(57)【要約】  本開示は、胆管減少症関連状態を治療するための、特に肝実質細胞でのＣＴＮＮＢ１発現の低減に有用なオリゴヌクレオチド、組成物、及び方法に関する。ＣＴＮＮＢ１発現を低減させるための本開示のオリゴヌクレオチドは、二本鎖であってもよく又は一本鎖であってもよく、ヌクレアーゼに対するより強力な耐性及びより低い免疫原性等の特徴を向上させるために修飾されていてもよい。また、ＣＴＮＮＢ１発現を低減させるための本開示のオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞等の特定の細胞又は臓器を標的とするための標的指向性リガンドを含んでいてもよい。【選択図】図７Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆管形成の促進を必要とする対象における胆管形成を促進するための方法であって、ＣＴＮＮＢ１発現を低減するオリゴヌクレオチドを前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記投与が、前記対象における機能的胆管の数及び／又はサイズの増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与が、前記対象における胆管の表面積の増加をもたらす、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、前記オリゴヌクレオチドの投与前に、胆管減少症（ＢＤＰ）関連状態を有すると特定されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＤＰ関連状態が、アラジール症候群である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＢＤＰ関連状態が、胆道閉鎖症である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢＤＰ関連状態が、Ｉ型胆道閉鎖症、ＩＩ型胆道閉鎖症、又はＩＩＩ型胆道閉鎖症である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象の胆管が、肝内胆管である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象の胆管が、肝外胆管である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、青年期ヒト対象である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡの標的配列との相補性領域を有し、前記相補性領域が、少なくとも１５連続ヌクレオチド長である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記相補性領域が、前記ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡの標的配列と完全に相補的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンス鎖が、１９〜２７ヌクレオチド長である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンス鎖が、２１〜２７ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜４０ヌクレオチド長のセンス鎖を更に含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記センス鎖が、１９〜４０ヌクレオチド長である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記二重鎖領域が、少なくとも１９ヌクレオチド長である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記二重鎖領域が、少なくとも２１ヌクレオチド長である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡとの前記相補性領域が、少なくとも１９連続ヌクレオチド長である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡとの前記相補性領域が、少なくとも２１連続ヌクレオチド長である、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記センス鎖が、その３’−末端に、Ｓ１−Ｌ−Ｓ２として示されるステム−ループを含み、式中、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｌが、テトラループである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｌが、４ヌクレオチド長である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｌが、ＧＡＡＡとして示される配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アンチセンス鎖が、２７ヌクレオチド長であり、前記センス鎖が、２５ヌクレオチド長である、請求項１５〜２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、２５ヌクレオチド長の二重鎖領域を形成する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アンチセンス鎖に２ヌクレオチド長の３’−突出配列を更に含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドが、各々が２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、１９〜２１ヌクレオチド長の範囲の二重鎖構造を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが、１又は複数ヌクレオチド長の３’−突出配列を含み、前記３’−突出配列が、前記アンチセンス鎖、前記センス鎖、又は前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖に存在する、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、２ヌクレオチド長の３’−突出配列を含み、前記３’−突出配列が、前記アンチセンス鎖に存在し、前記センス鎖が、２１ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチド長であり、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、２１ヌクレオチド長の二重鎖を形成する、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−修飾を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記２’−修飾が、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、修飾されている、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アンチセンス鎖の５’−ヌクレオチドの糖の４’−炭素が、ホスフェート類似体を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ホスフェート類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
各標的指向性リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＧａｌＮａｃ部分が、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４３】
前記ステム−ループのＬの最大で４個のヌクレオチドが、各々一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年３月２日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＢＩＬＥ  ＤＵＣＴ  ＰＡＵＣＩＴＹ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ」と題する米国特許仮出願第６２／６３７９７３号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものである。この文献の内容は全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、オリゴヌクレオチド、及びそれらの使用、特に胆管減少症に関する状態の治療に関する使用に関する。
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に提出されている。配列表は、ファイル名がＤ０８００．７００１３ＷＯ００−ＳＥＱ．ｔｘｔであり、２０１９年２月１５日に作成され、サイズが５．４５ＫＢのファイルとして提供されている。電子フォーマットの配列表の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
胆汁酸産生、分泌、及び／又は取り込みに影響を及ぼす障害は、重要な生理学的意味を有する場合がある。例えば、胆汁うっ滞は、特に新生児では、胆汁流及び排泄の減少、並びに長期抱合型高ビリルビン血症をもたらす一般的な肝臓疾患である。同様に、肝内胆管の減少は、慢性胆汁うっ滞、心奇形、筋骨格異常、眼球異常、及び顔面形成異常に関与する、アラジール症候群（ＡＧＳ）と呼ばれる家族性症候群を含む種々の障害及び異常に関連する。多くの個体、特にＡＧＳに罹患した個体では、胆管の減少は、急速進行性肝臓疾患に関連する。胆道閉鎖症（ＢＡ）は、乳児の肝内及び肝外胆管の別の進行性繊維閉塞性障害である。胆管減少症を改善するための方法を含む、そのような患者の治療に好適な方法は欠如している。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の態様は、対象の胆管減少症及び関連状態を治療するための方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、対象のＣＴＮＮＢ１発現を選択的に阻害することが、対象の胆管能力を増加させるために（例えば、新しい胆管形成を刺激するために）有用であるという発見に関する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、対象のβ−カテニン活性を低減し、それにより対象の胆管能力（例えば、胆管の再生を促進する）を増加させるためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが使用される。本明細書で提供される方法によりもたらされる胆管能力増加の帰結は、胆汁流の改善（例えば、胆汁酸取り込みの増加）、及び循環胆汁酸の対応する減少である（例えば、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの投与が、胆管損傷動物モデルにおいて胆汁酸レベルを低減させることが示されている実施例４を参照）。一部の実施形態では、β−カテニン活性の低減は、肝実質細胞での胆汁酸合成を減少させ、それにより対象における胆管減少症による胆汁酸誘導性急性毒性を予防することができる。従って、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、新しい胆管を再生すること及び胆汁酸合成を低減することにより、アラジール症候群及び胆道閉鎖症等の胆管減少症関連状態を治療するのに有用である。
本開示の一態様は、ＣＴＮＮＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、相補性領域は、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２連続ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、相補性領域は、ＣＴＮＮＢ１の標的配列と完全に相補的である。一部の実施形態では、ＣＴＮＮＢ１の相補性領域は、少なくとも１９連続ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１９〜２７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１〜２７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５〜４０ヌクレオチド長のセンス鎖を更に含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する。一部の実施形態では、センス鎖は、１９〜４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２７ヌクレオチド長であり、センス鎖は、２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、二重鎖領域は、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、２５ヌクレオチド長の二重鎖領域を形成する。
【０００５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖に２ヌクレオチド長の３’−突出配列を更に含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々が２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１９〜２１ヌクレオチド長の範囲である二重鎖構造を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１又は複数ヌクレオチド長の３’−突出配列を含み、３’−突出配列は、アンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２ヌクレオチド長の３’−突出配列を含み、３’−突出配列はアンチセンス鎖に存在し、センス鎖は２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長であり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長の二重鎖を形成する。
一部の実施形態では、ＣＴＮＮＢ１との相補性領域は、少なくとも１９連続ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖は、その３’−末端に、Ｓ１−Ｌ−Ｓ２として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ１はＳ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成する。
【０００６】
本開示の別の態様は、ＣＴＮＮＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、２１〜２７ヌクレオチド長であり、ＣＴＮＮＢ１との相補性領域を有し、センス鎖は、その３’−末端に、Ｓ１−Ｌ−Ｓ２として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ１はＳ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成し、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、少なくとも１９ヌクレオチド長の二重鎖構造を形成するが、共有結合で連結されていない、オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補性領域は、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡの少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１個の連続ヌクレオチドと完全に相補的である。一部の実施形態では、Ｌは、テトラループである。一部の実施形態では、Ｌは、４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、Ｌは、ＧＡＡＡとして示される配列を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−修飾を含む。一部の実施形態では、２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは全て修飾されている。
【０００７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の５’−ヌクレオチドの糖の４’−炭素は、ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンド（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。一部の実施形態では、ＧａｌＮａｃ部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である。一部の実施形態では、ステム−ループのＬの最大で４個のヌクレオチドが、各々一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、アプタマーを含む。
【０００８】
本開示の別の態様は、本開示のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物を提供する。本開示の別の態様は、本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、対象の胆管減少症の減少をもたらす。一部の実施形態では、本方法は、対象の胆管形成の増加、及び従って胆管能力の増加をもたらす。一部の実施形態では、治療しようとする対象は、アラジール症候群を罹患している。一部の実施形態では、治療しようとする対象は、胆道閉鎖症を罹患している。
本開示の別の態様は、ＣＴＮＮＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、１５〜４０ヌクレオチド長のセンス鎖及び１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、センス鎖はアンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、付表Ａに示されている表の行から選択される１対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。
【０００９】
本明細書に組み込まれており、本明細書の一部分を構成する添付の図面は、ある実施形態を図示するものであり、記載されている説明と共に、本明細書で開示されている組成物及び方法のある態様の非限定的な例を提供する役目を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】０．１％の３，５−ジエトキシカルボニル−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）を給餌し、ＰＢＳで処置したマウス（最初の３つのパネル）、及び０．１％ＤＤＣを給餌し、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置したマウス（最後の３つのパネル）に由来する肝臓切片におけるＣＫ１９の免疫組織化学染色を示す一連の写真である。ＣＫ１９は、胆管上皮マーカーである。配列番号１に示されている配列を有するセンス鎖、及び配列番号２に示されている配列を有するアンチセンス鎖を含むＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが提供される。
【図２】０．１％ＤＤＣを給餌し、ＰＢＳ又はＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで１０日間、２４日間、又は３８日間にわたって週１回処置したマウスに由来する肝臓切片におけるＣＫ１９の免疫組織化学染色を示す一連の写真を含む。写真の上段の行は、ＰＢＳ処置による結果を示し、写真の下段の行は、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによる結果を示す。処置日は、各々の日における２つの免疫組織化学染色と共に下部に示されている。各処置の通常餌マウス（０．１％ＤＤＣを給餌しないマウス）の結果は、最も右側に示されている。
【図３】ＰＢＳで処置したＭｄｒ２+/-マウス（左側の最初のパネル）、ＰＢＳで処置したＭｄｒ-/-マウス（左から２番目及び３番目のパネル）、及びＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置したＭｄｒ-/-マウス（右側に示されている最後の３つのパネル）に由来する肝臓切片におけるＣＫ１９の免疫組織化学染色を示す一連の写真である。各マウスの性別は、関連パネルの下に示されている。
【図４】ＰＢＳ（左側から開始して最初の３つのパネル）、５ｍｇ／ｋｇのＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（左から４番目のパネル）、及び１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、Ｑ１Ｗ×６（右側に示されている最後の３つのパネル）で処置した各々個々の野生型動物に由来する肝臓切片におけるＣＫ１９の免疫組織化学染色を示す一連の写真である。矢印は、実質区画の非門脈周囲区域のＣＫ１９陽性細胞を有する区域を示す。スケールバーは、１００μｍを示す。
【図５】ＰＢＳ（上部２つのパネル）又はＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（下部２つのパネル）で処置した２匹のＤＤＣ給餌動物（動物１及び動物２）の、レジンキャストを使用した胆管アーキテクチャーを示す一連の写真である。動物１の画像は、２×拡大であり、スケールバーは５００μｍを示し、動物２の画像は、４×拡大であり、スケールバーは１００μｍを示す。
【図６】ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置した単一のＤＤＣ給餌動物の、インク注入による胆管アーキテクチャーを示す写真である。画像は、１０×拡大であり、スケールバーは５０μｍを示す。
【図７Ａ】ＰＢＳで処置した対照餌マウス、及び０．１％ＤＤＣを給餌しＰＢＳで処置したマウス、及び０．１％ＤＤＣを給餌し、４回の週１回用量のＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置したマウスから重力流により収集した胆汁試料に由来する総胆汁酸濃度を比較するグラフである。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ雌マウスを使用した。
【図７Ｂ】ＰＢＳで処置した対照餌マウス、０．１％ＤＤＣを給餌しＰＢＳで処置したマウス、及び０．１％ＤＤＣを給餌しＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによりＱＷ×４で処置したマウスの胆汁流速を比較するグラフである。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ雌マウスを使用した。
【図７Ｃ】ＰＢＳで処置したＤＤＣ給餌マウス（明灰色バー）、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによりＱＷ×４で処置したマウス（暗灰色バー）でのＣＴＮＮＢ１、Ｃｙｐ２７ａ１、Ｃｙｐ７ａ１、Ｃｙｐ８Ｂ１、及びＳｈｐの発現を比較する一連のグラフである。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ雌マウスを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一部の態様によると、本開示は、胆管減少症を治療するための、細胞、特に肝臓細胞（例えば、肝実質細胞）におけるＣＴＮＮＢ１発現の低減に効果的な、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。従って、関連する態様では、本開示は、肝臓でのＣＴＮＮＢ１遺伝子発現を選択的に低減することを含む、胆管減少症を治療するための方法を提供した。ある実施形態では、本明細書で提供されるＣＴＮＮＢ１標的指向性オリゴヌクレオチドは、標的組織の選択された細胞（例えば、肝臓肝実質細胞）に送達して、対象の胆管減少症を治療するように設計されている。
【００１２】
用語の定義の説明を含む本開示の更なる態様が下記に提供されている。
Ｉ．定義
投与：本明細書で使用される場合、用語「投与する」又は「投与」は、物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を、薬理学的に有用な様式で（例えば、対象の状態を治療するために）対象に提供することを意味する。
およそ：本明細書で使用される場合、１つ又は複数の目的の値に適用される用語「およそ」又は「約」は、表記されている参照値と同様である値を指す。ある実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別様の記述がない限り又は別様に状況から明白でない限り（そのような数値が、可能な値の１００％を超えてしまう場合を除く）、表記されている参照値のいずれかの方向に（より大きな又は未満）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれよりも小さな値内に入る値の範囲を指す。
【００１３】
アラジール症候群：本明細書で使用される場合、「アラジール症候群」は、肝臓の胆管の狭窄、奇形、及び／又は減少により特徴付けられる障害を指す。アラジール症候群では、肝内胆管の分化障害が、胆管の狭窄、奇形、及び減少に結び付く場合がある。そのような胆管異常は、胆汁流を低減させ（肝内胆汁うっ滞）、肝臓での胆汁蓄積をもたらす。例えば、Ｔｕｒｎｐｅｎｎｙら、Ａｌａｇｉｌｌｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２０１２年３月；２０巻（３号）：２５１〜７頁を参照されたい。この文献は、参照により本目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１４】
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）：本明細書で使用される場合、用語「アシアロ糖タンパク質受容体」又は「ＡＳＧＰＲ」は、大きな４８ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ−１）及び小さな４０ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ−２）により形成される二分Ｃ型レクチン（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ）を指す。ＡＳＧＰＲは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む循環性糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を有する。
ＣＴＮＮＢ１：本明細書で使用される場合、ＣＴＮＮＢ１は、β−カテニンタンパク質をコードする遺伝子である。ヒトでは、ＣＴＮＮＢ１は、少なくとも４つの転写物、すなわちＮＭ＿００１９０４．３（バリアント１）、ＮＭ＿００１０９８２０９．１（バリアント２）、ＮＭ＿００１０９８２１０．１（バリアント３）、及びＮＭ＿００１３３０７２９．１（バリアント４）をコードする。バリアント１、２、及び３は、同じアイソフォーム（ＮＰ＿００１０９１６８０．１、アイソフォーム１）をコードする。バリアント４は、アイソフォーム１と比較してより短いＮ末端基を有するアイソフォーム２（ＮＰ＿００１３１７６５８．１）をコードする。マウスでは、ＣＴＮＮＢ１は、少なくとも２つの転写物、すなわちＮＭ＿００７６１４．３（バリアント１）及びＮＭ＿００１１６５９０２．１（バリアント２）をコードする。両転写物は、同じタンパク質（例えば、ＮＰ＿００１１５９３７４．１及びＮＰ＿０３１６４０．１で提供されている配列）をコードする。
胆管減少症：本明細書で使用される場合、「胆管減少症」は、対象における、胆管の非存在に起因する胆管機能縮小、胆管の数及び／若しくはサイズの低減、又は胆管の閉塞を指す。一部の実施形態では、胆管減少症は、肝内胆管の非存在又は数の低減に関連する。一部の実施形態では、胆管減少症は、肝外胆管の非存在又は数の低減に関連する。一部の実施形態では、胆管減少症は、肝内又は肝外胆管の閉塞に関連する。非限定的な例として、小葉間胆管の減少は、門脈路の総数と比較した、胆管を欠如する門脈路の比を決定することにより算出することができる（例えば、Ｈａｄｃｈｏｕｅｌ  Ｐａｕｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｏｂｕｌａｒ  ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９２年２月；９巻（１号）：２４〜３０頁を参照。この文献は、その全体が本目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。
【００１５】
胆管減少症関連状態：本明細書で使用される場合、用語「胆管減少症関連状態」又は「ＢＤＰ関連状態」は、その状態を有していない正常対照対象と比較して、対象に機能的胆管の数又はサイズの低減をもたらすか又は関連する対象の状態を指す。一部の実施形態では、ＢＤＰ関連状態を有する対象は、機能的胆管の数及び／又はサイズの低減を示す。一部の実施形態では、対象の欠損胆管系は、肝内胆管に生じる。一部の実施形態では、機能障害を有する肝内胆管は、門脈周囲細胆管（ヘリング管）及び小葉内胆管（細胆管）からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象において機能障害を有する胆管は、胆外胆管である。一部の実施形態では、機能障害を有する肝外胆管は、左胆管、右胆管、及び総胆管からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＢＤＰ関連状態は、アラジール症候群である。一部の実施形態では、ＢＤＰ関連状態は、胆道閉鎖症である。
胆道閉鎖症：本明細書で使用される場合、「胆道閉鎖症（ＢＡ）」は、胆管の破壊又は喪失が胆汁流を妨害する、特に幼児における疾患を指す。例えば、Ｋｅｌｌｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｌｉａｒｙ  Ａｔｒｅｓｉａ．Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ．２００７年１２月；９２巻（１２号）：１１３２〜５頁を参照されたい。この文献は、参照により本目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１６】
相補的：本明細書で使用される場合、用語「相補的」は、ヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にするヌクレオチド（例えば、一本鎖核酸鎖の向かい合う核酸又は向かい合う領域の２つのヌクレオチド）間の構造的関係性を指す。例えば、向かい合う核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的な一方の核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより共に塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、相補的ヌクレオチドは、ワトソン−クリック様式の、又は安定的二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式の塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載のような、相補性領域を形成するように互いに相補的なヌクレオチド配列を有していてもよい。
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２’位に水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、ホスフェート基、若しくは塩基に修飾を含むか又は糖、ホスフェート基、若しくは塩基の置換を含む、２’位以外の原子の１つ又は複数の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
【００１７】
二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「二本鎖オリゴヌクレオチド」は、実質的に二重鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に別々の核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に連結されている核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、フォールディングして（例えば、ヘアピンにより）共に塩基対を形成するヌクレオチドの相補的逆平行配列を提供する一本鎖核酸鎖で形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重鎖である２つの共有結合的に別々の核酸鎖を含む。しかしながら、一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二重鎖であり、例えば一方の又は両方の末端に突出を有する２つの共有結合的に別々の核酸鎖を含む。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であり、従って、内部ミスマッチ又は末端ミスマッチを含んでいてもよい１つ又は複数のミスマッチを有していてもよいヌクレオチドの逆平行配列を含む。
【００１８】
二重鎖：本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関する用語「二重鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合により形成される構造を指す。
賦形剤：本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、例えば、所望の稠度又は安定化効果を提供又は寄与するように組成物に含まれていてもよい非治療剤を指す。
肝実質細胞：本明細書で使用される場合、用語「肝実質細胞」又は「肝実質細胞（複数）」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。こうした細胞は、肝臓質量のおよそ７０〜８５％を占め、血清アルブミン、フィブリノーゲン、及び凝固因子のプロトロンビン群（第３因子及び第４因子を除く）を製造する。肝実質細胞系統細胞のマーカーとしては、これらに限定されないが、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミンシンテターゼ（Ｇｌｕｌ）、肝実質細胞核内因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝実質細胞核内因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）を挙げることができる。成熟肝実質細胞のマーカーとしては、これらに限定されないが、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ（Ｆａｈ）、グルコース６−ホスフェート（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２−２Ｆ８を挙げることができる。例えば、Ｈｕｃｈら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ、４９４巻（７４３６号）：２４７〜２５０頁を参照されたい。この文献の肝実質細胞マーカーに関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
ループ：本明細書で使用される場合、用語「ループ」は、互いに十分に相補的な核酸の２つの逆平行領域によりフランキングされる核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の非対合領域を指し、非対合領域をフランキングする２つの逆平行領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下で（例えば、リン酸緩衝液中で、細胞中で）ハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成する。
修飾ヌクレオチド間連結：本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド間連結」は、リン酸ジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間連結と比較して、１つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチド間連結を指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは非天然連結である。典型的には、修飾ヌクレオチド間連結は、修飾ヌクレオチド間連結が存在する核酸に１つ又は複数の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは非天然ヌクレオチドである。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／又はホスフェート基に１つ又は複数の化学的修飾を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドにコンジュゲートされた１つ又は複数の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ又は複数の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース環の２’位に２’−Ｏ−メチル置換又は２’−Ｆ置換を含む。
【００２０】
ニック付きテトラループ構造：「ニック付きテトラループ構造」は、別々のセンス鎖（パッセンジャー鎖）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖）が存在することにより特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造であって、センス鎖は、２つの鎖が二重鎖を形成するようにアンチセンス鎖との相補性領域を有し、鎖の少なくとも一方、一般にはセンス鎖は、二重鎖から伸長し、伸長は、テトラループ及びテトラループに隣接するステム領域を形成する２つの自己相補的配列を含み、テトラループは、少なくとも一方の鎖の自己相補的配列により形成される隣接ステム領域を安定させるように構成されている構造である。
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、１００ヌクレオチド長未満の短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／又は例えば修飾リボヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもよく又は二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有していてもよく又は有していなくともよい。１セットの非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｉｃｅｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、又は一本鎖ｓｉＲＮＡであってもよい。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
突出：本明細書で使用される場合、用語「突出」は、１つの鎖又は領域がそれと二重鎖を形成する相補的鎖の末端を越えて伸長する１つの鎖又は領域から生じる末端非塩基対合ヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、突出は、二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の二重鎖領域から伸長する１つ又は複数の非対合ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、突出は、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖にある３’突出又は５’突出である。
ホスフェート類似体：本明細書で使用される場合、用語「ホスフェート類似体」は、ホスフェート基の静電気特性及び／又は立体特性を模倣する化学部分を指す。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、酵素的に除去され易いことが多い５’−ホスフェートの代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置されている。一部の実施形態では、５’ホスフェート類似体は、ホスファターゼ耐性連結を含む。ホスフェート類似体の例としては、５’メチレンホスホネート（５’−ＭＰ）及び５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）等の５’ホスホネートが挙げられる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチドの糖の４’−炭素位置にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ばれる）。４’−ホスフェート類似体の例は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分に（例えば、その４’−炭素に）又はその類似体に結合されているオキシメチルホスホネートである。例えば、２０１７年９月１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９号パンフレット、２０１６年９月２日に出願された米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号明細書、及び２０１６年９月１２日に出願された第６２／３９３，４０１号明細書を参照されたい。これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの５’末端のための他の修飾が開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号パンフレット；米国特許第８，９２７，５１３号明細書；及びＰｒａｋａｓｈら（２０１５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、４３巻（６号）：２９９３〜３０１１頁を参照、これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２２】
発現の低減：本明細書で使用される場合、遺伝子の「発現の低減」という用語は、遺伝子によりコードされるＲＮＡ転写物若しくはタンパク質の量の減少、及び／又は適切な参照細胞若しくは参照対象と比較した細胞若しくは対象の遺伝子の活性の量の減少を指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡ配列と相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で細胞を処置する行為は、二本鎖オリゴヌクレオチドで処置されていない細胞と比較して、ＲＮＡ転写物、タンパク質、及び／又は酵素活性（ＣＴＮＮＢ１遺伝子によりコードされる）の量の減少をもたらすことができる。同様に、「発現を低減する」は、本明細書で使用される場合、遺伝子（例えば、ＣＴＮＮＢ１）の発現の低減をもたらす行為を指す。
【００２３】
相補性領域：本明細書で使用される場合、用語「相補性領域」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、例えば、リン酸緩衝液中、細胞中等で、ヌクレオチドの２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にするために、ヌクレオチドの逆平行配列（例えば、ｍＲＮＡ内の標的ヌクレオチド配列）と十分に相補的である核酸（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）のヌクレオチドの配列を指す。相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその部分内に存在する標的ヌクレオチド配列）と完全に相補的であってもよい。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列と完全に相補的である相補性領域は、ｍＲＮＡの対応する配列と一切のミスマッチ又はギャップ無しで相補的であるヌクレオチドの連続配列を有する。或いは、相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその部分に存在するヌクレオチド配列）と部分的に相補的であってもよい。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列と部分的に相補的である相補性領域は、相補性領域が適切なハイブリダイゼーション条件下でｍＲＮＡと依然としてハイブリダイズ可能である限り、ｍＲＮＡの対応する配列と相補的であるが、ｍＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ又は複数のミスマッチ又はギャップ（例えば、１つ、２つ、３つ、又はそれよりも多くのミスマッチ又はギャップ）を含むヌクレオチドの連続配列を有する。
【００２４】
リボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオチド」は、その２’位にヒドロキシル基を含むリボースをそのペントース糖として有するヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドは、リボース、ホスフェート基、若しくは塩基に修飾を含むか又はリボース、ホスフェート基、若しくは塩基の置換を含む、２’位以外の原子の１つ又は複数の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドである。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部分は、標的ｍＲＮＡの切断に際してアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより使用される二本鎖オリゴヌクレオチド、又は（ｂ）単一のアンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖（又はそのアンチセンス鎖の一部分）は、標的ｍＲＮＡの切断に際してＡｇｏ２エンドヌクレアーゼにより使用される一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
鎖：本明細書で使用される場合、用語「鎖」は、ヌクレオチド間連結（例えば、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結）を介して共に連結されているヌクレオチドの単一の連続配列を指す。一部の実施形態では、鎖は、２つの遊離末端、例えば、５’−末端及び３’−末端を有する。
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。用語「個体」又は「患者」は、「対象」と同義的に使用される場合がある。一部の実施形態では、対象は、青年期ヒト対象（例えば、１８歳未満、１２歳未満、６歳未満、３歳未満）である。しかしながら、一部の実施形態では、対象は、成人ヒト対象（例えば、１８歳又はそれよりも高齢の）である。
合成：本明細書で使用される場合、用語「合成」は、人為的に合成されたか（例えば、機械（例えば、固相核酸合成機）を使用して）、又はそうでなければ通常その分子を産生する天然供給源（例えば、細胞又は生物）に由来しない核酸又は他の分子を指す。
【００２５】
標的指向性リガンド：本明細書で使用される場合、用語「標的指向性リガンド」は、目的の組織又は細胞の同種分子（例えば、受容体）と選択的に結合し、他方の物質を目的の組織又は細胞へと標的化するために別の物質にコンジュゲート可能である分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質）を指す。例えば、一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドを目的の特定の組織又は細胞へと標的化するためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、細胞表面受容体と選択的に結合する。従って、一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされると、細胞の表面に発現されている受容体との選択的結合により、並びにオリゴヌクレオチド、標的指向性リガンド、及び受容体を含む複合体の細胞によるエンドソーム内部移行により、特定の細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にする。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドが細胞中で標的指向性リガンドから放出されるように、細胞内部移行後に又は細胞内部移行中に切断されるリンカーを介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。
【００２６】
テトラループ：本明細書で使用される場合、用語「テトラループ」は、ヌクレオチドのフランキング配列のハイブリダイゼーションにより形成される隣接二重鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、無作為に選択されたヌクレオチドの配列からなる同等の長さの１セットのループから平均して予想される隣接ステム二重鎖のＴmよりも高い隣接ステム二重鎖の融解温度（Ｔm）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対長の二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ4中で少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、又は少なくとも７５℃の融解温度を付与することができる。一部の実施形態では、テトラループは、スタッキング相互作用により隣接ステム二重鎖中の塩基対を安定させることができる。加えて、テトラループのヌクレオチド間の相互作用としては、これらに限定されないが、非ワトソン−クリック型塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が挙げられる（Ｃｈｅｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０年８月１６日；３４６巻（６２８５号）：６８０〜２頁；Ｈｅｕｓ及びＰａｒｄｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年７月１２日；２５３巻（５０１６号）：１９１〜４頁）。一部の実施形態では、テトラループは、３〜６個のヌクレオチドを含むか又はからなり、典型的には４〜５個のヌクレオチドである。ある実施形態では、テトラループは、修飾されていてもよく又はされていなくともよい（例えば、標的指向性部分にコンジュゲートされていてもよく又はされていなくともよい）３、４、５、又は６個のヌクレオチドを含むか又はからなる。一実施形態では、テトラループは、４個のヌクレオチドからなる。任意のヌクレオチドをテトラループに使用することができ、Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻：３０２１〜３０３０頁に記載の、そのようなヌクレオチドの標準ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ記号を使用することができる。例えば、文字「Ｎ」は、その位置には任意の塩基が存在してもよいことを意味するために使用することができ、文字「Ｒ」は、その位置にはＡ（アデニン）又はＧ（グアニン）が存在してもよいことを示すために使用することができ、「Ｂ」は、その位置にはＣ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、又はＴ（チミン）が存在してもよいことを示すために使用することができる。テトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０年１１月；８７巻（２１号）：８４６７〜７１頁；Ａｎｔａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１年１１月１１日；１９巻（２１号）：５９０１〜５頁）。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテト��ループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、Ｎａｋａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１巻（４８号）、１４２８１〜１４２９２頁、２００２年。ＳＨＩＮＪＩら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  第７８巻；２号；７３１頁（２０００年）を参照されたい。これらの文献は、それらの関連開示について参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、テトラループは、ニック付きテトラループ構造内に含まれている。
【００２７】
治療する：本明細書で使用される場合、用語「治療する」は、既存の状態（例えば、疾患、障害）と比べて対象の健康及び／又は安寧を向上させるために、又は状態の発生の可能性を予防若しくは減少させるために、例えば、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）を対象に投与することにより、それを必要とする対象に療治を提供する行為を指す。一部の実施形態では、治療は、対象が経験している状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、又は寄与要因の頻度又は重症度を低減させることを含む。
【００２８】
ＩＩ．オリゴヌクレオチドに基づく阻害剤
ｉ．  ＣＴＮＮＢ１標的指向性オリゴヌクレオチド
ＣＴＮＮＢ１標的指向性オリゴヌクレオチドを使用して、β−カテニン活性を低減させることより、並びに結果的には胆管形成を増加させること及び胆汁酸合成を阻害することにより、胆管減少症を有する対象の治療利益を達成することができる。製作された任意の好適なＣＴＮＮＢ１標的指向性オリゴヌクレオチドが使用される。例えば、製作されたＣＴＮＮＢ１標的指向性オリゴヌクレオチドは、２０１１年７月１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４２８２０号パンフレット；２０１２年２月９日に公開された国際公開第２０１２／０１８７５４号パンフレット；及び２０１３年７月１８日に公開された国際公開第２０１３／１０５０２２号パンフレットに見出される。これらの文献の各々のＣＴＮＮＢ１標的指向性オリゴヌクレオチドに関する内容は、本目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
標的指向性配列は、本明細書に記載のような複数の異なるオリゴヌクレオチド構造（又は形式）に入れることができる。
従って、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、細胞中のｍＲＮＡを標的としその発現を阻害するための、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡとの相補性領域を有するように設計されている。相補性領域は、一般に、オリゴヌクレオチド（又はその鎖）が、その発現を阻害するためにＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡにアニーリングすることを可能にするのに好適な長さ及び塩基内容である。
【００２９】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号３に示されている配列に対して、その長さにわたって少なくとも部分的に相補的な相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の）を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号３に示されている配列と、その長さにわたって完全に相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。一部の実施形態では、配列番号３に示されている配列の連続ヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の長さ全体にわたる。一部の実施形態では、配列番号３のいずれか１つに示されている配列の連続ヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の長さ全体の部分にわたる（例えば、アンチセンス鎖の３’末端の２個以外の全てのヌクレオチド）。
一部の実施形態では、相補性領域は、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１２〜３０（例えば、１２〜３０、１２〜２２、１５〜２５、１７〜２１、１８〜２７、１９〜２７、又は１５〜３０）ヌクレオチド長の範囲である、ＣＴＮＮＢ１との相補性領域を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である、ＣＴＮＮＢ１との相補性領域を有する。
【００３０】
一部の実施形態では、ＣＴＮＮＢ１との相補性領域は、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ又は複数のミスマッチを有してもよい。オリゴヌクレオチドにある相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持する限り、最大１つ、最大２つ、最大３つ、最大４つ、最大５つ等のミスマッチを有してもよい。或いは、オリゴヌクレオチドの相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持する限り、１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、又は５つ以下のミスマッチを有してもよい。一部の実施形態では、相補性領域に１つよりも多くのミスマッチが存在する場合、それらは、オリゴヌクレオチドが適切なハイブリダイゼーション条件下でＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力を維持する限り、連続的に（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれよりも多くが連続して）配置されていてもよく、又は相補性領域の全体にわたって点在していてもよい。
【００３１】
ｉｉ．オリゴヌクレオチド構造
本開示の方法でＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡを標的とするのに有用なオリゴヌクレオチドには、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ等を含む様々な構造が存在する。本明細書又は他所で開示される構造はいずれも、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡを標的とするためのフレームワークとして使用することができる。ＣＴＮＮＢ１発現を標的とするための二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉ経路による）は、一般に、互いに二重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されていない。しかしながら、一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されている。
一部の実施形態では、ＣＴＮＮＢ１発現を低減するための二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす。例えば、各鎖が、１〜５個ヌクレオチドの少なくとも１つの３’突出を有する１９〜２５個ヌクレオチドのサイズを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号明細書を参照）。ダイサーによりプロセシングされて活性ＲＮＡｉ産物を生成するより長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号明細書を参照）。更なる研究により、鎖の一方が熱力学的に安定なテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも一方の鎖の少なくとも一方の末端が二重鎖標的指向性領域を越えて伸長している伸長二本鎖オリゴヌクレオチドがもたらされた（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号明細書及び第８，９２７，７０５号明細書並びに国際公開第２０１００３３２２５号パンフレットを参照。これらの文献は、それらのオリゴヌクレオチドの開示について参照により本明細書に組み込まれる）。そのような構造としては、一本鎖伸長（分子の一方又は両方の側の）並びに二本鎖伸長を挙げることができる。
【００３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の配列は、両方とも１７〜３６ヌクレオチド長の範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドに組み込まれていてもよく、又はそうしたオリゴヌクレオチドを使用して標的化することができる。一部の実施形態では、それらのセンス鎖の３’伸長内にテトラループ構造、及びそのアンチセンス鎖の３’末端に２個の末端突出ヌクレオチドを有する、そのような配列が組み込まれているオリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、２個の末端突出ヌクレオチドは、ＧＧである。典型的には、アンチセンス鎖の２個の末端ＧＧヌクレオチドの一方又は両方は、標的と相補的ではない。
一部の実施形態では、両方とも２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する、そのような配列が組み込まれているオリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、１又は２ヌクレオチド長である３’突出が、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に提供されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２３個ヌクレオチドのガイド鎖及び２１個ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有し、パッセンジャー鎖の３’−末端及びガイド鎖の５’−末端は平滑末端を形成し、ガイド鎖は２個ヌクレオチドの３’突出を有する。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に突出（例えば、１、２、又は３ヌクレオチド長の）を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスである２１個ヌクレオチドのガイド鎖、及び相補的パッセンジャー鎖を含んでいてもよく、両鎖はアニーリングして、１９ｂｐ二重鎖、及びいずれかの又は両方の３’末端に２個ヌクレオチドの突出を形成する。例えば、米国特許第９０１２１３８号明細書、米国特許第９０１２６２１号明細書、及び米国特許第９１９３７５３号明細書を参照されたい。これらの文献の各々の内容は、それらの関連開示について本明細書に組み込まれる。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス−センス二重鎖を越えて伸長する領域を含む３６個ヌクレオチドのセンス鎖を有し、伸長領域は、ステムが６塩基対の二重鎖であり、テトラループが４個ヌクレオチドを有するステム−テトラループ構造を有する。こうした実施形態のあるものでは、テトラループヌクレオチドの３個又は４個は各々、一価ＧａｌＮａｃリガンドにコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２５個ヌクレオチドのセンス鎖、及びダイサー酵素による作用を受けると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖がもたらされる２７個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。［［この構造を指す参照を挿入する。出願を保留しないこと。］］
【００３４】
本明細書で開示される組成物及び方法で使用するための他のオリゴヌクレオチド設計としては、以下のものが挙げられる：１６量体ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（編）、Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年を参照）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ又はそれよりも短いステムを有する；例えば、Ｍｏｏｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０年；６２９巻：１４１〜１５８頁を参照）、平滑末端ｓｉＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ長の；例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ及びＢａｋｅｒ、ＲＮＡ  １２巻、１６３〜１７６頁（２００６年）を参照）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ。例えば、Ｓｕｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６巻、１３７９〜１３８２頁（２００８年）を参照）、非対称短鎖二重鎖ｓｉＲＮＡ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｓｈｏｒｔｅｒ−ｄｕｐｌｅｘ  ｓｉＲＮＡ）（例えば、Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９年４月；１７巻（４号）：７２５〜３２頁を参照）、フォーク型ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５５７巻、１〜３号；２００４年１月、１９３〜１９８頁を参照）、一本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０巻、１０６３頁（２０１２年））、ダンベル型環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９巻：１５１０８〜１５１０９頁（２００７年）を参照）、及び低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉｓｉＲＮＡ；例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７年９月；３５巻（１７号）：５８８６〜５８９７頁を参照）。上述の参考文献の各々は、その中の関連開示についてその全体が参照により組み込まれる。ＣＴＮＮＢ１の発現を低減又は阻害するために一部の実施形態で使用することができるオリゴヌクレオチド構造の更なる非限定的な例は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖ｓｉＲＮＡである（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．、２００２年、２１巻（１７号）：４６７１〜４６７９頁を参照；また米国特許出願公開第２００９００９９１１５号明細書を参照）。
【００３５】
ａ．アンチセンス鎖
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、最大で４０ヌクレオチド長（例えば、最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２７、最大で２５、最大で２１、最大で１９、最大で１７、又は最大で１２ヌクレオチド長）のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２２少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、又は少なくとも３８ヌクレオチド長）のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２〜４０（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２１、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０、又は３２〜４０）ヌクレオチド長の範囲のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を有してもよい。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる場合がある。例えば、アンチセンス鎖が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と係合し、アルゴノートタンパク質に結合するか、又は１つ若しくは複数の類似因子と係合若しくは結合し、標的遺伝子のサイレンシングを指図することができる場合、それをガイド鎖と呼ぶことができる。一部の実施形態では、ガイド鎖と相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる場合がある。
【００３６】
ｂ．センス鎖
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、最大で４０ヌクレオチド長（例えば、最大で４０、最大で３６、最大で３０、最大で２７、最大で２５、最大で２１、最大で１９、最大で１７、又は最大で１２ヌクレオチド長）のセンス鎖（又はパッセンジャー鎖）を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３６、又は少なくとも３８ヌクレオチド長）のセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２〜４０（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２１、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０、又は３２〜４０）ヌクレオチド長の範囲のセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド長のセンス鎖を有してもよい。
【００３７】
一部の実施形態では、センス鎖は、その３’−末端にステム−ループ構造を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、その５’−末端にステム−ループ構造を含む。一部の実施形態では、ステムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４塩基対長の二重鎖である。一部の実施形態では、ステム−ループは、分解（例えば、酵素的分解）に対するより良好な保護を分子に提供し、標的細胞へと送達するための標的指向性特徴を促進する。例えば、一部の実施形態では、ループは、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に実質的に影響を及ぼさずに修飾を行うことができる追加のヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、本明細書には、センス鎖が（例えば、その３’−末端に）Ｓ1−Ｌ−Ｓ2として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ1は、Ｓ2と相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間に最大で１０ヌクレオチド長（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長）のループを形成するオリゴヌクレオチドが提供される。
一部の実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）は、テトラループである（例えば、ニック付きテトラループ構造内の）。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組合せを含んでいてもよい。典型的には、テトラループは、４〜５個のヌクレオチドを有する。
【００３８】
ｃ．二重鎖の長さ
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、少なくとも１２（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１）ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長（例えば、１２〜３０、１２〜２７、１２〜２２、１５〜２５、１８〜３０、１８〜２２、１８〜２５、１８〜２７、１８〜３０、１９〜３０、又は２１〜３０ヌクレオチド長）の範囲である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の長さ全体にはわたっていない。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの長さ全体にわたる。ある実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の長さ全体にわたる。
【００３９】
ｄ．オリゴヌクレオチド末端
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のいずれかに、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に、３’−突出が存在する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、一方の５’末端が、他方の５’末端と比較して熱力学的により不安定である。一部の実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の３’末端に突出を含む非対称オリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’突出は、１〜８ヌクレオチド長（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８ヌクレオチド長）である。
典型的には、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に２個ヌクレオチドの突出を有する。しかしながら、他の突出が可能である。一部の実施形態では、突出は、１〜６個ヌクレオチド、任意選択で１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６個ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、若しくは６個ヌクレオチドの長さを含む３’突出である。しかしながら、一部の実施形態では、突出は、１〜６個ヌクレオチド、任意選択で１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６個ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、若しくは６個ヌクレオチドの長さを含む５’突出である。
一部の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端の１つ又は複数の（例えば、２、３、４個の）末端ヌクレオチドが修飾されている。例えば、一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１個又は２個の末端ヌクレオチドが修飾されている。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドが修飾されており、例えば２’−修飾、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１個又は２個の末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１個又は２個のヌクレオチドは、標的と相補的でない。一部の実施形態では、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端及び／又は３’末端は、逆向きキャップヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｃａｐ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を有する。
【００４０】
ｅ．ミスマッチ
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間には１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの）ミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つよりも多くのミスマッチが存在する場合、それらは、連続的に配置されていてもよく（例えば、２つ、３つ、又はそれよりの多くが連続して）、又は相補性領域の全体にわたって点在していてもよい。一部の実施形態では、センス鎖の３’−末端は、１つ又は複数のミスマッチを含む。一実施形態では、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’−末端のセグメントの塩基ミスマッチ又は不安定化は、恐らくはダイサーによるプロセシングを促進することにより、ＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力を向上させた。
【００４１】
ｉｉｉ．一本鎖オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＴＮＮＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。そのような構造としては、これらに限定されないが、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを挙げることができる。最近の努力により、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉら（２０１６年５月）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２４巻（５号）、９４６〜９５５頁を参照）。しかしながら、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に記載して、特定の核酸の標的とされているセグメントの逆相補体を含み、（例えば、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）として）細胞でのその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介性切断を誘導するように、又は（例えば、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）として）細胞での標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように好適に修飾されている核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本開示で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関するその開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５６７，５８７号明細書に示されているものを含む、当該技術分野で公知の任意の好適な様式で修飾することができる（例えば、長さ、核酸塩基（ピリミジン、プリン）の糖部分、及び核酸塩基のヘテロ環部分の変更を含む）。更に、アンチセンス分子は、特定の標的遺伝子の発現を低減させるために、数十年にわたって使用されている（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、５７巻：８１〜１０５頁を参照）。
【００４２】
ｉｖ．オリゴヌクレオチド修飾
オリゴヌクレオチドは、種々の方法で修飾して、特異性、安定性、送達、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解からの耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布、及び細胞取り込み、及び治療使用又は研究使用に関連する他の特徴を向上又は制御することができる。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００９年、３７巻、２８６７〜２８８１頁；Ｂｒａｍｓｅｎ及びＫｊｅｍｓ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３巻（２０１２年）：１〜２２頁）を参照されたい。従って、一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の好適な修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又はホスフェート基に修飾を有する。
オリゴヌクレオチドの修飾の数及びそうしたヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を及ぼす場合がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、それらを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又は類似の担体にコンジュゲートすることにより又は包含させることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰ又は類似の担体により保護されていない場合（例えば、「ネイキッド送達」）、そのヌクレオチドの少なくとも一部を修飾することが有利であり得る。従って、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれかのある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾されている。ある実施形態では、ヌクレオチドの半分よりも多くが修飾されている。ある実施形態では、ヌクレオチドの半分未満が修飾されている。典型的には、ネイキッド送達の場合、全てのヌクレオチドが、そのヌクレオチドの糖基の２’位で修飾されている。こうした修飾は、可逆的であってもよく又は不可逆的であってもよい。典型的には、２’−位置修飾は、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル等である。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素的分解からの保護、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に所望の細胞を標的とする能力、及び／又は熱力学的安定性）をもたらすのに十分な数及びタイプの修飾ヌクレオチドを有する。
【００４３】
ａ．糖修飾
一部の実施形態では、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ばれる）としては、例えば、糖の２’、３’、４’、及び／又は５’炭素位置に１つ又は複数の修飾が生じる修飾デオキシリボース又はリボース部分が挙げられる。また、一部の実施形態では、修飾糖は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎら（１９９８年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４巻、３６０７〜３６３０頁を参照）、アンロックド核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄら（２０１３年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２巻、ｅ１０３頁を参照）、及び架橋核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａ（２００２年）、Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１６５３〜１６５９頁を参照）に存在するもの等の、非天然代替炭素構造を含んでいてもよい。Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｓｎｅａｄら、並びにＩｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａは、糖修飾に関するそれらの開示が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、糖のヌクレオチド修飾は、２’−修飾を含む。ある実施形態では、２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、又は２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸であってもよい。典型的には、修飾は、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、又は２’−Ｏ−メトキシエチルである。しかしながら、オリゴヌクレオチドに使用するために開発された種々様々な２’位修飾を、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドに使用することができる。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００９年、３７巻、２８６７〜２８８１頁を参照されたい。一部の実施形態では、糖の修飾は、糖環の１つ又は複数の炭素の修飾を含んでいてもよい、糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’−炭素と１’−炭素又は４’−炭素との間の連結を含んでいてもよい。例えば、連結は、エチレン架橋又はメチレン架橋を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−炭素と３’−炭素との結合を欠如する非環式糖を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。
一部の実施形態では、末端３’−末端基（例えば、３’−ヒドロキシル）は、ホスフェート基、或いは例えば、リンカー、アダプター、若しくは標識を付着させるために、又はオリゴヌクレオチドを別の核酸と直接ライゲーションさせるために使用することができる他の基である。
【００４４】
ｂ．５’末端ホスフェート
オリゴヌクレオチドの５’−末端ホスフェート基は、アルゴノート２との相互作用を増強してもよく又は一部の場合では増強する。しかしながら、５’−ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素による分解に感受性であってもよく、それによりｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの生物学的利用能を制限することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドとしては、そのような分解に耐性である５’ホスフェートの類似体が挙げられる。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートであってもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然５’−ホスフェート基の静電気的及び立体的特性を模倣する化学部分（「ホスフェート模倣体」）に付着されている（例えば、Ｐｒａｋａｓｈら（２０１５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５年３月３１日；４３巻（６号）：２９９３〜３０１１頁を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。５’末端に付着させることができるホスフェート模倣体が数多く開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号明細書を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。オリゴヌクレオチドの５’末端のための他の修飾が開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号パンフレットを参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。ある実施形態では、ヒドロキシル基が、オリゴヌクレオチドの５’末端に付着されている。
【００４５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’−炭素位置にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ばれる）。例えば、２０１７年９月１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９号パンフレット、２０１６年９月２日に出願された、４’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅと題する米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号明細書、及び２０１６年９月１２日に出願された、４’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅと題する第６２／３９３，４０１号明細書を参照されたい。これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチドに４’−ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’−炭素に）又はその類似体に結合されているオキシメチルホスホネートである。他の実施形態では、４’−ホスフェート類似体は、チオメチル基の硫黄原子又はアミノメチル基の窒素原子が糖部分又はその類似体の４’−炭素に結合されているチオメチルホスホネート又はアミノメチルホスホネートである。ある実施形態では、４’−ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネートである。一部の実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＨ）2又は−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＲ）2により表され、式中、Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ3、アルキル基、ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、ＣＨ2ＯＣＯＣ（ＣＨ3）3、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3、又は保護基から選択される。ある実施形態では、アルキル基はＣＨ2ＣＨ3である。より典型的には、Ｒは、独立してＨ、ＣＨ3、又はＣＨ2ＣＨ3から選択される。
【００４６】
ｃ．修飾ヌクレオシド間連結
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間連結を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ホスフェート修飾又は置換は、少なくとも１つの（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも５つの）修飾ヌクレオチド間連結を含むオリゴヌクレオチドをもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１〜１０個の（例えば、１〜１０、２〜８、４〜６、３〜１０、５〜１０、１〜５、１〜３、又は１〜２個の）修飾ヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の修飾ヌクレオチド間連結を含む。
修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロジチオエート連結、ホスホロチオエート連結、ホスホトリエステル連結、チオノアルキルホスホネート連結、チオノアルキルホスホトリエステル連結、ホスホラミダイト連結、ホスホネート連結、又はボラノホスフェート連結であってもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。
【００４７】
ｄ．塩基修飾
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾核酸塩基を有する。一部の実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に連結されている。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含んでいない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかしながら、ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含んでいない（脱塩基）。
一部の実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の１’位に、又は二重鎖に存在する場合、二重鎖の構造を実質的に変更することなく１つよりも多くのタイプの塩基の反対側に配置することができるヌクレオチド糖部分置換の等価位置に位置するヘテロ環式部分である。一部の実施形態では、標的核酸と完全に相補的な参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸と形成される二重鎖よりも低いＴmを有する、標的核酸との二重鎖を形成する。しかしながら、一部の実施形態では、ユニバーサル塩基が、単一のミスマッチを生成するように塩基と置き換えられている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される二重鎖よりも高いＴmを有する、標的核酸との二重鎖を形成する。
【００４８】
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、及び／又は１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙらの米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号明細書；Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔら、Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５年１１月１１日；２３巻（２１号）：４３６３〜７０頁；Ｌｏａｋｅｓら、３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５年７月１１日；２３巻（１３号）：２３６１〜６頁；Ｌｏａｋｅｓ及びＢｒｏｗｎ、５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４年１０月１１日；２２巻（２０号）：４０３９〜４３頁。上述の文献の各々はそれらの塩基修飾に関する開示について参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４９】
ｅ．可逆的修飾
ある修飾をなして、標的細胞に到達する前のｉｎ  ｖｉｖｏ環境からオリゴヌクレオチドを保護することができるが、それらは、標的細胞のサイトゾルに到達するとオリゴヌクレオチドの効力又は活性を低減させる場合がある。分子が細胞の外部で望ましい特性を維持するように可逆的修飾をなすことができ、その後、可逆的修飾は、細胞のサイトゾル環境に進入すると除去される。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用により、又は細胞内部の化学条件により（例えば、細胞内グルタチオンによる還元により）除去することができる。
一部の実施形態では、可逆的に修飾されたヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間ジホスフェート連結により創出される負電荷を遮蔽し、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を向上させるように、環式ジスルフィド部分で化学的に修飾されている。元々はＴｒａｖｅｒｓａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．社に帰属する米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号明細書（「Ｔｒａｖｅｒｓａ」）、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｌｔｄ．社の国際公開第２０１５／１８８１９７号パンフレット（「Ｓｏｌｓｔｉｃｅ」）、Ｍｅａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、３２巻：１２５６〜１２６３頁（「Ｍｅａｄｅ」）、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ社の国際公開第２０１４／０８８９２０号パンフレットを参照されたい。これらの文献の各々は、そのような修飾の開示について参照により組み込まれる。ヌクレオチド間ジホスフェート連結のこの可逆的修飾は、サイトゾルの還元環境（例えば、グルタチオン）により細胞内で切断されるように設計されている。より初期の例としては、細胞内部で切断可能であることが報告された中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３年、１２５巻：９４０〜９５０頁）。
【００５０】
一部の実施形態では、そのような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ及び他の過酷な環境条件（例えば、ｐＨ）に曝されることになるｉｎ  ｖｉｖｏ投与中（例えば、血液及び／又は細胞のリソソーム／エンドソームコンパートメントを通過中）の保護を可能にする。グルタチオンのレベルが細胞外空間と比較してより高い細胞のサイトゾルへと放出されると、修飾は、元に戻り、その結果としてオリゴヌクレオチドが切断される。可逆的なグルタチオン感受性部分を使用すると、不可逆的化学修飾を使用する場合に利用可能な選択肢と比較して、立体的により大きな化学基を目的のオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。これは、そうしたより大きな化学基は、サイトゾルで除去されることになるため、細胞のサイトゾル内部のオリゴヌクレオチドの生物学的活性を妨害するはずがないからである。結果として、そうしたより大きな化学基を組み込んで、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び低免疫原性等の種々の利点をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに付与することができる。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分の構造を組み込んで、その放出の動力学を修飾することができる。
【００５１】
一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の２’炭素に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’−末端ヌクレオチドである場合、糖の５’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’−末端ヌクレオチドである場合、糖の３’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、２０１８年３月１日に公開された国際公開第２０１８／０３９３６４号パンフレット、及び２０１６年８月２３日に出願された、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆと題する米国特許仮出願第６２／３７８，６３５号明細書を参照されたい。これらの文献の内容は、その関連開示について参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
ｖ．標的指向性リガンド
一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを、１つ若しくは複数の細胞又は１つ若しくは複数の臓器に標的化することが望ましい場合がある。そのような戦略は、他の臓器における望ましくない効果の回避を支援することができるか、又はオリゴヌクレオチドにとって利益とならない可能性がある細胞、組織、若しくは臓器へのオリゴヌクレオチドの過度の喪失を回避することができる。従って、一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞、又は臓器の標的化を容易にするように、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされているヌクレオチドを含む。
標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質若しくはタンパク質の一部分（例えば、抗体又は抗体断片）、又は脂質を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的指向性リガンドはアプタマーである。例えば、標的指向性リガンドは、腫瘍血管系又は神経膠腫細胞を標的とするために使用されるＲＧＤペプチド、腫瘍血管系若しくはストーマ、トランスフェリン、ラクトフェリンを標的とするためのＣＲＥＫＡペプチド、又はＣＮＳ血管系で発現されるトランスフェリン受容体を標的とするためのアプタマー、又は神経膠腫細胞上のＥＧＦＲを標的とするための抗ＥＧＦＲ抗体であってもよい。ある実施形態では、標的指向性リガンドは、１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ部分である。
【００５３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、又は６個の）ヌクレオチドは各々、別々の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの２〜４個のヌクレオチドは各々、別々の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、標的指向性リガンドが歯ブラシの毛部分に相似し、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに相似するように、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の２〜４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端の２〜４個ヌクレオチドの突出又は伸長部分にコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端又は３’末端のいずれかにステム−ループを含んでいてもよく、ステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドは、例えば２０１６年６月２３日に公開された国際公開第２０１６／１００４０１号パンフレットに記載のような標的指向性リガンドに個々にコンジュゲートされていてもよい。この文献の関連内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
一部の実施形態では、ＣＴＮＮＢ１の発現を低減するオリゴヌクレオチドを、対象の肝臓の肝実質細胞に標的化することが望ましい、任意の好適な肝実質細胞指向性部分をこの目的に使用することができる。
ＧａｌＮＡｃは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む循環性糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を有するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する高親和性リガンドである。ＧａｌＮＡｃ部分を本開示のオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションすることにより（間接的又は直接的のいずれかで）、そうしたオリゴヌクレオチドを、そうした肝実質細胞上に発現されるＡＳＧＰＲへと標的化することができる。
一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価ＧａｌＮＡｃに直接的に又は間接的にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つよりも多くの一価ＧａｌＮＡｃに直接的に又は間接的にコンジュゲートされている（つまり、２つ、３つ、又は４つの一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされており、典型的には３つ又は４つの一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている）。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の二価ＧａｌＮＡｃ、三価ＧａｌＮＡｃ、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。
【００５５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、又は６個の）ヌクレオチドは各々、ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）の２〜４個のヌクレオチドは各々、別々のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛部分に相似し、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに相似するように、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の２〜４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端の２〜４個ヌクレオチドの突出又は伸長部分にコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端又は３’末端のいずれかにステム−ループを含んでいてもよく、ステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドは、個々にＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされている。例えば、各ＧａｌＮＡｃ部分が１個のヌクレオチドにコンジュゲートされる場合、４つのＧａｌＮＡｃ部分が、センス鎖のテトラループのヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。
【００５６】
適切な方法又は化学（例えば、クリック化学）を使用して、標的指向性リガンドをヌクレオチドに連結することができる。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、アセタールに基づくリンカーを使用して、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドにコンジュゲートされている。アセタールに基づくリンカーは、例えば、２０１６年６月２３日に公開された国際公開第２０１６１００４０１号Ａ１パンフレットに開示されている。そのようなリンカーに関するこの文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、リンカーは不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、かなり安定である。一部の実施形態では、二重鎖伸長部分（最大で３、４、５、又は６塩基対長）が、標的指向性リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）と二本鎖オリゴヌクレオチドとの間に提供されている。
【００５７】
ＩＩＩ．製剤
オリゴヌクレオチドの使用を容易にするための種々の製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑えるか、送達及び／若しくは取り込みを容易にするか、又は製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象又は細胞環境に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書には、ＣＴＮＮＢ１の発現を低減させるオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド）を含む組成物が提供される。そのような組成物は、標的細胞の直近環境に又は全身性のいずれかで対象に投与されると、十分な割合のオリゴヌクレオチドが細胞に進入して、ＣＴＮＮＢ１発現を低減するように好適に製剤化することができる。様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを使用して、本明細書で開示されるＣＴＮＮＢ１を低減するためのオリゴヌクレオチドを送達することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩溶液等の緩衝溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドで製剤化される。一部の実施形態では、ネイキッドオリゴヌクレオチド又はそれらのコンジュゲートは、水又は水溶液（例えば、ｐＨ調整剤を有する水）で製剤化される。一部の実施形態では、ネイキッドオリゴヌクレオチド又はそれらのコンジュゲートは、塩基性緩衝水溶液（例えば、ＰＢＳ）で製剤化される。
【００５８】
カチオン性脂質を有するオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）等のカチオン性脂質を使用することができる。好適な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社、ボールダー、コロラド州）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）が挙げられ、これらは全て製造業者の使用説明書に従って使用することができる。
従って、一部の実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、若しくはナノ粒子を含むか、又はそうでなければそれを必要とする対象の細胞、組織、臓器、若しくは体内に投与するために製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０１３年を参照）。
【００５９】
一部の実施形態では、本明細書で開示される製剤は、賦形剤を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、組成物に、安定性の向上、吸収の向上、溶解性の向上、及び／又は活性成分の治療増強を付与する。一部の実施形態では、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、又は水酸化ナトリウム）又はビヒクル（例えば、緩衝溶液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、又は鉱物油）である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その保管寿命を延長するために凍結乾燥され、その後使用（例えば、対象への投与）前に溶液にされる。従って、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つを含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はポリビニルピロリドン）、又は崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、フィコール、又はゼラチン）であってもよい。
一部の実施形態では、医薬組成物は、その意図されている投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、径粘膜、及び直腸内投与が挙げられる。典型的には、投与経路は、静脈内又は皮下である。
【００６０】
注射使用に好適な医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散物、及び無菌注射溶液又は分散物の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。静脈内投与又は皮下投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、パーシッパニー、ニュージャージー州）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいだろう。無菌注射溶液は、必要とされる量のオリゴヌクレオチドを、上記に列挙されている成分の１つ又は組合せを有する選択された溶媒に組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することにより調製することができる。
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１％又はそれよりも多くの治療剤（例えば、ＣＴＮＮＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチド）を含んでいてもよいが、活性成分のパーセンテージは、全組成物の質量又は容積の約１％〜約８０％又はそれよりも大きくてもよい。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品保管寿命等の要因、並びに他の薬学的考慮要因が、そのような医薬製剤を調製する当業者により企図されることになり、従って様々な投薬量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
幾つかの実施形態は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的送達に関するが、他の組織標的化も企図される。
【００６１】
ＩＶ．使用の方法
ｉ．細胞におけるＣＴＮＮＢ１発現の低減
一部の実施形態では、細胞でのＣＴＮＮＢ１の発現を低減させるための本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。本明細書で提供される方法は、任意の適切な細胞タイプに有用である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＴＮＮＢ１を発現するあらゆる細胞（例えば、肝実質細胞、マクロファージ、単球由来細胞、前立腺がん細胞、脳、内分泌組織、骨髄、リンパ節、肺、胆嚢、肝臓、十二指腸、小腸、膵臓、腎臓、胃腸管、膀胱、脂肪及び柔組織、並びに皮膚の細胞）である。一部の実施形態では、細胞は、対象から得られたものであり、細胞が実質的にその天然表現型特性を維持するように、継代の回数が限定的であってもよい初代細胞である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏであってもよく又はｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい（つまり、培養中の細胞に、又は細胞が存在する生物に送達することができる）。具体的な実施形態では、肝実質細胞においてのみＣＴＮＮＢ１の発現を低減させるための本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含む溶液を注射すること、オリゴヌクレオチドで覆われている粒子で衝撃すること、オリゴヌクレオチドを含む溶液を細胞又は生物と接触させること、又はオリゴヌクレオチドの存在下で細胞膜をエレクトロポレーションすることを含む、適切な核酸送達方法を使用して導入することができる。脂質媒介性担体輸送、化学媒介性輸送、及びリン酸カルシウム等のカチオン性リポソームトランスフェクション等の、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための他の適切な方法を使用することができる。
阻害の結果は、細胞又は対象の１つ又は複数の特性を評価するための適切なアッセイにより、又はＣＴＮＮＢ１発現を示す分子（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を評価する生化学的技法により確認することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドが、ＣＴＮＮＢ１の発現レベルを低減する程度は、発現レベル（例えば、ＣＴＮＮＢ１のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベル）を適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていないか又は陰性対照が送達されている細胞又は細胞集団でのＣＴＮＮＢ１発現のレベル）と比較することにより評価される。一部の実施形態では、ＣＴＮＮＢ１発現の適切な対照レベルは、対照レベルを毎回測定しなくともよいように、所定のレベル又は値であってもよい。所定のレベル又は値は、様々な形態をとることができる。一部の実施形態では、所定のレベル又は値は、中央値又は平均値等の、単一のカットオフ値であってもよい。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの投与は、細胞でのＣＴＮＮＢ１発現のレベルの低減をもたらす。一部の実施形態では、ＣＴＮＮＢ１発現レベルの低減は、ＣＴＮＮＢ１の適切な対照レベルと比較して、１％若しくはそれよりも低い、５％若しくはそれよりも低い、１０％若しくはそれよりも低い、１５％若しくはそれよりも低い、２０％若しくはそれよりも低い、２５％若しくはそれよりも低い、３０％若しくはそれよりも低い、３５％若しくはそれよりも低い、４０％若しくはそれよりも低い、４５％若しくはそれよりも低い、５０％若しくはそれよりも低い、５５％若しくはそれよりも低い、６０％若しくはそれよりも低い、７０％若しくはそれよりも低い、８０％若しくはそれよりも低い、又は９０％若しくはそれよりも低い低減であってもよい。適切な対照レベルは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞又は細胞集団でのＣＴＮＮＢ１発現レベルであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法による、細胞へのオリゴヌクレオチド送達の効果は、有限期間後に評価される。例えば、ＣＴＮＮＢ１のレベルは、オリゴヌクレオチドを細胞内に導入した少なくとも８時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後に、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は１４日後に、細胞で分析することができる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞でオリゴヌクレオチド（例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖）を発現するように遺伝子操作されている導入遺伝子の形態で送達される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示される任意のオリゴヌクレオチドを発現するように遺伝子操作されている導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、又は単純ヘルペスウイルス）又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミド又は合成ｍＲＮＡ）を使用して送達してもよい。一部の実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接注射してもよい。
【００６４】
ｉｉ．治療方法
本開示の態様は、対象の胆管減少症を治療するためにＣＴＮＮＢ１発現を低減するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象に本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を投与することを含んでいてもよい。そのような治療を使用して、例えば、対象の胆管及び／又は再生を促進し、それにより胆汁酸の排出を促進することができる。また、本治療は、例えば、対象の胆汁酸合成を阻害し、それにより肝臓損傷を低減するために使用することができる。本開示は、胆管減少症及び／又は胆管減少症に関連する疾患若しくは障害（例えば、アラジール症候群及び胆道閉鎖症を含む）のリスクがある（影響を受け易い）対象を治療するための予防法及び治療法の両方を提供する。
【００６５】
ある態様では、本開示は、対象に治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド又はそれをコードするベクター若しくは導入遺伝子）を投与することにより、本明細書に記載のような疾患又は障害を対象において予防するための方法を提供する。一部の実施形態では、治療しようとする対象は、例えば、肝臓におけるβ−カテニンタンパク質の量の低減から治療的に利益を得ることになる対象である。
本明細書に記載の方法は、典型的には、有効量の、すなわち望ましい治療結果をもたらすことが可能な量のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。治療的に許容される量は、疾患又は障害を治療することが可能な量であってもよい。任意の１つの対象にとって適切な投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間及び経路、全体的な健康、並びに同時に投与されている他の薬物を含むある要因に依存することになる。
【００６６】
一部の実施形態では、対象には、本明細書で開示される組成物のいずれか１つが、経腸的に（例えば、経口的に、経胃栄養チューブにより、十二指腸栄養チューブにより、胃瘻により、又は直腸的に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射又は注入、動脈内注射又は注入、筋肉内注射）、局所的に（例えば、上皮に、吸入により、目薬により、又は粘膜を介して）、又は標的臓器（例えば、対象の肝臓）への直接注射により投与される。典型的には、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、静脈内に又は皮下に投与される。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ）の範囲の用量で投与される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の、又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。
非限定的なセットの例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、典型的には、１年に１回、１年に２回、四半期毎に（３か月毎に１回）、２か月に１回（２か月毎に１回）、毎月、又は毎週投与されるだろう。
一部の実施形態では、治療しようとする対象は、ヒト又は非ヒト霊長類又は他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコ等の飼育動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリ等の家畜；並びにマウス、ラット、モルモット、及びハムスター等の動物が挙げられる。
【実施例】
【００６７】
実施例１：３，５−ジエトキシカルボニル−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）を給餌した胆管損傷マウスモデルにおけるＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド処置の評価
胆管上皮細胞分化に対するＣＴＮＮＢ１標的効果を決定するために、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに、０．１％の３，５−ジエトキシカルボニル−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）を給餌し、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（配列番号１に示されているセンス鎖配列及び配列番号２に示されているアンチセンス鎖配列を有する）で処置した。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、そのセンス鎖にあるテトラループ（−ＧＡＡＡ−）の４個ヌクレオチドの各々にコンジュゲートされた単一の一価ＧａｌＮａｃ部分、及びそのアンチセンス鎖の５’末端にホスフェート類似体を含むニック付きテトラループ構造を含んでいた。対照として、ＤＤＣ給餌マウスをＰＢＳで処置した。ＰＢＳ又はＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置したＤＤＣ給餌マウスに由来する肝臓切片に対して、胆管上皮マーカーＣＫ１９（図１及び図２）に対するウサギモノクローナル抗体（カタログ番号：ａｂ５２６２５、Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を使用して、免疫組織化学染色を実施した。図２では、ＰＢＳ又はＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置した通常餌のマウスに由来する肝臓切片も評価した。図２に示されているように、マウスに、週１回投薬し（０、７、１４、２１、２８、３５日目）、投薬３日後に犠牲にした。レジンキャストを使用して、対照ＰＢＳ又はＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置したＤＤＣ給餌マウスの胆管アーキテクチャーを可視化した（図５）。
【００６８】
図１に示されているように、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（配列番号１に示されているセンス鎖配列及び配列番号２に示されているアンチセンス鎖配列を有する）で２４日間処置したＤＤＣ給餌マウスに由来する肝臓切片は、ＰＢＳで処置した対照ＤＤＣマウスと比較して、ＣＫ１９陽性細胞数の増加を示した。同様の結果が、図２に示されている経時的研究で見出された。ＤＤＣ給餌は、ＣＫ１９染色の数の増加をもたらし、これは、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの第１の用量の１０日後、２４日後、及び３８日後に、ＰＢＳで処置したＤＤＣ給餌マウスに由来する肝臓切片と比較して、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（配列番号１に示されているセンス鎖配列及び配列番号２に示されているアンチセンス鎖配列を有する）で処置したＤＤＣ給餌マウスに由来する肝臓切片で更に増加する（図２）。また、ＰＢＳを受け取った対照マウスと比較して、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを受け取ったＤＤＣ給餌マウスで、より多くの小さな胆管が観察された（図５）。更に、ＣＫ１９陽性染色細胞の共局在化により明らかなように、新しい小さな胆管が十分に形成され、胆管系に接続しており、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置したＤＤＣ給餌マウスの総胆管にインク注入されている（図６）。従って、こうした結果は、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、ＤＤＣ給餌肝損傷マウスモデルにおいて胆管上皮細胞分化を誘導し、胆管再生を促進することを示唆する。
【００６９】
実施例２：Ｍｄｒ２-/-胆管損傷マウスモデルにおけるＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド処置の評価
ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（配列番号１に示されているセンス鎖配列及び配列番号２に示されているアンチセンス鎖配列）を、別の胆管損傷マウスモデルでも試験した（Ｍｄｒ２-/-マウス）。Ｍｄｒ２-/-マウスを、ＰＢＳ又はＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで６６日間処置した。処置したマウスに由来する肝臓切片を、胆管上皮マーカーＣＫ１９について染色した。ＰＢＳで処置したＭｄｒ２+/-マウスに由来する肝臓切片も分析した。
【００７０】
図３に示されているように、Ｍｄｒ２-/-マウスは、Ｍｄｒ２+/-マウスと比較して、ＣＫ１９染色の増加を示した。ＰＢＳで処置したＭｄｒ２-/-マウスと比較して、ＣＫ１９陽性細胞数の更なる増加が、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置したＭｄｒ２-/-マウスに由来する肝臓切片で検出された（図３）。従って、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、Ｍｄｒ２-/-マウスにおいても潜在的に胆管上皮細胞分化を誘導する。
【００７１】
実施例３：通常餌を給餌した野生型マウスにおけるＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド処置の評価。
胆管上皮細胞分化に対するＣＴＮＮＢ１標的化の効果を、野生型マウスでも評価した。ＣＤ−１マウスを、対照ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、又は１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで６週間にわたって週１回処置した（Ｑ１Ｗ×６）。その後、処置動物に由来する肝臓切片を、導管上皮マーカーＣＫ１９を認識する抗体で染色した。
図４に示されているように、ＰＢＳ処置マウスと比較して、１０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置した野生型マウスに由来する肝臓切片で、ＣＫ１９陽性細胞数の増加が観察された。こうした結果は、ＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡのＲＮＡ標的化が、野生型マウスにおいて潜在的に胆管上皮細胞分化を誘導することを示す。
【００７２】
実施例４：ＤＤＣ給餌胆管損傷マウスモデルにおける、胆汁合成に対するＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド処置の評価
胆汁合成に対するＣＴＮＮＢ１  ｍＲＮＡ標的化の効果を、ＤＤＣ給餌胆管損傷マウスモデルで特徴付けた。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ雌マウスを、３つの処置条件の１つに無作為化した。第１の群では、マウスに対照餌を給餌し、ＰＢＳで処置した。第２の群では、マウスに０．１％ＤＤＣ餌を給餌し、ＰＢＳで処置した。第３の群では、マウスに０．１％ＤＤＣ餌を給餌し、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置した。各処置群の肝臓での総胆汁酸濃度（図７Ａ）、胆汁流速（図７Ｂ）、及びｍＲＮＡ発現（図７Ｃ）を評価した。特に、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｙｐ７ａ１、Ｃｙｐ２７ａ、Ｃｙｐ８Ｂ１、及びＳｈｐ  ｍＲＮＡのレベルを測定した（図７Ｃ）。
図７Ａに示されているように、ＰＢＳ又はＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置したＤＤＣ給餌マウスは、対照餌を給餌したマウスと比較して、より低い胆汁酸濃度を有していた。総胆汁酸濃度が低減される傾向が、ＤＤＣ給餌マウスのＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド処置で観察された。図７Ｂに示されているように、胆汁流速は、対照餌を給餌したマウスと比較して、ＤＤＣ給餌マウスで増加した。β−カテニンＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによる処置は、ＤＤＣ給餌誘導性胆汁流速増加を部分的に正常化した。顕著には、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによるＤＤＣ給餌マウスの処置は、Ｃｙｐ７ａ１及びＣｙｐ２７ａの発現を低減した（図７Ｃ）。こうした結果は、胆管損傷マウスモデルにおいて、ＣＴＮＮＢ１  ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが胆汁酸合成を低減することを示す。
【００７３】
本明細書にて適切に例示的に記載されている本開示は、本明細書で具体的に開示されていない任意の１つ若しくは複数の要素、１つ若しくは複数の限定の非存在下で実施することができる。従って、例えば、本明細書中の各出現において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、説明のために使用されており、限定のためではない。そのような用語及び表現の使用において、図示及び説明されている特徴又はそれら部分のいかなる均等物も除外する意図はなく、特許請求されている本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されているが、当業者であれば、本明細書に開示されている概念の任意選択の特徴、改変、及び変異を実施することができ、そのような改変及び変異は、本明細書及び添付の特許請求の範囲により画定されている本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
加えて、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュ群又は選択肢の他のグループ化として記載されている場合、当業者であれば、本発明は、それによりマーカッシュ群又は他の群の任意の個々のメンバー又はメンバーの部分群としても記載されていることを認識するだろう。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は他の核酸の構造を説明する際に、配列表に示されている配列を参照することができることが認識されるべきである。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチド又は他の核酸は、指定の配列と比較して、１つ若しくは複数の代替ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ相当物又はＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相当物）、及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド、及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド間連結、及び／又は１つ若しくは複数の他の修飾を有していてもよいが、指定の配列と本質的に同じ又は同様の相補性特性を維持する。
【００７４】
本発明の説明の状況における（特に以下の特許請求の範囲の状況における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の指示物の使用は、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別様の記載のない限り、非限定的用語として解釈されるものとする（つまり、「含むが、それに限定されない」ことを意味する）。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書に別様の指定がない限り、その範囲内に入る各個別の値を個々に参照するための簡略的方法としての役割を果たすことが意図されているに過ぎず、各個別の値は、それが個々に本明細書に記載されているかの如く、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的文言（例えば、「等」）の使用は、本発明をより良好に説明することが意図されているに過ぎず、別様に特許請求されていない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の文言が、任意の特許請求されていない要素を、本発明の実施に不可欠であるものとして示していると解釈されるべきでない。
【００７５】
本発明の実施形態が本明細書に記載されている。そうした実施形態の変異は、当業者であれば、上述の説明を読むと明白になる場合がある。
本発明者らは、当業者がそのような変異を必要に応じて使用することを予想しており、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されているものとは別様に実施されることになることを意図している。従って、本発明は、準拠法により許容される、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載されている主題の改変及び均等物を全て含む。更に、それらの全ての考え得る変異における上記に記載の要素の任意の組合せは、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。当業者であれば、日常的なものを超える実験作業を使用することなく、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態の多数の均等物を認識することになるか又は確認することができるだろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021517909.tif 000013