(57)【要約】  本明細書では、ＰＤ１の関与を特徴とする癌を治療するためのＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物、およびその使用が開示され、そのワクチン組成物は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する有効量の免疫原を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）の関与を特徴とする癌を治療する方法であって、対象に、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する有効量の免疫原を含んでなるワクチン組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記免疫原が、ＰＤ１のＢ細胞エピトープを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号２〜１０９からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号９、４３および５７からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象に、第２の免疫原を、癌関連抗原に対する免疫応答を誘導する有効量で投与することをさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫応答が、抗体が癌関連抗原のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記対象に、癌関連抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することをさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌関連抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１、Ｂ黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シトシンリン酸ジエステルグアニン（ＣｐＧ）、糖タンパク質１００（Ｇｐ１００）、テロメラーゼトランスクリプターゼ（ｈ−ＴＥＲＴ）、黒色腫抗原コード遺伝子（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（メラン−Ａ）およびムチン−１（ＭＵＣ−１）からなる群から選択される、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫原が、担体を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴ、ＣＴＢ）、大腸菌およびその突然変異体の易熱性毒素（ＬＴ）、乳酸菌（ＬＡＢ）、細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソームならびにジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記担体が、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（配列番号１１８）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクチン組成物が、アジュバントを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、サポニン、ＴＬＲアゴニスト、ＣＲＭ１９７、油中水型エマルション、水中油型エマルション、フロイントの不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、モノホスホリル脂質Ａ（３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ；ＭＰＬ）、ＡＳ０１（ＭＰＬおよびＱＳ−２１のリポソーム製剤）、ＡＳ０４（ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムのリポソーム製剤）、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、ＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、スクアレンおよび前記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アジュバントが、ＴＬＲ−４アゴニストである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＬＲ−４アゴニストが、モノホスホリル脂質Ａである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アジュバントが、モンタニドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤ１の関与を特徴とする癌の治療のための薬剤の製造における、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなるワクチン組成物の使用。
【請求項１８】
前記薬剤が、第２の免疫原とともに投与するために調合され、前記第２の免疫原が、対象において癌関連抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量で存在する、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなる、ＰＤ１の関与を特徴とする癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２０】
前記免疫原が、ＰＤ１のＢ細胞エピトープを含んでなる、請求項１９に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２１】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号２〜１０９からなる群から選択される、請求項２０に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２２】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号９、４３および５７からなる群から選択される、請求項２１に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２３】
癌関連抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量の第２の免疫原をさらに含んでなる、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２４】
前記免疫応答が、抗体が癌関連抗原のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答である、請求項２３に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２５】
前記癌関連抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１、Ｂ黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シトシンリン酸ジエステルグアニン（ＣｐＧ）、糖タンパク質１００（Ｇｐ１００）、テロメラーゼトランスクリプターゼ（ｈ−ＴＥＲＴ）、黒色腫抗原コード遺伝子（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（メラン−Ａ）およびムチン−１（ＭＵＣ−１）からなる群から選択される、請求項２３または請求項２４に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２６】
前記免疫原が、担体を含んでなる、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２７】
前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴ、ＣＴＢ）、大腸菌およびその突然変異体の易熱性毒素（ＬＴ）、乳酸菌（ＬＡＢ）、プロバイオティクス細菌、細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、寄生虫由来抗原およびジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７からなる群から選択される、請求項２６に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２８】
前記担体が、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（配列番号１１８）である、請求項２７に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項２９】
前記ワクチン組成物が、アジュバントを含んでなる、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項３０】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、サポニン、フロイントの完全アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、ＣＲＭ１９７、油中水型エマルション、水中油型エマルション、フロイントの不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、モノホスホリル脂質Ａ（（３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ；ＭＰＬ）、ＡＳ０１（ＭＰＬおよびＱＳ−２１のリポソーム製剤）、ＡＳ０４（ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムのリポソーム製剤）、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、ＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバント、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項３１】
前記アジュバントが、ＴＬＲ−４アゴニストである、請求項３０に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項３２】
前記ＴＬＲ−４アゴニストが、モノホスホリル脂質Ａである、請求項３１に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項３３】
前記アジュバントが、モンタニドである、請求項３２に記載の癌の治療において使用するためのワクチン組成物。
【請求項３４】
抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなる、ＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物。
【請求項３５】
前記免疫原が、ＰＤ１のＢ細胞エピトープを含んでなる、請求項３４に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号２〜１０９からなる群から選択される、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号９、４３および５７からなる群から選択される、請求項３６に記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
癌関連抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量の第２の免疫原をさらに含んでなる、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
前記免疫応答が、抗体が癌関連抗原のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答である、請求項３８に記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
前記癌関連抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１、Ｂ黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シトシンリン酸ジエステルグアニン（ＣｐＧ）、糖タンパク質１００（Ｇｐ１００）、テロメラーゼトランスクリプターゼ（ｈ−ＴＥＲＴ）、黒色腫抗原コード遺伝子（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（メラン−Ａ）およびムチン−１（ＭＵＣ−１）からなる群から選択される、請求項３８または請求項３９に記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
前記免疫原が、担体を含んでなる、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴ、ＣＴＢ）、大腸菌およびその突然変異体の易熱性毒素（ＬＴ）、乳酸菌（ＬＡＢ）、プロバイオティクス細菌、細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、寄生虫由来抗原およびジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７からなる群から選択される、請求項４１に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
前記担体が、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（配列番号１１８）である、請求項４２に記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
アジュバントを含んでなる、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項４５】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、サポニン、フロイントの完全アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、ＣＲＭ１９７、油中水型エマルション、水中油型エマルション、フロイントの不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、モノホスホリル脂質Ａ（（３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ；ＭＰＬ）、ＡＳ０１（ＭＰＬおよびＱＳ−２１のリポソーム製剤）、ＡＳ０４（ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムのリポソーム製剤）、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、ＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバント、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項４４に記載のワクチン組成物。
【請求項４６】
前記アジュバントが、ＴＬＲ−４アゴニストである、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４７】
前記ＴＬＲ−４アゴニストが、モノホスホリル脂質Ａである、請求項４６に記載のワクチン組成物。
【請求項４８】
前記アジュバントが、モンタニドである、請求項４７に記載のワクチン組成物。
【請求項４９】
ＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物であって、
前記組成物が、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するペプチド配列を含んでなる免疫原を含んでなり、
前記ペプチド配列が、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および前記のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基を含んでなり、かつ、
前記免疫原のアミノ酸配列が、ＰＤ１の少なくとも５０個のアミノ酸残基の連続ストレッチと同一でない、ワクチン組成物。
【請求項５０】
前記ペプチド配列が、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも８つの連続アミノ酸残基を含んでなる、請求項４９に記載のワクチン組成物。
【請求項５１】
前記ペプチド配列が、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および５８〜６３からなる群から選択される、請求項５０に記載のワクチン組成物。
【請求項５２】
前記ペプチド配列が、配列番号９、配列番号４３、およびそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項４９または請求項５０に記載のワクチン組成物。
【請求項５３】
前記ペプチド配列が、配列番号９および配列番号４３からなる群から選択される、請求項５２に記載のワクチン組成物。
【請求項５４】
前記免疫原が、無差別なＴヘルパー細胞エピトープをさらに含んでなる、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５５】
前記免疫原が、前記ペプチド配列のうち少なくとも２つを含んでなる、請求項４８〜５４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５６】
前記免疫原が、配列番号９および配列番号４３を含んでなる、請求項５５に記載のワクチン組成物。
【請求項５７】
前記免疫原が、配列番号５６および配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項５６に記載のワクチン組成物。
【請求項５８】
前記免疫原が、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および５８〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【請求項５９】
前記免疫原が、配列番号９および配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる、請求項５８に記載のワクチン組成物。
【請求項６０】
前記免疫原が、配列番号５６および配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【請求項６１】
前記免疫原が、担体にコンジュゲートされている、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６２】
前記担体が、免疫原性である、請求項６１に記載のワクチン組成物。
【請求項６３】
前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴ、ＣＴＢ）、大腸菌およびその突然変異体の易熱性毒素（ＬＴ）、乳酸菌（ＬＡＢ）、細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、樹状細胞およびジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７からなる群から選択される、請求項６１または請求項６２に記載のワクチン組成物。
【請求項６４】
前記担体が、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（配列番号１１８）である、請求項６３に記載のワクチン組成物。
【請求項６５】
アジュバントを含んでなる、請求項４８〜６４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６６】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、サポニン、フロイントの完全アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、ＣＲＭ１９７、モンタニド（登録商標）、フロイントの不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、マトリックスＭ（商標）アジュバント、マトリックスＣ（商標）アジュバント、マトリックスＱ（商標）アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）またはＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体含有アジュバント、モノホスホリル脂質Ａ（（３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ；ＭＰＬ）、ＡＳ０１（ＭＰＬおよびＱＳ−２１のリポソーム製剤）、ＡＳ０４（ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムのリポソーム製剤）、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、ＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバント、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項６５に記載のワクチン組成物。
【請求項６７】
前記アジュバントが、ＴＬＲ−４アゴニストである、請求項６６に記載のワクチン組成物。
【請求項６８】
前記ＴＬＲ−４アゴニストが、モノホスホリル脂質Ａである、請求項６７に記載のワクチン組成物。
【請求項６９】
前記アジュバントが、モンタニドである、請求項６８に記載のワクチン組成物。
【請求項７０】
癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープをさらに含んでなる、請求項４８〜６９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項７１】
前記癌関連抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１、Ｂ黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シトシンリン酸ジエステルグアニン（ＣｐＧ）、糖タンパク質１００（Ｇｐ１００）、テロメラーゼトランスクリプターゼ（ｈ−ＴＥＲＴ）、黒色腫抗原コード遺伝子（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（メラン−Ａ）およびムチン−１（ＭＵＣ−１）からなる群から選択される、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項７２】
ＰＤ１の関与を特徴とする病態を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項４８〜７１のいずれか一項に記載のワクチン組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項７３】
前記病態が、癌である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象に、癌関連抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することをさらに含んでなる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記癌関連抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１、Ｂ黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シトシンリン酸ジエステルグアニン（ＣｐＧ）、糖タンパク質１００（Ｇｐ１００）、テロメラーゼトランスクリプターゼ（ｈ−ＴＥＲＴ）、黒色腫抗原コード遺伝子（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（メラン−Ａ）およびムチン−１（ＭＵＣ−１）からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ワクチン組成物の投与の後に、対象に投与される、請求項７４または請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ＰＤ１の関与を特徴とする病態の治療のための薬剤の製造における、請求項４８〜７７のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項７８】
前記病態が、癌である、請求項７７に記載の使用。
【請求項７９】
前記薬剤が、癌関連抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの投与の前に投与するために調合される、請求項７８に記載の使用。
【請求項８０】
前記癌関連抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１、Ｂ黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シトシンリン酸ジエステルグアニン（ＣｐＧ）、糖タンパク質１００（Ｇｐ１００）、テロメラーゼトランスクリプターゼ（ｈ−ＴＥＲＴ）、黒色腫抗原コード遺伝子（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（メラン−Ａ）およびムチン−１（ＭＵＣ−１）からなる群から選択される、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
請求項４８〜７１のいずれか一項に記載のワクチン組成物と、薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項８２】
前記担体が、ウイルス様粒子ではない、請求項９に記載の方法。
【請求項８３】
前記担体が、ウイルス様粒子ではない、請求項２６、４１および６１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、オーストラリア仮特許出願第２０１８９００３６８号、オーストラリア仮特許出願第２０１８９０３５１８号およびオーストラリア仮特許出願第２０１８９０３９６８号に基づき、それぞれの全内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、プログラム細胞死タンパク質１(programmed cell death protein 1)（ＰＤ１）に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物、そのような組成物を製造する方法、および癌などのＰＤ１の関与を特徴とする病態の治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、側副組織損傷を最小化するために末梢組織において生理学的免疫応答の持続期間および大きさを調節するために重要な免疫系に備わっている数多くの阻害経路に関する。多くの腫瘍には、免疫耐性機構として、特に、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対するある種の免疫チェックポイント経路が組み込まれている。
【０００４】
Ｔ細胞受容体共刺激経路は、Ｔ細胞の活性化および免疫寛容の調節において重要な役割を有する。Ｂ７−ＣＤ２８スーパーファミリーは、ＣＤ２８およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）をはじめ、共刺激受容体と阻害受容体の両方を含む。一般に、Ｔ細胞上のＰＤ１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）との相互作用は、通常の免疫応答の際に末梢Ｔ細胞免疫寛容の誘導および維持を制御する。このＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生に負の調節を行うことが記載されている。ＰＤ１経路の主要な役割は、Ｔ細胞活性化の初期段階におけるものではなく、側副組織の損傷を制限するためにＴ細胞の活性を下方調節することによって組織におけるエフェクターＴ細胞応答を調節することである。しかしながら、白血病および多発性骨髄腫などの数種の癌において、癌細胞上のＰＤ−Ｌ１の表面発現は細胞傷害性リンパ球を阻害し、これはこれらのＴ細胞の表面の高いＰＤ１レベルによる。これに関して、ＰＤ−Ｌ１は、急速進行性Ｂ細胞リンパ腫のサブセットにおいて、悪性細胞および浸潤免疫細胞の両方で発現される。同様に、骨髄腫細胞上でのＰＤ−Ｌ１発現の上方調節は、Ｔ細胞のアポトーシスおよび腫瘍特異的Ｔ細胞のアネルギー、ならびに急速進行性骨髄腫細胞の特徴の増進を誘導することが記載されている。
【０００５】
免疫チェックポイントの多くはリガンド−受容体相互作用により誘導されるので、それらは抗体により容易に遮断され、または組換え型のリガンドもしくは受容体により調節される。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4)（ＣＴＬＡ４）抗体は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認を得るためのこの種の免疫療法の筆頭であった(Nature Reviews Cancer, 12, 252-264, 2012)。もっと最近では、ＰＤ１およびその天然リガンドＰＤ−Ｌ１を標的とする治療抗体も開発され、上市された（例えば、オプジーボ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによる）およびキートルーダ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋによる））。
【０００６】
高い治療効力の可能性にもかかわらず、モノクローナル抗体の受動的投与には、反復投与が必要なこと、長期間が必要なこと、コストが高いこと、および単一のエピトープだけを標的とすることを含むいくつかの欠点がある。癌を治療するためのモノクローナル抗体の使用にもまたそのリスクおよび制限があり、それにより抗体の反復投与は患者によっては有害な影響をもたらすことがあり、その例として輸注反応、炎症、自己免疫および抗体耐性が含まれる。よって、チェックポイント抗原ＰＤ１に関連する、またはチェックポイント抗原ＰＤ１の関与を特徴とする癌を治療する改良法がなお切望されている。
【発明の概要】
【０００７】
開示の概要
本開示の一つの側面において、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）の関与を特徴とする癌を治療する方法が提供され、その方法は、対象にＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物を投与することを含んでなり、前記ワクチン組成物は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する有効量の免疫原を含んでなる。
【０００８】
一つの実施形態において、本方法は、対象に第２の免疫原を癌関連抗原に対する免疫応答を誘導する有効量で投与することをさらに含んでなる。さらに別の実施形態では、本方法は、対象に癌関連抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することをさらに含んでなる。
【０００９】
本開示の別の側面において、ＰＤ１の関与を特徴とする癌の治療のための薬剤の製造におけるワクチン組成物の使用が提供され、前記ワクチン組成物は、本明細書に記載されるように、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなる。一つの実施形態において、薬剤は、第２の免疫原を伴う投与のために調合され（formulated）、第２の免疫原は、本明細書に記載されるように、対象において癌関連抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量で存在する。
【００１０】
本開示の別の側面において、ＰＤ１の関与を特徴とする癌の治療において使用するためのワクチン組成物が提供され、ワクチン組成物は、本明細書に記載されるように、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなる。一つの実施形態において、この組成物は、本明細書に記載されるように、癌関連抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量の第２の免疫原をさらに含んでなる。
【００１１】
本開示の別の側面において、ＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物が提供され、ワクチン組成物は、本明細書に記載されるように、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなる。一つの実施形態において、この組成物は、本明細書に記載されるように、癌関連抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量の第２の免疫原を含んでなる。
【００１２】
本開示の一つの側面において、ＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物が提供され、前記組成物は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するペプチド配列を含んでなる免疫原を含んでなり、前記ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および前記のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基を含んでなり、前記免疫原のアミノ酸配列は、ＰＤ１の少なくとも５０個のアミノ酸残基の連続ストレッチ（continuous stretch）と同一ではない。
【００１３】
本開示の別の側面において、ＰＤ１の関与を特徴とする病態を治療する方法が提供され、この方法は、それを必要とする対象に本明細書に記載されるようなワクチン組成物を投与することを含んでなる。
【００１４】
本開示のさらに別の側面では、ＰＤ１の関与を特徴とする病態の治療のための薬剤の製造における本明細書に記載されるようなワクチン組成物の使用が提供される。
【００１５】
本開示のさらに別の側面では、本明細書に記載されるようなワクチン組成物と薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００１６】
本開示のさらに別の側面では、ＰＤ１の関与を特徴とする病態の治療のための本明細書に記載されるようなワクチン組成物を含んでなる医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＰＤ１の精製されたＧＳＴ−Ｂ細胞エピトープを示すＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ−Ｐａｇｅゲルの概略図である。このゲルはＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色されている。
【図２】図２は、組換えマウスＰＤ１に対する抗マウス−ＰＤ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合を阻害する、マウスＰＤ１の同定されたＢ細胞エピトープ（配列番号１１９）の能力を示す（ＥＬＩＳＡ  ＯＤ値、４５０ｎｍ）。
【図３】図３は、マウスＰＤ−１を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対する抗マウスＰＤ−１  ｍＡｂの結合を阻害する、Ｂ細胞エピトープ（配列番号１１９）の能力を示す。
【図４】図４は、ｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ（配列番号１１９）−ＣＲＭコンジュゲートで免疫したマウスの血清における抗ｍＰＤ１  ＩｇＧ抗体の抗体力価を示し、この結果は、０日目の初回免疫後４１日目（ＢＡ１）、６２日目（ＢＡ２）、８３日目（ＢＡ３）および１０４日目（ＢＡ４）の抗体力価の増加によって示されるような、ｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ−ＣＲＭコンジュゲートに対する明確な抗体応答を示す（図４）。
【図５】図５は、細胞アッセイにおけるＪＴ−ｍＰＤ１の阻害活性を示す。ｍＰＤ１を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、抗ｍＰＤ１  ｍＡｂ単独のまたは種々の濃度のＪＴ−ｍＰＤ１とのプレインキュベーション後の結合を調べるための結合アッセイで使用した。有意差をアスタリスクで示す。
【図６Ａ】図６は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上で発現された組換えｍＰＤ１に対する抗ＪＴ−ｍＰＤ１−ＩｇＧの結合を示す。Ａ）組換えｍＰＤ１を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、種々の濃度の抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧまたは抗ｍＰＤ１  ｍＡｂを用いる結合アッセイで使用した。有意差をアスタリスクで示す。
【図６Ｂ】図６は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上で発現された組換えｍＰＤ１に対する抗ＪＴ−ｍＰＤ１−ＩｇＧの結合を示す。Ｂ）種々の濃度の（ｉ）ＪＴ−ｍＰＤ１−ＫＬＨで免疫した(immunosed)ウサギから単離した抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧまたは（ｉｉ）ＰＢＳ対照ウサギから単離した全ＩｇＧ（５００μｇ／ｍｌ）とのプレインキュベーションの前または後の、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたｍＰＤ１に対する抗ｍＰＤ１  ｍＡｂ（０．２μｇ／ｍｌ）の結合を示す競合的ＥＬＩＳＡ。有意差をアスタリスクで示す。
【図６Ｃ】図６は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上で発現された組換えｍＰＤ１に対する抗ＪＴ−ｍＰＤ１−ＩｇＧの結合を示す。Ｃ）ＰＢＳ対照ウサギから単離した種々の濃度の抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧまたは全ＩｇＧ（５００μｇ／ｍｌ）とのプレインキュベーションの前または後の、ｍＰＤ１コーティングＥＬＩＳＡプレートに対する組換えｍＰＤＬ１−Ｆｃの結合を示す競合的ＥＬＩＳＡ法。結果は反復実験の代表例である。有意差をアスタリスクで示す。
【図７】図７は、同系マウス腫瘍モデルにおける抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧの抗腫瘍活性を示す。ＢＬＡＢ／ｃマウスにＨｅｒ−２発現乳癌Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞を移植した。バーは、屠殺時の各群におけるマウスから摘出した腫瘍の平均重量を示す。各摘出腫瘍の代表的な摘出腫瘍の対応する肉眼画像を各バーの下に示す。有意差をアスタリスクで示す。
【図８】図８は、ヒトＰＤ１の１２マーの線状ペプチドフラグメントのそれぞれに対するポリクローナル抗ＰＤ１抗体（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．；カタログ番号１０３７７−ＲＰ０３）の結合を示す。フラグメント（ペプチド配列）のアミノ酸配列をｘ軸に示し、表１の配列番号２〜５４および６２を表す（ｘ軸の左から右へ）。データは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）からの、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）の測定値（ｙ軸）を示す。
【図９】図９は、天然ヒトＰＤ１に対する、アフィニティー精製した抗ペプチド配列抗体（免疫ウサギ抗血清由来、１：２５，０００希釈）の結合を示す。ウサギが免疫された線状ペプチドフラグメントをｘ軸に示す。データは、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）測定値（ｙ軸）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
それ以外の定義がされない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本開示が属す技術分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の材料および方法はいずれも本発明を実施するために使用可能である。専門家は、当技術分野の定義および用語ならびに当業者に公知の他の方法に関して、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.,およびAusubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York, Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87を参照することができる。
【００１９】
本明細書において、文脈がそうではないことを必要としない限り、「を含んでなる(comprise)」、または「を含んでなる(comprises)」もしくは「を含んでなる(comprising)」などの変形形態は、記載の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を包含するが、他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を排除しないことを含意すると理解される。
【００２０】
「からなる(consisting of)」は包含し、かつ、「からなる」という句に続くものに限定されることを意味する。よって、「からなる」という句は、列挙された要素が必要とされるまたは必須であり、かつ、他の要素は存在してはならないことを示す。「から本質的になる(consisting essentially of)」とは、この句の後に列挙された要素を含み、かつ、それらの列挙された要素に関して本開示で特定された活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、「から本質的になる」という句は、列挙された要素が必要とされるまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかによって存在してもよいまたは存在してはならないことを示す。
【００２１】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの(a)、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の側面を含む。よって、例えば、「１つのペプチド」という場合には、単一のペプチド、ならびに２つ以上のペプチドを含み、「１つのエピトープ」という場合には、１つのエピトープ、ならびに２つ以上のエピトープを含むなどである。
【００２２】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、以下の表１および２に示されるように、配列識別番号（配列番号）によって参照される。配列番号は、数字的に、配列識別子＜４００＞１、＜４００＞２などに相当する。配列識別子の概要をここに示す。
【００２３】
【表１】
2021512966.tif 000002
2021512966.tif 000003
2021512966.tif 000004
【００２４】
【表２】
2021512966.tif 000005
2021512966.tif 000006
【００２５】
本開示は、少なくとも一部には、チェックポイント抗原ＰＤ１のＢ細胞エピトープのペプチド配列による免疫誘導が、抗体が天然ＰＤ１タンパク質に結合する抗体応答を惹起し得るという本発明者らの驚くべき発見に基づく。本発明者らはまた、意外にも、ＰＤ１由来Ｂ細胞エピトープによる免疫誘導は体重低下または炎症反応などのいずれの有害な副作用も生じるとは思えないことも見出した。
【００２６】
よって、本開示の一つの側面において、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）の関与を特徴とする癌を治療する方法が提供され、その方法は、対象にＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物を投与することを含んでなり、前記ワクチン組成物は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する有効量の免疫原を含んでなる。
【００２７】
本開示はまた、少なくとも一部には、ＰＤ１の少なくとも８個の連続アミノ酸残基の短いペプチド配列は、対象に投与された際に、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導し得るという、本発明者らの予期しない発見に基づく。
【００２８】
よって、ＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物も提供され、その組成物は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するペプチド配列を含んでなる免疫原を含んでなり、前記ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および前記のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基を含んでなり、前記免疫原のアミノ酸配列は、ＰＤ１の少なくとも５０個のアミノ酸残基の連続ストレッチと同一ではない。
【００２９】
免疫原
用語「免疫原」は、本明細書においては、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて体液性（抗体）応答を含む免疫応答を惹起し得るペプチドを表して使用される。用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書においては、２個以上のアミノ酸残基またはアミノ酸類似体の分子を指して最も広義で互換的に使用される。これらのアミノ酸残基は、ペプチド結合によって、またはその代わりに例えば、エステル、エーテル結合などの他の結合によって連結され得るが、ほとんどの場合には、ペプチド結合によって連結されている。用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、本明細書においては、Ｄ型もしくはＬ型の両方、およびアミノ酸類似体を含む、天然アミノ酸および非天然アミノ酸の両方または合成アミノ酸を包含して使用される。「アミノ酸類似体」は、対応する天然アミノ酸とは１以上の原子で異なる非天然アミノ酸として理解されるべきである。例えば、システインのアミノ酸類似体はホモシステインであり得る。
【００３０】
「少なくとも８個の連続アミノ酸残基」とは、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および前記のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の８、９、１０、１１またはそれを超える連続アミノ酸残基を意味する。一つの実施形態において、免疫原は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９および前記のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも９個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１１個の連続アミノ酸残基を含んでなる。
【００３１】
一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも９個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１１個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および５８〜６３からなる群から選択される。一つの実施形態において、免疫原は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および５８〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。
【００３２】
一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３、４９および前記のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸残基配列からなる群から選択されるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に１個以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個など）の付加的アミノ酸残基をさらに含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に１個以上のアミノ酸残基をさらに含んでなる。「１個以上の付加的アミノ酸残基」とは、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも６個、好ましくは少なくとも７個、好ましくは少なくとも８個、好ましくは少なくとも９個、好ましくは少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１１個、好ましくは少なくとも１２個、好ましくは少なくとも１３個または好ましくは少なくとも１４個の付加的アミノ酸残基を意味する。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号１の少なくとも１３個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号１の少なくとも１４個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号１の少なくとも１５個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号１の少なくとも１６個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号１の少なくとも１７個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号１の少なくとも１８個の連続アミノ酸残基を含んでなる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号１のペプチド配列のＣ末端から延長する１個以上のアミノ酸残基をさらに含んでなると考えられる。別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号１のペプチド配列のＮ末端から延長する１個以上のアミノ酸残基をさらに含んでなると考えられる。さらに別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号１のペプチド配列のＣ末端から延長する１個以上のアミノ酸残基およびＮ末端から延長する１個以上のアミノ酸残基をさらに含んでなると考えられる。
【００３３】
一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号５８〜６３および前記のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号５８〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号５８のアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号５９のアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号６３のアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。
【００３４】
本明細書の他所に示されているように、本発明者らは、意外にも、配列番号９のアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基のペプチド配列を含んでなる免疫原は、ｉｎ  ｖｉｖｏに投与された場合、本明細書に開示されている他のペプチド配列に比べて高い抗ＰＤ１抗体力価を生じることを見出した。よって、一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基を含んでなる。別の実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９、配列番号４３、およびそれと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一つの実施形態において、ペプチド配列は、配列番号９および配列番号４３からなる群から選択される。一つの実施形態において、免疫原は、配列番号９および配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。
【００３５】
一つの実施形態において、免疫原は、本明細書に開示されているペプチド配列のうち少なくとも２つを含んでなる。好ましい実施形態において、これら少なくとも２つのペプチド配列のそれぞれは、抗体がＰＤ１の異なるＢ細胞エピトープに結合する抗体応答をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する。
【００３６】
「ペプチド配列のうち少なくとも２つ」とは、本明細書に記載のペプチド配列のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはそれを超えるものを意味する。一つの実施形態において、免疫原は、本明細書に記載のペプチド配列のうち少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つ、またはより好ましくは少なくとも９つを含んでなる。一つの実施形態において、免疫原は、配列番号９および配列番号４３を含んでなる。
【００３７】
免疫原が少なくとも２つのペプチド配列を含んでなる場合、これら少なくとも２つのペプチド配列は、分岐構成または線状構成を有し得る。本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」は、一般に、相互に連結された２つ以上のペプチド配列から構成されるポリペプチドを指す。一つの実施形態において、融合タンパク質は、相互に末端と末端が連結された２つ以上のペプチド配列を含んでなる。一つの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書においてリンカーとも呼ばれる好適な連結部分を介して線状構成で相互に連結された２つ以上のペプチド配列を含んでなる。ペプチド配列を連結する好適な方法は当業者に公知であり、その実例としては、ペプチド（アミド）結合およびリンカーが含まれる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「リンカー」は、本明細書に記載されるようにいずれか２つの隣接するペプチド配列間に挿入された短いポリペプチド配列を指す。一つの実施形態において、リンカーは、１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１、２、３、４または５個の天然または非天然アミノ酸のポリペプチドリンカーである。一つの実施形態において、リンカーは、炭水化物リンカーである。好適な炭水化物リンカーは、当業者に公知である。本明細書に開示されている別の実施形態において、融合タンパク質は、１以上の他の非ペプチドまたは非ポリペプチドリンカーと共に１以上のペプチドまたはポリペプチドリンカーを含んでなる。さらに、適切と見なされる場合には、同じ融合ペプチドに異なる種類のペプチドまたは非ペプチドリンカーが組み込まれてもよい。ペプチドまたはポリペプチドリンカーが２つの個々のペプチド配列を連結するために使用される場合、そのリンカーは有利には、そのＮ末端が一方のペプチド配列のＣ末端にペプチド結合を介して結合され、かつ、そのＣ末端が他方のペプチド配列のＮ末端にペプチドを介して結合されるように組み込まれる。融合タンパク質内の個々のペプチド配列はまた、いずれかの末端または両方の末端に、好ましくはＣ末端に１以上のアミノ酸が付加されていてもよい。よって、例えば、ペプチドを連結するため、ならびにペプチドの相互の共有結合、および／またはアンカーとして働く担体分子などの送達系への共有結合を可能とするために、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または両方にリンカーまたはスペーサーアミノ酸を付加してもよい。好適なペプチドリンカーの実例は、ＬＰ（ロイシン−プロリン）である。
【００３９】
免疫原は、好適には、本明細書に開示されている２つ以上のペプチド配列のいずれかの組合せを含んでなる、該組合せからなる、または、該組合せから本質的になる融合タンパク質を含んでなり得る。一つの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に開示されているペプチド配列のうち少なくとも３つを含んでなる、該少なくとも３つからなる、または、該少なくとも３つから本質的になる。
【００４０】
融合タンパク質は、本明細書に開示されているペプチド配列のうち２つ以上を任意の順序で含んでなり得、その実例としては、配列番号９−１０、配列番号１０−９、配列番号９−１４、配列番号１４−９、配列番号１０−１４、配列番号１４−１０、配列番号９−２８、配列番号１０−２８、配列番号１４−２８、配列番号２８−９、配列番号２８−１０、配列番号２８−１４、配列番号９−２９、配列番号１０−２９、配列番号１４−２９、配列番号２８−２９、配列番号２９−９、配列番号２９−１０、配列番号２９−１４、配列番号２９−２８、配列番号９−１０−１４、配列番号９−１４−１０、配列番号１４−９−１０、配列番号１４−１０−９、配列番号１０−１４−９、配列番号１０−９−１４、配列番号９−１０−２８、配列番号９−２８−１０、配列番号２８−９−１０、配列番号２８−１０−９、配列番号１０−２８−９、配列番号１０−９−２８などが挙げられる。
【００４１】
一つの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９および配列番号４３のペプチド配列を含んでなる、該ペプチド配列からなる、または、該ペプチド配列から本質的になる。一つの実施形態において、免疫原は、配列番号５６および配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。一つの実施形態において、免疫原は、配列番号５６および配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。
【００４２】
また、本明細書においては、タンデムリピートとして２回以上連結された本明細書に開示されているペプチド配列のうちの少なくとも２つを含んでなる融合タンパク質も企図される。例えば、本明細書において企図される融合タンパク質は、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９および前記のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも８個の連続アミノ酸残基のペプチド配列の２以上のタンデムリピートを含んでなり得る。
【００４３】
理論または特定の適用様式に拘束されるものではないが、本明細書に記載されるように２つ以上の異なるペプチド配列を融合ペプチドに組み込むと、本明細書に開示されている単一のペプチド配列を含んでなる免疫原に比べて高い抗体力価を惹起することによってより有益な免疫応答が生じ得ることが理解されるであろう。
【００４４】
本明細書に記載されるように、融合タンパク質を製造する好適な方法は当業者に公知である。実例としては、本明細書に記載されるように各ペプチド配列を、その個々に隣接するペプチド配列に連結するペプチド結合の連続的形成と前記融合ペプチドの回収を含むペプチド合成が挙げられる。実例としては、“Amino Acid and Peptide Synthesis”(Oxford Chemistry Primers; John Jones, Oxford University Pressによる)に記載されている方法が挙げられる。合成ペプチドはまた、液相合成または種々の固相支持体（例えば、ポリスチレン、ポリアミド、もしくはＰＥＧ）上での固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって作製することもできる。ＳＰＰＳは、Ｆ−ｍｏｃ（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）またはｔ−Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）の使用を組み込み得る。また、特注ペプチドも、いくつかの商業的製造者から入手可能である。
【００４５】
あるいは、融合タンパク質は、組換え法によっても製造可能である。例えば、融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる核酸分子は、前記核酸配列を発現し得る好適な宿主細胞にトランスフェクトし、前記宿主細胞を前記核酸配列の発現に好適な条件下でインキュベートし、前記融合タンパク質を回収することができる。おそらくは、組換え融合タンパク質を発現および／または分泌するために使用される宿主細胞（例えば、微生物）の性質に基づくコドンの最適化を含む遺伝コードの知識に基づく、融合タンパク質をコードする核酸分子を製造するための好適な方法もまた当業者に公知である。好適な宿主細胞もまた当業者に公知であり、その実例としては、原核細胞（例えば、大腸菌(E. coli)）および真核細胞（例えば、Ｐ．パストリス(P. pastoris)）が挙げられる。“Short Protocols in Molecular Biology, 第5版, 2巻セット: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology” (Frederick M. Ausubel (筆者, 編者による), Roger Brent (編者), Robert E. Kingston (編者), David D. Moore (編者), J. G. Seidman (編者), John A. Smith (編者), Kevin Struhl (編者), J Wiley & Sons, London参照。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「コード」、「コードする」などは、別の核酸またはポリペプチドを提供する核酸の能力を指す。例えば、核酸配列は、一般に宿主細胞内で転写および／もしくは翻訳されてあるポリペプチドを産生できれば、または転写および／もしくは翻訳されてあるポリペプチドを産生できる形態にプロセシングできれば、そのポリペプチドをコードすると言われる。このような核酸配列は、コード配列またはコード配列と非コード配列の両方を含み得る。よって、用語「コード」、「コードする」などは、ＤＮＡ分子の転写から得られるＲＮＡ産物、ＲＮＡ分子の翻訳から得られるタンパク質、ＤＮＡ分子の転写によるＲＮＡ産物の形成と続いてのそのＲＮＡ産物の翻訳から得られるタンパク質、またはＤＮＡ分子の転写によるＲＮＡ産物の提供、そのＲＮＡ産物のプロセシングによるＲＮＡ産物（例えば、ｍＲＮＡ）の提供とそれに続くそのプロセシングＲＮＡ産物の翻訳から得られるタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるようなペプチド配列、または本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸配列は、好適な宿主細胞における発現のためにコドンが最適化される。例えば、融合タンパク質がヒト対象においてＰＤ１に対する体液性応答を誘導するために使用される場合、核酸配列は、ヒトコドンに関して最適化される。コドンの最適化の好適な方法は、John Hopkins University Build a Genomeウェブサイトの「Software Tools」にある「Gene Design」ツールの「Reverse Translation」オプションを用いるなど、当業者に公知である。
【００４７】
本明細書の他所に示されているように、ペプチド配列は、当業者に公知の手段により融合ペプチド内で相互に連結することができる。用語「連結する」および「連結された」は、ペプチド結合を介した２つのペプチド配列の直接結合を含み、すなわち、一方のペプチド配列のＣ末端が別のペプチド配列のＮ末端にペプチド結合を介して共有結合される。用語「連結する」および「連結された」にはまた、それらの意味の範囲内に、挿入されたリンカー要素を介した２つのペプチド配列の連結を含む。融合タンパク質と担体タンパク質のカップリングがリンカーを介する場合、Ｎ末端からのリンカーのカップリングは、場合によっては惹起される所望の免疫応答に悪影響を及ぼすことがあるため、融合タンパク質のＣ末端からこのようなリンカーを介するカップリングを果たすのが好ましいことが当業者には理解されるであろう。
【００４８】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、融合タンパク質中で少なくとも２つのペプチド配列が非天然リンカーペプチド配列を介して相互に連結される。
【００４９】
免疫原が少なくとも２つのペプチド配列を含んでなる場合、これらのペプチド配列は、融合タンパク質が天然ＰＤ１の少なくとも４０個、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸残基の連続ストレッチと同一ではないアミノ酸配列を含んでなることを確実とするような方法で、融合ペプチド内で相互に連結され得る。
【００５０】
単一の融合タンパク質内で少なくとも２つのペプチド配列を連結することにより、それら少なくとも２つのペプチド配列のそれぞれが、抗体が天然チェックポイント抗原のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する場合、１種類のみの融合タンパク質が存在する均質な調合物（formulation）が達成され得る。融合タンパク質の要素（すなわち、抗体が天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導し得るペプチド配列）は、総ての融合タンパク質で同じであってよく、望まれないポリペプチド内およびポリペプチド間相互作用が最小となるように選択（または選択および改変）することができる。
【００５１】
ワクチン組成物中に存在する少なくとも２つのペプチド配列の比は、最終的に、融合ペプチドにおけるこれらのペプチドの比によって決定され得る。このことは、ＰＤ１に対する抗体応答を惹起するためのいずれの所望の比も、融合タンパク質の構築および設計のレベルで容易かつ信頼性をもって固定可能であることを意味する。
【００５２】
融合ペプチドは、その融合ペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、抗体が天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する力または能力を保持する限り、いずれの好適な長さのアミノ酸配列を含んでなってもよいと理解されるべきである。一つの実施形態において、融合ペプチドは、少なくとも１６の（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０またはそれを超える）アミノ酸長である。一つの実施形態において、融合ペプチドは、約１６アミノ酸〜約４０アミノ酸長である。一つの実施形態において、融合ペプチドは、約１６アミノ酸〜約３６アミノ酸長である。一つの実施形態において、融合ペプチドは、約１６アミノ酸〜約２４アミノ酸長である。一つの実施形態において、融合ペプチドは、約２４アミノ酸長である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体により認識される分子の部分を指す。よって、「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体により認識（結合）され得る抗原のより小さな部分配列であると理解されるべきである。抗原は複数のＢ細胞エピトープを含んでもよく、従って、複数の異なる抗体が結合する場合があると理解されるべきである。また、単一のエピトープに、異なる抗原結合特異性および／または親和性を有する複数の抗体が結合することもある。また、異なるサブクラスの複数の抗体が同じエピトープに結合することもある。
【００５４】
免疫原は、対象に投与された際に、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに、好ましくは、天然ＰＤ１分子のＢ細胞エピトープに、すなわち、それが本来存在するようなＰＤ１抗原に結合するような抗体応答を誘導する少なくとも１つのペプチド配列を含んでなる。好ましくは、免疫原の少なくとも１つのペプチド配列は、抗体が天然ＰＤ１分子の細胞外ドメインのＢ細胞エピトープに結合するような抗体応答を誘導する。好ましくは、抗体が生成されるＢ細胞エピトープは、天然抗原の細胞外ドメイン内に位置するエピトープであると考えられる。一つの実施形態において、免疫原は、ＰＤ１の自己Ｂ細胞エピトープ、すなわち、処置される対象と同じ種のＰＤ１分子に由来するアミノ酸配列を有するＰＤ１のＢ細胞エピトープを含んでなる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「天然」および「本来の」は、自然界に通常存在するような分子の形態を指す。一つの実施形態において、ＰＤ１の天然配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる。逆に、「非天然リンカー」を含む「非天然」配列は、ＰＤ１の天然配列に属さない任意のアミノ酸配列である。
【００５６】
本開示はまた、ＰＤ１の非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタおよびマウスアイソフォームを含む、非ヒト種のＰＤ１アイソフォームにも及ぶ。本明細書に開示されている一つの実施形態において、非ヒトＰＤ１アイソフォームはマウスＰＤ１であり、その実例は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるＵｎｉｐｒｏｔ  Ｎｏ．Ｑ０２２４２のアミノ酸配列を含んでなる。
【００５７】
本明細書に記載されるように、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するペプチド配列はまた、本明細書においては、「機能的変異体」とも呼ばれる。「機能的変異体」は、本明細書で使用する場合、それが比較されるペプチド（すなわち、コンパレーター）（本来の（すなわち、天然）配列またはその合成変異体を含んでもよい）とは異なるアミノ酸配列を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する力をなお保持するペプチド配列を意味すると理解されるべきである。
【００５８】
機能的変異体が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、抗体が天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する力を保持するかどうかを判定する好適な方法は当業者に公知であり、その実例は本明細書の他所に記載される。例えば、誘導体化されていない天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープを含んでなる融合タンパク質により惹起される抗体応答は、同じアッセイを用いて、天然Ｂ細胞エピトープの変異体を含んでなる融合タンパク質により惹起されるものと比較することができる。変異体を含んでなる融合タンパク質により惹起される免疫応答が、誘導体化されていないＢ細胞エピトープを含んでなる融合タンパク質により惹起されるものと同様の強さであれば、そのアミノ酸置換は機能的に同等と見なすことができる。誘導体化を受けた免疫応答が誘導体化を受けていない免疫応答よりも優れていれば、そのアミノ酸置換は改良されていると見なすことができる。
【００５９】
機能的変異体は、天然ペプチド配列とは１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれを超える）アミノ酸置換によって異なるアミノ酸配列を含んでよく、前記の違いは、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する変異体の能力を無効にしないか、または完全には無効にしない。いくつかの実施形態において、機能的変異体は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するペプチド配列の能力を、天然ペプチド配列に比べて増強するアミノ酸置換を含んでなり得る。一つの実施形態において、機能的変異体は、天然ペプチド配列とは１以上の保存的アミノ酸置換によって異なる。本明細書で使用する場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、ほぼ同等のサイズ、電荷および／または極性のアミノ酸で置換するためにある位置のアミノ酸の属性を変化させることを指す。アミノ酸の天然の保存的置換の例としては、以下の８つの置換群（慣例の一文字コードで表記）：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ、Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；（７）Ｅ、Ｄ；および（８）Ｃ、Ｓが挙げられる。
【００６０】
「少なくとも７０％」という場合には、例えば、最適なアラインメントまたはベストフィット分析の後に、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９いずれか１つと７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。一つの実施形態において、機能的変異体は、例えば、最適なアラインメントまたはベストフィット分析の後に、配列番号９、１０、１４、２４、２８、２９、４２、４３および４９のいずれか１つと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％または好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【００６１】
用語「同一性」、「類似性」、「配列同一性」、「配列類似性」、「相同性」、「配列相同性」などは、本明細書で使用する場合、アラインされた配列中の任意の特定のアミノ酸残基の位置において、アラインされた配列間でアミノ酸残基が同一であることを意味する。用語「類似性」または「配列類似性」は、本明細書で使用する場合、アラインされた配列中の任意の特定の位置において、それらの配列間でアミノ酸残基が類似の種類であることを意味する。例えば、イソロイシン残基またはバリン残基はロイシンで置換可能である。これは保存的置換と呼ぶことができる。一つの実施形態において、アミノ酸配列は、その改変が非改変ポリペプチドに比べて改変ポリペプチドの結合特異性または機能活性に対して影響がないように、その中に含まれるアミノ酸残基のいずれかの保存的置換によって改変され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ペプチド配列に関する配列同一性は、配列をアラインし、配列同一性の一部として保存的置換を考慮することなく、最大パーセンテージの相同性を得るために必要に応じてギャップを導入した後に、対応するペプチド配列の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージに関する。Ｎ末端またはＣ末端延長も挿入も、配列同一性または相同性を引き下げるものと解釈されるべきでない。２つ以上のアミノ酸配列のアラインメントを実行しそれらの配列同一性または相同性を決定するための方法およびコンピュータープログラムは当業者に周知である。例えば、２つのアミノ酸配列の同一性または類似性のパーセンテージは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムなどのアルゴリズムを用いて容易に計算することができる。
【００６３】
アミノ酸配列の「類似性」を決定するための技術は、当業者に周知である。一般に、「類似性」とは、アミノ酸が同一であるか、または類似の電荷もしくは疎水性などの化学的および／もしくは物理的特性を有する場合の、２以上のペプチド配列または適当な場所におけるアミノ酸とアミノ酸の厳密な比較を意味する。次に、比較するペプチド配列間でいわゆる「類似性パーセント」を決定することができる。一般に、「同一性」は、２つのペプチド配列のアミノ酸とアミノ酸の厳密な一致を指す。
【００６４】
２つ以上のペプチド配列はまた、それらの「同一性パーセント」を決定することによっても比較することができる。２配列の同一性パーセントは、アラインされた２配列間の厳密な一致の数を短い方の配列の長さで割った商に１００を掛けたものとして表すことができる。核酸配列の近似アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム、Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981）により提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff編, 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)により標準化されたスコアリングマトリックスを用いて、ペプチド配列での使用に拡張することができる。配列間の同一性または類似性パーセントを計算するための好適なプログラムは一般に当技術分野で公知である。
【００６５】
比較ウインドウをアラインするための最適な配列アラインメントは、アルゴリズムのコンピューター実装形態（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USAのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）または視認および選択される種々の方法のいずれかによって作成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにおいて最高の相同性パーセンテージをもたらす）によって実行できる。例えば、Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res.25:3389により開示されているようなＢＬＡＳＴ系のプログラムも挙げられる。配列解析の詳細な考察は、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15のユニット１９．３に見出すことができる。
【００６６】
一つの実施形態において、機能的変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗体応答を誘導するその力を高めるための免疫原の安定性の増大および／または免疫原の溶解度の増大を目的とするアミノ酸置換および／または他の改変を含む。好適な改変は当業者に公知であり、その実例は本明細書の他所に記載される。
【００６７】
本明細書に開示されているペプチド配列は、当技術分野で周知の化学合成法により、単離されたペプチド配列としてまたは別のペプチドもしくはポリペプチドの一部として、合成的に生産することができる。あるいは、ペプチド配列は、１または複数の（組換え）ペプチド配列を産生する微生物で生産することもでき、次にこれを単離し、所望により、さらに精製することができる。これらのペプチド配列は、細菌、酵母もしくは真菌などの微生物、哺乳動物もしくは昆虫細胞などの真核生物細胞、またはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス(Simliki forest virus)、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスもしくはセンダイウイルスなどの組換えウイルスベクターで生産することができる。これらのペプチド配列を生産するための好適な細菌は当業者に公知であり、その実例としては、大腸菌、枯草菌(B.subtilis)またはこれらのペプチド配列を発現し得る他のいずれの細菌も挙げられる。これらのペプチド配列を発現させるために好適な酵母種の実例としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ(Candida)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)またはペプチドを発現し得る他のいずれの酵母も挙げられる。対応する方法は当技術分野で周知である。組換え生産されたペプチド配列を単離および精製するための方法もまた当技術分野で周知であり、例えば、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。
【００６８】
合成または組換えペプチド配列の単離を容易にするために、少なくとも１つのペプチド配列が、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能とする異種ポリペプチドに翻訳的に融合（共有結合）された融合ポリペプチドを作製することができる。典型的な異種ポリペプチドは、Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６．６個のヒスチジン残基）、ＧＳＴタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などである。この融合ポリペプチドは、免疫原の精製を容易にするだけでなく、精製中にポリペプチドを分解から防ぐこともできる。精製後に異種ポリペプチドを除去することが望まれる場合、融合ポリペプチドはペプチド配列と異種ポリペプチドの間の接合部に切断部位を含んでなってもよい。切断部位は、その部位のアミノ酸配列に特異的な酵素（例えば、プロテアーゼ）で切断されるアミノ酸配列からなる。
【００６９】
本明細書に開示されているペプチド配列は、それらのＮ末端および／またはＣ末端またはその付近において、その位置でシステイン残基がペプチド配列に結合されるように適宜改変されてよい。
【００７０】
ペプチド配列を作製するためには、例えばコンビナトリアル化学により生成された、または最も可変性の高い構造のためのハイスループットスクリーニング技術により得られたファージライブラリーおよび／またはペプチドライブラリーも好適である（例えば、Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (編者), et al.; およびWillats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 December; 50(6):837-54参照）。
【００７１】
好適な機能的変異体の実例は、配列番号６１のペプチド配列であり、配列番号６１は、配列番号４２の３番のシステイン残基がセリン残基に置き換わることで対応する天然ヒトＰＤ１ペプチドフラグメント（配列番号４２）とは異なることを注記しておく。よって、一つの実施形態において、機能的変異体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる。
【００７２】
本明細書に開示されているペプチド配列に対する抗体応答は、ＭＨＣ拘束性を迂回する助けとなるサイトカインの放出を促進するＴｈ細胞エピトープ（すなわち、無差別な（promiscuous）Ｔｈ細胞エピトープ）を免疫原に組み込むことによってさらに増強され得る。よって、本明細書に開示されている一つの実施形態において、免疫原は、無差別なＴヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープをさらに含んでなる。好適な無差別なＴｈ細胞エピトープは当業者に公知であり、その実例としては、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ；ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥ；配列番号１１０）、破傷風トキソイド（ＴＴ；ＮＳＶＤＤＡＬＩＮＳＴＩＹＳＹＦＰＳＶ；配列番号１１１）、ＴＴ１（ＰＧＩＮＧＫＡＩＨＬＶＮＮＱＳＳＥ；配列番号１１２）；ＴＴペプチドＰ２（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ；配列番号１１３）；ＴＴペプチドＰ３０（ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ；配列番号１１４）；ＭＶＦ’（ＬＳＥＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶ；配列番号１１５）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ；ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＮ；配列番号１１６）；スポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ；ＴＣＧＶＧＶＲＶＲＳＲＶＮＡＡＮＫＫＰＥｌ；配列番号１１７）、およびその全内容が引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２０００／０４６３９０に記載されるものが挙げられる。一つの実施形態において、無差別なＴｈエピトープは、約８〜約３６、好ましくは約８〜約２４、より好ましくは約８〜２２、最も好ましくは約８〜約２２のアミノ酸長である。一つの実施形態において、無差別なＴｈ細胞エピトープは、本明細書に記載されるようにペプチド配列または融合タンパク質に連結されてキメラペプチドを形成する。好適なリンカーは当業者に公知であり、その実例は本明細書の他所に記載される。
【００７３】
免疫原は一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに、好ましくは、天然ＰＤ１分子のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する少なくとも１つのペプチド配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはそれを超えるペプチド配列）を含んでなる。少なくとも１つのペプチド配列は、（ｉ）ＰＤ１のＢ細胞エピトープ、もしくはその機能的変異体、（ｉｉ）ＰＤ１  Ｂ細胞エピトープのミモトープ、または（ｉｉｉ）前記のいずれかの組合せを含んでなり得る。一つの実施形態において、免疫原は、少なくとも１つのＰＤ１のＢ細胞エピトープ、またはその機能的変異体を含んでなる。「少なくとも１つの」とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはそれを超えることを意味する。一つの実施形態において、免疫原は、ＰＤ１の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つ、好ましくは少なくとも９つ、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１１またはより好ましくは少なくとも１２の不連続Ｂ細胞エピトープ、またはその機能的変異体を含んでなる。一つの実施形態において、免疫原は、ＰＤ１の１つのＢ細胞エピトープまたはそれらの機能的変異体を含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる。別の実施形態において、免疫原は、ＰＤ１の２つの不連続Ｂ細胞エピトープまたはそれらの機能的変異体を含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる。本明細書に開示されている別の実施形態において、免疫原は、ＰＤ１の３つの不連続Ｂ細胞エピトープまたはそれらの機能的変異体を含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体により認識される分子の一部を指す。よって、「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体により認識（結合）され得る抗原のより短い部分配列であると理解されるべきである。抗原は複数のＢ細胞エピトープを含有する場合もあり、従って、複数の異なる抗体により結合され得ると理解されるべきである。単一のエピトープもまた、異なる抗原結合特異性および／または親和性を有する複数の抗体によって結合される場合がある。また、異なるサブクラスの複数の抗体が同じエピトープに結合する場合もある。
【００７５】
免疫原は、対象に投与された際に、抗体が天然ＰＤ１分子のＢ細胞エピトープに、すなわち、それが本来存在するＰＤ１抗原に結合するような抗体応答を誘導する少なくとも１つのペプチド配列を含んでなると考えられる。好ましくは、免疫原の少なくとも１つのペプチド配列は、抗体が天然ＰＤ１分子の細胞外ドメインのＢ細胞エピトープに結合するような抗体応答を誘導すると考えられる。好ましくは、抗体が生成されるＢ細胞エピトープは、天然抗原の細胞外ドメイン内に位置するエピトープであると考えられる。一つの実施形態において、免疫原は、ＰＤ１の自己Ｂ細胞エピトープ、すなわち、治療される対象と同じ種のＰＤ１分子に由来するアミノ酸配列を有するＰＤ１のＢ細胞エピトープを含んでなる。
【００７６】
ＰＤ１のＢ細胞エピトープを決定する方法は、当業者には公知である。一つの実例において、抗原の部分配列は、対象とする部分配列をヒトまたはマウス生殖細胞系によりコードされる抗体によって認識されることが知られる既知の配列および／または部分配列のデータベースを用いて比較する確立されたコンピュータープログラムを使用することにより、Ｂ細胞エピトープである、またはＢ細胞エピトープを含んでなるとして高い精度で特定され得る。あるいは、Ｂ細胞エピトープは、表面接近性、鎖のフレキシビリティー、疎水性／親水性特性、推定される二次構造などの抗原性の相関物の種々の組合せを用いたコンピューター支援の分析によって特定することもできる。あるいは、抗原は、動物を対象抗原で少なくとも１回免疫し、体液性免疫応答の誘導を可能とし、次いで、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット解析またはドットブロット解析を用いて、動物の血清を投与された抗原の少なくとも一部と特異的に結合する抗体に関して試験することによって、Ｂ細胞エピトープを含んでなるとして特定することができる。
【００７７】
一つの実施形態において、Ｂ細胞エピトープは、ヒトＰＤ１のＢ細胞エピトープ（配列番号１）である。上記の表１および２は、ヒトＰＤ１のＢ細胞エピトープの実例を示す。
【００７８】
一つの実施形態において、ＰＤ１のＢ細胞エピトープは、配列番号２〜１０９からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ＰＤ１のＢ細胞エピトープは、配列番号９、４３および５７からなる群から選択される。本明細書に開示されている別の実施形態において、ＰＤ１のＢ細胞エピトープは、ＰＤ１のＢ細胞エピトープの機能的変異体であり、この実例は、本明細書の表１および２（すなわち配列番号２〜１０９）に示される。
【００７９】
本開示はまた、ＰＤ１の非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタおよびマウスアイソフォームを含む非ヒト種のＰＤ１アイソフォームにも及ぶ。本明細書に開示されている一つの実施形態において、非ヒトＰＤ１アイソフォームはマウスＰＤ１であり、その実例は、引用することにより全内容が本明細書の一部とされるＵｎｉｐｒｏｔ  Ｎｏ．Ｑ０２２４２のアミノ酸配列を含んでなる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「機能的変異体」は、それが比較されるペプチド（すなわち、コンパレーター）（天然配列またはそのアイソフォームを含んでもよい）とは異なるアミノ酸配列を有し、投与された際に、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する力をなお保持するペプチド配列を意味する。機能的変異体には、ＰＤ１  Ｂ細胞エピトープのフラグメントが含まれる。ＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの機能的フラグメントは、そのフラグメントが、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答、好ましくは、抗体が天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する力を保持する限り、いずれの好適な長さであってもよいと理解されるべきである。
【００８１】
一つの実施形態において、機能的変異体は、配列番号２〜１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる配列番号１のＰＤ１タンパク質のフラグメントである。
【００８２】
別の実施形態において、機能的変異体は、配列番号９、４３および５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、該アミノ酸配列からなる、または、該アミノ酸配列から本質的になる配列番号１のＰＤ１タンパク質のフラグメントである。
【００８３】
ＰＤ１のＢ細胞エピトープの変異体が、抗体が天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する力を保持するかどうかを決定する好適な方法は当業者に公知であり、その実例は本明細書の他所に記載される。例えば、誘導体化されていない天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープを含んでなる融合タンパク質により惹起された抗体応答を、同じアッセイを用いて、天然Ｂ細胞エピトープの変異体を含んでなる融合タンパク質により惹起されたものと比較することができる。変異体を含んでなる融合タンパク質により惹起された免疫応答が、誘導体化されていないＢ細胞エピトープを含んでなる融合タンパク質によって惹起されたものと同じ強さであれば、そのアミノ酸置換は機能的に同等と見なすことができる。誘導体化を受けた免疫応答が誘導体化を受けていない免疫応答よりも優れていれば、そのアミノ酸置換は改善されていると見なすことができる。
【００８４】
用語「機能的変異体」はまた、天然配列とは１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個またはそれを超える）アミノ酸置換によって異なるアミノ酸配列を含み、前記の違いは、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する変異体の能力を無効にしないか、または完全には無効にしない。いくつかの実施形態において、機能的変異体は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する免疫原の能力を、そのＢ細胞エピトープの天然配列に比べて増強するアミノ酸置換を含んでなり得る。一つの実施形態において、機能的変異体は、天然ペプチド配列とは１以上の保存的アミノ酸置換によって異なる。本明細書で使用する場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、ほぼ同等のサイズ、電荷および／または極性のアミノ酸で置換するためにある位置のアミノ酸の属性を変化させることを指す。アミノ酸の天然の保存的置換の例としては、以下の８つの置換群（慣例の一文字コードで表記）：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ、Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；（７）Ｅ、Ｄ；および（８）Ｃ、Ｓが含まれる。
【００８５】
一つの実施形態において、機能的変異体は、天然ＰＤ１抗原のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。「少なくとも８５％」という場合には、例えば、最適なアラインメントまたはベストフィット分析の後に８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性または類似性を含む。よって、一つの実施形態において、この配列は、例えば、最適なアラインメントまたはベストフィット分析の後に、本明細書で特定された配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％または好ましくは１００％の配列同一性または配列相同性を有する。
【００８６】
一つの実施形態において、機能的変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗体応答を誘導するその力を高めるための免疫原の安定性の増大および／または免疫原の溶解度の増大を目的とするアミノ酸置換および／または他の改変を含む。好適な改変は当業者に公知であり、その実例は本明細書の他所に記載される。
【００８７】
免疫原は、そのペプチドが、本明細書に開示されている方法に従って対象に投与された際に、抗体が天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する力または能力を保持する限り、いずれの好適な長さのペプチド配列を含んでなってもよいと理解されるべきである。本明細書の他所に示されているように、ペプチド配列が、投与された際に、抗体が天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する力または能力を保持するかどうかを決定する方法は、当業者に公知である。一つの実施形態において、ペプチド配列は、少なくとも１０（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれを超える）アミノ酸長である。一つの実施形態において、ペプチド配列は、約１０個アミノ酸〜約４０アミノ酸長である。一つの実施形態において、ペプチド配列は、約１０個アミノ酸〜約３５アミノ酸長である。一つの実施形態において、ペプチド配列は、約１０個アミノ酸〜約３０アミノ酸長である。一つの実施形態において、ペプチド配列は、約１０個アミノ酸〜約２５アミノ酸長である。一つの実施形態において、ペプチド配列は、約１０個アミノ酸〜約２０アミノ酸長である。一つの実施形態において、ペプチド配列は、約１０個アミノ酸〜約１５アミノ酸長である。
【００８８】
本明細書の他所に示されているように、免疫原は、抗体がＰＤ１の、好ましくは天然ＰＤ１の、Ｂ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導し得る少なくとも１つのペプチド配列を含んでなると考えられる。これは、ＰＤ１のＢ細胞エピトープ（もしくはその機能的変異体）、および／またはＰＤ１  Ｂ細胞エピトープのミモトープのアミノ酸配列を含んでなるペプチド配列を用いることによって達成され得る。本明細書に開示されている一つの実施形態において、免疫原は、ＰＤ１のＢ細胞エピトープの少なくとも１つのミモトープを含んでなる。
【００８９】
本明細書で使用する場合、用語「ミモトープ」は一般に、それが模倣するＢ細胞エピトープと同じトポロジーを有する立体配座を有し、前記Ｂ細胞エピトープに免疫特異的に結合する同じ抗原結合領域に結合する分子を指す。ミモトープは、宿主において、それが模倣する抗原に対して反応性のある免疫応答を惹起すると考えられる。
【００９０】
ＰＤ１  Ｂ細胞エピトープのミモトープは、好ましくは、それらのアミノ酸配列が天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列とは異なる抗原ポリペプチドである。ミモトープは、天然ＰＤ１分子の１以上の天然アミノ酸残基のアミノ酸置換だけでなく、１以上の非天然アミノ酸（すなわち、２０種の「古典的」アミノ酸由来でない）を含んでなってもよく、またはそれらは、そのような非天然アミノ酸から完全に構築されてもよい。好適なミモトープは、商業的に入手可能なペプチドライブラリーから提供され得る。好ましくは、これらのミモトープは、少なくとも７アミノ酸長（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７またはそれを超えるアミノ酸長）である。好ましい長さは、１６まで、好ましくは、１４または２０アミノ酸（例えば、５〜１６アミノ酸残基）までであり得る。より長いミモトープも使用可能である。一つの実施形態において、ミモトープはポリペプチドの一部であってもよく、結果として、それらのＮ末端および／またはＣ末端に少なくとも１個のさらなるアミノ酸残基を含んでなってもよい。
【００９１】
本明細書に開示されているペプチド配列は、当技術分野で周知の化学合成法により、単離されたペプチド配列としてまたは別のペプチドもしくはポリペプチドの一部として、合成的に生産することができる。あるいは、ペプチド配列は、１または複数の（組換え）ペプチド配列を生産する微生物で生産することもでき、次にこれを単離し、所望により、さらに精製することができる。これらのペプチド配列は、細菌、酵母もしくは真菌などの微生物、哺乳動物もしくは昆虫細胞などの真核生物細胞、またはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス(Simliki forest virus)、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスもしくはセンダイウイルスなどの組換えウイルスベクターで生産することができる。ペプチド配列を生産するための好適な細菌は当業者に公知であり、その実例としては、大腸菌、枯草菌またはこれらのペプチド配列を発現し得る他のいずれの細菌も挙げられる。これらのペプチド配列を発現させるために好適な酵母種の実例としては、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、カンジダ、ピキア・パストリスまたはペプチドを発現し得る他のいずれの酵母も挙げられる。対応する方法は当技術分野で周知である。組換え生産されたペプチド配列を単離および精製するための方法もまた当技術分野で周知であり、例えば、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。
【００９２】
合成または組換えペプチド配列の単離を容易にするためには、少なくとも１つのペプチド配列が、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能とする異種ポリペプチドに翻訳的に融合（共有結合）された融合ポリペプチドを作製することができる。典型的な異種ポリペプチドは、Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６．６個のヒスチジン残基）、ＧＳＴタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などである。この融合ポリペプチドは、ミモトープの精製を容易にするだけでなく、精製中にポリペプチドを分解から防ぐこともできる。精製後に異種ポリペプチドを除去することが望まれる場合、融合ポリペプチドはペプチド配列と異種ポリペプチドの間の接合部に切断部位を含んでなってもよい。切断部位は、その部位のアミノ酸配列に特異的な酵素（例えば、プロテアーゼ）で切断されるアミノ酸配列からなる。
【００９３】
本明細書に開示されているペプチド配列は、それらのＮ末端および／またはＣ末端またはその付近において、その位置でシステイン残基がペプチド配列に結合されるように適宜改変されてよい。
【００９４】
ペプチド配列を作製するためには、例えばコンビナトリアル化学により生成された、または最も可変性の高い構造のためのハイスループットスクリーニング技術により得られたファージライブラリーおよび／またはペプチドライブラリーも好適である（例えば、Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (編者), et al.; およびWillats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 December; 50(6):837-54参照）。
【００９５】
免疫原が２つ以上のペプチド配列を含んでなる場合、それらのペプチド配列は融合タンパク質として存在してもよい。本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」は、一般に、相互に連結された２つ以上のペプチド配列から構成されるポリペプチドを指す。一つの実施形態において、融合タンパク質は、相互に連結された２つ以上のペプチド配列の非天然ポリペプチド配列を含んでなる。ペプチド配列を連結する好適な方法は当業者に公知であり、その実例としては、ペプチド（アミド）結合およびリンカーが挙げられる。
【００９６】
本明細書に開示されている免疫原は、好適には、本明細書に記載されるような２つ以上のＰＤ１  Ｂ細胞エピトープおよび／またはそれらのミモトープの任意の組合せを含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる融合タンパク質を含んでなり得る。一つの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＤ１の少なくとも２つのＢ細胞エピトープまたはそれらの機能的変異体を含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる。別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＤ１の少なくとも２つの不連続Ｂ細胞エピトープまたはそれらの機能的変異体を含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる。本明細書に開示されている別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＤ１の少なくとも３つの不連続Ｂ細胞エピトープまたはそれらの機能的変異体を含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる。
【００９７】
別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＤ１のＢ細胞エピトープの少なくとも２つのミモトープを含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる。別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＤ１のＢ細胞エピトープの少なくとも３つのミモトープを含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる。
【００９８】
本明細書においてはまた、本明細書に記載されるような少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６個またはそれを超える）ＰＤ１  Ｂ細胞エピトープまたはそれらの機能的変異体と本明細書に記載されるようなＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６つまたはそれを超える）ミモトープを含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる融合タンパク質を含んでなる免疫原が企図される。本明細書に開示されている一つの実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるような１つのＰＤ１のＢ細胞エピトープ、またはその機能的変異体と本明細書に記載されるようなＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの１つのミモトープを含んでなる。別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＤ１の２つのＢ細胞エピトープ、またはそれらの機能的変異体と本明細書に記載されるようなＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの１つのミモトープを含んでなる。別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるような１つのＰＤ１のＢ細胞エピトープ、またはその機能的変異体と本明細書に記載されるようなＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの２つのミモトープを含んでなる。本明細書に開示されている別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるような２つのＰＤ１のＢ細胞エピトープ、またはそれらの機能的変異体と本明細書に記載されるようなＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの２つのミモトープを含んでなる。別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＤ１の３つのＢ細胞エピトープ、またはそれらの機能的変異体と本明細書に記載されるようなＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの２つのミモトープを含んでなる。別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなＰＤ１の３つのＢ細胞エピトープ、またはそれらの機能的変異体と本明細書に記載されるようなＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの２つのミモトープを含んでなる。
【００９９】
また、１以上のＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの少なくとも２つのミモトープ（例えば少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つ、好ましくは少なくとも９つ、より好ましくは少なくとも１０のミモトープ）を含んでなる、それからなる、または、それから本質的になる融合タンパク質を含んでなる免疫原も本明細書に開示される。
【０１００】
融合タンパク質が２つ以上のミモトープを含んでなる場合、それらのミモトープは、それらの抗体がＰＤ１の同じＢ細胞エピトープに結合する、またはそれらの抗体がＰＤ１の異なるＢ細胞エピトープに結合し得る抗体応答を惹起し得ると理解されるべきである。よって、一つの実施形態において、融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、複数の抗体が少なくとも２つのＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ（例えば少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つ、好ましくは少なくとも９つ、好ましくは少なくとも１０つまたはそれを超えるＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ）に結合する抗体応答を誘導し得る少なくとも２つのミモトープを含んでなる。
【０１０１】
また、本明細書においては、タンデムリピートとして２回以上連結された本明細書に記載されるような少なくとも２つのペプチド配列を含んでなる融合タンパク質も企図される。例えば、本明細書において企図される融合タンパク質は、表１および２に列挙されているペプチドフラグメント（すなわち、配列番号２〜１０９またはそれらの機能的変異体）の２以上のタンデムリピートを含んでなり得る。
【０１０２】
理論または特定の適用様式に拘束されるものではないが、本明細書に記載されるように２つ以上の異なるＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープを融合ペプチドに組み込むと、ＰＤ１の単一のＢ細胞エピトープまたはそのミモトープを含んでなる免疫原に比べて高い抗体力価を惹起することによってより有益な免疫応答が生じ得ることが理解されるであろう。
【０１０３】
少なくとも２つのペプチド配列が自然界に見られるアミノ酸配列（例えば、天然ＰＤ１のＢ細胞エピトープに由来する配列）を含んでなる場合、それらのペプチド配列は、融合タンパク質が天然ＰＤ１の少なくとも４０個のアミノ酸残基の連続ストレッチと同一ではないアミノ酸配列を含んでなることを確実とするような方法で、融合ペプチド内で相互に連結され得る。例えば、少なくとも２つのペプチド配列がヒトＰＤ１のＢ細胞エピトープ（例えば、配列番号１）である場合、融合タンパク質は、ヒトＰＤ１の少なくとも２つの不連続Ｂ細胞エピトープを含んでなる、よって、融合タンパク質がＰＤ１の少なくとも２つのＢ細胞エピトープ（例えば、ＰＤ１の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはそれを超える不連続Ｂ細胞エピトープ）を含んでなる場合、融合タンパク質は、ＰＤ１の少なくとも２つのＢ細胞エピトープがそれらの天然状態で、すなわち、天然ＰＤ１において不連続であるように、相互に連結されたＰＤ１の少なくとも２つの不連続Ｂ細胞エピトープを含んでなり得る。
【０１０４】
担体
本明細書に記載されるような免疫原のペプチド配列は、好適には、担体にコンジュゲート、カップリングまたはそうでなければ付着され得る。よって、本明細書に開示されている別の実施形態において、免疫原は担体を含んでなる。
【０１０５】
一つの実施形態において、担体は免疫原性である。本明細書で使用する場合、用語「免疫原性」は、一般に、担体が存在しない場合に比べて、担体が、それがコンジュゲート、カップリングまたはそうでなければ付着されたペプチド配列に対して体液性免疫応答を促進または増強することができることを意味する。
【０１０６】
好適な担体は当業者に公知であり、その実例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴ、ＣＴＢ）、大腸菌およびその突然変異体の易熱性毒素（ＬＴ）、乳酸菌（ＬＡＢ）／プロバイオティクス細菌、細菌ゴースト、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)由来抗原（例えば、引用することによりその内容が本明細書の一部とされるWagner et al. Sci Rep. (2017); 7(1):15211, およびWagner et al., PLoS One. (2016);11(5):e0155081参照）などの寄生虫由来抗原、リポソーム、ウイルス様粒子、キトソーム、ビロソーム、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、脂質Ａ、細菌ＤＮＡ（ＣｐＧ）、ＩＳＣＯＭ、サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ）、ポリマー、無機マイクロおよびナノ粒子、ならびにジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７が挙げられる。本明細書に開示されている一つの実施形態において、担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴ、ＣＴＢ）、大腸菌およびその突然変異体の易熱性毒素（ＬＴ）、乳酸菌（ＬＡＢ）／プロバイオティクス細菌、細菌ゴースト、寄生虫由来抗原、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子、およびジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７からなる群から選択される。一つの実施形態において、担体は、ウイルス様粒子ではない。一つの実施形態において、ワクチン組成物は、ウイルス様粒子を含んでならない。
【０１０７】
一つの実施形態において、担体は、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（配列番号１１８）である。ＣＲＭ−１９７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ；配列番号１１８）は、アミノ酸残基５２に単一のアミノ酸置換（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）を含む酵素的に不活性で無毒型のジフテリア毒素である。Ｇｌｕ５２置換をもたらす単一のＧＣＡ突然変異は、ＣＲＭ−１９７をその野生種から区別する。ＣＲＭ−１９７に毒性が存在しないことは、野生種において、感染細胞で、タンパク質合成に必須の延長因子２（トランスロカーゼ）の化学修飾を触媒するそのフラグメントＡの酵素活性の欠如によるものであると思われる。この非毒性によって、ＣＲＭ−１９７は、コンジュゲートワクチンの作製に好適な担体タンパク質となる。
【０１０８】
配列番号１１８（ＣＲＭ−１９７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ）
【化１】
2021512966.tif 000007
【０１０９】
本明細書に開示されているようなペプチド配列または融合タンパク質をＣＲＭ−１９７などの担体にコンジュゲート、カップリングまたはそうでなければ付着させることができる方法は当業者に公知である。実例としては、Chang et al. (1998, FEBS Letters, 427:362-366)およびBerti et al. (2004, Biophysical Journal, 86:3-9)により記載されているものが挙げられる。
【０１１０】
本明細書に開示されているようなペプチド配列と担体のコンジュゲーションは、一般に、好適な架橋剤を用いるリシル残基の活性化によって達成される。例えば、ＣＲＭ−１９７は４０個のリシン残基を含み、それらの多くが架橋に利用可能であるので、ＣＲＭ−１９７コンジュゲーションの最終産物は、常にヘテロである。理論または特定の作用様式(mod)に拘束されるものではないが、ペプチド配列と担体の比はペプチド配列のサイズまたは分子量によって決まるものと一般に理解される。例えば、ペプチド配列が比較的小さい（例えば、約７５アミノ酸長の）場合、２０〜３９のペプチド配列とコンジュゲートされる担体を作製することが可能である。逆に、より大きなペプチド配列の場合、担体は、２０まで、または２０より少ないペプチド配列とコンジュゲートさせることができる。本明細書に記載の一つの実施形態において、免疫原は、担体にコンジュゲート、カップリングまたはそうでなければ付着された２〜３９のペプチド配列を含んでなる。別の実施形態において、免疫原は、担体にコンジュゲート、カップリングまたはそうでなければ付着された少なくとも２０のペプチド配列を含んでなる。さらに別の実施形態において、免疫原は、担体にコンジュゲート、カップリングまたはそうでなければ付着された６〜１２のペプチド配列を含んでなる。
【０１１１】
免疫原のペプチド配列は、共有結合により担体にコンジュゲート、カップリングまたはそうでなければ付着させることができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、ペプチド配列は、非共有結合的結合により担体にカップリングさせることもできる。ペプチド配列が担体と非共有結合的に結合される場合、その非共有結合的結合は一般に、ペプチド配列の１以上の原子と担体の１以上の原子の間の電磁相互作用を含む。実例としては、イオン結合（すなわち、２つの反対の電荷のイオンの間でこの反対の電荷のために形成される引力）、ファンデルワールス力（すなわち、融合タンパク質および担体内に存在する共有結合の永久双極子および／または誘起双極子間の力）および／または疎水性相互作用（すなわち、本明細書に記載されるようなペプチド配列または融合タンパク質内の疎水性／脂肪族部分の、担体の疎水性部分と会合する傾向から生じる力）が挙げられる。
【０１１２】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、ペプチドエピトープは、担体にコンジュゲートされる。
【０１１３】
ペプチドエピトープと担体タンパク質のカップリングがリンカーを介する場合、Ｎ末端からのリンカーのカップリングは、場合によっては惹起される所望の免疫応答に悪影響を及ぼすことがあるため、ペプチドエピトープのＣ末端からこのようなリンカーを介するカップリングを果たすのが好ましいことが当業者には理解されるであろう。
【０１１４】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、担体は、免疫原性がある。
【０１１５】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴ、ＣＴＢ）、大腸菌およびその突然変異体の易熱性毒素（ＬＴ）、乳酸菌（ＬＡＢ）、細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子、樹状細胞およびジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７からなる群から選択される。一つの実施形態において、担体はウイルス様粒子ではない。一つの実施形態において、ワクチン組成物は、ウイルス様粒子を含んでならない。
【０１１６】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、担体は、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ−１９７（配列番号５８）である。
【０１１７】
ＣＲＭ−１９７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ；配列番号５８）は、アミノ酸残基５２に単一のアミノ酸置換（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）を含む酵素的に不活性で無毒型のジフテリア毒素である。Ｇｌｕ５２置換をもたらす単一のＧＣＡ突然変異は、ＣＲＭ−１９７をその野生種から区別する。ＣＲＭ−１９７に毒性が存在しないことは、野生種において、感染細胞で、タンパク質合成に必須の延長因子２（トランスロカーゼ）の化学修飾を触媒するそのフラグメントＡの酵素活性の欠如によるものであると思われる。この非毒性によって、ＣＲＭ−１９７は、コンジュゲートワクチンの作製に好適な担体タンパク質となる。
【０１１８】
配列番号５８（ＣＲＭ−１９７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１００７２１６Ａ）
【化２】
2021512966.tif 000008
【０１１９】
ペプチドエピトープをＣＲＭ−１９７にコンジュゲート、カップリングまたはそうでなければ付着させることができる方法は当業者に公知である。実例としては、Chang et al. (1998, FEBS Letters, 427:362-366)およびBerti et al. (2004, Biophysical Journal, 86:3-9)により記載されているものが挙げられる。
【０１２０】
本明細書に記載されるようなペプチドエピトープとＣＲＭ−１９７のコンジュゲーションは、一般に、好適な架橋剤を用いるリシル残基の活性化によって達成される。例えば、ＣＲＭ−１９７は４０個のリシン残基を含み、それらの多くが架橋に利用可能であるので、ＣＲＭ−１９７コンジュゲーションの最終産物は、常にヘテロである。理論または特定の作用様式(mod)に拘束されるものではないが、免疫原と担体タンパク質の比は免疫原のサイズまたは分子量によって決まるものと一般に理解される。例えば、免疫原が比較的小さい（例えば、１２〜２４アミノ酸長の）場合、２０〜３９の免疫原とコンジュゲートされる担体を作製することが可能である。逆に、より大きな免疫原の場合、担体は、２０まで、または２０より少ない免疫原とコンジュゲートさせることができる。本明細書に記載の一つの実施形態において、担体は２〜３９の免疫原を含んでなる。別の実施形態において、担体は、少なくとも２０の免疫原を含んでなる。さらに別の実施形態において、担体は、６〜１２の免疫原を含んでなる。
【０１２１】
免疫原は、共有結合により担体にカップリングさせることができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、免疫原は、非共有結合的結合により担体にカップリングさせることもできる。免疫原が担体と非共有結合的に結合される場合、その非共有結合的結合は、一般に、免疫原の１以上の原子と担体の１以上の原子の間の電磁相互作用を含む。実例としては、イオン結合（すなわち、２つの反対の電荷のイオンの間でこの反対の電荷のために形成される引力）、ファンデルワールス力（すなわち、融合タンパク質および担体内に存在する共有結合の永久双極子および／または誘起双極子間の力）および／または疎水性相互作用（すなわち、本明細書に記載されるようなペプチド配列内の疎水性／脂肪族部分の、担体の疎水性部分と会合する傾向から生じる力）が挙げられる。
【０１２２】
アジュバント
本明細書に開示されているワクチン組成物は、好適には、ＰＤ１に対する抗体応答をさらに増強するためにアジュバントとともに調合され得る。よって、一つの実施形態において、本明細書に開示されているワクチン組成物は、アジュバントを含んでなる。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」は一般に、免疫原により惹起される免疫（抗体）応答の規模を、免疫原単独から予想されるものを超えて増し得る物質種を指す。
【０１２４】
好適なアジュバントは当業者に公知であり、その実例としては、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバンとも呼ばれる））、リポソーム、ビロソーム、油中水型または水中油型エマルション（例えば、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）およびＡＳ０３）、３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）およびＭＰＬ含有アジュバント（例えば、ＡＳ０１、ＡＳ０２およびＡＳ０４）、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、引用することにより全内容が本明細書の一部とされるKaczanowska et al., 2013, J. Leukoc. Biol. 93(6):847-863参照）、スクアレンおよびサポニン系アジュバントが挙げられる。サポニン系アジュバントには、例えば、キラヤ(Quillaja saponaria)、チョウセンニンジン(Panax ginseng)、サンシチニンジン(Panax notoginseng)、アメリカニンジン(Panax quinquefolium)、キキョウ(Platycodon grandiflorum)、セネガ(Polygala senega)、イトヒメハギ(Polygala tenuifolia)、キラヤ・ブラジリエンシス(Quillaja brasiliensis)、キバナオウギ(Astragalus membranaceus)およびイノコヅチ(Achyranthes bidentata)由来のサポニンまたはサポニン誘導体が含まれる。例示的サポニン系アジュバントとしては、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、マトリックスＭ（商標）アジュバント、マトリックスＣ（商標）アジュバント、マトリックスＱ（商標）アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）またはＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体を含有するアジュバント、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、およびＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバントが挙げられる。
【０１２５】
他の好適なアジュバントとしては、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子が含まれ、その実例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ：−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦ−β）、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＣＰ−１、ヒートショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ７０）、Ｃ型レクチン受容体アゴニスト（例えば、Ｍｉｎｃｌｅ、デクチン−１、デクチン−２およびＣＬＥＣ９Ａ）およびレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ(retinoic acid-inducible gene I)（ＲＩＧ−１）様受容体リガンド（例えば、ＲＩＧ−Ｉおよび黒色腫分化関連遺伝子５(melanoma differentiation-associated gene)（ＭＤＡ５））およびＴｏｌｌ様受容体リガンドまたはアゴニストが挙げられる。好適なＴｏｌｌ様受容体リガンドは当業者に周知であり、その実例としては、モノホスホリル脂質Ａ（３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ；ＭＰＬ）、細菌リポタンパク質、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ポリＩ：Ｃ、ポリＩＣＬＣ、グルコピラノシル脂質Ａ安定エマルション、およびＣｐＧ  ＯＤＮが挙げられる。Ｔｏｌｌ様受容体リガンドの他の例は、引用することにより全内容が本明細書の一部とされるSteinhagen et al. (2011, Vaccine, 29(17):3341-3355)に開示されている。
【０１２６】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、サポニン、ＴＬＲアゴニスト、ＣＲＭ１９７、油中水型エマルション、水中油型エマルション、フロイントの不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、モノホスホリル脂質Ａ（（３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ；ＭＰＬ）、ＡＳ０１（ＭＰＬおよびＱＳ−２１のリポソーム製剤）、ＡＳ０４（ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムのリポソーム製剤）、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、ＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバント、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される。
【０１２７】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、アジュバントは、ＴＬＲ−４アゴニストである。本明細書に開示されている一つの実施形態において、ＴＬＲ−４アゴニストは、モノホスホリル脂質Ａである。本明細書に開示されている一つの実施形態において、アジュバントは、モンタニドである。本明細書に開示されている一つの実施形態において、ＴＬＲ−４アゴニストは、ＡＳ０１（ＭＰＬおよびＱＳ−２１のリポソーム製剤）である。本明細書に開示されている一つの実施形態において、アジュバントは、ＡＳ０４（ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムのリポソーム製剤）である。本明細書に開示されている別の実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸カリウムアルミニウムからなる群から選択される。
【０１２８】
同じワクチン組成物内の２種類以上のアジュバントの混合物も、本明細書において企図される。本開示はまた、アジュバントおよび／または担体の組合せの使用にも及ぶ。
【０１２９】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、組成物は、アジュバントをさらに含んでなる。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」は一般に、免疫原により惹起される免疫応答の規模を、免疫原単独から、またはアジュバントの不在下で本明細書に記載されるような免疫原−担体コンジュゲートから予想されるものを超えて増し得る物質種を指す。
【０１３１】
好適なアジュバントは当業者に公知である。好適なアジュバントの限定されない例としては、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバンとも呼ばれる）、リポソーム、ビロソーム、油中水型または水中油型エマルション（例えば、フロイントのアジュバント、モンタニド（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）およびＡＳ０３）、３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）およびＭＰＬ含有アジュバント（例えば、ＡＳ０１、ＡＳ０２およびＡＳ０４）およびサポニン系アジュバントが挙げられる。サポニン系アジュバントには、例えば、キラヤ、チョウセンニンジン、サンシチニンジン、アメリカニンジン、キキョウ、セネガ、イトヒメハギ、キラヤ・ブラジリエンシス、キバナオウギおよびイノコヅチ由来のサポニンまたはサポニン誘導体が含まれる。例示的サポニン系アジュバントとしては、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、マトリックスＭ（商標）アジュバント、マトリックスＣ（商標）アジュバント、マトリックスＱ（商標）アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）またはＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体を含有するアジュバント、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、およびＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバントが挙げられる。本明細書に記載されるようなワクチン組成物はまた、例えば、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子を含む免疫調整薬と会合させることができる。同じワクチン組成物内の２種類以上のアジュバントの混合物もまた、本明細書において企図される。
【０１３２】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、サポニン、フロイントの完全アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、ＣＲＭ１９７、モンタニド（登録商標）、フロイントの不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、マトリックスＭ（商標）アジュバント、マトリックスＣ（商標）アジュバント、マトリックスＱ（商標）アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）−３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）またはＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体を含有するアジュバント、モノホスホリル脂質Ａ（（３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ；ＭＰＬ）、ＡＳ０１（ＭＰＬおよびＱＳ−２１のリポソーム製剤）、ＡＳ０４（ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムのリポソーム製剤）、ＱＳ−２１、ＱＳ−２１誘導体、ＱＳ−２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバント、および前記のいずれかの組合せからなる群から選択される。
【０１３３】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、アジュバントは、ＴＬＲ−４アゴニストである。本明細書に開示されている一つの実施形態において、ＴＬＲ−４アゴニストは、モノホスホリル脂質Ａである。本明細書に開示されている一つの実施形態において、アジュバントは、モンタニドである。本明細書に開示されている一つの実施形態において、ＴＬＲ−４アゴニストは、ＡＳ０１（ＭＰＬおよびＱＳ−２１のリポソーム製剤）である。本明細書に開示されている一つの実施形態において、アジュバントは、ＡＳ０４（ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムのリポソーム製剤）である。
【０１３４】
本開示はまた、アジュバントおよび／または担体の組合せの使用にも及ぶ。
【０１３５】
癌の治療
本明細書の他所に示されているように、本発明者らは、意外にも、チェックポイント抗原ＰＤ１のＢ細胞エピトープのペプチド配列による免疫誘導が、抗体が天然ＰＤ１タンパク質に結合する抗体応答を惹起し得ることを見出した。また、意外にも、ＰＤ１由来Ｂ細胞エピトープによる免疫誘導が、チェックポイント抗原に対する抗体の受動的投与で明らかになることがある有害な副作用を生じるとは思えないことも見出された。よって、本明細書において、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）の関与を特徴とする癌を治療する方法が開示され、その方法は、対象に、ＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物を投与することを含んでなり、前記ワクチン組成物は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導する有効量の免疫原を含んでなる。
【０１３６】
用語「癌」および「腫瘍」は、本明細書において互換的に使用され、悪性細胞を含んでなると理解され、また、新生細胞、癌細胞または腫瘍細胞とも呼ばれる。「悪性細胞」とは、制御を欠いた細胞増殖により増殖し、一般に、最初の増殖刺激が止まった後も増殖し続ける正常でない細胞を意味する。
【０１３７】
「ＰＤ１の関与を特徴とする癌」は、少なくとも一部には、癌に対する免疫応答の下方調節を担う内在する阻害経路におけるＰＤ１が関与する癌を意味する。
【０１３８】
当業者には、ＰＤ１の関与を特徴とする癌の種類は公知である。実例としては、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、ホジキンリンパ腫、胃癌、膵臓癌、前立腺癌および唾液腺癌などの悪性腫瘍が挙げられる。一つの実施形態において、癌は、非小細胞肺癌である。別の実施形態において、癌は、黒色腫である。別の実施形態において、癌は、胃癌である。本明細書の他所に示されているように、本明細書に記載の方法は、ＰＤ１の関与を特徴とする癌の治療のためのワクチン組成物を対象とする。他の実例としては、白血病、精上皮腫、奇形腫、神経芽腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌腫、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳癌、子宮頸癌、腸管癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、消化管癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌、肺癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、子宮頸癌腫およびそれらの転移が挙げられる。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、癌は、本明細書の他所に記載されているような癌関連抗原が悪性細胞または組織によって発現または異常発現（例えば、過剰発現）される悪性細胞の存在を特徴とする。好ましくは、癌は、癌関連抗原の表面発現を特徴とする。「異常な」または「正常でない」発現は、非悪性もしくは正常細胞の状態、または健常な個体（すなわち、抗原の異常なまたは正常でない発現に関連する疾患を有さない個体）に比べて癌関連抗原の発現が変更されている、好ましくは、増大していることを意味する。いくつかの実施形態において、癌関連抗原の発現の増大は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも１００％、またはそれを超える増大を指す。いくつかの実施形態において、癌関連抗原の異常なまたは正常でない発現は、その抗原が癌細胞または組織でのみ検出可能であり、正常または健常な組織での発現は検出不能であることを意味する。
【０１４０】
本明細書に記載されているようなワクチン組成物は、それを必要とする対象に、免疫原を提供するために「有効量」で、すなわち、とりわけ治療効果のいずれか１つ以上を惹起するために有効な量で投与するために調合される。当業者ならば、慣例の試験により、所望の転帰のために投与する有効な非毒性量を決定することができるであろう。一般に、本明細書に開示されているようなワクチン組成物は、投与経路およびレシピエントの身体的特徴（健康状態を含む）に適合した様式、およびそれが所望の効果（すなわち、治療効果）を惹起するような方法で投与することができる。例えば、組成物の適当な用量は、限定されるものではないが、対象の身体的特徴（例えば、年齢、体重、性別）、組成物が単剤として使用されるか補助療法の一部として（例えば、本明細書の他所に記載されているような癌関連抗原に対する第２の免疫原とともに）使用されるか、基礎にあるいずれかの癌の進行（すなわち、病的状態）、および当業者により認識され得る他の因子を含む様々な因子によって決まり得る。例えば、組成物の適当な用量を決定する際に考慮され得る一般考慮事項の他の実例は、Gennaro (2000, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins;およびGilman et al., (編), (1990), "Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press)により考察されている。
【０１４１】
上記で概説した考慮事項のいくつかを考慮して当業者に公知の方法によって決定され得る有効量は比較的広範囲であると思われる。
【０１４２】
投与される免疫原の有効量は一般に、対象当たり約５μｇ〜約１．０ｍｇの免疫原、対象当たり約１０μｇ〜約５００μｇの免疫原、または対象当たり約１５μｇ〜約６０μｇの免疫原であろう。有効量は、例えば、抗原特異的抗体力価の測定を含む標準法によって確定することができる。本明細書に記載される組成物により提供される免疫のレベルは、行う場合には、追加免疫の必要を決定するためにモニタリングすることができる。例えば、血清の抗原特異的抗体力価を評価した後、一般に、対象における組成物の初回投与後数日または数週間で、任意選択の追加免疫が必要とされる、および／または望まれる場合がある。
【０１４３】
個々の用量の最適な量および間隔は、所望の免疫応答を誘導するために必要とされれば、本明細書の他所に記載されているように、例えば、投与の形態、経路および部位、ならびに治療される特定の対象の性質によって決まり得ることは、当業者には明らかであろう。最適な条件は、当業者に公知の従来技術を用いて決定することができる。いくつかの場合、明細書に記載されるようなワクチンおよび／または医薬組成物の数回または多回の投与を行うことが望ましいことがある。例えば、これらの組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを超える回数で投与することができる。これらの投与は、約１日間隔〜約１２週間隔、特定の実施形態においては、約１週間〜約４週間間隔であり得る。腫瘍サイズの縮小および／または転移発生の低減などの所望の治療結果を達成するためには間欠的再投与が必要とされる場合がある。また、最適な投与コースは、従来の治療コースまたは有効性もしくは免疫状態の決定検査を用いて確定することができることも当業者には明らかであろう。
【０１４４】
本明細書で企図されるような免疫または抗原特異的抗体応答を「誘導すること」は、腫瘍サイズの縮小、腫瘍成長の緩徐化および／もしくは転移発生の低減などの所望の治療効果を得るために、免疫応答を「惹起もしくは刺激することおよび／または既存の免疫応答を増強することを含むと理解される。この効果はまた、例えば、転移発生を完全または部分的に予防するという点で予防でもあり得る。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、用語「投与」または「投与すること」は一般に、患者の免疫系が融合タンパク質内のペプチド配列に対する応答を惹起するように、本明細書に記載されるようなワクチンおよび／または医薬組成物を患者の身体に導入する工程を指す。本明細書で使用する場合、「それを必要とする対象」は、癌を有すると診断された個体を含む。よって、その最も広い意味において、用語「それを必要とする患者」は、既存の必要を有する個体ならびに癌を発症するリスクのある個体を包含する。
【０１４６】
用語「治療すること」、「治療」などは、本明細書において、対象における癌（その１以上の症状を含む）の進行を和らげる、軽減する、緩和する、改善するまたはそうでなければ阻害することも意味して互換的に使用される。用語「治療すること」、「治療」などは、本明細書において、癌の素因またはリスクがあり得るが癌を有するとはまだ診断されていない対象において、癌の発生を予防するまたは癌の発症もしくは続いての癌の進行を遅延させることも意味して互換的に使用される。この文脈で、用語「治療すること」、「治療」などは、「予防」、「予防的(prophylactic)」および「予防的(preventive)」などの用語と互換的に使用される。本明細書で使用する場合、癌を「治療する」薬剤は、理想的には、組成物の投与の中止時に疾患が再進行せずに寛解に留まるようにその基礎にある原因を排除することによって疾患を全体として排除する。本明細書で使用する場合、癌を「改善する」薬剤は、疾患の基礎にある原因を排除しないが、確立された任意のグレーディングシステムにより測定されるような、および／または患者のウェルビーイング、例えば、疼痛および／または不快感の低減における改善により測定されるような疾患の重症度を低減する。
【０１４７】
本発明においてはまた、１以上の付加的治療薬を使用することにより癌を治療するための補助療法も企図される。理論または特定の適用様式に拘束されるものではないが、一般に、本明細書に記載されるような第２の免疫原の使用は、対象における癌の治療のために免疫応答の増強を提供し得ることが理解されるであろう。一つの実施形態において、本明細書に開示されている方法は、対象に第２の免疫原を、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量で投与することをさらに含んでなる。一つの実施形態において、本明細書に開示されている方法は、対象に第２の免疫原を、癌関連抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量で投与することをさらに含んでなる。
【０１４８】
第２の免疫原により誘導される免疫応答は、好適には、Ｔ細胞応答（例えば、ＣＴＬ）、Ｂ細胞応答、または両方を含んでなり得る。例えば、第２の免疫原は、対象に有効量で投与された際に、そのチェックポイント抗原および／または癌関連抗原に対する抗体（Ｂ細胞）応答を誘導し得るように、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原および／または癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープ（および／またはそのミモトープ）を含んでなり得る。一つの実施形態において、第２の免疫原は、対象に、抗体（Ｂ細胞）応答を誘導するための有効量で投与される。一つの実施形態において、第２の免疫原は、対象に、抗体が癌関連抗原のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量で投与される。別の実施形態において、第２の免疫原は、対象に、抗体がＰＤ１以外のチェックポイント抗原のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量で投与される。一つの実施形態において、第２の免疫原は、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原および／または癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んでなる。別の実施形態において、第２の免疫原は、抗体がＰＤ１以外のチェックポイント抗原および／または癌関連抗原のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導し得るミモトープを含んでなる。
【０１４９】
代わりにまたは加えて、第２の免疫原は、対象に有効量で投与された際に、チェックポイント抗原および／または癌関連抗原に対するＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）応答を誘導し得るように、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原および／または癌関連抗原の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなり得る。よって、一つの実施形態において、第２の免疫原は、対象に、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原に対するＴ細胞応答を誘導するための有効量で投与される。別の実施形態において、第２の免疫原は、対象に、癌関連抗原に対するＴ細胞応答を誘導するための有効量で投与される。一つの実施形態において、第２の免疫原は、癌関連抗原の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる。別の実施形態において、第２の免疫原は、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる。
【０１５０】
他の実施形態において、第２の免疫原は、対象に有効量で投与された際に、癌関連抗原に対する抗体応答およびＴ細胞応答を誘導し得るように、癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープ、またはそのミモトープ、および癌関連抗原の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる。少なくとも１つのＴ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＢ細胞エピトープ、またはそのミモトープは、好適には、第２の免疫原が対象に有効量で投与された際に、それが同じ癌関連抗原に対する抗体応答およびＴ細胞応答を誘導し得るように、同じ癌関連抗原に由来してよい。代わりにまたは加えて、少なくとも１つのＴ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＢ細胞エピトープ、またはそのミモトープは、好適には、第２の免疫原が対象に有効量で投与された際に、それが異なる癌関連抗原のそれぞれに対する抗体応答およびＴ細胞応答を誘導し得るように、異なる癌関連抗原に由来してもよい。
【０１５１】
ＰＤ１以外の好適なチェックポイント抗原は当業者に周知であり、その実例は、Pardoll (2012, Nature Reviews Cancer 12:252-64)に記載されている。好適なチェックポイント抗原の他の実例としては、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４(cytotoxic T lymphocyte antigen-4)）およびそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６；ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）、ＰＤ−Ｌ２（プログラム細胞死リガンド２）、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子−３(lymphocyte activation gene-3)）およびそのリガンドＭＨＣクラスＩまたはＩＩ、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンタンパク質−３(T cell immunoglobulin and mucin protein-3)）およびそのリガンドＧＡＬ−９、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター(B- and T-lymphocyte attenuator)（ＢＴＬＡ）およびそのリガンドであるヘルペスウイルスエントリーメディエーター(herpes virus entry mediator)（ＨＶＥＭ）および例えば、Nirschl & Drake (2013 Clin Cancer Res 19:4917-24)により記載されている他のいくつかのものが挙げられる。本明細書に開示されている一つの実施形態において、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ−３およびＧＡＬ−９からなる群から選択される。
【０１５２】
用語「チェックポイント抗原」は、自己寛容を維持し、抗原刺激に対する免疫応答の持続期間および程度を調整する働きをするものなど免疫系の機能に関する内因的阻害経路に関与する抗原を意味するものと理解される。
【０１５３】
用語「癌関連抗原」、「癌に関連する抗原」、「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」、「癌抗原」などは、本明細書において、癌細胞または組織で異常な発現を示す抗原を意味して互換的に使用される。いくつかの実施形態において、抗原は、正常な状態において限られた数の組織および／もしくは器官でまたは特定の発達段階で発現され得る。例えば、この抗原は、胃組織の正常な状態で特異的に発現され得、１以上の癌細胞で発現または異常発現（例えば、過剰発現）される。抗原の発現は、癌細胞またはその癌の起源に関係のない組織で再活性化され得る。いくつかの実施形態において、癌関連抗原としては、分化抗原、好ましくは、細胞種特異的分化抗原（すなわち、ある特定の分化段階のある特定の細胞種において正常な状態で特異的に発現されるタンパク質）、癌／精巣抗原（すなわち、精巣および場合によっては胎盤の正常な状態で特異的に発現されるタンパク質）、および生殖細胞系特異的抗原が含まれる。
【０１５４】
一つの実施形態において、癌に関連する抗原は癌細胞の細胞表面で発現され、好ましくは、正常な細胞および組織では発現されないか、またはまれにしか発現されない。好ましくは、この抗原またはこの抗原の異常な発現は、癌細胞、好ましくは、腫瘍細胞を識別する。いくつかの実施形態において、対象（例えば、癌に罹患している患者）において癌細胞により発現される抗原は、自己タンパク質である。しかしながら、この抗原に対する自己抗体は、一般に、その抗原を有する対象（一般に、癌を有さない健常患者）において正常な状態では検出可能なレベルで見られない、またはこのような自己抗体はその抗原を有する組織または細胞を傷害するために必要とされる閾値濃度を下回る量でしか見られないと理解される。好適な癌関連抗原は当業者に公知であり、その実例としては、ＥＧＦＲ（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１）、ＢＡＧＥ（Ｂ黒色腫抗原）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、Ｃｐｇ（シトシンリン酸ジエステルグアニン）、Ｇｐ１００（糖タンパク質１００）、ｈ−ＴＥＲＴ（テロメラーゼトランスクリプターゼ）、ＭＡＧＥ（黒色腫抗原コード遺伝子）、メラン−Ａ（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原）およびＭＵＣ−１（ムチン−１）が挙げられる。よって、一つの実施形態において、癌関連抗原は、ＥＧＦＲ（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１）、ＢＡＧＥ（Ｂ黒色腫抗原）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣｐＧ（シトシンリン酸ジエステルグアニン）、Ｇｐ１００（糖タンパク質１００）、ｈ−ＴＥＲＴ（テロメラーゼトランスクリプターゼ）、ＭＡＧＥ（黒色腫抗原コード遺伝子）、メラン−Ａ（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原）およびＭＵＣ−１（ムチン−１）からなる群から選択される。本明細書に開示されている方法により産生されるワクチン組成物の標的となる抗原の選択は、一般に、ワクチン組成物の意図される使用によって異なることも理解されるであろう。例えば、ワクチン組成物が乳癌を有する対象を治療するために意図される場合、抗原は一般に、乳癌に関連する（例えば、乳癌により過剰発現される）抗原であろう。乳癌に関連する抗原の好適な例は当業者に周知であり、その実例としては、上皮細胞増殖因子受容体Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＨｅｒ１が挙げられる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原および／または癌関連抗原のアミノ酸配列は、それが正常組織で発現される場合の抗原とそれが癌細胞または組織で発現される場合の抗原の間で同一である。他の実施形態において、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原および／または癌関連抗原のアミノ酸配列は、正常な組織または細胞で発現される場合の天然抗原のアミノ酸配列に比べて、そのアミノ酸配列に突然変異を含んでなる。
【０１５６】
また、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原および／または癌関連抗原に対する免疫応答を惹起することによりワクチン組成物の有効性を改善する本明細書に記載されるような第２の免疫原の能力は、この第２の免疫原が、ＰＤ１により標的とされる免疫原とともにワクチン組成物中に存在することを必要とせず、または必要とする対象にＰＤ１により標的とされる免疫原と同時に投与されることを必要としないことも理解されるであろう。よって、本明細書に記載されるような第２の免疫原は、ＰＤ１により標的とされる免疫原の投与前または投与後に投与することができ、所望の相乗または相加作用を提供するよう、ＰＤ１により標的とされる免疫原の投与と第２の免疫原の投与の間の期間を最適化することができる。
【０１５７】
用語「正常組織」または「正常な状態」は一般に、健常な組織または健常な対象の状態、すなわち、非病的状態を指し、「健常」とは好ましくは、非腫瘍原性または非癌性を意味する。
【０１５８】
用語「特異的に発現される」は一般に、その抗原が唯一または主として特定の組織または器官で発現されることを意味する。例えば、乳房組織で特異的に発現される抗原は、主として乳房組織で発現され、他の組織では発現されないか、または他の組織もしくは器官では有意な程度には存在しない。従って、乳房組織の細胞で例外なく発現され、かつ、胃粘膜などの他のいずれの組織でも有意に低い程度に発現される抗原は、乳房組織の細胞で特異的に発現される。いくつかの実施形態において、抗原はまた、正常な状態で２つ以上の組織種または器官（例えば、２、３、４、５、６つのまたはそれを超える）組織種または器官で特異的に発現され得る。例えば、癌に関連する抗原が正常な状態で乳房および胃組織でほぼ同程度に発現されれば、その抗原は、乳房および胃組織で特異的に発現されると見なされる。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、用語「自己タンパク質」は、対象のゲノムによってコードされ、かつ、正常な状態（すなわち、非病的状態）で、場合によりある特定の正常組織種またはある特定の発達段階において発現されるタンパク質を意味する。
【０１６０】
また、本明細書では、ＰＤ１の関与を特徴とする癌を治療する方法も企図され、この方法では、本明細書に開示されているワクチン組成物が、癌を特異的に標的とする１以上の付加的治療薬とともに（同時にまたは逐次に）投与される。よって、別の実施形態において、その方法は、対象に悪性細胞を特異的に標的とする１種類以上の付加的治療薬を投与することをさらに含んでなる。
【０１６１】
別の実施形態において、本明細書に記載のワクチン組成物は、悪性細胞を特異的に標的とする１種類以上の付加的治療薬または化合物をさらに含んでなる。好適な付加的治療薬は当業者に公知であり、その実例としては、チェックポイント抗原および／もしくは癌関連抗原と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントが挙げられる。よって、一つの実施形態において、本明細書に開示されている方法は、対象に、本明細書の他所に記載されているような癌関連抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することをさらに含んでなる。さらに別の実施形態において、本明細書に開示されている方法は、対象に、本明細書の他所に記載されているようなチェックポイント抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することをさらに含んでなる。一つの実施形態において、この抗体または抗原結合フラグメントは、ＰＤ１以外のチェックポイント抗原と特異的に結合する。代わりにまたは加えて、この抗体または抗原結合フラグメントは、ＰＤ１と特異的に結合する。
【０１６２】
本開示の別の側面において、ＰＤ１の関与を特徴とする癌の治療のための薬剤の製造におけるワクチン組成物の使用が提供され、このワクチン組成物は、本明細書に記載されるように、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなる。
【０１６３】
本開示の別の側面において、ＰＤ１の関与を特徴とする癌の治療において使用するためのワクチン組成物が提供され、本明細書に記載されるように、このワクチン組成物は、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなる。
【０１６４】
本開示の別の側面において、ＰＤ１に対する体液性応答を惹起するためのワクチン組成物が提供され、このワクチン組成物は、本明細書に記載されるように、抗体がＰＤ１のＢ細胞エピトープに結合する抗体応答を誘導するための有効量の免疫原を含んでなる。
【０１６５】
一つの実施形態において、本明細書に記載のワクチン医薬組成物は、薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる。好適な薬学上許容可能な賦形剤（例えば、担体、希釈剤など）は、当業者に公知である。例えば、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などの様々な水性（薬学上許容可能な）賦形剤が使用可能である。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌可能であり、または濾過除菌が可能である。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装してもよいし、または凍結乾燥してもよく、この凍結乾燥製剤は、投与前に無菌溶液と合わせられる。これらの組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じてｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、とりわけ、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、スクロースまたは他の炭水化物などの薬学上許容可能な補助物質をさらに含んでなってもよい。非経口的に投与可能な化合物を調製するための好適な方法は当業者に既知または自明であり、A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., 第3版 Amer. Pharmaceutical Assocにより詳細に記載されている。
【０１６６】
ワクチン組成物は、非経口投与（例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射）に好適な形態または鼻腔吸入または経口吸入などの吸入による投与に好適なエアロゾル形態で調製され得る。
【０１６７】
また、本明細書に記載のワクチン組成物は、キットでも提供され得る。このキットは、投与装置、賦形剤、担体および／または希釈剤などの本明細書に記載されるような方法の実施を補助するための付加的成分を含んでなり得る。これらのキットは、種々の成分を収容する容器およびこのような方法でキット成分を使用するための説明書を含み得る。
【０１６８】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、ワクチン組成物は、本明細書の他所に記載されているように、第２の免疫原をＰＤ１以外のチェックポイント抗原および／または癌関連抗原に対する免疫応答を誘導するための有効量でさらに含んでなる。
【０１６９】
別の実施形態において、このワクチン組成物は、本明細書の他所に記載されているように、チェックポイント抗原および／もしくは癌関連抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含んでなる。
【０１７０】
別の実施形態において、このワクチン組成物は、本明細書の他所に記載されているように、悪性細胞を特異的に標的とする１種類以上の付加的治療薬をさらに含んでなる。
【０１７１】
癌関連抗原
ＰＤ１の関与を特徴とする病態の治療において本明細書に開示されているペプチドエピトープの有効性を改善する目的で、病態が癌である場合には、ワクチン組成物は、癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープをさらに含んでなり得る。
【０１７２】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、ワクチン組成物は、さらに癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープを、ペプチドエピトープと癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープが同じ組成物中に存在するように含んでなる。しかしながら、癌関連抗原に対する抗体応答を惹起することにより本明細書に開示されているペプチドエピトープの有効性を改善する癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープの能力は、癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープがペプチドエピトープとともにワクチン組成物中に存在することを必要とせず、または必要とする対象に同時に投与されることを必要としないことも理解されるであろう。よって、いくつかの実施形態において、本明細書の他所に記載されているように、癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープは、ペプチドエピトープの投与前または投与後に投与することができ、所望の相乗または相加作用を提供するよう、ワクチン組成物の投与と癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープの投与の間の期間を最適化することができる。
【０１７３】
本明細書の他所に示されているように、用語「癌関連抗原」、「癌に関連する抗原」、「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」、「癌抗原」などは、本発明において、癌細胞または組織で異常な発現を示す抗原を意味して互換的に使用される。いくつかの実施形態において、この抗原は、正常な状態において限られた数の組織および／もしくは器官でまたは特定の発達段階で発現され得る。例えば、この抗原は、胃組織の正常な状態で特異的に発現され得、１以上の癌細胞で発現または異常発現（例えば、過剰発現）される。抗原の発現は、癌細胞またはその癌の起源に関係のない組織で再活性化され得る。いくつかの実施形態において、癌関連抗原としては、分化抗原、好ましくは、細胞種特異的分化抗原（すなわち、ある特定の分化段階のある特定の細胞種において正常な状態で特異的に発現されるタンパク質）、癌／精巣抗原（すなわち、精巣および場合によっては胎盤の正常な状態で特異的に発現されるタンパク質）、および生殖細胞系特異的抗原が含まれる。一つの実施形態において、癌に関連する抗原は癌細胞の細胞表面で発現され、好ましくは、正常な細胞および組織で発現されないか、またはまれにしか発現されない。好ましくは、この抗原または抗原の異常な発現は、癌細胞、好ましくは、腫瘍細胞を識別する。いくつかの実施形態において、対象（例えば、癌に罹患している患者）において癌細胞により発現される抗原は、自己タンパク質である。しかしながら、この抗原に対する自己抗体は、一般に、その抗原を有する対象（一般に、癌を有さない健常患者）において正常な状態では検出可能なレベルで見られない、またはこのような自己抗体はその抗原を有する組織または細胞を傷害するために必要とされる閾値濃度を下回る量でしか見られないと理解される。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、癌関連抗原のアミノ酸配列は、それが正常組織で発現される場合の抗原とそれが癌細胞または組織で発現される場合の抗原の間で同一である。他の実施形態において、他の実施形態において、癌関連抗原は、正常な組織または細胞で発現される場合の癌関連抗原のアミノ酸配列に比べて、そのアミノ酸配列に突然変異を含んでなる。
【０１７５】
本明細書に記載の方法は、癌が単独または本明細書に記載されるような癌関連抗原の少なくとも１つのＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープにより誘導される標的化抗体応答と組み合わせたＰＤ１ペプチドエピトープにより誘導される標的化抗体応答によって治療可能であると見なされる限り、いずれの癌の治療のためのワクチン組成物の生産にも適用可能であることが理解されるであろう。好適な癌の実例としては、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳癌、子宮頸癌、腸管癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、消化管癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌、肺癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫およびそれらの転移が挙げられる。
【０１７６】
本明細書で使用する場合、用語「ミモトープ」は一般に、それが模倣するＢ細胞エピトープと同じトポロジーを有する立体配座を有し、前記Ｂ細胞エピトープに免疫特異的に結合する抗体の同じ抗原結合領域に結合する分子を指す。ミモトープは、宿主において、それが模倣するＢ細胞エピトープに対する抗原に対して反応性のある免疫応答を惹起すると考えられる。
【０１７７】
癌関連抗原のミモトープは、好ましくは、それらのアミノ酸配列が天然癌関連抗原のアミノ酸配列とは異なる抗原性ポリペプチドである。ミモトープは、天然癌関連抗原の１以上の天然アミノ酸残基のアミノ酸置換だけでなく、１以上の非天然アミノ酸（すなわち、２０種の「古典的」アミノ酸由来でない）を含んでなってもよく、またはそれらは、そのような非天然アミノ酸から完全に構築されてもよい。好適なミモトープは、商業的に入手可能なペプチドライブラリーから提供され得る。好ましくは、これらのミモトープは、少なくとも７アミノ酸長（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７またはそれを超えるアミノ酸長）である。好ましい長さは、１６まで、好ましくは、１４または２０アミノ酸（例えば、５〜１６アミノ酸残基）までであり得る。より長いミモトープも使用可能である。一つの実施形態において、ミモトープはポリペプチドの一部であってもよく、結果として、それらのＮ末端および／またはＣ末端に少なくとも１個のさらなるアミノ酸残基を含んでなってもよい。
【０１７８】
医薬組成物
本開示のさらに別の側面において、本明細書に記載されるようなワクチン組成物と薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。
【０１７９】
好適な薬学上許容可能な賦形剤（例えば、担体、希釈剤など）は当業者に公知である。例えば、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などの様々な水性の（薬学上許容可能な）賦形剤が使用可能である。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌可能であり、または濾過除菌が可能である。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装してもよいし、または凍結乾燥してもよく、この凍結乾燥製剤は、投与前に無菌溶液と合わせられる。これらの組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じてｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、とりわけ、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、スクロースまたは他の炭水化物などの薬学上許容可能な補助物質をさらに含んでなってもよい。非経口的に投与可能な化合物を調製するための好適な方法は当業者に既知または自明であり、A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., 第3版 Amer. Pharmaceutical Assocにより詳細に記載されている。
【０１８０】
医薬組成物は、非経口投与（例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射）に好適な形態または鼻腔吸入または経口吸入などの吸入による投与に好適なエアロゾル形態であり得る。
【０１８１】
また、本明細書に記載の医薬組成物は、キットでも提供され得る。このキットは、投与装置、賦形剤、担体および／または希釈剤などの本明細書に記載されるような方法の実施を補助するための付加的成分を含んでなり得る。これらのキットは、種々の成分を収容する容器およびこのような方法でキット成分を使用するための説明書を含み得る。
【０１８２】
本明細書に開示されている一つの実施形態において、医薬組成物(pharmaceutic composition)は、本明細書に記載されるようなチェックポイント抗原またはチェックポイント阻害剤をさらに含んでなる。
【０１８３】
使用および治療方法
本開示の別の側面において、ＰＤ１の関与を特徴とする病態を治療する方法が提供され、その方法は、必要とする対象に本明細書に記載されるようなワクチン組成物または本明細書に記載されるような医薬組成物を投与することを含んでなる。
【０１８４】
本開示はまた、必要とする対象においてＰＤ１の関与を特徴とする病態を治療するための薬剤の製造における、本明細書に記載されるようなワクチン組成物の使用にも及ぶ。
【０１８５】
本開示はまた、必要とする対象においてＰＤ１の関与を特徴とする病態の治療において使用するための本明細書に記載されるようなワクチン組成物または本明細書に記載されるような医薬組成物にも及ぶ。
【０１８６】
当業者はＰＤ１の関与を特徴とする病態の種類を周知であり、その実例としては、自己免疫疾患、癌、慢性ウイルス感染、および移植拒絶が挙げられる。一つの実施形態において、ＰＤ１の関与を特徴とする病態は癌である。実例としては、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌腫、膀胱癌、ホジキンリンパ腫、胃癌、膵臓癌、前立腺癌および唾液腺癌などの悪性腫瘍が挙げられる。一つの実施形態において、癌は非小細胞肺癌である。別の実施形態において、癌は黒色腫である。別の実施形態において、癌は胃癌である。
【０１８７】
本明細書に記載されているようなワクチンまたは医薬組成物は一般に、「有効量」で、すなわち、とりわけ治療効果のいずれか１つ以上を惹起するために有効な量で投与される。当業者ならば、慣例の試験により、所望の転帰のために投与する有効な非毒性量を決定することができるであろう。一般に、本明細書に開示されているようなワクチン組成物および／または医薬組成物は、投与経路およびレシピエントの身体的特徴（健康状態を含む）に適合した様式、およびそれが所望の効果（すなわち、治療効果）を惹起するような方法で投与することができる。例えば、組成物の適当な用量は、限定されるものではないが、対象の身体的特徴（例えば、年齢、体重、性別）、組成物が単剤として使用されるか補助療法の一部として（例えば、チェックポイント抗原またはチェックポイント阻害剤とともに）使用されるか、基礎にあるいずれかの癌の進行（すなわち、病的状態）、および当業者により認識され得る他の因子を含む様々な因子によって決まり得る。例えば、組成物の適当な用量を決定する際に考慮され得る一般考慮事項の他の実例は、Gennaro (2000, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins;およびGilman et al., (編), (1990), "Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press)により考察されている。
【０１８８】
上記で概説した考慮事項のいくつかを考慮して当業者に公知の方法によって決定され得る有効量は比較的広範囲であると思われる。
【０１８９】
投与されるペプチドエピトープの有効量は一般に、対象当たり約５μｇ〜約５．０ｍｇのペプチド配列、好ましくは対象あたり約５００μｇ〜約５．０ｍｇのペプチドエピトープ、好ましくは対象あたり約１０μｇ〜約５００μｇのペプチドエピトープ、または対象当たり約１５μｇ〜約６０μｇのペプチドエピトープの範囲であろう。有効量は、例えば、抗原特異的抗体力価の測定を含む標準法によって確定することができる。本明細書に記載される組成物により提供される免疫のレベルは、行う場合には、追加免疫の必要を決定するためにモニタリングすることができる。例えば、血清の抗原特異的抗体力価を評価した後、一般に、対象における組成物の初回投与後数日または数週間で、任意選択の追加免疫が必要とされる、および／または望まれる場合がある。本明細書の他所に示されているように、無差別なＴｈ細胞エピトープの使用は、本明細書に記載の免疫原により惹起される抗体応答を増強することができ、従って、より低用量の免疫原が必要とされ得る。免疫原が無差別なＴｈ細胞エピトープを含んでなる場合、その免疫原は、対象当たり約５μｇ〜約５．０ｍｇの免疫原、好ましくは対象当たり約５００μｇ〜約５．０ｍｇの免疫原、または好ましくは対象当たり約１ｍｇ〜約５ｍｇの免疫原の範囲で対象に投与され得る。
【０１９０】
本明細書に記載されているようなワクチンおよび／または医薬組成物は、それを必要とする対象に単剤としてまたは付加的治療薬と組み合わせて、すなわち、補助療法の一部として投与することができる。補助療法に関して、投与は同時または逐次であってよく、すなわち、まず、ワクチンおよび／または医薬組成物が投与され、その後、付加的治療薬および／もしくは予防薬の投与が続くか、または付加的治療薬の投与の後にワクチンおよび／または医薬組成物が投与される。よって、２つ以上のものが対象に「一緒に」投与される場合、それらは単一の組成物で同時に投与されてもよいし、または別個の組成物で時間をおいて投与されてもよい。
【０１９１】
付加的治療薬は、チェックポイント阻害剤を含んでなり得る。本明細書の他所に示されているように、用語「チェックポイント抗原」は一般に、自己寛容を維持し、抗原刺激に対する免疫応答の持続期間および程度を調整する働きをするものなど免疫系の機能に関する内因的阻害経路に関与する抗原を意味する。しかしながら、研究によれば、チェックポイント抗原は癌に対する宿主の免疫応答の有効性を低下させて腫瘍成長をもたらすことが示されている（Nirschl & Drake, 2013, Clin Cancer Res 19:4917-24参照）。好適なチェックポイント抗原は当業者に周知であり、その実例はPardoll (2012, Nature Reviews Cancer 12:252-64)に述べられている。好適なチェックポイント抗原の他の実例としては、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４）およびそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６；ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）、ＰＤ−Ｌ２（プログラム細胞死リガンド２）、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子−３）およびそのリガンドＭＨＣクラスＩまたはＩＩ、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンタンパク質−３）およびそのリガンドＧＡＬ−９、Ｂ−およびＴ−リンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）およびそのリガンドであるヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）および例えば、Nirschl & Drake (2013 Clin Cancer Res 19:4917-24)により記載されている他のいくつかのものが挙げられる。
【０１９２】
ワクチン組成物は、複数の抗原、すなわち、ＰＤ１の他の抗原を標的とし得る。例えば、このペプチドエピトープは、ペプチドエピトープが、投与された際にＰＤ１および１以上の癌関連抗原（例えば、２、３、４、５、６、７つまたはそれを超える癌関連抗原）に対する抗体応答を誘導するように、１以上の癌関連抗原の１以上のＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープをさらに含んでなり得る。さらに別の実施形態において、ペプチドエピトープは、ペプチドエピトープが、投与された際に１以上の付加的チェックポイント抗原（例えば、ＰＤ１以外の１、２、３、４、５、６、７つまたはそれを超えるチェックポイント抗原）に対する抗体応答を誘導するように、１以上の付加的（ＰＤ１以外の）チェックポイント抗原の１以上のＢ細胞エピトープおよび／またはミモトープを含んでなる。
【０１９３】
よって、一つの実施形態において、本明細書に開示されている方法は、対象に、癌関連抗原と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを投与することをさらに含んでなる。一つの実施形態において、癌関連抗原は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−１、Ｂ黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シトシンリン酸ジエステルグアニン（ＣｐＧ）、糖タンパク質１００（Ｇｐ１００）、テロメラーゼトランスクリプターゼ（ｈ−ＴＥＲＴ）、黒色腫抗原コード遺伝子（ＭＡＧＥ）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（メラン−Ａ）およびムチン−１（ＭＵＣ−１）からなる群から選択される。
【０１９４】
一つの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ワクチン組成物の投与の後に対象に投与される。
【０１９５】
個々の用量の最適な量および間隔は、所望の免疫応答を誘導するために必要とされれば、本明細書の他所に記載されているように、例えば、投与の形態、経路および部位、ならびに治療される特定の対象の性質によって決まり得ることは、当業者には明らかであろう。最適な条件は、当業者に公知の従来技術を用いて決定することができる。
【０１９６】
いくつかの場合、明細書に記載されるようなワクチンおよび／または医薬組成物の数回または多回の投与を行うことが望ましいことがある。例えば、これらの組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれを超える回数で投与することができる。これらの投与は、約１日間隔〜約１２週間隔、特定の実施形態においては、約１週間〜約４週間間隔であり得る。腫瘍サイズの縮小および／または転移発生の低減などの所望の治療結果を達成するためには間欠的再投与が必要とされる場合がある。また、最適な投与コースは、従来の治療コースまたは有効性もしくは免疫状態の決定検査を用いて確定することができることも当業者には明らかであろう。
【０１９７】
本明細書で企図されるような免疫または抗原特異的抗体応答を「誘導すること」は、腫瘍サイズの縮小、腫瘍成長の緩徐化および／もしくは転移発生の低減などの所望の治療効果を得るために、免疫応答を「惹起もしくは刺激することおよび／または既存の免疫応答を増強することを含むと理解される。この効果はまた、例えば、転移発生を完全または部分的に予防するという点で予防でもあり得る。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、用語「投与」または「投与すること」は一般に、患者の免疫系がペプチドエピトープ内のペプチド配列に対する応答を惹起するように、本明細書に記載されるようなワクチンおよび／または医薬組成物を患者の身体に導入する工程を指す。本明細書で使用する場合、「それを必要とする対象」は、癌を有すると診断された個体を含む。よって、その最も広い意味において、用語「それを必要とする患者」は、既存の必要を有する個体ならびに癌を発症するリスクのある個体を包含する。
【０１９９】
本明細書で使用する場合、癌を「治療する」薬剤は、理想的には、組成物の投与の中止時に疾患が再進行せずに寛解に留まるようにその基礎にある原因を排除することによって疾患を全体として排除する。本明細書で使用する場合、癌を「改善する」薬剤は、疾患の基礎にある原因を排除しないが、確立された任意のグレーディングシステムにより測定されるような、および／または患者のウェルビーイング、例えば、疼痛および／または不快感の低減における改善により測定されるような疾患の重症度を低減する。
【０２００】
本明細書に挙げられている総ての特許、特許出願および刊行物は、全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２０１】
当業者は、本明細書に記載の本発明は具体的に記載されるもの以外の変形および改変が可能であることを認識するであろう。本発明はその趣旨および範囲内にあるこのような変形および改変を総て含むものと理解されるべきである。本発明はまた、本明細書に個々にまたは集合的に言及されるまたは示される工程、特徴、組成物および化合物の総てまたは前記工程もしくは特徴のいずれか２つ以上のありとあらゆる組合せを含む。
【０２０２】
以下、実施例を参照して本発明の特定の実施形態を説明するが、これらの実施例は、単に説明のために意図されるものであり、以上に記載されている一般性の範囲を限定するものではない。
【０２０３】
本明細書の他所に示されているように、本明細書に記載されているようなワクチン組成物は、それを必要とする対象に単剤としてまたは１以上の付加的治療薬と組み合わせて、すなわち、補助療法の一部として投与することができる。補助療法に関して、投与は同時または逐次であってよく、すなわち、まず、ワクチン組成物が投与され、その後、１以上の付加的治療薬の投与が続くか、または付加的治療薬の投与の後にワクチン組成物が投与される。よって、２つ以上のものが対象に「一緒に」投与される場合、それらは単一の組成物で同時に投与されてもよいし、または別個の組成物で時間をおいて投与されてもよい。
【０２０４】
本明細書に挙げられている総ての特許、特許出願および刊行物は、全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２０５】
当業者は、本明細書に記載の本発明は具体的に記載されるもの以外の変形および改変が可能であることを認識するであろう。本発明はその趣旨および範囲内にあるこのような変形および改変を総て含むものと理解されるべきである。本発明はまた、本明細書に個々にまたは集合的に言及されるまたは示される工程、特徴、組成物および化合物の総てまたは前記工程もしくは特徴のいずれか２つ以上のありとあらゆる組合せを含む。
【０２０６】
以下、実施例を参照して本発明の特定の実施形態を説明するが、これらの実施例は、単に説明のために意図されるものであり、以上に記載されている一般性の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２０７】
実施例１−マウスＰＤ１（ｍＰＤ１）Ｂ細胞エピトープの同定および特性評価
Ａ．オーバーラッピングペプチドの作製および発現
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍成長に対するＰＤ１に対する免疫誘導の有効性を試験するために、ヒトＰＤ１エピトープに対するサロゲートとしてのマウスＰＤ１エピトープ、またはそのミモトープを同定するための実験を行い、これが以下の実施例３で概略を示すように、同系マウス腫瘍モデルにおいて次の試験の実施を可能とする。
【０２０８】
マウスＰＤ−１（Ｑ０２２４２；Ｕｎｉｐｒｏｔ）細胞外ドメインに相当するタンパク質配列は、ＤＮＡ配列に電気的に逆翻訳した（ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ；オーバーラッピング、ドイツ）。タンパク質コードＤＮＡ配列を、３ａａのオフセットを有する１５アミノ酸（ａａ）長のオーバーラッピングペプチドとして均一なサイズのペプチド−ＣＤＳに分割し、得られたＤＮＡ配列を発現ベクターｐＥＰＸ−１（ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ；オーバーラッピング、ドイツ）に挿入した。これらのＤＮＡ配列は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード遺伝子の下流に挿入し、誘導時に各オーバーラッピングペプチドのＮ末端に融合されたＧＳＴ含有タンパク質（２６ｋＤａ）が得られた。発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１の形質転換に使用した。発現ベクターを有する大腸菌のコロニー（クローン）を、カナマイシンを添加したプレートから採取し、コロニーブロットアッセイによるスクリーニングのために使用した。インサートのない発現ベクターを有するコロニー（すなわち、対照）も採取した。
【０２０９】
Ｂ．特定のオーバーラッピングペプチドを発現するクローンの検出のためのコロニーブロットアッセイ
目的のクローンをニトロセルロース膜に転写し、溶解溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０  ５０ｍＭ、リゾチーム２００μｇ／ｍｌ）で溶解させた後、−８０℃での凍結および３７℃での解凍を３回行った。最後の解凍工程の後、これらの膜を、ＰＢＳ−５％スキムミルクを含有するブロッキング溶液とともにインキュベートした。ブロッキング溶液を廃棄し、膜をラット抗マウスＰＤ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン２９Ｆ．１Ａ１２）とともに室温で２時間インキュベートした。次に、膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０．５％で３回洗浄し、アルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートした二次抗体ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに室温で２時間インキュベートした。上記のようにさらに洗浄した後に、基質溶液「１−ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰ」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてシグナルを生じさせた。以下のＰＤ１  Ｂ細胞エピトープがラット抗マウス  ＰＤ１モノクローナル抗体に反応性があるとして同定された：
ＩＳＬＨＰＫＡＫＩＥＥＳＰＧＡ（マウスＰＤ１（ｍＰＤ１）のアミノ酸残基１２６〜１４０；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｎｏ：Ｑ０２２４２；配列番号１１９）。
【０２１０】
Ｃ．細菌溶解液中でのＢ細胞エピトープの検出のためのドットブロット法
Ｂ細胞エピトープ候補を発現するクローンの細菌培養物を細菌溶解液のサイトゾル画分および総画分の調製に使用した。等しい２部の細菌培養物を遠心分離し、細菌ペレットを上記のように溶解させた。溶解した細菌は、さらに遠心分離して上清をサイトゾル画分として使用するか、または溶解細菌をそのまま総画分として使用した。
【０２１１】
検討した溶解液を、ドットブロット法において使用するためにニトロセルロース膜にスポットした。これらの膜をＰＢＳ−２％スキムミルクでブロッキングした後、それらの膜をコロニーブロットアッセイで陽性クローンの検出のために使用したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と反応させ、あとの検出手順はコロニーブロットアッセイと同様とした。
【０２１２】
Ｄ．下流の特性評価のためのＧＳＴ融合Ｂ細胞エピトープの精製
目的のＧＳＴ融合Ｂ細胞エピトープを含有する０．２２μｍで濾過したサイトゾル画分を、５ｍｌのグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＳＴｒａｐ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、新しく調製した溶出バッファー（１０ｍＭの還元型グルタチオンを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）を用いる精製のために使用した。溶出した材料を上記のようにドットブロット分析によって調べ、材料の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により可視化した。
【０２１３】
Ｅ．ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析
ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳサンプルバッファーおよびＮｕＰＡＧＥ還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と合わせた精製されたＧＳＴ−Ｂ細胞エピトープの一部を、２００ボルトで３５分間、ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに流した。次に、このゲルをＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。結果を図８に示す。
【０２１４】
Ｆ．競合的ＥＬＩＳＡ法
コーティング抗原（その上に種々の濃度のミモトープおよびｍＡｂを含有するプレインキュベート混合物を適用した）として使用した組換えマウスＰＤ１に対する抗マウス−ＰＤ１  ｍＡｂの結合を阻害する、同定されたＢ細胞エピトープの能力を調べるために、競合的ＥＬＩＳＡ法を使用した。コーティングされた組換えｍＰＤ１に結合した抗マウスＰＤ−１  ｍＡｂは、二次抗体マウス抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＨＲＰコンジュゲート）を用い、検出のためにＴＭＢ染色（ＥＬＩＳＡ  ＯＤ値、４５０ｎｍ）を用いて検出した。結果を図９に示す。
【０２１５】
Ｇ．ＰＤ１発現Ｔ細胞株
マウスＰＤ−１を発現するＴ細胞を生産するために、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１  ＮＦ−κＢ：：ｅＧＦＰリポーターＴ細胞株およびＫ５６２刺激細胞株を従前に記載のように培養した(Battin et al. PLoS One, 2017, 12(5):e0178220; PMID: 28542462)。マウスＰＤ−１を発現するＪＥ６．１  ＮＦ−ｋＢ：：ｅＧＦＰリポーター細胞は従前に記載されている(Jutz et al. Oncotarget, 2017, 8(39):64892-64906; PMID: 29029399)。Ｋ５６２細胞株に基づくＴ細胞刺激細胞（Ｋ５６２Ｓ）を、抗ヒトＣＤ３一本鎖フラグメントをコードするＣＤ５Ｌ−ＯＫＴ３ｓｃＦｖ−ＣＤ１４構築物をヒトＣＤ１４に融合したものをレトロウイルスに導入することにより作出した(Leitner et al. J. Immunol. Methods, 2010, 362(1-2):131-141; PMID: 20858499)。Ｋ５６２Ｓは、ヒトＴ細胞およびＴ細胞株をそれらのＴＣＲ−ＣＤ３複合体のライゲーションにより刺激する。リポーター細胞から刺激細胞を分離するために、Ｋ５６２Ｓを、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を構成的に発現するように操作した。個々の分子の均質発現および比較可能な発現を確認するために単細胞クローンを樹立した。個々の分子の細胞表面発現を確認するために、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（サンディエゴ、ＣＡ）からのＰＥコンジュゲート抗ｍＰＤ−１抗体（２９Ｆ．１Ａ１２）を使用した。Ｋ５６２Ｓ細胞上の膜結合した抗ＣＤ３フラグメントをＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ウエストグローブ、ＰＡ）で検出した。フローサイトメトリーデータの取得は、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアとともに（両方ともＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）を用いて行った。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（バージョン１０．０．８．、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、アッシュランド、ＯＲ）およびＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア，Ｉｎｃ．，ラホヤ、ＣＡ）を用いて分析した。
【０２１６】
Ｈ．腫瘍移植Ｂａｌｂ／Ｃマウスの確立
・Ｈｅｒ−２を安定発現するようにトランスフェクトしていない（Ｄ２Ｆ２）またはトランスフェクトした（Ｄ２Ｆ２／Ｅ２）マウス乳癌細胞を、２〜３週間以内に腫瘍を発達させるマウスを含むｉｎ  ｖｉｖｏ状態を確立し、腫瘍進行におけるマウスＰＤ１  Ｂ細胞エピトープの効果を評価するために使用した。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ズルツフェルト、ドイツ；納入時に６〜８週齢）に種々の量の細胞を移植した：
・群Ａ：０．５×Ｅ６／Ｄ２Ｆ２細胞／マウス  ｓ．ｃ．（ｎ＝４）
・群Ｂ：１×Ｅ６／Ｄ２Ｆ２細胞／マウス  ｓ．ｃ．（ｎ＝４）
・群Ｃ：２×Ｅ６／Ｄ２Ｆ２細胞／マウス  ｓ．ｃ．（ｎ＝４）
・群Ｄ：０．５×Ｅ６／Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞／マウス  ｓ．ｃ．（ｎ＝４）
・群Ｅ：１×Ｅ６／Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞／マウス  ｓ．ｃ．（ｎ＝４）
・群Ｆ：２×Ｅ６／Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞／マウス  ｓ．ｃ．（ｎ＝４）
【０２１７】
腫瘍のサイズは試験中およびマウスを屠殺した後に測定し、それらの結果は、試験期間中の、腫瘍サイズの顕著な増大を示す。
【０２１８】
実施例２−ｍＰＤ１に対する抗ｍＰＤ１モノクローナル抗体の結合はマウスＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ、ＪＴ−ｍＰＤ１（配列番号１１９）の存在下で阻害される
抗マウスＰＤ１  ｍＡｂの結合を阻害するＪＴ−ｍＰＤ１の能力を、ｍＰＤ１陽性Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を用いた細胞系アッセイで調べた（実施例１Ｇ参照）。抗マウスＰＤ１  ｍＡｂは単独でおよび種々の濃度のＪＴ−ｍＰＤ１とのプレインキュベーション後に試験した。抗ｍＰＤ１  ｍＡｂの最大結合は、ＪＴ−ｍＰＤ１の不在下に明確であった。この結合活性は、ＪＴ−ｍＰＤ１の存在下で用量依存的に阻害された（図３および５参照）。
【０２１９】
実施例３−Ｂａｌｂ／Ｃマウスの免疫ならびにｍＰＤ１に対する体液性応答および細胞性応答の特性評価
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ズルツフェルト、ドイツ；納入時に６〜８週齢）を、アジュバントとしてのミョウバンを伴うＣＲＭコンジュゲートＢ細胞エピトープ（Ｐｒｏｖｅｐｈａｒｍ）の腹腔内投与を含む試験設定で使用した。コンジュゲートＰＤ１  Ｂ細胞エピトープをＮａＣｌ溶液で希釈し、注射前にミョウバンと混合した。３週間隔で６回の免疫を行い、各免疫前と、マウスを屠殺した場合には最後の免疫の３週間後に血液サンプルを採取した。免疫試験はナイーブマウス群（ｎ＝４）、５０μｇのＣＲＭ（ｎ＝６）、１０μｇのｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ−ＣＲＭコンジュゲート（ｎ＝６）または５０μｇのｍＰＤ１−Ｂ細胞エピトープ−ＣＲＭコンジュゲート（ｎ＝６）で免疫したマウスを含んだ。簡単に述べれば、１日目にマウスにＣＲＭ単独またはｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ−ＣＲＭコンジュゲート（１０μｇまたは５０μｇ）の初回腹腔内用量を施した。次用量のＣＲＭ単独またはｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ−ＣＲＭコンジュゲートを２１日目（２回目の用量）、４２日目（３回目の用量）、６３日目（４回目の用量）、および８４日目（５回目の用量）に投与した。０日目（採血前−ＢＡ０）、４１日目（ＢＡ１）、６２日目（ＢＡ２）、８３日目（ＢＡ３）、および１０４日目（ＢＡ４）にマウスから血液サンプルを採取した。マウスは１０５日目に屠殺した。
【０２２０】
ｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ−ＣＲＭコンジュゲートで免疫したマウスは、０日目の初回免疫の後、４１日（ＢＡ１）、６２日（ＢＡ２）、８３日（ＢＡ３）および１０４日（ＢＡ４）に、抗ｍＰＤ１  ＩｇＧ抗体の力価の増大により示されるように、ｍＰＤ１−ＣＲＭコンジュゲートに対する明らかな抗体応答を示した（図４）。ＣＲＭ単独またはｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ−ＣＲＭコンジュゲートのいずれかで免疫したマウスは、有害な副作用、体重変化またはいずれの炎症徴候も示さなかった。
【０２２１】
実施例４−ＪＴ−ｍＰＤ１に対して生成された特異的ＩｇＧ抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍＰＤ１／ｍＰＤＬ１相互作用を遮断する
このペプチドに対して生成された抗体が天然ｍＰＤ１に結合して、マウスＰＤＬ１とのその相互作用を阻害するかどうかを調べるために、ｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ（配列番号１１９；ＪＴ−ｍＰＤ１）を検討した。
【０２２２】
簡単に述べれば、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（フランス）で、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートされたｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ（ＪＴ−ｍＰＤ１）２００μｇ、次いで、３週間隔でのさらに３回の用量の皮下投与によってウサギを免疫した。これらのウサギを４回目で最終の投与の２週間後に屠殺した。Ｓｑｕａｒｉｘ（ドイツ）で、免疫されたウサギの血清から全ＩｇＧおよびＪＴ−ＰＤ１特異的ＩｇＧを単離した。
【０２２３】
ｍＰＤ１を発現するＴ細胞に結合する、単離された抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧの能力を、組換えｍＰＤ１を発現するヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を用いた細胞アッセイにおいて調べた。細胞を抗マウスＰＤ１  ｍＡｂ単独とともにまたは漸増濃度のＪＴ−ｍＰＤ１ペプチドとのプレインキュベーション後にインキュベートした。図５に示されるように、組換え(recombinangt)ｍＰＤ１陽性（ｍＰＤ１＋）Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対する抗マウスＰＤ１  ｍＡｂの最大結合はＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧの不在下で明らかであったが、ｍＰＤ１＋Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対する抗マウスＰＤ１  ｍＡｂの結合は、ＪＴ−ｍＰＤ１とのプレインキュベーションによって用量依存的に阻害された（図５）。
【０２２４】
ｍＰＤ１  Ｂ細胞エピトープ（ＪＴ−ｍＰＤ１；配列番号１１９）を、このペプチドに対して生成された抗体がｍＰＤ１に結合し、ｍＰＤ１とそのリガンドであるマウスＰＤＬ１との相互作用を阻害し得るかどうかを決定するためにさらに検討した。図６Ａに示されるように、抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧは対照（ｍＰＤ１陰性）Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合しなかったが、抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧは、ｍＰＤ１＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に用量依存的に結合した。これらのデータは、ＪＴ−ｍＰＤ１に対して生成された抗体の特異性およびＴ細胞上の天然ｍＰＤ１への結合におけるそれらの能力を実証する。抗ＪＴｍＰＤ１  ＩｇＧの結合を抗ｍＰＤ１  ｍＡｂの結合と比較したところ、抗ｍＰＤ１  ｍＡｂでより強い結合が明らかであったことに留意されたい（図６Ａ）。
【０２２５】
ｍＰＤ１に対する抗ｍＰＤ１  ｍＡｂの結合を阻害する抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧの能力もまた競合的ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。図６Ｂに示されるように、抗ｍＰＤ１  ｍＡｂ単独は組換えｍＰＤ１に結合したが、抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧとのプレインキュベーションは、組換えｍＰＤ１に対する抗ｍＰＤ１  ｍＡｂの結合を用量依存的に阻害した。対照的に、このアッセイでは、非免疫ウサギ（ＰＢＳ対照）から単離された、生成されたウサギＩｇＧとのプレインキュベーションに、組換えｍＰＤ１に結合する抗ＰＤ１  ｍＡｂに対する阻害活性はなかった。これらの結果は、抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧおよび抗ｍＰＤ１  ｍＡｂがｍＰＤ１上の同じエピトープに結合することを実証する。
【０２２６】
抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧがｍＰＤ１とｍＰＤＬ１の間の相互作用を阻害し得るかどうかを調べるために、さらなる競合的ＥＬＩＳＡ法を行った。図６Ｃに示されるように、非免疫（ＰＢＳ対照）ウサギから５００μｇ／ｍｌの濃度で単離されたウサギＩｇＧはｍＰＤ１に対するマウスＰＤＬ１の結合に対して最小の効果しか持たなかったが、抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧは、ｍＰＤ１に対するマウスＰＤＬ１の結合を有意かつ用量依存的に阻害することが示された。
【０２２７】
実施例５−ＪＴ−ｍＰＤ１に対するＩｇＧ抗体はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍成長の阻害を付与する
本試験は、抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧがｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｍＰＤ１／ｍＰＤＬ１の相互作用を阻害し、腫瘍成長を低減することができるかどうかを調べようとするものである。
【０２２８】
簡単に述べれば、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、上記実施例３に記載されているように、乳癌細胞株Ｄ２Ｆ２／Ｅ２を移植した。次に、マウスにＰＢＳ（ＰＢＳ対照）、非免疫ウサギから単離された全ウサギＩｇＧ（ＩｇＧ対照）または抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ＩｇＧを施した。図７に示されるように、ＰＢＳ処置マウスまたはウサギＩｇＧ処置マウスでは同等の腫瘍重が見られたが、抗ＪＴ−ｍＰＤ１  ｍＡｂまたは抗ｍＰＤ１  ｍＡｂで処置したマウスでは、腫瘍重の有意な低減が見られた。これらの結果は、ＰＤ１  Ｂ細胞エピトープがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗ＰＤ１抗体応答を惹起するためのワクチン組成物において使用可能であることを示し、これらの抗ＰＤ１抗体は定着腫瘍の成長を阻害する。
【０２２９】
実施例６：ＥＬＩＳＡによるペプチド配列ライブラリーの、ＰＤ１のＢ細胞エピトープに関するスクリーニング
表１に挙げられているもの（配列番号２〜５４および６２）のビオチン化ペプチドフラグメントのライブラリーを作製し、次に、抗ＰＤ１抗体が結合するペプチドフラグメントを特定するために、ポリクローナル抗ＰＤ１抗体を用いたストレプトアビジンコーティングプレート上で酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした。
【０２３０】
ビオチン化ペプチドフラグメントは乾燥粉末として供給し、２００μＬの純粋な溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドもしくはジメチルホルムアミド）または溶媒／水混合物で再構成した。各ビオチン化ペプチドフラグメントを、使用直前に、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、１：１０００の検量線濃度に希釈した。
【０２３１】
ストレプトアビジンでコーティングしたＢＳＡブロッキングプレートをビオチン化ペプチドフラグメントと反応させるために、１００μＬの各希釈ビオチン化ペプチドフラグメント溶液をプレートの対応するウェル位置に移し、２０℃で約１時間、シェーカー上でインキュベートした。
【０２３２】
次に、これらのプレートを、０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム中、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）で４回洗浄した。洗浄工程の後、余分な洗浄バッファーをウェルから除去した。次に、これらのプレートを３７℃で乾燥させた。
【０２３３】
抗ＰＤ１ポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．；カタログ番号１０３７７−ＲＰ０３；組換えヒトＰＤ１／ＣＤ２７９に対して生成されたウサギポリクローナル抗体）を、０．１％アジ化ナトリウムを含有する２％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した。およそ１００μＬの希釈抗体を、捕捉されたビオチン化ペプチドフラグメントを含有するプレートの各ウェルに入れ、２０℃で１時間前後（あるいはまた４℃で一晩）、シェーカー上でインキュベートした。次に、これらのプレートをＰＢＳ／０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄し、各ウェルから余分な洗浄バッファーを除去した。
【０２３４】
次に、およそ１００μＬのセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を各ウェルに加え、２０℃で１時間前後インキュベートした。次に、これらのプレートをＰＢＳ／０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄し、各ウェルから余分な洗浄バッファーを除去した。次に、洗浄バッファーから残留する痕跡量のＴｗｅｅｎを除去するために、これらのプレートをＰＢＳ単独で２回洗浄した。
【０２３５】
セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体の存在を検出するために、１００μＬの１−Ｓｔｅｐ（商標）ＡＢＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３７６１５）を各ウェルに加え、２０℃で最大４５分間インキュベートした。各ウェルの色の変化の吸光度を、マイクロタイターＴｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣプレートリーダーを用い、参照波長４９２ｎｍに対して４０５ｎｍの二重波長モードで読み取り、ビオチン化ペプチドフラグメントを添加していないウェル、抗ＰＤ１ポリクローナル抗体を添加していないウェルおよび／またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を添加していないウェルで見られた色の変化などの適当な陰性対照と比較した。
【０２３６】
色の変化の検出（適当な対照と比較）は、ビオチン化ペプチドフラグメントに結合した抗ＰＤ１ポリクローナル抗体の存在の指標となった。ＥＬＩＳＡデータを図８に示す。その後、免疫試験のために１３のペプチド配列を選択した−配列番号９、１０、１３、１４、２８、２９、３６、４２、４３、４９および５８〜６１。
【０２３７】
実施例７−ＰＤ１に対する抗体応答を惹起し得るペプチドフラグメントのライブラリーをスクリーニングするための免疫プロトコール
Ａ．ウサギの免疫
同定され、上記実施例６のスクリーニングアッセイからスクリーニングされた１３のペプチド配列を、次に、担体タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートさせた。表３参照。
【０２３８】
【表３】
2021512966.tif 000009
【０２３９】
およそ２５０〜５００μｇの各ＫＬＨコンジュゲートペプチドフラグメントを生理食塩水で希釈し、次に、１：１の質量比でフロイントの完全または不完全アジュバントに乳化させた。以下の免疫プロトコールに従い、この乳化溶液を肩周囲の皮下注射および脚への筋肉内注射によってウサギに投与した。
ｉ．００日目−血清採取２ｍｌ（免疫前血清０．５〜１．０ｍｌ）；
ｉｉ．０１日目−初回免疫、フロイントの完全アジュバント、５００μｇペプチドフラグメント；
ｉｉｉ．１５日目−２回目の免疫、フロイントの完全アジュバント、５００μｇペプチドフラグメント；
ｉｖ．２９日目−３回目の免疫、フロイントの不完全アジュバント、２５０μｇペプチドフラグメント；
ｖ．３５日目−血清採取、ＥＬＩＳＡによる抗ＰＤ１抗体力価の評価用として２〜３ｍｌ；
ｖｉ．３６日目−４回目の免疫、フロイントの不完全アジュバント、２５０μｇペプチドフラグメント（任意選択）；
ｖｉｉ．４３日目−５回目の免疫、フロイントの不完全アジュバント、２５０μｇペプチドフラグメント（任意選択）；
ｖｉｉｉ．５０日目−６回目の免疫、フロイントの不完全アジュバント、２５０μｇペプチドフラグメント（任意選択）；
ｉｘ．５７日目−７回目の免疫、フロイントの不完全アジュバント、２５０μｇペプチドフラグメント（任意選択）；
ｘ．６３日目−免疫ウサギから血液サンプルを採取する。
【０２４０】
Ｂ．ＥＬＩＳＡによる免疫ウサギの抗ＰＤ１抗体力価の評価
免疫ウサギから採取した血液サンプル中の抗ＰＤ１抗体力価を測定するために酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用した。簡単に述べれば、マイクロタイタープレートを、ＨｉｓタグにコンジュゲートされたＰＤ１（配列番号１）でコーティングした。非特異的結合を最小にするためにマイクロタイタープレートのウェルをＢＳＡでブロッキングした後、免疫ウサギからの希釈血清をこれらのプレートに加え、２０℃で１時間前後（あるいはまた４℃で一晩）、シェーカー上でインキュベートした。次に、これらのプレートをＰＢＳ／０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄し、各ウェルから余分な洗浄バッファーを除去した。
【０２４１】
次に、およそ１００μＬのセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を各ウェルに加え、２０℃で１時間前後インキュベートした。次に、これらのプレートをＰＢＳ／０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄し、各ウェルから余分な洗浄バッファーを除去した。次に、洗浄バッファーから残留する痕跡量のＴｗｅｅｎを除去するために、これらのプレートをＰＢＳ単独で２回洗浄した。
【０２４２】
セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体の存在を検出するために、１００μＬの１−Ｓｔｅｐ（商標）ＡＢＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３７６１５）を各ウェルに加え、２０℃で最大４５分間インキュベートした。各ウェルの色の変化の吸光度を、マイクロタイターＴｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣプレートリーダーを用い、参照波長４９２ｎｍに対して４０５ｎｍの二重波長モードで読み取り、ＰＤ１を添加していないウェル、免疫ウサギ血清を添加していないウェルおよび／またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を添加していないウェルで見られる色の変化などの適当な陰性対照と比較した。
【０２４３】
色の変化の検出（適当な対照と比較）は、免疫ウサギにおいてそのペプチドフラグメントに対する免疫応答が惹起されたことの指標となった。免疫ウサギにおいて抗ＰＤ１抗体応答を惹起したと確認されたペプチド配列を以下の表４に示す。それらは配列番号９（血清番号２８０９００１）、配列番号１０（血清番号２８０９００３）、配列番号１４（血清番号２８０９００７）、配列番号２８（血清番号２８０９００９）、配列番号２９（血清番号２８０９０１１）、配列番号４９（血清番号２８０９０１５）、配列番号５９（血清番号２８０９０１９）、配列番号６１（血清番号２８０９０２３）および配列番号４３（血清番号２８０９０２５）として特定された。
【０２４４】
【表４】
2021512966.tif 000010
【０２４５】
２回の独立したＥＬＩＳＡアッセイから導かれた、ＥＬＩＳＡアッセイからの吸光度（ＯＤ）の読み取りを以下の表５および６に示す。
【０２４６】
【表５】
2021512966.tif 000011
【０２４７】
【表６】
2021512966.tif 000012
【０２４８】
実施例８−配列番号９および４３の融合ペプチドを用いる免疫プロトコール
配列番号９および４３のペプチド配列を組み合わせて２つの異なる融合ペプチド−配列番号５６および配列番号５７を形成し、次に、これらをＫＬＨにコンジュゲートさせた。表７参照（配列番号９に下線）：
【０２４９】
【表７】
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【０２５０】
およそ２５０〜５００μｇの各ＫＬＨコンジュゲート融合ペプチドを生理食塩水に希釈し、次に、質量比１：１でフロイントの完全または不完全アジュバントに乳化させた。上記の実施例２の免疫プロトコールに従い、これらの乳化溶液を肩周囲の皮下注射および脚への筋肉内注射によってウサギに投与した。
【０２５１】
上記の実施例２に示された方法論に従い、免疫ウサギから採取した血液サンプルの抗ＰＤ１抗体力価を測定するために酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いた。ＥＬＩＳＡアッセイからの吸光度の読み取りを以下の表８に示す（配列番号９に下線）：
【０２５２】
【表８】
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【０２５３】
実施例９−免疫ウサギ由来の抗ＰＤ１抗体の、他種のＰＤ１に対する交差反応性
免疫ウサギにおいて生成された抗ヒトＰＤ１抗体が他種のＰＤ１と交差反応するかどうかを評価するために、上記の実施例７および８からの抗ＰＤ１抗血清を、ＥＬＩＳＡアッセイで、マウス、アカゲザル、イヌおよびラットＰＤ１タンパク質に対する結合に関してスクリーニングした。ＥＬＩＳＡアッセイからのＯＤ読み取りを以下の表９に示す。
【０２５４】
【表９−１】
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【０２５５】
【表９−２】
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【０２５６】
実施例１０−免疫ウサギ由来の抗ＰＤ１抗体の、他種のＰＤ１に対する交差反応性の比較
免疫ウサギ（ウサギ１および２）で生成された抗ヒトＰＤ１抗体の、種々の種のＰＤ１タンパク質に対する交差反応性の直接比較を行うために、さらなるＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＯＤ読み取りを以下の表１０に示す。
【０２５７】
【表１０】
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【０２５８】
要約
発明者らは、抗ＰＤ１ポリクローナル抗体を使用して、ヒトＰＤ１の５４の線状ペプチドフラグメント（１２マー、３アミノ酸のオフセット）のライブラリーをスクリーニングし、それらの抗ＰＤ１ポリクローナル抗体が結合する合計１３のペプチド配列を特定した。これら１３のペプチド配列をそれぞれ担体タンパク質（ＫＬＨ）にコンジュゲートさせ、次に、これらのＫＬＨコンジュゲートペプチドをウサギに注射した。免疫ウサギ由来の抗血清を採取し、その抗血清から抗ＰＤ１抗体をアフィニティー精製し、天然ヒトＰＤ１に対する結合に関してスクリーニングした。本発明者らは意外にも、ウサギを免疫するために使用したこれらの１３のペプチドコンジュゲートのうち９つのコンジュゲートだけが十分な抗ＰＤ１抗体力価を生じたことを見出した−配列番号９、１０、１４、２８、２９、４９、５９、６１および４３。免疫ウサギで顕著な抗ＰＤ１抗体力価を生じた９つのペプチド配列のうち、配列番号９が最も高い抗ＰＤ１抗体力価を生じた。配列番号９と配列番号４３を含んでなる融合ペプチド（配列番号５６と配列番号５７）で免疫したウサギでも抗ＰＤ１抗体が生成された。
【０２５９】
配列番号９、１０、１４、２８、２９、４９、５９、６１、４３、５６および５７のペプチド配列で免疫したウサギ由来のアフィニティー精製抗ＰＤ１抗体は、他種、すなわち、マウス、ラット、アカゲザル、カニクイザルおよびイヌ由来のＰＤ１タンパク質と少なくともいくらかの交差反応性を示し、アカゲザルおよびカニクイザル由来のＰＤ１タンパク質との交差反応性が最大であった。
【０２６０】
これらのデータは、ＰＤ１の小さな線状ペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、その対象において抗体が天然ＰＤ１に結合する抗体応答を惹起するためにワクチン組成物で使用可能であり、従って、癌などのＰＤ１の関与を特徴とする病態の治療に使用可能であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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