(57)【要約】本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、治療有効性を向上させることに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させるか、または内在性タンパク質の１つ以上の機能を低下させて、免疫細胞のエフェクター機能が増強されるように改変した免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のように、抗原特異性を付与する導入遺伝子を導入することによってさらに改変した免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を用いて、がんのような細胞増殖性障害を治療する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２】
前記遺伝子調節システムが、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した内在性標的遺伝子のうちの２つ以上の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３】
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４】
前記遺伝子調節システムが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した内在性標的遺伝子のうちの２つ以上の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６】
前記遺伝子調節システムがさらに、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１または請求項２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７】
前記遺伝子調節システムが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８】
前記遺伝子調節システムが、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９】
前記遺伝子調節システムが、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる、請求項８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子調節システムが、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる、請求項８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１】
前記遺伝子調節システムが、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２】
前記遺伝子調節システムが、ＭＡＰ４Ｋ１、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３】
前記遺伝子調節システムが、ＭＡＰ４Ｋ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４】
前記遺伝子調節システムが、ＭＡＰ４Ｋ１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１５】
前記遺伝子調節システムが、ＭＡＰ４Ｋ１及びＴＮＦＡＰＩ３の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１６】
前記遺伝子調節システムが、ＮＲ４Ａ３、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１７】
前記遺伝子調節システムが、ＮＲ４Ａ３及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１８】
前記遺伝子調節システムが、ＮＲ４Ａ３及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１９】
前記遺伝子調節システムが、ＮＲ４Ａ３及びＴＮＦＡＰＩ３の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２０】
前記遺伝子調節システムが、（ｉ）１つ以上の核酸分子、（ｉｉ）１つ以上の酵素タンパク質または（ｉｉｉ）１つ以上のガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２１】
前記１つ以上の核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択されている、請求項２０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２２】
前記遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含む、請求項２０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２３】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２５】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２７】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２８】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項２９】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３０】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３１】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３であり、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３２】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３３】
前記遺伝子調節システムが、複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項２０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３４】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３５】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３６】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項３４または３５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３７】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３８】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項３９】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項３８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４０】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４１】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４２】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４３】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４４】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項４２または請求項４３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４５】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４６】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４７】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４８】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項４６または請求項４７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項４９】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項３３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５０】
前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、請求項２０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５１】
前記タンパク質が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、請求項５０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５２】
前記遺伝子調節システムが、ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、前記酵素タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである、請求項２０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５３】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項５２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５４】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項５３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５５】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項５３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５６】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項５２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５７】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項５６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５８】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項５６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項５９】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項５２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６０】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項５９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６１】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項５２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６２】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項６１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６３】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項６１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６４】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３であり、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｇ及び６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項５２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６５】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６６】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６７】
前記遺伝子調節システムが、複数のｇＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、請求項５２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６８】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項６７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項６９】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項６８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７０】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項６９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７１】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項６９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７２】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項６７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７３】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項６７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７４】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項７３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７５】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項７４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７６】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項７４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７７】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項６７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７８】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項６７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項７９】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項７８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８０】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項７９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８１】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項７９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８２】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項６７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８３】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項６７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８４】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項８３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８５】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項８４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８６】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項８４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８７】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項６７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８８】
ａ．前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含むとともに、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質であるか、
ｂ．前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含むとともに、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体であるか、または
ｃ．前記Ｃａｓタンパク質が、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している、
請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項８９】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項５２〜８８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９０】
前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３  ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、請求項８８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９１】
前記遺伝子調節システムが、前記１つ以上の内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入する、請求項５０〜９０のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９２】
前記不活性化変異が、前記２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む、請求項９１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９３】
前記欠失が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である、請求項９２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９４】
前記不活性化変異が、フレームシフト変異である、請求項９２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９５】
前記不活性化変異が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる、請求項９１〜９４のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９６】
前記遺伝子調節システムが、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入されている、請求項１〜９５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９７】
前記遺伝子調節システムが、前記システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている、請求項９６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９８】
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項９９】
（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１００】
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
前記１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０１】
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０２】
ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下された、請求項１０１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０３】
２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０４】
２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０５】
ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下された、請求項１０４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０６】
ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下された、請求項１０４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０７】
ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下された、請求項１０４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０８】
２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１０９】
ＭＡＰ４Ｋ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下された、請求項１０８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１０】
ＭＡＰ４Ｋ１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下された、請求項１０８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１１】
ＭＡＰ４Ｋ１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下された、請求項１０８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１２】
２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１３】
ＮＲ４Ａ３及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下された、請求項１１２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１４】
ＮＲ４Ａ３及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下された、請求項１１２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１５】
ＮＲ４Ａ３及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下された、請求項１１２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１６】
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１７】
（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１８】
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１１９】
ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２０】
前記ＣＢＬＢ遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１１９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２１】
２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２２】
２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２３】
前記ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２４】
前記ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２５】
前記ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２２に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２６】
２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２７】
前記ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２８】
前記ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１２９】
前記ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３０】
２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３１】
前記ＮＲ４Ａ３遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１３０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３２】
前記ＮＲ４Ａ３遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１３０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３３】
前記ＮＲ４Ａ３遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１３０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３４】
前記不活性化変異が、前記２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む、請求項１１６〜１３３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３５】
前記欠失が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である、請求項１３４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３６】
前記不活性化変異が、フレームシフト変異である、請求項１３４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３７】
前記不活性化変異によって、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下する、請求項１１６〜１３６のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３８】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現が、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する、請求項１〜１３７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１３９】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子の機能が、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する、請求項１〜１３７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４０】
細胞表面に提示された操作免疫受容体をさらに含む、請求項１〜１３９のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４１】
前記操作免疫受容体が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである、請求項１４０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４２】
前記操作免疫受容体が、操作ＴＣＲである、請求項１４０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４３】
前記操作免疫受容体が、標的細胞上に発現する抗原に特異的に結合し、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１４０〜１４２のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４４】
免疫活性化分子を発現する外来性導入遺伝子をさらに含む、請求項１〜１４３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４５】
前記免疫活性化分子が、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、活性化ペプチド、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されている、請求項１４４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４６】
前記抗体またはその結合断片が、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合し、前記タンパク質の機能を阻害する、請求項１４５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４７】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞から選択したリンパ球である、請求項１〜１４６のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４８】
前記リンパ球が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項１４７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１４９】
前記エフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、腫瘍への浸潤性、細胞傷害性、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択されている、請求項１〜１４８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
【請求項１５０】
請求項１〜１４９のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞を含む組成物。
【請求項１５１】
薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含む、請求項１５０に記載の組成物。
【請求項１５２】
少なくとも１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個または１×１０１１個の改変免疫エフェクター細胞を含む、請求項１５０または１５１に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記組成物が必要な対象に投与するのに適する、請求項１５０〜１５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記組成物が必要な前記対象に由来する自己免疫エフェクター細胞を含む、請求項１５０〜１５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５５】
ドナー対象に由来する同種異系免疫エフェクター細胞を含む、請求項１５０〜１５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５６】
（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。
【請求項１５７】
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。
【請求項１５８】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項１５６または請求項１５７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１５９】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されているか、またはＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６０】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５４〜４９８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５９に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６１】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５４〜４９８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５９または請求項１６０に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６２】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５９に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６３】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５９または請求項１６２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６４】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択されており、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６５】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６４に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６６】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６４または請求項１６５に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６７】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６８】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１６９】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６７または請求項１６８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７０】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６９に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７１】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１を含み、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７２】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１７１に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７３】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１７１または請求項１７２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７４】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３を含み、前記ｇＲＮＡ分子が、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７５】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１７４に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７６】
前記ｇＲＮＡ分子が、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１７４または請求項１７５に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７７】
ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含む、請求項１５６または請求項１５７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７８】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されているか、またはＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１７７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１７９】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号１５４〜４９８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１７８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８０】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号４９９〜８１３から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１７８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８１】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択されており、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１７７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８２】
前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号８１４〜１０６４から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１８１に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８３】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１７７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８４】
前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号１０６５〜１５０９から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１８３に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８５】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１を含み、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１７７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８６】
前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号５１０〜１５３８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１８５に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８７】
前記１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３を含み、前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１７７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８８】
前記ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号１５３９〜１５６６から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１８７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１８９】
細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択されており、
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、（ｅ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｆ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、
前記システムが、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。
【請求項１９０】
複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項１８９に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９１】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項１９０に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９２】
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する、請求項１９１に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９３】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１９１または請求項１９２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９４】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１９１または請求項１９２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９５】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項１９０に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９６】
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する、請求項１９５に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９７】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１９５または請求項１９６に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９８】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１９５または請求項１９６に記載の遺伝子調節システム。
【請求項１９９】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１９５または請求項１９６に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２００】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１９５または請求項１９６に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０１】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項１９０に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０２】
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する、請求項２０１に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０３】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項２０１または請求項２０２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０４】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項２０１または請求項２０２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０５】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項２０１または請求項２０２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０６】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項２０１または請求項２０２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０７】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項１９０に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０８】
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する、請求項２０７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２０９】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項２０７または請求項２０８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１０】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項２０７または請求項２０８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１１】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項２０７または請求項２０８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１２】
前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項２０７または請求項２０８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１３】
前記Ｃａｓタンパク質が、
ａ．酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質、
ｂ．酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体、
ｃ．前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）である、
請求項１５６〜２１２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１４】
前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン及びｍＳｉｎ３  ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、請求項２１３に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１５】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２１３または請求項２１４に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１６】
前記システムが、核酸分子を含み、前記核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡである、請求項１８９に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１７】
複数のｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項２１６に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１８】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項２１７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２１９】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２１８に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２０】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２１８または請求項２１９に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２１】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項２１７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２２】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２１に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２３】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２１または請求項２２２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２４】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２１または請求項２２２に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２５】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項２１７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２６】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２５に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２７】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２５または請求項２２６に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２８】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２５または請求項２２６に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２２９】
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている、請求項２１７に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２３０】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２９に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２３１】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２９または２３０に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２３２】
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２２９または２３０に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２３３】
前記システムが、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている、請求項１５６、１５７または１８９に記載の遺伝子調節システム。
【請求項２３４】
１つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、前記１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
【請求項２３５】
複数のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８または配列番号１５３９〜１５６６から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
【請求項２３６】
１つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む遺伝子調節システムであって、前記１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
【請求項２３７】
複数のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８または配列番号１５３９〜１５６６から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
【請求項２３８】
１つ以上のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、
前記１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記１つ以上のｇＲＮＡと、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、前記遺伝子調節システム。
【請求項２３９】
複数のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８または配列番号１５３９〜１５６６から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記１つ以上のｇＲＮＡと、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、前記遺伝子調節システム。
【請求項２４０】
請求項１５６〜２３９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを含むキット。
【請求項２４１】
（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、（ｄ）ＮＲ４Ａ３、（ｅ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２、または（ｆ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した内在性標的遺伝子内の標的配列に結合するターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子。
【請求項２４２】
ａ．前記内在性遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡが、表６Ａ及び６Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、
ｂ．前記内在性遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記ｇＲＮＡが、表６Ｃ及び表６Ｄに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、
ｃ．前記内在性遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１であり、前記ｇＲＮＡが、表６Ｅ及び表６Ｆに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、
ｄ．前記内在性遺伝子が、ＮＲ４Ａ３であり、前記ｇＲＮＡが、表６Ｇ及び表６Ｈに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、
ｅ．前記内在性遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡが、表５Ａ及び表５Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、または
ｆ．前記内在性遺伝子が、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、前記ｇＲＮＡが、表５Ａ及び表５Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、
請求項２４１〜２４７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４３】
前記ｇＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項２４１〜２４７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４４】
前記ｇＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項２４１〜２４７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４５】
前記標的配列が、ＰＡＭ配列を含む、請求項２４１〜２４４のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４６】
前記ｇＲＮＡが、モジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項２４１〜２４５のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４７】
前記ｇＲＮＡが、デュアルｇＲＮＡ分子である、請求項２４１〜２４５のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４８】
前記ターゲティングドメインが、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である、請求項２４１〜２４７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４９】
その５’末端もしくはその５’末端近傍（例えば、その５’末端から１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチドもしくは１〜２ヌクレオチド以内）の改変、及び／またはその３’末端もしくはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチドもしくは１〜２ヌクレオチド以内）の改変を含む、請求項２４１〜２４８のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２５０】
前記改変ｇＲＮＡをＴ細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する安定性が向上する、請求項２４９に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２５１】
前記改変ｇＲＮＡをＴ細胞に導入すると、自然免疫応答が軽減される、請求項２４９または請求項２５０に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２５２】
請求項２４１〜２５１のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項２５３】
請求項２４１〜２５１のいずれか１項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子、または請求項２５２に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２５４】
請求項２４１〜２５１のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ分子、または請求項２５２に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項２５５】
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
ａ．免疫エフェクター細胞を対象から採取すること、
ｂ．請求項１５６〜２３９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入すること、ならびに
ｃ．前記免疫エフェクター細胞を培養して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて低下するようにすること、
を含む、前記方法。
【請求項２５６】
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、請求項１５６〜２３９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含む、前記方法。
【請求項２５７】
ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、請求項２５５または２５６に記載の方法。
【請求項２５８】
前記遺伝子調節システム及び／または前記操作免疫受容体をコードする前記ポリヌクレオチドを、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する、請求項２５７に記載の方法。
【請求項２５９】
前記遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として、前記システムを導入する、請求項２５５〜２５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６０】
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
ａ．免疫エフェクター細胞集団を培養液で増殖させること、
ｂ．請求項１５６〜２３９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入すること、
を含む、前記方法。
【請求項２６１】
前記免疫エフェクター細胞集団を対象から採取することをさらに含む、請求項２６０に記載の方法。
【請求項２６２】
増殖前、増殖中または増殖後に、前記遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２６０または請求項２６１に記載の方法。
【請求項２６３】
前記免疫エフェクター細胞集団の前記増殖が、第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖を含む、請求項２６０または請求項２６１に記載の方法。
【請求項２６４】
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンドの増殖前、前記第１ラウンドの増殖中、または前記第１ラウンドの増殖後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記遺伝子調節システムを、前記第２ラウンドの増殖前、前記第２ラウンドの増殖中、または前記第２ラウンドの増殖後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６６】
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンド及び前記第２ラウンドの増殖の前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６７】
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンド及び前記第２ラウンドの増殖の後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６８】
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンドの増殖後、かつ前記第２ラウンドの増殖前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６９】
治療の必要な対象の疾患または障害の治療方法であって、請求項１〜１４９のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または請求項１５０〜１５５のいずれか１項に記載の組成物を有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項２７０】
前記疾患または障害が、細胞増殖性障害、炎症性障害または感染症である、請求項２６９に記載の方法。
【請求項２７１】
前記疾患または障害が、がんまたはウイルス感染症である、請求項２６９に記載の方法。
【請求項２７２】
前記がんが、白血病、リンパ腫または固形腫瘍から選択される、請求項２７１に記載の方法。
【請求項２７３】
前記固形腫瘍が、メラノーマ、膵臓腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍もしくは肺転移、大腸癌または頭頸部癌である、請求項２７２に記載の方法。
【請求項２７４】
前記がんが、ＰＤ１耐性またはＰＤ１非感受性のがんである、請求項２７１〜２７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７５】
前記対象が以前に、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤による治療を受けたことがある、請求項２７１〜２７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７６】
ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、そのタンパク質の機能を阻害する抗体またはその結合断片を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２７１〜２７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７７】
前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して自家である、請求項２６９〜２７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７８】
前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して同種異系である、請求項２６９〜２７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７９】
がん細胞の殺傷方法であって、請求項１〜１４９のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または請求項１５０〜１５５のいずれか１項に記載の組成物に、前記がん細胞を暴露することを含む、前記方法。
【請求項２８０】
前記暴露が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの暴露である、請求項２７９に記載の方法。
【請求項２８１】
免疫エフェクター細胞の１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、請求項１５６〜２３９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含む、前記方法。
【請求項２８２】
免疫エフェクター細胞の１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、請求項１５６〜２３９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、前記改変された免疫エフェクター細胞において、１つ以上のエフェクター機能が、改変しなかった前記免疫エフェクター細胞と比べて増強される、前記方法。
【請求項２８３】
前記１つ以上のエフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、細胞傷害性、腫瘍への浸潤性、サイトカイン産生の増加、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択される、請求項２８２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６４３，５７８号、２０１８年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／６９２，０１０号、２０１８年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／７６８，４２８号、２０１８年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６４３，５８７号、２０１８年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／６９２，０１９号、２０１８年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／７６８，４４３号、２０１９年２月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／８０４，２６５号、２０１８年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６４３，５９７号、２０１８年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／６９２，１００号、２０１８年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／７６８，４４８号、２０１８年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６４３，５９８号、２０１８年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／６９２，１１０号、及び２０１８年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／７６８，４５８号に基づく優先権を主張するものであり、これらの仮出願はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
電子的に提出したテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出したテキストファイル、すなわち、配列表のコンピューター可読形式のコピー（ファイル名：ＫＳＱＴ＿００７＿０４ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１９年３月１４日、ファイルサイズ３０８キロバイト）の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００３】
分野
本開示は、標的核酸配列を編集するか、または標的核酸配列の発現を調節するための方法、組成物及び構成成分、ならびに、細胞増殖性疾患、炎症性疾患及び／または感染症の治療において、受容体導入免疫エフェクター細胞とともに使用する用途を含め、それらの免疫療法関連用途に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子改変Ｔ細胞、特にＣＡＲ−Ｔ細胞を利用する養子細胞移入は、固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍に対する療法として、臨床試験段階に入っている。これまでの成果は、まちまちである。血液悪性腫瘍（特に、リンパ腫、ＣＬＬ及びＡＬＬ）では、いくつかの第１相試験及び第２相試験の患者の大半で、少なくとも部分奏効が見られ、一部では、完全奏効が見られた（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｂｌｏｏｄ  １  １９，２７０９−２７２０）。２０１７年には、ＦＤＡは、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）及びＹｅｓｃａｒｔａ（商標）という２つのＣＡＲ−Ｔ療法剤を認可し、両方とも、血液癌の治療用であった。しかしながら、大半の種類の腫瘍（メラノーマ、腎細胞癌及び大腸癌を含む）では、血液悪性腫瘍よりも低い奏効が観察された（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｌｏｏｄ  １  １４，５３５−５４６、Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９０４−９１２、Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５，Ｓ１−Ｓ２）。したがって、成果は大方、Ｂ細胞系の血液悪性腫瘍を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞のアプローチに限定されているので、養子Ｔ細胞療法には、改良の余地がかなりある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｂｌｏｏｄ  １  １９，２７０９−２７２０
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｌｏｏｄ  １  １４，５３５−５４６
【非特許文献３】Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９０４−９１２
【非特許文献４】Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５，Ｓ１−Ｓ２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の種類の腫瘍（メラノーマ、腎細胞癌及び大腸癌、Ｙｏｎｇ，２０１７，Ｉｍｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９５：３５６−３６３）では、奏効の低下が観察されたことから、がん治療での改変免疫細胞の養子移入の有効性を向上させるニーズ、特に、固形悪性腫瘍に対する養子細胞療法の有効性を向上させるニーズが存在する。加えて、養子移入の有益性が観察された血液悪性腫瘍でも、すべての患者が奏効を示すわけではなく、おそらくは、養子移入Ｔ細胞の機能の低下により、望ましい頻度を上回る頻度で再発が見られる。
がん治療剤としての遺伝子改変免疫細胞の有効性を制限する要因としては、（１）細胞の増殖性、例えば、養子移入後のＴ細胞の限られた増殖、（２）細胞の生存性、例えば、腫瘍環境における因子によるＴ細胞のアポトーシスの誘発、ならびに（３）細胞の機能、例えば、宿主免疫細胞及びがん細胞によって分泌される抑制因子による、細胞傷害性Ｔ細胞の機能の阻害と、製造プロセス中及び／または移入後における免疫細胞の疲弊が挙げられる。
【０００７】
免疫細胞の抗腫瘍作用を向上させると考えられる具体的な特徴としては、細胞が、１）養子移入後に、宿主内で増殖する能力、２）腫瘍に浸潤する能力、３）宿主内に存続し、及び／または免疫細胞の疲弊に対する耐性を示す能力、ならびに４）腫瘍細胞を殺傷できる形で機能する能力が挙げられる。本開示は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された免疫細胞を提供し、その改変免疫細胞では、増殖性の向上、腫瘍への浸潤性の向上、対象における免疫細胞の存続、及び／または免疫細胞の疲弊に対する耐性の向上を含め、１つ以上のエフェクター機能の増強が見られる。本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、腫瘍細胞に対する免疫細胞活性の増強を誘導するための方法及び組成物、ならびに養子免疫細胞移入療法との関連で使用するのに適する方法及び組成物も提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ核酸またはＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質（Ｒｅｇｎａｓｅ−１としても知られている）の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞を提供する。本開示には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーシステム及びｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡシステムを含む複数の方式によってＺＣ３Ｈ１２Ａを阻害することが記載及び実証されている。いくつかの実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａの発現／機能の低下は、抗体、小分子またはペプチドによって媒介される。いくつかの実施形態では、本開示は、がん細胞の殺傷方法であって、そのがん細胞を、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質阻害剤に暴露することを含み、前記阻害剤が、ＺＣ３Ｈ１２Ａに結合して、ＺＣ３Ｈ１２Ａの機能を低下させる抗体、小分子またはペプチドであり、前記阻害剤が、前記がん細胞を殺傷するのに有効な量である方法を提供する。いくつかの実施形態では、その暴露は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの暴露である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群から選択され、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００１１】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能を低下させることができる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＭＡＰ４Ｋ１、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＭＡＰ４Ｋ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＭＡＰ４Ｋ１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＭＡＰ４Ｋ１及びＴＮＦＡＰＩ３の発現及び／または機能を低下させることができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＮＲ４Ａ３、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＮＲ４Ａ３及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＮＲ４Ａ３及びＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＮＲ４Ａ３及びＴＮＦＡＰＩ３の発現及び／または機能を低下させることができる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、（ｉ）１つ以上の核酸分子、（ｉｉ）１つ以上の酵素タンパク質、または（ｉｉｉ）１つ以上のガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その１つ以上の核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択され、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００１９】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択され、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含むとともに、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、その酵素タンパク質が、その内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含み、その核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、その酵素タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである改変免疫エフェクター細胞を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、そのｇＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、そのｇＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのｇＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１であり、そのｇＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３であり、そのｇＲＮＡ分子が、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、複数のｇＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、複数のｇＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、複数のｇＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、複数のｇＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その遺伝子調節システムが、複数のｇＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲからなる群から選択されている。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログを含む改変免疫エフェクター細胞であって、（ａ）そのＣａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含む野生型Ｃａｓタンパク質であり、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるか、（ｂ）そのＣａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含むＣａｓニッカーゼ変異体であり、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるか、または（ｃ）そのＣａｓタンパク質は、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節できる異種タンパク質と結合している改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、その異種タンパク質は、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３  ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている。
【００３４】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その１つ以上の内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入する。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む。いくつかの実施形態では、その欠失は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーション、またはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって、免疫エフェクター細胞に導入されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下されている。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下されている。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＭＡＰ４Ｋ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＭＡＰ４Ｋ１及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＭＡＰ４Ｋ１及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下されている。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、その２つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＮＲ４Ａ３及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＮＲ４Ａ３及びＢＣＯＲの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＮＲ４Ａ３及びＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能が低下されている。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した１つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＣＢＬＢ遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３であり、少なくとも１つの標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＮＲ４Ａ３遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクターは、ＮＲ４Ａ３遺伝子及びＢＣＯＲ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及びＴＮＦＡＩＰ３遺伝子に不活性化変異を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む。いくつかの実施形態では、その欠失は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現は、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子の機能は、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その細胞表面に提示された操作免疫受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、操作ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、標的細胞上に発現した抗原に特異的に結合し、その抗原は、腫瘍関連抗原である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、免疫活性化分子を発現する外来性導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、その免疫活性化分子は、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、活性化ペプチド、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その抗体またはその結合断片は、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、そのタンパク質の機能を阻害する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞から選択したリンパ球である。いくつかの実施形態では、そのリンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、そのエフェクター機能は、細胞増殖性、細胞生存能、腫瘍への浸潤性、細胞傷害性、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択されている。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、その組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、改変免疫エフェクター細胞を少なくとも１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個または１×１０１１個含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、その組成物が必要な対象に投与するのに適している。いくつかの実施形態では、その組成物は、その組成物が必要な対象に由来する自己免疫エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、ドナー対象に由来する同種異系免疫エフェクター細胞を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｂ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択した、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む遺伝子調節システムを提供する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択した、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む遺伝子調節システムを提供する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む遺伝子調節システムを提供する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されているか、またはＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、そのｇＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｇＲＮＡ分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含むとともに、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができ、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されており、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５４〜４９８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５４〜４９８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、そのｇＲＮＡ分子が、配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択されており、そのｇＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのｇＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１を含み、そのｇＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３を含み、そのｇＲＮＡ分子が、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されているか、またはＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２から選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１５４〜４９８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号４９９〜８１３から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択されており、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８１４〜１０６４から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１０６５〜１５０９から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＭＡＰ４Ｋ１を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号５１０〜１５３８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、ｓｉＲＮＡ核酸分子またはｓｈＲＮＡ核酸分子を含み、その１つ以上の内在性標的遺伝子が、ＮＲ４Ａ３を含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１５３９〜１５６６から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、または（ｄ）ＮＲ４Ａ３から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、（ｅ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群、または（ｆ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、そのシステムが、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素分子、または（ｉｉｉ）ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む遺伝子調節システムを提供する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む遺伝子調節システムを提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｒ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合し、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、Ｃａｓタンパク質を含み、そのＣａｓタンパク質は、（ａ）酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質、（ｂ）酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体、（ｃ）その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）である。いくつかの実施形態では、その異種タンパク質は、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン及びｍＳｉｎ３  ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、核酸分子を含み、その核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、複数のｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａ及び表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＭＡＰ４Ｋ１であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、複数のｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含み、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ３であり、その内在性標的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されている遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｇ及び表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａ及び表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含み、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９〜３０個のヌクレオチドを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、そのタンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、その１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８または配列番号１５３９〜１５６６から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む遺伝子調節システムであって、その１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｇＲＮＡをコードするベクター、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む遺伝子調節システムであって、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８または配列番号１５３９〜１５６６から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む遺伝子調節システムを提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、その１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その１つ以上のｇＲＮＡと、そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する遺伝子調節システムを提供する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８または配列番号１５３９〜１５６６から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その複数のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つが、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その１つ以上のｇＲＮＡと、そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する遺伝子調節システムを提供する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを含むキットを提供する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群、（ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、（ｃ）ＭＡＰ４Ｋ１、（ｄ）ＮＲ４Ａ３、（ｅ）ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２、または（ｆ）ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した内在性標的遺伝子内の標的配列に結合するターゲティングドメイン核酸配列を含むｇＲＮＡ核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）その内在性遺伝子は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳからなる群から選択されており、そのｇＲＮＡは、表６Ａ及び６Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、（ｂ）その内在性遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのｇＲＮＡは、表６Ｃ及び表６Ｄに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、（ｃ）その内在性遺伝子は、ＭＡＰ４Ｋ１であり、そのｇＲＮＡは、表６Ｅ及び表６Ｆに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、（ｄ）その内在性遺伝子は、ＮＲ４Ａ３であり、そのｇＲＮＡは、表６Ｇ及び表６Ｈに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、（ｅ）その内在性遺伝子は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６及びＩＫＺＦ２からなる群から選択されており、そのｇＲＮＡは、表５Ａ及び表５Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、または（ｆ）その内在性遺伝子は、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲからなる群から選択されており、そのｇＲＮＡは、表５Ａ及び表５Ｂに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、配列番号８１４〜１０６４、配列番号１０６５〜１５０９、配列番号５１０〜１５３８、配列番号１５３９〜１５６６、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３から選択した配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その標的配列は、ＰＡＭ配列を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、モジュラーｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、デュアルｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメインは、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ分子は、その５’末端またはその５’末端近傍（例えば、その５’末端から１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチドもしくは１〜２ヌクレオチド以内）に改変を含み、及び／またはその３’末端またはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチドまたは１〜２ヌクレオチド以内）に改変を含む。いくつかの実施形態では、その改変ｇＲＮＡは、Ｔ細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する安定性が向上する。いくつかの実施形態では、その改変ｇＲＮＡは、Ｔ細胞に導入すると、自然免疫応答が軽減される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている１つ以上のｇＲＮＡ分子、またはそのｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている１つ以上のｇＲＮＡ分子、またはそのｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、（ａ）免疫エフェクター細胞を対象から採取すること、（ｂ）請求項１５６〜２３９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入すること、及び（ｃ）その免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすることを含む方法を提供する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入することを含む方法を提供するいくつかの実施形態では、その方法は、ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システム及び／またはその操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチドは、免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、（ａ）免疫エフェクター細胞集団を培養液で増殖させること、及び（ｂ）請求項１５６〜２３９のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞集団に導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、免疫エフェクター細胞集団を対象から採取することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、増殖前、増殖中または増殖後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞集団の増殖は、第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンドの増殖前、第１ラウンドの増殖中または第１ラウンドの増殖後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第２ラウンドの増殖前、第２ラウンドの増殖中または第２ラウンドの増殖後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンドの増殖後、かつ第２ラウンドの増殖前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療の必要な対象の疾患または障害の治療方法であって、本明細書に記載されている改変免疫エフェクターまたはその組成物を有効量投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その疾患または障害は、細胞増殖性障害、炎症性障害または感染症である。いくつかの実施形態では、その疾患または障害は、がんまたはウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、そのがんは、白血病、リンパ腫または固形腫瘍から選択される。いくつかの実施形態では、その固形腫瘍は、メラノーマ、膵臓腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍もしくは肺転移、大腸癌、または頭頸部癌である。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１耐性またはＰＤ１非感受性のがんである。いくつかの実施形態では、その対象は以前に、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤による治療を受けたことがある。いくつかの実施形態では、その方法は、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、そのタンパク質の機能を阻害する抗体またはその結合断片をその対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その対象に対して自家である。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その対象に対して同種異系である。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を行ったことがない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞もしくはその組成物の投与とともに、またはその投与の後に、高用量ＩＬ−２治療を行わない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞もしくはその組成物の投与とともに、またはその投与の後に、低用量ＩＬ−２治療を行う。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞もしくはその組成物の投与とともに、またはその投与の後に、ＩＬ−２治療を行わない。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本開示は、がん細胞の殺傷方法であって、そのがん細胞を、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物に暴露することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その暴露は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの暴露である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫エフェクター細胞の１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、免疫エフェクター細胞の１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入することを含み、その改変免疫エフェクター細胞において、１つ以上のエフェクター機能が、改変していないその免疫エフェクター細胞と比べて増強される方法を提供する。いくつかの実施形態では、その１つ以上のエフェクター機能は、細胞増殖性、細胞生存能、細胞傷害性、腫瘍への浸潤性、サイトカイン産生の増加、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。
【図１Ｂ】本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。
【図２Ａ】本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。
【図２Ｂ】本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。
【図３Ａ】本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。
【図３Ｂ】本明細書に記載されている方法によって改変できる内在性標的遺伝子の組み合わせを示している。
【図４】Ａ〜Ｄは、本明細書に記載されている方法を用いて、ＴＲＡＣ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子を編集した結果を示している。
【図５】Ａは、初代ヒトＴ細胞におけるＣＢＬＢの編集に関するＴＩＤＥ解析データを示している。Ｂは、初代ヒトＴ細胞におけるＣＢＬＢの編集に関するＴＩＤＥ解析データを示している。
【図６】ＣＢＬＢ  ｇＲＮＡを用いて編集した初代ヒトＴ細胞（Ｄ６５５１−ＣＢＬＢ）内のＣＢＬＢタンパク質のウエスタンブロット結果を未編集のコントロール（Ｄ６５５１−ＷＴ）と比較したもの示している。
【図７Ａ】マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける腫瘍の経時的成長を示している。ＣＢＬＢ編集ＯＴ１  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長を未編集のＯＴ１  Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。
【図７Ｂ】マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける腫瘍の経時的成長を示している。ＺＣ３Ｈ１２Ａ編集ＯＴ１  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長を未編集のＯＴ１  Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。
【図７Ｃ】マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける腫瘍の経時的成長を示している。ＺＣ３Ｈ１２Ａ編集ＯＴ１  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長を未編集のＯＴ１  Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。
【図７Ｄ】マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける腫瘍の経時的成長を示している。ＭＡＰ４Ｋ１編集ＯＴ１  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長を未編集のＯＴ１  Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。
【図７Ｅ】マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける腫瘍の経時的成長を示している。ＮＲ４Ａ３編集ＯＴ１  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の成長を未編集のＯＴ１  Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。
【図８】Ａ〜Ｂは、マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおいて、単一編集型Ｔ細胞で及び／または抗ＰＤ１療法と組み合わせて処置したマウスの腫瘍の経時的成長を示している。Ａは、ＭＡＰ４Ｋ１編集ＯＴ１  Ｔ細胞と抗ＰＤ１療法を組み合わせて処置したマウスの腫瘍の成長をコントロールのＯＴ１細胞及びＭＡＰ４Ｋ１編集ＯＴ１細胞のみの場合と比較したもの示している。Ｂは、ＮＲ４Ａ３編集ＯＴ１  Ｔ細胞及び抗ＰＤ１療法を組み合わせて処置したマウスの腫瘍の成長をコントロールのＯＴ１細胞及びＮＲ４Ａ３編集ＯＴ１細胞のみの場合と比較したものを示している。
【図９】マウスＭＣ３８／ｇｐ１００同系腫瘍モデルにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集ＰＭＥＬ  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の経時的成長を示している。
【図１０】Ｂ１６Ｆ１０肺転移モデルにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集ＰＭＥＬ  Ｔ細胞及びＰＤ１編集ＰＭＥＬ  Ｔ細胞で処置したマウスの生存曲線を示している。
【図１１】マウスＥｇ７  Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の経時的成長を示している。
【図１２】Ａ〜Ｂは、マウスについて、マウスＡ３７５異種移植モデルにおける腫瘍の経時的成長を示している。Ａは、ＣＢＬＢ編集型のＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞で処置したマウスについて、マウスＡ３７５異種移植モデルにおける腫瘍の経時的成長を未編集のＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の場合と比較したものを示している。Ｂは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ編集ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞で処置したマウスについて、マウスＡ３７５異種移植モデルにおける腫瘍の経時的成長をコントロールの編集Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。
【図１３】Ａ〜Ｂは、Ｒａｊｉ細胞を用いたバーキットリンパ腫の皮下モデルにおいて、単一編集型ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した後の腫瘍の成長を示している。Ａは、ＭＡＰ４Ｋ１編集ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した後の腫瘍の成長を未編集のＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。Ｂは、ＮＲ４Ａ３編集ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した後の腫瘍の成長を未編集のＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の場合と比較したものを示している。
【図１４】ＢＣＯＲ編集型の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＢＬＢ編集抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＢＣＯＲ／ＣＢＬＢデュアル編集抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の経時的成長を示している。腫瘍の成長は、非ＣＡＲ  Ｔ細胞または未編集の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスと比較されている。
【図１５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系における、ＢＣＯＲ編集型のＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＢＣＯＲ／ＣＢＬＢ編集型のＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の集積を示している。
【図１６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系における、ＢＣＯＲ編集ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＢＣＯＲ／ＣＢＬＢ編集ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生を示している。
【図１７】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系における、ＢＣＯＲ編集ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＢＣＯＲ／ＣＢＬＢ編集ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生を示している。
【図１８】マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｃｂｌｂデュアル編集ＯＴ１  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の経時的成長を示している。
【図１９】マウスＢ１６／Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおいて、Ｐｄ１／Ｌａｇ３デュアル編集ＯＴ１  Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍の経時的成長を示している。
【図２０】抗腫瘍記憶及びエピトープ拡大をもたらす標的としてのＺｃ３ｈ１２ａの検証結果を示している。
【図２１】ＭＡＰ４Ｋ１編集ＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＴＮＦαの産生を示している。
【図２２】Ｚｃ３ｈ１２ａ編集マウスＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩｃｏｓ、Ｉｌ６、Ｉｌ２、Ｉｆｎｇ及びＮｆｋｂｉｚのｍＲＮＡの発現を示している。
【図２３】Ｚｃ３ｈ１２ａ編集マウスＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＣＯＳの細胞表面での発現を示している。
【図２４】抗ＣＤ３／ＣＤ２８での刺激後のＺｃ３ｈ１２ａ編集マウスＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮγの産生を示している。
【図２５】Ａ〜Ｂは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ編集初代ヒトＴ細胞におけるＩＬ６の発現の増加を示している。Ａは、ドナーから採取したＺＣ３Ｈ１２Ａ編集ＰＢＭＣからのＩＬ−６タンパク質の産生を示している。Ｂは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ編集ＰＢＭＣにおけるＩＬ６  ｍＲＮＡの発現を示している。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、免疫療法との関連において、その細胞の治療有効性を向上させることに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞を本開示の方法によって改変して、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させるか、または内在性タンパク質の１つ以上の機能を低下させて、その免疫細胞の１つ以上のエフェクター機能が増強されるようにする。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）発現コンストラクトまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクトの導入のように、抗原特異性を付与する導入遺伝子の導入によって、さらに改変する。いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子調節システムの組成物のように、免疫エフェクター細胞を改変するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、がんのような細胞増殖性障害の治療方法であって、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を、治療の必要な対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１０４】
Ｉ．定義
本明細書及び添付の請求項で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数の言及物が含まれる。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「及び／または」という用語は、本開示では、別段に示されていない限り、「及び」または「または」のいずれかを意味する目的で使用する。
【０１０６】
本明細書の全体を通じて、文脈上別段に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形表現は、示されている要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群が含まれるが、いずれの他の要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群も排除されないことを示唆していると理解するものとする。
【０１０７】
本願で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、同義語として使用する。本願で用いられている数字であって、約／およそが付されているかまたは付されていないいずれの数字も、当業者によって認識されるあらゆる通常の変動を網羅するように意図されている。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載のない限り、または文脈から別段に明らかでない限り、いずれかの方向（示されている言及値を上回るかまたは下回る方向）で、示されている言及値から２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれらを下回る割合以内に入る値の範囲を指す（ただし、その数が、考え得る値の１００％を上回る場合を除く）。
【０１０８】
「減少する」または「低下する」とは、特定の値が少なくとも５％減少または低下すること、例えば、参照値と比べて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％減少することを指す。特定の値の減少または低下は、その値を参照値と比較した場合の変化倍率として、例えば、参照値と比べて、少なくとも１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、２００分の１、５００分の１、１０００分の１またはそれを上回る割合に減少するとして表されることもある。
【０１０９】
「増加する」とは、特定の値が少なくとも５％増加すること、例えば、参照値と比べて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれを上回る割合増加することを指す。特定の値の増加は、その値を参照値と比較した場合の変化倍率として、例えば、参照値のレベルと比べて、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、またはそれを上回る割合で増加するとして表されることもある。
【０１１０】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、その形態としては、コードアミノ酸、非コードアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、及び改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。
【０１１１】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基、その他の天然の塩基、化学的に改変された塩基、生化学的に改変された塩基、非天然塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限らない。「オリゴヌクレオチド」とは概して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５〜約１００ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的では、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離しても、当該技術分野において知られている方法によって化学的に合成してもよい。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語には、記載されている実施形態に適用可能なように、一本鎖ポリヌクレオチド（センス鎖またはアンチセンス鎖など）及び二本鎖ポリヌクレオチドが含まれると理解すべきである。
【０１１２】
「断片」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の全体よりも少ない配列を含むポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子の部分を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの断片は、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片またはポリヌクレオチド断片は、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個またはこれを上回る数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【０１１３】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間で、同じであるとともに、同じ相対的位置にある塩基またはアミノ酸の割合（％）を指す。したがって、一方のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対する配列同一性が、ある特定の割合（％）である。配列比較の際には、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較する参照配列としての役割を果たす。「参照配列」という用語は、試験配列と比較する分子を指す。
【０１１４】
「相補的」とは、天然の塩基もしくは非天然の塩基、またはそのアナログを含む２つの配列間で、塩基スタッキング及び特異的水素結合を通じて対合する能力を指す。例えば、核酸のある１つの位置の塩基が、標的の対応する位置の塩基と水素結合できる場合には、それらの塩基は、その位置において、互いに相補的であるとみなす。核酸は、ユニバーサル塩基、または水素結合に対してプラスまたはマイナスに寄与しない不活性な無塩基スペーサーを含むことができる。塩基対形成には、カノニカルなワトソン−クリック塩基対形成及び非ワトソン−クリック型塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成及びフーグスティーン塩基対形成）の両方を含めてよい。相補的塩基対合では、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）と相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）と相補的であり、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基は、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれともハイブリダイズでき、これらと相補的であるとみなすことができることが分かる。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２−４９３及びＬｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９４；２２：４０３９−４０４３。イノシン（Ｉ）も、当該技術分野において、ユニバーサル塩基であるとみなされてきており、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれとも相補的であるとみなされている。Ｗａｔｋｉｎｓ  ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５；３３（１９）：６２５８−６２６７を参照されたい。
【０１１５】
本明細書で言及されている場合、「相補的核酸配列」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な温度条件及び溶液イオン強度条件下で、配列特異的かつ逆平行な形で、その配列が別の核酸に非共有結合する（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ようにできるヌクレオチド配列を含む核酸配列である。
【０１１６】
比較するとともに、配列同一性パーセント及び相補性パーセントを求めるための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のために、配列を最適にアラインメントするのは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法によって、コンピューターによる、これらのアルゴリズムの実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、マニュアルアラインメント及び目視確認（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されているＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含め、当該技術分野において知られているアルゴリズムを用いることによって行うことができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて、公的に入手可能である。
【０１１７】
本明細書では、「ハイブリダイズする」という用語は、相補的ヌクレオチド塩基間が対合して（例えば、アデニン（Ａ）は、ＤＮＡ分子ではチミン（Ｔ）と、ＲＮＡ分子ではウラシル（Ｕ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方で、シトシン（Ｃ）と塩基対を形成する）、二本鎖核酸分子を形成することを指す（例えば、Ｗａｈｌ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。加えて、当該技術分野においては、２つのＲＮＡ分子のハイブリダイゼーション（例えばｄｓＲＮＡ）では、グアニン（Ｇ）が、ウラシル（Ｕ）と塩基対を形成することも知られている。例えば、Ｇ／Ｕという塩基対の形成は、ｍＲＮＡ内のコドンとのｔＲＮＡのアンチコドンの塩基対の形成に関しては、遺伝暗号の縮退（すなわち冗長性）の部分的な要因となっている。本開示との関連においては、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（二本鎖ｄｓＲＮＡ）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）と相補的であるとみなされ、Ｕは、そのＧと相補的であるとみなされる。したがって、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（二本鎖ｄｓＲＮＡ）の所定のヌクレオチド位置で、Ｇ／Ｕ塩基対を形成できるときには、その位置は、非相補的であるとはみなされず、むしろ相補的であるとみなされる。当該技術分野では、ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるには、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないと理解されている。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズして、介在セグメントまたは隣接セグメントが、ハイブリダイゼーション事象に関与しないようにし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチドは、その標的となる標的核酸配列内の標的領域との配列相補性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％であることができる。
【０１１８】
「改変」という用語は、対応する非改変物質または化合物と比べて、変質または変更された物質または化合物（例えば、細胞、ポリヌクレオチド配列及び／またはポリペプチド配列）を指す。
【０１１９】
「天然の」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸、ポリペプチド、細胞または生物に適用されている際には、自然界で見られる核酸、ポリペプチド、細胞または生物を指す。例えば、天然の供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列であって、実験室において人間が意図的に改変していないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然のものである。
【０１２０】
「単離」とは、天然の状態で見られる場合には通常、その物質に付随している構成成分から、様々な程度で遊離されている物質を指す。
【０１２１】
「発現カセット」または「発現コンストラクト」とは、プロモーターに機能可能に連結されたＤＮＡポリヌクレオチド配列を指す。「機能可能に連結された」とは、機能可能に連結されていると記載されている構成成分が、意図した形で機能できる関係にある並置状態を指す。例えば、プロモーターが、ポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターは、そのポリヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。
【０１２２】
「組み換えベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、そのベクターに挿入された別のポリヌクレオチドを移入または輸送できるポリヌクレオチド分子を指す。その挿入されたポリヌクレオチドは、発現カセットであってよい。いくつかの実施形態では、組み換えベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（例えばプラスミド）であってよい。
【０１２３】
「試料」という用語は、解析及び／または遺伝子改変を行う生物学的組成物（例えば、細胞、または組織の一部）を指す。いくつかの実施形態では、試料は、対象から直接採取するという点で、「一次試料」であり、いくつかの実施形態では、「試料」は、例えば、ある特定の構成成分を除去し、及び／または対象とする、ある特定の構成成分を単離もしくは精製する目的で、一次試料を処理して得られたものである。
【０１２４】
「対象」という用語には、例えば哺乳動物のような動物が含まれる。いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、霊長類動物である。いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタなどのような家畜、またはイヌ及びネコのような飼育動物である。いくつかの実施形態では（例えば、特に研究環境では）、対象は、齧歯類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類動物、または近交系ブタのようなブタなどである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義的に用いられている。
【０１２５】
「投与」とは、本明細書では、薬剤または組成物を対象に導入することを指す。
【０１２６】
「治療」とは、本明細書で使用する場合、生理学的転帰に影響を及ぼすために、薬剤または組成物を対象に送達することを指す。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、特定の生理作用をもたらすのに必要な薬剤または組成物の最小量を指す。特定の薬剤の有効量は、その薬剤の性質に基づき、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）といった様々な方法で表してよい。特定の薬剤の有効量は、半最大効果濃度（ＥＣ５０）として表してもよく、この値は、基準レベルと最大応答レベルの中間の、特定の生理応答をもたらす薬剤濃度を指す。
【０１２８】
細胞の「集団」は、２個以上のいずれの数の細胞も指すが、好ましくは、少なくとも１×１０３個の細胞、少なくとも１×１０４個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも１×１０１０個の細胞、少なくとも１×１０１１個以上の細胞である。細胞集団とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ集団（例えば、培養液中の細胞集団）またはｉｎ  ｖｉｖｏ集団（例えば、特定の組織に存在する細胞集団）を指してよい。
【０１２９】
分子細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）のような標準的な教科書に見ることができ、その開示内容は、参照により、本明細書に援用される。
【０１３０】
ＩＩ．改変免疫エフェクター細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書では、「改変免疫エフェクター細胞」という用語には、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上のゲノム改変を含む免疫エフェクター細胞、ならびに１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む免疫エフェクター細胞が含まれる。本明細書では、「非改変免疫エフェクター細胞」または「コントロールの免疫エフェクター細胞」は、ゲノムが改変されておらず、遺伝子調節システムを含まないか、またはコントロール遺伝子調節システム（例えば、空ベクターコントロール、非ターゲティングｇＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡなど）を含む細胞または細胞集団を指す。
【０１３１】
「免疫エフェクター細胞」という用語は、自然免疫応答及び適応免疫応答の惹起に関与する細胞を指し、リンパ球（Ｔ細胞（胸腺細胞を含む）及びＢ細胞など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好塩基球、好中球、樹状細胞、ならびにマスト細胞が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞もしくはＣＴＬともいう）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞またはＴｈ１７細胞のようなＴ細胞である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、腫瘍試料から単離したＴ細胞（本明細書では、「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」という）である。理論に束縛されることを望まないが、ＴＩＬは、腫瘍抗原に対する特異性が向上しており（Ｒａｄｖａｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ  １８：６７５８−６７７０）、したがって、外因性の操作受容体の導入なしに、腫瘍抗原特異的免疫応答（例えば、活性化、増殖及びがん細胞に対する細胞傷害活性）を媒介して、がん細胞を破壊させることができる（Ｂｒｕｄｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃ  １５：３１−４６）と考えられる。すなわち、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、対象の腫瘍から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、対象に再注入する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自己腫瘍抗原に対して特異的な１つ以上の外因性受容体を発現するように改変し、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、対象に再注入する。このような実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルを用いてモデル化でき、そのマウスには、がん抗原（例えばＣＤ１９）を発現するがん細胞株が移植されており、そのがん抗原に特異的である外因性受容体を発現する改変Ｔ細胞でそのマウスを処置する（例えば、実施例１０及び１１を参照されたい）。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、動物細胞であるか、または、無脊椎動物及び脊椎動物を含む動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥または哺乳動物）の細胞に由来するものである。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、哺乳動物細胞であるか、または哺乳動物細胞に由来するものである（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類動物、ヒト以外の霊長類動物、ヒトなど）。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、齧歯類動物細胞であるか、または齧歯類動物細胞に由来するものである（例えば、ラットまたはマウス）。いくつかの実施形態では、修飾免疫エフェクター細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来するものである。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に、その内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上の改変（例えば、１つ以上の核酸の挿入、欠失または変異）を含む。このような改変は、本明細書では「不活性化変異」といい、不活性化変異を含む内在性遺伝子は、「改変内在性標的遺伝子」という。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ｍＲＮＡの転写を減少させるかまたは阻害することによって、コードされるｍＲＮＡ転写物及びタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ｍＲＮＡの翻訳を減少させるかまたは阻害することによって、コードされるタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、非改変型（すなわち野生型）の内在性タンパク質と比べて、機能が低下または変更された改変内在性タンパク質（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）をコードする。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、内在性標的遺伝子以外のゲノム位置に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させるか、あるいは改変型の内在性タンパク質を発現させる１つ以上のゲノム改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムをコードするポリヌクレオチド配列をゲノム内の１つ以上の位置に挿入することによって、その遺伝子調節システムの発現の際に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。いくつかの実施形態では、改変型の内在性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、ゲノム内の１つ以上の位置に挿入されており、その改変型のタンパク質の機能が、非改変型または野生型のタンパク質と比べて低下する（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、改変された内在性標的遺伝子を１つ以上含み、その１つ以上の改変によって、その内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質）の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、ｍＲＮＡ転写物の発現が低下し、及び／またはタンパク質の発現が低下する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現は、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも５％低下する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現は、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを上回る程度低下する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、複数（例えば２つ以上）の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子に由来する遺伝子産物の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて低下する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞であって、１つ以上の内在性標的遺伝子またはその一部が欠失（すなわち「ノックアウト」）されており、そのｍＲＮＡ転写物またはタンパク質を発現しないようになっている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、複数の内在性標的遺伝子またはその一部の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の欠失を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の改変内在性標的遺伝子を含み、その標的ＤＮＡ配列に対する１つ以上の改変によって、非改変免疫エフェクター細胞で発現する対応するタンパク質（例えば「非改変内在性タンパク質」）の機能と比べて、機能が低下または変更されたタンパク質（例えば「改変内在性タンパク質」）が発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の改変内在性タンパク質をコードする２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の改変内在性標的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、その改変内在性タンパク質では、その改変免疫エフェクター細胞によって発現されるかもしくは別の細胞によって発現される別のタンパク質に対する結合親和性が低下もしくは変化するか、シグナル伝達能が低下もしくは変化するか、酵素活性が低下もしくは変化するか、ＤＮＡ結合活性が低下もしくは変化するか、または足場タンパク質として機能する能力が低下もしくは変化する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、その改変内在性標的遺伝子は、１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む。本明細書で使用する場合、「ドミナントネガティブ変異」とは、標的遺伝子の１つ以上のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されていて、そのコードされたタンパク質が、非改変標的遺伝子によってコードされるタンパク質に対して拮抗的に作用するようになっていることを指す。このネガティブな表現型は、対応する非改変遺伝子のポジティブな表現型に対して、遺伝的に優位となるので、その変異は、ドミナントネガティブである。１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む遺伝子、及びその遺伝子によってコードされるタンパク質は、「ドミナントネガティブ変異体」、例えば、ドミナントネガティブ遺伝子及びドミナントネガティブタンパク質という。いくつかの実施形態では、そのドミナントネガティブ変異体タンパク質は、その免疫エフェクター細胞のゲノム内の１つ以上の位置に挿入した外来性導入遺伝子によってコードされる。
【０１４０】
ドミナントネガティブの機序は、様々なものが知られている。典型的には、ドミナントネガティブ変異体の遺伝子産物は、非改変遺伝子産物の機能をいくつか保持しているが、非改変遺伝子産物の他の重要な機能を１つ以上欠損している。これにより、ドミナントネガティブ変異体は、非改変遺伝子産物を拮抗阻害する。例えば、例示的な実施形態として、転写因子のドミナントネガティブ変異体は、機能活性化ドメインを欠損しているが、機能性ＤＮＡ結合ドメインを保持し得る。この例では、ドミナントネガティブ転写因子は、非改変転写因子のようにＤＮＡの転写を活性化することはできず、ドミナントネガティブ転写因子は、非改変転写因子の転写因子結合部位への結合を阻止することによって、遺伝子の発現を間接的に阻害できる。別の例示的な実施形態として、二量体として機能するタンパク質のドミナントネガティブ変異が知られている。このような二量体タンパク質のドミナントネガティブ変異体は、非改変タンパク質と二量体を形成する能力を保持し得るが、それ以外は機能できないことがある。ドミナントネガティブ単量体は、非改変単量体と二量体を形成することによって、ヘテロ二量体を形成し、非改変単量体の機能的なホモ二量体の形成を阻止する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む。その遺伝子調節システムは、（例えば、ゲノムＤＮＡ配列内の１つ以上の核酸の挿入、欠失もしくは変異によって）内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を改変すること、内在性標的遺伝子の転写を調節すること（例えば、ｍＲＮＡの転写の阻害もしくは抑制）、及び／または（例えば、ｍＲＮＡの分解によって）内在性標的遺伝子の翻訳を調節することによる機序を含む様々な機序によって、内在性標的遺伝子改変部の発現及び／または機能を低下させることができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、遺伝子調節システム（例えば、核酸ベースの遺伝子調節システム、タンパク質ベースの遺伝子調節システム、またはタンパク質／核酸複合ベースの遺伝子調節システム）を含む。このような実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞に含まれる遺伝子調節システムは、１つ以上の内在性標的遺伝子を改変することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、
（ａ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
（ｂ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｃ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
（ｄ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができるタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
（ｆ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｈ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｉ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
（ｊ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｋ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｌ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｍ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｎ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｏ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｐ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または
（ｑ）上記をいずれかに組み合わせたものを含む遺伝子調節システム、
を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、その免疫エフェクター細胞のゲノムに挿入されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソーマルに発現され、その免疫エフェクター細胞のゲノムに挿入されていない。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されており、１つ以上のゲノム遺伝子座に挿入された１つ以上の外因性導入遺伝子をさらに含む（例えば遺伝子「ノックイン」）。いくつかの実施形態では、その１つ以上の外因性導入遺伝子は、検出可能なタグ、安全スイッチシステム、キメラスイッチ受容体及び／または操作型抗原特異的受容体をコードする。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、検出可能なタグをコードする外来性導入遺伝子さらに含む。検出可能なタグの例としては、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ（例えば６×Ｈｉｓ）、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ｃＭｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、アビジン、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、化学発光タンパク質、生物発光タンパク質及びリン光タンパク質が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その蛍光タンパク質は、青色／ＵＶタンパク質（ＢＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ及びＴ−Ｓａｐｐｈｉｒｅなど）、シアンタンパク質（ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ及びｍＴＦＰ１など）、緑色タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍｅＧＦＰ（Ａ２０８Ｋ変異）、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎなど）、黄色タンパク質（ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２及びＴａｇＹＦＰなど）、オレンジ色タンパク質（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ及びｍＯｒａｎｇｅ２など）、赤色タンパク質（ＲＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ及びｍＲｕｂｙ２など）、遠赤色タンパク質（ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ及びＮｉｒＦＰなど）、近赤外蛍光タンパク質（ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４及びｉＲＦＰなど）、ストークスシフトの長いタンパク質（ｍＫｅｉｍａ  Ｒｅｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２及びｍＢｅＲＦＰなど）、光活性化可能なタンパク質（ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１及びＰＡＴａｇＲＦＰなど）、光変換可能なタンパク質（Ｋａｅｄｅ（ｇｒｅｅｎ）、Ｋａｅｄｅ（ｒｅｄ）、ＫｉｋＧＲ１（ｇｒｅｅｎ）、ＫｉｋＧＲ１（ｒｅｄ）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ２（ｒｅｄ）、ｍＥｏｓ３．２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ３．２（ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ及びＰＳｍＯｒａｎｇｅなど）、ならびに光で切り替え可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａなど）からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その検出可能なタグは、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＨｃＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ及び／またはＡｃＧＦＰから選択でき、これらはいずれも、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である���
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、安全スイッチシステムをコードする外来性導入遺伝子をさらに含む。安全スイッチシステム（当該技術分野においては、自殺遺伝子システムともいう）は、改変免疫エフェクター細胞を対象に投与した後に、その細胞を除去可能にする１つ以上のタンパク質をコードする外因性導入遺伝子を含む。安全スイッチシステムの例は、当該技術分野において知られている。例えば、安全スイッチシステムは、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｈｓｖ−ｔｋ）及びガンシクロビル（ＧＣＶ）システム（Ｈｓｖ−ｔｋ／ＧＣＶ）のような、非傷害性のプロドラッグを傷害性化合物に変換するタンパク質をコードする遺伝子を含む。Ｈｓｖ−ｔｋは、非傷害性のＧＣＶを、細胞アポトーシスに導く傷害性化合物に変換する。したがって、Ｈｓｖ−ｔｋタンパク質をコードする導入遺伝子を含む改変免疫エフェクター細胞で治療した対象にＧＣＶを投与すると、その改変免疫エフェクター細胞を選択的に除去できる一方で、内在性免疫エフェクター細胞は影響を受けない。（例えば、Ｂｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６（５３１９）：１７１９−１７２４、Ｃｉｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００７，１０９（１１）：１８２８−１８３６、Ｂｏｎｄａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６，１０７（５）：１８２８−１８３６を参照されたい）。
【０１４７】
追加の安全スイッチシステムは、細胞表面マーカーをコードする遺伝子を含み、その細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体の投与によって、ＡＤＣＣを介して、改変免疫エフェクター細胞を除去できるようになっている。いくつかの実施形態では、その細胞表面マーカーは、ＣＤ２０であり、その改変免疫エフェクター細胞は、リツキシマブのような抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の投与によって除去できる（例えば、Ｉｎｔｒｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０００，１１（４）：６１１−６２０、Ｓｅｒａｆｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００４，１４，６３−７６、ｖａｎ  Ｍｅｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００６，１３，７８９−７９７を参照されたい）。ＥＧＦ−Ｒ及びセツキシマブまたはパニツムマブを用いる同様のシステムが、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号に記載されている。追加の安全スイッチシステムは、二量化の化学誘導物質（ＣＩＤ）に対する結合部位を１つ以上含むプロアポトーシス分子をコードする導入遺伝子を含み、そのプロアポトーシス分子のオリゴマー化及びアポトーシス経路の活性化を誘導するＣＩＤの投与によって、改変免疫エフェクター細胞を除去できるようになっている。いくつかの実施形態では、そのプロアポトーシス分子は、Ｆａｓ（ＣＤ９５としても知られている）である（Ｔｈｏｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００１，９７（５），１２４９−１２５７）。いくつかの実施形態では、そのプロアポトーシス分子は、カスパーゼ−９である（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（１１），４２４７−４２５４）。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、キメラスイッチ受容体をコードする外来性導入遺伝子をさらに含む。キメラスイッチ受容体は、内在性細胞表面受容体に由来する細胞外ドメイン、及び異種の細胞内シグナル伝達ドメインを含む操作型細胞表面受容体であり、その細胞外ドメインによってリガンドが認識されると、野生型の細胞表面受容体によって活性化されるシグナル伝達カスケードとは異なるシグナル伝達カスケードが活性化されるようになっている。いくつかの実施形態では、そのキメラスイッチ受容体は、細胞内ドメインに融合された抑制性の細胞表面受容体の細胞外ドメインを含み、その細胞内ドメインは、その抑制性の細胞表面受容体によって通常伝達される阻害シグナルではなく、活性化シグナルを伝達させるものである。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞の活性化を阻害することが知られている細胞表面受容体に由来する細胞外ドメインは、細胞内の活性化ドメインに融合できる。そして、対応するリガンドが結合すると、その免疫エフェクター細胞の活性化を阻害するのではなく、その活性化を増大させるシグナル伝達カスケードが活性化することになる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、ＰＤ１−ＣＤ２８スイッチ受容体をコードする導入遺伝子を含み、ＰＤ１の細胞外ドメインが、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインに融合されている（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７６：６（２０１６），１５７８−１５９０及びＭｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２（２０１４），Ｓ２０１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする導入遺伝子を含む（Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １３０：２２（２０１７），２４１０−２４１９を参照されたい）。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）のような標的細胞によって発現されるタンパク質標的を認識する操作型抗原特異的受容体をさらに含む（本明細書では「改変受容体導入細胞」または「改変ＲＥ細胞」という）。「操作抗原受容体」という用語は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような非天然の抗原特異的受容体を指す。いくつかの実施形態では、その操作抗原受容体は、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを介して、シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、標的細胞によって発現される抗原に、ＭＨＣに依存しない形で結合し、ＲＥ細胞を活性化及び増殖させる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合断片に融合されたタグを認識する。このような実施形態では、ＣＡＲの抗原特異性は、標識抗体の抗原特異性に依存しており、その結果、ある１つの抗体を別の抗体に置き換えることによって、単一のＣＡＲコンストラクトを用いて、複数の異なる抗原を標的とすることができる（例えば、米国特許第９，２３３，１２５号及び同第９，６２４，２７９号、米国特許出願公開第２０１５０２３８６３１号及び同第２０１８０１０４３５４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体に由来する抗原結合断片を含んでよい。本開示において有用である抗原結合ドメインとしては、例えば、ｓｃＦｖ、抗体、抗体の抗原結合領域、重鎖／軽鎖の可変領域、及び一本鎖抗体が挙げられる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体ζ鎖ドメイン（ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインなど）、ＦｃγＲＩＩＩドメイン、ＦｃεＲＩドメインまたはＴリンパ球活性化ドメインに由来してよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメインまたはＣＤ７０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメインまたはＣＤ７０ドメインのうちのいずれか２つを含む。例示的なＣＡＲの構造及び細胞内シグナル伝達ドメインは、当該技術分野において知られている（例えば、ＷＯ２００９／０９１８２６、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＷＯ２０１５／１４２６７５、ＷＯ２０１４／０５５６５７及びＷＯ２０１５／０９０２２９（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）。
【０１５１】
様々な腫瘍抗原に特異的なＣＡＲが、当該技術分野において知られており、例えば、ＣＤ１７１特異的ＣＡＲ（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００７）１５（４）：８２５−８３３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（２０１２）２３（１０）：１０４３−１０５３）、ＥＧＦ−Ｒ特異的ＣＡＲ（Ｋｏｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ（２０１４）１０７（１）：３６４）、炭酸脱水酵素Ｋ特異的ＣＡＲ（Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ（２０１６）４４（３）：９５１−９５９）、ＦＲ−α特異的ＣＡＲ（Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００６）１２（２０）：６１０６−６０１５）、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２０１５）３３（１５）１６８８−１６９６、Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２０１１）１９（１２）：２１３３−２１４３、Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００９）１７（１０）：１７７９−１７８７、Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１６）２６（７）：８５０−８５３、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２０１０）１８（４）：８４３−８５１、Ｇｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１３）９（２）：３２）、ＣＥＡ特異的ＣＡＲ（Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１５）２１（１４）：３１４９−３１５９）、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲ（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｃｎｅｒ  Ｒｅｓ（２０１５）２１（１８）：４０６２−４０７２）、ＧＤ２特異的ＣＡＲ（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（２３）：６０５０−６０５６、Ｃａｒｕａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２０１５）２１（５）：５２４−５２９）、ＥｒｂＢ２特異的ＣＡＲ（Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２（５）：１０５９−１０７０）、ＶＥＧＦＦ−Ｒ特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１６）２２（２）：４３６−４４７）、ＦＡＰ特異的ＣＡＲ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ（２０１４）２（２）：１５４−１６６）、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０１１）１７（１４）：４７１９−３０）、ＮＫＧ２Ｄ特異的ＣＡＲ（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２０１５）２３（１０）：１６００−１６１０）、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（アキシカブタジンシロルーセル（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））及びチサゲンレクルユーセル（Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標））である。腫瘍特異的ＣＡＲの臨床試験について論評しているＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌ（２０１８）１１（２２）も参照されたい。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、操作抗原受容体は、操作ＴＣＲである。操作ＴＣＲは、特定の標的抗原を認識するＴ細胞集団から単離及びクローニングしたＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖を含む。例えば、ＴＣＲα遺伝子及び／またはＴＣＲβ遺伝子（すなわち、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ）は、特定の悪性腫瘍を有する個体から単離したＴ細胞集団、または所定の腫瘍抗原もしくは腫瘍細胞で免疫したヒト化マウスから単離したＴ細胞集団からクローニングできる。操作ＴＣＲは、その内在性対応物と同じ機序を通じて（例えば、標的細胞の表面に発現した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質との関連において提示されたその同種抗原を認識することによって）、抗原を認識する。この抗原と結合すると、内在性シグナル伝達経路が刺激され、それにより、ＴＣＲ操作細胞が活性化及び増殖する。
【０１５３】
腫瘍抗原に特異的な操作ＴＣＲは、当該技術分野において知られており、例えば、ＷＴ１特異的ＴＣＲ（ＪＴＣＲ０１６（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、米国特許出願公開第２０１６００８３４４９号に記載されているＷＴ１−ＴＣＲｃ４）、ＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲ（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４（２００６）１２６−１２９に記載されているＤＭＦ４Ｔクローン、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１４（２００９）５３５−５４６に記載されているＤＭＦ５Ｔクローン、及びｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３（２０１５）１５４１−１５５０に記載されているＩＤ３Ｔクローンを含む）、ｇｐ１００特異的ＴＣＲ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１４（２００９）５３５−５４６）、ＣＥＡ特異的ＴＣＲ（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９（２０１１）６２０−６２６）、ＮＹ−ＥＳＯ及びＬＡＧＥ−１特異的ＴＣＲ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６（２０１１）９１７−９２４、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１（２０１５）１０１９−１０２７及びＲａｐｏｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１（２０１５）９１４−９２１に記載されている１Ｇ４Ｔクローン）、ならびにＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＴＣＲ（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３６（２０１３）１３３−１５１及びＬｉｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２２（２０１３）２２７−２４２）である。（Ｄｅｂｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３（２０１６）１０−２１も参照されたい。）
【０１５４】
いくつかの実施形態では、その操作抗原受容体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７８、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても知られている）、ＣＤ８６（Ｂ７−２としても知られている）、ＣＤ９６、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７１（ＣＬＬ１としても知られている）のような分化クラスター分子、５Ｔ４、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９及びＴＮＦＲＳＦ１７としても知られている。ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ０２２２３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸまたはＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２など）、ＥＬＦ２Ｍ、導管上皮ムチン、エフリンＢ２、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＦＣＲＬ５（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ６８ＳＮ８）、ＦＫＢＰ１１（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＹＬ４）、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＤ１）、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、腸カルボキシルエステラーゼ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＩＴＧＡ８（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ５３７０８）、ＫＡＭＰ３、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ、メソセリン、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＡＰ、プロスターゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、プロステイン、ＲＡＧＥ−１、ＲＯＲ１、ＲＵ１（ＳＦＭＢＴ１）、ＲＵ２（ＤＣＤＣ２）、ＳＬＡＭＦ７（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＱ２５）、サバイビン、タグ−７２及びテロメラーゼのような腫瘍関連表面抗原、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）のような腫瘍間質抗原、テネイシン−ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ  Ａ１）及び線維芽細胞関連タンパク質（ＦＡＰ）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＴＦＧβ−Ｒまたはその構成成分（エンドグリンなど）のようなサイトカイン受容体、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＨＩＶ特異的抗原（ＨＩＶ  ｇｐ１２０など）、ＥＢＶ特異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、ＨＰＶ特異的抗原、ラッサウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原のようなウイルス特異的表面抗原、及びこれらの表面抗原のいずれかの誘導体またはバリアントから選択した標的抗原に対するものである。
【０１５５】
Ａ．エフェクター機能
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の免疫細胞エフェクター機能が上昇する。本明細書では、「エフェクター機能」という用語は、免疫細胞の機能のうち、標的細胞または標的抗原に対する免疫応答の発生、維持及び／または増強に関連する機能を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞では、非改変免疫エフェクター細胞と比べて、腫瘍への浸潤性もしくは遊走性が向上する特徴、増殖性が向上する特徴、細胞生存能が向上もしくは延長する特徴、周囲の微小環境における抑制因子耐性が向上して、その細胞の活性化状態が延長または増大するようになる特徴、炎症誘発性免疫因子（例えば、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン及び／または酵素）の産生が増加する特徴、細胞傷害性が向上する特徴、及び／または疲弊耐性が向上する特徴のうちの１つ以上が見られる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫エフェクター細胞と比べて、腫瘍への浸潤性が向上する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞による腫瘍への浸潤性の向上とは、所定の期間において腫瘍に浸潤する改変免疫エフェクター細胞の数が、同じ期間において腫瘍に浸潤する非改変免疫エフェクター細胞の数と比べて増加することを指す。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、腫瘍への浸潤性が、非改変免疫細胞と比べて１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度向上する。腫瘍への浸潤性は、対象から１つ以上の腫瘍を単離し、フローサイトメトリー、免疫組織化学及び／または免疫蛍光法によって、その試料中の改変免疫細胞の数を評価することによって測定できる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、細胞増殖性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上する。これらの実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変免疫エフェクター細胞の数が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、増殖速度が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて上昇し、この場合、改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫エフェクター細胞よりも速い速度で分裂する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、増殖速度が、非改変免疫細胞と比べて１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度上昇する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、増殖期間が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて長く、この場合、その改変免疫エフェクター細胞及び非改変免疫エフェクター細胞は、同じ速度で分裂するが、改変免疫エフェクター細胞の方が、長い期間にわたって増殖状態を維持する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度長い時間、増殖状態を維持する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、細胞生存能が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上するかまたは延長される。このような実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変免疫エフェクター細胞の数が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度長い時間、生存状態を維持して存続する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、抑制因子耐性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上する。例示的な抑制因子としては、免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＩＤＯ）及び／または抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ）によるシグナル伝達が挙げられる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊に対する耐性が、非改変Ｔ細胞と比べて向上する。Ｔ細胞疲弊は、エフェクター機能が低下し、その後、抗原特異的Ｔ細胞が枯渇することによって特徴付けられる抗原特異的Ｔ細胞機能障害の状態である。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、抗原に応答して増殖する能力が欠損し、サイトカインの産生が減少し、及び／または腫瘍細胞のような標的細胞に対する細胞傷害性が低下する。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、ＣＤ１２２及びＣＤ１２７の細胞表面での発現の減少、ＰＤ１、Ｌａｇ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３及び／またはＣＴＬＡ４のような抑制性細胞表面マーカーの発現の増加、及び／またはＢｌｉｍｐ１、ＮＦＡＴ及び／またはＢＡＴＦのような転写因子の発現の増加のような、細胞表面マーカー及び転写因子の発現の変化によって特定する。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、ＴＧＦβのシグナル伝達に対する感受性の上昇及び／またはＩＬ−７及びＩＬ−１５のシグナル伝達に対する感受性の低下のような、サイトカインのシグナル伝達に対する感受性の変化が見られる。Ｔ細胞疲弊は、例えば、そのＴ細胞を標的細胞集団と共培養し、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生及び／または標的細胞の溶解を測定することによって判断することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を標的細胞（例えば、標的腫瘍抗原を発現するように操作した自己腫瘍細胞または自己腫瘍細胞株）の集団と共培養し、エフェクター細胞の増殖、サイトカインの産生及び／または標的細胞の溶解を測定する。続いて、これらの結果と、標的細胞をコントロールの免疫細胞（非改変免疫エフェクター細胞、またはコントロールの改変が施された免疫エフェクター細胞）集団と共培養することによって得られた結果を比較する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞による１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦαまたはＩＬ−２）の産生が、コントロールの免疫細胞集団で観察されるサイトカインの産生と比べて増加することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞によるサイトカインの産生が、コントロールの免疫細胞集団によるサイトカインの産生と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度増加することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞の増殖性が、コントロールの免疫細胞集団で観察される増殖性と比べて向上することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の増殖性が、コントロールの免疫細胞集団の増殖性と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度向上したことによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞による標的細胞の溶解が、コントロールの免疫細胞集団で観察される標的細胞の溶解と比べて増大することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞による標的細胞の溶解が、コントロールの免疫細胞集団による標的細胞の溶解と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを超える程度増大することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、コントロールの免疫細胞集団と比較した場合の改変免疫エフェクター細胞の疲弊は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの製造プロセス中に測定する。例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍断片から単離したＴＩＬを、本明細書に記載されている方法に従って改変してから、１ラウンド以上増殖させて、改変ＴＩＬ集団を作製する。このような実施形態では、その改変ＴＩＬの疲弊は、回収直後及び第１ラウンドの増殖の前、第１ラウンドの増殖後かつ第２ラウンドの増殖の前、及び／または第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に判断することができる。いくつかの実施形態では、コントロールの免疫細胞集団と比べた場合の改変免疫エフェクター細胞の疲弊は、改変免疫エフェクター細胞を対象に移入した後、１つ以上の時点に測定する。例えば、いくつかの実施形態では、その改変細胞を、本明細書に記載されている方法に従って作製し、対象に投与する。続いて、移入後、様々な時点に、試料を対象から採取して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの改変免疫エフェクター細胞の経時的な疲弊を判断することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、炎症誘発性免疫因子の発現または産生が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加する。炎症誘発性免疫因子の例としては、グランザイムＢ、パーフォリン及びグラニュライシンのような細胞溶解因子、ならびにインターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＣＸＣＬ８及び／またはＩＬ−６のような炎症誘発性サイトカインが挙げられる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する細胞傷害性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて上昇する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する細胞傷害性が、非改変免疫細胞と比べて、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度上昇する。
【０１６５】
免疫エフェクター機能を測定するためのアッセイは、当該技術分野において知られている。例えば、腫瘍への浸潤性は、対象から腫瘍を単離し、その腫瘍に存在するリンパ球の総数及び／または表現型をフローサイトメトリー、免疫組織化学及び／または免疫蛍光法によって求めることによって測定できる。細胞表面受容体の発現は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット及び／またはｑＰＣＲによって求めることができる。サイトカイン及びケモカインの発現及び産生は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及び／またはｑＰＣＲによって測定できる。細胞外の刺激（例えば、サイトカイン、抑制性リガンドまたは抗原）に対する応答性または感受性は、その刺激に応答する細胞増殖及び／または下流のシグナル伝達経路の活性化（例えば、下流のシグナル伝達中間体のリン酸化）をアッセイすることによって測定できる。細胞傷害性は、実施例全体を通じて説明されているような改変免疫エフェクター細胞と標的細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの共培養及びｉｎ  ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルを含め、当該技術分野において知られている標的細胞溶解アッセイによって測定できる。
【０１６６】
Ｂ．内在性の経路及び遺伝子の調節
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現もしくは機能が低下され、及び／または１つ以上の内在性標的遺伝子（下に記載されている）の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子は、エフェクター細胞応答の活性化及び調節に関連する経路に存在する。このような実施形態では、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能の低下により、その免疫細胞の１つ以上のエフェクター機能が増強される。
【０１６７】
本明細書に記載されている方法によって調節するのに適する例示的な経路は、表１に示されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞において、特定の経路内の内在性標的遺伝子の発現が低下する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞において、特定の経路内の複数（例えば２つ以上）の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、特定の経路における２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下し得る。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞において、ある１つの経路内の内在性標的遺伝子の発現、及び別の経路内の内在性標的遺伝子の発現が低下する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞において、ある１つの経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現、及び別の経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、ある１つの経路内の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下してよく、別の特定の経路内の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の発現が低下してよい。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、複数の経路内の複数の内在性標的遺伝子の発現が低下する。例えば、複数の経路（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の経路）のそれぞれに由来する１つの内在性遺伝子が低下してよい。追加の態様では、複数の経路（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の経路）のそれぞれに由来する複数の内在性遺伝子（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の遺伝子）が低下してよい。
表１：例示的な内在性経路
【表１】
2021518161.tif 000002
【０１６９】
例示的な内在性標的遺伝子は、下記の表２及び３に示されている。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明の改変エフェクター細胞は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲのうちの１つ以上（例えば、表２から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲのうちの１つ以上の発現及び／または機能が低下されている。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した少なくとも２つの遺伝子（例えば、表２から選択した少なくとも２つの遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ〜図１Ｂに示されているような１〜６００番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＢＣＯＲの発現及び／または機能の低下、ならびにＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及び／またはＢＣＯＲの発現を改変するための例示的な方法は、本明細書に記載されているが、これらの内在性標的遺伝子の発現は、当該技術分野において知られている方法によって改変してもよい。例えば、ＰＤ１（ＰＤＣＤ１によってコードされる）、ＮＲＰ１、ＨＡＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ及びＣＴＬＡ４に対する阻害抗体が、当該技術分野において知られており、腫瘍の適応症で、ＦＤＡの承認を受けているものもある（例えば、ＰＤ１に対するニボルマブ及びペムブロリズマブ）。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３のうちの１つ以上（例えば、表３から選択した１つ以上の内在性標的遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＣＤ１０８としても知られているセマフォリン７Ａ（ＳＥＭＡ７Ａ）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＳＥＭＡ７Ａ遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＲＮＡ結合タンパク質３９（ＲＢＭ３９）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＲＢＭ３９タンパク質は、核に存在し、核内で、コアスプライセオソームタンパク質と共局在する。このタンパク質との配列類似性が高いマウスタンパク質の研究により、このタンパク質が、ＪＵＮ／ＡＰ−１及びエストロゲン受容体に対する転写コアクチベーターとして機能し得ることが示唆されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＲＢＭ３９遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、一般的にはＢＩＭとも呼ばれているＢｃｌ−２様タンパク質１１（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、転写因子ＥＲＧＢとしても知られているフレンド白血病インテグレーション１転写因子（ＦＬＩ１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＦＬＩ１遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、カルモジュリン２（ＣＡＬＭ２）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＣＡＬＭ２遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤＨＯＤＨ）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＤＨＯＤＨタンパク質は、ミトコンドリア内膜の外面にあるミトコンドリアタンパク質であり、ｄｅ  ｎｏｖｏピリミジン生合成において、ユビキノンの媒介によるジヒドロオロト酸塩のオロト酸塩への酸化を触媒する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＤＨＯＤＨ遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼまたはオロチジン−５’−デカルボキシラーゼともいうウリジンモノリン酸シンターゼ（ＵＭＰＳ）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＵＭＰＳタンパク質は、多くの重要な生合成経路において、エネルギーを運ぶ分子であるウリジンモノリン酸（ＵＭＰ）の形成を触媒する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＵＭＰＳ遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、システインリッチ疎水性ドメイン２（ＣＨＩＣ２）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。コードされたＣＨＩＣ２タンパク質は、システインリッチ疎水性（ＣＨＩＣ）モチーフを含み、小胞構造及び細胞膜に局在するとともに、急性骨髄性白血病の一部の症例と関連付けられている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＣＨＩＣ２遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ポリ（ｒＣ）結合タンパク質１（ＰＣＢＰ１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＰＣＢＰ１遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＢＲＧ１関連因子１８０（ＢＡＦ１８０）としても知られているタンパク質ポリブロモ−１（ＰＢＲＭ１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＰＢＲＭ１は、クロマチン再構築複合体ＳＷＩ／ＳＮＦ−Ｂの構成成分であり、多くのサブタイプのがんにおける腫瘍抑制因子遺伝子である。変異は特に、明細胞腎細胞癌で多く見られる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＰＢＲＭ１遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、成体組織及び胎児組織で遍在して発現するＷＤリピートタンパク質ファミリーのメンバーであるＷＤリピート含有タンパク質６（ＷＤＲ６）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＷＤリピートは、最小限に保存された領域であって、典型的にはｇｌｙ−ｈｉｓ及びｔｒｐ−ａｓｐ（ＧＨ−ＷＤ）をひとまとまりとする、およそ４０アミノ酸の領域であり、ヘテロ三量体複合体または複数タンパク質の複合体の形成を促進し得る。このファミリーのメンバーは、細胞周期の進行、シグナル伝達、アポトーシス及び遺伝子の調節を含む様々な細胞プロセスに関与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＷＤＲ６遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、Ｅ２Ｆ転写因子８（Ｅ２Ｆ８）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。コードされたＥ２Ｆ８タンパク質は、核が適切な時点に分裂するようにすることによって、Ｇ１期からＳ期への進行を調節する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、Ｅ２Ｆ８遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、セルピンファミリーＡメンバー３（ＳＥＲＰＩＮＡ３）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＳＥＲＰＩＮＡ３は、α１−アンチキモトリプシン（α１ＡＣ、Ａ１ＡＣまたはａ１ＡＣＴ）タンパク質をコードし、このタンパク質は、カテプシンＧ及びキマーゼのような特定のプロテアーゼの活性を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＧＮＡＳ複合遺伝子座（ＧＮＡＳ）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。これは、多くのシグナル伝達経路の重要な構成成分である刺激性Ｇタンパク質αサブユニット（Ｇｓ−α）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＧＮＡＳ遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。Ｚｃ３ｈ１２ａ（ＭＣＰＩＰ１及びＲｅｇｎａｓｅ−１とも称する）は、ＣＣＣＨ型ジンクフィンガーモチーフのすぐ上流にＲＮａｓｅドメインを有するＲＮａｓｅである。Ｚｃ３ｈ１２ａは、ＩＬ−６のような転写産物の遺伝子の３’ＵＴＲ内の保存されたステムループ構造と結合することによって、そのヌクレアーゼ活性を通じて、ＩＬ−６のような転写産物のｍＲＮＡを標的として、不安定化する。Ｔ細胞では、Ｚｃ３ｈ１２ａは、ｃ−Ｒｅｌ、Ｏｘ４０及びＩＬ−２を含むいくつかの炎症誘発性遺伝子の転写レベルを制御する。単球では、Ｚｃ３ｈ１２ａは、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ＢのｍＲＮＡをダウンレギュレートし、それによって炎症を緩和する。がん細胞では、Ｚｃ３ｈ１２ａは、Ｂｃｌ２Ｌ１、Ｂｃｌ２Ａ１、ＲｅｌＢ及びＢｃｌ３を含む抗アポトーシス遺伝子を阻害することによって、アポトーシスを促進する。Ｚｃ３ｈ１２ａの活性化は一過性のものであり、プロテアソーム媒介性分解または粘膜関連リンパ組織１（ＭＡＬＴ１）媒介性切断を含むネガティブフィードバック機構の作用を受ける。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＭＡＰ４Ｋ１（ＨＰＫ１とも称する）は、哺乳動物Ｓｔｅ２０関連タンパク質キナーゼのＭＡＰ４Ｋファミリーのメンバーであり、造血器官で主に発現するタンパク質セリン−トレオニンキナーゼである。ＭＡＰ４Ｋ１タンパク質は、Ｎ末端キナーゼドメインの後に、Ｓｒｃ相同３ドメインを含むタンパク質に結合できる４つのプロリンリッチモチーフを含む。ＭＡＰ４Ｋ１は、Ｌｃｋ及びＺａｐ７０のようなキナーゼによってリン酸化され、かつＡＴＰの存在下にあると、触媒活性を有し、自己リン酸化、ならびにＳＬＰ−７６及びＭＡＰ３Ｋタンパク質のような下流の基質タンパク質のリン酸化を媒介する。ＳＬＰ−７６がＳｅｒ−３７６においてリン酸化されると、ＳＬＰ−７６のユビキチン化及びプロテアソームによる分解の両方が行われるとともに、ＳＬＰ−７６と１４−３−３τとの相互作用が増大し、この相互作用により、ＴＣＲシグナル伝達が負に調節される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＮＲ４Ａ３は、誘導性オーファン受容体であり、ステロイド−甲状腺ホルモン−レチノイド受容体スーパーファミリーのメンバーであり、転写活性化因子である。ＮＲ４Ａ３は、様々な刺激によって発現が誘導されると、細胞質から核に移行して、ＮＲ４Ａ１応答エレメント（ＮＢＲＥ）に単量体として、Ｎｕｒ応答エレメント（ＮｕｒＲＥ）にホモ二量体として結合することによって、リガンド非依存的に遺伝子発現を駆動する。続いて、ＮＲ４Ａ３は、免疫系の内外の両方で、細胞の生存及び分化を制御する別個の遺伝子セットの転写を駆動する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した少なくとも２つの遺伝子（例えば、表３から選択した２つ以上遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ａ〜図３Ｂに示されているような１１７６〜１６８１番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ａに示されているような１１７６〜１４８３番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ｂに示されているような１２５０〜１２６５番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ｂに示されているような１２６６〜１２８１番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ｂに示されているような１２８２〜１２９７番の組み合わせから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３のうちの１つ以上（例えば、表３から選択した１つ以上の遺伝子）、ならびにＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲのうちの１つ以上（例えば、表２から選択した１つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、その改変免疫エフェクター細胞は、６０１〜１０２５番の組み合わせから選択した組み合わせの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、６０１〜９５０番の組み合わせ（図２Ａに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、９５１〜９７５番の組み合わせ（図２Ｂに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、９７６〜１０００番の組み合わせ（図２Ｂに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、１００１〜１０２５番の組み合わせ（図２Ｂに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されていてよい。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した少なくとも１つ遺伝子の発現及び／または機能の低下が低下され、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つ遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つ遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＭＡＰ４Ｋ１、及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つ遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＭＡＰ４Ｋ１、及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つ遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＮＲ４Ａ３、及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つ遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＮＲ４Ａ３、及びＴＮＦＡＩＰ３、ＣＢＬＢまたはＢＣＯＲから選択した少なくとも１つ遺伝子に不活性化変異を含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した少なくとも１つ遺伝子の発現及び／または機能が低下され、ＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した少なくとも１つ遺伝子の発現及び／または機能が低下され、ＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＭＡＰ４Ｋ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＭＡＰ４Ｋ１及びＣＢＬＢに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＮＲ４Ａ３及びＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変エフェクター細胞は、ＮＲ４Ａ３及びＣＢＬＢに不活性化変異を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した遺伝子（例えば、表２から選択した１つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能が低下され、ならびにＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した２つの遺伝子（例えば、表３から選択した１つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、１０２６〜１２９７番の組み合わせ（図３Ａ〜図３Ｂに示されているような組み合わせ）から選択した組み合わせの２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下に加えて、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１及びＢＣＯＲから選択した遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の発現及び／または機能が低下され、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した２つの遺伝子（例えば、表２から選択した１つ以上の遺伝子）の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ〜図１Ｂに示されている１〜６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３のうちのいずれか１つの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ〜図１Ｂに示されている１〜６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ〜図１Ｂに示されている１〜６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ〜図１Ｂに示されている１〜６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＭＡＰ４Ｋ１の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図１Ａ〜図１Ｂに示されている１〜６００番の組み合わせから選択した２つの内在性標的遺伝子の組み合わせの発現及び／または機能の低下に加えて、ＮＲ４Ａ３の発現及び／または機能が低下されている。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、表２から選択した複数の遺伝子の発現及び／または機能の低下、ならびに表３から選択した複数の遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、表２から選択した２つの遺伝子の発現及び／または機能の低下、ならびに表３から選択した２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。例えば、いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、図３Ａ〜図３Ｂに示されているような１０２６〜１２９７番の組み合わせから選択した組み合わせの２つの遺伝子、ならびに図１Ａ〜図１Ｂに示されているような１〜６００番の組み合わせから選択した組み合わせの２つの遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲのうちの３つ以上の発現及び／または機能が低下され、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３のうちの３つ以上の発現及び／または機能が低下されていてよい。
表２：例示的な内在性遺伝子
【表２−１】
2021518161.tif 000003
【表２−２】
2021518161.tif 000004
表３：新規調節のための例示的な遺伝子
【表３−１】
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【表３−２】
2021518161.tif 000006
【表３−３】
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【０１９７】
ＩＩＩ．遺伝子調節システム
本明細書では、「遺伝子調節システム」という用語は、細胞に導入したときに、内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、コードされる遺伝子産物の発現または機能を調節することができるタンパク質、核酸またはそれらを組み合わせたものを指す。本開示の方法で使用するのに適する多くの遺伝子編集システムが、当該技術分野において知られており、そのシステムとしては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられるが、これらに限らない。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、遺伝子調節システムが内在性標的遺伝子に及ぼす作用に関連して「調節する」を使用するときには、「調節する」には、その内在性標的遺伝子の配列のいずれの変化、その内在性標的遺伝子のエピジェネティックな状態のいずれの変化、及び／またはその内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは機能のいずれの変化も含まれる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、例えば、内在性標的配列において１つ以上の核酸を挿入するかまたは欠失させることによるなど、１つ以上の変異をその内在性標的配列に導入することによって、その内在性標的遺伝子の配列の変化を媒介し得る。その内在性標的配列の変化を媒介できる例示的な機序としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（例えば古典的または代替的）、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）、相同配向型修復（例えば内在性ドナーテンプレート媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存的一本鎖アニーリング）、一本鎖アニーリングまたは一本鎖侵入が挙げられるが、これらに限らない。
【０２００】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的配列のエピジェネティックな状態の変化を媒介し得る。例えば、いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的遺伝子のＤＮＡの共有結合の改変（例えば、シトシンのメチル化及びヒドロキシメチル化）、または関連ヒストンタンパク質の改変（例えば、リシンのアセチル化、リシン及びアルギニンのメチル化、セリン及びトレオニンのリン酸化、ならびにリシンのユビキチン化及びＳＵＭＯ化）を媒介し得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化を媒介し得る。このような実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、またはそのＤＮＡ配列によってコードされるｍＲＮＡ産物に作用することによって、そのコードタンパク質の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムによって、改変内在性タンパク質を発現させ得る。このような実施形態では、その遺伝子調節システムの媒介により、内在性ＤＮＡ配列が改変されると、非改変免疫エフェクター細胞における対応する内在性タンパク質と比べて機能が低下した内在性タンパク質が発現される。このような実施形態では、その改変内在性タンパク質の発現レベルは、非改変免疫細胞における対応する内在性タンパク質の発現レベルよりも上昇しても低下してもよく、あるいは、その対応する内在性タンパク質の発現レベルと同じであっても実質的に同程度であってもよい。
【０２０２】
Ａ．核酸ベースの遺伝子調節システム
本明細書で使用する場合、核酸ベースの遺伝子調節システムは、外因性タンパク質を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を調節できる１つ以上の核酸分子を含むシステムである。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、標的核酸配列と相補的であるＲＮＡ干渉分子またはアンチセンスＲＮＡ分子を含む。
【０２０３】
「アンチセンスＲＮＡ分子」とは、長さを問わず、ｍＲＮＡ転写物と相補的であるＲＮＡ分子を指す。アンチセンスＲＮＡ分子とは、細胞、組織または対象に導入でき、内在性遺伝子のサイレンシング経路に依存するのではなく、ＲＮａｓｅＨの媒介による、標的ｍＲＮＡ転写物の分解に依存する機序を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現を低下させる、一本鎖ＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、改変された主鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは当該技術分野において知られているその他の主鎖を含み、あるいは、非天然のヌクレオシド間結合を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、ロックト核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。
【０２０４】
「ＲＮＡ干渉分子」とは、本明細書で使用する場合、内在性遺伝子のサイレンシング経路（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を通じて、標的ｍＲＮＡを分解することによって、内在性標的遺伝子産物の発現の低下を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉剤としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」ともいう）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー及びモルホリノが挙げられる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。ｍｉＲＮＡとは、約２１〜２５ヌクレオチド長で天然の、小分子の非コードＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、１つ以上の標的ｍＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡは、翻訳の抑制、ｍＲＮＡの切断及び／または脱アデニル化を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現をダウンレギュレートする（例えば低下させる）ことができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｓｈＲＮＡを含む。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成するとともに、相補的なｍＲＮＡ配列を分解させる約５０〜７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されるプラスミドまたは非複製型の組み換えウイルスベクターにクローニングして、ｓｈＲＮＡコード配列がゲノムに組み込まれるようにできる。したがって、ｓｈＲＮＡは、内在性標的遺伝子の翻訳及び発現を安定的かつ着実に抑制させることができる。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡとは、典型的には約２１〜２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）という複数タンパク質複合体と会合し、その会合の際に、「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。そして、活性化ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、配列相同性によって、対応するｍＲＮＡにＲＩＳＣを導き、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断し、その結果、特異的な遺伝子サイレンシングが行われる。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に、２塩基のオーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞及び／または培養系に導入して、標的ｍＲＮＡ配列を分解させることができる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡについては、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：１９，１９９８、ならびに米国特許第７，７３２，４１７号、同第８，２０２，８４６号及び同第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のモルホリノを含む。「モルホリノ」は、本明細書で使用する場合、標準的な核酸塩基がモルホリン環に結合しているとともに、ホスホロジアミデート結合を通じて連結されている改変核酸オリゴマーを指す。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列を分解させるために標的とするのではなく、ｍＲＮＡの翻訳を立体的に阻害し、ｍＲＮＡスプライシングを変化させることを通じて機能する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲ（すなわち、表２に列挙されている遺伝子）から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。本願の全体を通じて、参照ゲノム座標は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから得たヒトゲノムのＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８ともいう）アセンブリーのゲノムアノテーションに基づくものであり、このアセンブリーは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで入手可能である。ある１つのアセンブリーと別のアセンブリーとの間でゲノム座標を変換するツール及び方法は、当該技術分野において知られており、そのツール及び方法を用いて、本明細書に示されているゲノム座標を、ヒトゲノムの別のアセンブリーにおける対応する座標に変換できる（同じ機関によってまたは同じアルゴリズムを用いて作製された以前のアセンブリーに変換すること（例えば、ＧＲＣｈ３８からＧＲＣｈ３７に変換すること）、及び異なる機関またはアルゴリズムによって作製されたアセンブリーを変換すること（例えば、ＧＲＣｈ３８から、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって作製されたＮＣＢＩ３３に変換すること）を含む）。当該技術分野において知られている利用可能な方法及びツールとしては、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで利用可能なＮＣＢＩ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｍａｐｐｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｅｒのウェブサイトで利用可能なＵＣＳＣ  ＬｉｆｔＯｖｅｒ、及びＥｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇのウェブサイトで利用可能なＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒが挙げられるが、これらに限らない。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができ、配列番号４９９〜５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＢＣＯＲの発現及び／または機能を低下させることができ、配列番号７０８〜７７２または配列番号７０８〜７６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＴＮＦＡＩＰ３の発現及び／または機能を低下させることができ、配列番号３４８〜３９６または配列番号３４８〜３８６のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒなどのような市販業者から入手可能なｓｉＲＮＡコンストラクト及びｓｈＲＮＡコンストラクトなど、当該技術分野において知られているｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子から選択したｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＣＢＬＢであり、その核酸分子は、配列番号４１〜４４から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第２０１８１５６８８６号を参照されたい）または配列番号４５〜５３から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開ＷＯ２０１７１２０９９８号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＣＢＬＢであり、その核酸分子は、配列番号５４〜６３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号を参照されたい）または配列番号６４〜７３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８１２０９９８号及び同第ＷＯ２０１８１３７２９３号を参照されたい）である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＴＮＦＡＩＰ３であり、その核酸分子は、配列番号７４〜９５から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（米国特許第８，３２４，３６９号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＴＮＦＡＩＰ３であり、その核酸分子は、配列番号９６〜１０５から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号を参照されたい）である。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＣＴＬＡ４であり、その核酸分子は、配列番号１２８〜１３３から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＣＴＬＡ４であり、その核酸分子は、配列番号１３４〜１４３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号、同第ＷＯ２０１７１２０９９８号、同第ＷＯ２０１８１３７２９５号及び同第ＷＯ２０１８１３７２９３号を参照されたい）または配列番号１４４〜１５３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号を参照されたい）である。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＰＤＣＤ１であり、その核酸分子は、配列番号１０６〜１０７から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号を参照されたい）である。いくつかの実施形態では、その内在性標的遺伝子は、ＰＤＣＤ１であり、その核酸分子は、配列番号１０８〜１１７から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号、同第ＷＯ２０１７１２９９８号、同第ＷＯ２０１８１３７２９５号及び同第ＷＯ２０１８１３７２９３号を参照されたい）または配列番号１１８〜１２７から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡ（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号を参照されたい）である。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３（すなわち、表３に列挙されている遺伝子）から選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ａ〜表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ａまたは表６Ｂのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ｃまたは表６Ｄのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＭＡＰ４Ｋ１の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ｅまたは表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＮＲ４Ａ３の発現及び／または機能を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表６Ｇまたは表６Ｈのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒなどのような市販業者から入手可能なｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子など、当該技術分野において知られているｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子から選択したｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。例示的なｓｉＲＮＡコンストラクト及びｓｈＲＮＡコンストラクトは、下記の表４Ａ及び表４Ｂに記載されている。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表４Ａに記載されているｓｉＲＮＡコンストラクトなど、当該技術分野において知られているｓｉＲＮＡ分子から選択した２つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、表４Ｂに記載されているｓｈＲＮＡコンストラクトなど、当該技術分野において知られているｓｈＲＮＡ分子から選択した２つ以上のｓｈＲＮＡ分子を含む。
表４Ａ：例示的なｓｉＲＮＡコンストラクト
【表４Ａ−１】
2021518161.tif 000008
【表４Ａ−２】
2021518161.tif 000009
【表４Ａ−３】
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【表４Ａ−４】
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表４Ｂ：例示的なｓｈＲＮＡコンストラクト
【表４Ｂ−１】
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【表４Ｂ−２】
2021518161.tif 000013
【表４Ｂ−３】
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【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子（例えば、２つ以上のｓｉＲＮＡ、２つ以上のｓｈＲＮＡ、２つ以上のＲＮＡアプタマーまたは２つ以上のモルホリノ）を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｒ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａ〜表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢのＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２ＡのＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、表６Ｇまたは表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸分子を含み、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合し、その核酸分子のうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３のＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その２つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【０２３０】
Ｂ．タンパク質ベースの遺伝子調節システム
いくつかの実施形態では、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、核酸ガイド分子を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を配列特異的な形で調節することができる１つ以上のタンパク質を含むシステムである。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このような実施形態は、本明細書では「ＴＡＬＥＮ」という。
【０２３１】
１．ジンクフィンガーシステム
ジンクフィンガーベースのシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインという２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、１つ以上のジンクフィンガーを通じて、ＤＮＡと配列特異的な形で結合するタンパク質、またはより巨大なタンパク質内のドメインであり、その結合ドメイン内のアミノ酸配列領域のうち、亜鉛イオンへの配位を通じて構造が安定化している領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、その配列近傍の酵素ドメインの活性を誘導し、その結果、標的配列近傍の内在性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にいずれの所望の配列にも結合するように操作できる。したがって、切断または組み換えを行いたい標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座（例えば、表２または３で言及されている標的遺伝子内の標的座位）を特定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、その標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列に結合するようにできる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質が細胞内で発現すると、その標的遺伝子座で改変が行われる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１６０９−１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｂｕａｒｙ：５６−６５、米国特許第６，４５３，２４２号。典型的には、単一のジンクフィンガードメインは、約３０個のアミノ酸の長さである。個々のジンクフィンガーは、３つのヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの４つのヌクレオチド結合部位と、１つのヌクレオチドが重複し得る４つのヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインを操作して、結合するようにする配列（例えば標的配列）の長さによって、操作ジンクフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの数が決まることになる。例えば、フィンガーモチーフが、重複するサブ部位には結合しないＺＦＰの場合には、６個のヌクレオチド標的配列には、２つのフィンガー結合ドメインが結合し、９個のヌクレオチド標的配列には、３つの結合ドメインが結合するなどである。標的部位における、個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわちサブ部位）は、マルチフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間（すなわち、フィンガー間のリンカー）のアミノ酸配列の長さ及び性質に応じて、連続している必要はなく、１つまたは数個のヌクレオチドによって隔てられていることができる。いくつかの実施形態では、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、個別のジンクフィンガーリピートを３〜６個含み、それぞれ、９〜１８塩基対を認識できる。
【０２３３】
ジンクフィンガー結合ドメインは、所定の配列に結合するように操作できる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。操作ジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比べて、新規な結合特異性を有することができる。操作方法としては、合理的設計及び様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限らない。
【０２３４】
ジンクフィンガードメインによる結合について標的ＤＮＡ配列を選択することは、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って行うことができる。標的ＤＮＡ配列の選択を行うために、ヌクレオチド配列を単に目視確認することも利用できることは、当業者には明らかであろう。したがって、本明細書に記載されている方法では、標的ＤＮＡ配列を選択するためのいずれの手段も用いることができる。標的部位は概して、少なくとも９ヌクレオチドの長さであるので、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインと結合する。しかしながら、例えば、４つのフィンガーの結合ドメインと１２ヌクレオチドの標的部位との結合、５つのフィンガーの結合ドメインと１５ヌクレオチドの標的部位との結合、または６つのフィンガーの結合ドメインと１８ヌクレオチドの標的部位との結合も可能である。明らかなように、上記よりも大きい結合ドメイン（例えば、７個、８個、９個以上のフィンガー）と、上記よりも長い標的部位との結合も可能である。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＢＣＯＲの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７０８〜７７２または配列番号７０８〜７６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＴＮＦＡＩＰ３の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３４８〜３９６または配列番号３４８〜３８６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ａ〜表６Ｈのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、表６Ｇまたは表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガーシステムは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈのような市販業者から入手可能なジンクフィンガーシステムなど、当該技術分野において知られているジンクフィンガーシステムから選択する。例えば、いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガーシステムは、下記の表７に記載されているジンクフィンガーシステムなど、当該技術分野において知られているジンクフィンガーシステムから選択する。
表７：例示的なジンクフィンガーシステム
【表７−１】
2021518161.tif 000015
【表７−２】
2021518161.tif 000016
【表７−３】
2021518161.tif 000017
【０２４１】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ａ〜表６Ｈのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａの標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番頭４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、選択したＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｆまたは表６Ｇに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー結合ドメインをそれぞれ含む２つ以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、選択したＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のジンクフィンガー結合ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２５０】
そのジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、いずれのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼからも得ることができる。酵素ドメインの由来元とし得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限らない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．及びＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインの供給源として用いることができる。
【０２５１】
本明細書に記載されているＺＦＰの酵素ドメインとして用いるのに適する例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合して、結合部位でまたは結合部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えばタイプＩＩＳ）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、離れていることのできる結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖では、その認識部位から９ヌクレオチドの位置で、もう一方の鎖では、その認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素に由来する酵素ドメイン、及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０２５２】
切断ドメインが結合ドメインから離れていることのできる例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特有の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いて、二本鎖ＤＮＡの標的切断を行うには、ＦｏｋＩ酵素ドメインをそれぞれ含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性を持つ切断ドメインを再構成できる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。
【０２５３】
２．ＴＡＬＥＮシステム
ＴＡＬＥＮベースのシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製する。上記のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子調節システムで用いるのに適する例示的な酵素ドメインである。
【０２５４】
ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌が植物に感染する時に、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌によって、そのタイプＩＩＩ分泌システムを介して分泌されるタンパク質である。上記のＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３〜３４個のアミノ酸の反復配列を含むが、１２番目と１３番目のアミノ酸は異なる。これらの２つの位置は、反復可変二残基（ＲＶＤ）といい、可変性が高く、特異的なヌクレオチドの認識と密接に相関する。したがって、適切なＲＶＤを含む反復セグメントの組み合わせを選択することによって、ＴＡＬエフェクタードメインを操作して、特定の標的ＤＮＡ配列と結合するようにできる。ＲＶＤの組み合わせの核酸特異性は、以下のとおりである。すなわち、ＨＤは、シトシンを標的とし、ＮＩは、アデニンを標的とし、ＮＧは、チミンを標的とし、ＮＮは、グアニンを標的とする（ただし、いくつかの実施形態では、ＮＮは、グアニンよりも低い特異性で、アデニンとも結合し得る）。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＣＯＲ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、配列番号７０８〜７７２または配列番号７０８〜７６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＴＮＦＡＩＰ３の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、配列番号３４８〜３９６または配列番号３４８〜３８６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ａ〜表６Ｈのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、表６Ｇまたは表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ａ〜表６Ｈのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢの標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａの標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｄまたは表６Ｅに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、選択したＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、表６Ｆまたは表６Ｇに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ＴＡＬエフェクタードメインをそれぞれ含む２つ以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、選択したＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、その２つ以上のＴＡＬエフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０２６８】
ＴＡＬエフェクターリピートをアセンブルするための方法及び組成物は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：１２，２０１１，ｅ８２を参照されたい。ＴＡＬエフェクターリピートを構築するためのプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから市販されている。
【０２６９】
Ｃ．核酸／タンパク質複合体ベースの遺伝子調節システム
複合型遺伝子調節システムは、部位特異的改変ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的改変ポリペプチド」とは、核酸ガイド分子に結合し、標的核酸配列（例えば、内在性標的ＤＮＡ配列または内在性標的ＲＮＡ配列）に結合するその核酸ガイド分子によってその標的核酸配列に導かれ、（例えば、その標的核酸配列の切断、変異またはメチル化によって）その標的核酸配列を改変するポリペプチドを指す。
【０２７０】
部位特異的改変ポリペプチドは、核酸ガイドと結合する部分及び活性部分という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、部位特異的な酵素活性（例えば、ＤＮＡのメチル化、ＤＮＡまたはＲＮＡの切断、ヒストンのアセチル化、ヒストンのメチル化など）を呈する活性部分を含み、その酵素活性の部位は、ガイド核酸によって決定される。いくつかの場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列を改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する活性部分を含む。別の場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列と関連するポリペプチド（例えばヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボース化活性、脱リボース化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列の転写を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＲＮＡ配列の発現または翻訳を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。
【０２７１】
その核酸ガイドは、内在性標的核酸配列と相補的であり、内在性標的核酸配列と結合できる第１の部分（本明細書では「核酸結合セグメント」という）、及び部位特異的改変ポリペプチドと相互作用できる第２の部分（本明細書では「タンパク質結合セグメント」という）という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントは、単一のポリヌクレオチド分子内に含まれている。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントはそれぞれ、別々のポリヌクレオチド分子内に含まれており、その核酸ガイドは、会合し合って機能的ガイドを形成する２つのポリヌクレオチド分子を含むようになっている。
【０２７２】
その核酸ガイドは、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズすることによって、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節システムの標的特異性を媒介する。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物内に含まれるＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、標的遺伝子のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列である。本明細書で標的遺伝子に言及する場合には、複数の標的遺伝子座（すなわち、特定の標的遺伝子配列の一部（例えば、エキソンまたはイントロン））を含むその特定の遺伝子の完全長ＤＮＡ配列が含まれる。各標的遺伝子座内にあるのは、本明細書に記載されている遺伝子調節システムによって改変できる、より短い領域のＤＮＡ配列（本明細書では「標的ＤＮＡ配列」という）である。さらに、各標的遺伝子座は、「標的改変部位」を含み、その標的改変部位とは、遺伝子調節システムによって誘導される改変の正確な位置（例えば、挿入、欠失もしくは変異の位置、ＤＮＡ切断の位置、またはエピジェネティックな改変の位置）を指す。
【０２７３】
本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、単一の核酸ガイドを含んでも、複数の核酸ガイド（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の核酸ガイド）を含んでもよい。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節システムは、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  Ａｇｏ、すなわちＴｔＡｇｏ）に由来する部位特異的改変ポリペプチドを含む。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  Ａｇｏ  ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、その核酸ガイドは、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である（Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（２０１４），２５８−２６１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＤＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス２システムである。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型システム、Ｖ型システム及びＶＩ型システムという３つの型に分類される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９タンパク質を用いるクラス２  ＩＩ型システムである。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ９（またはそのバリアント）であり、その核酸ガイド分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３としても知られている）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹとしても知られている）及びＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸとしても知られている））を用いるクラス２  Ｖ型システムである。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１２（またはそのバリアント）であり、その核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１３タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２としても知られている）、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ）を用いるクラス２のＶＩ型システムである。（Ｐｙｚｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（２），３４７−３５６を参照されたい。）このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＲＮＡリボエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１３であり、その核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。
【０２７６】
Ｃａｓポリペプチドとは、ｇＲＮＡ分子と相互作用するとともに、ｇＲＮＡ分子に呼応して、標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列に誘導または局在化されることができるポリペプチドを指す。Ｃａｓポリペプチドには、天然のＣａｓタンパク質、及び操作、変更または別段に改変されたＣａｓタンパク質であって、天然のＣａｓ配列とは１つ以上のアミノ酸残基が異なるＣａｓタンパク質が含まれる。
【０２７７】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡ結合セグメント及びタンパク質結合セグメントという２つのセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、１つのＲＮＡ分子に含まれ、そのＤＮＡ結合セグメントは、別の異なるＲＮＡ分子に含まれる。このような実施形態は、本明細書では、「二重分子ｇＲＮＡ」、「二分子ｇＲＮＡ」または「デュアルｇＲＮＡ」という。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子であり、本明細書では、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、包括的な用語であり、二分子ガイドＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの両方を指す。
【０２７８】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的に、ハイブリダイズし合って二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する２つの相補的ヌクレオチド領域を含み、そのｄｓＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質への結合を促す。ｇＲＮＡの核酸結合セグメント（または「核酸結合配列」）は、特異的な標的核酸配列と相補的であり、その配列に結合できるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓポリペプチドと相互作用し、ｇＲＮＡ分子と部位特異的改変ポリペプチドとの相互作用によって、Ｃａｓが内在性核酸配列に結合し、標的核酸配列内または標的核酸配列内周辺で、１つ以上の改変が行われる。標的改変部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的核酸配列との塩基対形成の相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）という短いモチーフの位置（標的ＲＮＡ配列内では、プロトスペーサー隣接配列（ＰＦＳ）という）の両方によって決定される。Ｃａｓが標的核酸配列に結合するには、ＰＡＭ／ＰＦＳ配列が必要となる。様々なＰＡＭ／ＰＦＳ配列が当該技術分野において知られており、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）とともに使用するのに適する（例えば、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６−１１２１及びＳｃｉ  Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から５０塩基対以内に位置する。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から１０塩基対以内に位置する。本発明の方法によって標的にすることができるＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列と標的改変部位との相対的な距離、及び配列特異的かつｇＲＮＡ媒介性のＣａｓ結合を媒介するための特有の２０塩基対の配列の存在によってのみ制限される。いくつかの実施形態では、そのＰＦＳ配列は、標的ＲＮＡ配列の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位のイントロンまたはエキソン内に位置する。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。
【０２８０】
１．Ｃａｓタンパク質
いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質である。本明細書に記載されている方法及び組成物では、様々な種のＣａｓ分子を使用でき、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ．またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅに由来するＣａｓ分子が挙げられる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、天然のＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａともいう）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３及びＣｓｆ４からなる群から選択する。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質のようなエンドリボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａタンパク質（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５５０  （２０１７），２８０−２８４）、Ｃａｓ１３ｂタンパク質（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９−１０２７）、Ｃａｓ１３ｃタンパク質（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９−１０２７）またはＣａｓ１３ｄタンパク質（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １７５（２０１８），２１２−２２３）である。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型または天然のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログである。野生型Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するためのＨＮＨヌクレアーゼドメイン、及び非標的鎖を切断するためのＲｕｖＣ様ドメインを用いるマルチドメイン酵素である。ｇＲＮＡの特異性に基づき、野生型Ｃａｓ９がＤＮＡに結合すると、二本鎖ＤＮＡが切断され、この切断部は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）によって修復できる。例示的な天然のＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載されており、追加のＣａｓ９オルソログは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号に記載されている。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１５細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラ��ター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリーまたはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、天然のＣａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９及びＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６に記載されているＣａｓ９アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるアミノ酸配列を含む。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、
（ａ）ニッカーゼ活性、すなわち、一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
（ｂ）二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を起こす能力（一実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である）、
（ｃ）エンドヌクレアーゼ活性、
（ｄ）エキソヌクレアーゼ活性及び／または
（ｅ）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力、
という活性のうちの１つ以上を含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、様々な修復機序による、標的配列の修復の可能性または修復率をさらに向上させるために、ＤＮＡ損傷シグナル伝達タンパク質、エキソヌクレアーゼまたはホスファターゼを動員する異種タンパク質に融合されている。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、野生型Ｃａｓポリペプチドを核酸修復鋳型と共発現させる。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、（例えば、それぞれに異なるＰＡＭ配列選択性、酵素活性の向上または低下、細胞傷害性レベルの上昇または低下、ＮＨＥＪ、相同配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断などのバランスの変更のために）それぞれに異なるＣａｓタンパク質の様々な酵素特性を活用するためには、それぞれに異なるＣａｓタンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣａｓ９タンパク質）が、提供する各種方法で用いるものとして有益である場合がある。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡというＰＡＭ配列モチーフを認識する（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３；３３９（６１２１）：８２３−８２６）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧＮＧ及び／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２７（５９６２）：１６７−１７０及びＤｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ及び／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＡＴＴまたはＮＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｈ，ＰＮＡＳ  ２０１３，１−６を参照されたい）。上記の実施形態では、Ｎは、いずれのヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれであることもできる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉに由来するＣａｓ１３タンパク質であり、３’の単一のＡ、ＵまたはＣというＰＦＳ配列モチーフを認識する。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９０％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載されているＣａｓタンパク質と１００％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。
【０２９０】
２．Ｃａｓ変異体
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドの１つ以上の特性を改変させるために操作されている。例えば、いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、酵素特性が改変されており、例えば、（天然のＣａｓ分子もしくは他の参照Ｃａｓ分子と比べて）ヌクレアーゼ活性が改変されているか、またはヘリカーゼ活性が改変されている。いくつかの実施形態では、操作Ｃａｓポリペプチドは、その大きさを改変させる改変、例えば、そのＣａｓポリペプチドの別の特性に有意な影響を及ぼさずに、その大きさを縮小させる、アミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作Ｃａｓポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含む。例えば、操作Ｃａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように改変させることができる。
【０２９１】
所望の特性を有するＣａｓポリペプチドは、いくつかの方法で作製することができ、その方法としては、所望の特性を有する変異体または改変型のＣａｓポリペプチドを得られるように、天然のＣａｓポリペプチドまたは親Ｃａｓポリペプチドを改変することが挙げられる。例えば、１つ以上の変異を親Ｃａｓポリペプチド（例えば、天然のＣａｓポリペプチドまたは操作Ｃａｓポリペプチド）の配列に導入できる。このような変異及び相違は、置換（例えば、保存的置換もしくは重要ではないアミノ酸の置換）、挿入または欠失を含んでよい。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、親Ｃａｓポリペプチドに対して１個以上の変異（例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個または５０個の変異）を含む。
【０２９２】
一実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、天然のＣａｓポリペプチドとは異なる切断特性を含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓは、不活性型Ｃａｓ（ｄＣａｓ）変異体である。このような実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、いずれの内在性酵素活性も含まず、標的核酸切断を媒介できない。このような実施形態では、そのｄＣａｓは、非切断ベースの形式で標的核酸を改変できる異種タンパク質と融合してよい。例えば、いくつかの実施形態では、ｄＣａｓタンパク質は、転写活性化因子または転写抑制因子のドメイン（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘ）、ＥＲＦ抑制ドメイン（ＥＲＤ）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）など）に融合されている。いくつかのこのような場合では、そのｄＣａｓ融合タンパク質は、ｇＲＮＡによって、標的核酸における所定の位置（すなわち配列）に導かれて、座位特異的な調節（ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合のブロック（それにより、転写活性化因子の機能を選択的に阻害する）及び／または局在的なクロマチンの状態の改変（例えば、標的ＤＮＡを改変するか、もしくは標的ＤＮＡと関連するポリペプチドを改変する融合配列を用いる場合）など）を行う。いくつかのケースでは、その変化は、一過性である（例えば、転写の抑制または活性化）。いくつかのケースでは、その変化は、遺伝性である（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡと関連するタンパク質、例えばヌクレオソームヒストンに、エピジェネティックな改変を加える場合）。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓは、ｄＣａｓ１３変異体である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １７３（２０１８），６６５−６７６）。そして、これらのｄＣａｓ１３変異体は、ＲＮＡを改変する酵素に融合でき、その酵素としては、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２）が挙げられる。アデノシンデアミナーゼは、アデニンをイノシンに変換し、そのイノシンを翻訳機構がグアニンのように扱うことにより、ＲＮＡ配列において、機能上はＡ→Ｇという変更が行われる。いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓは、ｄＣａｓ９変異体である。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、その変異体のＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体である。Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体は、触媒活性を持つドメインを１つだけ含む（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）。このＣａｓ９ニッカーゼ変異体は、ｇＲＮＡ特異性に基づくＤＮＡ結合性を保持するが、切断できるのは、ＤＮＡの一方の鎖のみであることから、一本鎖切断（例えば「ニック」）が生じる。いくつかの実施形態では、同じ細胞内で、２つの相補的Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（例えば、ＲｕｖＣドメインが不活化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体、及びＨＮＨドメインが不活化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体）が、２つのそれぞれの標的配列（ＤＮＡセンス鎖上の１つの標的配列、及びＤＮＡアンチセンス鎖上の１つの標的配列）に対応する２つのｇＲＮＡとともに発現する。このデュアルニッカーゼシステムにより、ずれた位置で二本鎖切断が行われ、二本鎖切断を起こすのに充分なほど近くで２つのオフターゲットニックが生じる可能性が低くなるので、標的特異性を向上させることができる。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体を核酸修復鋳型と共発現させる。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣａｓポリペプチドを操作して、そのＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を改変できる。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、ＰＡＭ／ＰＦＳ特異性が、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性とは異なる。例えば、オフターゲット部位を減少させるか、特異性を向上させるか、またはＰＡＭ／ＰＦＳ認識要件を排除するために、天然のＣａｓタンパク質を改変して、その変異体Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ／ＰＦＳ配列を改変できる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を改変して、ＰＡＭ／ＰＦＳ認識配列の長さを長くできる。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１５個のアミノ酸の長さである。指向性進化法を用いて、異なるＰＡＭ／ＰＦＳ配列を認識する、及び／またはオフターゲット活性が低減されたＣａｓポリペプチドを作製できる。Ｃａｓポリペプチドの指向性進化法で使用できる例示的な方法及びシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７２（７３４４）：４９９−５０３に記載されている。
【０２９６】
例示的なＣａｓ変異体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６１２７６号及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １７３（２０１８），６６５−６７６に記載されており、これらは、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０２９７】
３．ｇＲＮＡ
本開示は、部位特異的改変ポリペプチドを所定の標的核酸配列に誘導するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、「核酸ターゲティングドメイン」または「ターゲティングドメイン」、及びタンパク質結合セグメントを含む。そのターゲティングドメインは、「スペーサー」配列と称することもあり、標的核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、ｇＲＮＡのターゲティングドメインセグメントは、配列特異的な形で、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対形成）によって標的核酸と相互作用し、ｇＲＮＡが結合する、標的核酸内の位置を決定する。ｇＲＮＡのターゲティングドメインセグメントを（例えば遺伝子操作によって）改変して、標的核酸配列内の所望の配列にハイブリダイズさせることができる。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約１３〜約２２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１または２２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約２０ヌクレオチド長である。
【０２９８】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的改変ポリペプチド（例えばＣａｓタンパク質）と相互作用して、そのｇＲＮＡ及びその部位特異的改変ポリペプチドを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。そして、ｇＲＮＡのターゲティングドメインセグメントが、結合した部位特異的改変ポリペプチドを、上記のスペーサー配列によって、標的核酸内の所定のヌクレオチド配列に導く。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるとともに、二本鎖ＲＮＡを形成する少なくとも２つのヌクレオチド領域を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、「足場」セグメントまたは「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称することもある。いくつかの実施形態では、そのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約３０〜約１８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約４０〜約９０ヌクレオチド長、約５０〜約９０ヌクレオチド長、約６０〜約９０ヌクレオチド長、約６５〜約８５ヌクレオチド長、約７０〜約８０ヌクレオチド長、約６５〜約７５ヌクレオチド長または約７５〜約８５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長、７２ヌクレオチド長、７３ヌクレオチド長、７４ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、７６ヌクレオチド長、７７ヌクレオチド長、７８ヌクレオチド長、７９ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、８１ヌクレオチド長、８２ヌクレオチド長、８３ヌクレオチド長、８４ヌクレオチド長、８５ヌクレオチド長、８６ヌクレオチド長、８７ヌクレオチド長、８８ヌクレオチド長または約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号３４（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３３９（６１２１）：８２３−８２６を参照されたい）、配列番号３５〜３６（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１０６２３６号を参照されたい）、配列番号３７〜３９（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｍａｒ  ３１；４７１（７３４０）：６０２−６０７を参照されたい）または配列番号４０（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３；１５５（７）；１４７９−１４９１を参照されたい）のＤＮＡ配列によってコードされる核酸配列を含む。上記のｔｒａｃｒ配列のいずれも、本明細書に記載されているｇＲＮＡターゲティングドメインの実施形態のいずれかと組み合わせて用いるのに適している。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む（すなわち、「デュアルｇＲＮＡ」）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子を含む（すなわち、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」）。本明細書では、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語を使用する際には、デュアルｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの両方が含まれる。デュアルｇＲＮＡは、「ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ」（または「ｃｒＲＮＡ」）及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という２つの別個のＲＮＡ分子を含む。ｃｒＲＮＡ分子は、「ｔｒａｃｒメイト」配列に共有結合したスペーサー配列を含む。そのトレーサーメイト配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子内の対応する配列と相補的であるヌクレオチド領域を含む。このｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒ配列とトレーサーメイト配列の相補性によって、互いにハイブリダイズする。
【０３００】
いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。このような実施形態では、その核酸ターゲティング配列及びタンパク質結合配列は、スペーサー配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に融合されていることによって、単一のＲＮＡ分子に存在する。いくつかの実施形態では、そのｓｇＲＮＡは、約５０〜約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｓｇＲＮＡは、約７５〜約１５０または約１００〜約１２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｓｇＲＮＡは、約１００ヌクレオチド長である。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡは、標的座位内の標的核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相補的であるか、または１００％相補的であるターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、ＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、ＤＮＡ標的配列である。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。ＣＢＬＢを標的とするのに適する追加のｇＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１７／０１７５１２８号に記載されている。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＴＮＦＡＩＰ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、配列番号３４８〜３９６または配列番号３４８〜３４８６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＢＣＯＲ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、配列番号７０８〜７７２または配列番号７０８〜７６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ａ〜表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ａまたは表６Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＺＣ３Ｈ１２Ａの配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ｃまたは表６Ｄに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ｅまたは表６Ｆに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、本発明で提供するｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、表６Ｇまたは表６Ｈに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子（例えば、表２から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３から選択した標的遺伝子（例えば、表３から選択した遺伝子）の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ａ〜６Ｈのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ａまたは表６Ｂのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＧＮＡＳから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号８１４〜１０６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａの標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｃまたは表６Ｄのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１５０９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１０６５〜１２６４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｅまたは表６Ｆのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの少なくとも１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５１０〜１５３８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＧＡＴＡ３、ＢＣＬ３、ＴＮＩＰ１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＡＮＫ、ＦＯＸＰ３、ＲＣ３Ｈ１、ＴＲＡＦ６、ＩＫＺＦ２、ＣＢＬＢ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＰＴＰＮ６、ＰＤＣＤ１またはＢＣＯＲから選択した標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表５Ａまたは表５Ｂに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、表６Ｇまたは表６Ｈのうちの１つに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５４〜４９８または配列番号４９９〜８１３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、２つ以上のｇＲＮＡ分子を含み、そのｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ＣＢＬＢ遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡうちの少なくとも１つは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡうちの少なくとも１つは、配列番号４９９〜５２４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含み、そのｇＲＮＡうちの少なくとも１つは、配列番号１５３９〜１５６６のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または１００％同一である核酸配列によってコードされるターゲティングドメインを含む。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、特定の標的座位または標的遺伝子に特有である標的配列を特定するための、当該技術分野において知られているアルゴリズム（例えばＣａｓ−ＯＦＦ  ｆｉｎｄｅｒ）を用いて、オフターゲット結合を最小限にするように設計されている。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を付与する１つ以上の改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドを含むことができる。このような実施形態では、これらの改変ｇＲＮＡは、非改変ｇＲＮＡと比べて、自然免疫の低下を誘発し得る。「自然免疫応答」という用語には、概ねウイルスまたは細菌由来の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答が含まれ、その応答には、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、ならびに細胞死の誘導が伴う。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、５’末端または５’末端近傍（例えば、その５’末端から１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチドまたは１〜２ヌクレオチド以内）が改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核ｍＲＮＡのキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログまたは３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））を含めることによって改変されている。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させたｇＲＮＡが、ホスファターゼ（例えば仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）で処理して５’三リン酸基を除去することによって改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチドまたは１〜２ヌクレオチド以内）に改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つ以上（例えば、２５〜２００個）のアデニン（Ａ）残基を付加することによって改変されている。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、ｇＲＮＡに存在できるが、他の遺伝子調節システム、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡベースのシステムにも存在し得る。いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、
（ａ）結合していないリン酸酸素及び／またはホスホジエステル骨格結合において結合しているリン酸酸素のうちの１つ以上のうちの一方または両方の改変、例えば置換、
（ｂ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば置換、
（ｃ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーへの大幅な置換、
（ｄ）天然の核酸塩基の改変または置換、
（ｅ）リボース−リン酸骨格の置換または改変、
（ｆ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変、例えば、末端のリン酸基の除去、改変もしくは置換、またはある部分のコジュゲーション、ならびに
（ｇ）糖の改変、
のうちの１つ以上を含むことができる。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、上に列挙した改変を組み合わせて、改変を２個、３個、４個または５個以上有し得る改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドをもたらすことができる。例えば、いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドは、改変糖及び改変核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのすべての塩基が改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基のすべてが、それぞれホスホロチオエート基に置き換わっている。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、例えば、ゲノム全体における総オフターゲット活性を最小限にするために、ソフトウェアツールを用いて、ユーザーの標的配列内におけるｇＲＮＡの選択を最適化することができる。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９を用いる場合の考え得る各ｇＲＮＡの選択を行う際には、ソフトウェアツールによって、ゲノム全体において、ある特定の数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）以下のミスマッチ塩基対を含むすべての潜在的オフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧのいずれかのＰＡＭの直前に位置する）を特定できる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験によって導出した重み付けスキームを用いて予測することができる。そして、考え得る各ｇＲＮＡをオフターゲット切断の総予測数によってランク付けし、上位のｇＲＮＡは、オンターゲット切断の可能性が最も高く、オフターゲット切断の可能性が最も低いｇＲＮＡとなる。そのツールには、他の機能、例えば、ｇＲＮＡベクターの構築用試薬の自動設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用プライマーの設計、次世代シーケンシングによってオフターゲット切断のハイスループットの検出及び定量を行うためのプライマーの設計の機能も含まれていることがある。
【０３２３】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをコードするポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよく、組み換えたもの、合成したもの、単離したもののいずれかであってよい。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡまたは組み換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限らない。ポリヌクレオチドとは、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、少なくとも４０ヌクレオチド長、少なくとも５０ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、少なくとも５００ヌクレオチド長、少なくとも１０００ヌクレオチド長、少なくとも５０００ヌクレオチド長、少なくとも１００００ヌクレオチド長、少なくとも１５０００ヌクレオチド長、またはこれを上回るヌクレオチド長のヌクレオチドポリマー形態（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変形態のいずれか）、ならびにあらゆる中間の長さのものを指す。この文脈においては、「中間の長さ」とは、示されている値の間のいずれの長さ（６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長など、１０１ヌクレオチド長、１０２ヌクレオチド長、１０３ヌクレオチド長など、１５１ヌクレオチド長、１５２ヌクレオチド長、１５３ヌクレオチド長など、２０１ヌクレオチド長、２０２ヌクレオチド長、２０３ヌクレオチド長など）も意味することは容易にわかるであろう。
【０３２４】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてよい。本明細書で使用する場合、「コドン最適化」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性及び／または活性を向上させるために、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内のコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす要因としては、（ｉ）２つ以上の生物もしくは遺伝子間または合成的に構築したバイアス表間におけるコドンバイアスのばらつき、（ｉｉ）生物、遺伝子または遺伝子セットにおけるコドンバイアスの程度のばらつき、（ｉｉｉ）コドンコンテクストを含むコドンの系統的なばらつき、（ｉｖ）コドンをデコードするｔＲＮＡによる、コドンのばらつき、（ｖ）トリプレット全体またはトリプレットの１つの位置のいずれかのＧＣ％による、コドンのばらつき、（ｖｉ）参照配列、例えば天然の配列との類似性の程度のばらつき、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフのばらつき、（ｖｉｉｉ）そのＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの構造的特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計のベースとなるＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸に対するコドンセットの系統的なばらつき、（ｘｉ）偽翻訳開始部位の単離除去、及び／または（ｘｉｉ）偶発性のポリアデニル化部位の除去（除去しなければ、短縮型ＲＮＡ転写産物が合成される）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限らない。
【０３２５】
「配列同一性」という記載、または例えば、「〜と５０％同一である配列」を含む記載は、本明細書で使用する場合、配列が、比較ウィンドウにわたって、ヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。「比較ウィンドウ」とは、ある配列と、連続した位置が同じ数である参照配列とを最適にアラインメントした後に、その２つの配列を比較する際の概念上のセグメントであって、連続した位置が少なくとも６個、一般的には約５０〜約１００個、より一般的には約１００〜約１５０個である概念上のセグメントを指す。したがって、「配列同一性（％）」は、最適にアラインメントした２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較し、両方の配列において、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が同一であるかまたはアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が同一である位置の数を決定して、一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性（％）を求めることによって算出し得る。
【０３２６】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列との配列同一性が充分な値であるポリヌクレオチド、または下に定義されているストリンジェントな条件で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語には、参照ポリヌクレオチドと比べて、１つ以上のヌクレオチドを付加もしくは欠失させたか、または異なるヌクレオチドに置換したポリヌクレオチドが含まれる。これに関しては、変異、付加、欠失及び置換を含む、ある特定の改変を参照ポリヌクレオチドに加えることによって、その改変ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的な機能または活性を保持するようにできることは、当該技術分野において充分に理解されているであろう。
【０３２７】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列との配列同一性が、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【０３２８】
さらに、本明細書に記載されているように、遺伝暗号の縮退により、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくはバリアントが数多く存在することは、当業者には明らかであろう。これらのポリヌクレオチドには、いずれの天然型遺伝子のヌクレオチド配列との相同性も最小限であるものもある。それにもかかわらず、特定の実施形態では、コドン使用頻度の違いにより様々であるポリヌクレオチド、例えば、ヒトコドン及び／または霊長類動物コドンの選択のために最適化されているポリヌクレオチドが具体的に企図されている。さらに、本発明で提供するポリヌクレオチド配列を含む対立遺伝子を用いてもよい。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加及び／または置換のような１つ以上の変異によって改変されている内在性遺伝子である。
【０３２９】
本発明で企図されているポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の別の箇所に開示されているか、または当該技術分野において知られているように、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチクローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、ならびに自己切断ポリペプチド、エピトープタグをコードするポリヌクレオチドといった他のＤＮＡ配列と組み合わせてよく、そのため、全体の長さは、かなり異なることがある。したがって、特定の実施形態では、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片を使用し得るが、好ましくは、全長は、意図されている組み換えＤＮＡのプロトコールでの調製及び使用のしやすさによって制限されることが想定される。
【０３３０】
ポリヌクレオチドは、充分に確立され、当該技術分野において知られているとともに利用可能である様々な技法のうちのいずれかを用いて、調製、操作及び／または発現できる。
【０３３１】
ベクター
本明細書に記載されている遺伝子調節システムを細胞内で発現させるために、その遺伝子調節システムをコードする発現カセットを適切なベクターに挿入できる。「核酸ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移入または輸送できる核酸分子を指す目的で用いられている。移入される核酸は概して、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入されている。核酸ベクターは、細胞内での自己複製を誘導する配列を含んでも、宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを可能にするのに充分な配列を含んでもよい。
【０３３２】
「発現カセット」という用語は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡを発現させた後に、タンパク質を発現させることができる、ベクター内の遺伝子配列を指す。その核酸カセットは、対象とする遺伝子、例えば遺伝子調節システムを含む。その核酸カセットは、ベクター内に位置的かつ順次的に配置されており、そのカセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合には、タンパク質またはポリペプチドに翻訳され、その形質転換細胞内での活性のために必要となる適切な翻訳後修飾が施され、適切な細胞内区画に誘導されるか、または細胞外区画に分泌されることによって、生物学的活性のために適切な区画に移行することができるようになっている。好ましくは、そのカセットは、ベクターに挿入しやすいように適合された３’末端及び５’末端を有し、例えば、それぞれの末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。そのカセットは、単一のユニットとして取り出して、プラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができる。
【０３３３】
特定の実施形態では、ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、トランスポゾン、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージのようなバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、本発明で開示する遺伝子調節システムを哺乳動物細胞内で発現させるために、その遺伝子調節システムのコード配列を上記のようなベクターにライゲーションできる。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターを用いて、本発明で企図されている１つ以上のポリヌクレオチドを免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に送達する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、プラスミドである。数多くの好適なプラスミド発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例えば、真核宿主細胞用では、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）というベクターが供給されている。しかしながら、宿主細胞と適合するものであれば、いずれの他のプラスミドベクターも使用し得る。使用する細胞の種類及び遺伝子調節システムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照されたい）。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、ウイルスベクターである。好適なウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４及びＷＯ９５／００６５５を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６、ＳｒｉｖａｓｔａｖａによるＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９を参照されたい）をベースとするウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス及び乳癌ウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクター）などが挙げられるが、これらに限らない。ベクターの例は、哺乳動物細胞での発現用のｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞内でレンチウイルスの媒介によって遺伝子の移入及び発現を行うためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、そのベクターは、非組み込み型ベクターであり、そのベクターとしては、エピソーマルベクター、または染色体外に保持されるベクターが挙げられるが、これらに限らない。本明細書で使用する場合、「エピソーマル」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれなくても、分裂宿主細胞から徐々に喪失することなく複製できるベクターを指し、前記ベクターが、染色体外でまたはエピソーマルに複製することも意味する。このベクターは、リンパ指向性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母に由来するＤＮＡ複製開始点、すなわち「ｏｒｉ」、特には、リンパ指向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製開始点であって、ＥＢＶのｏｒｉＰに対応する複製開始点をコードする配列を有するように操作されている。特定の態様では、そのリンパ指向性ヘルペスウイルスは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ）またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であってよい。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、ガンマヘルペスウイルスの例でもある。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、トランスポゾンベクターシステムを用いて、標的細胞または宿主細胞に導入する。ある特定の実施形態では、そのトランスポゾンベクターシステムは、転移因子、及び本発明で企図されているポリヌクレオチド、ならびにトランスポザーゼを含むベクターを含む。一実施形態では、そのトランスポゾンベクターシステムは、単一のトランスポザーゼベクターシステムであり、例えば、ＷＯ２００８／０２７３８４を参照されたい。例示的なトランスポザーゼとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓ１、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、Ｈｉｍａｒ  Ｉ、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ及びこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限らない。ｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えば米国特許第６，９６２，８１０号に記載されており、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙのトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えばＩｚｓｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：９３−１０２（２０００）に記載されており、この文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される。Ｔｏｌ２のトランスポゾンは、メダカであるＯｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓから初めて単離されたものであり、トランスポゾンのｈＡＴファミリーに属するが、このトランスポゾンは、Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）に記載されている。ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ２は、Ｔｏｌ２のバリアントであり、Ｂａｌｃｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）に記載されている。Ｔｏｌ２及びｍｉｎｉ−Ｔｏｌ２のトランスポゾンは、Ｔｏｌ２のトランスポザーゼと共作用すると、導入遺伝子が生物のゲノムに組み込まれるように促す。Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅのトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えばＭｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３−６８８１（２００３）に記載されている。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、調節エレメント、例えば、プロモーターのような転写調節エレメントに機能可能に連結されている。「調節エレメント」とは、ベクターの非翻訳領域のうち、転写及び翻訳を行うために宿主細胞タンパク質と相互作用する非翻訳領域（例えば、複製開始点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’の非翻訳領域）を指す。このようなエレメントは、強度及び特異性が様々であり得る。この転写調節エレメントは、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または原核細胞（例えば、細菌細胞もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能するものであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方でポリヌクレオチドの発現を可能にする複数の調節エレメントに機能可能に連結されている。
【０３３９】
使用する細胞の種類及び遺伝子調節システムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照されたい）。「プロモーター」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の部位のうち、ＲＮＡポリメラーゼが結合する認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに機能可能に連結されたポリヌクレオチドを開始させ、転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で機能するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域、及び／または転写開始部位から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列、すなわちＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは、いずれのヌクレオチドであってもよい）を含む。「エンハンサー」という用語は、転写を増大させることができる配列を含むとともに、いくつかの場合では、別のコントロール配列に対するその配向とは無関係に機能し得るＤＮＡセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーター及び／または他のエンハンサーエレメントと連携する形、あるいはプロモーター及び／または他のエンハンサーエレメントに付加される形で機能し得る。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。「機能可能に連結された」という用語は、記載されている構成成分が、意図されてとおりに機能できる関係で並置されていることを指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現コントロール配列（プロモーター及び／またはエンハンサーなど）と、第２のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドが機能的に連結されていることを指し、その発現コントロール配列は、その第２の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
【０３４１】
好適な真核生物プロモーター（真核細胞で機能するプロモーターを含む）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、初期ＳＶ４０プロモーター及び後期ＳＶ４０プロモーター）、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、レトロウイルスに由来する長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーターまたはラウス肉腫ウイルス（ＲＡＶ）ＬＴＲプロモーター）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスに由来するＨ５、Ｐ７．５及びＰ１１プロモーター、伸長因子１−α（ＥＦ１α）プロモーター、初期成長応答１（ＥＧＲ１）プロモーター、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）プロモーター、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）プロモーター、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）プロモーター、ヒートショックタンパク質９０ｋＤａ  βメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）プロモーター、ヒートショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）プロモーター、β−キネシン（β−ＫＩＮ）プロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６座プロモーター（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ネガティブコントロール領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）（ＭＮＤ）プロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は充分に、当業者のレベルの範囲内である。その発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターも含んでよい。その発現ベクターは、発現を増幅させるための適切な配列も含んでよい。その発現ベクターは、部位特異的改変ポリペプチドに融合されるタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列も含み、それにより、キメラポリペプチドが得られるようになっていてもよい。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに機能可能に連結されている。このような実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするそのポリヌクレオチドは、細胞内で構成的に及び／または遍在的に発現する。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能可能に連結されている。このような実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドは、条件的に発現する。本明細書で使用する場合、「条件的発現」とは、いずれの種類の条件的発現も指してよく、条件的発現としては、誘導性発現、抑制的発現、特定の生理学的状態、生物学的状態または病態を有する細胞または組織内での発現（例えば、細胞の種類または組織に特異的な発現）などが挙げられるが、これらに限らない。誘導性プロモーター／誘導性システムの実例的な例としては、ステロイド誘導性プロモーター（グルココルチコイド受容体またはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンによる処理によって誘導可能）など）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属による処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、ミフェプリストン調節性システム「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ，３２３：６７）、キュメート誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節システムなどが挙げられるが、これらに限らない。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、転写終結シグナルをさらに含む。異種の核酸転写産物の効率的な終結及びポリアデニル化を誘導するエレメントが、異種の遺伝子の発現を増加させる。転写終結シグナルは概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。特定の実施形態では、ベクターは、発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側に、ポリアデニル化配列を含む。「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結及びポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡテールをコード配列の３’末端に付加することによって、ｍＲＮＡの安定性を促進することで、翻訳効率の向上に寄与することができる。切断及びポリアデニル化は、ＲＮＡ内のポリ（Ａ）配列によって誘導される。哺乳動物ｐｒｅ−ｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断−ポリアデニル化部位を挟み込んでいる２つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡという六量体が、Ｕ残基またはＧＵ残基に富む、より可変性の高いエレメントから２０〜５０ヌクレオチド上流に存在する。新生転写物の切断は、これらの２つのエレメントの間で行われ、最大で２５０個のアデノシンを５’切断産物に付加することと共役している。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、これらのバリアント、または当該技術分野において知られている別の好適な異種もしくは内在性のポリＡ配列である。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、ベクターは、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のためのシグナルペプチド）をコードする配列が、本発明のシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合されたものも含んでよい。例えば、ベクターは、本発明のシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合された核局在化配列（例えば、ＳＶ４０に由来する核局在化配列）を含んでよい。
【０３４６】
ポリヌクレオチド及び組み換えベクターを宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において知られており、いずれかの既知の方法を用いて、遺伝子調節システムの構成成分を細胞に導入できる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、バクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子仲介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１２  Ｓｅｐ  １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９を参照されたい）、マイクロフルイディクス送達方法（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５９３４３号を参照されたい）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションによる送達は、細胞と、遺伝子調節システムの構成成分とをカートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で混合すること、ならびに電気的刺激を所定の期間及び振幅で１回以上加えることを含む。いくつかの実施形態では、細胞と、遺伝子調節システムの構成成分との混合物をカートリッジ、チャンバーまたはキュベットに送る装置（例えばポンプ）に連結した反応容器で、細胞を遺伝子調節システムの構成成分と混合し、電気的刺激を１回以上、所定の期間及び振幅で加えた後、その細胞を第２の反応容器に送る。特定の実施形態で想定されている特定の実施形態で用いるのに適するポリヌクレオチド送達システムの実例的な例としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｏｎ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって供給されているものが挙げられるが、これらに限らない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的なリポフェクションに適するカチオン性脂質及び中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７及びＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、ウイルスによる送達方法、例えばウイルストランスダクションによって、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、ウイルス以外による送達方法によって、細胞に導入する。特定の実施形態で想定されている、ウイルス以外によってポリヌクレオチドを送達する実例的な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介移入、遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）及びヒートショックが挙げられるが、これらに限らない。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分または遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、トランスポゾン、ナノ粒子（例えば脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、弱毒化細菌またはウイルス様粒子のようなウイルス以外の送達ビヒクルで、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、弱毒化細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ある特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ及び改変Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを含め、天然の細菌または人工的に操作されて、侵襲性であるが、発病を防ぐように弱毒化されている細菌）、標的特異的な細胞に対して栄養特異的及び組織特異的なトロピズムを有する細菌、標的細胞特異性を変化させるために、表面タンパク質が改変された細菌である。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、遺伝子改変バクテリオファージ（例えば、パッケージング能が大きく、免疫原性が小さめであり、哺乳動物のプラスミド保持配列を含み、ターゲティングリガンドが組み込まれた操作ファージ）である。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、哺乳動物のウイルス様粒子である。例えば、（例えば、「空の」粒子を精製してから、ｅｘ  ｖｉｖｏでウイルスを所望のカーゴとともにアセンブルすることによって）改変ウイルス粒子を作製できる。そのビヒクルを操作して、ターゲティングリガンドを組み込んで、標的組織特異性を改変することもできる。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、生体リポソームである。例えば、その生体リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、赤血球ゴースト（対象に由来する赤血球を溶血させ、球体構造にしたものであり、組織ターゲティングは、様々な組織特異的または細胞特異的リガンドの結合によって実現できる））、分泌エクソソーム、すなわち、対象から得られる、エンドサイトーシス由来の膜結合型ナノベシクル（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な種類の細胞から産生され得るので、ターゲティングリガンドを必要とすることなく、細胞に取り込ませることができる）である。
【０３４９】
Ｖ．改変免疫エフェクター細胞の作製方法
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞集団に導入することを含み、その遺伝子調節システムは、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。
【０３５０】
本明細書に記載されている遺伝子調節システム、例えば、核酸ベース、タンパク質ベースまたは核酸／タンパク質ベースのシステムの構成成分は、様々な送達方法及び製剤を用いて、様々な形態で標的細胞に導入できる。いくつかの実施形態では、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを組み換えベクター（例えば、上記のウイルスベクターまたはプラスミド）によって送達する。いくつかの実施形態では、そのシステムが、２つ以上の構成成分を含む場合には、ベクターは、そのシステムの構成成分をそれぞれコードする複数のポリヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、そのシステムが、２つ以上の構成成分を含む場合には、複数のベクターを用いてもよく、その各ベクターは、そのシステムの特定の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行う。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行う。
【０３５１】
特定の実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行う。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、培養でさらなる操作を行わずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで改変する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、さらなる活性化ステップ及び／または増殖ステップなしに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子調節システムを導入することを含む。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、改変及びさらなる操作を行う。例えば、いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、遺伝子調節システムの導入前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで活性化及び／または増殖させる。いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入してから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、活性化及び／または増殖させる。いくつかの実施形態では、改変に成功した細胞を、改変に失敗した細胞から（例えばフローサイトメトリーによって）選別及び／または単離して、改変免疫エフェクター細胞の精製集団を作製できる。続いて、改変に成功したこれらの細胞をさらに増殖させて、改変細胞数を増加させ、及び／または将来使用するために凍結保存することができる。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞集団を得ることを含む方法を提供する。免疫エフェクター細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、成長を支えるのに必要な様々な培養条件下、例えば、適切な温度（例えば３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）、ならびに適切な培養培地で培養してよい。培養培地は、液体または半固体、例えば、寒天、メチルセルロースなどを含むものであってよい。細胞培養培地の実例的な例としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミンが添加されており、無血清であるか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）または所定のホルモン群、及び／またはその免疫エフェクター細胞を成長及び増殖させるのに十分な量のサイトカイン（複数可）が添加されている最小必須培地（ＭＥＭ）、イスコブ改変ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、クリック培地、ＡＩＭ−Ｖ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、Ｘ−Ｖｉｖｏ２０及びＯｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられる。
【０３５３】
培養培地には、増殖及び生存能に必要な１つ以上の因子を添加してもよく、その因子としては、血清（例えば、約５％〜１０％のウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ−αのような成長因子が挙げられるが、これらに限らない。Ｔ細胞を増殖させるための他の添加剤の実例的な例としては、界面活性剤、プラスマネート、ＨＥＰＥＳのようなｐＨ緩衝剤、ならびにＮ−アセチル−システイン及び２−メルカプトエタノールのような還元剤、あるいはＬ−グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノールなど、細胞を成長させるのに適するいずれかの他の添加剤であって、当業者に知られているいずれかの他の添加剤、及び／または抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンが挙げられるが、これらに限らない。典型的には、抗生物質は、実験培養液のみに含め、対象に注入することになる細胞の培養液には含めない。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、対象に由来する試料から得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団を第１の対象から得て、本明細書に記載されている方法によって作製した改変免疫エフェクター細胞集団を第２の異なる対象に投与する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団を対象から得て、本明細書に記載されている方法によって作製した改変免疫エフェクター細胞集団を同じ対象に投与する。いくつかの実施形態では、その試料は、組織試料、流体試料、細胞試料、タンパク質試料、ＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料である。いくつかの実施形態では、組織試料は、いずれの種類の組織に由来してもよく、その組織としては、皮膚、毛髪（毛根を含む）、骨髄、骨、筋肉、唾液腺、食道、胃、小腸（例えば、十二指腸、空腸もしくは回腸の組織）、大腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、腎臓、膀胱、子宮、卵巣、膣、胎盤、精巣、甲状腺、副腎、心臓組織、胸腺、脾臓、リンパ節、脊髄、脳、眼、耳、舌、軟骨、白色脂肪組織または褐色脂肪組織が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、組織試料は、がん性腫瘍、前がん性腫瘍または非がん性腫瘍に由来してもよい。いくつかの実施形態では、流体試料は、口腔スワブ、血液、血漿、口腔粘膜、膣粘膜、末梢血、臍帯血、唾液、精液（ｓｅｍｅｎ）、尿、腹水、胸膜液、髄液、肺洗浄液、涙、汗、精液（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、精漿、前立腺液、射精前液（クーパー液）、排泄物、脳脊髄液、リンパ、１つ以上の細胞集団を含む細胞培養培地、１つ以上の細胞集団を含む緩衝化液などを含む。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、その試料を処理して、免疫エフェクター細胞集団をその試料の残部から濃縮または単離する。ある特定の実施形態では、その試料は末梢血試料であり、その末梢血試料に対しては、後で白血球アフェレーシスを行って、赤血球及び血小板を分離するとともに、リンパ球を単離する。いくつかの実施形態では、その試料は、免疫エフェクター細胞を単離または濃縮できるロイコパックである。いくつかの実施形態では、その試料は、腫瘍試料であって、さらに処理して（すなわち、その腫瘍を断片化し、酵素によって消化して、腫瘍浸潤リンパ球の細胞懸濁液を得ることによってさらに処理して）、その腫瘍に存在するリンパ球を単離する腫瘍試料である。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、本発明で企図されている改変免疫エフェクター細胞の製造方法は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、ならびに米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されているように、免疫エフェクター細胞集団を活性化及び／または増殖させることを含む。
【０３５７】
各種実施形態では、本発明で企図されている改変免疫エフェクター細胞の製造方法は、免疫エフェクター細胞を含む細胞集団を活性化させることを含む。特定の実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞の活性化は、（例えば、Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するか、または表面タンパク質ＣＤ２の刺激を介して）第１の刺激シグナルを供給すること、及びアクセサリー分子を介して第２の共刺激シグナルを供給することによって行うことができる。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞と、好適なＣＤ３結合剤、例えば、ＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体とを接触させることによって刺激してよい。ＣＤ３抗体の実例的な例としては、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、ＣＲＩＳ−７及び６４．１が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２結合剤を用いて、第１の刺激シグナルをＴ細胞に供給してもよい。ＣＤ２結合剤の実例的な例としては、ＣＤ２リガンド及び抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３６：８９７−９０６）、及び９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（Ｔ１１．１と同じエピトープを認識する）（Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００）が挙げられるが、これらに限らない。
【０３５９】
Ｔ細胞応答の誘導には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を介して供給される刺激シグナルに加えて、典型的には、Ｔ細胞上の共刺激分子と特異的に結合するリガンドによって供給される第２の共刺激シグナルが必要とされ、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって供給される第１のシグナルに加えて、その第２のシグナルによって、共刺激シグナルが供給され、その共刺激シグナルが、所望のＴ細胞応答を媒介する。好適な共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体と結合するアゴニストまたは抗体、及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限らない。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、共刺激リガンドは、Ｔ細胞に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、その分子としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合剤を用いて、共刺激シグナルを供給できる。ＣＤ２８結合剤の実例的な例としては、天然のＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然のリガンド（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）のような、Ｂ７ファミリータンパク質のメンバー、ＣＤ２８分子と架橋できる抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２及びＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられるが、これらに限らない。
【０３６１】
ある特定の実施形態では、刺激シグナル及び共刺激シグナルを供給する結合剤は、細胞の表面に局在化させる。この局在化は、その細胞表面でその結合剤を発現させるのに適する形で、その結合剤をコードする核酸を細胞にトランスフェクションもしくはトランスダクションすることによって、あるいは、結合剤をその細胞表面に結合させることによって行うことができる。いくつかの実施形態では、共刺激シグナルは、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）のような抗原提示細胞上に提示させた共刺激リガンドによって供給する。Ｋ５６２細胞、Ｕ９３７細胞、７２１．２２１細胞、Ｔ２細胞またはＣ１Ｒ細胞を操作して、様々な共刺激分子及びサイトカインを安定的に発現及び／または分泌するようにすることによって人工ＡＰＣを作製して、遺伝子改変Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの成長及び長期的な増殖を補佐することができる。特定の実施形態では、Ｋ３２  ａＡＰＣまたはＵ３２  ａＡＰＣを用いて、抗体ベースの刺激分子が１つ以上、ａＡＰＣ細胞表面上に提示されるように誘導する。様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣによって、Ｔ細胞集団を増殖でき、その分子としては、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６が挙げられるが、これらに限らない。例示的なａＡＰＣは、ＷＯ０３／０５７１７１及びＵＳ２００３／０１４７８６９で提供されており、これらの特許は、参照により、その全体が援用される。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、活性化シグナル及び共刺激シグナルを供給する結合剤は、固体表面（例えば、ビーズまたはプレート）に局在化させる。いくつかの実施形態では、活性化シグナル及び共刺激シグナルを供給する結合剤は両方とも、可溶性の形態で供給する（溶液で供給する）。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、１つ以上の増殖フェーズに培養増殖させる。「増殖」とは、免疫エフェクター細胞の数を増加させるために、免疫エフェクター細胞集団を所定の期間にわたって培養することを指す。免疫エフェクター細胞の増殖は、上記の活性化因子のうちの１つ以上を加える、及び／またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及び／またはＩＬ−７）のような１つ以上の成長因子を加えて、細胞の増殖及び／または生存を増強または促進することを含んでよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の増殖フェーズの間に、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び／またはＩＬ−２１を組み合わせたものを培養液に加えることができる。いくつかの実施形態では、その１つ以上の増殖フェーズの間にＩＬ−２を加える量は、６０００Ｕ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態では、その１つ以上の増殖フェーズの間にＩＬ−２を加える量は、約５５００Ｕ／ｍＬ、約５０００Ｕ／ｍＬ、約４５００Ｕ／ｍＬ、約４０００Ｕ／ｍＬ、約３５００Ｕ／ｍＬ、約３０００Ｕ／ｍＬ、約２５００Ｕ／ｍＬ、約２０００Ｕ／ｍＬ、約１５００Ｕ／ｍＬ、約１０００Ｕ／ｍＬまたは約５００Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、その１つ以上の増殖フェーズの間にＩＬ−２を加える量は、約５００Ｕ／ｍＬ〜約５５００Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、増殖プロセスの際に、フィーダー細胞と共培養してよい。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、所定の期間にわたって増殖させ、その所定の期間は、約３０日未満である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、３０日未満、２５日未満、２０日未満、１８日未満、１５日未満または１０日未満である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、４週間未満、３週間未満、２週間未満、または１週間未満である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日または２１日である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約５日〜約２５日、約１０〜約２８日、約１０〜約２５日、約１０〜約２１日、約１０〜約２０日、約１０〜約１９日、約１１〜約２８日、約１１〜約２５日、約１１〜約２１日、約１１〜約２０日、約１１〜約１９日、約１２〜約２８日、約１２〜約２５日、約１２〜約２１日、約１２〜約２０日、約１２〜約１９日、約１５〜約２８日、約１５〜約２５日、約１５〜約２１日、約１５〜約２０日または約１５〜約１９日である。いくつかの実施形態では、その所定の期間は、約５日〜約１０日、約１０日〜約１５日、約１５日〜約２０日または約２０日〜約２５日である。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、細胞数が所定の閾値に達するまで増殖させる。例えば、いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、培養物に少なくとも５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、５×１０１１個、１×１０１２個、５×１０１２個、１×１０１３個または少なくとも５×１０１３個の総細胞数が含まれるようになるまで増殖させる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、培養物に約１×１０９〜約１×１０１１個の総細胞数が含まれるようになるまで増殖させる。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法は、少なくとも２つの増殖フェーズを含む。例えば、いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞集団は、試料から単離した後に増殖させ、増殖を休止させてから、再び増殖させることができる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ある一連の増殖条件で増殖させた後に、第２の異なる一連の増殖条件で、第２ラウンドの増殖を行う。免疫細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１８−０２０７２０１号、同第２０１８０２８２６９４号及び同第２０１７０１５２４７８号、ならびに米国特許第８，３８３，０９９号及び同第８，０３４，３３４号に記載されているように、当該技術分野において知られており、これらの特許は、参照により本明細書に援用される。
【０３６７】
活性化プロセス及び／または増殖プロセスのいずれかの時点に、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入して、改変免疫エフェクター細胞集団を作製できる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、試料から免疫エフェクター細胞を濃縮した直後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、１つ以上の増殖プロセスの前、そのプロセスの最中またはそのプロセスの後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞を試料から濃縮するかまたは対象から採取するかした直後、かつあらゆる増殖ラウンドの前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンドの増殖の後、かつ第２ラウンドの増殖の前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞集団の製造方法であって、免疫エフェクター細胞集団を得ること、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞集団に導入すること、及びその免疫エフェクター細胞集団を１ラウンド以上の増殖で増殖させることを含む方法を提供する。この実施形態のいくつかの態様では、その免疫エフェクター細胞集団は、遺伝子調節システムの導入前に、第１ラウンドの増殖で増殖させ、遺伝子調節システムの導入後に、第２ラウンドの増殖で増殖させる。この実施形態のいくつかの態様では、その免疫エフェクター細胞集団は、遺伝子調節システムの導入前に、第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させる。この実施形態のいくつかの態様では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の前に、その免疫エフェクター細胞集団に導入する。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、対象から腫瘍を取り出し、その腫瘍試料を処理して、（例えば、その腫瘍を断片化し、酵素によって消化して、細胞懸濁液を得ることによって）腫瘍浸潤リンパ球集団を得ること、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞集団に導入すること、及びその免疫エフェクター細胞集団を１ラウンド以上の増殖で増殖させることを含む。この実施形態のいくつかの態様では、その腫瘍浸潤リンパ球集団は、遺伝子調節システムの導入前に、第１ラウンドの増殖で増殖させ、遺伝子調節システムの導入後に、第２ラウンドの増殖で増殖させる。この実施形態のいくつかの態様では、その腫瘍浸潤リンパ球集団は、遺伝子調節システムの導入前に、第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させる。この実施形態のいくつかの態様では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の前に、その腫瘍浸潤リンパ球集団に導入する。
【０３７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法によって作製した改変免疫エフェクター細胞は、直ちに使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明で企図されている製造方法は、保存及び／または対象に使用する際の調製のために、改変免疫細胞を凍結保存することをさらに含んでもよい。本明細書で使用する場合、「凍結保存」とは、（典型的には）７７Ｋ、すなわち−１９６℃（液体窒素の沸点）のような氷点下の温度まで冷却することによって、細胞を保存することを指す。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の保存方法は、解凍時に免疫エフェクター細胞が生存し続けているように、免疫エフェクター細胞を凍結保存することを含む。必要な場合には、凍結保存した改変免疫エフェクター細胞を解凍し、さらなる改変免疫エフェクター細胞を得るために、成長及び増殖させることができる。保存される細胞が、低温での凍結または室温への昇温により損傷するのを防ぐために、凍結保護剤を氷点下の温度で用いる場合が多い。凍結保存剤及び最適な冷却速度によって、細胞の損傷から保護することができる。使用できる凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５９；１８３：１３９４−１３９５、Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６１；１９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９６０；８５：５７６）及びポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６２；１９６：４８）が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その細胞は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝化媒体、または細胞を同様の凍結温度で保存する目的で当該技術分野において一般的に用いられているような何らかの他の同様の溶液で凍結させ、凍結した培養細胞を解凍するためのものとして当該技術分野において一般的に知られている方式で解凍する。
【０３７１】
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた、改変免疫エフェクター細胞の作製
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、標的ＤＮＡ配列と、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを含む複合体とを接触させることを伴う。上で論じたように、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドが複合体を形成し、そのｇＲＮＡのＤＮＡ結合ドメインが、その複合体を標的ＤＮＡ配列に導き、そのＣａｓタンパク質（または酵素活性が不活性なＣａｓタンパク質に融合された異種タンパク質）が、標的ＤＮＡ配列を改変する。いくつかの実施形態では、この複合体は、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（またはｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を細胞に導入した後に、細胞内で形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ核酸であり、細胞にトランスダクションによって導入する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムのＣａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分は、単一のポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡの構成成分をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターに含まれており、ウイルストランスダクションによって細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムのＣａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分は、異なるポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第１のウイルスベクターに含まれ、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、第２のウイルスベクターに含まれる。この実施形態のいくつかの態様では、第２のウイルスベクターよりも前に、第１のウイルスベクターを細胞に導入する。この実施形態のいくつかの態様では、第１のウイルスベクターよりも前に、第２のウイルスベクターを細胞に導入する。このような実施形態では、それらのベクターが組み込まれることにより、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分の発現が持続する。しかしながら、一部の種類の細胞では、Ｃａｓ９の発現の持続により、オフターゲット変異及びオフターゲット切断が増加し得る。したがって、いくつかの実施形態では、トランスフェクションによって、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ核酸配列を細胞集団に導入してもよい。このような実施形態では、Ｃａｓ９の発現は、時間とともに減少することになり、オフターゲット変異部位またはオフターゲット切断部位の数を減少し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質は、エレクトロポレーションによって別々に導入する。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、この複合体は、ｇＲＮＡ分子及びＣａｓタンパク質を一緒に混合し、複合体を形成させるのに充分な期間にわたってインキュベートすることによって、無細胞システムで形成させる。続いて、標的ＤＮＡ配列を改変する目的で、予め形成したこの複合体であって、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む複合体（本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ−リボ核タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＰ）という）を細胞に導入できる。いくつかの実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＰは、細胞にエレクトロポレーションによって導入する。
【０３７３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、改変免疫エフェクター細胞を作製する上記の実施形態のいずれにおいても、そのシステムは、例えば単一編集型の改変免疫エフェクター細胞を作製するために、単一の内在性標的遺伝子を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを含んでよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、改変免疫エフェクター細胞を作製する上記の実施形態のいずれにおいても、そのシステムは、例えばデュアル編集型の改変免疫エフェクター細胞を作製するために、２つ以上の内在性標的遺伝子を標的とする２つ以上のｇＲＮＡを含んでよい。
【０３７４】
Ｂ．ｓｈＲＮＡシステムを用いた、改変免疫エフェクター細胞の作製
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物と相補的である配列を有する１つ以上のｓｈＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。小さな遺伝子カセットを介して、所定のＤＮＡ配列を細胞核に導入することによって、免疫エフェクター細胞を改変して、ｓｈＲＮＡを作製することができる。レトロウイルス及びレンチウイルスの両方を用いて、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを免疫エフェクター細胞に導入することができる。導入されたＤＮＡは、細胞自体のＤＮＡの一部となることも、または核内に存続することもでき、その細胞機構に対して、ｓｈＲＮＡを産生するように命令する。ｓｈＲＮＡは、その細胞内のダイサーまたはＡｇｏ２の媒介によるスライサー活性によって処理して、ＲＮＡｉの媒介による遺伝子ノックダウンを誘導し得る。
【０３７５】
ＶＩ．組成物及びキット
「組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されている遺伝子調節システムまたは改変免疫エフェクター細胞の製剤であって、対象または細胞に投与または送達できる製剤を指す。典型的には、製剤は、あらゆる生理学的に許容可能な組成物（その誘導体及び／またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体もしくは互変異性体を含む）を、いずれかの生理学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤とともに含む。「治療用組成物」または「医薬組成物」（本明細書では同義的に用いられている）は、特定の疾患もしくは障害を治療するために、対象に投与するか、または１つ以上の内在性標的遺伝子を改変するために、細胞と接触させることができる、遺伝子調節システムまたは改変免疫エフェクター細胞の組成物である。
【０３７６】
「薬学的に許容可能な」という表現は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を引き起こさずに、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適するとともに、合理的な効果／リスク比に釣り合う化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す目的で使用する。
【０３７７】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」には、ヒト及び／または飼育動物での使用が認められるものとして、米国食品医薬品局から認可されているいずれのアジュバント、担体、賦形剤、流動化剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張化剤、溶媒、界面活性剤及び／または乳化剤も含まれるが、これらに限らない。例示的な薬学的に許容可能な担体としては、ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖、コーンスターチ及びバレイショデンプンのようなデンプン、セルロース、及びナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースのようなその誘導体、トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオ脂、ワックス、動物性油脂及び植物性油脂、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛、ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油のような油、プロピレングリコールのようなグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で用いられるいずれかの他の適合物質が挙げられるが、これらに限らない。いずれの従来の媒体及び／または作用剤も、本開示の薬剤と適合性がない場合を除き、治療用組成物で用いることが企図されている。補助的な有効成分も、その組成物に組み込むことができる。
【０３７８】
「薬学的に許容可能な塩」には、酸付加塩と塩基付加塩の両方が含まれる。薬学的に許容可能な塩には酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成されるもの）が含まれ、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、及び酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸など（これらに限らない）のような有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などのような無機塩基から誘導することもできる。有機塩基から誘導される塩としては、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などのような一級、二級及び三級アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂の塩が挙げられるが、これらに限らない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。
【０３７９】
湿潤剤、乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような潤沢剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、矯臭剤、保存剤、ならびに抗酸化剤も、その組成物に存在し得る。
【０３８０】
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどのような油溶性抗酸化剤、及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤が挙げられる。
【０３８１】
様々な種類の投与に適する製剤に関するさらなる手引きは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に見ることができる。薬物送達法の簡潔な論評については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照されたい。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている方法を行うためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、
（ａ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
（ｂ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｃ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
（ｄ）１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる改変タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｆ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｈ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｉ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
（ｊ）内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｋ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｌ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｍ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡ、
（ｎ）内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｏ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｐ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｑ）本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞、または
（ｒ）上記をいずれかに組み合わせたもの
を含むことができる。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む。いくつかの免疫チェックポイント阻害剤が当該技術分野において知られており、１つ以上のがんの治療用として、ＦＤＡから認可を受けている。例えば、ＦＤＡから認可されたＰＤ−Ｌ１阻害剤としては、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）及びデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられ、ＦＤＡから認可されたＰＤ−１阻害剤としては、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）及びニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられ、ＦＤＡから認可されたＣＴＬＡ４阻害剤としては、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。今後、治療標的となり得る追加の抑制性免疫チェックポイント分子としては、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＬＡＧ３（例えば、ＢＳＭによって開発中であるＢＭＳ−９８６０１６）、ＫＩＲ（例えば、ＢＳＭによって開発中であるリリルマブ）、ＴＩＭ３、Ｔｉｇｉｔ及びＶＩＳＴＡが挙げられる。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、及び当該技術分野において知られている１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、及び抗ＰＤ１抗体（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞（またはその集団）、及び当該技術分野において知られている１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞（またはその集団）、及び抗ＰＤ１抗体（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）を含む。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、そのキットは、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、ならびにその構成成分を再構成及び／または希釈するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムの１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）を含むキットは、１つ以上の追加の試薬をさらに含み、その追加の試薬は、その遺伝子調節システムを細胞に導入するための緩衝剤、洗浄緩衝液、コントロール試薬、コントロールの発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、その遺伝子調節システムをＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製するための試薬などから選択できる。キットの構成成分は、別々の容器に入れることも、単一の容器内で組み合わせることもできる。
【０３８６】
上記の構成成分に加えて、いくつかの実施形態では、キットは、そのキットの構成成分を用いて、本開示の方法を実施するための説明書をさらに含む。本開示の方法を実施するための説明書は概して、好適な記録媒体に記録されている。例えば、その説明書は、紙またはプラスチックなどのような基材に印刷されていてもよい。したがって、その説明書は、添付文書としてキット内に存在しても、キットまたはその構成成分の容器のラベルに存在してもよい（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付随していてもよい）。別の実施形態では、その説明書は、好適なコンピューター可読記憶媒体、例えばＣＲ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに別の実施形態では、実際の説明書は、キット内には存在しないが、その説明書をリモートソース、例えばインターネットから得る手段が供給されている。この実施形態の例は、その説明書を閲覧でき及び／またはその説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書に関しては、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録されている。
【０３８７】
ＶＩＩ．治療方法及び用途
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、様々な治療用途で用いてよい。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び／または遺伝子調節システムは、例えば疾患を治療するための遺伝子療法を目的として、抗ウイルス剤として使用するため、抗病原体剤として使用するため、抗がん剤として使用するため、または生物学的研究のために、対象に投与してよい。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、その対象は、新生体、幼若体または成体であってよい。特に対象となるのは、哺乳動物の対象である。本発明の方法で治療し得る哺乳動物種としては、イヌ科及びネコ科の動物、ウマ科の動物、ウシ亜科の動物、ヒツジなど、ならびに霊長類動物、特にヒトが挙げられる。動物モデル、特に、小型の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなど）を実験的研究に用いてよい。
【０３８９】
本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞、その集団及びその組成物の投与は、注射、灌注、吸入、摂食、電気浸透、血液透析、イオントフォレシス、及び当該技術分野において知られているその他の方法によって行うことができる。いくつかの実施形態では、投与経路は、局所経路または全身経路である。いくつかの実施形態では、投与経路は、動脈内経路、頭蓋内経路、皮内経路、十二指腸内経路、乳房内経路、髄膜内経路、腹腔内経路、髄腔内経路、腫瘍内経路、静脈内経路、硝子体内経路、眼内経路、非経口経路、脊髄経路、皮下経路、尿管経路、尿道経路、膣経路または子宮内経路である。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、投与経路は、注入（例えば、持続注入またはボーラス）による経路である。局所投与の方法、すなわち、損傷部位または疾患部位への送達方法の例としては、例えば髄腔内送達用のオンマイヤーリザーバーによる方法（例えば、米国特許第５，２２２，９８２号、同第５，３８５，５８２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、例えばシリンジによって、例えば関節にボーラス注射する方法、持続注入、例えば、対流を伴うような挿管による方法（例えば、米国特許出願公開第２００７−０２５４８４２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、またはその細胞が可逆的に添加されたデバイスを埋め込むことによる方法（例えば米国特許出願公開第２００８−００８１０６４号及び同第２００９−０１９６９０３号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）が挙げられる。いくつかの実施形態では、その投与経路は、局所投与または直接注射による経路である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、単独で、あるいは例えば、それらの細胞が移植される組織内でのその細胞の成長及び／または組織化を補助するための好適な基材またはマトリックスとともに、対象に供給してよい。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１×１０３個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも５×１０３個の細胞、１×１０４個の細胞、５×１０４個の細胞、１×１０５個の細胞、５×１０５個の細胞、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、５×１０１１個、１×１０１２個、５×１０１２個、またはこれを超える数の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７〜約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０８〜約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０９〜約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０１０〜約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０１１〜約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７〜約１×１０１１個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７〜約１×１０１０個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７〜約１×１０９個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７〜約１×１０８個の細胞を対象に投与する。対象に対する、治療のための投与数は、変動し得る。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の対象への導入は、１回限りであってよい。いくつかの実施形態では、このような治療には、継続的な一連の反復処置が必要となり得る。いくつかの実施形態では、効果が観察されるまでには、改変免疫エフェクター細胞の投与が複数回必要となり得る。厳密なプロトコールは、治療を受ける個々の対象の疾患または状態、病期、及びパラメーターに左右される。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子療法または生物学的研究などのために、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを用いて、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで改変する。このような実施形態では、遺伝子調節システムは、上記の方法によるなどして、対象に直接投与してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの改変に用いる。このような実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞を含む試料に投与する。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、対象に投与する、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、自己免疫エフェクター細胞である。この関連における「自己」という用語は、投与される同じ対象から得た細胞を指す。例えば、免疫エフェクター細胞は、対象から採取して、本明細書に記載されている方法に従って、ｅｘ  ｖｉｖｏで改変してから、疾患を治療する目的で同じ対象に投与し得る。このような実施形態では、その対象に投与する細胞は、自己免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、対象に投与する改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、同種異系免疫エフェクター細胞である。この関連における「同種異系」という用語は、ある対象から採取して、別の対象に投与する細胞を指す。例えば、免疫エフェクター細胞は、第１の対象から採取して、本明細書に記載されている方法に従って、ｅｘ  ｖｉｖｏで改変してから、疾患を治療する目的で第２の対象に投与し得る。このような実施形態では、その対象に投与する細胞は、同種異系免疫エフェクター細胞である。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、疾患を治療する目的で、対象に投与する。いくつかの実施形態では、治療は、細胞集団（例えば、改変免疫エフェクター細胞集団）またはその組成物を有効量、治療の必要な対象に送達することを含む。いくつかの実施形態では、治療とは、哺乳動物、例えばヒトの疾患の治療を指し、その治療には、（ａ）疾患を抑制すること、すなわち、疾患の発症を抑止するか、または疾患の進行を防止すること、（ｂ）疾患を軽減させること、すなわち、病態を好転させるか、または疾患の１つ以上の症状を軽減させること、及び（ｃ）疾患を治癒させること、すなわち、１つ以上の疾患症状を寛解させることが含まれる。いくつかの実施形態では、治療とは、１つ以上の疾患症状を短期的に（例えば、一時的に及び／または短時間）、及び／または長期的に（例えば持続的に）軽減することを指してよい。いくつかの実施形態では、治療によって、疾患の症状が改善または軽快する。この改善は、観察可能もしくは測定可能な改善であり得、または対象の体調的な感覚の改善であってもよい。
【０３９５】
特定の対象に投与する改変免疫エフェクター細胞の有効量は、様々な要因によって決定されることになり、その要因のうちのいくつかは、患者によって異なり、その要因としては、治療する障害及びその障害の重症度、用いる具体的な薬剤（複数可）の活性、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食生活、投与のタイミング、投与経路、治療期間、併用する薬物、処方医の判断、ならびに医療技術分野において知られている類似の要因が挙げられる。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、腫瘍の質量もしくは体積、腫瘍細胞数、または転移数を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る割合減少させるのに必要な細胞数であってよい。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、平均余命の延長、無増悪生存期間もしくは無病生存期間の延長、または治療する疾患と関連する様々な生理学的な症状の改善をもたらすのに必要な細胞数であってよい。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、少なくとも１×１０３個の細胞、例えば、５×１０３個の細胞、１×１０４個の細胞、５×１０４個の細胞、１×１０５個の細胞、５×１０５個の細胞、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、５×１０１１個、１×１０１２個、５×１０１２個またはこれを上回る数の細胞となる。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、がんのような細胞増殖性障害の治療で用いてよい。本発明で開示する組成物及び方法を用いて治療し得るがんとしては、血液のがん及び固形腫瘍が挙げられる。例えば、本発明で開示する組成物及び方法を用いて治療し得るがんとしては、腺腫、癌腫、肉腫、白血病またはリンパ腫が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、そのがんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経芽腫、大腸癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、メラノーマ、肉腫、前立腺癌、肺癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、星状細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、髄芽腫及び肝臓癌である。いくつかの実施形態では、そのがんは、メラノーマ、頭頸部癌、膀胱癌、肺癌、子宮頸癌、膵臓癌、乳癌及び大腸癌から選択される。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して非感受性または耐性のがんである。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して非感受性または耐性のがんであり、メラノーマ、頭頸部癌、膀胱癌、肺癌、子宮頸癌、膵臓癌、乳癌及び大腸癌から選択される。
【０３９８】
上記のように、様々な腫瘍の適応症で使用するものとして、現在、いくつかの免疫チェックポイント阻害剤が認可されている（例えば、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞を投与すると、治療効果が、免疫チェックポイント阻害剤による治療後に観察される効果よりも増強される（例えば、腫瘍の成長がさらに有意に低下する、リンパ球の腫瘍への浸潤性が向上する、無増悪生存期間が長くなるなど）。
【０３９９】
さらに、一部の腫瘍適応症は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して不応性（すなわち非感受性）のものである。さらに、最初は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に応答する（すなわち、感受性を示す）腫瘍適応症の一部は、治療の過程で阻害剤耐性表現型を発現する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）であるがんを治療する目的で投与する。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）であるがんを罹患している対象に、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を投与することによって、そのがんを治療する（例えば、腫瘍の成長を低下させる、無増悪生存期間を延長するなど）。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）のがんである。
【０４００】
いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与すると、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性、抵抗性または非感受性であるがんでの治療効果が、その改変免疫エフェクター細胞または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかのみによる治療によって観察される効果よりも増強される。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与すると、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して部分的に耐性、部分的に抵抗性または部分的に非感受性であるがんでの治療効果が、その改変免疫エフェクター細胞または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかのみによる治療によって観察される効果よりも増強される。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）、抵抗性（もしくは部分的に抵抗性）、または非感受性（もしくは部分的に非感受性）のがんである。
【０４０１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与すると、抗ＰＤ１抗体のみによる治療に対して耐性または非感受性であるがんでの治療効果が増強される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与すると、抗ＰＤ１抗体のみによる治療に対して部分的に耐性または部分的に非感受性であるがんでの治療効果が増強される。
【０４０２】
免疫チェックポイント阻害剤に対して耐性または感受性を示すがんは、当該技術分野において知られており、様々なｉｎ  ｖｉｖｏモデル及びｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで試験できる。例えば、いくつかのメラノーマは、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して感受性があり、ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍モデルでモデル化できる（実施例６、７、１６及び１９を参照されたい）。さらに、いくつかの大腸癌は、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性があることが知られており、ＰＭＥＬ／ＭＣ３８−ｇｐ１００モデルでモデル化できる（実施例８及び１７を参照されたい）。さらにまた、いくつかのリンパ腫は、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して非感受性があることが知られており、Ｒａｊｉ細胞のようなリンパ腫細胞株の養子移入または皮下投与によって、様々なモデルでモデル化できる（実施例１２、１４、１５、２１及び２２を参照されたい）。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、ウイルス感染症の治療で用いてよい。いくつかの実施形態では、そのウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス及び帯状疱疹ウイルスを含む）、ポックスウイルス、パポバウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスを含む）、パピローマウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ及びＣ型インフルエンザを含む）、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスまたはレトロウイルスのうちの１つから選択する。
【０４０４】
参照による援用
本明細書に引用されている参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願はいずれも、参照により、あらゆる目的でその全体が本明細書に援用される。しかしながら、本明細書に引用されているいずれの参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願に言及する際も、それらが、世界のいずれの国においても、正当な先行技術を構成したり、または技術常識の一部を形成すると解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりするものでないとともに、そのように解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりすべきでもない。
【実施例】
【０４０５】
実施例１：材料及び方法
本明細書に記載されている実験では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、それぞれ異なるＴ細胞集団における１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節する。
【０４０６】
Ｉ．材料
ｇＲＮＡ：別段に示されていない限り、いずれの実験でも、単分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用する。示されているように、デュアルｇＲＮＡ分子を使用したが、そのデュアルｇＲＮＡ分子は、２００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５３４）と２００μＭの標的特異的ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）をＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｄｕｐｌｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１１−０１−０３−０１）中で５分、９５℃で複合化して、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡが１：１の比率で存在する）を形成することによって形成した。下記の実験で使用したｇＲＮＡのターゲティング配列は、下記の表１０に示されている。
表１０：実験ｇＲＮＡのターゲティングドメインコード配列
【表１０】
2021518161.tif 000018
【０４０７】
Ｃａｓ９：Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質のいずれかを導入することによって、標的細胞内で発現させた。別段に示されていない限り、下記の実験では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、核局在化配列を含むＣａｓ９コードｍＲＮＡ（Ｃａｓ９−ＮＬＳ  ｍＲＮＡ）（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｌ−７２０６）、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴカタログ番号１０７４１８２）を使用した。
【０４０８】
ＲＮＰ：ヒトｇＲＮＡ−Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体１．２μＬと、２０μＭのＣａｓ９タンパク質１μＬ及びＰＢＳ０．８μＬとを混ぜ合わせることによって形成した。混合物を室温で２０分インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。マウスＲＮＰは、４４μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体１容量と、３６μＭのＣａｓ９  １容量とを混ぜ合わせることによって形成した。混合物を室温で２０分インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。
【０４０９】
マウス：野生型ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ  ＭＥ）から採取した。オボアルブミン（Ｏｖａ）特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＯＴ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から採取した。ＯＴ１マウスは、オボアルブミン（Ｏｖａ）タンパク質の２５７〜２６４位の残基を認識するトランスジェニックＴＣＲを有する。ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＰＭＥＬマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｈｙ１＜ａ＞／ＣｙＴｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）８Ｒｅｓｔ／Ｊ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ  ＭＥカタログ番号００５０２３）から採取した。Ｃａｓ９タンパク質を構成的に発現するマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから入手し（Ｂ６Ｊ．１２９（Ｃｇ）−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１．１（ＣＡＧ−ｃａｓ９＊，−ＥＧＦＰ）Ｆｅｚｈ／Ｊ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ  ＭＥ系統番号０２６１７９）、Ｃａｓ９を構成的に発現するＴＣＲトランスジェニックマウスは、ＯＴ１マウス及びＰＭＥＬマウスをＣａｓ９マウスと交配させることによって得た。
【０４１０】
ＣＡＲ発現コンストラクト：ヒトＣＤ１９、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２及びＥＧＦＲタンパク質に特異的なＣＡＲを作製した。簡潔に述べると、ＣＤ１９、ＨＥＲ２／Ｅｒｂｂ２またはＥＧＦＲのうちの１つに特異的に結合する抗原特異的ｓｃＦｖドメインに、ヒト顆粒球−マイクロファージコロニー刺激因子受容体サブユニットα（ＧＭＳＣＦ−Ｒα）の２２個のアミノ酸シグナルペプチドを融合した。ヒトＣＤ８αストークを膜貫通ドメインとして使用した。ＣＤ３ξ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインをそのＣＤ８αストークの細胞質末端に融合した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲでは、ｓｃＦｖを抗ヒトＣＤ１９クローンＦＭＣ６３から得た。ヒトＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２に特異的なＣＡＲを作製するのには、トラスツズマブに由来する抗ヒトＨＥＲ２  ｓｃＦｖを用いた。同様に、ＥＧＦＲに特異的なＣＡＲを作製するのには、セツキシマブに由来する抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを用いた。例示的なＣＡＲコンストラクトの概要は、下に示されており、完全長ＣＡＲコンストラクトのアミノ酸配列は、配列番号２６、２８及び３０に示されており、完全長ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号２７、２９及び３１に示されている。
表１１：例示的なＣＡＲコンストラクト
【表１１】
2021518161.tif 000019
【０４１１】
操作ＴＣＲ発現コンストラクト：ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＡＲＴ−１及びＷＴ−１に特異的な組み換えＴＣＲを作製した。ＴＣＲ−α：ＴＣＲ−βが対になった可変領域タンパク質の配列であって、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２）に特異的な１Ｇ４  ＴＣＲ、ＭＡＲＴ−１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号３）に特異的なＤＭＦ４  ＴＣＲ及びＤＭＦ５  ＴＣＲ、ならびにＷＴ−１ペプチドに特異的なＤＬＴ  ＴＣＲ及び高親和性ＤＬＴ  ＴＣＲ（各ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１によって提示される）をコードする可変領域タンパク質配列を文献（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８  １８０：６１１６−６１３１）から特定した。ＴＣＲα鎖は、Ｖ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント、ならびにＣＤＲ３α配列で構成させ、ＴＣＲβ鎖は、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント、ならびにＣＤＲ３−β配列で構成させた。天然型のＴＲＡＣタンパク質配列（配列番号２２）をα鎖可変領域のＣ末端に、ＴＲＢＣタンパク質配列（配列番号２４）をβ鎖可変領域のＣ末端に融合して、１Ｇ４−ＴＣＲα鎖（配列番号１１）／１Ｇ４−ＴＣＲβ鎖（配列番号１２）、９５：ＬＹ  １Ｇ４−ＴＣＲα鎖（配列番号１４）／９５：ＬＹ  １Ｇ４−ＴＣＲβ鎖（配列番号１３）、ＤＬＴ−ＴＣＲα鎖（配列番号５）／ＤＬＴ−ＴＣＲβ鎖（配列番号４）、高親和性ＤＬＴ−ＴＣＲα鎖（配列番号８）／高親和性ＤＬＴ−ＴＣＲβ鎖（配列番号７）、ＤＭＦ４−ＴＣＲα鎖（配列番号１７）／ＤＭＦ４−ＴＣＲβ鎖（配列番号１６）、及びＤＭＦ５−ＴＣＲα鎖（配列番号２０）／ＤＭＦ５−ＴＣＲβ鎖（配列番号１９）を作製した。
【０４１２】
これらの操作ＴＣＲα鎖タンパク質及びＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を作製し、その際には、ＴＣＲβ鎖及びＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ配列の間に、Ｐ２Ａ配列（配列番号１）を挿入して、両方のＴＣＲ鎖の発現を化学量論的に単一のプロモーターから駆動させるようにした。したがって、これらの操作ＴＣＲ鎖をコードする発現カセットは、ＴＣＲβ−Ｐ２Ａ−ＴＣＲαという形態を含んでいた。各ＴＣＲコンストラクトの最終的なタンパク質配列は、配列番号１２（１Ｇ４）、配列番号１５（９５：ＬＹ  １Ｇ４）、配列番号６（ＤＬＴ）、配列番号９（高親和性ＤＬＴ）、配列番号１８（ＤＭＦ４）及び配列番号２１（ＤＭＦ５）に示されている。
【０４１３】
ＣＡＲコンストラクト及びＴＣＲコンストラクトのレンチウイルスによる発現：続いて、上記の操作受容体の発現を駆動するＳＦＦＶプロモーター、Ｔ２Ａ配列及びピューロマイシン耐性カセットを含むプラスミドに、上記のＣＡＲ発現コンストラクト及び操作ＴＣＲ発現コンストラクトを挿入した。別段に示されていない限り、これらのプラスミドは、１つ以上のｓｇＲＮＡの発現を駆動する、ヒトまたはマウス（Ｔ細胞の由来元である種による）のＵ６プロモーターをさらに含むものであった。操作ＴＣＲ発現コンストラクトを含むレンチウイルスコンストラクトは、上記のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域をコードする内在性ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをさらに含んでよい。上記の操作受容体をコードするレンチウイルスは、以下のようにして作製した。簡潔に述べると、トランスフェクションの２４時間前に、２８９×１０６個のＬｅｎｔｉＸ−２９３Ｔ細胞を５段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫに播種した。無血清ＯｐｔｉＭＥＭ及びＴｒａｎｓＩＴ−２９３を合わせ、５分インキュベートしてから、ヘルパープラスミド（ＶＳＶＧを５８μｇ及びＰＡＸ２−Ｇａｇ−Ｐｏｌを１１５μｇ）と、上記の操作受容体及びｓｇＲＮＡ発現プラスミド２３１μｇを合わせた。２０分後、この混合物を上記のＬｅｎｔｉＸ−２９３Ｔ細胞に、新鮮な培地とともに加えた。トランスフェクションの１８時間後に、培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に、ウイルス上清を回収した。上清をヌクレアーゼＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で処理し、０．４５μｍのフィルターにかけて、ウイルス粒子を単離した。続いて、ウイルス粒子をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し、小分けし、力価の測定を行い、−８０℃で保存した。
【０４１４】
レトロウイルスｓｇＲＮＡ発現コンストラクト及び作製：ｓｇＲＮＡ配列をプラスミドに、マウスＵ６プロモーターの下流で挿入した。ヒトＣＤ２をＵｂｉＣプロモーター下で、ｓｇＲＮＡの下流に、選択可能なマーカーとして挿入した。レスキュー実験を行う際には、プラスミドに、上記のエレメントと、野生型マウスＺｃ３ｈ１２ａをコードするコドン最適化ｇＲＮＡ耐性ｃＤＮＡを含めた。レトロウイルスは、以下のように作製した。Ｐｈｏｅｎｉｘ−ＧＰ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−３２１５（商標））をプロデューサー細胞として使用した。８０％コンフルエントになったら、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓｂｉｏ、カタログ番号２７０６）を用いて、プロデューサー細胞にｐＣＬ−Ｅｃｏ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ、ならびにｓｇＲＮＡ及び上記の表面選択マーカーをコードするプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションの１８時間後、培地を完全Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭのβ−メルカプトエタノール）に交換した。１２時間ごとに、合わせて３回、ウイルス上清を回収し、−８０℃で凍結した。
【０４１５】
ＩＩ．方法
ヒトＴ細胞の単離及び活性化：ヒト全ＰＢＭＣを新鮮なロイコパックから、フィコール勾配遠心分離によって単離した。続いて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１７９５３）を用いて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を全ＰＢＭＣから精製した。Ｔ細胞の活性化のために、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を２×１０６細胞／ｍＬで、Ｔ１７５フラスコ内のＸ−ＶＩＶＯ１５Ｔ細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−４１８Ｑ）に、６．２５μＬ／ｍＬのＴ細胞活性化因子ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ２とともに播種した。レンチウイルスコンストラクトによるトランスダクションの前に、Ｔ細胞を１８時間活性化させた。
【０４１６】
ヒトＴＩＬの単離及び活性化：本明細書に記載されている方法によって、腫瘍浸潤リンパ球も改変することができる。このような場合では、腫瘍をヒト患者から手術により切除し、外科用メスで１ｍｍ３の切片に裁断し、一片の腫瘍を２４プレートの各ウェルに入れる。６０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２を添加した２ｍＬの完全ＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化男性ヒトＡＢ血清、１ｍＭのピルビン酸塩、２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１×グルタマックス）を単離ＴＩＬの各ウェルに加える。１ｍＬの培地をウェルから除去し、必要に応じて、最大で週に３回、新鮮な培地及びＩＬ−２と交換する。ウェルがコンフルエントになったら、１：１で、新たな培地＋ＩＬ−２に分ける。４〜５週間の培養後、急速増殖のために、それらの細胞を回収する。
【０４１７】
ＴＩＬの急速増殖：２０ｍＬのＴＩＬ培地＋２０ｍＬのＡｉｍ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３  ｍＡｂにおいて、５００，０００個のＴＩＬを２６×１０６個の同種異系の照射（５０００ｃＧｙ）ＰＢＭＣフィーダー細胞で活性化させることによって、ＴＩＬを急速に増殖させる。４８時間後（２日目）、その培養液に６０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を加える。５日目に、２０ｍＬの培地を除去し、２０ｍＬの新鮮な培地（＋３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３）を加える。７日目に、細胞を計数し、利用可能な細胞数に応じて、６０×１０６細胞／Ｌで、Ｇ−Ｒｅｘ６Ｍウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０６６０Ｍ）またはＧ−Ｒｅｘ１００Ｍ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）に播き直す。９日目に、６０００Ｕ／ｍＬの新鮮なＩＬ−２を加え、１２日目に、３０００Ｕ／ｍＬの新鮮なＩＬ−２を加える。１４日目に、ＴＩＬを回収する。続いて、Ｃｏｏｌｃｅｌｌ凍結容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、増殖細胞をＣｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ−１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）で低速凍結し、液体窒素中で長期保存する。
【０４１８】
マウスＴ細胞の単離及び活性化：ＷＴマウスまたはトランスジェニックマウスの脾臓を摘出し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムをメーカーの推奨に従って用いて、単細胞懸濁液まで解離させた。ＥａｓｙＳｅｐ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌカタログ番号１９８５３）を用いて、精製ＣＤ８＋  Ｔ細胞を得た。２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ−２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号５７５４０６）を添加した完全Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭのβ−メルカプトエタノール）で、ＣＤ８  Ｔ細胞を１×１０６細胞／ｍＬで培養し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  ｆｏｒ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、カタログ番号１１４５６Ｄ）で活性化させた。
【０４１９】
ヒトＴ細胞のレンチウイルストランスダクション：事前に１８時間活性化させたＴ細胞を６ウェルプレートに、１ウェル当たり５×１０６細胞で、体積１．５ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５培地、ならびに１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２及び１２．５μＬのヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２  Ｔ細胞活性化因子ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ中に播種した。上記の操作受容体を発現するレンチウイルスを、全細胞の８０％に感染できるＭＯＩで加えた。２５μＬのレトロネクチン（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えた。ＸＶＩＶＯ−１５培地を、１ウェル当たりの最終体積が２．０ｍＬまで加えた。別段に示されていない限り、レンチウイルスは、ｓｇＲＮＡも発現するものであった。プレートを６００×ｇで１．５時間、室温で回転させた。１８時間後（２日目）に、細胞を洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬで、Ｘ−ＶＩＶＯ１５、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２＋Ｔ細胞活性化因子中に播種した。
【０４２０】
マウスＴ細胞のレンチウイルストランスダクション：示されている場合、レンチウイルストランスダクションによって、ｇＲＮＡをＣａｓ９トランスジェニックＴ細胞に導入した。５μｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号Ｔ１００Ｂ）をコーティングした６ウェルプレートにおいて、５μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン及び２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ−２を添加した２ｍＬのレトロウイルス中に、２４時間前に活性化させたマウスＴ細胞を１ウェル当たり３×１０６細胞で播種した。レトロウイルスは、ｇＲＮＡ及び表面選択マーカー（ｈＣＤ２またはＣＤ９０．１）を発現するものである。プレートを６００×ｇで１．５時間、室温で回転させた。１８時間後（２日目）に、細胞を洗浄し、２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ−２を添加した完全Ｔ細胞培地で、その細胞を１×１０６細胞／ｍＬで培養した。感染の２４時間後に、細胞を洗浄し、ＩＬ−２を添加した完全Ｔ細胞培地で、その細胞を培養した。２４時間後、活性化ビーズを除去し、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ２  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌカタログ番号１８６５７）またはＥａｓｙＳｅｐ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ９０．１  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌカタログ番号１８９５８）を用いて、感染細胞を精製した。ＩＬ−２を添加した完全Ｔ細胞培地で、編集されたマウスＣＤ８  Ｔを１×１０６細胞／ｍＬで、新たに１〜４日間培養した。
【０４２１】
ヒトＴ細胞へのエレクトロポレーション：Ｔ細胞の活性化から３日後に、Ｔ細胞を回収し、ヌクレオフェクション緩衝液（Ａｍａｘａ  Ｐ３初代細胞４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＸキットＳの助剤１を１８％、Ｐ３緩衝液を８２％）に、１００×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。細胞溶液２０μＬ当たりに、１．５μＬのｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体（１２０ピコモルのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体及び２０ピコモルのＣａｓ９ヌクレアーゼを含む）、ならびに２．１μＬ（１００ピコモル）のエレクトロポレーション促進剤を加えた。続いて、細胞／ＲＮＰ／促進剤の混合物２５μＬを各エレクトロポレーションウェルに加えた。「ＥＯ−１１５」というプログラムによって、Ｌｏｎｚａのエレクトロポレーターを用いて、細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、温めたＸ−ＶＩＶＯ１５培地８０μＬを各ウェルに加え、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地中で、細胞を培養フラスコに、２×１０６細胞／ｍＬの密度でプールした。４日目に、細胞を洗浄、計数し、利用可能な細胞数に応じて、Ｇ−Ｒｅｘ６ＭウェルプレートまたはＧ−Ｒｅｘ１００Ｍ内のＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地に、５０〜１００×１０６細胞／Ｌの密度で播種した。６日目及び８日目に、その培養液に、１０ｎｇ／ｍＬの新鮮な組み換えヒトＩＬ−２を加えた。
【０４２２】
マウスＴ細胞へのエレクトロポレーション：事前に４８時間活性化させたマウスＴ細胞を回収し、活性化ビーズを除去し、細胞を洗浄し、Ｎｅｏｎのヌクレオフェクション緩衝液Ｔに再懸濁させた。Ｎｅｏｎ（商標）の１０μＬ用チップを用いて、９μＬの緩衝液Ｔに再懸濁させた最大２×１０６個の細胞をエレクトロポレーションでき、Ｎｅｏｎ（商標）の１００μＬ用チップを用いて、９０μＬの緩衝液Ｔに再懸濁させた２０×１０６個の細胞をエレクトロポレーションできる。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体またはＺＦＮ  ｍＲＮＡ（１０μＬ用チップ当たり１μＬ、または１００μＬ用チップ当たり１０μＬ）、及び１０．８μＭのエレクトロポレーション促進剤（１０μＬ用チップ当たり２μＬ、または１００μＬ用チップ当たり２０μＬ）を細胞に加えた。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体またはＺＦＮ  ｍＲＮＡと混合したＴ細胞をピペットでＮｅｏｎ（商標）チップに入れ、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（１７００Ｖ／２０ｍｓ／１パルス）を用いて、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション直後に、２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ−２を添加した温めた完全Ｔ細胞培地の入った培養フラスコに、細胞を１．６×１０６細胞／ｍＬの密度で移した。ＩＬ−２を添加した完全Ｔ細胞培地中で、編集されたマウスＣＤ８  Ｔ細胞をさらに、１×１０６細胞／ｍＬで、新たに１〜４日間培養した。
【０４２３】
操作Ｔ細胞の精製及び特徴付け：Ｔ細胞の活性化から１０日後、細胞を培養フラスコから取り出し、編集された操作受容体発現ＣＤ８＋  Ｔ細胞を精製した。操作受容体の発現は、抗体染色（例えば、ＤＭＦ４  ＴＣＲではＶβ１２、またはＮＹ−ＥＳＯ−１もしくは１Ｇ４ではＶβ１３／１３．１に対する抗体）によって判断できる。標的遺伝子の編集のさらなる判断は、表面タンパク質（例えばＣＤ３）のＦＡＣＳ解析、標的タンパク質のウエスタンブロット、及び／またはゲノムの切断部位のＴＩＤＥ／ＮＧＳ解析によって評価できる。続いて、Ｃｏｏｌｃｅｌｌ凍結容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、精製細胞をＣｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ−１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）で低速凍結して、将来使用するために、液体窒素中で長期保存することができる。
【０４２４】
実施例２：編集された受容体導入Ｔ細胞の特徴付け
編集された受容体発現細胞を、細胞表面でのＣＤ３の発現に基づき精製する実験を行った。操作前には、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＴＣＲα鎖／ＴＣＲβ鎖を含む複合体の一部として、細胞表面にＣＤ３分子を発現する（図４Ａ）。そのＴ細胞に、ＣＡＲ、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、及びＢ２Ｍ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（Ｂ２Ｍ遺伝子を用いて、標的遺伝子の編集の代わりに、非ＴＣＲ遺伝子の編集を評価した）を発現するレンチウイルスをトランスダクションした。レンチウイルスのトランスダクション及びＣａｓ９  ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後、トランスダクションが成功して編集されたＴ細胞では、ＴＲＡＣ遺伝子の編集により、表面ＣＤ３の発現が欠損し、Ｂ２Ｍ遺伝子の編集により、ＨＬＡ−ＡＢＣの発現が欠損する（図４Ｂ）。ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈカタログ番号１８０５１）を用いて、そのバルク集団（図４Ｂ）からＣＤ３発現細胞を除去した。続いて、細胞に対して、ＣＤ３について磁気による陰性選択を２ラウンド行った。このプロセスにより、高精製のＣＤ３陰性Ｔ細胞が得られた（図４Ｃ）。組み換えＣＤ１９−Ｆｃ試薬（ＣＤ１９  ＣＡＲと結合する）で染色したところ、編集された細胞では、ＣＤ１９  ＣＡＲの表面発現が見られるが、非編集細胞では見られないことが示された（図４Ｄ）。ＣＤ４５及びＢ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡの場合でも、同様の実験を行った。９６時間後に、ＣＤ４５及びＢ２Ｍの発現をフローサイトメトリーによって評価することによって、Ｔ細胞におけるＣａｓ９の編集活性を確認し、効率的なＣａｓ９機能は、ＦＡＣＳによって求めた場合の、Ｔ細胞表面でのＣＤ４５の発現の欠損によって示される。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びＣａｓ９  ＲＮＰの共エレクトロポレーションによって、ＣＤ４５座及びＢ２Ｍ座で大幅な編集が行われ、細胞の６６．３％で、デュアル編集が見られた。
【０４２５】
上記実施例に記載されているようにして、標的の編集を行い、Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ）解析法及びウエスタンブロット解析の両方を用いて、単一の例示的遺伝子ＣＢＬＢの編集を確認した。ＴＩＤＥは、標的とする細胞プールのＤＮＡにおいて、編集有効性を定量し、主要なタイプの挿入及び欠失（インデル）を特定する。
【０４２６】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号１３３２３）を業者推奨のプロトコールに従って用いて、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、編集されたＴ細胞から単離し、定量した。ｇＤＮＡの単離後、遺伝子座特異的ＰＣＲプライマー（Ｆ：５’−ＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＴＴ−３’（配列番号３２）、Ｒ：５’−ＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＧＴＡ−３’（配列番号３３））を用いてＰＣＲを行って、編集されたＤＮＡの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号：２８７０６）を用いて、抽出及び精製した。抽出産物をサンガーシーケンシングによってシーケンシングし、サンガーシーケンシングクロマトグラム配列ファイルをＴＩＤＥによって解析した。ｇＲＮＡ発現レンチウイルスによって導入したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体またはＣａｓ９  ｍＲＮＡのいずれかを用いた方法（いずれの場合も、使用したＣＢＬＢ  ｇＲＮＡは配列番号２８８である）によって編集したＣＢＬＢ編集Ｔ細胞では、得られたＴＩＤＥ解析結果によって、ＣＢＬＢ標的遺伝子の編集が確認された。ＴＩＤＥに加えて、抗ＣＢＬＢ抗体（ＳＣＴカタログ番号９４９８）を用いたウエスタンブロットによって、ＣＢＬＢタンパク質レベルの消失が確認された。そのデータは、図５Ａ及び５Ｂ、ならびに図６に示されている。
【０４２７】
遺伝子の編集を評価する別の方法は、次世代シーケンシングによるものである。この方法では、Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号１３３２３）を業者推奨のプロトコールに従って用いて、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、編集されたＴ細胞から単離し、定量した。ｇＤＮＡの単離後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングアダプターの付加に必要なオーバーハングを含む遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲを行って、編集されたゲノムＤＮＡの領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流して、ゲノム座位の特異的かつ充分な増幅が行われるようにしてから、業者推奨のプロトコールに従ってＭｏｎａｒｃｈ  ＰＣＲ  ＆  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（カタログ番号：Ｔ１０３０Ｓ）を用いて、ＰＣＲクリーンアップを行った。続いて、精製ＰＣＲ産物を定量し、２回目のＰＣＲを行って、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプター、及びマルチプレックスに必要な試料特異的なインデックス付与配列をアニールした。この後、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに流し、サイズを評価してから、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（内部で作製）を用いて精製した。続いて、Ｋａｐａ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号：ＫＫ４９２３）及びＫａｐａ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（カタログ番号：ＫＫ４９０３）を用いたｑＰＣＲによって、精製ＰＣＲ産物を定量した。続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｍｉｄ  Ｏｕｔｐｕｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｖ２（カタログ番号：ＦＣ−４０４−２００３）を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００システムに、定量した産物を充填した。生成されたシーケンシングデータの解析を行って、編集されたＴ細胞のプールのＤＮＡにおいて、予測切断部位での挿入及び欠失（インデル）を評価した。
【０４２８】
実施例３：ＯＴ１／Ｂ１６−Ｏｖａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の機能的ゲノムスクリーニングによる、養子Ｔ細胞移入療法の標的の特定
腫瘍におけるＴ細胞の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。プールＣＲＩＳＰＲのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのプールを腫瘍特異的Ｔ細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のｓｇＲＮＡが含まれるようにした。腫瘍試料において、特定の遺伝子がＴ細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、Ｔ細胞集団内の各ｓｇＲＮＡの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じｓｇＲＮＡの頻度と比較した。腫瘍試料におけるＴ細胞集積を正に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるＴ細胞集積を負に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに低下すると予測される。
【０４２９】
実施例１に記載されている方法に従って、Ｃａｓ９を発現するＯＴ１マウスから得たＣＤ８＋  Ｔ細胞を用いて、プールＣＲＩＳＰＲのスクリーニングを行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した精製ＯＴＩ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞に、プールｓｇＲＮＡライブラリーを導入して、編集されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団を作製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作後、Ｂ１６／Ｏｖａ腫瘍を担持するＣ５６ＢＬ／６マウスに、その編集されたＯＴ１  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を静脈内（ｉｖ）投与した。ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖後、臓器を摘出し、ＣＤ４５＋細胞を濃縮した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、その単離ＣＤ４５＋細胞のゲノムＤＮＡを単離した。続いて、ｓｇＲＮＡライブラリーをＰＣＲによって増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いてシーケンシングした。
【０４３０】
腫瘍担持マウスから摘出した試料中の各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度を解析し、最初のＴ細胞集団における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度と比較した。個々のｓｇＲＮＡのそれぞれにおいて、統計解析を行って、腫瘍担持マウスから採取したＴ細胞集団において有意に濃縮されたガイドを特定したとともに、各ガイドに濃縮スコアを割り当てた。同じ遺伝子を標的とする個々のｓｇＲＮＡの濃縮スコアを集約して、複数のｓｇＲＮＡ及び複数のＯＴ１ドナーマウスにわたって、Ｔ細胞集積に対して一定かつ再現性のある作用を及した標的遺伝子を特定した。これらの実験の結果は、下記の表１２に示されている。表１２のパーセンタイルは、パーセンタイルスコア＝１−（遺伝子濃縮順位／スクリーニングした遺伝子の総数）という式を用いて算出した。
表１２：標的遺伝子パーセンタイルスコア
【表１２−１】
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【表１２−２】
2021518161.tif 000021
【０４３１】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＡＲ−Ｔ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の機能的ゲノムスクリーニングによる、養子Ｔ細胞移入療法の標的の特定
ＣＡＲ−Ｔ細胞腫瘍試料の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。ゲノムワイドなプールＣＲＩＳＰＲのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのプールを腫瘍特異的ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のｓｇＲＮＡが含まれるようにした。特定の遺伝子が、腫瘍試料におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団内の各ｓｇＲＮＡの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じｓｇＲＮＡの頻度と比較した。腫瘍試料におけるＣＡＲ−Ｔ細胞集積を正に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるＣＡＲ−Ｔ細胞集積を負に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに低下すると予測される。
【０４３２】
ヒトＣＤ１９に特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを行った。プールｓｇＲＮＡライブラリーを上記のＣＤ１９  ＣＡＲＴに導入し、実施例１に記載されているように、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを細胞にエレクトロポレーションして、Ｃａｓ９で編集されたＣＤ１９  ＣＡＲＴの集団を作製した。続いて、ＣＤ１９を発現するように操作した付着大腸癌（ＣＲＣ）細胞株、または内在性ＣＤ１９を発現するバーキットリンパ腫細胞株とともに、その編集されたＣＤ１９  ＣＡＲＴを共培養した。共培養期間の全体を通じて、様々な時点にＣＡＲＴを回収し、細胞ペレットを凍結した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、これらの細胞ペレットからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングを用いてシーケンシングした。
【０４３３】
ＣＡＲＴ／腫瘍細胞共培養液から得たアリコートにおける各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度を解析し、最初の編集ＣＡＲ−Ｔ細胞集団における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度と比較した。個々のｓｇＲＮＡのそれぞれにおいて、統計解析を行って、腫瘍細胞の共培養後に、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団において有意に濃縮されたｓｇＲＮＡを特定したとともに、各ガイドに濃縮スコアを割り当てた。同じ遺伝子を標的とする個々のｓｇＲＮＡの濃縮スコアを集約して、複数のｓｇＲＮＡ及びＣＡＲ−Ｔ細胞集団にわたって、腫瘍試料におけるＣＡＲ−Ｔ細胞集積に対して一定かつ再現性のある作用を及ぼす標的遺伝子を特定した。標的をランク付けし、パーセンタイルに基づき、さらなる調査の対象とした。これらの実験の結果は、下記の表１３に示されている。表１３のパーセンタイルは、パーセンタイルスコア＝１−（遺伝子濃縮順位／スクリーニングした遺伝子の総数）という式を用いて算出した。
表１３：標的遺伝子パーセンタイルスコア
【表１３−１】
2021518161.tif 000022
【表１３−２】
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【０４３４】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＡＲ−Ｔ／腫瘍ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の機能的ゲノムスクリーニングによる、養子Ｔ細胞移入療法の標的の特定
腫瘍の存在下で、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。プールＣＲＩＳＰＲのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのプールを腫瘍特異的ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のｓｇＲＮＡが含まれるようにした。特定の遺伝子が、腫瘍試料におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団内の各ｓｇＲＮＡの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じｓｇＲＮＡの頻度と比較した。腫瘍試料におけるＣＡＲ−Ｔ細胞集積を正に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるＣＡＲ−Ｔ細胞集積を負に調節する遺伝子（例えば、Ｔ細胞の増殖性、生存能及び／または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子）を標的とするｓｇＲＮＡの頻度は、時間とともに低下すると予測される。
【０４３５】
バーキットリンパ腫モデル及び大腸癌（ＣＲＣ）モデルという２つの別々の皮下異種移植モデルで、ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングを行った。バーキットモデルでは、マトリゲル中の１×１０６個のバーキットリンパ腫腫瘍細胞を６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）マウスの右側腹部に皮下注射した。接種から１３日目、腫瘍がおよそ２００ｍｍ３の体積に達したら、マウスをモニタリングし、無作為に分けて、試験に登録した。ＣＲＣモデルでは、ＣＲＣ細胞を操作して、ＣＤ１９を発現するようにし、マトリゲル中の５×１０６個の腫瘍細胞を６〜８週齢のＮＳＧマウスの右側腹部に皮下注射した。接種から１２日目に、腫瘍がおよそ２００ｍｍ３の体積に達したら、マウスをモニタリングし、無作為に分け、試験に登録した。Ｃａｓ９で操作したＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞を尾静脈から３×１０６個及び１０×１０６個／マウス（３Ｍ及び１０Ｍ）で静脈内投与した。ＣＡＲ−Ｔの注射から８〜１０日後に、腫瘍を回収し、液体窒素で凍結した。その後、ゲノムＤＮＡの抽出のために、これらの組織を解離及び処理した。
【０４３６】
試験の最後に得られたゲノムＤＮＡ試料における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度を解析し、最初の編集ＣＡＲ−Ｔ細胞集団における各ｓｇＲＮＡの分布及び／または頻度と比較した。個々のｓｇＲＮＡのそれぞれにおいて、統計解析を行って、試験の最後に得られたゲノムＤＮＡ試料において有意に濃縮されたｓｇＲＮＡを特定したとともに、各ガイドに濃縮スコアを割り当てた。同じ遺伝子を標的とする個々のｓｇＲＮＡの濃縮スコアを集約して、複数のｓｇＲＮＡ及びＣＡＲ−Ｔ細胞集団にわたって、ＣＡＲ−Ｔ細胞存在量に対して一定かつ再現性のある作用を及した標的遺伝子を特定した。標的をランク付けし、パーセンタイルに基づき、さらなる調査の対象とした。これらの実験の結果は、下記の表１４に示されている。表１４のパーセンタイルは、パーセンタイルスコア＝１−（遺伝子濃縮順位／スクリーニングした遺伝子の総数）という式を用いて算出した。
表１４：標的遺伝子パーセンタイルスコア
【表１４】
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【０４３７】
実施例６：マウスＯＴ１／Ｂ１６  Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
マウスＯＴ１／Ｂ１６−Ｏｖａ皮下腫瘍モデルにおいて、単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的Ｔ細胞において標的遺伝子を編集すると、抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例３〜５においてパーセンタイルスコアが０．６以上であった標的を選択した。
【０４３８】
抗ＰＤ１抗体による治療に対する感受性があるＢ１６−Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、単一編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集マウスＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。ＯＴ１  Ｔ細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）Ｍａｐ４ｋ１を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａを標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｖ）Ｃｂｌｂを標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｖ）Ｎｒ４ａ３を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（ｖｉ）ＰＤ１を標的とする単一のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。標的遺伝子が編集された腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団を作製するために、実施例１に記載されているように、雌のＯＴ１マウスの脾臓を回収し、ＣＤ８  Ｔ細胞を単離し、編集した。続いて、その編集ＯＴ１  ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＢ１６−Ｏｖａ腫瘍担持Ｃ５６ＢＬ／６マウスに静脈内投与した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式に従って、平均腫瘍体積（ＴＶ）を用いて腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（標的ＴＶ最終−標的ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終−コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、Ｃｂｌｂ  ＴＧＩにおける最終は、Ｔ細胞の移入から１８日目であり、Ｚｃ３ｈ１２ａ、Ｎｒ４ａ３及びＭａｐ４ｋ１における最終は、Ｔ細胞の移入から１４日目であり、初期は、０日目（すなわちＴ細胞の移入日）である。
【０４３９】
Ｃｂｌｂ編集Ｔ細胞の結果は、図７Ａに示されている。これらのデータにより、Ｔ細胞においてＣｂｌｂ遺伝子を編集すると、抗腫瘍有効性が得られ、１８日目にＴＧＩが８５％になったことが示されている。Ｚｃ３ｈ１２ａ編集Ｔ細胞の結果は、図７Ｂに示されている。これらのデータにより、Ｔ細胞においてＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を編集すると、そのＴ細胞の抗腫瘍有効性が向上し、１４日目にＴＧＩが１０６％になったことが示されている。Ｚｃ３ｈ１２ａ編集細胞による追加実験のデータは、図７Ｃに示されている。Ｍａｐ４ｋ１編集Ｔ細胞の結果は、図７Ｄに示されている。これらのデータにより、Ｔ細胞においてＭａｐ４ｋ１遺伝子を編集すると、そのＴ細胞の抗腫瘍有効性が向上し、１４日目にＴＧＩが７２％になったことが示されている。Ｎｒ４ａ３編集Ｔ細胞の結果は、図７Ｅに示されている。これらのデータにより、Ｔ細胞においてＮｒ４ａ３遺伝子を編集すると、そのＴ細胞の抗腫瘍有効性が向上し、１４日目にＴＧＩが５６％になったことが示されている。
【０４４０】
実施例７：マウスＯＴ１／Ｂ１６−Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおける、抗ＰＤ１療法と組み合わせた単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
抗ＰＤ１療法と組み合わせたＭａｐ４ｋ１編集細胞の作用を評価するために、さらなる実験を行った。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集マウスＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、またはＭａｐ４ｋ１遺伝子を編集する単一のガイドのいずれかによって編集した。ＮＧＳ法を用いて、Ｍａｐ４ｋ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を求めたところ、８２％であった。Ｔ細胞の移入時に、指定のコホートでは、２．５ｍｇ／ｋｇの抗マウスＰＤ１抗体（クローンＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）による処置も開始し、試験期間中、週に３回注射した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。１４日目〜１日目におけるＭａｐ４ｋ１群の平均腫瘍体積／１４日目〜１日目におけるコントロール処置群の平均腫瘍体積（１日目は、編集マウスＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の移入日である）を用いて、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。この実験の結果は、図８Ａに示されている。
【０４４１】
Ｎｒ４ａ３編集細胞を用いて、同様の実験を行った。ＮＧＳ法を用いて、Ｎｒ４ａ３遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を求めたところ、２８％であった。１４日目〜１日目におけるＮｒ４ａ３群の平均腫瘍体積／１４日目〜１日目におけるコントロール処置群の平均腫瘍体積（１日目は、編集マウスＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の移入日である）を用いて、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。この実験の結果は、図８Ｂに示されている。
【０４４２】
抗ＰＤ１療法と組み合わせたＺｃ３ｈ１２ａ編集細胞が抗腫瘍有効性に及ぼす作用を評価するには、同様の実験を行う。
【０４４３】
実施例８：マウスＰＭＥＬ及びＭＣ３８／ｇｐ１００同系腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的Ｔ細胞において標的遺伝子を編集すると、大腸癌のマウスＭＣ３８ｇｐ１００皮下同系腫瘍モデル（抗ＰＤ１抗体による治療に対して非感受性である）において抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例３〜５においてパーセンタイルスコアが０．６以上であった標的を選択した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。
【０４４４】
簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１×１０６個のＭＣ３８ｇｐ１００腫瘍細胞を皮下注射した。そのＴ細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、または（ｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａを標的とする単一のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集マウスＰＭＥＬ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。
【０４４５】
Ｚｃ３ｈ１２ａ編集Ｔ細胞の結果は、図９に示されている。これらのデータにより、Ｔ細胞においてＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を編集すると、そのＴ細胞の抗腫瘍有効性が向上し、ＴＧＩが２０日目に７７％になったことが示されている。ＰＭＥＬ／ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいてＮｒ４ａ３編集細胞及びＭａｐ４ｋ１編集細胞が抗腫瘍有効性に及ぼす作用を評価するには、同様の実験を行う。
【０４４６】
実施例９：マウスＢ１６−Ｆ１０同系腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
肺転移として顕在化する疾患を伴う侵襲性転移性Ｂ１６−Ｆ１０同系腫瘍モデルにおいてＺｃ３ｈ１２ａを編集する作用を評価するには、追加の実験を行う。
【０４４７】
簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を静脈内注射する。マウスの体重を測定し、接種の前に、無作為化手順を用いてマウスを処置群に割り当てた。腫瘍の接種から３日目に、マウスに、マウスＰＭＥＬ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＰＤ−１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（ｉｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。体重を少なくとも週に２回モニタリングする。腫瘍の接種から１５日目（編集ＰＭＥＬの移入から１２日目）に、マウス肺を１０％パラホルムアルデヒドで灌流及び固定する。一晩固定後、肺をさらに保存するために７０％ＥｔＯＨに移す。肺においてがん細胞の黒色コロニーとして見ることができるＢ１６−Ｆ１０腫瘍量を目視で評価することによって、抗腫瘍有効性を評価できる。
【０４４８】
生存率が、パーセントでグラフ化されている（図１０）。図１０Ａに示されているように、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集ＰＭＥＬ  Ｔ細胞は、Ｂ１６Ｆ１０肺転移モデルにおいて、コントロールのＰＭＥＬ  Ｔ細胞及びＰＤ１編集ＰＭＥＬ  Ｔ細胞と比べて生存率を上昇させることができた。Ｂ１６−Ｆ１０同系腫瘍モデルにおけるＮｒ４ａ３編集細胞及びＭａｐ４ｋ１編集細胞の作用を評価するには、同様の実験を行う。
【０４４９】
実施例１０：マウスＯＴ１／ＥＧ７−Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
ＥＧ７−Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、マウスにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａの抗腫瘍有効性をさらに評価した。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１×１０６個のＥＧ７−Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集マウスＯＴ１  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を編集する単一のガイドのいずれかによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。
【０４５０】
下記の式に従って、平均腫瘍体積（ＴＶ）を用いて腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（標的ＴＶ最終−標的ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終−コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終ＴＧＩは、Ｔ細胞の移入から１４日目であり、初期は、０日目（すなわちＴ細胞の移入日）である。
【０４５１】
これらのデータにより、Ｔ細胞においてＺｃ３ｈ１２ａを編集すると、図１１に示されているように、そのＴ細胞の抗腫瘍有効性が向上し、ＴＧＩが８８％になったことが示されている。ＯＴ１／ＥＧ７ＯＶＡ皮下同系腫瘍モデルにおいて、Ｎｒ４ａ３編集細胞及びＭａｐ４ｋ１編集細胞が抗腫瘍有効性に及ぼす作用を評価するには、同様の実験を行う。
【０４５２】
実施例１１：Ａ３７５異種移植腫瘍モデルにおける単一編集型養子移入Ｔ細胞の検証
単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的Ｔ細胞において標的遺伝子を編集すると、Ａ３７５異種移植腫瘍モデルにおいて、抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例３〜５においてパーセンタイルスコアが０．６以上であった標的を選択した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。
【０４５３】
簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜１２週齢のＮＳＧマウスに、５×１０６個のＡ３７５細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ２００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを８頭からなる群に無作為に分け、１８．８７×１０６個のＣＢＬＢ編集ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞または５．７７×１０６個のＺＣ３Ｈ１２Ａ編集ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を尾静脈から静脈内注射した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、コントロールの編集細胞と比べて平均腫瘍体積が縮小し、生存率が上昇したこととして、有効性を評価した。１９日目〜０日目におけるＺＣ３Ｈ１２Ａ群の平均腫瘍体積／１９日目〜０日目におけるコントロール処置群の平均腫瘍体積（０日目は、ヒトＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の移入日である）を用いて、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
【０４５４】
これらの実験の結果は、図１２に示されている。これらのデータにより、Ｔ細胞においてＣＢＬＢ遺伝子（図１２Ａ）及びＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（図１２Ｂ）を編集すると、Ａ３７５  異種移植モデルにおいて抗腫瘍有効性が向上することが示されている。Ａ３７５異種移植モデルにおけるＭＡＰ４Ｋ１編集Ｔ細胞及びＮＲ４Ａ３編集Ｔ細胞の有効性を評価するには、同様の実験を行う。
【０４５５】
実施例１２：Ｒａｊｉ異種移植モデルにおける単一編集型養子移入ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞の検証
Ｒａｊｉ皮下細胞由来の異種移植腫瘍モデルを用いて、初代ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞においてＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３を編集することの抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Ｒａｊｉ細胞は、抗ＰＤ１抗体による治療に対して非感受性であることが知られているヒトリンパ腫細胞株である。
【０４５６】
簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＮＳＧマウスに、３×１０６個のＲａｊｉ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ２００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを５頭からなる群に無作為に分け、編集ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。その養子移入細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、またはＭＡＰ４Ｋ１もしくはＮＲ４Ａ３を編集するガイドのいずれかによって編集した。ＮＧＳ法を用いて、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子及びＮＲ４Ａ３を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を求めたところ、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子のものでは８３％、ＮＲ４Ａ３遺伝子のものでは７１％であった。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。その結果により、養子Ｔ細胞移入モデルにおいてＭＡＰ４Ｋ１及びＮＲ４Ａ３を編集すると、有効性が向上し、ＭＡＰ４Ｋ１の場合（図１３Ａ）にはＴＧＩが６５％に、ＮＲ４Ａ３の場合（図１３Ｂ）にはＴＧＩが８１％になったことが示されている。Ｒａｊｉ細胞由来の異種移植皮下腫瘍モデルにおいて、ＺＣ３Ｈ１２Ａ編集初代ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ヒト）の抗腫瘍有効性を評価するには、同様の実験を行うことになる。
【０４５７】
実施例１３：デュアル編集の組み合わせに関するスクリーニング
ダブルｓｇＲＮＡライブラリーをレトロウイルス骨格で構築した。そのライブラリーは、単一のガイドＲＮＡ（ガイド＋ｔｒａｃｒ、ｓｇＲＮＡ）の発現をそれぞれ駆動する２つのＵ６プロモーター（１つのヒトＵ６プロモーター及び１つのマウスＵ６プロモーター）で構成させた。それらのガイドをプールとしてクローニングして、すべてのｓｇＲＮＡそれぞれが、他のすべてのｓｇＲＮＡそれぞれのと対になるように、ガイドをランダムに組み合わせた。最終的なダブルガイドライブラリーをＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、マウスエコトロピックレトロウイルスを作製した。Ｃａｓ９を発現するＴＣＲトランスジェニックＯＴ１細胞を、ｓｇＲＮＡ発現ウイルスに感染させて、各ｓｇＲＮＡの標的となる２つの遺伝子座を編集した。続いて、４００ｍｍ３超のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍同種移植片を担持するマウスに、編集されたトランスジェニックＴ細胞を移入した。２週間後、その腫瘍を切り出し、その腫瘍を消化して、その腫瘍に存在するＣＤ４５＋細胞を濃縮することによって、腫瘍浸潤Ｔ細胞を精製した。Ｑｉａｇｅｎ  ＱＵＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔを用いて、ゲノムＤＮＡをＣＤ４５＋細胞から抽出し、レトロウイルス骨格配列に対応するプライマーを用いたＰＣＲによって、レトロウイルスインサートをＰＣＲによって回収した。続いて、得られたＰＣＲ産物をシーケンシングして、移入の２週間後に腫瘍に存在するｓｇＲＮＡを特定した。最終単離細胞集団内のガイドペアの内容を、最初のプラスミド集団、及びマウスに注射する前の感染トランスジェニックＴ細胞集団と比較した。Ｔ細胞の適応性及び／または腫瘍浸潤性を向上させるｓｇＲＮＡペアの頻度は、時間とともに上昇すると予測され、一方適応性を損なう組み合わせは、時間とともに減少すると予測された。下記の表１５には、最終細胞集団におけるｓｇＲＮＡ頻度を、ｉｎ  ｖｉｖｏ移入した最初の細胞集団におけるｓｇＲＮＡ頻度と比較した変化倍率の中央値が示されている。
表１５：組み合わせのスクリーニングにおけるｓｇＲＮＡ頻度
【表１５−１】
2021518161.tif 000025
【表１５−２】
2021518161.tif 000026
【０４５８】
実施例１４：Ｒａｊｉ異種移植モデルにおけるデュアル編集型ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞の検証
異種移植腫瘍モデルにおいてＴ細胞の抗腫瘍有効性を向上させる編集遺伝子の組み合わせを求めるための併用試験で、標的をさらに評価した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。
【０４５９】
編集の抗腫瘍有効性に関する併用作用の例として、初代ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞において、ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲを単独でまたは組み合わせて編集し、Ｒａｊｉ皮下細胞由来の異種移植腫瘍モデルを用いて、マウスにおいて評価した。Ｒａｊｉ細胞は、抗ＰＤ１抗体による治療に対して非感受性であることが知られているリンパ腫細胞株である。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＮＳＧマウスに、３×１０６個のＲａｊｉ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ２００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを５頭からなる群に無作為に分け、編集ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。その養子移入細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＣＢＬＢを標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）ＢＣＯＲを標的とする単一のｇＲＮＡ、または（ｉｖ）ＣＢＬＢ及びＢＣＯＲを標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。図１４に示されているように、コントロールのガイドと比較したところ、皮下バーキットリンパ腫Ｒａｊｉマウスモデルにおいて、示されているように標的遺伝子を単独でまたは組み合わせて編集したＢＣＯＲ／ＣＢＬＢデュアル編集型ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の養子移入によって、抗腫瘍応答が得られた。両方の標的を組み合わせて編集した時の方が、いずれかの標的を単独で編集した場合またはコントロールのガイドの場合よりも、抗腫瘍有効性が高かった。ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ  Ｒａｊｉ細胞異種移植モデルにおいて、ＺＣ３Ｈ１２Ａ／ＣＢＬＢデュアル編集型Ｔ細胞、ＭＡＰ４Ｋ１／ＣＢＬＢデュアル編集型Ｔ細胞、及びＮＲ４Ａ３／ＣＢＬＢデュアル編集型Ｔ細胞の有効性を評価するには、同様の実験を行う。
【０４６０】
実施例１５：ＣＡＲ−ＴにおいてＢＣＯＲ及びＣＢＬＢを二重編集すると、腫瘍の存在下における集積及びサイトカインの産生が増大する。
初代ＣＤ１９  ＣＡＲ−ＴをヒトＣＤ８  Ｔ細胞から作製し、ＲＮＰの形態でＣａｓ９と複合化させたガイドＲＮＡを用いたエレクトロポレーションによって、ネガティブコントロール遺伝子、ＢＣＯＲ、ＣＢＬＢ、またはＢＣＯＲ及びＣＢＬＢの両方を編集した。ＣＤ１９  ＣＡＲ−ＴをＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、１：０、０．３：１、１：１、３：１及び１０：１の比率で共培養した。２４時間後、ＣＡＲ−Ｔ細胞の総細胞数を求め、サイトカインの解析のために、上清を保存した。図１５に示されているように、ＢＣＯＲ編集ＣＡＲＴ及びＢＣＯＲ＋ＣＢＬＢ編集ＣＡＲＴでは、集積性が、コントロールまたはＣＢＬＢ編集ＣＡＲＴのいずれよりも３０％高く、ＢＣＯＲを編集すると、腫瘍の存在下でＣＡＲ−Ｔ細胞が集積する能力が向上することが示された。さらに、ＣＢＬＢ編集ＣＡＲＴ及びＣＢＬＢ＋ＢＣＯＲ編集ＣＡＲＴでは、いずれのコントロール編集ＣＡＲＴと比べても、１０倍以上のＩＬ−２（図１６）及びＩＦＮγ（図１７）が産生されたことから、ＣＢＬＢの編集により、ＣＡＲ−Ｔ細胞によるサイトカイン（Ｔ細胞の全体的な適応性及び機能的能力を向上させることが知られている）の産生が増大することが示された。ＣＤ８  Ｔ細胞は典型的にはＩＬ−２を産生しないので、ＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の増加は、驚くべきことである。これらのデータにより、いくつかのケースでは、エフェクター機能が増強されたＣＡＲ−Ｔ細胞の作製には、複数の遺伝子の編集が必要であることが示されている。例えば、この例では、腫瘍の存在下で集積が増大するとともに、サイトカインであるＩＬ−２及びＩＦＮγの産生が増加するＣＡＲ−Ｔ細胞の作製には、ＢＣＯＲ遺伝子及びＣＢＬＢ遺伝子の両方の編集が必要であった。
【０４６１】
実施例１６：マウスＯＴ１／Ｂ１６−Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおけるデュアル編集型養子移入Ｔ細胞の検証
マウスＯＴ１／Ｂ１６−Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルにおいてＴ細胞の抗腫瘍有効性を向上させる編集遺伝子の組み合わせを求めるための併用試験で、標的をさらに評価した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。
【０４６２】
Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ３７８．３ｍｍ３に達したら、マウスを無作為に群分けし、編集マウスＯＴ１  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）Ｃｂｌｂ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（ｉｖ）Ｃｂｌｂ遺伝子及びＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。Ｃｂｌｂ遺伝子及びＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を求めたところ、Ｃｂｌｂ遺伝子のものでは８２％、Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子のものでは８０％であった（ＮＧＳ法を用いて評価した）。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式に従って、平均腫瘍体積を用いて腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（標的ＴＶ最終−標的ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終−コントロールＴＶ初期）×１００
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、Ｔ細胞の移入から７日目であり、初期は、０日目（すなわちＴ細胞の移入日）である。
【０４６３】
図１８に示されているように、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞を移入したところ、ＴＧＩが、Ｃｂｌｂ単一編集型Ｔ細胞またはＺｃ３ｈ１２ａ単一編集型Ｔ細胞を移入した場合と比べて上昇した（Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｃｂｌｂ  ＴＧＩが１０７％であったのに対して、Ｃｂｌｂ単一の編集では４６％、Ｚｃ３ｈ１２ａ単一の編集では９９％であった）。
【０４６４】
ＯＴ１／Ｂ１６  Ｏｖａ同系腫瘍モデルにおいてＭａｐ４ｋ１／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞及びＮｒ４ａ３／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞の有効性を評価するには、同様の実験を行う。
【０４６５】
実施例１７：マウスＰＭＥＬ／ＭＣ３８−ｇｐ１００腫瘍モデルにおけるデュアル編集型養子移入Ｔ細胞の検証
ＭＣ３８ｇｐ１００皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞、Ｍａｐ４ｋ１／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞及びＮｒ４ａ３／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１×１０６個のＭＣ３８ｇｐ１００腫瘍細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスＰＭＥＬ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。Ｔ細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）ＰＤ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｖ）Ｃｂｌｂ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｖ）Ｍａｐ４ｋ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｖｉ）Ｎｒ４ａ３遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｖｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子の両方を標的とする２つのｇＲＮＡ、（ｖｉｉｉ）Ｎｒ４ａ３遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子の両方を標的とする２つのｇＲＮＡ、または（ｉｘ）Ｍａｐ４ｋ１遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子の両方を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出する。下記の式に従って、平均腫瘍体積を用いて腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出する。
（標的ＴＶ最終−標的ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終−コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、Ｔ細胞の移入から２１日目であり、初期は、０日目（すなわちＴ細胞の移入日）である。
【０４６６】
これらの実験では、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞、Ｍａｐ４ｋ１／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞またはＮｒ４ａ３／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞の移入後に、ＴＧＩが、ＰＤ１単一編集型Ｔ細胞、Ｚｃ３ｈ１２ａ単一編集型Ｔ細胞、Ｍａｐ４ｋ１単一編集型Ｔ細胞またはＮｒ４ａ３単一編集型Ｔ細胞の移入時と比べて上昇することが予測される。
【０４６７】
実施例１８：マウスＢ１６−Ｆ１０同系腫瘍モデルにおけるデュアル編集型養子移入Ｔ細胞の検証
肺転移として顕在化する疾患を伴う侵襲性転移性Ｂ１６−Ｆ１０同系腫瘍モデルを用いて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｃｂｌｂデュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を静脈内注射する。接種の前に、マウスの体重を測定し、無作為化手順を用いてマウスを処置群に割り当てる。腫瘍の接種から３日目に、マウスに、編集型マウスＰＭＥＬ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。これらの細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、（ｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ｃｂｌｂ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｉｖ）Ｍａｐ４ｋ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｖ）Ｎｒ４ａ３遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（ｖｉ）Ｍａｐ４ｋ１遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子のそれぞれを標的とする２つのｇＲＮＡ、（ｖｉｉ）Ｎｒ４ａ３遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子のそれぞれを標的とする２つのｇＲＮＡ、または（ｖｉｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子のそれぞれを標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。ＮＧＳ法を用いて、上記の遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価する。体重を少なくとも週に２回モニタリングする。腫瘍の接種から１５日目（編集型ＰＭＥＬの移入から１２日目）に、マウス肺を１０％パラホルムアルデヒドで灌流及び固定する。一晩固定後、肺をさらに保存するために７０％ＥｔＯＨに移す。肺においてがん細胞の黒色コロニーとして見られるＢ１６−Ｆ１０腫瘍量を目視で評価することによって、腫瘍有効性を評価する。
【０４６８】
これらの実験では、デュアル編集型細胞の抗腫瘍有効性が、コントロール及び単一編集型細胞と比べて上昇することが予測される。
【０４６９】
実施例１９：Ｂ１６−Ｏｖａマウス腫瘍モデルにおけるＰＤ１／ＬＡＧ３デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、ＰＤ−１／Ｌａｇ３デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ４８５ｍｍ３に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｌａｇ３遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）一方はＰＤ１遺伝子を標的とし、もう一方はＬａｇ３遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式を用いて、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（ＰＤ１／Ｌａｇ３  ＴＶ最終）−ＰＤ１／Ｌａｇ３  ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終−コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１０日目であり、初期は、編集型マウスＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の移入日である。
【０４７０】
図１９のデータには、ＰＤ１単一編集型Ｔ細胞の養子移入によって、ＴＧＩが７０％となり、Ｌａｇ３単一編集型Ｔ細胞の養子移入により、ＴＧＩが３６％となったことが示されている。驚くべきことに、ＰＤ１とＬａｇ３を組み合わせて編集したところ、腫瘍成長抑制率が上昇せず、ＴＧＩは３８％となった。
【０４７１】
実施例２０：腫瘍浸潤リンパ球の養子Ｔ細胞移入のための標的の検証
Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｚｃ３ｈ１２、Ｍａｐ４ｋ１及びＮｒ４ａ３／Ｃｂｌｂの単一編集型腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びデュアル編集型ＴＩＬの抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。この実験では、ドナーコホートのＣＤ４５．１Ｐｅｐ  Ｂｏｙマウス（Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ）及びレシピエントコホートのＣＤ４５．２  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）という２つのマウスコホートを使用し、それぞれ、６〜８週齢の雌マウスで構成される。
【０４７２】
ＴＩＬを作製するために、ドナーであるＣＤ４５．１Ｐｅｐ  Ｂｏｙマウス（Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ）に、０．５×１０６個のＢ１６−Ｏｖａ細胞を皮下注射する。腫瘍細胞の接種から１４日目に、腫瘍を摘出して、第２のコホートのマウスに注入するための編集型ＣＤ４５．１腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を作製した。Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍（２００〜６００ｍｍ３）を摘出し、裁断し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステム及びｍｏｕｓｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０−０９６−７３０）をメーカーの推奨に従って用いて、単細胞懸濁液まで解離させた。腫瘍懸濁液を７０μＭの細胞ストレーナーで濾過し、ＣＤ４／ＣＤ８（ＴＩＬ）Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０−１１６−４８０）を用いて、ＴＩＬを濃縮する。３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００−０２）を添加した完全ｍＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ）で、単離ＴＩＬを６ウェルプレートにおいて、１．５×１０６細胞／ｍＬで培養する。３日目に、細胞を回収し、洗浄し、ヌクレオフェクション緩衝液Ｔに再懸濁させ、実施例１に記載されているように、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰをエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後、３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２を添加した完全ｍＴＩＬ培地で、ＴＩＬを６ウェルプレートにおいて、１．５×１０６細胞／ｍＬで培養する。５日目及び７日目に、３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２を添加した新鮮な完全ｍＴＩＬ培地に細胞を再懸濁させ、１×１０６細胞／ｍＬの密度でフラスコに播種した。８日目に、細胞を回収し、計数し、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射のために、ＰＢＳに再懸濁させ、ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析のために、ペレットを調製した。
【０４７３】
これらのＴＩＬ細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｍａｐ４ｋ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）Ｎｒ４ａ３遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（５）Ｃｂｌｂを標的とする単一のｇＲＮＡ、（６）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡ、（７）Ｍａｐ４ｋ１遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡ、または（８）Ｎｒ４ａ３遺伝子及びＣｂｌｂ遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。
【０４７４】
レシピエントであるＣＤ４５．２  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型ＣＤ４５．１  ＴＩＬを尾静脈から静脈内注射する。任意に、Ｔ細胞の移入前に、マウスにシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、リンパ球除去を誘導でき、編集したＴＩＬは、最長で４日間、１日に２回、組み換えヒトＩＬ−２（７２０，０００ＩＵ／Ｋｇ）の腹腔内処置と組み合わせて静脈内投与できる。
【０４７５】
体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、下記の式に従って、％ＴＧＩを算出する。
％ＴＧＩ＝（標的ＴＶ最終−標的ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終−コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１７日目であり、初期は、編集ＴＩＬの移入日である。
【０４７６】
これらの結果によって、コントロールのガイドと比べて、Ｂ１６Ｏｖａ皮下マウスモデルにおいて、単一編集型またはデュアル編集型のマウスＴＩＬを養子移入すると、コントロールの編集細胞による処置と比べて、抗腫瘍応答が増強することが示されることが予測される。
【０４７７】
実施例２１：操作Ｔ細胞療法の標的の検証
ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及び／またはＮＲ４Ａ３の編集が、ＣＡＲ  Ｔ細胞及び人工ＴＣＲを発現するように操作したＴ細胞の抗腫瘍有効性に及ぼす作用を検証するために、実験を行う。表１７に記載されている操作Ｔ細胞を、実施例１に記載されているようにして編集して、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及び／またはＮＲ４Ａ３の発現を低下させる。続いて、示されている種類の細胞を用いて、皮下マウス異種移植モデルにおいて、これらの操作Ｔ細胞を評価する。例えば、ＣＤ１９特異的なＣＡＲまたは人工ＴＣＲを有するように操作したＴ細胞は、実施例１２で上記したように、Ｒａｊｉ細胞モデルにおいて、または表１６に示されている他の細胞株のうちのいずれかにおいて評価でき、ＭＡＲＴ１特異的なＣＡＲまたは人工ＴＣＲを有するように操作したＴ細胞は、ＳＫＭＥＬ５、ＷＭ２６６４またはＩＧＲ１細胞モデルなどで評価できる。
表１６：操作受容体の特異性及び標的細胞株
【表１６−１】
2021518161.tif 000027
【表１６−２】
2021518161.tif 000028
【０４７８】
簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＮＳＧマウスに、３×１０６個の標的細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ２００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを５頭からなる群に無作為に分け、編集した操作Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。その養子移入細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、あるいはＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及び／またはＮＲ４Ａ３を編集するガイドのいずれかによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積を各処置群において平均及び平均の標準誤差として算出する。これらの実験の結果によって、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及び／またはＮＲ４Ａ３編集型の操作Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が、生存性及びまたは腫瘍サイズの縮小によって測定した場合に、コントロールのガイドの場合と比べて向上することが示されることが予測される。
【０４７９】
実施例２２：受容体導入Ｔの機能に対する標的編集の検証
ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及び／またはＮＲ４Ａ３の編集が、操作Ｔ細胞によるサイトカインの産生に及ぼす作用を検証するために、実験を行う。簡潔に述べると、上記の表１６に記載されている操作Ｔ細胞をヒトＣＤ８  Ｔ細胞から作製し、ＲＮＰの形態でＣａｓ９と複合化したガイドＲＮＡを用いて、エレクトロポレーションによって、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＦＬＩ１、ＣＡＬＭ２、ＤＨＯＤＨ、ＵＭＰＳ、ＲＢＭ３９、ＳＥＭＡ７Ａ、ＣＨＩＣ２、ＰＣＢＰ１、ＰＢＲＭ１、ＷＤＲ６、Ｅ２Ｆ８、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＮＡＳ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＭＡＰ４Ｋ１及び／またはＮＲ４Ａ３のうちの１つ以上を編集する。ＣＡＲ−Ｔを、表１８に示されている対応する細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、１：０、０．３：１、１：１、３：１及び１０：１の比率で共培養する。２４時間後、操作Ｔ細胞の総細胞数を求め、サイトカインの解析のために上清を保存する。これらの実験の結果によって、コントロールの編集細胞と比べて、集積が増大し、編集ＣＡＲ  Ｔ細胞からのサイトカインの産生のレベルが上昇することが示されることが予測される。
【０４８０】
実施例２３：デュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球の作製
編集ＴＩＬは、ＴＩＬを単離及び増殖するために、ＦＤＡから認可された臨床試験で以前用いられた確立済みのプロトコールに従って作製する。腫瘍組織を取り出した後、腫瘍を断片化して２ｍｍ３の切片にし、機械的／酵素的にホモジナイズし、最長で６週間、または細胞数が１×１０８個以上になるまで、６，０００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２で培養する（これをＴＩＬ作製の急速増殖前フェーズ（ｐｒｅ−ＲＥＰ）とする）。ｐｒｅ−ＲＥＰの段階が完了したら、ＴＩＬに、ｃＧＭＰの条件下で、ＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子、ＦＬＩ１遺伝子、ＣＡＬＭ２遺伝子、ＤＨＯＤＨ遺伝子、ＵＭＰＳ遺伝子、ＲＢＭ３９遺伝子、ＳＥＭＡ７Ａ遺伝子、ＣＨＩＣ２遺伝子、ＰＣＢＰ１遺伝子、ＰＢＲＭ１遺伝子、ＷＤＲ６遺伝子、Ｅ２Ｆ８遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＮＡＳ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子、ＭＡＰ４Ｋ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションする。細胞には、ｐｒｅ−ＲＥＰプロセスの前またはその最中にエレクトロポレーションしてもよい。エレクトロポレーション後、１：１００の比率のＴＩＬ及び照射フィーダー細胞で、５０×１０６個の細胞を１ＬのＧ−Ｒｅｘ（商標）培養フラスコに、およそ２週間かけて移す。この作製部分は、急速増殖フェーズ（ＲＥＰ）とする。ＲＥＰフェーズの後、ＴＩＬを回収し、洗浄し、患者に即時注入するために溶液に懸濁させる。
【０４８１】
実施例２４：編集免疫エフェクター細胞の第Ｉ相試験
再発性であるかまたは抗ＰＤ−１療法に対して抵抗性である転移性メラノーマの患者を、本明細書に記載されている改変細胞で処置する第１相、オープンラベル、単一施設試験を行う。患者に細胞を１回注入し、疾患の進行または療法不耐性が見られるまで、試験を続ける。試験への参加を中止する前に、現場の放射線科医が放射線学的ＰＤを定める。
【０４８２】
試験の目的：試験の主目的は、（１）最大耐用量（ＭＴＤ）、用量制限毒性（ＤＬＴ）、ならびに進行固形腫瘍を有する患者において将来試験する際に推奨することになる、細胞組成物（及び必要とされる関連併用薬）の用量を求めることと、（２）患者において、移入した編集細胞の抗がん活性のいずれかのエビデンスを観察することである。試験の二次目的は、（１）その細胞組成物の薬物動態を求めることと、（２）生体試料中の薬力学的バイオマーカーの変化によって求めた場合において、その細胞組成物のオンターゲット活性を評価することと、（３）処置後の操作ＴＩＬの存続性によって求めた場合において、その改変細胞の増殖を評価することである。試験の探査的目的は、（１）いずれかの根本的な遺伝子変異（複数可）を臨床応答と相関付けることである。
【０４８３】
試験の評価項目：この試験の主要評価項目は、有害事象（ＡＥ）の発生率及び重症度（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ）バージョン４．３に従って格付け）、臨床検査値異常、１２誘導心電図（ＥＣＧ）パラメーターの変化、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１による客観的奏効率（ＯＲＲ）、ＣＮＳの応答（活動性の脳転移を有する患者における、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１によるＯＲＲ及び無増悪生存期間［ＰＦＳ］）である。この試験の副次評価項目は、患者申告の症状及び健康関連クオリティオブライフ（ＨＲＱｏＬ）スコア、奏効までの期間、奏効期間、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１による病勢コントロール率（完全奏効［ＣＲ］、ＰＲまたはＳＤのうちの最良の奏効が認められた患者の割合）、治療期間、免疫表現型分析結果、遺伝子操作ＴＩＬの存続性、トラフィキング及び機能、投与前及び投与後の試料中の薬力学的バイオマーカーである。この試験の探査的評価項目は、投与前の腫瘍生検標本及び／または末梢血において、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ（登録商標）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｐａｎｅｌまたは類似の代替策を用いて、がん関連変異及び／または遺伝子改変を評価した結果である。
【０４８４】
治療レジメン：治療レジメンの概要は、以下のとおりである。
（ａ）７日前及び６日前：シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）
（ｂ）５日前〜１日前：フルダラビン２５ｍｇ／ｍ２（静脈内）
（ｃ）１日目：細胞注入
（ｄ）１日目〜１５日目：ＩＬ−２（１２５，０００ＩＵ／ｋｇ／日）、最大１４回投与
【０４８５】
細胞の１回目の投与量は、１×１０９細胞以下の総用量となる。万が一、その患者において用量制限毒性（ＤＬＴ）が認められた場合には、２人の追加の患者を同じ用量レベルで処置する。１人目の患者において、ＤＬＴが認められることなく、ＤＬＴモニタリング期間（２１日）が経過したら、それ以降の患者は、１×１０１１個未満のＴＩＬという用量で処置することになる。
【０４８６】
併用処置：その試験中に発現し得る症状及び基礎病態の管理のために、その試験中に、緩和及び支持療法が認められる。
【０４８７】
有効性評価：ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１に従い、現場の放射線科医及び／または治験責任医師が腫瘍の応答性を求めることになる。腫瘍の評価は、疾患が進行するまで６週間おきに行い、その評価は、疾患の進行以外の理由で中止となった患者では、疾患が進行するまで、または別の抗がん療法の開始まで継続することになる。その試験に最後の患者を登録してから最長で３年間、生存についても追跡することになる。
【０４８８】
安全性評価：安全性評価には、身体診察、検査室での検査、バイタルサイン及びＥＣＧが含まれることになる。有害事象は、ＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ  ｖ４．０３に従って格付けする。試験の各コホートについて、有害事象発生率、及び総体的毒性（毒性グレード（重症度）によって分類）の発生頻度を明らかにする。検体検査結果のリストも作成し、検体検査の経時的変化を概括する記述統計結果も提示する。
【０４８９】
分子遺伝学的評価：腫瘍組織及び血漿試料の分子解析を通じて、腫瘍の生物学的作用に関与する遺伝子の変異状態を判断する。これらの試験結果は、試験手順に従って、解析後直ちに、治験責任医師及び治験依頼者に提供される。分子解析法としては、ダイレクトシーケンシング及び／またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限らない。
【０４９０】
患者申告の症状及びクオリティオブライフの評価：有効なＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（ＥＯＲＴＣ）Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＱＬＱ）−Ｃ３０（ｖ．３．０）（世界的な臨床試験で広範囲に研究されている）を実施することによって、患者申告の症状及びＨＲＱｏＬを調べる。ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０は、５つの機能の尺度（身体的機能、役割的機能、認知的機能、情緒的機能及び社会的機能）、３つの症状の尺度（倦怠感、痛み及び悪心／嘔吐）、ならびに全般的な健康状態／ＱｏＬスケールについてスコア化する。６つの単一項目の尺度も含める（呼吸困難、不眠、食欲不振、便秘、下痢及び経済的困難）。
【０４９１】
試験評価：これらの試験の評価パラメーターには、投与前及び奇数サイクルごとの１日目に腫瘍の放射線画像診断を行った後に、ＰＫ解析のための血液試料の採取（１日目、２日目、３日目、週に１回×４、月に１回×６）及び薬力学的解析を行い、サイトカインパネル解析（１日目、２日目、３日目、週に１回×４、月に１回×６）を行うことが含まれる。
【０４９２】
実施例２５：抗腫瘍記憶及びエピトープ拡大をもたらす標的としてのＺｃ３ｈ１２ａの検証
Ｂ１６−Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｔ細胞におけるＺｃ３ｈ１２ａの阻害または欠失によって駆動される抗腫瘍記憶及びエピトープ拡大をマウスにおいて評価した。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集マウスＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（ｉ）コントロールのｇＲＮＡ、または（ｉｉ）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。
【０４９３】
図２０に示されているように、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集Ｔ細胞を投与された１０頭のマウスのうちの９頭が評価可能であったとともに、ＯＴ１  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の移入から５５日後（または最初のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍の接種から６５日後）までに腫瘍を完全に拒絶した。これらのマウスは、完全奏効マウス（ＣＲ）とみなした。ＣＲマウスのうちの４頭を２回目のＢ１６−Ｏｖａの接種によって再感作し、別の４頭のＣＲマウスをＢ１６Ｆ１０の接種によって感作した。Ｂ１６−Ｏｖａは、ＯＴ１細胞に特異的であるＯｖａ抗原を含むように操作した、Ｂ１６Ｆ１０の誘導体である。加えて、１０頭のナイーブマウスにＢ１６−Ｏｖａを接種し、別の１０頭のナイーブマウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を接種した。Ｂ１６−Ｏｖａ  ＣＲマウスは、これらの接種後、Ｂ１６−Ｏｖａによる再感作及びＢ１６Ｆ１０による感作の両方とも拒絶したことがわかった。Ｂ１６−Ｏｖａの拒絶により、Ｚｃ３ｈ１２ａの駆動による抗腫瘍記憶応答が示されている。Ｂ１６Ｆ１０の拒絶により、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集Ｔ細胞が、宿主内の他のＴ細胞に対して、「エピトープ拡大」として知られる現象を通じて、非Ｏｖａ腫瘍抗原に対する増殖性抗腫瘍応答を起こすように命令することが示されている。エピトープ拡大は、決定基拡大としても知られており、初期免疫応答に関与しないＴ細胞が、初期免疫応答に組織特異的に関連付けられたエピトープに対して活性化すると、免疫応答に漸次的に寄与することである。
【０４９４】
実施例２６：ナイーブヒトＴ細胞におけるＭＡＰ４Ｋ１の編集により、サイトカインの産生が増加する。
解凍したドナーＰＢＭＣから初代ヒトＴ細胞を単離し、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２中で一晩培養した。翌日、Ｔ細胞に、単一のガイドコントロール遺伝子またはＭＡＰ４Ｋ１に対するＲＮＰをエレクトロポレーションした。遺伝子編集が行われるように培養液（Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２）中で４日経過後、活性化のために、細胞を２４時間、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ＋ＣＤ３／２８／２中で培養した。活性化してから２４時間後、上清を回収し、分泌されたサイトカインのレベルをＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）のプラットフォームによって測定した。図２１に示されているように、ＭＡＰ４Ｋ１編集Ｔ細胞では、ＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＴＮＦαの産生増加が見られた。ＺＣ３Ｈ１２ａ編集ＰＢＭＣ及びＮＲ４Ａ３編集ＰＢＭＣのサイトカイン産生を評価するためには、同様の実験を行うことができる。
【０４９５】
実施例２７：Ｚｃ３ｈ１２ａ編集マウスＣＤ８  Ｔ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーの発現
雌のＯＴ１マウスまたはｐＭＥＬマウスの膵臓を摘出し、実施例１に記載されているようにして、ＣＤ８  Ｔ細胞を単離した。実施例１に記載されている方法に従って、ＣＤ８  Ｔ細胞に、Ｃａｓ９タンパク質、及びＺｃ３ｈ１２ａまたはコントロール遺伝子のいずれかを標的とするｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをエレクトロポレーションした。複数のガイドにわたって、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集効率を測定したところ、３６〜６９％であった。
【０４９６】
Ｉｆｎｇ、Ｇｚｍａ及びＩｃｏｓの発現をＲＮＡ−ｓｅｑによって測定した。３００万個の編集細胞のペレットのＲＮＡの抽出及びシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）をＷｕｘｉ  ＮｅｘｔＣｏｄｅが行った。Ｓａｌｍｏｎ（バージョン０．１１．２、Ｐａｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２０１７））及びＧｅｎｃｏｄｅのマウス遺伝子アノテーション（バージョンＭ１５）を用いて、遺伝子発現レベルをＴＰＭとして定量する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１４））。Ｒパッケージｌｉｍｍａ３（バージョン３．３８．０、Ｒｉｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１５））を用いて、差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）を解析した。複数のガイドを用いて標的を阻害した場合には、その解析には、各ガイドの影響を組み込み、すべてのガイドから影響を受けた遺伝子のみを、差次的発現が有意であるとみなした。
【０４９７】
これらの実験によって、Ｚｃ３ｈ１２ａが編集されたマウスＯＴ−１細胞またはマウスＰＭＥＬ細胞において、Ｉｆｎｇ  ｍＲＮＡの発現（コントロールのｓｇＲＮＡの場合に対して、ＯＴ−１では１４４．５倍、ＰＭＥＬでは１１９．２倍）、ならびにＧｚｍａ  ｍＲＮＡの発現（コントロールのｓｇＲＮＡの場合に比べて、ＯＴ−１では７．２倍、及びｐＭＥＬでは３．１倍）が有意に増加したことが示された。Ｚｃ３ｈ１２ａ編集細胞では、既知のＺＣ３Ｈ１２Ａ基質であるＩｃｏｓのｍＲＮＡの発現も、ＯＴ−１細胞では１１倍、ＰＭＥＬ細胞では９．１倍アップレギュレートされた。これらのデータを勘案すると、Ｚｃ３ｈ１２ａが編集されたマウスＯＴ−１細胞またはマウスＰＭＥＬ細胞では、ｍＲＮＡの発現によって測定したところ、Ｔ細胞活性化マーカーのＩｆｎｇ、Ｇｚｍａ及びＩｃｏｓの発現が増加したことが示されている。
【０４９８】
実施例２８：Ｚｃ３ｈ１２ａ  ｓｉＲＮＡにより改変されたマウスＴ細胞によるＩＣＯＳの発現
追加の阻害機序によってＺｃ３ｈ１２ａの発現を改変することの作用を示すために、Ｚｃ３ｈ１２ａ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを使用した。コントロール（カタログ番号：Ｋ−００５０００−Ｇ１−０２）またはＺｃ３ｈ１２ａを標的とする（カタログ番号：Ｅ−０５２０７６−００−０００５）自己送達Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡをメーカーの指示に従って調製した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  ｆｏｒ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、カタログ番号１１４５６Ｄ）を用いて、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ−２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号５７５４０６）を添加した２．５％熱不活化ＦＢＳ及び終濃度１μＭの自己送達Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ送達培地（Ｄｈａｒｍａｃｏｎカタログ番号Ｂ−００５０００−５００）において、精製マウスＣＤ８  Ｔ細胞を活性化させた。７２時間後、活性化ビーズを除去し、フローサイトメトリー、またはｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析によって、表面のＩＣＯＳの発現について細胞を評価した。
【０４９９】
ｑＲＴ−ＰＣＲ解析では、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号：７４１０４）を用いて、ＲＮＡをＴ細胞から精製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  ＶＩＬＯ（カタログ番号：１１７５５−０５０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカーの指示に従って用いて、ｃＤＮＡを調製した。下に列挙されているのは、マウス転写産物またはヒト転写産物の検出の際に用いたＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。ＧＡＰＤＨをコントロール遺伝子として使用し、ΔΔＣｔ法を用いて、相対的な発現を定量した。細胞をＺｃ３ｈ１２ａ特異的ｓｉＲＮＡで処理したところ、Ｚｃ３ｈ１２ａ  ｍＲＮＡレベルがコントロールと比べて３０％低下した。
【表Ａ】
2021518161.tif 000029
【０５００】
ＩＣＯＳの表面発現では、マウスＣＤ８細胞を蛍光標識抗ＩＣＯＳ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：３１３５２４）によって、１：１００の希釈率で、メーカーの指示に従って染色した。ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．１というソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて、蛍光抗ＩＣＯＳ抗体で染色した細胞の平均蛍光強度を算出することによって、細胞表面のＩＣＯＳの発現の相対量を測定した。ｓｇＲＮＡの媒介によってＺｃ３ｈ１２ａを阻害した場合と整合して、Ｚｃ３ｈ１２ａを標的とするｓｉＲＮＡで処理した細胞において、ＩＣＯＳレベルは１．８倍高かった。
【０５０１】
実施例２９：Ｚｃ３ｈ１２ａジンクフィンガーによって編集したマウスＴ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーの発現
追加の阻害機序によってＺｃ３ｈ１２ａの発現を改変することの作用を示すために、ＺＦＮの媒介によってＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を編集した。
【０５０２】
操作ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ドメインは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈがプラスミドペア（ＣＳＴＺＦＮ−１ＫＴ  ＣＯＭＰＯＺＲ（登録商標）Ｃｕｓｔｏｍ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）Ｒ−３２５７６０９）で作製した。それらのドメインは、マウスＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子のＣｈｒ４：１２５１２２３９８−１２５１２２３９４及びＣｈｒ４：１２５１２１０８７−１２５１２１０８４という位置、ならびにコントロールのマウス遺伝子Ｏｌｆｒ４５５のＣｈｒ６：４２５３８４４６−４２５３８４４７という位置を認識するようにカスタマイズした。プラスミドは、市販のＮＥＢ  Ｍｏｎａｒｃｈ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐシステム（カタログ番号Ｔ１０１０）をメーカーのプロトコールに従って用いて調製した。全インプット量１０μｇを用いて、鋳型ＤＮＡを直鎖状にし、ＮＥＢ  Ｍｏｎａｒｃｈ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ  ｋｉｔ（カタログ番号Ｔ１０３０）を用いて精製した。精製した鋳型ＤＮＡ６μｇ及びＰｒｏｍｅｇａ  Ｔ７  ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐ１３００及びＰ１７１２）をメーカーの条件に従って用いて、５’にキャップを有するＲＮＡ転写産物を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。精製キットのＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（カタログ番号７４１０４）を用いて、転写産物を精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ４２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステムを用いて、各ＺＦＮドメイン転写物の完全性及び濃度を確認した。ＮＥＢ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍ０２７６）を用いて（反応ごとに１０ユニット使用した）、精製転写産物をポリアデニル化した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ４２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステムを用いて、サイズシフトによって、ポリアデニル化テールの付加を確認した。成熟ＺＦＮドメインｍＲＮＡ転写物のそれぞれを、その対応するペアと組み合わせ、各ペア１０μｇを５００万個のマウスＣＤ８  Ｔ細胞と混合して、マウスＴ細胞のエレクトロポレーションについて上記されている方法に従ってエレクトロポレーションした。
【０５０３】
Ｚｃ３ｈ１２ａの２つの遺伝子座を３つのＺＦＮによってそれぞれ標的とし、編集効率をＮＧＳによって測定した。ＺＦＮの媒介によってＺＣ３Ｈ１２Ａを不活性化する作用を追跡するために、ＺＣ３Ｈ１２Ａ基質であるＩｌ６及びＩｃｏｓ、ならびにＴ細胞活性化マーカーであるＩｆｎｇのｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。遺伝子座Ｃｈｒ４：１２５１２１０８８−１２５１２１０８５を標的とする３つのすべてのＺＦＮによって、コントロールのＺＦＮ標的Ｏｌｆｒ４５５と比べて、Ｉｃｏｓ  ｍＲＮＡの発現増加（１．２〜２倍の範囲）、Ｉｌ６  ｍＲＮＡの発現増加（２．３〜６２．８倍の範囲）及びＩｆｎｇ  ｍＲＮＡの発現増加（２．９〜１２．８倍の範囲）が見られたことから、ＺＦＮの媒介によってＺｃ３ｈ１２ａを編集すると、Ｔ細胞に対して、ＣＲＩＳＰＲの媒介による阻害と同様の作用が誘導されることが確認された。
【０５０４】
実施例３０：Ｚｃ３ｈ１２ａ編集マウスＴＩＬにおけるＴ細胞活性化マーカーの発現
実施例１に記載されているように、マウスＣＤ８  ＴＩＬを単離し、Ｚｃ３ｈ１２ａを標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰで編集した。Ｚｃ３ｈ１２ａ特異的ｓｇＲＮＡによって、Ｚｃ３ｈ１２ａが８６％阻害される。ＦＡＣＳ解析により、Ｚｃ３ｈ１２ａをｓｇＲＮＡで阻害したところ、細胞表面でＩＣＯＳの発現が２．７倍増加したことが確認された。ＲＮＡ−ｓｅｑ解析により、Ｉｃｏｓ  ｍＲＮＡが有意に２．７倍増加したとともに（ｐ＝１．６×１０−７１）、Ｉｆｎｇ  ｍＲＮＡの有意な増加（コントロールｓｇＲＮＡに対して９．３倍、ｐ＝０）及びＧｚｍａ  ｍＲＮＡの有意な増加（コントロールのｓｇＲＮＡに対して１．２倍、ｐ＝６．３×１０−６）が見られたことが確認されたことから、マウスＴＩＬにおけるＺｃ３ｈ１２ａの編集により、Ｔ細胞が活性化することが確認された。
【０５０５】
実施例３１：ＣＲＩＳＰＲの媒介によってマウスＣＤ８  Ｔ細胞におけるＺｃ３ｈ１２ａを編集することによる、ＺＣ３Ｈ１２Ａ活性の不活化
Ｚｃ３ｈ１２ａの遺伝子不活化が、マウスＣＤ８  Ｔ細胞の機能及び炎症性表現型に及ぼす作用を評価した。実施例３０に記載されている方法を用いて、マウスＯＴ−Ｉ  ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化させ、３つの異なるレトロウイルス上清のうちの１つに感染させた。レトロウイルスは、１）嗅覚受容体遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ（ネガティブコントロール）、２）Ｚｃ３ｈ１２ａを標的とするｓｇＲＮＡ（Ｚｃ３ｈ１２ａ編集条件）、または３）Ｚｃ３ｈ１２ａ及びＺｃ３ｈ１２ａのタンパク質産物をコードする遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ、（Ｚｃ３ｈ１２ａ編集ＷＴ  ＺＣ３Ｈ１２Ａレスキュー条件）のいずれかをコードするものであった。選択後、トランスダクション率は、いずれの場合にも９１％を超えており、次世代シーケンシングによって、ゲノム編集率が、いずれの場合にも８０％を超えていたことが確認された。
【０５０６】
続いて、ＣＤ８  Ｔ細胞をＰＭＡ及びイオノマイシンで６時間刺激して、炎症性転写産物の発現を誘導し、定量ＲＴ−ＰＣＲを行って、ｍＲＮＡレベルを評価した。転写産物の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈの発現と比較して評価した。Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子座の編集により、Ｉｃｏｓ、Ｉｌ６、Ｉｌ２、Ｉｆｎｇ及びＮｆｋｂｉｚの転写産物のレベルが、Ｏｌｆ４２１遺伝子座を編集したネガティブコントロール細胞と比べて著しく上昇した（図２２）。コドン最適化Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を内在性Ｚｃ３ｈ１２ａ編集細胞にレンチウイルスによって共送達することによって、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質を発現させたところ、炎症性ｍＲＮＡレベルが低下し（図２２）、観察された上記の表現型が、機能性ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質の欠損に依存することが示された。
【０５０７】
観察されたＺＣ３Ｈ１２Ａ依存性の転写変化が、細胞表面での変化に反映されるのか判断するために、細胞を蛍光抗ＩＣＯＳ抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて、細胞表面のＩＣＯＳレベルを求めた。Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子座の編集により、細胞表面のＩｃｏｓの発現が増加し、この増加は、レトロウイルスによって誘導したＺＣ３Ｈ１２Ａの過剰発現によって反転した（図２３）。
【０５０８】
Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子の不活化が、ＣＤ８  Ｔ細胞によるサイトカインの分泌に及ぼす作用も測定した。ＩＬ−２のみ、またはＩＬ−２及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓのいずれかを含む培地の入ったウェルに、細胞を４８時間かけて播種した。細胞上清を回収し、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＭＳＤのプラットフォームを用いて、分泌されたＩＦＮγ及びＩＬ−６のレベルを測定した。刺激した場合には、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集ＣＤ８  Ｔ細胞は、Ｏｌｆ４２１編集細胞よりもＩＬ−６及びＩＦＮγの産生量が多かった。さらに、Ｚｃ３ｈ１２ａ編集細胞は、外因性抗ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激のない状態では、Ｏｌｆ４２１編集細胞と比べて、ＩＦＮγの産生量もかなりの量であった（図２４）。
【０５０９】
実施例３２：ＣＲＩＳＰＲの媒介によって初代ヒトＴ細胞におけるＺＣ３Ｈ１２Ａを編集することによる、ＺＣ３Ｈ１２Ａの不活化
ＺＣ３Ｈ１２Ａの不活化が、初代ヒトＴ細胞に及ぼす作用を判断するために、ゲノム編集型ヒトＴ細胞によるＩＬ６  ｍＲＮＡ転写産物及びＩＬ−６タンパク質の産生を評価した。簡潔に述べると、初代ヒトＴ細胞を末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、実施例１に概説されているような方法に従って、ＺＣ３Ｈ１２ＡまたはＯＲ１Ａ２の遺伝子座のいずれかを標的とするＲＮＰを用いて、ゲノム編集を行った。編集効率は、次世代シーケンシングによって求めたところ、３０〜７２％の範囲であった。
【０５１０】
細胞を等しい濃度で播種し、抗ＣＤ３／ＣＤ２／ＣＤ２８テトラマー試薬（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む培養培地で培養した。２４時間後、細胞上清を回収し、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ−ｐｌｅｘ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｎｅｌ  １を用いて、ＩＬ−６レベルを求めた。ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子座を編集したＴ細胞は、複数のドナーにわたって、２４時間の期間において、ＯＲ１Ａ２遺伝子座を編集したＴ細胞よりもＩＬ−６を培養培地に多く分泌した（図２５Ａ）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間刺激後、ＩＬ−６  ｍＲＮＡの産生が有意に増加した（ドナー３８３５では１２．３倍、ドナー６９１５では５．９倍）ことも観察された（図２５Ｂ）。
【０５１１】
実施例３３：ＺＣ３Ｈ１２Ａタイリングスクリーニング及び検証アッセイ
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タイリングスクリーニングを行って、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子にまたがる標的座位内の阻害剤標的位置の候補を定めた。実施例１に記載されているようにして、初代ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離し、完全長のＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子にわたるゲノム位置を標的とするように設計したｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスライブラリーをトランスダクションした。レンチウイルスライブラリーのトランスダクションから２日後に、トランスダクションしたＣＤ８＋細胞に、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、さらに１０日間、培養した。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に培養してから１０日後、下記のようにスクリーニングを行った。追加のアッセイを行って、タイリングスクリーンで特定されたｇＲＮＡを検証した。ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする別個のｇＲＮＡを４３７個、下記のパラメーターに従ってアッセイした。
【０５１２】
タイリングスクリーン
増殖のリードアウト：Ｃａｓ９  ｍＲＮＡのエレクトロポレーションから１０日目に、第１のアームの細胞を回収した。ＤＮＡを抽出し、そのライブラリーにおける各種ｓｇＲＮＡの認識部位にまたがるアンプリコンをＰＣＲによって増幅し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってシーケンシングした。最終カウント数を参照カウント数で除したもののｌｏｇ比によって、その各ｓｇＲＮＡの濃縮または枯渇を求めた。
【０５１３】
ガイドを検証するための追加のアッセイ
追加のアッセイを開発して、上記のタイリングスクリーンで特定されたｇＲＮＡの有効性及びオンターゲット活性をさらに特徴付けた。細胞を単離し、タイリングスクリーンで特定されたＺＣ３Ｈ１２Ａ特異的ｇＲＮＡを含むＣａｓ９：ｇＲＮＡ  ＲＮＰをエレクトロポレーションした。細胞をおよそ１０日間培養し、１０日の時点に、下記のアッセイを行った。
【０５１４】
ＤＮＡ編集アッセイ：ＤＮＡ編集アッセイを開発して、個々のガイドが、そのそれぞれの標的の編集をＤＮＡレベルで誘導する能力を比較した。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ  ＲＮＰをエレクトロポレーションした後、細胞をおよそ１０日間培養し、１０日目の時点に、ペレットを回収し、ＤＮＡを抽出した。ガイド特異的なプライマーセットを用いて、各種ｓｇＲＮＡにおいてゲノムの標的座にまたがるアンプリコンをＰＣＲによって増幅し、ＮＧＳによってシーケンシングした。予測されるガイド切断部位に、シーケンシングリードをアラインメントし、ＤＮＡ配列が編集されたリードの割合（％）を求めた。１）オフターゲット編集の全体的割合（％）、及び２）オフターゲット編集遺伝子の識別という２つの基準に基づき、結果を評価した。最適なガイドは、オフターゲット編集率（％）のレベルが最低であり及び／またはオフターゲット編集遺伝子プロファイルが最も無害であると特定されたガイドであった。例えば、遺伝子内領域の遺伝子編集は、無害な作用とみなし、その一方で、既知のがん遺伝子または腫瘍抑制因子の編集は、望ましくないオフターゲットプロファイルとみなした。
【０５１５】
ウエスタンブロットアッセイ：ウエスタンブロットアッセイを用いて、個々のガイドが、そのそれぞれの標的のタンパク質の発現を減少させる能力を比較した。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ  ＲＮＰをエレクトロポレーションした後、細胞をおよそ１０日間培養してから、細胞ペレットを回収し、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。抽出されたタンパク質をブラッドフォードアッセイによって定量し、自動ウエスタンブロッティング装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉｍｐｌｅのＷｅｓ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ）に、機械の標準的な１２−２３０ｋＤ  Ｗｅｓ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅのプロトコールを用いて、１μｇ充填した。市販の標的特異的一次抗体を用いた後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体とインキュベートした。標的ガイドごとに検出されたシグナルを、ネガティブコントロールのガイド試料で見られたそれぞれのシグナルに対して正規化した。
【０５１６】
タイリング及び検証結果：上記のアッセイに基づき、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする２００個のｇＲＮＡ（配列番号１０６５〜１２６４）を最適なガイドとして特定した。ＢＣＯＲ及びＴＮＦＡＩＰ３についても同様の実験を行い、５７個のＢＣＯＲ  ｇＲＮＡ（配列番号７０８〜７６４）及び３９個のＴＮＦＡＩＰ３  ｇＲＮＡ（配列番号３４８〜３８６）が、最適なガイドの候補として特定された。
表５Ａ：ヒトゲノム座標
【表５Ａ−１】
2021518161.tif 000030
【表５Ａ−２】
2021518161.tif 000031
【表５Ａ−３】
2021518161.tif 000032
【表５Ａ−４】
2021518161.tif 000033
【表５Ａ−５】
2021518161.tif 000034
【表５Ａ−６】
2021518161.tif 000035
【表５Ａ−７】
2021518161.tif 000036
表５Ｂ：マウスゲノム座標
【表５Ｂ−１】
2021518161.tif 000037
【表５Ｂ−２】
2021518161.tif 000038
【表５Ｂ−３】
2021518161.tif 000039
【表５Ｂ−４】
2021518161.tif 000040
【表５Ｂ−５】
2021518161.tif 000041
【表５Ｂ−６】
2021518161.tif 000042
表６Ａ：ヒトゲノム座標
【表６Ａ−１】
2021518161.tif 000043
【表６Ａ−２】
2021518161.tif 000044
【表６Ａ−３】
2021518161.tif 000045
【表６Ａ−４】
2021518161.tif 000046
表６Ｂ：マウスゲノム座標
【表６Ｂ−１】
2021518161.tif 000047
【表６Ｂ−２】
2021518161.tif 000048
表６Ｃ：ヒトゲノム座標
【表６Ｃ−１】
2021518161.tif 000049
【表６Ｃ−２】
2021518161.tif 000050
【表６Ｃ−３】
2021518161.tif 000051
【表６Ｃ−４】
2021518161.tif 000052
【表６Ｃ−５】
2021518161.tif 000053
【表６Ｃ−６】
2021518161.tif 000054
【表６Ｃ−７】
2021518161.tif 000055
【表６Ｃ−８】
2021518161.tif 000056
【表６Ｃ−９】
2021518161.tif 000057
【表６Ｃ−１０】
2021518161.tif 000058
【表６Ｃ−１１】
2021518161.tif 000059
【表６Ｃ−１２】
2021518161.tif 000060
【表６Ｃ−１３】
2021518161.tif 000061
表６Ｄ：マウスゲノム座標
【表６Ｄ】
2021518161.tif 000062
表６Ｅ：ヒトゲノム座標
【表６Ｅ−１】
2021518161.tif 000063
【表６Ｅ−２】
2021518161.tif 000064
表６Ｆ：マウスゲノム座標
【表６Ｆ−１】
2021518161.tif 000065
【表６Ｆ−２】
2021518161.tif 000066
表６Ｇ：ヒトゲノム座標
【表６Ｇ】
2021518161.tif 000067
表６Ｈ：マウスゲノム座標
【表６Ｈ−１】
2021518161.tif 000068
【表６Ｈ−２】
2021518161.tif 000069
【図１Ａ】
2021518161.tif 000070
【図１Ｂ】
2021518161.tif 000071
【図２Ａ】
2021518161.tif 000072
【図２Ｂ】
2021518161.tif 000073
【図３Ａ】
2021518161.tif 000074
【図３Ｂ】
2021518161.tif 000075
【図４】
2021518161.tif 000076
【図５】
2021518161.tif 000077
【図６】
2021518161.tif 000078
【図７Ａ】
2021518161.tif 000079
【図７Ｂ】
2021518161.tif 000080
【図７Ｃ】
2021518161.tif 000081
【図７Ｄ】
2021518161.tif 000082
【図７Ｅ】
2021518161.tif 000083
【図８】
2021518161.tif 000084
【図９】
2021518161.tif 000085
【図１０】
2021518161.tif 000086
【図１１】
2021518161.tif 000087
【図１２】
2021518161.tif 000088
【図１３】
2021518161.tif 000089
【図１４】
2021518161.tif 000090
【図１５】
2021518161.tif 000091
【図１６】
2021518161.tif 000092
【図１７】
2021518161.tif 000093
【図１８】
2021518161.tif 000094
【図１９】
2021518161.tif 000095
【図２０】
2021518161.tif 000096
【図２１】
2021518161.tif 000097
【図２２】
2021518161.tif 000098
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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