(57)【要約】  本開示は、糖尿病を治療するための細胞ベースの組成物、内胚葉細胞に優先的に分化する細胞を同定するための方法、およびインスリン産生膵臓細胞を調製するための方法、ならびにインスリン欠乏症に関連する疾患を治療するための関連する使用方法を提供する。【選択図】図１
2021513348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のインスリン分泌細胞の産生方法であって、
ａ．哺乳動物幹細胞を接着状態で培養することにより、前記哺乳動物幹細胞が自発的に三次元構造を形成することを可能にすることと、
ｂ．前記三次元構造を浮遊状態で培養することと、を含み、
前記培養ステップが、少なくとも２０日間のレチノイン酸およびシクロパミンへの曝露を含み、かつ前記三次元構造の前記幹細胞をＷｎｔ３Ａに曝露することを含まない、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物幹細胞が、非ヒト霊長類幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物幹細胞が、細胞株に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
インスリン分泌細胞の産生方法であって、
ａ．アクチビンＡおよびワートマニンを含む第１の培地内の接着性基質上で哺乳動物幹細胞を培養し、前記哺乳動物幹細胞がＷｎｔ３ａに曝露されないことと、
ｂ．レチノイン酸およびシクロパミンを含む少なくとも１つの追加の培地で前記細胞をさらに培養することと、
ｃ．前記細胞が三次元細胞構造を形成するときに、前記細胞を浮遊培養に移すことと、を含み、
前記細胞が、少なくとも２０日間、レチノイン酸およびシクロパミンに曝露される、方法。
【請求項６】
前記哺乳動物幹細胞が、前記接着性基質上で培養されるときに三次元構造を形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物幹細胞が、非ヒト霊長類幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物のインスリン分泌細胞の産生方法であって、
ａ．内胚葉誘導因子を含む第１の培地で哺乳動物幹細胞を培養することにより、前記哺乳動物幹細胞を内胚葉細胞に分化させることと、
ｂ．内分泌誘導因子を含む第２の培地で（ａ）からの前記内胚葉細胞を培養することにより、前記内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させることと、を含み、
前記哺乳動物幹細胞が、内胚葉細胞への分化前にケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）に曝露されなかった、方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物幹細胞が、非ヒト霊長類幹細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記内胚葉誘導因子が、アクチビンＡを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の培地が、ワートマニンを含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の培地が、Ｗｎｔ３Ａを含まない、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、前記第１の培地で１〜３日間培養される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記内分泌誘導因子が、レチノイン酸およびシロパミンを含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の培地が、ノギンを含む、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の培地が、ＫＧＦを含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、前記第２の培地で１〜４日間培養される、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＫＧＦを含む第３の培地で前記内分泌細胞を培養することにより、前記内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させることをさらに含む、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第３の培地が、ノギンおよび上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第３の培地が、レチノイン酸およびシクロパミンを含む、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、前記第３の培地で１〜４日間培養される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ノギン、ＥＧＦ、γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、およびＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む第４の培地で前記膵臓始原細胞を培養することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記第４の培地が、レチノイン酸およびシクロパミンを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、前記第４の培地で１〜４日間培養される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ａｌｋ５ｉ  ＩＩおよびレチノイン酸を含む第５の培地で前記膵臓始原体を培養することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記第５の培地が、シクロパミンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、前記第５の培地で１〜５日間培養される、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ニコチンアミド、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉを含む第６の培地で前記膵臓始原体を培養することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記第６の培地が、レチノイン酸およびシクロパミンを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、前記第６の培地で１〜９日間培養される、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物幹細胞が、膵臓一次組織に由来する、請求項９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物幹細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物幹細胞が、多能性ではないリプログラム化された細胞である、請求項９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記リプログラム化された細胞が、膵臓一次組織に由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リプログラム化された細胞が、リプログラミング遺伝子を、前記細胞のゲノムに前記リプログラミング遺伝子を組み込むことなく発現することによって、リプログラム化されている、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記リプログラミング遺伝子が、少なくとも１つのエピソーム発現プラスミド上にコードされる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記リプログラミング遺伝子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃを含む、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、３０日以下の間培養される、請求項９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
インスリン分泌細胞の産生方法であって、
ａ．アクチビンＡおよびワートマニンを含む第１の培地でヒト幹細胞を培養することにより、前記ヒト幹細胞を内胚葉細胞に分化させ、前記ヒト幹細胞が内胚葉細胞への分化前にケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）に曝露されなかったことと、
ｂ．レチノイン酸およびシクロパミンを含む第２の培地で（ａ）からの前記内胚葉細胞を培養することにより、前記内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させることと、
ｃ．ＫＧＦ、ノギン、およびＥＧＦを含む第３の培地で（ｂ）からの前記内分泌細胞を培養することにより、前記内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させることと、
ｄ．ノギン、ＥＧＦ、γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、およびＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む第４の培地で（ｃ）からの前記膵臓始原細胞を培養することにより、前記膵臓始原細胞をインスリン産生細胞に分化させることと、を含む方法。
【請求項４３】
前記第２の培養培地が、ＫＧＦをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第３および第４の培地が、レチノイン酸およびシクロパミンをさらに含む、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ａｌｋ５Ｉ  ＩＩおよびレチノイン酸、ならびに任意選択的にシクロパミンを含む第５の培地で（ｄ）からの前記インスリン産生細胞をさらに培養する、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ニコチンアミン、ＩＧＦ−Ｉ、ならびに任意選択的にレチノイン酸およびシクロパミンを含む第６の培地で前記細胞をさらに培養することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
総培養時間が、３０日未満である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ヒト幹細胞が、膵臓一次組織に由来する、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
糖尿病を治療するための細胞ベースの組成物であって、それを必要とするヒト対象への移植のための代理膵臓細胞の集団および好適な担体を含み、前記細胞の少なくとも６６％がインスリン産生膵臓細胞である、組成物。
【請求項５０】
前記代理膵臓細胞の少なくとも６６％が、ＮｅｕｒｏＤ１を発現する、請求項４９に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項５１】
前記代理膵臓細胞の少なくとも６８％が、Ｎｋｘ６．１を発現する、請求項４９または請求項５０に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項５２】
請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の細胞ベースの組成物であって、
前記インスリン産生膵臓細胞が、
ａ．内胚葉誘導因子を含む第１の培地内の接着性基質上でヒト幹細胞の集団を培養し、前記哺乳動物幹細胞はＷｎｔ３ａに曝露されないことと、
ｂ．レチノイン酸およびシクロパミンを含む少なくとも１つの追加の培地で前記細胞をさらに培養することと、
ｃ．前記細胞が三次元細胞構造を形成するときに、前記細胞を浮遊培養に移すことと、を含み、
前記細胞は、少なくとも２０日間、レチノイン酸およびシクロパミンに曝露され、前記細胞は、少なくとも２０日間、レチノイン酸およびシクロパミンに曝露される方法に従って誘導される、細胞ベースの組成物。
【請求項５３】
前記内胚葉誘導因子が、アクチビンＡおよびワートマニンを含む、請求項５２に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項５４】
前記ヒト幹細胞が、膵臓一次組織に由来する、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項５５】
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項５６】
前記ヒト幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項５７】
前記ヒト幹細胞が、多能性ではないリプログラム化された細胞である、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項５８】
前記リプログラム化された細胞が、リプログラミング遺伝子を、前記細胞のゲノムに前記リプログラミング遺伝子を組み込むことなく発現することによって、リプログラム化されている、請求項５７に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項５９】
前記リプログラミング遺伝子が、少なくとも１つのエピソーム発現プラスミド上にコードされる、請求項５８に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項６０】
前記リプログラミング遺伝子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃを含む、請求項５９に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項６１】
前記担体が、マクロカプセルを含む、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項６２】
前記マクロカプセルが、アルギン酸塩、硫酸セルロース、グルコマンナン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６１に記載の細胞ベースの組成物。
【請求項６３】
内胚葉系譜に優先的に分化する未分化細胞を同定する方法であって、未分化細胞におけるＢＨＭＴ２およびＮＡＰ１Ｌ１の発現を評価することと、ＢＨＭＴ２の発現が対照細胞と比較して下方制御され、かつＮＡＰ１Ｌ１の発現が対照細胞と比較して上方制御される場合に、前記細胞を内胚葉系譜に分化する優先度を有するものとして同定することと、を含む方法。
【請求項６４】
前記未分化細胞におけるＣｏｘ７Ａ１およびＨＳＰＢ２の発現を評価することと、Ｃｏｘ７Ａ１およびＨＳＰＢ２の両方の発現が対照細胞と比較して下方制御される場合、前記細胞を内胚葉系譜に分化する優先度を有するものとして同定することと、をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記対照細胞が、前記内胚葉系譜への優先的分化を示さないまたは中胚葉系譜に分化することが実質的に不可能である、多能性細胞である、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＢＨＭＴ２の発現が、前記対照細胞に対して少なくとも２ｌｏｇ下方制御され、かつＮＡＰ１Ｌ１の発現が、前記対照細胞に対して少なくとも２ｌｏｇ上方制御される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
Ｃｏｘ７Ａ１およびＨＳＰＢ２の両方の発現が、前記対照細胞に対して少なくとも２ｌｏｇ下方制御される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＧＬＩＳ２、ＣＣＤＣ５８、ＭＴＸ３、およびＣ７ｏｒｆ２９の発現を評価することをさらに含む、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６９】
ＧＬＩＳ２、ＣＣＤＣ５８、およびＭＴＸ３の発現が、前記対照細胞に対して上方制御され、かつＣ７ｏｒｆ２９の発現が、前記対照細胞に対して下方制御される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記発現レベルは、Ｑ−ＰＣＲによって評価される、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記発現レベルは、マイクロアレイ分析によって評価される、請求項６３または６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年２月９日に出願された米国仮出願第６２／６２８，４７０号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、これらのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、細胞生物学、幹細胞、および細胞分化の分野に関する。より具体的には、本開示は、膵臓細胞を生成するための方法、細胞ベースの治療のための細胞を特定する方法、および糖尿病を治療するための関連する使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
以下の議論は、読者が本開示を理解するのを助けるために提供されるものであり、それに対する先行技術を記述したり、構成したりすることを認めるものではない。
【０００４】
糖尿病およびインスリン
真性糖尿病（すなわち、糖尿病）は、ホルモンインスリンを産生するまたはホルモンインスリンに応答する身体の能力が損なわれ、その結果炭水化物の代謝異常と血中および尿中のブドウ糖レベルの上昇が起こる疾患である。疾患は、いくつかのサブタイプに細分され、１型糖尿病、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）、成人潜在性糖尿病（ＬＡＤＡ）、不安定型糖尿病、痩せ型糖尿病、１．５型、２型、３型、肥満関連糖尿病、妊娠糖尿病、および当分野によって受け入れられる他の命名法として、代替的に記載される。
【０００５】
一般に、インスリン依存性糖尿病を有する対象は、血糖を十分に低下させるために外因性インスリンを投与することが必要である。非インスリン依存性対象は、インスリンに対する感受性を高める薬物の種類、またはブドウ糖の排泄を含む医薬品介入で十分に血糖を低下させ得る。インスリン依存性糖尿病を有する対象は、その疾患が１型、ＭＯＤＹ、ＬＡＤＡ、不安定型、痩せ型、１．５型、２型、３型、肥満関連糖尿病またはこれらの任意の組み合わせとして標識されているかどうかにかかわらず、インスリン産生細胞が対象に移植される細胞補充療法から利益を得ることができる。
【０００６】
Ｉ型糖尿病は、通常、子供および若年成人で診断され、以前は、若年性糖尿病として知られていた。糖尿病の人のうち、このような形の病気を持っている人はわずか５〜１０％しかいない。成熟期に発症した糖尿病はこの疾患の最も一般的な形態であり、インスリン産生β細胞の障害または破壊、インスリン抵抗性の発達、またはインスリン産生β細胞の障害とインスリン抵抗性の発達の両方によって発生する。遺伝的要因と環境的要因の組み合わせにより、非肥満成人および子供に糖尿病が発生することがある。肥満の成人および子供では、膵臓は血糖をコントロールするために余分なインスリンの作製を試み得るが、時間が経つにつれて血糖値を正常に継続して維持することができなくなる。また、生成されるインスリンに対する身体の感受性が低くなる場合がある。インスリン分泌β細胞の長期間の過剰活動は、β細胞の機能障害および死につながり得る。
【０００７】
糖尿病の症状は、対象の血糖がどの程度変動するかによって異なる。一部の人々、特に前糖尿病または非インスリン依存性糖尿病の人々の中には、最初は症状が出ない場合がある。Ｉ型糖尿病では、症状がすぐに現れやすい傾向があり、より重症化する。
【０００８】
Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の兆候および症状のいくつかには、限定するものではないが、渇きの増加、頻尿、極端な空腹感、原因不明の体重減少、尿中にケトンが存在する（ケトンは、利用可能なインスリンが十分でないときに起こる筋肉および脂肪の分解の副産物である）、疲労、過敏性、霧視、治癒の遅い傷、歯茎または皮膚感染症および膣感染症などの頻繁な感染症が含まれる。
【０００９】
糖尿病治療のための細胞ベースの療法
インスリン依存性糖尿病患者は、新しいインスリン産生細胞の移植により、治癒する可能性があるが、これらの細胞が十分な量と質で得ることが困難であるため、このアプローチはこれまでに限定的であった。例えば、Ｐａｇｌｉｕｃａ  ＦＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１５４（２）：４２８−４３９（２０１４）を参照されたい。したがって、より効率的かつ予測可能な方法でヒト幹細胞からインスリン産生β細胞を生成することは、生体医学研究の長い間の目標であった。同上。この目標を達成するためには、ブドウ糖に曝されるとインスリンを生成する均一なβ細胞集団を生成するプロトコルを確立しなければならない。しかしながら、このようなプロトコルはまだ難しいままである。多くの研究グループが異なる細胞株を使用して様々な結果をもたらした様々なプロトコルを提案してきた。このような機能性β細胞の一貫性のない産生は、治療上の利益を達成するために必要な全細胞用量を増加させるため、潜在的な治療のコストを増加させ、変わりやすい結果のために臨床適用性を制限する。
【００１０】
ヒト幹からインスリン産生β細胞を生成するためのほとんどの確立されたプロトコルは、非常に変わりやすい細胞集団を生成する。例えば、Ｐａｇｌｉｕｃａ  ＦＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１５４（２）：４２８−４３９（２０１４）を参照されたい。実際に、特定の細胞株に合わせて所与の分化プロトコルを調整することは、当該分野における一般的な慣行であり、そのため当該技術分野の分化のための任意の標準化を妨いでいる。種々の分化プロトコルからのβ細胞収率を向上させるためのアプローチには、典型的には、反復的、試行錯誤型のアプローチで分化経路に影響を及ぼす多くの要因の組み合わせを試験することが含まれる。例えば、Ｐａｇｌｉｕｃａ  ＦＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１５４（２）：４２８−４３９（２０１４）、Ｒｅｚｅｎｉａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３２：１１２１−３３（２０１４）、Ｓｃｈｕｌｚ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，７：ｅ３７００４（２０１２）。Ｃｈｅｔｔｙ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０：５５３−５５６（２０１２）。したがって、１つの開始幹細胞集団からβ細胞を作製するための特定のプロトコルは、異なる開始集団を分化するのに有効ではない場合がある。
【００１１】
さらに、この分野の研究者は、一貫して高パーセントのインスリン産生細胞を有する分化集団を得るのに苦労してきたため、得られた分化細胞集団内の一貫性のなさは、任意の提案された療法の臨床応用に影響を与えている。これは、糖尿病を治療するための細胞ベースの療法の潜在的有効性を損なうだけでなく、異種細胞の集団を含有する細胞移植片の腫瘍形成能に関する懸念を提起する。さらに、細胞バッチ間の低再現性は、細胞の産生コストに直接影響し、このプロトコルのクリニックへの橋渡しを制限する。
【００１２】
異なる分化プロトコルの使用におけるこの変動性のいくつかは、開始細胞株に対して追跡することができる。例えば、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞株は、特定の系譜に分化する能力において広く変化し得ることが示される。Ｂｏｃｋ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１４４：４３９−４５２（２０１１）、Ｌｉｍ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，（９０）：ｅ５１７５５（２０１４）、Ｏｓａｆｕｎｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：３１３−３１５（２００８）を参照されたい。現在利用されている分化プロトコルに対する個々のヒト幹細胞の応答におけるこの様々な能力は、研究者が所与の細胞株または開始細胞が最終的に治療細胞を産生する可能性の指標を持っていなかったため、克服するのに困難な障害であることが証明されている。
【００１３】
加えて、既存技術から提供されるガイダンスは、実際には、少し異なる遺伝的背景を有する細胞株を使用するときに逆効果であり得る。例えば、多能性幹細胞からインスリン産生細胞を生成するための確立されたプロトコルの一貫した特徴は、レチノイン酸およびシクロパミンへの曝露を制限することである。Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，４：１−１４（２０１５）を参照されたい。先行技術からの別の一貫したガイダンスは、浮遊状態の三次元培養において分化を開始することが膵臓細胞の適切な成熟のために必要である、ということである。Ｐａｇｌｉｕｃａ  ＦＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１５４（２）：４２８−４３９（２０１４）、Ｒｅｚａｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（１１）：１１２１−３３（２０１４）を参照されたい。以下でより詳細に議論されるように、かかるガイダンスに従うことは、実際には様々な幹細胞株からのインスリン分泌細胞の分化を阻害する可能性がある。
【００１４】
したがって、糖尿病の治療のための治療的なインスリン産生細胞を生成する改善された予測可能な方法のニーズが残っている。本開示は、それらのニーズを満たすものである。
【発明の概要】
【００１５】
本明細書に記載されるのは、インスリンを産生し、糖尿病を治療するために使用され得る細胞および細胞組成物、ならびにそれを作製および同定する方法である。
【００１６】
一態様において、本開示は、哺乳動物のインスリン分泌細胞の産生方法であって、方法は、哺乳動物幹細胞を接着状態で培養することにより、哺乳動物幹細胞が自発的に三次元構造を形成することを可能にすることと、三次元構造を浮遊状態で培養することと、を含み、培養ステップは、少なくとも２０日間のレチノイン酸およびシクロパミンへの曝露を含み、かつ三次元構造の幹細胞をＷｎｔ３Ａに曝露することを含まない、方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本開示は、インスリン分泌細胞の産生方法であって、アクチビンＡおよびワートマニンを含む第１の培地内の接着性基質上で哺乳動物幹細胞を培養することであって、哺乳動物幹細胞が、Ｗｎｔ３ａに曝露されない、培養することと、レチノイン酸およびシクロパミンを含む少なくとも１つの追加の培地で細胞をさらに培養することと、細胞が三次元細胞構造を形成するときに、細胞を浮遊培養に移すことと、を含み、細胞が、少なくとも２０日間、レチノイン酸およびシクロパミンに曝露される、方法を提供する。
【００１８】
前述の態様のいくつかの実施形態では、哺乳動物幹細胞はヒト幹細胞であってもよく、いくつかの実施形態では、哺乳動物幹細胞は非ヒト霊長類幹細胞であってもよい。前述の態様のいくつかの実施形態では、哺乳動物幹細胞は細胞株に由来する。
【００１９】
一態様において、本開示は、哺乳動物のインスリン分泌細胞の産生方法であって、内胚葉誘導因子を含む第１の培地で哺乳動物幹細胞を培養することにより、哺乳動物幹細胞を内胚葉細胞に分化させることと、内分泌誘導因子を含む第２の培地で内胚葉細胞を培養することにより、内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させることと、を含み、哺乳動物幹細胞が、内胚葉細胞に分化する前にケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）に曝露されなかった、方法を提供する。  
【００２０】
いくつかの実施形態では、哺乳動物幹細胞は、ヒト幹細胞、非ヒト霊長類幹細胞、またはブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、もしくはネコを含むがこれらに限定されない別の哺乳動物に由来する幹細胞であり得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、内胚葉誘導因子はアクチビンＡ、レチノイン酸、および／またはシクロパミンを含む。いくつかの実施形態では、第１の培地はワートマニンをさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、第１の培地はＷｎｔ３Ａを含まない。いくつかの実施形態では、細胞は第１の培地で１〜３日間培養される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第２の培地はノギンおよび／またはＫＧＦを含んでよい。いくつかの実施形態では、第２の培地はレチノイン酸およびシクロパミンを含んでよい。いくつかの実施形態では、細胞は第２の培地で１〜４日間培養される。
【００２３】
本態様のいくつかの実施形態は、ＫＧＦを含む第３の培地で内分泌細胞をさらに培養することにより、内分泌細胞を膵臓始原細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）に分化させることをさらに含んでいてよい。いくつかの実施形態では、第３の培地はノギンおよび／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む。いくつかの実施形態では、第３の培地はレチノイン酸およびシクロパミンを含む。いくつかの実施形態では、細胞は第３の培地で１〜４日間培養される。
【００２４】
本態様のいくつかの実施形態は、ノギン、ＥＧＦ、γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、および／またはＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む第４の培地で膵臓始原細胞をさらに培養することを含んでいてよい。いくつかの実施形態では、第４の培地はＴ３を含んでよい。いくつかの実施形態では、第４の培地はレチノイン酸およびシクロパミンを含んでよい。いくつかの実施形態では、細胞は第４の培地で１〜４日間培養される。
【００２５】
本態様のいくつかの実施形態は、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩおよび／またはレチノイン酸を含む第５の培地で膵臓始原体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）をさらに培養することを含んでよい。いくつかの実施形態では、第５の培地はＴ３を含んでよい。いくつかの実施形態では、第５の培地はレチノイン酸およびシクロパミンを含んでよい。いくつかの実施形態では、細胞を第５の培地において１〜５日間培養する。
【００２６】
本態様のいくつかの実施形態は、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ニコチンアミド、および／またはインスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉを含む第６の培地で膵臓始原体をさらに培養することを含んでよい。いくつかの実施形態では、第６の培地はＴ３および／またはＢＭＰ４を含んでよい。いくつかの実施形態では、第６の培地はレチノイン酸およびシクロパミンを含んでよい。いくつかの実施形態では、第６の培地はグルカゴンを含んでよい。いくつかの実施形態では、細胞を第６の培地において１〜９日間培養する。
【００２７】
別の態様では、本開示は、インスリン分泌膵細胞の産生方法であって、アクチビンＡおよびワートマニンを含む第１の培地でヒト幹細胞を培養することによりヒト幹細胞を内胚葉細胞に分化させることであって、ヒト幹細胞が内胚葉細胞に分化する前にケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）に曝露されなかった、分化させることと、レチノイン酸およびシクロパミンを含む第２の培地で内胚葉細胞を培養することにより内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させることと、ＫＧＦ、ノギンおよびＥＧＦを含む第３の培地で内分泌細胞を培養することにより内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させることと、ノギン、ＥＧＦ、γ−セクターゼ阻害剤ＸＸＩおよびＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む第４の培地で膵臓始原細胞を培養することにより膵臓始原細胞をインスリン産生成膵臓細胞に分化することと、を含む方法を提供する。
【００２８】
本態様のいくつかの実施形態では、第２の培養培地は、ＫＧＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞は膵臓一次組織に由来する。いくつかの実施形態では、第４の培地はＴ３などの甲状腺ホルモンを含んでよい。
【００２９】
本態様のいくつかの実施形態では、第３および第４の培地の両方は、レチノイン酸およびシクロパミンを含んでよい。
【００３０】
本態様のいくつかの実施形態は、第５および／または第６の培地で細胞をさらに培養することを含んでよく、第５の培地は、Ａｌｋ５Ｉ  ＩＩおよびレチノイン酸、ならびに任意選択でシクロパミンを含み、第６の培地は、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ニコチンアミン、ＩＧＦ−Ｉ、ならびに任意選択でレチノイン酸およびシクロパミンを含む。いくつかの実施形態では、第６の培地はグルカゴンを含んでよい。
【００３１】
前述の態様のいくつかの実施形態では、細胞を３０日以下の間培養してもよい。
【００３２】
別の態様において、本開示は、糖尿病を治療するための細胞ベースの組成物であって、それを必要とするヒト対象への移植のための代理膵臓細胞の集団および好適な担体とを含み、代理膵臓細胞の少なくとも６６％が、インスリン産生膵臓細胞である、細胞ベースの組成物を提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、代理膵臓細胞の少なくとも６６％はＮｅｕｒｏＤ１を発現するが、一方いくつかの実施形態では、代理膵臓細胞の少なくとも６８％はＮｋｘ６．１を発現する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、インスリン産生膵臓細胞は、内胚葉誘導因子を含む第１の培地内の接着性基質上でヒト幹細胞の集団を培養することであって、哺乳動物幹細胞がＷｎｔ３ａに曝露されない、培養することと、レチノイン酸およびシクロパミンを含む少なくとも１つの追加の培地で細胞をさらに培養することと、細胞が三次元細胞構造を形成するときに浮遊培養に細胞を移すことと、を含み、細胞が少なくとも２０日間レチノイン酸およびシクロパミンに曝露される、方法に従って誘導される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、内胚葉誘導因子はアクチビンＡおよび／またはワートマニンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の培地は、ＫＧＦ、ノギン、ＥＧＦ、および／またはＴ３などの甲状腺ホルモンを含んでよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、代理膵臓細胞はマクロカプセルにカプセル化され得る。例えば、細胞は、アルギン酸塩、硫酸セルロース、グルコマンナン、またはこれらの組み合わせを含むマクロカプセルにカプセル化され得る。
【００３７】
前述の態様のいくつかの実施形態では、ヒト幹細胞は、膵臓一次組織に由来するか、ヒト胚性幹細胞であるか、人工多能性幹細胞であるか、または多能性ではないリプログラム化された細胞である。いくつかの実施形態では、リプログラム化された細胞は、例えば、リプログラミング遺伝子を、細胞のゲノムにこのリプログラミング遺伝子を組み込むことなく発現することによって、膵臓一次組織から誘導される。いくつかの実施形態では、リプログラミング遺伝子は、ゲノムに組み込まれない少なくとも１つのエピソーム発現プラスミド上にコードされ得る。いくつかの実施形態では、リプログラミング遺伝子はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃを含む。
【００３８】
別の態様において、本開示は、内胚葉系譜に優先的に分化する細胞を同定する方法であって、未分化細胞におけるＢＨＭＴ２およびＮＡＰ１Ｌ１の発現を評価することと、ＢＨＭＴ２発現が対照細胞と比較して下方制御され、かつＮＡＰ１Ｌ１発現が対照細胞と比較して上方制御される場合に、内胚葉系譜に分化する優先度を有するものとして細胞を同定することと、を含む、方法を提供する。
【００３９】
本態様のいくつかの実施形態は、未分化細胞におけるＣｏｘ７Ａ１およびＨＳＰＢ２の発現を評価することと、Ｃｏｘ７Ａ１およびＨＳＰＢ２の発現の両方が対照細胞と比較して下方制御される場合、細胞を内胚葉系譜に分化する優先度を有するものとして同定することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、対照細胞は、内胚葉系譜への優先的分化を示さないまたは中胚葉系譜に分化することが実質的に不可能である多能性細胞であってもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、評価される未分化細胞が優先的に内胚葉系譜に分化する場合、ＢＨＭＴ２発現が、対照細胞に対して少なくとも２ｌｏｇ下方制御され、ＮＡＰ１Ｌ１発現が、対照細胞に対して少なくとも２ｌｏｇ上方制御される。いくつかの実施形態では、評価される未分化細胞が優先的に内胚葉系譜に分化する場合、Ｃｏｘ７Ａ１およびＨＳＰＢ２の両方の発現は、対照細胞に対して少なくとも２ｌｏｇ下方制御される。
【００４１】
本態様のいくつかの実施形態は、ＧＬＩＳ２、ＣＣＤＣ５８、ＭＴＸ３、およびＣ７ｏｒｆ２９の発現を評価することをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、評価される未分化細胞が優先的に内胚葉系譜に分化する場合、ＧＬＩＳ２、ＣＣＤＣ５８、およびＭＴＸ３発現は、対照細胞に対して上方制御されてもよく、Ｃ７ｏｒｆ２９発現は、対照細胞に対して下方制御されてもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、発現レベルはＱ−ＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ分析によって評価される。
【００４３】
以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的であり、本発明のさらなる説明を提供することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１Ａ〜１Ｃはランゲルハンス島からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株ＳＲ１４２３の選択を示す。図１Ａは、ＳＲ１４２３の選択スキームを示す。図１Ｂは分化の３日目における内胚葉マーカーＳｏｘ１７（左）およびＨＮＦ３β（中央）のＳＲ１４２３発現を示すための免疫染色とそれに続く蛍光顕微鏡検査法を表す。図１ＣはＳＲ１４２３細胞の分化の１１日目の膵臓マーカーＰｄｘ１（左）およびＮｋｘ６．１（中央）の免疫染色を示す。併合された画像は、核染色と組み合わされたマーカーの共染色を示す。画像は倍率４０倍で撮影されている。
【図２】図２はＳＲ１４２３細胞は中胚葉系譜への分化が低いことを示す。ＳＲ１４２３を、Ｓｏｘ１７（内胚葉）、ブラキュリ（中胚葉）、またはＯＴＸ２（外胚葉）について免疫染色した。核染色（中胚葉フレームで明らか）は、総細胞数を示す。図は、ＳＲ１４２３細胞が（Ｓｏｘ１７およびＯＴＸ２のほぼ均一な標識によって示されるように）内胚葉および外胚葉になる能力を有するが、ブラキュリを発現できないことによって示されるように、中胚葉への分化が低いことを示す。
【図３】図３Ａ〜３ＤはＳＲ１４２３細胞が多能性幹細胞に典型的な特徴を有することを示す。図３Ａは、ＳＲ１４２３細胞が、多能性マーカーＯｃｔ４、Ｔｒａ−１−８１、Ｔｒａ−１−６０、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡを発現することを示す。図３Ｂは、培養における４０回継代後のＳＲ１４２３細胞の核型が正常であることを示す。図３Ｃは、シングルタンデムリピート分析（ＳＴＲ）によって評価されるＤＮＡ指紋を示す。図３Ｄは、ＳＲ１４２３細胞倍加時間を示す。
【図４】図４Ａ〜４ＢはＳＲ１４２３細胞が、内胚葉系譜への優先分化と相関する遺伝子発現パターンを有することを示す。図４Ａは、ＳＲ１４２３細胞、Ｂ、Ｃ、およびＤの遺伝子発現プロファイルクラスタ分析を示す。内胚葉に対する優先分化を示す２つの株（ＳＲ１４２３細胞およびＢ）と、優先分化を示さない２つの株（Ｃ、Ｄ）との間の発現プロファイルの相関は、教師なし階層的クラスタリング分析によって示された。上方制御された遺伝子を赤色で示し、下方制御された遺伝子を緑色で示す。条件間に大きな発現差異を有する遺伝子を識別する強度フィルタに基づいて、このクラスタ分析から差次的に発現された遺伝子のサブセットを選択した。最大の発現差異を有する２５０個の遺伝子が表される。図４Ｂ  ｑＲＴは、Ａで同定された上方および下方制御された遺伝子のサブセットのＰＣＲ検証を示す。
【図５】図５Ａ〜５ＢはＳＲ１４２３細胞が、堅牢な膵臓、ホルモン分泌細胞集団を産生することを示す。図５Ａは、上列のＰｄｘ（左）、Ｎｋｘ６．１（中央）および併合（右）の免疫染色で２８日後のＳＲ１４２３分化を示す。下列は、インスリン（左）、グルカゴン（中央）、および併合（右）の免疫染色を示す。「併合」の画像には核染色が含まれている。すべての画像は、分化の２８日後に４０倍の元の倍率下で撮影した（ｎ＝１０）。図５Ｂは、集団における膵臓細胞の平均純度の定量を示す。細胞の６８％がＮｋｘ６．１を発現することが分かり、６６．５％がインスリンを発現していた。
【図６】図６Ａ〜６ＣはＫＧＦを除外することによって、複数の細胞株にわたって分化を改善することができることを示す。図６Ａは、ＫＧＦの有りまたは無しでの分化後のＳＲ１４２３細胞のＰｄｘ（左）およびＮｋｘ６．１（中央）の免疫蛍光染色を示す。図６ＢはＫＧＦの有りまたは無しでの分化後のＢＧＯ１Ｖ細胞のＰｄｘ（左）およびＮｋｘ６（中央）の免疫蛍光染色を示す。図６Ｃは、本開示されたプロトコルを、ＨＤＣ５７およびＢＧＯ１Ｖ細胞において初期内胚葉細胞をＫＧＦに曝露する公開されたプロトコルと比較する。発現レベルを未加工の輝度の総和（Ｒａｗ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ）（ｎ＝１０）によって測定し、−ＫＧＦプロトコルおよび＋ＫＧＦプロトコルを比較した。画像を倍率４０倍で収集した。エラーバーは、平均ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない、を表す。
【図７】図７はＳＲ１４２３分化は、高レベルのホルモン分泌を有する培養物を生じることを示す。これは、グルコースに応答して、ＳＲ１４２３細胞およびＨＤＣ５７細胞からのインスリンおよびグルカゴン分泌を比較することによって確立された。インスリンおよびグルカゴンレベルは、Ｃ−ペプチド（インスリンの代用として）またはグルカゴンＥＬＩＳＡを介して評価された。
【図８】図８は動物モデルにおける糖尿病の逆転を示す。移植された細胞は、ストレプトゾトシン誘導正常マウスへの移植後の血糖を調節する。０日目にカプセル化された細胞を移植した。示される結果は、３匹のマウスの平均である。エラーバーは、標準偏差である。
【図９】図９Ａ〜９Ｆは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）組織に由来する幹細胞株の代表的な例を示す。ＮＨＰドナーＡからの未分化株Ａ１．３は、多能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−８０およびＴｒａ−１−６０を発現する（Ａ〜Ｄ）。これらの細胞は、分化の４日目に内胚葉マーカーＳｏｘ１７およびＨＮＦ２βを発現し（Ｅ）、１２日目に膵臓マーカーＰｄｘ１およびＮｋｘ６．１を発現する（Ｆ）。細胞の核が染色されている。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂはグルカゴンに曝露すると、インスリンおよびグルカゴンを共発現する細胞の量が減少することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
糖尿病を治療するために使用することができるインスリン分泌細胞と、ヒトインスリン産生β細胞の純粋な治療細胞集団を生成する改善された方法が本明細書に記載される。より具体的には、本開示は、単純な分化プロトコルが、グルコースに応答してインスリンを分泌する成熟表現型を示す純粋なインスリン分泌細胞の集団をもたらすことができるように、内胚葉系譜に分化する優先度または素因を有する幹細胞株で培養を開始することを含む、哺乳動物インスリン分泌細胞の産生方法を提供する。開示されるプロトコルは、他のステップの中でも、幹細胞（特に、内胚葉系譜に対する優先度または素因を示す幹細胞）を、レチノイン酸およびシクロパミン（または化学類似体）に長期（例えば、少なくとも２０日）に曝露することを含み得る。培養物は、接着して開始され、細胞が三次元構造を自然かつ自発的に形成することを可能にし、次いで、この三次元構造を浮遊培養に移すことができる。細胞は、接着状態でまたは浮遊状態のいずれかで増殖している間、培養中にＷｎｔ３ａに曝露されない場合がある。さらに、本開示は、細胞療法に適し、かつ内胚葉系譜に向かって分化するための素因を有する細胞の集団を同定するための方法も提供する。
【００４６】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。用語が使用される文脈から考えると、当業者には明確でない用語の使用がある場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、組成物に、実質的に含まれない薬剤が添加されていないことを指すが、それは、薬剤の微量が存在することを除外しない。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「島細胞」という用語は、最終分化した膵臓内分泌細胞、および通常膵内分泌として分類される子孫を形成することに関与する任意の前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）を指す。島細胞は、島細胞系譜に典型的な形態学的特徴および表現型マーカー（以下に例示される）のいくつかを示す。成熟α細胞はグルカゴンを分泌し、成熟β細胞はインスリンを分泌し、成熟δ細胞はソマトスタチンを分泌し、ＰＰ細胞は膵臓ポリペプチドを分泌する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「膵臓始原体」、「膵臓前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」、または「膵臓幹細胞」は、有意義に内分泌ホルモンを分泌しない膵臓細胞または島細胞であるが、これらの細胞は、内分泌ホルモン（例えば、インスリン）を分泌することができる最終分化細胞を増殖させ、生成することができる。初期の膵臓始原体は多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）であり、これは少なくとも膵臓内分泌細胞と膵臓外分泌細胞を形成することができることを意味する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、特殊化した細胞（例えば、インスリン産生膵臓細胞）に分化することができる未分化細胞を示す。本出願の目的のために、「幹細胞」という用語は、３つの胚層（すなわち、内胚葉、中胚葉、および外胚葉）のすべての始原体を産生することができる受精後の前胚（ｐｒｅ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）組織、胚組織、または胎児組織に由来する多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）、人工多能性細胞（すなわち、リプログラミング遺伝子で形質導入された細胞）で３つの胚層のすべての始原体を産生することができるもの、ならびに１つまたは２つの胚層のみに分化することができる、または特定の胚葉に優先的に分化できるリプログラミングされた細胞（例えば、外胚葉または内胚葉細胞型に優先的に分化するリプログラミングされた細胞）などの多分化能細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（すなわち、リプログラミング遺伝子で形質導入された細胞）を含むことができる。この用語は、記載の様式で多能性または多分化能である様々な種類の幹細胞（一次組織から得られる細胞を含む）の両方の確立された株を含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「人工多能性細胞」または「人工多能性幹細胞」（「ｉＰＳ細胞」）という用語は、標準的な技術で受け入れられている方法（例えば、体細胞核転移、リプログラミング遺伝子による形質導入、化学的誘導（Ｄｅ  Ｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：１３３７−１３３８（２０１３）、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：１７９−１８７（２０１３））などを参照されたい）に従い、成人体細胞、生殖細胞、多能性細胞、または他の細胞型のリプログラミングによって誘導された多能性細胞を示す。この用語は、確立された人工多能性幹細胞と、記載される方法で多能性である一次組織から得られる細胞の両方を含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「非多能性リプログラミング細胞」または「多分化能リプログラミング細胞」という用語は、リプログラミング遺伝子の導入／発現、および上記で考察された他の方法などの既知のリプログラミング方法を用いて、成人体細胞、生殖細胞、多能性細胞、または他の細胞型のリプログラミングによって誘導された細胞を示す。人工多能性細胞とは異なり、「非多能性リプログラム細胞」または「多分化能リプログラム細胞」は、１つまたは２つの胚葉のみに分化し得るか、または特定の胚葉に分化する優先度を有し得る（例えば、優先的に外胚葉細胞または内胚葉細胞型に分化するが、中胚葉細胞に効率的に分化することができないリプログラム細胞）。この用語は、確立された人工多分化能細胞（例えば、ＳＲ１４２３）と、記載される方法で多分化能であるようにリプログラムされる一次組織から得られる細胞の両方を含む。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「リプログラミング遺伝子」という用語は、分化された細胞の多能性または多分化能を誘導するための当該技術分野で一般的に使用される既知の遺伝子および転写因子を示す。例示的なリプログラミング遺伝子としては、Ｏｃｔ４（すなわち、Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８などのＳｏｘファミリー転写因子、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、およびＫｌｆ５などのＫｌｆファミリー転写因子、Ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、およびＬ−ｍｙｃなどのＭｙｃファミリー転写因子、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、およびＧｌｉｓ１が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、開示されるリプログラミング遺伝子、ならびに当該技術分野で既知の他のリプログラミング遺伝子が、多能性または多分化能を誘導するために様々な方法で組み合わされ得ることを理解するであろう。例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８（５８５８）：１９１７−２０（２００７）は、ＬＩＮ２８、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの組み合わせを使用してｉＰＳ細胞を生成することができることを実証し、一方でＭａｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７４（７３５０）：２２５〜２９（２０１１）は、Ｇｌｉｓ１、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４の組み合わせを使用してｉＰＳ細胞を生成することができることを実証した。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「分化する」または「分化」という用語は、細胞型が特異性の低い細胞から特異性の高い細胞に変化することを示す。例えば、多能性状態を脱して、定義された生殖細胞系に向かって発達経路に沿って進行した任意の細胞は、分化を受けている。「分化された」という用語は相対的な用語であるため、分化細胞は、成熟した機能性細胞型に向かうそれらの発達経路の間の異なる段階であり得る。したがって、発達の進行の後期の細胞は、早期の細胞よりも分化していると言える。
【００５５】
本明細書で使用される場合、この開示で使用されるものとしての「分化誘導因子」は、本発明の培養系において幹細胞の分化を誘導して、膵島系譜の分化した細胞（前駆細胞および最終分化細胞を含む）にするための化合物の集合体のうちの１つを指す。化合物の作用様式に関して制限は意図されていない。例えば、薬剤は、表現型の変化を誘導または補助すること、特定の表現型を有する細胞の増殖を促進すること、または他のものの増殖を遅延させることによって、分化プロセスを補助することができる。それはまた、培地内にあるか、またはさもなければ、望ましくない細胞型への経路の分化を誘導する細胞集団によって合成され得る他の因子に対する阻害剤として機能し得る。「分化誘導因子」のカテゴリ内で、当業者は、特定の因子が、分化プロセスを通じて特定のステップを誘導することが既知であることを理解するであろう。例えば、当業者であれば、「内胚葉誘導因子」は、限定されないが、単独または組み合わせのいずれかで、アクチビンＡおよび／またはワートマニンを含むことができることを理解するであろう。同様に、「内分泌誘導因子」は、限定されないが、単独または組み合わせのいずれかで、レチノイン酸および／またはシクロパミンを含むことができる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「長期的」は、細胞ベースの療法／移植で使用される異質の治療細胞の生存および機能に関連して使用される場合、少なくとも６ヶ月以上の期間を意味する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、細胞が移植される特定の薬理学的効果、すなわち、インスリンを産生し、血糖を調節することを提供する対象に移植されるカプセル化細胞の量を意味する。治療有効量のカプセル化細胞は、そのような濃度が当業者によって治療有効量であるとみなされても、所与の対象における糖尿病の治療に必ずしも有効ではないことが強調される。便宜上、以下に例示的な量を提供する。
【００５８】
当業者は、特定の対象を治療するために必要に応じて標準的な実践に従ってそのような量を調整することができる。治療有効量は、移植部位、対象の年齢および体重、および／または、対象の疾患の重症度、対象の食事、および／または対象の全体的な健康状態を含む、対象の状態に基づいて変化し得る
【００５９】
糖尿病に関して本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」という用語は、高血糖および低血糖、心臓病、腎臓病、肝疾患、網膜症、神経障害、非治癒性潰瘍、歯周病などの糖尿病の１つ以上の症状または併存症を軽減、改善または排除すること、血糖を調節するための外因性インスリンへの対象の依存性を低減すること、外因性インスリンを使用せずに対象の血糖を調節すること、対象のグリコシル化ヘモグロビン、またはＨｂＡ１Ｃレベルの割合を低減すること、および／またはインスリン感受性改善薬、ブドウ糖排泄促進剤、および当技術分野で知られている他の治療法など、他の薬剤介入への対象の依存を低減すること、のうちの１つ以上を指す。
【００６０】
「個体」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の個々の哺乳動物対象、例えば、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒトを指す。
【００６１】
ＩＩ．細胞ベースの治療のための細胞の同定
従来の細胞ベース療法の１つの限界は、異なる細胞が成熟した細胞型に分化する異なる傾向を有することである。例えば、開始細胞集団のエピジェネティックなサインは、「エピジェネティックメモリ」と呼ばれる現象である、リプログラム化された細胞において持続することができることが報告されている。その結果、ｉＰＳ細胞および他のリプログラム化された細胞は、それらが由来した同じ胚葉に属する細胞に優先的に分化し得る。したがって、いくつかの実施形態では、インスリン産生細胞を生成するための開示された方法で使用される幹細胞は、多能性または多分化能幹細胞にリプログラム化された成熟内胚葉細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、開示される方法において使用される幹細胞は、再プログラムされたヒト膵臓細胞に由来し得る。かかるドナー膵臓細胞は、糖尿病で治療されている対象（すなわち、自己ドナー）または糖尿病で治療されていない人（すなわち、同種異系ドナー）から得られることができる。いくつかの実施形態では、開示される方法において使用される幹細胞は、同意した健常な成人ドナー膵臓のランゲルハンス島からのリプログラム化された初代細胞であってもよい（例えば、図１Ａを参照されたい）。
【００６２】
細胞培養で増殖した初代細胞は、おそらく人工培養条件または遺伝的浮動に適応した結果として、時間とともに均質になり、機能的成熟形質を失うことができる。したがって、初代細胞が開始細胞集団として使用されるとき、例えば、細胞の収穫または単離の７日、６日、５日、４日、３日、２日以内、または１日以内に初代細胞をリプログラミングすることが有利であり得る。例えば、単離された初代細胞は、細胞収穫の５日以内にリプログラミング遺伝子で形質導入され得る。
【００６３】
当業者は、初代細胞がリプログラミング遺伝子を使用してリプログラミングされるとき、使用することができるリプログラミング遺伝子の多数の組み合わせが存在することを理解するであろう。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃによる形質導入を介してリプログラムミングされ得る。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＣ−Ｍｙｃによる形質導入を介してリプログラミングされ得る。いくつかの実施形態では、初代細胞は、ＬＩＮ２８、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇによる形質導入を介してリプログラミングされ得る。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｇｌｉｓ１、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４による形質導入を介してリプログラミングされ得る。これらの例示的な組み合わせは、リプログラミング遺伝子の他の組み合わせが当該技術分野で既知であり、開示される方法の目的のために使用され得るため、限定することを意図するものではない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、開示される分化および治療方法において使用される細胞は、別の生殖細胞株よりもある生殖細胞系統に向かって分化するための優先度を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、初代細胞または幹細胞（例えば、ＳＲ１４２３）は、外胚葉または内胚葉系譜に効率的に分化し得るが、実質的に中胚葉系譜に分化することはできない。これは、例えば、分化プロトコルまたはキットを用いて、幹細胞を特定の生殖細胞株に向かって押し出すが、生殖細胞株マーカー（例えば、外胚葉に対するＯＴＸ２、内胚葉に対するＳｏｘ１７、または中胚葉に対するＢｒａｃｈｙｕｒｙ）の検出できないことによって決定され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、内胚葉系譜に沿って優先的に分化する幹細胞または初代細胞は、ある特定の分子マーカーによって識別され得る。例えば、内胚葉系譜に沿って優先的に分化する幹細胞または初代細胞は、多能性（例えば、図３Ａを参照のこと）および正常な核型（例えば、図３Ｂを参照のこと）に典型的なマーカーを発現し得るが、多能性に典型的なマーカーが発現されても、幹細胞は多分化能であっても全能性であってもよく、したがって多能性のための許容される基準に適合しない可能性がある。
【００６６】
内胚葉系譜に沿って優先的に分化する幹細胞または初代細胞はまた、固有の遺伝子発現プロファイルを有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、内胚葉系譜に沿って優先的に分化する幹細胞または初代細胞は、対照レベルまたは対照細胞と比較して、ＢＨＭＴ２、Ｃｏｘ７Ａ１、およびＨＳＰＢ２の発現を下方制御し得る。いくつかの実施形態では、内胚葉系譜に沿って優先的に分化する幹細胞または初代細胞は、対照レベルまたは対照細胞に対してＮＡＰ１Ｌ１の発現を上方制御し得る。加えて、内胚葉系譜に沿って優先的に分化する細胞は、対照細胞と比較して、ＧＬＩＳ２、ＣＣＤＣ５８、およびＭＴＸ３の発現を上方制御し得、Ｃ７ｏｒｆ２９の発現を下方制御し得る。発現レベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析などの当該技術分野で既知の任意の手段によって決定されてもよく、比較の標準として使用される対照細胞は、内胚葉系譜への優先的な分化または中胚葉系譜への実質的な分化不能を示さないＮＩＨレジストリに見出される標準胚性幹細胞株などの、多能性細胞を含んでもよい。理論に拘束されないが、少なくともＢＨＭＴ２およびＮＡＰ１Ｌ１は、ＤＮＡ修飾において役割を果たし、エピジェネティックメモリに寄与し得ると考えられる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＢＨＭＴ２、Ｃｏｘ７Ａ１、ＨＳＰＢ２、および／またはＮＡＰ１Ｌ１の分化発現は、内胚葉系譜への優先分化を示さず、かつ実質的に中胚葉系統への分化ができない多能性細胞、または多能性の標準基準を満たす幹細胞と比較して、少なくとも約１ｌｏｇ、少なくとも約２ｌｏｇ、または少なくとも約３ｌｏｇ増加（ＢＨＭＴ２、Ｃｏｘ７Ａ１、およびＨＳＰＢ２について）または減少（ＮＡＰ１Ｌ１について）し得る。
【００６８】
開示された発現プロファイルで幹細胞を同定することは、内胚葉系譜に分化し、その後インスリン産生細胞に分化するための優先度を示す。特定の胚葉に対する分化優先度を直接試験することは、特定の運命に傾いた細胞株を生成する効率が高まるため、細胞ベースの治療に適している。
【００６９】
ＩＩＩ．インスリン産生β細胞の生成プロトコル
哺乳動物幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、およびリプログラム化された細胞）が、胚膵臓発生を模倣することによってインスリン産生β細胞に分化することができることが示されている。例えば、Ｂｏｒｏｗｉａｋ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２１：７２７−３２（２００９）を参照されたい。多能性細胞は段階的に膵臓細胞に分化する。第１段階は、内胚葉系譜に向けた分化である。内胚葉細胞はさらに多分化能膵臓始原細胞に分化させ、次いで、それは島細胞に分化させ、次いで、ブドウ糖曝露時にインスリンを産生するβ細胞に分化させることができる。現在の分化プロトコルは、これらの段階をインビトロで模倣しようとしているが、これらの分化プロトコルの臨床適応の効率と成功率はかなり異なる。例えば、Ｐａｇｌｉｕｃａ  ＦＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１５４（２）：４２８−４３９（２０１４）を参照されたい。確かに、現在の分化プロトコルは、それらが適用される個々の細胞に応じて適応されなければならないことが多い。これにより、今日まで、普遍的で標準化された分化プロトコルの確立が妨げられている。実際、現在の分化プロトコルからのいくつかの一貫したガイダンスは、異なる遺伝子背景からの幹細胞株の分化を阻害し得る。本明細書に開示される改善された方法は、当該技術分野におけるこの欠陥に対処する。例えば、いくつかの実施形態では、開示されるプロトコルは、細胞特異的であり得る他の分化プロトコルとは対照的に、様々な細胞源からインスリン産生β細胞を堅牢に生成することができる。
【００７０】
インスリン産生細胞を生成する従来の手段は、幹細胞を培養および分化することを含む。開示されるプロトコルに関して、細胞源は、限定されないが、ヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、非多能性リプログラム化された細胞（例えば、ＳＲ１４２３）、および当該技術分野で既知の他の従来の細胞源を含み得る。
【００７１】
幹細胞からインスリン産生細胞を生成する開示される方法は、最初に内胚葉分化が開始され、続いて膵臓系譜への分化、続いて内分泌系譜への分化、最後にインスリン産生細胞への成熟プロセスが行われる、多段階プロセスを含む。内胚葉分化は、典型的には、幹細胞を、アクチビンＡもしくはワートマニンなどの内胚葉誘導剤またはこれらの組み合わせと接触させることによって開始される。十分な数の内胚葉細胞に到達したとき、この細胞をレチノイン酸もしくはシクロパミンなどの内分泌誘導剤またはこれらの組み合わせと接触させて、細胞を膵臓始原細胞にさらに分化させる。以下でより詳細に論じられるさらなる分化因子への曝露を介して、膵臓始原細胞は、糖尿病を治療するための細胞ベースの治療に使用することができるインスリン産生細胞に成熟させることができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、幹細胞は、内胚葉誘導剤を含む第１の培地で培養される。いくつかの実施形態では、内胚葉誘導剤は少なくともアクチビンＡを含む。いくつかの実施形態では、内胚葉誘導剤はアクチビンＡおよびワートマニンを含む。いくつかの実施形態では、開示される方法は、ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｗｎｔシグナル伝達の低分子活性化剤）および／または増殖因子Ｗｎｔ３ＡなどのＷｎｔシグナル伝達の活性化剤を使用しないか、または含まない。幹細胞を内胚葉誘導剤に曝露すると、内胚葉細胞への細胞の分化が起こる。
【００７３】
インスリン産生細胞を得る従来の方法とは対照的に、いくつかの実施形態では、開示される分化方法は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤を使用しない。従来の方法とは対照的に、いくつかの実施形態では、開示される分化方法は、細胞をレチノイン酸（ＲＡ）に長期間曝露する。従来の方法とは対照的に、いくつかの実施形態では、開示される分化プロトコルは、細胞をシクロパミンまたは化学類似体に長期間曝露する。従来の方法とは対照的に、いくつかの実施形態では、開示される分化プロトコルは、接着性培養物の解離および浮遊状態の細胞の再凝集による三次元浮遊培養物の作成を用いない。
【００７４】
いくつかの実施形態では、開示される分化方法は、幹細胞をケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）に曝露しない。ＫＦＧは、膵臓始原細胞からのβ細胞の分化を促進するために必要な成分であると考えられてきた。例えば、Ｍｏｖａｓｓａｔ  Ｊ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，４６：８２２−８２９（２００３）を参照されたい。ＫＧＦは、インビボで、特に、膵管細胞はＫＧＦおよびノギンの存在下で形成される、胎児膵臓組織においてβ細胞の分化を促進することが報告されている。したがって、培養における内胚葉分化の初期段階におけるＫＧＦの適用は、従来のプロトコルの開発における合理的な仮定であった。いくつかの実施形態では、開示される分化方法は、幹細胞をＫＧＦに曝露することを含み得る。
【００７５】
しかし本明細書では、本発明者らは予想外に、ＫＧＦが有効であるためには、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達によって膵臓始原体が確立されていなければならないことを発見した。確かに、他の因子がない場合、ＫＧＦでの処置は、β細胞分化にマイナスの影響を与えることが判明した。同様に、本開示は、ＫＧＦを初期内胚葉期から除外し、後の膵臓始原体期にＫＧＦを添加することにより、様々な細胞源からのβ細胞産生が改善され、インスリン産生細胞のほぼ均質な培養物の産生がもたらされることを示す。したがって、一態様において、本開示は、幹細胞が内胚葉誘導剤の前に、またはそれと同時にＫＧＦと接触しない、インスリン産生細胞を得るための新規な分化方法を提供する。むしろ、細胞は分化の後期でのみＫＧＦと接触する。例えば、ＫＧＦは、細胞がＲＡと接触すると同時に、または後の培養ステップで細胞に導入されてもよいが、それ以前は導入されない。
【００７６】
したがって、いくつかの実施形態では、分化細胞は、細胞が内分泌細胞に分化された後などの内胚葉分化の後期においてのみＫＧＦと接触する。この段階の前に、幹細胞をＫＧＦと接触させるべきではない。したがって、幹細胞を内胚葉細胞に分化するために使用される培地は、アクチビンＡおよび／またはワートマニンを含むことができるが、ＫＧＦを含むべきではない。いくつかの実施形態では、幹細胞を内胚葉細胞に分化するために使用される培地は、アクチビンＡ、ワートマニン、および／またはＷｎｔシグナル伝達の活性化剤、例えば、ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｗｎｔシグナル伝達の低分子活性化剤）および／または増殖因子Ｗｎｔ３Ａ、ならびにこれらの組み合わせを含むことができるが、ＫＧＦを含むべきではない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、幹細胞を内胚葉細胞に分化させるステップは、ＫＧＦを含みまたは含まずに、アクチビンＡ、ワートマニン、およびこれらの組み合わせを含む培地で、細胞を１〜４日間培養することを含んでよい。例えば、幹細胞を、これらの内胚葉誘導剤の存在下で約１、約２、約３、または約４日間培養することによって、幹細胞を内胚葉細胞に分化させることができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、幹細胞は、約１〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約１７５ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、または約７５〜約１２５ｎｇ／ｍＬの濃度のアクチビンＡの存在下で内胚葉細胞に分化される。例えば、アクチビンＡ濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１９０ｎｇ／ｍＬ、または約２００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、幹細胞は、約０．１〜約２．０μＭ、約０．２５〜約１．７５μＭ、約０．５〜約１．５μＭ、または約０．７５〜約１．２５μＭの濃度のワートマニンの存在下で内胚葉細胞に分化される。例えば、ワートマニン濃度は、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１．０μＭ、約１．５μＭ、または約２．０μＭであってもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態では、内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させるために使用される培地はＫＧＦを含むことができるが、いくつかの実施形態では、内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させるために使用される培地は、ＫＧＦを含まないレチノイン酸、ノギン、またはシクロパミンならびにこれらの組み合わせを含むことができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させるステップは、ＫＧＦを含みまたは含まずに、レチノイン酸、シクロパミン、および／またはノギンを含む培地で１〜５日間細胞を培養することを含み得る。例えば、内胚葉細胞を、これらの内分泌誘導剤の存在下で約１、約２、約３、約４、または約５日間培養することにより、内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させることができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、細胞は、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１．０μＭ、約１．５μＭ、または約２．０μＭの濃度でのレチノイン酸の存在下で少なくとも２０日間分化される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、細胞は、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２５μＭ、または約０．５μＭの濃度でのシロパミンの存在下で少なくとも２０日間分化される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、細胞は、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２５μＭ、または約０．５μＭの濃度でのシクロパミンＳＡＮＴ−１（（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチレン）−アミン）の化学類似体の存在下で分化される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、内胚葉細胞は、約１．０〜約１０．０μＭ、約２．０〜約８．０μＭ、または約３．０〜約５．０μＭの濃度でのレチノイン酸の存在下で内分泌細胞に分化される。例えば、レチノイン酸濃度は、約１．０μＭ、約１．５μＭ、約２．０μＭ、約２．５μＭ、約３．０μＭ、約３．５μＭ、約４．０μＭ、約４．５μＭ、約５．０μＭ、約５．５μＭ、約６．０μＭ、約６．５μＭ、約７．０μＭ、約７．５μＭ、約８．０μＭ、約８．５μＭ、約９．０μＭ、約９．５μＭ、または約１０．０μＭであり得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、内胚葉細胞は、約０．１〜約１．０μＭまたは約０．２５〜約０．７５μＭの濃度でのシクロパミンの存在下で内分泌細胞に分化される。例えば、シクロパミン濃度は、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、または約１．０μＭであり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、内胚葉細胞は、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、または約６０〜約７０ｎｇ／ｍＬの濃度でのノギンの存在下で内分泌細胞に分化される。例えば、ノギン濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、内胚葉細胞は、１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、または約６０〜約７０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＫＧＦの存在下で内分泌細胞に分化される。例えば、ＫＧＦ濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、細胞が内胚葉細胞から内分泌細胞に分化された後まで、細胞をＫＧＦに曝露しない。
【００８９】
いくつかの実施形態では、内分泌細胞を膵臓始原細胞、次いで最終的にはインスリン産生細胞に分化させるために、追加の増殖因子および／またはホルモンの存在下でさらに培養することができる。いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、レチノイン酸および／またはシクロパミンなどの内分泌誘導剤に曝露した後にＫＧＦを含む培地で培養することにより、内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させることができる。いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、レチノイン酸および／またはシクロパミンなどの内分泌誘導剤に曝露された後、ＫＧＦ、ノギン、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）またはこれらの組み合わせを含む培地で培養されてもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させるステップは、ＫＧＦ、ノギン、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）またはこれらの組み合わせを含む培地で細胞を１〜５日間培養することを含み得る。いくつかの実施形態では、内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させるステップは、ＫＧＦ、ノギン、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）またはこれらの組み合わせを含み、ならびにさらに、レチノイン酸および／またはシクロパミン（例えば、シクロパミンＫＡＡＤ）を含む培地で、細胞を１〜５日間培養することを含み得る。例えば、内胚葉細胞を、これらの薬剤の存在下で約１、約２、約３、約４、または約５日間培養することにより、内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させることができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、または約６０〜約７０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＫＧＦの存在下で膵臓始原細胞に分化される。例えば、ＫＧＦ濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、または約６０〜約７０ｎｇ／ｍＬの濃度でのノギンの存在下で膵臓始原細胞に分化される。例えば、ノギン濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、または約６０〜約７０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＥＧＦの存在下で膵臓始原細胞に分化される。例えば、ＥＧＦ濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、約１〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬ、または約７５〜約１２５ｎｇ／ｍＬの濃度でのレチノイン酸の存在下で膵臓始原細胞に分化される。例えば、レチノイン酸濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０５ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１５ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３５ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５５ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６５ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８５ｎｇ／ｍＬ、約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１９５ｎｇ／ｍＬ、または約２００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、約０．１〜約１．０μＭまたは約０．２５〜約０．７５μＭの濃度でのシクロパミンの存在下で膵臓始原細胞に分化される。例えば、シクロパミン濃度は、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、または約１．０μＭであり得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、膵臓系譜に向かって膵臓始原細胞を分化させ、最終的にはインスリン産生細胞に分化させるために、追加の増殖因子および／またはホルモンの存在下でさらに培養され得る。いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、ノギン、ＥＧＦ、γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、および／またはＴ３ならびにこれらの組み合わせを含む培地で培養され得る。いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、ノギン、ＥＧＦ、γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、および／またはＴ３ならびにこれらの組み合わせを含み、レチノイン酸および／またはシクロパミン（例えば、シクロパミンＫＡＡＤ）をさらに含む培地で培養され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ３は、分化のこの段階で培養培地に含まれない場合がある。例えば、膵臓始原細胞を、これらの薬剤の存在下で約１、約２、約３、約４、または約５日間培養することにより、膵臓始原細胞を膵臓系譜に分化させることができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、または約６０〜約７０ｎｇ／ｍＬの濃度でのノギンの存在下でさらに培養される。例えば、ノギン濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、または約６０〜約７０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＥＧＦの存在下でさらに培養される。例えば、ＥＧＦ濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約０．１〜約２．０μＭ、約０．２５〜約１．７５μＭ、約０．５〜約１．５μＭ、または約０．７５〜約１．２５μＭの濃度でのγ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩの存在下でさらに培養される。例えば、γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ濃度は、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１．０μＭ、約１．５μＭ、または約２．０μＭであり得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約１．０〜約５０．０μＭ、約５〜約２５μＭ、または約１０〜約２０μＭの濃度でのＡｌｋ５ｉ  ＩＩの存在下でさらに培養される。例えば、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ濃度は、約０．１μＭ、約１．０μＭ、約５．０μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、または約５０μＭであり得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約０．１〜約２．０μＭ、約０．２５〜約１．７５μＭ、約０．５〜約１．５μＭ、または約０．７５〜約１．２５μＭの濃度でのＴ３の存在下でさらに培養される。例えば、Ｔ３濃度は、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１．０μＭ、約１．５μＭ、または約２．０μＭであり得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約１〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬ、または約７５〜約１２５ｎｇ／ｍＬの濃度でのレチノイン酸の存在下でさらに培養される。例えば、レチノイン酸濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０５ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１５ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３５ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５５ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６５ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８５ｎｇ／ｍＬ、約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１９５ｎｇ／ｍＬ、または約２００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約０．１〜約１．０μＭまたは約０．２５〜約０．７５μＭの濃度でのシクロパミンの存在下でさらに培養される。例えば、シクロパミン濃度は、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、または約１．０μＭであり得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、細胞をインスリン産生細胞に最終的に分化させるために、追加の増殖因子および／またはホルモンの存在下でさらに培養され得る。いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、Ｔ３、および／またはレチノイン酸ならびにこれらの組み合わせを含む培地で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、Ｔ３、および／またはレチノイン酸ならびにこれらの組み合わせを含み、シクロパミン（例えば、シクロパミンＫＡＡＤ）をさらに含む培地で培養され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ３は、分化のこの段階で培養培地に含まれない場合がある。例えば、膵臓始原細胞を、これらの薬剤の存在下で約１、約２、約３、約４、または約５日間培養することにより、膵臓細胞をインスリン産生細胞型に向けて分化させることができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、約１．０〜約５０．０μＭの約５〜約２５μＭ、または約１０〜約２０μＭの濃度でのＡｌｋ５ｉ  ＩＩの存在下でさらに培養される。例えば、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ濃度は、約０．１μＭ、約１．０μＭ、約５．０μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、または約５０μＭであり得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、約０．１〜約２．０μＭ、約０．２５〜約１．７５μＭ、約０．５〜約１．５μＭ、または約０．７５〜約１．２５μＭの濃度でのＴ３の存在下でさらに培養される。例えば、Ｔ３濃度は、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１．０μＭ、約１．５μＭ、または約２．０μＭであり得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、約１〜約２００μＭ、約２５〜約１７５μＭ、約５０〜約１５０μＭ、または約７５〜約１２５μＭの濃度でのレチノイン酸の存在下でさらに培養される。例えば、レチノイン酸濃度は、約１μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、約１００μＭ、約１１０μＭ、約１２０μＭ、約１３０μＭ、約１４０μＭ、約１５０μＭ、約１６０μＭ、約１７０μＭ、約１８０μＭ、約１９０μＭ、または約２００μＭであり得る。いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約１〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬ、または約７５〜約１２５ｎｇ／ｍＬの濃度でのレチノイン酸の存在下でさらに培養される。例えば、レチノイン酸濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０５ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１５ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３５ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５５ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６５ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８５ｎｇ／ｍＬ、約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１９５ｎｇ／ｍＬ、または約２００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約０．１〜約１．０μＭまたは約０．２５〜約０．７５μＭの濃度でのシクロパミンの存在下でさらに培養される。例えば、シクロパミン濃度は、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、または約１．０μＭであり得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、細胞をインスリン産生細胞に最終的に分化させるために、追加の増殖因子および／またはホルモンの存在下でさらに培養され得る。いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、Ｔ３、ニコチンアミド、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、および／またはＢＭＰ４およびこれらの組み合わせを含む培地で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、Ｔ３、ニコチンアミド、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、および／またはＢＭＰ４、ならびにこれらの組み合わせ、ならびにこれらの組み合わせを含み、さらに、レチノイン酸および／またはシクロパミン（例えば、シクロパミンＫＡＡＤ）を含む培地中で培養され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ３および／またはＢＭＰ４は、この分化段階で培養培地に含まれない場合がある。例えば、膵臓始原細胞を、これらの薬剤の存在下で約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０日間培養することにより、膵臓細胞をインスリン産生細胞に分化し得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、約１．０〜約５０．０μＭの約５〜約２５μＭ、または約１０〜約２０μＭの濃度でのＡｌｋ５ｉ  ＩＩの存在下でさらに培養される。例えば、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ濃度は、約０．１μＭ、約１．０μＭ、約５．０μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、または約５０μＭであり得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、約０．１〜約２．０μＭ、約０．２５〜約１．７５μＭ、約０．５〜約１．５μＭ、または約０．７５〜約１．２５μＭの濃度でのＴ３の存在下でさらに培養される。例えば、Ｔ３濃度は、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１．０μＭ、約１．５μＭ、または約２．０μＭであり得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、約１．０〜約５０．０ｍＭ、約５〜約２５ｍＭ、または約１０〜約２０ｍＭの濃度でのニコチンアミドの存在下でさらに培養される。例えば、ニコチンアミド濃度は、約０．１ｍＭ、約１．０ｍＭ、約５．０ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭであり得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、または約６０〜約７０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＩＧＦ−Ｉの存在下でさらに培養される。例えば、ＩＧＦ−Ｉ濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬまたは約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、膵臓細胞は、約１．０〜約５０．０ｎｇ／ｍＬ、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬ、または約１０〜約２０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＢＭＰ４の存在下でさらに培養される。例えば、ＢＭＰ４濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ、約５．０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約１〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬ、または約７５〜約１２５ｎｇ／ｍＬの濃度でのレチノイン酸の存在下でさらに培養される。例えば、レチノイン酸濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約６５ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０５ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１５ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３５ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５５ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６５ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８５ｎｇ／ｍＬ、約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１９５ｎｇ／ｍＬ、または約２００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、膵臓始原細胞は、約０．１〜約１．０μＭまたは約０．２５〜約０．７５μＭの濃度でのシクロパミンの存在下でさらに培養される。例えば、シクロパミン濃度は、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、または約１．０μＭであり得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、細胞は、ビトロネクチンおよび／またはラミニンおよび／またはコラーゲンから成る接着性基質上で分化される。いくつかの実施形態では、自発的かつ自然に三次元構造を形成する細胞を収集し、浮遊培養に移す。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、細胞はハイドロゲル内にカプセル化され、細胞がハイドロゲル内にカプセル化される間に分化はさらに進行し得る。これらの実施形態では、分化プロトコルは、カプセル化されていない細胞と同じである（すなわち、分化プロトコルは、開示された分化方法と同じ試薬およびインキュベーション時間を含んでよい）。すなわち、ヒドロゲル内にカプセル化された後であっても、開示された培地内で細胞をインキュベートして、インスリン産生細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞をカプセル化するヒドロゲルは、アルギン酸ナトリウムを含んでもよく、またはアルギン酸ナトリウムからなってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、分化の１２日目前後にハイドロゲル内にカプセル化される。例えば、細胞は、分化の８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、または１５日目にハイドロゲル内にカプセル化され得る。したがって、細胞は、ノギンおよび／またはＥＧＦを含む培地（すなわち、本明細書に開示される「第３の培地」）でインキュベートされた後、ハイドロゲル内にカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、１４日目前後、１６日目前後、１８日目前後、２０日目前後、２２日目前後、２４日目前後、２６日目前後、または２８日目前後の分化の後期段階でハイドロゲル内にカプセル化される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、開示される分化方法において使用される幹細胞は膵臓一次組織に由来する。いくつかの実施形態では、開示される分化方法において使用される幹細胞は胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、開示される分化方法において使用される幹細胞は人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、開示される分化方法において使用される幹細胞は、非多能性リプログラムされた細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞はヒト幹細胞である。
【０１２０】
本開示の目的のために、細胞のゲノムにリプログラミング遺伝子を組み込まずに、細胞内でリプログラミング遺伝子を発現することによって、細胞をリプログラミングすることが望ましい場合がある。当業者であれば、形質導入された遺伝子は、例えばエピソーム発現プラスミドを使用して、それらの遺伝子をゲノムに組み込むことなく、細胞内で発現することができることを認識するであろう。リプログラミング遺伝子は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個以上のエピソーム発現プラスミド上で発現され得る。上述のように、複数のリプログラミング遺伝子は当該技術分野で既知であり、開示される方法の目的のために使用され得るが、いくつかの実施形態では、リプログラミング遺伝子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、幹細胞からインスリン産生細胞への細胞分化に必要な総培養時間は、約３０日以下であり得る。例えば、細胞は、約３０日間、約２９日間、約２８日間、約２７日間、約２６日間、約２５日間以下培養され得る。
【０１２２】
当業者はまた、各分化ステップにおける全体的な培養時間が変化し得ることを理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、インスリン分泌膵臓細胞の産生方法であって、（ａ）アクチビンＡおよびワートマニンを含む第１の培地でヒト幹細胞を培養することであって、ヒト細胞がＷｎｔ３ａに曝露されず、かつ任意選択で内胚葉細胞への分化前にケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）に曝露されず、それによってヒト幹細胞を内胚葉細胞に分化することと、（ｂ）レチノイン酸およびシクロパミンを含み、任意選択でＫＧＦを含む第２の培地で（ａ）からの内胚葉細胞を培養することにより、内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させることと、（ｃ）ＫＧＦを含む第３の培地において（ｂ）からの内分泌細胞を培養することにより、内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させることと、（ｄ）ノギン、ＥＧＦ、γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、およびＴ３を含む第４の培地で（ｃ）からの膵臓始原細胞を培養することと、（ｅ）Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、Ｔ３、およびレチノイン酸を含む第５の培地で（ｄ）からの細胞を培養することと、（ｆ）Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、Ｔ３、ニコチンアミド、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、およびＢＭＰ４を含む第６の培地で培養することと、を含む、方法を提供する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本開示は、インスリン分泌膵臓細胞の産生方法であって、（ａ）アクチビンＡおよびワートマニンを含む第１の培地内でヒト幹細胞を培養することであって、ヒト細胞がＷｎｔ３ａに曝露されず、かつ任意選択で、内胚葉細胞への分化前にケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）に曝露されず、それによって、ヒト幹細胞を内胚葉細胞に分化することと、（ｂ）レチノイン酸、ノギンおよびシクロパミンを含み、任意選択でＫＧＦを含む第２の培地で（ａ）からの内胚葉細胞を培養することにより、内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させることと、（ｃ）ＫＧＦ、ノギン、レチノイン酸、およびシクロパミンを含む第３の培地で（ｂ）からの内分泌細胞を培養することにより、内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させることと、（ｄ）ノギン、ＥＧＦ、γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、レチノイン酸、およびシクロパミンを含む第４の培地で（ｃ）からの膵臓始原細胞を培養することと、（ｅ）Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、Ｔ３、レチノイン酸、およびシクロパミンを含む第５の培地で（ｄ）からの細胞を培養することと、および（ｆ）Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ニコチンアミド、ＩＧＦ−Ｉ、レチノイン酸、およびシクロパミンを含む第６の培地で培養することと、を含む、方法を提供する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、第６の培地はグルカゴンを含んでよく、これはインスリンおよびグルカゴンを共発現する内分泌細胞の割合を低減させる有益な効果を有する。グルカゴンの濃度は、例えば、約４０ｎｇ／Ｌ、約７０ｎｇ／Ｌ、約１１０ｎｇ／Ｌ、または約１４０ｎｇ／Ｌであり得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｆ）の総培養時間は３０日以下であってよい。例えば、細胞は、約３０日間、約２９日間、約２８日間、約２７日間、約２６日間、約２５日間以下培養され得る。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は培養の１〜３日目を含んでよく、ステップ（ｂ）は培養の４〜７日目を含んでよく、ステップ（ｃ）は培養の８〜１１日目を含んでよく、ステップ（ｄ）は培養の１２〜１５日目を含んでよく、ステップ（ｅ）は培養の１６〜１９日目を含んでよく、ステップ（ｆ）は培養の２０〜２８日目を含んでよい。したがって、いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は１〜４日の培養を含み得、ステップ（ｂ）は１〜５日の培養を含み得、ステップ（ｃ）は１〜５日の培養を含み得、ステップ（ｄ）は１〜５日の培養を含み得、ステップ（ｅ）は１〜５日の培養を含み得、ステップ（ｆ）は１〜１０日の培養を含み得る。
【０１２６】
本明細書に開示されるように、より早期の内胚葉段階で分化細胞をＫＧＦに曝露することは、インスリン産生β細胞の生成を妨げる可能性があり、したがって、この成分の添加は任意選択であり、正確なプロトコルに応じて変化し得る。インスリン産生細胞を調製する目的では、したがって、いくつかの実施形態では、内胚葉分化の初期段階から、または分化細胞がレチノイン酸に曝露されている培養において少なくともある時期までＫＧＦを除外することが有益であり得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本開示は、インスリン分泌膵臓細胞の産生方法であって、（ａ）アクチビンＡおよびワートマニンを含む第１の培地でヒト幹細胞を培養することであって、ヒト細胞がＷｎｔ３ａに曝露されず、それによってヒト幹細胞を内胚葉細胞に分化することと、（ｂ）その後の培養ステップ中細胞を少なくとも２０日間レチノイン酸に曝露することと、（ｃ）その後の培養ステップ中細胞を少なくとも２０日間シクロパミンまたは化学類似体に曝露することと、（ｄ）接着性基質上で細胞培養を開始することと、（ｅ）自然かつ自発的に三次元構造を形成する細胞を浮遊培養に移すことと、任意選択的に（ｆ）グルカゴンの存在下で細胞を培養することと、を含む、方法を提供する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳動物幹細胞を接着状態で培養することにより、哺乳動物幹細胞が自発的に三次元構造を形成することを可能にすることと、三次元構造を浮遊状態で培養することと、を含む、哺乳動物のインスリン分泌細胞の産生方法であって、培養ステップは、少なくとも２０日間のレチノイン酸およびシクロパミンへの曝露を含み、かつ三次元構造の幹細胞をＷｎｔ３Ａに曝露することを含まない、方法を提供する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本開示は、インスリン分泌細胞の産生方法であって、アクチビンＡおよびワートマニンを含む第１の培地内の接着性基質上で哺乳動物幹細胞を培養することであって、哺乳動物幹細胞が、Ｗｎｔ３ａに曝露されない、培養することと、レチノイン酸およびシクロパミンを含む少なくとも１つの追加の培地で細胞をさらに培養することと、細胞が三次元細胞構造を形成するときに、細胞を浮遊培養に移すことと、を含み、細胞が、少なくとも２０日間、レチノイン酸およびシクロパミンに曝露される、方法を提供する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、優先的に分化するか、または内胚葉系譜へ分化しやすい開始幹細胞または非多能性始原細胞を選択することが好ましい場合がある。これは、より単純な分化を可能にし、従来の方法と比較して、インスリン分泌細胞のより純粋かつより成熟した培養を達成し得る。
【０１３１】
本開示の方法の目的のために、インスリン分泌細胞の産生は、細胞が最初に接着状態で増殖するか、または培養が接着性基質（例えば、正に荷電した表面またはビトロネクチンまたはマトリゲルでコーティングされた表面）上で開始され、これにより細胞が自然かつ自発的に三次元構造（例えば、細胞の凝集体）を形成することを可能にするときに最適化されると判断された。次いで、接着細胞から構成されるこれらの三次元構造を、開示される方法の間にわたって浮遊状態で培養することができる。
【０１３２】
したがって、いくつかの実施形態では、開始幹細胞集団は接着状態で増殖する一方で、培養の後期は浮遊状態で行われる。本開示の目的のために、「接着状態で増殖した」または「接着状態で培養した」という語句は、細胞が培養皿の表面に接着する標準的な細胞培養を指す。ある場合には、接着を促進するため培養皿を基質でコーティングしてもよく、ある場合には、接着を促進するため皿に正味正電荷を与えてもよい。一般に、ｉＰＳ細胞などの幹細胞の培養には、接着性基質が必要であり、種々の接着促進性基質が当該技術分野で既知である。例えば、細胞フラスコに１つのビトロネクチンまたはマトリゲルを塗布して接着を促進することができるが、マトリゲルはマウス肉腫細胞から採取され、したがって、臨床使用に好ましくない。いくつかの実施形態では、分化は、開始幹細胞集団を内胚葉誘導培地で培養することによって開始され、接着状態で増殖される。基質／プレート上の３Ｄ構造（例えば、分化した細胞／分化細胞の凝集体）の形成は、分化が進むにつれて徐々に生じ得る。約１５日までに、３Ｄ構造はプレートから分離し始め、これらの３Ｄ構造は、３Ｄ構造が遊離浮遊状態で培養されるように、接着性基質（例えば、ビトロネクチン）でコーティングされていない容器に移すことができる。接着状態における培養から浮遊培養へのこの移行は新規なことであり、インスリン分泌細胞へのより自然な分化を可能にする。
【０１３３】
また、従来の実践に反して、培養を開始するために使用される幹細胞を、分化を容易にするためにＷｎｔ３ａと接触させる必要がないと判断された。実際、Ｗｎｔ３ａは、開示された方法のいずれの時点でも必要ではない。
【０１３４】
最後に、インスリン分泌細胞を産生するプロセスを通じて様々な分化培地が交換されても、少なくとも約２０日間、細胞が少なくともある程度の濃度のレチノイン酸およびシクロパミンと接触したままである場合、分化が最も効率的であると判断された。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、好ましくは、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、または少なくとも約２８日間、レチノイン酸およびシクロパミンに曝露される。いくつかの実施形態では、このレチノイン酸およびシクロパミンへの継続的曝露は、開始幹細胞集団が内胚葉系譜に向かって強制された後、例えば、開始幹細胞集団がアクチビンＡおよびワートマニンの存在下で約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、または約５日間培養された後に開始することができる。
【０１３５】
当業者であれば、開示される方法は、ヒトおよび非ヒト霊長類幹細胞などの哺乳動物幹細胞に概して適用され得ることを理解するであろう。しかしながら、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、またはネコ幹細胞などの追加の哺乳動物細胞も、開示された方法に従って分化され得る。さらに、当業者は、開示される方法が、例えば、接着培養および／または浮遊培養を含む様々な形態の細胞培養を用いることができることを認識するであろう。
【０１３６】
インスリン産生細胞を生成するための開示されたプロトコルは、ヒト胚性幹細胞およびリプログラムされた膵臓組織の両方からのインスリン産生β細胞の収率を増強した。インスリン産生細胞を産生する従来の方法とは対照的に、本明細書に開示されるプロトコルは、インスリン産生細胞のほとんど均質な集団を産生する。均質な細胞集団を産生することは、幹細胞が移植されると奇形腫を形成し、腫瘍発生の可能性を有するため、治療効果に対するだけでなく安全性に対しても重要である。開示される分化方法によって提供される高い分化度および均質性は、有用な細胞療法の開発に不可欠である腫瘍発生可能性を有する細胞の数を減少させることを意味する。
【０１３７】
開示される分化方法を用いる前に、内胚葉細胞に優先的に分化する幹細胞は、本出願の第ＩＩ節に開示される方法に従って同定され得る。これは、分化プロセスの全体的な効率を増加させるとともに、インスリン産生細胞の収率を増加させることができる。
【０１３８】
ＩＶ．細胞ベースの組成物および治療方法
本明細書に開示されるインスリン産生細胞は、治療を必要とする対象における糖尿病を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、インスリン依存性糖尿病を有する哺乳動物、例えばヒト対象である。
【０１３９】
本開示は、糖尿病を治療するための細胞ベースの組成物に組み込むことができる、実質的に均質なインスリン産生細胞の集団の産生方法を提供する。したがって、本明細書で提供するのは、糖尿病を治療するための細胞ベースの組成物であって、代理膵臓細胞の集団と、治療を必要とするヒト対象への移植に好適な担体とを含み、細胞の少なくとも６６％がインスリン産生膵臓細胞である、組成物である。いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物は、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％のインスリン産生膵臓細胞を含み得る。
【０１４０】
治療細胞の移植に好適な担体は、当該技術分野で既知であり、限定されないが、ヒドロゲル、天然および合成ポリマー足場、細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどを含み得る）、ヒアルロン酸、生体模倣足場、ポリラクチド（ＰＬＡ）足場、ポリグリコライド（ＰＧＡ）足場、ＰＬＡ−ＰＧＡコポリマー（ＰＬＧＡ）足場、ならびにヒドロキシアパタイト足場、およびマクロ多孔質クリオゲルを含み得る。いくつかの実施形態では、移植に好適な担体は、アルギン酸塩、硫酸セルロース、グルコマンナン、またはこれらの組み合わせを含むマクロカプセルなどのマクロカプセルにインスリン産生細胞をカプセル化することを含んでよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、代理膵臓細胞の少なくとも６６％はＮｅｕｒｏＤ１を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％の代理膵臓細胞は、ＮｅｕｒｏＤ１を発現する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、代理膵臓細胞の少なくとも６８％はＮｋｘ６．１を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％の代理膵臓細胞は、Ｎｋｘ６．１を発現する。
【０１４３】
糖尿病を治療するための細胞ベースの組成物は、本明細書に開示される方法に従って調製することができる。例えば、細胞ベースの組成物のインスリン産生膵臓細胞は、例えば、下記方法であって（ａ）内胚葉誘導因子を含む第１の培地でヒト幹細胞の集団を培養することにより、ヒト幹細胞を内胚葉細胞に分化させることであって、ヒト幹細胞が内胚葉細胞への分化前にケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）に曝露されなかった、分化させることと、（ｂ）内分泌誘導因子を含む第２の培地で（ａ）からの内胚葉細胞を培養することにより、内胚葉細胞を内分泌細胞に分化させることと、（ｃ）ＫＧＦを含む第３の培地で（ｂ）からの内分泌細胞を培養することにより、内分泌細胞を膵臓始原細胞に分化させることと、（ｄ）甲状腺ホルモンを含む第４の培地で（ｃ）からの膵臓始原細胞を培養することにより、膵臓始原細胞をインスリン産生膵臓細胞に分化させることと、を含む、方法に従って誘導され得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物のインスリン産生膵臓細胞は、例えば、下記方法であって、（ａ）内胚葉誘導因子を含む第１の培地でヒト幹細胞の集団を培養することにより、ヒト幹細胞を内胚葉細胞に分化させることであって、前記ヒト幹細胞がＷｎｔ３ａに曝露されなかった、分化させることと、（ｂ）その後の培養ステップ中に細胞を少なくとも２０日間レチノイン酸に曝露することと、（ｃ）その後の培養ステップ中に細胞を少なくとも２０日間シクロパミンまたは化学類似体に曝露することと、（ｄ）接着性基質上で細胞培養を開始することと、（ｅ）三次元構造を自然かつ自発的に形成する細胞を浮遊培養に移すことと、を含む、方法に従って誘導され得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物のインスリン産生膵臓細胞は、例えば、方法であって、内胚葉誘導因子を含む第１の培地内の接着性基質上でヒト幹細胞の集団を培養することであって、哺乳動物幹細胞がＷｎｔ３ａに曝露されない、培養することと、レチノイン酸およびシクロパミンを含む少なくとも１つの追加の培地で細胞を浮遊状態でさらに培養することであって、細胞が少なくとも２０日間、レチノイン酸およびシクロパミンに曝露され、培養することと、を含む、方法に従って誘導され得る。いくつかの実施形態では、内胚葉誘導因子はアクチビンＡおよび／またはワートマニンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の培地は、ＫＧＦ、ノギン、ＥＧＦ、および／またはＴ３などの甲状腺ホルモンを含んでよい。
【０１４６】
種々の内胚葉誘導因子は当該技術分野で既知であり、限定されないが、アクチビンＡおよびワートマニンを含む。同様に、種々の内分泌誘導因子が当該技術分野で既知であり、限定されないが、レチノイン酸およびシクロパミンを含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、第２の培地はＫＧＦを含むが、いくつかの実施形態では、細胞はステップ（ｂ）の後までＫＧＦと接触しない。いくつかの実施形態では、ＫＧＦはステップ（ａ）の培地に含まれ得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、第３の培地はノギンおよび／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む。いくつかの実施形態では、第３の培地はレチノイン酸および／またはシクロパミンを含む。そしていくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンはＴ３であり得る。
【０１４９】
開示される細胞ベースの組成物を調製するために使用される幹細胞の供給源は特に限定されず、しかしながら、本明細書に開示されるように、内胚葉系譜に優先的に分化する細胞／細胞株を選択することは、インスリン産生細胞の収率を増加させ、分化効率を増加させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物を調製するために開示される分化方法において使用される幹細胞は膵臓一次組織に由来する。いくつかの実施形態では、開示される分化方法において使用される幹細胞は胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、開示される分化方法において使用される幹細胞は人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、開示される分化方法において使用される幹細胞は、非多能性リプログラム細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞はヒト幹細胞である。
【０１５０】
本開示の目的のために、糖尿病を治療するための細胞ベースの組成物に組み込むためのインスリン産生細胞を調製する場合、細胞のゲノムにリプログラミング遺伝子を組み込むことなく細胞内でリプログラミング遺伝子を発現することによって細胞をリプログラム化することが望ましい場合がある。当業者であれば、形質導入された遺伝子は、例えばエピソーム発現プラスミドを使用して、それらの遺伝子をゲノムに組み込むことなく、細胞内で発現することができることを認識するであろう。リプログラミング遺伝子は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個以上のエピソーム発現プラスミド上で発現され得る。上述のように、複数のリプログラミング遺伝子は当該技術分野で既知であり、開示される方法の目的のために使用され得るが、いくつかの実施形態では、リプログラミング遺伝子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物は、例えばマイクロカプセルまたはマクロカプセルにカプセル化される。
【０１５２】
本開示はまた、開示の細胞ベースの組成物を使用して糖尿病を治療する方法を提供する。糖尿病を治療する方法は、一般に、治療有効量のカプセル化されたインスリン産生細胞をそれを必要とする対象に移植することを含む。治療有効量のインスリン産生細胞は、細胞ベースの組成物、例えば、マイクロカプセル化またはマクロカプセル化された代理膵臓細胞の集団の形態であってもよい。
【０１５３】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のマクロカプセルにカプセル化されたインスリン産生細胞をそれを必要とする個体に移植することを含む。マクロカプセルの組成物は特に限定されず、当業者は、様々な材料を使用してインスリン産生細胞をカプセル化することができることを理解するであろう。例えば、カプセルは、アルギン酸塩、硫酸セルロース、グルコマンナン、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、マクロカプセルは、外側バリアが硫酸セルロースおよびグルコマンナンから成る、少なくとも１つのバリアを含んでよい。いくつかの実施形態では、マクロカプセルは、アルギン酸塩の内側カプセルおよび硫酸セルロースおよびグルコマンナンの外側カプセルから成る円筒管の形状で形成され得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本方法は、治療有効量の、開示されたマクロカプセルにカプセル化されたインスリン産生細胞を、それを必要とする個体に、約１年に１回、２年に１回、３年に１回、４年に１回、５年、またはそれ以上ごとに１回移植することを含む。いくつかの実施形態では、移植細胞は移植後少なくとも６ヶ月間生存する。したがって、いくつかの実施形態では、対象は１つのインプラントのみを必要とし得る。いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物は、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、もしくは１８ヶ月、またはそれ以上ごとに１回、１年、２年、３年、４年、もしくは５年またはそれ以上ごとに１回、あるいは対象が再発性高血糖症になるまで、あるいは糖尿病状態に戻るまで、交換する必要があってもよい。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物は、対象の大網に移植され得る。大網（ｇｒｅａｔｅｒ  ｏｍｅｎｔｕｍ）（大網（ｇｒｅａｔ  ｏｍｅｎｔｕｍ）、大網（ｏｍｅｎｔｕｍ  ｍａｊｕｓ）、胃結腸網（ｇａｓｔｒｏｃｏｌｉｃ  ｏｍｅｎｔｕｍ）、エピプロン（ｅｐｉｐｌｏｏｎ）、または、大網膜（ｃａｕｌ）とも呼ばれる）は、胃から垂れ下がり、胃の大きな湾曲から横方向の結腸まで上昇して伸びてから後腹壁に到達する、内臓腹膜の大きなエプロン状のひだである。したがって、細胞ベースの組成物は、この網から外科的に形成されるポーチに移植され得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物は腹腔に移植される。いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物は腹腔に移植され、網に固定される。いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物は、網のポーチに移植される。
【０１５７】
インスリン産生細胞の例示的な用量は、治療される個体のサイズおよび健康状態に応じて変化し得る。例えば、いくつかの実施形態では、開示される細胞ベースの組成物にカプセル化された細胞の例示的なインプラントは、体重１ｋｇ当たり５００万個の細胞〜１０００万個の細胞を含んでよい。
【０１５８】
さらに、開示される治療方法は、カプセル化された治療用細胞に加えて、第２の治療薬の投与をさらに含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、追加の治療用化合物は、限定されないが、インスリン注射、メトホルミン、スルホニル尿素、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、およびＳＧＬＴ２阻害剤を含むことができる。
【０１５９】
インスリン産生細胞を含む細胞ベースの組成物を移植することを含む特定の治療レジメンは、それらが所与の患者の転帰を改善するかどうかに従って評価されてもよく、これは、対象の血糖値の安定化または正常化するのに役立ち、または糖尿病に関連する症状もしくは併存症のリスクもしくは発生を低減するのに役立つことを意味し、この糖尿病に関連する症状もしくは併存症には、低血糖のエピソード、グリコシル化ヘモグロビンのレベル（ＨｂＡ１Ｃレベル）の上昇、心臓病、網膜症、神経障害、腎臓病、肝臓病、歯周病、および非治癒潰瘍が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞ベースの組成物は、例えば、アルギン酸塩、硫酸セルロース、グルコマンナン、またはこれらの組み合わせを含むカプセルにカプセル化される。
【０１６０】
このように、本開示の目的のために、対象は、所望の臨床結果を含む１つ以上の有益なまたは所望の結果が得られる場合に治療される。例えば、有益または所望の臨床結果として、限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：糖尿病に起因する１つ以上の症状を軽減させること、糖尿病に罹患している人の生活の質を高めること、糖尿病を治療するために必要とされる他の薬物の用量を減少させること、糖尿病に関連する合併症を遅延または予防すること、および／または個体の生存期間を延長すること。
【０１６１】
さらに、本方法の対象は概して糖尿病を有する対象であるが、患者の年齢は限定されない。開示される方法は、すべての年齢層およびコホートにわたる糖尿病の治療に有用である。したがって、いくつかの実施形態では、対象は小児対象であってもよく、他の実施形態では、対象は成人対象であってもよい。
【０１６２】
当業者であれば、本開示は、目的を実行し、言及される目的および利点、ならびにその固有の目的および利点を得るために十分に適合されていることを容易に理解するであろう。その中の改変および他の用途が、当業者に生じるであろう。これらの改変は、本開示の趣旨の範囲内に包含される。以下の実施例は、本発明を例示するために示される。しかしながら、本発明は、これらの実施例の特定の条件または詳細に限定されないことを理解されたい。
【実施例】
【０１６３】
実施例１−材料および方法
島の収穫：登録臓器提供から適切に同意され、匿名化されたヒト全膵臓が得られた。葉に、島分離液（０．３５ｇのＮａＨＣＯ３／Ｌおよび１％ヒト血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ  Ａ９７３１）を含有するＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１４０６５−０５６））中に１．４ｍｇ／ｍｌで再懸濁されたコラーゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ＃１１２９  ００２  ００１）を注入した。膨張した葉を３７Ｃで１５〜２５分間、軽度の撹拌でインキュベートした。消化物を冷島分離液で希釈し、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを激しく粉砕しながら冷島分離液中で洗浄した。この溶液を４２０μｍのふるい（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ，Ｃａｔ＃１９８５−０００４０）を通して濾過し、遠心分離した。ペレットを１．１００ｇ／ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ  ＃１０７７１、Ｓｉｇｍａ  ＃１１１９１）中に再懸濁し、１２００ＲＰＭで３０分間遠心分離した。上清を収集し、島分離液中で２倍希釈し、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。ペレットを島単離液中ですすぎ、遠心分離し、加湿インキュベータ中、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でＥ８培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃Ａ１５１７００１）で培養した。翌日、島を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、未希釈ＴｒｙｐｌＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  １０Ｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃Ａ１２１７７）に再懸濁し、３７Ｃで１０分間インキュベートした。解離した島をＥ８培地中で希釈し、遠心分離し、１００ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ＃Ｈ０１３５）、１Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ９３２６）、および１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ５０３６）を補充したＥ８中に再懸濁した。細胞を、メーカーの指示に従って、ビトロネクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃Ａ１４７００）でコーティングした皿上で培養した。
【０１６４】
リプログラミング：細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１４１９０１４４）ですすぎ、ＴｒｙｐｌＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  １Ｘ中で３７Ｃで５分間インキュベートした。Ｅ８培地で消化を停止し、細胞を１０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。細胞を２Ｅ６細胞／２００ｕｌでＢＴＸエレクトロポレーション溶液（ＶＷＲ  ＃８９１３０−５４２）中に再懸濁し、２０μｇのリプログラミングプラスミドを用いてエレクトロポレーションキュベットに添加した。ＣＭＶプロモーターの制御下でＥＢＮＡエピソーム発現配列、アンピシリン耐性、およびリプログラミング遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃを含む２個のリプログラミングプラスミドを社内で構築した。遺伝子パルサーＸＬ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションキュベットをパルスした。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃ＰＨＧ６０１５）および１μＭのヒドロコルチゾンを補充したＥ６培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃ａ１５１６４０１）のビトロネクチンコーティングした皿に移した。細胞を５％ＣＯ２を有する加湿インキュベータ中で３７Ｃで培養した。２４時間後、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、および１μＭのヒドロコルチゾン、および１００μＭの酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ１２６９）を補充したＥ６で培地を交換し、１日おきに交換した。幹細胞コロニーを手動で分離し、Ｅ８培地のビトロネクチンコーティングした皿に移した。２つのドナーの一次組織から生成された７３株を、内胚葉誘導剤アクチビンＡおよびワートマニンに４日間曝露した後に、内胚葉マーカーを発現する能力について最初にスクリーニングした。内胚葉マーカーを発現する細胞の割合が最も高い培養物を選択した。続いて、第１のスクリーニングを通過した２４個の細胞株を、１２日間の膵臓分化プロトコルに曝露した後に膵臓マーカーを発現する能力についてスクリーニングした。膵臓細胞の最も高い割合を一貫して生成した細胞株は、ＳＲ１４２３と名付けられ、貯蔵され、その後のすべての実験に使用された。
【０１６５】
細胞株の特徴付け：ＳＲ１４２３は、多能性細胞に典型的なマーカーを発現し（図３Ａ）、正常な核型を有した（図３Ｂ）。ＳＲ１４２３のＤＮＡ  ＳＴＲプロファイルは、ドナー組織と一致する単一細胞株であることを確認した（図３Ｃ）。加えて、ＳＲ１４２３は、多能性細胞株に典型的な速度で増殖する（図３Ｄ）。同じドナーおよびリプログラミング実験からの他の人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳＣ」と呼ぶ）株も優先分化を示したことが観察された。ＩＰＳＣ株「Ｂ」はまた、内胚葉に対して良好に分化したが、株「Ｃ」および「Ｄ」は内胚葉系譜への分化の優先性を示さなかった（データは示さない）。遺伝子発現プロファイルとｉＰＳＣが特定の系譜に分化できないこととの間に相関があったかどうかを判断するために、ＳＲ１４２３の発現遺伝子ならびに株Ｂ、Ｃ、およびＤの全ゲノムマイクロアレイプロファイリングを行った。例えば、Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ａｏｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０（２０１３）を参照されたい。少なくともＬｏｇ２の倍率変化発現（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に基づく教師なしの階層的クラスタリング分析（Ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により、ＳＲ１４２３が細胞株Ｂとともにクラスタリングされたが、ＣおよびＤからはクラスタリングされなかったことが明らかになった。これにより、内胚葉系譜に対する堅牢かつ優先的な分化と相関する遺伝子発現パターンが同定された（図４Ａ）。１０個の最も特異な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現遺伝子のうち、ＢＨＭＴ２、Ｃｏｘ７Ａ１、ＨＳＰＢ２、およびＮＡＰ１Ｌ１は、ｑＲＴ−ＰＣＲ測定値を使用して内胚葉を形成する能力と有意に相関した（図４Ｂ）。
【０１６６】
幹細胞培養：未分化のｉＰＳ細胞を、製造業者の指示に従って、ビトロネクチンＸＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃０７１８０）または１７ｕｇ／ｃｍ２でＧｅｌｔｒｅｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃Ａ１４１３３０１）でコーティングした６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＃６５７１６０）に維持し、Ｅ８培地を毎日供給した。培養物を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１５５７５）で３〜５日ごとに７５〜８５％のコンフルエンスで継代し、７×１０３細胞／ｃｍ２で播種した。
【０１６７】
分化：第１のバッチのＳＲ１４２３細胞を２．３×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、１８〜２４時間増殖させた。次いで、細胞をｄＰＢＳ（−Ｍｇ２＋／−Ｃａ２＋）で洗浄し、以下のように６種の培地配合物で構成される２８日間のスケジュールに従って培地を変更した：１日目、２日目、３日目：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１０５６５０１８）、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃  Ａ１４８６７０１）、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡおよび１μＭ  のワートマニン；４日目、５日目、６日目、７日目：ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１０５６７０１４）、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、４μＭのレチノイン酸、５０ｎｇ／ｍｌのＫＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのノギン、０．２５μＭのシクロパミンＫＡＡＤ；８日目、１０日目：ＤＭＥＭ、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍｌのＫＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのノギン、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ；１２日目、１４日目：ＤＭＥＭ、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍｌのノギン、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１μＭのγ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３；１６日目、１８日目：ＤＭＥＭ、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭ  のＴ３、１００ｎＭのレチノイン酸；２０日目、２２日目、２４日目、２６日目、２８日目：ＣＭＲＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１１５３００３７）、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、１Ｘグルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃３５０５００６１）、１０μＭの  Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３、１０ｍＭのニコチンアミド、５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４。ＫＧＦを用いた第２段階の追加による分化については、４日目、５日目、６日目にＤＭＥＭ、０．２％ＢＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、および５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦを含む培地を、残りのステージを３日後にシフトさせたスケジュールに挿入した。この実施形態のプロトコルは、分化の２８日目までに高純度の内分泌膵臓細胞集団を生成した（図５Ａ）。代表的な画像の定量化は、６８％が内分泌膵臓マーカーＮｋｘ６．１（図５Ａ、５Ｅで定量化）を発現し、６６．８％が後期膵臓マーカーＮｅｕｒｏＤ１（図５Ｂ、５Ｅで定量化）を発現し、６６．５％がインスリン（図５Ｄ、５Ｅで定量化）を発現している細胞からなる集団を明らかにした。ＫＧＦを、内胚葉細胞を分化することから除外するこの手法は、膵臓由来の幹細胞および確立されたヒト胚性幹細胞の両方の収率を改善した。図６．
【０１６８】
第２のバッチのＳｒ１４２３細胞を上述のように６．３×１０４で播種し、１８〜２４時間増殖させた。次いで、細胞をｄＰＢＳ（−Ｍｇ２＋／−Ｃａ２＋）で洗浄し、以下の６種の培地配合物で構成される２８日間のスケジュールに従って培地を変更した：１日目、２日目、３日目：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１０５６５０１８）、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃Ａ１４８６７０１）、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＃ＡＦ−１２０−１４Ｅ）、および１μＭのワートマニン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｗ  ３１４４）；４日目、５日目、６日目、７日目：ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１０５６７０１４）、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、２μＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｒ２６２５）、５０ｎｇ／ｍｌのＫＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＃ＡＦ−１００−１９）、５０ｎｇ／ｍｌのノギン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＃１２０−１０Ｃ）、０．２５μＭのシクロパミンＫＡＡＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃２３９８０４）；８日目、１０日目：ＤＭＥＭ、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍｌのＫＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのノギン、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＃ＡＦ−１００−１５）、１００ｎＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｒ２６２５）、０．２５μＭのシクロパミンＫＡＡＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃２３９８０４）；１２日目、１４日目：ＤＭＥＭ、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍｌのノギン、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１μＭのγ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃５６５７９０）、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ（Ａｘｘｏｒａ、＃ＡＬＸ−２７０−４４５）、１００ｎＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｒ２６２５）、０．２５μＭのシクロパミンＫＡＡＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃２３９８０４）；１６日目、１８日目：ＤＭＥＭ、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１００ｎＭのレチノイン酸、０．２５μＭのシクロパミンＫＡＡＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃２３９８０４）；２０日目、２２日目、２４日目、２６日目、２８日目：ＣＭＲＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１１５３００３７）、０．２％ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、１Ｘグルタマックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃３５０５００６１）、１０μＭ  のＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１０ｍＭのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｎ０６３６）、５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＃１００−１１）、１００ｎＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ＃Ｒ２６２５）、０．２５μＭのシクロパミンＫＡＡＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃２３９８０４））、およびグルカゴン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｇ２０４４）。
【０１６９】
ブドウ糖刺激インスリン分泌の検査：グルコース溶液に曝露する前に、細胞を、１ｇ／ｄＬのグルコース、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ＋１μＭのＴ３＋１０ｍＭのニコチンアミド＋５０ｎｇ／ｍＬの  ＩＧＦ−Ｉ＋１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を含む、ＣＭＲＬ、０．２％  ＨＳＡ、１ＸＢ２７サプリメント、１Ｘグルタマックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃３５０５００６１）中で２時間培養した。細胞を、ＫＲＥＢＳ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  ＃Ｊ６７５９１−ＡＰ）中の２ｍＭのグルコース中で３０分間インキュベートし、上清を収集した。緩衝液をＫＲＥＢＳ中の２０ｍＭのグルコースに３０分間交換し、上清を収集した。緩衝液をＫＲＥＢＳ中の２０ｍＭのグルコース、３０ｍＭのＫＣｌに３０分間交換し、上清を収集した。各上清中のＣペプチドの濃度を、超高感度ＣペプチドまたはグルカゴンＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ＃１０−１１４１−０１）およびＧＥＮｉｏｓマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を使用して決定した。吸光度測定は、Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウェア（ＴＥＣＡＮ）を用いて二重測定された。この手順に続いて、ＳＲ１４２３から分化した細胞が、インスリン（図７）およびグルカゴン（図示せず）の代用としてＣペプチドを使用してインスリンを分泌することが観察された。
【０１７０】
実施例２−結果
細胞株誘導体。ｉＰＳＣ株は、成熟細胞の核にリプログラミング遺伝子を導入することによって生成された。これらの遺伝子、典型的には、ＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、およびｃ−Ｍｙｃは、胚性幹細胞の遺伝子発現パターン、形態、および挙動を採用するように誘導した。この効果の持続時間は不明であるが、「エピジェネティックメモリ」と呼ばれる現象であるリプログラム細胞において、開始細胞集団のエピジェネティックサインが持続することが報告されている。膵臓系譜に効率的に分化するｉＰＳＣ株を生成する可能性を最大限に引き出すために、同意された健康成人ドナー膵臓のランゲルハンス島からの初代細胞をリプログラミングのため選択した（図１Ａ）。
【０１７１】
細胞培養で増殖した初代細胞は、おそらく人工培養条件への適応の結果として、均質になり、機能的成熟形質を経時的に失うことができる。開始細胞集団における遺伝子多様性の喪失を回避するために、リプログラミング遺伝子は、細胞収穫から５日以内であった。リプログラミング遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃを、２つのエピソーム発現プラスミドのエレクトロポレーションを介して初代細胞に導入した。Ｃ−ＭｙｃよりもＬ−Ｍｙｃを選択して、がん遺伝子を導入する可能性を低減した。２つのドナーの一次組織から生成された７３株を、内胚葉誘導剤アクチビンＡおよびワートマニンに４日間曝露した後に、内胚葉マーカーを発現する能力について最初にスクリーニングした。内胚葉マーカーを発現する細胞の割合が最も高い培養物を選択した。続いて、第１のスクリーニングを通過した２４個の細胞株を、１２日間の膵臓分化プロトコルに曝露した後に膵臓マーカーを発現する能力についてスクリーニングした。膵臓細胞の最も高い割合を一貫して生成した細胞株は、ＳＲ１４２３と名付けられ、貯蔵され、その後のすべての実験に使用された。この細胞株は、胚体内胚葉細胞（図１Ｂ）および膵臓始原細胞（図１ｃ）のほぼ均質な培養物を生成した。特筆すべきことに、ＳＲ１４２３は、外胚葉および内胚葉に分化する堅牢な能力を示した（それぞれＯＴＸ２およびＳｏｘ１７によって示されるように）が、商業キットを使用して分化したときに中胚葉マーカー、ブラキュリを発現できなかった（図２）。３つの胚葉がすべて達成されなかったため、ＳＲ１４２３は、ｉＰＳＣに対する多能性の許容される基準に適合せず、代わりに多分化能または非多能性とみなされ得る。
【０１７２】
細胞株の特徴付け。ＳＲ１４２３は、多能性細胞に典型的なマーカーを発現し（図３Ａ
）、正常な核型を有する（図３Ｂ）。そのＤＮＡ  ＳＴＲプロファイルは、ドナー組織と一致し（図３Ｃ）、ＮＩＨ、ＡＴＣＣ、およびＤＳＭＺデータベース内のすべての指紋と比べてユニークである単一の細胞株を確認する。加えて、ＳＲ１４２３は、多能性細胞株に典型的な速度で増殖する（図３Ｄ）。同じドナーおよびリプログラミング実験からの他のｉＰＳＣ細胞株も優先分化を示したことが観察された。ＩＰＳＣ株「Ｂ」はまた、内胚葉に対して良好に分化したが、ｉＰＳＣ株「Ｃ」および「Ｄ」は内胚葉系譜への分化の優先性を示さなかった（データは示さない）。発現遺伝子の全ゲノムマイクロアレイプロファイリングをＳＲ１４２３ならびに株Ｂ、Ｃ、およびＤにおいて行った。この比較によって、ドナーまたはリプログラミング方法による遺伝子発現の違いが排除された。少なくともＬｏｇ２の倍率変化発現に基づく教師なし階層的クラスタリング分析により、ＳＲ１４２３クラスタが細胞株Ｂとともにクラスタリングされたが、ＣおよびＤとは異なっていたことが明らかになった。これにより、内胚葉系譜に対する堅牢かつ優先的な分化と相関する遺伝子発現パターンを同定する（図４Ａ）。１０個の最も差次的に発現された遺伝子のうち、ＢＨＭＴ２、Ｃｏｘ７Ａ１、ＨＳＰＢ２、およびＮＡＰ１Ｌ１は、ｑＲＴ−ＰＣＲ測定を使用する内胚葉を形成する能力と有意に相関した（図４Ｂ）。これらの結果は、定義された遺伝子サブセットの遺伝子発現を使用して、治療的有用性を有する特定のｉＰＳＣ株を同定することができることを示唆する。
【０１７３】
細胞分化。多能性幹細胞集団からの膵臓細胞の産生を報告する他の群は、ユニークな幹細胞集団と組み合わせてユニークな細胞培養プロトコルを使用する。これは、各プロトコルが特定の開始細胞集団に合わせて調整されていることを意味し、開始細胞集団が分化の可能性の主な決定要因であるという概念に信憑性を与えている。
【０１７４】
ほとんどの方法では、β細胞の生成は、胚性膵臓発生の既知の段階を通じて、多能性細胞の進行的分化によって生じる。この進行は、胚体内胚葉の形成から始まり、その後、膵臓始原細胞、膵内分泌系（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ）、最後にホルモン発現膵臓細胞への移行が続く。従来、Ｓｏｘ１７およびＨＮＦ３βを発現する胚体内胚葉細胞の産生は、哺乳動物における内胚葉パターン化に関与するシグナル伝達分子であるアクチビンＡおよびＷｎｔ３ａに曝露することによって達成された。膵臓十二指腸ホメオボックス−１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ−１）（Ｐｄｘ１）の発現によって同定される膵臓始原体は、ＨＯＸ遺伝子をレチノイン酸で活性化した後に生じるが、シクロパミンでヘッジホッグシグナル伝達を阻害する。Ｐｄｘ１およびＮｋｘ６．１の両方を発現する内分泌細胞は、パターン化タンパク質ノギンの存在下で、膵管細胞の形成に関与するＫＧＦシグナル伝達の活性化によって膵臓始原体から形成される。ホルモンを発現する表現型への成熟は甲状腺ホルモンによって促される。分化プロトコルに用いられる増殖因子およびホルモンを小分子に置き換えるためにかなりの努力がなされている。
【０１７５】
本開示の方法は、ＳＲ１４２３および他の幹細胞のβ細胞表現型への分化を駆動することが可能である。開示されたプロトコルは、分化の２８日目までに高純度の内分泌膵臓細胞集団を生成した（図５Ａ）。代表的な画像の定量化は、６８％が内分泌膵臓マーカーＮｋｘ６．１を発現し、６６．８％が後期膵臓マーカーＮｅｕｒｏＤ１を発現し、６６．５％がインスリンを発現している細胞からなる集団を明らかにした（図５Ｂ）。
【０１７６】
本プロトコルは、Ｗｎｔ３Ａへの胚体内胚葉細胞の曝露を提供せず、任意選択で、培養の４〜７日目にＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害の有無にかかわらず、胚体内胚葉をＫＧＦ（ＦＧＦ７）に曝露しない。分化の初期段階におけるＫＧＦの影響を調べたところ、膵臓およびインスリン産生細胞の産生の著しい減少を示した（図６Ａ）。この結果がＳＲ１４２３細胞株に特異的であったかどうかを判定するために、開示されたプロトコルを、マッチングの結果を有する参照胚性幹細胞株ＢＧＯ１Ｖを使用して既知のプロトコルと比較した（図６Ｂ、６Ｃで定量化）。並べて使用された開示されたプロトコルは、これらの細胞株にわたってより多くのインスリン産生細胞を生成した。
【０１７７】
開示されたプロトコルに従ってＳＲ１４２３から分化した細胞は、インスリン（図７）およびグルカゴン（図示せず）を培地に分泌する。ＳＲ１４２３の連続的な分化は、われわれのプロトコルにより分化した場合、一貫した、再現性の高いレベルのＣ−ペプチド検出（図７）およびより高いレベルを示す。これらの細胞は、グルコース応答様式（図示せず）でインスリンを分泌することができる。したがって、これらのホルモン分泌細胞は、細胞置換療法の理想的な候補であり得る。さらに、培養培地にグルカゴンを添加することにより、成熟したインスリンおよびグルカゴン発現細胞の最適なバランスを実現することが可能であり、インスリンおよびグルカゴンを共発現する細胞の量を減少させる利点がある（図１０Ａ〜Ｃ）。
【０１７８】
実施例３−動物モデルにおける開示される治療細胞による糖尿病の治療
アルギン酸塩カプセル化：ＳＲ１４２３の分化平面培養物をセルリフターを使用して手動で遊離させ、６ウェル浮遊培養皿中で９５ｒｐｍで一晩揺り動かした。形成されたクラスタを１３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４中ですすぎ、２％Ｐｒｏｎｖａ  ＵＰ  ＭＶＧアルギン酸塩（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ）中に２Ｅ６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。アルギン酸塩／細胞混合物をシリンジに充填し、２０ｍＭのＢａＣｌ２、１３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭＯＰＳの重合浴に、０．２４μｍノズルで４ｍｌ／分および７ｋＶでＮｉｓｃｏ静電液滴発生器を介して供給したか、または手動で滴下した。ビーズを４回すすぎ、移植まで分化培地に戻した。
【０１７９】
マウスにおける糖尿病の誘導：８〜１０週齢の免疫適格性（Ｉｍｍｕｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＣＤ１マウスを使用して、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、ＶＷＲ＃１０２５１５−８４０）で糖尿病を誘導した。ＳＴＺをマウスに腹腔内（２００ｍｇ／ｋｇ）注入した。ＳＴＺ誘導性糖尿病は、血糖値を測定することによって確認された。
【０１８０】
アルギン酸塩カプセル化ＳＲ１４２３分化細胞の移植：ＳＴＺ誘導型糖尿病マウスを２０ｍｇ／ｋｇのトリブロモエタノール（Ｓｉｇｍａ  ＃７７６５５７８８８）で麻酔し、腹部を剃毛し、イソプロパノールで滅菌した。胸骨下の腹部中央に垂直切開を行った。腹膜にアルギン酸塩ビーズを移植し、切開部を縫合糸で閉じた。術後、マウスにケトプロフェン（２．５ｍｇ／Ｋｇ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｐ０８Ｄ００９）を３日間投与した。移植後に定期的にマウスを観察した。血糖値は、市販の血糖計を使用して尾静脈から少量の血液を採取することによって、週に２回モニタリングした。血糖の低下は、移植後４８時間以内に明らかになり、数週間維持された（図８）。
【０１８１】
動物モデルにおける糖尿病の逆転。移植のために島細胞を免疫保護する一般的な方法は、アルギン酸塩を含むマイクロビーズ内に細胞を埋め込むことである。アルギン酸塩の中に埋め込まれ、腹膜に移植される代理膵臓細胞は、糖尿病の短期的な逆転を示すことができ、概念実証の良い基盤を提供する。線維症を刺激する傾向が低い修飾アルギン酸塩で形成されたマイクロビーズは、通常のげっ歯類で最大６ヶ月間糖尿病を逆転させることができた。ＳＲ１４２３生成細胞が免疫保護デバイス内で糖尿病を逆転させる能力を実証するために、アルギン酸塩ビーズ内に分化細胞を埋め込み、これらを化学的に誘導された糖尿病の正常マウスの腹膜に移植した。血糖の低下は、移植後４８時間以内に明らかになり、数週間維持された（図８）。
【０１８２】
実施例４−開示される方法を使用して非ヒト霊長類細胞を培養する
多能性幹細胞を単離し、幹細胞をインスリン産生膵臓系譜に効率的に分化するための開示された方法は、非ヒト組織から始めて、非膵臓組織から始めるときにも有効である。アカゲザル種の３つの非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の皮膚生検から線維芽細胞を採取し、ヒト細胞について記載したものと同様に培養した（すなわち、実施例１の培養および分化ステップ）。リプログラミング遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ−Ｍｙｃを、２つのエピソーム発現プラスミドのエレクトロポレーションを介して初代線維芽細胞に導入した。ＮＨＰドナーの一次組織から生成された幹細胞株は、多能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−８０、およびＴｒａ−１−６０を発現した。これらの株を、内胚葉誘導剤アクチビンＡおよびワートマニンに４日間曝露した後に、内胚葉マーカーを発現する能力についてスクリーニングした。ＮＨＰドナーの各々から内胚葉マーカーを発現する細胞の割合が最も高い培養物を選択し、その後、１２日間の膵臓分化プロトコルに曝露した後に膵臓マーカーを発現する能力についてスクリーニングした。３つすべてのＮＨＰドナーからの組織は、記載の１２日間の分化プロトコルに曝露すると、膵臓内胚葉細胞を効率的に生成する少なくとも１つの幹細胞株を得た。図９は、ＮＨＰドナーに由来するこれらの株のうちの１つの代表的な例を示す。
【０１８３】
実施例５−開示される治療細胞を用いたヒト成人における糖尿病の治療
この実施例は、ヒト成人におけるＩ型糖尿病を治療するための治療細胞を生成するために開示されたプロトコルを使用する方法を例示する。
【０１８４】
インスリン依存性糖尿病の成人ヒト対象は、治療有効量の開示されたマクロカプセル化されたインスリン産生細胞を含む組成物含む移植片を、対象の網のポーチまたは腹腔内に受ける。対象は血糖値について評価される。対象は、対象の血糖値が安定していることを確認するため、治療上有効な数のマクロカプセル化細胞の移植後に監視される。対象をさらに、経時的にグリコシル化ヘモグロビン、および糖尿病の併存症についてスクリーニングする。
【図１】
2021513348.tif 000003
【図２】
2021513348.tif 000004
【図３】
2021513348.tif 000005
【図４】
2021513348.tif 000006
【図５】
2021513348.tif 000007
【図６】
2021513348.tif 000008
【図７】
2021513348.tif 000009
【図８】
2021513348.tif 000010
【図９】
2021513348.tif 000011
【図１０】
2021513348.tif 000012
【国際調査報告】
2021513348.tif 000013
2021513348.tif 000014
2021513348.tif 000015
2021513348.tif 000016
2021513348.tif 000017