(57)【要約】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター系成分を含む非ヒト動物細胞および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を作製および使用する方法が提供される。そのような非ヒト動物を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の発現を増加させるための、およびｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の発現を増加させる能力についてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター系を評価するための方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のゲノム的に組み込まれた発現カセットを含む非ヒト動物であって、前記第１の発現カセットは、
（ａ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸；および
（ｂ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたアダプターを含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸
を含む、非ヒト動物。
【請求項２】
１つもしくは複数のガイドＲＮＡまたは前記１つもしくは複数のガイドＲＮＡをコードする発現カセットをさらに含む非ヒト動物であって、各ガイドＲＮＡは、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントを含み、
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列にガイドすることが可能である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントを各々が含む１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする第２のゲノム的に組み込まれた発現カセットをさらに含む非ヒト動物であって、
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列にガイドすることが可能である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記標的配列は、前記標的遺伝子内の調節配列を含む、請求項２または３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーを含む、請求項４に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記標的配列は、前記標的遺伝子の転写開始部位の２００塩基対以内にある、請求項２〜５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記標的配列は、前記転写開始部位の２００塩基対上流および前記転写開始部位の１塩基対下流の領域内にある、請求項６に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々をコードする配列は、異なるＵ６プロモーターに作動可能に連結している、請求項２〜７のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
第１のアダプター結合エレメントは、前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある、請求項９に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含むシングルガイドＲＮＡであり、
前記第１のループは、配列番号１２の残基１３〜１６に対応するテトラループであり、前記第２のループは、配列番号１２の残基５３〜５６に対応するステムループ２である、請求項１０に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記アダプター結合エレメントは、配列番号１６に示されている配列を含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、配列番号４０または６３に示されている配列を含む、請求項１２に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｔｔｒ遺伝子を標的とし、必要に応じて、前記Ｔｔｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３４〜３６のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、前記Ｔｔｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３７〜３９のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とし、必要に応じて、前記Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８９〜９１のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、前記Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９２〜９４のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｌｄｌｒ遺伝子を標的とし、必要に応じて、前記Ｌｄｌｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号７５〜７７のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、前記Ｌｄｌｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号７８〜８０のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、２つまたはそれよりも多くの標的遺伝子を標的とする、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする複数のガイドＲＮＡを含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１９】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする少なくとも３つのガイドＲＮＡを含む、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項２０】
前記少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＴｔｒ遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号３４を含む配列を標的とするか、または配列番号３７に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号３５を含む配列を標的とするか、または配列番号３８に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号３６を含む配列を標的とするか、または配列番号３９に示されている配列を含む、請求項１９に記載の非ヒト動物。
【請求項２１】
前記少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＰｃｓｋ９遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号８９を含む配列を標的とするか、または配列番号９２に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号９０を含む配列を標的とするか、または配列番号９３に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号９１を含む配列を標的とするか、または配列番号９４に示されている配列を含む、請求項１９に記載の非ヒト動物。
【請求項２２】
前記少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＬｄｌｒ遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号７５を含む配列を標的とするか、または配列番号７８に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号７６を含む配列を標的とするか、または配列番号７９に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号７７を含む配列を標的とするか、または配列番号８０に示されている配列を含む、請求項１９に記載の非ヒト動物。
【請求項２３】
前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２４】
前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２３に記載の非ヒト動物。
【請求項２５】
前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質と最適にアラインした場合のＤ１０ＡおよびＮ８６３Ａに対応する変異を含む、請求項２３または２４に記載の非ヒト動物。
【請求項２６】
前記Ｃａｓタンパク質をコードする配列は、前記非ヒト動物での発現のためにコドン最適化されている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２７】
前記キメラＣａｓタンパク質の１つまたは複数の転写活性化因子ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、およびそれらの組合せから選択される、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２８】
前記キメラＣａｓタンパク質の前記１つまたは複数の転写活性化因子ドメインは、ＶＰ６４を含む、請求項２７に記載の非ヒト動物。
【請求項２９】
前記キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、請求項２８に記載の非ヒト動物。
【請求項３０】
前記キメラＣａｓタンパク質は、配列番号１に示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、請求項２９に記載の非ヒト動物。
【請求項３１】
前記キメラＣａｓタンパク質をコードする前記第１の発現カセットのセグメントは、配列番号２５に示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、請求項３０に記載の非ヒト動物。
【請求項３２】
前記第１の発現カセットは、前記キメラＣａｓタンパク質をコードするセグメントの上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターをさらに含み、
前記ポリアデニル化シグナルまたは前記転写ターミネーターは、リコンビナーゼ認識部位により挟まれており、
前記ポリアデニル化シグナルまたは前記転写ターミネーターは、組織特異的様式で切除されている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物
【請求項３３】
前記ポリアデニル化シグナルまたは前記転写ターミネーターは、肝臓では切除されている、請求項３２に記載の非ヒト動物。
【請求項３４】
前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、請求項３２または３３に記載の非ヒト動物。
【請求項３５】
組織特異的プロモーターに作動可能に連結したリコンビナーゼコード配列を含むゲノム的に組み込まれたリコンビナーゼ発現カセットをさらに含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項３６】
前記リコンビナーゼ遺伝子は、表２に示されているプロモーターの１つに作動可能に連結している、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項３７】
前記アダプターは、前記キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあり、前記１つまたは複数の転写活性化ドメインは、前記キメラアダプタータンパク質のＣ末端にある、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項３８】
前記アダプターは、ＭＳ２コートタンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントを含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項３９】
前記キメラアダプタータンパク質の前記１つまたは複数の転写活性化ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、およびそれらの組合せから選択される、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項４０】
前記キメラアダプタータンパク質の前記１つまたは複数の転写活性化ドメインは、ｐ６５およびＨＳＦ１を含む、請求項３９に記載の非ヒト動物。
【請求項４１】
前記キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む、請求項４０に記載の非ヒト動物。
【請求項４２】
前記キメラアダプタータンパク質は、配列番号６に示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、請求項４１に記載の非ヒト動物。
【請求項４３】
前記キメラアダプタータンパク質をコードする前記第１の発現カセットのセグメントは、配列番号２７に示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、請求項４２に記載の非ヒト動物。
【請求項４４】
前記第１の発現カセットは、マルチシストロン性である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項４５】
前記キメラＣａｓタンパク質をコードする前記第１の発現カセットのセグメントは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により、前記キメラアダプタータンパク質をコードする前記第１の発現カセットのセグメントから隔てられている、請求項４４に記載の非ヒト動物。
【請求項４６】
前記キメラＣａｓタンパク質をコードする前記第１の発現カセットのセグメントは、２Ａペプチドをコードする核酸により、前記キメラアダプタータンパク質をコードする前記第１の発現カセットのセグメントから隔てられている、請求項４４に記載の非ヒト動物。
【請求項４７】
前記２ＡペプチドはＴ２Ａペプチドである、請求項４６に記載の非ヒト動物。
【請求項４８】
前記第１の発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項４９】
前記第１の発現カセットおよび／または前記第２の発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれている、請求項２〜４８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項５０】
前記非ヒト動物は、前記第１の発現カセットがヘテロ接合性であり、前記第２の発現カセットがヘテロ接合であり、
前記第１の発現カセットは、前記セーフハーバー遺伝子座の第１の対立遺伝子内にゲノム的に組み込まれており、前記第２の発現カセットは、前記セーフハーバー遺伝子座の第２の対立遺伝子内にゲノム的に組み込まれている、請求項４９に記載の非ヒト動物。
【請求項５１】
前記セーフハーバー遺伝子座は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項５２】
前記第１の発現カセットは、前記セーフハーバー遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結している、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項５３】
哺乳動物である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項５４】
前記哺乳動物はげっ歯動物である、請求項５３に記載の非ヒト動物。
【請求項５５】
前記げっ歯動物は、ラットまたはマウスである、請求項５４に記載の非ヒト動物。
【請求項５６】
前記げっ歯動物は、前記マウスである、請求項５５に記載の非ヒト動物。
【請求項５７】
ゲノム的に組み込まれた発現カセットを含む非ヒト動物細胞であって、前記発現カセットは、
（ａ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸；および
（ｂ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたアダプターを含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸
を含む、非ヒト動物細胞。
【請求項５８】
ゲノム的に組み込まれた発現カセットを含む非ヒト動物ゲノムであって、前記発現カセットは、
（ａ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸；および
（ｂ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたアダプターを含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸
を含む、非ヒト動物ゲノム。
【請求項５９】
標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームおよび前記標的ゲノム遺伝子座の３’標的化配列を標的とする３’相同性アームにより挟まれた挿入核酸を含むターゲティングベクターであって、前記挿入核酸は発現カセットを含み、前記発現カセットは、
（ａ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸；および
（ｂ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたアダプターを含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸
を含む、ターゲティングベクター。
【請求項６０】
請求項１〜５６のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、
（ｉ）標的ゲノム遺伝子座の標的配列を標的とするヌクレアーゼ作用剤と；
（ｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび前記標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームにより挟まれた前記第１の発現カセットを含む核酸インサートを含むターゲティングベクターと
を導入するステップであって、
前記ターゲティングベクターは、前記標的ゲノム遺伝子座を組み換えて、そのゲノムにおいて前記標的ゲノム遺伝子座に前記第１の発現カセットを含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞をもたらす、ステップ；
（ｂ）前記遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；ならびに
（ｃ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母で懐胎させるステップであって、前記代理母は、そのゲノムにおいて前記標的ゲノム遺伝子座に前記第１の発現カセットを含むＦ０子孫の遺伝子改変された非ヒト動物を産む、ステップ
を含む方法。
【請求項６１】
前記ターゲティングベクターは、少なくとも１０ｋｂ長の大型ターゲティングベクターであるか、または前記５’相同性アームおよび前記３’相同性アームの総計が、少なくとも１０ｋｂ長である大型ターゲティングベクターである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１〜５６のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、
（ｉ）標的ゲノム遺伝子座の標的配列を標的とするヌクレアーゼ作用剤と；
（ｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび前記標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームにより挟まれた前記第１の発現カセットを含む核酸インサートを含むターゲティングベクターと
を導入するステップであって、
前記ターゲティングベクターは、前記標的ゲノム遺伝子座を組み換えて、そのゲノムにおいて前記標的ゲノム遺伝子座に前記第１の発現カセットを含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞をもたらす、ステップ；
（ｂ）遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母で懐胎させ、そのゲノムにおいて前記標的ゲノム遺伝子座に前記第１の発現カセットを含む遺伝子改変されたＦ０世代の非ヒト動物を産む、ステップ
を含む方法。
【請求項６３】
前記ヌクレアーゼ作用剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ステップ（ａ）は、前記標的ゲノム遺伝子座内の第２の標的配列を標的とする第２のガイドＲＮＡを導入するステップをさらに含む、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記非ヒト動物は、マウスまたはラットである、請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記非ヒト動物はマウスである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項１〜５６のいずれか一項に記載の非ヒト動物において標的遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏで増加させるための方法であって、前記非ヒト動物に、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントを各々が含む１つまたは複数のガイドＲＮＡを導入するステップを含み、
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、それらを前記標的遺伝子内の標的配列にガイドし、それにより前記標的遺伝子の発現を増加させる、方法。
【請求項６９】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達により導入される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＡＡＶはＡＡＶ８である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、脂質ナノ粒子媒介性送達または流体力学的送達により導入される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記標的遺伝子は、肝臓で発現される遺伝子である、請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記非ヒト動物への前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの投与経路は、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻、または硝子体内注射である、請求項６８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記標的配列は、前記標的遺伝子内の調節配列を含む、請求項６８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的配列は、前記標的遺伝子の転写開始部位の２００塩基対以内にある、請求項６８〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的配列は、前記転写開始部位の２００塩基対上流および前記転写開始部位の１塩基対下流の領域内にある、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で導入される、請求項６８〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＤＮＡの形態で導入される、請求項６８〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、異なるＵ６プロモーターに作動可能に連結している、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含む、請求項６８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
第１のアダプター結合エレメントは、前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含むシングルガイドＲＮＡであり、
前記第１のループは、配列番号１２の残基１３〜１６に対応するテトラループであり、前記第２のループは、配列番号１２の残基５３〜５６に対応するステムループ２である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記アダプター結合エレメントは、配列番号１６に示されている配列を含む、請求項６８〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、配列番号４０または６３に示されている配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、疾患関連遺伝子を標的とする、請求項６８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記疾患関連遺伝子は、Ｔｔｒ遺伝子であり、必要に応じて、前記Ｔｔｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３４〜３６のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、前記Ｔｔｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３７〜３９のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とし、必要に応じて、前記Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８９〜９１のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、前記Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９２〜９４のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項６８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記非ヒト動物に高コレステロール血症を引き起こす、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｌｄｌｒ遺伝子を標的とし、必要に応じて、前記Ｌｄｌｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号７５〜７７のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、前記Ｌｄｌｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号７８〜８０のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項６８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、２つまたはそれよりも多くの標的遺伝子を標的とする、請求項６８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする複数のガイドＲＮＡを含む、請求項６８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする少なくとも３つのガイドＲＮＡを含む、請求項６８〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＴｔｒ遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号３４を含む配列を標的とするか、または配列番号３７に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号３５を含む配列を標的とするか、または配列番号３８に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号３６を含む配列を標的とするか、または配列番号３９に示されている配列を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＰｃｓｋ９遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号８９を含む配列を標的とするか、または配列番号９２に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号９０を含む配列を標的とするか、または配列番号９３に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号９１を含む配列を標的とするか、または配列番号９４に示されている配列を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＬｄｌｒ遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号７５を含む配列を標的とするか、または配列番号７８に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号７６を含む配列を標的とするか、または配列番号７９に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号７７を含む配列を標的とするか、または配列番号８０に示されている配列を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記標的遺伝子の発現増加は、対照非ヒト動物と比べて、少なくとも０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または２０倍高い、請求項６８〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記第１の発現カセットは、前記キメラＣａｓタンパク質をコードするセグメントの上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターをさらに含み、
前記ポリアデニル化シグナルまたは前記転写ターミネーターは、部位特異的リコンビナーゼにより認識されるリコンビナーゼ認識部位により挟まれており、
前記方法は、前記リコンビナーゼを前記非ヒト動物に導入するステップをさらに含む、請求項６８〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記リコンビナーゼは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達により導入される、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＡＡＶはＡＡＶ８である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記リコンビナーゼは、脂質ナノ粒子媒介性送達または流体力学的送達により導入される、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記リコンビナーゼは、組織特異的様式で導入または発現される、請求項９８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記リコンビナーゼは、タンパク質の形態で導入される、請求項９８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記リコンビナーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態で導入される、請求項９８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記リコンビナーゼは、表２に示されているプロモーターの１つに作動可能に連結したＤＮＡの形態で導入される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記非ヒト動物への前記リコンビナーゼの投与経路は、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻、または硝子体内注射である、請求項９８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達により導入され、前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、異なるＵ６プロモーターに作動可能に連結しており、前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする複数のガイドＲＮＡを含む、請求項６８〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで非ヒト動物において高コレステロール血症をモデル化するための方法であって、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の非ヒト動物に、Ｐｃｓｋ９を標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡを導入するステップを含み、前記１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントを含み、
前記１つまたは複数のガイドＲＮＡは、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、それらをＰｃｓｋ９内の標的配列にガイドし、それによりＰｃｓｋ９の発現を増加させ、高コレステロール血症を引き起こす、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１９日に出願された米国出願第６２／６４４，９６１号の利益を主張するものであり、この文献は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ  ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
【０００２】
ファイル５２７５７８ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに書き込まれている配列表は１３７キロバイトであり、２０１９年３月１９日に作成され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子発現は、発生および疾患など、多くの生物学的プロセスで厳密に制御されている。転写因子は、標的遺伝子のエンハンサー領域およびプロモーター領域の特異的ＤＮＡ配列に結合することにより遺伝子発現を調節し、それらのエフェクタードメインにより転写をモジュレートする。同じ原理に基づき、種々の機能的ドメインを、目的の遺伝子に結合し、それによりそれらの発現をモジュレートするように操作されたＤＮＡ結合ドメインと融合させることにより、人工転写因子（ＡＴＦ）が生成されている。しかしながら、通常、こうしたＡＴＦの結合特異性は縮重しており、予測することが困難な場合があり、設計および生成が複雑で多くの時間を必要とするため、それらの応用には制限がある。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術は、有望な新しい治療モダリティであり、標的化ゲノム修飾をなすだけでなく、標的遺伝子の転写を調節するためにも使用することができる。しかしながら、導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ作用剤の効率をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するより良好な手段が必要とされている。この系をｉｎ  ｖｉｖｏで試験する際の１つの制限は、すべての成分を同時に生きた生物に導入する必要があることである。そうした成分を導入する典型的な方法は、適切なＲＮＡおよびタンパク質を生成する細胞に、ＤＮＡ構築物を一過性にトランスフェクトすることである。細胞は、Ｃａｓタンパク質がｓｇＲＮＡ成分との相互作用に利用可能になる前に、まずプラスミドＤＮＡ構築物が転写され、その後翻訳されることに依存しなければならないため、この手法は、有効ではあるが固有の欠点を有する。導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ作用剤の活性をより効果的に評価し、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の組織または細胞タイプを標的とするための様々な送達方法およびパラメーターを評価するためのより良好な方法およびツールが必要とされている。
【０００５】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ作用剤などの生物学的活性剤の対象への送達は、多くの場合、成分を標的細胞または標的組織に到着させることが困難であることにより妨げられる。こうした制限は、例えば、結果の達成に望ましい濃度よりもはるかに高い濃度の作用剤を使用する必要性をもたらす場合があり、それにより毒性作用および副作用のリスクが増加する。送達方法の改善およびそのような送達方法をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するための方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系を含む非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物（例えば、ＳＡＭが整った非ヒト動物）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＳＡＭ作用剤が標的遺伝子の転写を活性化する能力をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するための、または標的遺伝子の転写を活性化するもしくは発現を増加させる効果をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するための方法が提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系を含む非ヒト動物ゲノムまたは細胞も提供される。
【０００７】
一態様では、１つまたは複数のゲノム的に組み込まれた相乗的活性化メディエーター発現カセットを含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物が提供される。そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、例えば、第１のゲノム的に組み込まれた発現カセットを含んでいてもよく、第１の発現カセットは、（ａ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸；および（ｂ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたアダプターを含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸を含む。
【０００８】
そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または１つもしくは複数のガイドＲＮＡをコードする発現カセットをさらに含んでいてもよく、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントを含み、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列にガイドすることが可能である。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする発現カセットは、ＡＡＶ８などのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に存在する。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする発現カセットは、ＡＡＶに存在し、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、異なるＵ６プロモーターに作動可能に連結しており、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一遺伝子を標的とする複数のガイドＲＮＡを含む。
【０００９】
そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントを各々が含む１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする第２のゲノム的に組み込まれた発現カセットをさらに含んでいてもよく、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列にガイドすることが可能である。
【００１０】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、標的配列は、標的遺伝子内の調節配列を含む。必要に応じて、調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーを含む。一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、標的配列は、標的遺伝子の転写開始部位の２００塩基対以内にある。必要に応じて、標的配列は、転写開始部位の２００塩基対上流および転写開始部位の１塩基対下流の領域内にある。
【００１１】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々をコードする配列は、Ｕ６プロモーターなどの異なるプロモーターに作動可能に連結している。一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｔｈｅ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ）の各々は、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含む。必要に応じて、第１のアダプター結合エレメントは、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含むシングルガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１２の残基１３〜１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１２の残基５３〜５６に対応するステムループ２である。一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、アダプター結合エレメントは、配列番号１６に示されている配列を含む。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、配列番号４０または６３に示されている配列を含む。
【００１２】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、疾患関連遺伝子を標的とする。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｔｔｒ遺伝子を標的とし、必要に応じて、Ｔｔｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３４〜３６のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、Ｔｔｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３７〜３９のいずれか１つに示されている配列を含む。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とし、必要に応じて、Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８９〜９１のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９２〜９４のいずれか１つに示されている配列を含む。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｌｄｌｒ遺伝子を標的とし、必要に応じて、Ｌｄｌｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号７５〜７７のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、Ｌｄｌｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号７８〜８０のいずれか１つに示されている配列を含む。
【００１３】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、２つまたはそれよりも多くの標的遺伝子を標的とする。一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする複数のガイドＲＮＡを含む。一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする少なくとも３つのガイドＲＮＡを含む。必要に応じて、少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＴｔｒ遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号３４を含む配列を標的とするか、または配列番号３７に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号３５を含む配列を標的とするか、または配列番号３８に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号３６を含む配列を標的とするか、または配列番号３９に示されている配列を含む。必要に応じて、少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＰｃｓｋ９遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号８９を含む配列を標的とするか、または配列番号９２に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号９０を含む配列を標的とするか、または配列番号９３に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号９１を含む配列を標的とするか、または配列番号９４に示されている配列を含む。必要に応じて、少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＬｄｌｒ遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号７５を含む配列を標的とするか、または配列番号７８に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号７６を含む配列を標的とするか、または配列番号７９に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号７７を含む配列を標的とするか、または配列番号８０に示されている配列を含む。
【００１４】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。必要に応じて、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質である。必要に応じて、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質と最適にアラインした場合のＤ１０ＡおよびＮ８６３Ａに対応する変異を含む。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質をコードする配列は、非ヒト動物での発現のためにコドン最適化されている。
【００１５】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、キメラＣａｓタンパク質の１つまたは複数の転写活性化因子ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、およびそれらの組合せから選択される。必要に応じて、キメラＣａｓタンパク質の１つまたは複数の転写活性化因子ドメインは、ＶＰ６４を含む。
【００１６】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む。一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む。必要に応じて、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号１に示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。必要に応じて、キメラＣａｓタンパク質をコードする第１の発現カセットのセグメントは、配列番号２５に示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。
【００１７】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、第１の発現カセットは、キメラＣａｓタンパク質をコードするセグメントの上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを含み、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、リコンビナーゼ認識部位により挟まれており、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、組織特異的様式で切除されている。必要に応じて、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、肝臓では切除されている。必要に応じて、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼである。必要に応じて、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結したリコンビナーゼコード配列を含むゲノム的に組み込まれたリコンビナーゼ発現カセットをさらに含む。必要に応じて、リコンビナーゼ遺伝子は、表２に示されているプロモーターの１つに作動可能に連結している。
【００１８】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあり、１つまたは複数の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にある。必要に応じて、アダプターは、ＭＳ２コートタンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントを含む。必要に応じて、キメラアダプタータンパク質の１つまたは複数の転写活性化ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、およびそれらの組合せから選択される。必要に応じて、キメラアダプタータンパク質の１つまたは複数の転写活性化因子ドメインは、ｐ６５およびＨＳＦ１を含む。
【００１９】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む。必要に応じて、キメラアダプタータンパク質は、配列番号６に示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。必要に応じて、キメラアダプタータンパク質をコードする第１の発現カセットのセグメントは、配列番号２７に示されている配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。
【００２０】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、第１の発現カセットは、マルチシストロン性である。必要に応じて、キメラＣａｓタンパク質をコードする第１の発現カセットのセグメントは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により、キメラアダプタータンパク質をコードする第１の発現カセットのセグメントから隔てられている。必要に応じて、キメラＣａｓタンパク質をコードする第１の発現カセットのセグメントは、２Ａペプチドをコードする核酸により、キメラアダプタータンパク質をコードする第１の発現カセットのセグメントから隔てられている。必要に応じて、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
【００２１】
一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、第１の発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座（ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ  ｌｏｃｕｓ）に組み込まれている。一部の非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物では、第１の発現カセットおよび／または第２の発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。必要に応じて、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、第１の発現カセットがヘテロ接合性であり、第２の発現カセットがヘテロ接合性であり、第１の発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座の第１の対立遺伝子内にゲノム的に組み込まれており、第２の発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座の第２の対立遺伝子内にゲノム的に組み込まれている。必要に応じて、セーフハーバー遺伝子座は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である。必要に応じて、第１の発現カセットは、セーフハーバー遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結している。
【００２２】
一部のそのような非ヒト動物は、哺乳動物である。必要に応じて、哺乳動物は、げっ歯動物である。必要に応じて、げっ歯動物は、ラットまたはマウスである。必要に応じて、げっ歯動物は、マウスである。
【００２３】
別の態様では、上記で開示された非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物のいずれかを作製するためのターゲティングベクターが提供される。そのようなターゲティングベクターは、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アーム、および標的ゲノム遺伝子座の３’標的化配列を標的とする３’相同性アームにより挟まれた挿入核酸を含んでいてもよく、挿入核酸は発現カセットを含み、発現カセットは、（ａ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）１つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたアダプターを含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸を含む。
【００２４】
別の態様では、上記で開示された非ヒト動物のいずれかを作製する方法が提供される。一部のそのような方法は、（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座の標的配列を標的とするヌクレアーゼ作用剤と、（ｉｉ）標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームにより挟まれた第１の発現カセットを含む核酸インサートを含むターゲティングベクターとを導入するステップであって、ターゲティングベクターは、標的ゲノム遺伝子座を組み換えて、そのゲノムにおいて標的ゲノム遺伝子座に第１の発現カセットを含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞をもたらす、ステップ；（ｂ）遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；ならびに（ｃ）非ヒト動物宿主胚を代理母で懐胎させるステップであって、代理母は、そのゲノムにおいて標的ゲノム遺伝子座に第１の発現カセットを含むＦ０子孫の遺伝子改変された非ヒト動物を産む、ステップを含む。必要に応じて、ターゲティングベクターは、少なくとも１０ｋｂ長であるか、または５’相同性アームおよび３’相同性アームの総計が、少なくとも１０ｋｂ長である大型ターゲティングベクターである。
【００２５】
一部のそのような方法は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座の標的配列を標的とするヌクレアーゼ作用剤と、（ｉｉ）標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームおよび標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームにより挟まれた第１の発現カセットを含む核酸インサートを含むターゲティングベクターとを導入するステップであって、ターゲティングベクターは、標的ゲノム遺伝子座を組み換えて、そのゲノムにおいて標的ゲノム遺伝子座に第１の発現カセットを含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞をもたらす、ステップ；（ｂ）遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母で懐胎させ、そのゲノムにおいて標的ゲノム遺伝子座に第１の発現カセットを含む遺伝子改変されたＦ０世代の非ヒト動物を産むステップを含む。
【００２６】
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ作用剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。必要に応じて、そのような方法は、標的ゲノム遺伝子座内の第２の標的配列を標的とする第２のガイドＲＮＡを導入するステップを含んでいてもよい。
【００２７】
一部のそのような方法では、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。必要に応じて、非ヒト動物はマウスである。
【００２８】
別の態様では、非ヒト動物のいずれかにおいて標的遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏで増加させる方法が提供される。そのような方法は、例えば、非ヒト動物に、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントを各々が含む１つまたは複数のガイドＲＮＡを導入するステップであって、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、それらを標的遺伝子内の標的配列へとガイドし、それにより標的遺伝子の発現を増加させる、ステップを含んでいてもよい。必要に応じて、標的遺伝子は、肝臓で発現される遺伝子である。
【００２９】
一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達により導入される。必要に応じて、ＡＡＶはＡＡＶ８である。一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、脂質ナノ粒子媒介性送達または流体力学的送達により導入される。一部のそのような方法では、非ヒト動物への１つまたは複数のガイドＲＮＡの投与経路は、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻（ｎａｓａｌ  ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）、または硝子体内注射である。
【００３０】
一部のそのような方法では、標的配列は、標的遺伝子内の調節配列を含む。必要に応じて、調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーを含む。一部のそのような方法では、標的配列は、標的遺伝子の転写開始部位の２００塩基対以内にある。必要に応じて、標的配列は、転写開始部位の２００塩基対上流および転写開始部位の１塩基対下流の領域内にある。
【００３１】
一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で導入される。一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＤＮＡの形態で導入される。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、Ｕ６プロモーターなどの異なるプロモーターに作動可能に連結している。
【００３２】
一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含む。必要に応じて、第１のアダプター結合エレメントは、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含むシングルガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１２の残基１３〜１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１２の残基５３〜５６に対応するステムループ２である。
【００３３】
一部のそのような方法では、アダプター結合エレメントは、配列番号１６に示されている配列を含む。必要に応じて、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、配列番号４０または６３に示されている配列を含む。
【００３４】
一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、疾患関連遺伝子を標的とする。必要に応じて、疾患関連遺伝子は、Ｔｔｒ遺伝子であり、必要に応じて、Ｔｔｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３４〜３６のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、Ｔｔｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３７〜３９のいずれか１つに示されている配列を含む。一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とし、必要に応じて、Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８９〜９１のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９２〜９４のいずれか１つに示されている配列を含む。必要に応じて、方法は、非ヒト動物に高コレステロール血症を引き起こす。一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡの少なくとも１つは、Ｌｄｌｒ遺伝子を標的とし、必要に応じて、Ｌｄｌｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号７５〜７７のいずれか１つに示されている配列を含む配列を標的とするか、または必要に応じて、Ｌｄｌｒを標的とするガイドＲＮＡは、配列番号７８〜８０のいずれか１つに示されている配列を含む。
【００３５】
一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、２つまたはそれよりも多くの標的遺伝子を標的とする。一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする複数のガイドＲＮＡを含む。一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一の標的遺伝子を標的とする少なくとも３つのガイドＲＮＡを含む。必要に応じて、少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＴｔｒ遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号３４を含む配列を標的とするか、または配列番号３７に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号３５を含む配列を標的とするか、または配列番号３８に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号３６を含む配列を標的とするか、または配列番号３９に示されている配列を含む。必要に応じて、少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＰｃｓｋ９遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号８９を含む配列を標的とするか、または配列番号９２に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号９０を含む配列を標的とするか、または配列番号９３に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号９１を含む配列を標的とするか、または配列番号９４に示されている配列を含む。必要に応じて、少なくとも３つのガイドＲＮＡは、マウスＬｄｌｒ遺伝子座を標的とし、第１のガイドＲＮＡは、配列番号７５を含む配列を標的とするか、または配列番号７８に示されている配列を含み、第２のガイドＲＮＡは、配列番号７６を含む配列を標的とするか、または配列番号７９に示されている配列を含み、第３のガイドＲＮＡは、配列番号７７を含む配列を標的とするか、または配列番号８０に示されている配列を含む。
【００３６】
一部のそのような方法では、標的遺伝子の発現増加は、対照非ヒト動物と比べて、少なくとも０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または２０倍高い。
【００３７】
一部のそのような方法では、第１の発現カセットは、キメラＣａｓタンパク質をコードするセグメントの上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターをさらに含み、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、部位特異的リコンビナーゼにより認識されるリコンビナーゼ認識部位により挟まれており、方法は、リコンビナーゼを非ヒト動物に導入するステップをさらに含む。必要に応じて、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼである。必要に応じて、リコンビナーゼは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達により導入される。必要に応じて、ＡＡＶはＡＡＶ８である。必要に応じて、リコンビナーゼは、脂質ナノ粒子媒介性送達または流体力学的送達により導入される。必要に応じて、リコンビナーゼは、組織特異的様式で導入または発現される。必要に応じて、リコンビナーゼは、タンパク質の形態で導入される。必要に応じて、リコンビナーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態で導入される。必要に応じて、リコンビナーゼは、表２に示されているプロモーターの１つに作動可能に連結したＤＮＡの形態で導入される。必要に応じて、非ヒト動物へのリコンビナーゼの投与経路は、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻、または硝子体内注射である。
【００３８】
一部のそのような方法では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達により導入され、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、異なるＵ６プロモーターに作動可能に連結しており、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、単一遺伝子を標的とする複数のガイドＲＮＡを含む。
【００３９】
別の態様では、上記に記載の非ヒト動物のいずれかにて高コレステロール血症をモデル化するための方法が提供される。そのような方法は、非ヒト動物に、Ｐｃｓｋ９を標的とする１つまたは複数のガイドＲＮＡを導入するステップであって、１つまたは複数のガイドＲＮＡの各々は、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントを含み、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、それらをＰｃｓｋ９内の標的配列へとガイドし、それによりＰｃｓｋ９の発現を増加させ、高コレステロール血症を引き起こす、ステップを含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａ（正確な縮尺ではない）は、５’から３’に向かって、３’スプライシング配列；第１のｌｏｘＰ部位；ネオマイシン耐性遺伝子；ポリアデニル化シグナル；第２のｌｏｘＰ部位；ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−ＶＰ６４コード配列；Ｔ２Ａペプチドコード配列；ＭＣＰ−ＮＬＳ−ｐ６５−ＨＳＦ１コード配列；およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ（ＬＳＬ）ｄＣａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）対立遺伝子を示す。
【００４１】
図１Ｂ（正確な縮尺ではない）は、ｌｏｘＰが隣接した（ｆｌｏｘｅｄ）ネオマイシン耐性遺伝子およびポリアデニル化シグナルが除去された図１Ａに由来する対立遺伝子を示す。
【００４２】
【図２】図２は、図１Ａに由来するｄＣａｓ９  ＳＡＭ対立遺伝子を、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに標的化するための一般的概略図を示す。
【００４３】
【図３】図３Ａは、Ｆ１Ｈ４野生型（ＷＴ）マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）、Ｃａｓ９  ＷＴ  ｍＥＳＣ、ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ（ＬＳＬ）ｄＣａｓ９  ＳＡＭ  ｍＥＳＣ（図１Ａに示されたようなｌｏｘＰが隣接したポリアデニル化シグナルの下流にｄＣａｓ９  ＳＡＭ対立遺伝子を含むｍＥＳＣ）、およびｄＣａｓ９  ＳＡＭ  ｍＥＳＣ（ｌｏｘＰが隣接したポリアデニル化シグナルが図１Ｂに示されたようにＣｒｅリコンビナーゼによって切り出されたｄＣａｓ９  ＳＡＭ対立遺伝子を含むｍＥＳＣ）中でのＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【００４４】
図３Ｂは、Ｆ１Ｈ４野生型（ＷＴ）マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）、Ｃａｓ９  ＷＴ  ｍＥＳＣ、ＬＳＬ  ｄＣａｓ９  ＳＡＭ  ｍＥＳＣ（図１Ａを参照されたい）、およびｄＣａｓ９  ＳＡＭ  ｍＥＳＣ（図１Ｂを参照されたい）中でのｐ６５  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【００４５】
【図４】図４は、Ｆ１Ｈ４野生型（ＷＴ）マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）、Ｃａｓ９  ＷＴ  ｍＥＳＣ、ＬＳＬ  ｄＣａｓ９  ＳＡＭ  ｍＥＳＣ（図１Ａを参照されたい）、およびｄＣａｓ９  ＳＡＭ  ｍＥＳＣ（図１Ｂを参照されたい）中でのＣａｓ９タンパク質発現レベルを示す。
【００４６】
【図５】図５（正確な縮尺ではない）は、ガイドＲＮＡアレイ対立遺伝子を、ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス胚性幹細胞に導入するための概略図を示す。ガイドＲＮＡアレイ対立遺伝子は、５’から３’に向かって、３’スプライシング配列；第１のｒｏｘ部位；ピューロマイシン耐性遺伝子；ポリアデニル化シグナル；第２のｒｏｘ部位；第１のＵ６プロモーター；第１のガイドＲＮＡコード配列；第２のＵ６プロモーター；第２のガイドＲＮＡコード配列；第３のＵ６プロモーター；および第３のガイドＲＮＡコード配列を含む。
【００４７】
【図６】図６（正確な縮尺ではない）は、Ｔｔｒの転写開始部位の上流を標的とする３つのガイドＲＮＡを設計するための概略図を示す。
【００４８】
【図７】図７は、転写活性化ドメインに融合されたキメラＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）の動員を容易にするために、テトラループおよびステムループ２がＭＳ２−結合アプタマーで置き換えられた一般の単一ガイドＲＮＡ（配列番号６３）の概略図を示す。
【００４９】
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ＴｔｒガイドＲＮＡアレイで標的化されたヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）クローン中での、それぞれ、Ｔｔｒ、Ｄｓｇ２、およびＢ４ｇａｌｔ６  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。発現レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって決定した。ｙ軸は、サイクル閾値（ｃｔ）を示す。Ｆ１Ｈ４野生型ｍＥＳＣ、ＬＳＬ  ｄＣａｓ９  ＳＡＭ（図１Ａを参照されたい）、およびｄＣａｓ９  ＳＡＭ（図１Ｂを参照されたい）ｍＥＳＣクローンを、対照として使用した。
【００５０】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｌは、野生型マウス、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性でもあるヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから単離された様々な組織中でのＴＴＲタンパク質発現を示す。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｌは、野生型マウス、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性でもあるヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから単離された様々な組織中でのＴＴＲタンパク質発現を示す。
【図９−３】図９Ａ〜９Ｌは、野生型マウス、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性でもあるヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから単離された様々な組織中でのＴＴＲタンパク質発現を示す。
【００５１】
【図１０−１】図１０Ａおよび１０Ｂは、野生型マウス、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性でもあるヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから単離された、それぞれ、肺および脾臓中でのＴｔｒ  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。発現レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって決定した。ｙ軸は、サイクル閾値（ｃｔ）を示す。
【００５２】
【図１０−２】図１０Ｃおよび１０Ｄは、野生型マウス、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性でもあるヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから単離された、それぞれ、肺および脾臓中でのＤｓｇ２  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。発現レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって決定した。ｙ軸は、サイクル閾値（ｃｔ）を示す。
【００５３】
【図１０−３】図１０Ｅおよび１０Ｆは、野生型マウス、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性でもあるヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから単離された、それぞれ、肺および脾臓中でのＢｇａｌｔ６  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。発現レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって決定した。ｙ軸は、サイクル閾値（ｃｔ）を示す。
【００５４】
【図１１】図１１は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされた、野生型マウス、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性でもあるヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス中でのＴＴＲの血清レベルを示す。
【００５５】
【図１２】図１２は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされた、未処置のヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、ＡＡＶ８−ＧＦＰで処置したヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス中でのＴＴＲの血清レベルを示す。注射後５日、１９日、および６０日からの結果を示す。
【００５６】
【図１３】図１３は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされた、野生型マウス、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性でもあるヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス中でのＴＴＲの循環血清レベルを示す。注射後３〜１３ヶ月からの結果を示す。
【００５７】
【図１４】図１４は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされた、未処置のヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、ＡＡＶ８−ＧＦＰで処置したヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス中でのＴＴＲの循環血清レベルを示す。注射後５日、１９日、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、および８ヶ月からの結果を示す。
【００５８】
【図１５】図１５は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされた、未処置のホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、ＡＡＶ８−ＧＦＰで処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイまたは個々のガイドＲＮＡ  １、２もしくは３を含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス中でのＴＴＲの循環血清レベルを示す。注射後１週、２週、および３週からの結果を示す。
【００５９】
【図１６−１】図１６Ａおよび１６Ｂは、未処置のホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス（Ｐｒｅ  ＰＣＳＫ９、Ｐｒｅ  ＬＤＬＲ、Ｐｒｅ−ＷＴ、２ｗｋ  ＷＴ、もしくは５ｗｋ  ＷＴ）、Ｐｃｓｋ９ガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、またはＬｄｌｒガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス中での、それぞれ、コレステロールおよびＬＤＬレベルを示す。
【図１６−２】図１６Ａおよび１６Ｂは、未処置のホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス（Ｐｒｅ  ＰＣＳＫ９、Ｐｒｅ  ＬＤＬＲ、Ｐｒｅ−ＷＴ、２ｗｋ  ＷＴ、もしくは５ｗｋ  ＷＴ）、Ｐｃｓｋ９ガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、またはＬｄｌｒガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス中での、それぞれ、コレステロールおよびＬＤＬレベルを示す。
【００６０】
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、未処置のホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、Ｐｃｓｋ９ガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＬｄｌｒガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから単離された肝臓中での相対的なＬｄｌｒおよびＰｃｓｋ９  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【００６１】
【図１８−１】図１８Ａおよび１８Ｂは、未処置のホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス（ＵＮＴ）またはＬｄｌｒガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス（ＬＤＬＲ（ＨＦＤ））中での、それぞれ、コレステロールおよびＬＤＬレベルを示す。
【図１８−２】図１８Ａおよび１８Ｂは、未処置のホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス（ＵＮＴ）またはＬｄｌｒガイドＲＮＡアレイを含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス（ＬＤＬＲ（ＨＦＤ））中での、それぞれ、コレステロールおよびＬＤＬレベルを示す。
【００６２】
【図１９】図１９は、未処置のマウス、標的遺伝子１ガイドＲＮＡ＃１を含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、標的遺伝子１ガイドＲＮＡ＃２を含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、または標的遺伝子１ガイドＲＮＡ＃１＆２を含むＡＡＶ８で処置したホモ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから単離された肝臓中での標的遺伝子１の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを示す。発現レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって決定した。ｙ軸は、未処置の試料と比較した発現を示す。＊は、未処置と比較したｐ＜０．０００１を示す。＊＊は、ガイドＲＮＡ＃１またはガイドＲＮＡ＃２と比較したｐ＜０．００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
定義
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書では交換可能に使用され、コード化および非コード化アミノ酸、ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。こうした用語は、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されているポリマーも含む。用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
【００６４】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われる。用語「Ｎ末端」は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸により終結したタンパク質またはポリペプチドの開始部分に関する。用語「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）により終結したアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端に関する。
【００６５】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書では交換可能に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらのアナログもしくは修飾型を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。こうした用語は、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然の、化学的に修飾されている、生化学的に修飾されている、非天然の、もしくは誘導体化されているヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
【００６６】
核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われる。それは、モノヌクレオチドは、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、一方の方向のその近隣の３’酸素にホスホジエステル連結を介して結合するように反応して、オリゴヌクレオチドを作製するためである。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にある場合でも、５’末端および３’末端を有すると言われる場合もある。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のいずれにおいても、個別のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’にあると言及される。
【００６７】
用語「ゲノム的に組み込まれた」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように細胞に導入されている核酸を指す。核酸を細胞のゲノムに安定的に組み込むための任意のプロトコールを使用することができる。
【００６８】
用語「発現ベクター」または「発現構築物」または「発現カセット」は、特定の宿主細胞または生物において作動可能に連結したコード配列を発現するために必要な適切な核酸配列に作動可能に連結した所望のコード配列を含有する組換え核酸を指す。原核生物での発現に必要な核酸配列としては、通常、プロモーター、オペレーター（必要に応じた）、およびリボソーム結合部位、ならびに他の配列が挙げられる。真核細胞は、一般に、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが公知であるが、必要な発現を犠牲にせずに、一部のエレメントを欠失させることができ、他のエレメントを追加することができる。
【００６９】
用語「ターゲティングベクター」は、相同組換え、非相同末端結合媒介性ライゲーション、または細胞のゲノムの標的位置への任意の他の組換え手段により導入することができる組換え核酸を指す。
【００７０】
用語「ウイルスベクター」は、少なくとも１つのウイルス由来エレメントを含み、ウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分なまたはそれを可能にするエレメントを含む組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞へと移行させる目的に利用することができる。多数の形態のウイルスベクターが公知である。
【００７１】
タンパク質、核酸、および細胞に関する用語「単離された」は、通常ｉｎ  ｓｉｔｕに存在し得る他の細胞成分または生物成分に関して、相対的に精製されているタンパク質、核酸、および細胞を含み、タンパク質、核酸、または細胞の実質的に純粋な調製物に至るおよびそれを含む。また、用語「単離された」は、天然に存在する対応物を有さないタンパク質および核酸、または、化学的に合成されており、したがって他のタンパク質または核酸が実質的に混入していないタンパク質または核酸を含む。また、用語「単離された」は、それらが天然に付随している他のほとんどの細胞成分または生物成分（例えば、他の細胞タンパク質、核酸、もしくは細胞、または細胞外成分）から分離または精製されているタンパク質、核酸、または細胞を含む。
【００７２】
用語「野生型」は、正常な（変異体、罹患、または変更などと対照的な）状態または状況に見出されるような構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、複数の異なる形態（例えば対立遺伝子）で存在することが多い。
【００７３】
用語「内因性配列」は、細胞または非ヒト動物内にて天然に存在する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内因性Ｒｏｓａ２６配列は、非ヒト動物のＲｏｓａ２６遺伝子座に天然に存在する天然Ｒｏｓａ２６配列を指す。
【００７４】
「外因性」分子または配列は、細胞にその形態では通常は存在しない分子または配列を含む。通常の存在は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在を含む。外因性分子または配列は、例えば、内因性配列のヒト化型など、細胞内の対応する内因性配列の変異型を含むことができ、または細胞内にあるが異なる形態の（つまり染色体内にはない）内因性配列に対応する配列を含むことができる。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞において通常はその形態で存在する分子または配列を含む。
【００７５】
用語「異種の」は、核酸またはタンパク質の状況で使用される場合、核酸またはタンパク質が、天然に同じ分子に共に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、用語「異種の」は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントを参照して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界において互いに同じ関係性（例えば、共に結合している）では見出されない２つまたはそれよりも多くの部分配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種の」領域は、自然界では他の分子に伴って見出されない別の核酸分子内にあるかまたはそれが結合している核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種の領域は、自然界においてコード配列に伴って見出されない配列により挟まれたコード配列を含んでいてもよい。同様に、タンパク質の「異種の」領域は、自然界において他のペプチド分子に伴って見出されない別のペプチド分子内にあるかまたはそれが結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸またはタンパク質は、異種の標識または異種の分泌もしくは局在化配列を含んでいてもよい。
【００７６】
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対コドン組合せの多重度により表されるようなコドンの縮重を活用し、一般に、天然配列の少なくとも１つのコドンを、天然アミノ酸配列を維持しつつ、その宿主細胞の遺伝子にてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンに置き換えることにより、特定の宿主細胞での発現を増強するために核酸配列を修飾するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含む、所与の原核細胞または真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンで置換するように修飾することができる。コドン使用頻度表は、例えば「コドン使用頻度データベース」にて容易に入手可能である。そうした表は、様々な方法で改作することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２を参照されたい。この文献は、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。また、特定の宿主で発現させるために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムが利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照）。
【００７７】
用語「遺伝子座」は、遺伝子（または有意な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列の特定の場所、または生物のゲノム染色体の位置を指す。例えば、「Ｔｔｒ遺伝子座」は、Ｔｔｒ遺伝子、Ｔｔｒ  ＤＮＡ配列、ＴＴＲコード配列の特定の場所、またはそのような配列がどこに存在するかが識別されている生物のゲノム染色体のＴｔｒ位置を指すことができる。「Ｔｔｒ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組合せを含む、Ｔｔｒ遺伝子の調節エレメントを含んでいてもよい。
【００７８】
用語「遺伝子」は、産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードし、遺伝子が全長ｍＲＮＡに対応するように、非コードイントロンで中断されたコード領域ならびに５’および３’末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列（５’および３’非翻訳配列を含む）を含む染色体中のＤＮＡ配列を指す。また、用語「遺伝子」は、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位、サイレンサー、インシュレーター配列（ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびマトリックス結合領域を含む他の非コード配列を含む。こうした配列は、遺伝子のコード領域付近に（例えば、１０ｋｂ以内に）または遠隔部位にあってもよく、遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。
【００７９】
用語「対立遺伝子」は、遺伝子のバリアント形態を指す。一部の遺伝子は、染色体の同じ位置に、つまり遺伝子座に位置する、様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一対立遺伝子がある場合はホモ接合性であると記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性であると記載される。
【００８０】
「プロモーター」は、通常、特定のポリヌクレオチド配列の適切な転写開始部位にてＲＮＡ合成を開始させるようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることが可能なＴＡＴＡボックスを含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域を追加で含んでいてもよい。本明細書で開示されたプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書で開示された細胞タイプ（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯動物細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはそれらの組合せ）の１つまたは複数において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってもよい。プロモーターの例は、例えばＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができ、この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
構成的プロモーターは、すべての組織で、またはすべての発生段階の特定の組織で活性であるプロモーターである。構成的プロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ）、マウスサイトメガロウイルス前初期（ｍＣＭＶ）、ヒト伸長因子１アルファ（ｈＥＦ１α）、マウス伸長因子１アルファ（ｍＥＦ１α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ニワトリベータアクチンハイブリッド（ＣＡＧまたはＣＢｈ）、ＳＶ４０初期、およびベータ２チューブリンプロモーターが挙げられる。
【００８２】
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的に調節されるプロモーターおよび物理的に調節されるプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、以下のものが挙げられる：アルコールで調節されるプロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリンで調節されるプロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター、またはｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーター）、ステロイドで調節されるプロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、またはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属で調節されるプロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度で調節されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および光で調節されるプロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
【００８３】
組織特異的プロモーターは、例えば、ニューロン特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋肉細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であってもよい。
【００８４】
発生的に調節されたプロモーターとしては、例えば、胚発生段階中のみで、または成体細胞のみで活性なプロモーターが挙げられる。
【００８５】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結した」は、２つまたはそれよりも多くの成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）を、両成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが他の成分の少なくとも１つに及ぼす機能を媒介することができる可能性を可能にするように並置することを含む。例えば、プロモーターが、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結していると言える。作動可能な連結は、そのような配列が互いに接していることまたはトランスで作用すること（例えば、調節配列は、離れて作用して、コード配列の転写を制御することができる）を含むことができる。
【００８６】
核酸の「相補性」は、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基群が配向されることにより、反対側の核酸鎖の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は、典型的にはＡとＴおよびＣとＧである。ＲＮＡでは、相補的塩基は、典型的にはＣとＧおよびＵとＡである。相補性は、完全であってもよく、または本質的／十分であってもよい。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が、二重鎖のすべての塩基がワトソン−クリック型対合により相補的塩基に結合されている二重鎖を形成することができることを意味する。「本質的な」または「十分な」相補性は、一方の鎖の配列が、反対側の鎖の配列と完璧には／完全には相補的でないが、１セットのハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度および温度）にて安定なハイブリッド複合体を形成するのに十分な結合が２つの鎖の塩基間に生じることを意味する。そのような条件は、配列およびハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するための標準数学計算を使用することにより、または日常的な方法の使用による経験的なＴｍ決定により予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖間で形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（つまり、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる）温度を含む。Ｔｍよりも低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍよりも高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の鎖の融解または分離が有利である。１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中の既知Ｇ＋Ｃ含有量を有する核酸のＴｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することにより推定することができるが、他の公知のＴｍ計算法では核酸構造特徴が考慮される。
【００８７】
「ハイブリダイゼーション条件」は、一方の核酸鎖が、相補鎖相互作用および水素結合により第２の核酸鎖と結合して、ハイブリダイゼーション複合体を生成する累積的環境を含む。そのような条件としては、核酸を含有する水溶液または有機溶液の化学成分およびそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、ならびに混合物の温度が挙げられる。インキュベーション時間の長さまたは反応チャンバーの寸法などの他の要因が、環境に寄与する場合がある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，  ｐｐ．  １．９０−１．９１，  ９．４７−９．５１，  １  １．４７−１１．５７  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）を参照されたい。この文献は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【００８８】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、塩基間にはミスマッチがあってもよい。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、核酸の長さおよび相補性の度合い、周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の度合いが大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値は大きい。短い長さの相補性（ｓｈｏｒｔ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）（例えば、３５もしくはそれよりも少数の、３０もしくはそれよりも少数の、２５もしくはそれよりも少数の、２２もしくはそれよりも少数の、２０もしくはそれよりも少数の、または１８もしくはそれよりも少数のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置が重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上掲、１１．７−１１．８を参照）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さとしては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。さらに、相補性領域の長さおよび相補性の度合いなどの要因に従って、必要な場合は、温度および洗浄溶液塩濃度を調整することができる。
【００８９】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、介在するまたは隣接するセグメントが、ハイブリダイゼーション事象に関与しないように（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）、１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％配列相補性を含んでいてもよい。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域と相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズすることになるｇＲＮＡは、９０％相補性を表すことになる。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されていてもよく、または相補的ヌクレオチドと共に散在していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドと近接している必要はない。
【００９０】
核酸内の特定の一続きの核酸配列間の相補性パーセントは、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ  （１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：６４９−６５６）を使用して、またはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  １９８１，  ２，  ４８２−４８９）のアルゴリズムが使用されているＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を初期設定を使用して使用することにより、日常的に決定することができる。
【００９１】
本明細書で提供される方法および組成物には、様々な異なる成分が使われている。本明細書の全体にわたって一部の成分は、活性バリアントおよび断片を有することができる。そのような成分としては、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが挙げられる。そうした成分の各々の生物活性は、本明細書の他所に記載されている。用語「機能的」は、タンパク質または核酸（またはそれらの断片もしくはバリアント）が生物活性または機能を発揮する先天的能力を指す。そのような生物活性または機能としては、例えば、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡにおよび標的ＤＮＡ配列に結合する能力を挙げることができる。機能的断片またはバリアントの生物学的機能は、元の機能と比較して、同じであってもよく、または実際に変化してもよいが（例えば、それらの特異性または選択性または有効性に関して）、基本的な生物学的機能は維持される。
【００９２】
用語「バリアント」は、集団において最も優勢な配列と異なる（例えば、１つのヌクレオチドが）ヌクレオチド配列、または集団において最も優勢な配列と異なる（例えば、１つのアミノ酸が）タンパク質配列を指す。
【００９３】
用語「断片」は、タンパク質を参照する場合、全長タンパク質よりも短いか、またはより少数のアミノ酸を有するタンパク質を意味する。用語「断片」は、核酸を参照する場合、全長核酸よりも短いか、またはより少数のヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（つまり、タンパク質のＣ末端の部分の除去）、Ｃ末端断片（つまり、タンパク質のＮ末端の部分の除去）、または内部断片であってもよい。
【００９４】
「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の状況では、指定された比較ウインドウにわたって最大一致するようにアラインした場合に同じである、２つの配列の残基を参照する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有し、したがって分子の機能的特性を変化させない他のアミノ酸残基に置換されている保存的アミノ酸置換により異なることが多い。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために上方に調整してもよい。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は周知である。典型的には、これは、保存的置換を、完全なミスマッチではなく部分的なものとしてスコア化し、それにより配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸には１のスコアが与えられ、非保存的置換には、０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０〜１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に実装されているように算出される。
【００９５】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全に一致した残基の数が最も大きい）を比較することにより決定される値を含み、比較ウインドウにあるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列を最適にアラインするために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（つまりギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、両配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を、比較ウインドウにある位置の総数で除算し、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。別様の指定がない限り（例えば、より短い配列が連結された異種の配列を含む）、比較ウインドウは、比較されている２つの配列のより短い方の全長である。
【００９６】
別様の記述がない限り、配列同一性／類似性の値としては、以下のパラメーターを使用したＧＡＰバージョン１０を使用して得られる値が挙げられる：５０のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔおよび３のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔおよびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用したヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔおよび２のＬｅｎｇｔｈ  ＷｅｉｇｈｔおよびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用したアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはそれらの任意の等価なプログラム。「等価なプログラム」は、調査する任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０により生成される対応するアラインメントと比較して同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基一致および同一の配列同一性パーセントを有するアラインメント生成する任意の配列比較プログラムを含む。
【００９７】
用語「保存的アミノ酸置換」は、サイズ、電荷、または極性が同様である異なるアミノ酸による、配列に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基に代えての置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、またはグリシンとセリンとの間など、１つの極性（親水性）残基の、別の極性（親水性）残基に代えての置換が挙げられる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基の、別の塩基性残基に代えての置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の、別の酸性残基に代えての置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリシンなどの極性（親水性）残基に代えての置換、および／または極性残基の、非極性残基に代えての置換が挙げられる。典型的なアミノ酸分類は、下記の表１に要約されている。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
「相同性」配列（例えば、核酸配列）は、既知参照配列と同一であるかまたは実質的に類似するかのいずれかであり、例えば、既知参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。相同性配列としては、例えば、オルソロガス配列およびパラロガス配列を挙げることができる。相同性遺伝子は、例えば、典型的には、種分化事象（オルソロガス遺伝子）または遺伝子複製事象（パラロガス遺伝子）のいずれかにより共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソロガス」遺伝子としては、種分化により共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子が挙げられる。オルソログは、典型的には、進化の過程で同じ機能を維持する。「パラロガス」遺伝子としては、ゲノム内での複製により関連する遺伝子が挙げられる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させる場合がある。
【０１００】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、人工的環境および人工的環境（例えば、試験チューブ）内で生じるプロセスまたは反応を含む。用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、自然環境（例えば、細胞または生物または身体）および自然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、個体の身体から取り出された細胞、およびそのような細胞内で生じるプロセスまたは反応を含む。
【０１０１】
用語「レポーター遺伝子」は、内因性または異種のプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結したレポーター遺伝子配列を含む構築物を、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含有する（または含有するように作製することができる）細胞に導入すると容易におよび定量的にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例としては、これらに限定されないが、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。
【０１０２】
用語「蛍光レポータータンパク質」は、本明細書で使用される場合、蛍光に基づき検出可能であるレポータータンパク質を意味し、蛍光は、レポータータンパク質に直接由来するか、蛍光発生基質に対するレポータータンパク質の活性に由来するか、または蛍光タグ付き化合物に対する結合親和性を有するタンパク質に由来するかのいずれであってもよい。蛍光タンパク質の例としては、以下のものが挙げられる：緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、および細胞におけるその存在をフローサイトメトリー方法により検出することができる任意の他の好適な蛍光タンパク質。
【０１０３】
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する修復は、主に２つの保存されているＤＮＡ修複経路：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じる。Ｋａｓｐａｒｅｋ  ＆  Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  （２０１１）  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２２：８８６−８９７を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、外因性ドナー核酸により媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報交換の任意のプロセスを含んでいてもよい。
【０１０４】
用語「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報交換の任意のプロセスを含み、任意の機序により生じ得る。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）により生じ得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列相同性を必要とする場合がある核酸修復の形態を含み、「ドナー」分子を、「標的」分子（つまり、二本鎖切断を起こしたもの）を修復するための鋳型として使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の移行をもたらす。いかなる特定の理論に束縛されることは望まないが、そのような移行は、切断された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／またはドナーを使用して標的の一部分となる遺伝子情報を再合成する合成依存性鎖アニーリング、および／または関連プロセスを含んでいてもよい。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの部分が、標的ＤＮＡに組み込まれる。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１−９；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１：５３０−５３２を参照されたい。これら文献の各々は、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
ＮＨＥＪは、切断末端を互いにまたは外因性配列に直接ライゲーションすることにより、相同性鋳型を必要とせずに核酸の二本鎖切断を修復することを含む。ＮＨＥＪによる非連続配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位付近の欠失、挿入、または転座をもたらす場合がある。例えば、ＮＨＥＪは、切断端部を外因性ドナー核酸の末端に直接ライゲーションすることによる外因性ドナー核酸の標的化組込み（つまりＮＨＥＪに基づく捕捉）をもたらすこともできる。そのようなＮＨＥＪ媒介性標的化組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修複の実施が不良である細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に好ましい場合がある。加えて、相同組換え修復とは対照的に、切断部位をフランキングする大きな領域の配列同一性に関する知識は必要とされないため、ゲノム配列に関する知識が限定的であるゲノムを有する生物への標的化挿入を試みる場合に有益であり得る。組込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端ライゲーションにより、または切断されたゲノム配列におけるヌクレアーゼ作用剤により生成されるものと適合性である突出により挟まれている外因性ドナー核酸が使用される粘着末端（つまり、５’突出または３’突出を有する）のライゲーションにより進行させることができる。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２３（３）：５３９−５４６を参照されたい。これら文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。平滑末端がライゲーションされる場合、断片接合に必要なマイクロホモロジーの領域を生成するために、標的および／またはドナー切除が必要とされる場合があり、それにより、標的配列の望ましくない変更が作り出される場合がある。
【０１０６】
１つまたは複数の列挙されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含んでいてもよい。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物は、タンパク質を単独でまたは他の成分との組合せで含有していてもよい。移行句「から本質的になる」は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に列挙されている指定の要素ならびに請求されている本発明の基本的および新規の特徴に実質的に影響しない要素を包含すると解釈されるべきであることを意味する。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明の特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であると解釈されることは意図されていない。
【０１０７】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が生じてもよく、または生じなくともよく、この記載は、事象または状況が生じる場合およびそれが生じない場合を含むことを意味する。
【０１０８】
値の範囲の指定は、その範囲内のまたはその範囲を規定するすべての整数、およびその範囲内の整数により規定されるすべての部分範囲を含む。
【０１０９】
状況からそうではないことが明白でない限り、用語「約」は、表記されている値の標準測定誤差範囲（例えばＳＥＭ）内の値を包含する。
【０１１０】
用語「および／または」は、関連する列挙項目の１つまたは複数のありとあらゆる組合せ、ならびに選択肢（「または」）として解釈される場合は組合せの欠如を参照および包含する。
【０１１１】
用語「または」は、特定のリストの任意の１つのメンバーを参照し、そのリストのメンバーの任意の組合せも含む。
【０１１２】
単数形態の冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、状況がそうではないと明白に示さない限り、複数の参照事項を含む。例えば、用語「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「少なくとも１つのタンパク質」は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含んでいてもよい。
【０１１３】
統計的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。
詳細な説明
Ｉ．概要
【０１１４】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系は、ゲノムを遺伝子操作するための、および標的遺伝子の発現を調節するための強力なツールである。この系のｉｎ  ｖｉｖｏでの１つの制限は、すべての成分を生きた生物に同時に導入する必要があることである。典型的には、そうした成分は、適切なＲＮＡおよびタンパク質を生成する細胞にＤＮＡ構築物を一過性にトランスフェクトすることにより導入される。細胞は、Ｃａｓタンパク質がｓｇＲＮＡ成分との相互作用に利用可能になる前に、まずプラスミドＤＮＡ構築物が転写されその後翻訳されることに依存しなければならないため、この手法は、有効ではあるが固有の欠点を有する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ作用剤の活性をより効果的に評価し、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の組織または細胞タイプを標的とするための様々な送達方法およびパラメーターを評価するためのより良好な方法およびツールが必要とされている。
【０１１５】
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系では、幾つかの活性化ドメインが相互作用して、いずれか１つの因子単独により誘導され得るよりも大きな転写活性化を引き起こす。ＳＡＭ系を使用するためには、典型的には３つのウイルスを導入する必要がある。第１のウイルスは、４つのタンデムコピーの単純ヘルペスウイルスタンパク質１６で構成される転写活性化因子であるＶＰ６４ドメインと直接的に融合された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質を含有する。ＶＰ６４は、転写開始部位付近に結合するタンパク質に融合されている場合、強力な転写活性化因子として作用する。第２のウイルスは、２つの追加の活性化転写因子：熱ショック因子１（ＨＳＦ１）および転写因子６５（ｐ６５）に融合されたＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）をもたらす。ＭＣＰは、天然ではＭＳ２ステムループに結合する。例示的なＳＡＭ系では、ＭＣＰは、ＣＲＩＳＰＲ関連ｓｇＲＮＡに遺伝子操作されたＭＳ２ステムループと相互作用し、それにより、結合した転写因子が適切なゲノムの場所へと輸送される。第３のウイルスは、ＭＳ２ループ含有ｓｇＲＮＡを導入する。
【０１１６】
本明細書では、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の転写を活性化するための、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性転写活性化活性を評価するための方法および組成物が提供される。方法および組成物では、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、または相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット（例えば、キメラＣａｓタンパク質コード配列およびキメラアダプタータンパク質配列）を、成分が構成的に利用可能であり得るかまたは例えば組織特異的様式もしくは時間特異的様式で利用可能であり得るように含む細胞および非ヒト動物が使用される。カセットは、ゲノム的に組み込まれてもよい。また、そのような細胞および非ヒト動物は、本明細書の他所で開示されているようなガイドＲＮＡ発現カセットおよび／またはリコンビナーゼ発現カセットを含んでいてもよい。その代わりに、１つまたは複数の成分（例えば、ガイドＲＮＡおよび／またはリコンビナーゼ）は、標的遺伝子の転写活性化を誘導する他の手段により、細胞および非ヒト動物に導入することができる。
【０１１７】
ＳＡＭ発現カセットを含む非ヒト動物は、標的遺伝子の転写を活性化するためにガイドＲＮＡを非ヒト動物に導入することしか必要としないため、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分の送達および活性を試験するための過程が単純化される。非ヒト動物がガイドＲＮＡ発現カセットも含む場合、一切のさらなる成分を導入せずに、標的遺伝子活性化の効果を研究することができる。加えて、ＳＡＭ発現カセットまたはガイドＲＮＡ発現カセットは、必要に応じて、特定の組織または発生段階で選択的に発現させることができる条件付き発現カセットであってもよく、それにより、例えばｉｎ  ｖｉｖｏでのＣａｓ媒介性毒性リスクを低減することができる。その代わりに、そのような発現カセットを構成的に発現させて、ありとあらゆるタイプの細胞、組織、および器官での活性を試験することができる。
【０１１８】
また、Ｃａｓに基づくＳＡＭ系がｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の転写を活性化する能力を試験および測定するために、またはｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の転写を増加させる効果を評価するために、こうした非ヒト動物を作製および使用するための方法および組成物が提供される。
ＩＩ．相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットを含む非ヒト動物
【０１１９】
本明細書で開示された非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の転写を活性化する方法、およびＳＡＭ系またはそのような系の成分（例えば、非ヒト動物または細胞に導入されたガイドＲＮＡ）がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座の転写を活性化する能力を評価するための方法に使用するためのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）に基づく相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットを含む。本明細書で開示された方法および組成物では、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の転写を活性化する方法、およびＳＡＭ系またはそのような系の成分（例えば、非ヒト動物または細胞に導入されたガイドＲＮＡ）がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座の転写を活性化する能力を評価するための方法に使用するためのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）に基づく相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットを含む非ヒト動物または細胞が利用される。本明細書に記載のＳＡＭ系は、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質を含み、本明細書の他所に記載のようなガイドＲＮＡと共に使用して、標的遺伝子の転写を活性化することができる。ガイドＲＮＡは、ゲノム的に組み込まれた発現カセットによりコードされてもよく、またはＡＡＶもしくは任意の他の好適な手段により提供されてもよい。キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質（例えば、ガイドＲＮＡ内のアダプター結合エレメントに特異的に結合するアダプター；および１つまたは複数の異種の転写活性化ドメインを含む）は、本明細書の他所にさらに詳細に記載されている。
【０１２０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系としては、Ｃａｓ遺伝子の発現または活性の方向付けに関与する転写物および他のエレメントが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型系、ＩＩ型系、ＩＩＩ型系、またはＶ型系（例えば、Ｖ−Ａ亜型またはＶ−Ｂ亜型）であってもよい。本明細書で開示された組成物および方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しなくてもよい。「天然に存在しない」系としては、系の１つまたは複数の成分が、それらの天然に存在する状態から変更もしくは変異していること、自然界においてそれらに天然で会合する少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないこと、または天然ではそれらに会合していない少なくとも１つの他の成分と会合していることなど、人間の行為の関与を示すあらゆるものが挙げられる。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、天然では一緒に存在しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体が使用されるか、天然に存在しないＣａｓタンパク質が使用されるか、または天然に存在しないｇＲＮＡが使用される。
【０１２１】
本明細書で開示された方法および組成物では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）が、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座の転写活性化を誘導する能力を使用または試験することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が使用される。
【０１２２】
本明細書で開示されたゲノム、細胞、および非ヒト動物は、キメラＣａｓタンパク質発現カセットおよび／またはキメラアダプタータンパク質発現カセットを含む。例えば、本明細書で開示されたゲノム、細胞、および非ヒト動物は、キメラＣａｓタンパク質コード配列およびキメラアダプタータンパク質コード配列を含む相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットを含んでいてもよい。
【０１２３】
ＳＡＭ発現カセットを含むそのようなゲノム、細胞、または非ヒト動物は、標的ゲノム遺伝子座の転写活性化を誘導するために、ガイドＲＮＡの送達しか必要としないという利点を有する。一部のそのようなゲノム、細胞、または非ヒト動物は、ガイドＲＮＡ発現カセットも含み、そのため標的遺伝子の転写活性化に必要なすべての成分が既に存在する。ＳＡＭ系をそのような細胞で使用して、標的遺伝子の発現増加を任意の所望の様式で提供することができる。例えば、１つまたは複数の標的遺伝子の発現は、構成的な様式で、または調節された様式で（例えば、誘導性の、組織特異的、および時間的に調節された様式などで）増加させることができる。
Ａ．キメラＣａｓタンパク質
【０１２４】
本明細書の他所で開示されたガイドＲＮＡに結合して、標的遺伝子の転写を活性化することができるキメラＣａｓタンパク質が提供される。そのようなキメラＣａｓタンパク質は、（ａ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質、またはガイドＲＮＡと複合体を形成することおよび標的配列に結合することが可能であるその機能的断片もしくはバリアントであるＤＮＡ結合ドメイン、ならびに（ｂ）１つまたは複数の転写活性化ドメインまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントを含んでいてもよい。例えば、そのような融合タンパク質は、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多くの転写活性化ドメイン（例えば、２つもしくはそれよりも多くの異種の転写活性化ドメインまたは３つもしくはそれよりも多くの異種の転写活性化ドメイン）を含んでいてもよい。一例では、キメラＣａｓタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）およびＶＰ６４転写活性化ドメインまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントを含んでいてもよい。例えば、そのようなキメラＣａｓタンパク質は、配列番号１に示されているｄＣａｓ９−ＶＰ６４キメラＣａｓタンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。しかしながら、転写活性化ドメインが他の転写活性化ドメインまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントを含むか、および／あるいはＣａｓタンパク質が他のＣａｓタンパク質（例えば、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質）を含むキメラＣａｓタンパク質も提供される。他の好適な転写活性化ドメインの例は、本明細書の他所で提供される。
【０１２５】
転写活性化ドメイン（複数可）は、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、または任意の箇所に位置してもよい。例えば、転写活性化ドメイン（複数可）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質のＲｅｃ１ドメイン、Ｒｅｃ２ドメイン、ＨＮＨドメイン、またはＰＩドメイン、あるいはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質と最適にアラインした場合のオルソロガスＣａｓ９タンパク質またはホモロガスもしくはオルソロガスＣａｓタンパク質の任意の対応する領域に結合していてもよい。例えば、転写活性化ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質の５５３位でＲｅｃ１ドメインに、５７５位でＲｅｃ１ドメインに、１７５〜３０６位内の任意の位置でまたは１７５〜３０６位内の置換部分もしくは領域全体でＲｅｃ２ドメインに、７１５〜９０１位内の任意の位置でまたは７１５〜９０１位内の置換部分もしくは領域全体でＨＮＨドメインに、あるいは１１５３位でＰＩドメインに結合していてもよい。例えば、ＷＯ２０１６／０４９２５８を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。転写活性化ドメインは、本明細書の他所に記載のように、一方の側または両方の側で１つまたは複数のリンカーにより挟まれていてもよい。
【０１２６】
また、キメラＣａｓタンパク質は、追加の異種のポリペプチドに作動可能に連結または融合されていてもよい。融合または連結される異種のポリペプチドは、キメラＣａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、または任意の内部箇所に位置してもよい。例えば、キメラＣａｓタンパク質は、核局在化シグナルをさらに含んでいてもよい。好適な核局在化シグナルおよびＣａｓタンパク質に対する他の修飾の例は、本明細書の他所にさらに詳細に記載されている。
（１）Ｃａｓタンパク質
【０１２７】
Ｃａｓタンパク質は、一般に、ガイドＲＮＡと相互作用することができる少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質の機能的断片または機能的バリアントは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、標的遺伝子の標的配列に結合する（および例えば、標的遺伝子の転写を活性化する）能力を維持するものである。
【０１２８】
また、本明細書の他所に記載のような転写活性化ドメインに加えて、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含んでいてもよい。一部のそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然Ｃａｓタンパク質に由来してもよい。他のそのようなドメインを追加して、修飾Ｃａｓタンパク質を作製してもよい。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合を切断することを含む、核酸切断の触媒活性を有する。切断は、平滑末端を産生してもよく、または付着末端を産生してもよく、一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよい。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には平滑末端切断生成物を生じさせる。その代わりに、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、５ヌクレオチドの５’突出を有する切断生成物をもたらす場合があり、切断は、非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後、および標的化鎖の２３番目の塩基の後で生じる。Ｃａｓタンパク質は、標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断（例えば、平滑末端を有する二本鎖切断）を生じる完全切断活性を有してもよく、または標的ゲノム遺伝子座に一本鎖切断を生じるニッカーゼであってもよい。一例では、本明細書で開示されたキメラＣａｓタンパク質のＣａｓタンパク質部分は、ヌクレアーゼ活性の低下を有する（例えば、ヌクレアーゼ活性が、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％減少する）ように、またはすべてのヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する（つまり、ヌクレアーゼ活性が、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％減少するか、または野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の約０％、１％、２％、３％、５％、もしくは１０％以下を示す）ように修飾されている。ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質は、その触媒（つまり、ヌクレアーゼ）ドメインにおける不活化変異（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質のＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインにおける不活化変異、またはＣａｓ９のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインの両方における不活化変異）であることが知られている変異を有するＣａｓタンパク質、または野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、少なくとも約９７％、９８％、９９％、もしくは１００％減少したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質である。ヌクレアーゼ活性を低減または実質的に消失させる様々なＣａｓタンパク質変異の例は、下記に開示されている。
【０１２９】
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらのホモログまたは修飾型が挙げられる。
【０１３０】
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し、典型的には、保存されているアーキテクチャーと４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏ���ｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されており、この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに由来するＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍ．  ８：１４５００を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９よりも小型であり、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方よりも小型である。
【０１３１】
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  １に由来するＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンリッチクラスターの対応物と共に、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する大型タンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠如し、ＲｕｖＣ様ドメインは、ＨＮＨドメインを含む長いインサートを含有するＣａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１配列において近接している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７７１を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２に由来するＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ｑ７Ｑ２が割り当てられている）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
【０１３２】
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（つまり、自然界で生じるもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（つまり、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であってもよい。また、Ｃａｓタンパク質は、野生型または修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して活性のバリアントまたは断片であってもよい。触媒活性に関して活性のバリアントまたは断片は、野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質またはその部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を含んでいてもよく、活性バリアントは、所望の切断部位でカットする能力を維持し、したがってニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を維持する。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性のアッセイは公知であり、一般に、切断部位を含有するＤＮＡ基質に対するＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
【０１３３】
修飾Ｃａｓタンパク質の一例は、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された変更（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を内包するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の高忠実度バリアントである修飾ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１タンパク質である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２９（７５８７）：４９０−４９５を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１（６２６８）：８４−８８を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。他のＳｐＣａｓ９バリアントとしては、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが挙げられる。
【０１３４】
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性の１つまたは複数を増加または減少させるように修飾されていてもよい。また、Ｃａｓタンパク質は、安定性などの、タンパク質の任意の他の活性または特性を変化させるように修飾されていてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインは、修飾、欠失、または不活化されていてもよく、あるいはＣａｓタンパク質は、タンパク質の機能にとって不可欠でないドメインを除去するために、またはＣａｓタンパク質の活性もしくは特性を最適化する（例えば、増強または低減する）ためにトランケートされていてもよい。
【０１３５】
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなど、少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含んでいてもよい。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、恐らく二量体構成にある、標的ＤＮＡの両鎖を切断する、ＲｕｖＣ様ドメインを含む。また、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなど、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含んでいてもよい。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは各々、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖をカットして、ＤＮＡに二本鎖切断を作製することができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
ヌクレアーゼドメインの１つまたは複数またはすべてを、それらがもはや機能的でないかまたはヌクレアーゼ活性が低減されるように、欠失または変異させることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインの１つが欠失または変異される場合、得られるＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと呼ぶことができ、二本鎖標的ＤＮＡ内に一本鎖切断を生成することができるが、二本鎖切断を生成することができない（つまり、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することはできない）。ヌクレアーゼドメインが両方とも欠失または変異される場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼ−ｎｕｌｌもしくはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒的に枯渇したＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ、ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅａｄ  Ｃａｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ））。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９のＲｕｖＣドメインのＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位にあるアスパラギン酸のアラニンへの）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９のＨＮＨドメインのＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位のヒスチジンのアラニンへの）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位のヒスチジンのアラニンへの）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位のアスパラギンのアラニンへの）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するＣａｓ９の対応する変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：９２７５−９２８２およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。そのような変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介性変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを生じる他の変異の例は、例えばＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８に見出すことができ、これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインのすべてが欠失または変異される（例えば、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインが両方とも欠失または変異される）場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼ−ｎｕｌｌまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）。１つの具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ  Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９と最適にアラインした場合の、別の種に由来するＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ  Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９と最適にアラインした場合の、別の種に由来するＣａｓ９の対応する二重変異体である。触媒的に不活性なＣａｓ９タンパ���質（ｄＣａｓ９）の一例は、配列番号２に示されているｄＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１３７】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインの不活化変異の例も公知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質が生成されるように、Ｎ５８０位の置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）およびＤ１０位の置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含んでいてもよい。例えば、ＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインの不活化変異の例も公知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７（ＭｂＣｐｆ１  Ｃｐｆ１）に由来するＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異は、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置、あるいはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置に変異を含んでいてもよい。そのような変異としては、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異の１つまたは複数を挙げることができる。例えば、ＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
また、Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質として、異種のポリペプチドに作動可能に連結していてもよい。例えば、転写活性化ドメインに加えて、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメインまたはエピジェネティック修飾ドメインに融合されていてもよい。ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。また、Ｃａｓタンパク質は、安定性の増加または減少を提供する異種のポリペプチドに融合されていてもよい。融合されるドメインまたは異種のポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置してもよい。
【０１４０】
一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つまたは複数の異種のポリペプチドに融合されていてもよい。そのような異種のポリペプチドとしては、例えば、核へと標的化するための、単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＳＶ４０  ＮＬＳおよび／または双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）アルファ−インポーチンＮＬＳなどの１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへと標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル、ならびにＥＲ保留シグナルなどを挙げることができる。例えば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：５１０１−５１０５を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、または任意の箇所に位置してもよい。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含んでいてもよく、単節型配列または双節型配列であってもよい。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ−インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む、２つまたはそれよりも多くのＮＬＳを含んでいてもよい。また、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端に２つもしくはそれよりも多くのＮＬＳおよび／またはＣ末端に２つもしくはそれよりも多くのＮＬＳを含んでいてもよい。
【０１４１】
また、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ドメインまたはタンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結していてもよい。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来するＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスに由来する細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してもよい。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。細胞透過性ドメインは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、または任意の箇所に位置してもよい。
【０１４２】
また、Ｃａｓタンパク質は、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの、追跡または精製を容易にするための異種のポリペプチドに作動可能に連結していてもよい。蛍光タンパク質の例としては、以下のものが挙げられる：緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の好適な蛍光タンパク質。タグの例としては、以下のものが挙げられる：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリン。
【０１４３】
また、Ｃａｓタンパク質は、標識核酸に係留されていてもよい。そのような係留（つまり、物理的な連結）は、共有結合相互作用により達成されてもよく、または非共有結合相互作用により達成されてもよく、係留は、直接的であってもよく（例えば、タンパク質に対するシステインもしくはリシン残基の修飾またはインテイン修飾により達成することができる直接的融合または化学コンジュゲーションにより）、またはストレプトアビジンもしくはアプタマーなどの１つもしくは複数の介在性リンカーもしくはアダプター分子により達成してもよい。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５（１）：４１−５５；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ４６（４６）：８８１９−８８２２；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｘｏｎ  （２００９）  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  ６２（１０）：１３２８−１３３２；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  １０（９）：１５５１−１５５７；およびＫｈａｔｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０（１４）：４５３２−４５３９を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。タンパク質−核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合戦略としては、ビオチン−ストレプトアビジン方法およびニッケル−ヒスチジン方法が挙げられる。共有結合タンパク質−核酸コンジュゲートは、幅広く様々な化学を使用して、適切に機能化された核酸およびタンパク質を接続することにより合成することができる。こうした化学の一部は、オリゴヌクレオチドをタンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リシンアミンまたはシステインチオール）に直接的に結合させることを含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒性もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質を核酸に共有結合で付着させるための方法としては、例えば、タンパク質リシンまたはシステイン残基に対するオリゴヌクレオチドの化学的架橋、発現タンパク質ライゲーション、化学酵素方法、および光アプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）の使用を挙げることができる。標識核酸は、Ｃａｓタンパク質内のＣ末端、Ｎ末端、または内部領域に係留されていてもよい。一例では、標識核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留されている。同様に、Ｃａｓタンパク質は、標的核酸内の５’末端、３’末端、または内部領域に係留されていてもよい。すなわち、標識核酸は、任意の向きおよび極性で係留されていてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、標的核酸の５’末端または３’末端に係留されていてもよい。
（２）転写活性化ドメイン
【０１４４】
本明細書で開示されたキメラＣａｓタンパク質は、１つまたは複数の転写活性化ドメインを含んでいてもよい。転写活性化ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ガイドＲＮＡと複合体化された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質）と共に、転写機構と直接的にまたは活性化補助因子などの他のタンパク質を介してのいずれかにより接触させることにより、プロモーターからの転写を活性化することができる天然に存在する転写因子の領域を含む。また、転写活性化ドメインとしては、転写因子のそのような領域の機能的断片またはバリアント、およびネイティブの天然に存在する転写活性化ドメインに由来するかまたは標的遺伝子の転写を活性化するように人工的に作出もしくは合成されている操作された転写活性化ドメインが挙げられる。機能的断片は、好適なＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結している場合、標的遺伝子の転写を活性化することが可能な断片である。機能的バリアントは、好適なＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結している場合、標的遺伝子の転写を活性化することが可能なバリアントである。
【０１４５】
本明細書で開示されたキメラＣａｓタンパク質に使用するための特定の転写活性化ドメインは、ＶＰ６４転写活性化ドメインまたはその機能的断片もしくはバリアントを含む。ＶＰ６４は、単純ヘルペスＶＰ１６活性化ドメインに由来する最小活性化ドメインの四量体リピートである。例えば、転写活性化ドメインは、配列番号３に示されているＶＰ６４転写活性化ドメインタンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。
【０１４６】
転写活性化ドメインの他の例としては、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化ドメイン、ＶＰ６４（単純ヘルペスウイルスＶＰ１６の四重タンデムリピート）、ＮＦ−κＢ  ｐ６５（ＮＦ−κＢトランス活性化サブユニットｐ６５）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１トランス活性化ドメイン、ＨＳＦ１トランス活性化ドメイン（ヒト熱ショック因子１に由来するトランス活性化ドメイン）、ＲＴＡ（エプスタインバーウイルスＲトランス活性化因子活性化ドメイン）、ＳＥＴ７／９トランス活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１、ｐ５３活性化ドメイン２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）活性化ドメイン、ならびにそれらの機能的断片およびバリアントが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０２９８１２５、ＵＳ２０１６／０２８１０７２、およびＷＯ２０１６／０４９２５８を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。転写活性化ドメインの他の例としては、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、Ｇｌｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４、Ｌｅｕ３、ならびにそれらの機能的断片およびバリアントが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０２９８１２５を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。転写活性化ドメインのさらに他の例としては、Ｓｐｌ、Ｖａｘ、ＧＡＴＡ４、ならびにそれらの機能的断片およびバリアントが挙げられる。例えば、ＷＯ２０１６／１４９４８４を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。他の例としては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、ＡＰ−２、ＣＴＦ１、Ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＥＲＦ−２、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、ＡＲＦ−６、ＡＲＦ−７、ＡＲＦ−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、およびＴＲＡＢ１ＰＣ４に由来する活性化ドメイン、ならびにそれらの機能的断片およびバリアントが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０２３７４５６、ＥＰ３０４５５３７、およびＷＯ２０１１／１４６１２１を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。また、追加の好適な転写活性化ドメインが公知である。例えば、ＷＯ２０１１／１４６１２１を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｂ．キメラアダプタータンパク質
【０１４７】
また、本明細書の他所で開示されたガイドＲＮＡに結合することができるキメラアダプタータンパク質が提供される。本明細書で開示されたキメラアダプタータンパク質は、ｄＣａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）様の系において、標的遺伝子内の標的配列に向けられて標的遺伝子の転写を活性化する転写活性化ドメインの数および多様性を増加させるために有用である。キメラアダプタータンパク質をコードする核酸は、本明細書の他所で開示されているような細胞または非ヒト動物（例えば、ゲノム的に組み込まれたキメラＣａｓタンパク質発現カセットを含む細胞または非ヒト動物）にゲノム的に組み込まれていてもよく、またはキメラアダプタータンパク質もしくは核酸は、本明細書の他所で開示された方法（例えば、ＬＮＰ媒介性送達またはＡＡＶ媒介性送達）を使用して、そのような細胞および非ヒト動物に導入されてもよい。
【０１４８】
そのようなキメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡ内のアダプター結合エレメントに特異的に結合するアダプター（つまり、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）；および（ｂ）１つまたは複数の異種の転写活性化ドメインを含む。例えば、そのような融合タンパク質は、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多くの転写活性化ドメイン（例えば、２つもしくはそれよりも多くの異種の転写活性化ドメインまたは３つもしくはそれよりも多くの異種の転写活性化ドメイン）を含んでいてもよい。一例では、そのようなキメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡのアダプター結合エレメントに特異的に結合するアダプター（つまり、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）；および（ｂ）２つまたはそれよりも多くの転写活性化ドメインを含んでいてもよい。例えば、キメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡの１つまたは複数のＭＳ２アプタマー（例えば、ガイドＲＮＡの別々の場所の２つのＭＳ２アプタマー）に特異的に結合するＭＳ２コートタンパク質アダプター；および（ｂ）１つまたは複数（例えば、２つまたはそれよりも多くの転写活性化ドメイン）を含んでいてもよい。例えば、２つの転写活性化ドメインは、ｐ６５およびＨＳＦ１転写活性化ドメインまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントであってもよい。しかしながら、転写活性化ドメインが他の転写活性化ドメインまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントを含むキメラアダプタータンパク質も提供される。
【０１４９】
１つまたは複数の転写活性化ドメインは、アダプターに直接融合されていてもよい。その代わりに、１つまたは複数の転写活性化ドメインは、リンカーもしくはリンカーの組合せを介して、または１つもしくは複数の追加のドメインを介してアダプターに連結されていてもよい。同様に、２つまたはそれよりも多くの転写活性化ドメインが存在する場合、それらは、互いに直接融合されていてもよく、あるいはリンカーもしくはリンカーの組合せを介してまたは１つもしくは複数の追加のドメインを介して互いに連結されていてもよい。こうした融合タンパク質に使用することができるリンカーとしては、融合タンパク質の機能に干渉しない任意の配列を挙げることができる。例示的なリンカーは、短く（例えば、２〜２０アミノ酸）、典型的には可撓性である（例えば、グリシン、アラニン、およびセリンなどの自由度が高いアミノ酸を含む）。リンカーの一部の具体的な例は、任意の組合せのＧＧＧＳ（配列番号４）またはＧＧＧＧＳ（配列番号５）の２、３、４つ、またはそれよりも多くのリピートなど、ＧＧＧＳ（配列番号４）またはＧＧＧＧＳ（配列番号５）からなる１つまたは複数のユニットを含む。他のリンカー配列も使用することができる。
【０１５０】
１つまたは複数の転写活性化ドメインおよびアダプターは、任意の順序でキメラアダプタータンパク質内に存在してもよい。１つの選択肢として、１つまたは複数の転写活性化ドメインは、アダプターに対してＣ末端にあってもよく、アダプターは、１つまたは複数の転写活性化ドメインに対してＮ末端にあってもよい。例えば、１つまたは複数の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあってもよく、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあってもよい。しかしながら、１つまたは複数の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあるのではなく、アダプターに対してＣ末端にあってもよい（例えば、核局在化シグナルが、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にある場合）。同様に、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあるのではなく、１つまたは複数の転写活性化ドメインに対してＮ末端にあってもよい（例えば、核局在化シグナルが、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にある場合）。別の選択肢として、１つまたは複数の転写活性化ドメインは、アダプターに対してＮ末端にあってもよく、アダプターは、１つまたは複数の転写活性化ドメインに対してＣ末端にあってもよい。例えば、１つまたは複数の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあってもよく、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあってもよい。さらに別の選択肢として、キメラアダプタータンパク質が、２つまたはそれよりも多くの転写活性化ドメインを含む場合、２つまたはそれよりも多くの転写活性化ドメインは、アダプターに隣接できる。
【０１５１】
また、キメラアダプタータンパク質は、追加の異種のポリペプチドに作動可能に連結または融合されていてもよい。融合または連結される異種のポリペプチドは、キメラアダプタータンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、または任意の内部箇所に位置してもよい。例えば、キメラアダプタータンパク質は、核局在化シグナルをさらに含んでいてもよい。そのようなタンパク質の具体的な例は、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）に対してＣ末端のｐ６５転写活性化ドメインに連結（直接的にまたはＮＬＳを介してのいずれかで）されているＭＳ２コートタンパク質（アダプター）、およびｐ６５転写活性化ドメインに対してＣ末端のＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む。そのようなタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＭＣＰ、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含んでいてもよい。例えば、キメラアダプタータンパク質は、配列番号６に示されているＭＣＰ−ｐ６５−ＨＳＦ１キメラアダプタータンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。
【０１５２】
キメラアダプタータンパク質は、細胞内局在化を提供する１つまたは複数の異種のポリペプチドに融合または連結されていてもよい。そのような異種のポリペプチドとしては、例えば、核へと標的化するための、ＳＶ４０  ＮＬＳおよび／またはアルファ−インポーチンＮＬＳなどの１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへと標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル、ならびにＥＲ保留シグナルなどを挙げることができる。例えば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：５１０１−５１０５を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。ＮＬＳは、例えば、一続きの塩基性アミノ酸を含んでいてもよく、単節型配列または双節型配列であってもよい。必要に応じて、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端のＮＬＳ（例えば、アルファ−インポーチンＮＬＳ）および／またはＣ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ）を含む、２つまたはそれよりも多くのＮＬＳを含む。
【０１５３】
また、キメラアダプタータンパク質は、細胞透過性ドメインまたはタンパク質形質導入ドメインと作動可能に連結していてもよい。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来するＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスに由来する細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してもよい。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。別の例として、キメラアダプタータンパク質は、安定性の増加または減少を提供する異種のポリペプチドに融合または連結されていてもよい。
【０１５４】
また、キメラアダプタータンパク質は、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの、追跡または精製を容易にするための異種のポリペプチドに作動可能に連結していてもよい。蛍光タンパク質の例としては、以下のものが挙げられる：緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の好適な蛍光タンパク質。タグの例としては、以下のものが挙げられる：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリン。
【０１５５】
また、キメラアダプタータンパク質は、標識核酸に係留されていてもよい。そのような係留（つまり、物理的な連結）は、共有結合相互作用により達成してもよく、または非共有結合相互作用により達成してもよく、係留は、直接的であってもよく（例えば、タンパク質に対するシステインもしくはリシン残基の修飾またはインテイン修飾により達成することができる、直接的融合または化学コンジュゲーションにより）、またはストレプトアビジンもしくはアプタマーなどの１つもしくは複数の介在性リンカーもしくはアダプター分子により達成してもよい。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５（１）：４１−５５；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ４６（４６）：８８１９−８８２２；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｘｏｎ  （２００９）  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  ６２（１０）：１３２８−１３３２；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  １０（９）：１５５１−１５５７；およびＫｈａｔｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０（１４）：４５３２−４５３９を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。タンパク質−核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合戦略としては、ビオチン−ストレプトアビジン方法およびニッケル−ヒスチジン方法が挙げられる。共有結合タンパク質−核酸コンジュゲートは、幅広く様々な化学を使用して、適切に機能化された核酸およびタンパク質を接続することにより合成することができる。こうした化学の一部は、オリゴヌクレオチドをタンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リシンアミンまたはシステインチオール）に直接的に結合させることを含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒性もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質を核酸に共有結合で付着させるための方法としては、例えば、タンパク質リシンまたはシステイン残基に対するオリゴヌクレオチドの化学的架橋、発現タンパク質ライゲーション、化学酵素方法、および光アプタマーの使用を挙げることができる。標識核酸は、キメラアダプタータンパク質内のＣ末端、Ｎ末端、または内部領域に係留されていてもよい。同様に、キメラアダプタータンパク質は、標的核酸内の５’末端、３’末端、または内部領域に係留されていてもよい。すなわち、標識核酸は、任意の向きおよび極性で係留されていてもよい。
（１）アダプター
【０１５６】
アダプター（つまり、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）は、別個の配列を特異的に認識および結合する（例えば、配列特異的様式でアプタマーなどの別個のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列に結合する）核酸結合ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメイン）である。アプタマーとしては、特定の三次元コンフォメーションを取るそれらの能力により、高い親和性および特異性で標的分子に結合することができる核酸が挙げられる。そのようなアダプターは、例えば、特定のＲＮＡ配列および二次構造に結合することができる。こうした配列（つまり、アダプター結合エレメント）は、ガイドＲＮＡへと操作することができる。例えば、ＭＳ２アプタマーは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）と特異的に結合するガイドＲＮＡへと操作することができる。例えば、アダプターは、配列番号７に示されているＭＣＰ配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。
【０１５７】
アダプターおよび標的の一部の具体的な例としては、バクテリオファージコートタンパク質の多様性の中に存在するＲＮＡ結合タンパク質／アプタマー組合せが挙げられる。例えば、以下のアダプタータンパク質またはそれらの機能的断片もしくはバリアントを使用することができる：ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１ｌ、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、Φ  Ｃｂ８ｒ、Φ  Ｃｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、７ｓ、およびＰＲＲ１。例えば、ＷＯ２０１６／０４９２５８を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。アダプタータンパク質の機能的断片または機能的バリアントは、特定のアダプター結合エレメントに結合する能力（例えば、配列特異的様式で特定のアダプター結合配列に結合する能力）を維持するものである。例えば、アミノ酸６８〜６９がＳＧに変異されており、アミノ酸７０〜７５が野生型タンパク質から欠失されているＰＰ７  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓバクテリオファージコートタンパク質バリアントを使用することができる。例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  １０２（１２）：２９３６−２９４４およびＣｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５（１）：１０３−１０５を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、Ｎ５５Ｋ変異体などのＭＣＰバリアントを使用してもよい。例えば、Ｓｐｉｎｇｏｌａ  ａｎｄ  Ｐｅａｂｏｄｙ  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９（１２）：９００６−９０１０を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
使用することができるアダプタータンパク質の他の例としては、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮタンパク質（例えば、それに由来するＤＮＡ結合）のすべてまたは一部分が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
（２）転写活性化ドメイン
【０１５９】
本明細書で開示されたキメラアダプタータンパク質は、１つまたは複数の転写活性化ドメインを含む。そのような転写活性化ドメインは、天然に存在する転写活性化ドメインであってもよく、天然に存在する転写活性化ドメインの機能的断片もしくは機能的バリアントであってもよく、または操作されたもしくは合成の転写活性化ドメインであってもよい。使用することができる転写活性化ドメインとしては、本明細書の他所のキメラＣａｓタンパク質に使用するために記載されているものが挙げられる。
【０１６０】
本明細書で開示されたキメラアダプタータンパク質に使用するための特定の転写活性化ドメインは、ｐ６５および／もしくはＨＳＦ１転写活性化ドメインまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントを含む。ＨＳＦ１転写活性化ドメインは、ヒト熱ショック因子１（ＨＳＦ１）の転写活性化ドメインであってもよい。ｐ６５転写活性化ドメインは、ＲＥＬＡ遺伝子によりコードされる核内因子ＮＦ−カッパ−Ｂ  ｐ６５サブユニットとしても公知である転写因子ｐ６５の転写活性化ドメインであってもよい。一例として、転写活性化ドメインは、配列番号８に示されているｐ６５転写活性化ドメインタンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。別の例として、転写活性化ドメインは、配列番号９に示されているＨＳＦ１転写活性化ドメインタンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。
Ｃ．ガイドＲＮＡおよびガイドＲＮＡアレイ
【０１６１】
また、本明細書の他所で開示されたキメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質に結合して、標的遺伝子の転写を活性化することができるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡアレイが提供される。ガイドＲＮＡをコードする核酸は、本明細書の他所で開示されているような細胞もしくは非ヒト動物（例えば、ＳＡＭが整った細胞または非ヒト動物）にゲノム的に組み込まれてもよく、またはガイドＲＮＡもしくは核酸は、本明細書の他所で開示された方法（例えば、ＬＮＰ媒介性送達またはＡＡＶ媒介性送達）を使用して、そのような細胞および非ヒト動物に導入してもよい。本明細書の他所で開示されているような、リコンビナーゼの組織特異的送達を提供する送達方法を選択することができる。
【０１６２】
ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡアレイをコードする核酸は、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードすることができる（または、ガイドＲＮＡが細胞または非ヒト動物に導入される場合、１つもしくは複数のガイドＲＮＡを導入することができる）。例えば、２つもしくはそれよりも多くの、３つもしくはそれよりも多くの、４つもしくはそれよりも多くの、または５つもしくはそれよりも多くのガイドＲＮＡがコードまたは導入されてもよい。各ガイドＲＮＡコード配列は、同じプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）に作動可能に連結していてもよく、または異なるプロモーターに作動可能に連結していてもよい（例えば、各ガイドＲＮＡコード配列は、それ自体のＵ６プロモーターに作動可能に連結している）。ガイドＲＮＡの２つまたはそれよりも多くは、単一の標的遺伝子の異なる標的配列を標的とすることができる。例えば、２つもしくはそれよりも多くの、３つもしくはそれよりも多くの、４つもしくはそれよりも多くの、または５つもしくはそれよりも多くのガイドＲＮＡは各々が、単一の標的遺伝子の異なる標的配列を標的とすることができる。同様に、ガイドＲＮＡは、複数の標的遺伝子を標的とすることができる（例えば、２つもしくはそれよりも多くの、３つもしくはそれよりも多くの、４つもしくはそれよりも多くの、または５つもしくはそれよりも多くの標的遺伝子）。ガイドＲＮＡ標的配列の例は、本明細書の他所に開示されている。
（１）ガイドＲＮＡ
【０１６３】
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の場所へと標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡターゲティングセグメント」および「タンパク質結合セグメント」を含んでいてもよい。「セグメント」は、ＲＮＡ中の一続きの連続ヌクレオチドなど、分子の区画または領域を含む。Ｃａｓ９に対するものなどの一部のｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子：「活性化因子ＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「ターゲッターＲＮＡ（ｔａｒｇｅｔｅｒ−ＲＮＡ）」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含んでいてもよい。他のｇＲＮＡは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれることがある単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ９の場合、例えば、シングルガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに融合された（例えば、リンカーを介して）ｃｒＲＮＡを含んでいてもよい。Ｃｐｆ１の場合、例えば、標的配列への結合を達成するためには、ｃｒＲＮＡのみが必要である。用語「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、二重分子（つまり、モジュール式）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡを両方とも含む。
【０１６４】
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「活性化因子ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（一本鎖）およびｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の片方の半分を形成する一続きのヌクレオチドを両方とも含む。ＤＮＡターゲティングセグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡ尾部の例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１０）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書で開示されたＤＮＡターゲティングセグメントのいずれかを、配列番号１０の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成してもよい。
【０１６５】
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他方の半分を形成する一続きのヌクレオチドを含む。ｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドと相補的であり、それにハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。そのため、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、
【化１】
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を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１６６】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも必要とされる系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズして、ｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要とされる系では、ｃｒＲＮＡがｇＲＮＡであってもよい。加えて、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡターゲティングセグメントを提供する。細胞内での修飾に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的であるように設計することができる。例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１：２２７−２２９；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１：２３３−２３９；およびＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
所与のｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（ｃｒＲＮＡ）は、下記でより詳細に記載されているように、標的ＤＮＡの相補鎖における配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、ハイブリダイゼーション（つまり、塩基対合）により配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。そのため、ＤＮＡターゲティングセグメントのヌクレオチド配列は様々であってもよく、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。対象ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物に応じて異なるが、２１〜４６の間のヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）に挟まれた、２１〜７２の間のヌクレオチド長のターゲティングセグメントを含有することが多い（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。この文献は参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、ターゲティングセグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、それにハイブリダイズし、対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、次いでＣａｓタンパク質に結合する。
【０１６８】
ＤＮＡターゲティングセグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチドの長さを有してもよい。そのようなＤＮＡターゲティングセグメントは、例えば、約１２から約１００まで、約１２から約８０まで、約１２から約５０まで、約１２から約４０まで、約１２から約３０まで、約１２から約２５まで、または約１２から約２０ヌクレオチドまでの長さを有してもよい。例えば、ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１５から約２５ヌクレオチドまで（例えば、約１７から約２０ヌクレオチドまで、または約１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド）であってもよい。例えば、ＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい。この文献は参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡターゲティングセグメントは、１６〜２０の間のヌクレオチド長または１７〜２０の間のヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡターゲティングセグメントは、２１〜２３の間のヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡターゲティングセグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長である。
【０１６９】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態であってもよく（例えば、全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、長さが様々であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡとしては、一次転写物またはプロセシングされた形態を挙げることができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡの一部分として、または２分子ｇＲＮＡの一部分としての別々の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のすべてまたは部分（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれよりも多くのヌクレオチド）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド型、８９ヌクレオチド型、７５ヌクレオチド型、および６５ヌクレオチド型が挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７；ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５型内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられる。「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの＋ｎヌクレオチドまでがｓｇＲＮＡに含まれていることを示す。ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい。この文献は参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であってもよい。ＤＮＡターゲティングセグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であってもよい。例として、ＤＮＡターゲティングセグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端の１４個の連続ヌクレオチドにわたって１００％であり、残部にわたっては０％と低くともよい。そのような場合、ＤＮＡターゲティングセグメントは、１４ヌクレオチド長であるとみなすことができる。別の例として、ＤＮＡターゲティングセグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端の７個の連続ヌクレオチドにわたって１００％であり、残部にわたっては０％と低くともよい。そのような場合、ＤＮＡターゲティングセグメントは、７ヌクレオチド長であるとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡターゲティングセグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドは、標的ＤＮＡの相補鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡターゲティングセグメントは、２０ヌクレオチド長であってもよく、標的ＤＮＡの相補鎖と１つ、２つ、または３つのミスマッチを含んでいてもよい。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖の領域（つまり、ＰＡＭ配列の逆相補体）に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９塩基対だけ離れている）。
【０１７１】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２つの一続きのヌクレオチドを含んでいてもよい。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡターゲティングセグメントによって標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に向ける。
【０１７２】
シングルガイドＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングセグメントおよびスキャフォールド配列（つまり、ガイドＲＮＡのタンパク質結合配列またはＣａｓ結合配列）を含んでいてもよい。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’スキャフォールド配列に結合した５’ＤＮＡターゲティングセグメントを有してもよい。例示的なスキャフォールド配列は、以下のものを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる：
【化２】
2021518141.tif 000005
本明細書で開示されたガイドＲＮＡ標的配列のいずれかを標的とするガイドＲＮＡとしては、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端で例示的なガイドＲＮＡスキャフォールド配列のいずれかと融合されたガイドＲＮＡの５’末端におけるＤＮＡターゲティングセグメントを挙げることができる。すなわち、本明細書で開示されたＤＮＡターゲティングセグメントのいずれかを、上記スキャフォールド配列のいずれか１つの５’末端に結合して、シングルガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成してもよい。
【０１７３】
ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、安定性の修飾および調節、細胞内標的化、蛍光標識による追跡、ならびにタンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位など）を提供する修飾または配列を含んでいてもよい。そのような修飾の例としては、例えば、以下のものが挙げられる：５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（つまり、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節、ならびに／またはタンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接近可能性の調節を可能にする）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（つまり、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、および葉緑体など）に向ける修飾または配列；追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子との直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分とのコンジュゲーション、および蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質に対する結合部位を提供する修飾または配列；およびそれらの組合せ。修飾の他の例としては、操作されたステムループ二重鎖構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重鎖構造の３’にある操作されたヘアピン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成されている二重鎖内のヌクレオチドの非対合領域であってもよい。バルジは、二重鎖の一方の側に非対合５’−ＸＸＸＹ−３’を含んでいてもよく、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは、反対側の鎖におけるヌクレオチドとの揺らぎ対および二重鎖の他方の鎖における非対合ヌクレオチド領域を形成することができるヌクレオチドであってもよい。
【０１７４】
未修飾核酸は、分解し易い場合がある。また、外因性核酸は、先天性免疫応答を誘導する場合がある。修飾は、安定性の導入および免疫原性の低減を支援することができる。ガイドＲＮＡは、例えば、以下のものの１つまたは複数を含む、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい：（１）ホスホジエステル骨格連結における非連結リン酸の酸素の一方もしくは両方および／または連結リン酸の酸素の１つもしくは複数の変更または置き換え；（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの変更または置き換えなど、リボース糖の構成物の変更または置き換え；（３）リン酸部分のデホスホリンカー（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ  ｌｉｎｋｅｒ）での置き換え；（４）天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え；（５）リボース−リン酸骨格の置き換えまたは修飾；（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置き換え、または部分のコンジュゲーション）；ならびに（７）糖の修飾。他の考え得るガイドＲＮＡ修飾としては、ウラシルまたはポリウラシルトラクトの修飾または置き換えが挙げられる。例えば、ＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。同様の修飾を、Ｃａｓ  ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に対してなすことができる。例えば、Ｃａｓ  ｍＲＮＡは、同義語コドンを使用してウリジンを枯渇させることにより修飾することができる。
【０１７５】
一例として、ガイドＲＮＡの５’末端または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を含んでいてもよい（例えば、塩基は、ホスホロチオエート基である修飾リン酸基を有してもよい）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端または３’末端の２、３、または４つの末端ヌクレオチド間にホスホロチオエート連結を含んでいてもよい。別の例として、ガイドＲＮＡの５’末端および／または３’末端のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を有してもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４つの末端ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾を含んでいてもよい。例えば、ＷＯ２０１７／１７３０５４  Ａ１およびＦｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１８）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２２：１−９を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
一部のガイドＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ）では、ガイドＲＮＡの少なくとも１つのループ（例えば、２つのループ）は、１つまたは複数のアダプター（つまり、アダプタータンパク質またはドメイン）に結合する別個のＲＮＡ配列の挿入により修飾されている。そのようなアダプタータンパク質は、転写活性化ドメインなどの１つまたは複数の異種の機能的ドメインをさらに動員するために使用することができる。そのようなアダプタータンパク質を含む融合タンパク質（つまり、キメラアダプタータンパク質）の例は、本明細書の他所に開示されている。例えば、ＭＳ２結合ループ
【化３】
2021518141.tif 000006
が、配列番号１２もしくは配列番号１４に示されているｓｇＲＮＡスキャフォールド（骨格）のヌクレオチド＋１３〜＋１６およびヌクレオチド＋５３〜＋５６またはＷＯ２０１６／０４９２５８およびＫｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５１７（７５３６）：５８３−５８８に記載されているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のｓｇＲＮＡ骨格を置き換えていてもよい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、図７を参照されたい。本明細書で使用されるガイドＲＮＡの付番は、ガイドＲＮＡスキャフォールド配列（つまり、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントの下流にある配列）のヌクレオチド付番を指す。例えば、ガイドＲＮＡスキャフォールドの最初のヌクレオチドは＋１であり、スキャフォールドの２番目のヌクレオチドは＋２である、などである。配列番号１２または配列番号１４のヌクレオチド＋１３〜＋１６に対応する残基は、配列番号１２または配列番号１４のヌクレオチド＋９〜＋２１に及ぶ領域中の、本明細書ではテトラループと呼ばれる領域であるループ配列である。配列番号１２または配列番号１４のヌクレオチド＋５３〜＋５６に対応する残基は、配列番号１２または配列番号１４のヌクレオチド＋４８〜＋６１に及ぶ領域中の、本明細書ではステムループ２と呼ばれる領域であるループ配列である。配列番号１２または配列番号１４中の他のステムループ配列は、ステムループ１（ヌクレオチド＋３３〜＋４１）およびステムループ３（ヌクレオチド＋６３〜＋７５）を含む。得られる構造は、テトラループおよびステムループ２配列の各々がＭＳ２結合ループにより置き換えられているｓｇＲＮＡスキャフォールドである。テトラループおよびステムループ２は、ＭＳ２結合ループの付加が、いかなるＣａｓ９残基とも干渉しないような方法で、Ｃａｓ９タンパク質から突き出ている。加えて、テトラループおよびステムループ２部位がＤＮＡと近接していることは、これらの場所の局在化が、ＤＮＡと転写活性化因子などの任意の動員されたタンパク質との間に高度な相互作用をもたらすことができることを示す。したがって、一部のｓｇＲＮＡでは、配列番号１２もしくは配列番号１４に示されているガイドＲＮＡスキャフォールドの＋１３〜＋１６に対応するヌクレオチドおよび／もしくは＋５３〜＋５６に対応するヌクレオチド、またはこうしたスキャフォールド／骨格のいずれかと最適にアラインした場合の対応する残基は、１つまたは複数のアダプタータンパク質またはドメインに結合することが可能な別個のＲＮＡ配列により置き換えられている。その代わりにまたはそれに加えて、アダプター結合配列は、ガイドＲＮＡの５’末端または３’末端に付加されていてもよい。テトラループおよびステムループ２領域にＭＳ２結合ループを含む例示的なガイドＲＮＡスキャフォールドは、配列番号４０に示されている配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。テトラループおよびステムループ２領域にＭＳ２結合ループを含む例示的な汎用シングルガイドＲＮＡは、配列番号６３に示されている配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。
【０１７７】
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供することができる。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてのＲＮＡの形態で、および必要に応じてＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供することができる。また、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供することができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）をコードしてもよく、または別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしてもよい。後者の場合では、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別々のＤＮＡ分子として提供することができる。
【０１７８】
ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは、細胞にて一過性に発現されてもよく、条件付きで発現されてもよく、または構成的に発現されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに安定的に組み込まれ、細胞で活性なプロモーターに作動可能に連結していてもよい。その代わりに、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結していてもよい。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、異種の核酸を含むベクターに存在してもよい。そのような発現構築物で使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性であるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってもよい。また、そのようなプロモーターは、例えば双方向性プロモーターであってもよい。好適なプロモーターの具体的な例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
【０１７９】
その代わりに、ｇＲＮＡは、種々の他の方法により調製することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製することができる（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい。これらの文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。また、ガイドＲＮＡは、化学合成により調製された合成的に産生された分子であってもよい。
【０１８０】
ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４つ、またはそれよりも多くのガイドＲＮＡ）およびガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所与の保管条件下で（例えば、−２０℃、４℃、または周囲温度）、分解産物が、開始核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満など、閾値未満のままである期間を延長するか；またはｉｎ  ｖｉｖｏで安定性を増加させる）担体を含む組成物中に存在してもよい。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物（ｌｉｐｉｄ  ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含んでいてもよい。
（２）ガイドＲＮＡ標的配列
【０１８１】
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡとしては、結合が存在するための条件が十分である場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが結合する、ＤＮＡに存在する核酸配列が挙げられる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件としては、細胞に通常存在する生理学的条件が挙げられる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系での条件）は、当技術分野で公知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。ｇＲＮＡと相補的であり、それにハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と呼ぶことができ、「相補鎖」と相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡとは相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「鋳型鎖」と呼ぶことができる。
【０１８２】
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖における配列、および非相補鎖における対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）を両方とも含む。用語「ガイドＲＮＡ標的配列」は、本明細書で使用される場合、具体的には、ガイドＲＮＡが相補鎖でハイブリダイズする配列に対応する非相補鎖（つまり、逆相補体）における配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’にある）非相補鎖の配列を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと等価であるが、ウラシルの代わりにチミンを有する。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖の５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭの上流にある配列を指すことができる。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に対する相補性を有し、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントと標的ＤＮＡの相補鎖とのハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するように設計されている。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。本明細書にてガイドＲＮＡがガイドＲＮＡ標的配列を標的化すると呼ばれる場合、それが意味するのは、ガイドＲＮＡは、非相補鎖にあるガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズするということである。
【０１８３】
標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含んでいてもよく、例えば、細胞の核もしくは細胞質に、またはミトコンドリアもしくは葉緑体など、細胞の細胞小器官内に位置してもよい。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性である任意の核酸配列であってもよい。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列もしくは非コード配列（例えば、調節配列）であってもよく、または両方を含んでいてもよい。
【０１８４】
標的配列は、遺伝子の転写開始部位に隣接していることが好ましい場合がある。例えば、標的配列は、転写開始部位の１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、もしくは１塩基対以内、転写開始部位の上流の１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、もしくは１塩基対以内、または転写開始部位の下流の１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、もしくは１塩基対以内にあってもよい。必要に応じて、標的配列は、転写開始部位の２００塩基対上流および転写開始部位の１塩基対下流の領域内（−２００〜＋１）にある。
【０１８５】
標的配列は、転写活性化のために標的とすることが所望である任意の遺伝子内にあってもよい。一部の場合では、標的遺伝子は、発現しない遺伝子または発現が弱い遺伝子（例えば、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２倍など、バックグラウンドよりもわずかに多く発現される）であるものであってもよい。また、標的遺伝子は、対照遺伝子と比較して低いレベルで発現されるものであってもよい。また、標的遺伝子は後成的にサイレンシングされるものであってもよい。用語「後成的にサイレンシングされる」は、変異などの遺伝子変化以外の機序により、転写されていないか、または対照試料（例えば、正常細胞など、対応する対照細胞）における遺伝子の転写レベルと比べて減少したレベルで転写されている遺伝子を指す。遺伝子サイレンシングの後成的機序は周知であり、例えば、遺伝子の５’調節領域のＣｐＧ島にあるＣｐＧジヌクレオチドの高メチル化、および例えばヒストンアセチル化によるクロマチンの構造的変化のため、遺伝子転写が低減または阻害されることを含む。
【０１８６】
標的遺伝子としては、肝臓などの特定の器官または組織で発現される遺伝子を挙げることができる。標的遺伝子としては、疾患関連遺伝子を挙げることができる。疾患関連遺伝子は、非疾患対照の組織または細胞と比較して、疾患罹患組織に由来する細胞において異常なレベルでまたは異常な形態で転写または翻訳産物を産出する任意の遺伝子を指す。疾患関連遺伝子は、異常な高レベルで発現され、変更された発現が疾患の発症および／または進行と相関する遺伝子であってもよい。また、疾患関連遺伝子は、疾患の病因に寄与する変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）または遺伝的変異（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する遺伝子を指す。転写または翻訳された産物は既知であってもよく、または未知であってもよく、正常なレベルであってもよく、または異常なレベルであってもよい。例えば、標的遺伝子は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、およびトランスサイレチンアミロイドーシスなどのアミロイドーシスなどのタンパク質凝集疾患および障害に関連する遺伝子であってもよい（例えば、Ｔｔｒ）。また、標的遺伝子は、高コレステロール血症もしくはアテローム性動脈硬化症などの疾患もしくは状態と関係する経路に関与する遺伝子、または過剰発現させるとそのような疾患もしくは状態をモデル化することができる遺伝子であってもよい。また、標的遺伝子は、１つまたは複数のタイプのがんで発現または過剰発現される遺伝子であってもよい。例えば、Ｓａｎｔａｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  １０（１）：５９−６４を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
そのような標的遺伝子の１つの具体的な例は、Ｔｔｒ遺伝子である。必要に応じて、Ｔｔｒ遺伝子は、病原性変異（例えば、アミロイドーシスを引き起こす変異）を含んでいてもよい。そのような変異の例は、例えば、ＷＯ２０１８／００７８７１に提供されており、この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なヒトＴＴＲタンパク質および例示的なヒトＴＴＲ遺伝子は、それぞれＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０２７６６およびＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ７２７６により特定される。例示的なマウスＴＴＲタンパク質および例示的なマウスＴｔｒ遺伝子は、それぞれＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０７３０９およびＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２２１３９により特定される。トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、甲状腺ホルモンおよびレチノールに対するレチノール結合タンパク質を運搬する、血清および脳脊髄液に見出されるタンパク質である。肝臓はＴＴＲを血液へと分泌し、脈絡叢はそれを脳脊髄液へと分泌する。また、ＴＴＲは、網膜色素上皮で産生され、硝子体へと分泌される。アミロイド疾患である老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）、および家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）では、ミスフォールドしたおよび凝集したＴＴＲが、複数の組織および器官に蓄積する。トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、主に肝臓により合成されるが、脈絡叢によっても産生される、１２７アミノ酸の５５ｋＤａ血清および脳脊髄液輸送タンパク質である。また、トランスサイレチンは、プレアルブミン、チロキシン結合プレアルブミン、ＡＴＴＲ、ＴＢＰＡ、ＣＴＳ、ＣＴＳ１、ＨＥＬ１１１、ＨｓＴ２６５１、およびＰＡＬＢとも呼ばれている。ＴＴＲは、その天然状態では四量体として存在する。ホモ接合体では、ホモ四量体は、同一の１２７アミノ酸のベータシートリッチサブユニットを含む。ヘテロ接合体では、ＴＴＲ四量体は、典型的には統計的様式で組み合わされる、バリアントおよび／または野生型サブユニットで構成されていてもよい。ＴＴＲは、血清および脳脊髄液の両方におけるチロキシン（Ｔ４）およびレチノール結合ＲＢＰ（レチノール結合タンパク質）の運搬に寄与する。マウスＴｔｒ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列（ＰＡＭを含まない）の例は、それぞれ配列番号３４、３５、および３６に示されている。配列番号３４は、Ｔｔｒ転写開始部位の−６３に位置し（ゲノム座標：ビルドｍｍ１０、ｃｈｒ１８、＋鎖、２０６６５１８７−２０６６５２０９）、配列番号３５は、Ｔｔｒ転写開始部位の−１３４に位置し（ゲノム座標：ビルドｍｍ１０、ｃｈｒ１８、＋鎖、２０６６５１１６−２０６６５１３８）、配列番号３６は、Ｔｔｒ転写開始部位の−１１２に位置する（ゲノム座標：ビルドｍｍ１０、ｃｈｒ１８、＋鎖、２０６６５１３８−２０６６５１６０）。それぞれ配列番号３４、３５、および３６に示されているガイドＲＮＡ標的配列に対応するガイドＲＮＡ  ＤＮＡターゲティングセグメントは、それぞれ配列番号４１、４２、および４３に示されている。こうしたＤＮＡターゲティングセグメントを含むシングルガイドＲＮＡの例は、それぞれ配列番号３７、３８、および３９に示されて��る。
【０１８８】
標的遺伝子の他の例は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体（ＬＤＬＲ）である。例示的なヒトＰＣＳＫ９タンパク質および例示的なヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、それぞれＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８ＮＢＰ７およびＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２５５７３８により特定される。例示的なマウスＰＣＳＫ９タンパク質および例示的なマウスＰｃｓｋ９遺伝子は、それぞれＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８０Ｗ６５およびＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １００１０２により特定される。例示的なヒトＬＤＬＲタンパク質および例示的なヒトＬＤＬＲ遺伝子は、それぞれＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０１１３０およびＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ３９４９により特定される。例示的なマウスＬＤＬＲタンパク質および例示的なマウスＬｄｌｒ遺伝子は、それぞれＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ３５９５１およびＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １６８３５により特定される。
【０１８９】
ＬＤＬＲは、コレステロールを多く含むＬＤＬのエンドサイトーシスを媒介し、したがってＬＤＬの血漿レベルを維持する。これは、すべての有核細胞で生じるが、主として肝臓で生じ、約７０％のＬＤＬを循環から除去する。ＬＤＬ受容体は、細胞外液に由来するＬＤＬ粒子に結合し、細胞内への取込みを開始させ、したがってＬＤＬ粒子濃度を低減させる。ＬＤＬは、ＬＤＬＲに結合すると、エンドソーム内のＬＤＬＲ−ＬＤＬ複合体の内部移行を誘導する。エンドソーム環境の酸性度は、ＬＤＬＲがヘアピンコンフォメーションを取るように誘導する。コンフォメーション変化は、ＬＤＬＲによるそのＬＤＬリガンド放出を引き起こし、受容体は再利用され原形質膜に戻る。ヒトでは、ＬＤＬは、血液中にＬＤＬ−コレステロールが蓄積することにより、大多数の心血管疾患に寄与するプロセスであるアテローム性動脈硬化症の発症に直接的に関与する。
【０１９０】
ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲに結合すると、受容体−リガンド複合体のコンフォメーション変化を防止する。この阻害は、代わりにＬＤＬＲをリソソームへと再方向付けする。ＰＣＳＫ９は、主に原形質膜のＬＤＬＲレベルを低減させることにより、コレステロール恒常性に主要な調節的役割を果たす。ＬＤＬＲレベルの低減は、ＬＤＬ粒子の代謝減少をもたらし、高コレステロール血症を引き起こす場合がある。ＰＣＳＫ９が阻止されると、より多くのＬＤＬＲが再利用されて細胞表面に存在し、ＬＤＬ粒子を細胞外液から除去する。したがって、ＰＣＳＫ９の阻止は、血中ＬＤＬ粒子濃度を低下させることができるが、ＰＣＳＫ９の発現の増加は、血中ＬＤＬ粒子濃度を増加させる場合がある。したがって、本明細書の他所に記載のようにＰｃｓｋ９の発現活性化を使用して、アテローム性動脈硬化症（動脈の硬化）を引き起こす場合がある、高コレステロール血症（血液中に高レベルのコレステロールが存在すること）をモデル化することができる。
【０１９１】
マウスＬｄｌｒ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列（ＰＡＭを含まない）の例は、それぞれ配列番号７５、７６、および７７に示されている。それぞれ配列番号７５、７６、および７７に示されているガイドＲＮＡ標的配列に対応するガイドＲＮＡ  ＤＮＡターゲティングセグメントは、それぞれ配列番号８１、８２、および８３に示されている。こうしたＤＮＡターゲティングセグメントを含むシングルガイドＲＮＡの例は、それぞれ配列番号７８、７９、および８０に示されている。
【０１９２】
マウスＰｃｓｋ９遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列（ＰＡＭを含まない）の例は、それぞれ配列番号８９、９０、および９１に示されている。それぞれ配列番号８９、９０、および９１に示されているガイドＲＮＡ標的配列に対応するガイドＲＮＡ  ＤＮＡターゲティングセグメントは、それぞれ配列番号９５、９６、および９７に示されている。こうしたＤＮＡターゲティングセグメントを含むシングルガイドＲＮＡの例は、それぞれ配列番号９２、９３、および９４に示されている。
【０１９３】
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対合相補性および（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖中の、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方により決定される場所で生じ得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接してもよい。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端においてＰＡＭが隣接していてもよい（例えば、Ｃａｓ９の場合）。その代わりに、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端においてＰＡＭが隣接していてもよい（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０または約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）にあってもよい。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（つまり、非相補鎖にある）は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’であってもよく、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖におけるガイドＲＮＡ標的配列の直ぐ３’にある。そのため、相補鎖におけるＰＡＭに対応する配列（つまり、逆相補体）は、５’−ＣＣＮ２−３’ということになり、ここで、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする配列の直ぐ５’にある。一部のそのような場合では、Ｎ１およびＮ２は相補的であってもよく、Ｎ１−Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であってもよい（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝ＴおよびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであってもよく、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであってもよく、Ｒは、ＧまたはＡであってもよい。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉに由来するＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えばＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであってもよく、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであってもよく、Ｒは、ＧまたはＡであってもよい。一部の場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）では、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流にあり、配列５’−ＴＴＮ−３’を有してもよい。
【０１９４】
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質により認識されるＮＧＧモチーフ直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号１７）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号１８）である。例えば、ＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。５’末端のグアニンは、細胞でのＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの他の例は、Ｔ７ポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効率的な転写を促進するために、２つのグアニンヌクレオチドを５’末端に含んでいてもよい（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号１９）。例えば、ＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号１７〜１９の４〜２２の間のヌクレオチド長を有してもよい。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、配列番号１７〜１９の１４〜２０の間のヌクレオチド長を有してもよい。
【０１９５】
標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列に対応する領域内または領域付近の標的ＤＮＡの一方の鎖または両方の鎖（つまり、標的ＤＮＡの非相補鎖におけるガイドＲＮＡ標的配列、およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖における逆相補体）の切断をもたらすことができる。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあってもよい（例えば、ＰＡＭ配列に対して規定される場所）。「切断部位」としては、Ｃａｓタンパク質が、一本鎖切断または二本鎖切断を産生する標的ＤＮＡの位置が挙げられる。切断部位は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖にのみにあってもよく（例えば、ニッカーゼが使用される場合）または両方の鎖にあってもよい。切断部位は、両方の鎖の同じ位置にあってもよく（平滑末端を産生する；例えば、Ｃａｓ９）、または各鎖の異なる部位にあってもよい（付着末端（つまり、突出）を産生する；例えば、Ｃｐｆ１）。付着末端は、例えば、各々が異なる鎖の異なる切断部位に一本鎖切断を産生し、それにより二本鎖切断を産生する２つのＣａｓタンパク質を使用することにより産生することができる。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖に一本鎖切断を生じることができ、第２のニッカーゼは、突出配列が作り出されるように、ｄｓＤＮＡの第２の鎖に一本鎖切断を生じることができる。一部の場合では、第１の鎖のガイドＲＮＡ標的配列またはニッカーゼの切断部位は、第２の鎖のガイドＲＮＡ標的配列またはニッカーゼの切断部位と、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対により隔てられている。
Ｄ．リコンビナーゼおよびリコンビナーゼデリーター非ヒト動物
【０１９６】
キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、ＳＡＭ発現カセット、ガイドＲＮＡ発現カセット、またはリコンビナーゼ発現カセットを含む細胞または非ヒト動物であって、カセットは、本明細書で開示されているような部位特異的リコンビナーゼにより認識されるリコンビナーゼ認識部位により挟まれたポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの下流にある、細胞または非ヒト動物は、部位特異的リコンビナーゼの発現を駆動するリコンビナーゼ発現カセットをさらに含んでいてもよい。リコンビナーゼをコードする核酸は、ゲノム的に組み込まれてもよく、またはリコンビナーゼもしくは核酸は、本明細書の他所で開示された方法（例えば、ＬＮＰ媒介性送達またはＡＡＶ媒介性送達）を使用して、そのような細胞または非ヒト動物に導入してもよい。本明細書の他所で開示されているようなリコンビナーゼの組織特異的送達を提供する送達方法を選択することができる。
【０１９７】
部位特異的リコンビナーゼとしては、リコンビナーゼ認識部位間での組換えを促進することができ、２つの組換え部位が単一の核酸内で物理的に隔てられているかまたは別々の核酸上にある、酵素が挙げられる。リコンビナーゼの例は、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例は、Ｃｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンは、イントロンにより隔てられており、原核細胞でのその発現が防止される。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルを含んでいてもよい（例えば、ＮＬＳ−Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位としては、部位特異的リコンビナーゼにより認識され、組換え事象の基質としての役目を果たすことができるヌクレオチド配列が挙げられる。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
【０１９８】
リコンビナーゼ発現カセットは、本明細書で開示された他の発現カセットとは異なる標的ゲノム遺伝子座に組み込まれてもよく、または同じ標的遺伝子座にゲノム的に組み込まれてもよい（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の最初のイントロンに組み込まれるなど、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）。例えば、細胞または非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）およびリコンビナーゼ発現カセットの各々がヘテロ接合性であり、標的ゲノム遺伝子座の一方の対立遺伝子がＳＡＭ発現カセットを含み、標的ゲノム遺伝子座の第２の対立遺伝子がリコンビナーゼ発現カセット発現カセットを含んでいてもよい。同様に、細胞または非ヒト動物は、ガイドＲＮＡ発現カセット（例えば、ガイドＲＮＡアレイ発現カセット）およびリコンビナーゼ発現カセットの各々がヘテロ接合性であり、標的ゲノム遺伝子座の一方の対立遺伝子がガイドＲＮＡ発現カセットを含み、標的ゲノム遺伝子座の第２の対立遺伝子がリコンビナーゼ発現カセット発現カセットを含んでいてもよい。
【０１９９】
リコンビナーゼ発現カセットのリコンビナーゼ遺伝子は、任意の好適なプロモーターに作動可能に連結していてもよい。プロモーターの例は、本明細書の他所に開示されている。例えば、プロモーターは、組織特異的プロモーターまたは発生段階特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターは、所望の組織でのまたは所望の発生段階のみでの標的遺伝子の転写を選択的に活性化することができるため、有利である。例えば、Ｃａｓタンパク質の場合、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣａｓ媒介性毒性の可能性を低減することができる。マウスリコンビナーゼ欠失系統の例示的なプロモーターの非制限的なリストは、表２に提供されている。
【０２００】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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Ｅ．キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、相乗的活性化メディエーター、またはリコンビナーゼをコードする核酸
【０２０１】
また、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、リコンビナーゼ、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸が提供される。キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、およびリコンビナーゼは、本明細書の他所により詳細に記載されている。例えば、核酸は、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質の両方をコードする核酸を含む相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット、ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡアレイ発現カセット、リコンビナーゼ発現カセット、またはそれらの任意の組合せであってもよい。そのような核酸は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよく、直鎖状または環状であってもよい。ＤＮＡは、発現ベクターまたはターゲティングベクターなどのベクターの一部分であってもよい。また、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。本明細書で開示された核酸のいずれかを細胞に導入すると、コードされているキメラＤＮＡターゲティングタンパク質、キメラアダプタータンパク質、またはガイドＲＮＡを、細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。
【０２０２】
必要に応じて、特定の細胞または生物でタンパク質が効率的に翻訳されるように、核酸をコドン最適化してもよい。例えば、核酸を修飾して、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、または目的の任意の他の宿主細胞でより高い使用頻度を示すコドンに置換してもよい。
【０２０３】
核酸または発現カセットは、細胞または非ヒト動物のゲノムに（つまり染色体に）安定的に組み込まれてもよく、または染色体の外部に位置してもよい（例えば、染色体外で複製するＤＮＡ）。安定的に組み込まれる発現カセットまたは核酸は、非ヒト動物のゲノムに無作為に組み込まれてもよく（つまり、トランスジェニック）、または非ヒト動物のゲノムの所定領域に組み込まれてもよい（つまりノックイン）。一例では、核酸または発現カセットは、本明細書の他所に記載のようなセーフハーバー遺伝子座に安定的に組み込まれる。核酸または発現カセットが安定的に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、核酸もしくは発現カセットがヘテロ接合性であってもよく、または核酸もしくは発現カセットがホモ接合性であってもよい。例えば、標的ゲノム遺伝子座または細胞もしくは非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセットがヘテロ接合性であり、ガイドＲＮＡ発現カセットがヘテロ接合性であり、必要に応じて、各々は、異なる対立遺伝子の同じ標的ゲノム遺伝子座にある。
【０２０４】
本明細書に記載の核酸または発現カセットは、ｉｎ  ｖｉｖｏで非ヒト動物内にて発現させるための、またはｅｘ  ｖｉｖｏで細胞内にて発現させるための任意の好適なプロモーターに作動可能に連結していてもよい。非ヒト動物は、本明細書の他所に記載のような任意の好適な非ヒト動物であってもよい。一例として、核酸または発現カセット（例えば、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、またはキメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質の両方をコードする核酸を含むＳＡＭカセット）は、Ｒｏｓａ２６プロモーターなど、標的ゲノム遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結していてもよい。その代わりに、カセット核酸または発現カセットは、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーターまたはＵ６プロモーター）、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）など、外因性プロモーターに作動可能に連結していてもよい。そのようなプロモーターは周知であり、本明細書の他所に論述されている。発現構築物に使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体の１つまたは複数において活性であるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってもよい。
【０２０５】
例えば、ガイドＲＮＡをコードする核酸は、ヒトＵ６プロモーターまたはマウスＵ６プロモーターなどのＵ６プロモーターに作動可能に連結していてもよい。好適なプロモーター（例えば、ガイドＲＮＡを発現させるための）の具体的な例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
【０２０６】
必要に応じて、プロモーターは、１つの遺伝子（例えば、キメラＤＮＡターゲティングタンパク質をコードする遺伝子）および第２の遺伝子（例えば、ガイドＲＮＡまたはキメラアダプタータンパク質をコードする遺伝子）の発現を別の方向に駆動する二方向性プロモーターであってもよい。そのような二方向性プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ、ｄｉｓｔａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ、ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全で従来型の一方向性Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥ、およびＤＳＥの５’末端に逆向きに融合されたＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからなっていてもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥは、ＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスに隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することにより逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作出することにより、プロモーターを二方向にすることができる。例えば、ＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。２つの遺伝子を同時に発現するために二方向性プロモーターを使用することにより、送達を容易にする小型の発現カセットの生成が可能になる。
【０２０７】
マルチシストロン性発現構築物には、核酸の１つまたは複数が共に存在することができる。例えば、二シストロン性発現構築物には、キメラＣａｓタンパク質をコードする核酸およびキメラアダプタータンパク質をコードする核酸が共に存在することができる。例えば、図１Ａおよび１Ｂを参照されたい。マルチシストロン性発現ベクターは、同じｍＲＮＡ（つまり、同じプロモーターから産生される転写物）から２つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質を同時に発現する。タンパク質のマルチシストロン性発現に好適な戦略としては、例えば、２Ａペプチドの使用および内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用が挙げられる。例えば、そのような構築物は、以下のものを含んでいてもよい：（１）１つまたは複数のキメラＣａｓタンパク質および１つまたは複数のキメラアダプタータンパク質をコードする核酸、（２）２つまたはそれよりも多くのキメラアダプタータンパク質をコードする核酸、（３）２つまたはそれよりも多くのキメラＣａｓタンパク質をコードする核酸、（４）２つもしくはそれよりも多くのガイドＲＮＡまたは２つもしくはそれよりも多くのガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、（５）１つまたは複数のキメラＣａｓタンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、（６）１つまたは複数のキメラアダプタータンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、あるいは（７）１つまたは複数のキメラＣａｓタンパク質、１つまたは複数のキメラアダプタータンパク質、および１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡアレイをコードする核酸。一例として、そのようなマルチシストロン性ベクターは、１つまたは複数の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳開始を可能にすることができる。別の例として、そのようなマルチシストロン性ベクターは、１つまたは複数の２Ａペプチドを使用することができる。こうしたペプチドは、一般に１８〜２２アミノ酸の長さを有する小型の「自己切断性」ペプチドであり、同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数遺伝子をもたらす。リボソームは、２ＡペプチドのＣ末端でのグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップし、２Ａペプチドとその直ぐ下流のペプチドとの間の「切断」をもたらす。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（４）：  ｅ１８５５６を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。「切断」は、Ｃ末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間に生じる。これは、上流シストロンには、少数の追加の残基が末端に付加され、下流シストロンは、プロリンで始まることを意味する。その結果、「切断された」下流ペプチドは、そのＮ末端にプロリンを有する。２Ａ媒介性切断は、すべての真核細胞にて普遍的な現象である。ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、およびＣ型ロタウイルスに由来する２Ａペプチドが同定されている。例えば、Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６２７−６３８を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。使用することができる２Ａペプチドの例としては、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）；ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）；ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）；およびＦＭＤＶ  ２Ａ（Ｆ２Ａ）が挙げられる。例示的なＴ２Ａ配列、Ｐ２Ａ配列、Ｅ２Ａ配列、およびＦ２Ａ配列としては、以下のものが挙げられる：Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号２０）；Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号２１）；Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号２２）；およびＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号２３）。こうしたペプチドのいずれかの５’末端にＧＳＧ残基を付加して、切断効率を改善することができる。
【０２０８】
また、核酸または発現カセットはいずれも、コード配列の上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを含んでいてもよい。例えば、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、ＳＡＭ発現カセット、ガイドＲＮＡ発現カセット、またはリコンビナーゼ発現カセットは、発現カセットのコード配列（複数可）の上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、部位特異的リコンビナーゼにより認識されるリコンビナーゼ認識部位により挟まれていてもよい。また、必要に応じて、リコンビナーゼ認識部位は、例えば薬物耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットに隣接する。必要に応じて、リコンビナーゼ認識部位は、選択カセットに隣接しない。ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、コード配列によりコードされるタンパク質またはＲＮＡ（例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、またはリコンビナーゼ）の転写および発現を防止する。しかしながら、部位特異的リコンビナーゼに曝露されると、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは切除され、タンパク質またはＲＮＡを発現させることができる。
【０２０９】
発現カセット（例えば、キメラＣａｓタンパク質発現カセットまたはＳＡＭ発現カセット）のそのような構成は、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターが組織特異的または発生段階特異的様式で切除される場合、発現カセットを含む非ヒト動物での組織特異的発現または発生段階特異的発現を可能にすることができる。例えば、キメラＣａｓタンパク質の場合、それにより、細胞または非ヒト動物でのキメラＣａｓタンパク質の長期発現、あるいは非ヒト動物内の望ましくない発生段階でのまたは望ましくない細胞もしくは組織タイプでのキメラＣａｓタンパク質の発現による毒性を低減させることができる。例えば、Ｐａｒｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０（１）：ｅ０１１６４８４を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。発現カセットを含む非ヒト動物が、組織特異的または発生段階特異的プロモーターに作動可能に連結した部位特異的リコンビナーゼのコード配列をさらに含む場合、組織特異的または発生段階特異的様式でのポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの切除を達成することができる。そのため、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、そうした組織またはそうした発生段階でのみ切除され、組織特異的発現または発生段階特異的発現が可能になる。一例では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質、またはガイドＲＮＡを、肝臓特異的様式で発現させることができる。非ヒト動物のそのような「リコンビナーゼデリーター」系統を開発するために使用されているそのようなプロモーターの例は、本明細書の他所に開示されている。
【０２１０】
任意の転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルを使用することができる。「転写ターミネーター」は、本明細書で使用される場合、転写の終結を引き起こすＤＮＡ配列を指す。真核生物では、転写ターミネーターがタンパク質因子により認識され、終結の後にポリアデニル化が起こる。このポリアデニル化は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でポリ（Ａ）尾部がｍＲＮＡ転写物に付加されるプロセスである。哺乳動物ポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、切断およびポリアデニル化効率を増強する役目を果たす多様な補助配列により挟まれていてもよい、約４５ヌクレオチド長のコア配列からなる。コア配列は、ポリＡ認識モチーフまたはポリＡ認識配列と呼ばれ、切断およびポリアデニル化特異的因子（ＣＰＳＦ、ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）により認識される、ｍＲＮＡ中の高度に保存されている上流エレメント（ＡＡＴＡＡＡまたはＡＡＵＡＡＡ）、ならびに切断刺激因子（ＣｓｔＦ）が結合する明確には定義されていない下流領域（ＵまたはＧおよびＵを多く含む）からなる。使用することができる転写ターミネーターの例としては、例えば、以下のものが挙げられる：ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル、ウサギベータ−グロビンポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ポリアデニル化シグナル、ＡＯＸ１転写終結配列、ＣＹＣ１転写終結配列、または真核細胞での遺伝子発現の調節に好適であることが公知である任意の転写終結配列。
【０２１１】
部位特異的リコンビナーゼとしては、リコンビナーゼ認識部位間での組換えを促進することができ、２つの組換え部位が単一の核酸内で物理的に隔てられているかまたは別々の核酸にある、酵素が挙げられる。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例は、Ｃｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンは、イントロンにより隔てられており、原核細胞でのその発現が防止される。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルをさらに含んでいてもよい（例えば、ＮＬＳ−Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位としては、部位特異的リコンビナーゼにより認識され、組換え事象の基質としての役目を果たすことができるヌクレオチド配列が挙げられる。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
【０２１２】
本明細書で開示された発現カセットは、同様に他の成分を含んでいてもよい。そのような発現カセット（例えば、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、ＳＡＭ発現カセット、ガイドＲＮＡ発現カセット、またはリコンビナーゼ発現カセット）は、発現カセットの５’末端に３’スプライシング配列、および／またはコード配列（例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、またはリコンビナーゼをコードする）に続く第２のポリアデニル化シグナルをさらに含んでいてもよい。３’スプライシング配列という用語は、スプライシング機構により認識および結合され得る３’イントロン／エクソン境界の核酸配列を指す。発現カセットは、例えば薬物耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットをさらに含んでいてもよい。好適な選択マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）。必要に応じて、選択カセットは、部位特異的リコンビナーゼのリコンビナーゼ認識部位により挟まれていてもよい。発現カセットが、上記に記載のように、コード配列の上流でポリアデニル化シグナルに隣接するリコンビナーゼ認識部位をも含む場合、選択カセットは、同じリコンビナーゼ認識部位により挟まれていてもよく、または異なるリコンビナーゼにより認識される異なるセットのリコンビナーゼ認識部位により挟まれていてもよい。
【０２１３】
また、発現カセットは、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）などの１つまたは複数のレポータータンパク質をコードする核酸を含んでいてもよい。任意の好適なレポータータンパク質を使用することができる。例えば、本明細書の他所で規定されているような蛍光レポータータンパク質を使用してもよく、または非蛍光レポータータンパク質を使用してもよい。蛍光レポータータンパク質の例は、本明細書の他所に提供されている。非蛍光レポータータンパク質としては、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、およびＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ）およびベータ−グルクロニダーゼなどの、組織化学アッセイまたは生物発光アッセイで使用することができるレポータータンパク質が挙げられる。発現カセットは、フローサイトメトリーアッセイで検出することができるレポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光レポータータンパク質）および／または組織化学アッセイで検出することができるレポータータンパク質（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質）を含んでいてもよい。そのような組織化学アッセイの一例は、青色沈殿を産出するＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル（ｉｎｄｏｙｌ）−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）の加水分解による、またはベータ−メチルウンベリフェリルガラクトシド（ＭＵＧ）およびフルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）などの蛍光発生基質を使用する、組織化学的なｉｎ  ｓｉｔｕベータ−ガラクトシダーゼ発現の視覚化である。
【０２１４】
本明細書に記載の発現カセットは、任意の形態であってもよい。例えば、発現カセットは、ウイルスベクターなどのベクターまたはプラスミドに存在してもよい。発現カセットは、タンパク質またはＲＮＡの発現を指図する（例えば、上流のポリアデニル化シグナルの除去に際して）ことが可能な発現構築物のプロモーターに作動可能に連結していてもよい。その代わりに、発現カセットは、ターゲティングベクターに存在してもよい。例えば、ターゲティングベクターは、発現カセットに隣接する相同性アームを含んでいてもよく、相同性アームは、所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを指図して、内因性配列のゲノム組込みおよび／または置き換えを容易にするために好適である。
【０２１５】
本明細書に記載の発現カセットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよく、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞（例えば、胚性幹細胞）内に存在してもよく（例えば、ゲノム的に組み込まれているかまたは染色体外に）、またはｉｎ  ｖｉｖｏで生物（例えば、非ヒト動物）に存在してもよい（例えば、ゲノム的に組み込まれているかまたは染色体外に）。ｅｘ  ｖｉｖｏの場合、発現カセットは、胚性幹細胞（例えば、マウスまたはラット胚性幹細胞）または人工多能性幹細胞（例えば、ヒト人工多能性幹細胞）などの全能細胞などの、任意の生物に由来する任意のタイプの細胞に存在してもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏの場合、発現カセットは、任意のタイプの生物（例えば、本明細書の他所にさらに記載のような非ヒト動物）に存在してもよい。
【０２１６】
触媒的に不活性なＣａｓタンパク質をコードする核酸の具体的な例は、配列番号２に示されているｄＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。必要に応じて、核酸は、配列番号２４に示されている配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい（必要に応じて、配列は、配列番号２に示されているｄＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【０２１７】
キメラＣａｓタンパク質をコードする核酸の具体的な例は、配列番号１に示されているキメラＣａｓタンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。必要に応じて、核酸は、配列番号２５に示されている配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい（必要に応じて、配列は、配列番号１に示されているキメラＣａｓタンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【０２１８】
アダプターをコードする核酸の具体的な例は、配列番号７に示されているＭＣＰ配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。必要に応じて、核酸は、配列番号２６に示されている配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい（必要に応じて、配列は、配列番号７に示されているＭＣＰ配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【０２１９】
キメラアダプタータンパク質をコードする核酸の具体的な例は、配列番号６に示されているキメラアダプタータンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。必要に応じて、核酸は、配列番号２７に示されている配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい（必要に応じて、配列は、配列番号６に示されているキメラアダプタータンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【０２２０】
転写活性化ドメインをコードする核酸の具体的な例は、それぞれ配列番号３、８、または９に示されているＶＰ６４、ｐ６５、またはＨＳＦ１配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。必要に応じて、核酸は、それぞれ配列番号２８、２９、または３０に示されている配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい（必要に応じて、配列は、それぞれ配列番号３、８、または９に示されているＶＰ６４、ｐ６５、またはＨＳＦ１配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【０２２１】
１つの例示的な相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットは、５’から３’へと、（ａ）３’スプライシング配列、（ｂ）第１のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、（ｃ）薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）コード配列）、（ｄ）ポリアデニル化シグナル、（ｅ）第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、（ｆ）キメラＣａｓタンパク質コード配列（例えば、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−ＶＰ６４融合タンパク質）、（ｇ）２Ａタンパク質コード配列（例えば、Ｔ２Ａコード配列）、および（ｅ）キメラアダプタータンパク質コード配列（例えば、ＭＣＰ−ＮＬＳ−ｐ６５−ＨＳＦ１）を含む。例えば、図１Ａおよび配列番号３１（配列番号６４に示されているコード配列および配列番号４４に示されているコードタンパク質）を参照されたい。
【０２２２】
１つの例示的で一般的なガイドＲＮＡアレイ発現カセットは、５’から３’へと、（ａ）３’スプライシング配列、（ｂ）第１のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｒｏｘ部位）、（ｃ）薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）コード配列）、（ｄ）ポリアデニル化シグナル、（ｅ）第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｒｏｘ部位）、（ｆ）１つまたは複数のガイドＲＮＡ遺伝子を含むガイドＲＮＡ（例えば、第１のＵ６プロモーター続いて第１のガイドＲＮＡコード配列、第２のＵ６プロモーター続いて第２のガイドＲＮＡコード配列、および第３のＵ６プロモーター続いて第３のガイドＲＮＡコード配列）を含む。例えば、図５および配列番号３２を参照されたい。プロモーターおよびガイドＲＮＡコード配列を含む配列番号３２の領域は、配列番号６５に示されている。ガイドＲＮＡアレイ発現カセットのリコンビナーゼ認識部位は、ＳＡＭ発現カセットのリコンビナーゼ認識部位と同じであってもよく、または異なっていてもよい（例えば、同じリコンビナーゼにより認識されてもよく、または異なるリコンビナーゼにより認識されてもよい）。マウスＴｔｒを標的とするガイドＲＮＡをコードするそのような例示的なガイドＲＮＡアレイ発現カセットは、配列番号３３に示されている。プロモーターおよびガイドＲＮＡコード配列を含む配列番号３３の領域は、配列番号６６に示されている。
【０２２３】
別の例示的で一般的なガイドＲＮＡアレイ発現カセットは、１つまたは複数のガイドＲＮＡ遺伝子を含む（例えば、第１のＵ６プロモーター続いて第１のガイドＲＮＡコード配列、第２のＵ６プロモーター続いて第２のガイドＲＮＡコード配列、および第３のＵ６プロモーター続いて第３のガイドＲＮＡコード配列）。そのような例示的で一般的なガイドＲＮＡアレイ発現カセットは、配列番号６６に示されている。特定の遺伝子に対するそのようなガイドＲＮＡアレイ発現カセットの例は、例えば、配列番号３３、６６、６７、７１、８４、８５、および９８に示されている。
Ｆ．組込みのためのゲノム遺伝子座
【０２２４】
本明細書に記載の核酸および発現カセットは、細胞または非ヒト動物の標的ゲノム遺伝子座にゲノム的に組み込まれてもよい。遺伝子を発現することが可能な任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。
【０２２５】
本明細書に記載の核酸またはカセットを安定的に組み込むことができる標的ゲノム遺伝子座の例は、非ヒト動物のゲノムのセーフハーバー遺伝子座である。組み込まれた外因性ＤＮＡと宿主ゲノムとの相互作用は、組込みの信頼性および安全性を制限する場合があり、標的化遺伝子改変によるものではないが、代わりに周囲の内因性遺伝子に対する組込みの意図せざる効果によるものである顕在的表現型効果をもたらし得る。例えば、無作為に挿入された導入遺伝子は、位置効果およびサイレンシングの影響を受け、それらの発現は信頼性が低く予測不能なものになる可能性がある。同様に、染色体遺伝子座への外因性ＤＮＡの組込みは、周囲の内因性遺伝子およびクロマチンに影響を及ぼし、それにより細胞挙動および表現型が変更される場合がある。セーフハーバー遺伝子座としては、導入遺伝子または他の外因性核酸インサートが、細胞挙動または表現型を明白顕在的に変更に変更せずに（つまり、宿主細胞に有害効果を一切及ぼさずに）目的の組織すべてで安定的におよび信頼性高く発現され得る染色体遺伝子座が挙げられる。例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  １２：５１−５８を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、セーフハーバー遺伝子座は、挿入された遺伝子配列の発現が、近隣遺伝子からのいかなるリードスルー発現によっても妨害されないものであってもよい。例えば、セーフハーバー遺伝子座としては、外因性ＤＮＡが、内因性遺伝子の構造または発現に悪影響を及ぼさずに予測可能な様式で組み込まれ機能することができる染色体遺伝子座を挙げることができる。セーフハーバー遺伝子座は、例えば、非必須であるか、必ずしも必要でないか、または明白な表現型の結果をもたらさずに妨害することができる遺伝子内の遺伝子座などの、遺伝子外領域または遺伝子内領域を挙げることができる。
【０２２６】
例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座およびヒトにおけるその等価物は、すべての組織でオープンクロマチン構造を提供し、胚発生中および成体において遍在的に発現される。例えば、Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：３７８９−３７９４を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、Ｒｏｓａ２６遺伝子座は、高効率で標的とすることができ、Ｒｏｓａ２６遺伝子の妨害は明白な表現型をもたらさない。セーフハーバー遺伝子座の他の例としては、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、およびアルブミンが挙げられる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第７，９１４，７９６号；第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号；第８，４０９，８６１号；第８，５８６，５２６号；ならびに米国特許公開第２００３／０２３２４１０号；第２００５／０２０８４８９号；第２００５／００２６１５７号；第２００６／００６３２３１号；第２００８／０１５９９９６号；第２０１０／００２１８２６４号；第２０１２／００１７２９０号；第２０１１／０２６５１９８号；第２０１３／０１３７１０４号；第２０１３／０１２２５９１号；第２０１３／０１７７９８３号；第２０１３／０１７７９６０号；および第２０１３／０１２２５９１号を参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｒｏｓａ２６遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座の二対立遺伝子標的化は、否定的な帰結を示さないため、様々な遺伝子またはレポーターを２つのＲｏｓａ２６対立遺伝子へと標的化することができる。一例では、発現カセットは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の最初のイントロンなど、Ｒｏｓａ２６遺伝子座のイントロンに組み込まれる。例えば、図２を参照されたい。
【０２２７】
標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた発現カセットは、標的ゲノム遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結してもよく、または標的ゲノム遺伝子座に対して異種の外因性プロモーターに作動可能に連結してもよい。一例では、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、または相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットは、標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）に組み込まれ、標的ゲノム遺伝子座の内因性プロモーター（例えば、Ｒｏｓａ２６プロモーター）に作動可能に連結している。別の例では、ガイドＲＮＡ発現カセットは、標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）に組み込まれ、１つまたは複数の異種のプロモーター（例えば、各ガイドＲＮＡコード配列の上流の異なるＵ６プロモーターなどのＵ６プロモーター）に作動可能に連結している。
Ｇ．非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物
【０２２８】
本明細書に記載の核酸または発現カセットを含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物も提供される。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、雄であってもよく、または雌であってもよい。核酸または発現カセットは、細胞もしくは非ヒト動物のゲノムに（つまり染色体に）安定的に組み込まれてもよく、または染色体の外部に位置してもよい（例えば、染色体外で複製するＤＮＡ）。核酸または発現カセットは、非ヒト動物のゲノムに無作為に組み込まれてもよく（つまり、トランスジェニック）、または非ヒト動物のゲノムの所定領域（例えば、セーフハーバー遺伝子座）に組み込まれてもよい（つまりノックイン）。核酸または発現カセットが安定的に組み込まれている標的ゲノム遺伝子座は、核酸もしくは発現カセットがヘテロ接合性であってもよく、または核酸もしくは発現カセットがホモ接合性であってもよい。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一対立遺伝子がある場合はホモ接合性であると記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性であると記載される。本明細書に記載の安定的に組み込まれた核酸または発現カセットを含む非ヒト動物は、核酸または発現カセットをその生殖細胞系列に含んでいてもよい。
【０２２９】
例えば、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、本明細書で開示されているような、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、または相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット（キメラＣａｓタンパク質コード配列およびキメラアダプタータンパク質配列を両方とも含む）を含んでいてもよい。一例では、ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、キメラＣａｓタンパク質コード配列およびキメラアダプタータンパク質コード配列を両方とも含むＳＡＭ発現カセットを含む。一例では、ＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）は、ゲノムに安定的に組み込まれている。安定的に組み込まれたＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）は、非ヒト動物のゲノムに無作為に組み込まれていてもよく（つまり、トランスジェニック）、または非ヒト動物のゲノムの所定領域に組み込まれていてもよい（つまり、ノックイン）。一例では、ＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）は、セーフハーバー遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６）など、ゲノムの所定領域に安定的に組み込まれている。ＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）が安定的に組み込まれている標的ゲノム遺伝子座は、ＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）がヘテロ接合性であってもよく、またはホモ接合性であってもよい。
【０２３０】
必要に応じて、上記に記載のゲノム、細胞、または非ヒト動物は、ガイドＲＮＡ発現カセット（例えば、ガイドＲＮＡアレイ発現カセット）をさらに含んでいてもよい。ガイドＲＮＡ発現カセットは、細胞もしくは非ヒト動物のゲノムに（つまり、染色体に）安定的に組み込まれてもよく、または染色体の外部に位置してもよい（例えば、染色体外で複製するＤＮＡ、またはＡＡＶ、ＬＮＰ、もしくは本明細書で開示された任意の他の手段により細胞もしくは非ヒト動物に導入される）。ガイドＲＮＡ発現カセットは、非ヒト動物のゲノムに無作為に組み込まれてもよく（つまり、トランスジェニック）、または非ヒト動物のゲノムの所定領域（例えば、セーフハーバー遺伝子座）に組み込まれてもよい（つまりノックイン）。ガイドＲＮＡ発現カセットが安定的に組み込まれている標的ゲノム遺伝子座は、ガイドＲＮＡ発現カセットがヘテロ接合性であってもよく、またはホモ接合性であってもよい。一例では、ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）およびガイドＲＮＡ発現カセットを両方とも含む。一例では、両カセットはゲノム的に組み込まれる。ガイドＲＮＡ発現カセットは、ＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）とは異なる標的ゲノム遺伝子座に組み込まれてもよく、または同じ標的遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の最初のイントロンに組み込まれるなど、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）にゲノム的に組み込まれてもよい。例えば、ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）およびガイドＲＮＡ発現カセットの各々がヘテロ接合性であり、標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６）の一方の対立遺伝子がＳＡＭ発現カセット（またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）を含み、標的ゲノム遺伝子座の第２の対立遺伝子がガイドＲＮＡ発現カセット発現カセットを含んでいてもよい。
【０２３１】
必要に応じて、上記に記載のゲノム、細胞、または非ヒト動物はいずれも、リコンビナーゼ発現カセットをさらに含んでいてもよい。リコンビナーゼ発現カセットは、細胞もしくは非ヒト動物のゲノムに（つまり、染色体に）安定的に組み込まれてもよく、または染色体の外部に位置してもよい（例えば、染色体外で複製するＤＮＡ、またはＡＡＶ、ＬＮＰ、ＨＤＤ、もしくは本明細書で開示された任意の他の手段により細胞もしくは非ヒト動物に導入される）。リコンビナーゼ発現カセットは、非ヒト動物のゲノムに無作為に組み込まれてもよく（つまり、トランスジェニック）、または非ヒト動物のゲノムの所定領域（例えば、セーフハーバー遺伝子座）に組み込まれてもよい（つまりノックイン）。リコンビナーゼ発現カセットが安定的に組み込まれている標的ゲノム遺伝子座は、リコンビナーゼ発現カセットがヘテロ接合性であってもよく、またはホモ接合性であってもよい。リコンビナーゼ発現カセットは、本明細書で開示された他の発現カセットのいずれとも異なる標的ゲノム遺伝子座に組み込まれてもよく、または同じ標的遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の最初のイントロンに組み込まれるなど、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）にゲノム的に組み込まれてもよい。
【０２３２】
本明細書で提供されるゲノムまたは細胞は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞を含む、例えば、真核生物ゲノムまたは細胞であってもよい。用語「動物」は、哺乳動物、魚類、および鳥類を含む。哺乳動物ゲノムまたは細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯動物細胞、ラット細胞、マウス細胞、またはハムスター細胞であってもよい。他の非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、家畜（例えば、雌牛および去勢牛などのウシ種；ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルなどが挙げられる。飼育動物および農業動物も含まれる。用語「非ヒト」はヒトを除外する。
【０２３３】
また、細胞は、未分化状態または分化状態のいずれのタイプであってもよい。例えば、細胞は、全能細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってもよい。全能細胞としては、あらゆる細胞タイプを生じさせることができる未分化細胞が挙げられ、多能性細胞としては、１つよりも多くの分化細胞タイプへと発生する能力を有する未分化細胞が挙げられる。そのような多能性細胞および／または全能細胞は、例えば、ＥＳ細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ様細胞であってもよい。ＥＳ細胞としては、胚への導入に際して発生中の胚の任意の組織に寄与することが可能な胚由来の全能細胞または多能性細胞が挙げられる。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来してもよく、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれかの細胞に分化することが可能である。
【０２３４】
ヒト多能性細胞の例としては、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発生的に制限されたヒト前駆細胞、ならびに初回刺激を受けたヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞およびナイーブヒトｉＰＳ細胞などのヒトｉＰＳ細胞が挙げられる。人工多能性幹細胞としては、分化成体細胞から直接得ることができる多能性幹細胞が挙げられる。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリー転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリー転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、クルッペル様ファミリー（ＫＬＦ）転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、ならびに／またはＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、および／もしくはＧｌｉｓ１などの関連転写因子を含んでいてもよい特定のセットの再プログラミング因子を細胞に導入することにより生成することができる。また、ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、ｍｉＲＮＡ、転写因子の作用を模倣する低分子、または系譜指定因子（ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ）を使用することにより生成することができる。ヒトｉＰＳ細胞は、３つの脊椎動物胚葉、例えば内胚葉、外胚葉、または中胚葉の任意の細胞へと分化する能力により特徴付けられる。また、ヒトｉＰＳ細胞は、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で無制限に増殖する能力により特徴付けられる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ  （２００６）  Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。初回刺激を受けたヒトＥＳ細胞および初回刺激を受けたヒトｉＰＳ細胞としては、着床後胚盤葉上層細胞の特徴に類似した特徴を発現し、系譜指定および分化が関係づけられている細胞が挙げられる。ナイーブヒトＥＳ細胞およびナイーブヒトｉＰＳ細胞としては、着床前胚の内部細胞塊のＥＳ細胞の特徴に類似した特徴を発現し、系譜指定が関係づけられていない細胞が挙げられる。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （２００９）  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：４８７−４９２を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３５】
また、本明細書で提供される細胞は、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってもよい。細胞は、有系分裂的にコンピテントな細胞または有系分裂的に不活性な細胞、減数分裂的にコンピテントな細胞または減数分裂的に不活性な細胞であってもよい。また、同様に、細胞は、初代体細胞であってもよく、または初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞としては、生殖体、生殖細胞、生殖母細胞、でも未分化幹細胞でもない任意の細胞が挙げられる。例えば、細胞は、肝臓細胞、腎臓細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、血液細胞、メラノサイト、単球、単核細胞、単球前駆体、Ｂ細胞、赤血球巨核球細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆体、内分泌前駆細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、膠細胞、神経幹細胞、ニューロン、肝芽細胞、肝実質細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、腺管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色もしくは褐色脂肪細胞、または眼細胞（例えば、小柱網細胞、網膜色素上皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、網膜周皮細胞、結膜上皮細胞、結膜線維芽細胞、虹彩色素上皮細胞、角膜実質細胞、レンズ上皮細胞、非色素毛様体上皮細胞、眼球脈絡膜線維芽細胞、光受容細胞、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、またはアマクリン細胞）であってもよい。
【０２３６】
また、本明細書で提供される好適な細胞としては、初代細胞が挙げられる。初代細胞としては、生物、器官、または組織から直接的に単離された細胞または細胞の培養物が挙げられる。初代細胞としては、形質転換もされておらず不死でもない細胞が挙げられる。初代細胞としては、組織培養で以前に継代されていなかったか、または組織培養で以前に継代されているが、組織培養で無制限に継代することが可能ではない生物、器官、または組織から得られる任意の細胞が挙げられる。そのような細胞は、従来の技法により単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、単球、単核細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、膠細胞、肝実質細胞、骨格筋芽細胞、および平滑筋細胞を挙げることができる。例えば、初代細胞は、結合組織、筋組織、神経系組織、または上皮組織に由来してもよい。
【０２３７】
本明細書で提供される他の好適な細胞としては、不死化細胞が挙げられる。不死化細胞としては、通常は無制限に増殖することはないが、変異または変更により正常な細胞老化が回避され、代わりに分裂し続けることができる多細胞生物に由来する細胞が挙げられる。そのような変異または変更は、自然に生じる場合もあり、または意図的に誘導することができる。不死化細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞または２９３Ｔ細胞）、およびマウス胚性線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられる。多数のタイプの不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞としては、培養のためにまたは組換え遺伝子もしくはタンパク質を発現させるために典型的に使用される細胞が挙げられる。
【０２３８】
また、本明細書で提供される細胞としては、１細胞期胚（つまり、受精した卵母細胞または接合体）が挙げられる。そのような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景に由来してもよく（例えば、マウスの場合、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはそれらの組合せ）、新鮮または凍結であってもよく、自然繁殖またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精に由来してもよい。
【０２３９】
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってもよく、または疾患細胞もしくは変異体保有細胞であってもよい。
【０２４０】
本明細書に記載のような核酸または発現カセットを含む非ヒト動物は、本明細書の他所に記載の方法により作製することができる。用語「動物」は、哺乳動物、魚類、および鳥類を含む。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、げっ歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および家畜（例えば、雌牛および去勢牛などのウシ種；ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが挙げられる。飼育動物および農業動物も含まれる。用語「非ヒト」はヒトを除外する。好ましい非ヒト動物は、例えば、マウスおよびラットなどのげっ歯動物が挙げられる。
【０２４１】
非ヒト動物は、任意の遺伝的背景に由来してもよい。例えば、好適なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９およびＣ５７ＢＬ／６のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ系統に由来してもよい。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。また、好適なマウスは、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）に由来してもよい。同様に、好適なマウスは、前述の１２９系統のミックスまたは前述のＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来してもよい。
【０２４２】
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、ダークアグーチ（ＤＡ）ラット系統、ウィスターラット系統、ＬＥＡラット系統、スプラーグドーリー（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのフィッシャーラット系統を含む任意のラット系統に由来してもよい。また、ラットは、上記に列挙されている２つまたはそれよりも多くの系統のミックスに由来する系統から得ることができる。例えば、好適なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来してもよい。ＡＣＩラット系統は、白色の腹部および足を有する黒色アグーチおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手可能である。ダークアグーチ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチ外皮およびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手可能である。一部の場合では、好適なラットは、近交系ラット系統に由来してもよい。例えば、ＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。この文献は、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
ＩＩＩ．標的遺伝子の転写／発現を増加させる方法およびｉｎ  ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するための方法
【０２４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで１つもしくは複数の標的遺伝子の転写を活性化するため、または生きた動物の組織および臓器へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を評価するため、および生きた動物の組織および臓器中でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するために、相乗的活性化メディエーター系ならびに本明細書に記載の細胞および非ヒト動物を使用するための様々な方法が提供される。そのような方法により、本明細書の他の箇所に記載の発現カセットを含む非ヒト動物を使用することができる。
Ａ．標的遺伝子の発現を増加させる方法またはｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の転写を活性化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を試験する方法
【０２４４】
標的遺伝子の発現／転写を増加させる／活性化するため、または本明細書に記載の非ヒト動物を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の発現／転写を増加させる／活性化する本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系の能力を評価するための様々な方法が提供される。そのような非ヒト動物は、例えば、ＳＡＭ発現カセット（キメラＣａｓタンパク質コード配列およびキメラアダプタータンパク質コード配列を含む）を含んでもよい、またはキメラＣａｓタンパク質発現カセットもしくはキメラアダプタータンパク質発現カセットを含んでもよい。そのような方法は、非ヒト動物に、本明細書に開示されるキメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つまたは複数のアダプター結合エレメントをそれぞれ含む１つまたは複数のガイドＲＮＡを導入することを含んでもよい。１つまたは複数のガイドＲＮＡは、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、それらを、１つまたは複数の標的遺伝子内の標的配列にガイドし、それによって、１つまたは複数の標的遺伝子の発現を増加させることができる。そのような方法は、１つまたは複数の標的遺伝子の発現または転写を評価することをさらに含んでもよい。
【０２４５】
必要に応じて、標的遺伝子内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とするようにそれぞれ設計された、２つまたはそれより多いガイドＲＮＡを導入することができる。例えば、２つもしくはそれより多い、３つもしくはそれより多い、４つもしくはそれより多い、または５つもしくはそれより多いガイドＲＮＡを、単一の標的遺伝子を標的とするように設計することができる。あるいは、またはさらに、２つまたはそれより多い異なる標的遺伝子中の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とするようにそれぞれ設計された、２つまたはそれより多いガイドＲＮＡを導入することができる（すなわち、多重化）。
【０２４６】
必要に応じて、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、または相乗的活性化メディエーター発現カセット（キメラＣａｓタンパク質コード配列およびキメラアダプタータンパク質コード配列を含む）がコード配列（複数可）の上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを含み、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターが部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれる方法では、方法は、リコンビナーゼを非ヒト動物に導入することをさらに含んでもよい。リコンビナーゼは、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを切り出すことによって、下流のコード配列（複数可）の発現を可能にし得る。
【０２４７】
非ヒト動物が本明細書の他の箇所に記載されるガイドＲＮＡ発現カセットを既に含む一部の方法では、方法は、上流のポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを切り出すリコンビナーゼを非ヒト動物に導入することを単に含んでもよく、それによって、キメラＣａｓタンパク質および／またはキメラアダプタータンパク質の発現を可能にし、それによって、標的遺伝子の発現／転写が増加する／活性化される。
【０２４８】
必要に応じて、非ヒト動物がキメラＣａｓタンパク質発現カセットを含むが、キメラアダプタータンパク質発現カセットは含まない方法では、キメラアダプタータンパク質を非ヒト動物に導入することができる。同様に、非ヒト動物がキメラアダプタータンパク質発現カセットを含むが、キメラＣａｓタンパク質発現カセットは含まない方法では、キメラＣａｓタンパク質発現カセットを非ヒト動物に導入することができる。
【０２４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するための上記で提供された様々な方法を使用して、本明細書の他の箇所に記載のＣａｓ発現カセットを含む細胞を使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性をｅｘ  ｖｉｖｏで評価することもできる。
【０２５０】
ガイドＲＮＡおよび必要に応じて、リコンビナーゼは、本明細書の他の箇所に開示される任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路により、任意の形態（ガイドＲＮＡについてはＤＮＡまたはＲＮＡ；リコンビナーゼについてはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）で細胞または非ヒト動物に導入することができる。ガイドＲＮＡまたはリコンビナーゼは、一部の方法では、組織特異的様式で導入することができる。特定の方法では、送達は、ＡＡＶ媒介性送達によるものである。例えば、肝臓が標的化される場合、ＡＡＶ８を使用することができる。同様に、非ヒト動物または細胞がキメラＣａｓタンパク質発現カセットを含むが、キメラアダプタータンパク質発現カセットは含まない場合、キメラアダプタータンパク質は、本明細書の他の箇所に開示される任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路により、任意の形態（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）で細胞または非ヒト動物に導入することができる。あるいは、非ヒト動物または細胞がキメラアダプタータンパク質発現カセットを含むが、キメラＣａｓタンパク質発現カセットは含まない場合、キメラＣａｓタンパク質は、本明細書の他の箇所に開示される任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路により、任意の形態（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）で細胞または非ヒト動物に導入することができる。
【０２５１】
標的ゲノム遺伝子座の転写または発現の増加を評価するための方法は、本明細書の他の箇所に提供されており、周知である。評価は、本明細書の他の箇所に開示される任意の細胞型、任意の組織型、または任意の臓器型において行ってもよい。一部の方法では、肝臓細胞中での標的遺伝子の発現は、例えば、肝臓細胞中で標的ゲノム遺伝子座によって発現される分泌タンパク質の血清レベルを評価することによって評価される。標的遺伝子が特定の酵素活性を有するタンパク質をコードする場合、評価は、標的遺伝子の発現および／または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を測定することを含んでもよい。あるいは、またはさらに、評価は、非ヒト動物から単離された１つまたは複数の細胞中での発現を評価することを含んでもよい。評価は、非ヒト動物から標的臓器または組織を単離すること、および標的臓器または組織中での標的遺伝子の発現を評価することを含んでもよい。評価はまた、標的臓器または組織内の２つまたはそれより多い異なる細胞型中での標的遺伝子の発現を評価することを含んでもよい。同様に、評価は、非ヒト動物から非標的臓器または組織（例えば、２つまたはそれより多い非標的臓器または組織）を単離すること、および非標的臓器または組織中での標的遺伝子の発現を評価することを含んでもよい。
【０２５２】
一部の方法では、標的遺伝子は、本明細書の他の箇所に記載の疾患関連遺伝子であってもよい。例えば、標的遺伝子は、タンパク質凝集疾患または障害と関連する遺伝子であってもよい。具体例として、標的遺伝子は、タンパク質凝集疾患または障害と関連する遺伝子（例えば、Ｔｔｒ）であってもよく、方法は、その標的遺伝子の発現を増加させて、タンパク質凝集疾患または障害をモデル化することを含んでもよい。一部の具体例では、標的遺伝子は、Ｔｔｒであってもよい。必要に応じて、Ｔｔｒ遺伝子は、病因性変異（例えば、アミロイドーシスを引き起こす変異）または病因性変異の組合せを含んでもよい。そのような変異の例は、例えば、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／００７８７１に提供されている。
【０２５３】
他の方法では、標的遺伝子は、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症などの、疾患または状態と関連する経路に関与する遺伝子であってもよい。一部の具体例では、標的遺伝子は、Ｐｃｓｋ９またはＬｄｌｒであってもよい。他の方法では、標的遺伝子は、過剰発現された場合に、そのような疾患または状態をモデル化することができる遺伝子であってもよい。例えば、標的遺伝子は、Ｐｃｓｋ９であってもよく、方法は、Ｐｃｓｋ９の発現を増加させて、高コレステロール血症をモデル化することを含んでもよい。
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで標的遺伝子の発現を増加させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を最適化する方法
【０２５４】
細胞もしくは非ヒト動物へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を最適化するため、またはｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写活性化活性を最適化するための様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）第１の非ヒト動物または第１の細胞中で、上記の標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を試験する方法を１回目に実行するステップ；（ｂ）変数を変化させ、変化した変数を用いて、第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）または第２の細胞中で、方法を２回目に実行するステップ；および（ｃ）ステップ（ａ）における標的遺伝子の発現／転写と、ステップ（ｂ）における標的遺伝子の発現／転写とを比較し、標的遺伝子の最も高い発現／転写をもたらす方法を選択するステップを含んでもよい。
【０２５５】
あるいは、またはさらに、最も高い有効性、最も高い一貫性、または最も高い特異性をもたらす方法を選択することができる。より高い有効性とは、より高いレベルの標的遺伝子の発現／転写を指す（例えば、より高いパーセンテージの細胞が特定の標的細胞型内、特定の標的組織内、または特定の標的臓器内で標的化される）。より高い一貫性とは、１つより多い細胞、組織、または臓器の型が標的化される場合、異なる型の標的化された細胞、組織、または臓器の間での標的遺伝子の発現／転写のより一貫した増加を指す（例えば、標的臓器内のより多数の細胞型の発現／転写の増加）。特定の臓器が標的化される場合、より高い一貫性はまた、臓器内の全ての位置を通じた発現／転写のより一貫した増加を指してもよい。より高い特異性は、標的化される標的遺伝子または複数の遺伝子に関するより高い特異性、標的化される細胞型に関するより高い特異性、標的化される組織型に関するより高い特異性、または標的化される臓器に関するより高い特異性を指してもよい。例えば、標的特異性の増大とは、他の遺伝子に対するより小さいオフターゲット効果（例えば、標的ゲノム遺伝子座の改変の代わりに、またはそれに加えて、意図しない、オフターゲットゲノム遺伝子座（例えば、近隣のゲノム遺伝子座）での転写が増加したより低いパーセンテージの標的細胞）を指す。同様に、細胞型、組織、または臓器型特異性の増大とは、特定の細胞型、組織型、または臓器型が標的化される場合、オフターゲット細胞型、組織型、または臓器型におけるより小さい効果を指す（例えば、特定の臓器（例えば、肝臓）が標的化される場合、意図されない標的である臓器または組織中の細胞において、より小さい効果（すなわち、発現／転写の増加）がある）。
【０２５６】
変化した変数は、任意のパラメーターであってもよい。一例として、変化した変数は、ガイドＲＮＡ（または必要に応じて、リコンビナーゼもしくは他の成分）が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法であってもよい。ＬＮＰ、ＨＤＤ、およびＡＡＶなどの、送達方法の例は、本明細書の他の箇所に開示される。例えば、変化した変数は、ＡＡＶ血清型であってもよい。別の例として、変化した変数は、ガイドＲＮＡ（または必要に応じて、リコンビナーゼもしくは他の成分）の細胞または非ヒト動物への導入のための投与経路であってもよい。静脈内、硝子体内、実質内、および点鼻（ｎａｓａｌ  ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）などの投与経路の例は、本明細書の他の箇所に開示される。
【０２５７】
別の例として、変化した変数は、導入されるガイドＲＮＡ（または必要に応じて、リコンビナーゼもしくは他の構成成分）の濃度または量であってもよい。別の例として、変化した変数は、ガイドＲＮＡ（または必要に応じて、リコンビナーゼもしくは他の構成成分）が導入される回数または頻度であってもよい。別の例として、変化した変数は、ガイドＲＮＡ（または必要に応じて、リコンビナーゼもしくは他の構成成分）が導入される形態であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの形態で、またはＲＮＡの形態で導入することができる。同様に、ガイドＲＮＡ（または必要に応じて、リコンビナーゼもしくは他の構成成分）は、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどの、様々な組合せの改変を含んでもよい。別の例として、変化した変数は、導入されるガイドＲＮＡの配列であってもよい（例えば、異なる配列を有する異なるガイドＲＮＡを導入する）。
Ｃ．細胞および非ヒト動物へのガイドＲＮＡおよび他の構成成分の導入
【０２５８】
本明細書に開示される方法は、細胞または非ヒト動物に、本明細書の他の箇所に記載の１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡアレイ、リコンビナーゼ、または他の構成成分を導入することを含む。「導入」は、細胞または非ヒト動物に、核酸またはタンパク質が細胞の内部または非ヒト動物内の細胞の内部へのアクセスを獲得するような様式で核酸またはタンパク質を提示することを含む。導入は、任意の手段によって実現することができ、２つまたはそれより多い構成成分（例えば、２つの構成成分、または全部の構成成分）を任意の組合せで同時にまたは逐次的に細胞または非ヒト動物に導入することができる。例えば、第１のガイドＲＮＡを、第２のガイドＲＮＡの導入前に細胞または非ヒト動物に導入することができる。さらに、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ送達方法または異なる送達方法によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。同様に、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ投与経路または異なる投与経路によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。
【０２５９】
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ）の形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。同様に、リコンビナーゼなどのタンパク質構成成分を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入された場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡを、ＡＡＶによって送達し、Ｕ６プロモーターの下でｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。そのようなＤＮＡは、１つまたは複数の発現構築物中にあってもよい。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成成分であってもよい。あるいは、それらは２つまたはそれよりも多くの核酸分子中の任意の組合せで分けることができる（すなわち、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードするＤＮＡおよび１つまたは複数のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡが別々の核酸分子の構成成分であってもよい）。
【０２６０】
ガイドＲＮＡまたはリコンビナーゼ（または他の構成成分）をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列の発現を指令することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移行させることができる任意の核酸構築物を含む。発現構築物中で使用することができる好適なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってもよい。必要に応じて、プロモーターは、ガイドＲＮＡの一方向の発現および別の構成成分の他方向の発現の両方を駆動する双方向プロモーターであってもよい。そのような双方向プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥおよびＤＳＥの５’末端と逆配向で融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターからなってもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスと隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作出することによってプロモーターを双方向性にすることができる。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。ガイドＲＮＡと別の構成成分とをコードする遺伝子を同時に発現させるための双方向プロモーターを使用することにより、送達を容易にするための緻密な発現カセットの生成が可能になる。
【０２６１】
ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（もしくは他の構成成分）をコードする核酸は、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、分解産物が閾値未満、例えば、出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満で残存する所与の保存条件（例えば、−２０℃、４℃、もしくは周囲温度）下でその期間を延長する；またはｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を増加させる）担体を含む組成物中で提供することができる。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管が挙げられる。
【０２６２】
核酸またはタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入を可能にするための様々な方法および組成物が本明細書で提供される。核酸を様々な細胞型に導入するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、安定なトランスフェクション法、一過的トランスフェクション法、およびウイルス媒介性方法が挙げられる。
【０２６３】
トランスフェクションプロトコールならびに核酸配列を細胞に導入するためのプロトコールは、異なる場合がある。非限定的なトランスフェクション方法として、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２  （２）：  ４５６−６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４  （４）：  １５９０−４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｍ  （１９９１）．  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．  ｐｐ．  ９６−９７）；デンドリマー；またはＤＥＡＥ−デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する、化学に基づくトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法として、エレクトロポレーション、ソノポレーション、および光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションとして、遺伝子銃の使用、またはマグネットアシストトランスフェクションが挙げられる（Ｂｅｒｔｒａｍ  （２００６）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，  ２７７−２８）。ウイルスによる方法をトランスフェクションのために使用することもできる。
【０２６４】
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、エレクトロポレーションにより、細胞質内注射により、ウイルス感染により、アデノウイルスにより、アデノ随伴ウイルスにより、レンチウイルスにより、レトロウイルスにより、トランスフェクションにより、脂質媒介性トランスフェクションにより、またはヌクレオフェクションにより媒介することもできる。ヌクレオフェクションは、核酸基質を、細胞質だけでなく核膜を通って、および核内にも送達することを可能にする、改善されたエレクトロポレーション技術である。さらに、本明細書に開示される方法におけるヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常のエレクトロポレーションでは７００万個であるのと比較してたった約２００万個）。一例では、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用してヌクレオフェクションを実施する。
【０２６５】
核酸またはタンパク質の細胞（例えば、受精卵）への導入は、微量注射によって達成することもできる。受精卵（すなわち、１細胞期胚）中で、微量注射は、母系および／もしくは父系前核または細胞質への注射であってもよい。微量注射が一方だけの前核への注射である場合、父系前核は、そのサイズがより大きいため、好ましい。あるいは、核／前核と細胞質の両方への注射によって、微量注射を実行することができる：針を最初に核／前核に導入し、第１の量を注入することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、第２の量を細胞質に注入することができる。微量注射を実行するための方法は、周知である。例えば、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｇｙ  Ａ，  Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ  Ｍ，  Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ  Ｋ，  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｒ．，  ２００３，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．    Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい；また、Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０７：１５０２２−１５０２６およびＭｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０９：９３５４−９３５９も参照されたい。
【０２６６】
核酸またはタンパク質を細胞または非ヒト動物に導入するための他の方法は、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質−ナノ粒子媒介性送達、細胞透過性ペプチド媒介性送達、または埋込み可能デバイス媒介性送達を含んでもよい。特定の例として、核酸またはタンパク質を、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体に入れて細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達の一部の具体例としては、流体力学的送達、ウイルス媒介性送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達）、および脂質−ナノ粒子媒介性送達が挙げられる。
【０２６７】
核酸およびタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって達成することができる。流体力学的送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞内ＤＮＡ送達のための方法として出現したものである。実質細胞への遺伝子送達のためには、必須のＤＮＡ配列のみを、選択された血管を介して注射し、現行のウイルスベクターおよび合成ベクターに関連する安全性の懸念を排除する必要がある。血流中に注射されると、ＤＮＡは血液が接近可能な種々の組織中の細胞に到達することが可能である。流体力学的送達では、大きく膜不浸透性の化合物が実質細胞に進入することを妨げる内皮および細胞膜の物理的関門を克服するために大きな体積の溶液を循環中の圧縮できない血液中に急速注射することによって生じる力を使用する。この方法は、ＤＮＡ送達に加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＮＡ、タンパク質、および他の小さな化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｍａｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２８（４）：６９４−７０１を参照されたい。
【０２６８】
核酸の導入は、ＡＡＶ媒介性送達またはレンチウイルス媒介性送達などの、ウイルス媒介性送達によって達成することもできる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る。ウイルスは、宿主ゲノムに統合できるか、またはその代わりに、宿主ゲノムに統合しない。そのようなウイルスを、免疫が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製能力を有してもよく、または複製欠損性であってもよい（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングのさらなるラウンドにとって必要な１つまたは複数の遺伝子の欠損）。ウイルスは、一過的発現、長期的に続く発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、もしくは３ヶ月間）、または永続的発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こすことができる。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
【０２６９】
ｓｓＤＮＡ  ＡＡＶゲノムは、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの逆方向末端反復によって挟まれた、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐからなる。ＡＡＶ導入プラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２個のＩＴＲの間に置かれ、ＲｅｐおよびＣａｐはｉｎ  ｔｒａｎｓに供給することができる。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶは、アデノウイルスに由来する遺伝子を含有するヘルパープラスミドを必要としてもよい。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）は、ＡＡＶ複製を媒介した。例えば、導入プラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドを、アデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含有するＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を産生することができる。あるいは、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を、単一のプラスミド中で組み合わせることができる。同様のパッケージング細胞および方法を、レトロウイルスなどの他のウイルスのために使用することができる。
【０２７０】
ＡＡＶの複数の血清型が同定されている。これらの血清型は、それらが感染する細胞型（すなわち、その向性）において異なり、特定の細胞型の選択的形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。心臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。腎臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ２が挙げられる。肺組織のための血清型としては、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が挙げられる。膵臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ８が挙げられる。光受容体細胞のための血清型としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。網膜色素上皮組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。骨格筋組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。肝臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特に、ＡＡＶ８が挙げられる。
【０２７１】
向性は、異なるウイルス血清型に由来するキャプシドとゲノムとの混合である、偽型化によってさらに精緻化することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５に由来するキャプシド中にパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。偽型化されたウイルスの使用は、形質導入効率を改善する、ならびに向性を変更することができる。異なる血清型から誘導されるハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルス向性を変更することもできる。例えば、ＡＡＶ−ＤＪは、８つの血清型に由来するハイブリッドキャプシドを含有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで広範囲の細胞型にわたって高い感染性を示す。ＡＡＶ−ＤＪ８は、ＡＡＶ−ＤＪの特性を示すが、脳による取込みが増強されている。ＡＡＶ血清型を、変異によって改変することもできる。ＡＡＶ２の変異による改変の例としては、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ３の変異による改変の例としては、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ６の変異による改変の例としては、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが挙げられる。他の偽型化／改変されたＡＡＶバリアントとしては、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが挙げられる。
【０２７２】
導入遺伝子発現を促進するために、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するための細胞のＤＮＡ複製機構に依存するため、導入遺伝子発現は遅延し得る。この遅延に対処するために、感染すると自発的にアニーリングすることができる相補配列を含有するｓｃＡＡＶを使用して、宿主細胞のＤＮＡ合成に関する要件を取り除くことができる。
【０２７３】
パッケージング能力を増大させるために、より長い導入遺伝子を、第１のＡＡＶ導入プラスミドが３’スプライスドナーを有し、第２のＡＡＶ導入プラスミドが５’スプライスアクセプターを有する、２つのＡＡＶ導入プラスミドの間に分割してもよい。細胞の共感染の際に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これはより長い導入遺伝子の発現を可能にするが、発現はあまり効率的ではない。能力を増大させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、共発現が相同組換えを誘導し完全長導入遺伝子の発現を誘導するように、導入遺伝子を、実質的な配列重複を有する２つの導入プラスミド間に分割することができる。
【０２７４】
核酸およびタンパク質の導入を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって達成することもできる。例えば、ＬＮＰ媒介性送達を使用して、ＲＮＡの形態でガイドＲＮＡを送達することができる。そのような方法による送達は、ガイドＲＮＡの一過的存在をもたらし、生分解性脂質は、クリアランスを改善し、許容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、その細胞取込みを改善しながら、生体分子を分解から保護することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に会合する複数の脂質分子を含む粒子である。これらは、ミクロスフェア（単層および多層小胞、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相を含む。そのような脂質ナノ粒子を使用して、送達のための１つまたは複数の核酸またはタンパク質を封入することができる。陽イオン脂質を含有する製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含有され得る他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏで存在し得る期間を増加させるステルス脂質である。好適な陽イオン脂質、中性脂質、陰イオン脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例は、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、陽イオン脂質および１つまたは複数の他の構成成分を含んでもよい。一例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの必要に応じた中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含んでもよい。
【０２７５】
ＬＮＰは、下記：（ｉ）封入およびエンドソーム脱出のための脂質；（ｉｉ）安定化のための中性脂質；（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質；ならびに（ｉｖ）ステルス脂質のうちの１つもしくは複数または全部を含有してもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１８）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２２：１−９およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ９などの、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。
【０２７６】
封入およびエンドソーム脱出のための脂質は、陽イオン脂質であってもよい。脂質は、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であってもよい。好適な脂質の一例は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートである、リピドＡまたはＬＰ０１である。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１８）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２２：１−９およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）とも呼ばれる、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ）ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）である、リピドＢである。好適な脂質の別の例は、２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）である、リピドＣである。好適な脂質の別の例は、３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエートである、リピドＤである。
【０２７７】
本明細書に記載のＬＮＰ中での使用にとって好適な一部のそのような脂質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰとしては、少なくとも７５％の脂質が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが挙げられる。別の例として、少なくとも５０％のＬＮＰが、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失する。
【０２７８】
そのような脂質は、それらが存在する媒体のｐＨに応じてイオン化可能であってもよい。例えば、わずかに酸性の媒体中では、脂質はプロトン化され、したがって、正電荷を担持し得る。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などの、わずかに塩基性の媒体中では、脂質はプロトン化されず、したがって、電荷を担持しない。一部の実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。電荷を担持するそのような脂質の能力は、その固有のｐＫａと関連する。例えば、脂質は、独立に、約５．８〜約６．２の範囲のｐＫａを有してもよい。
【０２７９】
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、そのプロセシングを改善するように機能する。好適な中性脂質の例としては、様々な中性脂質、非荷電脂質または両性イオン性脂質が挙げられる。本開示における使用にとって好適な中性リン脂質の例としては、限定されるものではないが、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン、およびその組合せが挙げられる。例えば、中性リン脂質を、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択することができる。
【０２８０】
ヘルパー脂質は、トランスフェクションを増強する脂質を含む。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性の増強を含んでもよい。ある特定の場合、ヘルパー脂質は、膜融合性を増強することができる。ヘルパー脂質としては、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールが挙げられる。好適なヘルパー脂質の例としては、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノール、およびコレステロールヘミスクシネートが挙げられる。一例では、ヘルパー脂質は、コレステロールまたはコレステロールヘミスクシネートであってもよい。
【０２８１】
ステルス脂質としては、ナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏで存在し得る期間を変更する脂質が挙げられる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減させること、および粒径を制御することによって製剤化プロセスを補助することができる。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性をモジュレートすることができる。好適なステルス脂質としては、脂質部分に親水性頭部基が連結された脂質が挙げられる。
【０２８２】
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。ある特定のＬＮＰ製剤において、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する、ＰＥＧ２０００とも呼ばれる、ＰＥＧ−２Ｋである。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
【０２８３】
ステルス脂質の脂質部分は、例えば、鎖が、例えば、アミドまたはエステルなどの１つまたは複数の官能基を含んでもよい、約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立に含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものなどの、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから得ることができる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換されたアルキル基をさらに含んでもよい。
【０２８４】
一例として、ステルス脂質を、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール））、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）−２０００−ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡ）、および１，２−ジステアリールオキシプロピル−３−アミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡ）から選択することができる。１つの特定の例では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧであってもよい。
【０２８５】
ＬＮＰは、製剤中に異なるそれぞれのモル比の構成成分脂質を含んでもよい。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％〜約６０モル％、約３５モル％〜約５５モル％、約４０モル％〜約５０モル％、約４２モル％〜約４７モル％、または約４５モル％であってもよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％〜約６０モル％、約３５モル％〜約５５モル％、約４０モル％〜約５０モル％、約４１モル％〜約４６モル％、または約４４モル％であってもよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％〜約２０モル％、約５モル％〜約１５モル％、約７モル％〜約１２モル％、または約９モル％であってもよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％〜約１０モル％、約１モル％〜約５モル％、約１モル％〜約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってもよい。
【０２８６】
ＬＮＰは、封入しようとする核酸の生分解性脂質の正荷電アミン基（Ｎ）と、負荷電リン酸基（Ｐ）との様々な比を有してもよい。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５〜約１００、約１〜約５０、約１〜約２５、約１〜約１０、約１〜約７、約３〜約５、約４〜約５、約４、約４．５、または約５であってもよい。
【０２８７】
一部のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含んでもよい。Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、様々な比であってもよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１〜約１：２５の範囲、約１０：１〜約１：１０の範囲、約５：１〜約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ  ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１〜約１：５、または約１０：１のＣａｓ  ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ  ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。
【０２８８】
好適なＬＮＰの具体例は、４．５という窒素のリン酸に対する（Ｎ／Ｐ）比を有し、４５：４４：９：２のモル比で生分解性陽イオン脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含有する。生分解性陽イオン脂質は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであってもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１８）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２２：１−９を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）とも呼ばれる、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ）ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）である、リピドＢである。好適な脂質の別の例は、２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）である、リピドＣである。好適な脂質の別の例は、３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエートである、リピドＤである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）としても公知）が挙げられる。
【０２８９】
好適なＬＮＰの別の具体例は、６という窒素のリン酸に対する（Ｎ／Ｐ）比を有し、５０：３８：９：３のモル比で生分解性陽イオン脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含有する。生分解性陽イオン脂質は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであってもよい。
【０２９０】
送達様式は、免疫原性を低下させるように選択することができる。例えば、異なる構成成分を、異なる様式（例えば、二峰性送達（ｂｉ−ｍｏｄａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ））によって送達することができる。これらの異なる様式は、対象に送達される分子に対して異なる薬力学または薬物動態特性を付与することができる。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。一部の送達様式（例えば、自律的複製またはゲノム組込みによって細胞中で持続する核酸ベクターの送達）は、分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過的であり、あまり持続的ではない（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。例えば、ＲＮＡとしての、より一過的な様式での構成成分の送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が短期間だけ存在し、活性であることを確実にし、免疫原性を低減させることができる。そのような一過的送達はまた、オフターゲット改変の可能性を低減することもできる。
【０２９１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の適切な経路によるものであってもよい。全身性投与様式としては、例えば、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路の例としては、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が挙げられる。具体例は、静脈内注入である。局部投与様式としては、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核中もしくは被殻中）、大脳皮質、中心前回、海馬（例えば、歯状回もしくはＣＡ３領域中）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床下部、蓋、被蓋、または黒質への局部実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および経強膜的経路が挙げられる。有意により少量の構成成分（全身的手法と比較して）は、全身的に（例えば、静脈内）投与される場合と比較して、局部的に（例えば、実質内または硝子体内）投与される場合に効果を発揮し得る。局部投与様式はまた、治療有効量の構成成分が全身的に投与される場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減するか、または除去することもできる。
【０２９２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含めた任意の適切な経路によるものであってもよい。具体例は、静脈内注入である。点鼻および硝子体内注射は、他の具体例である。ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）を含む組成物を、１つまたは複数の生理的かつ薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に依存し得る。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または助剤が製剤の他の成分に適合し、そのレシピエントに対して実質的に有害でないことを意味する。
【０２９３】
投与頻度および用量の数は、他の因子の中でも、外因性ドナー核酸またはガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。核酸またはタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入は、１回またはある期間にわたって複数回実施することができる。例えば、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、導入を実施することができる。
Ｄ．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の測定および標的遺伝子の発現の評価
【０２９４】
本明細書に開示される方法は、標的遺伝子の発現を評価することをさらに含んでもよい。発現または活性を測定するための方法は、改変される標的遺伝子に依存する。
【０２９５】
例えば、標的遺伝子は、ＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子を含み、発現を評価する方法は、コードされるＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現または活性を測定することを含んでもよい。例えば、コードされるタンパク質が血清中に放出されるタンパク質である場合、コードされるタンパク質の血清レベルを測定することができる。ＲＮＡおよびタンパク質のレベルおよび活性を測定するためのアッセイは、周知である。
【０２９６】
非ヒト動物における標的遺伝子の発現の評価は、任意の組織または臓器に由来する任意の細胞型におけるものであってもよい。例えば、標的遺伝子の発現を、同じ組織もしくは臓器に由来する複数の細胞型において、または組織もしくは臓器内の複数の位置に由来する細胞において評価することができる。これは、標的組織もしくは臓器内の細胞型が標的とされているか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが組織もしくは臓器のどの部分に到達し、それらが改変されているかに関する情報を提供することができる。別の例として、標的遺伝子の発現を、複数の組織型または複数の臓器において評価することができる。特定の組織または臓器が標的とされる方法では、これは、どれぐらい効率的に組織または臓器が標的化されるか、および他の組織または臓器においてオフターゲット効果があるかどうかに関する情報を提供することができる。
ＩＶ．Ｃａｓ発現カセットおよび／またはリコンビナーゼ発現カセットを含む非ヒト動物を作製する方法
【０２９７】
本明細書の他の箇所に開示される、相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット（キメラＣａｓタンパク質コード配列およびキメラアダプタータンパク質発現コード配列を含む）、ガイドＲＮＡ発現カセット、およびリコンビナーゼ発現のうちの１つもしくは複数または全部を含む非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。同様に、本明細書の他の箇所に開示される、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、ガイドＲＮＡ発現カセット、およびリコンビナーゼ発現のうちの１つもしくは複数または全部を含む非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変生物を作り出すための任意の都合のよい方法またはプロトコールが、そのような遺伝子改変非ヒト動物を作り出すのに好適である。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４２：１９．１１：１９．１１．１−１９．１１．２２およびＧａｍａ  Ｓｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｆｕｎｃｔ．  ２１４（２−３）：９１−１０９を参照されたい。そのような遺伝子改変非ヒト動物は、例えば、標的化遺伝子座（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｏｃｕｓ）（例えば、Ｒｏｓａ２６などのセーフハーバー遺伝子座）での遺伝子ノックインによって、または無作為に組み込まれる導入遺伝子の使用によって生成することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０９３６２２およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。構築物をＲｏｓａ２６遺伝子座に標的化する方法は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／００１７２９０、ＵＳ２０１１／０２６５１９８、およびＵＳ２０１３／０２３６９４６に記載されている。
【０２９８】
例えば、本明細書の他の箇所に開示される発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む非ヒト動物を作り出す方法は、（１）発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップ；（２）発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および（４）宿主胚を代理母に移植し、懐胎させるステップを含んでもよい。例えば、本明細書の他の箇所に開示される発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む非ヒト動物を作り出す方法は、（１）発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップ；（２）発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および（４）宿主胚を代理母において懐胎させるステップを含んでもよい。必要に応じて、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚を、胚盤胞期までインキュベートした後、代理母に移植し、懐胎させて、Ｆ０非ヒト動物を作り出すことができる。次いで、代理母は、発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むＦ０世代の非ヒト動物を作り出すことができる。
【０２９９】
方法は、改変された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を同定するステップをさらに含んでもよい。様々な方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を同定することができる。
【０３００】
ゲノムを改変するステップは、例えば、本明細書の他の箇所に開示される発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むように標的ゲノム遺伝子座を改変するために、外因性ドナー核酸（例えば、ターゲティングベクター）を使用することができる。一例として、ターゲティングベクターは、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同アームと、標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同アームとを含んでもよい。外因性ドナー核酸はまた、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸挿入断片を含んでもよい。標的ゲノム遺伝子座中への核酸挿入断片の組込みは、標的ゲノム遺伝子座中での目的の核酸配列の付加、標的ゲノム遺伝子座中での目的の核酸配列の欠失、または標的ゲノム遺伝子座中での目的の核酸配列の置き換え（すなわち、欠失および挿入）をもたらし得る。相同アームは、本明細書の他の箇所に開示される発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む挿入核酸に隣接して、標的化ゲノム遺伝子座（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｕｓ）を生成することができる。
【０３０１】
外因性ドナー核酸は、非相同末端結合媒介挿入または相同組換えのためのものであってもよい。外因性ドナー配列は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖形態であっても環状形態であってもよいデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含んでもよい。例えば、修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であってもよい。
【０３０２】
外因性ドナー核酸はまた、非標的内因性標的ゲノム遺伝子座には存在しない異種配列を含んでもよい。例えば、外因性ドナー核酸は、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれた選択カセットなどの、選択カセットを含んでもよい。
【０３０３】
一部の外因性ドナー核酸は、相同アームを含む。外因性ドナー配列が核酸挿入断片も含む場合、相同アームは核酸挿入断片に隣接してよい。参照しやすくするために、本明細書では、相同アームを５’および３’（すなわち、上流および下流の）相同アームと称する。この用語法は、外因性ドナー配列内の核酸挿入断片に対する相同アームの相対的な位置に関する。５’および３’相同アームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と称される標的ゲノム遺伝子座内の領域に対応する。
【０３０４】
相同アームおよび標的配列は、２つの領域が互いに対して相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を共有する場合、互いに「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」または「対応している（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性ドナー配列に見出される対応する相同アームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こるのを可能にする任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）の相同アームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってもよい。さらに、相同アームと対応する標的配列との間の対応する相同領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さのものであってもよい。一部のターゲティングベクターでは、標的ゲノム遺伝子座中での意図的な変異が、相同アームによって挟まれた挿入核酸中に含まれる。
【０３０５】
１細胞期胚以外の細胞中で、外因性ドナー核酸は、細胞中での相同組換えを実施するために意図される他の手法によって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、それに由来する相同アームを含むターゲティングベクターを含む、「大きいターゲティングベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であってもよい。ＬＴＶＥＣはまた、細胞中での相同組換えを実施するために意図される他の手法によって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸挿入断片を含むターゲティングベクターも含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、そのサイズの限界のため、伝統的なプラスミドに基づくターゲティングベクターによっては収容できない大きい遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的化遺伝子座は、従来の方法を使用して標的とすることができない、またはヌクレアーゼ作用剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックもしくは二本鎖切断の非存在下では不正確にのみ、もしくは有意に低い効率でのみ標的とすることができる細胞の遺伝子座であってもよい（すなわち、５’および３’相同アームは、それに対応してもよい）。ＬＴＶＥＣは、任意の長さのものであってもよく、典型的には、少なくとも１０ｋｂの長さである。ＬＴＶＥＣ中の５’相同アームと３’相同アームとの総和は、典型的には、少なくとも１０ｋｂである。
【０３０６】
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含んでもよい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含んでもよい。
【０３０７】
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定したプローブ（複数可）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
【０３０８】
好適な多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）である。改変された多能性細胞を、例えば、（ａ）５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入核酸であって、本明細書に開示される発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む、挿入核酸を含む１つまたは複数のターゲティングベクターを細胞中に導入するステップ；ならびに（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノム中に含む少なくとも１つの細胞を同定するステップによって生成することができる。あるいは、改変された多能性細胞を、（ａ）（ｉ）標的ゲノム遺伝子座内の認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ作用剤；ならびに（ｉｉ）認識部位の十分近くに位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた、発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む挿入核酸を含む１つまたは複数のターゲティングベクターを、細胞中に導入するステップ；ならびに（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に改変（例えば、挿入核酸の組込み）を含む少なくとも１つの細胞を同定するステップによって生成することができる。ニックまたは二本鎖切断を所望の標的部位中に誘導する任意のヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成成分（例えば、ＣＲＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。
【０３０９】
ドナー細胞は、胚盤胞期または前桑実胚期（すなわち、４細胞期もしくは８細胞期）などの、任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
【０３１０】
あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を作り出す方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用して発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むように１細胞期胚のゲノムを改変するステップ；（２）遺伝子改変された胚を選択するステップ；および（３）遺伝子改変された胚を、代理母に移植し、懐胎させるステップを含んでもよい。あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を作り出す方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用して発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含むように１細胞期胚のゲノムを改変するステップ；（２）遺伝子改変された胚を選択するステップ；および（３）遺伝子改変された胚を、代理母において懐胎させるステップを含んでもよい。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。
【０３１１】
核移植技術を使用して、非ヒト哺乳動物を生成することもできる。簡単に述べると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、または除核された卵母細胞を提供するステップ；（２）除核された卵母細胞と混合しようとするドナー細胞または核を単離または提供するステップ；（３）細胞または核を、除核された卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成させるステップ；（４）再構成された細胞を、動物の子宮に埋め込んで、胚を形成させるステップ；および（５）胚を発生させるステップを含んでもよい。そのような方法では、卵母細胞は、一般には死んだ動物から回収されるが、それらを生きている動物の卵管および／または卵巣から単離することもできる。卵母細胞は、除核前に様々な周知の媒体中で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、いくつかの周知の様式で実施することができる。再構成された細胞を形成するための除核された卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射によるものであってもよい。接触／融合平面をわたるＤＣ電気パルスの印加（電気融合）によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスを用いて、融合を誘導することができる。核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、間、および／または後の電気的および／または非電気的手段によって、再構成された細胞を活性化することができる。活性化法としては、電気パルス、化学的誘導ショック（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｈｏｃｋ）、精子による貫通、卵母細胞中の二価陽イオンレベルの増大、および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤を手段とする）が挙げられる。活性化された再構成された細胞、または胚は、周知の培地中で培養し、次いで、動物の子宮に移すことができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
【０３１２】
本明細書で提供される様々な方法により、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞が発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を含む、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成が可能となる。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部を有するＦ０動物内の細胞数は変化することが認識される。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法による、対応する生物に由来する前桑実胚期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入により、Ｆ０動物のより高いパーセンテージの細胞集団が標的化遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を有する細胞を含むようになる。例えば、非ヒトＦ０動物の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の細胞寄与が、標的化改変を有する細胞集団を含んでもよい。
【０３１３】
遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、本明細書に開示される発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部についてヘテロ接合性であってもよいか、または本明細書に開示される発現カセットのうちの１つもしくは複数または全部についてホモ接合性であってもよい。
【０３１４】
上または下で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各個別の項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。異なるバージョンの配列が、異なる時期に受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日において受託番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、受託番号に関して実際の出願日または優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが異なる時期に公開されている場合、別段の指定のない限り本出願の有効な出願日時点で直近に公開されたバージョンを意味する。特に他の指示がなければ、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明を明瞭さおよび理解のために図表および例によっていくらか詳細に記載してきたが、ある特定の変化および改変を添付の特許請求の範囲内で実施することができることが明らかである。
配列の簡単な説明
【０３１５】
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各ラインの左から右に）３’末端まで進む標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）カルボキシ末端まで進む標準の慣習に従う。
【０３１６】
【表３−１】
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【表３−２】
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【実施例】
【０３１７】
（実施例１）
ＳＡＭ−Ｒｅａｄｙマウスの生成
ｄＣａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系を使用するために、典型的には、３つの構成成分：（１）ＶＰ６４ドメインに直接融合されたｄＣａｓ９；（２）２つのさらなる活性化転写因子（熱ショック因子１（ＨＳＦ１）および転写因子６５（ｐ６５））に融合されたＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）；ならびに（３）ＭＳ２ループを含有するｓｇＲＮＡを導入する必要がある。それぞれの構成成分は、典型的には、別々のレンチウイルス中に導入する必要がある。記載の３構成成分系は、細胞培養におけるいくらかの柔軟性を可能にするが、この設定は、動物モデルにおいてはあまり望ましくない。その代わりに、本発明者らは、内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターによって駆動される１つの転写物として、ｄＣａｓ９  ＳＡＭ構成成分（ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびＭＣＰ−ｐ６５−ＨＳＦ１）を導入することを選択した。最初に、ｄＣａｓ９  ＳＡＭ系の発現を、ｌｏｘＰが隣接したネオマイシン停止カセットの存在によって遮断する。Ｃｒｅリコンビナーゼを導入すると、停止カセットは欠失され、ｄＣａｓ９  ＳＡＭ発現のスイッチが入る。次いで、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡアレイ（例えば、Ｕ６プロモーターから発現される）を、他のＲｏｓａ２６対立遺伝子中にそれらを組み込むことによって、またはＡＡＶ導入によって、導入する。ｄＣａｓ９  ＳＡＭ対立遺伝子と、様々なＣｒｅ送達方法とを対にすることによって、遺伝子モジュレーションのタイミングおよび組織特異性を制御する。下記に示されるように、この系を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子の発現を誘導することができ、疾患モデリングなどの適用のために使用することができる。
【０３１８】
マウスＲｏｓａ２６遺伝子座を標的とする相同アームを含む大きいターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）を生成して、ｄＣａｓ９  ＳＡＭ発現カセットを、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに導入した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を使用した細菌相同組換え（ＢＨＲ）による細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡに由来するＬＴＶＥＣの生成および使用は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１（６）：６５２−６５９に記載されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの生成は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０３７６６２８およびＷＯ２０１５／２００３３４に記載されている。
【０３１９】
発現カセット中のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのｄＣａｓ９コード配列（ＣＤＳ）を、マウスにおける発現のためにコドン最適化した。コードされるｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを不活性にするために、以下の変異：Ｄ１０ＡおよびＮ８６３Ａを含む。ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−ＶＰ６４−Ｔ２Ａ−ＭＣＰ−ＮＬＳ−ｐ６５−ＨＳＦ１−ＷＰＲＥ発現カセットは、図１Ａおよび配列番号３１に記載される。相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）コード配列（ｄＣａｓ９−ＶＰ６４−Ｔ２Ａ−ＭＣＰ−ｐ６５−ＨＳＦ１）は、配列番号６４に記載され、配列番号４４に記載のタンパク質をコードする。発現カセットをＲｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに向けさせ（図２を参照されたい）、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の強力な普遍的発現およびＲｏｓａ２６遺伝子座を標的とすることの容易さを利用した。発現カセットの前に、ｌｏｘＰが隣接したネオマイシン耐性カセット（ネオカセット）を、適切なスプライシングシグナルおよび強力なポリアデニル化（ポリＡ）シグナルと共に置いた。ｄＣａｓ９  ＳＡＭ発現カセットの構成成分を、５’から３’に向かって、以下の表４に示す。
【０３２０】
【表４】
2021518141.tif 000013
【０３２１】
標的とされたＲｏｓａ２６対立遺伝子を生成するために、ＬＴＶＥＣをＦ１Ｈ４マウス胚性幹細胞中に導入した。抗生物質選択後、コロニーを拾い、拡大し、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によってスクリーニングした。対立遺伝子改変アッセイを行って、正確な標的化を確認した。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）および対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイは、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０１７８８７９；ＵＳ２０１６／０１４５６４６；ＷＯ２０１６／０８１９２３；およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４７６：２９５−３０７に記載されている。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングロジックを逆転させ、変異が指向された天然遺伝子座のゲノムＤＮＡ試料中のコピー数を定量するものである。正確に標的とされたヘテロ接合性細胞クローンでは、ＬＯＡアッセイにより２つの天然の対立遺伝子（ＸまたはＹ染色体上にない遺伝子）のうちの一方が検出され、他方の対立遺伝子は標的化改変によって破壊されている。同じ原理を、対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイとして逆に適用して、ゲノムＤＮＡ試料中の挿入されたターゲティングベクターのコピー数を定量することができる。スクリーニングのために使用されるプライマーおよびプローブを、表５に提供する。
【０３２２】
【表５】
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【０３２３】
Ｆ０マウスを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して生成した。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７６，２５９号；第７，６５９，４４２号；第７，２９４，７５４号；ＵＳ２００８／００７８０００；およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２５（１）：９１−９９を参照されたい。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、標的としたマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を、レーザー支援注入によって、完全にＥＳ細胞由来であるＦ０世代のマウスを効率的にもたらす、前桑実胚期の胚、例えば、８細胞期胚に注入する。
【０３２４】
Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によるｌｏｘＰが隣接したネオマイシン耐性カセット（ネオカセット）の除去の前に、ネオマイシン耐性遺伝子が転写および翻訳される；しかしながら、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−ＶＰ６４  ＣＤＳおよびＭＣＰ−ＮＬＳ−ｐ６５−ＨＳＦ１  ＣＤＳは、ランスルー転写を効率的に遮断する強力なポリ（Ａ）領域の存在のため、発現されない。図１Ａを参照されたい。しかしながら、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によりネオカセットを除去すると、ｄＣａｓ９およびＭＣＰ融合タンパク質のハイブリッドｍＲＮＡが、Ｒｏｓａ２６プロモーターによって構成的に発現される。図１Ｂを参照されたい。ｌｏｘＰが隣接したネオマイシン耐性カセット（ネオカセット）が除去された標的ｍＥＳＣから全ＲＮＡを抽出した後、逆転写してｃＤＮＡを生成し、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｑＰＣＲを行って逆転写されたｃＤＮＡを検出することによって（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、ｄＣａｓ９およびＭＣＰ発現を検証した。Ｃａｓ９およびｐ６５のｍＲＮＡレベルを測定した。それぞれ、図３Ａおよび３Ｂを参照されたい。ｄＣａｓ９発現を、ウェスタンブロットによっても確認した。図４を参照されたい。まとめると、作り出された系は、ｍＥＳＣおよびそれに由来するマウスにおいて、一貫したレベルのｄＣａｓ９融合タンパク質およびＭＣＰ融合タンパク質を連続的または条件的に発現することができる（ネオマイシン耐性カセットの除去を必要とすることによって）。
（実施例２）
ＴｔｒガイドＲＮＡを用いたＳＡＭ−Ｒｅａｄｙマウスの検証
【０３２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでこの系を検証するために、ヘテロ接合性ｄＣａｓ９  ＳＡＭ  ｍＥＳＣを、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンを標的とする相同アームを含むＴｔｒガイドＲＮＡアレイターゲティングベクターを用いて標的とした。ＴｔｒガイドＲＮＡアレイは、図５および配列番号３３に記載される。プロモーターおよびガイドＲＮＡコード配列を含む領域は、配列番号６６に記載される。アレイ中のガイドＲＮＡによって標的とされるマウスＴｔｒ遺伝子中のガイドＲＮＡ標的配列（ＰＡＭを含まない）は、それぞれ、配列番号３４（ＡＣＧＧＴＴＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＡＡ）、配列番号３５（ＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＣ）、および配列番号３６（ＧＡＣＡＡＴＡＡＧＴＡＧＴＣＴＴＡＣＴＣ）に記載される。配列番号３４は、Ｔｔｒ転写開始部位の−６３に位置し、配列番号３５は、Ｔｔｒ転写開始部位の−１３４に位置し、配列番号３６は、Ｔｔｒ転写開始部位の−１１２に位置する。これらのガイドＲＮＡ標的配列を標的とする単一ガイドＲＮＡは、それぞれ、配列番号３７、３８および３９に記載される。相同アームは、Ｔｔｒ遺伝子座を標的とする３つのＭＳ２−ステムループを含有するガイドＲＮＡを含むＴｔｒガイドＲＮＡアレイに隣接した。ＴｔｒガイドＲＮＡアレイを、ｒｏｘに挟まれた（ｒｏｘｅｄ）ピューロマイシン停止カセットと共にＲｏｓａ２６遺伝子座に組み込んだ。このカセットは、Ｒｏｓａ２６ランスルー転写物がＵ６プロモーター活性を阻害しないようにする。停止カセットの後、ＭＳ２ステムループを含有する３つのｓｇＲＮＡ配列を、それらを分離する伸長ＰｏｌＩＩＩ転写配列と並列するＵ６プロモーターによって発現させた。ｄＣａｓ９  ＳＡＭ構成成分を、Ｔｔｒ転写開始部位（ＴＳＳ）の上流の１００〜２００ｂｐの領域に向けるように、ガイドを設計した。図６を参照されたい。ＴｔｒガイドＲＮＡアレイ発現カセットの構成成分を、５’から３’に向かって、以下の表６に示す。ＭＳ２ステムループを含む、それぞれのガイドＲＮＡの構造の一般的概略図を、図７に示す。
【０３２６】
【表６】
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【０３２７】
標的ｍＥＳＣクローンがｄＣａｓ９  ＳＡＭ発現カセットについてヘテロ接合性であり、ガイドＲＮＡアレイ発現カセットについてヘテロ接合性であることを確認した後、本発明者らは、相対的遺伝子発現を決定するためにＲＴ−ｑＰＣＲを使用した。Ｔｔｒの場合、ＲＴ−ｑＰＣＲは、ｍＥＳＣが停止カセットによって遮断されたｄＣａｓ９  ＳＡＭ構成成分を含有する本発明者らのＷＴ  ｍＥＳＣにおいて３５のｃｔ値に達し、ｍＥＳＣはｄＣａｓ９  ＳＡＭ対立遺伝子（停止カセットが除去されている）を活発に発現した。しかしながら、Ｕ６  ＳＡＭ  Ｔｔｒガイドアレイをそれぞれの細胞系に標的化した後、活発なｄＣａｓ９  ＳＡＭ系＋ガイド発現を含有する細胞系のみが、ｃｔ値の２０への低下を見せた。図８Ａを参照されたい。１５ｃｔ値のこの低下は、相対的遺伝子発現の２５００倍の増加に相当する。Ｔｔｒ発現のそのような有意な増加に関して、本発明者らは、近隣の遺伝子がｄＣａｓ９  ＳＡＭ活性化構成成分のすぐ近くにあることによって影響されないことを確実にしたかった。このために、Ｄｓｇ２およびＢ４ｇａｌｔ６（Ｔｔｒのそれぞれの側にある遺伝子）を、ＲＴ−ｑＰＣＲによって評価し、上記の細胞系のいずれにおいても発現の有意な増加がないと決定した。それぞれ、図８Ｂおよび８Ｃを参照されたい。
【０３２８】
この遺伝子の上方調節が安定的であり、マウスモデルに変換できることを検証するために、標的遺伝子を８細胞のマウス胚に微量注射して、マウス系を誘導した。具体的には、透明帯に小さい孔を生じさせて、標的ｍＥＳＣの注射を容易にした。これらの注射された８細胞胚を、代理母に移して、導入遺伝子を有する生きた子を産生させた。代理母での懐胎の際に、注射された胚は、検出可能な宿主胚の寄与を有しないＦ０マウスを産生した。完全にＥＳ細胞に由来するマウスは、正常で、健康で、繁殖力があった（生殖細胞系列伝達を有する）。
【０３２９】
ＲＴ−ｑＰＣＲによってアッセイされた、Ｔｔｒ  ｍＲＮＡ発現を、野生型マウス、ｄＣａｓ９  ＳＡＭマウス、およびＴｔｒガイドＲＮＡアレイがゲノムに組み込まれたｄＣａｓ９  ＳＡＭマウスから収集した様々な組織において観察した。これらの組織のそれぞれから、ＲＮＡを抽出した。ｑＰＣＲ反応にカウントされないように、ゲノムＤＮＡを分解した。ＲＮＡを逆転写し、次いで、Ｔｔｒに特異的なアッセイを使用して、Ｔｔｒ転写物を検出した。実験では、それぞれの組織に由来する等しい質量のＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによってアッセイした。データは、Ｔｔｒ発現のレベルが、通常はＴＴＲが出現しないと予想される一部の臓器を含む全ての組織において上昇したことを示す。表７を参照されたい。ＴＴＲタンパク質発現も、肝臓、脾臓、心臓、肺、骨格筋、精巣、胸腺、眼、膵臓、リンパ節、腎臓、および脳を含む全ての組織において上昇した。それぞれ、図９Ａ〜９Ｌを参照されたい。しかしながら、相対的発現は組織によって影響された。全体として、対照マウスに由来する組織中での低いＴｔｒ発現は、ＳＡＭ系によるより高い上方調節と相関していた。肺および脾臓におけるサイクル閾値によって決定されたＴｔｒ  ｍＲＮＡ発現レベルを、それぞれ、図１０Ａおよび１０Ｂに示す。ＲＴ−ｑＰＣＲにおいて、陽性反応は、蛍光シグナルの蓄積によって検出される。サイクル閾値（ｃｔ）は、蛍光シグナルがバックグラウンドレベルを超えるのに必要とされるサイクルの数と定義され、より低いｃｔ値は、より高い発現を示す。さらに、ｍＥＳＣクローン中でのスクリーニングに関して、Ｄｓｇ２およびＢ４ｇａｌｔ６（Ｔｔｒのそれぞれの側の遺伝子）を、ＲＴ−ｑＰＣＲによって評価し、発現の有意な増加はないと決定した。例えば、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、および１０Ｆを参照されたい。
【０３３０】
【表７】
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【０３３１】
ｄＣａｓ９  ＳＡＭ構成成分およびＴｔｒを標的とするＳＡＭガイドＲＮＡアレイについてヘテロ接合性であるＦ０マウスは、野生型マウスまたはｄＣａｓ９  ＳＡＭ構成成分のみを発現するマウスと比較した場合、ＥＬＩＳＡによって血清中で検出される循環ＴＴＲの、１０００μｇ／ｍＬから４０００μｇ／ｍＬへの増加を示した。図１１を参照されたい。
【０３３２】
本発明者らは次に、ＴＴＲレベルの増加が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座からＴｔｒを標的とするガイドＲＮＡを発現するマウスにおいて安定であるかどうかを評価した。３つの群のマウス：（１）Ｆ１Ｈ４（ＷＴ）；（２）ヘテロ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ；および（３）Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ：Ｒｏｓａ２６−Ｕ６−ＴＴＲガイドアレイ（Ｔｔｒを標的とする３つのガイド）を使用した。これらのマウスを、上記のｍＥＳＣから生成し、Ｆ０世代を１歳まで年を取らせた。ＴＴＲの血清量を、ＥＬＩＳＡによって毎月測定し、動物を、任意の病的変化について観察した。１年でこれらの動物において病的変化は観察されなかったが、それらは循環ＴＴＲの２倍〜２．５倍の増加を維持していた。図１３を参照されたい。これらのデータは、Ｔｔｒ発現および循環ＴＴＲレベルが、少なくとも１年間にわたって、Ｒｏｓａ２６遺伝子座からＴｔｒに対して標的とするガイドを発現するマウスにおいて安定であることを示す。
【０３３３】
ｄＣａｓ９  ＳＡＭ構成成分と、ガイドＲＮＡアレイとの両方のための発現構築物がゲノムに組み込まれた系は、マウスの寿命を通して非常に高い遺伝子発現をもたらすための大きな系である。しかしながら、本発明者らはまた、発現の急性増加を模倣することができることも望んだ。これを行うために、本発明者らは、同じＴｔｒガイドアレイを担持するＡＡＶを、Ｒｏｓａ２６によって発現されるｄＣａｓ９  ＳＡＭ構成成分についてヘテロ接合性である成体マウスに導入した。ＡＡＶ（血清型８）を、尾静脈注射により標的肝臓細胞に導入した。本発明者らは、注射後５、１９および６０日で、ＥＬＩＳＡによって循環ＴＴＲを分析して、注射の成功を判定した。驚くべきことに、マウスにおいて循環するＴＴＲのレベルは、５日目までに、未処置のマウスまたはＧＦＰを発現するＡＡＶで処置した対照マウスにおける１０００μｇ／ｍＬから、ＡＡＶで処置したマウスにおける７０００μｇ／ｍＬまで急上昇した。１９日目までに、血清レベルは１１，０００μｇ／ｍＬまで増加し続けた。６０日目までに、血清レベルは、依然として約８０００μｇ／ｍＬであった。図１２を参照されたい。
【０３３４】
本発明者らは次に、この実験を、注射の８ヶ月後まで実行した。上記のように、３つの群のマウス：（１）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（未処置）；（２）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−ＧＦＰ）；および（３）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−ｇＴＴＲアレイ（ＴＴＲを標的とする３つのガイド））を評価した。これらのマウスに、８週齢でＡＡＶ８−ＧＦＰまたはＡＡＶ８−ｇＴＴＲアレイを注射し、注射の８ヶ月後まで追跡した。ＴＴＲの血清量を、様々な早期の時点および次いで毎月ＥＬＩＳＡによって測定し、これらの動物を、任意の病的変化について観察した。注射の８ヶ月後でこれらの動物において病的変化は観察されなかったが、それらは１９日目までに循環ＴＴＲの１１倍の初期増加を有し、そのレベルについて、注射の５ヶ月後までに約４倍上昇したＴＴＲの安定状態が認められた。図１４を参照されたい。
【０３３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの上方調節を可能にするために複数のガイドＲＮＡが必要であるかどうか、または単一のガイドＲＮＡで十分であるかどうかを追跡するために、本発明者らは、ガイドＲＮＡアレイからそれぞれのガイドＲＮＡを取り、それらを個別にＡＡＶ８にパッケージングした。６つの群のマウス：（１）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（未処置）；（２）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−ＧＦＰ）；（３）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−ｇＴＴＲアレイ（ＴＴＲを標的とする３つのガイド））；（４）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−ｇＴＴＲ＃１）；（５）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−ｇＴＴＲ＃２）；および（６）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−ｇＴＴＲ＃３）をこの実験において評価した。群（３）〜（６）におけるガイドＲＮＡ発現カセットの配列を、それぞれ、配列番号６７〜７０に記載する。これらのマウスに、８週齢で、ガイドＲＮＡまたはＧＦＰを含有するＡＡＶ８を注射し、注射の８ヶ月後まで追跡した。ＴＴＲの血清量を、様々な早期の時点で、３週までＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、図１５に示す。注射後１週で、ｇＴＴＲガイドアレイは、対照群と比較して循環ＴＴＲの６．５倍の増加を示したが、単一のガイドＲＮＡはそれぞれ、血清中の循環ＴＴＲの３倍の増加を示した。注射後２週で、ｇＴＴＲガイドアレイは、対照群と比較して循環ＴＴＲの５．５分の１まで減少したが、単一ガイドのうちの２つは、血清中の循環ＴＴＲの３．５倍の量を維持し、ｇＲＮＡ＃３は血清中の循環ＴＴＲのほぼ５倍の増加に急上昇した。注射後３週で、全てのｇＲＮＡが、ＷＴ対照と比較して血清中の循環ＴＴＲの約３．５倍増加したレベルを有していた。これらの結果は、ガイドＲＮＡアレイが最初は高いタンパク質バーストを提供することができるが、時間の経過と共に、単一のｇＲＮＡが循環ＴＴＲタンパク質をもたらす遺伝子上方調節において同等によく機能し得ることを示唆していた。
【０３３６】
ＡＡＶに組み込まれた単一のガイドまたは複数のガイドが、Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭマウスにおいて遺伝子上方調節により成功したかどうかを評価し続けるために、本発明者らは、１つのガイドＲＮＡまたは２つのガイドＲＮＡを使用して、肝臓における標的遺伝子１の発現を評価した。ＲＮＡ発現を、注射後３週で、ＴＡＱＭＡＮにより評価した。本発明者らは、未処置のホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭと比較して、３つ全部の群（（１）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−標的遺伝子１ガイドＲＮＡ＃１）、（２）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−標的遺伝子１ガイドＲＮＡ＃２）、および（３）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−標的遺伝子１ガイドＲＮＡ＃１＆２））において標的遺伝子１の有意な上方調節を観察した。この注射後３週時点で、１つのガイドＲＮＡ群と比較した場合、２つのガイドＲＮＡ群においてＲＮＡ発現の有意な増加があった。２つのガイドＲＮＡを有するＡＡＶ８を使用することにより、未処置と比較して肝臓発現の２００倍を超える増加が得られたが、１つのガイドＲＮＡを有するＡＡＶ８を使用することにより、未処置と比較して肝臓発現の１００倍を超える増加が得られた。図１９を参照されたい。
【０３３７】
上記の実験はマウスＴｔｒ遺伝子の上方調節に主に焦点を当てたものであるが、他の遺伝子を標的とする場合にも同様に発現の増加が観察された（データは示さない）。さらに、異なる血清型を使用するか、または組織特異的Ｃｒｅ処置を使用してｄＣａｓ９  ＳＡＭ発現を制御することにより、本発明者らは、遺伝子上方調節のタイミングおよび組織特異性を制御して、ロバストで信頼できる疾患モデルを生成することができる。
（実施例３）
Ｐｃｓｋ９およびＬｄｌｒガイドＲＮＡによるＳＡＭ−Ｒｅａｄｙマウスの検証
【０３３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのこの系のさらなる検証として、コレステロール経路に関与する２つの遺伝子（Ｐｃｓｋ９およびＬｄｌｒ）を、上方調節のための標的として選択し、コレステロールレベルに対する生理学的効果を、５週間の時間経過にわたって観察した。３つの群のマウス：（１）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−Ｐｃｓｋ９ガイドアレイ）；（２）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−Ｌｄｌｒガイドアレイ）；および（３）ホモ接合性Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（未処置）を評価した。
【０３３９】
Ｐｃｓｋ９ガイドＲＮＡアレイの配列を、配列番号８５に記載する。ガイドＲＮＡアレイは、３つのガイドＲＮＡをコードする。プロモーターおよびガイドＲＮＡコード配列を含む領域を、配列番号９８に記載する。アレイ中のガイドＲＮＡによって標的とされるマウスＰｃｓｋ９遺伝子中のガイドＲＮＡ標的配列（ＰＡＭを含まない）を、配列番号８９〜９１に記載する。これらのガイドＲＮＡ標的配列を標的とする単一のガイドＲＮＡを、それぞれ、配列番号９２〜９４に記載する。
【０３４０】
ＬｄｌｒガイドＲＮＡアレイの配列を、配列番号７１に記載する。ガイドＲＮＡアレイは、３つのガイドＲＮＡをコードする。プロモーターおよびガイドＲＮＡコード配列を含む領域を、配列番号８４に記載する。アレイ中のガイドＲＮＡによって標的とされるマウスＬｄｌｒ遺伝子中のガイドＲＮＡ標的配列（ＰＡＭを含まない）を、配列番号７５〜７７に記載する。これらのガイドＲＮＡ標的配列を標的とする単一のガイドＲＮＡを、それぞれ、配列番号７８〜８０に記載する。
【０３４１】
結果を、図１６Ａに示す。注射後２週で、Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−Ｐｃｓｋ９ガイドアレイ）は、注射前のコレステロールレベルと比較してコレステロールレベルの３．５倍の増加を示した。対照的に、Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−Ｌｄｌｒガイドアレイ）は、注射前のレベルと比較して総コレステロールレベルの７５％の低下を示した。未処置の動物は、そのコレステロールを維持した。注射後５週で、Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−Ｐｃｓｋ９ガイドアレイ）は、注射前のコレステロールレベルと比較してコレステロールレベルの３倍の増加を示した。対照的に、Ｒｏｓａ２６−ｄＣａｓ９−ＳＡＭ（ＡＡＶ８−Ｌｄｌｒガイドアレイ）は、注射前のレベルと比較して総コレステロールレベルの５０％の低下を示した。未処置の動物は、そのコレステロールを維持した。同様の効果は、ＬＤＬレベルに関しても観察された。図１６Ｂを参照されたい。
【０３４２】
次に、ＬｄｌｒおよびＰｃｓｋ９の発現を評価した。注射後５週での、上記実験におけるマウスの肝臓中のＬｄｌｒおよびＰｃｓｋ９のＴＡＱＭＡＮ発現レベルを、それぞれ、図１７Ａおよび１７Ｂに示す。
【０３４３】
ｄＣＡＳ９−ＳＡＭ系によるＬＤＬＲの増加が長期的な利益をもたらすことを示すさらなる検証として、本発明者らは、高脂肪食を給餌したホモ接合性ｄＣａｓ９−ＳＡＭマウス中のＡＡＶ８−ＬｄｌｒガイドＲＮＡアレイを評価し、ＡＡＶ８−ＬｄｌｒガイドＲＮＡアレイの注射後、２０週にわたってそれらを追跡した。マウスを、初期コレステロールレベルのために予め出血させ、次いで、８週間にわたって高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた（コレステロールレベルを試験するために４週毎に出血させた）。コレステロールおよびＬＤＬレベルの結果を、それぞれ、図１８Ａおよび１８Ｂに示す。８週後、マウスにＡＡＶ８−Ｌｄｌｒガイドアレイを注射したか、または未処置のままとした。マウスを毎月出血させ、その総コレステロールおよびＬＤＬレベルを評価した。この時間枠の間に、ＡＡＶ８−Ｌｄｌｒガイドアレイで処置したマウスは、ＨＦＤに関して未処置のマウスと比較した場合、より低い総コレステロールおよびより低いＬＤＬレベルを有していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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