(57)【要約】  担体およびベチバーの根の抽出物、とりわけ消耗されたベチバーの根の抽出物を含む化粧品組成物が提供される。この組成物は、皮脂の生成の刺激、皮脂の抗微生物の刺激、脂質の生成、脂肪細胞の体積増加の活性化、皮膚の水和、皮膚の弾力性ブースター、皮膚の疲労の低減、唇周辺のしわの低減、皮膚を再度ふっくらさせる、およびフレグランスの持続性の増強を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体および少なくとも１種の有効な化粧品成分を含む化粧品組成物であって、ここで第１の有効な化粧品成分が、ベチバーの根の抽出物を含む、前記組成物。
【請求項２】
化粧品組成物が、スキンケア組成物である、請求項１に記載の化粧品組成物。
【請求項３】
第１の有効な化粧品成分が、ベチバーの根の水性抽出物である、請求項１または２に記載の化粧品組成物。
【請求項４】
第１の有効な化粧品成分が、消耗されたベチバーの根の抽出物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項５】
ベチバーの根を抽出することを含む、有効な化粧品成分を調製する方法。
【請求項６】
以下のステップを含む、請求項５に記載の方法：
（ｉ）消耗されたベチバーの根を提供する；および
（ｉｉ）消耗されたベチバーの根を抽出する。
【請求項７】
抽出が、水を使用して実施される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ベチバーの根からの抽出物の、とりわけ消耗されたベチバーの根からの水性抽出物および／または抽出物の、スキンケアにおける使用。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化粧品組成物をヒトの皮膚に適用することによって、皮脂生成を刺激する、皮脂抗微生物を刺激する、脂質生成を刺激する、脂肪細胞の体積増加を活性化させる、皮膚の水和を改善する、皮膚の弾力性を引き上げる、皮膚の疲労を低減する、唇周辺のしわを低減する、皮膚を再度ふっくらさせる、および／またはフレグランスの持続性を増強する方法。
【請求項１０】
以下からなる群から選択される化学物質。
【化１】
2021517568.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベチバーの根の抽出物を含む化粧品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベチバー（Vetiveria zizanioides、またChrysopogon zizanioides、Andropogon squarrosus、またはAndropogon muricatus）は、インド原産のイネ科ファミリーの多年生の矮生草である。
ベチバーは主に、典型的には水蒸気蒸留によって、その根から蒸留される芳香性のエッセンシャルオイルのために栽培される。世界的規模の生産は、１年あたり約２５０トンと推定される。その優れた定着特性に起因して、ベチバーは、香料において幅広く使用される。それは、西洋全域の香料の９０％において含有される。インドネシア、中国、ハイチは、主要な生産国である。
【０００３】
ベチバーのエッセンシャルオイルは、１００を超える同定された構成成分、例えば、安息香酸、フルフロール、ベチベン、ベチベニルベチベナート、テルピネン−４−オール、５−エピプレジザン、クシメン、α−ムウロレン、クシモン、カラコネン、β−フムレン、α−ロングピネン、γ−セリネン、δ−セリネン、δ−カジネン、バレンセン、カラレン、α−グルジュネン、α−アモルフェン、エピジザナール、３−エピジザノール、クシモール、イソ−クシモール、バレレノール、β−ベチボン、α−ベチボン、およびベチバズレンなどを含有する複合油である。
【０００４】
油は、黄褐色であり、および、やや粘度が高い。その匂いは、奥行きがある、甘い、ウッディ、スモーキー、土のような、アンバー、およびバルサムとして説明される。根は、掘り出され、洗浄され、および次いで乾燥される。蒸留の前に、根は、刻まれ、水中に浸される。蒸留プロセスは、２４時間まで取り得る。蒸留後、消耗された（exhausted）根は、大抵廃棄される。
【発明の概要】
【０００５】
消耗されたベチバーの根に価値を付与することが、本発明の目的である。
これは、本発明の化粧品組成物および方法によって達成される。
第１の側面において、本発明は、担体および少なくとも１種の有効な化粧品成分を含む化粧品組成物であって、ここで第１の有効な化粧品成分が、ベチバーの根の抽出物を含む、前記組成物を提供する。
【０００６】
蒸留によって得られるエッセンシャルオイルとは対照的に、ベチバーの根の抽出物は、ベチバーの根を溶媒を用いて抽出することによって得られる。
本発明のベチバーの根の抽出物は、完全に天然であり、および匂いがない。
驚くべきことに、本発明のベチバーの根の抽出物は、優れたスキンケア特性を保有し、および皮膚における脂質合成を再活性化させることができることが見出された。
とりわけ、アンドロゲン性および非アンドロゲン性脂腺細胞モデルの両方における皮脂分泌を刺激することができる（下記参照）。さらに、再構築されたヒト表皮上の脂質の新しい合成を増加させること、および皮膚の外植片のモデル上の表皮の構造を改善することが見出された。これらの所見は、プロテオーム研究によって裏付けられている（下記参照）。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、最適化された抽出プロセスのフローチャートを示す。
【図２】図２は、例４ａ）の結果を示す。
【図３】図３は、例４ｂ）の結果を示す。
【図４】図４は、例４ｂ）の結果を示す。
【図５】図５は、例５ｂ）の結果を示す。
【図６】図６は、例５ｖ）の結果を示す。
【図７】図７は、例６の結果を示す。
【図８】図８は、例８ａ）の結果を示す。
【図９】図９は、例８ａ）の結果を示す。
【図１０】図１０は、例８ｂ）の結果を示す。
【図１１】図１１は、例９ａ）の結果を示す。
【図１２】図１２は、例９ｂ）の結果を示す。
【図１３】図１３は、例１０ａ）の結果を示す。
【０００８】
したがって、具体的な態様において、本発明の化粧品組成物は、スキンケア組成物、とりわけアンチエイジング組成物である。この目標に向けて、担体は、皮膚科学的に許容し得る担体であるべきである。
具体的に好適な抽出物は、ベチバーの根の水性抽出物である。したがって、本発明の好ましい態様において、第１の有効な化粧品成分は、ベチバーの根の水性抽出物を含む。
水性抽出物は、ベチバーの根を純粋な水を用いて抽出することによって得られてもよい。任意に、水は添加剤を、例としてｐＨを調整するための添加剤を含有してもよい。
【０００９】
驚くべきことに、消耗されたベチバーの根の抽出物でさえも、上に記載の有利な効果を有する有効な化粧品成分を提供したことが見出された。したがって、本発明の具体的な態様において、第１の有効な化粧品成分は、消耗されたベチバーの根の抽出物を含む。
本出願を通してずっと、用語「消耗されたベチバーの根」は、水蒸気蒸留によって前もって処理されたベチバーの根を指す。よって、それは、エッセンシャルオイルが除去された後の根の残留物を指す。
具体的な態様において、本発明は、消耗されたベチバーの根の水性抽出物に関する。これは、「廃棄」物に付加価値を付与することを可能にする。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、ベチバーの根を抽出することを含む、有効な化粧品成分を調製する方法に関する。
抽出することによって、ベチバーの根が溶媒または溶媒の混合物を用いて処理されることを意味する。溶媒（単数または複数）はまた、添加剤を含有してもよい。実例として、ベチバーの根は、水抽出、酸抽出、酵素抽出、超音波促進された（ultrasound assisted）水抽出、加圧水抽出またはエタノール抽出にさらされてもよい。
好ましくは、ベチバーの根は、抽出に先立ち、とりわけ切断および／または粉砕においてより小片へ小さくされる。
【００１１】
ベチバーの根はまた、抽出に先立ち、洗浄されてもよい。根を、とりわけ水で洗浄することが、抽出物の減少された着色につながったことが見出された。
任意に１以上の添加剤を含有する、水を用いた抽出が、最良の結果を提供することが見出された。
好適な添加剤は、これらに限定されないが、酸、塩基、緩衝剤、塩および／または共溶媒を包含する。とりわけ、抽出溶媒のｐＨは、酸（例として、Ｈ２ＳＯ４またはクエン酸）または塩基（例として、ＮａＯＨ）の添加によって調整されてもよい。
純粋な水（根と共に、ｐＨほぼ７．４８）の使用、または本質的に純粋な水の使用が、具体的に有利であることが見出された。
したがって、具体的な態様において、抽出は、純粋な水を使用して実施される。
【００１２】
抽出は、室温にてまたは高温にて、例として、約４０℃、約６０℃、または約８０℃の温度にて実施されてもよい。約６０℃の温度が具体的に有利であることが見出された。
ベチバーの根の抽出物は、例えば、濾過（例として、KDS15フィルター上）、活性炭処理（charcoal treatment）および／または殺菌濾過によって精製されてもよい。
ベチバーの根の抽出物はまた、濃縮されてもよい。濃縮の間抽出物の可溶性を改善するために、濃縮に先立ち、１，３−プロパンジオールを抽出物へ添加することもまた可能である。
【００１３】
具体的な態様において、本発明の方法は、（ｉ）消耗されたベチバーの根を提供する；および（ｉｉ）消耗されたベチバーの根を抽出するステップを含む。
図１は、最適化された抽出プロセスのフローチャートを示す。それは、以下のステップを含む：
（ｉ）水蒸気蒸留され、乾燥されたベチバーの根を提供する；
（ｉｉ）ベチバーの根を水で洗浄し、それらを乾燥させ、およびそれらを粉砕する；
（ｉｉｉ）ベチバーの根を、攪拌下、４時間、６０℃の温度にて、水を用いて抽出する；
（ｉｖ）抽出物をスピン乾燥させる、および濾過；
（ｖ）１，３−プロパンジオール（濾過物／１２の量）を添加する；
（ｖｉ）１２の濃縮係数による蒸発による濃縮；
（ｖｉｉ）濾過；および
（ｖｉｉｉ）乾燥物含量を０．７％へ調整する。
【００１４】
このプロセスによって得られた抽出物は、典型的には、約１５０〜約２５０ｍｇ／ｌ、とりわけ約２５０±２０ｍｇ／ｌのジザン酸（zozanoic acid）含量；約６．５〜約７．５、とりわけ約７．０±０．２のｐＨ；およびガードナー色数（Gardner Color Scale）に関する約７．８〜約９．１、とりわけ約８．５±０．３の値を有する。ジザン酸における色、ｐＨ、収率および乾燥物収率は安定的であることが見出された。
【００１５】
分析目的のために、２つのバッチが、以下の手順に従って調製された：
−  ２０００ｇの水中、７５ｇの洗浄された根の６０℃、８ｈの抽出
−  濾過
−  ５回の濃縮（ＦＣＭ１２プロパンジオールと同様）
−  濾過
−  殺菌濾過
−  凍結乾燥。
【００１６】
１．５３１８ｇの抽出物を遠心分離クロマトグラフィーにおいて分画するために、二相系ＭＴＢＥ／アセトニトリル／水（４／１／５；ｖ／ｖ）が使用された。溶離が、流速２０ｍｌ／ｍｉｎおよび１２００ｒｐｍの回転で、昇順モードで実施された。
上相が７０分間固定相を介してくみ上げられた。画分９〜７０が回収された。押出が降順モードにおいて確認され、画分７１〜７８に対応する。
画分がＴＬＣプロファイルにおける類似性に従って１３グループにおいてプールされた。ＴＬＣが、Machery nagelシリカゲル逆相および酢酸エチル／トルエン／酢酸／ギ酸（２０／８０／１１／１１）の溶媒を用いて実施された。
【００１７】
１３グループが１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲにおいて分析され、２Ｄ実験が記録された（ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ）。
よって、以下の物質が、消耗されたベチバーの根の水性抽出物において同定されている：
【化１】
2021517568.tif 000002
【００１８】
【化２】
2021517568.tif 000003
【００１９】
よって、本発明はまた、（１）〜（２０）から選択される２以上の物質の混合物、とりわけこれらの物質の少なくとも５の、より具体的にこれらの物質の少なくとも１０の、および最も具体的に物質（１）から（２０）のすべての混合物を提供する。
【００２０】
本発明の抽出物の１つの重要な構成要素は、これまでに報告されている構造（１）を有するセスキテルペンである、ジザン酸である。他の代謝体、実例として、オプロパノン（６）、ソラネリアノンＡ（８）、ベチベリアニン（vetiverianine）Ｂ（１０）、バレンセン−１１，１２−ジオール（１２）、イソバレンセン酸（１３）、およびトイヘテノン（１５）のいくつかもまたこれまでに記載されている。
一方で、物質（２）、（３）、（４）、（５）、（７）、（９）、（１１）、および（１４）は、以前に記載されていない。
【００２１】
したがって、さらなる側面において、本発明はまた、以下からなる群から選択される化学物質にも関する。
【化３】
2021517568.tif 000004
【００２２】
驚くべきことに、ジザン酸の水における可溶性は、本発明の抽出物中に存在する他の物質によって改善されることが見出された。
本発明の化粧品組成物は、下に示されるだろうとおり、優れたスキンケア特性を表した。
【００２３】
皮膚脂質は、皮膚の水和、柔軟性およびバリア機能の維持において基本の役割を果たす。それらは、以下の３つのタイプの細胞によってほとんど生成される：
−  皮脂腺に位置付けられる脂腺細胞は、トリグリセリド、ワックスエステル、スクアレン、および遊離脂肪酸から主に構成される、皮脂、脂質薄膜を生成する。皮脂は、皮膚の脱水からの保護、その柔軟性の維持を保証し、およびまたその酸性のｐＨおよびその抗微生物の脂質（ＡＭＬ）によって皮脂マイクロフローラを保護する。
−  角化細胞は、それらの分化の間に脂質、例えば、セラミドおよびコレステロール誘導体などを蓄積し、それは角質層の皮膚角化膜をさらに構築するだろう。このプロセスは、皮膚バリア機能の保存における重要なステップであり、およびまた皮膚脱水を阻止する。
−  皮下脂肪に存在する脂肪細胞は、エネルギー貯蔵、機械的保護および熱調節のための他のタイプのトリグリセリドを生成する。それらは、機械的な補助を請け合うことによって、皮膚体積、弾力性およびはり（firmness）における重要な役割を果たす。
【００２４】
角質層全体の崩壊は、脂質の欠乏から始まり、加齢と共に、全体の−３０％の減少を伴う。脂腺細胞によって生成される脂質はまた、１０年毎にほぼ２５％の皮脂生成の段階的な減少と共に影響を及ぼされる。これは、皮膚の水和の喪失をもたらす。
一方で、加齢時の顔面脂肪の喪失は、脂肪細胞のより低い分化、および減少された脂肪貯蔵に関連し、より低いはりおよび弾力性、たるみおよびしわの発現をもたらす。
【００２５】
本発明のベチバーの根の抽出物は、皮膚における３つの主要な脂質供給源に作用し、皮脂生成、角質化および脂肪を貯蔵する脂肪細胞の容量を改善する。プラセボに対する３つの臨床試験は、消費者利益を浮き彫りにした：
１．皮膚の水和の改善
２．皮膚の疲労の減少および、具体的には唇周辺のエリアにおける、しわの低減
３．フレグランスを増強する特性
【００２６】
ex vivo調査研究において、本発明のベチバーの根の抽出物は、脂質生成を増加させ、およびよって皮膚バリア機能を改善することが見出された（下の例３を参照）。
本発明のベチバーの根の抽出物はまた、皮脂の量および質を引き上げる（下の例４を参照）。
脂質生成の再活性化（in vitro／ex vivo）および皮膚バリアタンパク質の再活性化（ex vivo）もまた観察された（下の例５および例６参照）。これは、バリア機能の再構築を確認するものである。
【００２７】
本発明のベチバーの根の抽出物はまた、皮膚脂肪細胞の分化およびサイズを引き上げることも見出された（下の例７を参照）。
臨床の試験において、目に見える皮膚の疲労の低減および唇周辺のしわの減少が観察された（下の例８を参照）。
本発明の組成物はまた、皮膚組成物および水和の利益になることも見出された（下の例９を参照）。
本発明の組成物はさらに、フレグランスの引き上げ利益を保有することも見出された（下の例１０を参照）。
【００２８】
よって、要するに、本発明の組成物は、皮脂生成の刺激、皮脂抗微生物の刺激、脂質生成、脂肪細胞の体積増加の活性化、皮膚の水和、皮膚弾力性ブースター、皮膚の疲労低減、唇周辺のしわ低減、皮膚を再度ふっくらさせる、およびフレグランスの持続性の増強を提供する。
したがって、本発明の組成物は、乾燥皮膚のための血清、抗老化の唇周辺の血清、抗老化のナイトクリームおよびデイクリーム、抗疲労エッセンス、皮膚強化（tonifying）マスク、抗座瘡クリーム、およびフレグランスの持続性を増加させるためのボディローションにおいて使用されてもよい。
【００２９】
さらなる側面において、本発明は、ベチバーの根からの抽出物のスキンケアにおける使用に関する。これは、上に記載のベチバーの根の抽出物の肯定的な効果を利用することを可能にする。
具体的な態様において、消耗されたベチバーの根からの水性抽出物および／または抽出物が使用される。
ベチバーの根の抽出物は、抗老化製品において具体的に有利に使用される。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、本発明の化粧品組成物をヒトの皮膚へ適用することによって、皮脂生成を刺激する、皮脂の抗微生物を刺激する、脂質生成を刺激する、脂肪細胞の体積増加を活性化させる、皮膚の水和を改善する、皮膚の弾力性を引き上げる、皮膚の疲労を低減する、唇周辺のしわを低減する、皮膚を再度ふっくらさせる、および／またはフレグランスの持続性を増強する方法に関する。
【００３１】
本発明は、以下の非限定例を用いてさらに説明される：
例１：in vitroおよびex vivo研究のためのベチバーの根の抽出物の調製
ハイチ産の消耗されたvetiveria zizanioidesの根（７５ｇ）を水（２０００ｇ）中に懸濁した。抽出を、４ｈ、６０℃にて、攪拌下で実施した。ｐＨを抽出の間監視し、約７．４〜約７．８で変化させた。
濾過後、溶液を、０．７％の最終的な乾燥物含量になるまで、水の除去によって濃縮した。生成物は、典型的には、無臭の透明な暗黄色から琥珀色の液体であり、約７．７〜７．８のｐＨを有する。この抽出物を、典型的には、in vitroおよびex vivo研究のために用いる。
これに続く例において記載した研究のために、１％、２％および３％の抽出物を夫々含有する水性溶液を調製した。
【００３２】
例２：in vitro研究のためのベチバーの根の抽出物の調製
ハイチ産の消耗されたvetiveria zizanioidesの根（７５ｇ）を水（２０００ｇ）中に懸濁した。抽出を、４ｈ、６０℃にて、攪拌下で実施した。ｐＨを抽出の間監視し、約７．４〜約７．８で変化させた。
濾過後、１，３−プロパンジオールを溶液へ添加し、その結果得られる混合物を、０．７％の最終的な乾燥物含量になるまで、水の除去によって濃縮した。生成物は、典型的には、無臭の透明な暗黄色から琥珀色の液体であり、約６．５〜約７．５のｐＨを有する。この抽出物を、典型的には、in vivo研究のために使用する。
これに続く例において記載した研究のために、２％のベチバー抽出物を夫々含有する水性溶液を調製した。
【００３３】
例８および９のため：
【表１】
2021517568.tif 000005
【００３４】
例１１のため：
【表２】
2021517568.tif 000006
【００３５】
例３：バリア機能のための脂質生成の増加（ex vivo）
プロテオーム分析を、例１の抽出物からの１％溶液を６日間毎日適用した３人のドナー（５４歳、５６歳および６９歳女性）のヒトの皮膚の外植片について、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって実施した。結果を以下の表に示す：
【表３】
2021517568.tif 000007
【００３６】
これらの結果によって、例１の抽出物によって、脂質生成、脂質輸送および表皮分化を対象とする複数の経路に関与する完全な一連のタンパク質の発現が刺激されることが示された。組成物によって、皮膚の脂質代謝のモジュレーションを介して表皮性のバリアが改善された。
【００３７】
例４：皮脂の量および質の引き上げ
ａ）脂腺細胞の刺激（in vitro）
脂腺細胞を例１からの抽出物からの１％溶液を用いて４時間プレインキュベートした。次いで、脂質合成ミックス（ビタミンＣ、ビタミンＤ３、インスリンおよびカルシウム）を、インキュベーションの別の７日間添加した。３日後に処理を再開した。次いで、脂質含量を、Bodipy（登録商標）蛍光標識を使用して評価した（脂質を緑色において目に見えるようにした）。
結果を、図２に示す。例１の抽出物によって、脂質合成ミックスのみと比べて、３１％までの皮脂脂質蓄積の増加を伴う、有意な脂腺細胞の刺激が示された。
【００３８】
ｂ）抗微生物の脂質（ＡＭＬ）含量の増加（in vitro）
脂腺細胞を、３Ｄ培養で培養し、例１の抽出物からの１％溶液を用いて７日間全身において処理した。次いで、遊離脂肪酸の含量を、ＧＣ／ＭＳによって評価し、ＡＭＬ中のそれらの含量を分析した。
結果を、図３に示す。例１の抽出物によって、処理なしのものと比較して、皮脂中の抗微生物の脂質（ラウリン酸およびサピエン酸）の含量が、＋２３％まで有意に増加されたことを見出した。
【００３９】
同じ実験手順を、脂質合成ミックスの刺激なしで繰り返した。ベチバーの根の抽出物によって、他のあらゆる脂質合成刺激なしで、抗微生物の脂質の生成を脂腺細胞モデルへ誘導できることを見出した（図４）。
とりわけ、ベチバーの根の抽出物によって、共に重要なＡＭＬと考えられるラウリン酸（＋４２％）およびサピエン酸（＋４３％）の生成が有意に誘導された。
【００４０】
例５：バリア機能の再構築（in vitro）：脂質生成の再活性化（in vitro／ex vivo）
ａ）セラミドおよびそれらの前駆体の合成
再構築したヒト表皮（ＲＨＥ）を、例１の抽出物からの１％溶液を用いて７日間インキュベートした。
次いで、ＲＨＥ中に含有させた脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーおよび濃度測定分析によって研究し、ＲＨＥ中のセラミド前駆体の量を評価した。
【００４１】
結果を、以下の表に示す：
【表４】
2021517568.tif 000008
【００４２】
例１の抽出物によって、未処理のＲＨＥと比較して、表皮中のセラミドおよびそれらの様々な前駆体の生成が、＋４２％まで有意に増加されることを見出した。よって、ベチバーの抽出物は、ＲＨＥ中の特定の脂質の新しい合成を刺激する能力を有する。
【００４３】
ｂ）セラミド輸送の刺激
正常なヒトの角化細胞（ＮＨＥＫ）を、例１の抽出物からの１％溶液を用いて５日間刺激した。次いで、セラミド輸送タンパク質（ＣＥＲＴ）を免疫蛍光によって定量した。
結果を、図５に示す。例１の抽出物によって、未処理のＮＨＥＫと比較して、ＣＥＲＴの発現が、＋１２４．５％まで有意に増加され、表皮中の脂質のより良好な輸送が可能になることを見出した。
【００４４】
ｃ）脂質含量の引き上げ
６９歳のドナーからの皮膚の外植片を、例１の抽出物からの１％溶液を用いて６日間局所的に処理した。皮膚からの中性脂質を、LipidTOX（商標）を使用して染色した。免疫染色を顕微鏡観察（緑色蛍光）によって定量し、角質化の刺激を評価した。
結果を、図６に示す。脂質生成および輸送の引き上げの結果として、例１の抽出物によって、未処理の試料と比較して、角化膜中の脂質含量が、＋３０％まで有意に増加されることを見出した。
【００４５】
例６：バリア機能の再構築（in vitro）：皮膚バリアタンパク質の再活性化（ex vivo）
例１の抽出物からの１％溶液を６日間毎日適用した３人のドナー（５４歳、５６歳および６９歳女性）からのヒトの皮膚の外植片を、角化膜の３つの特徴的なタンパク質であるデルモカイン、インボルクリンおよびロリクリンの定量化のために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用するプロテオームによって評価した。
結果を、図７に示す。例１の抽出物によって、角質層の３つの主要なタンパク質の発現が、平均において＋５３％〜＋２３９％まで有意に増加されることを見出した。よって、ベチバーの抽出物は、これらのタンパク質の発現を再活性化させる、皮膚の角化膜をより密集させることによって表皮性のバリアの改善に明確な影響を有する。
【００４６】
例７：皮膚脂肪細胞の分化およびサイズの引き上げ
ａ）脂肪細胞の分化の改善（in vitro）
前脂肪細胞を、例１の抽出物からの３％溶液を用いて１３日間培養した。次いで、脂質液滴、脂肪細胞分化のマーカーを、AdipoRed（商標）（蛍光の脂質プローブ）を使用して標識して、分化を定量した。
例１の抽出物によって、未処理の試料と比較して、脂肪細胞の分化が、＋３４１３％までの効果を伴い、有意に増加されることを見出した。
【００４７】
ｂ）脂肪細胞の体積の増加（ex vivo）
完全な皮膚の外植片（表皮、真皮および皮下組織）を、例１からの３％溶液を用いて処理した。Ｄ０、Ｄ１、Ｄ４およびＤ６に、生成物を局所的に適用した。Ｄ８に、外植片を顕微鏡分析のために染色した。次いで、脂肪細胞のサイズの決定を、画像分析によって、それらの当量の環状の直径を測定することによって実施した。
例１の抽出物によって、顕微鏡によって観察されるとおり、皮下組織における脂肪細胞の平均サイズが有意に増加されることを見出した。
【００４８】
例１の抽出物の使用後、脂肪細胞の集団におけるシフトを観察し得ることもまた注目に値する：
−  in vitroで観察した分化のブーストが反映され、「小さい」脂肪細胞（２０〜６０μｍ）の数が、＋２６％まで増加される（前脂肪細胞からの新しい小さな脂肪細胞の発現）
−  平均サイズの増加およびより良好な脂肪貯蔵容量の結果として、「大きい」脂肪細胞（１００〜１４０μｍ）の数が、＋１８９％まで増加される（存在する脂肪細胞における脂質の蓄積）
【００４９】
老化の間、脂肪組織の体積の喪失は、脂肪組織機能の変更、例えば、脂肪細胞サイズの低減および前脂肪細胞のダイナミクスにおける変化などの結果である。これらの２つの研究によって実証されるとおり、ベチバーの抽出物は、体積の再定義に有益な影響を有し、前脂肪細胞の分化を再活性化させることによって、および、成熟した脂肪細胞における脂質生成を刺激することによって「再度ふっくらさせる」作用因子（agent）として作用する。
【００５０】
例８：目に見える皮膚の疲労の低減および唇周辺のしわの減少（臨床試験）
二重盲式臨床試験を、たるんだ顔およびしわをもつ２１人のボランティア（５２歳〜６９歳の、平均６０歳の女性）の２つのグループに実施した。プラセボまたは例２の抽出物からの２％溶液がボランティアの顔に５６日間、１日２度（朝および夜）適用された。
【００５１】
ａ）弾力性／はりおよび抗疲労効果の改善
Ｄ０、Ｄ２８およびＤ５６に、皮膚の生体力学特性を、粘弾性のバランスのおよび疲労効果の夫々代表的なパラメータであるＲ６およびＲ９に焦点を当てて、頬骨のキュトメトリー（cutometry）によって測定した。Ｄ０、Ｄ２８およびＤ５６に、ボランティアの顔が、立体画像と合わされた特許された投影ユニットであるAEVA HE（登録商標）を使用し得て分析された。
結果を、図８に示す。例２の抽出物によって、プラセボに対して、老化したボランティアの皮膚の生体力学特性の、＋１１．２％の弾力性における回復および−１７．８％の皮膚の疲労減少を伴う、時間進行性の回復および有意な回復が可能になる。これらの結果はまた、ボランティアの３Ｄ顔画像で明確に目に見える（図９）。
【００５２】
ｂ）唇周辺のしわの平滑
Ｄ０およびＤ５６に、具体的な焦点をボランティアの唇周辺のしわに当てて、AEVA HE（登録商標）を使用してそれらを定量した。
結果を、図１０に示す。例２の抽出物の毎日の適用によって、２ヶ月において、プラセボに対して１００％のボランティアについて、唇周辺のしわの−１８％＊＊＊の平均的な低減を伴う、有意な効果が可能になる。
***p<0.001 スチューデントｔ検定
【００５３】
ｃ）皮膚利益の自己評価
全てのボランティアに、Ｄ５６に彼らの皮膚に対する例２の抽出物の利益を評価するように依頼した：
７６％のボランティアが、彼らの皮膚をより水和したと感じた。
７２％のボランティアが、彼らの皮膚をより心地よくかつ快適にしたと感じた。
７１％のボランティアが、彼らの皮膚に栄養を与えたと感じた。
【００５４】
例９：皮膚組成物および水和利益（臨床試験）
二重盲式臨床評価を、乾燥した脚（コルネオメトリー（corneometry）値＜３５）をもつ２０人のボランティア（５０歳〜７０歳の、平均６３歳の女性）に実施した。例２の抽出物からの２％溶液またはプラセボが、ボランティアの脚に１日２度（朝および夜）、２８日間適用された。
【００５５】
ａ）脂質組織の改善
Ｄ０およびＤ２８に、ラマン分光法を使用して、皮膚における脂質状態の質を評価した。
結果を、図１１に示す。例２の抽出物によって、皮膚における脂質組織の＋２１％までの有意な改善が示され、したがってそれらの緊密性、および最終的にバリア機能が増加された。
【００５６】
ｂ）皮膚の水和の増加
Ｄ０およびＤ２８に、皮膚の水和をコルネオメトリーによって分析した。
結果を、図１２に示す。例２の抽出物によって、乾燥皮膚をもつボランティアに、皮膚の水和の＋７．３％までの有意な増加が示された。
【００５７】
例１０：フレグランスの引き上げ利益（臨床試験）
フレグランスの持続性を評価するために、臨床試験を２０人の女性ボランティアに実施した。プラセボクリームがボランティアの前腕に、例２の抽出物からの２％溶液が他の前腕に１ヶ月間、１日２度適用された。次いで、最終日に、ファインフレグランス(Tom Ford Neroli Portofino)を彼らの前腕の両方に適用した。
【００５８】
ａ）持続性の自己評価
ボランティアに、ファインフレグランスの嗅覚的な強度を、彼らの皮膚に適用後２時間および４時間にランク付けするよう依頼した。
ボランティアによって、プラセボを用いて処理した前腕上のフレグランス強度の有意な減少が観察されたが、一方で例２の抽出物を用いて処理したものによってフレグランスの適用の２ｈおよび４ｈ後のフレグランス強度が維持された。
比較結果を、図１３に示す。例２の抽出物によって、適用後のフレグランスの嗅覚的な強度時間が＋２５％までの有意に増加されることによって、フレグランスの持続性の引き上げ効果が実証される。
【００５９】
ｂ）熟練したフレグランス評価者の意見
例２の抽出物の利益をフレグランスの引き上げ特性の観点から確認するために、熟練したフレグランス評価者に、ボランティアの２本の前腕間の嗅覚的な特性の観点からの違いを評価するように依頼した。
評価者によって、例２の抽出物によって、フレグランスの中心およびベースノートが経時的に強調され、したがってフレグランスの官能性としての機能がより引き上げられるという結論に至った。
【００６０】
例１１：皮脂生成に対する影響（臨床試験）
二重盲式およびプラセボ制御した臨床評価を、３０人の女性ボランティア（６３歳〜７０歳、平均年齢６７±２）に実行した。ボランティアによって、彼らの顔の皮脂の低いレベルが表された。すべてのボランティアによって、研究の開始日に、彼らのインフォームドコンセント署名日が与えられた。
ボランティアによって、例２の抽出物からの２％溶液が彼らの顔の一方の側に、プラセボが他方の側に、１日に２度（朝および夜）、２８日間適用された。Ｄ０およびＤ２８に、額および頬上の皮脂生成を、Sebumeter（登録商標）（ex Courage-Khazaka Electronic）を使用して分析した。
【００６１】
結果
ベチバーの抽出物によって、額および頬上の適用の２８日後の、皮脂生成の、夫々＋９９％および＋７８％を伴う、有意な増加が誘導されることを見出した。
詳細な結果は、以下のとおりである：
【表５】
2021517568.tif 000009
【００６２】
したがって、２％でのベチバーの抽出物によって、そうでなければ年老いた人々において劇的に低減する皮脂生成を再活性化させることができる。
【００６３】
例１２：消耗されたベチバーの抽出物の分析
抽出物調製
消耗されたベチバーの根を、６ｈの間の６０℃での水を用いた抽出（１０００ｇの水あたり３７．５ｇ）の前に、洗浄し、乾燥させ、粉砕し、これに続き、濾過および濃縮することによって、５００ｇの水性抽出物が得られた。水性抽出物を、酢酸エチルを用いて３回抽出した（水性抽出物対合計の酢酸エチルの比率＝１：６）。酢酸エチル抽出物を蒸発させることによって、２．０８１ｇの黄色油が得られた。
【００６４】
遠心分離クロマトグラフィー（ＣＰＣ）による分画
酢酸エチル抽出物を、３０３ｍＬのカラムおよび２相溶媒系（ｎヘキサン／ＥｔＯＡｃ／メタノール／水（１０／８／１０／８、ｖ／ｖ））を使用して、ＣＰＣ器機FCPE300（登録商標）（Rousselet Robatel Kromaton）上で分画した。
ＣＰＣクロマトグラムを、２５４、２８０、３００、および３６０ｎｍで観察した。２０ｍＬの画分を、全体の実験にわたって回収し、それらの薄層クロマトグラフィープロファイルに従ってあわせた。
【００６５】
主要な代謝体のＮＭＲ分析および同定
ＣＰＣ画分を、ＴＸＩクライオプローブを備えたBruker Avance AVIII-600 分光計(Karlsruhe、ドイツ)で、２９８Ｋでの１３Ｃ ＮＭＲによって分析し、Chrysopogon zizanoides種においてこれまでに報告されている代謝体と比較した。追加の２Ｄ ＮＭＲ実験（ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、およびＣＯＳＹ）を推定的に同定した化合物を含有する画分に対して実施することによって、データベースが提案した分子構造がデレプリケーション(Dereplication）プロセスの最後に確認された。また、必要な場合、第２のＣＰＣ分画を実施した。
【００６６】
以下の主要な代謝体を同定した：
【化４】
2021517568.tif 000010
【００６７】
【化５】
2021517568.tif 000011
【００６８】
上の代謝体のうち、ジザン酸（１）、オプロパノン（６）、ソラネリアノンＡ（８）、ベチベリアニンＢ（１０）、バレンセン−１１，１２−ジオール（１２）、イソバレンセン酸（１３）、およびトイヘテノン（１５）は、これまでに記載された。
物質（２）、（３）、（４）、（５）、（７）、（９）、（１１）、および（１４）は、他方、前に記載されていない。
【図１】
2021517568.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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