(57)【要約】  本発明は、糖尿病の治療におけるマンヌロン二酸オリゴ糖組成物の使用に関する。
2021528459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病を治療するための薬剤の製造における、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物の使用であって、前記マンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、式（ＩＩＩ）のマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩：
【化１】
2021528459.tif 000010
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
を含んでなり、
ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、６０％以上であり、
ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、６０％未満である、使用。
【請求項２】
前記マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、１０〜５０％、好ましくは２５〜５０％である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝４〜７であるマンヌロン二酸の総重量に対する、ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸の総重量の比率が、１．０〜３．５の間である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝１または２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、５０％以上、好ましくは６０％〜９０％、より好ましくは７０％〜９０％である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ｍ＋ｍ’＝１であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、１０％以上、好ましくは３０〜４０％である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ｍ＋ｍ’＝２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、１０％以上、好ましくは３０〜５０％である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、８０〜９５％である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、２０〜７０％である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ｎ＝４〜７であるマンヌロン二酸の総重量に対する、ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸の総重量の比率が、１．０〜３．０の間である、請求項４に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物における様々な重合度のマンヌロン二酸の重量パーセント含量が、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類５〜２５％、六糖類２〜２０％、七糖類２〜２０％、八糖類２〜２０％、九糖類２〜２０％、十糖類２〜２０％である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記組成物における様々な重合度のマンヌロン二酸の重量パーセント含量が、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１０〜２０％、六糖類５〜１５％、七糖類３〜１０％、八糖類２〜５％、九糖類１〜５％、十糖類１〜５％である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記組成物における様々な重合度のマンヌロン二酸の重量パーセント含量が、二糖類１０〜２０％、三糖類１８〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１５〜２０％、六糖類５〜１０％、七糖類３〜５％、八糖類２〜５％、九糖類１〜３％、十糖類１〜３％である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
薬学上許容可能な塩が、ナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、糖尿病を有する患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性スクリーニング法により得られたマンヌロン二酸の最適な組成物の、糖尿病の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、ヒトの健康を著しく危険にさらす高頻度で起こる一般的な疾患である。特に、世界中で高齢者の数が増え、罹患率は年々増えている。従って、糖尿病の予防および治療はますます重要になっている。外来診療で糖尿病の予防および治療に慣用されている薬物には主としてインスリンおよび経口血糖降下薬が含まれ、これらは多くの場合、使用の不便さおよび重篤な副作用といった欠点がある。特に、２型糖尿病に好適な有効薬は決めて限定されている。
【０００３】
マンヌロン二酸は、その潜在的な医学的価値のために広く注目を集めている。マンヌロン二酸は通常、アルギン酸を原料として用いる多段階方法により調製される。
【０００４】
原料であるアルギン酸の多糖分子は、β−１，４−グルコシド結合により連結されたＤ−マンヌロン酸から形成されるＭセグメント、α−１，４−グルコシド結合により連結されたＬ−グルロン酸から形成されるＧセグメント、およびこの２つの糖(sacchorides)のハイブリダイゼーションにより形成されるＭＧセグメントを含んでなる。Ｄ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸の構造式を以下の式（Ｉ）に示す。
【化１】
2021528459.tif 000003
【０００５】
ＭセグメントおよびＧセグメントは、原料であるアルギン酸から分離することができる。一般的な方法を、以下に簡単に記載することができる。アルギン酸を予め分解し、ポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の多糖混合物を得る。次いでこの多糖混合物を酸性沈殿に供し、その中のポリグルロン酸を除去し、さらに精製して純度が９０％を超えるホモポリマンヌロン酸（以後、「Ｍセグメント中間体」とも称する）を得る。例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号およびＣＮ０２８２３７０７．２号に開示された方法を参照。
【０００６】
オリゴマンヌロン酸の一般的な調製方法は次の通りである：上記で得たＭセグメント中間体を酸性条件下で加熱することによりさらに酸分解に供し、所望の範囲の分子量を有する小断片マンヌロン酸ポリマーを得る。さらに、分解効率は酸化的分解方法により向上させることができ、一方、還元末端は開環サッカリン二酸(saccharic diacid)に酸化することができる。詳細については、Ｍｅｉｙｕ  Ｇｅｎｇらが出願した中国特許出願第２００５８０００９３９６．５号（特許文献１）および米国特許第８，８３５，４０３  Ｂ２号（特許文献２）を参照。便宜上、特許文献１および２を以後まとめて先行文献といい、引用することによりその全体が本明細書の開示の一部とされる。
【０００７】
先行文献において開示されているマンヌロン二酸を得る反応は、以下の反応式（ＩＩ）で表すことができる。すなわち、オリゴマンヌロン酸多糖の還元末端にあるマンヌロン酸のＣ１位のアルデヒド基が、カルボキシル基に酸化される。
【化２】
2021528459.tif 000004
【０００８】
上記の酸化変換過程において、慣用される酸化剤は、アルカリ性硫酸銅溶液、すなわちフェーリング試薬である。先行文献は、この酸化方法を採用していた。具体的には、アルカリ性条件下で、反応基質のポリマンヌロン酸、すなわち、上記のＭセグメント中間体を硫酸銅溶液に加え、沸騰水浴中で１５分〜２時間反応させる。この方法は、アルデヒド基を酸化するためにＣｕ２＋イオンを酸化剤として用いており、赤れんが色の酸化第一銅の沈殿が、反応において生成される。この反応は、しばしば還元糖の同定に使用される。
【０００９】
先行文献は、オリゴマンナル酸(oligomannaric acid)が、アルツハイマー病（ＡＤ）および糖尿病に効果を有することを開示している。アルツハイマー病および２型糖尿病の病因は両方とも、アミロイド（β−アミロイドおよびアミリン）と密接に関連している。アミロイドタンパク質は、凝集し、次いでタンパク質オリゴマーを形成し、さらに凝集して線維を形成する。これらのタンパク質凝集物は細胞傷害性であり、細胞における酸化反応を誘導してミトコンドリアを損傷させ、糖尿病反応などのカスケード反応を惹起して、多数のニューロンおよびβ細胞に損傷を引き起こし、最終的に、アルツハイマー病および２型糖尿病の発症に至る。オリゴマンナル酸はアミロイドタンパク質を標的とし、アミロイドタンパク質により誘導されるカスケード反応と拮抗するため、アルツハイマー病および２型糖尿病を予防および治療する効果を有する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、糖尿病の治療におけるマンヌロン二酸オリゴ糖組成物の使用に関する。本発明はまた、治療上有効な量の本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、糖尿病を治療する方法にも関する。
【００１１】
本発明において使用されるマンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、式（ＩＩＩ）のマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩；
【化３】
2021528459.tif 000005
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
を含んでなり、  ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、６０％以上であり、
ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、６０％未満である特定の組成を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、生成物Ａにおける二糖類、三糖類および四糖類の質量スペクトルを示す。
【図２】図２は、生成物Ａにおける五糖類、六糖類および七糖類の質量スペクトルを示す。
【図３】図３は、生成物Ａにおける八糖類、九糖類および十糖類の質量スペクトルを示す。
【図４】図４は、アミリンにより損傷を受けた膵β細胞に対する、単一の重合度のオリゴマンナル酸のそれぞれの保護効果を示す。横軸の数字は、オリゴ糖のそれぞれの重合度を示す。
【図５】図５は、糖尿病マウスの食後血糖に対するオリゴ糖組成物および六糖類の効果を示し、図の横軸の数字に対応するサンプルは、ｉ：対照群；ｉｉ：モデル群；ｉｉ：生成物Ａ；ｉｖ：生成物Ｂ；ｖ：生成物Ｃ；ｖｉ：生成物Ｄ；ｖｉｉ：六糖類を示す。
【発明の具体的説明】
【００１３】
本発明の種々の態様を以下に詳細に説明するが、本発明はこれらの特定の実施態様に限定されない。当業者ならば、以下の実質的な開示を踏まえ、本発明に多少の改変および調整を行うことができ、このような調整も、本発明の範囲に包含される。
【００１４】
本発明は、糖尿病の治療におけるマンヌロン二酸オリゴ糖組成物の使用に関する。本発明はまた、治療上有効な量の本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、糖尿病を治療するための方法に関する。本発明において使用されるマンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、式（ＩＩＩ）のマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩：
【化４】
2021528459.tif 000006
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
を含んでなり、  ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、６０％以上であり、
ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、６０％未満である特定の組成を有する。
【００１５】
本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、重合度の異なるマンヌロン二酸の混合物であり、その主成分は２〜１０の重合度を有するマンヌロン二酸オリゴ糖である。マンヌロン二酸において最も活性が高い糖類は、四糖類〜十糖類、特に六糖類である。しかしながら、本発明者らは今般、活性が低い二糖類および三糖類を最も活性が高い四糖類〜十糖類に特定の割合で加えると、同一質量の投与量のもとでは、生物活性は低下することなく、むしろ活性が高くなることを見出している。いかなる理論にも拘束されるものではないが、これは、低分子量の二糖類および三糖類は、単独では作用できないものの、他のオリゴ糖と混合し場合に相乗作用を示すためと考えられる。しかしながら、二糖類および三糖類の割合が高すぎると、組成物の全体的な活性は低下する。従って、組成物中の二糖類および三糖類の割合は特定の範囲内に制御しなければならない。
【００１６】
実際の調製工程では、酸化分解反応において特定の量の二糖類および三糖類が生成され、通常、その活性の低さから、生成物の医薬効果に影響を及ぼすことを避けるため、分離後に生成物から除去される。しかしながら、本発明者らの上記発見に基づけば、より活性の高い組成物は、酸化分解反応の条件の制御を介して二糖類および三糖類の割合を特定の範囲内に制御することによって得ることができ、二糖類および三糖類は除去すべき不純物とはみなされないため、生成物収量もまた、先願で開示されている生成物よりもかなり高い。このように、本発明は生産コストを大幅に削減し、廃棄物の排出を低減し、それにより実際の生産の実現が容易となり、産業的大規模生産の実現が容易となる。
【００１７】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝１または２であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して、５０％以上、好ましくは６０％〜９０％、より好ましくは７０％〜９０％である。特に、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝１であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して、１０％以上、好ましくは３０〜４０％である。別の好ましい実施態様では、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝２であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して、１０％以上、好ましくは３０〜５０％である。
【００１８】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量は、前記組成物の総重量に対して、８０〜９５％である。
【００１９】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量は、前記組成物の総重量に対して、１０〜５０％、好ましくは２５〜５０％である。
【００２０】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量は、前記組成物の総重量に対して、２０〜７０％である。
【００２１】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝４〜７であるマンヌロン二酸の総重量に対するｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸の総重量の比率は、１．０および３．５の間、好ましくは１．０〜３．０の間である。
【００２２】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物における重合度の異なるマンヌロン二酸オリゴ糖の重量パーセント含量は、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類５〜２５％、六糖類２〜２０％、七糖類２〜２０％、八糖類２〜２０％、九糖類２〜２０％、十糖類２〜２０％である。特に、前組成物におけるオリゴ糖の重量パーセント含量は、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１０〜２０％、六糖類５〜１５％、七糖類３〜１０％、八糖類２〜５％、九糖類１〜５％、十糖類１〜５％である。より好ましくは、組成物におけるオリゴ糖の重量パーセント含量は、二糖類１０〜２０％、三糖類１８〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１５〜２０％、六糖類５〜１０％、七糖類３〜５％、八糖類２〜５％、九糖類(nonaccharide)１〜３％、十糖類１〜３％である。
【００２３】
本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、その薬学上許容可能な塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩である。
【００２４】
本特許出願の発明者らは、個々のオリゴ糖を特定の割合で配合すると、高活性オリゴ糖組成物を得ることができ、その活性は、最も高い活性を有する六糖類よりも高いことを見出した。特に、特定の割合の二糖類および三糖類を含んでなる組成物は、二糖類および三糖類を配合しない組成物よりも高い活性を有する。高活性オリゴ糖組成物中のそれぞれのオリゴ糖の割合は、以下に示す割合に従って配合する必要がある。
【００２５】
組成物中のｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して、６０％以上であり、好ましくは８０〜９５％である。ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して、６０％未満であり、好ましくは１０〜５０％、より好ましくは２５〜５０％である。ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量は、前記組成物の総重量に対して、２０〜７０％である。ｎ＝４〜７であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量に対するｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量の比率は、１．０〜３．５の間、好ましくは１．０〜３．０の間である。
【００２６】
本発明の糖尿病を治療するための薬剤は、式（ＩＩＩ）のマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩、および１以上の薬学上許容可能な担体を含んでなる、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物を含んでなる。本発明の薬剤は、経口または非経口投与のための錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、腸溶カプセル剤、マイクロカプセル、顆粒、シロップ、注射、顆粒、エマルジョン、懸濁液、溶液および徐放性製剤の形であり得る。
【００２７】
本発明の薬学上許容可能な担体とは、当業者に公知の薬学上許容可能な担体を指す。本発明の薬学上許容可能な担体には、限定されるものではないが、増量剤、湿潤剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、粘着剤、流動促進剤、矯味剤、界面活性剤、保存剤などが含まれる。増量剤には、限定されるものではないが、ラクトース、微晶質セルロース、デンプン、糖粉末、デキストリン、マンニトール、硫酸カルシウムなどが含まれる。湿潤剤および結合剤には、限定されるものではないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、スクロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。崩壊剤には、限定されるものではないが、カルボキシメチルデンプンナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが含まれる。滑沢剤には、限定されるものではないが、ステアリン酸マグネシウム、シリカゲル微粉末、タルク、水素化植物油、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムなどが含まれる。粘着剤には、限定されるものではないが、アラビアガム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、グルコース結合剤、デキストリン、デキストロース、エチルセルロース、ゼラチン、液状グルコース、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリドン、アルファー化デンプン、アルギン酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン、シロップ，およびトラガカントガムが含まれる。流動促進剤には、限定されるものではないが、コロイドシリカ、セルロース粉末、三ケイ酸マグネシウム、シリカおよびタルクが含まれる。矯味剤には、限定されるものではないが、アスパルテーム、ステビオシド、フルクトース、グルコース、シロップ、ハチミツ、キシリトール、マンニトール、ラクトース、ソルビトール、マルチトール、およびグリチルリチンが含まれる。界面活性剤には、限定されるものではないが、Ｔｗｅｅｎ−８０およびポロキサマーが含まれる。保存剤には、限定されるものではないが、パラベン、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムなどが含まれる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を達成することを指す。この効果は、疾患またはその症状の完全または部分的予防によれば、予防的なものであり得、ならびに／あるいは疾患および／または疾患による副作用の部分的または完全な安定化または治癒によれば、治療的なものであり得る。本明細書で使用する場合、「治療」は患者の疾患のいかなる治療をも対象とし、（ａ）疾患または症状を起こしやすいが、まだ疾患に罹患していると診断されていない患者において発現する疾患または症状の予防、（ｂ）疾患の症状の抑制、すなわちその発症の予防、または（ｃ）疾患の症状の軽減、すなわち疾患の発症または症状の悪化の軽減、を含む。
【００２９】
マンヌロン二酸オリゴ糖組成物
本発明の糖尿病を治療するためのマンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、式（ＩＩＩ）のマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩：
【化５】
2021528459.tif 000007
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
を含んでなり、
ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して、６０％以上であり、
ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して、６０％未満である。
【００３０】
例示的な実施態様では、糖尿病を治療するためのマンヌロン二酸オリゴ糖組成物の調製方法は、以下の工程を含んでなる。
【００３１】
（１）マンヌロン二酸生成物の調製：
Ｍセグメント中間体の調製。上記のように、本発明において用いる原料であるＭセグメント中間体は、従来技術において公知の方法、例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号およびＣＮ０２８２３７０７．２号に開示の方法により調製することができる。一般的な方法は、以下に簡単に説明することができる。アルギン酸を予め分解し、ポリマンヌロン酸およびポリグルロン酸の多糖混合物を得る。次いで多糖混合物を酸性沈殿に供し、その中のポリグルロン酸を除去し、さらに精製して純度が９０％を超えるホモポリマンヌロン酸、すなわちＭセグメント中間体を得る。
【００３２】
オゾン酸化分解。Ｍセグメント中間体を、適当な量の水に溶かし、室温でまたは加熱条件下で攪拌する。オゾンを連続的に導入し、反応を開始する。反応のｐＨ値は、希塩酸または希ＮａＯＨ溶液を滴下することにより、３〜１３、好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８に調整することができる。温度は、好ましくは０〜７０℃、より好ましくは１０〜４５℃である。反応完了後、オゾンの導入を停止し、ｐＨを中性に調整する。
【００３３】
膜分離および精製。上記で得た反応生成物を、約１０％の濃度の溶液に調合し、分子カットオフ膜により分離して、単糖類以下の分解生成物を除去する。保持液を回収する。使用する分子カットオフ膜は、１０００Ｄａ〜３０００Ｄａ、好ましくは２０００ＤａのＭＷＣＯを有する。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、オリゴマンヌロン二酸混合物を得る。分析の後、これらの生成物は総て、含量が特定の割合の範囲内である二糖類〜十糖類のオリゴ糖組成物であることが見出される。実施例１〜３はこれらの方法工程の例である。
【００３４】
（２）単一の重合度を有するオリゴ糖の調製
工程（１）において得たオリゴ糖混合物を、約１０％の濃度まで溶解し、Ｐ６ゲルクロマトグラフィーカラムで分離し、紫外検出に供し、各溶出液成分を回収する。同じ重合度を有する成分を合わせる。二糖類〜十糖類の９種類の成分を回収し、Ｇ１０ゲルカラムクロマトグラフィーにより脱塩し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させる。特定の精製法および調製プロセスを実施例４に示す。カラムクロマトグラフィー、脱塩および乾燥のこれらの操作は、当業者に公知である。
【００３５】
単一の重合の、これら９種類のオリゴ糖の各薬理活性を評価するために抗糖尿病動物モデルを使用し、六糖類が最も高い活性を有することが判明している。
【００３６】
（３）オリゴ糖組成物の活性の比較
調製された本発明のオリゴ糖組成物および精製された六糖類を、それらの薬理活性を比較するために試験する。結果は、本発明のオリゴ糖組成物は、単一の重合度のオリゴ糖において最も高い活性を有する六糖類よりも有意に活性が高いことを示し、一方、二糖類および三糖類を含まない組成物の活性は、六糖類の活性よりもわずかに低い。従って、異なる重合度のオリゴ糖は配合された後に相乗作用を示し得ると見ることができる。組成物中の二糖類〜六糖類の割合が６０％以上である場合、ならびに二糖類および三糖類の割合が６０％未満である場合に、組成物の活性は最も高い。しかしながら、二糖類および三糖類の割合が６０％を超える場合、組成物の活性はまた、低下する。
【００３７】
有効性および活性を評価するための動物モデルおよび工程
１．アミリンにより損傷を受けた膵β細胞に対するオリゴマンナル酸の保護効果
ヒト膵β細胞のＮＩＴ株を、１０％ＦＢＳを含んでなるＤＭＥＭ培地で培養し、９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルで播種した。細胞融合の後、単一の重合度のリゴマンナル酸１００μｇ／ｍｌを加え、２４時間作用させた。標準対照群およびモデル群には等量の生理食塩水を加えた。モデル群および単一の重合度のオリゴ糖群には、エイジングしたアミリン（ＩＡＰＰと略される膵島アミロイドポリペプチドとしても知られる）を終濃度３０μＭで加える。標準対照群には、等量の生理食塩水を加える。さらに４８時間培養した後に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定する。
【００３８】
２．糖尿病に対する有効性を評価するための動物モデル
雄ＮＩＨマウスを用い、各群１０匹として、標準対照群、モデル群、および薬物投与群に無作為に群分けした。試験日に、標準群を除く他の総ての動物に１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを腹腔内注射した。対応する薬物を１０日間継続する。１１日目に、眼球を取り出し、血糖濃度測定するために採血する。
【００３９】
本発明の利点を、以下の限定されない例においてさらに示す。しかしながら、実施例で使用される特定の材料およびその量、ならびに他の実験条件は、本発明を限定するものと解釈してはならない。特に断りのない限り、本発明における部、割合、パーセンテージ、および同様のものは総て、質量で算出する。
【実施例】
【００４０】
実施例１：
工程１）：マンヌロン二酸オリゴ糖混合物の調製
Ｍセグメント中間体を、先行文献に開示の方法により調製した。特定の操作を以下に簡単に記載する。５Ｋｇのアルギン酸ナトリウムを約１０％の溶液に調合し、希塩酸を加えることにより、ｐＨを約３．０に調整した。この溶液を８０℃に加熱し、撹拌した。これを１０時間反応させた後、加熱を停止した。室温に冷却した後、ＮａＯＨを加えることによりｐＨを９．０に調整し、希塩酸を加えることにより、さらに２．８５に調整した、この溶液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収し、ＨＣｌを加えることによりｐＨを１．０に調整した。遠心分離後、沈殿を回収し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空乾燥して、１５００ｇのＭセグメント中間体を得た。Ｍセグメント中間体５００ｇを秤量し、蒸留水に溶かして、５Ｌの容量の溶液を調製した。溶液をＮａＯＨでｐＨ６．５に調整し、水浴中で加熱して、反応温度を７５℃に制御した。オゾンを質量濃度流速８ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。４時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約１０％に調整した。２，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、３５０ｇのマンヌロン二酸生成物Ａを得た。
【００４１】
工程２）：マンヌロン二酸生成物Ａにおける種々の重合度を有するオリゴ糖の割合および構造の分析
上記乾燥マンヌロン二酸生成物Ａ１００ｍｇを正確に秤量し、濃度１０ｍｇ／ｍＬまで水に溶かし、０．２２μｍ濾過膜に通して試験サンプル溶液を得た。組成物における異なる重合度を有するオリゴ糖の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により測定した。実験条件は、以下のとおりであった。
クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド１０／３００Ｇｌ
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ
注入量：１０μＬ
流速：０．３ｍＬ／分
試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は１９％、ｄｐ３は２５％、ｄｐ４は２２％、ｄｐ５は１３％、ｄｐ６は９％、ｄｐ７は６％、ｄｐ８は３％、ｄｐ９は２％、およびｄｐ１０は１％であった。
【００４２】
工程３）：マンヌロン二酸生成物Ａにおける種々の重合度を有するオリゴ糖の構造のＬＣ−ＭＳ分析
実験条件：
クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド１０／３００Ｇｌ
移動相：２０％メタノール＋８０％  ８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４Ａｃ
流速：０．１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃±０．８℃
質量分析条件：Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５４０  ＱＴＯＦ；イオン源：ＥＳＩ衝突電圧１２０Ｖ；陰イオンモード。取得したシグナルの幅（ｍ／ｚ）は、１００〜１０００であった。
【００４３】
種々の重合度を有するオリゴ糖の質量スペクトルを図１〜３に示す。質量スペクトル(mass spectrogra)における種々のシグナルピークを割り当て、生成物Ａにおける全オリゴ糖の分子構造、すなわち一般式（ＩＩＩ）に示される構造を確認した。シグナルの割り当ておよびシグナルに対応する構造は、以下の表１を参照。
【００４４】
【表１】
2021528459.tif 000008
【００４５】
上記の質量分析構造解析から、生成物Ａにおける糖鎖の還元末端のマンヌロン酸は、サッカリン二酸構造（構造は一般式ＩＩＩを参照）に酸化され、この構造は、含量が約１０〜３０％である６個の炭素原子を含んでなるマンナル二酸（mannaric diacid）構造（ｍ＋ｍ’＝３）であり得るか、または、マンナル二酸の脱炭酸生成物、すなわち、５個の炭素原子を含んでなるサッカリン二酸（ｍ＋ｍ’＝２）（３０〜５０％）および４個の炭素原子を含んでなるサッカリン二酸（ｍ＋ｍ’＝１）（３０〜４０％）であり得ることが分かった。
【００４６】
実施例２：
実施例１のＭセグメント中間体１００ｇを秤量し、蒸留水に溶かして、０．８Ｌの容量の溶液を調製した。溶液をＮａＯＨでｐＨ４．０に調整し、室温（２５℃）にて反応を行った。オゾンを質量濃度流速１ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。１０時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約１５％に調整した。１，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、８０ｇのマンヌロン二酸生成物Ｂを得た。
【００４７】
Ｂにおける種々の重合度を有するオリゴ糖成分の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により決定した。測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は２０％、ｄｐ３は２５％、ｄｐ４は１９％、ｄｐ５は１２％、ｄｐ６は９％、ｄｐ７は５％、ｄｐ８は５％、ｄｐ９は３％およびｄｐ１０は２％であった。
【００４８】
実施例３：
実施例１のＭセグメント中間体１００ｇを秤量し、蒸留水に溶かして、１．５Ｌ容量の溶液を調製した。溶液をＮａＯＨでｐＨ９．０に調整し、水浴中４５℃にて反応を行った。オゾンを質量濃度流速３ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。２時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約５％に調整した。３，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、６０ｇのマンヌロン二酸生成物Ｃを得た。
【００４９】
Ｃにおける種々の重合度を有するオリゴ糖の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により決定した。測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は８％、ｄｐ３は２０％、ｄｐ４は２８％、ｄｐ５は１９％、ｄｐ６は１３％、ｄｐ７は６％、ｄｐ８は３％、ｄｐ９は２％、およびｄｐ１０は１％であった。
【００５０】
実施例４：
工程１）単一の重合度を有するマンヌロン二酸オリゴ糖の調製は、以下のとおりであった。
【００５１】
１．サンプル調製：実施例１において調製したマンヌロン二酸生成物Ａ  ３００ｇを取り、水に溶かし、１０００ｍＬの濃縮液を調製し、使用するために、４℃の冷蔵庫に入れた。それぞれの使用のために、５０ｍＬを分取し、水で１：２に希釈した後、０．２２μｍ限外濾過膜で吸引濾過した。
【００５２】
２．クロマトグラフィー分離条件：クロマトグラフは、ＵＶ検出器および自動コレクターを備えたＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  １５０（ＧＥ  Ｃｏ．から購入）であった。分離クロマトグラフィーカラム：１．２ｋｇのＢｉｏＧｅｌ  Ｐ６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏ．から購入）を脱イオン水と混合し、真空脱気し、手動でガラスカラム（内径：１０ｃｍ）に充填し、１０カラム容量の純水ですすいだ。クロマトグラフィーカラムベッドは安定であり、高さは１．０ｍであった。次に、移動相を０．０２Ｍ  ＮａＣｌ溶液に変え、１０カラム容量で平衡化した後、サンプルローディングを開始した。
【００５３】
３．サンプルのローディングおよび分離：ポンプの流速を１ｍＬ／分に設定した。１００ｍＬのサンプル溶液をクロマトグラフ自体のポンプを介してカラムの上部に注入した後、これを移動相に切り替え、流速５ｍＬ／分で溶出させた。水のデッドボリュームを流出させた後、自動回収を開始し、チューブ１本あたり５０ｍＬを回収した。
【００５４】
４．サンプルローディングを繰り返し、調製を２０回繰り返した後、同じ画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して、二糖類〜十糖類の単一の重合度を有する計９種類のオリゴ糖を得た。
【００５５】
工程２）薬理活性の評価
単一の重合度を有するジマンオリゴサッカリン酸（dimannoligosaccharic acid）オリゴ糖の薬理活性の評価方法は以下のとおりである。
【００５６】
二糖類〜十糖類のそれぞれ１０ｇを使用した。実験プロセスは「アミリンにより損傷を受けた膵β細胞に対するオリゴマンナル酸の保護効果」の方法に従って実施した。
【００５７】
結果は、標準対照群と比較して、ＩＡＰＰモデル群の細胞生存率は有意に低く、一方、単一の重合度のオリゴ糖群のそれぞれは細胞生存率を増す傾向があり、４〜１０の単一の重合度を有するジマンオリゴサッカリン酸オリゴ糖は総て、細胞生存率を有意に増すことを示した。５〜８の４つの重合度を有するオリゴ糖の効果が特に良好であった。六糖類の活性が最も高かった（図４参照）。
【００５８】
実施例５
組成物における異なる重合度を有するオリゴ糖の相乗作用およびオリゴ糖の割合の範囲を調べるために、組成物と六糖類との間での薬理活性評価を行った。
【００５９】
サンプル調製：
実施例４において調製した単一の重合度を有するマンヌロン二酸オリゴ糖を、重合度別に二糖類〜十糖類を正確に秤量した。用いた各糖類の重量は以下のとおりであった。二糖類３．０ｇ、三糖類３．０ｇ、四糖類１．５ｇ、五糖類１．５ｇ、六糖類０．４ｇ、七糖類０．２ｇ、八糖類０．２ｇ、九糖類０．１ｇ、および十糖類０．１ｇ。これらを均一に混合し、１０ｇの組成物生成物Ｄを得た。
【００６０】
実施例１、２、および３でそれぞれ調製された生成物Ａ、Ｂ、およびＣ、ならびに本実施例で調製された生成物Ｄにおけるオリゴ糖の割合を以下の表２に示す。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
上記サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのそれぞれ１０ｇを用いて、「糖尿病に対する有効性を評価するための動物モデル」に記載の方法に従って、これらの組成物および六糖類（６Ｔ）の薬理活性を比較した。
【００６３】
実験において、モデル群を標準対照群と比較した。前者の食後血糖は有意に増し、評価モデルが成功していたことを示す。モデル群と比較して、薬物投与群のそれぞれの食後血糖は有意に低下し、生成物Ａ、ＢおよびＣの薬力学的活性は総て、従前に予想されていた最も活性の高い、単一の重合度の六糖類よりも良好である。しかしながら、生成物Ｄの活性は六糖類よりも弱い。いかなる理論にも拘束されるものではないが、組成物中のオリゴ糖の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼし、特定の割合の二糖類および三糖類の添加が相乗作用を有すると推測される。しかしながら、二糖類および三糖類の割合が高すぎると、組成物の活性は低下すると思われる。図５参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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