(57)【要約】  培養細胞から開始するウイルス汚染物質を含まない抗体含有溶液を作製する方法に関する発明を記載する。この方法は、抗体含有溶液を溶媒及び洗浄剤のミックスに又は高ｐＨに供する工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス不活性化抗体溶液を作製するための方法であって、（ｉ）細胞培養を経た、抗体のコード配列を含むトランスフェクトされた細胞によって産生された前記抗体材料を採取する工程、（ｉｉ）溶媒及び洗浄剤の混合物とのインキュベーション又は高ｐＨでのインキュベーションからなる群から選択される、前記採取された抗体に対するウイルス不活性化処理の工程を含む、方法。
【請求項２】
前記採取された抗体材料が非ヒト哺乳動物細胞で産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記採取された抗体材料がモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が組換え抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組換え抗体が多重特異性である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記溶媒がＴｎＢＰでありかつ、前記洗浄剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリソルベート８０及びポリソルベート２０からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴｎＢＰの濃度が約０．１％（重量／重量）以上、及び約１％（重量／重量）以下であり、特に前記ＴｎＢＰの濃度が約０．１％（重量／重量）、約０．３％（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）及び約１％（重量／重量）を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリソルベート８０又は前記ポリソルベート２０の濃度が約０．１％（重量／重量）以上、及び約２％（重量／重量）以下であり、特に前記ポリソルベート８０又は前記ポリソルベート２０の濃度が約０．２％（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）、約０．７５％（重量／重量）、約１％（重量／重量）、約１．２５％（重量／重量）を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
溶媒及び洗浄剤の前記混合物が０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び０．５％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物及び０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）ポリソルベート８０の混合物からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記採取された抗体材料が少なくとも５分間０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物とインキュベートされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記採取された抗体材料がプロテインＡクロマトグラフィーに最初に供され、かつ得られたプロテインＡ溶出液が室温で少なくとも１０分間０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物とインキュベートされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記採取された抗体材料が清澄化された採取物でありかつ室温で、攪拌しながら、約６０分間０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物とインキュベートされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記高ｐＨが９以上かつ１２．５以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記高ｐＨが少なくとも１０．５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記高ｐＨが約１１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記採取された抗体材料がプロテインＡクロマトグラフィーに最初に供され、かつ得られたＡ溶出液が前記高ｐＨでインキュベートされる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテインＡ溶出液が目標の高ｐＨにトリス、ヒスチジン  Ｌ−アルギニン、リン酸塩及びＮａＯＨの群から選択されるバッファーで滴定されかつインキュベートされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテインＡ溶出液が室温で約６０分間、目標のｐＨ１１に０．５ＭのＮａＯＨで滴定される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルス不活化アッセイにより請求項１に記載のウイルス不活化抗体溶液の一部を試験する更なる工程（ｉｉｉ）を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
バルク原薬の製造の方法であって、
（ａ）請求項１２に記載の溶媒洗浄剤処理による採取された抗体材料のウイルス不活化の工程、
（ｂ）前記得られたウイルス不活化溶液のプロテインＡクロマトグラフィーの工程、
（ｃ）ｐＨ６．０への前記プロテインＡ溶出液の中和、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｄ）前記中和されたプロテインＡ溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィー、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｅ）限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｆ）膜吸着を使用する、フロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーによる前記生成物の精製、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｇ）ウイルスナノ濾過の工程、
（ｈ）予備製剤バッファーへの限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる前記生成物の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｉ）ｐＨ５．９で５ｍＭクエン酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０を混合することによる、最終製剤バッファー中の目標の６ｍｇ／ｍＬ生成物への賦形剤添加、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｊ）滅菌バッグへの前記生成物の充填、それに続く−８０±２０℃での凍結及び保存の工程、
を含む方法。
【請求項２１】
バルク原薬の製造の方法であって、
（ａ）採取した抗体材料のプロテインＡクロマトグラフィーの工程、
（ｂ）請求項１８に記載される高ｐＨでの前記得られたＰＡ溶出液のインキュベーションの工程、
（ｃ）ｐＨ５．５への前記得られたウイルス不活化溶液の中和、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｄ）中和されたウイルス不活化プロテインＡ溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィー、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｅ）限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｆ）膜吸着を使用する、フロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーによる生成物の精製、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｇ）ウイルスナノ濾過の工程、
（ｈ）予備製剤バッファーへの限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる前記生成物の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｉ）５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０を混合することによる、最終製剤バッファー中の目標の６ｍｇ／ｍＬ生成物への賦形剤添加、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｊ）滅菌バッグへの前記生成物の充填、それに続く−８０±２０℃での凍結及び保存の工程、
を含む方法。
【請求項２１】
細胞採取物を高ｐＨで処理する工程それに続く濾過工程を含む前記細胞採取材料からの不純物の除去の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス不活性化の方法に関する。特に、本発明は、治療用抗体を含むウイルスを含まない溶液の製造に関する。本発明はまた、治療用抗体の精製及びウイルス不活化処理の工程を含むバルク原薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のような生体分子が疾患の治療のための医薬品として使用される場合、製造プロセスはヒトの健康を保証するように設計される。通常、治療用タンパク質の生産に使用される細胞培養物及び他の生体材料は、原材料に存在するか、製造プロセス中に導入されるウイルスによって汚染される可能性がある。除去されない又は不可逆的に不活性化されない場合、ウイルス汚染物質は薬物を使用している個人の健康に対するリスクである。したがって、ヒトでの使用に安全な医薬品を製造するには、生産されたタンパク質に活性なウイルス汚染物質がないことが必要とされる（ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／２９５／９５）。
【０００３】
治療用タンパク質を生産するため、精製プロセスを実施して、治療用タンパク質を残りの出発混合生体材料から分離する。クロマトグラフィー及び濾過等の精製工程は、ウイルス除去に貢献し、ウイルスクリアランスを保証するために特定のウイルス不活化技術と組み合わされる。ウイルス不活性化の方法は、当技術分野でよく知られている。血漿生成物中のウイルス不活化を保証する方法は、世界保健機構（ＷＨＯ）の技術報告、付録４のガイドラインで確立されるように、ウイルス脂質エンベロープを可溶化することによりウイルス活性を損なう、溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）ミックスで上記血漿製剤を処理することで構成される。この処理の最適化は、使い捨てバッグシステムでの血漿製剤のＳ／Ｄ処理を可能にするために実施されており（Ｈｓｉｅｈ，  ＹＴ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１６  Ｊｕｎ；５６（６）：１３８４−９３）、ＷＨＯ技術報告、付録４ガイドライン（国際公開第２０１２０８２９３１号）に示されている条件と比較して、より低温で短時間の条件で組換え第ＶＩＩＩ因子を処理する。さらに、非商業的な研究規模でＳ／Ｄ処理は、ヒトハイブリドーマ細胞株由来のサンプルを含む抗Ｄ抗体の追加のウイルス除去工程として適用されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＰＬ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０１４  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；  ３０（６）：１３４１−７）。不活性化はまた、ウイルスタンパク質の変性を引き起こす低ｐＨによる処理（Ｓｈｕｋｌａ  ＡＡ  ａｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．，  ２０１５，  ３（２）：１２７−１３８）又は高温（殺菌）（米国特許第４７４９７８３号）によっても達成され得る。これらの処理は、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスに対して有効であるが、治療用タンパク質も変性の影響を受けやすいため、全ての治療用タンパク質とは適合しない場合がある。
【０００４】
治療用タンパク質の重要なクラスは、動物の身体によって産生される抗体のような、自然な構造を持つことができるモノクローナル抗体、及び複数の方法でそれらの特性を強化するように操作されたモノクローナル抗体である。抗体は、様々な種類の癌及び免疫系の障害を含む多様な疾患の治療及び診断のための薬物として使用され得る。モノクローナル抗体は通常、抗体のコード配列を含むトランスフェクトされた細胞株を使用して商業的に生産され、それらは制御された細胞培養条件下で大規模に生育された後採取される。採取に続いて抗体を精製し、精製プロセスでは、ウイルス不活化の標準手順は低ｐＨでのサンプルのインキュベーションを含む（国際公開第２０１００４８１９２号、Ｌｉｕ  ＨＦ  ｅｔ  ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１０  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；  ２（５）：４８０−９９）。
【０００５】
抗体は、低ｐＨ等の非生理学的条件の影響を受けやすく、またエフェクター機能が強化されるか、又はホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成するように操作されている場合、より分解されやすい。抗体ベースの治療法が拡大し続け、これらの製品の複雑さも拡大するにつれて、新たなウイルス不活化戦略の開発が必要となっている。
【０００６】
さらに、抗体等の治療用タンパク質の精製プロセスは、ウイルス不活性化に一般的に使用される低ｐＨに適合しない可能性があることから、代替のウイルス不活化方法を利用可能にすることは、精製プロセスの開発及び改善を促進するであろう。
【０００７】
本発明は、既存のウイルス不活性化アプローチが機能せず、抗体産物の分解若しくは他の望ましくない結果につながるか、又は抗体精製プロセスに適合しない、商業的に生産された抗体に対するウイルス不活性化の新たな方法に関するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗体等の治療用タンパク質の精製プロセスに適合されるウイルス不活性化の新たな方法に関する。抗体精製のプロセスで使用される古典的な方法は、低ｐＨでの抗体含有溶液のインキュベーションである。それにもかかわらず、精製プロセスの最適化は、低ｐＨと適合しない工程の開発をもたらす可能性がある。さらに、低ｐＨ不安定抗体の場合、この方法は、抗体の安定性を損なうため適切でないことが観察されている。本発明において提示されるウイルス不活性化の新たな方法は、これらの問題を克服することを可能にする。
【０００９】
特に、本発明は、抗体精製のプロセスの間にウイルス汚染物質を含まない抗体溶液を作製する方法に関し、このウイルス不含抗体溶液の作製は、抗体を発現するトランスフェクト細胞の培養から始まり、（ｉ）トランスフェクトされた細胞によって産生された抗体材料を採取する工程と、（ｉｉ）溶媒洗浄剤又は高ｐＨにより抗体採取材料を処理する工程を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
より詳しくは、本発明は、（ｉ）細胞培養を経た、上記抗体のコード配列を含むトランスフェクトされた細胞により産生された抗体材料を収集する工程、ｉｉ）溶媒及び洗浄剤の混合物とのインキュベーション又は高ｐＨでのインキュベーションからなる群から選択される、上記採取された抗体材料に対するウイルス不活化処理の工程を含む、ウイルス不活化抗体溶液を作製する方法に関する。
【００１１】
一実施形態では、本発明の採取された抗体材料は、非ヒト哺乳動物細胞で産生される。
【００１２】
別の実施形態では、本発明の採取された抗体材料はモノクローナル抗体を含む。より具体的な実施形態では、モノクローナル抗体は組換え抗体である。特定の態様では、上記組換え抗体は多重特異性である。
【００１３】
本発明の一実施形態では、採取された抗体材料を溶媒及び洗浄剤の混合物とインキュベートし、ここで、溶媒はＴｎＢＰであり、洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリソルベート８０及びポリソルベート２０からなる群から選択される。
【００１４】
より具体的な実施形態では、上記ＴｎＢＰの濃度は、約０．１％（重量／重量）以上約１％（重量／重量）以下であり、特に、上記ＴｎＢＰの濃度は約０．１％（重量／重量）、約０．３％（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）及び約１％（重量／重量）を含む群から選択される。
【００１５】
別の特定の実施形態では、上記ポリソルベート８０又は上記ポリソルベート２０の濃度は、約０．１％（重量／重量）以上約２％（重量／重量）以下、特に上記ポリソルベート８０又は上記ポリソルベート２０は、約０．２％、約０．５％（重量／重量）、約０．７５％（重量／重量）、約１％（重量／重量）、約１．２５％（重量／重量）を含む群から選択される。
【００１６】
より具体的な実施形態では、溶媒及び洗浄剤の上記混合物は、０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び０．５％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物、並びに０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物からなる群から選択される。
【００１７】
さらに具体的には、上記採取された抗体材料を、０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物と少なくとも５分間インキュベートする。
【００１８】
特定の実施形態では、上記採取された抗体材料を、プロテインＡクロマトグラフィーに最初に供し、得られたプロテインＡ溶出液を０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物と共に室温で少なくとも１０分インキュベートする。
【００１９】
別の特定の実施形態では、上記採取された抗体材料は清澄化された採取物であり、室温で撹拌しながら約６０分間、０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物と共にインキュベートされる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、採取された抗体材料を高ｐＨでインキュベートし、ここで高ｐＨは９以上１２．５以下のｐＨである。より具体的には、上記高ｐＨは少なくとも１０．５である。さらに具体的には、上記高ｐＨは約１１である。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明による採取された抗体材料を最初にプロテインＡクロマトグラフィーに供し、得られたＡ溶出液を上記高ｐＨでインキュベートする。
【００２２】
本発明の一態様では、上記プロテインＡ溶出液を、トリス、ヒスチジンＬ−アルギニン、リン酸塩及びＮａＯＨ群から選択されるバッファーで目標とする高ｐＨまで滴定し、インキュベートする。
【００２３】
本発明のより具体的な態様では、上記プロテインＡ溶出液を室温で約６０分間、目標とするｐＨ１１まで０．５ＭのＮａＯＨで滴定する。
【００２４】
一実施形態では、本発明の方法は、ウイルス不活化アッセイでウイルス不活化抗体溶液の一部を試験する更なる工程（ｉｉｉ）を含む。
【００２５】
本発明はまた、バルク原薬の製造の方法であって、
（ａ）請求項１３に記載の溶媒洗浄剤処理による採取された抗体材料のウイルス不活化の工程、
（ｂ）得られたウイルス不活化溶液のプロテインＡクロマトグラフィーの工程、
（ｃ）プロテインＡ溶出液のｐＨ６．０への中和、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｄ）中和されたプロテインＡ溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィー、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｅ）限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｆ）膜吸着を使用するフロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーによる生成物の精製、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｇ）ウイルスのナノ濾過の工程、
（ｈ）予備製剤バッファーへの限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる生成物の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｉ）５ｍＭクエン酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０をｐＨ５．９で混合することによる、最終製剤バッファー中の目標の６ｍｇ／ｍＬの生成物への賦形剤の添加、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｊ）滅菌バッグへの生成物の充填、それに続く−８０±２０℃での凍結及び保存の工程、
を含む方法に関する。
【００２６】
また、本発明によって開示されるのは、バルク原薬の製造方法であって、
（ａ）採取した抗体材料のプロテインＡクロマトグラフィーの工程、
（ｂ）得られたＰＡ溶出液の請求項１８に記載される高ｐＨでのインキュベーションの工程、
（ｃ）得られたウイルス不活化溶液のｐＨ５．５への中和、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｄ）中和されたウイルス不活化プロテインＡ溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィー、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｅ）限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｆ）膜吸着を使用するフロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーによる生成物の精製、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｇ）ウイルスのナノ濾過の工程、
（ｈ）予備製剤バッファーへの限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる生成物の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｉ）５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０をｐＨ６．０で混合することによる、最終製剤バッファー中の目標の６ｍｇ／ｍＬの生成物への賦形剤の添加、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｊ）滅菌バッグへの生成物の充填、それに続いく−８０±２０℃での凍結及び保存の工程、
を含む方法である。
【００２７】
モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定化剤を含む液体医薬製剤も本発明によって開示され、ここで上記モノクローナル抗体が約０．０１ｍｇ／ｍＬ以上約１００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、好ましくは約６ｍｇ／ｍＬの濃度で上記医薬製剤中に存在し、上記バッファーが約５ｍＭの濃度で上記医薬製剤中に存在するクエン酸塩であり、上記界面活性剤が約０．０６％の割合で上記医薬製剤中に存在するポリソルベートであり、上記安定化剤が約１５％の割合で上記医薬製剤中に存在するスクロースであり、医薬製剤は約５．９のｐＨを有する。
【００２８】
モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定化剤を含む液体医薬製剤がまた本発明によって開示され、ここで上記モノクローナル抗体が約０．０１ｍｇ／ｍＬ以上約１００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、好ましくは約６ｍｇ／ｍＬの濃度で上記医薬製剤中に存在し、上記バッファーが約５ｍＭの濃度で上記医薬製剤中に存在するＬ−ヒスチジンであり、上記界面活性剤が約０．０６％の割合で上記医薬製剤中に存在するポリソルベートであり、上記安定化剤が約１５％の割合で上記医薬製剤中に存在するスクロース、及び約１２０ｍＭの濃度で上記医薬製剤に存在するＬ−アルギニン一塩酸塩であり、医薬製剤は約６．０のｐＨを有する。
【００２９】
さらに、本発明は、細胞採取材料から不純物を除去する方法であって、細胞採取物を高ｐＨで処理した後に濾過を行う工程を含む、方法に関する。
【００３０】
本発明では、「抗体」という用語及び「免疫グロブリン」という用語は互換的に使用される。「抗体」という用語は本明細書で言及される場合、完全長抗体及び抗体フラグメントを含む。抗体は、形質細胞によって産生される糖タンパク質であり、抗原分子を認識して不活性化することにより免疫応答において役割を果たす。哺乳類では、免疫グロブリンの５つのクラス、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥが産生される。ネイティブ型では、免疫グロブリンは、２本の同一の重（Ｈ）鎖及び２本の同一の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖で構成されるＹ字型ユニットの１つ又は複数のコピーとして存在する。共有結合性のジスルフィド結合と非共有相互作用は、鎖間結合を可能にし、特に重鎖は相互に連結され、各軽鎖は重鎖と対合する。重鎖と軽鎖はいずれも、Ｎ末端可変（Ｖ）領域及びＣ末端定常（Ｃ）領域を含む。重鎖では、可変領域は１つの可変ドメイン（ＶＨ）で構成され、定常領域は抗体クラスに応じて３つ又は４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）で構成されるのに対し、軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ）と単一の定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の３つの領域を含む。これらは抗原結合部位を形成し、抗体に特異性を付与する。ＣＤＲは、ＣＤＲの位置を定義するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、更に４つの保存された領域の間に位置している。抗原結合は、ドメインの位置の柔軟性によって促進され、例えば、３つの定常重ドメインを含む免疫グロブリンには、ＣＨ１とＣＨ２の間に「ヒンジ領域」と呼ばれるスペーサーがあり、標的との相互作用のための動作を可能にする。無傷でネイティブ型の抗体から開始して、酵素消化は抗体フラグメントの生成をもたらすことができる。例えば、ＩｇＧとエンドペプチダーゼパパインとのインキュベーションは、ヒンジ領域でのペプチド結合の破壊、及び結果として、それぞれ抗原結合が可能な２つの抗体結合（Ｆａｂ）フラグメント、及び結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）の３つのフラグメントの産生をもたらす。ペプシンによる消化は、代わりに、ジスルフィド結合で連結された２つのＦａｂユニットで構成される１つの大きなフラグメントＦ（ａｂ’）２、及びＦｃ領域の分解から得られる多くの小さなフラグメントを生じる。それらの性質に応じて、抗体及び抗体フラグメントは、単量体又は多量体、一価又は多価、単一特異性又は多重特異性であり得る。
【００３１】
「完全長抗体」という用語は本明細書で使用される場合、少なくとも２対の重鎖及び軽鎖を含むそれらのネイティブで無傷の構造の抗体を含む。
【００３２】
「抗体フラグメント」という用語は本明細書で使用される場合、完全長抗体の１つ又は複数の部分を含む。抗体フラグメントの非限定的な例としては以下が挙げられる：（ｉ）ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧではＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなり、並びにＩｇＥ及びＩｇＭではＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインからなる２つの定常重鎖フラグメントによって構成され、ジスルフィド結合及び非共有相互作用により対合する、結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）；（ｉｉ）ジスルフィド結合によって接続されたＶＬ、ＣＬ及びＶＨ、ＣＨ１からなる、フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）；（ｉｉｉ）ジスルフィド結合で接続されたＶＬ、ＣＬ及びＶＨ、ＣＨ１、及びヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステイン残基からなる、Ｆａｂ’；（ｉｖ）その中のシステイン残基が遊離スルフヒドリル基を含むＦａｂ’フラグメントである、Ｆａｂ’‐ＳＨ；（ｖ）ジスルフィド結合によってヒンジ領域で接続された２つのＦａｂフラグメントからなるＦ（ａｂ’）２；（ｖｉ）ＶＬ鎖及びＶＨ鎖からなり、非共有相互作用によって共に対合する、可変フラグメント（Ｆｖ）；（ｖｉｉ）リンカーによって共に対合するＶＬ鎖及びＶＨ鎖からなる、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；（ｉｘ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、（ｘ）ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント；（ｘｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｘｉｉ）ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる、単一ドメイン抗体ｄＡｂ；（ｘｉｉｉ）その中でＶＨドメイン及びＶＬドメインが同じ鎖におけるそれらの対合を防ぎ２つのｓｃＦｖの非共有結合的な二量体化を可能にする短いペプチドで接続される２つのｓｃＦｖフラグメントからなる、ダイアボディ；（ｘｉｖ）短いペプチドで接続されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを有する３つのｓｃＦｖが三量体を形成する、３価の１０トリアボディ（ｔｒｉｖａｌｅｎｔ  １０  ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）；（ｘｖ）単一の重鎖及び単一の可変鎖を含む半ＩｇＧ（ｈａｌｆ−ＩｇＧ）。
【００３３】
「ホモ二量体抗体」又は「ホモ二量体フラグメント」又は「ホモ二量体」という用語は本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子、又は第１及び第２のドメインのような少なくとも第１及び第２のポリペプチドを含む部分を含み、ここで、第２のポリペプチドはアミノ酸配列において第１のポリペプチドと同一である。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリンは２本のポリペプチド鎖を含み、第１の鎖は少なくとも１つの第２の鎖に同一なドメインを有し、両方の鎖が集合する、すなわちそれらの同一ドメインを介して相互作用する。具体的には、ホモ二量体免疫グロブリンは、少なくとも２つの同一のドメインを含み、両方のドメインが集合する、すなわち、それらのタンパク質−タンパク質界面を介して相互作用する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリンフラグメントは、少なくとも２つのドメインを含み、第１ドメインは第２ドメインと同一であり、両方のドメインが集合する、すなわちそれらのタンパク質−タンパク質界面を介して相互作用する。
【００３４】
「ヘテロ二量体抗体」又は「ヘテロ二量体フラグメント」又は「ヘテロ二量体」という用語は本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子又は第１及び第２のドメインのような少なくとも第１及び第２のポリペプチドを含む部分を含み、ここで、第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは２本のポリペプチド鎖を含み、第１鎖は少なくとも１つの第２鎖と非同一なドメインを有し、両方の鎖は集合する、すなわちそれらの非同一ドメインを介して相互作用する。具体的には、ヘテロ二量体免疫グロブリンは少なくとも２つのドメインを含み、第１のドメインは第２のドメインと同一ではなく、両方のドメインが集合する、すなわちそれらのタンパク質−タンパク質界面を介して相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、少なくとも２つの異なるリガンド、抗原又は結合部位に対して結合特異性を有する、すなわち二重特異性である。 
【００３５】
「原子価」という用語は本明細書で使用される場合、抗体中の結合部位の数を指す。２以上の原子価を持つ抗体は多価と呼ばれ、多価抗体の非限定的な例としては、２つの結合部位を特徴とする二価抗体、３つの結合部位を特徴とする三価抗体、及び４つの結合部位を特徴とする四価抗体が挙げられる。
【００３６】
「単一特異性抗体」という用語は本明細書で使用される場合、全てが同じエピトープを結合する、１つ又は複数の結合部位を有する任意の抗体又はフラグメントを指す。
【００３７】
「多重特異性抗体」という用語は本明細書で使用される場合、同じ抗原又は異なる抗原の異なるエピトープを結合できる２以上結合部位を有する任意の抗体又はフラグメントを指す。多重特異性抗体の非限定的な例は、二重特異性抗体である。
【００３８】
「二重特異性抗体」という用語は、同じ抗原の２つの異なるエピトープ、又は２つの異なる抗原を結合できる２つの結合部位を有する任意の抗体を指す。
【００３９】
「抗原」という用語は本明細書で使用される場合、それに抗体が特異的に結合できる任意の分子を指す。抗原の例としては、ポリペプチド、タンパク質、多糖及び脂質分子が挙げられる。抗原には、１つ又は複数のエピトープが存在し得る。「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は本明細書で使用される場合、抗体との直接的な化学的相互作用を引き起こす抗原の部分を指す。
【００４０】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書で使用される場合、全て同じ単一細胞に由来するクローン細胞によって産生され、標的抗原の同じエピトープを特異的に結合する抗体を指す。治療用抗体が産生される場合、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体を生成することが好ましい。実際に、モノクローナル抗体は単一のクローンに起源を持つ細胞によって産生され、全て同じエピトープを結合するが、ポリクローナル抗体は異なる免疫細胞によって産生され、特定の抗原の複数のエピトープを認識する。モノクローナル抗体は、バッチ間の均一性、交差反応性の低下、及び標的に対する高い特異性を保証する。組換えＤＮＡを使用して、例えば宿主細胞でモノクローナル抗体を発現させて、組換え抗体を生じることができる。
【００４１】
「組換え抗体」という用語は本明細書で使用される場合、組換えＤＮＡの使用を伴う任意のプロセスによって産生された抗体を指す。組換え抗体は、免疫原性、結合親和性、分子サイズ、特異性、半減期及びフォーマット等の特性を改善するように設計され得る。組換え抗体の例としては、操作抗体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体（ヒト化抗体等）、完全ヒト抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ操作抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体等）、単量体抗体及び多量体抗体（ホモ二量体抗体及びヘテロ二量体抗体等）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
「キメラ抗体」という用語は本明細書で使用される場合、可変領域が１つの種に由来し、それが別の種に由来する定常領域に融合される抗体を指し、キメラ抗体の非限定的な例としては、マウス可変領域がヒト定常領域に融合される抗体が挙げられる。
【００４３】
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は本明細書で使用される場合、ある種に由来するＣＤＲが別の種のフレームワーク領域にグラフトされる抗体を指し、ＣＤＲグラフト抗体の非限定的な例は、マウス等の哺乳動物種に由来するＣＤＲがヒトフレームワーク領域にグラフトされたヒト化抗体である。
【００４４】
「細胞トランスフェクション」という用語は、真核細胞への外来遺伝物質の導入を指す。人工的に導入された核酸によって体系化されたタンパク質が細胞によって発現されると、遺伝子改変細胞にそれぞれの野生型形態とは異なる特性が与えられる。導入される核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。外因性核酸を宿主細胞に導入するために一般的に使用される手法の例としては、リン酸カルシウム、リポソーム、カチオン性ポリマー又はデンドリマー等のトランスフェクション試薬によってトランスフェクションが媒介される化学物質に基づく方法；エレクトロポレーション及びマイクロインジェクション等の物理学に基づく方法；及びウイルス感染が遺伝子送達を媒介する、ウイルスに基づく方法が挙げられる。これらの手法を使用して、一過性の又は安定したトランスフェクションを実現することができる。一過性トランスフェクションでは、核酸配列は宿主細胞のゲノムに組み込まれないため、外因性遺伝物質によって体系化されたタンパク質の発現は時間が限定されるのに対し、細胞が外来遺伝物質をそれらのゲノム中に一体化すると安定なトランスフェクションが達成され、安定なトランスフェクト細胞株をもたらす。
【００４５】
「宿主細胞」という用語は、外来核酸が直接導入された細胞及びその子孫を含む、トランスフェクトされた核酸物質によって体系化されたタンパク質が発現される全ての細胞を指す。抗体の発現に適した細胞株としては、細菌、哺乳動物、昆虫、植物及び酵母の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。治療用抗体の発現及び生産によく使用される細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞、ヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞等の哺乳胴動物細胞株である。宿主細胞は、それらの成長及び抗体の発現を助ける条件で培養される。最適な培養条件は、細胞培養培地の処方、バイオリアクターの操作パラメーター、栄養供給様式及び培養時間を含む幾つかのパラメーターの制御及び調整によって得られる。培養培地の処方は、好ましい細胞の生存率及び繁殖に合わせて最適化する必要があり、細胞培養培地の成分の例としては、必須アミノ酸、塩、グルコース、増殖因子及び抗生物質が含挙げられるが、これらに限定されない。重要なバイオリアクターの操作パラメーターは、温度、ｐＨ、攪拌速度、酸素負荷及び二酸化炭素レベルである。栄養素を様々な方法で供給することができ、バッチモード培養では、必要な栄養素の全てが最初の基本培地に存在し、廃棄物を蓄積しながら使い尽くされるまで使用する；流加培養では、栄養素の枯渇を防ぎ、培養期間を延長するため、追加のフィード培地を供給する；それらとは異なり、灌流様式では、培養中の細胞は、細胞廃棄物を除去するバイオリアクターを流れる栄養素を含む新鮮な培地を継続的に補充される。培養期間は、細胞が一定量の生成物を産生するのに十分な長さが必要であるため重要であるが、細胞の生存率を損なうほど長すぎてはならない。
【００４６】
「採取された抗体材料」という用語は、細胞培養により得られた、宿主細胞により発現された抗体を含む材料を指す。採取された抗体材料は、最初に宿主細胞培養物を採取すること、および次いで、遠心分離及び／又は濾過の工程により細胞片を除去できる清澄化のプロセスに採取物を供することにより製造され得る。
【００４７】
「ウイルスクリアランス」という用語は、目的の材料を汚染する可能性のあるウイルスを効果的に除去及び／又は不活性化する任意の処理を指す。治療用抗体の精製プロセスに適用される場合、ウイルスクリアランスとは、ウイルスの不活性化又は抗体含有材料からのウイルス除去をもたらす任意の方法を指す。
【００４８】
「ウイルス不活化」という用語は、ウイルスが生体サンプルに感染すること又は複製することができないようにする任意の処理を指す。ウイルス不活化は、ウイルスエンベロープの可溶化によりウイルスの不活化を引き起こす、溶媒及び界面活性剤（Ｓ／Ｄ）との生体サンプルのインキュベーション、ウイルスタンパク質の変性をもたらす、低又は高ｐＨでのインキュベーション、高温によりウイルスタンパク質の変性が達成される、殺菌処理、等の様々な手法によって実現され得る。
【００４９】
「インキュベーション」という用語は、特定の条件で或る材料を維持する操作を指し、そのためにその材料が修飾を受ける条件を含む。ウイルス不活性化のプロセスでは、ウイルス不活性化を引き起こす化学的特性を有する溶液との或る材料のインキュベーションは、活性なウイルス汚染物質を含まない材料の生成をもたらす。
【００５０】
「溶媒界面活性剤処理」という用語は、有機溶媒等の溶媒との、又は有機溶媒及び界面活性剤との採取された抗体材料のインキュベーションを指す。
【００５１】
「高ｐＨ処理」という用語は、採取した抗体材料のｐＨが７を超えるバッファー液とのインキュベーションを指す。
【００５２】
「ウイルス除去」という用語は、処理されたサンプルからのウイルス粒子の物理的分離を可能にする処理を指す。治療用タンパク質の精製プロセスでは、ウイルス除去は濾過工程によって行われる。さらに、クロマトグラフィー工程等の精製プロセスの他のフェーズは、ウイルス粒子の除去を助ける。
【００５３】
「濾過」という用語は、固体を流体から分離する操作を指す。
【００５４】
「クロマトグラフィー」という用語は、クロマトグラフィーカラムの固定相と相互作用する化合物の能力に基づいて混合物の化合物を分離する操作を指し、クロマトグラフィーカラムの固定相から化合物を保持又は溶出することができる。
【００５５】
「ウイルス不活化アッセイ」及び「ウイルス除去検証（ＶＲＶ：ｖｉｒａｌ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）」という用語は本明細書で使用される場合、互換的であり、効果的なウイルス減少を試験するための手順を指す。ウイルス不活化アッセイを行うために、サンプル中のウイルスの存在を、既知量のストックウイルスでスパイクする前後に、アウトプットウイルス力価をそれぞれのロードウイルス力価と比較することにより測定する。ｌｏｇ１０減少係数（ＲＦ）を、次の式に従って次いで決定できる：ＲＦ＝ｌｏｇ１０｛インプットウイルス力価×インプットボリューム／アウトプットウイルス力価×アウトプットボリューム｝。ウイルスの不活化／除去を次の通り記載できる：ＲＦが４  ｌｏｇ１０を超える場合、「有効」；ＲＦが２  ｌｏｇ１０〜４  ｌｏｇ１０の間に含まれる場合、「適度に有効」；ＲＦが１  ｌｏｇ１０〜２  ｌｏｇ１０の間に含まれる、「ウイルス減少に対する貢献」；ＲＦが１  ｌｏｇ１０未満の場合、「無効」。
【００５６】
本発明では、開始抗体採取材料はモノクローナル抗体を含む。好ましくは、モノクローナル抗体は組換え体である。本発明の特定の実施形態では、モノクローナル組換え抗体はヘテロ二量体二重特異性抗体である。
【００５７】
本発明では、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、ＢＥＡＴ（登録商標）技術（国際公開第２０１２１３１５５５号）により生成され得る。本発明の一実施形態では、ＢＥＡＴ（登録商標）１と呼ばれる二重特異性抗体は、Ｔ細胞により発現される分化クラスター３（ＣＤ３）及び乳癌細胞でしばしば過剰発現されるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を結合する。別の実施形態では、ＢＥＡＴ（登録商標）２と呼ばれるモノクローナル二重特異性抗体（配列番号１、配列番号２及び配列番号３）は、多発性骨髄腫細胞で過剰発現されるＣＤ３及び分化クラスター３８（ＣＤ３８）を結合する。別の実施形態では、モノクローナル二重特異性抗体はＢＥＡＴ（登録商標）３（配列番号４、配列番号５及び配列番号６）であり、これはＣＤ３及びＥＧＦＲに結合し、結腸直腸癌を含む様々なタイプの癌の標的であることが知られている。別の実施形態では、Ａｂ１と呼ばれるモノクローナル抗体（配列番号７及び配列番号８）は、自己免疫疾患及び炎症性疾患に関与するＯＸ４０受容体を標的とするＩｇＧ１である。
【００５８】
本発明の抗体は、細胞トランスフェクションにより宿主細胞で発現される。本発明で採用される細胞トランスフェクション法としては、トランスフェクション試薬を利用する化学物質に基づく方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に適したトランスフェクション試薬としては、リン酸カルシウム、リポソーム、カチオン性ポリマー及びデンドリマーが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、細胞トランスフェクションはカチオン性ポリマーにより実施される。カチオン性ポリマーの非限定的な例は、ジエチルエタノールアミン及びポリエチレンイミンである。本発明の特定の実施形態では、カチオンポリマーはポリエチレンイミンである。
【００５９】
本発明の特定の態様によれば、抗体産生に利用される宿主細胞株としては真核細胞株が挙げられるが、これに限定されない。本発明の一実施形態では、宿主細胞株は哺乳動物細胞株である。より具体的な実施形態では、哺乳動物細胞株は非ヒト細胞株である。本発明の更により具体的な実施形態では、哺乳動物細胞株はＣＨＯ細胞株、特にＣＨＯ−Ｓ細胞株である。
【００６０】
本発明の宿主細胞は、溶存Ｏ２が空気飽和の４０％に維持され温度が３７℃に維持される、動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ：ａｎｉｍａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｆｒｅｅ）培地を含む２５０Ｌ作業容量の単回使用バイオリアクターで培養され得る。培養はフィードバッチ培養であってもよく、この場合、フィードは接種後３日目に開始される。フィードの毎日の大量投与をバイオリアクターに行う。フィード開始後１１日目又は細胞生存率が８０％若しくは８５％に達した際に培養物を採取する。
【００６１】
本発明では、ウイルス不活化抗体溶液は、採取された抗体材料から調製され得る。特に、採取された抗体材料は、宿主細胞培養物のバルク採取物の清澄化の生成物である。本発明の特定の実施形態では、採取された抗体材料は、「デッドエンド」深層濾過を含む濾過工程に続いて０．２μｍフィルターによる無菌濾過によりバルク採取物を清澄化することにより調製される。
【００６２】
採取された抗体材料はクロマトグラフィーカラムにロードされ得る。本発明の特定の実施形態では、採取された抗体材料を、プロテインＡ（ＰＡ）クロマトグラフィーにロードする。プロテインＡクロマトグラフィーにロードされる採取された抗体材料を「ＰＡロード」とも呼ぶ。収集した溶液を「ＰＡ溶出液」と呼ぶ。本発明では、プロテインＡクロマトグラフィーの樹脂を、最初にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でｐＨ７．４に平衡化する。本発明の特定の実施形態では、次いでカラムを洗浄し（例えば、トリス及び／又はアセテートによって）、グリシン又はアセテート等の溶出バッファーを使用してカラムから抗体を溶出する。本発明の一態様では、プロテインＡ溶出液を約５以上７以下のｐＨ、より具体的には、５．５以上６．５以下のｐＨに中和する。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では、ウイルス不活性化は、溶媒洗浄処理により実施される。本明細書に開示される方法に有用な有機溶媒としては、リン酸ｔｒｉ−（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ）のようなリン酸ジアルキルが挙げられる。有機溶媒の濃度は、約０．１％（重量／重量）以上約１％（重量／重量）以下であってよい。特に、有機溶媒の濃度は、約０．１％（重量／重量）、約０．２％（重量／重量）、約０．３％（重量／重量）、約０．４％（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）、約０．６％（重量／重量）、約０．７％（重量／重量）、約０．８％（重量／重量）、約０．９％（重量／重量）又は約１％（重量／重量）からなる群から選択される。より詳しくは、有機溶媒の濃度は、少なくとも約０．１％（重量／重量）、少なくとも約０．３％（重量／重量）、少なくとも約０．５％（重量／重量）又は少なくとも約１％（重量／重量）である。特定の好ましい実施形態では、有機溶媒の濃度は、約０．２％（重量／重量）以上約０．４％（重量／重量）以下である。特に、有機溶媒の濃度は、約０．２％（重量／重量）、又は約０．３％（重量／重量）、又は約０．４％（重量／重量）である。より好ましくは、有機溶媒の濃度は約０．３％（重量／重量）である。本発明はまた、上記の濃度の間の０．１％（重量／重量）、０．２％（重量／重量）、０．３％（重量／重量）、０．４％（重量／重量）、０．５％（重量／重量）、０．６％（重量／重量）、０．７％（重量／重量）、０．８％（重量／重量）、０．９％（重量／重量）又は１％（重量／重量）の間隔での有機溶媒の濃度を含む。
【００６４】
本明細書に開示される方法において有用な洗浄剤としては、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）等）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標）等）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ６０（登録商標）等）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）等）等のポリソルベート、及びポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００等）を含む、ポリオキシチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ｐｏｌｙｏｘｅｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ａｌｋｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。「ポリソルベート」及び「Ｔｗｅｅｎ」という用語は本明細書で使用される場合、互換的である。洗浄剤の濃度は、約０．１％（重量／重量）以上約２％（重量／重量）以下であり、特に、洗浄剤の濃度は０．２％（重量／重量）以上１．５％（重量／重量）以下である。本発明のより具体的な実施形態では、洗浄剤の濃度は、０．７５％（重量／重量）以上１．２５％（重量／重量）以下である。より具体的には、洗浄剤の濃度は、約０．１％（重量／重量）、約０．２％（重量／重量）、約０．３％（重量／重量）、約０．４％（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）、約０．６％（重量／重量）、約０．７％（重量／重量）、約０．８％（重量／重量）、約０．９％（重量／重量）、約１％（重量／重量）、約１．２％（重量／重量）、約１．５％（重量／重量）、約１．７％（重量／重量）、又は約２％（重量／重量）からなる群から選択される。より詳しくは、有機溶媒の濃度は、少なくとも約０．２％（重量／重量）、少なくとも約０．５％（重量／重量）、少なくとも約０．７５％（重量／重量）、少なくとも約１％（重量／重量）又は少なくとも約１．２５％（重量／重量）である。特定の好ましい実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．７５％（重量／重量）、又は約１％（重量／重量）又は約１．２５％（重量／重量）である。より好ましい実施形態では、洗浄剤の濃度は約１％（重量／重量）である。本発明はまた、上記濃度の間の０．０５％（重量／重量）、０．１％（重量／重量）、０．２％（重量／重量）、０．３％（重量／重量）、０．４％（重量／重量）、０．５％（重量／重量）、０．６％（重量／重量）、０．７％（重量／重量）、０．８％（重量／重量）、０．９％（重量／重量）又は１％（重量／重量）の間隔での有機溶媒の濃度を含む。
【００６５】
本発明の一態様では、抗体含有材料は、約５分以上約１２０分以下のインキュベーション時間の間溶媒若しくは洗浄剤、又は溶媒と洗浄剤の混合物とインキュベートされる。具体的には、インキュベーション時間は、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約６０分、約９０分及び約１２０分を含む群から選択される。より具体的には、上記インキュベーション時間は、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約６０分、少なくとも約９０分、及び少なくとも約１２０分である。さらにより具体的には、インキュベーション時間は３０分以上９０分以下であり、好ましくはインキュベーション時間は６０分である。本発明はまた、上記のインキュベーション間隔の間の１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、７５分又は９０分の間隔での溶媒及び洗浄剤のインキュベーション時間を含む。
【００６６】
本発明の一実施形態では、最終濃度が約０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）〜約１％重量／重量）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００であるように、抗体含有溶液をＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理する。この実施形態の別の態様では、最終濃度が約０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）〜約１％（重量／重量）のポリソルベート８０であるように、抗体含有溶液をＴｎＢＰ及びポリソルベート８０で処理する。この実施形態の別の態様では、最終濃度が約０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）〜約１％（重量／重量）のポリソルベート２０であるように、抗体を含む溶液をＴｎＢＰ及びポリソルベート２０で処理する。
【００６７】
本発明の一態様では、抗体を含む溶液はＰＡ溶出液である。特定の態様では、ＰＡ溶出液を、約０．１％（重量／重量）ＴｎＢＰ、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ、又は約０．５％（重量／重量）ＴｎＢＰ、又は約１％（重量／重量）ＴｎＢＰ、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．５％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約１％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）ポリソルベート８０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．５％（重量／重量）ポリソルベート８０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約１％（重量／重量）ポリソルベート８０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）ポリソルベート２０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．５％（重量／重量）ポリソルベート２０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約１％（重量／重量）ポリソルベート２０で処理する。より具体的な態様では、ＰＡ溶出液を、約０．２％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又は約０．５％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又は約０．５％（重量／重量）ポリソルベート８０、又は約１％（重量／重量）ポリソルベート８０、又は約０．２％（重量／重量）ポリソルベート２０、又は約０．５％（重量／重量）ポリソルベート２０、又は約１  ％（重量／重量）ポリソルベート２０と組み合わせた約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰで処理する。
【００６８】
本発明のより具体的な態様では、抗体を含む溶液はＰＡ溶出液であり、ＰＡ溶出液は０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰと１％（重量／重量）ポリソルベート８０の混合物と室温で少なくとも１０分間、好ましくは室温で約６０分間インキュベートされる。
【００６９】
本発明の別の態様では、抗体含有溶液はＰＡロードであり、ＰＡロードは、約１％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又は約１％（重量／重量）ポリソルベート８０、又は約１％（重量／重量）ポリソルベート２０と組み合わせた約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰで処理される。
【００７０】
本発明の特定の態様では、ＰＡロードは、先に明示されるインキュベーション時間の間、溶媒若しくは洗浄剤、又は溶媒と洗浄剤の混合物とインキュベートされる。さらに、上記溶媒若しくは上記洗浄剤、又は上記溶媒と洗浄剤の混合物とインキュベートされた上記ＰＡロードはＰＡクロマトグラフィーカラムにロードされ、ローディング時間は約７時間以下である。特定の実施形態では、ローディング時間は約３時間である。好ましくは、インキュベーション時間及びローディング時間の合計は７時間以下である。
【００７１】
本発明のより具体的な態様では、抗体を含む溶液はＰＡロードであり、ＰＡロードを、ＰＡクロマトグラフィーカラムにロードする前に０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）ポリソルベート８０の混合物と少なくとも５分間、好ましくは室温で６０分間インキュベートする。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、ウイルス不活性化の方法は高ｐＨ処理である。本明細書に開示される方法において有用なバッファー液としては、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、リン酸塩、ＮａＯＨを含むが、これらに限定されないアルカリ溶液が挙げられる。バッファー液のｐＨは、約７．５以上約１４以下であり得る。特に、バッファー液のｐＨは、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１、約１１．５、約１２、約１２．５、又は約１３、又は約１３．５、又は約１４の群から選択される。より具体的な実施形態では、バッファー液のｐＨは約１０以上約１２以下であり、より具体的には、バッファー液のｐＨは約１０．５以上約１１．５以下である。具体的には、バッファー液のｐＨは少なくとも１０．５であり、より具体的には、バッファー液のｐＨは約１１．５であり、より好ましくは約１１．２、更により好ましくは約１１である。本発明はまた、上記のｐＨ値の間の０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１の間隔でｐＨ値を含む。この実施形態の特定の態様では、抗体を含む溶液はＰＡ溶出液であり、ＰＡ溶出液はリン酸塩２５０ｍＭ、ＮａＯＨ  ０．１Ｍ及びＮａＯＨ  ０．５Ｍで処理される。
【００７３】
本発明の一実施形態では、抗体含有材料を、約１分以上約４時間以下のインキュベーション時間に亘り高ｐＨでインキュベートする。具体的には、インキュベーション時間は、約１分、約５分、約１０分、約３０分、約４５分、約６０分、約９０分、約２時間、約３時間及び約４時間を含む群から選択される。より具体的には、上記インキュベーション時間は、少なくとも約１分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約６０分、少なくとも約９０分、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間及び少なくとも約４時間である。更により具体的には、インキュベーション時間は３０分以上９０分以下であり、好ましくはインキュベーション時間は６０分である。本発明はまた、上記のインキュベーション間隔の間の１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、７５分、９０分又は１２０分の間隔での高ｐＨインキュベーション時間も含む。
【００７４】
プロテインＡクロマトグラフィー及びウイルス不活化処理後に、又はウイルス不活化処理及びプロテインＡクロマトグラフィー後に、抗体を含む溶液を他のクロマトグラフィー及び濾過工程で更に処理して抗体を更に精製及び濃縮し、治療用抗体を含む原薬を製造することができる。本発明の一態様では、バルク原薬の製造方法が開示される。バルク原薬の製造方法は、（ａ）溶媒洗浄剤処理によるウイルス不活性化、（ｂ）プロテインＡクロマトグラフィー精製、（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、（ｄ）限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、（ｅ）陰イオン交換膜吸収剤、（ｆ）ウイルスナノ濾過、（ｇ）ＵＦ／ＤＦ、（ｈ）賦形剤の添加及び濃度調整、の結果としての工程（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ  ｓｔｅｐｓ）；又は（ａ’）プロテインＡクロマトグラフィー精製、（ｂ’）溶媒洗浄剤処理によるウイルス不活性化、（ｃ’）ＣＥＸ、（ｄ’）ＵＦ／ＤＦ、（ｅ’）陰イオン交換膜吸収剤、（ｆ’）ウイルスナノ濾過、（ｇ’）ＵＦ／ＤＦ、（ｈ’）添加剤の添加及び濃度調整の結果としての工程、又は（ａ’’）プロテインＡクロマトグラフィー精製、（ｂ’’）高ｐＨ処理、（ｃ’’）ＣＥＸ、（ｄ’’）ＵＦ／ＤＦ、（ｅ’’）陰イオン交換膜吸収剤、（ｆ’’）ウイルスのナノ濾過、（ｇ’’）ＵＦ／ＤＦ、（ｈ’’）添加剤の添加及び濃度調整、の結果としての工程を含んでもよい。
【００７５】
本発明のより具体的な態様では、バルク原薬の製造方法は、撹拌下で６０分間ＴｎＢＰ  ０．３％（重量／重量）及びポリソルベート８０  １％（重量／重量）での溶媒洗浄剤処理により採取された抗体材料のウイルス不活性化を最初に行うことからなる。次いで、ウイルス不活化溶液のプロテインＡクロマトグラフィーを行い、得られたＰＡ溶出液をｐＨ６．０に中和し、０．２μｍ濾過を行い、次に、中和された中間ＰＡ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにロードし、生成物を０．２μｍフィルターに通す。次いで、抗体を２５ｍｇ／ｍＬの目標に濃縮し、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）システムにより５０ｍＭヒスチジンｐＨ６．５で透析する。次いで、生成物を０．２μｍ濾過し、フロースルーモードでの陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー用の正に帯電したＮａｔｒｉＦｌｏの使い捨てメンブレンで精製する。その後、溶出液を０．２μｍ濾過する。次に、物理的にウイルスを除去するため、生成物を使い捨てのミキシングバッグに無菌的に接続されたＶｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＨＦでナノ濾過する。０．２濾過済の予備製剤バッファー、５ｍＭクエン酸塩  ｐＨ６．０へのバッファー交換のために２回目のＵＦ／ＤＦを行う。次いで、得られた生成物を０．２μｍフィルターで濾過する。最終製剤バッファー中の６ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するために、生成物を計算量の５ｍＭクエン酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０  ｐＨ５．９と混合し、０．２μｍ濾過する。次いで、得られた生成物を０．２μｍフィルターで濾過した後、ポリオレフィン単層フィルムで構成される滅菌バッグに充填し、−８０±２０℃で凍結保存する。
【００７６】
本発明の別の特定の実施形態では、バルク原薬の製造方法は、清澄化された採取物をプロテインＡクロマトグラフィーにまず通すこと、それに続く室温でのインキュベーション時間６０分に亘る高ｐＨ（目標ｐＨ＝１１）でのＰＡ溶出液のインキュベーションからなる。次に、ウイルス不活化溶液をｐＨ５．５に中和し、０．２μｍ濾過する。次いで、中和された中間ＰＡ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにロードし、生成物を０．２μｍフィルターに通す。次いで、抗体を２５ｍｇ／ｍＬの目標に濃縮し、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）システムにより５０ｍＭヒスチジンｐＨ６．５で透析する。次いで、生成物を０．２μｍ濾過し、フロースルーモードでの陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー用の正に帯電したＮａｔｒｉＦｌｏの使い捨てメンブレンで精製する。その後、溶出液を０．２μｍ濾過する。次に、物理的にウイルスを除去するため、生成物を使い捨てのミキシングバッグに無菌的に接続されたＶｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＨＦでナノ濾過する。０．２μｍ濾過済の予備製剤バッファー、５ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭアルギニン一塩酸塩、ｐＨ６．０へのバッファー交換のために２回目のＵＦ／ＤＦ工程を行う。最終製剤バッファー中の６ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するために、生成物を計算量の５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０と混合する。次いで、得られた生成物を０．２μｍフィルターで濾過した後、ポリオレフィン単層フィルムで構成される滅菌バッグに充填し、−８０±２０℃で凍結保存する。
【００７７】
本発明の特定の実施形態では、モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定化剤を含む液体医薬製剤が開示される。
【００７８】
「液体」製剤は本明細書で使用される場合、液体形式で調製されたものである。かかる製剤は、被験体への直接投与に適している可能性があり、代替的には、液体形態、凍結状態、又は後で液体形態若しくは被験体への投与に適した他の形態に再構成する乾燥形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存用に包装することが可能である。 
【００７９】
「バッファー」という用語は本明細書で使用される場合、その酸−塩基複合体成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝された溶液を指す。本発明のバッファーは、約５．０〜約７．０の範囲のｐＨを有し、好ましくは６．０±０．５である。この範囲でｐＨを制御できるバッファーの例としては、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウム等）、グルコン酸塩、ヒスチジン（例えばＬ−ヒスチジン）、クエン酸塩、リン酸塩及び他の有機酸バッファーが挙げられる。
【００８０】
典型的な界面活性剤の例としては、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート）、グリセリン脂肪酸エステル（例えば、グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート、グリセリンモノステアレート）、ポリグリセリン脂肪酸エステル（例えば、デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート）、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビトールテトラオレエート）、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ポリエチレングリコールジステアレート）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（例えば、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）、ポリオキシエチレンミツロウ誘導体（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールミツロウ）、ポリオキシエチレンラノリン誘導体（例、ポリオキシエチレンラノリン）、及びポリオキシエチレン脂肪酸アミド（例えば、ポリオキシエチレンステアリルアミド）等の非イオン性界面活性剤（ＨＬＢ６〜１８）；Ｃｉｏ−Ｃｉｓアルキル硫酸塩（例：セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム）、平均２モル〜４モルのエチレンオキシドを含むポリオキシエチレンＣｉｏ−Ｃｉｓアルキルエーテル硫酸塩（例えば、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム）、及びＣｓ−Ｃｉｓアルキルスルホコハク酸エステル塩（例えば、ラウリルスルホコハク酸ナトリウムエステル）；並びにレシチン、グリセロホスホ脂質、スフィンゴホスホ脂質（例えばスフィンゴミエリン）、及びＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のショ糖エステル等の天然界面活性剤が挙げられる。好ましくは、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される。特に好ましくは、界面活性剤はポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１及び８５であり、最も好ましくはポリソルベート８０である。
【００８１】
タンパク質を安定化するために、製剤に安定化剤を添加してもよい。上記安定化は、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、ショ糖、ポリオール、糖、ヒスチジン、アルギニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニン一塩酸塩、グリシン、メチオニン、プロリン、リジン、グルタミン酸等のアミノ酸、アミン及びトレハロースを含む群から選択される。
【００８２】
本発明の特定の実施形態では、モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定化剤を含む液体医薬製剤を開示し、ここで上記モノクローナル抗体が約０．０１ｍｇ／ｍＬ以上約１００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、好ましくは約６ｍｇ／ｍＬの濃度で上記医薬製剤中に存在し、上記バッファーが約５ｍＭの濃度で上記医薬製剤中に存在するクエン酸塩であり、上記界面活性剤が約０．０６％の割合で上記医薬製剤中に存在するポリソルベートであり、上記安定化剤が約１５％の割合で上記医薬製剤中に存在するスクロースであり、ここで医薬製剤は約５．９のｐＨを有する。
【００８３】
本発明の別の実施形態では、モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定化剤を含む液体医薬製剤を開示し、ここで上記モノクローナル抗体が約０．０１ｍｇ／ｍＬ以上約１００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、好ましくは約６ｍｇ／ｍＬの濃度で上記医薬製剤中に存在し、上記バッファーが約５ｍＭの濃度で上記医薬製剤中に存在するクエン酸塩であり、上記界面活性剤が約０．０６％の割合で上記医薬製剤中に存在するポリソルベートであり、上記安定化剤が約１５％の割合で上記医薬製剤中に存在するスクロース、及び約１２０ｍＭの濃度で上記医薬製剤に存在するＬ−アルギニン一塩酸塩であり、ここで医薬製剤は約６．０のｐＨを有する。
【００８４】
ウイルス不活化アッセイは、抗体溶液の純度を試験し、ウイルス安全性を確保するために必要である。本発明の好ましい実施形態では、抗体含有溶液をモデルウイルスでスパイクし、サンプル中のウイルスの存在をスパイクの前後に測定する。モデルウイルスとしては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明は、古典的に採用されている低ｐＨ処理の代替として使用できるウイルス不活性化の方法を提案する。これらの代替方法は、精製する治療用抗体が低ｐＨ不安定である場合、及び／又は低ｐＨが精製プロセスに適合しない場合に特に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】低ｐＨによるウイルス不活性化、ラン１、単量体ＨＰＬＣ−ＳＥの％を示す図である。
【図２】低ｐＨによるウイルス不活化、ラン１；ＨＰＬＣ−ＳＥによる（Ａ）凝集物及び（Ｂ）ショルダーを示す図である。
【図３】低ｐＨ処理後の分解サンプルのＨＰＬＣ−ＳＥプロファイルを示す図である。
【図４】低ｐＨ処理後のＨＰＬＣ−ＨＩＣ結果、％メインピークを示す図である。
【図５】低ｐＨ処理後のＨＰＬＣ−ＨＩＣ結果、％凝集物＋ショルダーを示す図である。
【図６】低ｐＨでのウイルス不活化＋ＮａＣｌスパイク：ＨＰＬＣ−ＳＥの結果を示す図である。
【図７】低ｐＨでのウイルス不活化＋ＮａＣｌスパイク：ＣＧＥの結果を示す図である。
【図８】カプリル酸インキュベーション：ＨＰＬＣ−ＳＥの結果を示す図である。
【図９】カプリル酸インキュベーション：ＨＰＬＣ−ＨＩＣの結果を示す図である。
【図１０】ＢＥＡＴ（登録商標）２高ｐＨ保持時間の影響−ＳＥ−ＨＰＬＣを示す図である。
【図１１】ＢＥＡＴ（登録商標）２高ｐＨ保持時間の影響−ＮＲ  ＣＧＥを示す図である。
【図１２】ＢＥＡＴ（登録商標）２高ｐＨ保持時間の影響−還元ＣＧＥを示す図である。
【図１３】ＢＥＡＴ（登録商標）２高ｐＨ保持時間の影響−ＩＣＥを示す図である。
【図１４】用量反応曲線及びＥＣ５０値を示す図である。
【図１５】低ｐＨインキュベーション後のＨＰＬＣ−ＳＥによる単量体％を示す図である。
【図１６】低ｐＨインキュベーション後のＨＰＬＣ−ＳＥによるショルダー種及び凝集物％を示す図である。
【図１７】低ｐＨインキュベーション後の分解サンプルのＨＰＬＣ−ＳＥプロファイルを示す図である。
【図１８】低ｐＨインキュベーション後のサンプルｔ０のＣａｌｉｐｅｒ  ＣＧＥ非還元プロファイルを示す図である。
【図１９】低ｐＨインキュベーション後のサンプルＴ４８ｈのＣａｌｉｐｅｒ  ＣＧＥ非還元プロファイルを示す図である。
【図２０】種々の高ｐＨインキュベーション時間に対するＣＧＥ非還元プロファイルの比較を示す図である。
【図２１】種々の高ｐＨインキュベーション時間に対するＩＣＥプロファイルの比較を示す図である。
【図２２】パイロットスケールのＶＩ高ｐＨランに対するＣＧＥ非還元プロファイルの比較を示す図である。
【図２３】パイロットスケールのＶＩ高ｐＨランに対するＩＣＥプロファイルの比較を示す図である。
【図２４】高ｐＨ処理期間に応じた用量反応曲線及びＥＣ５０を示す図である。
【図２５】高ｐＨ処理速度論を示す図である。
【図２６】Ａｂ１高ｐＨ保持時間の影響−ＳＥ−ＨＰＬＣを示す図である。
【図２７】Ａｂ１高ｐＨ保持時間の影響−ＮＲ  ＣＧＥを示す図である。
【図２８】Ａｂ１高ｐＨ保持時間の影響−還元ＣＧＥを示す図である。
【図２９】Ａｂ１高ｐＨ保持時間の影響−ＩＣＥを示す図である。
【図３０】用量反応曲線及びＥＣ５０値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
実施例１：治療用タンパク質の精製プロセスでウイルス不活化工程として一般的に使用される低ｐＨ処理は、低ｐＨ不安定抗体の安定性を損なう
治療用タンパク質精製のプロセスでウイルスを不活性化するために一般的に使用される手法は、低ｐＨでタンパク質含有溶液をインキュベートすることからなる。ここでは、ウイルスを不活性化する低ｐＨ処理の能力、及びモノクローナルヘテロ二量体抗体の安定性に対するその効果を調査した。この調査の結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）１抗体の場合でのように、ウイルス不活化が有効でありかつ抗体の安定性が一般的に維持される低ｐＨ条件は、ＢＥＡＴ（登録商標）２等の低ｐＨ不安定抗体には適さないことを示唆する。この課題を克服するため、ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性及び活性に対するウイルス不活化の代替方法の効果を試験するための追加の研究を行った。この実施例は、（ａ）ＢＥＡＴ（登録商標）１含有プロテインＡ（ＰＡ）クロマトグラフィー溶出液の低ｐＨ処理に関するウイルス除去検証（ＶＲＶ）研究；（ｂ）ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性に対する有効な低ｐＨレベルの影響；代替のウイルス不活化手法を使用する場合に実施される（ｃ）ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性及び（ｄ）活性に関する研究、を示している。
【００８８】
ａ．ＢＥＡＴ（登録商標）１分子含有ＰＡ溶出液の低ｐＨ処理に関するＶＲＶ研究
まず、ＢＥＡＴ（登録商標）１抗体の精製プロセスの工程として、低ｐＨでのＢＥＡＴ（登録商標）１含有ＰＡ溶出液のインキュベーションによるウイルス不活化の有効性を調査した。
【００８９】
材料、方法及び機器
このＶＲＶ研究に使用したモデルウイルスは、内因性ウイルスの関連モデルであるマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）であった。このウイルスモデルの主な特徴を表１に示す。
【表１】
2021506226.tif 000003
【００９０】
低ｐＨ処理を、ＢＥＡＴ（登録商標）１分子含有ＰＡ溶出液に適用した。ＢＥＡＴ（登録商標）１精製プロセスで実施されたＶＲＶ研究中に使用された出発物質を表２に示す。
【表２】
2021506226.tif 000004
【００９１】
ＶＲＶ研究では、試験サンプルを低ｐＨ処理の前に採取し、ウイルス力価について分析した。サンプルを既知量のストックウイルスでスパイクし、アウトプットウイルス力価をそれぞれのロードウイルス力価と比較して、減少係数を計算した。これは、表３に示される「最悪の場合」の条件下で行われた。
【表３】
2021506226.tif 000005
【００９２】
この工程を、図４に示すように、３つの異なるｐＨ条件（設定点、＋０．２及び−０．２）で重複して行った。低ｐＨ不活性化工程の温度（Ｔ）仕様は２０℃〜２５℃である。しかしながら、実施中の目標温度は、最悪の場合のシナリオデータを得るため１６℃であった。
【表４】
2021506226.tif 000006
【００９３】
Ｌｏｇ減少係数を中和ロード（Ｌ）サンプルに関して計算し、サンプルを、異なるインキュベーション時間（ｔ）点、５分、１０分、３０分及び６０分の後に取り出し、その後、異なる低ｐＨ処理の速度論を得るため、０．２５ＭヒスチジンｐＨ１２．０を使用してｐＨ６．０〜ｐＨ８．０に中和する。次いで、サンプルを滴定の直前に氷上に置く。ロードホールド（Ｈ）サンプルを、プロセス期間中１６℃±１℃に保持し、ｔ＝６０分のサンプルを収集する。標準滴定に加えて、ｔ＝６０分のサンプルに対して大量プレーティング（ＬＶＰ）を行った。低ｐＨ不活性化工程中に行われたアッセイの概要を表５に示す。
【表５】
2021506226.tif 000007
【００９４】
結果及び結論
ロードサンプル及びロードホールドサンプルの間にウイルス力価において統計的に有意な変動が観察されなかった場合（注：１  ｌｏｇ１０未満の差は有意でないとみなされる）、これは減少係数の計算に使用されるロードサンプル、又は追加の濾過が行われた場合のロード２サンプル（ＶＲＦ工程のみ）であった。ロードとロードホールドの結果の間には、工程に関係なくウイルス力価の有意な変動は観察されなかったため（追加の濾過が行われたＶＲＦを除く）、ｌｏｇ１０減少係数を実施するためにロードの結果を使用した。
【００９５】
低ｐＨウイルス不活化工程ＢＥＡＴ（登録商標）１を、ＰＡ溶出液を使用してｐＨ３．５、ｐＨ３．７及びｐＨ３．９でのＭＬＶクリアランスに対する効率について評価した。表６は、様々な低ｐＨレベルで得られたｌｏｇ１０値及び実験ごとに計算されたｌｏｇ１０減少係数を示す。
【表６】
2021506226.tif 000008
【００９６】
ウイルス不活化研究は以下を示す：
−ｐＨ３．５での低ｐＨ不活性化は、ラン１及びラン２でそれぞれ５．９４  ｌｏｇ１０及び４．７１  ｌｏｇ１０の減少係数をもたらし、これは低ｐＨ不活性化がｐＨ３．５でＭＬＶに有効であることを意味する。しかしながら、表６に示される結果は、ラン１とラン２の間の変動が１  ｌｏｇ１０を超える差を有して顕著であり（ラン１で０．０８  ｌｏｇ１０、ラン２で１．６６  ｌｏｇ１０）従って反復ランの間で結果を比較できなかったことを示す。しかしながら、ｐＨ３．５での低ｐＨ不活性化は、ｐＨ３．５でのＭＬＶ不活性化の挙動に関するデータを提供するためにのみ実施され、そのためこれらの結果は全体のｌｏｇ減少係数の計算には使用されなかった。
−標準アッセイ（ｔ＝  ６０分の時間点で行ったＬＶＰ）で決定されたように、ｐＨ３．７での低ｐＨ不活性化はＭＬＶウイルスの不活性化に寄与した。２．１９  ｌｏｇ１０及び１．７５  ｌｏｇ１０（それぞれ、ラン１及びラン２）の減少係数が、低ｐＨ不活性化ランから得られた。表６に提示される結果は、ラン１と２の間の変動はラン１について４．１８  ｌｏｇ１０及びラン２について４．２７  ｌｏｇ１０を有して顕著でなく従って反復ランの間で結果を比較できることを示す。
−標準アッセイで（ｔ＝６０分の時間点で行われたＬＶＰ）決定されたように、ｐＨ３．９での低ｐＨ不活性化はＭＬＶウイルスの不活性化に寄与した。１．０５  ｌｏｇ１０及び１．０５  ｌｏｇ１０（それぞれ、ラン１及びラン２）の減少係数が、低ｐＨ不活性化ランから得られた。表６に示される結果は、ラン１とラン２の間の変動はラン１と２の両方で５．４９  ｌｏｇ１０を有して顕著でなく従って反復ランの間で結果は同等であることを示す。
【００９７】
得られた結果に基づいて、ｐＨ３．５での低ｐＨ不活性化はＭＬＶウイルスの不活性化に有効であることが示され、最小減少係数は４．７１  ｌｏｇ１０であった。ｐＨ３．７での低ｐＨ不活性化は、ＭＬＶウイルスの不活性化に寄与することが示され、最小減少係数は１．７５  ｌｏｇ１０であった。ｐＨ３．９での低ｐＨ不活性化は、ＭＬＶウイルスの不活性化に寄与することが示され、最小減少係数は１．０５  ｌｏｇ１０であった。
【００９８】
これらの結果は、モノクローナル抗体の生産プロセスでウイルスの不活性化に従来使用される低ｐＨ処理が、ｐＨ３．５でＭＬＶウイルスを効果的に不活性化できることを示す。
【００９９】
ｂ．低ｐＨに供したＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性研究
次に、他の抗体の安定性に関する研究を実施して、低ｐＨ処理の効果を評価した。特に、ＢＥＡＴ（登録商標）２を低ｐＨでインキュベートした。
【０１００】
材料、方法及び機器
この研究で使用した出発物質は、Ｋａｎｅｋａ製ＫａｎＣａｐＡ樹脂を使用するアフィニティクロマトグラフィーから得られたＰＡ溶出液であった。
【０１０１】
細胞培養を通常、生存率が８０％を下回ったときに終了し、細胞片をデッドエンド深層濾過とそれに続く０．２μｍフィルターでの濾過により除去した。細胞培養上清はＣＨＯ細胞に由来した。
【０１０２】
この研究では異なる出発物質を使用し、出発物質は代表的でないバルク採取物（２つのクローン、小規模バイオリアクター又はウェーブバッグ培養に由来するクローン１及びクローン２）及び代表的なバルク採取物（選択されたクローン１、使い捨てバイオリアクター２５０Ｌ）に由来した。
【０１０３】
インプロセス０．２μｍ濾過工程を通常、ＴＰＰ  ２５０ｍＬフィルタートップ、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して行った。０．２μｍの濾過工程を全てのバッファーと全ての中間体に対して、それらの中間体を直ちに更に処理しない限り行った。バッファーを室温で保管し、プロセス中間体を通常＋５±３℃で保管した。ウイルス不活化研究では、磁気攪拌機及びｐＨメーターのみを使用した。
【０１０４】
出発物質として使用したＰＡ溶出液は、直径１．１ｃｍのＶａｎｔａｇｅ  Ｌカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ及びＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われたプロテインＡ小規模クロマトグラフィー開発実験に由来した。
【０１０５】
採取力価をＰＡ−ＨＰＬＣを使用して決定した。ＰＡ溶出液をＨＰＬＣ−ＳＥで分析して、凝集物及びフラグメントの割合を推定した。しかしながら、ＳＥ−ＨＰＬＣはホモ二量体不純物の残留パーセンテージを判断するには十分ではなかった。したがって、ＰＡ溶出液サンプルを、ルーチンで非還元ＣＧＥによっても分析した。出発物質としてＰＡ溶出液を使用した幾つかのランでは、ウイルス不活化工程の収率を２８０ｎｍでＮａｎｏｄｒｏｐ装置（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により処理する前後の濃度を測定し、計算した。ＢＥＡＴ（登録商標）２のモル吸光係数は１．５２である。ＨＰＬＣ−ＨＩＣ及びｉＣＥ３を使用して、幾つかの実験を分析し、疎水性種及び電荷バリアントに対する処理の効果があるかどうかを調べた。
【０１０６】
結果及び結論
クローン１及びクローン２の細胞培養物からの少量のＰＡ溶出液（約３ｍＬ）を、ＨＣｌ３．７％を使用してｐＨ３．６、ｐＨ３．７、ｐＨ３．８及びｐＨ３．９に酸性化した。ＢＥＡＴ（登録商標）２を、攪拌しながら室温（ＲＴ）で６０分〜１２０分間、低ｐＨでインキュベートした。反応を停止するため、２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０を使用してｐＨをｐＨ６．０又はｐＨ５．５に上げた。この実験を数回繰り返して、結果を確認した。塩が分子に対する保護効果を有するかどうかを観察するため、低ｐＨでのインキュベーション前に最初にＰＡ溶出液をＮａＣｌでスパイクすることにより、同じ研究を行った。様々な濃度、すなわち１５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌを、ｐＨ３．７で９０分間の酸性化と組み合わせて試験した。次いで、生成物をＨＰＬＣ−ＳＥ、ＨＰＬＣ−ＨＩＣ及びＣＧＥ（非還元）により分析した。表７に低ｐＨインキュベーションで試験した条件の概要を示す。
【表７】
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【０１０７】
ＮａＣｌを含まないＰＡ溶出液
クローン２で行った実験でも同様の結果が得られたため、クローン１で得られた結果のみを示している。ＰＡ溶出液で４回繰り返し低ｐＨ実験を行ったが、結果は全て同様であり、それら全てについて比較可能であった。様々な時間点の様々なｐＨでのＨＰＬＣ−ＳＥによる単量体の割合を図１に示す。グラフに示されるように、ｐＨ３．６での最も酸性の高い条件では、単量体の割合が大幅に減少し、それは６０分間のインキュベーション後に９５％から８０％に低下する。ｐＨ３．７での処理は、ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性にも悪影響を及ぼした。ｐＨ３．８及びｐＨ３．９のより低い酸性条件のみが抗体に悪影響を及ぼさなかった。図２は、単量体、凝集物及び「ショルダー」種の分解中に他の種が増加することを示している。単量体のメインピークの前にショルダー種が現れていた。重要な量（１３％）の「ショルダー」種を含むＨＰＬＣ−ＳＥによるプロファイルの例を図３に示す。中和をｐＨ６．０又はｐＨ５．５まで行った、２つの異なる低ｐＨ処理ランのＣＧＥ（非還元）結果を表８に示す。
【表８】
2021506226.tif 000010
【０１０８】
ＣＧＥデータは、フラグメント及び他の種の割合が全ての条件で類似していたことから、インキュベーションのｐＨ及び時間がＢＥＡＴ（登録商標）２の量に影響しないことを示している。ｐＨ５．５での中和は、ＢＥＡＴ（登録商標）２が１％劣っていたことから、ｐＨ６．０での中和と比ベて良好であった。図４及び図５に示すように、ＨＰＬＣ−ＨＩＣによる分解が観察され、メインピークの割合は、凝集物種の増加に伴い、時間と共により酸性のｐＨで減少した。これらの結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）２がｐＨ３．９の条件でのみ安定であることを示しているにもかかわらず、ＢＥＡＴ（登録商標）１での以前の実験は、このｐＨは有効なウイルス不活化作用を持つには十分に酸性ではないことを示した。
【０１０９】
ＮａＣｌを含むＰＡ溶出液
塩を使用してタンパク質の安定性を高め、低ｐＨで処理する前に様々な濃度のＮａＣｌで１つの実験を行って、低ｐＨ処理のもとでＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性が改善されたかどうかを確認した。０．１５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌの様々な濃度をｐＨ３．７で９０分間酸性化する前に試験し、ＨＰＬＣ−ＳＥ及びＣＧＥ非還元をそれぞれ図６及び図７に示す。結果は、ＮａＣｌによりスパイクされた場合でも、ＢＥＡＴ（登録商標）２は低ｐＨで安定でないことを示している。収載されていないＨＰＬＣ−ＨＩＣにより、分解が観察され、メインピークが全ての塩条件で９０分間のインキュベーション後に８２％から６０％に減少した。図７では、ＣＧＥによる変動は観察されなかった。
【０１１０】
これらの実験の結果は、低ｐＨ処理はＢＥＡＴ（登録商標）２抗体精製プロセスに適したウイルス不活化工程ではないことを示している。
【０１１１】
ｃ．代替のウイルス不活化処理に供した場合のＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性の試験
低ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性を損なうことを考慮して、ウイルス不活化の他の方法を試験し、抗体の安定性に対するそれらの影響を調査した。試験した処理は、ＰＡ溶出液の殺菌処理、ＰＡ溶出液のカプリル酸（ＣＡ）処理、ＰＡ溶出液のアルギニン処理、ＰＡ溶出液の溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理、清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理、並びにＰＡ溶出液の高ｐＨ処理を含む。
【０１１２】
材料、方法及び機器
以下のＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性に使用される材料、方法及び機器は、「ｂ．低ｐＨに供したＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性の研究」に記載されるものと同じである。さらに、殺菌に加熱ブロックを使用した。
【０１１３】
結果及び結論
ＰＡ溶出液の殺菌処理
ウイルス不活化の商業プロセスで一般的に使用される殺菌を、低ｐＨ処理の代替として試験した。クローン１及びクローン２のＰＡ溶出液を使用して、ＢＥＡＴ（登録商標）２抗体の安定性に対する殺菌の効果を試験した。ＰＡ溶出液を、２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０を使用してｐＨ６．０に中和した。水浴を使用する３０分間及び６０分間の室温（ＲＴ）及び６０℃でのインキュベーションを含む、様々なインキュベーション条件を試験した。実験後、生成物をＨＰＬＣ−ＳＥ、ＨＰＬＣ−ＨＩＣ及びＣＧＥ（非還元）で分析した。
【０１１４】
沈殿が全ての条件で観察された。表９に処理後の結果の概要を示す。
【表９】
2021506226.tif 000011
【０１１５】
ＨＰＬＣ−ＳＥ及びＨＰＬＣ−ＨＩＣの結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）２が高温で安定でないことを示しており、３０分後でも両方の分析でメインピークの割合が大幅に減少している（ＨＰＬＣ−ＳＥでは９４．６％から４３．４％、ＨＩＣ−ＨＰＬＣでは８８．０から１３．３）。
【０１１６】
これらの結果に基づき、殺菌を更なる調査及び開発のために選択しなかった。
【０１１７】
ＰＡ溶出液のカプリル酸処理
カプリル酸は、ウイルスタンパク質を沈殿させるためのウイルス不活性化に使用可能な沈殿剤である。クローン１由来のＰＡ溶出液を使用して、ＢＥＡＴ（登録商標）２抗体の安定性に対するカプリル酸の効果を試験した。幾つかの濃度のカプリル酸を使用して、最終量を０．２％、０．５％、０．７％及び１％に到達させた。溶出後（ｐＨ４．３付近）又はｐＨ５．５で中和（２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０バッファーを使用する）したＰＡ溶出液を出発物質として使用した。適用したインキュベーション時間は３０分、６０分及び９０分であった。反応を停止するために、珪藻土（ＤＥ）を２ｍＬのＰＡ溶出液生成物に対してＤＥ０．５ｇの比率で使用した。０．２μｍのｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターを、ＤＥにより生成物を精製するために使用した。処理後に、生成物をＨＰＬＣ−ＳＥ、ＨＰＬＣ−ＨＩＣ及びＣＧＥ（非還元）で分析した。表１０にカプリル酸処理の試験条件の概要を示す。
【表１０】
2021506226.tif 000012
【０１１８】
ｐＨ５．５での結果は、０．２％超のカプリル酸で沈殿が観察されたため、示していない。ｐＨ４．３の結果を図８、図９及び表１１に報告する。ＨＰＬＣ−ＳＥの結果は、ｔ＝０分〜ｔ＝３０分、ｔ＝６０分、及びｔ＝９０分を比較すると経時的な分解を示し、単量体の減少（約６％）及び凝集物の増加を伴う。
【表１１】
2021506226.tif 000013
【０１１９】
大幅な分解はＣＧＥ及びＨＰＬＣ−ＨＩＣで認めらなかった。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果によると、ＢＥＡＴ（登録商標）２は低い酸カプリル濃度（０．２％）でも３０分後に安定でない。それにもかかわらず、カプリル酸の毒性及び試薬を除去するためのＤＥ濾過の必要性を考慮して、この代替案を捨て、ウイルス不活化代替法として選択しなかった。
【０１２０】
ＰＡ溶出液のアルギニン処理
アルギニンの使用は、エンベロープモデルウイルスを有効に不活性化することが知られている。この研究では、クローン１由来のＰＡ溶出液を出発物質として使用した。ＰＡ溶出液のｐＨを、ｐＨ４．０、ｐＨ４．７５、ｐＨ４．７９及びｐＨ５．５に調整した。０．３８Ｍ、０．４Ｍ及び０．８Ｍのアルギニンの最終濃度を目標にするため、様々な量のアルギニン（３０ｍＭ酢酸塩中）を添加した。実験を様々なインキュベーション時間：インキュベーション時間なし、６０分間又は１２０分間で行った（表１２を参照されたい）。反応を停止するために、ＰＤ１０をＰＢＳバッファーでのバッファー交換に使用した。
【表１２】
2021506226.tif 000014
【０１２１】
表１３にこの実験の結果を示す。
【表１３】
2021506226.tif 000015
【０１２２】
ｐＨ４．０のＰＡ溶出液はアルギニンとインキュベートされた場合、不安定であることが観察され、実際に、ＨＰＬＣ−ＳＥによる１３％の単量体損失が０．４Ｍアルギニン（９２．７％〜７９．３％）を使用するわずか６０分間のインキュベーション後に、そして８％の単量体損失が０．８Ｍアルギニン（９０．９％〜８２．５％％）と１２０分間インキュベートされた後にあった。ｐＨ４．７５以上の条件では、分解はｐＨ５．５で０．８Ｍアルギニンを最大１２０分使用しても観察されなかった。４．７５以上のｐＨを使用するアルギニン処理は、低ｐＨ処理の代替法の可能性があると考えられた。
【０１２３】
ＰＡ溶出液の溶媒洗浄剤処理
溶媒及び洗浄剤は、エンベロープウイルスのエンベロープの脂質を溶解する能力があるため、ウイルスの不活性化に使用可能である。
【０１２４】
クローン１由来のＰＡ溶出液を出発物質として使用した。最初に（研究１）、ＴｎＢＰ処理を様々な濃度：０．１％、０．３％、０．５％及び１％で試験した。次に（研究２）、ＴｎＢＰとＴｗｅｅｎ  ８０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｗｅｅｎ  ２０のような他の洗浄剤との組み合わせによる処理を試験した（生成物とのインキュベーションの１５分前にＳ／Ｄミックスを調製し、攪拌した）。ＰＤ１０を使用するバッファー交換は、Ｓ／Ｄを除去するのに効率的ではなく、ＰＢＳを使用する４ｇ／Ｌから０．３ｇ／Ｌへの１回の希釈を使用して、反応を停止しようとした。表１４に、ＰＡ溶出液に対してＳ／Ｄを使用して試験した１４の異なる条件の概要を報告する。
【表１４】
2021506226.tif 000016
【０１２５】
研究の第１の部分（研究１）の結果を表１５に報告する。この実験では、各時間点で、ＰＤ−１０バッファー交換を１回行った。
【表１５】
2021506226.tif 000017
【０１２６】
これらの結果は、１２０分間のインキュベーションの間、沈殿が観察され分析結果が得られなかった１％ＴｎＢＰを除く、全てのＴｎＢＰ条件でＢＥＡＴ（登録商標）２が安定であることを示している。分解はＨＰＬＣ−ＳＥによるｔ０以降、０．３％ＴｎＢＰ＋１％Ｔｗｅｅｎ  ８０の条件で認められたが、ＣＧＥ及びＨＰＬＣ−ＨＩＣでは確認されなかった。ＨＰＬＣ−ＳＥ生データの分析後に、凝集物の割合は、処理後のサンプルにＴｗｅｅｎ  ８０が残っているため増加し、Ｔｗｅｅｎ８０は方法に干渉し、実際に、Ｔｗｅｅｎ  ８０の保持時間は凝集物の保持時間に非常に近い。したがって、０．３％ＴｎＢＰ＋１％Ｔｗｅｅｎ  ８０の条件でサンプルの分解は観察されなかった。この第１の実験は、ＰＤ−１０バッファー交換で反応が停止せず、ＨＰＬＣ−ＳＥ分析中にサンプルにＴｗｅｅｎ  ８０がまだ存在していたため、最適ではなかった。次に、他の２つの洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ  ２０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を試験し、各時間点で各サンプルにＰＢＳバッファーを使用する０．３ｇ／Ｌへの希釈を行って反応を停止した（研究２）。表１６にＨＰＬＣ−ＳＥ及びＨＰＬＣ−ＨＩＣの分析を示す。
【表１６】
2021506226.tif 000018
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【０１２７】
表１６は、０．３％ＴｎＢＰをＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と組み合わせて処理したサンプルでは、分解が高濃度（１％）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で見られ、ＨＰＬＣ−ＳＥによりおよそ１５％の凝集物及び８％のフラグメントが見られたことを示す。Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｗｅｅｎ  ２０と組み合わせた０．３％ＴｎＢＰで処理したサンプルでは、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０の条件を除いて、分解の兆候は希釈したＰＡ溶出液と比較してＨＰＬＣ−ＳＥ及びＨＰＬＣ−ＨＩＣで認められなかった。違いは、全てのサンプル条件でｔ＝０分とｔ＝９０分との間で観察されなかった。
【０１２８】
全体として、これらの結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）２が１２０分までのほとんどのＳ／Ｄ処理条件で安定であることを示し、したがって、Ｓ／Ｄ処理はＢＥＡＴ（登録商標）２含有溶液のウイルス不活化の重要な選択肢である。
【０１２９】
清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理（ＰＡロード）
ＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理に関する研究から得られた結果に基づいて、溶媒及び洗浄剤のより良好な除去を確保しそれにより安全性を高めるために、清澄化した採取物に対するＳ／Ｄ処理を試験することにした。
【０１３０】
最初の２つの精製工程は、ＰＡクロマトグラフィーに続くウイルス不活化ではなく、ＰＡクロマトグラフィー及びウイルス不活化であった。
【表１７】
2021506226.tif 000020
【０１３１】
この工程では、ＴｎＢＰをＴｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と組み合わせて使用して、様々な条件を試験した。溶媒と洗浄剤の混合物をＰＡロードに加え、およそ２０分間インキュベートし、Ｋａｎｅｋａ  ＫａｎＣａｐＡ樹脂カラムにロードした。全ての結果を表１８に報告する。
【表１８】
2021506226.tif 000021
2021506226.tif 000022
【０１３２】
同様のパフォーマンスが全てのＳ／Ｄ条件で得られ、ＰＡ溶出液処理（ラン２、ラン３及びラン４）の結果は、収率及び全ての分析データでラン１（Ｓ／Ｄインキュベーションなし）に匹敵するが、それらはわずかに高いＣＶ溶出（３．５〜およそ５）及びより低い濃度値（７．０ｇ／Ｌ〜およそ５ｇ／Ｌ）を有した。Ｔｗｅｅｎ  ８０の除去は効率的であり、ＰＡ精製後にごくわずかなＴｗｅｅｎ  ８０のみが存在した。
【０１３３】
ＰＡ工程の前に実施したＳ／Ｄ処理は、ＰＡの精製によって反応が停止し純度に影響がなかったため、ウイルスの不活性化に使用できる可能性があることが実証された。さらに、後続のＣＥＸクロマトグラフィーは、ＰＡクロマトグラフィー後に存在する残留するわずかなＳ／Ｄを更に除去する。
【０１３４】
様々な洗浄剤で得られた結果は類似していたため、他のプロセス工程で既に使用されているＴｗｅｅｎ  ８０を後続の分析に選択した。したがって、０．３％ＴｎＢＰ＋１％Ｔｗｅｅｎ  ８０を組み合わせた条件を、清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理、及びＢＥＡＴ（登録商標）２含有溶液のウイルス不活性化を考慮した処理のために選択した。
【０１３５】
ＰＡ溶出液の高ｐＨ処理
クローン１からの少量（２０ｍＬ）のＰＡ溶出液を使用して、高ｐＨインキュベーション下でのＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性を試験した。まず、表１９に示されるように、幾つかのバッファーを、目標とするｐＨ１１．０に達するように、０．５Ｍ酢酸塩ｐＨ１２．０、０．５Ｍクエン酸塩ｐＨ１２．０、１ＭトリスｐＨ１２．０、０．２５ＭヒスチジンｐＨ１２．０、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニンｐＨ１２．０、０．２５Ｍリン酸塩ｐＨ１２、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、そして最後に０．５Ｍ  ＮａＯＨで試験した。
【表１９】
2021506226.tif 000023
【０１３６】
全てのバッファーで目標とするｐＨ１１．０に到達したわけではなく、例えば酢酸塩及びクエン酸塩０．５Ｍ  ｐＨ１２．０のトリス１Ｍ  ｐＨ１２．０では到達しなかった。ｐＨ調整用の比体積は、バッファー選択の１つの基準であり、その目的は、次の工程のために大容量を避けて最小比率にすることであった。
【０１３７】
この最初のスクリーニングの後、０．２５Ｍリン酸塩ｐＨ１２．０、０．１Ｍ  ＮａＯＨ及び０．５Ｍ  ＮａＯＨを選択して、更なる研究を行った。
【０１３８】
選択したバッファーを用いて３０分間、４５分間及び６０分間、ｐＨ１１．２でのインキュベーション行った、表２０を参照されたい。全ての実験で、処理後、生成物をＨＰＬＣ−ＳＥ、ＨＰＬＣ−ＨＩＣ、ＣＧＥ（非還元）及びｉＣＥ３で分析した。結果を表２１に示す。
【表２０】
2021506226.tif 000024
【表２１】
2021506226.tif 000025
【０１３９】
全ての実験の間、沈殿がｐＨ６．０付近で観察され、ｐＨ１１．０で消失した。収率はおよそ９５％であったが、それは、不純物の分析を行わなくても不純物の沈殿であると想定され、他のプロジェクトでも同じ現象が見られ、生成物を失うことなく低ｐＨインキュベーション後に中和された。ＢＥＡＴ（登録商標）２は最大６０分間のインキュベーションにおいてｐＨ１１．２で安定であった。実際、ＮａＯＨ  ０．５Ｍバッファーでは、ＨＰＬＣ−ＳＥによる単量体の割合はｐＨ１１．２で６０分後に安定であり、ＣＧＥ（最終時間点のみを試験）、ｉＣＥ３及びＨＰＬＣ−ＨＩＣで同等の結果が得られ、分解は出発物質と比較して観察されなかった。この実験を繰り返し、結果を確認した。これらの結果に基づいて、０．５Ｍ  ＮａＯＨバッファーを使用するｐＨ処理は、低ｐＨウイルス不活化の代替手段の可能性があると見なされた。
【０１４０】
ｄ．ＢＥＡＴ（登録商標）２の活性の試験
材料、方法及び機器
溶媒／洗浄剤、アルギニン及び高ｐＨの処理の影響を調査するため、結合親和性アッセイを、０．８  ＭアルギニンとのｐＨ４．０及びｐＨ５．５でのインキュベーション後に、及び高ｐＨ処理（ＮａＯＨ  ０．５Ｍ、ｐＨ１１．２）後に、溶媒洗浄剤（０．３％ＴｎＢＰ＋１％Ｔｗｅｅｎ  ８０）で処理した様々なサンプルに対して実施した。２つの抗原標的、ＣＤ３８及びＣＤ３を試験した。
【０１４１】
結果及び結論
全てのサンプルで有意な差は観察されず、実際、Ｋｄ値は同等である。したがって、抗体活性に対するこれら全ての処理の影響はなかった。この分析の結果を表２２に報告する。
【表２２】
2021506226.tif 000026
【０１４２】
実施例２：低ｐＨ不安定抗体を含むＰＡ溶出液のアルギニン処理は、抗体の安定性を損なうｐＨレベルでのみ有効なウイルス不活性化をもたらす
実施例１で報告された安定性及び活性の研究に基づいて、最も有望なウイルス不活化方法を、ウイルスを不活化するそれらの能力について更に試験した。ウイルス不活化の有効性を、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅでスパイク研究を行うことにより評価した。試験サンプルを各処理の前後に採取し、ウイルス力価について分析した。まず、アルギニン処理に関するＶＲＶ研究を実施した。
【０１４３】
材料、方法及び機器
この研究では、１種類のウイルスのみ、すなわちモノクローナル抗体等のＣＨＯ細胞株に由来する生物学的製剤に使用される典型的なモデルウイルスであるＭＬＶを使用した。合計７回のランを行った。開発ランからのＰＡ溶出液を出発物質として使用した。異なるｐＨ（ｐＨ４．０、ｐＨ４．７５、ｐＨ４．７９及びｐＨ５．５）のアルギニンの様々なストックバッファーを使用して、目標のｐＨ及び濃度に到達させた。サンプルを、反応を停止するために２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０バッファーを使用してｐＨ６．０付近に中和した。表２３は、ＶＲＶ研究の間に試験した条件を要約する。
【表２３】
2021506226.tif 000027
【０１４４】
Ｌｏｇ減少値を中和したロードサンプルに関し計算し、５プレートの大容量プレーティングおよび標準的な滴定をｔ＝６０分のサンプルに対して行った。中和したロードホールドサンプルを、１６．０℃〜２０．０℃で６０分間（ラン２、ラン４及びラン６）又は１２０分間（ラン１、ラン３、ラン５及びラン７）保持した。
【０１４５】
結果及び結論
アルギニン処理に関するＶＲＶ研究の結果を表２４に示す。
【表２４】
2021506226.tif 000028
【０１４６】
ｐＨ４．０での処理のみが有効なウイルスクリアランスをもたらし、かつこのｐＨ条件でＢＥＡＴ（登録商標）２が分解されることが示されたため（実施例１）、アルギニン処理をＢＥＡＴ（登録商標）２含有溶液のウイルス不活化処理の可能性のある選択肢から除外した。
【０１４７】
実施例３：低ｐＨ不安定抗体を含むＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理は、有効なウイルス不活化をもたらす
次に、ＢＥＡＴ（登録商標）２含有ＰＡ溶出液の溶媒洗浄剤処理の、ウイルスを不活性化する能力を試験した。
【０１４８】
材料、方法及び機器
ＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理を使用するウイルス不活化の有効性を、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅでスパイク研究を行うことにより評価した。この研究では、１種類のウイルス、すなわちモノクローナル抗体等のＣＨＯ細胞株に由来する生物学的製剤に使用される典型的なモデルウイルスであるＭＬＶのみを使用した。目標濃度は、ＴｎＢＰ  ０．３％及びＴｗｅｅｎ  ８０  １％であった。この研究を、ＰＡ溶出液（ｐＨ４．２付近）及び中和ＰＡ溶出液（ｐＨ６．０）に対して行った。温度の操作条件は１５℃＋／−２℃であり、これは化学的不活性化の最悪のシナリオである（温度が低いと不活性化が遅くなる）。プロセスの操作条件は、製造施設により通常１８℃〜２５℃である。速度論を０分、１０分、３０分及び６０分の時間点で行った。ＢＥＡＴ（登録商標）２について試験した条件の概要を表２５に示す。
【表２５】
2021506226.tif 000029
【０１４９】
表２６のＶＲＶ研究の結果は、ＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理が、ＰＡ溶出液が中和されない場合は効率的なウイルス不活性化をもたらし、６０分間のインキュベーション後にＰＡ溶出液が中和されると中程度の不活性化をもたらすことを示し、ＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理はＢＥＡＴ（登録商標）２精製プロセスに有効なＶＩ方法であることを確認する。
【表２６】
2021506226.tif 000030
【０１５０】
実施例４：低ｐＨ不安定抗体を含む清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理は、有効なウイルス不活性化をもたらす
さらに、溶媒及び洗浄剤によるＢＥＡＴ（登録商標）２含有清澄化採取物の処理についてＶＲＶ研究を行った。
【０１５１】
ＶＲＶ研究１
材料、方法及び機器
この研究では、１種類のウイルス、すなわちモノクローナル抗体等のＣＨＯ細胞株に由来する生物学的製剤に使用される典型的なモデルウイルスであるＭＬＶのみを使用した。合計３回のランを、ＴｎＢＰとＴｗｅｅｎ  ８０のミックスを使用して実施した。同じ割合のＴｎＢＰ（０．３％）と異なる割合のＴｗｅｅｎ  ８０を試験した（０．２５％、０．５％及び１．０％）。Ｓ／Ｄでスパイクした後、生成物をインキュベーション終了まで攪拌した。各時間点を収集して、１／２５に希釈しｐＨ６．００〜ｐＨ８．００に中和することにより直ちにクエンチした。表２７は、Ｓ／Ｄ処理に関するＶＲＶ研究の間、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅで試験した条件を報告する。
【表２７】
2021506226.tif 000031
【０１５２】
Ｌｏｇ減少値をクエンチしたロードサンプルに関して計算し、５プレートの大量プレーティングおよび標準的な滴定をｔ＝６０分のサンプルに対して行った。クエンチしたロードホールドサンプルを１６．０℃〜２０．０℃で６０分間保持した。
【０１５３】
結果及び結論
表２８に、ＶＲＶの研究結果の概要を示す。
【表２８】
2021506226.tif 000032
【０１５４】
清澄化採取物のＳ／Ｄ処理は、より低い濃度のＴｗｅｅｎ  ８０（０．２５％）を使用した場合でも、全ての試験条件でＭＬＶウイルスの不活性化において結果的に有効であった。
【０１５５】
ＶＲＶ研究２
さらに、清澄化した採取物の溶媒洗浄剤処理の、ＭＬＶ及びＰＲＶウイルスを不活性化する能力を、より悪い場合の条件下で評価した。
【０１５６】
材料、方法及び機器
プロセスロードサンプルをウイルスストックでスパイクし、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅで分析した。
【０１５７】
これは、表２９に示される「最悪の場合」の条件下で行われた。各重複について最低クリアランス係数を報告した。
【表２９】
2021506226.tif 000033
【０１５８】
結果及び結論
ＢＥＡＴ（登録商標）２用に開発された化学的ウイルス不活化工程を、採取ロット１及びロット２を使用して、０．２％ＴｎＢＰ＋０．７５％Ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．４％ＴｎＢＰ＋１．２５％Ｔｗｅｅｎ  ８０のＳ／ＤミックスによるＭＬＶ及びＰＲＶの不活化に対するそれらの効率について評価した。
【０１５９】
両方のウイルス実験について、同じプロトコルを適用し、スケールダウンされたプロセスから臨床スケールのプロセスへの比較を表３０に示す。
【表３０】
2021506226.tif 000034
【０１６０】
表３１は、ＭＬＶについて、実験ごとに計算したＬｏｇ減少係数を示す。
【表３１】
2021506226.tif 000035
【０１６１】
これらの結果は、Ｓ／Ｄ処理中のウイルスの不活性化が有効であることを示し、ｌｏｇ１０全ウイルスは経時的に減少し、５分、１０分、３０分及び６０分のインキュベーション後にそれぞれ１．３１  ｌｏｇ１０、２．４４  ｌｏｇ１０、２．８８  ｌｏｇ１０及び４．０３  ｌｏｇ１０未満である。
【０１６２】
さらに、アリコートをＳ／Ｄラン中に収集し、凍結し、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｎＢＰのパーセント含有量について分析し、結果を以下に示す。
【表３２】
2021506226.tif 000036
【０１６３】
これらの結果は次のことを示している：
低濃度（０．７５％Ｔｗｅｅｎ  ８０／０．２％ＴｎＢＰ）での化学的不活性化は、ラン１及びラン２でそれぞれ４．０３  ｌｏｇ１０及び３．７９  ｌｏｇ１０の減少係数を示し、これは低Ｓ／Ｄ濃度がＭＬＶの不活性化に適度に有効であったことを意味する。しかしながら、表３１に示される結果は、ラン１とラン２（０．７１％と０．５２％）の間の変動がＴｗｅｅｎ  ８０の割合に関して顕著であることを実証する。ラン２では０．５２％のＴｗｅｅｎ  ８０及び０．１５％のＴｎＢＰのみを測定したが、これは、それらが低濃度であるため最悪の場合である。０．７５％のＴｗｅｅｎ  ８０及び０．２％のＴｎＢＰの目標に到達していないと結論付けることができる。減少は、より低濃度のＴｗｅｅｎ  ８０及びＴｎＢＰ、０．５２％Ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．１５％ＴｎＢＰで行ったラン（ラン２）でより少なく、これは最悪の場合と見なされる。
【０１６４】
高濃度（１．２５％Ｔｗｅｅｎ  ８０／０．４％ＴｎＢＰ）での化学的不活性化は、ラン３とラン４でそれぞれ５．３７  ｌｏｇ１０以上及び５．０２  ｌｏｇ１０以上の減少係数を示し、これは、予想通り、より高いＳ／Ｄ濃度がＭＬＶ不活性化により有効であることを意味する。表３１に示す結果は、ラン３とラン４（０．９１と０．８９）の間の変動が、Ｔｗｅｅｎ  ８０の割合に関して顕著でなかったことを実証する。しかしこの場合も目標とする１．２５％Ｔｗｅｅｎ  ８０は両方のランで達成されず、実際に、ラン３及びラン４で測定されたのはそれぞれ０．９１％及び０．８９％に過ぎなかった。ＴｎＢＰデータに関しては、ランを０．４０％ではなく０．４８％で行った（ラン３  ｔ６０分）。この場合も、ウイルスの不活性化の結果は非常に論理的であり、より高いＴｗｅｅｎ  ８０及びＴｎＢＰ％でのラン３は、最良のウイルス不活性化を得ることを可能にする。結論として、ＭＬＶウイルス不活性化の最悪の場合のシナリオ（ラン２、０．５２％Ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．１５％ＴｎＢＰ）でさえ、３．７９  ｌｏｇ１０の中程度の効果的な減少が得られた。
【０１６５】
表３３は、ＰＲＶについて、測定されたＴｗｅｅｎ  ８０及びＴｎＢＰの％、並びに様々な化学的ウイルス不活化サンプルについて得られたｌｏｇ１０値、及び各ランで計算されたＬｏｇ減少係数を示す。
【表３３】
2021506226.tif 000037
【０１６６】
ウイルス不活化はインキュベーション中に有効であり、合計ｌｏｇ１０ウイルスは時間の経過と共に減少し、５回の処理直後で３．６８  ｌｏｇ１０未満、及び６０分のインキュベーション後で５．４９  ｌｏｇ１０である。アリコートを、Ｓ／Ｄラン中に収集し、凍結し、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｎＢＰのパーセント含有量について分析し、結果を以下に示す。
【表３４】
2021506226.tif 000038
【０１６７】
ＰＲＶの結果は次のことを示している：
低濃度（０．７５％Ｔｗｅｅｎ  ８０／０．２％ＴｎＢＰ）での化学的不活性化は、ラン１及びラン２でそれぞれ５．４６  ｌｏｇ１０以上及び５．１９  ｌｏｇ１０以上の減少係数を示し、これは低Ｓ／Ｄ濃度がＰＲＶの不活性化に有効であったことを意味する。しかしながら、表３３に示す結果は、ラン１とラン２の間の変動がＴｗｅｅｎ  ８０の割合の結果（０．７４％及び０．５７％）に関して顕著であることを実証する。ラン２では目標とする０．７５％Ｔｗｅｅｎ  ８０に到達せず、実際には０．５７％が測定されたに過ぎず、これは、洗浄剤の濃度が低いので、最悪のシナリオである。ＴｎＢＰの場合、両方のランは目標よりも低い比較可能な値、０．２０％ではなく０．１５％、を示す。予想通り、より低いＴｗｅｅｎ  ８０の割合では、ラン２は５．１９  ｌｏｇ１０以上であったラン１と比較して低いウイルス減少を示した。
【０１６８】
高濃度（１．２５％Ｔｗｅｅｎ  ８０／０．４％ＴｎＢＰ）での化学的不活性化は、ラン３及びラン４でそれぞれ５．１９  ｌｏｇ１０以上及び５．４６  ｌｏｇ１０以上の減少係数を示し、これは、予想どおり、より高いＳ／Ｄ濃度がＰＲＶの不活性化により有効であること意味する。表３３に示す結果は、両方のランの時間点ｔ０と時間点ｔ６０との間でＴｗｅｅｎ  ８０及びＴｎＢＰの値に変動があったことを示し、実質的にラン３では、Ｔｗｅｅｎ  ８０含有量はｔ０で０．８０％、ｔ６０で１．０１％であり、同じくＴｎＢＰについてｔ０で０．２７％及びｔ６０分で０．３３％である。この場合も、両方のランで目標とする１．２５％Ｔｗｅｅｎ  ８０に達したが、それでも低濃度のＳ／Ｄがウイルス不活化の最悪の場合である。ＴｎＢＰデータに関しては、ランを０．４０％ではなく０．４８％で実施した（ラン３  ｔ６０分）。繰り返すが、ウイルス減少の結果は非常に論理的であり、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｎＢＰ％がより高い実施例３は、より優れたウイルスクリアランスを示した。
【０１６９】
同一の化学的不活性化を使用してＭＬＶと比較してＰＲＶウイルスで得られたより高いウイルス不活性化は、実際にＰＲＶの物理化学的耐性が低いことを予想させる。
【０１７０】
全てのデータを結論付けると、最悪のシナリオ（ラン２）では、５．１９  ｌｏｇ１０の有効なＰＲＶウイルスの不活性化がある。
【０１７１】
総合すると、研究１及び研究２の結果は、ＰＡロードのＳ／Ｄ処理を使用してＶＩが達成されることを実証する。
【０１７２】
実施例５：低ｐＨ不安定抗体を含むＰＡ溶出液の高ｐＨ処理は、抗体の安定性を保持するｐＨでの適度に有効なウイルス不活性化をもたらす
材料、方法及び機器
ＢＥＡＴ（登録商標）２を含むＰＡ溶出液の高ｐＨ処理に関するＶＲＶ研究を行った。この研究では、１つのウイルス、ＭＬＶのみを使用した。実験をｐＨ１０．８での１回のランで行った（ｐＨ１１．０のプロセス目標、より低いｐＨの最悪の場合の条件に基づく）。この研究には開発ランに由来するＰＡ溶出液を使用し、ｐＨを、選択したバッファー０．５Ｍ  ＮａＯＨを使用して上げた。収集時に、全てのサンプルを３．７％ＨＣｌでｐＨ６〜ｐＨ８に中和した。
【０１７３】
Ｌｏｇ減少値を中和したロードサンプルに関し計算し、５プレートの大容量プレーティングおよび標準的な滴定をｔ＝６０分のサンプルに対して行った。中和ロードホールドサンプルを１６．０℃〜２０．０℃で６０分間保持した。
【０１７４】
結果及び結論
この研究中に得られたＶＲＶの結果を表３５に示す。
【表３５】
2021506226.tif 000039
【０１７５】
高ｐＨでのＢＥＡＴ（登録商標）２含有ＰＡ溶出液のインキュベーションは、減少係数が３．１８  ｌｏｇ１０の場合、１分間のインキュベーション後から６０分間のインキュベーションまでのＭＬＶウイルスの不活化に適度に有効である。したがって、高ｐＨ処理は、ＢＥＡＴ（登録商標）２の精製プロセスにおける低ｐＨ処理の有効な代替手段と見なすことができる。
【０１７６】
実施例６：ＰＡ溶出液の高ｐＨ処理は、低ｐＨ不安定抗体ＢＥＡＴ（登録商標）２の精製プロセスにおける効率的な不活性化工程である
高ｐＨ処理をＢＥＡＴ（登録商標）２の製造プロセスでウイルス不活化工程として使用する可能性を更に調査するため、追加の安定性及び活性の研究を行った。保持時間の影響を、２４時間のインキュベーションで等の、より悪い場合のシナリオを含む様々な時間点で評価した。
【０１７７】
材料、方法及び機器
この研究で使用した出発物質は、代表的なＰＡ溶出液であった。
【０１７８】
全ての化学物質は薬局方グレード（米国又は欧州）であった。インプロセスの０．２μｍ濾過工程を通常、全てのバッファー及びプロセス中間体に対して行った。さらに、マグネチックスターラー、ｐＨメーター及び導電率計を使用した。
【０１７９】
試験した時間点は室温にて１時間、２時間及び４時間、並びにこの時間点を超え、生成物を最大２４時間５±３℃に置いた。約１００ｍＬのＰＡ溶出液を、ＮａＯＨ  ０．５Ｍを使用してＮａｌｇｅｎｅボトル中でｐＨ１１．２に、マグネチックスターラーを用いて攪拌しながら塩基化した。このｐＨは、このプロセスの目標とするｐＨ１１．０を検証するために、生成物の品質について最悪の場合のシナリオとして選択された。以下に記載するように直ちに中和した時間点ｔ０を除いて、高ｐＨで生成物をインキュベートした。各時間点で、約１０ｍＬの高ｐＨ生成物を５０ｍＬのＴＰＰチューブに移し、凍結する前に、ＶＩ反応を停止するためにＨＣｌ  ３．７％を使用してｐＨを最大ｐＨ６．０に下げることにより中和した（中和工程）。
【０１８０】
生成物の品質を、全ての時間点についてＨＰＬＣ−ＳＥ、ｉＣＥ及びＣＧＥによって分析した。中和されておらず、どのＶＩ処理も行っていなＰＡ溶出液も分析し、基準として使用した。
【表３６】
2021506226.tif 000040
【０１８１】
上記のサンプルの幾つかを、表面プラズモン共鳴によって試験するために選択した（表３７）。目的は、高ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）２分子の目標ＣＤ３ε１−２６−Ｆｃ及びＣＤ３８への結合親和性に、したがって間接的にはその活性に影響を与えたかどうかを検証することであった。さらに、ＢＥＡＴ（登録商標）２分子活性に対する高ｐＨの影響を直接検証するため、細胞ベースの機能アッセイも行った。
【表３７】
2021506226.tif 000041
【０１８２】
結果及び結論
表３８及び図１０に示すように、ＢＥＡＴ（登録商標）２に対する高ｐＨでの保持時間の影響をＳＥ−ＨＰＬＣにより分析して、様々な時間点でのインキュベーション後のサンプルの純度を確立した。
【表３８】
2021506226.tif 000042
【０１８３】
表３８に示すように、単量体の割合は条件間で同等であり、２４時間までの高ｐＨ処理では著しい凝集は見られず、実際に、観察された変動は方法のばらつきの範囲内である。
【０１８４】
これらの結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）２が、通常は６０分以上９０分以下であるプロセス時間を安全マージンを有して網羅する２４時間まで安定であることを示唆している。
【０１８５】
さらに、表３９及び図１１に示すように、非還元ＣＧＥを行い、ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性を更に確認した。
【表３９】
2021506226.tif 000043
【０１８６】
ＢＥＡＴ％は基準サンプル（ＰＡ溶出液）と同等であり、４時間まで大幅なフラグメント化は示されない。ＢＥＡＴ（登録商標）２は、最大通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を安全マージンを有して網羅する２時間まで安定である。
【０１８７】
さらに、還元ＣＧＥは、ＢＥＡＴ（登録商標）２が、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を安全マージンを有して網羅する２４時間まで安定であることを示す（表４０及び図１２を参照されたい）。
【表４０】
2021506226.tif 000044
【０１８８】
電荷バリアントのバリエーションを評価するため、ｉＣＥを行った（図１３及び表４１）。
【表４１】
2021506226.tif 000045
【０１８９】
酸性種の増加が時間の経過と共に観察される。それでも、方法のばらつきは１０％以下であるため、２時間までに観測された差は方法のばらつきの範囲内であり、許容可能であり統計的に有意ではないと見なすことができた。観察される酸性％の増加は予想される傾向であるが、２時間の安全マージンは、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を（及びそれを超えて）網羅する。
【０１９０】
細胞ベースの機能アッセイの結果を図１４及び表４２に示す。５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）を用量反応曲線に基づいて決定した。得られたＥＣ５０値は、ゼロに等しい高ｐＨインキュベーション時間のサンプルを基準として、各サンプルの相対的効力を決定することを可能にした。
【表４２】
2021506226.tif 000046
【０１９１】
相対的な効力の値に時間の経過に伴う傾向は見られない。ｔ１ｈ及びｔ２ｈでの高ｐＨ処理は、基準として使用されたＰＡ溶出液と比較べて非常に類似した効力をもたらす。方法のばらつきが２５％以下の場合、高ｐＨ処理は２時間のインキュベーション後でもＢＥＡＴ（登録商標）２の機能を大幅に変えず、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を網羅する。
【０１９２】
様々な時間点で評価された、標的ＣＤ３及びＣＤ３８に対するＢＥＡＴ（登録商標）２抗体の結合親和性を表４３に収載する。
【表４３】
2021506226.tif 000047
【０１９３】
プロテインＡ溶出液と高ｐＨでインキュベートした全てのサンプルの間で、ヒトＣＤ３８への結合活性に違いは見られない。また、プロテインＡ溶出液と高ｐＨでインキュベートした全てのサンプルの間で、ヒトＣＤ３εへの結合活性の機能的重要性に違いは見られない。ヒトＣＤ３εへの親和性のわずかな違いがｔ０サンプルと他の全てのサンプルとの間で観察されたものの、親和性はなお同じ範囲（低ナノモル、ＰＡ溶出液より３２％高い）にあり、おそらく注入された濃度のわずかな違いによるものである。
【０１９４】
結論として、高ｐＨインキュベーションはＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性及び活性に影響を与えず、ＢＥＡＴ（登録商標）２の製造プロセスで使用可能である。
【０１９５】
実施例７：ＰＡ溶出液の高ｐＨ処理は低ｐＨ不安定抗体ＢＥＡＴ（登録商標）３の精製プロセスにおける効率的な不活性化工程である
第３のＢＥＡＴ抗体であるＢＥＡＴ（登録商標）３に対する最適なウイルス不活化方法を評価するため、安定性、活性及びＶＲＶの研究を行って、ＰＡ溶出液の低ｐＨ処理及び高ｐＨ処理の効果および清澄化した採取物の溶媒／洗浄剤処理を調査した。
【０１９６】
材料、方法及び機器
この研究で使用した出発物質は、清澄化採取物及びＫａｎｅｋａ製のＫａｎＣａｐＡ樹脂を使用するアフィニティクロマトグラフィー後のＰＡ溶出液であった。
【０１９７】
細胞培養を通常、生存率が８０％を下回ったときに終了し、細胞片をデッドエンド深層濾過の後に続く０．２μｍフィルターでの濾過により除去した。細胞培養上清はＣＨＯ細胞に由来した。初期開発試験を、最終的に選択されたクローンの親クローンからの代表的ではない材料を使用して、行った。開発の後期アッセイを、最終的に選択されたクローンに由来する、代表的な材料を使用して行った。
【０１９８】
インプロセスの０．２μｍ濾過工程を通常、全てのバッファー及びプロセス中間体に対して行った。ＶＩ研究では、マグネチックスターラー、ｐＨメーター及び導電率計のみを使用した。
【０１９９】
ＰＡ溶出液−低ｐＨウイルス不活化
ＰＡ溶出液約２５ｍＬを、３．７％ＨＣｌを使用して５０ｍＬ  ＴＰＰチューブ中でｐＨ３．７に酸性化した。低ｐＨの生成物を、以下に記載されるように直ちに中和した時間点ｔ０を除いて、マグネチックスターラーを使用して撹拌しながらインキュベートした。試験した時間点は、室温で１時間、２時間、４時間及び６時間、並びにこの時間点を超え、生成物を５±３℃で最大２４時間及び４８時間インキュベーションした。各時間点で、約３ｍＬの低ｐＨ生成物を１５ｍＬ  ＴＰＰチューブに移し、凍結前に、ＶＩ反応を停止するために２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０を使用してｐＨ５．０までｐＨを上げることにより中和した（中和工程）。
【０２００】
ハイスループットＨＰＬＣ−ＳＥ分析を使用して、全ての時間点を特性評価した。Ｃａｌｉｐｅｒ  ＣＧＥ（非還元）及びｉＣＥ分析を、ｔ０及びＴ４８時間にのみ行った。結果を、様々な時間点を時間点ｔ０（サンプルを低ｐＨでインキュベートし、直ちにｐＨ５．０に中和した）と比較することにより分析した。中和されておらず、どのＶＩ処理も行っていないＰＡ溶出液も分析し、ｔ０と比較するための基準として使用した。
【表４４】
2021506226.tif 000048
【０２０１】
清澄化した採取物−溶媒洗浄剤処理
混合物の均一性を確保するために、０．３％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｗｅｅｎ  ８０のミックスを調製し、インキュベーションの１５分前に攪拌した。先のプロジェクトで観察されたように、十分なウイルス不活性化を得るために、ミックスをＰＡローディング工程の前に最低６０分の間、マグネチックスターラーを使用してインキュベートし清澄化した採取物と混合した。ＶＩ反応を停止するために、処理した材料をＫａｎｅｋａ  ＫａｎＣａｐ  Ａ  樹脂の直径１．１ｃｍのカラムを使用して直ちに精製した。５±３℃で保たれたＰＡ溶出液を、その後ＨＰＬＣ−ＳＥ、ＣＧＥ（還元及び非還元）及びｉＣＥで分析した。
【０２０２】
ＰＡ溶出液−高ｐＨウイルス不活化
試験した時間点は、室温で１時間、２時間、４時間及び６時間、並びにこの時間点を超え、生成物を５±３℃で最大２４時間及び４８時間インキュベーションした。約２５ｍＬのＰＡ溶出液を、ＮａＯＨ  ０．５Ｍを使用して５０ｍＬ  ＴＰＰチューブ中でｐＨ１１．２に塩基化した。このｐＨは、プロセスの目標ｐＨ１１．０を検証するために、生成物の品質について最悪の場合のシナリオとして選択された。高ｐＨの生成物を、以下に記載されるように直ちに中和された時間点ｔ０を除いて、マグネチックスターラーを使用して撹拌しながらインキュベートした。各時間点で、約３ｍＬの高ｐＨ生成物を１５ｍＬ  ＴＰＰチューブに移し、凍結する前に、ＶＩ反応を停止するために、ＨＣｌ  ３．７％を使用してｐＨ６．０までｐＨを下げることにより中和した（中和工程）。
【０２０３】
生成物の品質を、全ての時間点についてＨＰＬＣ−ＳＥ、ｉＣＥ及びＣＧＥによって分析した。分析結果を、様々な時間点を時間点ｔ０（サンプルを高ｐＨでインキュベートし、直ちにｐＨ６．０で中和した）と比較することにより分析した。中和されておらず、どのＶＩ処理も行っていないＰＡ溶出液も分析し、ｔ０と比較するための基準として使用した。
【表４５】
2021506226.tif 000049
【０２０４】
結合親和性アッセイ
高ｐＨ処理開発ランからの幾つかのサンプル（表４６を参照されたい）を、表面プラズモン共鳴によって試験するため選択した。目的は、高ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）３分子の標的のＣＤ３ε１−２６−Ｆｃ及びＥＧＦＲへの結合親和性、したがって間接的にはその活性に影響を与えるかどうかを検証することであった。
【０２０５】
第１のアッセイは、ヒトＣＤ３ε１−２６−Ｆｃ抗原への結合親和性を決定することを目的としている。それをＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。ヒトＣＤ３ε１−２６−Ｆｃを、酢酸塩ｐＨ４．５バッファー中の濃度２５ｎＭで調製した。ＢＥＡＴ（登録商標）３サンプルを、１０００ｎＭ〜１．３７ｎＭで、希釈当たり２００μｌの最終容量で調製した。ランを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００プロセシングユニット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。
【０２０６】
第２のアッセイは、ヒトＥＧＦＲ−ｈｉｓ抗原への結合親和性を決定することを目的としている。それをＳｅｒｉｅ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。ＢＥＡＴ（登録商標）３サンプルを、ＨＢＳ−ＥＰ  ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バッファーでそれぞれ２５ｎＭに希釈した。ＥＧＦＲを１００ｎＭ〜０．１３ｎＭで調製し、希釈当たり２５０μｌの最終容量を実現した。
【表４６】
2021506226.tif 000050
【０２０７】
細胞ベースの機能アッセイ
細胞ベースの機能アッセイの目的は、高ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）３分子の活性に影響を及ぼすかどうかを検証することであった。高ｐＨ処理の開発から選択したサンプルを、表４７に記載の通り試験した。
【表４７】
2021506226.tif 000051
【０２０８】
細胞ベースの効力アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａで商業的に入手可能な相さされたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株を使用した。これらの細胞を、ルシフェラーゼｃＤＮＡ配列がＮＦＡＴ応答要素（ＲＥ）の制御下にあるレポーター構築物で安定的にトランスフェクトした。ルシフェラーゼの産生は、ＣＤ３ε（及びＴ細胞受容体複合体）に由来するシグナル等、ＮＦＡＴ転写因子を活性化するシグナルに直接依存した。アッセイを、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ細胞（レスポンダー細胞）（ＣＤ３ε＋、ＥＧＦＲ−）をＳＫ−ＢＲ−３目標細胞（ＥＧＦＲ  ＋ＣＤ３ε−）及びＢＥＡＴ（登録商標）３又は対照抗体と同時インキュベートすることにより設定した。レスポンダー細胞の活性化を、発光応答によって定量化した。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞株は６週間の培養を有し（Ｐ６）、ＳＫ−ＢＲ−３細胞株は３週間の培養を有した（Ｐ３）。
【０２０９】
アッセイを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートＵ字型底（ＴＰＰ）で行った。ＳＫ−ＢＲ−３発現ＥＧＦＲ細胞株（ＡＴＣＣ）を３×１０５細胞／ｍｌで再懸濁し、１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、２５μＬのＳＫ−ＢＲ−３発現ＥＧＦＲ細胞株をアッセイプレート中に保持し、６μｇ／ｍＬ（最終２μｇ／ｍＬ）に希釈した２５μＬの異なるＢＥＡＴ（登録商標）３サンプルを異なるウェルに移した。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｃｅｌｌｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１．２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、２５μｌをアッセイプレートの各ウェルに分配した。プレートを覆い、３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、７５μＬのＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、プレートをマイクロプレートリーダーで取得した。発光を、次の設定：読み取りテープ−エンドポイント；積分時間−１分；発光−ホール；光学位置−上部；ゲイン１３５；読み取り高さ−１．００ｍｍを使用して測定した。データを次いで、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを使用してプロット及び分析した。非線形回帰フィッティングをＸ＝Ｌｏｇ（Ｘ）変換後に適用し、シグモイド用量反応フィッティングを全てのデータセットに適用してＥＣ５０値を決定した。各サンプルについて相対的効力を、次の計算を使用して計算した。相対的効力％＝ＥＣ５０基準／ＥＣ５０サンプル×１００。
【０２１０】
残留ＤＮＡ及びＨＣＰアッセイ
ＶＩ工程の主な目的は、生成物の品質を確保しながらウイルスを効率的に不活化することである。それでも下流のプロセスでは、各工程が不純物レベルに影響を与える可能性がある。以下に説明するアッセイの目的は、ＣＨＯ細胞からの残留ＤＮＡ及びＨＣＰレベルに対する高ｐＨ処理の影響を評価することであった。
【０２１１】
ＨＣＰの定量には、２つの異なるアッセイ、ＣｙｇｎｕｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの３Ｇ  ＨＣＰ  Ｅｌｉｓａキット及びＦｏｒｔｅＢｉｏ−Ｃｙｇｎｕｓ製のＡｎｔｉ−ＣＨＯ  ＨＣＰ検出キットを使用し、データ処理にＰａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６機器を使用した。最初に両方の手法を使用して高ｐＨ処理によるＨＣＰ除去を評価し、また両方の手法、すなわち、より感度が高いことが知られているハイスループットオクテット及びＥＬＩＳＡも比較した。
【０２１２】
ＥＬＩＳＡのサンプル調製を、３Ｇ  Ｅｌｉｓａ  ＨＣＰキット（Ｃｙｇｎｕｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、１／１００希釈を使用して行った。サンプルを、抗ＣＨＯ  ＨＣＰ捕捉抗体で被覆したマイクロタイターウェル中で、アフィニティ精製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体と反応させた。洗浄後、基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を反応させた。加水分解された基質の量は、存在するＣＨＯタンパク質の濃度に正比例した。定量を、サンプルのシグナルを同時にアッセイされたＨＣＰ標準と比較することにより達成した。データを、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して処理した。
【０２１３】
Ｏｃｔｅｔに関しては、Ａｎｔｉ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ−Ｃｙｇｎｕｓ）を使用して、２つのサンプル希釈液（１／２００及び１／４００）を試験した。測定は、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のゴールドスタンダード３Ｇ抗ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体でプレコートしたＡｎｔｉ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒでのサンドイッチ型アッセイを含んだ。調製した９６ウェルプレートを、Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６機器で直接読み取った。データを、Ｏｃｔｅｔシステムデータ取得ソフトウェアにより処理した。
【０２１４】
残留ＤＮＡの定量に関しては、アッセイはタンパク質を除去するためのプロテイナーゼＫによるサンプルの処理を含んだ。次いで、ＤＮＡを、磁気ビーズを使用して抽出し、洗浄し、最後に溶出した。その後、ＤＮＡを、Ｆａｓｔ  ５０００  ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用するリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により定量する。サンプルの調製は、ｒｅｓＤＮＡＳＥＱ（商標）定量的ＣＨＯ  ＤＮＡキットＶ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。
【０２１５】
表４８に収載される、高ｐＨの開発に由来する幾つかのサンプルを、上に記載される残留ＤＮＡ及びＨＣＰアッセイにより試験するために選択した。ＶＩ後の０．２μｍ濾過も試験した。
【表４８】
2021506226.tif 000052
いずれのＰＡ溶出液もＶＩ工程の前に０．２μｍで濾過した。
【０２１６】
ＶＲＶ  ＮＲＴ研究
ＶＩ実験によるデータを分析し、高ｐＨ処理を、得られた生成物の品質に関するＶＲＶ  ＮＲＴ研究のために選択した。ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅによって行ったこのウイルスクリアランス研究の目的は、この処理がウイルスを効果的に不活性化する能力を評価することであった。この研究は、モノクローナル抗体等のＣＨＯ細胞株に由来する生物学的産物に使用される典型的なモデルウイルスである異種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）で行われた。ＭＬＶはまた、物理化学的処理に感受性であることが知られている（表４９を参照されたい）。
【表４９】
2021506226.tif 000053
【０２１７】
１回のランをｐＨ１０．８＋／−０．０５で行い、これはｐＨ１１．０のプロセス設定値の最悪の場合である（すなわち、下限のｐＨ範囲は不活性化するウイルスがより少ないはずである）。高ｐＨ処理の温度仕様は２０℃以上２５℃以下であったが、仕様外（ＯＯＳ：Ｏｕｔ  Ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の場合に最悪の場合のシナリオデータを得るため、ＭＬＶを１６℃±１℃でスパイクした。開発ランに由来するＰＡ溶出液を出発物質として使用した。０．５Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨを上昇させ、ＶＩ速度論を追跡するために、表５０に記載される様々な保持点の間、高ｐＨでサンプルをインキュベートした。反応を停止するために、サンプルを３．７％ＨＣｌでｐＨ６．０〜ｐＨ８．０に中和した。
【表５０】
2021506226.tif 000054
【０２１８】
ＢＥＡＴ（登録商標）３の精製プロセスの工程としての高ｐＨを試験するＶＲＶ研究
さらに、ＢＥＡＴ（登録商標）３精製プロセスの様々な工程がウイルスを不活性化又は除去する能力を、独立した２回のランで調査した。これらの中で、ＰＡ溶出液に対する高ｐＨ処理の能力を評価した。実験をＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅで行った。Ｌｏｇ減少係数を中和ロードサンプルに関して計算し、サンプルを様々なインキュベーション時間（ｔ）点、５分、１０分、３０分及び６０分に採取し、その後中和する。
【０２１９】
結果及び結論
ａ．ＰＡ溶出液−低ｐＨウイルス不活化
試験した様々な時間点でのＨＰＬＣ−ＳＥの結果を表５１に示し、図１５及び図１６で解説する。
【表５１】
2021506226.tif 000055
【０２２０】
ＨＰＬＣ−ＳＥの結果は、時間点ｔ０を含む低ｐＨで処理した全てのサンプルでの単量体％の大幅な減少を示し、低ｐＨインキュベーション及び中和の直後に生成物の高い分解を示した。この分解は、凝集物及び「ショルダー」種の増加に直接関連している。実際に、低ｐＨ処理は即座に凝集物の割合に影響を与え、割合はＰＡ溶出液での２．４％から時間点ｔ０での１３．１％に増加した。さらに、ｔ０での６．９％〜Ｔ４８ｈでの１２．０％の範囲で「ショルダー」種の増加が観察された。この「ショルダー」種は、単量体のメインピークの前に現れた。図１７において、重要な量（１２％）の「ショルダー」種を含むＨＰＬＣ−ＳＥ分析プロファイルの一例。
【０２２１】
さらに、様々なフラグメントの割合を特定及び評価することが可能な、Ｃａｌｉｐｅｒ非還元の結果を表５２に収載する。ＨＰＬＣ−ＳＥの結果で観察された重要かつ重大な分解を考慮して、ｔ０及びｔ２４時間の時間点のみを分析した。
【表５２】
2021506226.tif 000056
【０２２２】
低ｐＨインキュベーションは、生成物のフラグメント化を示し、ＰＡ溶出液の３．１％からｔ０で中和されたＶＩの１２．４％へのＢＥＡＴ’％の増加をもたらした。これらのＣＧＥデータは、前述のＨＰＬＣ−ＳＥデータと相関しているようであり、ＨＰＬＣ−ＳＥで観察される「ショルダー種」はＢＥＡＴ’種と同等である可能性があった。それでも、４８時間の時間点は、約３．８％で、ｔ０よりも低いＢＥＡＴ’の割合を示した。この結果は驚くべきものであり、一貫性がなかった。このデータは、採用された分析方法によって説明できる可能性がある。実際に、分析開発グループとの議論の後、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＣＧＥは、検出及び定量が十分に正確ではない又はＣＧＥと同程度であるスクリーニング方法としてみなされるに過ぎなかった。情報として、ｔ０及びｔ２４ｈの分析プロファイルを図１８及び図１９に示す。任意の決定的な結論を、これらの結果により出すことができ、Ｃａｌｉｐｅｒ分析はＶＩ工程開発の追求のため古典的なＣＧＥに完全に置き換えられた。
【０２２３】
ＩＣＥ３分析による電荷バリアントの結果を表５３に記載する。Ｃａｌｉｐｅｒ分析については、時間点ｔ０及びｔ２４時間のみを分析した。
【表５３】
2021506226.tif 000057
【０２２４】
電荷バリアント率の変動は低ｐＨ処理後に観察されなかった。酸性種の割合は約４９％〜５０％にとどまり、塩基性種は約９％、メインピークは約４１％であった。低ｐＨ処理は、４８時間のインキュベーションまでＢＥＡＴ（登録商標）３分子の電荷バリアントに影響を与えなかった。
結論として、低ｐＨ  ＶＩ戦略は、ＨＰＬＣ−ＳＥデータで観察される高い生成物分解を考慮して、ＶＩプロセスの適切な代替手段として明確に無効とされた。
【０２２５】
ｂ．清澄化した採取物−溶媒洗浄剤処理
清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理を、代表的な材料を使用して２回行った。Ｓ／Ｄ処理の後にＰＡ工程が続き、反応を停止し、生成物の品質を得られたＰＡ溶出液中で直接確認した。それらを、ＰＡ工程の開発に由来する、Ｓ／Ｄによって先に処理されなかった２回の基準ランと比較した。これらの２つの基準ランを、同じ出発物質を使用し同等のローディング係数で行った。溶出バッファーのｐＨのみが異なり、基準及びＳ／ＤランではそれぞれｐＨ４．３及びｐＨ４．２５であった。
【０２２６】
表５４は、これらのランで取得されたデータの要約を示す。
【表５４】
2021506226.tif 000058
【０２２７】
先にＳ／Ｄで処理したランに対応するラン１及びラン２を、それぞれ最小及び最大のローディング係数（すなわち、１０ｇ／Ｌ及び３４ｇ／Ｌ）で行った。この差は、最小及び最大のローディング係数についてそれぞれ５８％及び６７％の工程収量に影響を及ぼした。これらの結果は、Ｓ／Ｄなしの基準ランの結果と同等であった。
【０２２８】
品質に関して、ＨＰＬＣ−ＳＥ分析は、９４．９％〜９９．２％でばらつき０．８％〜４．３％の範囲の凝集物パーセンテージに関係したＰＡ溶出液の単量体％を示した。フラグメントの割合は、全てのランで１％未満のままであった。単量体及び凝集物の割合の変動は、ＰＡ溶出液濃度に直接関係していた。実際に、濃度はより高く、凝集物の割合はより高かった。それにもかかわらず、単量体の割合は９５％を超える値でなお許容された。さらに、還元ＣＧＥの結果に関して、差はランの間で観察されず（例えば、全てのランで９４．４％〜９５．７％の全ＢＥＡＴ％）、Ｓ／Ｄの使用による生成物のフラグメント化は見られなかった。最後に、電荷バリアントプロファイルは、３７．８％〜３９．８％のメインピークのパーセンテージを示し、酸性種又は塩基性種の出現が観察された。生成物の分解はＳ／Ｄ処理後に発生しなかった。
【０２２９】
さらに、ＰＡ工程のＳ／Ｄ除去能力を評価するために、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びＴｎＢＰの濃度をＰＡ工程の前後に測定した。採取物中のＴｗｅｅｎ  ８０濃度は、ＰＡ溶出液中の０．００１％（重量／重量）に対して１．１％（重量／重量）であり、測定されたＴｎＢＰは、採取物中で０．３％（重量／重量）及びＰＡ溶出液中で１ｍｇ／Ｌ（約０．０１％（重量／重量）に対応する）であった。その結果、プロテインＡ工程はＳ／Ｄを効率的に除去した。
【０２３０】
結論として、ＰＡ工程前のＳ／Ｄ処理は、ＢＥＡＴ（登録商標）３ウイルス不活性化に適した選択肢であった。
【０２３１】
ｃ．ＰＡ溶出液−高ｐＨウイルス不活化
小規模開発
このセクションでは、高ｐＨ処理について小規模で得られた生成物の品質データを示す。ＨＰＬＣ−ＳＥの結果を表５５に要約し、続いてＣＧＥ非還元及び電荷バリアントの結果をそれぞれ表５６及び表５７に示す。
【表５５】
2021506226.tif 000059
【０２３２】
単量体の割合は条件間で同等であり（例えば、Ｔ０で９５．０％、Ｔ４８ｈで９４．９％）、インキュベーションの４８時間まで高ｐＨ処理で凝集が発生しなかったことを確認できた。それでも、ＰＡ溶出液サンプルと高ｐＨ処理サンプルの間には１％の差があった。これは、高ｐＨインキュベーションの結果である可能性がある凝集物％のわずかな増加によるものであった。しかしながら、１％の差は方法のばらつきの範囲内であり、統計的に有意ではない可能性が高い。さらに、サンプルは同じ方法で保管されず、処理なしのＰＡ溶出液は５±３℃で保管され、高ｐＨで処理されたサンプルは凍結されたため、凍結サンプルでより可逆的な凝集をもたらした。
【０２３３】
非還元ＣＧＥの結果を表５６に示す。
【表５６】
2021506226.tif 000060
【０２３４】
ＣＧＥ非還元によって与えられたＢＥＡＴの割合は、ｔ０と比較して、試験した全てのサンプルで同じままであった（例えば、ＢＥＡＴ％はｔ０で８７．１％、Ｔ４８ｈで８７．２％であった）。さらに、フラグメントの増加は４８時間まで観察できなかった。これらのデータを、図２０に示す同等のＣＧＥプロファイルオーバーレイによって確認した。
【０２３５】
ＩＣＥ３の結果による電荷バリアントを下記表５７に示す。
【表５７】
2021506226.tif 000061
【０２３６】
ＩＣＥ３の結果は、Ｔ０で約４２．８％、１時間で４２．５％及び２時間で４１．８％のメインピーク％を示した。これらの同じ時間点で、酸性度はそれぞれ４９．２％、５０．２％及び５０．９％であった。電荷バリアントは、最長２時間まで同等である。２時間のインキュベーション後に、酸性バリアント％は増加し、４時間で５４．０％、４８時間で５９．６％である。それでも、方法のばらつきは１０％以下であり、４時間及び６時間のメインピーク％で観測される差は、方法のばらつき内の値で統計的に有意ではない可能性がある（例えば、ｔ０で４２．８％、Ｔ４ｈで３９．１％のメインピーク）。しかしながら、観測される酸性の％増加は予想される傾向であるが、２時間の安全マージンは、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間（及びそれよりも長い）を網羅している。高ｐＨインキュベーションの各時間点のプロファイルオーバーレイを図２１に示す。
【０２３７】
結論として、データは、２時間まで生成物の品質に高ｐＨ処理の影響がないことを示した。２時間を超えても、凝集又はフラグメント化をもたらすことはないであろう。しかしながら、２４時間後には７％、４８時間後には１０％の酸性種の増加が観察された。この提示される信頼性の高い高ｐＨインキュベーションは、低ｐＨの適切な代替手段である。
【０２３８】
上記のＳ／Ｄ処理及び高ｐＨのデータに照らして、高ｐＨ戦略が好ましい選択肢として選択された。実際に、同等の生成物品質データが２つのＶＩ戦略で得られた。それでも、スケーラビリティ、工業化のコスト、安全性又はウイルスクリアランスとして、他のパラメーターを考慮する必要がある。
【０２３９】
スケールアップ開発
小規模で開発されたプロセスをパイロット規模でスケールアップした。これらの実験により、以前に決定された結果を確認し、より大規模なプロセスデータを生成することができた。２つのランのプロセスパラメータ及び結果を表５８に記載する。
【表５８】
2021506226.tif 000062
【０２４０】
２回のランを、パイロットスケールでのＰＡ工程の後に、ラン１について１１ｇ／Ｌ、ラン２について２２ｇ／Ｌのローディング係数で行った。目標とするｐＨはｐＨ１１．２であり、インキュベーション時間は最悪の場合のシナリオを模倣するため９０分を超えて行った。幾つかのインプット操作範囲は、７７．９ｍＬ／Ｌ〜８３．４ｍＬ／Ｌの塩基化率及び４．１ｍＬ／Ｌ〜５．６ｍＬ／Ｌの中和率で得られた。これとは対照的に、代表的でない小規模ランの間、比率はこれらの範囲内であり、塩基化は８１．５ｍＬ／Ｌ、中和は４．７ｍＬ／Ｌであった。さらに、アウトプット操作範囲は、ローディング係数に直接関係する、約６．０で循環する（ｒｅｖｏｌｖｉｎｇ）ｐＨ、４．０ｍＳ／ｃｍ〜４．４ｍＳ／ｃｍの導電率及び１．７ｇ／Ｌ〜３．３ｇ／ＬのＰＡ溶出液濃度を示した。最後に、９４％の工程収量は、低／高ｐＨ不活性化工程について通常通りである。
【０２４１】
生成物の品質の結果に関して、ＨＰＬＣ−ＳＥは、２回のランで同様の結果を示し９４．３％の単量体であり、１時間のインキュベーションで９４．８％、２時間で９４．６％が観察された小規模データに匹敵した。さらに、ＢＥＡＴ％がラン１で８９．９％、ラン２で８７．６％であるＣＧＥ非還元結果は、約８８％のＢＥＡＴ％を示す小規模データに近似していた。ＢＥＡＴ％で見られたわずかな違いは、ＢＥＡＴ”％の変動に直接関連していた。実際に、ＢＥＡＴ”％はラン１で２．８％、ラン２で４．１％であった。１０％以下の方法のばらつき及び分析のピーク積分がこれらの変動を説明し得る。図２２に示されているプロファイルオーバーレイは、明らかなフラグメント化を示さない。
【０２４２】
最後に、４％の差が電荷バリアントのメインピークに現れ、ラン１で４０％、ラン２で３６％であった。この変動は、ラン１とラン２の間の酸性種の２％の増加に直接関連しており、かつ塩基性種に対しても同じであり、方法のばらつき内のため関連のない４％の減少をもたらす。比較のために、プロファイルオーバーレイを図２３に示す。近似値（Ｃｌｏｓｅｄ  ｖａｌｕｅ）が、約４２％のメインピークを伴って小規模において見られた。
【０２４３】
結論として、高ｐＨスケールアップは、小規模データと同等の良好な生成物の品質結果を示した。追加のデータを収集するため、細胞ベースの機能アッセイ及び結合親和性アッセイ等の他のアッセイを行った。
【０２４４】
結合親和性アッセイ
ＣＤ３ε１−２６−Ｆｃ及びＥＧＦＲに対する相対的親和性を表５９及び表６０にそれぞれ収載する。
【表５９】
2021506226.tif 000063
【表６０】
2021506226.tif 000064
【０２４５】
高ｐＨで処理したサンプル間では、ＣＤ３ε１−２６−Ｆｃ標的に対する親和性の違いは観察されなかった。相対解離定数の平均は、基準については１．０であり、２４時間の高ｐＨインキュベーション後はそれぞれ１．０７であった。
【０２４６】
ＥＧＦＲ標的に関しては、わずかな増加のみが２時間超のインキュベーション後に現れた。相対解離定数の平均は２時間後に１．０２、４時間後に１．０９及び２４時間後に１．１５であった。
【０２４７】
結論として、ＢＥＡＴ（登録商標）３のＥＧＦＲ及びＣＤ３ε１−２６−Ｆｃに対する親和性の違いは、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を網羅する２時間のインキュベーションまで高ｐＨで観察されなかった。
【０２４８】
細胞ベースの機能アッセイ
細胞ベースの機能アッセイの結果を図２４に示す。５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）を、用量反応曲線に基づいて決定した。異なる用量反応曲線の比較には、高ｐＨ条件間でわずかな変動を示した。実際に、右へのわずかなシフトが、インキュベーション時間が長くなるとｘ軸上で観察される。このシフトは、ＥＣ５０値の増加に直接関係する生成物の効力の低下を明らかにする（例えば、ｔ０でＥＣ５０＝０．００６３、ｔ２４ｈで０．００９４）。
【０２４９】
得られたＥＣ５０値により、ゼロに等しい高ｐＨインキュベーション時間によるサンプルを基準として、各サンプルの相対的効力を決定することができた。結果を表６１に示す。
【表６１】
2021506226.tif 000065
【０２５０】
結果は、２時間のインキュベーション後に９７％、４時間後に８５％及び２４時間後に６７％の相対的効力を示した。方法のばらつきが２５％以下であり、相対的効力は２時間のインキュベーションまで安定していることがわかり、その後、観察された減少はＢＥＡＴ（登録商標）３活性の変化を示しているようである。実際に、例えば、２４時間のインキュベーション後に、同じ活性レベルを得るには、ＢＥＡＴ（登録商標）３の濃度は基準サンプルの濃度（すなわち、インキュベーション時間がゼロに等しい）よりも高い必要がある。相対的効力パーセンテージのこの減少は、レスポンダー細胞の活性化の減少とその結果としての発光応答の減少に関与する分子の潜在的な酸化に関連している可能性がある。この仮説は、酸性種の増加が時間の経過と共に観察された前述のＩＣＥの結果と相関しているようであった。実際に、酸化は負に帯電した電子の損失を伴い、その結果、正に帯電した酸性種の増加を間接的に伴う。
【０２５１】
結論として、高ｐＨインキュベーション時間が増加すると、ＢＥＡＴ（登録商標）３活性の低下が見られるようである。それでも、ＢＥＡＴ（登録商標）３の活性は、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を網羅する、２時間のインキュベーションまで変化しなかった。高ｐＨ処理が適切であることが再度確認された。
【０２５２】
残留ＤＮＡ及びＨＣＰアッセイ
パイロットスケールの高ｐＨサンプルで行われた残留ＤＮＡアッセイを表６２に示す。
【表６２】
2021506226.tif 000066
ＶＩ工程の前に、全てのＰＡ溶出液を０．２μｍで濾過した。
【０２５３】
残留ＤＮＡ濃度は、タンパク質１ミリグラム当たりのＤＮＡのピクトグラムで表され、各サンプルのタンパク質濃度に関係なく、全てのサンプルをそれらの間で比較することが可能である。高ｐＨでの処理後に、ＤＮＡ濃度は１５９ｐｇ／ｍｇ（ロード＝ＰＡ溶出液で１８２ｐｇ／ｍｇに対して）であり、濾過後は３０ｐｇ／ｍｇであった。沈殿が高ｐＨインキュベーション中に観察され、おそらく、ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む不純物の沈殿のためである。その結果、高ｐＨ工程は沈殿によりＤＮＡを除去し、沈殿は次いで、０．２μｍ濾過により除去される。全体的な除去工程のパーセンテージは約８４％であった。
【０２５４】
ＨＣＰ汚染物質レベルに対する高ｐＨ工程の影響を評価し、結果を表６３に示す。
【表６３】
2021506226.tif 000067
【０２５５】
ＶＩ工程の前に、全てのＰＡ溶出液を０．２μｍで濾過した。
【０２５６】
残留ＨＣＰ濃度は、各サンプルのタンパク質濃度に関係なく、全てのサンプルを比較するため、タンパク質１ミリグラム当たりのＨＣＰのナノグラムで表された。第１のサンプルの残留ＨＣＰの濃度は、Ｏｃｔｅｔ機器により１４２５ｎｇ／ｍｇ、ＥＬＩＳＡ方法により２８０３ｎｇ／ｍｇである。Ｏｃｔｅｔを使用したアッセイは、従来のＥＬＩＳＡアッセイと比較してより感度が高いと供給業者によって説明されていたため、これらの結果は予想外であった。これらの２つの未処理サンプルを、各方法の基準として独立して使用した。
【０２５７】
Ｏｃｔｅｔの結果に関しては、高ｐＨ処理後に、ＨＣＰ濃度は、処理していないＰＡ溶出液の１４２５ｎｇ／ｍｇに対して１１５４  ｎｇ／ｍｇであった。濾過後、濃度は１８５ｎｇ／ｍｇであった。残留ＤＮＡアッセイで観察されたように、高ｐＨ処理は、おそらく高ｐＨインキュベーション中に沈殿し、０．２μｍ濾過により除去されるＨＣＰを除去する可能性を示した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、より高い感度が示された（すなわち、より高い濃度が測定された）にもかかわらず、ＨＣＰ除去率は、両方のＶＩで約８０％の除去であり、両方の方法の間で同等であった。
【０２５８】
結論として、高ｐＨ処理は、ＤＮＡ及びＨＣＰの不純物を除去する興味深い可能性を示した。工程の最後に行われる０．２μｍ濾過は、高ｐＨインキュベーション中に沈殿したＨＣＰ及びＤＮＡを物理的に除去するために不可欠であった。
【０２５９】
ＶＲＶ  ＮＲＴ研究  
ウイルスを効率的に不活性化する能力について、高ｐＨ処理を試験した。Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅで非規制試験を行い、ウイルスクリアランスの結果を表６４に要約する。
【表６４】
2021506226.tif 000068
【０２６０】
異種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に対して行われたウイルスクリアランスは、ｐＨ１０．８（＋／−０．０５）で６０分間の高ｐＨ処理後、５．６５  ｌｏｇ１０の減少係数を示した。したがって、高ｐＨ処理はウイルスクリアランスの観点から非常に有効であると考えられた。
【０２６１】
また、ＢＥＡＴ（登録商標）３精製プロセスのウイルス不活化工程として高ｐＨでのＢＥＡＴ（登録商標）３のインキュベーションを使用してウイルスクリアランスを試験する場合、クリアランスは、図２５の高ｐＨ処理速度論によって示されるように有効である。
【０２６２】
ウイルス力価及び計算されたｌｏｇ減少係数を下記表６６に要約する。
【表６５】
2021506226.tif 000069
【０２６３】
両方の重複するランは、同様の不活性化の速度論を示し、時間の経過と共に顕著且つ急速に減少し（例えば、５分、１０分、３０分及び６０分のインキュベーション後２．１５  ｌｏｇ１０、１．８１  ｌｏｇ１０、１．６２  ｌｏｇ１０及び１．４７  ｌｏｇ１０）、大きな減少が５分間のインキュベーション後に体系的に観察された。
【０２６４】
高ｐＨ処理で得られたＭＬＶ減少係数は５．７７  ｌｏｇ１０及び５．６５  ｌｏｇ１０（それぞれラン１及びラン２）であり、ＶＩがＭＬＶウイルスの不活化に有効であると結論付けることができた（すなわち、全てのＬＲＦ＞４．００  ｌｏｇ１０）。
【０２６５】
要約すると、抗体ＢＥＡＴ（登録商標）３に対する最適な処理を選択するために、様々なＶＩ戦略を検討した。ＶＩ条件の選択基準は、第１に処理後の分子の安定性、第２に許容可能なｌｏｇ減少でウイルスを不活性化する方法の効率、そして最後に製造プロセスをＧＭＰエリアに導入する容易さであった。
【０２６６】
ＰＡ溶出液に対する低ｐＨインキュベーションは、高分子量種の増加を伴う重要な生成物の分解を示した。この戦略は、このプロジェクトには適さないとされた。
【０２６７】
バルク採取物に対する溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理及びＰＡ溶出液に対する高ｐＨはどちらも適していることがわかり、物理化学的特性のみに関する生成物の品質の観点では同様の結果を示した。さらに、新たな処理方法と見なされた高ｐＨ  ＶＩは、生成物の活性又はウイルスクリアランスに基づく他のアッセイに適しているとうまく確認された。
【０２６８】
結論として、この報告で検討されている全てのパラメーターを考慮して、高ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）３プロジェクトに最適なＶＩ戦略として選択され、ＰＡとＣＥＸの工程の間のプロセスで実施された。Ｓ／Ｄ処理をバックアップ選択と考えた。
【０２６９】
また、ＢＥＡＴ（登録商標）３精製プロセスのウイルス不活化工程として高ｐＨでのＢＥＡＴ（登録商標）３のインキュベーションの際のウイルス除去を試験する場合、除去は、図２５の高ｐＨ処理速度論によって示されるように結果的に有効である。
【０２７０】
ウイルス力価及び計算したｌｏｇ減少係数を下記表６６に要約する。
【表６６】
2021506226.tif 000070
【０２７１】
重複ランはいずれも、同様の不活性化の速度論を示し、時間の経過と共に顕著且つ急速に減少し（例えば、５分、１０分、３０分及び６０分のインキュベーション後に２．１５  ｌｏｇ１０、１．８１  ｌｏｇ１０、１．６２  ｌｏｇ１０及び１．４７  ｌｏｇ１０）、大きな減少が５分間のインキュベーション後に体系的に観察された。
【０２７２】
高ｐＨ処理で得られたＭＬＶ減少係数は５．７７  ｌｏｇ１０及び５．６５  ｌｏｇ１０（それぞれラン１及びラン２）であり、ＶＩがＭＬＶウイルスの不活化に有効であると結論付けることができた（すなわち、全てのＬＲＦ＞４．００  ｌｏｇ１０）。
【０２７３】
実施例８：高ｐＨは非低ｐＨ不安定抗体の精製プロセスにおいても低ｐＨ処理の有効な代替手段である
非ｐＨ不安定抗体の精製プロセスにおいて低ｐＨインキュベーションの代替として高ｐＨを使用する可能性を試験するため、ヒト化ＩｇＧ１（ここではＡｂ１と呼ぶ）の安定性及び活性における高ｐＨインキュベーションの効果を調査した。
【０２７４】
材料、方法及び機器
この研究で使用した出発物質は、代表的なＰＡ溶出液であった。
【０２７５】
全ての化学物質は薬局方グレード（米国又は欧州）であった。インプロセス０．２μｍ濾過工程を通常、全てのバッファー及びプロセス中間体に対して行った。さらに、マグネチックスターラー、ｐＨメーター及び導電率計を使用した。
【０２７６】
試験した時間点は室温にて１時間、２時間及び４時間、並びにこの時間点を超え、生成物を５±３℃で最大２４時間インキュベーションした。約１００ｍＬのＰＡ溶出液を、ＮａＯＨ  ０．５Ｍを使用してＮａｌｇｅｎｅボトル中でｐＨ１１．２にマグネチックスターラーを用いて攪拌しながら塩基化した。このｐＨを、プロセスの目標ｐＨ１１．０を検証するために、生成物の品質について最悪の場合のシナリオとして選択した。高ｐＨの生成物を、以下に記載するように直ちに中和された時間点ｔ０を除いて、インキュベートした。各時間点で、約１０ｍＬの高ｐＨ生成物を５０ｍＬ  ＴＰＰチューブに移し、凍結する前に、ＶＩ反応を停止するためＨＣｌ  ３．７％（中和工程）を使用してｐＨ５．２までｐＨを下げて中和した。
【０２７７】
生成物の品質を、全ての時間点でＨＰＬＣ−ＳＥ、ｉＣＥ及びＣＧＥによって分析した。中和されておらず、どのＶＩ処理も行っていないＰＡ溶出液も分析し、基準として使用した。
【表６７】
2021506226.tif 000071
【０２７８】
上記の試験による幾つかのサンプルを、表面プラズモン共鳴により試験するため選択した（表３７）。目的は、高ｐＨ処理が標的のＯＸ４０Ｒ及びＦｃｇＲ３ａに対するＡｂ１分子の結合親和性に影響を与え、したがって間接的にその活性に影響を与えるかどうかを検証することであった。さらに、細胞ベースの機能アッセイも、Ａｂ１分子活性に対する高ｐＨの影響を直接検証するために行った。
【表６８】
2021506226.tif 000072
【０２７９】
結果及び結論
Ａｂ１の高ｐＨインキュベーションの保持時間の影響をＳＥ−ＨＰＬＣによって分析し、結果を図２６及び表６９に示す。
【表６９】
2021506226.tif 000073
【０２８０】
この研究は、単量体の割合が条件間で同等であることに加えて、２４時間までの高ｐＨ処理では凝集が見られないことを示している。観察された変動は方法のばらつき内に含まれ、統計的に有意ではない。したがって、これらの結果によれば、Ａｂ１は、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を安全マージンで網羅する２４時間まで安定である。
【０２８１】
高ｐＨ処理時のサンプルの純度及び同一性を更に調査するため、保持時間の影響を非還元ＣＧＥで分析した、表７０及び図２７。また、これらの実験は、中間体の割合が基準サンプル（ＰＡ溶出液）と同等であり、顕著なフラグメント化は２時間まで発生しないことを示している。１２５ｋＤａのフラグメントの割合は２時間後にわずかに増加し、ＩｇＧの割合の減少と相関している。
【０２８２】
これらの結果を総合すると、Ａｂ１は、通常は６０分以上９０分以下であるプロセス時間の安全マージンを網羅する２時間まで安定である。
【表７０】
2021506226.tif 000074
【０２８３】
還元ＣＧＥ（図２８及び表７１）はまた、顕著なフラグメントの増加が２時間までなく、２時間後に「不明なフラグメント」の割合のわずかな増加が起こり、これはＨＣ％の減少と相関することを示す。
【０２８４】
これらの結果は、Ａｂ１が、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間の安全マージンを網羅する２時間まで安定であることを確認する。
【表７１】
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【０２８５】
高ｐＨでの保持時間の影響をｉＣＥにより更に分析して、電荷バリアントを評価した。表７２及び図２９において、結果は、時間の経過と共に酸性種が増加することを示すが、それでも方法のばらつきは１０％以下であり、２時間までに観測される差は方法のばらつきの範囲内であり、許容可能であって統計的に有意ではないと見なすことができた。言い換えれば、観察された酸性パーセンテージの増加は予想される傾向であり、２時間の安全マージンは、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間（及びそれよりも長い）を網羅している。
【表７２】
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【０２８６】
分子活性に対する高ｐＨでの保持時間の影響を評価するため、細胞ベースの機能アッセイを行った。結果によれば、図３０及び表７３において、相対的効力の値における時間の経過に伴う傾向は見られない。ｔ１ｈ及びｔ２ｈでの高ｐＨ処理は、基準として使用されるＰＡ溶出液と比較して非常に類似した効力をもたらす。方法のばらつきが２５％以下であることを考慮すると、高ｐＨ処理は、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を網羅する、２時間のインキュベーションまでＡｂ１活性を大幅に変化させない。
【表７３】
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【０２８７】
Ａｂ１の活性に対する高ｐＨインキュベーションの影響を評価するため、結合親和性アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅで）を実施した（表７４）。
【表７４】
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【０２８８】
ヒトＯＸ４０への結合活性における機能的重要性の違いは、プロテインＡ溶出液と高ｐＨでインキュベートした全てのサンプルとの間で見られない。わずかな違いは、注入された濃度がわずかに異なるためかもしれない。
【０２８９】
ヒトＦｃγＲ３ａへの結合活性における機能的重要性の違いは、プロテインＡ溶出液と高ｐＨでインキュベートした全てのサンプルとの間で見られない。わずかな違いは、注入された濃度がわずかに異なるためかもしれない。
【０２９０】
総合するとこれらの結果は、ＰＡ溶出液の高ｐＨ処理が、非低ｐＨ不安定抗体の精製プロセスでも低ｐＨ処理の有効な代替手段であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月21日(2020.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021506226000001.app
【国際調査報告】
2021506226.tif 000109
2021506226.tif 000110