(57)【要約】本明細書に開示の方法は、形態形成遺伝子又はリプレッサー遺伝子を使用して、トランジェニックイベントの単一コピーを含むトランジェニック植物を提供する。形態形成遺伝子又はリプレッサー遺伝子は植物のゲノムに組み込まれず、且つ、植物はベクター（プラスミド）バックボーンを含まない。
2021517812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質遺伝子発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法であって、
植物細胞を、形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡ、及び形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡと接触させること；
前記形質遺伝子発現カセットを含み、形態形成遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びに
前記植物細胞からトランスジェニック植物を再生すること
を含む方法。
【請求項２】
前記接触は、植物細胞を、第１の菌株における形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡ、及び第２の菌株における形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡと、同時に接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触は、植物細胞を、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子発現カセット及びＴ−ＤＮＡ外の形態形成遺伝子発現カセットを含むプラスミドを含有する１つの菌株と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記接触は、植物細胞を、１つの菌株中の、形質遺伝子発現カセットを含有するＴ−ＤＮＡ、及び形態形成遺伝子発現カセットを含有するＴ−ＤＮＡと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｉｉ）Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド若しくは胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせ
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列は、前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド、及び前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択され、前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドはＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質形成遺伝子発現カセットは、
害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、乾燥耐性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害耐性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は同じ菌株である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記同じ菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は異なる菌株である、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記異なる菌株は、
（ｉ）非武装化アグロバクテリウムとオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌；
（ｉｉ）非武装化アグロバクテリウムとリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌；及び
（ｉｉｉ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌とオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌
から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は５０：５０の比で存在する、請求項２，１３又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は７５：２５の比で存在する、請求項２，１３又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は９０：１０の比で存在する、請求項２，１３又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は９５：５の比で存在する、請求項２，１３又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は９９：１の比で存在する、請求項２，１３又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、表４又は表５から選択されるプロモーターをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたユビキチンプロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＬＥＣ１遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ウイルス又は植物エンハンサー配列をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＢＢＭ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＲｅｐＡ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＰＫＬａｍｉＲＮＡ融合体に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質遺伝子発現カセットを含む植物種子。
【請求項３９】
形質遺伝子発現カセットの１コピー及び選択マーカー発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法であって、
植物細胞を、形質遺伝子発現カセット及び選択可能マーカー発現カセットに隣接する右境界配列及び左境界配列を有するＴ−ＤＮＡと、Ｔ−ＤＮＡの外側のリプレッサー遺伝子発現カセットとを含むプラスミドを含有する菌株と接触させること（ここで、前記選択可能マーカー発現カセットはリプレッサー遺伝子によって発現されるリプレッサーポリペプチドによって抑制されるプロモーターを含む）；
前記形質遺伝子発現カセット及び前記選択可能マーカー発現カセットを含み、リプレッサー遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びに
前記植物細胞からトランスジェニック植物を再生すること
を含む方法。
【請求項４０】
前記リプレッサー遺伝子発現カセットは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）、エタメツルフロンリプレッサー（ＥＳＲ）、クロルスルフロンリプレッサー（ＣＳＲ）、及び前記Ｔ−ＤＮＡ中の前記プロモーターを標的とするガイドＲＮＡを有するリプレッサー−ｄＣＡＳ９融合体をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレオチド配列は、前記Ｔ−ＤＮＡ中の前記選択マーカーに作動可能に連結された前記プロモーターを抑制する前記テトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）をコードする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヌクレオチド配列は、前記Ｔ−ＤＮＡ中の前記選択マーカーに作動可能に連結された前記プロモーターを抑制する前記エタメツルフロンリプレッサー（ＥＳＲ）をコードする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヌクレオチド配列は、前記Ｔ−ＤＮＡ中の前記選択マーカーに作動可能に連結された前記プロモーターを抑制する前記クロルスルフロンリプレッサー（ＣＳＲ）をコードする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ヌクレオチド配列は、前記Ｔ−ＤＮＡ中の前記選択マーカーに作動可能に連結された前記プロモーターを抑制するガイドＲＮＡを有する前記リプレッサー−ｄＣＡＳ９融合体をコードする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記形質形成遺伝子発現カセットは、
害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、乾燥耐性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害耐性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の形質遺伝子発現カセットを含む植物種子。
【請求項５１】
形質遺伝子発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法であって、
植物細胞を、第１の菌株における形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡ、及び第２の菌株における形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡと同時に接触させること
（ここで、前記形態形成遺伝子発現カセットは、
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｉｉ）Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド若しくは胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせ
を含み；
前記形質遺伝子発現カセットは、
害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、乾燥耐性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害耐性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む）；
前記形質遺伝子発現カセットを含み、形態形成遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びに
前記植物細胞からトランスジェニック植物を再生すること
を含む方法。
【請求項５２】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヌクレオチド配列は、前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド、及び前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択され、前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドはＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は同じ菌株である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記同じ菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は異なる菌株である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記異なる菌株は、
（ｉ）非武装化アグロバクテリウムとオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌；
（ｉｉ）非武装化アグロバクテリウムとリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌；及び
（ｉｉｉ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌とオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌
から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は５０：５０の比で存在する、請求項５８又は６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は７５：２５の比で存在する、請求項５８又は６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は９０：１０の比で存在する、請求項５８又は６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は９５：５の比で存在する、請求項５８又は６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の菌株と前記第２の菌株は９９：１の比で存在する、請求項５８又は６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、表４又は表５から選択されるプロモーターをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項７４】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたユビキチンプロモーターを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＬＥＣ１遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ウイルス又は植物エンハンサー配列をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＢＢＭ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８１】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＲｅｐＡ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８２】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＰＫＬａｍｉＲＮＡ融合体に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８３】
請求項５１に記載の形質遺伝子発現カセットを含む植物種子。
【請求項８４】
形質遺伝子発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法であって、
植物細胞を、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子発現カセット及びＴ−ＤＮＡ外の形態形成遺伝子発現カセットを含むプラスミドを含有する１つの菌株と接触させること
（ここで、前記形態形成遺伝子発現カセットは、
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｉｉ）Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド若しくは胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせ
を含み；
前記形質遺伝子発現カセットは、
害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、乾燥耐性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害耐性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む）；
前記形質遺伝子発現カセットを含み、形態形成遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びに
前記植物細胞からトランスジェニック植物を再生すること
を含む方法。
【請求項８５】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ヌクレオチド配列は、前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド、及び前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする、請求項８４に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択され、前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドはＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である、請求項８４に記載の方法。
【請求項９２】
前記非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、表４又は表５から選択されるプロモーターをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項９６】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたユビキチンプロモーターを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＬＥＣ１遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０１】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ウイルス又は植物エンハンサー配列をさらに含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０２】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＢＢＭ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０３】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＲｅｐＡ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０４】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＰＫＬａｍｉＲＮＡ融合体に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項８４に記載の形質遺伝子発現カセットを含む植物種子。
【請求項１０６】
形質遺伝子発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法であって、
植物細胞を、形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡ、及び形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを含む１つの菌株と接触させること
（ここで、前記形態形成遺伝子発現カセットは、
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｉｉ）Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド若しくは胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせ
を含み；
前記形質遺伝子発現カセットは、
害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、乾燥耐性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害耐性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む）；
前記形質遺伝子発現カセットを含み、形態形成遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びに
前記植物細胞からトランスジェニック植物を再生すること
を含む方法。
【請求項１０７】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ヌクレオチド配列は、前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド、及び前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択され、前記Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドはＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は前記胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記１つの菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１４】
前記非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、表４又は表５から選択されるプロモーターをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたユビキチンプロモーターを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＬＥＣ１遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ウイルス又は植物エンハンサー配列をさらに含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＢＢＭ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＲｅｐＡ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２６】
前記形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＰＫＬａｍｉＲＮＡ融合体に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
請求項１０６に記載の形質遺伝子発現カセットを含む植物種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般に、植物の遺伝子操作などの植物分子生物学の分野に関する。より具体的には、本開示は、形質転換植物を迅速且つ効率良く作製する方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６４１，７２５号明細書及び２０１８年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６４１，７３３号明細書の利益を主張するものであり、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１９年３月９日作成の２０１９０３０９＿７４８６ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ＴＸＴのファイル名の、８０３，１８０キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
形質転換及び再生の標準的なプロトコルの使用は、時間がかかり非効率的であり、初期の研究によって得られた結果に基づいて、大規模な現地作業での使用に、どの遺伝子コンストラクトを優先するか決定する「優先開発窓」に通常は季節的な制約があることを考慮すると、トランスジェニック製品の開発スケジュールに負の影響を及ぼす。形質転換及び再生に利用可能な標準的方法には、トランスジェニック植物を生産しスクリーニングする速さ及び効率を制限する多くの欠点がある。例えば、形質転換及び再生の多くの標準的方法は、オーキシン又はサイトカイニンを高濃度で使用する必要があり、また、肺発生カルス形成又は器官形成を含み、形質転換後に設ける温室で成育するための植物体を作製する前に何週間もかかる手順を生じさせる工程を必要とする。一連の遺伝的多様性を示し、顕著な商業的有用性を有する形質転換近交系を含む様々な出発組織型を用いて、多数の近交系において、形質転換率が有意により高く且つ品質が有意により良好なイベント（ベクター（プラスミド）バックボーンを持たない形質遺伝子発現カセットの１コピーを含むイベント）を生じる形質転換方法が依然として要望されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、形質遺伝子の１コピーを含むトランスジェニックイベントを作製するための方法及び組成物を含む。さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示した方法によって生産される植物の種子を提供する。
【０００６】
一態様では、本開示は、植物細胞を、形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡ、及び形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡと接触させること；形質遺伝子発現カセットを含み、形態形成遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びにその植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含む、形質遺伝子発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法を提供する。さらなる態様では、接触は、植物細胞を、第１の菌株における形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡ、及び第２の菌株における形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡと、同時に接触させることを含む。またさらなる態様では、接触は、植物細胞を、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子発現カセット及びＴ−ＤＮＡ外の形態形成遺伝子発現カセットを含むプラスミドを含有する１つの菌株と接触させることを含む。さらに別の態様では、接触は、植物細胞を、１つの菌株中の、形質遺伝子発現カセットを含有するＴ−ＤＮＡ、及び形態形成遺伝子発現カセットを含有するＴ−ＤＮＡと接触させることを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉ）Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド若しくは胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせを含む。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする。さらなる態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択される。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする。さらなる態様では、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド、及びＢａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする。さらなる態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択され、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドはＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である。さらなる態様では、形質遺伝子発現カセットは、害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、乾燥耐性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害耐性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は同じ菌株である。さらなる態様では、同じ菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である。さらなる態様では、非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される。さらなる態様では、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される。さらなる態様では、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される。またさらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は異なる菌株である。さらなる態様では、異なる菌株は、（ｉ）非武装化アグロバクテリウムとオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌；（ｉｉ）非武装化アグロバクテリウムとリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌；及び（ｉｉｉ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌とオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌から選択される。さらなる態様では、非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される。さらなる態様では、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される。さらなる態様では、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は５０：５０の比で存在する。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は７５：２５の比で存在する。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は９０：１０の比で存在する。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は９５：５の比で存在する。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は９９：１の比で存在する。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、表４又は表５から選択されるプロモーターをさらに含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたユビキチンプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＬＥＣ１遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ウイルス又は植物エンハンサー配列をさらに含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＢＢＭ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＲｅ��Ａ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＰＫＬａｍｉＲＮＡ融合体に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形質遺伝子発現カセットを含む植物種子が提供される。
【０００７】
一態様では、本開示は、植物細胞を、形質遺伝子発現カセット及び選択可能マーカー発現カセットに隣接する右境界配列及び左境界配列を有するＴ−ＤＮＡと、Ｔ−ＤＮＡの外側のリプレッサー遺伝子発現カセットとを含むプラスミドを含有する菌株と接触させること（ここで、選択可能マーカー発現カセットはリプレッサー遺伝子によって発現されるリプレッサーポリペプチドによって抑制されるプロモーターを含む）；形質遺伝子発現カセット及び選択可能マーカー発現カセットを含み、リプレッサー遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びにその植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含む、形質遺伝子発現カセットの１コピー及び選択マーカー発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法を提供する。さらなる態様では、リプレッサー遺伝子発現カセットは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）、エタメツルフロンリプレッサー（ＥＳＲ）、クロルスルフロンリプレッサー（ＣＳＲ）、及びＴ−ＤＮＡ中のプロモーターを標的とするガイドＲＮＡを有するリプレッサー−ｄＣＡＳ９融合体をコードするヌクレオチド配列を含む。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、Ｔ−ＤＮＡ中の選択マーカーに作動可能に連結されたプロモーターを抑制するテトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）をコードする。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、Ｔ−ＤＮＡ中の選択マーカーに作動可能に連結されたプロモーターを抑制するエタメツルフロンリプレッサー（ＥＳＲ）をコードする。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、Ｔ−ＤＮＡ中の選択マーカーに作動可能に連結されたプロモーターを抑制するクロルスルフロンリプレッサー（ＣＳＲ）をコードする。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、Ｔ−ＤＮＡ中の選択マーカーに作動可能に連結された、プロモーターを抑制するガイドＲＮＡを有するリプレッサー−ｄＣＡＳ９融合体をコードする。さらなる態様では、形質遺伝子発現カセットは、害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、乾燥耐性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害耐性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む。さらなる態様では、菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である。さらなる態様では、非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４、及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される。さらなる態様では、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される。さらなる態様では、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される。さらなる態様では、形質遺伝子発現カセットを含む植物種子が提供される。
【０００８】
一態様では、本開示は、植物細胞を、第１の菌株における形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡ、及び第２の菌株における形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡと同時に接触させること（ここで、形態形成遺伝子発現カセットは、（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉ）Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド若しくは胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせを含み；形質遺伝子発現カセットは、害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、干ばつ抵抗性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害抵抗性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む）；形質遺伝子発現カセットを含み、形態形成遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びにその植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含む、形質遺伝子発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法を提供する。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする。さらなる態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択される。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする。さらなる態様では、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド、及びＢａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする。さらなる態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択され、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドはＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は同じ菌株である。さらなる態様では、同じ菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である。さらなる態様では、非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される。さらなる態様では、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される。さらなる態様では、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される。さら���る態様では、第１の菌株と第２の菌株は異なる菌株である。さらなる態様では、異なる菌株は、（ｉ）非武装化アグロバクテリウムとオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、（ｉｉ）非武装化アグロバクテリウムとリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌；及び（ｉｉｉ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌とオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌から選択される。さらなる態様では、非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される。さらなる態様では、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される。さらなる態様では、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は５０：５０の比で存在する。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は７５：２５の比で存在する。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は９０：１０の比で存在する。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は９５：５の比で存在する。さらなる態様では、第１の菌株と第２の菌株は９９：１の比で存在する。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、表４又は表５から選択されるプロモーターをさらに含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたユビキチンプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＬＥＣ１遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ウイルス又は植物エンハンサー配列をさらに含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＢＢＭ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＲｅｐＡ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＰＫＬａｍｉＲＮＡ融合体に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形質遺伝子発現カセットを含む植物種子が提供される。
【０００９】
一態様では、本開示は、植物細胞を、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子発現カセット及びＴ−ＤＮＡ外の形態形成遺伝子発現カセットを含むプラスミドを含有する１つの菌株と接触させること（ここで、形態形成遺伝子発現カセットは、（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉ）Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド若しくは胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせを含み；形質遺伝子発現カセットは、害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、干ばつ抵抗性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害抵抗性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む）；形質遺伝子発現カセットを含み、形態形成遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びにその植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含む、形質遺伝子発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法を提供する。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする。さらなる態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択される。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする。さらなる態様では、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド、及びＢａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする。さらなる態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択され、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドはＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である。さらなる態様では、菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である。さらなる態様では、非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４、及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される。さらなる態様では、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される。さらなる態様では、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、表４又は表５から選択されるプ���モーターをさらに含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたユビキチンプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＬＥＣ１遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ウイルス又は植物エンハンサー配列をさらに含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＢＢＭ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＲｅｐＡ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＰＫＬａｍｉＲＮＡ融合体に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形質遺伝子発現カセットを含む植物種子が提供される。
【００１０】
一態様では、本開示は、植物細胞を、形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡ、及び形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを含む１つの菌種と接触させること（ここで、形態形成遺伝子発現カセットは、（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉ）Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド若しくは胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせを含み；形質遺伝子発現カセットは、害虫耐性を付与する遺伝子、除草剤耐性を付与する遺伝子、ストレス耐性を付与する遺伝子、干ばつ抵抗性を付与する遺伝子、窒素利用効率（ＮＵＥ）を付与する遺伝子、病害抵抗性を付与する遺伝子、及び代謝経路を変化させる能力を付与する遺伝子の群から選択される形質遺伝子を含む）；形質遺伝子発現カセットを含み、形態形成遺伝子発現カセットを含まない植物細胞を選択すること；並びにその植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含む、形質遺伝子発現カセットの１コピーを有するトランスジェニック植物を生産する方法を提供する。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする。さらなる態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択される。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする。さらなる態様では、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である。さらなる態様では、ヌクレオチド配列は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド、及びＢａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチド又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドをコードする。さらなる態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５及びＷＯＸ９から選択され、Ｂａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）ポリペプチドはＢＢＭ２、ＢＭＮ２及びＢＭＮ３から選択され、又は胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチドはＯＤＰ２である。さらなる態様では、１つの菌株は、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌の群から選択されるリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）である。さらなる態様では、非武装化アグロバクテリウムは、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４及びＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−の群から選択される。さらなる態様では、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌は表２から選択される。さらなる態様では、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌は表３から選択される。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、表４又は表５から選択されるプロモーター���さらに含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＨＢＳＴＡＲＴ３プロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたユビキチンプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＬＥＣ１遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＬＥＣ１遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ウイルス又は植物エンハンサー配列をさらに含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＢＢＭ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、Ｔ２ＡウイルスペプチドＲｅｐＡ遺伝子融合体に融合したＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形態形成遺伝子発現カセットは、ＷＵＳ遺伝子に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーター、及びＰＫＬａｍｉＲＮＡ融合体に作動可能に連結されたＰＬＴＰプロモーターを含む。さらなる態様では、形質遺伝子発現カセットを含む植物種子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１１にさらに記載されるように、プラスミドＰＨＰ８１７１８（ＷＵＳ処理）及びＰＨＰ８０７２８（ＴＡＧ−ＲＦＰ処理）の体細胞胚形成の効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、添付の図面を参照しながら本明細書中の開示をより詳しく説明するが、図面は可能な態様のいくつかを示すものであって全部ではない。実際、開示は、多くの異なる形態で具体化可能であり、本明細書中に記載した態様に限られると解釈すべきではなく、むしろ、これらの態様は、本開示が適用法的要件を満たすために提供されるものである。
【００１３】
本明細書に開示する多くの変更及び他の態様は、本開示の方法が関連する分野の当業者であって、以下の説明や添付の図面に提示された教示を利用できる者であれば、思い付くであろう。したがって、開示が、開示した特定の態様に限定されるべきではなく、また、変更やその他の態様が添付の特許請求の範囲に含まれることを意図していることは理解されるべきである。本明細書中には特定の用語が使用されるが、それらは、一般的且つ記述的意味でのみ使用されものであって、限定を目的として使用されるものではない。
【００１４】
本明細書で用いられる専門用語は、特定の態様を記載するという目的のためのものであるにすぎず、限定的であることを意図しない。本明細書及び特許請求の範囲で使用する用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」には、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」態様が含まれ得る。他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示の方法が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。この後に続く本明細書及び特許請求の範囲においては、本明細書で定義する多くの用語について言及するであろう。
【００１５】
本開示は、形態形成遺伝子を使用してトランスジェニック植物を作製する方法を含む。本明細書で使用される場合、用語「形態形成遺伝子」は、異所的に発現した場合に、植物を作製することができる体細胞から発生した構造体の形成を刺激する遺伝子を意味する。より正確には、形態形成遺伝子の異所性発現が、植物を作製することができる体細胞胚又はシュート分裂組織などの器官形成構造体のデノボ形成を刺激する。この刺激によるデノボ形成は、形態形成遺伝子が発現した細胞、又は隣接細胞で起こる。形態形成遺伝子は、他の遺伝子の発現を調節する転写因子、又は植物組織中のホルモン濃度に影響する遺伝子であり得、これらはいずれも形態形成変化を刺激することができる。本明細書中で使用される場合、用語「形態形成因子」は、形態形成遺伝子及び／又は形態形成遺伝子によって発現されるタンパク質を意味する。
【００１６】
形態形成遺伝子は、ＷＵＳ／ＷＯＸ遺伝子（ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５、又はＷＯＸ９）などの、植物代謝、器官発生、体細胞発生、細胞成長促進、器官形成、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／又は発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、又はそれらの組み合わせに関与する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３４８，４６８号明細書及び同第７，２５６，３２２号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１７／０１２１７２２号明細書及び同第２００７／０２７１６２８号明細書；Ｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：８７−９６；及びＭａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：８０５−８１５；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｒａａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：２４８；Ｄｏｌｚｂｌａｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １９：１０２８−３９を参照されたい。ＷＵＳ／ＷＯＸの調節は、植物代謝、器官発生、幹細胞発生、細胞成長促進、器官形成、体細胞胚形成開始、体細胞胚成熟の促進、頂端分裂組織の分化及び／若しくは発達、シュート分裂組織の分化及び／若しくは発達、又はそれらの組み合わせを含む植物及び／又は植物組織表現型を調節すると考えられる。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳの発現は栄養組織に幹細胞を誘導することができ、これは体細胞胚に分化することができる（Ｚｕｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３０：３４９−３５９）。この点に関して、ＭＹＢ１１８遺伝子（米国特許第７，１４８，４０２号明細書を参照）、ＭＹＢ１１５遺伝子（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２４−２３５を参照）、ＢＡＢＹＢＯＯＭ遺伝子（ＢＢＭ；Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１７３７−１７４９を参照）、又はＣＬＡＶＡＴＡ遺伝子（例えば、米国特許第７，１７９，９６３号明細書を参照）もまた興味深い。
【００１７】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドの形態形成ポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、本開示の方法において有用である。Ｗｕｓｃｈｅｌタンパク質（以下、ＷＵＳという）は、多能性幹細胞プールを含む頂端分裂組織の分化及び維持に重要な役割を果たす（Ｅｎｄｒｉｚｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０：９６７−９７９；Ｌａｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：８７−９６；及びＭａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：８０５−８１５）。ＷＵＳ遺伝子用のアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物変異体は、特定されておらず、分化するように見える幹細胞を含む。ＷＵＳは、転写調節因子として機能すると推定される新規のホメオドメインタンパク質をコードする（Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｅｌｌ９５：８０５−８１５）。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）シュート分裂組織の幹細胞集団は、器官開始を促進するＣＬＡＶＡＴＡ（ＣＬＶ）遺伝子と幹細胞同一性に必要なＷＵＳ遺伝子との間の調節ループによって維持される（ＣＬＶ遺伝子が転写レベルでＷＵＳを抑制し、ＷＵＳが分裂組織細胞同一性と幹細胞マーカーＣＬＶ３の発現を十分に誘導し得るだけ発現する）と考えられている（Ｂｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：６１７−６１９；Ｓｃｈｏｏｆ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｅｌｌ  １００：６３５−６４４）。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＷＵＳの構成的発現が葉からの不定のシュート増殖（植物内で）に導くことが示された（Ｌａｕｘ，Ｔ．，第ＸＶＩ回国際植物科学会議（ｔｈｅ  ＸＶＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｍｅｅｔｉｎｇ），Ａｕｇ．１−７，１９９９，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．での発表）。
【００１８】
一態様では、本開示の方法において有用なＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５、ＷＯＸ５Ａ、又はＷＯＸ９ポリペプチドである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３４８，４６８号明細書及び同第７，２５６，３２２号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１７／０１２１７２２号明細書及び同第２００７／０２７１６２８号明細書、並びにｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｒａａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：２４８を参照）。本開示の方法において有用なＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、本明細書に記載の植物のいずれかから得られ得るか、又はそれに由来し得る。本開示の方法において有用なさらなるＷＵＳ／ＷＯＸ遺伝子を、以下の表１に列挙する。
【００１９】
【表１−１】
2021517812.tif 000003
【００２０】
【表１−２】
2021517812.tif 000004
【００２１】
本開示に有用な他の形態形成遺伝子としては、ＬＥＣ１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，８２５，３９７号明細書、Ｌｏｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｅｌｌ  ９３：１１９５−１２０５）、ＬＥＣ２（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＮＡＳ  １０５：３１５１−３１５６；Ｂｅｌｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ  １１３：５４３−５５３）、ＫＮ１／ＳＴＭ（Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ７：７８７−７９５）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のＩＰＴ遺伝子（Ｅｂｉｎｕｍａ  ａｎｄ  Ｋｏｍａｍｉｎｅ，２００１，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ−Ｐｌａｎｔ  ３７：１０３−１１３）、ＭＯＮＯＰＴＥＲＯＳ−ＤＥＬＴＡ（Ｃｋｕｒｓｈｕｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．２０４：５５６−５６６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＶ−６ｂ遺伝子（Ｗａｂｉｋｏ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｍｕｒａ  １９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：９３９−９５１）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＡ−ｈ及びＩＡＡ−ｍ遺伝子の組み合わせ（Ｅｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，２０：９２３−９２８）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＳＥＲＫ遺伝子（Ｈｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７：８０３−８１６）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｏｐｓｉｓ）ＡＧＬ１５遺伝子（Ｈａｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３３：６５３−６６３）、ＦＵＳＣＡ遺伝子（Ｃａｓｔｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｉｎｋｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：２５−４１）、並びにＰＩＣＫＬＥ遺伝子（Ｏｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ  ９６：１３８３９−１３８４４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「発現カセット」は、形質転換／トランスフェクトされた細胞における発現を制御する５’及び３’調節配列を含む、コード配列及び非コード配列からなるベクターＤＮＡの個別の成分を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸をコードする開始コドン及び終止コドンを境界とするＤＮＡ配列の部分を意味する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「非コード配列」は、メッセンジャーＲＮＡを生成するために転写されるが、５’非翻訳領域、イントロン及び３’非翻訳領域などのタンパク質のアミノ酸をコードしないＤＮＡ配列の部分を意味する。非コード配列はまた、内因性遺伝子又は別の導入遺伝子の発現を下方制御することができる、マイクロＲＮＡ、干渉ＲＮＡ又はＲＮＡヘアピンなどのＲＮＡ分子を指し得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「調節配列」は、遺伝子の発現を増加又は減少させることができる核酸分子のセグメントを意味する。調節配列としては、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーエレメント、サイレンシングエレメント、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ（非翻訳領域）が挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「Ａｇｒｏ１」は、「形質遺伝子」発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを有するプラスミドを有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「Ａｇｒｏ２」は、ＢＢＭ及び／又はＷＵＳ２など（これらに限定されない）の遺伝子を発現する「形態形成遺伝子」発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを有するプラスミドを有するアグロバクテリウムを意味する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「トランスファーカセット」は、右境界配列及び左境界配列が隣接する１つ又は複数の発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを意味する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、Ｔ−ＤＮＡは、宿主植物細胞のゲノムに挿入されるＴｉプラスミドの一部を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー」は、形質転換／トランスフェクトされた細胞において発現した場合に、形質転換／トランスフェクトされていない細胞に対して毒性を示す抗生物質、除草剤及び他の化合物などの選択剤に対する耐性を付与する導入遺伝子を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「ＥＡＲ」は、転写因子内の転写抑制シグナルとして作用する、ＬＬｘＬｘＬ、ＤＮＬｘｘＰ、ＬｘＬｘＰＰ、Ｒ／ＫＬＦＧＶ、又はＴＬＬＬＦＲの一般的なコンセンサス配列を有するエチレン応答エレメント結合因子関連両親媒性抑制モチーフを意味する。転写因子、ｄＣＡＳ９、又はＬＥＸＡ（例として）などのＤＮＡ結合タンパク質にＥＡＲ型抑制エレメントを加えると、融合タンパク質に転写抑制機能が付与される（Ｋａｇａｌｅ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｏｚｗａｄｏｗｓｋｉ，Ｋ．２０１０．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ５：６９１−６９４）。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「転写因子」は、プロモーターのＤＮＡ配列に結合し、発現を上方制御又は下方制御することによって、特異的遺伝子の転写速度を制御するタンパク質を意味する。形態形成遺伝子でもある転写因子の例としては、ＡＰ２／ＥＲＥＢＰファミリー（例えば、ＢＢＭ（ＯＤＰ２））のメンバー、多血症及びアインテグメンタサブファミリー、ＬＥＣ１及びＨＡＰ３などのＣＡＡＴボックス結合タンパク質、並びにＭＹＢ、ｂＨＬＨ、ＮＡＣ、ＭＡＤＳ、ｂＺＩＰ及びＷＲＫＹファミリーのメンバーが挙げられる。
【００３３】
胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチド、及び関連ポリペプチド、例えばＢａｂｙｂｏｏｍ（ＢＢＭ）タンパク質ファミリータンパク質の形態形成ポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、本開示の方法において有用である。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドはＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２、又はＢＭＮ３ポリペプチドであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０１２１７２２号明細書を参照されたい。本開示の方法において有用なＯＤＰ２ポリペプチドは、２つの予想されるＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）ドメインを含み、ＡＰ２タンパク質ファミリーのメンバーである（ＰＦＡＭアクセッションＰＦ００８４７）。推定転写因子のＡＰ２ファミリーは、広範な発達プロセスを調節することがわかっており、ファミリーのメンバーは、ＡＰ２  ＤＮＡ結合ドメインを有することを特徴としている。この保存コアはＤＮＡに結合する両親媒性のアルファヘリックスを形成すると予想される。ＡＰ２ドメインは最初にＡＰＥＴＡＬＡ２、すなわち、分裂組織の決定、花器の特定、種皮の発達、及び花芽のホメオティック遺伝子の発現を調節するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のタンパク質で確認された。今では、ＡＰ２ドメインは様々なタンパク質で見出されている。
【００３４】
本開示のＯＤＰ２ポリペプチドは、ＡＰ２ファミリーのいくつかのポリペプチドと相同性を共有する（例えば、米国特許第８４２０８９３号明細書の図１を参照されたい（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、そこには２つのＡＰ２ドメインを有する８種の他のタンパク質と共に、トウモロコシ及びイネのＯＤＰ２ポリペプチドのアライメントが示されている））。米国特許第８４２０８９３号明細書のアライメントに示されている全タンパク質のコンセンサス配列もまた、その図１に示されている。本開示の方法において有用な２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、本明細書中に記載される植物のいずれかから得られ得るか、又はそれに由来し得る。一態様では、本開示の方法において有用な２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。一態様では、本開示の方法において有用な２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。本開示の方法において有用なＯＤＰ２ポリペプチド及びＢＢＭ２ポリペプチドは、本明細書に記載の植物のいずれかから得られ得るか、又はそれに由来し得る。
【００３５】
形態形成遺伝子は、植物のゲノムに安定的に組み込まれることもあれば、一時的に発現されることもある。一態様では、形態形成遺伝子の発現が制御される。制御された発現は、特定の期間の形態形成遺伝子の間欠的な発現であり得る。或いは、形態形成遺伝子が一部の形質転換細胞においてのみ発現され、他の細胞においては発現されないことがあり得る。形態形成遺伝子の発現の制御は、以下の本明細書中に開示する様々な方法によって行うことができる。本開示の方法において有用な形態形成遺伝子は、本明細書に記載される任意の植物種から得られ得るか、又はそれに由来し得る。
【００３６】
「植物」という用語は、全植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、植物組織、植物細胞、植物部分、種子、繁殖体、胚及びその子孫を指す。植物細胞は分化又は未分化であり得る（例えば、カルス、未分化カルス、未熟胚及び成熟胚、未熟接合胚、未熟子葉、胚軸、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉、葉細胞、根細胞、師管細胞、及び花粉）。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、外植片、未熟胚、胚、接合胚、体細胞胚、胚発生カルス、分裂組織、体細胞分裂組織、器官形成カルス、プロトプラスト、成熟穂生成種子由来胚、葉基、成熟植物由来葉、葉頂、未熟花序、房、未熟穂、シルク、子葉、未熟子葉、胚軸、分裂組織領域、カルス組織、葉由来細胞、葉由来細胞、茎由来細胞、根由来細胞、シュート由来細胞、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子由来の細胞が挙げられる。植物部としては、以下に限定されないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、及び様々な形態の培養物中の細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、及びカルス組織）を含む分化組織及び未分化組織が挙げられる。植物組織は、植物にあっても、植物の器官、組織若しくは細胞培養物にあってもよい。穀粒は、それらの種の栽培又は繁殖と異なる目的で栽培業者が作製する成熟種子を意味するものとする。再生植物の子孫、改変体及び変異体もまた、これらの子孫、改変体及び変異体が導入ポリヌクレオチドを含むなら、本開示の範囲に含まれる。
【００３７】
本開示は、以下に限定されないが、単子葉植物及び双子葉植物などの、任意の植物種の形質転換に使用することができる。単子葉植物としては、以下に限定されないが、オオムギ、トウモロコシ（トウモロコシ）、キビ（例えば、トウジンビエ（ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、テフ（エラグロスティス・テフ（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｆ））、オートムギ、イネ、ライムギ、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、ライコムギ、又はコムギ、或いは、葉及び茎作物、例えば、以下に限定されないが、竹、マーラム、牧草、アシ、ライグラス、サトウキビ；芝、観賞用草本、並びにスイッチグラス及び芝草などの他の草が挙げられる。或いは、本開示において使用される双子葉植物としては、以下に限定されないが、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、エンドウ、クローバー、アルファルファ、ソラマメ、トマト、ラッカセイ、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、又はワタが挙げられる。
【００３８】
目的とする植物種の例としては、以下に限定されないが、トウモロコシ（ズィー・メイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（例えば、Ｂ．ナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、Ｂ．ジュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））、特に、種子油源として有用なブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、キビ（例えば、トウジンビエ（ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ））、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））、コムギ（トリーティクム・アエスティウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））、ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ラッカセイ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ））、ワタ（ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、サツマイモ（イポモエア・バタツス（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ））、キャッサバ（マニホト・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コフィア属（Ｃｏｆｆｅａ）種）、ココナツ（ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ））、カンキツ樹（シトラス属（Ｃｉｔｒｕｓ）種）、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ））、チャノキ（カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（ムサ属（Ｍｕｓａ）種）、アボカド（ペルセア・アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））、イチジク（フィクス・カシカ（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ））、グアバ（プシディウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オレア・エウロパエア（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイア（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ））、カシュー（アナカルジウム・オクシデンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））、マカダミア（マカダミア・インテグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、アーモンド（プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ））、���ンサイ（ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、サトウキビ（サッカルム属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種）、カラスムギ、オオムギ、野菜、観賞植物及び球果植物が挙げられる。
【００３９】
高等植物、例えば、被子植物類（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）及び裸子植物類（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）を本開示に使用することができる。本開示に有用な好適な植物種は、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）、ユリズイセン科（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、ベニノキ科（Ｂｉｘａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、イヌガヤ科（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、イヌサフラン科（Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、マオウ科（Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ）、ユカノキ科（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、ヒカゲノカズラ科（Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、メランチウム科（Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、ヌマミズキ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、マツ科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）及びブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）由来であり得る。トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、パイナップル属（Ａｎａｎａｓ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）、アトローパ属（Ａｔｒｏｐａ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンレンボク属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、キナ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、コヒア属（Ｃｏｆｆｅａ）、イヌサフラン属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、エリスロキシルム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ガランサス属（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ナンヨウアブラギリ属（Ｊａｔｒｏｐｈａ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ヤマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヨモギキク属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ポア属（Ｐｏａ）、ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、サングイナリア属（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ウニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）、シュロソウ属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ビンカ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）及びトウモロコシ属（Ｚｅａ）に属する植物が本開示の方法に使用され得る。
【００４０】
農業、園芸、（液体燃料分子及び他の化学物質の作製のための）バイオマス作製、及び／又は林業にとって重要又は興味深い植物が、本開示の方法において使用され得る。非限定的な例としては、例えば、パニクム・ウィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、ミスカンツス・ギガンテウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ジャイアントミスカンサス）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ、エネルギー用サトウキビ）、ポプルス・バルサミフェラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ワタ（ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、ソルガム（ソルガム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、アンドロポゴン・ゲラルディー（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ペニセタム・プルプレウム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、ファラリスアルンディナケア（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（クサヨシ）、シノドン・ダクチロン（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（ギョウギシバ）、フェスツカ・アルンディナケア（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（オニウシノケグサ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、アルンド・ドナックス（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ、Ｅ．グランディス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）（及び、「ウログランディス」として知られるそのハイブリッド）、Ｅ．グロブルス（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、Ｅ．カマルドレンシス（Ｅ．ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）、Ｅ．テレティコルニス（Ｅ．ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉ）、Ｅ．ビミナリス（Ｅ．ｖｉｍｉｎａｌｉｓ）、Ｅ．ニテンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、Ｅ．サリグナ（Ｅ．ｓａｌｉｇｎａ）及びＥ．ウロフィラ（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）を含む）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（コムギ属（ｔｒｉｔｉｃｕｍ）−コムギ×ライムギ）、テフ（エラグロスティス・テフ（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｆ））竹、カルタムス  ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ヤトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ヤトロファ属（ｊａｔｒｏｐｈａ））、リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、エラエイス・グネーンシス（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、リヌム・ウシタティスシムム（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（亜麻）、マニホット��エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、リコペルシコン・エクスレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、ラクチュカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）（レタス）、ファセオルス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（サヤインゲン）、ファセオルス・リメンシス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）（ライマメ）、レンリソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）種（エンドウマメ）、ムサ・パラディシアカ（Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（Ｂ．ナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、Ｂ．ジュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ）、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（チャノキ）、フラガリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）（イチゴ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）（ココア）、コフェア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）（コーヒーノキ）、ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、カプシカム・アンヌム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ）（トウガラシ及びピーマン）、アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）（ラッカセイ）、イポモエア・バタツス（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）（サツマイモ）、ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）（ココナツ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）種（カンキツ類の木）、ペルセア・アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）（アボカド）、イチジク（フィクス・カシカ（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ））、グアバ（シジウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オレア・エウロパエ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ））、カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）（パパイア）、アナカルジウム・オクシデンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）（カシュー）、マカダミア・インテグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）（マカダミアの木）、プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）（アーモンド）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）（タマネギ）、ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）（マスクメロン）、ククミス・サチブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、ククミス・カンタルペンシス（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）（カンタロープ）、ククルビタ・マクシマ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ）（スクワシュ）、ククルビタ・モスカータ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）（スクワシュ）、スピナケア・オレラケア（Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、キトルッルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、アベルモスクス・エスクレンツス（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、シアムプシス・テトラゴノロバ（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ）（グアーマメ）、ケラトニア・シリクア（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）（イナゴマメ）、トリゴネラ・フォエヌム−グラエクム（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ）（フェヌグリーク）、ビグナ・ラディアタ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）（リョクトウ）、ビグナ・ウンギィクラタ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）（ササゲ）、ビシア・ファバ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）（ソラマメ）、キセル・アリエチヌム（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）（ヒヨコマメ）、レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）（レンズマメ）、パパフェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ケシ）、パパフェル・オリエンターレ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、タクスス・バッカータ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、タクスス・ブレウィフォリア（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、アルテミシア・アヌア（（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、カムプトテカ・アクミナーテ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、カタランツス・ロセウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ビンカ・ロセア（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ）、キンコナ・オッフィキナリス（Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、カリフォルニアバイケイソウ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ．）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ）、ジギタリス・プルプレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）種、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）種、シナマオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａｓｉｎｉｃａ）種、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）種、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ  ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）種、ホソバノトウゲシバ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｅｒｒａｔｕｍ）（トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ））、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）種、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）種、サンギナリア・カナデンシス（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）種、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、コシロギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔ���ｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）種（ｒｕｂｂｅｒ）、オランダハッカ（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、コショウハッカ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ）（ベニノキ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）種、バラ属（Ｒｏｓａ）種（バラ）、ツツジ属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）種（アザレア）、アザレア（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）（アザレア）、ブッソウゲ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）（ハイビスカス）、チューリップ属（Ｔｕｌｉｐａ）種（チューリップ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）種（ラッパズイセン）、ペチュニア・ハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）（ペチュニア）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、キク、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、シロバナルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ルピナス）、ユニオラ・パニクラタ（Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（カラスムギ）、ベントグラス（コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）種）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（ヤマナラシ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種（マツ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）種（モミ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）種（メープル）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（オオムギ）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ブルーグラス）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）種（ライグラス）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）（オオアワガエリ）、及び球果植物（ｃｏｎｉｆｅｒｓ）が挙げられる。
【００４１】
本開示においては球果植物を使用することができ、球果植物としては、例えば、テーダマツ（テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ））、スラッシュパイン（スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ））、ポンデローサマツ（ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ））、ロッジポールパイン（コントルタマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ））、及びモントレーパイン（ラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ））などのマツ；ダグラスファー（ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））；カナダツガ（カナダツガ（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））；アメリカツガ（アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ））；マウンテンヘムロック（マウンテンヘムロック（Ｔｓｕｇａ  ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ））；アメリカカラマツ又はカラマツ（ラリックス・オキシデンタリス（Ｌａｒｉｘ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））；ベイトウヒ（カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ））；セコイア（セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））；ヨーロッパモミ（アビエス・アマビリス（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ））及びバルサムモミ（バルサムモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ））などのトゥルーモミ；並びにベイスギ（ベイスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ））及びアラスカイエローシーダー（イエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））などのシーダーが挙げられる。
【００４２】
本開示においては芝草を使用することができ、芝草としては、以下に限定されないが、スズメノカタビラ（スズメノカタビラ（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ））、ネズミムギ（ネズミムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））、カナダブルーグラス（コイチゴツナギ（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））、コロニアルベントグラス（イトコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓｔｅｎｕｉｓ））、クリーピングベントグラス（コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、クレステッドホイートグラス（アグロピロン・デセルトルム（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ））、フェアウェイホイートグラス（アグロピロン・クリスタツム（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｃｒｉｓｔａｔｕｍ））、ハードフェスク（フェストゥカ・ロンギホリア（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ））、ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ））、オーチャードグラス（カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ））、ペレニアルライグラス（ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ））、レッドフェスク（オオウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ））、レッドトップ（コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓａｌｂａ））、ラフブルーグラス（オオスズメノカタビラ（Ｐｏａｔｒｉｖｉａｌｉｓ））、ウシノケグサ（ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｖｉｎａ））、スムーズブロムグラス（コスズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ））、オオアワガエリ（オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））、ベルベットベントグラス（ヒメヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ））、ウィーピングアルカリグラス（アレチタチドジョウツナギ（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ  ｄｉｓｔａｎｓ））、ヒメカモジグサ（アグロピロン・スミチイ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｍｉｔｈｉｉ））、セントオーガスチングラス（イヌシバ（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ））、ノシバ（シバ属（Ｚｏｙｓｉａ）種）、バヒアグラス（アメリカスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ））、カーペットグラス（ホソバツルメヒシバ（Ａｘｏｎｏｐｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ））、センチビードグラス（チャボウシノシッペイ（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ  ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ））、キクユグラス（キクユグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｃｌａｎｄｅｓｉｎｕｍ））、シーショアパスパラム（サワスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｖａｇｉｎａｔｕｍ））、ブルーグラマ（ブルーグラマ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ））、バッファローグラス（バッファローグラス（Ｂｕｃｈｌｏｅ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｓ））、アゼガヤモドキ（アゼガヤモドキ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ））が挙げられる。
【００４３】
特定の態様では、本開示の方法により形質転換される植物は、作物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、イネ、ソルガム、コムギ、キビ、タバコなど）である。特に目的とする植物としては、目的とする種子を提供する穀物植物、油糧種子植物及びマメ科植物が挙げられる。目的の種子としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライムギなどの穀物の種子が挙げられる。油糧種子植物としては、ワタ、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナッツなどが挙げられ、マメ科植物としては、以下に限定されないが、マメ及びエンドウマメが挙げられる。マメとしては、以下に限定されないが、グアー、イナゴマメ、フェヌグリーク、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、及びヒヨコマメが挙げられる。
【００４４】
本開示はまた、本明細書に開示した任意の方法により得られる植物を含む。本開示はまた、本明細書に開示した任意の方法により得られる植物由来の種子を含む。トランスジェニック植物は、導入遺伝子を含む成熟した稔性植物と定義される。
【００４５】
開示した方法では、未熟胚、１〜５ｍｍの接合胚、３〜５ｍｍの胚、並びに、成熟した雌穂由来の種子、葉基、十分に成長した植物体の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟雌穂、及びシルクに由来する胚などの様々な外植片を使用することができる。一態様では、開示した方法で使用される外植片は、成熟した雌穂由来の種子、葉基、十分に成長した植物体の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟雌穂、及びシルク由来のものであり得る。開示した方法で使用される外植片は、本明細書に記載される植物のいずれかに由来し得る。
【００４６】
本開示は、単離された、又は実質的に精製された核酸組成物を包含する。「単離された」又は「精製された」、核酸分子若しくはタンパク質又はそれらの生物活性部分は、その天然に存在する環境において見出されるような核酸分子若しくはタンパク質に通常付随するか若しくは相互作用する他の細胞物質若しくは成分を実質的に含まず、又は組み換え技術によって生成される場合、培養培地を実質的に含まず、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸に隣接している配列（タンパク質コード配列を含む）（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を実質的に有していない。例えば、各種態様においては、単離された核酸分子が含有する、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸分子に隣接しているヌクレオチド配列は、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満であり得る。細胞物質を実質的に含んでいないタンパク質としては、夾雑タンパク質の含有量が約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満（乾燥重量で）のタンパク質調製物が挙げられる。本開示の方法に有用なタンパク質、又はその生物学的に活性な部分が組み換え技術によって作られた場合、最適には、培養培地中の前駆的化学物質又は非目的タンパク質の化学物質は、約３０％、２０％、１０％、５％又は１％未満（乾燥重量で）である。本開示の方法に有用な配列は、それぞれの転写開始部位に隣接している５’末端側非翻訳領域から単離することができる。本開示は、本開示の方法に有用な単離又は実質的に精製された核酸又はタンパク質組成物を包含する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「断片」は、核酸配列の一部を指す。本開示の方法に有用な配列の断片は、核酸配列の生物学的活性を保持する。或いは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、必ずしも生物学的活性を保持していないことがある。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の断片は、その範囲が、少なくとも約２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０、１９７５、２０００、２０２５、２０５０、２０７５、２１００、２１２５、２１５０、２１７５、２２００、２２２５、２２５０、２２７５、２３００、２３２５、２３５０、２３７５、２４００、２４２５、２４５０、２４７５、２５００、２５２５、２５５０、２５７５、２６００、２６２５、２６５０、２６７５、２７００、２７２５、２７５０、２７７５、２８００、２８２５、２８５０、２８７５、２９００、２９２５、２９５０、２９７５、３０００、３０２５、３０５０、３０７５、３１００、３１２５、３１５０、３１７５、３２００、３２２５、３２５０、３２７５、３３００、３３２５、３３５０、３３７５、３４００、３４２５、３４５０、３４７５、３５００、３５２５、３５５０、３５７５、３６００、３６２５、３６５０、３６７５、３７００、３７２５、３７５０、３７７５、３８００、３８２５、３８５０、３８７５、３９００、３９２５、３９５０、３９７５、４０００、４０２５、４０５０、４０７５、４１００、４１２５、４１５０、４１７５、４２００、４２２５、４２５０、４２７５、４３００、４３２５、４３５０、４３７５、４４００、４４２５、４４５０、４４７５、４５００、４５２５、４５５０、４５７５、４６００、４６２５、４６５０、４６７５、４７００、４７２５、４７５０、４７７５、４８００、４８２５、４８５０、４８７５、４９００、４９２５、４９５０、４９７５、５０００、５０２５、５０５０、５０７５、５１００、５１２５、５１５０、５１７５、５２００、５２２５、５２５０、５２７５、５３００、５３２５、５３５０、５３７５、５４００、５４２５、５４５０、５４７５、５５００、５５２５、５５５０、５５７５、５６００、５６２５、５６５０、５６７５、５７００、５７２５、５７５０、５７７５、５８００、５８２５、５８５０、５８７５、５９００、５９２５、５９５０、５９７５、６０００、６０２５、６０５０、６０７５、６１００、６１２５、６１５０、６１７５、６２００、又は６２２５のヌクレオチドから、対象配列の完全長にまで及び得る。ヌクレオチド配列の生物学的に活性な部分は、配列の一部を単離し、その部分の活性を評価することによって調製することができる。
【００４８】
本開示の方法において有用なヌクレオチド配列の断片及び改変体、並びにそれらによってコードされるタンパク質もまた、包含される。本明細書で使用される場合、用語「断片」は、ヌクレオチド配列の一部、したがってそれによってコードされるタンパク質、又はアミノ酸配列の一部を指す。ヌクレオチド配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持しているタンパク質断片をコードし得る。或いは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、生物学的活性を保持している断片タンパク質を一般にコードしない。したがって、ヌクレオチド配列の断片は、その範囲が、少なくとも約２０個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチドから、本開示のタンパク質をコードする完全長のヌクレオチド配列にまで及び得る。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「改変体」は、本明細書に開示の配列と実質的類似性を有する配列を意味する。改変体は、天然のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの１つ以上の内部部位における１つ以上のヌクレオチド若しくはペプチドの欠失及び／若しくは付加、並びに／又は天然のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの１つ以上の部位における１つ以上のヌクレオチド若しくはペプチドの置換を含む。本明細書で使用される場合、「天然の」ヌクレオチド又はペプチド配列は、それぞれ、天然に存在するヌクレオチド又はペプチド配列を含む。ヌクレオチド配列では、天然に存在する改変体は、よく知られた分子生物学的手法、例えば、ポリヌクレアーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や、本明細書で概説しているようなハイブリダイゼーション法を用いて同定することができる。本開示の方法に有用なタンパク質の生物学的活性を有する改変体は、その天然のタンパク質と、僅かに１〜１５個のアミノ酸残基、僅かに１〜１０個、例えば６〜１０個、僅かに５個、僅かに４個、３個、２個、又はたった１個のアミノ酸残基だけで異なっていることがある。
【００５０】
改変体ヌクレオチド配列はまた、例えば、部位特異的変異誘発を使用して生成されたものなど、合成的に作られたヌクレオチド配列を含む。一般に、本明細書に開示のヌクレオチド配列の改変体は、本明細書の他の箇所に記載の配列アライメントプログラム（デフォルトパラメーターを使用）で測定したとき、そのヌクレオチド配列に対し少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有するであろう。本明細書に開示のヌクレオチド配列の生物学的に活性な改変体もまた包含される。生物学的活性は、ノーザンブロット解析、転写融合体で行うレポーター活性測定などの手法を用いて測定することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。或いは、ヌクレオチド断片又は改変体に作動可能に連結されたプロモーターの制御下で生成される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などのレポーター遺伝子のレベルを測定することができる。例えば、Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：９６９−９７３、米国特許第６，０７２，０５０号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｎａｇａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（１）：８７−９０を参照されたい。改変体ヌクレオチド配列にはまた、ＤＮＡシャフリングなどの変異組み換え誘導法により生成される配列も包含される。このような手順を用いて、１つ以上の異なるヌクレオチド配列を操作して、新たなヌクレオチド配列を作製し得る。このようにして、実質的な配列同一性を有し、インビトロ又はインビボで相同的に組み換えることができる配列領域を含む関連配列のポリヌクレオチドの集団から、組み換えポリヌクレオチドのライブラリーが作られる。このようなＤＮＡシャフリングのための戦略は当該技術分野で知られている。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１、Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９  ３９１、Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８、Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９、Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１、並びに米国特許第５，６０５，７９３号明細書及び同第５，８３７，４５８号明細書（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００５１】
変異誘発及びヌクレオチド配列改変の方法は当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、米国特許第４，８７３，１９２号明細書、Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びこれらに引用されている参考文献（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。目的タンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のモデルにおいて見出すことができる。１つのアミノ酸をそれと類似の特性を有する他のアミノ酸と交換するような保存置換が最適であり得る。
【００５２】
本開示のヌクレオチド配列は、他の生物、特には他の植物、より特には他の単子葉植物又は双子葉植物から対応する配列を単離するために使用することができる。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法は、本明細書に記載の配列に対する配列相同性に基づいてそのような配列を同定するのに使用することができる。本明細書に記載の全配列又はそれらの断片に対する配列同一性に基づいて単離された配列は、本開示に包含される。
【００５３】
ＰＣＲ法では、任意の目的の植物から抽出したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡからの対応するＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲ反応に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計する方法及びＰＣＲクローニングの方法は当該技術分野では一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。知られているＰＣＲ方法としては、以下に限定されないが、対合プライマー、ネステッドプライマー、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチのプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
【００５４】
ハイブリダイゼーション手法では、既知のヌクレオチド配列の全て又は一部を、選択した生物からのクローン化ゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ断片の集団（すなわち、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリー）に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用する。ハイブリダイゼーションのプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、又は他のオリゴヌクレオチドであり得、３２Ｐ又は任意の他の検出マーカーなどの検出可能な群で標識化することができる。このように、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブは、本開示の配列をベースとする合成オリゴヌクレオチドを標識化することにより作製することができる。ハイブリダイゼーション用プローブの調製方法、及びゲノムライブラリーの構築方法は、当該技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）に開示されている。
【００５５】
例えば、本明細書に開示の全配列、又はその１つ以上の部分を、対応するプロモーター配列及びメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして使用することができる。様々な条件下で特異的ハイブリダイゼーションを行うために、そのようなプローブは、配列に特有で、長さが一般に少なくとも約１０ヌクレオチド長又は少なくとも約２０ヌクレオチド長の配列を含む。そのようなプローブは、ＰＣＲにより選択された植物からの対応する配列を増幅するために使用することができる。この手法は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために、又は生物中のコード配列の存在を決定する診断アッセイとして使用することができる。ハイブリダイゼーション手法には、プレーティングしたＤＮＡライブラリー（プラーク又はコロニー、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照）のハイブリダイゼーションスクリーニングが含まれる。
【００５６】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブが他の配列よりその標的配列により検出できる程度に（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件を意味するものである。ストリンジェントな条件は、配列依存性があり、環境によって異なるであろう。ハイブリダイゼーション条件及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。或いは、ストリンジェンシー条件は、低い程度の類似性が検出されるように配列内での一部のミスマッチを許容するように調整することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブの長さは約１０００ヌクレオチド未満、最適には５００ヌクレオチド未満である。
【００５７】
通常、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、通常約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又は、他の塩）で、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合に少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）の場合に少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加により形成することができる。低ストリンジェントな条件の例としては、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液によるハイブリダイゼーション、及び５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）における洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェントな条件の例としては、３７℃で、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。高ストリンジェントな条件の例としては、３７℃で、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び６０〜６５℃で少なくとも３０分間、０．１×ＳＳＣにおける最終洗浄が挙げられる。ハイブリダイゼーションの時間は、概ね約２４時間未満であり、通常約４〜約１２時間である。洗浄時間は、少なくとも平衡に達することができるだけの時間であろう。
【００５８】
特異性は、通常、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度と温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、熱融点（Ｔｍ）はＭｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３８：２６７  ２８４の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ（式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対のハイブリッドの長さである）から概算することができる。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度及びｐＨで）である。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄の条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整し得る。例えば、９０％の同一性を有する配列を得たい場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列及びその相補配列についてのＴｍより約５℃低くなるように選択される。しかしながら、厳しいストリンジェントな条件は、Ｔｍより１、２、３、又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができ、中程度のストリンジェントな条件は、Ｔｍより６、７、８、９、又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができ、低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍより１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができる。当業者であれば、この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄の組成物、並びに所望のＴｍを使用して、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本質的に説明されていることを理解するであろう。所望のミスマッチの程度が４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴｍを生じる場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）もまた参照されたい。したがって、活性を有し、且つ本明細書に開示される配列又はその断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された配列は、本開示に包含される。
【００５９】
一般に、プロモーター活性を有し、且つ本明細書中に開示される配列にハイブリダイズする配列は、開示される配列と、少なくとも４０％〜５０％相同であり、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％〜９８％以上相同である。すなわち、配列の配列類似性は、少なくとも約４０％〜５０％、約６０％〜７０％、及び約８０％、８５％、９０％、９５％〜９８％の配列類似性を共有する範囲にわたり得る。
【００６０】
以下の用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド間の配列の関係性を記載するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、及び（ｅ）「実質的同一性」。本明細書で使用する場合、「参照配列」は、配列比較の基準として使用される規定の配列である。参照配列は、特定の配列のサブセット又はその全体、例えば、完全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメント、或いは完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列であり得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続した特定のセグメントをいい、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続したヌクレオチド長であり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００又はそれ以上であり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことに起因する参照配列に対する高い類似性を回避するために、ギャップペナルティが通常導入され、適合した数から減算されることを理解している。比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野においてよく知られている。したがって、任意の２つの配列間の配列同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。このような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ、ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８のアルゴリズム、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２：２６４（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７におけるように改変）のアルゴリズムであり、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューター化インプリメンテーションは、配列同一性を決定するための配列の比較に利用され得る。このようなインプリメンテーションとしては、限定はされないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）、並びにＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標），Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメーターを使用して実行し得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４、Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｃｏｒｐｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０、Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５、及びＰｅａｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）によく説明されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）（前出）のアルゴリズムに基づいている。ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティが、アミノ酸配列を比較する場合に、ＡＬＩＧＮプログラムで使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９０）（前出）のアルゴリズムに基づいている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行し、本開示のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行し、本開示のタンパク質又はポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０における）を利用することができる。或いは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０における）を使用して、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実行することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）（前出）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ、タンパク質に対するＢＬＡＳＴＸ）を使用し得る。国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイト、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。アライメントはまた、目視によって手動的に実行し得る。
【００６３】
別段の記載がない限り、本明細書に示されている配列同一性／類似性値は、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０により、以下のパラメータを用いて得られた値である：ヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ・ウエイト（ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ）５０、レングス・ウエイト（Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ）３、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリクスを使用；アミノ酸配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ・ウエイト（ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ）８、レングス・ウエイト（Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ）２、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用；又はそれらと等価の任意のプログラム。本明細書で使用する場合、「等価のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって作製されるその対応するアライメントと比較した場合、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致、及び同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを作製する、任意の配列比較プログラムである。
【００６４】
ＧＡＰプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（前出）を使用して、マッチ数を最大化しギャップ数を最小化する２つの完全な配列のアライメントを見出す。ＧＡＰは全ての可能なアライメント及びギャップ位置を考慮し、マッチした塩基の最大数と最小のギャップ数を有するアライメント作製する。これにより、マッチした塩基の単位におけるギャップクリエーションペナルティ及びギャップ伸長ペナルティの提示が可能になる。ＧＡＰは、挿入される各ギャップにマッチするギャップクリエーションペナルティ数を得る必要がある。ゼロより大きいギャップ伸長ペナルティを選択するなら、ＧＡＰはさらに、挿入される各ギャップに対し、ギャップ伸長ペナルティのギャップ倍長の長さを得る必要がある。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）のＶｅｒｓｉｏｎ  １０におけるプロテイン配列用のデフォルトのギャップクリエーションペナルティ値及びギャップ伸長ペナルティ値は、それぞれ８及び２である。ヌクレオチド配列では、デフォルトギャップクリエーションペナルティは５０であり、一方、デフォルトギャップ伸長ペナルティは３である。ギャップクリエーションペナルティ及びギャップ伸長ペナルティは、０〜２００からなる整数の群から選択される整数で表すことができる。したがって、例えば、ギャップクリエーションペナルティ及びギャップ伸長ペナルティは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又はそれ以上であり得る。
【００６５】
ＧＡＰは、最良のアライメントファミリーの１メンバーを示す。このファミリーには多くのメンバーが存在し得るが、より良好なクオリティを有するメンバーは他に存在しない。ＧＡＰは、アライメントのための４つの性能指数を表示する：クオリティ、率（Ｒａｔｉｏ）、同一性及び類似性。クオリティは、配列をアラインするために最大化された量である。率（Ｒａｔｉｏ）は、クオリティを短いセグメント中の塩基数で除したものである。同一性パーセントは、実際に一致している記号のパーセントである。類似性パーセントは、類似している記号のパーセントである。ギャップに向かい合っている記号は無視する。１対の記号のスコアリングマトリクス値が類似性閾値の０．５０より大きいか又は等しいとき、類似性のスコアが付けられる。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）のＶｅｒｓｉｏｎ  １０において使用されるスコアリングマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。
【００６６】
２つの核酸配列又はポリペプチド配列と関連する「配列同一性」又は「同一性」は、本明細書で使用する場合、ある特定の比較ウィンドウに最大の対応でアラインしたときに同じである２つの配列の残基をいう。配列同一性のパーセンテージをタンパク質に関して使用する場合、同一でない残基位置がしばしば保存的アミノ酸置換により異なることが認識される。ここで、アミノ酸残基は、類似の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、それゆえ、分子の機能特性は変化しない。保存的置換で配列が異なる場合、置換の保存的性質を補正するために、配列同一性パーセントを高める方向に調節してもよい。そのような保存的置換によって相異する配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。このような調節を行う方法は、当業者にはよく知られている。典型的には、これには、保存的置換を、完全ミスマッチとしてではなく部分的ミスマッチとして採点し、それにより、配列同一性パーセントを高める方法が含まれる。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、非保存的置換に０のスコアを与える場合、保存的置換には０と１との間のスコアを与える。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）において実行されるように算出される。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウに最適にアラインされた２つの配列を比較することにより決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントについて、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置の数を決定してマッチ位置数を得、そのマッチ位置数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００６８】
ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを使用するアライメントプログラムを使用して参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者であれば、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めなどを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整され得ることは認識していよう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、及び少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００６９】
ヌクレオチド配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするか否かである。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列のＴｍよりも約５℃低く選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、Ｔｍより約１℃〜約２０℃低い範囲の温度を含み、本明細書中の他で限定されるように、所望するストリンジェンシーの程度により変わる。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて作製される場合に、起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一である１つの指標は、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと、免疫学的に交差反応性である場合である。
【００７０】
「改変体」は、実質的に類似した配列を意味するものである。ポリヌクレオチドでは、保存的改変体は、遺伝コードの縮重のために、本明細書に開示される形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。改変体ポリヌクレオチドにはまた、例えば、部位特異的変異誘発によって生成されるが、それでもなお本明細書に開示される形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドのタンパク質をコードするポリヌクレオチドなど、合成的に誘導されたポリヌクレオチドが含まれる。一般に、本明細書に開示される特定の形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドの改変体は、本明細書の他の箇所に記載される配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定した場合、その特定の形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するであろう。
【００７１】
「改変体」タンパク質は、天然タンパク質の１つ以上の内部部位での１つ以上のアミノ酸の欠失若しくは付加により、且つ／又は天然タンパク質の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換により、天然タンパク質から生成されるタンパク質を意味するものである。本開示に包含される改変体タンパク質は、生物学的活性を有する。すなわち、それらは、天然タンパク質に必要な生物学的活性を保持している、すなわち、そのポリペプチドは、形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドの活性を有している。このような改変体は、例えば、遺伝的多型、又は人工的操作により生成され得る。本明細書に開示される天然の形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドのタンパク質の生物活性を有する改変体は、本明細書の他の箇所に記載される配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定した場合、その天然のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。生物活性を有する本開示のタンパク質の改変体は、そのタンパク質と、僅かに１〜１５個のアミノ酸残基、僅かに１〜１０個、例えば６〜１０個、僅かに５個、僅かに４個、３個、２個、又はたった１個のアミノ酸残基だけで異なっていることがある。
【００７２】
本明細書に開示される配列及び遺伝子、並びにその改変体及び断片は、植物の遺伝子操作、例えば、形質転換植物又はトランスジェニック植物の作製において、目的の表現型を発現させるのに有用である。本明細書で使用する場合、「形質転換植物」及び「トランスジェニック植物」という用語は、そのゲノム内に異種ポリヌクレオチドを含む植物を指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが何世代にもわたって伝えられるように、トランスジェニック又は形質転換植物のゲノムに安定に組み込まれる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムに単独で、又は組み換えＤＮＡコンストラクトの一部として組み込むことができる。本明細書で使用する場合、用語「トランスジェニックの」には、異種核酸の存在によってその表現型が改変されたあらゆる細胞、細胞系、組織、植物部又は植物体が、それらの最初に改変されたトランスジェニック体も、その最初のトランスジェニック体から有性交配又は無性繁殖によって作られたものも、含まれることは理解されるべきである。
【００７３】
トランスジェニック「イベント」は、目的の遺伝子を含む核酸発現カセットなどの異種ＤＮＡコンストラクトで植物細胞を形質転換し、植物体のゲノムへ導入遺伝子を挿入することによって植物体集団を再生し、そして、特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられた植物体を選択することによって作製される。イベントは、挿入遺伝子の発現によって、表現型で特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは植物体の遺伝子構造の一部である。用語「イベント」はまた、形質転換体と他の植物との間の有性交配によって作製された子孫を指し、その子孫は異種ＤＮＡを含む。
【００７４】
形質転換プロトコル、及びヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的の植物又は植物細胞の種類により、すなわち単子葉植物であるか双子葉植物であるかにより変わり得る。ヌクレオチド配列を植物細胞に導入し、続いて植物ゲノムに挿入する好適な方法としては、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション法（Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換法（Ｔｏｗｎｓｅｎｄらの  米国特許第５，５６３，０５５号明細書、Ｚｈａｏらの  米国特許第５，９８１，８４０号明細書）、遺伝子直接導入法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、弾道粒子加速法（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号明細書（Ｓａｎｆｏｒｄら）、米国特許第５，８７９，９１８号明細書（Ｔｏｍｅｓら）、米国特許第５，８８６，２４４号明細書（Ｔｏｍｅｓら）、米国特許第５，９３２，７８２号明細書（Ｂｉｄｎｅｙら）、Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，”ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（ｍａｉｚｅ）、ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６を参照）、及びＬｅｃ１形質転換法（国際公開第００／２８０５８号パンフレット）が挙げられる。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７、Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（タマネギ）、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８７：６７１−６７４（ダイズ）、ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（ダイズ）、Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）、Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（イネ）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）、米国特許第５，２４０，８５５号明細書（Ｔｏｍｅｓ）、米国特許第５，３２���，７８３号明細書及び同第５，３２４，６４６号明細書（Ｂｕｉｓｉｎｇら）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９１：４４０−４４４（トウモロコシ）、Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）、Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４、米国特許第５，７３６，３６９号明細書（Ｂｏｗｅｎら）（穀類）、Ｂｙｔｅｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ））、Ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）、Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８及びＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．  ８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）、Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ７５：４０７−４１３（イネ）、Ｏｓｊｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（トウモロコシ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による）、並びに米国特許出願公開第２０１７／０１２１７２２号明細書（迅速な植物形質転換）（これらの文献は全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【００７５】
本明細書で提供される方法では、目的のヌクレオチド配列が組み込まれた再生可能な植物細胞を作製するために、細菌媒介及び／又は微粒子銃媒介遺伝子導入を使用している。本開示の方法において有用な菌株としては、非武装化アグロバクテリウム、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、又はリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
本方法において有用な非武装化アグロバクテリウムとしては、ＡＧＬ−１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４、及びＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本方法において有用なオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の菌株としては、表２に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
【表２】
2021517812.tif 000005
【００７９】
本方法で有用なリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）の菌株としては、表３に列挙されているものが挙げられるが、これらに限定されない（米国特許第９，３６５，８５９号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００８０】
【表３−１】
2021517812.tif 000006
【００８１】
【表３−２】
2021517812.tif 000007
【００８２】
【表３−３】
2021517812.tif 000008
【００８３】
本開示のポリヌクレオチドは、植物をウイルス又はウイルス性核酸と接触させることにより、植物に導入することができる。一般に、このような方法は、本開示のヌクレオチドコンストラクトをウイルス性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に組み込むことを含む。ウイルス性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチドを植物に導入し、それによりコードされるタンパク質を発現させる方法は、当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書、同第５，３１６，９３１号明細書、及びＰｏｒｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２０９−２２１を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８４】
本開示の方法は、植物にポリペプチド又はポリヌクレオチドを導入することを含む。本明細書で使用する場合、「導入する」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを植物に、その配列が植物細胞の内部に侵入する方法で送ることを意味する。本開示の方法は、植物に配列を導入する特定の方法に依存することはなく、植物の少なくとも１つの細胞の内部にポリヌクレオチド又はポリペプチドを単に侵入させるだけである。ポリヌクレオチド又はポリペプチドを植物に導入する方法は、当該技術分野で知られており、以下に限定されないが、安定な形質転換方法、一過性形質転換方法、及びウイルス媒介方法が挙げられる。
【００８５】
「安定な形質転換」とは、植物に導入されるヌクレオチドコンストラクト又は発現コンストラクトが植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって受け継がれ得る形質転換をいう。「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチド又は発現カセットが植物に導入されるが植物のゲノムに組み込まれないか、又はポリペプチドが植物に導入されることを意味する。
【００８６】
レポーター遺伝子又は選択マーカー遺伝子もまた、本明細書に開示される発現カセットに含まれ得、そして本開示の方法において使用され得る。この技術分野で知られている好適なレポーター遺伝子の例は、例えば、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｅｌｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ｐｐ．１−３３、ＤｅＷｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７；Ｇｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２５１７−２５２２、Ｋａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：６５０−６５５、及びＣｈｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：３２５−３３０に見出すことができる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
選択マーカーは、多くの場合、特定の条件下で、ある分子又はこの分子を含む細胞を同定又は選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、活性（以下に限定されないが、ＲＮＡ、ペプチド若しくはタンパク質の産生など）をコードすることができる、又はＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物及び有機化合物、若しくは組成物などの結合部位を提供することができる。選択マーカーの例としては、以下に限定されないが、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；他の毒性化合物に耐性を示す産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、Ｂａｓｔａ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）などの抗生物質）；受容細胞において別に欠失している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；容易に同定することができる産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳなどの表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質；及び細胞表面タンパク質など）；新しいＰＣＲ用プライマー部位の世代（例えば、前に並置されていない２つのＤＮＡ配列の並列）；制限エンドヌクレアーゼ又は他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質などの作用を受けていない、又は作用を受けたＤＮＡ配列の含有物、並びに、同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）に要求されるＤＮＡ配列の含有物が挙げられる。
【００８８】
形質転換された細胞又は組織を選択するための選択マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性又は除草剤耐性を付与する遺伝子を挙げることができる。好適な選択マーカー遺伝子の例としては、以下に限定されないが、クロラムフェニコールに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７−９９２）、メトトレキサートに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３；Ｍｅｉｊｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７−８２０）、ヒグロマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｗａｌｄｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３−１０８、及びＺｈｉｊｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１０８：２１９−２２７）；ストレプトマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６−９１）、スペクチノマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．５：１３１−１３７）、ブレオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｉｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１−１７６）、スルホンアミドに対する耐性をコードする遺伝子（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７−３６）、ブロモキシニルに対する耐性をコードする遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９−４２３）、グリホサートに対する耐性をコードする遺伝子（Ｓｈａｗ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１並びに米国特許出願第１０／００４，３５７号明細書及び同第１０／４２７，６９２号明細書）、ホスフィノトリシンに対する耐性をコードする遺伝子（ＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２５１３−２５１８）が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８９】
除草化合物に対する耐性を付与する選択マーカーとしては、除草化合物、例えば、グリホサート、スルホニル尿素、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ））に対する耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）及び／又は耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）をコードする遺伝子が挙げられる。一般的に、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１、  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６３１４−６３１８、Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ７１：６３−７２、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２、Ｂａｒｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ，ｐｐ．１７７−２２０、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：５５５−５６６、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９：６０３−６１２；、Ｆｉｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５２：７１３−７２２、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４００−５４０４、Ｆｕｅｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２５４９−２５５３、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４８０−４８３、Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｒｅｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１９１７−１９２１、Ｌａｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６、Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９５２−３９５６、Ｂａｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５０７２−５０７６、Ｗｙｂｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４６４７−４６５３、Ｈｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃ．  Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２、Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１、Ｏｌｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ���ｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４：７２１−７２４）を参照されたい。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
本方法において有用な特定の選択マーカーとしては、以下に限定されないが、スルホニル尿素及びイミダゾリノンに対する耐性を付与するトウモロコシＨＲＡ遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：１２４１−１２４８）、グリホサートに対する耐性を付与するＧＡＴ遺伝子（Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０４：１１５１−１１５４）、ａａｄＡ遺伝子などのスペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４：１９７−２０５）、並びにグルホシネートアンモニウムに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１０６２）、及びＰＡＴ（又はトウモロコシのｍｏＰＡＴ、Ｒａｓｃｏ−Ｇａｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２１：５６９−７６を参照）が挙げられ、マンノース含有培地での成長を許容するＰＭＩ遺伝子（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２２：６８４−６９０）は、本方法の体細胞胚形成及び胚成熟に含まれる短い経過時間中の急速な選択に非常に有用である。しかしながら、使用する選択マーカーや、形質転換されている作物、近交系又は種に応じて、野生型エスケープの割合は変わり得る。トウモロコシ及びソルガムでは、ＨＲＡ遺伝子は、野生型エスケープの頻度の低減に有効である。
【００９１】
トランスジェニックイベントの回収において有用性を提供し得る他の遺伝子としては、以下に限定されないが、ＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質；Ｃｈａｌｆｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２）、ルシフェラーゼ（Ｒｉｇｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（１９）：８１１５及びＬｕｅｈｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３９７−４１４）、遠赤色、赤色、橙色、黄色、グリーンシアン、及び青色にわたる代替発光最適条件のスペクトルを有する様々な蛍光タンパク質（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９０５−９０９）、及びアントシアニン産生をコードするトウモロコシ遺伝子（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：４４９）の例が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
上に掲げた選択マーカーは、それらに限定することを意図するものではない。任意の選択マーカーが、本開示の方法において使用され得る。
【００９３】
一態様では、本開示の方法は、ポジティブな成長選択を可能にする形質転換方法を提供する。当業者であれば、従来の植物形質転換法の多くが、抗生物質又は除草剤（ネガティブ選択剤）の使用によって、形質転換していない細胞又は組織の成長を阻害又は死滅させ、トランスジェニック細胞又は組織は、耐性遺伝子の発現によって成長し続ける、ネガティブ選択スキームによるものであったことを認識している。対照的に、本開示の方法は、ネガティブ選択剤を適用せずに使用することができる。したがって、野生型細胞は阻害されずに成長し得るが、比較すると、形態形成遺伝子発現の制御の影響を受けた細胞は、周囲の野生型組織と比較して成長速度が速いため、容易に識別することができる。成長の速さを容易に観察できることに加えて、本開示の方法は、形質転換していない細胞と比べて、より急速な形態形成を示すトランスジェニック細胞を提供する。したがって、そのような成長及び形態発生の差によって、トランスジェニック植物構造体を、周囲の非形質転換組織から容易に識別することができ、そのプロセスを、本明細書では「ポジティブ成長選択」と称する。
【００９４】
本開示は、効率良く且つ高速でトランスジェニック植物を生産する方法、及び、一連の遺伝的多様性を示し、顕著な商業的有用性を有する形質転換近交系を含む様々な出発組織型を用いて、多数の近交系において、形質転換率が有意により高く且つ品質が有意により良好なイベント（ベクター（プラスミド）バックボーンを持たない形質遺伝子発現カセットの１コピーを含むイベント）を生じる方法を提供する。本開示の方法は、さらに、良好な形質及び特性を与えるポリヌクレオチドを含むことができる。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「形質」は、植物、又は特定の植物材料若しくは植物細胞の生理学的、形態学的、生化学的又は物理的特性を指す。いくつかの例において、この特性は、種子又は植物体の大きさなど、ヒトの目で視ることができ、或いは、種子若しくは葉に含まれるタンパク質、デンプン若しくは油の量を検出するなどの生化学的手法により、例えば、二酸化炭素の取り込み量を測定することによって、代謝若しくは生理的プロセスを観察することにより、例えば、ノーザン解析、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ遺伝子発現アッセイ、若しくはレポーター遺伝子発現システムを使用して、遺伝子若しくは遺伝子群の発現レベルを観察することにより、又は、ストレス耐性、収量、病原体耐性などの農学的観察により測定することができる。
【００９６】
含有する油、デンプン及びタンパク質の量などの農業的に重要な形質は、伝統的な育種法を使用することに加えて遺伝的に改変することができる。変更には、オレイン酸、飽和油及び不飽和油の含有量の増加、リシン及び硫黄濃度の上昇、必須アミノ酸の提供、またデンプンの変更が含まれる。ホルドチオニンタンパク質改変は、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第、５，８８５，８０２号明細書及び同第５，９９０，３８９号明細書に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。別の例としては、米国特許第５，８５０，０１６号明細書に記載のダイズ２Ｓアルブミンによりコードされるリシン及び／又は硫黄リッチ種子タンパク質、並びにＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９−１０６に記載の、オオムギ由来のキモトリプシン阻害剤がある。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
コード配列の誘導体は、予め選択したアミノ酸の、コードされたポリペプチドにおける濃度を高めるため、部位特異的変異誘発法によって作ることができる。例えば、ヒマワリの種子（Ｌｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，ｅｄ．Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ．）、ｐｐ．４９７−５０２；この文献は参照により本明細書に組み込まれる）；トウモロコシ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７１：３５９；これらの両文献は参照により本明細書に組み込まれる）；及びイネ（Ｍｕｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３、この文献は参照により本明細書に組み込まれる）などからのメチオニンリッチ植物タンパク質を使用することができよう。他の農学的に重要な遺伝子は、ラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ  ２、成長因子、種子貯蔵因子及び転写因子をコードする。
【００９８】
多くの農学的形質、例えば、限定はされないが、植物の高さ、莢の数、植物体における莢の位置、節間部の数、莢の破損の発生率、穀粒サイズ、根粒形成効率及び窒素固定効率、栄養の消化効率、生物的ストレス及び非生物的ストレスに対する耐性、炭素同化、植物構造、耐倒伏性、種子の発芽率、苗の成長力、並びに幼植物の形質が、「収穫」に影響を及ぼし得る。収穫に影響を及ぼし得る他の形質としては、発芽効率（例えば、ストレス条件下での発芽効率）、成長速度（例えば、ストレス条件下での成長速度）、穂の数、穂１個当たりの種子数、種子の大きさ、種子の組成（デンプン、油、タンパク質）、登塾特性が挙げられる。全植物の収穫量を増大させるか否かはわからないが、所望の表現型特性を示すトランスジェニック植物の世代もまた目的とされる。そのような特性としては、植物形態学的増強、植物生理学的増強、又はトランスジェニック植物から得られる成熟種子の成分の改善が挙げられる。
【００９９】
本開示のトランスジェニック植物の「収穫量の増大」は、多くの方法、例えば、重量の測定、１植物体当たりの種子数、種子重量、単位面積当たりの種子数（すなわち、１エーカー当たりの種子、若しくは種子重量）、１エーカー当たりのブッシェル数、１エーカー当たりのトン数、及び１へクタール当たりのキロ数で評価し測定することができる。例えば、トウモロコシの収穫量は、例えば、１エーカー当たりのブッシェル数又は１へクタール当たりのメートルトン数を単位とした、生産面積１単位当たりの、皮を剥いたトウモロコシ粒の産生量として測定することができ、それは、多くの場合、水分調節ベースで、例えば、水分１５．５％で報告される。収穫量の増大は、キーとなる生化学化合物、例えば、窒素、リン及び炭水化物などの利用の改善、又は、環境ストレス、例えば、寒さ、熱、乾燥、塩分、及び害虫若しくは病原体の攻撃に対する耐性の向上によりもたらされ得る。形質強化組み換えＤＮＡはまた、植物成長調節物質の発現の改変、又は細胞周期若しくは光合成経路の変更の結果として、成長及び発達が改善され、ひいては収穫量が増大するトランスジェニック植物を提供するために使用することができる。
【０１００】
本開示の態様の記載の中で使用する「形質の強化」には、水使用効率若しくは乾燥耐性の改善若しくは強化、浸透圧ストレス耐性、高塩分ストレス耐性、熱ストレス耐性、低温発芽耐性などの耐寒性の強化、収穫量の増大、種子品質の改善、窒素利用効率の強化、植物の早い成長及び発達、植物の遅い成長及び発達、種子タンパク質の強化、並びに種子油の生産性の強化が含まれる。
【０１０１】
本開示の方法には任意の目的ポリヌクレオチド又は形質遺伝子を使用することができる。目的遺伝子又は形質遺伝子によって付与される表現型の様々な変化としては、植物中の脂肪酸組成の変更、植物のアミノ酸含有量、デンプン含有量又は炭水化物含有量の改変、植物の病原体防御機構の改変、実サイズの改変、スクロース付加の改変などが挙げられる。目的遺伝子又は形質遺伝子はまた、栄養の取り込みの調節、及びフィチン酸塩遺伝子の発現の調節、特に、種子中のフィチン酸塩濃度を低下させるような調節に関与し得る。これらの結果は、植物において異種産物を発現させることにより、又は内因性産物の発現を増大させることにより得ることができる。或いは、これらの結果は、１種以上の内因性産物、特に、植物中の酵素又は補因子の発現を低減させることにより得ることができる。これらの変化は、形質転換植物の表現型の変化をもたらす。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「形質遺伝子」は、稔性トランスジェニックＴ０植物体を作製するために植物ゲノムに組み込まれる目的遺伝子を意味する。高耐性アセト乳酸合成酵素（ＨＲＡ）などの選択マーカー及び蛍光タンパク質遺伝子などの視覚マーカーが、例として本明細書で使用される。形質遺伝子は、付加価値のある農学的、生理学的、生化学的、又は物理的な表現型を与える任意の遺伝子（又は遺伝子の組み合わせ）であり得る。
【０１０３】
目的遺伝子／形質遺伝子は、商業市場、及び作物の開発に従事している者の関心を反映している。目的の作物及び市場は変化し、開発途上国が世界市場を広げるにつれ、新しい作物や技術もまた出現してくるであろう。さらに、収穫量や雑種強勢などの農学的形質や特性に対する理解が深まるにつれ、形質転換のための遺伝子や形質の選択もそれに応じて変化するであろう。本開示に有用な目的のヌクレオチド配列若しくは遺伝子又は形質遺伝子の一般的な種類としては、例えば、ジンクフィンガーなどの情報に関与する遺伝子、キナーゼなどの伝達に関与する遺伝子、及び熱ショックタンパク質などのハウスキーピングに関与する遺伝子が挙げられる。導入遺伝子のより具体的な種類としては、例えば、農学上の重要な形質、昆虫耐性、病害耐性、除草剤耐性、環境ストレス耐性（寒冷、塩、乾燥などに対する耐性の変化）、穀粒特性、及び市場の生産物をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１０４】
本明細書に開示の方法によって形質転換されたプロモーター配列によって発現する異種コード配列、異種ポリヌクレオチド、及び目的のポリヌクレオチドは、植物の表現型を変化させるために使用され得る。目的の表現型の様々な変化としては、植物における遺伝子発現の改変、植物の病原体又は昆虫に対する防御機構の改変、植物の除草剤に対する耐性の増大、環境ストレスに応答する植物の発達の改変、塩、温度（高温及び低温）、乾燥に対する植物の応答の調節などが挙げられる。これらの結果は、適切な遺伝子産物を含む目的の異種ヌクレオチド配列の発現によって得ることができる。特定の態様では、目的の異種ヌクレオチド配列は、その発現レベルが植物体又は植物部で増大する内因性の植物配列である。結果は、１つ以上の内因性遺伝子産物、特に、ホルモン、レセプター、シグナル伝達分子、酵素、トランスポーター又は補因子の発現の改変を提供することによって、或いは、植物の栄養摂取に影響を及ぼすことによって得ることができる。これらの変化は、形質転換植物の表現型の変化をもたらす。導入遺伝子のさらに他の種類としては、植物及びその他の真核生物、並びに原核生物由来の、酵素、補因子及びホルモンなどの外因性産物の発現を誘発する遺伝子が挙げられる。
【０１０５】
目的の任意の遺伝子、目的のポリヌクレオチド、形質遺伝子、又は目的の複数の遺伝子／ポリヌクレオチド／形質、例えば、１つ以上のさらなるインプット形質遺伝子（例えば、除草剤耐性、真菌耐性、ウイルス耐性、ストレス耐性、病害耐性、疾患耐性、雄性不稔性、茎強度など）又はアウトプット形質遺伝子（例えば、収穫量の増大、デンプンの改変、油プロファイルの改善、バランスのとれたアミノ酸、高リシン若しくは高メチオニン、消化性の増大、繊維品質の改善、乾燥耐性など）が積み重ねられ得る昆虫耐性形質遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結され、本明細書に開示される方法によって形質転換される植物において発現され得ることが確認された。
【０１０６】
プロモーターは、穀粒の品質、例えば、油のレベル（オレイン酸の含量の増加）及びタイプ、飽和及び不飽和、必須アミノ酸の品質及び量、リシン及び硫黄のレベルの増加、セルロースのレベル、並びにデンプン及びタンパク質含量に影響を及ぼす、本明細書に開示の方法によって形質転換される植物で発現させるための農学的に重要な形質遺伝子に作動可能に連結することができる。プロモーターは、本明細書に開示の方法によって形質転換される植物で発現させるためのホルドチオニンタンパク質改変を提供する形質遺伝子に作動可能に連結することができる。そのような遺伝子は、米国特許第５，９９０，３８９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第５，８８５，８０２号明細書及び同第５，７０３，０４９号明細書に記載されており、これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示の方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターを作動可能に連結することができる形質遺伝子の別の例は、米国特許第５，８５０，０１６号明細書に記載されているダイズ２Ｓアルブミンによってコードされるリシン及び／又は硫黄リッチ種子タンパク質、及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６５：９９−１０６に記載されているオオムギ由来のキモトリプシン阻害剤であり、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
プロモーターは、本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるための、根切り虫、ヨトウムシ、ヨーロッパアワノメイガなどの収穫量の低下（ｙｉｅｌｄ  ｄｒａｇ）をもたらす害虫に対する耐性をコードする昆虫耐性形質遺伝子に作動可能に連結することができる。このような遺伝子としては、例えば、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号明細書、同第５，７４７，４５０号明細書、同第５，７３６，５１４号明細書、同第５，７２３，７５６号明細書、同第５，５９３，８８１号明細書、及びＧｅｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９（これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））が挙げられる。本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結することができる病害耐性形質をコードする形質遺伝子としては、例えば、フモニシンを解毒する遺伝子などの解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号明細書）、非病原性（ａｖｒ）及び病害耐性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９、Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２、及びＭｉｎｄｒｉｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結することができる除草剤耐性形質遺伝子としては、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）の働きを阻害するように作用する除草剤、特に、スルホニル尿素系除草剤に対する耐性をコードする遺伝子（例えば、そのような耐性に導く変異、特にＳ４及び／又はＨｒａ変異を含むアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子）、グルタミン合成酵素の働きを阻害するように作用する除草剤、例えば、ホスフィノトリシン若しくはバスタに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）、グリホサートに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子及びＧＡＴ遺伝子；例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書、国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット及び国際公開第０５／０１２５１５号パンフレット（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照）、或いは当該技術分野で知られる他のそのような遺伝子が挙げられる。ｂａｒ遺伝子は除草剤のバスタに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は抗生物質のカナマイシン及びジェネティシンに対する耐性をコードし、ＡＬＳ−遺伝子変異体は除草剤のクロルスルフロンに対する耐性をコードしており、そのいずれもが本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０１０９】
グリホサート耐性は、変異５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子及びａｒｏＡ遺伝子によって付与され、これらの遺伝子は本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、Ｓｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照されたい。これには、グリホサート耐性を付与し得るＥＰＳＰＳの形態のヌクレオチド配列が開示されている。Ｂａｒｒｙらの米国特許第５，６２７，０６１号明細書にはまた、本明細書中に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができるＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子が記載されている。米国特許第６，２４８，８７６Ｂ１号明細書、同第６，０４０，４９７号明細書、同第５，８０４，４２５号明細書、同第５，６３３，４３５号明細書、同第５，１４５，７８３号明細書、同第４，９７１，９０８号明細書、同第５，３１２，９１０号明細書、同第５，１８８，６４２号明細書、同第４，９４０，８３５号明細書、同第５，８６６，７７５号明細書、同第６，２２５，１１４Ｂ１号明細書、同第６，１３０，３６６号明細書、同第５，３１０，６６７号明細書、同第４，５３５，０６０号明細書、同第４，７６９，０６１号明細書、同第５，６３３，４４８号明細書、同第５，５１０，４７１号明細書、米国再発行特許第３６，４４９号明細書、米国再発行特許第３７，２８７Ｅ号明細書、及び米国特許第５，４９１，２８８号明細書、並びに国際公開第９７／０４１０３号パンフレット、国際公開第９７／０４１１４号パンフレット、国際公開第００／６６７４６号パンフレット、国際公開第０１／６６７０４号パンフレット、国際公開第００／６６７４７号パンフレット、及び国際公開第００／６６７４８号パンフレット（これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい。グリホサート耐性はまた、米国特許第５，７７６，７６０号明細書、及び同第５，４６３，１７５号明細書（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳しく記載されているように、グリホサート酸化還元酵素をコードする、本明細書に開示される方法により形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる遺伝子を発現する植物に付与される。グリホサート耐性はまた、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする、本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる遺伝子の過剰発現によって、植物に付与することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書、国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット、及び同第０５／０１２５１５号パンフレット（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１１０】
本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結された不稔遺伝子もまた、ＤＮＡコンストラクトにおいてコードされ、物理的雄穂除去の代替法を提供することができる。このような方法に使用される遺伝子の例としては、雄性組織優先的遺伝子、及び米国特許第５，５８３，２１０号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＱＭなどの雄性不稔性表現型を有する遺伝子が挙げられる。本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる他の遺伝子としては、キナーゼ、及び雄性又は雌性の配偶体の成長に有害な化合物をコードするものが挙げられる。
【０１１１】
商業的形質もまた、例えばエタノール産生用デンプンを増加させる、又はタンパク質の発現を提供する、本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる遺伝子又は遺伝子群でコードされ得る。形質転換植物の他の重要な商業利用は、米国特許第５，６０２，３２１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているようなポリマー及びバイオプラスチックの生成である。ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進するβ−ケトチオラーゼ、ＰＨＢアーゼ（ポリヒドロキシ酪酸合成酵素）、及びアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素などの遺伝子は、本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１１２】
本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる、他の利用可能な形質遺伝子及びそれらの関連する表現型の例としては、ウイルス外皮タンパク質及び／若しくはＲＮＡをコードする遺伝子、又はウイルス耐性を与える他のウイルス若しくは植物遺伝子、真菌耐性を付与する遺伝子、収穫量増大を促進する遺伝子、並びに、寒冷、乾燥によって生ずる脱水、熱及び塩分などのストレス、有毒な金属若しくは微量元素などに対する耐性を与える遺伝子が挙げられる。
【０１１３】
以下は、本明細書に開示される方法によって形質転換される植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結することができる形質遺伝子の型の他の例のリストであるが、例示として示すものであって、限定することを意図したものではない。
【０１１４】
１．昆虫又は病害に対する耐性を付与し、且つコードする形質遺伝子：
（Ａ）植物の病害耐性遺伝子。植物防御は、植物中の病害耐性遺伝子（Ｒ）産物と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子産物との間の特異的相互作用によってしばしば活性化される。特定の病原体種に耐性を示す植物を設計するために、植物種をクローン化された耐性遺伝子で形質転換することができる。例えば、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｍａｔｏ  Ｃｆ−９  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）；Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２（ｔｏｍａｔｏ  Ｐｔｏ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＳＰ２  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）；ＭｃＤｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｗｏｆｆｅｎｄｅｎ，（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（４）：１７８−８３及びＴｏｙｏｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１１（６）：５６７−８２を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。病害耐性植物は、野生型植物と比較して病原体に対する耐性がより大きいものである。
【０１１５】
（Ｂ）バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質、その誘導体、又はそれをモデルとした合成ポリペプチド。例えば、Ｇｅｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９を参照されたい。これには、Ｂｔデルタ−エンドトキシン遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列が開示されている。さらに、デルタ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号４００９８、６７１３６、３１９９５及び３１９９８で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入することができる。遺伝子操作されるバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）導入遺伝子の他の例は、以下の特許及び特許出願に記載されており、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる：米国特許第５，１８８，９６０号明細書、同第５，６８９，０５２号明細書、同第５，８８０，２７５号明細書、国際公開第９１／１４７７８号パンフレット、国際公開第９９／３１２４８号パンフレット、国際公開第０１／１２７３１号パンフレット、国際公開第９９／２４５８１号パンフレット、国際公開第９７／４０１６２号パンフレット、並びに米国特許出願第１０／０３２，７１７号明細書、同第１０／４１４，６３７号明細書、及び同第１０／６０６，３２０号明細書。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
（Ｃ）エクジステロイド及び幼若ホルモンなどの昆虫特異的ホルモン若しくはフェロモン、その改変体、それに基づく模倣体、又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニスト。例えば、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼ、すなわち幼若ホルモンの不活性化剤のバキュロウイルス発現に関するＨａｍｍｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４５８による開示を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
（Ｄ）発現すると、その作用を受けた害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（発現クローニングは昆虫利尿ホルモン受容体のＤＮＡコードを得る）、Ｐｒａｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（アロスタチンがディプロプテラ・プンクタータ（Ｄｉｐｌｏｐｔｅｒａ  ｐｕｎｔａｔａ）で特定されている）、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３０（１）：３３−５４；Ｚｊａｗｉｏｎｙ，（２００４）Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  ６７（２）：３００−３１０。Ｃａｒｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｉ−ｄｅ−Ｓａ，（２００２）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ４０（１１）：１５１５−１５３９、Ｕｓｓｕｆ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｓｃｉ．８０（７）：８４７−８５３、及びＶａｓｃｏｎｃｅｌｏｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｉｒａ，（２００４）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ４４（４）：３８５−４０３の開示を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、Ｔｏｍａｌｓｋｉらの米国特許第５，２６６，３１７号明細書（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。これには、昆虫特異的毒素をコードする遺伝子が開示されている。
【０１１８】
（Ｅ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体、又は殺虫活性を有する他の非タンパク質分子の超集積に関与する酵素。
【０１１９】
（Ｆ）生物活性分子の改変、例えば翻訳後の改変などに関与する酵素、例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼ（天然であるか合成であるかを問わない）。例えば、Ｓｃｏｔｔらの名前によるＰＣＴ出願の国際公開第９３／０２１９７号パンフレットを参照されたい。これには、カラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。キチナーゼをコードする配列を含むＤＮＡ分子は、例えば、ＡＴＣＣからアクセッション番号３９６３７及び６７１５２で入手することができる。Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（これには、タバコ鉤虫キチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列が教示されている）、及びＫａｗａｌｌｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（これには、パセリのｕｂｉ４−２ポリウビキチン遺伝子のヌクレオチド配列が提示されている）、米国特許出願第１０／３８９，４３２号明細書、同第１０／６９２，３６７号明細書、及び米国特許第６，５６３，０２０号明細書も参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
（Ｇ）シグナル伝達を刺激する分子。例えば、リョクトウのカルモジュリンのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を記載のＢｏｔｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７による開示、及びトウモロコシのカルモジュリンのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を提示しているＧｒｉｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
（Ｈ）疎水性モーメントペプチド。ＰＣＴ出願の国際公開第９５／１６７７６号パンフレット及び米国特許第５，５８０，８５２号明細書（真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体の開示）、並びにＰＣＴ出願の国際公開第９５／１８８５５号パンフレット及び米国特許第５，６０７，９１４号明細書（病害耐性を付与する合成抗微生物ペプチドを教示）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
（Ｉ）膜透過酵素、チャネルフォーマー又はチャネルブロッカー。例えば、トランスジェニックタバコ植物にシュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に対する耐性を付与するセクロピン−ベータ溶解ペプチド類似体の異種発現のＪａｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．８９：４３による記載を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
（Ｊ）ウイルス侵入性タンパク質又はそれから誘導される複合毒素。例えば、形質転換植物細胞中のウイルス外皮タンパク質の蓄積は、外皮タンパク質遺伝子が由来するウイルス及び関連ウイルスによって引き起こされるウイルスの感染及び／又は病気の進行に対する耐性を付与する。Ｂｅａｃｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。外皮タンパク質が介在する、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎壊疽ウイルス、及びタバコモザイクウイルスに対する耐性が、形質転換植物に付与された（同文献）。
【０１２４】
（Ｋ）昆虫特異的抗体又はそれから誘導される免疫毒素。したがって、昆虫の消化管の重要な代謝機能を標的とした抗体は、その作用を受けた酵素を不活性化し、昆虫を死滅させるであろう。Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ♯４９７，ＳＥＶＥＮＴＨ  ＩＮＴ’Ｌ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ＯＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＬＡＮＴ−ＭＩＣＲＯＢＥ  ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮＳ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，１９９４）（一本鎖抗体断片の生成による、トランスジェニックタバコの酵素不活性化）を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
（Ｌ）ウイルス特異的抗体。例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９を参照されたい。この文献には、組み換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物がウイルスの攻撃から保護されることが示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
（Ｍ）病原体又は寄生生物により天然に産生する発達阻害タンパク質。したがって、例えば、真菌エンド−アルファ−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−アルファ−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌のコロニー形成及び植物の養分放出を促進する。Ｌａｍｂ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４３６を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び特徴付けは、Ｔｏｕｂａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３６７に記載されている。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
（Ｎ）植物により天然に産生される発達阻害タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：３０５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物体が、真菌性の病気に対し高い耐性を有することを示した。
【０１２８】
（Ｏ）全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）応答に関与する遺伝子及び／又は病因関連遺伝子。Ｂｒｉｇｇｓ，（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（２）：１２８−１３１，Ｐｉｅｔｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｌｏｏｎ，（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．７（４）：４５６−６４、及びＳｏｍｓｓｉｃｈ，（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３（７）：８１５−６。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
（Ｐ）抗真菌遺伝子（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，（１９９３）Ｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０１：７０９−７１２、及びＰａｒｉｊｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔａ  １８３：２５８−２６４、及びＢｕｓｈｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．２０（２）：１３７−１４９）。また、米国特許出願第０９／９５０，９３３号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３０】
（Ｑ）フモニシン、ビューベリシン、モニリホルミン及びゼアラレノン、並びにそれらの構造的に関連する誘導体などに対する解毒遺伝子。例えば、米国特許第５，７９２，９３１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３１】
（Ｒ）シスタチン、及びシステインプロテイナーゼ阻害剤。米国特許出願第１０／９４７，９７９号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３２】
（Ｓ）デフェンシン遺伝子。国際公開第０３／０００８６３号パンフレット及び米国特許出願第１０／１７８，２１３号明細書（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３３】
（Ｔ）線虫に対する耐性を付与する遺伝子。国際公開第０３／０３３６５１号パンフレット、及びＵｒｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｌａｎｔａ  ２０４：４７２−４７９，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．２（４）：３２７−３１（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３４】
（Ｕ）真菌コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｏｌａ）によって引き起こされる炭疽病による茎腐病に対する耐性を付与する、ｒｃｇ１などの遺伝子。Ｊｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−ｍｅａｎｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｕｓ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ  Ｓｔａｌｋ  Ｒｏｔ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｉｚｅ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）８９：４１３−４１８、及び米国仮特許出願第６０／６７５，６６４号明細書（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３５】
２．除草剤に対する耐性を付与する形質遺伝子、例えば：
（Ａ）イミダゾリノン又はスルホニル尿素などの、成長点又は分裂組織を阻害する除草剤。このカテゴリーの遺伝子の例は、例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１及びＭｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９にそれぞれ記載されているような変異ＡＬＳ及びＡＨＡＳ酵素をコードする。また、米国特許第５，６０５，０１１号明細書、同第５，０１３，６５９号明細書、同第５，１４１，８７０号明細書、同第５，７６７，３６１号明細書、同第５，７３１，１８０号明細書、同第５，３０４，７３２号明細書、同第４，７６１，３７３号明細書、同第５，３３１，１０７号明細書、同第５，９２８，９３７号明細書、及び同第５，３７８，８２４号明細書、並びに国際公開第９６／３３２７０号パンフレットも参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
（Ｂ）グリホサート（それぞれ変異５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート合成酵素（ＥＰＳＰ）遺伝子及びａｒｏＡ遺伝子により耐性が付与される）、及びグルホシネートなどの他のホスホノ化合物（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子及びストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子）、並びにピリジノキシプロピオン酸又はフェノキシプロピオン酸、及びシクロスヘキソン（ｃｙｃｌｏｓｈｅｘｏｎｅ）（ＡＣＣ酵素阻害剤をコードする遺伝子）。例えば、Ｓｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照されたい。これには、グリホサート耐性を付与し得るＥＰＳＰＳの形態のヌクレオチド配列が開示されている。Ｂａｒｒｙらの米国特許第５，６２７，０６１号明細書にもまた、ＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子が記載されている。米国特許第６，５６６，５８７号明細書、同第６，３３８，９６１号明細書，同第６，２４８，８７６Ｂ１号明細書、同第６，０４０，４９７号明細書、同第５，８０４，４２５号明細書、同第５，６３３，４３５号明細書、同第５，１４５，７８３号明細書、同第４，９７１，９０８号明細書、同第５，３１２，９１０号明細書、同第５，１８８，６４２号明細書、同第４，９４０，８３５号明細書、同第５，８６６，７７５号明細書、同第６，２２５，１１４Ｂ１号明細書、同第６，１３０，３６６号明細書、同第５，３１０，６６７号明細書、同第４，５３５，０６０号明細書、同第４，７６９，０６１号明細書、同第５，６３３，４４８号明細書、同第５，５１０，４７１号明細書、米国再発行特許第３６，４４９号明細書、米国再発行特許第３７，２８７Ｅ号明細書、及び米国特許第５，４９１，２８８号明細書、並びに国際公開の欧州特許第１１７３５８０号明細書、国際公開第０１／６６７０４号パンフレット、欧州特許第１１７３５８１号明細書、及び欧州特許第１１７３５８２号明細書（これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい。グリホサート耐性はまた、米国特許第５，７７６，７６０号明細書及び同第５，４６３，１７５号明細書（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳しく記載されているグリホサート酸化還元酵素をコードする遺伝子を発現する植物にも付与される。グリホサート耐性はさらに、グリホサートＮアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現により植物に付与することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書、国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット、及び同第０５／０１２５１５号パンフレット（参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣアクセッション番号３９２５６で得ることができ、その変異遺伝子のヌクレオチド配列はＣｏｍａｉの米国特許第４，７６９，０６１号明細書に開示されている。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｋｕｍａｄａらの欧州特許出願第０  ３３３  ０３３号明細書、及びＧｏｏｄｍａｎらの米国特許第４，９７５，３７４号明細書（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する耐性を付与するグルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらの欧州特許第０  ２４２  ２４６号明細書及び同第０  ２４２  ２３６号明細書、Ｄｅ  Ｇｒｅｅｆ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６１（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示されており、そこには、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製について記載されている。また、米国特許第５，９６９，２１３号明細書、同第５，４８９，５２０号明細書、同第５，５５０，３１８号明細書、同第５，８７４，２６５号明細書、同第５，９１９，６７５号明細書、同第５，５６１，２３６号明細書、同第５，６４８，４７７号明細書、同第５，６４６，０２４号明細書、同第６，１７７，６１６Ｂ１号明細書、及び同第５，８７９，９０３号明細書も参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。フェノキシプロピオン酸及びシクロスヘキソン（ｃｙｃｌｏｓｈｅｘｏｎｅ）（例えば、セトキシジム及びハロキシホップ）に対する耐性を付与する遺伝子の例は、Ｍａｒｓｈａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２及びＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子である。
【０１３７】
（Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡ遺伝子及びｇｓ＋遺伝子）及びベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）などの、光合成を阻害する除草剤。Ｐｒｚｉｂｉｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１６９（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）の形質転換が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列はＳｔａｌｋｅｒの米国特許第４，８１０，６４８号明細書（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣアクセッション番号５３４３５、６７４４１及び６７４４２で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び発現は、Ｈａｙｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３によって記載されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
（Ｄ）アセトヒドロキシ酸合成酵素は、この酵素を発現する植物を様々な種類の除草剤に対して耐性を有する植物とすることが見出され、各種の植物に導入されている（例えば、Ｈａｔｔｏｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４６：４１９（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。除草剤に対する耐性を付与する他の遺伝子としては、以下のものが挙げられる：ラットシトクロムＰ４５０７Ａ１及び酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０酸化還元酵素のキメラ蛋白質をコードする遺伝子、（Ｓｈｉｏｔａ，ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６（１）：１７−２３）、グルタチオン還元酵素及びスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子（Ａｏｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３６：１６８７）、及び様々なホスホトランスフェラーゼの遺伝子（Ｄａｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：６１９）が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
（Ｅ）プロトポルフィリノーゲン酸化酵素（ｐｒｏｔｏｘ）は、葉緑素の生成に必要であり、葉緑素はあらゆる植物の生存に必要である。ｐｒｏｔｏｘ酵素は、様々な除草化合物の標的として働く。これらの除草剤はまた、存在する異なる種類の植物全ての成長を阻害し、それら全体を破壊する。これらの除草剤に対し耐性を有する改変ｐｒｏｔｏｘ活性を含む植物の成長は、米国特許第６，２８８，３０６Ｂ１号明細書、同第６，２８２，８３７Ｂ１号明細書、及び同第５，７６７，３７３号明細書、並びに国際公開第０１／１２８２５号パンフレットに記載されている。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
３．以下のような改変穀粒特性を付与、又はそれに寄与する形質遺伝子：
（Ａ）例えば、以下による脂肪酸の改変：
（１）植物のステアリン酸含有量を増大させるステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素の下方制御。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６２４及び国際公開第９９／６４５７９号パンフレット（トウモロコシの脂質プロファイルを改変する不飽和化酵素の遺伝子）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、
（２）ＦＡＤ−２遺伝子の改変によるオレイン酸の増大及び／又はＦＡＤ−３遺伝子の改変によるリノレン酸の低減（米国特許第６，０６３，９４７号明細書、同第６，３２３，３９２号明細書、同第６，３７２，９６５号明細書、及び国際公開第９３／１１２４５号パンフレットを参照されたい（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、
（３）国際公開第０１／１２８００号パンフレット（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような共役リノレン酸又はリノール酸含有量の改変、
（４）ＬＥＣ１、ＡＧＰ、Ｄｅｋ１、Ｓｕｐｅｒａｌ１、ｍｉ１ｐｓ、ｌｐａ１、ｌｐａ３、ｈｐｔ又はｈｇｇｔなどの種々のｌｐａ遺伝子の改変。例えば、国際公開第０２／４２４２４号パンフレット、国際公開第９８／２２６０４号パンフレット、国際公開第０３／０１１０１５号パンフレット、米国特許第６，４２３，８８６号明細書、米国特許第６，１９７，５６１号明細書、米国特許第６，８２５，３９７号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、同第２００３／０２０４８７０号明細書、国際公開第０２／０５７４３９号パンフレット、国際公開第０３／０１１０１５号パンフレット、及びＲｉｖｅｒａ−Ｍａｄｒｉｄ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：５６２０−５６２４を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
（Ｂ）例えば、以下によるリン含有量の改変：
（１）フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィチン酸の分解を増強し、形質転換した植物により多くの遊離リン酸を加えることになろう。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示については、Ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２７：８７を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（２）フィターゼ含有量を減少させる遺伝子の上方制御。トウモロコシでは、これは、例えば、Ｒａｂｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３８３に記載されるように、低濃度のフィチン酸で特徴付けられるトウモロコシ変異体で同定されるＬＰＡアレルなどの１つ以上のアレルと関連するＤＮＡをクローニングし、その後、再導入することによって、且つ／又は国際公開第０２／０５９３２４号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／０００９０１１号明細書、国際公開第０３／０２７２４３号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、国際公開第９９／０５２９８号パンフレット、米国特許第６，１９７，５６１号明細書、米国特許第６，２９１，２２４号明細書、米国特許第６，３９１，３４８号明細書、国際公開第２００２／０５９３２４号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、国際公開第９８／４５４４８号パンフレット、国際公開第９９／５５８８２号パンフレット、国際公開第０１／０４１４７号パンフレットに記載されるように、イノシトールキナーゼ活性を変えることによって行い得るであろう。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
（Ｃ）例えば、デンプンの分枝パターンに作用する酵素の遺伝子、又はＮＴＲ及び／若しくはＴＲＸなどのチオレドキシンを改変する遺伝子を変えること（米国特許第６，５３１，６４８号明細書を参照されたい（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、並びに／又はｃｓ２７若しくはＴＵＳＣ２７若しくはｅｎ２７などのガンマゼインノックアウト若しくは変異体（米国特許第６，８５８，７７８号、米国特許出願公開第２００５／０１６０４８８号明細書及び同第２００５／０２０４４１８号明細書を参照されたい（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））によって得られる炭水化物の改変。Ｓｈｉｒｏｚａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：８１０（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）のフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２００：２２０（バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｐｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９２（バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の作製）、Ｅｌｌｉｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：５１５（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓφｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（オオムギアルファ−アミラーゼ遺伝子の部位特異的変異誘発）、及びＦｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）、国際公開第９９／１０４９８号パンフレット（ＵＤＰ−Ｄ−キシロース４−エピメラーゼ、Ｆｒａｇｉｌｅ１及び２、Ｒｅｆ１、ＨＣＨＬ、Ｃ４Ｈの修飾による消化性及び／又はデンプン抽出の改善）、米国特許第６，２３２，５２９号明細書（デンプンレベル（ＡＧＰ）の改変による高油料種子の作製方法）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。上記の脂肪酸修飾遺伝子を使用して、デンプンと油の経路の相互関係によってデンプン含有量及び／又は組成に影響を及ぼすこともできる。
【０１４３】
（Ｄ）トコフェロール又はトコトリエノールの改変などの、抗酸化物質の含有量又は組成の改変。例えば、米国特許第６，７８７，６８３号明細書、米国特許出願公開第２００４／００３４８８６号明細書、及び国際公開第００／６８３９３号パンフレット（フィチルプレニルトランスフェラーゼ（ｐｐｔ）の改変による抗酸化物質レベルの操作を含む）、国際公開第０３／０８２８９９号パンフレット（ホモゲンチシン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｈｇｇｔ）の改変による）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
（Ｅ）種子の必須アミノ酸の改変。例えば、米国特許第６，１２７，６００号明細書（種子中の必須アミノ酸の蓄積を増加させる方法）、米国特許第６，０８０，９１３号明細書（種子中の必須アミノ酸の蓄積を増加させるバイナリ方法）、米国特許第５，９９０，３８９号明細書（高リシン）、国際公開第９９／４０２０９号パンフレット（種子中のアミノ酸組成の改変）、国際公開第９９／２９８８２号パンフレット（タンパク質のアミノ酸の改変方法）、米国特許第５，８５０，０１６号明細書（種子中のアミノ酸組成の改変）、国際公開第９８／２０１３３号パンフレット（必須アミノ酸レベルを高めたタンパク質）、米国特許第５，８８５，８０２号明細書（高メチオニン）、米国特許第５，８８５，８０１号明細書（高トレオニン）、米国特許第６，６６４，４４５号明細書（植物アミノ酸生合成酵素）、米国特許第６，４５９，０１９号明細書（リシン及びトレオニンの増加）、米国特許第６，４４１，２７４号明細書（植物トリプトファン合成酵素ベータサブユニット）、米国特許第６，３４６，４０３号明細書（メチオニン代謝酵素）、米国特許第５，９３９，５９９号明細書（高硫黄）、米国特許第５，９１２，４１４号明細書（メチオニンの増加）、国際公開第９８／５６９３５号パンフレット（植物アミノ酸生合成酵素）、国際公開第９８／４５４５８号パンフレット（より高い割合で必須アミノ酸を含む改変種子タンパク質）、国際公開第９８／４２８３１号パンフレット（リシンの増加）、米国特許第５，６３３，４３６号明細書（含硫アミノ酸含有量の増加）、米国特許第５，５５９，２２３号明細書（植物の栄養価を改善するためにプログラム可能なレベルの必須アミノ酸を含有する、所定の構造を有する合成貯蔵タンパク質）、国際公開第９６／０１９０５号パンフレット（トレオニンを増加）、国際公開第９５／１５３９２号パンフレット（リシンの増加）、米国特許出願公開第２００３／０１６３８３８号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１５００１４号明細書、米国特許出願公開第２００４／００６８７６７号明細書、米国特許第６，８０３，４９８号明細書、国際公開第０１／７９５１６号パンフレット及び国際公開第００／０９７０６号パンフレット（ＣｅｓＡ：セルロース合成酵素）、米国特許第６，１９４，６３８号明細書（ヘミセルロース）、米国特許第６，３９９，８５９号明細書及び米国特許出願公開第２００４／００２５２０３号明細書（ＵＤＰＧｄＨ）、米国特許第６，１９４，６３８号明細書（ＲＧＰ）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
さらなる遺伝子が本明細書に開示される方法に有用な発現カセットに含まれ得る。非限定的な例として、以下が挙げられる。
【０１４６】
Ａ．部位特異的ＤＮＡ組み込みのための部位を作製する遺伝子
これには、ＦＬＰ／ＦＲＴ系に使用可能なＦＲＴ部位、及び／又はＣｒｅ／Ｌｏｘｐ系に使用可能なＬｏｘ部位の導入が含まれる。例えば、Ｌｙｚｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２１：９２５−９３２、及び国際公開第９９／２５８２１号パンフレットを参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。使用可能な他の系としては、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ（Ｍａｅｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｖｉｃｋｉ  Ｃｈａｎｄｌｅｒ，Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｃｈ．１１８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎリコンビナーゼ（Ｅｎｏｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、及びｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系（Ａｒａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）が挙げられる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
Ｂ．非生物的ストレス耐性（以下に限定はされないが、開花、雄穂及び種子の発達、窒素利用効率の増強、窒素反応性の改変、乾燥耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は乾燥耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、寒冷耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は寒冷耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、及び塩耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は塩耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を含む）に影響を及ぼし、ストレス下での収穫量を増大させる遺伝子。例えば、国際公開第００／７３４７５号パンフレット（リンゴ酸塩の改変によって水使用効率が改変される）；米国特許第５，８９２，００９号明細書、米国特許第５，９６５，７０５号明細書、米国特許第５，９２９，３０５号明細書、米国特許第５，８９１，８５９号明細書、米国特許第６，４１７，４２８号明細書、米国特許第６，６６４，４４６号明細書、米国特許第６，７０６，８６６号明細書、米国特許第６，７１７，０３４号明細書、国際公開第２０００／０６００８９号パンフレット、国際公開第２００１／０２６４５９号パンフレット、国際公開第２００１／０３５７２５号パンフレット、国際公開第２００１／０３４７２６号パンフレット、国際公開第２００１／０３５７２７号パンフレット、国際公開第２００１／０３６４４４号パンフレット、国際公開第２００１／０３６５９７号パンフレット、国際公開第２００１／０３６５９８号パンフレット、国際公開第２００２／０１５６７５号パンフレット、国際公開第２００２／０１７４３０号パンフレット、国際公開第２００２／０７７１８５号パンフレット、国際公開第２００２／０７９４０３号パンフレット、国際公開第２００３／０１３２２７号パンフレット、国際公開第２００３／０１３２２８号パンフレット、国際公開第２００３／０１４３２７号パンフレット、国際公開第２００４／０３１３４９号パンフレット、国際公開第２００４／０７６６３８号パンフレット、国際公開第９８／０９５２１号パンフレット及び国際公開第９９／３８９７７号パンフレット（凍結、高塩分及び乾燥という植物に対する負の効果を緩和し、植物表現型に他の正の効果を付与するのに有効な、ＣＢＦ遺伝子及び転写因子などの遺伝子を記載している）；米国特許出願公開第２００４／０１４８６５４号明細書及び国際公開第０１／３６５９６号パンフレット（植物中のアブシジン酸が改変され、それにより、収穫量の増加及び／又は非生物的ストレスに対する耐性の増大などの植物の表現型が改善される）；国際公開第２０００／００６３４１号パンフレット、国際公開第０４／０９０１４３号パンフレット、米国特許出願第１０／８１７４８３号明細書及び米国特許第６，９９２，２３７号明細書（サイトカイニン発現が改変され、それにより、乾燥耐性などのストレス耐性が増大し、且つ／又は収穫量が増加した植物が得られる）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、国際公開第０２／０２７７６号パンフレット、国際公開第２００３／０５２０６３号パンフレット、特開２００２−２８１９７５号公報、米国特許第６，０８４，１５３号明細書、国際公開第０１／６４８９８号パンフレット、米国特許第６，１７７，２７５号明細書及び米国特許第６，１０７，５４７号明細書（窒素利用の増強及び窒素反応性の改変）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。エチレンの改変については、米国特許出願公開第２００４／０１２８７１９号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１６６１９７号明細書及び国際公開第２０００／３２７６１号パンフレットを参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非生物的ストレスの植物転写因子又は転写調節因子については、例えば、米国特許出願公開第２００４／００９８７６４号明細書又は米国特許出願公開第２００４／００７８８５２号明細書を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
Ｃ．収穫量、開花、植物成長及び／又は植物構造などの植物の成長及び農学的形質に影響を及ぼす他の遺伝子及び転写因子を、植物に導入又は移入することができる。例えば、国際公開第９７／４９８１１（ＬＨＹ）号パンフレット、国際公開第９８／５６９１８（ＥＳＤ４）号パンフレット、国際公開第９７／１０３３９号パンフレット及び米国特許第６，５７３，４３０号明細書（ＴＦＬ）、米国特許第６，７１３，６６３号明細書（ＦＴ）、国際公開第９６／１４４１４号パンフレット（ＣＯＮ）、国際公開第９６／３８５６０号パンフレット、国際公開第０１／２１８２２号パンフレット（ＶＲＮ１）、国際公開第００／４４９１８号パンフレット（ＶＲＮ２）、国際公開第９９／４９０６４号パンフレット（ＧＩ）、国際公開第００／４６３５８号パンフレット（ＦＲＩ）、国際公開第９７／２９１２３号パンフレット、米国特許第６，７９４，５６０号明細書、米国特許第６，３０７，１２６号明細書（ＧＡＩ）、国際公開第９９／０９１７４号パンフレット（Ｄ８及びＲｈｔ）、並びに国際公開第２００４／０７６６３８号パンフレット及び国際公開第２００４／０３１３４９号パンフレット（転写因子）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
本明細書で使用する場合、「アンチセンス配向」は、アンチセンス鎖が転写される方向で、プロモーターに作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列への参照を含む。アンチセンス鎖は、内因性転写産物に十分に相補的であり、そのため内因性転写産物の翻訳は多くの場合抑制される。「作動可能に連結している」とは、単一の核酸断片上の２つ以上の核酸断片が、１つの断片の機能が他の断片に影響されるような関係にあることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）とき、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結している。コード配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【０１５０】
本明細書に開示される方法に有用な、プロモーターに作動可能に連結している異種ヌクレオチド配列、及びそれに関連する生物学的活性を有する断片又は改変体は、標的遺伝子のアンチセンス配列であり得る。用語「アンチセンスＤＮＡヌクレオチド配列」は、そのヌクレオチド配列の５’から３’という通常の方向に対し、その逆方向の配列を意味するものである。植物細胞に送達されると、アンチセンスＤＮＡ配列の発現は、標的遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の正常な発現を妨げる。アンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の転写によって生じた内因性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的でハイブリダイズすることができるＲＮＡ転写産物をコードする。この場合、標的遺伝子によってコードされる天然タンパク質の産生が阻害され、所望の表現型応答を得る。アンチセンス配列は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現を妨げるなら、改変されていてもよい。このように、対応するアンチセンス配列に対し７０％、８０％、８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築物を使用し得る。さらに、アンチセンスヌクレオチドの部分は、標的遺伝子の発現を妨げるために使用され得る。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又はそれ以上からなる配列を使用し得る。したがって、プロモーターは、本明細書に開示される方法によって形質転換された場合、アンチセンスＤＮＡ配列に作動可能に連結されて、植物における天然タンパク質の発現を低減又は阻害し得る。
【０１５１】
「ＲＮＡｉ」は遺伝子発現を抑制する一連の関連手法を指す（例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。他の名称で呼ばれる旧手法は、今日、同じメカニズムに依っていると考えられるが、文献では異なる名称が付されている。これらには、「アンチセンス阻害」、すなわち標的タンパク質の発現を抑制し得るアンチセンスＲＮＡ転写産物の産生、及び、同一又は類似性の高い外来性又は内因性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写産物の産生を指す「コサプレッション」又は「センスサプレッション」が含まれる（米国特許第５，２３１，０２０号明細書（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。このような手法は、１本はサイレンシングする標的遺伝子の相補的な二本鎖ＲＮＡの蓄積を生じるコンストラクトの使用に依存している。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」又は「転写開始領域」は、通常、ＴＡＴＡボックス又はＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導して特定のコード配列に適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始させることができるＤＮＡ配列を含むＤＮＡの調節領域を意味する。プロモーターは、ＴＡＴＡボックスの上流若しくは５’に一般的に位置する他の認識配列、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導してＲＮＡ合成を開始させることができるＤＮＡ配列（転写開始速度に影響を及ぼす上流プロモーターエレメントと呼ばれる）をさらに含み得る。
【０１５３】
転写開始領域、すなわちプロモーターは、宿主にネイティブ、すなわち同種であっても、外来、すなわち異種であってもよく、或いは、天然配列又は合成配列とすることができよう。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主に、転写開始領域が存在しないことを意味する。目的のコード配列に関し、ネイティブプロモーター又は異種プロモーターを使用することができる。
【０１５４】
転写（発現）カセットは、転写の５’−３’方向に、植物内で機能する、転写及び翻訳開始領域、目的ＤＮＡ配列／形質遺伝子、並びに転写及び翻訳終止領域を含む。終止領域は、転写開始領域とネイティブであっても、目的ＤＮＡ配列とネイティブであっても、又は他のソース由来であってもよい。使いやすい終止領域は、ジャガイモプロテイナーゼ阻害剤（ＰｉｎＩＩ）遺伝子から、又はノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ及びオパリンシンターゼ終止領域などの、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドの配列から得ることができる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４、Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９）もまた参照されたい。
【０１５５】
発現カセットは、発現カセットコンストラクト中に５’末端リーダー配列をさらに含有することができる。そのようなリーダー配列は翻訳を促進するよう作用し得る。翻訳リーダーは当技術分野で知られており、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’端非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ、Ｏ．，Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，Ｂ（１９８９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８６：６１２６−６１３０）；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（（タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ））（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５４：９−２０）、及びヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｓａｒｎｏｗ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスの外皮タンパク質ＭＡＲＮＡの非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｅｈｒｋｅ，Ｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，ｐａｇｅｓ  ２３７−２５６、Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３２５７−３２７３）；トウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｒｎｍｅｌ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）が挙げられる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，８４：９６５−９６８；及び内因性トウモロコシ５’端非翻訳配列も参照されたい。本翻訳を促進することが知られている他の方法及びｍＲＮＡ安定性を高めることが知られている他の方法では、例えば、トウモロコシユビキチンイントロン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｉｌ，（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．５：２１３−２１８、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８：６７５−６８９）又はトウモロコシＡｄｈＩイントロン（Ｋｙｏｚｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４０−４８、Ｋｙｏｚｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３５３−３５７）などのイントロンが使用され得る。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
発現カセットは、形質転換植物に導入され発現する、１つ以上の遺伝子又は核酸配列を含有することができる。したがって、各核酸配列は５’末端及び３’末端の調節配列に作動可能に連結するであろう。或いは、複数の発現カセットが提供され得る。
【０１５７】
本開示の方法に有用な発現カセットの調製には、各種ＤＮＡ断片が、適当な配向で、必要ならば、適当なリーディングフレームにおけるＤＮＡ配列を提供するように操作され得る。この終わり近くに、アダプター又はリンカーがＤＮＡ断片の結合に使用され得、或いは、適当な制限酵素認識部位、不要なＤＮＡの除去、制限酵素認識部位の除去などを提供するための他の操作が行われ得る。この目的のために、インビトロでの変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えばトランジション及びトランスバージョンが行われ得る。
【０１５８】
開示された方法によって外植片に導入された目的の形態形成遺伝子及び／又は形質遺伝子／ポリヌクレオチドは、好適なプロモーターに作動可能に連結され得る。「植物プロモーター」は、それが植物細胞由来であるか否かに関わりなく、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターである。植物プロモーターの例としては、以下に限定はされないが、植物、植物ウイルス、並びにアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）からなどの植物細胞で発現する遺伝子を含む細菌から得られるものが挙げられる。発生制御下のプロモーターの例としては、葉、根又は種子などの特定の組織で優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは「組織優先的」と呼ばれる。特定の組織でのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型」特異的プロモーターは、１種以上の器官の特定の細胞型、例えば根又は葉の血管細胞における発現を主に駆動する。組織特異的プロモーター、組織優先的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーター類を構成する。
【０１５９】
「誘導性」又は「抑制性」プロモーターは、環境制御又は外的制御下にあるプロモーターであり得る。誘導性プロモーターによる転写に影響し得る環境条件の例としては、嫌気的条件、又は特定の化学物質、又は光の存在が挙げられる。或いは、誘導性又は抑制性のプロモーターの外的制御は、標的ポリペプチドとの相互作用によって、プロモーターを誘導又は抑制する、好適な化学物質又は他の薬剤を与えることによって影響され得る。誘導性プロモーターとしては、熱誘導性プロモーター、エストラジオール応答性プロモーター、化学誘導性プロモーターなどが挙げられる。病原体誘導性プロモーターとしては、病原体の感染後に誘導される感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）、例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼなどからのものが挙げられる。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．８９：２４５−２５４；Ｕｋｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：６４５−６５６；及びＶａｎ  Ｌｏｏｎ（１９８５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．４：１１１−１１６を参照されたい。本方法において有用な誘導性プロモーターとしては、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、及びＸＶＥプロモーターが挙げられる。
【０１６０】
化学誘導性プロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）、エタメツルフロンリプレッサー（ＥＳＲ）、又はクロルスルフロンリプレッサー（ＣＳＲ）により抑制することができ、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンド又はスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。リプレッサーはＴＥＴＲであり得、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリン又はアンヒドロテトラサイクリンである（Ｇａｔｚ，Ｃ．，Ｆｒｏｈｂｅｒｇ、Ｃ．ａｎｄ  Ｗｅｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．（１９９２）Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２，３９７−４０４）。或いは、リプレッサーはＥＳＲであり得、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、又はハロスルフロンである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１０２８７９３６号明細書）。リプレッサーがＣＳＲであれば、ＣＳＲリガンドはクロルスルフロンである。米国特許第８，５８０，５５６号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１６１】
「構成的」プロモーターは、ほとんどの条件下で活性を有するプロモーターである。本開示に有用なプロモーターとしては、国際公開第２０１７／１１２００６号パンフレットに開示されているもの、及び米国仮特許出願第６２／５６２，６６３号明細書に開示されているものが挙げられる。植物の遺伝子発現に使用する構成的プロモーターは、当該技術分野で知られている。このようなプロモーターとして、以下に限定はされないが、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３、Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８：７８−９８）、アクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：１６３−１７１）、ヒストン、ＤｎａＪ（Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ４２：１８９−２０１）などの遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。各種態様において、本開示の方法に有用な構成的プロモーターとしては、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、及びＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）プロモーターが挙げられる。
【０１６２】
以下の表４に記載する、本開示に有用なプロモーターには、米国特許出願公開第２０１７／０１２１７２２号明細書、及び米国特許第８，７１０，２０６号明細書に開示されたものが含まれる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
【表４】
2021517812.tif 000009
【０１６４】
本開示の方法に有用なさらなるプロモーターを、以下の表５に列挙する。
【０１６５】
【表５−１】
2021517812.tif 000010
【０１６６】
【表５−２】
2021517812.tif 000011
【０１６７】
【表５−３】
2021517812.tif 000012
【０１６８】
【表５−４】
2021517812.tif 000013
【０１６９】
本明細書で使用する場合、用語「調節エレメント」はまた、通常、常にではないが、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は特定の部位で転写を開始するのに必要な他の因子を認識することによって、コード領域の発現を制御する配列を含む、構造遺伝子のコード配列の上流（５’）側のＤＮＡ配列を指す。ＲＮＡポリメラーゼ又は特定の部位で確実に開始させる他の転写因子を認識する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与しているコアプロモーターエレメント、及び遺伝子の発現を変化させる他の調節エレメントを含む。イントロン、又はコード領域配列も３’側に位置しているヌクレオチド配列もまた、目的のコード領域の発現の調節に寄与し得ることは理解されるべきである。好適なイントロンの例としては、以下に限定はされないが、トウモロコシＩＶＳ６イントロン、又はトウモロコシアクチンイントロンが挙げられる。調節エレメントはまた、転写開始部位の下流（３’）側、転写領域内、又はそれらの両方に位置するエレメントを含み得る。本開示の方法との関連では、転写後の調節エレメントとして、転写開始の後に活性なエレメント、例えば、翻訳エンハンサー及び転写エンハンサー、翻訳リプレッサー及び転写リプレッサー、並びにｍＲＮＡ安定性決定因子が挙げられる。
【０１７０】
「異種ヌクレオチド配列」、「目的の異種ポリヌクレオチド」、「異種ポリヌクレオチド」、又は「異種形質遺伝子」は、本開示全体を通して使用される場合、プロモーターと共に天然に存在せず、またプロモーターに作動可能に連結もしていない配列である。このヌクレオチド配列又は形質遺伝子は、プロモーター配列に対し異種であるが、宿主植物に対しては、同種の、又は天然の、又は異種の、又は外来のものであり得る。同様に、プロモーター配列は、宿主植物及び／又は目的のポリヌクレオチドに対して、同種の、又は天然の、又は異種の、又は外来のものであり得る。
【０１７１】
本開示の方法において有用なＤＮＡコンストラクト／発現カセットはまた、必要に応じて、エンハンサー（翻訳エンハンサー又は転写エンハンサー）をさらに含み得る。これらのエンハンサー領域は、当業者にはよく知られており、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含み得る。開始コドンは、全配列の翻訳を確かにするため、コード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然及び合成双方の様々な起源に由来するものであってよい。翻訳開始領域は、転写開始領域のソース又は構造遺伝子から提供され得る。配列はまた、遺伝子発現のために選択された調節エレメントに由来してもよく、特に、ｍＲＮＡの翻訳を増大させるように改変してもよい。転写レベルを高めるために、エンハンサーをプロモーター領域と組み合わせて使用し得ることがわかった。転写レベルを高めるために、エンハンサーをプロモーター領域と組み合わせて使用し得ることがわかった。エンハンサーは、プロモーター領域の発現を増加させるように作用するヌクレオチド配列である。エンハンサーは当該技術分野で知られており、ＳＶ４０エンハンサー領域、３５Ｓエンハンサーエレメントなどが挙げられる。いくつかのエンハンサーはまた、通常のプロモーター発現パターンを、例えば、プロモーターを構成的に発現させることによって変えることが知られている（エンハンサーがなければその同じプロモーターが１つ又は少数の特定の組織でのみ発現する場合）。本開示の方法に有用なエンハンサーを、以下の表６に列挙する。
【０１７２】
【表６】
2021517812.tif 000014
【０１７３】
一般に、「弱プロモーター」は、コード配列の発現を低レベルで駆動するプロモーターを意味する。「低レベル」の発現とは、約１／１０，０００〜約１／１００，０００〜約１／５００，０００の転写レベルで発現することを意味するものである。逆に、強プロモーターは、高レベル、すなわち約１／１０〜約１／１００〜約１／１，０００の転写レベルでコード配列の発現を駆動する。
【０１７４】
本開示の方法において有用な配列は、それらの天然のコード配列と共に使用され得、それによって形質転換植物の表現型の変化を生じることがわかった。本明細書に開示される形態形成遺伝子及び目的の遺伝子、並びにそれらの改変体及び断片は、任意の植物の遺伝子操作のための本開示の方法において有用である。用語「作動可能に連結している」は、異種ヌクレオチド配列の転写又は翻訳が、プロモーター配列の影響下にあることを意味する。
【０１７５】
本開示の一態様では、発現カセットは、形態形成遺伝子及び／又は異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、転写開始領域又はその改変体若しくは断片を含む。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下にヌクレオチド配列を挿入するための複数の制限酵素認識部位を有し得る。発現カセットはさらに、選択マーカー遺伝子及び３’終止領域を含み得る。
【０１７６】
発現カセットは、転写の５’−３’方向に、宿主生物において機能する、転写開始領域（すなわち、本プロモーター、又はその改変体若しくは断片）、翻訳開始領域、形態形成遺伝子及び／又は目的の異種ヌクレオチド配列、翻訳終止領域、及び、場合により転写終止領域を含み得る。本開示の方法において有用な調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域、及び翻訳終止領域）、形態形成遺伝子及び／又は目的のポリヌクレオチドは、宿主細胞に対し、又は相互にネイティブ／類似であり得る。或いは、調節領域、形態形成遺伝子及び／又は目的ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対し、又は相互に異種であり得る。本明細書で使用する場合、配列に関連した「異種の」は、外来種を起源とする配列であるか、又は同種からのものであれば、組成及び／又はゲノム遺伝子座が意図的な人的介入によって天然の形態から実質的に改変されている配列である。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、そのポリヌクレオチドが由来する種と異なる種からのものであるか、又は、同一／類似種からのものであれば、一方若しくは両方が元の形態及び／若しくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されており、或いは、プロモーターが、作動可能に連結しているポリヌクレオチドに対し天然のプロモーターではない。
【０１７７】
終止領域は転写開始領域とネイティブであってもよく、作動可能に連結された形態形成遺伝子とネイティブであってもよく、及び／若しくは作動可能に連結された目的のＤＮＡ配列と天然であってもよく、宿主植物宿とネイティブであってもよく、又は別の供給源由来（すなわち、プロモーター、形態形成遺伝子及び／若しくは発現されるＤＮＡ配列、宿主植物、又はそれらの任意の組み合わせに対して外来性又は異種）であってもよい。適切な終止領域は、オクトピン合成酵素終止領域及びノパリン合成酵素終止領域など、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから入手可能である。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；及びＪｏｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
形態形成遺伝子に作動可能に連結され、且つ／又は、場合によりさらに、異種ヌクレオチド配列、目的の異種ポリヌクレオチド、異種ポリヌクレオチドヌクレオチド、目的の配列、若しくは形質遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを使用して、任意の植物を形質転換することができる。或いは、プロモーターに作動可能に連結された目的の異種ポリヌクレオチド、異種ポリヌクレオチドヌクレオチド、目的の配列、若しくは形質遺伝子は、トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の外に配置された別個の発現カセット上にあり得る。このようにして、遺伝子組み換えが行われた植物体、植物細胞、植物組織、種子、根などを得ることができる。本開示の配列を含む発現カセットはまた、生物に同時形質転換される遺伝子、異種ヌクレオチド配列、目的の異種ポリヌクレオチド、又は異種ポリヌクレオチドの少なくとも１つの追加のヌクレオチド配列を含み得る。或いは、そのような追加の配列を別の発現カセットに供してもよい。
【０１７９】
適切な場合には、プロモーター配列の制御下で発現するヌクレオチド配列／形質遺伝子、及び任意の追加のヌクレオチド配列は、形質転換植物における発現を増加させるために最適化することができる。すなわち、発現を改善するために、これらのヌクレオチド配列を、植物に好適なコドンを用いて合成することができる。例えば、宿主優先コドンの利用についての考察には、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。植物優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書、同第５，４３６，３９１号明細書、及びＭｕｒｒａｙ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
細胞宿主中で遺伝子の発現を促進するために、追加的に配列を改変することが知られている。このような改変には、遺伝子の発現に有害であり得る、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン−イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様リピートをコードする配列、及び他のそのようなよく特徴付けられた配列の除去が含まれる。異種ヌクレオチド配列のＧ−Ｃ含量を、宿主細胞において発現した既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均レベルに調節することができる。可能であれば、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるように配列を改変する。
【０１８１】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、ヌクレオチドコンストラクト、例えば、発現カセットを宿主細胞に導入するためのプラスミド、コスミド又はバクテリオファージなどのＤＮＡ分子を指す。クローニングベクターは、通常、外来ＤＮＡ配列を特定可能な方法で、ベクターの必須の生物学的機能を失わずに挿入することができる１つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、クローニングベクターで形質転換された細胞の識別及び選択に使用するのに好適なマーカー遺伝子とを含む。マーカー遺伝子としては、通常、テトラサイクリン耐性、ハイグロマイシン耐性又はアンピシリン耐性を与える遺伝子が挙げられる。
【０１８２】
形質転換された細胞は、従来の方法で植物体に成長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。その後、これらの植物を成長させ、同じ形質転換種又は異なる種と授粉させ、それにより得られた、所望の表現型の特性を発現した子孫を確認することができる。所望の表現型特性の発現が安定して維持され、受け継がれるのを確実にするため、２世代以上生育させ、その後、所望の表現型特質の発現が達成されたことを確実にするため、種子を収穫することができる。このように、本開示は、ゲノムに安定に組み込まれた、本開示の方法に有用なヌクレオチドコンストラクト、例えば本開示の方法に有用な発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」ともいう）を提供する。
【０１８３】
植物組織から植物を再生する様々な方法がある。再生の特定の方法は、出発植物組織と再生する特定の植物種に依るであろう。単一植物プロトプラスト形質転換体又は種々の形質転換された外植片からの植物の再生、発達及び培養は、当該技術分野でよく知られている（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、（１９８８）Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。この再生及び育成プロセスには、通常、形質転換細胞を選択し、それらの個別の細胞を、胚の通常発生段階から小植物を根付かせる段階まで育成する工程を含む。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生される。得られる根付いたトランスジェニックシュートをその後、土壌などの適切な植物育成培地に植え付ける。好ましくは、再生植物を自家授粉させて同型のトランスジェニック植物を提供する。さもなければ、再生植物から得た花粉を、農学的に重要な系の種子から育った植物と交雑させる。逆に、これらの重要な系の植物の花粉を、再生植物への授粉に使用する。当業者によく知られた方法を用いて、目的の所望のポリヌクレオチドを含有する、本開示の方法によって作製されたトランスジェニック植物を培養する。
【０１８４】
植物ゲノムの特定の位置でポリヌクレオチドをターゲティングにより挿入する方法は当該技術分野で知られている。ゲノムの所望の位置でのポリヌクレオチドの挿入は、部位特異的組み換えシステムを用いて行われる。例えば、国際公開第９９／２５８２１号パンフレット、国際公開第９９／２５８５４号パンフレット、国際公開第９９／２５８４０号パンフレット、国際公開第９９／２５８５５号パンフレット及び国際公開第９９／２５８５３号パンフレットを参照されたい。これらの文献は全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。簡単に述べると、２つの非同一組み換え部位が隣接する目的のポリヌクレオチドが、Ｔ−ＤＮＡトランスファーカセットに含まれ得る。Ｔ−ＤＮＡトランスファーカセットは、トランスファーカセットの部位に対応する２つの非同一組み換え部位が隣接している標的部位がそのゲノムに安定に組み込まれた植物に導入される。適切なリコンビナーゼが提供され、トランスファーカセットが標的部位に組み込まれる。目的のポリヌクレオチドは、それによって植物ゲノムの特定の染色体上の位置に組み込まれる。
【０１８５】
本開示の方法を使用して、外植片由来の植物のゲノムにおける改変のための特定の部位を標的とするのに有用なポリヌクレオチドを外植片に導入することができる。本開示の方法によって導入することができる部位特異的改変としては、部位特異的改変を導入する任意の方法によるもの、例えば、以下に限定はされないが、遺伝子修復オリゴヌクレオチドの使用（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１９３４９号明細書）、又は、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓなどの二本鎖切断技術に使用によるものが挙げられる。例えば、植物体若しくは植物細胞のゲノム中の標的配列のゲノム改変のために、植物体を選択するために、塩基又は配列を欠失させるために、遺伝子編集のために、そして目的ポリヌクレオチドを植物体若しくは植物細胞のゲノムに挿入するために、本開示の方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを植物細胞又は植物体へ導入することができる。したがって、本開示の方法を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと共に使用して、植物体、植物細胞又は種子のゲノム中の標的部位及び目的ヌクレオチドを変更又は改変するのに有効なシステムを提供することができる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、この植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは植物ゲノムに結合し、ゲノム標的配列に二本鎖切断を引き起こすことができる。
【０１８６】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドにガイドされ、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、植物体、植物細胞又は種子のゲノム中の標的部位の改変に有効なシステムを提供する。さらに、細胞のゲノム中の標的部位の改変、及び細胞のゲノム中のヌクレオチド配列の編集に有効なシステムを提供するために、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法を提供する。ゲノム標的部位が特定されたなら、様々な方法を用いて、様々な目的ポリヌクレオチドを含むように標的部位をさらに改変することができる。本開示の方法を使用して、細胞のゲノム中のヌクレオチド配列の編集を行うＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを導入することができる。編集されるべきヌクレオチド配列（目的ヌクレオチド配列）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識される標的部位中にあっても標的部位外にあってもよい。
【０１８７】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）（ＳＰＩＤＲ−スペーサー散在型ダイレクトリピートとしても知られる）は、最近記載されたＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短く、且つ高度に保存されたＤＮＡリピート（通常２４〜４０ｂｐ、１〜１４０回の繰り返し−ＣＲＩＳＰＲリピートとも呼ばれる）から構成され、部分的に回文を形成している。反復配列（通常、種に固有である）は一定の長さの可変配列（通常、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に依り２０〜５８）がスペーサーとして存在している（２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。
【０１８８】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は最初にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて見出された（Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１６９：５４２９−５４３３；Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：３５５３−３５５６）。同様の間隔短配列リピートが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）及びマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で特定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７−１０６５、Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４−２６３、Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３０７：２６−３０、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５−９３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はリピートの構造により他のＳＳＲと異なり、短等間隔リピート（ｓｈｏｒｔ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｓｐａｃｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）（ＳＲＳＲ）と呼ばれていた（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＯＭＩＣＳ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．６：２３−３３、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４−２４６）。リピートは、クラスターの形態で生じる短いエレメントであり、常に一定の長さの可変配列により等しい間隔をおいて存在している（Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４−２４６）。
【０１８９】
Ｃａｓ遺伝子としては、一般にフランキングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合して、関連して、又は近接若しくは隣接して存在する遺伝子が挙げられる。用語「Ｃａｓ遺伝子」及び「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書では互換的に使用される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的レビューは、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０に示されている。
【０１９０】
４つの当初記載された遺伝子ファミリーに加え、さらに４１のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ファミリーが、米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０号明細書に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。この文献には、ＣＲＩＳＰＲシステムが、異なるリピート配列パターン、遺伝子群及び種の範囲を有する異なる分類に属することが示されている。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣａｓ遺伝子の数は、種によって変わり得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣａｓタンパク質と関連しており、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ標的配列へ二本鎖切断を導入することができる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドにガイドされ、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」には、ＤＮＡ標的部位に二本鎖切断を導入することができる、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチドとの複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的部位に近接したＤＮＡ二本鎖をほどき、標的配列を認識すると同時に、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端に略位置している限り、２本のＤＮＡ鎖をガイドヌクレオチドによって切断する（米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０号明細書の図２Ａ及び図２Ｂを参照）。
【０１９１】
一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、以下に限定はされないが、２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）の配列番号４６２、４７４、４８９、４９４、４９９、５０５、及び５１８に挙げられているＣａｓ９遺伝子である。別の態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物、トウモロコシ又はダイズ最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、以下に限定はされないが、米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０号明細書の図１Ａに示されているものである。
【０１９２】
別の態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓコドン領域上流のＳＶ４０核標的シグナル、及びＣａｓコドン領域下流の二分ＶｉｒＤ２核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７４４２−６）に作動可能に連結されている。
【０１９３】
一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０号明細書の、配列番号１、１２４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、１９３、若しくは配列番号５のヌクレオチド２０３７〜６３２９、又はその機能的断片若しくは改変体からなるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子である。
【０１９４】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して、用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」及び「機能的に等価な断片」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ配列の一部又はサブ配列を指す。
【０１９５】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して、用語「機能的改変体」、「機能的に等価である改変体」及び「機能的に等価な改変体」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの改変体を指す。断片及び改変体は、部位特異的変異誘発法及び合成構築法（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）などにより得ることができる。
【０１９６】
一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｎ（１２−３０）ＮＧＧ型のゲノム配列を認識することができる、植物コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子であり、原則として標的とし得る。
【０１９７】
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖のリン酸ジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷することなく特定の部位でＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含み、これらはさらに亜型を含む。Ｉ型及びＩＩＩ型系においては、メチラーゼ活性及び制限活性の両活性が単一複合体内に含まれる。エンドヌクレアーゼはまた、ホーミングヌクレアーゼ（ＨＥアーゼ）としても知られるメガヌクレアーゼを含み、この酵素は、制限エンドヌクレアーゼのように、特定の認識部位に結合し切断するが、メガヌクレアーゼの認識部位は通常長く、約１８ｂｐ以上である（２０１２年３月２２日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／３００６１号明細書）。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフを基に４つのファミリー、すなわち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈ−Ｎ−Ｈファミリー、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーに分類されている。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びリン酸ジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、その長い認識部位と、そのＤＮＡ基質の配列多型性を許容していることで知られている。メガヌクレアーゼの命名規則は、他の制限エンドヌクレアーゼの規則と類似している。メガヌクレアーゼはまた、それぞれ独立ＯＲＦ、イントロン及びインテインによってコードされる酵素に対して付される接頭辞のＦ−、Ｉ−又はＰＩ−で特徴付けられる。遺伝子組み換えプロセスの１つの工程は、認識部位又はその近傍でのポリヌクレオチドの切断を含む。この切断活性は、二本鎖の切断に使用され得る。部位特異的リコンビナーゼ及びその認識部位のレビューでは、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ５：５２１−７、及びＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ  ７：７６０−７を参照されたい。いくつかの例では、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリー又はリゾルバーゼファミリーからのものである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、植物又は他の有機体のゲノム中の特定の標的配列での二本鎖切断に使用することができる配列特異的ヌクレアーゼの新しい分類である。（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３−１４８）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び二本鎖切断誘発物質ドメインからなる人工の二本鎖切断誘発物質である。認識部位特異性は、通常、例えばＣ２Ｈ２構造を有する２つ、３つ若しくは４つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガードメインによって与えられるが、他のジンクフィンガー構造は知られており、工学的に作り出されている。ジンクフィンガードメインは、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドの設計に適している。ＺＦＮとしては、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに結合した人工ＤＮＡ結合ジンクフィンガードメイン、例えば、ＦｏｋｌなどのＭｓ型エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインが挙げられる。さらなる機能性は、ジンクフィンガー結合ドメイン、例えば、転写活性因子ドメイン、転写抑制因子ドメイン及びメチラーゼに融合することができる。いくつかの例では、切断活性にヌクレアーゼドメインの二量体化が要求される。各ジンクフィンガーは、標的ＤＮＡの３つの連続する塩基対を認識する。例えば、３フィンガードメインは、ヌクレアーゼの二量体化要件で、９個の連続するヌクレオチドからなる配列を認識し、２組のジンクフィンガートリプレットが、１８個のヌクレオチドからなる認識配列に結合するために使用される。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、「デッドＣＡＳ９」（ｄＣＡＳ９）は、転写リプレッサードメインを供給するために使用される。ｄＣＡＳ９は、もはやＤＮＡを切断できないように変異されている。ｄＣＡＳ０はｇＲＮＡによって配列にガイドされると、なお結合し得、また、リプレッサーエレメントに融合され得る（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３Ｊｕｌｙ  １８；１５４（２）：４４２−４５１、Ｋｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌ．１２  Ｎｏ．１１：１０５１−１０５４を参照）。リプレッサーエレメントに融合したｄＣＡＳ９は、本明細書に記載されるように、ｄＣＡＳ９〜ＲＥＰと略され、ここで、リプレッサーエレメント（ＲＥＰ）は、植物において特徴付けられている既知のリプレッサーモチーフのいずれかであり得る（レビューには、Ｋａｇａｌｅ  ａｎｄ  Ｒｏｚｘａｄｏｗｓｋｉ，２００１０  ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇ  ＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ５：６、６９１−６９４を参照）。発現ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）はｄＣＡＳ９〜ＲＥＰタンパク質に結合し、ｄＣＡＳ９−ＲＥＰ融合タンパク質のプロモーター（Ｔ−ＤＮＡ内のプロモーター）内の特定の所定のヌクレオチド配列への結合を標的とする。例えば、これがＺＭ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ｄＣＡＳ９〜ＲＥＰ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭカセットをＵ６−ＰＯＬ  ＰＲＯ：：ｇＲＮＡ：：Ｕ６  ＴＥＲＭカセットと共に使用して、境界を越えて発現し、ｇＲＮＡがｄＣＡＳ９−ＲＥＰタンパク質をガイドして、Ｔ−ＤＮＡ内の発現カセットＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ｍｏＰＡＴ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭに結合するように設計されているなら、境界配列を越えて配列を組み込んだイベントはビアラホス感受性となる。Ｔ−ＤＮＡのみを組み込んだトランスジェニックイベントは、ｍｏＰＡＴを発現し、ビアラホス耐性となるであろう。（ＴＥＴＲやＥＳＲとは対照的に）リプレッサーに融合したｄＣＡＳ９タンパク質を用いる利点は、Ｔ−ＤＮＡ内の任意のプロモーターに対しこれらのリプレッサーを標的とする能力である。ＴＥＴＲ及びＥＳＲは、同種のオペレーター結合配列に限定される。或いは、リプレッサードメインに融合した合成ジンクフィンガーヌクレアーゼを、上記のように、ｇＲＮＡ及びｄＣＡＳ９〜ＲＥＰに代えて使用することができる（Ｕｒｒｉｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．４：２３１）。
【０１９９】
細菌及び古細菌は、外来核酸の分解に短鎖ＲＮＡを使用する、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を発展させた（国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット、２００７年３月１日公開）。細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的へガイドするのにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に相補的な領域と、ＣａｓエンドヌクレアーゼにＤＮＡ標的を切断させるＲＮＡ二本鎖を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を有する塩基対とを含む。
【０２００】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドヌクレオチド」は、２つのＲＮＡ分子、可変ターゲティングドメインを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成的融合に関連している。一態様において、ガイドヌクレオチドは、１２〜３０ヌクレオチド配列からなる可変ターゲティングドメインと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用し得るＲＮＡ断片とを含む。
【０２０１】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関連している。このガイドポリヌクレオチドは一本鎖分子であっても二本鎖分子であってもよい。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であってよい。任意選択で、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合又は連結修飾、例えば、以下に限定はされないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、又は環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結を含むことができる。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドもまた、「ガイドヌクレオチド」と称される。
【０２０２】
ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン又はＣＥＲドメインと呼ばれる）とを含む二本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってよい。この二本鎖分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の個別の分子を含む。この２個の個別の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であってよい。一態様では、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、「ｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、「ｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌及び古細菌中で天然に存在するｃＲＮＡの断片を含む可能性がある。一態様では、本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中及び古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又はそれ以上のヌクレオチドから変動することができるがこれらに限定されない。
【０２０３】
一態様においては、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、「ｔｒａｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。一態様では、ＲＮＡ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
【０２０４】
ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン又はＣＥＲドメインと呼ばれる）とを含む一本鎖分子であってもよい。「ドメイン」は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続区間を意味する。一本鎖ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメイン及び／又はＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に連結されているｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む）を含み、この連結は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチド由来の配列及びｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、「一本鎖ガイドヌクレオチド」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、「一本鎖ガイドＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「一本鎖ガイドヌクレオチド−ＤＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称することができる。本開示の一態様においては、一本鎖ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡ又はｃＲＮＡ断片、及びｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。二本鎖ガイドポリヌクレオチドと対比して一本鎖ガイドポリヌクレオチドを使用する一態様は、一本鎖ガイドポリヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０２０５】
用語「可変ターゲティングドメイン」又は「ＶＴドメイン」は本明細書においては互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性％は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであり得る。一態様では、可変ターゲティングドメインは１２〜３０ヌクレオチドからなる連続ストレッチを含む。可変ターゲティングドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【０２０６】
ガイドポリヌクレオチドの用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」又は「ＣＥＲドメイン」は本明細書においては互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、本明細書に記載する改変を参照されたい）、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【０２０７】
一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。一態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００個のヌクレオチドであり得る。別の態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、以下に限定はされないがＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含み得る。
【０２０８】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメイン及び／又はＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変は、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変又は配列、トラッキングが生じる改変又は配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変又は配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるが、これらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらすことができ、この追加の有利な特徴は、安定性の変更又は調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用又はタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更、及び細胞透過性の増大の群から選択される。
【０２０９】
一態様では、ガイドヌクレオチドとＣａｓエンドヌクレアーゼとは、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位で二本鎖切断を導入するのを可能にする複合体を形成することができる。
【０２１０】
本開示の一態様では、可変標的ドメインの長さは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドである。
【０２１１】
本開示の一態様では、ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡ（又はｃＲＮＡ断片）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（又はｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。ガイドヌクレオチドは、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、以下に限定はされないが、粒子衝撃法又は局所的適用法により植物体又は植物細胞に直接導入することができる。
【０２１２】
一態様では、ガイドヌクレオチドは、植物細胞中でガイドヌクレオチドを転写することができる、植物特異的プロモーターに作動可能に連結した、対応するガイドＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡ分子を導入することによって、間接的に導入することができる。用語「対応するガイドＤＮＡ」には、ＲＮＡ分子の各「Ｕ」が「Ｔ」に置き替えられている以外はＲＮＡ分子と同じＤＮＡ分子が含まれる。
【０２１３】
一態様では、ガイドヌクレオチドは、粒子衝撃法により、又は、植物Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結した、対応するガイドＤＮＡを含む組み換えＤＮＡコンストラクトをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により形質転換するための本開示の方法によって導入される。
【０２１４】
一態様では、ＲＮＡ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡに対してガイドヌクレオチドを使用する利点の１つは、融合ガイドヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０２１５】
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」及び「ゲノム標的遺伝子座」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって植物細胞ゲノムで二本鎖切断が誘発される、植物細胞ゲノム中のポリヌクレオチド配列（葉緑体ＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡを含む）を指す。標的部位は植物ゲノム中の内因性部位であり得、或いは、標的部位は植物体に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していない、或いは標的部位は天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。
【０２１６】
本明細書で使用する場合、用語「内因性標的配列」及び「天然標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物ゲノムに対して内因性又は天然性であり、且つ植物ゲノム中の標的配列の内因性又は天然の位置に存在する標的配列を指す。一態様では、標的部位は、ＬＩＧ３−４エンドヌクレアーゼ（米国特許出願公開第２００９／０１３３１５２号明細書）又はＭＳ２６＋＋メガヌクレアーゼ（米国特許出願公開第２０１４／００２０１３１号明細書）などの二本鎖切断誘発物質によって特異的に認識され且つ／又は結合されるＤＮＡ認識部位又は標的部位に類似する部位であり得る。
【０２１７】
「人工標的部位」又は「人工標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物のゲノム中に導入された標的配列を指す。そのような人工標的配列は、植物ゲノム中の内因性標的配列又は天然標的配列と配列が同じであるが、植物ゲノム中の異なる場所（すなわち、非内因性又は非天然の場所）に存在し得る。
【０２１８】
「改変標的部位」、「改変標的配列」、「変更標的部位」及び「変更標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、非改変標的配列と比較した場合に、少なくとも１つの改変を含む本明細書に開示の標的部位を指す。そのような「改変」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
【０２１９】
一態様では、本開示の方法は、植物における標的遺伝子の遺伝子抑制に有用なポリヌクレオチドを植物に導入するために使用され得る。植物における遺伝子操作のいくつかの態様では、特定の遺伝子の活性低下（遺伝子サイレンシング又は遺伝子抑制としても知られる）が望まれる。多くの遺伝子サイレンシング技術が当業者に知られており、例えば、以下に限定はされないが、アンチセンス技術（例えば、Ｓｈｅｅｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８８０５−８８０９、並びに米国特許第５，１０７，０６５号明細書、同第５，４５３，５６６号明細書及び同第５，７５９，８２９号明細書を参照）；コサプレッション（例えば、Ｔａｙｌｏｒ（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：１２４５、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．８（１２）：３４０−３４４、Ｆｌａｖｅｌｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３４９０−３４９６、Ｆｉｎｎｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８、及びＮｅｕｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：２３０−２４１）；ＲＮＡ干渉（Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９、米国特許第５，０３４，３２３号明細書、Ｓｈａｒｐ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１３９−１４１、Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３、Ｊａｖｉｅｒ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：２５７−２６３、及びＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１５５０２−１５５０７）；ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：６９１−７０５、及びＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．２：１０９−１１３）；標的ＲＮＡ特異的リボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１）；ヘアピン構造（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３１９−３２０、国際公開第９９／５３０５０号パンフレット、同第０２／００９０４号パンフレット及び同第９８／５３０８３号パンフレット）；リボザイム（Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１５２５、米国特許第４，９８７，０７１号明細書、及びＰｅｒｒｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：２５３）；オリゴヌクレオチド媒介標的改変（例えば、国際公開第０３／０７６５７４号パンフレット及び同第９９／２５８５３号パンフレット）；Ｚｎフィンガー標的分子（例えば、国際公開第０１／５２６２０号パンフレット、同第０３／０４８３４５号パンフレット及び同第００／４２２１９号パンフレット）；人工マイクロＲＮＡ（米国特許第８１０６１８０号明細書、Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８：１１２１−１１３３）；及び当業者に知られる他の方法又は上記方法の組み合わせが挙げられる。
【０２２０】
一態様では、本開示の方法は、植物へのヌクレオチド配列の標的組み込みに有用なポリヌクレオチドを植物に導入するために使用され得る。例えば、本開示の方法は、標的部位を含む植物体を形質転換するために使用される、非同一組み換え部位が隣接する目的ヌクレオチド配列を含むＴ−ＤＮＡ発現カセットを導入するのに使用することができる。一態様では、標的部位は、Ｔ−ＤＮＡ発現カセット上のそれに対応する、非同一組み換え部位を少なくとも１セット含む。組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列の置換は、リコンビナーゼの影響を受ける。このように、本開示の方法は、ヌクレオチド配列の標的組み込みのためのＴ−ＤＮＡ発現カセットの導入に使用することができ、非同一組み換え部位が隣接するＴ−ＤＮＡ発現カセットは、非同一組み換え部位を認識し、非同一組み換え部位で組み換えを行うリコンビナーゼにより認識される。したがって、本開示の方法及び組成物は、非同一組み換え部位を含有する植物の成長の効率及び速度の改善に使用することができる。
【０２２１】
このように、本開示の方法は、外因性ヌクレオチドの形質転換植物への、方向性を有する標的組み込みを行うための方法をさらに含むことができる。一態様では、本開示の方法は、所望の遺伝子及びヌクレオチド配列の、以前に標的植物ゲノムに導入した対応する組み換え部位への、方向性を有するターゲティングを促進する遺伝子ターゲティングシステムにおいて、新規の組み換え部位を使用する。
【０２２２】
一態様では、２つの非同一組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列が、目的ヌクレオチド配列の挿入のために標的部位が設けられた、標的生物のゲノム由来の外植片の１つ以上の細胞に導入される。安定な植物体又は培養組織が確立されたなら、標的部位に隣接している組み換え部位に対応する部位が隣接した第２のコンストラクト、すなわち目的ヌクレオチド配列が、リコンビナーゼタンパク質の存在下に、安定に形質転換された植物体又は組織に導入される。このプロセスで、標的部位の非同一組み換え部位とＴ−ＤＮＡ発現カセットの間でヌクレオチド配列の置換が起こる。
【０２２３】
この方法で調製された形質転換植物体は、複数の標的部位、すなわち、非同一組み換え部位のセットを含み得ることがわかった。この方法では、形質転換植物体の標的部位に対して複数の操作を行うことができる。形質転換植物体の標的部位とは、形質転換植物体のゲノムに挿入された、非同一組み換え部位を含むＤＮＡ配列を意味する。
【０２２４】
本開示の方法で使用する組み換え部位の例は当該技術分野で知られており、例えば、ＦＲＴ部位（例えば、Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−１２７５１、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：４４３−４４８、Ｐａｕｌ  Ｄ．Ｓａｄｏｗｓｋｉ（１９９５）Ｉｎ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．５１，ｐｐ．５３−９１、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｍ．Ｃｏｘ（１９８９）  Ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ，Ｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｏｗｅ（ｅｄｓ）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．１１６−６７０、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）１８：４４９−４５８、Ｕｍｌａｕｆ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（１９８８）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：１８４５−１８５２、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：３１１８−３１１９、Ｋｉｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ９：４１３−４２１、Ｒｏｓｓａｎｔ  ａｎｄ  Ｇｅａｇｙ（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  １：５９２−５９４、Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：６４９−６５９、Ｂａｙｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３５３−３６１、Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：３６９−３７８、及びＤａｌｅ  ａｎｄ  Ｏｗ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８８：１０５５８−１０５６２０（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）；Ｌｏｘ（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：６４９−６５９、Ｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１７０６−１７１０、Ｓｔｕｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：９０１−９１３、Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｖｅｔ．２２３：３６９−３７８、Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：７９−８５；及びＢａｙｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３５３−３６１）が挙げられる。大部分の天然に存在するサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株に見出される２ミクロンのプラスミドは、２つの反転反復配列間のＤＮＡの反転を促進する、部位特異的リコンビナーゼをコードする。この反転はプラスミドのコピー数増幅に中心的な役割を果たす。
【０２２５】
タンパク質、指定されたＦＬＰタンパク質は、部位特異的組み換えイベントを触媒する。最小の組み換え部位（ＦＲＴ）が定義されており、非対称８ｂｐスペーサーを挟んだ、２つの反転１３塩基対（ｂｐ）の反復配列を含有する。ＦＬＰタンパク質は、反復配列とスペーサーとの接合部で部位を切断し、３’末端リン酸エステルにより共有結合でＤＮＡに結合する。ＦＬＰのような部位特異的リコンビナーゼは、特定の標的配列でＤＮＡを切断し、再ライゲーションして、２つの同一部位間で正確に定義された組み換えをもたらす。機能させるには、システムは組み換え部位とリコンビナーゼを必要とする。補助的因子は必要でない。このようにして、システム全体を植物細胞に挿入し、機能させることができる。酵母のＦＬＰ＼ＦＲＴ部位特異的組み換えシステムが植物で機能することが示されている。今日では、このシステムは不要なＤＮＡの切除に利用されている。Ｌｙｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｔ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２１：９６９−９７５を参照されたい。対照的に、本開示は、植物ゲノムにおけるヌクレオチド配列の置換、ターゲティング、配置、挿入及び発現の制御に、非同一ＦＲＴを使用する。
【０２２６】
一態様では、ゲノムに組み込まれた標的部位を含有する、植物体の外植片などの目的の形質転換生物を必要とする。標的部位は、非同一組み換え部位が隣接するという特徴を有する。形質転換生物の標的部位に含まれる部位に対応する非同一組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列を含むターゲティングカセットがさらに要求される。非同一組み換え部位を認識し、部位特異的組み換えを触媒するリコンビナーゼが要求される。
【０２２７】
リコンビナーゼは当該技術分野で知られている任意の手段で提供され得ることがわかった。すなわち、それは、生物中でリコンビナーゼを発現することができる発現カセットで生物を形質転換することにより、一過性発現により、又はリコンビナーゼ若しくはリコンビナーゼタンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を提供することにより、生物又は植物細胞中に提供され得る。
【０２２８】
「非同一組み換え部位」とは、隣接する組み換え部位の配列が同一でなく、組み換えが生じないか、又は部位間の組み換えが最少になるであろうことを意味する。すなわち、１つの隣接する組み換え部位がＦＲＴ部位で、第２の組み換え部位が変異したＦＲＴ部位であり得る。本開示の方法で使用される非同一組み換え部位は、２つの隣接する組み換え部位間の組み換え、及びそこに含まれるヌクレオチド配列の切除を妨げるか、又は大きく抑制する。したがって、本開示においては、ＦＲＴ及び変異ＦＲＴ部位、ＦＲＴ及びｌｏｘ部位、ｌｏｘ及び変異ｌｏｘ部位、並びに当該技術分野で知られている他の組み換え部位を含む、任意の好適な非同一組み換え部位を使用し得ることが確認された。
【０２２９】
好適な非同一組み換え部位とは、活性なリコンビナーゼの存在下に、２つの非同一組み換え部位間の配列の削除がなされるとしても、植物ゲノムへのヌクレオチド配列の組み換えによる標的配置の置換よりもかなり低い効率で生じることを意味する。このように、本開示で使用される好適な非同一部位には、部位間の組み換え効率が低い部位、例えば、効率が約３０〜約５０％未満、好ましくは約１０〜約３０％未満、より好ましくは約５〜約１０％未満の部位が含まれる。
【０２３０】
上述のように、ターゲティングカセットの組み換え部位は、形質転換した植物体の標的サイトのそれに対応する。すなわち、形質転換植物体の標的部位が、ＦＲＴ及び変異ＦＲＴという隣接する非同一組み換え部位を含有するならば、ターゲティングカセットは同じＦＲＴ及び変異ＦＲＴの非同一組み換え部位を含有するであろう。
【０２３１】
さらに、本開示の方法で使用するリコンビナーゼは、形質転換植物体及びターゲティングカセットの標的部位の組み換え部位により変わってくることが確認されたすなわち、ＦＲＴ部位が使用されるのであれば、ＦＬＰリコンビナーゼが必要になるであろう。同様に、ｌｏｘ部位が使用されるのであれば、Ｃｒｅリコンビナーゼが必要になる。非同一組み換え部位がＦＲＴ及びｌｏｘ部位の両者を含むのであれば、植物細胞中にＦＬＰ及びＣｒｅの両リコンビナーゼが必要となろう。
【０２３２】
ＦＬＰリコンビナーゼは、ＤＮＡ複製時に、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２ミクロンプラスミドのコピー数の増幅に関与する、部位特異的反応を触媒するタンパク質である。ＦＬＰタンパク質はクローン化され、発現されてきた。例えば、Ｃｏｘ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：４２２３−４２２７を参照されたい。本開示で使用するＦＬＰリコンビナーゼはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から得ることができる。目的の植物体での最適な発現のために、植物体に望ましいコドンを使用してリコンビナーゼを合成することが好ましいであろう。例えば、１９９７年１１月１８日出願の、発明の名称が「Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＦＬＰ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ」である米国特許出願第０８／９７２，２５８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２３３】
バクテリオファージリコンビナーゼＣｒｅは、２つのｌｏｘ部位間の部位特異的組み換えを触媒する。Ｃｒｅリコンビナーゼは当該技術分野で知られている。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：４０−４６、Ａｂｒｅｍｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９−１５１４、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４７７−４８８、及びＳｈａｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５６９５−５７０２）を参照されたい。これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。このようなＣｒｅ配列はまた、植物体に望ましいコドンを使用して合成することができる。
【０２３４】
適切な場合には、植物ゲノムに挿入すべきヌクレオチド配列は、形質転換植物における発現を増加させるために最適化することができる。本開示において哺乳動物、酵母又は細菌の遺伝子が使用される場合、発現改善のために、植物体に望ましいコドンを使用してそれらを合成することができる。単子葉植物における発現では、単子葉植物に望ましいコドンを使用して双子葉植物の遺伝子も合成できると認められる。植物優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書、同第５，４３６，３９１号明細書、及びＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物に望ましいコドンは、目的植物で発現するタンパク質において、より頻繁に使用されるコドンから決定され得る。特定の植物種にとってその植物に望ましい配列と同様に、単子葉植物又は双子葉植物に望ましい配列を構築し得ることがわかった。例えば、欧州特許出願公開第Ａ−０３５９４７２号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０３８５９６２号明細書、国際公開第９１／１６４３２号パンフレット、Ｐｅｒｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８８：３３２４−３３２８、及びＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：４７７−４９８．米国特許第５，３８０，８３１号明細書、米国特許第５，４３６，３９１号明細書など（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、遺伝子配列の全て又は任意の部分が最適化又は合成されてもよいことがわかった。すなわち、完全に最適化された配列であっても部分的に最適化された配列であっても使用することができる。
【０２３５】
配列のさらなる改変が、細胞宿主中での遺伝子発現を促進することが知られており、本開示で使用することができる。このような改変には、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン−イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様リピートをコードする配列、及び遺伝子の発現に有害であり得る他のそのようなよく特徴付けられた配列の除去が含まれる。配列のＧ−Ｃ含量を、宿主細胞において発現した既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均レベルに調節することができる。可能であれば、配列を、予想されるヘアピン二次ＲＮＡ構造を避けるように改変する。
【０２３６】
本開示はまた、新規なＦＬＰ組み換え標的部位（ＦＲＴ）を包含する。ＦＲＴは、次のような、８塩基スペーサーで分けられた、２つの１３塩基対からなる反復配列を含む最小配列として特定されている：５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ［ＴＣＴＡＧＡＡＡ］ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ３’（ここで、カッコ内のヌクレオチドはスペーサー領域を示す）。２つの１３塩基反復配列が８ヌクレオチドで分離されている限り、スペーサー領域のヌクレオチドは、ヌクレオチドの組み合わせで置換することができる。スペーサーの実際のヌクレオチド配列は重要ではないが、しかしながら、本開示の実施のためには、スペース領域のヌクレオチドのいくつかの置換は、他の領域の置換より良く機能し得る。８塩基対のスペーサーは、鎖置換時のＤＮＡ−ＤＮＡの対合に関与する。この領域の非対称性は、組み換えイベントの部位アライメントの方向を決定し、これは、その後、逆方向になるか、又は切除されるかに繋がる。上述のように、スペーサーの大部分は機能を失わずに変異することができる。例えば、Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−１２７５１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２３７】
新規のＦＲＴ変異体部位は、本開示の方法の実施で使用することができる。そのような変異体部位はＰＣＲをベースとした変異誘発により構築することができる。変異ＦＲＴ部位は知られている（国際公開第１９９９／０２５８２１号パンフレットの配列番号２、３、４、及び５を参照）が、本開示の実施に別の変異ＦＲＴ部位を使用できることがわかった。本開示では、特定のＦＲＴ又は組み換え部位の使用ではなくむしろ、非同一組み換え部位又はＦＲＴ部位が、植物ゲノム中のヌクレオチド配列のターゲティング挿入及び発現に使用され得る。したがって、本開示に基づいて、他の変異ＦＲＴ部位が構築され、使用され得る。
【０２３８】
上で論じたように、リコンビナーゼの存在下に、非同一組み換え部位を有する標的部位を含むゲノムＤＮＡを、対応する非同一組み換え部位を有するＴ−ＤＮＡ発現カセットを含むベクターと一緒にすると、組み換えが起こる。隣接する組み換え部位の間に位置するＴ−ＤＮＡ発現カセットのヌクレオチド配列は、隣接する組み換え部位の間に位置する標的部位のヌクレオチド配列と置換される。このようにして、目的ヌクレオチド配列を、宿主のゲノムに正確に組み込むことができる。
【０２３９】
本開示の多くの変形を実施できることが確認された。例えば、複数の非同一組み換え部位を有する標的部位を構築することができる。このように、複数の遺伝子又はヌクレオチド配列を、植物ゲノムの正確な位置に積み重ねるか、又はオーダーすることができる。同様に、ゲノム内に標的部位が確立されたならば、Ｔ−ＤＮＡ発現カセットのヌクレオチド配列内に追加の組み換え部位を組み込み、その部位を標的配列に移入することにより、追加の組み換え部位を導入することができる。このように、標的部位が確立されたならば、その後、組み換えにより部位を追加したり、部位を変更したりすることが可能である。
【０２４０】
別の変形として、生物の標的部位に作動可能に連結したプロモーター又は転写開始領域を提供することが挙げられる。プロモーターは最初の組み換え部位の５’端側にあることが好ましい。コード領域を含むＴ−ＤＮＡ発現カセットで生物を形質転換することにより、コード領域の発現は、Ｔ−ＤＮＡ発現カセットが標的部位に組み込まれたときに起こるであろう。この態様は、コード配列として選択マーカー配列を提供することにより、形質転換された細胞、特に植物細胞を選択する方法を提供する。
【０２４１】
本システムの別の利点として、上で論じたＴ−ＤＮＡ発現カセットを使用することによる、導入遺伝子又は導入ＤＮＡを生物に組み込むことの複雑さを軽減する能力、及び単純な組み込みパターンによる生物の選択が挙げられる。同様に、数種の形質転換イベントを比較することにより、ゲノム内の好ましい部位を特定することができる。ゲノム内の好ましい部位としては、必須配列の発現を妨害せず、且つ導入遺伝子配列を十分に発現させるものが挙げられる。
【０２４２】
本開示の方法はまた、ゲノム内の１ヵ所に複数の発現カセットを結合させる手段を提供する。ゲノム内の標的部位で、組み換え部位を追加又は切除することができる。
【０２４３】
本開示においては、本システムの３つの成分を一緒にする、当該技術分野で知られた手段を使用することができる。例えば、植物を安定に形質転換し、そのゲノム内に標的部位を宿させることができる。リコンビナーゼを一時的に発現させるか、又は提供することができる。或いは、リコンビナーゼを発現することができるヌクレオチド配列を植物のゲノムに安定的に組み込むことができる。対応する非同一組み換え部位が隣接するＴ−ＤＮＡ発現カセットは、対応する標的部位とリコンビナーゼの存在下に、形質転換植物のゲノムに挿入される。
【０２４４】
或いは、形質転換植物を有性交雑させることにより、本システムの成分を一緒にすることができる。この態様では、ゲノムに組み込まれた標的部位を含有する形質転換植物、すなわち第１の親は、第２の植物、すなわち第１の親に対応する隣接する非同一組み換え部位を含有するＴ−ＤＮＡ発現カセットで遺伝的に形質転換されている第２の親と有性交雑することができる。第１の植物又は第２の植物は、そのゲノム内にリコンビナーゼを発現するヌクレオチド配列を含有する。リコンビナーゼを構成的又は誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。このようにして、リコンビナーゼの発現及びその後の組み換え部位の活性を制御することができる。
【０２４５】
本開示の方法は、導入されるヌクレオチド配列を特定の染色体部位へ組み込むターゲティングに有用である。ヌクレオチド配列は任意の目的ヌクレオチド配列をコードすることができる。目的とする特定の遺伝子としては、宿主細胞及び／又は生物に容易に分析可能な機能的特徴を提供するもの、例えば、マーカー遺伝子や、受容細胞の表現型を変える他の遺伝子などが挙げられる。このように、本開示では、植物の成長、高さ、病気に対する感受性、昆虫、栄養価などに影響する遺伝子を使用することができる。ヌクレオチド配列はまた、遺伝子の発現を停止又は改変させる「アンチセンス」配列をコードすることができる。
【０２４６】
ヌクレオチド配列は、機能性発現ユニット又はＴ−ＤＮＡ発現カセットで使用できることが確認された。機能性発現ユニット又はＴ−ＤＮＡ発現カセットとは、機能性プロモーター及び殆どの場合に終止領域を有する目的ヌクレオチド配列を意味する。本開示の実施の中で機能性発現ユニットを実現させるには各種の方法がある。本開示の一態様では、目的核酸は機能性発現ユニットとしてゲノムに導入又は挿入される。
【０２４７】
或いは、ヌクレオチド配列はゲノム内のプロモーター領域の３’端側の部位へ挿入することができる。この後者の場合、プロモーター領域の３’端側へのコード配列の挿入が、組み込み時に機能性発現ユニットを実現させるものである。Ｔ−ＤＮＡ発現カセットは、目的ペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した転写開始領域、又はプロモーターを含むであろう。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下とする、目的遺伝子又は遺伝子群を挿入するための複数の制限部位を備えている。
【実施例】
【０２４８】
実施例１：プラスミド
実施例において参照される表示成分を含むプラスミドの説明は表７を参照されたい。プラスミド番号の後に「＋」が続くものは、表示成分を含むＴ−ＤＮＡとＴ−ＤＮＡ左境界配列（ＬＢ）を越えて位置する追加の表示成分とを含む。当業者の範囲内であるように、追加の成分は代替としてＴ−ＤＮＡ右境界配列（ＲＢ）を越えて位置してもよい。
【０２４９】
【表７−１】
2021517812.tif 000015
【０２５０】
【表７−２】
2021517812.tif 000016
【０２５１】
【表７−３】
2021517812.tif 000017
【０２５２】
実施例２：培養培地
実施例において参照される形質転換用、選択用及び再生用の培地構成の説明は表８、９及び１０を参照されたい。
【０２５３】
【表８−１】
2021517812.tif 000018
【０２５４】
【表８−２】
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【０２５５】
【表８−３】
2021517812.tif 000020
【０２５６】
【表９】
2021517812.tif 000021
【０２５７】
ダイズの形質転換、組織培養、及び再生に使用される種々の培地組成を表１０に概説する。この表において、培地Ｍ１は、これが形質転換のための出発物質である場合、懸濁培養の開始のために使用される。培地Ｍ２及びＭ３は、上に列挙した外植片の全範囲のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換に有用な代表的な共培養培地を示す。培地Ｍ４は選択に有用であり（適切な選択剤と共に）、Ｍ５は体細胞胚成熟に使用され、培地Ｍ６は発芽に使用されてＴ０小植物体を作出する。
【０２５８】
【表１０−１】
2021517812.tif 000022
【０２５９】
【表１０−２】
2021517812.tif 000023
【０２６０】
実施例３：粒子衝撃法
染色体１に予め組み込まれた、ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＦＲＴ１：ＮＰＴＩＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＦＲＴ８７からなる部位特異的組込標的部位（Ｃｈｒｏｍ−１標的部位）を含むＰｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１８４Ｃ（米国特許第８４４５７６３号明細書に開示）を使用する。衝撃の前、１０〜１２ＤＡＰ（授粉後の日数）にＰｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１８４Ｃの雌穂から未熟胚を分離し、１６％スクロースを加えた６０５Ｊ培養培地上に３時間置き、胚盤細胞を原形質分離する。
【０２６１】
各粒子衝撃では、通常、以下の４種のプラスミドを使用する：
１）リコンビナーゼ媒介カセット交換のためのＦＲＴ隣接ドナーカセットを含有するドナープラスミド（１００ｎｇ／μｌ）、例えば、ＦＲＴ１：ＰＭＩ：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ１ＺＭ  ＰＲＯ：：ＤＳ−ＲＥＤ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＦＲＴ８７を含有するプラスミド（ＰＨＰ０００４）；
２）発現カセットＵＢＩ１ＺＭ  ＰＲＯ：：ＦＬＰｍ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭを含有するプラスミド（２．５ｎｇ／μｌ）（ＰＨＰ５０９６）；
３）発現カセットＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＦＭＶ  ＆  ＰＣＳＶ  ＥＮＨＡＮＣＥＲＳを含有するプラスミド（１０ｎｇ／μｌ）（ＰＨＰ８９０３０）；及び
４）発現カセットＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭを含有するプラスミド（５ｎｇ／ｕｌ）（ＰＨＰ８９１７９）。
【０２６２】
ＤＮＡを０．６μｍの金粒子に付着させるために、低結合性マイクロチューブ（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３９６４０Ｔ）内に各プラスミドを１０μｌ加え、４種のプラスミドを全量を４０μｌとして混合する。この懸濁液に、０．６μｍの金粒子５０μｌ（３０μｇ／μｌ）と１．０μｌのＴｒａｎｓｉｔ  ２０／２０（カタログ番号ＭＩＲ５４０４，Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ）を加え、懸濁液をロータリーシェーカー上に１０分間置く。１０，０００ＲＰＭ（約９４００×ｇ）で懸濁液を遠心分離し、上清は捨てる。金粒子を１２０μｌの１００％エタノールに再懸濁し、低出力で短時間の超音波処理を行い、ピペットで１０μｌを各キャリアディスク上に採る。次いで、キャリアディスクを風乾して、残存するエタノールを全て除去する。２００ＰＳＩラプチャーディスクを使用し、水銀柱２８インチでＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ＰＤＦ−１０００により粒子衝撃を実施する。粒子衝撃後、未熟胚を、１２．５ｇ／ｌのマンノース及び５ｇ／ｌのマルトースを含み、スクロースを含まないように改変した６０５Ｊ培地上で選択する。１０〜１２週にわたる選択を行った後、小植物体を再生し、ｑＰＣＲを用いて分析する。ＳＳＩ成分（ドナーＤＮＡ（ＰＨＰ０００４）＋ＵＢＩ）：：ＦＬＰ（ＰＨＰ５０９６））と共にＰＬＴＰ：：ＯＤＰ２（ＰＨＰ８９０３０）及びＰＬＴＰ：：ＷＵＳ２（ＰＨＰ８９１７９）を同時導入することによって、ドナー断片のＣｈｒｏｍ−１標的部位への高頻度の部位特異的組み込みが生じる（すなわち、衝撃を受けた未熟胚の数に対して４〜７％の割合で）と予想される。
【０２６３】
実施例４：トウモロコシのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換
Ａ．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）マスタープレートの調製
バイナリードナーベクターを宿すアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、−８０℃の凍結アリコートから固体１２Ｒ培地上にストリークし、２８℃の暗所で２〜３日間培養し、マスタープレートを作った。
【０２６４】
Ｂ．固体培地上でのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の培養。
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の単一コロニー又は複数のコロニーをマスタープレートから採取し、８１０Ｋ培地を含有する第２のプレートにストリークし、２８℃の暗所で終夜インキュベートした。
【０２６５】
フード中で、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地（７００Ａ；５ｍｌ）及び１００ｍＭの３’−５’−ジメトキシ−４’−ヒドロキシアセトフェノン（アセトシリンゴン；５μＬ）を１４ｍＬのコニカルチューブに加えた。白金耳約３杯の、第２のプレートからのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）をチューブに懸濁させ、その後、チューブをボルテックスして、均一な懸濁液とした。懸濁液（１ｍｌ）を分光光度計のチューブに移し、懸濁液の光学濃度（５５０ｎｍ）を約０．３５〜１．０の読みに調節した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の濃度は約０．５〜２．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬであった。２ｍＬのマイクロ遠心チューブのそれぞれが懸濁液１ｍＬを含有するように、最終のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を分取した。その後、できるだけ速やかに懸濁液を使用した。
【０２６６】
Ｃ．アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の液体培地での培養。
或いは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、液体培地での培養により形質転換用として調製することができる。感染の１日前に、３０ｍｌの５５７Ａ培地（１０．５ｇ／ｌのリン酸水素二カリウム、４．５ｇ／ｌのリン酸水素一カリウム無水物、１ｇ／ｌの硫酸アンモニウム、０．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム脱水物、１０ｇ／ｌのスクロース、１ｍＭの硫酸マグネシウム）、並びに３０μＬのスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）及び３０μＬのアセトシリンゴン（２０ｍｇ／ｍＬ）が入った１２５ｍｌのフラスコを準備した。白金耳に半量の、第２のプレートからのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）をフラスコに懸濁させ、２００ｒｐｍに設定したオービタルシェーカーにセットし、２８℃で終夜インキュベートした。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の培養物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、アセトシリンゴン溶液を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染培地（７００Ａ）を加えた。ボルテックスして細菌を再懸濁させ、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液の光学濃度（５５０ｎｍ）を約０．３５〜２．０の読みに調節した。
【０２６７】
Ｄ．トウモロコシの形質転換。
Ｔｗｅｅｎ２０を１滴加えた２０％（ｖ／ｖ）漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）中で、トウモロコシ（ズィー・メイス・Ｌ．（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．））の品種の穂表面を１５〜２０分間滅菌し、続いて滅菌水で３回洗浄した。未熟胚（ＩＥ）を雌穂から分離し、アセトシリンゴン溶液を含む２ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地（７００Ａ）に移した。胚の最適サイズは近交系により変化するが、ＷＵＳ２及びＯＤＰ２による形質転換では、幅広いサイズの未熟胚を使用することができるであろう。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地（８１０Ｋ）を抜き取り、１ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を胚に加え、チューブを５〜１０秒間ボルテックスした。マイクロチューブをフード内で５分間静置させた。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の懸濁液と胚を、７１０Ｉ（又は５６２Ｖ）共培養培地（表８を参照）に注いだ。滅菌したスパチュラで、チューブに残った胚をプレートに移した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を抜き取り、胚を軸側を下にして培地上に置いた。このプレートを２１℃の暗所で１〜３日の共培養の間インキュベートした。
【０２６８】
胚を、選択せずに静止培地（６０５Ｔ培地）に移した。３〜７日後、選択剤を補った成熟培地（２８９Ｑ培地）に胚を移した。
【０２６９】
実施例５：形質発現カセットＴ−ＤＮＡのみを含むトウモロコシトランスジェニックイベント回収のためのアグロバクテリウム混合物
以下の実験は、形質発現カセットを含むプラスミドと共にＷＵＳ２を含むプラスミドを送達すると、形質Ｔ−ＤＮＡのみを含み、ベクター（プラスミド）バックボーンを含まないトランスジェニックＴ０植物体の回収が改善されることを示した。
【０２７０】
トウモロコシＮｏｎ−Ｓｔｉｆｆ−Ｓｔａｌｋ近交系ＨＣ６９の未熟胚を、２つの「形質」（ＺＳ−ＧＲＥＥＮ及びＺＭ−ＨＲＡ）発現カセットを有するＴ−ＤＮＡであるＰＨＰ８６４９１（表７）を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−（米国特許第８，３３４，４２９号明細書を参照、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）（Ａｇｒｏ１）で形質転換した。このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ１）を単独で使用して（対照処理）未熟胚に感染させるか、又はＷＵＳ発現カセット（ＰＨＰ８７５９８、ＰＨＰ８８１５６、ＰＨＰ８８１５７又はＰＨＰ８８１５８、表７を参照）を含有する別のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ２）との混合物の一部として使用した。処理（Ｔｒｔ）１〜４では、２種のアグロバクテリウムを、９５％の形質含有ＰＨＰ８６４９１プラスミド（Ａｇｒｏ１）対５％のＷＵＳ含有プラスミド（Ａｇｒｏ２）（ＰＨＰ８７５９８、ＰＨＰ８８１５６、ＰＨＰ８８１５７又はＰＨＰ８８１５８、表７を参照）の比率で混合した。以下の表１１に示すように、形質転換に形質Ｔ−ＤＮＡ（ＰＨＰ８６４９１）プラスミドを含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ１）のみを用いた場合、Ｔ−ＤＮＡの単一コピーを有し、プラスミドバックボーンを持たないＴ０植物体（Ｔ−ＤＮＡ境界外の配列）を回収する頻度は低かった（Ｔｒｔ  Ｃ＝１．８％）。しかし、ＷＵＳ発現カセット（ＰＨＰ８７５９８、ＰＨＰ８８１５６、ＰＨＰ８８１５７、又はＰＨＰ８８１５８、表７を参照）を有するＴ−ＤＮＡを含有する第２のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ２）をＡｇｒｏ１と低力価で混合した場合、形質Ｔ−ＤＮＡ（ＰＨＰ８６４９１−ＺＳ−ＧＲＥＥＮ＋ＺＭ−ＨＲＡ）の単一コピーのみを含有し、ＷＵＳ含有Ｔ−ＤＮＡ（ＰＨＰ８７５９８、ＰＨＰ８８１５６、ＰＨＰ８８１５７、又はＰＨＰ８８１５８、表７を参照）組み込みもプラスミドバックボーンの組み込みもないトランスジェニックＴ０植物体の回収は、実質的に改善された頻度（表１１中、Ｔｒｔ１〜４で６．４％〜１６．２％）で観察された。Ａｇｒｏ２の中のＴ−ＤＮＡであるＰＨＰ８７５９８が、ＣＲＥ発現を駆動する熱ショックプロモーター、構成的に発現するアントシアニン発現カセット（ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＣＲＣ：：ＳＢ−ＧＫＡＦ  ＴＥＲＭ）、及び３つの発現カセットの全てに隣接するｌｏｘＰ部位に加えて、ＷＵＳ発現を駆動するＺＭ−ＰＬＴＰプロモーターの５’側に３つのウイルスエンハンサーエレメント（ＥＮＨ）を含むＴｒｔ１では、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーが組み込まれ、プラスミドバックボーンのない頻度は６．５％であった。いずれもＷＵＳを駆動する３×ＥＮＨ：ＰＬＴＰプロモーターを有するＷＵＳ発現カセット（ＰＬＴＰプロモーターＴＡＴＡボックスの近くに位置するトウモロコシ由来エンハンサーエレメント（ＥＭＥ）の有無にかかわらず（３連（ＰＨＰ８８１５６では３×ＥＭＥ）、単一コピーとして（ＰＨＰ８８１５７ではＥＭＥ）、ＥＭＥ非含有（ＰＨＰ８８１５８ではＥＭＥ−））、及び構成的に発現するアントシアニン発現カセットを含むＰＨＰ８８１５６、ＰＨＰ８８１５７及びＰＨＰ８８１５８では、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、プラスミドバックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は、６．４％（ＰＨＰ８８１５６）、１６．２％（ＰＨＰ８８１５７）及び１２．１％（ＰＨＰ８８１５８）であった。エスケープ（再生非トランスジェニックＴ０植物）は、Ａｇｒｏ２がＰＨＰ８８１５７を含有する場合には４％であり、Ａｇｒｏ２がＰＨＰ８８１５８を含有する場合には１％であった。３×ＥＮＨは、ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＣＲＣ：：ＳＢ−ＧＫＡＦ  ＴＥＲＭ発現カセットに影響し、ＥＮＨ及びＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＣＲＣ：：ＳＢ−ＧＫＡＦ  ＴＥＲＭ発現カセットを含むＴ−ＤＮＡが組み込まれた場合、胚は濃赤色となり、小植物体を作出できなかった。処理２〜４（表１１）は、低力価（形質Ｔ−ＤＮＡを含むＡｇｒｏ１に対して５％）でＷＵＳ発現カセットを含む第２のアグロバクテリウムを混合すると、ＷＵＳ発現カセットを除去する形質転換プロセスを必要とせずに、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、プラスミドバックボーンは含まないＴ０植物体の回収を増強する有効な代替法を提供することを示した。
【０２７１】
【表１１】
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【０２７２】
米国特許第８，９０７，１６０号明細書に開示され、その全体が参照により本明細書に組み込まれるトウモロコシＳｔｉｆｆ−Ｓｔａｌｋ近交系ＰＨ１Ｖ６９の未熟胚を、ＰＨＰ８６４９１（表７）を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−（Ａｇｒｏ１）で形質転換した。このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ１）を単独で使用して（対照処理）未熟胚に感染させるか、又はＷＵＳ発現カセット（ＰＨＰ８７５９８又はＰＨＰ８８１５６又はＰＨＰ８８１５７又はＰＨＰ８８１５７）を含有する別のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ２）との混合物（９５％のＡｇｒｏ１対５％のＡｇｒｏ２）の一部として使用した。
【０２７３】
対照処理（Ａｇｒｏ１単独）では、エスケープ（再生非トランスジェニックＴ０植物体）は回収されず、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、プラスミドバックボーンを含まないＴ０植物体も回収されなかった。対照的に、ＰＨＰ８７５９８（表７）を含有する第２のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ２）をＡｇｒｏ１と混合し、この混合物を形質転換に使用した場合、エスケープはなお回収されず、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、プラスミドバックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は１６．５％であった。Ａｇｒｏ２のＰＨＰ８７５９８をＰＨＰ８７０７８（表７）で置換した場合、再生されたＴ０植物体においてエスケープは観察されず、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、プラスミドバックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は７．１％であった。これらの頻度はＷＵＳ含有発現カセットを組み込まず、形態形成遺伝子発現カセット（例えば、３ｘＥＮＨ：ＰＬＴＰ：：ＷＵＳ２）を使用して、高品質のＴ０植物体（外来性配列が組み込まれていない形質の単一コピー（プラスミドバックボーンもＡｇｒｏ２由来のＴ−ＤＮＡ配列もない））を回収する本発明者らの能力における主要な改善を示した。
【０２７４】
トウモロコシＳｔｉｆｆ−Ｓｔａｌｋ近交系ＰＨ１Ｖ６９の未熟胚を、プラスミドＰＨＰ８６４９１（表７）を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−で形質転換した。このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ１）を、ＷＵＳ発現カセットを含有するプラスミドＰＨＰ８７５９８（表７）を含有する別のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ２）との混合物の一部として使用した。Ａｇｒｏ１：Ａｇｒｏ２の２つの異なる比率（５０：５０又は９０：１０）を試験した。形質転換に５０：５０混合物を使用した場合、得られたＴ０植物体においてエスケープは観察されず、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、プラスミドバックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は８．２％であった。形質転換に９０：１０混合物を使用した場合、得られたＴ０植物体においてエスケープは観察されず、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、プラスミドバックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は２６％であった。この結果は、形質転換混合物中のＡｇｒｏ１とＡｇｒｏ２の相対濃度が、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、プラスミドバックボーンを含まないＴ０植物体の頻度に影響を及ぼすことを示した。
【０２７５】
４つの異なる熱帯トウモロコシ近交系から未熟胚を得、ＰＨＰ８１５６１（ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ＋ＮＰＴＩＩ）又はＰＨＰ８６４９１（ＺＳ−ＧＲＥＥＮ及びＺＭ−ＨＲＡ）を用いた２つの「形質」発現カセットのうちの一方で形質転換した。ＰＨ２ＫＤ１、ＰＨ４４ＭＨ、ＰＨ４ＢＡＨ、及びＰＨ２８ＳＶの４つの近交系の全てで、Ｇ−４１８選択又はイマザピル選択（それぞれＮＰＴＩＩ又はＨＲＡ遺伝子で）による形質転換率は、実質的に０％であった。しかしながら、（ＰＨＰ８８１５８、表７を参照）を含有する第２のアグロバクテリウムを、形質含有Ａｇｒｏ１（ＰＨＰ８１５６１を含有、表７を参照）に対して１０％の力価で添加し、Ｇ−４１８選択を体細胞胚成熟及び発芽を通して使用した場合、回収された、Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、ベクター（プラスミド）バックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は、出発胚の数に対して、ＰＨ２ＫＤ１で３０％、ＰＨ４４ＭＨで３８％、ＰＨ４ＢＡＨで４３％、及びＰＨ２８ＳＶで３．２％であった。ＰＨＰ８８１５８を含む第２のアグロバクテリウムをＺＳ−ＧＲＥＥＮ及びＺＭ−ＨＲＡ含有Ａｇｒｏ１（ＰＨＰ８６４９１を含む）に対して１０％の力価で添加し、０．１ｍｇ／ｌのイマザピル選択を体細胞胚成熟及び発芽を通して使用した場合、回収された、Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、ベクター（プラスミド）バックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は、出発胚の数に対して、ＰＨ２ＫＤ１で１５％、ＰＨ４４ＭＨで１８％、ＰＨ４ＢＡＨで９．６％、及びＰＨ２８ＳＶで０％であった。これらの結果は、Ａｇｒｏ２のＴ−ＤＮＡ内にＷＵＳ発現カセットを使用し、Ａｇｒｏ２を形質含有Ａｇｒｏ１（９０％）に対して１０％で混合することが、形質Ｔ−ＤＮＡを組み込む有効な方法をもたらし、Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含有し、ベクター（プラスミド）バックボーンを含有しないＴ０植物体が非常に高い頻度で回収されることを示した。
【０２７６】
実施例６：形質含有Ｔ−ＤＮＡ境界配列外のＷＵＳ発現カセットの、染色体ＤＮＡ中に組み込まれた、ＷＵＳ２発現カセットを含有しない単一コピーＴ０トウモロコシ植物体の形質転換及び選択を刺激するための使用
これらの実験のために、３つのプラスミドデザインからなるセットを試験した。３つのプラスミドはすべて同じＴ−ＤＮＡ（ＲＢ＋ＬＯＸＰ＋ＳＩ−ＵＢＩ３ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＢ）を含んだが、左境界配列を越えた位置のＷＵＳ２又はＷＵＳ２／ＯＤＰ２発現カセットは異なった。具体的には、ＰＨＰ８６２９５は、左境界配列のすぐ外側に２つの発現カセット、ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ（表７を参照）を含み、ＰＨＰ８６２９６は、左境界配列のすぐ外側に単一の発現カセット、ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭを含み、そしてＰＨＰ８６２９７は、左境界配列のすぐ外側に単一の発現カセット、ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２〜Ｔ２Ａ〜ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭを含んだ。Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｓｔｉｆｆ‐Ｓｔａｌｋ近交系ＰＨ１Ｖ６９について、これらのそれぞれのＴ‐ＤＮＡによるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、体細胞胚の成熟期間中の０．０５〜０．１ｍｇ／ｌのイマザピルによる選択、及び再生の後、Ｔ０植物体をｑＰＣＲにより分析した。ｑＰＣＲ分析に基づくと、ＰＨＰ８６２９５を用いた結果、回収されたＴ０植物の１０．２％がＴ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであり、組み込みＷＵＳ及び／又はＯＤＰ２はなく、プラスミドバックボーンの汚染もなかった。これらの値はＰＨＰ８６２９６及びＰＨＰ８６２９７ではそれぞれ１２．２％及び１２．３％であった。これらの結果は、ＷＵＳ２及び／又はＯＤＰ２発現カセットをＴ−ＤＮＡ左境界配列の外に配置することにより、これらの形態形成遺伝子発現カセットの同時組み込みを生じずに形質転換の必要な刺激が提供されることを示した。この結果はさらに、トウモロコシ形質転換を刺激するために、「境界配列を越えた」送達後に、ＷＵＳ及び／又はＯＤＰ２が一時的に発現され得ることを示した。対照的に、近交系ＨＣ６９では、これらの同じベクターを使用しても、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たない単一コピー形質Ｔ−ＤＮＡイベントの回収は増加せず、これは、この近交系が境界配列のリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｏｕｇｈ）の程度が高い多数コピー組み込みイベントを生じる傾向があるためと思われる。
【０２７７】
実施例７：Ｔ−ＤＮＡと形態形成遺伝子発現カセットの間の複数の左境界配列の使用は、単一コピー形質Ｔ−ＤＮＡ組み込みイベントの頻度を増加させる
トウモロコシ近交系は、多くの形態学的及び生理学的特性が多様である。この多様性の１つの現れは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染及び共培養の期間中のＴ−ＤＮＡ送達及び組み込みに対する未熟胚の胚盤の感受性の近交系間の違いである。例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−を用いてＰｉｏｎｅｅｒ近交系ＨＣ６９を形質転換すると、高頻度で回収されたトランスジェニックＴ０植物体はＴ−ＤＮＡの複数のコピーを含み、且つＴ−ＤＮＡ左境界配列（ＬＢ）でリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を受け、ベクター（プラスミド）バックボーンの組み込みが生じた。複数の左境界配列の導入により、この傾向は軽減されよう。一例として、ＰＨＰ８６２９６の形質含有Ｔ−ＤＮＡと隣接するＷＵＳ２発現カセットとの間に複数の左境界配列を導入し、以下の構成とする：ＲＢ＋ＬＯＸＰ＋ＳＩ−ＵＢＩ３  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＢ＋ＬＢ＋ＬＢ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ。上記の多重ＬＢ  Ｔ−ＤＮＡ及び隣接ＷＵＳ２発現カセットを含むＬＢＡ４４０４を用いてＨＣ６９を形質転換した場合、実質的により高頻度で回収されるＴ０植物体は、ＷＵＳ２発現カセットが組み込まれず、プラスミドバックボーンを持たないＴ−ＤＮＡの単一コピーであろうと予想される。  
【０２７８】
実施例８：左境界配列の変異誘発は、トランスジェニックイベントの回収頻度を増加させる
トウモロコシ近交系は、多くの形態学的及び生理学的特性が多様である。この多様性の１つの現れは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染及び共培養の期間中のＴ−ＤＮＡ送達及び組み込みに対する未熟胚の胚盤の感受性の近交系間の違いである。例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−を用いてＰｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ２８ＳＶを形質転換すると、胚盤のごく少数の細胞が、隣接するＷＵＳ２発現カセットなどのＬＢ隣接配列を受け取るため、迅速に新しい体細胞胚を形成するようには刺激されない。ＬＢ配列を選択的に変異誘発することによって、ＬＢの有効性を変化させて、より高い頻度のＬＢリードスルーを可能にすることができる。形質転換に用いた場合、より高い頻度で急速に体細胞胚を形成し、その結果、単一コピー形質遺伝子を含み、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たないＴ０植物体が作出されるであろうと予想される。
【０２７９】
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の共培養は、より感染しにくい種の場合、形態形成遺伝子の発現のための境界配列を越えた送達を実行不可能にする可能性がある。ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５のようなより攻撃的なアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株、又は病原性の非常に強いＴｉ−プラスミドｐＴｉＢｏ５４を有する株の使用は、この潜在的な欠点に対処するために使用できると予想される。加えて、より高いコピー数を有するバイナリーベクターの使用は細胞１個当たりＴ−ＤＮＡ分子の送達数を増加させるために使用することができ、結果として、境界配列リードスルー及びその後の形態形成遺伝子発現を増幅させることができる。
【０２８０】
実施例９：形質Ｔ−ＤＮＡのみを含有するキャノーラトランスジェニックイベント回収用プラスミド混合物
キャノーラ種子を表面滅菌し、半強度ＭＳ培地で発芽させて、無菌の１週齢の植物体を作出する。胚軸を１０ｍｌの２０Ａ培地（表９）に入れ、２ｍｍのセグメントに切断する。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−を２０Ａ培地に懸濁し、０．６  ＯＤ５５０に調整し、この懸濁液１０〜２００μｌを胚軸を含む各プレートに加える。
【０２８１】
胚軸セグメントを、２つの「形質」（ＳＰＣＮ及びＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ１  Ｎ１）発現カセットを有するＴ−ＤＮＡであるＰＨＰ８８１９３（表７）を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ（Ａｇｒｏ１）で形質転換する。このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ１）を単独で（対照処理）使用して胚軸セグメントに感染させる、又はＨＡ−ＷＵＳ発現カセットであるＰＨＰ９００９４（配列番号１１６）（表７）を含有する別のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ２）との混合物の一部として使用する。混合物は、９５％のＡｇｒｏ１及び５％のＡｇｒｏ２を含有する。２０Ａ培地（表９）中、低照度及び２１℃で、アグロバクテリウムと共培養した後、胚軸セグメントを選択培地に移す（７０Ａ培地（表９）で２週間から開始し、７０Ｂ培地（表９）でさらに２週間、次いで７０Ｃ培地（表９）で２週間）。継続的な発芽及び発根のために、小シュートを、半強度ＭＳ塩、１０ｇ／ｌのスクロース、０．５ｍｇ／ｌのＩＢＡ、及び５ｇ／ｌのＴＣ寒天からなる、ｐＨ  ５．７に調整された固体培地に移す。適切な根が形成されたなら、これらの小植物体を温室内の土壌に移す。
【０２８２】
Ａｇｒｏ１単独による対照処理では、スペクチノマイシンによるストリンジェントな選択のためにエスケープ（再生非トランスジェニックＴ０植物体）は回収されず、トランスジェニックＴ０植物体の回収頻度は低く（すなわち、＜１．５％）、アグロバクテリウム感染からＴ０小植物体の回収までの時間枠は通常３〜４カ月を要し、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、ベクター（プラスミド）バックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は低いであろうと予想される。対照的に、ＰＨＰ９００９４を含有する第２のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ２）をＡｇｒｏ１と混合し、この混合物を形質転換に使用した場合、ｉ）エスケープは回収されず、ｉｉ）トランスジェニックＴ０植物体の回収頻度は増加し、ｉｉｉ）アグロバクテリウム感染からＴ０植物体の回収までの時間枠は実質的に減少し、且つｉｖ）形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、ベクター（プラスミド）バックボーンを有さないＴ０植物体の頻度は実質的に増加すると予想される。
【０２８３】
実施例１０：ＷＵＳ２発現カセットを含まない単一コピーＴ０キャノーラ植物体の形質転換及び選択を刺激するための形質含有Ｔ−ＤＮＡ境界配列の外のＷＵＳ２発現カセットの使用
Ｔ−ＤＮＡの右境界配列及び左境界配列内に「形質」発現カセットを有し、左境界配列のすぐ外にＷＵＳ発現カセットを有する単一Ｔ−ＤＮＡを含む単一アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を用いて形質転換を行う。例えば、以下の構成を有する強化３５Ｓ  ＰＲＯ：：ＷＵＳ発現カセットを含むプラスミド（ＰＨＰ０００１、表７を参照）を使用することができる：ＲＢ＋ＡＴ−ＵＢＱ１０  ＰＲＯ：：ＣＴＰ：：ＳＰＣＮ：：ＵＢＱ１４  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＵＢＱ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ  Ｎ１：：ＮＯＳ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ＋ＦＭＶ  ＥＮＨ：ＰＳＣＶ  ＥＮＨ：ＭＭＶ  ＥＮＨ：ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ：：ＨＡ−ＷＵＳ：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ。
【０２８４】
Ｔ−ＤＮＡがＷＵＳ発現カセットを持たないＳＰＣＮ及びＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ  Ｎ１発現カセットを含む対照処理、ＰＨＰ８８１９３では、スペクチノマイシンによるストリンジェントな選択のためにエスケープ（再生非トランスジェニックＴ０植物体）は回収されず、トランスジェニックＴ０植物体の回収頻度は低く（すなわち、＜１．５％）、アグロバクテリウム感染からＴ０小植物体の回収までの時間枠は通常３〜４カ月を要し、形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、ベクター（プラスミド）バックボーンを含まないＴ０植物体の頻度は低いであろうと予想される。対照的に、上記の強化３５Ｓ  ＰＲＯ：：ＷＵＳ発現カセットを、Ｔ−ＤＮＡのＬＢのすぐ外側のプラスミドに加えた場合、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換後、ｉ）エスケープは回収されず、ｉｉ）トランスジェニックＴ０植物体の回収頻度は増加し、ｉｉｉ）アグロバクテリウム感染からＴ０植物体の回収までの時間枠は実質的に減少し、且つｉｖ）形質Ｔ−ＤＮＡの単一コピーのみを含み、ベクター（プラスミド）バックボーンは組み込まれていないＴ０植物体の頻度は実質的に増加すると予想される。
【０２８５】
実施例１１：左境界配列３’端に位置するＷＵＳ発現カセットは、Ｔ−ＤＮＡ内に成分を含むトランスジェニックダイズイベントの回収を改善する
この実験のために、ＰＶＳ１複製起点及び単一のＴ−ＤＮＡを含むバイナリーベクターを構築した。Ｔ−ＤＮＡの右境界配列及び左境界配列内に２つの発現カセットを有する対照ベクター（ＰＨＰ８０７２８）を構築した。第１の発現カセットは、ＴＡＧ−ＲＦＰの発現を駆動する大豆ＵＢＱプロモーターから構成され、その後にアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＵＢＱ３ターミネーターが続いた。第２の発現カセットは、ダイズ除草剤耐性ＡＬＳ遺伝子（ＨＲＡ）の発現を駆動する大豆ＳＡＭＳプロモーター及びダイズＡＬＳターミネーターから構成された。
【０２８６】
Ｔ−ＤＮＡ内に位置する同じ除草剤耐性ＡＬＳ遺伝子及び同じＴＡＧ−ＲＦＰ発現カセットを含有する第２のベクター（ＰＨＰ８１７１８）を構築し、さらに左境界配列を越えた位置に発現カセット：ＧＭ−ＥＦ１Ａ  ＰＲＯ：：ＡＴ−ＷＵＳ：：ＵＢＱ１４  ＴＥＲＭを含有させた。比較のために、これら２つのプラスミドをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１に導入した。
【０２８７】
対照Ｔ−ＤＮＡプラスミド（ＰＨＰ８０７２８）、又はＴ−ＤＮＡの左境界配列を越えた位置にＷＵＳを含むプラスミド（ＰＨＰ８１７１８）で、Ｐｉｏｎｅｅｒダイズ種９３Ｙ２１の未熟子葉を形質転換した後、子葉を２週間培養し、選択除草剤クロロスルホン１０μｇ／ｌを補充したＭ５成熟培地に移し、その後、Ｔ０小植物体を温室に送った。Ｔ０植物体の試料を採取し、ＡＬＳ、ＴＡＧ−ＲＦＰ及びＷＵＳ発現カセットの存在についてＰＣＲによりスクリーニングした。
【０２８８】
左境界配列外にＷＵＳを含むＴ−ＤＮＡプラスミド（ＰＨＰ８１７１８）は、体細胞胚形成の効率を大幅に改善し（図１を参照）、胚形成の効率を、ＴＡＧ−ＲＦＰ対照（ＰＨＰ８０７２８）における５％未満の中央値から、ＷＵＳ処理（ＰＨＰ８１７１８）の２５％超まで増加させた。これは、発芽してトランスジェニックＴ０植物体を形成することができるトランスジェニック成熟体細胞胚の頻度の増加に直接つながった。
【０２８９】
ＴＡＧ−ＲＦＰ対照ベクター（ＰＨＰ８０７２８）を用いた形質転換は、Ｔ０植物体を作出しなかった。これに対し、ＷＵＳ処理（ＰＨＰ８１７１８）は、いくらかのＴ０植物体を作出した。６つのＴ０植物体をｑＰＣＲによって分析し、４つのＴ０植物体は、ＡＬＳ及びＴＡＧ−ＲＦＰ発現カセットを含有する一方、組み込まれたＷＵＳはなく、プラスミドバックボーンの汚染もなかった。この結果は、ＷＵＳが、ゲノムに組み込まれることなく、体細胞胚形成を刺激するのに十分なレベルで、組み込まれたＴ−ＤＮＡと共に「境界配列を越えて」送達された後に一時的に発現されることを示した。これにより、ＷＵＳ発現カセットは一時的に発現するだけであって組み込まれることはないため、これを切除する必要はなく、ＷＵＳを使用して、トランスジェニックダイズイベント（形質ＡＬＳ及びＴＡＧ−ＲＦＰを保有する）を迅速に作出する効率的な方法が提供された。
【０２９０】
実施例１２：形質含有Ｔ−ＤＮＡ境界外での、ＷＵＳ２及びコムギ萎縮ウイルスＲｅｐＡの両発現カセットの、ＷＵＳ２発現カセットもＲｅｐＡ発現カセットも含有しない単一コピーＴ０トウモロコシ植物体の形質転換及び選択を刺激するための使用
これらの実験のために、２つのプラスミドを比較する。第１のプラスミドは、以下の成分を含むＴ−ＤＮＡを含み：ＲＢ＋ＬＯＸＰ＋ＳＩ−ＵＢＩ３  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＢ、その左境界配列のすぐ外に１つのさらなる発現カセットを有する：ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ（表７のＰＨＰ８６２９６を参照）。第２のプラスミドは、以下の成分を含むＴ−ＤＮＡを含み：ＲＢ＋ＬＯＸＰ＋ＳＩ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＢ、その左境界配列のすぐ外に次の２つのさらなる発現カセットを有する：ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＷＤＶ−ＲｅｐＡ：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ（表７のＰＨＰ０００２を参照）（ＷＤＶ−ＲｅｐＡはコムギ萎縮ウイルスＲｅｐＡであり、米国特許第６，２８４，９４７号明細書（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）を参照）。Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｓｔｉｆｆ‐Ｓｔａｌｋ近交系ＰＨ１Ｖ６９について、これらのそれぞれのＴ‐ＤＮＡによるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、体細胞胚の成熟期間中の０．０５〜０．１ｍｇ／ｌのイマザピルによる選択、及び再生の後、Ｔ０植物体をｑＰＣＲにより分析した。ＰＨＰ８６２９６を使用した場合、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであり、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たないＴ０植物体の（開始未熟胚数に対する）回収頻度は約１０％になると予想される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）においてＰＨＰ０００２を使用すると、形質転換率は対照（ＰＨＰ８６２９６）よりも高くなると予想され、トランスジェニック体細胞胚の成長は促進され、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであって、ＷＵＳ及びＲｅｐＡは組み込まれておらず、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たないＴ０植物体の回収頻度は、対照（ＰＨＰ８６２９６）処理に比べて増加すると予想される。ＷＵＳ２及びＲｅｐＡ発現カセットをＴ−ＤＮＡ左境界配列の外側に配置することにより、これらの形態形成遺伝子発現カセットを同時に組み込むことなく、形質転換の刺激を高めることができると予想される。
【０２９１】
或いは、ＬＢの外側に単一の発現カセットを含有する、ＲＢ＋ＳＩ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１ＴＥＲＭ＋ＬＢ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２〜Ｔ２Ａ〜ＷＤＶ−ＲｅｐＡ：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭを含むＴ−ＤＮＡ（ＰＨＰ０００５）は、同等に有効であり、対照よりも高い形質転換率を有し、トランスジェニック体細胞胚の成長が促進され、且つＴ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであって、ＷＵＳ及びＲｅｐＡは組み込まれておらず、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たないＴ０植物体の回収頻度は、対照処理に比べて増加すると予想される。
【０２９２】
実施例１３：形質含有Ｔ−ＤＮＡ境界配列の外側のＷＵＳ２発現カセット及びトウモロコシＰＩＣＫＬＥ（ＰＫＬ）転写物を標的とするａｍｉＲＮＡ発現カセットの両方の、ＷＵＳ２発現カセットもＲｅｐＡ発現カセットも含有しない単一コピーＴ０トウモロコシ植物体の形質転換及び選択を刺激するための使用
これらの実験のために、２つのプラスミドを比較する。第１のプラスミドＰＨＰ８６２９６は、以下の成分を含むＴ−ＤＮＡを含み：ＲＢ＋ＬＯＸＰ＋ＳＩ−ＵＢＩ３  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＢ、その左境界配列のすぐ外に１つのさらなる発現カセットを有する：ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ。
【０２９３】
第２のプラスミドは、左境界配列の外側に、１つのさらなる発現カセット、ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＰＫＬａｍｉＲＮＡ：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭを有する改変ＰＨＰ８６２９６を含む（表７のＰＨＰ０００３）。ＰＫＬａｍｉＲＮＡ成分は、分解を引き起こすＰＫＬ転写物を不安定化するトウモロコシＰＩＣＫＬＥ（ＰＫＬ）転写物中の短い配列を標的とする人工マイクロＲＮＡである。Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｓｔｉｆｆ‐Ｓｔａｌｋ近交系ＰＨ１Ｖ５Ｔについて、これらのそれぞれのＴ‐ＤＮＡによるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、体細胞胚の成熟期間中の０．０５〜０．１ｍｇ／ｌのイマザピルによる選択、及び再生の後、Ｔ０植物体をｑＰＣＲにより分析した。ＰＨＰ８６２９６を用いると、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子のための単一コピーであって、ＷＵＳ及びＰＫＬａｍｉＲＮＡは組み込まれておらず、プラスミドバックボーンを持たないＴ０植物体は、約１％の頻度（開始未熟胚数に対して）で回収されると予想される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）においてＰＨＰ０００３を使用すると、形質転換率はＰＨＰ８６２９６よりも高くなると予想され、トランスジェニック体細胞胚の成長は促進され、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであって、ＷＵＳ及びＲｅｐＡは組み込まれておらず、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たないＴ０植物体の回収頻度は、ＰＨＰ８６２９６処理に比べて増加すると予想される。
【０２９４】
これら２つのプラスミドを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いて、近交系ＰＨ１Ｖ５Ｔからのトウモロコシ葉組織を形質転換し、続いて体細胞胚成熟期間中に０．０５〜０．１ｍｇ／ｌのイマザピルで選択し、再生して、Ｔ０植物をｑＰＣＲにより分析する。ＰＨＰ８６２９６の使用により、トランスジェニックカルスが回収され、２〜３週間後には約１％の頻度（開始未熟胚数に対して）で体細胞胚が形成されると予想される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）においてＰＨＰ０００３を使用すると、形質転換率はＰＨＰ８６２９６よりも高くなり、体細胞胚は（カルス段階を経ずに）葉細胞から直接、急速に形成され、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであって、ＷＵＳ及びＰＫＬａｍｉＲＮＡは組み込まれておらず、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たないＴ０植物体の回収頻度は、ＰＨＰ８６２９６処理に比べて増加すると予想される。
【０２９５】
実施例１４：形質含有Ｔ−ＤＮＡ境界配列外側の構成的に発現するテトラサイクリンリプレッサー、及びＴ−ＤＮＡ内のｍｏＰＡＴ〜ＤｓＲＥＤの発現を駆動する抑制性プロモーターの、ＬＢのすぐ外にリプレッサー発現カセットを含有しない単一コピービアラホス耐性イベントの回収を促進するための使用
これらの実験のために、プラスミドＰＨＰ３８０４２（表７を参照）は、以下の成分を含むＴ−ＤＮＡを含む：ＲＢ＋ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ：３×ＴＥＴ−ＯＰ：ＡＤＨ１  ＩＮＴＲＯＮ１：：ＭＯ−ＰＡＴ〜ＤＳ−ＲＥＤ  ＥＸＰＲＥＳＳ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ＋ＵＢＩ１ＺＭ  ＰＲＯ：：ＴＥＴ  ＲＥＰＲＥＳＳＯＲ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ。
【０２９６】
Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｓｔｉｆｆ‐Ｓｔａｌｋ近交系ＰＨ１Ｖ５Ｔについて、このＴ‐ＤＮＡによるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、体細胞胚の成熟期間中の３．０ｍｇ／ｌのビアラホスによる選択、及び再生の後、Ｔ０植物体をｑＰＣＲにより分析する。ＰＨＰ３８０４２を用いると、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであって、ＴＥＴ  ＲＥＰＲＥＳＳＯＲは組み込まれておらず、プラスミドバックボーンを持たないＴ０植物体は、約３〜５％の頻度（開始未熟胚の数に対して）で回収され、ＴＥＴ  ＲＥＰＲＥＳＳＯＲが組み込まれていないＴ０植物は除草剤耐性であり、ＤＳ−ＲＥＤを発現すると予想される。
【０２９７】
実施例１５：ＷＵＳ２発現カセット、及び形質遺伝子含有Ｔ−ＤＮＡ境界配列外側の構成的に発現するｄＣＡＳ〜Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ（ＲＥＰ）融合発現カセットの両方の、ＷＵＳ２発現カセットもＲｅｐＡ発現カセットも含有しない単一コピーＴ０トウモロコシ植物体の形質転換及び選択を刺激するための使用
これらの実験のために、２つのプラスミドを比較する。第１のプラスミドは、以下の成分を含むＴ−ＤＮＡを含む：ＲＢ＋ＳＩ−ＵＢＩ３  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＢ（対照プラスミド）。第２のプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ内に同じ成分を含む（ＲＢ＋ＳＩ−ＵＢＩ３  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ）：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＢ）、加えて、その左境界配列のすぐ外に次の３つのさらなる発現カセットを含む：ｉ）ＺＭ−Ｕ６  ＰＲＯ：：ｇＲＮＡ：：ＺＭ−Ｕ６  ＴＥＲＭを含む発現カセット；ｉｉ）ＺＭ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ｄＣＡＳ９〜ＲＥＰ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ発現カセット；及びｉｉｉ）ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ発現カセット（試験プラスミド）。第１の発現カセット内のｇＲＮＡは、ｄＣＡＳ９〜ＲＥＰをＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ配列に標的化するように設計されており、この配列は、ＨＲＡ発現を転写的にサイレンシングし、細胞をイマザピルに感受性にする。
【０２９８】
パイオニアＳｔｉｆｆ−Ｓｔａｌｋ近交系ＨＣ６９について、対照プラスミドを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−でアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換後、体細胞胚成熟及び再生の間、Ｔ０植物をｑＰＣＲにより分析する。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）において対照プラスミドを使用した場合、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであり、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たないＴ０植物体の（開始未熟胚数に対する）回収頻度は約５％になると予想される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）において試験プラスミドを使用すると、形質転換率は対照よりも高くなり、トランスジェニック体細胞胚の成長は促進され、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子の単一コピーであって、ＷＵＳ及びｄＣＡＳ９〜ＲＥＰは組み込まれておらず、ベクター（プラスミド）バックボーンを持たないＴ０植物体の回収頻度は、対照処理に比べて増加すると予想される。ｄＣＡＳ９〜ＲＥＰ及びＷＵＳ２発現カセットをＴ−ＤＮＡ左境界配列の外側に配置することにより、これらの形態形成遺伝子発現カセットを同時に組み込むことなく、形質転換の刺激を高めることができると予想される。
【０２９９】
或いは、上記の例において、リプレッサードメインに融合した合成ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ｇＲＮＡ及びｄＣＡＳ９〜ＲＥＰに代えて使用することができる（Ｕｒｒｉｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ４：２３１）。
【０３００】
実施例１６：綿の形質転換
デリンティッドコットン（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））ｃｖ．コーカー３１０及び３１２の種子を、４０％（ｖ／ｖ；８０ｍｌの漂白剤及び１２０ｍｌの水）の市販の漂白剤及び１滴のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて３０分間表面滅菌し、２分間隔で３回、滅菌水ですすいだ。漂白剤処理後、種子を９５％エタノールで１分間すすぎ、再び滅菌水で３回すすいだ。次いで、種子を滅菌ペーパータオル上に置き、種子を拭った。
【０３０１】
１／２強度のＭＳ塩（２．２ｇ／Ｌ）、１／２強度のＢ５ビタミン、０．９ｇ／Ｌの塩化マグネシウム六水和物、１５ｇ／Ｌのグルコース、３．６ｇ／ＬのＰｈｙｔａｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）を含有し、ｐＨを５．８に調整した「綿種培地」（ＣＳＭ；（ＧＨ３２１０））中、２８℃で、ｐｈｙｔａｔｒａｙ１容器当たり５個の種子を用いて、２０個の表面滅菌種子を発芽させ、暗所で約７〜９日間インキュベートした。
【０３０２】
約３日後、種皮が裂け、根が出現した。滅菌鉗子を使用し、全ての種子の丸い先端（カラザ）を培地の表面で優しくつまんで、折り畳まれた子葉を露出させることによって種皮を除去し、幼根を培地に挿入した。ｐｈｙｔａｔｒａｙを再び２８℃でインキュベートして発芽を完了させた。８日後、はさみを用いて、胚軸及び子葉外植片を実生から切り取った。胚軸及び子葉外植片を滅菌ペトリ皿に入れ、メスブレードを用いて０．９ｃｍセグメント（胚軸）及び０．５平方ｃｍセグメント（子葉）に切断した。次いで、アグロバクテリウム処理の準備として、セグメントを、３５ｍｌの液体共培養培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのグルコース、０．９ｇ／Ｌの塩化マグネシウム六水和物、１．９ｇ／Ｌの硝酸カリウム、０．１ｇ／Ｌのミオイノシトール、ｐＨ５．８）が入った滅菌１００×２５ｍｍ（幅×深さ）ペトリ皿に入れた。
【０３０３】
この実験では、プラスミドＰＨＰ８９４８４は、以下の成分を有するＴ−ＤＮＡを含んだ：ＲＢ＋ＡＴ−ＵＢＱ１０  ＰＲＯ：：ＣＴＰ：：ＳＰＣＮ：：ＵＢＱ１４  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＵＢＱ  ＰＲＯ：：ＤＳ−ＲＥＤ２：：ＵＢＱ３ＴＥＲＭ＋ＬＢ＋ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ：：ＨＡ−ＷＵＳ：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＦＭＣ  ＥＮＨ：：ＰＣＳＶ  ＥＮＨ：：ＭＭＶ  ＥＮＨ。  ＷＵＳ発現カセットが存在しない対照プラスミド（ＰＨＰ８８１９３）は、以下の成分を有するＴ−ＤＮＡを含んだ：ＲＢ＋ＡＴ−ＵＢＱ１０  ＰＲＯ：：ＣＴＰ：：ＳＰＣＮ：：ＵＢＱ１４ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＵＢＱ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ１  Ｎ１：：ＮＯＳ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ。
【０３０４】
ＰＨＰ８９４８４を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４を、１００ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び２００μＭのアセトシリンゴンを加えた８１０Ｋ最小培地中で調製した。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物を、２８℃及び２８０ｒｐｍのインキュベーターシェーカー中で、６００ｎｍで０．６〜０．８のＯＤに達するまで一晩増殖させた。細菌細胞を４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離してペレット化し、７００Ａ培地に再懸濁して最終ＯＤ６００を０．６とした。４０ｍｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）溶液を、切断セグメントを含む各ペトリ皿に添加し、断続的に振盪しながら３０分間インキュベートした。
【０３０５】
感染後、約５０個の胚軸セグメント又は５０個の子葉外植片を、固体７１０Ｉ共培養培地が入ったペトリ皿に入れ、滅菌濾紙で覆った。１６時間の光周期を有する低光（５μＥ）下、２８℃で４日間、共培養した。次いで、外植片を、選択剤を含まない「カルス誘導培地」（ＣＩＭ）（ＭＳ塩、ビタミンＢ５、３０ｇ／Ｌのグルコース、０．９ｇ／Ｌの塩化マグネシウム六水和物、１．９ｇ／Ｌの硝酸カリウム、０．１ｇ／Ｌのミオイノシトール、０．１ｍｇ／Ｌのキネチン、０．１ｍｇ／Ｌ（０．４５μＭ）の２，４−Ｄ、５００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、３．６ｇ／ＬのＰｈｙｔａｇｅｌ（ｐＨ５．８））の表面に直接移した。１４日後、外植片を６０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含むＣＩＭに移した。
【０３０６】
Ａｇｒｏ処理の７日後、一過性ＲＦＰ発現をエピ蛍光実体顕微鏡下で観察した。強く発現するＤＳ−ＲＥＤ蛍光起点が、切断表面全体にわたり子葉及び胚軸外植片の両方で観察された。ＤＳ−ＲＥＤ発現は３週間後に多細胞ＤＳ‐ＲＥＤ発現構造を示す安定カルスで観察された。比較として、対照Ｔ−ＤＮＡ（ＰＨＰ８８１９３中）を同じ株及び同じ実験条件下で使用した場合、Ｔ−ＤＮＡ送達は蛍光に基づいて類似していたが、Ａｇｒｏ処理の３週間後には多細胞構造の成長は観察されなかった。
【０３０７】
実施例１７：ＷＵＳ２発現を駆動するためにオオムギＬＴＰ２  ＰＲＯと共にウイルスエンハンサーを使用することにより、「形質」Ｔ−ＤＮＡのみの単一コピートランスジェニックイベントの回収がさらに改善される。
病原性プラスミドＰＨＰ７１５３９（配列番号１３２）を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−を、全ての処理に使用した。「形質」発現カセットを有するＴ−ＤＮＡを含むＰＨＰ８６４９１（配列番号１１０）（ＲＢ＋ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＯＳ−ＵＢＩ  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ）もまた、全ての処理に使用した。陰性対照の処理１（Ｔｒｔ．Ｎｏ．１）として、ＰＨＰ８６４９１のみを含む単一のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株（Ａｇｒｏ１）を使用した。陽性対照の処理２（Ｔｒｔ．Ｎｏ．２）として、ＰＨＰ８８１５８（配列番号１０９）（ＲＢ＋ＦＭＶ  ＥＮＨ：ＰＳＣＶ  ＥＮＨ：ＭＭＶ  ＥＮＨ：ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＣＲＣ：：ＳＢ−ＧＫＡＦ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ）を含有する第２のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ａｇｒｏ２）をＡｇｒｏ１と混合した。両方のアグロバクテリウム懸濁液を０．７  ＯＤ５５０に調整し、次いで、９０％のＡｇｒｏ１対１０％のＡｇｒｏ２の比で混合した。第３の処理の処理３（Ｔｒｔ．Ｎｏ．３）では、ＰＨＰ９３１６１（配列番号１３０）（ＲＢ＋ＬＯＸＰ＋ＦＭＶ  ＥＮＨ：ＰＣＳＶ  ＥＮＨ：ＭＭＶ  ＥＮＨ：：ＬＴＰ２  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ  ＋  ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＣＲＣ：：ＳＢ−ＧＫＡＦ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ）を使用してＡｇｒｏ２中のＰＨＰ８８１５８を置換し、Ａｇｒｏ１／Ａｇｒｏ２の比率をＴｒｔ．Ｎｏ．２及びＴｒｔ．Ｎｏ．３の両方で同じ（９０％／１０％）に保った。
【０３０８】
Ｔｒｔ．Ｎｏ．１では、３５８個の近交系ＨＣ６９の未熟胚をアグロバクテリウム混合物に感染させ、９１のトランスジェニックＴ０植物体（形質転換率２５％）を生産し、それらの植物体の１１％は形質の単一コピーであった（胚の開始数に対して）。Ｔｒｔ．Ｎｏ．２では、形質転換率と単一コピー頻度はいずれもＴｒｔ．Ｎｏ．１と比べて改善した（それぞれ、２５％から３１％へ、及び１１％から１６％へ）。最終的な「形質の単一コピー％」値の改善は、高品質の粘性トランスジェニック植物を温室へ送達するという観点からは、成功の最終尺度であった。この値は、初期形質転換率（トランスジェニック細胞の作製）、再生頻度（トランスジェニック細胞から植物体の生産）、及び最終的な分子分析を含む、プロセスの間の多数の個々の工程の結果によって影響された。分子分析から、トランスジェニック植物は、ｉ）独立した組み込みイベントであり、ｉｉ）所望のＴ−ＤＮＡの単一コピーとその複合形質発現カセットを含み、ｉｉｉ）形態形成遺伝子発現カセットを有するＴ−ＤＮＡを含まず、且つｉｖ）アグロバクテリウムアプラスミドバックボーン配列を含まないことが確認された。これらの結果（形質転換率、再生頻度及び分子品質管理頻度）の各々はプロセスを進む中での減少の一因となり、表１２に示すように、「形質の単一コピー％」頻度によって要約される。この最終結果−高品質の稔性Ｔ０植物体を生産する頻度−の重要性により、Ｔｒｔ．Ｎｏ．１の１１％からＴｒｔ．Ｎｏ．２の１６％への改善は、この有用なパイオニア近交系の全体的な形質転換効率に対する重要且つ実質的な改善を示した。
【０３０９】
上記のように、ＰＨＰ９３１６１（配列番号１３０）では、ＺＭ−ＷＵＳ２遺伝子の発現に使用されるプロモーターを、Ｔｒｔ．Ｎｏ．２のＺＭ−ＰＬＴＰプロモーターからＴｒｔ．Ｎｏ．３のＬＴＰ２プロモーター（Ｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：８４９−８６０）に換えた。Ｔｒｔ．Ｎｏ．２とＴｒｔ．Ｎｏ．３中の両植物プロモーターは、３つの別個のウイルス、すなわち、ゴマノハグサモザイクウイルス、ラッカセイクロロチックストリークウイルス、及びミラビリスモザイクウイルス（表１２において「３ｘＥＮＨ」と略すこの順番の３つのエンハンサーエレメント配列）からの３つのプロモーターエンハンサーエレメントが先行した。Ｔｒｔ．Ｎｏ．３でＬＴＰ２プロモーターを用いた場合、形質転換率及び「形質の単一コピー％」頻度はいずれも、Ｔｒｔ  Ｎｏ．２と比べて増加した（それぞれ、３１％から４５％へ、及び１６％から２４％へ）。これは、この戦略では異なるプロモーターが有用であることを示した。それはまた、Ｔｒｔ．Ｎｏ．１をＴｒｔ．Ｎｏ．２比較して到達した結論を強化した。すなわち、１つのアグロバクテリウム（Ｔ−ＤＮＡ内に形質発現カセットを含む）を別のアグロバクテリウム（Ｔ−ＤＮＡ内に形態形成遺伝子発現カセットを含む）と混合することにより、形質のみを有するＴ−ＤＮＡを含む単一のアグロバクテリウムを用いる場合と比較して、高品質の稔性Ｔ０植物（ＰＣＲ特性に基づく独立イベント）を生産する全体的な頻度が増加した。
【０３１０】
【表１２】
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【０３１１】
表１２は、Ａｇｒｏ２（形態形成遺伝子発現カセット）がＴｒｔ．Ｎｏ．１におけるように存在しなかった場合、又は２つの異なるプロモーターを有するＷＵＳ２遺伝子発現カセットを含むＡｇｒｏ２を有する場合（Ｔｒｔ．Ｎｏ．２及びＴｒｔ．Ｎｏ．３）の形質転換効率を示す。第３号明細書を参照）。形質転換率は、未熟胚の開始数に対して回収したトランスジェニック（Ｔｎｘ）Ｔ０植物体の数に基づいて算出した。形質遺伝子（ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１及びＨＲＡ）と形態形成遺伝子（ＷＵＳ２）の単一コピー分析は、遺伝子の存在とコピー数を決定する定量的ＰＣＲを用いて決定した。ＷＵＳ２遺伝子を持たず、形質遺伝子の単一コピーのみを含むＴ０植物を用いて、未成熟胚の開始数に対する「形質の単一コピー％」値を計算した。
【０３１２】
実施例１８：形質含有アグロバクテリウムと形態形成遺伝子含有アグロバクテリウムとの混合物の使用は、ヒマワリ胚軸形質転換を改善した
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−を、ヒマワリ（ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）品種Ｆ１５０３ＬＧ）の形質転換に使用した。成熟乾燥ひまわり種子を漂白剤溶液（水中１０〜１５％  ｖ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ洗剤１滴を含む）中で１５分間滅菌し、次いで、滅菌水で３回すすいだ。種子に一晩、水を吸収させた。軟化した外皮から胚を取り出した。胚を単離したところで、胚の単離を容易にするために子葉の基部を切開し、それによって頂端分裂組織を覆っている葉原基を露出させた。根の先端は胚に付着させたままにした。単離後、感染のために胚軸（ＥＡ）をペトリ皿に移した。２種のアグロバクテリウム（それぞれ異なるＴ−ＤＮＡプラスミドを含む）を液体感染培地に懸濁した。第１のアグロバクテリウムは、ＳＰＣＮ（スペクチノマイシン耐性）及びＤＳ−ＲＥＤ２（蛍光）遺伝子の「形質」発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを有する、具体的には、ＲＢ＋ＬＯＸＰ＋ＧＭ−ＱＢＵ  ＰＲＯ：：ＣＴＰ：ＳＰＣＮ：：ＵＢＱ１４  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＥＦ１Ａ２  ＰＲＯ：：ＤＳ−ＲＥＤ２：：ＵＢＱ３  ＴＥＲＭ＋ＬＯＸＰ＋ＬＢを含む、プラスミドＰＨＰ９２３４９（配列番号：１３１）を保有した。第２のアグロバクテリウムは、ＨＡ−ＷＵＳの形態形成遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを有する、具体的には、ＲＢ＋ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ：：ＨＡ−ＷＵＳ：：ＯＳ−Ｔ２８ＴＥＲＭ＋ＦＭＶ  ＥＮＨＡＮＣＥＲ：ＰＣＳＶ  ＥＮＨＡＮＣＥＲ：ＭＭＶ  ＥＮＨＡＮＣＥＲ＋ＬＢを含む、ＰＨＰ９００９４を保有した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の各々を２０Ａ培地に懸濁し、細菌懸濁液の濃度を０．５  ＯＤ５５０に調整した。アグロバクテリウム懸濁液を１：１の比率で混合し、５ｍｌの懸濁液をＥＡに加え、外植片を覆った。次いで、ＥＡを２０分間ゆっくり撹拌しながら真空下に置いた。ＥＡをアグロバクテリウムから除去し、根の末端を２７２ＡＣ培地（標準ＭＳ塩及びビタミンレベル（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９７）、０．１ｇ／ｌのミオイノシトール、５０ｍｇ／ｌのチミジン、１００  ｕＭのアセトシリンゴン、０．１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、４０ｇ／ｌのスクロース、６ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天、ｐＨ  ５．６）に挿入し、２７２ＡＣ培地上に頂端ドームを残し、２１℃で３日間の共培養の暗い光の下に置いた。共培養後、ＥＡを２７２ＡＢスペクチノマイシン選択培地（標準ＭＳ塩及びビタミンレベル（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９７）、０．１ｇ／ｌのミオイノシトール、１０ｍｇ／ｌのメロペネム、０．１ｍｇ／ｌのメタトポリン、３０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシン二塩酸塩、０．１μｇ／ｌ、４０ｇ／ｌのスクロース、６ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天、ｐＨ５．６）を全光下、２８℃で移した。
【０３１３】
漂白した葉を定期的にトリミングしながら、ＥＡを成長させた。スペクチノマイシンに暴露してから約３週間以内に、緑色の領域又は緑色の葉全体が観察された。この緑色組織はＤＳ−ＲＥＤも発現し、ＰＨＰ９２３４９由来のＴ−ＤＮＡが組み込まれていることが確認された。発根のために、トランスジェニックイベントをＢｉｏ−Ｄｏｍｅ  Ｓｐｏｎｇｅ発根材料（Ｐａｒｋ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏ．、３５０７  Ｃｏｋｅｓｂｕｒｙ  Ｒｏａｄ、Ｈｏｄｇｅｓ、ＳＣ）に移した。Ｂｉｏ−Ｄｏｍｅ  Ｓｐｏｎｇｅ発根材料に移した後、１〜３週間以内に根が形成され、植物を鉢植えし、温室又は生育室に移した。
【０３１４】
「形質」プラスミドＰＨＰ９２３４９を含む単一のアグロバクテリウムのみを用いた対照実験では、８２３個のアグロバクテリウム感染ＥＡから３つのトランスジェニックＴ０植物体のみが回収され、形質転換率は０．４％であった。ＰＨＰ９２３４９（「形質」発現カセット）を含むアグロバクテリウムとＰＨＰ９００９４（形態形成遺伝子（ＷＵＳ）発現カセット）を含むアグロバクテリウムの１：１混合物を用いた場合、３７０個のアグロバクテリウム感染ＥＡから６つのトランスジェニックＴ０植物体を回収し、１．６％の形質転換率を得た。さらに、「形質」含有トランスジェニックＴ０植物のどれも、形態形成遺伝子（ＷＵＳ）発現カセットを含まなかった。これは、２種のアグロバクテリウムの混合物の使用により、形態形成遺伝子発現カセットの組み込みなしに形態形成刺激の利点を付与することが、ヒマワリにおける形質転換効率を改善することを実証した。
【０３１５】
実施例１９：１つの菌株からの２つのＴ−ＤＮＡプラスミドの共送達
２種のアグロバクテリウム（それぞれ２つのプラスミドのうちの１つを含む）の混合物を用いて形質遺伝子発現カセット及び形態形成遺伝子発現カセットを送達する代替法は、２つの異なるＴ−ＤＮＡを含む単一のアグロバクテリウムを使用することである。これは、２つのＴ−ＤＮＡを含む単一プラスミドを構築するか、形質遺伝子発現カセットＴ−ＤＮＡを含む１つと、形態形成遺伝子発現カセットＴ−ＤＮＡを含むもう１つのプラスミドを有する２つの別個のプラスミドを用いることによって達成される。トウモロコシ近交系は、多くの形態学的及び生理学的特性が多様である。この多様性の１つの現れは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染及び共培養の間のＴ−ＤＮＡ送達及び組み込みに対する未成熟胚の胚盤の感受性の近交系間の違いである。例えば、２つの菌株に含まれるプラスミド混合物を用いてＮｏｎ−Ｓｔｉｆｆ−Ｓｔａｌｋ近交系ＨＣ６９を形質転換する場合、多くの細胞はプラスミドのうちの一方のみを受け取るため、迅速に新たな体細胞胚を形成し、形質を有するトランスジェニックイベントを生成するようには刺激されない。プラスミド混合物を送達するためのＡｇｒｏ１：Ａｇｒｏ２の異なる比率の代わりに、同じ細菌細胞からのプラスミド混合物の送達は、両方のＴ−ＤＮＡを受容する細胞のより高い頻度をもたらし得、そしてより高い頻度のトランスジェニック事象産生を可能にし得る。形質転換に用いると、より高い頻度で急速に体細胞胚が形成され、その結果、単一コピー形質遺伝子発現カセットＴ−ＤＮＡを含み、ベクター（プラスミド）ＤＮＡを持たず、形態形成遺伝子発現カセットＴ−ＤＮＡの組み込みのないＴ０植物体が生産されると予想される。
【０３１６】
実施例２０：複製起点の異なるＴ−ＤＮＡプラスミドの、プラスミドコピー数を調節するための使用
これらの実験では、２つの異なるＴ−ＤＮＡを１つの細菌細胞から、複製起点（ＯＲＩ）の異なる２つのプラスミド（ＯＲＩ）にこれらのＴ−ＤＮＡを保持することにより、（互いに相対的に）様々な比率で送達する。異なるＯＲＩは、細菌細胞で維持されるプラスミドの数が相異する。異なるＯＲＩを使用して、プラスミドコピー数を滴定し、同じ細菌細胞中のプラスミドの異なる比率を達成することができる。この実験では、以下のＯＲＩから選択される１つ以上のＯＲＩを有するプラスミドを設計する：同じ細菌細胞内に存在する、ＢＢＲ１  ＯＲＩ；ＰＳＡ  ＯＲＩ；ＰＳＡ＋ＰＡＲＤＥ  ＯＲＩ；ＰＶＳ１  ＯＲＩ；ｒｅｐＡＢＣ  ＯＲＩ；ＲＫ２  ＯＲＩ；ＲＫ２＋ＰＡＲＤＥ  ＯＲＩ；又はＲＳＦ１０１０  ＯＲＩ（米国特許出願公開第２０１８／０２１６１２３号明細書、及び国際公開第２０１７／０７８８３６号パンフレット（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの種々のＯＲＩ内で、アグロバクテリウムにおいては、ｐＶＳ１が高いプラスミドコピー数（約２０コピー／細胞）を付与し、ｒｅｐＡＢＣは低いコピー数（約１〜２コピー／細胞）を付与することが以前に見出された（Ｚｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．３４：７４５−７５４）。
【０３１７】
【表１３】
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【０３１８】
この概念を検証するために、第１のプラスミドを、高いプラスミドコピー数（ｐＶＳ１）をもたらすＯＲＩと、ＺＳ−ＧＲＥＥＮ及びＨＲＡのような形質遺伝子発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを用いて構築する。第２のプラスミドは、低いコピー数（ｒｅｐＡＢＣ）をもたらすＯＲＩ及び形態形成遺伝子発現カセット（ＷＵＳ２）を含むＴ−ＤＮＡで構築する。両方のプラスミドを単一のアグロバクテリウムに導入する。同じ細菌細胞内に存在するプラスミドが同じ植物細胞内に同時送達されると、送達されたＴ−ＤＮＡの相対比は、アグロバクテリウムにおけるこれらのプラスミドの安定な比を反映する。
【０３１９】
このようにして、形質遺伝子発現カセットＴ−ＤＮＡ又は形態形成遺伝子発現カセットＴ−ＤＮＡを含有する２つの異なるアグロバクテリウムを混合する（すなわち、Ａｇｒｏ１とＡｇｒｏ２の９０％／１０％混合物）方法と比較すると、同様の効果が生じる。アグロバクテリウム混合法と同様に、同じ菌株からのプラスミド混合物の送達は、両方のＴ−ＤＮＡを受容する細胞の頻度がより高くなり、より高い形質転換率を可能にし得る。形質転換に用いると、より高い頻度で急速に体細胞胚が形成され、その結果、単一コピー形質遺伝子発現カセットＴ−ＤＮＡを含み、ベクター（プラスミド）ＤＮＡを持たず、形態形成遺伝子発現カセットＴ−ＤＮＡの組み込みのないＴ０植物体が生産されると予想される。
【０３２０】
実施例２１．Ｔ−ＤＮＡ外でのリプレッサー遺伝子発現カセットの、Ｔ−ＤＮＡ内の選択マーカーの発現を抑制するための使用
Ｔ−ＤＮＡの外側に同族リプレッサー発現遺伝子カセットに加えて、抑制性／非抑制性選択マーカーを含むプラスミド媒介性Ｔ−ＤＮＡを有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４を使用する。例えば、アグロバクテリウムプラスミドは、次のＴ−ＤＮＡ：ＲＢ＋ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ：ＴＯＰ３：：ＮＰＴＩＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ（ここで、ＴＯＰ３は、ＣＡＭＶ３５ＳプロモーターがＴＡＴＡボックスを取り囲み、転写開始部位と重複する３つのテトラサイクリンリプレッサー結合配列（オペレーター配列）を有する）、及び、左境界の外側に位置する、ＵＢＩ１ＺＭ  ＰＲＯ：：ＴＥＴＲ：：ＰＩＮＩＩを含む。上記構成に記載された発現カセットに加えて、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子発現カセット（例示的形質ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１を使用）、及びＴ−ＤＮＡ外の形態形成遺伝子発現カセット（ＷＵＳ２を使用）を加えることができ、その結果、以下のアグロバクテリウムプラスミドが得られる：ＲＢ＋ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＯＳ−ＵＢＩ  ＴＥＲＭ＋ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ：ＴＯＰ３：：ＮＰＴＩＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ＋ＵＢＩ１ＺＭ  ＰＲＯ：：ＴＥＴＲ：：ＰＩＮＩＩ＋ＰＬＴＰ：：ＷＵＳ２：：Ｉｎ２−１  ＴＥＲＭ（ＲＢ＋ＺＳ−ＧＲＥＥＮ＋ＲＥＰＲＥＳＳＩＢＬＥ  ＮＰＴＩＩ＋ＬＢ＋ＴＥＴＲ＋ＷＵＳ２と略称する）。
【０３２１】
この第２の構成（ＲＢ＋ＺＳ−ＧＲＥＥＮ＋ＲＥＰＲＥＳＳＩＢＬＥ  ＮＰＴＩＩ＋ＬＢ＋ＴＥＴＲ＋ＷＵＳ２）は、近交系ＨＣ６９由来のトウモロコシ未熟胚へのアグロバクテリウム感染によって導入される。回収されるトランスジェニックイベントの大部分では、Ｔ−ＤＮＡ（形質遺伝子発現カセット及び選択マーカー遺伝子発現カセットを含む）のみが組み込まれる一方、ＴＥＴＲ及びＷＵＳ２遺伝子発現カセットは組み込まれず、ＴＥＴＲ及びＷＵＳ２遺伝子の一過性の発現が生じると予想される。このように、ＷＵＳ２刺激体細胞胚形成は、形質転換率を増加させ、一方、一過性ＴＥＴＲ発現はＮＰＴＩＩ発現の一時的抑制をもたらす。感染後の培養の１週間後、トランスジェニック細胞を、１５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含有する培養培地に移す。Ｔ−ＤＮＡ（形質遺伝子発現カセットと選択マーカー遺伝子発現カセットを有する）が組み込まれた体細胞胚を形成することが容易に選択され、稔性トランスジェニック植物が高頻度で生産されると予想される。
【０３２２】
実施例２２．Ｔ−ＤＮＡ外側のｄＣＡＳ９リプレッサー融合発現カセットの、Ｔ−ＤＮＡ内の選択マーカーの発現を抑制するための使用
Ｔ−ＤＮＡの外側にｄＣＡＳ９−リプレッサー発現カセットに加えて、選択マーカーの発現を駆動する構成的プロモーターを含むプラスミド媒介性Ｔ−ＤＮＡを有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４を使用する。例えば、アグロバクテリウムプラスミドは、次のＴ−ＤＮＡ：ＲＢ＋ＵＢＩ１ＺＭ  ＰＲＯ：：ＮＰＴＩＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ、及び左境界配列の外側に位置する、ＵＢＩ１ＺＭ  ＰＲＯ：：ｄＣＡＳ：ＥＡＲ：：ＰＩＮＩＩを含む（ここで、ＥＡＲは、ｄＣＡＳ９にインフレームで融合されたリプレッサーペプチドをコードする配列を示す）。上記構成に記載された発現カセットに加えて、Ｔ−ＤＮＡ内の形質遺伝子発現カセット（例示的形質ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１を使用）、及びＴ−ＤＮＡ外の形態形成遺伝子発現カセット（ＷＵＳ２を使用）を加えることができ、その結果、以下のアグロバクテリウムプラスミドが得られる：ＲＢ＋ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＯＳ−ＵＢＩ  ＴＥＲＭ＋ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＰＲＯ：ＴＯＰ３：：ＮＰＴＩＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ＋ＵＢＩ１ＺＭ  ＰＲＯ：：ｄＣＡＳ９：ＥＡＲ：：ＰＩＮＩＩ＋ｚｍｕ６  ｐｒｏ：：ｇＲＮＡ：：ＺＭＵ６  ＴＥＲＭ＋ＰＬＴＰ：：ＷＵＳ２：：Ｉｎ２−１  ＴＥＲＭ（ＲＢ＋ＺＳ−ＧＲＥＥＮ＋ＲＥＰＲＥＳＳＩＢＬＥ  ＮＰＴＩＩ＋ＬＢ＋ｄＣＡＳ９：ＥＡＲ＋ｇＲＮＡ＋ＷＵＳ２と略称する）。
【０３２３】
この第２の構成（ＲＢ＋ＺＳ−ＧＲＥＥＮ＋ＲＥＰＲＥＳＳＩＢＬＥ  ＮＰＴＩＩ＋ＬＢ＋ｄＣＡＳ９：ＥＡＲ＋ｇＲＮＡ＋ＷＵＳ２）は、近交系ＨＣ６９由来のトウモロコシ未熟胚へのアグロバクテリウム感染によって導入される。回収されるトランスジェニックイベントの大部分では、Ｔ−ＤＮＡ（形質遺伝子発現カセット及び選択マーカー遺伝子発現カセットを含む）のみが組み込まれる一方、ｄＣＡＳ９：ＥＡＲ及びＷＵＳ２遺伝子発現カセットは組み込まれず、ｄＣＡＳ９：ＥＡＲ及びＷＵＳ２遺伝子の一過性の発現が生じると予想される。このように、ＷＵＳ２刺激体細胞胚形成は、形質転換率を増加させ、一方、一過性ｄＣＡＳ９：ＥＡＲ発現はＮＰＴＩＩ発現の一時的抑制をもたらす。感染後の培養の１週間後、トランスジェニック細胞を、１５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含有する培養培地に移すことができる。Ｔ−ＤＮＡ（形質遺伝子発現カセットと選択マーカー遺伝子発現カセットを有する）が組み込まれた体細胞胚を形成することが容易に選択され、稔性トランスジェニック植物が高頻度で生産されると予想される。
【０３２４】
本明細書では、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、そのような細胞を複数種含み、「タンパク質」への言及は、１つ以上のタンパク質及び当業者に知られたその同等物などを含む。別途明確な指示がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。
【０３２５】
本明細書で言及した全ての特許、刊行物及び特許出願は、本開示が属する技術分野の当業者の水準を示すものである。全ての特許、刊行物及び特許出願は、あたかも個々の特許、刊行物又は特許出願が、明確に且つ個々に参照により全体的に組み込まれるよう指示されているのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２６】
以上の開示は、理解を明確にする目的で、図面及び実施例を使ってある程度の詳しく説明してきたが、添付の請求項の範囲内で一定の変更及び修正を行うことができる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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