(57)【要約】  本開示は、微生物分野に関し、具体的に、ケイ素分解機能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ及びその使用に関するものである。当該菌株は、１）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４、受領日付が２０１９年０１月１６日である菌株、及び／又は２）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３、受領日付が２０１９年０１月１６日である菌株から選ばれるものである。当該菌株は、ケイ素分解力を有し、かつ、植物の生長を促進でき、耐アルカリ性、耐塩性、及び無酸素耐性を持ち、良好な応用前景を有する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記より選ばれるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
１）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４、受領日付が２０１９年０１月１６日である、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉ。
２）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３、受領日付が２０１９年０１月１６日である、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩ。
３）ケイ素分解機能を有する、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体。
及び／又は
４）ケイ素分解機能を有する、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体。
【請求項２】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体が、植物の成長促進機能を有し、好ましくは作物の根部乾物重を増加させる機能を有する、請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項３】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体が、５％以下のＮａＣｌを含む培養系においてもケイ素分解機能を有する、請求項１または２に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項４】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体が、２０％以下のＫＮＯ３を含む培養系においても生長することができ、かつ、１０％以下のＫＮＯ３を含む培養系においてもケイ素分解機能を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項５】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体が、６．５≦ｐＨ≦１０の培養系においてもケイ素分解機能を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項６】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体が、酸素濃度１０％以上の培養系においてもケイ素分解機能を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項７】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列が、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と、少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項８】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列が、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と、少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項９】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体のゲノム配列が、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉのゲノム配列と、少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項１０】
単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体のゲノム配列が、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩのゲノム配列と、少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉ、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩ、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体及び／又は単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体の培養物を含む組成物であって、
好ましくは、前記組成物は、液体、凍結又は乾燥粉末の形態であり、
好ましくは、前記組成物は、さらに、栄養素、肥料、殺ダニ剤、殺細菌剤、殺真菌剤、殺昆虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、殺虫剤から選ばれる化合物又は組成物を農業用有効な量で含む、組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、シリコン肥料を含み、前記シリコン肥料は、ケイ素の単体、有機ケイ素化合物及び／又は無機ケイ素化合物を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、カリ肥料を含み、前記カリ肥料は、カリウムの単体金属、有機カリウム化合物及び／又は無機カリウム化合物を含む、請求項１１又は請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株又は請求項１１に記載の組成物のケイ素分解における使用であって、
好ましくは、前記ケイ素は、ケイ素の単体又はケイ素イオンとして存在し、
好ましくは、前記ケイ素は、ケイ素イオンとその他の元素との会合体、又はその他の元素との結合錯体として存在し、
好ましくは、前記ケイ素は、ケイ酸塩又はケイ素含有鉱物として存在する、使用。
【請求項１５】
前記ケイ素は、ケイ酸塩として存在し、
好ましくは、前記ケイ酸塩は、ケイ酸マグネシウム、フルオロケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウムおよびケイ酸カリウムナトリウムからなる群から選ばれるものである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記ケイ素は、ケイ素含有鉱物として存在し、
前記ケイ素含有鉱物は、好ましくは、ネソ珪酸塩鉱物、ソロ珪酸塩鉱物、シクロ珪酸塩鉱物、イノ珪酸塩鉱物、単鎖イノ珪酸塩鉱物、二重鎖イノ珪酸塩鉱物、フィロ珪酸塩鉱物、テクト珪酸塩鉱物からなる群から選ばれるものである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記ケイ素は、輝石、かんらん石、エピドート、トルマリン、角閃石、雲母、白土、長石または石英として存在する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
植物の健康、生長又は生産量を向上させる方法であって、
有効量の請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を、前記植物又は前記植物の周辺環境に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記の植物の健康、生長又は生産量を向上させる方法は、前記植物の根部生長を促進することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物は、小麦、水稲、トウモロコシ、ベビーキャベツ（Ｂａｂｙ  ｃａｂｂａｇｅ）、トマト、キュウリ、ブロッコリー、イチゴ及び／又はブドウを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１９年０３月０４日に中国特許庁に出願された、出願番号が２０１９１０１６１３７８．２であり、発明名称が「ケイ素分解機能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ及びその使用」である中国特許出願に基づき、優先権を主張し、その内容の全体は引用により本願に援用される。
【０００２】
技術分野
本願は、微生物分野に関し、具体的に、ケイ素（シリコン）分解機能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ及びその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ケイ素は、国際土壤学界によって窒素、リン、カリウムに次ぐ四番目の栄養元素と認められ、イネ科及び根菜類の作物の生長に必要な養分である。研究で、水稲ではケイ素の添加により穂の窒素含有量が向上して、デンプン及びたんぱく質の合成が促進され、水稲の実が充実するようになること、ケイ素は冬瓜における窒素の吸収及び蓄積を顕著に促進する作用があり、成熟期における窒素及びミネラル元素の含有量の何れもケイ素の添加量とは正の相関が認められること、ケイ素の添加により、土壤におけるリンの有効性及び植物のリンの含有量が向上し、これにより、植物体内のカリウムが大幅に向上させるか又は若干向上させること、シリコン肥料の使用が、水稲、燕麦、小麦、サトウキビ、モロコシなどの作物の生長及び生産量ならびに品質を向上させる作用を有することが明かされた。ケイ素は、植物の成長において機能する以外、植物の耐病性および耐虫性を向上し、金属イオンによる害毒や塩ストレスを緩め、耐乾性を向上させることもできる。略奪的な栽培方式により、土壤中の有効なケイ素の含有量が大幅に低下し、ケイ素の欠乏した耕地は全国の耕地面積の５０％以上を占めるため、シリコン肥料の使用は重大な現実的な意義を有する。
【０００４】
自然界で、ケイ素は、わずかに酸素に次いで広く分布しているものであり、地殻中の含有量が二番目に多く、主として二酸化ケイ素及びケイ酸塩として存在する。土壤では、ケイ素の含有量が約７０％であり、いずれも非常に安定した、結晶状態及びアモルファス状態にあり、その溶解度がかなり低くて植物によって吸収されにくい。そこで、土壤中の不溶性ケイ素含有鉱物を分解可能な微生物の選別、バイオシリコン肥料の開発は、シリコン肥料関連問題を解決するための重要な手段となっている。微生物肥料は、土壤中の不溶性ケイ素含有鉱物を効率的に利用することができるばかりか、病気を抑え、土壤を改良することもでき、一度に複数の利益を収めることができる。
【０００５】
中国では、ケイ素分解微生物として、ケイ酸塩細菌（ｓｉｌｉｃａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓがよく挙げられる。これは、水不溶性カリ鉱からカリウムを遊離させることができる細菌であり、カリウム細菌（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）とも称される。当該細菌から、カリ肥料の使用性を高める微生物肥料を開発した。
【０００６】
一部の報告より、このような細菌がケイ素分解機能を有することが明らかにされた。そのほか、外国では、シュードモナス、リゾビウム、バチルスなどの微生物がケイ素分解機能を有することも報告されたが、これらの細菌のケイ酸塩鉱物に対する加水分解能力はそれほど強くもなく、それらから、ケイ素を含む鉱物を植物に吸収利用されるシリコン肥料に転化するものを開発した報告もない。
【０００７】
２００９年４月、インドの科学者は、地球の成層圏の上部から新種の微生物の細菌を３種発見した。それらは、地面に存在するものでなく、強烈な紫外線放射に抵抗する能力を持っているものである。科学者は、サンプルから計１２種の細菌及び計６種の真菌を発見した。ここで、１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子配列に基づき、そのうちの８種は、地面上の既知の微生物種に９８％の類似性を有することが認められた一方、そのうちの３種の細菌が新種のものであり、生物学的に近い種よりもはるかに高い紫外線抵抗性能を有することが認められた。しかしながら、現在の研究では、科学者は、この成層圏に由来する３種類の微生物の起源をまだ解明していない。将来の研究において、科学者は、その起源の謎を解明するようさらに探究していく。第１の新種の微生物の細菌は、多くの人の尊敬を受ける天体物理学者フレッド・ホイルにちなんで「ホイレイ分解菌」(Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｈｏｙｌｅｉ)と命名された。第２の微生物の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｓｒｏｎｅｎｓｉｓと命名され、この命名は、インド宇宙研究機関（ＩＳＲＯ）が行った今度の気球実験の成功が認められたことを示している。第３の微生物の細菌は、インドの有名な古代天文学者アーリヤバタ（Ａｒｙａｂｈａｔａ）にちなんで「アーリヤバタ桿菌」（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔａｉ）と命名された。
【０００８】
従来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株がバガスを分解して（単一菌による検証）グルコース及び果糖を生成することが可能であり、コロニーが円形で、黄色を呈し、辺縁がなめらかで規則的なものであるとの報告があった。しかしながら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉに関する研究の掘り下げは十分ではなく、特に、特別な機能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株の選別及び研究は少ない。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、下記から選ばれる、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株に関するものである。
１）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ,  ＣＧＭＣＣ）に寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４、受領日付が２０１９年０１月１６日である、菌株。
及び／又は
２）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３、受領日付が２０１９年０１月１６日である、菌株。
【００１０】
ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３及びＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４は、いずれも中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、保蔵の住所がいずれも北京市朝陽区北辰西路１号院３号である。
【００１１】
本開示はさらに、前記菌株の子孫、突然変異体又は誘導体の保護を請求する。
【００１２】
本開示の別の態様において、本開示は、上記のような菌株を含む組成物に関する。
【００１３】
本開示の別の態様において、本開示は、ケイ素分解における、上記のような菌株又は上記のような組成物の使用に関する。
【００１４】
本開示の別の態様において、本開示は、さらに、植物の健康、生長又は生産量を向上させる方法に関し、前記方法は、有効量の上記のような組成物を、前記植物又は前記植物の周辺環境に投与することを含む。
【００１５】
本発明者は、前記菌株がケイ素分解力を有することを思いがけなく発見した。さらに、当該菌株は、植物の生長を促進でき、耐アルカリ性、耐塩性、及び無酸素耐性を持ち、良好な応用前景を有する。
【００１６】
本開示は、下記より選ばれる、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株を提供する。
１）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４、受領日付が２０１９年０１月１６日である、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉ。
２）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３、受領日付が２０１９年０１月１６日である、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩ。
３）ケイ素分解機能を有する、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体。
及び／又は
４）ケイ素分解機能を有する、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体。
【００１７】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体は、さらに、植物の成長促進機能を有する。
【００１８】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体は、さらに、作物の根部乾物重を増加させる機能を有する。
【００１９】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体は、５％以下のＮａＣｌを含む培養系においてもケイ素分解機能を有する。
【００２０】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体は、２０％以下のＫＮＯ３を含む培養系においても生長することができ、かつ、１０％以下のＫＮＯ３を含む培養系においてもケイ素分解機能を有する。
【００２１】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体は、６．５≦ｐＨ≦１０の培養系においてもケイ素分解機能を有する。
【００２２】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体、及び単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体は、酸素濃度１０％以上の培養系においてもケイ素分解機能を有する。
【００２３】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と、少なくとも９９％の同一性を有する。
【００２４】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と、少なくとも９９％の同一性を有する。
【００２５】
ゲノム配列は、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉのゲノム配列と、少なくとも９９％の同一性を有する。
【００２６】
一つ又は複数の実施形態において、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体のゲノム配列は、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩのゲノム配列と、少なくとも９０％の同一性を有する。
【００２７】
本開示は、本開示によって特定されている、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉ、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩ、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株Ｉの子孫、突然変異体又は誘導体及び／又は単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株ＩＩの子孫、突然変異体又は誘導体の培養物を含む組成物を提供する。
【００２８】
一つ又は複数の実施形態において、前記組成物は、液体、凍結又は乾燥粉末の形態である。
【００２９】
一つ又は複数の実施形態において、前記組成物は、さらに、栄養素、肥料、殺ダニ剤、殺細菌剤、殺真菌剤、殺昆虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、殺虫剤から選ばれる化合物又は組成物を農業用有効な量で含む。
【００３０】
一つ又は複数の実施形態において、前記組成物は、さらに、シリコン肥料を含み、前記シリコン肥料は、ケイ素の単体、有機ケイ素化合物及び／又は無機ケイ素化合物を含む。
【００３１】
一つ又は複数の実施形態において、前記組成物は、さらに、カリ肥料を含み、前記カリ肥料は、カリウムの単体金属、有機カリウム化合物及び／又は無機カリウム化合物を含む。
【００３２】
本開示は、ケイ素分解における、本明細書に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株又は組成物の使用を提供する。
【００３３】
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ素は、ケイ素の単体又はケイ素イオンとして存在する。
【００３４】
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ素は、ケイ素イオンとその他の元素との会合体、又はその他の元素との結合錯体として存在する。
【００３５】
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ素は、ケイ酸塩又はケイ素含有鉱物として存在する。
【００３６】
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ素は、ケイ酸塩として存在する。
【００３７】
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ酸塩は、ケイ酸マグネシウム、フルオロケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウムおよびケイ酸カリウムナトリウムからなる群から選ばれるものである。
【００３８】
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ素は、ケイ素含有鉱物として存在する。
【００３９】
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ素含有鉱物は、ネソ珪酸塩鉱物、ソロ珪酸塩鉱物、シクロ珪酸塩鉱物、イノ珪酸塩鉱物、単鎖イノ珪酸塩鉱物、二重鎖イノ珪酸塩鉱物、フィロ珪酸塩鉱物、テクト珪酸塩鉱物からなる群から選ばれるものである。
【００４０】
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ素は、輝石、かんらん石、エピドート、トルマリン、角閃石、雲母、白土、長石または石英として存在する。
【００４１】
本開示は、植物の健康、生長又は生産量を向上させる方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の組成物を、前記植物又は前記植物の周辺環境に投与することを含む。
【００４２】
一つ又は複数の実施形態において、前記の植物の健康、生長又は生産量を向上させる方法は、前記植物の根部生長を促進することを含む。
【００４３】
一つ又は複数の実施形態において、前記植物は、小麦、水稲、トウモロコシ、ベビーキャベツ（Ｂａｂｙ  ｃａｂｂａｇｅ）、トマト、キュウリ、ブロッコリー、イチゴ及び／又はブドウを含む。
【００４４】
以下、本開示の具体的な実施形態又は従来技術の技術手段をより明らかにするために、具体的な実施形態又は従来技術の技術手段の記載に必要な図面を簡単に説明する。明らかなように、以下に記載する図面は本開示の一部の実施形態であり、当業者にとっては、創造的な労働を費やさないという条件の下で、これら図面に基づきその他の図面を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本開示の一実施形態に係る菌株ＭＢ２２と菌株ＭＢ３５−５のケイ素分解能力の測定結果を示す図である。
【図２】本開示の一実施形態に提供される菌株の耐塩性及び耐酸・耐アルカリ性の測定結果を示す図である。
【図３】本開示の一実施形態に提供される菌株の異なる培養条件でのケイ素分解能力を示す図である。
【００４６】
本開示が提供するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉは、
１）名称がＭＢ３５−５、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４である菌株、及び
２）名称がＭＢ２２、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３である菌株であり、
いずれも中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、２０１９年０１月１６日付けで保蔵センターによって生存が確認されて寄託された。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本開示の実施形態の目的、技術手段及び利点をより明らかにするために、本開示の実施形態に係る技術手段を明確且つ完全に説明する。実施形態において、具体的な条件が明記されていないものは、通常の条件又はメーカーの推奨する条件によるものとする。使用する試薬又は装置について、製造メーカーが明記されていないものは、いずれも市販で購入できる通常のものとする。
【００４８】
別途定義されない限り、明細書において用いられる科学用語及び技術用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を持つべきである。以下、例示的な方法及び材料を説明するが、本明細書に記載したものと類似又は同一の方法及び材料も本開示の実施又は試験に用いられてもよい。
【００４９】
本開示は、下記より選ばれる、単離したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株に関する。
１）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４、受領日付が２０１９年０１月１６日である、菌株。
及び／又は
２）中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３、受領日付が２０１９年０１月１６日である、菌株。
【００５０】
前記菌株はケイ素分解機能を有する。
ケイ素分解機能は、本開示の実施例に記載されている「３．ケイ素分解能力の測定」に指定される方法により測定される。ＭＢ３５−５菌株のケイ素分解円の大きさは４．５ｍｍ程度であり、例えば６ｍｍ、５ｍｍ、４ｍｍ、３．５ｍｍ、３ｍｍ、２．５ｍｍ、２ｍｍである。
ＭＢ２２菌株のケイ素分解円の大きさは６ｍｍ程度であり、例えば８ｍｍ、７ｍｍ、６．５ｍｍ、６ｍｍ、３ｍｍ、２．５ｍｍ、２ｍｍである。
【００５１】
本開示の一態様において、本開示は、以下の特徴を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株に関する。
ａ）上記のような菌株の子孫、突然変異体又は誘導体であること、及び
ｂ）ケイ素分解機能を有すること。
【００５２】
本開示は、前記受託番号に対応するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株、及び適度な範囲で突然変異が発生した、かなり強いケイ素分解能力を有する子孫、突然変異体又は誘導体菌株の保護を請求する。
【００５３】
本明細書において用いられるように、技術用語である「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株の子孫、突然変異体又は誘導体菌株」とは、そのゲノムがＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株のゲノムと高度に類似したＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株を指す。本願において、菌株の突然変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＭＢ３５−５）又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＭＢ２２）に示す１６Ｓ  ｒＲＮＡとの同一性≧９９％（例えば、同一性が９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９.９％）であることによって限定される。一つ又は複数の実施形態において、前記「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株の子孫、突然変異体又は誘導体菌株」は、ＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡとの同一性が、少なくとも９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。
【００５４】
技術用語である「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株の子孫、突然変異体又は誘導体菌株」又は菌株の突然変異体は、ゲノムにおいて高度に類似したことからカーバーできる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株のゲノムは、ＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株のゲノムに対して、多くとも１５０個の突然変異事象、例えば多くとも１４０個，１３０個、１２０個、１１０個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、３０個または２０個の突然変異事象を含む。突然変異事象は、ＳＮＰ（一塩基多型）又はＩＮＤＥＬ（挿入、欠失、及びそれらの組合せ）として限定される。以下のようにして突然変異事象の数を確定する。ＭＢ３５−５菌株のゲノムを対照として、突然変異株のゲノムに存在する突然変異事象を検出し、それぞれの突然変異事象(ＳＮＰまたはＩＮＤＥＬ)は一つの突然変異事象(すなわち、例えば、ヌクレオチドを若干含有する配列を挿入することは、一つの突然変異事象のみとしてみなされる)を示す。この文脈で、本開示の突然変異株のゲノム配列は、ＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株に対して含有する突然変異事象の数量によって限定される。突然変異事象の数量を用いた限定以外、ＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株のゲノム配列との同一性百分率によって余分に限定される。ここで、本明細書において、同一性百分率は、一つの菌株のゲノムに発見した、別の菌株のゲノムに存在する配列の百分率を示す。具体的には、ａ)ＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株のゲノムに発見した、菌株の突然変異体のゲノムに存在する配列の百分率、又は、ｂ）菌株の突然変異体のゲノム配列に発見した、ＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株のゲノムに存在する配列の百分率を示す。したがって、与ＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株との相違点は、挿入（一つ又は複数）または欠失（一つ又は複数）した菌株の突然変異体のみであり、有するゲノムとＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株のゲノムとの同一性百分率は１００％であり、これは、一つの菌株のゲノムに、別の菌株の全てのゲノム配列を完全に発見したからである。一つの具体的な実施例において、突然変異事象の数によって限定される本開示の突然変異株のゲノム配列は、ＭＢ３５−５又はＭＢ２２菌株のゲノム配列との同一性百分率が、少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９２％、９９．９４％、９９．９６％、９９．９８％又は９９．９９％であり、ここで、同一性百分率は、一つの菌株のゲノムに発見した、別の菌株のゲノムに存在する配列の百分率を示す。同一性は、二つのゲノム配列をそれらの全長において比較する（グローバルアライメント）ことで説明され、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づくプログラムのいずれかを用いて計算される。
【００５５】
ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４及び/又はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３菌株、及びその子孫、突然変異体又は誘導体菌株は、植物成長促進作用を有し、例えば、植物の根部の生長を促進し、作物の根部乾物重を増加させる。
【００５６】
ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４及び/又はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３菌株、及びその子孫、突然変異体又は誘導体菌株は、５％以下のＮａＣｌを含む培養系においてもケイ素分解機能を有する。
【００５７】
一つ又は複数の実施形態において、濃度は、例えば、４．５％ＮａＣｌ、４％ＮａＣｌ、３．５％ＮａＣｌ、３％ＮａＣｌ、２．５％ＮａＣｌから選ばれてもよい。
一つ又は複数の実施形態において、濃度は、例えば、４．５％ＮａＣｌ以下、４％ＮａＣｌ以下、３．５％ＮａＣｌ以下、３％ＮａＣｌ以下、２．５％ＮａＣｌ以下から選ばれてもよい。
【００５８】
ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４及び/又はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３菌株は、２０％以下のＫＮＯ３を含む培養系においても生長することができ、かつ、１０％以下のＫＮＯ３を含む培養系においてもケイ素分解機能を有する。
一つ又は複数の実施形態において、生長系におけるＫＮＯ３濃度は、例えば、１９％ＫＮＯ３、１８％ＫＮＯ３、１７％ＫＮＯ３、１６％ＫＮＯ３、１５％ＫＮＯ３、１４％ＫＮＯ３、１３%ＫＮＯ３、１２％ＫＮＯ３、１１％ＫＮＯ３、１０％ＫＮＯ３、９％ＫＮＯ３、８％ＫＮＯ３、７％ＫＮＯ３、６％ＫＮＯ３、５％ＫＮＯ３、４％ＫＮＯ３、３％ＫＮＯ３、２％ＫＮＯ３から選ばれてもよい。
一つ又は複数の実施形態において、生長系におけるＫＮＯ３濃度は、例えば、１９％ＫＮＯ３以下、１８％ＫＮＯ３以下、１７％ＫＮＯ３以下、１６％ＫＮＯ３以下、１５％ＫＮＯ３以下、１４％ＫＮＯ３以下、１３%ＫＮＯ３以下、１２％ＫＮＯ３以下、１１％ＫＮＯ３以下、１０％ＫＮＯ３以下、９％ＫＮＯ３以下、８％ＫＮＯ３以下、７％ＫＮＯ３以下、６％ＫＮＯ３以下、５％ＫＮＯ３以下、４％ＫＮＯ３以下、３％ＫＮＯ３以下、２％ＫＮＯ３以下から選ばれてもよい。
【００５９】
一つ又は複数の実施形態において、ケイ素分解系におけるＫＮＯ３濃度は、例えば、９％ＫＮＯ３、８％ＫＮＯ３、７％ＫＮＯ３、６％ＫＮＯ３、５％ＫＮＯ３、４％ＫＮＯ３、３％ＫＮＯ３、２％ＫＮＯ３から選ばれてもよい。
一つ又は複数の実施形態において、ケイ素分解系におけるＫＮＯ３濃度は、例えば、９％ＫＮＯ３以下、８％ＫＮＯ３以下、７％ＫＮＯ３以下、６％ＫＮＯ３以下、５％ＫＮＯ３以下、４％ＫＮＯ３以下、３％ＫＮＯ３以下、２％ＫＮＯ３以下から選ばれてもよい。
【００６０】
ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４及び/又はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３菌株、及びその子孫、突然変異体又は誘導体菌株は、６．５≦ｐＨ≦１０の培養系においてもケイ素分解機能を有する。
ｐＨは、５、６、６．５、７、８、９、１０から選ばれてもよい。
【００６１】
ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０４及び/又はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１７２０３菌株、及びその子孫、突然変異体又は誘導体菌株は、酸素濃度１０％以上の培養系においてもケイ素分解機能を有する。
一つ又は複数の実施形態において、酸素濃度は、さらに、１５％、２０％、２５％又はそれ以上から選ばれてもよい。
一つ又は複数の実施形態において、酸素濃度は、さらに、１５％以上、２０％以上、２５％以上またはそれ以上から選ばれてもよい。
【００６２】
本開示は、さらに、上記のような菌株の培養物を含む組成物に関する。
【００６３】
実際に応用する際に、運輸が必要な場合があることなどを考慮したうえで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株を拡大培養法で組成物（特に、微生物菌剤）の形としてその応用範囲を拡大する。
【００６４】
本開示の組成物（例えば、発酵剤培養物として用いられる場合）は、単純培養物又は混合培養物を含むが、これらに限られない。
従って、本開示において、単純培養物は、その培養物の全体又はほぼ全体が本開示の同種のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株からなるものとして限定されている。代替の実施形態において、混合培養物は、微生物を若干含み、具体的に細菌菌株を若干含み、本開示のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株及び/又はその子孫、突然変異体又は誘導体菌株を含む培養物として限定される。
【００６５】
一部の実施形態において、前記組成物は、さらに、カリウム分解機能を有する菌株を有する。
【００６６】
前記組成物は、農業に用いられるものであり、液体、凍結又は乾燥粉末の形態のものとしてもよく、または、顆粒剤、懸濁剤、水和剤、乳濁液または液剤といった本業界でよく用いられる製剤の形態で表される。
【００６７】
担体は、農業及び園芸における農薬によく用いられる、生物学的に不活性なものであればよく、固形体或いは液体を問わず、いずれも使用することができる。いずれかの特定の担体に限られない。
【００６８】
一部の具体的な実施形態において、前記組成物は、凍結又は乾燥粉末の形態である場合、固体状態の担体を含む。
【００６９】
固体状態の担体は、例として、陶土、タルク、ベントナイト、ゼオライト、炭酸カルシウム、珪藻土及びホワイトカーボン（Ｗｈｉｔｅ  ｃａｒｂｏｎ）といった鉱石粉、トウモロコシ粉及びでん粉といった植物製粉、ポリビニルアルコールといったポリアルキレングリコールのような高分子化合物を含む。一方、典型的な液体の担体は、デカンドやデカン、植物油及び鉱油といった様々な有機溶媒、及び水を含む。
【００７０】
一部の実施形態において、前記固体状態の担体は、泥炭、芝、タルク、亜炭、パイロフィライト、モンモリロナイト、アルギン酸塩、圧搾脱水汚泥、おがくず、パーライト、マイカ、シリカ、石英粉末、カルシウム型ベントナイト、バーミキュライト、カオリン、軽質炭酸カルシウム、珪藻土、麦飯石、方解石、ゼオライト、ホワイトカーボンブラック、細かい砂と粘土のうちの一つ又は複数を含む。
【００７１】
一部の実施形態において、前記組成物に助剤が含まれる。例えば、前記組成物は、通常、農業及び園芸用化学製品において助剤として用いられる界面活性剤、粘着剤、安定剤などを含むが、これらに限定されなく、それらは、単独で又は必要に応じて複数組み合わせて使用することができ、及び／又は安定剤、例えば、抗酸化剤及び／又はｐＨ調整剤が挙げられる。場合によっては、光安定剤を使用することができる。
【００７２】
これらの助剤の総量は、０ｗｔ％〜８０ｗｔ％であってもよく、担体の含有量は、１００ｗｔ％から有効成分量及び助剤の含有量を差し引いた値である。
【００７３】
一部の具体的な実施形態において、前記助剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、トレハロース、グリセリン、リグニンスルホン酸ナトリウム、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム重縮合物、ナイアシン、アルコール、緩衝塩、塩化ナトリウム、アミノ酸、ビタミン類、タンパク質、ポリペプチド、多糖類または単糖類、酵母エキス、ホワイトカーボンブラック、茶サポニン、脱脂乳のうちの一つ又は複数を含む。
【００７４】
一部の具体的な実施形態において、前記組成物は、栄養素、肥料、殺ダニ剤、殺細菌剤、殺真菌剤、殺昆虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、殺虫剤から選ばれる化合物又は組成物を農業用有効な量で含む。例えば、前記組成物は、さらに、肥料、例えばシリコン肥料及びカリ肥料を含む。シリコン肥料は、ケイ素の単体、有機ケイ素化合物及び／又は無機ケイ素化合物の形態である。カリ肥料は、カリウムの単体金属、有機カリウム化合物及び／又は無機カリウム化合物の形態である。
【００７５】
上記の成分は、本願が提供する菌株と組み合わせて、より優れる技術効果を達成することができる。
【００７６】
一部の実施形態において、前記組成物において、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ菌株の生菌数は、１０７〜１２ｃｆｕ・ｍＬ−１あるいは１０７〜１２ｃｆｕ・ｇ−１である。
又は、１０８ｃｆｕ・ｍＬ−１、１０９ｃｆｕ・ｍＬ−１、１０１０ｃｆｕ・ｍＬ−１、１０１１ｃｆｕ・ｍＬ−１から選んでもよい。又は、１０８ｃｆｕ・ｇ−１、１０９ｃｆｕ・ｇ−１、１０１０ｃｆｕ・ｍＬ−１、１０１１ｃｆｕ・ｍＬ−１から選んでもよい。
【００７７】
本開示は、ケイ素分解における上記のような菌株あるいは上記のような組成物の使用に関する。
【００７８】
一部の実施形態において、前記ケイ素は、ケイ素の単体又はケイ素イオンとして存在する。
【００７９】
一部の実施形態において、前記ケイ素は、ケイ素イオンとその他の元素との会合体、又はその他の元素との結合錯体として存在する。
【００８０】
一部の実施形態において、前記ケイ素は、ケイ酸塩又はケイ素含有鉱物として存在する。
一つ又は複数の実施形態において、前記ケイ酸塩は、ケイ酸マグネシウム、フルオロケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウムおよびケイ酸カリウムナトリウムから選んでもよい。
一つ又は複数の実施形態において、ケイ素含有鉱物は、ネソ珪酸塩鉱物、ソロ珪酸塩鉱物、シクロ珪酸塩鉱物、イノ珪酸塩鉱物、単鎖イノ珪酸塩鉱物、二重鎖イノ珪酸塩鉱物、フィロ珪酸塩鉱物、テクト珪酸塩鉱物から選んでもよい。
【００８１】
一つ又は複数の実施形態において、よく見かけるケイ素の形態は、例えば、輝石、かんらん石、エピドート、トルマリン、角閃石、雲母、白土、長石または石英が挙げられる。
【００８２】
本開示は、植物の健康、生長又は生産量を向上させる方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の組成物を、前記植物又は前記植物の周辺環境に投与することを含む。
【００８３】
以下、実施例により本開示の実施案を更に詳細に説明するが、下記の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を何等限定するものでない。実施例において、具体的な条件が明記されていないものは、通常の条件又はメーカーの推奨する条件によるものとする。使用する試薬又は装置について、製造メーカーが明記されていないものは、いずれも市販で購入できる通常のものとする。
【実施例】
【００８４】
実験手順
【００８５】
１  菌種の選別
１．１  土壌サンプルの採取
典型的な土壌、例えば砂土、粘土、黒土などを採取場所として選択した。サンプルは、畑地、牧草地、森林土など異なる区域に由来するものであってもよい。特に、水稲・小麦畑、及び長年シリコン肥料が使用された土壌からサンプルを採取した。一箇所につき１５〜２０ｇのサンプル採取を行なうと共に、採取されたサンプルの採取場所（省、県）、採取年月、土壌の由来（植物、砂土、又はその他）を明記した。８０％グリセリンの入った管にサンプルを入れ、−８０℃の冷蔵庫に保存した。
【００８６】
１．２  土壌サンプルにおける目的の微生物の富化
ステップ１の富化
１０ｍＬ純水に土壌サンプル１ｇを取り、振り動かして混合液を得た。栄養欠損Ｒ２Ａ液体培地（酵母パウダー０．５ｇ、トリプトン０．５ｇ、グルコース０．５ｇ、リン酸水素二カリウム０．３ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．３ｇ、ケイ酸マグネシウム５．０ｇ、水１Ｌ）に混合液１００μＬを取り、３０℃で３日間震盪培養を行なって培養した菌液を得た。培養した菌液を１０−６、１０−７、１０−８倍希釈した後、Ｒ２Ａ固体培地（酵母パウダー０．５ｇ、トリプトン０．５ｇ、ペプトン０．７５ｇ、グルコース０．５ｇ、可溶性デンプン０．５ｇ、リン酸水素二カリウム０．３ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．３ｇ、ケイ酸マグネシウム２．５ｇ、寒天１５ｇ、水１Ｌ）に塗布し、機能を有する菌株を選択した。
【００８７】
ステップ２の富化
ステップ１で得られた菌株を用いて調製した菌液を１００μＬ取り、１／２Ｎ栄養欠損Ｒ２Ａ培地（酵母パウダー０．２５ｇ、トリプトン０．２５ｇ、グルコース０．５ｇ、リン酸水素二カリウム０．３ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．３ｇ、ケイ酸マグネシウム５．０ｇ、水１Ｌ）において、３０℃で３日間震盪培養を行なって培養した菌液を得た。培養した菌液を１０−６、１０−７、１０−８倍希釈した後、シャーレに塗布し、ケイ素分解円機能を有する菌株を選択した。
【００８８】
ステップ３の富化
ステップ２で得られた菌株を用いて調製した菌液を１００μＬ取り、１／２Ｎ栄養欠損Ｒ２Ａ培地において、３０℃で３日間震盪培養を行なって培養した菌液を得た。培養した菌液を１０−６、１０−７、１０−８倍希釈した後、シャーレに塗布し、ケイ素分解円機能を有する菌株を選択した。
【００８９】
１．３  繰り返しの検証
菌株のケイ素分解能力の持続性を確保するために、富化したシャーレから選択された菌株を、０．２５％ケイ酸マグネシウムを含有するＲ２Ａ固体培地に播種し、３０℃で培養した。実験結果を毎日観察し、選択されたコロニーがケイ素機能を有するかどうかを検証し、偽陽性を示すコロニーを排除した。
【００９０】
２  菌種同定
２．１  ＣＴＡＢ法による細菌ＤＮＡの抽出
１）単一コロニーを５ｍＬのＲ２Ａ培地に播種し、３０℃で一晩培養してシード培養液を得た。
２）シード培養液を１ｍＬ取り、１００ｍＬのＲ２Ａ液体培地に播種し、３７℃、２２０ｒ／ｍｉｎ条件下で１６時間培養を行なって培養物を得た。
３）５０００ｒ／ｍｉｎで培養物を１０分間遠心分離し、上澄みを除去して菌体を得た。１０ｍＬのＴＥで菌体を遠心分離で洗浄した後、１０ｍＬのＴＥで菌体を懸濁させて懸濁液を得た。均一に混合した後、−２０℃で保存した。
４）菌体懸濁液を３．５ｍＬ取り、１０％ＳＤＳ１８４μＬを加えて、均一に混合し、１０ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＫを３７μＬ加えて、均一に混合した。３７℃で１時間インキュベートした。
５）５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを７４０μＬ加え、さらに、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌを５１２μＬ加え、均一に混合し、６５℃で１０分間インキュベートした。
６）同体積のクロロホルム/イソアミルアルコールを加え、均一に混合し、１００００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、上澄みを残した。
７）上澄みに同体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、均一に混合し、１００００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、上澄みを残した。
８）上澄みに対して０．６倍量のイソプロパノールを加え、均一に混合し、１００００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を収集し、７０％アルコールにて遠心分離して洗浄した。
９）１ｍＬのＴＥにＤＮＡ沈殿を溶かし、最終濃度２０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ  Ａを加えて、４℃で保存した。
【００９１】
２．２  増幅及びシーケンス
抽出したＤＮＡをテンプレートにし、１６Ｓ  ｒＤＮＡ増幅用ユニバーサルプライマーである２７ｆ（５‘−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）及び１４９２ｒ（５‘−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を用いて１６Ｓ  ｒＤＮＡをＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で３０秒間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で６０秒間の伸長を３５サイクルで行った。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、回収し、精製してからシーケンス解析を行った（北京美億美生物技術有限公司）。得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づき、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）により相同配列を検索した。さらに、ＭＥＧＡ５．０ソフトウェアにより系統樹を作成。
【００９２】
３  ケイ素分解能力測定
前のステップで選別された菌株を、０．５％ケイ酸マグネシウムを含有するＲ２Ａ培地に播種した。ケイ酸塩細菌を陽性対照として用いた。播種して４８時間後、コロニーを洗い流し、培地におけるケイ素分解円の直径を測定し、単位をｍｍとした。
ケイ素分解能力＝ケイ素分解円の直径（ｍｍ）＋Ｘ
ここで、Ｘは、重み係数であり、菌株のケイ素分解円の透明度に応じて、それぞれ−２、−１、０、１、２とする。
【００９３】
４  菌株形態の観察
選別された菌株をＲ２Ａプレートに播種し、３０℃で２４時間培養した後、コロニーの大きさ、形状、色、光沢度、粘着度、隆起形状、透明度、辺縁の特徴及び芽胞の有無などを観察した。
【００９４】
５  菌株のストレス耐性の測定
選別された菌株を、ｐＨ５、ｐＨ１０、５％ＮａＣｌ、５％ＫＮＯ３、１０％ＫＮＯ３、２０％ＫＮＯ３のＲ２Ａ培地に播種し、菌株が生長するかどうか、また生長が抑制されるかどうか、及び生長速度の速さを観察した。さらに、ｐＨ５、ｐＨ１０、５％ＮａＣｌ、１０％ＮａＣｌ、５％ＫＮＯ３、１０％ＫＮＯ３のＲ２Ａ培地（１．０％ケイ酸マグネシウムを含有する）における、菌株のケイ素分解能力を測定し、３．に記載の式によって計算した。
【００９５】
６  菌株の好気性の測定
三菱ガス化学株式会社製の二酸化炭素及び微好気培養用アネロパック（Ａｎａｅｒｏｐａｃｋ）を用いて酸素濃度を１５％及び１０％に制御し、酸素欠乏条件下における菌株の生長状況及びケイ素分解能力を検証した。
【００９６】
７  溶血性検査
上記で選別された菌種を血液寒天プレート培地（カゼインのパンクレアチンによる消化産物（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎ）１０．０ｇ、心臓のパンクレアチンによる消化産物３．０ｇ、コーンスターチ１．０ｇ、寒天１３．０ｇ、肉のペプシンによる消化産物５．０ｇ、酵母エキス５．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、蒸留水１０００ｍＬ、羊の血６０ｍＬ）に播種し、３０℃恒温箱において１８時間培養した。コロニーの形態を観察し、溶血円があらわれたかどうか観察した。
【００９７】
８  芽胞形成率の測定
無菌操作において、清潔なスライドをアルコールで火炎滅菌し、標本の区域を明確に標記し、リン酸緩衝液をその区域内に１滴加えた（０．２Ｍ、ｐＨ７．２）。播種用のループでコロニーを２〜３個取り、滴下されたリン酸塩緩衝液内又は１滴の菌体懸濁液に、薄膜となるように均一に塗布し、乾燥固着した。乾燥した後、塗布された菌体の膜の全ての区域をカバーするように、７．６％マラカイトグリーン溶液を菌体の膜に滴下して１５〜２０分間染色処理し、流した水の緑色が完全になくなるまで水洗して脱色した。表面の水を漉し、干した後、再染色処理し、０．５％サフラニン溶液を滴下して２〜３分間染色処理し、ひっくり返して染液を除去し、染液を水で少し洗い流してからフィルターペーパーで残液を吸い尽くし、乾燥後、芽胞コロニー標本とした。乾燥後、油浸レンズで観察したところ、芽胞が緑色を呈し、芽胞嚢及び栄養体が赤色を呈した。
【００９８】
少なくとも３つの視野を観察し、各視野における芽胞数及び細菌数を計数し、芽胞数の平均値（Ａ）及び細菌数の平均値（Ｂ）を記録して算出した。下記式により鏡検による芽胞形成率を算出した。
鏡検による芽胞形成率：Ｎ＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００％
式中、Ｎはサンプルの鏡検による芽胞形成率を表し、Ａはサンプルの鏡検視野での芽胞数の平均値を表し、Ｂはサンプルの鏡検視野での細菌数の平均値を表すものである。
【００９９】
９  ポット試験
バーミキュライトを基質とし、鉢ごとに土壌を５００ｇ入れ、さらに、等量、且つ少量の水で湿らした。大きさが均一な「鄭単９５８」及びポップコーン（太谷県緑宝種業有限公司）の種を選択し、１鉢に６粒ずつ播種し、４鉢繰り返した。菌液を５０倍希釈した後、トウモロコシ生長の需要に応じて、等量の菌液を適時、適量に流し込んだ。１５日後、根部乾物重を量った。何の菌株も播種されなかった栄養欠損Ｒ２Ａ液体培地をブランク対照ＣＫ１として、ケイ酸塩細菌を播種した培地を陽性対照ＣＫ２として用いた。
【０１００】
実験結果
【０１０１】
１  菌株の選別
本試験は、合計１０省、１６市・県から、小麦、水稲、トウモロコシ、ベビーキャベツ、トマト、キュウリ、ブロッコリー、イチゴ及び／又はブドウなどを含む１９種の農作物の３４個の土壌サンプルを採取した。富化の実験により、ケイ素分解機能を有する菌株を計２０６株選別して得られた。１６Ｓ  ｒＤＮＡシーケンス、及びケイ素分解能力、ストレス耐性、好気性、溶血性、菌株成長特性、芽胞形成率、ポット試験により検証したところ、生物学的安全性を有し、芽胞形成率が高く、ケイ素分解能力が強く、耐アルカリ・耐塩性を持ち、低酸素条件下で良好に成長でき、溶血円が発生しない且つ植物成長促進作用を有するグラム陽性菌−ＭＢ２２及びＭＢ３５−５を選択した。これら２つの菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を解析した結果より、それらとＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｙａｂｈａｔｔａｉとの同一性が９９％と高いことが明らかになっている。
【０１０２】
２  菌株の形態
Ｒ２Ａ培地で２日間生長させたところ、コロニーが円形を呈し、ベージュ色で不透明なものであり、表面が滑らかで潤いがあり、辺縁が規則的なものであり、ハロが認められ、中央に突起があり、その直径が１．５〜２ｍｍで、円形を呈し、光沢を持ちながら粘りけがあり、僅かな隆起が認められ、且つ、辺縁が滑らかで規則的なものである。
【０１０３】
３  ケイ素分解能力
表１及び図１から、菌株ＭＢ２２及びＭＢ３５−５のケイ素分解能力が対照のケイ酸塩菌株３０１６よりも顕著に高いことが明らかになっている。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
４  菌株のストレス耐性
表２及び図２に示す測定結果から、本開示に係る菌株ＭＢ２２及びＭＢ３５−５は、対照のケイ酸塩菌株３０１６に較べて、より優れる耐塩・耐アルカリ性を有し、かつ一定の耐酸性を有することが明らかになっている。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
５  ストレス条件でのケイ素分解能力
測定結果（表３）より、本開示に係る菌株が、塩濃度が高い条件下、強アルカリ性条件下及び弱酸性条件下で依然としてケイ素分解機能を有する一方、対照菌株であるケイ酸塩細菌３０１６がいずれのテストのストレス条件下でもうまく成長しないことが明らかにされた。
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
６  酸素欠乏条件における菌株の生存及びケイ素分解能力
表４の結果より、酸素欠乏条件及び非酸素欠乏条件のいずれにおいても、本開示に係る菌株ＭＢ２２及びＭＢ３５−５が、対照のケイ酸塩菌株及びその他の細菌菌株よりも顕著に優れることが明らかになっている。
【０１１０】
【表４】
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【０１１１】
７  溶血性検査
本開示により提供される２株の菌株のいずれも溶血円がない。実験から、本開示に係る菌株では溶血反応が起こらないことが明らかになっている。
【０１１２】
８  芽胞形成率の測定
表５に示す結果から、本実験において同じ条件下で本開示に係る菌株ＭＢ２２及びＭＢ３５−５が対照菌株であるケイ酸塩菌株３０１６よりも芽胞形成率が顕著に高いことが明らかになっている。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
９  ポット試験
表６に示す結果から、ケイ酸塩細菌３０１６及び本開示に係る菌株ＭＢ２２及びＭＢ３５−５がトウモロコシの根部生長の促進作用を有するが、菌株ＭＢ２２及びＭＢ３５−５の促進作用がケイ酸塩細菌及び実験に供したその他の２株の菌株ＭＢ１５−１３及びＭＢ１２−７よりも顕著に優れることが明らかになっている。本開示に係る２株の菌株は、小麦の根部生長促進作用を有するが、トウモロコシほどではない。対照のケイ酸塩細菌３０１６は小麦の根部生長促進作用を有しない。その他の２株の菌株は小麦の発達・生長に効果がある。
【０１１５】
【表６】
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【０１１６】
なお、上記の実施例は、本発明を説明するのみに使用され、本発明を限定するためのものではない。上記の実施例を参照して本開示を詳しく説明したが、この開示が属する技術分野の当業者は理解すべきこととして、上記の実施例に記載された技術方案を改修ことが可能であり、または技術特徴の一部或いは全部を均等物に入れ替えることができる。改修した又は入れ替えた内容に応じた技術方案の本質を、本開示に係る各実施例の技術方案の範囲から離脱させないと理解するだろう。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本開示に係る菌株は、ケイ素分解能力を有し、かつ、植物の生長を促進でき、耐アルカリ性、耐塩性、及び無酸素耐性を持ち、良好な応用前景を有する。当該菌株は、植物の健康、生長又は生産量の向上に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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