(57)【要約】  本発明は、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅの直鎖状デプシペプチド化合物、その医薬組成物、および創傷治癒に影響を与える方法、および創傷治癒に関与する生体プロセス（たとえば炎症、細胞増殖、組織の肉芽形成、瘢痕組織のリモデリングなど）に影響を与える方法を目的とする。【選択図】図４
2021504477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2021504477.tif 000029
に係る化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、または立体異性体。
【請求項２】
前記化合物が、
【化２】
2021504477.tif 000030
2021504477.tif 000031
2021504477.tif 000032
2021504477.tif 000033
2021504477.tif 000034
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体と、薬学的に許容される局所用担体とを含む、局所用医薬組成物。
【請求項５】
創傷に罹っているかまたは罹りやすい対象を処置する方法であって、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体の有効量を、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項６】
前記創傷が、慢性創傷である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記創傷が、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
対象の創傷治癒を加速させる方法であって、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体の有効量を、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項９】
前記創傷が、慢性創傷である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記創傷が、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＶＥＧＦにより媒介される障害または疾患に罹っているかまたは罹りやすい対象を処置する方法であって、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体の有効量を、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
前記障害または疾患が、ＶＥＧＦ−Ａにより媒介される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記障害または疾患が、創傷である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記創傷が、慢性創傷である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記創傷が、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
対象においてＶＥＧＦを誘導する方法であって、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。２０１７年１１月２２日出願の米国特許仮出願番号第６２／５８９，９５５号に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた発明に対する権利の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により認可されたＣＡ１７２３１０の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
創傷治癒は、複合的な生体プロセスであり、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、および血小板などのいくつかの細胞種の協調作用を含む、瘢痕組織の炎症、細胞増殖、組織の肉芽形成、およびリモデリングを含む一連の事象からなる（Ｃｌａｒｋ，  Ｒ．  Ａ．  （１９８５）  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ：  ｂａｓｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．  Ｉ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ａｃａｄ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １３，  ７０１−７２５；  Ｇｒｅａｖｅｓ，  Ｎ．  Ｓ．，  Ａｓｈｃｒｏｆｔ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｂａｇｕｎｅｉｄ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂａｙａｔ，  Ａ．  （２０１３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｃｉ．  ７２，  ２０６−２１７；  Ｇｏｒｅｎ，  Ｉ．，  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｅ．，  Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ，  Ｄ．，  Ｇｕｔｗｅｉｎ，  Ｐ．，  Ｓｅｉｔｚ，  Ｏ．，  Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．  （２００９）  Ａｋｔ１  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｒｉｖｅｎ  ＶＥＧＦ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ−ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｓｋｉｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １２９，  ７５２−７６４）。幅広い様々な増殖因子およびサイトカイン：血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が、創傷治癒の各段階に関与しており、多くの研究が、これら増殖因子の創傷治癒の惹起および促進に及ぼす重大な役割を明らかにしている（Ｇｒｅａｖｅｓ，  Ｎ．  Ｓ．，  Ａｓｈｃｒｏｆｔ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｂａｇｕｎｅｉｄ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂａｙａｔ，  Ａ．  （２０１３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｃｉ．  ７２，  ２０６−２１７；  Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ，  Ｓ．，  Ｓｔｏｊａｄｉｎｏｖｉｃ，  Ｏ．，  Ｇｏｌｉｎｋｏ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｂｒｅｍ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，  Ｍ．  （２００８）  Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．  １６，  ５８５−６０１）。これら増殖因子の調節不全は、創傷閉鎖を遅らせ、慢性損傷（たとえば糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］）をもたらし、これは米国において主要な医療負担となっている（Ｆａｌａｎｇａ，  Ｖ．  （２００５）  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐａ���ｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３６６，  １７３６−１７４３；  Ｂｒｅｍ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，  Ｍ．  （２００７）  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１７，  １２１９）。
【０００４】
今日までに、治療剤としての増殖因子の開発に多くの努力が費やされているにもかかわらず、この分野は期待外れなものである。ＤＦＵの処置に関して販売されている米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された唯一の増殖因子は、組み換え血小板由来の増殖因子、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのベカプレルミンである（Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ，  Ｓ．，  Ｂｒｅｍ，  Ｈ．，  Ｓｔｏｊａｄｉｎｏｖｉｃ，  Ｏ．，  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，  Ｍ．  （２０１４）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．  ２２，  ５６９−５７８）。また、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＧＭ−ＣＳＦを含む他の増殖因子も臨床試験中である（Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ，  Ｓ．，  Ｂｒｅｍ，  Ｈ．，  Ｓｔｏｊａｄｉｎｏｖｉｃ，  Ｏ．，  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，  Ｍ．  （２０１４）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．  ２２，  ５６９−５７８）。外部から増殖因子を局所投与する場合の制限の１つとして、これら増殖因子のタンパク質の性質による吸収の低さがある（Ｄｏｕ，  Ｃ．，  Ｌａｙ，  Ｆ．，  Ａｎｓａｒｉ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｒｅｅｓ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ａｈｍｅｄ，  Ａ．  Ｋ．，  Ｋｏｖｂａｓｎｊｕｋ，  Ｏ．，  Ｍａｔｓａｎｇｏｓ，  Ａ．  Ｅ．，  Ｄｕ，  Ｊ．，  Ｈｏｓｓｅｉｎｉ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ，  Ｃ．，  Ｆｏｘ−Ｔａｌｂｏｔ，  Ｋ．，  Ｔａｂｏｒ，  Ａ．  Ｔ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｌｉｕ，  Ｌ．，  Ｍａｒｔｉ，  Ｇ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｈａｒｍｏｎ，  Ｊ．  Ｗ．  （２０１４）  Ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２２，  ７５２−７６１；  Ｋｒｙｇｅｒ，  Ｚ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｆ．，  Ｄｏｇａｎ，  Ｔ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｃ．，  Ｌｉｎｅａｗｅａｖｅｒ，  Ｗ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｂｕｎｃｋｅ，  Ｈ．  Ｊ．  （２０００）  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  ｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ａ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｌａｐ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ：  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｒｏｕｔｅｓ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｌａｓｔ．  Ｓｕｒｇ．  ５３，  ２３４−２３９；  Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｓ．  Ｎ．，  Ｊｅｏｎｇ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ，  Ｍ．  Ｒ．  （２０１３）  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｂｙ  ｆｕｌｌ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ，  ｎｏｔ  ｊｕｓｔ  ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ３０，  １０９９−１１０９）。よって、小分子による創傷組織由来の内在性増殖因子の産生および分泌の刺激を目的とする代替の治療方法は、より有望であろう。
【０００５】
ＶＥＧＦは、最も強力な血管新生増殖因子のうちの１つであり、血管新生カスケードの全てのステップを促進する（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  （１９９９）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ５６，  ７９４−８１４）。ＶＥＧＦファミリーにおいて、ＶＥＧＦ−Ａは、腫瘍増殖、乾癬、および創傷治癒などの生理プロセスおよび疾患プロセスの両方を調節する最も十分に研究された血管新生増殖因子である（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．，  Ｈｉｌｌａｎ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｇｅｒｂｅｒ，  Ｈ．−Ｐ．，  ａｎｄ  Ｎｏｖｏｔｎｙ，  Ｗ．  （２００４）  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ，  ａｎ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ３，  ３９１−４００；  ＭｃＣｏｌｌ，  Ｂ．  Ｋ．，  Ｓｔａｃｋｅｒ，  Ｓ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ａｃｈｅｎ，  Ｍ．  Ｇ．  （２００４）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＥＧＦ  ｆａｍｉｌｙ  −  Ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ａｐｍｉｓ  １１２，  ４６３−４８０；  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，  Ｒ．  Ｋ．  （２０１１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，  ２９８−３０７）。ＶＥＧＦ−Ａは、創傷治癒の間にケラチノサイト、線維芽細胞、平滑筋細胞、血小板、好中球、およびマクロファージにより産生され、ケラチノサイトは、損傷後のＶＥＧＦ−Ａの主要な供給源であると考えられている（Ｒｏｓｓｉｔｅｒ，  Ｈ．，  Ｂａｒｒｅｓｉ，  Ｃ．，  Ｐａｍｍｅｒ，  Ｊ．，  Ｒｅｎｄｌ，  Ｍ．，  Ｈａｉｇｈ，  Ｊ．，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｅ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｔｓｃｈａｃｈｌｅｒ，  Ｅ．  （２００４）  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｌａｙｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４，  ３５０８−３５１６；  Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．，  Ｈｕｂｎｅｒ，  Ｇ．，  Ｂｒｅｉｅｒ，  Ｇ．，  Ｌｏｎｇａｋｅｒ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，  Ｄ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｓ．  （１９９５）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  １２６０７−１２６１３；  Ｂｒｏｗｎ，  Ｌ．  Ｆ．，  Ｙｅｏ，  Ｋ．，  Ｂｅｒｓｅ，  Ｂ．，  Ｙｅｏ，  Ｔ．  Ｋ．，  Ｓｅｎｇｅｒ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｄｖｏｒａｋ，  Ｈ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｗａｔｅｒ，  Ｌ．  （１９９２）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  （ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）  ｂｙ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６，  １３７５−１３７９）。ＶＥＧＦ−Ａは、創傷部位の内皮細胞に作用することにより血管新生を刺激する（Ｂａｏ，  Ｐ．，  Ｋｏｄｒａ，  Ａ．，  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，  Ｍ．，  Ｇｏｌｉｎｋｏ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｅｈｒｌｉｃｈ，  Ｈ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｂｒｅｍ，  Ｈ．  （２００９）  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｒｅｓ．  １５３，  ３４７−３５８）。ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子発現は、創傷後に皮膚でアップレギュレートされることが見出されている（Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．，  Ｈｕｂｎｅｒ，  Ｇ．，  Ｂｒｅｉｅｒ，  Ｇ．，  Ｌｏｎｇａｋｅｒ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，  Ｄ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｓ．  （１９９５）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  １２６０７−１２６１３）。さらに、遺伝的に糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）のマウスにおける皮膚修復の間のＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現パターンの変化は、創傷部位でのＶＥＧＦの合成および放出の機能障害が、慢性創傷に寄与し得ることを示唆した（Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．，  Ｈｕｂｎｅｒ，  Ｇ．，  Ｂｒｅｉｅｒ，  Ｇ．，  Ｌｏｎｇａｋｅｒ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，  Ｄ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｓ．  （１９９５）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  １２６０７−１２６１３）。これら知見と一致して、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの研究により、局所的または遺伝子導入によるＶＥＧＦ−Ａの投与が、血管新生、再上皮化、コラーゲンの蓄積、ならびに細胞外マトリックスの合成および成熟の刺激を介して実験的な創傷治癒を加速させることが示されている（Ｄｉ  Ｐｅｐｐｅ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｍａｎｇｏｎｉ，  Ａ．，  Ｚａｍｂｒｕｎｏ，  Ｇ．，  Ｓｐｉｎｅｔｔｉ，  Ｇ．，  Ｍｅｌｉｌｌｏ，  Ｇ．，  Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｃａｐｏｇｒｏｓｓｉ，  Ｍ．  Ｃ．  （２００２）  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＶＥＧＦ（１６５）  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ＣＤ１  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９，  １２７１；  Ｇａｌｅａｎｏ，  Ｍ．，  Ｄｅｏｄａｔｏ，  Ｂ．，  Ａｌｔａｖｉｌｌａ，  Ｄ．，  Ｃｕｃｉｎｏｔｔａ，  Ｄ．，  Ａｒｓｉｃ，  Ｎ．，  Ｍａｒｉｎｉ，  Ｈ．，  Ｔｏｒｒｅ，  Ｖ．，  Ｇｉａｃｃａ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ，  Ｆ．  （２００３）  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｏｕｓｅ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４６，  ５４６−５５５；  Ｍｉｃｈａｅｌｓ，  Ｊ．，  Ｄｏｂｒｙａｎｓｋｙ，  Ｍ．，  Ｇａｌｉａｎｏ，  Ｒ．  Ｄ．，  Ｂｈａｔｔ，  Ｋ．  Ａ．，  Ａｓｈｉｎｏｆｆ，  Ｒ．，  Ｃｅｒａｄｉｎｉ，  Ｄ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇｕｒｔｎｅｒ，  Ｇ．  Ｃ．  （２００５）  Ｔｏｐｉｃａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．  １３，  ５０６−５１２；  Ｂｒｅｍ，  Ｈ．，  Ｋｏｄｒａ，  Ａ．，  Ｇｏｌｉｎｋｏ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｅｎｔｅｒｏ，  Ｈ．，  Ｓｔｏｊａｄｉｎｏｖｉｃ，  Ｏ．，  Ｗａｎｇ，  Ｖ．  Ｍ．，  Ｓｈｅａｈａｎ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  Ａ．  Ｄ．，  Ｗｏｏ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｃ．，  Ｅｈｒｌｉｃｈ，  Ｈ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，  Ｍ．  （２００９）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １２９，  ２２７５−２２８７）。よって、上記の情報は、慢性創傷の処置におけるＶＥＧＦ−Ａ誘導因子の治療応用を強力に示唆している。
【０００６】
創傷および損傷の処置のために天然の生成物を使用することは、文明と同じく古くからある。古くから、人々は、ハーブ、蜂蜜、葉、オイルなどの治癒特性を認識していた（Ｆｏｒｒｅｓｔ，  Ｒ．  Ｄ．  （１９８２）  Ｅａｒｌｙ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｗｏｕｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｅｄ．  ７５，  １９８−２０５）。これまで同定されているこれら天然の創傷治癒剤の活性成分の全てではないが一部が、いくつかの構造的なクラス：ビタミン、テルペンまたはテルペノイド、ポリフェノール、およびアルカロイドに分類される（Ｒｅｉｃｈｒａｔｈ，  Ｊ．，  Ｌｅｈｍａｎｎ，  Ｂ．，  Ｃａｒｌｂｅｒｇ，  Ｃ．，  Ｖａｒａｎｉ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ，  Ｃ．  Ｃ．  （２００７）  Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｓ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ．  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  ３９，  ７１−８４；  Ｌｉｎ，  Ｔ．  Ｓ．，  Ａｂｄ  Ｌａｔｉｆｆ，  Ａ．，  Ａｂｄ  Ｈａｍｉｄ，  Ｎ．  Ａ．，  Ｎｇａｈ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｍａｚｌａｎ，  Ｍ．  （２０１２）  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ  Ｃｒｅａｍ  ｏｎ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒａｔｓ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．  Ａｌｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ；  ＭａｃＫａｙ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｌ．  （２００３）  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ａｌｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｖ．  ８，  ３５９−３７８；  Ｓｈｉｍ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｃｈｏｉ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｊｅｏｎｇ，  Ｍ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋａｎｇ，  Ｓ．  Ｓ．  （２００７）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｕｃｕｂｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｗｏｕｎｄｓ．  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  （Ｂｒｏｏｋｌｙｎ）．  ２１，  １０３７−１０４１；  Ｓｅｖｉｍｌｉ−Ｇｕｒ，  Ｃ．，  Ｏｎｂａｓiｌａｒ，  Ｉ．，  Ａｔｉｌｌａ，  Ｐ．，  Ｇｅｎｃ，  Ｒ．，  Ｃａｋａｒｃ，  Ｎ．，  Ｄｅｌｉｌｏgｌｕ−Ｇｕｒｈａｎ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｂｅｄｉｒ，  Ｅ．  （２０１１）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｙｃｌｏａｒｔａｎｅ−ｔｙｐｅ  ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｏｆ  Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｇｅｎｕｓ．  Ｊ．  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３４，  ８４４−８５０；  Ｓｈｕｋｌａ，  Ａ．，  Ｒａｓｉｋ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｊａｉｎ，  Ｇ．  Ｋ．，  Ｓｈａｎｋａｒ，  Ｒ．，  Ｋｕｌｓｈｒｅｓｔｈａ，  Ｄ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｄｈａｗａｎ，  Ｂ．  Ｎ．  （１９９９）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｓｉａｔｉｃｏｓｉｄｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｎｔｅｌｌａ  ａｓｉａｔｉｃａ．  Ｊ．  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６５，  １−１１；  Ｍｏｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｙ．  Ｍ．，  Ｌｅｅ，  Ｏ．  Ｈ．，  Ｌｅｅ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｋ．，  Ｃｈｕｎｇ，  Ｍ．  Ｈ．，  Ｐａｒｋ，  Ｙ．  Ｉ．，  Ｓｕｎｇ，  Ｃ．  Ｋ．，  Ｃｈｏｉ，  Ｊ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｉｍ，  Ｋ．  Ｗ．  （１９９９）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｌｏｅ  ｖｅｒａ  ｇｅｌ：  ｂｅｔａ−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ，  ａ  ｐｌａｎｔ  ｓｔｅｒｏｌ．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３，  １１７−１２３；  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｍｕｒｉｌｌｏ，  Ｒ．，  Ｂｒｕｈｎ，  Ｔ．，  Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ，  Ｇ．，  Ｇｏｅｔｔｅｒｔ，  Ｍ．，  Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，  Ｂ．，  Ｂｒｅｃｈｔ，  Ｖ．，  Ｌａｕｆｅｒ，  Ｓ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｍｅｒｆｏｒｔ，  Ｉ．  （２０１０）  Ｃａｔｅｃｈｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｒａｐｉｐｔａｄｅｎｉａ  ｒｉｇｉｄａ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  ７３，  ２０３５−２０４１；  Ｃｌｅｒｉｃｕｚｉｏ，  Ｍ．，  Ｔｉｎｅｌｌｏ，  Ｓ．，  Ｂｕｒｌａｎｄｏ，  Ｂ．，  Ｒａｎｚａｔｏ，  Ｅ．，  Ｍａｒｔｉｎｏｔｔｉ，  Ｓ．，  Ｃｏｒｎａｒａ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｌａ  Ｒｏｃｃａ，  Ａ．  （２０１２）  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｏｌｉｇｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｕｍ  ｖｕｌｇａｔｕｍ  Ｌ．  Ｈａｖｉｎｇ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．  ７８，  １６３９−１６４４；  Ｗａｎｇ，  Ｒ．，  Ｌｅｃｈｔｅｎｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｓｅｎｄｋｅｒ，  Ｊ．，  Ｐｅｔｅｒｅｉｔ，  Ｆ．，  Ｄｅｔｅｒｓ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈｅｎｓｅｌ，  Ａ．  （２０１３）  Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｌａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ＴＣＭ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ＴＣＭ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ  ８４，  ３０８−３１７；  Ｓｈａｒｉｆｉ，  Ｒ．，  Ｐａｓａｌａｒ，  Ｐ．，  Ｋａｍａｌｉｎｅｊａｄ，  Ｍ．，  Ｄｅｈｐｏｕｒ，  Ａ．  Ｒ．，  Ｔａｖａｎｇａｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｐａｋｎｅｊａｄ，  Ｍ．，  Ｍｅｈｒａｂａｎｉ  Ｎａｔａｎｚｉ，  Ｍ．，  Ｎｏｕｒｂａｋｈｓｈ，  Ｍ．，  Ａｈｍａｄｉ  Ａｓｈｔｉａｎｉ，  Ｈ．  Ｒ．，  Ａｋｂａｒｉ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｒａｓｔｅｇａｒ，  Ｈ．  （２０１３）  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｉｌｙｍａｒｉｎ  （Ｓｉｌｙｂｕｍ  ｍａｒｉａｎｕｍ）  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５１，  ２９８−３０３；  Ｐｏｒｒａｓ−Ｒｅｙｅｓ，  Ｂ．  Ｈ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｒｏｍａｎ，  Ｊ．，  Ｓｉｍｃｈｏｗｉｔｚ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｍｕｓｔｏｅ，  Ｔ．  Ａ．  （１９９３）  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｔａｓｐｉｎｅ  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２０３，  １８−２５；  Ｎｅｓｔｅｒｏｖａ，  Ｙ．  Ｖ．，  Ｐｏｖｅｔｉｅｖａ，  Ｔ．  Ｎ．，  Ｓｕｓｌｏｖ，  Ｎ．  Ｉ．，  Ｚｈｄａｎｏｖ，  Ｖ．  Ｖ．，  Ｈｒｉｃｈｋｏｖａ，  Ｔ．  Ｙ．，  Ｕｄｕｔ，  Ｅ．  Ｖ．，  Ｃｈａｙｋｏｖｓｋｉｙ，  Ａ．  Ｓ．，  Ｇａｙｄａｍｏｖｉｃｈ，  Ｎ．  Ｎ．，  Ａｎｄｒｅｅｖａ，  Ｔ．  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｄｙｇａｉ，  Ａ．  Ｍ．  （２０１２）  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｘｔｒａｃｔ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ  ｏｆ  ａｃｏｎｉｔｕｍ  ｂａｉｋａｌｅｎｓｅ．  Ｂｕｌｌ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １５２，  ４３９−４４３）。これら化合物は、皮膚細胞の増殖および遊走、血管新生、コラーゲン合成を促進すること、ならびに抗炎症性活性および殺菌活性を発揮することを含む様々な機構を介して創傷治癒を高める（Ｔｓａｌａ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ａｍａｄｏｕ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈａｂｔｅｍａｒｉａｍ，  Ｓ．  （２０１３）  Ｎａｔｕｒａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｐｈｙｔｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４，  ５３２−５６０）。これら従来の天然の供給源に加えて、海洋生物が、新規薬物にとって豊富な供給源となりつつある。たとえば、プソイドプテロシンは、抗炎症を介して創傷治癒を高めるオオイソバナ（ｇｏｒｇｏｎｉａｎ  ｃｏｒａｌ）由来の一連のジテルペン−ペントースグリコシド化合物である（Ｍａｙｅｒ，  Ａ．  Ｍ．  Ｓ．，  Ｇｌａｓｅｒ，  Ｋ．  Ｂ．，  Ｃｕｅｖａｓ，  Ｃ．，  Ｊａｃｏｂｓ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ｋｅｍ，  Ｗ．，  Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｒ．  Ｄ．，  ＭｃＩｎｔｏｓｈ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｐｏｔｔｓ，  Ｂ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｓｈｕｓｔｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．  （２０１０）  Ｔｈｅ  ｏｄｙｓｓｅｙ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：  ａ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ３１，  ２５５−２６５；  Ｄａｙ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｊａｂａｉａｈ，  Ｓ．，  Ｊａｃｏｂｓ，  Ｒ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｒ．  Ｄ．  （２０１３）  Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｓｅｕｄｏｐｔｅｒｏｓｉｎ  ａ  ｕｎｃｏｖｅｒｓ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍａｒ．  Ｄｒｕｇｓ  １１，  ３２５８−３２７１）。
【０００７】
海洋性シアノバクテリアは、ペプチド、ポリケチド、またはペプチド−ポリケチドのハイブリッドに属する様々な二次的な代謝物を産生する（Ｔａｎ，  Ｌ．  Ｔ．  （２００７）  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｉｎｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８，  ９５４−９７９）。海洋性シアノバクテリアが、抗癌、抗菌、プロテアーゼ阻害、免疫調節、神経調節の特性を含む幅広いスペクトラムの生体活性を有する化合物を産生し、医療用治療的使用にとって有効な供給源とみなされるという事実にも関わらず、これらは未だ、本出願人らが知る限り、創傷治癒に関連する活性と関連づけられていない。本明細書において、増殖因子の誘導因子としての海洋性シアノバクテリアから単離された新規の直鎖状デプシペプチドが記載されており、よって、創傷治癒における小ペプチドの役割についての新規の洞察を提供し、海洋性シアノバクテリア由来の化合物の活性スペクトラムを拡大する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ直鎖状デプシペプチド化合物、その医薬組成物、創傷治癒に影響を与える方法、および創傷治癒に関与する生体プロセス（たとえば炎症、細胞増殖、組織の肉芽形成、瘢痕組織のリモデリングなど）に影響を与える方法を目的とする。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、式：
【化１】
2021504477.tif 000003
に係る化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、または立体異性体を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明の化合物は、
【化２】
2021504477.tif 000004
2021504477.tif 000005
2021504477.tif 000006
2021504477.tif 000007
2021504477.tif 000008
のうちの１つ、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体である。
【００１１】
別の態様では、本発明は、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体と、薬学的に許容される局所用担体とを含む局所用医薬組成物を提供する。
【００１３】
一態様では、本発明は、対象の疾患、障害、またはその症状を処置する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体を前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、創傷に罹っているかまたは罹りやすい対象を処置する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、前記対象の創傷を処置するように、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。別の態様では、創傷は、慢性創傷である。別の態様では、慢性創傷は、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である。
【００１５】
別の態様では、本発明は、対象の創傷治癒を加速させる方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、前記対象の創傷の治癒が加速するように、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。別の態様では、創傷は、慢性創傷である。別の態様では、慢性創傷は、慢性創傷は、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である。一実施形態では、この加速は、列挙した化合物の投与がない状態の創傷治癒のレベルと比較される。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）により媒介される障害または疾患に罹っているかまたは罹りやすい対象を処置する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。別の態様では、ＶＥＧＦ（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）により媒介される障害または疾患は、創傷である。別の態様では、この創傷は慢性創傷である。別の態様では、慢性創傷は、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、対象のＶＥＧＦ（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）を誘導する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、対象の血管新生を増大させる方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、この増大は、列挙した化合物の投与がない状態での血管新生のレベルと比較される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）を誘導する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、血管新生を増大させる方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、この増大は、列挙した化合物の投与がない状態での血管新生のレベルと比較される。
【００２１】
別の態様は、本明細書中記載の化合物のいずれか、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体の有効量を単位剤形で含み、加えて創傷に罹っているかまたは罹りやすい対象に上記化合物を投与するための説明書を含むキットである。別の態様では、この創傷は、慢性創傷である。別の態様では、慢性創傷は、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である。
【００２２】
さらに本発明を、以下の非限定的な実施例および以下の図面に準拠して、以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＤＭＳＯ−ｄ６（６００ＭＨｚ）中の天然の生成物Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトラムを表す。
【図２】図２は、ＤＭＳＯ−ｄ６（６００ＭＨｚ）中の天然の生成物Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトラムを表す。
【図３】図３は、ＤＭＳＯ−ｄ６（６００ＭＨｚ）中のＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）のＮＭＲ分光データを表す。
【図４】図４は、１のＥＳＩＭＳフラグメンテーションパターンを表す。
【図５】図５は、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）の天然の生成物（黒色、ＤＭＳＯ−ｄ６（６００ＭＨｚ））および合成生成物（青色、ＤＭＳＯ−ｄ６（４００ＭＨｚ））の１Ｈ  ＮＭＲスペクトラムを表す。
【図６】図６は、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）の天然の生成物（黒色、ＤＭＳＯ−ｄ６（１５０ＭＨｚ））および合成生成物（青色、ＤＭＳＯ−ｄ６（１００ＭＨｚ））の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトラムを表す。
【図７】図７は、定量化のためのウサギのＶＥＧＦ−Ａプローブの検量線を表す。
【図８】図８は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのデータ解析での確実性効果の増大を表す。
【図９】図９Ａは、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌）細胞における１６時間でのＶＥＧＦ−Ａの転写レベルを表し；図９Ｂは、ＨＣＴ１１６細胞およびＣＣＤ−１８Ｃｏ細胞における４８時間での１の抗増殖作用を表す。
【図１０】図１０は、ＣＣＤ−１８Ｃｏ（ヒトの正常な結腸）細胞における１６時間でのＶＥＧＦ−Ａの転写レベルを表す。
【図１１】図１１は、３０μＭの１による４時間の処置および１２時間の処置の後の、ＨａＣａＴ細胞におけるＶＥＧＦ−Ａの転写物レベルを表す。
【図１２】図１２は、１６時間後のＨａＣａＴ細胞におけるＶＥＧＦ−Ａの転写物レベルを表す。
【図１３】図１３Ａは、２４時間後のＨａＣａＴ細胞からのＶＥＧＦ−Ａの分泌レベルを表し；図１３Ｂは、ＨａＣａＴ細胞における２４時間での１の抗増殖活性を表す。
【図１４】図１４Ａは、ＨａＣａＴ細胞における１６時間でのＰＤＧＦＢの転写物レベルを表し、図１４Ｂは、ＨａＣａＴ細胞における１６時間でのｂＦＧＦの転写物レベルを表す。
【図１５】図１５は、３０μＭの１による３時間の処置および１２時間の処置の後の転写物の変化に関するヒートマップを表す。
【図１６】図１６は、３０μＭのＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）での１２時間の処置後にアップレギュレートされた遺伝子およびダウンレギュレートされた遺伝子の上位の選択されたグループを表す。
【図１７】図１７Ａは、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）のトランスクリプトームプロファイリングのためＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用した、上位の調節因子の作用のネットワークを表し；図１７Ｂは、細胞の侵害（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）および細胞の維持の機能に関連する上位の関連した分子ネットワークを表す。
【図１８】図１８は、１．４５×１０−１６のＰ値でのＩＰＡ解析による上位の標準経路（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）としての小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路の同定を表す。赤色は、アップレギュレートされた転写物を表す。緑色は、ダウンレギュレートされた転写物を表す。
【図１９】図１９は、イムノブロット解析を使用してトランスクリプトームプロファイリングから選択されたヒットの検証を表す。
【図２０】図２０は、３０μＭのＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅによる１２時間の処置の後のアップレギュレートされた遺伝子およびダウンレギュレートされた遺伝子の完全なリストを表す。
【図２１】図２１Ａは、ＨＵＶＥＣを使用したマトリゲルアッセイ（スケールバー２００μＭ）によって１４時間で決定した場合、化合物１または溶媒対照のＤＭＳＯ（０．３％）の２４時間の存在下でのＨａＣａＴ培養物由来の条件培地（ＣＭ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生を誘導したことを表す。ＶＥＧＦ−Ａタンパク質１００ｎｇ／ｍＬを、陽性対照として使用した。またＨＵＶＥＣ用の完全増殖培地（ＥＧＭ，  Ｌｏｎｚａ）も、陽性対照として使用した。；図２１Ｂは、定量化法として使用した分岐点計測（ｂｒａｎｃｈ  ｐｏｉｎｔ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を表す。３つの無作為な顕微鏡視野を計測し、各ウェルの分岐点の数を平均化した。エラーバーは、２つの独立した実験からの８つのレプリケートの平均値＋ＳＥＭを表す。Ｐ値は、対応のないｔ検定を使用して対照（ＣＭ−ＤＭＳＯ）と比較して計算した（ｎ＝８）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２２】図２２は、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅが、ウサギの角膜上皮のｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおいてＶＥＧＦ−Ａを誘導したことを表す。データは、平均値＋ＳＥＭとして表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図２３】図２３は、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅが、ウサギの角膜上皮のｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおいてＶＥＧＦ−Ａを誘導したことを表す。データは、平均値＋ＳＥＭとして表す（＊Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
定義
本発明がより容易に理解され得るために、最初に、簡便性のため、特定の用語を定義する。
【００２５】
本明細書中使用される場合、用語障害を「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｅｇ）」は、障害および／または障害をもたらし得る病態を予防する、改善する、和らげる、および／または管理することを含む。用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｅｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患および／またはそれに付随する症状を緩和するまたは弱める方法を表す。本発明では、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｅｇ）」は、たとえば障害の有害な作用を、予防、遮断、阻害、減弱、当該作用から保護、当該作用を調節、反転すること、および当該作用の発症を低減することを含む。
【００２６】
本明細書中使用される場合、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、進行を予防、低減、および／または停止することを含む。
【００２７】
用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、本発明の化合物への曝露に応答した細胞の活性の増加または減少を表す。
【００２８】
用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、天然の状態で見出される際に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を表す。純度および均一性は、通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。特に、実施形態では、本化合物は、少なくとも８５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９０％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である。
【００２９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために、本明細書中互換可能に使用される。これら用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的ミメティックであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然には存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００３０】
「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸の配列である。ペプチドは、タンパク質を含む、短鎖アミノ酸配列および長鎖アミノ酸配列からなり得る。
【００３１】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類縁体および天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸ミメティックを表す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、たとえばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類縁体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合する炭素を有する化合物、たとえばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを表す。このような類縁体は、修飾されたＲ基（たとえばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸ミメティックは、一般的なアミノ酸の化学構造とは異なるが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する構造を有する化学化合物を表す。
【００３２】
用語「タンパク質」は、隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに接続する一連のアミノ酸残基を表す。
【００３３】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨されている、一般に知られている３文字の記号または１文字の記号のいずれかにより表さ得る。
【００３４】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列における単一のアミノ酸、または複数アミノ酸のごく一部を変更、付加、または欠失させる、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に対する個別の置換、欠失、または付加が、「保存的に改変されたバリアント」であり、変化によってアミノ酸と化学的に類似するアミノ酸との置換がもたらされることを認識しているであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野でよく知られている。
【００３５】
ポリペプチド構造などのマクロ分子の構造は、様々なレベルの構造化の観点から記載され得る。この構造化の一般的な論述については、たとえばＡｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  （３ｒｄ  ｅｄ．，  １９９４）  ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ．  Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （１９８０）を参照されたい。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を表す。「二次構造」は、局所的に順序付けされた、ポリペプチドの中の３次元構造を表す。これら構造は、一般的にドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトな単位を形成するポリペプチドの一部であり、通常、５０〜３５０アミノ酸長である。典型的なドメインは、βシートおよびαヘリックスの区間などの小さな構造化のセクションから構成されている。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な３次元構造を表す。「四次構造」は、独立した三次の単位の非共有結合により形成される３次元構造を表す。また異方性の用語は、エネルギー用語としても知られている。
【００３６】
用語「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏ）」または「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｎｇ）」は、意図される機能を行うために対象に化合物を導入する経路を含む。使用され得る投与経路の例として、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内）、局所投与、経口投与、吸入、直腸投与、経皮投与が挙げられる。
【００３７】
用語「有効量」は、所望の結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を含む。化合物の有効量は、対象の疾患状態、年齢、および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する化合物の能力などの要因によって変動し得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するために調節され得る。また有効量は、エラスターゼ阻害剤化合物のいずれの毒性作用または有害作用（たとえば副作用）を、治療上有用な作用が上回る量でもある。
【００３８】
「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」との文言は、本明細書中使用される場合、化合物、薬物、または他の物質が、患者の系に入ることにより代謝および他の同様のプロセスの対象となるような、化合物、薬物、または他の物質の投与を意味する。
【００３９】
用語「治療上有効量」は、処置される病態または障害の症状のうちの１つ以上の発症を予防するか、またはある程度まで緩和するために十分な、投与される化合物の量を表す。
【００４０】
化合物の治療上有効量（すなわち有効用量）は、約０．００５μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。他の実施形態では、治療上有効量は、約１．０ｐＭから約５００ｎＭの範囲であり得る。当業者は、限定するものではないが、対象の疾患もしくは障害の重症度、以前の処置、全般的な健康状態および／または年齢、ならびに他の疾患の存在を含む特定の要因が、対象を有効に処置するために必要な用量に影響を与え得ることを理解している。さらに、治療上有効量の化合物による対象の処置は、単回処置を含み得、または好ましくは、一連の処置を含み得る。一例では、対象は、約０．００５μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の化合物で、約１〜１０週間、好ましくは約２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、およびさらにより好ましくは約４、５、または６週間の間に、１週間あたり１回処置される。また、処置に使用される化合物の有効用量は、特定の処置の過程で増加または減少し得ることが理解される。
【００４１】
用語「キラル」は、鏡像のパートナーの重なりあうことができない性質を有する分子を表し、用語「アキラル」は、自身の鏡像パートナーと重なり合うことができる分子を表す。
【００４２】
用語「ジアステレオマー」は、２つ以上の非対称中心を有し、その分子が互いの鏡像ではない立体異性体を表す。
【００４３】
用語「エナンチオマー」は、互いの重なりあうことができない鏡像である、化合物の２つの立体異性体を表す。２つのエナンチオマーの等モル混合物は、「ラセミ混合物」または「ラセミ体」と呼ばれる。
【００４４】
用語「異性体」または「立体異性体」は、同一の化学構成を有するが、空間における原子または基の配置が異なる化合物を表す。
【００４５】
用語「プロドラッグ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで代謝され得る部分を有する化合物を含む。全般的に、プロドラッグは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてエステラーゼまたは他の機構により有効な薬物へと代謝される。プロドラッグおよびそれらの使用の例は、当該分野でよく知られている（たとえばＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：１−１９参照）。プロドラッグは、化合物の最終的な単離および精製の間に、または精製した化合物の遊離酸の形態もしくはヒドロキシルを適切なエステル化剤と反応させることにより、ｉｎ  ｓｉｔｕで調製され得る。ヒドロキシル基は、カルボン酸による処置を介してエステルへと変換され得る。プロドラッグ部分の例として、置換および非置換の、分枝状または非分枝状の、低級アルキルエステル部分（たとえばプロピオン酸エステル）、低級アルケニルエステル、ジ低級アルキルアルキルアミノ低級アルキルエステル（たとえば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル（たとえば、アセチルオキシメチルエステル）、アシルオキシ低級アルキルエステル（たとえば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール−低級アルキルエステル（たとえば、ベンジルエステル）、置換（たとえばメチル、ハロ、またはメトキシ置換基による）アリールおよびアリール−低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ−低級アルキルアミド、およびヒドロキシアミドが挙げられる。好ましいプロドラッグ部分は、プロピオン酸エステルおよびアシルエステルである。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで他の機構を介して有効な形態へと変換されるプロドラッグも含まれる。
【００４６】
用語「対象」は、動物、限定するものではないが、霊長類（たとえばヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む哺乳類を表す。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００４７】
さらに、本発明の化合物は、いずれかの幾何学を有するオレフィンを含む：「Ｚ」は、「シス」（同じ側）の立体構造と呼ばれるものを表し、「Ｅ」は、トランス（反対側）の立体構造と呼ばれるものを表す。キラル中心の命名法に関連して、用語「ｄ」および「ｌ」の立体構造は、ＩＵＰＡＣの推奨により定義される通りである。用語ジアステレオマー、ラセミ体、エピマー、およびエナンチオマーの使用に関して、これらは、製剤の立体化学を説明するための通常の文脈で使用される。
【００４８】
本明細書中使用される場合、用語「アルキル」は、１〜１２の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素基を表す。用語「低級アルキル」は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル鎖を表す。アルキル基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびｎ−ペンチルが挙げられる。アルキル基は、任意選択で、１つ以上の置換基で置換されてもよい。
【００４９】
用語「アルケニル」は、２〜１２の炭素原子と少なくとも１つの炭素間二重結合とを含む、直鎖または分枝鎖であり得る不飽和炭化水素鎖を表す。アルケニル基は、任意選択で、１つ以上の置換基で置換されてもよい。
【００５０】
用語「アルキニル」は、２〜１２の炭素原子と少なくとも１つの炭素間三重結合とを含む、直鎖または分枝鎖であり得る不飽和炭化水素鎖を表す。アルキニル基は、任意選択で、１つ以上の置換基で置換されてもよい。
【００５１】
アルケニル基およびアルキニル基のｓｐ２炭素またはｓｐ炭素は、それぞれ、任意選択で、アルケニル基またはアルキニル基の結合点であり得る。
【００５２】
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキルラジカルを表す。
【００５３】
本明細書中使用される場合、用語「ハロゲン」、「ｈａｌ」、または「ハロ」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉを意味する。
【００５４】
用語「シクロアルキル」は、少なくとも１つの飽和環を有するかまたは少なくとも１つの非芳香環（ここで非芳香環は、ある程度の不飽和を有し得る）を有する、炭化水素の３〜８員の単環系または７〜１４員の二環系を表す。シクロアルキル基は、任意選択で１つ以上の置換基で置換されてもよい。一実施形態では、シクロアルキル基の各環の０、１、２、３、または４つの原子が、置換基で置換され得る。シクロアルキル基の代表的な例として、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロブチル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどが挙げられる。
【００５５】
用語「アリール」は、炭化水素の単環、二環、または三環の芳香環系を表す。アリール基は、任意選択で１つ以上の置換基で置換されてもよい。一実施形態では、アリール基の各環の０、１、２、３、４、５、または６つの原子が、置換基で置換され得る。アリール基の例として、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フルオレニル、インデニル、アズレニルなどが挙げられる。
【００５６】
用語「ヘテロアリール」は、単環の場合は１〜４つの環ヘテロ原子、二環の場合は１〜６つのヘテロ原子、三環の場合は１〜９つのヘテロ原子を有する、芳香族の５〜８員の単環系、８〜１２員の二環系、または１１〜１４員の三環系を表し、ここでヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され、残りの環原子は、炭素である（特段他が記載されない限りは適切な水素原子を伴う）。ヘテロアリール基は、任意選択で１つ以上の置換基で置換されてもよい。一実施形態では、各環の０、１、２、３、または４つの原子が、置換基で置換され得る。ヘテロアリール基の例として、ピリジル、フラニル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソキサゾリル、キノリニル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、イソキノリニル、インダゾリルなどが挙げられる。
【００５７】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、単環の場合は１〜３つのヘテロ原子、二環の場合は１〜６つのヘテロ原子、三環の場合は１〜９つのヘテロ原子を含む、非芳香族の３〜８員の単環系、７〜１２員の二環系、または１０〜１４員の三環系を表し、ここでヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｂ、Ｐ、またはＳｉから選択され、この非芳香環系は完全に飽和されている。ヘテロシクロアルキル基は、任意選択で１つ以上の置換基で置換されてもよい。一実施形態では、ヘテロシクロアルキル基の各環の０、１、２、３、または４つの原子が、置換基で置換され得る。代表的なヘテロシクロアルキル基として、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、モルフォリニル、チオモルフォリニル、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チイレニル（ｔｈｉｉｒｅｎｙｌ）などが挙げられる。
【００５８】
用語「アルキルアミノ」は、１つまたは２つのアルキル基でさらに置換されているアミノ置換基を表す。用語「アミノアルキル」は、１つ以上のアミノ基でさらに置換されているアルキル置換基を表す。用語「ヒドロキシアルキル」または「ヒドロキシルアルキル」は、１つ以上のヒドロキシル基でさらに置換されているアルキル置換基を表す。アルキルアミノ、アミノアルキル、メルカプトアルキル、ヒドロキシアルキル、メルカプトアルコキシ、スルホニルアルキル、スルホニルアリール、アルキルカルボニル、およびアルキルカルボニルアルキルのアルキルまたはアリール部分は、任意選択で１つ以上の置換基で置換されてもよい
【００５９】
本明細書中の方法に有用な酸または塩基は、当該分野で知られている。酸触媒は、本質的に無機（たとえば塩酸、硫酸、硝酸、三塩化アルミニウム）または有機（たとえばカンファースルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、イッテルビウムトリフラート）であり得る、いずれかの酸性の化学物質である。酸は、化学反応を促進させるための触媒量または化学量論的な量で有用である。塩基は、本質的に無機（たとえば炭酸水素ナトリウムまたは水酸化カリウム）または有機（たとえばトリエチルアミン、ピリジン）であり得る、いずれかの塩基性の化学物質である。塩基は、化学反応を促進させるための触媒量または化学量論的な量で有用である。
【００６０】
アルキル化剤は、議論となる官能基（たとえばアルコールの酸素、アミノ基の窒素原子）のアルキル化に作用することができるいずれかの試薬である。アルキル化剤は、本明細書中記載の参照文献に記載されるものを含み当該分野で知られており、ハロゲン化アルキル（ヨウ化メチル、臭化ベンジルまたは塩化ベンジル）、アルキル硫酸塩（たとえば硫酸メチル）、または他の当該分野で知られているアルキル基−脱離基の組み合わせを含む。脱離基は、反応（たとえば除去反応、置換反応）の間に分子から脱離し得るいずれかの安定した種であり、本明細書中記載の参照文献に記載されるものを含み当該分野で知られており、ハロゲン化物（たとえばＩ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｆ−）、ヒドロキシ、アルコキシ（たとえば−ＯＭｅ、−Ｏ−ｔ−Ｂｕ）、アシルオキシアニオン（たとえば−ＯＡｃ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３）、スルホン酸塩（たとえばメシル、トシル）、アセトアミド（たとえば−ＮＨＣ（Ｏ）Ｍｅ）、カルバミン酸塩（たとえばＮ（Ｍｅ）Ｃ（Ｏ）Ｏｔ−Ｂｕ）、ホスホン酸塩（たとえば−ＯＰ（Ｏ）（ＯＥｔ）２）、水、またはアルコール（プロトン性の状態）などが挙げられる。
【００６１】
特定の実施形態では、いずれかの基（たとえばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル）での置換は、その基のいずれかの原子上での置換であり得、ここで置換され得るいずれかの基（たとえばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルなど）は、任意選択で、それぞれが水素原子と置き換えられる（同じかまたは異なり得る）１つ以上の置換基で置換され得る。適切な置換基の例として、限定するものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、オキソ（すなわちカルボニル）、カルボキシル、ホルミル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシカルボニル、チオ、メルカプト、メルカプトアルキル、アリールスルホニル、アミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アルキルアミノカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルカルボニル、またはアリールアミノ置換アリール；アリールアルキルアミノ、アラルキルアミノカルボニル、アミド、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、イミノ、カルバミド，カルバミル、チオウレイド、チオシアナート、スルホアミド、スルホニルアルキル、スルホニルアリール、またはメルカプトアルコキシが挙げられる。
【００６２】
本発明の化合物
一実施形態では、本発明は、式：
【化３】
2021504477.tif 000009
に係る化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、または立体異性体を提供する。
【００６３】
別の実施形態では、本発明の化合物は、
【化４】
2021504477.tif 000010
2021504477.tif 000011
2021504477.tif 000012
2021504477.tif 000013
2021504477.tif 000014
のうちの１つ、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体である。
【００６４】
本発明の化合物は、天然の供給源から入手され得るか、または有機合成の分野で知られている手段により作製もしくは改変して作製され得る。必要に応じて競合する副生成物を最小限にする、反応条件を最適化するための方法が、当該分野で知られている。反応の最適化およびスケールアップは、好適には、高速並行合成機器およびコンピュータ制御されたマイクロリアクター（たとえばＤｅｓｉｇｎ  Ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｒ，  Ｅｄ，  ２００５；  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．；  Ｊａｈｎｉｓｃｈ，  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｇｅｗ．    Ｃｈｅｍ．    Ｉｎｔ．    Ｅｄ．    Ｅｎｇｌ．  ２００４  ４３：  ４０６；およびそれらの中の参照文献）を利用し得る。さらなる反応のスキームおよびプロトコルが、市販の構造−検索可能なデータベースソフトウェア、たとえばＳｃｉＦｉｎｄｅｒ（登録商標）（ＣＡＳ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）およびＣｒｏｓｓＦｉｒｅ  Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ（登録商標）（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＭＤＬ）の使用によるか、またはＧｏｏｇｌｅ（登録商標）などのインターネット検索エンジンもしくは米国特許商標庁のテキストデータベースなどのキーワードのデータベースを使用する適切なキーワード検索により、当業者によって決定され得る。たとえば、式Ｉ〜ＶＩＩＩの化合物は、Ｄｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ．  ２００６  Ｆｅｂ  ２；８（３）：５３１−４；  Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２００６  Ｏｃｔ  １０；１２（２９）：７６１５−２６；  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００４  Ａｕｇ  １７；１０１（３３）：１２０６７−７２を含む、当該分野で知られている方法を使用して作製され得る。
【００６５】
また本明細書中の化合物は、結合（たとえば炭素間結合）をも含み得、ここで結合の回転は、たとえば環または二重結合の存在からもたらされる制限により、特定の結合に関して制限されている。よって、すべてのシス／トランスおよびＥ／Ｚの異性体は、本発明に明らかに含まれている。また本明細書中の化合物は、複数の互変異性の形態で表されてもよく、このような例では、本発明は、単一の互変異性の形態のみが提示され得る場合であっても、本明細書中記載の化合物の全ての互変異性の形態を明らかに含む。このような本明細書中の化合物の全ての異性体の形態は、明らかに本発明に含まれている。本明細書中記載の化合物の全ての結晶の形態および多形の形態は、明らかに本発明に含まれている。同様に、本発明の化合物を含む抽出物およびフラクションも具現化される。用語異性体は、ジアステレオ異性体、エナンチオマー、位置異性体、構造異性体、回転異性体、互変異性体などを含むように意図されている。１つ以上の不斉中心を含む化合物、たとえばキラル化合物では、本発明の方法は、エナンチオマーが豊富な化合物、ラセミ体、またはジアステレオマーの混合物を用いて行われ得る。
【００６６】
好ましいエナンチオマーが豊富な化合物は、５０％以上のエナンチオマー過剰率を有し、より好ましくはこの化合物は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％、またはそれ以上のエナンチオマー過剰率を有する。好ましい実施形態では、本発明のキラル化合物のうち１つのみのエナンチオマーまたはジアステレオマーが、細胞または対象に投与される。
【００６７】
処置の方法
一態様では、本発明は、対象の疾患、障害、またはその症状を処置する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体を前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、創傷に罹っているかまたは罹りやすい対象を処置する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、前記対象が創傷に関して処置されるように、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。別の態様では、創傷は、慢性創傷である。別の態様では、慢性創傷は、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である。
【００６９】
別の態様では、本発明は、対象の創傷治癒を加速させる方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、前記対象の創傷の治癒が加速するように、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。別の態様では、創傷は、慢性創傷である。別の態様では、慢性創傷は、慢性創傷は、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である。
【００７０】
別の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）により媒介される障害または疾患に罹っているかまたは罹りやすい対象を処置する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。別の態様では、ＶＥＧＦ（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）により媒介される障害または疾患は、創傷である。別の態様では、この創傷は慢性創傷である。別の態様では、慢性創傷は、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である。
【００７１】
別の態様では、本発明は、対象のＶＥＧＦ（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）を誘導する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００７２】
別の態様では、本発明は、対象の血管新生を増大させるための方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００７３】
別の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）を誘導する方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００７４】
別の態様では、本発明は、血管新生を増大させるための方法であって、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体、または医薬組成物の有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００７５】
本発明の別の目的は、創傷の処置に使用するための医薬の製造における、本明細書中記載の化合物（たとえば本明細書中のいずれかの式の化合物）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体の使用である。本発明の別の目的は、創傷の処置に使用するための、本明細書中記載の化合物（たとえば本明細書中のいずれかの式の化合物）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体の使用である。別の態様では、創傷は慢性創傷である。別の態様では、慢性創傷は、糖尿病性足部潰瘍［ＤＦＵ］、褥瘡［ＰＵ］、または慢性下腿静脈潰瘍［ＶＵ］である。
【００７６】
医薬組成物
一態様では、本発明は、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体と、薬学的に許容される担体とを含む局所用医薬組成物を提供する。一実施形態では、本明細書中の式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体は、局所投与を介した創傷への直接の投与に特に適しており、よって好適には、クリーム、ローション、ゲルを介して創傷に直接投与されるか、または経皮的に創傷領域へ投与される。別の実施形態では、局所組成物は、その中に式のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体を有するパッチ、包袋、または他のドレッシング材を介して適用され得る。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、化合物が、式：
【化５】
2021504477.tif 000015
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、または立体異性体である、
医薬組成物を提供する。
【００７９】
一実施形態では、本発明は、化合物が、
【化６】
2021504477.tif 000016
2021504477.tif 000017
2021504477.tif 000018
2021504477.tif 000019
2021504477.tif 000020
のうちの１つ、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、もしくは立体異性体である、医薬組成物を提供する。
【００８０】
別の実施形態では、本発明は、さらなる治療剤をさらに含む医薬組成物を提供する。
【００８１】
用語「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容される担体」は、本明細書中記載の化合物で見出される特定の置換基に応じて、比較的非毒性である酸または塩基で調製される有効な化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が、相対的に酸性の官能性を含む場合、未希釈（ｎｅａｔ）であるかまたは適切な不活性の溶媒中のいずれかで、当該化合物の中性の形態を十分な量の望ましい塩基と接触させることにより、塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウムの塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が相対的に塩基性の官能性を含む場合、未希釈であるかまたは適切な不活性の溶媒中のいずれかで、当該化合物の中性の形態を十分な量の望ましい酸と接触させることにより、酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リン酸、一水素リン酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、二水素リン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、硫酸、一水素硫酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などの無機塩に由来する塩、および酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。また、アルギン酸塩などのアミノ酸の塩、ならびにグルクロン酸およびガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）などの有機酸の塩なども含まれる（たとえばＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６６：１−１９  （１９７７）参照）。本発明の特定の具体的な化合物は、塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに化合物を変換させる塩基および酸の官能性の両方を含む。当業者に知られている他の薬学的に許容される担体は、本発明に適切である。
【００８２】
本化合物の中性の形態は、この塩を、塩基または酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することにより、再生成され得る。本化合物の親の形態は、極性溶媒中の溶解度などの特定の物理的な性質において、様々な塩の形態と異なるが、その他では、この塩は、本発明の目的に関して、本化合物の親の形態と同等である。
【００８３】
塩の形態に加え、本発明は、プロドラッグの形態である化合物を提供する。本明細書中記載の化合物のプロドラッグは、本発明の化合物を提供するため、生理的条件下で化学的変化を容易に受ける化合物である。さらにプロドラッグは、ｅｘ  ｖｉｖｏでの環境での化学的または生化学的な方法により、本発明の化合物に変換することができる。たとえば、プロドラッグは、適切な酵素または化学的な試薬と共に経皮パッチのリザーバーに載置される場合、本発明の化合物へとゆっくりと変換され得る。
【００８４】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和の形態および水和物の形態を含む溶媒和物の形態で存在し得る。一般に、溶媒和物の形態は非溶媒和の形態と同等であり、本発明の範囲内に包有されるように意図されている。本発明の特定の化合物は、多結晶（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）またはアモルファスの形態で存在し得る。一般に、すべての物理的な形態が、本発明が企図する使用で同等であり、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【００８５】
また本発明は、本明細書中記載の化合物の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、化合物は、薬学的に許容される製剤、たとえば、対象に薬学的に許容される製剤が投与されてから少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、１週間、２週間、３週間、または４週間、対象への本化合物の持続的な送達を提供する薬学的に許容される製剤を使用して、対象へ投与される。
【００８６】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルおよび投与の時間的経過は、患者に対して毒性（または許容され得ない毒性）ではなく、特定の患者、組成物、および投与形式に関して、所望の治療応答を達成するために有効である量の活性成分を得るために、変動し得る。
【００８７】
使用において、本発明に係る少なくとも１つの化合物が、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、もしくは脳室内注射によるか、または経口投与または局所的塗布により、薬学的な担体中でそれを必要とする対象へ薬学的に有効な量で投与される。本発明では、本発明の化合物は、単独で投与されるか、または第２の異なる治療用物質と共に投与され得る。「〜と共に」は、まとめて、実質的に同時にまたは連続を意味する。一実施形態では、本発明の化合物は急性的に投与される。よって本発明の化合物は、たとえば約１日から約１週間といった短期間の処置で投与され得る。別の実施形態では、本発明の化合物は、慢性障害を改善するために、長期間、たとえば処置される病態に応じて約１週間〜数カ月にわたり投与され得る。
【００８８】
「薬学的有効量」は、本明細書中使用される場合、妥当な医学的の判断範囲内で、処置される病態を有意に正に改変するためには十分多いが、重篤な副作用を回避するためには十分に少ない（合理的なリスク対効果の比での）本発明の化合物の量を意味する。本発明の化合物の薬学的有効量は、達成すべき特定の目的、処置される患者の年齢および健康状態、基礎疾患の重症度、処置の期間、使用される併用療法の性質および特定のＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅの化合物の性質で、変動するであろう。たとえば、小児または新生児に投与される本発明の化合物の治療上有効量は、妥当な医学的判断にしたがい、比例して減少されるであろう。よって本発明の化合物の有効量は、所望の効果を提供する最小量である。
【００８９】
本化合物は、非経口投与されるかまたは腹腔内投与され得る。また分散剤を、たとえば、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物において、ならびに油において、調製することができる。
【００９０】
注射可能な使用に適切な薬学的な形態として、無菌性の水系の液剤（水に可溶性）または分散剤、および無菌性の注射可能な液剤または分散剤の即時調製のための無菌性散剤が挙げられる。すべての場合でこの形態は無菌性でなければならず、注射針を容易に通過できる度合いまで流動的でなければならない。これは、製造および保存の条件下で安定していなければならない。この担体は、たとえば水、ＤＭＳＯ、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体のポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散剤の場合必要とされる粒径の維持により、維持することができる。多くの場合、たとえば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射可能組成物の持続的吸収は、組成物において、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった吸収を遅延させる作用物質を使用することによりもたらされ得る。
【００９１】
無菌性の注射可能な液剤は、上述の様々な他の成分を含む適切な溶媒に本発明の化合物を必要量組み込み、必要に応じてろ過滅菌を行うことにより調製される。
全般的に、分散剤は、基本的な分散媒体および上記に列挙されるもの由来の必要とされる他の成分を含む滅菌性のビヒクルに、様々な滅菌された化合物を組み込むことにより調製される。無菌性の注射可能な液剤の調製用の無菌性散剤の場合では、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて以前に滅菌ろ過されたその溶液の追加的な望ましい成分をもたらす真空乾燥および凍結乾燥の技術である。
【００９２】
経口の治療的投与では、本化合物は、賦形剤と共に組み込まれていてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウェハなどの形態で使用され得る。本発明に係る組成物または調製物は、経口の単位剤形が、対象の障害を処置するために十分な化合物濃度を含むように調製されている。
【００９３】
薬学的担体として作用し得る物質の例の一部は、糖、たとえばラクトース、グルコース、およびスクロース；デンプン、たとえばコーンスターチおよびポテトスターチ；セルロースおよびその誘導体、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末状のトラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、たとえばピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および、カカオ油（ｏｉｌ  ｏｆ  ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）；ポリオール、たとえばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトールマンニトール、およびポリエチレングリコール；寒天；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；およびリン酸緩衝液；スキムミルクの粉末；ならびに医薬の製剤化で使用される他の非毒性の適合性のある物質、たとえばビタミンＣ、エストロゲン、およびエキネシアである。ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および滑沢剤、ならびに着色剤、香味料、滑沢剤、賦形剤、錠剤化剤、安定剤、抗酸化剤、および保存剤もまた存在し得る。
【００９４】
本明細書で開示される主題の活性化合物（またはそのプロドラッグ）を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠の作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥のプロセスにより、製造され得る。本組成物は、活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への処理を容易にする１つ以上の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を使用して、従来の方法により製剤化され得る。
【００９５】
本明細書で開示される主題の医薬組成物は、たとえば局所、眼、経口、バッカル、全身、経鼻、注射、経皮、直腸、膣などを含む実質的に任意の投与形式に適切な形態をとり得るか、または吸入もしくは吹き入れによる投与に適切な形態をとり得る。
【００９６】
局所投与では、活性化合物またはプロドラッグは、液剤、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁剤などとして製剤化され得る。
【００９７】
全身製剤は、注射、たとえば皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、または腹腔内注射による投与のために設計された製剤、および経皮投与、経粘膜投与、経口投与、または肺投与のために設計された製剤を含む。
【００９８】
有用な注射可能な調製物は、水性または油性のビヒクルにおける活性化合物の無菌性の懸濁剤、液剤、またはエマルジョンを含む。また本組成物は、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤を含み得る。注射用の製剤は、単位剤形（たとえばアンプルまたはマルチドーズの容器）で提示され得、添加された保存剤を含み得る。
【００９９】
あるいは、注射可能な製剤は、限定するものではないが、使用前に、無菌性のパイロジェンフリー水、バッファー、デキストロース溶液などを含む適切なビヒクルによる再構成のための、粉末の形態で提供され得る。この目的のため、活性化合物は、凍結乾燥などのいずれかの当該分野で知られている技術により乾燥され、使用前に再構成され得る。
【０１００】
経粘膜投与では、透過される障壁に対して適切な浸透剤が、製剤に使用される。このような浸透剤は、当該分野で知られている。
【０１０１】
経口投与では、医薬組成物は、たとえば、結合剤（たとえばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（たとえばラクトース、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（たとえばポテトスターチまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤によって従来の手段により調製される、ロゼンジ、錠剤、またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、たとえば糖または腸溶コーティングによって当該分野でよく知られている方法によりコーティングされ得る。
【０１０２】
経口投与用の液体の調製物は、たとえば、エリキシル剤、液剤、シロップ剤、または懸濁剤の形態をとり得るか、または使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提示され得る。このような液体の調製物は、懸濁化剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）；乳化剤（たとえばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（たとえばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および保存剤（たとえばメチルまたはプロピル  ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤によって従来の手段により調製され得る。この調製物はまた、バッファーの塩、保存剤、香味料、着色剤、および甘味剤を適宜含み得る。
【０１０３】
経口投与用の調節物は、よく知られているように、活性化合物またはプロドラッグの制御された放出を提供するように適切に製剤化され得る。
【０１０４】
バッカル投与では、本組成物は、従来の方法で製剤化される錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。
【０１０５】
直腸および膣の投与経路では、活性化合物は、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を含む、液剤（停留浣腸用）、坐剤、または軟膏として製剤化され得る。
【０１０６】
経鼻投与または吸入もしくは吹き入れによる投与では、活性化合物またはプロドラッグは、適切な噴霧剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フルオロカーボン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用する加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で簡便に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定され得る。本化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な散剤基剤との粉末の混合物を含む、インヘラーまたは注入器で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（たとえばゼラチンから構成されるカプセルおよびカートリッジ）を製剤化することができる。
【０１０７】
市販の経鼻スプレー装置を使用した経鼻投与に適切な水性懸濁製剤の具体的な例は、以下の成分：活性化合物またはプロドラッグ（０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ）；塩化ベンザルコニウム（０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬ）；ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０；０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）；カルボキシメチルセルロースナトリウムまたは結晶セルロース（１〜１５ｍｇ／ｍｌ）；フェニルエタノール（１〜４ｍｇ／ｍｌ）；およびデキストロース（２０〜５０ｍｇ／ｍｌ）を含む。最終的な懸濁物のｐＨは、約ｐＨ５〜ｐＨ７の範囲に調節され得るが、約５．５のｐＨが典型的である。
【０１０８】
眼への投与では、活性化合物またはプロドラッグは、眼への投与に適切な液剤、エマルジョン、懸濁剤などとして製剤化され得る。眼へ化合物を投与するのに適切な様々なビヒクルが、当該分野で知られている。具体的な非限定的な例は、それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２６１，５４７号；米国特許第６，１９７，９３４号；米国特許第６，０５６，９５０号；米国特許第５，８００，８０７号；米国特許第５，７７６，４４５号；米国特許第５，６９８，２１９号；米国特許第５，５２１，２２２号；米国特許第５，４０３，８４１号；米国特許第５，０７７，０３３号；米国特許第４，８８２，１５０号；および米国特許第４，７３８，８５１号に記載されている。
【０１０９】
持続的送達のため、活性化合物またはプロドラッグは、埋め込みまたは筋肉内注射による投与のためのデポー調製物として製剤化され得る。活性成分を、適切なポリマー物質もしくは疎水性物質と共に（たとえば許容可能な油におけるエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂と共に製剤化することができ、または難溶性誘導体、たとえば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０１１０】
あるいは、経皮的な吸収で活性化合物をゆっくりと放出する接着性のディスクまたはパッチとして製造される経皮送達システムが使用され得る。この目的のために、活性化合物の経皮的浸透を容易にするために浸透促進剤を使用することができる。適切な経皮パッチは、たとえば、それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている、米国特許第５，４０７，７１３号；米国特許第５，３５２，４５６号；米国特許第５，３３２，２１３号；米国特許第５，３３６，１６８号；米国特許第５，２９０，５６１号；米国特許第５，２５４，３４６号；米国特許第５，１６４，１８９号；米国特許第５，１６３，８９９号；米国特許第５，０８８，９７７号；米国特許第５，０８７，２４０号；米国特許第５，００８，１１０号；および米国特許第４，９２１，４７５号に記載されている。
【０１１１】
あるいは、他の薬学的な送達システムが使用され得る。リポソームおよびエマルジョンは、活性化合物またはプロドラッグを送達するために使用され得る送達ビヒクルのよく知られている例である。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの特定の有機溶媒もまた使用することができる。
【０１１２】
本医薬組成物は、必要に応じて、活性化合物を含む１つ以上の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置に提示され得る。このパックは、例えば、金属またはプラスティックのホイル、たとえばブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付することができる。
【０１１３】
本明細書で開示される主題の活性化合物もしくはプロドラッグ、またはそれらの組成物は、全般的に、意図した結果を達成するために有効な量、たとえば処置される特定の疾患を処置または予防するために有効な量で使用される。本化合物は、治療上の利点を達成するために治療として、または予防的な利点を達成するために予防として、投与され得る。治療上の利点は、処置される基礎障害の根絶もしくは改善、および／または患者が未だ基礎障害を罹患しているが患者が感覚または状態の改善を報告するような基礎障害に関連する症状のうちの１つ以上の根絶もしくは改善を意味する。たとえば、アレルギーを罹患している患者への化合物の投与は、根底にあるアレルギー応答が根絶または改善される場合の治療上の利点だけでなく、アレルゲンへ曝露された後にアレルギーに関連する症状の重症度または持続期間の減少を患者が報告する場合の治療上の利点をも提供する。別の例として、喘息に関連する治療上の利点は、喘息の発作の発症後の呼吸の改善、または喘息のエピソードの頻度もしくは重症度の低減を含む。また治療上の利点は、改善が認識されるかどうかにかかわらず、疾患の進行の停止または遅延を含む。
【０１１４】
予防的投与では、本化合物は、前述の疾患のうちの１つを発症するリスクのある患者へ投与され得る。疾患を発症するリスクのある患者は、適切な医療の専門家またはグループにより定義される、患者を指定されたリスク患者のグループに置く特徴を有する患者であり得る。リスクのある患者はまた、通常または日常的に、本発明に係る金属酵素の阻害剤の投与により治療され得る基礎疾患の発症が起こり得る状況にある患者であり得る。言い換えると、リスクのある患者は、通常または日常的に病態を引き起こし得る疾患または疾病にさらされているか、または限定した時間の間急性的にさらされ得る患者である。あるいは、予防的投与は、基礎障害と診断された患者の症状の発症を回避するために適用され得る。
【０１１５】
投与される化合物の量は、たとえば処置される特定の適応、投与形式、望ましい利点が予防的または治療的であるかどうか、処置される適応の重症度、ならびに患者の年齢および体重、特定の活性化合物のバイオアベイラビリティなどを含む様々な要因に応じて変動する。有効用量の決定は、十分に、当業者の能力の範囲内にある。
【０１１６】
有効用量は、最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイから推定することができる。特定の化合物のバイオアベイラビリティを考慮して当該循環血中濃度または血漿中濃度を達成するための用量を計算することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。ガイダンスとして、参照によって本明細書中に組み込まれている、Ｆｉｎｇｌ  ＆  Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，  ”Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，”  Ｉｎ：  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １，  ｐｐ．  １−４６，  ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐａｇａｍｏｎｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、およびその中に記載される引用文献を参照されたい。
【０１１７】
また初回用量は、動物モデルなどのｉｎ  ｖｉｖｏのデータから推定することができる。上述の様々な疾患を処置または予防するための化合物の効能の試験に有用な動物モデルは、当該分野でよく知られている。
【０１１８】
用量は、通常、約０．０００１または０．００１または０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、他の要因の中でも特に、化合物の活性、そのバイオアベイラビリティ、投与形式、および上述の様々な要因に応じてこれよりも高くまたは低くなり得る。投与の量および間隔は、治療効果または予防効果を維持するために十分である化合物の血漿中レベルを提供するように、個別に調節され得る。限局的な局所投与などの局所投与または選択的な取り込みの場合、活性化合物の有効な局所濃度は、血漿中濃度に関連しない場合がある。当業者は、過度に実験を行うことなく有効な局所用量を最適化することができる。
【０１１９】
本化合物は、特に処置される適応および処方医師の判断に応じて、１日あたり１回、１日あたり数回、またはさらには１日あたり複数回、投与され得る。好ましくは、本化合物は、実質的な毒性を伴うことなく治療的または予防的な利点を提供する。本化合物の毒性は、標準的な薬学的手法を使用して決定され得る。毒性作用と治療（または予防）効果との間の用量比は、治療指数である。高い治療指数を示す化合物が好ましい
【０１２０】
本明細書中の変数のいずれかの定義における化学基の列挙の記載は、いずれかの単一の基または列挙される基の組み合わせとしての当該変数の定義を含む。本明細書中の変数に関する実施形態の記載は、いずれかの単一の実施形態としての当該実施形態、または他のいずれかの実施形態もしくはその一部と組み合わせた当該実施形態を含む。本明細書中の実施形態の記載は、いずれかの単一の実施形態としての当該実施形態、または他のいずれかの実施形態もしくはその一部と組み合わせた当該実施形態を含む。
【０１２１】
実施例
ここで本発明を、限定と解釈すべきではない特定の実施例を使用して例証する。
【０１２２】
全般的な実験手順
溶媒は、標準的な方法により精製した。ＴＬＣは、Ｍｅｒｃｋ  ６０Ｆ２５４シリカゲルプレートで行い、ＵＶ照射または酸性のモリブデン酸アンモニウム水溶液による染色により適宜視覚化した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（１７０〜４００メッシュ、Ｆｉｓｈｅｒ，  ＵＳＡ）上で行った。旋光は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ３４１旋光計で測定した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、データリストに記載されるように、Ｖａｒｉａｎ  ４００ＭＨｚまたはＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  ６００ＭＨｚの分光器で記録した。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）スペクトルの化学シフトは、７．２６ｐｐｍでの残留ＣＤＣｌ３および２．５０ｐｐｍでのＤＭＳＯ−ｄ６のシグナルと比較した百万分率で記録されている。炭素核磁気共鳴（１３Ｃ  ＮＭＲ）スペクトルの化学シフトは、７７．０ｐｐｍでのＣＤＣｌ３トリプレットおよび４０．０ｐｐｍでのＤＭＳＯ−ｄ６の中心線と比較した百万分率で記録されている。データは、以下：化学シフト、多重度（ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｂｒ＝ブロード、ｍ＝マルチプレット）、結合定数（Ｈｚ）、積分、および割り当てとして記載されている。ＨＲＥＳＩＭＳデータは、ＡＰＣＩ／ＥＳＩマルチモードイオンソース検出器を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ−ＴＯＦ質量分析装置を使用して得た。
【０１２３】
実施例１：Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）の単離および構造の決定
凍結乾燥したアプラタキシンを産生するモオレア・ボウイルロニ（Ｍｏｏｒｅａ  ｂｏｕｉｌｌｏｎｉｉ）の５つの異なるグアムコレクション（Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、グアムのフィンガーリーフから回収した（Ｌｕｅｓｃｈ，  Ｈ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｗ．  Ｙ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｐａｕｌ，  Ｖ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｃｏｒｂｅｔｔ，  Ｔ．  Ｈ．  （２００１）  Ｔｏｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｒａｔｏｘｉｎ  Ａ，  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｌｙｎｇｂｙａ  ｍａｊｕｓｃｕｌａ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２３，  ５４１８−５４２３）。それぞれを、個別にＣＨ２Ｃｌ２およびＭｅＯＨ（２：１）で抽出した後、溶媒分配、シリカクロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣの精製を行い、少量の代謝物として光学的に活性な化合物１（２．０ｍｇ、［α］Ｄ２０−１０１．９（ｃ  ０．５９、ＭｅＯＨ））を得た。
【化７】
2021504477.tif 000021
【０１２４】
ポジティブモードでの１のＨＲＥＳＩＭＳは、ｍ／ｚ  ８０５．４３８８［Ｍ＋Ｈ］＋で分子イオンのピークを示し、不飽和度１７を有するＣ４４Ｈ６０Ｎ４Ｏ１０の分子式を示唆していた。１の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図１）は、いくつかのα−プロトン（δＨ  ３．４〜５．３）、交換可能なアミドのプロトン（δＨ  ８．０８）、４つのＮ−メチル（δＨ  ２．２〜２．８）、および２つのＯ−メチル（δＨ  ３．５〜３．７）に特徴的なペプチドシグナルを呈した。典型的な酸素付加されたｓｐ３炭素に対応している、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルにおけるδＣ  ７５．０９でのシグナルは、アミノ酸に加えてヒドロキシ酸の存在を示唆していた。１Ｄおよび２ＤのＮＭＲ実験の解釈により、１Ｈおよび１３ＣのＮＭＲシグナル（図３）は、５つの部分構造：３つの修飾チロシン［Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ（１−ＯＭｅ）およびＮ，Ｎ−ジＭｅ−Ｔｙｒ（ＯＭｅ）］、１つのタンパク質原性アミノ酸（Ｖａｌ）、ならびに１つのαヒドロキシ酸部分［２−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸（Ｈｍｐａ）］に割り当てることができた。これらユニットの配列は、ＨＭＢＣおよびＮＯＥＳＹの相関に基づき確立され（図３）、さらに、ＥＳＩＭＳフラグメンテーションにより検証された（図４）。１の絶対配置を、エナンチオ選択的ＨＰＬＣ解析および真正標準物質との比較により決定した。
【０１２５】
実施例２：Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅの全般的な合成
以下のスキームは、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅの調製のための合成プロセスを表す。
【化８】
2021504477.tif 000022
上記のスキームは、対応する特定の絶対配置を特定することなくその中に例示される化合物を表しているが、すべてのジアステレオアイソマー、エナンチオマー、位置異性体、構造異性体、回転異性体、および互変異性体は、上記スキームに明示的に含まれている。当業者は、上記の化合物の任意の特定のステレオアイソマーが、出発アミノ酸の出発物質のそれぞれに関して適切な絶対配置を選択することにより、上記のスキームに記述されるプロセスを使用して、提供され得ることを、理解および認識するであろう。
【０１２６】
実施例３：Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）の全合成
天然由来のＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅの供給が限定されているため、生物学的な評価のためより多くの物質を得るために、全合成を行った。以下の収束的合成を、２つの構成ブロック：エステルおよびトリペプチドを得ることにより行った。エステルを構築するために、２つの市販のアミノ酸を、出発物質として得た。α−ヒドロキシカルボン酸４を、公開されているプロトコル（Ｐｏｔｅｒａｌａ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｐｌｅｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｊ．  （２０１１）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｃｈｉｒａｌ  ｉｏｎｉｃ  ｌｉｑｕｉｄｓ  ｆｒｏｍ  α−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ２２，  ２９４−２９９）により、Ｌ−イソロイシンから調製した。酸４によるＮ−Ｂｏｃ−Ｏ−Ｍｅ−チロシンのエステル化は、光延反応（Ｐｈ３Ｐ／ＤＥＡＤ）（Ｇｒａｂ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｂｒａｓｅ，  Ｓ．  （２００５）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｃｔａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｃｔａｔｅｓ．  Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ３４７，  １７６５−１７６８）により９６％の収率でエステル５を提供した。エステル５のＢｏｃ基を、酢酸エチル中４ＭのＨＣｌを使用して除去した。次に、所望のＮ，Ｎ−ジメチルアミノエステル２を、ＨＣＨＯ水溶液およびＮａＢＨ３ＣＮの混合物を使用する５の遊離アミンの還元的アルキル化反応により形成した（Ｃｏｎｒｏｙ，  Ｔ．，  Ｇｕｏ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｌｉｎｉｎｇｔｏｎ，  Ｒ．  Ｇ．，  Ｈｕｎｔ，  Ｎ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｐａｙｎｅ，  Ｒ．  Ｊ．  （２０１１）  Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇａｌｌｉｎａｍｉｄｅ  Ａ．  Ｃｈｅｍ．  −  Ａ  Ｅｕｒ．  Ｊ．  １７，  １３５４４−１３５５２）。エステル２の末端の酸の基を、ＭｅＯＨ中でＰｄ／Ｃ／Ｈ２による水素付加により遊離した。トリペプチド３を、カップリング系ＥＤＣＩ／ＨＯＡｔを使用して、Ｎ−Ｍｅ−チロシン（ＯＢｎ）と、次にＮ−Ｂｏｃ−バリンとＮ−Ｂｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−チロシン（ＯＢｎ）の連続的なカップリングによりスムーズに構築した（Ｃｈｅｎ，  Ｙ．，  Ｂｉｌｂａｎ，  Ｍ．，  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｃ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂｏｇｅｒ，  Ｄ．  Ｌ．  （２００２）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ＨＵＮ−７２９３  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｃ  （ｄｅｐｓｉ）ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２４，  ５４３１−５４４０）。３のＢｏｃ基を、酢酸エチル中４ＭのＨＣｌにより切断して、酢酸塩を含まないアミンを得て、次にエステル２の遊離酸と結合させて、ＤＭＦ中のＨＡＴＵ／ＨＯＡを使用して前駆体７を提供した。最後に、ＭｅＯＨ中でのＰｄ／Ｃ／Ｈ２による７の水素付加により、最終的な生成物１を６３％の収率で提供した。天然および合成のＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）のＮＭＲスペクトルは、同一であった（図５および６）。天然および合成の１の光学活性およびＨＲ−ＭＳの比較により、さらに、天然の生成物に関する構造的な割り当てが確認された。
【化９】
2021504477.tif 000023
【０１２７】
化合物４の合成
７．８７ｇ（６０ｍｍｏｌ）の１−Ｉｌｅを、氷冷したＨ２ＳＯ４（４０ｍＬ、２．５ｍｏｌ／Ｌ）に溶解した。６．２１ｇ（９０ｍｍｏｌ）のＮａＮＯ２を、３０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、上記の溶液に滴下した。この混合物を０℃で２時間保存した後、室温に温め、さらに１６時間撹拌した。ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ×１、１００ｍＬ×３）で抽出した後に、合わせた有機相を、ブライン（５０ｍＬ×１）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮して、無色の油としてαヒドロキシ酸（４．５０ｇ、５７％）を提供し、さらに精製することなく次のステップに使用した。
【０１２８】
混合した溶媒（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、６０ｍＬ／１５ｍＬ）中の上記で得られたα−ヒドロキシ酸（２．６４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に、２０ｍＬのＨ２Ｏ中のＣｓ２ＣＯ３（３．９１ｇ、１２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、５分間撹拌した後に、濃縮乾固した。粗製のセシウム塩を、３０ｍＬのＤＭＦに再度溶解した後、ＢｎＢｒ（２．８５ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）を添加し、次に２４時間撹拌した。
【０１２９】
溶媒をろ過および除去した後、残渣を水（５０ｍＬ）に懸濁し、Ｅｔ２Ｏ（１５０ｍＬ×１、５０ｍＬ×３）で抽出した。この抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製して、無色の油として所望のベンジルエステル（４）（（３．４５ｇ、７８％）を得た。
【０１３０】
化合物４．［α］Ｄ２０  −１３．４  （ｃ  １．５８，  ＭｅＯＨ）；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ７．３０−７．２８  （ｍ，  ５Ｈ，  ＡｒＨ），  ５．２３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  ＰｈＣＨａＨｂ），  ５．１７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  ＰｈＣＨａＨｂ），  ４．１１  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．２，  １．６  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−２），  ２．７９  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １．８８−１．７５  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈ−３），  １．３５−１．３０  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈ−４ａ），  １．２７−１．１６  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈ−４ｂ），  ０．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ０．８４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ３Ｈ，  ＣＨ３）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １００  ＭＨｚ）  δ  １７５．０，  １３５．４，  １２８．８，  １２８．７，  １２８．６，  ７５．０，  ６７．３，  ３９．３，  ２３．８，  １５．６，  １１．９；  ＥＳＩ−ＭＳ  （ｍ／ｚ）  ２４５．３  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；  ＨＲＥＳＩＭＳ  Ｃ１３Ｈ１８Ｏ３Ｎａ  ｃａｌｃｄ  ２４５．１１４８  ［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ｆｏｕｎｄ  ２４５．１１５５．
【０１３１】
化合物５の合成
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＭｅ）−ＯＨ（７０８．７ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）、アルコール４（４４４．６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、およびＰｈ３Ｐ（７８６．９ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解した。氷冷槽によって２０分間冷却した後、１．４０ｍＬ（３．０ｍｍｏｌ）のＤＥＡＤ（トルエン中４０％の溶液）をこの混合物に滴下した。０℃で１時間、次に室温でさらに１５時間撹拌した後、溶媒を真空下で除去した。この残渣を、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油として所望の化合物（５）（９５４．８０ｍｇ、９６％）を得た。
【０１３２】
化合物５．［α］Ｄ２０  ＋  ２．９  （ｃ  ０．５１，  ＭｅＯＨ）；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ７．３６−７．２８  （ｍ，  ５Ｈ，  ＡｒＨ），  ７．０５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ａｒ  ＝Ｈ），  ６．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ａｒ  Ｈ），  ５．１８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｃ６Ｈ５ＣＨａＨｂＯ），  ５．１３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｃ６Ｈ５ＣＨａＨｂＯ），  ５．０１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６１  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．８，  ６．６  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｔｙｒ  αＨ），  ３．７５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＯＣＨ３），  ３．０８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １４．１，  ６．１  Ｈｚ，  １Ｈ，  ｐ−ＭｅＯＣ６Ｈ４ＣＨａＨｂ），  ２．９６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １４．１，  ６．６  Ｈｚ，  １Ｈ，  ｐ−ＭｅＯＣ６Ｈ４ＣＨａＨｂ），  １．９７−１．９３  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  Ｈ−３），  １．３９  （ｓ，  ９Ｈ，  Ｂｏｃ），  １．３４−１．２８  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  Ｈ−４ａ），  １．２４−１．１４  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  Ｈ−４ｂ），  ０．８６６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ３Ｈ，  Ｈｍｐ  ＣＨ３），  ０．８６５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  ３Ｈ，  Ｈｍｐ  ＣＨ３）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １００  ＭＨｚ）  δ  １７１．９，  １６９．５，  １５８．８，  １５５．１，  １３５．５，  １３０．５，  １２８．８，  １２８．６，  １２８．５，  １２８．１，  １１４．１，  ８０．０，  ７５．８，  ６７．２，  ５５．４，  ５４．８，  ３７．６，  ３６．８，  ２８．５，  ２６．０，  １４．４，  １１．８；  ＥＳＩ−ＭＳ  （ｍ／ｚ）  ５２２．４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；  ＨＲＥＳＩＭＳ  Ｃ２８Ｈ３７ＮＯ７Ｎａ  ｃａｌｃｄ  ５２２．２４６９  ［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ｆｏｕｎｄ  ５２２．２４８３．
【０１３３】
化合物２の合成
４９９．６ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）の化合物５を、４ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で１時間処置した。濃縮乾固した後、５ｍＬのＥｔＯＡを添加し、この溶液を再度濃縮した。残渣をＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）に溶解した後、０℃でＤＩＥＡ（２４８μＬ、１．５ｍｍｏｌ）を添加し、次に３７％のホルムアルデヒド水溶液、次にＡｃＯＨ（０．１ｍＬ）を添加した。１時間撹拌した後、ＮａＢＨ３ＣＮ（１８８．５ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を注意深く添加した。ＡｃＯＨを定期的に添加して、ｐＨを５〜７に維持し、この混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。真空下で濃縮した後、残渣をＥｔＯＡｃに再度溶解し、飽和Ｎａ２ＣＯ３溶液およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、カラムクロマトグラフィーにより精製して、無色の油として化合物２（収率４６％）を得た。
【０１３４】
化合物２．［α］Ｄ２０  ＋  ５８．７  （ｃ  １．４６，  ＭｅＯＨ）；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ７．３５−７．３０  （ｍ，  ５Ｈ，  ＡｒＨ），  ７．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．７７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ５．１７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｃ６Ｈ５ＣＨａＨｂＯ），  ５．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｃ６Ｈ５ＣＨａＨｂＯ），  ４．８９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  αＨ），  ３．７４  （ｓ，  ３Ｈ，  ＯＣＨ３），  ３．４６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．７，  ５．７  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｔｙｒ  αＨ），  ２．９８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．２，  １０．０  Ｈｚ，  １Ｈ，  ｐ−ＭｅＯＣ６Ｈ４ＣＨａＨｂ），  ２．８６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．４，  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ，  ｐ−ＭｅＯＣ６Ｈ４ＣＨａＨｂ），  ２．３９  （ｓ，  ６Ｈ，  ＮＭｅ２），  １．８６−１．７８  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  Ｈ−３），  １．０１−０．８４  （ｍ，  ２Ｈ，  Ｈｍｐ  Ｈ−４），  ０．７５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ３Ｈ，  Ｈｍｐ  ＣＨ３），  ０．６８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ３Ｈ，  Ｈｍｐ  ＣＨ３）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １００  ＭＨｚ）  δ  １７１．７，  １７０．０，  １５８．４，  １３５．５，  １３０．３，  １３０．０，  １２８．７，  １２８．６，  １１４．０，  ７４．７，  ６９．５，  ６７．１，  ５５．４，  ４１．８，  ３６．６，  ３６．２，  ２５．８，  １４．４，  １１．７；  ＥＳＩ−ＭＳ  （ｍ／ｚ）  ４２８．５  ［Ｍ＋Ｈ］＋；  ＨＲＥＳＩＭＳ  Ｃ２５Ｈ３４ＮＯ５  ｃａｌｃｄ  ４２８．２４３１  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  ｆｏｕｎｄ  ４２８．２４３８．
【０１３５】
化合物６の合成
Ｈ−ＭｅＴｙｒ（ＯＢｎ）−ＯＭｅ塩酸塩（１００７．５ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）および１０７９．０ｍｇ（２．８ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＭｅＴｙｒ（ＯＢｎ）−ＯＨを、６０ｍＬの氷冷したＤＣＭに溶解した。ＥＤＣ（６４４．０ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４５７．０ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（９２６μＬ、５．６ｍｍｏｌ）を、それぞれ添加した。この混合物を０℃で２時間撹拌し、次に室温でさらに１６時間撹拌した後に、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈した。有機相を、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ（２０ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ×３）、ブライン（２０ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。この残渣を、カラムクロマトグラフィーにより精製して、無色の油として所望のジペプチド６（１５００．７ｍｇ、８０％）を得た。
【０１３６】
化合物６．［α］Ｄ２０  −１０３．２  （ｃ  ０．５０，  ＭｅＯＨ）；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ，  回転異性体の混合物）  δ  ７．３８−７．２７  （ｍ，  １０Ｈ，  ＡｒＨ），  ７．１７−７．０２  （ｍ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．８８−６．７７  （ｍ，  ６Ｈ，  ＡｒＨ），  ５．１７−５．０６  （ｍ，  １Ｈ，  Ｔｙｒ  αＨ），  ５．０３−４．９６  （ｂｒｄ，  ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ，  ４Ｈ，  Ｃ６Ｈ５ＣＨ２Ｏ  ×  ２），  ４．７２  （ｄｄ  ｌｉｋｅ  ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ，  １Ｈ，  Ｔｙｒ  αＨ），  ３．７２，  ３．７０２，  ３．６９５，  ３．６８８  （ｅａｃｈ  ｓ，  ｔｏｔａｌ  ３Ｈ，  ＣＯ２ＣＨ３），  ３．３３−３．１９，  ３．０２−２．９６，  ２．９２−２．８９，  ２．７３−２．７２  （ｄｄ  ｌｉｋｅ  ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ，  ｔｏｔａｌ  ４Ｈ，  ｐ−ＢｎＯＣ６Ｈ４ＣＨ２  ×  ２），  ２．９３，  ２．８５，  ２．７６，  ２．６８，  ２．６５，  ２．６０，  ２．３９，  ２．２８  （ｅａｃｈ  ｓ，  ｔｏｔａｌ  ６Ｈ，  Ｎ−ＣＨ３  ×  ２），  １．３２，  １．２７，  １．１７，  １．１４  （ｅａｃｈ  ｓ，  ｔｏｔａｌ  ９Ｈ，  Ｂｏｃ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３，  回転異性体の混合物）  δ  １７１．１，  １７０．６，  １５７．７，  １５７．６，  １５５．３，  １３７．４，  １３７．２，  １３０．８，  １３０．７，  １２９．９，  １２８．８，  １２８．７，  １２８．１３，  １２８．０７，  １２７．６，  １２７．５，  １１５．３，  １１４．８，  ８０．５，  ７０．２，  ５８．６，  ５６．５，  ５２．５，  ３４．５，  ３３．７，  ３２．７，  ２９．３，  ２８．４；  ＥＳＩ−ＭＳ  （ｍ／ｚ）  ６８９．５  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；  ＨＲＥＳＩＭＳ  Ｃ４０Ｈ４６Ｎ２Ｏ７Ｎａ  ｃａｌｃｄ  ６８９．３１９７  ［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ｆｏｕｎｄ  ６８９．３１９７．
【０１３７】
化合物３の合成
ジペプチド６（６４１．７ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を、４ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で１時間処置した。濃縮乾固した後、５ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、この溶液を再度濃縮した。得られたアミン塩酸塩およびＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（２０９．０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬの乾燥したＤＣＭに溶解し、氷冷槽で冷却した。ＥＤＣ（２２０．８ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（１５６．８ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（３１７μＬ、１．９ｍｍｏｌ）を、それぞれ添加した。この混合物を、この温度で２時間撹拌し、室温でさらに１６時間撹拌した。次に、混合物を、１５０ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ（２０ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ×３）、ブライン（２０ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。この残渣を、カラムクロマトグラフィーにより精製して、白色のフォームとして所望のポリペプチド３（２２０．９ｍｇ、３０％）を得た。
【０１３８】
化合物３．［α］Ｄ２０  −１６５．２（ｃ  ０．２５，  ＭｅＯＨ）；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ，  回転異性体の混合物）  δ  ７．３８−７．２７  （ｍ，  １０Ｈ，  ＡｒＨ），  ７．１５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．８０−６．７５  （ｍ，  ４Ｈ，  ＡｒＨ），  ５．４９  （ｔ  ｌｉｋｅ，  Ｊ  ＝  ７．６，  ６．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０４−４．９４  （ｍ，  ４Ｈ，  Ｃ６Ｈ５ＣＨ２Ｏ  ×  ２），  ４．８３−４．７７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３０  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．１，  ４．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＯ２ＣＨ３），  ３．２７−３．１７  （ｍ，  ２Ｈ，  ＡｒＣＨ２），  ２．９６−２．８１  （ｍ，  ２Ｈ，  ＡｒＣＨ２），  ２．６１  （ｓ，  ３Ｈ，  Ｎ−ＣＨ３），  ２．５９  （ｓ，  ３Ｈ，  Ｎ−ＣＨ３），  １．７８−１．６９  （ｍ，  １Ｈ，  Ｖａｌ  βＨ），  １．４１  （ｓ，  ９Ｈ，  Ｂｏｃ），  ０．８９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ３Ｈ，  Ｖａｌ  ＣＨ３），  ０．７７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，  ３Ｈ，  Ｖａｌ  ＣＨ３）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １００  ＭＨｚ，  回転異性体の混合物）  δ  １７１．９，  １７０．９，  １６９．９，  １５８．１，  １５７．８，  １５５．９，  １３７．３，  １３７．０，  １３０．８，  １３０．０，  １２９．４，  １２８．８，  １２８．７，  １２８．２，  １２８．０，  １２７．７，  １２７．６２，  １２７．５９，  １１５．１，  １１４．８，  ７９．７，  ７０．２，  ７０．１，  ６０．６，  ５５．２，  ５３．４，  ５２．５，  ３４．３，  ３３．６，  ３１．１，  ３０．７，  ３０．４，  ２８．５，  ２０．１，  １６．８；  ＥＳＩ−ＭＳ  （ｍ／ｚ）  ７８８．５  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；  ＨＲＥＳＩＭＳ  Ｃ４５Ｈ５５Ｎ３Ｏ８Ｎａ  ｃａｌｃｄ  ７８８．３８８１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋，  ｆｏｕｎｄ  ７８８．３８８１．
【０１３９】
化合物１の合成
２（５０．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の水素付加を、触媒量のＰｄ−Ｃ（１０％）の存在下、室温、水素下にて、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中で行った。Ｐｄ−Ｃを、セライトを介したろ過により除去し、減圧下で濃縮して、対応するカルボン酸を得て、次のステップに直接使用した。
【０１４０】
トリペプチド３（８９．６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、４ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ（３ｍＬ）で１時間処置し、溶液を、減圧下で濃縮した。この残渣を、５ｍＬのＥｔＯＡｃに再度溶解し、再度濃縮して、対応するアミンをその塩酸塩として得た。
【０１４１】
上記で得たカルボン酸および（その塩酸塩としての）アミンを、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、氷冷槽で冷却した。ＨＡＴＵ（５４．０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（１９．０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（７８μＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を、それぞれ添加した。この混合物を０℃で１時間撹拌し、次に室温でさらに１６時間撹拌した。溶媒をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、水（１０ｍＬ×３）、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ（１０ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ×３）、ブライン（１０ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。この残渣を、分取ＴＬＣにより精製して、粗製の完全に保護されているペンタペプチド７｛４３．６ｍｇ、３８％；ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）  ９８５．６［Ｍ＋Ｈ］＋｝を得て、さらに性質決定を行うことなく次のステップに使用した。
【０１４２】
化合物７（４８．０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を、パラジウム炭素（１０ｗｔ％）の存在下で２時間水素付加し、粗製のペンタペプチド１を得て、半分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μＭ、２５０×１０ｍｍ，２、０ｍＬ／分、３０分にわたる７５〜１００％のＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏによるグラジエント溶離）により精製して、純粋な化合物１（２４．９ｍｇ、６３％）を得た。
【０１４３】
化合物１．［α］Ｄ２０  −１０１．８  （ｃ  ０．２２，  ＭｅＯＨ）；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）  ９．２２  （ｂｒｓ，  ２Ｈ，  Ｔｙｒ  ＯＨ×２），  ８．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．９  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｖａｌ  ＮＨ），  ７．１０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．９９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．６８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ６．５１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ５．２７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．８，  ３．８  Ｈｚ，  １Ｈ，  ＮＭｅＴｙｒ−１  αＨ），  ４．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．７  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  αＨ），  ４．５４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．４，  ４．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  ＮＭｅＴｙｒ−２  αＨ），  ４．４５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｖａｌ  αＨ），  ３．６９  （ｓ，  ３Ｈ，  Ｎ，Ｎ  ジＭｅＴｙｒ（ＯＭｅ）  Ｏ−Ｍｅ），  ３．５９  （ｓ，  ３Ｈ，  Ｈｍｐ  ＣＯ２ＣＨ３），  ３．４６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．８，  ６．６  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｎ，Ｎ  ジＭｅＴｙｒ（ＯＭｅ）  αＨ），  ３．０９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．４，  １０．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  ＮＭｅＴｙｒ−１  Ｈ−３ａ），  ２．９８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．９，  ４．１  Ｈｚ，  １Ｈ，  ＮＭｅＴｙｒ−２  Ｈ−３ａ），  ２．８７−２．８０  （ｄｄ，  ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ，  ２Ｈ，  ＡｒＣＨ２），  ２．７６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．７，  ６．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  ＡｒＣＨａＨｂ），  ２．７０  （ｓ，  ３Ｈ，  ＮＭｅＴｙｒ−１  Ｎ−Ｍｅ），  ２．４４  （ｓ，  ３Ｈ，  ＮＭｅＴｙｒ−２  Ｎ−Ｍｅ），  ２．３４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．２，  ３．７  Ｈｚ，  １Ｈ，  ＮＭｅＴｙｒ−１  Ｈ−３ｂ），  ２．２９  （ｓ，  ６Ｈ，  ＮＭｅ２），  １．９４−１．８５  （ｍ，  １Ｈ，  Ｖａｌ  Ｈ−３），  １．７６−１．６８  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  Ｈ−３），  １．０８−０．９８  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  Ｈ−４ａ），  ０．９６−０．８６  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈｍｐ  Ｈ−４ｂ），  ０．７８  （ｂｒ  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ６Ｈ，  Ｖａｌ  ＣＨ３×２），  ０．６９  （ｔ  ｌｉｋｅ，  Ｊ  ＝  ７．２，  ７．０  Ｈｚ，  ６Ｈ，  Ｈｍｐ  ＣＨ３×２）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  １００  ＭＨｚ）  １７０．６２，  １７０．５８，  １７０．４，  １６８．７，  １６８．５，  １５７．８，  １５５．８２，  １５５．７８，  １３０．２，  １３０．０，  １２９．８０，  １２９．７６，  １２７．８，  １２７．２，  １１５．０１，  １１４．９７，  １１３．６，  ７５．１，  ６８．３，  ６１．２，  ５４．９，  ５３．７，  ５１．７，  ４１．１，  ３６．３，  ３４．４，  ３３．８，  ３２．５，  ３０．１，  ２９．６，  ２５．３，  １９．３，  １７．８，  １３．８，  １１．３；  ＥＳＩ−ＭＳ  （ｍ／ｚ）  ８０５．７  ［Ｍ＋Ｈ］＋；  ＨＲＥＳＩＭＳ  Ｃ４４Ｈ６１Ｎ４Ｏ１０  ｃａｌｃｄ  ８０５．４３８２  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  ｆｏｕｎｄ  ８０５．４３７１．
【０１４４】
以下の化合物は、実施例２および３に記載の手法と同様の手法を使用して調製され得る。
【化１０】
2021504477.tif 000024
2021504477.tif 000025
2021504477.tif 000026
2021504477.tif 000027
2021504477.tif 000028
【０１４５】
実施例４：絶対配置の決定
化合物１のサンプル（１００μｇ）を、１１０℃で２０時間、６ＮのＨＣｌ（０．３５ｍＬ）で加水分解した。加水分解物を濃縮乾固して、１００μＬのＨ２Ｏに再構成した後、キラルＨＰＬＣ  Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  ＴＡＧ（２５０×４．６ｍｍ），  Ｓｕｐｅｌｃｏ；溶媒：ＭｅＯＨ：１０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ（４０：６０、ｐＨ５．４８）；流速  ０．５ｍＬ／分；ポジティブイオンモードのＥＳＩＭＳによる検出（ＭＲＭスキャン）］により解析した。Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｙｒ、Ｎ，Ｎ−ジＭｅ−Ｌ−Ｔｙｒ（ＯＭｅ）およびＶａｌは、それぞれ、ｔＲ  １８．５、１９０、および８．２分で溶離した。真正アミノ酸の保持時間（ｔＲ、分；ＭＲＭイオン対、親→生成物）は、以下の通りであった：Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ｔｙｒ（１９．１；１９６．３→７７）、Ｎ−Ｍｅ−Ｄ−Ｔｙｒ（３７．６）、Ｎ，Ｎ−ジＭｅ−Ｌ−Ｔｙｒ（ＯＭｅ）（１９０．０；２２４．３→１７９．３）、Ｎ，Ｎ−ジＭｅ−Ｌ−Ｔｙｒ（ＯＭｅ）（１３０．０）、Ｌ−Ｖａｌ（８．２；１１８．３→７２）、Ｄ−Ｖａｌ（１５．１）。化合物依存性のＭＳパラメータは、以下の通りであった：Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ：ＤＰ  ４０、ＥＰ  ５、ＣＥ  ６５、ＣＸＰ  ３、ＣＥＰ  １０；Ｎ，Ｎ−ジＭｅ−Ｔｙｒ（ＯＭｅ）：ＤＰ  ３８、ＥＰ  ８、ＣＥ  １９、ＣＸＰ  ３、ＣＥＰ  １７；Ｖａｌ：ＤＰ  １３５、ＥＰ  ９、ＣＥ  １５、ＣＸＰ  ２、ＣＥＰ  １０６。供給源および気体に依存するＭＳパラメータは、以下の通りであった：ＣＵＲ  ３０、ＣＡＤ  ｈｉｇｈ、ＩＳ  ４５００、ＴＥＭ  ４５０、ＧＳ１  ４０、ＧＳ２  ４０。
【０１４６】
１の加水分解物中のＨｍｐａを、ネガティブイオンモード［カラム、Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  ＴＡＧ（４．６×２５０ｍｍ），  Ｓｕｐｅｌｃｏ；溶媒，ＭｅＯＨ−１０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ（４０：６０，ｐＨ５．３３）；流速，０．５ｍＬ／分；ネガティブイオンモードでのＥＳＩＭＳによる検出（ＭＲＭスキャン）］で検出した。使用したＭＳパラメータは、以下の通りであった：ＤＰ  −３０、ＥＰ  −５．０、ＣＥ  −１８、ＣＸＰ  −８、ＣＥＰ  −１３０、ＣＵＲ  ３０、ＣＡＤ  ｈｉｇｈ、ＩＳ  −４５００、ＴＥＭ  ４５０、ＧＳ１  ４０、およびＧＳ２  ４０。加水分解物由来の（２Ｒ，３Ｓ）−Ｈｍｐａは、ｔＲ  ６．４分で溶離した。真正標準物質の保持時間（ｔＲ、分；ＭＲＭイオン対、親→生成物）は、以下の通りであった：（２Ｓ，３Ｒ）−Ｈｍｐａ（６．７３；１３１→８５）、（２Ｓ，３Ｓ）−Ｈｍｐａ（６．９；１３１→８５）、（２Ｒ，３Ｓ）−Ｈｍｐａ（７．２；  １３１→８５）、および（２Ｒ，３Ｒ）−Ｈｍｐａ（７．７；１３１→８５）。加水分解物を、異なるＨＰＬＣ条件下で試験して、この割り当てを確認した［カラム，  Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＭＡ（＋）（４．６×５０ｍｍ）、Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．；溶媒，２ｍＭのＣｕＳＯ４−ＣＨ３ＣＮ（９０：１０）；流速，１．０ｍＬ／分；２５４ｎｍでのＵＶによる検出］。加水分解物由来の（２Ｒ，３Ｓ）−Ｈｍｐａは、ｔＲ  １５．４分で溶離した。真正標準物質の保持時間（ｔＲ，分）は、以下の通りであった：（２Ｒ，３Ｓ）−Ｈｍｐａ（１１．０）、（２Ｒ，３Ｒ）−Ｈｍｐａ（１４．５）、（２Ｓ，３Ｒ）−Ｈｍｐａ（１８．０）、および（２Ｓ，３Ｓ）−Ｈｍｐａ（２２．０）。
【０１４７】
実施例５：細胞培養
ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ細胞およびヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、３７℃の湿潤した空気および５％のＣＯ２下で培養した。ヒト正常結腸（ＣＣＤ−１８Ｃｏ）細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のウシ胎仔血清を補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）において、３７℃の湿潤空気および５％ＣＯ２下で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，  ｃａｔ＃  ＣＣ−２５１９，  Ｌｏｎｚａ）を、同一の条件下のＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ  ｃａｔ＃  ＣＣ−３１２４）において培養した。
【０１４８】
実施例６：細胞のバイアビリティのアッセイ（ＭＴＴ）
細胞を、９６ウェル透明底プレートに播種し、２４時間後に細胞を、様々な濃度のａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅまたは溶媒の対照（ＤＭＳＯ）で処置した。４８時間インキュベーション後に、細胞のバイアビリティを、ＭＴＴを製造社の説明（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に従って使用して検出した。非線形回帰解析を、ＩＣ５０値の計算のためＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ソフトウェアを使用して行った。
【０１４９】
実施例７：ヒトＶＥＧＦ−Ａ分泌の測定
ＨａＣａＴ細胞を、９６ウェル透明底プレートに播種した。細胞を、様々な濃度のａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅまたは溶媒の対照（ＤＭＳＯ）で処置した。２４時間インキュベーション後、培養上清を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡのキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を製造社の説明に従って使用するＶＥＧＦ−Ａの検出のために回収した。簡潔に述べると、アクセプタービーズおよび抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を、上清と共に６０分間インキュベートし、その後ドナービーズを添加し、さらに３０分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してシグナルを検出した。ＶＥＧＦ−Ａのレベル（ｐｇ／ｍＬ）を、検量線を使用して計算し、次に、細胞数に基づき正規化した。
【０１５０】
実施例８：イムノブロット解析
ＨａＣａＴ細胞を、処置の前日に、６ウェル透明底プレートに播種した。翌日、細胞を、１または溶媒の対照（ＤＭＳＯ）で処置した。２４時間後に、全細胞ライセートを、ＰｈｏｓｐｈｏＳａｆｅバッファー（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，  ＮＪ）を使用して回収した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）で測定した。等量のタンパク質を含むライセートを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（４〜１２％）により分離し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写し、一次抗体および二次抗体を用いてプロービングし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出した。ＢＩＰ、ＩＲＥ１、β−アクチン、および二次の抗マウスおよびウサギの抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ（Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）から得た。ＡＴＦ４およびＯＲＰ１５０の抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＣＡ）から得た。
【０１５１】
実施例９：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイ
ＨａＣａＴ細胞を、処置の前日に、１２ウェルプレートにおいて完全増殖培地中に播種した。翌日に、この培地を新鮮な培地と交換した後、１または溶媒対照の処置を行った。２４時間インキュベーションの後、条件培地を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生アッセイのために回収した。
【０１５２】
このアッセイでは、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）を継代４で使用した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生アッセイキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、製造社の推奨に従って使用した。簡潔に述べると、ＥＣＭａｔｒｉｘの氷冷混合物を、あらかじめ冷却した９６ウェルプレートに移した。マトリックス溶液が固化した後（３７℃で１時間超のインキュベーション）、１０，０００個の細胞を、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でＣＭまたはＥＧＭと混合し、各ウェルに播種した。３７℃で１４時間インキュベートした後、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ソフトウェアを搭載したニコン倒立顕微鏡を使用して、各ウェルの画像を撮影した。分岐点の計数を、定量化方法として使用した。３つの無作為な顕微鏡の視野を計数し、各ウェルの分岐点の数を平均化した。各グループの分岐点を、２つの独立した実験からの８つの反復実験を平均化することにより計算した。
【０１５３】
実施例１０：ＲＮＡの単離および逆転写
ＨａＣａＴ細胞を、ウェルあたり２×１０５個の密度で６ウェルプレートに播種し、処置の前に、補充物質を含まない培地中でさらに２４時間インキュベートした。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して、処置から３時間後、１２時間後、および１６時間後に単離した。総ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００を使用して定量化した。２μｇの総ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）およびｏｌｉｇｏ（ｄＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。
【０１５４】
実施例１１：ＨａＣａＴ細胞における転写物レベルの決定のためのリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
逆転写後のｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を、０．３μＬのアリコートのｃＤＮＡ、１２．５μＬのＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ混合物、１．２５μＬのプローブ、および１１μＬのＲＮａｓｅフリー水を含む２５μＬの反応溶液で行った。ｑＰＣＲを、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）プログラム：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および９５℃で１５秒（４０サイクル）、ならびに６０℃で１分間を使用してＡＢＩ  ７３００配列検出システムで行った。各実験は、三連で行った。ＶＥＧＦ−Ａ（Ｈｓ００９０００５５＿ｍ１）、ＰＤＧＦＢ（Ｈｓ００２６６６４５＿ｍ１）、およびｂＦＧＦ（Ｈｓ００９６６５２２＿ｍ１）を標的遺伝子として使用し、ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）を、内在性対照として使用した。グラフおよびデータの解析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行い、対応のないｔ検定を使用して解析した。
【０１５５】
実施例１２：トランスクリプトームのプロファイリング
ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  バイオアナライザを使用して解析して、それぞれ、ＲＮＡ濃度および質を決定した。ＲＮＡのサンプルを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＷＴ  ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を製造社の説明に従って使用して処置した。簡潔に述べると、２５０ｎｇのＲＮＡを、逆転写によるｃＤＮＡ合成に使用し、ｃＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写反応により調製されるビオチン標識したＲＮＡのテンプレートとして利用した。標識したＲＮＡを、さらに精製し、フラグメント化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ  ２．０に４５℃で１６時間旋回させながらハイブリダイズさせた。アレイを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０においてＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  ｋｉｔを使用して、洗浄および染色した。このチップは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ７Ｇ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用してスキャンした。マイクロアレイのデータの解析を、報告されている方法（Ｓａｌｖａｄｏｒ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｔａｏｒｉ，  Ｋ．，  Ｂｉｇｇｓ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｊａｋｏｎｃｉｃ，  Ｊ．，  Ｏｓｔｒｏｖ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｐａｕｌ，  Ｖ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｕｅｓｃｈ，  Ｈ．  （２０１３）  Ｐｏｔｅｎｔ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５６，  １２７６−１２９０）により行った。統計検定を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒの統計ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／）およびＲプログラムで行った。生データを、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｐｐｒｏａｃｈにより正規化した。次にプローブのセットの検出コール（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃａｌｌ）を、ウィルコクソンの符号順位に基づくアルゴリズムを使用することにより推定した。すべての試験サンプルに存在しないプローブのセットを、さらなる解析から除去した。Ｒソフトウェアのｌｉｍｍａパッケージで実施した線形モデリングアプローチおよび経験ベイズ法（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂａｙｅｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を、差次的な発現解析に使用した。得られたＰ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用する多重検定（ＦＤＲ）で制御した。次に、差次的に発現した遺伝子を、Ｐ値により順位付けし、Ｐ＜０．０５（ＦＤＲの相関を伴う）および１．５超または０．６７未満の倍数差を有する遺伝子を、統計的に有意なレベルで差次的に発現した遺伝子とみなした。データの階層的クラスタリングを、完全連結（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）およびピアソン相関距離を使用することにより対数変換し正規化したデータでコンピュータ計算した。トランスクリプトームのデータは、受託番号ＧＳＥ１０２１００でＮＣＢ���のＧＥＯ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ）に預けられている。
【０１５６】
実施例１３：ｅｘ  ｖｉｖｏでのウサギ角膜の臓器培養
１２匹の未処置ウサギ（Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅ）の眼球の角膜中央の直径６ｍｍの領域を、治療的レーザー角膜切除モードでＮｉｄｅｋ  ｅｘｃｉｍｅｒ  ｌａｓｅｒを使用して全体の深さが１５５ミクロンとなるまで除去した。次に、除去した角膜を、無菌のメスおよびピンセットを使用して、透明な角膜ではなくて強膜の周辺のみをつかむことにより、ウサギの眼球から外科的に切除した。角膜を、６ウェルプレートにおいて、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のＦＢＳ、０．０１％のデキストラン４０（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）、および０．０２５％のコンドロイチン硫酸（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２  １：１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。１２の角膜を、無作為に４つの群（各群で３つの角膜）：ＤＭＳＯ、２５μＭ、５０μＭ、または１００μＭのＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅに分けた。化合物または溶媒（１％のＤＭＳＯ）を、６ウェルプレートにおいて培地に直ちに添加して、角膜を完全に浸した。角膜を、３７℃で１８時間、５％のＣＯ２を含む湿潤雰囲気でインキュベートした後、総ＲＮＡを抽出した。
【０１５７】
実施例１４：Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）による処置後の除去されたウサギ角膜におけるＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡレベルの評価
各角膜の中心の瘢痕様組織を、８ｍｍパンチ生検を使用して回収した。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造社の説明に従って使用して、瘢痕様組織から回収した。ＶＥＧＦ−Ａのプライマーセット（ＩＤＴ  ＤＮＡ）を作製および検証するために、ｃＤＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を製造社の説明に従って使用して、ウサギの眼全体のＲＮＡから作製した。プライマーセットから得たアンプリコンを、単一の産物を確保するようにゲル精製した後、シーケンシングを行い予測した配列を確認した。次に、精製したｃＤＮＡを、ナノドロップを使用して定量化し、これを使用して検量線を作成した。定量化したｃＤＮＡのアンプリコンの連続１０倍希釈物を、ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＴ−ｑＰＣＲに供した。Ｌｏｇ［ｃＤＮＡ投入量］）を観察したＣＴ値と比較する検量線を作成して、ｍＲＮＡ標的のｃＤＮＡ投入量に比例する応答を証明した（図７）。ＧＡＰＤＨレベルは、標的遺伝子レベルよりも大きく変動することが見出された。生物学的反復実験においてＧＡＰＦＨに関する標準偏差の平均は、対照および１００μＭの処置で１．５４Ｃｔ＆１．９８Ｃｔであり；対してＶＥＧＦ−Ａではわずか０．０９Ｃｔ／０．０８Ｃｔであった。総ＲＮＡの単位あたりのＧＡＰＤＨにおけるこの程度の変動は、ＧＡＰＤＨが、これら目的にとって不十分な内部対照であることを示している。質量正規化ＶＥＧＦ−Ａに関する生物学的反復実験における高度の一貫性は、総ＲＮＡ投入量に対して正規化するという選択を支持する。Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ処置グループおよびＤＭＳＯ対照グループ（ｎ＝グループあたり３つの生物学的なレプリケート）の質量正規化Ｃｔ値を、一元配置ＡＮＯＶＡ（α＝０．０５、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌ  Ｐａｃｋ）、次にＥｘｃｅｌ  ２０１０において手動で計算したテューキーのＨＳＤポストホック検定を行うことにより解析した（図８）。
【０１５８】
実施例１５：結果
Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅは、ＨＣＴ１１６細胞においてＶＥＧＦ−Ａの転写を誘導する。
同じシアノバクテリア由来の以前に同定したアプラトキシンは、ＶＥＧＦ−Ａおよび他の分泌されるタンパク質の翻訳時輸送（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を防止することにより強力な阻害剤として特徴付けられた（Ｃｈｅｎ，  Ｑ．  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｙ．，  Ｃａｉ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｌｕｅｓｃｈ，  Ｈ．  （２０１４）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｐｒａｔｏｘｉｎ  Ｓ４  ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５７，  ３０１１−３０２９；  Ｃｈｅｎ，  Ｑ．  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｌｕｅｓｃｈ，  Ｈ．  （２０１１）  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｒａｔｏｘｉｎ  Ａ／Ｅ  ｈｙｂｒｉｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  ＡＣＳ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ２，  ８６１−８６）。しかしながら、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）は、反対の作用を有していた。ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞を使用した際に、１は、ＶＥＧＦ−Ａをアップレギュレートしたものの、示した細胞傷害性はわずかであった（図９Ａおよび９Ｂ）。５０マイクロモル濃度のＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅは、ＨＣＴ１１６細胞においてＶＥＧＦ−Ａの転写レベルを倍加させた（図９Ａ）。またＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅは、対応する正常結腸細胞（ＣＣＤ−１８Ｃｏ）において、同様の効果を発揮し、細胞のバイアビリティに及ぼす作用は無視できる程度であった（図１０および９Ｂ）。
【０１５９】
Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅは、ＨａＣａＴ細胞においてＶＥＧＦ−Ａの転写、分泌、および他の創傷治癒関連増殖因子の転写を誘導する。
ＶＥＧＦ−Ａ誘導因子は、慢性損傷の処置にとって有望な治療剤とみなされているため、１もまた、正常細胞タイプにおいて創傷治癒プロセスに関与するＶＥＧＦ−Ａを誘導し得る。よって１を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける創傷治癒モデル：ヒトケラチノサイト細胞（ＨａＣａＴ）においてプロファイリングした。予測されるように、ＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡのレベルは、３０μＭの１による４時間の処置の後に、１．７倍誘導され、１２時間後には、より大きな誘導効果が観察された（図１１）。１６時間後に、５０μＭの１は、ＶＥＧＦ−Ａの転写物のレベルを７倍増加させ、３１．６μＭの１は、５倍の増加をもたらした（図１２）。よって、５０μＭの１は、２４時間後に、ＨａＣａＴ細胞からのＶＥＧＦ−Ａの分泌の１．５倍の増加を誘導し、３１．６μＭの１は、細胞傷害性を引き起こすことなく、１．３倍の増加を誘導した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。およそ１９パーセントの細胞のバイアビリティが、２４時間後の５０μＭの１で観察された（図１３Ｂ）。
【０１６０】
複数の増殖因子およびサイトカインが、創傷治癒プロセスを調節するためのシグナルの複合的な統合に関与している（Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ，  Ｓ．，  Ｂｒｅｍ，  Ｈ．，  Ｓｔｏｊａｄｉｎｏｖｉｃ，  Ｏ．，  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，  Ｍ．  （２０１４）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．  ２２，  ５６９−５７）。よって１もまた、創傷治癒の間に、ＶＥＧＦ−Ａと協同的に作用し得る他の増殖因子を誘導し得る。ＲＴ−ｑＰＣＲのデータは、ＰＤＧＦおよびＢｂＦＧＦが全て、１によって刺激されることを示した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。
【０１６１】
トランスクリプトームのプロファイリングおよびＩｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析は、ＵＰＲが、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ誘導性のＶＥＧＦ−Ａの機構において役割を果たすことを示す。
複数の増殖因子が誘導されるＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅの作用機構をさらに解明するために、マイクロアレイプロファイリングを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ  ２．０を使用して行い、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）で処置したＨａＣａＴ細胞における転写物レベルの全体の変化を決定した。比較解析は、３０μＭの１による１２時間の処置の後に差次的に発現した３７１個の遺伝子を同定した（Ｐ＜０．０５、ＦＤＲ補正、変化倍率＞１．５または＜０．６７）（図１５）。以前のデータと一致して、ＶＥＧＦ−Ａは、最もアップレギュレートされる遺伝子のうちの１つであると思われた（図１６）。分子の機能および遺伝的ネットワークを調べるために、１２時間のマイクロアレイのデータを、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析（ＩＰＡ）を使用して解析した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。転写物レベルの全体的な変化は、血管新生、有糸分裂誘発、上皮組織の分化、および皮膚の形成を含む下流での表現型の作用の増大、ならびに肝臓細胞のアポトーシスおよび臓器の形成不全などの作用を減少に関連している（図１７Ａ）。３７１個のマイクロアレイヒットのＩＰＡ解析は、上位の標準経路としての小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）（図１８）を１．４５×１０−１６のｐ値で示した。またＩＰＡは、３７１個のヒットが、細胞の侵害（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）および細胞の維持の機能に関連する分子ネットワークに最も密接に関連していたことを解明した（図１７Ｂ）。このネットワークは、ＵＰＲ経路由来の分子の成分（ＡＴＦ４、ＩＮＳＩＧ１、ＣＨＯＰ、ＤＮＡＪＣ３、ＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＪＩＮＫ１／２）、ＮＲＦ２が介在する酸化ストレス応答のシグナリング由来の分子の成分（ＡＴＦ４、ＤＮＡＪＣ３、ＪＩＮＫ１／２、Ａｋｔ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＤＮＡＪＢ９）、およびグルココルチコイド受容体のシグナリング由来の分子の成分（ＡＤＲＢ、Ａｋｔ、ＪＩＮＫ１／２、ＰＥＰＣＫ、ＰＣＫ２）を含む。
【０１６２】
ＵＰＲの細胞保護的役割および増殖因子に及ぼすその調節作用
小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路は、細胞における小胞体（ＥＲ）ストレスに応答する細胞保護的シグナリングのカスケードである。ＵＰＲは、複数のシグナリング経路を協調し、肝臓の発達、血漿細胞の分化、骨の発達、血漿細胞の分化、正常な膵臓のホメオスタシスおよび胎盤の発達および胚のバイアビリティを含む、細胞および生物全体における様々な生理機能を制御する（Ｒｅｉｍｏｌｄ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｅｔｋｉｎ，  Ａ．，  Ｃｌａｕｓｓ，  Ｉ．，  Ｐｅｒｋｉｎｓ，  Ａ．，  Ｆｒｉｅｎｄ，  Ｄ．  Ｓ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．，  Ｈｏｒｔｏｎ，  Ｈ．  Ｆ．，  Ｓｃｏｔｔ，  Ａ．，  Ｏｒｋｉｎ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｂｙｒｎｅ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｇｒｕｓｂｙ，  Ｍ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇｌｉｍｃｈｅｒ，  Ｌ．  Ｈ．  （２０００）  Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＢＰ−１．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １４，  １５２−１５７；  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．，  ＭｃＧｒａｔｈ，  Ｂ．，  Ｌｉ，  Ｓ．，  Ｆｒａｎｋ，  Ａ．，  Ｚａｍｂｉｔｏ，  Ｆ．，  Ｒｅｉｎｅｒｔ，  Ｊ．，  Ｇａｎｎｏｎ，  Ｍ．，  Ｍａ，  Ｋ．，  ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｃａｖｅｎｅｒ，  Ｄ．  Ｒ．  （２００２）  Ｔｈｅ  ＰＥＲＫ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ２α  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２，  ３８６４−３８７４；  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  Ｍａｔｓｕｄａ，  Ｋ．，  Ｂｉａｌｅｋ，  Ｐ．，  Ｊａｃｑｕｏｔ，  Ｓ．，  Ｍａｓｕｏｋａ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｓｃｈｉｎｋｅ，  Ｔ．，  Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｂｒａｎｃｏｒｓｉｎｉ，  Ｓ．，  Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，  Ｐ．，  Ｔｏｗｎｅｓ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｈａｎａｕｅｒ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｋａｒｓｅｎｔｙ，  Ｇ．  （２００４）  ＡＴＦ４  ｉｓ  ａ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｏｆ  ＲＳＫ２  ａｎｄ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｆｆｉｎ−Ｌｏｗｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｃｅｌｌ  １１７，  ３８７−３９８；  Ｒｅｉｍｏｌｄ，    ａ  Ｍ．，  Ｉｗａｋｏｓｈｉ，  Ｎ．  Ｎ．，  Ｍａｎｉｓ，  Ｊ．，  Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｙｕｌａ，  Ｐ．，  Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ−Ｔｓｕｄａ，  Ｅ．，  Ｇｒａｖａｌｌｅｓｅ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｆｒｉｅｎｄ，  Ｄ．，  Ｇｒｕｓｂｙ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ａｌｔ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｇｌｉｍｃｈｅｒ，  Ｌ．  Ｈ．  （２００１）  Ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＢＰ−１．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，  ３００−３０７；  Ｉｗａｋｏｓｈｉ，  Ｎ．  Ｎ．，  Ｌｅｅ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｙｕｌａ，  Ｐ．，  Ｏｔｉｐｏｂｙ，  Ｋ．  Ｌ．，  Ｒａｊｅｗｓｋｙ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｇｌｉｍｃｈ��ｒ，  Ｌ．  Ｈ．  （２００３）  Ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＢＰ−１．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，  ３２１−３２９；  Ｓｃｈｅｕｎｅｒ，  Ｄ．，  Ｓｏｎｇ，  Ｂ．，  ＭｃＥｗｅｎ，  Ｅ．，  Ｌｉｕ，  Ｃ．，  Ｌａｙｂｕｔｔ，  Ｒ．，  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，  Ｐ．，  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｔ．，  Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｒ．  Ｊ．  （２００１）  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ７，  １１６５−１１７６；  Ｉｗａｗａｋｉ，  Ｔ．，  Ａｋａｉ，  Ｒ．，  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｏｈｎｏ，  Ｋ．  （２００９）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＲＥ１  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０６，  １６６５７−１６６６２）．  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔｌｙ，  ＵＰＲ  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ，  ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＵＰＲ  ｉｎ  ｒｅｓｃｕｉｎｇ  ｗｏｕｎｄ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ  （Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ，  Ｃ．，  Ｇｏｒｅｎ，  Ｉ．，  Ｌｉｎｋｅ，  Ａ．，  Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．  （２０１４）  Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗｏｕｎｄｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ：  Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ−ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ４４６，  １９５−２００）．  Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，  ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ＵＰＲ  ｗｏｕｌｄ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗｏｕｎｄｓ  （Ｌｅｅ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｏｚｃａｎ，  Ｕ．  （２０１４）  Ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８９，  １２０３−１２１１）。
【０１６３】
興味深いことに、ＶＥＧＦ−Ａに及ぼすＵＰＲの調節作用は研究によって未だ明らかになっていない。ＵＰＲは、ＡＴＦ４、ＩＲＥ１、およびＯＲＰ１５０の活性化を介したＥＲにおけるＶＥＧＦ−Ａの転写上のタンパク質のプロセシングおよび輸送に寄与しており、これらは全て、転写物およびタンパク質のレベルでＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅによりアップレギュレートされた（図１７Ｂおよび１９）（Ｇｈｏｓｈ，  Ｒ．，  Ｌｉｐｓｏｎ，  Ｋ．  Ｌ．，  Ｓａｒｇｅｎｔ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｍｅｒｃｕｒｉｏ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｈｕｎｔ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｒｏｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｕｒａｎｏ，  Ｆ．  （２０１０）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＥＧＦ−Ａ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，  ｅ９５７５；  Ｏｚａｗａ，  Ｋ．，  Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，  Ｙ．，  Ｈｏｒｉ，  Ｏ．，  Ｋｉｔａｏ，  Ｙ．，  Ｙａｎａｇｉ，  Ｈ．，  Ｓｔｅｒｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｏｇａｗａ，  Ｓ．  （２００１）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １５０，  ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ４２０６−４２１３；  Ｏｚａｗａ，  Ｋ．，  Ｋｏｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｈｏｒｉ，  Ｏ．，  Ｋｉｔａｏ，  Ｙ．，  Ｓｔｅｒｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｅｉｓｅｎｍｅｎｇｅｒ，  Ｗ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｏｈｓｈｉｍａ，  Ｔ．  （２００１）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＯＲＰ１５０  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＶＥＧＦ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０８，  ４１−５０）。これら知見は、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）がＵＰＲ経路を介してＶＥＧＦ−Ａを誘導し得ることを示唆している。ＶＥＧＦ−Ａのアップレギュレートに加え、ＵＰＲはまた、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、およびＩＬ−８などの多くの他の血管新生促進因子をアップレギュレートすることにより血管新生を亢進することが報告されている（Ｐｅｒｅｉｒａ，  Ｅ．  Ｒ．，  Ｌｉａｏ，  Ｎ．，  Ｎｅａｌｅ，  Ｇ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，  Ｌ．  Ｍ．  （２０１０）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，  ｅ１２５２１）。これら知見はまた、マイクロアレイおよびＲＴ−ｑＰＣＲの結果と関連しており、多くの他の血管新生促進因子（たとえばｂＦＧＦ、ＰＤＧＦＢ、ＨＢ−ＥＧＦ）もまた、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）による処置後にアップレギュレートされたことを表している（図１０〜１４、１６、および２０）。まとめると、ＥＲストレスとは無関係なＵＰＲ経路を活性化させることによりＥＲのホメオスタシスを改善する���とは、糖尿病に関連する慢性創傷の閉鎖を含む創傷閉鎖を加速させるために有望なツールであり得、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）は、このような治療剤の１つとなる有望な属性を有する（Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ，  Ｃ．，  Ｇｏｒｅｎ，  Ｉ．，  Ｌｉｎｋｅ，  Ａ．，  Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．  （２０１４）  Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗｏｕｎｄｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ：  Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ−ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ４４６，  １９５−２００）。
【０１６４】
ＵＰＲのこれら個別の分子成分を綿密に調査することによって、いくつかのエビデンスのラインの同定がさらに可能になり、これらがまた、ＵＰＲに依存してまたはＵＰＲとは無関係に、血管新生、創傷治癒、およびＶＥＧＦ−Ａのアップレギュレーションに直接寄与することを証明する（Ｉｗａｗａｋｉ，  Ｔ．，  Ａｋａｉ，  Ｒ．，  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｏｈｎｏ，  Ｋ．  （２００９）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＲＥ１  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０６，  １６６５７−１６６６２；  Ｎａｔｈａｎｉｅｌ  Ｒｏｙｂａｌ，  Ｃ．，  Ｈｕｎｓａｋｅｒ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｂａｒｂａｓｈ，  Ｏ．，  Ｖａｎｄｅｒ  Ｊａｇｔ，  Ｄ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ａｂｃｏｕｗｅｒ，  Ｓ．  Ｆ．  （２００５）  Ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓｏｒ  ａｒｓｅｎｉｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ＡＴＦ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  ２０３３１−２０３３９；  Ｍａｌａｂａｎａｎ，  Ｋ．  Ｐ．，  Ｋａｎｅｌｌａｋｉｓ，  Ｐ．，  Ｂｏｂｉｋ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，  Ｌ．  Ｍ．  （２００８）  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−４  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−２  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＶＥＧＦ−Ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  １０３，  ３７８−３８７；  Ｚｈｕ，  Ｋ．，  Ｊｉａｏ，  Ｈ．，  Ｌｉ，  Ｓ．，  Ｃａｏ，  Ｈ．，  Ｇａｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｚｈａｏ，  Ｚ．，  Ｚｈａｏ，  Ｘ．，  Ｌａｉ，  Ｙ．，  Ｆａｎ，  Ｊ．，  Ｉｍ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｘｉａｏ，  Ｇ．  （２０１３）  ＡＴＦ４  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂｏｎｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｖｅｇｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ２８，  １８７０−１８８４）。
【０１６５】
ＡＦＴ４は、転写物およびタンパク質のレベルの両方でＶＥＧＦ−Ａを活性化させるＵＰＲシグナリングカスケードの重要な転写因子である（Ｎａｔｈａｎｉｅｌ  Ｒｏｙｂａｌ，  Ｃ．，  Ｈｕｎｓａｋｅｒ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｂａｒｂａｓｈ，  Ｏ．，  Ｖａｎｄｅｒ  Ｊａｇｔ，  Ｄ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ａｂｃｏｕｗｅｒ，  Ｓ．  Ｆ．  （２００５）  Ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓｏｒ  ａｒｓｅｎｉｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ＡＴＦ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  ２０３３１−２０３３９；  Ｍａｌａｂａｎａｎ，  Ｋ．  Ｐ．，  Ｋａｎｅｌｌａｋｉｓ，  Ｐ．，  Ｂｏｂｉｋ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，  Ｌ．  Ｍ．  （２００８）  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−４  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−２  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＶＥＧＦ−Ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  １０３，  ３７８−３８７；  Ｚｈｕ，  Ｋ．，  Ｊｉａｏ，  Ｈ．，  Ｌｉ，  Ｓ．，  Ｃａｏ，  Ｈ．，  Ｇａｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｚｈａｏ，  Ｚ．，  Ｚｈａｏ，  Ｘ．，  Ｌａｉ，  Ｙ．，  Ｆａｎ，  Ｊ．，  Ｉｍ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｘｉａｏ，  Ｇ．  （２０１３）  ＡＴＦ４  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂｏｎｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｖｅｇｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ２８，  １８７０−１８８４）。ＡＴＦ４は、骨の環境におけるＶＥＧＦの発現および放出を増大させることにより骨の血管新生を促進する（Ｚｈｕ，  Ｋ．，  Ｊｉａｏ，  Ｈ．，  Ｌｉ，  Ｓ．，  Ｃａｏ，  Ｈ．，  Ｇａｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｚｈａｏ，  Ｚ．，  Ｚｈａｏ，  Ｘ．，  Ｌａｉ，  Ｙ．，  Ｆａｎ，  Ｊ．，  Ｉｍ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｘｉａｏ，  Ｇ．  （２０１３）  ＡＴＦ４  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂｏｎｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｖｅｇｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ２８，  １８７０−１８８４）。また、ＡＴＦ４発現が、ラットの動脈損傷後の平滑筋細胞において誘導され、その過剰発現がさらに、ＡＴＦ４とＶＥＧＦ−Ａ遺伝子に位置する認識エレメントとの間の相互作用によりＶＥＧＦ−Ａの発現を亢進したことが報告されている。マイクロアレイのデータおよびイムノブロット解析は、ＡＴＦ４が、ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの両方でＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅにより活性化され、その後、その下流の多くの分子の成分：ＣＨＯＰ、ＳＬＣ６Ａ９、ＣＨＡＣ１、ＡＴＦ３、ＳＡＲＳ、ＷＡＲＳ、およびその他の転写の誘導をもたらすことを示唆した（図１５および１７〜１９）。
【０１６６】
またＩＲＥ１は、ＥＲに位置する膜貫通タンパク質であり、血管新生、胎盤の発達、および胚のバイアビリティを含む生理的プロセスにおいて重要な役割を果たす（Ｉｗａｗａｋｉ，  Ｔ．，  Ａｋａｉ，  Ｒ．，  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｏｈｎｏ，  Ｋ．  （２００９）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＲＥ１  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０６，  １６６５７−１６６６２；  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｑｉｕ，  Ｙ．，  Ｙａｎｇ，  Ｚ．  Ｑ．，  Ｌｉ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  Ｋ．  （２０１７）  Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  １  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｒｎａｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６６，  １７７−１９２）。胎盤におけるＶＥＧＦ−Ａの発現は、部分的にＩＲＥ１に依存することが示されている。別の近年の研究は、２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＩＲＥ１の欠損、および、直接的なＩＲＥ１遺伝子導入を使用する細胞療法が血管新生の亢進を介して糖尿病マウスの皮膚の創傷治癒を加速させたことを同定した。これら知見は、ＩＲＥ１活性を亢進することによる糖尿病の創傷治癒のための治療上の戦略を強力に示唆した。さらに、ＩＲＥ１の欠失は、マイクロＲＮＡの上昇をもたらし、ＩＲＥ１の供給は、ｍｉＲＮＡの生合成の調節を介した糖尿病性の（骨髄由来の前駆体細胞）ＢＭＰＣの血管新生能を促進した。よって、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）による１２時間の処置後のいくつかのマイクロＲＮＡのダウンレギュレーションもまた観察されている（図１６および２０）。
【０１６７】
ＯＲＰ１５０はＥＲシャペロンであり、この発現は、ＵＰＲにより調節される。アデノウイルスベクターによるＯＲＰ１５０遺伝子の過剰発現は、細胞内のＶＥＧＦ輸送を調節することにより創傷治癒を加速させた（Ｏｚａｗａ，  Ｋ．，  Ｋｏｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｈｏｒｉ，  Ｏ．，  Ｋｉｔａｏ，  Ｙ．，  Ｓｔｅｒｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｅｉｓｅｎｍｅｎｇｅｒ，  Ｗ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｏｈｓｈｉｍａ，  Ｔ．  （２００１）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＯＲＰ１５０  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＶＥＧＦ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０８，  ４１−５０）。この知見は、ＯＲＰ１５０が、皮膚の創傷治癒に関与することを暗示した。
【０１６８】
Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅで処置したＨａＣａＴ細胞培養物の条件培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生を誘導した。
創傷治癒の間、ＶＥＧＦ−Ａは、血管新生を刺激するように分泌され、創傷領域の内皮細胞に主に作用する（Ｂａｏ，  Ｐ．，  Ｋｏｄｒａ，  Ａ．，  Ｔｏｍｉｃ−Ｃａｎｉｃ，  Ｍ．，  Ｇｏｌｉｎｋｏ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｅｈｒｌｉｃｈ，  Ｈ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｂｒｅｍ，  Ｈ．  （２００９）  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｒｅｓ．  １５３，  ３４７−３５８）。よって、１により誘導されるＨａＣａＴ細胞から分泌されるＶＥＧＦ−Ａの増大は、血管新生を亢進し得る。ＶＥＧＦ−Ａの分泌の増大が検出される場合、２４時間目に、１の存在下または非存在下のＨａＣａＴ細胞培養物から条件培地（ＣＭ）を回収した。ヒトの内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、得たＣＭと共にインキュベートし、その血管新生活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生アッセイを使用してモニタリングした（図２１Ａおよび２１Ｂ）。陽性対照としての２％のＦＢＳおよびウシの脳抽出物（ＢＢＥ）を含む完全増殖培地（ＥＧＭ）は、ＨＵＶＥＣに、１４時間後に個別の細胞からの管状構造を形成させることができた。しかしながら、ＨａＣａＴ細胞培養物由来のＣＭ（ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ）単独は、血管新生にほとんど作用せず、大部分のＨＵＶＥＣが個別の細胞として残存した。これは、恐らくは、ＤＭＥＭにおける内皮細胞の血管新生に必要とされる増殖補助成分が欠けているためである。ＣＭ−ＤＭＳＯグループにおける血管新生の減少は、ＨａＣａＴ培養物における３０または５０μＭの１による処置により回復し、管状構造の形成の増大により表された。Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅの作用と同じく、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質（１００ｎｇ／ｍＬ）もまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生を誘導した。対照的に、完全増殖培地に１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａを添加しても、恐らくはＢＢＥにおける十分な量の血管新生因子により、血管新生をさらに有意には誘導しなかった。上記の結果は、ａｐｒａｙｔｒａｍｉｄｅ（１）が、恐らくはＨａＣａＴ細胞から分泌されるＶＥＧＦ−Ａの誘導を介して血管新生を間接的に亢進することを証明した。
【０１６９】
Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのウサギ角膜内皮モデルにおいてＶＥＧＦ−Ａを誘導する。
より生理的な状況でＡｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）を評価するために、Ａｐｒａｔｙｒａｍｉｄｅ（１）を、バリデートされた創傷治癒モデルである、ｅｘ  ｖｉｖｏでのウサギの角膜内皮のモデルにおいて試験した（Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｄ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｇ．  Ｓ．  （２０１３）  Ａ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｃａｒｒｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０３７，  ２７７−２９８；  Ｓｒｉｒａｍ，  Ｓ．，  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｐ．，  Ｐｉ，  Ｌ．，  Ｔｕｌｉ，  Ｓ．，  Ｌｅｗｉｎ，  Ａ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｇ．  （２０１４）  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｓｃａｒｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｅｘｖｉｖｏ  ｏｒｇａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｃｏｒｎｅａｓ．  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  １２５，  １７３−１８２）。未処置のウサギの眼を得て、創傷を、レーザーにより角膜の中央に誘導した（図２２）。その後、眼球を切り取り、角膜組織を回収し、次に、１の存在下または非存在下で培地において培養した。１８時間後に、総ＲＮＡを角膜組織から回収し、ＲＴ−ｑＰＣＲ解析に供した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの作用と一致して、角膜におけるＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡの用量依存的な増加が、１による処置の後に検出された（図２３）。
【０１７０】
参照による組み込み
本出願にわたり記載される全ての参照（文献の参照文献、発行済みの特許、公開済みの特許出願、および係属中の特許出願）の内容の全体は、明らかに本明細書に組み込まれている。
【０１７１】
均等
当業者は、単なる規定の実験を使用して、本明細書中記載の発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包有されると意図されている。
【図１】
2021504477.tif 000035
【図２】
2021504477.tif 000036
【図３−１】
2021504477.tif 000037
【図３−２】
2021504477.tif 000038
【図４】
2021504477.tif 000039
【図５】
2021504477.tif 000040
【図６】
2021504477.tif 000041
【図７】
2021504477.tif 000042
【図８】
2021504477.tif 000043
【図９Ａ】
2021504477.tif 000044
【図９Ｂ】
2021504477.tif 000045
【図１０】
2021504477.tif 000046
【図１１】
2021504477.tif 000047
【図１２】
2021504477.tif 000048
【図１３Ａ】
2021504477.tif 000049
【図１３Ｂ】
2021504477.tif 000050
【図１４Ａ】
2021504477.tif 000051
【図１４Ｂ】
2021504477.tif 000052
【図１５】
2021504477.tif 000053
【図１６】
2021504477.tif 000054
【図１７Ａ】
2021504477.tif 000055
【図１７Ｂ】
2021504477.tif 000056
【図１８】
2021504477.tif 000057
【図１９】
2021504477.tif 000058
【図２０】
2021504477.tif 000059
【図２１Ａ】
2021504477.tif 000060
【図２１Ｂ】
2021504477.tif 000061
【図２２】
2021504477.tif 000062
【図２３】
2021504477.tif 000063
【国際調査報告】
2021504477.tif 000064