(57)【要約】本開示は、免疫優性タンパク質またはペプチドを使用することによる多発性硬化症（ＭＳ）の処置、診断および／または予防に関する。より具体的には、本発明は、寛容の誘導などの抗原特異的免疫療法の分野に関する。多発性硬化症（ＭＳ）の処置、診断および／または予防において使用するための、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質もしくはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアント、あるいは前記タンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントのいずれかをコードするヌクレオチド配列。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症（ＭＳ）の処置、診断および／または予防において使用するための、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質もしくはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアント、あるいは前記タンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントのいずれかをコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質が、
ａ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するか、または
ｂ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するか、または
ｃ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有するか、または
ｄ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有し、前記タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントが自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または配列番号１に記載されているアミノ酸配列もしくはその断片に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識されるか、または
ｅ）ＴＳＴＡ３遺伝子により、特にＮＣ＿０００００８．１１のヌクレオチド１４３６１２６１８〜１４３６１８０４８の遺伝子配列によりコードされるか、またはＮＣ＿０００００８．１１のヌクレオチド１４３６１２６１８〜１４３６１８０４８の遺伝子配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一の遺伝子によりコードされ、
および／または
前記ＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーの前記メンバーが、
ｆ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列を有するか、または
ｇ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するか、または
ｈ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有するか、または
ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有し、前記タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントが自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９のいずれかに記載されている各アミノ酸配列もしくはその断片に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識されるか、または
ｊ）ＲＡＳＧＲＰ遺伝子により、特に
−ＮＣ＿００００１５．１０のヌクレオチド３８４８８１０１〜３８５６５５７５、
−ＮＣ＿００００１１．１０のヌクレオチド６４７２６９１１〜６４７４５４５６、
−ＮＣ＿０００００２．１２のヌクレオチド３３４３６３２４〜３３５６４７５０、または
−ＮＣ＿００００１９．１０のヌクレオチド３８４０９０５１〜３８４２６３０５
の遺伝子配列によりコードされるか、
または、
−ＮＣ＿００００１５．１０のヌクレオチド３８４８８１０１〜３８５６５５７５、
−ＮＣ＿００００１１．１０のヌクレオチド６４７２６９１１〜６４７４５４５６、
−ＮＣ＿０００００２．１２のヌクレオチド３３４３６３２４〜３３５６４７５０、または
−ＮＣ＿００００１９．１０のヌクレオチド３８４０９０５１〜３８４２６３０５
の遺伝子配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一の遺伝子によりコードされる、
請求項１に記載の使用のためのタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
【請求項３】
前記断片が、５〜５０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは１０〜１５個のアミノ酸、さらにより好ましくは１５個のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の使用のためのタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
【請求項４】
前記断片が、
ａ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるか、または
ｂ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同であるか、または
ｃ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同であり、自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または前記各アミノ酸配列に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識される、請求項２または３に記載の使用のためのタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
【請求項５】
前記断片が、配列番号１０〜９８、好ましくは配列番号１０〜３５を含む群より選択される配列を含み、好ましくは、配列番号１０〜９８、好ましくは配列番号１０〜３５を含む群より選択される配列からなる、前記請求項のいずれかに記載の使用のためのタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
【請求項６】
ＭＳ、好ましくは初期ＭＳにおける自己抗原への寛容化に適切なヒト被験体を同定するための、前記請求項のいずれかに記載の使用のためのタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
【請求項７】
ヒト被験体におけるパターンＩＩ  ＭＳを診断するための、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のためのタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
【請求項８】
ＭＳの処置、診断および／または予防において使用するための担体であって、請求項１〜５のいずれかに記載の少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列を含む、担体。
【請求項９】
前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／もしくはスプライスバリアントに結合させており、ならびに／または前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列を含有する、請求項８に記載の担体。
【請求項１０】
細胞、好ましくは血液細胞、タンパク質、脂質、糖脂質、ビーズ、ナノ粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）および分子、例えば糖分子およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される、請求項８または９に記載の担体。
【請求項１１】
前記タンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントが、前記細胞、好ましくは前記血液細胞により発現される、請求項１０に記載の担体。
【請求項１２】
前記血液細胞が赤血球または白血球である、請求項１０または１１に記載の担体。
【請求項１３】
前記担体が血液細胞であり、前記血液細胞が、カップリング剤により、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ／ＥＤＣ）により前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントに化学的に結合させている、請求項１０〜１２のいずれかに記載の担体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の化学的に結合させた血液細胞を製造する方法であって、ヒト被験体から前記血液細胞を単離すること、前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントを追加すること、ならびに続いて前記カップリング剤、好ましくはＥＤＣを追加することを含む、方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
ＭＳを患っているかまたはそれを発症するリスクがあるヒト被験体において自己抗原への抗原特異的寛容を誘導するための方法であって、前記ヒト被験体に、
ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列、ならびに／または
ｂ）請求項８〜１３のいずれかに記載の少なくとも１つの担体
を適用するステップを含む、方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列が、経鼻、吸入、経口、皮下（ｓ．ｃ．）、体腔内（ｉ．ｃ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、経皮（ｔ．ｄ．）もしくは静脈内（ｉ．ｖ．）投与により、好ましくは静脈内、皮下、皮内、経皮、経口、吸入、経鼻により適用されるか、または担体、好ましくは赤血球に結合させている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
初期ＭＳにおける自己抗原への抗原特異的寛容を誘導するための、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＭＳ、好ましくは初期ＭＳにおける自己抗原への寛容化に適切なヒト被験体を同定するための方法であって、前記被験体の血液、ＣＳＦまたは他の体液からＴ細胞および／または抗体を単離すること、ならびに請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントに対する前記Ｔ細胞および／または抗体の反応性を測定することを含む、方法。
【請求項２０】
医薬として使用するための、請求項３〜５のいずれかに記載の断片、好ましくは請求項５に記載の断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、免疫優性タンパク質またはペプチドを使用することによる多発性硬化症の処置、診断および／または予防に関する。より具体的には、本発明は、寛容の誘導などの抗原特異的免疫療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多発性硬化症（ＭＳ）は、若年成人に主に影響を与える破壊的な自己免疫性炎症性疾患である。自己免疫反応は、脳および脊髄からなる中枢神経系（ＣＮＳ）のみを標的とするので、ＭＳは、臓器特異的自己免疫疾患（ＡＩＤ）の原型例である。臓器特異的ＡＩＤは、患者の免疫系が、自己反応性Ｔ細胞および／または抗体により特定の組織または細胞タイプを損傷することを意味する。
【０００３】
ＭＳは、２０〜４０歳の若年成人に優先的に影響を与えるが、子供および高齢者もＭＳを発症し得る。この疾患は、女性では、男性よりも約２〜３倍頻繁である。ＭＳは、通常、視覚（急性視神経炎）、感覚または運動および自律機能の一時的な問題により臨床的に現れるが、広範囲の神経学的症状をもたらし得る。
【０００４】
鑑別診断が除外された場合の最初の顕在化の時点では、脳脊髄液（ＣＳＦ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の所見が診断と一致するという条件で、この疾患は臨床的に孤立した症候群（ＣＩＳ）と称される。ＭＲＩは、ＭＳに典型的な場所、すなわち脳幹または脊髄における皮質近傍、脳室周囲の病変を明らかにする。空間的（１つを超える病変または臨床症状／徴候）および時間的（１つを超える事象）な播種としてまとめられ得る特定の基準が満たされる場合、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の診断が下され得る。特別な状況は、臨床症状を伴わないＭＳと適合するＭＲＩ病変の偶発的な発見である。これは放射線学的孤立症候群（ＲＩＳ）と称され、ＣＩＳおよびＲＲＭＳの前段階と考えられ得る。患者の８０％より多くはこれらのうちの１つを患っており、患者の大部分は、その後、二次進行性多発性硬化症（ＳＰＭＳ）と称されるものを発症する。この時点で、再発／悪化は低頻度であるかまたは完全に停止し、再発の間にまたはこれらを伴わずに神経学的障害（neurological  disability）は着実に増加する。
【０００５】
特別な形態のＭＳは、再発を示さないが神経学的症状、例えば歩行能力の着実な悪化で始まる原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）である。ＰＰＭＳは、ＭＳ患者のおよそ１０％ならびに等頻度で男性および女性に影響を与える。その発症は、通常、ＣＩＳまたはＲＲＭＳよりも遅い。原因および疾患機序に関して、ＰＰＭＳは、上記ＲＩＳ−ＣＩＳ−ＲＲＭＳ−ＳＰＭＳと同様であると考えられる。
【０００６】
典型的には、ＭＳは、改訂マクドナルドまたは最近のルブリン基準にしたがって診断される。これらの基準はまた、ＭＳの様々な形態および疾患活動性を区別することを可能にする（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２０１８，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ，１７（２）：１６２−１７３）。
【０００７】
ＭＳは、複雑な遺伝的背景を有する疾患である。過去１０年間で、２００個を超えるＭＳリスク対立遺伝子または量的形質（一塩基多型、ＳＮＰとして検出される遺伝子の一般的なバリアント）が同定されているが、しかしながら、最も重要なのはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ１５ハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｅ）である。加えて、いくつかの環境／ライフスタイルリスク因子が見出された。これらとしては、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の感染、喫煙、低いビタミンＤ３レベル、および最も重要なものとして肥満が挙げられる。
【０００８】
すべての遺伝的および環境的リスク因子は一般的であり、健常集団の多くの個体により共有される。特定の遺伝的および環境的リスク因子を有する個体において前記疾患が始まる正確な理由は明らかではないが、例えば、腸内細菌叢の変化によるウイルスおよび細菌感染がトリガーであり得ると推測する。一般集団における１／１０００のリスクと比較して、一卵性双生児の一致率が１０〜３０％であり、ＭＳ患者の第一度近親者のリスクが約２〜４％であることは、遺伝的リスク対環境的リスクの推定値を提供するが、この２つの間の相互作用も複雑である。
【０００９】
ＭＳにおける自己免疫反応が対象とするＣＮＳの構成要素を同定するために、研究者らは、ＭＳで影響を受ける細胞および構造、特にミエリンおよび軸索／ニューロン、ならびにこれらの細胞／構造に特異的なタンパク質に努力を向けた。過去３０年間の間に、いくつかのミエリンタンパク質、例えばミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）およびミエリンオリゴデンドログリア糖タンパク質（ＭＯＧ）は、動物モデル（実験的自己免疫性脳脊髄炎；ＥＡＥ）（すなわち、感受性齧歯類系統へのそれらの注射は、ＭＳとの類似性を有する疾患をもたらす）において、さらにはＭＳ患者由来の免疫細胞を調べることにより脳炎誘発性として同定されている（Ｓｏｓｐｅｄｒａ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，２００５，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：６８３−７４７）。上記自己抗原はＣＮＳ特異的であり、脳において排他的に（ＰＬＰおよびＭＯＧ）またはほぼ排他的に（ＭＢＰ）発現される。ＭＳでは、ＣＮＳ特異的ではない少数の自己抗原、例えばアルファＢクリスタリンおよびトランスアルドラーゼＨも潜在的な標的として記載されている。
【００１０】
現在の証拠は、ＭＳの自己免疫病因の中心因子としてのＣＤ４＋自己反応性Ｔ細胞がおそらく、自己免疫反応の誘導および維持だけではなく、組織損傷の間にも関連することを示唆している（Ｓｏｓｐｅｄｒａ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，２００５）。ＭＳ患者では、ミエリン鞘の主な構成要素、例えばＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧに反応性の高アビディティＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が増加する（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２００４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７２：３８９３−３９０４）。疾患病因へのそれらの関与により、ＣＤ４＋Ｔ細胞は治療的介入の標的である。
【００１１】
ＣＮＳ特異的タンパク質に対する免疫反応の詳細な調査は、その特定のペプチドが、疾患関連ＨＬＡ−ＤＲ分子との関連において患者の大部分により認識されることを示した。このようなペプチドは免疫優性と称される（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２００４）。
【００１２】
以下の特徴は、ＭＳとの関連において、タンパク質の特定のペプチドが免疫優性であることを示す：
ａ）多くの場合には疾患関連ＨＬＡ対立遺伝子またはハプロタイプとの関連において、Ｔ細胞による、すなわちＭＳ患者のおよそ１０％またはそれよりも多くによるこのペプチドの頻繁な認識（Ｓｏｓｐｅｄｒａ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，２００５）、および
ｂ）低濃度のペプチドに反応し（高アビディティＴ細胞）（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２００４）、したがって特に危険であると考えられ、および／または炎症促進性表現型を有し、および／または標的器官もしくは区画（ＣＮＳ）から単離されたものなどの疾患関連Ｔ細胞、ＭＳの場合には脳、脊髄またはＣＳＦ浸潤Ｔ細胞によるこのペプチドの認識。
【００１３】
しかしながら、ヒト化トランスジェニックマウスモデルでは、低アビディティミエリン特異的Ｔ細胞も病原性であることが示されているので（Ｑｕａｎｄｔら、２０１２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８９（６）：２８９７−２９０８）、高アビディティ認識は必要条件ではない。
【００１４】
最近、外因性抗原の非存在下では、ＭＳ患者のＴ細胞は、インビトロ増殖の増加を示すことが実証された（Ｍｏｈｍｅら、２０１３，Ｂｒａｉｎ，１３６：１７８３−１７９８）。これらの「自己増殖」Ｔ細胞は、ＭＳ患者の中枢神経系区画に存在する細胞に豊富であるので、脳／ＣＳＦ浸潤Ｔ細胞の末梢血源と考えられ得る（Ｊｅｌｃｉｃら、２０１８，Ｃｅｌｌ，１７５（１）：８５−１００．ｅ２３）。
【００１５】
インビトロにおけるＴ細胞の試験からのデータが利用可能ではない場合、またはこのような試験に加えて、ペプチドの免疫認識はまた、それぞれＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞について、個体のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ対立遺伝子によく結合するペプチドから予測／推測され得る。ペプチド結合予測は当業者に周知である。それらは、十分に確立された予測アルゴリズム（ＮｅｔＭＨＣＩＩ−ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩ／；ＩＥＤＢ−ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）およびＨＬＡ結合モチーフの分析（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ−ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）により実施され得る。
【００１６】
免疫優性ペプチドは、寛容誘導などの抗原特異的免疫療法において使用され得る。一例は、ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧの免疫優性ペプチドならびにＭＳ処置のためのそれらの適用について開示している欧州特許第２２０５２７３号である。そこに開示されているアプローチでは、ペプチドを白血球または赤血球に結合させる。
【００１７】
寛容誘導は抗原特異的であり、自己反応性Ｔ細胞を非機能的もしくはアネルギー性にするか、または前記標的抗原に対する望ましくない自己免疫を特異的に抑制する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を誘導する。標的自己抗原への寛容の誘導は、自己免疫疾患における非常に重要な治療目標である。それは、副作用をほとんど伴わずに、有効な方法で病原性自己免疫反応を特異的に減弱する機会を提供する。寛容誘導はまた、タンパク質の断片である免疫優性ペプチドに代えてまたはそれに加えて、タンパク質全体を適用することにより達成され得る（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＭＫら、１９９０，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４４（３）：９０９−１５）。
【００１８】
Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞駆動性自己免疫疾患のパラダイム動物モデルであるＥＡＥモデルでは、ＭＳのいくつかの病的特徴が反映されている。ＳＪＬマウスにおける再発性ＥＡＥ（Ｒ−ＥＡＥ）の研究は、慢性脱髄が、最初の疾患増悪が対象とする免疫優性ミエリンペプチド、すなわちＰＬＰ１３９−１５４に対するＴ細胞反応の活性化を伴うことを明確に示した。続いて、免疫反応は、エピトープ拡散と称されるプロセスで他のミエリンペプチドＰＬＰ、ＭＢＰおよびＭＯＧに広がる。Ｔ細胞の無反応、すなわち寛容は、例えば、抗原ペプチドでパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を例えば架橋剤１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ；ＥＤＣとも略される）で処理すると誘導され得る。
【００１９】
前臨床実験は、脳炎誘発性ミエリンペプチドの混合物でパルスされ、架橋剤ＥＤＣで固定されたナイーブマウス脾細胞の単回静脈内注射が、インビボにおけるペプチド特異的寛容の誘導において非常に効率的であることを証明した。ＥＡＥでは、このプロトコールは、疾患から動物を予防しただけではなく、疾患誘導後に与えた場合にはすべてのその後の再発の発症および重症度を有効に軽減さえしたが、これは、特異的寛容が進行中の自己免疫反応をダウンレギュレートし得ることを示している（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９１，Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，６３６：７９−９４）。ＭＳの処置にさらに関連して、ＥＡＥの研究は、脳炎誘発性ミエリンペプチドのカクテルを使用して、複数のエピトープに対して寛容を同時に誘導し得ることを示し、多重特異性を有する自己反応性Ｔ細胞を標的とする能力を提供している。
【００２０】
寛容化Ｔ細胞による増殖またはＴｈ１サイトカイン産生の失敗、およびこれらの細胞上における共刺激分子の発現の減少により示されるように、ＥＤＣで処理された自己抗原に結合させた細胞、例えばＡＰＣ（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋら、２０００，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２：５７−６６）または非有核細胞、すなわち赤血球（ＲＢＣ）によるヒトＴ細胞の寛容化はインビトロで有効である。
【００２１】
少なくとも２つの異なる機序が、このレジームによる抗原特異的寛容の誘導に関与するという証拠がある：
１）適切なＣＤ２８媒介性共刺激を受けることができなかった結果として、抗原に結合させたＡＰＣ上の名目抗原／ＭＨＣ複合体に遭遇するＴｈ１クローンがアネルギー化された直接的な寛容、および
２）寛容原性宿主ＡＰＣによる抗原の再プロセシングおよび再提示ならびに／またはＴｒｅｇ細胞の拡大により寛容が誘導される間接的な機序、例えば交差寛容。
【００２２】
後者の交差寛容は、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞の誘導および／または拡大を伴う可能性があり、この仮定は、本明細書に開示される第Ｉｂ相試験で得られたデータによっても裏付けられる。さらに、ＥＤＣによる細胞の処理は、かなりの割合の処理細胞においてアポトーシスを誘導する。したがって、アポトーシスを受ける固定ＡＰＣを伴い、次いで宿主ＡＰＣによりプロセシングおよび再提示される間接的な機序が考えられる。これは、ＭＨＣ欠損および同種マウスにおける寛容の有効な誘導によりさらに裏付けられる。インビトロ骨髄由来樹状細胞は、抗原をパルスし固定したＡＰＣを有効に貪食およびプロセシングする。
【００２３】
現在承認されているＭＳ治療は、部分的に有効にすぎない様々な抗原非特異的免疫調節または免疫抑制戦略を伴う。現在の治療薬（therapeutics）はすべて、毎日経口摂取されるか、または長期間にわたって様々な時間間隔で注射／注入される必要がある。さらに、それらは、時には重篤な多数の副作用を伴う。
その根底のＭＳ病因に対処する治療は、「正常な」免疫系を変化させずに、病原性自己反応性細胞を特異的に除去または機能的に阻害することを目的とすべきである。全体的な免疫調節および／または免疫抑制は、病原体に対する保護機能を果たす有益な制御性細胞および免疫細胞を阻害するという犠牲を強いられるので、これは重要である。理想的には、自己反応性免疫反応の遮断が疾患の播種および伝播を阻害し得、不可逆的な障害が予防され得る疾患の炎症段階の初期に、ペプチド特異的免疫寛容、すなわち、脳／脊髄組織に対する誤った自己免疫反応の特異的修正が達成されるべきである。したがって、好ましい標的患者群は、疾患経過の初期の再発性寛解性ＭＳ患者、またはさらにはＭＳを示唆する最初の臨床事象、すなわちＣＩＳを示す患者、またはＲＩＳ段階の特に初期に疾患が発見される患者である。この時点では、ＭＳ患者は一般に軽度の神経障害を有し、重大な妥協を伴わずに日常生活および仕事のすべての活動に参加することが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２０１８，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ，１７（２）：１６２−１７３
【非特許文献２】Ｓｏｓｐｅｄｒａ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，２００５，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：６８３−７４７
【非特許文献３】Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２００４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７２：３８９３−３９０４
【非特許文献４】Ｑｕａｎｄｔら、２０１２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８９（６）：２８９７−２９０８
【非特許文献５】Ｍｏｈｍｅら、２０１３，Ｂｒａｉｎ，１３６：１７８３−１７９８
【非特許文献６】Ｊｅｌｃｉｃら、２０１８，Ｃｅｌｌ，１７５（１）：８５−１００．ｅ２３
【非特許文献７】Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＭＫら、１９９０，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４４（３）：９０９−１５
【非特許文献８】Ｍｉｌｌｅｒら、１９９１，Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，６３６：７９−９４
【非特許文献９】Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋら、２０００，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２：５７−６６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の目的は、ＭＳの処置、診断および／または予防において、特に寛容化アプローチにおいて使用するために適切なＭＳ関連抗原を同定することである。本発明のさらなる態様は、寛容化に適切なヒト被験体の同定である。
【００２６】
本発明は、ＭＳ関連抗原を同定するための新規アプローチに基づく：非常に侵襲形態のＭＳで死亡した（ＭＳにおける主な遺伝的リスク因子であることが公知のＨＬＡ  ＤＲ１５ハプロタイプについてホモ接合性の）ＭＳ患者の脳においてクローン性に拡大したＴ細胞を調べた。それにより、初めて、標的器官においてクローン性に拡大した標的器官由来Ｔ細胞を抗原同定の目的で分析した。以前のアプローチではすべて、免疫優性抗原を同定するために、末梢血リンパ球が分析された。
【００２７】
ＭＳ脳病変におけるＴ細胞クローン（ＴＣＣ）のクローン性拡大は、前記細胞がＭＳ関連であることを示唆している。本明細書では、Ｐｌａｎａｓら、（Ｐｌａｎａｓら、２０１５，Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｎｅｕｒｏｌ，２（９）：８７５−８９３）に以前に記載されている特定のＴＣＣの標的抗原ＴＣＣ２１．１を同定した。さらに、同じ患者の別のＴＣＣ（ＴＣＣ１４）の標的抗原を同定した。ＴＣＣ１４の場合、自発的増殖（自己増殖）の増加および脳ホーミング自己反応性Ｔ細胞の富化を実証することにより、疾患関連であると同定された末梢血Ｔ細胞集団からクローンを単離した。具体的には、ＴＣＣ１４は、末梢血から単離されたにもかかわらず、ＭＳ脳病変においてクローン性に拡大することも見出された。ＴＣＣ２１．１およびＴＣＣ１４のような疾患関連Ｔ細胞の単離および同定は、図１に概略的に示されている。
【００２８】
次いで、生物学的関連（例えば、組織浸潤）Ｔ細胞により認識される標的エピトープを同定し得る（図２）。
【００２９】
この新規アプローチは、タンパク質ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（遺伝子略称：ＴＳＴＡ３；ＧＤＰ−Ｌ−フコース：ＮＡＤＰ＋４−オキシドレダクターゼ（３，５−エピマー化）またはＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼとしても公知）およびＲＡＳＧＲＰ（ＲＡＳグアニル放出タンパク質）ファミリーのタンパク質（ＲＡＳＧＲＰ１、ＲＡＳＧＲＰ２、ＲＡＳＧＲＰ３およびＲＡＳＧＲＰ４を含む）、ならびにＭＳにおいて特に関連するそれらのスプライスバリアントおよびアイソフォームを明らかにした。ＲＡＳＧＲＰ２が特に好ましい。したがって、これらのタンパク質はＭＳにおいて免疫優性であることが見出され、自己抗原である。
【００３０】
また、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼについてはＣＩＳ／ＭＳ患者由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞において、およびＲＡＳＧＲＰ２については末梢血由来単核細胞において、関連性を試験した。さらなる分析では、ＣＩＳ／ＭＳ患者由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２の両方を試験した。
【００３１】
したがって、本明細書の実施例に記載されている抗原は、ＭＳ脳病変においてクローン性に拡大するＴ細胞の特異性を調べることにより発見され、したがって、脳における損傷自己免疫反応に関与すると推定され得るＭＳにおける最初の免疫優性抗原である。それらの同定をもたらした方法論コンビナトリアルペプチドライブラリーは、ミエリン／脳タンパク質に関する上記焦点に関するものではないが、完全にバイアスフリーのものである。前記抗原は、これまでにＭＳへの関与が記載されていない。さらに、ＲＮＡシークエンシングおよびプロテオミクスは、両自己抗原、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２ならびに関連タンパク質ＲＡＳＧＲＰ１および３がＭＳ脳組織において発現されることを示した。
【００３２】
同定された抗原は、ＭＳの処置、診断および／または予防において、特に寛容化アプローチにおいて、ならびに寛容化に適切なヒト被験体を同定するために使用され得る。寛容化に適切なヒト被験体を同定することにより、ヒト被験体はＭＳとインビトロ診断され得る。換言すれば、同定された自己抗原は、ＭＳのインビトロ診断において使用され得る。このインビトロ試験は、臨床および画像所見、すなわち現在の技術水準による、特に改訂マクドナルド基準によるＭＳ診断を用いて補完され得る。したがって、同定された自己抗原は、さらなる診断試験の有無にかかわらず、ヒト被験体におけるＭＳの診断に役立ち得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】疾患関連Ｔ細胞の単離
【図２】標的エピトープの発見
【図３−１】ＴＣＣ２１．１の特異性を同定するためのバイオメトリック分析と組み合わせた単一および二重定義デカペプチド位置スキャン混合物
【図３−２】ＴＣＣ２１．１の特異性を同定するためのバイオメトリック分析と組み合わせた単一および二重定義デカペプチド位置スキャン混合物
【図４−１】バイオメトリックアプローチを用いて予測し、合成し、刺激能力について試験したヒトデカペプチドの概要
【図４−２】バイオメトリックアプローチを用いて予測し、合成し、刺激能力について試験したヒトデカペプチドの概要
【図４−３】バイオメトリックアプローチを用いて予測し、合成し、刺激能力について試験したヒトデカペプチドの概要
【図４−４】バイオメトリックアプローチを用いて予測し、合成し、刺激能力について試験したヒトデカペプチドの概要
【図５】脳組織において同定されたＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ転写産物およびペプチド
【図６−１】ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ、ミエリンおよびＣＥＦペプチド（サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルスおよびインフルエンザウイルス由来の対照ペプチド）
【図６−２】ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ、ミエリンおよびＣＥＦペプチド（サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルスおよびインフルエンザウイルス由来の対照ペプチド）
【図７】ＣＩＳ／ＭＳ患者由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドの認識
【図８】自己増殖Ｔ細胞の単離およびＭＳ脳病変に見られる自己増殖Ｔ細胞
【図９−１】位置スキャンライブラリーを使用した、自己増殖末梢血分離脳ホーミングＴＣＣ１４のペプチドリガンド同定のためのスクリーニング手順
【図９−２】位置スキャンライブラリーを使用した、自己増殖末梢血分離脳ホーミングＴＣＣ１４のペプチドリガンド同定のためのスクリーニング手順
【図１０】末梢血由来記憶Ｔ細胞のＲＡＳＧＲＰ２反応性
【図１１】末梢血Ｂ細胞および脳におけるＲＡＳＧＲＰの発現
【図１２】脳組織におけるＲＡＳＧＲＰ１、２および３タンパク質のペプチド同定
【図１３】ビオチン−ＰＬＰ１結合細胞の染色
【図１４−１】１０５人のＭＳ患者由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびミエリンペプチドの認識
【図１４−２】１０５人のＭＳ患者由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびミエリンペプチドの認識
【図１５−１】５７人のＭＳ患者由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＲＡＳＧＲＰ２およびミエリンペプチドの認識
【図１５−２】５７人のＭＳ患者由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＲＡＳＧＲＰ２およびミエリンペプチドの認識
【図１６−１】ミエリンペプチドに結合させた赤血球によるインビボにおける寛容誘導
【図１６−２】ミエリンペプチドに結合させた赤血球によるインビボにおける寛容誘導
【発明を実施するための形態】
【００３４】
免疫優性ペプチドおよび対応するタンパク質を同定するために使用されるＴ細胞は、理想的には、疾患に病原的に関連するＴ細胞である。後者の特徴に関して、ＭＳの標的組織、脳、脊髄およびＣＳＦにおいてクローン性に拡大するＴ細胞は、疾患関連標的抗原の同定に最も関心対象のものである。Ｐｌａｎａｓら、（２０１５）により記載されている方法にしたがって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖相補的またはゲノムＤＮＡ配列の次世代シークエンシングを使用して、ＭＳ患者の脳剖検病変においてクローン性に拡大したＴ細胞を同定し、（生細胞を含み、例えば生検または早期剖検により得られた）自己ＣＳＦおよび／または組織からＴＣＣとしてこれらのＴ細胞を単離し、機能的表現型および抗原特異性についてそれらを特性評価した。それにより、疾患関連ＴＣＣを単離した。具体的には、ＴＣＣ２１．１を同定および特性評価した。ＴＣＣ２１．１は、主にＴｈ２サイトカインを放出するＴｈ２表現型を示し、抗体産生のためのＢ細胞支援を提供することができた。この戦略は、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質の関連性の特定をもたらした。
【００３５】
また、上記戦略、すなわち脳／脊髄／ＣＳＦ浸潤Ｔ細胞のディープＴＣＲシークエンシングを使用して、末梢血から疾患関連Ｔ細胞を単離し、同定された自己増殖末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来Ｔ細胞をクローニングした。この戦略は、ＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーの関連性の特定をもたらした。
【００３６】
したがって、ＣＳＦ浸潤Ｔ細胞（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼについてならびにＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２の両方についてはさらなる分析で）および末梢血Ｔ細胞（ＲＡＳＧＲＰ２について）を用いた本研究は、これらが、ＭＳにおける自己免疫反応の免疫優性標的であり、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２（およびＲＡＳＧＲＰファミリーの他のメンバー）が両方とも、ＣＩＳ、ＲＲＭＳおよびＳＰＭＳを含むＭＳにおける脳浸潤Ｔ細胞により認識されることを実証する。また、ＮｅｔＭＨＣＩＩおよびＩＥＤＢインシリコペプチド結合予測アルゴリズムを使用して、（「実施例」に記載されているように）各タンパク質内の免疫優性領域を同定した。
【００３７】
細胞質酵素ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼは、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換し、次いでフコシルトランスフェラーゼがこれを使用して、すべてのオリゴ糖をフコシル化する。哺乳動物では、フコシル化グリカンは、輸血反応、宿主−微生物相互作用、がん病因、および脳における非炎症環境の維持を含む多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【００３８】
ＲＡＳＧＲタンパク質は、少なくとも４つのバリアントＲＡＳＧＲＰ１、ＲＡＳＧＲＰ２、ＲＡＳＧＲＰ３およびＲＡＳＧＲＰ４で存在する。ＲＡＳＧＲＰ１、ＲＡＳＧＲＰ２、ＲＡＳＧＲＰ３は、特に本発明に関係する。前記タンパク質ファミリーは、結合ＧＤＰのＧＴＰでの交換を通じてＲａｓを特異的に活性化するジアシルグリセロール（ＤＡＧ）調節ヌクレオチド交換因子として機能するＲａｓスーパーファミリーグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）ドメインの存在を特徴とする。前記タンパク質ファミリーのタンパク質は、Ｅｒｋ／ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する。それらは、ＥＢＶ感染Ｂ細胞のアポトーシスおよび腫瘍形成の減少、ＢおよびＴ細胞シグナル伝達、接着、運動性に関与し、Ｂ−Ｔ細胞恒常性の維持に重要である。ＲＡＳＧＲＰ２の少なくとも４つのアイソフォーム、すなわちスプライスバリアントが存在する。
【００３９】
同定された抗原ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２（ならびにＲＡＳＧＲＰ１、ＲＡＳＧＲＰ３およびＲＡＳＧＲＰ４）は、これまでにＭＳの原因（etiology）や病因およびその動物モデルＥＡＥに関係があるとはされてこなかった。タンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントが両方とも、ＭＳにおける自己免疫反応の免疫優性標的であるという本発見は、ＭＳの処置、診断および／または予防においてそれらを使用することを可能にする。
【００４０】
タンパク質は、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質自体を意味することを意図する。タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋエントリにより定義され得る。タンパク質配列はまた、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔエントリにより、および／またはＧｅｎＰｅｐｔエントリにより定義され得る。エントリは、番号、例えばアクセッション番号により定義され得る。該当する場合、データベースエントリとしては、各アクセッション番号（すなわち、エントリ番号）およびバージョン番号が挙げられる。タンパク質はまた、当業者に公知の任意の他のデータベースにより定義され得る。異なるアイソフォーム、誘導体および／またはスプライスバリアントが存在し得、これらも本発明により包含され得る。それにより、配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔエントリからの公知の配列と異なり得る。
【００４１】
本発明の「タンパク質（「ａ」ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「前記」タンパク質（「ｔｈｅ」ｐｒｏｔｅｉｎ）は、特に明確な言及がない限り、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質もしくはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質、好ましくはＲＡＳＧＲＰ２のいずれかを指すか、またはＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質もしくはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質、好ましくはＲＡＳＧＲＰ２の両方を指す。
【００４２】
スプライスバリアントは、遺伝子発現中に選択的スプライシングから生じる。本発明のスプライスバリアントは、好ましくは免疫優性である。
【００４３】
断片は、好ましくは、親タンパク質よりも短い（すなわち、より少ないアミノ酸を有する）タンパク質の任意の部分である。断片はペプチドであり得る。一実施形態では、断片は、５〜５０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは１０〜１５個のアミノ酸、さらにより好ましくは１５個のアミノ酸を含む。本発明の断片は、好ましくは免疫優性である。
【００４４】
１つを超える本発明の断片を使用することも可能である。好ましくは、３個を超える、５個を超える、１０個を超える、１５個を超えるまたはさらには２０個を超える異なる断片が使用される。好ましい実施形態では、５〜２０個、好ましくは５〜１５個の異なる断片が使用される。断片が同じアミノ酸配列で構成されていない場合、それは別の断片とは異なるものである。
【００４５】
別の実施形態では、本発明の各タンパク質（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質またはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質、好ましくはＲＡＳＧＲＰ２）の少なくとも１個の断片は組み合わされて使用される。本発明の各タンパク質の少なくとも１個の断片を少なくとも１つの現在の技術水準の公知のペプチド、特に少なくとも１つのミエリンペプチド、特に配列番号２６１〜２６７により定義されるミエリンペプチドの少なくとも１つまたは全部と組み合わせることが特に有利である。
【００４６】
配列の誘導体は、好ましくは、参照アミノ酸配列の対応する部分とその全長にわたって少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性または同一性を共有するアミノ酸配列として定義される。本発明の意味における「対応する部分」は、好ましくは、同じ親配列のアミノ酸の同じストレッチを指す。例えば、１００アミノ酸長を有する誘導体が配列番号１の一続きのアミノ酸（配列番号１のアミノ酸１〜１００）と２０アミノ酸異なる場合、この特定の誘導体は、参照アミノ酸配列（すなわち、配列番号１）の対応する部分（すなわち、アミノ酸１〜１００）とその全長にわたって８０％の同一性を共有する。本発明の誘導体は、好ましくは免疫優性である。
【００４７】
アミノ酸配列の「相同性」または「同一性」は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長にわたって、または参照アミノ酸配列の対応する部分（これは、相同性または同一性を定義する配列に対応する）の全長にわたって本発明にしたがって決定される。
【００４８】
「同一性」は同一のアミノ酸として定義され、「相同性」は同一のアミノ酸および保存的置換を含む。当業者は、保存的置換、例えば
−芳香族および芳香族ＦおよびＷ／Ｙ
−正荷電および正荷電ＲおよびＫ／Ｈ
−負荷電ＥおよびＤまたは
−脂肪族ＶおよびＬ／Ｍ／Ｉ、またはＡおよびＳ／Ｔ
を把握している。
【００４９】
本発明のタンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントのいずれかをコードするヌクレオチド配列は、任意のコードヌクレオチド配列、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ、特にｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを指す。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、プラスミドまたは当業者に公知の任意のタイプのベクターである。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列はイントロンを含まず、遺伝子配列はエキソンおよびイントロンを含む。
【００５０】
本発明の一態様では、多発性硬化症（ＭＳ）の処置、診断および／または予防において使用するためのタンパク質は、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼまたはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントである。本発明の別の態様では、タンパク質は、ＲＡＳＧＲＰファミリーのメンバーまたはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントである。本発明はまた、多発性硬化症（ＭＳ）の処置、診断および／または予防において使用するための、タンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントのいずれかをコードするヌクレオチド配列に言及する。
【００５１】
好ましい実施形態では、タンパク質はヒトタンパク質であり、ならびに／またはヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列はヒト配列である。
【００５２】
一実施形態では、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼは、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する酵素活性を示す。
【００５３】
別の実施形態では、ＲＡＳＧＲＰファミリーのメンバーは、結合ＧＤＰのＧＴＰでの交換を通じてＲａｓを活性化する。加えてまたはあるいは、タンパク質は、Ｅｒｋ／ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する。
【００５４】
好ましい実施形態では、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質は、
ａ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するか、または
ｂ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するか、または
ｃ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有するか、または
ｄ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有し、前記タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントは自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または配列番号１に記載されているアミノ酸配列もしくはその断片に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識されるか、または
ｅ）ＴＳＴＡ３遺伝子により、特にＮＣ＿０００００８．１１のヌクレオチド１４３６１２６１８〜１４３６１８０４８の遺伝子配列によりコードされるか、またはＮＣ＿０００００８．１１のヌクレオチド１４３６１２６１８〜１４３６１８０４８の遺伝子配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一の遺伝子によりコードされる。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、ＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのメンバーは、
ｆ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列を有するか、または
ｇ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するか、または
ｈ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有するか、または
ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有し、前記タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントは自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９のいずれかに記載されている各アミノ酸配列もしくはその断片に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識されるか、または
ｊ）ＲＡＳＧＲＰ遺伝子により、特に
−ＮＣ＿００００１５．１０のヌクレオチド３８４８８１０１〜３８５６５５７５、
−ＮＣ＿００００１１．１０のヌクレオチド６４７２６９１１〜６４７４５４５６、
−ＮＣ＿０００００２．１２のヌクレオチド３３４３６３２４〜３３５６４７５０、または
−ＮＣ＿００００１９．１０のヌクレオチド３８４０９０５１〜３８４２６３０５
の遺伝子配列によりコードされるか、
または、
−ＮＣ＿００００１５．１０のヌクレオチド３８４８８１０１〜３８５６５５７５、
−ＮＣ＿００００１１．１０のヌクレオチド６４７２６９１１〜６４７４５４５６、
−ＮＣ＿０００００２．１２のヌクレオチド３３４３６３２４〜３３５６４７５０、または
−ＮＣ＿００００１９．１０のヌクレオチド３８４０９０５１〜３８４２６３０５
の遺伝子配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一の遺伝子によりコードされる。
【００５６】
自己ＨＬＡ対立遺伝子への結合、Ｔ細胞による認識および／または抗体による認識は、タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントの免疫優性を示し得る。免疫優性はまた、以下に開示されているように試験され得る。
【００５７】
特に好ましい実施形態では、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼもしくはＲＡＳＧＲＰ２タンパク質またはそのスプライスバリアント、好ましくはＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼまたはＲＡＳＧＲＰ２タンパク質が本発明で使用される。ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質は、例えば、配列番号１に記載されている配列を有し、ＲＡＳＧＲＰ２タンパク質は、例えば、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９に記載されている配列を有する。
【００５８】
一実施形態では、断片は、５〜５０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは１０〜１５個、さらにより好ましくは１５個のアミノ酸を含む。
【００５９】
別の実施形態では、断片は
ａ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるか、または
ｂ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同であるか、または
ｃ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同であり、自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または前記各アミノ酸配列に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識される。
【００６０】
「各対応するアミノ酸配列」は、相同断片と同じ長さを有する対応するアミノ酸配列（すなわち、配列番号１）の各断片を指す（上記「対応する部分」の定義も参照のこと）。これらの同一性および／または相同性を有する断片は、５〜５０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは１０〜１５個、さらにより好ましくは１５個のアミノ酸を含み得る。同一性および／または相同性は、各断片の全長にわたって決定される。換言すれば、「対応するアミノ酸配列」は、未変更の配列を指し、すなわち、配列番号１に記載されている配列の断片が、各対応するアミノ酸と８５％同一である場合、断片は、配列番号１から「切除された」、すなわち直接取得またはコピーされた未変更の断片と（断片の全長にわたって）８５％同一である。
【００６１】
したがって、一実施形態では、タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントが自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または各配列番号に記載されているアミノ酸配列もしくはその断片に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識されるというさらなる要件で、タンパク質（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼまたはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのメンバー）は、配列番号に記載されている各示されている配列と特定の相同性（少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％）を有するアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントは自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、各配列番号に記載されているアミノ酸配列またはその断片に結合するかまたはそれを認識するＴ細胞により認識される。
【００６２】
自己ＨＬＡ対立遺伝子への結合、Ｔ細胞による認識または抗体による認識を測定および／または予測するためのアッセイは当業者に周知である。ＨＬＡ対立遺伝子へのペプチドの結合は、例えば、十分に認められているＮｅｔＭＨＣＩＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩ／）またはＩＥＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）インシリコペプチド結合予測アルゴリズムを使用して予測され得る。Ｔ細胞認識は、Ｔ細胞増殖アッセイにより、例えば取り込まれた放射能を測定することにより測定され得る。抗体へのペプチドおよび／またはタンパク質の結合は、当業者に公知の標準的なアッセイにより、例えばＥＬＩＳＡにより測定され得る。自己ＨＬＡ対立遺伝子への結合、Ｔ細胞による認識または抗体による認識は、ペプチドまたはタンパク質の免疫優性を示し得る。免疫優性はまた、以下に開示されているように試験され得る。
【００６３】
一実施形態では、断片は、ＲＡＳＧＲＰファミリーのタンパク質間で少なくとも９０％同一または相同である一続きの連続アミノ酸（例えば、２０〜３０アミノ酸）に相当する。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明の処置に使用されるペプチドは、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼのまたはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質の断片であり、配列番号１０〜９８からなる群より選択される配列を含む。特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号１０〜９８の１つに示されているアミノ酸配列からなる。配列番号１０〜３５の配列が好ましい。
【００６５】
配列番号１０〜３５に従う配列は、疾患関連Ｔ細胞により認識され、続いて、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼについてはＣＳＦ浸潤バルクＴ細胞およびＲＡＳＧＲＰ２についてはＰＢＭＣにより認識が検証されるので、免疫優性ペプチドとして同定された（「実施例」を参照のこと）。配列番号３６および３７に従うアミノ酸配列は、ＲＡＳＧＲＰ２とＲＡＳＧＲＰ３との間で一続きの同一の配列を表す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ７ＬＤＧ７−１およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ８ＩＶ６１のアライメント）。配列番号３８〜９８に従うアミノ酸は、ＭＳ患者由来の記憶Ｔ細胞の反応を生じさせたペプチドプールに含まれる（実施例の９および図１０を参照のこと）。ＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いたさらなる分析では、配列番号１２、２１、２３、２８および３２（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ）および配列番号４６（ＲＡＳＧＲＰ２）を有する配列を検証した（「実施例」の１３ならびに図１４および１５を参照のこと）。
【００６６】
配列番号１〜９８の配列はまた、以下の表１に列挙されている：
【表１−１】
2021528965.tif 000002
【表１−２】
2021528965.tif 000003
【表１−３】
2021528965.tif 000004
【表１−４】
2021528965.tif 000005
【表１−５】
2021528965.tif 000006
【表１−６】
2021528965.tif 000007
【表１−７】
2021528965.tif 000008
【表１−８】
2021528965.tif 000009
【表１−９】
2021528965.tif 000010
【表１−１０】
2021528965.tif 000011
【表１−１１】
2021528965.tif 000012
【表１−１２】
2021528965.tif 000013
【表１−１３】
2021528965.tif 000014
【表１−１４】
2021528965.tif 000015
【表１−１５】
2021528965.tif 000016
【表１−１６】
2021528965.tif 000017
【表１−１７】
2021528965.tif 000018
【表１−１８】
2021528965.tif 000019
【表１−１９】
2021528965.tif 000020
【表１−２０】
2021528965.tif 000021
【表１−２１】
2021528965.tif 000022
【００６７】
以下の遺伝子配列（表２）は、タンパク質ＧＤＰ−Ｌフコースシンターゼ（遺伝子：ＴＳＴＡ３）、ＲＡＳＧＲＰ１、ＲＡＳＧＲＰ２、ＲＡＳＧＲＰ３およびＲＡＳＧＲＰ４の遺伝子配列を表す（表２）。タンパク質またはその誘導体もしくはスプライスバリアントは、好ましくは、各遺伝子によりコードされる。
【００６８】
【表２】
2021528965.tif 000023
【００６９】
以下のヌクレオチド配列（表３）は、本発明のタンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントのいずれかをコードする好ましいヌクレオチド配列を表す。表はまた、多発性硬化症（ＭＳ）の処置、診断および／または予防においても使用され得るコード配列（ＣＤＳ）、すなわちタンパク質またはペプチドを含む。
【００７０】
【表３−１】
2021528965.tif 000024
【表３−２】
2021528965.tif 000025
【表３−３】
2021528965.tif 000026
【表３−４】
2021528965.tif 000027
【００７１】
２０１８年６月２２日に、各オンラインデータベースからすべての配列を取り出した。
【００７２】
一実施形態では、本発明のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアントは、ＭＳ、好ましくは初期ＭＳにおける自己抗原への寛容化に適切なヒト被験体を同定するために使用され得る。ＭＳ、好ましくは初期ＭＳにおける自己抗原への寛容化に適切なヒト被験体の同定は、好ましくは、ヒト被験体における自己抗原へのＴ細胞および／または抗体の陽性反応性を測定することを含む。それにより、ヒト被験体はまた、ＭＳであるとインビトロ診断され得る。換言すれば、同定された自己抗原はまた、ＭＳのインビトロ診断において使用され得る。
【００７３】
ＭＳのインビトロ診断は、好ましくは、以下：被験体の血液、ＣＳＦまたは他の体液からＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞および／または抗体を単離するステップ、ならびに本発明のタンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントに対するＴ細胞および／または抗体の反応性を測定するステップを含む。当業者は、被験体の血液、ＣＳＦまたは他の体液からＴ細胞および／または抗体を単離し、タンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアントに対するＴ細胞および／または抗体の反応性を測定するための方法を把握している。試験タンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントへのＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞および／または抗体の反応性は、被験体がＭＳを患っていることを示し得る。診断はまた、臨床および画像所見、すなわち現在の技術水準による、特に改訂マクドナルド基準によるＭＳ診断と組み合わせられ得る。
【００７４】
別の実施形態では、本発明のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアントは、ＭＳサブグループを区別するために使用され得る。特に、本発明のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアントは、ヒト被験体におけるパターンＩＩ  ＭＳを診断するために使用され得る。
【００７５】
以下の特徴は、ＭＳとの関連において、タンパク質の特定のペプチドが免疫優性であることを示す：
ａ）多くの場合には疾患関連ＨＬＡ対立遺伝子またはハプロタイプとの関連において、Ｔ細胞による、すなわちＭＳ患者のおよそ１０％またはそれよりも多くによるこのペプチドの頻繁な認識（Ｓｏｓｐｅｄｒａ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，２００５）、および
ｂ）低濃度のペプチドに反応し（高アビディティＴ細胞）（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２００４）、したがって特に危険であると考えられ、および／または炎症促進性表現型を有し、および／または標的器官もしくは区画（ＣＮＳ）から単離されたものなどの疾患関連Ｔ細胞、ＭＳの場合には脳、脊髄またはＣＳＦ浸潤Ｔ細胞によるこのペプチドの認識。
【００７６】
しかしながら、ヒト化トランスジェニックマウスモデルでは、低アビディティミエリン特異的Ｔ細胞も病原性であることが示されているので（Ｑｕａｎｄｔら、２０１２）、高アビディティ認識は必要条件ではない。
【００７７】
したがって、ＭＳとの関連において、タンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントが免疫優性であるかどうかが試験され得る。このような試験は、好ましくはインビトロ試験である。試験タンパク質または断片、誘導体もしくはスプライスバリアントへの、ＭＳと診断されたヒト被験体の血液、ＣＳＦまたは他の体液から得られたＴ細胞および／または抗体、好ましくはＣＳＦ浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性を測定することを可能にするインビトロ試験が特に適切である。当業者は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞および／または抗体の反応性を試験する方法を把握している。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖、および／またはそれらのＩＦＮ−γ分泌、またはＥＬＩＳＰＯＴ／ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴアッセイにおける反応性、またはＨＬＡ−ペプチド四量体に対する反応性が試験され得る。試験タンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントが、ＭＳと診断されたヒト被験体において反応性を誘導する場合、特にＴ細胞反応性の場合には２を超える刺激指数（ＳＩ）および／または２０ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ−γ分泌を誘導する場合、試験タンパク質または断片、誘導体もしくはスプライスバリアントは免疫優性と称され得る。このような試験のために、ＭＳと診断された１０人の患者を選択することも可能である。少なくとも２人の患者において反応性が誘導される場合、試験タンパク質または断片、誘導体もしくはスプライスバリアントは免疫優性と称され得る。好ましくは、１０人の患者は、確立された改訂マクドナルド基準にしたがってＲＲＭＳと診断されている。
【００７８】
最近、外因性抗原の非存在下では、ＭＳ患者のＴ細胞は、インビトロ増殖の増加を示すことが実証された（Ｍｏｈｍｅら、２０１３；Ｊｅｌｃｉｃら、２０１８）。これらの「自己増殖」Ｔ細胞は、ＭＳ患者の中枢神経系区画にホーミングする細胞について富化されているので、脳／ＣＳＦ浸潤Ｔ細胞の末梢血源と考えられ得る。
【００７９】
インビトロにおけるＴ細胞の試験からのデータが利用可能でない場合、またはこのような試験に加えて、ペプチドの免疫認識はまた、それぞれＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞について、個体のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によく結合するペプチドから予測／推測され得る。ペプチド結合予測は当業者に周知である。それらは、十分に確立された予測アルゴリズム（ＮｅｔＭＨＣＩＩ−ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩ／；ＩＥＤＢ−ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）およびＨＬＡ結合モチーフの分析（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ−ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）により実施され得る。「実施例」の１１を参照のこと。
【００８０】
本発明によれば、タンパク質ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのメンバー、特にＲＡＳＧＲＰ２は、ＭＳにおいて免疫優性であると同定されたので、それらは自己抗原として同定された。
【００８１】
ＨＬＡ対立遺伝子への結合が特に強いものである必要はない。実際、ＨＬＡ対立遺伝子に弱く結合するペプチドについても、免疫優性は発生し得る（Ｍｕｒａｒｏら、１９９７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ；１００（２）：３３９−３４９）。
【００８２】
寛容誘導は抗原特異的であり、自己反応性Ｔ細胞を非機能的もしくはアネルギー性にするか、または前記標的抗原に対する望ましくない自己免疫を特異的に抑制するＴｒｅｇ細胞を誘導する。標的自己抗原への寛容の誘導は、自己免疫疾患における非常に重要な治療目標である。それは、副作用をほとんど伴わずに、有効な方法で病原性自己免疫反応を特異的に減弱する機会を提供する。寛容誘導はまた、タンパク質の断片である免疫優性ペプチドに代えてまたはそれに加えて、タンパク質全体を適用することにより達成され得る（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＭＫら、１９９０）。赤血球に結合させた免疫優性ペプチドの静脈内注射により、ヒト患者において、寛容と一致する免疫学的変化が誘導され得ることが本明細書で示された（実施例の１４）。したがって、免疫優性ペプチドは寛容誘導に使用され得る。
【００８３】
したがって、タンパク質および／または断片の免疫優性は、タンパク質および／またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントを抗原特異的免疫療法、例えば寛容誘導に使用することを可能にする。
【００８４】
本発明によれば、抗原特異的寛容化は、すべての形態のＭＳで使用され得る：鑑別診断が除外された最初の顕在化の時点では、ＣＳＦおよびＭＲＩの所見が診断と一致するという条件で、この疾患はＣＩＳと称される。ＭＲＩは、ＭＳに典型的な場所、すなわち脳幹または脊髄における皮質近傍、脳室周囲の病変を明らかにする。空間的（１つを超える病変または臨床症状／徴候）および時間的（１つを超える事象）な播種としてまとめられ得る特定の基準が満たされる場合、ＲＲＭＳの診断がなされ得る。特別な状況は、臨床症状を伴わないＭＳと適合するＭＲＩ病変の偶発的な発見である。これはＲＩＳと称され、ＣＩＳおよびＲＲＭＳの前段階と考えられ得る。患者の８０％より多くはこれらのうちの１つを患っており、患者の大部分は、その後、ＳＰＭＳと称されるものを発症する。この時点で、再発／悪化は低頻度であるかまたは完全に停止し、再発の間にまたはこれらを伴わずに神経学的障害は着実に増加する。
【００８５】
特別な形態のＭＳは、再発を示さないが神経学的症状、例えば歩行能力の着実な悪化で始まるＰＰＭＳである。ＰＰＭＳは、ＭＳ患者のおよそ１０％ならびに等頻度で男性および女性に影響を与える。その発症は、通常、ＣＩＳまたはＲＲＭＳよりも遅い。原因および疾患機序に関して、ＰＰＭＳは、上記ＲＩＳ−ＣＩＳ−ＲＲＭＳ−ＳＰＭＳと同様であると考えられる。
【００８６】
典型的には、ＭＳは、改訂マクドナルド基準にしたがって診断される。これらの基準はまた、ＭＳの様々な形態および疾患活動性を区別することを可能にする（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２０１８，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ，１７（２）：１６２−１７３）。
【００８７】
好ましくは、寛容化アプローチは、初期段階、すなわちＲＩＳ、ＣＩＳおよび初期ＲＲＭＳで適用されるが、これは、この段階の免疫プロセスが自己反応性Ｔリンパ球により主に媒介され、疾患が進行すると、組織損傷（いわゆる変性変化）が徐々に重要になるためである。しかしながら、寛容化に使用される抗原に対する自己反応性Ｔ細胞反応がある限り（これは、ＳＰＭＳおよびＰＰＭＳ中にもあり得る）、寛容化は有意義である。
【００８８】
特に好ましい実施形態では、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼもしくはＲＡＳＧＲＰ２タンパク質またはそのスプライスバリアント、好ましくはＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼまたはＲＡＳＧＲＰ２タンパク質は、初期段階、すなわちＲＩＳ、ＣＩＳおよび初期ＲＲＭＳの寛容化アプローチにおいて使用される。ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質は、例えば、配列番号１に記載されている配列を有し、ＲＡＳＧＲＰ２タンパク質は、例えば、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９に記載されている配列を有する。
【００８９】
本発明の一態様では、ＭＳを患っているかまたはそれを発症するリスクがあるヒト被験体において自己抗原への抗原特異的寛容を誘導するための方法が提供される。前記方法は、それを必要とする患者に、すなわちヒト被験体に、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのメンバーからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質、その断片（ペプチド）、誘導体および／またはスプライスバリアント、本明細書に記載されるタンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントおよび／または遺伝子配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列を適用するステップ、あるいは本明細書に記載される少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列を含む少なくとも１つの担体を適用するステップを含む。
【００９０】
一実施形態では、ヌクレオチド配列または遺伝子配列は、担体、例えば細胞を介して患者に適用される。次いで、抗原は、担体、例えば細胞により発現され得る。自己抗原コードＲＮＡ／ＤＮＡを担体、例えば細胞に移入して上記自己抗原をコードすることもまた、抗原コードＲＮＡを用いる腫瘍ワクチン接種アプローチと同様、考えられる。
【００９１】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼのタンパク質全体（配列番号１）またはＲＡＳＧＲＰ２のタンパク質全体（配列番号２または配列番号６、７、８もしくは９）を抗原特異的寛容の誘導に使用することが特に好ましい。別の好ましい実施形態では、これらのタンパク質のいずれかの断片が使用される。配列番号１０〜９８のいずれかに記載されている断片を使用することが特に好ましい。配列番号１０〜３５のいずれかに記載されているペプチドがさらにより好ましい。
【００９２】
少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列は、経鼻、吸入、経口、皮下（ｓ．ｃ．）、体腔内（ｉ．ｃ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、経皮（ｔ．ｄ．）もしくは静脈内（ｉ．ｖ．）投与により、好ましくは寛容原性と考えられる投与経路により、例えば静脈内、皮下、皮内、経皮、経口、吸入、経鼻により適用され得るか、または寛容原性担体、好ましくはＲＢＣに結合させ得る。
【００９３】
特に、前記方法は、初期ＭＳまたはさらには疾患の前臨床段階において自己抗原への抗原特異的寛容を誘導するために使用され得る。
【００９４】
本明細書で提供される抗原特異的寛容プロトコールは、疾患を長期化させる複数の潜在的な脳炎誘発性エピトープに特異的な活性化およびナイーブ自己反応性Ｔ細胞の両方を選択的に標的とし得る。
【００９５】
寛容化アプローチはまた、ＭＳを予防するために使用され得る。このアプローチは、ＭＳを発症する高いリスクがある個体（例えば、ＭＳ患者を有する家族において）を同定することを含み得る。例えば、ＭＳを有する母親の子供またはＭＳを有する患者の一卵性双生児（これらの者では、ＭＳを発症するリスクが特に高いであろう）を寛容化することが可能である。
【００９６】
ＭＳまたはその形態の１つの診断は、空間的および時間的に播種するＭＳと適合する神経学的欠損および／またはＭＲＩ病変を実証することにより行われる。新規標的タンパク質ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰファミリーならびに／またはその断片、誘導体および／もしくはスプライスバリアントに対する自己免疫反応についての陽性の検査室試験は、特に抗原特異的寛容誘導から利益を得る可能性がある患者を同定する（すなわち、抗原特異的寛容アプローチを個別化することを可能にする）ために使用され得る。特に抗原特異的寛容誘導から利益を得る可能性がある患者を同定することにより、患者はＭＳであるとインビトロ診断され得る。換言すれば、同定された自己抗原ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰファミリー（特に、ＲＡＳＧＲＰ２）ならびに／またはその断片および／もしくは誘導体および／もしくはスプライスバリアントは、ＭＳのインビトロ診断において使用され得る。したがって、このインビトロ試験は、臨床および画像所見、すなわち現在の技術水準による、特に改訂マクドナルド基準によるＭＳ診断を用いて補完され得る。
【００９７】
本発明の別の態様では、ＭＳ、好ましくは初期ＭＳにおける自己抗原への寛容化に適切なヒト被験体を同定するための方法が提供される。それにより、処置から利益を受けるかまたはそれに適格な個々の患者が同定される。この方法はまた、ＭＳをインビトロ診断するために使用され得る。ＣＩＳ、おそらくさらにはＲＩＳおよびＲＲＭＳを有する患者は寛容化に最も適するが、患者が、寛容化処置に含まれる抗原ペプチドの少なくとも１つに反応する限り、寛容化は、ＳＰＭＳおよびＰＰＭＳを含むすべての形態のＭＳにおいて有意義であるようである。この方法のステップは、被験体の血液、ＣＳＦまたは他の体液からＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞および／または抗体を単離すること、ならびに本発明のタンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントに対するＴ細胞および／または抗体の反応性を測定することを含む。当業者は、被験体の血液、ＣＳＦまたは他の体液からＴ細胞および／または抗体を単離し、タンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアントに対するＴ細胞および／または抗体の反応性を測定するための方法を把握している。
【００９８】
個体がタンパク質または断片の１つに対する反応を有する場合、それにより、彼／彼女はＭＳとインビトロ診断され得、処置に適格であり、その良い候補であろう。さらなる選択ステップは、ＨＬＡクラスＩＩタイピングおよびＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の存在であり得る。
【００９９】
したがって、タンパク質、特にＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質（GDP-L-fucoase  synthase  protein）もしくはＲＡＳＧＲＰファミリーのタンパク質、特にＲＡＳＧＲＰ２または疾患関連抗原由来のその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントは、各自己抗原に対する既存のおよび／または特に強い炎症促進性（潜在的に有害な）Ｔ細胞または抗体反応を有する患者または患者サブグループを同定するために使用され得る。したがって、各自己抗原に対する既存のおよび／または特に強い炎症促進性（潜在的に有害な）Ｔ細胞または抗体反応を有する患者または患者サブグループを同定することにより、患者は、ＭＳとインビトロ診断され得る。この状況では、自己抗原に対する反応性を評価するための適切な試験を用いた患者の事前試験もまた、可能な限り特異的に寛容化し、さらには潜在的な有害効果を回避することを目的として、個々の患者または患者サブグループへの寛容化処置（例えば、寛容化に使用されるペプチド／タンパク質の組成）を調整することを可能にするであろう。しかしながら、抗原特異的寛容化もまた、寛容化抗原に対するＴ細胞反応が示されていない患者において実施され得る。したがって、一実施形態では、本発明のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントは、ＭＳと診断されたヒト被験体またはＭＳを発症するリスクがあるヒト被験体のインビトロ事前試験において使用され得る。
【０１００】
本発明の一態様では、少なくとも１つの本明細書に記載されるタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列を含む担体が提供される。担体を、少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／もしくはスプライスバリアントに結合させ得、ならびに／または担体は、少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列を含有し得る。一実施形態では、「含有する」という用語は、タンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列が担体の表面ではなく内部にあることを意味する。タンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントもまた担体に結合させ得、担体内に含ませ得るが、これは、タンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントのある部分を担体に結合させ、タンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントの別の部分を担体内に含ませることを意味する。
【０１０１】
当業者は、可能な担体を熟知している。例えば、担体は、任意の細胞、タンパク質、脂質、糖脂質、ビーズ、ナノ粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または分子、例えば糖分子、またはヒトにおける適用に適切なそれらの任意の組み合わせであり得、これらに、タンパク質および／または断片を、カップリングプロセスにより、例えば化学的カップリングプロセスにより、好ましくはＥＤＣにより結合させ得る。担体は、天然に存在するものに由来し得るか、または合成のものであり得る。好ましくは、細胞、分子、ビーズ、ナノ粒子またはＶＬＰはインビボ生分解性であるか、または生存個体に少なくとも適用可能であり、インビボで分解されるか、または担体が適用される身体から排除される。細胞という用語はまた、細胞前駆体、例えばＲＢＣ前駆体を含む。好ましくは、担体は、血液細胞、さらにより好ましくは赤血球または白血球である。白血球は、脾細胞またはＰＢＭＣまたは一般にはＡＰＣであり得る。
【０１０２】
一実施形態では、タンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントは、細胞、好ましくは血液細胞により発現される。それにより、タンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントをコードする遺伝情報は、タンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントが細胞により発現される前に細胞に導入される。
【０１０３】
タンパク質および／またはその断片を担体にカップリングするための任意のカップリング剤または方法が使用され得る。例えば、合成または天然リンカーがカップリングに用いられ得る。このようなリンカーの一例は、ＲＢＣの表面上に存在するグリコホリンＡである。一実施形態では、化学架橋が実施される。好ましい実施形態では、遊離アミノおよびカルボキシル基の間のペプチド結合の形成を触媒する化学架橋剤ＥＤＣが使用される。特に、ＥＤＣの存在下では、複数のペプチドを担体の表面に結合させることができ、それにより、複数のＴ細胞特異性の同時ターゲティングが可能になる。好ましくは、３個を超える、５個を超える、１０個を超える、１５個を超えるまたはさらには２０個を超える異なるペプチドを担体の表面に結合させる。好ましい実施形態では、５〜２０個、好ましくは５〜１５個の異なるペプチドが使用される。ペプチドが同じアミノ酸配列で構成されていない場合、それは別のペプチドとは異なるものである。担体は、好ましくは細胞であるが、必ずしもそうではない。遊離アミノ基が存在する限り、ＥＤＣは、任意の担体へのカップリングに使用され得る。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明の各タンパク質（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質またはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質、好ましくはＲＡＳＧＲＰ２）の少なくとも１つのペプチドを組み合わされて使用し、担体に結合させる。本発明の各タンパク質の少なくとも１つのペプチドを現在の技術水準の少なくとも１つの公知のペプチド、特に少なくとも１つのミエリンペプチド、特に配列番号２６１〜２６７により定義されるミエリンペプチドの少なくとも１つまたは全部と組み合わせることが特に有利である。
【０１０５】
好ましい一実施形態では、担体は血液細胞であり、血液細胞を、カップリング剤により、好ましくはＥＤＣにより、少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントに化学的に結合させる。このような化学的に結合させた、すなわち抗原に結合させた血液細胞を製造する方法であって、ヒト被験体から血液細胞を単離すること、少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアント、すなわち抗原を添加すること、ならびに続いてカップリング剤、好ましくはＥＤＣを添加することを含む方法も提供される。
【０１０６】
ＥＤＣによりペプチドを結合させた細胞の作用機序は完全には理解されていないが、ペプチドおよび細胞表面分子のアミノおよびカルボキシ基の共有結合的連結、続いて、ペプチドを結合させた、すなわち抗原を結合させた細胞のプログラム細胞死（有核細胞の場合にはアポトーシス；ＲＢＣの場合にはエリプトーシス）、次いで、インビボにおける死にかけている細胞の寛容原性提示を伴う。
【０１０７】
カップリング反応に使用されるＥＤＣの用量は、最高の有効性で最大の安全性を得るために用量設定され得る。高濃度では、ＥＤＣは、細胞、特にＲＢＣの溶解をもたらし得る。ＲＢＣの最適な安定性のために、１５ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、さらにより好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満、さらにより好ましくは約３ｍｇ／ｍｌのＥＤＣの最終濃度が使用され得る。また、最適な用量は変動し得る。当業者は、ＲＢＣの最適な安定性およびＥＤＣの最適な用量を決定する方法を認識している。
【０１０８】
結合させるべきタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントは、当業者により容易に決定される量で添加され得る。当業者は、最適量のＥＤＣとの相互作用において最適量を決定するための手段を把握している。
【０１０９】
インキュベーション時間は変動し得、特定の各カップリング反応のために調整され得る（例えば、１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、１２０分間）。インキュベーション時間が長いほど、カップリング効率が良好であり得る。一実施形態では、６０分後に最大値に達する。
【０１１０】
インキュベーション温度も変動し得る。例えば、１５〜２５℃または２〜８℃が使用され得る。一実施形態では、カップリング反応を１５〜２５℃で実施した場合、カップリング効率はより高かった。
【０１１１】
カップリング反応を可能にする任意の賦形剤が使用され得る。一実施形態では、賦形剤は、滅菌かつエンドトキシンフリーのものである。好ましい実施形態では、賦形剤は、滅菌エンドトキシンフリー生理食塩水（ＮａＣｌ  ０．９％）である。生理食塩水はヒトにおける使用について承認されており、最大限の安全性を提供する。
【０１１２】
当業者は、最適なインキュベーション時間および温度を決定する方法、ならびに可能な賦形剤を決定する方法を認識している。
【０１１３】
本発明の一態様では、本明細書に記載される少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が提供される。
【０１１４】
本発明の別の態様では、ヒト被験体におけるＭＳの治療的処置、予防または診断のための方法であって、前記被験体に、治療有効量の本明細書に記載されるタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列ならびに／または本明細書に記載される担体を投与することを含む方法が提供される。したがって、少なくとも１つの本発明のタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列を含む担体、特に、少なくとも１つの本発明のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントに結合させた担体、ならびに／または少なくとも１つの本発明のタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列を含む担体は、ＭＳの処置、診断および／または予防において使用され得る。
【０１１５】
本発明のさらなる態様では、本発明のペプチド、好ましくは、５〜５０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは１０〜１５個、さらにより好ましくは１５個のアミノ酸を含むペプチドは、医薬として使用される。
【０１１６】
医薬として使用するための好ましいペプチドは
ａ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるか、または
ｂ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同であるか、または
ｃ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同であり、自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または各アミノ酸配列に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識される。
【０１１７】
配列番号１０〜９８、好ましくは配列番号１０〜３５を含む群より選択される配列を有するペプチド、さらにより好ましくは、配列番号１０〜９８、好ましくは配列番号１０〜３５を含む群より選択される配列からなるペプチドは、医薬として使用するためにさらに好ましい。
【０１１８】
さらなる態様として、図３（ｉｉ）Ｅのペプチドモチーフ（配列番号９９）、図５に示されているＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチド（配列番号１９９〜２１５）、図６の表（ＩおよびＩＩ）のＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチド（配列番号１０〜１４、１９〜２０、２２〜２３、２５〜３２および２１６〜２９０）、ならびに図１２の表のＲＡＳＧＲＰ１、ＲＡＳＧＲＰ２およびＲＡＳＧＲＰ３ペプチド（配列番号２９１〜３０９）はすべて本発明の主題であり、本発明にしたがって使用され得る。
【実施例】
【０１１９】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ特異性
１．ＴＣＣ２１．１の特性評価
位置スキャン合成コンビナトリアルライブラリー（ｐｓ−ＳＣＬ）を使用した偏りのない標的抗原同定アプローチは、図２に概略的に示されている。Ｐｌａｎａｓら、（２０１５）に記載されているように、クローンＴＣＣ２１．１を同定した。ＴＣＣ２１．１は、ＣＳＦ浸潤細胞から単離されたＣＤ４＋ＴＣＣであり、パターンＩＩ脱髄を有するＳＰＭＳ患者（１１５４ＳＡ）由来の２つの活動性白質脱髄ＭＳ病変（ＬＩおよびＬＩＩＩ）においてクローン性に拡大する。ＴＣＣ２１．１はＴｈ２サイトカインを放出し、非特異的活性化により自己Ｂ細胞による増殖および抗体産生を支援する。デカペプチド位置スキャンライブラリーを使用して、特異性不明のこのＴＣＣにより認識されるペプチドを研究するために、最初に、ＴＣＣ２１．１がペプチド混合物の認識に使用するＨＬＡクラスＩＩ分子を同定した。これは、ペプチドライブラリー／バイオメトリック分析アプローチを標的抗原の偏りのない同定に使用するための必要条件である（Ｚｈａｏら、２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６７：２１３０−２１４１；Ｓｏｓｐｅｄｒａら、２０１０，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５３（１−２）：９３−１０１）。患者１１５４ＳＡは、ＤＲ１５ハプロタイプについてホモ接合性であったので、異なる単一自己ＨＬＡ  ＤＲ／ＤＱ分子（ＤＲＡ＊０１：０１／ＤＲＢ５＊０１：０１＝ＤＲ２ａ、ＤＲＡ＊０１：０１／ＤＲＢ１＊１５：０１＝ＤＲ２ｂおよびＤＱＡ１＊０１：０２／ＤＱＢ１＊０６：０２）をトランスフェクトしたＥＢＶ不死化不全リンパ球症候群（ＢＬＳ）Ｂ細胞株（ＢＣＬ）細胞により提示された位置５で定義されるアミノ酸（ＡＡ）との混合物を用いて、ＴＣＣ２１．１を最初に試験した。抗ＣＤ３およびＰＭＡによる非特異的刺激後に、ＴＣＣ２１．１はこのサイトカインを放出するので（Ｐｌａｎａｓら、２０１５）、Ｔ細胞活性化のリードアウトとしてＧＭ−ＣＳＦ産生を使用した。ＤＲＢ１＊１５：０１（ＤＲ２ｂ）クラスＩＩ分子を発現するＢＣＬにより提示された混合物のみが刺激性であった（データは示さず）。
【０１２０】
２．抗原を同定するための方法としての位置スキャン合成コンビナトリアルライブラリー／ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼの同定
次いで、ＤＲＢ１＊１５：０１クラスＩＩ分子を発現するＢＣＬにより提示された完全デカペプチド位置スキャンライブラリー（２００個の混合物；すなわち、１０−ｍｅｒの１０個の位置と、各固定位置において２０個のＬ−アミノ酸の１個とを表す混合物）を用いて、ＴＣＣ２１．１を試験した。完全ライブラリーに反応したＧＭ−ＣＳＦ放出は図３Ａに示されている。ＩＬ−１０放出を用いて、同様の反応パターンが得られた。次に、以前に記載されているように（Ｚｈａｏら、２００１）、デカペプチドライブラリーの１０個の各位置の２０個の規定の各ＡＡの刺激電位に数値を割り当てることにより、バイオメトリック分析スコア化マトリックスを生成した。ここでは、混合物の存在下における３回の独立した実験のメジアンＧＭ−ＣＳＦ（ｐｇ／ｍｌ）分泌から、混合物の非存在下における該分泌を差し引いたものの１０を底とする対数として、その値を計算した（図３Ｂ）。ペプチド抗原認識への個々のＡＡの独立した寄与のモデルに基づいて、所定のペプチドの予測刺激スコアは、各位置のペプチドに含まれる各ＡＡのマトリックス値の合計である（Ｚｈａｏら、２００１）。このスコア化アプローチを適用して、刺激効力を予測する刺激スコアにしたがって、ＵｎｉＰｒｏｔヒトタンパク質データベース内のタンパク質配列のすべての自然に重複する１０−ｍｅｒペプチドをランク付けした。これらの予測値に基づいて、最高スコアを有する５０個の予測ヒト天然ペプチドを合成し、５μｇ／ｍｌで試験した（図４）。予想外のことに、どのペプチドも明らかに刺激性ではなかった（図３Ｃ）。位置スキャンライブラリーおよびバイオメトリック分析を組み合わせた上記アプローチの予測能力は、このＴＣＣの場合には、以前の研究における他のＴＣＣよりも低かった。図３Ｂに示されている最も刺激性の混合物は、連続位置に同一の規定のＡＡを有するが、これは、複数のフレームで１つのＡＡモチーフが認識される可能性を示唆している。図２に概説されているアプローチを使用してデータを分析することができるために、２２個の二重定義混合物（すなわち、２つの規定の位置を有する位置スキャン混合物）のセットを設計、合成および試験した（図３Ｄ）；結果は、異なる隣接残基を有するユニークな認識モチーフ（ＬＨＳＸＦＥＶ、配列番号９９）の存在を確認した（図３Ｅ）。２つのフレーム中のこの認識モチーフを元のＧＭ−ＣＳＦ由来マトリックスに適用し、バイオメトリック分析を実施するために、調和平均モデル（ＨＭ）を使用して、いくつかの二重定義混合物（図３Ｄ、フレーム１／２−ＨＭ混合物）の刺激反応を元のマトリックスに統合した。新たな「ハーモニックブースト」フレーム１およびフレーム２マトリックスを使用して、ＵｎｉＰｒｏｔヒトタンパク質データベース由来のすべての自然に重複する１０−ｍｅｒペプチドをスコア化し、図２に概略的に示されているようにランク付けした。両マトリックスで最高スコアを有する５０個の予測天然ペプチドを合成し、ＧＭ−ＣＳＦ放出について試験した（図４）。これら２つのマトリックスは、３つの明らかに刺激性のペプチドの同定を可能にした（図３Ｆ）。ハーモニックブーストフレーム１を用いて予測されたＮＶＬＨＳＡＦ���ＶＧ（配列番号１６）、およびハーモニックブーストフレーム２を用いて予測されたＤＮＶＬＨＳＡＦＥＶ（配列番号１５）の２つの最も刺激性のペプチドは、ＴＳＴＡ３遺伝子によりコードされるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼに属し、９ＡＡ重複する。
【０１２１】
詳細には、図３は以下を示す：Ａ．ＤＲＢ１＊１５：０１のみを発現するＢＬＳ細胞により提示された完全デカペプチド位置スキャンライブラリー（２００個の混合物）に反応したＴＣＣ２１．１によるＧＭ−ＣＳＦ産生。Ｂ．３回の独立した実験のＧＭ−ＣＳＦ産生のｌｏｇ１０中央値を用いて設計したスコアマトリックス。太字境界線は、二重定義混合物のために選択した混合物を示す。Ｃ．ＧＭ−ＣＳＦベースのスコア化マトリックスを使用して予測した最高スコアを有する５０個のペプチドに反応したＴＣＣ２１．１によるＧＭ−ＣＳＦ産生。Ｄ．２２個の二重定義混合物に反応したＴＣＣ２１．１によるＧＭ−ＣＳＦ産生。フレーム１では、ＴＣＲモチーフの規定のＡＡを有する混合物は灰色であり、フレーム２では黒色である。調和平均モデルを使用して、太字の混合物（フレーム１／２−ＨＭ）の刺激反応を元のマトリックスに統合した。Ｅ．調和平均モデルに基づいて選択して元のマトリックスに組み込んだＴＣＲモチーフおよび二重定義混合物活性値。フレーム１−ＨＭは灰色であり、フレーム２−ＨＭは黒色である。Ｆ．ハーモニックブーストフレーム１および２スコアマトリックスを使用して予測したより高いスコアを有する５０個のペプチドに反応したＴＣＣ２１．１によるＧＭ−ＣＳＦ産生。完全デカペプチドライブラリー、二重定義混合物および個々のデカペプチドは、ＤＲＢ１＊１５：０１を発現するＢＬＳ細胞により提示された。混合物を２００μｇ／ｍｌで試験し、個々のデカペプチドを５μｇ／ｍｌで試験した。ヒストグラムは、３回の独立した実験の平均±標準誤差平均（mean  ±  standard  error  mean）（ＳＥＭ）およびドットプロット平均を示す。放出されたサイトカインは常に、刺激に反応したＴＣＣ２１．１により放出されたｐｇ／ｍｌから刺激の非存在下で放出されたｐｇ／ｍｌ（陰性対照）を引いたものとして表されている。
【０１２２】
図４は、バイオメトリックアプローチを用いて予測したヒトデカペプチドの要約を示し、これらを合成し、次いで、ＧＭ−ＣＳＦ放出に基づいて５ｍｇ／ｍｌにおける刺激能力について試験した。ペプチドは、それぞれＨＭブーストフレーム１および２について１〜５０にランク付けされている。
【０１２３】
３．脳組織におけるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼの発現を実証するＲＮＡＳｅｑ／トランスクリプトームおよびプロテオームデータ
自己脳ＬＩおよびＬＩＩＩにおけるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼの「リード／キロベースのエクソンモデル／１００万個のマッピングされたリード」（ＲＰＫＭ）として表される転写レベルは図５に示されている。他の脳特異的遺伝子の転写物値もまた、サンプルの品質対照として、ならびに高い（ＭＢＰ、ＰＬＰ１）および中等度の（ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ））レベルで発現される遺伝子の参照として示されている。
【０１２４】
プロテオミクス分析により、他のＭＳ患者および非ＭＳ対照由来の白質および灰白質脳組織において、１７個のＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドが同定された。ペプチド配列、および異なるサンプルにおけるペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）は図５に掲載されている。同定されたペプチドによりカバーされるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼＡＡ配列のパーセンテージは５６％であった。位置は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ１３６３０．１の配列を指す。参照として他の脳特異的タンパク質の分析も含まれる（図５）。
【０１２５】
要約すると、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼは、脳において発現されることが示されている（ＲＮＡおよびタンパク質）。
【０１２６】
４．脳浸潤ＴＣＣの主な自己抗原としてのＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ
ＴＣＣ２１．１がクローン性に拡大することが公知の２つの自己脳病変（ＬＩおよびＩＩＩ（Ｐｌａｎａｓら、２０１５））においてＴＣＣ２１．１により認識される自己抗原を同定するために、次いで、ハーモニックブーストフレーム１およびフレーム２マトリックスを使用して、刺激スコアにしたがって、これら２つの病変からのＲＮＡＳｅｑベースのトランスクリプトームデータ（ＧＳＥ６０９４３）を用いて作成した脳−タンパク質サブデータベース内のタンパク質配列中のすべての自然に重複する１０−ｍｅｒペプチドをスコア化およびランク付けした。フレーム１マトリックスについて最高スコアを有する４０個の予測天然脳ペプチドのうち、３８個のペプチドは、偏りのないＵｎｉＰｒｏｔヒトデータベースから既に予測されていた。フレーム２マトリックスについては、上位４０個のペプチドは以前に予測されていた（図４）。フレーム１の２つの新たなペプチドを合成および試験した。ＮＶＬＨＳＡＦＥＶＧ（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ９６〜１０５、配列番号１６）およびＤＮＶＬＨＳＡＦＥＶ（９５〜１０４、配列番号１５）は、ＴＣＣ２１．１を刺激することが見出された（図４）。
【０１２７】
５．ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ認識の特性評価／反応の特性評価
上述のように、ＴＣＣ２１．１により認識される２つのＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドは９ＡＡ重複する。ＤＲＢ１＊１５：０１発現ＢＣＬ細胞上において、９ＡＡ重複する９個のさらなる１０−ｍｅｒペプチドを合成および試験し、ＧＭ−ＣＳＦ放出を誘導するさらなるペプチドＶＬＨＳＡＦＥＶＧＡ（９７〜１０６、配列番号１８）を同定した。ペプチドＮＶＬＨＳＡＦＥＶＧ（９６〜１０５、配列番号１６）は、０．２μｇ／ｍｌのＥＣ５０で最適な反応を示し、ＤＲＢ１＊１５：０１およびＤＱＢ１＊０６：０２分子により提示された。３つの刺激性ペプチドの共通ＡＡはＶＬＨＳＡＦＥＶ（９７〜１０４）である（データは示さず）。
【０１２８】
次に、自己照射ＰＢＭＣおよびＢＣＬにより提示されたＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドへのＴＣＣ２１．１の反応を特性評価した。２つのタイプのＡＰＣにより提示されたＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドは、増殖を誘導することができた。この反応の機能的表現型も分析した。ＴＣＣ２１．１はＴｈ２表現型を示し、主にＴｈ２サイトカインを放出し、ＩＬ−２２およびＩＬ−１０のレベルを低下させた。予想外のことに、ペプチドが自己ＢＣＬにより提示された場合、それらは、より高いレベルのＩＦＮγを誘導した。加えて、ＴＣＣ２１．１はまた、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドに反応してＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を放出した。これら２つのサイトカインの放出は、異なる状態を有する患者から生成された他のＴｈ１、Ｔｈ１＊またはＴｈ１／２ＴＣＣと比較して、このＴＣＣの特異的特徴であると思われる。細胞内サイトカイン染色は、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（９６〜１０５、配列番号１６）に反応したＴＣＣ２１．１のＴｈ２機能的表現型を確認した。ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（９６〜１０５、配列番号１６）による刺激後、ＴＣＣ２１．１細胞の６０％より多くがＩＬ−４＋であり、約１２％のみがＩＦＮγ＋であった。細胞の約６０％はＧＭ−ＣＳＦ＋であり、これらの４７．７％もＩＬ−４＋であった。ＴＣＣ２１．１のさらなる特性評価は、ＣＤ２８およびケモカイン受容体ＣＲＴｈ２の発現を実証した（データは示さず）。
【０１２９】
６．患者１１５４ＳＡ由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼの認識
１０ＡＡ重複し、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質全体をカバーする６２個の１５−ｍｅｒペプチド（図６）を合成し、自己ＰＢＭＣにより提示された場合のＴＣＣ２１．１増殖を誘導する能力について試験した。７つの免疫優性／脳炎誘発性ミエリンペプチド（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２００４）、ＣＥＦ（サイトメガロウイルス、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスおよび破傷風トキソイド）ペプチドプールおよび対照ビーズを並行して試験した（図６）。ＴＣＣ２１．１は、先に同定された３つの刺激性デカペプチド（９５〜１０４（配列番号１５）、９６〜１０５（配列番号１６）および９７〜１０６（配列番号１８））を含有する２つの重複ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチド９１〜１０５（配列番号１４）および９６〜１１０（配列番号１７）を認識した。
【０１３０】
７．ＣＩＳ／ＭＳ患者由来のＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼの認識
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼの特異的認識が、異なる形態のＭＳ（大部分はＣＩＳおよびＲＲＭＳ）を有する患者におけるＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞において起こるかを調べるために、新たなプロトコールを開発して、新鮮ＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋細胞を単一ラウンドで多数に拡大させて、元のＴ細胞レパートリーの変動を最小化した。自己照射ＰＢＭＣにより提示された６２個の重複ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドを用いて、ならびに７つのミエリンペプチド、ＣＥＦペプチドプールおよび対照ビーズを用いて、３１人のＣＩＳ／ＭＳ患者由来の、休止したＰＨＡにより拡大したＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＮＳ区画にも由来するＴ細胞）を４回反復で試験した。すべての刺激指数（ＳＩ；対照ビーズを除く）をプールし、１未満のＳＩ値を、単位値を有するとして処理した。クラスタｋ−平均分析を実施して、この患者集団における反応性ＳＩ値と非反応性とを区別するための最適なカットオフを決定した。ｋ−平均クラスタ化は、正の反応と負の反応とを区別するための１．４５５のカットオフ値をもたらした。続いて、各患者について、１．４５５を超える（４連ウェルの）中央値ＳＩを有するすべてのペプチドを陽性反応として同定した。
【０１３１】
次に、各反応性ペプチドの中央値ＳＩの合計を計算し、そのペプチドに反応した総患者数で重み付けすることにより、患者のスコアを構築した。このようにして、各ペプチドのＳＩ値自体と、各ペプチドの相対的な免疫原性との両方を考慮に入れて、特定の抗原に対する免疫反応の頻度および強度を評価した。基本となる１０人の患者のスコアに対して３クラスタｋ−平均分析を実施したところ、患者は、３つのカテゴリ：「非反応者」、「中等度反応者」および「高反応者」に明確にグループ化された。したがって、１９人の患者（６１．３％）は、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼに対して非反応者として特性評価され、６人（１９．３５％）は中等度として特性評価され、６人（１９．３５％）は高反応者として特性評価された（データは示さず）。ＣＥＦ反応について、または陽性もしくは陰性対照について、３つのグループ間で有意差は見られなかった。患者の少なくとも１０％において陽性反応を誘導することができるペプチドとして、免疫優性ペプチドを定義した。この基準を達成する１４個のＧＤＰ−Ｌ−フコースペプチドが図７に示されている。いくつかの免疫優性ペプチドへの最も強い反応の機能分析は、主にＩＦＮ−γ産生を伴うＴｈ１表現型を明らかにした（データは示さず）。
【０１３２】
詳細には、図７は以下を示す：ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドに反応したＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞を有するＣＩＳ／ＭＳ患者の数。少なくとも３人の患者において陽性であった免疫優性ペプチドは黒色で示されている。黒色四角は高反応者であり、白色四角は中等度反応者の患者である。
【０１３３】
結論として、ＭＳ患者（ＣＩＳ、ＲＲＭＳ、ＳＰＭＳ）の約２０〜２５％は、異なる免疫優性ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドへの免疫反応を示す；これらのＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ特異的Ｔ細胞のほとんどは、Ｔｈ１表現型（ＭＳ患者において最も頻繁な表現型）を有する。７つのミエリンペプチド（ＥＴＩＭＳペプチド）への反応との比較は、これらのペプチドに反応する患者が、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼと比較して有意に少ないことを示している。
【０１３４】
ＲＡＳＧＲＰ２特異性
８．ＴＣＣ１４の同定、およびＴＣＣ１４を用いたｐｓ−ＳＣＬの試験によるＲＡＳＧＲＰ２の同定
ＴＣＣ１４は、（ＨＬＡ−ＤＲ１５についてホモ接合性の）ＭＳ患者１から類似のアプローチで同定されたが、しかしながらこの場合、脳ホーミングＴ細胞について富化された自己増殖（刺激なしの増殖）末梢血Ｔ細胞の画分から同定された。患者の脳病変に浸潤する細胞のディープＴＣＲシークエンシングによっても、ＴＣＣ１４は、脳においてクローン性に拡大することが示された。図１（右側）に概略的に示されているように、ＴＣＣ１４を生成した。自己増殖Ｔ細胞の単離は、図８Ａにより詳細に示されている。詳細には、刺激なしで色素カルボキシフルオレセインジアセテートＮ−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した後、末梢血単核細胞を複製ウェルに播種する。７日間の培養後、フローサイトメトリーにより増殖（ＣＦＳＥｄｉｍ）および非増殖（ＣＦＳＥｈｉ）細胞を同定し、細胞選別により自己増殖Ｔ細胞（ＣＦＳＥｄｉｍ）を単離する。ＭＳ脳病変とＣＦＳＥｄｉｍ（自己増殖）集団との間でＴＣＲβＶ配列を比較する。ＣＦＳＥｄｉｍ集団のＴＣＲβＶ配列の２０％より多くは、ＭＳ脳病変においても見出される（図８Ｂ）。
【０１３５】
次いで、ＴＣＣ１４を拡大し、偏りのないアプローチを使用して、図２に示されているように試験して、上記位置スキャンコンビナトリアルペプチドライブラリーおよびバイオメトリック分析を使用してＴＣＣ１４の標的抗原を同定した。２００個の位置スキャンライブラリー混合物の全セットを用いて試験されるように、ＴＣＣ１４を十分に拡大した。ＴＣＣは、ＨＬＡ−ＤＲ１５ホモ接合性ＭＳ患者に由来するので、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子（ＤＲ２ａ、ＤＲ２ｂまたはＤＱｗ６）を発現するＨＬＡ−ＤＲ１５ハプロタイプをトランスフェクトしたＢＬＳ細胞を用いて、ＴＣＣ１４の拘束性を試験した。そのＨＬＡクラスＩＩ拘束性（ＤＲＢ１＊１５：０１）を決定した後、ＤＲＢ１＊１５：０１をトランスフェクトしたＢＬＳ細胞を使用して、２００個すべてのサンプルに対する反応性を試験し、１０個の各位置において単一または複数のアミノ酸（ａａ）に対する陽性反応を示した。７２時間後、ＴＣＣ反応のリードアウトとして、チミジン取り込みアッセイに基づく増殖（刺激指数＝ＳＩ；点線ＳＩ＝２）を使用した（図９のパネルＩ）。スコア化マトリックスを使用して、複数回投与を試験した後に、デカペプチドライブラリーの１０個の各位置において２０個すべてのＬ−ａａに対するＴＣＣ１４の反応性を要約し、バイオメトリック分析プロセス（Ｚｈａｏら、２００１）を使用して、ＴＣＣ１４により認識されるペプチド（図９のパネルＩＩ）を予測した。３回の反復実験からの平均反応を使用して、潜在的なペプチドリガンドの最適なアミノ酸組み合わせのマトリックスを生成した。ＴＣＣを単離した患者１の脳トランスクリプトームデータおよび各タンパク質を検索データベースとして使用した。９２個の配列を合成し、使用したマトリックスの少なくとも１つについて予測された上位５０個のペプチドにおけるそれらの出現に基づいて、ＴＣＣ１４による認識について試験した（ＳＩ＞３の刺激反応）（図９のパネルＩＩＩ）。他のＴＣＣについて以前に示されているように、ＴＣＣ１４は高スコアのペプチドの多くを認識したので、予測される高ランクとＴ細胞反応との間に良好な関係がある（Ｓｏｓｐｅｄｒａら、２０１０；Ｚｈａｏら、２００１）。これらの機能的アビディティを評価するために、陽性反応を示した３３個のペプチドを用いて用量滴定実験を実施した。これらの中に、配列番号３３〜３５を有するペプチドがあった。７２時間後にＢＬＳ  ＤＲ２ｂを使用して、ＴＣＣ１４の増殖反応について、刺激性ペプチドを漸減濃度で試験した（図９のパネルＩＶ）。ＲＡＳＧＲＰ２由来のペプチドは、高い抗原アビディティ（ＥＣ５０＝０．０１２μＭ）で認識されたが（配列番号３３）、いくつかの他のＲＡＳＧＲＰアイソフォーム（ＲＡＳＧＲＰ１、−３、４）由来のペプチドおよび他のペプチドのペプチドも同様に陽性反応を示した（図９のパネルＩＶ）。ＴＣＣ１４によるＲＡＳＧＲＰ２ペプチドの認識は、Ｔｈ２サイトカインおよびさらにはＩＦＮ−γの分泌をもたらした（データは示さず）。
【０１３６】
結論として、ＲＡＳＧＲＰ２を有するクローンＴＣＣ１４により、圧倒的に最も高いアビディティ（すなわち、より低い抗原濃度）で複数のＲＡＳＧＲＰバージョンが認識されるが、これは、その生物学的関連性を強調している。
【０１３７】
９．末梢血細胞のＲＡＳＧＲＰ２反応性
末梢血由来記憶Ｔ細胞におけるＲＡＳＧＲＰ２への反応性を試験するために、ナタリズマブ処置ＭＳ患者（ＮＡＴ；ｎ＝８）の凍結保存ＰＢＭＣ（１×１０８個の細胞）を解凍し、その後、磁気細胞選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＣＤ４５ＲＡ発現細胞を枯渇させた。１ウェル当たり２×１０５個のＣＤ４５ＲＡ枯渇ＰＢＭＣをＸ−Ｖｉｖｏ培地に播種し（１０〜１５個の複製ウェル／条件）、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズのいずれかで処理し、またはＲＡＳＧＲＰ２ペプチドプール（１０μＭのプール最終濃度）もしくは精製ＲＡＳＧＲＰ２タンパク質全体（Ｏｒｉｇｅｎｅ；０．３μｇ／ｍｌ）でパルスした。１プール当たり７つのペプチドを含み、Ｎ末端（プール１）からＣ末端（プール９）にＲＡＳＧＲＰ２の配列をカバーする９つのペプチドプールで、ＲＡＳＧＲＰ２タンパク質全体をカバーする１５ｍｅｒ重複ペプチド（配列番号３８〜９８）を編成した。チミジン取り込みアッセイを使用して、ＲＡＳＧＲＰ２への増殖反応を測定した。７日目に、１ウェル当たり１μＣｉのメチル−３Ｈ−チミジンで細胞をパルスし（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ）、１５時間後に膜（Ｔｏｍｔｅｃ）上に回収した。β−シンチレーションカウンティング（Ｗａｌｌａｃ  １４５０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により、取り込みを測定した。結果はドットとして示されている（平均±ＳＥＭ）。ビヒクル対照に対するペプチドまたはタンパク質刺激の比として、刺激指数（ＳＩ）を計算した。＞２のＳＩ値を陽性とみなした（図１０）。
【０１３８】
要約すると、図１０は、高い自己増殖を有するＭＳ患者由来の記憶Ｔ細胞がＲＡＳＧＲＰ２に反応することを示す。８人のドナーはすべて、ＲＡＳＧＲＰ２ペプチドの個々のもしくはいくつかのペプチドプール（ＴＣＣ１４の標的ペプチド（配列番号３３）と重複する配列番号４６のペプチドを含有するプール２を含む）および／またはタンパク質全体に反応したが、これは、ＲＡＳＧＲＰ２が、高度の自己増殖を有するＭＳ患者により広く認識される自己抗原であることを実証している。
【０１３９】
１０．Ｂ細胞および脳におけるＲＡＳＧＲＰ２の発現を実証するＲＮＡＳｅｑ／トランスクリプトームおよびプロテオームデータ
末梢Ｂ細胞および脳において、ＲＡＳＧＲＰ１−４の発現をＲＮＡおよびタンパク質レベルで試験した（図１１）。ＲＡＳＧＲＰ１〜３は、患者１の脳および自己増殖記憶Ｂ細胞のトランスクリプトームの両方において発現される（図１１）。
【０１４０】
詳細には、図１１は以下を示す：（Ａ）ＭＳ患者１（ＲＰＫＭ）の活動性脳病変ＩＩＩおよび６人のＲＲＭＳ（ＲＥＭ）患者由来の自己増殖（ＣＦＳＥｄｉｍ）末梢血Ｂ細胞（ＲＰＫＭ）における刺激性ペプチド由来転写産物の発現レベル。０．１未満の発現レベルまたは転写産物発現の非存在を０．１として設定した。脳（ＭＯＢＰ）およびＢ細胞（ＣＤ１９）の対照転写産物の発現も示されている。（Ｂ）ＭＳ患者のＲＲＭＳ（ＲＥＭ、ｎｉｈｉｌ；ｎ＝４）および脳組織（灰白質、プール、ｎ＝６）の末梢血Ｂ細胞の質量分析。ＲＡＳＧＲＰ１〜４のタンパク質カバレッジ（列）およびスペクトルカウント（数字）は、タンパク質存在量の尺度として示されている。
【０１４１】
質量分析を使用したプロテオミクスを用いて、対照およびＭＳ患者の脳組織（白質および灰白質）も試験した。ＲＡＳＧＲＰ１、２および３タンパク質のペプチドは脳組織において同定され、特にＲＡＳＧＲＰ２の存在量が多かった（図１２）。位置は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ９７３４９．１（ＲＡＳＧＲＰ１）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＩ１０３０７．１（ＲＡＳＧＲＰ２）およびＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＹ１５０３７．１（ＲＡＳＧＲＰ３）の配列を指す。
【０１４２】
さらに、免疫組織化学（ＩＨＣ）研究を実施したところ、脳灰白質、具体的には皮質ニューロンおよび脾臓におけるＲＡＳＧＲＰ２タンパク質の発現が示された（データは示さず）。
【０１４３】
１１．ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２配列内のさらなる免疫優性ペプチドの同定
さらに、一般に使用される検索アルゴリズムおよび潜在的に免疫原性であるという仮定に基づいて、ペプチドを同定した。（腫瘍由来の）自己タンパク質中の免疫原性ペプチドの検索が標準的な手順である腫瘍ワクチン接種の文脈から、このアプローチを採用した。この状況では、疾患関連ＨＬＡ対立遺伝子（または所定の腫瘍患者のＨＬＡ対立遺伝子）に結合すると予測されるペプチドについて、タンパク質配列をスクリーニングする。したがって、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２配列を取得し、十分に認められているＮｅｔＭＨＣＩＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩ／）およびＩＥＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）インシリコペプチド結合予測アルゴリズムを使用して、強い（ＳＢ）または弱い（ＷＢ）結合ペプチドを予測した。検索を実施するための方法の詳細は、２つの検索アルゴリズムのＷｅｂサイトで容易に入手可能である。簡潔に言えば、検索は、目的のタンパク質の配列をＷｅｂツールにコピーし、目的のＨＬＡ−クラスＩＩ（または目的のクラスＩ）対立遺伝子を選択することを伴う。次いで、アルゴリズムは、ペプチド配列と、ＨＬＡ−クラスＩＩ対立遺伝子へのそれらの各予測結合とを生成する。ＮｅｔＭＨＣＩＩ検索が可能ではなかった対立遺伝子については、ＩＥＤＢを使用した。ＭＳに関連することが公知のＨＬＡ対立遺伝子を使用した。ここで、ＷＢ（これらは自己抗原の文脈で最も重要である）もしくはＳＢ（ＮｅｔＭＨＣＩＩ検索）であると予測されるか、または２５％もしくはそれ未満の予測結合ランク（ＩＥＤＢ）を有する２つのタンパク質のすべての領域を考慮する場合、これらの一続きのアミノ酸は、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２タンパク質のほぼ全体をカバーする：
【０１４４】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質については、アミノ酸１〜３１５の領域にわたるペプチドが結合すると予測された。
【０１４５】
ＲＡＳＧＲＰ２タンパク質については、アミノ酸９〜４４９および４５７〜６５９の領域にわたるペプチドが結合すると予測された。
【０１４６】
以下の対立遺伝子を使用した：
−ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１（ＮｅｔＭＨＣＩＩ）
−ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１：０１（ＮｅｔＭＨＣＩＩ）
−ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０１（ＮｅｔＭＨＣＩＩ）
−ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３：０３（ＩＥＤＢ）
−ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０１（ＩＥＤＢ）
−ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２：０２（ＩＥＤＢ）
−ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１（ＮｅｔＭＨＣＩＩ）
−ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０４（ＮｅｔＭＨＣＩＩ）
−ＨＬＡ−ＤＱｗ６（ＤＱＡ１＊０１：０１；ＤＱＢ１＊０６：０２）（ＩＥＤＢ）
以下のタンパク質配列を使用した：
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ９３０６１．１
ＲＡＳＧＲＰ２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＩ１０３０７．１
結論として、タンパク質全体および免疫優性ペプチドは、ＭＳの処置、診断および／または予防において使用するために適切である。
【０１４７】
１２．化学的に結合させた赤血球の製造
化学架橋剤としてのＥＤＣ
ビオチン残基を用いて合成されたペプチド（ビオチン−ＰＬＰ１；ＰＬＰ１＝ＰＬＰ  １３９−１５４）を使用して、フルオロフォア結合ストレプトアビジン（strepatividin）を使用した高度に特異的なペプチド検出を可能にした。簡潔に言えば、ビオチン−ＰＬＰ１（最終濃度０．０５ｍｇ／ｍｌ）、ＥＤＣ（最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）（両方ともＰＢＳ中）のいずれかで末梢血単核細胞を４℃で１時間パルスした。２回の洗浄ステップの後、細胞をフルオロフォア結合ストレプトアビジンで染色し、フローサイトメトリー（ストレプトアビジン−ＡＰＣ）により分析した。
【０１４８】
図１３に示されているように、両方（ビオチン−ＰＬＰペプチドおよびＥＤＣ）の存在下においてのみ、効率的なペプチド結合が観察された。
【０１４９】
１３．（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼについては）１０５人のＭＳ患者および（ＲＡＳＧＲＰ２については）５７人のＭＳ患者を用いたさらなる分析
（ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼについては）１０５人のＭＳ患者および（ＲＡＳＧＲＰ２については）５７人のＭＳ患者を用いたさらなる分析を実施して、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチド５１〜６５、１３６〜１５０、１６１〜１７５、２４６〜２６０および２９６〜３１０（配列番号１２、２１、２３、２８および３２）およびＲＡＳＧＲＰ２ペプチド７８〜９２（配列番号４６）の免疫優性を検証した。試験ペプチドへのＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞（これは、ＭＳの病原性に非常に関連する）の反応性を、公知の免疫優性参照ペプチドＭＢＰ１３〜３２、ＭＢＰ８３〜９９、ＭＢＰ１１１〜１２９、ＭＢＰ１４６〜１７０、ＭＯＧ１〜２０、ＭＯＧ３５〜５５およびＰＬＰ１３９〜１５４への反応性と比較した。
【０１５０】
結果は図１４および１５に示されている。データは、本明細書で同定されたタンパク質ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびＲＡＳＧＲＰ２の断片である試験ペプチドが、公知の免疫優性参照ペプチドと同様にまたはさらにより反応性であることを示している。したがって、試験ペプチドは免疫優性であることが再び確認された。標的器官、すなわち脳、脊髄またはＣＳＦに浸潤した自己反応性Ｔ細胞は生物学的に関連する可能性があると考えられるので、ＣＳＦ浸潤Ｔ細胞および推定自己抗原へのそれらの反応の研究は特に有意義である。
【０１５１】
特に指定がない限り、上記７および下記１５．材料および方法に記載されているように、増殖反応およびＩＦＮ−γ分泌を試験した。
【０１５２】
詳細には、図１４は以下を示す：Ａ．自己ＰＢＭＣにより提示された５つのＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチド（５１〜６５、１３６〜１５０、１６１〜１７５、２４６〜２６０および２９６〜３１０）、４つのＭＢＰペプチド（１３〜３２、８３〜９９、１１１〜１２９および１４６〜１７０）、２つのＭＯＧペプチド（１〜２０および３５〜５５）、１つのＰＬＰペプチド（１３９〜１５４）およびＣＥＦペプチドへのＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激指数（ＳＩ）およびＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）として表される増殖反応（単一ラウンドのＰＨＡ拡大）。患者当たり４個のウェルで、すべてのペプチドを試験した。各ドットは１個のウェルを表し、４２０個のウェル（４個のウェル×１０５人の患者）で各ペプチドを試験した。陽性ウェルは、２を超えるＳＩを有するか（点線）または２０ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ−γを有するウェル（点線）である。陽性ウェルのパーセンテージ、ならびにＩＦＮ−γおよびＳＩの陽性ウェルのパーセンテージ間の比も示されている。Ｂ．異なるペプチドに特異的であるかまたは特異性が同定されていないＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞を有する陽性患者のパーセンテージ。陽性患者は、ＳＩ（左のヒストグラム）、ＩＦＮ−γ（中央のヒストグラム）およびＳＩまたはＩＦＮ−γ（右のヒストグラム）について４個のウェルのうちの２個よりも多くが陽性である患者として定義される。
【０１５３】
詳細には、図１５は以下を示す：Ａ．自己ＰＢＭＣにより提示された１つのＲＡＳＧＲＰ２ペプチド（７８〜９２）、４つのＭＢＰペプチド（１３〜３２、８３〜９９、１１１〜１２９および１４６〜１７０）、２つのＭＯＧペプチド（１〜２０および３５〜５５）、１つのＰＬＰペプチド（１３９〜１５４）およびＣＥＦペプチドへのＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激指数（ＳＩ）およびＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）として表される増殖反応（単一ラウンドのＰＨＡ拡大）。患者当たり４個のウェルで、すべてのペプチドを試験した。各ドットは１個のウェルを表し、２２８個のウェル（４個のウェル×５７人の患者）で各ペプチドを試験した。陽性ウェルは、２を超えるＳＩを有するか（点線）または２０ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ−γを有するウェル（点線）である。陽性ウェルのパーセンテージ、ならびにＩＦＮ−γおよびＳＩの陽性ウェルのパーセンテージ間の比も示されている。Ｂ．異なるペプチドに特異的であるかまたは特異性が同定されていないＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞を有する陽性患者のパーセンテージ。陽性患者は、ＳＩ（左のヒストグラム）、ＩＦＮ−γ（中央のヒストグラム）およびＳＩまたはＩＦＮ−γ（右のヒストグラム）について４個のウェルのうちの２個よりも多くが陽性である患者として定義される。
【０１５４】
１４．第Ｉｂ相試験におけるミエリンペプチドによるインビボ寛容誘導
ＭＳと診断された１０人の患者を、寛容誘導について試験した。特に、第Ｉｂ相試験との関連において、ペプチド結合ＥＤＣ固定赤血球の安全性および忍容性について、ならびに一連のミエリンペプチド（ＭＢＰ１３〜３２、ＭＢＰ８３〜９９、ＭＢＰ１１１〜１２９、ＭＢＰ１４６〜１７０、ＭＯＧ１〜２０、ＭＯＧ３５〜５５およびＰＬＰ１３９〜１５４）（配列番号２６１〜２６７）に化学的に（ＥＤＣにより）結合させた自己赤血球の静脈内注射によるインビボ寛容誘導の指標について、それらを試験した。簡潔に言えば、各患者から血液を採取し、赤血球を分離する。次いで、赤血球を、滅菌条件下でエクスビボでミエリンペプチドに化学的に結合させ、患者に静脈内注射する。２人の患者に１×１０１０個の細胞を投与し、３人の患者に１×１０１１個の細胞を投与し、５人の患者に３×１０１１個の細胞を投与した。注射日を０日目として定義した。
【０１５５】
注射の６週間前（＝寛容化前）および注射の１２週間後（＝寛容化後）にも、血液を採取した。これらの日に、末梢血リンパ球を取得し、蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーにより、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（誘導Ｔ制御性細胞（Ｔｒ１）または天然Ｔ制御性細胞（ｎＴｒｅｇ）のマーカーを発現するものを含む）のいくつかのサブ集団を含む広範囲の異なる細胞タイプの存在について調べた。後者の２つの細胞タイプは、以下のマーカーを特徴とし得る：
−Ｔ制御性１（Ｔｒ１）細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ３＋）
−ＦｏｘＰ３＋天然Ｔ制御性（ｎＴｒｅｇ）細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ  ＦＯＸＰ３＋）
加えて、同日に、すなわち注射の６週間前および注射の１２週間後に、下記「ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびミエリンペプチドに対するＣＩＳ患者およびＲＲＭＳ患者由来のＣＳＦ由来バルクＴ細胞の試験」および「Ｔ細胞刺激」に記載されているように、末梢血Ｔ細胞およびＣＳＦ浸潤Ｔ細胞について、７つすべてのペプチドへのＴ細胞反応性を個々に測定した。
【０１５６】
図１６は、Ｔｒ１およびＦｏｘＰ３＋ｎＴｒｅｇ細胞の増加ならびにペプチド特異的Ｔ細胞反応性の減少により測定した場合に、上記結合させた赤血球を注射した際の抗原特異的寛容誘導の徴候が検出可能であったことを示す。これらのデータは、免疫優性ペプチドを投与することにより、各免疫優性ペプチドへの寛容を誘導し得ることを示している。
【０１５７】
詳細には、図１６は以下を示す：Ａ．注射の６週間前（＝寛容化前）および注射の１２週間後（＝寛容化後）のＣＤ４＋記憶細胞のＴｒ１細胞のパーセンテージ。Ｂ．注射の６週間前（＝寛容化前）および注射の１２週間後（＝寛容化後）のＣＤ４＋記憶細胞のＦｏｘＰ３＋ｎＴｒｅｇ細胞のパーセンテージ。Ｃ．注射の６週間前および注射の１２週間後に３×１０１１個の細胞を投与した５人の患者におけるＴ細胞反応性（灰色の点：注射前；黒色の点：注射後）。上のグラフは、すべてのペプチドに反応する細胞のパーセンテージを示す。下のグラフは、個々の各マイクロウェル（合計６０個）の増殖を示す。
【０１５８】
１５．材料および方法
患者材料
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ
患者１１５４ＳＡ：以前に記載されているように（Ｐｌａｎａｓら、２０１５）、パターンＩＩ脱髄病変を有するＳＰＭＳ患者からＣＳＦ由来単核細胞およびＰＢＭＣを得た。この患者のＨＬＡ−クラスＩおよびＩＩタイプは、Ａ＊３２：０１、Ａ＊３３：０１、Ｂ＊１４：０２、Ｂ＊５１：０１、ＤＲＢ１＊１５：０１、ＤＲＢ５＊０１：０１、ＤＱＢ１＊０６：０２およびＤＱＡ１＊０１：０２であった。
【０１５９】
３１人の未処置ＭＳ患者（ＣＩＳを有する８人の患者、ＲＲＭＳを有する２０人の患者およびＳＰＭＳを有する３人の患者）から、診断的腰椎穿刺およびドナー末梢血由来のＣＳＦを収集した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｈａｍｂｕｒｇ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆのｉｎｉｍｓ外来クリニックおよびデイホスピタルならびにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｚｕｒｉｃｈの神経科クリニックのｎｉｍｓセクションから、患者を募集した。ＭＳ診断は、改訂マクドナルド基準に基づいていた。すべてのＣＩＳ患者は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）により検出されたＣＳＦ特異的オリゴクローナルバンドを有していた。登録の少なくとも４週間前にステロイドを投与されておらず過去３カ月の間にいかなる免疫調節剤も免疫抑制剤も受けていない患者を未処置とみなし、研究に含めた。これらの患者由来の新鮮ＣＳＦ細胞をインビトロで拡大させた（以下を参照のこと）。フィコール密度勾配遠心分離（ＰＡＡ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）により、ＥＤＴＡ含有血液チューブからＰＢＭＣを新たに単離し、凍結保存した。Ｅｔｈｉｋ  Ｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｅｒ  Ａｒｚｔｅｋａｍｍｅｒ  Ｈａｍｂｕｒｇ，ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．２７５８およびＣａｎｔｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｚｕｒｉｃｈ，ＥＣ−Ｎｏ．ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｊｅｃｔ  ２０１３−０００１が研究手順を承認した。すべての患者または親族からインフォームドコンセントを得た。
【０１６０】
１３人のＭＳ患者（７人のＳＰＭＳ、５人のＰＰＭＳおよび１人の原発性再発性（ＰＲ）ＭＳ）および７人の非ＭＳ対照由来の脳剖検組織は、ＵＫ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ（ＵＫ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＭＲＥＣ／０２／２／３９）から得た。
【０１６１】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼのさらなる分析（「実施例」の１３）のために、１０５人の患者からＣＳＦを収集した。１０５人の患者のうち、男性に対する女性の比は１．９であり、平均年齢は３５．６８歳（１７〜５８歳の範囲）であり、４人の患者はＲＩＳと診断され、１０人の患者はＣＩＳと診断され、８２人の患者はＲＲＭＳと診断され、４人の患者はＳＰＭＳと診断され、５人の患者はＰＰＭＳと診断された。
【０１６２】
ＲＡＳＧＲＰ２
フィコール密度遠心分離により、患者１１５４ＳＡからＰＢＭＣを単離した。
【０１６３】
ＲＡＳＧＲＰ２のさらなる分析（「実施例」の１３）のために、５７人の患者からＣＳＦを収集した。ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼについて、１０５人の患者のうち５７人の患者を試験した。５７人の患者のうち、男性に対する女性の比は２．５であり、平均年齢は３５．３３歳（１７〜５５範囲）であり、２人の患者はＲＩＳと診断され、８人の患者はＣＩＳと診断され、４３人の患者はＲＲＭＳと診断され、１人の患者はＳＰＭＳと診断され、３人の患者はＰＰＭＳと診断された。
【０１６４】
自己増殖アッセイ
１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン（ＰＡＡ）および５％加熱脱補体化（heat-decomplemented）ヒト血清（ＨＳ、ＰＡＡ）を含有する完全ＩＭＤＭ培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＰＢＭＣを解凍し、その後、ヒトアルブミンを含む無血清ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧＩＢＣＯ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１回洗浄した。５０Ｕ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で細胞を３７℃で１５分間インキュベートして、細胞塊の形成を回避した。０．１％ＨＳを含有するＰＢＳによる２回の洗浄ステップの後、細胞を細胞１０×１０６個／ｍｌの濃度でＰＢＳ／０．１％ＨＳに再懸濁し、次いで、最終濃度０．５μＭのＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温で３分間標識した。１０％ＨＳを含有する５倍過剰量の冷完全ＲＰＭＩ（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）培地でクエンチすることにより、標識を停止した。ＡＩＭ−Ｖによる１回のさらなる洗浄ステップの後、ＣＦＳＥ標識細胞を、外因性刺激（＝自己増殖）の非存在下、３７℃、５％ＣＯ２で、９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）中ＡＩＭ−Ｖ（複製ウェル１０〜１２個／ドナーおよび条件）にＰＢＭＣ  ２×１０５個／２００μｌ／ウェルで播種した。従来のＴ細胞反応については、同じドナーの場合には、ＴＣＲ非依存性刺激としてＰＨＡ（０．５μｇ／ｍｌ）、外来抗原刺激として破傷風トキソイド（ＴＴｘ、５μｇ／ｍｌ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、および同種抗原刺激として混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用した。７日後、ＣＦＳＥ標識細胞を収集し、複製ウェルからプールし、ＰＢＳで洗浄し、ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でＦｃ遮断し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４℃で標識した。２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２％ＦＣＳを含有する冷ＰＢＳで洗浄した後、蛍光色素結合抗体（Ｋｅｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔａｂｌｅ）を使用して表面マーカーについて細胞を直接染色した。ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定を実施し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いてデータを分析した。このアッセイをさらに使用して、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＤ４、抗ＩＦＮ−γおよび抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ）または適切なアイソタイプ対照の存在下でＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを７日間インキュベートすることにより、自己増殖の競合を試験した。チミジン取り込みアッセイについては、１ウェル当たり２×１０５個のＰＢＭＣ（複製ウェル１０〜１２個／ドナーおよび条件）を、９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート中で無血清ＡＩＭ−Ｖ培地と共に３７℃、５％ＣＯ２で培養し、７日目に、１ウェル当たり１μＣｉのメチル−３Ｈ−チミジン（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ）でパルスし、１５時間後、細胞を回収した（Ｔｏｍｔｅｃ）。β−シンチレーションカウンティング（Ｗａｌｌａｃ  １４５０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により、取り込みを測定した。
【０１６５】
Ｔ細胞クローニング
自己増殖区画からＴＣＣを生成するために、（上記ＴＣＲＶβシークエンシングのための）ＭＳ患者１のＣＦＳＥｄｉｍ細胞（２０．０００個の細胞）の選別細胞プールからの５００個のＣＦＳＥｄｉｍ細胞を分割し、以前に記載されているように（Ａｌｙら、２０１１）限界希釈を実施した。ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）およびヒトＩＬ−２を用いた増殖プロトコール（Ａｌｙら、２０１１）を使用して、ＴＣＣを富化した。以前に記載されているように（Ｙｏｕｓｅｆら、２０１２）、生成したＴＣＣのＴＣＲ再配置のシークエンシングを分析した。ＴＣＣのサイトカイン反応を評価するために、抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体ロードＭＡＣＳｉｂｅａｄ粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｘ−Ｖｉｖｏ培地（Ｌｏｎｚａ）中各２００．０００個の細胞を含む７つの複製ウェル中の各ＴＣＣを刺激した。４８時間後、上清を収集し、上記のようにサイトカイン反応を測定した。ケモカイン受容体発現については、細胞を一晩解凍および休止させた後、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  Ａｑｕａと、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ６に対する抗体とでＴＣＣを染色した。
【０１６６】
トランスクリプトーム分析
以前に記載されているように（Ｐｌａｎａｓら、２０１５）、脳病変のトランスクリプトーム分析を実施した。考察したデータはＮＣＢＩ遺伝子発現オムニバスに寄託されており、ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓアクセッション番号ＧＳＥ６０９４３を通じてアクセス可能である。
【０１６７】
プロテオミクス分析
プロテオミクス分析については、バロサイクラー（２３２０ＥＸＴ，ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ  Ｅａｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して。圧力支援タンパク質抽出および消化を実施した。還元およびアルキル化をホモジネートに適用してから、サンプルをＬｙｓ−Ｃおよびトリプシンで分解した。固相抽出カラム（Ｃ１８  Ｆｉｎｉｓｔｅｒｒｅ，Ｗｉｃｏｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）によりペプチドを脱塩し、真空乾燥し、再溶解し、測定した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００、分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）。得られたペプチドを精製し、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ、カラムＰｏｌｙａｍｉｎ  ＩＩ  ２５０×３．０ｍｍ  １２０Å、５μｍを備えるＡｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ１２００）により分離してから、それらを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に連結されたナノ液体クロマトグラフィーシステムＥａｓｙ−ｎＬＣに注入した。ヒトＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベース（２０１６年３月２２日、４０９１２エントリ）を使用してＭＡＳＣＯＴソフトウェアを用いて、データ分析を実施した。検索パラメータは、フラグメント質量許容差０．０５Ｄａおよび前駆体質量１０ｐｐｍ、最小ペプチド数２、およびＦＤＲ（偽発見率）０．１％であり、トリプシン断片の２回の誤切断を許容した。システインのカルバミドメチル化を固定改変として設定し、メチオニンの酸化、ｎ末端アセチル化を可変改変として設定した。
【０１６８】
位置スキャンペプチドライブラリーと個々のペプチド
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ
位置スキャンフォーマット（２００個の混合物）の合成Ｎ−アセチル化Ｃ−アミドＬ−アミノ酸（ＡＡ）デカペプチドコンビナトリアルライブラリーおよび２２個の二重定義混合物を調製した。Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｅｌｅｐｈａｎｔｓ  ＧｍｂＨ（Ｐｏｔｓｄａｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、個々のペプチド（図４および図６）を合成した。
【０１６９】
ＲＡＳＧＲＰ２
標準的な方法により、Ｌ−ａａデカペプチド位置スキャンライブラリー（Ｎ−アセチル化およびＣ−アミドＴＰＩ２０４０）を調製した。チミジン取り込みアッセイを使用して、４０、１２０および２００μｇ／ｍｌにおけるＴＣＣ１４によるそれらの増殖活性について、ライブラリーの２００個の各混合物を試験した。ＴＣＣはＨＬＡ−ＤＲ１５ホモ接合性ＭＳ患者に由来するので、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子（ＤＲ２ａ（＝ＤＲＢ５＊０１：０１）、ＤＲ２ｂ（＝ＤＲＢ１＊１５：０１）またはＤＱｗ６（＝ＤＱＢ１＊０６０２））を発現するＨＬＡ−ＤＲ１５ハプロタイプをトランスフェクトしたＢＬＳ細胞を用いて、ＴＣＣ１４の拘束性を試験した。ＤＲ２ａ、ＤＲ２ｂおよびＤＱに対する特異的抗体を用いてＢＬＳ細胞株のＨＬＡクラスＩＩ発現を検証し、細胞はマイコプラズマ検査で陰性であった。結果を４つのマトリックス（それぞれが上記用量の１つにおける活性を表す３つのマトリックス、および３倍の増殖を達成するための濃度を使用して３つすべての用量を単一の活性へと組み合わせた１つのマトリックス）に編成した（データは示さず）。ＭＳ患者１１５４ＳＡの脳からのトランスクリプトームタンパク質データベースに対するバイオメトリック分析プロセス（Ｚｈａｏら、２００１）を使用して、４つの各マトリックスについて予測されたペプチドリストを生成した。上記予測されたリスト間の大量の一致により、少なくとも１つのマトリックスの予測リストの上位５０個の予測されたペプチド内で、合計９２個の異なる十量体ペプチドが生じた。これらのペプチドを（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｅｌｅｐｈａｎｔｓ  ＧｍｂＨ，Ｐｏｔｓｄａｍ，Ｇｅｒｍａｎｙによる）合成のために選択し、試験した。
【０１７０】
細胞および培養条件
以前に報告されているように（Ｐｌａｎａｓら、２０１５）、患者１１５４ＳＡ由来のバルクＣＳＦ由来単核細胞を拡大させた。簡潔に言えば、１ウェル当たり２０００個の細胞を、２×１０５個の同種の照射したＰＢＭＣ（４５Ｇｙ）、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＩＬ−２上清（５００Ｕ／ｍｌ）と一緒に９６ウェルＵ底マイクロタイタープレートに播種した。培地は、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＡ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｃａｍｂｒｅｘ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および５％加熱脱補体化ヒト血清（ＰＡＡ）を含有するＩＭＤＭ（ＰＡＡ）からなるものであった。さらなるＩＬ−２を３〜４日ごとに追加した。抗ＣＤ４磁気ビーズ（ＣＤ４  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｅａｄｓ  ｈｕｍａｎ  ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞をポジティブ選択し、ＰＨＡ−Ｌ、ＩＬ−２および同種の照射したＰＢＭＣで再度刺激した。
【０１７１】
以前に記載されているように（Ｐｌａｎａｓら、２０１５）、ＣＳＦ浸潤細胞からＴＣＣ２１．１を樹立し、ＰＢＭＣ由来自己増殖Ｔ細胞からＴＣＣ１４を樹立した。
【０１７２】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼおよびミエリンペプチドに対するＣＩＳおよびＲＲＭＳ患者由来のＣＳＦ由来バルクＴ細胞の試験
３１人のＣＩＳ／ＭＳ患者由来の新鮮バルクＣＳＦ由来単核細胞を５×１０６個の同種の照射したＰＢＭＣと混合し、抗ＣＤ４磁気ビーズを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞をポジティブ選択した。次いで、ＣＤ４＋画分を、１．５×１０５個の同種の照射したＰＢＭＣ、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−ＬおよびＩＬ−２上清と一緒に９６ウェルＵ底マイクロタイタープレートに細胞１５００個／ウェルで播種した。培地は、２ｍＭグルタミン（Ｐａｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５０μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）、０．００００１％  β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）および５％ヒト血清（Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ  Ｂａｓｅｌ）を補充したＨｅｐｅｓ不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｐａｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からなるものであった。さらなるＩＬ−２を４日ごとに追加した。成長中のウェルを４８ウェルプレートに移し、最後に、細胞が完全に休止するまで（２０〜２５日間）７５ｃｍ３フラスコに移した。単一ラウンドの刺激で細胞を高度に拡大させた。
【０１７３】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドおよびＲＡＳＧＲＰ２ペプチドのさらなる分析（「実施例」の１３）のために、同じ方法を実施した。
【０１７４】
ＥＢＶ形質転換により、患者１１５４ＳＡ由来の自己ＢＣＬを生成した。単一のＨＬＡクラスＩＩ分子ＤＲ２ａ（ＤＲＡ１＊０１：０１、ＤＲＢ５＊０１：０１）、ＤＲ２ｂ（ＤＲＡ１＊０１：０１、ＤＲＢ１＊１５：０１）およびＤＱｗ６（ＤＱＡ１＊０１：０２、ＤＱＢ１＊０６：０２）をＢＬＳ細胞にトランスフェクトした。
【０１７５】
Ｔ細胞刺激
コンビナトリアルペプチド混合物または個々のデカペプチドの有無にかかわらず、（示されているように）２×１０４個のＴ細胞および５×１０４個の照射ＢＬＳ細胞株もしくは自己ＢＣＬまたは１×１０５個の照射ＰＢＭＣを２回反復で播種することにより、単一／二重定義ペプチド混合物または個々のデカペプチドへのＴＣＣ反応を試験した。２．５μｇ／ｍｌ  ＰＨＡおよび１０−７Ｍ  ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）、１μｇ／ｍｌの表面コーティングされた抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）および０．５μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ならびにＴ細胞活性化キット（抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２ビーズ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）は、示されているように陽性対照として機能した。
【０１７６】
ペプチドの有無にかかわらず、６×１０４個のＴ細胞および２×１０５個の照射自己ＰＢＭＣを４回反復で播種することにより、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ、ミエリンおよびＣＥＦペプチドへの、ＰＨＡにより拡大したＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応（図６）を試験した。ＥｄＵ実験については、ＢＬＳ  ＤＲＢ１＊１５：０１をＡＰＣとして使用した。Ｔ細胞活性化キットを陽性対照として使用した。
【０１７７】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドおよびＲＡＳＧＲＰ２ペプチドのさらなる分析（「実施例」の１３）のために、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼへの、ＰＨＡにより拡大したＣＳＦ浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応の場合と同じ方法を実施した。
【０１７８】
サイトカイン測定
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ
４８時間後に、製造業者の指示にしたがってヒトＴヘルパーサイトカインパネルＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘビーズベースのイムノアッセイ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）およびＩＬ−３  ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、刺激ＴＣＣ２１．１および拡大したＣＳＦ細胞の上清中のサイトカインを測定した。
【０１７９】
細胞内サイトカイン染色については、刺激の４８時間後に、ＴＣＣ２１．１を分析した。５時間後、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐタンパク質輸送阻害剤（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下でＴ細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による固定および透過処理の後、サポニンおよびＢＳＡを含有するＰＢＳ中、ＣＤ４（ＡＰＣ−Ｃｙ７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＦＮ−γ（ＦＩＴＣ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ−４（ＰＥ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＡＰＣ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＩＬ−３（ＰＥ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１８０】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドおよびＲＡＳＧＲＰ２ペプチドのさらなる分析（「実施例」の１３）のために、４８時間の培養後に、製造業者の指示にしたがってすべての単一ウェルで２回反復でＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、刺激および非刺激拡大ＣＳＦ浸潤Ｔ細胞の上清中のＩＦＮ−γの分泌を測定した。
【０１８１】
増殖反応
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ
７２時間後に、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  １４５０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｒｏｄｇａｕ−Ｊｕｅｒｇｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で３Ｈ−チミジン（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）取り込みにより、増殖を測定した。以下のように刺激指数（ＳＩ）を計算した：ＳＩ＝中央値（反復ｃｐｍペプチド）／中央値（反復ｃｐｍペプチドなし）。製造業者の指示にしたがってＣｌｉｃｋ−ｉＴＴＭ  ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキット（ＡＰＣ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、増殖も測定した。以下の抗体抗ＣＤ３（ＰＥ−Ｃｙ−７，ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および抗ＴＲＢＶ−２１（ＦＩＴＣ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
ＲＡＳＧＲＰ２
【０１８２】
９に記載されているように、増殖反応を試験した。
【０１８３】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼペプチドおよびＲＡＳＧＲＰ２ペプチドのさらなる分析（「実施例」の１３）のために、上記ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼについて記載されているように、増殖反応を測定した。
【０１８４】
表面受容体発現
ＣＤ４（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＴＲＢＶ２１（ＦＩＴＣ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ２８（ＰＥ−Ｃｙ７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＣＲ４（ＡＰＣ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＣＲ６（ＢＶ７８５，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＲＴｈ２（ＰＥ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に対する抗体で休止ＴＣＣ２１．１を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１８５】
フローサイトメトリー分析
Ｄｉｖａソフトウェアを備えるＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してサンプル取得を実行し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いてデータを分析した。
【０１８６】
ＴＣＲ再配置のＲＴ−ＰＣＲおよびシークエンシング
以前に報告されているように（Ｐｌａｎａｓら、２０１５）、ＴＣＣ２１．１のＲＮＡ抽出、逆転写およびＴＣＲα／β鎖（ＴＲＡ／ＢＶ）シークエンシングを評価した。ＴＣＲ遺伝子表記は、ＩＭＧＴ命名法（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ，ｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇ）に従う。
【０１８７】
ＨＬＡ
Ｈｉｓｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＬＬＣ，ＮＹ，ＵＳＡにおいて、ＨＬＡ−クラスＩおよびＩＩ分子について個体をタイピングした。標準的なＤＮＡ単離プロトコールを用いてＴｒｉｔｏｎ溶解バッファーおよびプロテイナーゼＫ処理を使用して、１５ｎｇ／μｌの最終濃度を有する全血からのＤＮＡの単離を実施した。高解像度ＨＬＡ配列ベースのタイピング（ＳＢＴ）を使用して、ＨＬＡクラスＩ（Ａ＊およびＢ＊）およびＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲＢ１＊、ＤＲＢ３＊、ＤＲＢ４＊、ＤＲＢ５＊、ＤＱＡ１＊およびＤＱＢ１＊）について、サンプルをタイピングした。ＩＥＤＢ分析リソースコンセンサスツールを使用して、ＨＬＡクラスＩＩ結合予測を行った。
【０１８８】
統計分析
患者スコアに対して３クラスタｋ−平均分析を実施して、患者を３つのカテゴリにグループ化した。有意性５％で、必要に応じてボンフェローニホルム補正を適用してフィッシャーの直接確率検定を使用して、ペプチドの反応レベルと患者とＨＬＡステータスとの間の関連付けをすべて実施した。
【０１８９】
実施形態
実施形態１．  多発性硬化症（ＭＳ）の処置、診断および／または予防において使用するための、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質もしくはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアント、あるいは前記タンパク質またはその断片、誘導体もしくはスプライスバリアントのいずれかをコードするヌクレオチド配列。
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質もしくはＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーのタンパク質、特にＲＡＳＧＲＰ２またはその断片が特に好ましい。
【０１９０】
実施形態２．  前記ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質が、
ａ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するか、または
ｂ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するか、または
ｃ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有するか、または
ｄ）配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有し、前記タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントが自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または配列番号１に記載されているアミノ酸配列もしくはその断片に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識されるか、または
ｅ）ＴＳＴＡ３遺伝子により、特にＮＣ＿０００００８．１１のヌクレオチド１４３６１２６１８〜１４３６１８０４８の遺伝子配列によりコードされるか、またはＮＣ＿０００００８．１１のヌクレオチド１４３６１２６１８〜１４３６１８０４８の遺伝子配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一の遺伝子によりコードされ、
および／または
前記ＲＡＳＧＲＰタンパク質ファミリーの前記メンバーが、
ｆ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列を有するか、または
ｇ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するか、または
ｈ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有するか、または
ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のいずれかに記載されているアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有し、前記タンパク質またはその断片もしくはスプライスバリアントが自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９のいずれかに記載されている各アミノ酸配列もしくはその断片に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識されるか、または
ｊ）ＲＡＳＧＲＰ遺伝子により、特に
−ＮＣ＿００００１５．１０のヌクレオチド３８４８８１０１〜３８５６５５７５、
−ＮＣ＿００００１１．１０のヌクレオチド６４７２６９１１〜６４７４５４５６、
−ＮＣ＿０００００２．１２のヌクレオチド３３４３６３２４〜３３５６４７５０、または
−ＮＣ＿００００１９．１０のヌクレオチド３８４０９０５１〜３８４２６３０５
の遺伝子配列によりコードされるか、
または、
−ＮＣ＿００００１５．１０のヌクレオチド３８４８８１０１〜３８５６５５７５、
−ＮＣ＿００００１１．１０のヌクレオチド６４７２６９１１〜６４７４５４５６、
−ＮＣ＿０００００２．１２のヌクレオチド３３４３６３２４〜３３５６４７５０、または
−ＮＣ＿００００１９．１０のヌクレオチド３８４０９０５１〜３８４２６３０５
の遺伝子配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一の遺伝子によりコードされる、
実施形態１に記載のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼタンパク質、もしくは少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質、またはその断片が特に好ましい。配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９に記載されているアミノ酸配列を有するＲＡＳＧＲＰ２タンパク質、もしくは少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質、またはその断片も特に好ましい。
【０１９１】
実施形態３．前記断片が、５〜５０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは１０〜１５個のアミノ酸、さらにより好ましくは１５個のアミノ酸を含む、実施形態１または２に記載のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
１０〜１５アミノ酸長の断片が特に好ましい。
【０１９２】
実施形態４．前記断片が、
ａ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるか、または
ｂ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％相同であるか、または
ｃ）各対応するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％相同であり、自己ＨＬＡ対立遺伝子に結合し、Ｔ細胞により認識され、および／または前記各アミノ酸配列に結合するかもしくはそれを認識する抗体により認識される、実施形態２または３に記載のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
断片は、各対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であることが特に好ましい。
【０１９３】
実施形態５．前記断片が、配列番号１０〜９８、好ましくは配列番号１０〜３５を含む群より選択される配列を含み、好ましくは、配列番号１０〜９８、好ましくは配列番号１０〜３５を含む群より選択される配列からなる、前記実施形態のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。
断片は、好ましくは、配列番号１０〜３５を含む群より選択される配列を含む。
【０１９４】
実施形態６．ＭＳ、好ましくは初期ＭＳにおける自己抗原への寛容化に適切なヒト被験体を同定するための、前記実施形態のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。タンパク質またはその断片を使用することが特に好ましい。
【０１９５】
実施形態７．ヒト被験体におけるパターンＩＩ  ＭＳを診断するための、実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体またはスプライスバリアント。タンパク質またはその断片を使用することが特に好ましい。
【０１９６】
実施形態８．実施形態１〜５のいずれかに記載の少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列を含む、担体。担体は、少なくとも１つのタンパク質、断片またはヌクレオチド配列を含むことが特に好ましい。
【０１９７】
実施形態９．前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／もしくはスプライスバリアントに結合させており、ならびに／または前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列を含有する、実施形態８に記載の担体。
担体を、少なくとも１つのタンパク質もしくは断片に結合させており、および／または担体は、ヌクレオチド配列を含有することが特に好ましい。
【０１９８】
実施形態１０．細胞、好ましくは血液細胞、タンパク質、脂質、糖脂質、ビーズ、ナノ粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）および分子、例えば糖分子およびそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される、実施形態８または９に記載の担体。
担体は、好ましくは血液細胞である。
【０１９９】
実施形態１１．前記タンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントが、前記細胞、好ましくは前記血液細胞により発現される、実施形態１０に記載の担体。
タンパク質は、血液細胞により発現されることが特に好ましい。
【０２００】
実施形態１２．  前記血液細胞が赤血球または白血球である、実施形態１０または１１に記載の担体。
【０２０１】
実施形態１３．前記担体が血液細胞であり、前記血液細胞が、カップリング剤により、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ／ＥＤＣ）により前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントに化学的に結合させている、実施形態１０〜１２のいずれかに記載の担体。好ましくは、少なくとも１つのタンパク質または断片を、ＥＤＣにより血液細胞に結合させる。
【０２０２】
実施形態１４．実施形態１３に記載の化学的に結合させた血液細胞を製造する方法であって、ヒト被験体から前記血液細胞を単離すること、前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントを追加すること、ならびに続いて前記カップリング剤、好ましくはＥＤＣを追加することを含む、方法。好ましくは、少なくとも１つのタンパク質または断片が添加される。
【０２０３】
実施形態１５．実施形態１〜５のいずれかに記載の少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。医薬組成物は、好ましくは、少なくとも１つのタンパク質もしくはその断片またはヌクレオチド配列と、薬学的に許容され得る担体とを含む。
【０２０４】
実施形態１６．ＭＳを患っているかまたはそれを発症するリスクがあるヒト被験体において自己抗原への抗原特異的寛容を誘導するための方法であって、前記ヒト被験体に、
ａ）実施形態１〜５のいずれかに記載の少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列、ならびに／または
ｂ）実施形態８〜１３のいずれかに記載の少なくとも１つの担体
を適用するステップを含む、方法。
【０２０５】
抗原特異的寛容を誘導するための方法であって、少なくとも１つのタンパク質もしくはその断片、または少なくとも１つのタンパク質もしくは断片に結合させた担体、および／またはヌクレオチド配列を含有する担体を適用する方法が好ましい。
【０２０６】
実施形態１７．前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列が、経鼻、吸入、経口、皮下（ｓ．ｃ．）、体腔内（ｉ．ｃ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、経皮（ｔ．ｄ．）もしくは静脈内（ｉ．ｖ．）投与により、好ましくは静脈内、皮下、皮内、経皮、経口、吸入、経鼻により適用されるか、または担体、好ましくは赤血球に結合させている、実施形態１６に記載の方法。
【０２０７】
実施形態１８．初期ＭＳにおける自己抗原への抗原特異的寛容を誘導するための、実施形態１６または１７に記載の方法。
【０２０８】
実施形態１９．ＭＳ、好ましくは初期ＭＳにおける自己抗原への寛容化に適切なヒト被験体を同定するための方法であって、前記被験体の血液、ＣＳＦまたは他の体液からＴ細胞および／または抗体を単離すること、ならびに実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントに対する前記Ｔ細胞および／または抗体の反応性を測定することを含む、方法。断片に対するＴ細胞および／または抗体の反応性を測定することが特に好ましい。
【０２０９】
実施形態２０．医薬として使用するための、実施形態３〜５のいずれかに記載の断片、好ましくは実施形態５に記載の断片。断片は、特に、配列番号１０〜３５を含む群より選択される配列を含む。
【０２１０】
実施形態２１．ＭＳのインビトロ診断における、実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントの使用。タンパク質またはその断片を使用することが特に好ましい。
【０２１１】
実施形態２２．実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントを使用してＭＳをインビトロ診断するための方法。タンパク質またはその断片を使用することが特に好ましい。
【０２１２】
実施形態２３．ＭＳと診断されたヒト被験体またはＭＳを発症するリスクがあるヒト被験体のインビトロ事前試験における、実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントの使用。タンパク質またはその断片を使用することが特に好ましい。
【０２１３】
実施形態２４．ＭＳの処置、診断および／または予防のための医薬を製造するための、実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントの使用。タンパク質またはその断片を使用することが特に好ましい。
【０２１４】
実施形態２５．前記誘導体が、参照アミノ酸配列の対応する部分とその全長にわたって少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性または同一性を共有するアミノ酸配列である、実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアント。
【０２１５】
実施形態２６．ＭＳ、好ましくは初期ＭＳにおける自己抗原への寛容化に適切なヒト被験体を同定するためのインビトロ方法であって、前記被験体の血液、ＣＳＦまたは他の体液から事前に得られたＴ細胞および／または抗体を用いて、実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体および／またはスプライスバリアントに対するＴ細胞および／または抗体の反応性を測定することを含むインビトロ方法。タンパク質またはその断片を使用することが特に好ましい。
【０２１６】
実施形態２７．ＭＳを患っているかまたはそれを発症するリスクがあるヒト被験体において自己抗原への抗原特異的寛容を誘導するための方法であって、前記ヒト被験体に、少なくとも１つの実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列ならびに／または少なくとも１つの実施形態８〜１３のいずれかに記載の担体を適用するステップを含む方法において使用するための、少なくとも１つの実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列ならびに／または少なくとも１つの実施形態８〜１３のいずれかに記載の担体。タンパク質もしくはその断片および／またはタンパク質もしくはその断片に結合させた少なくとも１つの担体を使用することが特に好ましい。
【０２１７】
実施形態２８．前記少なくとも１つのタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／または遺伝子配列が、経鼻、吸入、経口、皮下（ｓ．ｃ．）、体腔内（ｉ．ｃ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、経皮（ｔ．ｄ．）もしくは静脈内（ｉ．ｖ．）投与により、好ましくは静脈内、皮下、皮内、経皮、経口、吸入、経鼻により適用されるか、または担体、好ましくは赤血球に結合させる、少なくとも１つの実施形態２７に記載のタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列ならびに／または少なくとも１つの実施形態２７に記載の担体。タンパク質もしくはその断片および／またはタンパク質もしくはその断片に結合させた少なくとも１つの担体を使用することが特に好ましい。
【０２１８】
実施形態２９．初期ＭＳにおける自己抗原への抗原特異的寛容を誘導するための、少なくとも１つの実施形態１〜５のいずれかに記載のタンパク質、断片、誘導体、スプライスバリアント、ヌクレオチド配列および／もしくは遺伝子配列ならびに／または少なくとも１つの実施形態８〜１３のいずれかに記載の担体。タンパク質もしくはその断片および／またはタンパク質もしくはその断片に結合させた少なくとも１つの担体を使用することが特に好ましい。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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