(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種の胆汁酸、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩、カルシウム、及びビタミンＤを含む、医薬品として使用するための、特に哺乳動物においてビタミンＤ−受容体活性化補助因子であるＨｓｐ９０βの発現を誘導して、ビタミンＤの誘導によるカルシウム取り込みを増加させることにおいて使用するための組成物に関する。本発明はまた、上記の組成物を含み、健康補助食品用又は栄養補助食品用の従来の成分をさらに含む健康補助食品又は栄養補助食品にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆汁酸がタウロコール酸ではないという条件で、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩、カルシウム、及びビタミンＤを含む、医薬品としての使用のための組成物。
【請求項２】
カルシウム吸収欠乏の治療及び／又は予防における、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
哺乳動物における、カルシウム欠乏に起因する骨粗鬆症、カルシウム欠乏に起因する吸収不良状態、又はカルシウム欠乏に起因する骨障害の治療及び／又は予防における、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
哺乳動物におけるカルシウム欠乏に起因する骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することによる骨粗鬆症の治療及び／又は予防のための、或いはルーワイ胃バイパス術（ＲＹＧＢ）の患者又はスリーブ状胃切除術（ＳＧ）の患者における骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することによる骨粗鬆症の治療のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１種の胆汁酸が、一次胆汁酸及び二次胆汁酸並びにそれらの塩から選ばれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１種の脂肪酸が飽和又は不飽和である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１種の脂肪酸が、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）、又は極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）であり、特にＣ４〜Ｃ８脂肪酸から選択される短鎖脂肪酸であり、特に酪酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種の脂肪酸が中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）であり、特にオレイン酸である、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記ビタミンＤが、ビタミンＤ３から主としてなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記カルシウムが、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、若しくはリン酸カルシウム、又はそれらの混合物として存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記組成物中のカルシウム及びビタミンＤの量が、１日当たりの推奨摂取量（ＲＤＩ）以下として存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ビヒクル、賦形剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤、崩壊剤、結合剤、及び崩壊剤のうち少なくとも１種を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、経口送達用、非経口送達用、静脈内注入用、又は注射用に製剤化される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、液体形態又は固体形態である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、咀嚼錠、発泡錠、散剤、丸剤、錠剤、又はカプセル剤として製剤化される、請求項１４に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記脂肪酸が酪酸又はその塩であり、前記胆汁酸がグリココール酸（ＧＣＡ）又はその塩であり、ビタミンＤがビタミンＤ３である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
前記脂肪酸がオレイン酸又はその塩であり、前記胆汁酸がグリココール酸（ＧＣＡ）又はその塩であり、ビタミンＤがビタミンＤ３である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
前記組成物が栄養補助食品又は健康補助食品である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩を含む組成物に関する。本組成物はまた、カルシウム及びビタミンＤも含んでもよく、医薬品としての使用、特に腸のカルシウム取り込み欠乏に関係する障害の治療及び／又は予防のためのものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
世界的な肥満症の蔓延は、２００３年に１５億人を超す人々を襲っていると推計されたが、その発生は世界中で増加し続けている。肥満症の罹患率の増加は、肥満症の併存疾患（例えば、２型糖尿病、高脂血症、高血圧症、虚血性心疾患、卒中、喘息、背中及び下肢の関節変性の問題、数種のがん、うつ病など）の罹患率の増加に結びついている。西欧では年間約３２万人が肥満症により死亡していると推定される。このため、肥満症を原因とする平均余命の喪失は深刻である。正常体重の人と比較して、病的肥満の２５歳男性の寿命の喪失は、平均でおよそ１２年である。
【０００３】
肥満外科手術は、この数十年に、病的肥満の唯一の長期有効治療として浮上してきた。系統的にレビューすると、病的肥満の患者において、肥満外科手術を受けた後に、有効な体重減少が達成されている。糖尿病、高脂血症、高血圧症、及び閉塞性睡眠時無呼吸の既往のある患者の実質的大多数が、手術後に改善を示し、完全に回復した場合もあった。スウェーデンで最も一般的な肥満外科手術の形態は、腹腔鏡下ルーワイ胃バイパス術（ＲＹＧＢ）である。新たに出てきた肥満外科手術法はスリーブ状胃切除術（ＳＧ）である。
【０００４】
通常、腹腔鏡下の肥満外科手術をすると、術後の回復は早い。普通、最初の６〜１２カ月の間に急速な体重減少が起こり、手術後約２年で横ばい状態となる。胃バイパス術後の生活とは、食事の量が減り、回数が増えることによる、食物摂取のパターンの変化を意味する。
【０００５】
胃及び十二指腸を通る食物の通路の前腸を空置し、未消化の食物を空腸へ迅速に後腸送達すること、即ち食物脚（alimentary limb）を設けることを伴う胃腸管のルート変更のため、微量栄養素の取り込みが弱められる。バイパスされた胃は、塩酸及び内因子（ＩＦ）の分泌量が少なくなり、例えば鉄及びビタミンＢ１２の取り込みに悪影響を及ぼす。したがって、生涯にわたるビタミンＢ１２、並びに総合ビタミン剤及び微量ミネラルの補給が、ＲＹＧＢ後の全ての患者に推奨される。鉄の補給は、閉経期前の女性、及び他の鉄欠乏の患者に推奨される。
【０００６】
活性なビタミンＤの誘導によるカルシウム取り込みは、通常、近位小腸、即ち十二指腸及び空腸の前半において起こる。したがって、生涯にわたるビタミンＤ及びカルシウムの補給が、ＲＹＧＢを受けた患者に推奨される。ＲＹＧＢ後には小腸のルート変更のため、十二指腸はバイパスされて栄養素の通路ではなくなっている。ビタミンＤ受容体の活性化補助因子である熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）９０β、及び最も重要であり、ビタミンＤの誘導によるカルシウム輸送タンパク質であるＴＲＰＶ６は、ＲＹＧＢの後、食物脚（alimentary limb）の粘膜において下方制御されることが最近示された（Elias et al.）。これに伴い、垂直遮断胃形成術（ＶＢＧ）を受けた患者とは異なり、ＲＹＧＢでは処置に依存して骨ミネラル密度（ＢＭＤ）が低下したことも示された。このため、ＲＹＧＢ後に、これらの患者におけるＢＭＤのさらなる低下及びさらなる骨粗鬆症性骨折のリスクを回避するために、カルシウム及びビタミンＤの補給は重要であると思われる。
【０００７】
最近導入されたＳＧ（スリーブ状胃切除術）の手術は、体重減少と代謝の改善の両方に有効であるが、胃を切除すると、胃酸の総産出量が劇的に減少し、管腔の内容物が遠位小腸に移動する時間が短くなる。機能的には、この状態は胃バイパスの効果を部分的に模倣しており、このため粘膜がビタミンＤに対して反応する能力を低下させ、ひいては、カルシウム吸収を減少させる。実際、ＳＧ処置は骨ミネラルの代謝回転が変化する徴候と関連しており、これは長期的には骨の脱ミネラル化のリスクを示唆するものである（Crawford et al.）。
【０００８】
ＳＧ後には、ＲＹＢＰ後と同様に、患者はビタミンＤ及びカルシウムの補給を処方される。しかしながら、そのような補給がＢＭＤの損失を予防することができるかどうかは立証されていない。実際のところ、そうではない場合があることを示すデータが存在する。例えば、カルシウム及びビタミンＤの補給を受けたＲＹＧＢ患者の大部分が、二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）を発症し、ＰＴＨレベルが増加し、カルシウムレベルが減少したのであるが、これは、補給しているにもかかわらず、腸内でのカルシウム吸収が依然として欠乏している場合があることを示すものである（Hewit S et al.）。補給をした患者には、手術の１８カ月後に、Ｃ末端テロペプチド（ＣＴＸ）レベルの顕著な増加があったことも分かっており、これは、骨代謝回転が増加したことを示している。ビタミンＤレベルが最適化されていた場合でさえも、腸管でのカルシウム吸収（分画カルシウム吸収）がＲＹＧＢ後に著しく損なわれ、およそ８０％減少することを示す最近のデータもある（Schafer A L et al.）。したがって、現在のレジメンによるカルシウム及びビタミンＤの補給は実効的ではない。
【０００９】
さらに、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の全般的低下がある、及び／又はカルシウム取り込みの全般的減少がある、及び／又は骨の病的状態、例えばカルシウム欠乏に起因する骨粗鬆症がある別の患者群も存在し、この患者群はビタミンＤの誘導によるカルシウム取り込みの増加によって利益を得ることが可能である。ビタミンＤ及びカルシウムの補給とは別に、明白な骨ミネラル化疾患は、現在、主に全身的なホルモンＰＴＨ補給により、又は薬理学的骨吸収抑制薬（ビスホンホネート（bisphonphonate）類、エストロゲン類似体、吸収機序を標的とする抗体など）により、治療されている。腸管でのカルシウム吸収能力の回復を狙う治療レジメンはほとんどないか、又は機能しないことが分かる場合が多い。
【００１０】
骨の状態を治療するための、コショウソウ（Lepidium Sativum）、カルシウム、ビタミンＤ及び抗酸化剤を含む活性成分のナノ製剤を含む組成物を開示している米国特許第８，５６３，０５３号。別の例は、胆汁酸レベルを調節することによって代謝障害を治療するための方法及び組成物を開示している国際公開第２０１３／０４９５９５号である。
【００１１】
上記のことを考慮すると、当技術分野において、上記の問題、特に、胃の手術を受けた患者、例えばＲＹＧＢ及びＳＧの患者における、ビタミンＤの誘導によるカルシウム取り込みの減少及び骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の低下に対する解決策を見出す必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の概要
本発明の目的は、上記の問題を解決すること、並びに少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、及び少なくとも１種の脂肪酸又はその塩を含む組成物を提供することである。本組成物はまた、カルシウム及びビタミンＤも含有することもできる。本組成物は、医薬品としての使用が意図される。
【００１３】
驚くべきことに、本発明に関して、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩を含む組成物は、個々の２つの成分である胆汁酸と脂肪酸とをそれぞれ単独で用いる場合と比較して、ビタミンＤ−受容体活性化補助因子であるＨｓｐ９０βの発現を相乗的に誘導し、次いでカルシウム吸収を増加させることが分かった。したがって、全部で４つの成分、要するに、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩、カルシウム、及びビタミンＤを含む組成物が提供される。
【００１４】
以前に、骨量減少はカルシウム吸収の損傷に起因し、その損傷は、熱ショックタンパク質９０βが媒介するビタミンＤに依存性のカルシウム吸収機序が活性低下することで起こり得ると記述されている（Elias et al.）。したがって、本発明の知見は、肥満外科手術を受けた患者に、及び一般に、カルシウム吸収の増加により助けられ得る状態に罹患している任意の患者に有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様における、カルシウム吸収欠乏の治療及び／又は予防。
【００１６】
カルシウム吸収欠乏は、例えばルーワイ胃バイパス術（ＲＹＧＢ）後に起こり得る。これを補償し、血漿中カルシウムレベルを上げて正常レベルに維持するために、ＲＹＧＢ後によく見られる１つの代償機序として、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）産生の増加がある（Hewitt et al.）。甲状腺の手術は、副甲状腺の機能及びその副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の産生に悪影響を及ぼすことによってカルシウム吸収の欠乏を引き起こし得る別の外科的処置である。これら２つの処置、即ちＲＹＧＢと甲状腺の手術とを併用すると、血漿カルシウムレベルが著しく低下し、低カルシウム血症の症状が起こり得るということが、文献で報告されている。その機序は、腸管でのカルシウム吸収の低下をＰＴＨ産生の増加によって補償することができなくなるということのようである。ＲＹＧＢと甲状腺手術との併用では、場合により、低カルシウム血症の治療が極めて困難であることが判明している（Goldenberg et al.）。本明細書で定義される組成物を投与することにより、カルシウムのレベルは増加し得る。これは、カルシウム吸収の低下が、血漿中カルシウムレベルの低下、又は骨ミネラル化の減少を引き起こしている患者において、特に重要である。
【００１７】
本発明の別の態様において、哺乳動物における、カルシウム欠乏に起因する骨粗鬆症、カルシウム欠乏に起因する吸収不良状態、又はカルシウム欠乏に起因する骨障害の治療及び／又は予防において。さらに、本組成物は、哺乳動物において、カルシウム欠乏に起因する骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することにより、骨粗鬆症を治療及び／又は予防するために使用することができる。本組成物はまた、ルーワイ胃バイパス術（ＲＹＧＢ）の患者又はスリーブ状胃切除術（ＳＧ）の患者において、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することにより骨粗鬆症を治療するために使用することもできる。
【００１８】
本発明の別の態様は、前記少なくとも１種の胆汁酸が、一次胆汁酸及び二次胆汁酸並びにそれらの塩から選ばれる、本明細書で定義される組成物である。胆汁酸は、胆汁酸がタウロコール酸でもその誘導体でもないという条件で選択される。
【００１９】
本発明の別の態様は、前記少なくとも１種の脂肪酸が飽和又は不飽和である組成物であり、一例は、前記少なくとも１種の脂肪酸が、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）又は極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）である。特に、短脂肪酸は酪酸であり、又は中鎖脂肪酸はオレイン酸である。
【００２０】
本発明の一態様における、ビタミンＤ３から主としてなるビタミンＤを含む、使用するための組成物。
【００２１】
本発明の別の態様は、前記カルシウムが、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、若しくはリン酸カルシウム、又はそれらの混合物として存在する組成物である。
【００２２】
本発明の一態様において、組成物中のカルシウム及びビタミンＤの量は、１日当たりの推奨摂取量（ＲＤＩ）以下として存在する。組成物は、ビヒクル、賦形剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤、崩壊剤、結合剤及び崩壊剤のうち少なくとも１つをさらに含んでもよい。
【００２３】
本明細書で定義される組成物は、経口送達用、非経口送達用、静脈内注入用、又は注射用に製剤化される。組成物は液体形態又は固体形態であってもよく、組成物は、咀嚼錠、発泡錠、散剤、丸剤、錠剤又はカプセル剤として製剤化されてもよい。
【００２４】
本発明の一態様において、組成物は、栄養補助食品又は健康補助食品である。
【００２５】
本発明の一態様において、使用するための組成物は、酪酸又はその塩である脂肪酸を含み、前記胆汁酸はグリココール酸又はその塩であり、ビタミンＤはビタミンＤ３である。
【００２６】
図面の簡単な説明
本発明は、添付の図面と併せて考慮される以下の詳細な説明から、より深く理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ビタミン−Ｄ受容体の活性化補助因子である熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）９０βの発現は、Caco-2細胞培養液中に、胆汁酸ＧＣＡと脂肪酸のブチレートとを一緒に４８時間添加しておくことによって相乗的に誘導されるが、ＧＣＡ単独又はブチレート単独では誘導されないことを開示している。ＧＣＡは１×１０−４Ｍの濃度で、ブチレートは５×１０−４Ｍの濃度で添加した。＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＧＣＡ＋ブチレートｖｓ対照、対応のないｔ検定。
【図２】ウエスタンブロットを開示し、ビタミン−Ｄが、培養したCaco-2細胞中でクローディン−２タンパク質の発現を用量依存的に増加させる効果を有し、それにより、「受動」カルシウム吸収を容易にすることを開示している。ビタミン−Ｄの活性化補助因子Ｈｓｐ９０βを特異的阻害剤ゲルダナマイシンで抑制すると、明らかにビタミン−Ｄの活性の阻害によりクローディン−２の発現も抑制され、それにより、Ｈｓｐ９０βが「受動」カルシウム吸収にも重要であることを示している。
【図３】カルシウム取り込みに対するビタミンＤ３の存在の影響を開示している。
【図４】カルシウム取り込み（勾配なし）に対する、胆汁酸、脂肪酸、ビタミンＤ３の影響を開示している。
【図５】カルシウム取り込み（勾配あり）に対する、胆汁酸、脂肪酸、ビタミンＤ３の影響を開示している。
【図６】カルシウム取り込みに対する、胆汁酸、脂肪酸、ビタミンＤ３の影響を開示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の詳細な説明
本発明の原理及び機能を全般的に理解できるように、例示的なある特定の実施形態を以下に記載する。記載される例示的な実施形態は非制限的であり、本発明の範囲は特許請求の範囲によって規定されることを当業者は理解されよう。
【００２９】
上に述べたとおり、本発明は、
ａ）少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、
ｂ）少なくとも１種の脂肪酸又はその塩、
ｃ）カルシウム、及び
ｄ）ビタミンＤ
を含む組成物に関する。
【００３０】
本組成物は、医薬品としての使用が意図される。
【００３１】
驚くべきことに、本発明に従って観測すると、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩、ビタミンＤ、及びカルシウムを含む組成物は、ビタミンＤ−受容体活性化補助因子であるＨｓｐ９０βの発現を相乗的に誘導することが分かった。
【００３２】
ビタミンＤ−受容体活性化補助因子の発現を誘導することにより、ビタミンＤの誘導によるカルシウム輸送を実質的に増加させることができる。即ち、ＲＹＧＢ患者及びＳＧ患者など、カルシウム欠乏に罹患している患者において正常化することができる。
【００３３】
Ｈｓｐ９０βは、カルシウムの経細胞能動輸送に関与するタンパク質であるタンパク質ＴＲＰＶ６に対して周知の刺激作用を有する。しかしながら、カルシウムの能動輸送は目的の組成物に感受性をもつことができない。その代わり、本発明によれば、Ｈｓｐ９０βは、受動（傍細胞）カルシウム通過においてビタミンＤ依存の増加を活性化する。これは本発明の重要な特徴である。ビタミンＤとは別に、カルシウムそれ自体もまた傍細胞輸送に必要な経上皮濃度勾配を得るために、組成物中に含まれなければならない。
【００３４】
上記の、ビタミンＤ−受容体活性化補助因子であるＨｓｐ９０βの誘導を考慮すると、本発明の組成物は、カルシウム吸収の増加により助けられ得る状態に罹患している任意の患者の治療に使用することができる。そのような病的状態、例えば、吸収不良が原因でのカルシウム欠乏に起因する場合がある骨粗鬆症においては、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防する必要がある。哺乳動物には、そのような状態になりやすい個体がある。例えば、本発明の組成物は、カルシウム欠乏に起因する骨粗鬆症に罹患している高齢者などの患者の治療に好適である。
【００３５】
本発明の組成物は、一実施形態では、ルーワイ胃バイパス術（ＲＹＧＢ）の患者又はスリーブ状胃切除術（ＳＧ）の患者において、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することにより、骨粗鬆症を治療及び／又は予防することに好適である。
【００３６】
本発明による組成物は、少なくとも１種の「胆汁酸」又はその塩、少なくとも１種の「脂肪酸」又はその塩、並びにカルシウム及びビタミンＤを含む。
【００３７】
「胆汁酸」という語句は、本明細書で使用する場合、生物における天然のものと、合成胆汁酸であるものとの両方を含む。天然の胆汁酸は、肝臓で合成される一次胆汁酸、及び腸内での細菌作用の結果として生じる二次胆汁酸の両方とすることができる。天然の胆汁酸はまた、抱合胆汁酸であってもよく、それは、胆汁酸がカルボン酸基上でグリシン部分又はタウリン部分と抱合していることを意味し、一次胆汁酸及び二次胆汁酸の両方について当てはまり得る。
【００３８】
一次胆汁酸には、コール酸（ＣＡ）及びケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）が属し、対応するそれらの抱合形態は、それぞれ、グリココール酸（ＧＣＡ）及びタウロコール酸（ＴＣＡ）、並びにグリコケノコール酸（ＧＣＤＣＡ）及びタウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）である。特に、本発明の目的の一次胆汁酸は、コール酸（ＣＡ）及びケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、並びに対応するそれらの抱合形態であり、それぞれ、グリココール酸（ＧＣＡ）及びグリコケノコール酸（ＧＣＤＣＡ）である。
【００３９】
二次胆汁酸には、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）及びヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）が属し、対応するそれらの抱合形態は、それぞれ、グリチョデオキシコール酸（glychodeoxycholic acid：ＧＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、グリチョリトコール酸（glycholithocholic acid ：ＧＬＣＡ）、トゥロリトコール酸（turolithocholic acid：ＴＬＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、グリコヒオデオキシコール酸（ＧＨＤＣＡ）及びタウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）である。特に、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）及びヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、並びに対応するそれらの抱合形態（それぞれ、グリチョデオキシコール酸（glychodeoxycholic acid：ＧＤＣＡ）、グリチョリトコール酸（glycholithocholic acid：ＧＬＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、及びグリコヒオデオキシコール酸（ＧＨＤＣＡ））は、本発明において重要である。
【００４０】
抱合胆汁酸は非抱合胆汁酸より酸性度が高く、それ故、「胆汁酸塩」と呼ばれることが多い。種々の胆汁酸は、様々な生物における「胆汁」の主成分であるが、例えば種々の動物における特定の種々の胆汁酸の存在量は、広範囲にわたって様々であり得る。合成胆汁酸は、例えばオベチコール酸（ＯＣＡ）（６アルファ−エチル−ケノデオキシコール酸）である。
【００４１】
本明細書で使用する胆汁酸への言及はいずれも、胆汁酸又はその塩への言及を含む。「胆汁酸」という用語はまた、「複数種の胆汁酸」、「胆汁酸塩」、「複数種の胆汁酸塩」及び「胆汁酸／塩」と互換的に使用してもよい。当然ながら、組成物は少なくとも１種の胆汁酸を含み、例えば２種以上の胆汁酸を含むことが可能である。使用される少なくとも１種の胆汁酸は、一次胆汁酸及び二次胆汁酸並びにそれらの塩から選ばれることが可能である。
【００４２】
生理的状態にある間、食事性脂肪は、上部消化管腔内で脂肪酸とモノグリセロールとに分解され、次いで粘膜により吸収される。肥満外科手術後、及び管腔での脂質分解の能力が低い他の状態にある間では、濃度遊離脂肪酸は上部消化管内で非生理的に低い。
【００４３】
したがって、本発明による組成物は、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩を含むことになり、前記少なくとも１種の脂肪酸は飽和又は不飽和である。不飽和脂肪酸は、シス配置又はトランス配置を有していてもよい。前記少なくとも１種の脂肪酸は、例えば、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ、脂肪族末端に６個未満の炭素）、例えばブチレート、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ、脂肪族末端に６〜１２個の炭素原子、直鎖又は分岐鎖）、例えば飽和のカプリル酸（８個の炭素原子）及びラウリン酸（１２個の炭素）、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ；１３〜２１個の炭素）、例えば不飽和のパルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、並びに飽和のパルミチン酸及びステアリン酸、又は極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ、２１個を超える炭素原子）である。当然ながら、組成物は、少なくとも１種の脂肪酸を含み、例えば、２種以上の脂肪酸を含むことが可能である。組成物中に使用される少なくとも１種の脂肪酸又はその塩は、入手可能で当技術分野の当業者に公知の、いずれのものでもよい。
【００４４】
本明細書に記載される組成物は、ビタミンＤを含む。ビタミンＤは、あるビタミンの群であり、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、アルファカルシドール、カルシトリオールを含む。本明細書に記載される組成物は、ビタミンＤ３として存在するビタミンＤ、又は少なくともビタミンＤ３から主としてなるビタミンＤを含む。本発明の別の態様において、カルシウムは、塩として、Ｃａ２＋−塩として、例えば、クエン酸カルシウム塩、炭酸カルシウム塩、又は任意のリン酸カルシウム塩として存在する。
【００４５】
本発明の一態様において、組成物が提供され、組成物中のカルシウム及びビタミンＤの量は、おおよそ１日当たりの推奨摂取量（ＲＤＩ）として存在する。カルシウムの１日当たりの推奨摂取量は、成人の場合１０００ｍｇ／日（ミリグラム／日）であり、人によって、例えば、高齢者及び若年者で１３００〜２５００ｍｇ／日までのレベルが推奨され、ビタミンＤの１日当たりの推奨摂取量は６００ＩＵ／日であり、成人の場合１５（μｇ）に相当し、高齢者には８００ＩＵ／日（２０、μｇ）までのレベルが推奨される。本発明の組成物は、１日当たりの推奨摂取量のビタミンＤを含んでもよく、又はその周辺量を含んでもよく、組成物の目的に依存して、即ち組成物が１日に何回投与されるかに依存して、１２５０μｇ／日に相当する５０，０００ＩＵ／日までを含んでもよい。
【００４６】
カルシウムの量は、組成物中に、１００〜２５００ｍｇの範囲で、例えば２００〜２０００の範囲で、例えば３００〜１５００ｍｇの範囲で、例えば４００〜１０００ｍｇの範囲で、例えば４００〜８００ｍｇ又は４００〜６００ｍｇで存在してもよい。カルシウムの量は、組成物中に、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００ｍｇの量で存在してもよい。ビタミンＤ、例えばビタミンＤ３の量は、５〜１２５０μｇの量で、例えば、１０〜１０００、又は２０〜８００の範囲で、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００μｇなどで、及びもっと低い範囲の約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０μｇで存在してもよい。組成物中のビタミンＤ及びカルシウムの量は、所望の最適応当（例えば、治療応答又は予防応答）をもたらすように調整されてもよい。
【００４７】
組成物中の前記少なくとも１種の胆汁酸の量は、約１×１０−７〜１×１０−３Ｍの腸内濃度をもたらす範囲で存在し、それは約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇに相当し、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば２〜４０ｍｇ／ｋｇ、例えば４〜３０ｍｇ／ｋｇ、例えば６〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば８〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８ｍｇ／ｋｇである。ビタミンＤ及びカルシウムに関しては、組成物は、単回用量又は複数回用量で所望の最適応当をもたらすように、前記少なくとも１種の胆汁酸を基準にして調整されてもよい。
【００４８】
組成物中の前記少なくとも１種の脂肪酸の量は、０．５ｇ〜約２０ｇ／日の範囲における十分な量で存在し、例えば１〜１８、例えば３〜１５ｇ、例えば５〜１２ｇ、７〜１０である。示されたこれらの範囲は、必須脂肪酸の所要量に合わせたものである。組成物は、単回用量又は複数回用量で所望の最適応当をもたらすように、脂肪酸の量に関して調整されてもよい。幾つかの態様では、胆汁酸塩及び脂肪酸の選択において、例えば溶解性、毒性の可能性及び有害な副作用、経口組成物における味の良さ、並びにその経口組成物が食品添加物又は医薬品と考えられるかどうかに関しての経口組成物の状態が考慮されなければならない。
【００４９】
本発明の一態様における、
ａ．少なくとも１種の胆汁酸又はその塩を、約１×１０−７〜１×１０−３Ｍの腸内濃度をもたらす量、
ｂ．少なくとも１種の脂肪酸又はその塩を、０．５ｇ〜約２０ｇの量、
ｃ．カルシウムを、１００〜２５００ｍｇの量、及び
ｄ．ビタミンＤを、８００〜２５００ｍｇの量
含む組成物。
【００５０】
組成物の例は、
ａ）一次胆汁酸であるコール酸（ＣＡ）及びケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、並びにそれぞれ、対応するそれらの抱合形態である、グリココール酸（ＧＣＡ）及びグリコケノコール酸（ＧＣＤＣＡ）、又は対応するそれらの二次胆汁酸である、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）及びヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、並びにそれぞれ、対応するそれらの抱合形態である、グリチョデオキシコール酸（glychodeoxycholic acid：ＧＤＣＡ）、グリチョリトコール酸（glycholithocholic acid：ＧＬＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）及びグリコヒオデオキシコール酸（ＧＨＤＣＡ）から選択される、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩を、約１×１０−７〜１×１０−３Ｍの腸内濃度をもたらす量、
ｂ）短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ、脂肪族末端に６個未満の炭素）、例えばブチレート、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ、脂肪族末端に６〜１２個の炭素原子、直鎖又は分岐鎖）、例えば飽和のカプリル酸（８個の炭素原子）及びラウリン酸（１２個の炭素）、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ；１３〜２１個の炭素）、例えば不飽和のパルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、並びに飽和のパルミチン酸及びステアリン酸、若しくは極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ、２１個を超える炭素原子）又はそれらの塩から選択される少なくとも１種の脂肪酸を、０．５ｇ〜約２０ｇの量、
ｃ）カルシウムを、１００〜２５００ｍｇの量、及び
ｄ）ビタミンＤ３などのビタミンＤを、８００〜２５００ｍｇの量
含む。
【００５１】
この組成物は、１日１回の投与が意図されている。１日２回、３回などの投与で組成物を提供するように、適切な調整がなされてもよい。上記で定義された組成物は、医薬品として使用するためのものである。
【００５２】
本発明の一態様において、組成物は、経口送達用に製剤化される。組成物は、経口送達用に製剤化されることに限定はされず、非経口送達用、静脈内注入用、又は注射用に製剤化されることも可能である。経口送達用に製剤化される場合、組成物は、食品の摂取前（食前）、及び／又は食品の摂取後（食後）に送達されてもよい。例えば、組成物は、食前、食事中及び／又は食後に送達することができる。
【００５３】
本発明の一態様において、組成物は、液体形態又は固体形態である。組成物が固体形態として製剤化される場合、咀嚼錠、発泡錠、散剤、丸剤、液剤、ゲル剤、錠剤又はカプセル剤として製剤化されてもよい。前述の固体形態を製剤化するために、他のよく知られている担体が、そのような固体形態の中に組み入れられてもよい。そのような担体は当業者に周知であり、例えば、生理学的に適合性の、溶媒、分散媒、コーティング剤、香味剤、抗菌剤及び抗真菌剤、並びに等張剤などが挙げられる。そのような担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せのうち１つ又は複数が挙げられる。等張剤、例えば糖類、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールなど、又は塩化ナトリウムを使用するのが好ましいことが多い。
【００５４】
本発明の別の態様において、哺乳動物、例えばヒト個体において、カルシウム欠乏に起因する骨粗鬆症、カルシウム欠乏に起因する吸収不良状態、若しくはカルシウム欠乏に起因する骨の病的状態、若しくはカルシウム欠乏に起因する骨ミネラル密度の損失を予防及び／又は治療する方法、或いはルーワイ胃バイパス術（ＲＹＧＢ）の個体又はスリーブ状胃切除術（ＳＧ）の個体において、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することにより、骨粗鬆症を治療する方法が提供され、それらの方法は、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、及び少なくとも１種の脂肪酸又はその塩を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することによって行われる。上記の組成物を投与することにより、ビタミンＤ−受容体活性化補助因子であるＨｓｐ９０βの発現が誘導され、ビタミンＤの誘導によるカルシウム取り込みが増加する。
【００５５】
別の態様において、本発明は、胆汁酸又はその塩、及び脂肪酸又はその塩、並びに任意選択によりカルシウム及びビタミンＤを含む組成物を含む健康補助食品又は栄養補助食品に関する。健康補助食品用又は栄養補助食品用の他の従来の成分もまた、当然ながら、そのような補助食品に添加してもよい。
【００５６】
本発明の一態様において、健康補助食品は、他の微量栄養素、例えば、鉄、マグネシウム、亜鉛、銅及びビタミン類（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ又はビタミンＥ）、並びに他の従来の成分を含む。そのような従来の成分は、当技術分野の当業者に公知であり、その例は、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、緩衝剤、賦形剤、補助剤、抗酸化剤、保存剤である。
【００５７】
本発明の一態様において、組成物は、
ａ）少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、
ｂ）少なくとも１種の脂肪酸又はその塩、
ｃ）カルシウム、
ｄ）ビタミンＤ、及び任意選択により、
ｅ）微量栄養素の群から選択されるさらに１種の成分、例えば、鉄、マグネシウム、ジンク（zink）、銅、及びビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＤ又はビタミンＥ）からなる群から選択される成分、及び任意選択により、
ｆ）充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、緩衝剤、賦形剤、補助剤、抗酸化剤、保存剤から選択される１種又は複数種の成分
を含む。
【００５８】
本発明の一実施形態では、組成物は、
ａ）グリココール酸（ＧＣＡ）を、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩として、
ｂ）オレイン酸又は酪酸を、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩として、
ｃ）カルシウム、
ｄ）ビタミンＤ、及び任意選択により、
ｅ）微量栄養素の群から選択されるさらに１種の成分、例えば、鉄、マグネシウム、ジンク（zink）、銅、及びビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＤ又はビタミンＥ）からなる群から選択される成分、及び任意選択により、
ｆ）充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、緩衝剤、賦形剤、補助剤、抗酸化剤、保存剤から選択される１種又は複数種の成分
を含む。
【００５９】
特に、少なくとも１種の胆汁酸（ａ）はグリココール酸（ＧＣＡ）であり、少なくとも１種の脂肪酸（ｂ）は酪酸であり、成分ｃ）からｆ）までを一緒に伴う。
【００６０】
特に、少なくとも１種の胆汁酸（ａ）はグリココール酸（ＧＣＡ）であり、少なくとも１種の脂肪酸（ｂ）はオレイン酸であり、成分ｃ）からｆ）までを一緒に伴う。
【００６１】
組成物は、健康補助食品としての使用が意図されてもよい。健康補助食品又は栄養補助食品は、上記の組成物に加えて、ヒトの健康に有益な効果のある他のビタミン類及び微量栄養素を含有してもよい。
【００６２】
本発明の組成物に関する上記の各態様は、特許請求の範囲にも開示されており、健康補助食品及び栄養補助食品の態様にも適用可能である。
【００６３】
上記の実施形態に基づいて、当業者は本発明のさらなる特徴及び利点を理解することになる。したがって、本発明は、実施例又は図面に具体的に示され、記載されていることに限定されるものではない。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、カルシウム欠乏に起因する骨粗鬆症、カルシウム欠乏を引き起こす炎症状態及び吸収不良状態、カルシウム欠乏に起因する骨障害、若しくはカルシウム欠乏に起因する骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を治療及び／又は予防するための医薬品、或いはルーワイ胃バイパス術（ＲＹＧＢ）の個体若しくはスリーブ状胃切除術（ＳＧ）の個体、又は他の類似の外科的手法により治療された個体において、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することにより、骨粗鬆症を治療するための医薬品の製造における、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、少なくとも１種の脂肪酸又はその塩、１種又は複数種のビタミンＤ、及びカルシウム又はその塩の使用が提供される。本発明のこの態様の効果及び特徴は、上記の各態様の効果及び特徴と類似している。本明細書に記載される組成物は、上に開示されている疾患及び障害の治療における医薬品としての使用が意図される。
【００６５】
本発明の別の態様によれば、少なくとも１種の胆汁酸又はその塩、及び少なくとも１種の脂肪酸又は塩を含む組成物が提供され、前記少なくとも１種の胆汁酸は、上記の胆汁酸のうちの１種であり、前記少なくとも１種の脂肪酸は、上記の脂肪酸のうちの１種である。
【実施例】
【００６６】
実験
実験の目的は、例えばＲＹＧＢ又はＳＧの手術を受けた患者において、近位小腸内でのビタミンＤの誘導によるカルシウム取り込みを改善する方法を調査することである。前記事項は、特定の胆汁酸（又はヒト胆汁）及び脂肪酸を添加して、ビタミンＤ−受容体活性化補助因子であるＨｓｐ９０βの発現を誘導することによって試験される。Ｈｓｐ９０βを誘導することにより、ビタミンＤの誘導によるカルシウム輸送の発現を実質的に増加させることができる。即ちカルシウム取り込みの増加を必要とするいかなる患者においても、例えばＲＹＧＢの患者、及びおそらくＳＧの患者においても、それを正常化させることができる。
【００６７】
Caco-2細胞株
Caco-2細胞株は、Sloan-Kettering institute for Cancer Researchが開発した非均質なヒト上皮大腸腺癌細胞の連続株である。この細胞は癌腫をもつ結腸又は大腸に由来するが、この細胞が特定の条件下で培養されると、分化し、極性化してその表現型を作り、小腸を覆う腸管上皮細胞に形態的及び機能的に類似する。
【００６８】
通常そのような腸管上皮細胞の特性である、タイトジャンクション、微絨毛、並びに複数の酵素及び輸送体、即ち、ペプチダーゼ、エステラーゼ、Ｐ−糖タンパク質、アミノ酸、胆汁酸、カルボン酸の取り込み輸送体などを、Caco-2細胞が発現することが分かっている。顕微鏡的にはCaco-2細胞培養物は非均質であり、この見解は、世界中の様々な研究からの様々な有意性結果を示す細胞の特性によって裏付けられる。Caco-2細胞は、一般に、個別の細胞としてではなく、細胞培養液インサートフィルター上のコンフルエントな単層として使用される。この培養形態により、細胞は分化して極性化上皮細胞の単層を形成し、イオン及び低分子の通路に対する物理的及び生化学的なバリアとなる。Caco-2単層培養は、経口投与された薬物の吸収を調査するために、ヒト小腸粘膜のインビトロモデルで広く使用される。
【００６９】
Caco-2細胞培養
継代数１又は約４５（分離した回数）のCaco-2細胞（Sigma-Aldrich、Stockholm、スウェーデン）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Life Technologies）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Life Technologies）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンストレプトマイシン（Pen-Strep）（Life Technologies）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Life Technologies Invitrogen AB、Lidingo、スウェーデン）中で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、細胞培養フラスコ（BD Falcon（登録商標）、VWR Internationals、Stockholm、スウェーデン）の中で培養し、培地を毎週月曜、水曜、金曜に交換した。
【００７０】
細胞を、およそ１週間培養した後に剥離し（０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ、Life Technologies）半透性フィルターインサート（孔径３μｍ、BD Biosciences、Le Pont de Claix、仏国）を伴う６ウェルプレートに、２００,０００細胞／ウェルで播種した。コンフルエントになると、上部ウェルコンパートメント及び下部ウェルコンパートメントの両方において、培養液を、ＦＢＳを含まないものに交換し、下部コンパートメントにはまた、１０μＬ／ｍＬインスリン、０．５５μｇ／ｍＬトランスフェリン及び６．７ｎｇ／ｍＬセレンの混合物（ＩＴＳ、Life Technologies）も添加して、細胞極性及び構造的分化を樹立した（６〜７）。細胞単層は、実験まで１４日間培養した。
【００７１】
次いで、細胞を、上部の「管腔の」コンパートメントの中で、脂肪酸、及びヒト胆汁酸若しくは胆汁の酸、又は両方の組合せを伴う１０ｍＭで、２４時間又は４８時間刺激し（処置細胞）、他は対照として残した（無処置細胞）。胆汁酸は胆汁の成分として存在する。
【００７２】
ウエスタンブロット解析
タンパク質を回収するために、細胞を掻き取り、プロテインキナーゼ阻害剤緩衝液（１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８、１０ｍＭの３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ：Boehringer Mannheim、Mannheim、独国）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠Complete（Roche Diagnostics AB、Stockholm、スウェーデン）を含有するプロテインキナーゼ阻害溶液（１％Triton x-100、ＥＤＴＡ；エチレンジアミン四酢酸）に入れて溶解緩衝液にした。氷上で数回振盪させた後に、細胞片を遠心分離（１００００×ｇ、４℃で１０分間）によって除去し、上清のタンパク質含量を、ブラッドフォード法を使用して分析した。
【００７３】
試料をＳＤＳ緩衝液中に希釈し、７０℃で１０分間加熱してから、NuPage１０％Bis-Trisゲルに載せ、ＭＯＰＳ緩衝液（Invitrogen AB、Lidingo、スウェーデン）を使用して電気泳動を行った。各ゲルの１レーンに染色済み分子量スタンダード（SeeBlue、NOVEX、San Diego、ＣＡ、米国）を装填した。電気泳動後、タンパク質をポリビニルジフルオリド膜（Amersham、Buckinghamshire、英国）に移し、これをＨｓｐ９０β抗体（abcam；ab80159、Cambridge、英国）とともにインキュベートし、アルカリホスファターゼをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Santa Cruz）及びCDP-Star（Tropix、Bedford、ＭＡ、米国）を基質として使用し、化学発光を用いて免疫反応性タンパク質を同定した。画像をChemidox XRS冷却ＣＣＤカメラでキャプチャーし、Quantity Oneソフトウェア（BioRad laboratories、Hercules、ＣＡ、米国）で分析した。
【００７４】
Ｃａ２＋の取り込み及び輸送
Caco-2細胞を、透過性支持体上で、Giuliano A. R., & Wood R.Jに従い多少の変更を加えて、１１〜１４日間培養した。実験日に経上皮電気抵抗を測定し、４００〜９００オーム×ｃｍ２の値の標本のみをカウントした。試験物質は上部のコンパートメントに入っており、２４〜４８時間後に結果を読み取った。液体シンチレーションを使用してＣａ２＋流束を測定し、下部コンパートメントと上部コンパートメントとを比較した。
【００７５】
実験１
この実験では、Caco-2細胞に、脂肪酸である酪酸（又はブチレートと呼ばれる）、胆汁酸であるグリココール酸（ＧＣＡ）、又は酪酸とＧＣＡとの組合せを加えて試験した。
【００７６】
細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、次いで、ビヒクル、酪酸、胆汁酸、又は胆汁酸と酪酸との組合せを加えて４８時間インキュベートした。次いで細胞を回収し、細胞内の全タンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを使用して分析した。Ｈｓｐ９０βの発現は、制御されていない対照タンパク質ＧＡＰＤＨの発現を基準に正規化して示されている。抱合胆汁酸ＧＣＡに、脂肪酸である酪酸を添加して、及び添加せずに培養したCaco-2細胞中でのＨｓｐ９０βの発現に対する効果が、図１に示されている。
【００７７】
その結果により、ＧＣＡは、単独ではＨｓｐ９０βに対して効果がなかったが、酪酸と併用した場合にのみ、ビヒクル処置した対照細胞と比較して、Ｈｓｐ９０βタンパク質の発現を顕著に極めて有意に増加させたことが示されている。
【００７８】
実験２
クローディン−２は、遠位小腸におけるカルシウム吸収を、傍細胞経路によって増加させる（通常、「受動」カルシウム吸収と呼ばれる）、許容性のタイトジャンクション構成タンパク質である。図２は、ビタミン−Ｄには、Caco-2細胞においてクローディン−２タンパク質の発現を用量依存的に増加させ、それにより、「受動」カルシウム吸収を促進する効果があることを示す。ビタミン−Ｄ活性化補助因子であるＨｓｐ９０βを特異的阻害剤ゲルダナマイシンで抑制すると、明らかにビタミン−Ｄ活性の阻害によってクローディン−２の発現も抑制され、これは、Ｈｓｐ９０βが「受動」カルシウム吸収についても重要であることを立証している。したがって、小腸内でのＨｓｐ９０βの発現を促進すると、ヒト小腸における受動カルシウム吸収にも有益な効果があるはずである。Caco-2細胞を、実験１と同じ実験条件で培養した。ビタミンＤを１０μＭ（低用量）又は１００μＭ（高用量）の濃度で添加した。ゲルダナマイシンを０．５μＭの濃度で添加した。
【００７９】
実験３
本実験では、Caco-2細胞を、上皮状のコンフルエントになるまで１４日かけて培養し、増殖させた。その後の各実験は、Giuliano A. R.、& Wood R.Jに従って実施した。カルシウム輸送に対する１０ｎＭの１．２５（ＯＨ）２−ビタミンＤ３の効果を、最後の４８時間で試験した。カルシウム（Ｃａ２＋）勾配をつけずに流束を試験し、カルシウムの濃度は細胞の層の各側で１．８ｍＭとした。このようにして、ビタミンＤの能動輸送を確認した。結果は図３に示されている。
【００８０】
実験４
本実験では、Caco-2細胞を、上皮状のコンフルエントになるまで１２日かけて培養し、増殖させた。次いで、０．１ｍＭのＧＣＡの存在下で、若しくは０．５ｍＭのブチレートの存在下で、又はＧＣＡとブチレートとを組み合わせて存在させて、細胞をさらに４日増殖させた。
【００８１】
カルシウム輸送に対する１０ｎＭの１．２５（ＯＨ）２−ビタミンＤ３の効果を、最後の４８時間で試験した。カルシウム（Ｃａ２＋）勾配をつけずに流束を試験し、カルシウムの濃度は細胞の層の各側で１．８ｍＭとした。
【００８２】
結果は図４に示されている（平均±ＳＥＭが示されている）。
【００８３】
この実験は、Caco-2上皮層を通過する能動輸送を示す。輸送速度は１．２５（ＯＨ）２−ビタミンＤ３単独の場合と同じオーダーであり、カルシウム勾配がない場合には、胆汁酸を脂肪酸と組み合わせてもさらなる効果はないと結論づけることができる。
【００８４】
実験５
本実験では、Caco-2細胞を、上皮状のコンフルエントになるまで１２日かけて培養し、増殖させた。次いで、ビタミンＤ３を単独で、又は０．５ｍＭのブチレートと組み合わせて、若しくは０．１ｍＭのＧＣＡと組み合わせて、若しくはＧＣＡ及びブチレートの両方と組み合わせて、若しくは０．１ｍＭのＴＣＡ、若しくはＴＣＡ及びブチレートの両方と組み合わせて存在させて、細胞をさらに４日増殖させた。
【００８５】
カルシウム輸送に対する１０ｎＭの１．２５（ＯＨ）２−ビタミンＤ３の効果を、最後の４８時間で試験した。頂端側で４０ｍＭ、及び基底外側で１．８ｍＭのカルシウム（Ｃａ２＋）勾配をつけて流束を試験した。
【００８６】
クラスカル・ウォリス検定により、ダンの多重比較検定と対照させて、効果を測定した。結果は図５に示されている（平均±９５％−コンフィセンス（conficence）区間が示されている）。ここで、カルシウムの取り込みの増加はビタミンＤとＧＣＡとブチレートとの組合せで達成されると結論づけることができる。しかしながら、ビタミンＤ、ＴＣＡ及びブチレートでは取り込みが実現できなかったと結論づけることもできる。
【００８７】
実験６
本実験では、Caco-2細胞を、上皮状のコンフルエントになるまで１２日かけて培養し、増殖させた。次いで、ビタミンＤ３を単独で、又は０．５ｍＭのブチレートと組み合わせて、若しくは０．１ｍＭのＧＣＡと組み合わせて、若しくはＧＣＡ及びブチレートの両方と組み合わせて、若しくはＧＣＡ及びオレイン酸と組み合わせて存在させて、細胞をさらに４日増殖させた。
【００８８】
カルシウム輸送に対する１０ｎＭの１．２５（ＯＨ）２−ビタミンＤ３の効果を、最後の４８時間で試験した。頂端側で４０ｍＭ、及び基底外側で１．８ｍＭのカルシウム（Ｃａ２＋）勾配をつけて流束を試験した。
【００８９】
クラスカル・ウォリス検定により、ダンの多重比較検定と対照させて、効果を測定した。結果は図６に示されている（平均±９５％−コンフィセンス（conficence）区間）。ここで、カルシウムの取り込みの増加はビタミンＤとＧＣＡとブチレートとの組合せで達成され、取り込みの増加はビタミンＤ、ＧＣＡ及びオレイン酸でも達成されたと結論づけることができる。
【００９０】
参考文献
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【図１】
2021517578.tif 000003
【図２】
2021517578.tif 000004
【図３】
2021517578.tif 000005
【図４】
2021517578.tif 000006
【図５】
2021517578.tif 000007
【図６】
2021517578.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月12日(2020.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆汁酸であるグリココール酸（ＧＣＡ）又はその塩、並びに短鎖及び中鎖、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）若しくは極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）、又はそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含む、医薬品としての使用のための組成物。
【請求項２】
胆汁酸であるグリココール酸（ＧＣＡ）又はその塩、並びに短鎖及び中鎖、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、若しくは中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）、又はそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含む、医薬品としての使用のための請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記短鎖脂肪酸が酪酸である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記中鎖脂肪酸がカプリル酸である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
胆汁酸であるグリココール酸（ＧＣＡ）又はその塩、及び長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）、好ましくはオレイン酸、又は極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）若しくはその塩、好ましくはリングノセリン（Ｃ２４）酸からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含む、医薬品としての使用のための請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
胆汁酸であるグリココール酸（ＧＣＡ）又はその塩、及び酪酸若しくはその塩、又はオレイン酸若しくはその塩からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含む、医薬品としての使用のための請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
カルシウム吸収欠乏の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
哺乳動物における、カルシウム欠乏に起因する骨粗鬆症、カルシウム欠乏に起因する吸収不良状態、又はカルシウム欠乏に起因する骨障害の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
哺乳動物におけるカルシウム欠乏に起因する骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することによる骨粗鬆症の治療及び／又は予防における使用のための、或いはルーワイ胃バイパス術（ＲＹＧＢ）の患者又はスリーブ状胃切除術（ＳＧ）の患者における骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の損失を予防することによる骨粗鬆症の治療のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物がビタミンＤをさらに含み、好ましくは前記ビタミンＤがビタミンＤ３から主としてなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記組成物がカルシウムをさらに含み、好ましくは前記カルシウムが、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、若しくはリン酸カルシウム、又はそれらの混合物として存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記組成物中のカルシウム及びビタミンＤの量が、１日当たりの推奨摂取量（ＲＤＩ）以下として存在する、請求項１０又は１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、ビヒクル、賦形剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤、結合剤、及び崩壊剤のうち少なくとも１種を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、経口送達用、非経口送達用、静脈内注入用、又は注射用に製剤化される、請求項１〜６及び１０〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、液体形態又は固体形態である、請求項１〜６及び１０〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、咀嚼錠、発泡錠、散剤、丸剤、錠剤、又はカプセル剤として製剤化される、請求項１５に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
前記組成物が栄養補助食品又は健康補助食品である、請求項１〜６及び１０〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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