(57)【要約】本明細書において、試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢ核酸のうちの少なくとも１つを検出するための組成物、キット、および方法が提供される。いくつかの実施形態では、１１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣまたは１８４Ｔ  ｔｃｄＣなどのｔｃｄＣの１つ以上の対立遺伝子が検出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物またはキットであって、フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーを含み、かつ第１および第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーの一方または両方をさらに含み、
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、第１のｔｃｄＣ配列に、その１１７位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されているが、第２のｔｃｄＣ配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、前記第１のｔｃｄＣ配列は、配列番号３の配列であり、前記第２のｔｃｄＣ配列は、配列番号４の配列であり、
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、第３のｔｃｄＣ配列の配列に、その１８４位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されているが、第４のｔｃｄＣ配列の配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、前記第３の配列は、配列番号５の配列であり、前記第４のｔｃｄＣ配列は、配列番号２の配列であり、
前記フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成され、前記ｔｃｄＣアンプリコンは、前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号３もしくは配列番号４の１１７位を含み、および／または前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号５の１８４位を含む、組成物またはキット。
【請求項２】
フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーと、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーおよび第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーの一方または両方と、フォワードおよびリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーと、少なくとも１つのｔｃｄＡ検出オリゴマーと、を含む、組成物であって、
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、配列番号３の配列である第１のｔｃｄＣ配列に、その１１７位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成され、
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、配列番号５の配列である第３のｔｃｄＣ配列に、その１８４位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成され、
前記フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成され、前記ｔｃｄＣアンプリコンは、前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号３の１１７位を含み、および／または前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号５の１８４位を含み、
前記フォワードおよびリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｔｃｄＡアンプリコンを生成するように構成され、
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、前記ｔｃｄＡアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、組成物。
【請求項３】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を検出する方法であって、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子は、１１７ｄｅｌ変異または１８４Ｔ変異を含み、前記方法は、
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むかまたはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むと疑われる試料をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物を調製することと、
前記組成物を増幅条件に供することと、
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーまたは前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーのうちの少なくとも１つが、ｔｃｄＣアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかを判定することにより、前記試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  １１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣ対立遺伝子または１８４Ｔ  ｔｃｄＣ対立遺伝子の存在を検出することと、を含む、方法。
【請求項４】
組成物またはキットであって、
（ｉ）第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーおよび第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマー、ならびに
（ｉｉ）第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーおよび第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマー、のいずれかまたは両方を含み、
前記少なくとも１つの第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、第１のｔｃｄＣ配列に、その１１７位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されたインベーダーオリゴマーであるが、第２のｔｃｄＣ配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、前記第１のｔｃｄＣ配列は、配列番号３の配列であり、前記第２のｔｃｄＣ配列は、配列番号４の配列であり、
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、存在する場合、前記第１のｔｃｄＣ配列の存在下で前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーと侵襲的切断基質を形成するように構成され、
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、第３のｔｃｄＣ配列の配列に、その１８４位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されているインベーダーオリゴマーであるが、第４のｔｃｄＣ配列の配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、前記第３のｔｃｄＣ配列は、配列番号５の配列であり、前記第４のｔｃｄＣ配列は、配列番号２の配列であり、
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、存在する場合、前記第３のｔｃｄＣ配列の存在下で前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーと侵襲的切断基質を形成するように構成されている、組成物またはキット。
【請求項５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を検出する方法であって、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子は、１１７ｄｅｌ変異または１８４Ｔ変異を含み、前記方法は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むかまたはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むと疑われる試料をさらに含む、請求項４に記載の組成物を調製することと、
前記組成物を侵襲的切断反応条件に供することと、
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブまたは前記第２のｔｃｄＣ一次プローブの少なくとも一方が切断を受けたかどうかを判定することにより、前記試料中の変異Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ配列の存在を検出することと、を含む、方法。
【請求項６】
前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子は、１１７ｄｅｌ変異および１８４Ｔ変異のうちの少なくとも１つを含む、請求項３または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、１１７ｄｅｌ変異ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成するように構成されている、請求項３、５、または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、１１７Ｔ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成されている、請求項３または５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、１１７Ｄ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成されている、請求項３または５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号８６〜９２、１８３、１９２、または１９３からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１０に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号８７〜９２のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１０または１１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号８８の配列を含む、請求項１２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１９２または１９３の配列を含む、請求項１０または１１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号８６の配列を含む、請求項１０または１１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１８３の配列を含む、請求項１０または１１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１７】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、配列番号８６〜９２、１８３、１９２、または１９３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドとミスマッチを有しない、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、配列番号８６または１８３の配列を含む、請求項１７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９】
前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、配列番号８７〜９２、１９２、または１９３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２０】
（ｉ）前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、配列番号８９〜９２のうちのいずれか１つの配列を含み、
（ｉｉ）前記組成物またはキットは、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーとは異なる、配列番号８９〜９２のうちのいずれか１つの配列を含む追加の第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーをさらに含む、請求項１９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２１】
前記組成物またはキットは、前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーの存在下で侵襲的切断構造を形成するように構成される少なくとも１つの第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーと、配列番号３の配列を含むポリヌクレオチドと、をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２２】
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号９３〜１３７または１８４〜１８７のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項２１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２３】
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１３８〜１８２または１８８〜１９１からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項２１または２２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２４】
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１１５の配列を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２５】
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１２２の配列を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２６】
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１８５の配列を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２７】
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、配列番号９３〜１３７または１８４〜１８７の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２８】
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、配列番号９３〜１３７または１８４〜１８７のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項２７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２９】
前記第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１３８〜１８２または１８８〜１９１のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３０】
前記１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、配列番号１３８〜１８２または１８８〜１９１のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項２９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３１】
前記方法は、１８４Ｔ変異ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成するように構成されている請求項３または５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在し、第３のｔｃｄＣ配列の配列に、その１８４位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されているが、第４のｔｃｄＣ配列の配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、前記第３のｔｃｄＣ配列が、配列番号５の配列であり、前記第４のｔｃｄＣ配列が、配列番号２の配列である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３３】
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１９４〜１９６または２０５のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項３２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３４】
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１９６の配列を含む、請求項３２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３５】
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２０５の配列を含む、請求項３２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３６】
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、配列番号１９４〜１９６または２０５の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３７】
前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、配列番号１９４〜１９６または２０５のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項３６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３８】
前記組成物またはキットは、前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーの存在下で侵襲的切断構造を形成するように構成されている少なくとも１つの第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーと、配列番号５の配列を含むポリヌクレオチドと、をさらに含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項３９】
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１９７〜２００、２０６〜２１２、または２３３〜２３７のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項３８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４０】
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２０１〜２０４、２１３〜２１９、または２３８〜２４２からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項３８または３９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４１】
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２００の配列を含む、請求項３９または４０に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４２】
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２０９の配列を含む、請求項３９または４０に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４３】
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、配列番号１９７〜２００、２０６〜２１２、または２３３〜２３７の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４４】
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、配列番号１９７〜２００、２０６〜２１２、または２３３〜２３７のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項４３に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４５】
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２０１〜２０４、２１３〜２１９、または２３８〜２４２のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４６】
前記第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、配列番号２０１〜２０４、２１３〜２１９、または２３８〜２４２のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項４５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項４７】
前記方法は、１１７Ｔ  １８４Ｃ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成されている、請求項３または５に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法は、１１７Ｄ  １８４Ｃ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物またはキットは、少なくともフォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーをさらに含み、前記フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、前記第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号３または配列番号４の１１７位を含むｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成され、および／または前記第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号５または配列番号２の１８４位を含むｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成されている、請求項４〜４８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５０】
前記第１の検出オリゴマーは、ｉＰｒｉｍｅｒであり、前記組成物またはキットは、第１の追加の増幅オリゴマーをさらに含み、前記ｉＰｒｉｍｅｒは、フォワード増幅オリゴマーであり、前記第１の追加の増幅オリゴマーが、リバース増幅オリゴマーであり、または前記ｉＰｒｉｍｅｒは、リバース増幅オリゴマーであり、前記第１の追加の増幅オリゴマーは、フォワード増幅オリゴマーであり、前記第１の追加の増幅オリゴマーおよび第１の検出オリゴマーは、配列番号３または配列番号４の１１７位を含むｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成されている、請求項４〜４８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５１】
前記第２の検出オリゴマーは、ｉＰｒｉｍｅｒであり、前記組成物またはキットは、第２の追加の増幅オリゴマーをさらに含み、前記ｉＰｒｉｍｅｒは、フォワード増幅オリゴマーであり、前記第２の追加の増幅オリゴマーは、リバース増幅オリゴマーであり、または前記ｉＰｒｉｍｅｒは、リバース増幅オリゴマーであり、前記第２の追加の増幅オリゴマーは、フォワード増幅オリゴマーであり、前記第２の追加の増幅オリゴマーおよび第２の検出オリゴマーは、配列番号５または配列番号２の１８４位を含むｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成されている、請求項４〜４８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５２】
前記フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２４３〜２４８のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１〜３または４９〜５１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５３】
前記フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２４３〜２４８からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１〜３または４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５４】
前記フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２４５の配列を含む、請求項５２または５３に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５５】
前記フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２４７の配列を含む、請求項５２または５３に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５６】
前記フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、配列番号２４３〜２４８のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１〜３または４９〜５５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５７】
前記フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、配列番号２４３〜２４８のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項５６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５８】
前記リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２４９〜２５９のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１〜３または４９〜５７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項５９】
前記リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２４９〜２５９からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１〜３または４９〜５８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６０】
前記リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２５５の配列を含む、請求項５８または５９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６１】
前記リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２５８の配列を含む、請求項５８または５９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６２】
前記リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、配列番号２４９〜２５９のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１〜３または４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６３】
前記リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、配列番号２４９〜２５９のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項６２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６４】
前記組成物またはキットは、少なくともフォワードおよびリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマー、および少なくとも１つのｔｃｄＡ検出オリゴマーをさらに含み、
前記フォワードおよびリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｔｃｄＡアンプリコンを生成するように構成され、
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、前記ｔｃｄＡアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１または３〜６３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６５】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、前記ｔｃｄＡアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかに少なくとも部分的に基づいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ病原性遺伝子座の存在を検出することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記フォワードまたはリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、ｉＰｒｉｍｅｒであり、前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、一次プローブである、請求項２〜６５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６７】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、一次プローブであり、前記組成物またはキットは、インベーダーオリゴマーをさらに含む、請求項２〜６５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６８】
前記フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号５９〜６０、６４、または６５のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項２〜６７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項６９】
前記フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号５９〜６０、６４、または６５からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項２〜６８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７０】
前記フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号６４の配列を含む、請求項６８または６９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７１】
前記フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号６５の配列を含む、請求項６８または６９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７２】
前記フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、配列番号５９〜６０、６４、または６５のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項２〜７１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７３】
前記フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、配列番号５９〜６０、６４、または６５のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７４】
前記リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号７０〜７３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項２〜７３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７５】
前記リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号７０〜７３からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項２〜７４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７６】
前記リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号７０の配列を含む、請求項７４または７５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７７】
前記リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号７２の配列を含む、請求項７４または７５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７８】
前記リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、配列番号７０〜７３のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項２〜７７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項７９】
前記リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、配列番号７０〜７３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８０】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する、配列番号５７、６１、６６、または６７のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項２〜９３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８１】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、ｔｃｄＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号５８、６２、６８、または６９からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項２〜８０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８２】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号６６の配列を含む、請求項８０または８１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８３】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号６７の配列を含む、請求項８０または８１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８４】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、配列番号５７、６１、６６、または６７のうちのいずれか１つのヌクレオチドの５’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個とミスマッチを有しない、請求項２〜８３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８５】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、配列番号５７、６１、６６、または６７のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項８４に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８６】
前記ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、配列番号５８、６２、６８、または６９のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項８４に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８７】
前記組成物またはキットは、ｔｃｄＡインベーダーオリゴマーをさらに含み、前記ｔｃｄＡインベーダーオリゴマーは、ｔｃｄＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号６３からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／または前記ｔｃｄＡインベーダーオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号６３の配列を含む、請求項２〜８６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８８】
前記ｔｃｄＡインベーダーオリゴマーは、配列番号６３のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項８７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項８９】
前記組成物またはキットは、フォワードおよびリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーをさらに含み、
前記フォワードおよびリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｔｃｄＢアンプリコンを生成するように構成され、
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、前記ｔｃｄＢアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項９０】
フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマー、追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマー、およびリバース増幅オリゴマーを含む組成物またはキットであって、前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２６０〜２７９または３３９からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／または前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２６０〜２７９または３３９のいずれか１つの配列を含み、前記追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２６０〜２７９または３３９からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／または前記追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２６０〜２７９または３３９のうちのいずれか１つを含み、前記追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーとは異なり、前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマー、追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマー、およびリバース増幅オリゴマーは、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｔｃｄＢアンプリコンを生成するように集合的に構成されている、組成物またはキット。
【請求項９１】
前記フォワードおよびリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、請求項９０に記載の通りであり、前記組成物またはキットは、請求項９０に記載の前記追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーをさらに含む、請求項８９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項９２】
ｔｃｄＢを検出する方法であって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むかまたはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むことが疑われる試料をさらに含む、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の組成物を調製することと、
前記組成物を増幅条件に供することと、
少なくとも１つのｔｃｄＢアンプリコンの存在を検出することと、を含む、方法。
【請求項９３】
前記組成物またはキットは、少なくとも１つのｔｃｄＢアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されているｔｃｄＢ検出オリゴマーをさらに含む、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項９４】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、前記ｔｃｄＢアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかに少なくとも部分的に基づいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ病原性遺伝子座の存在を検出することをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記フォワードまたはリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、ｉＰｒｉｍｅｒであり、前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、一次プローブである、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項９６】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、一次プローブであり、前記組成物またはキットは、インベーダーオリゴマーをさらに含む、請求項８９〜９５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項９７】
前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２６０〜２７９または３３９のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項８９〜９６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項９８】
前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２６０〜２７９または３３９からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項８９〜９７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項９９】
前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２７４の配列を含む、請求項９７または９８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１００】
前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２７７の配列を含む、請求項９７または９８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０１】
前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２７９の配列を含む、請求項９７または９８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０２】
前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３３９の配列を含む、請求項９７または９８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０３】
前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、配列番号２６０〜２７９または３３９のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項８９〜１０２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０４】
前記フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、配列番号２６０〜２７９または３３９のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１０３に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０５】
前記追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが存在し、配列番号２７４、２７７、２７９、または３３９のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項９０〜１０４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０６】
前記リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３１７〜３３８のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項８９〜１０５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０７】
前記リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号３１７〜３３８からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項８９〜１０６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０８】
前記リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３１７の配列を含む、請求項１０６または１０７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１０９】
前記リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３２４または３２５の配列を含み、任意選択で、前記組成物またはキットは、少なくとも２つのリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーを含み、最大２つのミスマッチを有する配列番号３２４の配列および最大２つのミスマッチを有する配列番号３２５の配列をそれぞれ含む、請求項１０６または１０７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１０】
前記リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３３６の配列を含む、請求項１０６または１０７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１１】
前記リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３３８の配列を含む、請求項１０６または１０７に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１２】
少なくとも１つまたは少なくとも２つのリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、配列番号３１７〜３３８のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項８９〜１１１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１３】
少なくとも１つまたは少なくとも２つのリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、配列番号３１７〜３３８のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１１２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１４】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８１〜２９８のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項９３〜１１３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１５】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２９９〜３１６からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項９３〜１１４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１６】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８５の配列を含む、請求項１１４または１１５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１７】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８７の配列を含む、請求項１１４または１１５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１８】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８８の配列を含む、請求項１１４または１１５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１１９】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、配列番号２８１〜２９８のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項９３〜１１８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２０】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、配列番号２８１〜２９８のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１１９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２１】
前記ｔｃｄＢ検出オリゴマーは、配列番号２９９〜３１６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１１９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２２】
前記組成物またはキットは、ｔｃｄＢインベーダーオリゴマーをさらに含み、前記ｔｃｄＢインベーダーオリゴマーは、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２８０からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／または前記ｔｃｄＢインベーダーオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８０の配列を含む、請求項９３〜１２１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２３】
前記ｔｃｄＢインベーダーオリゴマーは、配列番号２８０のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１２２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２４】
前記組成物またはキットは、フォワードおよびリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマー、および少なくとも１つのｃｄｔＢ検出オリゴマーをさらに含み、
前記フォワードおよびリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｃｄｔＢアンプリコンを生成するように構成され、
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、前記ｃｄｔＢアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１〜１２３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２５】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、前記ｃｄｔＢアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかに少なくとも部分的に基づいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｃｄｔ遺伝子座の存在を検出することをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記フォワードまたはリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、ｉＰｒｉｍｅｒであり、前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、一次プローブである、請求項１２４または１２５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２７】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、一次プローブであり、前記組成物またはキットは、インベーダーオリゴマーをさらに含む、請求項１２４または１２５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２８】
前記組成物またはキットは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３０〜３３または５５のうちのいずれか１つの配列を含むフォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーを含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１２９】
前記フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、ｃｄｔＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号３０〜３３または５５からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１２４〜１２８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３０】
前記フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３３の配列を含む、請求項１２８または１２９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３１】
前記フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３１の配列を含む、請求項１２８または１２９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３２】
前記フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、配列番号３０〜３３または５５のいずれかの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１２４〜１３１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３３】
前記フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、配列番号３０〜３３または５５のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１３２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３４】
前記組成物またはキットは、最大２つのミスマッチを有する配列番号４０〜４１、４９〜５０、または５６のいずれか１つの配列を含むリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーを含む、請求項１２４〜１３３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３５】
前記リバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、ｃｄｔＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号４０〜４１、４９〜５０、または５６からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１２４〜１３４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３６】
前記リバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号４０の配列を含む、請求項１３４または１３５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３７】
前記リバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号４１の配列を含む、請求項１３４または１３５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３８】
前記リバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号５６の配列を含む、請求項１３４または１３５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１３９】
少なくとも１つまたは少なくとも２つのリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーは、配列番号４０〜４１、４９、５０、または５６のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１２４〜１３８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４０】
前記組成物またはキットは、配列番号４０〜４１、４９、５０、または５６のうちのいずれか１つの配列を含むリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーを含む、請求項１３９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４１】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３４〜３６、４３〜４５、５１、または５２のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１２４〜１４０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４２】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、ｃｄｔＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号３７〜３９、４６〜４８、５３、または５４からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１２４〜１４１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４３】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３４の配列を含む、請求項１４１または１４２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４４】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号３５の配列を含む、請求項１４１または１４２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４５】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号５１の配列を含む、請求項１４１または１４２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４６】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、配列番号３４〜３６、４３〜４５、５１、または５２のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１２４〜１４５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４７】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、配列番号３４〜３６、４３〜４５、５１、または５２のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１４６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４８】
前記ｃｄｔＢ検出オリゴマーは、配列番号３７〜３９、４６〜４８、５３、または５４のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１４６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１４９】
前記組成物またはキットは、ｃｄｔＢインベーダーオリゴマーをさらに含み、前記ｃｄｔＢインベーダーオリゴマーは、ｃｄｔＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号４２からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／または前記ｃｄｔＢインベーダーオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号４２の配列を含む、請求項１２４〜１４８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５０】
前記ｃｄｔＢインベーダーオリゴマーは、配列番号４２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１４９に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５１】
前記組成物またはキットは、フォワードおよびリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマー、および少なくとも１つのｃｄｔＡ検出オリゴマーをさらに含み、
前記フォワードおよびリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーは、８０〜４００ヌクレオチドサイズを有するｃｄｔＡアンプリコンを生成するように構成され、
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、前記ｃｄｔＡアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１〜１５０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５２】
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、前記ｃｄｔＡアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかに少なくとも部分的に基づいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｃｄｔ遺伝子座の存在を検出することをさらに含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記フォワードまたはリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーは、ｉＰｒｉｍｅｒであり、前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、一次プローブである、請求項１５１または１５２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５４】
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、一次プローブであり、前記組成物またはキットは、インベーダーオリゴマーをさらに含む、請求項１５１または１５２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５５】
前記組成物またはキットは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１３の配列を含むフォワードｃｄｔＡ増幅オリゴマーを含む、請求項１５１〜１５４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５６】
前記フォワードｃｄｔＡ増幅オリゴマーは、ｃｄｔＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１３からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１５１〜１５５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５７】
前記フォワードｃｄｔＡ増幅オリゴマーは、配列番号１３のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しないか、または配列番号１３の配列を含む、請求項１５１〜１５６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５８】
前記組成物またはキットは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２１〜２９のうちのいずれか１つの配列を含むリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーを含む、請求項１５１〜１５７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１５９】
前記リバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーは、ｃｄｔＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２１〜２９からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１５１〜１５８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６０】
少なくとも１つまたは少なくとも２つのリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーは、配列番号２１〜２９のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１５１〜１５９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６１】
前記組成物またはキットは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１６または１７のうちのいずれか１つの配列を含むｃｄｔＡ検出オリゴマーを含む、請求項１５１〜１６０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６２】
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、ｃｄｔＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１８〜２０からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項１５１〜１６１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６３】
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１６の配列を含む、請求項１６１または１６２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６４】
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１７の配列を含む、請求項１６１または１６２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６５】
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、配列番号１６または１７のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１５１〜１６４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６６】
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、配列番号１６または１７の配列を含む、請求項１６５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６７】
前記ｃｄｔＡ検出オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１８〜２０のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１６５に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６８】
前記組成物またはキットは、ｃｄｔＡインベーダーオリゴマーをさらに含み、前記ｃｄｔＡインベーダーオリゴマーは、ｃｄｔＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１４または１５からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／または前記ｃｄｔＡインベーダーオリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号１４または１５の配列を含む、請求項１５１〜１６７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１６９】
前記ｃｄｔＡインベーダーオリゴマーは、配列番号１４または１５のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、請求項１６８に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１７０】
配列番号１８〜２０、３７〜３９、４６〜４８、５３、５４、５８、６２、６８、６９、１３８〜１８２、１８８〜１９１、２０１〜２０４、２１３〜２１９、２３８〜２４２、または２９９〜３１６のいずれか１つの７〜１８位に示される配列を含む検出オリゴマーであって、前記検出オリゴマーは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢ核酸に特異的にハイブリダイズするための十分な追加の配列をさらに含む、検出オリゴマー。
【請求項１７１】
配列番号１６、１７、３４〜３６、４３〜４５、５１、５２、５７、６１、６６、６７、９３〜１３７、１８４〜１８７、１９７〜２００、２０６〜２１２、２３３〜２３７、または２８１〜２９８のいずれか１つに示される配列の逆相補鎖に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項１７０に記載の検出オリゴマー。
【請求項１７２】
最大２つのミスマッチを有する配列番号１６、１７、３４〜３６、４３〜４５、５１、５２、５７、６１、６６、６７、９３〜１３７、１８４〜１８７、１９７〜２００、２０６〜２１２、２３３〜２３７、または２８１〜２９８のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１７０または１７１に記載の検出オリゴマー。
【請求項１７３】
配列番号１６、１７、３４〜３６、４３〜４５、５１、５２、５７、６１、６６、６７、９３〜１３７、１８４〜１８７、１９７〜２００、２０６〜２１２、２３３〜２３７、または２８１〜２９８のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項１７２に記載の検出オリゴマー。
【請求項１７４】
最大２つのミスマッチを有する配列番号１８〜２０、３７〜３９、４６〜４８、５３、５４、５８、６２、６８、６９、１３８〜１８２、１８８〜１９１、２０１〜２０４、２１３〜２１９、２３８〜２４２、または２９９〜３１６のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項１７０〜１７３のいずれか一項に記載の検出オリゴマー。
【請求項１７５】
配列番号１８〜２０、３７〜３９、４６〜４８、５３、５４、５８、６２、６８、６９、１３８〜１８２、１８８〜１９１、２０１〜２０４、２１３〜２１９、２３８〜２４２、または２９９〜３１６のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１７４に記載の検出オリゴマー。
【請求項１７６】
少なくとも１つの検出オリゴマーは、伸長不能である、請求項１〜８９または９３〜１７５のいずれか一項に記載の組成物、キット、方法、または検出オリゴマー。
【請求項１７７】
少なくとも１つの検出オリゴマーは、標識を含む、請求項１〜８９または９３〜１７６のいずれか一項に記載の組成物、キット、方法、または検出オリゴマー。
【請求項１７８】
少なくとも１つの検出オリゴマーは、１５〜５５ヌクレオチド長を有する、請求項１〜８９または９３〜１７７のいずれか一項に記載の組成物、キット、方法、または検出オリゴマー。
【請求項１７９】
請求項１７０〜１７８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの検出オリゴマーおよび少なくとも１つの二次検出オリゴマーを含む組成物またはキットであって、前記二次検出オリゴマーは、少なくとも１つの標識を含み、前記検出オリゴマーの断片と相互作用するように構成されている、組成物またはキット。
【請求項１８０】
前記組成物またはキットは、標識を含み、前記検出オリゴマーの断片と相互作用するように構成されている、少なくとも１つの二次検出オリゴマーをさらに含む、請求項１〜８９または９３〜１６９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８１】
前記二次検出オリゴマーは、少なくとも２つの標識を含む、請求項１７９または１８０に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８２】
前記少なくとも２つの標識は、ＦＲＥＴ対を含む、請求項１８１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８３】
前記少なくとも２つの標識は、クエンチャーを含む、請求項１８１または１８２に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８４】
前記検出オリゴマーの断片は、少なくとも６ヌクレオチドの５’末端フラップである、請求項１７９〜１８３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８５】
前記１つ以上の二次検出オリゴマーは、ＦＲＥＴカセットである、請求項１８４に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８６】
前記キットまたは組成物は、請求項８９、９３〜９６、または１１４〜１２３のいずれか一に記載の少なくともｔｃｄＢ一次検出オリゴマー、および請求項２または８０〜８６のいずれか一項に記載のｔｃｄＡ一次検出オリゴマーを含み、前記１つ以上の二次検出オリゴマーは、ｔｃｄＢ核酸の存在下およびｔｃｄＡ核酸の存在下で、正のシグナルを生成するように構成されている前記二次検出オリゴマーを含む、請求項１８０〜１８４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８７】
前記キットまたは組成物は、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の少なくとも第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマー、および請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーを含み、前記１つ以上の二次検出オリゴマーは、１１７ｄｅｌ変異を含むｔｃｄＣ対立遺伝子の存在下および１８４Ｔ変異を含むｔｃｄＣ対立遺伝子の存在下で、正のシグナルを生成するように構成されている二次検出オリゴマーを含む、請求項１８０〜１８６のいずれか一項に記載の組成物、キットまたは方法。
【請求項１８８】
前記１つ以上の二次検出オリゴマーは、配列番号１０の配列を含む二次検出オリゴマーを含む、請求項１８０〜１８７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１８９】
前記１つ以上の二次検出オリゴマーは、配列番号１１の配列を含む二次検出オリゴマーを含む、請求項１８０〜１８８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９０】
前記１つ以上の二次検出オリゴマーは、配列番号１２の配列を含む二次検出オリゴマーを含む、請求項１８０〜１８９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９１】
前記組成物またはキットは、３’末端侵襲的により形成される３本鎖構造に対する構造特異的活性を有するヌクレアーゼを含む、請求項１〜１６９または１７６〜１９０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９２】
前記組成物またはキットは、クリベースまたは５’ヌクレアーゼを含む、請求項１〜１６９または１７６〜１９１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９３】
前記組成物またはキットは、ＦＥＮ１ヌクレアーゼを含む、請求項１〜１６９または１７６〜１９２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９４】
前記組成物またはキットは、ポリメラーゼを含む、請求項１〜１６９または１７６〜１９３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９５】
前記組成物またはキットは、ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１〜１６９または１７６〜１９４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９６】
前記組成物またはキットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１〜１６９または１７６〜１９５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９７】
前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼである、請求項１９６に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９８】
前記組成物またはキットは、ＮＴＰを含む、請求項１〜１６９または１７６〜１９７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項１９９】
前記組成物またはキットは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む、請求項１〜１６９または１７６〜１９８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２００】
少なくとも１つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を検出する方法であって、
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸もしくは少なくとも１つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンを含むかまたはそれらを含むことが疑われる試料をさらに含む、請求項１７６〜１９９のいずれか一項に記載の組成物または請求項１７０〜１７５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの検出オリゴマーを含む組成物を調製することと、
ハイブリダイゼーションアッセイを行うことによって、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸または前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンの存在を検出することと、前記検出オリゴマーは、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸または前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかを判定することと、を含む、方法。
【請求項２０１】
前記組成物は、請求項１７９〜１９０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの二次検出オリゴマーを含み、前記方法は、前記検出オリゴマーは、前記検出オリゴマーを構造特異的ヌクレアーゼに曝露することによって、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸または前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンに少なくとも部分的にハイブリダイズしたかどうかを判定することと、前記構造特異的ヌクレアーゼによって生成された前記検出オリゴマーの断片は、前記二次検出オリゴマーと相互作用するかどうかを判定することと、を含む、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記検出オリゴマーの断片は、５’末端フラップである、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記組成物は、前記検出オリゴマーのハイブリダイゼーション部位と重複する前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸または前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンの部位にハイブリダイズする少なくとも１つの侵襲的オリゴマーをさらに含み、前記検出オリゴマーおよび前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸または前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンの存在下で、前記構造特異的ヌクレアーゼによる切断について認識される構造を形成する、請求項２００〜２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記侵襲的オリゴマーは、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸または前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンへのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１４、１５、４０〜４２、６３〜６５、７４〜７６、８６〜９２、１８３、１９２〜１９６、２０５、２２０、２２１、２２３〜２２５、２６０〜２８０、または３１７のうちのいずれか１つの配列からなる配列を有するオリゴマーと競合する、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
前記侵襲的オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する、配列番号１４、１５、４０〜４２、６３〜６５、７４〜７６、８６〜９２、１８３、１９２〜１９６、２０５、２２０、２２１、２２３〜２２５、２６０〜２８０、または３１７のいずれか１つの配列を含む配列を有する、請求項２１７または２１８に記載の方法。
【請求項２０６】
前記少なくとも１つのオリゴマーは、少なくとも１つのメチル化シトシンを含む、請求項１〜２０５のいずれか一項に記載の組成物、キット、検出オリゴマー、または方法。
【請求項２０７】
前記配列番号の配列は、配列表に示されるアデニンメチル化を含む、請求項１〜２０６のいずれか一項に記載の組成物、キット、検出オリゴマー、または方法。
【請求項２０８】
前記配列番号の配列は、配列表に示されるシトシンメチル化を含む、請求項１〜２０７のいずれか一項に記載の組成物、キット、検出オリゴマー、または方法。
【請求項２０９】
水性であるか、凍結されているか、もしくは凍結乾燥されているか、または少なくとも１つのオリゴマーが固体基質に結合されている、請求項１〜２、４、１０〜３０、３２〜４６、４９〜６４、６６〜９１、９３、９５〜１２４、１２６〜１５１、１５３〜１６９、１７９〜１９９、もしくは２０６〜２０８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１７０〜１７５のいずれか一項に記載の検出オリゴマーを含む組成物。
【請求項２１０】
試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢ核酸のうちの少なくとも１つを検出するための説明書をさらに含む、請求項１〜２、４、１０〜３０、３２〜４６、４９〜６４、６６〜９１、９３、９５〜１２４、１２６〜１５１、１５３〜１６９、１７９〜１９９、または２０６〜２０９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１１】
試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢ核酸のうちの少なくとも１つを検出するための、請求項１〜２、４、１０〜３０、３２〜４６、４９〜６４、６６〜９１、９３、９５〜１２４、１２６〜１５１、１５３〜１６９、１７９〜１９９、もしくは２０６〜２１０のいずれか一項に記載の組成物もしくはキットの使用、または請求項１７０〜１７５のいずれか一項に記載の検出オリゴマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮出願第６２／５９９，４９４号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、電子形式の配列表と共に提出される。配列表は、２０１８年１２月１３日に作成された「２０１８−１２−１３＿０１１５９−００１５−００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という表題のファイルとして提供され、そのサイズは１１４ＫＢである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
導入部および概要
本明細書の実施形態は、より具体的には、毒素産生Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を検出するための組成物および方法を使用することにより、感染性因子を検出する分野に関する。本明細書で使用されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅと同義である。
【０００４】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、胃腸感染症、抗生物質関連下痢を含む下痢、偽膜性大腸炎の原因となるグラム陽性菌である。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、無症候で個体にコロニーを形成し得る。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、熱、抗生物質への暴露などを含む、栄養細菌を死滅させる多くの条件に耐性がある胞子を形成するための胞子形成（ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ）を行い得る。そのため、患者の消化管中の胞子（無症候性のコロニー形成とは対照的に、症候性感染に関連する場合とそうでない場合がある）は、抗生物質治療を生き延びた後に発芽して、その後の病気を引き起こし得る。糞便中に排泄され、また土壌中に天然で発生するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子を不活性化させることが困難であることは、消毒液および紫外線処理などのいくつかの除染手順が効果的ではない場合があり、したがって、糞便または土壌に曝露された後に汚染が持続し、感染の拡大に役立ち得ることを意味する。
【０００５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株は、下痢および他の症状の原因となる様々な毒素を産生し得る。これらには、それぞれｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ遺伝子によってコードされ、病原性遺伝子座に見出される毒素Ａおよび毒素Ｂ、ならびにＣｄｔ遺伝子座中のｃｄｔＡおよびｃｄｔＢ遺伝子によってコードされる２つのサブユニットを有する２成分毒素が含まれる。全ての毒素遺伝子が、全ての株で発生するわけではない。非毒素産生菌株は、毒素を発現せず、動物のデータに基づくと、おそらく胃腸管でのコロニー形成のために病原性菌株と競合することによって保護効果をもたらすことが示唆されている。毒素ＡおよびＢは、２成分毒素よりも早期に特徴付けられ、歴史的には病原性に必要であると考えられていたが、毒素Ｂに陰性であるＲＡ０９−７０と命名された株で、病原性が最近報告された。ＰｕｂＭｅｄ  ＣｅｎｔｒａｌでＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４５９７２１４として入手可能なＭｏｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１５；５：１５０２３を参照されたい。
【０００６】
さらに、ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢの発現の調節因子をコードするｔｃｄＣ遺伝子の特定の変異は、毒素ＡおよびＢレベルの増加ならびに高病原性の表現型をもたらし得る。比較的最近のいくつかの報告では、２成分毒素が、いくつかの場合では、毒素ＡおよびＢの不存在下で大腸炎を引き起こすのに十分であり得ることが示されている。Ｃｄｔ遺伝子座および病原性遺伝子座の両方の存在はまた、より重篤な疾患に関連している。
【０００７】
特に高病原性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含む毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの迅速かつ信頼できる同定は、感染した対象の治療するため、ならびに抗生物質療法ならびに厳格な消毒および衛生予防策などの他の感染症対策を含む細菌感染の拡大を封じ込みおよび抑制するための、両方の適切な応答を促進するために重要である。したがって、毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの迅速かつ信頼できる核酸ベースの検出のための組成物および方法が望ましい。
【０００８】
しかしながら、核酸に基づくＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの検出は、いくつかの要因により複雑となっている。上記のように、非毒素産生株は疾患を引き起こすとは考えられず、防御的である場合があるので、核酸ベースの手法は、論理的には、遺伝子型が高病原性の原因であり得る毒素コード遺伝子およびｔｃｄＣに着目している。他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｓｏｌｄｅｌｌｉ）は、関連する毒素遺伝子を保有し得るため、他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種由来の配列との交差反応が問題になり得る。さらに、ＰａＬｏｃおよびＣｄｔＬｏｃに存在する遺伝子の多くの異なる対立遺伝子が、異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に存在するため、検出がさらに複雑になり得る。例えば、ｔｃｄＢの配列バリアントは、増幅または検出オリゴマーと十分にハイブリダイズできない場合、偽陰性になり得る。さらなる例として、１１７位の少なくとも４つのｔｃｄＣ変異体が記載されており、そのうちの１つだけが高病原性をもたらす。高病原性と関連するｔｃｄＣの対立遺伝子を特異的に検出するための努力がなされてきたが、これらは誤った結果となる場合がある。例えば、１１７Ｔ  ｔｃｄＣ対立遺伝子は高病原性を促進しないが、いくつかのアッセイでは、高病原性を示す偽正のシグナルが発生する場合がある。さらに、いくつかのアッセイでは、高病原性に関連する２つのｔｃｄＣ対立遺伝子である１１７ｄｅｌと１８４Ｔが検出されず、これにより、アッセイが偽陰性の結果となる傾向となる。
【０００９】
したがって、種内異質性にもかかわらず毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの正確な同定に使用し得、高病原性に関連する対立遺伝子と高病原性に関連しない対立遺伝子とを区別し、それにより、高病原性株および非高病原性株の同定に役立ち得る、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素および毒素関連標的配列の様々な対立遺伝子の迅速かつ感度の高い増幅を提供し得る組成物および方法が必要とされている。本開示は、これらの必要性を満たすこと、他の利益を提供すること、または少なくとも公衆に有用な選択を提供することを目的としている。
【００１０】
本明細書では、以下の実施形態が提供される。実施形態１は、フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーを含み、第１および第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーの一方または両方をさらに含む組成物またはキットであって、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、第１のｔｃｄＣ配列に、その１１７位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されているが、第２のｔｃｄＣ配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、第１のｔｃｄＣ配列は、配列番号３の配列であり、第２のｔｃｄＣ配列は、配列番号４の配列であり、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、第３のｔｃｄＣ配列の配列に、その１８４位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されているが、第４のｔｃｄＣ配列の配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、第３の配列は、配列番号５の配列であり、第４のｔｃｄＣ配列は、配列番号２の配列であり、フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成され、ｔｃｄＣアンプリコンは、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号３もしくは配列番号４の１１７位を含み、および／または第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号５の１８４位を含む、組成物またはキットである。
【００１１】
実施形態２は、フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマー、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーおよび第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーの一方または両方、フォワードおよびリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマー、および少なくとも１つのｔｃｄＡ検出オリゴマーを含む組成物であって、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、配列番号３の配列である第１のｔｃｄＣ配列に、その１１７位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成され、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、配列番号５の配列である第３のｔｃｄＣ配列に、その１８４位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成され、フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成され、ｔｃｄＣアンプリコンは、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号３の１１７位を含み、および／または第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号５の１８４位を含み、フォワードおよびリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーは、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｔｃｄＡアンプリコンを生成するように構成され、ｔｃｄＡ検出オリゴマーは、ｔｃｄＡアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、組成物である。
【００１２】
実施形態３は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を検出する方法であって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子は、１１７ｄｅｌ変異または１８４Ｔ変異を含み、方法は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むかまたはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むと疑われる試料をさらに含む、実施形態１または２に記載の組成物を調製することと、組成物を増幅条件に供することと、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーまたは第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーのうちの少なくとも１つが、ｔｃｄＣアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかをすることにより、判定試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  １１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣ対立遺伝子または１８４Ｔ  ｔｃｄＣ対立遺伝子の存在を検出することと、を含む、方法である。
【００１３】
実施形態４は、（ｉ）第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーおよび第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマー、ならびに（ｉｉ）第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーおよび第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーのいずれかまたは両方を含む組成物またはキットであって、少なくとも１つの第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、第１のｔｃｄＣ配列に、その１１７位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されたインベーダーオリゴマーであるが、第２のｔｃｄＣ配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、第１のｔｃｄＣ配列は、配列番号３の配列であり、第２のｔｃｄＣ配列は、配列番号４の配列であり、第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、存在する場合、第１のｔｃｄＣ配列の存在下で第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーと侵襲的切断基質を形成するように構成され、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーは、存在する場合、第３のｔｃｄＣ配列の配列に、その１８４位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されているインベーダーオリゴマーであるが、第４のｔｃｄＣ配列の配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、第３のｔｃｄＣ配列は、配列番号５の配列であり、第４のｔｃｄＣ配列は、配列番号２の配列であり、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーは、存在する場合、第３のｔｃｄＣ配列の存在下で第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーと侵襲的切断基質を形成するように構成されている、組成物またはキットである。
【００１４】
実施形態５は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を検出する方法であって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子は、１１７ｄｅｌ変異または１８４Ｔ変異を含み、方法は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むかまたはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むと疑われる試料をさらに含む、実施形態４に記載の組成物を調製することと、組成物を侵襲的切断反応条件に供することと、第１のｔｃｄＣ一次プローブまたは第２のｔｃｄＣ一次プローブの少なくとも一方が切断を受けたかどうかをすることにより、判定試料中の変異Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ配列の存在を検出することと、を含む、方法である。
【００１５】
実施形態６は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣ対立遺伝子が、１１７ｄｅｌ変異および１８４Ｔ変異のうちの少なくとも１つを含む、実施形態３または５のいずれか一項に記載の方法である。
【００１６】
実施形態７は、１１７ｄｅｌ変異ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成するように構成されている、実施形態３、５、または６のいずれか一項に記載の方法である。
【００１７】
実施形態８は、１１７Ｔ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成されている、実施形態３または５〜７のいずれか一項に記載の方法である。
【００１８】
実施形態９は、１１７Ｄ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成されている、実施形態３または５〜８のいずれか一項に記載の方法である。
【００１９】
実施形態１０は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２０】
実施形態１１は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号８６〜９２、１８３、１９２、または１９３からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１０に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２１】
実施形態１２は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号８７〜９２のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１０または１１に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２２】
実施形態１３は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号８８の配列を含む、実施形態１２に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２３】
実施形態１４は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１９２または１９３の配列を含む、実施形態１０または１１に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２４】
実施形態１５は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号８６の配列を含む、実施形態１０または１１に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２５】
実施形態１６は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１８３の配列を含む、実施形態１０または１１に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２６】
実施形態１７は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、配列番号８６〜９２、１８３、１９２、または１９３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２７】
実施形態１８は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、配列番号８６または１８３の配列を含む、実施形態１７に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２８】
実施形態１９は、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、配列番号８７〜９２、１９２、または１９３のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１１に記載の組成物、キット、または方法である。
【００２９】
実施形態２０は、（ｉ）第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、配列番号８９〜９２のうちのいずれか１つの配列を含み、（ｉｉ）組成物またはキットが、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーとは異なる、配列番号８９〜９２のうちのいずれか１つの配列を含む追加の第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーをさらに含む、実施形態１９に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３０】
実施形態２１は、組成物またはキットが、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーの存在下で侵襲的切断構造を形成するように構成される少なくとも１つの第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーと、配列番号３の配列を含むポリヌクレオチドと、をさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３１】
実施形態２２は、第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号９３〜１３７または１８４〜１８７のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態２１に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３２】
実施形態２３は、第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１３８〜１８２または１８８〜１９１からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態２１または２２に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３３】
実施形態２４は、第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１１５の配列を含む、実施形態２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３４】
実施形態２５は、第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１２２の配列を含む、実施形態２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３５】
実施形態２６は、第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１８５の配列を含む、実施形態２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３６】
実施形態２７は、第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、配列番号９３〜１３７または１８４〜１８７の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態２１〜２６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３７】
実施形態２８は、第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、配列番号９３〜１３７または１８４〜１８７のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態２７に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３８】
実施形態２９は第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１３８〜１８２または１８８〜１９１のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態２１〜２８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００３９】
実施形態３０は、１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、配列番号１３８〜１８２または１８８〜１９１のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態２９に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４０】
実施形態３１は、１８４Ｔ変異ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成するように構成されている実施形態３または５〜３０のいずれか一項に記載の方法である。
【００４１】
実施形態３２は、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在し、第３のｔｃｄＣ配列の配列に、その１８４位を含む部位で特異的にハイブリダイズするように構成されているが、第４のｔｃｄＣ配列の配列とは明らかに異なるハイブリダイゼーションを示し、第３のｔｃｄＣ配列が、配列番号５の配列であり、第４のｔｃｄＣ配列が、配列番号２の配列である、実施形態１〜３１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４２】
実施形態３３は、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１９４〜１９６または２０５のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態３２に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４３】
実施形態３４は、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１９６の配列を含む、実施形態３２に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４４】
実施形態３５は、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２０５の配列を含む、実施形態３２に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４５】
実施形態３６は、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、配列番号１９４〜１９６または２０５の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態３２〜３５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４６】
実施形態３７は、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが、配列番号１９４〜１９６または２０５のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態３６に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４７】
実施形態３８は、組成物またはキットが、第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーの存在下で侵襲的切断構造を形成するように構成されている少なくとも１つの第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーと、配列番号５の配列を含むポリヌクレオチドと、をさらに含む、実施形態３２〜３７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４８】
実施形態３９は、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１９７〜２００、２０６〜２１２、または２３３〜２３７のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態３８に記載の組成物、キット、または方法である。
【００４９】
実施形態４０は、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２０１〜２０４、２１３〜２１９、または２３８〜２４２からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態３８または３９に記載の組成物、キット、または方法である。
【００５０】
実施形態４１は、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２００の配列を含む、実施形態３９または４０に記載の組成物、キット、または方法である。
【００５１】
実施形態４２は、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２０９の配列を含む、実施形態３９または４０に記載の組成物、キット、または方法である。
【００５２】
実施形態４３は、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、配列番号１９７〜２００、２０６〜２１２、または２３３〜２３７の５’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態３８〜４２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００５３】
実施形態４４は、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、配列番号１９７〜２００、２０６〜２１２、または２３３〜２３７のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態４３に記載の組成物、キット、または方法である。
【００５４】
実施形態４５は、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２０１〜２０４、２１３〜２１９、または２３８〜２４２のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態３８〜４４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００５５】
実施形態４６は、第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーが、配列番号２０１〜２０４、２１３〜２１９、または２３８〜２４２のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態４５に記載の組成物、キット、または方法である。
【００５６】
実施形態４７は、１１７Ｔ  １８４Ｃ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成されている、実施形態３または５に記載の方法である。
【００５７】
実施形態４８は、１１７Ｄ  １８４Ｃ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成されている、実施形態４７に記載の方法である。
【００５８】
実施形態４９は、組成物またはキットが、少なくともフォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーをさらに含み、フォワードおよびリバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、第１のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号３または配列番号４の１１７位を含むｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成され、および／または第２のｔｃｄＣ検出オリゴマーが存在する場合、配列番号５または配列番号２の１８４位を含むｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成されている、実施形態４〜４８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００５９】
実施形態５０は、第１の検出オリゴマーが、ｉＰｒｉｍｅｒであり、組成物またはキットが、第１の追加の増幅オリゴマーをさらに含み、ｉＰｒｉｍｅｒが、フォワード増幅オリゴマーであり、第１の追加の増幅オリゴマーが、リバース増幅オリゴマーであり、またはｉＰｒｉｍｅｒが、リバース増幅オリゴマーであり、第１の追加の増幅オリゴマーが、フォワード増幅オリゴマーであり、第１の追加の増幅オリゴマーおよび第１の検出オリゴマーが、配列番号３または配列番号４の１１７位を含むｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成されている、実施形態４〜４８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６０】
実施形態５１は、第２の検出オリゴマーが、ｉＰｒｉｍｅｒであり、組成物またはキットが、第２の追加の増幅オリゴマーをさらに含み、ｉＰｒｉｍｅｒが、フォワード増幅オリゴマーであり、第２の追加の増幅オリゴマーが、リバース増幅オリゴマーであり、またはｉＰｒｉｍｅｒが、リバース増幅オリゴマーであり、第２の追加の増幅オリゴマーが、フォワード増幅オリゴマーであり、第２の追加の増幅オリゴマーおよび第２の検出オリゴマーが、配列番号５または配列番号２の１８４位を含むｔｃｄＣアンプリコンを生成するように構成されている、実施形態４〜４８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６１】
実施形態５２は、フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２４３〜２４８のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１〜３または４９〜５１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６２】
実施形態５３は、フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２４３〜２４８からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１〜３または４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６３】
実施形態５４は、フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２４５の配列を含む、実施形態５２または５３に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６４】
実施形態５５は、フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２４７の配列を含む、実施形態５２または５３に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６５】
実施形態５６は、フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、配列番号２４３〜２４８のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１〜３または４９〜５５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６６】
実施形態５７は、フォワードｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、配列番号２４３〜２４８のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態５６に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６７】
実施形態５８は、リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２４９〜２５９のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１〜３または４９〜５７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６８】
実施形態５９は、リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、ｔｃｄＣ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２４９〜２５９からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１〜３または４９〜５８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００６９】
実施形態６０は、リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２５５の配列を含む、実施形態５８または５９に記載の組成物、キット、または方法である。
【００７０】
実施形態６１は、リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２５８の配列を含む、実施形態５８または５９に記載の組成物、キット、または方法である。
【００７１】
実施形態６２は、リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、配列番号２４９〜２５９のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１〜３または４９〜６１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００７２】
実施形態６３は、リバースｔｃｄＣ増幅オリゴマーが、配列番号２４９〜２５９のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態６２に記載の組成物、キット、または方法である。
【００７３】
実施形態６４は、組成物またはキットが、少なくともフォワードおよびリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマー、および少なくとも１つのｔｃｄＡ検出オリゴマーをさらに含み、
【００７４】
フォワードおよびリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｔｃｄＡアンプリコンを生成するように構成され、
【００７５】
ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、ｔｃｄＡアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、実施形態１または３〜６３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００７６】
実施形態６５は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、ｔｃｄＡアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかに少なくとも部分的に基づいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ病原性遺伝子座の存在を検出することをさらに含む、実施形態６４に記載の方法である。
【００７７】
実施形態６６は、フォワードまたはリバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、ｉＰｒｉｍｅｒであり、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、一次プローブである、実施形態２〜６５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００７８】
実施形態６７は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、一次プローブであり、組成物またはキットが、インベーダーオリゴマーをさらに含む、実施形態２〜６５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００７９】
実施形態６８は、フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号５９〜６０、６４、または６５のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態２〜６７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８０】
実施形態６９は、フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、ｔｃｄＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号５９〜６０、６４、または６５からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態２〜６８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８１】
実施形態７０は、フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号６４の配列を含む、実施形態６８または６９に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８２】
実施形態７１は、フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号６５の配列を含む、実施形態６８または６９に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８３】
実施形態７２は、フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、配列番号５９〜６０、６４、または６５のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態２〜７１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８４】
実施形態７３は、フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、配列番号５９〜６０、６４、または６５のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態７２に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８５】
実施形態７４は、フォワードｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号７０〜７３のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態２〜７３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である・
【００８６】
実施形態７５は、リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、ｔｃｄＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号７０〜７３からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態２〜７４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８７】
実施形態７６は、リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号７０の配列を含む、実施形態７４または７５に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８８】
実施形態７７は、リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号７２の配列を含む、実施形態７４または７５に記載の組成物、キット、または方法である。
【００８９】
実施形態７８は、リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、配列番号７０〜７３のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態２〜７７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９０】
実施形態７９は、リバースｔｃｄＡ増幅オリゴマーが、配列番号７０〜７３のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態７８に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９１】
実施形態８０は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する、配列番号５７、６１、６６、または６７のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態２〜９３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９２】
実施形態８１は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、ｔｃｄＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号５８、６２、６８、または６９からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態２〜８０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９３】
実施形態８２は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号６６の配列を含む、実施形態８０または８１に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９４】
実施形態８３は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号６７の配列を含む、実施形態８０または８１に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９５】
実施形態８４は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、配列番号５７、６１、６６、または６７のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態２〜８３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９６】
実施形態８５は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、配列番号５７、６１、６６、または６７のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態８４に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９７】
実施形態８６は、ｔｃｄＡ検出オリゴマーが、配列番号５８、６２、６８、または６９のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態８４に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９８】
実施形態８７は、組成物またはキットが、ｔｃｄＡインベーダーオリゴマーをさらに含み、ｔｃｄＡインベーダーオリゴマーが、ｔｃｄＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号６３からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／またはｔｃｄＡインベーダーオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号６３の配列を含む、実施形態２〜８６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【００９９】
実施形態８８は、ｔｃｄＡインベーダーオリゴマーが、配列番号６３のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態８７に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１００】
実施形態８９は、組成物またはキットが、フォワードおよびリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーをさらに含み、フォワードおよびリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｔｃｄＢアンプリコンを生成するように構成され、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、ｔｃｄＢアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、実施形態１〜８８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１０１】
実施形態９０は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマー、追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマー、およびリバース増幅オリゴマーを含む組成物またはキットであって、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、ストリンジェントな条件下で、配列番号２６０〜２７９または３３９からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／またはフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２６０〜２７９または３３９のいずれか１つの配列を含み、追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２６０〜２７９または３３９からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／または追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、最大２つのミスマッチを有する配列番号２６０〜２７９または３３９のうちのいずれか１つを含み、追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーは、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーとは異なり、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマー、追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマー、およびリバース増幅オリゴマーは、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｔｃｄＢアンプリコンを生成するように集合的に構成されている、組成物またはキットである。
【０１０２】
実施形態９１は、フォワードおよびリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、実施形態９０に記載の通りであり、組成物またはキットが、実施形態９０に記載の追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーをさらに含む、実施形態８９に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１０３】
実施形態９２は、ｔｃｄＢを検出する方法であって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むかまたはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を含むことが疑われる試料をさらに含む、実施形態８９〜９１のいずれか一項に記載の組成物を調製することと、組成物を増幅条件に供することと、少なくとも１つのｔｃｄＢアンプリコンの存在を検出することと、を含む、方法である。
【０１０４】
実施形態９３は、組成物またはキットが、少なくとも１つのｔｃｄＢアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されているｔｃｄＢ検出オリゴマーをさらに含む、実施形態８９〜９２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１０５】
実施形態９４は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーがｔｃｄＢアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかに少なくとも部分的に基づいてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ病原性遺伝子座の存在を検出することをさらに含む、実施形態９３の方法である。
【０１０６】
実施形態９５は、フォワードまたはリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、ｉＰｒｉｍｅｒであり、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、一次プローブである、実施形態８９〜９４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１０７】
実施形態９６は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、一次プローブであり、組成物またはキットが、インベーダーオリゴマーをさらに含む、実施形態８９〜９５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１０８】
実施形態９７は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２６０〜２７９または３３９のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態８９〜９６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１０９】
実施形態９８は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２６０〜２７９または３３９からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態８９〜９７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１０】
実施形態９９は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２７４の配列を含む、実施形態９７または９８に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１１】
実施形態１００は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２７７の配列を含む、実施形態９７または９８に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１２】
実施形態１０１は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２７９の配列を含む、実施形態９７または９８に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１３】
実施形態１０２は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３３９の配列を含む、実施形態９７または９８に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１４】
実施形態１０３は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、配列番号２６０〜２７９または３３９のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態８９〜１０２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１５】
実施形態１０４は、フォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、配列番号２６０〜２７９または３３９のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１０３に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１６】
実施形態１０５は、追加のフォワードｔｃｄＢ増幅オリゴマーが存在し、配列番号２７４、２７７、２７９、または３３９のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態９０〜１０４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１７】
実施形態１０６は、リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３１７〜３３８のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態８９〜１０５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１８】
実施形態１０７は、リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号３１７〜３３８からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態８９〜１０６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１１９】
実施形態１０８は、リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３１７の配列を含む、実施形態１０６または１０７に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２０】
実施形態１０９は、リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３２４または３２５の配列を含み、任意選択で、組成物またはキットが、少なくとも２つのリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーを含み、最大２つのミスマッチを有する配列番号３２４の配列および最大２つのミスマッチを有する配列番号３２５の配列をそれぞれ含む、実施形態１０６または１０７に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２１】
実施形態１１０は、リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３３６の配列を含む、実施形態１０６または１０７に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２２】
実施形態１１１は、リバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３３８の配列を含む、実施形態１０６または１０７に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２３】
実施形態１１２は、少なくとも１つまたは少なくとも２つのリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、配列番号３１７〜３３８のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態８９〜１１１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２４】
実施形態１１３は、少なくとも１つまたは少なくとも２つのリバースｔｃｄＢ増幅オリゴマーが、配列番号３１７〜３３８のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１１２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２５】
実施形態１１４は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８１〜２９８のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態９３〜１１３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２６】
実施形態１１５は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２９９〜３１６からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態９３〜１１４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２７】
実施形態１１６は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８５の配列を含む、実施形態１１４または１１５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２８】
実施形態１１７は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８７の配列を含む、実施形態１１４または１１５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１２９】
実施形態１１８は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８８の配列を含む、実施形態１１４または１１５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３０】
実施形態１１９は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、配列番号２８１〜２９８のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態９３〜１１８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３１】
実施形態１２０は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、配列番号２８１〜２９８のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１１９に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３２】
実施形態１２１は、ｔｃｄＢ検出オリゴマーが、配列番号２９９〜３１６のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１１９に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３３】
実施形態１２２は、組成物またはキットが、ｔｃｄＢインベーダーオリゴマーをさらに含み、ｔｃｄＢインベーダーオリゴマーが、ｔｃｄＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２８０からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／またはｔｃｄＢインベーダーオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２８０の配列を含む、実施形態９３〜１２１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３４】
実施形態１２３は、ｔｃｄＢインベーダーオリゴマーが、配列番号２８０のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１２２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３５】
実施形態１２４は、組成物またはキットが、フォワードおよびリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマー、および少なくとも１つのｃｄｔＢ検出オリゴマーをさらに含み、フォワードおよびリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、８０〜４００ヌクレオチドのサイズを有するｃｄｔＢアンプリコンを生成するように構成され、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、ｃｄｔＢアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、実施形態１〜１２３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３６】
実施形態１２５は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、ｃｄｔＢアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかに少なくとも部分的に基づいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｃｄｔ遺伝子座の存在を検出することをさらに含む、実施形態１２４に記載の方法である。
【０１３７】
実施形態１２６は、フォワードまたはリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、ｉＰｒｉｍｅｒであり、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、一次プローブである、実施形態１２４または１２５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３８】
実施形態１２７は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、一次プローブであり、組成物またはキットが、インベーダーオリゴマーをさらに含む、実施形態１２４または１２５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１３９】
実施形態１２８は、組成物またはキットが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３０〜３３または５５のうちのいずれか１つの配列を含むフォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーを含む、実施形態１２４〜１２７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４０】
実施形態１２９は、フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、ｃｄｔＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号３０〜３３または５５からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１２４〜１２８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４１】
実施形態１３０は、フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３３の配列を含む、実施形態１２８または１２９に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４２】
実施形態１３１は、フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３１の配列を含む、実施形態１２８または１２９に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４３】
実施形態１３２は、フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、配列番号３０〜３３または５５のいずれかの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１２４〜１３１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４４】
実施形態１３３は、フォワードｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、配列番号３０〜３３または５５のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１３２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４５】
実施形態１３４は、組成物またはキットが、最大２つのミスマッチを有する配列番号４０〜４１、４９〜５０、または５６のいずれか１つの配列を含むリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーを含む、実施形態１２４〜１３３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４６】
実施形態１３５は、リバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、ｃｄｔＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号４０〜４１、４９〜５０、または５６からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１２４〜１３４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４７】
実施形態１３６は、リバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号４０の配列を含む、実施形態１３４または１３５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４８】
実施形態１３７は、リバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号４１の配列を含む、実施形態１３４または１３５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１４９】
実施形態１３８は、リバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号５６の配列を含む、実施形態１３４または１３５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５０】
実施形態１３９は、少なくとも１つまたは少なくとも２つのリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーが、配列番号４０〜４１、４９、５０、または５６のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１２４〜１３８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５１】
実施形態１４０は、組成物またはキットが、配列番号４０〜４１、４９、５０、または５６のうちのいずれか１つの配列を含むリバースｃｄｔＢ増幅オリゴマーを含む、実施形態１３９に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５２】
実施形態１４１は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３４〜３６、４３〜４５、５１、または５２のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１２４〜１４０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５３】
実施形態１４２は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、ｃｄｔＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号３７〜３９、４６〜４８、５３、または５４からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１２４〜１４１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５４】
実施形態１４３は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３４の配列を含む、実施形態１４１または１４２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５５】
実施形態１４４は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号３５の配列を含む、実施形態１４１または１４２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５６】
実施形態１４５は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号５１の配列を含む、実施形態１４１または１４２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５７】
実施形態１４６は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、配列番号３４〜３６、４３〜４５、５１、または５２のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態態１２４〜１４５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５８】
実施形態１４７は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、配列番号３４〜３６、４３〜４５、５１、または５２のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１４６に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１５９】
実施形態１４８は、ｃｄｔＢ検出オリゴマーが、配列番号３７〜３９、４６〜４８、５３、または５４のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１４６に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１６０】
実施形態１４９は、組成物またはキットが、ｃｄｔＢインベーダーオリゴマーをさらに含み、ｃｄｔＢインベーダーオリゴマーが、ｃｄｔＢ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号４２からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／またはｃｄｔＢインベーダーオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号４２の配列を含む、実施形態１２４〜１４８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１６１】
実施形態１５０は、ｃｄｔＢインベーダーオリゴマーが、配列番号４２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１４９に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１６２】
実施形態１５１は、組成物またはキットが、フォワードおよびリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマー、および少なくとも１つのｃｄｔＡ検出オリゴマーをさらに含み、
【０１６３】
フォワードおよびリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーが、８０〜４００ヌクレオチドサイズを有するｃｄｔＡアンプリコンを生成するように構成され、
【０１６４】
ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、ｃｄｔＡアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成されている、実施形態１〜１５０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１６５】
実施形態１５２は、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、ｃｄｔＡアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかに少なくとも部分的に基づいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｃｄｔ遺伝子座の存在を検出することをさらに含む、実施形態１５１に記載の方法である。
【０１６６】
実施形態１５３は、フォワードまたはリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーが、ｉＰｒｉｍｅｒであり、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、一次プローブである、実施形態１５１または１５２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１６７】
実施形態１５４は、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、一次プローブであり、組成物またはキットが、インベーダーオリゴマーをさらに含む、実施形態１５１または１５２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１６８】
実施形態１５５は、組成物またはキットが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１３の配列を含むフォワードｃｄｔＡ増幅オリゴマーを含む、実施形態１５１〜１５４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１６９】
実施形態１５６は、フォワードｃｄｔＡ増幅オリゴマーが、ｃｄｔＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１３からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１５１〜１５５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７０】
実施形態１５７は、フォワードｃｄｔＡ増幅オリゴマーが、配列番号１３のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しないか、または配列番号１３の配列を含む、実施形態１５１〜１５６のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７１】
実施形態１５８は、組成物またはキットが、最大２つのミスマッチを有する配列番号２１〜２９のうちのいずれか１つの配列を含むリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーを含む、実施形態１５１〜１５７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７２】
実施形態１５９は、リバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーが、ｃｄｔＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号２１〜２９からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１５１〜１５８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７３】
実施形態１６０は、少なくとも１つまたは少なくとも２つのリバースｃｄｔＡ増幅オリゴマーが、配列番号２１〜２９のいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１５１〜１５９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７４】
実施形態１６１は、組成物またはキットが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１６または１７のうちのいずれか１つの配列を含むｃｄｔＡ検出オリゴマーを含む、実施形態１５１〜１６０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７５】
実施形態１６２は、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、ｃｄｔＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１８〜２０からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態１５１〜１６１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７６】
実施形態１６３は、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１６の配列を含む、実施形態１６１または１６２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７７】
実施形態１６４は、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１７の配列を含む、実施形態１６１または１６２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７８】
実施形態１６５は、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、配列番号１６または１７のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の５’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１５１〜１６４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１７９】
実施形態１６６は、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、配列番号１６または１７の配列を含む、実施形態１６５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１８０】
実施形態１６７は、ｃｄｔＡ検出オリゴマーが、配列番号１８〜２０のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１６５に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１８１】
実施形態１６８は、組成物またはキットが、ｃｄｔＡインベーダーオリゴマーをさらに含み、ｃｄｔＡインベーダーオリゴマーが、ｃｄｔＡ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１４または１５からなる配列を有するオリゴマーと競合し、および／またはｃｄｔＡインベーダーオリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する配列番号１４または１５の配列を含む、実施形態１５１〜１６７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１８２】
実施形態１６９は、ｃｄｔＡインベーダーオリゴマーが、配列番号１４または１５のうちのいずれか１つの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の３’末端ヌクレオチドに対するミスマッチを有しない、実施形態１６８に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１８３】
実施形態１７０は、配列番号１８〜２０、３７〜３９、４６〜４８、５３、５４、５８、６２、６８、６９、１３８〜１８２、１８８〜１９１、２０１〜２０４、２１３〜２１９、２３８〜２４２、または２９９〜３１６のいずれか１つの７〜１８位に示される配列を含む検出オリゴマーであって、検出オリゴマーが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢ核酸に特異的にハイブリダイズするための十分な追加の配列をさらに含む、検出オリゴマーである。
【０１８４】
実施形態１７１は、配列番号１６、１７、３４〜３６、４３〜４５、５１、５２、５７、６１、６６、６７、９３〜１３７、１８４〜１８７、１９７〜２００、２０６〜２１２、２３３〜２３７、または２８１〜２９８のいずれか１つに示される配列の逆相補鎖に特異的にハイブリダイズするように構成されている、実施形態１７０に記載の検出オリゴマーである。
【０１８５】
実施形態１７２は、最大２つのミスマッチを有する配列番号１６、１７、３４〜３６、４３〜４５、５１、５２、５７、６１、６６、６７、９３〜１３７、１８４〜１８７、１９７〜２００、２０６〜２１２、２３３〜２３７、または２８１〜２９８のいずれか１つに示される配列を含む、実施形態１７０または１７１に記載の検出オリゴマーである。
【０１８６】
実施形態１７３は、配列番号１６、１７、３４〜３６、４３〜４５、５１、５２、５７、６１、６６、６７、９３〜１３７、１８４〜１８７、１９７〜２００、２０６〜２１２、２３３〜２３７、または２８１〜２９８のうちのいずれか１つに示される配列を含む、実施形態１７２に記載の検出オリゴマーである。
【０１８７】
実施形態１７４は、最大２つのミスマッチを有する配列番号１８〜２０、３７〜３９、４６〜４８、５３、５４、５８、６２、６８、６９、１３８〜１８２、１８８〜１９１、２０１〜２０４、２１３〜２１９、２３８〜２４２、または２９９〜３１６のうちのいずれか１つに示される配列を含む、実施形態１７０〜１７３のいずれか一項に記載の検出オリゴマーである。
【０１８８】
実施形態１７５は、配列番号１８〜２０、３７〜３９、４６〜４８、５３、５４、５８、６２、６８、６９、１３８〜１８２、１８８〜１９１、２０１〜２０４、２１３〜２１９、２３８〜２４２、または２９９〜３１６のいずれか１つに示される配列を含む、実施形態１７４に記載の検出オリゴマーである。
【０１８９】
実施形態１７６は、少なくとも１つの検出オリゴマーが、伸長不能である、実施形態１〜８９または９３〜１７５のいずれか一項に記載の組成物、キット、方法、または検出オリゴマーである。
【０１９０】
実施形態１７７は、少なくとも１つの検出オリゴマーが、標識を含む、実施形態１〜８９または９３〜１７６のいずれか一項に記載の組成物、キット、方法、または検出オリゴマーである。
【０１９１】
実施形態１７８は、少なくとも１つの検出オリゴマーが、１５〜５５ヌクレオチド長を有する、実施形態１〜８９または９３〜１７７のいずれか一項に記載の組成物、キット、方法、または検出オリゴマーである。
【０１９２】
実施形態１７９は、実施形態１７０〜１７８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの検出オリゴマーおよび少なくとも１つの二次検出オリゴマーを含む組成物またはキットであって、二次検出オリゴマーが、少なくとも１つの標識を含み、検出オリゴマーの断片と相互作用するように構成されている、組成物またはキットである。
【０１９３】
実施形態１８０は、組成物またはキットが、標識を含み、検出オリゴマーの断片と相互作用するように構成されている、少なくとも１つの二次検出オリゴマーをさらに含む、実施形態１〜８９または９３〜１６９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１９４】
実施形態１８１は、二次検出オリゴマーが、少なくとも２つの標識を含む、実施形態１７９または１８０に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１９５】
実施形態１８２は、少なくとも２つの標識が、ＦＲＥＴ対を含む、実施形態１８１に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１９６】
実施形態１８３は、少なくとも２つの標識が、クエンチャーを含む、実施形態１８１または１８２に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１９７】
実施形態１８４は、検出オリゴマーの断片が、少なくとも６ヌクレオチドの５’末端フラップである、実施形態１７９〜１８３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１９８】
実施形態１８５は、１つ以上の二次検出オリゴマーが、ＦＲＥＴカセットである、実施形態１８４に記載の組成物、キット、または方法である。
【０１９９】
実施形態１８６は、キットまたは組成物が、実施形態８９、９３〜９６、または１１４〜１２３のいずれか一に記載の少なくともｔｃｄＢ一次検出オリゴマー、および実施形態２または８０〜８６のいずれか一項に記載のｔｃｄＡ一次検出オリゴマーを含み、１つ以上の二次検出オリゴマーが、ｔｃｄＢ核酸の存在下およびｔｃｄＡ核酸の存在下で、正のシグナルを生成するように構成されている二次検出オリゴマーを含む、実施形態１８０〜１８４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２００】
実施形態１８７は、キットまたは組成物が、実施形態２１〜３０のいずれか一項に記載の少なくとも第１のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマー、および実施形態３８〜４６のいずれか一項に記載の第２のｔｃｄＣ一次プローブオリゴマーを含み、１つ以上の二次検出オリゴマーが、１１７ｄｅｌ変異を含むｔｃｄＣ対立遺伝子の存在下および１８４Ｔ変異を含むｔｃｄＣ対立遺伝子の存在下で、正のシグナルを生成するように構成されている二次検出オリゴマーを含む、実施形態１８０〜１８６のいずれか一項に記載の組成物、キットまたは方法である。
【０２０１】
実施形態１８８は、１つ以上の二次検出オリゴマーが、配列番号１０の配列を含む二次検出オリゴマーを含む、実施形態１８０〜１８７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２０２】
実施形態１８９は、１つ以上の二次検出オリゴマーが、配列番号１１の配列を含む二次検出オリゴマーを含む、実施形態１８０〜１８８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２０３】
実施形態１９０は、１つ以上の二次検出オリゴマーが、配列番号１２の配列を含む二次検出オリゴマーを含む、実施形態１８０〜１８９のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２０４】
実施形態１９１は、組成物またはキットが、３’末端侵襲的により形成される３本鎖構造に対する構造特異的活性を有するヌクレアーゼを含む、実施形態１〜１６９または１７６〜１９０のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２０５】
実施形態１９２は、組成物またはキットが、クリベースまたは５’ヌクレアーゼを含む、実施形態１〜１６９または１７６〜１９１のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２０６】
実施形態１９３は、組成物またはキットが、ＦＥＮ１ヌクレアーゼを含む、実施形態１〜１６９または１７６〜１９２のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２０７】
実施形態１９４は、組成物またはキットが、ポリメラーゼを含む、実施形態１〜１６９または１７６〜１９３のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２０８】
実施形態１９５は、組成物またはキットが、ＤＮＡポリメラーゼを含む、実施形態１〜１６９または１７６〜１９４のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２０９】
実施形態１９６は、組成物またはキットが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む、実施形態１〜１６９または１７６〜１９５のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２１０】
実施形態１９７は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼである、実施形態１９６に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２１１】
実施形態１９８は、組成物またはキットが、ＮＴＰを含む、実施形態１〜１６９または１７６〜１９７のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２１２】
実施形態１９９は、組成物またはキットが、デオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む、実施形態１〜１６９または１７６〜１９８のいずれか一項に記載の組成物、キット、または方法である。
【０２１３】
実施形態２００は、少なくとも１つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を検出する方法であって、
【０２１４】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸もしくは少なくとも１つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンを含むかまたはそれらを含むことが疑われる試料をさらに含む、実施形態１７６〜１９９のいずれか一項に記載の組成物または実施形態１７０〜１７５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの検出オリゴマーを含む組成物を調製することと、
【０２１５】
ハイブリダイゼーションアッセイを行うことによって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンの存在を検出することと、検出オリゴマーが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンにハイブリダイズしたかどうかを判定することと、を含む、方法である。
【０２１６】
実施形態２０１は、組成物が、実施形態１７９〜１９０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの二次検出オリゴマーを含み、方法が、検出オリゴマーが、検出オリゴマーを構造特異的ヌクレアーゼに曝露することによって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンに少なくとも部分的にハイブリダイズしたかどうかを判定することと、構造特異的ヌクレアーゼによって生成された検出オリゴマーの断片が、二次検出オリゴマーと相互作用するかどうかを判定することと、を含む、実施形態２００に記載の方法である。
【０２１７】
実施形態２０２は、検出オリゴマーの断片が、５’末端フラップである、実施形態２０１に記載の方法である。
【０２１８】
実施形態２０３は、組成物が、検出オリゴマーのハイブリダイゼーション部位と重複するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンの部位にハイブリダイズする少なくとも１つの侵襲的オリゴマーをさらに含み、検出オリゴマーおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンの存在下で、構造特異的ヌクレアーゼによる切断について認識される構造を形成する、実施形態２００〜２０２のいずれか一項に記載の方法である。
【０２１９】
実施形態２０４は、侵襲的オリゴマーが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅアンプリコンへのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で、配列番号１４、１５、４０〜４２、６３〜６５、７４〜７６、８６〜９２、１８３、１９２〜１９６、２０５、２２０、２２１、２２３〜２２５、２６０〜２８０、または３１７のうちのいずれか１つの配列からなる配列を有するオリゴマーと競合する、実施形態２０３に記載の方法である。
【０２２０】
実施形態２０５は、侵襲的オリゴマーが、最大２つのミスマッチを有する、配列番号１４、１５、４０〜４２、６３〜６５、７４〜７６、８６〜９２、１８３、１９２〜１９６、２０５、２２０、２２１、２２３〜２２５、２６０〜２８０、または３１７のいずれか１つの配列を含む配列を有する、実施形態２１７または２１８に記載の方法である。
【０２２１】
実施形態２０６は、少なくとも１つのオリゴマーが、少なくとも１つのメチル化シトシンを含む、実施形態１〜２０５のいずれか一項に記載の組成物、キット、検出オリゴマー、または方法である。
【０２２２】
実施形態２０７は、配列番号の配列が、配列表に示されるアデニンメチル化を含む、実施形態１〜２０６のいずれか一項に記載の組成物、キット、検出オリゴマー、または方法である。
【０２２３】
実施形態２０８は、配列番号の配列が、配列表に示されるシトシンメチル化を含む、実施形態１〜２０７のいずれか一項に記載の組成物、キット、検出オリゴマー、または方法である。
【０２２４】
実施形態２０９は、水性であるか、凍結されているか、もしくは凍結乾燥されているか、または少なくとも１つのオリゴマーが固体基質に結合されている、実施形態１〜２、４、１０〜３０、３２〜４６、４９〜６４、６６〜９１、９３、９５〜１２４、１２６〜１５１、１５３〜１６９、１７９〜１９９、もしくは２０６〜２０８のいずれか一項に記載の組成物、また実施形態項１７０〜１７５のいずれか一項に記載の検出オリゴマーを含む組成物である。
【０２２５】
実施形態２１０は、試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢ核酸のうちの少なくとも１つを検出するための説明書をさらに含む、実施形態１〜２、４、１０〜３０、３２〜４６、４９〜６４、６６〜９１、９３、９５〜１２４、１２６〜１５１、１５３〜１６９、１７９〜１９９、または２０６〜２０９のいずれか一項に記載のキットである。
【０２２６】
実施形態２１１は、試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢ核酸のうちの少なくとも１つを検出するための、実施形態１〜２、４、１０〜３０、３２〜４６、４９〜６４、６６〜９１、９３、９５〜１２４、１２６〜１５１、１５３〜１６９、１７９〜１９９、もしくは２０６〜２１０のいずれか一項に記載の組成物もしくはキットの使用、または実施形態１７０〜１７５のいずれか一項に記載の検出オリゴマーの使用である。
【０２２７】
項目の見出しは、読み手の便宜のために提供されており、本開示の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための形態】
【０２２８】
概要
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、およびｃｄｔＢ標的配列を増幅および／または検出するためのオリゴマーが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうちの２つ以上を検出するためのオリゴマーは、単一の反応が複数の遺伝子に関する情報を提供するように、多重形式で使用することができる。高病原性に関連するｔｃｄＣ対立遺伝子を特異的に検出するために、特定のオリゴマーを使用することができる。いくつかの実施形態では、例えば、感度を増加させるか、または特定の配列多型に起因し得る偽陰性を低減するために、追加の増幅オリゴマーまたはプローブが使用される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、ＩＮＶＡＤＥＲまたはＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳアッセイなどの侵襲的切断アッセイを行う際に使用するためのものである。そのような手法は、侵襲的オリゴマーの３’末端が、標的配列へのハイブリダイゼーションについて別のオリゴマーの５’フラップと競合する構造を形成し、部分的に一本鎖の一次プローブを含む複合体を生じさせるために、侵襲的および一次プローブオリゴマーを含む一連の検出オリゴマーのセットを使用する。この構造を認識して、一次プローブを切断し、したがって、その後の検出のための５’フラップを解放する、切断剤が使用される。これを侵襲的切断反応と称する。いくつかの実施形態では、検出は、５’フラップが二重標識オリゴマー（例えば、ＦＲＥＴカセット）とハイブリダイズし、切断剤の基質を形成する、第２の侵襲的切断反応によって起こる。二重標識されたオリゴマーの切断は、２つの標識を分離することができ、それにより、フルオロフォアの消光の喪失など、標識の挙動の検出可能な変化を提供することができる。この手法は、高病原性を非高病原性ｔｃｄＣ対立遺伝子から識別するのに好適であり、多重化にも好適であり、毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸が試料に含まれているか、試料が高病原性に関連するｔｃｄＣ対立遺伝子を含むか、ならびに／または試料が病原性遺伝子座およびＣｄｔ遺伝子座の一方、他方、または両方を持っているかを評価するための迅速で簡素化された手法を促進することが見出されている。
【０２３０】
定義
本教示を詳細に説明する前に、本開示が特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それらは変化し得ることを理解されたい。本明細書および付随する特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の言及を含み、「１つ以上の項目」などの表現は、単一の言及を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「１つのオリゴマー」への言及は、複数のオリゴマーなどを含み、さらなる例では、「１つ以上の二次検出オリゴマーはＦＲＥＴカセットである」という記述には、正確に１つの二次検出オリゴマーがあり、それがＦＲＥＴカセットである状況を含む。接続詞「または」は、包括的な意味が文脈において不当でない限り、包括的な意味で、すなわち、「および／または」と同等であると解釈されるべきである。クラス（例えば、オリゴマー）の「少なくとも１つの」メンバーが存在する場合、「その」メンバー（例えば、オリゴマー）への言及は、存在するメンバー（１つだけの場合）または存在するメンバーのうちの少なくとも１つ（例えば、オリゴマー）（２つ以上の場合）を指す。
【０２３１】
測定値および測定可能値は、概算値と理解され、有効数字および測定に関連する誤差を考慮に入れる。全ての範囲は、「端点を含まない」などの明示的な除外がない場合には端点を包含すると解釈されるべきである。したがって、例えば、「１０〜１５以内」には１０および１５の値が含まれる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定を意図するものではない。上記の概要および詳細な説明は両方とも、例示的かつ説明的なものにすぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。参照により組み込まれるいかなる資料の範囲も本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が優先する。
【０２３２】
特に明記しない限り、様々な構成要素を「含む」と記載する本明細書の実施形態はまた、記載された構成要素「からなる」またはそれ「から本質的になる」として企図される。「から本質的になる」とは、本明細書に記載の組成物および方法の基本かつ新規の特徴を実質的に変化させない、追加の構成要素、組成物、または方法ステップが、それらの組成物または方法に含まれ得ることを意味する。そのような特徴には、毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種および他の既知の病原体から区別する特異性による、試料に存在する毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸配列を検出する能力が含まれる。いくつかの実施形態では、特徴には、約１０ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍＬの低さの毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出するのに十分な感度でＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸配列を検出する能力が含まれる。いくつかの実施形態では、特徴には、サイクル増幅反応が使用される場合、増幅反応の開始から約６０分以内および／または約５０サイクル以内でＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸配列を検出する能力が含まれる。
【０２３３】
組成物またはキットの請求項が、第１の所与の特徴（例えば、所与の配列からなる配列を有するオリゴマーを有する核酸に結合するために、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションについて競合すること）を有するオリゴマーを記載する場合、およびその従属請求項が、追加の所与の特徴（例えば、配列番号の所与の列挙のうちの少なくとも１つの配列を含むこと）を有するオリゴマーを記載する場合、組成物またはキットは、その特徴を集合的に有する複数のオリゴマーまたは第１および追加の特徴を有する個々のオリゴマーを含むことができる（特徴が関連する場合、例えば、所与の配列からなる配列を有するオリゴマーを有する核酸に結合するために、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションについて競合することが、所与の配列と重複する配列番号の配列を含むことと関連する場合を含むが、必ずしもこれに限定されない）。
【０２３４】
「試料」は、生物学的、臨床的、環境的、および食品試料を含むがこれらに限定されない、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の核酸を含み得る材料を指す。環境試料には、表面物質、土壌、水、工業試料などの環境物質、ならびに食品および乳製品加工機器、装置、設備、器具、使い捨て品および非使い捨て品から得られる試料が含まれる。「生物学的」または「臨床的」試料とは、例えば体液、糞便試料およびそのスワブ、ならびに結腸もしくは直腸生検物または洗浄物を含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的核酸を含み得る、生きているもしくは死んだヒトまたは動物に由来する組織または材料を指す。試料を組織または細胞構造を物理的、化学的、または機械的に破壊し、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などを含み得る溶液中に細胞内核酸を放出するように処理して、分析用試料を調製することができる。これらの例は、本開示に適用可能な試料の種類を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２３５】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびそれらの類似体であるポリマーを含むポリヌクレオチドを形成するために一緒に連結された窒素複素環塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指す。核酸「骨格」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ；ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号を参照されたい）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な結合から構成することができる。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボースまたは置換（例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換）を有する類似化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの類似体（例えば、イノシンまたはその他；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，第１１版，１９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、デアザプリンまたはアザプリン、デアザピリミジンまたはアザピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５−メチルシトシン）、２位、６位、または８位に置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であり得る。核酸は、骨格がポリマーの位置に対する窒素含有塩基を含まない、１つ以上の「脱塩基」残基を含むことができる（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、通常のＲＮＡまたはＤＮＡの糖、塩基および結合のみを含み得るか、または従来の構成要素および置換の両方を含み得る（例えば、２’メトキシ結合を有する従来の塩基、もしくは従来の塩基および１つ以上の塩基アナログを含有するポリマー）。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）、糖立体配置を模倣するＲＮＡ中にロックされた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含む類似体を含み、これは相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼし得るオリゴマーの実施形態には、ＰＮＡオリゴマー、２’−メトキシもしくは２’−フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、またはハイブリダイゼーション複合体の全電荷、電荷密度、もしくは立体会合（ｓｔｅｒｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に影響を及ぼすオリゴマー（荷電された結合（例えば、ホスホロチオエート）もしくは中性基（例えば、メチルホスホネート）を含有するオリゴマーを含む）が含まれる。特に明記しない限り、５−メチルシトシンなどのメチル化シトシンは、ＲＮＡまたはＤＮＡ骨格（またはそれらの混合物）を含む上述の主鎖／糖／結合のいずれかと共に使用され得る。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物は異なる糖部分（即ちリボース対デオキシリボース）を有し、ＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミンの存在によって異なり得る。等価物は特定の配列に対して同程度の相補性を有するので、ＲＮＡ等価物とＤＮＡ等価物との間の相違は相同性の相違には寄与しない。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さについての範囲に言及する場合、その範囲は全ての整数を含む（例えば、１９〜２５個の連続したヌクレオチド長には、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、および２５個が含まれる）ことが理解される。
【０２３６】
「Ｃ残基」は、文脈が別に示さない限り、メチル化および非メチル化シトシンを含む。いくつかの実施形態では、メチル化シトシンは、５−メチルシトシンを含むか、またはそれからなる。
【０２３７】
「Ａ残基」は、文脈が別に示さない限り、メチル化および非メチル化アデニンを含む。いくつかの実施形態では、メチル化アデニンは、２’−Ｏ−メチルアデノシンを含むか、またはそれからなる。
【０２３８】
「核酸増幅」または単に「増幅」は、標的核酸配列もしくはその相補配列またはそれらの断片（すなわち、完全標的核酸より少なく含む増幅配列）の複数コピーを生成する任意のインビトロ手順を指す。増幅方法には、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅、および転写関連増幅としても既知である転写媒介増幅（ＴＭＡ）が含まれる。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７８６，６００号を参照されたい）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、および熱サイクリングを使用して、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成するか、またはｃＤＮＡから合成する（例えば、参照により各々が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号を参照されたい）。ＬＣＲ増幅は、４つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する（例えば、参照により各々が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４２７，９３０号および同第５，５１６，６６３号を参照されたい）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマー、および標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼを使用し、それにより、一連のプライマー伸長および鎖置換ステップで増幅が起こる（例えば、参照により各々が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４２２，２５２号、同第５，５４７，８６１号、および同第５，６４８，２１１号を参照されたい）。ヘリカーゼ依存性増幅は、ヘリカーゼを使用して、ＤＮＡ二本鎖の２つの鎖を分離して一本鎖鋳型を生成し、続いて、鋳型にハイブリダイズする配列特異的プライマーのハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長を行い、標的配列を増幅する（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８２，３２８号を参照されたい）。増幅は線形または指数関数的であり得る。
【０２３９】
転写関連増幅は、核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を最終的に生成するために、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、プロモーター含有オリゴヌクレオチドを使用し、任意選択で、他のオリゴヌクレオチドを含むことができる（米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号，Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４３７，９９０号，Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ第ＷＯ８８／０１３０２号および同第ＷＯ８８／１０３１５号，Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，１３０，２３８号，Ｍａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号，Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ第ＷＯ９４／０３４７２号，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、ならびにＰＣＴ第ＷＯ９５／０３４３０号，Ｒｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に詳細に記載される）。ＴＭＡを使用する方法は、以前に詳細に記載されている（米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号）。
【０２４０】
リアルタイムでアンプリコンを検出するサイクリック増幅法において、「閾値サイクル（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）」（Ｃｔ）という用語は、標的の増幅に関連するシグナルの出現時間の尺度であり、例えば、正規化レポーターシグナルの標準偏差の約１０倍であり得る。増幅が「閾値サイクル」に達すると、一般に、プローブが結合する配列の陽性の増幅産物があると考えられる。プローブの結合は、一般に、産物の同一性について重要な情報（例えば、産物が、場合により、ｔｃｄＢもしくはｔｃｄＡアンプリコンであるか、または１つ以上の対立遺伝子特異的プローブの場合、遺伝子の対立遺伝子の特定クラスのメンバーであるとの情報）を提供する。加えて増幅産物は、ゲル電気泳動、核酸配列決定、および他のそのような分析手順などの当業者に既知の方法によってさらに特徴付けられ得る。
【０２４１】
「オリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」は、一般に１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸を指し、約２〜５ｎｔの下限および約５００〜９００ｎｔの上限を有するサイズ範囲のものを含む。いくつかの特定の実施形態は、約５〜１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ｎｔの下限および約５０〜６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲のオリゴマーであり、他の特定の実施形態は、約１０〜２０ｎｔの下限および約２２〜１００ｎｔの上限を有するサイズ範囲のオリゴマーである。オリゴマーは、天然に存在する供給源から精製することができるが、任意の周知の酵素的または化学的方法を使用することによって合成し得る。オリゴマーは機能名（例えば、捕捉プローブ、プライマー、またはプロモータープライマー）によって称される場合があるが、当業者はそのような用語がオリゴマーを指すことを理解するであろう。オリゴマーは、自己ハイブリダイズすることによって、または他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって二次および三次構造を形成し得る。かかる構造には、二重鎖、ヘアピン、十字型、屈曲および三重鎖を含まれ得るが、これらに限定されない。オリゴマーは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、またはこれらの組み合わせを含む任意の方法で生成され得る。いくつかの実施形態では、侵襲的開裂構造を形成するオリゴマーが、反応において生成される（例えば、酵素による伸長反応におけるプライマーの伸長によって）。
【０２４２】
「アンプリコン」または「増幅産物」とは、核酸増幅反応において生成され、かつ標的核酸に由来する核酸分子を意味する。アンプリコンまたは増幅産物は、標的核酸と同じかまたは反対方向のものであり得る標的核酸配列を含有する。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、約１００〜２０００ヌクレオチド、約１００〜１５００ヌクレオチド、約１００〜１０００ヌクレオチド、約１００〜８００ヌクレオチド、約１００〜７００のヌクレオチド、約１００〜６００ヌクレオチド、または約１００〜５００ヌクレオチドの長さを有する。
【０２４３】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」は、標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはその相補体を指し、核酸増幅反応に関与する（例えば、プライマーおよび／またはプロモーター−プライマーとして機能する）。特定の増幅オリゴマーは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に相補的な少なくとも１０個の連続した塩基、所望により少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続した塩基を含有する。連続した塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に少なくとも８０％、少なくとも９０％、または完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、相補配列の２つのセグメントの間に、介在リンカーまたは非相補配列を含み、例えば、オリゴマーの当該２つの相補的セグメントは、合計で少なくとも１０個の相補的塩基、所望により少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の相補的塩基を含む。当業者は、記載された範囲がその範囲内の全ての整数および有理数（例えば、９２％または９８．３７７％）を含むことを理解するであろう。特定の増幅オリゴマーは、１０〜６０塩基長であり、所望により修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０２４４】
「プライマー」とは、鋳型核酸とハイブリダイズし、かつ重合によって伸長される３’末端を有するオリゴマーを指す。プライマーは、所望により、例えば標的配列に非相補的な５’領域を含むことによって修飾され得る。そのような修飾は、タグ、プロモーター、またはプライマーもしくは標的オリゴヌクレオチドを操作もしくは増幅するために使用されるもしくは有用な他の配列などの機能性付加を含むことができる。５’プロモーター配列を用いて修飾されたプライマーは、「プロモーター−プライマー」と称され得る。分子生物学または生化学の当業者は、プライマーとして機能し得るオリゴマーは、５’プロモーター配列を含むように修飾され得、次いで、プロモーター−プライマーとして機能し、同様に、任意のプロモーター−プライマーは、その５’プロモーター配列の有無にかかわらずプライマーとして機能し得ることを理解するであろう。
【０２４５】
「検出オリゴマー」または「プローブ」は、標的核酸と相互作用して検出可能な複合体を形成するオリゴマーを指す。例には、以下で論じる、侵襲的プローブ（インベーダーオリゴマーとも称する）、ｉＰｒｉｍｅｒ、および一次プローブが含まれる。プローブの標的配列は、一般に、プローブが特異的にハイブリダイズする、より大きい配列（例えば、遺伝子、アンプリコン、遺伝子座など）内の特異的配列を指す。検出オリゴマーは、標的特異的な配列および標的に相補的でない配列を含み得る。そのような標的に相補的でない配列には、検出および／または増幅を促進するために使用され得る、フラップまたはヘアピン構造などの所望の二次または三次構造を付与する配列を含み得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、同第６，８４９，４１２号、同第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、同第６，９１３，８８１号、同第６，０９０，５４３号、および同第７，４８２，１２７号、ＷＯ９７／２７２１４、ＷＯ９８／４２８７３、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９）、ならびにＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，９７：８２７２（２０００））。既定の配列のプローブは、当業者に公知の技術によって、例えば、化学合成によって、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボでの発現によって生成され得る。
【０２４６】
「プローブシステム」とは、標的配列を検出するための複数の検出オリゴマーまたはプローブを意味する。いくつかの実施形態では、プローブシステムは、少なくとも一次および二次プローブ、少なくとも侵襲的および一次プローブ、または侵襲的、一次、および二次プローブを含む。「侵襲的プローブ」または「インベーダーオリゴマー」は、一次プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーション領域の近くの位置で標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、侵襲的プローブオリゴヌクレオチドは、一次プローブオリゴヌクレオチドと標的核酸との間のハイブリダイゼーション領域と重複する部分（例えば、その標的に相補的であるかどうかにかかわらず、化学部分またはヌクレオチド）を含む。「ｉＰｒｉｍｅｒ」は、増幅オリゴマーでもあり、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する、侵襲的プローブであり、すなわち、ｉＰｒｉｍｅｒは、伸長がない場合に侵襲的プローブとして機能し得、ｉＰｒｉｍｅｒはまた、増幅中に伸長し、プライマーのように機能し得る。侵襲的切断アッセイ用の「一次プローブ」は、標的核酸にハイブリダイズする標的特異的領域を含み標的核酸に相補的でない「５’フラップ」領域を、さらに含む。一般に、検出は、直接的（すなわち、標的に直接ハイブリダイズしたプローブ）または間接的（すなわち、検出可能な標識または検出可能に標識された分子（例えば、ＦＲＥＴカセット）を標的に連結する中間構造を含む）のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、一次プローブは、標的ハイブリダイズ（ｔａｒｇｅｔ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）配列および標的に相補的でない配列を含む。いくつかの実施形態では、一次プローブは、構造特異的ヌクレアーゼ、例えば、クリベースまたは５’−ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼであり得る適切な切断剤の存在下で標的配列にハイブリダイゼーションした際に、核分解（例えば、５’切断またはエンドヌクレアーゼ切断（ｅｎｄｏ  ｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｓ）などの切断）を受ける。いくつかの実施形態では、そのような核分解により、二次プローブと相互作用する一次プローブから「フラップ」または切断断片が解放される。いくつかの実施形態では、二次プローブは、少なくとも１つの標識を含む。いくつかの実施形態では、二次プローブは、相互作用する一対の標識、例えば、ＦＲＥＴ対またはフルオロフォアおよびクエンチャーなどの、少なくとも一対の標識を含む。いくつかの実施形態では、二次プローブと一次プローブの解放されたフラップとの相互作用は、例えば、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）アッセイ、ＦＲＥＴ、および／または消光に関して以下で論ずるように、二次プローブの放出特性の検出可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態では、プローブシステムは、一次プローブおよび一次プローブの解放されたフラップと相互作用するように構成された二次プローブを含み、例えば、一次プローブを切断して、二次プローブまたはそのセグメントに十分に相補的な解放されたフラップを生じさせて、複合体を形成し得る。
【０２４７】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、２つの完全または部分的に相補的な核酸鎖が、平行方向または逆平行方向で、特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一体になり、二本鎖領域を有する安定な構造を形成する能力を意味する。ハイブリッドと呼ばれることもあるこの二本鎖構造の２つの構成鎖は、水素結合によって結び付いている。これらの水素結合は、最も一般的には、単一核酸鎖上の塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で形成されるが、塩基対合はこれらの「正準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」対のメンバーではない塩基間で形成することもできる。非正準塩基対合は当該技術分野で周知である。（例えば、Ｒ．Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（１１ｔｈ  ｅｄ．１９９２）を参照されたい。）
【０２４８】
本明細書で使用する場合、「特定の」とは、１つのみ（または特に示された群のみ）に関係すること、例えば、１つのみ（または特に指示された群のみ）に対して特定の影響を有すること、または特定の方法で１つのみ（または特に示された群のみ）に影響を与えることを意味する。例えば、ＦＲＥＴカセットに特異的な切断された５’フラップは、そのＦＲＥＴカセットにハイブリダイズし、侵襲的切断構造を形成し、異なるＦＲＥＴカセット（例えば、異なる５’フラップハイブリダイズ配列を有するＦＲＥＴカセット）にハイブリダイズして、切断反応を促進し得ない。さらに、特異的は、増幅および検出オリゴヌクレオチドのセットなどの、オリゴヌクレオチドの組み合わせに関連して使用し得る（例えば、増幅オリゴヌクレオチドは、複数の標的配列を非特異的に増幅し得るが、検出オリゴヌクレオチドは、特異的増幅配列を検出するのみであり、したがって、組み合わせを特異的にする）。
【０２４９】
本明細書で使用する場合、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、所与のハイブリダイゼーション条件下で、プローブまたはプライマーが、実質的に、標的配列を含む試料中のその標的配列のみに、検出可能にハイブリダイズすること（すなわち、非標的配列への検出可能なハイブリダイゼーションがほとんどないかまたは全くないこと）を意味する。特に、例えば、様々な多型Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素および毒素関連遺伝子配列の場合、オリゴマーまたはその組み合わせは、標的セットのいずれか１つに特異的にハイブリダイズするように構成し得る。したがって、第１のｔｃｄＣ対立遺伝子に特異的にハイブリダイズすると記載されたオリゴマーはまた、第２（または第２および第３など）のｔｃｄＣ対立遺伝子に特異的にハイブリダイズし得る（が必ずしもそうではない）。標的核酸に特異的にハイブリダイズする増幅および検出オリゴマーは、標的核酸を増幅および検出するのに有用であるが、非標的核酸、特に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ以外のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａなどの系統発生的に密な関係にある生物の非標的核酸、またはいくつかの場合では、標的対立遺伝子に関連する表現型とは異なる表現型を生じる対立遺伝子を増幅および検出するのに有用ではない。したがって、オリゴマーは、非標的核酸よりも十分に高い程度で標的核酸にハイブリダイズし、当業者が、必要に応じて、特定の標的（例えば、毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に由来する核酸を増幅し、および／またはその存在（もしくは非存在）を正確に検出することが可能となる。一般に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度を低下させることは、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度または比率を低下させるであろう。しかしながら、１つ以上の非相補的ヌクレオシドまたは核酸塩基を含めることは、オリゴヌクレオチドが非標的核酸配列を区別する能力を促進し得る。
【０２５０】
特異的ハイブリダイゼーションは、当該技術分野で既知であり、本明細書、例えば、以下に提供される実施例などに記載される技術を使用して測定し得る。いくつかの実施形態では、試験試料中の標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも１０倍の差、少なくとも１００倍の差、または少なくとも１，０００倍の差がある。いくつかの実施形態では、試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。
【０２５１】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」とは、オリゴマーが、標的核酸（例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸）に優先的にハイブリダイズすることを可能にするが、密に関連する非標的核酸に由来する核酸にはハイブリダイズすることを可能としない条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の定義は変わらないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに使用することができる実際の反応環境は、オリゴマーのＧＣ含量および長さ、試験試料に存在し得るオリゴマー配列と標的核酸配列および非標的核酸配列との間の類似性の程度を含む要因に応じて変わり得る。ハイブリダイゼーション条件には、温度およびハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成が含まれる。本開示のオリゴマーを用いて１つ以上のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に由来する標的核酸を増幅および／または検出するための例示的なハイブリダイゼーションアッセイ条件は、二価の塩、例えばＭｇＣｌ２などの塩濃度が５〜２１ｍＭの範囲にある場合、６３℃〜７２℃または６５℃〜６９℃の温度に対応する。ハイブリダイゼーション条件のさらなる詳細は、実施例の項目に記載されている。他の許容されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者によって容易に確認され得る。
【０２５２】
本明細書で使用される場合、「標識」または「検出可能な標識」は、検出されるプローブまたは検出可能なシグナルを生じさせるプローブに直接的または間接的に結合された部分または化合物を指す。直接的な結合は、共有結合または非共有結合相互作用（例えば、水素結合、疎水性またはイオン相互作用、およびキレート錯体または配位錯体形成）を使用し得るが、間接的な結合は、架橋部分またはリンカー（例えば、検出可能なシグナルを増幅する抗体または追加のオリゴヌクレオチドを介する）を使用し得る。任意の検出可能部分には、例えば、放射性核種、ビオチンまたはアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応性基、検出可能な色を付与する色素または粒子などの発色団（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）、発光化合物（例えば生物発光性、リン光性、または化学発光性化合物）、および蛍光化合物（すなわち、フルオロフォア）が使用され得る。フルオロフォアの実施形態には、４９５〜６９０ｎｍの範囲の光を吸収し（例えば、ピーク吸収波長を有する）、５２０〜７１０ｎｍの範囲で発光する（例えば、ピーク発光波長を有する）ものを含み、ＦＡＭ（登録商標）、ＴＥＴ（登録商標）、ＨＥＸ（登録商標）、ＣＡＬ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）（ＯｒａｎｇｅまたはＲｅｄ）、ＣＹ（登録商標）、およびＱＵＡＳＡＲ（登録商標）化合物が含まれる。フルオロフォアは、フルオロフォアに極めて接近した際に光を吸収してバックグラウンド蛍光を減少させるクエンチャー分子と組み合わせて使用され得る。そのようなクエンチャーは、当該技術分野において周知であり、該クエンチャーには、例えば、ＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）（もしくはＢＨＱ（登録商標））、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（もしくはＢＢＱ−６５０（登録商標））、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）、またはＴＡＭＲＡ（商標）化合物が含まれる。特定の実施形態には、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を示す均質系において検出可能である「均質な検出可能標識」が含まれ、これは、ハイブリダイズしていない標識プローブからハイブリダイズした標識プローブを物理的に取り除くことなく標識を検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。例示的な均一の検出可能な標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知である標準的なＡＥまたはＡＥ誘導体（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）を含む、化学発光化合物が含まれる。標識を合成する方法、標識を核酸に結合する方法、および標識からのシグナルを検出する方法は公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）第１０章、および米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７��号、同第５，５８５，４８１号、同第５，６３９，６０４号および同第４，５８１，３３３号、ならびに欧州特許出願第０７４７７０６号）。他の検出可能に標識されたプローブには、ＦＲＥＴカセット、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、および分子ビーコンが含まれる。ＦＲＥＴカセットを以下で詳しく論じる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブはドナーおよびアクセプター標識を含み、ここで、クエンチャーの存在からフルオロフォアを放出するために増幅中にプローブを酵素的に分解すると蛍光が検出される。分子トーチおよびビーコンは、開放および閉鎖配置で存在し、閉鎖配置はフルオロフォアをクエンチし、開放位置はフルオロフォアをクエンチャーから分離して検出可能な蛍光シグナルの変化を可能にする。標的へのハイブリダイゼーションは、そうでなければ閉じたプローブを開く。
【０２５３】
配列が完全に相補的である必要はないが、２つの核酸配列の安定なハイブリダイゼーション、例えばプローブおよび標的配列の安定なハイブリッドを可能にする場合、配列は「十分に相補的」である。すなわち、「十分に相補的な」配列は、標準的な塩基対合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ）を使用することにより、相補的ヌクレオチドの一連のサブセット間の水素結合によって別の配列にハイブリダイズするが、２つの配列は、配列全体が適切なハイブリダイゼーション条件で安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する限り、相補的ではない１つ以上の残基（脱塩基位置を含む）を含み得る。十分に相補的な配列は、互いにハイブリダイズする配列において少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または完全に相補的であり得る。適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、配列組成に基づいて予測することができ、または日常的な試験を使用することによって経験的に判定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．  ａｔ  §§１．９０〜１．９１，７．３７〜７．５７，９．４７〜９．５１および１１．４７〜１１．５７，特に§§９．５０〜９．５１，１１．１２〜１１．１３，１１．４５〜１１．４７および１１．５５〜１１．５７）。
【０２５４】
「伸長不能な」オリゴマーは、伸長を防ぐためにその３’末端またはその近くにブロッキング部分を含む。３’末端付近のブロッキング基は、いくつかの実施形態において、３’末端から５残基以内であり、ポリメラーゼのオリゴマーへの結合を制限するのに十分に大きく、他の実施形態は、３’末端に共有結合したブロッキング基を含有する。多くの異なる化学基、例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基（例えば、３’−ヘキサンジオール残基）、およびコルジセピンが、３’末端をブロックするために使用され得る。ブロッキング部分のさらなる例には、３’−デオキシヌクレオチド（例えば、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）；３’−リン酸化ヌクレオチド；フルオロフォア、クエンチャー、または伸長を妨害する他の標識；反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ヌクレオチド（例えば、露出した５’−ＯＨもしくはホスフェートを任意選択的に有する３’から３’へのホスホジエステルを介して前のヌクレオチドに結合される）；またはポリメラーゼによる新生（ｎａｓｃｅｎｔ）核酸鎖のさらなる伸長を妨げるためにオリゴヌクレオチドに結合されたタンパク質もしくはペプチドが含まれる。本開示の伸長不能なオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０塩基長であり得、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチド長まで伸長し得る。検出可能な標識を含む伸長不能なオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することができる。
【０２５５】
特に特許請求の範囲における「配列番号Ｘの配列」への言及は、別に示さない限り、対応する配列表に記載の塩基配列を指し、骨格（例えば、ＲＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）の同一性または塩基修飾（例えば、シトシン残基のメチル化）を必要としない。さらに、特に明記しない限り、Ｔ残基はＵ残基と交換可能であり、逆もまた同様であると理解される。
【０２５６】
特に明記しない限り、「フォワード」、「センス」、「プラスセンス」、または「プラス鎖」核酸は、一般に、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）のコード鎖、またはそれが一部であるか、もしくはそうでなければ最も近いＯＲＦの転写物、オペロン、ｍＲＮＡなどのコード鎖と同じ鎖上の非コード核酸を指し、「リバース」、「アンチセンス」、「ネガティブセンス」、「ネガティブ鎖」核酸は、「センス」、「プラスセンス」、または「プラス鎖」核酸の相補体を指す。例示的なセンス鎖配列は、以下の配列表の配列番号１〜７に提供される。特に明記しない限り、「核酸へのハイブリダイズ」などには、そのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか、例えば、ｄｓＤＮＡ配列のいずれかの鎖へのハイブリダイズが含まれる。同様に、「配列番号ＹのＸ位を含む部位へのハイブリダイゼーション」および「配列番号Ｙへのハイブリダイゼーションについての競合」などの表現は、一般に、配列番号Ｙのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにハイブリダイズすることを含み得、ハイブリダイズしたオリゴマーが、アンプリコンを生成するように構成されている場合、適切な方向付けは、当業者には直ちに明らかであろう。
【０２５７】
本明細書で使用する場合、「侵襲的切断構造」（または単に「切断構造」）という用語は、（１）標的核酸、（２）上流の核酸（例えば、侵襲的プローブオリゴヌクレオチド）、および（３）下流の核酸（例えば、一次プローブオリゴヌクレオチド）を含む構造を指し、上流および下流の核酸は、標的核酸の隣接領域にアニールし、上流の核酸の３’部分と、下流の核酸と標的核酸との間で形成された二本鎖と、の間で重複が形成される。上流および下流の核酸由来の１つ以上の塩基が、標的核酸塩基に関して同じ位置を占める場合、上流の核酸の重複塩基が標的核酸と相補的であるかどうかに関わらず、およびそれらの塩基が天然塩基かまたは非天然塩基かどうかに関わらず、重複が生じる。いくつかの実施形態では、下流の二本鎖と重複する上流の核酸の３’部分は、例えば、米国特許第６，０９０，５４３号に開示されるような芳香環構造などの非塩基化学部分である。いくつかの実施形態では、例えば、核酸ステムループなどの共有結合を介して、または非核酸化学結合（例えば、複数の炭素鎖）を介して、１つ以上の核酸を互いに結合させてもよい。侵襲的切断構造はまた、切断された５’フラップがＦＲＥＴカセットにハイブリダイズする場合に（すなわち、「標的核酸」および「下流の核酸」が、ステムループ構成で共有結合されている場合に）作成される。切断された５’フラップにハイブリダイズするＦＲＥＴカセットの「標的核酸」配列は、「５’フラップハイブリダイズ配列」と称し得る。
【０２５８】
本明細書で使用する場合、「ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ」または「侵襲的切断アッセイ」は、侵襲的切断構造が形成され、標的配列の存在下で切断される、標的核酸配列を検出するためのアッセイを指す。いくつかの実施形態では、侵襲的切断アッセイのための試薬には、切断剤およびオリゴヌクレオチド（例えば、「侵襲的プローブ」、「一次プローブ」、および「ＦＲＥＴカセット」）が含まれる。いくつかの実施形態では、侵襲的プローブは、増幅オリゴマーまたはその伸長産物である。侵襲的切断アッセイは、単一の反応混合物において２つの侵襲的シグナル増幅反応（すなわち、「一次反応」および「二次反応」）を連続して組み合わせ得る。いくつかの実施形態では、侵襲的切断構造の存在の検出は、切断剤を使用して達成される。一次プローブは、プローブシステムの一部であり得る。いくつかの実施形態では、一次プローブの追加の部分は、標的核酸に相補的ではなく、および／または伸長不能である、３’末端ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、一次プローブの追加の部分は、ＦＲＥＴカセットと相互作用するように構成され、例えば、例えば標的核酸に相補的ではないＦＲＥＴカセット相互作用配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ用の試薬は、ヌクレアーゼ、例えば、クリベース、例えば、ＦＥＮ酵素（例えば、Ａｆｕ、Ａｖｅ、ＲＡＤ２、またはＸＰＧタンパク質）、または他の酵素（例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有し、任意選択で、不活性化されたまたは低減した合成活性を有する、ＤＮＡポリメラーゼ）をさらに含み、ヌクレアーゼは、侵襲的プローブおよび一次プローブの両方が標的配列にハイブリダイズしたときに形成される構造（例えば、一次プローブおよび標的の二本鎖が、侵襲的プローブによって３’末端侵襲を受けたときに生じ得る構造であって、侵襲的プローブの少なくとも３’末端部分および／または中間部分がハイブリダイズされ、一次プローブの５’末端が遊離し、一次プローブの中間部分および／または３末端部分がハイブリダイズされている、構造）に対して特異的な活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ用の試薬は、緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、二価カチオンの供給源（例えば、マグネシウム塩またはマンガン塩、例えば、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、酢酸マグネシウム、酢酸マンガンなどのＭｎ２＋および／またはＭｇ２＋イオン）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ用の試薬は、第１のオリゴマーと一緒に、例えばＰＣＲを介してアンプリコンを生成するように構成される少なくとも１つの増幅オリゴマーなどの、少なくとも１つの第３のオリゴマーをさらに含む。そのような実施形態では、一次プローブは、アンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ用の試薬は、ＰＣＲ試薬などの増幅試薬をさらに含む。標的配列が増幅され得るＩＮＶＡＤＥＲアッセイの実施形態は、ＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳアッセイと称し得る。アッセイにおいて増幅を含めることにより、検出の下限が提供され得る。ＩＮＶＡＤＥＲアッ���イ、クリベース、他のヌクレアーゼ、他の可能なＩＮＶＡＤＥＲ／ＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳ（登録商標）試薬などは、例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、同第６，９１３，８８１号、同第６，０９０，５４３号、同第７，４８２，１２７号、および同第９，０９６，８９３、ＷＯ９７／２７２１４、ＷＯ９８／４２８７３、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９）、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，９７：８２７２（２０００）、ならびにＷＯ２０１６／１７９０９３で論じられている。
【０２５９】
本明細書で使用する場合、「フラップエンドヌクレアーゼ」または「ＦＥＮ」（例えば、「ＦＥＮ酵素」）という用語は、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの間の接合部に重複ヌクレオチドが存在するように、別の核酸鎖によって置換される鎖のうちの一方にある一本鎖５’オーバーハングまたはフラップを含む二本鎖を有するＤＮＡ構造に対する構造特異的エンドヌクレアーゼとして機能する、核分解酵素のクラスを指す。ＦＥＮ酵素は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの接合部に隣接するホスホジエステル結合３’の加水分解切断を触媒し、オーバーハングまたは「フラップ」を放出する（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：３３１−３３６（１９９８）およびＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：５８９−６１５（２００４）を参照されたい）。ＦＥＮ酵素は、個々の酵素、マルチサブユニット酵素であってもよく、または別の酵素もしくはタンパク質複合体、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの活性として存在してもよい。フラップエンドヌクレアーゼは、熱安定性であり得る。本明細書に開示される方法において有用なＦＥＮ酵素の例は、米国特許第５，６１４，４０２号、同第５，７９５，７６３号、同第６，０９０，６０６号、ならびにＷＯ９８／２３７７４、ＷＯ０２／０７０７５５、ＷＯ０１／９０３３７、およびＷＯ０３／０７３０６７によって識別される公開されたＰＣＴ出願に記載され、それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。市販のＦＥＮ酵素の特定の例には、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）が含まれる。
【０２６０】
ＩＮＶＡＤＥＲアッセイおよび／または侵襲的切断アッセイもしくは反応に関して使用される場合の「カセット」は、本明細書で使用する場合、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイにおける検出オリゴマーの切断に応答して検出可能なシグナルを生成するように構成された、オリゴマーまたはオリゴマーの組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、カセットは、検出オリゴマー（例えば、一次プローブ）の切断からの切断産物（例えば、「フラップ」）にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、そのようなハイブリダイゼーションは、蛍光の検出可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態では、そのようなハイブリダイゼーションは、カセットがその後に切断され得るように、第２の侵襲的切断構造を形成する。いくつかの実施形態では、カセットは、相互作用する標識の対、例えば、ＦＲＥＴ対（この場合、カセットは「ＦＲＥＴカセット」である）を含む。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴカセットは、検出オリゴマーの切断からの切断産物へのハイブリダイゼーションの際に、蛍光特性の検出可能な変化を受ける。例えば、ＦＲＥＴカセットは、検出オリゴマーの切断からの切断産物へのハイブリダイゼーションの際における標識間の平均距離の変化に基づいて、第１の波長での蛍光発光を増加させ、および／または第２の波長での蛍光発光を低減することができる。これは、ドナーフルオロフォアからのエネルギー移動の減少（例えば、フルオロフォアの消光の減少、またはドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアへのエネルギー移動の減少）から生じ得る。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴカセットは、ヘアピン構造を採り、標識の対の相互作用は、検出可能なエネルギー放出（例えば、蛍光放出）を実質的に抑制する（例えば、消光する）。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴカセットは、切断剤（例えば、ＦＥＮ酵素）の基質である侵襲的切断構造を形成するために、一次プローブの相補的切断５’フラップにハイブリダイズする部分を含む。いくつかの実施形態では、切断剤によるＦＲＥＴカセットの切断は、ドナー部分およびアクセプター部分を分離し、その結果、抑制が緩和され、シグナルの生成が可能になる。
【０２６１】
「１１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣ対立遺伝子」は、野生型ｔｃｄＣオープンリーディングフレームの１１７位に対応する欠失がある、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣの対立遺伝子である。したがって、例えば、例示的な１１７ｄｅｌ配列の配列番号３では、１１２位〜１２１位はＡＴＴＴＴＧＧＣＧＴであるが、例示的な野生型配列断片の配列番号２では、１１２位〜１２２位はＡＴＴＴＴＡＧＧＣＧＴである。１１７位は多型であることが観察されており、ＧおよびＴが同様にそこで生じることが既知である（それぞれ、配列番号１および４を参照されたい）。したがって、「１１７Ｄ  ｔｃｄＣ対立遺伝子」は、Ａ、Ｇ、またはＴが１１７位に存在するものであり（Ｄは、Ａ、Ｇ、またはＴ／ＵについてのＩＵＰＡＣ多義コードである）、個々の非欠失多型は、１１７Ａ、１１７Ｇ、および１１７Ｔ  ｔｃｄＣ対立遺伝子である。当業者は、標準パラメータを使用するＳｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎまたはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムなどの既知のアラインメント方法を使用して、配列バリアント間の対応する位置を同定し得る。代替的に、配列番号１〜５などの高度に類似した配列を手動でアラインメントすることができる。
【０２６２】
「１８４Ｔ  ｔｃｄＣ対立遺伝子」は、野生型ｔｃｄＣオープンリーディングフレームの１８４位に対応する位置にＴが存在する、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣの対立遺伝子である。したがって、例えば、例示的な１８４Ｔ配列の配列番号５では、１７９位〜１８９位はＣＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡであり、例示的な野生型配列断片の配列番号２では、１７９位〜１８９位はＣＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡである。１８３位も多型であり、１８４Ｔおよび１８４Ｃ対立遺伝子は、それぞれ、１８３Ｃまたは１８３Ｔのいずれかであり得る（例えば、配列番号２は、１８３Ｃ  １８４Ｃであり、配列番号１および４は、１８３Ｔ  １８４Ｃであり、配列番号５は、１８３Ｔ  １８４Ｔである）。対応する位置の同定は、上記の通りである。
【０２６３】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的な定義は、分子生物学の分野に関連する技術書、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）またはＴｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に見出すことができる。
【０２６４】
例示的な組成物、キット、方法、および使用
本開示は、試料由来のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸の増幅および検出に有用なオリゴマー、組成物、およびキットを提供する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、例えばキットまたは組成物中に提供される。オリゴマーは、一般に、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素または毒素関連遺伝子、例えばｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢなどのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ領域を含む。異なる長さおよび塩基組成のオリゴマーは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を増幅するために使用し得るが、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴマーは、約１０〜６０塩基長、約１２〜５０塩基長、約１２〜４０塩基長、約１２〜３５塩基長、または約１２〜３０塩基長の標的ハイブリダイズ領域を有する。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、標的ハイブリダイズ領域に加えて、配列の第２の領域を含み、これは標的ハイブリダイズ領域の５’に位置し得る。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、第２の配列領域を含まない。いくつかの実施形態では、配列の第２の領域は、プロモーターである。いくつかの実施形態では、配列の第２の領域は、ＦＲＥＴカセットと相互作用するように構成される。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、一方のオリゴマーが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸のセンス鎖とハイブリダイズするように構成され、他方が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸のアンチセンス鎖とハイブリダイズするように構成されている、オリゴマーの対が提供される。そのようなオリゴマーは、ＰＣＲまたは他の形態の増幅のためのプライマー対を含む。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、プライマーセット（標的配列からアンプリコンを生成するように構成された少なくとも２つのプライマーとして定義される）、またはプライマーセットおよび任意選択で非伸長不能なおよび／または標識された（例えば、ＦＲＥＴカセットと一緒に、一次プローブまたはプローブシステムの一部として使用するための）追加のオリゴマー（例えば、検出オリゴマー）などの１つ以上のオリゴマーが、少なくとも１、２、３、もしくは４つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素または毒素関連遺伝子、例えば、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢにハイブリダイすするように構成されている。追加のオリゴマー（例えば、検出オリゴマー）は、存在する場合、プライマーセットによって生成されたアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成することができる。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ；ｔｃｄＣ  およびｔｃｄＡ；ｔｃｄＢ  およびｔｃｄＣ；ｔｃｄＣ  およびｃｄｔＢ；ｔｃｄＢ  およびｃｄｔＢ；ｔｃｄＡ  およびｃｄｔＢ；ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｔｃｄＣ；ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｃｄｔＢ；ｔｃｄＡ、ｃｄｔＢ、およびｔｃｄＣ；ｃｄｔＢ、ｔｃｄＢ、およびｔｃｄＣ；ｃｄｔＢ、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｔｃｄＣ；ｔｃｄＣおよびｃｄｔＡ；ｔｃｄＢ  およびｃｄｔＡ；ｔｃｄＡ  およびｃｄｔＡ；ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｔｃｄＣ；ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｃｄｔＡ；ｔｃｄＡ、ｃｄｔＡ、およびｔｃｄＣ；ｃｄｔＡ、ｔｃｄＢ、およびｔｃｄＣ；ｃｄｔＡ、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｔｃｄＣ；またはｃｄｔＡ、ｃｄｔＢ、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｔｃｄＣに集合的にハイブリダイズする複数のオリゴマーが提供され、前述の遺伝子名はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ遺伝子を指すと理解される。いくつかの実施形態では、前述の遺伝子の組み合わせのいずれかと集合的にハイブリダイズする複数のプライマーセットが提供される。いくつかの実施形態では、前述の遺伝子の組み合わせのいずれかと集合的にハイブリダイズする、任意選択で伸長不能なおよび／または標識された複数のプライマーセットおよび追加のオリゴマー（例えば、検出オリゴマー）（例えば、ＦＲＥＴ  カセットなどと一緒に、一次プローブとして使用され、任意選択で、プローブシステムの一部として使用される）が提供される。
【０２６９】
例示的なｃｄｔＡ、ｃｄｔＢ、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｔｃｄＣ配列は、以下の配列表に提供されている。追加の例示的な配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで提供され、当業者がアクセスし得る。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、セット、キット、組成物、または反応混合物中の１つ以上のオリゴマーは、メチル化シトシン（例えば、５−メチルシトシン）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー中のシトシンの少なくとも約半分は、メチル化されている。いくつかの実施形態では、オリゴマー中のシトシンの全てまたは実質的に全て（例えば、１つまたは２つを除く全て）は、メチル化されている。いくつかの実施形態では、３’末端または３’末端の２つ、３つ、４つ、もしくは５つ以内のシトシンがメチル化されていないことを除いて、全てのまたは実質的に全てのシトシンがメチル化されている。シトシンのメチル化は、標的に対するオリゴマーの親和性を調節するために使用し得、一般に、ハイブリダイズした複合体の融解温度の上昇をもたらし得る。
【０２７１】
例示的なオリゴマーセット（例えば一次検出オリゴマーとして標識または使用される、プライマーの対および検出オリゴマー）およびプローブシステム（一次および二次検出オリゴマー）を以下の表に示す。表Ａの検出オリゴマーは、一次検出オリゴマーとして（例えば、侵襲的切断アッセイ、例えば、ＩＮＶＡＤＥＲまたはＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳ（登録商標）アッセイなどにおいて、構造特異的ヌクレアーゼと共に）使用される場合、表Ｂの一次検出オリゴマーに関連する任意の二次検出オリゴマーと組み合わせることができる。
【０２７２】
表Ａ．例示的なオリゴマーセット。オリゴマーは配列番号によって示される（以下の配列表を参照されたい）。表ＡのｔｃｄＣの例示的な検出オリゴマーが標的とする対立遺伝子は、括弧内に示されている。オリゴマーは、メチル化、標識付け、および配列表に記載される他の非配列機能を含むことができる。
【表Ａ−１】
2021506274.tif 000002
【表Ａ−２】
2021506274.tif 000003
【表Ａ−３】
2021506274.tif 000004
【表Ａ−４】
2021506274.tif 000005
＊：示された検出オリゴマーと共に、構造特異的ヌクレアーゼの基質を形成するための侵襲的オリゴマーとして使用
【０２７３】
上記で示したセットは例示であり、排他的なものではない。例えば、増幅オリゴマーは、収束的な（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）３’末端とは反対に方向付けなければならず、検出オリゴマーは、増幅オリゴマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズさせなければならない（すなわち、ハイブリダイゼーションは、増幅オリゴマーハイブリダイゼーション部位間の領域で発生するか、いくつかの場合では、増幅オリゴマーハイブリダイゼーション部位の３’末端と重複する領域で発生する）。いくつかの実施形態では、表Ａで言及される遺伝子のうちの１つを標的とする少なくとも２つのフォワードプライマーを組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、ｔｃｄＢを標的とする少なくとも２つのフォワードオリゴマーを組み合わせて使用する。オリゴマーおよび異なる配列の組み合わせは、ｔｃｄＢを含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ配列の種内異質性を考慮して、アッセイ感度に利点を提供することができる。以下の例２を参照されたい
【０２７４】
表Ａで言及する検出オリゴマー配列番号（侵襲的のオリゴマーを除く）は、一般に、５’フラップ配列を含み、これは、切断剤による切断後にＦＲＥＴカセットと相互作用することができる本質的に任意の配列である（例示的な二次検出オリゴマーおよびそれらと相互作用する５’フラップ配列については以下の表Ｂを参照されたい）。５’フラップ配列を省略した検出オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列も配列表に提供されており、当業者は、１つの検出オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列を、別の検出オリゴマーの配列の５’フラップ配列または同様のハイブリダイゼーション特性を提供する別の５’フラップ配列と対合することができることを理解するであろう。さらに、いくつかの実施形態では、５’フラップが検出オリゴマー中に必要ではないＴａｑＭａｎなどのアッセイ形式などにおいて、５’フラップ配列が省略されてもよい。いくつかの実施形態では、表Ａに示される組み合わせの検出オリゴマーなどの検出オリゴマーは、以下に論じるように、分子トーチプローブの場合など、５’フラップ配列の代わりに部分的に自己相補的な配列を備えている。
【０２７５】
ｔｃｄＣに関して、上記の検出オリゴマーは、高病原性と関連するｔｃｄＣの１１７ｄｅｌまたは１８４Ｔ対立遺伝子を検出する（それらの存在下でシグナルを生成する）ように構成される。したがって、本明細書で提供される方法は、１１７Ｔ  １８４Ｃ  ｔｃｄＣまたは１１７Ｄ  １８４Ｃ  ｔｃｄＣの存在下で正のシグナルを生成しないように構成され得、すなわち、任意のシグナルが、そのようなｔｃｄＣ対立遺伝子を使用した関連する検出システムから生成される限りにおいては、シグナルは、負とみなされるほど十分に低い。１１７ｄｅｌ一次プローブおよび侵襲的オリゴマー（インベーダーまたはｉＰｒｉｍｅｒ）は、一次プローブ標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号９３〜１３７または１８４〜１８７）が、侵襲的オリゴマーからの欠失の反対部位にハイブリダイズするように構成し得、その結果、両方が、１１７Ｄ対立遺伝子ではなく１１７ｄｅｌ対立遺伝子との複合体中にある場合に、侵襲的オリゴマーの３’末端が、標的ハイブリダイズ配列の５’末端に十分近接して、侵襲的切断構造を形成する。配列番号１０６（一次プローブ標的ハイブリダイズ配列）および８８（ｉＰｒｉｍｅｒ）（一部）を、配列番号３の抜粋、１１７ｄｅｌ対立遺伝子（アスタリスクで示した位置）とアラインメントさせて、例としてそれぞれ以下に示し、欠失部位をダッシュ記号で示す。（本書の他の箇所で論じるように、一次プローブは、伸長を防止するために伸長不能な３’末端を有することができる）。一次プローブ標的ハイブリダイズ配列の５’末端および侵襲的オリゴマー（ここではｉＰｒｉｍｅｒ）の３’末端は両方とも、１１８位を占有し、プローブ（ＡＡＡ−−）および標的（ＴＴＴＴ−）をアラインメントさせた場合、１１２位と１１８位との間に１ヌクレオチドのオフセットがあり、これは、１１２位と１１８位の間の標的鎖に突出部（ｂｕｌｇｅ）の形成をもたらし、それにより、侵襲的切断構造の形成、およびその後のＩＮＶＡＤＥＲまたはＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳアッセイでの検出が可能となる。１１７Ｄ  ｔｃｄＣ対立遺伝子が代わりに存在する場合、２ヌクレオチドのオフセットが存在し、これは、必要な三次構造を不安定化させ、それにより、侵襲的切断構造の形成およびその後のＩＮＶＡＤＥＲまたはＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳアッセイでの検出が低減または排除され、したがって、対立遺伝子特異的な検出がもたらされる。したがって、いくつかの実施形態では、１１７ｄｅｌ対立遺伝子との複合体において、一次プローブの下で標的配列の突出部を誘導する部位にハイブリダイズし、１１７Ｄ対立遺伝子との複合体中の侵襲的切断構造を実質的に不安定化する、１１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を検出するための侵襲的オリゴマーおよび一次プローブが提供される。特に、この手法は、１１７Ｄ対立遺伝子の１１７位のヌクレオチドの同一性を本質的に無関係にしなければならず、その理由は、塩基対合特性に対する影響ではなく、間隔に対する影響が、アッセイの結果に影響を与えるものであり、したがって、この位置での様々な既知の非高病原性多型が原因となる可能性のある誤差を低減または排除するためである。
配列番号
【化１】
2021506274.tif 000006
上に示すのは、配列番号１０６の１〜２２位、配列番号８８の１１〜２９位、および配列番号３の８９〜１３４位である。
【０２７６】
１８４Ｔ一次プローブおよび侵襲的オリゴマー（インベーダーまたはｉＰｒｉｍｅｒ）は、一次プローブ標的ハイブリダイズ配列（例えば、配列番号１９７〜２００または２０６〜２１２）および侵襲的オリゴマーが、１８４位を含む重複部位にハイブリダイズするように構成することができ、その結果、例えば、一次プローブの５’−ヌクレオチド（その位置は、侵襲的オリゴマーの３’末端ヌクレオチドに対応する）は、１８４Ｔ対立遺伝子との複合体中の１８４位の塩基とワトソン−クリック塩基対を形成できるが、１８４Ｃ対立遺伝子との複合体では形成できない。対立遺伝子が１８４Ｃである場合、この位置にワトソンクリック塩基対がないことにより、１８４Ｔ対立遺伝子が存在する場合に形成される認識可能な侵襲的切断構造の形成が低減または排除され、したがって、対立遺伝子特異的な検出を提供することが意図される。配列番号１９８（一次プローブ標的ハイブリダイズ配列）および１９４（インベーダー）（一部）を、配列番号５の逆相補鎖の抜粋と共に例として以下に示し、アスタリスクは１８４位を示す。したがって、いくつかの実施形態では、重複する部位にハイブリダイズする、１８４Ｔ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を検出するための侵襲的オリゴマーおよび一次プローブが提供され、  侵襲的オリゴマーの３’末端ヌクレオチドに対応する位置の一次プローブのヌクレオチドは、１８４Ｔ対立遺伝子との複合体ではワトソン−クリック塩基対を形成できるが、１８４Ｃ対立遺伝子との複合体では形成できない。いくつかの実施形態では、重複する部位にハイブリダイズする、１８４Ｔ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を検出するための侵襲的オリゴマーおよび一次プローブが提供され、侵襲的オリゴマーの３’から２番目のヌクレオチドは、１８３Ｔ対立遺伝子との複合体ではワトソンクリック塩基対を形成するが、１８３Ｃ対立遺伝子との複合体では形成しない。
配列番号
【化２】
2021506274.tif 000007
上に示すのは、配列番号１９８の１〜２２位、配列番号１９４の１２〜３０位、および配列番号５の１６７〜２１２位の逆相補鎖である。
【０２７７】
表Ｂ．例示的な二次検出オリゴマーと一次検出オリゴマー５’フラップ配列との対。二次検出オリゴマーは、その配列番号によって示される（以下の配列表を参照されたい）。いくつかの実施形態では、表Ｂの二次検出オリゴマーと適合性一次検出オリゴマー（一次プローブ）との組み合わせは、表Ａの適合性一次検出オリゴマーに関連する侵襲的オリゴマーをさらに含む。
【表Ｂ】
2021506274.tif 000008
【０２７８】
いくつかの実施形態では、標識を含み、および／または伸長不能なオリゴマーが提供される。そのようなオリゴマーは、プローブとして、またはプローブシステムの一部として（例えば、標的結合検出オリゴマーと組み合わせたＦＲＥＴカセットとして）使用することができる。いくつかの実施形態では、標識されたオリゴマーは、表Ａの検出オリゴマーの列に列挙された配列番号に対応する配列またはその標的ハイブリダイズ配列を有する。いくつかの実施形態では、標識は、非ヌクレオチド標識である。好適な標識には、検出可能な光シグナルを放出する化合物、例えば、均一な混合物中で検出することができるフルオロフォアまたは発光（例えば、化学発光）化合物が含まれる。２つ以上の標識および２種以上の標識は、特定のプローブ上に存在することができるか、または検出は、各プローブが検出可能なシグナルを生成する化合物で標識されているプローブの混合物の使用に依存することができる（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号を参照されたい）。標識は、共有結合、キレート化、およびイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに結合し得る。いくつかの実施形態では、標識は共有結合される。例えば、いくつかの実施形態では、検出プローブは、例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物などの結合された化学発光標識を有する（例えば、米国特許第５，１８５，４３９号；同第５，６３９，６０４号；同第５，５８５，４８１号；および同第５，６５６，７４４号を参照されたい）。蛍光標識または化学発光標識などの標識は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合することができる（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号；同第５，６５６，７４４号；および同第５，６３９，６０４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、伸長不能であり、かつ、増幅オリゴマー（例えば、ｉＰｒｉｍｅｒ）またはプライマーとして使用されない侵襲的のオリゴマーなどの、キットまたは組成物における追加のオリゴマーのハイブリダイゼーション部位と重複するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸中の部位にハイブリダイズするオリゴマーが提供される。そのようなオリゴマーのハイブリダイゼーションは、例えば、ＩＮＶＡＤＥＲまたはＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳアッセイにおける検出機構の一部として、構造特異的ヌクレアーゼの基質を形成することができる。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、標識されたオリゴマー（例えば、蛍光標識を含む）は、第１の標識と相互作用する第２の標識をさらに含む。例えば、第２の標識はクエンチャーであり得る。そのようなプローブは、（例えばＴａｑＭａｎ（商標）アッセイにおいて）使用することができ、プローブを標的またはアンプリコンにハイブリダイズさせ、続いて５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼにより、蛍光標識が解放され、それにより蛍光が増加するか、または第２の標識との相互作用とは無関係の蛍光がもたらされる。そのようなプローブを、（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲまたはＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳアッセイにおいて（例えば、ＦＲＥＴカセットとして））使用することもできる。いくつかの実施形態では、標識されたオリゴマーは、表Ｂの第２の検出オリゴマーの列に列挙された配列番号を有する。
【０２８０】
いくつかの用途において、検出前にハイブリダイズしていないプローブの除去を最初に必要とせずに試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を容易にするために、少なくともある程度の自己相補性を示す１つ以上のプローブを使用する。そのような検出プローブの具体的な実施形態は、例えば、一般にヘアピンと呼ばれる立体配座などの、分子内ハイブリダイゼーションによって保持される立体配座を形成するプローブを含む。好適なヘアピンプローブには、「分子トーチ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｒｃｈ）」（例えば、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号を参照されたい）、ならびに「分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）」（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号および米国特許第５，３１２，７２８号を参照されたい）が含まれる。分子トーチは、結合領域（例えば、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−リンカー）によって接続され、かつ所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の異なる領域（造語「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」）を含む。適切な標的または変性条件に曝露された場合、分子トーチの２つの相補領域（完全にまたは部分的に相補的であり得る）が融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件に戻したときに、標的結合ドメインが標的配列へのハイブリダイゼーションについて利用可能になる。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的配列へのハイブリダイゼーションを促進するように設計されている。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズするときとは対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズするときには異なるシグナルが生じるように位置付けられた相互作用標識（例えば、蛍光／消光剤）を含み、それにより、それに関連する実行可能な標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二本鎖を検出することを可能にする。
【０２８１】
本開示に関連して使用することができる相互作用するドナー−アクセプター標識対の例には、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオロレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、ＴｅｘａｓＲｅｄ／ＤＡＢＣＹＬ，ＣＹ５／ＢＨＱ１（登録商標）、ＣＹ５／ＢＨＱ２（登録商標）、ＣＹ５／ＢＨＱ３（登録商標）、ＣＹ５．５／ＢＨＱ３（登録商標）、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（登録商標）／ＢＨＱ３（登録商標）、Ｑｕａｓａｒ  ７０５（登録商標）／ＢＨＱ３（登録商標）、ＣＹ３／ＢＨＱ１（登録商標）、ＣＹ３／ＢＨＱ２（登録商標）  、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７（登録商標）色素が含まれる。当業者であれば、ドナー色素およびアクセプター色素が異なる場合、アクセプターの増感蛍光の出現またはドナー蛍光の消光によって、エネルギー移動が検出され得ることを理解するであろう。ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ７色素（登録商標）などの非蛍光アクセプターは、直接的な（すなわち、非増感）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を有利に排除する。ドナー−アクセプター対の一方のメンバーとして使用することができる例示的なフルオロフォア部分には、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（例えば、ＣＹ５）が含まれる。ドナー−アクセプター対の別のメンバーとして使用することができる例示的な消光剤部分には、ＤＡＢＣＹＬ，Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｄｅｘｔｅｒ，ＭＩ）から入手可能なＢＬＡＣＫＢＥＲＲＹ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）部分が含まれる。当業者は、様々な検出形式（例えば、ＦＲＥＴ、ＴａｑＭａｎ（商標）、ＩＮＶＡＤＥＲなど）で使用するためのドナーおよびアクセプター標識の適切な対を使用することができる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、検出オリゴマー（例えば、プローブ、一次プローブ、または標識されたプローブ）は伸長不能である。例えば、標識されたオリゴマーは、３’末端３’−デオキシヌクレオチド（例えば、末端２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）を有するか、３’末端逆位ヌクレオチド（例えば、最後のヌクレオチドが逆位であり、それにより、３’から３’へのホスホジエステル結合またはその類似体、例えばホスホロチオエートによって、最後から２番目のヌクレオチドに結合される）を有するか、または結合したフルオロフォア、クエンチャー、もしくは伸長を妨げる他の標識（おそらく末端ヌクレオチドの３’位を介して結合するが、必ずしもそうとは限らない）を有する、３’付加物（例えば、３’リン酸化または３’アルカンジオール）によって伸長不能にし得る。いくつかの実施形態では、３’末端ヌクレオチドは、メチル化されていない。いくつかの実施形態では、検出オリゴマーは、３’−アルカンジオール（例えば、ヘキサンジオール）などの３’末端付加物を含む。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、検出オリゴマーなどのオリゴマーは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢから生成されたアンプリコンに特異的にハイブリダイズするように構成される（例えば、オリゴマーは、特異的なハイブリダイゼーションのためのアンプリコンに十分に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる）。標的ハイブリダイズ配列は、オリゴマー中に存在する任意の配列番号の配列またはそのバリアントを超える追加のヌクレオチドを含み得る。
【０２８４】
試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的核酸の存在または非存在を判定するための反応混合物もまた、本発明によって提供される。本開示による反応混合物は、以下のうちの少なくとも１つ以上を含む：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、もしくはｃｄｔＢのうちの少なくとも１つまたは上記のそれらの任意の組み合わせの増幅のための、本明細書に記載のオリゴマーの組み合わせ、ならびにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、もしくはｃｄｔＢのうちの１つまたは上記のそれらの任意の組み合わせの存在または非存在を判定するための、本明細書中に記載の少なくとも１つの検出プローブオリゴマー。反応混合物は、捕捉プローブ（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３／０２０９９９２に記載されるポリ（ｋ）捕捉プローブ）などの多くの任意選択的な構成要素をさらに含むことができる。増幅反応混合物について、反応混合物は、典型的には、インビトロで増幅を行うのに好適である他の試薬、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰもしくはｄＵＴＰの一方もしくは両方、ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）、ならびに／または酵素（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および／または逆転写酵素、および／またはＲＮＡポリメラーゼ、および／またはＦＥＮ酵素）を含み、典型的には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸が存在してもまたは存在しなくてもよい試験試料構成要素を含む。反応混合物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、またはｃｄｔＢのうちの少なくとも１つまたは上記のそれらの組み合わせのいずれかのための増幅オリゴマーを含むことができる。加えて、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含む反応混合物については、反応混合物のための増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって連結される（すなわち、反応混合物は、反応混合物の増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう）。
【０２８５】
本明細書に記載の方法を実施するためのキットもまた、本開示によって提供される。本開示によるキットは、以下のうちの少なくとも１つ以上を含む：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、もしくはｃｄｔＢのうちの少なくとも１つまたは上記の任意の組み合わせの増幅のための、本明細書に記載される増幅オリゴマーの組み合わせ、ならびにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、もしくはｃｄｔＢのうちの１つまたは上記のそれらの任意の組み合わせの存在または非存在を判定するための、本明細書中に記載される少なくとも１つの検出プローブオリゴマー。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意のオリゴマーの組み合わせがキット中に存在する。キットは、例えば、捕捉プローブ（例えば、ＵＳ２０１３／０２０９９９２に記載されるポリ（ｋ）捕捉プローブ）などの多くの任意選択的な構成要素をさらに含むことができる。
【０２８６】
キットに存在し得る他の試薬は、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰもしくはｄＵＴＰの一方もしくは両方、ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）、および／または酵素（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および／または逆転写酵素、および／またはＲＮＡポリメラーゼおよび／またはＦＥＮ酵素）を含み、典型的には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸存在してもまたは存在していなくてもよい試験試料構成要素を含む。さらに、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含むキットに関して、反応混合物のための増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって関連付けられる（すなわち、反応混合物は、反応混合物の増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含む）。特定の実施形態では、キットは、本開示による方法を実施するための使用説明書のセットをさらに含み、使用説明書は、添付文書および／またはキットもしくはその構成要素の包装に関連し得る。
【０２８７】
本明細書に開示されるあらゆる方法が、本方法の目的に向けられた本方法に関与する材料の対応する使用の開示としても理解されるべきである。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸配列を含むオリゴマーのうちのいずれか、およびそのようなオリゴマーを含む任意の組み合わせ（例えば、反応混合物を含むがこれに限定されない、キットおよび組成物）はまた、毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸の検出または定量化における使用、および毒素産生Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸の検出または定量化のための組成物の調製における使用のために開示されるものとして理解されるべきである。
【０２８８】
大まかに述べると、方法は、以下の構成要素：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸（例えば、臨床試料などの試料に由来する）が捕捉オリゴマー（例えば、特異的または非特異的な捕捉オリゴマー）にアニールされる、標的捕捉；単離（例えば、捕捉オリゴマーと会合していない材料を除去するための洗浄）；増幅；および例えば増幅と共にリアルタイムで実施することができる、アンプリコン検出、のうちの１つ以上を含むことができる。ある特定の実施形態は、上記のステップの各々を伴う。ある特定の実施形態は、指数関数的増幅を含み、任意選択的に先行する線形増幅ステップを伴う。ある特定の実施形態は、指数関数的増幅およびアンプリコン検出を伴う。ある特定の実施形態は、上に列挙した構成要素のうちのいずれか２つを伴う。特定の実施形態は、すぐ上に列挙した任意の２つの構成要素（例えば、洗浄および増幅、または増幅および検出）を伴う。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、増幅は、（１）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、もしくはｃｄｔＢの少なくとも１つまたは上記のそれらの組み合わせを増幅するために、試料を少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、オリゴマーは、上記の少なくとも２つの増幅オリゴマー（例えば、指数関数的増幅のためにセンス方向に向けられた１つ以上およびアンチセンス方向に向けられた１つ以上）を含む、接触させること（２）インビトロ核酸増幅反応を行うことであって、試料に存在するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、もしくはｃｄｔＢのうちの少なくとも１つのいずれかまたは上記のそれらの組み合わせのいずれかを、増幅産物の生成するための鋳型として使用する、インビトロ核酸増幅反応を行うことと、（３）増幅産物の存在または不存在を検出し、それにより、試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、もしくはｃｄｔＢのうちの少なくとも１つまたは上記のそれらの任意の組み合わせの存在または非存在を判定することと、を含む。
【０２９０】
本開示に従った検出方法は、方法のその後のステップに供される試料を得るステップをさらに含むことができる。特定の実施形態では、使用される試料を「得ること」は、例えば、方法の１つ以上のステップが実施される試験施設もしくは他の場所で試料を受け取ること、対象または対象の処置を提供するかもしくは象の処置を助ける人から試料を受け取ること、および／あるいは方法の１つ以上のステップが実施される施設内の場所から（例えば、保存所または他の保管所から）試料を取り出すことを含む。
【０２９１】
特定の実施形態では、方法は、増幅（例えば、捕捉ステップ）の前に、試料中の他の構成要素（例えば、非核酸構成要素）からＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸を精製することを含む。そのような精製は、試料中に含まれる生物を他の試料構成要素から分離および／もしくは濃縮する方法、または非核酸試料構成要素（例えば、タンパク質、炭水化物、塩、脂質など）を除去もしくは分解する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、例えば、試料をスワブと関連させて、スワブを洗浄液に移すことにより、粗製試料などの試料を洗浄液（例えば、水、緩衝液、洗剤溶液など）と接触させ、少なくともいくらかの不純物が洗浄液中に放出される。次いで、少なくとも部分的に精製された試料をスワブから担体液体（例えば、水、緩衝液、溶解溶液など）に放出することができる。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡを（例えば、ＲＮａｓｅおよび／もしくは熱によって）分解し、任意選択で、ＲＮａｓｅを除去もしくは不活性化し、および／または分解されたＲＮＡを除去する。
【０２９２】
特定の実施形態では、標的核酸を精製することは、標的核酸を捕捉して、標的核酸を他の試料構成要素から特異的または非特異的に分離することを含む。非特異的な標的捕捉方法は、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈殿させること、他の非核酸試料構成要素を除去するために洗浄される支持体に核酸を付着させること、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸および他の試料構成要素を含むかもしくはそれを含む疑いのある混合物から核酸を物理的に分離するための他の手法を伴うことができる。
【０２９３】
標的捕捉は、典型的には、ハイブリダイズ条件下でＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的配列にハイブリダイズする１つ以上の捕捉プローブオリゴマーを含む液相混合物中で生じさせることができる。捕捉プローブオリゴマーが捕捉プローブテールを含む実施形態の場合、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的：捕捉プローブ複合体は、捕捉プローブテールが例えば支持体に会合された固定化プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件を適用することによって捕捉される。ある特定の実施形態は、常磁性ビーズなどの微粒子固体支持体を使用する。
【０２９４】
単離は、捕捉の後に続くことができ、固体支持体上の複合体は、他の試料構成要素から分離される。単離は、任意の適切な技術（例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的配列と会合した支持体を１回以上（例えば、２回または３回）洗浄し、他の試料構成要素および／または結合していないオリゴマーを除去すること）によって達成することができる。常磁性ビーズなどの特定の支持体を使用する実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的と会合した粒子は、洗浄溶液中で懸濁され、いくつかの実施形態では磁気吸引を使用することによって、洗浄溶液から取り出すことができる。取り扱いステップ数を制限するために、支持体上の複合体におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的配列を増幅オリゴマーと単に混合し、増幅ステップへと進めることによって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的核酸を増幅することができる。
【０２９５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的配列を指数関数的に増幅させることは、増幅される標的領域に隣接する少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用するインビトロ増幅反応を利用する。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも２つの増幅オリゴマーが提供される。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーの複数の対が提供され、該複数には、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、およびｃｄｔＢのうちの少なくとも２、３、もしくは４つ、またはｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、およびｃｄｔＢのうちの少なくとも２、３、もしくは４つにハイブリダイズするように構成されたオリゴマー対を含む。増幅反応は循環的または等温的であり得る。好適な増幅方法には、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）が含まれる。
【０２９６】
検出ステップは、例えば、増幅産物を標識された検出プローブとハイブリダイズし、標識されたプローブから（いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション後にプローブから放出された標識から、を含む）生じるシグナルを検出することなどによって、増幅された標的配列に特異的に関連するシグナルを検出するための様々な既知の技術のいずれかを使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、標識プローブは、上述のように、クエンチャーまたは第１の標識と相互作用する他の部分などの第２の部分を含む。検出ステップはまた、例えば、核酸塩基配列の全部または一部など、増幅配列についての追加の情報を提供することができる。検出は、増幅反応が完了した後に実施することができ、または標的領域を増幅させることと同時に（例えばリアルタイムで）実施することができる。一実施形態では、検出ステップにより、均一な検出、（例えば、ハイブリダイズしていないプローブを混合物から除去することなく、ハイブリダイズしたプローブの検出が可能となる（例えば、米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号を参照されたい））。いくつかの実施形態では、核酸は、検出可能な電荷などの物理的変化を結果として生じる表面と会合している。増幅された核酸は、該核酸をマトリックス中またはマトリックス上で濃縮し、核酸または該核酸と会合する色素（例えば、臭化エチジウムまたはサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出するか、または溶液相中の核酸と関連する色素の増加を検出することによって検出することができる。他の検出方法は、増幅産物中の配列に特異的にハイブリダイズし、プローブ：産物複合体の存在を検出するように構成されている核酸検出プローブを使用することができるか、または増幅産物と会合した検出可能なシグナルを増幅することができるプローブの複合体を使用することによるものであり得る（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号、および同第５，８４９，４８１号、それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。増幅産物と特異的に会合する直接的または間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。特に、増幅産物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ染色体中の標的配列またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ染色体中の配列に相補的な標的配列を含み、プローブは、増幅産物中に含まれる配列に直接的または間接的に結合して、試験試料中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸の存在を示す。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、増幅産物は、標的核酸の存在を必要とする侵襲的切断構造を形成するための手段を提供する侵襲的切断アッセイにより検出される。このアッセイは、侵襲的切断構造を切断して、特有の切断産物を放出することをさらに含む。例えば、ＦＥＮ酵素などの切断剤は、標的依存性の侵襲的切断構造を切断するために使用され、それにより、試料中の特定の標的核酸配列の存在を示す切断産物がもたらされる。２つのオリゴヌクレオチドが標的核酸鎖にハイブリダイズして、それらが上記で定義されたように重複する侵襲的切断構造を形成する場合、侵襲的切断が生じ得る。切断剤（例えば、ＦＥＮ酵素）および上流のオリゴヌクレオチド（すなわち、侵襲的プローブ）の相互作用により、切断剤に、下流のオリゴヌクレオチド（すなわち、一次プローブ）を内部部位で切断させるようにすることができ、その結果、特有の断片が生成される。「解放されたフラップ」または「切断された５’フラップ」または単に「フラップ」と称する場合もある断片は、それ自体で、（例えば、検出可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル）を生成する後続の反応において、侵襲的プローブとして参加することによって）ＦＲＥＴカセットなどの二次プローブと相互作用することができる。そのような実施形態は、米国特許第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、および同第６，０９０，５４３号、ＷＯ９７／２７２１４、ＷＯ９８／４２８７３、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９）、ＰＮＡＳ，９７：８２７２（２０００）、ならびにＷＯ２０１６／１７９０９３に記載されている。より具体的には、例えば単一の反応混合物中で組み合わせられる、複数のＩＮＶＡＤＥＲ反応は、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、およびｃｄｔＢのうちの２つ以上、またはｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、およびｃｄｔＢのうちの２つ以上の検出を含む、本明細書に開示される多重適用に使用することができる。さらに、内部対照を多重増幅および検出手順に含めることもできる。
【０２９８】
侵襲的切断アッセイは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのアンプリコンを含む、増幅されていないＤＮＡおよび増幅されたＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ産物）の特定の標的配列を検出するために使用することができる。一次プローブおよび侵襲的プローブは、標的核酸と並行してハイブリダイズして、重複構造を形成する。対合していない「フラップ」は、一次プローブの５’‘末端に含まれる。切断剤（例えば、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．から入手可能なＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素などのＦＥＮ酵素）は、重複を認識し、対合していない５’フラップを切断する。いくつかの実施形態では、二次反応において、この切断産物は、ＦＲＥＴカセット上で侵襲的プローブとして機能し、構造特異的酵素によって認識される構造を再び作り出す。単一のＦＲＥＴカセット上の２つの標識が切断によって分離されるとき、バックグラウンド蛍光を超える検出可能な蛍光シグナルが生成される。結果として、この第２の侵襲的切断構造の切断により、蛍光が増加し、これは標的配列の存在を示す。
【０２９９】
代替的に、増幅ステップの終了近くまたは終了時に増幅産物を検出する実施形態では、増幅産物へのプローブのハイブリダイゼーションを示すためのシグナルを提供するために、直鎖状検出プローブを使用することができる。そのような検出の一例は、標的核酸にハイブリダイズする発光標識されたプローブを使用する。次いで、発光性標識が、非ハイブリダイズプローブから加水分解される。検出は、ルミノメーターを使用して化学発光によって実施される（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ８９／００２４７６号を参照されたい）。リアルタイム検出を使用する他の実施形態では、検出プローブは、プローブが増幅産物に結合されたときに検出されるレポーター部分で標識された、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブなどのヘアピンプローブであり得る。そのようなプローブは、標的ハイブリダイズ配列および非標的ハイブリダイズ配列を含むことができる。そのようなプローブの様々な形態は、例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６／００６８４１７Ａ１号および同第２００６／０１９４２４０Ａ１号に記載されている。
【０３００】
いくつかの実施形態では、１つ以上の内部増幅対照ポリヌクレオチド（「内部対照」；例えば、プラスミド、プラスミド断片、または他のポリヌクレオチドであり、一般に、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、およびｃｄｔＢ）、ならびに内部対照を増幅および検出するためのオリゴマーは、本明細書に開示される組成物またはキットの構成要素として提供され、および／または本明細書に開示される方法で使用される。内部対照からのアンプリコンの検出は、標的配列が検出されない場合の機器または試薬の不具合による偽陰性を回避するのに役立つ。
【０３０１】
以下は、本開示による方法から得られる様々な可能な結果の解釈を示す表である。いくつかの実施形態では、結果は、この表に従って解釈される。Ｕは、アンプリコンの検出が予想されるが、コール（ｃａｌｌ）には必要ないことを示す。ｃｄｔＡおよびｔｃｄＡなどの以下に示される１つ以上の標的を増幅および／または検出するための試薬が使用されない実施形態では、表は、特定の標的に対して言及される関連する列が検出される（例えばｃｄｔＢまたはｔｃｄＢ）かのように、適用され得る。
表Ｃ．結果の解釈
【表Ｃ】
2021506274.tif 000009
略語は上記で定義した通りである。
【実施例】
【０３０２】
以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を例示するよう提供され、本開示の範囲をいかなる方法でも制限するものとして解釈されるべきではない。
【０３０３】
実施例の項目における配列番号への全ての言及は、シトシンメチル化、標識、および以下の配列表に示される他の特徴を含む。
【０３０４】
一般的な試薬および方法。特に明記しない限り、非特異的標的捕捉を使用して核酸を単離した。例示的な非特異的標的捕捉試薬および手順は、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１３／０２０９９９２Ａ１に開示されている。標的捕捉手順は、一般に、ＰａｎｔｈｅｒまたはＰａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）機器を使用して行った。
【０３０５】
特に明記しない限り、増幅は、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）装置またはＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ（商標）機器で行った。特に明記しない限り、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｃｄｔＡ、およびｃｄｔＢのうちの１つ以上から増幅される配列を検出するために設計された、上記に開示したオリゴマーの組み合わせを用いて増幅を行った。いくつかの実験では、ｔｃｄＣ用の一次プローブのセットを使用し、第１の一次プローブは、配列番号３の１１７位を含む部位を標的とし（ｔｃｄＣの１１７ｄｅｌ対立遺伝子を検出するため）、第２の一次プローブは、配列番号５の１８４位を含む部位を標的とした（ｔｃｄＣの１８４Ｔ対立遺伝子を検出するため）。これらの配列は、少なくともフォワードおよびリバース増幅オリゴマー、ならびに上記のＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳアッセイで標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの一次検出オリゴマーを使用して検出された。いくつかの反応では、１つ以上の増幅オリゴマーまたはその伸長産物が、侵襲的プローブ、すなわち、ｉＰｒｉｍｅｒとして機能した。いくつかの反応では、別の侵襲的プローブを使用した。内部対照プラスミドも一般に反応に含んだ。
【０３０６】
これらの実施例で使用されるクリベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）は、米国特許第９，０９６，８９３号に記載されているＡｆｕ  ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼとした。
【０３０７】
増幅試薬は、２５μＭのｄＮＴＰ、市販のホットスタートＴａｑポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、クリベース、ＭＯＰＳ、およびＴｒｉｓバッファー、非アセチル化ＢＳＡ、ならびにＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘが供給する他の構成要素とした。特に明記しない限り、プライマーは、０．２〜０．７５μＭの最終濃度で供給した。オリゴマーのアニーリング温度を６５℃〜６９℃とし、７２℃の標準的な伸長温度を１０サイクル使用し、続いて、６５℃のインベーダー反応ステップを有する一連のサイクルを行った。特に明記しない限り、３５のＩＮＶＡＤＥＲ反応サイクルについてデータを収集した。「検出なし」は、３５番目のサイクルの収集データまでにＣｔが発生しなかったことを示す。
【０３０８】
上記のように、アンプリコンの検出にはＩＮＶＡＤＥＲ  ＰＬＵＳケミストリーを使用した。一次プローブに集合的に対応する１つ以上のＦＲＥＴカセットを含んだ。２つのｔｃｄＣ一次プローブを使用した場合、いずれかのｔｃｄＣ一次プローブから生成される断片と相互作用する１つのＦＲＥＴカセット（例えば、配列番号１１）を使用した。ｔｃｄＡおよび／またはｔｃｄＢ一次プローブを使用した場合、ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ一次プローブのいずれかから生成された断片（解放されたフラップ）と相互作用する１つのＦＲＥＴカセット（例えば、配列番号１２）を使用した。少なくとも１つのｃｄｔＢ一次プローブを使用した場合、これから生成された断片（解放されたフラップ）と相互作用するＦＲＥＴカセット（例えば、配列番号１０）を使用した。ＦＲＥＴカセットは、エネルギー移動関係にある相互作用標識対で標識し、標識対の両方のメンバーがＦＲＥＴカセットに付加された場合に蛍光発光が消光した。したがって、所与の標的に対する正のシグナルは、一般に、標的配列が存在し、対応するプライマーセットによって増幅されたこと；プライマーまたは検出オリゴマー（インベーダーオリゴマー）、アンプリコン、および対応する一次プローブを含む侵襲的切断構造が、クリベースによって形成および切断されたこと；これにより一次プローブから解放されたフラップは、対応するＦＲＥＴカセットと侵襲的切断構造を形成し、次いで、これはクリベースによって切断され、それにより、ＦＲＥＴカセットの標識された切断産物の蛍光検出を可能にすることを示すと解釈された。
【０３０９】
実施例１．ｔｃｄＣ対立遺伝子の検出
配列表に示すｔｃｄＣ増幅および検出オリゴマーを設計した。オリゴマーの組み合わせを、０（陰性対照）、５、１０、または１００コピーのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＣを２５μＬ反応で含む試料を用いて試験した。反応は一般に３つ組で行った。
表Ｄ．ｔｃｄＣ増幅オリゴマーセット  
【表Ｄ】
2021506274.tif 000010
【０３１０】
セット１は、１００コピーでは閾値に近いが達していないシグナルを示し、より低い値では検出されなかった。セット２は、１００コピーでは３１〜３５の範囲のＣｔ値を示し、５コピーまたは１０コピーでは検出されなかった。セット３は、１００コピーでは２９〜３２の範囲のＣｔ値を示し、５または１０コピーでは検出されなかった。セット４は、１００コピーでは３２〜３５の範囲のＣｔ値を示し、５または１０コピーでは検出されなかった。セット５は、１００コピーでは３１〜３２の範囲のＣｔ値を示し（２／３つ組で検出）、５または１０コピーでは検出されず（２／３つ組で検出）、５または１０コピーでは検出されなかった。セット６は、１００コピーでは３０〜３５の範囲のＣｔ値を示し、５または１０コピーでは検出されなかった。特に明記しない限り、３／３つ組で検出された。
【０３１１】
プライマーシステムが互いに干渉しないことを確認するために、反応は、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、およびｃｄｔＢプライマーを使用して多重で行った。どのｔｃｄＣオリゴマーセットが使用されたかに関係なく、ｔｃｄＡ／Ｂの検出は、１００コピー反応では２２〜２５の範囲のＣｔにおいて一致し、ｃｄｔＢの検出は、１００コピー反応では２７〜３１の範囲のＣｔにおいて一致した。
【０３１２】
１１７ｄｅｌおよび１８４Ｔ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を標的とする侵襲的プローブおよび一次検出オリゴマー（配列番号８６、１６１、１６５〜１６７、１９６、２０４）を、以下のように１０コピーの関連するｔｃｄＣ対立遺伝子（それぞれ５つ組）を用いた反応で試験した。
【０３１３】
本段落のＣｔは、１１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣを検出するためのものである。配列番号８６および１６１では、Ｃｔは約３５であり、２／５つ組で検出された。配列番号８６および１６７では、Ｃｔは３０〜３５の範囲であり、５／５つ組で検出された。配列番号８６および１６５では、Ｃｔは３２〜３５の範囲であり、４／５つ組で検出された。配列番号８６および１６６では、Ｃｔは３０〜３４の範囲であり、４／５つ組で検出された。
【０３１４】
上記のものから選択された例示的な侵襲的プローブおよび一次検出オリゴマーの対もまた、１１７Ｔおよび１１７Ａ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を用いて試験した。１反応あたり１０、１００、および１０００コピーにおいて、Ｃｔは、１１７ｄｅｌ対立遺伝子と比較して１１７Ｔ対立遺伝子について、１反応あたり１０００コピーの場合では１２サイクル遅延し、１０または１００コピー濃度では検出されず、このことは、プローブシステムが、１１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣ（高病原性と関連する）と１１７Ｔ  ｔｃｄＣ（高病原性と関連しない）とを識別できることを示している。さらに、１１７Ａ  ｔｃｄＣ対立遺伝子（野生型であり、高病原性ではない）は、１反応あたり１０、１００、および１０００コピーで正のシグナルを生成しなかったが、これは、システムが１１７Ａ対立遺伝子を検出しないことを示している。
【０３１５】
特に明記しない限り、１８４Ｔ  ｔｃｄＣの検出は２つ組で行った。１８４Ｔ多型が１８３Ｔ多型と一致することが観察されたため、これらの試験で使用する鋳型配列もまた、配列番号７のように１８３位にＴを含んだ。結果は次の表に示され、観測されたＣｔが含まれる範囲として提示されている。「コピー」は、１反応あたりのコピーを示す。
表Ｅ．１８４Ｔ  ｔｃｄＣの検出のＣｔ結果
【表Ｅ】
2021506274.tif 000011
【０３１６】
比較反応は、野生型の非高病原性ｔｃｄＣ鋳型（配列番号２の１８３〜１８４位、１８３Ｃ  １８４Ｃ）および１８３Ｔ  １８４Ｃ非高病原性ｔｃｄＣ鋳型（配列番号１の１８３〜１８４位）を用いて、１反応あたり１０，０００コピーで２つ組で行った。結果を以下に示す。
表Ｆ．１８３Ｔ  １８４Ｃおよび１８３Ｃ  １８４Ｃ  ｔｃｄＣについての検出のＣｔ結果
【表Ｆ】
2021506274.tif 000012
【０３１７】
実施例２ｔｃｄＢの検出
フォワード増幅オリゴマーの配列番号２６６および２６９、リバースｉＰｒｉｍｅｒ配列番号３１７および３２４、ならびに配列番号３１２の一次プローブオリゴマーの試験により、１反応あたり１０コピーで、２６〜２８の範囲の感度（Ｃｔ）が得られ、ｔｃｄＣ増幅および検出オリゴマーとの多重において適合性であった。別のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種であるＣ．ｓｏｄｅｒｌｌｉｉ（ＡＴＣＣ９７１４またはＪＧ６３８２株）由来の鋳型との交差反応が観察された。
【０３１８】
フォワード増幅オリゴマー配列番号３３９、配列番号３２３および３２７から選択されたリバースｉＰｒｉｍｅｒ、ならびに配列番号３０７および３００から選択された一次プローブオリゴマーを含むオリゴマーセットの試験により、１反応あたり１０コピーで、一般には３０未満の感度（Ｃｔ）が得られたが、陰性対照反応ではいくつかのシグナルが生成された。
【０３１９】
２つの追加のオリゴマーセットを試験し、結果を以下に示す。ｔｃｄＢオリゴマーセット１は、配列番号２７４、２７７、３０５、３０６、および３３６を含み、ｔｃｄＢオリゴマーセット２は、配列番号２７４、２７５、３０１、３０５、および３３６を含んだ。異なるｔｃｄＢ配列を有する２つの異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株（１：ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０５、および２：ＣＣＵＧ２０３０９）由来の溶解物を、示された数のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を投入材料として使用して２つ組で試験した。
表Ｇ．異なる株でのｔｃｄＢの検出のＣｔ結果
【表Ｇ−１】
2021506274.tif 000013
【表Ｇ−２】
2021506274.tif 000014
＊：１／２つ組の検出
【０３２０】
ｔｃｄＢオリゴマーセット１および２は、陰性対照反応で有意なシグナルを生成せず、ｔｃｄＣ増幅オリゴマーとの多重で適合性であった。これらのオリゴマーセットと、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｃｄＢと最も類似するＣ．ｓｏｄｅｒｌｉｉ配列であるＣ．ｓｏｄｅｒｌｉｉ  ｔｃｓＬ配列と、の間のミスマッチ数に基づくと、Ｃ．ｓｏｄｅｒｌｉｉとの交差反応性は予想されなかった。
【０３２１】
実施例３ｃｄｔＢの検出
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、ｃｄｔＡおよびｃｄｔＢ２成分毒素遺伝子を有する２成分毒素遺伝子座を含むことができる。いずれかの２成分毒素遺伝子を検出するためのオリゴマー設計。ｃｄｔＢ設計は、多重反応において、より優れた特異性および性能を提供できることが見出された。第１の実験でいくつかの交差反応性が観察されたが、新たに調製された合成標的ＤＮＡを使用したその後の試験では、本質的に交差反応性がなくなったが、これは、元の標的ＤＮＡストックの汚染が原因であり得ることを示唆している。
【０３２２】
フォワード増幅オリゴマー、一次プローブ、リバースｉＰｒｉｍｅｒの順で列挙される代表的なｃｄｔＢオリゴマーセットは、配列番号３３、３７、および４０、もしくは３１、３８、および４１、またはそれらの順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）であり、例えば、配列番号３３が配列番号３１と交換されるか、またはその逆である。
【０３２３】
代表的なｃｄｔＢオリゴマーセットの結果は以下の通りである。これらの実験では、３８サイクルのインベーダー反応のデータが収集された。
表Ｈ．ｃｄｔＢ検出についてのＣｔ結果
【表Ｈ】
2021506274.tif 000015
【０３２４】
実施例４ｔｃｄＡの検出
ｔｃｄＢ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ病原性遺伝子座の毒素Ｂ遺伝子）の検出に影響を与える変異が発生した場合の感度の低下を回避するために、ｔｃｄＢ検出用のオリゴマーおよび上記で論じた他の遺伝子と多重化することができるｔｃｄＡ検出用のオリゴマーを設計した。
【０３２５】
例示的なｔｃｄＡオリゴマーセットは、フォワードｉＰｒｉｍｅｒとしての配列番号６４または６５、一次プローブとしての配列番号６８または６９、およびリバースプライマーとしての配列番号７０〜７３のうちのいずれか１つを含んだ。以下に示す結果（表Ｉ）において、ｔｃｄＡセット１は、配列番号６４、６９、および７２を使用し、ｔｃｄＡセット２は、配列番号６５、６９、および７２を使用した。３８サイクルのＩＮＶＡＤＥＲ反応についてのデータを収集した。これらの結果は、１反応あたり６、１２、または２５コピーの標的ＤＮＡを用いたｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、およびｃｄｔＢオリゴマーセットとの多重で行い（各条件でｎ＝８）、上記のように、ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ一次プローブの両方の切断を検出するＦＲＥＴカセットを使用した。組み合わせたｔｃｄＡ／ｔｃｄＢ検出は、存在する両方のｔｃｄＡシステムと共に良好に実施された。さらに、ｔｃｄＢオリゴマーの非存在下で、１反応あたり１００コピーのｔｃｄＡ＋標的（ｎ＝６、野生型、１８４Ｔ、および１１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣ遺伝子型をそれぞれ２つ含む）を用いて、セット１のｔｃｄＡオリゴマーを試験し、結果は、２７〜２８のＣｔで陽性であり、ｔｃｄＡオリゴマーを多重で使用することによる悪影響がないことと一致した。標的ＤＮＡは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４１１８由来であり、これは、１反応あたり示されるコピー数で１１７ｄｅｌ  ｔｃｄＣ対立遺伝子を保有する。陽性は、正のシグナルが観察された複製の割合を示す。どのセットが使用されたかに関係なく、ｔｃｄＡ／Ｂ、ｔｃｄＣ、およびｃｄｔＢのうちの少なくとも１つが、全ての複製で検出された。陰性対照は、予想した通りであった（表示していない）。
表Ｉ．多重でのｔｃｄＡ／Ｂ、ｔｃｄＣ、およびｃｄｔＢの検出のＣｔ結果
【表Ｉ】
2021506274.tif 000016
配列表
【表１−１】
2021506274.tif 000017
【表１−２】
2021506274.tif 000018
【表１−３】
2021506274.tif 000019
【表１−４】
2021506274.tif 000020
【表１−５】
2021506274.tif 000021
【表１−６】
2021506274.tif 000022
【表１−７】
2021506274.tif 000023
【表１−８】
2021506274.tif 000024
【表１−９】
2021506274.tif 000025
【表１−１０】
2021506274.tif 000026
【表１−１１】
2021506274.tif 000027
【表１−１２】
2021506274.tif 000028
【表１−１３】
2021506274.tif 000029
【表１−１４】
2021506274.tif 000030
【表１−１５】
2021506274.tif 000031
【表１−１６】
2021506274.tif 000032
【表１−１７】
2021506274.tif 000033
【表１−１８】
2021506274.tif 000034
【表１−１９】
2021506274.tif 000035
【表１−２０】
2021506274.tif 000036
【表１−２１】
2021506274.tif 000037
【表１−２２】
2021506274.tif 000038
【表１−２３】
2021506274.tif 000039
【表１−２４】
2021506274.tif 000040
【表１−２５】
2021506274.tif 000041
【表１−２６】
2021506274.tif 000042
【表１−２７】
2021506274.tif 000043
【表１−２８】
2021506274.tif 000044
【表１−２９】
2021506274.tif 000045
【表１−３０】
2021506274.tif 000046
【表１−３１】
2021506274.tif 000047
１小文字の塩基は、ＲＮＡ骨格を有する；大文字の塩基は、ＤＮＡ骨格を有する；ｍＣは、５−メチル化シトシンを示す；ｍＡは、２’−Ｏ−メチルアデノシンを示す；Ｈｄｉｏｌ＝ヘキサンジオール、ＨＥＸ＝ヘキソクロロフルオレセイン、ＦＡＭ＝フルオレセイン、Ｒｅｄ＝Ｒｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄフルオロフォア、ＢＢＱｄＴ＝Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標）  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ６５０  ｄＴ、Ｅｃｌ＝  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ。Ｃ９（ｓｐ９とも称する）は、スペーサー９リンカー（トリエチレングリコール鎖）を示す。
【配列表】
2021506274000001.app
【国際調査報告】
2021506274.tif 000048
2021506274.tif 000049