(57)【要約】  本発明は、ＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクター、ＲＮＡインビトロ転写方法、ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュール、および自動化されたＲＮＡ製造装置に関連する。さらに、本明細書に記載されるＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクターの使用は、本発明の一部である。本発明は、ＧＭＰに従った条件下において自動化された方法で操作可能であるように設計されたＲＮＡインビトロ転写リアクターに関連する。とりわけ、前記ＲＮＡインビトロ転写リアクターは、様々なＲＮＡインビトロ転写反応のためのＤＮＡ鋳型の繰り返しの使用を可能にする。さらに、本発明は（ａ）鋳型ＤＮＡ合成モジュールと、（ｂ）前記ＲＮＡインビトロ転写リアクターを含む、ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュールと、任意選択的に（ｃ）ＲＮＡ配合モジュールと、を含む、ＲＮＡ製造装置に関連する。
2021528051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）磁性粒子、ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡ固定化バッファー、ＤＮＡ磁性粒子およびＩＶＴマスターミックスを保持するのに適した反応容器（２）であって、前記ＤＮＡ磁性粒子は浮動性の前記磁性粒子上に固定化されたＤＮＡ鋳型である、前記反応容器（２）と、
（ｂ）前記反応容器に位置する磁石ユニット（３）であって、前記磁石ユニットは、前記磁性粒子および前記ＤＮＡ磁性粒子を捕捉するように、または、前記磁性粒子および前記ＤＮＡ磁性粒子の運動を導入するように構成される、前記磁石ユニット（３）と、
を備えるＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクター（１）。
【請求項２】
前記反応容器（２）の内面は、楕円形、長円形内部形状または卵形内部形状を有する、請求項１に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３】
前記反応容器（２）の前記内面は、角縁のない形状を有する、請求項１または２に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４】
前記磁性粒子または前記ＤＮＡ磁性粒子のうちの少なくとも１つの前記運動は、当該粒子の沈殿を避けるように、または当該粒子を浮動させ続けるように、または当該粒子の沈殿を避けかつ浮動させ続けるように構成される、請求項１〜３のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５】
前記磁石ユニット（３）は、前記反応容器の外面上にまたは外面に近接して置かれた電磁石のアレイである、請求項１〜４のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項６】
前記磁石ユニット（３）は、前記反応容器（２）の長手軸に沿った長手方向（３６２）と、前記反応容器（２）対して接離する横断方向（３６３）とのうちの少なくとも１つの方向に可動である永久磁石または電磁石である、請求項１〜４のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項７】
前記磁石ユニット（３）は、前記反応容器（２）の長手軸に沿って長手方向（１１０）に可動でありかつ前記反応容器（２）の垂直軸の周りに回転可能（１１１）である、電磁石および好ましくは少なくとも誘導コイルまたは１組のヘルムホルツコイルである、請求項１〜４のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項８】
前記磁石ユニット（３）は、前記反応容器（２）の前記長手軸の周りに回転可能なように構成され、かつ前記磁石ユニット（３）の回転方向は混合中に切り替え可能である、請求項１〜７のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項９】
前記磁石ユニット（３）は磁性リング（３１）を備え、前記磁性リング（３１）は、前記反応容器（２）を取り囲むように設計される、請求項１〜８のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１０】
前記磁性リング（３１）は、第１ロッド（３２０）および第２ロッド（３２２）の自由端（３２１，３２３）が互いに向かい合うように前記磁性リング（３１）の内周（３４）から前記磁性リング（３１）の中心（３３）に延在する少なくとも前記第１ロッド（３２０）および前記第２ロッド（３２２）を備える、請求項９に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１１】
前記第１ロッド（３２０）の前記自由端（３２１）は、Ｎ極の磁石を備え、前記第２ロッド（３２２）の前記自由端（３２３）は、Ｓ極の磁石を備える、請求項１０に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１２】
前記磁性リング（３１）は、複数のロッド（３２０，３２２）を備え、前記複数のロッド（３２０，３２２）は、前記磁性リング（３１）の内周（３４）から前記磁性リング（３１）の中心（３３）に延在し、互いに等間隔をおいて星形に配置され、Ｎ極の磁石およびＳ極の磁石が各ロッドの自由端に交互に配置される、請求項８または９に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１３】
前記磁性リング（３１）および前記ロッド（３２０，３２２）は、磁場からの周辺成分を遮蔽するための積層スタックを形成するように構成される、請求項８〜１２のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１４】
前記磁性リング（３１）は、前記磁性リング（３１）の内周（３４）から前記磁性リング（３１）の中心に延在する複数のガイドプレート（３５０）を備え、各ガイドプレート（３５０）は、磁場を生成するように構成された電気コイル（３５１）を備える、請求項９に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１５】
前記磁性リング（３１）は、冷却手段を有するハウジング（３５２）内に配置される、請求項１４に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１６】
前記磁石ユニット（３）は、前記磁性リング（３１）を回転するように構成された第１駆動手段（３６）と、前記磁性リング（３１）を垂直方向に動かすように構成された第２駆動手段（３７）とをさらに備える、請求項１〜１５のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１７】
前記反応容器（２）は、常磁性体であるか、または前記反応容器壁に磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子を引き止めるために磁場を透過させるように構成される、請求項１〜１６のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１８】
前記磁石ユニット（３）は、前記磁性粒子または前記ＤＮＡ磁性粒子を混合するために周期的に活性化されるように構成される、請求項１〜１７のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項１９】
前記磁石ユニット（３）は、同一のＤＮＡ鋳型上での２回の連なるＲＮＡインビトロ転写の間、前記ＤＮＡ磁性粒子を捕捉するために活性化されるように構成される、請求項１〜１８のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２０】
前記磁石ユニット（３）は、前記反応容器を洗浄するために、前記ＤＮＡ磁性粒子を取り除くために活性化されるように構成される、請求項１〜１９のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ磁性粒子または前記反応容器（２）のうちの少なくとも１つのための機械的運動を導入する手段がない、請求項１〜２０のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２２】
前記反応容器のための機械的運動がオービタルシェーカーによって導入される、請求項１〜２０のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２３】
前記反応容器（２）は、前記反応容器（２）の長手方向に、前記反応容器（２）の内面（２１）に少なくとも部分的に沿って配置された少なくとも１つのフローブレーカ（４）を備える、請求項１〜２２のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２４】
前記反応容器（２）は、前記反応容器（２）の径方向に互いに間隔をあけて離れている２つのフローブレーカ（４）を備える、請求項２３に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２５】
前記フローブレーカ（４）がリブ形である、請求項２３または２４に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２６】
前記リブ形のフローブレーカ（４）は、Ｔ形またはＬ形の断面を備える、請求項２５に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２７】
前記フローブレーカ（４）は、波状である、請求項２３または２４に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２８】
前記フローブレーカ（４）は、複数の突出部を備え、前記突出部は、好ましくは互いに間隔をあけて離れている、請求項２３または２４に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項２９】
前記反応容器（２）の温度を調整するために前記反応容器（２）の前記内面（２１）と前記外面（２３）との間に温度素子（５）が置かれる、請求項１〜２８のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３０】
前記温度素子（５）は、前記反応容器（２）の径方向に前記反応容器（２）を少なくとも部分的にらせん状に取り囲む熱交換チャネル（５１）を備える、請求項２９に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３１】
前記熱交換チャネル（５１）は、第１端（５２）と第２端（５３）とを備え、前記第１端（５２）は前記反応容器（２）の上部に配置され、前記第２端（５３）は、前記反応容器（２）の底部に置かれる、請求項３０に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３２】
前記熱交換チャネル（５１）または前記反応容器（２）のうちの少なくとも１つは、追加の製造プロセス手段によって製造される、請求項３０または３１のうちの１つに記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３３】
前記反応容器（２）は、前記反応容器（２）の径方向に、少なくとも部分的にらせん状に前記反応容器（２）を取り囲む加熱ワイヤ（５４）を備える温度素子（５）をさらに備える、請求項１〜２８のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３４】
前記加熱ワイヤ（５４）は、前記反応容器（２）の外面内に少なくとも部分的に組み込まれるか、または、前記反応容器（２）の前記外面において少なくとも部分的にコートされる、請求項３３に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３５】
前記反応容器（２）は、少なくとも２０ｍｌの液体、好ましくは２０ｍｌ〜１００ｍｌまたは２０ｍｌ〜５０ｍｌの流体の汲み上げのために構成される、請求項１〜３４のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３６】
前記ＩＶＴマスターミックスは、リボヌクレオシド３リン酸およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１〜３５のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ固定化バッファーは、ＤＮＡ鋳型および塩含有バッファーを含む、請求項１〜３６のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ鋳型は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ鋳型、好ましくはＰＣＲ増幅されたＤＮＡ鋳型である、請求項１〜３７のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項３９】
前記磁性粒子は磁性ビーズ、好ましくはストレプトアビジン磁性ビーズまたは化学的に機能化された磁性ビーズである、請求項１〜３８のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４０】
前記反応容器（２）の内面は、Ｒａ＜＝０．８、好ましくはＲａ＜＝０．６のＲａ値を有する、請求項１〜３９のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４１】
前記反応容器（２）は、前記反応容器（２）の底部に、媒質を前記反応容器（２）に対して給排するためのポート（２４）を備え、前記ポート（２４）はバルブ手段（６０）に接続可能である、請求項４０に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４２】
前記バルブ手段（６０）が磁性トラップ（６１）を備え、前記磁性トラップ（６１）は、磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子を捕らえるように構成される、請求項４１に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４３】
前記磁性トラップ（６１）は、電磁石半球または磁化可能な半球または磁化可能なリングまたは半透過性フィルタのうちの少なくとも１つを備える、請求項４２に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４４】
前記反応容器から磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子の漏れを防ぐように制御可能である、請求項４２または４３のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４５】
前記磁性トラップ（６１）は、前記反応容器（２）の外側で少なくとも部分的に媒質パイプ（６６）を取り囲むように置かれ、前記ポート（２４）の下流に当接する、請求項４２〜４４のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４６】
前記ポート（２４）は、前記反応容器（２）の最下部に置かれる、請求項４５に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４７】
前記磁性トラップの下流に置かれ、前記ポート（２４）から磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子を取り除くために、前記ポート（２４）を通る洗浄ガスまたは洗浄液を方向づけるように構成される、マルチポジションバルブ（６２）をさらに備える、請求項１〜４６のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４８】
前記マルチポジションバルブ（６２）は、前記ＤＮＡ磁性粒子を混合するために、前記反応容器（２）内にプロセスガスまたはプロセス流体を方向づけるよう構成される、請求項４７に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項４９】
前記バイオリアクターは、前記バイオリアクターを垂直に支持する少なくとも第１脚部（２５）および第２脚部（２６）を備え、前記第１脚部（２５）は第１導管（２５１）を備え、前記第２脚部（２６）は第２導管（２６１）を備え、前記第１導管（２５１）は、前記バルブ手段（６０）と流体連結するように構成され、前記第２導管（２６１）は、前記温度素子（５）の前記熱交換チャネル（５１）の前記第２端（５３）と流体連結するように構成される、請求項１〜４８のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５０】
排気ダクト（７３）および廃棄チャネル（７４）のうちの少なくとも１つに接続された出口ポート（７）をさらに備え、前記出口ポート（７）の下流に配置された出口フローセル（７２）を任意選択的に備える、請求項１〜４９のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５１】
前記磁性トラップ（６１）の下流に置かれ、磁性粒子またはＤＮＡ磁性粒子から発生する磁場を方向づけるように構成されるホールセンサ（６３）をさらに備える、請求項１〜５０のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５２】
前記反応容器（２）はチタンを含む、請求項１〜５１のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５３】
前記反応容器（２）内に前記磁性粒子を引き止めるために前記ポート（２４）にフィルタ要素、好ましくは単回使用フィルタをさらに備え、前記フィルタ要素の前記孔は、好ましくは１μｍのオーダー、また、より好ましくは０．１μｍ〜０．９μｍの間のサブミクロンサイズを有する、請求項１〜５２のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５４】
前記温度素子（５）は、前記反応容器温度を２０〜３７℃の転写温度に調整するように、好ましくは７５〜８５℃の洗浄温度にも調整するように構成される、請求項１〜５３のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５５】
前記バルブ手段（６０）は、前記ポート（２４）の下流に配置されたフローセル（６４）をさらに備える、請求項１〜５４のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５６】
前記反応容器（２）は、ＲＮＡインビトロ転写に適したバッファー、キャップアナログ、修飾されたリボヌクレオシド３リン酸、リボヌクレアーゼ阻害剤、ピロホスファターゼ、ＭｇＣｌ２、抗酸化剤、ポリアミンおよび、洗浄または衛生化のうちの１つ以上のための溶液、の要素のうちの少なくとも１つを保持するようにさらに構成される、請求項１〜５５のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５７】
前記反応容器（２）は、ｐＨ、塩濃度、マグネシウム濃度、リン酸塩濃度、温度、圧力、流速、ＲＮＡ濃度またはリボヌクレオチド三リン酸濃度のうちの１つ以上を、測定、または調整、または測定および調整するための少なくとも１つの手段を保持するように構成される、請求項１〜５６のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５８】
前記バイオリアクターは、バッチ、セミバッチ、または繰り返しバッチモード、または、半連続または連続モードで作動する、請求項１〜５７のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項５９】
前記ポートに磁性粒子の沈殿を防ぐために前記反応容器を回転させるための回転手段をさらに備える、請求項１〜２０、２２〜５８のうちの１項に記載のバイオリアクター（１）。
【請求項６０】
ＲＮＡインビトロ転写の方法であって、
請求項１〜５９のうちのいずれか１項に記載のバイオリアクター（１）の反応容器にＤＮＡ磁性粒子およびＩＶＴマスターミックスを提供する工程、
ＲＮＡを得るために、浮動性のＤＮＡ磁性粒子とともに前記ＩＶＴマスターミックスを前記ＤＮＡ磁性粒子および前記磁石ユニットの協働の手段によって混合する工程（Ｓ３）
を含む、前記方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法であって、
請求項１〜５９のうちのいずれか１項に記載のバイオリアクター（１）の反応容器に磁性粒子、ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡ固定化バッファーを提供する工程（Ｓ１）、
前記浮動性の磁性粒子上に固定化された前記ＤＮＡ鋳型である、ＤＮＡ磁性粒子を得るために、前記磁性粒子および前記バイオリアクターの磁石ユニットの協働の手段によって前記磁性粒子、前記ＤＮＡ鋳型および前記ＤＮＡ固定化バッファーを混合する工程（Ｓ２）、
をさらに含み、
工程Ｓ１およびＳ２は、請求項６０で定義された前記工程の前に実施される、前記方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、
前記磁石ユニットの手段によってＤＮＡ磁性粒子を捕捉する工程、および工程Ｓ３から得られたＲＮＡを回収／集積する工程（Ｓ４ａ）、
バイオリアクター（１）の反応容器内に新たなＩＶＴマスターミックスを提供する工程（Ｓ４ｂ）、
浮動性のＤＮＡ磁性粒子を提供するために捕捉されたＤＮＡ磁性粒子を解離する工程（Ｓ４ｃ）、
ＲＮＡを得るために前記ＤＮＡ磁性粒子および前記磁石ユニットの協働の手段によって、前記浮動性のＤＮＡ磁性粒子を前記ＩＶＴマスターミックスと混合する工程（Ｓ４ｄ）
をさらに含み、
工程Ｓ４ａ〜Ｓ４ｄは請求項６０で定義された前記工程の後に実施される、前記方法。
【請求項６３】
ポート（２４）の手段によって前記反応容器（２）から前記ＤＮＡ磁性粒子を除去する工程をさらに含む、請求項６０〜６２のうちの１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記反応容器（２）を２０℃〜３７℃の間の温度に温度を合わせる工程（ＳＴ）をさらに含む、請求項６０〜６２のうちの１項に記載の方法。
【請求項６５】
洗浄ガスまたは洗浄液のうちの少なくとも１つによって前記反応容器（２）を洗浄する工程（ＳＣ）をさらに含む、請求項６２〜６２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記工程Ｓ４が少なくとも２回実施される、請求項６０〜６５のうちの１項に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６０〜６６のうちのいずれか１項に記載の方法における請求項１〜５９のうちのいずれか１項に記載のバイオリアクター（１）の使用。
【請求項６８】
請求項１〜５９のうちのいずれか１項のバイオリアクター（１）を含む、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡに転写するためのモジュール（１５）であって、前記モジュールは、ＩＶＴマスターミックス（１２）を調製するためのユニット、固定化バッファーを調製するためのユニット、得られたＲＮＡ産物を前処理するための装置（１３）、得られたＲＮＡ産物を精製するための装置（１４）、ＲＮＡを前処理するための装置またはＲＮＡ滅菌ろ過のための装置のうちの少なくとも１つ以上をさらに含む、前記モジュール。
【請求項６９】
前記ＩＶＴマスターミックス（１２）を調製するために前記ＩＶＴマスターミックスの成分を前記ユニットに供給する媒質供給ユニットをさらに備える、請求項６８に記載のモジュール（１５）。
【請求項７０】
前記ＤＮＡ鋳型は、末端修飾または末端機能化されたＰＣＲ生成されたＤＮＡ鋳型、好ましくはビオチン化されたＰＣＲ生成されたＤＮＡ鋳型、末端修飾または修飾されていない線状化プラスミドＤＮＡ、または末端修飾または修飾されていない線状化ドギーボーンＤＮＡである、請求項６８〜６９のうちの１項に記載のモジュール（１５）。
【請求項７１】
請求項１〜５９のうちのいずれか１項に記載のバイオリアクター（１）を備える自動化されたＲＮＡ製造装置であって、
ＤＮＡ合成（Ｔ）モジュール、および
ＲＮＡ配合（Ｆ）モジュール
のうちの少なくとも１つをさらに備える、前記装置。
【請求項７２】
ＲＮＡ配合のための前記モジュールがＬＮＰカプセル化されたＲＮＡを生成するように構成される、請求項７１に記載の装置。
【請求項７３】
前記装置が層流空気流生成のためのユニットのある密閉コンテナ内、好ましくは単一コンテナ内に配置される、請求項７１または７２に記載の装置。
【請求項７４】
ＤＮＡ固定化モジュール、ＤＮＡ線状化モジュール、インビトロ転写されたＲＮＡにｃａｐ０またはｃａｐ１構造を加えるためのＲＮＡキャッピングモジュール、ＲＮＡポリアデニル化モジュール、ＲＮＡ混合モジュール、ＲＮＡ噴霧乾燥モジュール、ＲＮＡ凍結乾燥モジュール、または最終生成物貯蔵のためのモジュールのうちの少なくとも１つをさらに備える、請求項７１〜７３のうちのいずれかに記載の装置。
【請求項７５】
ＲＮＡ配合のための前記モジュールは、プロタミン複合ＲＮＡまたはポリエチレングリコール／ペプチドポリマー複合ＲＮＡを生成するように構成される、請求項７１〜７４のうちのいずれかに記載の装置。
【請求項７６】
ＮＧＳモジュール、ＭＳモジュール、キャピラリー電気泳動モジュール、ｄｄＰＣＲモジュール、媒質供給ラックまたは媒質供給モジュール、文書化モジュールまたは全ての処理工程のためのコンピュータ支援制御のためのモジュールのうちの少なくとも１つ以上をさらに備える、請求項７１〜７５のうちのいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクター、ＲＮＡインビトロ転写方法、ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュール、および自動化されたＲＮＡ製造装置に関連する。さらに、本明細書に記載されるＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクターの使用は、本発明の一部である。本発明は、ＧＭＰに従った条件下において自動化された方法で操作可能であるように設計されたＲＮＡインビトロ転写リアクターに関連する。とりわけ、前記ＲＮＡインビトロ転写リアクターは、様々なＲＮＡインビトロ転写反応用のＤＮＡ鋳型の繰り返しの使用を可能にする。さらに、本発明は（ａ）鋳型ＤＮＡ合成モジュールと、（ｂ）前記ＲＮＡインビトロ転写リアクターを含む、ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュールと、任意選択的に（ｃ）ＲＮＡ配合モジュール、とを含む、ＲＮＡ製造装置に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ分子を含む治療用核酸は、新たに注目を集めている種類の薬の代表例である。ＲＮＡベースの治療法は、ワクチンとして使用される抗原をコードするｍＲＮＡ分子を含む（非特許文献１）。加えて、成長因子または酵素などの失われたタンパク質を患者に提供する（非特許文献２、非特許文献３）などの置換療法のためのＲＮＡ分子の使用も構想されている。さらにまた、ノンコーディング免疫賦活ＲＮＡ分子（例えば特許文献１）およびマイクロＲＮＡおよび長鎖ノンコーディングＲＮＡなどの他のノンコーディングＲＮＡ（非特許文献４）またはゲノム編集に適したＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）の治療学的な使用が考慮される。したがって、免疫治療、遺伝子治療、およびワクチン接種におけるＲＮＡベースの治療法の使用は、現代医学において最も見込みがあり急激に発展している治療分野である。
【０００３】
規制当局によって承認され現在確立されているＲＮＡ分子の製造プロセスは、多くの異なる製造工程を実施する。特に、それぞれの製造工程は、いくつかの異なる装置によって実施される。さらに、様々な別個の品質管理は、特許文献２に詳細に記載されるようなＤＮＡ量およびＲＮＡ量で実施される。
【０００４】
ＲＮＡ製造において重要な工程は、適したＤＮＡ鋳型を生成することであり、それは工業規模においては主要なコスト要因である。現在、ＤＮＡ鋳型は、単回のＲＮＡインビトロ転写反応のためにのみ使用されることができ、続いてＤＮａｓｅ消化によって破壊され、最終的にＲＮＡベースの治療法の有効性および安全性を担保するためにＲＮＡ精製によって取り除かれる必要がある。
【０００５】
ＲＮＡ製造は、ＧＭＰ−規制の実験室内でよく訓練された技術スタッフによって実行されるマニュアル操作が大いに必要とされる。その結果、現在の確立された製造プロセスは、時間がかかり、コストがかかり、多くの実験スペースおよび実験設備を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／０９５２２６号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１８０４３０号
【特許文献３】国際公開第２０１７／１０９０１３４号
【特許文献４】国際公開第２０１６／１９３２２６号
【特許文献５】国際公開第２０１６／１７４２７１号
【特許文献６】国際公開第２００８／０７７５９２号
【特許文献７】国際公開第２０１４／１５２０３１号
【特許文献８】国際公開第２０１６／１９３２０６号
【特許文献９】国際公開第２０１２／０１３３２６号
【特許文献１０】国際公開第２０１６／１６５８２５号
【特許文献１１】国際公開第２０１８／０４１９２１号
【特許文献１２】国際公開第２０１６／１８４５７５号
【特許文献１３】国際公開第２０１６／１８４５７６号
【特許文献１４】国際公開第２０１６／１６５８３１号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／０６９５８６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋら、２０１２．Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１４（６）：４２８−４３９
【非特許文献２】Ｋａｒｉｋoら、２０１２．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（５）：９４８−９５３
【非特許文献３】Ｋｏｒｍａｎｎら、２０１２．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（２）：１５４−１５７
【非特許文献４】Ｅｓｔｅｌｌｅｒ、２０１１．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２（１２）：８６１−７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上に概説したように、一般的な製造装置およびプロセスに付随した問題には、現在よく訓練された技術スタッフのマニュアル操作が大いに必要とされるという問題がある。それ故に、時間、空間、設備および人的なもの（ｐｅｒｓｏｎａｌ）を節約するための改善されたＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクターおよび自動化されたＲＮＡ製造装置を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
改善されたバイオリアクターの利点は、いくつかのＲＮＡ製造プロセスにおいてＤＮＡ鋳型の繰り返し使用を可能にしうることであり、この繰り返し使用は、使用する必要のある出発材料（すなわちＤＮＡ鋳型）をより少なくでき、ＤＮａｓｅ処理を省くか実質的に最小化できるので、コストを削減する。また、改善されたバイオリアクターは、より高い純度プロファイル（最終ＲＮＡ産物内に残留ＤＮａｓｅが全くなく、残留ＤＮＡ断片が全くない）のＲＮＡの確固とした製造を可能にしうる。自動化されたＲＮＡ製造装置の利点は、全製造プロセスがより確固として、かつ信頼できること（ヒューマンエラーを最小限にするため）と、ＲＮＡ製造が加速されうることとである。
【００１０】
さらに、ＲＮＡ製造の加速は、公衆衛生、とりわけ、パンデミックシナリオに関して、極めて有利であろう。それに関して、さらに有利なことは、持ち運び可能なＲＮＡ製造装置を必要とするであろう集団発生が起きた地域におけるＲＮＡ治療法の提供である。
【００１１】
上記の問題は、独立請求項の主題によって解決され、さらなる実施形態は従属項に組み込まれる。以下に記載された本発明の特徴は、ＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクター、ＲＮＡインビトロ転写方法、ＤＮＡをＲＮＡに転写されたモジュール、自動化されたＲＮＡ製造装置に対して、および本明細書に記載された使用に対して等しく適用されることに注意されたい。
【００１２】
第１態様において、本発明は、
反応容器と
前記反応容器に位置する磁石ユニットと、
を備えるＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクターに向けられる。
【００１３】
前記反応容器は、磁性粒子、ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡ固定化バッファー、ＤＮＡ磁性粒子およびＲＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）マスターミックスのうちの少なくとも１つを保持するのに適する。この意味では、前記ＤＮＡ磁性粒子は、前記浮動性の磁性粒子上に固定化されたＤＮＡ鋳型である。前記磁石ユニットは、前記反応容器内に保持された前記磁性粒子および前記ＤＮＡ磁性粒子の捕捉または運動を導入するように構成される。そのような運動に関して、前記磁性粒子および／または前記ＤＮＡ磁性粒子の混合または撹拌が誘導され得る。したがって、前記反応容器内に保持される追加の成分の数に応じて、磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子ならびにＤＮＡ鋳型、ＤＮＡ固定化バッファー、およびＩＶＴマスターミックスのうちの少なくとも１つの混合または撹拌が前記磁性ユニットによって誘導され得る。例えば、前記反応容器内に保持される成分としてのＤＮＡ鋳型および浮動性の磁性粒子に関して、磁石ユニットによって誘導される磁性粒子の混合または撹拌は、混合されたＤＮＡ磁性粒子に繋がる場合があり、前記ＤＮＡ磁性粒子は、前記磁性粒子上に固定化された前記ＤＮＡ鋳型である。前記磁性ユニットによって誘導された前記ＤＮＡ磁性粒子の運動のために前記ＤＮＡ磁性粒子および前記ＩＶＴマスターミックスが混合されるか、または撹拌される場合、それによってＤＮＡ磁性粒子および前記ＩＶＴマスターミックスの確立された、より均一な混合物は、鋳型ＤＮＡからＲＮＡへの前記ＲＮＡインビトロ転写を補助する。
【００１４】
本発明による前記バイオリアクターは、薬学的な応用（例えば薬学的核酸製造）に適した規制された条件（ＧＭＰ）下の使用にさらに適している場合がある。前記バイオリアクターは、液体核酸組成物、好ましくはリボ核酸（ＲＮＡ）組成物の連続的な製造または繰り返しバッチ製造を可能にしうる。本発明に関して、用語ＲＮＡは任意のタイプのリボ核酸を示すために使用される。したがって、用語「ＲＮＡ」は、長鎖ＲＮＡ、コーディングＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、直鎖状ＲＮＡ（ｌｉｎＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡｓ、リボスイッチ、免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、リボザイム、アプタマー、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、レトロウイルスＲＮＡまたはレプリコンＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、およびＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）からなる群から選択される、分子または分子種を表しうる。
【００１５】
一実施形態において、前記反応容器の前記内面は、楕円形または長円形内部形状を有する。発明者によって、楕円形形状または長円形内部形状がより良好な混合結果を可能にすることが見出された。加えて、そのような形状は、より良好な流体の滴り落ちまたは排出を可能にし、より良好な掃除しやすさを可能にしうる。後者は、前記バイオリアクターの前記内面に、そうでなければ不利な乾燥である滴の形成を防ぎうる。これは、特に、例えば、前記反応容器によって保持される前記流体のタンパク性残留物（例えば３７℃以上で固まるか、または固体化しうる）にあてはまりうる。
【００１６】
一実施形態において、前記反応容器の前記内面は卵形内部形状を有する。そのような卵形は、前記楕円形形状に関して上述されたような同一な利点または改善した利点を提供しうる。卵形は、また、最適な圧力分布、混合または撹拌中の前記磁性ビーズの最適な挙動、前記反応容器内面における前記磁性ビーズの保持のため、洗浄プロセス中の分布をも提供する。卵形は、例えば、同一の基礎円半径の２つの半分の長球から得られる場合があり、前記長球のうちの１つは、前記基礎円半径と等しい高さの半球であり、かつ、他方の長球は、前記基礎円半径よりも大きい高さを有する。代わりに、前記反応容器の前記内面は、長球の形状、とりわけ球状の形状を有しうるか、または前記内面は、丸薬形状を有しうる。前記反応容器の前記内面は、また、卵形および楕円の組み合わせか、または卵形および円筒形状の組み合わせからの形態を有しうる。そのような組み合わせによって、前記反応容器の前記内面の一部は、例えば卵形を有するが、前記内面の残りの部分は、例えば円筒形状を有する。
【００１７】
一実施形態において、前記反応容器の前記内面は、球形内部形状を有しうる。そのような球形は、前記卵形反応容器に関して上述されたような同一の利点および改善された利点を提供しうる。
【００１８】
一実施形態において、前記反応容器の前記内面は、角縁のない形状（例えば、丸みのある縁のある直方体）を有する。この形状は、同様に、滴の最適な排出を補助し、したがって前記反応容器に保持される前記流体のタンパク性残留物が固まることを防ぐ。そのような形状（角縁なし）は、効果的な洗浄手順を可能にする。
【００１９】
一実施形態において、前記反応容器は、幅の広い間隙または裂け目のない内面を有しうる。それに関して、２μｍより大きい間隙または裂け目、好ましくは、１μｍより大きい間隙または裂け目、より好ましくは０．８μｍより大きい間隙または裂け目がそれでもなお「幅の広い」間隙または裂け目であるとみなされる。より大きい間隙は、微生物汚染およびバイオフィルムまたは残留物のニッチを提供しうるので、そのような形状（幅の広い間隙なし）は、効果的な洗浄手段を可能にする。
【００２０】
一実施形態において、前記磁性粒子および／または前記ＤＮＡ磁性粒子の前記運動は、前記反応容器内に保持される前記粒子の沈殿が避けられるように構成される。加えて、または代わりに、前記磁性粒子および／または前記ＤＮＡ磁性粒子の前記運動は、前記反応容器の底における沈殿が防がれ得るように、前記反応容器に含まれる前記粒子が浮動させ続けるように構成される。さらに、混合または旋回プロセスは、前記粒子を前記容器内に浮動させ続けることによって、および／またはビーズの凝固が妨げられまたは減少することによって改善される。有利には、磁性粒子および／または前記ＤＮＡ磁性粒子を浮動させ続けること、および／または磁性粒子および／または前記ＤＮＡ磁性粒子の沈殿を避けることは、前記バイオリアクター内の生化学反応、すなわちＤＮＡ固定化およびＲＮＡインビトロ転写を改善する。
【００２１】
一実施形態において、前記バイオリアクターの前記磁石ユニットは、電磁石のアレイによって与えられる。後者は、前記反応容器の前記外面上または前記外面に近接して置かれうる。前記アレイの個々の電磁石は、個々につけたり消したりされうる。前記反応容器内に保持された磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子のそのような混合または旋回の方法は、改善され、およびより良好に制御されうる。前記電磁石のアレイは、好ましくは可動ではなく、かつ、前記バイオリアクターそれ自体は可動ではなく（振盪なしなど）および混合または旋回が磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子および磁石ユニットの協働によって導入される。
【００２２】
前記磁石ユニットは、代わりに、別の実施形態において、前記反応容器の長手軸に沿って長手方向に可動である永久磁石または電磁石でありうる。そのような長手の運動に加えて、またはその代わりに、前記永久磁石または電磁石は、横断方向に、前記反応容器に向かって、およびから離れて可動でありうる。電磁石のアレイの場合と同様、長手方向におよび／または横断方向に可動な永久または電磁石は、より良好な混合／旋回の制御およびより良好な混合結果を可能にしうる。
【００２３】
前記磁石ユニットは、代わりに、さらに別の実施形態において、電磁石によって、および好ましくは少なくとも１つの誘導コイルによって与えられうる。この場合において、前記磁石ユニットは、前記反応容器の長手軸に沿って長手方向に可動である。加えて、前記磁石ユニットは、前記反応容器の垂直軸の周りに回転可能である。
【００２４】
好適には、前記磁石ユニットは少なくとも１つのヘルムホルツコイルの形態において配置されうる。
前記反応容器に近接した前記磁石ユニットの位置は、磁石ユニットと反応容器との間の距離を表し、前記磁石ユニットが電源をつけられたときに前記反応容器内で確立される適した磁場をそれでもなお可能にする。したがって、前記磁場の強度および形態は、磁性粒子の旋回／混合が誘導されうるか、および／または磁性粒子が前記反応容器の前記内面上に捕捉されうるようにされる必要がある。
【００２５】
一実施形態において、前記磁石ユニットは、前記反応容器の長手軸の周りに回転可能であるように構成され、前記磁石ユニットの回転方向は混合中切り替え可能である。前記磁石ユニットは、前記反応容器の前記長手軸に関して径方向に前記磁性粒子を誘導することによって前記反応容器の径方向に前記磁性粒子の運動を導入しうる。その磁力は、回転を引き起こし、したがって、前記磁性粒子の混合を引き起こすように前記反応容器の周りに前記磁石ユニットを回転させることによって静的または動的に生成され得る。前記磁石ユニットの回転方向は、前記反応容器の前記長手軸に関して時計回りまたは反時計回りか、および／または交互に変えられうる。したがって、前記磁性粒子は、非接触方式で浮動性のままである場合があり、それゆえ、前記成分の混合が改善されうる。前記磁石ユニットの前記回転が止まるとすぐに、前記磁気粒子（例えば、ＤＮＡ磁性粒子）は、前記反応容器の前記内面に捕捉され、それ以上回転しない。したがって、前記磁石ユニットは、（ｉ）上述されたように前記磁性粒子の運動を導入するように前記反応容器の長手軸の周りに回転するように構成され、かつ、（ｉｉ）回転を止めたときに前記磁性粒子を捕捉するように構成される。
【００２６】
一実施形態において、前記磁石ユニットは磁性リングを備え、前記磁性リングは前記反応容器を取り囲むように設計される。前記反応容器の周りの前記磁石ユニットの組み立ておよび回転を容易にするため、前記磁石ユニットはリング形状において形成されうる。換言すれば、前記反応容器は、前記磁石ユニットが前記反応容器を包囲するようにリング形状の磁石ユニットの中心に置かれてよい。
【００２７】
一実施形態において、前記磁性リングは、前記第１ロッドおよび第２ロッドの前記自由端が互いに向かい合うように前記磁性リングの内周から前記磁性リングの中心に延在する少なくとも第１ロッドおよび第２ロッドを備える。一実施形態において、前記第１ロッドの前記自由端は、Ｎ極の磁石を備え、および前記第２ロッドの前記自由端はＳ極の磁石を備える。
【００２８】
前記ディスク形状またはリング形状の磁石ユニットは、前記磁性リングの円周方向に配置された磁石を備えうる。前記磁石は、前記磁石と前記反応容器との間の間隙を減少させるように、前記磁性リングに直接および接触して、または前記磁性リングからずれて前記磁気リングの中心に位置する前記反応容器により近くに配置されうる。前記リングから離れて前記磁石を保持するために、内面に接続され、かつ前記リングの前記中心から延在する磁石ホルダーが使用されうる。前記磁石ホルダーは、保持ロッドとして設計されてよく、前記保持ロッドの一端は前記磁性リングの前記内周に取り付けられ、前記保持ロッドの他端は、前記磁石を保持する。前記磁性リングおよび前記保持ロッドは、別個に製造され、および互いに取り付けられてよく、または、例えば、成形によって一部品として製造されてよい。
【００２９】
前記磁性粒子の運動を効果的に誘導するために、前記磁性リングは、前記磁性リングの前記周囲に沿って互いに間隔をあけて離れている少なくとも２つのロッドを備えてよく、前記ロッドの前記自由端は互いに向かい合う。さらに、前記ロッドの各自由端にはＮ極およびＳ極の永久磁石が交互に取り付けられうる。したがって、前記磁性リングを回転させるとき、前記磁性粒子は前記反応容器の周りに回転可能に誘導されてよく、それは前記反応容器内の前記成分の改善された混合を引き起こす。
【００３０】
効果的に磁性粒子を捕捉するために、前記磁性リングの回転は前記反応容器内の前記成分の混合後に止められうる。
別の実施形態において、前記磁性リングは複数のロッドを備え、前記複数の前記ロッドは前記磁性リングの内周から前記磁性リングの中心に延在し、互いに等間隔をおいて星形に配置される。好ましくは、Ｎ極の磁石およびＳ極の磁石は、前記ロッドの各自由端に交互に配置される。
【００３１】
好ましい実施形態において、前記磁性リングは、偶数個のロッドを備えてよく、前記複数のロッド、およびしたがって前記ロッドの各自由端に取り付けられた前記複数の磁石は不均一または周期的な磁場を提供するように対で配置される。さらに、前記磁性リングの前記周囲に沿って等間隔をおかれたロッドは前記反応容器内の前記磁気粒子を誘導する対称的な磁場を可能にする。
【００３２】
一実施形態において、前記磁性リングおよび前記ロッドは磁場からの周辺成分を遮蔽するための積層スタックを形成するように構成される。前記磁性リングおよび前記ロッドは、複数の磁化可能な積層電気シートから作られてよい。前記積層電気シートは、電磁鋼を備えてよく、絶縁のために使用されてよい。前記積層スタックは前記ロッドの前記自由端に取り付けられた前記永久磁石によって生成された前記磁場を遮ってよく、前記反応容器を除いた他の装置に影響を全く及ぼさなくてよい。前記磁場の遮蔽は特に有利であって、磁場によって影響を及ぼされる他の装置／成分を含む装置内の前記バイオリアクターの統合を可能にする。
【００３３】
一実施形態において、前記磁性リングは、前記磁性リングの内周から前記磁性リングの中心に延在する複数のガイドプレートを備える。好ましくは、各ガイドプレートは磁場を生成するように構成された電気コイルを備える。前記磁性リングは、少なくとも１つ、好ましくは複数の、電磁コイルによって磁場を生成する電磁石を備えうる。前記ガイドプレートは、前記磁気リングの前記周囲に沿って星形に配置されてよく、前記反応容器が置かれうる前記磁気リングの前記中心に延在してよい。前記電磁コイルは、電流の量を制御することによって前記磁場を素早く変えることができる。
【００３４】
一実施形態において、前記磁性リングは、冷却手段を有するハウジング内に配置される。前記冷却手段は、前記電磁コイルを通る高電流によって引き起こされる熱を運び去るように、前記磁性リングの前記周囲に沿って前記磁性リングの前記ハウジング内に組み込まれうる。前記冷却手段は、水などの冷媒が循環される冷却チャネルでありうる。前記冷却手段は、好ましくは電磁コイルを備える磁性リング内に組み込まれうる。前記冷却手段は、永久磁石を備える（および電磁コイルを備えない）磁性リングに組み込まれえない。
【００３５】
一実施形態において、前記磁石ユニットは、前記反応容器の長手軸の周りに前記磁性リングを回転させるよう構成された第１駆動手段および前記反応容器の前記長手軸に沿って垂直方向に前記磁性リングを動かすように構成された第２駆動手段をさらに備える。前記磁性リングは、前記反応容器の前記長手方向に動くフレームによって保持されうる。したがって、前記磁気リングが回転し、および垂直に動くとき、前記磁場は、前記反応容器の前記長手方向および前記径方向の両方に提供され、変化してよく、前記反応容器内の前記成分の一層良好な均一な混合に繋がりうる。
【００３６】
前記磁性リングを回転させるための前記駆動手段および前記磁性リングを前記垂直方向に動かすための前記駆動手段は別個に提供されてよい。前記磁性リングを回転させるための前記第１駆動手段は、前記磁性リングに直接配置されてよく、また、前記反応容器の上方に置かれてよいが、前記磁性リングを垂直に動かすための前記第２駆動手段は、前記フレームを介して前記磁性リングに接続されてよく、前記磁気リングを固定して保持し、また、前記磁性リングが垂直に動くのを可能にする。
【００３７】
一実施形態において、前記反応容が常磁性体であり、磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子は、前記常磁性体容器および前記反応容器に位置する前記磁石ユニットの協働によってその反応容器内壁に引き止められうる。したがって、その反応容器全体が常磁性体であってよく、または、前記反応容器の前記内面が常磁性体であってよく、例えば、常磁性体材料または磁性導電材料を含むことによる。前記用語「磁化可能な」は、本発明を通して磁性粒子が前記反応容器壁に引き寄せられ、および引き止められうるように前記反応容器またはその内面が一時的に磁化されうるということを意味する。前記反応容器またはその内面の前記磁化は、しかしながら、逆転されてよく、その結果前記反応容器壁に引き止められた磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子が解離されうる。したがって、前記バイオリアクターの前記材料および／または前記バイオリアクターの前記内面は前記磁石ユニットのスイッチを入れることによって永久に磁化されるのではない（すなわち、強磁性ではない）ことは重要である。
【００３８】
したがって、好ましい実施形態において、前記反応容器は、常磁性体である。他の実施形態において、前記反応容器は、磁化可能にすることなく磁場を透過させるように構成される。
【００３９】
一実施形態において、前記磁石ユニットは前記磁性粒子および／または前記ＤＮＡ磁性粒子を混合するために周期的に活性化されるように構成される。前記磁石ユニットの周期的な活性化は前記磁石ユニットの連続的な活性化と比べて、前記成分の改善された混合につながりうる。前記成分の改善された混合につながる前記磁石ユニットのそのような周期的な活性化は、前記磁性粒子または前記ＤＮＡ磁性粒子を浮動させ続けるための方法で調整される必要があり、生化学反応が最適な方法で起こる（例えば、前記ＲＮＡインビトロ転写などの前記生化学反応に関与する全ての成分が混合され、ＲＮＡ合成が起こるように互いに接触する）ような方法での混合を可能にする必要がある。同様に、前記周期的に活性化する磁石および前記ＤＮＡ磁性粒子／磁気粒子によって誘導される前記混合を望まれないせん断力が最小限にされ、かつ熱の発生（熱の発生は磁気エネルギーの熱への変換によって誘導されうるか、または摩擦熱によって誘導されうる）が減少される方法で調整することは、重要である。
【００４０】
一実施形態において、前記磁石ユニットは、同一ＤＮＡ鋳型（ＤＮＡ磁性粒子の形態で提供される）上での２つ以上の続くＲＮＡインビトロ転写の間、前記ＤＮＡ磁性粒子を捕捉するために活性化されるように構成される。そのような捕捉は、前記反応容器の前記内面における前記ＤＮＡ磁性粒子の引き止めにつながる前記反応容器の磁化に付随してよく、および／または前記反応容器内の磁化可能であるが化学的に不活性なビーズまたは半球の磁化に付随してよい。有利には、そのような捕捉は２つ以上のＲＮＡインビトロ転写反応におけるＤＮＡ磁性粒子の再利用を可能にし、それによって鋳型提供スケールを減少させることによって製造の時間、および、前記ＲＮＡ産物のコストを減少させる（ＤＮＡ鋳型が数回使用され得る）。
【００４１】
一実施形態において、前記磁石ユニットは、前記磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子を除去するために活性化されるように構成される。そのような磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子の除去は、前記反応容器の洗浄を意図しうる。ＤＮＡ磁性粒子の除去は、最後のＲＮＡインビトロ転写反応後（例えば前記磁性リングの前記回転を停止させることによって）に実施されうる。そのようなＤＮＡ磁性粒子の除去は、例えばＤＮａｓｅを介した酵素的消化なしにＤＮＡを除去できるという利点を有し、これは前記最終ＲＮＡ産物内のＤＮＡ汚染および酵素汚染を減少し（ＤＮＡ消化産物なし、ＤＮａｓｅ酵素なし）、前記ＲＮＡ産物のコストを削減する（最終生成物内のＤＮａｓｅ汚染の制御が必要でない、ＤＮａｓｅ酵素が必要でない）。
【００４２】
一実施形態において、前記磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子のための機械的運動導入手段は全く備えられていない。この実施形態によると、前記混合が前記磁石ユニットによってのみ誘導されるように、前記反応容器内に保持された前記成分の混合または撹拌を誘導できる追加の機械的撹拌機またはかき混ぜ機がない。これは、前記反応容器内に位置する機械的運動導入手段は、望まれない沈殿の形成（例えば前記機械的攪拌手段上の沈殿）を引き起こしうるので、本発明に関して特に有利である。また、機械的運動導入手段の不在は、前記バイオリアクターの前記洗浄も改善する（表面の減少、前記反応容器内に角縁なし）。
【００４３】
代替的一実施形態において、前記磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子のための機械的運動導入手段は、シェーカーの形態で備えられ（例えば、オービタルシェーカー）、前記シェーカーは、好ましくは前記反応容器外に置かれる。
【００４４】
一実施形態において、前記反応容器内に保持された前記成分の混合または撹拌は、（ｉ）前記磁性粒子および磁石ユニットの協働、（ｉ）機械的運動導入手段、および／または（ｉｉｉ）前記反応容器内へのプロセスガスまたはプロセス流体の方向づけ、の組み合わせによって導入されうる。
【００４５】
一実施形態において、前記反応容器は前記反応容器の長手方向において、前記反応容器の内面に少なくとも部分的に沿って配置された少なくとも１つのフローブレーカを備える。前記フローブレーカは、前記反応容器内の前記成分の等流を妨げ、それによって混合を改善しうる。また、前記フローブレーカは、前記磁気リングが回転を止めるとき、および／または回転方向を変えるときに前記磁気粒子の沈殿を防ぎうる。したがって、前記フローブレーカは、前記磁性粒子が蓄積しうる溝が全くなく連続的に、とりわけ前記反応容器の長手方向に垂直な水平方向において、設計されてよい。
【００４６】
前記フローブレーカは、前記反応容器の径方向において前記反応容器の前記内面から突出して前記反応容器の長手方向に沿って延在してよい。前記フローブレーカは、前記反応容器の上部から底部に連続的に延在しうるか、または、前記反応容器の前記長手方向に沿って互いに別個に配置された複数の構成要素を備えうる。したがって、前記フローブレーカは、好ましくは互いに間隔をあけて離れている複数の突出部を備えうる。
【００４７】
一実施形態において、前記反応容器は、前記反応容器の前記周囲に沿って互いに間隔をあけて離れている２つのフローブレーカを備える。前記反応容器は、少なくとも１つ、正確には２つ以上のフローブレーカを備えうる。前記フローブレーカは、混合を改善するためおよび前記磁性粒子の沈殿を防ぐために、好ましくは前記反応容器の前記径方向において前記反応容器の前記内面に沿って均等に分布される。
【００４８】
一実施形態において、前記フローブレーカはリブ形であり、好ましくは前記リブ形フローブレーカは、Ｔ形またはＬ形の断面を備えうる。前記反応容器の前記内面から中心方向に突出する前記フローブレーカは、前記反応容器の曲がった内面に沿って弓形に形成されてよく、前記反応容器の前記楕円形内部形状に沿って複数の曲率半径を備えうる。前記反応容器の前記長手軸に関する前記フローブレーカの径方向の断面はまた変わりうる。例えば、前記径方向の断面は、Ｔ形、Ｌ形または凸形として形成されうる。前記フローブレーカの前記径方向の断面の突出部長は、前記反応容器の前記上部から前記底部に前記内面に沿って変わりうる。一実施形態において、前記フローブレーカは波状である。前記リブ形フローブレーカはまた前記反応容器の前記内面に沿って波形であってもよく、それは前記磁性粒子の沈殿を防ぎうる。波状フローブレーカの波形表面は、前記反応容器の前記内面に垂直に並べられうる。
【００４９】
一実施形態において、温度素子は、前記反応容器の温度を調製するために前記反応容器の前記内面と前記外面との間に置かれる。換言すれば、前記反応容器は、前記内面と前記外面との間への前記温度素子の組み込みを可能にする固体材料から作られた厚い壁を備えうる。したがって、前記反応容器の加熱および冷却に関する早い温度調整が容易になりうる。
【００５０】
一実施形態において、前記温度素子は、前記反応容器の径方向に、少なくとも部分的にらせん状に前記反応容器を取り囲む熱交換チャネルを備える。前記熱交換チャネルは前記内面と前記外面との間に組み込まれ、かつ前記反応容器内の前記温度を調整するように適合されうる。効果的かつ均一な加熱または冷却を提供するために、前記熱交換チャネルは、完全に前記反応容器を取り囲んでよく、熱交換媒質は前記熱交換チャネル内を流れてよい。
【００５１】
一実施形態において、前記熱交換チャネルは第１端および第２端を備え、前記第１端は前記反応容器の上部に配置され、前記第２端は前記反応容器の底部に置かれる。前記らせん状に配置された熱交換チャネルは前記熱交換媒質の注入および／または排出のための少なくとも２つのポートを有してもよく、１つのポートが前記反応容器の前記上部に配置され、他方のポートが前記反応容器の前記底部に配置されるとき、それが重力を加え前記熱交換媒質の効果的な分布は容易にされうる。
【００５２】
一実施形態において、前記熱交換チャネルおよび／または前記反応容器は、追加の製造プロセス手段によって製造される。したがって、前記反応容器の前記内面と前記外面との間のらせん状に前記反応容器を取り囲む前記熱交換チャネルを含む前記反応容器の複雑な形状は簡単に実現されうる。
【００５３】
一実施形態において、前記反応容器は、前記反応容器の長手軸に関して径方向に前記反応容器を少なくとも部分的にらせん状に取り囲む加熱ワイヤを備える温度素子をさらに備える。前記熱交換チャネルの代替として、前記加熱ワイヤは前記反応容器内の前記成分の温度を調整するために前記反応容器上に配置されうる。前記加熱ワイヤは、また均一な加熱を提供するためにらせん状に前記反応容器を取り囲む。
【００５４】
一実施形態において、前記加熱ワイヤは、前記反応容器の外面に少なくとも部分的に組み込まれるか、または、前記反応容器の前記外面上に少なくとも部分的にコートされる。熱損失を最小限にするため、および、前記加熱ワイヤによる効果的な加熱を提供するために、前記加熱ワイヤは前記反応容器の前記外面に固定されうる。その代わりに、または加えて、前記反応容器は、の前記外面は断熱材でコートされてよく、前記加熱ワイヤは少なくとも部分的に断熱材内に納まりうる。
【００５５】
一実施形態において、前記反応容器は、少なくとも２０ｍｌの液体、または少なくとも５０ｍｌの液体、または少なくとも１００ｍｌの液体、または少なくとも５００ｍｌの液体を汲み上げられるように寸法をあわせられる。好ましくは、前記反応容器は２０ｍｌ〜１００ｍｌまたは２０ｍｌ〜５０ｍｌの液体を汲み上げられる。前記反応容器は、また、５０ｍｌ〜１００ｍｌの液体を汲み上げるように構成されうる。とりわけ、第２態様に明記されたような方法において使用されるとき、前記反応容器は、前記液体の十分な振盪を可能にするために約６０％〜約８０％までしか充填されない。特定の実施形態においては、前記反応容器は、約１００ｍｌの液体を汲み上げられるように寸法をあわせられ、液体の６０ｍｌ〜８０ｍｌだけが前記反応容器内に充填され、反応容器は約６０％〜８０％だけ充填されることに対応する。別の特定の実施形態において、前記反応容器は、約２０ｍｌ〜５０ｍｌの液体を組み上げることができ、前記反応容器はこの場合約６０％まで充填されるものとする。
【００５６】
前記ＩＶＴマスターミックスは、一実施形態によると、リボヌクレオシド３リン酸およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含みうる。前記ＤＮＡ固定化バッファーは、一実施形態によると、ＤＮＡおよび塩含有バッファーを含みうる。前記ＤＮＡ鋳型は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ鋳型によって与えられてよく、それらは好ましくはＰＣＲ増幅されたＤＮＡ鋳型でありうる。一実施形態において、前記磁性粒子は磁性ビーズ、好ましくはストレプトアビジン磁性ビーズまたは化学的に機能化された磁性ビーズ、最も好ましくは常磁性体ストレプトアビジンまたは化学的に機能化された磁性ビーズによって与えられうる。
【００５７】
一実施形態において、前記反応容器の前記内面は、Ｒａ＜＝０．８の表面粗さ値（Ｒａ値）、好ましくはＲａ＜＝０．６を有する。前記内面は、前述のＲａ値が達成されるように、例えば、電解研磨またはその他、例えば化学的にまたは機械的に処理されうる。そのようなＲａ値は、そのような材料が前記反応容器の前記内面における例えばタンパク性残留物またはバイオフィルムなどの堆積および固まることを防ぎ、または減少させるので前記リアクターの掃除しやすさを改善しうるため、特に有利である。
【００５８】
一実施形態において、前記バイオリアクターは、前記反応容器内に充填媒質を導入することを可能にする注入ポートを備える。したがって、前記注入ポートは、最大流体振幅または流体レベル（液位）より下に配置される。本発明に関して、最大流体振幅は、前記反応容器内に含まれる流体の振幅であることが理解され、振盪または回転運動されると最大で前記反応容器の前記内面に到達する。回転運動の場合、前記流体分子に作用する遠心力は、流体を前記反応容器の前記内面の上方に押すことにつながる。前記内面上の濡れた領域および乾いた領域の間の境界は線を画定し、前記最大流体振幅を与える。換言すれば、最大流体振幅は、前記反応容器に含まれる流体の振盪または回転運動の過程で濡れる線または領域に付随し得る。前記反応容器の前記注入ポートを通って導入される充填媒質は、例えば、磁性粒子、ＤＮＡ鋳型、固定化バッファーおよび／またはＩＶＴマスターミックスによって与えられうる。さらに充填媒質は洗浄液、洗い液およびプロセス流体などでありうる。最大流体振幅より下に前記注入ポートを配置させることは前記反応容器の前記内面に物質（例えばタンパク質、ＤＮＡ、または粒子、または塩など）が堆積し、固まる（例えば、およそ３７℃の温度でのタンパク質でありうる）ことを防ぐ。
【００５９】
一実施形態において、前記反応容器は、前記反応容器内に／から外へ媒質を供給するために、および／または除去するために前記反応容器の下部において媒質ポートを備え、前記ポートはバルブ手段に接続可能である。換言すれば、前記バイオリアクターは、好ましくは前記反応容器の最下部に位置する、組み合わされた注入および排出ポート（注入／排出ポート）を備える。前記バルブ手段は、前記反応容器内への充填媒質の導入および前記反応容器から外へ前記媒質の排出を可能にしうる。有利には、前記バルブ手段は、前記バルブ手段が閉じているとき前記反応容器内に例えば前記磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子を維持するように、または前記バルブ手段が開いているとき例えばＲＮＡ産物を含む流体の通過を可能にするように構成されうる。
【００６０】
一実施形態において、前記バルブ手段は、磁性トラップを備える。磁性トラップは前記媒質ポート上に置かれ、磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子を捕らえるように構成される。そのようにして磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子は、前記反応容器の洗浄のとき捕らえられうる。加えてまたは代わりに、前記反応容器に望まれずに残る磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子は捕らえられ、それによって例えば製造されたＲＮＡから分離される。前記磁性トラップは前記反応容器の外側に置かれてよく、少なくとも部分的に媒質パイプを取り囲んでよい。その媒質パイプは、前記反応容器の前記媒質ポートに接続されてよく、下流に当接する。前記媒質ポートは、前記反応容器の最下部に置かれうる。そのように、流体は、重力によって簡単に前記反応容器から流出しうる。
【００６１】
一実施形態において、前記磁性トラップは、磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子を留めることを可能にする、磁化可能または磁性の球、または、磁化可能または磁性リング、および／または半透過性フィルタを備える。前記磁性トラップは、電磁石または永久磁石を備えうる。前記磁性トラップは、前記反応容器から磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子が漏れるのを防ぐように制御可能でありうる。そのような制御は、有利には、磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子から製造されたＲＮＡを分離するときに使用され得る。
【００６２】
一実施形態において、前記バイオリアクターは、マルチポジションバルブを備える。後者は、前記磁性トラップの下流に置かれ、前記ポートを通って洗浄ガスまたは洗浄液を方向づけるように構成される。この構成は、前記ポートにおいてマルチポジションバルブから回収される磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子または他の沈殿を除去するのに役立つ。
【００６３】
一実施形態において、前述のマルチポジションバルブは、前記反応容器内にプロセスガスまたはプロセス流体を方向づけるように構成される。前記反応容器に方向づけられた前記プロセスガスまたはプロセス流体は、前記磁性粒子またはＤＮＡ磁性粒子の混合、撹拌または旋回につながりうる。
【００６４】
一実施形態において、前記バイオリアクターは、前記排出ポートに位置するバルブ手段、前記注入ポート、および／または前記注入／排出ポートを備え、前記バルブ手段が閉じているとき前記反応容器内に例えば前記磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子を維持するように、または前記バルブ手段が開いているとき例えばＲＮＡ産物を含む流体の通過を可能にするように構成される。有利には、前記バルブ手段は、前記排出ポートおよび／または注入ポートまたは前記組み合わされた注入／排出ポートの開閉を可能にするよう構成されうる。好適には、そのようなバルブ手段はボール弁、バタフライ弁、調節弁、ダイアフラム弁、ゲート弁、ニードル弁またはピンチ弁またはそれらの組み合わせでありうる。
【００６５】
一実施形態において、前記バイオリアクターは、前記バイオリアクターを垂直に（前記反応容器の長手方向に沿って）支持する、少なくとも第１脚部および第２脚部を備える。前記第１脚部は、第１導管を備え、前記第２脚部は第２導管を備える。前記第１導管は、前記バルブ手段と流体連結するように構成され、前記第２導管は前記温度素子の前記熱交換チャネルの一端と流体連結するように構成される。前記第１脚部および前記第２脚部は、前記反応容器の前記底部に置かれ、かつ、前記反応容器を垂直に安定化するように構成されうる。また、前記第１および前記第２脚部は、それぞれの脚部内に導管を備えうる。前記第１脚部内に設置された前記第１導管の前記第１端は前記反応成分を供給するため、および／または排出するために前記バルブ手段に接続されてよく、前記第１導管の前記第２端は、前記反応媒質を供給するおよび／または排出する周辺装置に接続されうる。さらに、前記第２脚部内に設置された前記第２導管の前記第１端は、前記反応容器の周りにらせん状に巻き付いた前記熱交換チャネルの前記第２端に接続され、前記第２導管の前記第２端は前記熱交換媒質を供給するおよび／または排出する周辺装置に接続されうる。したがって、前記反応容器は簡潔に設計されうる。
【００６６】
一実施形態において、前記バイオリアクターは出口ポートを備える。前記出口ポートは排気ダクトおよび廃棄チャネルのうちの少なくとも１つに接続される。例えば、前記出口ポートはマルチポジションバルブによって少なくとも前記排気ダクトおよび前記廃棄チャネルの両方に接続されうる。前記出口ポートは、排ガスまたは前記反応容器内で発生する排ガスを受け、通気することを可能にしうる。廃液または洗浄液の場合、前記出口ポートは前記反応容器から外に前記液体を排出するために役立ちうる。前記出口ポート、前記排気ダクトおよび／または前記廃棄チャネルは、圧力計測および／または圧力調節のための少なくとも１つの手段を保持しうる。
【００６７】
一実施形態において、前記バイオリアクターは、ホールセンサをさらに備える。前記ホールセンサは前記磁性トラップの下流に構成され、磁場を検出するのに役立つ。前記ホールセンサは、磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子のない、前記磁性トラップ下流のキャピラリーに流入する例えば流体などの製品を注視しうるか、または制御しうる。このようにして、前記ホールセンサは前記磁性トラップの正しい動作の制御に役立つ。例えば磁性粒子またはＤＮＡ磁性粒子から発生する磁場の測定の結果として、前記ホールセンサによる誤った信号が与えられうる。
【００６８】
本発明に関して、「下流」および「上流」は、本発明によってカバーされるプロセス内の流体またはガスの動きの方向を表す。例えば、ホールセンサが磁性トラップの下流に構成されるとき、これは前記磁性トラップおよび前記ホールセンサは流体またはガスが運ばれるキャピラリーに、例えば取り囲んで配置されることと、前記キャピラリー内を運ばれる流体またはガスが最初に前記磁性トラップを通りすぎ、その後前記ホールセンサを通りすぎることとを意味する。
【００６９】
一実施形態において、前記反応容器はチタンを含む。チタンは低い保磁性、換言すれば残留磁気、を含み、これは外部磁場が除去された後強磁性材料中に磁化が残されることを意味する。したがって、チタンで作られた前記反応容器は、前記反応容器内に含まれる前記磁気リングおよび前記磁気粒子によって生成された磁力との間の即時の相互作用を提供しうる。
【００７０】
好適には、前記反応容器は、例えば洗浄手順に耐性のある（化学的に耐性のある）、極端な温度（例えば、７５℃および８５℃、洗浄手順のため）、極端なｐＨ値（塩基または酸での前記リアクターの洗浄、例えばＮａＯＨでの洗浄）、機械的な力（例えば磁性粒子によって引き起こされる摩擦）、および／または腐食に対して耐性がある材料を有しうる。また、前記反応容器の材料は、およそ２０℃の使用温度で熱伝導性であるべきである（例えばＷ／（ｍＫ）値が少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５）。
【００７１】
好適には、および本発明に関して特に重要なことに、前記反応容器の前記内面は、前記最終生成物を汚染させうる、望まれない化合物を放出しない表面材料を有する。前記反応容器および／または前記反応容器の前記内面の適した材料は、常磁性体、化学的に耐性のある、ｐＨ耐性のある、温度耐性のある、および熱伝導性のオーステナイト系ステンレス鋼（例えば、１．４４０４（ＡＩＳＩ  ３１６Ｌ）、１．４４３５（ＡＩＳＩ  ３１６Ｌ））、鉄のないＨａｓｔｅｌｌｏｙ（登録商標）合金またはチタン（Ｔｉ１）である。
【００７２】
前記反応容器および／または前記反応容器の前記内面のさらに適した材料は、ガラス（例えばホウケイ酸ガラス）、工業用セラミック（例えばＦＲＩＤＵＲＩＴ（登録商標））、ポリアリールエーテルケトン（例えば、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ））、熱可塑性物質（例えばＤｕｒａＦｏｒｍ（登録商標）Ｐａ  ｏｒ  ＤｕｒａＦｏｒｍ（登録商標）ＧＦ）であり、これらすべては非磁性であり、化学的耐性があり、ｐＨ耐性があり、および温度耐性がある。ガラス（例えばホウケイ酸ガラス）の利点は、前記反応容器が外観検査しうることでありうる。
【００７３】
一実施形態において、前記バイオリアクターは、前記媒質ポートまたは前記媒質パイプに（半透過性）フィルタ要素をさらに備える。前記フィルタは、前記反応容器内に磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子を引き止めるのを促進しうる。前記フィルタ要素は、効果的なフィルタのための１μｍより小さい孔サイズを有しうる。前記半透過性フィルタは、磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子を引き止めるのに適した分画分子量（ＭＷＣＯ）のろ過膜を備えうる。詰まったフィルタによる前記ポートの詰まりを防ぐために、前記フィルタは、好ましくは単回使用フィルタでありうる。
【００７４】
一実施形態において、前記温度素子前記反応容器内の温度をＤＮＡ固定化またはＲＮＡ転写温度の２０℃〜３７℃に調整するように構成される。加えて、前記温度素子は前記反応容器内を７５℃〜８５℃の洗浄温度に調整するようにも構成されうる。適した温度（例えば２０℃〜３７℃または７５℃〜８５℃）は、温度計測および／または温度調整のための少なくとも１つの手段（例えば温度センサ）によって制御されてよく、前記少なくとも１つの手段は、好適には、前記反応容器の前記内面に、および／または前記反応容器に近接して、および／または前記温度素子に近接して置かれてよい。例えば磁気エネルギーまたは摩擦は生化学反応を妨げうる望まれない熱を生じうる（例えば反応中の望まれない温度上昇）ので、温度素子と温度計測および／または温度調整手段とは特に重要である。
【００７５】
一実施形態において、前記バイオリアクターは、注入フローセルおよび／または排出フローセルおよび／または出口フローセルを備える。前記注入フローセルは前記注入ポートの上流に配置されてよく、前記排出フローセルは前記排出ポートの下流に配置されてよく、前記出口フローセルは前記出口ポートの下流に配置されてよい。前記注入フローセルおよび／または前記排出フローセルおよび／または前記出口フローセルは較正可能であってよく、前記反応容器の中にまたはから外へ流れる流体またはガスの流量を監視するために配置されてよい。後者は、本発明に関する前記バイオリアクターの例えばＲＮＡ転写または洗浄の前記プロセスの部分的な制御に貢献しうる。
【００７６】
一実施形態において、反応容器は、加えて、ＲＮＡインビトロ転写のために適したバッファー、リボヌクレオシド３リン酸、キャップアナログ、修飾されたリボヌクレオシド３リン酸、リボヌクレアーゼ阻害剤、ピロホスファターゼ、ＭｇＣｌ２、抗酸化剤、ポリアミン、および、洗浄および／または衛生化のための溶液によって与えられる要素のうちの少なくとも１つを保持するように構成される。
【００７７】
一実施形態において、前記反応容器は、ｐＨまたは含まれている成分の濃度、ならびにマグネシウム濃度、リン酸塩濃度、温度、圧力、流速、ＲＮＡ濃度および／またはリボヌクレオチド三リン酸濃度を計測および／または調整するための少なくとも１つの手段を保持するようにさらに構成されうる。前記手段はそれぞれのセンサまたはそれぞれのプローブによって与えられうる。そのような手段は、本発明によってカバーされるプロセスの監視に貢献しうる。前記測定手段は計測装置またはセンサであってよく、前記調整手段はおそらく投薬装置でありうる。例えば、前記手段は、前記反応容器内に含まれる成分のｐＨを計測するためのセンサ、またはそのマグネシウム濃度または塩濃度を計測するためのセンサでありうる。さらに、例示的には、前記手段はその温度、圧力または流速を計測するための装置でありうる。流速の場合、その手段は、例えば前記反応容器の内側または流出におけるフローセルでありうる。
【００７８】
一実施形態において、前記バイオリアクターは、バッチ、繰り返しバッチ、連続モード、または、半連続または連続モードで作動するように設計される。繰り返しバッチＲＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）は、本明細書ですでに概説したような利点のある同一ＤＮＡ鋳型上のいくつかの反応を可能にするので好ましい。
【００７９】
前記バイオリアクターが機械的運動導入手段を備える一実施形態において、前記バイオリアクターは、前記反応容器を回転するための回転手段を備えうる。そのような回転は、前記排出ポートにおける磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子の沈殿を防ぐのを促進しうる。
【００８０】
第２態様において、本発明はＲＮＡインビトロ転写方法に向けられる。本方法は、以下の工程、
バイオリアクターの反応容器内にＤＮＡ磁性粒子およびＩＶＴマスターミックスを提供する工程であって、前記バイオリアクターは、前記第１態様の上記の実施形態のうちの少なくとも１つによって設計される、工程（Ｓ３ａ）、
前記ＤＮＡ磁性粒子および前記バイオリアクターの磁石ユニットの協働の手段によって、および／またはシェーカーの手段によって浮動性のＤＮＡ磁性粒子を前記ＩＶＴマスターミックスと混合する工程。この目的のために、前記磁石ユニットは、適切な電磁場によって、前記ＤＮＡ磁性粒子および前記ＩＶＴマスターの前記成の運動を誘導するように構成されうる。前記混合の結果として、インビトロ転写されたＲＮＡが得られる、工程（Ｓ３ｂ）
を備える。
【００８１】
前記第２態様の前記方法は、加えて、以下の工程、
バイオリアクターの反応容器内に磁性粒子、ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡ固定化バッファーを提供する工程であって、前記バイオリアクターは、前記第１態様の上記の実施形態のうちの少なくとも１つによって設計される、工程（Ｓ１）、
前記磁性粒子、前記ＤＮＡ鋳型および前記ＤＮＡ固定化バッファーを混合する工程。混合する工程は前記磁性粒子および磁石ユニットの協働の手段によって、および／またはシェーカーの手段によって実施される（Ｓ２）。この目的のために、前記磁石ユニットは、適切な電磁場によって前記磁性粒子およびＤＮＡ磁性粒子の運動を誘導するように構成されうる。前記混合工程の結果として、前記浮動性の磁性粒子上に固定化された前記ＤＮＡ鋳型であるＤＮＡ磁性粒子が得られる。前記浮動性の磁性粒子上に固定化された前記ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡを得るためにＩＶＴマスターミックスと混合されうる（上記のように、Ｓ３）。したがって、工程Ｓ１およびＳ２は前記工程Ｓ３の前に実施される、工程
を備えうる。
【００８２】
前記第２態様の前記方法は、加えて、以下の工程、
前記磁石ユニットの手段によってＤＮＡ磁性粒子を捕捉する工程および得られたインビトロ転写されたＲＮＡを例えば前記排出ポートを通って回収する工程／集積する工程（Ｓ４ａ）、
前記第１態様のバイオリアクターの反応容器内に新たなＩＶＴマスターミックスを提供する工程（Ｓ４ｂ），
浮動性のＤＮＡ磁性粒子を提供するために捕捉されたＤＮＡ磁性粒子を解離する工程（Ｓ４ｃ）、
ＲＮＡを得るために前記ＤＮＡ磁性粒子および磁石ユニットの協働の手段によって、および／またはシェーカーの手段によって、前記浮動性のＤＮＡ磁性粒子を前記ＩＶＴマスターミックスと混合する工程（Ｓ４ｄ）
を備えうる。
【００８３】
好ましくは、工程Ｓ４ａ〜Ｓ４ｄは工程Ｓ３後に実施される。前記方法工程（Ｓ４）は、１回より多いＲＮＡインビトロ転写反応が実施される実施形態において特に適している。好ましくは、前記方法工程は、少なくとも２回、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０または３０回まで実施される。
【００８４】
一実施形態において、本発明による前記方法は、ｐＨおよび／または塩濃度を調整する工程をさらに備えうる。
一実施形態において、本発明による前記方法は、前記反応容器を２０℃〜３７℃の間の温度に温度を合わせる工程をさらに備える。そのような温度はＲＮＡインビトロ転写に適している場合がある。前記温度を合わせる工程は前記反応容器を充填する工程の前に実施されうる。
【００８５】
磁性粒子上にＤＮＡ鋳型を固定化するための追加の方法工程において、前記反応容器は、２０℃〜２５℃の間の温度、好ましくは２２℃に温度を合わせられうる。さらに、追加の方法工程において、前記反応容器は、前記反応容器の洗浄プロセスのために／洗浄プロセス中に７５℃〜８５℃の間の温度に温度を合わせられる。
【００８６】
一実施形態において、前記方法は、洗浄ガスおよび／または洗浄液によって前記反応容器を洗浄する工程をさらに備える。洗浄前または洗浄中、前記反応容器は、例えば前述の７５℃〜８５℃の間の温度に加熱されうる。前記インビトロ転写されたＲＮＡを得た後、ＤＮＡ磁性粒子は前記ＤＮＡ磁性粒子および磁石ユニットの協働の手段によって、除去されうる。この方法工程は、例えばＤＮａｓｅ消化を実施する工程なしにＤＮＡ鋳型の除去を可能にする。
【００８７】
磁性粒子またはＤＮＡ磁性粒子の混合または捕捉／解離を可能にするために、前記磁石ユニットによって導入される例えば前記混合工程中の前記リアクターの壁への不可逆的な付着を避けるために前記磁性粒が常磁性体であることは重要である。適した磁性粒子の例はＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）磁性ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。
【００８８】
前記方法は、例えばＲＮＡ同一性、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡ純度などの評価を可能にしうる異なる品質管理工程をさらに備えうる。前記品質管理はライン内またはラインにおいて実施されうる。
【００８９】
本明細書に概説されたようなＲＮＡインビトロ転写方法は、１つのＲＮＡ種を含むＲＮＡ組成物を生成するように１つのＤＮＡ鋳型上で実施されうる。他の実施形態において、ＲＮＡインビトロ転写方法は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む組成物を生成するように少なくとも２つの異なるＤＮＡ鋳型上で実施されうる。したがって、例えば国際公開第２０１７／１０９０１３４号（特許文献３）に記載される方法が適合され、前記第１態様のバイオリアクターの反応容器内で実施されうる。
【００９０】
前記方法は、前記第１態様のバイオリアクターの反応容器内で実施されうる酵素的ＲＮＡキャッピングの工程（例えば磁性粒子上に固定化されたキャッピング酵素の使用、固定化されたキャッピング酵素は国際公開第２０１６／１９３２２６号（特許文献４）に開示された方法を使用して得られうる）をさらに備えうる。前記磁石ユニットは、適切な電磁場によって、磁性粒子上の前記キャッピング酵素および前記ＲＮＡの運動を誘導するように構成されうる。前記混合工程の結果として、キャップされたＲＮＡが得られる。
【００９１】
前記方法は、前記第１態様のバイオリアクターの反応容器内で実施されうる酵素的ＲＮＡポリアデニル化（例えば磁性ビーズ上に固定化されたポリＡポリメラーゼを使用、固定化されたポリＡポリメラーゼは国際公開第２０１６／１７４２７１号（特許文献５）に開示された方法を使用して得られうる）の工程をさらに備えうる。前記磁石ユニットは、適切な電磁場によって、磁性粒子上の前記ポリＡポリメラーゼおよび前記ＲＮＡの運動を誘導するように構成されうる。前記混合工程の結果として、ポリアデニル化されたＲＮＡが得られる。
【００９２】
第３態様において、本発明は、上記されたような方法における上記されたようなバイオリアクターの使用に向けられる。
さらに、前記第１態様の前記バイオリアクターは、ＲＮＡインビトロ転写反応に使用されてよく、前記ＤＮＡは固定されていないか、または非磁性粒子（例えばアガロースビーズ、セファロースビーズ、非磁性ポリスチロールビーズ、および他の適切な合成樹脂）上に固定化され、かつ、前記混合工程は、ＤＮＡ鋳型を運んでいない磁性粒子および前記第１態様の前記バイオリアクターの前記磁石ユニットの協働の手段によって導入される。そのような一実施形態において、前記ＲＮＡインビトロ転写反応は一度だけ実施され得る。さらに、前記バイオリアクターは、核酸を含む任意の酵素的な方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温ＤＮＡ増幅、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写）において使用されてよく、混合工程は、磁性粒子と前記第１態様の前記バイオリアクターの前記磁性ユニットとの協働の手段によって導入される。
【００９３】
第４態様において、本発明は鋳型ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュールに向けられる。前記モジュールは、前記第１態様の上述の実施形態のうちの少なくとも１つによるバイオリアクターと、さらにＩＶＴマスターミックスを調製するためのユニット、固定化バッファーを調製するためのユニット、得られたＲＮＡ産物を精製するための装置、ＲＮＡ前処理のための装置および／またはＲＮＡ滅菌ろ過のための装置のうちの少なくとも１つと、を備える。
【００９４】
好ましい実施形態において、得られたＲＮＡ産物を精製するための前記装置はＨＰＬＣユニット、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣを実施するためのユニットを備える。それに関して特に好ましいのは、国際公開第２００８／０７７５９２号（特許文献６）に開示される方法を使用した、好ましくは多孔性の、非アルキル化ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）逆相を使用したＲＰ−ＨＰＬＣであって、前記逆相はビーズによって形成されるか、または重合ブロックとして生じる（例えばモノリシック）。代わりに、または加えて、得られたＲＮＡ産物を精製するための前記装置はオリゴｄＴ機能化マトリックスまたはビーズまたはカラム（例えば国際公開第２０１４／１５２０３１号（特許文献７）に記載されるような）を介した、得られたポリアデニル化ＲＮＡのアフィニティー精製のためのオリゴｄＴ精製ユニットを備えうる。
【００９５】
好ましい実施形態において、ＲＮＡ前処理のための前記装置は、接線流ろ過ユニットを備える。それに関して特に好ましいのは国際公開第２０１６／１９３２０６号（特許文献８）に記載される接線流ろ過であって、ＴＦＦはＲＮＡの透析ろ過および／または濃縮および／または精製に使用される。
【００９６】
一実施形態において、前記モジュールは媒質供給ユニットをさらに備える。後者のユニットは、前記ＩＶＴマスターミックスを調製するための前記ユニットに対して前記ＩＶＴマスターミックスの成分を供給するように構成される。
【００９７】
一実施形態において、前記ＤＮＡ鋳型は、末端修飾または末端機能化されたＰＣＲ生成されたＤＮＡ鋳型である。好ましくは、前記ＤＮＡ鋳型は、ビオチン化されたＰＣＲ生成されたＤＮＡ鋳型、非修飾または末端修飾線状化プラスミドＤＮＡ、または、非修飾または末端修飾線状化ドギーボーンＤＮＡである。
【００９８】
第５態様において、本発明は、前述の前記第１態様のバイオリアクターまたは前記第４態様のモジュールを備える自動化されたＲＮＡ製造装置に向けられ、前記装置はＤＮＡ合成モジュールおよびＲＮＡ配合モジュールのうちの少なくとも１つをさらに備える。
【００９９】
一実施形態において、ＤＮＡ合成のための前記モジュールは、態様１のバイオリアクターまたは態様２のＤＮＡをＲＮＡに転写するための前記モジュールにおける使用に適した十分な量のＤＮＡを生成するように構成される。好ましい実施形態において、ＤＮＡ合成のための前記モジュールはＰＣＲベースのＤＮＡ増幅のためのサーモサイクラー要素および得られたＰＣＲ産物を精製するための要素を備えうる。好適には、ＤＮＡ合成のための前記モジュールは、ビオチン化されたＤＮＡ鋳型、好ましくはＰＣＲベースのビオチン化されたＤＮＡ鋳型を生成しうる。
【０１００】
一実施形態において、ＲＮＡ配合のための前記モジュールは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）カプセル化されたＲＮＡを生成するように構成される。したがって、ＲＮＡ配合のための前記モジュールは、ＬＮＰ配合モジュールを備え、前記ＬＮＰ配合モジュールは、例えばポンプ要素（例えばシリンジポンプ）、接線流要素、およびろ過要素（例えば滅菌フィルタを備える）を備えうる。
【０１０１】
一実施形態において、ＲＮＡ配合のための前記モジュールは、ポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質（例えばプロタミンまたは高分子担体、例えばポリエチレングリコール／ペプチドポリマー、例えば国際公開第２０１２／０１３３２６号（特許文献９）による）と複合体化されたＲＮＡを生成するように構成される。したがって、ＲＮＡ配合のための前記モジュールは、プロタミン配合／複合体生成モジュール、および／またはポリエチレングリコール／ペプチドポリマー配合／複合体生成モジュールのうちの少なくとも１つを備える。それに関して、ＲＮＡ配合のための前記モジュールは、好適には国際公開第２０１６／１６５８２５号（特許文献１０）および／または国際公開第２０１８／０４１９２１号（特許文献１１）による方法および手段を使用しうる。
【０１０２】
一実施形態において、前記自動化装置は密閉コンテナ内、および好ましくは単一コンテナ内に配置され、前記コンテナは層流空気流生成のためのユニットを備える。単一コンテナ内のそのような構成は、設備および人員に加えて、とりわけスペースを節約するのを促進する。また、前記自動化装置は持ち運び可能であるように構成されてよく、例えばパンデミックが発生した地域への輸送を可能にするように寸法を合わせられる。
【０１０３】
一実施形態において、前記自動化装置は、ＤＮＡ固定化モジュール（例えばプラスミドＤＮＡ固定化のため、例えばＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４２６４またはＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６６８４に記載される）、ＤＮＡ線状化モジュール（例えばプラスミドＤＮＡまたはドギーボーンＤＮＡの線状化のため）、ＲＮＡキャッピングモジュール（例えばｃａｐ０またはｃａｐ１構造をインビトロ転写されたＲＮＡに付加するため）、ＲＮＡポリアデニル化モジュール（例えばポリＡ鎖をインビトロ転写されたＲＮＡに付加するため）、ＲＮＡ混合モジュール（例えば少なくとも２つの異なるＲＮＡ種を混合するため）、ＲＮＡ噴霧乾燥モジュール（例えば噴霧乾燥または凍結噴霧乾燥ＲＮＡを生成するため、例えば国際公開第２０１６／１８４５７５号（特許文献１２）または国際公開第２０１６／１８４５７６号（特許文献１３）による）、凍結乾燥されたＲＮＡ生成のためのＲＮＡ凍結乾燥モジュール（例えば国際公開第２０１６／１６５８３１号（特許文献１４）または国際公開第２０１１／０６９５８６号（特許文献１５）による）、および／または最終生成物貯蔵のためのモジュール、のうちの少なくとも１つをさらに備える。
【０１０４】
一実施形態において、前記自動化装置は、ＮＧＳ（次世代シーケンサー）モジュール（例えば配列解析のため）、質量分析（ＭＳ）モジュール、品質管理モジュール（例えば分析ＨＰＬＣのためのＨＰＬＣユニットを備える）、ｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲモジュール、キャピラリー電気泳動モジュール、媒質供給ラックまたは媒質供給モジュール、文書化モジュールおよび／または全ての処理工程および高次制御および文書化システムのためのインターフェースのためのコンピュータ支援制御のためのモジュールのうちの少なくとも１つをさらに備える。
【０１０５】
要約すると、経済的な、制御可能な、再現可能な、連続的な（繰り返しバッチ）、およびＧＭＰ適合性のＲＮＡ製造装置および方法が示される。記載された方法および手段は、いくつかのＲＮＡ（大量）製造プロセスにおけるＤＮＡ鋳型の繰り返し使用を可能にする。上述された前記装置は、したがって、例えば、ＲＮＡ製造の加速された製造を可能にする。さらに、適切なサイズのために、自動化された持ち運び可能な上記のＲＮＡ製造装置は、パンデミックの発生した地域におけるＲＮＡ治療薬の製造に関して有利である。
【０１０６】
独立請求項によるＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクター、ＲＮＡインビトロ転写方法、前記方法によるバイオリアクターの使用、ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュール、および自動化されたＲＮＡ製造装置は、同様の、および／または同一の好ましい実施形態、とりわけ、従属項に定義されるような実施形態を有することを理解されたい。本発明の好ましい実施形態は、また、それぞれの独立請求項と従属項の任意の組み合わせでもあり得ることをさらに理解されたい。
【０１０７】
本発明のこれらのおよび他の態様は下記の実施形態を参照することから明らかになり、かつ解明されるであろう。
以下に示される図面は、単なる例示であり、本発明をさらに記載するものではない。これらの図面は、本発明をそれに限定するように解釈されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】本発明の一実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図２】本発明の一実施形態による反応容器の概略図。
【図３Ａ】本発明の一実施形態による反応容器の概略図。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態による反応容器の概略図。
【図４】本発明の一実施形態による磁石ユニットの概略図。
【図５】本発明の別の実施形態による磁気リングの概略図。
【図６】本発明の別の実施形態による磁石ユニットの概略図。
【図７Ａ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図７Ｂ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図７Ｃ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図８Ａ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図８Ｂ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図８Ｃ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図９Ａ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図９Ｂ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図９Ｃ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図９Ｄ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図９Ｅ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図９Ｆ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図９Ｇ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図９Ｈ】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図１０】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図１１】本発明の別の実施形態によるバイオリアクターの概略図。
【図１２Ａ】本発明の一実施形態による可動磁石ユニットのあるバイオリアクターの概略図。
【図１２Ｂ】本発明の一実施形態による可動磁石ユニットのあるバイオリアクターの概略図。
【図１３】本発明の一実施形態による回転可能な磁石ユニットのあるバイオリアクターの概略図。
【図１４Ａ】オービタルシェーカー付きバイオリアクターの概略図。
【図１４Ｂ】オービタルシェーカー付きバイオリアクターの概略図。
【図１５】ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュールの例示的な構成成分を示す図。
【図１６】一実施形態によるＤＮＡをＲＮＡに転写するための一例示的な方法を示す図。
【図１７】一実施形態による自動化ＲＮＡ製造のための一例示的な装置の図。
【図１８】一実施形態によるＲＮＡ製造のための一例示的なプロセスの概観を示す図。
【図１９】３ＩＶＴ反応中の同じ固定化ＤＮＡ鋳型を使用した繰り返しバッチＲＮＡインビトロ転写の結果を示す図。実験は実施例１において記載されるように実施された。
【図２０Ａ】ＨｅｐＧ２細胞において発現された、製造されたＲＮＡ（ＲＡＶＧ  ｍＲＮＡ）の効力を示す図。本実験は実施例１に記載されるように実施された。
【図２０Ｂ】ＨｅｐＧ２細胞において発現された、製造されたＲＮＡ（ＲＡＶＧ  ｍＲＮＡ）の効力を示す図。本実験は実施例１に記載されるように実施された。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
定義
明確性と読みやすさのために以下の定義が提供される。これらの定義のために述べられる任意の技術的な特徴は、本発明のそれぞれおよびすべての実施形態に関して読まれてもよい。追加の定義および説明は、これらの実施形態の文脈において具体的に提供される場合がある。
【０１１０】
ドギーボーン（Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ）、ドギーボーンＤＮＡ（ｄｏｇｇｙ  ｂｏｎｅ  ＤＮＡ）：
本明細書に使用されるとき、用語「ドギーボーン（商標）」（ｄｂＤＮＡ）は、Ｔｏｕｃｈｌｉｇｈｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌｔｄによって酵素的に開発された、最小限の、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを示す。直鎖状ＤＮＡは、迅速に製造され、プラスミドフリーであり、エンコードされた対象、プロモーター（例えばポリＡ鎖およびテロメア端）の配列のみを含むベクターカセットを産生する酵素的なプロセスによって合成される。
【０１１１】
混合：
本発明の文脈において、「混合」は、典型的には、それをより均一なものにする意図を持った不均一な物理システムの操作を含むプロセスである。混合は、１つ以上の流れ、成分、または相の間で物質移動を可能にするように実施される。混合は、基本的には、より均一な状態に向けた空間依存濃度の時間の進化である。
【０１１２】
本発明の文脈において、本明細書に定義される反応容器内に含まれる成分の改善された混合のための磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子と協働することを、好ましくは、機械的応力（せん断応力など）を前記成分に加えることなく、可能にする磁石ユニットが使用される。とりわけ、混合される成分に機械的応力を誘導することが知られる従来の混合手段は、好ましくは、本発明によれば回避される。例えば、流体の混合は、好ましくは、反応容器を振盪および／またはかき混ぜることなしに実施される。代わりに、磁石ユニットは、磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子に作用する力につながる適切な磁場を生成するように構成され、その結果ＤＮＡ磁性粒子は、反応容器内で運動しはじめ、それによって、反応容器内に含まれる成分の混合につながる。
【０１１３】
磁性粒子およびまたはＤＮＡ磁性粒子の誘導された運動は、反応容器内に含まれる成分の振盪または振動によっては引き起こされない乱流を導入する場合があり、乱流は均一な組成物を生成するように反応容器内の成分の改善された混合を可能にする。
【０１１４】
ＲＮＡインビトロ転写：
用語「ＲＮＡインビトロ転写」は、プロセスに関連し、ＲＮＡは、無細胞系で合成される。ＲＮＡは、適切なＤＮＡ鋳型のＤＮＡ依存性ＲＮＡインビトロ転写によって得られてもよく、本発明によると適切なＤＮＡ鋳型は線状化プラスミドＤＮＡ鋳型またはＰＣＲ増幅されたＤＮＡ鋳型でありうる。ＲＮＡインビトロ転写を制御するプロモーターは任意のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモーターであり得る。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの具体例はＴ７、Ｔ３、ＳＰ６、またはＳｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１１５】
ＤＮＡ鋳型（例えば、プラスミドＤＮＡ、ドギーボーンＤＮＡ）は、ＲＮＡインビトロ転写される前に適した制限酵素で線状化されてよく、および磁性ビーズ上に固定化されてよい（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４２６４またはＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６６８４に記載されるように）。代わりに、ＤＮＡ鋳型は、磁性粒子上に固定化されたＰＣＲ増幅されたＤＮＡとして（ＰＣＲベースのＤＮＡ鋳型増幅のためのビオチン化されたプライマーの使用および続くストレプトアビジン磁性ビーズ上への固定化）提供されうる。
【０１１６】
ＲＮＡインビトロ転写において使用される試薬は、典型的には、バクテリオファージにエンコードされたＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、またはＳｙｎ５）などのそれぞれのＲＮＡポリメラーゼに対して高い親和性結合を有するプロモーター配列のあるＤＮＡ鋳型（線状化ＤＮＡまたは直鎖状ＰＣＲ産物）と、４塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシル）に対するリボヌクレオチド三リン酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＮＴＰｓ）と、任意選択的にキャップアナログ（例えばｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ）または国際公開第２０１７／０５３２９７号の請求項１〜５に開示される構造から由来しうるキャップアナログまたは国際公開第２０１８／０７５８２７号の請求項１または請求項２１に定義される構造から由来しうる任意のキャップ構造）と、任意選択的に、本明細書に定義されるさらに修飾ヌクレオチドと、ＤＮＡ鋳型内のプロモーター配列に結合することが可能なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６、またはＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼ）と、任意選択的に、任意の潜在的に汚染したＲＮａｓｅを失活させるためのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）阻害剤と、任意選択的に、ピロリン酸を分解するためのピロホスファターゼ（ＲＮＡ合成の阻害剤）と、ポリメラーゼにコファクターとしてＭｇ２＋イオンを供給するＭｇＣｌ２と、適したｐＨ値を維持するための緩衝液（ＴＲＩＳまたはＨＥＰＥＳ）であって、緩衝液は、また、抗酸化剤（例えばＤＴＴ）、および／または例えば国際公開第２０１７／１０９１６１号に開示されるようなクエン酸塩および／またはベタインを含む緩衝液系などの最適な濃度のスペルミジンなどのポリアミンとを含む、緩衝液とを含む。
【０１１７】
ＲＮＡインビトロ転写において使用されるヌクレオチド混合物は、加えて、本明細書に定義される修飾ヌクレオチドを含んでもよい。それに関して、好ましい修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチルシトシン、および５−メトキシウリジンを含む。ＲＮＡインビトロ転写反応に使用されるヌクレオチド混合物（すなわち混合物内の各ヌクレオチドの部分）は、好ましくは国際公開第２０１５／１８８９３３号に記載されるように、所与のＲＮＡ配列に最適化されてよい。
【０１１８】
ＲＮＡインビトロ転写マスターミックス、ＩＶＴマスターミックス：
ＲＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）マスターミックスは、上に定義したＲＮＡインビトロ転写反応を実施するために必要な成分を含みうる。したがってＩＶＴマスターミックスは、ヌクレオチド混合物、キャップアナログ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、ＭｇＣｌ２、緩衝液、抗酸化剤、ベタイン、クエン酸塩から選択される成分のうちの少なくとも１つを含みうる。
【０１１９】
半透過性フィルタ：
特定の粒子が孔径よりも小さい場合に、その粒子がフィルタ材料の孔を通ることを可能にし、それによってフィルタ材料の孔径よりも大きな粒子の透過を防ぐフィルタである。
【０１２０】
下記に少なくとも特定の数の実施形態を含むように群が定義された場合、これは、また、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群を含有することを意味する。
本明細書および特許請求の範囲に使用されるとき、特に文脈が指示しなければ、単数形の「ａ」および「ａｎ」は、また、対応する複数形をも含む。
【０１２１】
用語「含む／備える（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）」は限定ではないことを理解されたい。本発明の目的のために、用語「からなる（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ”）」は、用語「を含む／備える（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ”）」の好ましい実施形態であるとみなされる。
【０１２２】
本発明の根底にある発見の詳細な説明
本発明は、ＧＭＰに従った条件下において自動化された方法で操作可能であるように構成されたＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクターに関連する。本発明の一実施形態によるＲＮＡインビトロ転写用バイオリアクターの概略図は、特に図１および７に提供される。
【０１２３】
バイオリアクター１は、磁性粒子、ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡ固定化バッファー、ＤＮＡ磁性粒子およびＩＶＴマスターミックスを保持するための反応容器２を含む。反応容器２の内面２１は、卵形の内部形状を有する。代わりに、本発明の反応容器２の内面２１は、楕円形または長円形でありうる。いずれにせよ、反応容器２の内面２１は、角縁のない形状を有することが好ましい。これは特にバイオリアクター１の混合特性にとって重要でありうる。また、前記楕円形、長円形または卵形、とりわけ角縁の欠如は、掃除しやすさ（ＧＭＰ適合性のために重要）にとって有利であり、バイオリアクター内での望まれない沈殿形成のリスクを減少させる。また、卵形は、流体（例えばＲＮＡ産物）が媒質ポート６を経由して媒質パイプ６６内へバイオリアクター１から簡単に流れ出る場合がある平らな丸い形状などに対して利点を有する（図１１も参照）。
【０１２４】
さらに、上記の内部形状は、概して角縁のない形状、また特に楕円形、長円形または卵形は流体の良好な排出を補助するので内面においてタンパク性残留物などの固着および乾ききるのを防ぐのに役立つ。加えて、楕円形、長円形または卵形は、例えば「円錐形」などに対して、リアクター底部におけるＤＮＡ磁性粒子の集合のリスク（ＲＮＡインビトロ転写の収量低下（それらのＤＮＡ鋳型はＲＮＡポリメラーゼが接近できないなど）または、媒質ポート６を詰まらせる場合がある）を最小にする利点を有する。さらに媒質ポート６の詰まりを防ぐために、液体は、転写反応中に定期的に媒質ポート６を通ってバイオリアクター１内に洗い流されうる。これらの洗い流しは、加えて、バイオリアクター内の生化学反応（例えばＩＶＴ反応、ＤＮＡ固定化反応）の混合特性を改善しうる。
【０１２５】
バイオリアクター１は、浮動性の磁性粒子（「ＤＮＡ磁性粒子」）上に固定化されたＤＮＡ鋳型上で繰り返しＲＮＡインビトロ転写反応を可能にするように構成される。例えば、ＤＮＡ鋳型は磁性ビーズ上に固定化されたＰＣＲ増幅されたＤＮＡとして（ＰＣＲベースのＤＮＡ鋳型増幅のためのビオチン化されたプライマーの使用および続くストレプトアビジン磁性ビーズ上の固定化）または磁性ビーズ上に固定化された線状化プラスミドＤＮＡ（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４２６４またはＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６６８４に記載されるように）として提供されうる。
【０１２６】
バイオリアクター１は、反応容器２に位置する磁石ユニット３をさらに含む。磁石ユニット３は、磁性粒子またはＤＮＡ磁性粒子を含む反応の、非接触混合（混合プロセス中で混合手段を全く実装する必要がないことを含意する）を可能にし、これは、例えばＲＮＡの製薬製造におけるバイオリアクター１の十分な掃除しやすさに関して有利な特徴である。また、インビトロ反応におけるＲＮＡの混合は、バイオリアクター１の回転／振盪なしに実施されうる。これは、バイオリアクター１上に据え付けられる必要がある異なる注入ポートおよび排出ポートにより回転または振盪が強く損なわれるので、特に有利である。
【０１２７】
さらに、磁石ユニット３は、別のサイクルのＲＮＡインビトロ転写を開始する前にＤＮＡ磁性粒子を捕捉するために使用される場合があり、それによって全体的なＲＮＡ製造コストを劇的に減少させる、同じＤＮＡ鋳型上の繰り返しバッチＲＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）を可能にする。さらに、磁石ユニット３はバイオリアクター１の最終的な洗浄または衛生化のためのＤＮＡ磁性粒子除去のために使用されうる。したがって、ＤＮＡは、酵素的なＤＮａｓｅ処理の必要なしに除去されうる。これは、（ｉ）そのような酵素が必要ではないのでコストを低減する、（ｉｉ）さらなる成分（すなわちＤＮａｓｅ）の最終的なＲＮＡ産物への汚染のリスクを低減する、および（ｉｉｉ）ＤＮＡ断片または部分的に消化されたＤＮＡ断片の最終的なＲＮＡ産物への汚染のリスクを低減する。
【０１２８】
図１において、磁石ユニット３はリング形状において形成され（図４も参照）、磁石ユニット３の中心３３で反応容器２を受け、その結果、磁石ユニット３は反応容器２の周囲を回転しうる。磁石ユニット３はアーム３７を経由してスピンドル軸３６に取り付けられ、スピンドル軸３６は磁石ユニット３を垂直方向に動かしうる。磁石ユニット３を垂直に動かすことによって、磁場は反応容器２の長手方向に沿って生成され得る。したがって、反応容器２内の成分の均一な混合は径方向および長手方向の両方において磁性粒子を誘導することによって実現されうる。磁石ユニット３のための回転駆動手段３８は、反応容器２の上のアーム３７に直接配置され、スピンドル軸３６を操作するための駆動手段３９は、スピンドル軸３６において直接配置される。
【０１２９】
図２は透視図において反応容器２を示し、図３Ａは反応容器２の下面図を示し、および図３Ｂは、反応容器２の上面図を示す。反応容器２は、チタンなどの化学的に耐性があり、極端な温度、極端なｐＨ値、機械的な力、および／または腐食に対して耐性がある材料から作られうる。
【０１３０】
本発明によるバイオリアクター１の全ての実施形態において、反応容器２の内面２１は、角縁のない形状、好ましくは楕円形、長円形または卵形を有する。反応容器２の内面２１は、値Ｒａ＜＝０．８であるように研磨されることがさらに好ましい。そのようなＲａ値を得るための適した方法は、当業者には既知である。例えば、内面２１は、機械的に研磨され、電解研磨され、または化学的研磨などされる場合がある。
【０１３１】
図３Ｂに示されるように、反応容器２は排ガスまたは廃液のための出口ポート７を備える。出口ポート７は、例えば、容器を充填中に反応容器２を通気するために使用されうる。この目的のために出口ポート７は、反応容器２の最上点に配置される。温度素子５の熱交換チャネル５１の第１端５２は、反応容器２の上部に配置される。図１１に示されるように、出口ポート７は、排気ダクト７３および廃棄チャネル７４のうちの少なくとも１つに接続されうる。例えば出口ポート７は、マルチポジションバルブによって排気ダクト７３および廃棄チャネル７４の少なくとも両方に接続されうる。出口ポート７は、排ガスまたは反応容器２内で発生する排ガスを受け、通気することを可能にしうる。廃液または洗浄液の場合、出口ポート７は、反応容器２から外に液体を排出するために役立ちうる。出口ポート排気ダクトおよび／または廃棄チャネルは、圧力計測および／または圧力調節のための少なくとも１つの手段を保持しうる。
【０１３２】
さらに、媒質ポート６は、反応容器２の最下点に配置され、成分の供給または排出をガイドするバルブ手段６０にさらに接続されうる（図３Ａ内）。反応容器２は、２つの脚部２５，２６を備え、これらは反応容器２を垂直に支持しうる。さらに各脚部２５，２６は、脚部２５，２６を通って延在する導管２５１，２６１を備える。したがって、第１脚部２５は、バルブ手段６０と流体連結するように構成される第１導管２５１を備え、第２脚部２６は、温度素子５の熱交換チャネル５１の第２端５３と流体連結するよう構成された第２導管２６１を備える（図７Ｂおよび７Ｃ参照）。
【０１３３】
図４は磁石ユニット３の好ましい実施形態を示す。磁石ユニット３は、磁性リング３１および複数のロッド３２を備える星形に形成される。磁性リング３１およびロッド３２は、複数の磁化可能な積層電気シートから作られてよく、それ故に磁場からの周辺成分を遮蔽するための積層スタックを形成する磁気リング３１は、反応容器２を取り囲むように設計される。換言すれば、反応容器２は、磁性リング３１の中心３３内に置かれ得る。
【０１３４】
磁性リング３１は、第１ロッド３２０および第２ロッド３２２の自由端３２１，３２３が互いに向かい合うように、磁性リング３１の内周３４から磁性リング３１の中心３３へ延在する第１ロッド３２０および第２ロッド３２２を備える。第１ロッド３２０の自由端３２１は、Ｎ極の磁石を備え、第２ロッド３２２の自由端３２３は、Ｓ極の磁石を備える。図５に示すように、しかしながら、ロッド３２の数および長さは変化し得る。ロッドは、磁性リング３１の内周３４に配置され、磁性リング３１の中心３３の方向に延在する。複数のロッド３２は星形に配置され、かつ互いに等間隔をおかれ、磁性リング３１は、対称的に形成される。ロッド３２の各自由端において、Ｎ極の磁石およびＳ極の磁石は交互に配置される。
【０１３５】
代わりに、図６に示されるように、磁石ユニット３は、複数のガイドプレート３５０および複数の電気コイル３５１を含む磁気リング３１を備える。星形のガイドプレート３５０は、磁性リング３１の内周３４から磁性リング３１の中心３３に対して延在する。各ガイドプレート３５０は、磁場を生成するための電気コイル３５１を備える。磁気リング３１は冷却手段３５２を有するハウジングによって取り囲まれる。冷却手段３５２は、電磁コイルを通る高電流によって生成される熱を運び去るように磁性リング３１の周囲に沿って、磁性リングのハウジング内に組み込まれる。冷却手段３５２は、水などの冷媒がその中に提供される冷却チャネルでありうる。
【０１３６】
図７Ａ〜７Ｃは、バイオリアクター１の別の好ましい実施形態を示す。反応容器２は、固体材料から作られてよく、内面２１および外面２３を備える。温度素子５は、反応容器２の温度を調整するために、内面２１と外面２３との間に組み込まれる。温度素子５は、反応容器２の長手軸に関して径方向に反応容器２をらせん状に取り囲む熱交換チャネル５１を備える。そのような複雑な外形のある反応容器２の製造を容易にするために、反応容器２は、追加の製造手段によって製造されうる。
【０１３７】
熱交換チャネル５１は、第２脚部２６内の第２導管２６１に流体連結した第１端５２および第２端５３を備える。第１端５２は、反応容器２の上部に配置されるが、出口ポート７の確実なアクセシビリティを確保するように、最上部または出口ポートからずれて置かれる。熱交換チャネルの第２端は、反応容器２の底部に配置されるが、媒質ポート６の確実なアクセシビリティを確保するように、最下部または媒質ポート６からずれて置かれる。第１端５２または第２端５３を通って、水などの熱交換媒質は、反応容器２内の成分を加熱または冷却するために熱交換チャネル５１内へと供給され得る。
【０１３８】
図８Ａおよび８Ｂは、温度素子５の一代替的実施例を示す。温度素子５は、少なくとも部分的に、好ましくは完全に、反応容器２の長手軸に関して径方向に反応容器２をらせん状に取り囲む加熱ワイヤ５４を備える。加熱ワイヤ５４は、少なくとも部分的に反応容器２の外面２３内に組み込まれる（図８Ａ内）。加えて、または代わりに、反応容器２の外面２３は断熱材５５でコートされてもよく、加熱ワイヤ５４は、少なくとも部分的に断熱材５５内に納まる（図８Ｂ内）。
【０１３９】
図７Ｂおよび７Ｃを参照すると、反応容器２は、反応容器２の長手方向において、少なくとも部分的に反応容器２の内面２１に配置される、少なくとも１つ、好ましくは２つのフローブレーカ２４を備える。フローブレーカ２４は、反応容器２内の成分の単一の流れを妨げる場合があり、それによって混合を改善し得る。また、フローブレーカ２４は、磁石ユニット３が回転を停止し、および／または回転方向を変える場合、磁気粒子の沈殿を妨げうる。２つのフローブレーカ２４は、反応容器２の長手軸に関して径方向に互いに間隔をあけて離れている。
【０１４０】
図９Ａ〜９Ｈに示されるように、フローブレーカ２４は、リブ形であってよく、反応容器２の長手方向に沿って反応容器２の内面２１から突出しうる。別の実施形態において、フローブレーカ２４は弓形であり、Ｔ形の断面（図９Ａおよび９Ｂ内）またはＬ形の断面（図９Ｅおよび９Ｆ内）を備える。さらに別の実施形態において、フローブレーカ２４は、波状にされるか、または、波形である（図９Ｃおよび９Ｄ内）。代わりに、フローブレーカ２４は、反応容器２の内面２１に長手方向に沿って、互いに間隔をあけて離れている半円形の複数の突出部を備える（図９Ｇおよび９Ｈ内）。
【０１４１】
とりわけ、図１０〜１２に関して述べられる本発明のバイオリアクター１の要素および特徴は、本明細書に明確に述べられていない場合でも図１〜９に示されるリアクターの一部と同様でありうる。したがって、図１〜９に示されるバイオリアクター１は、磁性トラップ６１、ホールセンサ６３、フローセル６４、温度センサ９１、追加センサ９２、または特定充填レベル２７または最大流体振幅２８から選択される少なくとも１つをも備える。
【０１４２】
図１０は、バイオリアクター１の別の実施形態を示す。図１０のバイオリアクター１は、電反応容器の外面上に位置する電磁石３のアレイを備える。電磁石３のアレイは、電磁石３の前記アレイの周期的な活性化によって引き起こされる反応の混合（反応中の磁性粒子またはＤＮＡ磁性粒子の循環による）を可能にする。これは、磁性粒子またはＤＮＡ磁性粒子を含む反応の、非接触混合（混合プロセス中で混合手段を全く実装する必要がないことを含意する）を可能にし、これは、例えばＲＮＡの製薬製造におけるバイオリアクター１の十分な掃除しやすさに関して有利な特徴である。また、インビトロ反応におけるＲＮＡの混合は、バイオリアクター１の回転／振盪なしに実施されうる。これは、バイオリアクター１上に据え付けられる必要がある異なる注入ポートおよび排出ポートにより回転または振盪が強く損なわれるので特に有利である。さらに、電磁石３の前記アレイは別のサイクルのＲＮＡインビトロ転写を開始する前にＤＮＡ磁性粒子を捕捉するために使用される場合があり、それによって全体的なＲＮＡ製造コストを劇的に減少させる、同じＤＮＡ鋳型上の繰り返しバッチＲＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）を可能にする。さらに、電磁石３の前記アレイはバイオリアクター１の最終的な洗浄または衛生化のためのＤＮＡ磁性粒子除去のために使用されうる。したがって、ＤＮＡは、酵素的なＤＮａｓｅ処理の必要なしに除去されうる。これは、（ｉ）そのような酵素が必要ではないのでコストを低減する、（ｉｉ）さらなる成分（すなわちＤＮａｓｅ）の最終的なＲＮＡ産物への汚染のリスクを低減する、および（ｉｉｉ）ＤＮＡ断片または部分的に消化されたＤＮＡ断片の最終的なＲＮＡ産物への汚染のリスクを低減する。
【０１４３】
さらに図１０に反応容器２内に保持される流体の充填レベル２７を示す。加えて、破線は、最大流体振幅２８を示す。この意味では、最大流体振幅２８は、反応容器２に含まれる流体の振幅であることが理解され、振盪または回転運動されると最大で反応容器２の内面２１に到達する。バイオリアクター１は、反応容器２内に媒質を充填することを可能にする、反応容器に配置された注入ポート８をさらに備える。図１１から分かるように、注入ポート８は、反応容器２の側方かつ反応容器２の内面２１の最大流体振幅２８のレベルより下に配置される。この構成は、注入ポートが最大流体振幅の上方に配置される場合の、反応容器２の内面２１にタンパク質残留物が堆積、および固まることを防ぐことを助長する。注入ポートが最大流体振幅の上方に配置される場合において、反応容器２の充填からの残留物は、例えば注入ポートに、および／または注入ポートの周りに堆積しうる。また、充填レベル２７に近い注入ポート８の側方位置は、反応容器の内面２１上に堆積して固まる残留物を形成しうるはね返しの望まれない形成なしに反応容器内に媒質を充填することを可能にする。注入ポート８の上流には、注入ポート８に対して、および、反応容器２内に、媒質充填をガイドするための注入パイプ８３が配置される。バイオリアクター１は、排ガスまたは廃液のための廃棄ポート７をさらに備える。廃棄ポート７は、例えば、容器の充填中の反応容器２の通気のために使用されうる。この目的のために、廃棄ポート７は、反応容器２の最上部に配置される。廃棄ポート７の下流には、容器２から廃棄ポート７を通る排ガスまたは廃液を吸い上げることを可能にする廃棄チャネル７４が配置される。さらに、排出ポート６は、反応容器２の最下部に配置され、それによって、排出パイプ６６を通ってこれらの流体をさらにガイドするように、排出ポート６を通る流体の便利なダクトまたは排出を可能にする。
【０１４４】
図１１は、本発明によるバイオリアクター１の別の好ましい実施形態を示す。図１〜１０にすでに示された構成要素を除いて−すなわち、例えば、反応容器２および磁石ユニット３、廃棄ポート７、廃棄チャネル７４、排出ポート６、排出パイプ６６注入ポート８、注入パイプ８３、また、反応容器２の内面における流体表面の接触線を表す充填レベル２７および最大流体振幅２８−図１１内の実施形態は、加えて、ＤＮＡ磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子がＲＮＡ産物に汚染するリスクを最小限にするように排出ポート６に位置する磁性トラップ６１を備える。これは、磁性トラップ６１が排出ポート６を通って反応容器２から製造されたＲＮＡが排出される際、反応容器２内に磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子を留めることを助長することを含意する。磁性トラップ６１は、例えば、少なくとも部分的に排出ポート６を取り囲むか、または排出ポート６下流の排出パイプ６６に当接しうる。好ましくは、磁性トラップ６１は、リング磁石、例えばリング形状の電磁石であってよい。排出ポート６および磁性トラップ６１の下流に、マルチポジションバルブ６２が配置される。マルチポジションバルブ６２は、３つのさらなるラインで排出ポート６、または排出ポート６の下流に接続された排出パイプ６６に接続している。３つのラインのうちの第１ラインは、ＲＮＡインビトロ転写反応が成功して行われた後のＲＮＡ含有流体成分のダクトで送ることに役立つ。磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子がこの成分に全く含まれていないことを監視するために、ホールセンサ６３は第１ラインに、マルチポジションバルブ６２の下流に配置される。したがって、ホールセンサ６３は、ＲＮＡ産物中の望まれない磁場の検出のために構成される。排出ポート６に接続された第２ラインは、例えば、洗浄液のための廃棄チャネル６７として働く。監視目的で、フローセル６４は、この第２ラインに配置される。マルチポジションバルブ６２に接続された第３ラインは、プロセスガスまたは洗浄ガス、例えばＮ２または合成溶液を矢印６５で示された方向にダクトしうる。プロセスガスまたは洗浄ガスは、マルチポジションバルブ６２によって、排出ポート６の方向に周期的に方向づけられうる。それによって、ポートの詰まりにつながる、排出ポートにおける磁性粒子および／またはＤＮＡ磁性粒子の沈殿は防がれる。
【０１４５】
さらに、バイオリアクター１は、バイオリアクター１℃をＲＮＡインビトロ転写に最適な温度である３７℃に加熱または冷却、および、バイオリアクター１℃をバイオリアクター１の洗浄／衛生化に最適な温度である８０℃に加熱することを可能にする例えばペルチェ素子９などの温度素子を備える。温度センサ９１は、反応容器２の温度を監視するために反応容器２にさらに配置される。さらに、温度センサは、反応容器の内面２１に、および／または、反応容器に近接して（例えば注入ポートまたは排出ポートに）置かれてよい。例えば、追加センサ９２は、例えば温度、ｐＨ、または塩濃度の測定のために反応容器２内に置かれうる。
【０１４６】
依然として図１１を参照すると、バイオリアクター１は、廃棄ポート７の下流に配置されたマルチポジションバルブ７１および廃棄ポート７に当接した廃棄チャネル７４をさらに備える。マルチポジションバルブ７１を経由して、廃棄ポート７および廃棄チャネル７４は、廃液の流れを監視するためにそのラインに配置された廃棄フローセル７２のある、廃液のためのラインに接続される。さらに、マルチポジションバルブ７１は、例えば反応容器２の充填中または洗浄中に発生しうる排ガスのために、廃棄ポート７および廃棄チャネル７４を排気ダクト７３に接続する。任意選択的に、廃棄ポート７における、および／または廃棄チャネル７４内の圧力測定のために廃棄ポートまたは廃棄チャネル７４に配置される圧力センサ７６がありうる。注入ポート８の上流の注入パイプ８３において加熱装置８１は、例示的に加熱コイルとして示されるが、注入パイプの周りに配置される。加熱装置８１のあるパイプ部分の上流に、反応容器２内への成分の供給を監視するために加熱フローセルが配置される。前記加熱装置８１は、リアクター内に充填される媒質の温度を所望の最適温度（例えばＲＮＡインビトロ転写のために３７℃）に調整するために使用されうる。
【０１４７】
図１２Ａおよび１２Ｂならびに図１３は、本発明によるバイオリアクター１の磁石ユニットの代替的な設計を示す。図１２Ａおよび１２Ｂを参照すると、排出ポート６、廃棄ポート７、および注入ポート８ならびに磁石ユニット３のある反応容器２を含む、バイオリアクター１の一実施形態が示される。とりわけ、図１１に明記されたようなバイオリアクターに関して述べられた構成要素は、本明細書に明確に述べられていない場合でも図１２Ａ，１２Ｂに示されるリアクターの一部と同様でありうる（例えば、温度センサ９１、ホールセンサ６３、フローセル６４、卵形、など）。磁石ユニット３は、矢印３６３で示されるように反応容器２の横断軸に沿って反応容器２に対して接離して動く磁石、好ましくは電磁石、または永久磁石、または制御可能なヘルムホルツコイルの形態で実現される。さらに磁石ユニット３は矢印３６２で示されるように、反応容器２の長手軸に沿って、上方におよび下方に動くことができる。この目的のために、磁石ユニット３は、上述の磁石ユニット３の運動を可能にする可動支持部３６１上に据え付けられている。加えて、図１２Ａおよび１２Ｂにさらに示されるように、反応容器２は、この実施形態において、その垂直軸の周りに回転可能でありうる。代わりに、反応容器２は、磁石ユニット３（これは可動支持部３６１上に据え付けられていない）に関する反応容器２の上述した運動を可能にする可動支持部（図示せず）上に据え付けられうる。加えて、図１２Ａおよび１２Ｂにさらに示されるように、反応容器２は、この実施形態において、その垂直軸の周りに回転可能でありうる。
【０１４８】
図１２Ａは、磁石ユニット３が反応容器２から側方に除去された状態のバイオリアクター１を示し、図１２Ｂは、磁石ユニット３が側方に反応容器２に対して最も近い位置にある構成を示す。
【０１４９】
図１３は、矢印１１１で示されるように反応容器の周りに回転可能であり支持部１０の水平バー１１に回転可能に配置される少なくとも２つの磁性コイルによって磁石ユニット３が実現されてあるバイオリアクター１の一実施形態を示す。水平バー１１は、矢印１１０によって示されるように上方および下方に動くことができ、反応容器２における磁性コイル３の磁場の位置は加えて変化してもよい。とりわけ、図１〜１１に明記されたようなバイオリアクターに関して述べられた構成要素は、本明細書に明確に述べられていない場合でも図１３に示されるリアクターの一部と同様でありうる（例えば温度センサ９１、ホールセンサ６３、フローセル６４、卵形、など）。
【０１５０】
図１４Ａおよび１４Ｂにおいて、機械的運動導入手段によって、ならびに、加えて反応容器内にプロセスガスまたはプロセスガス流体方向づけることによってか、または磁性粒子および磁石ユニットの協働によってかのいずれかによって、反応容器内に保持される成分の混合または撹拌を可能にするバイオリアクター１の複数の実施形態が示される。
【０１５１】
図１１に関してすでに記載された構成要素を除いて、図１４Ａは、オービタルシェーカーＯＳ上に反応容器２が置かれてあるバイオリアクター１を示す。オービタルシェーカーＯＳは、反応容器の三次元運動（好ましくは、反応容器２の運動による損傷をうけてはならない流体、ガス、およびバイオリアクターのセンサとの接続のため小さい振幅で）を可能にする。オービタルシェーカーＯＳの手段による反応容器２の運動を導入するように、反応容器２は、オービタルシェーカーＯＳの頂部に配置される。反応容器２は、側方に少なくとも部分的に取り囲まれ、それによって支持部２０によって保持されうる。支持部２０は、反応容器を加熱および／または冷却するためのペルチェ素子９を含む。図１４Ａの排出ポート６および排出パイプ６６を通って、プロセスガス、好ましくはＮ２、または、代わりにプロセス流体は、反応容器２内に保持される成分の混合／撹拌のための追加の運動を導入するように、反応容器２内にガイドされうる。排出ポート６および排出パイプ６６は、また、反応容器から媒質、例えば製造されたＲＮＡを排出するのにも役立つ。注入パイプ８３および注入ポート８を通って、媒質は反応容器内に充填され得る。さらに、図１４Ａは、反応容器の最上部に配置された廃棄ポート７および廃棄チャネルを示す。
【０１５２】
図１４Ｂにおいて、ヘルムホルツコイルおよび磁性粒子、オービタルシェーカーＯＳおよび反応容器内へのプロセスガスまたはプロセス流体の方向づけの協働によって、容器２内に保持される成分の混合または撹拌を可能にするバイオリアクター１の一実施形態を示す。この目的のために、オービタルシェーカーＯＳは、水平支持部Ｓを介して、支持部Ｓによって保持され、磁石ユニット３の中央に位置する反応容器２に接続される。磁石ユニットは、ここに、ヘルムホルツコイルの形態で実現される。反応容器２を保持する支持部の一部は、ペルチェ素子９が置かれた凹部を含む。容器の効率的な加熱および／または冷却のために、ペルチェ素子は、反応容器の近くにまたは接触さえして置かれる。前述した構成要素に加えて、図１４Ｂは注入ポート８および注入パイプ８３、廃棄ポート７および廃棄チャネル７４、ならびに排出ポート６および排出パイプ６６を示し、後者の要素は図１１および図１４Ａに関して説明されるものと同様である。
【０１５３】
図１５において、ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュールの一実施形態を示す。それは、プレミキサーとも言及される、ＩＶＴマスターミックス１２を調製するためのユニットを備える。ＩＶＴマスターミックス１２を調製するためのユニットに入ってくる矢印で示されるように、このユニット１２は、ＩＶＴバッファー（ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ）、ヌクレオチド混合物（ヌクレオチドおよび任意選択的に修飾ヌクレオチドを含む）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、キャップアナログ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、ＭｇＣｌ２、抗酸化剤（ＤＴＴ）、ベタイン、クエン酸塩で充填されうる。
【０１５４】
それぞれの成分は、媒質供給ラック（図示せず）によって提供されうる。製造されたＩＶＴマスターミックスは、ＩＶＴマスターミックス１２を調整するためにそのユニットからライン１２１を経由して本発明によるバイオリアクター１内へとガイドされる。ＩＶＴマスターミックスを除いて、ＤＮＡは、フィードインライン１２２を経由してバイオリアクター１に提供される。加えて、バイオリアクター１は、フィードインライン１２３を経由して洗浄バッファーで充填されうる。バイオリアクター１の充填は、図１２〜１５内に例示的に示され、および図１２〜１５に関して説明される、バイオリアクター１の注入ポート８を通って処理されることを理解されたい。図５にさらに関連して、未精製のＲＮＡ産物は、ライン１２４を経由して、例えば、接線流ろ過の働きによって調整装置１３に方向づけられる。前処理に続いて、そのＲＮＡは、ＲＮＡ精製のための装置１４（例えば、国際公開第２００８／０７７５９２号（特許文献６）に開示ざれた方法を使用したＲＰ−ＨＰＬＣ、ＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標））に方向づけられる。ＲＮＡ精製のための装置１４は、好ましくは、未精製のＲＮＡの自動化精製および分画のためのＲＰ−ＨＰＬＣ装置である。ＲＮＡ精製のための装置１４は、加えて、または代わりに、未精製のＲＮＡの自動化精製および分画のためのオリゴｄＴ精製装置を備える。点線の矢印で示されるように、ＲＮＡは続いて、さらなる装置、例えば、接線流ろ過などによるＲＮＡ前処理のための別の装置、および／またはＲＮＡ滅菌ろ過による装置、に方向づけられる。
【０１５５】
本発明に関してプロセスを実行するための適した環境として、プロセスルーム（プロセスルーム）またはハウジングが提供されうる。プロセスルームまたはハウジングは、プロセスを制御および／または監視するのに必要な制御システムから分離しうる。プロセスルーム内において、実験機構は設置されうる。プロセスルームの正面は、例えば、スライドドアによって開けられうる。プロセスルームの下部架台は、３つのパーツに分割されうるモジュール機構からなる場合がある。一例として、その３つのモジュールは、１メートルモジュール、２メートルモジュール、および全長３．５メートルかつ約２メートルの高さのバックパックからなりうる。さらに、追加のスペースを必要としうる排出システムが含まれうる。媒質供給は、１メートルモジュール内に設置されてよく、分離壁によって２メートルモジュール内に設置された実際のプロセスルームから物理的に分離されるものとする。分離壁は、例えば、ガラス仕切り、およびスライドドアの後ろに設置されたＰＶＣカーテンによっても実現されてよい。
【０１５６】
プロセスルーム内部は、任意選択的に排出システムに接続されてよい。プロセスされている液体がさらなる安全対策を必要とすることが望まれうる。これは、プロセスルーム内に含まれうる防爆および／またはさらなる生物学的および化学的安全対策を含む。
【０１５７】
図１６は、本発明の一実施形態によるＲＮＡインビトロ転写方法のフロー図を示す。本方法は、本発明の一実施形態によるバイオリアクターの反応容器に磁性粒子、ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡ固定化バッファーおよびＩＶＴマスターミックスを提供する工程Ｓ１を備える。工程Ｓ２において、磁性粒子、ＤＮＡ鋳型およびＤＮＡ固定化バッファーは、浮動性の磁性粒子上に固定化されたＤＮＡ鋳型であるＤＮＡ磁性粒子を得るために、バイオリアクターの磁性粒子および磁石ユニットの協働の手段によって混合される。方法工程Ｓ３において、ＤＮＡ磁性粒子は、ＲＮＡを得るために、ＤＮＡ磁性粒子および磁石ユニットの協働手段によって、ＩＶＴマスターミックスとともに混合される。工程Ｓ３の後、本方法は、磁石ユニットの手段によってＤＮＡ磁性粒子を捕捉することと、例えば排出ポートを通って、得られたインビトロ転写されたＲＮＡを回収すること／集積すること（Ｓ４ａ）、第１態様のバイオリアクターの反応容器内に新たなＩＶＴマスターミックスを提供すること（Ｓ４ｂ）、浮動性のＤＮＡ磁性粒子を提供するために捕捉されたＤＮＡ磁性粒子を解離すること（Ｓ４ｃ）、ＲＮＡを得るためにＤＮＡ磁性粒子および磁石ユニットの協働の手段によって、浮動性のＤＮＡ磁性粒子をＩＶＴマスターミックスと混合すること（Ｓ４ｄ）、および最後にＤＮＡのないインビトロ転写されたＲＮＡを得るために、ＲＮＡからＤＮＡ磁性粒子を除去することを含む、工程Ｓ４を備えうる。とりわけ、Ｓ４は複数回実施されてよい。
【０１５８】
上記工程に加えて、バイオリアクターの反応容器の温度を合わせる工程ＳＴが工程Ｓ１とＳ２との間、または／および工程Ｓ２とＳ３との間で実施され得る。反応容器が洗浄液および／または洗浄ガスで洗浄される洗浄または衛生化工程ＳＣが工程Ｓ３に加えて、続いてよい。
【０１５９】
図１７および１８は、本発明による自動化されたＲＮＡ製造装置の複数の実施形態を表す。図１７において、自動化装置のモジュールおよび各モジュールのための構成要素を有する一例が示される。本装置は、ＤＮＡ合成モジュール（「鋳型生成装置」）Ｔ、ＤＮＡをＲＮＡに転写するためのモジュールＭ、およびＲＮＡ配合および充填し、および完成させるためのモジュールＦを備える。ＤＮＡ合成モジュールは、分取ＰＣＲ４２のユニットにガイドされる、ＰＣＲマスターミックス４１を調製するためのユニットであるプレミキサー４０を備える。得られた未精製のＤＮＡ鋳型は、続いてＤＮＡ前処理のためのユニット４３にガイドされる。点線および点線のボックスは、調整されたＤＮＡ鋳型が、続いて精製のためのユニット（例えばＲＰ−ＨＰＬＣおよび／またはオリゴｄＴを含む）などの追加のユニットにガイドされることを示す。精製されたＤＮＡは、その後モジュールＴから外に破線矢印で示されるように解離されうる。しかしながら、精製されたＤＮＡは、また、モジュールＭに対して、とりわけ構成要素１、モジュールＮのバイオリアクターに対して提供されてよい。追加のインプットとして、バイオリアクター１は、ＩＶＴマスターミックス１２を調製するためのユニットからＩＶＴマスターミックスを得る。バイオリアクター１内のＲＮＡインビトロ転写反応によって得られた未精製のＲＮＡは、未精製のＲＮＡを前処理するためのユニット（例えば、ＴＦＦを含む）１３にガイドされ、続いてＲＮＡ精製のためのユニット１４（例えばＲＰ−ＨＰＬＣおよび／またはオリゴｄＴを含む）にガイドされる。点線および点線のボックスで示されるように、得られたＲＮＡのさらなるプロセスおよび／または純化する（例えばインビトロ転写されたＲＮＡにｃａｐ０またはｃａｐ１構造を加えるためのＲＮＡキャッピングモジュール、ＲＮＡポリアデニル化モジュール、ＲＮＡ混合モジュール、ＲＮＡ噴霧乾燥モジュール、ＲＮＡ凍結乾燥モジュール）追加のユニットが続いてよい。記載された工程の後、ＲＮＡはモジュールＦに提供される。このモジュールにおいて、例えばＬＮＰカプセル化されたＲＮＡは、混合用ユニット、前処理用ユニット（例えばＴＦＦを経由して）、滅菌ろ過用ユニット、および得られた医薬品の充填用ユニットのうちの少なくとも１つを含む異なるユニットの組み合わせによって製造されうる。
【０１６０】
図１８は、以下に記載される実施例１に関して実施されるようなＤＮＡ合成、ＤＮＡ精製およびＲＮＡインビトロ転写を含む方法工程の概観を示す。
実施例
以下の実施例は、単なる例証であって、さらなる方法で本発明を記載するものとする。実施例は、本発明をそれに限定するように解釈されるべきではない。
【０１６１】
実施例：モデルバッチ
本発明に関して記載されるプロセスおよび方法の例示的な実施例として、一例のモデルバッチプロセスが実験室内において手動で実施された。それぞれの方法工程は、図１８に示される。第１工程の過程で、ＤＮＡ鋳型生成工程、すなわち、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）Ｔ１、および（ＲＰ−ＨＰＬＣを使用した）ＤＮＡ精製Ｔ２、また、（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰを使用した）ＡＸＰ精製のサブ工程が実施されている。したがって、最後のサブ工程Ｔ３は、本発明の実施工程による最終的な、かつ、自動化されたプロセスにおいて実施されるものではなく、実施例におけるように手動でプロセスされたモデルバッチにのみ必要とされる。次の工程において、ＲＮＡインビトロ転写が実施され、この工程は、以下のサブ工程を備える。ＤＮＡ鋳型が浮動性の磁性ビーズ上に固定化される、第１サブ工程としてのＤＮＡ固定化、Ｍ１。第２サブ工程Ｍ２は、ＲＮＡインビトロ転写反応を表す。次のサブ工程（図２０に図示せず）として、ＡＸＰ精製が実施され、この場合も、この精製工程は、最終的な、かつ、自動化されたプロセスにおいて実施されるものではないが、手動でプロセスされたモデルバッチにおいてのみ実施される。サブ工程Ｍ３において、製造された未精製のＲＮＡは、精製される。サブ工程Ｍ４は、例えばＴＦＦを使用した限外ろ過（ＵＦ）／透析ろ過（ＤＦ）を表し、およびサブ工程Ｍ５のように、滅菌ろ過が実施される。本実施例は、非限定であり、追加の方法工程が実施されうるという事実を強調し、引用符号Ｍ５の破線のボックスは、ＲＮＡインビトロ転写工程中に追加のサブ工程がありうることを示す。第３工程として、製造された未精製のＲＮＡに配合が実施されてもよい。この目的のために、ライン内混合がサブ工程Ｆ１において行われた。図２０中には図示されていない次の工程として、透析が行われ、また、このサブ工程は、最終的な、かつ、自動化されたプロセスの場合は、省かれることが意図され、手動でプロセスされたモデルバッチにおいてのみ必要である。次のサブ工程Ｆ２はＵＦ／ＤＦを指し、凍結保護工程がまた続き、この工程は、手動でプロセスされたモデルバッチにのみ必要であるので図２０に示されていない。最後に３つのサブ工程は、また、単一のＵＦ／ＤＦ工程に組み合わされてもよい。サブ工程Ｆ３において、滅菌ろ過が実施される。引用符号Ｆ４のある破線のボックスは、本発明による方法に追加のサブ工程が組み込まれうることを示す。実施例の場合においては、しかしながら、さらなるサブ工程は全く実施されなかった。
【０１６２】
実施例内で実施されたように、繰り返しバッチＲＮＡインビトロ転写は、ＰＣＲ鋳型生成およびＤＮＡ鋳型精製工程を備え、これら両方は鋳型生成装置内で実施された。ＲＮＡ製造の次の工程内で、第１サブ工程において鋳型固定化が行われ、続いて繰り返しバッチＲＮＡインビトロ転写反応工程が行われる。後者は、その後、繰り返しバッチＨＰＬＣサブ工程が続き、最終的に単一のバッチＴＦＦサブ工程が続く。
【０１６３】
リサイクルされた、すなわち、繰り返しＲＮＡインビトロ転写反応に関する結果は図１９に集められる。同じ固定化されたＤＮＡ鋳型が３以上のＲＮＡインビトロ転写反応に使用される。本結果は３サイクルの間のＲＮＡインビトロ転写の量的および質的の両方で安定的な実施を示す。
【０１６４】
図２０ＡおよびＢにおいて、製造された原薬、製造された（ＨＰＬＣ精製された）ＲＮＡのＨｅｐＧ２細胞で発現された（ＲＡＶＧ  ｍＲＮＡ）ＲＮＡ効力アッセイが示され、本繰り返しＲＮＡインビトロ転写反応（好適には本発明のバイオリアクター内で実施されうる）が確固としたかつ信頼できる方法で高品質のＲＮＡを製造することを実証している。
【０１６５】
本発明の複数の実施形態が異なる主題に関して説明されていることに注意されたい。とりわけ、いくつかの実施形態は方法タイプのクレームに関するが、他の実施形態は装置タイプのクレームに関する。しかしながら、当業者は、上記記載と以下の記載から、特に提示されなければ、主題の１タイプに属する特徴の任意の組み合わせに加えて、異なる主題に関連する特徴間の任意の組み合わせも本出願で開示されているとみなすことを推測するであろう。しかしながら、全ての特徴は、組み合わされて特徴の単なる累積効果を超える相乗効果を提供し得る。
【０１６６】
本発明は、図面および前述の記載に詳細に示され、説明されたが、そのような説明図および記載は例証または例示的であり、限定するものではないとみなされるべきである。本発明は、開示された実施形態に限定されない。当該開示された実施形態の他の変形は、当業者によってクレームされた発明を実施し、図面、本開示、および従属項の検討から理解され、および達成され得る。
【０１６７】
特許請求の範囲において、単語「含む／備える」は、他の構成要素または工程を排除せず、不定冠詞の「１つの（“ａ”または“ａｎ”）」は、複数形を排除しない。特定の手段が互いに異なる従属項に再引用されるという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが利点のために使用され得ないことを示さない。特許請求の範囲内の任意の引用符号は、当該範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【符号の説明】
【０１６８】
１     バイオリアクター
１０   支持部
１１   水平バー
１１０ 矢印
１１１ 矢印
２     反応容器
２１   反応容器の内面
２３   反応容器の外面
２４   フローブレーカ
２５   反応容器の第１脚部
２５１ 第１導管
２６   反応容器の第２脚部
２６１ 第２導管
２７   充填レベル
２８   最大流体振幅
３     磁石ユニット
３１   磁性リング
３２   ロッド
３２０ 第１ロッド
３２１ 第１ロッドの自由端
３２２ 第２ロッド
３２３ 第２ロッドの自由端
３３   磁石ユニットの中心
３４   磁性リングの内周
３５０ ガイドプレート
３５１ 電気コイル
３５２ 冷却手段
３６   スピンドル軸
３７   アーム
３８   回転駆動手段
３９   駆動手段
３６１ 可動支持部
３６２ 矢印
３６３ 矢印
５     温度素子
５１   熱交換チャネル
５２   第１端熱交換チャネル
５３   第２端熱交換チャネル
５４   加熱ワイヤ
５５   断熱材
６     媒質ポート／排出ポート
６０   バルブ手段
６１   磁性トラップ
６２   マルチポジションバルブ
６３   ホールセンサ
６４   フローセル
６５   矢印
６６   媒質パイプ／排出パイプ
６７   廃棄チャネル
７     出口ポート／廃棄ポート
７１   マルチポジションバルブ
７２   廃棄フローセル
７３   排気ダクト
７４   廃棄チャネル
７６   圧力センサ
８     注入ポート
８１   加熱装置
８３   注入パイプ
９１   温度センサ
９２   追加センサ
１２   ＩＶＴマスターミックス
１２１ バイオリアクター内へのライン
１２２ ライン
１２３ ライン
１２４ ライン
１３   調整装置
１４   ＲＮＡ精製
４０   プレミキサー
４１   ＰＣＲマスターミックス
４２   分取ＰＣＲ
４３   ＤＮＡ前処理用ユニット
【図１】
2021528051.tif 000003
【図２】
2021528051.tif 000004
【図３Ａ】
2021528051.tif 000005
【図３Ｂ】
2021528051.tif 000006
【図４】
2021528051.tif 000007
【図５】
2021528051.tif 000008
【図６】
2021528051.tif 000009
【図７Ａ】
2021528051.tif 000010
【図７Ｂ】
2021528051.tif 000011
【図７Ｃ】
2021528051.tif 000012
【図８Ａ−８Ｃ】
2021528051.tif 000013
【図９Ａ】
2021528051.tif 000014
【図９Ｂ】
2021528051.tif 000015
【図９Ｃ】
2021528051.tif 000016
【図９Ｄ】
2021528051.tif 000017
【図９Ｅ】
2021528051.tif 000018
【図９Ｆ】
2021528051.tif 000019
【図９Ｇ】
2021528051.tif 000020
【図９Ｈ】
2021528051.tif 000021
【図１０】
2021528051.tif 000022
【図１１】
2021528051.tif 000023
【図１２Ａ】
2021528051.tif 000024
【図１２Ｂ】
2021528051.tif 000025
【図１３】
2021528051.tif 000026
【図１４Ａ】
2021528051.tif 000027
【図１４Ｂ】
2021528051.tif 000028
【図１５】
2021528051.tif 000029
【図１６】
2021528051.tif 000030
【図１７】
2021528051.tif 000031
【図１８】
2021528051.tif 000032
【図１９】
2021528051.tif 000033
【図２０Ａ】
2021528051.tif 000034
【図２０Ｂ】
2021528051.tif 000035
【国際調査報告】
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