(57)【要約】  ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の調製方法及び関節軟骨欠損を修復する薬物の調製におけるその用途であって、当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の調製方法は、（ａ）ヒアルロン酸と無水メタクリル酸を反応させてアクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物を合成し、（ｂ）当該アクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物と光重合開始剤を混合し、紫外光を照射して光重合反応を行うことでヒアルロン酸ヒドロゲルを取得し、（ｃ）当該ヒアルロン酸ヒドロゲルをスクリーンに通すことで当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を取得する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の調製方法であって、
（ａ）ヒアルロン酸と無水メタクリル酸を反応させてアクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物を合成し、
（ｂ）前記アクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物と光重合開始剤を混合し、紫外光を照射して光重合反応を行うことでヒアルロン酸ヒドロゲルを取得し、
（ｃ）前記ヒアルロン酸ヒドロゲルをスクリーンから押し出すことで前記ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を取得する方法。
【請求項２】
前記光重合開始剤は、２−メチル−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−アセトンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スクリーンのメッシュサイズは１０〜５００μｍである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の粒径サイズは１〜３００μｍである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の粒径サイズは７０〜２００μｍである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の粒径サイズは１００〜１５０μｍである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子のアクリル酸メチル化度は１５〜１４０％である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
関節軟骨欠損を修復する薬物を調製するための組成物の用途であって、前記組成物はヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を含む用途。
【請求項９】
前記ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子は、
（ａ）ヒアルロン酸と無水メタクリル酸を反応させてアクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物を合成し、
（ｂ）前記アクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物と光重合開始剤を混合し、紫外光を照射して光重合反応を行うことでヒアルロン酸ヒドロゲルを取得し、
（ｃ）前記ヒアルロン酸ヒドロゲルをスクリーンから押し出すことで前記ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を取得する
とのステップで調製される請求項８に記載の用途。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の粒径サイズは１００〜１５０μｍである請求項８に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の調製方法及び関節軟骨欠損の修復におけるその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨組織は、血管やリンパ系及び神経を有さない結合組織であり、主として硝子軟骨（Ｈｙａｌｉｎｅ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）からなる。また、硝子軟骨は、主に、軟骨細胞、ＩＩ型コラーゲン（ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）から構成される。軟骨組織はひとたび損傷すると、隣接する軟骨細胞の数に非常に限りがあることから十分に修復されず、更には、細胞外基質を損傷部位に移動させて包囲することが難しいとの課題も存在する。現在知られているように、軟骨の自己修復により生成される新たな組織の大部分は線維軟骨（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ）組織であり、主としてＩ型コラーゲン（ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）からなる。しかし、線維軟骨組織には軟骨の然るべき生物力学的特性が不足しており、硝子軟骨の機能も有していない。そのため、次第に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）されて行き、関節を損傷前の正常な運動状態に回復させることは困難である。臨床では、例えば、マイクロフラクチャー（ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ）、骨軟骨移植（Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）、或いは自家軟骨細胞移植（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）といった手術方式が存在するが、依然として、線維軟骨（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ）が生成されたり、新たに生成された軟骨組織の接着が不可能であったり、軟骨細胞が変性したり等の課題が存在する。また、近年は、組織工学を利用した軟骨組織の修復がかなりのスピードで発展している。この方式では、活性を有する細胞足場に軟骨細胞や間葉系幹細胞のような細胞を組み合わせることで軟骨を修復する。
【０００３】
ヒアルロン酸は関節軟骨の成分の一つであり、細胞足場として関節軟骨の修復に応用されることが多い。しかし、関節軟骨組織の修復にヒアルロン酸を応用する場合には、軟骨細胞又は間葉系幹細胞を組み合わせる必要がある。つまり、ヒアルロン酸は、細胞と組み合わせて使用することで初めて軟骨修復の効果を持ち得る。ところが、軟骨細胞又は間葉系幹細胞を使用する場合には、細胞が増殖しにくい、細胞供給源のコントロールが難しい、或いは同種移植により病原体が持ち込まれる恐れがあるとの課題が存在する。
【０００４】
そのため、如何にしてヒアルロン酸を細胞足場として単独で使用し、細胞との組み合わせを回避するかが、現在喫緊に解決を要する課題となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、光架橋方式を利用して、ヒアルロン酸をヒアルロン酸ヒドロゲルとしたあとに、分解速度を調整するためにヒアルロン酸ヒドロゲルを切断してヒアルロン酸微粒子とすることで、軟骨細胞又は間葉系幹細胞との組み合わせを必要とすることなく、単独で効果的に関節軟骨欠損の修復に使用可能とするヒアルロン酸微粒子の調製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の調製方法を提供する。当該方法は、（ａ）ヒアルロン酸と無水メタクリル酸を反応させてアクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物を合成し、（ｂ）当該アクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物と光重合開始剤を混合し、紫外光を照射して光重合反応を行うことでヒアルロン酸ヒドロゲルを取得し、（ｃ）当該ヒアルロン酸ヒドロゲルをスクリーンから押し出すことで当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を取得する。
【０００７】
一実施例において、当該光重合開始剤は、２−メチル−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−アセトンである。
【０００８】
一実施例において、当該スクリーンのメッシュサイズは１０〜５００μｍである。
【０００９】
一実施例において、当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の粒径サイズは１〜３００μｍである。他の実施例において、当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の粒径サイズは７０〜２００μｍである。他の実施例において、当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の粒径サイズは１００〜１５０μｍである。
【００１０】
一実施例において、当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子のアクリル酸メチル化度は５〜２００％である。他の実施例において、当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子のアクリル酸メチル化度は１５〜１４０％である。
【００１１】
本発明は、更に、関節軟骨欠損を修復する薬物を調製するための組成物の用途であって、当該組成物がヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を含む用途を提供する。
【００１２】
一実施例において、当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子は、（ａ）ヒアルロン酸と無水メタクリル酸を反応させてアクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物を合成し、（ｂ）当該アクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物と光重合開始剤を混合し、紫外光を照射して光重合反応を行うことでヒアルロン酸ヒドロゲルを取得し、（ｃ）当該ヒアルロン酸ヒドロゲルをスクリーンから押し出すことで当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を取得する、とのステップで調製される。
【００１３】
本発明は、更に、ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を関節軟骨欠損部位に投与する関節軟骨欠損を修復する方法を提供する。
【００１４】
一実施例において、当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子は、（ａ）ヒアルロン酸と無水メタクリル酸を反応させてアクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物を合成し、（ｂ）当該アクリル酸メチル化ヒアルロン酸共役物と光重合開始剤を混合し、紫外光を照射して光重合反応を行うことでヒアルロン酸ヒドロゲルを取得し、（ｃ）当該ヒアルロン酸ヒドロゲルをスクリーンから押し出すことで当該ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子を取得する、とのステップで調製される。
【００１５】
本文中で使用する用語「ヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）」とは、水を分散媒とするゲルのことである。ヒドロゲルは、網目状の架橋構造を有する水溶性高分子に部分的な疎水基と親水性残基を導入した構造となっており、親水性残基が水分子と結合し、水分子を網目の内部に接続することで、疎水性残基が水に遭遇すると膨潤する架橋ポリマーである。そのため、水溶性又は親水性の高分子であれば、いずれも一定の化学架橋又は物理架橋によってヒドロゲルを形成し得る。
【００１６】
ヒドロゲルは、物理ゲルと化学ゲルに分けられる。（１）物理ゲルとは、例えば、静電気の働きや水素結合、鎖の巻き付き等の物理的作用によって形成されるものである。このようなゲルは非恒久的であり、加熱によって溶液に変化し得るため、疑似ゲル又は熱可逆性ゲルとも称される。多くの天然高分子は、例えばｋ２型カラギーナンや寒天等のように、常温下で安定的なゲル状態を呈する。合成ポリマーの中ではポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が典型的な例であり、凍結融解処理によって６０℃以下で安定するヒドロゲルを取得可能である。
【００１７】
（２）化学ゲルとは、化学結合による架橋で形成される３次元ネットワークポリマーであり、恒久的であるため真性ゲルと称される。また、ヒドロゲルのサイズや形状の違いによって、マクロゲルとミクロゲル（微粒子）という区分もある。更に、マクロゲルは、形状の違いによって、柱状、多孔スポンジ状、繊維状、膜状、球状等に分けることができる。また、現在製造されている微粒子には、マイクロレベルとナノレベルの違いがある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、アクリル酸メチル化ヒアルロン酸（Ｍｅ−ＨＡ）ヒドロゲル微粒子の調製のフローチャートである。
【図２】図２は、アクリル酸メチル化ヒアルロン酸（Ｍｅ−ＨＡ）ヒドロゲル微粒子の形態、サイズ分布及び平均粒径サイズを示す。
【図３】図３は、アクリル酸メチル化ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の体外分解を示す。
【図４】図４は、ウサギ骨軟骨欠損修復モデルに対するアクリル酸メチル化ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子のプロトタイプ（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）のＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ組織学軟骨修復評価を示す。
【図５】図５は、ウサギ骨軟骨欠損修復モデルに対する脂肪由来幹細胞＋ヒアルロン酸、及びアクリル酸メチル化ヒアルロン酸による軟骨修復を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、異なる形式で実施される場合もあり、下記で提示する実施例に限らない。下記の実施例は、本発明における異なる面及び特性の代表的なものにすぎない。
【００２０】
ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の調製について、図１のフローを参照する。無水メタクリル酸を１％（ｗ／ｖ）ヒアルロン酸（ＨＡ）溶液に添加してアクリル酸メチル化ヒアルロン酸（Ｍｅ−ＨＡ）共役物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を合成した。当該１％ヒアルロン酸溶液とは、脱イオン蒸留水中であって、５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ８に調整したものである。次に、マクロマー溶液を脱イオン蒸留水で少なくとも７２時間透析して精製し、凍結乾燥することで最終生成物を取得した。また、プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ  ＮＭＲ）で置換度を測定した。置換度は、各二糖繰り返し単位のメタクリロイル基の数と定義し、アクリル酸メチルプロトンの相対ピーク積分（〜５．２及び〜５．５ｐｐｍ部分のピーク）と、ＨＡのメチル基プロトン（〜４．３ｐｐｍ）との比率から算出した。ヒドロゲルの形成については、Ｍｅ−ＨＡを比率１％（ｗ／ｖ）で０．０５％（ｗ／ｖ）の２−メチル−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−アセトン（２−ｍｅｔｈｙｌ−１−［４−（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎｏｎｅ，Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９，Ｉ２９５９）を含有するＰＢＳに溶解した。そして、Ｍｅ−ＨＡ溶液を０．３Ｊｃｍ２の紫外光（３６５ｎｍ，スペクトロライン，ＵＳＡ）で光重合した。次に、Ｍｅ−ＨＡヒドロゲルを１００μｍのスクリーンから押し出すことで微粒子化した。微粒子化したＭｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子は、２００μｍのスクリーンで濾過した。これにより、サイズが２００μｍ以下のＭｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子を収集した。続いて、濾過したＭｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子を７０μｍのスクリーンで濾過することで、後の実験で使用するためにサイズが７０μｍ以上の部分を収集した。
【００２１】
ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子の形態、サイズ分布及び平均粒径サイズについて、図２を参照する。Ｍｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子は不規則形状をなしており、Ｍｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子の平均粒径サイズは１２７±１６μｍであった。
【００２２】
Ｍｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子について体外分解試験を行った。分解状況については図３を参照する。Ｍｅ−ＨＡの右下の数字１５、３０、６５、８５及び１４０は、アクリル酸メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）の度合を表している。Ｍｅ−ＨＡ１５：Ｍｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子のアクリル酸メチル化度が１５％であることを表す。Ｍｅ−ＨＡ３０：Ｍｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子のアクリル酸メチル化度が３０％であることを表す。Ｍｅ−ＨＡ６５：Ｍｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子のアクリル酸メチル化度が６５％であることを表す。Ｍｅ−ＨＡ８５：Ｍｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子のアクリル酸メチル化度が８５％であることを表す。Ｍｅ−ＨＡ１４０：Ｍｅ−ＨＡヒドロゲル微粒子のアクリル酸メチル化度が１４０％であることを表す。
【００２３】
ウサギ骨軟骨欠損修復モデル（ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｄｅｆｅｃｔ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ）を用いて実験を行った。動物モデルをアクリル酸メチル化ヒアルロン酸ヒドロゲル微粒子で処理したあと、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ組織学軟骨修復評価を行った。群については、未治療のブランク群（Ｅｍｐｔｙ）、ＨＡで骨軟骨欠損を治療するＨＡ群、Ｍｅ−ＨＡ１５で骨軟骨欠損を治療するプロトタイプ（Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）１、Ｍｅ−ＨＡ６５で骨軟骨欠損を治療するプロトタイプ２、Ｍｅ−ＨＡ１４０で骨軟骨欠損を治療するプロトタイプ３に分けた。これにより、下記のようになった。
＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１：ブランク群との比較。ｎ＝４〜６。
＃ｐ＜０．０５：ＨＡ群との比較。ｎ＝４〜６。
結果から明らかなように、Ｍｅ−ＨＡ治療群の骨軟骨欠損の修復効果は、未治療群又はＨＡ治療群と比べて顕著に向上した。
【００２４】
動物モデルを脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＡＤＳＣ）＋ヒアルロン酸（ＨＡ）、及びＭｅ−ＨＡで治療して軟骨修復実験を行った。群については、未治療のブランク群（Ｅｍｐｔｙ）、脂肪由来幹細胞及びＨＡで骨軟骨欠損を治療するＡＤＳＣ＋ＨＡ群、微粒子化していないＭｅ−ＨＡ１５ヒドロゲルで骨軟骨欠損を治療するＭｅ−ＨＡ１５群、微粒子化していないＭｅ−ＨＡ６５で骨軟骨欠損を治療するＭｅ−ＨＡ６５群、微粒子化していないＭｅ−ＨＡ１４０で骨軟骨欠損を治療するＭｅ−ＨＡ１４０群に群分けした。結果から明らかなように、Ｍｅ−ＨＡに軟骨細胞又は間葉系幹細胞を組み合わさなくても、関節軟骨欠損を効果的に修復可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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