(57)【要約】本開示は、目的のタンパク質を含む組成物中のジスルフィド結合還元を評価するための宿主細胞タンパク質バイオマーカーの使用に関する。いくつかの実施形態において、該開示は、目的のタンパク質を含む組成物中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法に関し、ここで少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルは、測定され、かつ該目的のタンパク質のジスルフィド結合還元または低分子重量種の発生に関連するベンチマーク値を提供する。いくつかの実施形態において、該開示は、目的のタンパク質を生産する方法に関し、ここで目的のタンパク質を生産できる宿主細胞は培養され、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルは測定され、かつ目的のタンパク質の下流単離は宿主細胞タンパク質測定により知らされる。
2021518115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質を含む組成物中のジスルフィド結合還元の発生を予測する方法であって、該方法は、該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルを測定すること、または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルを測定することを含み、ここでベンチマーク値より上の宿主細胞タンパク質発現、活性、またはバイオリアクター代謝物レベルが該目的のタンパク質のジスルフィド結合還元の発生に関連する、方法。
【請求項２】
目的のタンパク質を含む組成物中のインタクトな単量体タンパク質種のジスルフィド還元の発生を予測する方法であって、該方法は、該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルを測定すること、または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルを測定することを含み、ここでベンチマーク値より上の宿主細胞タンパク質発現、活性、またはバイオリアクター代謝物レベルが該目的のタンパク質のインタクトな単量体タンパク質種のジスルフィド還元の発生に関連する、方法。
【請求項３】
目的のタンパク質を生産する方法であって、
ａ）該目的のタンパク質を生産することができる宿主細胞を培養すること；
ｂ）該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルまたは活性レベルを測定すること、または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルを測定すること；および
ｃ）宿主細胞タンパク質発現、活性、またはバイオリアクター代謝物レベルのいずれかがベンチマーク値より下である場合に、該目的のタンパク質を単離すること
を含む、方法。
【請求項４】
目的のタンパク質を含む組成物が、細胞培養から生産される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
該細胞培養が、該目的のタンパク質を生産することができる宿主細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該宿主細胞タンパク質の発現レベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの宿主細胞タンパク質の発現レベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも３つの宿主細胞タンパク質の発現レベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酸化ストレス経路、熱ショックタンパク質経路、および／または低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つのタンパク質の発現レベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
該宿主細胞タンパク質の活性レベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２つの宿主細胞タンパク質の活性レベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
酸化ストレス経路、熱ショックタンパク質経路、および／または低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つのタンパク質の活性レベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
該バイオリアクター代謝物のレベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２つのバイオリアクター代謝物のレベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも３つのバイオリアクター代謝物のレベルが、決定される、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、ペルオキシレドキシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からなる群から選択される、請求項６−８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質が、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からなる群から選択される、請求項６−８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質が、チオレドキシンレダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルは、測定され、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性のレベルは、測定され、および／または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルは、測定される、請求項１−１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
発現レベルが、細胞培養液中で測定される、請求項１−９、１６、１７、および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
発現レベルが、細胞内で測定される、請求項１−９、１６、１７、および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞内発現レベルが、細胞培養ライセート中で測定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
発現レベルが、ウェスタンブロット分析またはｑＰＣＲ分析により測定される、請求項１−９、１６、１７、および１９−２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
チオレドキシンレダクターゼ活性レベルが、チオレドキシンレダクターゼ活性アッセイにより測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）活性レベルが、Ｇ６ＰＤ活性アッセイにより測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）活性レベルが、ＧＡＰＤＨ活性アッセイにより測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
バイオリアクター代謝物のレベルが、細胞培養液中で測定される、請求項１−５、１３−１５、および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生が、キャピラリー電気泳動により検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
チオレドキシンの発現レベルは、測定され、かつベンチマーク値がウェスタンブロット分析により決定されるとき約２００％のチオレドキシン相対バンド強度である、請求項１−９および２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
チオレドキシンレダクターゼの発現レベルは、測定され、かつベンチマーク値がウェスタンブロット分析により決定されるとき約１６０％のチオレドキシンレダクターゼ相対バンド強度である、請求項１−９および２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＧＡＰＤＨの発現レベルは、測定され、かつベンチマーク値がウェスタンブロット分析により決定されるとき約１４０％のＧＡＰＤＨ相対バンド強度である、請求項１−９および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
チオレドキシンレダクターゼの活性レベルは、測定され、かつベンチマーク値がチオレドキシンレダクターゼ活性アッセイにより決定されるとき６０秒後にａ．０の相対ＴｒｘＲ活性（ＡＵ）である、請求項１−５、１０、１１、および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性レベルは、測定され、かつベンチマーク値がＧ６ＰＤ活性アッセイにより決定されるとき３．０の正規化されたレゾルフィン蛍光（ＡＵ）である、請求項１−５、１０、１１、および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の活性レベルは、測定され、かつＧＡＰＤＨ活性アッセイにより決定されるとき該対照と比較して正規化されたＧＡＰＤＨ活性における減少、請求項１−５、１０、１１、および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
目的のタンパク質が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１−３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
抗体が、キメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体が、ＩｇＧアイソタイプのものである重鎖定常領域を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＩｇＧサブタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項３−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞培養が、バッチ、流加培養、または灌流培養である、請求項３−５、３９、および４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
該哺乳類細胞の初期密度が、少なくとも２ｘ１０２細胞／ｍＬ；少なくとも２ｘ１０３細胞／ｍＬ；少なくとも２ｘ１０４細胞／ｍＬ；少なくとも２ｘ１０５細胞／ｍＬ；少なくとも２ｘ１０６細胞／ｍＬ；少なくとも５ｘ１０６細胞／ｍＬ；または少なくとも１０ｘ１０６細胞／ｍＬである、請求項３９−４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
細胞が、最大生細胞密度の少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも９９パーセントの所望の生細胞密度に到達するのに十分な期間増殖される、請求項３−５および３９−４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞が、バイオリアクター中で増殖される、請求項３−５、および３９−４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
バイオリアクターが、Ｎ−１シードバイオリアクターである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
バイオリアクターが、目的のタンパク質の大規模生産のために使用される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
バイオリアクターが、１，０００Ｌ、２，５００Ｌ、５，０００Ｌ、８，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１２，０００Ｌ、または１５，０００Ｌバイオリアクターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
培養の生細胞密度が、定期的に測定される、請求項３−５および３９−４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
培養のパーセント生存性が、定期的に測定される、請求項３−５および３９−４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
培養の乳酸レベルが、定期的に測定される、請求項３−５および３９−４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
培養のアンモニウムレベルが、定期的に測定される、請求項３−５および３９−５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
目的のタンパク質の力価が、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
培養の浸透圧が、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
培養物中の溶存酸素の量が、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
培養のｐＣＯ２レベルが、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
培養のｐＨが、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
培養のグルタミンレベルが、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
培養のグルタミン酸レベルが、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
培養のグルコースレベルが、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルが、定期的に測定される、請求項３−５または３９−５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
測定が、細胞培養の増殖フェーズの間行われる、請求項４８−６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
測定が、細胞培養の移行フェーズの間行われる、請求項４８−６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
測定が、細胞培養の生産フェーズの間行われる、請求項４８−６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
該測定が、毎日行われる、請求項４８−６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
発現または活性レベルが、細胞培養のスタート後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日に測定される、請求項３−５または３９−５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
宿主細胞タンパク質が、ＣＨＯ細胞タンパク質である、請求項１−６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
目的の抗体を生産する方法であって、
ａ）該抗体を生産することができる宿主細胞を培養すること；
ｂ）目的の該抗体でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルまたは活性レベルを測定すること；
ｃ）宿主細胞タンパク質発現または活性レベルのいずれかがベンチマーク値より上である場合、該宿主細胞の少なくとも１つの増殖条件を変更すること；および
ｄ）目的の該抗体を単離すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の背景
広範囲の疾患を標的とするバイオ医薬品に対する増加した需要に伴い、現代の開発努力は、処理関連不純物を制御しながら、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）産物収量を最大化することに重く当てられる。より高い宿主細胞密度、力価、および生産性の予期せぬ副作用の１つは、採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の増加した存在である。増加したＨＣＰは、下流不純物クリアランス努力をさらに困難にするだけでなく、精製が始まる前であってもｍＡｂ安定性に影響を与えることもできる。増加したＨＣＰの１つのかかる結果は、インタクトなｍＡｂのチオレドキシン（Ｔｒｘ）誘導ジスルフィド結合還元および低分子重量種（ＬＭＷ）の後続の形成である。ジスルフィド還元は、産物安定性、効力、および患者安全性への直接的なリスクであり；還元の酵素メカニズムによりよく確立されているが、ＨＣＣＦ中の増加したレダクターゼ活性および発現につながる細胞メカニズムは不明なままである。さらに、ジスルフィド還元におけるバッチ間変動性は、かかるメカニズムを研究することを困難にする。
【背景技術】
【０００２】
従って、細胞培養におけるジスルフィド結合還元に関連するマーカーを同定するための、およびかかるマーカーを利用して採取前にジスルフィド結合リスクを確実に予測する方法の開発のための当該技術分野における必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
該開示の要約
１つの実施形態において、本開示は、目的のタンパク質を含む組成物中のジスルフィド結合還元の発生を予測する方法に関し、該方法は、該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルを測定すること、または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルを測定することを含み、ここでベンチマーク値より上の宿主細胞タンパク質発現、活性、またはバイオリアクター代謝物レベルは該目的のタンパク質のジスルフィド結合還元の発生に関連する。
【０００４】
１つの実施形態において、本開示は、目的のタンパク質を含む組成物中のインタクトな単量体タンパク質種のジスルフィド還元の発生を予測する方法に関し、該方法は、該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルを測定すること、または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルを測定することを含み、ここでベンチマーク値より上の宿主細胞タンパク質発現、活性、またはバイオリアクター代謝物レベルは該目的のタンパク質のインタクトな単量体タンパク質種のジスルフィド還元の発生に関連する。
【０００５】
１つの実施形態において、本開示は、目的のタンパク質を生産する方法に関し、該方法は、ａ）該目的のタンパク質を生産することができる宿主細胞を培養すること；ｂ）該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルまたは活性レベルを測定すること、または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルを測定すること;およびｃ）宿主細胞タンパク質発現、活性、またはバイオリアクター代謝物レベルのいずれかがベンチマーク値より下である場合に、該目的のタンパク質を単離することを含む。
【０００６】
１つの実施形態において、本開示は、目的の抗体を生産する方法に関し、該方法は、ａ）該抗体を生産することができる宿主細胞を培養すること；ｂ）目的の該抗体でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルまたは活性レベルを測定すること、または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルを測定すること；ｃ）宿主細胞タンパク質発現、活性、またはバイオリアクター代謝物レベルのいずれかがベンチマーク値より下である場合に、該宿主細胞の少なくとも１つの増殖条件を変えること；およびｄ）目的の該抗体を単離することを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を含む組成物は、細胞培養から生産される。いくつかの実施形態において、細胞培養は、該目的のタンパク質を生産することができる宿主細胞を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質の発現レベルは、決定される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの宿主細胞タンパク質の発現レベルは、決定される。いくつかの実施形態において、少なくとも３つの宿主細胞タンパク質の発現レベルは、決定される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、酸化ストレス経路、熱ショックタンパク質経路、および／または低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルは、決定される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質の活性レベルは、決定される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの宿主細胞タンパク質の活性レベルは、決定される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、バイオリアクター代謝物のレベルは、測定される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのバイオリアクター代謝物のレベルは、測定される。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのバイオリアクター代謝物のレベルは、測定される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質は、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、ペルオキシレドキシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質は、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質は、チオレドキシンレダクターゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルは、測定され、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性のレベルは、測定され、および／または少なくとも１つのバイオリアクター代謝物のレベルは、測定される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、酸化ストレス経路、熱ショックタンパク質経路、および／または低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルは、決定される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、発現レベルは、細胞培養液中で測定される。いくつかの実施形態において、発現レベルは、細胞内で測定される。いくつかの実施形態において、細胞内発現レベルは、細胞培養ライセート中で測定される。いくつかの実施形態において、発現レベルは、ウェスタンブロット分析またはｑＰＣＲ分析により測定される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、チオレドキシンレダクターゼ活性レベルは、チオレドキシンレダクターゼ活性アッセイにより測定される。いくつかの実施形態において、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）活性レベルは、Ｇ６ＰＤ活性アッセイにより測定される。いくつかの実施形態において、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）活性レベルは、ＧＡＰＤＨ活性アッセイにより測定される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、バイオリアクター代謝物のレベルは、細胞培養液中で測定される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、キャピラリー電気泳動により検出される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、チオレドキシンの発現レベルは、測定され、かつベンチマーク値は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約２００％のチオレドキシン相対バンド強度である。いくつかの実施形態において、チオレドキシンレダクターゼの発現レベルは、測定され、かつベンチマーク値は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約１６０％のチオレドキシンレダクターゼ相対バンド強度である。いくつかの実施形態において、ＧＡＰＤＨの発現レベルは、測定され、かつベンチマーク値は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約１４０％のＧＡＰＤＨ相対バンド強度である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、チオレドキシンレダクターゼの活性レベルは、測定され、かつベンチマーク値は、チオレドキシンレダクターゼ活性アッセイにより決定されるとき６０分後の１．０の相対ＴｒｘＲ活性（Ａ．Ｕ．）である。いくつかの実施形態において、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の活性レベルは、測定され、かつベンチマーク値は、Ｇ６ＰＤ活性アッセイにより決定されるとき３．０の正規化されたレゾルフィン蛍光（ＡＵ）である。いくつかの実施形態において、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の活性レベルは、測定され、タンパク質濃度に正規化される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、細胞培養は、バッチ、流加培養、または灌流培養である。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞の初期密度は、少なくとも２ｘ１０２細胞／ｍＬ；少なくとも２ｘ１０３細胞／ｍＬ；少なくとも２ｘ１０４細胞／ｍＬ；少なくとも２ｘ１０５細胞／ｍＬ；少なくとも２ｘ１０６細胞／ｍＬ；少なくとも５ｘ１０６細胞／ｍＬ；または少なくとも１０ｘ１０６細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態において、細胞は、最大生細胞密度の少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも９９パーセントの所望の生細胞密度に到達するのに十分な期間、増殖される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、細胞は、バイオリアクター中で増殖される。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、Ｎ−１シードバイオリアクターである。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、目的のタンパク質の大規模生産のために使用される。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、１，０００Ｌ、２，５００Ｌ、５，０００Ｌ、８，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１２，０００Ｌ、または１５，０００Ｌバイオリアクターである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、培養の生細胞密度は、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養の乳酸レベルは、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養のアンモニウムレベルは、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質の力価は、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養の浸透圧(osmolarity)は、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養物における溶存酸素の量は、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養のｐＣＯ２レベルは、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養のｐＨは、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養のグルタミンレベルは、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養のグルタミン酸レベルは、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、培養のグルコースレベルは、定期的に測定される。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルは、定期的に測定される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、測定は、細胞培養の増殖フェーズの間行われる。いくつかの実施形態において、測定は、細胞培養の移行フェーズの間行われる。いくつかの実施形態において、測定は、細胞培養の生産フェーズの間行われる。いくつかの実施形態において、測定は、毎日行われる。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルは、細胞培養のスタート後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日に測定される。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質は、ＣＨＯ細胞タンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１−１】図１Ａ−１Ｊは、モノクローナル抗体についての製造規模および実験室規模実行における１２のモニターされた上流パラメーターについての傾向を示す。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す実行は平均化され、各パラメーターについて平均＋ＳＥＭとして表される。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す試料間の差異は、両側対応ｔ検定により分析された。各試料について、図１ＡはバイオリアクターｐＨプロファイル、図１Ｂはバイオリアクターグルタミンプロファイル、図１Ｃはバイオリアクター乳酸プロファイル、図１Ｄはバイオリアクターアンモニウムプロファイル、図１Ｅはバイオリアクター生細胞密度、図１Ｆはバイオリアクターパーセント細胞生存性、図１Ｇはバイオリアクター溶存酸素含量、図１ＨはバイオリアクターｐＣＯ２含量、図１Ｉはバイオリアクターグルタミン酸プロファイル、および図１Ｊはバイオリアクターグルコースプロファイルを示す。
【図１−２】図１Ａ−１Ｊは、モノクローナル抗体についての製造規模および実験室規模実行における１２のモニターされた上流パラメーターについての傾向を示す。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す実行は平均化され、各パラメーターについて平均＋ＳＥＭとして表される。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す試料間の差異は、両側対応ｔ検定により分析された。各試料について、図１ＡはバイオリアクターｐＨプロファイル、図１Ｂはバイオリアクターグルタミンプロファイル、図１Ｃはバイオリアクター乳酸プロファイル、図１Ｄはバイオリアクターアンモニウムプロファイル、図１Ｅはバイオリアクター生細胞密度、図１Ｆはバイオリアクターパーセント細胞生存性、図１Ｇはバイオリアクター溶存酸素含量、図１ＨはバイオリアクターｐＣＯ２含量、図１Ｉはバイオリアクターグルタミン酸プロファイル、および図１Ｊはバイオリアクターグルコースプロファイルを示す。
【図１−３】図１Ａ−１Ｊは、モノクローナル抗体についての製造規模および実験室規模実行における１２のモニターされた上流パラメーターについての傾向を示す。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す実行は平均化され、各パラメーターについて平均＋ＳＥＭとして表される。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す試料間の差異は、両側対応ｔ検定により分析された。各試料について、図１ＡはバイオリアクターｐＨプロファイル、図１Ｂはバイオリアクターグルタミンプロファイル、図１Ｃはバイオリアクター乳酸プロファイル、図１Ｄはバイオリアクターアンモニウムプロファイル、図１Ｅはバイオリアクター生細胞密度、図１Ｆはバイオリアクターパーセント細胞生存性、図１Ｇはバイオリアクター溶存酸素含量、図１ＨはバイオリアクターｐＣＯ２含量、図１Ｉはバイオリアクターグルタミン酸プロファイル、および図１Ｊはバイオリアクターグルコースプロファイルを示す。
【図１−４】図１Ａ−１Ｊは、モノクローナル抗体についての製造規模および実験室規模実行における１２のモニターされた上流パラメーターについての傾向を示す。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す実行は平均化され、各パラメーターについて平均＋ＳＥＭとして表される。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す試料間の差異は、両側対応ｔ検定により分析された。各試料について、図１ＡはバイオリアクターｐＨプロファイル、図１Ｂはバイオリアクターグルタミンプロファイル、図１Ｃはバイオリアクター乳酸プロファイル、図１Ｄはバイオリアクターアンモニウムプロファイル、図１Ｅはバイオリアクター生細胞密度、図１Ｆはバイオリアクターパーセント細胞生存性、図１Ｇはバイオリアクター溶存酸素含量、図１ＨはバイオリアクターｐＣＯ２含量、図１Ｉはバイオリアクターグルタミン酸プロファイル、および図１Ｊはバイオリアクターグルコースプロファイルを示す。
【図１−５】図１Ａ−１Ｊは、モノクローナル抗体についての製造規模および実験室規模実行における１２のモニターされた上流パラメーターについての傾向を示す。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す実行は平均化され、各パラメーターについて平均＋ＳＥＭとして表される。ジスルフィド結合還元を示すかまたはジスルフィド結合還元が無いことを示す試料間の差異は、両側対応ｔ検定により分析された。各試料について、図１ＡはバイオリアクターｐＨプロファイル、図１Ｂはバイオリアクターグルタミンプロファイル、図１Ｃはバイオリアクター乳酸プロファイル、図１Ｄはバイオリアクターアンモニウムプロファイル、図１Ｅはバイオリアクター生細胞密度、図１Ｆはバイオリアクターパーセント細胞生存性、図１Ｇはバイオリアクター溶存酸素含量、図１ＨはバイオリアクターｐＣＯ２含量、図１Ｉはバイオリアクターグルタミン酸プロファイル、および図１Ｊはバイオリアクターグルコースプロファイルを示す。
【００２８】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、モノクローナル抗体の生産に関連する平常（ＮＣ  Ｄ１４）および低生存性（ＬＶＣ  Ｄ１５）細胞培養条件から得られる試料中のジスルフィド結合還元の程度を示す。細胞のピーク生細胞密度（ＶＣＤ）、ＶＣＤ、および％生存性の測定はまた、各細胞培養条件について示される。特に、図２Ａは、１４日での平常条件に関連する％単量体および細胞培養パラメーターを示し、図２Ｂは、１５日での低生存性条件に関連する％単量体および細胞培養パラメーターを示す。試料は、２４時間以上空気無しでまたはエアヘッドスペース(air head space)で２−８°Ｃまたは室温（ＲＴ）で貯蔵された。
【００２９】
【図３】図３は、１０日および１４日（Ｄ１０およびＤ１４）で平常（ＮＣ）細胞培養条件からおよび１４日および１５日（Ｄ１４およびＤ１５）で低生存性（ＬＶＣ）細胞培養条件から得られる試料中のレドックスおよびアポトーシスに関連する２３のタンパク質のプロテオミクス分析を示す。全ての試料は、ジスルフィド還元試料（ＮＣ  Ｄ１４）に対する異なる発現について比較された。
【００３０】
【図４−１】図４Ａ−４Ｄは、２つのモノクローナル抗体についてのベンチ、パイロット、および製造規模実行から採取される試料中のチオレドキシン１およびチオレドキシンレダクターゼ１の発現を示す。図４Ａは、チオレドキシン１についてのウェスタンブロットを示し、バンド密度が図４Ｂで定量されている。図４Ｃは、チオレドキシンレダクターゼ１についてのウェスタンブロットを示し、バンド密度が図４Ｄで定量されている。図４Ａおよび４Ｃ中の太字の試料は、ジスルフィド結合還元を実証した。ブロットは、各試料について３重に(triplicate)実行され、かつバンド密度は、３つの別個のブロットについての平均＋ＳＥＭを示す。
【図４−２】図４Ａ−４Ｄは、２つのモノクローナル抗体についてのベンチ、パイロット、および製造規模実行から採取される試料中のチオレドキシン１およびチオレドキシンレダクターゼ１の発現を示す。図４Ａは、チオレドキシン１についてのウェスタンブロットを示し、バンド密度が図４Ｂで定量されている。図４Ｃは、チオレドキシンレダクターゼ１についてのウェスタンブロットを示し、バンド密度が図４Ｄで定量されている。図４Ａおよび４Ｃ中の太字の試料は、ジスルフィド結合還元を実証した。ブロットは、各試料について３重に実行され、かつバンド密度は、３つの別個のブロットについての平均＋ＳＥＭを示す。
【００３１】
【図５】図５は、２つのモノクローナル抗体についてのベンチ、パイロット、および製造規模実行から採取される試料についてのチオレドキシンレダクターゼ活性アッセイの結果を示す。囲まれている試料は、ジスルフィド結合還元を実証した一方、他の試料は実証しなかった。
【００３２】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、２つのモノクローナル抗体についての製造およびパイロット規模実行から採取される試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の発現を示す。図６Ａは、Ｇ６ＰＤについてのウェスタンブロットを示し、バンド密度が図６Ｂで定量されている。図６Ａ中の太字の試料は、ジスルフィド結合還元を実証した。ブロットは、各試料について３重に実行され、かつバンド密度は、３つの別個のブロットについて平均＋ＳＥＭを示す。
【００３３】
【図７】図７は、モノクローナル抗体についての製造および実験室規模実行から採取される試料からのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）活性アッセイの結果を示す。枠で囲まれた試料はジスルフィド結合還元を実証した一方、アスタリスクが付けられた試料は実証しなかった。
【００３４】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、モノクローナル抗体についての製造および実験室規模実行から採取される試料中のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を示す。図８Ａは、ＧＡＰＤＨについてのウェスタンブロットを示し、バンド強度が図８Ｂで定量されている。ブロットは、各試料について３重に実行され、かつバンド密度は３つの別個のブロットについて平均＋ＳＥＭを示す。
【００３５】
【図９】図９Ａ−９Ｃは、二次モノクローナル抗体についての実験室規模およびパイロット実行から採取される試料中のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現およびジスルフィド結合還元の程度を示す。図９Ａは、ＧＡＰＤＨについてのウェスタンブロットを示し、バンド密度が図９Ｂで定量されている。図９Ｃは、２４時間空気無しでまたはエアオーバーレイで(air overlay)２−８°Ｃまたは室温（ＲＴ）で貯蔵された実験室規模およびパイロット実行からの試料中のジスルフィド結合還元の程度を示す。
【００３６】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、モノクローナル抗体についての製造規模実行から採取される試料についてのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）活性アッセイの結果を示す。図１０Ａは相対的ＧＡＰＤＨ活性を示し、かつ図１０Ｂはタンパク質濃度に正規化された相対的ＧＡＰＤＨ活性を示す。
【００３７】
【図１１−１】図１１Ａ−１１Ｊは、グリセルアルデヒド（Glyceraldeyde）−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびタンパク質発現の結果を示す。図１１Ａおよび１１Ｂ：対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、およびＲｅｄｕｃｉｎｇ３試料からのｍＲＮＡが、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＧＡＰＤＨ遺伝子発現について分析された。相対的発現は、対照条件に正規化され、かつ結果は、経時的に（１１Ａ）または７日および９日細胞ペレット試料について（１１Ｂ）プロットされた。相対的発現結果は、試験された各試料について平均＋ＳＥＭを示す。図１１Ｃ、１１Ｅ、１１Ｇ、および１１Ｉは、対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、またはＲｅｄｕｃｉｎｇ３下で培養されたｍＡｂＢ細胞ペレット中のＧＡＰＤＨについてのウェスタンブロットを示す。バンド密度は、定量され、かつ試験された各条件について０日細胞ペレットに正規化された（それぞれ１１Ｄ、１１Ｆ、１１Ｈ、１１Ｊ）。ブロットは、各試料について３重に実行され、バンド密度は、３つの別個のブロットについて平均＋ＳＥＭを示す。
【図１１−２】図１１Ａ−１１Ｊは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびタンパク質発現の結果を示す。図１１Ａおよび１１Ｂ：対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、およびＲｅｄｕｃｉｎｇ３試料からのｍＲＮＡが、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＧＡＰＤＨ遺伝子発現について分析された。相対的発現は、対照条件に正規化され、かつ結果は、経時的に（１１Ａ）または７日および９日細胞ペレット試料について（１１Ｂ）プロットされた。相対的発現結果は、試験された各試料について平均＋ＳＥＭを示す。図１１Ｃ、１１Ｅ、１１Ｇ、および１１Ｉは、対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、またはＲｅｄｕｃｉｎｇ３下で培養されたｍＡｂＢ細胞ペレット中のＧＡＰＤＨについてのウェスタンブロットを示す。バンド密度は、定量され、かつ試験された各条件について０日細胞ペレットに正規化された（それぞれ１１Ｄ、１１Ｆ、１１Ｈ、１１Ｊ）。ブロットは、各試料について３重に実行され、バンド密度は、３つの別個のブロットについて平均＋ＳＥＭを示す。
【図１１−３】図１１Ａ−１１Ｊは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびタンパク質発現の結果を示す。図１１Ａおよび１１Ｂ：対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、およびＲｅｄｕｃｉｎｇ３試料からのｍＲＮＡが、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＧＡＰＤＨ遺伝子発現について分析された。相対的発現は、対照条件に正規化され、かつ結果は、経時的に（１１Ａ）または７日および９日細胞ペレット試料について（１１Ｂ）プロットされた。相対的発現結果は、試験された各試料について平均＋ＳＥＭを示す。図１１Ｃ、１１Ｅ、１１Ｇ、および１１Ｉは、対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、またはＲｅｄｕｃｉｎｇ３下で培養されたｍＡｂＢ細胞ペレット中のＧＡＰＤＨについてのウェスタンブロットを示す。バンド密度は、定量され、かつ試験された各条件について０日細胞ペレットに正規化された（それぞれ１１Ｄ、１１Ｆ、１１Ｈ、１１Ｊ）。ブロットは、各試料について３重に実行され、バンド密度は、３つの別個のブロットについて平均＋ＳＥＭを示す。
【００３８】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、実験室規模ｍＡｂＢバッチについてのジスルフィド還元分析を示す。図１２Ａ：対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、またはＲｅｄｕｃｉｎｇ３下で培養されたベンチ規模生産バイオリアクターからのＨＣＣＦは、５日間、溶存酸素有り（ＤＯ、塗りつぶし(solid)バー）で２−８°Ｃで、または溶存酸素無し（ＮＯ  ＤＯ、チェック模様の(checkered)バー）で周囲温度でインキュベートされた。図１２Ａは、各試料中に存在するインタクトな単量体のパーセント量を示す。図１２Ｂ：細胞試料は、示される時間に、各生産バイオリアクター（対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、およびＲｅｄｕｃｉｎｇ３）から取られ、上清は、乳酸およびピルビン酸含量について分析された。乳酸の濃度は、ピルビン酸の濃度により割られ、経時的に各バイオリアクターについてｌａｃ／ｐｙｒ比を生じた。Ｌａｃ／ｐｙｒ比は、対照条件に正規化され、ｌａｃ／ｐｙｒ比対時間における相対的％増加としてプロットされた。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
該開示の詳細な説明
一般的な用語および表現の定義
本開示をより容易に理解するために、特定の用語が最初に定義される。この出願において使用されるように、本明細書中で他に明示的に提供される場合を除き、以下の用語のそれぞれは、以下に記載される意味を有するべきである。追加の定義が、該出願を通して記載される。
【００４０】
本明細書中で使用される「および／または」なる用語は、もう片方のもの有りまたは無しの２つの特定された特徴または構成要素のそれぞれの特異的な開示としてみなされるべきである。ゆえに、本明細書中の「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用されるとき「および／または」なる用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ（単独）」および「Ｂ（単独）」を含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用されるとき「および／または」なる用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）のそれぞれを包含するように意図される。
【００４１】
本明細書中でどこに「を含む」なる語を用いて態様が記載されても、他に、「からなる」および／または「本質的に・・からなる」なる用語において記載される類似の態様も提供されることが理解される。
【００４２】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、この開示が関連する分野における当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press;およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, 改訂, 2000, Oxford University Pressは、この開示中で使用される語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【００４３】
単位、接頭辞、および記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）が受け入れる形式で示される。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。本明細書中で提供される見出しは、明細書を全体として参照することにより有されることができる該開示の種々の態様を限定するものではない。従って、すぐ下で定義される語は、明細書全体を参照することにより、より完全に定義される。
【００４４】
代替物（例えば、「または」）の使用は、代替物のいずれか一つ、両方、またはその任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、任意の列挙(recite)または列挙(enumerate)された構成要素の「１つ以上」を指すと理解されるべきである。
【００４５】
「約」または「本質的に・・を含む」なる用語は、値または組成がどのように測定または決定されるのか、つまり測定システムの限定に一部依存するであろう、当業者により決定されるとき特定の値または組成についての許容可能な誤差範囲内にある値または組成を指す。例えば、「約」または「本質的に・・を含む」は、当該技術分野における慣行ごとに１以内または１を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」または「本質的に・・を含む」は、最大１０％または２０％（つまり、±１０％または±２０％）の範囲を意味することができる。例えば、約３ｍｇは、２．７ｍｇおよび３．３ｍｇ（１０％の場合）の間または２．４ｍｇおよび３．６ｍｇ（２０％の場合）の間の任意の数を含むことができる。さらに、特に生物学的システムまたは処理に関して、該用語は、最大１桁、または最大５倍の値を意味することができる。特定の値または組成が該出願および特許請求の範囲において提供される場合、他に述べられない限り、「約」または「本質的に・・を含む」の意味は、その特定の値または組成についての許容可能な誤差範囲内にあると見なされるべきである。
【００４６】
本明細書中に記載される場合、いかなる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲も、他に示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「ジスルフィド結合還元」なる用語は、硫黄−硫黄結合が壊され、かつ水素−硫黄結合により置き換えられる化学処理を指す。ジスルフィド基（Ｓ−Ｓ結合を特徴とする）およびチオール（Ｈ−Ｓ結合を特徴とする）の相互変換はレドックス反応を表し、ここでチオールは還元状態を表し、ジスルフィドは酸化状態を表す。タンパク質中で、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合は、は、しばしば、タンパク質の３次元構造および安定性に寄与し；ゆえにジスルフィド結合の還元は、低分子重量タンパク質種の形成をもたらすことができる。ジスルフィド結合還元の程度および低分子重量種の存在は、キャピラリー電気泳動などの既知の方法により測定されることができる。かかる測定は、しばしば、試料中の単量体％として表され、９５％未満の単量体％は、ジスルフィド結合還元の存在を典型的に示す。
【００４８】
開示の方法は、これらに限定されないが、灌流細胞培養、バッチ培養、および流加培養細胞培養を企図する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「灌流する(perfuse)」、「灌流」および「灌流培養」なる用語は、細胞を培養する方法を指すために交換可能に使用され、ここで追加の新鮮な培地が培養に提供され、使用済み培地が該培養から除去される。灌流は培養が播種される後に開始され、継続的または断続的いずれかに、所望によりある期間にわたって生じることができる。灌流の間に添加された新鮮な培地は、典型的に、培養処理の間に枯渇した細胞のための栄養サプリメントを提供する。灌流はまた、細胞培養からの細胞廃棄産物および毒性副産物の除去を可能にする。灌流は、細胞の増殖フェーズの間に実施されるが、細胞が流加培養細胞培養に移された後も継続されることができる。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「バッチ培養」なる用語は、培地並びに細胞自体を含む、細胞の培養において最終的に使用されるであろう全ての構成要素が、該培養処理の始めに提供される、細胞を培養する方法を指す。バッチ培養は、典型的に、ある時点で停止され、培地中の細胞および／または構成要素は採取され、所望により精製される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「流加培養」なる用語は、細胞培養が新鮮な培地を補足される、すなわち、使用済みの培地は除去されない一方で細胞が新しい培地を「供給」される、細胞を培養する方法を指す。典型的に、「流加培養」培養処理は、バイオリアクター中で実施され、追加の構成要素（例えば栄養サプリメント）は、培養処理の開始後のある時に培養に添加される。栄養素の該制御された添加は、培養の増殖速度に直接影響し、オーバーフロー代謝物の蓄積の回避を可能にする（例えば、Wlaschin, K. F. ら, 「Fedbatch culture and dynamic nutrient feeding」, Cell Culture Engineering, 101:43-74 (2006)およびLee, J. ら, 「Control of fed-batch fermentations」, Biotechnol. Adv., 17:29-48 (1999)を参照)。流加培養は、典型的に、ある時点で終了され、培地中の細胞および/または構成要素は採取され、所望により精製される。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「接種(innoclulation)」、「接種(inoculum)」および「播種」は、培養を始めるための開始培地への細胞の添加を指す。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「細胞密度」なる用語は、培地の所与の体積中の細胞の数を指す。細胞密度は、市販の細胞をカウントする装置を使用して、またはバイオリアクター自体中に（または、培地および浮遊細胞が通過して、次いでバイオリアクターに戻されるループ中に）導入された市販の適したプローブを使用することにより、培養から細胞を抽出し、顕微鏡下で該細胞を分析することを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の技術によりモニターされることができる。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「スーパー高細胞密度」および「高細胞密度」なる用語は、交換可能に使用され、Ｎ−１灌流バイオリアクター中の少なくとも約４０ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度を指す。既知の細胞培養技術は、細胞を「第１臨界レベル」（すなわち、「細胞培養を灌流し、概ね５００万から４０００万細胞／ｍＬを得る前に、細胞生存性が廃棄物生産（例えば、細胞増殖阻害剤および、例えば乳酸、アンモニアなどの毒性代謝物）の増加した濃度に影響されてもよい細胞サイクル増殖フェーズの間の時点」）に増殖させることを含んでもよい。対照的に、本開示に従って増殖された細胞は、高細胞密度に達してもよい。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、または１３０ｘ１０６細胞／ｍＬを超える標的細胞密度へ増殖される。特定の実施形態において、本開示の細胞は、約６０ｘ１０６細胞／ｍＬの標的細胞密度へ増殖される。他の実施形態において、本開示の細胞は、約４０ｘ１０６細胞／ｍＬの標的細胞密度へ増殖される。高密度播種は、培養を、約５ｘ１０６細胞／ｍＬ、約１０ｘ１０６細胞／ｍＬ、約１５ｘ１０６細胞／ｍＬ、約２０ｘ１０６細胞／ｍＬ、または約２５ｘ１０６細胞／ｍＬで播種することを指す。特定の実施形態において、高密度播種は、培養を約１０ｘ１０６細胞／ｍＬで播種することを指す。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「生細胞密度」または「ＶＣＤ」なる用語は、実験条件の所与のセット下で培地の所与の体積中に存在する生細胞の数を指す。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「細胞生存性」なる用語は、培養における細胞の条件または実験変動の所与のセット下で生き残る能力を指す。本明細書中で使用される場合、該用語はまた、その時の培養中の細胞の総数（例えば、生および死）に関して、特定の時に生きている細胞のその一部を指す。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、細胞培養の「増殖フェーズ」は、いずれの時点での生細胞密度も以前のどの時点よりも高いフェーズを指す。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、細胞培養の「生産フェーズ」は、将来の処理のために蓄積する有意な量のタンパク質を細胞が生産するフェーズを指す。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、細胞培養の「移行フェーズ」は、細胞培養条件が（例えば、細胞培養の温度を低くすることにより）変えられてもよい増殖および生産フェーズの間のフェーズを指す。典型的に、移行フェーズは、生産フェーズに入る前に２４−４８時間行われる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「細胞全体(integral)」なる用語は、細胞増殖プロファイルの過程の間の全生細胞数を指す。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「力価」なる用語は、培地体積の所与の量で割った細胞培養により生産されるタンパク質の総量を指す。本質的に、「力価」なる用語は、濃度を指し、典型的に、培地１リットルあたりのポリペプチドのミリグラムの単位で表される。本開示の方法は、当該技術分野において既知の他の細胞培養方法から生産されるポリペプチド産物力価と比較して、ポリペプチド産物力価を実質的に増加させてもよい。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、それらの文法的バリエーションを含む「培地」、「細胞培養培地」および「培養培地」なる用語は、交換可能に使用され、細胞（例えば、動物または哺乳類細胞）が培養において増殖される栄養素溶液を指す。細胞培養培地は、細胞について物理化学的、栄養的、およびホルモン的環境であり、典型的に、以下からの少なくとも１以上の構成要素を含む：エネルギー源（例えば、グルコースなどの炭水化物の形態の）；２０の塩基性アミノ酸およびシステインを含む必須アミノ酸；典型的に低濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機化合物；脂質または遊離脂肪酸（例えば、リノール酸）；および微量元素（例えば、典型的に、通常はマイクロモル範囲の非常に低濃度で必要とされる無機化合物または天然要素）。培地は、固体、ゼラチン状、液体、気体、または相および材料の混合物であってもよい。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「細胞」なる用語は、動物細胞、哺乳類細胞、培養された細胞、宿主細胞、組み換え細胞、および組み換え宿主細胞を指す。かかる細胞は、一般に、適切な栄養素および／または増殖因子を含有する培地中に置かれた場合、増殖し生き残ることができる哺乳類組織から得られるかまたはそれに由来する細胞株である。本開示の方法において利用される細胞は、一般に、培養培地中に大量の特定のタンパク質を発現および分泌することができるか、または発現および分泌するように分子的に操作されることができる動物または哺乳類細胞である。１つの実施形態において、細胞により生産されるタンパク質は、細胞に内因性または同種であることができる。あるいは、タンパク質は、細胞に対して異種、すなわち外来である。
【００６４】
本開示の方法において利用される細胞は、当該技術分野において既知であるかまたは商業的に入手可能であるものを含む任意の数の細胞培養培地中で増殖および維持されることができる。当業者は、特定の培養された宿主細胞における細胞増殖、細胞生存性および／またはタンパク質生産を最大化するように選択される１つ以上の既知の細胞培養培地を使用することを選んでもよい。例示的細胞培養培地は、目的のタンパク質を発現することができる細胞を培養するのに適した任意の培地を含む。いくつかの実施形態において、培地は、化学的に定義された培地である。
【００６５】
加えて、細胞培養培地は、所望により、適切な濃度または量で、必要または所望により当業者により知られており実施されるように、１つ以上の追加の構成要素を含むように補足されることができる。例示的サプリメントは、化学遺伝子選択剤、ホルモンおよび他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、表皮増殖因子、血清、ソマトトロピン、下垂体抽出物、アプロチニン）；塩（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、および緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ（４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジン−エタンスルホン酸））；ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジン、ヒポキサンチン）；タンパク質および加水分解物；抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）；細胞保護剤（例えば、プルロニックポリオール（ＰＬＵＲＯＮＩＣ．ＲＴＭ．Ｆ６８））および細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン）を含むが、これらに限定されない。特定の細胞培養の増殖および維持を支持するサプリメントは、例えば、Barnes ら(Cell, 22:649 (1980))により;Mammalian Cell Culture, Mather, J. P., ed., Plenum Press, NY (1984)において;および米国特許番号5,721,121において記載されるように、当業者により容易に決定されることができる。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「バイオリアクター」なる用語は、細胞培養を増殖させるために使用される任意の装置、密閉容器または容器（例えば、発酵チャンバー）を指す。バイオリアクターは、循環ループフロー、ｐＨ、温度、過圧および／または培地灌流速度を含むがこれらに限定されない、細胞灌流処理の間に種々のパラメーターを制御することを可能にする。バイオリアクターは、市販のバイオリアクター、古典的な発酵槽および細胞培養灌流システム、並びに使い捨てバイオリアクターを含む。
【００６７】
バイオリアクターは、該開示の方法に従って、望ましい規模で細胞を培養するのに有用な任意のサイズであることができる。例えば、本開示の方法において採用されるバイオリアクターは、少なくとも約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，００００、１３，０００、１４，０００、１５，０００リットルまたはそれを超える、または任意の中間体積であってもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法において採用されるバイオリアクターは、目的のタンパク質の大規模生産のために使用されてもよい。かかる実施形態において、本開示の方法において採用されるバイオリアクターは、１，０００Ｌバイオリアクター、２，５００Ｌバイオリアクター、５，０００Ｌバイオリアクター、８，０００Ｌバイオリアクター、１０，０００Ｌバイオリアクター、１２，０００Ｌバイオリアクター、または１５，０００Ｌまたはそれを超えるバイオリアクターであってもよい。
【００６８】
適したバイオリアクターは、本開示の培養条件下で細胞培養を保持するのに適した任意の材料で構成され（つまり、で構造され(constructed of)）てもよく、細胞増殖および生存性を助長する。例えば、本開示の方法において採用されるバイオリアクターは、ガラス、プラスチックまたは金属で作られていることができる。しかしながら、バイオリアクターを含む材料は、ポリペプチド産物の発現または安定性に干渉するべきではない。適したバイオリアクターは、当該技術分野において既知であり、商業的に入手可能である。実施形態において、バイオリアクターは、Ｎ−１シードバイオリアクター（Ｎ−１バイオリアクター）である。
【００６９】
本開示の方法において使用される灌流バイオリアクターは、使い捨て灌流バイオリアクターまたは他の任意の伝統的な灌流バイオリアクターであることができる。バイオリアクターは、所望により、スピンフィルター、タンジェンシャルフロー膜フィルター、動的(dynamic)膜、超音波セパレーター、重力セトラー、連続遠心分離または音響細胞保持装置、ミクロ濾過装置、超濾過装置などを含むがこれらに限定されない、任意の内部または外部細胞保持装置を装備してもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態において、該開示の灌流バイオリアクターは、灌流処理の間に高細胞密度および高細胞生存性を得ることができるバイオリアクターである。特定の実施形態において、灌流バイオリアクターは、Ｎ−１バイオリアクター（またはＮ−１シードバイオリアクター）である。
【００７１】
「バイオマスキャパシタンスプローブ」は、他の能力の中で生細胞密度を測定することができるプローブを指す。バイオマスキャパシタンスプローブは、キャパシタンスを使用して培養中の総生細胞を測定する。生細胞は、流電界におけるコンデンサとして働く。バイオマスキャパシタンスプローブは、これらの細胞からの電荷を測定し、それを報告することができる。
【００７２】
本開示の方法に包含される細胞培養は、細胞型および培養条件について適切な任意の温度で増殖されてもよい。１つの実施形態において、タンパク質生産を高めるために、約３０°Ｃおよび３８°Ｃの間の温度を使用することが望ましい。別の実施形態において、温度は、少なくとも約２５°Ｃ、２６°Ｃ、２７°Ｃ、２８°Ｃ、２９°Ｃ、３０°Ｃ、３１°Ｃ、３２°Ｃ、３３°Ｃ、３４°Ｃ、３５°Ｃ、３６°Ｃ、３７°Ｃ、３８°Ｃ、３９°Ｃ、４０°Ｃ、または４１°Ｃである。培養の間、異なる時に異なる温度を使用することも、望ましくてもよい。
【００７３】
該開示の方法
実施形態において、該開示は、目的のタンパク質を含む組成物中のジスルフィド結合還元を評価するための、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質バイオマーカーの使用に向けられる。いくつかの実施形態において、該開示は、目的のタンパク質を含む組成物中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法に関し、ここで少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルが、測定され、かつ該目的のタンパク質のジスルフィド結合還元または低分子重量種の発生に関連するベンチマーク値を提供する。他の実施形態において、該開示は、目的のタンパク質を生産する方法に関し、ここで目的のタンパク質を生産することができる宿主細胞が培養され、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルが測定され、かつ目的のタンパク質の下流単離が宿主細胞タンパク質測定により知らされる。
【００７４】
ジスルフィド結合還元および低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生を予測する方法は、該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルを測定することを含み、ここでベンチマーク値より上の宿主細胞タンパク質発現または活性レベルは該目的のタンパク質のジスルフィド結合還元の発生に関連する。いくつかの実施形態において、低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルを測定することを含み、ここでベンチマーク値より上の宿主細胞タンパク質発現または活性レベルは、該目的のタンパク質の低分子重量タンパク質種の発生に関連する。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、キャピラリー電気泳動により検出されることができる。
【００７５】
実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法が、目的のタンパク質を含む組成物に実施される。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質は、ＣＨＯ細胞タンパク質である。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を含む組成物は、細胞培養から生産される。いくつかの実施形態において、細胞培養は、目的のタンパク質を生産することができる宿主細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養は、該目的のタンパク質を生産することができる宿主細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養は、哺乳類細胞、例えばCHO細胞を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態においては、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも２つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも３つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００の宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも２つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００の宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、酸化ストレス経路、熱ショックタンパク質経路、および／または低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、酸化ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態においては、該方法は、熱ショックタンパク質ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、チオレドキシン（ＴＲＸ様またはＴＲＸ１、細胞質）、チオレドキシンレダクターゼ、ペルオキシレドキシン（ＰＲＤＸ−１、ＰＲＤＸ−２、またはＰＲＤＸ−６様）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からなる群から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、およびＧＡＰＤＨからなる群から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともチオレドキシンの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともチオレドキシンレダクターゼの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともＧＡＰＤＨの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴＰ１、ＧＳＴオメガ−１様アイソフォーム３、ＧＳＴ  Ｙ１様、ＧＳＴ  Ａ４様、またはＧＳＴアルファ−３様）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ、細胞質様）、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＬＤＨ  Ａ鎖）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６−ＰＤＧ、脱炭酸様）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ、ＰＤＩ  Ａ４、ＰＤＩ  Ａ３、またはＰＤＩ  Ａ６様）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ［Ｃｕ−Ｚｎ］様）、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄ−３−ＰＨＧＤＨ様）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ［ＮＡＤＰ］細胞質様）、Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  １（ＭＺＦ−１）、またはアポトーシス誘導因子１（ＡＩＦＭ１、ミトコンドリア様）の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質の発現レベルは、細胞培養液（ＣＣＦ）中で測定される。他の実施形態において、宿主細胞タンパク質の発現レベルは、細胞内で測定される。いくつかの実施形態において、細胞内発現レベルは、細胞培養ライセート中で測定される。特定の実施形態において、発現レベルは、ウェスタンブロット分析により測定される。
【００８０】
これらの酵素は、平常細胞レドックス調節において重要な役割を果たし；かつジスルフィド還元試料中のそれらの存在は、ジスルフィド還元を実証した細胞培養条件における酸化ストレスの増加したレベルを示唆する可能性がある。
【００８１】
いくつかの実施形態においては、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、酸化ストレス経路、熱ショックタンパク質経路、および／または低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、酸化ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、熱ショックタンパク質経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、チオレドキシン（ＴＲＸ様またはＴＲＸ１、細胞質）、チオレドキシンレダクターゼ、ペルオキシレドキシン（ＰＲＤＸ−１、ＰＲＤＸ−２、またはＰＲＤＸ−６様）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からなる群から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、およびＧＡＰＤＨからなる群から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともチオレドキシンの活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともチチオレドキシンレダクターゼの活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともＧＡＰＤＨの活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ  Ｐ１、ＧＳＴオメガ−１様アイソフォーム３、ＧＳＴ  Ｙ１様、ＧＳＴ  Ａ４様、またはＧＳＴアルファ−３様）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ、細胞質様）、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＬＤＨ  Ａ鎖）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６−ＰＤＧ、脱炭酸様）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ、ＰＤＩ  Ａ４、ＰＤＩ  Ａ３、またはＰＤＩ  Ａ６様）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ［Ｃｕ−Ｚｎ］様）、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄ−３−ＰＨＧＤＨ様）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ［ＮＡＤＰ］細胞質様）、Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  １（ＭＺＦ−１）、またはアポトーシス誘導因子１（ＡＩＦＭ１、ミトコンドリア様）の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質の活性レベルは、細胞培養液（ＣＣＦ）中で測定される。他の実施形態において、宿主細胞タンパク質の活性レベルは、細胞内で測定される。いくつかの実施形態において、細胞内活性レベルは、細胞培養ライセート中で測定される。特定の実施形態において、活性レベルは、活性アッセイにより測定される。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、チオレドキシンレダクターゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、チオレドキシンレダクターゼ活性レベルは、チオレドキシンレダクターゼ活性アッセイにより測定される。いくつかの実施形態において、Ｇ６ＰＤ活性レベルは、Ｇ６ＰＤ活性アッセイにより測定される。いくつかの実施形態において、ＧＡＰＤＨ活性レベルは、ＧＡＰＤＨ活性アッセイにより測定される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベル、および少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。
【００８６】
特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、チオレドキシンの発現レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約２００％のチオレドキシン相対バンド強度により示される。
【００８７】
特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、チオレドキシンレダクターゼの発現レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約１６０％のチオレドキシンレダクターゼ相対バンド強度により示される。
【００８８】
特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、ＧＡＰＤＨの発現レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約１４０％のＧＡＰＤＨ相対バンド強度により示される。
【００８９】
特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、チオレドキシンレダクターゼの活性レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、チオレドキシンレダクターゼ活性アッセイにより決定されるとき６０分後の１．０の相対ＴｒｘＲ活性 (AU)により示される。
【００９０】
特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、Ｇ６ＰＤの活性レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、Ｇ６ＰＤ活性アッセイにより決定されるとき３．０の正規化されたレゾルフィン蛍光（ＡＵ）により示される。
【００９１】
特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、ＧＡＰＤＨの活性レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、ＧＡＰＤＨ活性アッセイにより決定されるとき該対照と比較して正規化されたＧＡＰＤＨ活性における減少により示される。
【００９２】
タンパク質を生産する方法
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、以下を含む：該目的のタンパク質を生産することができる宿主細胞を培養すること；該目的のタンパク質でない少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルまたは活性レベルを測定すること；および宿主細胞タンパク質発現または活性レベルのいずれかがベンチマーク値より下である場合、該目的のタンパク質を単離すること。実施形態において、ベンチマーク値であるかまたはそれより上の発現または活性レベルは、目的のタンパク質のジスルフィド結合還元の発生または低分子重量種の存在を示す。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質は、ＣＨＯ細胞タンパク質である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも２つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも３つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００の宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも２つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも３つの、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００の宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、酸化ストレス経路、熱ショックタンパク質経路、および／または低酸素誘導(hypoxia-inducible)因子１−アルファ経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、酸化ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、熱ショックタンパク質ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、チオレドキシン（ＴＲＸ様またはＴＲＸ  １、細胞質）、チオレドキシンレダクターゼ、ペルオキシレドキシン（ＰＲＤＸ−１、ＰＲＤＸ−２、またはＰＲＤＸ−６様）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からなる群から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、およびＧＡＰＤＨなる群から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともチオレドキシンの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともチオレドキシンレダクターゼの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともＧＡＰＤＨの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ  Ｐ１、ＧＳＴオメガ−１様アイソフォーム３、ＧＳＴ  Ｙ１様、ＧＳＴ  Ａ４様、またはＧＳＴアルファ−３様）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ、細胞質様）、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＬＤＨ  Ａ鎖）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６−ＰＤＧ、脱炭酸様）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ、ＰＤＩ  Ａ４、ＰＤＩ  Ａ３、またはＰＤＩ  Ａ６様）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ［Ｃｕ−Ｚｎ］様）、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄ−３−ＰＨＧＤＨ様）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ［ＮＡＤＰ］細胞質様）、Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  １（ＭＺＦ−１）、またはアポトーシス誘導因子１（ＡＩＦＭ１、ミトコンドリア様）の発現レベルを決定することを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において，宿主細胞タンパク質の発現レベルは、細胞培養液（ＣＣＦ）中で測定される。他の実施形態において，宿主細胞タンパク質の発現レベルは、細胞内で測定される。いくつかの実施形態において、細胞内発現レベルは、細胞培養ライセート中で測定される。特定の実施形態において、発現レベルは、ウェスタンブロット分析およびｑＰＣＲにより測定される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、酸化ストレス経路、熱ショックタンパク質経路、および／または低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、酸化ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、熱ショックタンパク質経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、低酸素誘導ストレス経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合還元の発生または低分子重量タンパク質種の発生を予測する方法は、チオレドキシン（ＴＲＸ様またはＴＲＸ  １、細胞質）、チオレドキシンレダクターゼ、ペルオキシレドキシン（ＰＲＤＸ−１、ＰＲＤＸ−２、またはＰＲＤＸ−６様）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からなる群から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、およびＧＡＰＤＨからなる群から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともチオレドキシンの活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともチチオレドキシンレダクターゼの活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、少なくともＧＡＰＤＨの活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ  Ｐ１、ＧＳＴオメガ−１様アイソフォーム３、ＧＳＴ  Ｙ１様、ＧＳＴ  Ａ４様、またはＧＳＴアルファ−３様）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ、細胞質様）、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＬＤＨ  Ａ鎖）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６−ＰＤＧ、脱炭酸様）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ、ＰＤＩ  Ａ４、ＰＤＩ  Ａ３、またはＰＤＩ  Ａ６様）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ［Ｃｕ−Ｚｎ］様）、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄ−３−ＰＨＧＤＨ様）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ［ＮＡＤＰ］細胞質様）、Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  １（ＭＺＦ−１）、またはアポトーシス誘導因子１（ＡＩＦＭ１、ミトコンドリア様）の活性レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質の活性レベルは、細胞培養液（ＣＣＦ）中で測定される。他の実施形態において、宿主細胞タンパク質の活性レベルは、細胞内で測定される。いくつかの実施形態において、細胞内活性レベルは、細胞培養ライセート中で測定される。特定の実施形態において、活性レベルは、活性アッセイにより測定される。
【０１００】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、チオレドキシンレダクターゼまたはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）から選択される少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、チオレドキシンレダクターゼ活性レベルは、チオレドキシンレダクターゼ活性アッセイにより測定される。いくつかの実施形態において、Ｇ６ＰＤ活性レベルは、Ｇ６ＰＤ活性アッセイにより測定される。いくつかの実施形態において、ＧＡＰＤＨ活性レベルは、ＧＡＰＤＨ活性アッセイにより測定される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現レベルおよび少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の活性レベルを決定することを含む。
【０１０３】
特定の実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、チオレドキシンの発現レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約２００％のチオレドキシン相対バンド強度により示される。
【０１０４】
特定の実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、チオレドキシンレダクターゼの発現レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約１６０％のチオレドキシンレダクターゼ相対バンド強度により示される。
【０１０５】
特定の実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、ＧＡＰＤＨの発現レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元低分子重量タンパク質種の発生は、ウェスタンブロット分析により決定されるとき約１４０％のＧＡＰＤＨ相対バンド強度により示される。
【０１０６】
特定の実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、チオレドキシンレダクターゼの活性レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、チオレドキシンレダクターゼ活性アッセイにより決定されるとき６０分後の１．０の相対ＴｒｘＲ活性（ＡＵ）により示される。
【０１０７】
特定の実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、Ｇ６ＰＤの活性レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、Ｇ６ＰＤ活性アッセイにより決定されるとき３．０の正規化されたレゾルフィン蛍光（ＡＵ）により示される。
【０１０８】
特定の実施形態において、目的のタンパク質を生産する方法は、ＧＡＰＤＨの活性レベルを決定することを含み、かつ目的のタンパク質中のジスルフィド結合還元または低分子重量タンパク質種の発生は、ＧＡＰＤＨ活性アッセイにより決定されるとき該対照と比較して正規化されたＧＡＰＤＨ活性における減少により示される。
【０１０９】
目的のポリペプチドおよびタンパク質
宿主細胞中で発現可能な任意のポリペプチドまたはタンパク質は、本開示に従って目的のポリペプチドまたはタンパク質として生産されてもよい。該ポリペプチドは、宿主細胞に内因性である遺伝子から、または遺伝子工学によって宿主細胞中に導入される遺伝子から発現されてもよい。該ポリペプチドは、自然に生じるものであってもよく、またあるいは人間の手により操作または選択された配列を有してもよい。操作されたポリペプチドは、自然に個々に生じる他のポリペプチドセグメントから組み立てられてもよく、また天然でない1つ以上のセグメントを含んでもよい。
【０１１０】
本開示に従って望ましく発現されてもよいポリペプチドは、しばしば、興味深い生物学的または化学的活性に基づいて選択されるだろう。例えば、本開示は、薬学的または商業的に関連する酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などを発現するために採用されてもよい。
【０１１１】
抗体
医薬品または他の市販の薬剤として現在使用されているかまたは調査下にある多数の抗体を考えると、本開示に従う抗体の生産は興味深い。抗体は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質である。宿主細胞中で発現されることができる任意の抗体またはその抗原結合断片は、本開示に従って使用されてもよい。いくつかの実施形態において、発現されるべき抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。特定の実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【０１１２】
別の実施形態において、抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、複数の生物に由来するアミノ酸断片を含有する。キメラ抗体分子は、例えば、ヒト定常領域とともに、マウス、ラット、または他の種の抗体からの抗原結合ドメインを含むことができる。キメラ抗体を作るための様々なアプローチが記載される。例えば、Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takedaら, Nature 314, 452 (1985), Cabillyら, 米国特許番号4,816,567; Bossら, 米国特許番号 4,816,397; Tanaguchiら, 欧州特許公開EP171496; 欧州特許公開 0173494, 英国特許 GB 2177096Bを参照のこと。
【０１１３】
別の実施形態において、抗体は、例えば、リボソームディスプレイまたはファージディスプレイライブラリー（例えば、Winter ら, 米国特許番号6,291,159 およびKawasaki, 米国特許番号 5,658,754を参照）の使用またはネイティブ抗体遺伝子が不活性化され、ヒト抗体遺伝子で機能的に置き換えられ、一方でネイティブ免疫系の他の構成要素をインタクトなままにしているゼノグラフィック種の使用（例えば、Kucherlapatiら, 米国特許番号 6,657,103を参照）により得られるヒト抗体である。
【０１１４】
５つのヒト免疫グロブリンクラスは、それらの重鎖組成に基づいて定義され、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤと名付けられる。ＩｇＧクラスおよびＩｇＡクラス抗体は、さらにサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、およびＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体中の重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３と呼ばれる３つの定常領域ドメインを有し、かつＩｇＭおよびＩｇＥ抗体中の重鎖は、４つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４を有する。
【０１１５】
別の実施形態において、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、アミノ酸残基の大部分がヒト抗体に由来するキメラ抗体であり、ゆえにヒト対象に送達される時にいかなる潜在的な免疫反応も最小限にする。ヒト化抗体において、相補性決定領域中のアミノ酸残基は、少なくとも一部、所望の抗原特異性または親和性を付与する非ヒト種からの残基で置き換えられる。かかる変えられた免疫グロブリン分子は、当該技術分野において既知のいくつかの技術のいずれかにより作られることができ、（例えば、その全てが参照により本明細書中に組み込まれるTeng ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 7308-7312 (1983); Kozborら, Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson ら, Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)), およびその全てが参照により本明細書中に組み込まれるPCT公開WO92/06193 または EP 0239400の教示に従って作られる）。ヒト化抗体もまた、商業的に生産されることができる。さらなる参照のために、その全てが参照により本明細書中に組み込まれるJonesら, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann ら, Nature 332:323-329 (1988); および Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【０１１６】
さらに別の実施形態において、上記のモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、またはヒト化抗体は、自然のいずれの種におけるいずれの抗体においても自然に生じないアミノ酸残基を含有してもよい。これらの外来残基は、例えば、モノクローナル、キメラまたはヒト化抗体に新規または改変された特異性、親和性またはエフェクター機能を付与するために利用されることができる。別の実施形態において、上記の抗体は、毒素、低分子重量細胞毒性薬物、生物学的反応修飾剤、および放射性核種などの全身薬物療法のための薬物にコンジュゲートされてもよい（例えば、Kunzら, Calicheamicin derivative-carrier conjugates、 US20040082764 A1を参照）。
【０１１７】
細胞
細胞培養およびポリペプチドの発現の影響を受けやすい任意の哺乳類細胞または細胞型は、本開示に従って利用されてもよい。本開示に従って使用されてもよい哺乳類細胞の非限定的な例は、以下を含む：ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統；ヒト胎児腎臓株（懸濁培養中での増殖のためにサブクローン化された２９３または２９３細胞、Grahamら., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞±ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub および Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）;マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）；ＴＲＩ細胞（Matherら, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）; ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）。特定の実施形態において、本開示は、ＣＨＯ細胞株からのポリペプチドおよびタンパク質の培養および発現において使用される。
【０１１８】
加えて、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の数の商業的および非商業的に入手可能なハイブリドーマ細胞株は、本開示に従って利用されてもよい。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養要求を有する可能性があるおよび/または最適な増殖およびポリペプチドまたはタンパク質発現のために異なる培養条件を必要とする可能性があり、かつ必要に応じて条件を変更することができるであろうことを理解する。
【０１１９】
上記のように、多くの場合、細胞は、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生するように選択または操作されるだろう。しばしば、細胞は、例えば目的のタンパク質ポリペプチドをコードする遺伝子の導入によりおよび/または目的のポリペプチドをコードする遺伝子（内因性でも導入されていても）の発現を調節する制御要素の導入により、高レベルのタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【０１２０】
特定のポリペプチドは、細胞増殖、細胞生存性、または目的のポリペプチドまたはタンパク質の生産を何らかの方法で最終的に限定する細胞のその他の特性に有害な影響を有する可能性がある。特異的ポリペプチドを発現するように操作された１つの特定のタイプの細胞の集団の中でさえ、細胞集団内の変動性は、特定の個々の細胞がより良く増殖し、および／またはより多くの目的のポリペプチドを生成するように存在する。本開示の特定の実施形態において、細胞株は、細胞を培養するために選択された特定の条件下で、安定した(robust）増殖のために実施者により経験的に選択される。特定の実施形態において、特定のポリペプチドを発現するように操作された個々の細胞は、発現されたポリペプチドの細胞増殖、最終細胞密度、パーセント細胞生存性、力価またはこれらの任意の組み合わせまたは実施者により重要であるとみなされる他の条件に基づいて、大規模生産のために選択される。
【０１２１】
培地および培養条件
いくつかの実施形態において、哺乳類宿主細胞は、本明細書中に開示された任意のポリペプチドである目的のポリペプチドの生産を促進する条件下で培養される。基礎細胞培養培地処方は、当該技術分野において周知である。当業者は、これらの基礎培養培地処方に、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素などの構成要素を、培養されるべき宿主細胞の要求に応じて添加するだろう。培養培地は、血清および／またはタンパク質を含有しても含有しなくてもよい。無血清および／または定義された培養培地を含む種々の組織培養培地は、細胞培養のために商業的に入手可能である。組織培養培地は、該開示の目的のために、インビトロ細胞培養における動物細胞、およびいくつかの実施形態において哺乳類細胞の増殖に適した培地として定義される。典型的に、組織培養培地は、緩衝液、塩、エネルギー源、アミノ酸、ビタミン、およびトレース必須要素を含有する。培養において適切な真核細胞の増殖を支持することができる任意の培地は、使用されることができ；該開示は、培養における真核細胞、特に哺乳類細胞に広く適用可能であり、かつ培地の選択は該開示に重要ではない。該開示における使用に適した組織培養培地は、例えばＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から商業的に入手可能である。例えば、以下の培地のいずれか１つまたはそれらの組み合わせは、使用されることができる：ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、およびＥＸ−ＣＥＬＬ．ＴＭ．３００シリーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ,Ｌｅｎｅｘａ,Ｋａｎｓ．,ＵＳＡから入手可能）などの無血清培地、とりわけ中でも、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、並びに他の売り手から得られることができるもの。無血清および／または無ペプトンの定義された培地が使用される場合、通常、培地はアミノ酸および微量元素について高度に濃縮される。例えば、米国特許番号5,122,469からMatherらへ、および米国特許番号5,633,162からKeenらへを参照のこと。
【０１２２】
特定の実施形態において、細胞は、無血清、無タンパク質、無増殖因子、および/または無ペプトン培地中で増殖されることができる。培地に適用される「無血清」なる用語は、ウシ胎児血清などの血清を含有しない任意の哺乳類細胞培養培地を含む。培地に適用される「無インスリン」なる用語は、外因性インスリンが添加されていない任意の培地を含む。この文脈において、外因性は、細胞自体の培養により生産されるもの以外を意味する。培地に適用される「無ＩＧＦ−１」なる用語は、外因性インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）または類似物（例えば、Ｔｈｅｂａｒｔｏｎ，Ｓｏｕｔｈ  ＡｕｓｔｒａｌｉａのＧｒｏＰｅｐ  Ｌｔｄ．から入手可能なＬｏｎｇＲ３、［Ａｌａ３１］、または［Ｌｅｕ２４］［Ａｌａ３１］ＩＧＦ−１類似物など）が添加されていない任意の培地を含む。培地に適用される「無増殖因子」なる用語は、外因性増殖因子（例えば、インスリン、ＩＧＦ−１）が添加されていない任意の培地を含む。培地に適用される「無タンパク質」なる用語は、外因的に添加されたタンパク質、例えば、トランスフェリンおよびタンパク質増殖因子ＩＧＦ−１およびインスリンなどが無い培地を含む。無タンパク質培地は、ペプトンを有しても有さなくてもよい。培地に適用される「無ペプトン」なる用語は、外因性タンパク質加水分解物、例えば、動物および／または植物タンパク質加水分解物などが添加されていない任意の培地を含む。培地からペプトンを排除することは、ロット間変動性を減少させ、かつ濾過などの処理を高めるという利点を有する。化学的に定義された培地は、各構成要素が定義され、かつ純粋なソース、特定の実施形態において非動物ソースから得られる培地である。特定の実施形態において、培地は、化学的に定義され、かつ完全に無血清および無タンパク質である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、特定の培養宿主細胞における細胞増殖、細胞生存性、および／または組み換えポリペプチド生産を最大化するように開発されてきた多くの個別化された培地処方の一つは、利用される。本明細書中に記載される方法は、市販の細胞培養培地との、または特定の細胞株を用いた使用のために個々に処方された細胞培養培地との組み合わせにおいて使用されてもよい。例えば、増加したポリペプチド生産を支持することができる濃縮培地は、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、または１：１５までまたはそれより高い比で組み合わされたＤＭＥＭおよびハムＦ１２培地などの２つ以上の商業的培地の混合物を含んでもよい。あるいはまたは加えて、培地は、アミノ酸またはペプトンなどの栄養素の添加により濃縮されることができ、および／または培地（または以下に記載される例外を有するその構成要素のほとんど）は、その通常の推奨される濃度より高い、例えば、例えば２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、またはそれより高い濃度で使用されることができる。本明細書中で使用される場合、「１Ｘ」は標準濃度を意味し、「２Ｘ」は該標準濃度の２倍を意味する等。これらの実施形態のいずれかにおいて、塩などの実質的に浸透圧に影響することができる２Ｘは、培地の浸透圧が許容可能な範囲の外になるように、濃度において増加されることはできない。ゆえに、培地は、例えば、１Ｘのみで存在することができる塩を除く全ての構成要素に関して８Ｘであってもよい。濃縮培地は、無血清および／または無タンパク質であってもよい。さらに、培地は、例えば、ビタミン、アミノ酸、および代謝前駆体などの枯渇することができる培地構成要素を補填するために培養を維持する間、定期的に補足されてもよい。当該技術分野において既知であるように、異なる培地および温度は、異なる細胞株への多少の異なる効果を有してもよく、同じ培地および温度は、全ての細胞株に適していなくてもよい。
【０１２４】
哺乳類細胞に適した培養条件は、当該技術分野において既知である。例えば、Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford university press, New York (1992)を参照のこと。哺乳類細胞は、懸濁状態でまたは固体基板に付着している状態で培養されてもよい。さらに、哺乳類細胞は、例えば、マイクロキャリア有りまたは無しで、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル、振とうフラスコ、または攪拌タンクバイオリアクター中で培養され、かつバッチ、流加培養、連続、半連続、または灌流モードで操作されてもよい。
【０１２５】
培養条件をモニターすること
本開示の特定の実施形態において、実施者は、増殖中の細胞培養の特定の条件を定期的にモニターすることが有益または必要であることを見出してもよい。細胞培養条件をモニターすることは、実施者が、該細胞培養が組換えポリペプチドまたはタンパク質を準最適レベルで生産しているかどうか、または該培養が準最適生産フェーズに入ろうとしているかどうかを決定することを可能にする。特定の細胞培養条件をモニターするために、分析のために培養の少量のアリコートを除去することが必要であるだろう。当業者は、かかる除去が潜在的に細胞培養柱にコンタミネーションを導入してもよいことを理解し、かかるコンタミネーションのリスクを最小限にするために適切な注意をするであろう。
【０１２６】
非限定的な例として、細胞培養の温度、ｐＨ、細胞密度、生細胞密度、細胞生存性、統合生細胞密度、乳酸塩レベル、アンモニウムレベル、浸透圧、溶存酸素量、ｐＣＯ２レベル、グルタミンレベル、グルタミン酸レベル、またはグルコースレベル、あるいは発現されたポリペプチドまたはタンパク質の力価をモニターすることは、有益または必要であってもよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルは、代替として、または上記の細胞培養パラメーターに加えてモニターされる。いくつかの実施形態において、かかるパラメーターは定期的に測定される。特定の実施形態において、かかるパラメーターは毎日測定される。いくつかの実施形態において、かかる測定は、細胞培養の増殖フェーズの間行われる。いくつかの実施形態において、かかる測定は、細胞培養の移行フェーズの間行われる。いくつかの実施形態において、かかる測定は、細胞培養の生産フェーズの間行われる。特定の実施形態において、宿主細胞タンパク質の発現または活性レベルは、細胞培養のスタート後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日に測定される。
【０１２７】
当業者がこれらの条件を測定することを可能にする多くの技術が、当該技術分野において周知である。例えば、細胞密度は、血球計算盤、コールターカウンター、または細胞密度検査（ＣＥＤＥＸ）を使用して測定されてもよい。生細胞密度は、培養試料をトリパンブルーを用いて染色することにより決定されてもよい。死細胞のみがトリパンブルーを取り込むため、生細胞密度は、細胞の総数をカウントし、色素を取り込む細胞の数を細胞の総数で割り、その逆数をとることにより決定されることができる。細胞生存性は、バイオマスキャパシタンスプローブを使用して測定されることもできる。ＨＰＬＣは、乳酸、アンモニウム、または発現したポリペプチドやタンパク質のレベルを測定するために使用されることができる。あるいは、発現されたポリペプチドまたはタンパク質のレベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色、ウエスタンブロッティング、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、およびＵＶ吸収などの標準的な分子生物学技術により決定されることができる。リン酸化およびグリコシル化を含む、発現されたポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾をモニターすることも有益または必要であってもよい。
【０１２８】
哺乳類細胞培養を提供すること
バッチおよび流加培養によるタンパク質またはポリペプチドの生産のために哺乳類細胞を調製する種々の方法は、当該技術分野において周知である。発現に到達するのに十分な核酸（典型的に、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子および任意の作動可能に連結された遺伝子制御要素を含有するベクター）は、任意の数の周知の技術により宿主細胞株中に導入されてもよい。典型的に、細胞はスクリーニングされて、どの宿主細胞が実際にベクターを取り込み、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現するかが決定される。哺乳類細胞により発現される特定の目的のポリペプチドまたはタンパク質を検出する従来の方法は、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術、生物活性アッセイおよびアフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。当業者は、発現されたポリペプチドまたはタンパク質を検出するための他の適切な技術を知っているであろう。複数の宿主細胞が目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する場合、列挙された技術のいくつかまたは全てが使用されて、どの細胞がそのポリペプチドまたはタンパク質を最高レベルで発現するかが決定されることができる。
【０１２９】
目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞が同定されると、その細胞は、当業者に周知の様々な方法のいずれかにより培養において増殖される。目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は、典型的に、細胞の生存、増殖、および生存性を助長する温度でおよび培地においてそれを増殖させることにより増殖される。初期培養体積は、任意のサイズであることができるが、しばしば、目的のポリペプチドまたはタンパク質の最終生産において使用される生産バイオリアクターの培養体積よりも小さく、頻繁に、細胞は生産バイオリアクターに播種する前に体積が増加するバイオリアクター中で何度か継代される。細胞培養は、攪拌または振とうされ、培地の酸素化および細胞への栄養素の分散が増加されることができる。あるいはまたは加えて、当該技術分野において周知の特別な散布装置を使用して、培養の酸素化を増加および制御することができる。本発明に従って、当業者は、ｐＨ、温度、酸素化などを含むがこれらに限定されないバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有益であることができることを理解するであろう。
【０１３０】
生産バイオリアクター中の開始細胞密度は、当業者により選択されることができる。本開示に従って、生産バイオリアクター中の開始細胞密度は、培養体積ごとの単一細胞と同じくらい低くあることができる。本開示の好ましい実施形態において、生産バイオリアクター中の開始細胞密度は、１ｍＬあたり約２×１０２生細胞から１ｍＬあたり約２×１０３、２×１０４、２×１０５、２×１０６、５×１０６または１０×１０６生細胞およびそれを超える範囲であることができる。
【０１３１】
初期および中間細胞培養は、次の中間または最終生産バイオリアクターに播種する前に任意の所望の密度に増殖されてもよい。総生存性または総生存性近くが必要とされないが、播種の前に細胞のほとんどが生きたままであることが好ましい。本開示の１つの実施形態において、細胞は、例えば低スピード遠心分離により、上清から除去されてもよい。いかなる不要な代謝廃棄産物または培地構成要素をも除去するために、次のバイオリアクターに播種する前に、除去された細胞を培地を用いて洗浄することもまた望ましくてもよい。培地は、細胞が以前増殖された培地であってもよく、または本開示の実施者により選択される異なる培地または洗浄溶液であってもよい。
【０１３２】
細胞は、次いで、生産バイオリアクターに播種するための適切な密度へ希釈されてもよい。本開示の好ましい実施形態において、細胞は、生産バイオリアクター中で使用されるであろう同じ培地中へ希釈される。あるいは、細胞は、本開示の実施者の必要または所望に応じて、または細胞自体の特定の要求を満たすために、例えばそれらが生産バイオリアクターに播種する前に短期間貯蔵されるべきである場合、別の培地または溶液中へ希釈されることができる。
【０１３３】
初期増殖フェーズ
上記のように一度生産バイオリアクターが播種されると、細胞培養は、細胞培養の生存、増殖および生存性を助長する条件下で、初期増殖フェーズに維持される。正確な条件は、細胞型に応じて変わり、細胞が由来する生物、および発現されたポリペプチドまたはタンパク質の性質および特徴に応じて変わるだろう。
【０１３４】
本開示に従って、生産バイオリアクターは、ポリペプチドまたはタンパク質の大規模生産に適切ないかなる体積であることもできる。好ましい実施形態において、生産バイオリアクターの体積は、少なくとも５００リットルである。他の好ましい実施形態において、生産バイオリアクターの体積は、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００リットルまたはそれを超える体積、またはその間の任意の体積である。当業者は、本開示の実施における使用に適したバイオリアクターを知っているかまたは選択することができるだろう。生産バイオリアクターは、生産されるポリペプチドまたはタンパク質の発現または安定性に干渉しない細胞増殖および生存性を助長する任意の材料で構成されてもよい。
【０１３５】
初期増殖フェーズにおける細胞培養の温度は、細胞が生存可能のままである温度の範囲に主に基づいて選択されるだろう。例えば、初期増殖フェーズの間、ＣＨＯ細胞は、３７°Ｃでよく増殖する。一般に、ほとんどの哺乳類細胞は、約２５°Ｃから４２°Ｃの範囲内で良く増殖する。好ましくは、哺乳類細胞は、約３５°Ｃから４０°Ｃの範囲内でよく増殖する。当業者は、細胞の必要および実施者の生産要求に応じて、適切な温度または細胞を増殖させるための温度を選択することができるだろう。
【０１３６】
本開示の１つの実施形態において、初期増殖フェーズの温度は、単一の一定の温度で維持される。別の実施形態において、初期増殖フェーズの温度は、ある温度の範囲内で維持される。例えば、温度は、初期増殖フェーズの間、徐々に増加または減少されてもよい。あるいは、温度は、初期増殖フェーズの間、何度も別々の量で増加または減少されてもよい。当業者は、単一または複数の温度が使用されるべきか、および温度は徐々にまたは別々の量で調整されるべきか決定することができるだろう。
【０１３７】
細胞は、実施者の必要および細胞自体の要件に応じて、初期増殖フェーズの間、より多いまたはより少ない時間、増殖されてもよい。１つの実施形態において、細胞は、邪魔されずに増殖することが可能とされる場合に最終的に達するであろう最大生細胞密度の所与のパーセンテージの生細胞密度に到達するのに十分な期間、増殖される。例えば、細胞は、最大生細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの所望の生細胞密度に到達するのに十分な期間、増殖されてもよい。
【０１３８】
別の実施形態において、細胞は、定義された期間、増殖するのを可能にされる。例えば、細胞培養の開始濃度、細胞が増殖される温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、細胞は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれを超えて増殖されてもよい。いくつかの場合において、細胞は、１カ月間またはそれを超えて増殖するのを可能にされてもよい。細胞は、初期増殖フェーズ温度でのシードバイオリアクター中での増殖が、その接種時の生産バイオリアクター中の生細胞密度がすでに最大生細胞密度の所望のパーセンテージであるのに十分である場合、生産バイオリアクター中で０日間増殖されるであろう。本開示の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質生産要求および細胞自体の必要に応じて、初期増殖フェーズの期間を選択することができるであろう。
【０１３９】
細胞培養は、初期培養フェーズの間攪拌または振とうされて、細胞への酸素化および栄養素の分散を増加させてもよい。本開示に従って、当業者は、ｐＨ、温度、酸素化などを含むがこれらに限定されない初期増殖フェーズの間のバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有益であることができることを理解するであろう。例えば、ｐＨは、適切な量の酸または塩基を供給することにより制御されることができ、酸素化は、当該技術分野において周知である散布装置を用いて制御されることができる。
【０１４０】
培養条件をシフトさせること
本開示の教示に従って、初期増殖フェーズの終わりに、培養条件の少なくとも１つはシフトされて、第２のセットの培養条件が適用され、培養における代謝シフトが生じてもよい。阻害性代謝物、最も特に乳酸およびアンモニアの蓄積は、増殖を阻害する。例えば細胞培養の温度、ｐＨ、浸透圧または化学的誘導物質レベルにおける変化により達成される代謝シフトは、特異的グルコース消費速度に対する特異的乳酸塩生産速度の比における減少を特徴としてもよい。１つの非限定的な実施形態において、培養条件は、培養の温度をシフトさせることによりシフトされる。しかしながら、当該技術分野において既知であるように、温度をシフトさせることは、適切な代謝シフトが到達されることができる唯一のメカニズムではない。例えば、かかる代謝シフトは、ｐＨ、浸透圧、および酪酸ナトリウムレベルを含むがこれらに限定されない他の培養条件をシフトさせることにより到達されることもできる。上記のように、培養シフトのタイミングは、ポリペプチドまたはタンパク質生産要求または細胞自体の必要に基づいて、本開示の実施者により決定されるであろう。
【０１４１】
培養の温度をシフトさせる場合、温度シフトは比較的緩やかであってもよい。例えば、温度変化が完了するまでに数時間または数日かかってもよい。あるいは、温度シフトは比較的急激であってもよい。例えば、温度変化は数時間未満で完了してもよい。ポリペプチドまたはタンパク質の商業的大規模生産において標準的であるような適切な生産および制御装置を考えると、温度変化は１時間未満内で完了してさえもよい。
【０１４２】
後続の増殖フェーズにおける細胞培養の温度は、主に、細胞培養が生存可能なままであり、商業的に適切なレベルで組換えポリペプチドまたはタンパク質を発現する温度の範囲に基づいて選択されるであろう。一般に、ほとんどの哺乳類細胞は生存可能なままであり、約２５°Ｃから４２°Ｃの範囲内で商業的に適切なレベルで組換えポリペプチドまたはタンパク質を発現する。好ましくは、哺乳類細胞は生存可能なままであり、約２５°Ｃから３５°Ｃの範囲内で商業的に適切なレベルで組換えポリペプチドまたはタンパク質を発現する。当業者は、細胞の必要および実施者の生産要件に応じて、細胞を増殖させるための適切な温度（単数または複数）を選択することができるであろう。
【０１４３】
本開示の１つの実施形態において、後続の増殖フェーズの温度は、単一の一定の温度に維持される。別の実施形態において、後続の増殖フェーズの温度は、ある温度の範囲内に維持される。例えば、温度は、後続の増殖フェーズの間、徐々に増加または減少されてもよい。あるいは、温度は、後続の増殖フェーズの間、何度も別々の量で増加または減少されてもよい。当業者は、複数の別々の温度シフトがこの実施形態に包含されることを理解するであろう。例えば、温度は一度シフトされ、細胞は特定の期間この温度または温度範囲に維持され、その後、温度は再び、より高いかまたはより低い温度いずれかにシフトされてもよい。各別々のシフト後の培養の温度は一定であってもよく、または特定の温度範囲内に維持されてもよい。
【０１４４】
後続の生産フェーズ
本開示に従って、細胞培養の条件が上記のように一度シフトされると、細胞培養は、細胞培養の生存および生存性を助長し、商業的に適切なレベルでの所望のポリペプチドまたはタンパク質の発現に適切である第２のセットの培養条件下で、後続の生産フェーズの間維持される。
【０１４５】
上記のように、培養は、温度、ｐＨ、浸透圧、および酪酸ナトリウムレベルを含むがこれらに限定されないいくつかの培養条件の１つ以上をシフトさせることによりシフトされてもよい。１つの実施形態において、培養の温度がシフトされる。この実施形態によれば、後続の生産フェーズの間、培養は、初期増殖フェーズの温度または温度範囲よりも低い温度または温度範囲に維持される。例えば、後続の生産フェーズの間、ＣＨＯ細胞は、２５°Ｃから３５°Ｃの範囲内で組換えポリペプチドおよびタンパク質をよく発現する。上記のように、複数の別々の温度シフトは採用されて、組換えポリペプチドまたはタンパク質の細胞密度または生存性を増加させるか、またはその発現を増加させてもよい。
【０１４６】
本開示に従って、細胞は、所望の細胞密度または生産力価が達せられるまで、後続の生産フェーズにおいて維持されてもよい。１つの実施形態において、細胞は、組換えポリペプチドまたはタンパク質に対する力価が最大に達するまで、後続の生産フェーズにおいて維持される。他の実施形態において、培養は、実施者の生産要件または細胞自体の必要に応じて、この時点の前に採取されてもよい。例えば、細胞は、最大生細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセントの生細胞密度に到達するのに十分な期間維持されてもよい。いくつかの場合において、生細胞密度が最大に到達するのを可能にし、次いで培養を採取する前に生細胞密度があるレベルまで低下するのを可能にすることが望ましくてもよい。極端な例において、培養を採取する前に、生細胞密度がゼロに近づくかまたはゼロに達するのを可能にすることが望ましくてもよい。
【０１４７】
本開示の別の実施形態において、細胞は、後続の生産フェーズの間に、定義された期間増殖することを可能にされる。例えば、後続の増殖フェーズのスタート時の細胞培養の濃度、細胞が増殖される温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれを超えて増殖されてもよい。いくつかの場合において、細胞は、１か月間またはそれを超えて増殖することを可能にされてもよい。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質生産要件および細胞自体の必要に応じて、後続の生産フェーズの期間を選択することができるであろう。
【０１４８】
特定の場合において、後続の生産フェーズの間、細胞により枯渇または代謝された栄養素または他の培地構成要素で、細胞培養を補足することが有益または必要であってもよい。例えば、細胞培養のモニタリングの間に枯渇したことが観察された栄養素または他の培地構成要素で細胞培養を補足することは、有利である可能性がある。あるいはまたは加えて、後続の生産フェーズの前に細胞培養を補足することは、有益または必要であってもよい。非限定的な例として、ホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、またはグルコースまたは他のエネルギー源で細胞培養を補足することは、有益または必要であってもよい。
【０１４９】
これらの補足構成要素は、全て一度に細胞培養に添加されてもよく、または一連の添加において細胞培養に提供されてもよい。本開示の１つの実施形態において、補足構成要素は、比例量で複数回細胞培養に提供される。別の実施形態において、最初に特定の補足構成要素のみを提供し、後で残りの構成要素を提供することが望ましくてもよい。本開示のさらに別の実施形態において、細胞培養は、これらの補足構成要素を継続的に供給される。
【０１５０】
本開示に従って、細胞培養に添加される総体積は、所望により最小量に保たれるべきである。例えば、細胞培養に添加された補足構成要素を含有する培地または溶液の総体積は、補足構成要素を提供する前の細胞培養の体積の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％であってもよい。
【０１５１】
細胞培養は、細胞への酸素化および栄養素の分散を増加させるために、後続の生産フェーズの間、攪拌または振とうされてもよい。本発明に従って、当業者は、ｐＨ、温度、酸素化などを含むがこれらに限定されない後続の増殖フェーズの間のバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調節することが有益であることができることを理解するであろう。例えば、ｐＨは、適切な量の酸または塩基を供給することにより制御されることができ、酸素化は、当該技術分野において周知の散布装置を用いて制御されることができる。
【０１５２】
発現した目的のポリペプチドまたはタンパク質の単離
一般に、典型的には、本開示に従って発現される目的のタンパク質またはポリペプチドを単離および／または精製することが望ましいであろう。好ましい実施形態において、発現されたポリペプチドまたはタンパク質は培地中へ分泌され、ゆえに、細胞および他の固形物は、例えば精製処理における第１の工程として、遠心分離または濾過により除去されてもよい。
【０１５３】
あるいは、発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、宿主細胞の表面に結合している。この実施形態において、培地は除去され、ポリペプチドまたはタンパク質を発現している宿主細胞は、精製処理における第１の工程として、溶解される。哺乳類宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を含む、当業者に周知の任意の数の手段により到達されることができる。
【０１５４】
ポリペプチドまたはタンパク質は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、または示差溶解性、エタノール沈殿を含むがこれらに限定されない標準的な方法によりまたはタンパク質の精製に利用可能な任意の他の技術（例えば、全て参照により本明細書中に組み込まれる、Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S. J. および Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; および Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997を参照）により、単離および精製されてもよい。特に免疫アフィニティークロマトグラフィーについて、タンパク質は、該タンパク質に対して産生され、固定支持体に固定された抗体を含むアフィニティーカラムにそれを結合させることにより単離されてもよい。あるいは、インフルエンザコート配列、ポリヒスチジン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの親和性タグは、標準的な組換え技術によりタンパク質に結合され、適切なアフィニティーカラムの通過による容易な精製を可能にすることができる。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤は、精製処理の間のポリペプチドまたはタンパク質の分解を低減または排除するために、任意または全ての段階で添加されてもよい。プロテアーゼ阻害剤は、特に、発現されたポリペプチドまたはタンパク質を単離および精製するために細胞を溶解しなければならない場合に所望である。当業者は、正確な精製技術が、精製されるべきポリペプチドまたはタンパク質の特性、ポリペプチドまたはタンパク質が発現される細胞の特性、および細胞が増殖された培地の組成に応じて変化することを理解するであろう。
【実施例１】
【０１５５】
分析のための細胞培養条件および試料の調製
独自の細胞培養培地および異なるＩｇＧ抗体を発現する２つの独自の組換えＣＨＯ細胞株を、以下の実施例に記載の実験のために使用した。細胞培養培地は、化学的に定義され、完全に無血清であった。組換えＩｇＧ生産ＣＨＯ細胞を、２５０ｍＬ、１Ｌ、および３Ｌの振とうフラスコ中で懸濁培養中で維持し、３６．５°Ｃ、１５０ｒｐｍ、ＣＯ２濃度５％でのインキュベーションのためにＣＯ２シェーカーインキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ）を使用した。
【０１５６】
Ｎ−１シードおよび流加培養生産両方のための実験室規模リアクター培養（cultivation）を、５Ｌ攪拌タンクリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で行った。全ての５Ｌリアクターは、２つの４５°ピッチの３枚羽根インペラー、ｐＨおよびＤＯプローブを装備した。Ｎ−１シードにおいて、培養を、３Ｌ振とうフラスコ培養から０．４−０．８ｘ１０６細胞／ｍＬの範囲で３６．５°Ｃの温度で接種した。５Ｌバイオリアクターの初期作業体積は３Ｌであった。ｐＨを、１Ｍ炭酸ナトリウム添加およびＣＯ２ガススパージングにより７．０から７．４の範囲に制御した。インペラー攪拌を２６０ｒｐｍに設定し、通気を０．５ｍｍのドリル穴スパージャーによる純酸素スパージングにより提供した。溶存酸素を、カスケード酸素スパージングを介して５０％のレベルに維持した。消泡剤（ＥＸ−ＣＥＬＬ消泡剤、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をバイオリアクターに添加して、泡レベルを制御した。細胞密度を、毎日のオフライン測定（Ｖｉ−ｃｅｌｌ,Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりおよび／またはオンラインキャパシタンスプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を介して測定した。毎日のオフライン試料も、ｐｈＯＸ機器（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を介してｐＨ、溶存酸素、およびｐＣＯ２についてモニターし、グルコースおよび乳酸プロファイルを、Ｃｅｄｅｘ  Ｂｉｏ  ＨＴ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。
【０１５７】
細胞培養液（ＣＣＦ）採取を、一次および二次深度フィルターとしてそれぞれ１０ＳＰ０２Ａおよび９０ＺＢ０５Ａを使用する深度濾過を用いて行った。濾過の間、負荷の関数として差圧をモニターし、濾過フラックスに対する差圧の比率としてフィルター抵抗を算出した。濾過実験を、ＮＦＦＳＳソフトウェアにより制御されるＰｅｎｄｏＴＥＣＨ機器（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ,Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ,ＮＪ）を使用して実施した。特に記載されない限り、フィルターの平衡化を、逆浸透脱イオン水（ＲＯＤＩ）を使用して、６００リットル／平方メートル／時（ＬＭＨ）で＞１００Ｌ／ｍ２に達するまで実施し、その後、一次深度有効濾過面積（ＥＦＡ）に基づいて、５０ＬＭＨの一定フラックスでロードし、その後１５Ｌ／ｍ２でのＰＢＳ追跡が続く。採取された細胞培養液を、実験試験を開始する前に、−８０°Ｃまたは４°Ｃで最大３日間貯蔵した。
【０１５８】
実験室および製造規模バイオリアクターからの試料を、２５−３０μｍフィルタープレートによる流出物の遠心分離を使用して、バッチ結合、９６ウェル形式でアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＰＣＣ  ｒｅｓｉｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。プレートを、３００μＬのスラリー樹脂を９６ウェルフィルタープレート中に添加し、２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、９６ウェル廃棄物回収プレートからのフロースルーを廃棄することにより樹脂を用いて調製した。次いで、プレートを３００μｌの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，ＤＥ）を用いて平衡化し、上記のように３重に遠心分離した。濾過したＨＣＣＦ試料を≦２ｍｇ／ｍｌに調整し、２００μｌを調製したプレート上に２重にロードし、２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。これを合計４回反復した。次いで、ウェルを、上記の平衡化工程に示されるように１ＸＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いてコハク酸または酢酸緩衝液ｐＨ５．５−５．８のいずれかを用いて２回洗浄し、上記のように処理した。試料を溶出するために新鮮な廃棄物回収プレートを使用して、１９６μｌのコハク酸または酢酸溶出バッファー（ｐＨ３．０−３．８）を樹脂に添加し、２０００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより、試料を溶出した。溶出工程を、ウェルあたり合計３回の溶出について２回反復した。タンパク質濃度を、Ｌｕｎａｔｉｃ  ＵＶ／Ｖｉｓリーダー（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ  Ｌａｂｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して適切な吸光係数を使用して決定した。
【０１５９】
プロテオミクス分析のためのプロテオミクスのためにＩｇＧが枯渇したＨＣＣＦ試料について、プレートを樹脂を用いてロードし、上記のように平衡化した。ＨＣＣＦを４重にウェル中に添加し、攪拌してレジンスラリーを再懸濁し、１時間インキュベートし、次いで回収プレート中へ２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。各試料からのＩｇＧ枯渇ＨＣＣＦをプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して＞２５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、シグナル正規化に使用されるように２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ,Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ,ＵＳＡ）を用いて２０ｍｇ／ｍｌ総タンパク質の最終濃度に調整した。
【実施例２】
【０１６０】
ＬＭＷ形成および非形成バッチにわたるバイオリアクター性能の比較
モノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ａ）についての還元リスクを評価するために、２つの別個の製造キャンペーンの間に生産されたバッチからのＨＣＣＦアリコートを、低溶存酸素条件下で一晩保持し、タンパク質Ａにより精製し、そしてジスルフィド還元の存在についてキャピラリー電気泳動によりスクリーニングした（結果を表１に要約する）。試験された１１ロットのうち、９バッチのタンパク質Ａ溶出液中で還元ｍＡｂ種を検出し、２バッチ（Ｃ１Ｌ２およびＣ２Ｌ２）のみが還元を示さなかった。
【表１】
2021518115.tif 000003
【０１６１】
ジスルフィド結合還元に関連するバイオリアクタープロファイルをよりよく視覚化するために、還元を示す試料およびそうでない試料についてデータを編集した。図１Ａ−１Ｊは、時間に対してプロットされた抗体製造規模および実験室規模の実行における１２の上流パラメーターを示す。試料からのデータ±ジスルフィド結合還元を、各条件について８つの別個の実験室、パイロット、および製造規模バッチにわたって平均化した。試験された抗体のジスルフィド結合還元を実証する試料について、バイオリアクターｐＨは、７日にスタートする統計的に有意な０．０５ｐＨ単位の低下傾向を示した（図１Ａ）。グルタミン消費は、９日からおよそ２倍減少し（図１Ｂ）、アンモニウム生産はジスルフィド還元試料中でより高い傾向があり、１４日で非還元試料におけるより２．２倍高かった（図１Ｄ）。驚くべきことに、ジスルフィド還元試料中で８日から乳酸生産が低下する傾向があり、ＣＣＦ中での１４日の乳酸は非還元試料におけるよりおよそ１．５倍低かった（図１Ｃ）。ピーク生細胞密度およびパーセント細胞生存性などの他の測定されたパラメーター（図１Ｅ−１Ｊ）は、ＣＣＦ中への細胞質ゾル放出量の直接的な因子であるにもかかわらず、ＬＭＷ形成との相関を示さなかった。従って、これらのデータは、バイオリアクターの性能またはバイオリアクター代謝物レベルの標準的な測定値が、ジスルフィド結合還元を確実には同定または予測しないことを示す。
【実施例３】
【０１６２】
ジスルフィド還元および非還元試料中のＨＣＣＦのプロテオミクス分析
採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）中のジスルフィド結合還元電位に影響を及ぼしてもよい細胞培養条件をよりよく特徴付けるために、２つの培養を別個の点で採取して、モノクローナル抗体の生産に関連する平常（ＮＣ  Ｄ１４）および低生存性（ＬＶＣ  Ｄ１５）条件を比較した。ジスルフィド結合還元を、キャピラリー電気泳動により複数の貯蔵条件下で評価した。簡潔には、実験室規模、パイロット規模、および／または臨床製造規模培養からのＨＣＣＦを室温まで温め、バイオセーフティキャビネット中で滅菌濾過し、ルアーロック滅菌エアフィルターを備えた滅菌単回使用培地ボトルアセンブリに分割した。ジスルフィド結合還元について試験されるべき試料に窒素を３０−６０分間散布して溶存酸素を除去し、その後ボトルの入口および出口を密閉した。試料を、エアオーバーレイ有りまたは無しで、２−８°Ｃまたは室温のいずれかで２４時間貯蔵し、次いでタンパク質Ａ精製の前に２０ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を用いて処理した。ジスルフィド結合還元の程度を、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用したキャピラリー電気泳動により測定し、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸソフトウェアを使用して分析した。細胞生存性条件を表２に示す。
【表２】
2021518115.tif 000004
【０１６３】
これらの実験の結果を、図２Ａおよび２Ｂに示す。驚くべきことに、平常生存性での条件（ＮＣ  Ｄ１４）は、低ＤＯ２下での貯蔵後の１１．２％のみのインタクトな単量体、および空気下で貯蔵した場合に２９．５％の単量体で、室温で貯蔵した場合に有意なジスルフィド結合還元を示した（図２Ａ）。対照的に、低生存性条件（ＬＶＣ  Ｄ１５）は、室温での低ＤＯ２条件下でさえ、有意なジスルフィド結合還元を示さなかった（図２Ｂ）。これらのデータは、ピーク可変細胞密度および採取生存性などのパラメーターがジスルフィド形成を直接予測しないことを確認する。
【０１６４】
ＨＣＣＦ中のタンパク質含量における差異をよりよく理解するために、各バイオリアクター（ＮＣ  Ｄ１４、ＬＶＣ  Ｄ１５）からの試料をＩｇＧ枯渇させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオミクスにより分析した。簡潔には、ＩｇＧ枯渇ＨＣＣＦ試料を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３  ＭＷＣＯスピンコンセントレーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して＞２５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）により検証した。次いで、試料にウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）をスパイクし、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび２０ｍｇ／ｍｌ総タンパク質の最終濃度に調整した。タンパク質試料を、プロテオミクスグレードのトリプシンを用いて３７°Ｃで一晩消化し、各試料について０．８ｍｇ／ｍＬの濃度がもたらされた。試料を２．４ｍｇ／ｍＬに濃縮し、Ａｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してクロマトグラフィーで分離した。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ取得を切り替えるために、データ依存モードで動作するＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＰＬＵＳ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）上に試料を３重に注入した（１注入あたり２０μｇ）。シースガス流量４０、補助ガス流量１０、スプレー電圧３ｋＶ、キャピラリー温度２７５°Ｃ、およびＳ−Ｌｅｎｓ  ＲＦレベル６０を使用して生成されたイオン。分解能を、それぞれ調査スキャンおよびＭＳ／ＭＳ事象について７０，０００（ＡＧＣ標的３ｅ６）および１７，５００（ＡＧＣ標的１３５）に設定した。単一反復カウントを用いて使用されるときの１０秒の動的除外期間。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＣＨＯプロテオームに対してペプチド検索を行い、スペクトル分析を実施してヒットを同定した。目的の２３のタンパク質についてのピークシグナルをＢＳＡシグナルに正規化して、試料にわたる相対的発現レベルを生成した。
【０１６５】
上記の２つのバイオリアクター試料に加えて、各バイオリアクターからの１つの追加の試料もまた、比較のために分析した：培養の１０日でのＮＣからの試料（ＮＣ  Ｄ１０）および１４日でのＬＶＣからの試料（ＬＶＣ  Ｄ１４）。発現をＮＣＤ１４に正規化し、結果を図３に示す。ジスルフィド還元試料において、チオレドキシン（Ｔｒｘ）発現はＬＶＣ  Ｄ１５よりわずか８％高かった一方、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼはＮＣ  Ｄ１４中で３４％低かった。ペルオキシレドキシンおよびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの他のレダクターゼをプロテオミクススクリーニングにおける両方の試料中で検出し、還元された試料中でより高いレベルが発現された。加えて、２つの代謝酵素６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＤＧ）およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、ＮＣ  Ｄ１４対ＬＶＣ  Ｄ１５において有意により高い発現を示した（それぞれ１７６％および９９９％）。ＧＡＰＤＨもまた、ＮＣ  Ｄ１４対ＬＶＣ  Ｄ１４において有意により高かった（２６０％）。まとめると、これらのデータは、酸化ストレスの増加したレベルおよび増加したレダクターゼ活性がジスルフィド結合還元に関連することを示す。
【実施例４】
【０１６６】
ジスルフィド還元および非還元試料中のＴｒｘおよびＴｒｘＲ発現および活性の分析
実施例３に記載のプロテオミクスデータに基づいて、チオレドキシン（Ｔｒｘ）およびチオレドキシンレダクターゼ１（ＴｒｘＲ）の発現を、試料±ジスルフィド結合還元にわたってさらに分析した。ＴｒｘおよびＴｒｘＲは（主に一酸化窒素シグナル伝達の文脈内で）酸化ストレス反応に関与し、Ｔｒｘシステムは、ＨＣＣＦにおけるモノクローナル抗体減少に直接関係する。従って、２つのモノクローナル抗体からのベンチ、パイロット、および製造規模試料中のＴｒｘおよびＴｒｘＲの発現を、ウェスタンブロット分析により分析した。簡潔には、ＨＣＣＦ材料を、ＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して総タンパク質濃度について分析した。ライセートを、２０μｇ総タンパク質に正規化し、１０％またはＡｎｙＫＤ  ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で泳動し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写し、５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いてブロックし、ＴｒｘまたはＴｒｘＲに対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：１，０００希釈液を用いて、４°Ｃで一晩プローブした。次いで、ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：２０，０００希釈液を用いてプローブした。化学発光を、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＭＰシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でＣｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を使用して視覚化した。バンド密度を、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量し、ＩｇＧ４軽鎖を各ブロットについてローディング対照として使用した。
【０１６７】
図４Ａは、Ｔｒｘ発現についてのウェスタンブロットを示し、図４Ｃは、ｍＡｂ  ＡおよびｍＡｂ  Ｂ試料についてのウェスタンブロットおよびＴｒｘＲ発現を示す。相対バンド強度もまた、ＴｒｘおよびＴｒｘＲ両方について定量した（それぞれ図４Ｂおよび４Ｄ）。Ｔｒｘ（図４Ａおよび４Ｂ）について、発現は、ジスルフィド結合還元を受けなかった試料（Ｃ１Ｌ２、Ｃ２Ｌ２、実験室規模Ｄ１０、実験室規模Ｄ１４）に対して相対的なＨＣＣＦ中でジスルフィド結合還元を受けた試料中で２４３±２４％から１３３２±５３６％より高い範囲だった。ＴｒｘＲ（図４Ｃおよび４Ｄ）について、試料を含有するジスルフィド結合還元における過剰発現の大きさはＴｒｘよりも低く、発現は、非還元試料（Ｃ１Ｌ２、Ｃ２Ｌ２、実験室規模Ｄ１０、実験室規模Ｄ１４）と比較して２２９±５２％から４３０±７７％の範囲であった。しかしながら、Ｔｒｘと同様に、発現は、ＬＶＣ  Ｄ１５を除いて、ＬＭＷ形成試料中で一貫して高く、他の非還元試料と比較して３９９±５７％の発現を示した。
【０１６８】
ＨＣＣＦ中のＴｒｘＲ活性もまた、両方のモノクローナル抗体についての試料にわたって測定した。簡潔には、ＨＣＣＦ材料をＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して総タンパク質濃度について分析し、試料を５μｇ総タンパク質に正規化し、アッセイ指示書に従って、チオレドキシンレダクターゼアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して３重にアッセイした。Ａ４１２読み取りを、０−６０分の時点で行った。試料を３重に実行し、各試料ポイントについて平均±ＳＥＭを算出した。次の反応に従って、各条件について結果をプロットした：
【化１】
2021518115.tif 000005
【０１６９】
図５は、ＴｒｘＲ活性アッセイの結果を示す。全ＴｒｘＲ活性は、還元を示さなかった試料と比較して、ジスルフィド結合還元を含有する試料中で６．０±０．２から２７．０±１．１倍に増加した。しかしながら、非還元可能試料である試料ＣｌＬ２は、Ｃ２Ｌ２と比較してＴｒｘＲ活性におけるわずかな３．４±０．２倍の増加を示した。加えて、還元可能でもない試料ＬＶＣ  Ｄ１５についての活性は、試験された試料のいずれかの最も高いＴｒｘＲ活性（Ｃ２Ｌ２より２７．０±１．１倍高い）のいくつかを有した。まとめると、これらのデータは、ジスルフィド結合還元および酸化ストレス反応に関与する特定の酵素の増加した発現および活性との関連を示す。
【実施例５】
【０１７０】
ジスルフィド還元および非還元試料中のＧ６ＰＤ発現および活性の分析
ＮＡＤＰＨがＴｒｘＲおよびＴｒｘ活性についての重要な補因子であることを考え、ペントースリン酸経路における最初のＮＡＤＰＨ生成酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の発現を調べた。２つのモノクローナル抗体培養からの試料を、ウェスタンブロットにより分析し（図６Ａ）、バンド強度を、実施例４に記載の手順（Ｇ６ＰＤに対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用）に従って定量した（図６Ｂ）。いくつかの試料は、非ジスルフィド還元試料と比較しておよそ１３０％の発現を示した一方、Ｇ６ＰＤ発現およびジスルフィド結合還元の間に明確な相関関係はなかった。
【０１７１】
Ｇ６ＰＤ活性がジスルフィド還元試料中で変化されたかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡベースの試験を使用して、ＮＡＤＰＨを生成するＧ６ＰＤの能力における差異を視覚化した。簡潔には、ＨＣＣＦ材料をＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して総タンパク質濃度について分析し、試料を５ｍｇ／ｍｌ総タンパク質に正規化し、キット指示書に従ってＧ６ＰＤアッセイキットを使用してアッセイした。試料蛍光を、５４０ｎｍのλｅｘおよび５９０ｎｍのλｅｍを使用してＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｍｅｔｅｒを使用して０分および３０分に測定した。試料を３重に実行し、各試料ポイントについて平均±ＳＥＭを算出した。次の反応に従って、各条件について結果をプロットした：
【化２】
2021518115.tif 000006
【０１７２】
図７に示すように、正規化された蛍光結果（Ｃ２Ｌ２と比較して）は、Ｃ２Ｌ２についてのものよりそれらのジスルフィド還元可能試料において３．３±０．２から５．５±０．３倍の範囲のより高いＧ６ＰＤ活性を示す。他の２つの非還元可能試料、Ｃ１Ｌ２およびＬＶＣ  Ｄ１５は、Ｃ２Ｌ２に対してそれぞれ２．７±０．５および２．１±０．３の増加を示した一方、非還元可能試料中の全Ｇ６ＰＤ活性は、還元を示す試料中のものよりも低かった。Ｇ６ＰＤの増加した発現は、ジスルフィド結合還元を示す全ての試料で傾向はなかったが、これらのデータは、還元された試料中の増加したＧ６ＰＤ活性およびＬＭＷ形成の間の明確な関連を示し、これは酸化ストレスにさらされた細胞における増加したＮＡＤＰＨ生産およびレダクターゼ活性に対する潜在的な調節メカニズムを示唆する。データはまた、Ｇ６ＰＤ酵素活性が細胞培養の間のタンパク質発現とは無関係にサイトゾル中で調節されてもよいことを示唆し、これは酸化ストレスにさらされた細胞における増加したＮＡＤＰＨ生産およびレダクターゼ活性についての潜在性を提供する。酸化ストレスは、ｍＡｂ生産の間のサイトゾルおよび後続のＨＣＣＦ中の増加したレダクターゼ活性のドライバーである可能性がある一方、この仮説を確認するためにはさらなる研究が必要である。
【実施例６】
【０１７３】
ジスルフィド還元および非還元試料中のＧＡＰＤＨ発現および活性の分析
ＧＡＰＤＨは、重要な細胞ストレスセンサーであることが知られており、細胞レダクターゼシステムと相乗的に作用して、酸化的損傷を防止してもよい。核内において、ＧＡＰＤＨは細胞の代謝状態に反応して遺伝子転写を誘導することもできる。さらに重要なことに、ＧＡＰＤＨシステイン残基は、その一時的な不活性化を引き起こす過剰な過酸化物およびスーパーオキシドの存在に対して高い感受性を示す。この不活性化は解糖を停止し、Ｇ６Ｐをペントースリン酸経路中にシャトルして増加したＮＡＤＰＨ生産および後続のレダクターゼ機能を可能にする主要なメカニズムである。酸化ストレスが低い場合、ＧＡＰＤＨはＴｒｘにより十分に減少され、その活性状態に戻り、ゆえに解糖を再活性化し、レダクターゼ活性を低下させる。
【０１７４】
ジスルフィド還元および非還元試料にわたるＧＡＰＤＨ発現をさらに視覚化するために、１つのモノクローナル抗体培養からのＨＣＣＦ試料を、ウェスタンブロットにより分析し（図８Ａ）、バンド密度を、実施例４に記載の手順（ＧＡＰＤＨに対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用）に従って定量した（図８Ｂ）。ＧＡＰＤＨの過剰発現は、還元試料対非還元試料（Ｃ１Ｌ２およびＬＶＣ  Ｄ１５）において１４０±３％から２８７±２１％の範囲であった。ＬＶＣ  Ｄ１５試料は前の分析においてより高いＴｒｘおよびＴｒｘＲ発現および活性を示したが（図４）、その相対的なＧＡＰＤＨ発現プロファイルは全ての試料の中で最も低く、ジスルフィド還元を示さなかった他の試料と一致していた。
【０１７５】
ＨＣＣＦ中のＧＡＰＤＨ発現がジスルフィド結合還元リスクを予測するために使用できるかどうかをさらに試験するために、二次モノクローナル抗体の３つの別個の培養からの４つの試料（実験室規模Ｄ１０、実験室規模Ｄ１４、パイロット１およびパイロット２）を、ウェスタンブロットにより試験し（図９Ａ）、それらのバンド密度を定量した（図９Ｂ）。パイロット１およびパイロット２は、実験室規模培養と比較して非常に高いＧＡＰＤＨの発現を示した（それぞれ９９３±１７％から１８２２±５％）。ＬＳ  Ｄ１４、パイロット１、およびパイロット２からのＨＣＣＦ試料を分注し、平常および低ＤＯ２の条件下で２−８°Ｃまたは室温いずれかで２４時間貯蔵し、精製し、キャピラリー電気泳動によりインタクトな％単量体について分析した（図９Ｃ）。結果は、ウェスタンブロットにより高レベルのＧＡＰＤＨを発現する２つの試料も、有意なジスルフィド結合還元活性を示した（パイロット１について２１％のインタクトな単量体、およびパイロット２について０％のインタクトな単量体）が、非常に低いＧＡＰＤＨ発現を有する試料（ＬＳ  Ｄ１４）は、同様の貯蔵条件下でジスルフィド結合還元を示さなかったことを示した。これらのデータは、ＧＡＰＤＨ発現が複数の異なる培養試料にわたるＨＣＣＦ中のジスルフィド結合還元を予測することができることを実証する。
【０１７６】
バイオリアクター採取材料からの細胞試料中でＧＡＰＤＨ活性が変化されたかどうかを決定するために、ＫＤＡｌｅｒｔＴＭＧＡＰＤＨ活性アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットを使用した。細胞を、バイオリアクター採取材料から単離し、ペレット化し、そして凍結した。凍結された細胞を氷上で解凍し、ＰＢＳ中に再懸濁した。再懸濁された細胞ペレットをＫＤＡｌｅｒｔＴＭ溶解バッファー中に溶解し、その後ＰｉｅｒｃｅＴＭＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質を定量した。各試料についてタンパク質定量を決定し、ＫＤＡｌｅｒｔＴＭＧＡＰＤＨ活性アッセイにおいて使用するために、試料を２０μｇの総タンパク質を含有するように希釈した。活性アッセイの標準的なプロトコルに従って、試料を９６ウェルプレートに３重に移し、ＫＤＡｌｅｒｔＴＭマスターミックスを蛍光プレートリーダー中に添加した。励起波長は５６０ｎｍ、発光波長は５９０ｎｍであった。試料を、アッセイの始め（Ｔ０）および４分後（Ｔ４）に測定した。結果を、Ｔ４からＴ０を引くことにより算出した。試料の反復の平均を、後続の計算に使用した。
【０１７７】
図１０Ａは、４つの異なる条件下で培養されたｍＡｂ  Ｂについて実験室規模バイオリアクターから０、４、５、６、７、９、１０、１２、および１４日に採取された細胞からの相対的ＧＡＰＤＨ活性を示す：中心点ＤＯ２培養（対照）、バリアントＮ−１中心点ＤＯ２条件（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１）、高細胞培養ＤＯ２条件（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２）および低細胞培養ＤＯ２条件（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ３）。図１０Ｂは、同じ条件下で１０、１２、および１４日についてのタンパク質濃度に対して正規化された相対的データを示す。図１０Ｂに示すように、１０日から１４日までの各試料は、該対照ＧＡＰＤＨ試料と比較してより低いレベルのＧＡＰＤＨ活性を有した。図９Ｂは、パイロット１および２からのＨＣＣＦ試料中のＧＡＰＤＨタンパク質発現における大幅な増加を示すが、図１０Ｂは、実際のＧＡＰＤＨ活性が減少することを示す。同様に、ｑＰＣＲデータは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが、減少したＧＡＰＤＨ活性を最終的に示した試料中で増加したことを明らかにした（データは示さず）。ＧＡＰＤＨ活性における減少は、ジスルフィド還元およびＬＷＭ形成についての能力を増加させる細胞における代謝シフトと相関する。ゆえに、この活性アッセイは、バイオリアクター中でのタンパク質生産フェーズの間、ジスルフィド還元を測定することにより、ＬＷＭ形成の早期検出を可能にする。
【実施例７】
【０１７８】
バイオリアクター培養においてジスルフィド還元を予測するためのＧＡＰＤＨ発現の使用
生産細胞培養の間のＧＡＰＤＨ発現を、その時間的発現パターンを視覚化するために、いくつかの異なる培養条件下で試験した。ｍＡｂ  Ｂのための実験室規模バイオリアクターを、４つの異なる条件下で培養した：中心点ＤＯ２培養（対照）、バリアントＮ−１中心点ＤＯ２条件（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１）、高細胞培養ＤＯ２条件（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２）および低細胞培養ＤＯ２条件（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ３）。該対照およびＲｅｄｕｃｉｎｇ１バイオリアクター両方からの細胞を、ＧＡＰＤＨ発現への変化をモニターするために、０、１、４、７、および９−１４日にサンプリングした。全ＲＮＡを各バイオリアクターについての細胞ペレットから単離し、分光光度法で定量し、各反応について同じ開始テンプレート濃度に正規化し、そしてΔΔＣｔ法を使用してｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより分析した（図１１Ａ）。Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１条件の結果は、対照よりも１．３倍高くから始まる１日から相対的ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現において全体的により高い傾向を示し、９日に２．２倍より高い発現のピークまで徐々に増加し、その後１０−１４日から急激に低下した。これらの結果を検証し、追加の還元バイオリアクター条件を試験するために、対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、およびＲｅｄｕｃｉｎｇ３バイオリアクターの新しいセットからの細胞ペレットも、培養の７日および９日に分離し、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＧＡＰＤＨ発現について分析した（図１１Ｂ）。Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１条件について、ＧＡＰＤＨ発現は、９日に該対照より２．３倍より高く増加した。Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２条件について、ＧＡＰＤＨ発現は、７日に該対照より１．５倍より高く増加したが、９日に１．２倍のみより高く増加した一方、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ３条件は、９日に該対照より１．７倍より高かった。
【０１７９】
ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ分析のために使用される該対照、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２バイオリアクターの０、９、１２、および１４日、およびＲｅｄｕｃｉｎｇ３バイオリアクターについての０、９、１２、および１３日からの細胞ペレットもまた、ウェスタンブロットによりＧＡＰＤＨ発現について分析した（それぞれ図１１Ｃ、１１Ｅ、１１Ｇ、１１Ｉ）。各ブロットについての相対的バンド密度を定量およびプロットし（それぞれ図１１Ｄ、１１Ｆ、１１Ｈ、１１Ｊ）、各バンドをそのそれぞれのバイオリアクターについての０日レベルに正規化した。該対照（図１１Ｃおよび１１Ｄ）について、ＧＡＰＤＨ発現レベルは培養全体を通して一定のままであった。０日と比較したＧＡＰＤＨ発現は、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１（図１１Ｅおよび１１Ｆ）について３２５±１８％、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２（図１１Ｇおよび１１Ｈ）について２０１±１１％、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ３（図１１Ｉおよび１１Ｊ）について１７１±１６％増加し、全て１２日にピークＧＡＰＤＨ発現を有した。
【０１８０】
ジスルフィド還元についてのマーカーとしてのＧＡＰＤＨ発現の使用を検証するために、これらの４つのバイオリアクターからのＨＣＣＦをアリコートに分割し、ＤＯ２の存在下または非存在下で２−８°Ｃまたは室温で最大５日間保持し、精製された試料にキャピラリー電気泳動を実施した（図１２Ａ）。対照条件について、試験したいずれの貯蔵条件(conditon)下でも、５日にジスルフィド還元は検出されなかった。Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１−３条件について、ＤＯ２が存在する間（「ＤＯ」）、２−８°Ｃの試料中で還元は検出されなかったものの、単量体は、それぞれ、低ＤＯ２条件下（「ＮＯ  ＤＯ」）、室温で保持された各条件について１６．８、５．２、および０．１％に減少した。さらに、乳酸産生、ピルビン酸消費、または両方のパラメーターにおける増加を、４つのバイオリアクター条件全てについて同定した。乳酸のピルビン酸に対するモル比（該対照条件値に正規化）を、図１２Ｂにおける各条件についての１４日バイオリアクター実行の過程を通してプロットした。Ｒｅｄｕｃｉｎｇ１Ｒｅｄｕｃｉｎｇ２、およびＲｅｄｕｃｉｎｇ３条件は、対照と比較して、それぞれ、１４日に６０６％、１４日に１３４８％、および１３日に５３９％のｌａｃ／ｐｙｒ比における増加を示した。３つの条件全て、対照と比較して、６日から９日までの間に始まる上昇したｌａｃ／ｐｙｒをも示した。これらの増加のタイミングは、図１１におけるＧＡＰＤＨ遺伝子およびタンパク質発現プロファイルの両方のタイミングと相関する。
【０１８１】
ジスルフィド還元の全ての場合において、結果は、ＧＡＰＤＨタンパク質発現が、非還元可能試料に対して上方制御されたことを示した。非還元可能対照は、安定したＧＡＰＤＨ遺伝子およびタンパク質発現、並びに還元バイオリアクター条件と比較してより低い一貫したｌａｃ／ｐｙｒモル比を示した。ｌａｃ／ｐｙｒプロファイルにおけるこの差異は、最終的にジスルフィド還元を生じる異なるメカニズムを示していてもよい。低酸素条件が細胞質ゾル環境の還元にどのようにつながるかについての１つの説明は、低酸素誘導因子１アルファ（ＨＩＦ−１α）の活性を含む。慢性低酸素症の間、ＨＩＦ−１αは過剰な活性酸素種を生産することが示されており、ゆえに低酸素条件下でも細胞質ゾル中に酸化ストレスを誘導する。
【０１８２】
本発明は、本明細書に記載される特異的実施形態により範囲が限定されるべきではない。実際、記載されたものに加えて本発明の種々の修正が、前述の説明および付随する図面から当業者に明らかになるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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