(57)【要約】【課題】温和な条件下でテンプレートタンパク質を完全に除去できるだけでなく、タンパク質分子インプリントポリマーのインプリンティング効果を大幅に向上する。【解決手段】１）主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤およびテンプレートタンパク質を混合し、水溶性溶媒に溶解して混合溶液を得るステップと、２）混合溶液に開始剤を添加し、ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在する条件下で重合するステップと、３）ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在する条件下でテンプレートの溶出を行い、ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーを得るステップと、を含み、前記ポリペプチド架橋剤は、アミノ酸配列の両端に重合可能な二重結合を有し、且つｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換を起こすことができるポリペプチドである。【選択図】図３
2021517174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーの製造方法であって、
１）主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤およびテンプレートタンパク質を混合し、水溶性溶媒に溶解して混合溶液を得るステップと、
２）ステップ１）に記載の混合溶液に開始剤を添加し、ポリペプチド架橋剤がヘリックス（ｈｅｌｉｘ）構造で存在する条件下で重合し、ポリマーを得るステップと、
３）ポリペプチド架橋剤がコイル（ｃｏｉｌ）構造で存在する条件下でステップ２）に記載のポリマーに対してテンプレートの溶出を行い、ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーを得るステップと、
を含み、
前記ポリペプチド架橋剤は、アミノ酸配列の両端に重合可能な二重結合を有し、且つｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換を起こすことができるポリペプチドである、製造方法。
【請求項２】
前記ポリペプチド架橋剤におけるアミノ酸の数は２〜１００であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリペプチド架橋剤におけるアミノ酸の数は５〜３０であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
ステップ１）に記載の水溶性溶媒は、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液及びＮａＣｌＯ４溶液のうち一種を含むことを特徴する請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
ステップ１）に記載の主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤及びテンプレートタンパク質の質量比は、（１０〜３０）：（０．５〜２）：（５〜２０）：（５〜２０）であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記開始剤は、過硫酸アンモニウム溶液とテトラメチルエチレンジアミン、過硫酸アンモニウム溶液と亜硫酸水素ナトリウム、過硫酸カリウム溶液とテトラメチルエチレンジアミン及び過硫酸カリウム溶液と亜硫酸水素ナトリウムのうち一つのグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ポリペプチド架橋剤の構造状態は、円偏光二色性スペクトルＣＤによって検出され、ＣＤスペクトルが２２２ｎｍ、２０８ｎｍに負のピークを示し、１９０ｎｍ±５ｎｍに正のピークがある場合にｈｅｌｉｘ構造であり、ＣＤスペクトルが１９９ｎｍに負のピークを示し、２２０ｎｍ±５ｎｍに正のピークがある場合にｃｏｉｌ構造であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法により製造して得られたポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマー。
【請求項９】
タンパク質の濃縮、分離及び精製における、請求項８に記載のポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーの使用。
【請求項１０】
前記ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーは、ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在する条件下で標的タンパク質の吸着を行い、ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在する条件下で標的タンパク質の溶出を行うことを特徴とする請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１９年２月２８日に中国特許庁に提出され、出願番号２０１９１０１４７９３８．９、発明の名称「ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマー及びその製造方法と使用」の中国特許出願の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は生体分離工学の技術分野に属し、特にポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマー及びその製造方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子インプリントポリマーは、抗体が抗原を特異的に認識することに示唆を得て提案された人工合成受容体のクラスである。抗体などの天然受容体と比較して、分子インプリントポリマーは、簡単な調製、良好な安定性、低コストという利点を有し、環境、ライフサイエンスなどの多くの分野で重要な用途がある。分子インプリンティングの一般的なプロセスは、（１）テンプレート分子の存在下で重合性モノマーと架橋剤とが重合し、（２）テンプレートを溶出して、ポリマーにおいてテンプレート分子との化学的および空間的に相補的なインプリンティング部位を残し、（３）テンプレート分子含有の溶液に改めて露出すると、インプリントポリマーは標的分子を認識し且つ選択的にそれに改めて結合できることである。
【０００４】
小分子インプリントポリマーの研究は大成功を達成した。しかしながら、生体高分子のインプリンティング、特にタンパク質のインプリンティングは依然として困難である。タンパク質インプリンティングが直面する一番重要な問題は、テンプレートの溶出が難しいことである。これは、タンパク質の分子量が大きく、架橋ポリマーネットワーク内で拡散することが難しいためである。現在では、一般的にはいくつかの厳しい条件を使用してタンパク質テンプレートの溶出を行い、例えば高濃度の塩溶液（例えば１Ｍ  ＮａＣｌ）または酢酸／界面活性剤（ＳＤＳまたはＴｗｅｅｎ−２０）の混合溶液（一般的な配合成分は１０％ＳＤＳ／１０％ＡｃＯＨ）で溶出を行う。トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用して、テンプレートタンパク質を消化することにより、このテンプレートタンパク質を除去することもできる。これらの処理は、テンプレートタンパク質の完全な除去を保証することができず、且つインプリントポリマーのネットワークの構造の変化、タンパク質の非特異的吸着およびインプリントされた部位の閉塞などの問題を引き起こすことがよくある。さらに深刻なことは、厳しい溶出条件がテンプレートタンパク質の変性、不活性化を引き起こして、溶出された標的タンパク質の使用価値を失わせる傾向にあり、しかも、タンパク質分解酵素消化法がテンプレートタンパク質を直接破壊するほどのこともある。タンパク質の濃縮、分離及び精製などのタンパク質インプリンティングの多くの使用では、活性のある標的タンパク質を回収する必要があり、そのため、厳しい溶出条件により、このようなインプリントポリマーは使用の価値を大きく失う。
【０００５】
タンパク質インプリンティングが直面する２番目の深刻な問題は、インプリンティングの効果が悪いことである。タンパク質は水のみに溶解でき、且つ変性により不活性化されやすく、小分子インプリンティングで一般的に使用される有機溶媒は使用できず、水溶液のみでインプリンティングできる。これは、一方ではモノマーの選択を制限し、同時に水の存在のためテンプレートと機能性モノマーとの間に形成される水素結合を破壊し、テンプレートと機能性モノマーとの間の作用力を弱める。標的分子を認識するためには、ポリマーのインプリント部位のサイズと空間構成を維持する必要があるため、小分子のインプリントでは、ポリマーの架橋度は５０％以上である場合が多い。しかしながら、タンパク質インプリンティングにおいてはテンプレートを除去しにくいため、低い架橋度しか使用できない。これらの理由により、従来のタンパク質インプリンティング材料のインプリンティング効果は理想的ではない。例えばＣｈｅｎらは、リゾチームをテンプレートタンパク質として使用したインプリントポリマーを開示している。該インプリントポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを主モノマーとして、メタクリル酸とアクリルアミドを機能性モノマーとして、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを架橋剤として重合したものであり、架橋剤の含有量は３．１１ｍｏｌ％である。テンプレートタンパク質は１Ｍ  ＮａＣｌで溶出される。インプリント容量Ｑｍは３５０ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、インプリント因子はわずか１．１６７（Ｚ．Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２００８、２１（１）、７１−７７）である。
【０００６】
タンパク質インプリントでは、テンプレート溶出が難しくインプリントの効果が低いという問題はその固有の問題ようであり、且つ２つの問題は互いに制約されており、同時に解決しにくい。人々が長期的に研究をした結果では、効果的な解決策がまだ見つからず、それによりタンパク質インプリンティングの見通しを曇らせる（Ｃｕｌｖｅｒ、Ｈ．Ｒ．、Ｐｅｐｐａｓ、Ｎ．Ａ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１７、２９（１４）、５７５３−５７６１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この点を鑑みて、本発明はポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマー及びその製造方法と使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決手段を提供する：
ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーの製造方法であって、
１）主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤およびテンプレートタンパク質を混合し、水溶性溶媒に溶解して混合溶液を得るステップと、
２）ステップ１）に記載の混合溶液に開始剤を添加し、ポリペプチド架橋剤がヘリックス（ｈｅｌｉｘ）構造で存在する条件下で重合し、ポリマーを得るステップと、
３）ポリペプチド架橋剤がコイル（ｃｏｉｌ）構造で存在する条件下でステップ２）に記載のポリマーに対してテンプレートの溶出を行い、ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーを得るステップと、
を含み、
前記ポリペプチド架橋剤は、アミノ酸配列の両端に重合可能な二重結合を有し、且つｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換を起こすことができるポリペプチドである。
【０００９】
好ましくは、前記ポリペプチド架橋剤におけるアミノ酸の数は２〜１００である。
好ましくは、前記ポリペプチド架橋剤におけるアミノ酸の数は５〜３０である。
好ましくは、ステップ１）に記載の水溶性溶媒は、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液及びＮａＣｌＯ４溶液のうちいずれか一種を含む。
好ましくは、ステップ１）に記載の主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤及びテンプレートタンパク質の質量比は、（１０〜３０）：（０．５〜２）：（５〜２０）：（５〜２０）である。
好ましくは、前記開始剤は、過硫酸アンモニウム溶液とテトラメチルエチレンジアミン、過硫酸アンモニウム溶液と亜硫酸水素ナトリウム、過硫酸カリウム溶液とテトラメチルエチレンジアミン、および過硫酸カリウム溶液と亜硫酸水素ナトリウムのうちいずれか一つのグループから選択される。
好ましくは、前記ポリペプチド架橋剤の構造状態は、円偏光二色性スペクトルによって検出され、ＣＤスペクトルが２２２ｎｍ、２０８ｎｍに負のピークを示し、１９０ｎｍ±５ｎｍに正のピークがある場合にｈｅｌｉｘ構造であり、ＣＤスペクトルが１９９ｎｍに負のピークを示し、２２０ｎｍ±５ｎｍに正のピークがある場合にｃｏｉｌ構造である。
【００１０】
本発明は、前記製造方法により製造して得られたポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーを提供する。
本発明は、タンパク質の濃縮、分離及び精製における、前記ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーの使用を提供する。
好ましくは、前記ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーは、ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在する条件下で、標的タンパク質の吸着を行い、ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在する条件下で、標的タンパク質の溶出を行う。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明により提供されるポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーの製造方法は、従来の架橋剤（例えばＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）の代わりにポリペプチド架橋剤を使用し、ポリペプチド架橋剤が異なる条件下で異なる構造変化を生じるという特殊な性質を利用し、前記ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在する条件下で重合を行い、前記ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在する条件下でテンプレートの溶出を行う。前記ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造からｃｏｉｌ構造に変換されるとき、タンパク質分子インプリントポリマーが膨張し、温和な条件下でテンプレートタンパク質の除去が達成される。前記ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーが使用されるとき、外部環境のパラメータを調整し、前記ポリペプチド架橋剤をｃｏｉｌ構造からｈｅｌｉｘ構造に再変換させることにより、タンパク質分子インプリントポリマー全体が収縮する。より重要なのは、ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造からｈｅｌｉｘ構造に折り畳まれたときに非常に特異的であるため、タンパク質分子インプリントポリマーにおけるインプリンティング部位は、サイズと空間構成が完全に復元され、したがって標的タンパク質を特異的に認識することができる。
【００１２】
本発明により提供されるポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーは、温和な条件下でテンプレートタンパク質を完全に除去できるだけでなく、タンパク質分子インプリントポリマーのインプリンティング効果を大幅に改善できる。実施例１の記載によれば、本発明の前記方法で調製され文献（Ｚ．Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２００８、２１（１）、７１−７７）と同じ配合成分のリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）をテンプレートとしたタンパク質インプリンティングポリマーは、その架橋剤含有量は依然として３．１ｍｏｌ％であり、一般的な架橋剤Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを実施例１に記載のポリペプチド架橋剤に変更するだけである。ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液（生理的イオン強度のＮａＣｌを含有）を溶出液としてテンプレートタンパク質の完全な溶出を達成し、タンパク質吸着研究の結果は、新しく合成されたインプリントポリマーのインプリント容量Ｑｍは６７９ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、インプリント因子は１０．０であることを示した。引用文献（Ｚ．Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２００８、２１（１）、７１−７７）のインプリントポリマーの最大吸着容量Ｑｍは３５０ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌで、インプリント因子は１．１６７である。引用文献に比べ、ポリペプチド架橋インプリントポリマーのインプリンティング効果が大幅に向上される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１における異なる条件下でのポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーのＣＤスペクトルであり、ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーにおけるポリペプチドセグメントを示す構造は、ｈｅｌｉｘからｃｏｉｌに可逆的に変化する。
【図２】図２は、テンプレートタンパク質吸着用のポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーＭＩＰ及び対応する非インプリントポリマーＮＩＰの等温線図である。
【図３】図３は、テンプレートタンパク質リゾチーム（Ｌｙｓ）ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーＭＩＰおよび対応する非インプリントポリマーＮＩＰによるさまざまなタンパク質への吸着結果である。
【図４】図４は、低塩および高塩溶液から溶出するテンプレートタンパク質リゾチームと未処理リゾチームの相対活性である。
【図５】図５は、卵白から抽出されたリゾチームのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果であり、そのうち、第１レーンはリゾチーム標準サンプルであり、第２レーンは未処理の卵白サンプルであり、第３レーンはポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーで処理した卵白サンプルであり、第４レーンはポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーで卵白を処理した後に低塩溶液で溶出したときの溶出液のサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーの製造方法を提供し、それは、
１）主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤およびテンプレートタンパク質を混合し、水溶性溶媒に溶解して混合溶液を得るステップと、
２）ステップ１）に記載の混合溶液に開始剤を添加し、ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在する条件下で重合し、ポリマーを得るステップと、
３）ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在する条件下でステップ２）に記載のポリマーに対してテンプレートの溶出を行い、ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーを得るステップと、
を含み、前記ポリペプチド架橋剤は、アミノ酸配列の両端に重合可能な二重結合を有し、且つｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換を起こすことができるポリペプチドである。
【００１５】
本発明において、前記ポリペプチド架橋剤は、アミノ酸配列の両端に重合可能な二重結合を有し、且つｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換を起こすことができるポリペプチドである。本発明において、前記ポリペプチド架橋剤のｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換は、好ましくは異なる条件下で生じる。本発明の具体的な実施プロセス中において、前記ｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換の条件は、ポリペプチド架橋剤溶液温度の変化、ｐＨ値の変化及びイオン強度の変化等であってもよい。本発明は、前記ｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換の条件について特別な要件がなく、ｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造の変換が達成できる限り、異なるポリペプチド架橋剤の種類に基づいて決定される。本発明において、前記ポリペプチド架橋剤の構造状態は円偏光二色性スペクトルによって検出され、ＣＤスペクトルが２２２ｎｍ、２０８ｎｍに負のピークを示し、１９０ｎｍ±５ｎｍに正のピークがある場合にｈｅｌｉｘ構造であり、ＣＤスペクトルが１９９ｎｍに負のピークを示し、２２０ｎｍ±５ｎｍに正のピークがある場合にｃｏｉｌ構造である。
【００１６】
本発明は、前記ポリペプチド架橋剤におけるアミノ酸の数、種類及び配列について特別な要件がなく、アミノ酸配列の両端に重合可能な二重結合を有し、且つｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ構造変換を生じることができるすべてのポリペプチドはいずれも、本発明に記載のポリペプチド架橋剤とすることができる。本発明の具体的な実施プロセス中において、前記ポリペプチド架橋剤におけるアミノ酸の数は、好ましくは２〜１００であり、より好ましくは５〜３０である。本発明の実施例に記載のポリペプチド架橋剤は、具体的には下記式Ｉ〜式ＶＩの構造のポリペプチドから選択することができる。
【化１】
2021517174.tif 000003
【化２】
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【化３】
2021517174.tif 000005
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【００１７】
本発明は、主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤及びテンプレートタンパク質を混合して水溶性溶媒に溶解して混合溶液を得る。本発明において、前記主モノマー、機能性モノマーの種類は特に限定されず、本分野のタンパク質インプリントポリマーの調製における従来の主モノマーおよび機能性モノマーを使用してもよい。本発明は、前記テンプレートタンパク質の種類を特に限定するものではなく、あらゆる種類のタンパク質をいずれもテンプレートタンパク質として使用することができる。本発明において、前記水溶性溶媒は、好ましくはリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液及びＮａＣｌＯ４溶液のうち一種を含むがこれらに限定されない。本発明において前記水溶性溶媒は、好ましくは濃度及びｐＨ値が水溶性溶媒の種類及び具体的なポリペプチド架橋剤の種類に基づいて決定される。前記水溶性溶媒がリン酸緩衝液である場合、前記リン酸緩衝液の濃度は１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記リン酸緩衝液のｐＨ値は、好ましくは５．０〜５．６である。前記水溶性溶媒がＴｒｉｓ緩衝液である場合、前記Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度は、好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記Ｔｒｉｓ緩衝液のｐＨ値は、好ましくは７．０〜１０である。前記水溶性溶媒がＮａＣｌＯ４溶液である場合、前記ＮａＣｌＯ４溶液の濃度は０．０５〜０．５０ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌである。本発明において、前記主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤及びテンプレートタンパク質の質量比は、好ましくは（１０〜３０）：（０．５〜２）：（５〜２０）：（５〜２０）である。本発明において、前記主モノマー、機能性モノマー、ポリペプチド架橋剤及びテンプレートタンパク質の総質量と水溶性溶媒の体積の比は、好ましくは（１〜５）：（５〜１５）である。
【００１８】
本発明は前記混合溶液を得た後、前記混合溶液に開始剤を添加し、ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在する条件下で重合を行い、ポリマーを得る。本発明において、前記開始剤は、好ましくは過硫酸アンモニウム溶液とテトラメチルエチレンジアミン、過硫酸アンモニウム溶液と亜硫酸水素ナトリウム、過硫酸カリウム溶液とテトラメチルエチレンジアミン及び過硫酸カリウム溶液と亜硫酸水素ナトリウムのうちいずれか一つのグループから選択され、より好ましくは過硫酸アンモニウム溶液とテトラメチルエチレンジアミンである。前記開始剤として過硫酸アンモニウム溶液とテトラメチルエチレンジアミンを選択するとき、前記過硫酸アンモニウム溶液の質量濃度は、好ましくは１〜２０％であり、より好ましくは５〜１０％である。前記過硫酸アンモニウム溶液とテトラメチルエチレンジアミンの体積比は、好ましくは（８〜１２）：１であり、より好ましくは１０：１である。本発明において、前記混合溶液と前記開始剤の体積比は、好ましくは（２５〜５０）：（１〜５）である。本発明において、前記重合時間は、好ましくは２０〜２８ｈであり、より好ましくは２４ｈである。前記重合温度は、具体的なポリペプチド架橋剤の種類に基づいて対応して調整され、前記ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在できるようにするものであればよい。
【００１９】
本発明は、前記ポリマーを得た後、ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在する条件下で、前記ポリマーに対してテンプレート溶出を行い、ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーを得る。本発明において、前記溶出用溶出液は、好ましくは対応する水溶性溶媒と一致し、前記溶出のｐＨ値又は温度は重合時とは異なる。本発明において前記溶出条件は特に限定されず、前記ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在できるようにするものであればよい。
【００２０】
本発明は、前記調製方法で調製して得られたポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーを提供する。
本発明は、タンパク質の濃縮、分離及び精製における前記ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーの使用を提供する。本発明の具体的な実施プロセス中において、前記ポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーは、ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在する条件下で、標的タンパク質の吸着を行い、ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在する条件下で、標的タンパク質の溶出を行う。
【００２１】
以下では実施例を参照しながら、本発明により提供される技術的解決手段を詳しく説明するが、それらは本発明の保護範囲への限定として理解されるものではない。
【実施例】
【００２２】
実施例１
インプリントポリマーの合成：
２００ｍｇ  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、４μＬメタクリル酸、１１５ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質リゾチームを２ｍＬ  ２０ｍＭ  ｐＨ５．５リン酸緩衝溶液に溶解した。十分に混合した後、５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加して重合を開始し、３７℃で２４時間反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質リゾチームが添加されていないことだけを除き、インプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は式Ｉに示すとおりである。
【化７】
2021517174.tif 000009
【００２３】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で２０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行った。溶出液の吸光度値を測定し、紫外分光光度計を利用して特定の波長での標的タンパク質の吸光度−濃度の標準曲線を描き、該曲線に基づいてタンパク質溶液の吸光度値を濃度値に変換した。結果は以下のとおりである。溶出液は毎回に１００ｍＬを使用し、１回目に溶出した後に溶出液におけるテンプレートタンパク質の濃度は０．９２７ｍｇ／ｍＬであり、２回目に溶出した後に溶出液におけるテンプレートタンパク質の濃度は０．０４７４ｍｇ／ｍＬであり、３回目に溶出した後に溶出液におけるテンプレートタンパク質の濃度は０．００３７ｍｇ／ｍＬであり、４回目に溶出した後に紫外分光光度計で溶出液にはテンプレートタンパク質の含有が検出されなかった。溶出率＝溶出タンパク質総量／インプリンティングタンパク質総量、インプリンティングタンパク質総量は１００ｍｇであり、溶出率は９７．８％である。最後に脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００２４】
インプリンティング効果の検討：
２０ｍＭ  ｐＨ５．５リン酸緩衝溶液で異なる濃度のリゾチーム溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるリゾチームの濃度を検出し、吸着量を計算した。吸着量の計算は、本分野の従来の計算方法を用い、文献Ｚ．Ｈｕａ、ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００８、２４，５７７３−５７８０を参照した。吸着等温線図（平衡タンパク質濃度−吸着量曲線）を描き、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでカーブフィッティングを行い、得られたＭＩＰのインプリント容量Ｑｍは６７９ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、インプリント因子は１０．０である。本実施例の配合成分は、引用文献における架橋剤の代わりに同じモル量のポリペプチド架橋剤を使用したことを除き、引用文献（Ｚ．Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２００８、２１（１）、７１−７７）と同じである。引用文献（Ｚ．Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２００８、２１（１）、７１−７７）のインプリントポリマーの最大吸着容量Ｑｍは３５０ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌで、インプリント因子は１．１６７である。引用文献に比べ、本実施例の調製したインプリントポリマーのインプリンティング効果は大幅に向上された。
【００２５】
２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝溶液でそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ濃度の様々なタンパク質溶液を調製し、リゾチーム、シトクロムｃ（Ｃｙｔ  Ｃ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、トリプシン抑制因子（Ｔｒｙ）を含む。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、上澄み液の吸光度の値を紫外検出し、吸着量を計算した。得られた様々なタンパク質のインプリント因子は、それぞれ１０．４８（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）、３．７０（Ｃｙｔ  Ｃ）、１．１５（Ｈｂ）、１．５７（ＨＲＰ）、１．０２（ＢＳＡ）、１．２４（Ｔｒｙ）であり、インプリントポリマーはリゾチームを選択的に吸着できることを示す。
【００２６】
比較例１
インプリントポリマーの合成：
２００ｍｇ  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、４μＬメタクリル酸、９ｍｇ  Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）及び１００ｍｇテンプレートタンパク質リゾチームを２ｍＬ  ２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝溶液に溶解した。十分に混合した後、５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加して重合を開始し、３７℃で２４時間反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質リゾチームが添加されていないことを除きインプリントポリマーの調製と同じである。該配合成分は、文献（Ｚ．Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２００８、２１（１）、７１−７７）と完全に同じである。実施例１におけるインプリントポリマーの配合成分と比べると、ポリペプチド架橋剤を同じモル量の一般的な架橋剤Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミドに置き換えただけである。
【００２７】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で２０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行った。１回目の溶出率は３５．７７％であり、２回目の溶出率は５．５２％であり、３回目の溶出率は２．８５％であり、４回目の溶出率は０であった。総溶出率は４４．１４％である。結果は、この条件で溶出すると、半分以上のテンプレートタンパク質が依然として溶出に失敗したことを示す。実施例１で調製されたポリペプチド架橋インプリントポリマーは、同じ条件下でテンプレートタンパク質を完全に溶出できる。
ポリペプチド架橋剤で合成されたタンパク質分子インプリントポリマーのインプリンティング実験と対比するために、残りのテンプレートタンパク質を完全に溶出するまで３７℃で１Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液でタンパク質溶出を行った。
【００２８】
インプリンティング効果の検討：
ＭＩＰを１Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液でタンパク質溶出を行い、テンプレートタンパク質を完全に除去した。２０ｍＭ  ｐＨ５．５リン酸緩衝溶液で異なる濃度のリゾチーム溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるリゾチームの濃度を検出し、吸着量を計算した。吸着量は、本分野の従来の計算方法を用いて計算され、文献Ｚ．Ｈｕａ、ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００８、２４、５７７３−５７８０を参照した。吸着等温線図（平衡タンパク質濃度−吸着量曲線）を描き、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでカーブフィッティングを行い、得られたＭＩＰのインプリント容量Ｑｍは３８７．０  ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、ＮＩＰの最大吸着容量Ｑｍは２１０．９  ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、インプリント因子は１．８３である。引用文献（Ｚ．Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、２００８、２１（１）、７１−７７）で報告されている結果と同等である。
【００２９】
比較例１の配合成分は実施例１と基本的に同じであり、唯一の違いは、比較例１では一般的な架橋剤Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミドを使用し、実施例１では同じモル量のポリペプチド架橋剤を使用したことである。ポリペプチド架橋剤を使用すると、温和な条件下でテンプレートタンパク質を完全に溶出できるだけでなく、インプリンティング効果も大幅に向上することがわかる。
【００３０】
実施例２
インプリントポリマーの合成：
２００ｍｇ  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２．５ｍｇアクリルアミド、８μＬメタクリル酸ジメチルアミノエチル、１１５ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を２ｍＬ  ２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝溶液に溶解した。十分に混合した後、開始剤５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、３７℃で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質ウシ血清アルブミンが添加されていないことを除き、インプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は実施例１と同じである。
【００３１】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で２０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行い、４回の溶出率はそれぞれ９５．２４％、２．０５％、０．２４％、０％であった。総溶出率は９７．５１％である。最後に、脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００３２】
インプリンティング効果の検討：
２０ｍＭ  ｐＨ５．５リン酸緩衝溶液で異なる濃度のＢＳＡ溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質ウシ血清アルブミンの濃度を検出し、吸着等温線図（平衡タンパク質濃度−吸着量曲線）を描き、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでカーブフィッティングを行い、得られたＭＩＰの最大吸着容量Ｑｍは４２０．３ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、ＮＩＰの最大吸着容量Ｑｍは５４．４ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、インプリント因子は７．７２であった。
【００３３】
比較例２
インプリントポリマーの合成：
２００ｍｇのＮ−イソプロピルアクリルアミド、２．５ｍｇアクリルアミド、８μＬメタクリル酸ジメチルアミノエチル、９ｍｇのＮ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミド及び１００ｍｇテンプレートタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を２ｍＬ  ２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝溶液に溶解した。十分に混合した後、開始剤５０μｌ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、３７℃で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質ウシ血清アルブミンが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。
【００３４】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で２０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行った。１回目の溶出率は５４．７７％であり、２回目の溶出率は６．９６％であり、３回目の溶出率は０．７５％であり、４回目の溶出率は０であった。総溶出率は６２．４８％である。結果は、この条件で溶出すると、大量のテンプレートタンパク質が依然として溶出に失敗したことを示す。実施例２で調製されたポリペプチド架橋インプリントポリマーは、同じ条件下でテンプレートタンパク質を完全に溶出できる。
３７℃で１Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液でテンプレートタンパク質を完全に溶出するまでタンパク質溶出を行った。
【００３５】
インプリンティング効果の検討：
ＭＩＰを１Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液でタンパク質溶出を行い、テンプレートタンパク質を完全に除去した。２０ｍＭ  ｐＨ５．５リン酸緩衝溶液で異なる濃度のＢＳＡ溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質ウシ血清アルブミンの濃度を検出して吸着量を計算し、吸着等温線図（平衡タンパク質濃度−吸着量曲線）を描き、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでカーブフィッティングを行い、得られたＭＩＰの最大吸着容量Ｑｍは２１４．７ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、ＮＩＰの最大吸着容量Ｑｍは１２６．３ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、インプリント因子は１．６９であった。
【００３６】
比較例２の配合成分は実施例２と基本的に同じであり、唯一の違いは、比較例２では一般的な架橋剤Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミドを使用し、実施例２では同じモル量のポリペプチド架橋剤を使用したことである。ポリペプチド架橋剤を使用すると、温和な条件下でテンプレートタンパク質を完全に溶出できるだけでなく、インプリンティング効果も大幅に向上することがわかる。
【００３７】
実施例３
インプリントポリマーの合成：
２００ｍｇ  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、４μＬメタクリル酸、５１．７４ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質シトクロムＣ（Ｃｙｔ  Ｃ）を２ｍＬ  ２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝液に溶解した。十分に混合した後、開始剤５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、３７℃で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質シトクロムＣが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は実施例１と同じである。
【００３８】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で２０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行い、４回の溶出率はそれぞれ９３．４０％、２．０６％、１．３４％、０％であった。総溶出率は９６．８％である。最後に、脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００３９】
インプリンティング効果の検討：
２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝溶液で異なる濃度のＣｙｔ  Ｃ溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質シトクロムＣの濃度を検出して吸着等温線図（平衡タンパク質濃度−吸着量曲線）を描き、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでカーブフィッティングを行った。得られたＭＩＰの最大吸着容量Ｑｍは５６２．０ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、ＮＩＰ的最大吸着容量Ｑｍは７９．６ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、得られたインプリント因子は７．１である。
【００４０】
比較例３
インプリントポリマーの合成：
２００ｍｇのＮ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、４μＬメタクリル酸、４ｍｇのＮ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミド及び１００ｍｇテンプレートタンパク質シトクロムＣ（ＣｙｔＣ）を２ｍＬ  ２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝溶液に溶解した。十分に混合した後、開始剤５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、３７℃で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質シトクロムＣが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。
【００４１】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で２０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行った。１回目の溶出率は４８．３２％であり、２回目の溶出率は５．８５％であり、３回目の溶出率は２．５９％であり、４回目の溶出率は０である。総溶出率は５６．７６％である。結果は、この条件で溶出すると、大量のテンプレートタンパク質が依然として溶出に失敗したことを示す。実施例３で調製されたポリペプチド架橋インプリントポリマーは、同じ条件下でテンプレートタンパク質を完全に溶出できる。
３７℃で１Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液でテンプレートタンパク質を完全に溶出するまでタンパク質溶出を行った。
【００４２】
インプリンティング効果の検討：
ＭＩＰを１Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液でタンパク質溶出を行い、テンプレートタンパク質を完全に除去した。２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝溶液で異なる濃度のＣｙｔ  Ｃ溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質ウシ血清アルブミンの濃度を検出して吸着量を計算し、吸着等温線図（平衡タンパク質濃度−吸着量曲線）を描き、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでカーブフィッティングを行い、得られたＭＩＰの最大吸着容量Ｑｍは３２８．４ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、ＮＩＰの最大吸着容量Ｑｍは２３６．４ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｇｅｌであり、インプリント因子は１．３９であった。
【００４３】
比較例３の配合成分は実施例３と基本的に同じであり、唯一の違いは、比較例３では一般的な架橋剤Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミドを使用し、実施例３では同じモル量のポリペプチド架橋剤を使用したことである。ポリペプチド架橋剤を使用すると、温和な条件下でテンプレートタンパク質を完全に溶出できるだけでなく、インプリンティング効果も大幅に向上することがわかる。
【００４４】
実施例４
インプリントポリマーの合成：
２００ｍｇＮ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、４μＬメタクリル酸、１５０ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質リゾチーム（Ｌｙｚ）を２ｍＬ  ２０ｍＭ  ｐＨ５．０のリン酸緩衝溶液に溶解した。十分に混合した後、開始剤５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、３７℃で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質リゾチームが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は式ＩＩに示すとおりである。
【化８】
2021517174.tif 000010
【００４５】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で２０ｍＭ  ｐＨ７．４リン酸緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行い、溶出率は９７．８％であった。最後に、脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００４６】
インプリンティング効果の検討：
２０ｍＭ  ｐＨ５．０のリン酸緩衝溶液で異なる濃度のリゾチーム（Ｌｙｚ）溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質リゾチームの濃度を検出して吸着量を計算した。得られたインプリント因子は１０．２１である。
【００４７】
実施例５
インプリントポリマーの合成：
４００ｍｇ  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、１６μＬ  Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−メタクリルアミド（Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  （ＤＭＡＰＭＡ））、２００ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質ＢＳＡを２ｍＬ  １０ｍＭ  ｐＨ１０．０Ｔｒｉｓ緩衝溶液に溶解した。３０分間窒素で酸素除去し、５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、室温で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製はテンプレートタンパク質ＢＳＡが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は式ＩＩＩに示すとおりである。
【化９】
2021517174.tif 000011
【００４８】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で１０  ｍＭ  ｐＨ７．４  ｔｒｉｓ緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行い、溶出率は９６．８％であった。最後に、脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００４９】
インプリンティング効果の検討：
１０ｍＭ  ｐＨ１０．０ｔｒｉｓ緩衝溶液で異なる濃度のＢＳＡ溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質ＢＳＡの濃度を検出して吸着量を計算し、得られたインプリント因子は１０．１３であった。
【００５０】
実施例６
インプリントポリマーの合成：
４００ｍｇ  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、１６μＬ  Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−メタクリルアミド（Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  （ＤＭＡＰＭＡ））、２１０ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質ＢＳＡを２ｍＬ  １０ｍＭ  ｐＨ１０．０Ｔｒｉｓ緩衝溶液に溶解した。３０分間窒素で酸素除去し、５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、室温で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質ＢＳＡが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は式ＩＶに示すとおりである。
【化１０】
2021517174.tif 000012
【００５１】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で１０ｍＭ  ｐＨ７．４ｔｒｉｓ緩衝溶液（生理的イオン強度をシミュレートするための０．１５４Ｍ  ＮａＣｌを含有）でタンパク質溶出を行い、溶出率は９８．２％であった。最後に、脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００５２】
インプリンティング効果の検討：
１０ｍＭ  ｐＨ１０．０ｔｒｉｓ緩衝溶液で異なる濃度のＢＳＡ溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質ＢＳＡの濃度を検出して吸着量を計算し、得られたインプリント因子は１０．９６であった。
【００５３】
実施例７
インプリントポリマーの合成：
４００ｍｇ  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、１６μＬ  Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−メタクリルアミド（Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＤＭＡＰＭＡ））、２１０ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質ＢＳＡを２ｍＬ  ０．２Ｍ  ＮａＣｌＯ４溶液に溶解した。３０分間窒素で酸素除去し、５０μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、２５℃で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質ＢＳＡが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は実施例６と同じである。
【００５４】
テンプレートタンパク質の溶出：
２５℃で０．１５４Ｍ  ＮａＣｌ溶液でタンパク質溶出を行い、溶出率は９７．１％であった。最後に、脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００５５】
インプリンティング効果の検討：
２ｍＬ  ０．２ＭＮａＣｌＯ４溶液で異なる濃度のＢＳＡ溶液を調製した。３７℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質ＢＳＡの濃度を検出して吸着量を計算した。得られたインプリント因子は１０．３８である。
【００５６】
実施例８
インプリントポリマーの合成：
４００ｍｇＮ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、１６μＬ  Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−メタクリルアミド（  Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＤＭＡＰＭＡ））、２００  ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質ＢＳＡを氷水浴で１０ｍＭ  ｐＨ７．０Ｔｒｉｓ緩衝溶液に溶解した。３０分間窒素で酸素除去し、５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、０℃で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質ＢＳＡが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は式Ｖに示すとおりである。
【化１１】
2021517174.tif 000013
【００５７】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で１０ｍＭ  ｐＨ７．０  ｔｒｉｓ緩衝溶液でタンパク質溶出を行い、溶出率は９８．８％であった。最後に、脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００５８】
インプリンティング効果の検討：
２ｍＬ  １０ｍＭ  ｐＨ７．０  ｔｒｉｓ緩衝溶液で異なる濃度のＢＳＡ溶液を調製した。０℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質ＢＳＡの濃度を検出して吸着量を計算し、得られたインプリント因子は１０．８７であった。
【００５９】
実施例９
インプリントポリマーの合成：
４００ｍｇＮ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、１６μＬ  Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−メタクリルアミド（Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＤＭＡＰＭＡ））、２１０ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質ＢＳＡを氷水浴で１０ｍＭ  ｐＨ７．０Ｔｒｉｓ緩衝溶液に溶解した。３０分間窒素で酸素除去し、５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加し、０℃で２４ｈ反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。非インプリントポリマーＮＩＰの調製は、テンプレートタンパク質ＢＳＡが添加されていないことだけを除きインプリントポリマーの調製と同じである。ポリペプチド架橋剤の構造は式ＶＩに示すとおりである。
【化１２】
2021517174.tif 000014
【００６０】
テンプレートタンパク質の溶出：
３７℃で１０ｍＭ  ｐＨ７．０  ｔｒｉｓ緩衝溶液でタンパク質溶出を行い、溶出率は９７．２％であった。最後に、脱イオン水でインプリントポリマーを洗浄することで残留塩化ナトリウムを洗い流した。
【００６１】
インプリンティング効果の検討：
２ｍＬ  １０ｍＭ  ｐＨ７．０  ｔｒｉｓ緩衝溶液で異なる濃度のＢＳＡ溶液を調製した。０℃で、ＭＩＰ又はＮＩＰを添加し、十分に吸着した後、紫外分光光度計で上澄み液におけるテンプレートタンパク質ＢＳＡの濃度を検出して吸着量を計算し、得られたインプリント因子は１０．９６であった。
【００６２】
実施例１０
インプリントポリマーの合成：
２００ｍｇ  Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、５ｍｇアクリルアミド、４μＬメタクリル酸、１１５ｍｇポリペプチド架橋剤及び１００ｍｇテンプレートタンパク質リゾチームを２ｍＬ  ２０ｍＭ  ｐＨ５．５リン酸緩衝溶液に溶解した。十分に混合した後、５０  μＬ  １０％  ＡＰＳ及び５μＬ  ＴＥＭＥＤを添加して重合を開始し、３７℃で２４時間反応させ、インプリントポリマーＭＩＰを得た。ポリペプチド架橋剤の構造は式Ｉに示すとおりである。
【００６３】
テンプレートタンパク質の溶出回収：
３７℃でそれぞれ２種の異なる溶液でテンプレートタンパク質リゾチームの溶出を行った。第一種の溶液は、０．１５４Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液であり、第二種の溶液は、１Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液である。溶出液を透析により脱塩し、凍結乾燥し、回収されたテンプレートタンパク質リゾチームを得た。
回収されたリゾチームサンプルの円偏光二色性を測定し、元のサンプルと比較した。結果は、０．１５４Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液で溶出して回収されたタンパク質の二次および三次構造にはほとんど変化がなかった。ただし、１Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液で溶出して回収されたタンパク質の二次および三次構造は顕著な変化が発生した。結果は、温和な条件下でタンパク質溶出を行うと、タンパク質の高度な構造にはほとんど影響を与えず、高濃度の塩溶液でタンパク質を溶出すると、タンパク質の高次構造が破壊されることを示す。
ミクロコッカス・ルテウスを基質として使用して、回収された２つのリゾチームサンプルの生物学的活性を測定し、元のサンプルと比較した。温和な条件下で溶出したリゾチームサンプルの活性は依然として８９％と高く、高濃度の塩溶液で溶出したリゾチームサンプルの活性はわずか８％である。これは、温和な条件でテンプレートタンパク質溶出を行うと標的タンパク質の活性を保存することに有利であることを示す。
【００６４】
実施例１１
実施例１で合成されたリゾチームインプリントポリマーを用いて、卵白からリゾチームを抽出した。卵白には１４８種のタンパク質が含まれており、その中のリゾチーム含有量は３−３．５％であることが知られている。
卵白からのリゾチームの抽出：
新鮮な卵白を２０ｍＭ  ｐＨ５．５のリン酸緩衝溶液で２０倍に希釈した。２０ｍｇインプリントポリマーを添加し、３７℃で１０ｈインキュベートした。インプリントポリマーを取り出し、０．１５４Ｍ  ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ  ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液で溶出し、吸着したリゾチームタンパク質を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで抽出結果を分析した。第１レーンはリゾチーム標準サンプル、第２レーンは未処理の卵白サンプル、第３レーンはインプリントポリマーで処理した後の卵白サンプル、第４レーンはインプリントポリマー溶出液のサンプルである。結果は、実施例１で合成されたリゾチームインプリントポリマーは卵白からリゾチームを選択的に抽出できることを示す。ＨＰＬＣで抽出結果を分析し、実施例１で合成されたリゾチームインプリントポリマーは卵白からリゾチームを選択的に抽出できることを再び検証した。ＨＰＬＣ結果から分かるように、この方法でリゾチームを抽出すると、回収率は９６．３％と高く、製品純度は９３．４％に達する。
ミクロコッカス・ルテウスを基質として使用して、抽出されたリゾチームサンプルの生物学的活性を測定し、得られたその相対活性は９２％であった（元のサンプルに対し）。
【００６５】
上記実施例から分かるように、本発明により提供されるポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーの製造方法は、前記ポリペプチド架橋剤がｈｅｌｉｘ構造で存在する条件下で重合を行い、前記ポリペプチド架橋剤がｃｏｉｌ構造で存在する条件下でテンプレート溶出を行う。温和な条件下でテンプレートタンパク質の除去を実現でき、タンパク質分子インプリントポリマーにおけるインプリント部位はサイズと空間構成が完全に復元され、標的タンパク質を特異的に認識することができる。本発明により提供されるポリペプチド架橋タンパク質分子インプリントポリマーは、温和な条件下でテンプレートタンパク質を完全に除去できるだけでなく、タンパク質分子インプリントポリマーのインプリンティング効果を大幅に改善できる。
【００６６】
上記は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者にとっては、本発明の原理から逸脱することなく、多くの改善および修正が可能であることに留意すべきであり、これらの改善および修正も本発明の保護範囲と見なされるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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