(57)【要約】  本開示は、ペプチド−ポリマーコンジュゲート、及び関節内疾患又は障害の治療におけるそれらの使用を対象とする。
2021517169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節結合部における疾患又は障害を治療する方法であって、前記関節結合部に、約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと複数のペプチドとを含む、有効量のコンジュゲートを注射することを含み、前記ペプチドが約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有し；
各ペプチドが前記ポリマーと共有結合し、
前記コンジュゲートにおける前記ペプチドの前記ポリマーに対するモル比が少なくとも約５：１である、方法。
【請求項２】
前記生体適合性ポリマーが約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量；及び複数のペプチドを有し、前記ペプチドが約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有し；
各ペプチドが前記ポリマーと共有結合し；
前記ポリマーの前記分子量がペプチドあたり約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、
前記コンジュゲートにおける前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が少なくとも約５：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体適合性ポリマーがポリサッカリドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体適合性ポリマーがグリコサミノグリカンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生体適合性ポリマーがヒアルロン酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生体適合性ポリマーが約０．２ＭＤａ〜約１．５ＭＤａの分子量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生体適合性ポリマーが約０．９ＭＤａの分子量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生体適合性ポリマーが約０．８ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体適合性ポリマーが約２ＭＤａの分子量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが免疫細胞機能の活性を調整する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、インターロイキン６、又はインターフェロンγを阻害する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが腫瘍壊死因子αを阻害する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体フラグメント、単鎖可変領域抗体、シングルドメイン重鎖抗体、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤、又は受容体デコイである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYADSVKGRFAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSS（配列番号１）。
【請求項１８】
前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が約５：１〜約４００：１である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が約１０：１〜約１００：１である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が約３０：１〜約５０：１である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドが、スルフィド結合と約１００Ｄａ〜約５００Ｄａの分子量を有するリンカーとを介して前記ポリマーと共有結合している、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカーが約１００Ｄａ〜約３００Ｄａの分子量を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンカーがスクシンイミドを含む、請求項２１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記コンジュゲートの拡散半減期が前記ペプチドよりも少なくとも２倍長い、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記コンジュゲートの前記拡散半減期が前記ペプチドよりも約２〜約１００倍長い、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記コンジュゲートの関節内半減期が前記ペプチドよりも少なくとも約２０％長い、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記コンジュゲートの前記関節内半減期が前記ペプチドよりも約２０％〜約１０００％長い、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患又は障害が、関節リウマチ、摩耗関連変形性関節症、加齢関連変形性関節症、外傷後変形性関節症、乾癬性関節炎、及び無腐性のインプラントの緩み、関節滲出液、強直性脊椎炎、滑液包炎、痛風、反応性関節炎、滑膜炎、又は虚血壊死である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記コンジュゲートを前記関節結合部におよそ一カ月に一度以下注射する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記コンジュゲートを前記関節結合部におよそ一月に一度から六カ月に一度注射する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記コンジュゲートを前記関節結合部に二カ月に一度又は三カ月に一度注射する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと複数のペプチドとを含むコンジュゲートであって、前記ペプチドが約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有し；
各ペプチドが前記ポリマーと共有結合し、
前記コンジュゲートにおける前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が少なくとも約５：１である、コンジュゲート。
【請求項３３】
前記生体適合性ポリマーが約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量と複数のペプチドとを有し、前記ペプチドが約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有し；
各ペプチドが前記ポリマーと共有結合し；
前記ポリマーの前記分子量がペプチドあたり約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、
前記コンジュゲートにおける前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が少なくとも約５：１である、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記生体適合性ポリマーがポリサッカリドである、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記生体適合性ポリマーがグリコサミノグリカンである、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記生体適合性ポリマーがヒアルロン酸である、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
前記生体適合性ポリマーが約０．２ＭＤａ〜約１．５ＭＤａの分子量を有する、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
前記生体適合性ポリマーが約０．９ＭＤａの分子量を有する、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
前記生体適合性ポリマーが約０．８ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４０】
前記生体適合性ポリマーが約２ＭＤａの分子量を有する、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
前記ペプチドが免疫細胞機能の前記活性を調整する、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
前記ペプチドが、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、インターロイキン６、又はインターフェロンγを阻害する、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
前記ペプチドが腫瘍壊死因子αを阻害する、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
前記ペプチドが、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体フラグメント、単鎖可変領域抗体、シングルドメイン重鎖抗体、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤、又は受容体デコイである、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
前記ペプチドが約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａの分子量を有する、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
前記ペプチドが約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項３２〜４５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４７】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３２〜４６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
前記ペプチドが、配列：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYADSVKGRFAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSS（配列番号１）を有する、請求項３２〜４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４９】
前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が約５：１〜約４００：１である、請求項３２〜４６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５０】
前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が約１０：１〜約１００：１である、請求項３２〜４９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５１】
前記ペプチドの前記ポリマーに対する前記モル比が約３０：１〜約５０：１である、請求項３２〜５０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５２】
前記ペプチドが、スルフィド結合と約１００Ｄａ〜約５００Ｄａの分子量を有するリンカーとを介して前記ポリマーと共有結合している、請求項３２〜５１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
前記リンカーが約１００Ｄａ〜約３００Ｄａの分子量を有する、請求項５２に記載のコンジュゲート。
【請求項５４】
前記リンカーがスクシンイミドを含む、請求項５２〜５３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５５】
前記コンジュゲートの前記拡散半減期が前記ペプチドよりも少なくとも２倍長い、請求項３２〜５４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５６】
前記コンジュゲートの前記拡散半減期が前記ペプチドよりも約２〜約１００倍長い、請求項３２〜５５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５７】
請求項３２〜５６のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬剤的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、あらゆる目的についてその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年３月９日に出願された米国仮出願第６２／６４０，７４９号の優先権を主張する。
配列表に関する記載
【０００２】
本願に関連する配列表は、紙面の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書中に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、０５２５６６−５０４００１ＷＯ＿ＳＬ−ＳＴ２５．ｔｘｔ．である。テキストファイルは１４，８９０バイトであり、２０１９年３月８日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
関節結合部の組織に薬物治療を送達するために使用することができる２つの投与経路：（１）全身投与（すなわち、経口、皮下、及び静脈内）、又は（２）関節内注射がある。
【０００４】
全身投与の利点は、多くの場合、患者が自宅で、容易に実施することができることであり、したがって、患者に再投薬することは困難ではない。しかしながら、有効な製剤に関して、罹患した関節において治療用量を維持するために必要な高い全身性レベルは体内の他の場所で危険な副作用を引き起こる可能性もあるので、高い全身性レベルの薬物は望ましくない場合がある。
【０００５】
関節内投与の利点は、有効な薬物を罹患した関節中に直接送達することができることである。関節中に直接送達される用量は、全身投与後に同じ治療効果を達成するために必要であるよりも低い可能性がある。なぜなら、薬物は標的組織に局所投与されているからである。しかしながら、関節内投与は、関節組織中への注射を安全に提供するためには熟練者が必要である。したがって、関節内注射は投与するのに実質的により手間がかかり、費用がかかる。
【０００６】
多くの関節への投与に関するさらなる課題は、関節組織周辺に生じる流体動圧流体動圧によりタンパク質及び小分子が関節中の流体から迅速に排出されることである。実際、関節を取り巻く滑膜組織は、リンパ管を含み、これは、関節腔からにじみ出る流体及び他の物質を容易に収集することができる。その結果、関節内腔に投与される薬物は、関節から迅速に血流へと排出され、薬物は罹患した組織に対してもはや効果的に作用できなくなる。したがって、関節内注射によって送達された薬物は、有効性を維持するためには頻繁に再投薬する必要がある。
【０００７】
したがって、関節組織中に規定どおり注射された薬物の関節内滞留時間を改善する強い誘因がある。既存の薬物を、関節内腔内のその滞留時間を増加させるように修飾することが有用であり得る。薬物の関節内投与の頻度を低減することによって、薬物の慢性投与と関連する合併症の全体的リスクを低減することが可能である。生物活性の持続期間を増加させることはまた、薬物の強化された治療結果ももたらし得る。
【０００８】
より長い関節内滞留時間を示す薬物は、同等な治療機能を得るためにはより頻繁に投与しなければならない別の製剤と比較して、患者に好まれるであろう。関節内注射は局所麻酔下で実施され、概して痛みを伴わないと考えられるが、患者にとって、注射のために診療所を度々訪れることは面倒である。注射部位での短期間の炎症もあり得る。したがって、患者は、必要とする関節内注射がより少ない同等な療法を優先する可能性が高い。
【０００９】
生物学的に活性なポリペプチド薬物と生体適合性ポリマーとを含むコンジュゲートは、生体適合性ポリマーにコンジュゲート化されない場合、生物学的に活性なポリペプチドの関節内半減期よりも長い関節内半減期を示す。薬物の半減期を増加させることは、薬物が有効な治療応答を生じさせるために必要な濃度閾値より高い時間を増加させる効果を有する。
【００１０】
関節中のコンジュゲートの増大した半減期は、患者に対する負担の低減；投与の回数及び／又は頻度の低減；安全性の増加；感染発生の減少；患者コンプライアンスの増加；及び有効性の増加をはじめとする、ある特定の利点を付与する。加えて、これらのコンジュゲートはまた、関節疾患及び障害の治療のためのポリペプチドの使用を可能にすることもでき、このポリペプチドは、非コンジュゲート形態では充分な時間、関節中に保持されない。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書中で提供されるのは、関節結合部内に局在化する疾患又は障害を治療する方法である。この方法は、バイオポリマーと、複数の生物活性ペプチド、例えば抗体とから構成されるバイオコンジュゲートを関節内投与して、疾患又は障害を治療することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、関節結合部における疾患又は障害を治療する方法であって、関節結合部に、有効量の、約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと、複数のペプチドとを含むコンジュゲートを注射することを含む方法を提供し、ペプチドは、約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと、複数のペプチドとのコンジュゲートを提供し、ペプチドは、約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。
【００１４】
一実施形態において、本開示は、約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと、複数のペプチドとを含むコンジュゲートを提供し、ペプチドは約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、ポリマーの分子量は、ペプチドあたり約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。
【００１５】
本明細書中でさらに提供されるのは、本開示のコンジュゲートと、薬剤的に許容される賦形剤、希釈剤、及び／又は担体とを含む医薬組成物である。
【００１６】
本開示はまた、関節結合部における疾患又は障害を治療する方法であって、関節結合部中に、治療上有効な量の本明細書中で記載するコンジュゲート、又は当該コンジュゲートを含む医薬組成物を注射することを含む方法も包含する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、関節結合部における疾患又は障害を治療する方法であって、関節結合部中に、有効量の、約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと、複数のペプチドとを含むコンジュゲートを注射することを含む方法を提供し、ペプチドは、約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量と、複数のペプチドとを有し、ペプチドは約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、生体適合性ポリマーは、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有し；、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本開示の方法で使用するための抗炎症バイオコンジュゲートを生成するコンジュゲーション反応の一般化概略図を示す。ステップ１は、反応性クロスリンカーの、好適なバイオポリマー上の特異的官能基に対する共有結合的付加からなる。この例におけるバイオポリマーの化学構造はＨｙＡであり、クロスリンカーＥＭＣＨはカルボジイミド化学によりカルボン酸官能基に付加される。ステップ２において、反応性バイオポリマーを、化学的クロスリンカーとの共有結合の標的とされる残基を含む抗炎症ペプチドと反応させる。この実施例において、ペプチドは、コンジュゲーションの標的としてチオールを提供する残基を含む。
【００１９】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａは、抗炎症抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体（配列番号７）の、様々なＭＷのＨｙＡに対する共有結合を検証するために使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ゲルは非共有相互作用を逆転させる還元条件下で流され、したがって抗炎症バイオコンジュゲートは分離ゲルの最上部にとどまるであろう。図２Ｂは、抗炎症抗ＴＮＦαアフィボディ（配列番号６）のＨｙＡ及びＣＭＣに対する共有結合を検証するために使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ｃは、抗炎症抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体（配列番号７）とＣＭキトサンの間の共有結合を検証するために使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図２Ｄは、抗炎症抗ＩＬ−１βｓｃＦｖ（配列番号９）抗体のＨｙＡ及びＣＭＣに対する共有結合を検証するために使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、抗炎症抗ＴＮＦαＶＨＨ（配列番号７）抗体のＣＭＣに対する共有結合を検証するために使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００２０】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは、ペプチド供給比に基づいて様々なバイオポリマーの抗炎症ペプチド価を示すための多価コンジュゲートのキャラクタリゼーションを示す。この例では、ＶＨＨコンジュゲーション効率は６２±１０％であり、ＨｙＡ分子量とは無関係であった。図３Ｂは、コンジュゲーション反応後のバイオコンジュゲートのＨｙＡ成分の最終分布を示す。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ｃは、サイズ排除カラムを使用した分離後の抗炎症バイオコンジュゲートのＵＶ吸収及び静的光散乱クロマトグラム例を示す。図３Ｄは、図３Ｃに示すクロマトグラムのピークに関する、静的光散乱分析によって決定される、抗炎症バイオコンジュゲートの回転半径（Ｒg,z）を示す。
【００２１】
【図４−Ｂ】図４Ａは、抗ＴＮＦαＶＨＨ（配列番号７）＋ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）バイオコンジュゲートのＴＮＦα結合アフィニティが、バイオレイヤー干渉分光法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ、スチューデントｔ試験、ｎ＝３）によって測定して、非コンジュゲート抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体よりも大きいことを示す。図４Ｂは、競合的ＥＬＩＳＡ（ｎ＝５）を使用して、溶液中で抗ＴＮＦαＶＨＨ（配列番号７）＋ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）バイオコンジュゲート及び非コンジュゲート抗ＴＮＦαＶＨＨのＴＮＦαと結合する能力を比較する。
【図４Ｃ−Ｄ】図４Ｃは、バイオアッセイにおいて抗ＴＮＦαＶＨＨ（配列番号７）＋ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）バイオコンジュゲート及び非コンジュゲート抗ＴＮＦαＶＨＨの、Ｌ９２９線維芽細胞においてＴＮＦαで誘発されたアポトーシスを阻害する生物活性を比較する。図４Ｄは、抗ＴＮＦαＶＨＨ＋ＨｙＡバイオコンジュゲートの効力が、図４Ｃデータ（スチューデントｔ試験、ｎ＝４）の適合から算出したＩＣ５０に基づいて非コンジュゲートＶＨＨ抗体よりも約１０倍大きかったことを示す。
【００２２】
【図５】図５Ａは、４８時間にわたる様々な時点で有窓膜から構成されるチャンバー内部にロードされた抗ＴＮＦαＶＨＨ及び抗ＴＮＦαＶＨＨ（配列番号７）＋ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）バイオコンジュゲートの濃度を示す。膜の平均孔サイズは、直径約２０ｎｍ又は１００ｎｍのいずれかであった。図５Ｂは、二つの膜孔サイズのそれぞれについて指数関数的減衰の適合（Ｒ2＞０．９０００）によって決定されるＶＨＨ及びバイオコンジュゲートの輸送半減期を示す。膜を越える多価コンジュゲートの拡散は、未修飾ＶＨＨ抗体と比較して実質的に緩徐であった（ａ−ｂ、ａ−ｃ、ａ−ｃ：ｐ＜０．００５、分散分析、ｎ＝４）。
【００２３】
【図６】図６Ａは、抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体（配列番号７；ｎ＝４）及び３５０ｋＤａ（ｎ＝３）、７５０ｋＤａ（ｎ＝３）、８５０ｋＤａ（ｎ＝３）、及び２０００ｋＤａ（ｎ＝４）のＭＷを有するＨｙＡとコンジュゲート化された抗ＴＮＦαＶＨＨ（配列番号７）から作製された抗炎症バイオコンジュゲートの関節内半減期を示す。関節内半減期は、９６時間にわたって赤外タグ付けされた治療ペプチドのＲＯＩ放射効率の指数関数的減衰適合を用いて算出した。８５０ｋＤａ及び２０００ｋＤａのＨｙＡを使用して作製されたバイオコンジュゲートの半減期は、非コンジュゲートＶＨＨよりも有意に長かった（ａ−ｂ：ｐ＜０．０５、ａ−ｃ：ｐ＜０．０００１、ｂ−ｃ：ｐ＜０．０００５、一元配置分散分析）。図６Ｂは、抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体（ｎ＝４）及び７００ｋＤａのＣＭＣにコンジュゲート化された抗ＴＮＦαＶＨＨ（配列番号７）から作製された抗炎症バイオコンジュゲート（ｎ＝３）の関節内半減期を示す。バイオコンジュゲートの半減期は、非コンジュゲート化ＶＨＨの半減期とは有意に異ならなかった（ｐ＝０．３２、スチューデントｔ試験）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体（ｎ＝３）及び８５０ｋＤａ  ＨｙＡとコンジュゲート化された抗ＴＮＦαＶＨＨから作製された抗炎症バイオコンジュゲート（ｎ＝３）の関節内半減期を示す。このバイオコンジュゲートの半減期は、非コンジュゲート化ＶＨＨよりも有意に長かった（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ試験）。
【００２４】
【図７】図７は、薬物がその治療閾値をいつ下回るかを予想する、確立された薬理学モデルを示す。このモデルは、薬物の初期用量を正規化して、様々な治療薬の生物活性及び分子量の差異を説明することができる。典型的には、抗炎症ＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）は、炎症性関節疾患の改善に有効であるためにはおよそ一週間に一回の投与を必要とする。我々の方法を用いたバイオコンジュゲーション後の効力の増加（図４Ａ〜Ｄ）及びＩＡ半減期（図５Ａ〜Ｂ）を示すデータに基づいて、以前の臨床研究で使用されたＩｇＧと同等の生物活性を有するＶＨＨ抗体（１５ｋＤａ）を用いて作製された質量等価用量のバイオコンジュゲートが同等の治療効果を得るためには、１１〜１２週ごとに一度再投薬することが必要であると予想する。
【発明の詳細な説明】
【００２５】
Ｉ．概要
本発明は、高分子ポリマーと複数のペプチドとのコンジュゲートを提供し、これは、非コンジュゲートペプチドよりも高い効力と、増大した半減期とを有するため、コンジュゲートが特に関節内疾患及び障害を治療するのが可能になる。
【００２６】
ＩＩ．定義
特に別段の指定がない限り、本明細書中で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。加えて、本明細書中で記載する方法及び材料と類似又は同等の任意の方法又は材料を本発明の実施で使用することができる。本発明の目的のために、以下の用語を定義する。
【００２７】
「ＨｙＡ」は、本明細書中で使用する場合、ヒアルロン酸を指す。
【００２８】
「ＣＭＣ」は、カルボキシメチルセルロースを指す。
【００２９】
「ｓｃＦＶ」は、短鎖可変フラグメント抗体を指す。
【００３０】
「ＶＨＨ」は、本明細書中で用いられる場合、シングルドメイン重鎖抗体を指す。
【００３１】
「ＤＡＲＰｉｎ」は、設計アンキリンリピートタンパク質を指し、これは概して遺伝子組換え抗体模倣タンパク質であって、高特異的かつ高アフィニティ標的タンパク質結合を示し得る。
【００３２】
「関節結合部」は、本明細書中で用いられる場合、繊維性又は軟骨性関節を指し、これは、二つ以上の骨が互いに結合している繊維性又は軟骨性領域である。
【００３３】
「治療上有効な量」は、本明細書中で用いられる場合、それが投与される目的の治療効果をもたらす用量を指す。正確な用量は、治療の目的に依存し、公知技術を使用して当業者には確認可能である（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照のこと）。感作細胞では、治療上有効な量は、多くの場合、非感作細胞について通常の治療上有効な量よりも低い可能性がある。
【００３４】
「生体適合性ポリマー」は、本明細書中で用いられる場合、注射部位の関節と適合性であるポリマーを指す。代表的な生体適合性ポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリサッカリド、グリコサミノグリカン、及びヒアルロン酸が挙げられる。
【００３５】
「ポリマー分子量」は、本明細書中で用いられる場合、ポリマーの分子量を指す。
【００３６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書中では交換可能に用いられ、任意の長さの天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びにアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物であって、天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するものを指す。「ポリペプチド」という用語は融合タンパク質を包含し、これは、限定されるものではないが、非相同性アミノ酸配列との融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するかまたは有さない、非相同性及び相同性リーダー配列との融合物；免疫学的にタグ付けされたタンパク質などを含む。「ポリペプチド」という用語は、翻訳後に修飾されたポリペプチドを包含する。
【００３７】
「調整する」とは、本明細書中で用いられる場合、関連する活性の機能、又は活性（例えば、免疫細胞機能）を増加又は減少させる化合物の能力を指す。
【００３８】
「免疫細胞機能」は、例えば、免疫応答の調整を包含する。調整は、免疫抑制又は免疫賦活であり得る。免疫応答の例としては、限定されるものではないが液性免疫応答、細胞性免疫応答、又は炎症応答が挙げられる。
【００３９】
「阻害」、「阻害する」及び「阻害物質」は、本明細書中で用いられる場合、特異的作用又は機能を妨げる化合物又は妨げる方法を指す。
【００４０】
「抗体」は、本明細書中で用いられる場合、抗原と特異的に結合し認識するイムノグロブリン遺伝子又はそのフラグメントによってコード化されるポリペプチドを指す。認識されるイムノグロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに多種多様なイムノグロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κ又はλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεに分類され、これらはそれぞれ、イムノグロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを規定する。抗体は、ホルモン受容体、薬物標的、例えば、末梢型ベンゾジアゼピン受容体、及び担体タンパク質を含む多種多様な受容体を代表するものである。代表的な抗体としては、限定されるものではないが、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体フラグメント、単鎖ｓｃＦｖ抗体、シングルドメイン重鎖ＶＨＨ抗体、又は改変抗体様スカフォールド、例えば、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤａＲＰｉｎ、及び改変されたＫｕｎｉｔｚ型阻害剤が挙げられる。他の例には、腫瘍壊死因子α及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、又はインターフェロンγなどの免役調節サイトカインの受容体デコイも含まれる。
【００４１】
「スルフィド結合」は、本明細書中で用いられる場合、硫黄共有結合を有する任意の部分を指す。
【００４２】
「リンカー」は、本明細書中で用いられる場合、ポリペプチドをポリマーに直接又は間接的に共有結合させる化学的部分を指す。本発明において有用なリンカーは、約１００Ｄａ〜５００Ｄａであり得る。本発明のリンカーのタイプとしては、限定されるものではないが、イミド、アミド、アミン、エステル、カーバメート、尿素、チオエーテル、チオカーバメート、チオカーボネート及びチオ尿素が挙げられる。当業者には、他のタイプのリンカーが本発明において有用であることを理解するであろう。
【００４３】
「拡散半減期」は、本明細書中で用いられる場合、所与の体積または空間内のコンジュゲートの初期濃度が半減するのに要する時間を指し、ここで、濃度の減少は濃度勾配の関数である。
【００４４】
「関節内半減期」は、本明細書中で用いられる場合、特定の関節内のコンジュゲートの初期濃度が半減するのに要する時間を指し、ここで、関節外への輸送は対流による。対流輸送は、拡散及び移流による輸送の組み合わせであり、ここで、移流輸送は、バルクモーションによる物質の輸送である。
【００４５】
「医薬組成物」は、本明細書中で用いられる場合、特定量の特定の成分を含む生成物、並びに特定量の特定成分の組み合わせから直接又は間接的に得られる生成物を指す。医薬組成物は、概して、生物学的使用に安全である。
【００４６】
「薬剤的に許容される担体」及び「薬剤的に許容される賦形剤」は、本明細書中で用いられる場合、対象による吸収のための活性剤の投与を助ける物質を指す。本発明において有用な医薬担体及び／又は賦形剤としては、限定されるものではないが、バインダー、フィラー、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、フレーバー及び染料が挙げられる。当業者は、他の医薬担体及び／又は賦形剤が本発明において有用であることを理解するであろう。
【００４７】
ＩＩＩ．ペプチド−ポリマーコンジュゲート
本発明は、高分子ポリマーと複数のペプチドとのコンジュゲートを提供し、これは、非コンジュゲート化ペプチドの同様の濃度よりも高い効力を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと、複数のペプチドとのコンジュゲートを提供し、ペプチドは、約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量と、複数のペプチドと有し、ペプチドは約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、ポリマーの分子量はペプチドあたり約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。
【００４９】
生体適合性ポリマー
本発明のコンジュゲートにおいて有用なポリマーには、任意の好適な生体適合性ポリマーが含まれる。生体適合性ポリマーは、親水性ポリマーであって、概して免疫応答を引き起こさないものである。好適な生体適合性ポリマーには、限定されるものではないが、ポリサッカリド、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸及びその誘導体，セルロース、カルボキシメチルセルロース及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体、ダーマチン、デンプン及び加工デンプン、コンドロイチン、キトサン、カルボキシメチルキトサンなどが挙げられる。生体適合性ポリマーはまた、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリウレタン、エチレン酢酸ビニルコポリマー、コラーゲン、ポリイソブチレン、エチレンビニルアルコールコポリマー、ポリエチレンポリカーボネート、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコリド、カーボマー、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアクリレート、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリド（例えば、ヒアルロン酸、ヒドロキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、又はその誘導体）、ポリエーテル、その誘導体及びそれらの組み合わせが含まれ得る。生体適合性ポリマーは、例えば硫酸化、スルホン化、重水素化などの方法によってさらに修飾することができる。
【００５０】
生体適合性ポリマーとして有用なポリサッカリドとしては、限定されるものではないが、特に、セルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、キチン、グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロナン（ヒアルロン酸）、ヘパリン、ヘパラン硫酸などが挙げられる。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーはポリサッカリドであり得る。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーはグリコサミノグリカンであり得る。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーはヒアルロン酸であり得る。
【００５１】
本発明の生体適合性ポリマーは任意の好適な分子量を有するものであり得る。例えば、好適な生体適合性ポリマーは、約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａ、又は約１００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａの分子量を有し得る。ポリマー分子量は、典型的には、数平均分子量（Ｍn）又は重量平均分子量（Ｍw）として表すことができる。数平均分子量は、個々の巨大分子の分子質量の算術平均である。重量平均分子量はより大きな分子によって影響を受けるので、数平均分子量よりも大きな数値である。Ｍw／Ｍnの比はポリマーの多分散性であり、ポリマーサンプル中の分子量の幅を表す。本発明における分子量についての言及は、特に断りの無い限り、重量平均分子量（Ｍw）を指す。
【００５２】
生体適合性ポリマーに有用な分子量としては、限定されるものではないが、約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａ、約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａ、約０．２ＭＤａ〜約１．５ＭＤａ、約０．８ＭＤａ〜約３ＭＤａ、約１ＭＤａ〜約３ＭＤａ、約１．５ＭＤａ〜約３ＭＤａ、又は約１ＭＤａ〜約２ＭＤａが挙げられる。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約０．２ＭＤａ〜約１．５ＭＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約０．８ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する。生体適合性ポリマーは、約０．１ＭＤａ、又は０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又は約３ＭＤａの分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは少なくとも約０．８５ＭＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約０．９ＭＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは少なくとも約１ＭＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約２ＭＤａの分子量を有する。
【００５３】
生体適合性ポリマーは、ペプチドあたり、約５ｋＤａ〜約６００ｋＤａ、又は約５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、又は約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの分子量を有し得る。生体適合性ポリマーは、ペプチドあたり、約５ｋＤａ、又は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は約１００ｋＤａの分子量を有し得る。
【００５４】
ペプチド
本発明において好適なペプチドは、少なくとも約２ｋＤａの分子量を有するものであり、三次構造を示す。代表的なペプチドとしては、限定されるものではないが、ポリペプチド、一つ以上のアプタマー、ヒトＡドメインスカフォールドに基づくアビマー（ａｖｉｍｅｒ）スカフォールド、ダイアボディ、ラクダ科、サメＩｇＮＡＲ抗体、特異性が修飾されたフィブロネクチンＩＩＩ型スカフォールド、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドが挙げられる。
【００５５】
特に有用な一つの実施形態において、ペプチドは治療用タンパク質である。多くの治療用タンパク質、例えば限定されるものではないが、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、ヒト成長ホルモン、及びイミグルセラーゼが本願全体にわたって開示されている。
【００５６】
一実施形態において、ペプチドは、限定されるものではないが：Ａβ、アガルシダーゼ、アレファセプト、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、アムドキソビル（ＤＡＰＤ）、アンチド、ベカプレルミン、Ａ型及びＢ型並びにボツリヌス毒素活性を有する低分子量化合物を含むボツリヌス毒素、カルシトニン、シアノビリン、デニロイキンジフチトクス、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯアゴニスト、ドルナーゼα、赤血球産生刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）、凝固因子、例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子；セレダーゼ、セレザイム、α−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルフェートスルファターゼ、コラーゲン、シクロスポリン、αディフェンシン、βディフェンシン、デスモプレシン、エキセンジン−４、サイトカイン、サイトカイン受容体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、α−１プロテイナーゼ阻害物質、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、フィブリノゲン、フィルグラスチム、成長ホルモンヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ソマトロピン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−β抗体、骨形成タンパク質、例えば、骨形成タンパク質−２、骨形成タンパク質−６、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ＯＰ−１；酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子２１、ＣＤ−４０リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω、インターフェロンτ、コンセンサスインターフェロン、ヒトリシルオキシダーゼ様−２（ＬＯＸＬ２）；インターロイキン及びインターロイキン受容体、例えば、インターロイキン１受容体、インターロイキン２、インターロイキン２融合タンパク質、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン４受容体、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１２、インターロイキン１７、インターロイキン２１、インターロイキン２３、ｐ４０、インターロイキン１３受容体、インターロイキン１７受容体；ラクトフェリン及びラクトフェリンフラグメント、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インスリン、プロインスリン、インスリンアナログ、レプチン、グレリン、アミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、オクトレオチドを含むソマトスタチンアナログ、バソプレッシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、イミグルセラーゼ、インフルエンザワクチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、プラスミノゲンアクチベータ、例えば、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、及びテネテプラーゼ；神経成長因子（ＮＧＦ）、オステオプロテゲリン、血小板由来成長因子、組織成長因子、形質転換成長因子−１、血管内皮成長因子、白血病抑制因子、ケラチノサ���ト成長因子（ＫＧＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ分子／抗原、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β）、ＴＮＦ受容体（例えば、ＴＮＦ−α受容体及びＴＮＦ−β受容体）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４受容体、単球走化性タンパク質−１、内皮成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチド、ソマトトロピン、サイモシンα１、ラスブリカーゼ、サイモシンα１  ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害物質、サイモシンβ１０、サイモシンβ９、サイモシンβ４、α−１アンチトリプシン、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）化合物、ＶＬＡ−４（最晩期抗原−４）、ＶＬＡ−４阻害物質、ビスホスホネート、呼吸器合胞体ウイルス抗体、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、及び抗ＣＭＶ抗体を含む具体的に特定されたタンパク質又はペプチド剤から選択することができる。例示的モノクローナル抗体としては、エタネルセプト（ＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５ｋＤのＴＮＦ受容体の細胞外リガンド結合部分から構成される二量体融合タンパク質）、アブシキシマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アレムツズマブ、Ｂリンパ球に対する抗体、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ、ベルチリムマブ、ＣＤＰ−４８４、ＣＤＰ−５７１、ＣＤＰ−７９１、ＣＤＰ−８６０、ＣＤＰ−８７０、セツキシマブ、クレノリキシマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、フォントリズマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イノリモマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レルデリムマブ、オリズマブ、放射標識されたｌｙｍ−１、メテリムマブ、メポリズマブ、ミツモマブ、ムロモナド（ｍｕｒｏｍｏｎａｄ）−ＣＤ３、ネバクマブ、ナタリズマブ、オズリモマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、ペムツモマブ、ペキセリズマブ、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ、リツキシマブ、サツモマブペンデチド、セビルマブ、シプリズマブ、トシツモマブ、Ｉ．ｓｕｐ．１３１トシツモマブ、トラスツズマブ、ツビルマブ、ビジリズマブ、並びにそのフラグメント及び模倣物が挙げられる。
【００５７】
一実施形態において、ペプチドは融合タンパク質である。例えば、限定されるものではないが、ペプチドは、一つ以上のある特定の有用なペプチド配列と融合したイムノグロブリン又はイムノグロブリンの一部であり得る。例えば、ペプチドは、抗体Ｆｃフラグメントを含み得る。一実施形態において、ペプチドはＣＴＬＡ４融合タンパク質である。例えば、ペプチドはＦｃ−ＣＴＬＡ４融合タンパク質であり得る。別の実施形態において、ペプチドは第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質である。例えば、ペプチドはＦｃ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であり得る。
【００５８】
特に有用な一つの実施形態において、ペプチドは、ヒトタンパク質又はヒトポリペプチド、例えば、異種産生されたヒトタンパク質又はヒトポリペプチドである。対応するヒト形態がある、多くのタンパク質及びポリペプチドが本明細書中に開示されている（すなわち、タンパク質又はペプチドは、通常、ヒト体内のヒト細胞内で産生される）。したがって、一実施形態において、ペプチドは、ヒト形態が存在する、本明細書中で開示されるタンパク質及びポリペプチドの各々のヒト形態である。そのようなヒトタンパク質の例としては、限定されるものではないが、ヒト抗体、ヒト酵素、ヒトホルモン及びヒトサイトカイン、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン（例えば、αインターフェロン及びβインターフェロン）、ヒト成長ホルモン及びエリスロポエチンが挙げられる。
【００５９】
治療用タンパク質の他の例としては、限定されるものではないが、第ＶＩＩＩ因子、ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、抗凝固剤；ヒルジン、アルテプラーゼ、ｔｐａ、レテプラーゼ、ｔｐａ、５つのうち３ドメインが欠失したｔｐａ、インスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、長時間作用型インスリンアナログ、ｈｇｈ、グルカゴン、ｔｓｈ、フォリトロピン−β、ｆｓｈ、ｇｍ−ｃｓｆ、ｐｄｇｈ、ｉｆｎα２、ｉｆｎα２ａ、ｉｆｎα２ｂ、ｉｎｆ−ａｐｈａ１、コンセンサスｉｆｎ、ｉｆｎ−β、ｉｆｎ−β１ｂ、ｉｆｎ−β１ａ、ｉｆｎ−γ（例えば、１及び２）、ｉｆｎ−λ、ｉｆｎ−δ、ｉｌ−２、ｉｌ−１１、ｈｂｓａｇ、ｏｓｐａ、ｔ−リンパ球抗原に対するネズミｍａｂ、ｔａｇ−７２に対するネズミｍａｂ、腫瘍関連糖タンパク質、血小板表面受容体ｇｐＩＩ（ｂ）／ＩＩＩ（ａ）に対するキメラｍａｂ由来のｆａｂフラグメント、腫瘍関連抗原ｃａｌ２５に対するネズミｍａｂフラグメント、ヒトがん胎児性抗原に対するネズミｍａｂフラグメント、ｃｅａ、ヒト心臓ミオシンに対するネズミｍａｂフラグメント、腫瘍表面抗原ｐｓｍａに対するネズミｍａｂフラグメント、ｈｍｗ−ｍａａに対するネズミｍａｂフラグメント（ｆａｂ／ｆａｂ２ｍｉｘ）、がん関連抗原に対するネズミｍａｂフラグメント（ｆａｂ）、ｎｃａ９０に対するｍａｂフラグメント（ｆａｂ）、表面顆粒球非特異的交差反応抗原、ｂリンパ球の表面上で見られるｃｄ２０抗原に対するキメラｍａｂ、ｉｌ２受容体のα鎖に対するヒト化ｍａｂ、ｉｌ２受容体のα鎖に対するキメラｍａｂ、ｔｎｆ−αに対するキメラｍａｂ、呼吸器合胞体（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｔｉａｌ）ウイルスの表面上のエピトープに対するヒト化ｍａｂ、ｈｅｒ２に対するヒト化ｍａｂ、ヒト表皮成長因子受容体２、サイトケラチン腫瘍関連抗原抗ｃｔｌａ４に対するヒトｍａｂ、ｂリンパ球ドルナーゼ−αｄｎａｓｅのｃｄ２０表面抗原に対するキメラｍａｂ、βグルコセレブロシダーゼ、ｔｎｆ−α、ｉｌ−２−ジフテリア毒素融合タンパク質、ｔｎｆｒ−ｌｇｇフラグメント融合タンパク質ラロニダーゼ、ｄｎａａｓｅ、アレファセプト，ダーベポエチンα（コロニー刺激因子）、トシツモマブ、ネズミｍａｂ、アレムツズマブ、ラスブリカーゼ、アガルシダーゼβ、テリパラチド、副甲状腺ホルモン誘導体、アダリムマブ（ｌｇｇ１）、アナキンラ、生物学的修飾物質、ネシリチド、ヒトｂ型ナトリウム排泄増加ペプチド（ｈｂｎｐ）、コロニー刺激因子、ペグビソマント、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト、組換え活性化タンパク質ｃ、オマリズマブ、イムノグロブリンｅ（ｌｇｅ）ブロッカー、イブリツモマブチウキセタン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、サイモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部放出因子、エタネルセプト、抗利尿ホルモン、プロラクチン及び甲状腺刺激ホルモンが挙げられる。そして、これらのうちのいずれも、天然（例えば、セリンからシステインへの置換）（例えば、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの��法につきホルミルアルデヒド）又は非天然アミノ酸を用いて部位特異的コンジュゲーション点（Ｎ末端、又はＣ末端、又は他の場所）を有するように修飾することができる。
【００６０】
本発明において有用な治療用抗体（又はそれらの各ｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメント）の例としては、限定されるものではないが、抗ＴＮＦ阻害物質、例えばＴＮＦ受容体デコイエタネルセプト及びモノクローナル抗体アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブ、ＩＬ−６モノクローナル抗体阻害物質シルツキシマブ、ＩＬ−１７モノクローナル抗体阻害物質セクキヌマブ及びイキセキズマブ、ＩＬ−１２／２３モノクローナル抗体阻害物質ウステキヌマブ、インテグリン受容体アンタゴニスト、例えば、モノクローナル抗体阻害物質ナタリズマブ及びエトロリズマブ、ＣＬＴＡ受容体アンタゴニストアバタセプト、ＩＬ−１３モノクローナル抗体阻害物質トラロキヌマブ、ケモカイン阻害物質、例えば、モノクローナル抗体エルデルマブ及びベルチルマブ、並びにＩＬ−１阻害物質、例えば受容体デコイリロナセプト及びモノクローナル抗体カナキヌマブが挙げられる。
【００６１】
本発明において有用な治療用抗体（又はそれらの各ｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメント）の他の例としては、限定されるものではないが、転移性乳がん患者の治療用のヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるHERCEPTIN（商標）（トラスツズマブ）（Genentech, CA）；血栓形成防止用の血小板上の抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩｃ受容体であるREOPRO（商標）（アブシキシマブ）（Centocor）；急性腎臓同種移植拒絶反応防止用免疫抑制ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体であるZENAPAX（商標）（ダクリズマブ）（Roche Pharmaceuticals, Switzerland）；ネズミ抗１７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体であるPANOREX（商標）（Glaxo Wellcome/Centocor）；ネズミ抗イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体であるＢＥＣ２（ImClone System）；キメラ抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体であるＩＭＣ−Ｃ２２５（ImClone System）；ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体であるVITAXIN（商標）（Applied Molecular Evolution/MedImmune）；Ｃａｍｐａｔｈ；ヒト化抗ＣＤ５２ＩｇＧ１抗体であるＣａｍｐａｔｈ  １Ｈ／ＬＤＰ−０３（Leukosite）；ヒト化抗ＣＤ３３ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔ  Ｍ１９５（Protein Design Lab/Kanebo）；キメラ抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体であるRITUXAN（商標）（IDEC Pharm/Genentech,Roche/Zettyaku）；ヒト化抗ＣＤ２２ＩｇＧ抗体であるLYMPHOCIDE（商標）（Immunomedics）が挙げられ；ＩＣＭ３はヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ）である；ＩＤＥＣ−１１４は霊長類抗ＣＤ８０抗体（IDEC Pharm/Mitsubishi）である；ZEVALIN（商標）は放射標識されたネズミ抗ＣＤ２０抗体（ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）である；ＩＤＥＣ−１３１はヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体（ＩＤＥＣ／Ｅｉｓａｉ）である；ＩＤＥＣ−１５１は霊長類化抗ＣＤ４抗体（ＩＤＥＣ）である；ＩＤＥＣ−１５２は霊長類化抗ＣＤ２３抗体である（IDEC/Seikagaku）；ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３はヒト化抗ＣＤ３ＩｇＧ（Protein Design Lab）である；５Ｇ１．１はヒト化抗補体因子５（ＣＳ）抗体（Alexion Pharm）；Ｄ２Ｅ７はヒト化抗ＴＮＦ−α抗体（CATIBASF）である；ＣＤＰ８７０はヒト化抗ＴＮＦ−αＦａｂフラグメント（Celltech）である；ＩＤＥＣ−１５１は霊長類化抗ＣＤ４ＩｇＧ１抗体（IDEC Pharm/SmithKline Beecham）である；ＭＤＸ−ＣＤ４はヒト抗ＣＤ４ＩｇＧ抗体（Medarex/Eisai/Genmab）である；ＣＤＰ５７１はヒト化抗ＴＮＦ−α  ＩｇＧ４抗体（Celltech）である；ＬＤＰ−０２はヒト化抗α４β７抗体（LeukoSite/Genentech）である；ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ  ＯＫＴ４Ａはヒト化抗ＣＤ４  ＩｇＧ抗体（Ortho Biotech）である；ＡＮＴＯＶＡ（商標）はヒト化抗ＣＤ４０Ｌ  ＩｇＧ抗体（Biogen）である；ＡＮＴＥＧＲＥＮ（商標）はヒト化抗ＶＬＡ−４  ＩｇＧ抗体（Elan）である；ＣＡＴ−１５２、ヒト抗ＴＧＦ−β．ｓｕｂ．２抗体（Cambridge Ab Tech）；セツキシマブ（BMS）はモノクローナル抗ＥＧＦ受容体（ＥＧＦｒ）抗体である；ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａ）（Genentech）は抗ＶＥＧＦヒトモノクローナル抗体である；インフリキシマブ（Centocore, JJ）は自己免疫障害を治療するために用いられるキメラ（マウス及びヒト）モノクローナル抗体である；ゲムツズマブオゾガマイシン（Wyeth）は化学療法に用いられるモノクローナル抗体である；そしてラニビズマブ（Genentech）は、黄斑変性を治療するために用いられるキメラ（マ���ス及びヒト）モノクローナル抗体である。
【００６２】
本明細書中で開示されるタンパク質及びペプチドは、インビトロ合成による産生及び生物系における産生を含む任意の有用な方法によって産生することができる。当該技術分野で周知のインビトロ合成法の典型例としては、固相合成（「ＳＰＰＳ」）及び固相フラグメント縮合（「ＳＰＦＣ」）が挙げられる。タンパク質の産生に使用される生物系も当該技術分野で周知である。細菌（例えば、大腸菌及びバシラス属）、酵母（例えば、作家ロマイセス・セレビシエ及びピキア・パストリス）、タバコの葉（タバコモザイクウイルスによる）は、非相同性タンパク質の産生に広く用いられている。加えて、本明細書中で開示される使用のためのペプチド産生のための非相同性遺伝子発現は、動物細胞系、例えば、哺乳動物細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞）を使用して達成することができる。特に有用な一つの実施形態において、ペプチドは、トランスジェニックまたはクローン動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びトリ（例えば、ニワトリ、ウズラ、アヒル及びシチメンチョウ）において産生され、それぞれ当該技術分野で理解されるとおりである。例えば、その開示の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、２００４年８月２４日に発行された、米国特許第６，７８１，０３０号を参照。
【００６３】
本発明において有用なタンパク質又はポリペプチドは、タンパク質及びポリペプチドで見られる一般的な天然に存在するアミノ酸に加えて、天然に存在しないアミノ酸も含み得る。ポリペプチド又はタンパク質の特性を変更する目的のために存在することに加えて、天然に存在しないアミノ酸を導入して、タンパク質又はポリペプチドを直接ランダムコポリマーに連結するために使用できる官能基を提供することができる。さらに、天然に存在するアミノ酸、例えば、システイン、チロシン、トリプトファンをこのように使用できる。
【００６４】
天然に存在しないアミノ酸をタンパク質及びペプチドに様々な手段によって導入することができる。非天然アミノ酸の導入のための技術の一部は米国特許第５，１６２，２１８号で考察され、その開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。まず、天然に存在しないアミノ酸は、アミノ酸側鎖上又はアミノ末端若しくはカルボキシル末端のいずれかでのポリペプチド若しくはタンパク質の化学的修飾により導入することができる。タンパク質又はペプチドの化学的修飾の非限定例は、ジアゾメタンなどの薬剤によるメチル化、又はリジンの側鎖中に存在するアミノ基又はペプチド若しくはタンパク質のアミノ末端でのアセチル化の導入であり得る。非天然アミノ酸を調製するためのタンパク質／ポリペプチドアミノ基修飾の別の例は、メチル３−メルカプトプロピオンイミデートエステル又は２−イミノチオランを使用して、第一アミンを有するタンパク質又はポリペプチドの位置に連結した、チオール（スルフヒドリル、−−ＳＨ）を有する官能基を導入することである。いったん導入されると、そのような基は、タンパク質又はポリペプチドへの共有結合を形成するために使用できる。
【００６５】
第二に、天然に存在しないアミノ酸は、化学合成の際にタンパク質及びポリペプチドに導入することができる。合成法は、典型的には、約２００より少ないアミノ酸を有し、一般的には約１５０より少ないアミノ酸を有し、さらに一般的には１００以下のアミノ酸を有するポリペプチドを調製するために使用される。約７５未満又は約５０未満のアミノ酸を有する、より短いタンパク質又はポリペプチドを、化学合成によって調製することができる。
【００６６】
所望の位置での非天然アミノ酸の挿入を可能にするために特に好都合である合成調製法は当該技術分野で公知である。好適な合成ポリペプチド調製法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法に基づくものであり得、このＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法では、アミノ酸を成長鎖に連続して付加させる(Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156)。かかる技術によってポリペプチドを合成するための自動システムは、現在、Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif. 94404; New Brunswick Scientific, Edison, N.J. 08818;及びPharmacia, Inc., Biotechnology Group, Piscataway, N.J. 08854などの供給業者から市販されている。
【００６７】
ポリペプチドの化学合成の間に導入することができる天然に存在しないアミノ酸の例としては、限定されるものではないが：Ｄ−アミノ酸並びに２０の天然に存在するアミノ酸、Ｎ−ホルミルグリシン、オルニチン、ノルロイシン、ヒドロキシプロリン、β−アラニン、ヒドロキシバリン、ノルバリン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ロイシン、２−アミノ−３，３−ジメチルブタン酸）、ヒドロキシ−ｔ−ブチルグリシン、アミノ酪酸、シクロロイシン、４−ヒドロキシプロリン、ピログルタミン酸（５−オキソプロリン）、アゼチジンカルボン酸、ピペコリン酸、インドリン−２−カルボン酸、テトラヒドロ−３−イソキノリンカルボン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，６−ジアミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，６−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、５−ヒドロキシリジン、ノイラミン酸、及び３，５−ジヨードチロシンのＤ及びＬ形の混合物が挙げられる。
【００６８】
第三に、天然に存在しないアミノ酸は、非天然アミノ酸が挿入される位置に対応するコドンにてポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）におけるナンセンスコドン（例えば、アンバー又はオーカーコドン）の挿入により、インビボ又はインビトロでの生物学的合成によって導入することができる。そのような技術は、例えば、米国特許第５，１６２，２１８号及び同第６，９６４，８５９号で考察されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発を含む様々な方法を使用して変異コドンを挿入することができる。変更された配列を次に、所望の天然に存在しないアミノ酸で化学的又は酵素によりアシル化されたナンセンスコドンに対して、インビボで、又はサプレッサｔＲＮＡを提供するシステムにおいてインビトロで、転写・翻訳される。合成アミノ酸は、ナンセンスコドンに対応する位置で挿入される。より大きな及び／又はグリコシル化されたポリペプチドの調製のために、このタイプの組換え調製技術が通常好まれる。このようにして導入することができるアミノ酸には：ホルミルグリシン、フルオロアラニン、２−アミノ−３−メルカプト−３−メチルブタン酸、ホモシステイン、ホモアルギニンなどがある。タンパク質中の非天然アミノ酸を得るための他の同様のアプローチとしては、メチオニン置換法が挙げられる。
【００６９】
天然に存在しないアミノ酸が選択的修飾を受けやすい官能基を有する場合、それらはタンパク質又はポリペプチドに対する共有結合を形成するために特に有用である。官能基が選択的修飾を受けやすい環境としては、官能基が独自のものであるもの、又は関心対象の条件下で反応し得る他の官能基が立体化学的若しくは他の方法のいずれかで妨害されるものが挙げられる。
【００７０】
他の抗体、例えばシングルドメイン抗体は本発明において有用である。シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ablynxはナノボディと呼ぶ）は、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。全抗体のように、ｓｄＡｂは特異抗原と選択的に結合することができる。わずか１２〜１５ｋＤａの分子量であるので、シングルドメイン抗体は一般的な全抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さい。シングルドメイン抗体は、重鎖抗体の、又は一般的なＩｇＧの一つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む、約１１０アミノ酸長のペプチド鎖である。
【００７１】
全抗体とは異なって、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、例えばＶＨＨは、Ｆｃ領域が欠如しているので、相補系によって引き起こされる細胞傷害性を示さない。ラクダ科及び魚類由来のｓｄＡｂは、全抗体、例えば酵素の活性部位に接近することができない隠れた抗原と結合することができる。
【００７２】
ｓｄＡｂは、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ又はサメを所望の抗原で免疫化し、その後、重鎖抗体をコード化するｍＲＮＡを単離することによって得ることができる。別法として、それらは、合成ライブラリをスクリーニングすることによって作製できる。ラクダ科は、ラクダ亜目の唯一生きている科である生物学的ラクダ科のメンバーである。ラクダ、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーナ、及びグアナコがこの群に含まれる。
【００７３】
本発明において有用なペプチドはまた、限定されるものではないが、大環状ペプチド、シクロチド、ＬＤＬ受容体Ａドメイン、可溶性受容体、酵素、ペプチドマルチマー、ドメインマルチマー、抗体フラグメントマルチマー、及び融合タンパク質も含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ペプチドは免疫細胞機能の活性を調整する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、インターロイキン６、又はインターフェロンγを阻害する。いくつかの実施形態では、ペプチドは腫瘍壊死因子αを阻害する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体フラグメント、単鎖可変領域抗体、シングルドメイン重鎖抗体、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤、又は受容体デコイである。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは抗ＴＮＦａシングルドメイン重鎖（ＶＨＨ）抗体であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは抗ＴＮＦａアフィボディであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは抗ＴＮＦａ設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは抗ＩＬ−１Ｂ単鎖（ｓｃＦｖ）抗体であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは可溶性インターロイキン受容体２（ｓＩＬＲ２）であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号９、又は配列番号１１であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号６、配列番号７、又は配列番号９であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号６であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号７であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号９であるアミノ酸配列を有する。
【００７６】
本発明において有用なペプチドは、少なくとも２ｋＤａの分子量を有し得、三次構造を示し得る。例えば、ペプチドの分子量は、約２ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、又は約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａであり得る。ペプチドの代表的な分子量としては、約２ｋＤａ、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、又は約１５０ｋＤａが挙げられる。
【００７７】
コンジュゲート
本発明のコンジュゲートは、式Ｉ：
（Ｘ−Ｙ）n−Ｚ  （Ｉ）
の化合物として記述することができ、式中、Ｘは上述したペプチドであり、Ｚは上述の生体適合性ポリマーであり、Ｙは任意のリンカーであり、下付き文字ｎは５〜５００である。
【００７８】
本発明のペプチド−ポリマーコンジュゲートは、ペプチドのポリマーに対するモル比が少なくとも５：１である、任意の好適なペプチドと生体適合性ポリマーとの組み合わせを含み得る。本発明において有用なペプチドの生体適合性ポリマーに対する代表的なモル比としては、５：１〜約１０００：１、５：１〜約５００：１、５：１〜約４００：１、約１０：１〜約５００：１、約１０：１〜約４００：１、約１０：１〜約３００：１、約１０：１〜約２００：１、約１０：１〜約１００：１、約２０：１〜約１００：１、約３０：１〜約１００：１、約５０：１〜約１００：１、約１０：１〜約５０：１、約２０：１〜約５０：１、又は約３０：１〜約５０：１が挙げられる。本発明において有用な、ペプチドの生体適合性ポリマーに対する他のモル比としては、約５０：１〜約５００：１、約５０：１〜約４００：１、約５０：１〜約３００：１、又は約５０：１〜約２００：１が挙げられる。ペプチドの生体適合性ポリマーに対する代表的なモル比としては、約１０：１、又は１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１２５：１、１５０：１、１７５：１、２００：１、２５０：１、３００：１、３５０：１、４５０：１又は約５００：１が挙げられる。
【００７９】
各ペプチドは、BroadPharm of San Diego, CAから提供されるものなど、抗体−薬物コンジュゲートを形成するために当該技術分野で一般的に公知の様々なリンカーによって生体適合性ポリマーに連結させることができる。バイオコンジュゲート結合を形成するための方法は、Bioconjugate Techniques, 3rd Edition, Greg T. Hermansonに記載されている。リンカーは、アミン、カルボニル、カルボキシル及び活性化エステルと反応性であり得、クリック化学（Ｃｌｉｃｋ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（銅の有無を問わない）によって反応することができるか、又はチオールと反応性であり得る。
【００８０】
例えば、ペプチドはリンカーなしで生体適合性ポリマーと直接共有結合することができる。あるいは、ペプチドは、カルボキシレート及びアンモニウムイオンを介するなどイオン結合の形成によって生体適合性ポリマーと連結することができる。リンカーを使用してペプチを生体適合性ポリマーと共有結合させる場合、代表的なリンカーは、アミド若しくはジスルフィドを含むか、又は無水コハク酸、スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、無水マレイン酸、マレイミド、ヒダントイン、フタルイミドなどの反応性基から形成される。本発明において有用なリンカーは小さく、概して、マレイミドとアミン又はヒドラジドのいずれかとからなる二つの官能基を含む約１００Ｄａ〜約５００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドが、スルフィド結合と、約１００Ｄａ〜約５００Ｄａの分子量を有するリンカーとを介してポリマーと共有結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは約１００Ｄａ〜約３００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、リンカーはスクシンイミドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、Ｎ−アミノエチルマレイミド、Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸ヒドラジド（ＫＵＭＨ）、ヒドラジド−ＰＥＧ２−マレイミド、アミン−ＰＥＧ２−マレイミド、ヒドラジド−ＰＥＧ３−マレイミド、又はアミン−ＰＥＧ３−マレイミドを用いて形成される。
【００８１】
式Ｉ中の代表的なリンカー基Ｙとしては、限定されるものではないが、
【化１】
2021517169.tif 000003
が挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、リンカー基ＹはＮ−ε−マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）：
【化２】
2021517169.tif 000004
であり得る。
【００８３】
本発明のコンジュゲートにおいて有用なリンカーは、短ペプチドでもあり得る。柔軟性、半柔軟性、硬性ペプチドリンカーが抗炎症ペプチド配列の一部として含まれていてもよい。
【００８４】
本発明の生体適合性ポリマーのペプチドのコンジュゲートは、非コンジュゲートペプチドよりも長い拡散半減期を有し得る。例えば、コンジュゲートは、ペプチドの拡散半減期よりも少なくとも２倍長いか、又はペプチドの拡散半減期よりも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは少なくとも１００倍長い拡散半減期を有し得る。コンジュゲートの拡散半減期は、ペプチドよりも約２〜約１００倍、又はペプチドよりも約２〜約５０、約１０〜約１００、約２５〜約１００、約５０〜約１００倍長い可能性がある。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの拡散半減期はペプチドよりも少なくとも約２倍長い。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの拡散半減期はペプチドよりも約２〜約１００倍長い
【００８５】
本発明のコンジュゲートはまた、非コンジュゲートペプチドよりも長い関節内半減期を有し得る。例えば、コンジュゲートは、非コンジュゲートペプチドよりも少なくとも２０％長いか、又は非コンジュゲートペプチドよりも少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００若しくは１０００％長い関節内半減期を有し得る。コンジュゲートの関節内半減期は、非コンジュゲートペプチドよりも約２０％〜約１０００％長いか、又は非コンジュゲートペプチドよりも約１００％〜約１０００％、若しくは約１００％〜約５００％、若しくは約１００％〜約３００％長い可能性がある。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの関節内半減期は、ペプチドよりも少なくとも約２０％長い。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの関節内半減期は、ペプチドよりも約２０％〜約１０００％長い。
【００８６】
いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約０．８ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有し；各ペプチドは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約１０：１である。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約０．８ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量を有し；各ペプチドは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約１０：１である。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量を有し；各ペプチドは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約１０：１である。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量を有し；各ペプチドは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約２０：１である。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは約２ＭＤａの分子量を有し；各ペプチドは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５０：１である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明は、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）13−ＨｙＡ（２００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）17−ＨｙＡ（３５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）23−ＨｙＡ（７５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）46−ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）88−ＨｙＡ（１３５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）184−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、（抗（マウス）ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）273−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）41−ＣＭＣ（９０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）37−ＣＭＣ（２５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）42−ＣＭＣ（７００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）5−ＣＭキトサン（２００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）13−ＨｙＡ（２００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαアフィボディ−ＥＭＣＨ）21−ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαアフィボディ−ＥＭＣＨ）22−ＣＭＣ（７００ｋＤａ）、（抗ＩＬ−１βｓｃＦｖ抗体−ＥＭＣＨ）15−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、又は（抗ＩＬ−１βｓｃＦｖ抗体−ＥＭＣＨ）13−ＣＭＣ（７００ｋＤａ）のコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）13−ＨｙＡ（２００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）17−ＨｙＡ（３５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）23−ＨｙＡ（７５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）46−ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）88−ＨｙＡ（１３５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）184−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、（抗（マウス）ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）273−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）37−ＣＭＣ（２５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）42−ＣＭＣ（７００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）5−ＣＭキトサン（２００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）13−ＨｙＡ（２００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαアフィボディ−ＥＭＣＨ）21−ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαアフィボディ−ＥＭＣＨ）22−ＣＭＣ（７００ｋＤａ）、（抗ＩＬ−１βｓｃＦｖ抗体−ＥＭＣＨ）15−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、又は（抗ＩＬ−１βｓｃＦｖ抗体−ＥＭＣＨ）13−ＣＭＣ（７００ｋＤａ）のコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）46−ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）88−ＨｙＡ（１３５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）184−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、（抗（マウス）ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）273−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαアフィボディ−ＥＭＣＨ）21−ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）、又は（抗ＩＬ−１βｓｃＦｖ抗体−ＥＭＣＨ）15−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）のコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）46−ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）88−ＨｙＡ（１３５０ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）184−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、（抗（マウス）ＴＮＦαＶＨＨ抗体−ＥＭＣＨ）273−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）、（抗ＴＮＦαアフィボディ−ＥＭＣＨ）21−ＨｙＡ（８５０ｋＤａ）、又は（抗ＩＬ−１βｓｃＦｖ抗体−ＥＭＣＨ）15−ＨｙＡ（２０００ｋＤａ）のコンジュゲートを提供する。
【００８８】
ＩＶ．医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲートと薬剤的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００８９】
Ａ．処方
本発明のコンジュゲートから医薬組成物を調製するために、薬剤的に許容される担体は固体又は液体のいずれかであり得る。固体形態製剤としては、散剤、カシェー、及び分散性顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、バインダー、防腐剤、崩壊剤、又は封入材料としても作用し得る一つ以上の物質であり得る。処方及び投与の技術に関する詳細は、科学及び特許文献で充分に記載されており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA ("Remington's")の最新版を参照のこと。
【００９０】
散剤では、担体は微粉化固体であり、これは微粉化活性成分との混合物である。錠剤では、活性成分を、必要な結合特性を有する担体と、好適な割合で混合し、望ましい形状及びサイズに圧縮する。散剤及び錠剤は、好ましくは、５％又は１０％〜７０％の本発明のコンジュゲートを含む。
【００９１】
液体形態調製物には、溶液、懸濁液、及びエマルション、例えば、水又は水／プロピレングリコール溶液が含まれる。非経口注射について、液体調製物は、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液で処方することができる。
【００９２】
経口使用に適した水溶液は、本発明のコンジュゲートを水中に溶解させ、必要に応じて、好適な着色剤、フレーバー、安定剤、及び増粘剤を添加することによって調製することができる。経口使用に適した水性懸濁液は、微粉化活性成分を、粘着性物質、例えば、天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアゴム、及び分散剤又は湿潤剤、例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）と共に水中に分散させることによって作製できる。水性懸濁液はまた、一つ以上の防腐剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル又はｎ−プロピル、一つ以上の着色剤、一つ以上の矯味矯臭剤及び一つ以上の甘味剤、例えば、スクロース、アスパルテーム又はサッカリンも含み得る。処方は、オスモル濃度について調節することができる。
【００９３】
固体形態調製物も含まれ、これは、使用直前に経口投与用液体形態調製物に変換されるように意図されている。そのような液体形態としては、溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。これらの調製物は、活性成分に加えて、着色剤、フレーバー、安定剤、緩衝液、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでもよい。
【００９４】
油懸濁液は、本発明のコンジュゲートを植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナツ油、若しくは鉱油、例えば、流動パラフィン；又はこれらの混合物中に懸濁させることによって処方できる。油懸濁液は、増粘剤、例えば、ミツロウ、固形パラフィン又はセチルアルコールを含み得る。甘味剤、例えば、グリセロール、ソルビトール又はスクロースを添加して、味の良い経口調製物を提供することができる。これらの処方は、抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸の添加によって保存することができる。注射可能な油ビヒクルの一例として、Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281 :93-102, 1997を参照。本発明の製剤処方はまた、水中油エマルションの形態でもあり得る。油性相は、前記の植物油若しくは鉱油、又はこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤としては、天然に存在するゴム、例えば、アカシアゴム及びトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズレシチン、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、及びこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エマルションはまた、シロップ及びエリキシルの処方中のように、甘味剤及び矯味矯臭剤も含み得る。そのような処方は、鎮痛薬、防腐剤、又は着色剤も含み得る。
【００９５】
本発明の組成物はまた、体内での徐放性のために、ミクロスフェアとして送達することもできる。例えば、ミクロスフェアは、ゆっくりと皮下放出される、薬物含有ミクロスフェアの皮内注射による投与のために（Rao, J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645, 1995を参照）；生分解性及び注射可能なゲル処方として（例えば、Gao Pharm. Res. 12:857-863, 1995を参照）；または経口投与用ミクロスフェアとして（例えば、Eyles, J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674, 1997を参照）、処方することができる。経皮経路及び皮内経路のどちらも、数週間又は数か月間の定量送達をもたらす。
【００９６】
別の実施形態において、本発明の組成物は、体腔、例えば関節の関節内空間などへの非経口投与用に処方することができる。投与用処方は、通常、薬剤的に許容される担体中に溶解された本発明の組成物の溶液を含む。用いることができる許容されるビヒクル及び溶媒には、水及びリンゲル液、等張塩化ナトリウムが含まれ得る。加えて、無菌固定油を、通常、溶媒又は懸濁媒として用いることができる。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドをはじめとする、任意のブランドの固定油を用いることができる。加えて、脂肪酸、例えばオレイン酸は、注射液の調製で同様に使用することができる。これらの溶液は無菌であり、概して望ましくないものを含まない。これらの処方は、従来の周知滅菌技術によって滅菌することができる。処方は、生理学的状態に近づけるために必要な薬剤的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節及び緩衝剤、毒性調節剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。これらの処方中の本発明の組成物の濃度は大きく異なり得、主に、流体体積、粘度、体重などに基づき、選択された特定の投与様式及び患者のニーズにしたがって選択される。ＩＶ投与について、処方は、無菌注射調製物、例えば、注射可能な無菌水性又は油性懸濁液であり得る。この懸濁液は、公知技術に従い、これらの好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して処方することができる。無菌注射調製物はまた、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の注射可能な無菌溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液でもあり得る。
【００９７】
別の実施形態において、本発明の組成物の処方は、リポソームの使用によって送達することができ、このリポソームは、細胞膜と融合するか又は、すなわちリポソームに結合したリガンドを用いることによって取り込まれるか、又は細胞の表面膜タンパク質受容体と結合したオリゴヌクレオチドに直接結合され、その結果、エンドサイトーシスが起こる。リポソームを使用することによって、リポソーム表面が、標的細胞に対して特異的なリガンドを有するか、又はそうでなければ特定の臓器へ優先的に向けられる場合、インビボでの標的細胞への本発明の組成物の送達に着目することができる。（例えば、Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13:293-306, 1996; Chonn, Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708, 1995; Ostro, Am. J. Hosp. Pharm. 46: 1576-1587, 1989を参照のこと）。
【００９８】
脂質系薬物送達システムとしては、脂質溶液、脂質エマルション、脂質分散液、自己乳化薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）及び自己微乳化薬物送達システム（ＳＭＥＤＤＳ）が挙げられる。特に、ＳＥＤＤＳ及びＳＭＥＤＤＳは、水性媒体中に自発的に分散することができ微細エマルション（ＳＥＤＤＳ）又はミクロエマルション（ＳＭＥＤＤＳ）を形成できる、脂質、界面活性剤及び補助界面活性剤の等方性混合物である。本発明の処方において有用な脂質としては、限定されるものではないが、ゴマ油、オリーブ油、ヒマシ油、ピーナッツ油、脂肪酸エステル、グリセロールエステル、Labrafil（登録商標）、Labrasol（登録商標）、Cremophor（登録商標）、Solutol（登録商標）、Tween（登録商標）、Capryol（登録商標）、Capmul（登録商標）、Captex（登録商標）、及びPeceol（登録商標）をはじめとする任意の天然又は合成脂質が挙げられる。
【００９９】
Ｂ．投与
本発明のコンジュゲート及び組成物は、経口、非経口及び局所的方法をはじめとする任意の好適な手段で送達することができる。いくつかの実施形態では、送達方法は関節内である。
【０１００】
医薬品は好ましくは単位投与形態である。そのような形態において、調製物を、適切な量の本発明のコンジュゲート及び組成物を含む単位用量に細分する。単位投与形態は、パック入り錠剤、カプセル、及びバイアル又はアンプル中の散剤などの離散量の調製物を含むパッケージ化調製物であり得る。
【０１０１】
本発明のコンジュゲート及び組成物を他の薬剤と同時投与することができる。同時投与は、他の薬剤の０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、又は２４時間以内に本発明のコンジュゲート又は組成物を投与することを含む。同時投与はまた、同時に、ほぼ同時に（例えば、互いに約１、５、１０、１５、２０、若しくは３０分以内）、又は任意の順で連続して投与することを含む。さらに、本発明のコンジュゲート及び組成物は、それぞれ、１日に１回、または１日につき２回、３回、またはそれ以上投与して、１日当たり好ましい投与量レベルを提供することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、同時投与は、同時処方により、すなわち、本発明のコンジュゲート及び組成物と任意の他の薬剤とを含む単一の医薬組成物を調製することによって達成することができる。別法として、様々な成分を別々に処方することができる。
【０１０３】
本発明のコンジュゲート及び組成物、並びに任意の他の薬剤は、任意の好適な量で存在することができ、限定されるものではないが、対象の体重及び年齢、疾患の状態などをはじめとする様々な因子に依存し得る。好適な投与量範囲としては、約０．１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、又は約１０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、又は約２５ｍｇ〜約５００ｍｇ、又は約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇが挙げられる。好適な投与量としてはまた、約１ｍｇ、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ｍｇが挙げられる。組成物はまた、他の適合性治療薬も含み得る。本明細書中で記載するコンジュゲートは、互いと、グルココルチコイド受容体の調整で有用であることが知られている他の活性剤と、又は単独で有効であり得るが、活性剤の有効性に寄与し得る補助薬と、組わせて使用することができる。
【０１０４】
Ｖ．方法
本発明は、本発明のペプチド−ポリマーコンジュゲートを使用して関節結合部における疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、関節結合部における疾患又は障害を治療する方法であって、関節結合部に、約０．１ＭＤａ〜約３ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと、複数のペプチドとを含む、有効量のコンジュゲートを注射することを含む方法を提供し、ペプチドは、約５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。いくつかの実施形態では、本発明は、関節結合部における疾患又は障害を治療する方法であって、関節結合部に、約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと、複数のペプチドとを含む有効量のコンジュゲートを注射することを含む方法を提供し、ペプチドは約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有し；各ペプチドはポリマーと共有結合し、ポリマーの分子量はペプチドあたり約５ｋDａ〜約５０ｋＤａであり、コンジュゲートにおけるペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも約５：１である。
【０１０５】
本発明はまた、本発明のコンジュゲートを使用した関節組織の疾患及び障害を治療する方法も提供する。関節組織の疾患及び障害の例としては、限定されるものではないが、関節リウマチ、摩耗関連変形性関節症、加齢関連変形性関節症、外傷後変形性関節症、乾癬性関節炎、及び無腐性のインプラントの緩み、関節滲出液、強直性脊椎炎、滑液包炎、痛風、反応性関節炎、滑膜炎、及び虚血壊死が挙げられる。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、関節リウマチ、摩耗関連変形性関節症、加齢関連変形性関節症、外傷後変形性関節症、乾癬性関節炎、及び無腐性のインプラントの緩み、関節滲出液、強直性脊椎炎、滑液包炎、痛風、反応性関節炎、滑膜炎、又は虚血壊死である。
【０１０６】
免疫細胞機能を軽減する薬物は、多くの関節障害の治療に実質的な有用性を有するので、多くのポリペプチドが使用される。関節組織は、損傷及び疾患に特にかかりやすい。なぜなら、これらの取り組み、すなわち炎症性メディエータの上方調節に対する典型的な細胞応答はまた、関節軟骨の異化及び下層の骨組織の再吸収を促進するシグナルでもあるからである。関節表面の変性は、関節組織への損傷の悪化及び炎症性メディエータのさらなる上方調節を促進する。経時的に、これらのメカニズムは、フィードフォワードループを生じさせ、これは関節組織に対して累積損傷をもたらす。
【０１０７】
ヒト又は動物の身体のいかなる関節も、本発明の方法及びコンジュゲートで治療することができる。代表的な関節としては、限定されるものではないが、繊維性関節、軟骨性関節、滑膜関節、面関節、不動結合関節、半関節、及び可動関節が挙げられる。関節は、二つの関節表面を有する単関節、三つ以上の関節表面を有する複合関節、又は二つ以上の関節表面及び関節膝若しくは半月板を有する複関節であり得る。本発明のコンジュゲート及び方法を用いて治療され得る解剖学的関節としては、限定されるものではないが、指を含む手関節、肘関節、手首関節、肩関節、胸骨及び鎖骨の関節、脊椎関節、顎及び頭蓋骨関節、骨盤及び股関節、膝関節、足首関節、及び足指を含む足関節が挙げられる。関節はまた、平面関節、球関節、蝶番関節、車軸関節、顆状関節及び鞍関節として分類することもできる。本発明のコンジュゲート及び方法は、限定されるものではないが、結合組織、軟骨、関節表面、滑液腔、半月板などを含む関節の組織を治療するために使用することができる。
【０１０８】
免疫細胞機能を減弱するように設計された薬物の例としては、腫瘍壊死因子α及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、又はインターフェロンγを妨害し得る抗体が挙げられる。他の例としては、Ｔ細胞及びＢ細胞機能の選択的抗体阻害物質が挙げられる。これらの抗体は、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体フラグメント、単鎖ｓｃＦｖ抗体、シングルドメイン重鎖ＶＨＨ抗体、又は改変抗体様スカフォールド、例えば、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤａＲＰｉｎ、及び改変Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤であり得る。他の例には、例えば腫瘍壊死因子α及びＩＬ−１β、ＩＬ−６、又はインターフェロンγなどの免役調節サイトカインの受容体デコイも含まれる。
【０１０９】
前述のものなど抗炎症薬物の使用の一般的な副作用の一つは、感染のリスクが高いことである。抗炎症薬物は身体の免疫応答を減弱するので、免疫系は細菌、ウイルス、及び寄生虫に対抗することができなくなる。したがって、これらの薬物の全身的使用の利点は、全身的免疫抑制に関連するリスクに対して慎重に比較検討する必要がある。全身が過免疫障害に冒されている疾患、例えば関節リウマチの場合、免疫減弱薬物の全身的使用は正当とみなすことができる。しかしながら、一つだけ又は限られた数の関節に影響を及ぼす状態に関しては、感染の全身的リスクのため、多くの場合、これらの薬物の全身的使用は正当とみなされない。
【０１１０】
代替法として、免疫調整薬の関節内（ＩＡ）投与が、変形性関節症に関連する炎症の長期効果を防止又は阻害するために提案されている。しかしながら、これらの薬物は、関節腔から迅速に排出され、ＩＡ投与後に適切な療法期間を提供しない。ＩＡ注射後、滑膜における抗炎症タンパク質の半減期は短い（＜１．５時間）。このことは、インフリキシマブ及びエタネルセプトをはじめとする炎症阻害物質を様々な関節障害についてヒトにＩＡ注射によって投与する臨床研究から明らかである。これらの研究の一部は、関節炎の著しい低減を報告しているが、功を奏するためには頻繁（例えば毎週）な投与が必要であるとしている。したがって、既存の薬物を使用するＩＡ抗炎症療法は、高いコストと、頻繁にＩＡ投与をするという不都合によって限定される。明らかに、この治療的アプローチで関節障害の治療を可能にするためには、滑液内での抗炎症薬物生物活性を拡大する方法が必要である。
【０１１１】
関節障害に関連する初発症状は、痛み、浸出、限定された可動域、及び関節構造の病理学的リモデリングである。関節障害を治療するための治療の有効性は、視覚的評価スコアなどの一般化評価によって測定される痛みの低減を含み得る。有効性はまた、特定の関節障害に対して特異的なシステムを使用する改善されたスコア、例えば、変形性関節症についてはＷＯＭＡＣスコア、関節リウマチについてはＡＣＲ２０、乾癬性関節炎については乾癬性関節炎クオリティ・オブ・ライフ、又は強直性脊椎炎についてはＳＡＳＳＳに基づいて決定することもできる。有効性はまた、機能的結果、例えば痛みのない歩行距離の増加又は関節可動域の増加を用いて測定することもできる。有効性はまた、正常な関節構造の修復を示す証拠となるＸ線像に基づいて測定することもできる。
【０１１２】
コンジュゲートは、上述の任意の好適な頻度又は量で投与することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ほぼ月に一度以下で関節結合部に注射される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、関節結合部に、ほぼ一カ月に一度から六カ月につき一度注射される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、関節結合部に、二カ月につき一度又は三カ月につき一度注射される。
【０１１３】
Ａ．変形性関節症
２０１５年に、推定７７５万人の米国人が公知関節損傷に関連し得る変形性関節症（ＯＡ）の症状を経験した。外傷後ＯＡ（ＰＴＯＡ）は全てのＯＡ例の少なくとも１５％を占めるが、多くの他のＯＡ診断はまた、事前の関節外傷に関連する可能性があると推測される。疾患修飾性療法がないために、関節置換手術は、多くの場合、伴う不快感を取り除き可動性を回復するための治療法の選択肢に過ぎない。しかしながら、ＰＴＯＡは、若年の患者で診断されることが多く、かかる患者への関節置換は実効可能な選択肢ではない。全体として、これらのＰＴＯＡ患者の治療コストは、毎年４０億ドルを越える。
【０１１４】
損傷に関連する炎症の短期阻害は、ＰＴＯＡの慢性症状を限定するであろう。脱臼、靱帯裂傷、半月板損傷、及び関節内骨折をはじめとする多くのタイプの関節損傷がＰＴＯＡと関連付けられている。初期損傷は急性でない場合もあるが、損傷は炎症性メディエータのカスケードを開始するのに充分である。結果としての慢性全関節炎は、経時的に蓄積しＰＴＯＡとして存在する、さらなる組織損傷をもたらす関節軟骨の異化を促進する。ＴＮＦα及びＩＬ−１βは、関節炎を媒介するのに周知の役割を果たす。これらのサイトカインは相互作用して軟骨破壊を促進し、この軟骨破壊は、軟骨マトリックス成分の発現の下方調節及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現の上方調節の両方によっておこる。ＴＮＦαはまた、破骨細胞動員を刺激し、炎症性環境において骨を形成する骨芽細胞のアポトーシスを誘導し、これは、関節軟骨組織の崩壊に寄与する。ＴＮＦα及びＩＬ−１βは、関節損傷に対する炎症応答を軽減するための強制的標的である。関節環境においてこれらの重要な急性炎症性サイトカインを阻害することが、ＰＴＯＡの進行を止めるための早期介入として提案されている。
【０１１５】
Ｂ．関節内微粒子に対する免疫応答による炎症
関節の関節表面間で生じる摩耗は、ミクロン規模の粒子を生じる可能性があり、これは関節炎及び骨溶解を推進する。摩耗粒子は、骨化軟骨損傷、骨増殖体（骨棘）、又は露出軟骨下骨損傷などの内因性表面間の摩滅のために生じる可能性がある。このタイプの摩耗粒子生成は、ＯＡの後期で頻繁に起こり、結果として重度の関節の痛み及び不動性が起こる。このさらなる炎症応答はＯＡにおける関節組織変性の速度を加速する。
【０１１６】
摩耗粒子はまた、人工関節の表面間でも形成され得る。２０１５年に、７００万人をこえる米国人が人工関節を移植して生活していた。これらの個人のうちほぼ２５０，０００人は、装置を取り巻く骨の骨溶解のために最終的に再置換術が必要になり、最終的に装置が緩み不具合となるであろう。
【０１１７】
摩耗関連炎症は、関節表面から流出した、その他の点では不活性な微粒子に対する異物反応に起因する。滑膜裏層内部のマクロファージは、摩耗微粒子を異物として容易に認識し、炎症誘発因子を放出し、これは他の活性な免疫細胞を滑膜へ動員し、破骨細胞増殖を刺激しつつ、同時に骨形成を抑制する。したがって、持続した炎症は、フィードフォワードサイクルを引き起こし、このサイクルでは、軟骨変性及び骨溶解は、関節表面間のより多くの摩滅と、より多くの動きと身体的ストレスとに至り、これによりさらに多くの粒子が生じる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ペプチドは免疫細胞機能の活性を調整する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１β、インターロイキン６、又はインターフェロンγを阻害する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、腫瘍壊死因子αを阻害する。
【０１１９】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）は、異物反応を制御するための強制的標的である。ＴＮＦαは関節炎の媒介において周知の役割を果たす。ＴＮＦαはまた、破骨細胞動員を刺激し、炎症性環境において骨を形成する骨芽細胞のアポトーシスを誘導し、軟骨下骨の骨溶解をもたらす。全身投与された受容体アンタゴニスト（エタネルセプト）を使用したＴＮＦαの阻害は、マウスにおいて摩耗粒子によって誘発される骨吸収を低減することが示されているが、全身性抗ＴＮＦαに関連するリスクは、概して局所状態にとって許容されないとみなされる。代替法として、ＩＡ抗ＴＮＦα療法が、関節内摩耗粒子に対する溶骨性応答を防止又は阻害するために提案されている。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、モノクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体フラグメント、単鎖可変領域抗体、シングルドメイン重鎖抗体、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤、又は受容体デコイである。
【０１２１】
本発明の方法は、約０．１ＭＤａ〜約２ＭＤａの分子量を有する生体適合性ポリマーと、それぞれ約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する複数のペプチドとを含むペプチド−ポリマーコンジュゲートを含み、各ペプチドはポリマーと共有結合し、各ペプチドについて約５０ｋＤａのポリマーから約５ｋＤａのポリマーがあり、ペプチドのポリマーに対するモル比は少なくとも５：１である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号３〜配列番号５に係るＣＤＲを有するペプチドを含む：
DHSGYTYTIG（配列番号３）、
ARIYWSSGNTYYADSVKG（配列番号４）、及び
RDGIPT（配列番号５）。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号１に係るアミノ酸配列を有するペプチドを含む：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYADSVKGRFAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSS（配列番号１）。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号２に係るアミノ酸配列を有するペプチドを含む：
SNAQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYADSVKGRFAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSSPSTPPTPSPSTPPGGC（配列番号２）。
【０１２５】
本発明のコンジュゲートは、関節付近に発生する炎症を改善して、それに続く軟骨変性及び骨溶解を阻害するために適切な位置にある。これらのコンジュゲートは、関節内に保持される滑液の巨大分子とマッチする生物物理学的特質を示すように設計されている。加えて、複数コピー又は生物活性ポリペプチドのコンジュゲート化は、それらの標的との多価相互作用に関与することによってそれらの効力を増大させるために充分である。したがって、本発明は、様々な疾患の治療のために連接する関節に対して局所的に長時間作用型薬物を投与する方法を可能にするために適している。
【０１２６】
バイオコンジュゲート薬物が標的とする市場の一例は、関節損傷後に慢性炎症及び浸出を経験し、したがってＰＴＯＡを発症するリスクのある患者の約２５％の患者である。これらの患者の選択肢は、現在は全身性鎮痛及び局所コルチコステロイド治療に限定されている。長期化した炎症期を解消できないと、関節軟骨の異化に至る可能性があり、結果としてさらなる損傷が起こり、これは時間と共に蓄積する。抗炎症バイオコンジュゲートに基づき、三カ月おき（またはさらに低頻度）の投与用に設計された治療は、長期関節炎の影響を軽減することができ、それによって、痛みを低減し、高額な手術の必要性を遅らせるかまたは抑える。これらの利点は、感染のリスク、患者にとっての不都合、及び処置コストを含み得る、（一年につき四回もの）反復ＩＡ注射の不利な点を上回る可能性が高い。
【０１２７】
バイオコンジュゲート薬物が標的とする市場の別の例は、石灰化軟骨損傷、骨棘、又は軟骨下骨損傷の発症に起因する慢性炎症及び痛みを経験している患者である。外科的修復は痛みの緊急の原因を排除し得るが、既存の炎症、手術による炎症、及びさらなる摩耗粒子に対する炎症は、関節損傷及び変性を加速するであろう。これらの患者の長期選択肢は、現在、全身性鎮痛及び局所コルチコステロイド治療に限定されている。長期化した炎症期を解消できないと、関節表面の不具合に至る可能性があり、このため、患者を身体活動に復帰させるためには関節置換手術が必要となる。抗炎症バイオコンジュゲートに基づき、三カ月おき（またはさらに低頻度）の投与用に設計された治療は、長期関節炎の影響を軽減することができ、それによって、痛みを低減し、高額な手術の必要性を遅らせるかまたは抑える。これらの利点は、感染のリスク、患者にとっての不都合、及び処置コストを含み得る、（一年につき四回もの）反復ＩＡ注射の不利な点を上回る可能性が高い。
【０１２８】
バイオコンジュゲート薬物が標的とする市場の別の例は、関節置換後に痛み及び浸出を経験しているが、これらの症状の主原因であるインプラント周囲の感染の証拠を示さない、人工関節を有する患者の約２５％である。これらの患者の選択肢は、現在、その後の骨溶解が装置故障をもたらすまで、鎮痛及び臨床的モニタリングに限られている。三カ月ごとの投与又はより低頻度の投与用に設計された抗炎症バイオコンジュゲートに基づく治療は、摩耗粒子に対する応答を軽減することができ、それによって、痛みを低減し、高額な再置換術の必要性を遅らせるか又は抑える。これらの利点は、感染のリスク、患者にとっての不都合、及び処置コストを含み得る、慢性的ＩＡ注射（一年につき四回もの）の不利な点を上回る可能性が高い。
【０１２９】
多価抗体コンジュゲートは、関節損傷又は摩耗粒子への曝露に起因して起こる炎症を改善し、その後の異化組織損傷を抑制するために適切な位置にある。高効力を示すことに加えて、コンジュゲートは特異的巨大分子特性を有するように操作することができ、関節内に保持される。抗炎症ペプチドを、滑膜で保持されるのに充分大きなＨｙＡにコンジュゲート化することによって、コンジュゲート化抗体の生物活性半減期を、同等な非コンジュゲート抗体と比較して有意に延長することができる。
【０１３０】
ＶＩ．実施例
実施例１  コンジュゲートの調製
一般法。抗炎症バイオコンジュゲートを以前に記載された方法に従って調製した（ＰＭＩＤ：２８６７９０３７）。ここでは製造業者によって特定されるそれらの重量平均ＭＷに基づいて言及される、１５０ｋＤａ〜２．０ＭＤａのＭＷの範囲にわたるポリマーを得た。ｐＨを５．５〜８．５の範囲に維持するために適切な０．１〜１Ｍの緩衝液、例えばＭＥＳ、リン酸塩緩衝液、Ｈｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ、グルクロン酸、シトレート、アセテートＨＥＰＥＳを含む水溶液を使用した溶液にポリマーを入れた。
【０１３１】
一つ以上の以下の賦形剤を溶液に添加して、ポリマーを溶液に溶かした：５０〜５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０００１〜０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．０００１〜０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０、１〜１０％スクロース、１〜１０％マンノース（ｍａｎｏｓｅ）、１〜１０％トレハロース、１〜１０％、１〜１０％マンニトール、１〜１０％ソルビトール、１〜１０％グリセロールなど。一つ以上の以下のかき混ぜ法を使用して、それらを溶液中に溶かした：ロッキング、オービタルシェーキング、回転、又は撹拌（例えば、撹拌子又はバーティカルスターラーを使用）。
【０１３２】
ポリマー上のカルボン酸側基のカルボジイミド置換を開始して、抗炎症ペプチドのコンジュゲーションハンドルを生成させた。各々３ｍｇのポリマーについて、以下のものを溶液に添加した：１〜１０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）以下のもののうちの一つ：０．２５〜２．５ｍｇ／ｍＬのＮ−ε−マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、０．２５〜２．５ｍｇ／ｍＬのＢＭＰＨ、０．２５〜２．５ｍｇ／ｍＬのヒドラジド−ＰＥＧ２−マレイミド、又は０．２５〜２．５ｍｇ／ｍＬのアミン−ＰＥＧ２−マレイミド。以下のもののうちの一つを添加して、カルボジイミド反応を促進した：０．１〜３ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ、０．１〜３ｍｇ／ｍＬのオキシマ、又は０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬのＨＯＢｔ。溶液を２時間、４℃又は周囲温度のいずれかで反応させた。未反応コンジュゲーション反応物を５０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用い、列挙された緩衝溶液のうちの一つに対して透析した。透析緩衝液を４時間後に二回、次いで２４時間後に一回かえた。この反応の生成物は、マレイミド反応性基を利用可能なカルボン酸反応性基の０．５〜５％で付加させたポリマーであった。
【０１３３】
マレイミド活性化ポリマーを次に抗炎症ペプチドと反応させた。炎症を抑制するために許容される標的及びペプチド部分は明細書中の他の箇所に記載されている）。Ｃ末端又はＮ末端のいずれかでコンジュゲーションに利用可能なシステインを含むようにペプチドを操作した。柔軟性、半柔軟性、硬性ペプチドリンカーが抗炎症ペプチド配列の一部として含まれていてもよい。さらなるペプチド、例えば、ＨＩＳ６、ＦＬＡＧ又はストレプトアビジンも、ペプチド精製を容易にするために抗炎症ペプチド配列に添加してもよく、これらはコンジュゲーション前に切断しても、切断しなくてもよい。ペプチドは、適切な組換え発現系、例えば、大腸菌、酵母、ＣＨＯ細胞、タバコの葉などを使用して生成させた。
【０１３４】
様々な価数にわたってペプチドがコンジュゲート化した抗炎症バイオコンジュゲートを得るために、固定濃度のペプチドをポリマーとともに様々な規定供給比にてＰＢＳ中で組み合わせ、４℃又は周囲温度のいずれかで４時間反応させた。コンジュゲーション反応の間に、一つ以上の以下のものを添加して、反応効率を改善した：ペプチド間のジスルフィド架橋を最小化するための０．５〜５ｍＭのＴＣＥＰ及び／又は遊離チオール酸化を最小化するための０．５〜５ｍＭのＥＤＴＡ。未反応ペプチドをペプチド−ポリマーコンジュゲートから以下の方法の一つ以上によって除去した：上記の緩衝液の一つに対して５０〜１００ｋＤａのＭＷＣＯを用いて４℃にて４時間二回、２４時間一回透析すること、上記の緩衝液の一つに対する接線流ろ過、サイズ排除カラムを用いたＦＰＬＣポリシング、コンジュゲートのポリマー成分に結合するように設計されたアフィニティクロマトグラフィカラムでのＦＰＬＣポリシング、又はコンジュゲートのエタノール沈殿。
【０１３５】
表１に記載した全ての例示的コンジュゲートの調製物は、以下の方法を使用して合成した（図１）。まず、各バイオポリマーの４ｍｇ／ｍＬ溶液をＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．７）中で調製し、溶液を周囲温度での回転（約５ＲＰＭ）によって２４時間撹拌して、確実にポリマーを完全に溶液中に溶かした。それぞれ４ｍｇのポリマーに対して、以下のものを溶液に添加した：８．８ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、０．８ｍｇ／ｍＬのＮ−ε−マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、及び０．０４ｍｇ／ｍＬのＨＯＢｔ。溶液を、周囲温度での回転（約５ＲＰＭ）によって撹拌しながら、２時間反応させた。未反応コンジュゲーション試薬は、５０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して順に以下の緩衝溶液の各々に対して透析することによって除去した：まず、５０ｍＭのグリシンを添加したリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ６．５）で４時間、二番目に、リン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ６．５）で一晩、そして三番目に１０％グリセロールを添加したリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ６．５）で４時間。ＥＭＣＨ活性化ポリマーの各溶液に、ペプチドを６０：１のペプチド：ポリマーモル供給比で添加し、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０１％の最終濃度まで添加した。溶液を、周囲温度での回転（約５ＲＰＭ）によって撹拌しながら、２時間反応させた。未反応ペプチドは、順に以下の緩衝溶液の各々に対して透析することによって除去した：まず、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７）で４時間、二番目に、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７）で一晩、そして０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７）で４時間。
【０１３６】
実施例２  コンジュゲートのキャラクタリゼーション
様々な方法を使用して、炎症性関節疾患又は障害に罹っている個人の開示された治療方法に適した組成物を評価した。コンジュゲーション反応におけるペプチド内容物の濃度は、タンパク質濃度についての標準的方法、例えば、ＢＣＡ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、及び／又はＡ２８０でのＵＶ吸収を使用して測定した。コンジュゲーション反応におけるポリマー内容物の濃度は、Ａ２０４でのＵＶ吸収を用いて測定した。ポリマー内容物の濃度はまた、硫酸で消化し、続いてフェノールとともにインキュベーションすることによって測定して、比色分析によって分析することができ、また標準曲線に対して比較することができる生成物を誘導することもできる。ペプチド及びポリマーの濃度はまた、酵素又は酸消化のいずれかによってポリマー成分の完全解重合後の質量分析によって分析することもできる。濃度測定から決定される、ポリマーのペプチドに対するモル比を使用して、各コンジュゲートの価数を推定した。
【０１３７】
ペプチドとポリマーとの間の共有化学的コンジュゲーションは、還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に反応生成物をかけることによって確認した。これらの方法は、コンジュゲーション反応の生成物が、不安定な的外れの反応部位でポリマーと反応した任意の非コンジュゲート化ペプチド又はペプチドを含むか否かを判定するために充分である。ゲルは、クーマシーブルー染色剤又はより高分解能のＳＹＰＲＯルビー染色剤を用いて染色することができる。コンジュゲート化タンパク質は、ローディングウェルの上部付近にとどまる一方で、非コンジュゲート又は不安定結合ペプチドは、それらの分子量に基づいて予想されるようにゲルを通して移動する。この方法により、コンジュゲーション反応生成物において検出されたペプチドの総濃度の約０．１％まで非コンジュゲート化ペプチドを概算することが可能である。別法として、ＨＰＬＣを用いてコンジュゲーション反応生成物をサイズ排除カラム（ＳＥＣ）に通してコンジュゲート化ペプチドを非コンジュゲート化ペプチドから分離し定量化することが可能であった。この方法はまた、ペプチド−ポリマーコンジュゲートのサイズを概算見積もりする。
【０１３８】
光散乱法を使用して、ペプチド−ポリマーコンジュゲートのサイズを算出した。例えば、静的多角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）法を、コンジュゲーション産物に対してＳＥＣによる分離後に使用して、ペプチド−ポリマーコンジュゲートの数及び重量平均分子量を決定した。さらにまたインラインＵＶ検出器及び示唆屈折率計を使用してサイズ分離コンジュゲートの吸収性屈折度を測定することにより、コンジュゲートの割合は、ペプチド又はポリマー成分のいずれかから構成されているものと推定された。したがって、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析により、ペプチド価（すなわち、ポリマーあたりのペプチドの割合）の独立した評価並びにコンジュゲート化ポリマーの最終数平均及び重量平均分子量の推定値を提供することができる。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析は、平均回転半径（Ｒｇ）及びコンジュゲートのＲｇ分布ももたらすであろう。動的光散乱を使用して、コンジュゲートの平均流体力学半径（Ｒｈ）及びＲｈの分布を推定した。
【表１】
2021517169.tif 000005
【０１３９】
各サンプル中のペプチドがバイオポリマー骨格に対して共有結合的にコンジュゲート化していたことを検証するために、コンジュゲーション反応生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Mini Protean System, BioRad）で、２．５％のβメルカプトエタノールの添加により還元条件下で実施した１２％アクリルアミドゲルを使用して分析した。これらの条件は、非共有結合によるペプチド相互作用を分離することができる。ペプチドは、SYPROルビー（BioRad）を使用してゲル中で可視化した。非コンジュゲート化ペプチドは、ペプチド参考ラダーに基づいて予想されるようにゲルを通って移動し、その一方で、各バイオコンジュゲートの主要タンパク質バンドは大きすぎるので、分離ゲルに侵入できなかった。ごく微量の非コンジュゲート化ペプチド（サンプルあたり全ペプチドの２％未満）がバイオコンジュゲートレーン中にバンドとして出現した。したがって、ペプチドは試験した各バイオコンジュゲートのバイオポリマー骨格に対して共有結合的にコンジュゲート化されていた。
【０１４０】
ペプチド分子量（図３Ａ）、ＨｙＡ  ＭＷ（図３Ｂ）、サイズ排除クロマトグラム（図３Ｃ）、及び回転半径（Ｒg,z）は、サイズ排除クロマトグラフィ多核度光散乱（SEC-MALS; Bioconjug Chem. 2012;23(9):1794）の確立された方法を用いて測定した。分岐分析法も使用し、これで線状バイオポリマーからのタンパク質分岐を推測して、一連のＨｙＡ  ＭＷにわたってタンパク質価数の分布をより正確に算出した（Biomacromolecules. 2016;17(10):3162）。事前の実験に基づいて、経験的データを使用して、標的コンジュゲート化数を達成するために必要な供給比を予測することができる。
【０１４１】
実施例３  抗炎症ＭＶＰの生物活性
一つ以上の以下の方法を使用して、タンパク質−ポリマーコンジュゲートの生物活性を測定した。一例として、BLI; ForteBio Octet Red）を使用して、各ペプチド及びペプチド−ポリマーコンジュゲートのそれらの標的に対する結合アフィニティを測定した。このアッセイのために、ペプチド標的をガラスＢＬＩプローブ上に吸着させる。ビオチンとコンジュゲート化又はビオチンを含有する融合ペプチドとして発現された最も一般的な標的を使用して、それらを、共有結合したストレプトアビジン表面層で前処理されたＢＬＩプローブに吸着させる。標的で吸着されたプローブを次に既知濃度のペプチド又はペプチド−ポリマーコンジュゲートのいずれかの溶液中に入れる。レーザー光を次にＢＬＩプローブの長さを下降させ、プローブ先端でその標的と結合するペプチド又はコンジュゲートによって生じるレーザー光干渉を、結合したペプチド又はコンジュゲートの質量と直接関連づけることができる。長時間にわたる干渉データを使用して、ｋ−オン結合キネティクスを算出することができる。次にペプチド又はコンジュゲートのいずれも含まない溶液中にプローブを入れることによって、レーザー光干渉は逆転し、そのキネティクスを使用して、ｋ−オフを決定することができる。したがって、このＢＬＩ法は、各ペプチド及びコンジュゲートのその標的に対する結合アフィニティ（ｋＤ）を測定することができる。
【０１４２】
抗炎症抗体の多価形態は、効力を増強するために十分である。一例として、抗ＴＮＦαタンパク質は、ヒトＴＮＦαに対して反応性であるシングルドメイン（ＶＨＨ）ラクダ科抗体の公開された配列を使用して生成させた（ＩＣ５０＝２０ｎＭ、これは既存のＴＮＦ阻害物質に匹敵する（例えば、インフリキシマブ：ＩＣ５０＝１２ｎＭ；Ann Rheum Dis. 2010;69(2):443）。これらの抗体をＨｙＡにコンジュゲート化させて、異なるＭＷ  ＨｙＡ骨格上にｍｖＡｎｔｉＴＮＦ（２１５及び８６０ｋＤａ）を生成させ、次いで固定濃度のＴＮＦαをプローブに吸着させ、一連の抗体／コンジュゲート濃度にわたって抗ＴＮＦα抗体又はｍｖＡｎｔｉＴＮＦの結合アフィニティを測定することによって、バイオレイヤー干渉分光法（BLI; ForteBio Octet Red）を使用して生物活性を評価した（図４Ａ）。いずれかのＭＷ  ＨｙＡ骨格を有する抗ＴＮＦαの多価コンジュゲーション後、ｍｖＡｎｔｉＴＮＦコンジュゲートは、非コンジュゲート化抗体と比較して、結合ＴＮＦαに対してより高い効力を示した。さらなる生物活性データを表２で提示する。
【表２】
2021517169.tif 000006
【０１４３】
別法として、競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、各ペプチド及びペプチド−ポリマーコンジュゲートのその標的に対する結合アフィニティを検証した（図４Ｂ）。このアッセイのために、ペプチド標的を検出下限まで検出するように設計されたサンドイッチＥＬＩＳＡシステムを使用した。アッセイを開始する前に、一連の濃度（例えば、５０〜０．００５ｎｇ／ｍＬ）にわたる各ペプチド又はコンジュゲートを固定濃度（例えば、０．５ｎｇ／ｍＬ）の標的ペプチドと、非コンジュゲート化ペプチド又はコンジュゲートのいずれかと共に一連の総ペプチド濃度にわたってインキュベートする。抗炎症ペプチド又はコンジュゲートに結合された標的ペプチドは、ＥＬＩＳＡによって検出されるＥＬＩＳＡ抗体によって挟むことができず、したがって、このアッセイは、ペプチド及びコンジュゲート生物活性の独立検証、並びにペプチド及びコンジュゲートの相対的結合活性を比較する手段を提供する。
【０１４４】
最終的に、抗炎症ペプチド及びペプチド−ポリマーコンジュゲートの生物活性は、細胞ベースの薬理学アッセイを使用して定量化した。例えば、Ｌ９２９線維芽細胞の使用に基づく細胞生存アッセイを使用して、ＴＮＦαのシグナリング活性をブロックすることによって作用する抗炎症ペプチドの生物活性を試験することができる（図４Ｃ）。このアッセイについて、細胞を、固定濃度（５０ｎｇ／ｍＬ）のＴＮＦα及び一連のペプチド濃度（例えば、５００〜０．０５ｎｇ／ｍＬ）にわたってＴＮＦαペプチド阻害物質又はＴＮＦαペプチド−ポリマーコンジュゲート阻害物質で処理し、次いで細胞生存について２４〜７２時間後に評価した。細胞生存について検出する方法は、細胞アポトーシスについての標準的アッセイ、例えば、ＴＵＮＥＬ、アクチノマイシンＤ、カスパーゼ検出などを含み得る。細胞生存はまた、様々な濃度のＴＮＦα阻害物質に曝露された細胞集団から得られる相対的成長速度を比較することによって検出することができる。各治療のＩＣ５０は、このデータを４パラメータ論理学的適合に適合させることによって算出することができる（図４Ｄ）。
【０１４５】
第二の例として、Ｄ１０リンパ球の使用に基づく細胞増殖アッセイを使用して、ＩＬ−１βのシグナリング活性をブロックすることによって作用する抗炎症ペプチドの生物活性を試験することができる。このアッセイのために、細胞を、固定濃度（１ｎｇ／ｍＬ）のＩＬ−１β及び一連のペプチド濃度（例えば、１００〜０．０１ｎｇ／ｍＬ）にわたるＩＬ−１βペプチド阻害物質又はＩＬ−１βペプチド−ポリマーコンジュゲート阻害物質で処理し、次いで細胞増殖について２４〜７２時間後に評価した（図２Ｂ）。細胞生存について検出する方法は、細胞定量化についての標準的アッセイ、細胞定量化、例えば、ＣｙＱｕａｎｔ、細胞計数、又はフローサイトメトリーの標準的アッセイを含む。
【０１４６】
実施例４  有窓膜を越える抗炎症ＭＶＰの拡散
多価コンジュゲートはより低速の有窓膜を越える拡散速度を示す。滑液は、グリコサミノグリカン分子の膜により関節腔内に保持される高分子量巨大分子を含む。この膜は、小分子及びタンパク質の関節腔からの脱出を可能にする有窓を含むが、巨大分子を保持する。
【０１４７】
ペプチド−ポリマーコンジュゲートが有窓膜を通過する速度は、ベンチトップアッセイを使用して測定した。これらの実験において、溶液約１ｍＬで、約１０〜１００ｎｍの範囲の平均直径の有窓を有する膜から構築された円筒形チャンバーを入手した。チャンバーを、既知濃度の抗炎症ペプチド又はタンパク質−ポリマーのいずれかを含む溶液で満たし、少なくとも２００ｍＬの検証溶液の容器に膜を入れた。これらの容器を撹拌子で撹拌し、膜を越えるペプチド又はコンジュゲートの輸送を促進する。２４時間ごとに、７日まで、サンプルを容器の内部の溶液から採取し、ペプチド濃度を、タンパク質定量化の典型的な方法、例えば、ＢＣＡ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、又はＡ２６０でのＵＶ吸収を用いて測定した。チャンバー内部のペプチドの質量は、単相指数関数的減衰と一致する割合で降下した。したがって、ペプチド濃度を使用して、チャンバー内の各ペプチド又はコンジュゲートの半減期を推定した。
【０１４８】
多価抗ＴＮＦａＶＨＨバイオコンジュゲート（４０ＶＨＨ：１８６０ｋＤａ  ＨｙＡ）又は非コンジュゲート抗ＴＮＦａ  ＶＨＨのいずれかの溶液を上述の膜から構成されたチャンバーに入れ、長時間にわたり、このバリヤを越えて拡散したＶＨＨコンジュゲート及び非コンジュゲートＶＨＨの濃度を測定した（図５Ａ）。多価コンジュゲートは非コンジュゲートタンパク質と比較して実質的により低速で膜を越えて拡散した。さらに、コンジュゲート拡散の速度は孔サイズに依存していた（図５Ｂ）。
【０１４９】
実施例５  抗炎症バイオコンジュゲートの薬物動態
周知のラットモデルを、関節からのタンパク質のクリアランス率を評価するために使用して、ｍｖＡｎｔｉＴＮＦのＩＡ半減期を測定した（Arthritis Rheum. 1999;42(10):2094）。このアッセイのために、ラットを麻酔し、それらの後肢の膝を滅菌注射のために準備した。３０Ｇ針を使用して、各膝関節の滑膜を通して注射し、滑液に４０μＬの滅菌緩衝液を注射した。各々の右膝で、注射はまた、抗炎症ペプチド、又は抗炎症ペプチドのいずれかを総ペプチドの等濃度で含んでいた。概して、この実験に使用したペプチドを、近赤外線フルオロフォア（例えば、Alexa Fluor 750）で、所定のペプチドタグ付け法を用いてタグ付けした。注射後１０日までの様々な時点で、ラットを、インビボイメージングシステム（例えば、Perkin Elmer IVIS Spectrum）を使用して撮像して、膝での蛍光シグナル（例えば、平均放射効率）の強度を測定した。各々の左膝を対側イメージング対照として使用した。近赤外線レポータは、関節中のタンパク質のピコグラム量までの検出を可能にするインビボイメージングシステムを使用して高感度でラット膝において検出することができる。各治療の半減期をＩＡ注射後に、光学インビボイメージングの確立された指数関数的減衰計算を使用して決定した（Pharmaceutical research. 2013;30(1):257）。したがって、ペプチド濃度を使用して、投与後の関節内の各ペプチド又はコンジュゲートの関節内半減期を推定した。滑液を、質量分析によるプロテオーム解析の実験の最後に集めて、膝関節におけるペプチドの最終濃度を測定することができる。投与前に、ペプチドを、Alexa Fluor 750近赤外線プローブ（ThermoFisher）で、製造業者のプロトコルに従ってタグ付けした。簡単に言うと、ペプチドを、スルホ−Ｃｙ７−ＮＨＳエステルと２：１のプローブ：ペプチド比で混合した。プローブをペプチドと１時間、室温にて反応させ、次いで１部の１．５ＭのＴｒｉｓを各々１０部の反応溶液に添加することによってクエンチした。ペプチドを、ＮＡＰ−１０脱塩カラムを使用し、ＰＢＳ、ｐＨ７．０で溶出して、精製した。
【０１５０】
全群に、ＩＡ注射プロトコル（４０μＬの２５０μｇ／ｍＬ溶液：合計１０μｇ）に従って各々の右膝に同じ用量の総抗ＴＮＦα抗体を投与した。このＩＡ抗ＴＮＦα抗体濃度（約８０μｇ／ｍＬ又は４．５μＭ）は、臨床研究において関節炎の改善に認可外と評価された場合、抗ＴＮＦ剤、例えば、インフリキシマブ及びエタネルセプトの初期ＩＡ濃度と匹敵する（典型的には１．５〜１７．５μＭ）。
【０１５１】
一セットの実験（図６Ａ）において、抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体の関節内半減期（ｎ＝４）を、３５０ｋＤａ（ｎ＝３）、７５０ｋＤａ（ｎ＝３）、８５０ｋＤａ（ｎ＝３）、及び２０００ｋＤａ（ｎ＝４）のＭＷを有するＨｙＡにコンジュゲート化した抗ＴＮＦαＶＨＨから作製した抗炎症バイオコンジュゲートの半減期と比較した。８５０ｋＤａ及び２０００ｋＤａ  ＨｙＡを使用して作製したバイオコンジュゲートの半減期を、非コンジュゲートＶＨＨよりも有意に長かった。独立した実験（図６Ｂ）において、抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体の関節内半減期（ｎ＝４）を、７００ｋＤａ  ＣＭＣとコンジュゲート化した抗ＴＮＦαＶＨＨから作製した抗炎症バイオコンジュゲートの半減期と比較した（ｎ＝３）。このバイオコンジュゲートの半減期は、非コンジュゲートＶＨＨの半減期とは大きく異ならなかった。別の独立した実験において、抗ＴＮＦαＶＨＨ抗体の関節内半減期（ｎ＝３）を、８５０ｋＤａのＨｙＡとコンジュゲート化した抗ＴＮＦαＶＨＨから作製した抗炎症バイオコンジュゲートの半減期と比較した（ｎ＝３）。このバイオコンジュゲートの半減期は、非コンジュゲートＶＨＨの半減期と大きく異ならなかった。
【０１５２】
実施例６  抗炎症ＭＶＰのプロトコルを施すための薬理学的モデル
有効治療用量を維持するために必要な抗炎症ペプチドの必要な再投薬頻度を予想するためのモデルを開発した。モデルは、異なる局所組織半減期の観点から一連の標的結合アフィニティにわたって必要な抗ＶＥＧＦ薬を予想するために本来開発されたモデルに基づく。このモデルにおいて立てられた重要な仮説は、単相指数関数的減衰後の標的組織から排出させるということであり、これは、関節内投与後の本発明の抗炎症ポリマー−ペプチドコンジュゲートについて証明されている（実施例３を参照）。再投薬頻度は、抗炎症ペプチドについて、臨床研究の結果（ＰＭＩＤ：２０６４２８４０、１７２１６０１５、１８４１５７７５）を用いて、ヒト関節において有効な応答を提供するように確立された（１〜２週ごとに注射）。
【０１５３】
関節内投与後のペプチド薬物の関節内半減期を見積もると、治療濃度は、治療濃度に対して予測することができる。同等用量（ｍｇ／関節）の抗炎症ペプチドの投与頻度を予測するために、モル濃度における差異は、臨床研究で使用した薬物に対するペプチドの所与のサイズ差異（例えば、ＶＨＨ抗体のモル投与量は、伝統的ＩｇＧ抗体薬物の同等質量の１２倍高い）の主因であるはずである。さらに、ペプチドが、モデルにおいて参照として使用した市販の抗炎症ＩｇＧに対して同等な結合アフィニティを有する場合、ペプチド−ポリマーコンジュゲートは市販のＩｇＧよりも１０倍有効である。モデルにおいて、これは、参照薬物についての投薬よりも１０倍高い出発モル濃度を有することと同等である。これらの要因をあわせると、ペプチド−ポリマーコンジュゲートに基づいて抗炎症薬物の再投薬を推定することが可能である。
【０１５４】
実施例７  臨床プロトコル
本開示の方法での治療に適した対象には、炎症性関節疾患又は障害、例えば、前記の関節疾患又は障害のいずれかに罹っていると診断された個人が含まれる。
【０１５５】
本開示の方法での治療に適した個人には、炎症性関節疾患又は障害のために、関節の痛みを有するか又は関節可動域が低減した個人が含まれる。本開示の方法での治療に適した個人には、炎症性関節疾患又は障害のために流出物のある個人が含まれる。本開示の方法での治療に適した個人には、炎症性関節疾患又は障害のために関節において関節表面損傷のある個人が含まれる。本開示の方法での治療に適した個人には、炎症性関節疾患又は障害のために関節において骨棘、石灰化軟骨、又は軟骨下骨損傷に対する関節摩耗がある個人が含まれる。
【０１５６】
本開示の方法での治療は、他の全身性若しくは関節内薬物によるか又は外科的介入による治療をはじめとする、炎症性関節疾患又は障害の症状を軽減する他の方法と組み合わせてもよい。
【０１５７】
本開示の方法での治療後の関節の痛みを測定するために適した方法は、以下の方法の一つ以上を使用する痛みスコアリングである：西オンタリオ及びマクマスター大学変形性関節症指数（ＷＯＭＡＣ）、患者全体的評価（ＰＴＧＡ）、臨床的関節者の全体的評価（ＣＯＧＡ）、又は視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）。本開示の方法での治療後の関節の痛みを軽減するための有効性を測定するために適した方法は、以下の方法の一つ以上を使用する痛みスコアリングである：救済の鎮痛薬を再使用するまでの時間及び５０フィートの歩行後のＶＡＳによる痛み評価。本開示の方法での治療後の関節の可動範囲を測定するために適した方法、痛みスコアリングは、以下の機器の一つ以上の使用を含む：ゴニオメータ又はイメージモーショントラッキング。本開示の方法での治療後の全体的な患者可動性及びクオリティ・オブ・ライフを測定するために適した方法は、以下の方法の一つ以上を使用する痛みスコアリングである：健康状態質問票（ＨＡＱ）又は簡易３６（ＳＦ−３６）質問票での評価。本開示の方法での治療後の関節損傷の領域に対する改善を測定するために適したＸ線像法は、以下の方法の一つ以上を用いる痛みスコアリングである：トータルシャープスコア（ＴＳＳ）、関節崩壊スコア、関節腔狭窄（ＪＳＮ）スコア、又は骨塩定量化。
【０１５８】
一つ以上のこれらの診断研究で異常を示す対象（例えば、健常な関節について正常とみなされる範囲から外れた対象）は、本開示に従って治療することができる。
【０１５９】
実施例８  バイオコンジュゲート有効性を評価するための非臨床プロトコル
変形性関節症により誘導された軟骨異化を防止するための本開示の方法に基づく治療の有効性は、以前に記載された非臨床アッセイを用いて評価することができる。この研究で、軟骨異化バイオマーカー、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）及びＩＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ−ＩＩ）の正確な長期的測定を可能にするためには、成体（＞５月齢）のラットが必要である。麻酔下で、ラットを、二つのローディングプラテンからなる脛骨圧縮システムにロードする：ボトムプラテンは曲がった膝を保持し、トッププラテンは足首を３０°曲げて足を保持する。軸力試験機（Bose ElectroForce 3200）は１ｍｍ／ｓの割合で単一の１２−Ｎ圧縮荷重を加える。このローディング法は、大腿遠位に対して脛骨の一時的前部亜脱臼によりマウスにおいて一貫性のある圧縮損傷を生じさせるために充分であった。25ラットを次に体重によりランダム化された山群に分割し、各群に以下の治療のうちの一つを施す：抗炎症バイオコンジュゲート、非コンジュゲート抗炎症ペプチド、又はビヒクル生理食塩水。
【０１６０】
損傷直後、及び４週、７週、及び１０週の初めに、抗ＴＮＦα治療及び対照を、右膝への４０μＬのＩＡ注射によって投与する。すべての治療群に同じ用量の総抗ＴＮＦα抗体（関節あたり合計１０μｇの総抗体について２５０μｇ／ｍＬ）を投与し、約８０μｇ／ｍＬ（約４．５μＭ）のＩＡ濃度となる。損傷の２４時間後、両膝にＩＡ注射することによってＭＭＰ活性（ＭＭＰＳｅｎｓｅ７５０；２ｎｍｏｌ／関節）についての蛍光レポータを注射し、ＭＭＰ生物活性を関節において、第２日、第４日、及び第７日に測定する。第１週、第２週、第３週、第６週、及び第９週の最後に、約３００μＬの血液を各ラットから集める。第１２週の最後（第８４日）にラットをすべて処分し、両方の後肢の大腿骨及び脛骨を集め、イメージング分析のためにホルマリン固定する。試料のイメージングは、Ｘ線写真（Faxitron）又はμＣＴスキャン（Inveon MM CT）によって実施することができる。試料を次に、所定の脱灰履歴並びにヘマトキサリン／エオシン及びサフラニンＯ／ファストグリーンでの染色のために準備し、関節における変形性関節症の程度を評価する。ＯＡのラットモデルに関するＯＡＲＳＩガイドラインに従って、組織形態計測スコアリングを実施する。
【０１６１】
関節炎を最小化する本開示の方法９に基づいた治療の有効性は、前述の非臨床前十字靱帯（ＡＣＬ）離断（ＡＣＬＴ）モデルアッセイを用いて評価することができる。簡単に説明すると、ラット（３００〜４００ｇ）の右膝に関して嚢切開を実施し、外科用メスでＡＣＬを横に切断し、その後、手術部位を閉じる。左膝に関してＡＣＬＴなしに偽手術を実施し、これを負の内部対照として使用する。ＡＣＬＴの２４時間後、ラットを三群に分割し、各群に以下の治療のうちの一つを施す：抗炎症バイオコンジュゲート、非コンジュゲート抗炎症ペプチド、又はビヒクル対照。第４週、第７週及び第１０週の最初に、追加用量の各治療／対照をＩＡ注射により両膝に投与する。ベースラインで、また第６週及び第９週の最後に、血液を炎症バイオマーカー分析のために集め、軟骨異化の代謝マーカーのために尿を集める。第１２週の最後に、最終尿サンプルをバイオマーカー分析のために終末血液収集の前に集める。両方の後肢の大腿骨及び脛骨を収集し、Ｘ線写真（Faxitron）、μＣＴスキャン（Inveon MM CT）、及びＭＲＩ（BioSpec 7T）によりイメージ化する。試料を次に、所定の脱灰履歴並びにヘマトキサリン／エオシン及びサフラニンＯ／ファストグリーンでの染色のために準備し、関節における変形性関節症の程度を評価する。ＯＡのラットモデルに関するＯＡＲＳＩガイドラインに従って、組織形態計測スコアリングを実施する。炎症性サイトカインのLuminex多重ＥＬＩＳＡアレイを使用して、血清バイオマーカー分析を実施する。このアレイは、関節炎を示すと考えられるもの：ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＴＮＦαをはじめとする、炎症に関連する２８の血液因子を検出する。血清軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）及びＩＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ−ＩＩ）は、軟骨異化を定量化するためのＥＬＩＳＡを使用して検出される。
【０１６２】
関節内摩耗粒子による関節炎及び骨溶解を防止するための本開示の方法に基づく治療の有効性は、以前に記載された非臨床アッセイ、商業的に純粋なチタン（Goodfellow USA）から作製された大腿骨ロッド（１５ｍｍ×１．５ｍｍ直径）を用いて評価することができ（ＰＭＩＤ：２２２７５１６３及び２４６０４７６）、二重酸エッチングによる移植のために準備する。ポリエチレン微粒子（１．７５μｍ中位径；Ceridust VP 3610）を準備し、ＬＰＳでドープし、以前に記載されている定量化によって検証する。9チタンロッドをラット（３００〜４００ｇ）の大腿遠位に移植する。移植手術の翌日、ＬＰＳドープされた微粒子を毎週４０μＬ関節内注射（１回の注射につき４．７５ｘ１０7粒子）する。ラットを次に三群に分割し、各群に以下の治療を施す：抗炎症バイオコンジュゲート、非コンジュゲート抗炎症ペプチド、又は対照としてビヒクル生理食塩水。第１週、第４週、第７週及び第１０週の初めに、治療及び対照を両膝へ４０μＬをＩＡ注射することによって投与する。ベースラインで、また第６週及び第９週で、血液を炎症バイオマーカー分析のために集める。第１２週の最後に、バイオマーカー分析用の終末血液収集のためにラットを処分し、Ｘ線像分析（Faxitron）のために両方の後肢の大腿骨及び脛骨を収集する。一方の後肢からの骨を固定し、多方の後肢骨をμＣＴスキャン及び機械的検査のために凍結する。μＣＴスキャン（Scanco model 50）を、骨インプラント密着を評価するために１．５μｍボクセルサイズ、及びインプラント周囲骨梁及び皮質骨を評価するために１０μｍのボクセルを使用して、インプラントの長軸に対して垂直な三つの位置で実施する。機械的引き抜き試験は他の箇所で詳細に記載するように実施する（Instron 8847 testing System）。静的組織形態計測的測定のために、固定試料の半分を、プラスチック包埋し、試料を研磨して鏡面仕上げにし、次いで塩基性フクシン及びトルイジンブルーで表面染色することによって、未脱灰履歴について処理する。試料の残りの半分を所定の脱灰履歴について処理して、骨インプラント界面での微粒子の存在及び分布（ヘマトキサリン（ｈｅｍａｔｏｘａｌｙｎ）及びエオシン並びに偏光顕微鏡法）又は酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色によりインプラント周囲領域中の破骨細胞数を検証する。血清バイオマーカー分析は、炎症性サイトカインについてLuminex多重ＥＬＩＳＡアレイを使用して実施する。このアレイは、慢性関節炎を示すと予想されるもの：ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＴＮＦαをはじめとする炎症に関連する２８の血液因子を検出する。5我々は、これらのサイトカインが如何にしてＬＰＳドープされた微粒子への関節内曝露後の血清において検出可能に上方調節されるかを示すパイロットデータを有する。
【０１６３】
前記発明を明確な理解のために説明及び実施例によりある程度詳細に記載してきたが、当業者は、ある特定の変化及び修飾を、添付の特許請求の範囲内で実施することができることを理解するであろう。加えて、本明細書中で提示する文献の各々は、参照により各文献が個々に組み込まれるのと同じ程度まで、その全体が参照により組み込まれる。本願と本明細書中で提示する文献との間に矛盾が存在する場合、本願が支配する。
配列
配列番号１（抗ＴＮＦａシングルドメイン重鎖（ＶＨＨ）抗体）
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKER
EFVARIYWSSGNTYYADSVKGRFAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYY
CAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSS 
配列番号２（抗ＴＮＦａシングルドメイン重鎖（ＶＨＨ）抗体）
SNAQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKER
EFVARIYWSSGNTYYADSVKGRFAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYY
CAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSSPSTPPTPSPSTPPGGC
配列番号３
DHSGYTYTIG,
配列番号４
ARIYWSSGNTYYADSVKG
配列番号５
RDGIPT
配列番号６（抗ＴＮＦａアフィボディ）
SNACGGGVDN KFNKEVGWAF GEIGALPNLN ALQFRAFIIS LWDDPSQSAN 50
LLAEAKKLND AQAPK                                       65
配列番号７（抗ＴＮＦａシングルドメイン重鎖（ＶＨＨ）抗体）
SNAQVQLQES GGGLVQPGGS LRLSCAASGR TFSDHSGYTY TIGWFRQAPG 50
KEREFVARIY WSSGNTYYAD SVKGRFAISR DIAKNTVDLT MNNLEPEDTA 100
VYYCAARDGI PTSRSVESYN YWGQGTQVTV SSSPSTPPTP SPSTPPGGCD 150
DDDKHHHHHH DYKDDDDK                                    168
配列番号８（抗ＴＮＦａ設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ））
SNADLGKKLL EVARAGQDDE VRILMANGAD VNAADHQSFT PLHLYAIFGH 50
LEIVEVLLKN GADVNASDWH GNTPLHLAAW IGHLEIVEVL LKYGADVNAT 100
DHSGSTPLHL AATLGHLEIV EVLLKYGADV NAQDKFGKTA FDISIDNGNE 150
DLAEILQKAA GGGSGGGSC                                   169
配列番号９  （抗ＩＬ−１Ｂ単鎖（ｓｃＦｖ）抗体）
SNAEIVMTQS PSTLSASVGD RVIITCQASQ SIDNWLSWYQ QKPGKAPKLL 50
IYRASTLASG VPSRFSGSGS GAEFTLTISS LQPDDFATYY CQNTGGGVSI 100
AFGQGTKLTV LGGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL 150
RLSCTASGFS LSSAAMAWVR QAPGKGLEWV GIIYDSASTY YASWAKGRFT 200
ISRDTSKNTV YLQMNSLRAE DTAVYYCARE RAIFSGDFVL WGQGTLVTVS 250
SSPSTPPTPS PSTPPGGC                                    268
配列番号１０（可溶性インターロイキン受容体２（ｓＩＬＲ２））
HTGAARSCRF RGRHYKREFR LEGEPVALRC PQVPYWLWAS VSPRINLTWH 50
KNDSARTVPG EEETRMWAQD GALWLLPALQ EDSGTYVCTT RNASYCDKMS 100
IELRVFENTD AFLPFISYPQ ILTLSTSGVL VCPDLSEFTR DKTDVKIQWY 150
KDSLLLDKDN EKFLSVRGTT HLLVHDVALE DAGYYRCVLT FAHEGQQYNI 200
TRSIELRIKK KKEETIPVII SPLKTISASL GSRLTIPCKV FLGTGTPLTT 250
MLWWTANDTH IESAYPGGRV TEGPRQEYSE NNENYIEVPL IFDPVTREDL 300
HMDFKCVVHN TLSFQTLRTT VKESPSTPPT PSPSTPPGGC            340
配列番号１１  抗（マウス）ＴＮＦａシングルドメイン重鎖（ＶＨＨ）抗体
SNAQVQLQDS GGGLVQAGGS LRLSCAASGG TFSSIIMAWF RQAPGKEREF 50
VGAVSWSGGT TVYADSVLGR FEISRDSARK SVYLQMNSLK PEDTAVYYCA 100
ARPYQKYNWA SASYNVWGQG TQVTVSSSPS TPPTPSPSTP PGGCDDDDKH 150
HHHHH                                                  155
【図１】
2021517169.tif 000007
【図２Ａ−Ｂ】
2021517169.tif 000008
【図２Ｃ−Ｄ】
2021517169.tif 000009
【図２Ｅ】
2021517169.tif 000010
【図３Ａ−Ｂ】
2021517169.tif 000011
【図３Ｃ−Ｄ】
2021517169.tif 000012
【図４Ａ−Ｂ】
2021517169.tif 000013
【図４Ｃ−Ｄ】
2021517169.tif 000014
【図５】
2021517169.tif 000015
【図６Ａ−Ｂ】
2021517169.tif 000016
【図６Ｃ】
2021517169.tif 000017
【図７】
2021517169.tif 000018
【配列表】
2021517169000001.app
【国際調査報告】
2021517169.tif 000019
2021517169.tif 000020