(57)【要約】本発明は、改良されたヒンジ領域およびＣＡＲ骨格の構築におけるその応用を提供し、前記改良されたヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内生存時間および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍浸潤能を高めることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内生存時間を延長および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞腫瘍浸潤能を高めることができるヒンジ領域であって、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１、配列番号２または配列番号３に示していることを特徴とする。
【請求項２】
請求項１に記載の前記ヒンジ領域を得る方法であって、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１ははヒトＣＤ７に由来するヒンジ構造であり、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列番号２は部位特異的変異によって配列番号４のようなアミノ酸配列をテンプレートとして改造することを特徴とする。
【請求項３】
請求項１に記載の前記ヒンジ領域を得る改造方法であって、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列配列番号３はヒトＣＤ８αアミノ酸配列に由来するヒンジ配列は２９位システインと４６位のシステインを利用して改造し、改造方法にはランダム変異および欠失が含まれ、ヒトＣＤ８αアミノ酸配列に由来するヒンジアミノ酸配列は配列番号５に示すことを特徴とする。
【請求項４】
請求項２に記載に改造方法によって得られたヒンジ配列であって、配列配列番号４は１５〜１８位と７９位で変異および／または欠失していることを特徴とする。
【請求項５】
前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は、ヒトＣＤ８αアミノ酸配列に由来するヒンジ配列から２９位のシステインと４６位のシステインを削除することを特徴とする請求項３に記載の改造方法。
【請求項６】
キメラ抗原受容体であって、請求項１に記載のヒンジ領域のアミノ酸配列配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むことを特徴とする。
【請求項７】
前記キメラ抗原受容体には抗原認識領域、膜貫通領域と細胞内シグナルドメインを含むことを特徴とする請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記キメラ抗原受容体の抗原認識領域は、抗原を発現する腫瘍細胞を認識することができ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＧＰＣ３またはｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗原分子を含むがこれらに限定されない請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
ＰＳＣＡを標的とするキメラ抗原受容体であって、抗ヒトＰＳＣＡ抗原を含む単鎖抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域と細胞内シグナルドメインを含み、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１、配列番号２または配列番号３に示すことを特徴とする。
【請求項１０】
前記抗ヒトＰＳＣＡ抗原の単鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号６、配列番号７、配列番号２６または配列番号２７に示すことを特徴とする請求項９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記膜貫通領域はＣＤ２８ＴＭまたはＣＤ８ＴＭ、前記ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列は配列番号８、前記ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列は配列番号９、前記細胞内シグナルドメインはＣＤ２８および／またはＣＤ１３３７および／またはＣＤ３、前記ＣＤ２８のアミノ酸配列は配列番号１０、前記ＣＤ１３７のアミノ酸配列は配列番号１１、前記ＣＤ３のアミノ酸配列配列番号１２に示すことを特徴する請求項９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０に示すことを特徴とする請求項９−１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
請求項６〜１２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体により調製されたベクター。
【請求項１４】
前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクターまたはプラスミドの一種であることを特徴とする請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞またはＤＣ細胞を含むがこれらに限定されないことを特徴とする請求項１３〜１４のいずれか一項に記載のベクターに感染した細胞。
【請求項１６】
腫瘍を治療するための薬物の調製における請求項１５に記載の細胞の応用。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞または組織がＰＳＣＡを発現できることを特徴とする請求項１６に記載の応用。
【請求項１８】
ＣＡＲ骨格の構築におけるヒンジ領域として請求項１に記載のヒンジ領域のアミノ酸配列の応用
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫治療分野に属し、改造されたヒンジ領域およびＣＡＲ骨格の構築におけるその応用に関し、具体的にはＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内生存時間を延長および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍浸潤能を高めることができるヒンジ領域およびＣＡＲ骨格の構築におけるその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体(chimeric  antigen  receptor，ＣＡＲ)は、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内シグナルドメインなど、ＴＣＲの機能を模倣した人工受容体である。細胞内シグナルドメインは通常、ＣＤ３ζ鎖またはＦｃＲγであるか、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）などの１つまたはその以上の共刺激分子にリンクする。腫瘍細胞表面の抗原（受容体）がキメラ抗原受容体の抗体（リガンド）に結合すると、ヒンジ領域と膜貫通領域を介して細胞内にシグナルが伝達され、細胞内シグナルドメインはシグナルを活性化シグナルに変換してエフェクター細胞を活性化し、それにより、エフェクター細胞は増殖してサイトカインを産生し、さらに腫瘍細胞を殺す。
【０００３】
近年、キメラ抗原受容体Ｔリンパ球（ＣＡＲ−Ｔ）は、腫瘍の治療、特にＣＤ１９陽性悪性腫瘍の治療において、有意な治療効果を示している。しかし、有意な治療効果のある急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）であっても、治療後に寛解を完了するまでの期間の中央値は一般に約８か月であり、多くの患者が再発するが、これは患者の生体内のＣＡＲ−Ｔ細胞の生存時間が短いことに関連している可能性がある。したがって、ＣＡＲ−Ｔの生体内持続性を向上させることは、ＣＡＲ−Ｔの治療効果にとって非常に重要である。
【０００４】
固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔの使用に関する研究もますます注目されているが、固形腫瘍に対するほとんどのＣＡＲ−Ｔ治療の効果は満足のいくものではない、その理由は２つある、１つは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内持続性が悪く、ＣＡＲ−Ｔ細胞が急速に死亡して殺傷効果に影響を与える、もう一つは、ほとんどの固形腫瘍は、代謝、免疫逃避、および組織形成における多能性でさまざまな側面で免疫系による制御と殺傷を制限しているので、ＣＡＲ−Ｔ細胞が固形腫瘍組織に浸潤することが困難になり、大きな固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ治療効果がわずかである。ＣＡＲ−Ｔの生体内生存時間を延長し、固形腫瘍組織内のＣＡＲ−Ｔ細胞の浸潤を促進することにより腫瘍を効果的に殺傷して腫瘍細胞の再発を抑制することができるが、現時点ではＣＡＲ−Ｔの生体内生存時間を延長してＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍浸潤を促進する効果的な方法がない現状である。
【０００５】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これを考慮して、本発明の目的の１つは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内生存時間を延長および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍浸潤能を高めることができるヒンジ領域を提供することである。本発明のヒンジ領域を含むＣＡＲ−Ｔの生体内生存時間がより長くなり、細胞の腫瘍浸潤能が著しく強化され、そして殺傷効果がより良い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決手段は以下のとおりである。
【０００８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内生存時間を延長および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍浸潤能を高めることができるヒンジ領域であって、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１、配列番号２と配列番号３に示すことを特徴とする。
【０００９】
前記ヒンジ領域のヌクレオチド配列は、配列番号２０、配列番号２１と配列番号３２に示す。
【００１０】
腫瘍細胞表面の抗原（受容体）がキメラ抗原受容体の抗体（リガンド）に結合すると、ヒンジ領域と膜貫通領域を介して細胞内にシグナルが伝達され、細胞内シグナルドメインはシグナルを活性化シグナルに変換してエフェクター細胞を活性化し、それにより、エフェクター細胞は増殖してサイトカインと一連の活性化反応を引き起こし、さらに腫瘍細胞を殺す。ＣＡＲ構造のヒンジ領域の再構築に関する出願者の研究により、ヒンジ領域の構造は、ＣＡＲ−Ｔの生体内持続性と腫瘍浸潤能に密接に関連していることが分かった。
【００１１】
ヒンジ領域はスペーサーまたはｈｉｎｇｅとも呼ばれ、ＣＡＲ抗原認識領域と膜貫通領域を繋いでいる。ヒンジ領域は、抗原認識を促進するために、抗原結合領域を異なる方向に向けることができるように十分に柔軟でなければならない。異なる長さのヒンジ領域は、ＣＡＲ−Ｔの安定性に異なる影響を及ぼす。出願者は、さまざまな比較の組み合わせを通じて、ヒンジ領域がＣＡＲ−Ｔの生体内持続性と腫瘍浸潤能に重要な影響を与えていることを予期せず発見した。多くのスクリーニング作業を通じて、最終的にＣＡＲ−Ｔの生体内生存時間を効果的に延長し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍浸潤を促進できるヒンジ配列の配列番号１、配列番号２と配列番号３を得た、そして、７Ｈ、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔまたは８Ｈ（ｄｃ）という名前を付けた。
【００１２】
発明者は、８Ｈ（ｄｃ）、７Ｈ、Ｇ４Ｈｉｎｇｅ、Ｇ４ＨＨ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔとＤＨの６つのヒンジ構造を設計した、その中で、７Ｈ、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔと８Ｈ（ｄｃ）のアミノ酸配列は配列番号１、配列番号２や配列番号３、ヌクレオチド配列は、配列番号２０、配列番号２１と配列番号３２、Ｇ４Ｈｉｎｇｅ、Ｇ４ＨＨ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔのアミノ酸配列は、表１に示す。
【００１３】
現在一般的に使用されているヒンジ構造Ｇ４ｈ（Ｇ４ＨＨ２Ｈ３）と８ＨのＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲ陽性率、ＣＡＲ−Ｔの生体内と生体外殺傷およびＣＡＲ−Ｔ生体内持続性および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞腫瘍浸潤能を比較すると、８Ｈ（ｄｃ）や７ＨまたはＧ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔヒンジ構造を含むＣＡＲのＣＡＲ−Ｔ生体内生存時間がより長く、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３または８Ｈヒンジを含むＣＡＲ−Ｔと比較して、７Ｈ、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔと８Ｈ（ｄｃ）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞腫瘍浸潤能が大幅に強化され、殺傷効果がより良い。
【００１４】
Ｇ４ＨＨ２Ｈ３アミノ酸配列は次のとおりである。
【００１５】
（外１）
2021517824.tif 000003
【００１６】
８Ｈヒンジアミノ酸配列は次のとおりである。
【００１７】
（外２）
2021517824.tif 000004
【００１８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存時間を延長および／または細胞腫瘍浸潤能を高めるヒンジの改造方法は、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３配列をテンプレートとして使用し、部位特異的変異によってヒンジ領域を改造することである。
【００１９】
本発明の第２の目的は、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列配列番号１または配列番号２を得るための方法を提供することであり、前記方法は、配列番号１がヒトＣＤ７のヒンジ構造に由来で、配列番号２はＰＣＲを介した部位特異的変異を使用する方法であり、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３アミノ酸配列をテンプレートとして改造し、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３アミノ酸配列は配列番号４に示すことを特徴とする。
【００２０】
さらに、上記の改造方法によってヒンジ配列Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔを獲得し、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔが１５−１８位および７９位で変異および／または欠失しているＧ４ＨＨ２Ｈ３アミノ酸配列であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の第３の目的は、前記ヒンジ領域を改造する方法を提供することである、前記ヒンジ領域のアミノ酸配列配列番号３はヒトＣＤ８αのアミノ酸配列に由来するヒンジ配列を利用して、２９位のシステインと４６位のシステインで改造を行い、改造の方法にはランダムな変異と欠失が含まれる。前記ヒトＣＤ８αアミノ酸配列に由来するヒンジアミノ酸配列は配列番号５に示す。
【００２２】
さらに、前記ヒンジ領域の配列は、ヒトＣＤ８αアミノ酸配列に由来するヒンジ配列であり、２９位のシステインと４６位のシステインが削除される。
【００２３】
本発明の第４の目的は、ヒンジ領域アミノ酸配列配列番号１、配列番号２または配列番号３を含むキメラ抗原受容体を提供することであり、ヒンジ領域は７Ｈ、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔまたは８Ｈ（ｄｃ）である。
【００２４】
さらに、キメラ抗原受容体にはまた、抗原認識領域、膜貫通領域および細胞内シグナルドメインを含む。
【００２５】
さらに、キメラ抗原受容体の抗原認識領域は、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＧＰＣ３、またはｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗原分子を含むがこれらに限定されない抗原を発現する腫瘍細胞を認識できる。
【００２６】
前記キメラ抗原受容体によって認識できる腫瘍細胞は発現する抗原には、上記の抗原分子を含むがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明の第５の目的は、ＰＳＣＡを標的とするキメラ抗原受容体を提供することであり、前記キメラ抗原受容体は抗ヒトＰＳＣＡ抗原の単鎖抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域および細胞内シグナルとメインを含む、前記ヒンジ領域は７ＨまたはＧ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔであり、そのアミノ酸配列は配列番号１、配列番号２または配列番号３に示す。
【００２８】
さらに、前記抗ヒトＰＳＣＡ抗原単鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号６、配列番号７、配列番号２６または配列番号２７に示す。
【００２９】
さらに、前記膜貫通領域はＣＤ２８ＴＭまたはＣＤ８ＴＭであり、前記ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列は配列番号８、前記ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列は配列番号９に示す。前記細胞内シグナルドメインはＣＤ２８および／またはＣＤ１３７および／またはＣＤ３であり、前記ＣＤ２８のアミノ酸配列は配列番号１０、前記ＣＤ１３７のアミノ酸配列は配列番号１１、前記ＣＤ３のアミノ酸配列は配列番号１２に示す。
【００３０】
さらに、前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０に示す。
【００３１】
前記キメラ抗原受容体によって認識できる腫瘍細胞は発現する抗原には、上記の抗原分子を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
本発明の第６の目的は、前記キメラ抗原受容体により調製されたベクターを提供することであり、前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクターまたはプラスミドのいずれであってもよい。
【００３３】
ベクターの調製方法は、具体的には以下の手順を含む。
【００３４】
１）ＰＳＣＡを標的とするキメラ抗原受容体のヌクレオチド配列を合成する；リーダーペプチド、抗ヒトＰＳＣＡ抗原を合成する単鎖抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域および細胞内シグナルドメインを含むキメラ抗原受容体を含む核酸配列を合成する；前記リーダーペプチド核酸配列は配列番号１９に示す；前記ヒンジ領域核酸配列は配列番号２０、配列番号２１または配列番号３２に示す。
【００３５】
２）キメラ抗原受容体を発現するウイルスベクターを構築：プライマーを設計する、フォワードプライマーのヌクレオチド配列は配列番号２２に示すようであり、リバースプライマーのヌクレオチド配列は配列番号２３に示すようであり、手順１）に記載のキメラ抗原受容体のヌクレオチド配列をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を実行し、ＤＮＡフラグメントを取得し、ウイルスベクターをパッケージ化して精製し、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００３６】
３）前記ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を制限酵素で二重消化し、その同時にウイルス発現ベクターｐＣＤＨ−ＣＡＧを制限酵素で消化し、そして消化後のターゲットフラグメントとウイルス発現ベクターフラグメントをＴ４リガーゼで連結し、キメラ抗原受容体を発現するウイルスベクターを得る。
【００３７】
手順１）前記キメラ抗原受容体のヌクレオチド配列は、配列番号２４、配列番号２５または配列番号３１に示す。
【００３８】
この方法で前記レンチウイルスベクターを得る、このようなレンチウイルスベクターによって形質導入された陽性細胞の発現率は高く、患者の細胞培養中で安定であり、ＣＡＲ陽性率が時間の経過とともに低下しないことである。前記レンチウイルスベクターに感染した細胞を使用し、このような細胞は、標的細胞を殺す機能を備える。
【００３９】
本発明の第７の目的は、前記ベクターに感染した細胞を提供することであり、具体的には、前記細胞にはＴ細胞、ＮＫ細胞またはＤＣ細胞を含むがこれらに限定されない。
【００４０】
本発明の第８の目的は、腫瘍を治療するための薬物の調製における前記細胞の応用を提供することである。
【００４１】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の解決手段を採用する。
【００４２】
本発明は、腫瘍を治療するための薬物の調製における細胞の応用を提供し、前記腫瘍の細胞または組織はＰＳＣＡを発現することができる。
【００４３】
本発明の第９の目的は、応用を提供し、具体的には、前記ヒンジ領域アミノ酸配列をヒンジ領域としてＣＡＲ骨格の構築における応用を提供することである。
【００４４】
前記ヒンジ領域アミノ酸配列は配列番号１、配列番号２または配列番号３に示す。
【００４５】
一部の実施例では、ヒトＣＤ８α配列に由来するヒンジ領域の改造は、２９位のシステインおよび４６位のシステインを変異させることができる。一部の実施例では、キメラ抗原受容体のヒンジ領域は、配列番号３配列における２９位および／または４６位のシステインのグリシンまたはアラニンへの変異であってもよい。
【００４６】
一部の実施例では、キメラ抗原受容体のヒンジ領域は、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３配列によって改造された配列であってもよい、例えば、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３配列を欠失するＨ２Ｈ３セグメントのアミノ酸配列のヒンジ領域を含むキメラ抗原受容体など。一部の実施例では、キメラ抗原受容体のヒンジ領域配列は、Ｈ２セグメントを欠失するＧ４ＨＨ２Ｈ３配列の配列であり、具体的な配列は表１に示しているようであり、具体的な配列は表１に示す。
【００４７】
表1：Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ヒンジ配列の改造
【００４８】
【表１】
2021517824.tif 000005
【００４９】
一部の実施例では、前記ヒンジ構造を含むキメラ抗原受容体の抗原認識領域は、ＰＳＣＡに特異的に結合できるリガンド、二重特異性抗体、ｓｃＦＶ、任意の架橋されたＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、単一ドメイン抗体、およびＨｉｓタグまたはＨＡタグがリンクされたｓｃＦＶなど、ＰＳＣＡ抗原に結合できる任意のポリペプチドであってよい。一部の実施例では、ＰＳＣＡを特異的に認識する抗体は７Ｆ５に由来する；一部の実施例では、抗原認識領域のアミノ酸配列は以下のとおりである。
【００５０】
（外３）
2021517824.tif 000006
【００５１】
（外４）
2021517824.tif 000007
【００５２】
一部の実施例では、ＰＳＣＡを特異的に認識する抗体アミノ酸配列は以下のとおりである。
【００５３】
（外５）
2021517824.tif 000008
【００５４】
一部の実施例では、ＰＳＣＡを特異的に認識する抗体アミノ酸配列は以下のとおりである。
【００５５】
（外６）
2021517824.tif 000009
【００５６】
一部の実施例では、ＰＳＣＡを特異的に認識する抗体アミノ酸配列は以下のとおりである。
【００５７】
（外７）
2021517824.tif 000010
【００５８】
一部の実施例では、本発明者によって改造されたヒンジを含むキメラ抗原受容体は第２世代のキメラ抗原受容体であり、すなわち、細胞内シグナルはＣＤ２８シグナルおよびＣＤ３シグナル、またはＣＤ１３７シグナルおよびＣＤ３シグナルであり、その配列には、以下の表２に示している配列が含まれるがこれらに限定されない、配列番号１と２のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２９と配列番号３０である。
【００５９】
表２：８Ｈ（ｄｃ）ヒンジ構造を含むＣＡＲ組み合わせ
【００６０】
【表２−１】
2021517824.tif 000011
【００６１】
【表２−２】
2021517824.tif 000012
【００６２】
本発明の有益な効果は以下のとおりである。
【００６３】
１）本発明によって提供されるヒンジ領域構造は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内生存時間を延長することができる。
【００６４】
２）本発明によって提供されるヒンジ領域構造の組み合わせのキメラ抗原受容体は、Ｔリンパ球上でより安定して発現され、腫瘍細胞を取り除くための優れた能力を有し、患者の細胞培養においてＰＳＣＡを標的とするキメラ抗原受容体の陽性率を維持できるだけでなく、ＣＡＲ−Ｔの増殖および腫瘍の殺傷能力を強化することができ、抗原陰性細胞に毒性と副作用がなく、腫瘍の標的治療に使用できる。
【００６５】
３）本発明によって提供されるヒンジ構造を含むＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍組織に浸潤する能力が強化され、固形腫瘍を効果的に殺傷することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】異なるヒンジ領域およびその構成のＣＡＲ構造図である。
【００６７】
【図２】異なるヒンジ配列を表す。
【００６８】
【図３】異なるヒンジ領域の組み合わせによるＣＡＲの発現率を示すグラフである。
【００６９】
【図４】異なるヒンジ領域の組み合わせによるＣＡＲ−Ｔ細胞ＣＡＲ平均蛍光強度検査の結果を示すグラフである。
【００７０】
【図５】異なるヒンジ領域の組み合わせによるＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲ発現安定性の検査の結果を示すグラフである。
【００７１】
【図６】異なるヒンジ領域の組み合わせによるＣＡＲ−Ｔ細胞の長期的な増殖を示すグラフである。
【００７２】
【図７】異なるヒンジ領域の組み合わせによるＣＡＲ−Ｔ細胞の体外殺傷率を示すグラフである。
【００７３】
【図８】異なるヒンジ領域の組み合わせによるＣＡＲ−ＴT細胞の体内殺傷効果を示すグラフである。
【００７４】
【図９】異なるヒンジ領域の組み合わせによるＣＡＲ−Ｔ細胞の体内殺傷後の腫瘍重量を示すグラフである。
【００７５】
【図１０】異なるヒンジ領域の組み合わせによるＣＡＲ−Ｔ細胞の体内生存および腫瘍浸潤能の研究の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
実施例は、本発明をよりよく説明するためのものであるが、本発明の内容は、実施例に限定されるものではない。したがって、当業者は、上記の発明によって実施例に対して行う本質的でない改良および調整は、依然として本発明の保護範囲に属する。
【００７７】
【実施例１】
【００７８】
ヒンジ領域の改造
ＩｇＧ４ＦＣ配列に由来するＧ４ＨＨ２Ｈ３配列をテンプレートとして使用し、部位特異的変異によってヒンジ領域を改造する。８Ｈ（ｄｃ）は、一般的に使用されているヒンジ領域の８Ｈ配列の２９位と４６位のシステインを削除することによって得られる改造された配列である。７ＨとＤＨは、それぞれヒトＣＤ７とヒトＩｇＤに由来するヒンジ領域配列である。改造結果を図１および図２に示す、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔは、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３が１５〜１７位および７９位で変異、第１８位が欠失して得られる改造された配列である。Ｇ４ＨＨ３はＨ２セグメントを削除した配列であり、Ｇ４ＨｉｎｇｅはＨ２Ｈ３セグメントを削除して改造された配列である。８Ｈ（ｄｃ）は一般的に使用されているヒンジ領域８Ｈ配列の２９位と４６位のシステインを削除することによって得られる改造された配列である。
【００７９】
【実施例２】
【００８０】
異なるヒンジ領域を含むキメラ抗原受容体ウイルスの構築
ＣＡＲ−Ｔ生体内持続性および腫瘍浸潤能に対する異なる構造のヒンジ領域の効果を検証するために、標的ＰＳＣＡのＣＡＲ−Ｔを対象として実験を行う。図１に示すように、８つの異なるヒンジ構造を持つＣＡＲを設計する。
【００８１】
１  上記で設計したヒンジ配列を含むＰＳＣＡを標的とするキメラ抗原受容体遺伝子配列の合成
【００８２】
リーダーペプチド（シグナルペプチドとも呼ばれる）（ＬＰと略称）、抗ヒトＰＳＣＡ抗原の単鎖抗体、８つの異なるヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域（ＴＭと略称）、およびＣＤ２８、ＣＤ１３７とＣＤ３細胞内シグナルドメインを含むＣＡＲ構造を合成する。
【００８３】
２  キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターの構築
【００８４】
次のプライマーを設計し、バイオテクノロジー企業で合成した。具体的なプライマーは次のとおりである。
【００８５】
プライマー1：5’-atcgctagcatggccctgccagtgaccgcc-3’、下線を付けたのはＮｈｅＩ制限酵素切断部位である。
【００８６】
プライマー1：5’-ccaggtcgacttagcgagggggcagggcctg-3’、下線を付けたのはＳａｌｌ制限酵素切断部位である。
【００８７】
次に、上記の配列をプライマーとして、上記で合成した各キメラ抗原受容体配列をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ＫＯＤ  ＦＸ  ＮＥＯ  ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO社から購入）の説明書に従って反応システムに試料を追加し、増幅産物が同定された後、ＤＮＡフラグメントは回収キット（Promega社）を使用して回収する、具体的な方法については、説明書を参照し、その回収によりキメラ抗原受容体を獲得し、回収されたＤＮＡセグメントをバイオテクノロジー会社に提出して配列を測定する。
【００８８】
キメラ抗原受容体をコードするクローン化された遺伝子配列は、制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩ(Thermo社から購入)で二重消化し、その同時にレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ−ＣＡＧ（addgene  Plasmid社から購入）を制限酵素NheIとSalIで消化し、説明書に従って酵素消化反応を行う。消化産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、アガロースゲルＤＮＡセグメント回収キットでＤＮＡセグメントを回収し、そして目的セグメントとベクターセグメントをＴ４リガーゼ（Promega社から購入）でリンクし、発現キメラ抗原受容体のレンチウイルスベクターを獲得し、Ｌｖ−ｈｉｎｇｅと呼ばれる。レンチウイルスベクターを大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換し、モノクローナル抗体を選択して１２時間培養し、プラスミド抽出キット（Invitrogen社）を使用してプラスミドを抽出する。具体的な方法については、説明書を参照してください。
【００８９】
上記の方法に従って8つのレンチウイルスベクターを構築する。
【００９０】
“scFv-8H  hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；
【００９１】
“scFv-8H(dc)hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；
【００９２】
“scFv-7H  hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；
【００９３】
“scFv-DH  hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；
【００９４】
“scFv-G4HH2H3  hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；
【００９５】
“scFv-G4HH2H3mt  hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；
【００９６】
“scFv-G4HH3  hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；
【００９７】
“scFv-G4Hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”。
【００９８】
3レンチウイルスのパッケージング
【００９９】
この実施例では、レンチウイルスのパッケージはリン酸カルシウム法を採用している、具体的な手順については、分子クローニング実験ガイド（第3版、Sambrook.J.）を参照してください。
【０１００】
4レンチウイルスの精製
【０１０１】
ウイルスの上清を50mlの遠心管に集め、遠心ろ過し、ろ液を3000r/分で10分間遠心分離し、新しい50ml遠心管に移す。ウイルス上清の量に応じて、質量分率50％のPEG6000および4M  NaClをそれぞれ加え、PEG6000の最終濃度が8.5％、NaClの最終濃度が0.3Mになるように医療用生理食塩水で容量を調整し、そして4℃の冷蔵庫に静置き、4℃で遠心分離し、上清を捨て、ウイルスを200μl  DMEM培地に再懸濁し、1.5mlEPチューブに分注し、チューブ毎に40μlを分注し、−80℃で保存した。
【０１０２】
5レンチウイルス力価の測定
【０１０３】
手順１：  ２９３Ｔ細胞にウイルスを感染させる
【０１０４】
感染前に２９３Ｔ細胞をプレーティングし、1μlの精製ウイルスを取り、医療用生理食塩水で１０倍に希釈し、各穴の細胞に1μlのポリブレン(Polybrene)溶液を加え、それぞれ２９３Ｔ細胞に加え、２４時間後に10％FBS(wt)を含むDMEM培地に交換し、72時間感染させた後、1000r/分で5分間遠心分離し、細胞を回収してゲノムを抽出する。
【０１０５】
手順２：  ゲノムの抽出
【０１０６】
ゲノム抽出キットは、Qiagenから購入する（商品番号511004）QIAamp  DNA  Blood  Mini  Kitであり、その説明書に従って操作する。
【０１０７】
手順３：  ｑＲＴ−ＰＣＲによるウイルス力価の測定
【０１０８】
反応システムは次のとおりである：Premix  Ex  TaqTM  II(2×)10μl、上流プライマー(GAG  up)1μl、下流プライマー(GAG  dn)1μl、抽出するゲノム1μl、RNase-Free  dH2O  7μl、サンプル、標準品ごとに少なくとも3つの重複穴がある。次に、次の手順に従って増幅する：95℃で30秒間事前変性、95℃で5秒間変性、60℃で30秒間変性、72℃で30秒間変性、反応後、解析ソフトウェアでデーターを解析し、標準曲線に従ってウイルス力価を計算する。
【０１０９】
【実施例３】
【０１１０】
ＣＡＲがＴリンパ球をトランスフェクトする能力の検出
１  ヒト末梢血単核球の分離
【０１１１】
採血管で約60mlの末梢血を採取し、50mlの遠心管に分注し、7.5mlのヒドロキシエチル澱粉を加えて希釈する。室温（18〜25℃）で約30min自然に沈降し、上部血漿を収集し、収集した上部血漿を遠心分離し、生理食塩水で再懸濁して沈殿し、1:1の容量比でリンパ球分離液に加え、勾配遠心する。遠心分離後、遠心管は上から下へ、第1層：血漿層、第2層：乳白色の環状リンパ球層、第３層：透明な分離液層、第４層：赤血球層に分割される。第2層の白色のリンパ球層を取り、生理食塩水で2回洗浄し、5分間遠心分離し、細胞を整理食塩水に再懸濁し、10％FBSを含むRPMI  1640完全培地を加えて培養し、ヒト末梢血単核細胞を得る。
【０１１２】
２  Ｔリンパ球にレンチウイルスベクターを感染させる
【０１１３】
新しく調製された単核細胞PBMCを、10％ウシ胎児血清を含むRPMI  1640完全培地で培養し、最初の日にPBMCの活性化を行う。3日目にレンチウイルス感染を行い、5MOIに対応するレンチウイルスベクターを加え、感染していないTリンパ球をブランク対照群として使用する。24時間後に培地を500IU/mlの組換えヒトIL-2を含むRPMI  1640完全培地に交換し、引き続き10−20日間を培養する。抗原認識領域、ヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内シグナルドメインなどのキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を取得し、改造されたヒンジ領域で  ＰＳＣＡ−ＣＡＲ−Ｇ４ＨＨ２Ｈ３、ＰＳＣＡ−ＣＡＲ−Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、ＰＳＣＡ−ＣＡＲ−Ｇ４ＨＨ３、ＰＳＣＡ−ＣＡＲ−Ｇ４Ｈｉｎｇｅ、ＰＳＣＡ−ＣＡＲ−７Ｈ、ＰＳＣＡ−ＣＡＲ−８Ｈ、ＰＳＣＡ−ＣＡＲ−８Ｈ（ｄｃ）およびＰＳＣＡ−ＣＡＲ−ＤＨと名付ける。描画時の標記を容易にするために、後述の実施例および明細書の図面において、上記のＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、Ｇ４ＨＨ３、Ｇ４Ｈｉｎｇｅ、７Ｈ、８Ｈ、８Ｈ（ｄｃ）およびＤＨと略記する。
【０１１４】
1）培養期間中、ウイルスを感染した10日間培養したT細胞を遠心分離して上清を捨て、細胞を収集する。体積分率1％のウシ胎児血清を含むPBS溶液で細胞を再懸濁し、細胞密度を１×１０６細胞/mlに調整する。収集した細胞をフローサイトメトリーに分離して、Protein-L陽性率を検出し、検出結果は、培養１０日目のＴリンパ球で発現したＣＡＲの組み合わせの陽性率を示す、同時に、フローサイトメトリーでＭＦＩ（平均蛍光強度）を分析することにより、ＣＡＲの平均蛍光強度の結果を取得できる。
【０１１５】
その結果を図３と図４に示す、図３の結果からわかるように、Ｔ細胞の表面上の改造されたヒンジ構造Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、Ｇ４ＨＨ３、Ｇ４Ｈｉｎｇ、７ＨおよびＤＨ組み合わせのＣＡＲの発現陽性率は一般的なヒンジＧ４ＨＨ２Ｈ３または８Ｈの組み合わせのＣＡＲと比較して、有意差がない。図４は、異なるヒンジ構造のＣＡＲ−Ｔ細胞の表面上のＣＡＲ発現平均蛍光強度であり、そのうち、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、７Ｈまたは８Ｈ（ｄｃ）構造のＣＡＲは、より高い平均蛍光強度をＴ細胞表面で発現できる、表面平均蛍光の強度がより高いことから、細胞表面でより多くのＣＡＲ分子が発現されていることを示す。しかし、Ｇ４ＨＨ３、Ｇ４ＨｉｎｇｅまたはＤＨ構造のＣＡＲ表面平均蛍光強度が低いである。
【０１１６】
要約すると、Ｔ細胞の表面上のＧ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、Ｇ４ＨＨ３、Ｇ４Ｈｉｎｇ、７Ｈおよび８Ｈ（ｄｃ）ヒンジ構造のＣＡＲの陽性発現率には有意差はないが、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、７Ｈおよび８Ｈ（ｄｃ）構造のＣＡＲ表面平均蛍光強度はより高く、抗原により敏感で、予想される殺菌効果を達成するために必要なＣＡＲ−Ｔデーターも低くなる。
【０１１７】
２）感染によりＣＡＲ−Ｔ細胞を獲得した５、１０および１４日目に１）の検出方法によって異なるヒンジ構造の組み合わせのＣＡＲ発現を検出し、長期培養後のＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲ発現安定性を検出する。
【０１１８】
その結果を図５に示す。ＣＡＲの長期発現の検出により、改造された構造が改造されていない構造のＧ４ＨＨ２Ｈ３および８Ｈと比較して、ＤＨヒンジ構造のＣＡＲ発現安定性が悪く、ＣＡＲ陽性率は５日後に大幅に減少し、培養時間が長くなるほど、減少は大きくなり、残りの改造されたヒンジ構造と改造されていないヒンジ構造の組み合わせのＣＡＲ安定性に有意差がなく、その中で８Ｈ（ｄｃ）のＣＡＲ発現が比較的高く、長期的発現がより安定していることがわかる。
【０１１９】
【実施例４】
【０１２０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の長期増殖能力の検出
通常の培養条件下で感染したＰＳＣＡ-ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を検出する、実施例３で得られたＣＡＲ−Ｔ細胞を実施例３の手順２の培養法を用いて１０日間培養する。ＰＳＣＡ抗原コーティング24ウェルプレートを4℃で一晩静置し、ＣＡＲ−Ｔ細胞１×１０６個/ウェルプレーティングした細胞をＰＳＣＡ抗原コーティング24ウェルプレートに入れ、抗原刺激後のＣＡＲ−Ｔ細胞の生存時間を観察する。刺激後の3日、6日、9日および12日目に細胞カウンターを使用してＣＡＲ−Ｔ細胞の数を統計し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖の倍数を計算する。その結果を図６に示す。
【０１２１】
生体内実験の経験によれば、抗原刺激は7日ごとに行い、図６の結果は、3回目の抗原刺激後にＣＡＲ−Ｔ細胞が増殖しなくなったため、3回刺激して15日後に実験を終了し、ＣＡＲ−Ｔ長期増殖倍数、長期増殖反応ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存時間を統計した。
【０１２２】
この実験は図６に示す、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、８Ｈ、７Ｈ、および８Ｈ（ｄｃ）ヒンジの組み合わせたＣＡＲ−Ｔ細胞の長期的増殖は比較的速く、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体外生存能力がより強く、ＤＨ、Ｇ４Ｈｉｎｇｅ、およびＧ４ＨＨ３の長期増殖能力が悪い。
【０１２３】
要約すると、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、７Ｈ、８Ｈ、および８Ｈ（ｄｃ）ヒンジの組み合わせたＣＡＲ−Ｔ細胞は比較的迅速に増殖し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体外生存能力がより強い。
【０１２４】
【実施例５】
【０１２５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷能力への影響
異なるヒンジ構造のＣＡＲ−Ｔの標的細胞への殺傷能力は、ACEA  xCELLigence  RTCA  MP機器によって行い、実験手順は機器取扱説明書に従って実行する。初日、標的細胞（ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞）をウェルあたりに2-5×１０４で計器の96ウェルプレートに入れ、ウェルの底に付着した腫瘍細胞を抵抗指数をデーターとして15分ごとに記録する。24時間後、事前に設計されたエフェクター細胞と標的細胞の比率で各ウェルに対応するＣＡＲ−Ｔ細胞をプレーティングし、そして15分ごとに抵抗指数を記録し、抵抗指数で付着した標的細胞の増殖または死亡状況を判断する。抵抗指数分析結果の式を使用すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞殺傷率＝ベースライン抵抗指数−リアルタイム抵抗指数である。
【０１２６】
ＨｅｌａとＲＴ４はＰＳＣＡ発現の高い腫瘍細胞であり、Ｔ２４はＰＳＣＡを発現しない陰性対照細胞である。
【０１２７】
実験結果を図7に示す、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、８Ｈおよび８Ｈ（ｄｃ）は優れた殺傷能力を有し、陰性細胞を殺傷しない、強い特異性を持つ。
【０１２８】
そして、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、８Ｈ、７Ｈおよび８Ｈ（ｄｃ）ヒンジ構造を含むＣＡＲ−Ｔ細胞を利用して生体内実験を行う。
【０１２９】
【実施例６】
【０１３０】
動物モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果の検証
動物モデルでＰＳＣＡを標的とするキメラ抗原受容体を発現するTリンパ球の抗腫瘍効果を検証するために、ヒトＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞株のマウス異種移植モデルを構築する。
【０１３１】
生体内検証で使用されるマウスはNOD.Cg  PrkdcscidII2rgtm1Sug  /  JicCrlであり、ＮＯＧマウスと呼ばれ、日本実験動物研究所（CIEA）のMamoru  Itoによって飼育され、ＣＡＲ−Ｔ生体内関連腫瘍形成実験の最も一般的な品種である。生体内検証に使用された腫瘍形成標的細胞は、予備的生体外検証に使用されたホタルルシフェラーゼを安定して発現するＰＳＣＡ陽性細胞株であるＨｅｌａ（Ｈｅｌａ−ｌｕｃ）である。
【０１３２】
予備的生体外実験によると、改造されたヒンジＧ４ＨＨ２Ｈ３、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、７Ｈ、８Ｈおよび８Ｈ（ｄｃ）構造がより優れた殺傷力および生体外生存能力を有するため、動物実験でこの５つのＣＡＲ−Ｔ細胞（一般的に使用されているＧ４ＨＨ２Ｈ３および８ＨはヒンジであるＣＡＲ−Ｔ細胞を含む）を使用してマウスの生体内腫瘍殺傷能力を検証する。治療に注射されたエフェクター細胞は、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３、７Ｈ、８Ｈ（ｄｃ）および８Ｈヒンジ構造を含むＣＡＲ−Ｔ細胞であり、対照群は生理食塩水、非感染のＰＢＭＣ細胞である。
【０１３３】
腫瘍形成後、エフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞５×１０５細胞/マウスを尾静脈に注射する。ＣＡＲ−Ｔ細胞の注射後、PerkinElmerのIVS生体内イメージングシステムによって7日ごとに画像を撮影し、腫瘍の成長状況を示した。その期間中、マウスの生存状況を毎日に観察して記録し、その結果を図８に示す。Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、７Ｈ、８Ｈ（ｄｃ）および８Ｈヒンジを含むＣＡＲ−Ｔ細胞は、生体内で腫瘍細胞に対して優れた殺傷効果を示している。さらに、実験の最後にマウスを殺し、腫瘍組織を取り出して重量をはかり、結果を図９に示す。Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔ、７Ｈおよび８Ｈ（ｄｃ）ヒンジを含むＣＡＲ−Ｔ細胞で治療するマウスの腫瘍は最も軽い、特に７Ｈと８Ｈ（ｄｃ）ヒンジの組み合わせのＣＡＲ−Ｔ細胞で治療するマウスの腫瘍は、基本的に除去された。
【０１３４】
【実施例７】
【０１３５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内生存率と腫瘍浸潤能に関する研究
ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内生存およびＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍浸潤能、ＲＴ−ＰＣＲを利用して腫瘍組織のＣＡＲ遺伝子のコピー数を検出する。
【０１３６】
1.  プライマー設計：
【０１３７】
BBZ-HF：CAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTG；
【０１３８】
BBZ-HR:TACTCCTCTCTTCGTCCTAGATTG
【０１３９】
２．  腫瘍ＲＮＡの抽出
【０１４０】
まず、乳鉢に液体窒素を加え、腫瘍組織を細かく切り、液体窒素で粉末に粉砕し、液体窒素であらかじめ冷やしておいた薬スプーンを使用して、適切な量の組織粉末を取り出し、Trizol溶液が入っているEPチューブに加え、よく混ぜ合わせる。室温で5分間放置した後、200mlのクロロホルムを加え、EPチューブにしっかりと蓋をして、15秒間激しく振盪する。遠心分離して上部の水相を新しいEPチューブに入れ、500mlのイソプロパノールを加え、やさしく転倒して混和させ、室温で放置し、10分間遠心する。上清を注意深く除去し、1mlの75％エタノールを加え、渦混合し、遠心操作を1回繰り返す。上清を捨て、室温または真空で5〜100分間乾燥させる。RNAを30ml  DEPCで処理された水に溶解し、70％エタノールに保存し、−70℃で保存する。
【０１４１】
３．ＲＴ−ＰＣＲ
【０１４２】
ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０１４３】
反応システムは次のとおりである：Forward  primer(10μM)0.5μl，Reverse  primer(10μM)0.5μl，2×SYBR  Premix  Ex  Taq  II  10μl，Template  1ul、抽出されたゲノム1μl、RNase-Free  dH2O  7μl、各サンプル、標準品は少なくとも3つの重複穴がある。次の手順に従って増幅する：95℃2分間，95℃15秒間，60℃1分間、40サイクル、反応後、解析ソフトウェアでデーターを解析し、解析結果を表３と図１０に示す。
【０１４４】
表３は、検出された異なる構造のＣＡＲ−Ｔ細胞で治療された腫瘍組織におけるＣＡＲコピー数であり、図１０は表３の結果に従って描かれたグラフである。その結果からわかるように、７Ｈ、Ｇ４ＨＨ２Ｈ３ｍｔおよび８Ｈ（ｄｃ）はヒンジ領域としてＣＡＲ−Ｔ腫瘍浸潤能を大幅に向上できる。
【０１４５】
表３：ＣＡＲ−Ｔ細胞の再注入から45日後、異なるヒンジ構造のＣＡＲ−Ｔ生体内生存時間
【０１４６】
【表３】
2021517824.tif 000013
【０１４７】
最後に、上記の実施例は、本発明の技術的解決手段を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない、本発明は、好ましい実施例を参照して詳細に説明されたが、当業者は、本発明の技術的解決手段の宗旨および範囲から逸脱しないように修正または同等の置換を行うことができ、この修正と同等の置換は本発明の特許請求範囲に含まれることを理解するものとする。
【図１】
2021517824.tif 000014
【図２】
2021517824.tif 000015
【図３】
2021517824.tif 000016
【図４】
2021517824.tif 000017
【図５】
2021517824.tif 000018
【図６】
2021517824.tif 000019
【図７】
2021517824.tif 000020
【図８】
2021517824.tif 000021
【図９】
2021517824.tif 000022
【図１０】
2021517824.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月25日(2021.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、ヒンジ領域。
【請求項２】
前記配列番号３のアミノ酸配列は、ヒトＣＤ８αアミノ酸配列に由来し、するヒンジ配列は２９位システインと４６位のシステインは、ランダム変異及び／又は欠失により修飾され、かつ、ヒトＣＤ８αアミノ酸配列は、配列番号５で示される、請求項１に記載のヒンジ領域。
【請求項３】
前記２９位のシステインと前記４６位のシステインが欠失する、請求項２に記載のヒンジ領域。
【請求項４】
配列番号３のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項５】
さらに、抗原認識領域、膜貫通領域及び細胞内シグナルドメインを含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記抗原認識領域は、腫瘍細胞により発現される抗原を認識することができ、ここで、前記抗原は、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＧＰＣ３又はｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗原分子である、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
抗ヒトＰＳＣＡ抗原の単鎖抗体、膜貫通領域及び細胞内シグナルドメインを含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記抗ヒトＰＳＣＡ抗原の単鎖抗体のは、配列番号６、配列番号７、配列番号２６又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列による、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
前記膜貫通領域はＣＤ２８ＴＭ又はＣＤ８ＴＭであり、ここで、前記ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列は配列番号８であり、前記ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列は配列番号９であり；前記細胞内シグナルドメインはＣＤ２８及び／又はＣＤ１３３７及び／又はＣＤ３であり、ここで、前記ＣＤ２８のアミノ酸配列は配列番号１０であり、前記ＣＤ１３７のアミノ酸配列は配列番号１１であり、前記ＣＤ３のアミノ酸配列配列番号１２である、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０で表される、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
請求項４〜１０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体により調製されたベクター。
【請求項１２】
前記ベクターは、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター又はプラスミドである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＤＣ細胞である、請求項１１又は１２に記載のベクターに感染した細胞。
【請求項１４】
腫瘍を治療するための、請求項１３に記載の細胞を含む、薬物。
【請求項１５】
前記腫瘍細胞又は前記腫瘍細胞を含む組織は、ＰＳＣＡを発現する、請求項１４に記載の薬物。
【請求項１６】
ＣＡＲ骨格の構築におけるヒンジ領域として請求項１に記載のヒンジ領域の使用。
【国際調査報告】
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