(57)【要約】  レポーター分子として使用するために、レポーター核酸分子を非複製形質導入粒子にパッケージングするための方法及びシステムを提供する。非複製形質導入粒子は、ウイルスから構築でき、ウイルスの形質導入および複製システムを使用できる。レポーター核酸分子は、標的遺伝子または細胞を検出するためのレポーター分子または選択可能なマーカーといったレポーター遺伝子を含む。レポーター分子として非複製形質導入粒子を使用して、細胞および標的核酸分子を検出するための方法およびシステムも提供する。
2021506317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における黄色ブドウ球菌を検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）複数の非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を含むライセートを試料に接触させ、該試料に黄色ブドウ球菌が存在する場合、前記複数のＮＲＴＰを黄色ブドウ球菌に形質導入させるようにする工程、ここで、前記複数のＮＲＴＰは以下によって生成される：
（ｉ）細菌細胞パッケージングシステムの溶菌期を誘導する工程、ここで前記細菌細胞パッケージングシステムは、以下を含む：宿主細菌細胞；宿主細菌細胞内で溶原として存在する破壊ｔｅｒＳパッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノム；ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子及びレポーター核酸分子のレプリコンをＮＲＴＰ内へパッケージングするのを容易にするための非破壊パッケージング開始部位配列を有する、φ８０αバクテリオファージゲノムとは別個のレポーター核酸分子、ここで、前記レポーター核酸分子は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択される配列を含む；
（ｉｉ）レポーター核酸分子のレプリコンをパッケージングしてＮＲＴＰを生成する工程；
（ｂ）ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子の発現のための条件を設ける工程；並びに、
（ｃ）ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子により生じた光の存在又は不存在を検出する工程、ここで、光の存在が黄色ブドウ球菌の存在を示す。
【請求項２】
工程（ｂ）の前に、試料に抗菌剤を提供し、そして、ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子により生じた光の存在又は不存在を検出することにより、前記試料が前記抗菌剤に耐性または感受性の黄色ブドウ球菌を含むか否かを決定する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーター核酸分子は配列番号３の配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記レポーター核酸分子は配列番号４の配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記レポーター核酸分子は配列番号５の配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
破壊ｔｅｒＳパッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノムは、配列番号１の配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
レポーター核酸分子を、黄色ブドウ球菌に導入するための非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、以下を含む細菌細胞パッケージングシステム：
（ａ）宿主細菌細胞；
（ｂ）宿主細菌細胞内で溶原として存在する破壊パッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノム；並びに、
（ｃ）ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子及びレポーター核酸分子のレプリコンをＮＲＴＰ内へパッケージングするのを容易にするための非破壊パッケージング開始部位配列を有する、φ８０αバクテリオファージゲノムとは別個のレポーター核酸分子、ここで、前記レポーター核酸分子は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択される配列を含む。
【請求項８】
前記レポーター核酸分子は配列番号３の配列を含む、請求項７に記載の細胞パッケージングシステム。
【請求項９】
前記レポーター核酸分子は配列番号４の配列を含む、請求項７に記載の細胞パッケージングシステム。
【請求項１０】
前記レポーター核酸分子は配列番号５の配列を含む、請求項７に記載の細胞パッケージングシステム。
【請求項１１】
破壊ｔｅｒＳパッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノムは、配列番号１の配列を含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の細胞パッケージングシステム。
【請求項１２】
試料における黄色ブドウ球菌を検出するための複数の非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を生成および収集するための方法であって、以下を含む方法：
（ａ）細菌細胞パッケージングシステムの溶菌期を誘導する工程、ここで前記細菌細胞パッケージングシステムは、以下を含む：
（ｉ）宿主細菌細胞；
（ｉｉ）宿主細菌細胞内で溶原として存在する破壊パッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノム；
（ｉｉｉ）ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子及びレポーター核酸分子のレプリコンをＮＲＴＰ内へパッケージングするのを容易にするための非破壊パッケージング開始部位配列を有する、φ８０αバクテリオファージゲノムとは別個のレポーター核酸分子、ここで、前記レポーター核酸分子は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択される配列を含む；
（ｂ）レポーター核酸分子のレプリコンをパッケージングしてＮＲＴＰを生成する工程；並びに
（ｃ）複数のＮＲＴＰを含むライセートを収集する工程。
【請求項１３】
前記レポーター核酸分子は配列番号３の配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター核酸分子は配列番号４の配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター核酸分子は配列番号５の配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
破壊ｔｅｒＳパッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノムは、配列番号１の配列を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択される配列を含むレポーター核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の標的遺伝子を検出するための非複製形質導入レポーター分子のパッケージングおよび細胞への送達のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質導入粒子とは、非ウイルス核酸を細胞内に送達可能なウイルスを指す。ウイルスベースのレポーターシステムが、細胞の存在を検出し、ウイルスの溶原期に依存し細胞からレポーター分子を発現させるために使用されてきた。これらのウイルスベースのレポーターシステムは、レポーター分子を発現し、標的細胞に検出可能なシグナルを放出させる複製能力のある形質導入粒子を使用する。
【０００３】
しかし、ウイルスの溶菌サイクルはウイルスベースのレポーターアッセイに障害となることが示されている。Ｃａｒｒｉeｒｅら，Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｈａｇｅｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７．３５（１２）：ｐ．３２３２−３２３９．Ｃａｒｒｉeｒｅらは、溶菌サイクルは３０℃で抑制されるが３７℃では活性となるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｂａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕeｒｉｎ（ＢＣＧ）ルシフェラーゼレポーターファージを開発した。このシステムを使用して、Ｃａｒｒｉeｒｅらは、溶菌サイクルが抑制されたファージレポーターを使用したＢＣＧの検出を実証した。
【０００４】
しかしながら、バクテリオファージベースのレポーターアッセイは、バクテリオファージの複製機能を抑制するが排除はしないことによる欠点がある。第１に、バクテリオファージの複製機能を制御するため、アッセイ条件が制限的になってしまう。例えば、Ｃａｒｒｉeｒｅらによって使用されたレポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌サイクルは、細胞に感染させるのにファージを３０℃の非許容温度で使用された場合は抑制された。この温度要件は、標的細菌の最適温度が３７℃であるという点で、レポーターアッセイ条件を制限するものである。これらの制限条件は、最適なアッセイ性能を妨げる。
【０００５】
さらに、ウイルスの複製機能を制御することは困難である。レポーターシステムとして形質導入粒子を使用する際は、ウイルスの複製を抑制すべきである。例えば、Ｃａｒｒｉeｒｅらによって報告されたレポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌活性は低減したものの排除はされず、その結果、アッセイにおけるルシフェラーゼシグナルが低下した。Ｃａｒｒｉeｒｅらは、ファージレポーターの溶菌サイクルが排除されなかったという事実に起因する、完全なファージ発現遺伝子およびアッセイの温度制限といったレポーターシグナルの低下をもたらす可能性がある要素を強調した。
【０００６】
ファージの天然の溶原化サイクルに依存するレポーターアッセイは、散発的に溶菌活性を示すことが予期される。さらに、ファージの溶原化サイクルに依存するアッセイは、入ってくるウイルス核酸を標的とする天然に存在する宿主制限システムと同様に、類似のファージにより既に溶原化された標的細胞からの重感染免疫を受けやすく、したがって、これらのレポーターファージの宿主の範囲が制限されてしまう。
【０００７】
他の例では、形質導入粒子産生システムが外因性核酸分子をパッケージングするように設計されるが、形質導入粒子は、外因性核酸分子と天然子孫ウイルス核酸分子との組み合わせを含んでしまうことがしばしばある。天然ウイルスはアッセイ性能に対する障害となる溶菌活性を示すことがあり、形質導入粒子を精製するにはウイルスの溶菌活性は排除されなければならない。しかしながら、この精製は一般に不可能である。「Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」という表題の米国特許出願公開第２００９／０１５５７６８号明細書において、Ｓｃｈｏｌｌらは、このような形質導入粒子システムの開発を記載している。このシステムの産物は、レポーター形質導入粒子と天然バクテリオファージとの組み合わせである（参考文献の図８）。著者らは形質導入粒子および天然バクテリオファージが超遠心分離によって分離され得ることを示すが、この分離は、形質導入粒子および天然ウイルスが超遠心分離により分離可能となるべく異なる密度を示すシステムにおいてのみ可能である。この特徴はこの文献に記載されるバクテリオファージＴ７ベースのパッケージングシステムでは示されるが、他のウイルスシステムに一般的に適用可能な特徴ではない。ウイルスパッケージング機構は、ヘッドフルパッケージングを示すことが一般的であり、天然のウイルスと形質導入粒子が超遠心分離によって分離することができないような識別不能な密度を示す結果となるであろう。また、ウイルスパッケージングシステムは、適切なウイルス構造アセンブリのための要件として、最小量のパッケージングに依存するため、天然ウイルスと形質導入粒子が識別不能な密度で生じる結果となる。
【０００８】
したがって、ウイルスの溶菌機能、並びに、重複感染免疫によって制限される可能性およびウイルス核酸分子およびウイルス機能を標的とする宿主制限機構（これらは全て、検出限界を増大させことによりレポーターアッセイの性能を制限し、偽陰性結果をもたらす可能性がある）による障害の影響を受けない非複製形質導入粒子が必要とされている。
【０００９】
形質導入粒子を操作しても、細胞中の標的核酸分子の存在を検出および報告するために形質導入粒子を使用するための方法には限界がある。いくつかの方法は、細胞の破壊やライセート中の転写物を単離および検出するための煩わしい技術を必要とする。検出方法には、抗体、アプタマー、または核酸プローブなどの標識プローブを使用することが含まれる。標的遺伝子用の標識プローブが、意図しない標的へ非特異的結合する場合や、高いシグナル対ノイズ比を有するシグナルを生成してしまう場合もある。したがって、細胞中の内因性核酸分子の検出および報告のための特異的、有効かつ正確な方法が必要とされている。
【００１０】
さらに最近では、レポーター核酸分子を非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にパッケージする方法およびシステムが米国特許第９，３８８，４５３号に記載されており、バクテリオファージゲノム中のパッケージング開始部位の破壊により、複製能力のある天然子孫ウィルス核酸分子の産生が大幅に減少したことが記載されている。それにもかかわらず、少数であるが観察可能な数の天然ウイルスがこのシステムから依然として検出され、ＮＲＴＰ中に存在するレポーター分子の発現によって検出されるアッセイの感度を制限するおそれがある。
【００１１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ：黄色ブドウ球菌）は通性嫌気性グラム陽性細菌であり、その自然保有宿主としてはヒトの皮膚と鼻が挙げられ、創傷にも生息しうる。黄色ブドウ球菌を保菌している人のほとんどは感染の徴候を示さないが、正常なバリアが破られると、黄色ブドウ球菌は侵襲性となり体内で感染を引き起こすことがある。黄色ブドウ球菌は、ニキビ、できもの（ｂｏｉｌｓ）、膿瘍などの軽い皮膚感染症から、肺炎、髄膜炎、敗血症などの重症な疾患まで、さまざまな疾患を引き起こす。皮膚および鼻以外の組織はバリア、例えば、皮膚または粘膜の被覆が破られると感染する可能性があり、吹出物やおでき（ｆｕｒｕｎｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｃａｒｂｕｎｃｌｅｓ）を引き起こす。黄色ブドウ球菌感染症は、感染した人との皮膚接触や、感染した人が使用した物との接触により人々の間で広がることがある。
【００１２】
黄色ブドウ球菌は、ペニシリン系（メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン）を含む主要な抗生物質に対する耐性を獲得する顕著な能力を有しており、「スーパーバグ」と称される。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）はペニシリンに耐性となった細菌であり、治療が困難なある種のヒト感染症の原因となっている。ＭＲＳＡはオキサシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＯＲＳＡ）や多剤耐性黄色ブドウ球菌としても知られているが、黄色ブドウ球菌の非メチシリン耐性株はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）と呼ばれることもある。
【００１３】
したがって、当技術分野では、ＭＲＳＡを高感度に特異的に検出するための迅速かつ信頼性の高い方法が必要とされている。また、複製可能な子孫ウイルスを排除しながら、細胞内のレポーター分子のパッケージングおよび発現を可能にするＭＲＳＡを検出するために使用される非複製形質導入粒子を生成するための方法およびシステムが必要である。発現されたレポーター分子を用いて細胞中の分子を検出するための効果的かつ正確な方法も必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、試料中の黄色ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌）を検出する方法を提供する。これらの方法は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の両方を検出するために使用してもよい。本発明はまた、試料中の黄色ブドウ球菌を検出するために使用される非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を含む組成物、およびＮＲＴＰを生成する方法も提供する。
【００１５】
したがって、１つの態様では、本発明は、試料における黄色ブドウ球菌を検出する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：（ａ）複数の非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を含むライセートを試料に接触させ、該試料に黄色ブドウ球菌が存在する場合、前記複数のＮＲＴＰを黄色ブドウ球菌に形質導入させるようにする工程、ここで、前記複数のＮＲＴＰは以下によって生成される（ｉ）細菌細胞パッケージングシステムの溶菌期を誘導する工程、ここで前記細菌細胞パッケージングシステムは、以下を含む：宿主細菌細胞；宿主細菌細胞内で溶原として存在する破壊パッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノム；ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子及びレポーター核酸分子のレプリコンをＮＲＴＰ内へパッケージングするのを容易にするための非破壊パッケージング開始部位配列を有する、φ８０αバクテリオファージゲノムとは別個のレポーター核酸分子、ここで、前記レポーター核酸分子は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択される配列を含む；（ｉｉ）レポーター核酸分子のレプリコンをパッケージングしてＮＲＴＰを生成する工程；（ｂ）ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子の発現のための条件を設ける工程；並びに、（ｃ）ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子により生じた光の存在又は不存在を検出する工程、ここで、光の存在が黄色ブドウ球菌の存在を示す。
【００１６】
一実施形態では、上記方法は、工程（ｂ）の前に、試料に抗菌剤を提供し、そして、ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子により生じた光の存在又は不存在を検出することにより、前記試料が前記抗菌剤に耐性または感受性の黄色ブドウ球菌を含むか否かを決定する工程を更に含む。一実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号３の配列を含む。別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号４の配列を含む。更に別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号５の配列を含む。一実施形態では、φ８０αバクテリオファージゲノムは、配列番号１の配列を含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、レポーター核酸分子を、黄色ブドウ球菌に導入するための非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、以下を含むシステムに関する：宿主細菌細胞；宿主細菌細胞内で溶原として存在する破壊パッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノム；ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子及びレポーター核酸分子のレプリコンをＮＲＴＰ内へパッケージングするのを容易にするための非破壊パッケージング開始部位配列を有する、φ８０αバクテリオファージゲノムとは別個のレポーター核酸分子、ここで、前記レポーター核酸分子は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択される配列を含む。一実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号３の配列を含む。別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号４の配列を含む。更に別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号５の配列を含む。一実施形態では、φ８０αバクテリオファージゲノムは、配列番号１の配列を含む。
【００１８】
また更に別の実施形態では、本発明は、試料における黄色ブドウ球菌を検出するための複数の非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を生成および収集するための方法であって、以下を含む方法に関する：（ａ）細菌細胞パッケージングシステムの溶菌期を誘導する工程、ここで前記細菌細胞パッケージングシステムは、以下を含む：宿主細菌細胞；宿主細菌細胞内で溶原として存在する破壊パッケージング開始部位配列を有するφ８０αバクテリオファージゲノム；ｌｕｘＡＢレポーター遺伝子及びレポーター核酸分子のレプリコンをＮＲＴＰ内へパッケージングするのを容易にするための非破壊パッケージング開始部位配列を有する、φ８０αバクテリオファージゲノムとは別個のレポーター核酸分子、ここで、前記レポーター核酸分子は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択される配列を含む；（ｂ）レポーター核酸分子のレプリコンをパッケージングしてＮＲＴＰを生成する工程；並びに、（ｃ）複数のＮＲＴＰを含むライセートを収集する工程．一実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号３の配列を含む。別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号４の配列を含む。更に別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は配列番号５の配列を含む。一実施形態では、φ８０αバクテリオファージゲノムは、配列番号１の配列を含む。
【００１９】
別の態様では、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択される配列を含む又はかかる配列からなるレポーター核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、レポーター核酸分子はプラスミド又はベクターである。
【００２０】
本発明の上記又はその他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面によりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、パッケージングレポータープラスミドｐＴ１８１  ＭＲＳＡおよびプラスミドのコンポーネントの概略図を示す。
【００２２】
【図２】図２は、パッケージング開始部位を欠く破壊されたｔｅｒＳ遺伝子を含み、ｐＴ１８１  ＭＲＳＡパッケージングプラスミドでトランスフェクトされ、φ８０αバクテリオファージゲノムで溶原化された黄色ブドウ球菌細胞を含む破壊／相補パッケージングシステムの設計と機能の例を示す。
【００２３】
【図３Ａ】図３Ａは、実施例１の記載により実施された、ｐＴ１８１  ＭＲＳＡ由来のパッケージングシステムの細胞ライセートからの発光アッセイの結果を示す。
【００２４】
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例１の記載により実施された、ｐＴ１８１  ＭＲＳＡ由来のパッケージングシステムの細胞ライセートからのファージプラークアッセイの結果を示す。
【００２５】
【図４】図４は、新しいパッケージングレポータープラスミドｐＳＤ０２の構築を示す。
【００２６】
【図５Ａ】図５Ａは、実施例２の記載により実施された、ｐＳＤ０２由来のパッケージングシステムの細胞ライセートからの発光アッセイの結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例２の記載により実施された、ｐＳＤ０２由来のパッケージングシステムの細胞ライセートからのファージプラークアッセイの結果を示す。
【００２７】
【図６】図６は、実施例２に記載のｐＳＤ０８由来のパッケージングシステムからの細胞ライセートを様々な量で使用するファージプラークアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ｉ．定義
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は別段の規定がない限り、以下に記載のように定義される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「レポーター核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むヌクレオチド配列をいう。レポーター核酸分子は、天然に存在するか、または人工もしくは合成分子であり得る。いくつかの実施形態では、レポーター核酸分子は宿主細胞に対して外因性であり、プラスミドまたはベクターなどの外因性核酸分子の一部として宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態において、レポーター核酸分子は、細胞中の標的遺伝子に相補的であり得る。他の実施形態において、レポーター核酸分子はレポーター分子（例えば、レポーター酵素、タンパク質）をコードするレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、レポーター核酸分子が「レポーター構築物」または「核酸レポーター構築物」と呼される。
【００３０】
「レポーター分子」または「レポーター」は、検出可能または選択可能な表現型を生物に付与する分子（例えば、核酸またはタンパク質）をいう。検出可能な表現型は例えば、比色、蛍光または発光であり得る。レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素をコードするレポーター遺伝子（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素をコードする遺伝子（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質をコードする遺伝子（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチドをコードする核酸分子（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、および選択マーカーをコードする遺伝子（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から発現され得る。レポーター分子は、核酸分子または外因性配列（プラスミド）の細胞への取り込みが成功したことのマーカーとして使用できる。レポーター分子はまた、本明細書中に記載されるように、標的遺伝子、標的核酸分子、標的細胞内分子、または細胞の存在を示すために使用できる。あるいは、レポーター分子は、アプタマーまたはリボザイムのような核酸であることもある。
【００３１】
本発明のいくつかの態様において、レポーター核酸分子は、プロモーターに作動的に連結される。本発明の他の態様において、プロモーターは、特定の細胞（例えば、特定の種）におけるプロモーターの活性に基づくレポーターシステムの反応性および交差反応性に寄与するが、それ以外では寄与しないように選択または設計できる。特定の態様において、レポーター核酸分子は複製起点を含む。他の態様において、複製起点の選択は、同様に、標的細胞内のレポーター核酸分子の複製が特定の細胞（例えば、特定の種）における複製起点の活性に基づくレポーターシグナル産生に寄与するかまたは必要とされる場合、レポーターシステムの反応性および交差反応性に寄与できるが、それ以外では寄与できない。いくつかの実施形態において、レポーター核酸分子は、ウイルス複製の際に子孫ウイルス中にコンカテマーＤＮＡとしてパッケージングされ得るレプリコンを形成する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「標的転写物」は、標的遺伝子の転写の間に形成されるもの、および一次転写物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、標的細胞によって天然に形成されるＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の一部をいう。標的転写物はまた、細胞転写物または天然に存在する転写物と称されることもある。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「転写物」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型配列または遺伝子から転写される一定の長さのヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をいう。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されるｃＤＮＡ配列、またはＤＮＡ鋳型から転写されるｍＲＮＡ配列であり得る。転写物は、タンパク質をコードするもの又はコードしないものであり得る。転写物はまた、操作された核酸構築物から転写され得る。
【００３４】
レポーター核酸分子に由来する転写物は「レポーター転写物」と呼ばれる。レポーター転写物には、レポーターの配列とシス抑制配列が含まれる。レポーター転写物は、転写物が二重鎖を形成する２つの領域（例えば、分子間二重鎖領域）を含むように、相補性の領域を形成する配列を有し得る。１つの領域は「シス抑制配列」と称されることがあり、標的転写物および／またはレポーター配列の一部または全部に対して相補性を有する。転写物の第２の領域は「レポーター配列」と称され、シス抑制配列に対して相補性を有し得る。相補性は、完全な相補性または実質的な相補性であり得る。レポーター配列に対するシス抑制配列の存在および／または結合によりレポーター転写物中にコンホメーションを形成することができ、これによりレポーター分子のさらなる発現をブロックすることができる。レポーター転写物は、ヘアピン構造などの、レポーター転写物内の互いに相補的な領域が互いにハイブリダイズすることができるような二次構造を形成し得る。
【００３５】
「細胞に導入する」とは、核酸分子または外因性配列（例えば、プラスミド、ベクター、構築物）に言及する場合、当業者によって理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を容易にすることを意味する。核酸構築物または転写物の吸収または取り込みは、自発的な拡散または活性細胞プロセスを通して、あるいはバクテリオファージ、ウイルス、および形質導入粒子の使用によるものを含む補助剤またはデバイスによって生じ得る。この用語の意味はインビトロでの細胞に限定されず；核酸分子が、「細胞に導入」されてもよく、ここで、細胞は生体の一部である。このような場合、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、インビボ送達のために、本発明の核酸分子、構築物またはベクターは、組織部位に注射され得るか、または全身投与され得る。細胞へのインビトロ導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのような当該分野で公知の方法を含む。さらなるアプローチは、本明細書中に記載されるか、または当該分野で公知である。
【００３６】
「形質導入粒子」は、非ウイルス核酸分子を細胞に送達可能なウイルスを指す。ウイルスはバクテリオファージ、アデノウイルスなどであり得る。
【００３７】
「非複製形質導入粒子」は非ウイルス性核酸分子を細胞内に送達可能であるが、自身の複製ウイルスゲノムを形質導入粒子にパッケージング不可能なウイルスをいう。ウイルスはバクテリオファージ、アデノウイルスなどであり得る。
【００３８】
「プラスミド」とは、細胞内の染色体ＤＮＡとは物理的に別個の分子であり、染色体ＤＮＡとは独立に複製することができる小さなＤＮＡ分子である。最も一般的には細菌において小さな環状の二本鎖ＤＮＡ分子として見られるが、プラスミドは古細菌や真核生物に存在することもある。プラスミドはレプリコンと考えられ、適切な宿主内で自律的に複製可能である。
【００３９】
「ベクター」は外来遺伝物質を、複製および／または発現できるように別の細胞に人工的に運ぶためのビヒクルとして使用される核酸分子である。
【００４０】
「ウイルス」は、他の生物の生細胞内でのみ複製する小さな感染性物質である。ウイルス粒子（ビリオンとして知られる）は、以下の２つまたは３つの部分を含む：ｉ）遺伝情報を保有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかから作製される遺伝物質；ｉｉ）これらの遺伝子を保護するタンパク質の被覆；および場合によってはｉｉｉ）９３８８である脂質のエンベロープ。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」は、破壊された同一配列（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｈａｓ  ｂｅｅｎ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）の存在に対する非破壊配列（ｎｏｎ−ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、あるいは破壊配列（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対する非破壊配列の関係をいう。一実施形態では、相補体は、機能的かつ発現可能であり、バクテリオファージ上の破壊前の破壊遺伝子と同じ機能を有するタンパク質を発現する、細胞中のポリヌクレオチドにコードされた遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、相補体遺伝子は、破壊前の破壊バクテリオファージ遺伝子、すなわち天然バクテリオファージ遺伝子と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、相補体遺伝子は、バクテリオファージから欠失されたポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、相補体遺伝子は、プラスミド上のバクテリオファージのパッケージング機構をコードする遺伝子で、同じ遺伝子がバクテリオファージでは破壊されているものを指す。従って、プラスミドはポリヌクレオチドを形質導入粒子にパッケージングするために必要なパッケージング機構を提供するために、変異パッケージング機構遺伝子を有するバクテリオファージの存在下にあることが必要である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「パッケージング関連酵素活性」は、ポリヌクレオチドを形質導入粒子にパッケージングするためのパッケージング開始部位配列との相互作用に重要な１つ以上のポリペプチドをいう。いくつかの実施形態において、一対のターミナーゼ遺伝子がこのような相互作用のために必要とされ、ここで、各ターミナーゼは、パッケージング関連酵素活性をコードする。いくつかの実施形態において、酵素活性は、黄色ブドウ球菌バクテリオファージφ１１またはφ８０α由来のｔｅｒＳおよび／またはｔｅｒＬ遺伝子、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓバクテリオファージφＥｆ１１由来のｔｅｒＡおよびｔｅｒＢ遺伝子、あるいはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅバクテリオファージＰ１のｐａｃＡおよびｐａｃＢ遺伝子によってコードされる。これらの実施形態において、ターミナーゼ遺伝子対の各々はパッケージング関連酵素活性を発現し、そして両方の機能バージョンが、パッケージング開始部位を有するポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる。いくつかの実施形態において、パッケージング関連酵素活性に関連する複数の遺伝子のうちの１つの遺伝子の破壊は、パッケージング関連酵素活性を排除する。いくつかの実施形態では、一対のターミナーゼ遺伝子の両方がバクテリオファージ上で破壊されることで、バクテリオファージ上の遺伝子をコードするパッケージング関連酵素活性のセット全体が破壊される。
【００４３】
「ＭＲＳＡ」は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を指す。
【００４４】
「ＭＳＳＡ」は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌を指す。
【００４５】
「改善する」という用語は疾患状態、例えば、疾患状態の予防、重症度または進行の軽減、寛解、または治癒を含む、疾患状態の治療における任意の治療的に有益な結果を指す。
【００４６】
「インサイチュ」という用語は、生きている生物とは別個に成長する、例えば、組織培養で成長するといった、生きている細胞で起こるプロセスを指す。
【００４７】
「インビボ」という用語は、生体内で起こるプロセスを指す。
【００４８】
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語はヒトおよび非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、およびブタを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」はそれぞれ、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ含有するヌクレオチドを意味する。「Ｔ」および「ｄＴ」は本明細書では互換的に使用され、核酸塩基がチミン、例えば、デオキシリボチミンであるデオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳述するように、修飾ヌクレオチドまたは大体置換部分も指すことができることが理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させることなく、他の部分によって置換され得ることを十分に認識する。例えば、限定されないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドはアデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。従って、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含有するヌクレオチドによって置換され得る。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に対して記載するために使用される場合、当業者によって理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の状態で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力をいう。また、相補的配列は、互いに結合するものとして記載され、結合親和性という特徴を有する。
【００５１】
例えば、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（例えば、アニールする）場合、第１のヌクレオチド配列は第２のヌクレオチド配列に相補的であると記載できる。ハイブリダイゼーション条件は、アニーリングおよび／または洗浄工程のための温度、イオン強度、ｐＨ、および有機溶媒濃度が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件という用語は、第１のヌクレオチド配列がその標的配列、例えば、第２のヌクレオチド配列に優先的にハイブリダイズし、他の配列へはより少ない頻度でハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしない条件が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は配列依存性であり、そして異なる環境パラメータ下で異なる。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける当該ヌクレオチド配列に対する熱融点（Ｔm）より約５℃低くなるように選択される。Ｔmは、第１のヌクレオチド配列の５０％が完全に一致する標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨにおける）温度である。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ，ｃｈａｐ．２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（“Ｔｉｊｓｓｅｎ”）にみられる。生体内で起こり得る生理学的関連状態といった他の状態を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従い、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件のセットを決定できるであろう。
【００５２】
これには、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対形成が含まれる。このような配列は、本明細書中で、互いに「完全に相補的」と称され得る。しかし、本明細書中で、第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、最終用途に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、それら２つの配列は完全に相補的であり得るか、あるいは、ハイブリダイゼーションの際に、１つ以上であるが、一般的には４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかし、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションする際に、１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関しミスマッチとみなされない。例えば、２１ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチドという別の長さのオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡであって、長いほうのオリゴヌクレオチドが短いほうのオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含む場合、そのｄｓＲＮＡは本明細書中に記載の目的では「完全相補的」ということができる。
【００５３】
「相補的」配列はまた、本明細書中で使用される場合、ハイブリダイズする能力に関する上記の要件が満たされるならば、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むか、あるいはそれから完全に形成されてもよい。このような非ワトソンクリック塩基対にはＧ：Ｕ  ＷｏｂｂｌｅまたはＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中の用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、使用される文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡの二本鎖の間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間、一本鎖ＲＮＡ配列または一本鎖ＤＮＡ配列の相補鎖間の塩基マッチングに関して使用してもよい。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「二重鎖構造」は、２つの逆平行および実質的に相補的な核酸配列を含む。核酸構築物中の相補的配列が、２つの転写物の間、１つの転写物内の２つの領域の間、または１つの転写物と１つの標的配列の間で、「二重鎖構造」を形成することができる。一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書中に詳細に記載されるように、鎖の一方又は両方が、少なくとも１つの非リボヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または改変ヌクレオチド）を含んでもよい。二重鎖構造を形成する２本の鎖は、１つの大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、または別個の複数のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つの大きな分子の一部であり、したがって二本鎖構造を形成しているそれぞれの一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間がヌクレオチドの連続鎖によってつながっている場合、つながっているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。二本鎖構造を形成しているそれぞれの一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間がヌクレオチドの連続鎖以外の手段によって２本の鎖が共有結合的に連結されている場合、この連結構造は「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖のヌクレオチド数は同じでも異なっていてもよい。塩基対の最大数は、二重鎖のうち短いほうの鎖のヌクレオチド数から二重鎖中に存在するオーバーハングを差し引いたものである。一般に、二重鎖構造は、長さが１５〜３０、または２５〜３０、または１８〜２５、または１９〜２４、または１９〜２１、または１９、２０、または２１塩基対である。一実施形態では、二重鎖の長さは１９塩基対である。別の実施形態において、二重鎖の長さは、２１塩基対長である。２つの異なるｓｉＲＮＡが組み合わせて使用される場合、二重鎖の長さは、同一であっても異なっていてもよい。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「相補性の領域」は、本明細書中で定義されるように、配列（例えば、標的配列）に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域をいう。相補性の領域が標的配列に完全に相補的でない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、そして存在する場合、一般に、末端領域（単数または複数）、例えば、５’末端および／または３’末端の６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。
【００５７】
「パーセント同一性」という用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、以下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または目視検査によって測定される際に、対応が最大になるように比較およびアラインされる場合、同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基が特定のパーセンテージである２つ以上の配列または部分配列をいう。アプリケーションにより、パーセント「同一性」は、比較する配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって、あるいは、比較対象の２つの配列の全長にわたって存在し得る。
【００５８】
配列の比較のため、典型的には、１つの配列が被験配列を比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００５９】
比較のための最適な配列のアラインメントは例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、あるいは、目視検査（一般的には、下記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照）によって行うことができる。
【００６０】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。
【００６１】
用語「十分な量」は所望の効果を生じるのに十分な量、例えば、細胞から検出可能なシグナルを生じるのに十分な量を意味する。
【００６２】
用語「治療有効量」は疾患の症状を改善するのに有効な量であり、治療有効量は、予防が治療と考えられる場合「予防有効量」であり得る。
【００６３】
明細書及び特許請求の範囲で使用されているように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に他のことを指示しない限り、複数の場合を含んでいることに留意されたい。
【００６４】
ＩＩ．ウイルスの溶原化と溶菌サイクル
ウイルスは宿主細胞内で溶原サイクルと溶菌サイクルを経る。溶原サイクルの場合、ファージ染色体は細菌染色体に組み込まれるか、宿主内で安定なプラスミドとして確立され、そこで長期間休眠状態を保つことができる。溶原が誘導されると、ファージゲノムは細菌の染色体から切り出され、溶菌サイクルを開始し、それにより、最終的に細胞の溶菌とファージ粒子の放出が起こる。溶菌サイクルは、宿主の溶菌によって放出される新しいファージ粒子の産生を導く。
【００６５】
特定の鋳型ファージは溶菌活性を示し得、そしてこの傾向は宿主細菌の変化とともに変化し得る。この現象を説明するために、ＭＲＳＡ臨床分離株１０株に対する２つの鋳型黄色ブドウ球菌ファージの溶菌活性をプラークアッセイにより調べた（表１）。ファージφ１１は臨床ＭＲＳＡ分離株１０株中１０株で溶菌活性を示し、φ８０αは臨床ＭＲＳＡ分離株１０株中６株で溶菌活性を示した。従って、ファージの天然の溶原化サイクルに依存するレポーターアッセイは、散発的に溶菌活性を示すことが期待できる。
【００６６】
【表１】
2021506317.tif 000003
【００６７】
さらに、宿主ベースおよびプロファージ由来のファージ耐性メカニズムによりファージの宿主範囲が限定的であるため、ファージベースのレポーターなどのウイルスベースのレポーターアッセイは、反応性（すなわち、分析的包含性）が限定されることがある。これらの耐性メカニズムは天然ファージ核酸を標的とし、ファージＤＮＡおよび機能の破壊又は阻害をもたらす結果となり得る。このような耐性メカニズムには、ファージＤＮＡを切断する制限系およびファージ由来転写物を阻害するＣＲＩＳＰＲ系が含まれる。
【００６８】
溶菌活性とファージ耐性のいずれも、レポーターファージに基づくアッセイに対する阻害となりうる。溶菌活性は、細胞を破壊するかあるいは検出可能なシグナルを生成する能力を阻害することによって、シグナルを阻害し、それにより、検出可能なシグナルの量を減少させるか、あるいはかかるシグナルの生成を妨げることによって、検出の限界に影響を及ぼし得る。ファージ耐性メカニズムは、ファージの宿主範囲を制限し、そしてファージベースのレポーターの包含性を制限し、同様に、検出可能なシグナルの量を減少させるか、あるいはかかるシグナルの生成を妨げることによって、検出の限界に影響を及ぼし得る。レポーターファージへのファージＤＮＡの取り込みによって引き起こされる溶菌活性とファージ耐性の両方が、これらのファージレポーターを組み込んだアッセイにおける偽陰性の結果を導き得る。
【００６９】
ＩＩＩ．非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）の生成方法
非複製形質導入粒子を生成するための破壊／相補ベースの方法
ウイルスパッケージング機構によって、ウイルス産生の間にゲノムパッケージングが開始されるエレメントとして認識されるウイルスのゲノムのコンポーネントの破壊ベースの非複製形質導入粒子パッケージングシステムが、本明細書に開示される。１つの実施形態において、この破壊はバクテリオファージ由来のパッケージング開始部位を破壊し、そしてまた、ターミナーゼ機能を破壊する。破壊されたエレメントの例として、ｐａｃ型バクテリオファージのｐａｃ部位配列およびｃｏｓ型バクテリオファージのｃｏｓ部位配列挙げられる。ファージ内のパッケージング開始部位配列が破壊されると、ファージは機能的なターミナーゼをつくることができない。一例ではｐａｃ部位がｐａｃＡ遺伝子配列内にコードされ、ターミナーゼ機能は機能的ＰａｃＡおよびＰａｃＢの両方を必要とする。プラスミドＤＮＡは、前記破壊されたターミナーゼに相補し、プラスミドＤＮＡ上の認識可能なパッケージング開始部位を含むことにより、ファージカプシドにパッケージングされる。バクテリオファージは、腸内細菌科(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）バクテリオファージＰ１又はφＥＦ１１，又は黄色ブドウ球菌バクテリオファージφ８０α又はバクテリオファージφ１１のような任意のバクテリオファージであり得る。
【００７０】
パッケージング開始部位は、ウイルス産生に不可欠な遺伝子のコード領域内に見られることが多い。バクテリオファージゲノムの領域は、パッケージング開始部位を破壊する挿入、置換、欠失、または突然変異によって破壊されうる。これを達成する破壊の例としては、バクテリオファージゲノム上のパッケージング開始部位配列を含む配列を、抗生物質耐性遺伝子の配列のような別の配列と置換する対立遺伝子交換事象、または小および大ターミナーゼ遺伝子の完全な欠失が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ターミナーゼ遺伝子ｐａｃＡおよびｐａｃＢを使用する例において、ｐａｃＡは、ｐａｃＢ発現および／またはＰａｃＡおよびＰａｃＢによって媒介される全体的なターミナーゼ機能をも破壊する極性効果を引き起こす様式で破壊され得る。他の例としては、ターミナーゼ遺伝子には、黄色ブドウ球菌バクテリオファージφ１１またはφ８０α由来のｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ遺伝子、またはＥｆａｅｃａｌｉｓバクテリオファージφＥｆ１１由来のｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ遺伝子も含まれ得る。
【００７１】
１つの例では、細胞のゲノムは、パッケージング開始部位が破壊されたウイルスゲノムで溶原化される。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、黄色ブドウ球菌細胞、またはＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ細胞であり得る。細胞は、グラム陰性またはグラム陽性であり得る。相補体プラスミド（またはレポーター核酸分子）が細胞に導入され、プラスミドＤＮＡは少なくとも、バクテリオファージ内で破壊された遺伝子、ならびにパッケージング開始部位配列、ならびに場合によりさらなるバクテリオファージ遺伝子およびレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子は、検出可能なマーカーおよび／または選択可能なマーカーをコードできる。このプラスミドは、米国特許第９，３８８，４５３号に見られる方法を使用して構築され得る。プラスミドの１つ以上の遺伝子を、（バクテリオファージを誘導することによってパッケージングが開始されるときに誘導することができる）誘導性プロモーターのようなプロモーターに作動的に連結することができる。いくつかの実施形態では、プロモーターが小ターミナーゼ遺伝子または大ターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターであり得る。天然プロモーターは、バクテリオファージによって制御され得、従って、パッケージングの間に誘導される条件的プロモーターとして効果的に作用する。
【００７２】
いくつかの例では、破壊／相補が変異ウイルスＤＮＡと相補的外因性ＤＮＡとの間に相同性がないように設計されることが好ましい。これは、突然変異したウイルスＤＮＡと相補的外因性ＤＮＡとの間に相同性がないと、ウイルスゲノムにパッケージング配列を再導入する恐れのある２つのＤＮＡ分子間の相同組換えの可能性が回避されるためである。相同性をなくすことを達成するために、１つの戦略としては、ウイルスゲノムからパッケージング開始部位配列を含む遺伝子全体（または複数の遺伝子）を欠失させ、次いで、ウイルスから欠失させたＤＮＡ配列以上を含まないことが好ましい外因性ＤＮＡ分子でこの遺伝子を相補することである。この戦略では、相補的なＤＮＡ分子がウイルスから欠失した遺伝子を発現するように設計されている。このようなシステムの別の例が、バクテリオファージφ８０α、ｐａｃ型ファージを用いて提供される。ファージゲノムは宿主細菌細胞で溶原化され、ファージゲノムはｐａｃ型プロファージφ８０αのｐａｃ部位が欠失した小ターミナーゼ遺伝子を含む。天然のｐａｃ部位をもつ相補的な小ターミナーゼ遺伝子を含むプラスミドを細胞内に形質転換する。溶原化したプロファージの溶菌サイクルが誘導されると、バクテリオファージパッケージングシステムは、天然のバクテリオファージＤＮＡをパッケージングするのではなく、子孫バクテリオファージ構造成分にプラスミドＤＮＡをパッケージングする。このように、パッケージングシステムは、プラスミドＤＮＡを運搬する非複製形質導入粒子を産生する。
【００７３】
レポーター遺伝子は、検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをコードする。例では、レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光たんぱく質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光ペプチド）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、選択可能マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）からなる群から選択される。一実施形態では、レポーター遺伝子はｌｕｘＡである。いくつかの実施形態では、耐性マーカーが抗生物質耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、耐性マーカーがカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターはＰｂｌａｓｔを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージゲノム破壊は、パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム上の配列を置換または破壊する対立遺伝子交換事象によって達成される。
【００７４】
一実施形態では、バクテリオファージゲノム上の一対のターミナーゼ遺伝子、例えば、ｐａｃＡおよびｐａｃＢ、ｔｅｒＡおよびｔｅｒＢ、またはｔｅｒＳおよびｔｅｒＬは、ターミナーゼ遺伝子の１つの発現および／またはターミナーゼ遺伝子によって媒介される全体的なターミナーゼ機能をも破壊する極性効果を引き起こす様式で破壊することができる。破壊されたバクテリオファージは、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子（例えば、ｐａｃＡおよびｐａｃＢ、ｔｅｒＡおよびｔｅｒＢ、またはｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ）を含むプラスミドで相補され得る。突然変異したウイルスが溶菌サイクルを経ると、バクテリオファージゲノムまたは（破壊された場合）相補的プラスミドのいずれかから産生されたウイルスパッケージングタンパク質は、プラスミドＤＮＡのレプリコンがパッケージング開始部位を含むためこれをパッケージングユニットにパッケージングし、複製されたプラスミドＤＮＡを運んで非複製形質導入粒子を生成する。
【００７５】
ＩＶ．レポーター
いくつかの実施形態では、本発明のＮＲＴＰおよび構築物は、レポーター遺伝子を含むレポーター核酸分子を含む。レポーター遺伝子はレポーター分子をコードし得、そしてレポーター分子は検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーであり得る。特定の実施形態では、レポーター遺伝子が、細胞内で発現されたときに検出可能なシグナルを生成するレポーター分子をコードする。
【００７６】
特定の実施形態ではレポーター分子が、これらに限定されないものの、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙ、ならびに近赤外蛍光タンパク質などの蛍光レポーター分子であり得る。
【００７７】
他の実施形態では、レポーター分子が発光反応（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃなど）を媒介する酵素であり得る。レポーター分子には、細菌のルシフェラーゼ、真核生物のルシフェラーゼ、比色検出に適した酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）のような免疫検出に適したタンパク、アプタマーとして機能するまたは酵素活性（リボザイム）を示す核酸、あるいは抗生物質耐性遺伝子（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）のような選択可能マーカーが含まれる。標的核酸または細胞を検出するためのシグナルを生成するために、当技術分野で公知の他のレポーター分子を使用することもできる。
【００７８】
他の態様では、レポーター分子は核酸分子を含む。いくつかの態様において、レポーター分子は、特異的結合活性を有するか、または酵素活性を示すアプタマー（例えば、アプタザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム）である。
【００７９】
レポーターおよびレポーターアッセイは、本明細書のセクションＶにさらに記載される。
【００８０】
Ｖ．ＮＲＴＰおよびレポーターアッセイ
誘導因子レポーターアッセイ
いくつかの実施形態では、本発明は、生細胞内の遺伝子プロモーターを標的とする内因性または天然の誘導因子と共に使用するためのレポーター分子としてＮＲＴＰを使用する方法を含む。本発明のＮＲＴＰは、セクションＩＩＩおよび以下の実施例１〜２に記載される方法を使用して操作できる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、この方法はＮＲＴＰをレポーターとして使用する工程を包含し、ここで、このＮＲＴＰは、標的細胞内の標的遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターに作動的に連結されるレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子を含むＮＲＴＰを標的細胞に導入すると、レポーター核酸分子中の標的遺伝子プロモーターの誘導を介してレポーター遺伝子の発現が可能である。
【００８２】
転写産物
上述のように、転写物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型配列または遺伝子から転写されるヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の長さである。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されるｃＤＮＡ配列、またはＤＮＡ鋳型から転写されるｍＲＮＡ配列であり得る。転写物は、操作された核酸構築物から転写され得る。転写物は、分子内二重鎖を形成することができる２つの領域を含むように、転写物自体の中に相補性の領域を有することができる。１つの領域は「シス抑制配列と称されることがあり、レポーター配列に結合しその翻訳を阻止する。転写産物の第２の領域は「レポーター配列」と称され、検出可能または選択可能なマーカーといったレポーター分子をコードする。
【００８３】
本発明の転写物は、５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５ヌクレオチドの長さの転写配列でありうる。他の実施形態では、転写物は少なくとも２５，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００，１０００，１５００，２０００，３０００，４０００，５０００またはそれを超えるヌクレオチドの長さでありうる。シス抑制配列およびレポーター配列の長さは同じでも異なっていてもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、シス抑制配列は、レポーター配列から１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０またはそれを超えるスペーサーヌクレオチドにより離れている。
【００８５】
ベクター
別の態様において、本発明の転写物（アンチセンスおよびセンス配列を含む）は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａら，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．ら，国際ＰＣＴ公報ＷＯ００／２２１１３，Ｃｏｎｒａｄ，国際ＰＣＴ公報ＷＯ００／２２１１４，及びＣｏｎｒａｄ，米国特許第６，０５４，２９９号参照）。これらの配列は線状構築物、環状プラスミド、またはバクテリオファージベースのベクターを含むウイルスベクターとして導入することができ、それらは、宿主ゲノムに組み込まれ、導入遺伝子として遺伝することができる。転写物は、染色体外プラスミドとして遺伝することができるように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【００８６】
転写物配列は、発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。１つの実施形態において、シス抑制配列およびレポーター配列は、転写物がステムおよびループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復として発現される。
【００８７】
組換え発現ベクターを用いて、本発明の転写物を発現させることができる。組換え発現ベクターは一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。転写物を発現するウイルスベクターは、限定されないものの、以下のものをベースにして構築することができる：アデノ随伴ウイルス（レビューとしてＭｕｚｙｃｚｋａら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９）参照）；アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６），Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４），ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２），Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５）参照）；又はアルファウイルス、並びに当該分野で知られているその他のもの。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボで、上皮細胞を含む多くの様々な細胞型にさまざまな遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１６１４５；Ｈｕｂｅｒら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−１９  ；Ｋａｙら，１９９２，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入および発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムをＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰといった適切なパッケージング細胞株にトランスフェクトすることによって作製することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅら，１９９１，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：５−１０；Ｃｏｎｅら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）中の多種多様な細胞および組織に感染させるために使用することができ（Ｈｓｕら，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、また、感染のために有��分裂活性細胞を必要としないという利点を有する。
【００８８】
発現される転写物のコード配列を受容することが可能な任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなどに由来するベクターを使用することができる。ウイルスベクターの指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）は、適宜、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質またはその他の表面抗原で偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）すること、あるいは異なるウイルスカプシドタンパク質を置換することによって改変することができる。
【００８９】
例えば、本発明において特徴付けられるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ由来の表面タンパク質を用いて偽型化できる。本発明において特徴付けられるＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することによって、異なる細胞を標的とするように作製できる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当技術分野の範囲内である。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  Ｊ  Ｅら（２００２），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７９１−８０１参照。
【００９０】
本発明での使用に適する組換えウイルスベクターの選択、転写物を発現するための核酸配列をベクターに挿入する方法、およびウイルスベクターを目的の細胞に送達する方法は、当業者の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ  Ｍ  Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ  Ａ  Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｗ  Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０；ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  Ｄ  Ａら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照。
【００９１】
ウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来し得る。本発明で特徴付けられる転写物を発現させるための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ  Ｈら（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。本発明で特徴付けられる転写物を発現させるための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒら（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｋ  Ｊら（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒら（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願公報ＷＯ９４／１３７８８号；及び国際特許出願公報ＷＯ９３／２４６４１号に記載されている。
【００９２】
本発明で特徴付けられるＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかで転写物の発現を促進するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーターもしくはアクチンプロモーターもしくはＵ１  ｓｎＲＮＡプロモーター）、または一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６  ｓｎＲＮＡもしくは７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター）、または原核生物プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）であり得、ただし、発現プラスミドがＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼもコードすることが条件である。プロモーターはまた、導入遺伝子の発現を膵臓に向けることもできる（例えば、Ｂｕｃｃｈｉｎｉら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２５１１−２５１５）の膵臓のインスリン調節配列を参照）。
【００９３】
さらに、転写物の発現は、例えば、誘導性調節配列および発現系（例えば、特定の生理学的調節因子（例えば、循環グルコースレベルまたはホルモン）に感受性の調節配列）を使用することによって、正確に調節され得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、１９９４、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物における導入遺伝子発現の制御に適したこのような誘導性発現系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導物質、およびイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の意図される使用に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができる。
【００９４】
一般に、転写物分子を発現し得る組換えベクターは、以下に記載されるように送達され、そして標的細胞中に存続する。あるいは、転写物分子の一過性発現をもたらすウイルスベクターを使用することができる。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現すると、転写物は標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。転写物発現ベクターの送達は例えば、静脈内または筋肉内投与によって、患者から取り出した標的細胞への投与後に患者へ再導入することによって、あるいは所望の標的細胞への導入を可能にする他の任意の手段によって、全身的であってもよい。
【００９５】
転写物発現ＤＮＡプラスミドは、典型的にはカチオン性脂質キャリア（例えば、オリゴフェクタミン）または非カチオン性脂質ベースキャリア（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランスフェクトされる。１週間以上の期間にわたる単一のＰＲＯＣ遺伝子または複数のＰＲＯＣ遺伝子の異なる領域を標的とするｄｓＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションもまた、本発明によって意図される。宿主細胞へベクター導入が成功したことは、種々の公知の方法を用いてモニターできる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いてシグナル伝達することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞の安定なトランスフェクションは、特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性（例えば、ヒグロマイシンＢ耐性）をトランスフェクトされた細胞にもたらすマーカーを使用して確認できる。
【００９６】
組換えＤＮＡを含むベクターの送達は、非生物学的または生物学的な系によって行うことができる。リポソーム、ウイルス様粒子、ファージまたはウイルスに由来する形質導入粒子、および複合体を含むが、これらに限定されない。
【００９７】
転写アッセイのためのレポーター
いくつかの実施形態において、核酸構築物はレポーター配列（例えば、レポーター遺伝子配列）を含む。レポーター遺伝子は、細胞内で発現されるとシグナルを発生するレポーター分子をコードする。いくつかの実施形態において、レポーター分子は、検出可能または選択可能なマーカーであり得る。特定の実施形態では、レポーター分子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光レポーター分子であり得る。他の実施形態では、レポーター分子は化学発光タンパク質であり得る。
【００９８】
レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、比色検出に適した酵素、免疫検出に適したタンパク質、免疫検出に適したペプチド、またはアプタマーとして機能するかまたは酵素活性を示す核酸であり得る。
【００９９】
選択可能なマーカーはまた、レポーターとして使用され得る。選択マーカーは例えば、抗生物質耐性遺伝子であり得る。
【０１００】
実施例
下記は、本発明を実施するための具体的な実施形態の実施例である。これらの実施例は説明目的にのみ提供されるのであって、決して本発明の範囲を限定する意図ではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関し正確さを確認する努力がなされてきたが、もちろん、いくらかの実験誤差および偏差が許容されるべきである。
【０１０１】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、および薬理学上で従来の方法を使用する。このような技術は文献で全て説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３rd  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照。
【０１０２】
実施例１：破壊／相補パッケージングシステムの構築
黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方）の検出用の非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を製造するための破壊／相補ベースのパッケージングシステムの設計および構築は、米国特許第９，３８８，４５３号の実施例２に記載されている。簡単に言うと、溶原化されたφ８０αバクテリオファージゲノムに、小さなターミナーゼｔｅｒＳ遺伝子の欠損（パッケージング開始部位配列も欠損している）を含む制限欠損黄色ブドウ球菌株ＳＴ２４が構築された。ｔｅｒＳ遺伝子とパッケージング開始部位が欠損したφ８０αバクテリオファージゲノム配列の一部を配列番号１に示す。プラスミドレポーター核酸分子、ｐＴ１８１  ＭＲＳＡ（米国特許第９，３８８，４５３号ではｐＧＷ８０Ａ００１と呼ばれる）で図１に示されるものが構築され、以下を記載の順序で含んでいた：ｐＴ１８１ｃｏｐ６２３  ｒｅｐＣ複製起点、テトラサイクリン耐性、小ターミナーゼｔｅｒＳ遺伝子、アンピシリン耐性、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ複製起源、黄色ブドウ球菌ＰｃｌｐＢプロモーター、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉのｌｕｘＡおよびｌｕｘＢルシフェラーゼ遺伝子、および転写物イオン終結配列。ｐＴ１８１  ＭＲＳＡの完全ヌクレオチド配列を配列番号２に示す（米国特許第９，３８８，４５３号の配列番号１４に示すｐＧＷ８０Ａ００１の完全ヌクレオチド配列と同一である）。
【０１０３】
図２に示すように、次にパッケージングシステムを、ＳＴ２４株をｐＴ１８１  ＭＲＳＡプラスミドで形質転換し、φ８０α溶菌サイクルを誘導することによって構築し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むコンカテマー化されたプラスミドを含む主にＮＲＴＰからなるライセートが得られた。これらの細胞ライセートを黄色ブドウ球菌細胞（ＲＮ４２２０  ｓｔｒａｉｎ，Ｋｒｅｉｓｗｉｒｔｈ，Ｂ．Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３，３０５（５９３６）ｐ．７０９−７１２）の形質導入に１：１の容量で使用し、ルシフェラーゼ基質トリデカナール（１ｍＭ溶液）を使用する発光アッセイを、米国特許第９，３８８，４５３号の実施例７に記載されているように行ったところ、（図３Ａに示すように）光を検出でき、形質導入細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を示した。しかし、宿主黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株細胞のもとでライセート希釈液の５倍希釈系列を使用して、標準的なファージプラークアッセイで試験した場合、これらの細胞ライセートは、（図３Ｂに示されるように）明白なファージプラークを生成することが観察され、黄色ブドウ球菌の検出のための発光アッセイの感度を妨げる天然φ８０αバクテリオファージの存在が示された。
【０１０４】
実施例２：新しいプラスミドレポーター核酸分子の構築
ＮＲＴＰによって生成されるシグナルを増加させ、そしてさらに天然バクテリオファージの産生を減少させる黄色ブドウ球菌の検出のためのパッケージングシステムを作成するために、新しいプラスミドレポーター核酸分子を構築した。最初に、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）クローニングプロトコル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、ｐＴ１８１  ＭＲＳＡプラスミド上のテトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を切除し、プラスミドｐＤＬ２７６由来のカナマイシン耐性遺伝子（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｄ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｄｕｎｎｙら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１，５７（４）：１１９４−２０１）で置換し、そして小ターミナーゼｔｅｒＳ遺伝子の上流に挿入ししたところ、サイズが２．７ｋｂ減少したプラスミドｐＳＤ０２を生じた（図４を参照）。ｐＳＤ０２の完全な７５５８ｂｐの配列を配列番号３に示す。パッケージング株ＳＴ２４をｐＳＤ０２で形質転換し、細胞ライセートを実施例１に記載のように収集した。次いで、これらのライセートを用いて黄色ブドウ球菌細胞に形質導入し、発光アッセイおよびファージプラークアッセイの両方を行った。結果は、元のｐＴ１８１  ＭＲＳＡプラスミドからの観察値と比較して、約５倍高い発光強度（図５Ａ）および約１０倍少ないファージプラーク形成（図５Ｂ）の増加を示す。
【０１０５】
天然バクテリオファージ粒子の産生をさらに低減または排除し、プラスミド中の配列と（ｔｅｒＳ破壊を有する）溶原化φ８０αゲノムとの相同性が相同組換えおよび天然ファージの生成をもたらすという仮説を検証するために、他の２つのプラスミドレポーターを構築した。まず、「Ｒｏｕｎｄ−ｔｈｅ−ｈｏｒｎ  ＰＣＲ」ベースの突然変異誘発（ＯｐｅｎＷｅｔＷａｒｅ．ｏｒｇ）を用いて、切除すべき９４ｂｐ領域から外側に増幅するプライマーを設計することにより、ｐＳＤ０２の予測されるｔｅｒＳプロモーター領域の上流９４ｂｐ領域を切り出し、９４ｂｐ領域を除外し、７４６４ｂｐのプラスミドｐＳＤ０７（配列番号４）を生じるアンプリコンを作製した。さらに、（コドン最適化ソフトウェアおよび「Ｒｏｕｎｄ−ｔｈｅ−ｈｏｒｎ  ＰＣＲ」を用いることにより）ｔｅｒＳ遺伝子の３’末端の８０ｂｐコード配列にサイレント突然変異を導入して、長さ７４６４ｂｐのプラスミドｐＳＤ０８（配列番号５）を作製した。発光およびファージプラークアッセイを行ったとき、ｐＳＤ０７由来のライセートで形質導入された細胞は、ｐＳＤ０２ライセート由来の値と比較して、発光強度またはプラーク形成に差異を示さなかった（データは示さず）。対照的に、ｐＳＤ０８形質導入黄色ブドウ球菌細胞から種々の濃度で収集したライセートからはほとんどプラークは観察されなかったが（図６）、発光強度はｐＳＤ０２形質導入細胞からの強度よりも有意に低かった（約１／３）。
【図１】
2021506317.tif 000004
【図２】
2021506317.tif 000005
【図３Ａ】
2021506317.tif 000006
【図３Ｂ】
2021506317.tif 000007
【図４】
2021506317.tif 000008
【図５Ａ】
2021506317.tif 000009
【図５Ｂ】
2021506317.tif 000010
【図６】
2021506317.tif 000011
【配列表】
2021506317000001.app
【国際調査報告】
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