(57)【要約】  本出願は、変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼ、及びそれを用いたホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列において、２８５番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されるか、３９８番目のアミノ酸がグルタミンに置換されるか、又はそれらの組み合わせにより置換された変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列において、さらに３７８番目のアミノ酸がトリプトファンに置換された、請求項１に記載の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含むコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
前記コリネバクテリウム属微生物は、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を生産する、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｏ−アセチルホモセリン及びＬ−メチオニンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム属微生物はＬ−アラニンを生産する、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
請求項４に記載の微生物を培地で培養する工程と、前記培養した微生物又は培養した培地からホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を回収する工程とを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産方法。
【請求項１０】
前記ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン及びＬ−メチオニンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項９に記載のホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産用組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコリネバクテリウム属微生物から培養するステップを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の排出増加方法。
【請求項１３】
ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、請求項１に記載の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼの使用。
【請求項１４】
ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、請求項３に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼに関し、具体的にはホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼであって、前記アミノ酸置換は、２８５番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換、３９８番目のアミノ酸のグルタミンへの置換、もしくはそれらの組み合わせを含む変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼ、それを用いてホモセリンもしくはホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を生産する方法、ホモセリンもしくはホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産用組成物、ホモセリンもしくはホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の排出増加方法、又は前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸のうちＬ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−メチオニンは、アスパラギン酸セミアルデヒド（aspartate-semialdehyde，以下、ＡＳＡ）からホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase，以下、Ｈｏｍ，ＥＣ：１．１．１．３）により生成されたホモセリンを共通に用いる。よって、前記アミノ酸を発酵法により生産するためには、生合成経路で用いられる酵素の活性を一定レベル以上に維持することは必須であり、それについての集中的な研究が行われてきた。
【０００３】
特に、Ｌ−リシン及びＬ−トレオニン生合成経路の分岐点で作用するホモセリンデヒドロゲナーゼは、Ｌ−トレオニン及びＬ−イソロイシンにより活性が調節されることが知られている。Ｌ−トレオニンによるフィードバック阻害が脱感作されたＨｏｍ及びそれを用いたＬ−トレオニンの生産方法については従来から複数の報告がある。１９９１年にドイツのＥｉｋｍａｎｎらは、Ｈｏｍの３７８番目のアミノ酸残基であるグリシンがグルタミン酸に置換されて脱感作されたＨｏｍを報告しており（非特許文献１）、１９９１年に米国のＡｒｃｈｅｒらは、フレームシフト突然変異によりＨｏｍのＣ末端が損傷を受けると脱感作特性を示すことを報告している（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国登録特許第０１５９８１２号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−００５７６８４号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号公報
【特許文献４】韓国公開特許第２００８−００２５３５５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Eikmanns BJ et al., Appl. Microbial Biotechnol. 34: 617-622, 1991
【非特許文献２】Archer JA et al., Gene 107: 53-59, 1991
【非特許文献３】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献４】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献５】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献６】Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351
【非特許文献７】Peoples et al., Mol. Biol. 2(1):63-72, 1988
【非特許文献８】Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993)
【非特許文献９】J. Biotechnol. 103:51-65, 2003
【非特許文献１０】van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、トレオニンによるフィードバック阻害の脱感作に関する研究を重ねた結果、変異型Ｈｏｍをコードする新規遺伝子を分離し、前記新規遺伝子が形質導入された微生物においてＬ−アミノ酸生産能が向上することを確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願は、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼであって、前記アミノ酸置換は、２８５番目のアミノ酸もしくは３９８番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、又はそれらの組み合わせによる置換を含む変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを提供することを目的とする。
【０００８】
また、本出願は、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本出願は、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含むコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップと、前記培養された微生物又は培地からホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を回収するステップとを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本出願は、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産用組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本出願は、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコリネバクテリウム属微生物から培養するステップを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の排出増加方法を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本出願は、本出願のホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼの用途を提供することを目的とする。
【００１４】
さらに、本出願は、本出願のホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、前記ポリヌクレオチドの用途を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本出願は、本出願のホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、前記コリネバクテリウム属微生物の用途を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１６】
本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、天然又は野生型に比べて最終産物によるフィードバック阻害が脱感作されるので、より効率的なホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の大量生産に広く活用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
【００１８】
前記目的を達成するための本出願の一態様は、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼであって、前記アミノ酸置換は、２８５番目のアミノ酸もしくは３９８番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、又はそれらの組み合わせによる置換を含む変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを提供する。
【００１９】
具体的には、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼであって、前記アミノ酸置換は、２８５番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換、３９８番目のアミノ酸のグルタミンへの置換、又はそれらの組み合わせによる置換を含むホモセリンデヒドロゲナーゼ変異体を提供する。より具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において、２８５番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されるか、３９８番目のアミノ酸がグルタミンに置換されるか、又はそれらの組み合わせにより置換された変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを提供する。
【００２０】
本出願におけるホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase, EC:1.1.1.3）とは、植物、微生物においてメチオニン、トレオニン、イソロイシン生合成の共通の中間物質であるホモセリンの合成を触媒する酵素を意味し、ホモセリン脱水素酵素ともいう。本出願におけるホモセリンデヒドロゲナーゼは、前記変換活性を有するタンパク質であればその由来はいかなるものでもよく、任意の有機体（植物、微生物など）に由来する酵素を用いることができる。具体的には、前記ホモセリンデヒドロゲナーゼは、コリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（corynebacterium glutamicum）由来であってもよい。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と混用されてもよい。
【００２１】
本出願におけるホモセリンデヒドロゲナーゼを確保する方法には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができる。その方法の例として、タンパク質発現に通常広く用いられるコリネバクテリウム属微生物からタンパク質を高効率で確保できるように、コドン最適化をはじめとする遺伝子合成技術や、微生物の大量のゲノム情報に基づいた生物情報学的方法による有用酵素資源のスクリーニングにより確保することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本出願におけるホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質は、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号１のアミノ酸配列、アミノ酸配列の前後の無意味な配列付加、自然に発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、本願のホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質に含まれる。具体的には、本願のホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと８０％、９０％、９５％もしくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００２３】
また、本出願において「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド」と記載されているとしても、そのような相同性を有して前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。例えば、本出願におけるホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質は、コリネバクテリウム・グルタミカム（corynebacterium glutamicum）由来のホモセリンデヒドロゲナーゼであってもよい。より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７由来のホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号４９）、又はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号５０）であってもよい。前記配列を有するホモセリンデヒドロゲナーゼは、互いに８０％、９０％、９５％又は９７％以上の相同性を示し、ホモセリンデヒドロゲナーゼに相当する効能を示すので、本出願のホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質に含まれることは言うまでもない。
【００２４】
前記「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分（moiety）間の同一性の割合を意味する。与えられたアミノ酸配列又は塩基配列に一致する程度を意味し、百分率で表されてもよい。本明細書において、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「％相同性」で表される。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定されてもよい。例えば、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献３、４）で決定されてもよい。
【００２５】
本出願における「変異」、「変異型」又は「変異体」とは、遺伝的又は非遺伝的に１つの安定した表現型の変化を示す培養物や個体を意味する。具体的には、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質に対応するアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が変異し、その活性が野生型、天然又は非変異のものと比較して効率的に増加した変異体や、イソロイシン、トレオニン、それらのアナログ又は誘導体に対するフィードバック阻害が解除された変異体や、活性増加とフィードバック阻害の解除の両方がもたらされた変異体を意味する。
【００２６】
本出願における変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、「変異したホモセリンデヒドロゲナーゼ」や「ホモセリンデヒドロゲナーゼ変異体」と混用されてもよい。なお、このような変異体は、天然に存在しない（non-naturally occurring）ものであってもよい。
【００２７】
本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、具体的には、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型タンパク質であって、前記アミノ酸置換は、２８５番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換、３９８番目のアミノ酸のグルタミンへの置換、又はそれらの組み合わせを含む変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼであってもよい。前記ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、前述した通りであり、例えば配列番号１のアミノ酸配列であってもよい。また、前記２８５番目のアミノ酸は、トレオニンがイソロイシンに置換されたものであってもよく、前記３９８番目のアミノ酸は、アルギニンがグルタミンに置換されたものであってもよい。
【００２８】
さらに、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型タンパク質であって、前記アミノ酸置換は、３７８番目のアミノ酸のトリプトファンへの置換を含む変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼであってもよい。さらに、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型タンパク質であって、前記アミノ酸置換は、２８５番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換、３９８番目のアミノ酸のグルタミンへの置換、又はそれらの組み合わせによる置換を含む変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼが、さらに３７８番目のアミノ酸のトリプトファンへの置換を含むものであってもよい。より具体的には、前記３７８番目のアミノ酸は、グリシンがトリプトファンに置換されたものであってもよい。
【００２９】
さらに具体的には、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型タンパク質であって、前記アミノ酸置換は、２８５番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換、３９８番目のアミノ酸のグルタミンへの置換、又はそれらの組み合わせを含む変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼであってもよい。例えば、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、配列番号１０、１１、１２又は１３のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、前記配列の前後の無意味な配列付加、自然に発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼと同一又は相当する活性を有するものであれば、本願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質に含まれる。具体的には、本願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、配列番号１０、１１、１２もしくは１３のアミノ酸配列、又はそれと８０％、９０％、９５％もしくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、本出願において「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチド」と記載されているとしても、そのような相同性を有して前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
【００３０】
また、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドを有する変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼであって、２８５番目のアミノ酸又は３９８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異を含み、ホモセリンデヒドロゲナーゼに相当する効能を示すタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
【００３１】
さらに、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼは、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有する野生型又は天然タンパク質や非変性タンパク質とは異なり、最終産物であるイソロイシン、トレオニン、メチオニン、ホモセリン又はそれらの誘導体もしくはアナログによるフィードバック阻害が解除又は脱感作された特徴を有するものであってもよい。本出願における「フィードバック阻害（feedback inhibition）」とは、代謝の最終産物がそれより前の段階の反応を阻害することを意味する。よって、ホモセリンデヒドロゲナーゼのフィードバック阻害を解除又は脱感作すると、そうしていないものに比べて微生物のホモセリン及びホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させることができる。
【００３２】
前記ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸とは、Ｌ−ホモセリンを前駆体として生合成されるＬ−アミノ酸を意味し、Ｌ−ホモセリンから生合成される物質であればいかなるものでもよい。前記ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸は、ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸だけでなく、その誘導体も含まれる。例えば、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−メチオニン及び／又はＬ−グリシンであってもよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン及び／又はＬ−メチオニンであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本出願の他の態様は、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、変異型については前述した通りである。
【００３５】
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖であり、より具体的には前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。本出願の変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本出願のホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有する変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
【００３６】
本出願におけるホモセリンデヒドロゲナーゼ変異体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、具体的にはコリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、より具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【００３７】
また、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、タンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、又はそれと８０％、９０％、９５％もしくは９７％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。また、そのような相同性を有して実質的に前記タンパク質と同一又は相当する効能を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたポリヌクレオチド配列も本出願に含まれることは言うまでもない。本出願のホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であってもよい。例えば、配列番号４８のポリヌクレオチド配列であってもよいが、これに限定されるものではない。また、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であってもよく、具体的には配列番号１０、１１、１２又は１３をコードするポリヌクレオチド配列であってもよい。例えば、配列番号６、７、８、９のポリヌクレオチド配列であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
あるいは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（例えば、非特許文献５）に具体的に記載されている。例えば、相同性の高い遺伝子同士、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似したヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたヌクレオチド断片が含まれてもよい。具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節されてもよい。ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献５参照）。
【００３９】
本出願のさらに他の態様は、変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む微生物を提供する。具体的には、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属（the genus of Corynebacterium）微生物を提供する。また、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む、Ｌ−アラニンを生産するコリネバクテリウム属（the genus of Corynebacterium）微生物を提供する。しかし、これらに限定されるものではない。
【００４０】
前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、変異体については前述した通りである。
【００４１】
具体的には、本出願における変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む微生物とは、自然にホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物、又はホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産能のない親株にホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産能が付与された微生物を意味する。より具体的には、前記ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む微生物は、配列番号１のアミノ酸配列において、２８５番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換、３９８番目のアミノ酸のグルタミンへの置換、又はそれらの組み合わせによる置換を含む変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現する微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記微生物は、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて変異型ポリペプチドを発現する細胞又は微生物であり、本出願の目的上、前記宿主細胞又は微生物は、前記変異型ポリペプチドを含み、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を生産する微生物であればいかなるものでもよい。
【００４２】
本出願の変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む微生物は、野生型又は非変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質を含む微生物に比べて、ホモセリン、ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸又はＬ−アラニンの生産能が向上するので、これらの微生物からホモセリン、ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸又はＬ−アラニンを高収率で得ることができる。
【００４３】
本出願における前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む微生物は、その種類が特に限定されるものではなく、エンテロバクター（Enterbacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であってもよい。より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物であってもよい。
【００４４】
本出願における「コリネバクテリウム属微生物」とは、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。より具体的には、本出願におけるコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよい。
【００４５】
一方、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む微生物は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された微生物であってもよい。具体的には、前記導入は、形質転換により行われてもよいが、これに限定されるものではない。
【００４６】
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれてもよい。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００４７】
本出願に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本出願に使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。また、細胞内染色体挿入用ベクターにより、染色体内に標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチド分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【００４９】
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらが全て含まれるものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記形質転換する方法は、ポリヌクレオチドを細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（Ｃａ（Ｈ2ＰＯ4）2、ＣａＨＰＯ4、又はＣａ3（ＰＯ4）2）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。作動可能な連結は当該技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野の切断及び連結酵素などを用いて作製することができるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む微生物は、コリネバクテリウム属微生物が前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含むように形質転換されたものであってもよい。前記コリネバクテリウム属微生物には、例えば２−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｖａｌｅｒａｔｅ（ＡＨＶ）に耐性を有する菌株、トレオニン生合成経路において最初の重要な酵素として作用するａｓｐａｒｔａｔｅ ｋｉｎａｓｅ（ｌｙｓＣ）のフィードバック阻害（feedback inhibition）を解除するために、ｌｙｓＣの３７７番目のアミノ酸であるロイシン（Leucine）がリシン（Lysine）に置換され、Ｌ−トレオニンを生産する菌株、前記Ｌ−トレオニンを生産する菌株においてＬ−トレオニンデヒドラターゼ（L-threonine dehydratase, isoleucine生合成経路の最初の酵素）をコードする遺伝子ｉｌｖＡの３２３番目のアミノ酸がアラニンに置換され、Ｌ−イソロイシンを生産する菌株（非特許文献６）、Ｏ−アセチル−ホモセリン分解経路のＯ−アセチル−ホモセリンチオールリアーゼ（O-acetylhomoserine(thiol)-lyase）及びシスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma-synthase）タンパク質が不活性化され、Ｏ−アセチルホモセリンを生産する菌株、又はメチオニンシステイン転写調節因子タンパク質が不活性化され、メチオニンを生産する菌株が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本出願のさらに他の態様は、前記微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培養した培地からホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を回収するステップとを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産方法を提供する。
【００５３】
前記微生物は、前述したように、本出願のホモセリンデヒドロゲナーゼ変異体を含むコリネバクテリウム属微生物であってもよく、より具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカムであってもよい。また、前記コリネバクテリウム属微生物又はコリネバクテリウム・グルタミカムは、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を生産する微生物であってもよい。前記ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸には、ホモセリン由来Ｌ−アミノ酸だけでなく、その誘導体も含まれる。例えば、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、Ｌ−メチオニン及び／又はＬ−グリシンであってもよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン及び／又はＬ−メチオニンであってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記コリネバクテリウム属微生物又はコリネバクテリウム・グルタミカムは、Ｌ−アラニンを生産する微生物であってもよい。
【００５４】
前記ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸は、本出願の前記微生物が生産したホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の培養液、又は精製した形態であってもよい。また、それ自体の形態だけでなく、その塩の形態も全て含まれることは当業者にとって自明である。
【００５５】
前記ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を生産する方法は、当該技術分野で公知の最適化された培養条件及び酵素活性条件において当業者が容易に決定することができる。
【００５６】
前記方法における前記微生物を培養するステップは、特に限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行うことができる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節し、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持することができる。培養温度は２０℃〜４５℃、具体的には２５℃〜４０℃に維持し、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これらに限定されるものではない。前記培養により生産されたトレオニン、イソロイシン又はアセチルホモセリンは、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
【００５７】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
【００５８】
本出願の前記培養ステップで生産されたホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とする産物を回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から標的物質であるホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を回収することができる。また、前記回収ステップは、精製工程をさらに含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。
【００５９】
本出願のさらに他の態様は、変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産用組成物を提供する。
【００６０】
前記ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産用組成物とは、本出願のポリヌクレオチドによりホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸を生産する組成物を意味する。例えば、前記組成物には、前記ポリヌクレオチドが含まれ、さらに前記ポリヌクレオチドを作動させることのできる構成が全て含まれる。前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞において作動可能に連結された遺伝子を発現させることができるようにベクター内に含まれる形態であってもよい。
【００６１】
また、前記組成物は、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
本出願のさらに他の態様は、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコリネバクテリウム属微生物から培養するステップを含む、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の排出増加方法を提供する。
【００６３】
前記「変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼ」、「コリネバクテリウム属微生物」、「培養」及び「ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸」については前述した通りである。
【００６４】
本出願のさらに他の態様は、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼの用途を提供する。
【００６５】
本出願のさらに他の態様は、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの用途を提供する。
【００６６】
本出願のさらに他の態様は、ホモセリン又はホモセリン由来Ｌ−アミノ酸の生産用組成物の製造のための、前記変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼを含むコリネバクテリウム属微生物の用途を提供する。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これらの実施例はあくまで本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６８】
人工変異法によるＡＨＶ耐性微生物のスクリーニング
本実施例においては、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１（特許文献１）を親株として、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase，以下、Ｈｏｍ，ＥＣ：１．１．１．３）のＬ−トレオニンによるフィードバック阻害を解除するために、Ｌ−トレオニンアナログである２−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｖａｌｅｒａｔｅ（以下、ＡＨＶ）に対する耐性を付与する実験を行った。
【００６９】
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine：以下、ＮＴＧ）を用いた人工変異法により変異を誘導した。種培地で１８時間培養したＫＦＣＣ１０８８１菌株を種培地４ｍｌに接種し、ＯＤ660が約１．０になるまで培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収し、その後５０ｍＭのＴｒｉｓ−ｍａｌａｔｅ緩衝液（ｐＨ６．５）で２回洗浄し、最後に４ｍｌの同じ緩衝液に懸濁した。菌体懸濁液に最終濃度１５０ｍｇ／ｌになるようにＮＴＧ溶液（２ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ｍａｌａｔｅ緩衝液（ｐＨ６．５））を添加して室温で２０分間静置し、その後遠心分離により菌体を回収し、ＮＴＧ除去のために同じ緩衝液で２回洗浄した。最終的に、洗浄した菌体を２０％グリセリン溶液４ｍｌに懸濁し、使用するまで−７０℃で保管した。３ｇ／ｌのＡＨＶを含む最小培地にＮＴＧ処理菌株を塗抹し、前記過程により１５５株のＡＨＶ耐性ＫＦＣＣ１０８８１菌株を得た。
種培地（ｐＨ７．０）
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
最小培地（ｐＨ７．２）
グルコース５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ５ｇ，ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．４ｇ，ＮａＣｌ ０．５ｇ，ビオチン２００μｇ，チアミンＨＣｌ １００μｇ，パントテン酸カルシウム１００μｇ，ニコチンアミド０．０３ｇ，尿素２ｇ，Ｎａ2Ｂ4Ｏ7１０Ｈ2Ｏ ０．０９ｍｇ，（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ27４Ｈ2Ｏ ０．０４ｍｇ，ＺｎＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．０１ｍｇ，ＣｕＳＯ4５Ｈ2Ｏ，ＭｎＣｌ2４Ｈ2Ｏ ０．０１ｍｇ，ＦｅＣｌ3６Ｈ2Ｏ １ｍｇ，ＣａＣｌ2 ０．０１ｍｇ（蒸留水１リットル中）
【実施例２】
【００７０】
ＡＨＶ耐性ＫＦＣＣ１０８８１菌株に対するＬ−トレオニン生産試験
実施例１で得た１５５株のＡＨＶ耐性菌株に対してＬ−トレオニン生産能試験を行った。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに実施例１で得た１５５株の菌株を接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次のＬ−トレオニン生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
Ｌ−トレオニン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ，Ｕｒｅａ ３ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４０ｇ，Ｐｅｐｔｏｎｅ ２．５ｇ，ＣＳＬ（Ｓｉｇｍａ） ５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，Ｌｅｕｃｉｎｅ ４００ｍｇ，ＣａＣＯ3 ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
【００７１】
培養終了後に、生産された様々なアミノ酸の生産量をＨＰＬＣにより測定した。実験を行った１５５株の菌株のうち、Ｌ−トレオニン生産能に優れる上位２２株に対するアミノ酸の培養液中の濃度を表１に示す。前記過程により確認した２２株の候補をそれぞれＫＦＣＣ１０８８１−１〜ＫＦＣＣ１０８８１−２２と命名した。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
表１に示すように、ＡＨＶ耐性を有する２２種の菌株が生産するＬ−トレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシンは対照群に比べて増加したのに対して、Ｌ−リシンは減少した。
【００７４】
Ｌ−トレオニンとＬ−リシンの生合成経路は、アスパラギン酸セミアルデヒド（aspartate-semialdehyde, 以下、ＡＳＡ）を分岐点として分かれる。すなわち、Ｌ−トレオニン生産量が増加するにつれて、Ｌ−リシン生産量は減少する。よって、Ｌ−トレオニン生産量が増加するにつれて、Ｌ−トレオニン生合成経路の副産物であるホモセリン（Ｈｓｅ）、Ｌ−グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉｌｅ）も増加するので、それらの生産量の合計（Ｔｈｒ＋Ｈｓｅ＋Ｇｌｙ＋Ｉｌｅ）も確認した。
【００７５】
よって、前記ＡＨＶ耐性菌株のうち、Ｌ−リシン生産量が減少し、Ｌ−トレオニン生産量が多く、Ｔｈｒ＋Ｈｓｅ＋Ｇｌｙ＋Ｉｌｅの総生産量が多い４種の菌株（ＫＦＣＣ１０８８１−１、ＫＦＣＣ１０８８１−１４、ＫＦＣＣ１０８８１−１９及びＫＦＣＣ１０８８１−２２）を最も優れたＡＨＶ耐性菌株として選択した。
【実施例３】
【００７６】
ＫＦＣＣ１０８８１由来トレオニン生産能に優れる菌株の塩基配列分析
実施例１で選択した菌株におけるＬ−トレオニン生合成酵素の塩基配列の分析を次のように行った。ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）が提供する遺伝子情報に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｈｏｍの塩基配列（配列番号１，ＮＣｇｌ１１３６）、ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢの塩基配列（配列番号２，遺伝子番号ＮＣｇｌ１１３７）をそれぞれ確保した。ｈｏｍとｔｈｒＢは、オペロン構造をとることが知られている（非特許文献７）。
【００７７】
選択した菌株のｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンを含むＤＮＡ断片を確保するために、菌株の菌体を鋳型とし、配列番号３及び４のプライマー組み合わせによりＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のための重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の重合反応を３０サイクル行うものとした。その結果、配列番号１の開始コドンの上流にプロモーター部位を有する３００ｂｐの塩基配列を含み、配列番号２の終止コドンの下流の２００ｂｐを含む２７７８ｂｐの遺伝子断片が増幅された（配列番号５）。
【００７８】
前述したように作製したプライマーを用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３０ＸＬ Ａｎａｌｙｚｅｒ（96 capillary type, Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。ＫＦＣＣ１０８８１−１内のｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンのｈｏｍに相当する塩基配列は、配列番号１の８５４番目の塩基であるシトシンがチアミンに変異し、トレオニン残基をコードするＡＣＴ遺伝子コドンがイソロイシン残基をコードするＡＴＴ遺伝子コドンに変異したことが分かった（以下、Ｔ２８５Ｉ変異；配列番号６）。また、ＫＦＣＣ１０８８１−１４内のｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンに相当する塩基配列は、配列番号１の１１９３番目の塩基であるグアニンがアデニンに変異し、アルギニン残基をコードするＣＧＡ遺伝子コドンがグルタミン残基をコードするＣＡＡ遺伝子コドンに変異したことが分かった（以下、Ｒ３９８Ｑ変異；配列番号７）。さらに、ＫＦＣＣ１０８８１−１９内のｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンに相当する塩基配列は、配列番号１の１１３２番目の塩基であるグアニンがシトシンに変異し、グリシン残基をコードするＧＧＧ遺伝子コドンがトリプトファン残基をコードするＴＧＧ遺伝子コドンに変異したことが分かった（以下、Ｇ３７８Ｗ変異；配列番号８）。さらに、ＫＦＣＣ１０８８１−２２内のｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンに相当する塩基配列は、配列番号１の１１３２番目の塩基であるグアニンがアデニンに変異し、１１３４番目の塩基であるグアニンがシトシンに変異し、グリシン残基をコードするＧＧＧ遺伝子コドンがセリン残基をコードするＡＧＣ遺伝子コドンに変異したことが分かった（以下、Ｇ３７８Ｓ変異；配列番号９）。一方、配列番号２に相当するｔｈｒＢにおいては変異が発見されなかった。
【００７９】
これらの塩基配列分析結果をまとめると、ＫＦＣＣ１０８８１−１内で発現するＨｏｍ（配列番号１０）は２８５番目のアミノ酸残基であるトレオニンがイソロイシンに変異し（以下、Ｔ２８５Ｉ変異）、ＫＦＣＣ１０８８１−１４内に発現するＨｏｍ（配列番号１１）は３９８番目のアミノ酸残基であるアルギニンがグルタミンに変異し（以下、Ｒ３９８Ｑ変異）、ＫＦＣＣ１０８８１−１９内に発現するＨｏｍ（配列番号１２）は３７８番目のアミノ酸残基であるグリシンがトリプトファンに変異し（以下、Ｇ３７８Ｗ変異）、ＫＦＣＣ１０８８１−２２内に発現するＨｏｍ（配列番号１３）は３７８番目のアミノ酸残基であるグリシンがセリンに変異し（以下、Ｇ３７８Ｓ変異）、Ｌ−トレオニンによるフィードバック阻害が脱感作されたことが分かった。
【実施例４】
【００８０】
新規ホモセリンデヒドロゲナーゼ導入菌株の作製
実施例２で確認した変異体Ｔ２８５Ｉ、Ｒ３９８Ｑ、Ｇ３７８Ｗ、Ｇ３７８Ｓが野生型菌株に導入された菌株を作製するために、配列番号１４及び１５のプライマーを作製した。
【００８１】
Ｔ２８５Ｉ、Ｒ３９８Ｑ、Ｇ３７８Ｗ、Ｇ３７８Ｓ ｈｏｍ変異がそれぞれ導入された菌株を作製するために、ＫＦＣＣ１０８１１−１、ＫＦＣＣ１０８１１−１４、ＫＦＣＣ１０８１１−１９、ＫＦＣＣ１０８１１−２２菌株からそれぞれ抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４及び１５のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のための重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａTM高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。その結果、１３３８ｂｐのｈｏｍ遺伝子の約３００ｂｐのプロモーター部位を含む１６６８ｂｐの遺伝子断片がそれぞれ得られた。ＱＵＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｔ２８５Ｉ、Ｒ３９８Ｑ、Ｇ３７８Ｗ、Ｇ３７８Ｓ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ−Ｔ２８５Ｉ、ｐＤＺ−Ｒ３９８Ｑ、ｐＤＺ−Ｇ３７８Ｗ、ｐＤＺ−Ｇ３７８Ｓを作製した。
【００８２】
作製された各ベクターをエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各変異型塩基に置換された菌株が得られた。適切に置換されたか否かは、次に挙げるプライマー組み合わせを用いて、ＭＡＳＡ（Mutant Allele Specific Amplification）ＰＣＲ法（非特許文献８）により、各変異型配列に一致するプライマー組み合わせ（ＣＴＲ−Ｔ２８５Ｉ：配列番号１６及び１７，ＣＴＲ−Ｒ３９８Ｑ：配列番号１６及び１８，ＣＴＲ−Ｇ３７８Ｗ：配列番号１６及び１９，ＣＴＲ−Ｇ３７８Ｓ：配列番号１６及び２０）から増幅される菌株を選択することにより１次決定した。選択した菌株のｈｏｍ配列分析は、配列番号１６及び２１を用いて、実施例２と同様に変異型配列分析を行うことにより、２次確認した。各変異型塩基に置換された菌株をＣＴＲ−Ｔ２８５Ｉ、ＣＴＲ−Ｒ３９８Ｑ、ＣＴＲ−Ｇ３７８Ｗ、ＣＴＲ−Ｇ３７８Ｓと命名した。
【実施例５】
【００８３】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ酵素活性の測定
前述したように作製した菌株を対象にＨｏｍ酵素活性を測定した。実施例４で作製したＣＴＲ−Ｔ２８５Ｉ、ＣＴＲ−Ｒ３９８Ｑ、ＣＴＲ−Ｇ３７８Ｗ、ＣＴＲ−Ｇ３７８Ｓ、及び対照群としての野生型菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）を下記種培地２５ｍｌに接種し、その後対数期の後半まで培養した。遠心分離により菌体を回収し、０．１Ｍのｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．６）緩衝液で２回洗浄し、その後３０％の濃度のグリセリンを含有する同じ緩衝液２ｍｌに最終懸濁した。菌体懸濁液を一般的なガラスビーズボルテックス法により１０分間物理的に破砕し、その後２回の遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，４℃，３０分）により上清を回収し、Ｈｏｍ酵素活性の測定のための粗酵素液（crude extract）として用いた。Ｈｏｍ酵素活性の測定のために、酵素活性測定用反応液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）緩衝液，２５ｍＭ ＮＡＤＰＨ，５ｍＭ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｅｍｉ−ａｌｄｅｈｙｄｅ）０．９ｍｌに粗酵素液０．１ｍｌを添加し、３０℃で反応させた。Ｈｏｍ酵素活性（Ｕ）は、Ｌ−トレオニンの有無（０ｍＭ，１０ｍＭ）による１分当たり消費したＮＡＤＰＨ ｕｍｏｌ数により決定した。酵素活性の測定結果を表２に示す。
【００８４】
【表２】
2021513341.tif 000003
【００８５】
実験の結果、Ｔ２８５Ｉ、Ｒ３９８Ｑ、Ｇ３７８Ｗ、Ｇ３７８Ｓ変異をそれぞれ含むＨｏｍにおいて、１０ｍＭのＬ−トレオニンを含む条件では、野生型Ｈｏｍとは異なり、活性抑制の程度が減少し、Ｌ−トレオニンに対して脱感作されたことが分かった。
【実施例６】
【００８６】
Ｌ−トレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物菌株の作製及び評価
野生種コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＬ−トレオニン生産菌株を作製した。具体的には、トレオニン生合成経路において最初の重要な酵素として作用するａｓｐａｒｔａｔｅ ｋｉｎａｓｅ（ｌｙｓＣ）のフィードバック阻害（feedback inhibition）を解除するために、ｌｙｓＣの３７７番目のアミノ酸であるロイシン（Leucine）をリシン（Lysine）に置換した（配列番号２２）。
【００８７】
より具体的には、ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異が導入された菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号２３及び２４、又は配列番号２５及び２６のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のための重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａTM高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。その結果、ｌｙｓＣ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５１５ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５３８ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２３及び２６のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、３７７番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体をコードするｌｙｓＣ遺伝子の変異を含む１０２３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＵＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｌ３７７Ｋ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ−Ｌ３７７Ｋを作製した。
【００８８】
作製されたベクターをエレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各塩基変異が変異型塩基に置換された菌株が得られた。これをＣＪＰ１と命名した。
【００８９】
前記菌株のＬ−トレオニン生産の変化を明確に確認するために、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserin dehydrogenase）をコードする遺伝子に実施例４で確認した変異をそれぞれ導入した。具体的には、Ｔ２８５Ｉ、Ｒ３９８Ｑ、Ｇ３７８Ｗ、Ｇ３７８Ｓ変異をＣＴＲ−Ｌ３７７Ｋ菌株にそれぞれ導入するために、実施例４で作製したｐＤＺ−Ｔ２８５Ｉ、ｐＤＺ−Ｒ３９８Ｑ、ｐＤＺ−Ｇ３７８Ｗ、ｐＤＺ−Ｇ３７８ＳベクターをエレクトロポレーションによりＣＪＰ１に形質転換し、実施例４と同様に２次交差過程を経て、染色体上で各塩基変異が変異型塩基に置換された菌株を得た。各変異型塩基に置換された菌株をＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ、ＣＪＰ１−Ｒ３９８Ｑ、ＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ、ＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｓと命名した。
【００９０】
菌株ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ、ＣＪＰ１−Ｒ３９８Ｑは、２０１７年９月２６日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）にそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２１１９Ｐ、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐとして国際寄託した。
【００９１】
【表３】
2021513341.tif 000004
【００９２】
その結果、各変異を導入した菌株は、対照群であるＣＪＰ１菌株に比べてＬ−リシン生産量が減少し、Ｌ−トレオニン生産量がそれぞれ０．７〜０．９ｇ／Ｌ増加した。
【００９３】
一方、Ｔ２８５Ｉ、Ｒ３９８Ｑ変異を同時に含む菌株を得るために、ｐＤＺ−Ｒ３９８ＱベクターをＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ菌株に形質転換し、前記と同様に菌株を得た（ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｒ３９８Ｑ）。また、Ｇ３７８Ｗ、Ｒ３９８Ｑ変異を同時に含む菌株を得るために、ｐＤＺ−Ｒ３９８ＱベクターをＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗに形質転換し、前記と同様に菌株を得た（ＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ，Ｒ３９８Ｑ）。さらに、Ｔ２８５Ｉ、Ｇ３７８Ｗ変異を同時に含む菌株を得るために、ｐＤＺ−Ｇ３７８ＷベクターをＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉに形質転換し、前記と同様に菌株を得た（ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｇ３７８Ｗ）。実施例２と同様にＬ−トレオニン生産能試験を行った。それを表４に示す。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
その結果、本発明の変異を２種導入したものにおいて、前述した実施例で最も高いＴｈｒ生産能を示したＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗより高いＴｈｒ生産能が確認された。２つの変異を導入した菌株は、対照群であるＣＪＰ１菌株に比べて、トレオニン生産量がそれぞれ１．１〜１．７ｇ／Ｌ増加したので、Ｈｏｍの脱感作効果が大幅に向上することが確認された。
【実施例７】
【００９６】
Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物菌株の作製及び評価
イソロイシン生産菌株を作製するために、実施例６で作製した菌株において、公知のＬ−トレオニンデヒドラターゼ（L-threonine dehydratase, isoleucine生合成経路の最初の酵素）をコードする変異遺伝子ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）（非特許文献６）の発現を強化するためのベクターを作製した。
【００９７】
具体的には、ｉｌｖＡ遺伝子を対象とする変異導入ベクターを作製するために、変異位置を中心に５’末端上流を増幅するためのプライマー対（配列番号２７及び２８）と、３’末端下流を増幅するためのプライマー対（配列番号２９及び３０）を考案した。配列番号２７及び３０のプライマーは、各末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線表示）を挿入し、配列番号２８及び２９のプライマーは、交差するように考案した部位にヌクレオチド置換変異（下線表示）が位置するようにした。
【００９８】
【表５】
2021513341.tif 000006
【００９９】
野生型の染色体を鋳型とし、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｉｌｖＡ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の６２７ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の６０８ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２７及び３０のプライマーでＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、３２３番目のバリンがアラニンに置換されたＩｌｖＡ変異体をコードするｉｌｖＡ遺伝子の変異を含む１２１７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献２）ベクターと１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得て、それをｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）と命名した。
【０１００】
ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）ベクターを実施例６で作製したＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｒ３９８Ｑ、ＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ，Ｒ３９８Ｑ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｇ３７８Ｗ菌株にエレクトロポレーションで導入し、その後カナマイシン（Kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地に塗抹して形質転換株を得た。実施例２のフラスコ培養法と同様に培養し、培養液中のＬ−イソロイシン濃度を分析した。それを表６に示す。
【０１０１】
【表６】
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【０１０２】
その結果、ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｗ）変異を含む菌株において、対照群菌株に比べてＬ−イソロイシン生産能が０．２ｇ／Ｌ向上することが確認された。また、２つの変異が同時に導入されたｈｏｍ変異を含む菌株は、対照群菌株に比べてＬ−イソロイシン生産能が０．３〜０．５ｇ／Ｌ向上し、とりわけＴ２８５Ｉ、Ｒ３９８Ｑの２つの変異の両方を含むＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｒ３９８Ｑ／ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＡ（Ｖ３２３Ａ）菌株において、１．１ｇ／ｌのＬ−イソロイシンが生産された。
【実施例８】
【０１０３】
変異型Ｈｏｍに置換されたＯ−アセチル−ホモセリン（ＯＡＨ）生産菌株の作製及び評価
８−１：変異型Ｈｏｍに置換されたＡＴＣＣ１３０３２菌株の作製
実施例７と同様に、ＡＴＣＣ１３０３２菌株にＴ２８５Ｉ及びＲ３９８Ｑの２種の変異を導入し、その菌株をＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRと命名した。
【０１０４】
８−２：ｍｅｔＢ遺伝子の欠損
本実施例においては、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、Ｏ−アセチル−ホモセリン分解経路のシスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma-synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子を確保した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）からｍｅｔＢ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号Ｎｃｇｌ２３６０，配列番号３１）を確保し、それに基づいてｍｅｔＢ遺伝子のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ部分とｌｉｎｋｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅを含有するプライマー（配列番号３２，３３）、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ部分とｌｉｎｋｅｒ部分を含有するプライマー（配列番号３４，３５）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２及び３３と配列番号３４及び３５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａTM高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を３０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ部分とｌｉｎｋｅｒを含有する５００ｂｐの増幅された遺伝子と、ｍｅｔＢ遺伝子のＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ部分とｌｉｎｋｅｒを含有する５００ｂｐの増幅された遺伝子が得られた。
【０１０５】
前述したように得られた増幅された２つの遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９６℃で６０秒間の変性、５０℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を１０サイクル行い、その後配列番号３２及び３５を添加して２０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌを含有するｍｅｔＢ不活性化カセットである１０００ｂｐｓの増幅されたΔｍｅｔＢ遺伝子が得られた。前記ＰＣＲにより得られたｍｅｔＢ遺伝子を末端に含まれる制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理し、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理したｐＤＺ（特許文献３）ベクターにライゲーション（ligation）によりクローニングし、最終的にｍｅｔＢ不活性化カセットがクローニングされたｐＤＺ−ΔｍｅｔＢ組換えベクターを作製した。
【０１０６】
作製したｐＤＺ−ΔｍｅｔＢベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRに形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｍｅｔＢ遺伝子が不活性化されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＢ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＢを得た。不活性化されたｍｅｔＢ遺伝子は、配列番号３２及び３５のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後ｍｅｔＢ遺伝子が不活性化されていないＡＴＣＣ１３０３２との比較により最終確認した。
【０１０７】
８−３：ｍｅｔＹ遺伝子の欠損
本実施例においては、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、Ｏ−アセチル−ホモセリン分解経路のＯ−アセチル−ホモセリンチオールリアーゼ（O-acetylhomoserine(thiol)-lyase）をコードするｍｅｔＹ遺伝子を確保した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）からｍｅｔＹ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号Ｎｃｇｌ０６２５，配列番号３６）を確保し、それに基づいてｍｅｔＹ遺伝子のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ部分とｌｉｎｋｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅを含有するプライマー（配列番号３７，３８）、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ部分とｌｉｎｋｅｒ部分を含有するプライマー（配列番号３９，４０）を合成した。
【０１０８】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａTM高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を３０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ部分とｌｉｎｋｅｒを含有する５００ｂｐの増幅された遺伝子と、ｍｅｔＹ遺伝子のＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ部分とｌｉｎｋｅｒを含有する５００ｂｐの増幅された遺伝子が得られた。前述したように得られた増幅された２つの遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９６℃で６０秒間の変性、５０℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を１０サイクル行い、その後配列番号３７及び４０のプライマーを添加して２０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌを含有するｍｅｔＢ不活性化カセットである１０００ｂｐｓの増幅されたΔｍｅｔＹ遺伝子が得られた。
【０１０９】
前記ＰＣＲにより得られたｍｅｔＹ遺伝子を末端に含まれる制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理し、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理したｐＤＺ（特許文献４）ベクターにライゲーション（ligation）によりクローニングし、最終的にｍｅｔＹ不活性化カセットがクローニングされたｐＤＺ−ΔｍｅｔＹ組換えベクターを作製した。
【０１１０】
作製したｐＤＺ−ΔｍｅｔＹベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBR、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＢ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＢ菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｍｅｔＹ遺伝子が不活性化されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＹ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＹ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＢΔｍｅｔＹ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＢΔｍｅｔＹを得た。不活性化されたｍｅｔＹ遺伝子は、配列番号３７及び４０のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後ｍｅｔＹ遺伝子が不活性化されていないＡＴＣＣ１３０３２との比較により最終確認した。
【０１１１】
８−４：Ｏ−アセチル−ホモセリン生産菌株の作製及び評価
実施例８−１〜８−３で作製した、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＢＹ遺伝子が欠損して変異型ｈｏｍ遺伝子に置換されたＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＢ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＹ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＢΔｍｅｔＹ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBR、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＢ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＹ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＢΔｍｅｔＹ菌株のＯ−アセチル−ホモセリン生産能を比較した。
【０１１２】
具体的には、３２℃の培養器にてＬＢ固体培地で一晩培養した単一コロニーを２５ｍｌのＯ−アセチル−ホモセリン力価培地に１白金耳ずつ接種し、３２℃、２５０ｒｐｍで４２〜６４時間培養した。培養物からＯ−アセチル−ホモセリンをＨＰＬＣにより分析した。分析結果を表７に示す。
Ｌ−Ｏ−アセチルホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ，Ｕｒｅａ ３ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４０ｇ，Ｐｅｐｔｏｎｅ ２．５ｇ，ＣＳＬ（Ｓｉｇｍａ） ５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ４００ｍｇ，Ｌｅｕｃｉｎｅ ４００ｍｇ，ＣａＣＯ3 ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
その結果、表７に示すように、対照群菌株であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２を培養してもＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリンが蓄積されないのに対して、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＢＹが不活性化されたＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＢ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＹ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｍｅｔＢΔｍｅｔＹ菌株においては、それぞれ０．３、０．３、０．５ｇ／ＬのＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリンが蓄積されることが確認された。
【０１１５】
また、ｈｏｍ遺伝子をｍｕｔａｎｔ形態に置換したＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBR菌株、前記菌株においてｍｅｔＢ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＢＹがそれぞれ不活性化されたＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＢ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＹ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ＨｏｍFBRΔｍｅｔＢΔｍｅｔＹ菌株においては、それぞれ１．２、１．４、３．５ｇ／ＬのＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリンが蓄積されることが確認された。
【０１１６】
よって、これらの結果から、本発明の変異型ｈｏｍを用いると、ホモセリンを前駆体として用いる標的アミノ酸の生産量が大幅に向上することが確認された。
【実施例９】
【０１１７】
メチオニン（Ｍｅｔ）生産菌株の作製及び評価
９−１：ｍｃｂＲ遺伝子の欠損のための組換えベクターの作製
本実施例においては、メチオニン生産菌株を作製するために、実施例６で作製した菌株において公知のメチオニンシステイン転写調節因子タンパク質をコードするｍｃｂＲ（非特許文献９）を不活性化するベクターを作製した。
【０１１８】
具体的には、ｍｃｂＲ遺伝子をコリネバクテリウムＡＴＣＣ１３０３２染色体上で欠損させるために、次の方法で組換えプラスミドベクターを作製した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカムのｍｃｂＲ遺伝子及び周辺配列（配列番号４１）を確保した。
【０１１９】
ｍｃｂＲ遺伝子を欠損させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４２及び４３、配列番号４４及び４５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ７００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【０１２０】
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献３）と前述したように増幅されたｍｃｂＲ遺伝子断片を染色体導入用制限酵素ｓｍａＩで処理し、次いでＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより標的遺伝子が欠損した断片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、ｐＤＺ−△ｍｃｂＲと命名した。
【０１２１】
９−２：Ｌ−メチオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物菌株の作製及び評価
実施例９で作製したｐＤＺ−△ｍｃｂＲベクターを、染色体上での相同組換えにより実施例６で作製したＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｒ３９８Ｑ、ＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ，Ｒ３９８Ｑ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｇ３７８Ｗ、及びＣＪＰ１菌株に、エレクトロポレーションにより形質転換した（非特許文献１０）。その後、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地において２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー４６とプライマー４７を用いたＰＣＲにより、ｍｃｂＲ遺伝子が欠損した菌株を確認した。その組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｒ３９８Ｑ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ，Ｒ３９８Ｑ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｇ３７８Ｗ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１／ΔｍｃｂＲと命名した。
【０１２２】
前述したように作製したＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｒ３９８Ｑ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ，Ｒ３９８Ｑ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｇ３７８Ｗ／ΔｍｃｂＲ菌株のＬ−メチオニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＰ１／ΔｍｃｂＲ菌株と共に、次のように培養した。
【０１２３】
下記種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＰ１／ΔｍｃｂＲと本発明の菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｒ３９８Ｑ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｇ３７８Ｗ，Ｒ３９８Ｑ／ΔｍｃｂＲ、ＣＪＰ１−Ｔ２８５Ｉ，Ｇ３７８Ｗ／ΔｍｃｂＲを接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ3 １２ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【０１２４】
前記培養方法で培養し、培養液中のＬ−メチオニン濃度を分析した。それを表８に示す。
【０１２５】
【表８】
2021513341.tif 000009
【０１２６】
その結果、Ｇ３７８Ｗ ｈｏｍ変異を含む菌株において、対照群菌株に比べてＬ−メチオニン生産能が０．１２ｇ／Ｌ向上することが確認された。また、２つの変異が同時に導入されたｈｏｍ変異を含む菌株は、対照菌菌株に比べてＬ−メチオニン生産能が０．１６〜０．１９ｇ／ｌ向上することが確認された。
【０１２７】
これらの結果から、本発明の変異型ｈｏｍを用いると、Ｌ−メチオニン生産量が大幅に向上することが確認された。
【０１２８】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【０１２９】
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【０１３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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