２】図２２は、ＬＩＮＣ複合体を破壊する薬剤を検出するためのスクリーニング方法の概略図を示す。
【図２３】図２３は、ＬＩＮＣ複合体を破壊する低分子を同定するためのより詳細なスクリーニング方法を示すフローチャートを示す。
【図２４】図２４は、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１  ＫＡＳＨ破壊（Ｃ’ＴΔ８）変異を有するまたは有しない野生型（Ｃ５７／Ｂｌ６）マウスが通常の生存期間を有することを示すカプラン・マイヤー曲線である。Ｌｍｎａヌル／ＫＯ変異（ＬＡ−ＺＰ３ｃｒｅΔ／Δ）を有する、Ｎｅｓｐ１−Ｃ’ＴΔ８に関して野生型（Ｎｅｓｐ１＋／＋）またはヘテロ接合型（Ｎｅｓｐ１＋／Ｃ’ＴΔ８）のマウスは、１５または１８日の生存期間中央値を有し、生存期間中央値は、Ｌｍｎａ  ＫＯ／Ｎｅｓｐ１ホモ変異（ＬＡ−ＺＰ３ｃｒｅΔ／Δ；Ｎｅｓｐ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８）マウスでは３８日まで増加する。
【図２５】図２５は、野生型Ｌｍｎａ（Ｎ１ＣＴΔ８／ＣＴΔ８ＬＡ＋／＋ＭＣｒｅ＋／−）を有するマウス、またはｌｏｘＰ配列を導入したＬｍｎａのアレルを有するが心臓特異的Ｃｒｅドライバーを欠く（Ｎ１ＣＴΔ８／ＣＴΔ８ＬＡｆ／ｆＭＣｒｅ＋／＋およびＮ１ＷＴ／ＷＴＬＡｆ／ｆＭＣｒｅ＋／＋）マウスが実験の期間生きることを示すカプラン・マイヤー曲線である（優先出願時において約８０日、変化のないまま１２０日まで延びた）。Ｌｍｎａの心筋細胞特異的欠失（Ｎ１ＷＴ／ＷＴＬＡｆ／ｆＭＣｒｅ＋／−）を有するマウスは、タモキシフェン（ＴＭＸ）送達によるＣｒｅ／ｌｏｘＰ媒介欠失の誘導後、２２〜２４日の生存期間を有し、生存期間は、ＴＭＸによって誘導したＬｍｎａの心筋細胞特異的欠失およびさらにＮｅｓｐｒｉｎ−１に関するホモ変異（Ｎ１ＣＴΔ８／ＣＴΔ８ＬＡｆ／ｆＭＣｒｅ＋／−）を有するマウスでは実験の期間まで増加する。
【図２６−１】図２６Ａ〜２６Ｄは、Ｓｕｎ１喪失がＬｍｎａ変異マウスの寿命を延ばすことに関するカプラン・マイヤー曲線を示す。（図２６Ａ）Ｓｕｎ１を有するまたは有しない野生型（Ｃ５７／Ｂｌ６）マウスは通常の生存期間を有するが、ラミンＡが全ての組織において欠失しているＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：Ｚｐ３マウスの出生後平均生存期間は１７．５日であった（＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ログランク検定）。Ｓｕｎ１−／−背景に関しては、寿命は３２．５日まで増加する。（図２６Ｂ）ＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘマウスをＣｒｅαＭｙＨＣ系と交配させることによってＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘを心臓において特異的かつ恒常的に欠失させた場合、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：αＭｙＨＣマウスは平均して２６．５日生きた。Ｓｕｎ１−／−背景に関しては、これらのマウスは６か月超生きた。
【図２６−２】（図２６Ｃ）３〜５か月齢ＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘをＴｍｘ誘導型心筋細胞特異的Ｃｒｅ  Ｔｇ｛Ｍｙｈ６−ｃｒｅ／Ｅｓｒ１）（ｍｃｍと略記）と交配させた場合、マウスはＴｍｘの単回注射後３〜４週間以内に死亡する。Ｓｕｎ１−／−背景に関しては、これらのマウスは１年超生きた。（図２６Ｄ）１１１日の平均生存期間を有したＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｎ１９５ＫＳｕｎ１−／−マウスと比較して、ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｎ１９５Ｋマウスは平均７８日間生きた。（＊＊＊Ｐ≦０．０００１、＊＊Ｐ＝０．００７３、ログランク検定）。
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｅは、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスの生存期間および表現型を示す。（図２７Ａ）ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍマウスの平均生存期間は、単回Ｔｍｘ注射後２７日であった（＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ログランク検定）。（図２７Ｂ）ＰＣＲは、ｌｏｘＰ配列を導入した（欠失した）Ｌｍｎａ遺伝子（鏃印）をＴｍｘ注射後の心臓組織においてのみ検出し、他の組織においてもＴｍｘが注射されなかった場合にも検出しなかった。
【図２７−２】（図２７Ｃ）ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスは注射後２１日までに脊柱後湾（鏃印）を発病した。
【図２７−３】（図２７Ｄ）Ｔｍｘの２１日後にＰＣＭ−１染色によって心筋細胞（ＣＭ）核を検出したところ、免疫蛍光によって検出されるラミンＡ／Ｃタンパク質は、対照においては存在したが（ｉ、ｉｉｉ）、単離されたＣＭ（ｉｉの２つ目のパネル）と心臓切片（ｉｖ）の両方のＣＭ核においては減少していた／存在しなかった（白色の鏃印）。
【図２７−４】（図２７Ｅ）注射の２１日後に全心臓溶解液のウェスタン分析によってラミンＡ／Ｃレベルを定量した。Ａ型ラミンタンパク質の有意な減少（＊＊＊Ｐ≦０．０００１、Ｔ検定）が検出されたが、ラミンＣレベルは、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスにおいて、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋ＣＴＬと比較して有意には低下しなかった。（図２７Ｆ）Ｔｍｘの２１日後に定量分析を実施した。ＷＴ−Ｌｍｎａ遺伝子におけるＬｏｘＰ部位の存在（ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ）は、ＬｍｎａＷｔ／Ｗｔレベルと比較してＬｍｎａ転写物レベルの低下をもたらすが、このことは寿命に対しても成長／生存に対しても明白な効果を有しなかった。
【図２８−１】図２８Ａ〜２８Ｄは、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスの心エコー図、心臓機能、および組織構造を示す。（図２８Ａ）ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスは低下した心収縮機能を示す。（図２８Ｂ）ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ心臓は、減少したＥＦ％およびＦＳ％、ならびに増大したＬＶＩＤを示す（＊＊＊Ｐ≦０．０００１、＊＊Ｐ＝０．００１０、二元配置分散分析）。
【図２８−２】（図２８Ｃ）心臓の組織学的分析は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘｍｃｍ心臓における有核細胞の増加した浸潤および細胞間空間を明らかにした（ｉおよびｉｉ）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ対照と比較して有意に少ない生存（煉瓦様）ＣＭがＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ心臓から単離された（ｉｉｉ）。さらに拡大すると、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ心臓から単離された心筋細胞は大きな細胞内空胞を含有していた（鏃印、ｉｖ）。
【図２８−３】（図２８Ｄ）ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ心臓における左室内腔は拡大し（ｉ）、これは線維化の増加（ｉｉ）（＊＊Ｐ＝０．０００７、２８Ｄの中段のパネルｉｉにおける薄灰色の領域、およびｉｖの左側のパネルとして認められる）ならびにＴＵＮＥＬ染色によって明らかとなるアポトーシス核の増加（＊Ｐ＝０．０２２０、一元配置分散分析）（ｉｉｉおよびｉｖの右側のパネル）と共に生じた。全ての試料採取および分析は、Ｔｍｘ注射の２１日後に心臓に関して実施した。
【図２９−１】図２９Ａ〜２９Ｄは、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍにおけるＴｍｘ注射後のＳｕｎ１の有無に関する核形態および心臓構造の変化を示す。（図２９Ａ）減少したまたは存在しないラミンＡ／Ｃ発現を有するＣＭ核は白色の鏃印によって示される（１、３）。正常なラミンＡ／Ｃレベルを有するＣＭ核（２、４）は灰色の鏃印によって示される。
【図２９−２】蛍光強度（５）とウェスタンブロット（６）の両方によって測定したＬＭＮＡタンパク質レベルは、ＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍＳｕｎ１＋／＋対照と比較してＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘ（＊＊＊Ｐ＝０．０００９、Ｔ検定）およびＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ（＊Ｐ＝０．０３５９、Ｔ検定）において有意に低下した（下段のグラフ、６）。
【図２９−３】（図２９Ｂ）左室（ＬＶ）拡大は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘ心臓においては明らかであったが（パネル１）、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓のＬＶでは明らかではなかった（パネル２）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスは、対照と比較して有意に増加した線維化を有したが（パネル３、線維化は灰色）、ＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓（パネル３）では、対照と比較して線維化の有意な増加は存在しなかった（パネル４、パネル５において定量化、＊＊＊Ｐ＝０．０００１、一元配置分散分析）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスからの心臓乳頭筋作用力測定は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋対照（＊＊Ｐ＝０．００４７、Ｔ検定）およびＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ（＊Ｐ＝０．０１１３、Ｔ検定）と比較して有意に減少した（パネル６）。
【図２９−４】（図２９Ｃ）ＣＭ核形態は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスにおいて有意に変化した（パネル１、塗りつぶされた鏃印）。ＴＭＸの非存在下では、対照心臓切片（ＣＴＬ、パネル２）は少数の核異常を表す。Ｓｕｎ１の非存在下では、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心筋細胞は核異常を示さなかった（パネル３および４）。図２９Ｃのパネル５は、要約すると、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘマウスにおける１％未満のＣＭ核に対して、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスにおける７０％のＣＭがＮＥの破裂／歪みまたは奇形核を有したことを明らかにする。
【図２９−５】（図２９Ｄ）Ｔｍｘ誘導後、ＴＭＸ処置マウスおよび対照マウスに関するエコー分析を実施した。３〜５か月齢のマウスに関してＴｍｘ注射の２８日後に実施した心エコー図（ＥＣＧ）（パネル１）。Ｃｒｅ誘導前およびＣｒｅ誘導後に実施したＥＣＧは、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウス（無地の黒色線）における心臓収縮力の進行性悪化をＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘマウスと比較して明らかにした（パネル２〜４）。ＳＵＮ１の喪失は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスと比較して、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋ＴｍｘマウスにおいてＥＦ（パネル２）、ＦＳ（パネル３）、および長軸方向グローバルストレイン（ＧＬＳ、パネル４）を維持した。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｂは、Ｌｍｎａ遺伝子におけるミスセンス変異（Ｎ１９５Ｋ）によって誘発された心臓病態に対する、ＳＵＮ１の欠失に関するカプラン・マイヤーのグラフおよびＳＵＮ１の欠失の心臓機能効果を示す図である。（図３０Ａ）Ｓｕｎ１の非存在は、ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘマウスの生存期間をＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスと比較して有意に増加させる（＊Ｐ＝０．０１０１、ログランク検定）。１コピーのみのＮ１９５Ｋ変異（ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／−：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘ）を有するマウスは、４７日の平均生存期間を有し、ホモ接合型、すなわち２コピーのＮ１９５Ｋアレルを有するマウスのおよそ半分の生存期間であった。（図３０Ｂ）Ｃｒｅ誘導前およびＣｒｅ誘導後に実施した心エコー図（ＥＣＧ）は、ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／−：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスにおける心臓収縮力の進行性悪化をＬｍｎａＮ１９５Ｋ／−：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘマウスと比較して経時的に明らかにした。ＥＣＧ画像はＴｍｘ注射の２８日後に記録した（左手側のパネル）。ＳＵＮ１の喪失は、ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋ＴｍｘマウスにおいてＥＦ、ＦＳ、およびＧＬＳをＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスと比較して保存した（右手側の下部の３つのパネル）。
【図３１−１】図３１Ａ〜３１Ｇは、ＡＡＶ形質導入ＤＮＳｕｎ１を発現するＬｍｎａＦｌｘｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスが向上した心機能および増加した寿命を呈することを示す。（図３１Ａ）ＬｍｎａＦｌｘｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋ＴｍｘマウスへのＤＮ−Ｓｕｎ１ミニタンパク質のＡＡＶ媒介形質導入に関するプロトコルを示す図である。出生後１４日目に単回Ｔｍｘ（ＩＰ）注射を行い、Ｌｍｎａ欠失を誘導する。次いで出生後１５日目にＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１またはＡＡＶ９−ＧＦＰウイルス粒子を胸部腔に注射する。実験の終点をＴｍｘの１００日後に設定した。（図３１Ｂ）ＤＮＳｕｎ１ミニタンパク質は、Ｎｅｓｐｒｉｎ（ＣＭにおいてこれはＮｅｓｐｒｉｎ１である）のＫＡＳＨドメインへの結合に関して内在性Ｓｕｎ１と競合する。ミニタンパク質は、ＮｅｓｐｒｉｎのＫＡＳＨドメインへの結合において内在性ＳＵＮ１と競合する。ＤＮＳｕｎ１ミニタンパク質は、ＩＮＭにおいて係留しないため、内在性ＳＵＮタンパク質をＫＡＳＨドメインへの結合から効果的に引き離し、それゆえにＬＩＮＣを壊す。（図３１Ｃ）Ｔｍｘ注射後の組み換えられたＬｍｎａ遺伝子の存在を、心臓組織のＰＣＲによって確認した（上段のパネル）。ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１タンパク質とＡＡＶ９−ＧＦＰタンパク質（投薬量：５×１０＾１０ｖｇ／ｇマウス）の両方の強力な発現は、ＡＡＶ注射の９９日後の全心臓からの抽出物において検出された（下段のパネル）。（図３１Ｄ）ヒトｉＰＳ幹細胞に由来するＣＭに、ＡＶＶ−ＤＪをベクターとして使用して、ＤＮＳｕｎ１を形質導入した。灰色の矢印によって示される、高レベルのＤＮＳｕｎ１を発現するＣＭでは、ＮＥへのＮｅｓｐｒｉｎ１局在は減少しているかまたは存在しない。ＮＥへのＮｅｓｐｒｉｎ１局在は、ＡＶＶ−ＤＪ−ＤＮＳｕｎ１を発現しないＣＭまたは低いレベルで発現する場合のＣＭのいずれかにおいて維持される（白色の鏃印）。
【図３１−２】（図３１Ｅ）ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＧＦＰマウスはＴｍｘ誘導後、平均３４．５日間生きたが、ＡＡ９−ＤＮＳｕｎ１（５×１０＾１０ｖｇ／ｇ／マウス）を注射したＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスはそれよりも有意に長く（＊＊Ｐ＝０．００３８、ログランク検定）、Ｔｍｘの少なくとも１００日後まで生き、その後マウスは分析のために屠殺された。このデータのセットは図２０に示すものに由来し、雌マウスおよび異なる用量のウイルスを用いたマウスを除去することによって調整した。図Ｅ（ｉ）は雄マウスを表し、図Ｅ（ｉｉ）は雌マウスを表す。
【図３１−３】（図３１Ｆ）Ｔｍｘの３５日後において、広範な線維化（本来の画像では青色、ここでは灰色）および心室拡大が、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＧＦＰ心臓においてＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１心臓と比較して検出された。（図３１Ｇ）ＥＣＧ分析は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１心臓がＴｍｘ注射の３５日後においてＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＧＦＰ心臓と比較してより良好な心機能を有したことを確認した。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｄは、Ｓｕｎ１を破壊することによってＬＩＮＣを壊すことがいかにして心筋細胞を収縮誘導応力から保護するのか、ということに関するモデルを示す。（図３２Ａ）ＬｍｎａＡ／Ｃを発現する心筋細胞核は、ＬＩＮＣ複合体を介して細胞質からＮＥへ伝達される機械的応力および張力に耐えることができる。（図３２Ｂ）Ｌｍｎａ遺伝子の喪失またはＬｍｎａ遺伝子内への変異の導入は、核ラミナの喪失／または不正確な集合体をもたらし、ラミナ／ＮＥを弱める。弱められた核は、ＬＩＮＣ複合体を介して心筋細胞の収縮するサルコメアから発揮される張力／応力のために損傷する。（図３２Ｃ、Ｄ）ＳＵＮ１の非存在下において、またはＳＵＮ１のＫＡＳＨドメインへの結合をＤＮＳｕｎ１の発現により破壊することによって、繋がれていないＬＩＮＣ複合体は心筋細胞核に対してより小さい張力を発揮し、Ｌｍｎａ変異心筋細胞の生存を可能にする。
【図３３】図３３は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘコンディショナルアレルの構造を示す。Ｃｒｅ組換え前とＣｒｅ組換え後の両方のＬｍｎａ遺伝子の遺伝子型を同定するためのプライマー位置を、ＬｍｎａＦｌｘアレル（Ｆｌｏｘ）、Ｌｍｎａ欠失アレル（Δ）、および野生型アレルに関して示す［Ａ．Ｓ．Ｗａｎｇら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８９：１１〜２１（２０１５）］。
【図３４】図３４は、組換えＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１およびＡＡＶ９−ＧＦＰミニタンパク質の図を示す。ＤＮ−Ｓｕｎ１は、ＳＵＮドメイン、ＨＡタグ、シグナル配列（ＳＳ、タンパク質をＥＲにターゲティングするため）、およびＫＤＥＬ（ＥＲ保持シグナル）を含む［Ｍ．Ｃｒｉｓｐら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７２：４１〜５３（２００６）］。ＡＡＶ９−ＧＦＰは、ＳＳおよびＫＤＥＬ配列を含む。ＧＦＰは対照としてＳｕｎ１Ｌ−ＫＤＥＬの代わりに使用した。
【図３５】図３５は、Ｔｍｘ注射後のＣｒｅリコンビナーゼの心筋細胞特異的発現の顕微鏡写真を示す。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍマウスを、ｍＴ／ｍＧ（ＪＡＸ：Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ、−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊ）レポーターマウスと交配させた。Ｃｒｅの非存在下では、ＲＦＰが発現する。Ｃｒｅが誘導される場合は、ＧＦＰが発現する。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍマウスのＣＭのみがＴＭＸ注射時にＧＦＰを発現する。心臓組織は、Ｔｍｘ注射の７日後に分析した。
【図３６】図３６は、Ｓｕｎ２の喪失がＬｍｎａの喪失を救済しないことを示す。Ｓｕｎ２の喪失はＬｍｎａΔ／ΔＳｕｎ２−／−マウスの生存期間を延ばさない。
【図３７−１】図３７Ａ〜３７Ｅは、Ｔｍｘ注射の１２〜１４か月後におけるＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍＳｕｎ１＋／＋およびＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍＳｕｎ１−／−心臓の表現型を示す。（図３７Ａ）対照と比較した有意な形態学的変化、例えばＬＶ拡大または（図３７Ｂ）線維化の変化がないことを明らかにする、Ｔｍｘ注射の１２〜１４か月後の老化ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ／：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋心臓の組織学的分析。
【図３７−２】図３７Ａ〜３７Ｅは、Ｔｍｘ注射の１２〜１４か月後におけるＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍＳｕｎ１＋／＋およびＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍＳｕｎ１−／−心臓の表現型を示す。（図３７Ａ）対照と比較した有意な形態学的変化、例えばＬＶ拡大または（図３７Ｂ）線維化の変化がないことを明らかにする、Ｔｍｘ注射の１２〜１４か月後の老化ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ／：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋心臓の組織学的分析。（図３７Ｃ）ＰＣＲ分析は、Ｌｍｎａ遺伝子の持続した欠失を確認した。
【図３７−３】（図３７Ｄ）タンパク質定量は、ＴＭＸの１４か月後におけるＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓におけるＬＭＮＡレベルの有意な低下を明らかにした。
【図３７−４】（図３７Ｅ）老化マウスからの心エコー図（左手側のパネル）は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋ＣＴＬ老化マウスとＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ老化マウスの両方において減少したＥＦおよびＦＳ（右手側のパネル）を示した。
【図３８】図３８は、ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１による救済が注射されるウイルス粒子の投薬量に依存することを示す。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋ＴＭＸマウスの生存期間はＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１の投薬量に依存し、濃度が低いほど短い生存期間をもたらす。各点はマウスを表し、横線は平均を示す。
【図３９−１】図３９Ａ〜３９Ｃは、Ｔｍｘ誘導後のラミンＡ／ＣのレベルおよびＡＡＶ発現タンパク質の発現を示す。（図３９Ａ）ラミンＡ／ＣレベルはＴｍｘ誘導後に有意に低下し、ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１タンパク質またはＡＡＶ９−ＧＦＰタンパク質のいずれの存在もＬＭＮＡタンパク質レベルを変化させなかった（ラミンＡ／Ｃ免疫蛍光強度の定量）。全心臓におけるラミンＡ／Ｃ、ＤＮＳｕｎ１、およびＧＦＰタンパク質の量もまたウェスタン分析によって定量した（下段の３つのグラフ）。（Ｔｍｘの３５日後に実施した分析）。
【図３９−２】（図３９Ｂ）ＤＮＳｕｎ１タンパク質とＧＦＰタンパク質の両方の発現は注射したウイルス粒子の濃度に依存した。（図３９Ｃ）免疫蛍光は、大多数のＣＭが首尾よく感染し、５×１０＾１０ｖｇ／ｇのＡＡＶ９−ＧＦＰによりＧＦＰを発現した（左側の画像）ことを、その１０分の１（５×１０＾９ＡＡＶ９−ＧＦＰ、右側の画像）の濃度のウイルス粒子による感染と比較して明らかにした。
【図４０−１】図４０Ａ〜４０Ｃは、ＣＲＩＳＰＲによるＳｕｎ１  ＳＵＮドメインの標的化がＳｕｎ１タンパク質の喪失をもたらすことを示す。（Ａ、Ｂ）野生型Ｓｕｎ１におけるＣＲＩＳＰＲ誘導変異に隣接するＳｕｎ１  ＤＮＡ（図４０Ａ）およびアミノ酸（図４０Ｂ）配列（それぞれ配列番号６９および７２）、４ｂｐの挿入を有するＳｕｎ１（Ｓｕｎ１＿ｐｌｕｓ４；それぞれ配列番号７０および７３）、および７ｂｐの欠失を有するＳｕｎ１（Ｓｕｎ１＿ｄｅｌ７；それぞれ配列番号７１および７４）のＣｌｕｓｔａｌ形式のアラインメント。番号付けはＳｕｎ１コード配列（Ａ）およびタンパク質配列（Ｂ）のものである。（Ｂ）における太字はＳＵＮドメインを示す。
【図４０−２】図４０Ａ〜４０Ｃは、ＣＲＩＳＰＲによるＳｕｎ１  ＳＵＮドメインの標的化がＳｕｎ１タンパク質の喪失をもたらすことを示す。（Ａ、Ｂ）野生型Ｓｕｎ１におけるＣＲＩＳＰＲ誘導変異に隣接するＳｕｎ１  ＤＮＡ（図４０Ａ）およびアミノ酸（図４０Ｂ）配列（それぞれ配列番号６９および７２）、４ｂｐの挿入を有するＳｕｎ１（Ｓｕｎ１＿ｐｌｕｓ４；それぞれ配列番号７０および７３）、および７ｂｐの欠失を有するＳｕｎ１（Ｓｕｎ１＿ｄｅｌ７；それぞれ配列番号７１および７４）のＣｌｕｓｔａｌ形式のアラインメント。番号付けはＳｕｎ１コード配列（Ａ）およびタンパク質配列（Ｂ）のものである。（Ｂ）における太字はＳＵＮドメインを示す。
【図４０−３】（図４０Ｃ）野生型およびＳｕｎ１変異マウスに由来するマウス成体線維芽細胞の免疫蛍光染色。Ｓｕｎ１発現は変異マウスにおいて喪失するが、Ｓｕｎ２およびＮｅｓｐｒｉｎ−１発現は３つの遺伝子型全てで類似する。スケールバー＝１０μｍ。
【図４１−１】図４１Ａ〜Ｄは、ＣＲＩＳＰＲによるＳｙｎｅ１  Ｃ末端の標的化が変異Ｎｅｓｐｒｉｎ−１タンパク質の発現をもたらすことを示す。（Ａ、Ｂ）野生型Ｎｅｓｐｒｉｎ−１  ＤＮＡ（配列番号７５）およびＮｅｓｐｒｉｎ−１Ｃ’ＴΔ８（Ｎｅｓｐｒｉｎ１＿ＣＴｄｅｌ８）（配列番号７６）（Ａ）ならびに野生型Ｎｅｓｐｒｉｎ−１（配列番号７７）およびＮｅｓｐｒｉｎ−１Ｃ’ＴΔ８（Ｎｅｓｐｒｉｎ１＿ＣＴｄｅｌ８）（配列番号７８）におけるＣＲＩＳＰＲ誘導変異に隣接するアミノ酸配列（Ｂ）のＣｌｕｓｔａｌ形式のアラインメント。太字のＴＧＡはＳｙｎｅ１／Ｎｅｓｐｒｉｎ−１遺伝子の終止コドンを示す。
【図４１−２】（Ｃ、Ｄ）Ｓｙｎｅ１／Ｎｅｓｐｒｉｎ−１野生型およびＳｙｎｅ１／Ｎｅｓｐｒｉｎ−１Ｃ’ＴΔ８変異心臓および筋肉組織からのＮｅｓｐｒｉｎ−１の免疫ブロット。
【図４２】図４２Ａ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ誘導Ｓｙｎｅ１変異が誤局在した「無ＫＡＳＨ」Ｎｅｓｐｒｉｎ−１タンパク質を生じることを示す顕微鏡写真である。野生型（ＷＴ）およびＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８変異マウスに由来するマウス成体線維芽細胞（Ａ）および一次筋管（Ｂ）の免疫蛍光染色。Ｎｅｓｐｒｉｎ−１は変異試料において核エンベロープから誤局在する。マージ画像はＮｅｓｐｒｉｎ−１およびＤＮＡ染色を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図４３】図４３Ａ〜Ｃは、Ｓｙｎｅ１変異がある特定の核エンベロープタンパク質の局在を破壊しないことを示す顕微鏡写真である。（Ａ〜Ｃ）野生型（ＷＴ）およびＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８変異マウスに由来するマウス一次筋管の免疫蛍光染色。Ｓｕｎ１（Ａ）、Ｓｕｎ２およびエメリン（Ｂ）、ならびにラミンＡ／Ｃ（Ｃ）は、通常では核エンベロープに局在する。マージ画像はタンパク質およびＤＮＡ染色を示す。矢印は正常に局在した核エンベロープタンパク質の例を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図４４】図４４Ａ〜Ｃは、Ｓｙｎｅ１変異が核エンベロープ局在化中心体タンパク質の局在を破壊することを示す顕微鏡写真である。（Ａ〜Ｃ）野生型（ＷＴ）およびＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８変異マウスに由来するマウス一次筋管の免疫蛍光染色。通常では筋管における核エンベロープに局在するＰｃｍ１、ペリセントリン（Ｐｃｎｔ）、およびＡｋａｐ４５０は、Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８変異筋管では核エンベロープから移動する。ＭＦ２０はミオシン重鎖に関する抗体であり、筋管マーカーである。マージ画像はタンパク質およびＤＮＡ染色を示す。矢印はこれらの中心体タンパク質に関する典型的な核エンベロープ染色を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図４５】図４５Ａ〜Ｃは、Ｓｙｎｅ１変異がマウス表現型に影響を及ぼさないことを示す。（Ａ〜Ｂ）１２週齢の雄（Ａ）および雌（Ｂ）マウスの例示的な画像。（Ｃ）６週間にわたる、雄および雌の野生型（ＷＴ）およびＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８変異マウスの体重。
【図４６】図４６Ａ〜Ｃは、Ｓｙｎｅ２構築物およびＳｙｎｅ１／Ｓｙｎｅ２二重変異マウスが周産期致死性を経験することを示す。（図４６Ａ）Ｓｙｎｅ２変異を発生させるためのＩＲＥＳ−βｇａｌ  ＰＧＫ−Ｎｅｏ標的構築物の設計。（図４６Ｂ）野生型（ＷＴ）およびＮｅｓｐｒｉｎ−２の喪失を示すＳｙｎｅ２変異マウスに由来するマウス成体線維芽細胞の免疫蛍光染色。（図４６Ｃ）新生仔の画像。上段の列は、少なくとも１つの野生型Ｓｙｎｅ１またはＳｙｎｅ２アレルを有する、健康なピンク色に見えるマウスである。下段の列は、青く見え、出生時に死亡しているチアノーゼの二重変異Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８：ｓｙｎｅ２−／−の仔を示す。
【図４７】図４７は、Ｓｙｎｅ２変異がＬｍｎａ病態を改善しないことを示すカプラン・マイヤーのグラフである。Ｓｙｎｅ２変異状態（野生型、ヘテロ接合型、または変異体）にかかわらず、ＬｍｎａΔ／Δマウスが出生の３週間以内に死亡することを示すカプラン・マイヤー生存曲線。
【発明を実施するための形態】
【０１５４】
定義
本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられるある特定の用語は、便宜上ここにまとめられる。
【０１５５】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」という用語は、本明細書で使用する場合、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質配列、またはこれらのいずれかの断片、および天然に存在する分子または合成分子を指す。本明細書において「アミノ酸配列」が天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列を指すために記載される場合、「アミノ酸配列」および同様の用語は、そのアミノ酸配列を、記載されたタンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味しない。
【０１５６】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、明記された特徴、整数、ステップ、または構成要素の存在を言及されたように規定するものとして解釈されるべきであるが、１つもしくは複数の特徴、整数、ステップ、もしくは構成要素、またはそれらの群の存在または付加を排除しない。しかしながら、本開示に関する文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は「からなる」も含む。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語の活用形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語の活用形、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、対応して変化した意味を有する。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」および「ＣＲＩＳＰＲ」系という用語はある程度交換可能に使用され、ＲＮＡに導かれたヌクレアーゼを使用して外来遺伝子要素を切断する微生物の獲得免疫系を指す。これは、クラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲ）、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ、ならびに標的化された遺伝子配列内の特異的部位において二本鎖切断を同定および導入するようにプログラムすることができる合成ガイドＲＮＡを含む。回文繰り返し配列は、プロトスペーサーとして知られる外在性ＤＮＡ標的に由来する短い可変配列によって間隔を空けられ、同時にＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）アレイを構成する。ＤＮＡ標的内において、各プロトスペーサーは特異的ＣＲＩＳＰＲ系に応じて変動し得るプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と常に関連する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、ＲＮＡに導かれたＣａｓ９ヌクレアーゼの使用に関係する系の特異的様式であり、本来はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、これによって標的ＤＮＡは５’−ＮＧＧ  ＰＡＭの直前に位置しなければならなくなる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１を含む、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の変種は公知であり［Ｒａｎ  ＦＡら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ  ８、２２８１〜２３０８（２０１３）；Ｒａｎ  ＦＡら、Ｃｅｌｌ  １５４、１３８０〜１３８９（２０１３）］、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は本明細書では実施例において使用されるが、本発明が特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に限定されることは意図されない。
【０１５８】
本明細書で使用する場合、「ドミナントネガティブ」という用語は、遺伝子産物が同じ細胞内の正常な野生型遺伝子産物に有害な影響を及ぼす変異を指す。これは通例、その産物が依然として野生型産物と同じエレメントと相互作用することができるが、その機能のある側面を遮断する場合に生じる。一例では、導入遺伝子は二量体として機能性であるタンパク質として発現する。機能ドメインを除去するが二量体化ドメインを保持する変異は、タンパク質二量体のある部分が機能ドメインのうちの１つを欠損している可能性があるため、ドミナントネガティブ表現型を引き起こし得る。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、表１に記載した疾患に関連する「通常のフォント」という用語は、単純な字体で書かれており太字体で書かれていない疾患を指す。「太字体」という用語は一般的な意味を有する。
【０１６０】
本明細書で使用する場合、「安定化ポリペプチド」または「安定化タンパク質」という用語は、別々のドメインに折り畳まれ、それによりそのペプチドの残りの部分が、例えば適当なトポロジーを維持することを確実にする不活性なポリペプチドを指す。一例では、安定化タンパク質は、ＫＡＳＨタンパク質が小胞体膜および核外膜上で適当なトポロジーを維持することを確実にする。別の例では、安定化ポリペプチドは、付着したポリペプチドが例えば核膜槽に移行するのを妨げる。
【０１６１】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結した」という用語は、その用語が適用される複数の成分が好適な条件下で固有の機能を実行することができる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結した」対照配列は、タンパク質コード配列にライゲーションし、その結果、タンパク質コード配列の発現は、対照配列の転写活性と適合性の条件下で達成される。一例として、第１の核酸配列は、第２の拡散配列と機能的関係にある場合、第２の拡散配列と作動可能に連結する。例えば、プロモーターは、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結する。全体として、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続的であり、２つのタンパク質コード領域を結びつける必要がある場合、同じ読み枠にある。
【０１６２】
本明細書で使用する場合、「伸長鎖」という用語は、所望のペプチドのＮまたはＣ末端に付着することが見出され得る１個または複数個のアミノ酸を指す。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」という用語は、アミノ酸の１つまたは複数の鎖を指し、ここで各鎖はペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはペプチドは、天然タンパク質、すなわち、天然に存在し特異的に組み換えられていない細胞によって産生されたタンパク質、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生されたタンパク質の配列を有する、ペプチド結合によって非共有結合的および／または共有結合的に一緒に連結した複数の鎖を含むことができ、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、あるいは天然配列の１個もしくは複数個のアミノ酸からの欠失、そのようなアミノ酸への付加、および／またはそのようなアミノ酸の置換を有する分子を構成することができる。「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、１つ（「単量体」と称される）または複数（「多量体」と称される）のアミノ酸鎖を含むことができる。
【０１６３】
「対象」という用語は、本明細書においては脊椎動物、特に哺乳動物、より詳細にはヒトとして定義される。研究を目的とする場合、対象は特に少なくとも１種の動物モデル、例えばマウス、およびラット等であり得る。特に、ＤＣＭ等のラミノパチーの処置または予防の場合、対象はヒトであり得る。
【０１６４】
「処置」という用語は、本発明の文脈において使用される場合、回復的、治療的、または治癒的処置を指す。
理論に拘束されるわけではないが、本発明者らは、療法の根本原理の全てはＬＩＮＣ複合体機能を破壊することでＬｍｎａ変異が抑制されることであると考える。特許請求される方法の標的がＬＩＮＣ複合体におけるＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用であることがさらに指摘される。内在性タンパク質レベルは影響を受けるべきではない。
【０１６５】
全長ＳＵＮドメインタンパク質がシグナル配列とＫＤＥＬとの間に挿入される場合、ＳＵＮドメインが核膜槽／ＥＲ内腔にもはや存在しないようにタンパク質の膜トポロジーを反転させるため、導入遺伝子（例えばドミナントネガティブ導入遺伝子）は機能しない可能性があるということもまたさらに指摘される。膜貫通ドメインに続く領域のみ、すなわち管腔ドメインが使用され得る。
【０１６６】
当業者は、本発明が過度な実験をせずに本明細書に記載の方法に従って実施することができることを理解するだろう。方法、技法、および化学物質は、引用された参照文献に記載されているか、または生物工学および分子生物学の標準的な教科書におけるプロトコルからのものである。
【実施例】
【０１６７】
実施例１
材料および方法
マウスを、Ａ＊ＳＴＡＲ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ施設およびＮＵＳ動物施設に、各施設の動物実験委員会のガイドラインに従って維持した。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘマウスをこれまでに記載されたように生成および特性解析した［Ａ．Ｓ．Ｗａｎｇら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ、（２０１５）；Ｉ．Ｓｏｌｏｖｅｉら、Ｃｅｌｌ  １５２：５８４〜５９８（２０１３）］（図３３）。全欠失Ｌｍｎａ（ＬｍｎａΔ／Δ）を有するマウスを得るために、ｌｏｘＰ配列を導入したアレル（ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ）を、Ｃｒｅリコンビナーゼがマウス透明帯３遺伝子（Ｚｐ３；Ｔｇ（Ｚｐ３−ｃｒｅ）９３Ｋｎｗ、ＪＡＸストック００３６５１）の制御配列によって駆動するマウスに交配によって導入した［Ｗ．Ｎ．ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２６：１１０〜１１２（２０００）］。Ｌｍｎａの心筋細胞特異的欠失（ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ／ＮＩＭｈｃ）を取得するために、初めにＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘマウスを、Ｃｒｅ発現が心臓特異的マウスアルファミオシン重鎖（Ｍｙｈ６、ミオシン、重ポリペプチド６、心臓筋、アルファ）プロモーター（ＭｙＨＣ；Ｔｇ（Ｍｙｈｃａ−ｃｒｅ）２１８２Ｍｄｓ、ＪＡＸストック０１１０３８）によって駆動するマウスに交配させた。Ｌｍｎａのタモキシフェン誘導型心筋細胞特異的欠失（ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ）を取得するために、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘを、タモキシフェン誘導型Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＭｅｒＣｒｅＭｅｒ）を幼若および成体心臓筋細胞において特異的に発現するマウス心臓特異的アルファ−ミオシン重鎖プロモーター（αＭＨＣまたはアルファ−ＭＨＣ；Ｍｙｈ６）によってＣｒｅ発現が駆動するマウス（ｍｃｍ；Ｔｇ（Ｍｙｈ６−ｃｒｅ／Ｅｓｒ１＊）１Ｊｍｋ、ＪＡＸストック００５６５７）と交配させた。心筋細胞に対するｍｃｍ  Ｃｒｅ発現の特異性を、Ｃｒｅ系をｍＴ／ｍＧレポーターマウスに交配させることによって確認した［Ｍ．Ｄ．Ｍｕｚｕｍｄａｒら、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ４５：５９３〜６０５（２００７）］（図３５）。Ｓｕｎ１−／−マウスの生成はこれまでに記載され［Ｙ．Ｈ．Ｃｈｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６：９６５〜９７３（２００９）］、ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｎ１９５Ｋマウスも同様に記載された［Ｌ．Ｃ．Ｍｏｕｎｋｅｓら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １４：２１６７〜２１８０（２００５）］。Ｓｕｎ１−／−マウスは不妊であるため、ＬｍｎａΔ／Δ：Ｓｕｎ１−／−およびＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘｍｃｍ：Ｓｕｎ１−／−マウスは、それぞれのラミン−Ｃｒｅマウス系統をＳｕｎ１＋／−マウスと交配させることによって取得した。
【０１６８】
ｌｏｘＰ部位およびコンディショナル欠失アレルの挿入を試験するために、遺伝子型同定を、以下のプライマーを使用する二重ＰＣＲプロトコルにより実施した。
【０１６９】
【化１】
2021510529.tif 000086
【０１７０】
Ｓｕｎ１欠失を試験するために、以下のプライマーを使用した。
【０１７１】
【化２】
2021510529.tif 000087
【０１７２】
ＭｙＨＣ導入遺伝子を試験するために、以下のプライマーを使用した。
【０１７３】
【化３】
2021510529.tif 000088
【０１７４】
ｍｃｍ導入遺伝子の存在を試験するために、以下のプライマーを使用した。
【０１７５】
【化４】
2021510529.tif 000089
【０１７６】
タモキシフェン注射および組織収集
若齢マウス（１４日齢）および成体マウス（３〜５か月齢）に、コーン油（Ｓｉｇｍａ）に溶解した４０ｍｇ／ｋｇのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）を１回注射した。タモキシフェン注射後の様々な時点で、マウスをＣＯ２安楽死によって屠殺するか、または１．５％イソフルラン（ＢｉｏＭａｃ）および１．５ＬＯ２の気体混合物を用いて麻酔した。１５％ＫＣｌの注射によって心停止を誘導し、続いてＰＢＳを用いて洗って血液を除去した。パラフィン包埋用の心臓を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いてさらに洗い、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に一晩放置し、７０％エタノール中で少なくとも２４時間脱水し、パラフィンに包埋した。凍結切片用の心臓をトラガカントゴム（Ｓｉｇｍａ）に包埋し、液体Ｎ２で冷却したイソペンタン（ＢＤＨ−ＡｎａｌａＲ）中で凍結し、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０）によって９μｍ切片に切り分け、帯電スライド上に収集し、組織学的および免疫蛍光染色のために−２０℃で保存した。タンパク質およびＲＮＡ抽出用の心臓を液体Ｎ２で急速凍結し、さらなる処理のために保存した。
【０１７７】
心筋細胞単離
心筋細胞単離を標準的なプロトコル通りに実行した［Ｍ．Ａｃｋｅｒｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１９：９０９（２０１６）］。簡潔に述べると、マウスをイソフルラン（０．５Ｌ／分の１００％Ｏ２、４％のイソフルラン噴霧器ダイヤル）を用いて麻酔した。マウス心臓を、１５％ＫＣｌを用いて停止し、下行大動脈を切り離し、７ｍＬのＥＤＴＡ緩衝液を右室に注入して心臓を洗った。上行大動脈を、レイノルズ鉗子を使用して遮断し、心臓全体を取り出して新鮮なＥＤＴＡ緩衝液を含有する６０ｍｍディッシュに置いた。１０ｍＬのＥＤＴＡ緩衝液、３ｍＬの灌流緩衝液、および３０〜５０ｍＬのコラゲナーゼ緩衝液の左室への逐次注射によって心臓を消化した。鉗子を使用して、消化した心臓をより小さな約１ｍｍの小片に穏やかに引き裂き、穏やかな研和に供した。酵素活性を、５ｍｌの停止緩衝液を添加することによって阻害した。細胞懸濁液を１００ｕｍフィルターに通し、連続した４ラウンドの重力沈降により筋細胞を濃縮し、最終的に高度に純粋な筋細胞画分を取得した。筋細胞ペレットを液体Ｎ２で急速凍結し、さらなる処理のために−８０℃で保存した。
【０１７８】
組織学的および免疫蛍光顕微鏡観察
組織学的研究のために、切片（９μｍ）を、細胞形態のための標準的なヘマトキシリンおよびエオジン、コラーゲンを検出するマッソントリクローム染色、およびアポトーシス核を検出するＴＵＮＥＬアッセイを用いて染色した。画像をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ顕微鏡で取得した。凍結心臓切片に関する免疫蛍光のために、切片を室温に温め、ＰＢＳを用いて再水和させ、Ｍ．Ｏ．Ｍブロック（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｈｉｅｌｄｓ）およびロバ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてブロッキングし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いでスライドをＰＢＳ中で洗浄し、二次抗体およびヘキスト色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に６０分間インキュベートし、ＰＢＳを用いて洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ−Ｇｏｌｄ褪色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントした。一次抗体：ＬＭＮＡ／Ｃ  Ｎ−１８（ヤギ、１：５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｓｕｎ１モノクローナル（マウス、未希釈、Ｂ．Ｂｕｒｋｅから）、ＰＣＭ−１（ウサギ、１：２００、Ｓｉｇｍａ）、およびサルコメア−α−アクチニン（マウス、１：１００、ａｂｃａｍ）；二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、５６８、および６４７（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。単離した心筋細胞の免疫蛍光のために、筋細胞を懸濁液中で染色し、溶液変化ごとに穏やかにスピンダウンし、次いでＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０倒立型共焦点顕微鏡を用いて撮像するためにガラススライド上に置いた。
【０１７９】
ＬＭＮＡ、ＳＵＮ１、ＨａタグおよびＧＦＰのウェスタン分析
全心臓および四頭筋をＲＩＰＡ溶解緩衝液中で均質化し、１３，２００ｇ、４℃で１０分遠心分離した。総細胞溶解液を電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に移して、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてブロッキングした。膜を一次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。その後、膜をＴＢＳＴ洗浄液中で洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩＲＤｙｅ二次抗体中で１時間インキュベートした後、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で可視化した。ＬＭＮＡの最初の５０個のアミノ酸におけるエピトープに特異的な、ＬＭＮＡ／Ｃの検出のために使用した一次抗体（ウサギ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、Ｓｕｎ１モノクローナル（マウス、１：５００、Ｂｕｒｋｅ）、および対照のベータ−チューブリン（ウサギ、１：１０００、Ａｂｃａｍ）。
【０１８０】
心臓乳頭筋の作用力測定
マウス左室からのマウス乳頭筋を以前に記載された方法に従って調製した［Ｃ．Ｎ．Ｔｏｅｐｆｅｒら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５９４：５２３７〜５２５４（２０１６）］。簡潔に述べると、説明したマウス心臓を、１２単位／ｍＬのヘパリンナトリウム（ＥＤＱＭ）および３０ｍＭ  ２，３−ブタンジオンモノオキシム（ＢＤＭ、Ｓｉｇｍａ）を含む酸素化した氷冷Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を用いて直ちに濯ぎ、過剰な血液を除去した。その後、心臓をガラス製ペトリ皿中の氷冷Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に、冷却ステージを備える解剖顕微鏡下で移した。円筒形の乳頭（直径２００〜３００μｍおよび長さ１．５〜２ｍｍ）を左室から切除した。孔の開いたＴ字型のアルミニウム製クリップを乳頭調製物の両端に圧着し、調製した乳頭塊を、ＰＤＭＳ  ｓｙｌｇａｒｄ１８４（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）の層を含むガラス製ペトリ皿上にピンを使用して固定した。乳頭調製物を４℃の２％トリトンＸ−１００溶液に一晩浸漬した。
【０１８１】
力測定をこれまでに記載されたように実施した［Ｃ．Ｔｏｅｐｆｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：１３４４６〜１３４５４（２０１３）］。乳頭調製物の両端のＴ字型のアルミニウム製クリップを力変換器（ＡＥ８０１、ＨＪＫ  Ｓｅｎｓｏｒｅｎ＋Ｓｙｓｔｅｍｅ）のフックに取り付け、実験リグのサーボモーターを、エタノール（Ｓｉｇｍａ）中シェラックを用いて接着して、実験中の移動を最小限にした。乳頭収縮力を２０℃で測定した。最大収縮力を、３２μｍｏｌ／Ｌの遊離Ｃａ２＋を含む活性化溶液（ａｃｔｉｖｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１００ｍＭ  ＴＥＳ、６．５Ｍｍ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  Ｃａ−ＥＧＴＡ、５．７ｍＭ  Ｎａ２ＡＴＰ、２０ｍＭグルタチオン、２１．５ｍＭクレアチンリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．１、イオン強度は１５０ｍｍｏｌ／Ｌである）中で測定した。データを、力変換器、およびＬａｂＶＩＥＷ  ２０１３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によってプログラムされたカスタマイズされたソフトウェアを使用するＤＡＱデータ獲得装置（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）から収集し、処理した。各マウスにおいて少なくとも５つの繊維を試験し、実験群ごとに少なくとも３匹のマウスを試験した。
【０１８２】
ＡＡＶ９−ＤＮ−Ｓｕｎ１およびＡＡＶ９−ＧＦＰウイルス
ＤＮ−Ｓｕｎ１（ＳＳ−ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌ−ＫＤＥＬ）およびＧＦＰ（ＳＳ−ＧＦＰ−ＫＤＥＬ）ベクターは記載された通りであった［Ｍ．Ｃｒｉｓｐら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７２：４１〜５３（２００６）］。簡潔に述べると、Ｓｕｎ１の内腔ドメインのほぼ全体において、そのＮＨ２末端にＨＡをタグ付けした（ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌ）。ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌを可溶形態としてＥＲの内腔およびＰＮＳに導入するために、ヒト血清アルブミンのシグナル配列およびシグナルペプチダーゼ切断部位をＨＡ−Ｓｕｎ１ＬのＮＨ２末端に融合し、ＳＳ−ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌを得た。その分泌を妨げるために、ＫＤＥＬテトラペプチドをＳＳ−ＨＡ−Ｓｕｎ１ＬのＣＯＯＨ末端に融合し、最終的なＳＳ−ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌ−ＫＤＥＬを形成した。ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌ領域をＧＦＰ配列に置き換えてＳＳ−ＧＦＰ−ＫＤＥＬを生成した。
【０１８３】
ＤＮ−Ｓｕｎ１およびＧＦＰ断片を、下記に列挙するプライマー（同じ順方向プライマーを両方の断片に関して使用した）を用いて増幅し、ｐＥＮＮ−ＡＡＶ−ｃＴｎＴ−ＰＩ−ｅＧＦＰプラスミド（Ｊ．Ｊｉａｎ博士より寄贈）にライゲーションし、ＮｃｏｌおよびＫｐｎｌを用いて消化して、Ｐｅｎｎ−ＡＡＶ−ｃＴｎＴ−Ｓｕｎ１ＤＮを作製した（図１０、配列番号３）。
【０１８４】
【化５】
2021510529.tif 000090
【０１８５】
全ての制限酵素はＮＥＢから購入した。ＰＣＲ反応を、Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ、Ｍ０４９４Ｌ）を使用して行った。ライゲーションを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ、Ｅ２６２１Ｌ）を用いた等温アセンブリを使用して行った。プラスミドを構築するために使用したプライマーはＩＤＴに注文したものであった。
【０１８６】
ＡＡＶウイルスを標準的なプロトコル通りに作製した［Ｈ．Ｗａｋｉｍｏｔｏら、ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、２００１）］。Ｒ．Ｆｏｏによって供給された材料：ｐＡＡＶ２／９−  ＡＡＶレプリカーゼおよびカプシド遺伝子をコードするトランスプラスミド（配列番号２、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｐｅｎｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅから入手可能）；ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６−  アデノウイルスヘルパープラスミド（配列番号１）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｐｅｎｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅから入手可能）；ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ；ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）；トランスフェクション試薬（ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、例えばＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＡＡＶ−ＤＪカプシドはＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃから取得した。ｐＡＡＶ２／９、ＡＡＶ−ＤＪ、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、ＤＮ−Ｓｕｎ１、およびＧＦＰプラスミドを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを使用して精製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＡＡＶ２／９プラスミドと、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６プラスミドと、ＤＮ−Ｓｕｎ１プラスミドまたはＧＦＰプラスミドのいずれかとのウイルス組合せをトランスフェクトした。細胞を収集し、ウイルスをイオジキサノール勾配超遠心分離によって精製した。
【０１８７】
以下の予定をマウス心臓の感染に関して使用した。出生後１０日にマウスの遺伝子型を同定した。次いで出生後１４日にマウスをＴｍｘの１回のＩＰ注射（４０ｍｇ／ｋｇマウス体重）に供し、続いて出生後１５日に５×１０＾１０ｖｇ／ｇの濃度のＡＡＶ９−ＤＮ−Ｓｕｎ１またはＡＡＶ９−ＧＦＰウイルスを胸腔に注射した。成体マウス（３〜５か月齢）に単回用量のＴｍｘ（４０ｍｇ／ｋｇマウス体重）をＩＰ注射し、続いて５×１０＾１０ｖｇ／ｇのＡＡＶ９−ＤＮ−Ｓｕｎ１またはＡＡＶ９−ＧＦＰウイルスの濃度のＡＡＶを胸腔に注射した。若齢および成体マウスを、１．５％イソフルラン（ＢｉｏＭａｃ）および１．５Ｌ  Ｏ２の気体混合物を用いて麻酔した後、ウイルス注射を行った。
【０１８８】
プラスミド構築ならびにＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの生成
ｐＸ３３０をＡｄｄｇｅｎｅから取得した（＃４２２３０、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）。２０ｎｔのＳｕｎ１およびＳｙｎｅ１単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を、ＣＲＩＳＰＲ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌ（ｃｒｉｓｐｒ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ）を利用して設計した。目的の遺伝子の領域をツールに与えて好適な標的部位を同定した。オフターゲット変異がマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介標的化変異において起こり得るため、ＣＲＩＳＰＲ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌは、ｇＲＮＡ標的部位ごとにオフターゲットゲノム改変を実験的に評価し、所期の標的ごとにコンピュータで予測されたオフターゲット部位を提供して、標的配列を、塩基対ミスマッチの同定、位置、および分布の効果に関する定量的な特異性分析に従ってランク付けすることができる。ｇＲＮＡ標的配列を含有する相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｐＸ３３０のＢｂｓｌ部位にクローニングした。ガイドＲＮＡ配列は以下の通りであった。
【０１８９】
Ｓｕｎ１ΔＳＵＮに関しては５’−ＧＣＡＣＡＡＴＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＧ−３’  （配列番号３３）
Ｓｙｎｅ１−ｓｔｏｐに関しては５’−ＣＣＧＴＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴ−３’  （配列番号３４）
チロシナーゼ４ａに関しては５’−ＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＴＡＧＧＴＧＣＡＴ−３’  （配列番号３５）
次いでこれらのプラスミド（ｐＳｕｎ１ΔＳＵＮ、ｐＳｙｎｅ１−ｓｔｏｐ、およびｐチロシナーゼ４ａ）を配列決定して、標的配列の正確な挿入を検証した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に関して、一般的な逆方向プライマー（ＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣ−３’、配列番号３６）、および以下のようなＴ７プロモーター配列をコードするｇＲＮＡ特異的順方向プライマーを使用してＰＣＲを実施して、適切な転写鋳型を生成した。
【０１９０】
Ｓｕｎ１ΔＳＵＮ：５’−ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＣＡＡＴＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＧ−３’  （配列番号３７）；
Ｓｙｎｅ１−ｓｔｏｐ：５’−ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴ−３’  （配列番号３８）；
チロシナーゼ４ａ：５’−ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＴＡＧＧＴＧＣＡＴ−３’  （配列番号３９）
次いでｇＲＮＡ  ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動（１．５％アガロース）に供し、成功したＰＣＲであることを確認し、ゲル精製を行い、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用した。ｇＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製し、無ＲＮアーゼ水に溶出した。次いで精製したｇＲＮＡの試料を、品質確認のためにアガロースゲル電気泳動に供した後、接合体に注射した。
【０１９１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した変異マウスの生成
３〜４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌に、妊馬血清性性腺刺激ホルモン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、３６７２２、５ＩＵ／ｍｌ）を用いて過剰排卵させた。４８時間後、雌にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（Ｓｉｇｍａ、ＣＧ１０、５ＩＵ／ｍｌ）を注射し、Ｃ５７ＢＬ６雄と掛け合わせた。翌日、受精した０．５ｄｐｃ胚を卵管から収集した。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＳ９ＭＲＮＡ、１００ｎｇ／ｕｌ）、チロシナーゼ４ａ  ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／ｕｌ）、および遺伝子特異的ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／ｕｌ）を、マイクロインジェクションシステム（Ｎｉｋｏｎ）を使用してＭ２培地（ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）Ｓｉｇｍａ）中の胚の細胞質に同時注射した。Ｓｙｎｅ１−ｓｔｏｐ  ｓｇＲＮＡを使用してＳｙｎｅ１  Ｃ’Ｔ変異マウスを得て、Ｓｕｎ１ΔＳＵＮ  ｓｇＲＮＡを使用してＳｕｎ１ΔＳＵＮ変異マウスを得た。注射した接合体を、３７℃、５％ＣＯ２および５％Ｏ２に維持されたインキュベーターにおいて、アミノ酸を含むＫＳＯＭ（ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）Ｓｉｇｍａ）中で２時間培養した後、０．５ｄｐｃ偽妊娠Ｃ３Ｈ−ＩＣＲ雌に移植した。
【０１９２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９マウスの遺伝子型同定のためのＤＮＡ抽出
マウスの尾を切り、それぞれを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。８０μｌの溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＯＨ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１２）をチューブに分注し、９５℃で６０分間加熱した。加熱後、緩衝液を、等容量の４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ５を用いて中和した。ある特定の用途のために、ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してマウスの尾から抽出および精製した。
【０１９３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９マウスの遺伝子型同定
ＣＲＩＳＰＲ改変変異マウスの遺伝子型を、ＰＣＲと、それに続く高分解能アガロース（２％ＭｅｔａＰｈｏｒアガロース、Ｌｏｎｚａ）を使用するゲル電気泳動とによって同定した。
【０１９４】
Ｓｙｎｅ１ＣＴ’Δ８マウスのプライマーは、
順方向：５’−ＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＡＴＴ−３’  配列番号４０、および
逆方向：５’−ＡＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＧＴＣＴＣＣ−３’  配列番号４１
であった。
【０１９５】
Ｓｕｎ１  ＣＲＩＳＰＲマウスのプライマーは、
順方向：５’−ＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＣ−３’  配列番号４２、および
逆方向：５’−ＴＣＡＧＡＡＣＡＣＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＡ−３’  配列番号４３
であった。
【０１９６】
Ｌｍｎａ変異マウスの遺伝子型を実施例１に記載したように同定した。ＣＲＩＳＰＲ誘導変異の配列を決定するために、マウス尾部ＤＮＡからのＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローニング（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（商標）ＴＯＰＯ（商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、４５０２４５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に供した。少なくとも１０の細菌コロニーからのプラスミドＤＮＡを、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎ、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）を使用して単離し、サンガー配列決定を行った。
【０１９７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９研究のための筋芽細胞、線維芽細胞、および細胞培養の獲得
筋芽細胞を単離するために、安楽死させたマウスから四肢を取得し、筋肉を骨から切り取った。等容量の２．４Ｕ／ｍｌの濃度のディスパーゼＩＩ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．０４９４２０７８００１）および１％コラゲナーゼＩＩ（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ  １７１０１−０１５）からなる酵素溶液中の筋肉組織を３７℃の水浴中において１０分間隔で随時混合しながら３０分間インキュベートすることによって、組織消化を実施した。３０分後、酵素溶液をＤ１０培地（１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））中で中和した。次いで混合物を７０μｍ滅菌フィルター（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（商標）、ｃａｔ  ３５２３５０）および４０μｍ滅菌フィルター（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（商標）、ｃａｔ  ３５２３４０）を通してろ過する。次いで懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、その後、１０μｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、ｃａｔ  ＰＨＧ０２６４）を補充したＦ１０培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．１１５５００４３）に再懸濁して１００ｍｍプレートにプレーティングした。マウス成体線維芽細胞を２〜３時間静置した後、上清（浮遊筋芽細胞を含む）を収集し、０．１５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ  Ｇ１３９３）をコートした６０ｍｍプレートに再度プレーティングした。Ｄ１０培地を、ＭＡＦを有する１００ｍｍプレートに添加した。筋芽細胞を最終的に筋管に分化させるため、培地を、２％ウマ血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧＩＢＣＯ（登録商標）、ｃａｔ  １６０５０１２２）を補充したＤＭＥＭに変更した。
【０１９８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９研究のための免疫ブロッティング
全細胞溶解液を、Ｌｙｓｉｓ−Ｍキット溶液（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ）を使用して生成した。細胞を氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｍ緩衝液を用いて溶解し、１４，０００ｇで１０分間遠心分離して細胞片を除去した。タンパク質を組織試料から抽出するために、組織の小さなスライスをＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）に迅速に入れ、液体窒素で急速凍結した。急速凍結後、チューブを−８０℃で保存するかまたは直ちにタンパク質分析のために使用した。タンパク質抽出緩衝液（蒸留水中、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．４％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、１×プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤カクテル、カタログ番号０４６９３１５９００１、Ｒｏｃｈｅ）、２％トリトン、１ｍＭジチオスレイトール）を組織に添加し、次いでＦａｓｔＰｒｅｐ（商標）−２４器具（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して均質化した。次いで試料を１４，０００ｇで１０分間遠心分離して細胞片を除去した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質濃度を定量した後、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルに充填して、等量が分析されることを確実にした。全てのタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によって分離し、ウェット式転写によってポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に２０Ｖ、４℃で４８時間転写した。膜を、５％粉ミルク（Ａｎｌｅｎｅ）を補充した０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中室温で１時間ブロッキングした。ウェスタンブロット分析を、５％粉ミルク（ＴＢＳＴ中に希釈）に希釈した一次抗体を使用して実施した。膜を室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。二次抗体に関しては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートした抗体を化学発光イメージングのために使用した。膜を二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。化学発光によって可視化される免疫ブロットに関しては、膜をＥＣＬ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）中に１分間インキュベートした後、化学発光感受性フィルム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露し、その後処理した。
【０１９９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９研究のための免疫蛍光
細胞を８ウェルスライド（Ｉｂｉｄｉ）において成長させ、氷冷メタノール中−２０℃で１５分間固定した。次いで細胞をＰＢＳ中で２回濯ぎ、ＰＢＳ中０．１％トリトンＸ、３％ＢＳＡを用いて室温で１５分間透過処理およびブロッキングした。次いで固定および透過処理した細胞をＰＢＳ中で３回濯いだ。次いで試料を一次抗体（表２）と共に室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。次いで試料を、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、その後二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中での３回の洗浄後、細胞を褪色防止剤（１％ＤＡＢＣＯ、９０％グリセロール、１０％ＰＢＳ）でマウントし、Ｚｅｉｓｓ５１０Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡またはＡｘｉｏｖｅｒｔ２００倒立型落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して検査した。画像を、Ｚｅｉｓｓ  ＺＥＮ、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ、またはＩｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）ソフトウェアを使用して記録および分析した。
【０２００】
【表２】
2021510529.tif 000091
【０２０１】
マウス遺伝子学
Ｌｍｎａマウスおよびタモキシフェン注射を実施例１に記載した。ＬｍｎａΔ／Δ：Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８およびＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘｍｃｍ：Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８二重変異マウスを取得するために、ＬｍｎａΔ／＋またはＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍマウスをＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８マウスと交雑させた。Ｓｙｎｅ２マウスモデルにおいて、ｌｏｘＰ部位によって挟まれたＩＲＥＳ−β−ｇａｌネオマイシン選択カセット（ＰｇｋＮｅｏ）をＳｙｎｅ２遺伝子に挿入し、その結果エクソン１０２の一部およびエクソン１０３〜１０４の全ての欠失をもたらした。その後ネオマイシンカセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼマウスと交配させることによって除去した。Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／＋またはＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８マウスをＳｙｎｅ２＋／−またはＳｙｎｅ２−／−マウスと交配させ、変異Ｓｙｎｅ１およびＳｙｎｅ２アレルを有するマウスを取得し、これらを交雑させて二重変異マウスを取得した。カプラン・マイヤー法を使用して生存曲線を描写した。
【０２０２】
ヒトガイドＲＮＡ配列
ヒトＳＹＮＥ１  ＫＡＳＨドメインまたはＳＵＮ１  ＳＵＮドメインを破壊する潜在的なガイドＲＮＡ配列を、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇソフトウェア（Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）におけるＣＲＩＳＰＲツールを使用して決定し、表３に示す。
【０２０３】
【表３】
2021510529.tif 000092
【０２０４】
統計分析
全ての統計分析はＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。
実施例２
Ｌｍｎａの心筋細胞特異的喪失は心不全の急速な発症をもたらす
マウスの出生後の病態におけるＳｕｎ１とＬｍｎａとの間の相互作用をさらに定義するために、Ｃｒｅ活性化によって組み換えた場合にラミンＡ／Ｃタンパク質の完全な喪失をもたらすコンディショナルＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ系のマウス（図３３）を使用することによって、異なる組織においてＬｍｎａ遺伝子を特異的に取り除いた［Ａ．Ｓ．Ｗａｎｇら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ、（２０１５）；Ｉ．Ｓｏｌｏｖｅｉら、Ｃｅｌｌ  １５２：５８４〜５９８（２０１３）］。ＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘマウスをＺｐ３−Ｃｒｅマウスと交配させることによってＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘを全ての組織において恒常的に欠失させた場合［Ｗ．Ｎ．ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２６：１１０〜１１２（２０００）］、平均出生後生存期間は１７．５日であった（図２６Ａ）。同じ欠失をＳｕｎ１の非存在下で誘導した場合、ＬｍｎａΔ／Δ：Ｓｕｎ１−／−マウスは平均で３２．５日まで生き、寿命はほぼ倍となった（図２６Ａ）。同じＬｍｎａ欠失をＳｕｎ２ヌル背景に関して実施することはＬｍｎａΔ／Δマウスの寿命を延ばさず、寿命延長はＳｕｎ１の喪失に特異的であることを明らかにした（図３６）。Ａ型ラミンはほぼ全ての成体組織において広く発現するため、次いで、Ｌｍｎａ欠失、具体的には心筋細胞におけるＬｍｎａ欠失がＬｍｎａΔ／Δマウスの出生後早期の死亡にどの程度寄与するかを決定した。さらに、本発明者らは、Ｓｕｎ１の喪失がＬｍｎａ欠損心筋細胞を包含するこれらのマウスの寿命を増加し得るか否かを確かめることを望んだ。初めに、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘを、Ｃｒｅ発現が、恒常的発現であるが心筋細胞に制限されており、胚形成中に開始する、恒常的ｍｙｈ６  Ｃｒｅ［Ｒ．Ａｇａｈら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００：１６９〜１７９（１９９７）］と交配させた。これらのマウスはＬｍｎａΔ／Δよりもわずかに長く、出生後平均２６．５日まで生存した（図２６Ｃ）。同じ心筋細胞特異的欠失をＳｕｎ１−／−背景に関して実施した場合、これは生後少なくとも６か月まで、およびそれを超える寿命の有意な増加をもたらした（図２６Ｃ）。Ｌｍｎａの喪失、およびその出生後／成体心筋細胞における効果をさらに定義するために、Ｃｒｅがタモキシフェン（Ｔｍｘ）の単回注射によって誘導される［Ｄ．Ｓ．Ｓｏｈａｌら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８９：２０〜２５（２００１）］誘導型心筋細胞特異的Ｃｒｅ  Ｔｇ（Ｍｙｈ６−ｃｒｅ／Ｅｓｒ１）（ここではｍｃｍと略記）を保有するＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘアレルに関してホモ接合型のマウスを得た。この交配からの３〜５か月齢のＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍマウスのＣｒｅ誘導後の平均生存期間は２７日であった（図２７Ａ）。対照はＴｍｘ注射による影響を受けなかった。ＰＣＲおよび免疫蛍光分析は、Ｌｍｎａ欠失がＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ心筋細胞に特異的であり、検出可能な組換えは脳、横隔膜、肺、肝臓、および骨格筋に生じず、野生型対照動物においても生じなかったことを確認した（図２７Ｂ）。注射後２１日までに、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍマウスは、努力呼吸、被毛が乱れて毛繕いされていない外観、増加した嗜眠、および脊柱後湾（図２７Ｃ）を示した。単離した心筋細胞（ＣＭ）とＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ心臓の切片との免疫蛍光分析は、ラミンＡタンパク質の低下したレベルおよびラミンＡ発現を有しない心筋細胞核を示した（図２７Ｄ）。ラミンＡタンパク質レベルは、Ｃｒｅ誘導後のＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ心臓において、誘導しなかったＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍおよびＬｍｎａ＋／＋／ｍｃｍ心臓と比較して３．５分の１に減少した（図２７Ｅ）。Ｔｍｘ注射後の一定の時点でＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍマウスを試料採取することによって、Ｃｒｅ誘導後、ＬＭＮＡタンパク質レベルが５０％下がるのに７〜１４日かかると推定され（データは示していない）、これは４８時間後に１．３分の１、および１０．５日後に４分の１にさらに低下したことを示すヒト線維芽細胞におけるｓｉＲＮＡ  ＬＭＮＡノックダウンを使用した研究［Ａ．ＢｕｃｈｗａｌｔｅｒおよびＭ．Ｗ．Ｈｅｔｚｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ８：３２８（２０１７）；Ｔ．Ｓｉｅｐｒａｔｈら、Ｎｕｃｌｅｕｓ  ６：２３６〜２４６（２０１５）］と一致する速度であった。Ｃｒｅ誘導の２１日後に実施した心エコー図（ＥＣＧ）は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍマウスにおいて、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ対照と比較して不十分な心臓収縮力を明らかにした（図２８Ａ）。駆出率（ＥＦ％）および短縮率（ＦＳ％）の有意な減少が存在した（Ｐ＜０．０００１）（図２８Ｂ）。左室収縮期および拡張期内径（ＬＶＩＤ）は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ対照と比較して拡大した（図２８Ｂ）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ対照と比較して有意に少ない生存（煉瓦様）心筋細胞がＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ心臓から単離された（図２８Ｃ）。視覚分析は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ心臓から単離された心筋細胞が大きな細胞内空胞を含有したことを明らかにした（図２８Ｃ）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ心臓の組織学的分析は、有核細胞の浸潤、およびＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ対照心臓と比較して増加した心筋細胞間の細胞間空間を明らかにした（図２８Ｄ）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ心臓における左室内腔は有意に拡大し、同時にＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ対照と比較して有意に増加した線維化のレベル（Ｐ＝０．００９８）がＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ心臓において認められた（図２８Ｄ）。対照心臓と比較して増加したアポトーシス細胞の数もまたＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ心臓において同定された（図２８Ｄ）。しかしながら、Ｒａｄ５１、ＭＲＥ１１、Ｈ２ＡＸ蛍光体−Ｓｅｒ、および５３ＢＰ１免疫染色によって評価されたように、心筋細胞において検出可能な広範なＤＮＡ損傷に関する証拠は存在しなかった（データは示していない）。
【０２０５】
実施例３
Ｓｕｎ１の欠失はＬｍｎａ喪失によって誘導された心臓病態を改善する
Ｌｍｎａ変異を有するマウスはＳｕｎ１の非存在下で寿命の有意な増加および健康の有意な増進を示す［Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）］。記載したように、心筋細胞におけるＬｍｎａの誘導欠失（ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ）はＣｒｅ誘導後１か月以内に死亡をもたらす（図２６Ｃ）。驚いたことに、同じ欠失をＳｕｎ１ヌル背景に関して誘導した場合、マウスはＣｒｅ誘導後１年超生存した（図２６Ｃ）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘマウスからの心臓を、誘導の３週間後、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘからの心臓と比較して、ＳＵＮ１喪失が心筋細胞におけるＬｍｎａ喪失によって誘導された病理学的変化を改善した程度を決定した。ラミンＡ／Ｃに関する免疫蛍光イメージングは多くの細長く歪んだ核を同定した。これらの一部では、残留ラミンＡ／ＣがＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘ心臓における核の一方の極へ移動していた（図２９Ａのパネル１および挿入画像）。対照的にＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓では、ラミンＡ／Ｃ染色が存在しない場合であっても、多くの細長い核が存在したが、これらはたとえあったとしてもほとんど歪みを示さなかった（図２９Ａのパネル３の黄色の鏃印）。全心臓のウェスタン分析は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓溶解液において、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋対照と比較してラミンＡ／Ｃの有意な減少を明らかにした（Ｐ＝０．０３５９）（図２９Ａの下段のパネル）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘ心筋細胞核は、増加した長軸方向の長さを区分された外観と共に呈し、区分は狭い橋によって接続された（図２９ＡおよびＣ、パネル１の矢印）。しかしながら、Ｓｕｎ１の非存在下では、ＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍＳｕｎ１−／−心筋細胞核は異常も区分化も呈しなかった（図２９Ｃのパネル３および４）。全体で、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−からの１％未満の心筋細胞に対して、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋マウスにおける７０％の心筋細胞が破裂した核または奇形核を有した（図２９Ｃのパネル５）。
【０２０６】
左室（ＬＶ）の明確な拡大は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋マウスにおいて明らかであったが、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓のＬＶにおいては明らかでなかった（図２９Ｂ、パネル１および２）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋心臓は対照と比較して有意に増加したレベルの線維化を呈したが（Ｐ＜０．０００１）、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−心臓では有意な線維化は存在しなかった（図２９Ｂ、パネル３〜５）。
【０２０７】
左室筋の作動機構に関するモデルとして、心臓乳頭筋における作用力を測定した。作用力は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ：Ｓｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘ乳頭筋において、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋ＣＴＬと比較して有意に、６６％減少した（Ｐ＝０．００２８）。ＳＵＮ１の非存在下では、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓乳頭作用力は、対照の作用力と有意に異ならないレベルに維持された（図２９Ｂのパネル６）。
【０２０８】
Ｃｒｅ誘導前およびＣｒｅ誘導後に実施した心エコー図は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスにおける心臓収縮力の進行性悪化をＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘマウスと比較して明らかにした（図２９Ｄ）。ＳＵＮ１の喪失は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋ＴｍｘマウスにおいてＥＦ、ＦＳ、および長軸方向グローバルストレイン（ＧＬＳ）（ＧＬＳは心筋収縮力を評価するために使用される独立したパラメータであり、心不全のより良好な予測因子である）のいずれもＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋Ｔｍｘマウスと比較して保存した。
【０２０９】
Ｔｍｘ注射の１２〜１４か月後の老化ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓のＰＣＲ分析は、Ｌｍｎａ遺伝子の持続した欠失を確認し（図３７Ｃ）、タンパク質定量は、ＴＭＸの１２〜１４か月後のＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓におけるＬＭＮＡレベルの有意な低下を明らかにした（図３７Ｄ）。１２〜１４か月のＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘ心臓の組織学的分析は、対照と比較して線維化の有意な増加がないことを明らかにした（図３７ＡおよびＢ）。しかしながら、これらの老化マウスに関する心エコー図は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋＋ＣＴＬマウスとＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘｍｃｍＳｕｎ１−／−＋Ｔｍｘマウスの両方において減少したＥＦおよびＦＳを示したが（図３７Ｅ）、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘマウスの平均生存期間は１３〜１４か月であり（図２６Ｃ、それゆえに低下した収縮機能は老化によるものであったと考えられる。さらに、これらの知見は、成体（２〜３か月）心筋細胞におけるＬｍｎａの喪失はＣｒｅ活性化後３〜４週間以内の心臓不全をもたらすのに十分であるが、この病態はＳｕｎ１を欠失させることによって驚くほど軽減し、この軽減は１年間持続することを実証する。
【０２１０】
実施例４
ＳＵＮ１の喪失はＬｍｎａミスセンス変異体の寿命を延ばす
ＬＭＮＡ誘導ＤＣＭの大半の症例はミスセンス変異に起因するため、ＡＤ−ＥＤＭＤと診断された２名の無関係な患者において同定されているＮ１９５Ｋミスセンス変異［Ｄ．Ｆａｔｋｉｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４１：１７１５〜１７２４（１９９９）；Ｊ．Ｐ．ｖａｎ  Ｔｉｎｔｅｌｅｎら、Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １５４：１１３０〜１１３９（２００７）］を保有する、ＤＣＭが原因で死亡するこれまでに記載されたＬｍｎａ変異マウス系［Ｌ．Ｃ．Ｍｏｕｎｋｅｓら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １４：２１６７〜２１８０（２００５）］の寿命および心機能に対して、ＳＵＮ１の喪失がどのような効果を有するかを決定した。ここでも、ＳＵＮ１の非存在が、向上した心機能と共にこの変異マウス系の生存期間を有意に延ばしたことを見出した（図２６Ｄ）。これらの知見を、ＷＴ−ＬｍｎａアレルにｌｏｘＰ配列を導入した、Ｎ１９５Ｋ変異に関してヘテロ接合型のマウスを得ることによって、すなわちＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ×Ｓｕｎ１＋／＋によって拡張した。これらのマウスにおいてＴｍｘ誘導型心筋細胞Ｃｒｅアレルを誘導すること（ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ）は、ＷＴ  ｆｌｏｘ  Ｌｍｎａアレルの欠失をもたらし、心筋細胞をＬｍｎａＮ１９５Ｋ／−変異としてヘミ接合型にした。これらのマウスは５０日未満の平均生存期間を有し、本来のＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｎ１９５Ｋホモ接合型のマウスの半分の寿命であった（図３０Ａ）。ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ変異をＳｕｎ１ヌル背景に関して誘導した場合、寿命は５０日未満から２００日超まで有意に延び（図３０Ａ）、Ｓｕｎ１の喪失が、Ｌｍｎａミスセンス変異、具体的には心筋細胞におけるＬｍｎａミスセンス変異によって引き起こされるＤＣＭを予防するのにも効果的であったことを明らかにした。
【０２１１】
Ｃｒｅ誘導前およびＣｒｅ誘導後に実施した心エコー図は、ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋マウスにおける心臓収縮力の進行性悪化をＬｍｎａＮ１９５Ｋ／Ｆｌｘ：ｍｃｍＳｕｎ１−／−マウスと比較して明らかにした（図３０Ｂ）。ＳＵＮ１の喪失は、ＬｍｎａＮ１９５Ｋ／−：ｍｃｍＳｕｎ１−／−マウスにおいてＥＦ、ＦＳ、および長軸方向グローバルストレイン（ＧＬＳ）のいずれもＬｍｎａＮ１９５Ｋ／−：ｍｃｍＳｕｎ１＋／＋マウスと比較して保存した（図３０Ｂ）。
【０２１２】
実施例５
ＤＮＳｕｎ１のＡＡＶ９媒介形質導入および発現はＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスの生存期間を延長する
上記の結果は、ＳＵＮ１の機能を遺伝子的に取り除くかまたはＳＵＮ１レベルを遺伝子的に低下させることがＤＣＭを処置することにおいて治療的価値を有し得ることを実証した。本発明者らは次いで、これが、毒性となるＳＵＮ１の過多を、ＳＵＮ１のレベルを変更せずに、かつＯＮＭにおけるＫＡＳＨドメインタンパク質を繋ぐことにより核を細胞骨格の成分に繋ぐことに関するＳＵＮ１のＬＩＮＣ複合体に関連する役割を特異的に破壊することで克服する、ＳＵＮ１の機能の完全な排除によるものか否かを検証した。これら２つの可能性を区別するために、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）を利用して、タンパク質産物が心筋細胞核膜槽におけるＳＵＮ１−ＫＡＳＨ結合とＳＵＮ２−ＫＡＳＨ結合の両方と競合し得るドミナントネガティブＳＵＮ１ミニ遺伝子［Ｍ．Ｃｒｉｓｐら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７２：４１〜５３（２００６）］を心筋細胞において特異的に形質導入および発現させた。Ｓｕｎ１遺伝子の管腔ドメイン全体に対応する領域において、そのＮ末端にＨＡ（ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌ）エピトープをタグ付けした。結果として生じたタンパク質産物を小胞体（ＥＲ）および核膜槽（ＩＮＭとＯＮＭとの間−ＰＮＳ）に局在させるために、ヒト血清アルブミンのシグナル配列およびシグナルペプチダーゼ切断部位をＨＡ−Ｓｕｎ１ＬのＮ末端に融合してＳＳ−ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌを得た。ミニタンパク質の分泌を妨げるために、ＫＤＥＬテトラペプチドをＳＳ−ＨＡ−Ｓｕｎ１ＬのＣ末端に連結して、ＳＳ−ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌ−ＫＤＥＬを形成した（図３４）。シグナル配列は、ＨＡ−Ｓｕｎ１ＫＤＥＬが細胞内で連続的な核周辺（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）ＥＲおよびＰＮＳ内腔内に蓄積することを確実にし得る。ミニ遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列をニワトリ心筋トロポニン（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｏｎｉｎ）プロモーター（ｃＴｎＴ）に融合して、ミニ遺伝子が心筋細胞のみにおいて転写されることを確実にした［Ｋ．Ｍ．Ｐｒａｓａｄら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １８：４３〜５２（２０１１）］。ＳＳ−ＨＡ−Ｓｕｎ１Ｌ（ＤＮ−Ｓｕｎ１）がＫＡＳＨドメインタンパク質をＰＮＳ中のＬＩＮＣ複合体からＥＲへどのように移動させるかについての図を図１５（第３のパネル）および図３１Ｂに示す。
【０２１３】
ＤＮ−Ｓｕｎ１が心筋細胞（ＣＭ）において機能したことを検証するために、最初に、ＡＡＶ９血清型よりも高い感染率を培養細胞において提供する、ＤＮ−Ｓｕｎ１を形質導入するために使用されるＡＡＶ−ＤＪ系［Ｄ．Ｇｒｉｍｍら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８２（１２）：５８８７〜９１１（２００８）］をマウス心臓においてｃＴｎＴプロモーターの転写制御下で使用して、ｉＰＳ幹細胞に由来するヒトＣＭに形質導入を行った。ＤＮ−Ｓｕｎ１は、図３１Ｄに示すように、ＤＮ−Ｓｕｎ１を発現しているＣＭにおける核エンベロープからＮｅｓｐｒｉｎ−１を移動させるのに効果的であった。高レベルおよび低レベルのＤＮ−Ｓｕｎ１を発現する細胞をそれぞれ灰色および白色の鏃印によって示す。高レベルのＤＮ−Ｓｕｎ１発現は核エンベロープからのＮｅｓｐｒｉｎ−１の移動をもたらした。このことは、ＤＮ−Ｓｕｎ１がＣＭにおけるＬＩＮＣ複合体を破壊することに効果的であったことを確認した。
【０２１４】
ＡＡＶ（血清型９）を使用して、ＤＮ−Ｓｕｎ１ミニ遺伝子を出生後マウスの心臓に胸腔内注射によって形質導入し、発現させた。手順を図３１Ａに要約し、全てのマウスをＴｍｘ注射の１００日後に分析のために屠殺した。心臓におけるＬｍｎａ欠失のＰＣＲによる検出は、Ｔｍｘ注射によるＣｒｅ誘導を確認した（図３１Ｃ）。ＤＮ−Ｓｕｎ１ミニ遺伝子の局在および発現レベルを決定するために、総タンパク質を心臓の半分から抽出した。ウェスタン分析は、ＡＡＶ注射の９９日後のＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１タンパク質とＡＡＶ９−ＧＦＰ対照タンパク質（注射用量：５×１０＾１０ｖｇ／ｇマウス）の両方の強力な発現を明らかにし（図３１Ｃ）、両方のタンパク質の発現レベルは注射したウイルス粒子の用量に依存した（図３８）。ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１タンパク質またはＡＡＶ９−ＧＦＰタンパク質いずれかの発現はＬＭＮＡタンパク質レベルに影響を及ぼさなかった（図３９Ａ）。免疫蛍光分析は、５×１０＾１０ｖｇ／ｇのＡＡＶ９−ＧＦＰでは、その１０分の１の用量のウイルス粒子（５×１０＾９  ＡＡＶ９−ＧＦＰ）に起因するレベルと比較して大きな百分率の心筋細胞がＧＦＰを発現していたことを明らかにした（図３９Ｂおよび図３９Ｃ）。
【０２１５】
ＡＡＶ９−ＧＦＰ対照を注射したＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋ＴｍｘマウスはＴｍｘ誘導後、平均３４．５日生きたが、ＡＡ９−ＤＮＳｕｎ１（５×１０＾１０ｖｇ／ｇマウス）を注射したＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘマウスはそれよりも有意に長く生き、大多数はＴｍｘ後少なくとも１００日の時点で生存しており、その後、分析のために屠殺された（Ｐ＝０．０００２）（図２０は雄および雌マウスに関する初期の時間期間の結果を示し、図３１Ｅは１００日における結果を、異なるウイルス注射力価を有するマウスが除去された、雄マウスおよび雌マウスに関する別個のグラフにより示す）。エコー分析は、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１心臓がＴｍｘの３５日後においてＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＧＦＰ心臓よりも良好に機能していたことを確認した（図３１Ｇ）。ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１マウスは誘導後１００日の時点で生存していたが、ＥＦ％とＦＳ％の両方は対照ＬｍｎａＦｌｘ／ＦｌｘＷＴ＋Ｔｍｘマウスと比較して有意に低かった（図３１Ｇ）。Ｔｍｘの３５日後において、増加した線維化が、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１心臓とＬｍｎａＦｌｘｘ／Ｆｌｘｘｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＧＦＰ心臓の両方において検出されたが（図３１Ｆ）、ＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘ：ｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＤＮＳｕｎ１心臓における線維化はＬｍｎａＦｌｘｘ／Ｆｌｘｘｍｃｍ＋Ｔｍｘ＋ＡＡＶ９−ＧＦＰ心臓におけるよりも有意に少なかった（図３１Ｆの下段のパネル）。
【０２１６】
実施例６
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したマウスにおけるＬＩＮＣ複合体の破壊
全身的変異と心臓特異的変異のいずれであれ、多様なＬｍｎａ変異を包含するマウスは、Ｓｕｎ１の非存在下では寿命の有意な増加および健康の有意な増進を示す［（Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）、および実施例２〜４］。実施例２〜５に記載した知見以前、この救済の機構は、明らかではなかったが、Ｌｍｎａ変異体における過剰なＳｕｎ１の毒性効果によるものと推測されていた［Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）］。ドミナントネガティブＬＩＮＣ複合体破壊導入遺伝子のＡＡＶ媒介発現は、Ｌｍｎａ変異に関連する病態を改善する［実施例５］。実施例２〜５における知見は、過剰なＳｕｎ１よりもむしろＬＩＮＣ複合体機能がＬｍｎａ病態の分子ドライバーであるという考えと一致する。このことは、マウスにおけるＳｕｎ１およびＳｕｎ２の喪失を介したＬＩＮＣ複合体の遺伝子的破壊［Ｋ．Ｌｅｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：１０２０７〜１０２１２（２００９）］またはＮｅｓｐｒｉｎ−１およびＮｅｓｐｒｉｎ−２の心臓特異的破壊［Ｂａｎｅｒｊｅｅら、ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔ  １０（２）：ｅ１００４１１４（２０１４）］は様々な病態をもたらしたため、驚くべきことであった。
【０２１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＩＮＣ複合体を破壊することの代替的手段を開発するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、ＬＩＮＣ複合体を構成するタンパク質のＳＵＮおよびＫＡＳＨドメインを障害することができるかを検討した。ＳＵＮドメインとＫＡＳＨドメインはどちらもそれぞれのタンパク質のＣ末端に位置するため、ＳＵＮまたはＫＡＳＨドメインタンパク質をコードする遺伝子の３’末端を標的とするＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ誘導非相同末端結合後に未成熟終止コドンを生じ得ると仮定した。これは、Ｃ末端ＳＵＮまたはＫＡＳＨドメインが変異した短縮型タンパク質を生じ得る。短縮型タンパク質は、発現して膜局在し得るが、自らの同族のＬＩＮＣ複合体パートナーと相互作用することができない。実施例２において、本発明者らはＳｕｎ２の喪失がＬｍｎａ関連病態を改善しないことを見出した。したがって、Ｓｕｎ１がＬｍｎａ病態を媒介する支配的なＳＵＮドメインタンパク質であると考えられるため、ＣＲＩＳＰＲを使用してＳｕｎ１  ＳＵＮドメインを標的とすることを選択した。ＫＡＳＨドメインタンパク質のうち、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１、Ｎｅｓｐｒｉｎ−２、およびＮｅｓｐｒｉｎ−３のみが広範に発現する［Ｈ．Ｆ．Ｈｏｒｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０９：２８７〜３２１（２０１４））。Ｎｅｓｐｒｉｎ−１およびＮｅｓｐｒｉｎ−２は機能的に重複する近縁のパラログである。これらはアクチンおよび微小管細胞骨格と相互作用するが、Ｎｅｓｐｒｉｎ−３は中間径フィラメントと特異的に相互作用すると考えられる［Ｋｉｍら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３９６：２９５〜３１０（２０１５）］。本発明者らは、研究室において利用可能な、従来の遺伝子ターゲティングによって得たＮｅｓｐｒｉｎ−２およびＮｅｓｐｒｉｎ−３変異マウス系統を既に有していたため、ＣＲＩＳＰＲを使用してＮｅｓｐｒｉｎ−１のＫＡＳＨドメインを標的とすることを選択し、ラミノパチーの処置のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができるかを検証した。
【０２１８】
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス接合体にＣａｓ９  ｍＲＮＡと、ＳＵＮ１ドメインを標的とするｇＲＮＡ（５’−ＧＣＡＣＡＡＴＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＧ−３’、配列番号６６）またはＫＡＳＨ１ドメインを標的とするｇＲＮＡ（５’−ＣＣＧＴＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴ−３’  配列番号６７）とをマイクロインジェクションし、続いて代理母への移植することによって、Ｓｕｎ１遺伝子、およびＮｅｓｐｒｉｎ−１タンパク質をコードするＳｙｎｅ１遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで直接標的とした。ＳＵＮ１  ｇＲＮＡはＳＵＮドメインの上流にあるＳｕｎ１を標的としてＳＵＮドメインを取り除くことに注意されたい。チロシナーゼ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ（５’−ＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＴＡＧＧＴＧＣＡＴ−３’、配列番号６８）を同時注射した−ＣＲＩＳＰＲゲノム編集を受けた後代はチロシナーゼ破壊に起因する白色またはモザイクの被毛色を有し得る。これらの仔の遺伝子型を同定して、成功した遺伝子破壊であることを確認し、これらの仔を初代動物として使用して、Ｓｕｎ１またはＮｅｓｐｒｉｎ−１変異コロニーを樹立した。
【０２１９】
変異マウスの特性解析
初代動物およびＦ１後代のサンガー配列決定後、７ｂｐの欠失を有するＳｕｎ１変異アレル（Ｓｕｎ１＿ｄｅｌ７またはＳｕｎ１Δ７、配列番号７１）および４ｂｐの挿入を有するＳｕｎ１変異アレル（Ｓｕｎ１＿ｐｌｕｓ４、配列番号７０）（図４０Ａ）、ならびに８ｂｐの欠失を有するＳｙｎｅ１（Ｎｅｓｐｒｉｎ−１）変異アレル（Ｓｙｎｅ１＿ＣＴｄｅｌ８またはＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８、配列番号７６）（図４１Ａ）を特性解析することに集中して取り組んだ。Ｓｕｎ１変異アレルは、未成熟終止コドンを有するｍＲＮＡを産生し、結果としてＳＵＮドメインを欠く短縮型Ｓｕｎ１タンパク質を生じると予測された（図４０Ｂ）。尾部先端線維芽細胞をＳｕｎ１ホモ変異動物から単離した。免疫蛍光染色は、Ｓｕｎ１タンパク質の喪失を明らかにし（図４０Ｃ）、ＣＲＩＳＰＲによって発生した挿入欠失がＳｕｎ１  ｍＲＮＡのナンセンス変異依存分解機構を引き起こしたことを示唆した。ＳＵＮドメインの内側ではなくＳＵＮドメインの外側であった変異の部位が変異型遺伝子の発現に対して効果を有していたか否かは明らかではない。ＳＵＮドメインを欠くＳｕｎ１タンパク質を産生するＳｕｎ１変異アレルを取得することができず、代わりにＳｕｎ１ヌル動物を本質的に取得したため、これらの変異系をさらに特性解析することはしなかった。
【０２２０】
Ｓｙｎｅ１  Ｃ’ＴΔ８アレルは、野生型配列（配列番号７７）における最終の１１個のアミノ酸が変異し、選択的読み枠によってコードされる追加の５０個のアミノ酸が続くタンパク質（図４１Ｂ、配列番号７８）を産生すると予測される。Ｓｙｎｅ１ＷＴおよびＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８心臓および筋肉組織に関して実施した免疫ブロッティングは、ＷＴにおいて横紋筋に豊富なＳｙｎｅ１遺伝子のＮｅｓｐｒｉｎ−１αアイソフォームに対応する約１２０ｋＤａのバンドを明らかにした（図４１Ｃ、Ｄ）。Ｃ’ＴΔ８心臓および筋肉組織では、推定的なＮｅｓｐｒｉｎ−１αポリペプチドは、野生型におけるよりも少なく、より低い電気泳動移動度であると考えられた（図４１Ｃ、Ｄ）。このことは、Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８アレルにおける８ｂｐの欠失が新規終止コドンを下流に導入し、結果としてより高い分子量のタンパク質を生じるということと一致する。加えて、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１Ｇｉａｎｔに対応する可能性が高い約１ＭＤａのバンドが、Ｓｙｎｅ１ＷＴマウスとＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８マウスの両方からの心臓組織において観察された。
【０２２１】
１２週齢のマウスに由来するマウス成体線維芽細胞（ＭＡＦ）の免疫蛍光分析は、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１がＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８  ＭＡＦにおいて核エンベロープから細胞質に誤局在したことを明らかにした（図４２Ａ）。同様に、筋管では、Ｎｅｓｐ−１はＳｙｎｅ１ＷＴ筋管と比較するとＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８筋管において細胞質に再分布する（図４２Ｂ）。ＳＵＮ１、ＳＵＮ２、エメリン、およびラミンＡ等の他のＬＩＮＣ複合体およびＮＥタンパク質はＮＥに局在したままであった（図４３Ａ〜Ｃ）。これまでの報告［Ｇｉｍｐｅｌら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２７：２９９９〜３００９．ｅ９．（２０１７）］と一致して、筋管におけるＮｅｓｐｒｉｎ−１の破壊は、筋管核エンベロープからの中心体タンパク質ＰＣＭ１、Ｐｃｎｔ、およびＡｋａｐ４５０の誤局在をもたらした（図４４Ａ〜Ｃ）。核エンベロープからのＮｅｓｐｒｉｎ−１の誤局在は、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１  ＫＡＳＨドメインの破壊と一致し、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１Ｃ’ＴΔ８変異タンパク質が、通常ではＮｅｓｐｒｉｎ−１を核エンベロープに制限し得るＳｕｎ１およびＳｕｎ２のＳＵＮドメインと相互作用することを妨げる。膜貫通領域は破壊されないため、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１はＣ’ＴΔ８変異では小胞体（ＥＲ）に誤局在する可能性が高い。この理由は、ＥＲおよび核膜槽が連続的な膜系を形成するためである。
【０２２２】
これまでに報告された１つのＮｅｓｐｒｉｎ−１マウスモデル［Ｚｈａｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４（５）：９０１〜８（２００７）］と同様に、また２つの他のモデル［Ｐｕｃｋｅｌｗａｒｔｚら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １８：６０７〜６２０（２００９）；Ｚｈａｎｇら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９：３２９〜３４１（２０１０）］と対照的に、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１の破壊されたＫＡＳＨドメインは、Ｓｙｎｅ１野生型（ＷＴ）とＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８変異との間に明白な表現型の差を生じない（図４５Ａ〜Ｂ）。雄のホモ変異体と雌のホモ変異体はどちらも繁殖性であり、Ｓｙｎｅ１ＷＴマウスとＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８マウスとの間で体重における有意な差はなかった（図４５Ｃ）。Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８マウスはまた、成長遅延も明らかな筋ジストロフィーも一切呈せず、筋肉低下の指標となり得る運動の困難も毛繕いの困難も一切示さなかった。
【０２２３】
Ｌｍｎａ病態における他のＫＡＳＨドメインタンパク質の役割を探索するために、Ｎｅｓｐｒｉｎ−２をコードするＳｙｎｅ２に関するマウス変異を、従来の遺伝子ターゲティングによって生成した（図４６Ａ）。変異を特性解析するために、尾部先端線維芽細胞の免疫蛍光顕微鏡観察を実行した。Ｓｙｎｅ２−／−ホモ変異線維芽細胞はＮｅｓｐｒｉｎ−２をほとんどまたは全く発現しなかった（図４６Ｂ）。これまでの知見［Ｚｈａｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４（５）：９０１〜８（２００７）］と一致して、Ｓｙｎｅ２−／−マウスは明白に正常であって、成長遅延も不妊症も有しなかったが、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１／２二重変異マウス（Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８：Ｓｙｎｅ２−／−）は周産期致死であった（図４６Ｃ）。
【０２２４】
Ｎｅｓｐｒｉｎ−１  ＫＡＳＨドメインの破壊はＬｍｎａ病態を改善する
Ｎｅｓｐｒｉｎ−１が依然として発現したとしても、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１含有ＬＩＮＣ複合体はＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８細胞および動物では形成されないと考えられた。ドミナントネガティブＳＵＮ１を使用したｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＩＮＣ複合体のＡＡＶ媒介破壊はＬｍｎａ病態を救済するため（実施例５）、本発明者らは、本発明者らが生成した「無ＫＡＳＨ」Ｎｅｓｐｒｉｎ−１変異アレルもまたＬｍｎａ病態を救済し得ると推論した。この仮説を検証するために、Ｌｍｎａヌル（ＬｍｎａΔ／Δ）アレルに関してヘテロ接合型のマウス（実施例１）をＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８マウスと交雑させて、ＬｍｎａΔ／Δ：Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８二重変異マウスを取得した。ＬｍｎａΔ／Δマウスは１５〜１７日間生きたが、ＬｍｎａΔ／Δ：Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８二重変異マウスは最大４２日間生きた（図２４）。Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８アレルに関してヘテロ接合型のＬｍｎａヌルマウスは生存期間の延長を一切経験しなかった。Ｓｙｎｅ２−／−ホモ変異背景に関するＬｍｎａΔ／Δマウスもまた生存期間の延長を経験せず（図４７）、Ｌｍｎａ病態が主としてＮｅｓｐｒｉｎ−１／Ｓｕｎ１  ＬＩＮＣ複合体によって媒介されることを示した。
【０２２５】
Ｌｍｎａの心臓特異的喪失を有するマウスにおけるＳｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８アレルの効果を検討するために、Ｃｒｅがタモキシフェン（Ｔｍｘ）の単回注射によって誘導される誘導型心筋細胞特異的Ｃｒｅ  Ｔｇ（Ｍｙｈ６−ｃｒｅ／Ｅｓｒ１）（ここではｍｃｍと略記）を保有するコンディショナルＬｍｎａＦｌｘ／Ｆｌｘアレルに関してホモ接合型のマウスを、実施例１〜２に記載したように使用した。Ｌｍｎａの心臓特異的欠失は１か月以内に死亡をもたらしたが、ホモ接合型Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８背景に関して誘導した同じ欠失を有するマウスはＴｍｘ誘導後少なくとも１２０日間生きた（図２５、８０〜１２０日目まで変化なし）。
【０２２６】
実施例７
ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を遮断する低分子をスクリーニングするための方法
ヒトＳＵＮ２の結晶学的研究は、ＳＵＮドメインがクローバー様の三量体構造として集合体を形成することを明らかにする［Ｓｏｓａら、Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０３５〜４７（２０１２）］。三量体化は、推定長さが４０〜４５ｎｍである三重螺旋コイルドコイルによって媒介される。これは、核膜槽（ＰＮＳ）を架橋するのに十分であり、ＳＵＮおよびＫＡＳＨドメインが直接相互作用することを可能にする［Ｓｏｓａら、Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０３５〜４７（２０１２）］。ＫＡＳＨ結合部位は主として、隣接するＳＵＮドメイン間の境界に形成される溝内に形成される（図５Ｂ、図２１の左側のパネル）。この溝は伸長された立体構造における約１８残基のＫＡＳＨドメインの一部を収容する。しかしながら、その部分はＫＡＳＨドメインのＣ末端テトラペプチドであり、３つのプロリン残基とそれに続く末端脂肪族残基であるＬｅｕまたはＴｈｒ（それぞれＮｅｓｐ１およびＮｅｓｐ２の場合）を特徴とし、ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用にきわめて重要である（図２１の右側のパネル、Ｓｏｓａら、Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０３５〜４７（２０１２）の図１から引用。このテトラペプチドの重要性は、単一のＳＵＮ単量体内に形成された、十分に画定されたポケットに位置付けられるということである。Ｃ末端における単一残基（Ａｌａ）の付加を含む任意の手段におけるこのペプチドの修飾は、ＳＵＮ−ＫＡＳＨ接触領域全体にわたりＳＵＮ−ＫＡＳＨ会合を完全に排除する（Ｓｏｓａら、Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０３５〜４７（２０１２）および図２２の左側のパネル）。結論としては、ＫＡＳＨドメインの安定な結合は１８〜２０残基を必要とするが、結合を実際に開始するのはＣ末端テトラペプチドであるということになる。したがって、ＳＵＮ単量体内のテトラペプチド結合ポケットを遮断することはＳＵＮ−ＫＡＳＨ会合を崩壊させ得る。本開示において、拡張型心筋症を含むラミノパチーのための処置として、内在性ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を壊すＡＡＶに基づく遺伝子療法戦略を記載した。あるいは、ＳＵＮ結合ポケットにおいてＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を遮断する低分子はＬＩＮＣ複合体を破壊し、ラミノパチーを同様に処置し得る。低分子薬物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする多様な標準的方法が存在する。
【０２２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングは、作製方法がこれまでに公開されている組換えＳＵＮおよびＫＡＳＨドメイン、またはＫＡＳＨペプチド［Ｓｏｓａら、Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０３５〜４７（２０１２）］を用いて構築することができる。そのようなスクリーニングの１つは、酵素連結免疫吸着アッセイに類似のアッセイ技法を含む（図２２の右側のパネル、Ｌｅｐｏｕｒｃｅｌｅｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．５（１）：９１〜１０２（２００４）と同等）。組換えＳＵＮドメインは、固体表面、典型的には９６ウェルプレートに固定化され、次いで比色または化学発光読み出しを生成することができる酵素に連結した組換えＫＡＳＨドメインと複合体形成する。この連結を可能にするための方法の１つは、ビオチニル化ＫＡＳＨペプチドを合成することであり、これは次いで市販のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートと連結することができる。候補化合物を適切な供給業者から取得し、ＫＡＳＨ−ＳＵＮ会合を阻害する能力に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする。ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を阻害することができない化合物は、プレートにおいて、組換えＳＵＮが酵素連結ＫＡＳＨドメインに結合するウェルを生じることになる。洗浄ステップおよび比色または化学発光ＨＲＰ基質とのインキュベーション後、ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用の存在を標準的なプレートリーダーにおいて検出する。化合物がＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を阻害することができる場合、洗浄ステップ後、ＫＡＳＨドメインは除去され、ウェルの酵素反応は低下しているかまたは存在しないと考えられる。
【０２２８】
あるいは、蛍光異方性または分極を使用して、ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用の低分子阻害剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングしてもよい［Ｌｅａ，Ｗ．Ａ．およびＳｉｍｅｏｎｏｖ，Ａ．．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ６：１７〜３２（２０１１）］。このアッセイもまた組換えＳＵＮおよびＫＡＳＨドメインを用いる。ＫＡＳＨドメインを蛍光標識する；例えば、化学合成ＫＡＳＨペプチドはフルオレセイン部分を用いて容易に官能基化することができる。ＳＵＮドメインと相互作用する相互作用性ＫＡＳＨドメインの蛍光異方性を、プレートリーダー等の標準的な機器を使用して測定することができる。蛍光ＫＡＳＨはＳＵＮに結合しない場合、蛍光異方性が変化するため、ＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用を破壊する低分子阻害剤は容易に検出することができる。
【０２２９】
薬物スクリーニング過程において典型的であるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ一次スクリーニングを首尾よく通過した化合物を次いで細胞系の二次スクリーニングに供することができる（図２３）。この場合、免疫蛍光顕微鏡観察を用いて、ＬＩＮＣ複合体を解離させることができる化合物を同定し得る。これは核周辺小胞体へのＫＡＳＨ成分の分散として明らかとなるが、一方で同族のＳＵＮタンパク質は核内膜に保持される。この顕微鏡観察に基づくアッセイは初めにＨｅＬａ細胞に関して実施することができる。次いで活性化合物を、疾患関連組織からの培養細胞、例えば心臓細胞に関して評価する。追加の二次スクリーニングは、同定した化合物がＬｍｎａノックアウト細胞における増殖欠陥を救済することが可能かどうかを含んでもよい。標準的方法を使用した、同定した化合物のヒットからリードへの最適化後、化合物は、本明細書に記載したようなラミノパチーのマウスモデルにおいて、Ｌｍｎａ拡張型心筋症に関して試験することができる。リードの有効性は、本明細書に記載したような、心臓機能を評価するための変異マウスの生存期間および心エコー図を使用して評価することができる。
【０２３０】
考察
ＬＭＮＡによって引き起こされるＤＣＭは、進行性であると見なされており、多くの場合、早死または心臓移植術をもたらす［Ｍ．Ｐａｓｏｔｔｉら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ５２：１２５０〜１２６０（２００８）；Ｍ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４１：７７１〜７８０（２００３）］。６０歳までに、１１％の特発性心筋症を有する患者に対して５５％のＬＭＮＡ変異保有者が心血管不全のために死亡するかまたは心臓移植を受ける。ペースメーカーを調整することによってＤＣＭを改善する試みは、最良でも一時的に有益となるに過ぎない。そのため、ＬＭＮＡ変異によって引き起こされるＤＣＭを処置するための新規な治療手段を開発することが必要である。
【０２３１】
ＤＣＭを引き起こすＬＭＮＡ変異の大多数はドミナントネガティブミスセンスである。各変異を修復する従来の遺伝子療法による処置は非常に困難である可能性があり、患者を残りの正常なＷＴアレルに関してヘミ接合型とする変異型アレルの除去もまた、心不全をもたらし得る［Ｇ．Ｂｏｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１：２８５〜２８８（１９９９）］。ラミン遺伝子の下流における様々な他の手段が潜在的な治療介入のために探索されており、これにはラパマイシン／ラパログを用いたｍＴＯＲ阻害［Ｊ．Ｃ．Ｃｈｏｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１４４ｒａ１０２（２０１２）；Ｆ．Ｊ．Ｒａｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１４４ｒａ１０３（２０１２）］、およびＭＥＫ１／２キナーゼ経路の阻害［Ｗ．Ｗｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２３：５３〜６１（２０１１）］が含まれる。いずれの手段も向上した心室機能および増加した寿命（１０〜４０％）をもたらしたが、その程度および長期的な有効性はＳｕｎ１の喪失に関して本発明者らが観察したものより有意に低かった。
【０２３２】
ラミノパチーの多岐にわたる表現型の原因となる分子機構は依然として十分に理解されていないが、２つの選択的な仮説が組織特異的病態を説明するために提唱されている。第１の「遺伝子制御仮説」は、ＬＭＮＡ変異／喪失が、ＮＥタンパク質およびクロマチンとの相互作用を変化させる変異のために様々な分子経路の平衡を破壊し、この破壊が遺伝子発現を変化させると提唱する。この仮説を支持する証拠は、ＡＫＴ−ＭＴＯＲ経路［Ｊ．Ｃ．Ｃｈｏｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１４４ｒａ１０２（２０１２）］、ＷＮＴ／β−カテニン経路［Ｌ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １９：４１３〜４２５（２０１０）；Ｃ．Ｌｅ  Ｄｏｕｒら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２６：３３３〜３４３（２０１７）］、ＴＧＦ−β／Ｓｍａｄ［Ｊ．Ｈ．Ｖａｎ  Ｂｅｒｉｏら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １４：２８３９〜２８４９（２００５）；Ｔ．Ｖ．Ｃｏｈｅｎら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２２：２８５２〜２８６９（２０１３）］、ＭＡＰキナーゼ経路［Ａ．Ｂｒｕｌｌら、Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９：１５３３（２０１８）］、およびＥＲＫ１／２−ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２経路［Ｍ．Ｃｈａｔｚｉｆｒａｎｇｋｅｓｋｏｕら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：２２２０〜２２３３（２０１６）］を含むシグナル伝達経路の変化を報告する研究に由来する。これらの変化は記述されているが、いずれもこれらの変化が疾患組織の二次的な代償効果であるか否かを明確には立証していない。ｍＲＮＡではなくＳｕｎ１タンパク質がラミノパチーにおいて上方制御されるため、Ｓｕｎ１もまたこの破壊された発現レベルの範疇に当てはまり、ラミノパチー表現型が過剰なＳｕｎ１からの毒性によって引き起こされるという提言に至る［Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ  １４９：５６５〜５７７（２０１２）］。
【０２３３】
第２の仮説は、Ｌｍｎａ喪失または変異が核の脆弱性の増加をもたらすということを示唆した。結果として、ＬＩＮＣ複合体を介して細胞質からＮＥへ伝達される機械的応力および張力はＮＥに対して損傷を引き起こす［Ｊ．Ｌａｍｍｅｒｄｉｎｇら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：３７０〜３７８（２００４）］。この仮説は、ジストロフィンの喪失が筋細胞膜の脆弱性を増加させ、張力−応力が、筋肉収縮中に加えられる場合、筋細胞の破裂および死をもたらすデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に関して提唱された仮説と類似する［Ｄ．Ｊ．Ｂｌａｋｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８２：２９１〜３２９（２００２）］。Ｌｍｎａ変異線維芽細胞は、機械的ひずみに供される場合、核の変形、欠陥性のメカノトランスダクション、および低下した生存性を示し、同時に低いおよび中程度の圧力においてＷＴ核と比較して増加した核の破裂を示す［Ｊ．Ｌａｍｍｅｒｄｉｎｇら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：３７０〜３７８（２００４）；Ｊ．Ｌａｍｍｅｒｄｉｎｇら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７０：７８１〜７９１（２００５）；Ｊ．Ｌａｍｍｅｒｄｉｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２５７６８〜２５７８０（２００６）］。収縮しているマウス心筋細胞において、１分当たり５００〜６００回の収縮によって引き起こされる機械的応力および張力はＬＩＮＣ複合体を介してＮＥに伝達され、結果として図２８および２９に記載するように核の歪み、損傷、および最終的な死／喪失をもたらす。おそらく、そのような力はＬｍｎａヌル心筋細胞の脆弱なＮＥに対して著しい損傷を引き起こし、結果としてＣＭ死をもたらすと考えられる。張力−応力仮説がＮＥに対して損傷を与えるものである場合、ＳＵＮ１を破壊することによってＬＩＮＣ複合体の連結を断つことは、ＣＭ核に関する張力−応力を減少させ、変異ＣＭにおけるＣＭ細胞死を妨げ得る（図３２Ａ〜Ｃ）。ここにおいて１つ注意すべきことは、ＤＮ−Ｓｕｎ１の過剰発現後に起こり得るＬＩＮＣ複合体の完全な破壊は、潜在的に治療的というよりもむしろ有害性であり得るということである。細胞レベルにおいて、細胞内の力の伝達、細胞分極、および細胞遊走を含む複数の機械的現象は、ドミナントネガティブＳＵＮおよびＫＡＳＨ構築物によるＬＩＮＣ複合体破壊後に影響された［Ｌｏｍｂａｒｄｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６（３０）：２６７４３〜５３（２０１１）］。動物モデルでは、Ｓｕｎ１／Ｓｕｎ２［Ｌｅｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０６（２５）：１０２０７〜１２（２００９）］およびＮｅｓｐｒｉｎ−１／Ｎｅｓｐｒｉｎ−２［Ｚｈａｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４（５）：９０１〜８（２００７）］二重変異マウスは周産期致死性を経験し、胚心臓Ｃｒｅドライバー（Ｎｋｘ２．５−Ｃｒｅ）を使用したＮｅｓｐｒｉｎ−１およびＮｅｓｐｒｉｎ−２のＫＡＳＨドメインの心臓特異的破壊は心筋症の早期発症をもたらす［Ｂａｎｅｒｊｅｅら、ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔ  １０（２）：ｅ１００４１１４（２０１４）］。
【０２３４】
ＫＡＳＨドメイン結合に関して内在性Ｓｕｎ１およびＳｕｎ２タンパク質と競合し、そのためにＳｕｎ１レベルを直接変化させることなくＬＩＮＣ複合体の連結を断つＤＮ−Ｓｕｎ１構築物を使用して、心筋細胞における張力−応力仮説と発現レベル仮説とを区別することを試みた（図３２Ｄおよび３４）。ＣＭに関して高い親和性を有するＡＡＶ９ベクターを使用して、ＤＮ−Ｓｕｎ１をｃＴｎＴプロモーター下でＣＭに送達した［Ｃ．Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１０７３〜１０８０（２００８）］。本発明者らの結果は、心筋細胞へのＧＦＰの成功した送達（図３１Ｃ）、および対照ＧＦＰタンパク質とＤＮ−Ｓｕｎ１タンパク質の両方の強力な発現（図３１Ｃ）を示し、後者は心筋細胞核からのＫＡＳＨドメインタンパク質の分散を生じた（図３１Ｄ）。驚くべきことに、ＡＡＶ−ＤＮ−Ｓｕｎ１は、大きく低下した心臓Ｌｍｎａレベルを有するマウスにおける病態を改善しただけでなく、心臓において完全なＬＩＮＣ複合体破壊を同様に経験すると予期された野生型マウスの心臓の健康に対して識別可能な効果を有しなかった（図３１ＥおよびＧ）。このことは、完全なＬＩＮＣ複合体は胚発生においては必要とされるが出生後は必要とされないという可能性があることを示唆する。
【０２３５】
加えて、マウスにおいてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、破壊されて非機能性のＫＡＳＨドメインを有する短縮型Ｎｅｓｐｒｉｎ−１タンパク質を生じるＳｙｎｅ１変異アレル（Ｃ’ＴΔ８）を生成した。全体的にまたは心臓においてＬｍｎａを欠くマウスは短くなった生存期間を有するが、Ｓｙｎｅ１Ｃ’ＴΔ８／Ｃ’ＴΔ８ホモ変異の存在は有意な生存期間の延長をもたらした。Ｓｕｎ１の喪失、またはドミナントネガティブ導入遺伝子によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＩＮＣ複合体のＡＡＶ媒介破壊はＬｍｎａ病態の類似した救済をもたらしたが（実施例２〜５）、Ｓｕｎ２およびＮｅｓｐｒｉｎ−２変異は救済をもたらさなかった。総合すると、これらのデータは、Ｓｕｎ１およびＮｅｓｐｒｉｎ−１で構成されるＬＩＮＣ複合体がＬｍｎａ変異細胞および動物において病態を駆動することを示唆する。
【０２３６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分をｉｎ  ｖｉｖｏで送達する、疾患を処置するためのＡＡＶの使用に関するいくつかの報告が存在する。本発明者らの結果は、罹患組織におけるＮｅｓｐｒｉｎ−１  ＫＡＳＨドメインを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のＡＡＶ媒介ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を使用して、拡張型心筋症を含むラミノパチーを処置することができると予測する。例えば、心臓向性ＡＡＶ（例えばＡＡＶ９）を使用して、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ酵素発現を駆動する心臓特異的プロモーター（例えばｃＴｎＴ）と、ｇＲＮＡ発現を駆動する適切なプロモーター（例えばＵ６）とを含有する導入遺伝子カセットを送達してＬＭＮＡ  ＤＣＭを処置することができる。ＡＡＶのパッケージング能力は４．７ｋｂに限定されるため、より大きくより一般的に使用されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９よりもむしろ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに由来するより小さなＣａｓ９（ｓａＣａｓ９）が好ましいと考えられる。あるいは、ＡＡＶパッケージングに十分な程小さく、ｓａＣａｓ９よりも多く見出されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有するＣｐｆ１等の他のＣＲＩＳＰＲ酵素を使用してもよい［Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ら、Ｃｐｆ１  Ｉｓ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ  １６３、７５９〜７７１（２０１５）］。
【０２３７】
ガイドＲＮＡはＫＡＳＨドメインをコードするＮｅｓｐｒｉｎ−１遺伝子の３’領域を標的とし得る（表３）。本発明者らは終止コドンに隣接する領域を標的としたが、ＣＲＩＳＰＲによって生成される挿入欠失はＫＡＳＨドメインを障害するフレームシフト変異をもたらす可能性が高いため、原則として、ＫＡＳＨドメインをコードするいずれの遺伝子領域を標的としてもよい。しかしながら、ＫＡＳＨドメインにおける最終の４個のアミノ酸はＳＵＮドメイン相互作用、したがってＬＩＮＣ複合体形成に絶対的に必要とされることが公知であるため［Ｓｏｓａら、Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０３５〜４７（２０１２）］、終止コドンの近傍におけるｇＲＮＡを選択することが、フレームシフトを生じない挿入欠失であっても依然としてＳＵＮ−ＫＡＳＨ相互作用に必要とされる関連するＫＡＳＨアミノ酸を変異させ得るために、賢明である。さらに、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１をコードするＳｙｎｅ１遺伝子は非常に大きく、複数のスプライスアイソフォームおよび選択的開始部位を有するため、ＫＡＳＨドメインの外側を標的とするガイドＲＮＡは、一部の変異Ｎｅｓｐｒｉｎ−１アイソフォームを生じるが、ＫＡＳＨ含有アイソフォームを含むＮｅｓｐｒｉｎ−１タンパク質の他のアイソフォームの発現を乱し得ないということは注意されるべきである。これは、Ｌｍｎａ変異体において病態を依然として駆動することができ得る機能性または部分機能性Ｎｅｓｐｒｉｎ−１／Ｓｕｎ１  ＬＩＮＣ複合体をもたらし得る。ＬｍｎａΔ／Δ：Ｓｙｎｅ２−／−マウスはＬｍｎａΔ／Δマウスと表現型の点で区別不能であるため、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９戦略はＮｅｓｐｒｉｎ−２のＫＡＳＨドメインには拡張され得ないと考えられる。
【０２３８】
本発明者らは、ＳＵＮドメインを欠くＳｕｎ１を有するマウスの代わりに既に十分に特性解析されているＳｕｎ１ヌルマウスを本質的に取得したため、本研究において生成したＳｕｎ１変異マウスをさらに調査することはしなかった。本発明者らは、Ｓｕｎ１においてＣＲＩＳＰＲ変異を誘導することがＳｕｎ１転写物のナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）をもたらしたと考える。エクソン−エクソン接合部の５０〜５５ヌクレオチド上流における未成熟終止コドン（ＰＴＣ）の出現はＮＭＤのトリガーである［Ｐｏｐｐ，Ｍ．Ｗ．およびＭａｑｕａｔ，Ｌ．Ｅ．Ｃｅｌｌ  １６５：１３１９〜１３２２（２０１６）］。また、転写物の中央に出現するＰＴＣはＮＭＤをもたらす可能性がより高い［Ｅｂｅｒｌｅら、ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｅ９２（２００８）；Ｒｅｂｅｒら、ＭＢｏＣ  ２９：７５〜８３（２０１８）］。Ｓｕｎ１＿ｐｌｕｓ４変異体では、ＰＴＣはエクソン−エクソン接合部の５５ヌクレオチド超上流にあり、ＮＭＤを惹起する可能性が高い。Ｓｕｎ１Δ７変異体に関しては、ＰＴＣはエクソン−エクソン接合部から５０ヌクレオチド以内にある。しかしながら、両方の変異体に関して、本発明者らは、かなり大きなＳＵＮドメインの上流を標的としたため、ＰＴＣは転写物の長さの概ね２／３にあり、したがってこれらのＰＴＣもＮＭＤを惹起する可能性が高い。ヌル変異を誘導せずにＳｕｎ１におけるＳＵＮドメインを特異的に破壊するために、Ｎｅｓｐｒｉｎ−１に関するものと類似した戦略−ガイドＲＮＡを転写物のコード領域の３’末端に導く−を採用することができる（表３）。これまでの取り組みは、ＳＵＮ２（Ｙ７０７Ｆ）のＣ末端におけるチロシン残基のフェニルアラニンへの変異がＫＡＳＨ結合を崩壊させたことを実証した［Ｓｏｓａら、Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０３５〜４７（２０１２）］。この決定的なチロシン残基はＳＵＮ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｅ９ＰＨＩ４におけるＹ８１２）において保存されており、ＳＵＮ１転写物の最終のコーディングエクソンに存在する。Ｙ８１２のコドンの５’側の近位におけるｇＲＮＡの選択は、Ｙ８１２を変異させてＫＡＳＨ結合を破壊し得るフレームシフト変異を引き起こす挿入欠失変異を生成し得る。ｇＲＮＡは最終のコーディングエクソンに存在し得るため、ＮＭＤを惹起する可能性は低いと考えられる。したがって、ＫＡＳＨ結合に必要とされる、ＳＵＮ１  ＳＵＮドメインにおける決定的な残基を標的とすることによってラミノパチーを処置するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく戦略を構想することができる。ＡＡＶを使用して、ＣＲＩＳＰＲ酵素およびＳＵＮ１を標的とするｇＲＮＡを適切な疾患組織、例えば心臓に送達してもよい。その場合、ＫＡＳＨ結合に関するＳＵＮ１の無能化は、Ｌｍｎａ変異の有害性の効果を改善し得る。
【０２３９】
これらの結果から、本発明者らはＬｍｎａの喪失またはＬｍｎａ内の変異が、核ラミナの喪失または不正確な集合体のためにＣＭ核における不安定性を引き起こすと提唱する。このことにより、核は、ＣＭの収縮するサルコメアからＬＩＮＣ複合体を介して発揮される張力／応力の影響を受けやすくなる。ＳＵＮ１の非存在下、またはＮｅｓｐｒｉｎ−１  ＫＡＳＨドメインの変異後では、繋がれていないＬＩＮＣ複合体はＣＭ核に対してより小さい張力を発揮し、ラミン欠損心筋細胞の生存を可能にする。
【０２４０】
これらの結果は、ＤＮ−Ｓｕｎ、ＤＮ−ＫＡＳＨのＡＡＶ媒介送達、または内在性ＳＵＮもしくはＫＡＳＨタンパク質の直接的な変異を、患者におけるラミノパチー関連ＤＣＭのための潜在的な治療として使用する機会を提供する。患者における治療送達手段としてのＡＡＶ系は、一部の疾患を処置することに関して確立され、ＦＤＡによって承認されている。ＡＡＶ系は、心臓疾患を有する患者への導入を含む複数の進行中の臨床試験のため、より広く使用されるようになってきている。しかしながら、張力−応力がＬｍｎａ欠損ＣＭ死の主要な原因であり得るとしても、ＬｍｎａΔ／Δ：Ｓｕｎ−／−はＬｍｎａがＣＭにおいて特異的に欠失したマウスよりも若い年齢で死亡するため、ＳＵＮ１を破壊することは骨格筋におけるＬＭＮＡ変異誘導細胞死を妨げることに効果的ではない可能性がある。どの筋肉群（またはＬｍｎａを欠く他の組織であれ）が早期致死性をもたらすかは今後同定されるべきである。しかしながら、大半のＬＭＮＡ  ＤＣＭ患者では、死亡の原因であるのは心不全であり、本発明者らの結果はＣＭにおけるＬＩＮＣ複合体を破壊することが心不全を長期間妨げるのに効果的であり得ることを示す。
【０２４１】
参考文献
【０２４２】
【表４−１】
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【０２４３】
【表４−２】
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【０２４４】
【表４−３】
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【０２４５】
【表４−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図２９−４】
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【図２９−５】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３７−４】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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