(57)【要約】  本開示は、概して、植物に有益な特性を付与することができる微生物をスクリーニング、同定および産生するための方法を対象とする。いくつかの側面では、植物根浸出物または根浸出物化合物を用いて、実験進化により、改善した植物関連土壌微生物が生成される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物関連土壌微生物（ＰＡＳＭ）細胞の製造方法であって、
（ａ）対象の植物によって生産された根浸出物化合物を含む第１の培地中またはその上で、ＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群を増殖させる工程、
（ｂ）得られたＰＡＳＭ細胞の少なくとも一部を採取し、採取したＰＡＳＭ細胞を、目的の植物によって産生された根浸出物化合物を含む第２の培地の中または上で増殖させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返す工程、
（ｄ）遺伝的に均一な個体群と比較して異なる少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を選択する工程
を含む、製造方法。
【請求項２】
工程（ａ）または工程（ｂ）によって必要とされる増殖期のうちの少なくとも１つの間に、ＰＡＳＭ細胞が対数増殖期まで増殖される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記第１の培地および／または前記第２の培地が、液体培地または固体培地を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
根浸出物化合物が、工程（ａ）で増殖したＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群に対して抗菌性の抗菌性化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
根浸出物化合物が、以下：
（ｉ）フェノール、ベンゾオキサジノン、フラボノイドまたはイソフラボノイド、タンニン、クマリン、テルペノイド、アルカロイド、ｔ−ケイ皮酸、フェルラ酸、ｐ−クマル酸、バニリン酸、シリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、インドール酢酸、安息香酸、またはロスマリン酸；
（ｉｉ）植物由来の単糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖アルコールまたは有機酸；および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に列挙された化合物もしくは化合物のクラスのいずれかの天然または合成の誘導体
の１つまたは複数である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
１以上の根浸出物化合物が、クメストロール、ゲニステイン、グリシテインおよびダイゼインからなる群から選択されるイソフラボノイドである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞が、工程（ａ）で増殖したＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群と比較して、以下：
（ｉ）増加した増殖率；
（ｉｉ）増加した細胞の長さおよび／または細胞サイズ；および／または
（ｉｉｉ）増加したバイオマス；
（ｉｖ）植物の根のコロニー形成を改善する遺伝子型または表現型の形質；および／または
（ｖ）強化されたバイオフィルム形成能
の１以上に基づいて選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞が、工程（ａ）で増殖したＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群と比較して、以下：
（ｉ）根浸出物化合物に対する増加した耐性または新規免疫；
（ｉｉ）根浸出物化合物に対する増加した耐性または新規免疫（ここで、根浸出物化合物は抗菌性である）；および／または
（ｉｉｉ）根浸出物化合物を代謝する増加したまたは新規の能力
の１以上に基づいて選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞が、工程（ａ）で増殖したＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群と比較して、以下：
（ｉ）根浸出物化合物を代謝する新規または改善した能力；
（ｉｉ）植物の根のコロニー形成を改善する遺伝子型または表現型の形質；および／または
（ｉｉｉ）少なくとも１つの有益な表現型形質を植物に付与する改善した能力
の１以上に基づいて選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記第２の培地が液体培地であり、
前記少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞が、第２の培地で増殖したＰＡＳＭ細胞の光学密度に基づいて選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ＰＡＳＭ細胞が、細菌細胞または真菌細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記第１の培地および前記第２の培地が、同じ根浸出物化合物を使用して、または、それに由来して調製される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記第１の培地および前記第２の培地が、同じ根浸出物化合物を、異なる量または濃度含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
選択された少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を発酵させることをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
選択された少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を植物に適用することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
選択された少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞が内生胞子形成細菌である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１７】
少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞が、遺伝的に均一な個体群と比較して、より早い発芽時間を有する細胞に基づいて、工程（ｄ）で選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記ＰＡＳＭ細胞がバチルス種に由来する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１９】
対象の植物が、ダイズ植物である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記発酵が、少なくとも約１×１０ ５コロニー形成単位（ＣＦＵ）の選択された少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を有する、選択された少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞の発酵産物を生成する、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記発酵産物が、少なくとも約１×１０ ６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の選択された少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を有する、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
（ｉ）対象の植物によって産生された根浸出物化合物を含む培地中のケモスタット中で遺伝的に均一なＰＡＳＭ細胞の個体群を増殖させる工程；および
（ｉｉ）遺伝的に均一な個体群と比較して異なる少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を選択する工程
を含む、ＰＡＳＭ細胞の製造方法。
【請求項２３】
前記根浸出物化合物が、工程（ａ）で増殖したＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群に対して抗菌性の抗菌性化合物である、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記根浸出物化合物が、以下：
（ｉ）フェノール、ベンゾオキサジノン、フラボノイドまたはイソフラボノイド、タンニン、クマリン、テルペノイド、アルカロイド、ｔ−ケイ皮酸、フェルラ酸、ｐ−クマル酸、バニリン酸、シリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、インドール酢酸、安息香酸、またはロスマリン酸；
（ｉｉ）植物由来の単糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖アルコールまたは有機酸；および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に列挙された化合物もしくは化合物のクラスのいずれかの天然または合成誘導体
の１以上である、請求項２２または２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記１以上の根浸出物化合物が、クメストロール、ゲニステイン、グリシテインおよびダイゼインからなる群から選択されるイソフラボノイドである、請求項２４に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞が、イソフラボノイドに対する耐性の増大に基づいて選択される、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記ケモスタットの流出物からＰＡＳＭ細胞をサンプリングして、ＰＡＳＭ細胞における遺伝的および／または表現型の変化をモニターすることをさらに含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２８】
前記培地中の根浸出物化合物の濃度が、ＰＡＳＭ細胞の増殖中に増加し、選択圧を増大させる、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の製造方法を使用して生産されたＰＡＳＭ細胞。
【請求項３０】
植物の根圏から得られたＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群に由来するＰＡＳＭ細胞であって、
ＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群と比較して：
（ｉ）増加した増殖率；
（ｉｉ）増加したバイオマス；
（ｉｉｉ）根の浸出物中の抗菌化合物に対する増加した耐性または新規免疫；および／または
（ｉｖ）植物の根のコロニー形成を改善する遺伝子型または表現型の形質
を有する、ＰＡＳＭ細胞。
【請求項３１】
植物の根圏から得られた遺伝的に均一なＰＡＳＭ細胞個体群に由来するＰＡＳＭ細胞であって、
ＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群と比較して：
（ｉ）増加した増殖率、
（ｉｉ）増加した細胞の長さおよび／または細胞サイズ、
（ｉｉｉ）増加したバイオマス、
（ｉｖ）根の浸出物に存在する抗菌化合物に対する増加した耐性または新規免疫、および／または
（ｖ）植物の根のコロニー形成を改善する遺伝子型または表現型の形質
を有し、
当該ＰＡＳＭ細胞は、根浸出物化合物を含む培地中で遺伝的に均一なＰＡＳＭ細胞の個体群を増殖させることによって生成される、ＰＡＳＭ細胞。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＰＡＳＭ細胞を、植物の安定的または一時的なコロニー形成をもたらすのに十分な量で、植物に適用することを含む、有益な表現型の形質を植物に提供する方法。
【請求項３３】
請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＰＡＳＭ細胞を、土壌または植物成長培地に、植物の根圏の安定または一時的なコロニー形成をもたらすのに十分な量で適用すること、および
当該土壌または植物成長培地で当該植物を成長させること
を含む、有益な表現型形質を植物に提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／６１５，８１６号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、植物に有益な特性を付与することができる微生物、ならびに、かかる微生物をスクリーニング、同定および産生するための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
研究者は、大腸菌を「試験対象」として実験進化に関連する研究を行ってきた。これらの進化研究は、細菌が複数世代にわたって同じ環境に適応し、細胞サイズと平均適合度に関して急速に進化することを示している。これらの研究者らは、一般に、ミクロ進化とそれが進化に関して提供する教訓を理解することに焦点を当てている。したがって彼らは、細胞増殖に、典型的な実験用培地を使用している。さらに、特定目的を対象とする、改善された脂質について、生じた微生物をスクリーニングするのではなく、むしろ相違について結果を分析するのが一般的である。
【０００３】
米国特許第９，１５０，８５１号は、植物に少なくとも１つの有益な表現型形質を付与することのできる微生物の選択方法を開示している。本方法は、多くの工程を含み、これら工程には、１以上の微生物の第１セットの存在下、成長培地で植物を成長させること、有益な植物表現型形質選択基準に基づいて１以上の植物を選択すること、植物からの１以上の微生物または植物と、当該植物を含む成長培地との第２セットを得ること、前記工程を１回以上繰り返すこと（１以上の微生物の前記第２セットは、任意の連続する繰り返しの微生物の第１セットとして用いる）、ならびに、植物に有益な表現型の形質を付与することに関連する１以上の微生物を選択することを含む。したがって、これらの方法は、とりわけ、プロセスの反復ごとに植物を成長させて分析する必要があるため、手間がかかるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第９，１５０，８５１号
【０００５】
本開示は、例えば、実験進化を使用して、植物に有益な特性を付与することのできる微生物をスクリーニング、同定および生成するための方法を提供する。本開示は、植物自体を遺伝的に改変することなく、植物関連土壌微生物（ＰＡＳＭ）を増強する方法を提供し、ＰＡＳＭは、所与の植物と相互作用し、植物の成長または健康を改善するか、または他の有益な表現型形質を提供する。かかる方法は、様々な植物種（例えば、限られた遺伝情報が利用可能な種を含む）に広く適用され、本明細書に詳細に記載されるような他の利益を提供し得る。この開示全体を通して、「細胞」という単語が後に続く場合のみ、頭字語ＰＡＳＭは「植物関連土壌微生物（microorganism）」ではなく「植物関連土壌微生物（microbial）」を意味する。
【０００６】
いくつかの側面において、本方法は概して以下を含む：（ａ）対象の植物によって産生された根浸出物または根浸出物化合物のアリコートを含む第１培地の中またはその上で、ＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群を増殖させる工程；（ｂ）得られたＰＡＳＭ細胞の少なくとも一部を採取し、採取したＰＡＳＭ細胞を、目的の植物によって産生された根浸出物または根浸出物化合物のアリコートを含む第２の培地の中またはその上で増殖させる工程；（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返す工程；および（ｄ）遺伝的に均一な個体群と比較して異なる少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を選択、同定および／または生成する工程。いくつかの側面において、選択されたＰＡＳＭ細胞は、遺伝的に均一な個体群と比較して、少なくとも１つの有益な表現型形質を植物に付与する改善された能力を有する。いくつかの例示的な側面において、ＰＡＳＭ細胞を、以下に記載するとおり、ハイスループット自動化システムの一部として、工程（ｄ）の前に複数の継代（例えば、工程（ｃ）の５、１０、２０またはそれ以上の反復）に供しても良い。根浸出物または根浸出物化合物は、本開示による方法全体にわたって、変更されるか、または、一貫していてもよい（例えば、根浸出物化合物の濃度および／または組み合わせは、選択の前に、異なる継代において滴定または他の方法で変更されてもよい）。いくつかの態様では、本開示は、以下を有する植物根圏から得られた遺伝的に均一なＰＡＳＭ細胞の個体群に由来する改善されたＰＡＳＭ細胞を提供する：（ａ）増加した増殖速度；（ｂ）増加した、細胞の長さおよび／または細胞サイズ；（ｃ）増加したバイオマス；（ｄ）根の浸出物に存在する、抗菌化合物に対する増加した抵抗性（resistance）、耐性（tolerance）または新規免疫；（ｅ）改善した胞子発芽の改善（例えば、野生型と比較して、より早い発芽またはより完全な発芽；すなわち、野生型と比較して、より高い割合の細胞が発芽する。例えば、少なくとも約８０％発芽細胞、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％）；（ｆ）発芽後の栄養細胞の増殖の改善；（ｇ）ＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群と比較して、植物の根のコロニー形成を改善する遺伝子型または表現型の形質；および／または（ｈ）ＰＡＳＭ細胞の他の好ましい生理学的または形態学的特徴の改善。かかるＰＡＳＭ細胞は、根浸出物、または根浸出物に由来する１以上の化合物を含む培養中で、遺伝的に均一なＰＡＳＭ細胞の個体群を増殖させることによって生成することができる。本開示で使用される場合、「抗菌」の語は、殺菌性、静菌性、殺真菌性および／または静真菌性を意味する。
【０００７】
他の側面において、本開示は、ＰＡＳＭ細胞の製造方法を提供し、当該方法は、以下を含む：（ａ）対象の植物によって生産された根浸出物化合物を含む培地中、ケモスタットで遺伝的に均一なＰＡＳＭ細胞の個体群を増殖させる工程；（ｂ）遺伝的に均一な個体群と比較して異なる少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を選択する工程。一側面において、根浸出物化合物は、工程（ａ）で増殖したＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群に対して抗菌性の抗菌性化合物である。
【０００８】
いくつかの側面において、上記段落に記載される選択工程の後に、遺伝的に均一な個体群と比較して異なる、選択された少なくとも1つのＰＡＳＭ細胞の発酵産物を産生する。
【０００９】
いくつかの側面において、抗菌化合物は、以下のうちの1つまたは複数である：（ａ）フェノール、ベンゾオキサジノン、フラボノイドまたはイソフラボノイド、タンニン、クマリン、テルペノイド、アルカロイド、ｔ−ケイ皮酸、フェルラ酸、ｐ−クマル酸、バニリン酸、シリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、インドール酢酸、安息香酸、またはロスマリン酸；（ｂ）植物由来の単糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖アルコールまたは有機酸；および／または（ｃ）（ａ）または（ｂ）に列挙された化合物または化合物のクラスのいずれかの天然または合成誘導体。
【００１０】
特定の側面において、１以上の抗菌化合物は、クメストロール、ゲニステイン、グリシテインおよびダイゼインからなる群より選択されるイソフラボノイドである。別の側面において、前記少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞は、イソフラボノイドに対する耐性の増大に基づいて選択される。いくつかの側面において、開示される方法は、ケモスタットの流出物からＰＡＳＭ細胞をサンプリングして、ＰＡＳＭ細胞における遺伝的および／または表現型の変化をモニターすることをさらに含む。他の側面において、培地中の根浸出物化合物の濃度は、ＰＡＳＭ細胞の増殖中に増加し、選択圧を増加させる。
【００１１】
いくつかの側面において、本開示は、植物に有益な表現型形質を付与する方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の例示的な側面に従って生成された改善したＰＡＳＭ細胞を、植物の安定的なまたは一時的なコロニー形成をもたらすのに十分な量で植物に適用することを含む。いくつかの例示的な側面において、改良されたＰＡＳＭ細胞は、代わりに、土壌または植物成長培地に適用されてもよく、その後、対象の植物を成長させるのに使用される。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、上記工程（ａ）におけるＰＡＳＭ細胞の個体群は、遺伝的に均一ではないが、１以上の親株に由来する変異体ＰＡＳＭ細胞の個体群であり、そのような個体群は、親株を含んでも、含んでいなくてもよい。この実施形態の別の側面では、工程（ａ）のＰＡＳＭ細胞の個体群は、異なる属および／または種および／またはそれらの突然変異体からのＰＡＳＭ細胞の収集物（collection）または共同体（consortia）を含む。
【００１３】
別の実施形態では、工程（ａ）におけるＰＡＳＭ細胞の個体群は、土壌中に存在し、かつ、本明細書では土壌阻害剤と呼ばれる、ＰＡＳＭの増殖を阻害することが既知である化合物の存在下で増殖する。土壌阻害剤は、植物によって生成される根浸出物化合物、および、微生物や線虫などのＰＡＳＭの土壌生息捕食者によって生成される化合物、または、対象のＰＡＳＭに対して抗菌性の、ＰＡＳＭによって生成される化合物を包含する。したがって、すべての土壌阻害剤が植物由来であるとは限らない。
【００１４】
一態様において、当該方法は一般に以下を含む：（ａ）土壌阻害剤のアリコートを含む第１の培地の中またはその上で、ＰＡＳＭ細胞の個体群、共同体または収集物を増殖させる工程、（ｂ）得られたＰＡＳＭ細胞の少なくとも一部を採取し、採取したＰＡＳＭ細胞を、土壌阻害剤のアリコートを含む第２の培地の中またはその上で増殖させる工程、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返す工程、および（ｄ）出発個体群、共同体または収集物と比較して異なる少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を選択、同定および／または生成する工程。土壌阻害剤は、本開示による方法全体にわたって、変更されるか、または、一貫していてもよい（例えば、土壌阻害剤の濃度および／または組合せは、選択前に種々の継代で滴定または他の方法で変更されてもよい）。いくつかの側面において、選択する工程の後に、出発個体群、共同体または収集物と比較して異なる、選択された少なくとも1つのＰＡＳＭ細胞の発酵産物を産生する。
【００１５】
本開示における、これらの側面および他の側面を、以下でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、継代後の野生型バチルス細菌（ＷＴ）およびその細菌の変異体（Ａ１〜Ａ１０）の発芽開始時間および増殖速度を示す。ＷＴは、表示されている最も低い曲線である（ブランクに対応するフラットラインを除く）。グラフの右端から見ると、各変異体の曲線は、Ａ９、Ａ１、Ａ３、Ａ６、Ａ２、Ａ５、Ａ７、Ａ８、Ａ１０の順に上から下に表示される。
【図２】図２は、野生型バチルス菌（ＷＴ）で処理した種子の根と比較した、野生型バチルス菌の変異体（Ａ１〜Ａ１０）で処理した種子から成長したダイズの根の表面積の総パーセントを示し、野生型で処理した種子の根の表面積は１００％表面積に設定した。
【図３】図３は、野生型バチルス菌（ＷＴ）で処理した種子の根と比較した、野生型バチルス菌の変異体（Ａ１〜Ａ１０）で処理した種子から成長したダイズの根の根重量の総パーセントを示し、野生型で処理した種子の根の根重量は１００％根重量に設定した。
【図４】図４は、野生型バチルス細菌（ＷＴ）および当該細菌の変異体（Ａ１〜Ａ１０）で処理した種子から成長した植物の葉面積を示す。
【図５】図５は、ダイズ根浸出物上で増殖した株２（図ではバチルスＷＴ２と称される）および選択された派生個体群の第１のセットの増殖率を示す。
【図６】図６は、ダイズ根浸出物上で増殖した株２および選択された派生個体群の第２のセットの増殖率を示す。
【図７】図７は、ダイズ根浸出物上で増殖した株２（図ではバチルスＷＴ２と称される）および選択された派生個体群の第３のセットの増殖率を示す。
【図８】図８は、株２（図ではバチルスＷＴ２と称される）および選択された派生個体群で処理した２週齢のダイズ実生の根の総表面積（ｃｍ２単位）を示す。
【図９】図９は、株２（図ではバチルスＷＴ２と称される）および選択された派生個体群で処理した２週齢のダイズ実生から得られた根の合計長さ（ｃｍ単位）を示す。
【図１０】図１０は、株２（図ではバチルスＷＴ２と称される）および選択された派生個体群で処理した２週齢のダイズ実生から得られた新芽の総重量（ｇ）を示す。
【図１１】図１１は、株２（図ではバチルスＷＴ２と称される）および選択された派生個体群で処理した２週齢のダイズ実生から得られた乾燥芽の総重量（ｇ）を示す。
【００１７】
種々の実施形態の説明
植物に有益な表現型形質を提供することのできるＰＡＳＭを、スクリーニング、同定および／または生成するための様々な方法が、本明細書に記載されている。いくつかの例示的な側面において、前記方法は以下を含む：（ａ）対象の植物により生成された根浸出物または根浸出物化合物を含む土壌阻害剤のアリコートを含む第１の培地中またはその上でＰＡＳＭ細胞の個体群、収集物または共同体を増殖させる工程、（ｂ）得られたＰＡＳＭ細胞の少なくとも一部を採取し、採取したＰＡＳＭ細胞を土壌阻害剤のアリコートを含む第２の培地の中またはその上で増殖させる工程、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返す工程、および、（ｄ）ＰＡＳＭ細胞の出発個体群、収集物または共同体と比較して異なる少なくとも１つのＰＡＳＭ細胞を選択する工程。改良されたＰＡＳＭを含む組成物、および、それを植物に適用する方法も提供される。
【００１８】
いくつかの側面において、本方法は、１以上の土壌阻害剤を使用して、微生物の進化および共適応を推進し、微生物株の性能を高める。土壌阻害剤は、土壌中に存在し、１以上のＰＡＳＭの増殖を阻害する化合物を含む。土壌阻害剤は、根浸出物などの植物由来、微生物由来、線虫由来であるか、あるいは、外部供給源、例えば肥料、窒素または農薬を含む他の化学物質などを介して追加される。土壌阻害剤の例としては、２，４−ジアセチルフロログルシノール（ＤＡＰＧ）、ピロルニトリン、シアン化水素、ピオルテオリン、および以下で説明する根浸出物化合物が挙げられる。
【００１９】
いくつかの側面において、本方法は、根浸出物（または根浸出物に由来する１以上の化合物）を使用して、微生物の進化および共適応を促進し、植物を改善するための微生物株の性能を高める（たとえば、植物の健康を高める）。理論に縛られることを望まないが、このアプローチは、作物の根浸出物を使用することにより、微生物の根圏コンピテンシー（土壌微生物が植物の根の上またはその近くで増殖して定着する能力）を向上させることを目的としている。この根圏コンピテンシーの向上により、微生物は、植物の成長と活力をよりよく向上させることができ、そうでなければ、植物に有益な表現型の形質を付与する。
【００２０】
本明細書に記載される方法は、植物の形質における観察可能な変化とは無関係に実施することができ、したがって、ロボット工学および自動化を使用したハイスループット法への変換が可能である。特に、本方法は、継代間の改善について、植物またはＰＡＳＭのいずれも評価せずに継代により実施することができ、これによって、従来の選択方法では不可能であるハイスループットの実験進化が可能になり、とりわけ、プロセスの各反復で植物を成長させ、分析することを要する。
【００２１】
植物の根圏微生物相は、植物の根浸出物（分泌物）によって影響を受ける土壌の狭い領域に生息する多数のＰＡＳＭ（例えば、細菌、真菌、原生生物）を含む。植物の根は、根浸出物として根圏に膨大な数の化合物を分泌し、根浸出物は根圏の微生物群集構造の主要な決定要因である。さらに、光合成で固定された全炭素の約５％〜２１％が、根浸出物を通じて根圏に移動する。以下でさらに詳細に説明するように、根浸出物には、アミノ酸、有機酸、炭水化物、糖、粘液、ビタミンおよびタンパク質などの水溶性化合物が含まれる。
【００２２】
根浸出物は、根圏の物理的および生化学的特性を変化させ、根の成長および植物の生存に貢献する。例えば、根は、水を分泌して根圏を湿らせ、根の膨張またはヒドロキシルイオンが局所的なｐＨレベルを調整して栄養素の吸収を改善する。植物は、物理的または生化学的刺激に応答して、または、ＰＡＳＭに応答して、根浸出物に分泌される化合物の量と種類を変更することがある。例えば、化合物は、局所的な根圏の病原菌（例えば、抗菌化合物）の量を特異的に低減し、または、有益もしくは共生細菌（例えば、栄養素および／またはシグナル分子）の増殖を促進するために分泌されることがある。このように、根圏は動的環境であり、植物とそのＰＡＳＭ微生物叢との間の相互作用は、植物の成長、健康、および、重要な表現型の形質の発達／発現において重要な役割を果たす。
【００２３】
根浸出物は、根圏で起こる、植物と土壌との生物相互作用の調節における重要なメカニズムである。ＰＡＳＭは、植物の機能を強化するために宿主の生理機能を調節することが既知である。有益な相互作用において、土壌微生物は、成長、生物的および非生物的ストレス耐性ならびに作物収量を含む、植物の特性に影響を与える可能性がある。土壌関連微生物が根圏にコロニーを形成し、微生物の定着を達成する能力には、作物の根浸出物を利用する能力が必要である。根浸出物中の化学物質は、微生物の組成と作物根圏の多様性を調整する基質、走化性因子またはシグナル伝達分子として機能する。Chaparro et al．，”Rhizosphere Microbiome Assemblage is Affected by Plant Development,”2014年、ISME Journal、vol． 8、pp．790-803を参照されたい。根浸出物の組成は、植物の年齢、植物の種、環境、および根圏の微生物のコロニー形成など、いくつかの生物的および非生物的要因の影響を受ける。 Bais et al．， “Root Exudates Modulate Plant-Microbe Interactions in the Rhizosphere,” 2008, Secondary Metabolites in Soil Ecology, pp. 241-252, Springer, Berlin; Badri et al., “Regulation and Function of Root Exudates,” 2009, Plant, Cell and Environment, vol. 32, no. 6, pp. 666-681を参照のこと。根浸出物中の二次代謝産物は、植物宿主とリゾビウム属などの微生物との間の特殊な関連を促進する上でも重要である。Redmond et al.,“Flavones Induce Expression of Nodulation Genes in Rhizobium,” 1986, Nature, vol. 323, pp. 632-635を参照のこと。上記で特定した刊行物、および、これらにおいて引用される後続の刊行物すべての各々の内容が、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体が参照により組み込まれる。
【００２４】
自然界では、特定の植物の根圏微生物相は、有益で病原性があり、かつ、無害な共生ＰＡＳＭの複雑な混合物を含む。結果として、植物の成長、健康または特定の表現型の形質に対する個々の自然発生のＰＡＳＭの影響を特徴づけること、測定することは困難である。さらには、多くの効果と表現型の形質が、複数のＰＡＳＭの正味の効果として、または複数のＰＡＳＭ間の特定の相互作用によって生じる可能性があり、農業用途に役立つ可能性のある特定のＰＡＳＭを特定する取り組みをさらに複雑にする。農業において幅広い用途を有するＰＡＳＭを特定する取り組みは、有益なＰＡＳＭが植物の特定の種（または他の分類群）に固有である可能性があるという事実により、ある程度制限されている。例えば、第１の植物種の栄養素の取り込み、成長率または他の陽性表現型の形質を改善する細菌は、第２の種の根浸出物に存在する抗菌化合物によって、第２の植物種の根圏にコロニーを形成できない場合がある。同様に、有益なＰＡＳＭは、第１の植物の根浸出物に存在する化合物に依存するように進化し（たとえば、共生関係の一部として）、他の農業上重要な関連植物種によってそのようなＰＡＳＭの使用を制限する可能性がある。
【００２５】
本開示は、例えば、実験進化を使用して、特定の特性を有するＰＡＳＭを人工的に選択および操作する方法を提供する。いくつかの側面では、実験進化は、植物根浸出物または少なくとも１つの根浸出物化合物を含む培地内またはその上でＰＡＳＭを増殖させることにより実行され、反復の方法において、根浸出物に存在する抗菌化合物に対する新規または増加し抵抗性を備えた人工的に進化したＰＡＳＭを生成する。かかる方法は、植物によって生成した任意の化合物または化合物の複雑な混合物（例えば、根浸出物、希釈または分画根浸出物、１以上の根浸出物化合物など）に対する抵抗性または免疫が強化された、改良ＰＡＳＭの進化を導くための幅広いプラットフォームとして使用することができる。これらの方法を使用して設計された、改良ＰＡＳＭは、元の自然発生ＰＡＳＭよりも多くの植物種にコロニーを形成し、有益な表現型形質を与えることができるため、農業用途における有益なＰＡＳＭのより広範な使用が可能になる。
【００２６】
改善されたＰＡＳＭをスクリーニング、識別および生成する方法
一側面において、本明細書に記載の方法は、１以上の作物根浸出物または根浸出物の任意の成分を使用する。例えば、根浸出物の１つの成分が微生物の進化を促進していると判定された場合、現行の方法は、完全な根浸出物ではなく、この重要な成分を含む培地を使用して実施されてもよい。根浸出物は、ダイズまたはトウモロコシなどの任意の植物からのものであってもよく、あるいは、ダイズおよびトウモロコシなどの複数の植物からの根浸出物の組み合わせであってもよい。このような組み合わせは、複数の植物の根浸出物による微生物の増殖の促進に向けた進化を促進する可能性がある。根浸出物または根浸出物の主要成分を含む培地は、ＰＡＳＭの個体群、収集物または共同体を増殖させるための培地として使用することができ、１つのＰＡＳＭの遺伝的に均一な個体群が含まれる。
【００２７】
ＰＡＳＭまたはＰＡＳＭの個体群、収集物または共同体は、内生胞子形成細菌（例えば、バシルス（Bacillus）種）またはグラム陰性細菌（例えば、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）種）などの植物に関連する微生物であってよい。本明細書に記載された方法において指向進化のための出発点として使用されるＰＡＳＭは、（ｉ）ＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群、（ｉｉ）親株およびその変異体、または親株から派生した変異体を含むＰＡＳＭ細胞の個体群、または（ｉｉｉ）同一または異なる属および／または種を有する細菌株の収集物または共同体であってよい。「変異体」の語は、親株に由来する遺伝的変異体を指す。一実施形態では、変異体は、親株の識別（機能）特性すべてのうちの１以上を有する。そのような変異体は、親株との配列同一性が約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９８％超または約９９％超のゲノム配列を有する遺伝的変異体であり得る。変異体は、親株の細胞を化学物質または放射線で処理することにより、または、そのような親株の個体群から自然変異体（ファージ抵抗性または抗生物質抵抗性変異体など）を選択することにより、ゲノムシャッフリングにより、または、当業者に既知のその他の手段により、得ることができる。
【００２８】
作物の根浸出物を調製し、培地中で微生物を増殖させる方法は、当技術分野で既知であり、本明細書で例示される。微生物は通常、移動する前に対数増殖期まで増殖するが、これは厳密な要件ではない
【００２９】
開示される方法による使用に適した根浸出物化合物としては、対象の植物の浸出物に存在する任意の化合物（例えば、炭水化物、アミノ酸、酵素、タンパク質、ペプチド、有機酸、糖、脂質、一次および二次代謝産物、イオン、粘液、ならびにインドール酢酸などの植物ホルモン）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような化合物は、抗菌性であり得るか、または、有益、相互主義的、共生的または共生微生物の増殖および／またはコロニー形成を促進し得ることが理解される。かかる化合物はまた、シグナル伝達化合物（例えば、走化性を調節、促進または破壊する）または植物ホルモンであり得る。任意の所与の根浸出物化合物は、複数の構造的または機能的分類の対象となり得ることが理解される。
【００３０】
例示的な抗菌性根浸出物化合物としては、防御タンパク質、フィトアレキシン、インドール、ベンゾオキサジノン、テルペノイド、フラボノイド、アルカロイド、フェノール類（例えば、イソフラボノイド誘導体、タンニン、およびクマリン）、イソフラボノイド（例えば、イソフラボノン、イソフラボノン、イソフラボノン、イソフラボノイド、イソフラボノイドなど）、グリシテイン、またはダイゼイン、イソフラバン、プテロカルパン、ロテノイド）、有機酸（例えば、ロスマリン酸、リンゴ酸、ｔ−桂皮酸、フェルラ酸、クマリン酸、バニリン酸、シリンギ酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、インドール酢酸、クエン酸、コハク酸、安息香酸））、テルペン（例えば、ジテルペン、リザタレンＡ）、グルコシノレート、イソチオシアネート、チオシアネート、ニトリル、防御関連植物ホルモン（例えば、ジャスモン酸、ジャスモン酸、サリチル酸、アブシジン酸）、ならびに、抗菌性単糖類、多糖類対象の植物の根浸出物に存在するタンパク質、および糖タンパク質が挙げられる。
【００３１】
いくつかの例示的な側面において、根浸出物化合物は、植物根由来の炭素源または窒素源であり得る。このような化合物としては、限定はしないが、植物ホルモン、アミノ酸、ペプチド／タンパク質、炭水化物、糖アルコール、および有機酸が挙げられる。
【００３２】
いくつかの例示的な態様では、根浸出物化合物はシグナル伝達分子であり得る。例示的なシグナル伝達分子としては、限定されないが、アミノ酸（グルタミン、アルギニン、システイン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン）、酵素、ペプチド、糖（オリゴ糖、フルクトース、アラビノース、グルコース、マンノース、マルトース）、ビタミン、ヌクレオチド、有機酸（アスコルビン酸、酢酸、安息香酸、フェルラ酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸）、真菌刺激剤、植物阻害剤、化学誘引物質（例えば、アラビノガラクタンタンパク質）、成長調整剤、ステロール（カンペストロール、コレステロール、シトステロール、スチグマステロール）、脂肪酸（パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸）、タンニン、およびフェノール化合物が挙げられる。
【００３３】
本明細書に記載される根浸出物化合物は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。例えば、均一な個体群から選択されたＰＡＳＭは、本明細書に記載されている根浸出物化合物のいずれか１つまたは複数を含む増殖培地の中またはその上で増殖させることができる。 一部の側面において、１つ以上の根浸出物化合物の存在、量または濃度は、継代間で異なり得る（例えば、所与の根浸出物化合物の濃度は、複数の連続継代の後に徐々に上方に滴定され得る）。本方法を使用して生成された改善されたＰＡＳＭは、異なる根浸出物化合物を使用して複数回の継代に供され得る（例えば、複数の抗菌性根浸出物化合物に対する、増加した抵抗性または新規の抵抗性を有する改善されたＰＡＳＭを生成するため）。
【００３４】
本開示による方法は、ＰＡＳＭ細胞の以上の継代を含み得る。いくつかの側面において、かかる方法は、改善されたＰＡＳＭ細胞の選択の前に複数の継代を含む。具体的には、方法は、（ａ）対象の植物の根浸出物または根浸出物化合物の第１のアリコートにおいて、遺伝的に均一なＰＡＳＭの個体群を増殖させること、（ｂ）得られたＰＡＳＭ細胞を採取し、採取したＰＡＳＭ細胞を、対象の植物の根浸出物または根浸出物化合物の第２のアリコートにおいて増殖させること、および、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返すことを含んでもよい。一部の側面において、工程（ｂ）は、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００回または１００回より多く、繰り返されてもよい。連続継代は、植物根浸出物化合物を補充した液体微生物増殖培地で行うことができる。あるいは、植物根浸出物化合物が補充された固体（例えば、寒天）微生物増殖培地で連続継代を行うこともできる。連続継代はまた、完全な植物根浸出物またはその任意の画分に対して、液体形態または固体（例えば、寒天）形態の両方で行うことができる。本発明の方法により生産された人工的に進化した微生物細胞は、微生物細胞の遺伝的に均一な個体群と比較して、植物の根および／または植物の根のすぐ近く（すなわち、対象の植物の根圏）でコロニー形成および増殖する新規または改善された能力に基づいて選択することができる。いくつかの局面において、コロニー形成の改善は、植物の健康／活力の改善をもたらし得るか、または、植物に有益な表現型形質を付与し得る。
【００３５】
１回以上の継代の後に、改善されたＰＡＳＭが得られ得ることが理解される。例えば、本開示による方法は、５継代ごとに改善されたＰＡＳＭを得ることを含み得る。ＰＡＳＭは、遺伝的に均一な個体群と比較したさまざまな特性（これには、成長率の向上、バイオマスの増加、細胞の長さとサイズの増加、および／または芽胞形成ＰＡＳＭの場合は初期の発芽を含むが、これらに限定されない）に基づいて選択することができる。さらに、ＰＡＳＭは、根圏におけるバイオフィルムまたは一般的な改善された競争優位性を形成する強化された能力に基づいて選択でき、どちらも植物の根および／または植物の根のすぐ近くでコロニー形成および増殖する新規または改善された能力につながる。土壌または代理増殖ミックスでＰＡＳＭを増殖させ、かつ、細胞外高分子物質や炭水化物結合タンパク質などのバイオフィルムに存在することが既知の化合物の生産を測定することにより、強化されたバイオフィルム形成を測定することができ、改善したＰＡＳＭを選択することができる。
【００３６】
本開示による実験進化方法は、Sandberg et al．，“Evolution of Escherichia coli to 42°C and Subsequent Genetic Engineering Reveals Adaptive Mechanisms and Novel Mutations,” Molecular Biology and Evolution, 31.10 (2014): 2647-2662に記載されているプロトコルまたはパラメーターのいずれかを使用して実行することができ、本内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特に、いくつかの側面において、実験進化は、Sandberg et al．の材料および方法のセクションに記載されるように、自動化システムによって実行され得る。そのような自動化された方法は、１日複数回、指数増殖期中期のバッチ培養の通過を可能にするように構成され、比較的短時間で多くの世代の増殖を可能にし、選択プロセスを促進する。自動化システムを使用して、本明細書に記載の方法のいずれかまたはすべての工程を制御または実行することができる。例えば、自動化システムは、ＰＡＳＭ細胞の増殖、採取および／または選択を実行するよう構成され得る。いくつかの側面において、これらの工程は、ハイスループットスクリーニングおよび選択プロセスの一部として並行して実行されてもよい。
【００３７】
あるいは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gresham et al, “The Functional Basis of Adaptive Evolution in Chemostats,” FEMS Microbiology Reviews, 39 (2015): 2-16で説明または引用されているプロトコルまたはパラメーターのいずれかを使用して、実験進化法を実行することもできる。特に、いくつかの側面において、実験進化は、ケモスタットで行われてよく、これにより、Gresham et al．に記載されるように、一定の環境におけるＰＡＳＭ細胞の継続的な増殖が可能になる。ケモスタットは、対数増殖期などの特定の増殖相におけるＰＡＳＭ細胞の維持を可能にするように構成され得る。ケモスタットはまた、実験進化が進むにつれて根の浸出物化合物が徐々に増加するように構成されてもよい。
【００３８】
特定の側面では、根浸出物化合物に対する耐性の選択などの選択は、ケモスタット選択を使用して達成することができる。ケモスタットの選択は、微生物の連続培養を可能にするケモスタットを使用し、比増殖速度と細胞数とを独立して制御することができる。連続培養は本質的に一定容量のフローシステムであり、培地が連続的に加えられ、そこからオーバーフローが連続的に除去される。このようなシステムが平衡状態になると、細胞数と栄養素の状態は一定に保たれ、システムは定常状態になる。ケモスタットは、希釈率、ならびに、炭素源や窒素源などの制限栄養素の濃度の変更によって、培養物の個体群密度と比増殖率の両方を制御することができる。培養物が増殖するにつれて条件を変更する（例えば、根浸出物化合物の濃度を増加させる）ことにより、変更された条件でより速く増殖することができる個体群内の微生物が選択され、新しい条件でも十分に機能しない微生物を増殖させる。典型的には、かかる選択は、ケモスタット培養の増殖の経過にわたって、少なくとも１つの培養成分の漸進的な増加または減少を必要とする。
【００３９】
いくつかの側面において、変異体ＰＡＳＭを選択するのに使用される改善されたまたは新規な表現型には、以下の特性の１つ以上が含まれることがある：増殖率の改善、毒性／増殖阻害化合物への耐性、植物根浸出物に由来する化合物を代謝する改善した能力、または、植物の根のコロニー形成を改善する任意の特性。
【００４０】
特定の側面において、変異体ＰＡＳＭは、改善された植物活力など、目的の表現型形質を植物に付与することができる。本発明によれば、「改善された植物の活力」は、特定の作物特性が、本発明の組成物を適用することなく同じ条件下で生産された植物の同じ因子を超えて、測定可能な量または顕著な量だけ増加または改善されることを意味する。改善された植物の活力は、とりわけ、以下に示す植物の改善された特性によって特徴付けることができる：（ａ）植物の活力の改善、（ｂ）植物および／または植物製品の品質の改善、例えばタンパク質含有量の向上、（ｃ）視覚的外観の改善、（ｄ）老化の遅延、（ｅ）根の成長の増強および／またはより発達した根系（例えば、根の乾燥質量によって決定される）、（ｆ）根粒形成、特に根粒菌の根粒形成の増強、（ｇ）長い穂、（ｈ）より大きな葉身、（ｉ）クロロフィル含有量の増加、（ｊ）光合成活動期間の延長、（ｋ）植物のスタンド密度の増加または改善、（ｌ）より少ない植物の節（verse）（倒伏）、（ｍ）植物の重量の増加、（ｎ）植物の高さの増加、（ｏ）分げつの増加、（ｐ）より強力なおよび／またはより生産的な分げつ、（ｑ）強化された光合成活動および／または強化された色素含有量、ひいては緑の葉の色、（ｒ）より早いおよび／または改善された発芽、（ｓ）改善および／またはより均一なおよび／またはより早い出現、（ｔ）新芽の成長の増加、（ｕ）初期の開花、（ｖ）初期の結実、（ｗ）早期の穀物の成熟、（ｘ）必要な肥料の減少、（ｙ）必要な種子の減少、（ｚ）収量の増加、および／または（ａａ）病気や害虫に対する抵抗性の増加。本発明によれば、植物、特に農業、園芸および／または観賞植物の「増加した収量」は、それぞれの植物の製品の収量が、本開示の組成物の適用なし、または、親細菌株の適用ありの、同じ条件下で生産された植物の、同じ製品の収量よりも測定可能な量だけ増加することを意味する。したがって、いくつかの側面では、適切なコントロールと比較した場合、収率は、少なくとも０．５％、または少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも４％、または少なくとも５％、または少なくとも１０％増加する可能性がある。
【００４１】
改良されたＰＡＳＭ
本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、特性が改善された（たとえば、抗菌性根浸出物化合物に対する新規または増加した耐性／免疫を有する）ＰＡＳＭを生成することができる。適切なＰＡＳＭは、対象の所与の植物の根圏に見られる植物関連原核生物（例えば、細菌もしくは古細菌）または真核生物（例えば、真菌もしくは原生生物）の微生物を広く含む。
【００４２】
例示的なＰＡＳＭには、プロテオバクテリア（例えば、シュードモナス（Pseudomonas）、エンテロバクター（Enterobacter）、ステノトロフォマス（Stenotrophomonas）、バークホルデリア（Burkholderia）、リゾビウム（Rhizobium）、ヘルバスピリラム（Herbaspirillum）、パントエア（Pantoea）、セラチア（Serratia）、ラーネラ（Rahnella）、アゾスピリルム（Azospirillum）、アゾリゾビウム（Azorhizobium）、アゾトバクター（Azotobacter）、ドゥガネラ（Duganella）、デルフチア（Delftia）、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobiun）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）およびハロモナス（Halomonas）)、ファーミキューテス（Firmicutes）(例えば、バシルス（Bacillus）、パエニバシラス（Paenibacillus）、ラクトバシルス（Lactobacillus）、マイコプラズマ（Mycoplasma）およびアセトバクテリウム（Acetobacterium）)、放線菌（例えば、ストレプトマイセス（Streptomyces）、ロドコッカス（Rhodococcus）、マイクロバクテリウム（Microbacterium）およびキュロトバクテリウム（Curtobacterium）)、ならびに真菌子嚢菌（例えば、トリコダーマ（Trichoderma）、アンペロマイセス（Ampelomyces）、コニオスリウム（Coniothyrium）、パエコエロマイセス（Paecoelomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、クラドスポリウム（Cladosporium）、ヒポクレア（Hypocrea）、ボーヴェリア（Beauveria）、メタリジウム（Metarhizium）、バーティシリウム（Verticullium）、ノムシタケ（Cordyceps）、ピキア（Pichia）およびカンジダ（Candida）、担子菌（Basidiomycota）(例えば、コプリナス（Coprinus）、コルチシウム（Corticium）およびアガリクス（Agaricus）)ならびに卵菌（Oomycota）（例えば、ピシウム（Pythium）、ケカビ（Mucor）およびクサレケカビ（Mortierella））が挙げられるが、これらに限定されない。上記のように、いくつかの側面において、ＰＡＳＭは内生胞子形成細菌であり得る。
【００４３】
改善されたＰＡＳＭは、（ｉ）定方向進化のために選択されたＰＡＳＭ細胞の遺伝的に均一な個体群、（ｉｉ）選択されたＰＡＳＭ細胞の個体群と比較して、新しいまたは改善された特性を示す、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して少なくとも１継代後に選択されたＰＡＳＭを含む親株とその変異株、または親株から何らかの手段で派生した変異株、または（ｉｉｉ）細菌株の収集物または共同体が同じまたは異なる属および／または種を持っている場合がある。一部の側面では、改善されたＰＡＳＭは、遺伝的に均一な個体群、収集物または共同体であり得る開始個体群と比較して、植物に少なくとも１つの有益な表現型形質を付与する改善された能力を示し得る。例えば、改良されたＰＡＳＭは、ＰＡＳＭ細胞の開始個体群（いくつかの局面では遺伝的に均一な個体群であり得る）、収集物または共同体のメンバーによってコロニー形成され得ない植物の異なる種にコロニー形成するように適合され得る。
【００４４】
改善されたＰＡＳＭを使用して植物に有益な表現型形質を提供する方法
本明細書に記載の方法のいずれかを使用して生成された改善されたＰＡＳＭは、対象の植物（例えば、ダイズまたはトウモロコシ植物）に適用して、植物に少なくとも１つの有益な表現型形質を付与することができる。本開示に従って生成された改善されたＰＡＳＭは、改善されたＰＡＳＭによって一過性にまたは安定的にコロニー形成され得る、またはそうでなければＰＡＳＭへの曝露に基づいて改善された表現型形質を受け取ることができる、任意の目的の植物に適用され得ることが理解される。
【００４５】
いくつかの例示的な側面において、改善されたＰＡＳＭは、植え付けの前または後に、植物もしくは土壌（または他の成長培地）に直接施用することができる。本開示による１つ以上の改善されたＰＡＳＭを含む組成物は、任意の所望の方法、例えば、種子コーティング、土壌灌注の形態で、および／または直接畝間、および／または葉面スプレーとして、塗布されてよく、出現前、出現後、またはその両方のいずれかに塗布されてもよい。
【００４６】
例示的な側面において、選択する工程の後、ＰＡＳＭの初期個体群、共同体または収集物とは異なる、選択された、改善されたＰＡＳＭが発酵される。得られた発酵産物は、（例えば、濃縮および／または乾燥により）処理され、所望の用途に適した担体と共に処方され得る。次いで、そのような処方された発酵生成物を、上記の方法のうちの１つで、植物もしくは植物部分（例えば、種子）または植物を取り巻く場所（例えば、土壌）に適用する。発酵および処方については、以下でさらに説明する。
【００４７】
本発明の組成物は、本明細書に記載される選択された改善されたＰＡＳＭの、生物学的に純粋な培養物を含む。「生物学的に純粋な培養物」の語は、制御された実験室または製造条件下で所定の培地中、他の種の不在下で増殖する細胞の個体群を指し、クローン細菌個体群または遺伝的に均一な個体群を含む。従来の大規模な微生物培養プロセスには、液中発酵、固体発酵、または液体表面培養が含まれる。発酵は、バチルス種などの胞子形成微生物において、コロニー形成単位を高レベルで取得し、胞子形成を促進するように構成されている。発酵により生じた培地中の細菌細胞、胞子および／または代謝産物は、直接使用するか、または遠心分離またはタンジェンシャルフロー濾過（tangential-flow filtration）またはデプス濾過（depth filtration）などの濾過、および蒸発などの従来の工業的方法により濃縮することができる。
【００４８】
本発明の組成物は、本明細書に記載される微生物培養プロセスの産物を含む。培養プロセスとして液中発酵が使用される実施形態では、生成物は「発酵ブロス」と呼ばれる。上記のように、かかるブロスは濃縮されてもよい。濃縮された発酵ブロスは、例えばダイアフィルトレーションプロセスを介して洗浄されて、残存する発酵ブロスおよび代謝産物を除去することができる。本明細書で使用する「ブロス濃縮物」の語は、上記のように従来の工業的方法によって濃縮されているが、液体形態のままである発酵ブロスを指す。本明細書で使用される「発酵生成物」の語は、発酵ブロス、ブロス濃縮物および／または乾燥発酵ブロスもしくはブロス濃縮物を指す。
【００４９】
発酵ブロスまたはブロス濃縮物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、トレイ乾燥、流動層乾燥、ドラム乾燥、または蒸発などの従来の乾燥プロセスまたは方法を使用して、担体の添加ありまたはなしで乾燥することができる。
【００５０】
得られた乾燥産物は、特定の粒子サイズまたは物理的フォーマットを達成するために、製粉または造粒などによってさらに処理されてもよい。担体は、乾燥後に追加することもできる。
【００５１】
一実施形態では、発酵産物は、選択された改善されたＰＡＳＭの少なくとも約１×１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。別の実施形態では、発酵産物は、選択された改善されたＰＡＳＭを少なくとも約１×１０６ ＣＦＵ含む。さらに別の実施形態では、発酵産物は、選択された改善されたＰＡＳＭを少なくとも約１×１０７ ＣＦＵ含む。別の実施形態では、発酵産物は、選択された改善されたＰＡＳＭを少なくとも約１×１０８ ＣＦＵ含む。別の実施形態では、発酵産物は、選択された改善されたＰＡＳＭを少なくとも約１×１０９ ＣＦＵを含む。別の実施形態では、発酵産物は、選択された改善されたＰＡＳＭを少なくとも約１×１０１０ ＣＦＵを含む。別の実施形態では、発酵産物は、選択された改善されたＰＡＳＭを少なくとも約１×１０１１ ＣＦＵ含む。例示的な一態様では、選択され、改善されたＰＡＳＭは、１つのＰＡＳＭのクローン個体群または１つのＰＡＳＭの遺伝的に均一な個体群である。
【００５２】
以下の非限定的な例は、本開示をさらに説明するために提供される。
【００５３】
例
例１：継代技術を用いた改善バチルス芽胞の選択
【００５４】
ダイズ根浸出物は、バチルス種の胞子の遺伝的に均一な１０の基本個体群を増殖させるための培地として使用された。ＴＳＢシェーファー（TSB Schaeffer）の培地に、バチルス種の単一コロニーを接種し、３０℃で４〜５日間増殖させた。胞子を洗浄し、８０℃で３０分間熱処理した。根の浸出物での継続的な増殖のために、１０の独立した選択ラインを選択した。このバチルス親株は、実施例１〜３および対応する図全体を通して、「野生型」または「バチルスＷＴ」と呼ばれる。
【００５５】
ダイズ根浸出物を生成するために、滅菌済みダイズ（Glycine max）を、２５℃の成長チャンバー内で、１ｍＬの水中、ディープウェルブロック内で成長させた。１週間後、根の浸出物を採取し、真空濾過して−８０℃で保存した。この方法で生成されたダイズ根浸出物の組成（同じ生殖質と生育条件を使用して）を試験し、種々のロットの組成が均一であると判断した。
【００５６】
１００μＬの胞子（０．２０ ＯＤ）を、ダイズ根浸出物中、３０℃で対数期まで増殖させた。次いで、細胞をダイズ根浸出物の新しいサンプルに移し、再び３０℃で対数増殖期まで増殖させた。（ＯＤ６００は定期的に測定され、サンプルは０．３から０．６で採取された。）。このプロセスは、４週間にわたり１３回繰り返された。これらの実施例では、各反復は「継代」と呼ばれ、野生型とは異なる形態を有する各継代から生じる株は「変異体」と呼ばれる。継代プロセス中に親個体群との違いを確認するために、５つごと、または最後のパッセージについては３つのパッセージの後に変異体が特定された。最後（１３番目）の継代から１０の変異体を、以下に記載されるアッセイに従って評価した。野生型は、胞子発芽の速度、増殖速度および最大収量を考慮した場合、他のバチルス株と比較してダイズ根浸出物で比較的不十分に機能するため、「親」株として選択された。
【００５７】
最後の継代後に収集された変異体を、以下：（ｉ）胞子形成能力、（ｉｉ）細胞面積および長さ（形態計測）、ならびに（ｉｉｉ）ダイズ根浸出物で増殖させたときの細菌細胞増殖速度について試験した。いかなる理論にも縛られることを望まないが、出願人は、増殖の増加は、継代が行われた培地で観察される可能性が高いと仮定する。
【００５８】
胞子形成する能力の保持を評価するために、５０ｍＬの無菌シェーファー（Schaeffer）培地を入れた２５０ｍＬフラスコで、各変異株を胞子形成まで増殖させた。無菌ループを使用して、単一コロニーをストリークプレートから培地に移した。フラスコを３０℃で２２０ｒｐｍに設定したシェーカーに入れ、３〜５日間インキュベートし、フローサイトメトリーで胞子を評価した。胞子形成能力は変異体間で変化したが、変異体はすべて、胞子形成する能力を維持した。
【００５９】
細胞面積および長さは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージングを介して分析された。Schindelin etal, (2012),“Fiji: An Open-Source Platform for Biological-Image Analysis,” Nat. Methods, 9(7): 676-682に記載される方法に従って、５つの単一細胞を測定するＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を分析した。ルリアブロス（Luria broth）でサンプルを培養したときの細胞面積の違いを下記表１に示す。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
各変異体（ＯＤ ０．２）と野生型のダイズ根浸出物と胞子溶液を等量ずつ、Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ細胞生存率試薬（Thermo Fisher Scientificから入手可能）と一緒に９６ウェルマイクロプレートに組み合わせた。プレートリーダーを使用して蛍光強度を測定した。発芽率、発芽時間、および最大増殖率を使用し、調整した増殖率評価値を算出した。野生型との増殖の違いを図１に示す。変異体はすべて、親のバチルス株と比較して、ダイズ根浸出物中で増殖する能力の増加を示す。
【００６２】
変異体および野生型の群発運動性は、Patrick et al.,“Laboratory Strains of Bacillus subtilis Do Not Exhibit Swarming Motility,” Journal of Bacteriology (2009) 191(22): 7129-7133に記載のアッセイで評価された。変異体はすべて、野生型と比較して、群がって泳ぐ能力の低下を示した。
【００６３】
例２：変異株を用いた成長チャンバーアッセイ
変異体と野生型を使用して種子を処理し、変異体が野生型株で処理した種子と比較して根の表面積を大きくするかどうかを判断した。具体的には、野生型と変異体を、３０℃にてＴＳＢシェーファーで３〜５日間培養した。各株の１×１０６ ＣＦＵ／種子を使用して、コム（com）およびダイズ種子を処理した。種子を２８℃で７日間、無菌砂で成長させた後、根を収穫し、洗浄し、秤量し、ＷｈｉｎＲｈｉｚｏソフトウェアを使用して分析して、根の総表面積を決定した（図２）。種々の株で処理した種子からの根の重量を図１に示す。変異体は、野生型と比較して根の重量が増加していた。
【００６４】
例３：温室試験
ダイズの種子を変異体および野生型で、１ｘ１０６ ＣＦＵ／種子の割合で処理し、温室条件下で３週間栽培した。次に、得られた植物の葉の総面積を測定した。結果を図４に示す。
【００６５】
例４：液体増殖培地中の選択したダイズ根浸出物化合物上のバチルス細胞の実験進化
バチルス細胞の遺伝的に均一な個体群を進化させて、選択したダイズ根浸出物化合物を補充した標準的な細菌増殖培地で細菌細胞を連続継代することにより、選択したダイズ根浸出物化合物の毒性および／または増殖阻害を克服することができる。例示的なダイズ根浸出物化合物には、クメストロール、ゲニステイン、グリシテインおよびダイゼインなどのイソフラボンが含まれる。
【００６６】
実験進化を行うため、進化させるバチルス株の単一コロニーを、選択したダイズ根浸出物を、抑制されていない増殖と比較して比増殖率を減少させる濃度（通常、イソフラボンの場合は２〜５ｐｇ／ｍＬ）で補充した標準の細菌増殖培地（ＬＢレノックスなど）に接種する。任意で、複数の選択されたダイズ根浸出物化合物を補充して、バチルス細胞を進化させ、選択された各ダイズ根浸出物化合物に対する耐性も同時に進化させることができる。
【００６７】
連続継代は、菌株の最適増殖温度（３０〜３７℃）または非周囲温度で、選択したダイズ根浸出物化合物を用いて攪拌（２２０ＲＰＭ）しながらバッフル付き振とうフラスコでバチルス細胞を増殖させることにより行われる。細胞は、対数期の後期（光学密度によって決定される）までインキュベートされ、その時点で、細胞の継代培養が新しいフラスコに接種される。このプロセスは、選択したダイズ根浸出物化合物に対する望ましい耐性が達成されるまで繰り返される。任意で、選択されたダイズ根浸出物化合物の濃度を、必要に応じて各連続継代で増加させることができる。
【００６８】
連続継代の終わりに、進化した個体群を固体の細菌増殖培地にストリークして、個々の進化した細胞を単離する。進化した細胞の個々から生じるコロニーをスクリーニングして、選択したダイズ根浸出物化合物に対する耐性を改善する。耐性を評価するため、個々の進化した分離株を、選択したダイズ根浸出物化合物を補充した標準的な増殖培地で増殖させ、増殖率を光学密度で測定する。進化した分離株は、親株に比べて増殖率が増加する。あるいは、進化した個体群を、選択されたダイズ根浸出物化合物が補充された固体の細菌増殖培地にストリークする。選択したダイズ根浸出物化合物に対する耐性が進化した細胞は、耐性が進化していない細胞よりも早くコロニーを形成し、その後この方法で選択することができる。
【００６９】
例５：固体増殖培地上の選択したダイズ根浸出液化合物上のバチルス細胞の実験進化
バチルス細胞の遺伝的に均一な個体群を進化させて、選択したダイズ根浸出物化合物を補充した固体寒天標準細菌増殖培地上で細菌細胞を連続継代することにより、選択したダイズ根浸出物化合物の毒性および／または増殖阻害を克服することができる。選択したダイズ根浸出物化合物の例は、クメストロール、ゲニステイン、グリシテインおよびダイゼインなどのイソフラボンであり得る。
【００７０】
実験進化を行うために、進化させるバチルス株の単一のコロニーを液体の標準的な細菌増殖培地（例えば、ＬＢレノックス）に接種し、標準的な増殖条件を使用して２４時間インキュベートして液体の接種材料を準備する。次に、液体接種材料を、選択したダイズ根浸出物化合物を、抑制されない増殖と比較して比増殖率（コロニー形成速度により決定）を低下させる濃度（通常、イソフラボンでは２〜５ｐｇ／ｍＬ）で補った固体寒天細菌増殖培地（ＬＢレノックス寒天）にプレーティングする。任意に、複数の選択されたダイズ根浸出物化合物を補充してバチルス細胞を進化させ、選択された各ダイズ根浸出物化合物に対する耐性を同時に進化させることができる。
【００７１】
選択したダイズ根浸出物化合物を用いて、菌株に最適な増殖温度（例：３０〜３７℃）または非周囲温度で、固体増殖培地上でバチルス細胞を増殖させることにより、連続継代を行うことができる。視認可能なコロニーが形成されるまで細胞をインキュベートする。最も大きいコロニーをプレートからかき取り、バッファー（リン酸緩衝生理食塩水など）に再懸濁し、選択したダイズ根浸出物化合物を含む新しい固体増殖培地にプレーティングする。このプロセスは、選択したダイズ根浸出物化合物に対する望ましい耐性が達成されるまで繰り返される。任意に、選択されたダイズ根浸出物化合物の濃度は、必要に応じて各連続継代で増加させることができる。
【００７２】
連続継代の最後に、進化したコロニーを固体の細菌増殖培地にストリークし、個々の進化した細胞を分離する。個々の進化した細胞から生じるコロニーをスクリーニングして、選択したダイズ根浸出物化合物に対する耐性を改善する。耐性を評価するため、個々の進化した分離株を、選択されたダイズ根浸出物化合物を補充した標準的な増殖培地で増殖させ、増殖率を光学密度で測定する。進化した分離株は、親株に比べて増殖率が増加する。
【００７３】
例６：バチルス・アミロリケファシエンスおよびバチルス・メガテリウムの菌株の実験進化
実験進化は、バチルスアミロリケファシエンス株（「株２」）とバチルスメガテリウム株（「株３」）の単一コロニーで行われ、イソフラボンに耐性のある株を得た。上記菌株の増殖を阻害するために必要なジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）で調製したクメストロールとゲニステインの１：１混合物の濃度を決定するために、予備実験を行った。ＤＭＳＯがどちらの株の増殖も阻害しないことを確認するための実験も行われた。
【００７４】
株２と株３の７つのクローン細菌個体群の種子培養物を使用して、ＤＭＳＯ中で調製したゲニステインとクメストロールのストック溶液を補充したＬＢレノックス培地（US Biological Life Sciences-カタログ番号L1505から入手可能）に接種し、３０℃で１２００ｒｐｍの攪拌速度で、自動プラットフォームのマルチミリリットル容器で一晩培養した。プレートリーダーで、ＯＤ６００によって増殖を測定した。本明細書では阻害化合物と呼ばれる、ＬＢレノックス培地中のゲニステインとクメストロールの初期濃度は、それぞれ４ｐｇ／ｍＬであった。この濃度は、下記表２で「初期ストレッサー濃度［ｐｇ／ｍＬ］」と称される。
【００７５】
培養は、実験の間中、指数関数的増殖（すなわち対数期）で継続的に維持された。株２は４０日間増殖し、個体群あたり約３６０世代を生産した。株３は４０日間増殖し、個体群あたり約２８０世代を生産した。各濃度で０．３５ＯＤ／ｈｒ以上の増殖速度が観察されたとき、阻害化合物の濃度が増加した。個体群適応度は、阻害化合物の添加によって変化したが、実験中、０．１〜０．４ＯＤ／ｈｒの範囲に留まった。
【００７６】
表２に示すように、実験の終わりに、双方の株の耐性は各個体群で数倍増加した。同じ出発菌株からの複製個体群はすべて、やや低い濃度に達した株２の４回目の複製を除いて、阻害化合物の同様の最終濃度値に進化した。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
例７：ダイズ根浸出物における株２からの派生個体群の増殖
初期ストレッサー濃度への耐性能力の増加後、および、増殖率が０．３５／ｈｒ以上のしきい値レベルに達した後の異なる時点で、例６で説明した実験進化実験中に生成した株２の８２の派生個体群を収集し、さらに試験した。選択の連続ラウンドは、突然変異、遺伝的ドリフト、遺伝子フローなどを伴うクローン個体群内の遺伝的変異を生成した。遺伝的に均一ではなかったこれらの新しい個体群は、以降の例で派生個体群と称する。それらはダイズ根浸出物中で増殖し、株２の増殖速度と比較した。
【００７９】
各誘導体個体群のグリセロールストックをトリプシンダイズ寒天（「ＴＳＡ」）にストリークし、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、コンフルエントな細胞を使用し、２５０ｍＬバッフル付き振とうフラスコに含まれる５０ｍＬ ＴＳＢシェーファー培地に接種した。次に、振とうフラスコを、胞子形成に達するまで、３０℃、２２０ＲＰＭに設定した振とうインキュベーターに５日間置いた。
【００８０】
ダイズ根浸出物を生成するため、滅菌ダイズ品種を培養試験管内で、２５℃の光で成長チャンバー内の滅菌脱イオン水１ｍＬで培養した後、回転プラットフォームに移し、通気（暗サイクル）を毎日行った。１週間後、根浸出物を採取し、真空濾過して−８０℃で保存した。
【００８１】
株２の胞子（〜０．２０のＯＤ）９１μＬと、上記８２の派生個体群とを、１８μＬのＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ細胞生存率試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィックから入手可能）を含む９６ウェルプレートの四重無作為複製で９１μＬのダイズ根浸出物で増殖させ、プレート全体に重ねた。定常期に達するまで、プレートを３０℃でインキュベートした。蛍光を、２０時間ごとに６０時間測定した。
【００８２】
株２と比較して、８２の派生個体群が、ダイズ根浸出物の胞子発芽と細胞増殖動態の改善について試験された。予想通り、阻害化合物の濃度は遅滞期ではなく対数期に増加したため、派生個体群は増殖の遅滞期に株２と比較して改善を示さなかった。例６を参照のこと。対数期の増殖率の違いは、個体群派生株と株２の間で観察された。８２の個体群派生株を４つのセットで試験し、各セットを株２と比較して各行程（run）にブランクを含めた。株２は、図では「バチルスＷＴ２」と称される。「ブランク」またはネガティブコントロールは微生物を含まず、汚染をチェックするために含められた。図５、６および７は、株２の対数期における経時的な蛍光測定の勾配である増殖評価値と、４つのセットのうち３つにおいてダイズ根浸出物中で増殖した派生個体群の選択を示している。セット１（図５）からの７つの派生個体群、セット２（図６）からの１つの派生個体群、およびセット３（図７）からの１つの派生個体群は、細菌増殖率評価において、株２に対して、改善または同様のパフォーマンスの肯定的な傾向を示し、以下の例８に記載されるように、植物成長促進の改善を測定するため、植物内バイオアッセイでさらに試験するために選択された。株２と比較して改善した細菌増殖率を示さなかった個体群派生株のデータは表示されていない。
【００８３】
例８：変異個体群による温室アッセイ
（実施例７に記載されるように）株２と比較して、実証された同様の性能または増殖速度論の改善に基づいて、８２の派生個体群のうちのより少数が選択された。これらの派生個体群はさらに、プランタスクリーニングで試験され、ダイズの植物成長促進の改善をチェックした。これらの派生個体群と株２（即ち、野生型、親株）を使用して種子を処理し、変異体個体群が野生型株で処理した種子と比較して植物バイオマスの増加をもたらしたかどうかを判断した。具体的には、野生型と変異体とをＴＳＢシェーファーで、３０℃で３〜５日間培養した。１×１０６ ＣＦＵ／種子の株２または各派生個体群を使用して、ダイズ種子を処理した。温室内で種子を合成培地と砂の混合物で１４日間栽培した後、植物を根と新芽の重量のために収穫した。図８に示すように、根を洗浄し、ＷｈｉｎＲｈｉｚｏソフトウェアを使用して分析し、総根表面積を決定した。この研究で試験した株２と派生個体群は、未処理（即ち、水処理）対照（「ＵＴＣ」）と比較して、ダイズの総根長が増加するという正の傾向を示した。さらに、Ｇ０１とＣ０３の誘導体は、総根長の増加において、株２よりも有意に（＠Ｐ０．０５）優れていた。
【００８４】
株２で処理された種子および種々の派生個体群からの根の長さを図９に示す。この研究で試験した株２とほとんどの派生個体群は、ＵＴＣと比較してダイズの総根長を増加させ、葉生物Ｇ０２、Ｃ０３、Ａ０６（＠Ｐ０．０５）は、株２の合計根長の増加において有意に良好に機能した。細い根と呼ばれる、直径が０．５ｍｍ未満の根の数も、複製ごとに測定された。興味深いことに、特定の派生個体群、Ａ０６、Ｃ０３、Ｇ０１およびＨ０２は、株２および水対照（＠Ｐ＝０．０５）と比較して、細根の数を大幅に増やした。
【００８５】
株２で処理した種子を有する植物およびその様々な派生個体群からの総新芽重量および総乾燥新芽重量を図１０および図１１に示す。株２とその派生個体群は、（ＵＴＣまたは水対照と比較した場合）ダイズの新芽の総重量を増加させ、一部の派生物（Ｇ０２、Ｃ０３、Ｈ０２）は、株２と比較してシュートの総新鮮重量の増加にプラスの傾向を示した。さらに、選択した派生物は、株２と比較して、乾燥重量で測定したバイオマス蓄積が増加するという正の傾向を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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