(57)【要約】本発明は、血液悪性腫瘍の処置における細胞表面受容体ＣＤ７およびＣＤ３３への細胞阻害剤の二重標的化に関する。特に、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤に関する。このような剤は、二重特異性抗体薬物結合体を含むことができる。【選択図】図２３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するためにＣＤ３３に結合する細胞阻害剤であって、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤が、ＣＤ７に結合する細胞阻害剤との併用投与用であるか；または、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤が、ＣＤ７に追加的に結合する、細胞阻害剤。
【請求項２】
ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤が、ＣＤ３３＋細胞への前記第１の細胞阻害剤のＣＤ３３受容体媒介内部移行を誘導することができる、請求項１に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項３】
前記ＣＤ３３＋細胞がＡＭＬ細胞である、請求項１または請求項２に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項４】
前記細胞阻害剤が、抗体依存性細胞毒性を媒介することができる抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項５】
前記細胞阻害剤が免疫エフェクター細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項６】
前記細胞阻害剤がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む、請求項５に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項７】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項６に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項８】
前記免疫エフェクター細胞が抗ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔである、請求項７に記載の使用のためにＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項９】
前記Ｔ細胞がＣＤ３３＋Ｔ細胞を含む、請求項８に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項１０】
前記細胞阻害剤が細胞死滅部分およびＣＤ３３結合部分を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項１１】
前記ＣＤ３３結合部分が抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１０に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項１２】
前記細胞死滅部分が細胞毒素である、請求項１０または請求項７に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項１３】
前記細胞毒素が、ｉ）ペプチド毒素またはｉｉ）化学毒素から選択される、請求項１２に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項１４】
前記細胞阻害剤が、前記細胞死滅部分とＣＤ３３結合部分との間の連結部分をさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤。
【請求項１５】
ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤であって、ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤が、ＣＤ３３に結合する細胞阻害剤との併用投与用であるか；または、ＣＤ７に結合する前記阻害剤が、さらにＣＤ３３に結合する、細胞阻害剤。
【請求項１６】
ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤が、ＣＤ７＋細胞への第１の細胞阻害剤のＣＤ７受容体媒介内部移行を誘導することができる、請求項１５に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項１７】
前記ＣＤ７＋細胞がＡＭＬ細胞である、請求項１５または請求項１６に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項１８】
前記細胞阻害剤が、抗体依存性細胞毒性を媒介することができる抗ＣＤ７抗体またはその抗原結合部分である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項１９】
前記細胞阻害剤が免疫エフェクター細胞を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２０】
前記細胞阻害剤がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む、請求項１９に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２１】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項２０に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２２】
前記免疫エフェクター細胞が抗ＣＤ７  ＣＡＲ−Ｔである、請求項２１に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞がＣＤ７＋Ｔ細胞を含む、請求項２２に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２４】
前記細胞阻害剤が、細胞死滅部分およびＣＤ７結合部分を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２５】
前記ＣＤ７結合部分が、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項２４に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２６】
前記細胞死滅部分が細胞毒素である、請求項２４または請求項２５に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２７】
前記細胞毒素が、ｉ）ペプチド毒素またはｉｉ）化学毒素から選択される、請求項２６に記載の使用のためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤。
【請求項２８】
前記細胞阻害剤が、前記細胞死滅部分とＣＤ７結合部分との間の連結部分をさらに含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項２９】
ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するための、ＣＤ３３に結合する細胞阻害剤とＣＤ７に結合する細胞阻害剤との組合せ。
【請求項３０】
ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤が、前記第１の細胞阻害剤のＣＤ３３＋細胞へのＣＤ３３受容体媒介内部移行を誘導することができる、請求項２９に記載の使用のための組合せ。
【請求項３１】
前記ＣＤ３３＋細胞がＡＭＬ細胞である、請求項２９または請求項３０に記載の使用のための組合せ。
【請求項３２】
ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤が、抗体依存性細胞傷害性を媒介することができる抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項３３】
ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤が免疫エフェクター細胞を含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項３４】
前記細胞阻害剤が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む、請求項３３に記載の使用のための組合せ。
【請求項３５】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項３４記載の使用のための組合せ。
【請求項３６】
免疫エフェクター細胞が抗ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔである、請求項３５に記載の使用のための組合せ。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞がＣＤ３３＋Ｔ細胞を含む、請求項３６に記載の使用のための組合せ。
【請求項３８】
ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤が、細胞死滅部分およびＣＤ３３結合部分を含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項３９】
前記ＣＤ３３結合部分が、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３８に記載の使用のための組合せ。
【請求項４０】
前記細胞死滅部分が細胞毒素である、請求項３８または３９に記載の使用のための組合せ。
【請求項４１】
前記細胞毒素が、ｉ）ペプチド毒素またはｉｉ）化学毒素から選択される、請求項４０に記載の使用のための組合せ。
【請求項４２】
前記細胞阻害剤が、前記細胞死滅部分とＣＤ３３結合部分との間の連結部分をさらに含む、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項４３】
ＣＤ７に特異的に結合する前記細胞阻害剤が、ＣＤ７＋細胞への前記第１の細胞阻害剤のＣＤ７受容体媒介内部移行を誘導することができる、請求項２９〜４２のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項４４】
前記ＣＤ７＋細胞がＡＭＬ細胞である、請求項４３記載の使用のための組合せ。
【請求項４５】
ＣＤ７に特異的に結合する前記細胞阻害剤が、抗体依存性細胞傷害性を媒介することができる抗ＣＤ７抗体またはその抗原結合部分である、請求項２９〜４４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項４６】
ＣＤ７に特異的に結合する前記細胞阻害剤が、抗ＣＤ７  ＣＡＲ−Ｔである、請求項２９〜４４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項４７】
前記細胞阻害剤が免疫エフェクター細胞を含む、請求項４６に記載の使用のための組合せ。
【請求項４８】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む、請求項４７に記載の使用のための組合せ。
【請求項４９】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項４８に記載の使用のための組合せ。
【請求項５０】
前記Ｔ細胞がＣＤ７＋Ｔ細胞を含む、請求項４９に記載の使用のための組合せ。
【請求項５１】
ＣＤ７に特異的に結合する前記細胞阻害剤が、細胞死滅部分およびＣＤ７結合部分を含む、請求項２９〜４４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項５２】
前記ＣＤ７結合部分が、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５１に記載の使用のための組合せ。
【請求項５３】
前記細胞死滅部分が細胞毒素である、請求項５１または請求項５２に記載の使用のための組合せ。
【請求項５４】
前記細胞毒素が、ｉ）ペプチド毒素またはｉｉ）化学毒素から選択される、請求項５３に記載の使用のための組合せ。
【請求項５５】
ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤が、細胞死滅部分とＣＤ７結合部分との間の連結部分をさらに含む、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
【請求項５６】
ＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合して、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するための細胞阻害剤。
【請求項５７】
前記細胞阻害剤が、ＣＤ３３＋および／またはＣＤ７＋細胞への前記細胞阻害剤のＣＤ３３および／またはＣＤ７受容体媒介内部移行を誘導することができる、請求項５６に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項５８】
前記ＣＤ３３＋およびＣＤ７＋細胞がＡＭＬ細胞である、請求項５６または請求項５７に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項５９】
前記細胞阻害剤が二重特異性抗体またはその抗原結合部分であり、任意に、前記二重特異性抗体またはその抗原結合部分が抗体依存性細胞傷害性を媒介することができる、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６０】
前記細胞阻害剤が免疫エフェクター細胞を含む、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６１】
前記細胞阻害剤がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む、請求項６０に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６２】
前記細胞阻害細胞がＴ細胞である、請求項６１に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６３】
前記免疫エフェクター細胞が二重特異性抗ＣＤ３３抗ＣＤ７  ＣＡＲ−Ｔである、請求項６２に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６４】
前記Ｔ細胞がＣＤ３３＋Ｔ細胞、ＣＤ７＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６３に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６５】
前記細胞阻害剤が、ｉ）細胞死滅部分；ｉｉ）ＣＤ７結合部分およびｉｉｉ）ＣＤ３３結合部分を含む、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６６】
前記ＣＤ３３結合部分が抗体の抗原結合断片を含む、請求項６５に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６７】
前記ＣＤ７結合部分が抗体の抗原結合断片を含む、請求項６５または請求項６６に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６８】
前記細胞死滅部分が細胞毒素である、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項６９】
前記細胞毒素が、ｉ）ペプチド毒素またはｉｉ）化学毒素から選択される、請求項６８に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【請求項７０】
前記細胞阻害剤が、連結部分をさらに含む、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液悪性腫瘍の処置における細胞表面受容体ＣＤ７およびＣＤ３３への細胞阻害剤の二重標的化に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ）または急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ）（ＡＭＬ）は、骨髄および末梢血中の骨髄芽球のクローン性増殖を含む不均一な血液悪性腫瘍である。ＡＭＬは成人急性白血病の症例の９０％超を占め、劇症の臨床的経過をたどる依然として大部分が侵攻性の疾患である。治療レジメンの進歩と造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）成功の現在の理解にもかかわらず、ＡＭＬ患者の死亡率は依然として高い。ＡＭＬと診断されたすべての成人のうち、平均して５年以上生存するのは４分の１に過ぎない。６５歳超の人々では、５年以上生存する見通しはさらにわずか１２％にまで低下する（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ）。これは、乳癌、前立腺癌、腸癌など、過去数十年間にはるかにより多大な投資を受けてきた他の多くの高発生率癌に比べて実質的に低く、５年生存率はここでそれぞれ８７％、８５％、５９％である（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ）。このことは、ＡＭＬにおける満たされていないニーズの程度と、新規治療薬へのより多大な投資に対する緊急の傾向を強調している。
【０００３】
現在のガイドラインでは、ＡＭＬの集中的な処置は、患者が臨床的および血液学的寛解に達したら、導入化学療法（アントラサイクリンとシタラビンの併用を含む）とその後の地固め療法から構成されることが推奨されている。導入療法の中心は、「７＋３」または同様の「１０＋３」レジメンからなり、７日間または１０日間のシタラビン持続注入と３日間のアントラサイクリンを併用する。それは、一般に、予後が中等度から良好で、処置関連死亡のリスクが低い患者に提供される。残念ながら、完全寛解（ＣＲ）では微小な残存病変が持続することが多く、処置を中止すれば再発はほぼ避けられない。したがって、導入療法に対して良好な応答を示したすべての患者には、第２の導入レジメンを施与するか、または地固め療法を継続して寛解の持続を達成するようにすべきである。
【０００４】
アントラサイクリンおよびシタラビンは、強力な細胞傷害性薬物の代謝拮抗薬クラスに属し、ＤＮＡ複製を阻害することにより高い増殖指数（ＰＩ）を有する細胞を標的とするため、化学療法レジメンで一般的に使用される。衰弱性副作用は、悪性細胞に対して十分に選択性ではなく、従って、高いＰＩをもつ健常組織に対して実質的な損傷を示すため、これらの剤でよく起こる。一般的な副作用には、生命を脅かす感染症、悪心および嘔吐、脱毛、挫傷および出血合併症ならびに腫瘍崩壊症候群の高いリスクと関連する骨髄抑制がある（ｗｗｗ．ｍａｃｍｉｌｌａｎ．ｏｒｇ．ｕｋ）。これらの薬物に関連する毒性の程度は、特殊な地域病院の感染管理病棟内での入院を必要とする。患者は、１サイクルの処置後に骨髄が完全に回復するまで、平均４〜５週間入院を続けなければならない。多くの患者は、より若い患者であっても、集中的な療法の最初の経過を生き延びることはない。
【０００５】
同種ＨＳＣＴは、現時点ではこの疾患設定における治癒のための唯一の選択肢であるが、この処置に関連する死亡率および罹病率のリスクが高いこと、しばしば処置関連死亡率が４０％にも及ぶことから、尚多くの疾患適応症のための最後の手段と考えられている。この処置の選択肢は、利用可能である適切なドナーに依存しており、ドナーを見つけて手順を生存した患者のうち、これらの患者の３０〜４５％が再発し、多くは追加の移植を必要とする。
【０００６】
６０歳を超える高齢患者集団における処置選択肢は最小限であり、最適なアプローチはまだ確立されていない。細胞遺伝学的に有害な高齢患者は、化学療法に応答しにくく、処置関連毒性の影響をより受けやすいことが多い。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を処置するために当初使用されていたアザシチジンなどの低メチル化剤は、高齢患者において、ＣＲを達成するための導入化学療法に当該患者を橋渡しすることを含む何らかの利益を最近示した（非特許文献１）。
【０００７】
ＡＭＬは、標的療法に利用可能な提案された腫瘍抗原の多くが悪性細胞集団に対して非特異性であるため、処置するための問題となる疾患を表す。ＡＭＬで示される従来の治療的アプローチは、白血病芽球の表面に発現される単一の抗原を標的とすることを目的とする。これらの治療薬は「標的療法」とみなされる一方、それらが標的とする抗原はまた、健康な免疫系に必要な、一連の健康な造血幹細胞に対して高レベルで発現される。これらの療法によって実証された健常な細胞に対するこの程度のオンターゲットオフ組織毒性は、疾患設定におけるそれらの有用性を実質的に制限する。その結果、しばしば、臨床医は、選択肢を持たず、患者に最適以下の用量を投与し、療法単独の結果として相当数の患者が死亡することになる。
【０００８】
ＣＤ３３は、この設定で広範に検討されているＡＭＬ抗原であり、十分に確立され、検証されたＡＭＬ標的であり、現在でも多くの既存の新規治療薬についての最適な抗原である。さらに、ＣＤ３３は、十分な抗原密度および内部移行を示す、検証されたＡＤＣ標的抗原であることも示されている。このことは、２０００年に発売された市販のＡＤＣ治療薬マイロターグによって、このＡＤＣがＡＭＬにおいてＣＤ３３抗原を標的にしていることからも明らかである。
【０００９】
ＣＤ３３は、ＡＭＬ細胞上でのこの抗原の広範な発現および初期のＣＤ３４＋造血幹細胞上での認識された発現低下のために、ＡＭＬにおける多くの薬物開発者にとって好ましい標的である一方、ＣＤ３３抗原はまた、健康な細胞集団において有力な骨髄性マーカーである。したがって、あらゆるＣＤ３３標的化処置で予想されるように、この抗原を標的とする療法はまた、健康な細胞集団に対して多くの標的外作用を有し、抗原を有するあらゆる骨髄細胞の有意である枯渇を引き起こす。これらの細胞は、健康な免疫系の必要条件であり、従って、枯渇は、患者が、特殊な感染制御室での入院が必要であるようにし、生命を脅かす感染に対して高い感受性を伴う。これに沿って、著名なＡＤＣ製薬会社であるＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓは、２０１７年６月に、第３相試験（ｆｉｅｒｃｅｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）でプラセボと比較して致死性感染症を含めて、患者の死亡率がより高いことを見た後に、ＣＤ３３を標的としたＡＤＣであるそれらの臨床的候補ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａを含むすべての試験を中止したと発表した。
【００１０】
ＣＤ７は、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞と一般的に関連する抗原であり、初期リンパ系発生におけるＴ細胞相互作用およびＴ／Ｂ細胞相互作用において必須の役割を果たすと考えられている。この抗原は、現在のところ、健康なＴ細胞集団上でのこの抗原の広範な発現に起因すると想定される、治療的開発における一般的に標的された抗原を代表するものではない。
【００１１】
１９８０年代後半から、特定のＡＭＬ細胞集団が、他の点ではリンパ系に限定された抗原であるＣＤ７を、この疾患において特異的な方式で発現することが明らかになってきた。ＡＭＬにおけるこの抗原の発現は、いくつかのグループによって報告されており、ＡＭＬ症例の１０〜３８％に認められ（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）、より乏しい結果と関連することが示唆されている。
【００１２】
ＡＭＬのＣＤ７＋サブタイプは、白血球増加、化学療法に対する応答不良ならびに全生存および無病生存の不良と関連している（非特許文献１２）。臨床的には、ＣＤ７＋ＡＭＬ患者はより若年で、より頻繁に男性であり、中枢神経系浸潤の発生率がより高く、ＡＭＬのより良好に分化していないサブタイプと関連していることが多く、より不良な結果とさらに関連している（非特許文献１３）。ＣＤ７＋ＡＭＬ細胞の未熟性は、この集団におけるＣＤ３４の高発現によってさらに支持されている。Ｐｏｅｔａら、１９９５による１件の研究では、ＣＤ７＋白血病を有する患者はＣＤ７−表現型を有する患者よりもＣＲが有意に低く（３２％対７４％）、このサブタイプの標準治療に対する再発および／または難治性性質の程度を示していることが見出された（非特許文献２）。
【００１３】
ＣＤ７は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ＋ＡＭＬサブグループの特徴と強く相関しており、その特徴であると考えられている。このサブタイプは、アポトーシスタンパク質の翻訳をダウンレギュレートするシグナルとなるＦＬＴ３チロシンキナーゼ受容体の調節解除によるより不良な臨床転帰と関連している。その結果、この受容体における脱調節は、ＡＭＬ細胞集団において化学療法で誘発された細胞死に対する抵抗性を誘導する（非特許文献４）。ＡＭＬの特に予後不良なサブタイプとして、ＦＬＴ３  ＡＭＬサブグループは、キナーゼ阻害剤および単特異性ＡＤＣを含む多くの新しい治療薬が特にこの集団を標的とする、新規の創薬者が標的とする望ましい疾患クラスである。
【００１４】
ＡＭＬにおけるＣＤ７の異常な発現を説明するために、いくつかの機序が記載されている。これらには、白血病細胞における疾患特異的不規則遺伝子発現（系統の非忠実性）、リンパ系および骨髄系の分化が可能な多能性前駆細胞の悪性形質転換、または正常な細胞分化中に異なる細胞系のマーカーを一時的に発現する可能性のあるまれな前駆細胞の増殖および成熟停止が含まれる（非特許文献１３）。
【００１５】
過渡状態ＣＤ７発現は、骨髄系およびリンパ系の両方の起源の細胞を産生することができる初期前駆細胞のサブセットで報告されているが、成熟骨髄系の形質転換の間に失われる（非特許文献１３）。これに沿って、１件の研究では、これら２つの抗原の最小かつ一過性の共発現が、発生中に失われた共発現を伴う、多能性幹細胞（ＣＤ３３ｌｏｗ／ＣＤ７＋／−）、いくつかの骨髄前駆細胞（ＣＤ３３ｈｉｇｈ／ＣＤ７＋／−）およびいくつかのＴ細胞前駆細胞（ＣＤ３３＋／−／ＣＤ７ｍｅｄ）を含む、健康な造血細胞の特定のサブセットで同定されていることが見出された（非特許文献１４）。したがって、この共発現パターンは、これら２つの抗原が一時的に一緒に見られる発生の特定の段階で捕獲され、悪性形質転換の間に共発現が増幅される、前駆細胞の特定のサブセットのクローン性増殖の結果であり得るのがもっともらしい。
【００１６】
ある種の前駆細胞サブセットでは、これらの２つの抗原に対して何らかの過渡状態共発現が明らかであり得る一方、各抗原の発現の程度が低い、ないし陰性であることは明らかである。ＣＤ３３およびＣＤ７は、初期造血発達のどの段階内でも高レベルの共発現を示さず、初期前駆細胞の選択された小サブ集団上での限定された発現を示し、前駆細胞プール全体には反映されない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｋｏｕｃｈｋｏｖｓｋｙ，＆  Ａｂｄｕｌ−Ｈａｙ，Ｍ．（２０１６）’Ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ２０１６  ｕｐｄａｔｅ’．Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６  １−１０
【非特許文献２】Ｐｏｅｔａ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＣＤ７  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１７，１１１−１１９
【非特許文献３】Ｒｏｈｒｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＣＤ７  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＣＥＢＰＡ，ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３  １−７
【非特許文献４】Ｒａｕｓｅｉ−Ｍｉｌｌｓ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ７  ｉｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｓ  Ｉｓ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  Ｗｉｔｈ  ＦＬＴ３／ＩＴＤ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１２９  ６２４−６２９
【非特許文献５】Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｏｆ  ＣＤ７＋Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ７３  ６９−７４
【非特許文献６】Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ  ８１  ３０８３−３０９０
【非特許文献７】Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐｅｌｅ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ
【非特許文献８】Ｌｏ  Ｃｏｃｏ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＣＤ７  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ：ａ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍａｔｕｒｉｔｙ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ７３  ４８０−４８５
【非特許文献９】Ｋｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ７  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ  ８１，２３９９−２４０５
【非特許文献１０】Ｅｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ＣＤ７  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｌｏｕｒｎａｌ  ｏｌＨａｅｒｎａｔｏｌｏｇｙ  ８２  ５０８−５１１
【非特許文献１１】Ｃｈａｎｇ，Ｈ．（２００４）Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｉｎ  ３７９  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８  ４３−４８
【非特許文献１２】Ｋａｈｌ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＣＤ７＋  ａｎｄ  ＣＤ５６＋  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｓ  ａ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｅｎｔｉｔｙ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４０  １１２−１１９
【非特許文献１３】Ｔｉｅｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｃ．（１９９８）ＣＤ７  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，３  ９３−９８
【非特許文献１４】Ｂａｒｃｅｎａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ７  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｔ−  ａｎｄ  Ｍｙｅｌｏｉｄ−ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｙｍｕｓ，Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １７  １−１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、ＡＭＬを含む血液悪性腫瘍を処置するための改善された特異性を有するより効果的な療法が、依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
第１の態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤を提供し、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に結合する細胞阻害剤との併用投与用であるか；またはＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に追加的に結合する。
【００２０】
関連局面において、本発明は、必要な個体におけるＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置する方法を提供し、方法は、ＣＤ３３に結合する細胞阻害剤を個体に投与することを含み、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に結合する細胞阻害剤との併用投与用であるか、またはＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に追加的に結合する。細胞阻害剤が人工的に生成されることが好ましい。
【００２１】
別の関連する局面において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置のための医薬の製造に使用するためのＣＤ３３に結合する細胞阻害剤を提供し、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に結合する細胞阻害剤との併用処理用であるか、またはＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に追加的に結合する。
【００２２】
一実施形態では、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ３３＋細胞への前記第１の細胞阻害剤のＣＤ３３受容体媒介内部移行を誘導することが可能であり、任意に、ＣＤ３３＋細胞は、ＡＭＬ細胞である。
【００２３】
ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ３３に特異的に結合し得る。
【００２４】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、抗体依存性細胞傷害性を媒介することができる抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。細胞阻害剤が抗ＣＤ３３抗体である場合、そのような抗体は完全長抗体であってもよい。
【００２５】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、抗ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔである。細胞阻害剤は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３３＋Ｔ細胞を含むことができる。
【００２６】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、細胞死滅部分およびＣＤ３３結合部分を含む。任意に、前記ＣＤ３３結合部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。任意に、前記細胞死滅部分は、細胞毒素である。前記細胞毒素は、以下から選択され得る：ｉ）ペプチド毒素、またはｉｉ）化学毒素。任意に、前記細胞阻害剤は、連結部分をさらに含む。前記連結部分は、好ましくは、細胞死滅部分とＣＤ３３結合部分との間にあるであろう。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤を提供し、ＣＤ７に結合する細胞阻害剤は、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤と組み合わせて投与するためである；またはＣＤ７に結合する前記阻害剤は、ＣＤ３３に追加的に結合する。
【００２８】
関連局面において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を、その処置を必要とする個体において処置する方法を提供し、この方法は、以下の投与を含む：ＣＤ７に結合する細胞阻害剤が、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤との併用投与用であるか、またはＣＤ７に結合する細胞阻害剤は、ＣＤ３３に追加的に結合することを含む。細胞阻害剤が人工的に生成されることが好ましい。
【００２９】
さらなる関連局面において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置のための医薬の製造に使用するためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤を提供し、ＣＤ７に結合する細胞阻害剤は、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤との併用投与用であるか；またはＣＤ７に結合する前記阻害剤は、ＣＤ３３に追加的に結合する。
【００３０】
一実施形態では、ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤は、前記第１の細胞阻害剤のＣＤ７＋細胞へのＣＤ７受容体媒介性の内部移行を誘導することができ、場合によってはＣＤ７＋細胞は、ＡＭＬ細胞である。
【００３１】
ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に特異的に結合し得る。
【００３２】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、抗体依存性細胞傷害性を媒介することができる抗ＣＤ７抗体またはその抗原結合部分である。細胞阻害剤が抗ＣＤ７抗体である場合、そのような抗体は、完全長抗体であり得る。
【００３３】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、抗ＣＤ７  ＣＡＲ−Ｔである。細胞阻害剤は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ７＋Ｔ細胞を含むことができる。
【００３４】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、細胞死滅部分およびＣＤ７結合部分を含む。任意に、前記ＣＤ７結合部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。任意に、前記細胞死滅部分は、細胞毒素である。前記細胞毒素は、以下から選択され得る：ｉ）ペプチド毒素、またはｉｉ）化学毒素。任意に、前記細胞阻害剤は、連結部分をさらに含む。前記連結部分は、好ましくは、細胞死滅部分とＣＤ７結合部分との間にあるであろう。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ３３に結合する細胞阻害剤と、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するためのＣＤ７に結合する細胞阻害剤との組合せを提供する。
【００３６】
関連局面において、本発明は、ＣＤ３３に結合する細胞阻害剤とＣＤ７に結合する細胞阻害剤との組合せを投与することを含む、その処置を必要とする個体におけるＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置する方法を提供する。細胞阻害剤が人工的に生成されることが好ましい。
【００３７】
さらなる関連局面において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置するための医薬の製造に使用するための、ＣＤ３３に結合する細胞阻害剤とＣＤ７に結合する細胞阻害剤との組合せを提供する。
【００３８】
一実施形態では、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、前記第１の細胞阻害剤のＣＤ３３＋細胞へのＣＤ３３受容体媒介性の内部移行を誘導することができ、場合によってはＣＤ３３＋細胞は、ＡＭＬ細胞である。
【００３９】
組合せにおいて、ＣＤ３３に結合する細胞阻害剤は、ＣＤ３３に特異的に結合し得る。
【００４０】
一実施形態では、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、抗体依存性細胞傷害性を媒介することができる抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合部分である。細胞阻害剤が抗ＣＤ３３抗体である場合、そのような抗体は完全長抗体であってもよい。
【００４１】
一実施形態では、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、抗ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔである。細胞阻害剤は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３３＋Ｔ細胞を含むことができる。
【００４２】
一実施形態では、ＣＤ３３に結合する前記細胞阻害剤は、細胞死滅部分およびＣＤ３３結合部分を含む。任意に、前記ＣＤ３３結合部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。任意に、前記細胞死滅部分は、細胞毒素である。前記細胞毒素は、以下から選択され得る：ｉ）ペプチド毒素、またはｉｉ）化学毒素。任意に、前記細胞阻害剤は、連結部分をさらに含む。前記連結部分は、細胞死滅部分とＣＤ３３結合部分との間にあってもよい。
【００４３】
一実施形態では、ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤は、前記第１の細胞阻害剤のＣＤ７＋細胞へのＣＤ７受容体媒介内部移行を誘導することができ、任意にＣＤ７＋細胞は、ＡＭＬ細胞である。
【００４４】
ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に特異的に結合し得る。
【００４５】
一実施形態では、ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤は、抗体依存性細胞傷害性を媒介することができる抗ＣＤ７抗体またはその抗原結合部分である。
【００４６】
一実施形態では、ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤は、抗ＣＤ７  ＣＡＲ−Ｔである。細胞阻害剤は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ７＋Ｔ細胞を含むことができる。
【００４７】
一実施形態では、ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤は、細胞死滅部分およびＣＤ７結合部分を含む。任意に、前記ＣＤ７結合部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。任意に、前記細胞死滅部分は、細胞毒素である。前記細胞毒素は、以下から選択され得る：ｉ）ペプチド毒素、またはｉｉ）化学毒素。任意に、ＣＤ７に結合する前記細胞阻害剤は、連結部分をさらに含む。前記連結部分は、好ましくは、細胞死滅部分とＣＤ７結合部分との間にあるであろう。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するための、ＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤を提供する。
【００４９】
関連局面において、本発明は、ＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤の投与を含む、それを必要とする個体におけるＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置する方法を提供する。細胞阻害剤が人工的に生成されることが好ましい。
【００５０】
さらなる関連局面において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置のための医薬の製造に使用するための、ＣＤ３３およびＣＤ７に二重特異的に結合する細胞阻害剤を提供する。
【００５１】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、前記細胞阻害剤のＣＤ３３＋およびＣＤ７＋細胞へのＣＤ３３およびＣＤ７受容体媒介内部移行を誘導することができ、場合によってはＣＤ３３＋およびＣＤ７＋細胞は、ＡＭＬ細胞である。
【００５２】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、二重特異性抗体またはその抗原結合部分であり、任意に、前記二重特異性抗体またはその抗原結合部分は、抗体依存性細胞傷害性を媒介することができる。細胞阻害剤が二重特異性抗体である場合、そのような抗体は完全長抗体であり得る。
【００５３】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、二重特異性抗ＣＤ３３抗ＣＤ７  ＣＡＲ−Ｔである。細胞阻害剤は、免疫エフェクター細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含むことができる。免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３３＋Ｔ細胞、ＣＤ７＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００５４】
１つの実施形態において、前記細胞阻害剤は、ｉ）細胞死滅部分；ｉｉ）ＣＤ７結合部分およびｉｉｉ）ＣＤ３３結合部分を含む。任意に、前記ＣＤ３３結合部分は、抗体の抗原結合断片を含み、かつ／または前記ＣＤ７結合部分は、抗体の抗原結合断片を含む。任意に、前記細胞死滅部分は、細胞毒素である。前記細胞毒素は、以下から選択され得る：ｉ）ペプチド毒素、またはｉｉ）化学毒素。任意に、前記細胞阻害剤は、連結部分をさらに含む。前記連結部分は、好ましくは、細胞死滅部分とＣＤ３３および／またはＣＤ７結合部分との間にあるであろう。
【００５５】
本発明の特定の局面、実施形態または例と関連して記載された特徴、整数、特性、結合部分または群は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載されたいずれかの他の局面、実施形態または例にも適用可能であると理解されるべきである。本明細書に開示された全ての特徴（添付した特許請求の範囲、要約書および図面のいずれをも含む）、ならびに／または開示された任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、前述の如何なる実施形態の詳細にも限定されない。本発明は、開示された任意の方法またはプロセスのステップの、本明細書に開示された特徴（添付した特許請求の範囲、要約書および図面のいずれをも含む）の任意の新規なものもしくは任意の新規な組み合わせ、またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスのステップの任意の新規なものもしくは任意の新規な組み合わせに及ぶ。
【００５６】
本発明の実施形態は、以下、添付した図面を参照してさらに記載される：
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ＲＬＵとして表されるαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下での抗ＣＤ３３の細胞傷害性プロファイルを示すグラフである。
【図２】図２は、抗ＣＤ３３およびαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理によるＫａｓｕｍｉ−３の生存百分率を示すグラフである。
【図３】図３は、ＲＬＵとして表されるαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下での抗ＣＤ７の細胞傷害性プロファイルを示すグラフである。
【図４】図４は、抗ＣＤ７およびαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理によるＫａｓｕｍｉ−３の生存百分率を示すグラフである。
【図５】図５は、ＲＬＵとして表されるαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下での抗ＣＤ１３の細胞傷害性プロファイルを示すグラフである。
【図６】図６は、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理の存在下での抗ＣＤ１３によるＫａｓｕｍｉ−３の生存百分率を示すグラフである。
【図７】図７は、ＲＬＵとして表されるαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下での抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７の細胞傷害性プロファイルを示すグラフである。
【図８】図８は、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理の存在下での抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７によるＫａｓｕｍｉ−３の生存百分率を示すグラフである。
【図９】図９は、ＲＬＵとして表されるαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下での抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ１３の細胞傷害性プロファイルを示すグラフである。
【図１０】図１０は、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理の存在下での抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ１３によるＫａｓｕｍｉ−３の生存百分率を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＲＬＵとして表されるαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下での抗ＣＤ３３の細胞傷害性プロファイルを示すグラフである。
【図１２】図１２は、抗ＣＤ３３およびαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理によるＨＥＬ  ９２．１．７の生存百分率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ＲＬＵとして表されるαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下での抗ＣＤ５６の細胞傷害性プロファイルを示すグラフである。
【図１４】図１４は、抗ＣＤ５６およびαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理によるＨＥＬ  ９２．１．７の生存百分率を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＲＬＵとして表されるαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下での抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ５６組み合わせの細胞傷害性プロファイルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理の存在下での抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ５６併用によるＨＥＬ  ９２．１．７の生存百分率を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ウェル当たり２×１０４細胞のＫａｓｕｍｉ−３細胞に対して、ウェル当たり６ｎＭのＭＭＡＥの濃度に対する野生型ＢｉＦａｂおよび抗ヒトＦａｂ−ＭＭＡＥの５ポイント用量応答を用いて行われた細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間処理した。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。ＩＣ５０は、約０．１１６９ｎＭであった。エラーバーは、三重反復の標準偏差を表す。
【図１８】図１８は、ウェルあたり２×１０４のＫａｓｕｍｉ−３について、直接結合したＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥの８ポイント用量応答を用いて実施した細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間処理した。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。ＩＣ５０は、０．３２１１ｎｍであった。エラーバーは、二重反復の標準偏差を表す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、１３．２ｎＭの抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥ抗体の存在下で、ＣＤ７およびＣＤ３３抗体の各々の５ポイント用量応答で処理したＫａｓｕｍｉ−３細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。抗体またはＭＭＡＥ結合抗体を持たない対照ウェルを含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、三重反復の標準偏差を表す。Ａ）抗ＣＤ７  ａｂ２１３０１４。ＩＣ５０は０．４４８５ｎＭであった。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、１３．２ｎＭの抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥ抗体の存在下で、ＣＤ７およびＣＤ３３抗体の各々の５ポイント用量応答で処理したＫａｓｕｍｉ−３細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。抗体またはＭＭＡＥ結合抗体を持たない対照ウェルを含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、三重反復の標準偏差を表す。Ｂ）抗ＣＤ３３  ａｂ００２８３−１．１。ＩＣ５０は０．３２３ｎＭであった。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、１３．２ｎＭの抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥ抗体の存在下で、ＣＤ７およびＣＤ３３抗体の各々の５ポイント用量応答で処理したＫａｓｕｍｉ−３細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。抗体またはＭＭＡＥ結合抗体を持たない対照ウェルを含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、三重反復の標準偏差を表す。Ｃ）抗ＣＤ７＋抗ＣＤ３３。ＩＣ５０は０．３６６１ｎＭであった。
【図２０Ａ】図２０Ａは、１３．２ｎＭの抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥの存在下で、ＣＤ７およびＣＤ３３抗体の各々の５ポイント用量応答で処理したＳＥＴ−２細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。抗体またはＭＭＡＥ結合抗体を持たない対照ウェルを含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、三重反復の標準偏差を表す。Ａ）抗ＣＤ７  ａｂ２１３０１４。ＩＣ５０は０．４８１７ｎＭであった。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、１３．２ｎＭの抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥの存在下で、ＣＤ７およびＣＤ３３抗体の各々の５ポイント用量応答で処理したＳＥＴ−２細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。抗体またはＭＭＡＥ結合抗体を持たない対照ウェルを含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、三重反復の標準偏差を表す。Ｂ）抗ＣＤ３３  ａｂ００２８３−１．１。ＩＣ５０は計算不能であった。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、１３．２ｎＭの抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥの存在下で、ＣＤ７およびＣＤ３３抗体の各々の５ポイント用量応答で処理したＳＥＴ−２細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。抗体またはＭＭＡＥ結合抗体を持たない対照ウェルを含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、三重反復の標準偏差を表す。Ｃ）抗ＣＤ７＋抗ＣＤ３３。ＩＣ５０は０．２０６ｎＭであった。
【図２１】図２１は、ｂｉ−Ｆａｂと一緒に標的化した場合のＣＤ７とＣＤ３３の間の相乗的結合を、別々のＦａｂと個別に比較して検討した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）実験の結果を表すグラフである。二重抗原陽性細胞株、Ｋａｓｕｍｉ−３およびＳＥＴ−２を、１ｎＭのＣＤ７／ＣＤ３３  ＢｉＦａｂ、ＣＤ７  Ｆａｂ、ＣＤ３３  Ｆａｂまたは両方のＣＤ７  Ｆａｂ＋ＣＤ３３で０℃で１時間処理した。二次抗Ｆａｂ  ＰＥ抗体を加え、細胞と共に氷上で４５分間インキュベートし、過剰を除去した。細胞を二次抗体のみと共にインキュベートした対照試料も含めた（ブランク）。細胞上のＰＥ標識は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを用いて検出した。エラーバーは、二重反復の標準偏差を表す。
【図２２】図２２は、白血病細胞株のパネル全体でのＷＴ  ＣＤ７／ＣＤ３３  Ｂｉｆａｂとその構成要素ＣＤ７およびＣＤ３３  Ｆａｂの結合を比較するＦＡＣＳ分析を表すグラフである。細胞は、１ｎＭのＣＤ７／ＣＤ３３  ＢｉＦａｂ、ＣＤ７  ＦａｂまたはＣＤ３３  Ｆａｂと共に、０℃で１時間インキュベートした。二次マウス抗Ｆａｂ  ＰＥ抗体を用いて、ｂｉ−ＦａｂおよびＦａｂ結合を検出した。細胞を二次抗体のみと共にインキュベートした対照試料も含めた（ブランク）。細胞上のＰＥ標識は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを用いて検出した。エラーバーは、二重反復の標準偏差を表す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥ、ＣＤ７−ＭＭＡＥ、ＣＤ３３−ＭＭＡＥおよびＣＤ７＋ＣＤ３３−ＭＭＡＥの滴定で処理した、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間処理した。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは二重反復の標準偏差を表し、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥのＩＣ５０値は以下の通りであった：Ａ）０．３２１１ｎＭ。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥ、ＣＤ７−ＭＭＡＥ、ＣＤ３３−ＭＭＡＥおよびＣＤ７＋ＣＤ３３−ＭＭＡＥの滴定で処理した、ＳＥＴ−２細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間処理した。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは二重反復の標準偏差を表し、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥのＩＣ５０値は以下の通りであった：Ｂ）１．４５３ｎＭ。
【図２４】図２４は、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥまたはゲムツズマブ−ＭＭＡＥの滴定で処理した、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間処理した。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、二重反復の標準偏差を表し、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥのＩＣ５０は０．３２１１ｎＭであり、ゲムツズマブ−ＭＭＡＥのＩＣ５０は０．８７８１ｎＭであった。
【図２５】図２５は、１０μｌのＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥおよびゲムツズマブ−ＭＭＡＥで処理した、ＳＥＴ−２細胞について実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間処理した。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎをウェルごとにピペットで加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、二重反復の標準偏差を表し、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥのＩＣ５０は１．４５３ｎＭであり、ゲムツズマブ−ＭＭＡＥのＩＣ５０は計算不能であった。
【図２６】図２６は、ＣＤ７／ＣＤ３３二重陽性サブ集団、ＨＥＬ−９２およびＭＯＬＭ−１６細胞株の特異的細胞死滅アッセイの結果を示すグラフであり、両方ともＣＤ３３＋／ＣＤ７＋細胞のサブ集団を含み、ＷＴ  ｂｉＦａｂ−ＭＭＡＥの滴定と共に０、０．０３、０．１および０．３ｎＭで３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、別々の試料を、抗ヒトＦａｂ−ＰＥ、抗ＣＤ７−ＰＥ、抗ＣＤ３３  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ７−ＰＥ＋抗ＣＤ３３  ＦＩＴＣと共に、または二次抗体なしで氷上で１時間インキュベートした。過剰な二次抗体を除去し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを用いて蛍光を検出した。ＣＤ３３抗原のみの細胞およびＣＤ７／ＣＤ３３二重抗原細胞を表す２つの領域における事象について試料を分析した。
【図２７】図２７は、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥの滴定で処理された、ＨＮＴ−３４細胞に対して実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間処理した。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、二重反復の標準偏差を表す。ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥのＩＣ５０は０．４５ｎＭであった。
【図２８】図２８は、ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥの滴定で処理された、ＵＯＣ−Ｍ１細胞に対して実施された細胞死滅アッセイの結果を示すグラフである。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間処理した。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットした。エラーバーは、二重反復の標準偏差を表す。ＢｉＦａｂ−ＭＭＡＥのＩＣ５０は２．７ｎＭであった。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明者らは、驚くべきことに、ＡＭＬ細胞上のＣＤ７およびＣＤ３３の二重標的化が相乗的な治療効果を提供することを実証した。本発明者らは、この二重標的化がＡＭＬ細胞死の誘導に対して有意な相乗効果をもたらすことを実証した。具体的には、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＭＬ疾患細胞株におけるＣＤ７およびＣＤ３３の二重標的化が、単一の標的化と比較して癌細胞死の２０倍の増加をもたらすことを確認した。
【００５９】
本発明者らは、ＡＭＬにおける異なる潜在的標的抗原の組み合わせの適用を検討するために、細胞生存アッセイのパネル（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標））を実施した。各標的抗原組み合わせで２つの抗原を発現するＡＭＬ細胞株を選択し、一次モノクローナル抗体の濃度を増加させながら、単独または組み合わせでインキュベートした。細胞傷害性ペイロード、ＭＭＡＥに連結された規定された濃度の二次抗マウスＦｃ抗体を、切断可能なリンカーと共に添加して、「ＡＤＣ」効果を発揮した。内部移行後、二次抗体からのＭＭＡＥペイロードはリソソーム内で放出され、細胞死をもたらした。細胞の生存百分率を計算し、データセットからＩＣ５０値を導出した。
【００６０】
このアッセイは、ＣＤ７およびＣＤ３３抗原の両方がＡＤＣ療法に必要な性質を有することを実証した。どちらの抗原も、抗体によって結合されると内部移行され、ペイロード放出のために抗体をリソソームに向かわせ、細胞死をもたらした。
【００６１】
単独で標的化した場合、ＣＤ７抗体およびＣＤ３３抗体の両方は、抗原陽性細胞に対して乏しい細胞毒性を誘発し、ＩＣ５０はそれぞれ１５８．２ｎＭおよび１６３．６ｎＭであった。しかし、組み合わせでインキュベートした場合、効力の２０倍の増加、８．２ｎＭが記録された。このことは、２つの受容体をタンデムに標的とすることが急速な内部移行を駆動し、その結果、一定の用量でリソソームに到達するペイロードの程度がより大きくなることを示唆している。これは、試験した代替の組み合わせでは明らかではなかった。
【００６２】
ＣＤ７は、ＴおよびＢリンパ球の前駆細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞上に発現する汎白血球性受容体であり（Ｈａｏ，２００１；Ｓｅｍｐｏｗｋｉ，１９９９）、Ｔ細胞活性化に付随的な役割を果たし（Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ，１９９４；Ｓｔｉｌｌｗｅｌｌ，２０１１）、成熟ＣＤ４＜＋＞細胞の表面に持続する（Ｃｏｔｔａ，２００６；Ｌｏｂａｃ，１９８５）。ＣＤ７は、白血病およびリンパ腫処置のための細胞毒性分子の送達の標的として広く研究されている（Ｐｅｉｐｐ，２００２；Ｂｒｅｍｍｅｒ，２００６；Ｆｒａｎｋｅｒ，１９９７；Ｖａｌｌｅｒａ，１９９６；Ｗａｕｒｚｙｎｉａｋ，１９９７）。
【００６３】
ＣＤ３３は、シアル酸に結合する６７ｋＤａの細胞膜タンパク質であり、タンパク質のシアル酸結合Ｉｇ関連レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーの要素である。ＣＤ３３は、骨髄細胞上に発現することが知られている。ＣＤ３３の発現は、多くの悪性細胞についても報告されている。
【００６４】
一般的な骨髄性抗原であるＣＤ３３は、ＡＭＬ細胞の大部分上に発現している（Ｄｅ  Ｐｒｏｐｒｉｓ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｈｉｇｈ  ＣＤ３３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ（ＮＰＭ１）ｍｕｔａｔｉｏｎ，ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ，９６  １５４８−１５５１；Ｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３３  ａｎｄ  ＣＤ１２３  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４  １−１０）一方、一般的なＴおよびＮＫ細胞マーカーであるＣＤ７は、予後不良の表現型を付与するＡＭＬ細胞の化学療法抵抗性サブ集団（約２２％に相当）上に異常に発現している（Ｐｏｅｔａ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＣＤ７  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１７，１１１−１１９；Ｒｏｈｒｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＣＤ７  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＣＥＢＰＡ，ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３  １−７；Ｒａｕｓｅｉ−Ｍｉｌｌｓ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ７  ｉｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｓ  Ｉｓ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  Ｗｉｔｈ  ＦＬＴ３／ＩＴＤ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１２９  ６２４−６２９；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｏｆ  ＣＤ７＋Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ７３  ６９−７４；Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ  ８１  ３０８３−３０９０；Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐｅｌｅ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １５３  ４２１−４３６；Ｌｏ  Ｃｏｃｏ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＣＤ７  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ：ａ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍａｔｕｒｉｔｙ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ７３  ４��０−４８５；Ｋｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ７  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ  ８１，２３９９−２４０５；Ｅｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ＣＤ７  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｌｏｕｒｎａｌ  ｏｌＨａｅｒｎａｔｏｌｏｇｙ  ８２  ５０８−５１１；Ｃｈａｎｇ，Ｈ．（２００４）Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｉｎ  ３７９  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８  ４３−４８）。
【００６５】
ＡＭＬのＣＤ７＋サブタイプは、白血球増加、化学療法に対する応答不良ならびに全生存および無病生存の不良と関連している（Ｋａｈｌ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＣＤ７＋  ａｎｄ  ＣＤ５６＋  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｓ  ａ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｅｎｔｉｔｙ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４０  １１２−１１９）。臨床的には、ＣＤ７  ＡＭＬ患者はより若年であり、より頻繁に男性であり、中枢神経系浸潤の発生率がより高く、ＡＭＬのより分化度の低いサブタイプと関連していることが多く、より不良な結果とさらに関連している（Ｔｉｅｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｃ．（１９９８）ＣＤ７  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，３  ９３−９８）。ＣＤ７＋ＡＭＬ細胞の未熟性は、この集団におけるＣＤ３４の高発現によってさらに支持されている。Ｐｏｅｔａら、１９９５による１件の研究では、ＣＤ７＋白血病を有する患者はＣＤ７−表現型を有する患者よりもＣＲが有意に低く（３２％対７４％）、このサブタイプの標準治療に対する再発の程度および／または難治性の性質を示していることが見出された（Ｐｏｅｔａ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＣＤ７  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，１７，１１１−１１９）。
【００６６】
ＣＤ７は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ＋ＡＭＬサブグループの特徴と強く相関しており、その特徴であると考えられている。このサブタイプは、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ受容体の調節解除によるより乏しい臨床結果と関連しており、それは、アポトーシスタンパク質の翻訳をダウンレギュレートするシグナルとなり、その結果、ＡＭＬ細胞集団において化学療法誘発性細胞死に対する抵抗性を誘導する（Ｒａｕｓｅｉ−Ｍｉｌｌｓ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ７  ｉｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｓ  Ｉｓ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  Ｗｉｔｈ  ＦＬＴ３／ＩＴＤ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１２９  ６２４−６２９）。ＡＭＬの特に予後不良なサブタイプとして、ＦＬＴ３  ＡＭＬサブグループは、キナーゼ阻害剤および単特異性ＡＤＣを含む多くの新しい治療薬が特定的にこの集団を標的とする、新規の創薬者が標的とする望ましい疾患クラスである。
【００６７】
ＡＭＬにおけるＣＤ７の異常な発現を説明するために、いくつかの機序が記載されている。これらには、白血病細胞における疾患特異的な不規則な遺伝子発現（血統不忠実）、リンパ球および骨髄の分化が可能な多能性前駆細胞の悪性形質転換、または正常な細胞分化中に異なる細胞系統のマーカーを一過性に発現し得るまれな前駆細胞の増殖および成熟停止（系統の乱交）が含まれる（Ｔｉｅｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｃ．（１９９８）ＣＤ７  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，３  ９３−９８）。
【００６８】
一過性のＣＤ７発現は、骨髄系およびリンパ系の両方の起源の細胞を産生することができる初期前駆細胞のサブセットにおいて報告されているが、成熟骨髄系およびリンパ系の形質転換の間に失われる（Ｔｉｅｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｃ．（１９９８）ＣＤ７  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，３  ９３−９８）。これに沿って、１件の研究では、これら２つの抗原の低レベルでの共発現が、多能性幹細胞（ＣＤ３３ｌｏｗ／ＣＤ７＋／−）、一部の骨髄前駆細胞（ＣＤ３３ｈｉｇｈ／ＣＤ７＋／−）および一部のＴ細胞前駆細胞（ＣＤ３３＋／−／ＣＤ７ｍｅｄ）を含む健康な造血細胞の特定のサブセットで確認されていたが、発生中に共発現が失われたことが見出された（Ｂａｒｃｅｎａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ７  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｔ−  ａｎｄ  Ｍｙｅｌｏｉｄ−ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｙｍｕｓ，Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １７  １−１１）。したがって、この共発現パターンは、これら２つの抗原が一過性に一緒に見られ、この発現が悪性形質転換の間に増幅される、発生の特定の段階で捕獲された前駆細胞の特定のサブセットのクローン性増殖の結果であり得る可能性がある。
【００６９】
有利なことに、ある種の前駆体サブセットにおいて、これらの２つの抗原に対して何らかの一過性の共発現が明らかであり得る一方、各抗原の発現の程度は低いないし陰性であることは明らかである。ＣＤ３３およびＣＤ７は、初期の造血発生のどの段階においても高レベルの共発現を示さず、初期前駆細胞の選択された小サブ集団上での限定された発現を示し、前駆細胞プール全体には反映されない。
【００７０】
この抗原の組合せは、白血病芽球の共発現パターンの忠実度に基づいて、可能なＡＭＬの組合せのパネルから選択された。二重標的化の相乗作用は全く予想外であり、予測できなかった。
【００７１】
本発明は、ＡＭＬ細胞集団に限定される２つの細胞表面抗原、ＣＤ７およびＣＤ３３の疾患特異的共発現を同時に標的化し、２つの抗原のうちの１つのみを発現し得る健康な細胞に対する標的効果を回避する二重標的化治療アプローチを提供する。このように、提案された二重特異性ＡＤＣは、他のＡＭＬ療法よりも選択性を改善したであろう。この選択性は、より高い、より有効な用量の治療薬を長期間にわたって送達することを可能にするであろう。
【００７２】
従って、本発明は、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤、ならびに、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置するための二重標的化療法において同時に、別々に、または連続的に投与することができる、ＣＤ７と特異的に結合する細胞阻害剤およびその治療組成物を提供する。
【００７３】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤と、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤と、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置するためのその治療組成物との組み合わせを提供する。
【００７４】
本発明はまた、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置するための、ＣＤ３３およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤を提供する。
【００７５】
第１の態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するための、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤を提供し、ＣＤ３３に特異的に結合する前記細胞阻害剤は、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤と組み合わせて投与するために調製される。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するための、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤を提供し、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤は、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤と組み合わせて投与するために調製される。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するための、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤とＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤との組み合わせを提供する。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に使用するための、ＣＤ３３およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤を提供する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤、およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤、およびＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の再発を防止または遅延させるための二重標的化療法において同時に、別々に、または連続的に投与することができるその治療組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤と、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤と、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の再発を防止または遅延させるためのその治療組成物との組み合わせを提供する。さらなる態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の再発を防止または遅延させるための、ＣＤ３３およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤ならびにその治療組成物を提供する。
【００８０】
本明細書中に記載される細胞阻害剤およびその治療組成物は、医薬の製造において使用するためのものであり得る。本明細書で使用される「医薬」とは、医療処置に使用される物質（すなわち、薬剤）を指す。医薬は、例えば、養子細胞移入に使用するためのものであるＴ細胞産物であってもよい。
【００８１】
本明細書に記載される細胞阻害剤およびその治療組成物は、それを必要とする対象におけるＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置する方法、またはそれを必要とする対象におけるＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の再発を防止もしくは遅延させるために使用され得る。
【００８２】
従って、それを必要とする対象におけるＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍を処置するための方法は、以下：
ｉ）ＣＤ３３に特異的に結合する有効量の細胞阻害剤を対象に投与するステップ、
ｉｉ）ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤を対象に投与するステップ、
を含み、
ステップｉ）およびｉｉ）は、別個、同時または連続的であり、任意の順序である。
【００８３】
本明細書で使用されるように、ＣＤ７は、好ましくはヒトＣＤ７であり、ＣＤ３３は、好ましくはヒトＣＤ３３である。特定の実施形態において、細胞阻害剤は、細胞表面で発現されるＣＤ７およびＣＤ３３に特異的に結合する。本明細書で使用される場合、「細胞表面で発現される」という表現は、ＣＤ７および／またはＣＤ３３タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の細胞外側に曝露され、かつ本発明の細胞阻害剤にアクセス可能であるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の表面に発現される１以上のＣＤ７および／またはＣＤ３３タンパク質（複数可）を意味する。
【００８４】
用語「ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍」とは、悪性細胞（例えば、細胞表面上でＣＤ３３および／もしくはＣＤ７を過剰発現する、ならびに／または、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤、もしくはＣＤ７およびＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤での療法に許容されると考えられるレベルでＣＤ３３および／もしくはＣＤ７を発現する血液悪性腫瘍）の表面上のＣＤ７およびＣＤ３３の両方の発現を特徴とする血液悪性腫瘍を指す。
【００８５】
ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍には、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）が含まれる。
【００８６】
好ましい実施形態では、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍はＡＭＬである。
【００８７】
本発明の細胞阻害剤は、患者に静脈内または皮下投与することができる。
【００８８】
別の態様では、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の再発を防止または遅延させるための二重標的化療法において同時に、別々に、または連続的に投与することができる、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤、およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤、およびその治療組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の再発を防止または遅延させるための、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤と、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤と、その治療組成物との組み合わせを提供する。さらなる態様において、本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の再発を防止または遅延させるための、ＣＤ３３およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤およびその治療組成物を提供する。
【００８９】
本明細書中で使用される「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、障害または症状の発生を防止するか、または病態を変えることを意図して行われる介入を含むものと解釈される。したがって、「処置する（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、目的が標的された障害または症状を防止または減速（軽減）することである治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。したがって、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、障害または症状の発生を処置および／または防止することを包含する。本明細書で使用される「療法」とは、疾患または障害の防止または処置を指す。療法は、予防的または治療的であり得る。
【００９０】
このような局面において、本発明の細胞阻害剤は、血液悪性腫瘍からの寛解において患者に投与され、その結果、基礎となる血液悪性腫瘍の再発を防止または遅延させる。
【００９１】
本明細書中で使用される、「患者」は、典型的には、血液悪性腫瘍、好ましくはＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置を受けているか、または有すると診断されたヒトである。いくつかの実施形態では、細胞阻害剤は、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍から寛解している患者に投与され、それによって、血液悪性腫瘍の再発は防止されるかまたは遅延される。いくつかの実施形態では、患者は、血液悪性腫瘍の検出可能な細胞を欠いている。本明細書中で使用されるように、「検出可能な細胞の欠如」は、標準的な診断的または予後的方法によって決定される。ＡＭＬから寛解した患者は、典型的には、異常な臨床的特徴の消失、正常な血球数への回復、および芽球細胞が５％未満、好中球数が１．０００〜１，５００を超え、血小板数が１００，０００を超え、白血病クローンが消失した、骨髄における正常な造血を示す。例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃ．１１，Ｃｈ．１３８（第１７版、１９９７）：Ｅｓｔｅｙ，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  ９２（５）：１０５９−１０７３を参照。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍から寛解した患者は、骨髄移植を受けていない。他の実施形態では、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍から寛解した患者は、骨髄移植を受けている。骨髄移植は、自家または同種骨髄移植のいずれかとすることができる。
【００９３】
ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）を処置し、ＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）の再発を遅延防止または遅延させる実施形態では、ＡＭＬ癌細胞死を誘導することおよび／またはＡＭＬ癌細胞成長を阻害することを含む。
【００９４】
細胞阻害剤は、化合物（すなわち、細胞阻害剤（複数可））および１以上の他の成分を含む組成物（例えば、治療組成物）の一部であってもよい。組成物は、細胞阻害剤ならびに薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤および／または担体を含む治療組成物であり得る。治療組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、アジュバントおよびサイトカインのような補足的免疫増強剤、ならびに任意に他の治療剤または化合物を常習的に含むことができる。
【００９５】
本明細書中で使用される「薬学的に許容される」とは、生物学的または他の点で不所望ではない物質を指し、すなわち、物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こさず、またはそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、選択された化合物とともに個体に投与され得る。
【００９６】
賦形剤は、活性成分（例えば、ワクチン、細胞周期阻害剤、免疫抑制機構のモジュレーター、または免疫チェックポイント阻害剤（適宜））と共に処方される天然または合成物質であり、処方物を膨張させる目的で、または薬物の吸収もしくは溶解性を促進するなど、最終的な投薬形態の活性成分に治療的増強を与える目的で含まれる。賦形剤はまた、予期される貯蔵寿命にわたる変性の防止などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を助けることに加えて、粉末流動性または非粘着特性を促進することなどによって、関連する活性物質の取り扱いを助けるために、製造プロセスにおいて有用であり得る。薬学的に許容可能な賦形剤は、当技術分野で周知である。従って、適切な賦形剤は、通常の当業者によって容易に同定可能である。一例として、適当な薬学的に許容される賦形剤は、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等を含む。
【００９７】
アジュバントは、処方物中の他の剤の効果を修正する薬理学的および／または免疫学的剤である。薬学的に許容可能なアジュバントは、当技術分野で周知である。従って、適切なアジュバントは、通常の当業者によって容易に確認可能である。
【００９８】
希釈剤は希釈する剤である。薬学的に許容可能な希釈剤は、当技術分野で周知である。従って、適当な希釈剤は、通常の当業者によって容易に同定可能である。
【００９９】
担体は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、処方物の他の成分と適合性である。用語「担体」は、有機または無機成分、天然または合成を示し、それらと活性成分を組み合わせて適用を容易にする。薬学的に許容可能な担体は、当技術分野で周知である。従って、適当な担体は、通常の当業者によって容易に確認可能である。
【０１００】
本明細書中で使用される用語「有効量」および「治療有効量」は、毒性、刺激、またはアレルギー応答のような過度の副作用なしに所望の治療応答をもたらすのに十分な活性治療剤の量を指す。特定の「有効量」は、明らかに、処置される特定の状態、患者の身体状態、処置される動物の種類、処置の期間、同時療法の性質（もしあれば）、ならびに使用される特定の製剤および化合物またはその誘導体の構造のような因子によって変化するであろう。この場合、（ａ）癌細胞成長（例えば、ＡＭＬ細胞）の阻害；および（ｂ）癌細胞（例えば、ＡＭＬ細胞）の死滅の１つ以上をもたらしたが、これらに限定されない場合、量は治療的に有効であるとみなされるであろう。
【０１０１】
患者に投与される細胞阻害剤およびその治療組成物の用量は、年齢および患者の大きさ、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変化し得る。好ましい用量は、典型的には、体重または体表面積に従って計算される。
【０１０２】
細胞阻害剤およびその治療組成物の投与方法には、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれる。細胞阻害剤およびその治療組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介する吸収によって投与することができ、他の生物学的活性剤と一緒に投与することができる。投与は、全身的または局所的であってもよい。
【０１０３】
好適には、本明細書に記載される二重標的化処置は、それを必要とする対象におけるＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液悪性腫瘍の処置に利益をもたらすであろう。例えば、二重標的化療法は、それを必要とする対象におけるＡＭＬの処置に対して相加または相乗効果を有し得る。二重標的化療法とは、例えば、応答の程度（例えば、アポトーシスまたは細胞生存率）、応答速度、疾患進行までの期間または生存期間によって測定されるように、その効果が、二重標的化療法の成分のうちの１つまたは他の成分をその従来の用量で投与することで達成可能なものよりも治療的に優れている場合に、「相加効果」、「相乗効果」または「相乗的処置」をもたらすものと定義される。例えば、二重標的化療法の効果は、効果が、ＣＤ３３単独に特異的に結合する細胞阻害剤またはＣＤ７単独に特異的に結合する細胞阻害剤で達成可能な効果よりも治療的に優れている場合、相加的である。例えば、併用処置の効果が併せて加えられた個々の処置の効果に取って代わる場合、併用治療の効果は相乗的であり得る。さらに、ＣＤ３３単独に特異的に結合する細胞阻害剤またはＣＤ７単独に特異的に結合する細胞阻害剤に応答しない（または応答が悪い）対象の群において有益な効果が得られた場合、組み合わせの効果は有益である（例えば、相加的または相乗的）。さらに、組み合わせ処置の効果は、成分の１つが従来の用量で投与され、他方の成分が減量された用量で投与された場合に利益（例えば相加効果または相乗効果）をもたらすものとして定義され、例えば、応答の程度、応答速度、疾患進行までの時間または生存期間は、組合せ処置の成分のいずれか１つの従来の量を投与することで達成可能なものと同等またはそれより良好である。特に、ＣＤ３３に特異的に結合する従来の用量の細胞阻害剤またはＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤が、応答の程度、応答速度、疾患進行までの時間および生存データの１つ以上に有害なことなく、特に応答の持続時間に有害なことなく、しかし、各成分の従来の用量を使用した場合に生じる副作用よりも少ない、かつ／または煩わしくない副作用を伴って低下し得る場合に、有益性が存在するとみなされる。
【０１０４】
ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤は、対象への連続的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）（連続的（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ））、分離的（前または後）および／または同時的（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）（同時的（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））投与に適した形態で、任意の順序で提供され得る。例えば、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤を、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤との連続的、分離的および／または同時投与に適した形態で提供することができる（またはその逆）。
【０１０５】
ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤とＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤を同時に投与する場合には、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤と、同時に投与されるＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤を、同時に投与される別々の組成物として投与してもよく、または両者を含む併用組成物として投与してもよい。
【０１０６】
ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤は、ＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤が対象中のＣＤ３３＋ＣＤ７＋ＡＭＬ細胞と接触するのと同じ点で、細胞阻害剤が対象中のＣＤ３３＋ＣＤ７＋ＡＭＬ細胞と接触するのを可能にする任意の方法で投与することができる。通常の当業者は、適切な投与レジメンを確認することができる。
【０１０７】
ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤の投与が連続的または別々である場合、第２の処方物の投与における遅延は、併用療法の有益な効果を失うほどではないはずである。
【０１０８】
本発明の文脈では、「標的化」および「二重標的化」が、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤が、それら自体がそれらの存在が望まれる少なくとも１つの組織部位に優先的に局在するように働くことを示すために、本明細書で使用される。本発明において、細胞阻害剤は、ＣＤ３３、ＣＤ７またはＣＤ３３およびＣＤ７に特異的に結合し、それによって、当該対象への投与後に、対象の体内の少なくとも１つの所望部位に平均よりも大きな局在を提供する。本症例における標的化部分は、細胞表面受容体ＣＤ３３に特異的に結合するように選択されるであろう。特定の病態（例えば、ＡＭＬ）を有する細胞においてＣＤ３３およびＣＤ７が発現および／または過剰発現される場合、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤およびＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤は、このような疾患に罹患した細胞に対する複合体を標的とするのに役立ち得る。
【０１０９】
本明細書中で使用される用語「細胞阻害剤」は、標的細胞の細胞死滅を誘導するか、または標的細胞の細胞成長を阻害する任意の剤を指す。本明細書中で使用されるように、「標的細胞の死滅」は、例えば、細胞生存率が低下するようなタンパク質合成の阻害、または標的細胞の除去もしくは死をもたらすアポトーシスの誘導に関する。細胞死滅およびアポトーシスを決定するアッセイは、当技術分野で周知である。細胞毒性アッセイは、薬理学的物質（例えば、ＬＤＨ細胞毒性アッセイ、または生死細胞アッセイ）による処置後の集団における生細胞および死細胞の数を評価する。アポトーシスアッセイは、細胞死時に活性化されるマーカー（例えば、ＰＳ露出アッセイ、カスパーゼ活性化アッセイ、ＤＮＡ断片化アッセイ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ決定、ＬＤＨ細胞毒性アッセイ、生死細胞アッセイ、または非カスパーゼプロテアーゼ活性化アッセイ）を測定することによって、細胞がどのように死滅しているかを評価する。
【０１１０】
本明細書で使用される、「細胞成長を阻害する」（例えば、標的細胞を指す）とは、本開示による細胞阻害剤と接触していない同一細胞の成長と比較して、本発明による細胞阻害剤と接触した場合の標的細胞の成長または増殖のあらゆる測定可能な減少、例えば、細胞の成長の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％の阻害を指す。細胞の生存性または増殖を決定するアッセイは、当技術分野で周知である。細胞生存アッセイは、細胞活性のマーカー（例えば、ＡＴＰおよびＡＤＰ判定アッセイ、細胞周期アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞生存アッセイ、ＬＨＤ細胞毒性アッセイ、または生死細胞アッセイ）を測定することによって、細胞がどのように健康であるかを評価する。細胞増殖アッセイは、細胞集団の成長速度を評価するか、または成長している集団中の娘細胞を検出するために評価する（例えば、細胞周期アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞生存アッセイ、または老化アッセイ）。
【０１１１】
本明細書で使用する、「ＣＤ３３発現細胞」および「ＣＤ３３＋細胞」は、表面抗原としてＣＤ３３を有する細胞を指す。本明細書で使用する、「ＣＤ７発現細胞」および「ＣＤ７＋細胞」は、表面抗原としてＣＤ７を有する細胞を指す。本明細書で使用する、「ＣＤ３３およびＣＤ７発現細胞」および「ＣＤ３３＋ＣＤ７＋細胞」は、表面抗原としてＣＤ３３およびＣＤ７の両方を有する細胞を指す。
【０１１２】
本明細書中で使用する「標的細胞」とは、標的分子ＣＤ７およびＣＤ３３の発現または過剰発現を特徴とする細胞または細胞型を指す。ＣＤ７およびＣＤ３３を発現する任意のタイプの細胞を、本発明の細胞阻害剤による処置のための標的細胞として想定することができる。ある実施形態において、細胞は、腫瘍細胞、例えばＡＭＬ細胞のような血液悪性腫瘍由来の腫瘍細胞である。
【０１１３】
特定の実施形態において、本明細書に記載される細胞阻害剤は、前記細胞阻害剤のＣＤ３３＋細胞へのＣＤ３３受容体媒介性の内部移行、および／または前記細胞阻害剤のＣＤ７＋細胞へのＣＤ７受容体媒介性の内部移行を誘導することができる。特定の実施形態において、細胞阻害剤は、ＣＤ３３およびＣＤ７の両方に特異的に結合し、細胞表面上のＣＤ７およびＣＤ３３の両方の結合に際してＣＤ７＋ＣＤ３３＋細胞への剤の内部移行を誘導することができる細胞阻害剤である。
【０１１４】
本明細書で使用する、「ＣＤ３３受容体媒介性の内部移行」は、細胞表面上のＣＤ３３に結合するとＣＤ３３＋細胞によって取り込まれる（すなわち、進入する）ことを指す。治療的適用のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの内部移行が考えられる。本明細書で使用する、「ＣＤ７受容体媒介性の内部移行」は、細胞表面上のＣＤ７に結合するとＣＤ７＋細胞によって取り込まれる（すなわち、進入する）ことを指す。治療的適用のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの内部移行が考えられる。
【０１１５】
治療的適用のためには、内部移行した細胞阻害剤の数は、ＣＤ３３＋ＣＤ７＋細胞、特にＡＭＬ細胞のようなＣＤ７＋ＣＤ３３＋血液癌細胞を死滅させるのに十分または適切であろう。細胞阻害剤の効力に依存して、いくつかの例において、単一分子の細胞内への取り込みは、剤が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。細胞阻害剤がＣＤ３３および／またはＣＤ７受容体媒介内在化を誘導するかどうかは、当技術分野で周知の種々のアッセイによって決定することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内部移行のために、細胞を、培養培地に添加した関連する細胞阻害剤の存在下または非存在下で組織培養皿中でインキュベートし、所望の時点で顕微鏡分析のために処理することができる。細胞中の内部移行し、標識された細胞阻害剤の存在は、放射標識された細胞阻害剤が使用される場合、顕微鏡により、またはオートラジオグラフィーにより直接可視化することができる。あるいはまた、定量的生化学アッセイにおいて、ＣＤ３３＋ＣＤ７＋細胞を含む細胞の集団を、放射標識試験細胞阻害剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで接触させ、細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏで接触させた場合、適切な量の時間の後に細胞を単離する）をプロテアーゼで処理するか、または酸洗浄に供して、細胞表面上の内部移行していない細胞阻害剤を除去する。細胞を粉砕し、シンチレーションカウンターを通してホモジネートを通過させることにより、各バッチの細胞に関連するプロテアーゼ抵抗性、分当たりの放射能計数（ｃｐｍ）の量を測定する。放射標識された細胞阻害剤の既知の比活性に基づいて、１細胞あたりの内部移行した細胞阻害分子の数を、グラウンドアップ細胞のシンチレーションカウントから推定することができる。細胞は、好ましくは培養皿またはフラスコ中の細胞培養培地に細胞を添加し、抗体を培地と十分に混合することなどにより、溶液形態でｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞阻害剤と「接触」させて、細胞の細胞阻害剤への均一な曝露を確実にする。培養培地に添加する代わりに、細胞を、試験管中のＰＢＳなどの等張溶液中で所望の期間にわたって試験細胞阻害剤と接触させることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、患者に投与する場合には後述する投与方法のような被験細胞阻害剤を投与する任意の適切な方法により、細胞を細胞阻害剤と接触させる。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明の細胞阻害剤は、限定されるものではないが、抗体およびその断片、ＡＤＣ、低分子薬物結合体（ＳＭＤＣ）、免疫毒素、ペプチドおよび非ペプチド結合体、イメージング剤、治療用ワクチン、ナノ粒子であってもよい。特定の実施において、細胞阻害剤は、抗体およびその断片である。
【０１１７】
本明細書で使用される用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」は、既知の抗原、特に免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する結合部位を含む分子（すなわち、ＣＤ７またはＣＤ３３）に結合する分子または分子の活性断片を指す。本発明による免疫グロブリンは、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４におけるＩｇＧ、またはＩｇＡ１およびＩｇＡ２におけるＩｇＡ）であり得る。
【０１１８】
本発明の範囲内で、用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖、二重特異性、ヒトおよびヒト化抗体、ならびにその活性断片を含む。既知の抗原に結合する分子の活性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖ断片が挙げられ、これらには、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産物ならびに上記の抗体および断片のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。
【０１１９】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、単一のクローニングから実験室で大量に生産され、１つの抗原のみを認識する抗体を指す。モノクローナル抗体は、典型的には、通常は短寿命の抗体産生Ｂ細胞を、癌細胞（ときに「不死」細胞と呼ばれる）のような速く成長する細胞に融合することによって作られる。得られたハイブリッド細胞、またはハイブリドーマは、急速に増殖し、大量の抗体を産生するクローンを作り出す。本発明の目的のために、「モノクローナル抗体」は、また、未だ完全なモノクローナル性に達していない母クローンによって産生される抗体を含むことも理解されるべきである。
【０１２０】
本明細書中で使用される用語「キメラ抗体」は、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域と、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含むモノクローナル抗体を指す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体は、例示的な実施形態である。このようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよびヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現免疫グロブリン遺伝子の産物である。本開示によって包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラスまたはサブクラスが元の抗体のものから改変または変更されたものである。このような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体を産生するための方法は、現在当技術分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１（１９８４）６８５１−６８５５；米国特許第５，２０２，２３８号および米国特許第５，２０４，２４４号を参照のこと。
【０１２１】
本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」または「抗体のヒト化版」とは、親免疫グロブリンのものと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むようにフレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変された抗体を指す。いくつかの例示的な実施形態では、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８）３２３−３２７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（１９８５）２６８−２７０を参照のこと。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同一の、または異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であり得る。ヒト重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）−Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｐ  Ａ．１Ｐ．１−Ａ．１Ｐ．３７に列挙され、例えば、ＩＭＧＴ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）またはｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋを介してアクセス可能である。任意に、フレームワーク領域は、さらなる突然変異によって修飾され得る。例示的ＣＤＲは、キメラ抗体について上述した抗原を認識する配列を表すものに対応する。いくつかの実施形態において、このようなヒト化版は、ヒト定常領域でキメラ化される。本明細書中で使用される用語「ヒト化抗体」はまた、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチング」、すなわちＦｃ部分の変化または突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、開示に従って特性を生成するために定常領域において修飾されるこのような抗体を含む。
【０１２２】
本明細書中で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。ヒト抗体は、最新技術で周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．およびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８−３７４）。ヒト抗体はまた、免疫化に際して、内因性免疫グロブリン産生がなくても完全なレパートリーまたはヒト抗体の選択を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）において産生することができる。このような生殖系突然変異マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの伝達は、抗原負荷時のヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（１９９３）２５５−２５８；Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３−４０を参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１−３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１−５９７）。Ｃｏｌｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．の技術は、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である（Ｃｏｌｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｓｓ，Ａ．Ｒ．（１９８５）ｐ．７７；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６−９５）。既に言及したように、本開示によれば、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」はまた、例えば「クラススイッチング」、すなわちＦｃ部分の変化または突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、例えばＣ１ｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関して、開示に従って特性を生成するために定常領域において修飾されるこのような抗体を含む。
【０１２３】
本明細書中で使用される「一本鎖抗体」は、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を指し、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインが結合して抗原結合部位（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３）または二重特異性一本鎖Ｆｖ（国際公開第０３／１１１６１号）を形成できるようにするペプチドリンカーによって連結される。
【０１２４】
本明細書で使用される用語「抗体断片」は、完全長抗体の一部を指し、用語「抗原結合断片」は、その可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位、例えばＣＤＲを指す。抗体断片の例としては、二重特異性抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−８８に記載されている。抗体断片は、多くの当技術分野で既知の技術によって、本発明の抗体から誘導することができる。例えば、精製されたモノクローナル抗体は、ペプシンのような酵素で切断し、ＨＰＬＣゲルろ過に供することができる。次いで、Ｆａｂ断片を含む適当な画分を、膜ろ過等により収集し、濃縮することができる。抗体の活性断片の単離のための一般的な技術のさらなる説明については、例えば、Ｋｈａｗ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２３：１０１１−１０１９（１９８２）；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：６６３−６９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６を参照のこと。
【０１２５】
本明細書で使用される用語「二重特異性抗体」は、２つ（以上）の異なる抗原に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原に特異的に結合することが可能である。特定の局面において、本発明の二重特異性抗体は、ヒト抗体である。本明細書で使用される表現「二重特異性抗原結合分子」は、少なくとも第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を意味する。二重特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、または１以上の追加のＣＤＲと組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明との関連では、第１の抗原結合ドメインは第１の抗原（例えば、ＣＤ７）と特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは第２の別個の抗原（例えば、ＣＤ３３）と特異的に結合する。ある局面において、二重特異性分子は、ヒトＣＤ７およびヒトＣＤ３３に同時に結合することができる。
【０１２６】
特定の実施形態では、ＣＤ７およびＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤は、二重特異性抗体であり、そのような抗体は、「抗ＣＤ７×ＣＤ３３」または「抗ＣＤ７／抗ＣＤ３３」などと称され得る。
【０１２７】
任意の二重特異性抗体フォーマットまたは技術を用いて、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製することができる。本発明の文脈において使用することができる具体的な例示的な二重特異性フォーマットには、限定するものではないが、例えば、ｓｃＦｖベースまたは二重特異性抗体二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−ｌｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブ−イン−ホール、共通軽鎖（例えば、ノブ−イン−ホール等を有する共通軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）体、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ｌｇＧ１／ｌｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ｌｇＧ、Ｍａｂ２二重特異性フォーマット（例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，ｉｍＡｂｓ  ４：６，１−１  １、および前述のフォーマットのレビューのためにそこで引用される引用文献を参照）、およびＦａｂベース二重特異性フォーマットが含まれる。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、Ｆａｂベースの抗ＣＤ７×ＣＤ３３二重特異性である。
【０１２８】
本明細書中で使用される用語「特異性の」および「特異的に」は、ＣＤ７またはＣＤ３３以外の生体分子（または生体分子が二重特異性分子である場合はＣＤ７およびＣＤ３３の両方）が抗体に有意に結合しないことを示すために交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、ＣＤ７またはＣＤ３３以外の生体分子への結合のレベルは、ＥＬＩＳＡまたは親和性決定によって無視できる（例えば、決定可能ではない）。
【０１２９】
「無視できる結合」によって、ＣＤ７またはＣＤ３３への結合よりも少なくとも約８５％、特に少なくとも約９０％、より特に少なくとも約９５％、さらに特に少なくとも約９８％、しかし特に少なくとも約９９％および最大１００％少ない結合を意味する。
【０１３０】
ペプチドまたはエピトープに対する抗体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）のような標準的な結合アッセイで測定することができる。本明細書中で使用される用語「表面プラズモン共鳴」は、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によるリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる記述については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照のこと。
【０１３１】
１つの実施形態において、本発明の細胞阻害剤は、抗体依存性細胞毒性を媒介することができる。好適には、このような実施形態では、細胞阻害剤は、抗体、例えば完全にヒト、ヒト化された抗体もしくはキメラ抗体、または二重特異性抗体である。抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、モノクローナル抗体の抗腫瘍活性に寄与し得る免疫エフェクター細胞媒介機構である（Ｗｅｉｎｅｒ  ＧＪ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２００７，３９（ｌ−３）：２７１−８）。抗腫瘍効果に対するＡＤＣＣの関連性は、前臨床モデル、例えばマウス腫瘍モデルで実証されている（ｅ．ｇ．Ｃｌｙｎｅｓ  ＲＡ，Ｔｏｗｅｒｓ  ＴＬ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０００  Ａｐｒ；６（４）：４４３−６）。臨床試験からのデータは、治療抗体の臨床的有効性に対するＡＤＣＣの関連性を支持している（例えば、Ｗｅｎｇ  ＷＫ，Ｌｅｖｙ  Ｒ  Ｔｗｏ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００３  Ｎｏｖ  ｌ；２１（２１）：３９４０−７．Ｅｐｕｂ、２００３年９月１５日）。モノクローナル抗体の免疫細胞上のＦｃ受容体との相互作用が、ＡＤＣＣに寄与する。抗体のＦｃは、Ｆｃ受容体に対する増強された親和性を示すように修飾することができる（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｍｉｎｉｍｉｚｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００６年８月７日；５８（５−６）：６４０−５６．Ｅｐｕｂ、２００６年５月２３日）。Ｆｃ受容体へのこのような増強された親和性は、ＡＤＣＣ活性の増大をもたらし、患者における抗腫瘍効果の増大につながる可能性がある。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明の細胞阻害剤は、キメラ抗原Ｔ細胞受容体タンパク質（ＣＡＲ）を発現する免疫応答性細胞であり、キメラＴ細胞受容体タンパク質は、ＣＤ７またはＣＤ３３に特異的に結合する。１つの実施形態では、免疫応答性細胞は二重特異性であり、キメラ抗原Ｔ細胞受容体タンパク質（ＣＡＲ）は、キメラＴ細胞受容体タンパク質がＣＤ７およびキメラ抗原Ｔ細胞受容体タンパク質（ＣＡＲ）に特異的に結合し、キメラＴ細胞受容体タンパク質はＣＤ３３に特異的に結合する。ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞および単球系列の細胞からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、免疫応答性細胞はＴ細胞である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、免疫応答性細胞は、対象に対して自己である。別の実施形態では、免疫応答性細胞は、対象に対して自己ではない。特定の実施形態では、免疫応答性細胞はＴ細胞であり、処置される対象に対して自己である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、細胞阻害剤（例えば、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤および／もしくはＣＤ７に特異的に結合する細胞阻害剤、またはＣＤ７およびＣＤ３３に特異的に結合する細胞阻害剤）は、結合部分（すなわち、ＣＤ３３結合部分、ＣＤ７結合部分、またはＣＤ７およびＣＤ３３結合部分）ならびに細胞死滅部分を含む。特定の実施形態において、細胞結合部分は、抗体またはその抗原結合断片、アプタマー、ペプチドまたは非ペプチド小分子である。特定の実施形態において、細胞結合部分は、抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態では、細胞阻害剤は、結合部分および細胞死滅部分を含み、結合部分は、抗ＣＤ７抗体またはその結合部分である。一実施形態では、細胞阻害剤は、結合部分および細胞死滅部分を含み、結合部分は、抗ＣＤ３３抗体またはその結合部分である。一実施形態では、細胞阻害剤は、結合部分および細胞死滅部分を含み、結合部分は、抗ＣＤ７抗ＣＤ３３二重特異性抗体またはその結合部分である。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、細胞阻害剤は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、腫瘍細胞を死滅させ、または阻害する化合物を含む。このような剤は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、プロテアソームおよび／またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、その細胞毒性および細胞増殖抑制作用を付与し得る。
【０１３６】
細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、例えば、ペプチド毒素、低分子毒素または放射性同位体であり得る。
【０１３７】
１つの実施形態において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、チューブリン阻害剤；またはＤＮＡ相互作用剤であってもよい。チューブリン阻害剤は、チューブリン重合を調節する。ＤＮＡ相互作用剤は、細胞ＤＮＡを標的とする。
【０１３８】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、チューブリン阻害剤である。一実施形態では、チューブリン阻害剤は、（ａ）アウリスタチン；および（ｂ）メイタンシン誘導体からなる群から選択される。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、アウリスタチンである。アウリスタチンには、天然に存在する化合物ドラスタチン−１０の合成誘導体が含まれる。アウリスタチンは、抗腫瘍性／細胞増殖抑制性偽ペプチドのファミリーである。ドラスタチンは、天然の生合成産物中に同定された４つの異常なアミノ酸（Ｄｏｌａｖａｉｎｅ、Ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｉｎｅ、ＤｏｌａｐｒｏｉｎｅおよびＤｏｌａｐｈｅｎｉｎｅ）の組み込みのために、構造的に独特である。さらに、このクラスの天然産物は、Ｐｅｔｔｉｔら（米国特許第４，９７８，７４４号）による全合成研究によって定義される多数の非対称中心を有する。構造活性の関係から、ＤｏｌａｉｓｏｌｅｕｉｎｅおよびＤｏｌａｐｒｏｉｎｅ残基は抗腫瘍活性に必要であると思われる（米国特許第５，６３５，４８３号および米国特許第５，７８０，５８８号）。一実施形態では、アウリスタチンは、以下からなる群から選択される：アウリスタチンＥ（ＡＥ）；モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）；アウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）；ｖｃＭＭＡＥ；およびｖｃＭＭＡＦ。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、メイタンシンまたはメイタンシンの構造類似体である。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、メイタンシンである。メイタンシンには、構造的に複雑な抗有糸分裂ポリペプチドが含まれる。メイタンシンは、腫瘍細胞のアポトーシスに導く微小管集合の強力な阻害剤である。一実施形態において、メイタンシンは、Ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ（ＤＭ１）；およびＤＭ３またはＤＭ４のようなメイタンシンの構造類似体からなる群から選択される。好ましくは、薬物はｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ（ＤＭ１）である。
【０１３９】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、ＤＮＡ相互作用剤である。一実施形態では、ＤＮＡ相互作用剤は、（ａ）カリケアマイシン、（ｂ）デュオカルマイシンおよび（ｃ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、カリケアマイシンである。カリケアマイシンは、二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こし、細胞死をもたらす強力な細胞傷害剤である。カリケアマイシンは、天然に存在するエンジイン系抗生物質である（Ａ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，３９，１１，２１０３−２１１７）。カリケアマイシンは、土壌微生物Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ中に見出された。一実施形態では、カリケアマイシンは、カリケアマイシンガンマ１である。一実施形態では、薬物は、デュオカルマイシンである。デュオカルマイシンは強力な抗腫瘍性抗生物質であり、ＤＮＡ二本鎖の副溝に配列選択的に結合し、アデニンのＮ３をアルキル化することにより、その生物学的効果を発揮する（Ｄ．Ｂｏｇｅｒ，Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，６６，４，８３７−８４４）。一実施形態では、デュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ；デュオカルマイシンＢ１；デュオカルマイシンＢ２；デュオカルマイシンＣ１；デュオカルマイシンＣ２；デュオカルマイシンＤ；デュオカルマイシンＳＡ；シクロプロピルベンゾインドール（ＣＢＩ）デュオカルマイシン；センタナマイシン；ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）；アドゼレシン；ビゼレシン；およびカルゼレシンからなる群から選択される。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）は、天然に存在する抗腫瘍性抗生物質のクラスである。ピロロベンゾジアゼピン類はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにみられる。ＰＢＤは、プリン−グアニン−プリン単位で特異的に副溝のＤＮＡに共有結合することにより、その抗腫瘍活性を発揮する。それらは、アミナール結合を介してグアミンのＮ２に挿入され、それらの形状のために、それらは、ＤＮＡらせんに最小限の破壊を引き起こす。ＤＮＡ−ＰＢＤ付加体の形成は核酸合成を阻害し、ＤＮＡらせんに切除依存性の一本鎖および二本鎖切断を引き起こすと考えられている。合成誘導体として、２つのＰＢＤ単位がフレキシブルなポリメチレンテザーを介して一緒に結合することにより、ＰＢＤ二量体は、きわめて致死的な病変を生じる対向するＤＮＡ鎖を架橋することができる。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、フレキシブルな性ポリメチレンテザーを介して結合した２つのピロロベンゾジアゼピン単位の合成誘導体である。一実施形態では、ピロロベンゾジアゼピンは、アントラマイシン（およびその二量体）；マゼラマイシン（およびその二量体）；トマイマイシン（およびその二量体）；プロトラカルシン（およびその二量体）；チカマイシン（およびその二量体）；ネオスラマイシンＡ（およびその二量体）；ネオスラマイシンＢ（およびその二量体）；ＤＣ−８１（およびその二量体）；シビロマイシン（およびその二量体）；ポロスラマイシンＡ（およびその���量体）；ポロスラマイシンＢ（およびその二量体）；シバノマイシン（およびその二量体）；アブベイマイシン（およびその二量体）；ＳＧ２０００；およびＳＧ２２８５からなる群から選択される。
【０１４０】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、アルキル化を介してＤＮＡ鎖間架橋を標的とする薬物である。アルキル化を介してＤＮＡ鎖間架橋を標的とする薬物は、ＤＮＡ標的マスタード；グアニン特異性アルキル化剤；およびアデニン特異性アルキル化剤から選択される。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、ＤＮＡ標的マスタードである。例えば、ＤＮＡ標的マスタードは、オリゴピロール；オリゴイミダゾール；ビス−（ベンズイミダゾール）担体；ポリベンズアミド担体；および９−アニリノアクリジン−４−カルボキサミド担体からなる群から選択され得る。
【０１４１】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、ネトロプシン；ディスタマイシン；レキシトロプシン；タリムスチン；ジブロモタリムスチン；ＰＮＵ１５７９７７；およびＭＥＮ  １０７１０からなる群から選択される。
【０１４２】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、ビス−（ベンズイミダゾール）担体である。好適には、薬物は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８である。
【０１４３】
グアニン特異性アルキル化剤は、特定のヌクレオシド位置で反応する高度に位置特異性のアルキル化剤である。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、Ｇ−Ｎ２アルキル化剤；Ａ−Ｎ３アルキル化剤；マイトマイシン；カルメチゾール類似体；エクテインアシジン類似体からなる群から選択されるグアニン特異性アルキル化剤である。一実施形態では、マイトマイシンは：マイトマイシンＡ；マイトマイシンＣ；ポルフィロマイシン；およびＫＷ−２１４９から選択される。一実施形態では、カルメチゾール類似体は、ビス−（ヒドロキシメチル）ピロリジジン；およびＮＳＣ  ６０２６６８から選択される。一実施形態では、エクテイナシジン類似体は、エクテイナシジン７４３である。
【０１４４】
アデニン特異性アルキル化剤は、ポリピリミジン配列中のアデニンのＮ３で反応する位置特異性かつ配列特異性の副溝アルキル化剤である。
【０１４５】
シクロプロパインドロンおよびデュオカマイシンは、アデニン特異性アルキル化剤として定義され得る。一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、シクロプロパインドロン類似体である。好適には、薬物は、以下から選択される：アドゼレシン；およびカルゼレシン。
【０１４６】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、ベンズ［ｅ］インドロンである。好適には、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、以下から選択される：ＣＢＩ−ＴＭＩ；およびイソ−ＣＢＩ。
【０１４７】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、ビゼレシンである。
【０１４８】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、海洋性抗腫瘍薬である。海洋性抗腫瘍薬は、抗腫瘍薬開発の領域において発展途上の分野であった（Ｉ．Ｂｈａｔｎａｇａｒｅｔ  ａｌ，Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ  ２０１０，８，Ｐ２７０２−２７２０およびＴ．Ｌ．Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００５，４（２），Ｐ３３３−３４２）。海綿、海綿と微生物の共生関係、ゴルゴニアン、放線菌、および軟サンゴを含む海洋生物は、潜在的な抗癌剤について広く探索されてきた。
【０１４９】
一実施形態では、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、シタラビン、Ａｒａ−Ｃ；トラベクテジン（ＥＴ−７４３）；およびエリブリンメシラートから選択される。一実施形態では、エリブリンメシラートは、（Ｅ７３８９）；ソブリドチン（ＴＺＴ  １０２７）；乳酸スクアラミン；セマドチンプリナブリン（ＮＰＩ−２３５８）；プリチデプシン；エリシデプシン；Ｚａｌｙｐｓｉｓ；タシドチン、シンタドチン；（ＩＬＸ−６５１）；ディスコデルモリド；ＨＴ１２８６；ＬＡＦ３８９；カハラリドＦ；ＫＲＮ７０００；ブリオスタチン１；ヘミアステリン（Ｅ７９７４）；マリゾミブ；サリノスポラミドＡ；ＮＰＩ−００５２）；ＬＹ３５５７０３；ＣＲＹＰＴＯ  ５２；デプシペプチド（ＮＳＣ６３０１７６）；エクテイナサイジン７４３；シンタドチン；カハラリドＦ；スクアラミン；デヒドロジデムニンＢ；ジデムニンＢ；セマドチン；ソブリドチン；Ｅ７３８９；ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４；ディスコデルモリド；ＨＴＩ−２８６；ＬＡＦ−３８９；ＫＲＮ−７０００（アゲラスフィン誘導体）；キュラシンＡ；ＤＭＭＣ；サリノスポラミドＡ；ラウリマリド；ビチレブアミド；ジアゾナミド；エロイテロビン；サルコジクチン；ペロルシドＡ；サリチルハリミドＡおよびＢ；チオコラリン；アシジデミン；バリオリン；ラメラリンＤ；ジクチオデンドリン；ＥＳ−２８５（スピスロシン）；およびハリコンドリンＢから選択される。
【０１５０】
以下の細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤もまた、本発明に含まれる：アマニタ属の担子菌類、例えば、Ｇｒｅｅｎ  Ｄｅａｔｈｃａｐ  ｍａｓｈｒｏｏｍ；Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎｓ；Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎｓ；ｄｏｌｙｓｌａｂｅｌａｎｉｎｓ；Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ。Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓによって産生されるアマトキシン（α−アマニチン）二環式オクタペプチドは、非タキサンチューブリン重合剤のクラスを構成し、粘液細菌Ｓｏｒａｎｇｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍの天然発酵によって得られる。これらの部分は、微小管の安定化に関連し、Ｇ２／Ｍ転移で有糸分裂停止をもたらす強力な細胞毒性活性を有する。エポチロンは、癌細胞株のパネルを通して強力な細胞毒性を示し、しばしばパクリタキセルよりも強力な効力を示している（Ｘ．：Ｐｉｖｏｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００８；４（２），Ｐ４２−４５）。一実施形態では、薬物はアマトキシンである。一実施形態では、薬物はチューブリシンである。一実施形態では、薬物はサイトリシンである。一実施形態では、薬物はドラベラニンである。一実施形態では、薬物はエポチロンである。
【０１５１】
以下の細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤も本発明に包含される。一実施形態では、薬物は、ドキソルビシン；エピルビシン；エソルビシン；デトルビシン；モルホリノ−ドキソルビシン；メトトレキサート；メソプテリン；ブレオマイシン；ジクロロメトトレキサート；５−フルオロウラシル；シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド；タキソール；アンギジン；メルファラン；ビンブラスチン；フォモプシンＡ；リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）；ダウノルビシン；ビンカアルカロイド；イダルビシン；メルファラン；シスプラチン；リシン；サポリン；アントラサイクリン；インドリノ−ベンゾジアゼピン；６−メルカプトプリン；アクチノマイシン；ロイシン；ロイロシデイン；カルミノマイシン；アミノプテリン；タリソマイシン；ポドフィロトキシン；エトポシド；ヘアピンポリアミド；エトポシドリン酸塩；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；タキソテールレチノイン酸；Ｎ８−アセチルスペルミジン；カンプトテシン；エスペラマイシン；およびエンジインから選択される。
【０１５２】
一実施形態では、細胞阻害剤は、結合部分および細胞死滅部分を含み、結合部分は、抗ＣＤ７抗体またはその結合部分であり、細胞死滅部分は、ペプチド毒素、例えば、ＭＭＡＥなどのアウリスタチンである。一実施形態では、細胞阻害剤は、結合部分および細胞死滅部分を含み、結合部分は、抗ＣＤ３３抗体またはその結合部分であり、細胞死滅部分は、ペプチド毒素、例えば、ＭＭＡＥなどのアウリスタチンである。一実施形態では、細胞阻害剤は、結合部分および細胞死滅部分を含み、結合部分は、抗ＣＤ７抗ＣＤ３３二重特異性抗体またはその結合部分であり、細胞死滅部分は、ペプチド毒素、例えば、ＭＭＡＥなどのアウリスタチンである。
【０１５３】
特定の実施形態では、細胞阻害剤は、細胞死滅部分に結合される結合部分を含む。このような結合体は、通常の当業者に公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によって調製することができる。細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤をタンパク質、特に抗体に結合させる技術は、周知である。（例えば、Ａｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０  １４：１−９；Ｓｅｎｔｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．，２００８，１４（３）：１５４−１６９を参照のこと。）
【０１５４】
特定の実施形態では、連結基を用いて、結合部分および細胞死滅部分を結合する。
【０１５５】
リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり得、その結果、リンカーを切断すると、細胞内環境における結合部分から細胞死滅部分が放出される。切断可能なリンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。切断剤には、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが含まれ得る（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３，１９９９参照）。最も典型的なのは、ＮＴＢ−Ａ発現細胞中に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーである。例えば、癌組織で高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能なペプチジルリンカーを、使用することができる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＶａｌ−Ｃｉｔペプチドを含むリンカー）。
【０１５６】
切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値での加水分解に対して感受性であり得る。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を、用いることができる。
【０１５７】
他のリンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。切断可能なリンカーはまた、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３，１９９５）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３：１２９９−１３０４，１９９５）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３：１３０５−１２，１９９５）であり得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、リンカーは、プロテアーゼ切断可能なリンカー、例えばバリン−シトルリンであり得、リソソーム中のカテプシンＢによって切断され得る。
【０１５９】
また、リンカーは、非切断性リンカー、例えば、治療剤に直接結合し、結合部分のタンパク質分解的分解によって放出されるマレイミド−アルキレンまたはマレイミド−アリールリンカーであってもよい。
【０１６０】
特定の実施形態において、細胞阻害剤は、結合部分と細胞死滅部分とを含み、それは、別々に投与され、かつｉｎ  ｖｉｖｏで結合して細胞阻害剤を一括して形成する。例えば、細胞結合部分をまず投与し、細胞阻害剤を、細胞結合部分にｉｎ  ｖｉｖｏで結合するのと同時に、または好ましくはその後に投与する。細胞結合部分および細胞阻害剤を相互親和性を伴って提供するのに適した特異的結合対は、当技術分野で周知である（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンを有するビオチン、抗原を有する抗体結合ドメイン）。
【０１６１】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語ならびにそれらの変化形は、「限定されるものではないが含む」を意味し、それらは他の部分、添加剤、成分、整数またはステップを除外することを意図しない（および除外しない）。本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈が他のことを要求していない限り複数形を含む。特に、不定冠詞が使用される場合は、本明細書は、文脈が他のことを要求していない限り単数形および複数形を意図していると理解されたい。
【０１６２】
本発明の特定の態様、実施形態または例と結び付けて記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分または群は、矛盾していない限り、本明細書に記載した任意の他の態様、実施形態または例に適用できると理解されたい。本明細書に開示された全ての特徴（添付した特許請求の範囲、要約書および図面をすべて含む）、ならびに／または開示された任意の方法もしくはプロセスの全てのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除き、任意の組合せで組合せてもよい。本発明は、前述の如何なる実施形態の詳細にも限定されない。本発明は、本明細書（添付した特許請求の範囲、要約書および図面をすべて含む）に開示された特徴のあらゆる新規なもの、もしくはあらゆる新規な組み合わせ、または、そのように開示したあらゆる方法もしくはプロセスのステップのあらゆる新規なもの、もしくはあらゆる新規な組み合わせに及ぶ。
【０１６３】
読者の注意は、本出願に関連して本明細書と同時に、またはそれ以前に提出され、かつ本明細書で公衆の査察を受けることができる全ての論文および文書に向けられており、そのような全ての論文および文書の内容は、参考として本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１６４】
実施例１：Ｋａｓｕｍｉ−３細胞株における５種類のモノクローナル抗体（単独および併用）のＩＣ５０の測定
実験条件
【表１】
2021504469.tif 000003
試験する試料の数
５抗体または組合せ＊８濃度＊１細胞株＊３（３つ１組）＝１２０
陰性対照（ＭＭＡＥに結合した抗Ｆｃ）＊１濃度＊１細胞株＊３（３つ１組）＝３
３陽性対照（一次抗体）＊１濃度＊１細胞株＊３（３つ１組）＝９
対照（免疫処置を行わなかった細胞）＊１細胞群＊３（３つ１組）＝３
合計＝１３５検定
【０１６５】
２．材料：
ｉ．Ｋａｓｕｍｉ−３：ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２７２５（商標）
ｉｉ．ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＡＴＣＣ（登録商標）３０−２００１（商標）
ｉｉｉ．ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：ＡＴＣＣ（登録商標）３０−２０２０（商標）
ｉｖ．ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）：Ｇｉｂｃｏ（商標）
ｖ．モノクローナル抗体：ｏ抗ＣＤ３３抗体ｏ  抗ＣＤ７抗体ｏ  抗ＣＤ１３抗体
ｖｉ．二次抗体
−  切断可能なリンカーを有する抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＭＭＡＥ抗体（αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ）：Ｍｏｒａｄｅｃ
ｖｉｉ．非付着性培養フラスコ
ｖｉｉｉ．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネセント細胞生存率アッセイ：Ｐｒｏｍｅｇａ
ｉｘ．９６ウェルプレート（組織グレード白色）
【０１６６】
３．方法：
３．１  細胞培養
Ｋａｓｕｍｉ−３細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で完全成長培地（２０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）と共に懸濁液中に維持した。細胞密度は、３×１０５〜３×１０６細胞／ｍｌの間で維持され、培地は、２〜３日の間隔で変更した。
【０１６７】
３．２  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネセント細胞生存率アッセイを用いた細胞毒性検出
ｉ  新たに分裂したＫａｓｕｍｉ−３細胞を、１００μｌ培養培地中のウェル当たり２０，０００細胞の密度で培養培地中の９６ウェル白色プレートに播種した。
ｉｉ．一次モノクローナル抗体（ＣＤ３３、ＣＤ７およびＣＤ１３）を培養培地で希釈し、プレートに加えて所望の濃度範囲（０．０００１〜１０００ｎＭ）を得た。
ｉｉｉ．次いで、細胞を、一次抗体の存在下で５〜１０分間インキュベートした。
ｉｖ．一方、二次抗体（αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ）は、培養培地で希釈した。一次抗体と共にインキュベートした後、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥをウェルに加えて、ウェル当たり１３．２ｎＭを得た。
ｖ．ブランク、対照、陰性対照および陽性対照などの条件も、各アッセイプレートに含めた。抗ＣＤ３３、抗ＣＤ７、抗ＣＤ１３、抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７、抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７併用および抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ１３併用によるＫａｓｕｍｉ−３のプレートレイアウトについては、それぞれ表１〜５を参照する。
・ブランク＝培養培地のみ
・対照＝処理していない細胞
・陰性対照＝１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥで処理した細胞
・陽性対照＝０．１ｎＭの一次抗体で処理した細胞。
ｖｉ．プレートを７２時間インキュベートした。
ｖｉｉ．７２時間のインキュベーション後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加した。
ｖｉｉｉ．内容物を軌道シェーカー上で２分間混合して、細胞溶解を誘導し、室温で１０分間インキュベートした。
ｉｘ．発光強度は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ機器を用いて測定した。
【０１６８】
３．３  データ解析
ブランクの平均読み取り値は、他のすべての読み取り値から差し引いた。ブランクは培養培地のみを含み、アッセイプレートの背景として表された。その後、データを統計的に分析し（一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０２ソフトウェアを用いてプロットした。ルミネセンス強度はｙ軸上の相対的ルミネセンス単位（ＲＬＵ）として表され、種々の条件および一次抗体濃度は、ｘ軸上に表された。
【０１６９】
対照（処理していない）を１００％生存とし、細胞の生存率（％生存率）を算出した。他の細胞の生存率は、対照に正常化した。データは、非線形回帰曲線を用いてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０２ソフトウェアでプロットした。ＩＣ５０は、二次抗体薬物結合体（αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ）の存在下で５０％の細胞毒性作用を誘導する関連する一次抗体の濃度と定義される。これは、非線形回帰曲線フィッティングにより分析した％生存率曲線を用いて算出した。
【０１７０】
４．結果
４．１  Ｋａｓｕｍｉ−３細胞に対する抗ＣＤ３３抗体の細胞毒性プロファイル
−  抗ＣＤ３３処理のためのルミネセンス強度についての未加工のデータおよびブランク減算後のデータを、それぞれ表６および７に示す。表７のグラフ表示を、図１に示す。図１は、１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で、０．０１ｎＭを超える抗ＣＤ３３抗体の濃度で、一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定（＊ｐ＜０．０２；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００３、＜０．０００１；±ＳＥＭ）を用いて分析した場合に、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞生存率の統計的に有意な低下が観察されたことを示す。定量は、平均値（±標準誤差平均値［ＳＥＭ］）で表す。
【０１７１】
−  一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定を、表７のデータに実施した。αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下で、０．０１、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ３３抗体で、未処理細胞と比較して、Ｋａｓｕｍｉ−３生存率の統計的に有意な低下が観察された（＊ｐ＜０．０２；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【０１７２】
−  ％生存率のデータを表８に示し、図２にグラフで示した。図２は、抗ＣＤ３３およびαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理についての非線形回帰曲線を示す。ＩＣ５０＝１６３．６ｎＭが観測された。
【０１７３】
−  非線形回帰曲線から１６３．６ｎＭのＩＣ５０を得た。
【０１７４】
４．２  Ｋａｓｕｍｉ−３細胞に対する抗ＣＤ７抗体の細胞毒性プロファイル
−  抗ＣＤ７処置のためのルミネセンス強度についての未加工のデータおよびブランク減算後のデータを、それぞれ表９および１０に示す。表１２のグラフ表示を、図３に示す。図３は、１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ７抗体で、一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定（＊＊＊ｐ＜０．０００６；±ＳＥＭ）を用いて分析した場合に、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞生存率の統計的に有意な低下が観察されたことを示す。定量は、平均値（±標準誤差平均値［ＳＥＭ］）で表す。
【０１７５】
−  一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定を、表１０のデータに実施した。未処理細胞と比較した場合、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下で、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ７抗体により、Ｋａｓｕｍｉ−３生存率の統計的に有意な低下が観察された（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０１７６】
−  ％生存率のデータを表１１に示し、図４にグラフで示した。
【０１７７】
−  非線形回帰曲線から１５８．２ｎＭのＩＣ５０を得た。
【０１７８】
４．３  Ｋａｓｕｍｉ−３細胞に対する抗ＣＤ１３抗体の細胞毒性プロファイル
−  抗ＣＤ１３処理のためのルミネセンス強度についての未加工のデータおよびブランク減算後のデータを、それぞれ表１２および１３に示す。表１３のグラフ表示を図５に示す。図５は、１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で、すべての濃度の抗ＣＤ１３抗体で、一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定（＊＊＊ｐ＜０．０００６；±ＳＥＭ）を用いて分析した場合に、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞生存率の統計的に有意な低下が観察されたことを示す。定量は、平均値（±標準誤差平均値［ＳＥＭ］）で表す。
【０１７９】
−  表１３のデータについて、一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定を実施した。αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下で、全ての濃度（０．０００１〜１０００ｎＭ）の抗ＣＤ１３抗体で、未処理細胞と比較して、Ｋａｓｕｍｉ−３生存率の統計的に有意な低下が観察された（＊＊＊ｐ＜０．０００６）。
【０１８０】
−  ％生存率のデータを表１４に示し、図６にグラフで示した。図６は、抗ＣＤ１３処理についての非線形回帰曲線を示す。ＩＣ５０＝１．３５６ｎＭが認められた。
【０１８１】
−  非線形回帰曲線から１．３５６ｎＭのＩＣ５０を得た。
【０１８２】
４．４  Ｋａｓｕｍｉ−３細胞に対する抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７抗体の細胞毒性プロファイル
−  抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７併用処理のためのルミネセンス強度についての未加工のデータおよびブランク減算後のデータを、それぞれ表１５および１６に示す。図７に表１６のグラフ表示を示す。図７は、１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で、１、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７組み合わせにより、一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定（＊＊＊ｐ＜０．０００７；±ＳＥＭ）を用いて分析した場合に、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞生存率の統計的に有意な低下が観察されたことを示す。定量は、平均値（±標準誤差平均値［ＳＥＭ］）で表す。
【０１８３】
−  図２２のデータについて、一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定を実施した。αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下での抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７併用の１ｎＭより高い濃度では、未処理細胞と比較してＫａｓｕｍｉ−３生存率の統計的に有意な低下が観察された（＊＊＊ｐ＜０．０００７）。
【０１８４】
−  ％生存率のデータを表１７に示し、図８にグラフで示した。図８は、抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ７処理についての非線形回帰曲線を示す。ＩＣ５０＝８．１９６ｎｍが観察された。
【０１８５】
−  非線形回帰曲線から８．１９６ｎＭのＩＣ５０を得た。
【０１８６】
４．５  Ｋａｓｕｍｉ−３細胞に対する抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ１３抗体の細胞毒性プロファイル
−  抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ１３処置のためのルミネセンス強度についての未加工のデータおよびブランク減算後のデータを、それぞれ表１８および１９に示す。表１９のグラフ表示を、図９に示す。図９は、１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で、一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定（＊＊＊ｐ＜０．０００１；±ＳＥＭ）を用いて分析した場合、すべての濃度の抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ１３組み合わせによりＫａｓｕｍｉ−３細胞生存率の統計的に有意な低下が観察されたことを示す。定量は、平均値（±標準誤差平均値［ＳＥＭ］）で表す。
【０１８７】
−  一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定を、表１９のデータについて実施した。未処理細胞と比較した場合、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下で、抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ１３組み合わせの全ての濃度で、Ｋａｓｕｍｉ−３生存率の統計的に有意な低下が観察された（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０１８８】
−  ％生存率のデータを表２０に示し、図１０にグラフで示した。図１０は、抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ１３処理についての非線形回帰曲線を示す。ＩＣ５０＝９．３７８ｎＭが観察された。
【０１８９】
−  非線形回帰曲線から９．３７８ｎＭのＩＣ５０を得た。
【０１９０】
５．結論：
−  αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で抗ＣＤ３３抗体で処理した場合のＫａｓｕｍｉ−３細胞は、０．０１、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭ濃度で細胞生存率の統計的に有意な低下を示した（＊＜０．０２；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＜０．００１）。ＩＣ５０＝１６３．６ｎＭを、％生存率曲線から計算した。
【０１９１】
−  αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で抗ＣＤ７抗体で処理した場合のＫａｓｕｍｉ−３細胞は、１０、１００および１０００ｎＭ濃度で細胞生存率の統計的に有意な低下を示した（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＩＣ５０＝１５８．２ｎＭを、％生存率曲線から計算した。
【０１９２】
−  αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下で抗ＣＤ１３抗体で処理した場合、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞は、全ての濃度で統計的に有意な細胞生存率の低下を示した（＊＊＊ｐ＜０．０００６）。ＩＣ５０＝１．３５６ｎＭを、％生存率曲線から計算した。
【０１９３】
−  αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で抗ＣＤ３３抗体と抗ＣＤ７抗体の併用で処理した場合のＫａｓｕｍｉ−３細胞は、１、１０、１００および１０００ｎＭ濃度で細胞生存率の統計的に有意な低下を示した（＊＊＊ｐ＜０．０００７）。ＩＣ５０＝８．１９６ｎＭを、％生存率曲線から計算した。
−  αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で抗ＣＤ３３および抗ＣＤ１３抗体の併用で処理した場合のＫａｓｕｍｉ−３細胞は、すべての濃度で細胞生存率の統計的に有意な低下を示した（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＩＣ５０＝９．３７８ｎＭを％、生存率曲線から計算した。
【０１９４】
これらの結果を、以下の表Ｂに要約する：
【表２】
2021504469.tif 000004
【０１９５】
６．要約：
−  二次抗体−薬物結合体αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ単独で処理した場合のＫａｓｕｍｉ−３細胞（陰性対照）は、最小の毒性を示した。
【０１９６】
−  ０．１ｎＭ濃度での一次抗体（抗ＣＤ７）は、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞に対して毒性を示さなかった。一次抗体の中濃度０．１ｎＭを、陽性対照として試験するために選択した。
【０１９７】
−  しかし、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥのない抗ＣＤ３３および抗ＣＤ１３抗体は、０．１ｎＭ濃度でＫａｓｕｍｉ−３細胞に対して有意な毒性を示した。
【０１９８】
−  抗ＣＤ３３、抗ＣＤ７、抗ＣＤ１３および組み合わせの存在下で、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥでＫａｓｕｍｉ−３細胞を処理した場合、用量依存的な細胞生存率の低下が観察された。このことは、一次抗体が過剰発現した細胞表面マーカーに結合する特異性を示唆している。
【０１９９】
−  Ｋａｓｕｍｉ−３細胞を抗ＣＤ７および抗ＣＤ３３抗体の両方の存在下でαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥで処理した場合、細胞生存率の予想外で相乗的な減少が観察された。
【０２００】
実施例２：二重抗原細胞株ＨＥＬ  ９２．１．７における３種のモノクローナル抗体（単独および併用）のＩＣ５０の測定
実験条件
【表３】
2021504469.tif 000005
【０２０１】
試験する試料の数
−  ３抗体または組合せ＊８濃度＊１細胞株＊３（３つ１組）＝７２
−  陰性対照（ＭＭＡＥに結合した抗Ｆｃ）＊１濃度＊１細胞株＊３（３つ１組）＝３
−  ２陽性対照（一次抗体）＊１濃度＊１細胞株＊３（３つ１組）＝６
−  対照（免疫処理を行わなかった細胞）＊１細胞群＊３（３つ１組）＝３
合計＝８４検定
【０２０２】
２．材料：
ｉ．ＨＥＬ  ９２．１．７：ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１８０
ｉｉ．ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＡＴＣＣ（登録商標）３０−２００１（商標）
ｉｉｉ．ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：ＡＴＣＣ（登録商標）３０−２０２０（商標）
ｉｖ．ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）：Ｇｉｂｃｏ（商標）
ｖ．モノクローナル抗体：
−  抗ＣＤ３３抗体
−  抗ＣＤ５６抗体
ｖｉ．二次抗体
切断可能なリンカー（αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ）を有する抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＭＭＡＥ抗体：Ｍｏｒａｄｅｃ
ｖｉｉ．非付着性培養フラスコ
ｖｉｉｉ．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネセント細胞生存率アッセイ：Ｐｒｏｍｅｇａ
ｉｘ．９６ウェルプレート（組織グレード白色）
【０２０３】
３．方法：
３．１  細胞培養
ＨＥＬ  ９２．１．７細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で完全成長培地（１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ−１６４０）を有する懸濁液中で維持した。２〜３日の間隔で培地を交換しながら、細胞密度を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌに維持した。
【０２０４】
３．２  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネセント細胞生存率アッセイを用いた細胞毒性検出
ｉ．新たに分割したＨＥＬ  ９２．１．７細胞を、９６ウェル白色プレート中に培養培地中に１００μｌ培養培地中ウェル当たり５０００細胞の密度で播種した。
ｉｉ．一次モノクローナル抗体（ＣＤ３３、ＣＤ５６）を培養培地で希釈し、プレートに加えて所望の濃度範囲（０．０００１〜１０００ｎＭ）を得た。
ｉｉｉ．次いで、細胞を、一次抗体の存在下で５〜１０分間インキュベートした。
ｉｖ．一方、二次抗体（αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ）は、培養培地で希釈した。一次抗体と共にインキュベートした後、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥをウェルに加えて、ウェル当たり１３．２ｎＭを得た。
ｖ．ブランク、対照、陰性対照および陽性対照などの条件も、各アッセイプレートに含めた。それぞれ抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５６および抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ５６組み合わせによるＨＥＬ  ９２．１．７のプレートレイアウトについては、表２１、２２および２３を参照のこと。
・ブランク＝培養培地のみ
・対照＝処理していない細胞
・陰性対照＝１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥで処理した細胞
・陽性対照＝０．１ｎＭ一次抗体で処理した細胞
ｖｉ．プレートを、７２時間インキュベートした。
ｖｉｉ．７２時間のインキュベーション後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を、各ウェルに添加した。
ｖｉｉｉ．内容物を軌道シェーカー上で２分間混合して細胞溶解を誘導し、室温で１０分間インキュベートした。
ｉｘ．ルミネセンス強度は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ機器を用いて測定した。
【０２０５】
３．３  データ解析
−  ブランクの平均読み取りは、他のすべての読み取りから差し引いた。ブランクは培養培地のみを含み、アッセイプレートの背景として表された。その後、データを統計的に分析し（一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０２ソフトウェアを用いてプロットした。ルミネセンス強度は、ｙ軸上の相対的ルミネセンス単位（ＲＬＵ）として表され、種々の条件および一次抗体濃度は、ｘ軸上に表された。
【０２０６】
−  対照（処理していない）を１００％生存性とし、細胞の生存百分率（％生存率）を算出した。他の細胞の生存百分率は、対照に正常化した。データは、非線形回帰曲線を用いてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０２ソフトウェアでプロットした。ＩＣ５０は、二次抗体薬物結合体（αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ）の存在下で５０％の細胞毒性作用を誘導する関連する一次抗体（ＣＤ３３、ＣＤ５６単独またはＣＤ３３＋ＣＤ５６の併用）の濃度と定義される。これは、非線形回帰曲線フィッティングにより分析した％生存率曲線を用いて算出した。
【０２０７】
４．結果：
４．１  ＨＥＬ  ９２．１．７に対する抗ＣＤ３３抗体の細胞毒性プロファイル
−  抗ＣＤ３３処理についてのルミネセンス強度についての未加工のデータおよびブランク減算後のデータを、それぞれ表２４および２５に示す。表２５のグラフ表示を、図１１に示す。図１１は、１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ３３抗体で、一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；±ＳＥＭ）を用いて分析した場合に、ＨＥＬ  ９２．１．７細胞生存率の統計的に有意な低下が観察されたことを示す。定量は、平均値（±標準誤差平均値［ＳＥＭ］）で表す。
【０２０８】
−  一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較試験を、表２５のデータに関して実施した。ＨＥＬ  ９２．１．７生存率の統計的に有意な低下が、未処理細胞と比較した場合、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下で、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ３３抗体で観察された（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０２０９】
−  ％生存率のデータを表２６に示し、図１２にグラフで表した。図１２は、抗ＣＤ３３およびαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理についての非線形回帰曲線を示す。ＩＣ５０＝９１５．７ｎＭが、観察された。
【０２１０】
−  非線形回帰曲線から９１５．７ｎＭのＩＣ５０を得た。
【０２１１】
４．２  ＨＥＬ  ９２．１．７に対する抗ＣＤ５６抗体の細胞毒性プロファイル
−  抗ＣＤ５６処理についてのルミネセンス強度についての未加工のデータおよびブランク減算後のデータを、それぞれ表２７および２８に示す。図１３に表２８のグラフ表示を示す。図１３は、１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ３３抗体で、一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；±ＳＥＭ）を用いて分析した場合に、ＨＥＬ  ９２．１．７細胞生存率の統計的に有意な低下が観察されたことを示す。定量は、平均値（±標準誤差平均値［ＳＥＭ］）で表す。
【０２１２】
−  一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定を、図４０のデータに実施した。未処理細胞と比較した場合、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下で、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ５６抗体により、ＨＥＬ  ９２．１．７生存率の統計的に有意な低下が観察された（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０２１３】
−  ％生存率のデータを表２９に示し、図１４にグラフで示す。図１４は、抗ＣＤ５６およびαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ処理についての非線形回帰曲線を示す。ＩＣ５０＝１５．８２ｎＭが観測された。
【０２１４】
−  非線形回帰曲線から１５．８２ｎＭのＩＣ５０を得た。
【０２１５】
４．３  ＨＥＬ  ９２．１．７に対する抗ＣＤ３３抗体および抗ＣＤ５６抗体併用時の細胞毒性プロファイル
−  抗ＣＤ３３および抗ＣＤ５６併用処理のルミネセンス強度について、未加工のデータおよびブランク減算後のデータを、それぞれ表３０および３１に示す。図１５に、表３１のグラフ表示を示す。図１５は、１３．２ｎＭのαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で、１、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ５６抗体併用により、一元配置分散分析、続いてダネット事後多重比較検定（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；±ＳＥＭ）を用いて分析した場合に、ＨＥＬ  ９２．１．７細胞生存率の統計的に有意な低下が観察されたことを示す。定量は、平均値（±標準誤差平均値［ＳＥＭ］）で表す。
【０２１６】
−  一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定を、表３１のデータに関して実施した。ＨＥＬ  ９２．１．７生存率の統計的に有意な低下が、αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥの存在下で、未処理細胞と比較して、１、１０、１００および１０００ｎＭの抗ＣＤ５６抗体で観察された（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【０２１７】
−  ％生存率のデータを表３２に示し、図１６にグラフで示す。図１６は、抗ＣＤ３３＋抗ＣＤ５６併用処理の非線形回帰曲線を示す。ＩＣ５０＝１６．９５ｎＭが観測された。
【０２１８】
−  非線形回帰曲線から１６．９５ｎＭのＩＣ５０を得た。
【０２１９】
５．結論：
−  αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で抗ＣＤ３３抗体で処理した場合のＨＥＬ  ９２．１．７細胞は、１０、１００および１０００ｎＭ濃度で細胞生存率の統計的に有意な低下を示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＩＣ５０＝９１５．７ｎＭを、％生存率曲線から計算した。
【０２２０】
−  αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で抗ＣＤ５６抗体で処理した場合のＨＥＬ  ９２．１．７細胞は、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭ濃度で細胞生存率の統計的に有意な低下を示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＩＣ５０＝１５．８２ｎＭを、％生存率曲線から計算した。
【０２２１】
−αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で抗ＣＤ３３および抗ＣＤ５６抗体の併用で処理した場合のＨＥＬ  ９２．１．７細胞は、１、１０、１００および１０００ｎＭ濃度で細胞生存率の統計的に有意な低下を示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＩＣ５０＝１６．９５ｎＭを、％生存率曲線から計算した。
【０２２２】
これらの結果を、以下の表Ｄに要約する：
【表４】
2021504469.tif 000006
【０２２３】
６．要約：
−  二次抗体−薬物結合体αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ単独（陰性対照）で処理した場合のＨＥＬ  ９２．１．７細胞は、最小毒性を示した。
【０２２４】
−  ０．１ｎＭ濃度の一次抗体（抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５６および併用）は、ＨＥＬ  ９２．１．７細胞に対して毒性を示さなかった。一次抗体の中濃度０．１ｎＭを、陽性対照として試験するために選択した。
【０２２５】
−  ＨＥＬ  ９２．１．７細胞を抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５６および組合せ一次抗体の存在下でαＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥで処理した場合、細胞生存率の用量依存的減少が観察された。このことは、一次抗体が過剰発現した細胞表面マーカーに結合する特異性を示唆している。
【０２２６】
−  αＭＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＥ存在下で抗ＣＤ５６抗体で処理した場合のＨＥＬ  ９２．１．７細胞株は、抗ＣＤ３３（９１５．７ｎＭ）および併用（１６．９５ｎＭ）処理と比較した場合、低いＩＣ５０（１５．８２ｎＭ）を示した。これは、ＣＤ３３マーカーと比較した場合、細胞表面上のＨＥＬ  ９２．１．７上のＣＤ５６マーカーの発現がより高いためであり得る。
【０２２７】
実施例３：Ｋａｓｕｍｉ−３に対するＢｉＦａｂを用いた二次細胞死滅アッセイの繰り返し
Ｋａｓｕｍｉ−３細胞株に対してＢｉＦａｂを用いた二次細胞死滅アッセイを繰り返すための実験を行った。
【０２２８】
試薬
ＫＡＳＵＭＩ−３細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ７１４
ＲＰＭＩ−１６４０培地    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１８７５０３４
ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３５０５００６１
ウシ胎児血清、加熱不活性化    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０５０００６４
抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ−ＭＭＡＥ抗体    Ｍｏｒａｄｅｃ  ＬＬＣ  ＡＨ−１２２ＡＥ
９６ウェル透明平底マイクロプレート    Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃａｔ  ＃３９９７
セルタイター９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ    Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ３５８０
野生型ＢｉＦａｂ（ＷＴ  Ｂｉｆａｂ）    ＡＤＣＢｉｏ  ＳＯＮ−１５０−２０  ７Ｄ−３３Ｎ（Ｂｉ−Ｆａｂ）
【０２２９】
成長培地
ＲＰＭＩ−１６４０培地
１０％ウシ胎児血清
１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント
【０２３０】
方法
Ｋａｓｕｍｉ−３細胞を回収し、計数し、ウェル当たり１００μｌの成長培地中で２×１０４細胞で９６ウェルプレートに播種した。ＷＴ  Ｂｉｆａｂの５ポイント用量応答を、最終アッセイ濃度の５０倍の成長培地で調製した。２μｌのＷＴ  Ｂｉｆａｂ滴定を、播種細胞上にピペットし、各濃度を３つのウェルにわたってアッセイした。細胞を室温で１０分間インキュベートして、Ｂｉｆａｂが結合できるようにした。一方、抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ−ＭＭＡＥ抗体を成長培地で希釈して、製造業者のプロトコルに記載されているように、ウェル当たり６ｎＭのＭＭＡＥの最終アッセイ濃度を得た。希釈したＭＭＡＥ抗体２μｌを、ウェルごとにピペットした。ＢｉｆａｂまたはＭＭＡＥ結合抗体を含まない対照ウェルを、含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。７２時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットし、図１７に示した。
【０２３１】
結果
図１７にプロットしたＯＤ４９２〜６９０ｎｍは、細胞をｂｉ−Ｆａｂ／抗ヒトＦａｂ−ＭＭＡＥ複合体で９６時間処理した後に残った生存Ｋａｓｕｍｉ−３細胞の尺度である。ｂｉ−Ｆａｂの濃度の増加は、生存細胞の低下に反映される細胞死滅の増加をもたらした。ＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉ−Ｆａｂの非存在下での抗ヒトＦａｂ−ＭＭＡＥによるＫａｓｕｍｉ−３細胞の処理は、細胞死滅を引き起こさない。
【０２３２】
結論
ＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉ−Ｆａｂ／抗ヒトＦａｂ−ＭＭＡＥ複合体がＣＤ７／ＣＤ３３二重抗原陽性細胞に結合する結果、複合体の内部移行および生存細胞数の減少によって反映されるそれに続く細胞死滅がもたらされる。
【０２３３】
実施例４：直接結合ＢｉＦａｂを用いた細胞死滅アッセイの繰り返し
直接結合ＢｉＦａｂを用いて細胞死滅アッセイを繰り返すように実験を行った。
【０２３４】
試薬
ＫＡＳＵＭＩ−３細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ７１４
ＲＰＭＩ−１６４０培地    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１８７５０３４
グルタマックス（商標）サプリメント    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３５０５００６１
ウシ胎児血清、加熱不活性化    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０５０００６４
ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １５１４０１２２
９６ウェル透明平底マイクロプレート    Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃａｔ  ＃３９９７
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ    Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ３５８０
野生型ＢｉＦａｂ（ＷＴ  Ｂｉｆａｂ）−ＭＭＡＥ    ＡＤＣＢｉｏ  ＳＯＮ−１５０−２７＿ＢＩＦＡＢ−ＭＭＡＥ
【０２３５】
成長培地
ＲＰＭＩ−１６４０培地
１０％ウシ胎児血清
１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント
１％ペニシリン−ストレプトマイシン
【０２３６】
方法
Ｋａｓｕｍｉ−３細胞を回収し、計数し、９０μｌ成長培地当たり２×１０４細胞で再懸濁した。Ｂｉｆａｂ−ＭＭＡＥの８ポイント用量応答を、最終アッセイ濃度の１０倍で成長培地中に調製した。ＷＴ  Ｂｉｆａｂ−ＭＭＡＥ滴定の１０μｌを９６ウェルプレートにピペットし、各濃度を重複ウェルにわたって試験した。９０μｌの細胞をウェル中にピペットし、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベート後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットし、図１８に示した。
【０２３７】
結果
図１８にプロットしたＯＤ４９２〜６９０ｎｍは、抗ＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥ結合体で細胞を９６時間処理した後に残存する生存Ｋａｓｕｍｉ−３細胞の尺度である。ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥの濃度の増加は、生存細胞の低下に反映される細胞死滅の増加をもたらした。
【０２３８】
結論
ＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥがＣＤ７／ＣＤ３３二重抗原陽性細胞に結合する結果、複合体の内部移行およびその後の生存細胞数の減少によって反映される細胞死滅がもたらされる。
【０２３９】
実施例５：市販の抗体および抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥを用いた細胞死滅アッセイの繰り返し
市販の抗体および抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥを用いて細胞死滅アッセイを繰り返すように実験を行った。
【０２４０】
試薬
ＫＡＳＵＭＩ−３細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ７１４
ＳＥＴ−２細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ６０８
ＲＰＭＩ−１６４０培地    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１８７５０３４
ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３５０５００６１
ウシ胎児血清、加熱不活性化    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０５０００６４
抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＭＭＡＥ抗体    Ｍｏｒａｄｅｃ  ＬＬＣ  ＡＭ−１０２ＡＥ
９６ウェル透明平底マイクロプレート    Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃａｔ  ＃３９９７
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ    Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ３５８０
ＣＤ７に対するマウスモノクローナル［１２４−１Ｄ１］    ＡｂＣａｍ  ａｂ２１３０１４
マウス抗ＣＤ３３［ｈＰ６７．６（ゲムツズマブ）］    絶対抗体Ａｂ００２８３−１．１；
【０２４１】
成長培地
ＲＰＭＩ−１６４０培地
１０％ウシ胎児血清
１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント
【０２４２】
方法
Ｋａｓｕｍｉ−３細胞（図１９）およびＳＥＴ−２細胞（図２０）を回収し、計数し、それぞれの細胞株について８０μｌの成長培地当たり２×１０４細胞で再懸濁した。ＣＤ７およびＣＤ３３抗体の各々の５ポイント用量応答を、最終アッセイ濃度の１０倍の成長培地で調製した。１０μｌの抗体滴定および１０μｌの成長培地を９６ウェルプレートにピペットし、ＣＤ７またはＣＤ３３抗体の各濃度を３つのウェルにわたって試験した。ＣＤ７抗体およびＣＤ３３抗体の両方の１０μｌの抗体組み合わせについて、同じ濃度で、ウェルに加えた。細胞８０μｌをウェルにピペットし、プレートおよび細胞を室温で１０分間インキュベートして、抗体が結合できるようにした。抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥ抗体を成長培地で希釈して、製造業者のプロトコルに記載されるように、ウェル当たり１３．２ｎＭのＭＭＡＥの最終アッセイ濃度を得た。希釈したＭＭＡＥ抗体２μｌを、ウェルごとにピペットした。抗体またはＭＭＡＥ結合抗体を持たない対照ウェルを含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。９６時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、およびプレートを、３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットし、図１９および２０に示した。
【０２４３】
結果
図１９および２０にプロットしたＯＤ  ４９２〜６９０ｎｍは、抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥに結合した抗ＣＤ７単独、抗ＣＤ３３単独、または抗ＣＤ７＋抗ＣＤ３３抗体を用いて細胞を９６時間処理した後に残った、生存可能なＫａｓｕｍｉ−３細胞（図１９）およびＳＥＴ−２（図２０）の尺度である。細胞死滅の増加は、抗ＣＤ７および抗ＣＤ３３／抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥ複合体の濃度の増加に伴って観察された。抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥ単独では、いかなる細胞死滅も引き起こさなかった。
【０２４４】
結論
抗マウスＦｃ−ＭＭＡＥと複合した抗ＣＤ７抗体および抗ＣＤ３３抗体が二重抗原陽性細胞に結合する結果、抗原内部移行を介して細胞死滅が起こる。Ｋａｓｕｍｉ−３およびＳＥＴ−２細胞において、抗ＣＤ７および抗ＣＤ３３抗体の両方の添加は、抗ＣＤ７抗体単独の添加よりも強力な細胞死滅をもたらした。
【０２４５】
実施例６：結合アッセイにおいて標的ＣＤ７とＣＤ３３との間に相乗作用が存在するかどうかの確認
結合アッセイにおいて標的ＣＤ７とＣＤ３３との間に相乗作用が存在するかどうかを確認するために実験を行った。
【０２４６】
試薬
Ｋａｓｕｍｉ−３細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ７１４
ＳＥＴ−２細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ６０８
ＭＯＬＭ−１６細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ５５５
ＡＬＬ−ＳＩＬ細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ５１１
ジャーカット細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ２８２
ＨＥＬ−９２    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  １１
ＳＨＩ−１    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ６４５
ＭＶ４−１１    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  １０２
ＴＨＰ−１    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  １６
ＤＮＤ−３９    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ５２５
Ｒａｍｏｓ    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ６０３
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １４１９０１４４
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）画分Ｖ  ７．５％溶液    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １５２６００３７
ファルコン５ｍＬ丸底ポリスチレンＦＡＣＳチューブ    Ｆａｌｃｏｎ  ３５２０５４
マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ二次抗体、ＰＥ    Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＭＡ１１０３７７
ＣＤ７  Ｍｏｎｏｆａｂ    ＳＯＮ−１５０−２４  ＣＤ７  Ｆａｂ  ＡＤＣＢｉｏ
ＣＤ７  Ｍｏｎｏｆａｂ    ＳＯＮ−１５０−２４  ＣＤ３３  Ｆａｂ  ＡＤＣＢｉｏ
ＷＴ  ＣＤ７／ＣＤ３３  Ｂｉｆａｂ    ＳＯＮ−１５０−２０  ７Ｄ−３３Ｎ  （Ｂｉ−Ｆａｂ）ＡＤＣＢｉｏ
【０２４７】
方法
Ｋａｓｕｍｉ−３、ＳＥＴ−２、ＭＯＬＭ−１６、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＬ−９２、ＳＨＩ−１、ＭＶ４−１１、ＴＨＰ−１、ＤＮＤ−３９およびＲａｍｏｓ細胞を回収し、計数した。各細胞株の３×１０６個の細胞を、５分間１０００ｒｐｍで遠心分離することによってペレット化した。上清を流し落とし、細胞を１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液の１ｍｌアリコートを５ｍｌのＦＡＣＳチューブに移した。チューブに蓋をし、細胞を１０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離することによって再ペレット化した。上清を注ぎ出し、細胞を１００μｌの１ｎＭのＷＴ  ＣＤ７／ＣＤ３３  Ｂｉｆａｂ、ＣＤ７  ｍｏｎｏｆａｂもしくはＣＤ３３  ｍｏｎｏｆａｂ、または１ｎＭの各ＣＤ７およびＣＤ３３  ｍｏｎｏｆａｂの組み合わせに再懸濁し、氷冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で調製した。各抗体条件を、２つ１組で試験した。細胞を二次抗体のみと共にインキュベートした対照試料も、含めた。細胞を氷上で１時間インキュベートして、Ｆａｂを結合させた。インキュベーション後、各ＦＡＣＳチューブに氷冷ＰＢＳ４ｍｌを添加することによって、結合していないＦａｂを除去した。細胞を、１０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離することによってペレット化した。上清を流し出し、チューブを組織に反転させて可能な限り多くのＰＢＳを除去した。一方、二次マウス抗Ｆａｂ  ＰＥ抗体をＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で調製し、製造プロトコルに記載されているように最終濃度を６．６μｇとした。細胞を、さらに４５分間氷上でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、前述のように遠心分離することにより、余分な二次抗体を除去した。上清を注ぎ出し、細胞ペレットを３００μｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞上のＰＥ標識は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを用いてＦＬ２で検出した。各ｆａｂ条件のＧｅｏｍｅａｎをプロットし、図２１および２２に示した。
【０２４８】
結果
二次抗ヒトＦａｂ−ＰＥ抗体ＦＡＣＳ分析を用いて、白血病細胞株に対するＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉ−Ｆａｂ、ＣＤ７  Ｆａｂ、ＣＤ３３  ＦａｂまたはＣＤ７＋ＣＤ３３  Ｆａｂの結合を検出した。図２１および２２のグラフは、細胞に結合した各Ｆａｂアームの１ｎＭについて測定した蛍光のＧｅｏｍｅａｎを示す。
【０２４９】
結論
ＦＡＣＳ解析は、二重抗原陽性細胞株Ｋａｓｕｍｉ−３およびＳＥＴ−２について、単独または組み合わせでインキュベートした場合、ｂｉ−Ｆａｂの多くが個々のＦａｂアームよりも細胞に結合することを図２１に示す。対照的に、図２２にプロットしたＦＡＣＳデータは、細胞が１つの抗原のみを発現する場合を示し、ｂｉ−Ｆａｂは、ＣＤ７＋ｖｅ／ＣＤ３３−ｖｅ細胞中のＣＤ７  ＦａｂおよびＣＤ７−ｖｅ／ＣＤ３３＋ｖｅ細胞株中のＣＤ３３  Ｆａｂと同程度に結合する。例外は、ＭＯＬＭ−１６およびＨＥＬ−９２細胞株であり、その後、ＣＤ３３のみおよびＣＤ７／ＣＤ３３二重陽性細胞の亜集団を含むことが示された。
【０２５０】
実施例７：細胞死滅検定：ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ７＋ＣＤ３３およびＢｉｆａｂで処理した二重抗原陽性細胞株
ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ７＋ＣＤ３３およびＢｉｆａｂで処理した二重抗原陽性細胞株を評価するために、細胞死滅実験を行った。
【０２５１】
試薬
ＫＡＳＵＭＩ−３細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ７１４
ＳＥＴ−２細胞    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ６０８
ＲＰＭＩ−１６４０培地    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１８７５０３４
ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３５０５００６１
ウシ胎児血清、加熱不活性化    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０５０００６４
ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １５１４０１２２
９６ウェル透明平底マイクロプレート    Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃａｔ  ＃３９９７
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ    Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ３５８０
野生型ＢｉＦａｂ（ＷＴ  Ｂｉｆａｂ）−ＭＭＡＥ    ＡＤＣＢｉｏ  ＳＯＮ−１５０−２７＿ＢＩＦＡＢ−ＭＭＡＥ
ゲムツズマブ−ＭＭＡＥ
【０２５２】
成長培地
ＲＰＭＩ−１６４０培地
１０％ウシ胎児血清
１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント
１％ペニシリン−ストレプトマイシン
【０２５３】
方法
Ｋａｓｕｍｉ−３細胞およびＳＥＴ−２細胞を回収し、計数し、各細胞株の９０μｌの成長培地当たり２×１０４細胞で再懸濁した。Ｂｉｆａｂ−ＭＭＡＥ、ＣＤ７−ＭＭＡＥ、ＣＤ３３−ＭＭＡＥ、ＣＤ７−ＭＭＡＥ＋ＣＤ３３−ＭＭＡＥまたはゲムツズマブ−ＭＭＡＥの７ポイント用量応答を、それぞれ、最終アッセイ濃度の１０倍で成長培地中に調製した。１０μｌの各滴定を、９６ウェルプレートに別々にピペットし、各濃度を２つ１組のウェルにわたって試験した。９０μｌの細胞をウェル中にピペットし、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットし、図２３〜２５に示した。
【０２５４】
結果
図２３〜２５にプロットしたＯＤ４９２〜６９０ｎｍは、指示されたｂｉ−Ｆａｂ、Ｆａｂまたは抗体ＭＭＡＥ結合体による細胞の９６時間処理後に残存する生存Ｋａｓｕｍｉ−３（図２３Ａおよび２４）ならびにＳＥＴ−２（図２３Ｂおよび２５）細胞の尺度である。細胞生存率の低下は、ＭＭＡＥ結合体による内部移行および細胞死滅を反映する。Ｋａｓｕｍｉ−３細胞についての結果は、ＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉＦａｂ−ＭＭＡＥおよびゲムツズマブ−ＭＭＡＥは強力な細胞死滅をもたらすが、試験された濃度では、個々のＦａｂ−ＭＭＡＥ結合体では細胞死滅は見られなかったことを示す。ＳＥＴ−２細胞についての結果は、ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥ結合体での処理のみが細胞死滅をもたらしたことを示す。
【０２５５】
結論
以前のデータは、個々のＣＤ７およびＣＤ３３  ＦａｂｓがＫａｓｕｍｉ−３およびＳＥＴ−２細胞に結合できることを示したが、これらのＦａｂｓのＭＭＡＥ結合体では細胞死滅は観察されなかった。対照的に、ＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉ−Ｆａｂは、Ｋａｓｕｍｉ−３およびＳＥＴ−２細胞の両方において強力な細胞死滅を引き起こす。
【０２５６】
実施例７：ＣＤ７／ＣＤ３３二重陽性サブ集団の特異的細胞死滅
ＣＤ７／ＣＤ３３二重陽性サブ集団を評価するために、細胞死滅実験を行った。
【０２５７】
試薬
ＨＥＬ−９２    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  １１
ＭＯＬＭ−１６    ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ５５５
ＲＰＭＩ−１６４０培地    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１８７５０３４
ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３５０５００６１
ウシ胎児血清、加熱不活性化    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０５０００６４
ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １５１４０１２２
Ｃｏｓｔａｒ  ２４  Ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ＴＣプレート    ＳＬＳ  ３５２６
グレイナー９６  Ｖウェルマイクロプレートポリスチレン    ＳＬＳ  Ｇ６５１１０１
野生型ＢｉＦａｂ（ＷＴ  Ｂｉｆａｂ）−ＭＭＡＥ    ＡＤＣＢｉｏ  ＳＯＮ−１５０−２７＿ＢＩＦＡＢ−ＭＭＡＥ
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １４１９０１４４
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）画分Ｖ  ７．５％溶液    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １５２６００３７
ファルコン５ｍＬ丸底ポリスチレンＦＡＣＳチューブ    Ｆａｌｃｏｎ３５２０５４
ＣＤ３３モノクローナル抗体（Ｐ６７．６）、ＦＩＴＣ    Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  １１−０３３７−４２
ＣＤ７モノクローナル（ｅＢｉｏ１２４−１Ｄ１（１２４−１Ｄ１））−ＰＥ    Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  １２−００７９−４２
マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ二次ＰＥ    Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＭＡ１１０３７７
【０２５８】
成長培地
ＲＰＭＩ−１６４０培地
１０％ウシ胎児血清
１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント
１％ペニシリン−ストレプトマイシン
【０２５９】
方法
ＨＥＬ−９２およびＭＯＬＭ−１６細胞を回収し、１．５ｍｌのＲＰＭＩ成長培地中で１ウェル当たり３００，０００細胞で２４ウェルプレートに播種した。ＷＴ  ｂｉ−Ｆａｂ滴定は、最高最終濃度０．３ｎＭで、最終アッセイ濃度の１０倍の成長培地中で調製した。ｂｉ−Ｆａｂ滴定の１５０μｌをウェルごとにピペットし、その結果、双方の細胞株を各濃度のｂｉ−Ｆａｂで試験した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、各試験ウェルからの細胞を回収し、４℃で５分間１０００ｒｐｍでペレット化した。細胞を、３００μｌの氷冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁した。
【０２６０】
次いで、各試料を、試料当たり約５０，０００細胞の６つの等しい試料に分割し、抗ヒトＦａｂ−ＰＥ、抗ＣＤ７−ＰＥ、抗ＣＤ３３  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ７−ＰＥ＋抗ＣＤ３３  ＦＩＴＣまたは二次抗体なしのいずれかの結合について分析するべきものとした。５０μｌの試料を、二次抗体インキュベーションのためにＶ底９６ウェルプレートのウェルにピペットし、氷上で１時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、ペレット化し、ＦＡＣＳチューブ中の３００μｌのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを用いて蛍光分析した。
【０２６１】
ＣＤ３３抗原のみの細胞とＣＤ７／ＣＤ３３二重抗原細胞を表す２つの領域における事象について、試料を分析した。ＷＴ  ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥが各領域の事象の数に及ぼす影響をプロットし、図２６に示した。
【０２６２】
結果
ＨＥＬ−９２およびＭＯＬＭ−１６細胞株に対する抗ＣＤ７−ＰＥおよび抗ＣＤ３３−ＦＩＴＣ抗体の結合のＦＡＣＳ分析は、ＣＤ７およびＣＤ３３またはＣＤ３３のみを発現するこれらの細胞株内にサブ集団が存在することを示した。ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥの増加する濃度を処理した細胞株の試料を、その後、抗ＣＤ７−ＰＥおよび抗ＣＤ３３  ＦＩＴＣで処理した。ＣＤ３３のみおよびＣＤ７／ＣＤ３３細胞サブ集団をゲートし、各試料について各ゲートした領域内の細胞の数を、ＦＡＣＳによって記録した。ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥの濃度の増加に伴う細胞の消失百分率を計算し、データを図２６に示すようにプロットした。
【０２６３】
結論
細胞の試料をＣＤ７／ＣＤ３３−ｂｉＦａｂ−ＭＭＡＥで処理した後のこれらのサブ集団のＦＡＣＳ分析は、ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥがＣＤ７／ＣＤ３３サブ集団のみを特異的に死滅させることができることを示した。
【０２６４】
実施例８：さらなるＣＤ７／ＣＤ３３二重陽性ＡＭＬ系にわたるＷＴ  ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥの細胞死滅解析
さらなるＣＤ７／ＣＤ３３二重陽性ＡＭＬ系にわたるＷＴ  ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥの細胞死滅を分析するために、実験を行った。
【０２６５】
試薬
ＵＯＣ−Ｍ１    ＡＣＣ  ７７５
ＨＮＴ−３４    ＡＣＣ  ６００
ＲＰＭＩ−１６４０培地    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１８７５０３４
ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３５０５００６１
ウシ胎児血清、加熱不活性化    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０５０００６４
ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）    Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １５１４０１２２
９６ウェル透明平底マイクロプレート    Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃａｔ  ＃３９９７
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ    Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ３５８０
野生型ＢｉＦａｂ（ＷＴ  Ｂｉｆａｂ）−ＭＭＡＥ    ＡＤＣＢｉｏ  ＳＯＮ−１５０−２７＿ＢＩＦＡＢ−ＭＭＡＥ
【０２６６】
成長培地
ＲＰＭＩ−１６４０培地
１０％ウシ胎児血清
１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント
１％ペニシリン−ストレプトマイシン
【０２６７】
方法
ＵＯＣ−Ｍ１およびＨＮＴ−３４細胞を回収し、計数し、９０μｌの成長培地当たり２×１０４細胞で再懸濁した。Ｂｉｆａｂ−ＭＭＡＥの８ポイント用量応答を、最終アッセイ濃縮液の１０倍で成長培地中で調製した。ＷＴ  Ｂｉｆａｂ−ＭＭＡＥ滴定の１０μｌを９６ウェルプレートにピペットして、各濃度が２つ１組のウェルにわたって試験されるようにした。９０μｌの細胞をウェル中にピペットし、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。
【０２６８】
９６時間のインキュベート後、１０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎをウェル当たりピペットし、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに３時間インキュベートした。吸光度は、４９２および６９０ｎｍで読み取った。ＯＤ４９２ｎｍからＯＤ６９０ｎｍを差し引き、データをＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてプロットし、図２７および２８に示した。
【０２６９】
結果
図１８にプロットしたＯＤ  ４９２〜６９０ｎｍは、抗ＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥ結合体で細胞を９６時間処理した後に残存する生存ＨＮＴ−３４（図２７）およびＵＯＣ−Ｍ１（図２８）細胞の尺度である。ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥの濃度の増加は、生存細胞の低下に反映される細胞死滅の増加をもたらした。
【０２７０】
結論
ＣＤ７／ＣＤ３３  ｂｉ−Ｆａｂ−ＭＭＡＥがＣＤ７／ＣＤ３３二重抗原陽性細胞に結合する結果、複合体の内部移行および生存細胞の数の減少によって反映されるその後の細胞死滅がもたらされる。
【０２７１】
前述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を限定することを意図したものではなく、むしろ、発明がどのように実用化され得るかの例を記述することを意図したものである。
【０２７２】
データの表
【表５】
2021504469.tif 000007
【０２７３】
【表６】
2021504469.tif 000008
【０２７４】
【表７】
2021504469.tif 000009
【０２７５】
【表８】
2021504469.tif 000010
【０２７６】
【表９】
2021504469.tif 000011
【０２７７】
【表１０】
2021504469.tif 000012
【０２７８】
【表１１】
2021504469.tif 000013
【０２７９】
【表１２】
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【０２８０】
【表１３】
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【０２８１】
【表１４】
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【０２８２】
【表１５】
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【０２８３】
【表１６】
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【０２８４】
【表１７】
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【０２８５】
【表１８】
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【０２８６】
【表１９】
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【０２８７】
【表２０】
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【０２８８】
【表２１】
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【０２８９】
【表２２】
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【０２９０】
【表２３】
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【０２９１】
【表２４】
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【０２９２】
【表２５】
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【０２９３】
【表２６】
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【０２９４】
【表２７】
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【０２９５】
【表２８】
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【０２９６】
【表２９】
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【０２９７】
【表３０】
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【０２９８】
【表３１】
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【０２９９】
【表３２】
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【０３００】
【表３３】
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【０３０１】
【表３４】
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【０３０２】
【表３５】
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【０３０３】
【表３６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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