(57)【要約】  本発明は、組換えバイオテクノロジーの分野、特にタンパク質発現の分野に存する。本発明は一般的に、本発明の少なくとも１つの転写因子、好ましくはＭｓｎ４／２をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させることによって、真核宿主細胞、好ましくは酵母における、関心対象タンパク質（ＰＯＩ）の収量を増加させる方法に関する。本発明はさらに、ＰＯＩを製造するための組換え真核宿主細胞（ここでの宿主細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されている）、並びに、ＰＯＩを製造するための宿主細胞の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを真核宿主細胞において過剰発現させ、これにより、該転写因子をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現していない宿主細胞と比較して、関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させる工程を含む、該真核宿主細胞における前記の関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させる方法であって、該転写因子は少なくとも
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ｉ）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む、方法。
【請求項２】
ｉ）少なくとも：
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ａ１）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は
ａ２）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように宿主細胞を工学操作する工程、
ｉｉ）関心対象のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むように該宿主細胞を工学操作する工程、
ｉｉｉ）少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させ、関心対象のタンパク質を過剰発現させるに適した条件下で該宿主細胞を培養する工程、場合により
ｉｖ）細胞培養液から関心対象のタンパク質を単離する工程、及び場合により
ｖ）関心対象のタンパク質を精製する工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｉ）少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作された宿主細胞を準備する工程（ここでの宿主細胞はさらに、関心対象のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含み、ここでの転写因子は少なくとも
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ａ１）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は
ａ２）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、
ｂ）活性化ドメイン
を含む）
ｉｉ）少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させ、関心対象のタンパク質を過剰発現させるに適した条件下で該宿主細胞を培養する工程、場合により
ｉｉｉ）細胞培養液から関心対象のタンパク質を単離する工程、及び場合により
ｉｖ）関心対象のタンパク質を精製する工程、及び場合により
ｖ）関心対象のタンパク質を修飾する工程、及び場合により
ｖｉ）関心対象のタンパク質を製剤化する工程
を含む、真核宿主細胞によって関心対象の組換えタンパク質を製造する方法。
【請求項４】
前記転写因子の過剰発現が、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質ｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を増加させる、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドが、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、又は、宿主細胞のゲノムに組み込まれない、ベクター若しくはプラスミドに含有されている、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの転写因子をコードしている前記ポリヌクレオチドが、異種又は同種の転写因子をコードしている、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
異種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現が、
ｉ）異種転写因子をコードしている該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を交換若しくは修飾する工程、又は
ｉｉ）異種転写因子をコードしている該ポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをプロモーターの制御下に宿主細胞に導入する工程
によって達成される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現が、
ｉ）同種転写因子をコードしている該ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターを使用する工程、
ｉｉ）同種転写因子をコードしている該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を交換若しくは修飾する工程、又は
ｉｉｉ）同種転写因子をコードしている該ポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをプロモーターの制御下に宿主細胞に導入する工程
によって達成される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドの過剰発現が、
ｉ）前記同種転写因子の天然プロモーターを、同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドに作動可能に連結された異なるプロモーターと交換する工程、
ｉｉ）前記の異種及び／又は同種の転写因子の天然終結因子配列を、より効率的な終結因子配列と交換する工程、
ｉｉｉ）前記の異種及び／又は同種の転写因子のコード配列を、コドンの最適化されたコード配列と交換する工程（ここでのコドン最適化は、前記宿主細胞のコドン使用頻度に従って行われる）、
ｉｖ）前記同種転写因子の天然の正の調節エレメントを、より効率的な調節エレメントと交換する工程、
ｖ）前記同種転写因子の天然発現カセットに存在しない、別の正の調節エレメントを導入する工程、
ｖｉ）前記同種転写因子の天然発現カセットに通常存在する、負の調節エレメントを欠失させる工程、又は
ｖｉｉ）異種及び／又は同種の転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピー又はその組合せを導入する工程、
によって達成される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
転写因子が、配列番号１５〜２７に示されるようなアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
転写因子がさらに核局在シグナルを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記核局在シグナルが、ホモログ又はヘテロログ核局在シグナルである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記転写因子が、関心対象のタンパク質の発現のために使用されるプロモーターを刺激しない、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
真核宿主細胞が、真菌宿主細胞、好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）、コマガタエラ菌種（Komagataella）、及びシゾサッカロミケス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）からなる群より選択された酵母宿主細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
関心対象の組換えタンパク質が、酵素、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
治療用タンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを宿主細胞において過剰発現させる工程、又は過剰発現するように宿主細胞を工学操作する工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記小胞体補助タンパク質が、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一率を有するその機能的ホモログを有する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドを宿主細胞において過剰発現させる工程、又は過剰発現するように宿主細胞を工学操作する工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
ａ）第一の小胞体補助タンパク質が、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一率を有するその機能的相同体を有し、及び
ｂ）第二の小胞体補助タンパク質が、
ｉ）配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一率を有するその機能的相同体、又は
ｉｉ）配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列、又はその相同体（ここでの相同体は、配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２０％の配列同一率を有する）
を有し、及び場合により、
ｃ）第三の小胞体補助タンパク質が、
ｉ）配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一率を有するその機能的相同体
を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
１つの追加の転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを宿主細胞において過剰発現させる工程、又は過剰発現するように宿主細胞を工学操作する工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
追加の転写因子が、少なくとも：
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ｉ）配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一率を有する、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
追加の転写因子が、配列番号７４〜８２に示されるようなアミノ酸配列を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記の追加の転写因子が、関心対象のタンパク質の発現のために使用されるプロモーターを刺激しない、請求項２１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
関心対象のタンパク質を製造するための組換え真核宿主細胞であって、該宿主細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作され、該転写因子は、少なくとも
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ｉ）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む、組換え真核宿主細胞。
【請求項２６】
前記転写因子の過剰発現が、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質ｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を増加させる、請求項２５記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項２７】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドが、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、又は、宿主細胞のゲノムに組み込まれない、ベクター若しくはプラスミドに含有されている、請求項２５又は２６記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項２８】
少なくとも１つの転写因子をコードしている前記ポリヌクレオチドが、異種又同種の転写因子をコードしている、請求項２５〜２７のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項２９】
異種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現が、
（ｉ）異種転写因子をコードしている前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を交換若しくは修飾する工程、又は
ｉｉ）異種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをプロモーターの制御下に宿主細胞に導入する工程
によって達成される、請求項２８記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３０】
同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現が、
（ｉ）同種転写因子をコードしている前記ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターを使用する工程、
ｉｉ）同種転写因子をコードしている前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を交換若しくは修飾する工程、又は
ｉｉｉ）同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをプロモーターの制御下に宿主細胞に導入する工程
によって達成される、請求項２８記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドの過剰発現が、
ｉ）前記異種及び／又は同種転写因子の天然プロモーターを、同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドに作動可能に連結された異なるプロモーターと交換する工程、
ｉｉ）前記の異種及び／又は同種の転写因子の天然終結因子配列を、より効率的な終結因子配列と交換する工程、
ｉｉｉ）前記の異種及び／又は同種の転写因子のコード配列を、コドンの最適化されたコード配列と交換する工程（ここでのコドン最適化は、前記宿主細胞のコドン使用頻度に従って行われる）、
ｉｖ）前記の異種及び／又は同種転写因子の天然の正の調節エレメントを、より効率的な調節エレメントと交換する工程、
ｖ）前記の異種及び／又は同種転写因子の天然発現カセットに存在しない、別の正の調節エレメントを導入する工程、
ｖｉ）前記の異種及び／又は同種転写因子の天然発現カセットに通常存在する、負の調節エレメントを欠失させる工程、又は
ｖｉｉ）異種及び／又は同種の転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピー又はその組合せを導入する工程
によって達成される、請求項２５〜３０のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３２】
転写因子が、配列番号１５〜２７に示されるようなアミノ酸配列を含む、請求項２５〜３１のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３３】
転写因子が、核局在シグナルをさらに含む、請求項２５〜３２のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３４】
前記核局在シグナルが、ホモログ又はヘテロログ核局在シグナルである、請求項３３記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３５】
真核宿主細胞が、真菌宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞、より好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）、コマガタエラ菌種（Komagataella）、及びシゾサッカロミケス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）からなる群より選択された酵母宿主細胞である、請求項２５〜３４のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３６】
関心対象の組換えタンパク質が、酵素、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である、請求項２５〜３５のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３７】
治療用タンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項３６記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、少なくとも１つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するようにさらに工学操作されている、請求項２５〜３７のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項３９】
前記補助タンパク質が、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一率を有するその機能的ホモログを有する、請求項３８記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項４０】
前記宿主細胞が、少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドを過剰発現するようにさらに工学操作されている、請求項２５〜３７のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項４１】
ａ）第一の小胞体補助タンパク質が、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一率を有するその機能的相同体を有し、及び
ｂ）第二の小胞体補助タンパク質が、
ｉ）配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一率を有するその機能的相同体、又は
ｉｉ）配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列、又はその相同体（ここでの相同体は、配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２０％の配列同一率を有する）
を有し、及び／又は、
ｃ）第三の小胞体補助タンパク質が、
ｉ）配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一率を有するその機能的相同体
を有する、請求項４０記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、１つの追加の転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するようにさらに工学操作されている、請求項２５〜３７のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項４３】
追加の転写因子が、少なくとも：
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ｉ）配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一率を有する、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む、請求項４２記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項４４】
追加の転写因子が、配列番号７４〜８２に示されるようなアミノ酸配列を含む、請求項４２〜４３のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞。
【請求項４５】
関心対象の組換えタンパク質を製造するための、請求項２５〜４４のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月２７日に出願された欧州特許出願第１８１８０１６４．８号の優先権の恩典を主張し、その内容はこれにより、全ての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、組換えバイオテクノロジーの分野、特にタンパク質発現の分野に存する。本発明は一般的に、本発明の少なくとも１つの転写因子、好ましくはＭｓｎ４／２をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させることによって、真核宿主細胞、好ましくは酵母における、関心対象タンパク質（ＰＯＩ）の収量を増加させる方法に関する。本発明はさらに、ＰＯＩを製造するための組換え真核宿主細胞（ここでの宿主細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されている）、並びに、ＰＯＩを製造するための宿主細胞の使用に関する。
【０００３】
発明の背景
関心対象タンパク質（ＰＯＩ）の成功裡な産生は、原核細胞宿主及び真核細胞宿主のどちらを用いても成し遂げられる。最も顕著な例は、大腸菌（Escherichia coli）のような細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）又はハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）のような酵母、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のような糸状菌、又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞である。いくつかのタンパク質の収率は、高い比率で容易に達成されるが、多くの他のタンパク質は、比較的低いレベルでしか産生されない。
【０００４】
一般的に、異種タンパク質の合成は、様々なレベルで制限され得る。起こり得る制限は、転写及び翻訳、タンパク質フォールディング、及び該当する場合には分泌、ジスルフィド橋形成、及びグリコシル化、並びに、標的タンパク質の凝集及び分解である。転写は、強力なプロモーターを利用することによって、又は異種遺伝子のコピー数を増加させることによって増強させることができる。しかしながら、これらの措置は明らかにプラトーに達し、このことは、転写の下流にある他の難関が発現を制限することを示す。
【０００５】
宿主細胞における高いレベルのタンパク質収量はまた、フォールディング、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、細胞内の輸送、又は細胞からの放出のような、１つ以上の異なる工程においても制限され得る。関与する機序の多くは依然として完全に解明されておらず、宿主生物の全ゲノムのＤＮＡ配列が入手可能である場合でさえも、現在の最先端技術の知識に基づいて予測することはできない。さらに、高い収率で組換えタンパク質を産生する細胞の表現型は、低下した増殖速度、減少したバイオマス形成、及び全体的に低下した細胞適応度である場合がある。
【０００６】
当技術分野において、関心対象のタンパク質の産生を向上させるための様々な試み、例えば、タンパク質フォールディングを促進するシャペロンの過剰発現、外部からのアミノ酸の補充などが行なわれた。
【０００７】
しかしながら、宿主細胞の関心対象のタンパク質の産生能及び／又は分泌能を向上させるための方法が依然として必要である。本発明の基礎にある技術的問題は、この必要性に応じることである。
【０００８】
技術的問題の解決は、工学操作された宿主細胞などの手段、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを真核宿主細胞において過剰発現させることによって、該宿主細胞における関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させるために該手段を適用する方法、及び適用する使用の提供である。これらの手段、方法、及び使用は、本明細書において詳述され、特許請求の範囲において説明され、実施例において例証され、図面において図解されている。
【０００９】
したがって、本発明は、簡単かつ効率的で、工業的方法に使用するのに適している、宿主細胞における組換えタンパク質の収量を増加させるための新規方法及び使用を提供する。本発明はまた、この目的を達成するための宿主細胞も提供する。
【００１０】
本明細書において使用する単数形「ａ（１つの）」、「an（１つの）」及び「the（その）」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていなければ、複数のものを含み、逆もまた然りであることが注記されなければならない。したがって、例えば、「１つの宿主細胞」又は「１つの方法」への言及は、それぞれ、１つ以上のこのような宿主細胞又は方法を含み、「その方法」への言及は、当業者には公知である、修飾され得るか又は置き換えられ得る、等価な工程（複数形）及び方法（複数形）を含む。同様に、例えば、「方法（複数形）」又は「宿主細胞（複数形）」への言及は、それぞれ、「１つの宿主細胞」又は「１つの方法」を含む。
【００１１】
そうでないことが示されない限り、一連の要素の前にある「少なくとも」という用語は、一続きの中にあるあらゆる要素に言及することを理解すべきである。当業者は、単に通常の実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施態様に対する多くの均等物が分かるか、又は確かめることができるであろう。このような均等物は、本発明によって包含されるものとする。
【００１２】
「及び／又は」という用語は、本明細書において使用される場合にはいつでも、「及び」、「又は」及び「該用語によって接続された全ての要素又は任意の他の組合せの要素」の意味を含む。例えば、Ａ、Ｂ及び／又はＣは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、及びＡ＋Ｂ＋Ｃを意味する。
【００１３】
本明細書において使用する「約」又は「およそ」という用語は、所与の数値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。それはまた具体的な数字も含み、例えば、約２０は２０を含む。
【００１４】
「より少ない」、「より多い」又は「より大きい」という用語は、具体的な数字を含む。例えば、２０より少ないは、２０以下を意味し、２０より多いは、２０以上を意味する。
【００１５】
本明細書及びクレーム又は項目の全体を通して、文脈からそうではないことが必要とされなければ、「含む」という単語及び変化形、例えば「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」は、記述された整数（又は工程）又は整数群（又は工程群）を含むことを意味すると理解されるだろう。それはどのような他の整数（又は工程）又は整数群（又は工程群）も除外しない。本明細書において使用される場合、「含んでいる」という用語は、「含有している」、「から構成されている」、「含んでいる（including）」、「有している」又は「保有している」で置き換えることができ、逆もまた然りであり、例えば、「有している」という用語は、「含んでいる（comprising）」という用語で置き換えることができる。本明細書において使用する場合の「からなる」は、クレーム／項目に明記されていないあらゆる整数又は工程を除外する。本明細書において使用する場合の「本質的にからなる」は、クレーム／項目の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない、整数群又は工程群を除外しない。
【００１６】
さらに、本発明のそれぞれの実施態様を記載する際に、本明細書は、特定の工程順としての、本発明の方法及び／又はプロセスを提示してもよい。しかしながら、方法又はプロセスが、本明細書に示された特定の工程順に依拠しない範囲内で、該方法又はプロセスは、記載された特定の工程順に限定されるべきではない。当業者が認識しているであろうように、他の工程順も可能であり得る。それ故、本明細書に示された特定の工程順は、クレームに対する制限と捉えられるべきではない。さらに、本発明の方法及び／又はプロセスに向けられたクレームは、記載の順序でのそれらの工程の実施に限定されるべきではなく、当業者は、順序を変更してもよく、依然として本発明の精神及び範囲内に留まることを容易に認識することができる。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、材料、試薬、及び物質などに限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載することのみを目的とし、本発明の範囲を制限する意図はなく、本発明の範囲は、クレーム／項目によってのみ定義される。
【００１８】
上記であれ又は下記であれ、本明細書の文書全体を通して引用された全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学文献、製造業者の仕様書、説明書などを含む）はこれにより、その全体が参照により組み入れられる。本明細書のどの記述も、本発明が、先行発明のために、このような開示に先行する資格はないことを認めるためのものと捉えられるべきではない。参照により組み入れられた材料が、本明細書と矛盾するか又は一貫しないという限度になるまで、本明細書は、あらゆるこのような材料によって代用されるだろう。
【００１９】
要約
本発明者らの知見はかなり驚くべきものである。なぜなら、本発明の転写因子は、本発明まで、本発明者らの知る限りでは、真核宿主細胞、特に真菌宿主細胞における関心対象のタンパク質の収量を増加させることに関連してもたらされたことはなかったからである。
【００２０】
本発明は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを真核宿主細胞において過剰発現させ、これにより、該転写因子をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現していない宿主細胞と比較して、関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させる工程を含む、該真核宿主細胞における前記の関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させる方法を含み、該転写因子は、少なくとも、ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、ｉ）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又はｉｉ）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及びｂ）活性化ドメインを含む。
【００２１】
本発明の方法は、
ｉ）少なくとも：
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ａ１）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は
ａ２）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように宿主細胞を工学操作する工程、
ｉｉ）関心対象のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むように該宿主細胞を工学操作する工程、
ｉｉｉ）少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させ、関心対象のタンパク質を過剰発現させるに適した条件下で該宿主細胞を培養する工程、場合により
ｉｖ）細胞培養液から関心対象のタンパク質を単離する工程、及び場合により
ｖ）関心対象のタンパク質を精製する工程
を含み得る。
【００２２】
さらに、本発明は、
ｉ）少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作された宿主細胞を準備する工程
（ここでの宿主細胞はさらに、関心対象のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含み、ここでの転写因子は少なくとも：
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ａ１）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は
ａ２）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む）、
ｉｉ）少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させ、関心対象のタンパク質を過剰発現させるに適した条件下で該宿主細胞を培養する工程、場合により
ｉｉｉ）細胞培養液から関心対象のタンパク質を単離する工程、及び場合により
ｉｖ）関心対象のタンパク質を精製する工程、及び場合により
ｖ）関心対象のタンパク質を修飾する工程、及び場合により
ｖｉ）関心対象のタンパク質を製剤化する工程
を含む、真核宿主細胞によって関心対象の組換えタンパク質を製造する方法を想定する。
【００２３】
本発明の方法は、前記転写因子の過剰発現が、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質ｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を増加させることを含み得る。
【００２４】
さらに、本発明は、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドが、該宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、又は、該宿主細胞のゲノムに組み込まれない、ベクター若しくはプラスミドに含有されている、本発明の方法を含み得る。
【００２５】
本発明は、真核宿主細胞が、真菌宿主細胞、好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）（異名コマガタエラ菌種）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha（異名Ｈ．アングスタ（angusta））、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニー（Candida boidinii）、コマガタエラ菌種（Komagataella）、及びシゾサッカロミケス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）からなる群より選択された酵母宿主細胞である、本発明の方法を包含し得る。ハンゼヌラ・ポリモルファは、オガタエア属に再分類されている（Yamada et al. 1994. Biosci Biotechnol Biochem. 58(7):1245-57）。オガタエア・アングスタ（Ogataea angusta）、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）及びオガタエア・パラポリモルファ（Ogataea parapolymorpha）は、近年互いに分離された、密接に関連した種である（Kurtzman et al. 2011. Antonie Van Leeuwenhoek. 100(3):455-62）。
【００２６】
本発明は、関心対象の組換えタンパク質が酵素、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である、本発明の方法を想定し得る。
【００２７】
さらに、本発明は、少なくとも１つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを該宿主細胞において過剰発現させる工程、又は過剰発現するように該宿主細胞を工学操作する工程をさらに含む、本発明の方法を含み得る。
【００２８】
好ましくは、前記小胞体補助タンパク質は、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一率を有するその機能的ホモログを有する。
【００２９】
本発明によって考えられるのは、少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドを該宿主細胞において過剰発現させる工程、又は過剰発現するように該宿主細胞を工学操作する工程をさらに含む、本発明の方法であり得る。
【００３０】
好ましくは、第一の小胞体補助タンパク質は、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一率を有するその機能的相同体を有し、第二の小胞体補助タンパク質は、
ｉ）配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一率を有するその機能的相同体、又は
ｉｉ）配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列、又はその相同体（ここでの相同体は、配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２０％の配列同一率を有する）
を有し得る。
場合により、第三の小胞体補助タンパク質は、配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一率を有するその機能的相同体を有し得る。
【００３１】
さらに、本発明は、１つの追加の転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを該宿主細胞において過剰発現させる工程、又は過剰発現するように該宿主細胞を工学操作する工程をさらに含む、本発明の方法を含み得る。
【００３２】
好ましくは、追加の転写因子は、少なくとも：
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ｉ）配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一率を有する配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列の機能的相同体を含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む。
【００３３】
本発明はまた、関心対象のタンパク質を製造するための組換え真核宿主細胞を含み、該宿主細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作され、該転写因子は少なくとも、
ａ）ＤＮＡ結合ドメイン（これは、
ｉ）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む）、及び
ｂ）活性化ドメイン
を含む。
【００３４】
本発明によって考えられるのはまた、関心対象の組換えタンパク質を製造するための上記のような組換え真核宿主細胞の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】小規模スクリーニング培養におけるｖＨＨの分泌（力価及び収量）の改善。小規模スクリーニングでのピキア・パストリスにおけるｖＨＨの分泌を増加させる、過剰発現させた遺伝子又は遺伝子の組合せの概観。宿主細胞を工学操作してこれらの遺伝子又は遺伝子の組合せを過剰発現させるために使用された、プラスミド又はプラスミド群は、括弧内の遺伝子又は遺伝子の組合せの下に示されている。小規模スクリーニングの変化倍率の数値は、２０個以下のクローン／形質転換体の算術平均値である。
【図２】フェッドバッチバイオリアクター培養におけるｖＨＨの分泌（力価及び収量）の改善。フェッドバッチ培養におけるピキア・パストリスのｖＨＨの分泌を増加させる、過剰発現させた遺伝子又は遺伝子の組合せの概観。宿主細胞を工学操作してこれらの遺伝子又は遺伝子組合せを過剰発現させるために使用された、プラスミド又はプラスミド群は、括弧内の遺伝子又は遺伝子組合せの下に示されている。フェッドバッチ培養の変化倍率の数値は、１つの選択されたクローンのものである。
【図３】小規模スクリーニング培養におけるｓｃＦｖの分泌（力価及び収量）の改善。小規模スクリーニングでのピキア・パストリスにおけるｓｃＦｖの分泌を増加させる、過剰発現させた遺伝子又は遺伝子の組合せの概観。宿主細胞を工学操作してこれらの遺伝子又は遺伝子の組合せを過剰発現させるために使用された、プラスミド又はプラスミド群は、括弧内の遺伝子又は遺伝子の組合せの下に示されている。小規模スクリーニングの変化倍率の数値は、２０個以下のクローン／形質転換体の算術平均値である。
【図４】フェッドバッチバイオリアクター培養におけるｓｃＦｖの分泌（力価及び収量）の改善。フェッドバッチ培養におけるピキア・パストリスにおけるｓｃＦｖの分泌を増加させる、過剰発現させた遺伝子又は遺伝子の組合せの概観。宿主細胞を工学操作してこれらの遺伝子又は遺伝子の組合せを過剰発現させるために使用された、プラスミド又はプラスミド群は、括弧内の遺伝子又は遺伝子の組合せの下に示されている。フェッドバッチ培養の変化倍率の数値は、１つの選択されたクローンのものである。
【図５】フェッドバッチバイオリアクター培養における他の種に由来するＭＳＮ２／４ホモログの過剰発現による、ｓｃＦｖの分泌（力価及び収量）の改善。
【図６】由来の異なるＭｓｎ４ｐ転写因子のアラインメントの概観。タンパク質構造モチーフのジンクフィンガーは、明らかに強い保存を示し（図６のボックス）、これはサッカロマイセス・セレビシエにおいて十分に特徴付けられた転写因子のＭｓｎ４ｐ及びＭｓｎ２ｐ（ＳｃＭｓｎ４／２）のＤＮＡ結合ドメインとして知られる。
【図７−１】Ｍｓｎ４様Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸共通配列。
【図７−２】Ｍｓｎ４様Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸共通配列。
【図８】ピキア・パストリスのＭＳＮ４／２の配列アラインメント。ピキア・パストリスの完全長Ｍｓｎ４ｐと他の生物の各ホモログとの間のペアワイズな配列類似率／同一率を、エンボス・ニードルアルゴリズムを用いたグローバルペアワイズ配列アラインメントによって評価した。ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン及び他の生物の各ホモログのＤＮＡ結合ドメインについての、ペアワイズな配列類似率／同一率も調べた。
【図９】ピキア・パストリスのＫＡＲ２に対する配列同一率。配列同一率は、ＢＬＡＳＴｐを用いて評価された。
【図１０】ピキア・パストリスのＬＨＳ１に対する配列同一率。配列同一率は、ＢＬＡＳＴｐを用いて評価された。
【図１１】ピキア・パストリスのＳＩＬ１に対する配列同一率。配列同一率は、ＢＬＡＳＴｐを用いて評価された。
【図１２】ピキア・パストリスのＥＲＪ５に対する配列同一率。配列同一率は、ＢＬＡＳＴｐを用いて評価された。
【図１３】ピキア・パストリスのＨＡＣ１の配列アラインメント。ピキア・パストリスの完全長Ｈａｃ１ｐと他の生物の各ホモログとの間のペアワイズな配列類似率／同一率を、エンボス・ニードルアルゴリズムを用いたグローバルペアワイズ配列アラインメントによって評価した。ピキア・パストリスのＨａｃ１ｐのＤＮＡ結合ドメイン及び他の生物の各ホモログのＤＮＡ結合ドメインについての、ペアワイズな配列類似率／同一率も調べた。
【図１４】ＭＳＮ４／２のＤＮＡ結合ドメインの共通配列に対する配列同一率。Ｍｓｎ４ｐ／Ｍｓｎ２ｐのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の共通配列と、他の生物の各ホモログのＤＮＡ結合ドメインとの間のペアワイズな配列類似率／同一率を、エンボス・ニードルアルゴリズムを用いたグローバルペアワイズ配列アラインメントによって調べた。
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明は、関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させることが判明した、本明細書に記載のような少なくとも１つの転写因子の過剰発現という驚くべき知見に一部には基づく。特に、本発明は、本発明の少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを真核宿主細胞において過剰発現させ、これにより、該転写因子をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現していない宿主細胞と比較して、関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させる工程を含む、該真核宿主細胞における前記の関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させる方法を含む。
【００３７】
「宿主細胞における関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させること」という用語は、同じ培養条件下で同じ関心対象タンパク質（ＰＯＩ）を発現しているが、転写因子をコードしているポリヌクレオチドが過剰発現されていないか、又は転写因子をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現させるように工学操作されていない、同細胞と比較して、関心対象のタンパク質の収量が増加することを意味する。
【００３８】
この文脈における「収量」という用語は、例えば工学操作された宿主細胞から収集される、本明細書に記載のような関心対象タンパク質又はモデルタンパク質（群）、特にｓｃＦｖ、すなわち一本鎖可変断片（配列番号１３）及びｖＨＨ（又はＶＨＨＶ）、単一ドメイン抗体断片（配列番号１４）の量をそれぞれ指し、増加した収量は、宿主細胞内で増加した産生量、又は宿主細胞による増加した関心対象タンパク質の分泌に起因し得る。「収量」という用語はまた、細胞１つあたりの本明細書に記載のような関心対象タンパク質又はモデルタンパク質（群）の量を指し、宿主細胞のバイオマス１ｇあたりの関心対象タンパク質のmg（乾燥細胞重量又は湿潤細胞重量として測定される）によって提示され得る。本明細書において使用される場合の「力価」という用語は同様に、培養上清又は全細胞ブロス１Ｌあたりの関心対象タンパク質のmgとして提示される、産生された関心対象タンパク質又はモデルタンパク質の量を指す。本発明はまた、本発明の転写因子が真核宿主細胞において過剰発現されている、関心対象の組換えタンパク質の力価を増加させる方法を含み得る。工学操作された宿主細胞から得られた収量を、工学操作前の宿主細胞から、すなわち、工学操作されていない宿主細胞から得られた収量と比較すると、収量の増加を決定することができる。好ましくは、本明細書に記載のようなモデルタンパク質の文脈で本明細書において使用される場合の「収量」は、実施例３、４、及び５に記載のように決定される。例えば、「収量」という用語は、浸漬培養全期間中に一定量のバイオマスによって産生される、関心対象タンパク質の量を指し得る。その中に組換え関心対象タンパク質は、細胞内で産生及び蓄積され得るか、又は培養上清に分泌され得る。「宿主細胞内の関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させること」という用語は、細胞内で若しくは細胞によって産生される関心対象タンパク質の量を増加させること、及び／又は、細胞から分泌される関心対象タンパク質の量を増加させることを指す。
【００３９】
当業者によって認識されているであろうように、本発明の転写因子の過剰発現は、関心対象タンパク質、特に組換え関心対象タンパク質の収量を増加させるだけでなく、力価も増加させることが示された。
【００４０】
本明細書において使用する「関心対象タンパク質」（ＰＯＩ）という用語は一般的に、あらゆるタンパク質に関するが、好ましくは「異種タンパク質」又は「組換えタンパク質」、好ましくはモデルタンパク質ｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）に関する。本発明の関心対象タンパク質の具体例は、本明細書の何処か他に示されている。本明細書において使用する「組換え」は、ヒトの介入による遺伝子材料の改変を指す。典型的には、組換えは、クローニング及び組換えをはじめとする、分子生物学的（組換えＤＮＡ技術）方法による、ウイルス、細胞、プラスミド、又はベクター内のＤＮＡ又はＲＮＡの操作を指す。組換えタンパク質は典型的には、それがどのように天然の対応物（「野生型」）とは異なるかに関して記載され得る。好ましくは、本発明の真核宿主細胞によって発現される関心対象の組換えタンパク質は、異なる生物に由来する。関心対象タンパク質は好ましくは、転写因子ではなく、すなわち、転写因子及び関心対象タンパク質は同一ではない。組換えタンパク質はまた、同種タンパク質であってもよい。この場合、同種タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーが、遺伝子操作によって宿主細胞に導入される。
【００４１】
「ポリヌクレオチドを発現している」という用語は、ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡに転写され、該ｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳される場合を意味する。「過剰発現する」という用語は一般的に、参照標準（例えば、タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されていない、同じ培養条件下の同じ宿主細胞）によって示される発現レベルよりも高い任意の量を指す。本発明における「過剰発現する」、「過剰発現している」、「過剰発現された」及び「過剰発現」という用語は、宿主細胞の遺伝子改変前、又は、規定の条件下で遺伝子的に改変されていない同等な宿主における、同遺伝子産物又はポリペプチドの発現よりも高いレベルの遺伝子産物又はポリペプチドの発現を指す。本発明において、配列番号１５〜２７のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列又はその機能的ホモログを含む転写因子が過剰発現される。宿主細胞が所与の遺伝子産物を含まない場合、発現のために宿主細胞に遺伝子産物を導入することが可能であり；この場合、任意の検出可能な発現が、「過剰発現」という用語によって包含される。好ましい実施態様では、「過剰発現している」は、以下に記載されているような「過剰発現するように工学操作すること」を意味する。このような好ましい実施態様は、本明細書に記載のような「過剰発現」又は「過剰発現している」に関する任意の実施態様について考えられる。
【００４２】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのポリマー状の非分枝形の、ヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれか、又はその両方の組合せを指す。好ましくは、ポリヌクレオチドは、任意の長さのポリマー状の非分枝形の、デオキシリボヌクレオチドを指す。ここで、ヌクレオチドは、五炭糖（デオキシリボース）、窒素含有塩基（アデニン、グアニン、シトシン、又はチミン）、及びリン酸基からなる。「ポリヌクレオチド（群）」、「核酸配列（群）」という用語は本明細書において同義語として使用される。
【００４３】
本明細書において使用する「少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド」という用語は、１つの転写因子をコードしている１つのポリヌクレオチド、２つの転写因子をコードしている２つのポリヌクレオチド、３つの転写因子をコードしている３つのポリヌクレオチド、４つの転写因子をコードしている４つのポリヌクレオチドなどを指す。好ましくは、１つの転写因子をコードしている１つのポリヌクレオチドが本発明によって含まれる。より好ましくは、１つの転写因子をコードしている１つのポリヌクレオチド及び１つの追加の転写因子をコードしている１つのポリヌクレオチドが本発明によって含まれる。
【００４４】
「転写因子」という用語は、特定のＤＮＡ配列に、好ましくはそのＤＮＡ結合ドメインと結合することによって、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝子情報の転写速度を制御するタンパク質を指す。それらの機能は、遺伝子が正しい細胞内で、正しいときに、正しい量で、確実に発現されるようにするために遺伝子を調節及び／又は活性化することである。例えば、転写因子は、飢餓又は熱ショックなどの刺激に応答して、特定の遺伝子（群）の転写を開始し得る。本発明において、Ｍｓｎ４ｐ転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインを含む配列番号１５〜２７、並びに、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する及び／又は本明細書に記載のような配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログと、任意の活性化ドメイン（例えば、本発明の転写因子又は本明細書の何処か他に記載されているような任意の種の他の転写因子の合成ドメイン、ウイルス性ドメイン、又は活性化ドメイン）、好ましくは配列番号８３に見ることができるような活性化ドメインとを含む転写因子を指す。本明細書に記載のような本発明の転写因子の該ＤＮＡ結合ドメインと任意の活性化ドメインの整列は、当業者の知識に従って実施され得、それは任意の順序で行なわれ得る。本発明の転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、当業者によってＣ末端又はＮ末端に、好ましくはＣ末端に並べられ得る。さらなる実施態様では、合成形の本発明の転写因子（例えばｓｙｎＭＳＮ４）も本発明に使用され得る（例えば配列番号２７）。合成形の転写因子は、合成ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号１２など）を含み得る。さらに、合成形の本発明の転写因子は、活性化ドメイン（本発明の転写因子又は本明細書の何処か他に記載されているような任意の種の他の転写因子の合成ドメイン、ウイルス性ドメイン、又は活性化ドメイン）、好ましくは配列番号８４に見ることができるような活性化ドメインを含み得る。ここでも、本明細書に記載のような本発明の転写因子の該ＤＮＡ結合ドメインと任意の活性化ドメインの整列は、当業者の知識に従って実施され得、それは任意の順序で行なわれ得る。本発明の合成転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、当業者によってＣ末端又はＮ末端に、好ましくはＣ末端に並べられ得る。
【００４５】
本発明において、転写因子は、Ｍｓｎ４／２タンパク質（Ｍｓｎ４/２ｐ又はＭＳＮ４/２）を指す。Ｍｓｎ４ｐは、全ゲノム重複イベントを受けた、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母及びその近縁類におけるＭｓｎ２ｐに対するホモログである。大半の他の酵母及び真菌種はＭｓｎ型の転写因子しか含有せず、これらの種におけるこれらの転写因子を妥当に区別することはできない。この機能的な冗長性のために、これらの転写因子は、Ｍｓｎ２又はＭｓｎ４又はＭｓｎ４/２のいずれかで呼ばれ得る。高い相同性のために、Ｍｓｎ４ｐ及びＭｓｎ２ｐは相互交換可能である確率が高く、すなわち、転写因子は冗長性である。Ｍｓｎ２依存性発現とＭｓｎ４依存性発現との間には基本的な差異はなく、Ｍｓｎ４ｐの構造とＭｓｎ２ｐの構造も非常に類似している。ピキア・パストリスは、Ｍｓｎ４ｐと命名された、唯一のホモログを有する。いくつかの他の酵母でも、Ｍｓｎ４/２に対するたった１つのホモログが存在するが、異なる名称を有する場合がある。アスペルギルス・ニガーでは、Ｍｓｎ４/２のホモログはＳｅｂ１と呼ばれる。サッカロマイセス・セレビシエでは、Ｍｓｎ４/２のホモログはＣｏｍ２と呼ばれる。
【００４６】
ＭＳＮ４（例えばＭＳＮ２）は、一般的なストレス応答を調節する転写因子をコードしている。サッカロマイセス・セレビシエでは、Ｍｓｎ４ｐ（例えばＭｓｎ２ｐ）は、熱ショック、浸透圧ショック、酸化ストレス、低ｐＨ、グルコース枯渇、ソルビン酸、及び高エタノール濃度をはじめとするいくつかのストレスに対して応答して、約２００個の遺伝子を、これらの遺伝子のプロモーターに位置するＳＴＲＥエレメント５’−ＣＣＣＣＴ−３’への、Ｍｓｎ４ｐ（例えばＭｓｎ２ｐ）ジンクフィンガー結合ドメインによる、Ｃ末端での結合によって調節する。そのＮ末端では、Ｍｓｎ４ｐ（例えばＭｓｎ２ｐ）は、転写活性化ドメイン及び核外搬出配列を含む。さらに、Ｍｓｎ４ｐ（例えばＭｓｎ２ｐ）は、核局在シグナルを含み、これは、プロテインキナーゼＡのリン酸化によって抑制され、プロテインホスファターゼ１による脱リン酸化によって活性化される。ストレスのない条件下では、Ｍｓｎ４ｐ（例えばＭｓｎ２ｐ）は、細胞質内に位置する。細胞質内局在化は一部には、ＴＯＲシグナル伝達によって調節される。ストレスがかかると、Ｍｓｎ４ｐ（例えばＭｓｎ２ｐ）は、過剰リン酸化され、核に再局在化し、その後、周期的な核−細胞質の往復行動を示す。
【００４７】
好ましくは、本発明の転写因子は、配列番号１５〜２７に示されるようなアミノ酸配列を含む。
【００４８】
現在までに、転写因子Ｍｓｎ４ｐが、組換え関心対象タンパク質の収量／力価を増加させることに関与していること、又は一般的に真核宿主細胞による組換え関心対象タンパク質の分泌に関与していることは何処にも判明していなかった。したがって、真核宿主細胞におけるＭｓｎ４ｐの過剰発現が、本発明の組換え関心対象タンパク質の収量／力価を増加させたことは驚くべきことであった。
【００４９】
本発明における転写因子は最初に、ピキア・パストリス（コマガタエラ・ファフィ）ＣＢＳ７４３５株（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ培養収集物）から単離された。転写因子は、多種多様な宿主細胞で過剰発現させることができると想定される。したがって、種又は属に対して天然である配列を使用する代わりに、転写因子配列はまた、他の原核生物又は真核生物から、好ましくは真菌宿主細胞から、より好ましくは酵母宿主細胞、例えばピキア・パストリス（異名コマガタエラ菌種）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（異名ハンゼヌラ・アングスタ）、トリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガー、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニー、コマガタエラ菌種、及びシゾサッカロミケス・ポンベから取得され得るか又は由来し得る。好ましくは、転写因子は、ピキア・パストリス（コマガタエラ菌種）、サッカロマイセス・セレビシエ、ヤロウィア・リポリティカ、又はアスペルギルス・ニガーに、より好ましくはピキア・パストリス（コマガタエラ菌種）に由来する。さらに、合成形の本発明の転写因子を使用してもよい。本明細書において使用するコマガタエラ菌種は、コマガタエラ属の全ての種を含む。好ましい実施態様では、転写因子は、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス（Komagataella pseudopastoris）、又はコマガタエラ・ファフィに由来する。さらにより好ましい実施態様では、転写因子は、コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィに由来する。
【００５０】
好ましくは、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び組換え宿主細胞の使用に使用される転写因子は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（ピキア・パストリス、特にコマガタエラ・ファフィ又はコマガタエラ・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）及び活性化ドメインを含む。したがって、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用は好ましくは、ピキア・パストリス（コマガタエラ菌種）において、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む転写因子を過剰発現する。ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガー、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニー、コマガタエラ菌種、及びシゾサッカロミケス・ポンベにおける、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む該転写因子の過剰発現も好ましい。
【００５１】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び組換え宿主細胞の使用に使用される転写因子は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）の機能的ホモログを含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む。さらに、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）の機能的ホモログを含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び組換え宿主細胞の使用に使用される転写因子も本発明によって考えられる。好ましくは、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び組換え宿主細胞の使用に使用される転写因子は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）の機能的ホモログを含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む。したがって、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用はさらに、ピキア・パストリスにおいて、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと、活性化ドメインとを含む転写因子を過剰発現させることを含み得る。したがって、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用はさらに、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガー、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニー、コマガタエラ菌種、又はシゾサッカロミケス・ポンベにおける、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと、活性化ドメインとを含む、転写因子を過剰発現させることを含み得る。
【００５２】
好ましくは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【００５３】
したがって、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用はさらに、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２に示されるようなアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む転写因子を過剰発現させることを含み得る。
【００５４】
さらに、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用はさらに、ピキア・パストリスにおいて、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２に示されるようなアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む転写因子を過剰発現させることを包含し得る。したがって、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用は、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガー、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニー、コマガタエラ菌種、又はシゾサッカロミケス・ポンベにおける、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２に示されるようなアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む転写因子を過剰発現させることを含み得る。
【００５５】
本明細書において使用する「ＤＮＡ結合ドメイン」又は「結合ドメイン」は、その調節される遺伝子のＤＮＡに結合する、転写因子のドメインを指す。好ましくは、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１、又は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログ（例えば配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２）からなる群より選択される。最も好ましいのは、配列番号１に示されるようなＤＮＡ結合ドメインである。したがって、本発明は、配列番号１２から分かるような、合成ＤＮＡ結合ドメインも含み得る。
【００５６】
本明細書において使用する配列番号８７は、ＭＳＮ４／２様のＣ２Ｈ２型ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの共通配列を指す（図６参照）。由来の異なるＭＳＮ４／２転写因子のアラインメントを、実施例６に記載のようにソフトウェアＣＬＣメインワークベンチ（キアゲン・バイオインフォマティクス社）を用いて実施した。ここで、実験において使用されることの多いモデル生物であり、かつ全ゲノム重複（ＷＧＤ、whole-genome duplication）を受け、よって２つのホモログであるＭｓｎ４ｐ及びＭｓｎ２ｐを有する、サッカロマイセス・セレビシエにおける、Ｍｓｎ４ｐ／Ｍｓｎ２ｐの既知のＤＮＡ結合ドメインが、他の生物において同じ機能を誘導するために使用される。サッカロマイセス・セレビシエのＭｓｎ２/４におけるジンクフィンガーは、Ｘ２−Ｃ−Ｘ２，４−Ｃ−Ｘ１２−Ｈ−Ｘ３，４，５−Ｈのアミノ酸配列モチーフを有する、Ｃ２Ｈ２様の折り畳みを有する（図７参照）。Ｍｓｎ４/２ＤＮＡ結合ドメインの共通配列（配列番号８７）は以下の配列：
【表１】
2021528985.tif 000002
（式中、
１０位のＫは、Ｒと相互交換可能であり得；
１１位のＲは、Ｋと相互交換可能であり得；
１５位のＸａａは、Ｑ又はＳであり得；
１９位のＫは、Ｒと相互交換可能であり得；
２２位のＸａａは、任意の天然アミノ酸であり得；
２５位のＸａａは、Ｖ又はＬであり得；
２７位のＳは、Ｔと相互交換可能であり得；
２８位のＸａａは、任意の天然アミノ酸であり得；
３０位のＫは、Ｒと相互交換可能であり得；
３３位のＸａａは、任意の天然アミノ酸であり得；
３５〜３６位のＸａａは、任意の天然アミノ酸であり得；
３８位のＸａａは、任意の天然アミノ酸であり得；
４０位のＫは、Ｒと相互交換可能であり得；
４４位のＳは、Ｔと相互交換可能であり得；
４８位のＸａａは、任意の天然アミノ酸であり得；
５２位のＲは、Ｋと相互交換可能であり得る）
を有する。太文字は高度に保存され、下線の文字はＣ２Ｈ２型のジンクフィンガーの一部である。
【００５７】
本明細書において使用する本発明の転写因子又は転写因子の結合ドメインの「相同体（homologue）」又は「ホモログ（homolog）」は、タンパク質が、それらの一次構造、二次構造、又は三次構造における対応する位置に、同じ残基又は保存された残基を有することを意味する。該用語はまた、同種ポリペプチドをコードしている２つ以上のヌクレオチド配列まで拡大される。転写因子としての又は転写因子の結合ドメインとしての機能がこのような相同体を用いて証明される場合、該相同体は、「機能的相同体」と呼ばれる。機能的相同体は、それが由来する転写因子又は転写因子の結合ドメインと同じ又は実質的に同じ機能を遂行する。ヌクレオチド配列の場合、「機能的相同体」は好ましくは、元来のヌクレオチド配列とは異なる配列を有するが、縮重した遺伝子コードの使用に因り同じアミノ酸配列を依然としてコードしている、ヌクレオチド配列を意味する。タンパク質、特に、転写因子又は転写因子の結合ドメインの機能的ホモログは、タンパク質、特に転写因子又は転写因子の結合ドメインの１つ以上のアミノ酸を置換することによって得られ、その置換（群）は、タンパク質、特に転写因子又は転写因子の結合ドメインの機能を保存する。特に、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率、及び/又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一���を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６１％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６２％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６３％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６４％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配���同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６６％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６７％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６８％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミ���酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約６９％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。
いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７１％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７２％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７３％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７４％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７６％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７７％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７８％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約７９％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。
いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。
いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。いくつかの実施態様では、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン）に対して少なくとも約１００％のアミノ酸配列同一率、及び配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列（共通配列）に対して少なくとも約６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％のアミノ酸配列同一率を有する。
【００５８】
一般的には、相同体は、当技術分野において公知である任意の突然変異誘発手順、例えば、部位特異的突然変異誘発、合成による遺伝子構築、半合成による遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャッフリングなどを使用して調製され得る。部位特異的突然変異誘発は、１つ以上（例えば数個）の突然変異が、親をコードしているポリヌクレオチド内の１つ以上の定められた部位に導入される、技術である。部位特異的突然変異誘発は、インビトロにおいて、所望の突然変異を含有しているオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含むＰＣＲによって達成され得る。部位特異的突然変異誘発はまた、インビトロにおいて、親をコードしているポリヌクレオチドを含むプラスミド内の部位での制限酵素による切断、及び続く、ポリペプチド内に突然変異を含有しているオリゴヌクレオチドのライゲーションを含む、カセット突然変異誘発によって行なわれ得る。
【００５９】
通常、プラスミドとオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同じであり、これにより、プラスミドと挿入断片の粘着末端が互いにライゲートすることが可能となる。例えば、Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955；及びBarton et ai, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966を参照されたい。部位特異的突然変異誘発はまた、インビボにおいて、当技術分野において公知である方法によって成し遂げられ得る。例えば、米国特許出願公開公報第２００４/０１７１１５４号；Storici et ai, 2001 , Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et ai, 1998, Nat. Med. 4: 285-290；及び Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16を参照されたい。合成による遺伝子構築は、関心対象のポリペプチドをコードするために設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロにおける合成を含む。遺伝子合成は、数多くの技術、例えばTian et al.（2004, Nature 432: 1050-1054）によって記載された多重マイクロチップに基づいた技術、及び、オリゴヌクレオチドをフォトプログラム可能なマイクロ流体チップ上に合成し組み立てる類似の技術を使用して実施され得る。単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を、公知の突然変異誘発法、組換え法、及び／又はシャッフリング法を使用し、その後、関連するスクリーニング手順、例えばReidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156；国際公開公報第９５／１７４１３号；又は国際公開公報第９５／２２６２５号によって開示されている手順を使用して、作製及び試験し得る。使用され得る他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al, 1991, Biochemistry 30: 10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開公報第９２／０６２０４号）、及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7:127）が挙げられる。突然変異誘発法／シャッフリング法を、ハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせることにより、宿主細胞によって発現された、クローニングされ突然変異させたポリペプチドの活性を検出することができる（Ness et a/., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。活性ポリペプチドをコードしている突然変異したＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当技術分野において公知の標準的な方法を使用して迅速にシークエンスすることができる。これらの方法は、ポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能とする。半合成による遺伝子の構築は、合成による遺伝子の構築、及び／又は部位特異的突然変異誘発、及び／又はランダム突然変異誘発、及び／又はシャッフリングの態様を組み合わせることによって達成される。半合成による構築は、ＰＣＲ技術と組み合わせて合成されるポリヌクレオチド断片を利用したプロセスによって典型的に表わされる。したがって、遺伝子の規定された領域は、新規で合成されてもよく、一方、他の領域は部位特異的突然変異誘発プライマーを使用して増幅されてもよく、さらに他の領域は、エラープローンＰＣＲ又はエラープローンではないＰＣＲによる増幅にかけられてもよい。その後、ポリヌクレオチド部分配列をシャッフルしてもよい。あるいは、相同体は、例えば、天然源から、例えば他の生物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、又��、核酸データベース、好ましくは密接に関連した若しくは関連した生物、例えばコマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス又はコマガタエラ・ファフィ、コマガタエラ菌種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガー、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニー、コマガタエラ菌種、若しくはシゾサッカロミケス・ポンベの相同体における相同性探索によって得ることができる。したがって、配列番号２〜１２は、配列番号１に示されるような転写因子の結合ドメインの機能的ホモログであり、配列番号１６〜２７は、配列番号１５に示されるような転写因子の機能的ホモログである。
【００６０】
本明細書に開示されているような、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する（例えば、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２）、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列の相同体の機能、あるいは、配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも１１％の配列同一率を有する、配列番号１５に示されるような転写因子のアミノ酸配列の相同体（例えば、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７）の機能、あるいは、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一率を有する、配列番号６５に示されるような追加の転写因子のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列の相同体（例えば配列番号６６〜７３）の機能、あるいは、配列番号７４に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも２０％の配列同一率を有する、配列番号７４に示されるような追加の転写因子のアミノ酸配列の相同体（例えば配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２）の機能を、配列番号１に示されるようなＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列の相同体と活性化ドメイン（例えば、配列番号８３又は８４など）と核局在シグナル（ＮＬＳ）（例えば配列番号８５又は８６など）とを含む転写因子、又は配列番号６５に示されるようなＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列の相同体と活性化ドメインと核局在シグナル（ＮＬＳ）とを含む追加の転写因子、又は配列番号１５に示されるような転写因子のアミノ酸配列の相同体、又は配列番号７４に示されるような転写因子のアミノ酸配列の相同体が挿入されている発現カセットを準備し、実施例の章に使用されるモデルタンパク質の１つ又は別の関心対象タンパク質などの試験タンパク質をコードしている配列を有する宿主細胞を形質転換し、同一条件下でモデルタンパク質又は関心対象タンパク質の収量の差を決定することによって試験することができる。
【００６１】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに、天然アミノ酸と同じような様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、並びに、後に修飾されているアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合している炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同じような様式で機能する化合物を指す。
【００６２】
「配列同一率」又は「同一率％」は、標準化アルゴリズムを使用してアラインさせた少なくとも２つのポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の残基の一致率を指す。このようなアルゴリズムは、標準化されかつ再現可能な方法で、２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される配列にギャップを挿入し得、それ故、２つの配列のより意味ある比較を達成し得る。本発明において使用される配列同一率は、少なくとも２つのポリペプチド配列（アミノ酸配列）間で同一なアミノ酸を有する比率を指す。本発明において列挙された配列類似率は、少なくとも２つのポリペプチド配列（アミノ酸配列）間でそれらの側鎖及び荷電により類似しているアミノ酸基を有する比率を指す。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の配列同一率は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．２．２９（２０１４年１月６日）を使用して決定される（Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402）。２つのアミノ酸配列の配列同一率は、以下のパラメーターで設定されたｂｌａｓｔｐを用いて決定され得る：マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、ワードサイズ：３；期待値：１０；ギャップコスト：イグジステンス＝１１、エクステンション＝１；フィルター＝不活化された低複雑性領域；組成調整：条件成分に応じたスコアマトリックス調整。本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の配列同一率は、以下の例示的パラメーターに設定されたｂｌａｓｔｎと共にＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．２．２９（２０１４年１月６日）を使用して決定される：ワードサイズ：２８；期待値：１０；ギャップコスト：線形；フィルター＝活性化された低複雑性領域；マッチ／ミスマッチスコア；１、−２。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の配列同一率をさらに、ＢＬＡＳＴ及びエンボス・ニードルアルゴリズムを使用して決定する。ＤＮＡ結合ドメインの配列同一率は、エンボス・ニードルアルゴリズムを用いた、該グローバルペアワイズ配列アラインメントによって評価された。エンボス・ニードルウェブサーバー（https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）が、デフォールト設定を使用した、ペアワイズタンパク質配列アラインメントのために使用された（マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．５：エンドギャップペナルティ：偽；エンドギャップオープン：１０；エンドギャップ伸長：０．５）。エンボス・ニードルは２つの入力配列を解読し、それらの最適なグローバル配列アラインメントを書き出しファイルする。それはニードルマン・ブンシュアラインメントアルゴリズムを使用して、その全長に沿って２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つける。ピキア・パストリスのＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＳＩＬ１及びＥＲＪ５に対する配列同一率は、ＢＬＡＳＴによって決定された。
【００６３】
本明細書において使用する「活性化ドメイン」という用語は、転写を活性化することができる任意のドメインを指す。活性化ドメインとして、当業者には公知である任意の生物の任意の転写因子に由来する各々の活性化ドメインを、本発明において使用し得る。好ましくは、本発明の転写因子のために、本明細書における任意の規定された種の本発明の転写因子の任意の活性化ドメイン、好ましくは配列番号８３に示されるような活性化ドメインが使用され得る。追加の転写因子のためにまた、本明細書における任意の規定された種の追加の転写因子の任意の活性化ドメインが使用され得る。さらなる実施態様ではまた、合成（例えば配列番号８４）又はウイルス性（例えばＶＰ６４）活性化ドメインもまた、本発明の転写因子のために、又は追加の転写因子のために、本発明において使用し得る。活性化ドメインの機能は、当技術分野における公知の方法によって、すなわち、生酵母細胞において相互作用しているタンパク質の検出を可能とする酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）技術によって測定され得る。したがって、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される転写因子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む。配列番号８３又は配列番号８４に示されるような活性化ドメインが好ましくあり得る。また、機能的相同体に由来する活性化ドメインが使用され得ることも考えられる。ピキア・パストリスのＭＳＮ４に特異的な活性化ドメインは、配列番号８３の一部であり得る。
【００６４】
本発明はさらに、ｉ）少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む本発明の少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように宿主細胞を工学操作する工程、ｉｉ）関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むように該宿主細胞を工学操作する工程、ｉｉｉ）少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するのに、及び関心対象タンパク質を過剰発現するのに、適した条件下で、該宿主細胞を培養する工程、場合によりｉｖ）関心対象タンパク質を細胞培養液から単離する工程、及び場合によりｖ）関心対象タンパク質を精製する工程を含む、宿主細胞における関心対象の組換えタンパク質の収量を増加する方法を提供する。
【００６５】
（ｉ）及び（ｉｉ）に列挙されている工程は、列挙されている順序で実施する必要はないことが注記されるべきである。まず（ｉｉ）に列挙されている工程、その後、（ｉ）に列挙されている工程を実施することができる。工程（ｉ）において、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含むＤＮＡ結合ドメインを含む、本発明の少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作することができる。
【００６６】
宿主細胞が、所与のタンパク質を「過剰発現するように工学操作」される場合、宿主細胞が、本発明の転写因子又はその機能的相同体を発現、好ましくは過剰発現する能力を有し、これにより、所与のタンパク質、例えば関心対象タンパク質又はモデルタンパク質の発現が、操作前の同条件下の宿主細胞と比較して増加するように、宿主細胞は操作されている。１つの実施態様では、「過剰発現するように工学操作される」は、宿主細胞に対する遺伝子改変が、タンパク質の発現を増加させるために行なわれること、すなわち、細胞が、（意図的に）このようなタンパク質を過剰発現するように遺伝子的に工学操作されていることを意味する。
【００６７】
本発明の宿主細胞の文脈に使用される場合の「工学操作前」又は「操作前」は、このような宿主細胞が、本発明の転写因子又はその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドを使用して工学操作されていないことを意味する。したがって、該用語はまた、宿主細胞が本発明の転写因子若しくはその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現しないか、又は、本発明の転写因子若しくはその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されていないことを意味する。したがって、「工学操作前の宿主細胞」又は「操作前の宿主細胞」又は「転写因子をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現しない宿主細胞」は、本発明の転写因子若しくはその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現していない宿主細胞、又は、本発明の転写因子若しくはその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されていない宿主細胞である。さらに、「工学操作前の宿主細胞」又は「操作前の宿主細胞」又は「転写因子をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現しない宿主細胞」は、関心対象の該組換えタンパク質の収量の増加が比較されるのと同じ宿主細胞であるが、本発明の転写因子若しくはその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現していない、又は、本発明の転写因子若しくはその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されていない。
【００６８】
本明細書において使用する「前記の関心対象のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むように該宿主細胞を工学操作すること」という用語は、本発明の宿主細胞が関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを具備していること、すなわち、本発明の宿主細胞が、関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含有するように工学操作されていることを意味する。これは、例えば、形質転換若しくはトランスフェクション、又は、宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入について当技術分野において公知である任意の他の適切な技術によって成し遂げられ得る。
【００６９】
例えば、転写因子及び／又は関心対象タンパク質、プロモーター、エンハンサー、リーダーなどをコードしている、ポリヌクレオチド配列を操作するために使用される手順は、当業者には周知であり、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第３版), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York（2001）によって記載されている。
【００７０】
外来又は標的のポリヌクレオチド、例えば過剰発現した転写因子又は関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、様々な手段によって、例えば、相同的組換えによって、あるいは組込み部位における配列を特異的に標的とするハイブリッドリコンビナーゼを使用することによって、染色体に挿入され得る。上記の外来又は標的のポリヌクレオチドは典型的には、ベクター（「挿入用ベクター」）に存在する。これらのベクターは典型的には環状であり、相同的組換えに使用する前に鎖状化される。代替選択肢として、外来又は標的のポリヌクレオチドは、融合ＰＣＲによって接続されたＤＮＡ断片、又は合成で構築されたＤＮＡ断片であってもよく、これはその後、宿主細胞に組換えられる。相同性アームに加えて、ベクターはまた、選択若しくはスクリーニングに適したマーカー、複製起点、及び他のエレメントを含有していてもよい。また、ランダム又は非標的化組込みをもたらす、異種組換えを使用することも可能である。異種組換えは、かなり異なる配列を有するＤＮＡ分子間の組換えを指す。組換え法は当技術分野において公知であり、例えば、Boer et al., Appl Microbiol Biotechnol (2007) 77:513-523に記載されている。また、酵母細胞の遺伝子操作については、Primrose及びTwymanによるPrinciples of Gene Manipulation and Genomics（第７版 Blackwell Publishing 2006）も参照し得る。
【００７１】
過剰発現した転写因子及び／又は関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、発現ベクター上に存在し得る。このようなベクターは当技術分野において公知である。発現ベクターでは、プロモーターは、異種タンパク質をコードしている遺伝子の上流に配置され、遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターは、そのマルチクローニングサイトのために特に有用である。発現のために、プロモーターは一般的には、マルチクローニングサイトの上流に配置される。転写因子及び／又は関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの組込み用ベクターは、まず、転写因子及び／又は関心対象タンパク質をコードしている全ＤＮＡ配列を含有しているＤＮＡ構築物を調製し、続いて、この構築物を適切な発現ベクターに挿入することによって、あるいは、ＤＮＡ結合ドメイン、活性化ドメインなどの個々のエレメントについての遺伝子情報を含有しているＤＮＡ断片を順次挿入し、その後、ライゲーションすることによってのいずれかで構築され得る。断片の制限酵素による切断及びライゲーションの代替選択肢として、付着部位（ａｔｔ）及び組換え酵素に基づいた組換え法を使用して、ＤＮＡ配列をベクターに挿入し得る。このような方法は、例えば、Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949によって記載され、当業者には公知である。
【００７２】
本発明による宿主細胞は、標的ポリヌクレオチド配列を含むベクター又はプラスミドを細胞に導入することによって得ることができる。真核細胞をトランスフェクト若しくは形質転換するための、又は原核細胞を形質転換するための技術は当技術分野において周知である。これらは、脂質小胞により媒介される取り込み、熱ショックにより媒介される取り込み、リン酸カルシウムにより媒介されるトランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡの共沈降）、ウイルスによる感染、特に例えば修飾されたアデノウイルスなどの修飾されたウイルスを使用したウイルスによる感染、マイクロインジェクション、及び電気穿孔法が挙げられ得る。原核生物の形質転換のための技術としては、熱ショックにより媒介される取り込み、インタクトな細胞と細菌プロトプラストの融合、マイクロインジェクション、及び電気穿孔法が挙げられ得る。植物の形質転換のための技術としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）によるなどの、アグロバクテリウムにより媒介される導入、急速に噴射されたタングステン又は金微粒子銃、電気穿孔法、マイクロインジェクション及びポリエチレングリコールにより媒介される取り込みが挙げられる。ＤＮＡは、一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、鎖状であっても又は環状であってもよく、ほどかれていも又はスーパーコイルしていてもよいＤＮＡである。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための様々な技術については、例えば、Keown et al. (1990) Processes in Enzymology 185:527-537を参照されたい。
【００７３】
「少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するのに、及び関心対象タンパク質を過剰発現するのに、適した条件下で、該宿主細胞を培養すること」という語句は、所望の化合物（関心対象タンパク質）の産生を得るのに、又は本発明の転写因子を得るか若しくは過剰発現するのに、適切な若しくは十分な条件下（例えば温度、気圧、ｐＨ、誘導、増殖速度、培地、期間など）で真核宿主細胞を維持及び／又は増殖することを指す。
【００７４】
転写因子の遺伝子（群）及び／又は関心対象タンパク質の遺伝子（群）を用いての形質転換によって得られた本発明による宿主細胞は好ましくはまず、組換えタンパク質を発現する負担を伴うことなく、多くの細胞数となるまで効率的に増殖する条件で培養し得る。細胞が関心対象タンパク質の発現のために調製される場合、関心対象タンパク質を産生するために、適切な培養条件が選択され最適化される。
【００７５】
例えば、転写因子（群）及び関心対象タンパク質（群）のために、異なるプロモーター及び／又はコピー及び／又は組込み部位を使用して、転写因子（群）の発現を、関心対象タンパク質（群）の発現についての誘導の時点及び強度に対して制御することができる。例えば、関心対象タンパク質の発現の誘導前に、転写因子をまず発現させ得る。これは、転写因子が、関心対象タンパク質の翻訳開始時に、すでに存在しているという利点を有する。あるいは、転写因子及び関心対象タンパク質（群）を同時に誘導してもよい。
【００７６】
誘導刺激がかけられるとすぐに、活性化状態となり、誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子の転写を指令する誘導性プロモーターを使用し得る。誘導刺激を含む増殖条件下では、細胞は通常、通常の条件下よりもゆっくりと増殖するが、培養液は前段階で増殖してすでに多くの細胞数となっているので、全体としての培養系は大量の組換えタンパク質を産生する。誘導刺激は好ましくは、適切な薬剤（例えばアルコールオキシダーゼプロモーターではメタノール）の添加、又は適切な栄養分（例えばＭＥＴ３プロモーターではメチオニン）の枯渇である。また、エタノール、メチルアミン、カドミウム、又は銅、並びに、熱、又は浸透圧上昇剤の添加は、転写因子及び関心対象タンパク質（群）に作動可能に連結されたプロモーターに応じて発現を誘導することができる。
【００７７】
最適化された増殖条件下、バイオリアクター中で本発明による宿主細胞（群）を培養して、少なくとも１ｇ/Ｌ、好ましくは少なくとも１０ｇ/Ｌの細胞乾燥重量、より好ましくは少なくとも５０ｇ/Ｌの細胞乾燥重量の細胞密度を得ることが好ましい。実験室規模でだけでなく、試験的規模又は工業的規模においても、このような生体分子の産生収量を達成することが有利である。
【００７８】
本発明によると、少なくとも１つの転写因子の過剰発現に因り、関心対象タンパク質を、バイオマスが低く保たれている場合でさえも、高い収率で得ることができる。したがって、乾燥バイオマス１ｇあたりの関心対象タンパク質のmgで測定される、高い比収量は、実験室規模、試験的規模及び工業的規模において、１〜２００、例えば５０〜２００、例えば１００〜２００の範囲内であり得、実現可能である。本発明による生産宿主細胞の比収量は好ましくは、少なくとも１つの転写因子の過剰発現を伴わない産物の発現と比較して、少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、又は少なくとも１．４倍を与え、場合によっては、２倍を超える増加が示される場合がある。
【００７９】
本発明による宿主細胞を、標準的な試験、例えばＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴（ビアコア）、ウェスタンブロット、キャピラリー電気泳動（キャリパー）、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用することによって、細胞培養液の上清中又は細胞のホモジナイズ後の細胞の細胞ホモジネート中の関心対象タンパク質の力価を測定することによって、その発現能／分泌能又は収量について試験し得る。
【００８０】
好ましくは、宿主細胞は、適切な炭素源を含む最小培地中で培養され、これにより、単離プロセスはかなりさらに単純化する。例えば、最小培地は、利用可能な炭素源（例えば、グルコース、グリセロール、エタノール、又はメタノール）、多量元素（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸塩、リン酸塩）及び微量元素（銅、ヨウ素、マンガン、モリブデン、コバルト、亜鉛、及び鉄の塩、及びホウ酸）を含有している塩を含有している。
【００８１】
酵母細胞の場合、細胞を、上記の発現ベクター（群）の１つ以上を用いて形質転換し、交配して二倍体株を形成し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードしている遺伝子の増幅に適したように修飾されている通常の栄養培地中で培養し得る。酵母の増殖に適した多くの最小培地が当技術分野において公知である。これらの中の任意の培地に、必要に応じて、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ、クエン酸、及びリン酸緩衝液）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質、微量元素、ビタミン、及びグルコース、又は等価なエネルギー源を補充しても良い。当業者には公知であろう、任意の他の必要な補助物質も、適切な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に用いられた条件であり、これは当業者には公知である。他の種類の宿主細胞のための細胞培養条件も公知であり、当業者によって容易に決定され得る。様々な微生物用の培養培地の記載は、例えば、アメリカ微生物学会のハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」（ワシントンＤＣ、米国、１９８１）に含まれている。
【００８２】
宿主細胞を、液体培地中で培養（例えば維持及び／又は増殖）させることができ、好ましくは、通常の培養法、例えば静置培養、試験管培養、振盪培養（例えば回転振盪培養、振盪フラスコ培養など）、通気スピナー培養、又は発酵によって、連続的に又は断続的にのいずれかで培養する。いくつかの実施態様では、細胞を振盪フラスコ又は深底ウェルプレート中で培養する。さらに他の実施態様では、細胞をバイオリアクター（例えばバイオリアクター培養プロセス）中で培養する。培養プロセスとしては、バッチ培養法、フェッドバッチ培養法、及び連続培養法が挙げられるがこれらに限定されない。「バッチプロセス」及び「バッチ培養」という用語は、培地、栄養分、補助添加物などの組成が、培養開始時に設定され、培養中に変化を受けない閉じた系を指し；しかしながら、過剰な培地の酸性化及び／又は細胞死を防ぐために、ｐＨ及び酸素濃度などのこのような因子を制御する試みがなされてもよい。「フェッドバッチプロセス」及び「フェッドバッチ培養」という用語は、培養が進むにつれて、１つ以上の基質又は補助物質が加えられる（例えば、徐々に又は連続的に加えられる）ということを除いたバッチ培養を指す。「連続プロセス」及び「連続培養」という用語は、所定の培養培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、等量の使用済培地又は「馴化」培地が、例えば、所望の産物の回収のために、同時に除去される系を指す。多種多様なこのようなプロセスが開発され、当技術分野においては周知である。
【００８３】
いくつかの実施態様では、宿主細胞を約１２〜２４時間培養し、他の実施態様では、宿主細胞を約２４〜３６時間、約３６〜４８時間、約４８〜７２時間、約７２〜９６時間、約９６〜１２０時間、約１２０〜１４４時間、又は１４４時間を超える時間をかけて培養する。さらに他の実施態様では、培養は、関心対象タンパク質の所望の産生収量に到達するのに十分な時間継続する。
【００８４】
上記の方法はさらに、発現された関心対象タンパク質を単離する工程を含み得る。関心対象タンパク質が細胞から分泌されれば、最先端技術を使用して培養培地から単離及び精製することができる。細胞からの関心対象タンパク質の分泌が一般的に好ましい。なぜなら、産物は、細胞が破壊されて細胞内タンパク質を放出した時に生じるタンパク質の複合混合物からではなく、培養上清から回収されるからである。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤が、精製中のタンパク質分解を抑制するのに有用であり得、外来汚染菌の増殖を防ぐために抗生物質が含まれていてもよい。該組成物を、当技術分野において公知の方法を使用して、濃縮、ろ過、透析などをしてもよい。発酵／培養後の細胞培養液を、遠心分離機又は遠心管を使用して遠心分離にかけることにより、培養上清から細胞を分離することができる。その後、濃縮物から上清をタンジェンシャルフローろ過を使用することによってろ過することができる。あるいは、培養した宿主細胞を、超音波で又は機械的に（例えば高圧ホモジナイゼーション）、酵素的に、又は化学的に破壊して、所望の関心対象タンパク質を含有している細胞抽出物を得てもよく、これから関心対象タンパク質を単離及び精製してもよい。
【００８５】
関心対象タンパク質を得るための単離法及び精製法は、溶解度の差を利用した方法、例えば塩析、溶媒沈殿、熱による沈殿、分子量の差を利用した方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過、及びゲル電気泳動、電荷差を利用した方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、特異的親和性を利用した方法、例えばアフィニティクロマトグラフィー、疎水性の差を利用した方法、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点の差を利用した方法（例えば等電点電気泳動が使用され得る）、及び特定のアミノ酸を利用した方法、例えばＩＭＡＣ（固定金属イオンアフィニティクロマトグラフィー）に基づき得る。関心対象タンパク質が、不活性かつ可溶性の封入体として発現されている場合、可溶化されている封入体はリフォールディングされる必要がある。
【００８６】
単離され精製された関心対象タンパク質は、通常の方法、例えばウェスタンブロット又は関心対象タンパク質の活性についての特異的なアッセイによって同定され得る。精製された関心対象タンパク質の構造は、アミノ酸分析、アミノ末端ペプチドシークエンス、一次構造分析、例えば質量分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡなどによる分析によって決定され得る。関心対象タンパク質は、大量にかつ高純度で得ることができ、したがって、医薬組成物中の活性成分として、又は飼料添加物若しくは食品添加物として使用されるに必要な必要条件を満たしていることが好ましい。
【００８７】
本明細書において使用する「単離された」という用語は、天然には存在しない、形状の又は環境の物質を意味する。単離された物質の非制限的な例としては、（１）任意の非天然物質；（２）天然においては随伴している１つ以上又は全ての天然構成成分から少なくとも部分的に取り出されている、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、又は補因子を含むがこれらに限定されない、任意の物質；（３）天然に見られる物質と比較して、人の手により修飾されている任意の物質、例えばｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡ；又は（４）それが天然においては随伴している他の成分と比較して、物質の量を増加させることによって修飾されている（例えば、宿主細胞内の組換え産生；物質をコードしている遺伝子の複数のコピー；及び、物質をコードしている遺伝子に天然において付随しているプロモーターよりも強力なプロモーターの使用）任意の物質が挙げられる。
【００８８】
本発明はさらに、（ｉ）少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されている宿主細胞を準備する工程（ここでは、宿主細胞はさらに、関心対象のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含み、本発明の転写因子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む）、（ｉｉ）少なくとも１つの転写因子又はその機能的相同体をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するのに、及び関心対象タンパク質を過剰発現するのに、適した条件下で、該宿主細胞を培養する工程、及び場合により（ｉｉｉ）細胞培養液から関心対象タンパク質を単離する工程、及び場合により（ｉｖ）関心対象タンパク質を精製する工程、及び場合により（ｖ）関心対象タンパク質を修飾する工程、及び場合により（ｖｉ）関心対象タンパク質を製剤化する工程を含む、真核宿主細胞による関心対象の組換えタンパク質を製造する方法を提供する。
【００８９】
好ましくは、工程（ｉ）において、宿主細胞は、配列番号１に示されるようなアミノ酸、又は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／若しくは、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む、ＤＮＡ結合ドメインを含む、本発明の少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されている。
【００９０】
この文脈では、本明細書において使用する「真核宿主細胞によって／真核宿主細胞において関心対象の組換えタンパク質を製造すること」という用語は、関心対象の組換えタンパク質が、組換え宿主細胞の形成のための真核宿主細胞を使用することによって製造され得ることを意味する。これにより、真核宿主細胞は細胞内で関心対象の組換えタンパク質を産生し得、細胞の内部（細胞内）に組換え関心対象タンパク質を維持し得るか、又は、培養培地中（細胞外）に（ここで宿主細胞はこの中で培養される）組換え関心対象タンパク質を分泌し得る。よって、関心対象タンパク質を、該培養培地（細胞培養液の上清）又は細胞ホモジネーション後の細胞の細胞ホモジネートから単離し得る。
【００９１】
この文脈では、「関心対象のタンパク質を修飾すること」という用語は、関心対象タンパク質が化学的に修飾されていることを意味する。当技術分野において公知である多くのタンパク質修飾法が存在する。タンパク質を、糖質又は脂質に結合させてもよい。関心対象タンパク質を、半減期の延長のためにＰＥＧ化（関心対象タンパク質をポリエチレングリコールに化学結合させる）又はＨＥＳ化（関心対象タンパク質をヒドロキシエチルデンプンに化学結合させる）してもよい。関心対象タンパク質はまた、半減期延長のための例えばヒト血清アルブミンに対する親和性ドメインなどの他の部分と結合させてもよい。関心対象タンパク質はまた、前駆配列から活性成分を形成するための切断のために、又は精製のためのアフィニティタグなどのタグを除去するために、プロテアーゼによって、又は加水分解条件下で処理されてもよい。関心対象タンパク質はまた、毒素、放射性部分、又は任意の他の部分などの他の部分と結合させてもよい。関心対象タンパク質は、二量体、三量体などを形成する条件下でさらに処理されてもよい。
【００９２】
さらに、「関心対象タンパク質を製剤化すること」という用語は、関心対象タンパク質をより長時間保存することのできる条件に関心対象タンパク質をもたらすことを指す。当技術分野において公知である多くの異なる方法が、タンパク質を安定化させるために利用可能である。精製及び／又は修飾後に関心対象タンパク質が存在する緩衝液を交換することによって、関心対象タンパク質は、より安定である条件下にもたらされ得る。当技術分野において公知である、様々な緩衝物質及び添加剤、例えばショ糖、穏和な界面活性剤、安定化剤などを使用することができる。関心対象タンパク質をまた、凍結乾燥によって安定化させてもよい。いくつかの関心対象タンパク質のための製剤化は、関心対象タンパク質と、脂質又はリポタンパク質、例えばポリプレックスなどとの複合体の形成によって行なわれ得る。いくつかのタンパク質は、他のタンパク質と共製剤化してもよい。
【００９３】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される前記の本発明のＭｓｎ４ｐ転写因子（群）（配列番号１５〜２７参照）の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質ｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を増加させ得る。上記のモデルタンパク質（群）の収量は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加し得る。本明細書において使用する「０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％など」という用語は、１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍などを指す。「倍」という接頭辞は、倍数を指す。「１倍」は全体を意味し、「２倍」はその２倍であることを意味し、「３倍」はその３倍であることを意味する。本発明のピキア・パストリスの天然転写因子Ｍｓｎ４ｐの過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｓｃＦｖ（配列番号１３）の収量を、少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明の合成転写因子ｓｙｎＭｓｎ４ｐの過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｖＨＨ（配列番号１４）の収量を少なくとも１０％、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。
【００９４】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される転写因子（群）をコードしているポリヌクレオチド及び／又は関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは好ましくは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。「ゲノム」という用語は一般的にＤＮＡ（又はあるウイルス種ではＲＮＡ）にコードされている生物の全遺伝情報を指す。それは、染色体内に、プラスミド上又はベクター上、又はその両方に存在し得る。好ましくは、転写因子をコードしているポリヌクレオチドは該細胞の染色体に組み込まれる。
【００９５】
転写因子（群）及び関心対象タンパク質（群）をコードしているポリヌクレオチドは、関連遺伝子をそれぞれ１つのベクターにライゲートすることによって、宿主細胞内で組換えられ得る。遺伝子を有する単一のベクター、又は、一方は転写因子の遺伝子を有し他方は関心対象タンパク質の遺伝子を有する２つの別々のベクターを構築することが可能である。これらの遺伝子は、このようなベクター又はベクター群を使用して宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。いくつかの実施態様では、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子はゲノムに組み込まれ、転写因子をコードしている遺伝子はプラスミド又はベクターに組み込まれる。いくつかの実施態様では、転写因子をコードしている遺伝子（群）はゲノムに組み込まれ、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子（群）はプラスミド又はベクターに組み込まれる。いくつかの実施態様では、関心対象タンパク質と転写因子とをコードしている遺伝子が、ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施態様では、関心対象タンパク質と転写因子とをコードしている遺伝子が、プラスミド又はベクターに組み込まれる。関心対象タンパク質をコードしている複数の遺伝子が使用される場合、関心対象タンパク質をコードしているいくつかの遺伝子はゲノムに組み込まれ、他の遺伝子は、同じ又は異なるプラスミド又はベクターに組み込まれてもよい。転写因子（群）をコードしている複数の遺伝子が使用される場合、転写因子をコードしている遺伝子のいくつかはゲノムに組み込まれ、他の遺伝子は、同じ又は異なるプラスミド又はベクターに組み込まれてもよい。
【００９６】
転写因子又はその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドは、その天然遺伝子座に組み込まれてもよい。「天然遺伝子座」は、転写因子をコードしているポリヌクレオチドが位置する特定の染色体上の位置、例えば、本発明の転写因子をコードしている遺伝子の天然遺伝子座を意味する。しかしながら、別の実施態様では、転写因子をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム内のその天然遺伝子座ではない場所に存在し、異所的に組み込まれる。「異所的組込み」という用語は、微生物のゲノムの、その通常の染色体の遺伝子座以外の部位への核酸の挿入、すなわち、予め決定された又は無作為な組込みを意味する。代替的には、転写因子又はその機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドは、その天然遺伝子座に及び異所的に組み込まれてもよい。
【００９７】
酵母細胞では、転写因子をコードしているポリヌクレオチド及び／又は関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＥＮＯ１、ＴＥＦ、ＨＩＳ４（Zamir et al., Proc. NatL Acad. Sci. USA (1981) 78(6):3496-3500）、ＨＯ（Voth et al. Nucleic Acids Res. 2001 June 15; 29(12): e59）、ＴＹＲ１（Mirisola et al., Yeast 2007; 24: 761-766）、Ｈｉｓ３、Ｌｅｕ２、Ｕｒａ３（Taxis et al., BioTechniques (2006) 40:73-78）、Ｌｙｓ２、ＡＤＥ２、ＴＲＰ１、ＧＡＬ１、ＡＤＨ１、ＲＧＩ１などであるがこれらに限定されない所望の遺伝子座に、又はリボソームＲＮＡ遺伝子座に挿入し得る。
【００９８】
他の実施態様では、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチド及び／又は関心対象タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを、プラスミド又はベクターに組み込んでもよい。「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、自律的複製ヌクレオチド配列、並びにゲノム組み込みヌクレオチド配列を含む。当業者は、使用される宿主細胞に応じて、適切なプラスミド又はベクターを使用することができる。
【００９９】
好ましくは、プラスミドは、真核細胞発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターである。
【０１００】
プラスミドは、適切な宿主生物における、クローニングされた組換えヌクレオチド配列の転写、すなわち組換え遺伝子の転写、及びそれらのｍＲＮＡの翻訳のために使用され得る。プラスミドはまた、当技術分野において公知である、例えばJ. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York（2001）によって記載された方法によって、標的ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込むために使用され得る。「プラスミド」は通常、自律複製起点、選択マーカー、多くの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列、及び転写終結因子を含み、それらの成分は、互いに作動可能に連結されている。関心対象のポリペプチドコード配列は、宿主細胞内でポリペプチドの発現をもたらす、転写調節配列及び翻訳調節配列に作動可能に連結されている。
【０１０１】
核酸は、同じ核酸分子上の別の核酸配列と機能的な関係となるように配置されている場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる場合に、組換え遺伝子のコード配列と作動可能に連結されている。
【０１０２】
大半のプラスミドは、１つの細菌細胞あたり１つのコピーしか存在しない。しかしながら、いくつかのプラスミドは、多数のコピー数で存在する。例えば、プラスミドＣｏｌＥ１は典型的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において１つの染色体あたり１０〜２０個のプラスミドコピーで存在する。本発明のヌクレオチド配列がプラスミド内に含まれている場合、プラスミドは、１つの宿主細胞あたり、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜１００、又はそれ以上のコピー数を有し得る。多コピー数のプラスミドでは、細胞によって転写因子を過剰発現することが可能である。
【０１０３】
多くの適切なプラスミド又はベクターが当業者には公知であり、多くが市販されている。適切なベクターの例は、Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory （1989）及び Ausubel et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York（1997）に提供されている。
【０１０４】
本発明のベクター又はプラスミドは、酵母人工染色体を包含し、これは、テロメア配列、セントロメア配列、及び複製の起点（複製起点）配列を含有し、異種ＤＮＡ配列（例えば３０００kbもの大きさのＤＮＡ配列）を含有するように、遺伝子的に修飾されていてもよいＤＮＡ構築物を指す。
【０１０５】
本発明のベクター又はプラスミドはまた、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を包含し、これは、複製起点配列（Ｏｒｉ）を含有し、そして１つ以上のヘリカーゼ（例えば、ｐａｒＡ、ｐａｒＢ及びｐａｒＣ）を含有し得、異種ＤＮＡ配列（例えば３００kbもの大きさのＤＮＡ配列）を含有するように、遺伝子的に修飾されていてもよいＤＮＡ構築物を指す。
【０１０６】
宿主として酵母を使用するプラスミドの例としては、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹＣｐ型ベクター（Ｙｘｐベクターは、例えば、Romanos et al. 1992, Yeast. 8(6):423-488に記載されている）、ｐＧＰＤ−２（Bitter et al., 1984, Gene, 32:263-274に記載されている）、ｐＹＥＳ、ｐＡＯ８１５、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＰＩＣ３Ｋ、ｐＰＩＮＫ−ＨＣ、ｐＰＩＮＫ−ＬＣ（全て、サーモフィッシャーサイエンティフィック社／インビトロジェン社から入手可能）、ｐＨＷＯ１０（Waterham et al., 1997, Gene, 186:37-44に記載）、ｐＰＺｅｏＲ、ｐＰＫａｎＲ、ｐＰＵＺＺＬＥ及びｐＰＵＺＺＬＥ誘導体、例えばｐＰＭ２ｄ、ｐＰＭ２ａＫ２１又はｐＰＭ２ｅＨ２１（Stadlmayr et al., 2010, J Biotechnol. 150(4):519-29.; Marx et al. 2009, FEMS Yeast Res. 9(8):1260-70に記載）；ゴールデンＰｉＣＳシステム（骨格ＢＢ１、ＢＢ２及びＢＢ３ａＫ／ＢＢ３ｅＨ／ＢＢ３ｒＮからなる）；ｐＪベクター（例えば、ｐＪＡＮ、ｐＪＡＧ、ｐＪＡＺ及びそれらの誘導体；全てバイオグラマティクス社から入手可能）、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓベクター、ｐＤ９０２、ｐＤ９０５、ｐＤ９１５、ｐＤ９１２及びそれらの誘導体、ｐＤ１２ｘｘ、ｐＪ１２ｘｘ（全てＡＴＵＭ／ＤＮＡ２．０から入手可能）、ｐＲＧプラスミド（Gnugge et al., 2016, Yeast 33:83-98に記載）、２μmのプラスミド（例えばLudwig et al., 1993, Gene 132(1):33-40に記載）が挙げられる。このようなベクターは公知であり、例えば、Cregg et al., 2000, Mol Biotechnol. 16(1):23-52又はAhmad et al. 2014., Appl Microbiol Biotechnol. 98(12):5301-17に記載されている。さらなる適切なベクターは、例えばLee et al. 2015, ACS Synth Biol. 4(9):975-986; Agmon et al. 2015, ACS Synth. Biol., 4(7):853-859；又はWagner and Alper, 2016, Fungal Genet Biol. 89:126-136によって記載されているような、応用分子クローニング技術によって容易に作製され得る。さらに、これらの及び他の適切なベクターはまた、アドジーン社（ケンブリッジ、ＭＡ州、米国）からも入手できる。
【０１０７】
好ましくは、ゴールデンＰｉＣＳシステムのＢＢ１プラスミドを使用して、特異的な制限酵素を使用することによって、本発明の転写因子の遺伝子断片を導入する（表１）。それぞれのコード配列を有する構築されたＢＢ１をその後さらに、ゴールデンＰｉＣＳシステムにおいて処理して、Prielhofer et al. 2017に記載のような必要とされるＢＢ３組込みプラスミドを作製し得る。
【０１０８】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドは、異種又は同種転写因子をコードし得る。
【０１０９】
本明細書において使用する「異種」という用語は、異なるゲノムバックグラウンドを有する細胞若しくは生物（好ましくは酵母）又は合成配列に由来することを意味する。したがって、「異種転写因子」は、外来起源（又は種、例えばサッカロマイセス・セレビシエのＭｓｎ４ｐ又はｓｙｎＭｓｎ４ｐ）から派生し、外来起源以外の起源（又は種、例えばピキア・パストリス）に使用されるものである。「同種」という用語は、同じゲノムバックグラウンドを有する同じ細胞又は生物に由来することを意味する。したがって、「同種転写因子」は、同じ起源（又は種、例えばピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐ）から派生し、同じ起源（又は種、例えばピキア・パストリス）に使用されるものである。
【０１１０】
一般的に、過剰発現は、後に詳述されるであろうように、当業者に公知の任意の方法で成し遂げられ得る。過剰発現は、遺伝子の転写／翻訳を増加させることによって、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることによって、又は調節配列を改変若しくは修飾することによって成し遂げられ得る。例えば、過剰発現は、調節配列（例えばプロモーター）に作動可能に連結された、転写因子又は機能的相同体をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーを導入することによって成し遂げられ得る。例えば、遺伝子を、高い発現レベルに到達するために、強力な構成性プロモーターに作動可能に連結させることができる。このようなプロモーターは、内因性プロモーターであっても、組換えプロモーターであってもよい。あるいは、発現が恒常的となるように、調節配列を除去することができる。所与の遺伝子の天然プロモーターを、遺伝子の発現を増加させるか又は遺伝子の恒常的発現をもたらす異種プロモーターで置き換えてもよい。例えば、転写因子は、工学操作前の同条件下で培養された宿主細胞と比較して、宿主細胞によって、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、又は３００％を超えて過剰発現され得る。さらに、過剰発現はまた、例えば、特定の遺伝子の染色体位置を修飾することによって、特定の遺伝子に隣接する核酸配列、例えばリボソーム結合部位又は転写終結因子などを改変することによって、遺伝子の転写及び／又は遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）を修飾することによって、あるいは、例えばリプレッサータンパク質の発現を遮断するためのアンチセンス核酸分子の使用、又は過剰発現させることを所望する遺伝子の発現を通常抑制する転写因子の遺伝子の欠失若しくは突然変異を含むがこれらに限定されない、当技術分野において慣例である特定の遺伝子の発現を調節解除する任意の他の慣用的な手段によって成し遂げられ得る。ｍＲＮＡの寿命の延長もまた、発現レベルを向上させ得る。例えば、特定の終結因子領域を使用して、ｍＲＮＡの半減期を延長させ得る（Yamanishi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2011) 75:2234及び米国特許第２０１３／０２４４２４３号）。複数のコピーの遺伝子が含まれている場合、遺伝子は、変動するコピー数のプラスミドに位置しても、又は染色体内に組み込まれ増殖させてもよい。宿主細胞が転写因子をコードしている遺伝子を含まない場合、遺伝子を、発現のために宿主細胞に導入することができる。この場合、「過剰発現」は、当業者に公知の任意の方法を使用して遺伝子産物を発現することを意味する。
【０１１１】
当業者は、とりわけ、Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))、Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))、Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))、欧州特許第０４７２８６９号、米国特許第４，６０１，８９３号、Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991))、Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001- 1007 (1993))、国際公開公報第９６／１５２４６号、Malumbres et al. (Gene 134, 15- 24 (1993))、日本特許公開公報第１０−２２９８９１号、Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))及びMakrides (Microbiological Reviews 60, 512-538 (1996))、並びに、遺伝学及び分子生物学に関する周知のテキストにおいて、関連した説明を発見するだろう。
【０１１２】
したがって、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される異種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現は、異種転写因子をコードしている該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を交換又は修飾することによって成し遂げられ得る。この文脈では、「調節配列（エレメント）」は、生物内の特定の遺伝子の発現を増加又は減少させることのできる、核酸分子のセグメントである。正の調節配列は発現を増加させることができ、一方、負の調節配列は発現を減少させることができる。調節配列（（エレメント）は、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ポリアデニル化シグナル、転写終結因子（終結因子配列）、コード配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などを含む。正の調節配列は、エンハンサーを含み得るがこれに限定されない。負の調節配列は、サイレンサーを含み得るがこれに限定されない。この文脈における調節配列の交換によって、前記の異種の転写因子の天然終結因子配列を、より効率的な終結因子配列に交換すること、又は前記の異種転写因子のコード配列を、コドンの最適化されたコード配列（コドン最適化は、該宿主細胞のコドン使用頻度に応じて行なわれる）と交換すること、又は前記の異種転写因子の天然の正の調節エレメントをより効率的な調節エレメントに交換することを意味する。
【０１１３】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される異種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現はさらに、異種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーを、プロモーター制御下に宿主細胞に導入することによって成し遂げられ得る。
【０１１４】
本明細書において使用する「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を促進する領域を指す。プロモーターは典型的には、プロモーターが全く存在しない場合に発現される組換え産物の量と比較して、ヌクレオチド配列から発現される組換え産物の量を増加させる。ある生物に由来するプロモーターを利用して、別の生物から派生する配列からの組換え産物の発現を増強させることができる。プロモーターを、当技術分野において公知である方法（例えば、Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12): 6640-6645 (2000)）を使用して、相同的組換えにより宿主細胞の染色体に組み込むことができる。さらに、１つのプロモーターエレメントは、直列に付された複数の配列に対して発現される産物の量を増加させることができる。したがって、１つのプロモーターエレメントは、１つ以上の組換え産物の発現を増強させることができる。プロモーターの活動性は、その転写効率によって評価され得る。これは、例えばノザンブロット、定量ＰＣＲによる、プロモーターからのｍＲＮＡの転写量の測定によって直接的に、又はプロモーターから発現される遺伝子産物の量の測定によって間接的に決定され得る。
【０１１５】
プロモーターは「誘導性プロモーター」であっても「構成性プロモーター」であってもよい。「誘導性プロモーター」は、特定の因子の有無によって誘導され得るプロモーターを指し、「構成性プロモーター」は、誘導物質に関係なく常に活動性であり、それ故、その関連する遺伝子若しくは遺伝子群の連続的な転写を可能とする、プロモーターを指す。
【０１１６】
好ましい実施態様では、転写因子及び関心対象タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の両方の転写がそれぞれ、誘導性プロモーターによって駆動される。別の好ましい実施態様では、転写因子及び関心対象タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の両方の転写がそれぞれ、構成性プロモーターによって駆動される。さらに別の好ましい実施態様では、転写因子をコードしているヌクレオチド配列の転写は構成性プロモーターによって駆動され、関心対象タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の転写は誘導性プロモーターによって駆動される。さらに別の好ましい実施態様では、転写因子をコードしているヌクレオチド配列の転写は誘導性プロモーターによって駆動され、関心対象タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の転写は構成性プロモーターによって駆動される。一例として、転写因子をコードしているヌクレオチド配列の転写は構成性ＧＡＰプロモーターによって駆動され得、関心対象タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の転写は誘導性ＡＯＸプロモーターによって駆動され得る。１つの実施態様では、転写因子及び関心対象タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の転写は、プロモーター活動性、プロモーター調節及び／又は発現挙動の点で、同じプロモーター又は類似したプロモーターによって駆動される。別の実施態様では、転写因子及び関心対象タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の転写は、プロモーター活動性、プロモーター調節及び／又は発現挙動の点で、異なるプロモーターによって駆動される。
【０１１７】
酵母宿主細胞で使用されるに適したプロモーター配列はMattanovich et al., Methods Mol. Biol. (2012) 824:329-58に記載され、これには、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ又はＧＡＰ）のような解糖酵素のプロモーター及びその変異体、ラクターゼ（ＬＡＣ）及びガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）のプロモーター、翻訳伸長因子プロモーター（ＰＴＥＦ）、及びピキア・パストリスのエノラーゼ１（ＥＮＯ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、リボソームサブユニットタンパク質（ＲＰＳ２、ＲＰＳ７、ＲＰＳ３１、ＲＰＬ１）のプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸ）又は特徴の修飾されたその変異体、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（ＦＬＤ）、イソクエン酸リアーゼプロモーター（ＩＣＬ）、α−ケトイソカプロ酸デカルボキシラーゼプロモーター（ＴＨＩ）、熱ショックタンパク質ファミリーメンバー（ＳＳＡ１、ＨＳＰ９０、ＫＡＲ２）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＮＤ１）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ１）、トランスケトラーゼ（ＴＫＬ１）、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＩＳ１）、二酸化鉄酸化還元酵素（ＦＥＴ３）、高親和性鉄透過酵素（ＦＴＲ１）、抑制性アルカリホスファターゼ（ＰＨＯ８）、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ１）、フェロモン応答転写因子（ＭＣＭ１）、ユビキチン（ＵＢＩ４）、一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＡＤ２）のプロモーター、ミトコンドリア内膜の主要なＡＤＰ／ＡＴＰ担体（ＰＥＴ９）のプロモーター（国際公開公報第２００８/１２８７０１号）、及びギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）プロモーターが含まれる。さらなる適切なプロモーターは、Prielhofer et al. 2017 (BMC Syst Biol. 11(1):123.)、Gasser et al. 2015 (Microb Cell Fact. 14:196.)、Portela et al. 2017（ACS Synth Biol. 6(3):471-484）又はVogl et al. 2016（ACS Synth Biol. 5(2):172-86）によって記載されている。ＡＯＸプロモーターは、メタノールによって誘導され得、そして例えばグルコースによって抑制される。
【０１１８】
適切なプロモーターのさらなる例としては、サッカロマイセス・セレビシエのエノラーゼ（ＥＮＯＩ−１）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター、及びマルターゼ遺伝子（ＭＡＬ）プロモーターが挙げられる。
【０１１９】
酵母宿主細胞用の他の有用なプロモーターは、Romanos et al, 1992, Yeast 8:423-488によって記載されている。
【０１２０】
本発明の異種転写因子（例えばｓｙｎＭｓｎ４ｐ）の各コード配列を、ＧＡＰプロモーターと共に、組込みプラスミド、好ましくはＢＢ３に組み込み得る。
【０１２１】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現は、同種転写因子をコードしている該ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターを使用することによって成し遂げられ得る。内因性の同種転写因子に作動可能に連結されている、内因性／天然プロモーターを別のより強力なプロモーターと交換することにより、高い発現レベルに到達し得る。このようなプロモーターは、誘導性であっても、構成性であってもよい。内因性プロモーターの修飾及び／又は置き換えは、当技術分野において公知の方法を使用した、突然変異又は相同的組換えによって行なわれ得る。
【０１２２】
本発明の同種転写因子（例えばピキア・パストリスにおいて発現されている場合には、Ｐ．パストリスの天然Ｍｓｎ４ｐ）の各コード配列を、強力な構成性又は誘導性プロモーター、例えばＧＡＰプロモーター、ｐＴＨＩ１１、ｐＳＢＨ１７、又はｐＰＯＲ１などと共に、組込みプラスミド、例えばＢＢ３に組み込み得る。
【０１２３】
転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現は、当技術分野において公知の他の方法によって、例えば、Marx et al., 2008 (Marx, H., Mattanovich, D. and Sauer, M. Microb Cell Fact 7 （2008): 23）及びPan et al., 2011（Pan et al., FEMS Yeast Res. (2011) May; (3):292-8）によって記載されているように、それらの内因性調節領域を遺伝子的に修飾することによって成し遂げられ得、このような方法としては、例えば、転写因子（群）の発現を増加させる組換えプロモーターの組込みが挙げられる。形質転換は、Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385に記載されている。
【０１２４】
したがって、本発明は、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現を含み得、これは、同種転写因子をコードしている該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を交換又は修飾することによってさらに成し遂げられる。
【０１２５】
この文脈における調節配列を交換することによって、それは例えば、前記の同種転写因子の天然終結因子配列を、より効率的な転写終結因子配列に交換すること、又は、前記の同種転写因子のコード配列を、コドンの最適化されたコード配列（コドン最適化は、該宿主細胞のコドン使用頻度に応じて行なわれる）と交換すること、又は前記の同種転写因子の天然の正の調節エレメントをより効率的な正の調節エレメントに交換することが意味される。
【０１２６】
この文脈において本明細書において使用する「調節配列を修飾すること」という用語は、別の正の調節配列の付加、又は負の調節配列の欠失を意味する。したがって、調節配列を修飾することは、前記の同種／異種転写因子（エレメント）の天然発現カセットに存在しない、別の正の調節配列を導入／付加すること、又は、前記の同種／異種転写因子の天然発現カセットに通常存在する、負の調節配列（エレメント）を欠失させることを指す。天然発現カセットは、天然に細胞内に存在し、かつ、組換え遺伝子技術を使用してヒトによって人工的に作製されなかった、該タンパク質の発現の正の調節又は負の調節に関与している、その５’ フランキング配列及び３’フランキング配列、例えばプロモーター、終結因子、ポリアデニル化シグナルなどを含む、タンパク質をコードしている配列を意味する。異種並びに同種の天然発現カセットが存在し得る。ある種由来の発現カセットが別の種に導入され、その結果、該天然発現カセットによってコードされているタンパク質の発現が依然として生じる場合、そこで、この天然発現カセットは、異種天然発現カセットと捉えられる。
【０１２７】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現はさらに、同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをプロモーターの制御下に宿主細胞に導入することによって成し遂げられ得る。
【０１２８】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドの過剰発現は、ｉ）前記同種転写因子の天然プロモーターを、同種転写因子をコードしているポリヌクレオチドに作動可能に連結された異なるプロモーター、例えばより強力なプロモーターと交換する工程、ｉｉ）前記の異種及び／又は同種の転写因子の天然終結因子配列を、より効率的な終結因子配列と交換する工程、ｉｉｉ）前記の異種及び／又は同種の転写因子のコード配列を、コドンの最適化されたコード配列（例えば、ｍＲＮＡの安定性若しくは半減期のために最適化されているような、又は、最も頻度の高いコドンを使用するためなどの）（ここでのコドン最適化は、該宿主細胞のコドン使用頻度に従って行われる）と交換する工程、ｉｖ）前記の異種及び／又は同種の転写因子の天然の正の調節エレメントを、より効率的な調節エレメントと交換する工程、ｖ）前記の同種転写因子の天然発現カセットに存在しない、別の正の調節エレメントを導入する工程、ｖｉ）前記の同種転写因子の天然発現カセットに通常存在する、負の調節エレメントを欠失させる工程、又はｖｉｉ）異種及び／又は同種の転写因子又はその組合せをコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーを導入する工程によって成し遂げられる。
【０１２９】
本発明はさらに、配列番号１５〜２７に示されるようなアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも１１％の配列同一率を有する、配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される転写因子（群）を含み得る。さらなる実施態様では、本発明はさらに、配列番号１５〜２７に示されるようなアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも１１％、例えば１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又はさらには１００％の配列同一率を有する、配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される転写因子（群）を含み得る。
【０１３０】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される転写因子（群）はさらに、任意の核局在シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。したがって、本発明の転写因子は、本明細書の何処か他に記載されているようなＤＮＡ結合ドメイン、本明細書の何処か他に記載されているような任意の活性化ドメイン、及び任意のＮＬＳを含み得る。この具体的な文脈における任意のＮＬＳは、合成ＮＬＳ（例えば配列番号８６）、又はウイルス性ＮＬＳ、又は本発明の転写因子若しくは本明細書に記載のような任意の種の他のタンパク質のＮＬＳを含み得る。ＮＬＳは、核輸送により細胞核内に移入するためのタンパク質を「タグ化」する、アミノ酸配列である。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上に露出した正に荷電したリジン又はアルギニンの１つ以上の短い配列からなる。配列番号８５（ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐの予測されるＮＬＳ：EPRKKETKQRKRAK；ＳｅｑＮＬＳによる最善の予測による（スコア＞０．８９）；http://mleg.cse.sc.edu/seqNLS/MainProcess.cgi）又は配列番号８６（ｓｙｎＭｓｎ４ｐのＮＬＳ：PKKKRKV）に示されるようなアミノ酸配列が、本発明におけるＮＬＳとして好ましい。
【０１３１】
核局在シグナルは、同種のＮＬＳであっても又は異種のＮＬＳであってもよい。この文脈において、「異種ＮＬＳ」という用語は、外来起源（又は種、例えばサッカロマイセス・セレビシエ由来のＮＬＳ又はヒトＮＬＳ、Weninger et al. 2015. FEMS Yeast Res. 15:7も参照）から派生するＮＳＬを指すか、又は合成配列であり、外来起源以外の起源（又は種、例えばピキア・パストリス）に使用される。「同種ＮＬＳ」は、同じ起源（又は種、例えばピキア・パストリスのＮＬＳ）から派生するものであり、同じ起源（又は種、例えばピキア・パストリス）に使用される。
【０１３２】
本発明はさらに、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される転写因子（群）を含み得、該転写因子（群）は、関心対象のタンパク質の発現のために使用されるプロモーターを刺激しない。これにより、本発明の転写因子は、関心対象タンパク質のプロモーターには全く影響を及ぼさないことを意味する。それはむしろ、関心対象タンパク質以外の異なるタンパク質のプロモーターに対して作用を及ぼす。この文脈において、「刺激しない」又は「無刺激」という用語は、関心対象タンパク質のプロモーターに対して全く作用を及ぼさないか、又は、関心対象タンパク質のプロモーターに対して軽微な作用を及ぼすことを意味し、よって結果として、約１０％以下という関心対象タンパク質の収量の僅かな増加、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の該関心対象タンパク質の収量の増加が生じる。
【０１３３】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用は、宿主細胞として真核細胞を使用する。本明細書において使用する「宿主細胞」は、タンパク質の発現を起こすことができ、場合によりタンパク質の分泌を起こすことができる細胞を指す。このような宿主細胞が、本発明の方法に適用される。その目的のために、宿主細胞が少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するためには、該転写因子をコードしているポリヌクレオチド配列は、細胞内に存在するか、細胞内に導入される。真核細胞の例としては、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、線虫細胞、昆虫細胞、幹細胞、真菌細胞、又は酵母細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３４】
好ましくは、真核宿主細胞は真菌細胞である。より好ましいのは酵母宿主細胞である。酵母細胞の例としては、サッカロマイセス属（例えばサッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、コマガタエラ属（コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス（Komagataella pseudopastoris）又はコマガタエラ・ファフィ）、クルイベロマイセス属（例えばクルイベロマイセス・ラクティス、クルイベロマイセス・マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus））、カンジダ属（例えばカンジダ・ユチリス（Candida utilis）、カンジダ・カカオイ（Candida cacaoi））、ゲオトリウム属（例えばゲオトリウム・フェルメンタス（Geotrichum fermentans））、並びにハンゼヌラ・ポリモルファ及びヤロウィア・リポリティカが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３５】
好ましい実施態様では、ピキア属が特に興味深い。ピキアは、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）及びピキア・アングスタ（Pichia angusta）の菌種をはじめとする、多くの菌種を含む。最も好ましいのはピキア・パストリス菌種である。
【０１３６】
以前ピキア・パストリスだった菌種は、分類され、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ及びコマガタエラ・シュードパストリスと再命名された。それ故、ピキア・パストリスは、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ及びコマガタエラ・シュードパストリスの双方と同義語である。
【０１３７】
本発明において有用なピキア・パストリス株の例は、Ｘ３３及びそのサブタイプであるＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ；ＣＢＳ７４３５（ｍｕｔ＋）及びそのサブタイプであるＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳ、ＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳΔＡｒｇ、ＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳΔＨｉｓ、ＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳΔＡｒｇΔＨｉｓ、ＣＢＳ７４３５ｍｕｔＳＰＤＩ＋、ＣＢＳ７０４（＝ＮＲＲＬＹ−１６０３＝ＤＳＭＺ７０３８２）、ＣＢＳ２６１２（＝ＮＲＲＬ Ｙ−７５５６）、ＣＢＳ９１７３−９１８９及びＤＳＭＺ ７０８７７並びにその突然変異体である。これらの酵母株は、工業製品供給業者、又は細胞集積所、例えばアメリカ合衆国細胞系統保存期間（ＡＴＣＣ）、ドイツのブラウンシュヴァイクにある「ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）」（ＤＳＭＺ）から、又はオランダのユトレヒトにあるオランダ「ヴェステルダイク菌類多様性研究所（Centraalbureau voor Schimmelcultures）」（ＣＢＳ）から入手可能である。
【０１３８】
さらなる好ましい実施態様によると、酵母宿主細胞は、ピキア・パストリス（コマガタエラ菌種）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガー、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニー、コマガタエラ菌種、及びシゾサッカロミケス・ポンベからなる群より選択される。これらの酵母株は、細胞集積所、例えばアメリカ合衆国細胞系統保存期間（ＡＴＣＣ）、ドイツのブラウンシュヴァイクにある「ドイツ微生物細胞培養コレクション」（ＤＳＭＺ）から、又はオランダのユトレヒトにあるオランダ「ヴェステルダイク菌類多様性研究所」（ＣＢＳ）から入手可能である。
【０１３９】
本発明はさらに、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される関心対象の組換えタンパク質が酵素であり得るということを含む。好ましい酵素は、工業的用途のために、例えば洗浄剤、デンプン、燃料、織物、パルプ及び紙、油、パーソナルケア製品の製造に、又は例えばパン焼き、有機合成などに使用することができるものである。（Kirk et al., Current Opinion in Biotechnology (2002) 13:345-351参照）。
【０１４０】
本発明はさらに、関心対象の組換えタンパク質が、治療用タンパク質であり得るということを含む。関心対象タンパク質は、抗原結合性タンパク質のようなバイオ医薬品物質、例えば本明細書においてより詳細に記載されているような、抗体又はその抗体断片、又は抗体由来骨格、単一ドメイン抗体及びその誘導体、他の抗体に由来しない親和性骨格、例えば抗体模倣体、増殖因子、ホルモン、ワクチンなどとして適したタンパク質であり得るがこれらに限定されない。
【０１４１】
このような治療用タンパク質としては、インシュリン、インシュリン様増殖因子、ヒト成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、例えばインターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、又はＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦα、及びＴＮＦβ、ＴＲＡＩＬ；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質１、及び血管内皮増殖因子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４２】
治療用タンパク質のさらなる例としては、血液凝固因子（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ）、フサリウム（Fusarium）由来のアルカリプロテアーゼ、カルシトニン、ＣＤ４受容体ダルベポエチン、デオキシリボヌクレアーゼ（膿疱性線維症）、エリスロポエチン、ユートロピン（ヒト成長ホルモン誘導体）、卵胞刺激ホルモン（フォリトロピン）、ゼラチン、グルカゴン、グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病）、アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー由来のグルコースオキシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、成長ホルモン（ソマトトロピン）、Ｂ型肝炎ワクチン、ヒルジン、ヒト抗体断片、ヒトアポリポタンパク質Ａ１、ヒトカルシトニン前駆体、ヒトコラゲナーゼＩＶ、ヒト表皮増殖因子、ヒトインシュリン様増殖因子、ヒトインターロイキン６、ヒトラミニン、ヒトプロアポリポタンパク質Ａ１、ヒト血清アルブミン、インシュリン、インシュリン及びムテイン、インシュリン、インターフェロンα及びムテイン、インターフェロンβ、インターフェロンγ（ムテイン）、インターロイキン２、黄体形成ホルモン、モノクローナル抗体５Ｔ４、マウスコラーゲン、ＯＰ−１（骨形成、神経保護因子）、オプレルベキン（インターロイキン１１作動薬）、有機ホスホヒドロラーゼ、血小板由来成長因子の作動薬、フィターゼ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、組換えプラスミノーゲン活性化因子Ｇ、スタフィロキナーゼ、幹細胞因子、破傷風毒素断片Ｃ、組織プラスミノーゲン活性化因子、及び腫瘍壊死因子（Schmidt, Appl Microbiol Biotechnol (2004) 65:363-372参照）が挙げられる。
【０１４３】
好ましくは、治療用タンパク質は抗原結合性タンパク質である。より好ましくは、治療用タンパク質は、抗体、抗体断片、又は抗体模倣体を含む。さらにより好ましくは、治療用タンパク質は、抗体又は抗体断片である。
【０１４４】
好ましい実施態様では、タンパク質は抗体断片である。「抗体」という用語は、エピトープに適合し認識する特異的な形状を有する、任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことを意図するが、ここで１つ以上の非共有結合による相互作用が、分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化させる。典型的な抗体分子は免疫グロブリンであり、全ての起源、例えばヒト、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物、ニワトリ、他のトリなどに由来する全種類の免疫グロブリン、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹなどが「抗体」であると考えられる。例えば、抗体断片は、Ｆｖ（ＶＬとＶＨとを含む分子）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（ペプチドリンカーによって接続されたＶＬとＶＨとを含む分子）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（単一可変ドメインと３つのＣＤＲとを含む分子）、及びその多価提示物が挙げられ得るがこれらに限定されない。抗体又はその断片は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、又はその断片であり得る。治療用タンパク質の例としては、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体断片、例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ、直列型ｓｃＦｖ、二重特異的直列型ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨ及びＶＬ、又はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、細胞内発現抗体、ディアボディ、テトラボディ、ミニボディ、又はモノボディが挙げられる。好ましくは、抗体断片は、ｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）である。抗体模倣体は、抗原に結合するが、抗体と構造的に関連していない有機化合物を指す。このような抗体模倣体は、約３〜２０ｋＤａの分子量を有する、人工ペプチド又はタンパク質、例えば、先行技術において公知であるような、アフィボディ分子、アフィリン（affilins）、アフィマー、アフィチン（affitins）、アルファボディ（alphabodies）、アンチカリン（anticalin）、アビマー、人工アンキリン反復タンパク質（DARPins）、モノボディ、ナノクランプ（nanoCLAMPs）を指す。
【０１４５】
関心対象のタンパク質はさらに食品添加物であってもよい。食品添加物は、食品、飼料、又は化粧品などにおける、栄養補助剤、食事補助剤、消化補助剤として使用されるタンパク質である。食品は、例えば、ブイヨン、デザート、シリアルバー、お菓子、スポーツドリンク、ダイエット製品、又は他の栄養製品であり得る。「食物」は、天然又は人工の食事など、又はヒトによって食べられる、摂取される、消化されることを目的としたか又は適したこのような食事の成分を意味する。
【０１４６】
関心対象のタンパク質はさらに飼料添加物であってもよい。飼料添加物として使用され得る酵素の例としては、フィターゼ、キシラナーゼ、及びβ−グルカナーゼが挙げられる。
【０１４７】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用は、少なくとも１つの小胞体（ＥＲ）補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを該宿主細胞において過剰発現させる工程、又は過剰発現するように該宿主細胞を工学操作する工程をさらに含み得る。この文脈において、「ＥＲ」という用語は、「小胞体」を指す。好ましくは、該宿主細胞において、少なくとも１つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを追加して過剰発現させることによって、関心対象の組換えタンパク質の収量は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現しているが、少なくとも１つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドは過剰発現していない宿主細胞と比較して増加する。
【０１４８】
本明細書において使用する「少なくとも１つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド」という用語は、１つの小胞体補助タンパク質をコードしている１つのポリヌクレオチド、少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている２つのポリヌクレオチド、３つの小胞体補助タンパク質をコードしている３つのポリヌクレオチドなどを意味する。
【０１４９】
「小胞体補助タンパク質」という用語は、シャペロン、コシャペロン及び／又はヌクレオチド交換因子を指す。本明細書において使用する「シャペロン」という用語は、他のポリペプチドのフォールディング、アンフォールディング、アセンブリ、又はディスアセンブリを支援するポリペプチドに関する。シャペロンは、新規に翻訳された真核細胞室内のタンパク質及び分泌タンパク質の正しいフォールディング又はアンフォールディング及び輸送に関与する、タンパク質を指す。シャペロンには多くの異なるファミリーがあり、各々のファミリーは異なった方法でタンパク質のフォールディングを助けるように作用する。小胞体シャペロンと細胞質シャペロンが存在する。
【０１５０】
酵母細胞内の細胞質シャペロンは、Ｓｓａ１ｐ、Ｓｓａ２ｐ、Ｓｓａ３ｐ、Ｓｓａ４ｐ、Ｓｓｂ１ｐ、Ｓｓｂ２ｐ、Ｓｓｅ１ｐ、Ｓｓｅ２ｐを含むがこれらに限定されず、これはＨｓｐ７０システムを指す。Ｓｓａ１−４ｐは、新規合成されたタンパク質のフォールディング、並びに小胞体及びミトコンドリアへの中間体タンパク質の輸送に関与している。Ｓｓｂ１ｐ及びＳｓｂ２ｐは、リボソームに結合した新生鎖のフォールディングに関与し、Ｓｓｅ１ｐ及びＳｓｅ２ｐは、Ｓｓａｐ及びＳｓｂｐのためのヌクレオチド交換因子として作用する。Ｙｄｊ１ｐ及びＳｉｓ１ｐは酵母におけるＨｓｐ４０システムに属し、コシャペロンとして非天然ポリペプチドと相互作用し、Ｓｓａ１−４ｐによるＡＴＰの加水分解をトリガーし、膜間のタンパク質輸送に関与する。Ｓｎｌ１ｐ、Ｆｅｓ１ｐ、及びＣｎｓ１ｐは、Ｓｓａ１−４ｐの他のコシャペロンである（Chang et al., Cell 128 (2007)）。この文脈において、「コシャペロン」という用語は、タンパク質のフォールディング及び他の機能においてシャペロンを支援するタンパク質を指す。コシャペロンは、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０によって媒介されるタンパク質フォールディングを支援する、クライアントではない結合分子である。
【０１５１】
酵母細胞における小胞体シャペロンは、例えばＫａｒ２ｐを含むがこれらに限定されず、これはＨｓｐ７０システム又はＰｄｉ１ｐを指す。Ｋａｒ２ｐは、アセンブリしていない／ミスフォールディングされた小胞体タンパク質サブユニットに結合し、小胞体ストレス応答（unfolded protein response）（ＵＰＲ）を調節して、小胞体へのタンパク質の移行に関与する。それは、そのコシャペロン、例えばＬｈｓ１ｐ、Ｓｉｌ１ｐ、Ｅｒｊ５ｐ、Ｓｅｃ６３ｐ、Ｓｃｊ１ｐ、Ｊｅｍ１ｐ又は当技術分野において公知であるその他のものなどと相互作用する。Ｌｈｓ１ｐ及びＳｉｌ１ｐは、Ｋａｒ２ｐのヌクレオチド交換因子を指し、Ｈｓｐ７０システムに属する（Chang et al., Cell 128 (2007)）。この文脈において、「ヌクレオチド交換因子」という用語は、ヌクレオシド二リン酸（ＡＤＰ、ＧＤＰ）を、他のタンパク質に（好ましくはシャペロンに）結合したヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ）と交換（置換）することを刺激するタンパク質を指す。Ｅｒｊ５ｐ、Ｓｅｃ６３及びＳｃｊ１は、Ｈｓｐ４０型のタンパク質群に属する。Ｅｒｊ５ｐは、例えば、Ｊドメインを有するＩ型膜タンパク質であり；小胞体のフォールディング能を保つことに必要とされ；必須ではないＥＲＪ５遺伝子の欠失により、恒常的に誘発される小胞体ストレス応答が生じる（Mehnert et al., Molecular biology of the cell, 26 (2014)）。
【０１５２】
少なくとも１つの小胞体補助タンパク質は、追加的な過剰発現のために、又は追加して過剰発現させるために宿主細胞を工学操作するために、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・ボイディニー、アスペルギルス・ニガー、好ましくはピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）から取得され得る。他の真核生物種に由来する最も近縁なホモログも、少なくとも１つの小胞体補助タンパク質のために取得され得る。
【０１５３】
好ましくは、該宿主細胞において追加して過剰発現される、前記の本発明の小胞体補助タンパク質は、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＫａｒ２ｐ）に対して、少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％の配列同一率を有するその機能的ホモログを有する。好ましくは、配列番号２８の機能的相同体は配列番号２９〜３６である。したがって、該宿主細胞において追加して過剰発現される、前記の本発明の小胞体補助タンパク質は、配列番号２８〜３６に示されるようなアミノ酸配列を有する。配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列を有する小胞体補助タンパク質が好ましい。好ましくは、補助タンパク質は、上記に示されているような本発明の転写因子と同一ではなく、関心対象のタンパク質と同一ではない。
【０１５４】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、同じベクター又はプラスミド上の、同じプロモーターの制御下に組み込まれても、又は異なるプロモーターの制御下に（Ｍｓｎ４ｐはあるプロモーターの制御下に、Ｋａｒ２ｐは異なるプロモーターの制御下に）組み込まれてもよい。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、同時に又は連続的に（１つずつ）、異なるベクター又はプラスミド上に組み込まれてもよい。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドと追加の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの両方が、異なるベクター又はプラスミド上に導入され得る場合、少なくとも１つの転写因子のみを有する一方のプラスミドと、少なくとも１つの追加の小胞体補助タンパク質のための過剰発現カセットを有する別のプラスミドが、好ましくは使用される。
【０１５５】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、同じベクター又はプラスミド上に、同じプロモーターの制御下に又は異なるプロモーターの制御下に組み込まれ得る（一方のプロモーターの制御下にＭｓｎ４ｐの１つ以上のコピー、異なるプロモーターの制御下にＫａｒ２ｐの１つ以上のコピー）。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、同時に又は連続的に（１つずつ）、異なるベクター又はプラスミド上に組み込まれてもよい。
【０１５６】
追加の小胞体補助タンパク質の過剰発現は、関心対象タンパク質が小胞体内で正しくフォールディングされ、これにより、関心対象タンパク質の収量がさらにより増加することを確実にし得ると推定される。
【０１５７】
前記の本発明のＭｓｎ４ｐ転写因子（群）及び前記の第一のＫａｒ２ｐ補助タンパク質（群）の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質の収量を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明のピキア・パストリスの天然（ホモログ）転写因子Ｍｓｎ４ｐ及び前記のピキア・パストリスの第一の小胞体補助タンパク質Ｋａｒ２ｐの過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明の合成転写因子ｓｙｎＭｓｎ４ｐ及び前記のピキア・パストリスの第一の小胞体補助タンパク質Ｋａｒ２ｐの過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも３０％、例えば４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、又は５００％増加させ得る。
【０１５８】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用はさらに、該宿主細胞において少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドを過剰発現させること、又は過剰発現するように該宿主細胞を工学操作することを含み得る。
【０１５９】
本発明が２つの追加の小胞体補助タンパク質と言及する場合、これは、「第一の小胞体補助タンパク質」及び「第二の小胞体補助タンパク質」を意味する。本発明が３つの追加の小胞体補助タンパク質と言及する場合、これは、「第一の小胞体補助タンパク質」及び「第二の小胞体補助タンパク質」及び「第三の小胞体補助タンパク質」を意味する。好ましくは、該宿主細胞において少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドを追加して過剰発現させることによって、前記の関心対象の組換えタンパク質の収量は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現しているが、少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドを追加して過剰発現していない、宿主細胞と比較して増加している。該宿主細胞において少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドを追加して過剰発現させることによって、前記の関心対象の組換えタンパク質の収量は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現し、少なくとも１つの追加の小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現しているが、少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドは過剰発現していない、宿主細胞と比較して増加している。
【０１６０】
好ましくは、第一の小胞体補助タンパク質は、上記のような配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＫａｒ２ｐ）に対して、少なくとも７０％、例えば７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％の配列同一率を有するその機能的相同体を有する。好ましくは、該転写因子に追加して過剰発現されている第一の小胞体補助タンパク質としての配列番号２８の機能的相同体は、配列番号２９〜３６である。したがって、該宿主細胞において追加して過剰発現されている、前記の本発明の第一の小胞体補助タンパク質は、配列番号２８〜３６に示されるようなアミノ酸配列を有する。第一の小胞体補助タンパク質には配列番号２８が好ましい。
【０１６１】
好ましくは、第二の小胞体補助タンパク質は、配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列、又は、配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＬｈｓ１ｐ）に対して、少なくとも２５％、例えば２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％の配列同一率を有するその機能的相同体を有する。したがって、本発明は、本発明の転写因子と、配列番号２８に記載の第一の補助タンパク質（ピキア・パストリスのＫａｒ２ｐ）又はその機能的相同体及び配列番号３７に記載の第二の小胞体補助タンパク質（ピキア・パストリスのＬｈｓ１ｐ）又はその機能的相同体との組合せの過剰発現を含む。好ましくは、該転写因子に対して及び第一の小胞体補助タンパク質に対して追加して過剰発現させた、第二の小胞体補助タンパク質としての配列番号３７の機能的相同体は、配列番号３８〜４６である。
【０１６２】
配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列又はその機能的ホモログを有する第二の小胞体補助タンパク質は、追加の過剰発現のために、又は追加して過剰発現させるために宿主細胞を工学操作するために、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・ボイディニー、シゾサッカロミケス・ポンベ、アスペルギルス・ニガー、好ましくはピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）から取得され得る。
【０１６３】
前記の本発明のＭｓｎ４ｐ転写因子（群）及び前記の第一のＫａｒ２ｐ補助タンパク質（群）及び前記の第二のＬｈｓ１ｐ補助タンパク質（群）の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明のピキア・パストリスの天然転写因子Ｍｓｎ４ｐ及び前記のピキア・パストリスの第一の小胞体補助タンパク質Ｋａｒ２ｐ及び前記のピキア・パストリスの第二の補助タンパク質Ｌｈｓ１ｐの過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも６０％、例えば７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明の合成転写因子ｓｙｎＭｓｎ４ｐ及び前記のピキア・パストリスの第一の小胞体補助タンパク質Ｋａｒ２ｐ及び前記のピキア・パストリスの第二の補助タンパク質Ｌｈｓ１ｐの過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｓｃＦｖ（配列番号１３）の収量を少なくとも８０％、例えば９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。
【０１６４】
本発明は、本発明の転写因子と、配列番号２８に記載の第一の補助タンパク質又はその機能的相同体及び配列番号４７に記載の別の第二の小胞体補助タンパク質又はその機能的相同体との組合せの別の過剰発現を含む。
【０１６５】
好ましくは、他の第二の小胞体補助タンパク質は、配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列、又はその相同体を有し、ここでの相同体は、配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＳｉｌ１ｐ）に対して、少なくとも２０％、例えば２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％の配列同一率を有する。好ましくは、該転写因子に対して及び第一の小胞体補助タンパク質に対して追加して過剰発現させた、他の第二の小胞体補助タンパク質としての配列番号４７の機能的相同体は、配列番号４８〜５４である。
【０１６６】
配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列又はその機能的ホモログを有する第二の小胞体補助タンパク質は、追加の過剰発現のために、又は追加して過剰発現させるために宿主細胞を工学操作するために、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・ボイディニー、好ましくはピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）から取得され得る。他の真核生物種に由来する最も近縁なホモログも、配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列又はその機能的ホモログを有する、少なくとも１つの小胞体補助タンパク質のために取得され得る。
【０１６７】
本発明の前記のＭｓｎ４ｐ転写因子（群）及び前記の第一のＫａｒ２ｐ補助タンパク質（群）及び前記の第二のＳｉｌ１ｐ補助タンパク質（群）の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。
【０１６８】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の２つの小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、同じベクター又はプラスミド上の、同じプロモーターの制御下に、又は異なるプロモーターの制御下に組み込まれる（（ａ）Ｍｓｎ４ｐはあるプロモーターの制御下に、Ｋａｒ２ｐは異なるプロモーターの制御下に、Ｌｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐは別の異なるプロモーターの制御下に、あるいは、ｂ）Ｍｓｎ４ｐ及びＫａｒ２ｐは同じプロモーターの制御下に、Ｌｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐは異なるプロモーターの制御下に、あるいはｃ）Ｍｓｎ４ｐはあるプロモーターの制御下に、Ｋａｒ２ｐ及びＬｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐは別のプロモーターの制御下に）。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の２つの小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチド（一方のポリヌクレオチドは第一の小胞体補助タンパク質をコードし、別のポリヌクレオチドは他の第二の小胞体補助タンパク質をコードしている）は、同時に又は連続的に（１つずつ）、別々のベクター又はプラスミド上に組み込まれる（一方のベクター／プラスミドは、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドを含み、別のベクター／プラスミドは、第一及び第二の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む）。一例として、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドと追加の少なくとも２つの小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの両方が、別々のベクター又はプラスミド上に導入され得る場合、プロモーター制御下に少なくとも１つの転写因子のみを有する組込みプラスミドＢＢ３、及び追加の２つの小胞体補助タンパク質（例えば、Ｋａｒ２ｐはプロモーター制御下にあり、Ｌｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐは別のプロモーターの制御下にある）を有する別の組込みプラスミドＢＢ３を使用することができる。
【０１６９】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、少なくとも２つの追加の小胞体補助タンパク質の１つ以上のコピーをコードしているポリヌクレオチドは、同じベクター又はプラスミド上に、同じプロモーターの制御下に又は異なるプロモーター（群）の制御下に組み込まれる（ａ）一方のプロモーターの制御下にＭｓｎ４ｐの１つ以上のコピー、異なるプロモーターの制御下にＫａｒ２ｐの１つ以上のコピー、及び別の異なるプロモーターの制御下にＬｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐの１つ以上のコピー、あるいはｂ）同じプロモーターの制御下にＭｓｎ４ｐ及びＫａｒ２ｐの１つ以上のコピー、異なるプロモーターの制御下にＬｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐの１つ以上のコピー、あるいはｃ）一方のプロモーターの制御下にＭｓｎ４ｐの１つ以上のコピー、別のプロモーターの制御下にＫａｒ２ｐ及びＬｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐの１つ以上のコピー）。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の２つの小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピー（一方のポリヌクレオチドは第一の小胞体補助タンパク質をコードし、別のポリヌクレオチドは他の第二の小胞体補助タンパク質をコードする）は、同時に又は連続的に（１つずつ）、別の異なるベクター又はプラスミド上に組み込まれる（一方のベクター／プラスミドは、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドを含み、別のベクター／プラスミドは、第一及び第二の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む）。
【０１７０】
２つの追加の小胞体補助タンパク質（Ｋａｒ２ｐとＬｈｓ１ｐ又はＫａｒ２ｐとＳｉｌ１ｐ）の過剰発現は、関心対象タンパク質が小胞体内で正しくフォールディングされ、これにより、関心対象タンパク質の収量／力価がさらにより増加することを確実にし得る。この実施態様では、第二の補助タンパク質（例えばＬｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐ）は、関心対象タンパク質をフォールディングする場合、コシャペロンとして第一の小胞体補助タンパク質（例えばＫａｒ２ｐ）と相互作用し得る。
【０１７１】
前記の追加の小胞体補助タンパク質（例えばＫａｒ２ｐ、Ｌｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐ）の過剰発現又はそれを過剰発現するように宿主細胞を工学操作することは、当業者には公知の任意の方法で成し遂げられ、これは、本発明の同種転写因子について、又は本発明の異種転写因子についても、以前に本明細書に記載されている。
【０１７２】
本発明は、本発明の転写因子と、配列番号２８に記載の第一の小胞体補助タンパク質又はその機能的相同体、及び配列番号３７／配列番号４７に記載の別の第二の小胞体補助タンパク質又はその機能的相同体、及び場合により配列番号５５に記載の第三の小胞体補助タンパク質又はその機能的相同体との組合せの別の過剰発現を含む。
【０１７３】
好ましくは、第三の小胞体補助タンパク質は、配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列又はその相同体を有し、ここでの相同体は、配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＥｒｊ５ｐ）に対して、少なくとも２５％、例えば２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％の配列同一率を有する。好ましくは、前記転写因子、第一の小胞体補助タンパク質、及び第二の小胞体補助タンパク質に追加して過剰発現させた第三の小胞体補助タンパク質としての配列番号５５の機能的相同体は、配列番号５６〜６４である。
【０１７４】
配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列又はその機能的ホモログを有する第三の小胞体補助タンパク質は、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・ボイディニー、シゾサッカロミケス・ポンベ、アスペルギルス・ニガーから、好ましくはピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）から取得される。
【０１７５】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の３つの小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、同じベクター又はプラスミド上に、同じプロモーターの制御下に又は異なるプロモーターの制御下に組み込まれる。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の３つの小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチド（１つのポリヌクレオチドは、第一の小胞体補助タンパク質をコードし、別のポリヌクレオチドは、他の第二の小胞体補助タンパク質をコードし、別のポリヌクレオチドは、他の第三の小胞体補助タンパク質をコードする）は、同時に又は連続的に（１つずつ）、別の異なるベクター又はプラスミド上に組み込まれる（一方のベクター／プラスミドは、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドを含み、別のベクター／プラスミドは、第一、第二及び第三の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む）。一例として、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドと追加の３つの小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの両方が、異なるベクター又はプラスミド上に導入され得る場合、プロモーター制御下に少なくとも１つの転写因子のみを有する組込みプラスミドＢＢ３及び追加の３つの小胞体補助タンパク質（例えば、Ｋａｒ２ｐはプロモーター制御下にあり、Ｌｈｓ１ｐ又はＳｉｌ１ｐは別のプロモーターの制御下にあり、Ｅｒｊ５ｐはまた別のプロモーターの制御下にある）を有する別の組込みプラスミドＢＢ３を使用することができる。
【０１７６】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の３つの小胞体補助タンパク質の１つ以上をコードしているポリヌクレオチドは、同じベクター又はプラスミド上に、同じプロモーターの制御下に又は異なるプロモーターの制御下に組み込まれる。少なくとも１つの（同種及び／又は異種の）転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の３つの小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピー（１つのポリヌクレオチドは、第一の小胞体補助タンパク質をコードし、別のポリヌクレオチドは、他の第二の小胞体補助タンパク質をコードし、別のポリヌクレオチドは、第三の小胞体補助タンパク質をコードする）は、同時に又は連続的に（１つずつ）、別の異なるベクター又はプラスミド上に組み込まれる（一方のベクター／プラスミドは、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドを含み、別のベクター／プラスミドは、第一、第二及び第三の小胞体補助タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む）。
【０１７７】
前記の本発明のＭｓｎ４ｐ転写因子（群）及び前記の第一のＫａｒ２ｐ補助タンパク質（群）及び前記の第二のＬｈｓ１ｐ補助タンパク質（群）及び前記の第三のＥｒｊ５ｐ補助タンパク質（群）の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明のピキア・パストリスの天然転写因子Ｍｓｎ４ｐ、及び前記のピキア・パストリスの第一の小胞体補助タンパク質Ｋａｒ２ｐ、及び前記のピキア・パストリスの第二の小胞体補助タンパク質Ｌｈｓ１ｐ、及び前記のピキア・パストリスの第三の補助タンパク質Ｅｒｊ５ｐの過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明の合成転写因子ｓｙｎＭｓｎ４ｐ、及び前記のピキア・パストリスの第一の小胞体補助タンパク質Ｋａｒ２ｐ、及び前記のピキア・パストリスの第二の小胞体補助タンパク質Ｌｈｓ１ｐ、及び前記のピキア・パストリスの第三の小胞体補助タンパク質Ｅｒｊ５ｐの過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｖＨＨ（配列番号１４）の収量を少なくとも７０％、例えば８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。
【０１７８】
本発明の前記のＭｓｎ４ｐ転写因子（群）、及び前記の第一のＫａｒ２ｐ補助タンパク質（群）、及び前記の第二のＳｉｌ１ｐ補助タンパク質（群）、及び前記の第三のＥｒｊ５ｐ補助タンパク質（群）の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質ｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。
【０１７９】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用は、１つの追加の転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを該宿主細胞において過剰発現させること、又は過剰発現するよう該宿主細胞を工学操作することをさらに含み得る。したがって、該宿主細胞は、本発明の少なくとも１つの転写因子及び１つの追加の転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現する。好ましくは、該宿主細胞において少なくとも１つの追加の転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させることによって、前記の関心対象の組換えタンパク質の収量は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現しているが少なくとも１つの追加の転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドは過剰発現していない宿主細胞と比較して増加している。
【０１８０】
追加の転写因子は最初に、ピキア・パストリス（コマガタエラ・ファフィ）ＣＢＳ７４３５株（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ培養収集物）から単離された。転写因子（群）は、多種多様な宿主細胞で過剰発現させることができると想定される。したがって、種又は属に対して天然である配列を使用する代わりに、転写因子配列（群）はまた、他の原核生物又は真核生物から取得され得るか又は由来していてもよい。好ましくは、転写因子（群）は、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス又はコマガタエラ・ファフィ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・ボイディニー、及びアスペルギルス・ニガーから、追加の過剰発現のために、又は追加的に過剰発現させるために宿主細胞を工学操作するために採用される。
【０１８１】
本発明において、追加のＨａｃ１転写因子は、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列、又は本明細書に記載のような配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一率を有する配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含むＤＮＡ結合ドメイン、及び任意の活性化ドメイン（本明細書の何処か他に記載されているような任意の種の追加の転写因子の合成ドメイン、ウイルス性ドメイン、又は活性化ドメイン）を含む、配列番号７４〜８２を指す。本明細書に記載のような追加の転写因子の該ＤＮＡ結合ドメインと任意の活性化ドメインの整列は、当業者の知識に従って行なわれ得、任意の順序で行なわれ得る。
【０１８２】
好ましくは、追加の転写因子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインを含み、ここでのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列（ピキア・パストリスのＨａｃ１ｐのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。
【０１８３】
好ましくは、追加の転写因子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインを含み、ここでのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、例えば少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％の配列同一率を有する、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む。
【０１８４】
好ましくは、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一率を有する、配列番号６５に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログは、配列番号６６〜７３である。
【０１８５】
したがって、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用はさらに、配列番号６５〜７３に示されるようなアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む、追加の転写因子を過剰発現させることをさらに含み得る。
【０１８６】
ＨＡＣ１は、小胞体ストレス応答に関与している、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ファミリーの転写因子をコードしている（Mori K et al., Genes Cells 1(9):803-17, 1996 andCox JS and Water P, Cell 87(3):391-404, 1996）。熱ストレス、薬物処理、分泌タンパク質の突然変異、又は野生型分泌タンパク質の過剰発現は、フォールディングされていないタンパク質が小胞体内に蓄積することを引き起こし、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）をトリガーし得る。ＨＡＣ１は、通常の増殖条件下では必須ではないが、小胞体ストレス応答をトリガーする条件下では必須である。Ｈａｃ１ｐは、ＫＡＲ２、ＰＤＩ１、ＥＵＧ１、ＦＫＢ２などの、小胞体ストレス応答により調節される遺伝子のプロモーター内の、小胞体ストレス応答エレメント（ＵＰＲＥ）と呼ばれるＤＮＡ配列に結合する。Ｈａｃ１ｐの量は、ＨＡＣ１ｍＲＮＡのスプライシングによって調節される。スプライシングされたＨＡＣ１ｍＲＮＡは、スプライシングされていない転写物よりもはるかに高い効率で翻訳される。Ｈａｃ１ｐは、例えば小胞体ストレス応答に関与するＫａｒ２ｐなどの、小胞体シャペロンをコードしている遺伝子の転写を誘導する。例えば小胞体シャペロンをはじめとする可溶性小胞体タンパク質をコードしている遺伝子の増加した転写は、小胞体ストレス応答の重要な特色である。さらに、Ｈａｃ１ｐは、タンパク質のフォールディングに必要とされる小胞体に存在するタンパク質の合成を増加させる。
【０１８７】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の転写因子をコードしているポリヌクレオチドは、同じベクター又はプラスミド上に、同じプロモーターの制御下に又は異なるプロモーターの制御下に組み込まれる（一方のプロモーターの制御下にＭｓｎ４ｐ、異なるプロモーターの制御下にＨａｃ１ｐ）。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドと追加の転写因子をコードしているポリヌクレオチドとの両方が、同じベクター又はプラスミド上に導入され得る場合、組換えプラスミドＢ３３が好ましくは使用され、ここでは、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドはプロモーターの制御下にあり、少なくとも１つの追加の転写因子をコードしているポリヌクレオチドは異なるプロモーターの制御下にある。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の転写因子をコードしているポリヌクレオチドは、同時に又は連続的に（１つずつ）、異なるベクター又はプラスミド上に組み込まれる。一例として、少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドと追加の転写因子をコードしているポリヌクレオチドの両方が、異なるベクター又はプラスミド上に導入され得る場合、少なくとも１つの転写因子のみを有する組込みプラスミドＢＢ３と、少なくとも１つの追加の転写因子のみを有する別の組込みプラスミドＢＢ３を使用することができる。
【０１８８】
少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーは、同じベクター又はプラスミド上に、同じプロモーターの制御下に又は異なるプロモーターの制御下に組み込まれる（一方のプロモーターの制御下にＭｓｎ４ｐの１つ以上のコピー、異なるプロモーターの制御下にＨａｃ１ｐの１つ以上のコピー）。少なくとも１つの転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーをベクター又はプラスミドによってプロモーターの制御下に導入する場合、追加の転写因子をコードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコピーは同時に又は連続的に（１つずつ）、異なるベクター又はプラスミド上に組み込まれる。
【０１８９】
追加の転写因子の過剰発現により、小胞体ストレス応答の重要な特色である、小胞体シャペロン、例えばＫａｒ２ｐの過剰発現がもたらされ得、これにより、関心対象タンパク質の収量はさらにより増加する。
【０１９０】
前記の本発明のＭｓｎ４ｐ転写因子（群）及び前記のＨａｃ１ｐの追加の転写因子（群）の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質ｓｃＦｖ（配列番号１３）及び／又はｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明のピキア・パストリスの天然転写因子Ｍｓｎ４ｐ及び前記のピキア・パストリスのＨａｃ１ｐの追加の転写因子の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも６０％、例えば７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。本発明の合成転写因子ｓｙｎＭｓｎ４ｐ及び前記のピキア・パストリスのＨａｃ１ｐの追加の転写因子の過剰発現は、工学操作前の宿主細胞と比較して、モデルタンパク質、好ましくはｖＨＨ（配列番号１４）の収量を、少なくとも８０％、例えば９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、又は５００％増加させ得る。
【０１９１】
少なくとも１つの追加の転写因子をコードしている前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドは、異種又は同種の追加の転写因子をコードしている。前記の追加の転写因子（Ｈａｃ１ｐ）の過剰発現、又は過剰発現するように宿主細胞を工学操作することは、本発明の同種転写因子について、又は本発明の異種転写因子について前記で考察されているように成し遂げられる。
【０１９２】
本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される追加の転写因子（群）は、配列番号７４〜８２に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号７４に示されるようなアミノ酸配列の少なくとも２０％の配列同一率を有する、配列番号７４に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含み得る。さらなる実施態様では、本発明の方法、組換え宿主細胞、及び使用に使用される追加の転写因子（群）は、配列番号７４〜８２に示されるようなアミノ酸配列、又は配列番号７４に示されるようなアミノ酸配列の少なくとも２０％、例えば２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又はさらには１００％の配列同一率を有する、配列番号７４に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含み得る。追加の転写因子（群）はさらに、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。
【０１９３】
本発明はさらに、該宿主細胞において少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させ、これにより、該転写因子をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現していない宿主細胞と比較して、関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させる工程を含む、真核宿主細胞による前記の関心対象の組換えタンパク質の分泌を増加させる方法を想定し、ここでの転写因子は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む。
【０１９４】
さらに、本発明はさらに、真核宿主細胞において少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現させ、これにより、該転写因子をコードしているポリヌクレオチドを過剰発現していない宿主細胞と比較して、関心対象の組換えタンパク質の収量を増加させる工程を含む、真核宿主細胞による前記の関心対象の組換えタンパク質の分泌を増加させる方法を想定し、ここでの転写因子は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む。
【０１９５】
本発明はまた、関心対象のタンパク質を製造するための組換え真核宿主細胞を提供し、ここでの宿主細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作されている。
【０１９６】
好ましくは、本発明は、関心対象のタンパク質を製造するための組換え真核宿主細胞を提供し、ここでの宿主細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作され、ここでの転写因子は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含み、ここでのＤＮＡ結合ドメインは配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を含む。
【０１９７】
さらに、本発明は、関心対象のタンパク質を製造するための組換え真核宿主細胞を提供し、ここでの宿主細胞は、少なくとも１つの転写因子をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを過剰発現するように工学操作され、ここでの転写因子は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、及び／又は、配列番号８７に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一率を有する、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列の機能的ホモログを含む、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含む。
【０１９８】
「組換え細胞」又は「組換え宿主細胞」は、該細胞に対して天然ではなかった核酸配列を含むように遺伝子的に改変されている、細胞又は宿主細胞を指す。
【０１９９】
本発明はさらに、関心対象の組換えタンパク質を製造するための組換え真核宿主細胞の使用を包含する。宿主細胞は、１つの以上の関心対象タンパク質（群）をコードしているポリペプチドを導入するために有利に使用され得、その後、関心対象タンパク質を発現するのに適した条件下で培養され得る。
【０２００】
実施例
以下の実施例は、対象発明の作製法及び使用法の完全な開示及び説明を、当業者に提供するために述べられ、本発明として捉えられ特許請求の範囲に定義されている範囲を制限するためのものではない。使用されている数字（例えば量、温度、濃度など）に関する正確さを確保する努力が払われているが、幾分の実験誤差及び逸脱は許容されるべきである。特記されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり；圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【０２０１】
以下の実施例は、新規に同定された補助タンパク質（群）が、その／それらの過剰発現時に、組換えタンパク質のそれぞれ力価（容量あたりの産物（mg/L））及び収量（バイオマスあたりの産物（mg/g）、バイオマスは乾燥細胞重量又は湿潤細胞重量として測定される）を増加させることを実証するだろう。一例として、ピキア・パストリス酵母における組換え抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ、ｖＨＨ）の収量は増加する。正の効果が、振盪培養液中（振盪フラスコ又は深底ウェルプレート中で実施される）及び実験室規模のフェッドバッチ培養液中で示された。
【０２０２】
実施例１：抗体断片ｓｃＦｖ及びｖＨＨを分泌しているピキア・パストリス株の作製及び選択
【０２０３】
ピキア・パストリスＣＢＳ７４３５ｍｕｔｓ変異体（Sturmberger et al. 2016によってシークエンスされたゲノム）が宿主株として使用された。ｐＰＭ２ｄ＿ｐＧＡＰ及びｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ発現プラスミドは、ｐＵＣ１９細菌複製起点とゼオシン抗生物質耐性カセットからなる、国際公開公報第２００８／１２８７０１Ａ２号に記載のｐＰｕｚｚｌｅ＿ＺｅｏＲプラスミド骨格の誘導体である。異種遺伝子の発現は、それぞれ、ピキア・パストリスのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター又はアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーター、及びサッカロマイセス・セレビシエＣＹＣ１転写終結因子によって媒介される。プラスミドはすでに、Ｎ末端にサッカロマイセス・セレビシエα接合因子プレ−プロリーダー配列を含んでいた。ｓｃＦｖ及びｖＨＨの遺伝子は、ＤＮＡ２．０によってコドン最適化され、合成ＤＮＡとして得られた。Ｈｉｓ６−タグを、検出のために遺伝子のＣ末端に融合させた。ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（ｓｃＲ用）又はＥｃｏＲＶ（ｖＨＨ用）を用いての制限酵素による消化後、各々の遺伝子を、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＶで消化されたプラスミドｐＰＭ２ｄ＿ｐＧＡＰ及びｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸの両方にライゲートした。
【０２０４】
プラスミドを、それぞれＡｖｒＩＩ制限酵素（ｐＰＭ２ｄ＿ｐＧＡＰ用）又はＰｍｅｌ制限酵素（ｐＰＭ２ｄ＿ｐＡＯＸ用）を使用して鎖状化し、その後、ピキア・パストリスに（Gasser et al. 2013. Future Microbiol. 8(2):191-208に記載のような標準的な形質転換プロトコールを使用して）電気穿孔した。正の形質転換体の選択は、１００μg/mlのゼオシンを含有しているＹＰＤプレート（１リットルあたり：１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、２０ｇのアガーアガー）上で行なわれた。
【０２０５】
全ての形質転換アプローチの１つのコロニー（合計で約１２０個）を、形質転換プレートから拾い上げ、９６深底ウェルプレートの１つのウェルに入れた。初期増殖期でバイオマスを生じた後に、ＡＯＸ１プロモーターからの発現を、メタノールを含有している培地組成による補充によって誘導した（計４回）。初回のメタノールによる誘導から７２時間後、全ての深底ウェルプレートを遠心分離にかけ、全てのウェルの上清を、ストック用のマイクロタイタープレートにその後の分析のために収集した。ＧＡＰプロモーターからの発現は、初期増殖期後の所定の時点に（すなわち、２日間にわたり１日あたり２回）、グルコースの補充によって継続した。初回の接種から計１１０時間後、培養液を上記のように収集した。
【０２０６】
小規模スクリーニング（実施例３）及びフェッドバッチ培養液中（実施例４）で最も高い生産性を有するクローンを選択して、さらなる工学操作のための基本産生株とした。クローンＣＢＳ７４３５ｍｕｔｓｐＡＯＸｓｃＲ ４Ｅ３が、ｓｃＦｖ分泌のための基本産生株として選択された。クローンＣＢＳ７４３５ｍｕｔｓｐＡＯＸ ｖＨＨ １４Ｇ８が、ｖＨＨ分泌のための基本産生株として選択された。
【０２０７】
実施例２：補助遺伝子を過剰発現している工学操作された株の作製
ｓｃＦｖ及びｖＨＨの分泌に対する正の効果を調べるために、補助遺伝子の候補を、２つの基本的な産生株：ＣＢＳ７４３５ｍｕｔｓｐＡＯＸｓｃＲ（ｓｃＦｖ）４Ｅ３及びＣＢＳ７４３５ｍｕｔｓｐＡＯＸ ｖＨＨ（ｖＨＨ）１４Ｇ８において過剰発現させた（作製については、実施例１参照）。
【０２０８】
ａ）選択された分泌補助遺伝子の候補の増幅及びクローニングの一般的手順
過剰発現のために選択された遺伝子を、開始コドンから終止コドンまでＰＣＲ（Ｑ５（登録商標）ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ、ニューイングランドバイオラボ社）によって増幅させたか、又は２つかいくつかの断片に分割した。ゴールデンＰｉＣＳシステム（Prielhofer et al. 2017. BMC Systems Biol. doi: 10.1186/s12918-017-0492-3）は、いくつかのコード配列へのサイレント突然変異の導入を必要とする。これは、１つのコード配列からいくつかの断片を増幅することによって行なわれた。あるいは、ｇＢｌｏｃｋｓ又は合成のコドン最適化遺伝子は、供給業者（Integrated DNA Technology IDT社、Geneart社、及びATUM社を含む）から入手した。増幅したコード配列を、ｐＰＵＺＺＬＥ系発現プラスミドｐＰＭ２ａＫ２１若しくはｐＰＭ２ｅＨ２１、又はゴールデンＰｉＣＳシステム（骨格ＢＢ１、ＢＢ２、及びＢＢ３ａＫ/ＢＢ３ｅＨ/ＢＢ３ｒＮからなる）のいずれかにクローニングした。表１に列挙された遺伝子断片を、ＢｓａＩ制限酵素を使用することによって、ゴールデンＰｉＣＳシステムのＢＢ１に導入した。ＢＢ２又はＢＢ３骨格内に発現カセットを構築するために使用された全てのプロモーター及び終結因子は、Prielhofer et al. 2017（BMC Systems Biol. doi: 10.1186/s12918-017-0492-3）に記載されている。ｐＰＭ２ａＫ２１及びＢＢ３ａＫは、３’−ＡＯＸ１ゲノム領域内への組込みを可能とし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び酵母における選択のためのＫａｎＭＸ選択マーカーカセットを含有している。ｐＰＭ２ｅＨ２１及びＢＢ３ｅＨは、５’−ＥＮＯ１ゲノム組込み領域と、ハイグロマイシンでの選択のためのＨｐｈＭＸ選択マーカーカセットとを含有している。ＢＢ３ｒＮは、５’−ＲＧＩ１ゲノム組込み領域と、ノーセオトリシンでの選択のためのＮａｔＭＸ選択マーカーカセットとを含有している。全てのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉのための複製起点を含有している（ｐＵＣ１９）。ピキア・パストリス株ＣＢＳ７４３５ｍｕｔｓ由来のゲノムＤＮＡ又はｇＢｌｏｃｋｓ（Integrated DNA Technologies社）は、ＰＣＲ鋳型としての役目を果たした。
【０２０９】
表１は、制限酵素ＢｓａＩを使用することによって、ゴールデンＰｉＣＳシステムのＢＢ１に遺伝子断片を導入するために必要とされる該遺伝子断片を列挙する。その後、それぞれのコード配列を有している構築されたＢＢ１を、ゴールデンＰｉＣＳシステムにおいてさらに処理して、Prielhofer et al. 2017に記載のような、必要とされるＢＢ３組込みプラスミドを作り出した。下線の付いたヌクレオチドで、ゴールデンＰｉＣＳに適合した遺伝子断片を作り出すのに必要とされる最初の正方向プライマー及び最後の逆方向プライマーに印を付け、開始コドン及び終止コドンは太字で印を付けている。
【０２１０】
【表２】
2021528985.tif 000003
2021528985.tif 000004
2021528985.tif 000005
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【０２１１】
ｂ）天然及び合成のＭＳＮ４過剰発現株の作製
１つのサイレント突然変異を、ピキア・パストリスのＭＳＮ４の天然コード配列に導入して、ＢｓａＩ制限酵素部位を除去した。このコード配列を、ゴールデンＰｉＣＳシステムのＢＢ１に導入した。合成ＭＳＮ４コード配列は、転写活性化ドメイン配列（ＶＰ６４）及び核局在配列（ＳＶ４０）を、ヌクレオチド８８３番から１０７１番のＭＳＮ４の天然ＤＮＡ結合ドメインと融合させることによって構築された。ＤＮＡ結合ドメインは、Nicholls et al. 2004（Eukaryot Cell. doi: 10.1128/EC.3.5.1111-1123.2004）において公表されているアミノ酸配列に対する配列相同性によって同定された。この合成コード配列（ｓｙｎＭＳＮ４）をゴールデンＰｉＣＳシステムのＢＢ１に導入した。サッカロマイセス・セレビシエのＭＳＮ２、サッカロマイセス・セレビシエのＭＳＮ４、アスペルギルス・ニガーのＭＳＮ４ホモログＳｅｂ１、及びヤロウィア・リポリティカのＭＳＮ４ホモログを、それぞれ、サッカロマイセス・セレビシエのＣＥＮ．ＰＫ、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ５１３．８８及びヤロウィア・リポリティカＤＳＭＺのゲノムＤＮＡから増幅し、ＢＢ１に導入した。
【０２１２】
各々のＭＳＮ４コード配列を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター及びサッカロマイセス・セレビシエのＣＹＣ１転写終結因子と共に、組込みプラスミドＢＢ３ｒＮ（例えば、天然のピキア・パストリスのＭＳＮ４では１８９＿ＢＢ３ｒＮ又は１４２＿ＢＢ３ｅＨ）中で組み合わせた。ピキア・パストリスのＭＳＮ４は、ＴＨＩ１１プロモーター及びＩＤＰ１終結因子（２５３＿ＢＢ３ｅＨ）、又はＰＯＲ１プロモーター及びＩＤＰ１終結因子（２５４＿ＢＢ３ｅＨ）とも組み合わせた。ｓｙｎＭＳＮ４コード配列をさらに、ＴＨＩ１１プロモーター（Landes et al. 2016. Biotechnol Bioeng. doi: 10.1002/bit.26041）及びＩＤＰ１転写終結因子（２５８＿ＢＢ３ｅＨ）、又はＳＢＨ１７プロモーター及びＴＤＨ３終結因子（１９１＿ＢＢ３ａＫ）と組み合わせた。ｓｙｎＭＳＮ４コード配列はまた、ＧＡＰプロモーター及びＴＤＨ３転写終結因子と共に、組込みプラスミド２０８＿ＢＢ３ａＫ中で組み合わせた。全ての組込みプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩを用いて鎖状化し、その後、基本産生株を形質転換するためにそれらを適用した。ＭＳＮ４又は合成ＭＳＮ４を過剰発現しているクローンの力価及び収量（湿潤細胞重量あたりの力価）を、小規模スクリーニングで決定し、それらの親の基本産生株と比較した（実施例３）。
【０２１３】
ｃ）（合成）ＭＳＮ４＋ＫＡＲ２過剰発現株の作製
ＫＡＲ２のみを含有している過剰発現カセットを、組込みプラスミドＢＢ３ｅＨ（２１９＿ＢＢ３ｅＨ）中に構築した。このプラスミドは、ＢＢ１プラスミドをＫＡＲ２コード配列及びＧＡＰプロモーター並びにＲＰＳ３終結因子と組み合わせることから得られる。
【０２１４】
小規模スクリーニング（実施例３）で決定された産物の収量の点から、ＭＳＮ４又は合成ＭＳＮ４を過剰発現している最善のクローンを、実施例２ｂのそれぞれのプラスミドを用いての形質転換後に選択し、これをさらに、ＳｍａＩで鎖状化したＫＡＲ２組込みプラスミド２１９＿ＢＢ３ｅＨを用いて形質転換した。これにより最終的に、２つの異なる組込みプラスミドを用いた２回の順次的な形質転換によって導入された、２つの異なる過剰発現カセットを有するクローンが得られた。
【０２１５】
ｄ）（合成）ＭＳＮ４＋ＨＡＣ（ｉ）過剰発現株の作製
導入された（ｉ）バージョンのＨＡＣ（ｉ）コード配列は、Guerfal et al. 2010（Microb Cell Fact. doi: 10.1186/1475-2859-9-49）に従って、ヌクレオチド番号８５７〜１１７８から代替的イントロンを除去することによって作り出された。コード配列をＢＢ１に導入した。さらに、コドン最適化されたＨＡＣ（ｉ）配列を、Ｈａｃ１（ｉ）の過剰発現のために使用した。それをさらに、ＢＢ２プラスミド内のＦＤＨ１のプロモーターとＲＰＬ２Ａの終結因子と組み合わせた。他のＢＢ２構築物は、ＭＤＨ３プロモーターとＲＰＬ２Ａ終結因子、又はＡＤＨ２プロモーターとＲＰＬ２Ａ終結因子の制御下にＨＡＣ１を含んでいた。
【０２１６】
異なるプロモーターの制御下にＭＳＮ４＋ＨＡＣ１（ｉ）の組合せを有する、組込みプラスミド２４３＿ＢＢ３ｅＨ、２５３＿ＢＢ３ｅＨ、２５４＿ＢＢ３ｅＨ、及び２５７＿ＢＢ３ｅＨは、実施例２ｄのＢＢ２を、ＭＳＮ４用の発現カセットを含有しているＢＢ２プラスミド（実施例２ｂ）と組み合わせることによって作製された。同じ組合せはまた、ＭＳＮ４のみを有する組込みプラスミドＢＢ３ｒＮ（１８９＿ＢＢ３ｒＮ）、及びＦＤＨ１プロモーターとＲＰＬ２Ａ終結因子と共にＨＡＣ１（ｉ）のみを有する組込みプラスミドＢＢ３ｅＨ（２３４＿ＢＢ３ｅＨ）を用いての順次的な形質転換によって作製された。組込みプラスミド（２５８＿ＢＢ３ｅＨ）においてｓｙｎＭＳＮ＋ＨＡＣ１（ｉ）の組合せを有するプラスミドでは、実施例２ｄのＢＢ２をＢＢ２プラスミドと組み合わせ、このＢＢ２プラスミドは、ＴＨＩ１１プロモーター及びＩＤＰ１転写終結因子と組み合わせた、ｓｙｎＭＳＮ４を有するＢＢ１プラスミド（実施例２ｂ）から得られた。両方の組込みプラスミドを、制限酵素ＳｍａＩを用いて鎖状化し、その後、それらを基本の産生株を形質転換するために適用した。
【０２１７】
ｅ）（合成）ＭＳＮ４＋ＫＡＲ２及び／又はＬＨＳ１、（合成）ＭＳＮ４＋ＫＡＲ２及び／又はＳＩＬ、（合成）ＭＳＮ４＋ＫＡＲ２＋ＬＨＳ１又はＳＩＬ１及びＥＲＪ５過剰発現株の作製
ＫＡＲ２（７つのサイレント突然変異が必要とされる）、ＬＨＳ１（１つのサイレント突然変異が必要とされる）、ＳＩＬ１（突然変異なし）、及びＥＲＪ５（１つのサイレント突然変異が必要とされる）のコード配列を、ゴールデンＰｉＣＳシステムのＢＢ１に導入した。組込みプラスミド２１９＿ＢＢ３ｅＨは、ＧＡＰプロモーター及びＲＰＳ３転写終結因子と共にＫＡＲ２を含有している。ＬＨＳ１と組み合わせたＫＡＲ２の過剰発現を、組込みプラスミド１７４＿ＢＢ３ｅＨに構築し、これは２つのＢＢ２（一方は、ＧＡＰプロモーター及びＲＰＳ３転写終結因子と共にＫＡＲ２を含有し、他方のＢＢ２は、ＰＯＲ１プロモーター及びＩＤＰ１転写終結因子と共にＬＨＳ１を含有している）から得られる。ＳＩＬ１と組み合わせたＫＡＲ２の過剰発現を、組込みプラスミド０７８＿ＢＢ３ｅＨに構築し、これは２つのＢＢ２（一方は、ＧＡＰプロモーター及びＲＰＳ３転写終結因子と共にＫＡＲ２を含有し、他方のＢＢ２は、ＰＯＲ１プロモーター及びＩＤＰ１転写終結因子と共にＳＩＬ１を含有している）から得られる。ＬＨＳ１及びＥＲＪ５と組み合わせたＫＡＲ２の過剰発現を、組込みプラスミド０５２＿ＢＢ３ｅＨに構築し、これは３つのＢＢ２（第一は、ＧＡＰプロモーター及びサッカロマイセス・セレビシエのＣＹＣ１転写終結因子と共にＫＡＲ２を含有し、第二のＢＢ２は、ＰＯＲ１プロモーター及びＩＤＰ１転写終結因子と共にＬＨＳ１を含有し、第三のＢＢ２は、ＭＤＨ３プロモーター及びＴＤＨ１転写終結因子と共にＥＲＪ５を含有している）から得られる。
【０２１８】
小規模スクリーニング（実施例３）で決定された収量（バイオマスあたりの力価）の点から最善のクローンを、実施例２ｂのそれぞれのプラスミドを用いての形質転換後に選択し、上記されたそれぞれのＳｍａＩで鎖状化したＢＢ３ｅＨ組込みプラスミドを用いてさらに形質転換した。これにより最終的に、２つの異なる組込みプラスミドを用いた２回の順次的な形質転換によって導入された２つの異なる過剰発現カセットを有するクローンが得られた。
【０２１９】
実施例３：増加したｓｃＦｖ又はｖＨＨの分泌についてのスクリーニング
小規模スクリーニングでは、２０個までの各々の過剰発現の組合せの形質転換体を、形質転換後に試験した。形質転換体を、上清中のそれらのｓｃＦｖ又はｖＨＨの力価、それらの湿潤細胞重量（遠心分離及び上清除去後のバイオマス）、及びそれらのｓｃＦｖ又はｖＨＨの収量（湿潤細胞重量あたりの力価）を、それぞれの親の基本産生株と比較することによって評価した。各々の過剰発現の組合せについて、力価、収量、及び湿潤細胞重量の平均変化倍率を決定して、分泌の改善を評価した。力価、収量、及び湿潤細胞重量の平均変化倍率は、全ての形質転換体の力価、収量、及び湿潤細胞重量の算術的平均値を、同じ深底ウェルプレート上で培養された基本産生株の４つの生物学的レプリケートの力価、収量、及び湿潤細胞重量の算術的平均値で割ることによって計算された。
【０２２０】
ａ）ｓｃＦｖ又はｖＨＨの産生株の小規模スクリーニング培養
１０ｇ/Ｌのグルコース及び５０μg/mlのゼオシン（基本産生株）又は５０μg/mLのゼオシン及び５００μg/mLのＧ４１８及び／又は２００μg/mLのハイグロマイシン及び／又は１００μg/mLのノーセオトリシンを（工学操作株の組込みプラスミドに応じて）含有している、２mLのＹＰ培地（１０ｇ/Ｌの酵母抽出物、２０ｇ/Ｌのペプトン）に、ピキア・パストリスクローンの１つのコロニーを接種し、２５℃で一晩増殖させた。これらの培養液を、グルコースフィード錠剤（Kuhner社、スイス；製造番号ＳＭＦＢ６３３１９）又はｘ％の酵素（ｍ２ｐ培地開発キット）の補充された、２mLの合成スクリーニング培地Ｍ２又はＡＳＭｖ６（培地組成は以下に示されている）に移し、２４深底ウェルプレート中、２５℃で２８０rpmで１〜２５時間インキュベートした。これらの培養液のアリコート（最終ＯＤ６００は４又は８に相当する）を、２mLの合成スクリーニング培地Ｍ２又はＡＳＭｖ６に移した（ＡＳＭｖ６の場合、ｍ２ｐ培地開発キットを用いて新鮮な２４深底ウェルプレート中で）。０．５容量％の純粋なメタノールを最初に加え、１容量％の純粋なメタノールを、１９時間後、２７時間後、及び４３時間後に繰り返し加えた。４８時間後、細胞を、室温で２，５００×ｇでの１０分間の遠心分離によって収集し、分析のために調製した。バイオマスは、１mLの細胞懸濁液の細胞重量を測定することによって決定され、上清中に分泌された組換えタンパク質の決定は、以下の実施例３ｂ〜３ｃに記載されている。
【０２２１】
合成スクリーニング培地Ｍ２は、１リットルあたり、以下（２２．０ｇのクエン酸一水和物、３．１５ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．４９ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８０ｇのＫＣｌ、０．０２６８ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．４７mLのＰＴＭ１微量金属、４mgのビオチン）を含んでいた；ｐＨはＫＯＨ（固体）を用いて５に設定された。
【０２２２】
合成スクリーニング培地ＡＳＭｖ６は、１リットルあたり、以下（４４．０ｇのクエン酸一水和物、１２．６０ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．９８ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５．２８ｇのＫＣｌ、０．１０７０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．９４mLのＰＴＭ１微量金属、８mgのビオチン）を含んでいた；ｐＨはＫＯＨ（固体）を用いて６．５に設定された。
【０２２３】
ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析
タンパク質ゲル分析のために、ＭＯＰＳ泳動緩衝液と共に１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを、又はＭＥＳ泳動緩衝液と共に４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用した、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓシステムが使用された（全てインビトロジェン社製）。電気泳動後、タンパク質をコロイドクーマシー染色によって可視化したか、又はウェスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜に転写した。それ故、タンパク質を、ミニゲル用のすぐに使用できるメンブラン及びろ紙及びプログラムＴｕｒｂｏと共にバイオラッド社のトランスブロット（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）転写システムを使用して、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした（７分間）。ブロッキング後、ウェスタンブロットを、以下の抗体を用いてプローブした。Ｈｉｓタグ化ｓｃＦｖ及びｖＨＨは、以下の抗体を用いて検出された。１：２，０００に希釈された、抗ポリヒスチジン−ペルオキシダーゼ抗体（Ａ７０５８、シグマ社）。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートについての検出は、化学発光剤のSuper Signal West化学発光基質（サーモサイエンティフィック社）を用いて行なわれた。
【０２２４】
ｃ）マイクロ流体キャピラリー電気泳動（ｍＣＥ）による定量
「ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ／ＧＸＩＩシステム」（パーキンエルマー社）を、培養上清中に分泌されたタンパク質の力価の定量分析のために使用した。消耗品「Protein Express Lab Chip」（７６０４９９、パーキンエルマー社）及び「Protein Express Reagent Kit」（ＣＬＳ９６０００８、パーキンエルマー社）を使用した。簡潔に言えば、全培養上清の数μLを蛍光標識し、マイクロ流体に基づいた電気泳動システムを使用してタンパク質のサイズに従って分析した。内部標準物質は、検出されたシグナルのおよそのサイズ（kDa）及びおよその濃度の割り当てを可能とする。
【０２２５】
実施例４：フェッドバッチ培養
工学操作株のクローン（実施例２）を、小規模スクリーニング培養（実施例３）後に選択した。フェッドバッチバイオリアクター培養による、より大きな培養容量中で選択されたクローンを、さらに評価した。小規模スクリーニングにおける分泌の改善は、フェッドバッチバイオリアクター培養中にも存在し、これが確認された。
【０２２６】
ａ）フェッドバッチバイオリアクター培養手順
それぞれの株を、５０mLのＹＰｈｙＧで充填された広口のバッフル付きの蓋付き３００mLの振盪フラスコに接種し、１１０rpmで２８℃で一晩振盪した（前培養１）。前培養２（１０００mLの広口のバッフル付きの蓋付き振盪フラスコ中の１００mLのＹＰｈｙＧ）に、ＯＤ６００（６００nmで測定される吸光度）が夕方におよそ２０（ＹＰｈｙＧ培地に対して測定された）に達するように、前培養１を接種した（倍加時間：約２時間）。前培養２のインキュベーションを同様に１１０rpmにて２８℃で実施した。
【０２２７】
フェッドバッチを、０．８Ｌの作業容量のバイオリアクター（Minifors、Infors、スイス）で実施した。全てのバイオリアクター（ｐＨ約５．５の４００mLのＢＳＭ培地で充填された）に、ＯＤ６００が２．０となるまで前培養２を個々に接種した。一般に、ピキア・パストリスをグリセロール上で増殖させてバイオマスを生成し、その後、培養物をグリセロール供給、続くメタノール供給に供した。
【０２２８】
初期バッチフェーズでは、温度を２８℃に設定した。産生フェーズを開始する前の１時間にわたって、温度を２４℃まで下降させ、残りのプロセスを通してこのレベルで維持し、その間にｐＨは５．０まで低下し、このレベルで維持した。酸素飽和度を、プロセス全体を通して３０％に設定した（カスケード制御：スターラー、流量、酸素補給）。撹拌を７００〜１２００rpmで適用し、１．０〜２．０Ｌ/分の流量範囲（空気）を選択した。２５％アンモニウムを使用して、ｐＨ５．０の制御を達成した。必要に応じて、消泡剤Glanapon 2000の添加によって発泡を制御した。
【０２２９】
バッチフェーズの間、約１１０〜１２０ｇ/Ｌの湿潤細胞重量（ＷＣＷ）となるまでバイオマスが生成された（μは１時間あたり約０．３０）。古典的なバッチフェーズ（バイオマス生成）は、約１４時間続くだろう。２．６＋０．３×ｔ（ｇ/ｈ）の式によって定義される速度でグリセロールをフィードし、よって、計３０ｇのグリセロール（６０％）が８時間以内に補給されるだろう。最初のサンプリング点は、２０時間目となるように選択された（０時間が誘導時間）。
【０２３０】
続く１８時間において（プロセス時間は２０時間から３８時間）、グリセロール／メタノールの混合フィードが適用された：６６ｇのグリセロール（６０％）を供給して式：２．５＋０．１３×ｔ（ｇ/ｈ）によって定義されるグリセロールフィード速度、及び２１ｇのメタノールを添加して、式０．７２＋０．０５×ｔ（ｇ/ｈ）によって定義されるメタノールフィード速度。
【０２３１】
次の７２〜７４時間の間に（プロセス時間は３８時間から１１０〜１１２時間）、メタノールが、式２．２＋０．０１６×ｔ（ｇ/Ｌ）によって定義されるフィード速度でフィードされた。
【０２３２】
ＹＰｈｙＧ前培養培地（１リットルあたり）は以下を含有していた：２０ｇのフィトン−ペプトン、１０ｇのＢａｃｔｏ酵母抽出物、２０ｇのグリセロール。
【０２３３】
バッチ培地：改変基礎塩培地（ＢＳＭ）（１リットルあたり）は以下を含有していた：１３．５mLのＨ３ＰＯ４（８５％）、０．５ｇのＣａＣｌ・２Ｈ２Ｏ、７．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、９ｇのＫ２ＳＯ４、２ｇのＫＯＨ、４０ｇのグリセロール、０．２５ｇのＮａＣｌ、４．３５mLのＰＴＭ１、０．１mLのGlanapon 2000（消泡剤）。
【０２３４】
ＰＴＭ１微量元素（１リットルあたり）は以下を含有していた：０．２ｇのビオチン、６．０ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０９ｇのＫＩ、３．００ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＨ３ＢＯ３、０．５ｇのＣｏＣｌ２、４２．２ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６５．０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び５．０mLのＨ２ＳＯ４（９５％〜９８％）。
【０２３５】
フィード溶液グリセロール（１kgあたり）は以下を含有していた：６００ｇのグリセロール、１２mLのＰＴＭ１。
【０２３６】
フィード溶液メタノールは以下を含有していた：純粋なメタノール。
【０２３７】
ｂ）フェッドバッチバイオリアクター培養の試料の分析
試料を、以下の手順を用いて様々な時点で取得した。最初の３mLのサンプリングされた培養ブロス（シリンジを用いて）は廃棄された。１mLの新たに取得された試料（３〜５mL）を１．５mLの遠心分離管に移し、１３，２００rpm（１６，１００ｇ）で５分間遠心分離にかけた。上清を別々のバイアルにしっかりと移し、４℃で保存したか、又は分析するまで凍結した。
【０２３８】
秤量されたエッペンドルフバイアル中の、１mLの培養ブロスを、１３，２００rpm（１６，１００ｇ）で５分間遠心分離にかけ、結果として得られた上清を正確に除去した。バイアルを秤量し（正確度０．１mg）、空のバイアルの重さを差し引いて、湿潤細胞重量を得た。
【０２３９】
各バイオリアクター培養の個々のサンプリング時点の上清を、ウシ血清アルブミン又は精製された標準物質（ｓｃＲ−ＧＧ−６ｘＨＩＳ及びｖＨＨ−ＧＧ−６ｘＨＩＳについての）に対して、ｍＣＥ（マイクロ流体キャピラリー電気泳動、ＧＸＩＩ、パーキンエルマー社）を使用して分析した。
【０２４０】
実施例５：転写因子（群）及び補助遺伝子（群）の過剰発現による、組換えタンパク質の産生及び分泌の改善
分泌の改善は、それぞれの工学操作されていない基本産生株に言及する力価及び収量の変化倍率値によって測定される（実施例１）。
【０２４１】
ａ）転写因子のみの過剰発現又は補助遺伝子（群）と組み合わせた過剰発現による、ｖＨＨタンパク質分泌収量の改善−小規模スクリーニングからの結果。
【０２４２】
図１は、小規模スクリーニング（実施例３）においてピキア・パストリスにおけるｖＨＨの分泌を増加させる、過剰発現させた遺伝子又は遺伝子の組合せを列挙する。小規模スクリーニングの変化倍率値は、最大２０個のクローン／形質転換体の算術的平均値である（実施例３参照）。
【０２４３】
ｖＨＨの分泌は、転写因子Ｍｓｎ４の過剰発現によって増加する（図１）。天然及び合成のＭｓｎ４変異体のどちらも、ｖＨＨの力価及び収量を同じようなレベルまで増加させる。意外なことに、シャペロンＫａｒ２単独の過剰発現又はコシャペロンＬｈｓ１と組み合わせての過剰発現は、ｖＨＨの分泌を増加させなかった。これらを、転写因子Ｍｓｎ４又はｓｙｎＭｓｎ４と共過剰発現させた場合にのみ、増加したｖＨＨの力価及び収量が観察された。さらにＥｒｊ５などのＨｓｐ４０タンパク質の共発現により、さらにｖＨＨの分泌は増加した。
【０２４４】
また、Ｈａｃ１とＭｓｎ４又はｓｙｎＭｓｎ４の共発現により、ｖＨＨの分泌は増強され、単一のＨａｃ１の過剰発現より優れていた。それにより、同じようなレベルの増強が、２つの転写因子が同じベクターから発現されたか又は２つの別々のベクターから発現されたかに関係なく得られた。また、異なるプロモーター対が２つの転写因子の発現のために使用された場合にも有意差はなかった。
【０２４５】
ｂ）転写因子単独の過剰発現又は補助遺伝子（群）と組み合わせての過剰発現による、ｖＨＨタンパク質分泌収量の改善−フェッドバッチバイオリアクター培養からの結果。
【０２４６】
図２は、フェッドバッチ培養（実施例４）におけるピキア・パストリスにおけるｖＨＨの分泌を増加させる、過剰発現させた遺伝子又は遺伝子の組合せを列挙する。フェッドバッチ培養の変化倍率値は、１つの選択されたクローンのものである。
【０２４７】
スクリーニングにおいて観察された、組換えタンパク質産生に対する転写因子Ｍｓｎ４を過剰発現させることの正の影響はまた、制御されたバイオリアクター培養においても確認された（図２）。スクリーニングと同様に、Ｍｓｎ４又はｓｙｎＭｓｎ４をシャペロン又は他の転写因子と組合せた過剰発現により、後者の因子のみを過剰発現している株の性能を著しく超越した。ｖＨＨ分泌の有益な効果に関して、天然のＭｓｎ４の過剰発現と合成形のＭｓｎ４の過剰発現との間には明確な差は見られなかった。
【０２４８】
ｃ）転写因子単独の過剰発現又は補助遺伝子（群）と組み合わせての過剰発現による、ｓｃＦｖタンパク質分泌収量の改善−小規模スクリーニングからの結果。
図３は、小規模スクリーニング（実施例３）においてピキア・パストリスにおけるｓｃＦｖの分泌を増加させる、過剰発現させた遺伝子又は遺伝子の組合せを列挙する。小規模スクリーニングの変化倍率値は、最大２０個のクローン／形質転換体の算術的平均値である（実施例３参照）。
【０２４９】
Ｍｓｎ４の過剰発現はまた、別のモデル関心対象タンパク質の代表である、ｓｃＦｖの分泌レベルを増強させた（図３）。ｖＨＨについての分泌の収量及び力価は、Ｋａｒ２などのシャペロンの単独の過剰発現又はＬｈｓ１と組み合わせての過剰発現と、Ｍｓｎ４又はｓｙｎＭｓｎ４の過剰発現を組み合わせることによって、さらに増強され、Ｍｓｎ４を伴わず、Ｋａｒ２及びＬｈｓ１の過剰発現によって得られた改善を超越した。また、Ｈａｃ１の過剰発現と、Ｍｓｎ４又はｓｙｎＭｓｎ４の組合せは、ｓｃＦｖの分泌に対する正の影響を及ぼした。
【０２５０】
ｄ）転写因子単独の過剰発現又は補助遺伝子（群）と組み合わせての過剰発現による、ｓｃＦｖタンパク質分泌収量の改善−フェッドバッチバイオリアクター培養からの結果。
図４は、フェッドバッチ培養（実施例４）においてピキア・パストリスにおけるｖＨＨの分泌を増加させる、過剰発現させた遺伝子又は遺伝子の組合せを列挙する。フェッドバッチ培養の変化倍率値は、１つの選択されたクローンのものである。
【０２５１】
第二の組換えモデルタンパク質についても、スクリーニングで得られた結果は、制御されたプロセスに似たバイオリアクター条件下で確認された（図４）。Ｍｓｎ４のみの過剰発現は、野生型産生株（親）と比較して、ｓｃＦｖの力価及び収量を改善させた。シャペロン又は他の転写因子（例えばＨａｃ１）とＭｓｎ４との共過剰発現は、シャペロン又はＨａｃ１のみの過剰発現と比較してｓｃＦｖの分泌を刺激した。
【０２５２】
ｅ）フェッドバッチバイオリアクター培養における他の種に由来するＭＳＮ２／４ホモログの過剰発現による、ｓｃＦｖの分泌（力価及び収量）の改善。
図５は、フェッドバッチ培養（実施例４）においてピキア・パストリスにおけるｓｃＦｖの分泌を増加させる、過剰発現させたＭＳＮ２／４ホモログを列挙する。フェッドバッチ培養の変化倍率値は、１つの選択されたクローンのものである。
【０２５３】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の２つのＭｓｎ４ホモログの過剰発現は、ｓｃＦｖの分泌に対して正の効果を及ぼし（図５）、これは、他の種に由来するホモログも、ピキア・パストリスにおけるタンパク質の分泌に対して正の効果を及ぼすことを確認する。ピキア・パストリスの天然Ｍｓｎ４及び合成のＭｓｎ４変異体からの結果と合わせて、これはまた、他の産生宿主における、標的化されたＭｓｎ４の過剰発現が、組換えタンパク質の産生を改善する保存された効果を指し示し、本発明者らのアプローチの多用途な適用可能性を強調する。
【０２５４】
実施例６：ＭＳＮ４のアラインメント及びＰｐＭＳＮ４に対する配列同一性
ＭＳＮ２／４の機能に関する知識は、それが真核細胞の最も重要なモデル生物であるために、サッカロマイセス・セレビシエから得られる。この文脈において、サッカロマイセス・セレビシエが全ゲノム重複（ＷＧＤ）を受けたことを注記することは重要である。これは、サッカロマイセス・セレビシエのゲノムが、その遺伝子の多くの非常に類似したコピーを有することを引き起こす。冗長な転写因子Ｍｓｎ２ｐ及びＭｓｎ４ｐはそのような例である。この機能的な冗長性により、これらの転写因子は通常、ＭＳＮ２／４と呼ばれる。他の酵母のタンパク質の機能に関する記載は、モデル生物であるサッカロマイセス・セレビシエを用いた実験から得られる。ピキア・パストリスは、例えば、全ゲノム重複を受けず、それ故、１つのホモログ、すなわちＭｓｎ４ｐのみを有する。基本的にサッカロマイセス・セレビシエにおいてＭｓｎ２ｐとＭｓｎ４ｐとの間に機能的に明確な差異は全くないため、他の酵母におけるこれらの転写因子を妥当に区別できない。
【０２５５】
アラインメントは、ソフトウェアＣＬＣメインワークベンチ（キアゲン・バイオインフォマティクス社）を用いて行なわれ、図６に見ることができる。強く保存された唯一の領域は、図６の点線のボックスに強調され、ジンクフィンガーのタンパク質構造モチーフからなる。これは、サッカロマイセス・セレビシエにおいて十分に特徴付けられた転写因子であるＭｓｎ４ｐ及びＭｓｎ２ｐ（ＳｃＭＳＮ４／２）の既知のＤＮＡ結合ドメインであり、他の生物において同じ機能を得るために同様に使用され得る（Nicholls et al. 2004）。
【０２５６】
サッカロマイセス・セレビシエのＭＳＮ２／４におけるジンクフィンガーは、Ｃ２Ｈ２様の折り畳みを有する。アミノ酸配列モチーフは、Ｘ２−Ｃ−Ｘ２，４−Ｃ−Ｘ１２−Ｈ−Ｘ３，４，５−Ｈであり、これも図７に示されている。配列アラインメント（図７）の強く保存されている領域（図６の黒い点線のボックス）の画像を徐々に拡大すると、このモチーフを明瞭に観察することができる。
【０２５７】
ＭＳＮ４様のＣ２Ｈ２型ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの共通配列が灰色で強調されている。Ｃ２Ｈ２モチーフは、黒いアステリスク（＊）で印が付けられている。共通配列は、
【表３】
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である。
【０２５８】
さらに、ピキア・パストリスの完全長Ｍｓｎ４ｐと他の生物の各ホモログとの間のペアワイズな配列類似率／同一率を、エンボスニードルアルゴリズムを用いたグローバルなペアワイズ配列アラインメントによって調べた。ペアワイズな配列類似率／同一率は、ピキア・パストリスのＭｓｎ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン及び他の生物の各ホモログのＤＮＡ結合ドメインについても調べた。エンボスニードルウェブサーバー（(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）を、デフォールト設定（マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．５；エンドギャップペナルティ：偽；エンドギャップオープン：１０；エンドギャップ伸長：０．５）を使用してペアワイズなタンパク質配列アラインメントのために使用した。エンボスニードルは、２つの入力配列を解読し、それらの最適なグローバル配列アラインメントを書き出しファイルする。それは、その全長に沿って２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つけるために、ニードルマン・ブンシュアラインメントアルゴリズムを使用する。
【０２５９】
同一率の結果を図８に列挙する。予想された通り、完全長Ｍｓｎ４のグローバル配列同一率は、ＤＮＡ結合ドメインのみよりもはるかに少ない保存度を示す。
【０２６０】
Ｍｓｎ４ｐ／Ｍｓｎ２ｐのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の共通配列と、他の生物の各ホモログのＤＮＡ結合ドメインの共通配列との間のペアワイズな配列の類似率／同一率を、同じようにエンボスニードルアルゴリズムを用いたグローバルなペアワイズ配列アラインメントによって調べた（図１４参照）。
【０２６１】
実施例７：ＨＡＣ１アラインメント及びＰｐＨＡＣ１に対する配列類似率
アラインメントは、ソフトウェアＣＬＣメインワークベンチ（キアゲン・バイオインフォマティクス社）を用いて行なわれた。
【０２６２】
ピキア・パストリスの完全長Ｈａｃ１ｐ又はそのＤＮＡ結合ドメインと、他の生物の各ホモログとの間のペアワイズな配列の類似率／同一率を調べた。グローバルな類似率／同一率は、エンボスニードルアルゴリズムを用いたグローバルなペアワイズ配列アラインメントによって評価された（図１３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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