(57)【要約】  本願は、医薬分野に関する。本願は、分離された防風多糖、及び糖尿病又は高脂血症を治療するための医薬の製造におけるその使用に関する。特に、本願は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース及びＤ−ガラクトースを含む分離された防風多糖であって、Ｌ−アラビノース：Ｄ−ガラクツロン酸：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトースのモル比は、１−１５：１−１０：１−１０：１０−４０：１−１５であり、好ましくは１−５：５−１０：１−５：２０−２５：１−５である、分離された防風多糖に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース及びＤ−ガラクトースを含む分離された防風多糖であって、前記Ｌ−アラビノース：Ｄ−ガラクツロン酸：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトースのモル比は、１−１５：１−１０：１−１０：１０−４０：１−１５であり、好ましくは１−５：５−１０：１−５：２０−２５：１−５であることを特徴とする、分離された防風多糖。
【請求項２】
前記Ｌ−アラビノースは、１，４−結合のＬ−アラビノース及び／又は１，３，４−結合のＬ−アラビノースを含み、
前記Ｄ−ガラクツロン酸は、末端基Ｄ−ガラクツロン酸を含み、
前記Ｄ−マンノースは、１，６−結合のＤ−マンノースを含み、
前記Ｄ−グルコースは、１，４−結合のＤ−グルコース及び／又は１，３，６−結合のＤ−グルコースを含み、
前記Ｄ−ガラクトースは、末端基Ｄ−ガラクトース及び／又は１，４−結合のＤ−ガラクトースを含む、
ことを特徴とする、請求項１に記載の分離された防風多糖。
【請求項３】
前記１，４−結合のＬ−アラビノース：１，３，４−結合のＬ−アラビノース：末端基Ｄ−ガラクツロン酸：１，６−結合のＤ−マンノース：１，４−結合のＤ−グルコース：１，３，６−結合のＤ−グルコース：末端基Ｄ−ガラクトース：１，４−結合のＤ−ガラクトースのモル比は、１−５：１−１０：１−１０：１−１０：１０−３０：１−１０：１−５：１−１０であり、好ましくは１−３：１−５：５−１０：１−５：１５−２５：１−５：１−３：１−５であることを特徴とする、請求項２に記載の分離された防風多糖。
【請求項４】
前記分離された防風多糖分子量は、５×１０４から５×１０５Ｄａであり、好ましくは１×１０５から３．５×１０５Ｄａであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離された防風多糖。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離された防風多糖の製造方法であって、
（１）水で防風を一回又は多回抽出し、防風の水抽出液を得て、任意に前記防風の水抽出液を濃縮する工程と、
（２）前記任意に濃縮された防風の水抽出液に有機溶媒を加えて、有機溶媒濃度が１５〜３０％であり、好ましくは１７〜２８％であり、より好ましくは２０〜２５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得る工程と、
（３）前記上澄み液に有機溶媒を加えて、有機溶媒濃度が７０〜９０％であり、好ましくは７５〜８５％であり、より好ましくは８０〜８５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得る工程と、
（４）前記沈殿を乾燥して、前記の分離された防風多糖を得る工程と、
を含むことを特徴とする、分離された防風多糖の製造方法。
【請求項６】
前記工程（１）における水と防風の体積重量比は、８：１から３０：１であり、好ましくは２０：１から３０：１であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（１）における抽出温度は、４０〜１００℃であり、好ましくは６０〜１００℃であり、最も好ましくは９０〜９５℃であることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（１）における抽出時間が１〜４時間であり、好ましくは１〜２時間であることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（１）における水で防風を抽出する回数は、一回以上であり、好ましくは１〜４回であり、最も好ましくは２〜３回であることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（３）と（４）の間には、さらに、水で工程（３）で得られた沈殿を溶解して水溶液を得て、前記水溶液に有機溶媒を加えて有機溶媒濃度が７０〜９０％であり、好ましくは７５〜８５％であり、より好ましくは８０〜８５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して沈殿を得る工程（３’）が存在し；工程（３’）が、一回又は多回繰り返してもよく、好ましくは１、２又は３回繰り返すことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（２）及び／又は（３）及び／又は（３’）における有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、又はその混合物からなる群より選ばれ、好ましくはエタノールであることを特徴とする、請求項５又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（１）における防風は、防風の煎じ薬であることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１３】
糖尿病又は高脂血症を治療する医薬の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離された防風多糖の使用。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離された防風多糖と、薬理的に許容される担体とを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１５】
糖尿病又は高脂血症を治療するための医薬の製造における、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
糖尿病又は高脂血症を治療するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離された防風多糖。
【請求項１７】
それを必要とする対象に治療的有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離された防風多糖を投与することを含む、糖尿病又は高脂血症を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、医薬分野に関する。具体的に、本願は、分離された防風多糖（Ｓａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉａ  Ｄｉｖａｒｉｃａｔａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＳＤＰ）、及び糖尿病又は高脂血症を治療するための医薬の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究により、糖類物質は、一種類の重要な構造物質及びエネルギー物質だけでなく、重要な生物学的機能を持つことが発見された。糖類物質は、細胞間の相互認識及び情報伝達プロセスに関与し、生体内で核酸以外の別の種類の重要な情報分子と考えられる。そして、糖類物質は、細胞表面信号認識、抗原抗体反応、細胞間情報伝達及び知覚の肝要な因子でもある。そのため、生物学的活性を持つ多糖に対する研究は、益々注目を集めている。糖類物質の構造が複雑であるため、その分離及び構造の同定は、いずれも困難である。これまでには、臨床的に使用されるのは、雲芝多糖、猪苓多糖、香蕈多糖、末広茸多糖、茯苓多糖等に限られる。本分野には、より多くの生物学的活性を持つ多糖が必要である。
【０００３】
漢方薬である防風は、せり科の植物である防風の花柄を引き出していない植物体の乾燥根である。防風は、風邪や頭痛、リウマチや麻痺、風疹や痒み、及び破傷風等の疾患の治療によく使用される。
【０００４】
防風の主な化学成分として、揮発性油、クロモン、クマリン、有機酸、防風多糖等が挙げられる。防風多糖は、複数種類の単糖が連結してなる分岐多糖の一種である。一般的に、それらに含まれる単糖の組成及びその連結方式により、防風多糖を表示する。異なる抽出方法により製造した各々の防風多糖の単糖組成及びその連結方式は、互いに相違する。竇紅霞らの（防風の化学成分及び薬理的作用の研究進展、中医薬情報、２００９、２６(２)、１５）には、複数種類の防風多糖が防風から抽出されたことを記載された：ＸＣ−１（平均分子量が１３１００である。）、ＸＣ−２（平均分子量が７３５００である。）、Ｓａｐｏｎｉｋｏｖａｎ  Ａ、Ｂ、Ｃ（分子量がそれぞれ５４０００、２８００００、１３２０００である。）。防風多糖は、本分野において、抗腫瘍、抗酸化、体の免疫力の向上等に一般的に使用される。これまでには、防風多糖が糖尿病又は高脂血症の治療に使用されることが報告されていない。
【０００５】
糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ）とは、インスリン分泌不全及び／又はインスリン機能不全による高血糖を特徴とする代謝性疾患を意味する。糖尿病は、さらに、糖尿病性心疾患、糖尿病性眼疾患、糖尿病性血管疾患等のような複数種類の合併症を引き起こすことができる。糖尿病は、現在、公衆健康を深刻に脅かす慢性疾患である。
【０００６】
高脂血症（Ｈｙｐｅｒｌｉｐｏｉｄｅｍｉａ）とは、血液における一種又は複数種類の脂質レベルが異常となる（例えば、複数種類の脂質レベルが正常レベルよりも高い）代謝性疾患を意味する。高脂血症は、血液における総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）及び低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルが高すぎる、又は高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルが低すぎることを表現とする。近年、高脂血症の発生率は増加しつつある。高脂血症は、いくつかの深刻な心臓・脳血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心臓病等）と密接に関連する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
糖類物質の構造が複雑であり、異なる抽出方式が多糖の構造組成に直接影響するため、薬理的効果に影響することがある。本発明は、勾配沈殿の工程を含む、改良された防風多糖の製造方法を提供する。構造解析によれば、本発明による分離された防風多糖は、従来の防風多糖と構造が全く異なることが分かった。動物試験による検証によれば、本発明による分離された防風多糖は、糖尿病の治療及び血脂の調整での潜在的な作用を持つ。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願の一態様では、Ｌ−アラビノース（Ｌ−Ａｒａ）、Ｄ−ガラクツロン酸（Ｄ−ＧｌａＡ）、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）及びＤ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）等の単糖を含む分離された防風多糖であって、Ｌ−アラビノース：Ｄ−ガラクツロン酸：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトースのモル比が、１−１５：１−１０：１−１０：１０−４０：１−１５である、分離された防風多糖を提供する。一つの実施形態では、Ｌ−アラビノース：Ｄ−ガラクツロン酸：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトースのモル比は、１−５：５−１０：１−５：２０−２５：１−５である。
【０００９】
一つの実施形態では、前記分離された防風多糖に含まれる単糖成分は、特定の方式で互いに連結する。前記Ｌ−アラビノースは、１，４−結合のＬ−アラビノース及び／又は１，３，４−結合のＬ−アラビノースを含み；前記Ｄ−ガラクツロン酸は、末端基Ｄ−ガラクツロン酸を含み；前記Ｄ−マンノースは、１，６−結合のＤ−マンノースを含み；前記Ｄ−グルコースは、１，４−結合のＤ−グルコース及び／又は１，３，６−結合のＤ−グルコースを含み；前記Ｄ−ガラクトースは、末端基Ｄ−ガラクトース及び／又は１，４−結合のＤ−ガラクトースを含む。
【００１０】
一つの好ましい実施形態では、本願によるＬ−アラビノースは、１，４−結合のＬ−アラビノース及び／又は１，３，４−結合のＬ−アラビノースを含む。
【００１１】
一つの好ましい実施形態では、本願によるＤ−ガラクツロン酸は、末端基Ｄ−ガラクツロン酸を含む。
【００１２】
一つの好ましい実施形態では、本願によるＤ−マンノースは、１，６−結合のＤ−マンノースを含む。
【００１３】
一つの好ましい実施形態では、本願によるＤ−グルコースは、１，４−結合のＤ−グルコース及び／又は１，３，６−結合のＤ−グルコースを含む。
【００１４】
一つの好ましい実施形態では、本願によるＤ−ガラクトースは、末端基Ｄ−ガラクトース及び／又は１，４−結合のＤ−ガラクトースを含む。
【００１５】
一つの実施形態では、前記分離された防風多糖は、１，４−結合のＬ−アラビノース、１，３，４−結合のＬ−アラビノース、末端基Ｄ−ガラクツロン酸、１，６−結合のＤ−マンノース、１，４−結合のＤ−グルコース、１，３，６−結合のＤ−グルコース、末端基Ｄ−ガラクトース及び１，４−結合のＤ−ガラクトースを含む。別の好ましい実施形態では、前記１，４−結合のＬ−アラビノース：１，３，４−結合のＬ−アラビノース：末端基Ｄ−ガラクツロン酸：１，６−結合のＤ−マンノース：１，４−結合のＤ−グルコース：１，３，６−結合のＤ−グルコース：末端基Ｄ−ガラクトース：１，４−結合のＤ−ガラクトースのモル比は、１−５：１−１０：１−１０：１−１０：１０−３０：１−１０：１−５：１−１０であり、好ましくは１−３：１−５：５−１０：１−５：１５−２５：１−５：１−３：１−５である。
【００１６】
一つの好ましい実施形態では、本願は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース及びＤ−ガラクトースを含む分離された防風多糖であって、前記Ｌ−アラビノースが、１，４−結合のＬ−アラビノース及び／又は１，３，４−結合のＬ−アラビノースを含み；前記Ｄ−ガラクツロン酸が、末端基Ｄ−ガラクツロン酸を含み；前記Ｄ−マンノースが、１，６−結合のＤ−マンノースを含み；前記Ｄ−グルコースが、１，４−結合のＤ−グルコース及び／又は１，３，６−結合のＤ−グルコースを含み；前記Ｄ−ガラクトースが、末端基Ｄ−ガラクトース及び／又は１，４−結合のＤ−ガラクトースを含む、分離された防風多糖を提供する。さらに好ましい実施形態では、前記１，４−結合のＬ−アラビノース：１，３，４−結合のＬ−アラビノース：末端基Ｄ−ガラクツロン酸：１，６−結合のＤ−マンノース：１，４−結合のＤ−グルコース：１，３，６−結合のＤ−グルコース：末端基Ｄ−ガラクトース：１，４−結合のＤ−ガラクトースのモル比は、１−５：１−１０：１−１０：１−１０：１０−３０：１−１０：１−５：１−１０であり、好ましくは１−３：１−５：５−１０：１−５：１５−２５：１−５：１−３：１−５である。
【００１７】
別の実施形態では、前記単糖成分の一つ又は複数種類は、ピラノースであり；一つの好ましい実施形態では、前記単糖成分は、いずれもピラノースである。
【００１８】
一つの好ましい実施形態では、本願による分離された防風多糖は、分子量が５×１０４から５×１０５Ｄａであり、好ましくは１×１０５から３．５×１０５Ｄａである。
【００１９】
本願の別の態様では、分離された防風多糖の製造方法であって、
（１）水で防風を一回又は多回抽出し、防風の水抽出液を得て、任意に前記防風の水抽出液を濃縮する工程と、
（２）前記任意に濃縮された防風の水抽出液に有機溶媒を加えて、有機溶媒濃度が１５−３０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得る工程と、
（３）前記上澄み液に有機溶媒を加えて、有機溶媒濃度が７０−９０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得る工程と、
（４）前記沈殿を乾燥して、前記の分離された防風多糖を得る工程と、
を含む、分離された防風多糖の製造方法を提供する。
【００２０】
一つの実施形態では、前記工程（２）における有機溶媒濃度は、好ましくは１７−２８％であり、より好ましくは２０−２５％である。いくつかの実施形態では、前記工程（２）は、第１の勾配沈殿ともいう。
【００２１】
一つの実施形態では、前記工程（３）における有機溶媒濃度は、好ましくは７５−８５％であり、より好ましくは８０−８５％である。
【００２２】
一つの実施形態では、前記工程（１）における水と防風の体積重量比は、８：１から３０：１であり、好ましくは２０：１から３０：１である。
【００２３】
一つの実施形態では、前記工程（１）における抽出温度が４０−１００℃であり、好ましくは６０−１００℃であり、より好ましくは８０−１００℃であり、最も好ましくは９０−９５℃である。
【００２４】
一つの実施形態では、前記工程（１）における抽出時間が１−４時間であり、好ましくは１−２時間である。
【００２５】
一つの実施形態では、前記工程（１）における水で防風を抽出する回数は、一回以上である。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、前記工程（１）における水で防風を抽出する回数は、１、２、３又は４回である。
【００２７】
一つの実施形態では、前記工程（３）と（４）の間には、さらに、水で工程（３）で得られた沈殿を溶解して水溶液を得て、前記水溶液に有機溶媒を加えて有機溶媒濃度が７０−９０％であり、好ましくは７５−８５％であり、より好ましくは８０−８５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して沈殿を得る工程（３’）が存在し；工程（３’）が、一回又は多回繰り返してもよく、好ましくは１、２又は３回繰り返す。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記工程（３）及び／又は（３’）は、第２の勾配沈殿ともいう。
【００２９】
一つの実施形態では、前記工程（２）及び／又は（３）及び／又は（３’）における有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、又はその混合物からなる群より選ばれ、好ましくはエタノールである。
【００３０】
本願による防風は、市販の生薬である防風（即ち、植物防風の花柄を引き出していない植物体の乾燥根）及び防風の煎じ薬を含む。一つの実施形態では、本願による防風は、防風の煎じ薬である。
【００３１】
「分離された防風多糖」という用語とは、人工的手段（例えば、抽出、精製等）により防風多糖をその原始的植物素材の天然環境から分離して得られる防風多糖を意味する。前記植物素材は、植物形式の防風でも生薬形式の防風であってもよく、例えば、植物防風の花柄を引き出していない植物体の乾燥根又は防風の煎じ薬であってもよい。
【００３２】
本願の別の態様では、本願による方法により得られる、分離された防風多糖を提供する。一つの好ましい実施形態では、前記分離された防風多糖は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース及びＤ−ガラクトースを含む防風多糖であって、Ｌ−アラビノース：Ｄ−ガラクツロン酸：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルコース：Ｄ−ガラクトースのモル比が、１−１５：１−１０：１−１０：１０−４０：１−１５であり、好ましくは１−５：５−１０：１−５：２０−２５：１−５である。一つの好ましい実施形態では、前記Ｌ−アラビノースは、１，４−結合のＬ−アラビノース及び／又は１，３，４−結合のＬ−アラビノースを含み；前記Ｄ−ガラクツロン酸は、末端基Ｄ−ガラクツロン酸を含み；前記Ｄ−マンノースは、１，６−結合のＤ−マンノースを含み；前記Ｄ−グルコースは、１，４−結合のＤ−グルコース及び／又は１，３，６−結合のＤ−グルコースを含み；前記Ｄ−ガラクトースは、末端基Ｄ−ガラクトース及び／又は１，４−結合のＤ−ガラクトースを含む。一つのさらに好ましい実施形態では、前記１，４−結合のＬ−アラビノース：１，３，４−結合のＬ−アラビノース：末端基Ｄ−ガラクツロン酸：１，６−結合のＤ−マンノース：１，４−結合のＤ−グルコース：１，３，６−結合のＤ−グルコース：末端基Ｄ−ガラクトース：１，４−結合のＤ−ガラクトースのモル比は、１−５：１−１０：１−１０：１−１０：１０−３０：１−１０：１−５：１−１０であり、好ましくは１−３：１−５：５−１０：１−５：１５−２５：１−５：１−３：１−５である。
【００３３】
前記１，４−結合のＬ−アラビノースとは、糖環の１と４位でのグルコシド結合を介して隣接する基（例えば、隣接する単糖残基）と連結するＬ−アラビノースを意味する。
【００３４】
前記１，３，４−結合のＬ−アラビノースとは、糖環の１、３と４位でのグルコシド結合を介して隣接する基（例えば、隣接する単糖残基）と連結するＬ−アラビノースを意味する。
【００３５】
前記末端基Ｄ−ガラクツロン酸とは、その糖環の１位でのグルコシド結合を介して隣接する基（例えば、隣接する単糖残基）と連結するＤ−ガラクツロン酸を意味する。
【００３６】
前記１，６−結合のＤ−マンノースとは、糖環の１及び６位でのグルコシド結合を介して隣接する基（例えば、隣接する単糖残基）と連結するＤ−マンノースを意味する。
【００３７】
前記１，４−結合のＤ−グルコースとは、糖環の１と４位でのグルコシド結合を介して隣接する基（例えば、隣接する単糖残基）と連結するＤ−グルコースを意味する。
【００３８】
前記１，３，６−結合のＤ−グルコースとは、糖環の１、３及び６位でのグルコシド結合を介して隣接する基（例えば、隣接する単糖残基）と連結するＤ−グルコースを意味する。
【００３９】
前記末端基Ｄ−ガラクトースとは、糖環の１位でのグルコシド結合を介して隣接する基（例えば、隣接する単糖残基）と連結するＤ−ガラクトースを意味する。
【００４０】
前記１，４−結合のＤ−ガラクトースとは、糖環の１と４位でのグルコシド結合を介して隣接する基（例えば、隣接する単糖残基）と連結するＤ−ガラクトースを意味する。
【００４１】
本願による糖は、α配置でもβ配置であってもよい。
【００４２】
本願の別の態様では、糖尿病又は高脂血症を治療する医薬の製造における本発明により得られる分離された防風多糖の使用を提供する
【００４３】
本願の別の態様では、治療的有効量の本発明により得られる分離された防風多糖と、薬理的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００４４】
一つの好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、懸濁液、溶液、分散剤、経口又は非経口投与用の徐放性製剤、静脈注射製剤、皮下注射製剤、吸入製剤、経皮製剤、直腸又は膣坐剤。
【００４５】
本願による薬理的に許容される担体とは、当業者に周知の薬理的に許容される担体を意味し、本願の薬理的に許容される担体は、充填剤、湿潤剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、接着剤、流動促進剤、矯味剤、界面活性剤、防腐剤等を含むが、これらに限定されない。充填剤は、ラクトース、微結晶セルロース、デンプン、粉砂糖、デキストリン、マンニトール、硫酸カルシウム等を含むが、これらに限定されない。湿潤剤及び結合剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、スクロース、ポリビニルピロリドン等を含むが、これらに限定されない。崩壊剤は、カルボキシメチルデンプンナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を含むが、これらに限定されない。潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、微粉末シリカゲル、タルク、硬化植物油、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウム等を含むが、これらに限定されない。接着剤は、アラビアゴム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、グルコース結合剤、デキストリン、デキストロース、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン、シロップ及びトラガカントを含むが、これらに限定されない。流動促進剤は、コロイド状シリカ、粉末状セルロース、三ケイ酸マグネシウム、シリカ及びタルクを含むが、これらに限定されない。矯味剤は、アスパルテーム、ステビオシド、フルクトース、グルコース、シロップ、蜂蜜、キシリトール、マンニトール、ラクトース、ソルビトール、マルチトール、グリチルリチンを含むが、これらに限定されない。界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−８０、ポロキサマーを含むが、これらに限定されない。防腐剤は、パラベン、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム等を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
各種の比例で活性成分を含有する各種の医薬組成物の製造方法は、従来のものであるか、本願の開示内容によって当業者に明らかなものであって、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．Ｗ．，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄ．(１９９５)に記載されるようなものである。前記医薬組成物の製造方法は、適切な薬学賦形剤、担体、希釈剤等を混入することを含む。従来の方法により本願による医薬組成物を製造することは、一般的な混合、溶解又は凍結乾燥方法を含む。
【００４７】
本願による医薬組成物において、活性成分の比例が変化することがあるが、所定の単位剤形の重量の約０．０１％から約９９％に占めることができる。このような治療に有用な医薬組成物製剤において、活性成分の量は、有効用量レベルを得ることが可能にする。
【００４８】
本願による錠剤、カプセル剤等は、可以包含：トラガカント、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンのような接着剤と、リン酸水素二カルシウムのような賦形剤と、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸等のような崩壊剤と、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と、スクロース、フルクトース、ラクトース又はアスパルテームのような甘味剤；又は、薄荷、ウィンターグリーンオイル又はサクランボフレーバーのような調味剤を含んでもよい。単位剤形がカプセルである場合、上記種類の材料に加えて、さらに、植物油又はポリエチレングリコールのような液体担体を含んでもよい。各種のその他の材料は、コーティングとして、又は、その他の方式で固形単位剤形を変化させた物理的形式として存在してもよい。例えば、錠剤又はカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラック又は糖等でコートされてもよい。シロップは、活性成分と、甘味剤としてスクロース又はフルクトースと、防腐剤としてパラヒドロキシ安息香酸メチル又はパラヒドロキシ安息香酸プロピルと、染料及び調味剤（例えば、サクランボフレーバー又はミカンフレーバー）を含んでもよい。もちろん、いずれの単位剤形の製造に用いられるいずれの材料は、薬理的に許容され、かつ適用量で無毒でなければならない。また、活性成分は、徐放性製剤及び徐放性装置に混入されてもよい。
【００４９】
活性成分は、また、注入又は注射によって静脈内又は腹腔内に投与することができる。活性成分又はその塩の水溶液を調製することができ、任意で無毒の界面活性剤と混合することができる。グリセリン、液体ポリエチレングリコール、グリセリルトリアセテート、又はそれらの混合物、又は油中の分散液を調製することもできる。このような製剤は、保存及び使用の通常の条件下で微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。
【００５０】
注射又は注入に適した医薬組成物の剤形には、無菌の注射又は注入可能な溶液又は分散液の即時製剤に適した活性成分（リポソームに封入されてもよいもの）を含む無菌水溶液、分散液又は無菌粉末が含まれてもよい。いずれの場合に、最終的な剤形は、製造及び保存の条件下で無菌、液体、及び安定でなければならない。液体担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリド又はそれらの適切な混合物を含む溶媒又は液体分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合に所望の粒子サイズを維持することによって、又は界面活性剤の使用によって維持することができる。様々な抗菌剤及び抗真菌剤（パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等）を使用して、微生物を防止する役割を果たす。多くの場合には、糖、緩衝液又は塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収延遅剤の組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を使用することによって達成できる。
【００５１】
無菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性成分を、必要に応じて上記で挙げられる様々なその他の成分と組み合わせ、その後、無菌濾過することにより調製される。注射用の無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分と無菌濾過溶液中に存在するその他の必要な成分の粉末が生成される。
【００５２】
有用な固体担体には、粉砕された固体（例えば、タルク、クレー、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等）が含まれる。有用な液体担体には、水、エタノール又はエチレングリコール、又は水−エタノール／エチレングリコールの混合物が含まれ、その中に、本出願の医薬組成物が、任意で非毒性の界面活性剤を介して有効含有量で溶解又は分散されることができる。補助剤（例えば、芳香剤）とその他の抗微生物剤を加えて、特定の用途に合わせて特性を最適化できる。
【００５３】
増粘剤（例えば、合成の重合体、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪族アルコール、改性セルロース又は改性無機材料）は、液体担体とともにコーティング可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸などに用いられ、そのまま使用者の皮膚に適用することができる。
【００５４】
活性成分の治療的有効量は、選択した特定の塩だけでなく、投与方式、治療する疾患の性質、及び患者の年齢と状態にも依存するが、最終的に主治医又は臨床医の判断によって決定されるものである。
【００５５】
上記の製剤は、単位用量を含む物理的に別個の単位であり、ヒト及びその他の哺乳動物への投与に適している単位剤形で提供することができる。単位剤形は、カプセル又は錠剤であってもよい。活性成分の単位用量は、係る具体的な治療によって、約０．０１〜約１０００ｍｇ以上の間に変化又は調整することができる。
【００５６】
本願の別の態様では、糖尿病又は高脂血症を治療するための医薬の製造における、治療的有効量の本発明により得られる分離された防風多糖を含有する医薬組成物の使用を提供する。
【００５７】
さらに別の態様では、本願は、それを必要とする対象に治療的有効量の本発明により得られる分離された防風多糖を投与することを含む、糖尿病又は高脂血症を治療する方法を提供する。
【００５８】
一つの好ましい実施形態では、前記の糖尿病又は高脂血症を治療する方法は、それを必要とする対象に治療的有効量で治療的有効量の本発明により得られる防風多糖を含有する医薬組成物を投与することを含む。
【００５９】
一つの態様では、本発明は、さらに、糖尿病又は高脂血症を治療するための、分離された防風多糖を提供する。
【発明の効果】
【００６０】
本願による糖尿病の治療は、血糖レベルの低下（例えば、空腹血糖レベルの低下）、耐糖能の向上、膵島細胞への損傷の軽減、インスリン放出の増加等を含む。本願による高脂血症の治療は、血脂代謝の調節、血脂レベルの調節（例えば、血中脂質のレベルの低下、例えば、血中総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）及び低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のレベルの低下）を含む。また、本願による防風多糖は、さらに、対象（例えば、血清及び肝臓中）のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−ｐｘ）の活性を向上させ、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の含有量を低下させることができる。
本願で用いる「治療」という用語とは、一般的に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを意味する。当該効果は、疾患又はその症状の完全又は部分的予防によって予防的なものであってもよく、及び／又は、疾患及び／又は疾患による副作用の部分的又は完全な安定化又は治愈によって治療的なものであってもよい。ここで用いる「治療」は、患者の疾患に対するあらゆる治療を包含し、(ａ)疾患又は症状を罹患しやすいが疾患が診断されていない患者における疾患又は症状の発生の予防、(ｂ)疾患の症状の抑制、即ちその進展の阻害、又は(ｃ)疾患の症状の緩和、即ち疾患又は症状の退行の誘導を含む。
特に明記しない限り、本願による百分率、比例、比率又は部は、体積で表示するものである。本願による体積重量比は、ｍＬ／ｇ（又はＬ／ｋｇ）での体積重量比である。本願による濃度は、体積濃度である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの膵島組織に対する防風多糖の影響である。図１Ａ：正常対照群；図１Ｂ：ＳＴＺ  １２０ｍｇ／ｋｇ群；図１Ｃグリベンクラミド群２５ｍｇ／ｋｇ群；図１Ｄ防風多糖５０ｍｇ／ｋｇ群；図１Ｅ防風多糖２００ｍｇ／ｋｇ群。ＳＴＺ：ストレプトゾトシン。
【図２】ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの血清インスリンレベルに対する防風多糖の影響である（ｘ（ｘの上に横棒）±Ｓ．Ｄ、ｎ＝１０）。正常対照群（正常群）と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；モデル群（ＳＴＺ  １２０ｍｇ／ｋｇ）と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；ＧＬＩ：グリベンクラミド；ＳＤＰ：防風多糖；ＳＴＺ：ストレプトゾトシン。
【図３】ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの血清脂質に対する防風多糖の影響である（ｘ（ｘの上に横棒）±Ｓ．Ｄ、ｎ＝１０）。正常対照群（正常群）と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；モデル群（ＳＴＺ  １２０ｍｇ／ｋｇ）と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；ＧＬＩ：グリベンクラミド；ＳＤＰ：防風多糖；ＳＴＺ：ストレプトゾトシン。
【図４】ＳＴＺ誘発糖尿病マウスのＭＤＡ含有量及びＳＯＤ活性に対する防風多糖の影響である（ｘ（ｘの上に横棒）±Ｓ．Ｄ、ｎ＝１０）。正常対照群（正常群）と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；モデル群（ＳＴＺ  １２０ｍｇ／ｋｇ）と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；ＧＬＩ：グリベンクラミド；ＳＤＰ：防風多糖；ＳＴＺ：ストレプトゾトシン。
【図５】高脂血症マウスの血脂レベルに対する防風多糖の影響である（ｘ（ｘの上に横棒）±Ｓ．Ｄ、ｎ＝１０）。正常対照群（正常群）と比較して、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；高脂肪モデル群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）。
【図６】高脂血症マウスの肝臓ＴＣ、ＴＧ及び肝臓重量係数に対する防風多糖の影響である（ｘ（ｘの上に横棒）±Ｓ．Ｄ、ｎ＝１０）。正常対照群（正常群）と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；高脂肪モデル群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）。
【図７】高脂血症マウスの肝臓形態学に対する防風多糖の影響である。図７Ａ：正常対照群；図７Ｂ：高脂肪モデル群；図７Ｃ：リピディル４０ｍｇ／ｋｇ群；図７Ｄ：防風多糖５０ｍｇ／ｋｇ群；図７Ｅ：防風多糖２００ｍｇ／ｋｇ群。
【図８】高脂血症マウスの肝臓ＳＯＤ、ＧＳＨ−ｐｘ活性及びＭＤＡ含有量に対する防風多糖の影響である（ｘ（ｘの上に横棒）±Ｓ．Ｄ、ｎ＝１０）。正常対照群（正常群）と比較して、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）；高脂肪モデル群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ＬＳＤ法検定）。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
以下、本願は、実施例を通じて本願の有益な効果を実証する。当業者は、これらの実施例が例示であり、限定ではないことを理解する。本願の範囲は、これらの実施例によってなんらかに限定されない。以下の実施例に係る実験操作は、特に説明のない限り、いずれも一般的な操作であり、前期試薬及び材料は、特に説明のない限り、いずれも市販されるものである。
【００６３】
主な試薬と材料
防風の煎じ薬は、中国安徽省亳州漢方薬材市場から購入され、生産地が中国安国であるものである。９５％エタノール、塩酸、水酸化ナトリウム、クマシーブリリアントブルー、硫酸、フェノール、塩化バリウム、トリフルオロ酢酸、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルスルホキシド等は、いずれも中国国薬集団化学試薬有限公司から購入されたものである。Ｌ−アラビノース（Ｌ−Ａｒａ）、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｄ−ガラクツロン酸（Ｄ−ＧａｌＡ）参照品及び１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）は、いずれもＳｉｇｍａ社から購入されたものである。
【００６４】
主な装置
１２６０型高速クロマトグラフィー計（ＤＡＤ及びＲＩＤ検出器、米国Ａｇｉｌｅｎｔ社）；ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ−II型１８角度レーザー光散乱分光計（米国Ｗａｙｙａｔ社）；７８９０Ｂ型ガスクロマトグラフィー質量分析計（米国Ａｇｉｌｅｎｔ社）；Ｉｎｆｉｎｉｔｅｍ２００型マイクロプレートリーダー（米国Ｔｅｃａｎ社）。
【００６５】
実施例１：防風多糖の製造
（１）３００ｇ防風の煎じ薬に６Ｌ蒸留水を加えた。９０℃で前記蒸留水で防風の煎じ薬を２時間抽出し、抽出液を得た。抽出液を分離した後、毎回６Ｌ蒸留水を使用して、毎回２時間で、抽出を２回繰り返した。得られた抽出液を合併し、２Ｌまで濃縮し、濃縮抽出液を得た。
（２）前記濃縮抽出液にエタノールを加えて、エタノール濃度が２０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得た。
（３）前記上澄み液にエタノールを加えて、エタノール濃度が８０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（３’）前記沈殿に０．５Ｌ蒸留水を加えて、溶解させた。その後、再びエタノールを加えて、エタノール濃度が８０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（４）得られた沈殿を乾燥して、収率２％で防風多糖６ｇを得た。
【００６６】
実施例２：防風多糖の製造
（１）３００ｇ防風の煎じ薬に９Ｌ蒸留水を加えた。４０℃で前記蒸留水で防風の煎じ薬を４時間抽出し、抽出液を得た。抽出液を分離した後、毎回９Ｌ蒸留水を使用して、毎回４時間で、抽出を３回繰り返した。得られた抽出液を合併し、２Ｌまで濃縮し、濃縮抽出液を得た。
（２）前記濃縮抽出液にメタノールを加えて、メタノール濃度が３０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得た
（３）前記上澄み液にメタノールを加えてメタノール濃度が９０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（３’） 前記沈殿に０．５Ｌ蒸留水を加えて、溶解させた。その後、再びメタノールを加えて、メタノール濃度が９０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。工程（３’）の操作を２回繰り返した。
（４）得られた沈殿を乾燥して、収率１．６％で防風多糖４．８ｇを得た。
【００６７】
実施例３：防風多糖の製造
（１）３００ｇ防風の煎じ薬に３Ｌ蒸留水を加えた。９０℃で前記蒸留水で防風の煎じ薬を２時間抽出し、抽出液を得た。抽出液を分離した後、毎回３Ｌ蒸留水を使用して、毎回２時間で、抽出を３回繰り返した。得られた抽出液を合併し、２Ｌまで濃縮し、濃縮抽出液を得た。
（２）前記濃縮抽出液にエタノールを加えて、エタノール濃度が１５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得た。
（３）向前記上澄み液にを加えてエタノール以得到エタノール濃度が８０％の混合物、遠心処理前記混合物以得到沈殿。
（３’） 前記沈殿に０．５Ｌ蒸留水を加えて、溶解させた。その後、再びエタノールを加えて、エタノール濃度が８０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。工程（３’）の操作を１回繰り返した。
（４）得られた沈殿を乾燥して、収率２．１％で防風多糖６．２ｇを得た。
【００６８】
実施例４：防風多糖の製造
（１）３００ｇ防風の煎じ薬に２．４Ｌ蒸留水を加えた。１００℃で前記蒸留水で防風の煎じ薬を１時間抽出し、抽出液を得た。抽出液を分離した後、毎回２．４Ｌ蒸留水を使用して、毎回１時間で、抽出を４回繰り返した。得られた抽出液を合併し、２Ｌまで濃縮し、濃縮抽出液を得た。
（２）前記濃縮抽出液にプロパノールを加えて、プロパノール濃度が２０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得た。
（３）前記上澄み液にプロパノールを加えて、プロパノール濃度が７０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（３’） 前記沈殿に０．５Ｌ蒸留水を加えて、溶解させた。その後、再びプロパノールを加えて、プロパノール濃度が７０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（４）得られた沈殿を乾燥して、収率１．６％で防風多糖４．９ｇを得た。
【００６９】
実施例５：防風多糖の製造
（１）３００ｇ防風の煎じ薬に６Ｌ蒸留水を加えた。６０℃で前記蒸留水で防風の煎じ薬を３時間抽出し、抽出液を得た。抽出液を分離した後、毎回６Ｌ蒸留水を使用して、毎回３時間で、抽出を２回繰り返した。得られた抽出液を合併し、２Ｌまで濃縮し、濃縮抽出液を得た。
（２）前記濃縮抽出液にアセトンを加えて、アセトン濃度が２０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得た。
（３）前記上澄み液にアセトンを加えて、アセトン濃度が７５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（３’）前記沈殿に０．５Ｌ蒸留水を加えて、溶解させた。その後、再びエタノールを加えて、エタノール濃度が７５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（４）得られた沈殿を乾燥して、収率１．７％で防風多糖５．２ｇを得た。
【００７０】
実施例６：防風多糖の製造
（１）３００ｇ防風の煎じ薬に６Ｌ蒸留水を加えた。８０℃で前記蒸留水で防風の煎じ薬を２時間抽出し、抽出液を得た。抽出液を分離した後、毎回６Ｌ蒸留水を使用して、毎回２時間で、抽出を２回繰り返した。得られた抽出液を合併し、２Ｌまで濃縮し、濃縮抽出液を得た。
（２）前記濃縮抽出液にエタノールを加えて、エタノール濃度が２５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得た。
（３）前記上澄み液にエタノールを加えて、エタノール濃度が８０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（４）得られた沈殿を乾燥して、収率１．９％で防風多糖５．８ｇを得た。
【００７１】
実施例７：防風多糖の製造
（１）３００ｇ防風の煎じ薬に９Ｌ蒸留水を加えた。７０℃で前記蒸留水で防風の煎じ薬を２時間抽出し、抽出液を得た。抽出液を分離した後、毎回９Ｌ蒸留水を使用して、毎回２時間で、抽出を３回繰り返した。得られた抽出液を合併し、２Ｌまで濃縮し、濃縮抽出液を得た。
（２）前記濃縮抽出液にエタノールを加えて、エタノール濃度が２０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得た。
（３）前記上澄み液にエタノールを加えて、エタノール濃度が８５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（３’）前記沈殿に０．５Ｌ蒸留水を加えて、溶解させた。その後、再びエタノールを加えて、エタノール濃度が８５％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（４）得られた沈殿を乾燥して、収率１．９％で防風多糖５．７ｇを得た。
【００７２】
実施例８：防風多糖の製造
（１）３００ｇ防風の煎じ薬に６Ｌ蒸留水を加えた。９５℃で前記蒸留水で防風の煎じ薬を２時間抽出し、抽出液を得た。抽出液を分離した後、抽出を１回繰り返した。得られた抽出液を合併し、２Ｌまで濃縮し、濃縮抽出液を得た。
（２）前記濃縮抽出液にエタノールを加えて、エタノール濃度が２０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、上澄み液を得た。
（３）前記上澄み液にエタノールを加えて、エタノール濃度が８０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（３’）前記沈殿に０．５Ｌ蒸留水を加えて、溶解させた。その後、再びエタノールを加えて、エタノール濃度が８０％である混合物を得て、前記混合物を遠心処理して、沈殿を得た。
（４）得られた沈殿を乾燥して、収率２％で防風多糖６．１ｇを得た。
【００７３】
実施例９：防風多糖の構造同定
（１）総糖、ウロン酸、タンパク質及び硫酸基含有量測定
硫酸−フェノール法（張澤慶、防風多糖の精製、構造解析及び生物学的活性研究、陝西師範大学修士学位論文、２００８、７７頁参照）により、実施例１−８で得られた防風多糖の総糖含有量を測定した。
（２）メタヒドロキシビフェニル法（高林、ＭＣＰ中のウロン酸の含有量測定、化学工業と工程、２００５、２２（６）：４８７−４８９参照）により、実施例１−８で得られた防風多糖のウロン酸含有量を測定した。
（３）クマシーブリリアントブルー法（Jie Zhang、塩炙前後キハダ多糖の基本含有量測定及び免疫機能に対する影響、遼寧中医雑誌、２０１７、４４（６）：１２６３−１２６７参照）により、実施例１から実施例８で得られた防風多糖のタンパク質含有量を測定した。
（４）硫酸バリウム−比濁法（陳乾、硫酸バリウム−比濁法によるフコイダンにおける硫酸塩イオンの含有量の測定、薬学実践雑誌、２０１２、３０（２）：１１８−１２０）により、実施例１から実施例８で得られた防風多糖の硫酸基含有量を測定した。
【００７４】
測定結果は、以下の表１に示した。
【表１】
2021512997.tif 000002
【００７５】
（５）重量平均分子量測定
多角度レーザー光散乱法（丁厚強、多角度レーザー光散乱分光計とサイズ排除クロマトグラフィー法の併用によるヒアルロン酸の相対分子質量及びその分布の測定、食品及び薬品、２００９、１１（３）：２４−２６参照）により、実施例１−８で得られた防風多糖の重量平均分子量を測定した。
【００７６】
測定方法
１０ｍｇ被検サンプルを１．５ｍＬ遠心管に置いた。その後、１ｍＬ脱イオン水を加えて、前記サンプルを溶解させた。１４０００ｒｐｍの回転数で前記遠心管を１０ｍｉｎ遠心して、上澄み液を得た。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣクロマトグラフィー計を使用して、前記上澄み液を測定し、重量平均分子量を決定した。
【００７７】
クロマトグラフィー条件：
クロマトグラフィーカラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣ  ２００  Å  Ｃｏｌｕｍｎ（３．５  μｍ，７．８×３００ｍｍ）；カラム温度：２５℃；ＲＩＤ温度：３５℃；移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＡｃ溶液；流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；サンプル注入量：３０μＬ。
【００７８】
測定結果は、表２に示した。
【表２】
2021512997.tif 000003
【００７９】
（６）単糖組成解析
２ｍｇ実施例１−８で得られた防風多糖を、それぞれ、アンプル中の１ｍＬの３ｍｏｌ／Ｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に溶解し、その後、前記アンプルを密封した。前記アンプル中の防風多糖を、１０５℃で４時間加水分解した。前記アンプル中の水を、減圧条件で乾燥まで留去した後、前記アンプルに２ｍＬメタノールを加えて、その後、乾燥まで留去した。エタノールの添加と乾燥までの留去蒸干の操作を２回繰り返して、ＴＦＡを除去した。その後、前記アンプルに１００μＬ水を加えて、前記多糖が酸性条件で完全に加水分解されたサンプルを得た。
【００８０】
別途に、適量の単糖参照品を計量し、濃度が１ｍｇ／ｍＬである母液を調製した。母液１０μＬを抽出して、１００μＬまでに定容した。
【００８１】
誘導化処理：５０μＬ参照品溶液を取り、順次に１００μＬ  ０．３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液、１２０μＬ  ０．５ｍｏｌ／Ｌの１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロンのメタノール溶液を加えて、均一に混合して、混合溶液を得た。前記混合溶液を７０℃で６０分間反応した。反応完了後、前記溶液を室温まで冷却し、ｐＨ値を中性まで調節するように適量な０．３ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを加えて、その後、１ｍＬクロロホルムで抽出し、有機相を棄却した。５０μＬ前記多糖が酸性条件で完全に加水分解されたサンプルを取り、同様に以上の方法により誘導化処理された。
【００８２】
クロマトグラフィー条件：
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８クロマトグラフィーカラム；移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液(ｐＨ＝６．７)：アセトニトリル(ｖ／ｖ＝８３：１７)；カラム温度２５℃；検出波長２４５ｎｍ；流速１．０ｍＬ  ／ｍｉｎ；サンプル注入体積１０μＬ。
【００８３】
測定結果は、表３に示した。
【表３】
2021512997.tif 000004
【００８４】
（７）メチル化解析
文献方法（方積年、多糖のメチル化解析方法、国外医学（薬学分册）、１９８６、(４)：２２２−２２６）を参照しながら、それぞれ、実施例１−８の防風多糖をメチル化した。メチル化後の生成物を９０％ギ酸で解重合し、２ｍｏｌ／Ｌ  ＴＦＡで完全に加水分解し、メチル化単糖を得た。その後、得られたメチル化単糖をＮａＢＨ４で還元し、酢酸無水物でアセチル化して、前記メチル化単糖のアルジトールアセテート誘導体を製造し、その後、前記誘導体をＧＣ−ＭＳ解析した。
【００８５】
メチル化解析結果から、実施例１−８の防風多糖は、以下の単糖：１，４−Ｌ−アラビノース、１，３，４−Ｌ−アラビノース、末端基Ｄ−ガラクツロン酸、１，６−Ｄ−マンノース、１，４−Ｄ−グルコース、１，３，６−Ｄ−グルコース、末端基Ｄ−ガラクトース、及び１，４−Ｄ−ガラクトースを含むことが分かった。メチル化解析結果は、表４−１１に示した。
【００８６】
【表４】
2021512997.tif 000005
【００８７】
【表５】
2021512997.tif 000006
【００８８】
【表６】
2021512997.tif 000007
【００８９】
【表７】
2021512997.tif 000008
【００９０】
【表８】
2021512997.tif 000009
【００９１】
【表９】
2021512997.tif 000010
【００９２】
【表１０】
2021512997.tif 000011
【００９３】
【表１１】
2021512997.tif 000012
【００９４】
実施例１０：血糖降下作用実験
実験薬：実施例１の防風多糖は、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ（低用量）及び２００ｍｇ／ｋｇ（高用量）の用量で投与された。
【００９５】
実験試薬：グルコースアッセイキットは、上海栄盛生物薬業有限公司から提供され；インスリンＥＬＩＳＡアッセイキットは、上海西唐実業有限公司から提供され；ＴＣ、ＴＧ、ＨＤＬ−Ｃ、ＳＯＤ、ＭＤＡ及びクマシーブリリアントブルータンパク質アッセイキットは、いずれも南京建成生物工程研究所から提供された。
【００９６】
実験動物：クリーングレードの健康な雄昆明マウス（体重１８−２２ｇ、上海斯莱克実験動物有限責任公司から提供）。
【００９７】
実験装置：高速冷凍遠心機、ドイツＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製；電子天平、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ社製；多機能マイクロプレートリーダー、米国ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社製。
【００９８】
実験方法：マウスを、２０±２℃の温度及び５０±５％の湿度で、１２時間の光照と１２時間の暗闇の条件で、３日間飼養し、その間に、マウスは自由に飲食させた。１０匹の健康なマウスを正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として選択した。０．２ｍｌ／１０ｇ体重で残りのマウスにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）溶液を腹腔内注射した。７２時間後、マウスの空腹血糖（ｆａｓｔ  ｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅ、ＦＢＧ）を測定した。ＦＢＧ値１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ超え２５ｍｍｏｌ／Ｌ未満のマウスを糖尿病モデルマウスとして選択した。糖尿病モデルマウスを、ランダムに、各群１０匹のマウスで、モデル群（ＳＴＺ  １２０ｍｇ／ｋｇ）、低用量防風多糖群（ＳＤＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）、高用量防風多糖（ＳＤＰ  ２００ｍｇ／ｋｇ）群及び陽性薬（グリベンクラミド 、ＧＬＩ  ２５ｍｇ／ｋｇ）対照群に分けた。各投与群に対して、毎日午前８:００に、０．２ｍｌ／１０ｇ体重で強制経口投与した。正常対照群及びモデル群のマウスには、同等体積の蒸留水を投与した。実験中に、各群のマウスは、自由に飲食させ、１０日ごとに一回にＦＢＧ及び体重を測定した。投与３０日後に、マウスを処置し、以下の指標を測定した。
【００９９】
（１）耐糖能：実験終了前日の８:００に絶食させ、４時間後に、マウスの眼窩から採血し、ＦＢＧをグルコース投与前（０時間）の血糖値として測定し、その後、０．２ｍｌ／１０ｇ体重ですべてのマウスに１０％グルコース溶液を腹腔内注射した。腹腔注射グルコース０．５時間（０．５時間）及び２時間（２時間）後に、マウスの眼窩から採血し、血糖値を測定し、以下の式に従って、血糖曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。
【０１００】
【数１】
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【０１０１】
（２）実験終了前日の２２:００に、水を自由に与えて絶食させ、実験は、当日の８:００から始まった。マウスの眼窩から採血し、遠心により血液から血清を得た。血清中のインスリン、総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）及び高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、及びＳＯＤ活性及びＭＤＡ含有量を測定した。マウスの肝臓組織を一部取り、ホモジナイズし、肝臓のＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）活性及びＭＤＡ（マロンジアルデヒド）含有量を測定した。マウスの膵臓組織を一部取り、１０％ホルムアルデヒドで固定して、形態学検査を行った。
【０１０２】
実験結果：
（１）ＳＴＺ誘発糖尿病モデルマウスの空腹血糖及び耐糖能に対する防風多糖の影響
表１２に示すように：正常対照群と比較して、モデル群マウスの血糖レベルは、有意に上昇した（Ｐ＜０．０１）。モデル群と比較して、防風多糖は、糖尿病マウスの血糖レベルを有意に降下させることができた（Ｐ＜０．０５）。
【０１０３】
【表１２】
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【０１０４】
表１３に示すように、正常対照群と比較して、モデル群マウスの耐糖能は、有意に低下し、血糖曲線下面積は、有意に増加した（Ｐ＜０．０１）。モデル群と比較して、防風多糖は、耐糖能を有意に改善し（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）、血糖曲線下面積を有意に低下させることができた（Ｐ＜０．０１）。
【０１０５】
【表１３】
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【０１０６】
（２）ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病マウスの膵島組織及び血清インスリンレベルに対する防風多糖の影響
図１に示すように：正常対照群と比較して、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの膵島組織中の細胞には、核濃縮、ヒアリン化病変、炎症細胞浸潤、不完全な膵島形態を生じた（図１Ｂ）。防風多糖の投与後、ＳＴＺ群と比較して、低倍率で、防風多糖群の膵島数は有意に低下しなく、高倍率でｈ、防風多糖群マウスの膵島の損傷は有意に軽減され、形態が比較的に完全であった（図１Ｄ、１Ｅ）。
【０１０７】
同時に、マウスの血清インスリンレベルを測定した。実験結果は、図２に示した。正常対照群と比較して、ＳＴＺ群（モデル群）マウスの血清インスリンレベルは、有意に降下させた（Ｐ＜０．０１）。一方、防風多糖の投与後、ＳＴＺ群と比較して、防風多糖（２００ｍｇ／ｋｇ）高用量群の血清インスリンレベルは、有意に上昇した（Ｐ＜０．０１）。
【０１０８】
（３）ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの血清脂質に対する防風多糖の影響
脂肪毒性は、２型糖尿病の発症メカニズムの要因の一つとされる。図３に示すように、正常対象と比較して、ＳＴＺ群（モデル群）マウスの血清ＴＣ及びＴＧレベルは、いずれも有意に上昇した（Ｐ＜０．０１）。一方、防風多糖の投与後、ＳＴＺ群と比較して、低用量及び高用量の防風多糖は、いずれも糖尿病マウスの血清ＴＣ及びＴＧレベルを有意に低下させ、かつ用量依存性を示した（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）。また、血清ＨＤＬ−Ｃレベルは、各群の間に有意な影響が見られなかった。
【０１０９】
（４）ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病マウスの血清及び肝臓ＭＤＡ含有量及びＳＯＤ活性に対する防風多糖の影響
ＳＴＺ誘発糖尿病ラットモデルでは、酸素ラジカルが大量に生成される。脂質は、酸素ラジカルの作用で過酸化作用を生じることにより、アルデヒド系、アルコール系などの物質が大量に生成され、その中、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は、代表的な性質の一つである。プロピレングリコール含有量は、過酸化作用の程度を反映する。一方、ＳＯＤの活性は、体の酸素ラジカルの除去能力を反映する。実験結果は、図４に示すように、正常対照と比較して、ＳＴＺ群（モデル群）マウスの血清及び肝臓中のＭＤＡの含有量は、いずれも有意に上昇し（Ｐ＜０．０１）、同時に肝臓中のＳＯＤの活性は、有意に低下した（Ｐ＜０．０１）。一方、防風多糖の投与後、ＳＴＺ群と比較して、防風多糖は、いずれも糖尿病マウスの血清ＭＤＡ含有量を低下させることができた。特に、高用量の防風多糖は、マウスの血清ＭＤＡ含有量を有意に低下させることができ（Ｐ＜０．０１）；低用量及び高用量の防風多糖は、いずれもマウスの肝臓ＭＤＡ含有量を有意に低下させることができた（Ｐ＜０．０５）。ＳＴＺ群と比較して、防風多糖は、いずれもマウスの血清ＳＯＤ活性を上昇させることができた。特に、高用量の防風多糖は、マウスの血清ＳＯＤ活性を有意に上昇させることができ（Ｐ＜０．０５）；低用量及び高用量の防風多糖は、いずれもマウスの肝臓ＳＯＤ活性を上昇させることができ、その中、高用量の防風多糖は、マウスの肝臓ＳＯＤ活性を有意に上昇させることができた（Ｐ＜０．０１）。
【０１１０】
実験結論：防風多糖は、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの空腹血糖レベルを有意に低下させ、かつ糖尿病マウスの耐糖能を有意に増加させることができた。そして、防風多糖は、さらに、マウス膵島の損傷を軽減し、インスリンの放出を増加し、そして高血糖マウスの血清中ＴＣ及びＴＧレベルを有意に低下させることができた。防風多糖は、血清及び肝臓中のＳＯＤ活性を増加しながら、ＭＤＡの含有量を低下させることができた。
【０１１１】
実施例１１    防風多糖の血脂降下作用実験
実験薬：実施例１の防風多糖は、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ（低用量）及び２００ｍｇ／ｋｇ（高用量）の用量で投与された。
【０１１２】
実験試薬：ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＳＯＤ、ＧＳＨ−ｐｘ、ＭＤＡ及び及びクマシーブリリアントブルータンパク質アッセイキットは、いずれも南京建成生物工程研究所から提供された。
【０１１３】
実験動物：クリーングレードの健康な雄昆明マウス（体重１８−２２ｇ、上海斯莱克実験動物有限責任公司から提供）。
【０１１４】
実験装置：高速冷凍遠心機、ドイツＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製；電子天平、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ社製；多機能マイクロプレートリーダー、米国ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社製。
【０１１５】
文献方法（孫立彦、劉振亮、孫金霞ら．マウスの耐酸欠作用に対する白茅根多糖の影響、中国医院薬学雑誌、２００８，２８(２):９６−９９；冷斌、ＩｇＡ腎疾患ラットの免疫調節及び腎線維化に対する白茅根多糖の介入、桂林医学院学位論文、２０１３；呂世静、龍啓才、何徳袁ら、Ｂ型肝炎患者のリンパ細胞の増殖及びＴ細胞サブグループに対する白茅根多糖の調節作用、［会議論文］２００１−第２回全国中医薬免疫学術研討）を参照し、高脂血症モデルを確立した。実験方法：マウスを、２０±２℃の温度及び５０±５％の湿度で、１２時間の光照と１２時間の暗闇の条件で、３日間飼養し、その間に、マウスは自由に飲食させた。マウスを、ランダムに、各群１０匹のマウスで、正常対照群（正常群）、高脂肪モデル群、陽性薬リピディル（Ｌｉｐａｎｔｈｙｌ、フェノフィブラート、４０ｍｇ／ｋｇ）群、低用量防風多糖群（ＳＤＰ  ５０ｍｇ／ｋｇ）及び高用量防風多糖群（ＳＤＰ  ２００ｍｇ／ｋｇ）の５つの群に分けた。各投与群に対して、毎日８:００−９:００に、０．２ｍｌ／１０ｇ体重でそれぞれの用量の薬剤を投与した。正常対照群及び高脂肪モデル群には、同等体積の蒸留水を投与した。正常対照群を除き、各群のマウスは、連続した３週間の間に毎日１４:００−１５:００に０．２ｍｌ／１０ｇ体重で高脂飲食（２０％ラード、１０％コレステロール、０．２％プロピルチオウラシル、２０％プロピレングリコール及び２０％Ｔｗｅｅｎ−８０を含有するもの）を強制経口投与し、防風多糖の高血脂症への予防作用を考察した。実験終了の際に、水を自由に与えて絶食させ、８時間後処置した。マウスの眼窩から採血し、遠心により血液から血清を得た。血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ−Ｃを測定した。マウスの肝臓組織を一部取り、ホモジナイズし、肝臓のＴＣ及びＴＧ含有量、及びＳＯＤ、ＧＳＨ−ｐｘ活性及びＭＤＡ含有量を測定した。別途に、マウスの肝臓組織を一部取り、１０％ホルムアルデヒドで固定して、形態学検査を行った。
【０１１６】
実験結果：
（１）高脂血症マウスの血脂レベルに対する防風多糖の影響
図５に示すように、正常対照群と比較して、高脂肪モデル群中のマウスの血清ＴＣ及びＬＤＬ−Ｃレベルは、いずれも有意に上昇した（Ｐ＜０．０１）。高脂飲食群と比較して、防風多糖は、血清ＴＣ、ＴＧ及びＬＤＬ−Ｃレベルを低下させることができた。特に、低用量及び高用量の防風多糖は、血清ＴＣレベルを有意に低下させることができ（Ｐ＜０．０５）、高用量の防風多糖は、血清ＴＣ、ＴＧ及びＬＤＬ−Ｃレベルを有意に低下させることができた（Ｐ＜０．０５）。防風多糖は、血清ＨＤＬ−Ｃレベルに対して、明らかな影響が見られなかった。
【０１１７】
（２）高脂血症マウスの肝臓ＴＣ、ＴＧ及び肝臓重量係数に対する防風多糖の影響
図６に示すように、正常対照群と比較して、高脂肪モデル群中のマウスの肝臓ＴＣ及びＴＧ含有量（Ｐ＜０．０１）、及び肝臓重量係数（Ｐ＜０．０１）は、いずれも有意に上昇した。高脂肪モデル群と比較して、防風多糖は、肝臓ＴＣ、ＴＧ含有量及び肝臓重量係数を低下させることができた。特に、低用量及び高用量の防風多糖は、肝臓ＴＣ含有量を有意に低下させることができた（Ｐ＜０．０１）。高脂肪モデル群と比較して、高用量の防風多糖は、肝臓ＴＣ、ＴＧ含有量及び肝臓重量係数を有意に低下させることができた（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）。陽性薬リピディルは、肝臓ＴＣ含有量を有意に低下させることができたが（Ｐ＜０．０１）、肝臓重量係数について、明らかに上昇した。そのため、防風多糖、特に高用量の防風多糖は、ＴＣ、ＴＧの低下、特に肝臓重量係数の低下での作用が、明らかに陽性薬リピディルよりも優れることが分かった。
【０１１８】
（３）高脂血症マウスの肝臓形態学に対する防風多糖の影響
図７に示すように、正常対照群マウスの肝臓構造は完全であり、肝細胞索がきれいに観察され、明らかな脂質空胞が見られなかった（図７Ａ）。マウスへの高脂飲食投与３週間後、高脂肪モデル群マウスの肝臓では、大量の脂質空胞が観察された（図７Ｂ）。防風多糖は、肝臓の脂質空胞を明らかに改善することができ；高用量の防風多糖は、より優れた効果を示した（図７Ｄ、７Ｅ）。
【０１１９】
（４）高脂血症マウスの肝臓ＳＯＤ、ＧＳＨ−ｐｘ活性及びＭＤＡ含有量に対する防風多糖の影響
ＳＯＤ及びＧＳＨ−ｐｘは、肝臓における抗酸化酵素であり、活性酸素の量を減少させ、脂質の過酸化作用による肝臓細胞への損傷を軽減することができる。実験結果は、図８に示すように、正常対照と比較して、高脂肪モデル群マウスの肝臓中ＳＯＤ及びＧＳＨ−ｐｘ活性は、いずれも有意に低下させ（Ｐ＜０．０１）、同時に、ＭＤＡ含有量は、有意に上昇した（Ｐ＜０．０５）。防風多糖の投与後、ＳＴＺ群と比較して、防風多糖は、マウス肝臓ＳＯＤ及びＧＳＨ−ｐｘ活性を上昇させ、ＭＤＡ含有量を有意に低下させた。特に、低用量及び高用量の防風多糖は、いずれもマウス肝臓ＳＯＤ（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）活性を有意に上昇させ、マウス肝臓ＧＳＨ−ｐｘ（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）活性を有意に上昇させ、ＭＤＡ含有量を有意に低下させた（Ｐ＜０．０５）。
【０１２０】
実験結論：防風多糖は、高脂飲食誘導の高脂血症マウスの血清ＴＣ、ＴＧ及びＬＤＬ−Ｃレベルを有意に低下させ、同時に、肝臓重量係数及び肝臓ＴＣ及びＴＧ含有量を有意に低下させ、肝臓における脂質空胞を明らかに減少することができた。そして、防風多糖は、肝臓中のＳＯＤ及びＧＳＨ−ｐｘ活性を増加させながら、ＭＤＡの含有量を低下させることができた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2021512997.tif 000029
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