(57)【要約】エキソソームを含み、該エキソソームが、その表面にCD47を含み、かつCRISPRシステムをさらに含む、組成物が本明細書において提供される。遺伝子編集のために該エキソソームを使用する方法、および遺伝子編集によるがんの処置がさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソソームを含み、該エキソソームがその表面にCD47を含みかつ該エキソソームがCRISPRシステムを含む、組成物。
【請求項２】
前記CRISPRシステムがエンドヌクレアーゼとガイドRNA(gRNA)とを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記エンドヌクレアーゼがCasエンドヌクレアーゼである、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記エンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼである、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記エンドヌクレアーゼがCpf1エンドヌクレアーゼである、請求項2に記載の組成物。
【請求項６】
前記ガイドRNAが1本のgRNAである、請求項2に記載の組成物。
【請求項７】
前記1本のgRNAがCRISPR-RNA(crRNA)である、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
前記1本のgRNAが、crRNAとトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)の融合体を含む、請求項6に記載の組成物。
【請求項９】
前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAとを含む、請求項2に記載の組成物。
【請求項１０】
前記エンドヌクレアーゼと前記gRNAが、前記エキソソーム内の1本の核酸分子上にコードされている、請求項2に記載の組成物。
【請求項１１】
前記CRISPRシステムが、疾患の原因となる変異を標的とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
前記疾患の原因となる変異が、がんの原因となる変異である、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
前記がんの原因となる変異が、がん遺伝子中の活性化型変異である、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
前記がんの原因となる変異が、腫瘍抑制遺伝子中の阻害型変異である、請求項12に記載の組成物。
【請求項１５】
前記がんの原因となる変異がKrasG12Dである、請求項12に記載の組成物。
【請求項１６】
前記エキソソームの少なくとも50％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項2に記載の組成物。
【請求項１７】
前記エキソソームの少なくとも60％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
前記エキソソームの少なくとも70％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
前記エキソソームの少なくとも80％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
前記エキソソームの少なくとも90％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか一項に記載のエキソソームと、賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
非経口投与用に製剤化されている、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
静脈内注射用、筋肉内注射用、皮下注射用、または腹腔内注射用に製剤化されている、請求項22に記載の組成物。
【請求項２４】
抗菌剤をさらに含む、請求項22に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗菌剤が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである、請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
それを必要とする患者において疾患を処置する方法であって、請求項21〜25のいずれか一項に記載の組成物を該患者に投与し、それによって該患者において該疾患を処置する工程を含む、該方法。
【請求項２７】
投与によって、前記患者の疾患細胞において遺伝子編集が引き起こされる、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患ががんである、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記がんが膵管腺がんである、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が全身投与である、請求項26に記載の方法。
【請求項３１】
前記全身投与が静脈内投与である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも第2の療法を前記患者に実施する工程をさらに含む、請求項26に記載の方法。
【請求項３３】
前記第2の療法が、外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者がヒトである、請求項26に記載の方法。
【請求項３５】
前記エキソソームが前記患者にとって自己由来である、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
患者における疾患の処置において使用するための、エキソソームを含む組成物であって、該エキソソームがその表面にCD47を含みかつ該エキソソームがCRISPRシステムを含む、該組成物。
【請求項３７】
前記CRISPRシステムがエンドヌクレアーゼとガイドRNA(gRNA)とを含む、請求項36に記載の組成物。
【請求項３８】
前記エンドヌクレアーゼがCasエンドヌクレアーゼである、請求項37に記載の組成物。
【請求項３９】
前記エンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼである、請求項38に記載の組成物。
【請求項４０】
前記エンドヌクレアーゼがCpf1エンドヌクレアーゼである、請求項37に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ガイドRNAが1本のgRNAである、請求項37に記載の組成物。
【請求項４２】
前記1本のgRNAがCRISPR-RNA(crRNA)である、請求項41に記載の組成物。
【請求項４３】
前記1本のgRNAが、crRNAとトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)の融合体を含む、請求項41に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAとを含む、請求項37に記載の組成物。
【請求項４５】
前記エンドヌクレアーゼと前記gRNAが、前記エキソソーム内の1本の核酸分子上にコードされている、請求項36に記載の組成物。
【請求項４６】
前記CRISPRシステムが、疾患の原因となる変異を標的とする、請求項36に記載の組成物。
【請求項４７】
前記疾患の原因となる変異が、がんの原因となる変異である、請求項46に記載の組成物。
【請求項４８】
前記がんの原因となる変異が、がん遺伝子中の活性化型変異である、請求項47に記載の組成物。
【請求項４９】
前記がんの原因となる変異が、腫瘍抑制遺伝子中の阻害型変異である、請求項47に記載の組成物。
【請求項５０】
前記がんの原因となる変異がKrasG12Dである、請求項47に記載の組成物。
【請求項５１】
前記エキソソームの少なくとも50％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項37に記載の組成物。
【請求項５２】
前記エキソソームの少なくとも60％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項51に記載の組成物。
【請求項５３】
前記エキソソームの少なくとも70％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項52に記載の組成物。
【請求項５４】
前記エキソソームの少なくとも80％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項53に記載の組成物。
【請求項５５】
前記エキソソームの少なくとも90％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項54に記載の組成物。
【請求項５６】
投与によって、前記患者の疾患細胞において遺伝子編集が引き起こされる、請求項36に記載の組成物。
【請求項５７】
前記疾患ががんである、請求項36に記載の組成物。
【請求項５８】
前記がんが膵管腺がんである、請求項57に記載の組成物。
【請求項５９】
非経口投与用に製剤化されている、請求項36に記載の組成物。
【請求項６０】
静脈内注射用、筋肉内注射用、皮下注射用、または腹腔内注射用に製剤化されている、請求項59に記載の組成物。
【請求項６１】
抗菌剤をさらに含む、請求項59に記載の組成物。
【請求項６２】
前記抗菌剤が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである、請求項61に記載の組成物。
【請求項６３】
少なくとも第2の療法をさらに含む、請求項36に記載の組成物。
【請求項６４】
前記第2の療法が、外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、請求項63に記載の組成物。
【請求項６５】
前記患者がヒトである、請求項36に記載の組成物。
【請求項６６】
前記エキソソームが前記患者にとって自己由来である、請求項65に記載の組成物。
【請求項６７】
疾患を処置するための医薬の製造におけるエキソソームの使用であって、該エキソソームがその表面にCD47を含みかつ該エキソソームがCRISPRシステムを含む、該使用。
【請求項６８】
前記CRISPRシステムがエンドヌクレアーゼとガイドRNA(gRNA)とを含む、請求項67に記載の使用。
【請求項６９】
前記エンドヌクレアーゼがCasエンドヌクレアーゼである、請求項68に記載の使用。
【請求項７０】
前記エンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼである、請求項69に記載の使用。
【請求項７１】
前記エンドヌクレアーゼがCpf1エンドヌクレアーゼである、請求項68に記載の使用。
【請求項７２】
前記ガイドRNAが1本のgRNAである、請求項68に記載の使用。
【請求項７３】
前記1本のgRNAがCRISPR-RNA(crRNA)である、請求項72に記載の使用。
【請求項７４】
前記1本のgRNAが、crRNAとトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)の融合体を含む、請求項72に記載の使用。
【請求項７５】
前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAとを含む、請求項68に記載の使用。
【請求項７６】
前記エンドヌクレアーゼと前記gRNAが、前記エキソソーム内の1本の核酸分子上にコードされている、請求項68に記載の使用。
【請求項７７】
前記CRISPRシステムが、疾患の原因となる変異を標的とする、請求項67に記載の使用。
【請求項７８】
前記疾患の原因となる変異が、がんの原因となる変異である、請求項77に記載の使用。
【請求項７９】
前記がんの原因となる変異が、がん遺伝子中の活性化型変異である、請求項78に記載の使用。
【請求項８０】
前記がんの原因となる変異が、腫瘍抑制遺伝子中の阻害型変異である、請求項78に記載の使用。
【請求項８１】
前記がんの原因となる変異がKrasG12Dである、請求項78に記載の使用。
【請求項８２】
前記エキソソームの少なくとも50％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項68に記載の使用。
【請求項８３】
前記エキソソームの少なくとも60％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項82に記載の使用。
【請求項８４】
前記エキソソームの少なくとも70％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項83に記載の使用。
【請求項８５】
前記エキソソームの少なくとも80％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項84に記載の使用。
【請求項８６】
前記エキソソームの少なくとも90％がエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む、請求項85に記載の使用。
【請求項８７】
前記疾患ががんである、請求項67に記載の使用。
【請求項８８】
前記がんが膵管腺がんである、請求項87に記載の使用。
【請求項８９】
前記医薬が非経口投与用に製剤化される、請求項67に記載の使用。
【請求項９０】
前記医薬が全身投用に製剤化される、請求項67に記載の使用。
【請求項９１】
前記医薬が、静脈内注射用、筋肉内注射用、皮下注射用、または腹腔内注射用に製剤化される、請求項89に記載の使用。
【請求項９２】
前記医薬が抗菌剤を含む、請求項67に記載の使用。
【請求項９３】
前記抗菌剤が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである、請求項92に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、全内容が参照により本明細書に組み入れられる2017年12月15日に出願された米国特許仮出願第62/599,340号の優先権恩典を主張する。
【０００２】
1.分野
本発明は全体として医学および腫瘍学に関する。さらに詳細には、本発明は、遺伝子編集のために、ヌクレアーゼ複合体をインビボ送達するためのエキソソームの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
2.関連技術の説明
遺伝子編集は、生細胞内の標的遺伝子を改変する技術である。最近では、CRISPR細菌免疫系を利用して遺伝子編集を要望に応じて行うことで、科学者がゲノム編集を行う手法が一変した。RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼであるCRISPRシステムのCas9タンパク質は、そのガイドRNA配列を変えることで、新たな部位を標的とするように比較的簡単に操作することができる。この発見により、配列特異的な遺伝子編集が機能的に有効になった。現行のCRISPR/Cas9技術は、インビトロで培養細胞の遺伝子を編集する信頼性の高い方法を提供する。しかしながら、インビボで、様々な臓器における特定の細胞を標的にする新たな方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
概要
従って、様々な臓器および腫瘍にCRISPR-Cas9を高効率で運ぶように操作されたエキソソームが提供され、それにより、がんおよび他の遺伝病を治療的遺伝子編集によって制御することが可能になる。一態様では、エキソソームを含み、エキソソームがその表面にCD47を含みかつエキソソームがCRISPRシステムを含む、組成物が提供される。一部の局面では、CRISPRシステムはエンドヌクレアーゼとガイドRNA(gRNA)とを含む。一部の局面では、エンドヌクレアーゼはCasエンドヌクレアーゼである。一部の局面では、エンドヌクレアーゼはCas9エンドヌクレアーゼである。他の局面では、エンドヌクレアーゼはCpf1エンドヌクレアーゼである。一部の局面では、ガイドRNAは1本のgRNAである。一部の局面では、1本のgRNAはCRISPR-RNA(crRNA)である。一部の局面では、1本のgRNAは、crRNAとトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)の融合体を含む。一部の局面では、ガイドRNAはcrRNAとtracrRNAを含む。一部の局面では、エンドヌクレアーゼとgRNAは、エキソソーム内の1本の核酸分子上にコードされている。一部の局面では、エンドヌクレアーゼとgRNAは、エキソソーム内の別々の核酸分子上にコードされている。
【０００５】
一部の局面では、CRISPRシステムは、疾患の原因となる変異を標的とする。一部の局面では、疾患の原因となる変異は、がんの原因となる変異である。一部の局面では、がんの原因となる変異は、がん遺伝子中の活性化型変異である。一部の局面では、がんの原因となる変異は、腫瘍抑制遺伝子中の阻害型変異である。一部の局面では、CRISPRシステムはアンドラッガブル(undruggable)遺伝子を標的とする。一部の局面では、がんの原因となる変異はKrasG12Dである。一部の局面では、エキソソームの少なくとも2％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％(またはその中から導き出せる任意の値)はエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む。
【０００６】
一態様では、エキソソームと薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物であって、エキソソームがその表面にCD47を含みかつエキソソームがCRISPRシステムを含む、薬学的組成物が提供される。一部の局面では、CRISPRシステムはエンドヌクレアーゼとガイドRNA(gRNA)とを含む。一部の局面では、エンドヌクレアーゼはCasエンドヌクレアーゼである。一部の局面では、エンドヌクレアーゼはCas9エンドヌクレアーゼである。他の局面では、エンドヌクレアーゼはCpf1エンドヌクレアーゼである。一部の局面では、ガイドRNAは1本のgRNAである。一部の局面では、1本のgRNAはCRISPR-RNA(crRNA)である。一部の局面では、1本のgRNAは、crRNAとトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)の融合体を含む。一部の局面では、ガイドRNAはcrRNAとtracrRNAを含む。一部の局面では、エンドヌクレアーゼとgRNAは、エキソソーム内の1本の核酸分子上にコードされている。一部の局面では、エンドヌクレアーゼとgRNAは、エキソソーム内の別々の核酸分子上にコードされている。一部の局面では、CRISPRシステムは、疾患の原因となる変異を標的とする。一部の局面では、疾患の原因となる変異は、がんの原因となる変異である。一部の局面では、がんの原因となる変異は、がん遺伝子中の活性化型変異である。一部の局面では、がんの原因となる変異は、腫瘍抑制遺伝子中の阻害型変異である。一部の局面では、CRISPRシステムはアンドラッガブル遺伝子を標的とする。一部の局面では、がんの原因となる変異はKrasG12Dである。一部の局面では、エキソソームの少なくとも2％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％(またはその中から導き出せる任意の値)はエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む。一部の局面では、前記組成物は非経口投与用に製剤化される。一部の局面では、前記組成物は静脈内注射用、筋肉内注射用、皮下注射用、または腹腔内注射用に製剤化される。さらなる局面では、前記組成物は抗菌剤をさらに含む。一部の局面では、抗菌剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド(centrimide)、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン(exetidine)、イミド尿素(imidurea)、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール(phenylethl alcohol)、硝酸フェニル水銀(phenlymercuric nitrate)、プロピレングリコール、またはチメロサールである。
【０００７】
一態様では、それを必要とする患者において疾患を処置する方法が提供され、前記方法は、薬学的組成物がエキソソームと薬学的に許容される賦形剤とを含み、エキソソームがその表面にCD47を含みかつエキソソームがCRISPRシステムを含む、薬学的組成物を含む組成物を患者に投与し、それによって患者において疾患を処置する工程を含む。一部の局面では、投与によって、患者の疾患細胞において遺伝子編集が引き起こされる。一部の局面では、疾患はがんである。一部の局面では、がんは膵管腺がんである。一部の局面では、投与は全身投与である。一部の局面では、全身投与は静脈内投与または動脈内投与である。一部の局面では、前記方法は少なくとも第2の療法を患者に実施する工程さらに含む。一部の局面では、第2の療法は外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む。一部の局面では、患者はヒトである。一部の局面では、エキソソームは患者にとって自己由来である。一部の局面では、前記薬学的組成物を投与すると、エキソソームを含まないCRISPRシステムの投与と比べて優れた治療的利益が得られる。一部の局面では、前記薬学的組成物は1回だけ患者に投与される。一部の局面では、前記薬学的組成物は患者に複数回投与される。一部の局面では、前記薬学的組成物は患者に限度のある回数で投与される。一部の局面では、前記薬学的組成物は患者に連続投与される。一部の局面では、前記薬学的組成物は患者に少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも11回、少なくとも21回、少なくとも13回、少なくとも14回、少なくとも15回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも35回、少なくとも40回、少なくとも45回、もしくは少なくとも50回(またはその中から導き出せる任意の値)投与される。
【０００８】
一態様では、患者における疾患の処置において使用するための、エキソソームを含む組成物であって、エキソソームがその表面にCD47を含みかつエキソソームがCRISPRシステムを含む、組成物が提供される。一部の局面では、CRISPRシステムはエンドヌクレアーゼとガイドRNA(gRNA)とを含む。一部の局面では、エンドヌクレアーゼはCasエンドヌクレアーゼである。一部の局面では、エンドヌクレアーゼはCas9エンドヌクレアーゼである。他の局面では、エンドヌクレアーゼはCpf1エンドヌクレアーゼである。一部の局面では、ガイドRNAは1本のgRNAである。一部の局面では、1本のgRNAはCRISPR-RNA(crRNA)である。一部の局面では、1本のgRNAは、crRNAとトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)の融合体を含む。一部の局面では、ガイドRNAはcrRNAとtracrRNAを含む。一部の局面では、エンドヌクレアーゼとgRNAは、エキソソーム内の1本の核酸分子上にコードされている。一部の局面では、エンドヌクレアーゼとgRNAは、エキソソーム内の別々の核酸分子上にコードされている。一部の局面では、CRISPRシステムは、疾患の原因となる変異を標的とする。一部の局面では、疾患の原因となる変異は、がんの原因となる変異である。一部の局面では、がんの原因となる変異は、がん遺伝子中の活性化型変異である。一部の局面では、がんの原因となる変異は、腫瘍抑制遺伝子中の阻害型変異である。一部の局面では、CRISPRシステムはアンドラッガブル遺伝子を標的とする。一部の局面では、がんの原因となる変異はKrasG12Dである。一部の局面では、エキソソームの少なくとも2％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％(またはその中から導き出せる任意の値)はエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む。一部の局面では、投与によって、患者の疾患細胞において遺伝子編集が引き起こされる。一部の局面では、疾患はがんである。一部の局面では、がんは膵管腺がんである。一部の局面では、前記組成物は非経口投与用に製剤化される。一部の局面では、前記組成物は静脈内注射用、筋肉内注射用、皮下注射用、または腹腔内注射用に製剤化される。さらなる局面では、前記組成物は抗菌剤をさらに含む。一部の局面では、抗菌剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである。さらなる局面では、前記組成物は少なくとも第2の療法を含む。一部の局面では、第2の療法は外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む。一部の局面では、患者はヒトである。一部の局面では、エキソソームは患者にとって自己由来である。
【０００９】
一態様では、疾患を処置するための医薬の製造におけるエキソソームの使用であって、エキソソームがその表面にCD47を含みかつエキソソームがCRISPRシステムを含む、使用が提供される。一部の局面では、CRISPRシステムはエンドヌクレアーゼとガイドRNA(gRNA)とを含む。一部の局面では、エンドヌクレアーゼはCasエンドヌクレアーゼである。一部の局面では、エンドヌクレアーゼはCas9エンドヌクレアーゼである。他の局面では、エンドヌクレアーゼはCpf1エンドヌクレアーゼである。一部の局面では、ガイドRNAは1本のgRNAである。一部の局面では、1本のgRNAはCRISPR RNA(crRNA)である。一部の局面では、1本のgRNAは、crRNAとトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)の融合体を含む。一部の局面では、ガイドRNAはcrRNAとtracrRNAを含む。一部の局面では、エンドヌクレアーゼとgRNAは、エキソソーム内の1本の核酸分子上にコードされている。一部の局面では、エンドヌクレアーゼとgRNAは、エキソソーム内の別々の核酸分子上にコードされている。一部の局面では、CRISPRシステムは、疾患の原因となる変異を標的とする。一部の局面では、疾患の原因となる変異は、がんの原因となる変異である。一部の局面では、がんの原因となる変異は、がん遺伝子中の活性化型変異である。一部の局面では、がんの原因となる変異は、腫瘍抑制遺伝子中の阻害型変異である。一部の局面では、CRISPRシステムはアンドラッガブル遺伝子を標的とする。一部の局面では、がんの原因となる変異はKrasG12Dである。一部の局面では、エキソソームの少なくとも2％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％(またはその中から導き出せる任意の値)はエンドヌクレアーゼとgRNAとを含む。一部の局面では、疾患はがんである。一部の局面では、がんは膵管腺がんである。一部の局面では、医薬は非経口投与用に製剤化される。一部の局面では、医薬は静脈内注射用、筋肉内注射用、皮下注射用、または腹腔内注射用に製剤化される。一部の局面では、医薬は抗菌剤を含む。一部の局面では、抗菌剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである。
【００１０】
本明細書で使用する「本質的に含まない」とは指定された成分の観点からいうと、指定された成分がどれも、意図を持って組成物中に製剤化されていないこと、および/または単に汚染物質として、もしくは微量に存在することを意味するために本明細書において用いられる。従って、組成物の意図されない汚染に起因する、指定された成分の総量は、0.05％よりかなり少なく、好ましくは0.01％より少ない。指定された成分の量を標準的な分析方法を用いて検出できない組成物が最も好ましい。
【００１１】
本明細書で使用する「1つの(a)」または「1つの(an)」とは1つまたは複数を意味することがある。本明細書中の特許請求の範囲において使用する場合、「含む(comprising)」という単語と共に用いられる時には、「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語は1つまたは複数を意味することがある。
【００１２】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢だけを指すか、または選択肢が互いに相容れないことを指すと明示されていない限り「および/または」を意味するために用いられるが、この開示は、選択肢だけと「および/または」を指す定義を裏付ける。本明細書で使用する「別の」とは少なくとも第2の、またはそれより多くを意味することがある。
【００１３】
本願全体を通して「約」という用語は、ある値が、この値を求めるために用いられている装置、方法の誤差の固有の変動、または試験対象間に存在するばらつきを含むことを示すために用いられる。本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は本発明の、ある特定の態様を示しているが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲の中で様々な修正および変更が当業者に明らかになるので例示にすぎないことが理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明のある特定の局面をさらに証明するために含まれる。本発明は、これらの図面の1つまたは複数を、本明細書において示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによってさらに深く理解され得る。
【図１】図1a〜h: HEK293T細胞に、リポフェクタミンを用いてCRISPR-Cas9ベクター対照およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2を72時間トランスフェクトし、次いで、1μg/mlピューロマイシンを用いて10日間選択して、安定したHEK293T CRISPR-Cas9ベクター対照およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2細胞を得た。安定細胞を、1μg/mlピューロマイシンを含有する選択培地と共に培養した。(図1a)上述した細胞からDNAおよびRNAを抽出し、定量リアルタイムPCR(qPCR)を用いてCas9レベルを求めた。(図1b)エキソソームをHEK293Tブランク細胞、ならびに安定したHEK293T CRISPR-Cas9ベクター対照およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2細胞から収集し、その後にNanosight検証を行った。(図1c)エキソソームDNAおよびRNAを抽出し、qPCRを行って、エキソソームにおけるCas9レベルならびにRab27a-2に対するsgRNAを検出した。(図1d)細胞とエキソソームの両方のCas9タンパク質レベルを、それぞれ、抗Flag抗体またはCas9抗体と、対照としてビンキュリンまたはCD9を用いたウエスタンブロットによって評価した。(図1e)および(図1f)T7/SURVEYORアッセイを使用して、細胞(図1e)およびエキソソーム(図1f)におけるDNA編集を確かめた。(図1g)および(図1h)HEK293Tブランク細胞、HEK293T CRISPR-Cas9ベクター対照、およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2安定細胞から収集した3E10エキソソームを処理してBxPC-3に24時間毎に入れた。+ 1回処理、++ 2回処理。DNAおよびRNAをレシピエント細胞から抽出した。DNA(g)およびmRNA(h)レベルの両方でCas9レベルを検出した。各時点でのバーは左から右にかけて「ブランク対照」、「CRISPR-Cas9ベクター対照」、および「CRISPR-Cas9-sgRab27a-2」を表している。
【図２】図2a〜c: HEK293Tブランク細胞、HEK293T CRISPR-Cas9ベクター対照、およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2安定細胞から収集した3E10エキソソームを処理してBxPC-3に24時間毎に2回導入した。DNAおよびRNAをレシピエント細胞から抽出した。(図2a)および(図2c)DNA(図2a)およびmRNA(図2c)レベルの両方でRab27a-2に対するsgRNAをPCRによって検出した。(図2b)T7/SURVEYORアッセイを用いて、レシピエントBxPC-3細胞におけるDNA編集を確かめた。
【図３】図3a〜d: BJ細胞からエキソソームを収集した。(図3a)Nanosightを用いてエキソソームを検証した。(図3b)エキソソームをさらに確認するために、エキソソームマーカーCD9、CD81、フロチリン、およびTSG101をウエスタンブロットによって検出した。(図3c)1E10 BJエキソソームを15ugのCRISPR-Cas9-GFPプラスミドと共に電気穿孔し、次いで、DNアーゼで処理したか、またはDNアーゼで処理しなかった。エキソソームDNAを抽出し、Cas9レベルをqPCRによって評価した。さらに、基準としてCRISPR-Cas9-GFPプラスミドを用いた絶対qPCRによってコピー数を計算した。(図3d)DNアーゼを用いた電気穿孔済みエキソソームを24時間処理してBJ細胞に導入した。Cas9レベルをDNAレベルとmRNAレベルの両方で検出した。
【図４】図4a〜b: リポフェクタミン2000によって、HEK293T細胞に、CRISPR-Cas9 Rab27b-1/2または空の対照プラスミドとともにパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトした。レンチウイルスを含有する培地を収集し、次いで、レンチウイルスを含有する培地を収集し、次いで、BxPC-3細胞に形質導入した。形質導入した細胞を0.4μg/mLピューロマイシンを用いてさらに選択し、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b細胞の単一クローンをつつき、増殖させ、ウエスタンブロットおよびT7/SURVEYORアッセイによって検証した。(図4a)全ての単一クローンにおいてRab27bおよびRab27aのタンパク質レベルを評価した。β-アクチンをローディング対照として使用した。代表的なウエスタンブロット結果を(図4a)に示した。(図4b)全てのクローンをさらに検証するためにT7/SURVEYORアッセイも使用した。代表的なウエスタンブロット結果を(図4b)に示した。さらなる実験に、BxPC-3/CRIPSR-Cas9-sgRab27b-1クローン3(C3)およびBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2クローン6(C6)を使用した。
【図５】図5a〜f: BxPC-3/CRISPR-Cas9ベクター対照安定細胞と単一クローンBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6を、0.4μg/mlピューロマイシンを含有する選択培地と共に培養した。(図5a)上述した細胞からDNAおよびRNAを抽出し、qPCRを用いてCas9レベルを求めた。(図5b)上述した細胞からエキソソームを収集し、その後にNanosight検証を行った。分泌されたエキソソームの数を分析し、Nanosightによって比較した。(図5c)エキソソームDNAおよびRNAを抽出し、qPCRを行って、エキソソームのCas9レベル、ならびにRab27b-1/2に対するsgRNAを検出した。(図5d)細胞とエキソソームの両方でCas9およびRab27bタンパク質レベルをウエスタンブロットで評価した。それぞれ、b-アクチンまたはCD9を対照として使用した。(図5e)および(図5f)T7/SURVEYORアッセイを使用して、2つの異なるプライマーを用いて細胞(図5e)とエキソソーム(図5f)の両方においてDNA編集を確かめた。
【図６】図6a〜b: (図6a)BxPC-3/CRISPR-Cas9ベクター対照安定細胞と単一クローンBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6から収集したエキソソームを溶解し、さらに、タンパク質含有量をBCAキットによって製造業者の説明に従って検出した。(図6b)100μLのBxPC-3ブランク、BxPC-3/CRISPR-Cas9空の対照、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3、およびBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6細胞を96ウェルプレートに1E5細胞/mlの濃度で播種した。細胞増殖を、MTTアッセイを用いて異なる時点で評価した。各時点でのバーは左から右にかけて「ブランク対照」、「CRISPR-Cas9ベクター対照」、「CRISPR-Cas9-sgRab27b-1-C3」、および「CRISPR-Cas9-sgRab27b-2-C6」を表している。
【図７】図7a〜g: (図7a)インビトロ転写sgRab27bを作製するために、最初に、sgRab27b-1/2をPCR増幅し、次いで、PCR産物を、Qiagen(登録商標)PCR精製キットを用いて精製した。sgRab27-1/2の精製PCR産物を、MEGAshortscript(商標)キットを用いて製造業者の説明に従ってインビトロ転写した。さらに、8M尿素ポリアクリルアミドゲルによってRNA品質を評価した。(図7b)インビトロ転写Cas9を作製するために、Cas9をPCR増幅し、さらに、Qiagen(登録商標)PCR精製キットを用いてPCR産物を精製した。精製Cas9 PCR産物を、mMESSAGE mMACHINE(登録商標) T7 Ultraキットを用いてインビトロ転写した。ホルムアルデヒドゲルを用いてCas9 RNA品質を検出した。(図7c〜e)HEK293T/CRISPR-Cas9ベクター対照細胞を、リポフェクタミン2000(図7c)、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬(図7d)、または電気穿孔済みエキソソームを用いて1μgのIVT-sgRab27b RNAで72時間処理した (図7e)。DNAを抽出し、T7/SURVEYORアッセイを行って遺伝子編集を調べた。HEK293T細胞(図7f)とBxPC-3細胞(図7g)に、リポフェクタミン2000、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いてCas9 mRNAをトランスフェクトしたか、またはCas9 mRNAと共に電気穿孔した1E9 MSCエキソソームで48時間処理した。ウエスタンブロットを行ってCas9タンパク質レベルを検出した。
【図８】図8a〜c: HEK293T/CRISPRCas9ベクター対照とBxPC-3/CRISPR-Cas9ベクター対照細胞からRNAを抽出した。相対Cas9発現レベル(図8a)と1/Ct値(図8b)をqPCRによって確かめた。(図8c)1μgのCas9 RNAを、HEK293T/CRISPRCas9ベクター対照とBxPC-3/CRISPR-Cas9ベクター対照細胞に由来するRNAと共に逆転写に使用した。qPCRを行って1/Ct値を検出した。
【図９】図9a〜g: Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いて、HEK293T細胞を10μgのプラスミド(CRISPR-Cas9-レンチ(lenti)-V2ベクター対照、CRISPR-Cas9-レンチ-V2-sgRab27b-1、CRISPR-Cas9-GFPベクター対照)で24時間毎に4回(1日目、2日目、3日目、4日目)処理した。細胞を5日目に収集した。DNA、RNA、およびタンパク質を抽出した。(図9a)5日目に撮影した写真は、対照としてCRISPR-Cas9-GFPベクター対照プラスミドを用いることでExo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を表していることが示された。(図9b)相対Cas9発現レベルと1/Ct値をqPCRによって確かめた。(図9c)ウエスタンブロットを用いてCas9タンパク質レベルを評価した。(図9d)T7/SURVEYORアッセイを行って、CRISPR-Cas9-レンチ-V2-sgRab27b-1プラスミドで処理した後にHEK293T細胞において遺伝子編集を調べた。同じ実験をBxPC-3細胞において行った。Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いて、BxPC-3細胞を10μgのプラスミド(CRISPRCas9-レンチ-V2ベクター対照、CRISPR-Cas9-レンチ-V2-sgRab27b-1)で24時間毎に4回(1日目、2日目、3日目、4日目)処理した。細胞を5日目に収集した。(図9e)相対Cas9発現レベルをqPCRによって確かめた。(図9f)ウエスタンブロットを用いてCas9タンパク質レベルを評価した。(図9g)T7/SURVEYORアッセイを行ってBxPC-3細胞において遺伝子編集を調べた。
【図１０】図10a〜h: KPC689細胞に、リポフェクタミン2000によって、5μgのプラスミド(レンチ-V2、GFP、ピューロマイシンバックボーンを有するCRISPR-Cas9-sgmKrasG12Dと、ベクター対照)を48時間トランスフェクトした。DNA、RNA、およびタンパク質を抽出した。(図10a)CRISPR-Cas9-GFPベクター対照プラスミドを対照として用いることでリポフェクタミンのトランスフェクション効率を表すために、48時間トランスフェクトした後に写真を撮影した。相対Cas9発現レベル(図10b)とmKrasG12Dレベル(図10c)をqPCRによって確かめた。(図10d)T7/SURVEYORアッセイを行って、リポフェクタミンでトランスフェクションした後のKPC689細胞における遺伝子編集を調べた。Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いて、KPC689細胞を、10μgのプラスミド(GFPバックボーンのあるCRISPR-Cas9-sgmKrasG12D、およびそのベクター対照)で24時間毎に3回(1日目、2日目、3日目)処理した。4日目に細胞を収集した。DNA、RNA、およびタンパク質を抽出した。(図10e)5日目に撮影した写真は、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を表していることが示された。相対Cas9発現レベル(図10f)とmKrasG12Dレベル(図10g)をqPCRによって確かめた。(図10h)T7/SURVEYOURアッセイを行って、CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12Dプラスミドで処理した後にKPC689細胞の遺伝子編集を調べた。
【図１１】図11a〜f: (図11a)および(図11b)リポフェクタミン2000によって、HEK293T細胞に、CRISPR-Cas9ドキシサイクリン誘導性プラスミドとともにパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトした。レンチウイルスを含有する培地を収集し、次いで、Panc1細胞に形質導入した。形質導入した細胞を1μg/mlピューロマイシンでさらに選択した。1μg/mlドキシサイクリンを用いてPanc1誘導性Cas9安定細胞を維持した。エキソソームを、ドキシサイクリンで処理したPanc1誘導性細胞またはドキシサイクリンで処理しなかったPanc1誘導性細胞から収集した。ウエスタンブロットを用いて、細胞(図11a)およびエキソソーム(図11b)におけるCas9タンパク質レベルを調べた。(図11c)リポフェクタミン、Fugene、またはExo-Fectによって、Panc1誘導性細胞を2μgのhKrasG12Dに対するIVT-sgRNA、1μgのhKrasG12Dプラスミドで72時間処理した。T7/SURVEYORアッセイを行ってPanc1誘導性細胞において遺伝子編集を調べた。(図11d)Panc1 Cas9安定細胞を、レンチウイルスに基づく方法を用いて樹立した。Cas9タンパク質レベルをウエスタンブロットによって確かめた(図11e)。Panc1細胞を、リポフェクタミン、Exo-Fect、または電気穿孔済みエキソソームを用いてレンチ-V2、GFP、もしくはピューロマイシンバックボーンのあるCRISPR-Cas9-sghKrasG12Dで処理した。Panc1 Cas9安定細胞を、リポフェクタミン、Exo-Fect、または電気穿孔済みエキソソームを用いてsghKrasG12Dプラスミドで処理した。T7/SURVEYORアッセイを行ってPanc1細胞およびPanc1 Cas9安定細胞において遺伝子編集を調べた。(図11f)Panc1 sghKrasG12D T1安定細胞を、レンチウイルスに基づく方法を用いて樹立した。Panc1 sghKrasG12D T1安定細胞に、GFPまたはピューロマイシンバックボーンを有する10μgまたは20μgのCas9プラスミドを24時間トランスフェクトした。T7/SURVEYORアッセイを行って、Panc1 sghKrasG12D T1安定細胞において遺伝子編集を調べた。
【図１２】図12a〜b: KPC689細胞をマウスの背中に皮下移植した。マウスを4つの群に分け、1群につき1匹または2匹のマウスにした。群1:1E9エキソソームおよび10μlのExo-Fectで処置した(n=1,K504);群2:10μgのCas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1プラスミドで処置した(n=1,K509);群3:1E9エキソソーム、10μgのCas9-GFP-ベクター対照プラスミド、および10μlのExo-Fectで処置した(n=2、#1: K501, #2: K510。K510を3日後に登録した。他の全てのマウスと比較した);群4:1E9エキソソーム、10μgのCas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1プラスミド、および10μlのExo-Fectで処置した(n=2, #1: K502, #2: K505)。2週間にわたって毎日、各群のマウスを静脈内(I.V.)注射および腫瘍内(I.T.)注射した。(図12a)腫瘍の長さ(a、mm)および幅(b、mm)ならびに体重(図12b)を測定した。腫瘍量(図12a)をV(mm3)=0.52*a*b^2として計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
がん細胞を標的にし、遺伝子編集プログラムを誘導してがん細胞ゲノムを変える能力を持った、様々なガイドRNA分子を利用する一体型CRISPR/Cas9システムを有するエキソソーム(例えば、iExosomeCRISPR/Cas9)が本明細書において提供される。エキソソームそれ自体において遺伝子編集が効率的に行われたことを示すために遺伝子編集アッセイが用いられており、そのため、KrasG12Dなどの変異を有するがん細胞を標的にする、変異した遺伝子を削除する、変異した遺伝子を野生型KRAS遺伝子と交換するか、または顕性変異遺伝子を除去し、正常遺伝子がその機能を引き継ぐことを目的としたiExosomeCRISPR/Cas9の効率と、その後の使用の迅速な検証方法となった。iExosomeCRISPR/Cas9を用いると、治療的利益を得るように、またはがん細胞と腫瘍の生物学を変えるように、開始、進行、および/または転移に寄与している、がん細胞および腫瘍全体のゲノムDNAの一部である任意の遺伝子を編集することができる。この技術を用いると、治療的利益を伴って、現在、がん関連遺伝子編集用であるCRISPR/Cas9技術のインビボ用途の不備が克服される。表面にCD47があるエキソソームを用いると、治療的利益のためにiExosomeCRISPR/Cas9を首尾良く腫瘍に送達することができる。
【００１６】
I.脂質ベースナノ粒子
一部の態様では、脂質ベースナノ粒子は、リポソーム、エキソソーム、脂質調製物、または別の脂質ベースナノ粒子、例えば、脂質ベース小胞(例えば、DOTAP:コレステロール小胞)である。脂質ベースナノ粒子は正に荷電してもよく、負に荷電していてもよく、中性でもよい。
【００１７】
A.リポソーム
「リポソーム」は、閉じた脂質二重層または凝集物を生じることで形成された様々な単一膜および多重膜の脂質ビヒクルを含む総称的な用語である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二重層膜がある小胞構造と、一般的に水性組成物を含む内部媒体を有すると特徴付けられることがある。本明細書において提供されるリポソームには、単層リポソーム、多重膜リポソーム、および多胞体リポソーム(multivesicular liposome)が含まれる。本明細書において提供されるリポソームは正に荷電してもよく、負に荷電していてもよく、中性に荷電していてもよい。ある特定の態様では、リポソームは電荷が中性である。
【００１８】
多重膜リポソームには、水性媒体によって分けられた複数の脂質層がある。リン脂質を含む脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、このようなリポソームは自発的に形成する。脂質成分は自己再編成した後に、閉じた構造が形成され、脂質二重層の間に水と、溶解した溶質が閉じ込められる。親油性分子または親油性領域を有する分子も脂質二重層に溶解するか、または脂質二重層と結合し得る。
【００１９】
特定の局面では、ポリペプチド、核酸、または低分子薬物は、例えば、リポソームの水性内部に入れられてもよく、リポソームの脂質二重層内に分散されてもよく、リポソームとポリペプチド/核酸の両方と結合する連結分子を介してリポソームに付着されてもよく、リポソームの中に閉じ込められてもよく、リポソームと複合体化されてもよい。
【００２０】
本態様に従って用いられるリポソームは、当業者に公知なように様々な方法によって作製することができる。例えば、リン脂質、例えば、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)をtert-ブタノールに溶解する。次いで、脂質をポリペプチド、核酸、および/または他の成分と混合する。Tween20が組成物の重量の約5％になるようにTween20を脂質混合物に添加する。tert-ブタノールの体積が少なくとも95％になるように、この混合物に過剰なtert-ブタノールを添加する。混合物をボルテックスし、ドライアイス/アセトン浴に入れて凍結し、一晩凍結乾燥する。凍結乾燥した調製物を-20℃で保管し、3ヶ月まで使用することができる。必要な時に、凍結乾燥したリポソームを0.9％食塩水に溶解して再構成する。
【００２１】
または、リポソームは、容器、例えば、ガラス梨型フラスコの中で溶媒に溶解して脂質を混合することによって調製することができる。容器の体積は、予想されるリポソーム懸濁液の体積の10倍でなければならない。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を陰圧下で約40℃で除去する。通常、溶媒は、望ましいリポソーム体積に応じて約5分〜2時間以内に除去される。この組成物をデシケーターに入れて減圧下でさらに乾燥することができる。乾燥した脂質は時間の経過につれて劣化する傾向があるので一般的には約1週間後に廃棄する。
【００２２】
乾燥した脂質は、脂質膜が全て再懸濁されるまで震盪することで、発熱物質を含まない滅菌水に約25〜50mMリン脂質で溶解して水和することができる。次いで、リポソーム水溶液をアリコートに分け、それぞれをバイアルに入れ、凍結乾燥し、減圧下で密封することができる。
【００２３】
上記のように調製した、乾燥した脂質または凍結乾燥したリポソームを脱水し、タンパク質またはペプチドの溶液に溶解して再構成し、適切な溶媒、例えば、DPBSを用いて適切な濃度まで希釈し得る。次いで、混合物をボルテックスミキサーに入れて勢いよく震盪させる。ホルモン、薬物、核酸構築物などを含むが、これに限定されない作用物質などの包まれていない、さらなる材料を遠心分離によって29,000×gで除去し、リポソームペレットを洗浄する。洗浄したリポソームを適切な総リン脂質濃度、例えば、約50〜200mMで再懸濁する。包まれた、さらなる材料または活性物質の量は標準的な方法に従って求めることができる。リポソーム調製物に包まれた、さらなる材料または活性物質の量を求めた後に、リポソームを適切な濃度で希釈し、使用するまで4℃で保管し得る。リポソームを含む薬学的組成物は、通常、薬学的に許容される滅菌した担体または希釈剤、例えば、水または食塩水を含む。
【００２４】
本態様と共に有用であり得る、さらなるリポソームには、カチオン性リポソーム、例えば、WO02/100435A1、米国特許第5,962,016号、米国特許出願第2004/0208921号、WO03/015757A1、WO04029213A2、米国特許第5,030,453号、および米国特許第6,680,068号に記載のカチオン性リポソームが含まれる。これらは全て、免責事項(disclaimer)なく、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２５】
このようなリポソームを調製する際に、本明細書に記載の、または当業者に公知の任意のプロトコールを使用することができる。リポソームを調製するさらなる非限定的な例は、米国特許第4,728,578号、同第4,728,575号、同第4,737,323号、同第4,533,254号、同第4,162,282号、同第4,310,505号、および同第4,921,706号;WO1986/000238およびWO1990/004943に記載され、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。
【００２６】
ある特定の態様では、脂質ベースナノ粒子は中性リポソーム(例えば、DOPCリポソーム)である。本明細書で使用する「中性リポソーム」または「非荷電リポソーム」は、本質的に中性の実効電荷(実質的に非荷電)を生じる1つまたは複数の脂質成分を有するリポソームと定義される。「本質的に中性」または「本質的に非荷電」とは、ある特定の集団(例えば、リポソームの集団)の中に、もしあれば、いくつかの脂質成分が、別の成分の反対の電荷によって相殺されない電荷を含む(すなわち、成分の10％未満、より好ましくは5％未満、最も好ましくは1％未満が、相殺されていない電荷を含む)ことを意味する。ある特定の態様では、中性リポソームは、大部分は、生理学的条件下(すなわち、約pH7)では、それ自体で中性の脂質および/またはリン脂質を含んでもよい。
【００２７】
本態様のリポソームおよび/または脂質ベースナノ粒子はリン脂質を含むことがある。ある特定の態様では、リポソームの作製において1種類のリン脂質が用いられる場合がある(例えば、中性リポソームを作製するために中性リン脂質、例えば、DOPCが用いられる場合がある)。他の態様では、リポソームを作製するために複数種類のリン脂質が用いられる場合がある。リン脂質は中性供給源または合成供給源に由来してもよい。リン脂質には、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンが含まれる。ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは生理学的条件下(すなわち、約pH7)では非荷電であるので、これらの化合物は中性リポソームを作製するのに特に有用な場合がある。ある特定の態様では、非荷電リポソームを生成するためにリン脂質DOPCが用いられる。ある特定の態様では、リン脂質でない脂質(例えば、コレステロール)が用いられる場合がある。
【００２８】
リン脂質にはグリセロリン脂質およびある特定のスフィンゴ脂質が含まれる。リン脂質には、ジオレオイルホスファチジルコリン(「DOPC」)、卵ホスファチジルコリン(「EPC」)、ジラウリロイルホスファチジルコリン(「DLPC」)、ジミリストイルホスファチジルコリン(「DMPC」)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(「DPPC」)、ジステアロイルホスファチジルコリン(「DSPC」)、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(「MPPC」)、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン(「PMPC」)、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン(「PSPC」)、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(「SPPC」)、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール(「DLPG」)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(「DPPG」)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(「DSPG」)、ジステアロイルスフィンゴミエリン(「DSSP」)、ジステアロイルホファチジルエタノールアミン(distearoylphophatidylethanolamine)(「DSPE」)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(「DOPG」)、ジミリストイルホスファチジン酸(「DMPA」)、ジパルミトイルホスファチジン酸(「DPPA」)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(「DMPE」)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(「DPPE」)、ジミリストイルホスファチジルセリン(「DMPS」)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(「DPPS」)、脳ホスファチジルセリン(「BPS」)、脳スフィンゴミエリン(「BSP」)、ジパルミトイルスフィンゴミエリン(「DPSP」)、ジミリストイルホスファチジルコリン(「DMPC」)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DAPC」)、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DBPC」)、1,2-ジエイコセノイル(dieicosenoyl)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DEPC」)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(「DOPE」)、パルミトイルオエオイル(palmitoyloeoyl)ホスファチジルコリン(「POPC」)、パルミトイルオエオイルホスファチジルエタノールアミン(「POPE」)、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これに限定されない。
【００２９】
B.エキソソーム
「細胞外小胞」および「EV」は、クラスとして、エキソソーム、エキソソーム様小胞、エクトソーム(原形質膜から直接生じた小胞の出芽に起因する)、微粒子、マイクロベシクル、分泌マイクロベシクル(shedding microvesicle)(SMV)、ナノ粒子を含み、(大きな)アポトーシスブレブ(apoptotic bleb)もしくはアポトーシス小体(細胞死に起因する)または膜粒子でさえも含む、細胞に由来し、かつ細胞から分泌されたマイクロベシクルである。
【００３０】
本明細書で使用する「マイクロベシクル」および「エキソソーム」という用語は、直径(または粒子がスフェロイドでない場合は最大の寸法)が約10nm〜約5000nm、より典型的には30nm〜1000nm、最も典型的には約50nm〜750nmであり、エキソソームの膜の少なくとも一部が細胞から直接得られている膜状粒子を指す。最も一般的には、エキソソームのサイズ(平均直径)はドナー細胞のサイズの5％までである。従って、特に意図されるエキソソームには、細胞から脱落したエキソソームが含まれる。
【００３１】
エキソソームは、例えば、体液などの任意の適切な試料タイプの中に検出されてもよく、任意の適切な試料タイプから単離されてもよい。本明細書で使用する「単離された」という用語は、天然環境から分離することを指し、少なくとも部分的な精製を含むことが意図され、大幅な精製を含む場合がある。本明細書で使用する「試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を指す。前記試料は、検出または単離に適したエキソソームを含む任意の試料でよい。試料の供給源には、血液、骨髄、胸膜液、腹水、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、関節液、母乳、汗、涙、滑液、および気管支洗浄液が含まれる。一局面では、前記試料は、例えば、全血またはその任意の画分もしくは成分を含む、血液試料である。本発明と使用するのに適した血液試料は、血球またはその成分を含む公知の任意の供給源、例えば、静脈、動脈、末梢、組織、帯(cord)などから抽出することができる。例えば、試料は、周知の、かつ日常的な臨床方法(例えば、全血を採取および処理するための手順)を用いて入手および処理することができる。一局面では、例示的な試料は、がんがある対象から採取された末梢血でもよい。
【００３２】
エキソソームはまた、組織試料、例えば、手術試料、生検試料、組織、糞便、および培養細胞からも単離されてよい。組織供給源からエキソソームを単離する時に、単一細胞懸濁液を入手し、その後に細胞を溶解してエキソソームを放出するために組織をホモジナイズすることが必要な場合がある。組織試料からエキソソームを単離する時に、エキソソームを破壊しないホモジナイゼーションおよび溶解の手順を選択することが重要である。本明細書において意図されるエキソソームは、好ましくは、生理学的に許容される溶液、例えば、緩衝食塩水、増殖培地、様々な水性媒体などに溶解した体液から単離される。
【００３３】
エキソソームは、新鮮に収集された試料から単離されてもよく、凍結または冷蔵されて保管されていた試料から単離されてもよい。一部の態様では、エキソソームは細胞培養培地から単離されてもよい。必要ではないが、試料から破片を除去するために、流体試料が、体積排除(volume-excluding)ポリマーを用いた沈殿前に清澄化されれば、さらに高純度のエキソソームが得られる場合がある。清澄化方法には、遠心分離、超遠心、濾過、または限外濾過が含まれる。最も典型的には、エキソソームは、当技術分野において周知の非常に多くの方法によって単離することができる。好ましい方法の1つは、体液または細胞培養上清からの分画遠心である。エキソソーム単離の例示的な方法は、(Losche et al., 2004; Mesri and Altieri, 1998; Morel et al., 2004)に記載されている。または、エキソソームはまた、(Combes et al., 1997)に記載のようにフローサイトメトリーでも単離されることがある。
【００３４】
エキソソームを単離するための一般に認められているプロトコールの1つには、比較的低い密度のエキソソームを浮かべるためにスクロース密度勾配またはスクロースクッションと組み合わされることが多い超遠心が含まれる。連続分画遠心によるエキソソームの単離は、他のマイクロベシクルまたは巨大分子複合体とサイズ分布が重複する可能性があるために複雑になる。さらに、遠心分離は、サイズに基づいて小胞を分離する不十分な手段を提供することがある。しかしながら、連続遠心分離がスクロース勾配超遠心と組み合わされるとエキソソームを高度に濃縮することができる。
【００３５】
超遠心経路に代わるものを用いるサイズに基づいたエキソソームの単離が別の選択肢である。超遠心よりも時間がかからず、特別な装置を必要としない、限外濾過手順を用いた首尾良いエキソソーム精製が報告されている。同様に、流体を動かす陽圧を用いて、あるマイクロフィルターで細胞、血小板、および細胞破片を除去し、第2のマイクロフィルターに30nmよりも大きな小胞を捕獲する市販のキット(EXOMIR(商標), Bioo Scientific)を利用することができる。しかしながら、このプロセスの場合、エキソソームは回収されず、そのRNA内容物は、第2のマイクロフィルターに捕らえた材料から直接抽出され、次いで、PCR分析に使用することができる。HPLCベースのプロトコールを用いた場合、これらのプロセスは専用の装置を必要とし、スケールアップすることが難しいが、潜在的には高純度のエキソソームを得ることができるだろう。重大な問題は、血液と細胞培養培地が両方とも、エキソソームと同じサイズ範囲の多数のナノ粒子(一部は非小胞)を含有することである。例えば、エキソソームではなく細胞外タンパク質複合体の中に、いくらかのmiRNAが含まれることがある。しかしながら、プロテアーゼ(例えば、プロテイナーゼK)を用いた処理を行って、「エキソソーム外(extraexosomal)」タンパク質による、あらゆる汚染を排除することができる。
【００３６】
別の態様では、がん細胞由来エキソソームが、試料のエキソソームを濃縮するのによく用いられる技法、例えば、免疫特異的相互作用が関与する技法(例えば、免疫磁気的捕獲)によって捕獲される場合がある。免疫磁気的捕獲は免疫磁気的細胞分離とも知られ、典型的には、ある特定の細胞タイプの表面に見出されるタンパク質に対して作られた抗体を小さな常磁性ビーズに付着することを伴う。抗体でコーティングしたビーズを血液などの試料と混合すると、ビーズは特定の細胞に付着し、取り囲む。次いで、試料を強力な磁場に配置すると、ビーズが片側でペレット化する。血液を除去した後に、捕獲した細胞はビーズと一緒に保持される。この一般的方法の多くのバリエーションが当技術分野において周知であり、エキソソームを単離するための使用に適している。一例では、エキソソームは磁気ビーズ(例えば、アルデヒド/硫酸塩ビーズ)に付着さられることがあり、次いで、ビーズに付着されたエキソソームの表面上のエピトープを認識させるために、混合物に抗体が添加される。がん細胞由来エキソソーム上に見出されることが分かっている例示的なタンパク質には、ATP-binding cassette sub-family A member 6(ABCA6)、テトラスパニン-4(TSPAN4)、SLIT and NTRK-like protein 4(SLITRK4)、putative protocadherin β-18(PCDHB18)、骨髄性細胞表面抗原CD33(CD33)、およびグリピカン-1(GPC1)が含まれる。がん細胞由来エキソソームは、例えば、これらのタンパク質のうちの1つまたは複数に対する抗体またはアプタマーを用いて単離され得る。
【００３７】
本明細書で使用する分析は、エキソソームの直接的または間接的な視覚化を可能にする任意の方法を含み、インビボでもエクスビボでもよい。例えば、分析には、固体支持体に結合したエキソソームの顕微鏡または細胞数測定によるエクスビボ検出および視覚化、フローサイトメトリー、蛍光画像化などが含まれ得るが、これに限定されない。例示的な局面では、がん細胞由来エキソソームは、ATP-binding cassette sub-family A member 6(ABCA6)、テトラスパニン-4(TSPAN4)、SLIT and NTRK-like protein 4(SLITRK4)、putative protocadherin β-18(PCDHB18)、骨髄性細胞表面抗原CD33(CD33)、グリピカン-1(GPC1)、ヒストンH2A 2型-A(HIST1H2AA)、ヒストンH2A 1-A型(HIST1H1AA)、ヒストンH3.3(H3F3A)、ヒストンH3.1(HIST1H3A)、ジンクフィンガータンパク質37ホモログ(ZFP37)、ラミニンサブユニットβ-1(LAMB1)、Tubulointerstitial nephritis antigen-like(TINAGL1)、ペルオキシレデオキシン(Peroxiredeoxin)-4(PRDX4)、コラーゲン α-2(IV)鎖(COL4A2)、推定タンパク質C3P1(C3P1)、ヘミセンチン(Hemicentin)-1 (HMCN1)、Putative rhophilin-2-like protein(RHPN2P1)、Ankyrin repeat domain-containing protein 62(ANKRD62)、Tripartite motif-containing protein 42(TRIM42)、Junction plakoglobin(JUP)、チューブリンβ-2B鎖(TUBB2B)、エンドリボヌクレアーゼダイサー(DICER1)、E3ユビキチン-タンパク質リガーゼTRIM71(TRIM71)、Katanin p60 ATPase-containing subunit A-like 2(KATNAL2)、タンパク質S100-A6(S100A6)、5’-nucleotidase domain-containing protein 3(NT5DC3)、バリン-tRNAリガーゼ(VARS)、カズリン(Kazrin)(KAZN)、ELAV-like protein 4(ELAVL4)、リングフィンガータンパク質166(RNF166)、FERM and PDZ domain-containing protein 1(FRMPD1)、78 kDa glucose-regulated protein(HSPA5)、Trafficking protein particle complex subunit 6A(TRAPPC6A)、スクアレンモノオキシゲナーゼ(SQLE)、Tumor susceptibility gene 101 protein(TSG101)、Vacuolar protein sorting 28 homolog(VPS28)、Prostaglandin F2 receptor negative regulator(PTGFRN)、Isobutyryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial(ACAD8)、26S protease regulatory subunit 6B(PSMC4)、伸長因子1-γ(EEF1G)、タイチン(TTN)、チロシン-タンパク質ホスファターゼ13型(PTPN13)、トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI1)、もしくはカルボキシペプチダーゼE(CPE)の1つもしくは複数に対して作られた抗体を用いて検出され、その後に、固体支持体に結合され得る、および/または顕微鏡もしくは細胞数測定による検出を用いて視覚化され得る。
【００３８】
細胞において発現している全てのタンパク質が、その細胞が分泌したエキソソームに見出されるとは限らないことに留意しなければならない。例えば、カルネキシン、GM130、およびLAMP-2は全て、MCF-7細胞において発現しているタンパク質であるが、MCF-7細胞が分泌したエキソソームには見出されない(Baietti et al., 2012)。別の例として、ある研究から、190/190人の膵管腺がん患者に、健常対照より高いレベルのGPC1+エキソソームがあることが見出された(Melo et al., 2015。その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。注目すべきことに、平均して健常対照の2.3％にしかGPC1+エキソソームがなかった。
【００３９】
1.細胞培養物からエキソソームを収集するための例示的なプロトコール
翌日に細胞が約70％コンフルエントになるように、1日目に、10％FBSを含有する培地が入っているT225フラスコに、十分な数の細胞(例えば、約500万個の細胞)を播種する。2日目に、細胞上の培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄し、次いで、25〜30mLの基本培地(すなわち、PenStrepもFBSも無い)を細胞に添加する。細胞を24〜48時間インキュベートする。48時間のインキュベーションが好ましいが、細胞株の中には無血清培地に対して感受性が高いものもあり、そのため、インキュベーション時間を24時間に短縮しなければならない。FBSは、NanoSight結果を強くゆがめるエキソソームを含有することに留意のこと。
【００４０】
3/4日目に、培地を収集し、死細胞と大きな破片をペレット化するために800×gで室温において5分間遠心分離する。上清を新しいコニカルチューブに移し、他の大きな破片と大きな小胞を除去するために2000×gで10分間、培地を再遠心分離する。培地を0.2μmフィルターに通し、次いで、35mL/チューブを用いて超遠心チューブ(例えば、25×89mm Beckman Ultra-Clear)にアリコートする。1チューブあたりの培地の体積は35mL未満であれば、35mLになるようにチューブの残りをPBSで満たす。SW 32 Tiローター(k-factor 266.7, RCF max 133,907)を用いて、培地を28,000rpmで4℃において2〜4時間超遠心する。およそ1インチの液体が残るまで、上清を注意深く吸引する。チューブを傾け、残りの培地を、ゆっくりと吸引ピペットに入れる。所望であれば、エキソソームペレットをPBSで再懸濁し、エキソソーム集団をさらに精製するために28,000rpmの超遠心を1〜2時間繰り返すことができる。
【００４１】
最後に、エキソソームペレットを210μLのPBSに再懸濁する。各試料について複数の超遠心チューブがあれば、同じ210μL PBSを用いて、それぞれのエキソソームペレットを連続して再懸濁する。各試料について、10μLを採取し、ナノ粒子追跡分析に使用するために990μLのH2Oに添加する。残りの200μLエキソソーム含有懸濁液を下流プロセスに使用するか、または-80℃ですぐに保管する。
【００４２】
2.血清試料からエキソソームを抽出するための例示的なプロトコール
最初に、血清試料を氷上で解凍する。次いで、250μLの無細胞血清試料を11mLのPBSで希釈する。0.2μm孔フィルターで濾過する。希釈した試料を150,000×gで4℃において一晩超遠心する。翌日、上清を注意深く捨て、11mL PBSでエキソソームペレットを洗浄する。150,000×gで4℃において2時間、2回目の超遠心を行う。最後に、上清を注意深く捨て、分析のために100μL PBSにエキソソームペレットを再懸濁する。
【００４３】
C.エキソソームおよびリポソームを電気穿孔するための例示的なプロトコール
1×108個のエキソソーム(NanoSight分析によって測定した)または100nmリポソーム(例えば、Encapsula Nano Sciencesから購入した)と、1μgのsiRNA(Qiagen)またはshRNAを400μLの電気穿孔緩衝液(1.15mMリン酸カリウム, pH7.2、25mM塩化カリウム、21％Optiprep)に入れて混合する。4mmキュベットを用いてエキソソームまたはリポソームを電気穿孔する(例えば、Alvarez-Erviti et al., 2011; El-Andaloussi et al., 2012を参照されたい)。電気穿孔後に、エキソソームまたはリポソームをプロテアーゼフリーRNアーゼで処理し、その後に10×濃縮RNアーゼ阻害剤を添加する。最後に、前記のように超遠心法下でエキソソームまたはリポソームをPBSで洗浄する。
【００４４】
II. CRISPR/Casシステム
一般的に、「CRISPRシステム」とは、Cas遺伝子をコードする配列を含むCRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現または活性誘導に関与する転写物および他のエレメント、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、tracrRNAもしくは活性のある部分的tracrRNA)、tracr-mate配列(内因性CRISPRシステムの文脈では「ダイレクトリピート」およびtracrRNAによってプロセシングされた部分的ダイレクトリピートを含む)、ガイド配列(内因性CRISPRシステムの文脈では「スペーサー」とも呼ばれる)、ならびに/またはCRISPR遺伝子座に由来する他の配列および転写物を総称して指す。
【００４５】
CRISPR/CasヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、DNAに配列特異的に結合するノンコーディングRNA分子(ガイド)RNAと、ヌクレアーゼ機能(例えば、2つのヌクレアーゼドメイン)を有するCasタンパク質(例えば、Cas9)を含んでもよい。CRISPRシステムの1つまたは複数のエレメントはI型、II型、またはIII型CRISPRシステムに由来してもよく、例えば、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)などの内因性CRISPRシステムを含む特定の生物に由来してもよい。
【００４６】
一部の局面では、CasヌクレアーゼとgRNA(標的配列に特異的なcrRNAと、ある決まったtracrRNAの融合体を含む)が細胞に導入される。一般的に、gRNAの5'末端における標的部位は、相補的塩基対合を用いて、標的部位、例えば、遺伝子をCasヌクレアーゼの標的にする。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列のすぐ5'側、例えば、典型的にはNGGまたはNAGのすぐ5'側のその場所に基づいて選択され得る。この点に関して、gRNAは、標的DNA配列に対応するようにガイドRNAの最初の20、19、18、17、16、15、14、14、12、11、または10ヌクレオチドを改変することによって望ましい配列を標的にする。一般的に、CRISPRシステムは、標的配列部位にCRISPR複合体形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」とは、一般的に、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を指し、この場合、標的配列とガイド配列の間でハイブリダイズすることでCRISPR複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性が必ずしも必要とされるわけではない。
【００４７】
CRISPRシステムは標的部位に二本鎖切断(DSB)を誘導し、その後に、本明細書において開示されるように破壊を誘導することができる。他の態様では、「ニッカーゼ」だと考えられるCas9変種は、1本鎖の標的部位に切れ目を入れるのに用いられる。対になるニッカーゼを、例えば、特異性を改善するために使用することができ、ニックが同時に導入されて5'オーバーハングが導入されるように、それぞれのニッカーゼは、配列を標的とする一対の異なるgRNAによって向けられる。他の態様では、遺伝子発現に影響を及ぼすために、触媒的に不活性なCas9が、転写リプレッサーまたはアクチベーターなどの異種エフェクタードメインと融合される。
【００４８】
標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAポリヌクレオチドを含んでよい。標的配列は細胞の核または細胞質に、例えば、細胞の細胞小器官の中にあってもよい。一般的に、標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに用いられ得る配列またはテンプレートは「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ばれる。一部の局面では、外因性テンプレートポリヌクレオチドが編集テンプレートと呼ばれることがある。一部の局面では、組換えは相同組換えである。
【００４９】
典型的に、内因性CRISPRシステムの文脈では、CRISPR複合体(標的配列にハイブリダイズし、1つまたは複数のCasタンパク質と複合体化したガイド配列を含む)が形成すると、標的配列の中で、または標的配列の付近で(例えば、標的配列から1塩基対、2塩基対、3塩基対、4塩基対、5塩基対、6塩基対、7塩基対、8塩基対、9塩基対、10塩基対、20塩基対、50塩基対、またはそれより多い塩基対の範囲内で)一方の鎖または両方の鎖が切断される。tracr配列はまた野生型tracr配列の全てもしくは一部(例えば、野生型tracr配列の約20、約26、約32、約45、約48、約54、約63、約67、約85、もしくはそれより多いヌクレオチド、または約20超、約26超、約32超、約45超、約48超、約54超、約63超、約67超、約85超、もしくはそれより多いヌクレオチド)を含んでもよく、あるいはそれからなってもよく、例えば、tracr配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に機能的に連結されたtracr mate配列の全てまたは一部にハイブリダイズすることでCRISPR複合体の一部になり得る。tracr配列は、ハイブリダイズし、CRISPR複合体の形成に関与するのに十分な、tracr mate配列に対する相補性、例えば、最適にアラインメントされた時に、tracr mate配列の長さに沿って少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列相補性を有する。
【００５０】
CRISPRシステムの1つまたは複数のエレメントを発現させることで1つまたは複数の標的部位にCRISPR複合体が形成されるように、CRISPRシステムの前記エレメントを発現させる1つまたは複数のベクターを細胞に導入することができる。成分はタンパク質および/またはRNAとしても細胞に送達することができる。例えば、Cas酵素、tracr-mate配列と連結したガイド配列、およびtracr配列はそれぞれが、別々のベクター上で別々の調節エレメントに機能的に連結することができる。または、1つのベクターの中で、同じ、または異なる調節エレメントから発現されるエレメントの2つ以上が、第1のベクターに含まれないCRISPRシステムの任意の成分を供給する1つまたは複数のさらなるベクターと組み合わされてもよい。このベクターは1つまたは複数の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列(「クローニング部位」とも呼ばれる)を含んでもよい。一部の態様では、1つまたは複数の挿入部位は、1つまたは複数のベクターの1つまたは複数の配列エレメントの上流および/または下流に位置する。複数の異なるガイド配列が用いられる時には、1種類の発現構築物が、細胞内の複数の異なる対応する標的配列をCRISPR活性の標的にするために用いられてもよい。
【００５１】
ベクターは、CRISPR酵素、例えば、Casタンパク質をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含んでもよい。Casタンパク質の非限定的な例には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1およびCsx12とも知られる)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、そのホモログ、またはその改変バージョンが含まれる。これらの酵素は公知である。例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9タンパク質のアミノ酸配列はSwissProtデータベースにおいてアクセッション番号Q99ZW2で見られるかもしれない。
【００５２】
CRISPR酵素はCas9(例えば、S.ピオゲネスまたはS.ニューモニア(S.pneumonia)に由来する)でもよい。CRISPR酵素は、標的配列の場所で、例えば、標的配列内で、および/または標的配列の相補鎖内で一方の鎖または両方の鎖の切断を誘導することができる。このベクターは、変異したCRISPR酵素から、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方の鎖または両方の鎖を切断する能力が無くなるように、対応する野生型酵素に対して変異したCRISPR酵素をコードすることができる。例えば、S.ピオゲネスに由来するCas9のRuvC I触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換(D10A)は、両方の鎖を切断するヌクレアーゼに由来するCas9をニッカーゼ(1本の鎖を切断する)に変換する。一部の態様では、Cas9ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、それぞれ、DNA標的のセンス鎖とアンチセンス鎖を標的とする2つのガイド配列と組み合わせて用いられることがある。この組み合わせを用いると、両方の鎖に切れ目を入れ、NHEJまたはHDRを誘導するのに使用することが可能になる。
【００５３】
一部の態様では、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞において発現するようにコドン最適化される。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含むが、これに限定されない、ある特定の生物、例えば、哺乳動物の真核細胞でもよく、それに由来してもよい。一般的に、コドン最適化は、関心対象の宿主細胞における発現を強化するために、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも1つのコドンを、その宿主細胞の遺伝子において頻繁に、または最も頻繁に用いられるコドンと交換することによって核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、ある特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特有のバイアスを示す。コドンバイアス(生物間のコドン使用頻度の差)はメッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関関係があることが多く、その結果として、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率は、特に、コドンが翻訳される性質と、特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられている。ある細胞では、選択されたtRNAの数が優勢なことは、そのコドンが、ペプチド合成において最も頻繁に用いられるコドンであることを反映している。従って、ある特定の生物において最適に遺伝子発現するように、コドン最適化に基づいて遺伝子を合わせることができる。
【００５４】
一般的に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、CRISPR複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の態様では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて適切にアラインメントされた時には、約50％、約60％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約97.5％、約99％、もしくはそれより大きいか、または約50％超、約60％超、約75％超、約80％超、約85％超、約90％超、約95％超、約97.5％超、約99％超、もしくはそれより大きい。
【００５５】
最適アラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを用いて確かめることができる。この非限定的な例には、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies、ELAND(Illumina, San Diego, Calif.)、SOAP(soap.genomics.org.cnから入手可能)、およびMaq (maq.sourceforge.netから入手可能)が含まれる。
【００５６】
CRISPR酵素は、1種類または複数種類の異種タンパク質ドメインを含む、融合タンパク質の一部でもよい。CRISPR酵素融合タンパク質は、任意の2つのドメイン間に任意のさらなるタンパク質配列、任意で、リンカー配列を含んでもよい。CRISPR酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性、および核酸結合活性の1つまたは複数を有するタンパク質ドメインが含まれるが、それに限定されるわけではない。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザ血球凝集素(HA)タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン(Trx)タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)βガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)を含む自己蛍光(autofluorescent)タンパク質が含まれるが、これに限定されない。CRISPR酵素は、DNA分子に結合するか、またはマルトース結合タンパク質(MBP)、S-タグ、LexA DNA結合ドメイン(DBD)融合、GAL4A DNA結合ドメイン融合、および単純ヘルペスウイルス(HSV)BP16タンパク質融合を含むが、これに限定されない他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質断片をコードする遺伝子配列と融合されてもよい。CRISPR酵素を含む融合タンパク質の一部となり得る、さらなるドメインは、参照により本明細書に組み入れられるUS20110059502に記載されている。
【００５７】
III. CRISPRシステムの送達
一部の局面では、CRISPR-Cas9標的分子、複合体、または組み合わせをコードする核酸が細胞に投与または導入される。一部の局面では、このシステムは細胞に既に存在してもよく、細胞のエキソソーム内に存在してもよい。この核酸は、典型的には、ウイルス発現ベクターなどの発現ベクターの形で投与される。一部の局面では、発現ベクターはレトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、DNAプラスミド発現ベクター、またはAAV発現ベクターである。一部の局面では、破壊分子または複合体、例えば、DNA標的分子をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドが細胞に送達される。一部の局面では、送達は1つまたは複数のベクターの送達によるものであり、その1つもしくは複数の転写物、および/またはそれから転写された1つもしくは複数のタンパク質が細胞に送達される。
【００５８】
一部の態様では、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入した結果として細胞中でインサイチューで合成される。一部の局面では、前記ポリペプチドは細胞外で産生され、次いで、細胞に導入することができる。ポリヌクレオチド構築物を動物細胞に導入するための方法は公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞ゲノムに組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞ゲノムに組み込まれない一過的形質転換法、およびウイルスを介した方法を含む。一部の態様では、前記ポリペプチドは、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどによって細胞に導入されてもよい。例えば、一部の局面では、一過的な形質転換法は、マイクロインジェクション、電気穿孔、またはパーティクルボンバードメントを含む。一部の態様では、前記ポリペプチドは、細胞において発現されることを考慮してベクター、さらに詳細にはプラスミドまたはウイルスに含まれてもよい。
【００５９】
一部の態様では、ウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を用いて哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入することができる。このような方法を用いてCRISPRシステム成分をコードする核酸を培養中の細胞、または宿主生物内の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、RNA(例えば、本明細書に記載のベクターの転写物)、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、細胞に送達された後にエピソームゲノムまたは一体化したゲノムとなるDNAウイルスおよびRNAウイルスが含まれる。遺伝子療法手順の総説については、Anderson, 1992; Nabel & Feigner, 1993; Mitani & Caskey, 1993; Dillon, 1993; Miller, 1992; Van Brunt, 1988; Vigne, 1995; Kremer & Perricaudet, 1995; Haddada et al., 1995;およびYu et al., 1994を参照されたい。
【００６０】
核酸の非ウイルス送達方法には、エキソソーム、リポフェクション、ヌクレオフェクション(nucleofection)、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム(immunoliposome)、ポリカチオンまたは脂質:核酸結合体、裸のDNA、人工ビリオン、および作用物質により強化されたDNA取り込みが含まれる。リポフェクションは(例えば、米国特許第5,049,386号、同第4,946,787号;および同第4,897,355号)に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質には、Feigner, WO91117424; WO91116024のものが含まれる。送達は細胞への送達(例えば、インビトロまたはエクスビボ投与)でもよく、標的組織への送達(例えば、インビボ投与)でもよい。
【００６１】
一部の態様では、送達は、核酸送達のためにRNAウイルスまたはDNAウイルスに基づくシステムの使用を介した送達である。ウイルスベクターは一部の局面では患者に直接送達されてもよく(インビボ)、インビトロまたはエクスビボで細胞を処理し、次いで、患者に投与するのに使用することができる。ウイルスに基づくシステムは一部の態様では、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含む。
【００６２】
一部の局面では、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)を含む自己蛍光タンパク質を含むが、これに限定されないレポーター遺伝子が、遺伝子産物の発現の変化または改変を測定するためのマーカーとして役立つ遺伝子産物をコードするように細胞に導入されることがある。さらなる態様では、遺伝子産物をコードするDNA分子はベクターを介して細胞に導入されることがある。一部の態様では、遺伝子産物はルシフェラーゼである。
【００６３】
当業者により理解されるように、カーゴ(cargo)を詰め込む前またはカーゴを詰め込んだ後に、本エキソソームは、カーゴ送達用のビヒクルとして、その有用性を高めるためにターゲティング部分を含めることによってさら改変されてもよい。この点について、エキソソームは、組織タイプを特異的に特定の細胞の標的にする実体を組み込むように操作されてもよい。この標的特異的実体、例えば、標的細胞上または標的組織上の受容体またはリガンドに対して親和性を有するペプチドがエキソソーム膜の内部に組み込まれてもよく、例えば、当技術分野において十分に確立した方法を用いてエキソソーム膜マーカーと融合することによってエキソソーム膜の内部に組み込まれてもよい。
【００６４】
IV.疾患の処置
本発明のある特定の局面は、CRISPRシステムなどの遺伝子編集システムを発現するか、または含むエキソソームを用いて患者を処置することを提供する。CRISPRシステムは患者のがん細胞の中で遺伝子編集を誘導する可能性がある。エキソソームはmRNA転写とタンパク質翻訳を完了するのに必要な機構を備えることが知られているので(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO2015/085096を参照されたい)、治療用タンパク質をコードするmRNAまたはDNA核酸がトランスフェクションによってエキソソームに導入されてもよい。または、治療用タンパク質そのものが電気穿孔によってエキソソームに導入されてもよく、リポソームに直接組み込まれてもよい。
【００６５】
本明細書で使用する「対象」とは、本方法が行われる任意の個体または患者を指す。一般的に対象はヒトであるが、当業者に理解されるように、対象は動物でもよい。従って、哺乳動物、例えば、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む)、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜(ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む)、および霊長類(サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む)を含む他の動物が対象の定義の中に含まれる。
【００６６】
「処置」および「処置する」とは、対象への治療用物質の投与もしくは適用、または疾患もしくは健康に関連する状態の治療的利益を得ることを目的とした対象への手技もしくはモダリティの遂行を指す。例えば、処置は、CRISPRシステムを含むエキソソーム、化学療法、免疫療法、または放射線療法の実施、外科手術の遂行、またはその任意の組み合わせを含んでもよい。
【００６７】
本明細書で使用する「治療的利益」または「治療に有効な」という用語は、この状態の医学的処置に関して対象の健康を増進する、または向上させる、どんなものも指す。この用語には、疾患の徴候または症状の頻度または重篤度の低下が含まれるが、これに限定されない。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍の侵襲性の低下、がんの増殖速度の低下、または転移の阻止を含んでもよい。がんの処置はまた、がんのある対象の生存期間の延長も指すことがある。
【００６８】
本明細書で使用する「がん」という用語は、固形腫瘍、転移がん、または非転移がんを説明するために用いられることがある。ある特定の態様では、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮において生じることがある。
【００６９】
がんは、具体的には、以下の組織学的タイプのがん:新生物、悪性;がん腫;がん腫、未分化;巨細胞および紡錘体細胞のがん腫;小細胞がん;乳頭状がん;扁平上皮がん;リンパ上皮がん;基底細胞がん;石灰化上皮腫(pilomatrix carcinoma);移行上皮がん;乳頭状移行上皮がん;腺がん;ガストリノーマ、悪性;胆管がん;肝細胞がん;混合型肝細胞がんおよび胆管がん;小柱腺がん(trabecular adenocarcinoma);腺様嚢胞がん;腺腫性ポリープ内腺がん;腺がん、家族性大腸ポリポーシス;固形がん;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支肺胞(branchiolo-alveolar)腺がん;乳頭状腺がん;色素嫌性がん;好酸性がん(acidophil carcinoma);好酸性腺がん(oxyphilic adenocarcinoma);塩基好性がん;明細胞腺がん;顆粒細胞がん;濾胞腺がん;乳頭状腺がんおよび濾胞腺がん;非被包性硬化性がん(nonencapsulating sclerosing carcinoma);副腎皮質がん;類内膜がん(endometroid carcinoma);皮膚付属器がん;アポクリン腺がん;皮脂腺がん;耳道腺がん(ceruminous adenocarcinoma);粘表皮がん;嚢胞腺がん;乳頭状嚢胞腺がん;乳頭状漿液嚢胞腺がん;粘液性嚢胞腺がん;粘液性腺がん;印環細胞がん;浸潤性導管がん;髄様がん;小葉がん;炎症性がん;パジェット病、乳房;腺房細胞がん;腺扁平上皮がん;扁平上皮化生を伴う腺がん;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫、悪性;莢膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;アンドロブラストーマ、悪性;セルトリ細胞腫;ライディッヒ細胞腫、悪性;脂質細胞腫瘍(lipid cell tumor)、悪性;パラガングリオーマ、悪性;乳房外パラガングリオーマ(extra-mammary paraganglioma)、悪性;クロム親和細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;無色素性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑中の悪性黒色腫(malignant melanoma in giant pigmented nevus);類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣型横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミューラー混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;がん肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胚性がん腫;テラトーマ、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛がん;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル芽細胞歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星状細胞腫;星状芽細胞腫;グリア芽細胞腫;乏突起神経膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;未分化神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫瘍、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病(hodgkin's disease);ホジキン病(hodgkin's);側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、びまん性大細胞性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;明記された他の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;マスト細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;プラズマ細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;マスト細胞白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;および毛様細胞性白血病でもよいが、これらに限定されない。それにもかかわらず、本��明はまた、非がん疾患(例えば、真菌感染、細菌感染、ウイルス感染、神経変性疾患、および/または遺伝性障害)を処置するのにも用いられ得る。
【００７０】
「接触された」および「曝露された」という用語は細胞に適用された時には、治療用物質が標的細胞に送達されるか、または標的細胞とじかに並べて配置されるプロセスを説明するために本明細書において用いられる。細胞を死滅させるために、例えば、1種類または複数種類の作用物質が、細胞を死滅させるか、または細胞の分裂を阻止するのに有効な量で細胞に送達される。
【００７１】
患者の有効な応答または処置に対する患者の「応答性」とは、疾患もしくは障害のリスクがある、または疾患もしくは障害に罹患している患者に与えられる臨床的利益または治療的利益を指す。このような利益は、細胞応答または生物学的応答、完全応答、部分応答、安定病態(進行も再発も無い)、または後で再発する応答を含んでもよい。例えば、有効な応答は、がんと診断された患者における腫瘍サイズの縮小または無増悪生存期間でもよい。
【００７２】
治療アウトカムは予測およびモニタリングすることがでる、ならびに/またはこのような処置から利益を得る患者は、本明細書に記載の方法によって特定もしくは選択することができる。
【００７３】
新生物状態の処置に関して、新生物状態のステージに応じて、新生物状態の処置は、以下の療法:新生物組織を除去するための外科手術、放射線療法、および化学療法の1つまたは組み合わせを伴う。他の治療レジメンが、抗がん剤、例えば、治療用組成物および化学療法剤の投与と組み合わされてもよい。例えば、このような抗がん剤で処置しようとする患者はまた放射線療法も受けてよい、および/または外科手術も受けてもよい。
【００７４】
疾患を処置する場合、治療用組成物の適切な投与量は、前記で定義されたような処置しようとする疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、患者の病歴および剤に対する応答、ならびに主治医の判断に左右される。前記剤は、1回で、または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【００７５】
治療的および予防的な方法および組成物は、望ましい効果を実現するのに有効な組み合わせた量で提供することができる。組織、腫瘍、または細胞が、作用物質の1つまたは複数を含む1種類または複数種類の組成物または薬理学的製剤と接触されてもよく、組織、腫瘍、および/または細胞を2つ以上の別個の組成物または製剤と接触させることで接触されてもよい。また、このような併用療法が化学療法、放射線療法、外科的療法、または免疫療法と共に使用できることも意図される。
【００７６】
併用投与は、2種類またはそれ以上の剤を同じ剤形の中に入れて同時投与すること、別々の剤形に入れて同時投与すること、および別々に投与することを含んでもよい。すなわち、本治療用組成物と別の治療用物質を同じ剤形の中に入れて一緒に製剤化し、同時投与することができる。または、本治療用組成物と別の治療用物質を同時投与することができ、この場合、両物質とも別々の製剤に存在する。別の選択肢では、治療用物質を投与し、その直後に他の治療用物質を投与することができ、逆もまた同じである。別の投与プロトコールでは、本治療用組成物と別の治療用物質は数分間あけて、または数時間あけて、または数日あけて投与されることがある。
【００７７】
第1の抗がん処置(例えば、組換えタンパク質を発現するエキソソーム、またはエキソソームから単離された組換えタンパク質)は、第2の抗がん処置の前、第2の抗がん処置の間、第2の抗がん処置の後に、または第2の抗がん処置と比べて様々な組み合わせで実施されてもよい。実施は同時から数分〜数日〜数週間に及ぶ間隔でもよい。第1の処置が第2の処置とは別に患者に提供される態様では、2種類の化合物が、患者に対して有利に組み合わされた効果を依然として発揮できるように、一般的には、有効な期間がそれぞれの送達の間に終わらないようにするだろう。このような場合、どちらかの療法を実施して約12〜24時間以内または72時間以内に、より詳細には、どちらかの療法を実施して約6〜12時間以内に、第1の療法および第2の療法が患者に提供され得ることが意図される。状況によっては、処置のための期間を大幅に延ばすことが望ましい場合もある。この場合、それぞれの実施の間の期間は数日(2日、3日、4日、5日、6日、または7日)〜数週間(1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間)である。
【００７８】
ある特定の態様では、処置の経過は1〜90日またはそれより長く(このような範囲は、その間の日を含む)続く。ある剤が、1日目〜90日目の任意の日に(このような範囲は、その間の日を含む)またはその任意の組み合わせで与えられてもよく、別の剤が、1日目〜90日目の任意の日に(このような範囲は、その間の日を含む)またはその任意の組み合わせで与えられることが意図される。1日(24時間の期間)の中で、患者には1回または複数回の剤投与が行われてもよい。さらに、処置の経過の後、抗がん処置が実施されない期間があることが意図される。この期間は、患者の状態、例えば、患者の予後、体力、健康状態などに応じて1〜7日、および/または1〜5週間、および/または1〜12ヶ月以上(このような範囲は、その間の日を含む)続くことがある。処置サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。
【００７９】
様々な組み合わせが用いられ得る。下記の例について、第1の抗がん療法が「A」であり、第2の抗がん療法が「B」である。
2021506795.tif 000002
【００８０】
患者への本発明の任意の化合物の投与または本発明の任意の療法の実施は、剤の毒性があればそれを考慮して、このような化合物を投与するための一般的なプロトコールに従う。従って、一部の態様では、併用療法に起因する毒性をモニタリングする工程がある。
【００８１】
1.化学療法
多種多様な化学療法剤を本発明に従って使用することができる。「化学療法」という用語は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を意味するために用いられる。これらの剤または薬物は、細胞内での活性の様式、例えば、細胞周期に影響を及ぼすかどうか、またはどの段階で細胞周期に影響を及ぼすのかによって分類される。または、剤は、DNAを直接架橋する能力、DNAにインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことで染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられることがある。
【００８２】
化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド(cyclosphosphamide);アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa);アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamime)を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン(methylamelamine);アセトゲニン(特に、ブラタシンおよびブラタシノン(bullatacinone));カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン(callystatin);CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン(carzelesin)、およびビセレシン合成類似体を含む);クリプトフィシン(特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む);エリュテロビン;パンクラチスタチン(pancratistatin);サルコジクチン(sarcodictyin);スポンギスタチン(spongistatin);ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード;ニトロスレア(nitrosurea)、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン;抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質(例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンγlIおよびカリチアマイシンωI1);ディネミシン(dynemicin)Aを含むディネミシン;ビスホスホネート、例えば、クロドロネート;エスペラミシン;ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質(antiobiotic)クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスララニシン(authrarnycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、またはゾルビシン;代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオ��シウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン;抗副腎剤、例えば、ミトタンおよびトリロスタン;葉酸補充剤、例えば、フォリン酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキサート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エルフォルミチン(elformithine);酢酸エリプチニウム;エポシロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダイニン;マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサミトシン(ansamitocin);ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラエリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン(losoxantrone);ポドフィリニック酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK多糖複合体;ラゾキサン;リゾキシン(rhizoxin);シゾフィラン(sizofiran);スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特に、T-2毒素、ベラクリン(verracurin)A、ロリジン(roridin)A、およびアングイジン(anguidine));ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル、ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;イリノテカン(例えば、CPT-11);トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えば、レチノイン酸;カペシタビン;シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン(plicomycin)、ゲムシタビエン(gemcitabien)、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金(transplatinum)、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。
【００８３】
2.放射線療法
DNA損傷を引き起こし、広範に用いられてきた他の要因には、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の特異的送達として一般に知られているものが含まれる。マイクロ波、陽子線照射(米国特許第5,760,395号および同第4,870,287号)、ならびにUV照射などの他の形態のDNA損傷因子も意図される。これらの要因が全て、DNA、DNA前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範な損傷に影響を及ぼす可能性が高い。X線の線量範囲は、長期の場合(3〜4週間)は50〜200レントゲンの1日線量から、2000〜6000レントゲンの単回線量まで及ぶ。放射性同位体の線量範囲は多種多様であり、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みによって決まる。
【００８４】
3.免疫療法
当業者は、本発明の方法と組み合わせて、または本発明の方法と一緒に、さらなる免疫療法が用いられ得ることを理解する。がん治療の状況では、免疫療法は、一般的に、がん細胞を標的にするおよび破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に頼る。リツキシマブ(Rituxan(登録商標))は、このような例の1つである。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体でもよい。この抗体だけが療法のエフェクターとして働いてもよく、他の細胞を動員して細胞死滅に実際に影響を及ぼしてもよい。この抗体はまた薬物または毒素(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)に結合体化されてもよく、単にターゲティング物質として働いてもよい。または、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球でもよい。様々なエフェクター細胞には細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【００８５】
免疫療法の一局面では、腫瘍細胞は、ターゲティングの対象となる、すなわち、他の細胞の大多数に存在しない、何らかのマーカーを有さなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはどれも、本発明の状況におけるターゲティングに適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、CD20、がん胎児抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erbB、およびp155が含まれる。免疫療法の別の局面は、抗がん作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。サイトカイン、例えば、IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、ケモカイン、例えば、MIP-1、MCP-1、IL-8、および増殖因子、例えば、FLT3リガンドを含む免疫刺激分子も存在する。
【００８６】
現在研究中のまたは使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物(米国特許第5,801,005号および同第5,739,169号; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、IL-1、GM-CSF、ならびにTNF(Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998);遺伝子療法、例えば、TNF、IL-1、IL-2、およびp53(Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 米国特許第5,830,880号および同第5,846,945号);ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、および抗p185(Hollander, 2013; Hanibuchi et al., 1998; 米国特許第5,824,311号)である。1種類または複数種類の抗がん療法が本明細書に記載の抗体療法と共に用いられ得ることが意図される。
【００８７】
一部の態様では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤の場合がある。免疫チェックポイントはシグナルを強くするか(例えば、補助刺激分子)、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイント阻害によって標的にされ得る阻害性免疫チェックポイントには、アデノシンA2A受容体(A2AR)、B7-H3(CD276とも知られる)、B and T lymphocyte attenuator(BTLA)、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4。CD152とも知られる)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、キラー細胞免疫グロブリン(KIR)、lymphocyte activation gene-3(LAG3)、programmed death 1 (PD-1)、T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3(TIM-3)、およびV-domain Ig suppressor of T cell activation(VISTA)が含まれる。特に、免疫チェックポイント阻害剤はPD-1 axisおよび/またはCTLA-4を標的とする。
【００８８】
免疫チェックポイント阻害剤は、薬物、例えば、低分子、組換え型のリガンドもしくは受容体の場合があるか、または特に、抗体、例えば、ヒト抗体(例えば、国際特許公報WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012;両方とも参照により本明細書に組み入れられる)である。既知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤またはその類似体が用いられることがあり、特に、キメラ化型、ヒト化型、またはヒト型の抗体が用いられることがある。当業者が知っているように、本開示において言及された、ある特定の抗体について別の名前および/または同等の名前が用いられることがある。このような別の名前および/または同等の名前は本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブはMK-3475およびペンブロリズマブという別の名前および/または同等の名前でも知られていることが分かっている。
【００８９】
一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PD-1リガンド結合パートナーはPDL1および/またはPDL2である。別の態様では、PDL1結合アンタゴニストは、PDL1とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PDL1結合パートナーはPD-1および/またはB7-1である。別の態様では、PDL2結合アンタゴニストは、PDL2とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PDL2結合パートナーはPD-1である。前記アンタゴニストは抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドでもよい。例示的な抗体は米国特許第8,735,553号、同第8,354,509号、および同第8,008,449号に記載されており、全てが参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において提供される方法において使用するための他のPD-1 axisアンタゴニストは、米国特許出願公開第20140294898号、同第2014022021号、および同第20110008369号に記載のように当技術分野において公知であり、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
【００９０】
一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは抗PD-1抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)である。一部の態様では、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびCT-011からなる群より選択される。一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン(例えば、定常領域(例えば、免疫グロブリン配列のFc領域)と融合したPDL1またはPDL2の細胞外部分またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン)である。一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストはAMP-224である。ニボルマブはMDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびOPDIVO(登録商標)とも知られ、WO2006/121168に記載の抗PD-1抗体である。ペンブロリズマブはMK-3475、Merck3475、ランブロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標)、およびSCH-900475とも知られ、WO2009/114335に記載の抗PD-1抗体である。CT-011はhBATまたはhBAT-1とも知られ、WO2009/101611に記載の抗PD-1抗体である。AMP-224はB7-DCIgとも知られ、WO2010/027827およびWO2011/066342に記載のPDL2-Fc融合可溶性受容体である。
【００９１】
本明細書において提供される方法において標的にされることができる別の免疫チェックポイントは、CD152とも知られる細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4(CTLA-4)である。ヒトCTLA-4の完全cDNA配列はGenbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4はT細胞表面に見出され、抗原提示細胞の表面上のCD80またはCD86に結合すると「オフ」スイッチとして働く。CTLA4は、ヘルパーT細胞表面に発現し、阻害シグナルをT細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA4はT細胞補助刺激タンパク質であるCD28に類似し、両分子とも、抗原提示細胞上の、B7-1とも呼ばれるCD80と、B7-2とも呼ばれるCD86に結合する。CTLA4は阻害シグナルをT細胞に伝達するのに対して、CD28は刺激シグナルを伝達する。細胞内CTLA4は調節性T細胞の中にも見出され、その機能にとって重要である可能性がある。T細胞受容体およびCD28を介してT細胞が活性化されると、B7分子に対する抑制性受容体であるCTLA-4の発現が増加する。
【００９２】
一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
【００９３】
本方法における使用に適した抗ヒト-CTLA-4抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗CTLA-4抗体を使用することができる。例えば、米国特許第8,119,129号、WO01/14424、WO98/42752;WO00/37504(CP675,206、トレメリムマブ;以前はチシリムマブ(ticilimumab)とも知られる)、米国特許第6,207,156号; Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206);およびMokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304に開示される抗CTLA-4抗体は、本明細書において開示される方法において使用することができる。前述した刊行物のそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4との結合では、これらの当技術分野において認められている任意の抗体と競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、国際特許出願番号WO2001014424、WO2000037504、および米国特許第8,017,114号に記載され、全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【００９４】
例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ(10D1、MDX-010、MDX-101、およびYervoy(登録商標)とも知られる)またはその抗原結合断片および変種である(例えば、WO01/14424を参照されたい)。他の態様では、前記抗体はイピリムマブの重鎖および軽鎖CDRまたはVRを含む。従って、一態様では、前記抗体は、イピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインと、イピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。別の態様では、前記抗体は、前述した抗体と同じ、CTLA-4上のエピトープとの結合において競合する、および/または前述した抗体と同じ、CTLA-4上のエピトープに結合する。別の態様では、前記抗体は、上述した抗体と少なくとも約90％の可変領域アミノ酸配列同一性(例えば、イピリムマブと少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％の可変領域同一性)を有する。
【００９５】
CTLA-4を調節するための他の分子には、CTLA-4リガンドおよび受容体、例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5844905号、同第5885796号、ならびに国際特許出願番号WO1995001994およびWO1998042752に記載のCTLA-4リガンドおよび受容体、ならびにイムノアドヘシン、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8329867号に記載のイムノアドヘシンが含まれる。
【００９６】
一部の態様では、免疫療法は、エクスビボで作製した自己抗原特異的T細胞の移入を伴う養子免疫治療になる場合がある。養子免疫治療に用いられるT細胞は、抗原特異的T細胞を拡大するか、または遺伝子工学によってT細胞をリダイレクション(redirection)することによって作製することができる(Park, Rosenberg et al. 2011)。腫瘍特異的T細胞の単離および移入はメラノーマ治療に成功したことが示されている。T細胞における新規の特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)を遺伝子移入することによって首尾良く生じた(Jena, Dotti et al. 2010)。CARは、1つの融合分子の形で1つまたは複数のシグナル伝達ドメインと結合したターゲティング部分からなる合成受容体である。一般的に、CARの結合部分は、モノクローナル抗体の軽鎖断片および可変断片が可動性リンカーによってつながった単鎖抗体(scFv)の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も首尾良く用いられてきた。第1世代CARのシグナル伝達ドメインはCD3ζの細胞質領域またはFc受容体γ鎖に由来する。CARを用いることで、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な新生物に由来する腫瘍細胞の表面に発現している抗原にT細胞は首尾良くリダイレクションされている(Jena, Dotti et al. 2010)。
【００９７】
一態様では、本願は、養子T細胞療法およびチェックポイント阻害剤を含む、がんを処置するための併用療法を提供する。一局面では、養子T細胞療法は自己由来および/または同種異系のT細胞を含む。別の局面では、自己由来および/または同種異系のT細胞は腫瘍抗原に対して標的にしている。
【００９８】
4.外科手術
がんを有する人の約60％は、予防手術、診断、または進行度診断のための手術、根治的手術、および姑息的手術を含む何らかの種類の外科手術を受ける。根治的手術は、がん組織の全てまたは一部が物理的に除去、切除、および/または破壊される切除を含み、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および/または代替療法などの他の療法と共に用いられる場合がある。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡的に管理される手術(microscopically-controlled surgery)(モース術)を含む。
【００９９】
がんの細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切除すると体内に空洞が形成されることがある。処置は、その領域にさらなる抗がん療法を灌流、直接注射、または局所塗布することによって行われてもよい。このような処置は、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、もしくは7日ごとに、または1週間、2週間、3週間、4週間、および5週間ごとに、または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月ごとに繰り返されてもよい。これらの処置もまた様々な投与量の処置であり得る。
【０１００】
5.他の作用物質
処置の治療有効性を改善するために、本発明のある特定の局面と組み合わせて他の作用物質が用いられ得ることが意図される。これらのさらなる作用物質には、細胞表面受容体およびギャップ結合のアップレギュレーションに影響を及ぼす作用物質、細胞分裂停止物質および分化物質、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める作用物質、または他の生物学的作用物質が含まれる。ギャップ結合数を増やすことで細胞間シグナル伝達を増大させると、付近の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖作用が増大する。他の態様では、処置の抗過剰増殖有効性を改善するために、細胞分裂停止物質または分化物質は本発明のある特定の局面と組み合わせて使用することができる。細胞接着阻害剤は本発明の有効性を改善することが意図される。細胞接着阻害剤の例は局所接着キナーゼ(FAK)阻害剤およびロバスタチンである。処置有効性を改善するために、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を高める他の作用物質、例えば、抗体c225を本発明のある特定の局面と併用できることがさらに意図される。
【０１０１】
V.薬学的組成物
CRISPRシステムを発現するまたは含むエキソソームは、腫瘍細胞増殖を阻害するために、最も好ましくは局所進行がんまたは転移がんを有するがん患者のがん細胞を死滅させるために全身投与または局所投与できることが意図される。CRISPRシステムを発現する、または含むエキソソームは静脈内投与、くも膜下腔内投与、および/または腹腔内投与することができる。CRISPRシステムを発現する、または含むエキソソームは単独で投与されてもよく、抗増殖性薬物と組み合わせて投与されてもよい。一態様では、CRISPRシステムを発現する、または含むエキソソームは外科手術または他の処置の前に患者のがん負荷(cancer load)を減らすために投与される。または、CRISPRシステムを発現する、または含むエキソソームは、残存しているがん(例えば、外科手術で除去されなかったがん)が生き残らないことを確かなものにするために外科手術後に投与することができる。
【０１０２】
本発明が治療用調製物の特定の性質によって制限されることは意図されない。例えば、このような組成物は、生理学的に許容できる液体、ゲル、固体担体、希釈剤、または賦形剤と一緒に製剤の形で提供することができる。これらの治療用調製物は他の治療用物質と同様に獣医学的使用、例えば、家畜を用いた獣医学的使用、およびヒトにおける臨床的使用のために哺乳動物に投与することができる。一般的に、治療有効性に必要とされる投与量は使用のタイプおよび投与方法ならびに個々の対象の特定の要件に従って変化する。
【０１０３】
臨床適用が意図される場合、意図された用途に適した形で組換えタンパク質および/またはエキソソームを含む薬学的組成物を調製することが必要な場合がある。一般的に、薬学的組成物は非経口製剤でもよく、薬学的に許容される担体に溶解または分散された、有効量の1種類もしくは複数種類の組換えタンパク質および/もしくはエキソソームならびに/またはさらなる作用物質を含んでもよい。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、適宜、例えば、ヒトなどの動物に投与された時に有害な、アレルギー性の、または他の都合悪い反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において開示される組換えタンパク質および/もしくはエキソソーム、またはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990により例示される。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与の場合、調製物は、FDAの生物製剤部の基準(the FDA Office of Biological Standard)に求められるように無菌性、発熱性、一般安全性、および純度の基準を満たさなければならないことが理解される。
【０１０４】
さらに、本発明のある特定の局面によれば、投与に適した組成物は、不活性希釈剤と共に、または不活性希釈剤を伴わずに薬学的に許容される担体に溶解して提供されてもよい。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知の任意のおよび全ての水性溶媒(例えば、水、アルコール/水溶液、エタノール、食塩水、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなど)、非水性溶媒(例えば、脂肪、油、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチル)、脂質、リポソーム、分散媒、コーティング(例えば、レシチン)、界面活性剤、抗酸化物質、防腐剤(例えば、抗菌剤または抗真菌剤、アンチオキシダント、キレート剤、希ガス、パラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはその組み合わせ)、等張剤(例えば、糖および塩化ナトリウム)、吸収遅延剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、樹脂、増量剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、色素、液体(fluid)および栄養補充薬(nutrient replenisher)、このような同様の材料およびその組み合わせを含む。担体は同化できなければならず、液体、半固体、すなわち、ペースト、または固体担体を含む。さらに、所望であれば、前記組成物は微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、安定化剤、またはpH緩衝剤を含有することがある。薬学的組成物中の様々な成分のpHおよび正確な濃度は周知のパラメータに従って調節される。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンを用いることによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、界面活性剤を用いることによって維持することができる。
【０１０５】
薬学的に許容される担体は特にヒトへの投与のために製剤化されるが、ある特定の態様では、非ヒト動物への投与のために製剤化されたが、ヒトへの投与には(例えば、政府規制のために)許容されない薬学的に許容される担体を使用することが望ましい場合がある。従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて(例えば、レシピエントに有害な、または担体に含まれる組成物の治療効果に有害な場合を除いて)、治療組成物または薬学的組成物における、その使用が意図される。本発明のある特定の局面によれば、前記組成物は、任意の便利な、かつ実用的なやり方で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル化、吸収などによって担体と組み合わされる。このような手順は当業者にとって日常的なものである。
【０１０６】
本発明のある特定の態様は、固体、液体、またはエアロゾルの形で投与されるかどうかに応じて、注射などの投与経路のために滅菌する必要があるかどうかに応じて異なるタイプの担体を含んでもよい。前記組成物は、静脈内投与、皮内投与、経皮投与、くも膜下腔内、動脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、腟内投与、直腸内投与、筋肉内投与、皮下投与、粘膜投与、経口投与、局部投与、局所投与されてもよく、吸入(例えば、エアロゾル吸入)によって、注射によって、注入によって、連続注入によって、標的細胞を直接浸す局所灌流により、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物(例えば、リポソーム)の中に入れて、または他の方法もしくは前述の任意の組み合わせによって投与されてもよい。これらは。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990に記載されている。
【０１０７】
活性化合物は非経口投与用に製剤化することができる、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路を介した注射用に、または腹腔内経路を介した注射用でも製剤化することができる。従って、態様は非経口製剤を含む。典型的に、このような組成物は液体溶液または懸濁液のいずれかで調製することができる。注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適した固体剤形も調製することができる。調製物は乳化することもできる。
【０１０８】
本態様によれば、非経口製剤は、本明細書において開示されるエキソソームを、1種類もしくは複数種類の溶質および/もしくは溶媒、1種類もしくは複数種類の緩衝剤および/または1種類もしくは複数種類の抗菌剤、あるいはその任意の組み合わせと共に含んでもよい。一部の局面では、溶媒には、水、水混和性溶媒、例えば、エチルアルコール、液体ポリエチレングリコール、および/もしくはプロピレングリコール、ならびに/または水不混和性の溶媒、例えば、例えば、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、および/もしくはゴマ油を含む不揮発性油が含まれ得る。ある特定のバージョンでは、溶質には、1種類もしくは複数種類の抗菌剤、緩衝剤、抗酸化物質、張性物質、凍結防御物質、および/または凍結乾燥防御物質(lyoprotectant)が含まれ得る。
【０１０９】
本開示に従う抗菌剤には、本開示の他の箇所で提供される抗菌剤ならびにベンジルアルコール、フェノール、水銀剤、および/またはパラベンが含まれ得る。抗菌剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および/またはチメロサール、またはその任意の組み合わせが含まれ得る。抗菌剤は、様々な局面では、薬学的作用物質に必要とされるような無菌性を保証するのに必要な濃度で存在することができる。例えば、前記作用物質は、調製物中に、例えば、多用量容器に含まれる調製物中に、静菌濃度または静真菌濃度で存在することができる。様々な態様では、前記作用物質は防腐剤でもよい、および/または微生物、例えば、調製物に意図せずに導入された、例えば、皮下針と注射器を用いて内容物の一部を引き抜いている間に調製物に意図せずに導入された微生物の増殖を防ぐために使用時に十分な濃度で存在してもよい。様々な局面では、作用物質には、最大体積および/または濃度限界(例えば、硝酸フェニル水銀およびチメロサール0.01％、塩化ベンゼトニウムおよび塩化ベンザルコニウム0.01％、フェノールまたはクレゾール0.5％、およびクロロブタノール0.5％)がある。様々な場合で、硝酸フェニル水銀などの作用物質が0.002％の濃度で用いられる。p-ヒドロキシ安息香酸メチル0.18％とp-ヒドロキシ安息香酸プロピル0.02％の組み合わせ、およびベンジルアルコール2％も態様に従って適用することができる。抗菌剤には、ヘキシルレゾルシノール0.5％、安息香酸フェニル水銀0.1％、および/または治療用化合物も含まれ得る。
【０１１０】
本開示に従う抗酸化物質には、アスコルビン酸および/もしくはその塩、ならびに/またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)のナトリウム塩が含まれ得る。本明細書に記載の張性物質には電解質および/または単糖もしくは二糖が含まれ得る。凍結防御物質および/または凍結乾燥防御物質は、フリーズドライ処理中の製品の凍結および/または乾燥による有害作用から生物製剤を保護する添加物である。凍結防御物質および/または凍結乾燥防御物質には、糖(非還元)、例えば、スクロースまたはトレハロース、アミノ酸、例えば、グリシンまたはリジン、ポリマー、例えば、液体ポリエチレングリコールまたはデキストラン、およびポリオール、例えば、マンニトールまたはソルビトールが含まれ得る。これらは全て、可能性のある凍結防御物質または凍結乾燥防御物質である。本態様はまた、抗真菌剤、例えば、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および/またはソルビン酸、またはその任意の組み合わせも含んでよい。本開示に従って使用され得る、さらなる溶質および抗菌剤、緩衝剤、抗酸化物質、張性物質、凍結防御物質および/または凍結乾燥防御物質、ならびにその特徴、ならびに本非経口製剤を作製する方法の局面は、例えば、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 21st Ed., 2005、例えば、第41章に記載されている。
【０１１１】
注射使用に適した薬学的形態には、滅菌した水溶液または分散液;ゴマ油、ピーナッツ油、またはプロピレングリコール水溶液を含む製剤;および滅菌した注射液または分散液を即時調製するための滅菌した散剤が含まれる。すべての場合で、剤形は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に液状でならなければならない。剤形はまた製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守らなくてはならない。
【０１１２】
治療剤は遊離塩基、中性、または塩の形で組成物に製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、酸添加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成された酸添加塩、あるいは無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などのような有機酸と形成された酸添加塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成された塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄;またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインのような有機塩基からも得ることができる。製剤化されたら、溶液は、投与製剤と適合するやり方で、かつ治療に有効な量で投与される。製剤は様々な剤形で容易に投与され、例えば、注射液、または肺に送達する場合にはエアロゾルなど非経口投与用に製剤化されるか、または薬物放出カプセルなどの食事投与用に製剤化される。
【０１１３】
本発明の特定の態様では、前記組成物は半固体担体もしくは固体担体と組み合わされるか、または半固体担体もしくは固体担体と共に徹底的に混合される。混合は粉砕などの任意の便利なやり方で行うことができる。組成物を治療活性の消失、すなわち、胃の中での変性から保護するために、混合プロセスにおいて安定化剤も添加することができる。組成物において使用するための安定剤の例には、緩衝剤、アミノ酸、例えば、グリシンおよびリジン、炭水化物、例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどが含まれる。
【０１１４】
さらなる態様では、本発明は、1種類または複数種類の脂質と水性溶媒を含む、薬学的な脂質ビヒクル組成物の使用に関することがある。本明細書で使用する「脂質」という用語は、特色として水に溶解せず、有機溶媒を用いて抽出可能な広範な任意の物質を含むと定義される。この広範な化合物クラスは当業者に周知であり、「脂質」という用語が本明細書において用いられる時には、どの特定の構造にも限定されない。例には、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含有する化合物が含まれる。脂質は天然でもよく、合成でもよい(すなわち、人間によって設計または生成されてもよい)。しかしながら、通常、脂質は生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質(lysolipid)、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド(sulphatide)、エーテル結合およびエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合可能な脂質、ならびにその組み合わせを含む。もちろん、当業者が脂質だと理解する本明細書中で具体的に説明された化合物以外の化合物も前記の組成物および方法に含まれる。
【０１１５】
当業者は、組成物を脂質ビヒクルで分散させるために使用することができる技法の範囲をよく知っているだろう。例えば、治療用物質は、脂質を含有する溶液で分散されてもよく、脂質を用いて溶解されてもよく、脂質を用いて乳化されてもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と組み合わされてもよく、脂質と共有結合されてもよく、脂質に溶解した懸濁液として含まれてもよく、ミセルもしくはリポソームを用いて含まれるか、もしくは複合体化されてもよく、または当業者に公知の任意の手段によって脂質もしくは脂質構造と別のやり方で結合されてもよい。分散によってリポソームが形成されてもよく、形成されなくてもよい。
【０１１６】
「単位用量」または「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、投与、すなわち、適切な経路および処置レジメンに関連して前記で議論された望ましい応答を生じるように計算された所定量の治療用組成物を含有する。投与しようとする量は、治療の回数および単位用量に応じて、望ましい効果に左右される。患者または対象に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、身体的要因および生理学的要因、例えば、対象の体重、年齢、健康状態、および性別、処置されている疾患のタイプ、疾患侵入の程度、以前の治療介入または同時治療介入、患者の特発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療物質の効力、安定性、および毒性によって決定することができる。例えば、用量はまた、1回の投与につき約1μg/kg/体重〜約1000mg/kg/体重(このような範囲は、その間の用量を含む)またはそれより多い用量、およびその中から導き出せる任意の範囲も含んでよい。本明細書において列挙された数から導き出せる範囲の非限定的な例では、約5μg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5μg/kg/体重〜約500mg/kg/体重などの範囲を投与することができる。投与を担当する医者は、どんな状況でも、組成物中の活性成分の濃度と、個々の対象に適した用量を決定する。
【０１１７】
動物患者に投与された組成物の実際の投与量は、身体的要因および生理学的要因、例えば、体重、状態の重篤度、処置されている疾患のタイプ、以前の治療介入または同時治療介入、患者の特発性疾患、および投与経路によって決定することができる。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および/または有効量の投与の回数は対象の応答に従って変化することがある。投与を担当する医者は、どんな状況でも、組成物中の活性成分の濃度と、個々の対象に適した用量を決定する。
【０１１８】
ある特定の態様では、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含んでもよい。他の態様では、活性化合物は、例えば、単位の重量の約2％〜約75％または約25％〜約60％、およびその中から導き出せる任意の範囲を含んでもよい。天然では、それぞれの治療上有用な組成物中には、化合物のある特定の単位用量で適切な投与量が得られるようなやり方で、前記の量の活性化合物が調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的な考慮すべき事項などの要因が、このような薬学的製剤を調製する当業者によって検討され、従って、様々な投与量および処置レジメンが望ましい場合がある。
【０１１９】
他の非限定的な例では、用量はまた、1回の投与につき、約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重〜約1000ミリグラム/kg/体重、またはそれより多く、およびその中から導き出せる任意の範囲も含んでもよい。本明細書において列挙された数から導き出せる範囲の非限定的な例では、上記の数に基づいて、約5ミリグラム/kg/体重〜約100ミリグラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を投与することができる。
【０１２０】
VI.核酸およびベクター
本発明のある特定の局面では、治療用タンパク質または治療用タンパク質を含有する融合タンパク質をコードする核酸配列が開示され得る。どの発現系が用いられるかに応じて、核酸配列は従来の方法に基づいて選択することができる。例えば、それぞれの遺伝子またはその変種は、ある特定の系において発現するようにコドン最適化されてもよい。関心対象のタンパク質を発現するために様々なベクターも使用することができる。例示的なベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームベースのベクターが含まれるが、これに限定されない。
【０１２１】
VII.組換えタンパク質および阻害性RNA
一部の態様は組換えタンパク質およびポリペプチドに関する。特定の態様は、RNAガイドエンドヌクレアーゼ活性を有する組換えタンパク質またはポリペプチドに関する。さらなる局面では、前記タンパク質またはポリペプチドは血清安定性を高めるように改変されてもよい。従って、本願が「改変されたタンパク質」または「改変されたポリペプチド」の機能または活性について言及している時に、これは、例えば、改変されていないタンパク質またはポリペプチドと比べて、さらなる利点を有するタンパク質またはポリペプチドを含むと当業者に理解されるだろう。「改変されたタンパク質」に関する態様は「改変されたポリペプチド」に関して実施されることがあり、逆もまた同じであると特に意図される。
【０１２２】
組換えタンパク質はアミノ酸の欠失および/または置換を有することがある。従って、欠失のあるタンパク質、置換のあるタンパク質、および欠失と置換のあるタンパク質は、改変されたタンパク質である。一部の態様では、これらのタンパク質は、挿入または付加されたアミノ酸、例えば、融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質をさらに含むことがある。「改変された欠失タンパク質」は天然タンパク質の1つまたは複数の残基を欠いているが、天然タンパク質の特異性および/または活性を有することがある。「改変された欠失タンパク質」はまた免疫原性または抗原性が低下していることがある。改変された欠失タンパク質の一例は、特定の生物、例えば、改変されたタンパク質が投与される可能性がある生物のタイプにおいて抗原性になることが確かめられたタンパク質領域である少なくとも1つの抗原性領域からアミノ酸残基が欠失されたものである。
【０１２３】
置換変種または交換変種は、典型的には、タンパク質内の1つまたは複数の部位での、あるアミノ酸から別のアミノ酸への交換を含有し、ポリペプチドの1つまたは複数の特性、特に、そのエフェクター機能および/またはバイオアベイラビリティを調節するように設計されることがある。置換は保存的置換でもよく、すなわち、あるアミノ酸が、類似する形状または電荷のアミノ酸と交換され、置換は保存的置換でなくてもよい。保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリンへの;アルギニンからリジンへの;アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの;アスパラギン酸からグルタミン酸への;システインからセリンへの;グルタミンからアスパラギンへの;グルタミン酸からアスパラギン酸への;グリシンからプロリンへの;ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの;イソロイシンからロイシンまたはバリンへの;ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの;リジンからアルギニンへの;メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの;フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニンへの;セリンからスレオニンへの;スレオニンからセリンへの;トリプトファンからチロシンへの;チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの;およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの交換を含む。
【０１２４】
欠失または置換に加えて、改変されたタンパク質は残基の挿入を有することがあり、残基の挿入は、典型的には、ポリペプチドへの少なくとも1つの残基の付加を伴う。これは、ターゲティングペプチドまたはターゲティングポリペプチドの挿入を含んでもよく、単に、1個の残基の挿入を含んでもよい。融合タンパク質と呼ばれる末端付加を下記で議論する。
【０１２５】
「生物学的に機能する等価物」という用語は当技術分野においてよく理解されており、さらに本明細書において詳細に定義される。従って、タンパク質の生物学的活性が維持されるのであれば、対照ポリペプチドのアミノ酸と同一の、または機能的に等価な、約70％〜約80％のアミノ酸配列、または約81％〜約90％のアミノ酸配列、または約91％〜約99％のアミノ酸配列さえ含まれる。組換えタンパク質は、ある特定の局面では、その天然対応物に生物学的に機能的に等価なものでもよい。
【０１２６】
アミノ酸配列および核酸配列は、タンパク質発現と関係がある生物学的タンパク質活性の維持を含む上記で示した判断基準を満たす限り、さらなる残基、例えば、さらなるN末端アミノ酸もしくはC末端アミノ酸または5'配列もしくは3'配列を含んでもよいが、依然として、本明細書において開示される配列の1つに本質的に示されたようなものであることも理解される。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の5'部分もしくは3'部分に隣接する様々な非コード配列を含み得るか、または様々な内部配列、すなわち、遺伝子内部に存在することが知られているイントロンを含み得る核酸配列に適用される。
【０１２７】
本明細書で用いられる時、タンパク質またはペプチドは、一般的に、遺伝子から翻訳される、約200アミノ酸超から完全長配列までのタンパク質;約100アミノ酸超のポリペプチド;および/または約3〜約100アミノ酸のペプチドを指すが、これに限定されない。便宜的に、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチドという用語は本明細書中、同義で用いられる。
【０１２８】
本明細書で使用する「アミノ酸残基」は、当技術分野において公知の任意の天然アミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣物を指す。ある特定の態様では、タンパク質またはペプチドの残基は連続しており、アミノ酸残基配列を非アミノ酸は中断しない。他の態様では、この配列は1つまたは複数の非アミノ酸部分を含むことがある。特定の態様では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は1つまたは複数の非アミノ酸部分によって中断されることがある。
【０１２９】
従って、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然のタンパク質に見出される20種類の一般アミノ酸のうちの少なくとも1つ、または少なくとも1つの修飾アミノ酸もしくは珍しいアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
本発明のある特定の態様は融合タンパク質に関する。これらの分子は、治療用タンパク質のN末端またはC末端が異種ドメインに連結されていてもよい。例えば、融合はまた、異種宿主でのタンパク質の組換え発現を可能にするために他の種に由来するリーダー配列も用いることがある。別の有用な融合には、タンパク質アフィニティタグ、例えば、血清アルブミンアフィニティタグまたは6つのヒスチジン残基、または免疫学的に活性なドメイン、例えば、抗体エピトープ、好ましくは、融合タンパク質精製を容易にするために切断可能な抗体エピトープの付加が含まれる。非限定的なアフィニティタグには、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)が含まれる。
【０１３１】
融合タンパク質を作製する方法は当業者に周知である。このようなタンパク質は、例えば、完全融合タンパク質の新規合成によって、または異種ドメインをコードするDNA配列を付着させ、その後にインタクトな融合タンパク質を発現させることによって産生することができる。
【０１３２】
親タンパク質の機能活性を回復する融合タンパク質の産生は、直列に接続されているポリペプチド間でスプライスされるペプチドリンカーをコードする架橋DNAセグメントを用いて遺伝子をつなげることによって容易になる場合がある。リンカーは、結果として生じる融合タンパク質の正しいフォールディングを可能にするのに十分な長さのリンカーであろう。
【０１３３】
VIII.キットおよび診断剤
本発明の様々な局面では、エキソソームを体液または組織培養培地から精製するための必要な成分を含むキットが想定される。他の局面では、エキソソームを単離し、エキソソームにCRISPRシステムをトランスフェクトするための必要な成分を備えるキットが想定される。キットは、このような任意の成分を含む1つまたは複数の密封したバイアルを含んでもよい。一部の態様では、キットはまた、キットの成分と反応しない容器である適切な容器手段、例えば、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、注射器、瓶、またはチューブも備えてよい。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作製されてもよい。
【０１３４】
キットは、本明細書において説明される方法の手順工程を概説する指示書をさらに備えてもよく、本明細書に記載のものと実質的に同じ手順に従うか、または当業者に公知である。指示書の情報は、コンピュータを用いて実行された時に、試料からエキソソームを精製し、CRISPRシステムをトランスフェクションまたは電気穿孔によってエキソソームに導入する現実または仮想の手順を表示する機械可読指示書を備えるコンピュータ可読媒体の中にあってもよい。
【実施例】
【０１３５】
IX.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明者が発見した技法が本発明の実施において十分に機能することを示すこと、かつ、従って、本発明を実施するための好ましい態様を構成すると考えられ得ることが、当業者に理解されるはずである。しかしながら、本開示を考慮すれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更を加えることができ、それでもなお、類似または同様の結果を得ることができると当業者に理解されるはずである。
【０１３６】
実施例1 - 材料および方法
エキソソームの単離および精製。 以前に述べられたように(Alvarez-Erviti et al., 2011; El-Andaloussi et al., 2012)分画遠心プロセスによってエキソソームを精製した。エキソソームを枯渇させたFBSを含有する培地中で48時間培養した細胞から上清を収集し、その後に、800gで5分間、および2000gで10分間の連続遠心分離工程に供した。次いで、結果として生じた、この上清を、培養瓶の中で0.2μmフィルターを用いて濾過し、28,000gでSW 32 Tiローターに入れて2時間の超遠心(Beckman)後にペレットを回収した。上清を吸引し、ペレットをPBSで再懸濁し、その後に、もう2時間超遠心した。次いで、精製したエキソソームを分析し、実験手順のために使用した。
【０１３７】
エキソソームおよびリポソームの電気穿孔。 1×108〜3×108個のエキソソーム(nanosight分析によって測定)と、示された量のRNAを400μlの電気穿孔緩衝液(1.15mMリン酸カリウム, pH7.2、25mM塩化カリウム、21％Optiprep(商標))の中で混合した。以前に述べられたように(Alvarez-Erviti et al., 2011; El-Andaloussi et al., 2012)、4mmキュベットを用いて、Gene Pulser Xcell(商標)Electroporation System(BioRad)を用いてエキソソームを電気穿孔した。電気穿孔後に、エキソソームをprotease-free RNAse A(Sigma Aldrich)で処理した後に、10×concentrated RNase inhibitor(Ambion)を添加し、前記のように超遠心法下でPBSで洗浄した。
【０１３８】
エキソソームトランスフェクション。 エキソソームを用いたインビトロトランスフェクションの場合、エキソソームを電気穿孔し、前記のようにPBSで洗浄し、6ウェルプレート中の200,000個の細胞をエキソソームで、各アッセイについて説明されたように必要とされる時間にわたって処理し、その後にPBSで洗浄し、さらなる分析に使用した。
【０１３９】
リアルタイムPCR分析。 TRIzol(登録商標)(Invitrogen)を用いて、製造業者の指示に従って全RNAを精製した後に、MultiScribe Reverse Transcriptase(Applied Biosystems)とオリゴ-d(T)プライマーを用いてRNAをレトロ転写(retro-transcribe)した。リアルタイム PCR分析を、SYBR(登録商標) Green Master Mix(Applied Biosystems)を用いてABI PRISM(登録商標) 7300HT Sequence Detection System Instrumentで行った。関心対象の転写物を18S転写物レベルに対して正規化した。それぞれの測定を3回繰り返して行った。増幅された標的の量が、ある決まった閾値に達する分数サイクル数である閾値サイクルを求め、発現を、2-ΔCt式を用いて測定した。
【０１４０】
ウエスタンブロット。 24時間後、エキソソームで処理した後の細胞のタンパク質発現を推定するために、細胞をRIPA緩衝液に収集し、Bradford定量を用いてタンパク質溶解産物を正規化した。タンパク質を変性条件下で電気泳動分離するために40μgの溶解産物をアクリルアミドゲルにロードし、湿った(wet)電気泳動転写によってPVDF膜(ImmobilonP)に転写した。次いで、膜を、PBS/0.05％Tween-20に溶解した5％脱脂粉乳を用いて室温で1時間ブロックし、適切な一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。二次抗体を室温で1時間インキュベートした。抗体インキュベーション後に、洗浄をオービタルシェーカー上で1×PBS 0.05％Tween(登録商標)-20を用いて15分間隔で3回行った。Pierceの化学発光試薬を用いて、製造業者の指示に従って膜を発色させ、膜上の化学ルミネセンスを捕らえた。
【０１４１】
CRISPR-Cas9-sgRab27a-2細胞のトランスフェクションおよび検証。 リポフェクタミンで72時間処理することによって、HEK293T細胞にCRISPR-Cas9ベクター対照またはCRISPR-Cas9-sgRab27a-2をトランスフェクトした。次いで、細胞を1μg/mlピューロマイシンで10日間選択して、安定したHEK293T CRISPR-Cas9ベクター対照およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2細胞を得た。次いで、安定細胞を、1μg/mlピューロマイシンを含有する選択培地と共に培養した。DNAおよびRNAを前記のように安定細胞株から抽出し、qPCRおよびRT-qPCRを用いてCas9レベルを求めた。
【０１４２】
エキソソーム収集および検証。 前記のように、トランスフェクトされていないHEK293T細胞ならびに安定したHEK293T CRISPR-Cas9ベクター対照およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2細胞からエキソソームを収集した。エキソソームの品質をNanosightによって検証した。
【０１４３】
CRISPR-Cas9ゲノム編集。 適切なベクターの存在を保証するために、かつその量を求めるために、エキソソームDNAおよびRNAを抽出し、qPCRおよびRT-qPCRを行ってエキソソームのCas9ベクター対照レベルならびにRab27a-2に対するsgRNAのレベルを検出した。さらに、細胞とエキソソームの両方のCas9タンパク質レベルを、それぞれ、抗Flag抗体またはCas9抗体と、対照としてビンキュリンまたはCD9を用いたウエスタンブロットによって評価した。T7/SURVEYORアッセイを使用して、細胞とエキソソームの両方でDNA編集が行われたことを確かめた。
【０１４４】
エキソソームを用いたBxPC-3腺がん細胞の処理。 HEK293Tブランク細胞、HEK293T CRISPR-Cas9ベクター対照、およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2安定細胞から収集した3×1010個のエキソソームを、前記のように24時間毎に1回または2回処理してBxPC-3腺がん細胞に導入した。DNAおよびRNAをレシピエント細胞から抽出した。qPCRおよびRT-qPCRを用いてDNAおよびRNAの両方からCas9レベルまたはsgRNAレベルを検出した。次いで、T7/SURVEYORアッセイを使用して、レシピエントBxPC-3細胞における編集を確かめた。
【０１４５】
BJ細胞から単離したCRISPR-Cas9エキソソームを用いたBJ細胞の処理。 前記のようにエキソソームをBJ細胞から収集した。Nanosightを使用してエキソソームを検証した。エキソソームをさらに確認するために、エキソソームマーカーCD9、CD81、フロチリン、およびTSG101をウエスタンブロットによって検出した。1×1010個の単離および検証したBJ細胞エキソソームを、15μgのCRISPR-Cas9-GFPプラスミドと共に電気穿孔し、次いで、DNアーゼで処理したか、またはDNアーゼで処理しなかった。DNアーゼ処理後に、エキソソームDNAを抽出し、Cas9レベルをqPCRによって評価した。さらに、基準としてCRISPR-Cas9-GFPプラスミドを用いた絶対qPCRによってコピー数を計算した。次いで、DNアーゼを用いた電気穿孔済みエキソソームを、前記のようにトランスフェクションによってBJ細胞に24時間導入した。次いで、qPCRまたはRT-qPCRを用いてCas9レベルをDNAおよびmRNAから検出した。
【０１４６】
HEK293T/CRISPR-Cas9培地を用いたBxPC-3細胞の形質導入。 前記のようにリポフェクタミン2000によって、HEK293T細胞に、CRISPR-Cas9 Rab27b-1/2または空の対照プラスミドとともにパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトした。レンチウイルスを含有する培地を収集し、次いで、BxPC-3細胞に形質導入した。形質導入した細胞を0.4μg/mLピューロマイシンを用いてさらに選択し、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b細胞の単一クローンをつつき、クローン増殖させ、ウエスタンブロットとT7/SURVEYORアッセイの両方で検証した。次いで、全ての単一クローンにおいてRab27bおよびRab27aタンパク質レベルを評価した。T7/SURVEYORアッセイは、全てのクローンにおいて遺伝子編集が行われたことを検証するのにも使用した。BxPC-3/CRISPR-Cas9ベクター対照安定細胞および単一クローンBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6を、0.4μg/mlピューロマイシンを含有する選択培地と共に培養した。分泌型エキソソームと同様に、上述した細胞からエキソソームを収集し、その後にNanosight検証を行った。エキソソームDNAおよびRNAを抽出し、qPCRを行ってエキソソームのCas9レベルを検出し、RT-qPCRを行って、Rab27b-1/2に対するsgRNAを検出した。細胞とエキソソームの両方でCas9およびRab27bタンパク質レベルをウエスタンブロットで評価し、T7/SURVEYORアッセイを使用して、DNA編集が細胞とエキソソームの両方で行われたかどうか判定した。
【０１４７】
エキソソームからのタンパク質濃度の評価。 BxPC-3/CRISPR-Cas9ベクター対照安定細胞および単一クローンBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1クローン3(C3)、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2クローン6(C6)を培養し、エキソソームを前記のように収集した。BxPC-3/CRISPR-Cas9ベクター対照安定細胞および単一クローンBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6から収集したエキソソームを溶解し、タンパク質含有量をBCAキットによって製造業者の説明に従って評価した。
【０１４８】
細胞増殖アッセイ。 細胞増殖がCRISPR-Cas9または遺伝子編集の存在の影響を受けないことを確実にするために、対照およびCRISPR-Cas9で処理した細胞を評価した。100μLの、処理をしなかったBxPC-3細胞、CRISPR-Cas9空のベクター対照を用いたBxPC-3、BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3、およびBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6細胞を96ウェルプレートに1×105細胞/mLの濃度で播種した。MTTアッセイを用いて細胞増殖を様々な時点で評価した。
【０１４９】
sgRab27bのインビトロ転写。 インビトロ転写sgRab27bを作製するために、最初に、sgRab27b-1/2をPCR増幅し、次いで、Qiagen(登録商標)PCR精製キットを用いてPCR産物を精製した。MEGAshortscript(商標)キット(Thermo Fisher Scientific(登録商標)カタログ番号1354)を用いて製造業者の説明に従ってsgRab27-1/2の精製PCR産物をインビトロ転写した。さらに、8M尿素ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動によってRNA品質を評価した。インビトロ転写Cas9を作製するために、Cas9をPCR増幅し、さらに、Qiagen(登録商標)PCR精製キットを用いてPCR産物を精製した。mMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7 Ultraキットを用いて精製Cas9 PCR産物をインビトロ転写した。ホルムアルデヒドゲルを用いてCas9 RNA品質を検出した。
【０１５０】
インビトロ転写RNAを用いた細胞の処理。 トランスフェクションとCRISPR-Cas9効率を評価するために、リポフェクタミン2000、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬、または電気穿孔済みエキソソームを用いて、HEK293T/CRISPR-Cas9ベクター対照細胞に1μgのIVT-sgRab27b RNAを72時間トランスフェクトした。トランスフェクション後に、DNAを抽出し、T7/SURVEYORアッセイを行って遺伝子編集が起こったかどうか確かめた。HEK293T細胞およびBxPC-3細胞に、リポフェクタミン2000、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いてCas9 mRNAをトランスフェクトしたか、またはHEK293T細胞およびBxPC-3細胞を、Cas9 mRNAと共に電気穿孔した1×109個のMSCエキソソームで48時間処理した。ウェスタンブロッティングを行ってCas9タンパク質レベルを検出した。
【０１５１】
Exo-Fect/エキソソーム処理の評価。 Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いて、Hekt293T細胞を10μgのプラスミド(CRISPR-Cas9-レンチ-V2ベクター対照、CRISPR-Cas9-レンチ-V2-sgRab27b-1、CRISPR-Cas9-GFPベクター対照)で24時間ごとに4回(1日目、2日目、3日目、4日目)処理した。GFP発現を検出するためにCRISPR-Cas9-GFP細胞を5日目に画像化した。核酸およびタンパク質を単離するために5日目に細胞も収集した。DNA、RNA、およびタンパク質を抽出した。各プラスミドをトランスフェクトした細胞について相対Cas9発現レベルと1/Ct値をqPCRによって確かめ、ウエスタンブロットを用いてCas9タンパク質レベルを検出した。T7/SURVEYORアッセイを行って、CRISPR-Cas9-レンチ-V2-sgRab27b-1プラスミド処理後のHEK293T細胞における遺伝子編集の発生を確かめた。BxPC-3細胞を用いて同じ実験を繰り返した。
【０１５２】
KPC689細胞のsgmKras編集。 リポフェクタミン2000によって、KPC689細胞に5μgの対照プラスミド、またはCRISPR-Cas9-sgmKrasG12D-レンチ-V2プラスミドを48時間トランスフェクトした。トランスフェクション後に、トランスフェクション効率を確かめるためにCRISPR-Cas9-GFPベクター対照細胞を画像化した。DNA、RNA、およびタンパク質を前記のように全培養物から抽出した。相対的なCas9およびmKrasG12Dの発現レベルをqPCRによって、および前記のように確かめた。T7/SURVEYORアッセイを行って、KPC689細胞においてリポフェクタミンによるトランスフェクション後に遺伝子編集が起こったかどうか調べた。Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いて、新鮮なKPC689細胞を、GFPバックボーンがあるCRISPR-Cas9-sgmKrasG12Dのプラスミドまたはそのベクター対照10μgで24時間毎に3日間処理した。トランスフェクション効率を確かめるために細胞のGFP発現を画像化し、細胞を4日目に収集した。DNA、RNA、およびタンパク質を抽出し、相対的なCas9およびmKrasG12Dの発現レベルをqPCRによって確かめた。T7/SURVEYORアッセイを行って、CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12Dプラスミド処理後のKPC689細胞における遺伝子編集を確認した。
【０１５３】
ドキシサイクリン誘導性CRISPR-Cas9プラスミドのトランスフェクションおよび検証。 リポフェクタミン2000によって、HEK293T細胞にレンチウイルスパッケージングプラスミドとCRISPR-Cas9ドキシサイクリン誘導性プラスミドの混合物をトランスフェクトした。レンチウイルスを含有する培地を収集し、次いで、Panc1細胞に形質導入した。形質導入した細胞を1μg/mlピューロマイシンでさらに選択した。誘導性Cas9のある安定Panc1細胞を1μg/mlドキシサイクリンと一緒に培養することによって維持した。エキソソームを、ドキシサイクリンで処理したPanc1誘導性細胞またはドキシサイクリンで処理しなかったPanc1誘導性細胞から収集した。ウェスタンブロッティングを用いて、細胞とエキソソームの両方でCas9タンパク質レベルを調べた。リポフェクタミン、Fugene、またはExo-Fectによって、Panc1誘導性細胞を、2μgのhKrasG12Dに対するIVT-sgRNA、1μgのhKrasG12Dプラスミドで72時間処理した。次いで、T7/SURVEYORアッセイを行って、Panc1誘導性細胞における遺伝子編集を確認した。
【０１５４】
CRISPR-Cas9-sghKRasG12Dを用いたPanc1細胞株の処理。 Panc1-Cas9およびPanc1 sghKrasG12D T1安定細胞株を、レンチウイルスに基づく方法を用いて樹立した。Panc1-Cas9細胞におけるCas9タンパク質発現をウエスタンブロットによって確認した。リポフェクタミン、Exo-Fect、または電気穿孔済みエキソソームを用いて、トランスフェクトされていないPanc1細胞を、レンチ-V2、GFP、もしくはピューロマイシンバックボーンのCRISPR-Cas9-sghKrasG12Dで処理した。Panc1-Cas9安定細胞を、リポフェクタミン、Exo-Fectまたは電気穿孔済みエキソソームを用いてsghKrasG12Dプラスミドで処理し、Panc1 sghKrasG12D T1安定細胞に、GFPまたはピューロマイシンバックボーンを有する10μgまたは20μgのCas9プラスミドを24時間トランスフェクトした。T7/SURVEYORアッセイを行って遺伝子編集が行われたことを確認した。
【０１５５】
インビボでの移植KPC689腫瘍の処置。 KPC689細胞を各マウスの背中に皮下移植した。マウスを4つの群に分け、1群につき1匹または2匹のマウスにした。群1を1×109個のエキソソームおよび10μLのExo-Fectで処置した。群2を10μgのCas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1プラスミドで処置した。群3を1×109個のエキソソーム、10μgのCas9-GFP-ベクター対照プラスミド、および10μLのExo-Fectで処置した。群4を1×109個のエキソソーム、10μgのCas9-GFP-sgmKrasG12D-mK1プラスミド、および10μLのExo-Fectで処置した。各群のマウスを2週間毎日、静脈内注射(I.V.)および腫瘍内注射(I.T.)した。腫瘍の長さ(a、mm)および幅(b、mm)ならびに体重を測定し、腫瘍量を計算した。
【０１５６】
実施例2 - CRISPR-Cas9エキソソームの確立
CRISPR-Cas9ベクター対照をトランスフェクトしたHEK293Tと、CRISPR-Cas9-sgRab27a-2をトランスフェクトしたHEK293TからDNAおよびRNAを抽出し、定量リアルタイムPCR(qPCR)を用いてCas9レベルを求めた(図1a)。両ベクターとも効率的にトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞はβ-アクチン対照と比べて有意に高いCas9発現を示した。HEK293Tブランク細胞ならびに安定したHEK293T CRISPR-Cas9ベクター対照およびCRISPR-Cas9-sgRab27a-2細胞からエキソソームを収集した。エキソソームのNanosight検証は図1bで見ることができる。エキソソームDNAおよびRNAを抽出し、qPCRを行ってエキソソームのCas9レベルならびにRab27a-2に対するsgRNAを検出した。前記細胞と同様に、ベクター対照およびベクターとガイドRNAの両方をエキソソームにおいて発現させた(図1c)。Cas9発現を確認するために、細胞とエキソソームの両方のCas9タンパク質レベルを、それぞれ、抗Flag抗体またはCas9抗体を使用し、対照としてビンキュリンまたはCD9を用いたウエスタンブロットによって評価した(図1d)。T7/SURVEYORアッセイを用いて細胞とエキソソームの両方でDNA編集を確認した。これは、図1eおよび1fの複数の部分中の四角内に見ることができる。エキソソームで処理したBxPC-3細胞を、Cas9 DNAおよびCas9発現が存在するかどうか評価した(図1gおよび1h)。図1gから分かるように、2回処理した細胞のCas9 DNAは増加した。ガイドRNAが存在することを確認するために、エキソソームで処理したBxPC-3細胞を、ガイドRNAが存在するかどうか試験した(図2aおよび2c)。DNAははっきり見えたが、RNA発現は無かった。このことは、T7/SURVEYORアッセイで活性が無いことによって確認された(図2b)。
【０１５７】
エキソソームをBJ細胞から収集し、図3aに図示したようにnanosight分析によって確認した。エキソソームをさらに確認するために、エキソソームマーカーCD9、CD81、フロチリン、およびTSG101をウエスタンブロットによって検出した(図3b)。BJエキソソームを15ugのCRISPR-Cas9-GFPプラスミドと共に電気穿孔し、次いで、DNアーゼで処理したか、またはDNアーゼで処理しなかった。Cas9 DNAは、DNアーゼで処理しなかった試料中で強く検出され、プラスミド単独よりもエキソソームとプラスミドを両方とも含むDNアーゼ処理試料ではさらに効率的に検出された(図3c)。1/Ct値から作成した検量線を用いてプラスミドコピー数を求めた(図3c)。DNアーゼを用いた電気穿孔済みエキソソームを処理してBJ細胞に24時間導入した。Cas9レベルはブランクエキソソームと比較してDNAとmRNAの両方で増加した(図3d)。
【０１５８】
CRISPR-CAS9 Rab27b-1/2プラスミドを含有するレンチウイルス培地を用いて形質導入したクローン増殖BxPC-3細胞をウエスタンブロット(図4a)とT7/SURVEYORアッセイ(図4b)の両方で検証した。2つのクローンが活性であることが見出され、図4bの四角の中に示した。BxPC-3/CRIPSR-Cas9-sgRab27b-1クローン3(C3)およびBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2クローン6(C6)をさらなる実験に使用した。BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3およびBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6を、0.4μg/mlピューロマイシンを含有する選択培地と共に培養し、DNAおよびRNAを抽出した。Cas9 DNAの存在をqPCRによって確認したのに対して、Cas9発現をRT-qPCRによって確認し、ベクター対照細胞よりも有意に高いことが見出された(図5a)。これらの細胞からエキソソームを収集し、nanosight分析によって確認した(図5b)。エキソソームDNAおよびRNAを抽出し、qPCRを行ってエキソソームのCas9レベルを検出した。BxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6のCas9発現はBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C3よりも有意に高いことが見出された(図5c)。これは、Rab27b-1/2に対するsgRNAを検出することによって確認された(図5c、下)。細胞とエキソソームの両方でCas9およびRab27bタンパク質レベルを、それぞれ、b-アクチンまたはCD9を対照として使用するウエスタンブロットによって評価した。Rab27bは、ガイドRNAを有する細胞およびエキソソームではノックダウンされたことが見出された(図5d)。T7/SURVEYORアッセイを使用して、DNA編集を細胞とエキソソームの両方で2つの異なるプライマーセットを用いて確認した(図5eおよび5f)。そして、DNA編集は、四角で囲まれた箇所で暗いバンドとして見ることができる。
【０１５９】
BxPC-3/CRISPR-Cas9ベクター対照安定細胞およびクローン増殖させたBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-1 C3およびBxPC-3/CRISPR-Cas9-sgRab27b-2 C6細胞のエキソソームタンパク質含有量をBCAによって評価した(図6a)。細胞増殖をMTTアッセイによって評価した。CRISPR-Cas9の存在は増殖に負の影響を及ぼさなかった(図6b)。
【０１６０】
IVT RNAを用いたトランスフェクション。 sgRab27b-1/2をPCR増幅し、精製した(図7a)。次いで、sgRab27-1/2の精製PCR産物を前記のようにインビトロ転写し、品質を分析するために変性ゲル上で移動させた(図7a、右)。Cas9をPCR増幅し、精製した(図7b)。精製Cas9 PCR産物をインビトロ転写し、ホルムアルデヒドゲル上での電気泳動によって検出した(図7b)。リポフェクタミン2000(図7c)、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬(図7d)、または電気穿孔済みエキソソーム(図7e)を用いて、HEK293T/CRISPR-Cas9ベクター対照細胞を1μgのIVT-sgRab27b RNAで72時間処理した。RNAと、リポフェクタミンまたはエキソソームトランスフェクション試薬で処理した細胞において遺伝子編集が確認されたが(図7cおよび7d)、エキソソームでは確認されなかった。HEK293T細胞およびBxPC-3細胞に、リポフェクタミン2000、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いてCas9 mRNAをトランスフェクトしたか、またはHEK293T細胞およびBxPC-3細胞を、Cas9 mRNAと共に電気穿孔したMSCエキソソームで48時間処理した。この場合もまた、リポフェクタミンまたはエキソソームトランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションでしか、Cas9を発現する細胞をウエスタンブロットにおいて生じなかった(図7fおよび7g)。Cas9ベクターを用いたHEK293T細胞とBxPC-3細胞の両方のCas9対照を図8a〜8cに示した。
【０１６１】
HEK293TおよびBxPC-3トランスフェクションおよび遺伝子編集。 Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いて、HEK293T細胞を10μgのプラスミド(CRISPR-Cas9-レンチ-V2ベクター対照、CRISPR-Cas9-レンチ-V2-sgRab27b-1、CRISPR-Cas9-GFPベクター対照)で24時間毎に4回(1日目、2日目、3日目、4日目)処理し、Cas9-GFPをトランスフェクトした細胞のトランスフェクション効率を検査した(図9a)。相対Cas9発現レベルと1/Ct値をqPCRによって確かめ(図9b)、ウェスタンブロッティングによってCas9の存在を確かめた(図9C)。遺伝子編集をT7/SURVEYORアッセイで確認した(図9d)。BxPC-3細胞において同じ実験を行ったが、T7/SURVEYORアッセイで遺伝子編集を検出することができなかった(図9e〜9g)。
【０１６２】
KPC689トランスフェクションおよび遺伝子編集。 リポフェクタミン2000によって、KPC689細胞に5μgのプラスミド(レンチ-V2、GFP、ピューロマイシンバックボーンを有するCRISPR-Cas9-sgmKrasG12Dと、ベクター対照)を48時間トランスフェクトし、GFPバックボーンで細胞を画像化することによってトランスフェクションを確認した(図10a)。相対Cas9レベル(図10b)とmKrasG12Dレベル(図10c)をqPCRによって確かめ、T7/SURVEYORアッセイを行ってKPC689細胞における遺伝子編集を調べたが、遺伝子編集は存在しなかった(図10d)。前記と同様に、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬を用いて、KPC689細胞を10μgのプラスミド(GFPバックボーンのあるCRISPR-Cas9-sgmKrasG12Dと、そのベクター対照)で処理し、Exo-Fect/エキソソームトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を確認するためにGFPをトランスフェクトした細胞を画像化した(図10e)。相対Cas9発現レベル(図10f)とmKrasG12Dレベル(図10g)をqPCRによって求めた。T7/SURVEYORアッセイを行って、CRISPR-Cas9-GFP-mKrasG12Dプラスミドで処理した後にKPC689細胞の遺伝子編集を調べたが、編集は存在しなかった(図10h)。
【０１６３】
エキソソームを含有する細胞における誘導性プラスミドを用いた処置。 リポフェクタミン2000によって、HEK293T細胞に、CRISPR-Cas9ドキシサイクリン誘導性プラスミドとともにパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトした。レンチウイルスを含有する培地を収集し、次いで、Panc1細胞に形質導入した。形質導入した細胞をピューロマイシンで選択し、ドキシサイクリンで維持した。ドキシサイクリンで処理したPanc1誘導性細胞またはドキシサイクリンで処理しなかったPanc1誘導性細胞からエキソソームを収集し、ウェスタンブロッティングを用いて細胞およびエキソソームのCas9タンパク質レベルを確認した(図11aおよび11b)。リポフェクタミン、Fugene、またはExo-FectによってPanc1誘導性細胞を2μgのhKrasG12Dに対するIVT-sgRNA、1μgのhKrasG12Dプラスミドで72時間処理し、T7/SURVEYORアッセイを行ってPanc1誘導性細胞における遺伝子編集を調べた。編集はリポフェクタミン中でガイドRNAプラスミドをトランスフェクトした細胞にしか検出されなかった(図11c)。Pacn1 Cas9安定細胞においてCas9タンパク質レベルをウエスタンブロットによって確かめた(図11d)。Panc1細胞を、リポフェクタミン、Exo-Fect、または電気穿孔済みエキソソームを用いて、レンチ-V2、GFP、ピューロマイシンバックボーンがあるCRISPR-Cas9-sghKrasG12Dで処理したのに対して、示されたようにリポフェクタミン、Exo-Fect、または電気穿孔済みエキソソームを用いて、Panc1 Cas9安定細胞をsghKrasG12Dプラスミドで処理した。T7/SURVEYORアッセイを行ってPanc1細胞およびPanc1 Cas9安定細胞における遺伝子編集を調べた(図11e)。遺伝子編集は、四角で囲んだ箇所から分かるようにピューロマイシンバックボーンのCas9を用いて形質転換したPanc1細胞において、ならびにリポフェクタミンまたはExo-Fectを用いてガイドRNAをトランスフェクトしたPanc1-Cas9安定細胞株において見出された(図11e)。Panc1 sghKrasG12DT1安定細胞を、レンチウイルスに基づく方法を用いて樹立した。Panc1 sghKrasG12DT1安定細胞に、10μgまたは20μgの、GFPまたはピューロマイシンバックボーンを有するCas9プラスミドを24時間トランスフェクトし、T7/SURVEYORアッセイを行い、Panc1 sghKrasG12DT1安定細胞において遺伝子編集が見出された(図11f)。
【０１６４】
エキソソームおよびCRISPR-Cas9を用いた誘導腫瘍の処置。 KPC689細胞をマウスの背中に皮下移植した。マウスを4つの群に分け、下記のように処置した(図12aおよび12b)。各群のマウスを2週間毎日、静脈内(I.V.)注射および腫瘍内(I.T.)注射し、腫瘍量を評価した(図12a)。エキソソームとトランスフェクション作用物質で処置しても腫瘍成長は遅くならなかったが、エキソソーム、Cas9とガイドRNAプラスミド、およびトランスフェクション作用物質で処置すると処置期間にわたって、かつ処置期間を過ぎても腫瘍成長が阻止された(図12a)。マウスの体重も評価した。全群での処置が体重に悪影響を及ぼさなかった(図12b)。
【０１６５】
本明細書において開示および請求された方法は全て、本開示を考慮すれば過度の実験なく作製および実施することができる。本発明の組成物および方法が好ましい態様に関して説明されたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および本明細書に記載の方法の工程または工程の順序に変更を加えることができることは当業者に明らかである。さらに具体的には、本明細書に記載の作用物質の代わりに、化学的および生理学的に関連している、ある特定の作用物質を使用することができ、それと同時に、同一の結果または類似の結果が得られることは明らかである。当業者に明らかな、このような類似する代用および変更は全て、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内だと考えられる。
【０１６６】
参照文献
以下の参照文献は、例示的な手順の詳細または本明細書に記載のものを補足する他の詳細を示す程度まで参照により本明細書に特に組み入れられる。
2021506795.tif 000003
2021506795.tif 000004
2021506795.tif 000005
2021506795.tif 000006
2021506795.tif 000007
【図１ａ】
2021506795.tif 000008
【図１ｂ】
2021506795.tif 000009
【図１ｃ】
2021506795.tif 000010
【図１ｄ】
2021506795.tif 000011
【図１ｅ】
2021506795.tif 000012
【図１ｆ】
2021506795.tif 000013
【図１ｇ】
2021506795.tif 000014
【図１ｈ】
2021506795.tif 000015
【図２ａ】
2021506795.tif 000016
【図２ｂ】
2021506795.tif 000017
【図２ｃ】
2021506795.tif 000018
【図３ａ】
2021506795.tif 000019
【図３ｂ】
2021506795.tif 000020
【図３ｃ】
2021506795.tif 000021
【図３ｄ】
2021506795.tif 000022
【図４ａ】
2021506795.tif 000023
【図４ｂ】
2021506795.tif 000024
【図５ａ】
2021506795.tif 000025
【図５ｂ】
2021506795.tif 000026
【図５ｃ】
2021506795.tif 000027
【図５ｄ】
2021506795.tif 000028
【図５ｅ】
2021506795.tif 000029
【図５ｆ】
2021506795.tif 000030
【図６ａ】
2021506795.tif 000031
【図６ｂ】
2021506795.tif 000032
【図７ａ】
2021506795.tif 000033
【図７ｂ】
2021506795.tif 000034
【図７ｃ】
2021506795.tif 000035
【図７ｄ】
2021506795.tif 000036
【図７ｅ】
2021506795.tif 000037
【図７ｆ】
2021506795.tif 000038
【図７ｇ】
2021506795.tif 000039
【図８ａ】
2021506795.tif 000040
【図８ｂ】
2021506795.tif 000041
【図８ｃ】
2021506795.tif 000042
【図９ａ】
2021506795.tif 000043
【図９ｂ】
2021506795.tif 000044
【図９ｃ】
2021506795.tif 000045
【図９ｄ】
2021506795.tif 000046
【図９ｅ】
2021506795.tif 000047
【図９ｆ】
2021506795.tif 000048
【図９ｇ】
2021506795.tif 000049
【図１０ａ】
2021506795.tif 000050
【図１０ｂ】
2021506795.tif 000051
【図１０ｃ】
2021506795.tif 000052
【図１０ｄ】
2021506795.tif 000053
【図１０ｅ】
2021506795.tif 000054
【図１０ｆ】
2021506795.tif 000055
【図１０ｇ】
2021506795.tif 000056
【図１０ｈ】
2021506795.tif 000057
【図１１ａ】
2021506795.tif 000058
【図１１ｂ】
2021506795.tif 000059
【図１１ｃ】
2021506795.tif 000060
【図１１ｄ】
2021506795.tif 000061
【図１１ｅ】
2021506795.tif 000062
【図１１ｆ】
2021506795.tif 000063
【図１２ａ】
2021506795.tif 000064
【図１２ｂ】
2021506795.tif 000065
【国際調査報告】
2021506795.tif 000066
2021506795.tif 000067
2021506795.tif 000068