(57)【要約】本発明は、遺伝性血管性浮腫を鑑別診断するための方法に関し、この方法は、対象者由来のサンプル中のC4タンパク質、C1-INHタンパク質およびC1qタンパク質のレベルを測定する工程を含んでなり、ここで、該サンプルは乾燥血液スポットサンプルであり、該レベルは質量分析によって測定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝性血管性浮腫を鑑別診断するための方法であって、対象者由来のサンプル中のC4タンパク質、C1-INHタンパク質およびC1qタンパク質のレベルを測定する工程を含んでなり、ここで、該サンプルが乾燥血液スポットサンプルであり、該レベルが質量分析によって測定される、方法。
【請求項２】
C4タンパク質のレベルを測定する工程が、C4フラグメントペプチドのレベルを検出および定量化することを含み、C1-INHタンパク質のレベルを測定する工程が、C1-INHフラグメントペプチドのレベルを検出および定量化することを含み、C1qタンパク質のレベルを測定する工程が、C1qフラグメントペプチドのレベルを検出および定量化することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルがC4タンパク質の検査で陰性であり、かつC1-INHタンパク質とC1qタンパク質の検査で陽性である場合、前記対象者が遺伝性血管性浮腫タイプIIに罹患している、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルがC4タンパク質とC1-INHタンパク質の検査で陰性であり、かつC1qタンパク質の検査で陽性である場合、前記対象者が遺伝性血管性浮腫タイプIに罹患している、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
遺伝性血管性浮腫タイプIと遺伝性血管性浮腫タイプIIを区別するための方法である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
C4タンパク質またはC4フラグメントペプチドのレベルがカットオフ値よりも高い場合には、サンプルがC4タンパク質の検査で陽性であり、C4タンパク質またはC4フラグメントペプチドのレベルがカットオフ値よりも低い場合には、サンプルがC4タンパク質の検査で陰性である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
C1-INHタンパク質またはC1-INHフラグメントペプチドのレベルがカットオフ値よりも高い場合には、サンプルがC1-INHタンパク質の検査で陽性であり、C1-INHタンパク質またはC1-INHフラグメントペプチドのレベルがカットオフ値よりも低い場合には、サンプルがC1-INHタンパク質の検査で陰性である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
C1qタンパク質またはC1qフラグメントペプチドのレベルがカットオフ値よりも高い場合には、サンプルがC1qタンパク質の検査で陽性であり、C1qタンパク質またはC1qフラグメントペプチドのレベルがカットオフ値よりも低い場合には、サンプルがC1qタンパク質の検査で陰性である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
C4フラグメントペプチド、C1-INHフラグメントペプチド、C1qフラグメントペプチドおよび/またはC3フラグメントペプチドが、プロテアーゼ消化またはペプチダーゼ消化によって前記サンプルから調製される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロテアーゼが、Arg-C、Asp-N、Asp-N（N末端Glu）、BNPSまたはNCS/尿素、カスパーゼ1、カスパーゼ10、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、キモトリプシン、キモトリプシン（低特異性）、クロストリパイン、CNBr、CNBr（メチル-Cys）、CNBr（酸を含む）、エンテロキナーゼ、第Xa因子、ギ酸、Glu-C（AmAcバッファー）、Glu-C（Phosバッファー）、グランザイムB、HRV3Cプロテアーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、Lys-C、Lys-N、Lys-N（Cys修飾）、弱酸加水分解、NBS（長時間曝露）、NBS（短時間曝露）、NTCB、膵エラスターゼ、ペプシンA、ペプシンA（低特異性）、プロリルエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼK、TEVプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビンを含む群から選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼがトリプシンまたはペプシンであり、好ましくはトリプシンである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記C4フラグメントペプチドが、
2021512316.tif 000050
2021512316.tif 000051
2021512316.tif 000052
2021512316.tif 000053
2021512316.tif 000054
2021512316.tif 000055
2021512316.tif 000056
からなる群より選択される、請求項2〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記C4フラグメントが、C4β[571-579]、C4α[680-685]、C4α[786-791]、C4β[294-297]およびC4γ[1638-1641]からなる群より選択され、好ましくは前記C4フラグメントがC4β[571-579]である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
C1-INHフラグメントペプチドが、
2021512316.tif 000057
2021512316.tif 000058
からなる群より選択される、請求項2〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記C1-INHフラグメントペプチドがSerpinG1 [242-249]およびSerpinG1 [391-400]からなる群より選択され、好ましくは前記C1-INHフラグメントがSerpinG1 [242-249]である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記C1qフラグメントペプチドが、
2021512316.tif 000059
2021512316.tif 000060
からなる群より選択される、請求項2〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記C1qフラグメントペプチドが、C1qβ[178-186]およびC1qβ[63-77]からなる群より選択され、好ましくは前記C1qフラグメントがC1qβ[178-186]である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
C4フラグメントペプチドC4β[571-579]のカットオフ値が500ng/mlであり；
C4フラグメントペプチドC4α[680-685]のカットオフ値が260ng/mlであり；
C4フラグメントペプチドC4α[786-791]のカットオフ値が100ng/mlであり；
C4フラグメントペプチドC4β[294-297]のカットオフ値が201ng/mlであり；かつ
C4フラグメントペプチドC4γ[1638-1641]のカットオフ値が920ng/mlである
請求項6〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
C1-INHフラグメントペプチドSerpinG1[242-249]のカットオフ値が835ng/mlであり；かつ
C1-INHフラグメントペプチドSerpinG1[391-400]のカットオフ値が392ng/mlである
請求項7〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
C1qフラグメントペプチドC1qβ[178-186]のカットオフ値が800ng/mlであり；かつ
C1qフラグメントペプチドC1qβ[63-77]のカットオフ値が1690ng/mlである
請求項8〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法の感度が、遺伝性血管性浮腫タイプIまたは遺伝性血管性浮腫タイプIIに罹患している対象者の検出について100％である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
質量分析が、SELDI MS、MALDI MS、ESI MS、DESI MS、およびイオンモビリティMSを含む群から選択される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
質量分析が、Triple Quad、ToF、QToF、イオントラップ、オービトラップ、イオンモビリティ、およびそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される分析装置を使用する、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
分光分析が、MS/MS、MRM、SRMまたはそれらの任意の組み合わせ、好ましくはMS/MS、MSe、MSn、MS/MRMまたはMS/SRM、を含むかまたは使用する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
遺伝性血管性浮腫の鑑別診断のための方法において、好ましくは請求項1〜24のいずれか一項に記載の遺伝性血管性浮腫の鑑別診断のための方法において使用するのに適したキットであって、1つのバイオマーカーの相互作用パートナー、1つのバイオマーカー、該キットの使用説明書、および1つまたは複数の容器を含む群から選択される少なくとも1つの要素を含んでなり、ここで、該バイオマーカーが、C4タンパク質、C4タンパク質のフラグメントペプチド、C1-INHタンパク質、C1-INHタンパク質のフラグメントペプチド、C1qタンパク質およびC1qのフラグメントペプチドを含む群から選択される、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象者における遺伝性血管性浮腫を鑑別診断するための方法、および遺伝性血管性浮腫の鑑別診断で使用するのに適したキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝性血管性浮腫は、血管外への体液の蓄積を繰り返し起こすこと、血液またはリンパ液の正常な流れを遮断すること、および手、足、四肢、顔、腸管、または気道の組織の急速な腫れを引き起こすことを特徴とする稀な遺伝性疾患である。通常、この腫れはかゆみを伴わない；かゆみはアレルギー反応による可能性があるからである。消化管の腫れはけいれんを引き起こす。気道の腫れは、潜在的に非常に深刻な合併症である閉塞につながる可能性がある。これらの症状は、非常に小さな血管、すなわち毛細血管を通る体液の正常な流れを維持するのに役立つ特定のタンパク質の欠乏または不適切な機能の結果として現れる。場合によっては、体液は他の内臓に蓄積することがある。
【０００３】
この疾患の重症度は、罹患した個人間で大きく異なっている。遺伝性血管性浮腫には主に3つのタイプ、すなわち、タイプI、タイプII、タイプIIIがあり、タイプIが最も一般的である。遺伝性血管性浮腫のタイプIとタイプIIはどちらも、通常は補体系の活性化を抑制するC1インヒビタータンパク質を作るSERPING1遺伝子の変異によって引き起こされる一方で、タイプIIIは第XII因子の遺伝子の変異によることが多い。
【０００４】
遺伝性血管性浮腫は常染色体優性形質として遺伝する。変異遺伝子はどちらかの親から受け継がれるか、または罹患した個体における自然発生的な新しい変異の結果であり得る。
【０００５】
急性発作の患者の治療には、血漿由来C1エステラーゼ阻害剤（「ベリナート（Berinert：登録商標）」、CSL Behring社）、カリクレイン阻害剤（「カルビトール（Kalbitor：登録商標）」、Dyax Corporation）、またはブラジキニン拮抗剤（「フィラジル（Firazyr：登録商標）」、Shire社）の投与が含まれる。長期予防のための患者の治療には、C1エステラーゼ阻害剤、例えば「シンライズ（Cinryze：登録商標）」（Viropharma社）、および/または17α-アルキル化アンドロゲン、例えばダナゾール（Danazol）（「Danatrol」、「Danocrine」、「Danol」、「Danoval」などのブランド名で入手可能）の投与が含まれる。
【０００６】
遺伝性血管性浮腫は、発色アッセイまたは複合体測定ELISAのいずれかを用いてC1-INHレベルを測定することにより、診断することができる。そのような検査室テスト、すなわち発色アッセイまたは複合体測定ELISAは、非特異的で、時間がかかり、ハイレベルまたはリソース、例えば、生物学的サンプル、時間、検査室材料などを必要とする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の根底にある課題は、遺伝性血管性浮腫を鑑別診断するための方法および手段を提供することである。
【０００８】
これらおよび他の課題は、添付の独立請求項の主題によって解決される。好ましい実施態様は、添付の従属請求項から得ることができる。
【０００９】
より具体的には、本発明の根底にある課題は、第1の局面では、遺伝性血管性浮腫を鑑別診断するための方法によって解決され、この方法は、対象者由来のサンプル中のC4タンパク質、C1-INHタンパク質およびC1qタンパク質のレベルを測定する工程を含んでなり、ここで、該サンプルは乾燥血液スポットサンプルであり、該レベルは質量分析によって測定される。
【００１０】
本発明の根底にある課題は、第2の局面では、遺伝性血管性浮腫の鑑別診断法、好ましくは第1の局面による遺伝性血管性浮腫の鑑別診断法で使用するのに適したキットによって解決され、このキットは、1つのバイオマーカーの相互作用パートナー、1つのバイオマーカー、キットの使用説明書、および1つまたは複数の容器を含む群から選択される少なくとも1つの要素を含んでなり、ここで、該バイオマーカーは、C4タンパク質、C4タンパク質のフラグメントペプチド、C1-INHタンパク質、C1-INHタンパク質のフラグメントペプチド、C1qタンパク質およびC1qのフラグメントペプチドを含む群から選択される。
【００１１】
本発明者は、驚くべきことに、遺伝性血管性浮腫の鑑別診断に有用なバイオマーカーのセットを同定した。そのようなバイオマーカーのセットは、（a）C4タンパク質またはC4フラグメントペプチド、（b）C1-INHタンパク質またはC1-INHフラグメントペプチド、および（c）C1qタンパク質またはC1qフラグメントペプチドを含む。
【００１２】
本発明のそれぞれの任意の局面によれば、前記バイオマーカーは、C4タンパク質、ある態様ではC4フラグメントペプチドであるC4タンパク質由来のペプチド、C1-INHタンパク質、ある態様ではC1-INHフラグメントペプチドであるC1-INHタンパク質由来のペプチド、C1qタンパク質、およびある態様ではC1qフラグメントペプチドであるC1qタンパク質由来のペプチドを含む群から選択される。したがって、いずれかの局面およびその態様を含む本発明の様々な方法を実施する際に、C4タンパク質、C1-INHタンパク質および/またはC1qタンパク質のレベルを測定することは、本発明の範囲内である。より具体的には、いずれかの局面およびその態様を含む本発明の様々な方法を実施する際に、C4タンパク質、C1-INHタンパク質およびC1qタンパク質のレベルを測定することは、本発明の範囲内である。
【００１３】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、C1qタンパク質由来のペプチドは、C1qタンパク質の酵素消化、好ましくはC1qタンパク質のトリプシン消化によるC1qタンパク質の消化、により得られたまたは得ることができるペプチドである。一態様では、そのようなペプチドは化学的に変化、転換または誘導体化されない。
【００１４】
補体系の亜成分C1qは、免疫グロブリン複合体に結合して、C1r（酵素）、C1s（プロ酵素）、および他の8つの補体成分の連続的な活性化をもたらす。C1qは、A、B、Cと呼ばれる3種類の異なる鎖で構成されている。好ましくは、本明細書におけるC1qまたはタンパク質C1qへの言及は、別の記載がない限り、亜成分C1qと、その個々の鎖A、BおよびCのいずれかの両方を指す。
【００１５】
C1qのA鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである。
2021512316.tif 000002
【００１６】
C1qのB鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである。
2021512316.tif 000003
【００１７】
C1qのC鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである。
2021512316.tif 000004
【００１８】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、C1qに由来するフラグメントペプチドは、以下の表から選択されるものである。
2021512316.tif 000005
2021512316.tif 000006
【００１９】
C1qに由来する特に好ましいペプチドは、C1qB_[178-186]であり、これは、高分解能イオンモビリティ質量分析計で測定した分子質量m/zが510.26の化合物であり、MRM-MSで測定することができ、そのアミノ酸配列は次の通りである：GNLCVNLMR。このペプチドは、好ましくは、対照としておよび/またはHAEとAAEを区別するために使用される。
【００２０】
C1qに由来する別の特に好ましいペプチドは、C1qB_[63-77]であり、これは、高分解能イオンモビリティ質量分析計で測定した分子質量m/zが742.36または495.24の化合物であり、MRM-MSで測定することができ、そのアミノ酸配列は次の通りである：GLPGLAGDHGEFGEK。このペプチドは、好ましくは、対照としておよび/またはHAEとAAEを区別するために使用される。
【００２１】
本発明のそれぞれの任意の局面によれば、本発明のそのようなそれぞれの任意の局面の態様において、前記バイオマーカーとは別に、本方法は、他のバイオマーカーの存在および/またはレベルを測定する工程を含んでなり、ここで、該他のバイオマーカーは、C1-INHタンパク質、C1-INH由来のペプチド、C4タンパク質および/またはC4タンパク質由来のペプチドである。
【００２２】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、C1-INHタンパク質由来のペプチドは、C1-INHタンパク質の酵素消化、好ましくはC1-INHタンパク質のトリプシン消化によるC1-INHタンパク質の消化、により得られたまたは得ることができるペプチドである。一態様では、そのようなペプチドは化学的に変化、転換または誘導体化されない。
【００２３】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、C4タンパク質由来のペプチドは、C4タンパク質の酵素消化、好ましくはC4タンパク質のトリプシン消化によるC4タンパク質の消化、により得られたまたは得ることができるペプチドである。一態様では、そのようなペプチドは化学的に変化、転換または誘導体化されない。
【００２４】
C1-INHのアミノ酸配列は、以下の通りである。
2021512316.tif 000007
【００２５】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、C1-INHに由来するフラグメントペプチドは、以下の表から選択されるものである。
2021512316.tif 000008
2021512316.tif 000009
【００２６】
C1-INHに由来する特に好ましいフラグメントペプチドは、SerpinG1_[242-249]およびSerpinG1_[391-400]であり、MRMトランジション455.74→696.33を有するSerpinG1_[242-249]が特に好適である。
【００２７】
C4のアミノ酸配列は、以下の通りである。
2021512316.tif 000010
【００２８】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、C4に由来するフラグメントペプチドは、以下の表から選択されるものである。
2021512316.tif 000011
2021512316.tif 000012
2021512316.tif 000013
2021512316.tif 000014
2021512316.tif 000015
2021512316.tif 000016
【００２９】
C4に由来する特に好ましいフラグメントペプチドは、C4β[571-579]、C4α[680-685]、C4α[786-791]、C4β[294-297]であり、MRMトランジション466.26→243.13を有するC4β[571-579]が特に好適である。
【００３０】
本発明のそれぞれの任意の局面に関連して、C3タンパク質および/またはC3タンパク質由来のペプチドは、好ましくは、検出システムの、好ましくはバイオマーカーのレベルの定量に使用される分析技術の、適切な機能のための内部対照として、使用され得る。
【００３１】
C3に由来するペプチドは、C3タンパク質の酵素消化、好ましくはC3タンパク質のトリプシン消化によるC3タンパク質の消化、により得られたまたは得ることができるペプチドである。
【００３２】
補体系の成分C3は、古典的経路、第2経路、およびレクチン活性化経路において、例えば以下のような、いくつかの重要な生物学的役割を果たしている：（1）補体系の完全な活性化に不可欠なC3-およびC5-コンベルターゼの形成；（2）微生物の食作用を増強するオプソニンの生産；（3）フラグメントC3aおよびC5aによって促進される肥満細胞および好塩基球の脱顆粒；（4）C3bに結合した免疫複合体の可溶化とクリアランス；（5）フラグメントC3dおよびC3dgのアジュバント機能；および（6）アポトーシス細胞のクリアランス。遺伝性血管性浮腫の患者は一般的に、正常なC3レベルを有する。
【００３３】
C3のアミノ酸配列は、以下の通りである。
2021512316.tif 000017
【００３４】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、C3に由来するフラグメントペプチドは、以下の表から選択されるものである。
2021512316.tif 000018
2021512316.tif 000019
2021512316.tif 000020
2021512316.tif 000021
【００３５】
C3に由来する特に好ましいペプチドは、C3β_[489-497]であり、これは、高分解能イオンモビリティ質量分析計で測定した分子質量m/zが604.81で、MRMトランジション604.8→327.22を有する化合物であり、MRM-MSで測定することができ、そのアミノ酸配列は次の通りである：YYTYLIMNK。C3の別の好ましいフラグメントペプチドは、MRMトランジション824.74→798.44を有するC3cα1_[814-834]_Cys_CAM: 816である。
【００３６】
C3に由来する別の特に好ましいペプチドは、C3cα_[814-834]Cys_CAM816であり、これは、高分解能イオンモビリティ質量分析計で測定した分子質量m/zが495.25の化合物であり、MRM-MSで測定することができ、そのアミノ酸配列は
2021512316.tif 000022
である。「CAM」はカルバミドメチルを指し、C3のペプチドへの開裂後の遊離SH基のアルキル化の結果である。
【００３７】
本明細書で好ましく使用されるフラグメントペプチドは、消化、好ましくはタンパク質分解酵素によるタンパク質の完全消化、により生成されたタンパク質のペプチドである。
【００３８】
タンパク質C1q、C1-INH、C4およびC3からそれぞれペプチドを生成するためにトリプシンを使用しないで、別のタンパク質分解酵素を使用できることが認識されよう。好ましくは、タンパク質分解酵素はプロテアーゼまたはペプチダーゼであり、これはタンパク質が完全に消化されるとペプチドの混合物をもたらし、ここで、該ペプチドのそれぞれの種は1回だけ存在する。これにより、該タンパク質と、プロテアーゼを用いた該タンパク質のそのような完全消化により得られた各ペプチドとの間には、1：1の化学量論が存在することが保証される。別の態様では、消化反応またはプロテアーゼは、以下を含む群から選択される：Arg-C、Asp-N、Asp-N（N末端Glu）、BNPSまたはNCS/尿素、カスパーゼ1、カスパーゼ10、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、キモトリプシン、キモトリプシン（低特異性）、クロストリパイン、CNBr、CNBr（メチル-Cys）、CNBr（酸を含む）、エンテロキナーゼ、第Xa因子、ギ酸、Glu-C（AmAcバッファー）、Glu-C（Phosバッファー）、グランザイムB、HRV3Cプロテアーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、Lys-C、Lys-N、Lys-N（Cys修飾）、弱酸加水分解、NBS（長時間曝露）、NBS（短時間曝露）、NTCB、膵エラスターゼ、ペプシンA、ペプシンA（低特異性）、プロリルエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼK、TEVプロテアーゼ、サーモリシン（Thermolysin）、トロンビン。
【００３９】
当業者にはさらに認識されるように、原則として、全てのタンパク質由来ペプチドは本発明の任意の局面の任意の方法での使用に適しているが、バイオマーカーの検出に使用される技術に応じて、異なるペプチド類の使用が好ましいことがある。したがって、本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、バイオマーカーは、特に検出が質量分析で行われる場合、質量分析による検出に特に適した、タンパク質C1q、C1-INHおよびC4のいずれかに由来するペプチドである。さらに、それに応じて、本発明のそれぞれの任意の局面の態様では、バイオマーカーは、タンパク質C1q、C1-INHおよびC4のいずれかに由来するペプチドであって、該ペプチドに対して抗体または機能性核酸を作成することができ、該抗体および機能性核酸は、特にそのような抗体または機能性核酸を該ペプチドの相互作用パートナーとして使用するアッセイを用いて検出が行われる場合、前記タンパク質の高度に特異的および/または高度に選択的な検出および/または定量化をもたらす。
【００４０】
用語「遺伝性血管性浮腫」（hereditary angioedema：HAE）は、本明細書では「疾患」とも呼ばれ、血管外への体液の蓄積を繰り返し起こすこと、血液またはリンパ液の正常な流れを遮断すること、および手、足、まぶた、唇、四肢、顔、腸管、気道、生殖器の組織の急速な腫れを引き起こすことを特徴とする稀な遺伝性疾患である。通常、この腫れはかゆみを伴わない；かゆみはアレルギー反応による可能性があるからである。消化管の腫れはけいれんを引き起こす。気道の腫れは、潜在的に非常に深刻な合併症である閉塞につながる可能性がある。これらの症状は、非常に小さな血管（毛細血管）を通る体液の正常な流れを維持するのに役立つ特定のタンパク質の欠乏または不適切な機能の結果として発生する。
【００４１】
場合によっては、体液は他の内臓に蓄積することがある。この疾患の重症度は、罹患した個人間で大きく異なっている。浮腫はまた、気道および消化管を覆う粘膜にも発生する可能性があり、このことは、他の形態の血管性浮腫（すなわち、後天性または外傷性）の患者よりも、遺伝性血管性浮腫の患者によく起こる。この障害がある人は通常、腫れの領域に、赤みやかゆみ（掻痒）ではなく、こわばりと痛みを伴う。皮膚の発疹（蕁麻疹）はめったに存在しない。
【００４２】
遺伝性血管性浮腫の症状は再発することがあり、さらに重症になる可能性がある。怪我、激しい痛み、手術、歯科処置、ウイルス性疾患、および/またはストレスは、症状の再発の引き金となったり、症状を悪化させたりすることがある。
【００４３】
消化器系（胃腸管）の腫れに関連する症状には、吐き気、嘔吐、急性腹痛、および/または他の閉塞の兆候が含まれる。のど（咽頭）または発声器（喉頭）の浮腫は、痛み、飲み込みにくさ（嚥下障害）、話しにくさ（発声障害）、騒がしい呼吸（吸気性喘鳴）、および生命を脅かす可能性のある窒息状態を引き起こすことがある。
【００４４】
遺伝性血管性浮腫には3つのタイプがあり、すなわち、遺伝性血管性浮腫タイプI、遺伝性血管性浮腫タイプIIおよび遺伝性血管性浮腫タイプIIIである。
【００４５】
この障害の最も一般的なタイプは、遺伝性血管性浮腫タイプIであり、これは補体成分C1エステラーゼインヒビターとして知られるタンパク質の欠損の結果である。患者の85％を占める遺伝性血管性浮腫タイプIでは、C1エステラーゼインヒビターの血清レベルが正常の35％未満である。タイプIIでは、そのレベルは正常であるか、または上昇しているが、該タンパク質が非機能性である。これらの2つのタイプは臨床的に区別できない。遺伝性血管性浮腫タイプIIIは、5q染色体の凝固第XII因子（F12；610619）をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる。
【００４６】
遺伝性血管性浮腫は常染色体優性形質として遺伝する。遺伝性血管性浮腫の根底にある遺伝的欠陥は、11q染色体上のC1エステラーゼインヒビター遺伝子（C1NH、SERPING1）のヘテロ接合性変異である。遺伝性血管性浮腫タイプIの患者には、C1エステラーゼインヒビター遺伝子の欠失、または終止コドンが原因でトランケートされた転写産物が存在するようであるが、遺伝性血管性浮腫タイプIIの患者には、単一の塩基置換がある。これらの2つのタイプは臨床的に見分けがつかない。遺伝性血管性浮腫に関連するC1エステラーゼインヒビター遺伝子の変異および/または遺伝性血管性浮腫の診断で検査されるC1エステラーゼインヒビター遺伝子の変異は、当業者に知られており、日常的な手段を用いて科学論文から検索することができる。遺伝性血管性浮腫に関連するC1エステラーゼインヒビタータンパク質の変異および/または遺伝性血管性浮腫の診断で検査されるC1エステラーゼインヒビタータンパク質の変異は、当業者に知られており、日常的な手段を用いて科学論文から検索することができる。C1エステラーゼインヒビター遺伝子の公知のDNA変化は、c.550G＞A、c.671T＞A、c.551_685del、エクソン1および2のc.-191_51del/del、c.1081C＞T、c.106_107del、ならびにc.1397G＞Aである。
【００４７】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、遺伝性血管性浮腫は、遺伝性血管性浮腫タイプIである。
【００４８】
本明細書で使用される用語「サンプル」は、好ましくは、限られた量の対象者の材料を意味し、ここで、対象者の材料は、対象者および/または対象者の身体の一部であるか、それらから採取されたものである。好ましくは、該材料は、体液、例えば、血液、血液産物、尿、唾液、脳脊髄液およびリンパ液、ならびに対象者および/または対象者の身体の一部である糞便または任意の種類の組織および/または細胞材料を含む群から選択される。当業者には認識されるように、該サンプル中の本発明のバイオマーカーの存在および/またはレベルは、より多くの量のその対象者の材料中のバイオマーカーの存在および/またはレベルと類似していて、それを表していることが意図される。より正確には、例示的で非限定的な例として、対象者由来の血液のサンプル、例えば数mlのサンプル、中に測定された本発明のバイオマーカーのレベルはまた、対象者の身体の血液中の該バイオマーカーのレベルを表している。さらに、本発明のそれぞれの任意の局面の方法の態様において、対象者由来のサンプルは、該サンプルが本発明のそれぞれの任意の局面の方法で使用するのに適するように、例えば、処理、固定および/または保存された形で、該対象者の材料を含み、そのような処理、固定および/または保存は、患者の血液中にそれ自体存在しなかったバイオマーカーを、少なくとも意図的に、生成しないことが好ましい。したがって、サンプル中の対象者の材料は、例えば、本発明のそれぞれの任意の局面の方法に適した、メタノールおよび/または水などの溶媒で、希釈したり、例えばフィルターカード上で、乾燥させたり、そのように乾燥させた後に、例えばメタノールおよび/または水などの本発明の方法に適した溶媒で、再溶解したり、あるいは、例えばEDTAまたはヘパリンなどの、血液の凝固を防止する物質を添加したりすることができる。
【００４９】
本発明のそれぞれの任意の局面に関連して好ましく使用されるサンプル、そのような方法で使用されるサンプルは、全血などの一次供給源から調製される。他のサンプルには、血清サンプルおよび血漿サンプルが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の様々な局面の態様において、一次サンプルは全血であり、それは、ある態様では、乾燥血液フィルターカード上に集めるように処理される；好ましくは、約3μlの全血を、直径3mmの乾燥血液フィルターカードのスポット上に集める。当業者であれば、このようにして集められる正確な量は特定の患者のヘマトクリットに応じて異なり得ることを認識するであろう。
【００５１】
本発明のそれぞれの任意の局面の態様において、サンプルが血液もしくは乾燥血液スポットまたは他の液体もしくは組織であり、かつバイオマーカーがC4タンパク質、C1qタンパク質および/またはC1-INHタンパク質に由来するペプチドである場合、サンプルは次のように処理することができる：
−  血液成分を抽出する；
−  抽出物をその場で還元剤、好ましくはジチオスレイトール（DDT）、との反応に供してタンパク質のジスルフィド架橋を還元し、かつアルキル化剤、好ましくはヨードアセトアミド（IAA）、との反応に供して遊離SH基をアルキル化する；
−  その混合物を、好ましくはプロテアーゼを使用して、より好ましくはプロテアーゼトリプシンを使用して、ペプチドへと消化する；および
−  タンパク質のペプチドフラグメントを含む混合物を質量分析、好ましくはLC-質量分析により、より好ましくは内部標準の存在下で、分析する。
【００５２】
内部標準がサンプルに加えられる本発明の方法のそれぞれの任意の局面の態様において、その内部標準は、トリプシン消化工程の前または後にサンプルに加えることができ、すなわち、内部標準は、サンプルを対象者から採取した直後にサンプルに添加されるか、HPLCにかけられる上清に添加されるか、これらの時点の中間に添加される。バイオマーカーのレベルの正確な検出および定量化を達成するために、内部標準をサンプルにいつどのように添加すべきかを判断することは、当業者の技能の範囲内であり、本発明によれば、好ましくは、内部標準はバイオマーカーを含むサンプルに添加される。
【００５３】
当業者には認識されるように、本発明による前記方法に供されるサンプルへの内部標準（本明細書ではISとも呼ばれる）の前記添加により、すなわち、サンプルのスパイキング（spiking）により、サンプル中のISの濃度は既知であり、例えばHPLC-質量分析クロマトグラムで、内部標準のピーク下面積、つまりピーク面積を求めることによって、ピーク面積と物質（例えば、IS）の濃度および/または本発明のバイオマーカーとの間の関係が確立され、したがって、サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定するための手段が提供される。当業者はさらに、様々な分子がISとして使用され得ることを認識するであろう。それにもかかわらず、バイオマーカーなどの分子と比較して類似した化学構造を有するISが好適である。好ましい態様では、ISである分子は、本発明のバイオマーカーから区別することができる。後者は、特に、バイオマーカーがC4タンパク質、C1-INHタンパク質および/またはC1qタンパク質に由来するペプチドである本発明のそれぞれの任意の局面の態様に適用される。本発明のそれぞれの任意の局面のさらに好ましい態様では、理想的には自然界に存在しないか稀である分子が、重いアイソトープを保有し（バイオマーカーのC13、N15バージョンなど）、D-アミノ酸または＋もしくは−アミノ酸などの修飾アミノ酸、または右旋性ペプチドを含むように、ISが選択される。本発明のそれぞれの任意の局面の好ましい態様では、ロイシン-エンケファリンが自然界にそれ自体存在しない内部標準として使用される。
【００５４】
内部標準が対象者由来のサンプルに加えられる本発明の様々な局面の態様では、サンプルへの添加前にISが溶媒、例えば水、に溶解されるように、ISを添加することが好ましい。
【００５５】
任意の局面およびその態様を含む本発明に従って、バイオマーカーが検出される。
【００５６】
本明細書で好ましく使用される用語「検出」とは、サンプル中の物質の存在もしくは非存在を検出すること、および/または該物質のタイプを特定すること含む方法を意味する。一態様では、該物質はバイオマーカー、対照および/または内部標準である。検出は、当技術分野で公知の方法および本明細書でさらに説明する方法によって行うことができる。これらの方法には、限定するものではないが、質量分析、バイオチップアレイ、機能性核酸および/イムノアッセイが含まれる。好ましくは、バイオマーカーは、質量分析により検出および/または定量化される。より好ましい態様では、質量分析は、SELDI MS、MALDI MS、ESI MS、DESI MSおよびイオンモビリティMSを含む群から選択される。一態様では、質量分析は、ToF、QToF、イオントラップ、Triple Quad、オービトラップ、FT-ICR、イオンモビリティ、およびそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される分析装置を使用する。任意の局面およびその態様を含めて、本発明の態様では、バイオマーカーのレベルは、HPLC分離の後に質量分析により測定される。
【００５７】
本発明のそれぞれの任意の局面の別の態様では、バイオマーカーは相互作用パートナーによって検出される。そのような相互作用パートナーは、抗体、アンチカリン（anticaline）および機能性核酸を含む群から選択されるものである。バイオマーカーに結合する抗体を作成することは、当業者の技能の範囲内である。抗体は、当業者に知られているように、例えば、Harlow, E., and Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されるように、作成することができる。バイオマーカーに結合するアンチカリンを作成することは、当業者の技能の範囲内である。アンチカリンの作成は、例えば、ドイツ特許出願DE 197 42 706に記載されている。ある態様では、機能性核酸はアプタマーである。アプタマーを作成することは、当業者の技能の範囲内である。アプタマーは、標的分子と特異的に相互作用する、一本鎖または二本鎖のD-核酸である。アプタマーの作成は、例えば、欧州特許EP 0 533 838に記載されている。ある態様では、機能性核酸はシュピーゲルマー（spiegelmer）である。シュピーゲルマーを作成することは、当業者の技能の範囲内である。シュピーゲルマーは、標的分子と特異的に相互作用する、一本鎖または二本鎖のL-核酸である。アプタマーの作成は、例えば、国際特許出願WO 98/08856に記載されている。
【００５８】
バイオマーカーを検出するための上記の技術および方法は、バイオマーカーを定量化するために同様に使用できることが、当業者には理解されよう。
【００５９】
任意の局面およびその態様を含めて、本発明の態様では、本明細書で好ましく使用される「レベル」または「バイオマーカーのレベル」は、好ましくは対象者のサンプル中の、濃度またはバイオマーカーの濃度を意味する。レベルは、例えばng/ml（サンプル1ml中の、それぞれ化合物およびバイオマーカーのng数）で表される絶対レベルであり得る。レベルは相対レベルであってもよい。そのような相対レベルは、ある態様では、バイオマーカーの内部標準に対する比率である。任意の局面およびその態様を含めて、本発明の態様では、以下のように、好ましくはタンパク質C4、C1qおよび/またはC1-INHペプチドフラグメントの開裂後、より好ましくはペプチドの遊離SH基のアルキル化後に、測定される。実施例の部で詳しく説明される分析設定では、内部標準が分析されるサンプルに添加される。そのような分析の過程では、サンプル中に検出された様々な化合物を個々のピークとして示すクロマトグラムが得られる。様々な化合物には、とりわけ、C4タンパク質、C1qおよび/またはC1-INHタンパク質のフラグメント、ならびに内部標準が含まれる。そのようなクロマトグラムとそこに示されるピークから、フラグメントペプチド（複数可）の濃度またはレベルを決定するために、ペプチドフラグメントに対応するピークのピーク面積および内部標準に対応するピークのピーク面積が測定される。フラグメントペプチドのピーク面積と内部標準のピーク面積に基づいて、フラグメントペプチドの内部標準に対する比率を求めることができる。フラグメントペプチド（複数可）の濃度は、既知の濃度の内部標準の存在下で様々な濃度のフラグメントペプチドの標準曲線を用いて、取得される。
【００６０】
任意の局面およびその態様を含めて、本発明の態様では、バイオマーカーのレベルは、例えば、同じ患者からの、別の患者からの、対照からの、および/または同じもしくは異なる時点からの、別のサンプルで測定された本発明の同じまたは異なるバイオマーカーのレベル、および/または対照のレベルおよび/またはISのレベルと比較される。これに関連して、本明細書で使用される「比較する」または「と比較される」は、好ましくは、バイオマーカーのレベルまたは比率の2つ以上の値の数学的比較を意味する。したがって、そのような値または比率の少なくとも2つを互いに比較すれば、該値の1つがより高いか、より低いか、または同一であるかは、すぐに明らかになる。ある態様では、そのような比較は絶対レベルを用いて行われる。別の態様では、そのような比較は相対レベルを用いて行われる。
【００６１】
任意の局面およびその態様を含めて、本発明の態様では、バイオマーカーのレベルは、対照においても測定される。本明細書で使用する場合の対照とは、好ましくは、対象者の遺伝性血管性浮腫の状態が知られている、該対象者由来のサンプルである。ある態様では、対照は健康な患者のサンプルである。さらなる態様では、ある量の該バイオマーカーを健康な患者のサンプルに添加してから、該添加されたバイオマーカーを含む健康な患者の該サンプル中の該バイオマーカーのレベルを、好ましくは本発明の方法を実施して、測定する。さらなる態様では、対照は、遺伝性血管性浮腫の状態が知られている少なくとも1人の対象者、例えば対照患者、由来のサンプルである；さらに別の好ましい態様では、対照は、C1エステラーゼインヒビタータンパク質を含む、該疾患で影響される遺伝子の変異に関する遺伝的状態をも含み、すなわち、ホモ接合性変異および/または複合ヘテロ接合性変異を有する対象者を含み、該対象者は変異の保因者である。さらに好ましい態様では、対照は、該疾患の治療を受けていない対象者由来のサンプルである。さらに別の好ましい態様では、対照は、単一の対象者由来のサンプル、または異なる対象者由来のサンプルのプール、および/または異なる時点で対象者（複数可）から採取されたサンプルである。
【００６２】
任意の局面およびその態様を含めて、本発明の態様では、ある対象者が前記疾患に関連する症状を患っていない場合、その対象者は該疾患に関して健康な対象者であるとみなされる。より具体的には、任意の局面およびその態様を含めて、本発明の態様では、対象者がC1エステラーゼインヒビター遺伝子の機能性部分の変異（C1エステラーゼインヒビタータンパク質またはその活性の低下または欠乏を引き起こし、結果的に遺伝性血管性浮腫に関連する症状をもたらす変異）を有しない場合、その対象者は遺伝性血管性浮腫に関して健康であるとみなされる。
【００６３】
任意の局面およびその態様を含めて、本発明との関連で、「患者」は、該疾患の少なくとも1つの症状を示す対象者である。より好ましくは、患者は、C1エステラーゼインヒビター遺伝子の1つのホモ接合性変異または複数のヘテロ接合性変異を示して、それぞれのタンパク質および/またはタンパク質活性の低下または欠乏を引き起こし、結果的に遺伝性血管性浮腫に関連する症状が出現する対象者である。さらに、それに関連して、「保因者」は、C1エステラーゼインヒビター遺伝子の1つのヘテロ接合性変異を示して、それぞれのタンパク質および/またはタンパク質活性の低下または欠乏を引き起こすかまたは引き起こさず、通常または好ましくは遺伝性血管性浮腫に関連する症状が出現しない対象者である。
【００６４】
任意の局面およびその態様を含めて、本発明の態様では、バイオマーカーのレベルは、カットオフ（この用語は、カットオフ値またはカットオフレベルという用語と同義に使用される）と比較される。本明細書で好ましく使用される用語「カットオフ値」とは、人が疾患に罹患しているか、および/または疾患に罹患するリスクがあるかの指標となる、絶対レベルまたは相対レベルであり得るレベル（または濃度）である。バイオマーカーに応じて、それぞれ検出および測定されたバイオマーカーのレベルがカットオフ値よりも低い場合、またはそれぞれ検出および測定されたバイオマーカーのレベルがカットオフ値よりも高い場合、対象者は、疾患に罹患しているか、または疾患に罹患するリスクがあるとみなされる。本明細書で好ましく使用されるカットオフ値は、健常者のコホートの平均値±2×標準偏差に設定される。
【００６５】
遺伝性血管性浮腫の鑑別診断法に使用されるフラグメントペプチドの一部のカットオフ値は、以下の通りである。
2021512316.tif 000023
【００６６】
当業者には理解されるように、上記のカットオフ値に基づいて、他のフラグメントペプチドのいずれかの対応するカットオフ値は、上記フラグメントペプチドと前記他のフラグメントペプチドの分子量に基づいて計算することができる。同じことが、C4タンパク質、C1-INHタンパク質、およびC1qタンパク質のいずれか1つと、それを形成する個々のポリペプチドのカットオフ値にも当てはまる。このようにして計算されたカットオフ値は、本明細書では、対応するカットオフ値とも呼ばれ、それによって、示されたフラグメントペプチドの上記カットオフ値の1つまたは複数を参照することが好ましい。
【００６７】
本明細書で好ましく使用される、対照のバイオマーカーなどの物質の「検出限界」とは、物質のレベルを測定するための方法によって測定される物質のレベルであって、この場合、該検出限界よりも少ないまたは低いレベルは該方法によって測定され得ない。したがって、本明細書で使用される「カットオフ値」および「検出限界」は、好ましくは必ずしも同一ではないが、どちらも、物質の、例えば本発明のバイオマーカーの、特定のレベルを反映していることが即明らかである。また、カットオフ値は、好ましくは該方法の選択性と感度が可能な限り高くなるように選択されることが直ちに理解されよう。これとは対照的に、検出限界は、バイオマーカーのレベルを測定するための方法で検出できるバイオマーカーの最小レベルを反映する、本発明のバイオマーカーの絶対レベルを表している。したがって、検出限界は、物質のレベルを測定するための方法と、その方法によりレベルを測定されるはずの物質とに依存することが明白である。当業者には直ちに理解されるように、高い検出限界は、例えば理想的なカットオフ値よりも高いと、その方法の感度を低くする可能性がある。なぜなら、検査で陽性であると予測される真の陽性の割合は、その真の陽性についてバイオマーカーのレベルを測定できるかにもかかっているからである。言い換えると、検出限界が理想的なカットオフ値よりも高い場合、該カットオフ値よりわずかに高いバイオマーカーのレベルを有する真陽性は、該カットオフ値より低いバイオマーカーのレベルを有する真陰性から区別できない可能性がある。なぜなら、該カットオフ値よりわずかに高いバイオマーカーのレベルを有する真陽性と、該カットオフ値より低いバイオマーカーのレベルを有する陰性の両方についてバイオマーカーのレベルを測定できないためである。したがって、低い検出限界が有利であることは明白である。好ましくは、本明細書で使用される「理想的なカットオフ値」は、最も高い選択性と感度を有するカットオフ値である。
【００６８】
本発明の第1の局面の主題である前記疾患を診断する方法では、一態様において、サンプルを採取された対象者が、サンプルを前記方法に以前に供していた対象者であることを包含することは、本発明の範囲内である。好ましい態様では、前記2つのサンプル間の時間差は、2週間、1ヶ月、2ヶ月または3ヶ月である；好ましくは、前記2つのサンプル間の時間差は1ヶ月である。それに従って、第1の局面（そのいずれかの態様を含む）の方法は、対象者由来のサンプル中のバイオマーカーのレベルを測定する工程と、さらなる工程として、該対象者からの第2のサンプル中のバイオマーカーのレベルを測定する工程とを含み、ここで、第2のサンプルは前記時間差の後に該対象者から採取されたものである。
【００６９】
本発明の第1の局面の主題である前記疾患を診断する方法では、一態様において、サンプルを採取した時点よりも前に治療を施した対象者から、またはサンプルを採取した時点で治療を施した対象者から、採取されたサンプルを使用することは、本発明の範囲内である。
【００７０】
本発明の第1の局面の主題である前記疾患を診断する方法では、一態様において、サンプルを採取した時点よりも前に治療を施していなかった対象者から、またはサンプルを採取した時点で治療を施さなかった対象者から、採取されたサンプルを使用することは、本発明の範囲内である。
【００７１】
第2の局面では、本発明はキットに関し、該キットは、バイオマーカーの相互作用パートナー、バイオマーカー、キットの使用説明書、および1つまたは複数の容器を含む群から選択される少なくとも1つの要素を含む。ある態様では、該キットは、本発明の第1の局面による方法で使用するためのものである。好ましい態様では、該キットは、バイオマーカーの相互作用パートナー、好ましくはC4、C1qおよびC1-IHNのそれぞれの1つのフラグメントペプチドの相互作用パートナー、またはC4、C1qおよびC1-IHNのそれぞれの相互作用部分、および使用説明書、任意で1つまたは複数の容器を含む。別の好ましい態様では、該キットは、バイオマーカー、好ましくはC4、C1qおよびC1-IHNのそれぞれの1つのフラグメントペプチドの相互作用パートナー、またはC4、C1qおよびC1-IHNのそれぞれの相互作用部分、および使用説明書、任意で1つまたは複数の容器を含む。
【００７２】
第2の局面の態様では、該相互作用パートナーは、抗体、アンチカリン、アプタマーおよびシュピーゲルマーを含む群から選択されるものであり、ここで、抗体、アンチカリン、アプタマーおよびシュピーゲルマーのいずれか1つはバイオマーカーに結合することができ、好ましくは、その結合は、バイオマーカーと相互作用パートナーとの間に複合体が形成されるようなものであり、これにより、該複合体の検出および定量、または、好ましくは複合体の分解後に、該バイオマーカーの検出および定量がそれぞれ可能になる。
【００７３】
本明細書で使用される用語「疾患を発症するリスクがある」とは、好ましくは、特に治療が施されない場合、対象者が該疾患に罹患し、かつ/または該疾患もしくは該疾患に関連する症状を発症する可能性が高い、ことを意味する。これに関連して、遺伝性血管性浮腫は遺伝性疾患であることを認識する必要がある；したがって、親族、特に該疾患を有するかまたは該疾患の原因であることが知られている突然変異を有する親の存在は、該疾患を発症するリスクがある対象者を示しており、例えば、2人の遺伝性血管性浮腫の患者または2人の遺伝性血管性浮腫の保因者の子供は、該疾患を発症するリスクがある。さらに、疾患の進行は、症状の発生ならびに該症状の重症度に関連していることが認識されよう。したがって、現時点で症状を呈していない人は、しかし、該疾患を発症するリスクがあり得る；その理由は、例えば、疾患を引き起こすことが知られている遺伝子の遺伝的変異が存在するにもかかわらず、症状または深刻な症状がまったく発生しないためである。それでもなお、本発明の方法およびバイオマーカーは、特に本発明によるバイオマーカーのレベルがバイオマーカーに応じて減少または増加する場合、そのような対象者が症状の有無とは無関係に該疾患を発症するリスクがあると診断することを可能にする、ことが直ちに理解されよう。したがって、本発明による方法は、対象者が該疾患を患うリスクがあるかどうかを判定することを可能にする。対象者が該疾患を患うリスクがあるかないかに基づいて、治療を施す、維持する、減らす、高める、または施さないことも本発明の範囲内である。
【００７４】
本明細書で使用される対象者における「遺伝性血管性浮腫の状態を認定する」という用語は、好ましくは、対象者における遺伝性血管性浮腫の存在または非存在を特定または検出すること、対象者における遺伝性血管性浮腫の発症または発症のリスクを予測すること、対象者における遺伝性血管性浮腫の経過を調べること、対象者が遺伝性血管性浮腫の初期状態に罹患しているか、または遺伝性血管性浮腫の進行または進展状態に罹患しているかを判断すること、または対象者のバイオマーカーのレベルが経時的に大幅に変化したかどうかを判定すること、を含む群から選択される対象者のバイオマーカープロファイルの分類を意味する。
【００７５】
本明細書で使用される「対象者治療を管理する」または「対象者管理」という用語は、好ましくは、遺伝性血管性浮腫の状態を判定した後の臨床医または医師の行動を指す。例えば、本発明による方法の結果が確定的でない場合、または状態の確認を必要とする理由がある場合、医師は、影響されるタンパク質の機能の検査および/またはC1エステラーゼインヒビター遺伝子の配列決定などの、新しい検査を命ずることができる。あるいは、遺伝性血管性浮腫の治療が適切であることをその状態が示している場合、医師は、遺伝性血管性浮腫を治療するための該対象者の予定をたてることができる。同様に、その状態が陰性である場合、または結果が治療の成功を示している場合、それ以上の管理は必要ないかもしれない。それにもかかわらず、当業者は、遺伝子治療のほかに、本明細書に開示される治療法を含めて、任意の適切なおよび/または効果的な治療を施すことができることを直ちに認識するであろう。さらに、対象者の治療の管理が、遺伝性血管性浮腫の治療として適用される薬物の用量（例えば、患者および/または対象者に適用または投与されるC1エステラーゼインヒビター、カリクレイン阻害剤、またはブラジキニン拮抗薬の量）の設定を含むことは、本発明の一態様である。対象者由来のサンプル中に存在するバイオマーカーのレベルが、いくつかの時点で測定されるか、あるいは該バイオマーカーの他のレベルと、対照中の該バイオマーカーのカットオフ値および/またはレベルと、および/または2つのバイオマーカーのレベルの比率の別の値と比較される本発明の方法のいくつかの態様では、当業者は、治療を施したり施さなかったり、あるいは、遺伝性血管性浮腫を治療したり治療しないために、または治療を継続するために、すでに施されている治療を修正するであろう。
【００７６】
本発明の態様では、「疾患を発症するリスクがある」および「疾患を患うリスクがある」という用語は、そうでないとの指示がない限り、本明細書では相互交換可能に使用される。
【００７７】
次に、本発明を以下の図面および実施例でさらに説明するが、それらから、さらなる特徴、態様および利点を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
より具体的には、
図1〜9は、示されたペプチドのレベルを示す箱ひげ図である；ｙ軸は、実施例の部に記載されるようにフィルターカード上の乾燥血液スポットから測定された、ng/mlでの示されたペプチドの対数変換レベルを示す；x軸は、実施例の部に記載されるようにグループ分けされた対象者のグループを示す。箱ひげ図は、対象者の各グループの25パーセンタイルと75パーセンタイルをそれぞれ箱の下部と上部に表す；箱の中央付近のバンドは、各グループの50パーセンタイル（すなわち、中央値）を表す；ひげは、データの平均を上回るおよび下回る1標準偏差を表す；ひげの間に含まれていないデータは、小さな円または星の外れ値として表示される。水平線は、示されたペプチドについてのng/mlとして表されるカットオフレベルを表す。
【図１】カットオフ値500ng/mlを示す、タンパク質C4βのペプチドフラグメントC4β_[571-579]の箱ひげ図である。そのようなカットオフ値により、健康な対照と、HAEタイプ1およびHAEタイプ2に罹患している患者とを区別することができる。
【図２】カットオフ値835ng/mlを示す、タンパク質C1-INHのペプチドフラグメントであるSerpinG1_[242-249]の箱ひげ図である。そのようなカットオフ値により、健康な対照と、HAEタイプ1に罹患している患者とを区別することができる。
【図３】カットオフ値800ng/mlを示す、タンパク質C1qβのペプチドフラグメントC1qβ_[178-186]の箱ひげ図である。このペプチドフラグメントは対照として使用することができる。
【図４】カットオフ値260ng/mlを示す、タンパク質C4αのペプチドフラグメントC4α_[680-685]の箱ひげ図である。そのようなカットオフ値により、健康な対照と、HAEタイプ1またはHAEタイプ2に罹患している患者とを区別することができる。
【図５】カットオフ値100ng/mlを示す、タンパク質C4αのペプチドフラグメントC4α_[786-791]の箱ひげ図である。そのようなカットオフ値により、健康な対照と、HAEタイプ1またはHAEタイプ2に罹患している患者とを区別することができる。
【図６】カットオフ値201ng/mlを示す、タンパク質C4βのペプチドフラグメントC4β_[294-297]の箱ひげ図である。そのようなカットオフ値により、健康な対照と、HAEタイプ1またはHAEタイプ2に罹患している患者とを区別することができる。
【図７】カットオフ値920ng/mlを示す、タンパク質C4γのペプチドフラグメントC4γ_[1638-1641]の箱ひげ図である。そのようなカットオフ値により、健康な対照と、HAEタイプ1またはHAEタイプ2に罹患している患者とを区別することができる。
【図８】カットオフ値392ng/mlを示す、タンパク質C1-INHのペプチドフラグメントであるSerpinG1_[391-400]の箱ひげ図である。そのようなカットオフ値により、健康な対照と、HAEタイプ1に罹患している患者とを区別することができる。
【図９】カットオフ値1690ng/mlを示す、タンパク質C1qβのペプチドフラグメントC1qβ_[63-77]の箱ひげ図である。このペプチドフラグメントは対照として使用することができる。
【実施例】
【００７９】
以下に記載される実施例では、フィルターカード上の乾燥血液スポット（略してDBS）を対象者由来のサンプルとして使用した。
【００８０】
実施例1：C3、C1q、C4およびC1-INHのペプチドへのフラグメンテーションとその質量分析に基づいたHAEの診断方法
乾燥血液スポット（DBS）抽出物中のC3、C1q、C4およびC1-INHの含有量/レベルを定量化するために、記載されるようなプロトコルを使用した。血液成分の抽出後、DBS抽出物をその場でジチオスレイトール（DDT）と反応させてタンパク質のジスルフィド架橋を還元し、ヨードアセトアミド（IAA）と反応させて遊離SH基をアルキル化した。次に、この反応混合物をトリプシンで完全に消化した。分析される該タンパク質のペプチドフラグメントを含むトリプシン消化混合物をLC/IM高分解能質量分析に注入した。全てのタンパク質について、翻訳後修飾のないペプチドを血液マトリックス中で同定することができた（表1「DBS抽出物の完全トリプシン消化後に得られたトリプシン消化混合物中に同定されたC3、C1q、C4、C1-INHペプチド、+H付加物を含むペプチドを選択」を参照されたい）。全てのペプチドについて、フラグメンテーションスペクトルを取得し、実験的フラグメンテーションパターンに基づいて、トランジションを多重反応モニタリング質量分析で使用した。
【００８１】
次に、トリプシン消化ペプチドをLC/MRM-MSで測定することができた。以下は、LC/MRM-MSを用いて検出および定量化されたC3、C1q、C4およびC1-INHからのトリプシン消化ペプチドの例である。
【００８２】
機器
ドナーの生物学的サンプル中の定量化される前記タンパク質のトリプシン消化ペプチドを検出するために、以下の機器を使用した：
2021512316.tif 000024
【００８３】
試薬
対象者由来のサンプル中の定量化される前記タンパク質のペプチドを検出するために、以下の試薬を使用した。値（例えば、pH値）が温度に依存する限り、そのような値は25℃の温度で測定された。
2021512316.tif 000025
【００８４】
内部標準原液の調製
内部標準（IS 1）原液を内部標準として使用し、3mgのロイシン-エンケファリン（英国のWaters社から提供された）を水に溶解して400μg/mLの濃度にすることで調製した。
【００８５】
サンプルおよび溶液の保存
対照サンプルおよび試験サンプル（乾燥血液スポット）は、室温で保存した。内部標準液は、使用するまで室温で保存した。
【００８６】
分析用のサンプル調製
3.2mmの1パンチφを、乾燥血液スポットのあるフィルターカードから切り取り、次のプロトコルに供した：
最初に、抽出のために、100μLの1M NH4HCO3を該パンチに添加し、その材料を60℃で10分間超音波処理し、37℃でシェーカー（700rpm）上にて30分間インキュベートした。
2番目に、その溶液に125μlの1M DTTを添加し、反応混合物をシェーカー（700rpm）上にて37℃で3時間インキュベートした。
3番目に、375μlの1M IAAを添加し、その溶液を暗所でシェーカー（700rpm）上にて1.5時間インキュベートした。
4番目に、10μlの0.5μg/μlトリプシンを添加し、その溶液を暗所でシェーカー（700rpm）上にて3〜16時間インキュベートした。
このようにして得られた血液抽出物の消化物を含む溶液を、PTFE（ポリテトラフルオロエチレン）フィルタープレート（Acroprep（商標），Pall社，ドイツ）に移し、次に3,500rpmで遠心分離して96ウェルプレートに移した。その後、20〜400ng/mLの既知濃度を有する100μLの内部標準を添加した。
【００８７】
方法
当業者には認識されるように、質量分析を用いて対象者由来のサンプル中の分析されるタンパク質のフラグメントペプチドを検出する方法はまた、対象者由来の該サンプル中のHAE関連ペプチドフラグメントおよびそれらのアイソフォームの特異的検出および/または定量化を可能にする、他のトリプシン消化ペプチド、特定のトランジションおよび特定のフラグメントを利用することもできる。
【００８８】
DBS抽出物からの分析されるタンパク質のペプチドフラグメントのLC/IM-QToF-MS分析は、Vion質量分析計（Waters社，英国）と連結させたWaters Acquity iclass UPLC（Waters社，英国）を使用して、次のように実施した。
1.  クロマトグラフ分析は、Kinetex EVO C18カラム（Phenomenex社，ドイツ）で行った。10μLの抽出物を該カラムに注入し、0％A（50mMギ酸水溶液）から100％B（50mMギ酸アセトニトリル溶液：メタノール体積比＝1：1）までの直線勾配を用いて抽出物の化合物を溶出した。
2.  内部標準を水中200ng/mLの濃度で連続的に注入し、そのシグナルを使用してバッチごとにサンプルシグナルを正規化した。
【００８９】
IM-QToF MS分析は、正イオンモードで以下のパラメータを使用して実施した。
-  アナライザモード：感度
-  MSモード：高解像度MSE
-  キャピラリー電圧：1.2kV
-  ソース温度：150℃
-  脱溶媒和（desolvation）温度：600℃
-  脱溶媒和ガス：1000L/h
-  コーンガス：50L/h
-  低コリジョン（衝突）エネルギー：6eV
-  高コリジョンエネルギーランプ：20〜40eV
-  スキャン質量：50〜1000m/z
-  スキャン時間：0.5s
【００９０】
DBS抽出物についての分析されるタンパク質のペプチドフラグメントのLC/MRM-MS分析は、TQ-Sマイクロ質量分析計（Waters社，英国）と連結させたWaters Acquity iclass UPLC（Waters社，英国）を使用して実施した。
【００９１】
実施例では、次のパラメータをペプチドフラグメントの定量化において使用した。
1.  クロマトグラフ分析は、Kinetex EVO C18カラム（Phenomenex社，ドイツ）で行った。10μLの抽出物を該カラムに注入し、0％A（50mMギ酸水溶液）から100％B（50mMギ酸アセトニトリル溶液：メタノール体積比＝1：1）までの直線勾配を用いて化合物を溶出した。
2.  内部標準については、MRMトランジション556.24→119.97をモニタリングした。各ペプチドについては、実施例2に示すように、特定のトランジションを使用した。
【００９２】
MRM-MS分析は、正イオンモードで以下のパラメータを使用して実施した。
-  キャピラリー電圧：1.2kV
-  コーン電圧：20V
-  ソース温度：150℃
-  脱溶媒和温度：600℃
-  脱溶媒和ガス：1000L/h
-  コーンガス：50L/h
-  コリジョンエネルギー：20V
-  コリジョンセルエントランス：30eV
-  コリジョンセルイグジット：30eV
【００９３】
実施例2：健康なドナーの乾燥血液スポットにおけるタンパク質C1q、C4、C1-INHおよびC3のペプチドフラグメントの定量化
実施例1で概説した方法を用いて、タンパク質C1q、C4、C1-INHおよびC3の様々なペプチドフラグメントを、合計270人の健常者からのDBSを使用して定量化した。
【００９４】
補体C1qの場合、以下のトリプシン消化ペプチドを定量化することができた；括弧内の数字は、C1qのアミノ酸配列におけるペプチドの最初のアミノ酸と最後のアミノ酸の位置を表す（該配列は、N末端が左側に、C末端が右側に示される）。そのようなペプチドを表1に示す。
【００９５】
【表１】
2021512316.tif 000026
2021512316.tif 000027
【００９６】
全ての補体C1qトリプシン消化ペプチドは、健常者と遺伝性血管性浮腫の患者を区別するために使用することができる。前記ペプチドのうちの2つ、すなわち、MRMトランジション510.26→254.58を有するC1q-B_[178-186]およびMRMトランジション495.25→774.5を有するC1q-B_[63-77]を、代表的な実例として使用した（実施例3参照）。
【００９７】
補体C3では、以下のトリプシン消化ペプチドを定量化することができた；括弧内の数字は、C3のアミノ酸配列におけるペプチドの最初のアミノ酸と最後のアミノ酸の位置を表す（該配列は、N末端が左側に、C末端が右側に示される）。そのようなペプチドを表2に示す。
【００９８】
【表２】
2021512316.tif 000028
2021512316.tif 000029
2021512316.tif 000030
2021512316.tif 000031
【００９９】
全ての補体C3トリプシン消化ペプチドは、該アッセイにおいて使用することができる。前記ペプチドのうちの2つ、すなわち、MRMトランジション604.8→327.22を有するC3β_[489-497]およびMRMトランジション824.74→798.44を有するC3cα1_[814-834]_Cys_CAM: 816を、説明に役立つ実例として使用した（実施例3参照）。
【０１００】
補体C4では、以下のトリプシン消化ペプチドを定量化することができた；括弧内の数字は、C4のアミノ酸配列におけるペプチドの最初のアミノ酸と最後のアミノ酸の位置を表す（該配列は、N末端が左側に、C末端が右側に示される）。そのようなペプチドを表3に示す。
【０１０１】
【表３】
2021512316.tif 000032
2021512316.tif 000033
2021512316.tif 000034
2021512316.tif 000035
2021512316.tif 000036
2021512316.tif 000037
【０１０２】
全ての補体C4トリプシン消化ペプチドは、健常者と遺伝性血管性浮腫の患者を区別するために使用することができる。前記ペプチドのうちの5つ、すなわち、MRMトランジション375.2→536.28を有するC4α_[680-685]、MRMトランジション359.69→490.26を有するC4α_[786-791]、MRMトランジション285.66→322.19を有するC4β_[294-297]、MRMトランジション466.26→243.13を有するC4β_[571-579]、およびMRMトランジション232.64→322.19を有するC4γ_[1638-1641]を、代表的な実例として使用した（実施例3参照）。
【０１０３】
補体C1-INH（SerpinG1とも呼ばれる）では、以下のトリプシン消化ペプチドを定量化することができた；括弧内の数字は、C1-INHのアミノ酸配列におけるペプチドの最初のアミノ酸と最後のアミノ酸の位置を表す（該配列は、N末端が左側に、C末端が右側に示される）。そのようなペプチドを表4に示す。
【０１０４】
【表４】
2021512316.tif 000038
【０１０５】
全ての補体C1-INHトリプシン消化ペプチドは、健常者と遺伝性血管性浮腫の患者を区別するために使用することができる。2つのペプチド、すなわち、MRMトランジション455.74→696.33を有するSerpinG1_[242-249]およびMRMトランジション593.35→455.79を有するSerpinG1 [391-400]を、代表的な実例として使用した（実施例3参照）。
【０１０６】
実施例3：健常者およびSerping1遺伝子の公知の病原性変異体を持つ遺伝性血管性浮腫患者からのDBS抽出物におけるタンパク質C3、C1q、C4およびC1-INHのトリプシン消化ペプチドフラグメントの定量化
HAE患者
遺伝性血管性浮腫タイプ1/2の全ての患者、または参加センターに送られた遺伝性血管性浮腫タイプ1/2を患っていると強く推定された患者をこの試験に加えた。次世代シーケンシング、サンガーシーケンシング、多重連結依存性プローブ増幅などの手法を用いて、この試験について考慮された全患者においてSerpinG1変異を確認した。
【０１０７】
タンパク質C4
実施例1で概説した方法を使用して、タンパク質C4のペプチドフラグメントC4α_[680-685]、C4α_[786-791]、C4β_[294-297]、C4β_[571-579]およびC4γ_[1638-1641]の含有量を、合計270人の健常者由来のDBSにおいて定量化した。同様に、タンパク質C4のペプチドフラグメントC4α_[680-685]、C4α_[786-791]、C4β_[294-297]、C4β_[571-579]およびC4γ_[1638-1641]の含有量を、以前に遺伝性血管性浮腫と遺伝的に診断された合計135人の患者由来のDBSにおいて定量化した。
【０１０８】
このアッセイでは、純粋な合成ペプチドを取得して、血液サンプルに由来するペプチドの定量に使用される標準曲線を得るために使用した。標準曲線の直線性は、以下の表5のR2値に反映されている。
【０１０９】
【表５】
2021512316.tif 000039
【０１１０】
以下の表6に示すように、タンパク質C4のペプチドC4α[680-685]、C4α_[786-791]、C4β_[294-297]、C4β_[571-579]、およびC4γ_[1638-1641]は、健常者と比較して、遺伝性血管性浮腫患者では統計的に有意に減少した（p＜0.0001）。各種ペプチドの値はng/mlである。
【０１１１】
【表６】
2021512316.tif 000040
2021512316.tif 000041
2021512316.tif 000042
【０１１２】
タンパク質C1-INH
実施例1で概説した方法を使用して、タンパク質C1-INHのペプチドフラグメントSerpinG1_[242-249]およびSerpinG1_[391-400]の含有量を、合計270人の健常者由来のDBSにおいて定量化した。同様に、タンパク質C1-INHのペプチドフラグメントSerpinG1_[242-249]およびSerpinG1_[391-400]の含有量を、以前に遺伝性血管性浮腫と遺伝的に診断された合計135人の患者由来のDBSにおいて定量化した。
【０１１３】
このアッセイでは、純粋な合成ペプチドを取得して、血液サンプルに由来するペプチドの定量に使用される標準曲線を得るために使用した。標準曲線の直線性は、以下の表7のR2値に反映されている。
【０１１４】
【表７】
2021512316.tif 000043
【０１１５】
以下の表8に示すように、タンパク質C1-INHのSerpinG_[242-249]およびSerpinG1_[391-400]は、健常者と比較して、遺伝性血管性浮腫タイプIの患者では統計的に有意に減少した（p＜0.0001）。各種ペプチドの値はng/mlである。
【０１１６】
【表８】
2021512316.tif 000044
【０１１７】
この試験に含まれる全てのサンプルの場合、HAEタイプI患者を健康な対照（非HAE）から区別することができた。
【０１１８】
タンパク質C1q
実施例1で概説した方法を使用して、タンパク質C1qのペプチドフラグメントC1q-B_[178-186]およびC1q-B_[63-77]の含有量を、合計270人の健常者由来のDBSにおいて定量化した。同様に、タンパク質C1qのペプチドフラグメントC1q-B_[178-186]およびC1q-B_[63-77]の含有量を、以前に遺伝性血管性浮腫と遺伝的に診断された合計135人の患者由来のDBSにおいて定量化した。
【０１１９】
このアッセイでは、純粋な合成ペプチドを取得して、血液サンプルに由来するペプチドの定量に使用される標準曲線を得るために使用した。標準曲線の直線性は、以下の表9のR2値に反映されている。
【０１２０】
【表９】
2021512316.tif 000045
【０１２１】
以下の表10に示すように、タンパク質C1qのペプチドフラグメントC1q-B_[178-186]およびC1q-B_[63-77]は、健常者と比較して、遺伝性血管性浮腫タイプIの患者において統計的に有意に減少しなかった。各種ペプチドの値はng/mlである。
【０１２２】
【表１０】
2021512316.tif 000046
【０１２３】
タンパク質C3
実施例1で概説した方法を使用して、タンパク質C3のペプチドフラグメントC3β_[250-258]の含有量を、合計270人の健常者由来のDBSにおいて定量化した。同様に、タンパク質C3のペプチドフラグメントC3β_[250-258]の含有量を、以前に遺伝性血管性浮腫と遺伝的に診断された合計135人の患者由来のDBSにおいて定量化した。
【０１２４】
このアッセイでは、純粋な合成ペプチドを取得して、血液サンプルに由来するペプチドの定量に使用される標準曲線を得るために使用した。標準曲線の直線性は、以下の表11のR2値に反映されている。
【０１２５】
【表１１】
2021512316.tif 000047
【０１２６】
以下の表12に示すように、タンパク質C1qのC3β_[250-258]は、健常者と比較して、遺伝性血管性浮腫タイプIの患者において統計的に有意に減少しない。各種ペプチドの値はng/mlである。
【０１２７】
【表１２】
2021512316.tif 000048
【０１２８】
実施例4：健常者およびSerping1遺伝子の公知の病原性変異体を持つ遺伝性血管性浮腫患者からのDBS抽出物におけるバイオマーカーのカットオフレベルの決定
実施例3のデータおよび結果に基づいて、また、合成ペプチドをSerpinG_[242-249]、C4α_[680-685]、C4α_[786-791]、C4β_[294-297]、C4β_[571-579]、C1q-β_[178-186]、C4γ_[1638-1641]、SerpinG1_[391-400]およびC1q-β_[63-77]のキャリブレーション標準として使用して、カットオフレベルを各ペプチドについて実験的に決定した。
【０１２９】
2021512316.tif 000049
【０１３０】
これらの結果は、図1〜9に示される。
【０１３１】
この試験に含まれる全てのサンプルの場合、HAE患者を健康な対照（非HAE、NC）から区別することができた。
【０１３２】
明細書、特許請求の範囲、配列表および/または図面に開示された本発明の特徴は、別々にまたはそれらの任意の組み合わせで、本発明をその様々な形態で実現するための資料となり得る。
【図１】
2021512316.tif 000061
【図２】
2021512316.tif 000062
【図３】
2021512316.tif 000063
【図４】
2021512316.tif 000064
【図５】
2021512316.tif 000065
【図６】
2021512316.tif 000066
【図７】
2021512316.tif 000067
【図８】
2021512316.tif 000068
【図９】
2021512316.tif 000069
【配列表】
2021512316000001.app
【国際調査報告】
2021512316.tif 000070
2021512316.tif 000071
2021512316.tif 000072