(57)【要約】  本発明は、原核アルゴノートタンパク質に基づいた核酸検出方法およびその使用を提供する。具体的に、標的核酸分子を検出するための検出系であって、ガイドssDNA、遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）および蛍光レポーター核酸を含む検出系を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子を検出するための検出系であって、
（a） ガイドssDNA対、
（b） 遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）、および
（c） 蛍光基および消光基を持つ蛍光レポーター核酸
を含み、
ここで、前記の標的核酸分子は標的DNAである
ことを特徴とする検出系。
【請求項２】
前記のガイドssDNAの長さは14〜60 nt、好ましくは16〜40 ntであることを特徴とする請求項1に記載の検出系。
【請求項３】
前記PfAgo酵素は古細菌ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）由来のものであることを特徴とする請求項1に記載の検出系。
【請求項４】
前記標的核酸分子の異なる型に相応する突然変異部位はガイドssDNAの10、11番目に位置することを特徴とする請求項1に記載の検出系。
【請求項５】
前記の標的核酸分子（またはその増幅産物）は前記PfAgo酵素によって切断されると、二次ガイドssDNAが生成することを特徴とする請求項1に記載の検出系。
【請求項６】
前記の被験標的核酸分子の前記検出系における濃度は1 fM〜200 pM、好ましくは1〜1000 fM、より好ましくは1〜100 fM、最も好ましくは1〜20 fMであることを特徴とする請求項1に記載の検出系。
【請求項７】
前記の標的DNAは、一本鎖DNA（cDNAを含む）、二本鎖DNA、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の検出系。
【請求項８】
標的核酸分子を検出するためのキットであって、
（i） 請求項1に記載の検出系または前記検出系を調製するための試薬、および
（ii） 前記の検出系で標的核酸分子を検出する方法を記述する使用説明書
を含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
検体に標的核酸分子が存在するか検出する方法であって、
（a） 請求項1に記載の標的核酸分子を検出するための検出系を提供する工程、および
（b） 前記検出系を被験検体を所定の温度で反応させることにより、第一の反応溶液を形成させる工程、
（c） 前記第一の反応溶液に対して蛍光検出を行うことにより、蛍光信号値を得る工程
を含み、
ここで、前記第一の反応溶液から蛍光信号値が検出されると、前記検体に標的核酸分子が存在することを表すが、前記第一の反応溶液から蛍光信号値が検出されないと、前記検体に標的核酸分子が存在しないことを表す
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
二次切断による標的核酸分子の検出に基づいた試薬またはキットを製造するために使用されることを特徴とするヌクレアーゼピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野に属し、具体的に、原核アルゴノート（Argonaute）タンパク質に基づいた核酸検出方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸検出技術は分子医学診断、食品安全検出や環境監視測定などの多くの分野で幅広く使用されている。迅速で、安価でかつ高感度の核酸検出は病原体検出、遺伝子型決定、疾患経過モニタリングなどにおいて幅広く使用することができる。
【０００３】
一部の従来の核酸検出方法（qPCR、シークエンシング、サザンブロッティングなど）は既に幅広く使用されているが、まだ欠点がいくつかある。たとえば、qPCRやハイスループットシークエンシングなどには、時間がかかる、コストが高い、設計原理が複雑といった欠点がある。また、極めて微量の被験核酸に対し、本分野で満足できる検出方法はまだない。
【０００４】
現在、遺伝子編集酵素を用いた核酸検出の方法として、C2C2酵素を介する傍系切断効果を利用して標的RNAを検出するものがある。しかし、標的DNA（特に微量DNA）に対して迅速で有効な検出方法はまだない。
【０００５】
そのため、本分野では、標的DNAに対する、感度が高く、特異性が良く、ハイスループットの核酸検出方法の開発が切望されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、標的DNAに対する、感度が高く、特異性が良く、ハイスループットの核酸検出方法およびその使用を提供することである。
【０００７】
本発明の第一の側面では、標的核酸分子を検出するための検出系であって、
（a） ガイドssDNA対、
（b） 遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）、および
（c） 蛍光基および消光基を持つ蛍光レポーター核酸
を含み、
ここで、前記の標的核酸分子は標的DNAである
検出系を提供する。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前記のガイドssDNA対はセンス鎖のガイドssDNAおよびアンチセンス鎖のガイドssDNAを含む。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記のガイドssDNAは5'-リン酸化の一本鎖DNA分子である。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記のガイドssDNAの長さはn塩基で、かつn≧14である。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記のnは≦100、好ましくは≦80、より好ましくは≦60である。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記のガイドssDNAの長さは14〜60 nt、好ましくは16〜40 ntである。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記のガイドssDNAの数は一対または複数対である。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記PfAgo酵素は古細菌ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）由来のものである。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記のPfAgoは、野生型および突然変異型のPfAgoを含む。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記標的核酸分子の異なる型に相応する突然変異部位はガイドssDNAの10、11番目に位置する。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記の検出系は、さらに、（d）緩衝液を含む。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記の検出方法は、さらに、標的核酸分子を増幅させるためのプライマーを含む。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記の検出方法は、さらに、被験標的核酸分子を含む。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記の標的核酸分子（またはその増幅産物）は前記PfAgo酵素によって切断されると、二次ガイドssDNAが生成する。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記の二次ガイドssDNAは前記の蛍光レポーター核酸の配列と相補的である。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記の二次ガイドssDNAは前記の蛍光レポーター核酸の配列と相補的に結合すると、前記PfAgo酵素による前記蛍光レポーター核酸に対する切断をガイドすることで、検出可能な信号（たとえば蛍光）が発生する。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記の被験標的核酸分子の前記検出系における濃度は1〜1000コピー/μLまたは103〜1010コピー/μL、好ましくは100〜1000コピー/μL、より好ましくは1〜100コピー/μLである。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記の被験標的核酸分子の前記検出系における濃度は1 fM〜200 pM、好ましくは1〜1000 fM、より好ましくは1〜100 fM、最も好ましくは1〜20 fMである。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記遺伝子編集酵素の作用温度は87〜99℃である。
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記の検出系では、前記蛍光レポーター核酸の濃度は100〜1000 nMである。
【００２７】
もう一つの好適な例において、前記の検出系では、前記蛍光レポーター核酸と前記標的核酸分子のモル比は103：1〜108：1、好ましくは104：1〜107：1である。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前記の標的DNAは、cDNAを含む。
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記の標的DNAは、一本鎖DNA（cDNAを含む）、二本鎖DNA、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３０】
もう一つの好適な例において、前記の蛍光基および消光基はそれぞれ独立に前記蛍光レポーター核酸の5'末端、3'末端に位置する。
【００３１】
もう一つの好適な例において、前記の蛍光レポーター核酸の長さは9〜100 nt、好ましくは10〜60 nt、より好ましくは15〜40 ntである。
【００３２】
もう一つの好適な例において、前記標的核酸分子は、植物、動物、微生物、ウイルス、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるもの由来の標的核酸分子を含む。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前記の標的DNAは、人工的に合成されるDNAまたは天然に存在するDNAである。
【００３４】
もう一つの好適な例において、前記の標的DNAは、野生型または突然変異型のDNAである。
【００３５】
本発明の第二の側面では、標的核酸分子を検出するためのキットであって、
（i） 本発明の第一の側面に記載の検出系または前記検出系を調製するための試薬、および
（ii） 前記の検出系で標的核酸分子を検出する方法を記述する使用説明書
を含むキットを提供する。
【００３６】
もう一つの好適な例において、前記キットは、さらに、緩衝液を含んでもよい。
【００３７】
もう一つの好適な例において、前記のキットは、
（a） 第一の容器および前記第一の容器にあるガイドssDNA、
（b） 第二の容器および第二の容器にある酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）、ならびに
（c） 第三の容器および第三の容器にある蛍光レポーター核酸
を含む。
【００３８】
もう一つの好適な例において、前記のキットは、さらに、
（d） 第四の容器および第四の容器にある酵素で酵素切断するための緩衝液
を含む。
【００３９】
もう一つの好適な例において、前記の酵素で酵素切断するための緩衝液はMnCl2を含有する。
【００４０】
もう一つの好適な例において、前記のキットは、さらに、
（f） 第五の容器および第五の容器にある標的核酸分子を増幅させるためのプライマーまたはプライマー対、
（g） 任意に第六の容器および第六の容器にある反応を増幅させるためのポリメラーゼ、ならびに
（h） 任意に第七の容器および第七の容器にある反応を増幅させるための増幅緩衝液
を含む。
【００４１】
本発明の第三の側面では、検体に標的核酸分子が存在するか検出する方法であって、
（a） 本発明の第一の側面に記載の標的核酸分子を検出するための検出系を提供する工程、および
（b） 前記検出系を被験検体を所定の温度で反応させることにより、第一の反応溶液を形成させる工程、
（c） 前記第一の反応溶液に対して蛍光検出を行うことにより、蛍光信号値を得る工程
を含み、
ここで、前記第一の反応溶液から蛍光信号値が検出されると、前記検体に標的核酸分子が存在することを表すが、前記第一の反応溶液から蛍光信号値が検出されないと、前記検体に標的核酸分子が存在しないことを表す
方法を提供する。
【００４２】
もう一つの好適な例において、前記の被験検体は増幅されていない検体および増幅された（または核酸増幅された）検体を含む。
【００４３】
もう一つの好適な例において、前記の被験検体は増幅して得られた検体である。
【００４４】
もう一つの好適な例において、前記核酸増幅の方法は、PCR増幅、LAMP増幅、RPA増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐DNA増幅、NASBA、SDA、転写媒介増幅およびローリングサークル増幅からなる群から選ばれる。
【００４５】
もう一つの好適な例において、前記のPCRは、高温PCR、常温PCR、低温PCRを含む。
【００４６】
もう一つの好ましい例において、前記方法は、標的部位における核酸にSNP、点突然変異、欠失、および/または挿入が存在するか検出するためのものである。
【００４７】
もう一つの好ましい例において、工程（b）では、前記蛍光検出はマイクロプレートリーダーまたは蛍光分光光度計によって行われる。
【００４８】
もう一つの好適な例において、前記の方法は体外の方法である。
【００４９】
もう一つの好適な例において、前記の方法は非診断的で非治療的なものである。
【００５０】
本発明の第四の側面では、二次切断による標的核酸分子の検出に基づいた試薬またはキットを製造するためのヌクレアーゼピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノートの使用を提供する。
【００５１】
もう一つの好適な例において、前記酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノートは古細菌ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）由来のもの、あるいは同様または類似の機能を有するホモログである。
【００５２】
もう一つの好適な例において、前記のPfAgoは、野生型および突然変異型のPfAgoを含む。
【００５３】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図1は、本発明の遺伝子編集酵素の一次切断の概略図を示すが、ここで、同一のDNA鎖に対してい一対のガイドssDNAを設計し、その相応する切断部位は黒矢印で表示され、pfAgo酵素で作用されると平滑末端になる。
【図２】図2は、本発明の遺伝子編集酵素の二次切断の概略図を示すが、ここで、一次ガイドssDNAでガイドされる特異的な切断によって二次ガイドssDNAが生成する。
【図３】図3は、本発明の検出方法の工程および原理を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、核酸検出系の特異性および感度を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、核酸検出系の特異性および感度を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、核酸検出系の特異性および感度を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、核酸検出系の特異性および感度を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、核酸検出系の特異性および感度を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、核酸検出系の特異性および感度を示す。
【図４Ｇ】図４Ｇは、核酸検出系の特異性および感度を示す。
【図４Ｈ】図４Ｈは、核酸検出系の特異性および感度を示す。
【図５Ａ】図5Aは、CON1-1b-FAMレポーター核酸分子（鋳型なし）が使用された、本発明の一つの実施例における核酸検出系の多重性実験の結果を示す。
【図５Ｂ】図5Bでは、CON1-1b-FAMレポーター核酸分子（CON1-1b鋳型）が使用された、本発明の一つの実施例における核酸検出系の多重性実験の結果を示す。
【図５Ｃ】図5Cでは、CON1-1b-FAMレポーター核酸分子（JFH-1 2a鋳型）が使用された、本発明の一つの実施例における核酸検出系の多重性実験の結果を示す。
【図５Ｄ】図5Dでは、JFH-1 2a -VICレポーター核酸分子（鋳型なし）が使用され、本発明の一つの実施例における核酸検出系の多重性実験の結果を示す。
【図５Ｅ】図5Eでは、JFH-1 2a -VICレポーター核酸分子（JFH-1 2a鋳型）が使用された、本発明の一つの実施例における核酸検出系の多重性実験の結果を示す。
【図５Ｆ】図5Fでは、JFH-1 2a -VICレポーター核酸分子（CON1-1b鋳型）が使用された、本発明の一つの実施例における核酸検出系の多重性実験の結果を示す。
【図６】図６は、プラスミドを検体として行われるHPVの異なる組み合わせのサンプルに対する多重検出を示す。
【図７】図７は、臨床検体の高リスク群サブタイプHPV16/HPV18の多重検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究したところ、初めて、標的DNAに対する、検出限界が低く、感度が高く、操作が便利で、検出コストが低く、短時間で、ハイスループットの核酸検出方法を開発した。本発明の方法はPfpAgo酵素の特性を利用し、すなわち、最初に一次ガイドssDNA（guide ssDNA）を介して切断した後、適切な反応温度（たとえば約90〜98度）で、断裂した5'核酸断片は再びPfAgo酵素によってそれと相補的な蛍光レポーター核酸鎖を切断することができる。結果から、本発明の方法は、痕跡量の核酸分子に対して迅速にハイスループットで検出するのみならず、正確に検出結果を出すことができることで、病原体検出、遺伝子型決定、疾患経過モニタリングなどに役立つ。これに基づき、本発明を完成させた。
【００５６】
用語
本明細書で用いられるように、用語「本発明の検出系」、「アルゴノートタンパク質に基づいた核酸検出系」とは、本発明の第一の側面に記載の検出系をいうが、入れ替えて使用することができる。
【００５７】
本明細書で用いられるように、用語「本発明の検出方法」、「アルゴノートタンパク質に基づいた核酸検出方法」とは、本発明の第二の側面に記載の検出方法をいうが、入れ替えて使用することができる。
【００５８】
本明細書で用いられるように、用語「遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート」、「ヌクレアーゼピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート」、「PfAgo酵素」とは、本発明の第一の側面に記載の酵素をいうが、入れ替えて使用することができる。
【００５９】
本明細書で用いられるように、用語「二次切断」とは、本発明の検出方法において、一次ガイドssDNAの存在下で、本発明のAgo酵素は標的核酸配列を切断し、新たな5'リン酸化の核酸配列（二次ガイドssDNA）が生成した後、二次ガイドssDNAは続いてPfAgo酵素の作用下で、PfAgo酵素の二次ガイドssDNAと相補的な蛍光レポーター核酸に対する切断をガイドすることをいう。まず標的核酸配列に対して特異的な切断（1回目の切断）を行った後、蛍光レポーター核酸に対して特異的な切断（2回目の切断）を行うことは、「二次切断」と定義されている。本発明において、1回目の切断と2回目の切断のいずれも特異的な切断である。
【００６０】
Ago酵素
本発明の検出系および検出方法において、一つの核心成分は遺伝子編集酵素、たとえばAgo酵素である。
【００６１】
本発明において、好適なAgo酵素はPfAgo酵素で、古細菌ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）由来のもので、遺伝子の長さが2313 bpで、アミノ酸配列が770個のアミノ酸からなる。
【００６２】
PfAgo酵素の酵素切断の特性は、当該酵素がガイドssDNAとして5'リン酸化のオリゴヌクレオチドを使用して当該酵素の標的核酸配列に対する精確な切断をガイドし、切断部位がガイドssDNAの10と11番目のヌクレオチドに相応する標的核酸（ssDNA）の間のホスホジエステル結合に位置することである。
【００６３】
通常、PfAgo酵素の好適な作用温度は95±2度である。
【００６４】
ガイドssDNA対
本発明の検出系および検出方法において、一つの核心成分はガイドssDNA対である。
【００６５】
本発明において、好適なガイドssDNAはいずれも長さが14〜24 nt（たとえば16 nt）のオリゴヌクレオチドで、その5'末端の1番目のヌクレオチドがいずれもリン酸化修飾されたチミン（T）である。
【００６６】
図1に示すように、同一のDNA鎖に対する一対のガイドssDNAが標的核酸分子に結合し、その相応する切断部位は黒矢印で表示され、pfAgo酵素で作用されると平滑末端になる。
【００６７】
レポーター核酸分子
本発明の検出系および検出方法において、一つの核心成分はレポーター分子を持つレポーター核酸である。
【００６８】
好適なレポーター分子は蛍光分子または蛍光基である。一つの好適なレポーター核酸分子はそれぞれ蛍光基および消光基を持つ核酸分子である。たとえば、5'末端に蛍光基（F）で、3'末端に消光基（Q）で標識されている。図2では、長さが17 ntで、5'末端に蛍光基（F）で、3'末端に消光基（Q）で標識されている、蛍光レポーター核酸が示された。
【００６９】
本発明において、蛍光レポーター核酸は二次ガイドssDNAの生成位置によって決まり、一次ガイドssDNAによって標的核酸配列が切断され、新たな5'リン酸化の核酸配列が生成し、二次ガイドssDNAと呼ばれ、蛍光レポーター核酸が二次ガイドssDNAの相応する位置（たとえば1〜16番目の塩基）をカバーする。
【００７０】
検出系
本発明は、標的核酸分子を検出するための検出系であって、
（a） ガイドssDNA対、
（b） 遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）、および
（c） 蛍光基および消光基を持つ蛍光レポーター核酸
を含み、
ここで、前記の標的核酸分子は標的DNAである
検出系を提供する。
【００７１】
検出方法
また、本発明は、遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）に基づいた核酸検出方法を提供する。
【００７２】
わかりやすくなるように、本発明者は本発明の検出方法の原理を以下の機序を提供する。なお、本発明の保護範囲は前記原理に制限されない。
【００７３】
図2および図3を参照する。本発明の方法において、PfAgo酵素による切断活性は、標的核酸配列によって一連のガイドssDNAを設計することができ、これらのガイドssDNAは被験核酸と標的としてPfAgo酵素の標的断片に対する切断を仲介することによって新たな二次ガイドssDNAを生成させる。二次ガイドssDNAは続いてPfAgo酵素の作用下で、PfAgo酵素の二次ガイドssDNAと相補的な蛍光レポーター核酸に対する切断をガイドすることで、標的核酸に対する検出を実現させる。
【００７４】
本発明において、ガイドssDNAの設計の要求により、特殊な設計でPfAgo酵素が選択的に一部の部位で異なる核酸配列を切断するようにすることで、型別の検出を実現させることができる。
【００７５】
本発明において、異なる型を区別するために、ガイドssDNAを設計する時、異なる型に相応する突然変異部位をガイドssDNAの10、11番目の2箇所に配置し、pfAgo酵素の選択特異性のため、連続した2箇所の突然変異の場合、切断活性が抑制されることで、異なる型に対する検出を実現させることができる。
【００７６】
好適な例において、本発明は、核酸を検出するためのプライマー、ガイドssDNAおよび蛍光レポーター核酸、たとえば、それぞれ標的遺伝子PIK3CA E545K、またはHCVウイルスを検出するための2種の型、すなわち、JFH-1 2aおよびCON1-1bを提供する。
【００７７】
本発明において、PfAgo酵素の切断系に同時に複数の被験標的核酸およびガイドssDNAを入れ、異なる蛍光基を持つレポーター核酸に結合させ、標的核酸の多重検出を実現させることができる。
【００７８】
本発明の方法は痕跡量の核酸の検出に非常に適する。PCRおよび特定の配列を有するガイドssDNA対を合わせることにより、本発明はfMまで低い濃度の標的核酸を検出することができる。
【００７９】
一つの好適な例において、本発明の検出方法は、以下の工程を含む：
工程1：異なる被験標的核酸配列に対して増幅プライマー、特異的オリゴヌクレオチドのガイドssDNAおよび蛍光レポーター核酸を設計する；
工程2：被験検体を採取し、標的配列を含む核酸複合体を抽出する；
工程3：得られた被験検体を鋳型として異なる増幅プライマー対を入れて予備増幅反応を行う；
工程4：工程3の予備増幅反応系に特異的オリゴヌクレオチドのガイドssDNA、それに相応する蛍光レポーター核酸およびPfAgo酵素を入れて95度に維持しながら特異的な切断を行う；
工程5：工程4の反応系に対して定量的リアルタイムPCRによる定量分析を行う；
工程6：画像を分析した後、ベースラインのスタート値、エンド値および閾値ラインを調節し、結果を判定する。
【００８０】
本発明において、増幅反応に使用される増幅プライマーは、Tm値が通常60±3度程度で、増幅断片の大きさが約90〜120 bpである。好ましくは、増幅プライマーを設計する時、被験領域を避ける。
【００８１】
キット
また、本発明は本発明の検出方法に使用されるキットを提供する。
【００８２】
典型的に、前記のキットは、
（a） 第一の容器および前記第一の容器にあるガイドssDNA、
（b） 第二の容器および第二の容器にある遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）、ならびに
（c） 第三の容器および第三の容器にある蛍光レポーター核酸
を含む。
【００８３】
もう一つの好適な例において、前記のキットは、さらに、
（d） 第四の容器および第四の容器にある遺伝子編集酵素で酵素切断するための緩衝液
を含む。
【００８４】
もう一つの好適な例において、前記の遺伝子編集酵素で酵素切断するための緩衝液はMnCl2を含有する。
【００８５】
もう一つの好適な例において、前記のキットは、さらに、
（f） 第五の容器および第五の容器にある標的核酸分子を増幅させるためのプライマーまたはプライマー対、
（g） 任意に第六の容器および第六の容器にある反応を増幅させるためのポリメラーゼ、ならびに
（h） 任意に第七の容器および第七の容器にある反応を増幅させるための増幅緩衝液
を含む。
【００８６】
応用
本発明は、特に微量の標的核酸分子の検出、および多重検出に適し、幅広い応用性を有する。
【００８７】
本発明において、標的核酸分子はDNAでもよく、RNAでもよい。標的核酸分子がRNAである場合、逆転写によってDNAに変換させた後、検出することができる。
【００８８】
もう一つの好適な例において、前記標的核酸分子は、植物、動物、微生物、ウイルス、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるもの由来の標的核酸分子を含む。
【００８９】
もう一つの好適な例において、前記の標的DNAは、人工的に合成されるDNAまたは天然に存在するDNAである。
【００９０】
もう一つの好適な例において、前記の標的DNAは、野生型または突然変異型のDNAである。
【００９１】
本発明は、疾患のモニタリングにおいて、疾患に対して予測、予防などの能動的な管理ができ、早期発見・早期治療、または事前予測・事前予防が可能である。本発明は検出感度が非常に高いため、早期診断に適し、適切な治療が可能で、患者の治療時間を節約し、治療の成功率を向上させることができる。本発明は、高価な医療コストの浪費を減少し、そして治療のゴールデンタイミングを掴む。
【００９２】
環境のモニタリングにおいて、本発明は便利に、迅速に環境汚染物における核酸分子を正確に鑑定し、有効な環境検出データを提供することができる。
【００９３】
本発明の主な利点は以下の通りである。
【００９４】
1）  本発明に係る遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）に基づいた核酸検出方法は十分に当該酵素の特有な切断特性を発揮し、特異性の高い検出手段になっている。
【００９５】
2）  本発明に係る反応系に同時に複数の被験標的核酸および相応する一次ガイドssDNAおよび蛍光レポーター核酸を入れ、単管で多重検出を実現することができる。
【００９６】
3）  本発明に係る核酸検出方法は高い感度を有し、核酸に対する検出限界がaM〜fMレベルである。
【００９７】
4）  本発明に係る核酸検出方法は優れた特異性を有し、異なる型の核酸配列を区別することができる。
【００９８】
5）  本発明に係る核酸検出方法は操作が便利で、設計が簡単で、安価である。
【００９９】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
【０１００】
配列情報
実施例に係る3群の標的遺伝子の濃縮および増幅オリゴヌクレオチド配列を下記表に示す。
【０１０１】
【表１】
2021517469.tif 000002
【０１０２】
【表２】
2021517469.tif 000003
【実施例１】
【０１０３】
検出試薬の調製および検出方法
本実施例では、本発明の遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）に基づいた核酸検出方法に使用されるキットおよびその使用方法を提供する。
【０１０４】
1.1  検出試薬およびキット
本実施例において、PIK3CA遺伝子のE545K突然変異の検出を例として、相応する特異性標的核酸配列は
5’-CTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCTCAGTGATTTCAGAGAGAGGATCTCGTGTAGAAATTGCTTTGAGCTGTTCTTTGTCATTTTCCCT-3’で、配列番号1である。
【０１０５】
本発明の方法に基づき、相応する検出試薬は以下のものを含む。
【０１０６】
（1）  増幅プライマーのF-プライマーおよびR-プライマーは、具体的に以下の通りである。
【０１０７】
F-プライマー：5’-CTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCC-3’（配列番号2）
R-プライマー：5’-AGGGAAAATGACAAAGAACAGCTC-3’（配列番号3）
（2）  特異性ガイドssDNA対は、センス鎖のガイドssDNAおよびアンチセンス鎖のガイドssDNAを含み、具体的な配列は以下の通りである。
【０１０８】
センス鎖のガイドssDNA:5’P-TTCTCCTGCTCAGTGA-3’（配列番号4）
アンチセンス鎖のガイドssDNA:5’P-TGAAATCACTGAGCAG-3’（配列番号5）
（3）  二次ガイドssDNAに相応する蛍光レポーター核酸は、具体的な配列は以下の通りである。
【０１０９】
蛍光レポーター核酸：5’FAM（蛍光基）-CTCGTCCTCTTTCTAAA-BHQ1（消光基） 3’（配列番号6）。
【０１１０】
（4）  増幅反応酵素製剤：たとえばAceQ qPCR Probe Master Mix（Vazyme）。
【０１１１】
（5）  MnCl2溶液：10mM MnCl2溶液
1.2  検出方法
本発明の遺伝子編集酵素ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）アルゴノート（PfAgo）に基づいた核酸検出方法の概略図は図3に示すように、具体的な操作工程は以下の通りである。
【０１１２】
（1）  前記の増幅プライマーのF-プライマーおよびR-プライマーの乾燥粉末を超純水で10μMのストック液に調製した。前記のセンス鎖のガイドssDNAおよびアンチセンス鎖のガイドssDNAの乾燥粉末を超純水で100μMのストック液に調製した。前記の蛍光レポーター核酸の乾燥粉末を超純水で10μMのストック液に調製した。
【０１１３】
（2）  AceQ qPCR Probe Master Mix（2X）酵素製剤と超純水、増幅プライマーで増幅反応予混合液に調製した（増幅プライマーの最終濃度は500 nMである）。
【０１１４】
（3）  被験サンプルを増幅反応予混合液に入れ、反応系は20μLであった。
【０１１５】
（4）  増幅系をPCR装置に入れて増幅反応を行った（95度で5min予備変性、95度で15sec変性、60度で15sec伸長、30サイクル）。
【０１１６】
（5）  増幅反応終了後、工程（4）にPfAgo酵素、MnCl2、センス鎖のガイドssDNAおよびアンチセンス鎖のガイドssDNA、蛍光レポーター核酸を入れ、25μLの反応系にした（PfAgo酵素の最終濃度は200 nMで、MnCl2の最終濃度は500μMで、ガイドssDNAの最終濃度は2μMで、蛍光レポーター核酸の最終濃度は400 nMである）。
【０１１７】
（6）  工程（5）における反応系を蛍光定量PCR装置にセットして検出した（95度に30分維持し、1分間に1回蛍光信号を検出した）。
【実施例２】
【０１１８】
異なる濃度の被験核酸に対する検出
10倍希釈法の原則に沿って特異性標的核酸（配列番号1）を、それぞれ200 pM、20 pM、2 pM、200 fM、20 fM、2 fMおよび0 fMの標準母液に希釈した。異なる濃度の核酸標準母液をそれぞれ実施例1に記載の反応系に入れ、手順通りに仕込んで反応させ、そして蛍光定量PCRによって相応する蛍光基の波長における蛍光信号値を検出した。
【０１１９】
結果を図4A〜4Hに示す。ここで、図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4Gにおける標的核酸の濃度はそれぞれ0 fM、2 fM、20 fM、200 fM、2 pM、20 pM、200 pMで、図4Hは非標的核酸である（系に20 ng）。
【０１２０】
非標的核酸は正常ヒト血清から抽出される全DNAである。結果から、系に20 ngの無関係の非標的核酸を入れても、陽性の結果が出たことが示された。
【０１２１】
結果から、本発明の方法は最低でfMレベルまで標的核酸分子を検出することができることが示された。さらに、非標的核酸に対し、検出系の成分を入れても、陽性の信号が生じないため、本発明の方法は特異性が非常に高い。
【実施例３】
【０１２２】
特異性試験および多重検出
濃度が200 pMの異なる種類の標的核酸溶液を調製し、それぞれHCVウイルスの2種類の型、すなわち、JFH-1 2aおよびCON1-1bである。
【０１２３】
なお、この2種類の型の違いは、配列における連続した2箇所で異なることのみにある。
【０１２４】
多重混合検出系の調製：2対の特異性増幅プライマーを同時に検出増幅系に入れ、標的検出核酸は、（1）ブランク対照、（2）JFH-1 2a、（3）CON1-1b、（4）JFH-1 2aおよびCON1-1bの4群で検出増幅系に入れた。（図5では、それぞれ蛍光レポーター核酸の特異性が検証され、一つの反応系において互いに影響しない）
増幅反応終了後、PfAgo酵素、MnCl2、2組の特異性のssDNA、2対の異なる蛍光基を持つ蛍光レポーター核酸（JFH-1 2a型はVIC蛍光に、CON1-1b型はFAM蛍光に相応する）を同一の反応管に入れ、実施例1における反応工程に従って検出した。
【０１２５】
結果を図5A〜5Fに示す。結果から、検出標的核酸がブランク対照である場合、蛍光信号値が発生せず、検出標的核酸がJFH-1 2aである場合、VIC蛍光のみが発生し、検出標的核酸がCON1-1bである場合、FAM蛍光のみが発生し、検出標的核酸がJFH-1 2aおよびCON1-1bである場合、FAMおよびVICの2種類の蛍光が同時に発生したことが示された。よって、本発明の核酸検出方法は単管の多重検出に使用することができることが示された。
【実施例４】
【０１２６】
ヒトパピローマウイルス（HPV）における4種類のサブタイプ：HPV-6（配列番号19）、HPV-11（配列番号20）、HPV-16（配列番号21）、HPV-18（配列番号22）を選んで多重検出を行った。上記4種類の遺伝子を含むプラスミドを構築して多重実験を行った。
【０１２７】
多重検出に必要な4種類のgDNA、4種類のレポーター核酸および一対の縮重増幅プライマー（配列番号17、配列番号18）を設計した。
【０１２８】
16通りの組み合わせの鋳型DNAでPCR増幅を行った後、多重蛍光検出を行った。
【０１２９】
増幅反応終了後、PfAgo酵素、MnCl2、4種類の特異性のssDNA、4種類の異なる蛍光基を持つ蛍光レポーター核酸（HPV-6型はNED蛍光に、HPV-11型はROX蛍光に、HPV-16型はFAM蛍光に、HPV-18型はJOE蛍光に相応する）を同一の反応管に入れ、実施例1における反応工程に従って検出した。
【０１３０】
結果を図6に示す。結果から、検出標的核酸がブランク対照である場合、蛍光信号値が発生せず、検出標的核酸がその1種または複数種である場合、相応する蛍光信号が発生し、採取して検出したことが示された。よって、本発明の核酸検出方法は単管の四重検出を実現させることができることが示された。
【０１３１】
臨床HPV16/18の検体を本検出に使用して検証し、上記反応系に従って仕込み、反応させた。
【０１３２】
結果を図7に示す。結果から、当該検出系は実際の臨床検出に使用することができ、高感度、高特異性、迅速な効果を有する。
【０１３３】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2021517469.tif 000011
【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
2021517469.tif 000013
【図４Ｈ】
2021517469.tif 000014
【図５Ａ】
2021517469.tif 000015
【図５Ｂ】
2021517469.tif 000016
【図５Ｃ】
2021517469.tif 000017
【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
2021517469.tif 000019
【図５Ｆ】
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【図６】
2021517469.tif 000021
【図７】
2021517469.tif 000022
【配列表】
2021517469000001.app
【国際調査報告】
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