(57)【要約】  本発明は、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、  ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）に対して中和活性を有する結合分子に関する。より具体的には、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対する優れた結合能力を有し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに対して中和効果を有する結合分子に関し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染に対する予防、治療、または診断に非常に有用である。【選択図】図１
2021512599.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）の表面のスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合する、中和結合分子。
【請求項２】
下記ｉ）〜ｖｉ）の結合分子：
ｉ）ａ）配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；
ｉｉ）ａ）配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；
ｉｉｉ）ａ）配列番号１３のＣＤＲ１領域、配列番号１４のＣＤＲ２領域、および配列番号１５のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１６のＣＤＲ１領域、配列番号１７のＣＤＲ２領域、および配列番号１８のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；
ｉｖ）ａ）配列番号１９のＣＤＲ１領域、配列番号２０のＣＤＲ２領域、および配列番号２１のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；
ｖ）ａ）配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号２８のＣＤＲ１領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、および配列番号３０のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；および
ｖｉ）ａ）配列番号３１のＣＤＲ１領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域、および配列番号３３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号３４のＣＤＲ１領域、配列番号３５のＣＤＲ２領域、および配列番号３６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子
からなる群から選択される何れか１つである、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
下記ｉ）〜ｖｉ）：
ｉ）ａ）配列番号３７のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号３８のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；
ｉｉ）ａ）配列番号３９のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４０のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；
ｉｉｉ）ａ）配列番号４１のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４２のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；
ｉｖ）ａ）配列番号４３のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４４のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；
ｖ）ａ）配列番号４５のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４６のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；および
ｖｉ）ａ）配列番号４７のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４８のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子
から構成された群から選択される何れか１つである、請求項１に記載の結合分子。
【請求項４】
Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子。
【請求項５】
請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子にさらに１つ以上のタグが結合された、イムノコンジュゲート。
【請求項６】
請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子が挿入された発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターが宿主細胞に形質転換され、中東呼吸器症候群コロナウイルスに結合して中和能力を有する結合分子を生産する、細胞株。
【請求項９】
前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ボーズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする、請求項８に記載の細胞株。
【請求項１０】
請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子を含む、中東呼吸器症候群コロナウイルス感染の予防または治療用組成物。
【請求項１１】
滅菌注射溶液、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）剤型、プレフィルドシリンジ（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）溶液剤、経口剤型、外用剤、または坐剤であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
中東呼吸器症候群コロナウイルス感染により発生する疾患を有する対象に、請求項１０または１１に記載の組成物を治療学的に有効な量で投与するステップを含む、中東呼吸器症候群コロナウイルス感染により発生する疾患の診断、予防、または治療方法。
【請求項１３】
請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子を含む、中東呼吸器症候群コロナウイルス診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）に対して中和活性を有する結合分子に関する。より具体的には、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの表面のスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対する優れた結合能力を有し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに対して中和効果を有する結合分子に関し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染に対する予防、治療、または診断に非常に有用である。
【背景技術】
【０００２】
中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）は、ベータコロナウイルス（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）に属するコロナウイルスによる感染病であって、２０１２年に中東で発生した原因不明の肺炎患者から初めて原因ウイルスが発見された。中東呼吸器症候群コロナウイルスの起源はコウモリにあると推定されており、ラクダを介してヒトに流入したと、現在知られている。伝播経路が完全に明らかになってはいないが、中東では、ラクダからヒトにこのウイルスが繰り返して流入し、限定的で且つ非持続的なヒト−ヒト間の伝播が起こっていると考えられる。
【０００３】
中東呼吸器症候群コロナウイルスは、現在まで２７ヶ国で発症し、２０１２年９月から現在（２０１７年９月２９日）まで２，０７８人の患者が発生しており、そのうち７３０人が死亡して致死率が３５．１％に達することが知られている（ＷＨＯ）。まだ特に治療剤や予防剤がなく、抗ウイルス剤の役割が明確に証明されていないが、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの高い死亡率と罹患率を考慮して、疾患初期にリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）とインターフェロンアルファ−２α（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｐｈａ−２α）、ロピナビル／リトナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ／ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）の併合療法などの抗ウイルス剤治療を積極的に行うことが勧告されているが、副作用があって問題となっている。
【０００４】
一方、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ結合抗体に関する従来技術として、韓国特許登録第１０−１５９３６４１号公報に、ＭＥＲＳ−ＣｏＶヌクレオカプシドを認識する抗体、それを含む診断組成物、キット、およびそれを用いたＭＥＲＳ−ＣｏＶの検出方法が開示されている。しかし、上記の文献は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのヌクレオカプシドに特異的に結合する抗体を利用してＭＥＲＳ−ＣｏＶの感染有無を測定することができることに関するものであって、前記抗体のＭＥＲＳ−ＣｏＶに対する中和能力については分かりにくい。したがって、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに対して治療効果を有する抗体が求め続けられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、上記で挙げられた問題を解決するために、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対する結合能力を有する結合分子を開発し、この結合分子が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに対して中和効果を有することを確認することで、本発明を完成した。
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に結合し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに対して中和活性を有する結合分子を提供することにある。
【０００７】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記結合分子を含むＭＥＲＳ−ＣｏＶの予防または治療用組成物を提供することにある。
【０００８】
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記結合分子を含むＭＥＲＳ−ＣｏＶの診断用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明の１つの実施例は、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）の表面のスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合する中和結合分子を提供する。
【００１０】
また、本発明の他の実施例は、前記結合分子を含むＭＥＲＳ−ＣｏＶの予防または治療用組成物を提供する。
【００１１】
さらに、本発明の他の実施例は、前記結合分子を含むＭＥＲＳ−ＣｏＶの診断用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の結合分子は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対する優れた結合能力を有することで、中和効果を示すため、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの感染に対する予防、治療、または診断に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】最終的に選定された２種の抗体でプラークアッセイ（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）を行い、韓国分離種中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ／Ｋｏｒｅａ／ＫＮＩＨ／００２＿０５＿２０１５）に対する抗体濃度毎の中和能力を示した図である。
【図２】ヒト肺組織感染モデル（ｅｘ  ｖｉｖｏ）を利用した抗体の中和能評価を行うために、韓国分離種中東呼吸器症候群コロナウイルスを抗体とともにヒト肺組織に感染させ、組織培養した後、プラークアッセイによりウイルス力価を示した図である。
【図３Ａ】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）および前記ウイルスに結合する抗体を利用して、動物治療効能を評価するための定量ＰＣＲを行った結果を示した図である。
【図３Ｂ】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）および前記ウイルスに結合する抗体を利用して、動物治療効能を評価するためのプラークアッセイ実験を行った結果を示した図である。
【図４Ａ】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）を利用して、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する抗体の予防効能を評価するために、定量ＰＣＲを行った結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４Ｂ】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）を利用して、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する抗体の予防効能を評価するためにプラークアッセイ実験を行った結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）を利用して、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する抗体の予防効能を評価するためにマウス肺の組織学的変化を示した図である。
【図６Ａ】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）を利用して、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する抗体の治療効能を評価するために、マウスの体重減少の程度を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６Ｂ】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）を利用して、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する抗体の治療効能を評価するために、マウスの生存率を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６Ｃ】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）を利用して、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する抗体の治療効能を評価するために定量ＰＣＲを行った結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６Ｄ】中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染および増殖が可能な動物モデル（ｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス）を利用して、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する抗体の治療効能を評価するためにプラークアッセイ実験を行った結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１５】
本発明の１つの実施例は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に結合する中和結合分子に関する。
【００１６】
本発明の１つの実施例は、下記ｉ）〜ｖｉ）の結合分子からなる群から選択される何れか１つである、中和結合分子に関する。
ｉ）ａ）配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｉｉ）ａ）配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｉｉｉ）ａ）配列番号１３のＣＤＲ１領域、配列番号１４のＣＤＲ２領域、および配列番号１５のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１６のＣＤＲ１領域、配列番号１７のＣＤＲ２領域、および配列番号１８のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｉｖ）ａ）配列番号１９のＣＤＲ１領域、配列番号２０のＣＤＲ２領域、および配列番号２１のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｖ）ａ）配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号２８のＣＤＲ１領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、および配列番号３０のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｖｉ）ａ）配列番号３１のＣＤＲ１領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域、および配列番号３３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号３４のＣＤＲ１領域、配列番号３５のＣＤＲ２領域、および配列番号３６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
【００１７】
本発明の１つの実施例として、前記結合分子は、下記表１の抗体１〜抗体３６を含む。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本発明において、可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ等によって考案されたシステムに従って、通常の方法により決定された（文献［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］参照）。本発明に用いられたＣＤＲナンバリングにはＫａｂａｔ方法を用いたが、その他にも、ＩＭＧＴ方法、Ｃｈｏｔｈｉａ方法、ＡｂＭ方法などの他の方法により決定されたＣＤＲを含む結合分子も本発明に含まれる。
【００２０】
本発明の１つの実施例は、下記ｉ）〜ｖｉ）の結合分子からなる群から選択される何れか１つである、中和結合分子に関する。
ｉ）ａ）配列番号３７のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号３８のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｉｉ）ａ）配列番号３９のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４０のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｉｉｉ）ａ）配列番号４１のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４２のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｉｖ）ａ）配列番号４３のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４４のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｖ）ａ）配列番号４５のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４６のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
ｖｉ）ａ）配列番号４７のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４８のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子。
【００２１】
本発明の１つの実施例として、前記結合分子は下記表２の抗体１〜抗体６を含む。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
本発明の１つの実施例において、前記結合分子は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよいが、これらに限定されない。本発明の一実施態様では、Ｓタンパク質に結合する完全なヒト抗体を提供する。本明細書において、抗体はできる限り広い意味で用いられ、具体的に、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、２種以上のインタクト抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および目的とする生物学的活性を示す抗体断片を含む。抗体は、特異的な抗原を認識して結合できる免疫系により生成されるタンパク質である。その構造的な点から、抗体は、通常、４本のアミノ酸鎖（２本の重鎖および２本の軽鎖）からなるＹ字状のタンパク質を有する。それぞれの抗体は、主に可変領域および不変領域の２つの領域を有する。Ｙの腕の末端部分に位置した可変領域は、標的抗原に結合して相互作用する。前記可変領域は、特定の抗原上の特異的結合部位を認識して結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。Ｙのしっぽ部分に位置した不変領域は、免疫系により認識されて相互作用する。標的抗原は、一般に、多数の抗体上のＣＤＲによって認識される、エピトープという多数の結合部位を有している。異なるエピトープに特異的に結合するそれぞれの抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、１つ以上の相応する抗体を有することができる。
【００２４】
尚、本発明は、前記結合分子の機能的変異体を含む。結合分子は、変異体がＭＥＲＳ−ＣｏＶまたはそのＳタンパク質に特異的に結合するために本発明の結合分子と競争することができ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに対して中和能力を有するものであれば、本発明の結合分子の機能的変異体として見なされる。機能的変異体は、一次構造的配列が実質的に類似な誘導体を含むが、これに制限されるものではなく、例えば、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）変形、化学薬品および／または生化学薬品を含み、これらは、本願発明の親モノクローナル抗体では発見されない。かかる変形には、例えば、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、架橋、二硫化結合形成、グルコシル化、水酸化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解、およびリン酸化などが含まれる。機能的変異体は、選択的に親抗体のアミノ酸配列と比べて、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせを含有するアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。さらに、機能的変異体は、アミノ末端またはカルボキシ末端のうち一方または両方で、アミノ酸配列の切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）を含んでもよい。本発明の機能的変異体は、本発明の親抗体と比べて同一でも異なってもよく、より高いか低い結合親和力を有してもよいが、相変らずＭＥＲＳ−ＣｏＶまたはそのＳタンパク質に結合することができる。一例として、骨格構造、超可変（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）領域、特に、軽鎖または重鎖の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）を含むが、これに限定されない可変領域のアミノ酸配列が変形されてもよい。一般に、軽鎖または重鎖領域は、３つのＣＤＲ領域を含む、３つの超可変領域、およびさらに保存された領域、すなわち、骨格領域（ＦＲ）を含む。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基と超可変ループからのアミノ酸残基を含む。本発明の範囲に属する機能的変異体は、本明細書の親抗体と約５０％〜９９％、約６０％〜９９％、約８０％〜９９％、約９０％〜９９％、約９５％〜９９％、または約９７％〜９９％のアミノ酸配列同一性を有することができる。比較されるべきアミノ酸配列を最適に配列し、類似または同一のアミノ酸残基を定義するために、コンピュータアルゴリズムのうち当業者に公知されているＧａｐ法またはＢｅｓｔｆｉｔ法を使用可能である。機能的変異体は、親抗体またはその一部を、ＰＣＲ法、オリゴマーヌクレオチドを利用した突然変異の生成および部分突然変異の生成を含む公知の一般の分子生物学的方法により変化させること、および、有機合成法により得ることができるが、これに制限されるものではない。
【００２５】
また、前記結合分子に薬物がさらに付着されてもよい。すなわち、本発明に係る結合分子は、薬剤が結合された抗体−薬物接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の形態で用いられてもよい。薬物を局所伝達するために、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）、すなわち、イムノコンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いると、前記薬物部分（ｍｏｉｅｔｙ）を感染された細胞に標的化伝達することができるが、前記薬物作用剤を接合させないまま投与する場合、正常細胞においても許容されないレベルの毒性が引き起こされ得るためである。薬物−連結性および薬物−放出性だけでなく、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性を高めることで、ＡＤＣの最大効能と最小毒性を改善することができる。
【００２６】
薬物部分を抗体に付着させる、すなわち、共有結合により連結させる通常の手段では、一般に、薬物部分が抗体上の多くの部位に付着される不均質な分子混合物が誘発される。例えば、細胞毒性薬物を、典型的に、種々の抗体の数多くのリシン残基を介して抗体と接合させ、不均質な抗体−薬物接合体混合物を生成させ得る。反応条件によって、かかる不均質な混合物は、典型的に、薬物部分に付着された抗体分布度が０〜約８以上である。また、特定の整数比の薬物部分：抗体を伴う接合体の各亜群は、薬物部分が抗体上の各種部位に付着される、潜在的に不均質な混合物である。抗体は、大きく、且つ複雑であり、構造的に多様な生体分子であって、種々の反応性官能基を多く有している。リンカー試薬および薬物−リンカー中間体との反応性は、ｐＨ、濃度、塩の濃度、および助溶媒のような要因によって左右される。
【００２７】
また、本発明の他の実施例は、前記結合分子をコードする核酸分子を提供する。
【００２８】
本発明の核酸分子は、本発明で提供する抗体のアミノ酸配列が、当業者に公知のようにポリヌクレオチド配列に翻訳された核酸分子の何れもを含む。したがって、ＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）による様々なポリヌクレオチド配列が製造されることができ、これも本発明の核酸分子に含まれる。
【００２９】
また、本発明の他の実施例は、前記核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
【００３０】
前記発現ベクターとしては、セルトリオン固有の発現ベクターであるＭａｒＥｘベクター（韓国特許登録第１０−１０７６６０２号参照）、および商業的に広く用いられているｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムドイド（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１  Ｐ２２、Ｑμ、Ｔ−偶数系、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群から選択される何れか１つの発現ベクターを用いてもよいが、これらに限定されず、当業者に発現ベクターとして知られた全ての発現ベクターが本発明で使用可能である。発現ベクターを選択する際には、目的とする宿主細胞の性質によって選択する。宿主細胞へのベクターの導入時に、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、または電気穿孔法により行われてもよいが、これらに限定されず、当業者であれば、使用する発現ベクターおよび宿主細胞に好適な導入方法を選択して用いることができる。例えば、ベクターは、１つ以上の選別マーカーを含有するが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いても、生産物の生産有無によって選別が可能である。選別マーカーの選択は、目的とする宿主細胞によって選択され、これは当業者に既に公知された方法を利用するため、本発明はこれに制限を設けない。
【００３１】
本発明の結合分子の精製を容易にするために、タグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させることができる。前記タグとしては、ヘキサ−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、またはｆｌａｇタグを含むが、これらに限定されず、当業者に公知の精製を容易にするタグは何れも本発明で使用可能である。
【００３２】
また、本発明の他の実施例は、前記発現ベクターが宿主細胞に形質転換され、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに結合して中和能力を有する結合分子を生産する細胞株を提供する。
【００３３】
本発明において、前記細胞株は、哺乳動物、植物、昆虫、菌類、または細胞性起源の細胞を含んでもよいが、これらに限定されない。前記哺乳動物の細胞としては、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ボーズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなる群から選択される何れか１つを宿主細胞として用いてもよいが、これらに限定されず、当業者に公知された哺乳動物の宿主細胞として使用可能な細胞は何れも利用可能である。
【００３４】
また、本発明の他の実施例として、本発明は、前記結合分子を含むＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の予防または治療用組成物に関する。本発明の組成物は、前記結合分子の他に、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容可能な賦形剤は、当業者に既に公知されている。
【００３５】
本発明の組成物は、さらに、少なくとも１つの他の治療剤または診断剤を含んでもよい。例えば、前記結合分子とともに、インターフェロン、抗−Ｓタンパク質モノクローナル抗体、抗−Ｓタンパク質ポリクローナル抗体、ヌクレオシド類似体、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ製剤、または治療ワクチンを抗ウイルス薬物としてさらに含んでもよい。
【００３６】
本発明の結合分子を含む組成物は、それぞれ通常の方法により、滅菌注射溶液、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）剤型、プレフィルドシリンジ（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）溶液剤、経口剤型、外用剤、または坐剤などの形態で剤型化してもよいが、これらに限定されない。
【００３７】
また、本発明の結合分子を含む組成物は、投与方法が経口および非経口に分けられ、一例として、投与経路は静脈内であってもよいが、これに限定されない。
【００３８】
本発明の組成物を、ヒトを含む哺乳動物に投与することで、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染およびＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染により誘発される疾病を予防または治療することができる。この際、前記結合分子（例えば、抗体）の投与量は、処理対象、疾病または状態の重篤度、投与速度、および処方医の判断によって決定される。
【００３９】
また、本発明の他の実施例として、本発明は、前記結合分子を含む診断用キットに関する。診断用キットに用いられる本発明の結合分子は検出可能に標識されることができる。生分子の標識に使用可能な様々な方法が当業者に公知されており、本発明の範疇内で考慮される。本発明で使用可能な標識種類の例としては、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物が挙げられる。通常用いられる標識は、蛍光物質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、放射性同位元素（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド金属、化学発光または生物発光化合物（例えば、ジオキセタン、ルミノール、またはアクリジニウム）を含む。酵素またはビオチニル基の共有結合法、ヨウ化法、リン酸化法、ビオチン化法などの標識方法が当分野で公知されている。検出方法としては、オートラジオグラフィー法、蛍光顕微鏡法、直接および間接酵素反応法などが挙げられ、これらに制限されない。通常用いられる検出分析法としては、放射性同位元素法または非−放射性同位元素法が挙げられる。これらは、中でも、ウエスタンブロット法、オーバーレイ分析法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）およびＩＲＭＡ（ＩｍｍｕｎｅＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ）法、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）法、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ）法、およびＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ）法が挙げられる。
【００４０】
本発明の診断用キットは、サンプルと前記結合分子を接触させた後、反応を確認し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの存在有無を検出するのに用いられることができる。
【００４１】
前記サンプルは、対象の痰、唾、血液、汗、肺細胞、肺組織の粘液、呼吸器組織、および唾液からなる群から選択される何れか１つであってもよいが、これらに限定されず、当業者に公知された通常の方法によりサンプルの準備が可能である。
【００４２】
また、本発明の他の実施例は、
ａ）前記結合分子と、
ｂ）容器と、
を含む、ＭＥＲＳ−ＣｏＶにより発生する疾患の診断、予防、または治療用キットを提供する。
【００４３】
本発明の診断、予防、または治療用キットにおいて、キットの容器には、固体担体が含まれてもよい。本発明の抗体は固体担体に付着されることができ、かかる固体担体は、多孔性または非多孔性、平面または非平面であってもよい。
【００４４】
また、本発明は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染により発生する疾患を有する対象に、前記組成物を治療学的に有効な量で投与する段階を含む、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染により発生する疾患の診断、予防、または治療方法を提供する。
【００４５】
本発明の１つの実施例において、前記診断、予防、または治療方法は、抗−ウイルス薬物、ウイルス進入抑制剤、またはウイルス付着抑制剤を投与する段階をさらに含んでもよい。
【００４６】
以下、本発明で用いられる用語を次のように定義する。
【００４７】
本発明で用いられる用語「結合分子」は、キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体のようなモノクローナル抗体を含む完全な（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、または抗原に結合するイムノグロブリンである抗原結合断片を含む。例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）との結合において、完全な（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリンと競争するイムノグロブリン断片を含む可変性ドメイン、酵素、受容体、タンパク質を意味する。構造にかかわらず、抗原−結合断片は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリンにより認識された同一の抗原と結合される。抗原結合断片は、抗体のアミノ酸配列の２個以上の連続基、２０個以上の連続アミノ酸残基、２５個以上の連続アミノ酸残基、３０個以上の連続アミノ酸残基、３５個以上の連続アミノ酸残基、４０個以上の連続アミノ酸残基、５０個以上の連続アミノ酸残基、６０個以上の連続アミノ酸残基、７０個以上の連続アミノ酸残基、８０個以上の連続アミノ酸残基、９０個以上の連続アミノ酸残基、１００個以上の連続アミノ酸残基、１２５個以上の連続アミノ酸残基、１５０個以上の連続アミノ酸残基、１７５個以上の連続アミノ酸残基、２００個以上の連続アミノ酸残基、または２５０個以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含んでもよい。
【００４８】
「抗原結合断片」は、特に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の１本鎖抗体、１本鎖ファージ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ、テトラボディ、ポリペプチドへの特定抗原に結合するに十分なイムノグロブリンの１つ以上の断片を含有するポリペプチドなどを含む。前記断片は、合成により、または完全なイムノグロブリンの酵素的または化学的分解により生成されてもよく、組換えＤＮＡ技術により遺伝工学的に生成されてもよい。生成方法は当業界で公知されている。
【００４９】
本発明で用いられる「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、容認可能なまたは便利な投薬形態を製造するための薬物、製剤、または抗体のような活性分子より組み合わされる不活性物質を意味する。薬学的に許容可能な賦形剤は、非毒性であるか、少なくとも毒性が、使用された用量および濃度で受容者にその意図された用途のために許容される賦形剤であり、薬物、製剤、または結合粉剤を含む剤型化の他の成分と両立することができる。
【００５０】
本発明で用いられる「治療学的に有効な量」という用語は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの露出前または露出後に、予防または治療に有効な本発明の結合分子の量を表す。
【００５１】
以下、実施例を挙げて詳細に本発明を説明する。しかし、下記実施例は本発明の内容を例示するものにすぎず、発明の範囲は実施例によって限定されない。本発明で引用された文献は、本発明の明細書に参照として組み込まれる。
【実施例１】
【００５２】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ回復患者の血液からＰＢＭＣの分離
血液供与者は、２０１５年にＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染されたと確定診断され、治療を通じてそれ以上ウイルスが検出されない人らを対象とした。供与者の選定と採血過程は、治験審査委員会（ＩＲＢ）の承認を受けて行われた。供与者の選定後、約３０ｍｌの全血を採血し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）方法によりＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）を分離した。分離されたＰＢＭＣは、リン酸緩衝溶液で２回洗浄した後、冷凍培地（ＲＰＭＩ：ＦＢＳ：ＤＭＳＯ＝５：４：１）で細胞１ｘ１０７個／ｍｌの濃度に調製し、液体窒素タンク（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔａｎｋ）に保管した。
【実施例２】
【００５３】
抗体ディスプレイされたファージライブラリ（ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）の製作
実施例１で分離したＰＢＭＣから、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）によりｃＤＮＡを合成した。
【００５４】
合成されたｃＤＮＡからの抗体ライブラリの製作は、先行文献を参考にした（Ｂａｒｂａｓ  Ｃ．ｅｔ．ａｌ．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２００１．ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ）。簡単に述べると、合成されたｃＤＮＡから、Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）とデジェネラティブプライマーセット（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ）（ＩＤＴ）を用いて抗体の軽鎖と重鎖の可変領域をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅した。分離された軽鎖と重鎖の可変領域断片が、無作為の組み合わせにより１つの配列として連結されるように、ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ方法によりｓｃＦｖ形態の遺伝子にしてから増幅した後、制限酵素で切断し、１％アガロースゲル電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）とｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）方法によりｓｃＦｖを分離した。ファージベクターも同一の制限酵素で切断して分離した後、前記ｓｃＦｖ遺伝子と混合し、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を入れてから、１６℃で１２時間以上反応させた。反応液をＥＲ２７３８コンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）と混合し、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）方法により形質転換した。形質転換されたＥＲ２７３８は、振盪培養後にＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れて１２時間以上培養した。
【実施例３】
【００５５】
ファージ酵素免疫分析を利用した選別
実施例２で製作したファージライブラリ培養液を遠心分離して宿主細胞を除去した後、４％のＰＥＧと０．５ＭのＮａＣｌを入れ、遠心分離してファージを沈降させ、上層液を除去した。沈降したファージを１％のＢＳＡ／ＴＢＳに希釈してファージライブラリを得た後、様々なＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質（以下、Ｓタンパク質）に対する結合および解離反応によりパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を独立に行うことで、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対する結合能力を有するｓｃＦｖ−ファージを分離した。例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の一部であるＲＢＤ領域（ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ３６７  ｔｏ  ５８８  ｏｎ  Ｓ１  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が結合されたＥＬＩＳＡプレート（ｐｌａｔｅ）にファージライブラリを入れ、常温で２時間反応させた。反応液を除去した後、ＥＬＩＳＡプレートを、０．０５％のｔｗｅｅｎ  ２０が含まれているＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍのｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を６０μｌ入れ、抗原に結合したｓｃＦｖ−ファージを取り外し、２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．１）を用いて中和した。中和されたｓｃＦｖ−ファージはＥＲ２７３８に感染させた後、ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）ファージを入れて培養し、次回のパニングに使用した。感染させたＥＲ２７３８の一部は、ヘルパーファージを入れる前にＬＢプレートに塗抹して、翌日にコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を得た。
【００５６】
各パニング毎に形成された総１，２００個のコロニーは、９６−ｗｅｌｌ  ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ａｘｙｇｅｎ）に入っている培養液に入れて振盪培養し、ＯＤ６００が０．７以上の値になった時にヘルパーファージを入れ、３７℃で１２時間以上振盪培養した。培養液を遠心分離して宿主細胞を除去し、ｓｃＦｖ−ファージを含む上清を準備した。
【００５７】
準備したｓｃＦｖ−ファージ上清を６％のＢＳＡ／ＰＢＳと１：１に希釈した後、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質を吸着後、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した９６−ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに入れ、３７℃で２時間静置した。各ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０が含まれているＰＢＳで３回洗浄した後、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が標識された抗Ｍ１３抗体を入れ、３７℃で１時間静置した。各ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０が含まれているＰＢＳで３回洗浄した後、ＡＢＴＳ（２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ］−ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ）を入れ、４０５ｎｍでの吸光度を測定することで、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対する結合力を有するｓｃＦｖ−ファージの４４４種を選別した。
【実施例４】
【００５８】
抗体断片（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の結合能の確認
実施例３で選別された４４４種のｓｃＦｖ−ファージは、後でコロニーを振盪培養してＤＮＡを得た後、抗体可変領域について配列を分析した。このうち、アミノ酸配列として重複されたクローンを除いて選定された１１８個のｓｃＦｖ−ファージを、候補抗体動物細胞株での発現能と中和能を評価するために、Ｆｃ領域を含んでいるベクターにクローニングして抗体断片（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の形態に転換した。トランスフェクション試薬（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）を用いてＦ２Ｎ細胞（韓国登録特許第１０−１００５９６７号、特許権者：（株）セルトリオン）に形質感染させて発現させた後、その培養液を用いて、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の３種に対する抗体断片（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の結合能力をＥＬＩＳＡにより確認した。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレートにＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質を付け、発現された抗体断片を入れた。結合されていない抗体を０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０が含まれているＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された抗−ヒトＦｃ抗体を利用して、抗原と結合した抗体断片を選別した。その結果、１１１種の抗体断片がＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対して特異的に結合することを確認した。
【実施例５】
【００５９】
抗体断片の中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する中和能の評価（一次ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和能評価）
１）サウジ分離種ウイルスの中和能の測定
実施例４の方法により発現させた１１１種の抗体断片培養液を順に２倍希釈し、１２種の濃度のサンプルを準備した。サウジ分離種ウイルス（ＭＥＲＳ／ＨＣｏＶ／ＫＳＡ／ＥＭＣ／２０１２）は、ウイルスストック（ｖｉｒｕｓ  ｓｔｏｃｋ）を溶かして２５  ｏｆ  ＴＣＩＤ５０／ウェルの濃度に希釈し、前記準備された１２種の濃度の抗体断片培養液とそれぞれ混合し、３７℃で２時間静置した後、ベロ細胞（Ｖｅｒｏ  ｃｅｌｌ）が培養された９６−ウェル培養プレートに移し、３７℃で１時間静置して感染を誘導した。抗体断片培養液とウイルスの混合液を除去し、培養培地を各ウェルに入れ、５％の二酸化炭素が入っている３７℃の培養器で３日間培養した後、各ウェルでの細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を顕微鏡で測定して、ウイルス中和能（５０％の中和能が観察されるウェルの抗体濃度）を算出した（Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ方法）。各ウェル当たりに使用されたウイルスの量（２５  ｏｆ  ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）は、逆算（ｂａｃｋ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）して確認した。５０％のウイルス中和効果を示す抗体濃度が低いほど、中和能に優れることを表す。
【００６０】
表３に示したように、３６種の抗体断片が、陽性対照群の抗体１および２（ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に結合し、中和効果が知られた抗体）に比べて優れた中和能を有することが確認された。
【００６１】
【表３】
2021512599.tif 000005
【００６２】
２）韓国分離種ウイルスの中和能の測定
前記１）でサウジウイルスの中和効能が確認された３６種の抗体断片を、韓国分離種ウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ／Ｋｏｒｅａ／ＫＮＩＨ／００２＿０５＿２０１５）に対してＰＲＮＴ測定法（ｐｌａｑｕｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）により評価した。
【００６３】
ＰＲＮＴ測定法は、抗体試料を希釈した後、それぞれ同量の１００ＰＦＵウイルスと混合し、３７℃で１時間反応させてから細胞株に感染させ、プラークアッセイ（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）を行った。３７℃、５％のＣＯ２インキュベータ（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３日間培養した後、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）を利用して染色し、形成されたプラークの数を比較、分析することで、抗体試料の中和能を評価した。
【００６４】
比較分析の結果、前記選別された抗体断片が、２つの陽性対照群抗体に比べてプラークの形成を減少させることが確認され、本発明の３６種の抗体断片が、前記２つの陽性対照群抗体より優れた中和能を有することが確認された（結果を示さない）。
【実施例６】
【００６５】
完全ヒト抗体に転換した後、抗体発現率および抗体結合特異性の評価
選定された抗体断片の遺伝情報を利用して完全ヒト抗体に変換し、実施例４の方法により抗体培養液を準備して、完全ヒト抗体での抗原結合部位、抗体発現率などを確認した。前記ウイルス中和能の評価結果とまとめて、３６種のうち１８種の完全ヒト抗体を選別した。
【実施例７】
【００６６】
完全ヒト抗体の、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する中和能の評価（二次ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和能評価）
１）サウジ分離種ウイルスに対する中和能の評価
実施例６で選定された１８種の抗体を完全ヒト抗体に転換した後、サウジ分離種ウイルスに対するウイルス中和能の評価を、実施例５の１）と同様の方法により行った。表４に示されたように、１８種の抗体のうち１６種の抗体が、陽性対照群抗体１（ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に結合し、中和効果が知られた抗体）より優れたウイルス中和能を有することを確認した。
【００６７】
【表４】
2021512599.tif 000006
【００６８】
２）完全ヒト抗体の韓国分離種ウイルスに対する中和能の評価
実施例６で選定された１８種の抗体を完全ヒト抗体に転換した後、韓国分離種ウイルスに対するウイルス中和能の評価を実施例５の２）と同様の方法により行った。
【００６９】
前記ＰＲＮＴ測定は、一次（抗体７種）および二次（抗体１１種）の１８種の表５に示されたように、１８種の抗体が何れも陽性対照群抗体１および２（ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に結合し、中和効果が知られた抗体）よりも低い数値を示し、より優れたウイルス中和能を有することを確認した。
【００７０】
【表５】
2021512599.tif 000007
【実施例８】
【００７１】
細胞株開発進行対象クローンの選定
細胞株開発対象抗体を選定するために、前記中和能評価結果の他に、さらに物性評価を行った。物性評価として、抗体ターゲット部位、抗体発現率、熱抵抗性評価を行った。熱抵抗性評価のために、簡単には、抗体とＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を適正濃度で希釈して混合し、ＰＣＲ９６ウェルプレートに準備したサンプルを入れ、７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ）にて、２５℃から９９℃まで溶融曲線（ｍｅｌｔ  ｃｕｒｖｅ）を設定して蛍光値を測定した。前記中和能評価と表６に記載の物性評価の結果をまとめて、表５に示した６種の抗体を選定し、これを細胞株進行に適したベクターでクローニングした。
【００７２】
【表６】
2021512599.tif 000008
【実施例９】
【００７３】
サウジおよびヨルダンウイルスに対する中和能の評価（三次ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和能評価）
実施例８で選定された６種の抗体に対して、実施例５の１）と同様の方法によりサウジ分離種ウイルス、ヨルダン分離種ウイルス（ＭＥＲＳ−ＨＣｏＶ／Ｊｏｒｄａｎ／０１）に対する中和能の評価を行った。表７に示したように、陽性対照群の抗体４種（ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に結合し、中和効果が知られた抗体）より優れたウイルス中和能が確認された。
【００７４】
【表７】
2021512599.tif 000009
【実施例１０】
【００７５】
韓国分離種ウイルスに対する中和能の評価（三次ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和能評価）
実施例９で選定した２種の抗体に対して、実施例５の２と同様の方法によりプラークアッセイ（ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ）を行い、韓国分離種中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ／Ｋｏｒｅａ／ＫＮＩＨ／００２＿０５＿２０１５）に対する抗体濃度毎の中和能を評価した。その結果、２種の抗体が、陽性対照群抗体４（ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に結合し、中和効果が知られた抗体）に比べて優れたウイルス中和能を有することを確認した（図１）。
【実施例１１】
【００７６】
ウイルス中和能の評価（ｅｘ  ｖｉｖｏ）
細胞株開発進行抗体に対して、ヒト肺組織感染モデル（ｅｘ  ｖｉｖｏ）を用いた中和能の評価を行った（表８）。簡単には、韓国分離種の中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ／Ｋｏｒｅａ／ＫＮＩＨ／００２＿０５＿２０１５）と評価抗体試料を、ＩＣ５０値を基準として設定してから準備して１時間反応させた後、ウイルスと抗体の反応物をヒト肺組織に感染させ、組織培養を行った。その後、３日間培養しながら２４時間間隔で培養上層液を得て、プラークアッセイによりウイルス力価を測定した。実施例１０で効能を確認した２種の抗体をそれぞれ１００ｎｇずつＭＥＲＳ−ＣｏＶと反応させ、ヒト肺組織に感染させた結果、表８に示したように、２４、４８、７２時間後に、上層液から、抗体処理をしていない陰性対照群抗体および陽性対照群抗体に比べて中東呼吸器症候群コロナウイルスの成長が抑えられていることを確認した（図２）
【００７７】
【表８】
2021512599.tif 000010
【実施例１２】
【００７８】
抗体物性および結合特性の評価
ウイルス中和能などの抗体特性を測定した結果から、最終の細胞株開発進行抗体を２種選定し、これらの抗体物性の評価を行った。評価項目として、凝集体形成評価、配列分析、二硫化結合維持分析、シグナルペプチド切断評価、重鎖および軽鎖の正常結合程度を測定した。表９に示したように、抗体物性特性において特異事項がなかった。
【００７９】
【表９】
2021512599.tif 000011
【００８０】
また、中東呼吸器症候群コロナウイルスの表面タンパク質（ＲＢＤ）に対する抗原結合力の評価（ＳＰＲ、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を行った。表１０に示したように、抗体の中和能および抗体の物性などを総合的に判断して最終的に選定された２種の抗体の結合特性を、陽性対照群抗体４と比較評価した。抗体５は、陽性抗体４に比べて優れた結合特性を有することを確認した。
【００８１】
【表１０】
2021512599.tif 000012
【実施例１３】
【００８２】
ウイルス中和能の評価（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
２種の細胞株開発進行抗体に対して、動物モデルを用いて、中東呼吸器症候群コロナウイルスに対する中和能の評価を行った。具体的に、前記ウイルスの人体内感染に必要なｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス（ＴＧ  ｍｏｕｓｅ）に、抗体投与および韓国分離種の中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ／Ｋｏｒｅａ／ＫＮＩＨ／００２＿０５＿２０１５）の感染を行い、前記最終的に選定された２種の抗体の予防および治療効能を評価した。
【００８３】
先ず、ｈＤＰＰ４  ＴＧマウスに対する中東呼吸器症候群コロナウイルスの感染条件および陽性対照群抗体４の効力を、抗体３、５および陰性対照群抗体を用いて確立した（図３）。そのために、前記ウイルスを動物に感染させ、翌日に各抗体および該当投与量を腹腔内注射した。感染後、特定日が経過した後にマウスの肺組織を摘出し、定量ＰＣＲ（図３Ａ）およびプラークアッセイ（図３Ｂ）により前記ウイルスの量を定量した。動物感染実験が円滑に行われていることを予め確認し、抗体３および抗体５が、陽性対照群抗体４に比べて優れるか類似の治療効能を有することを予め確認した。
【００８４】
予防効能を評価するために、中東呼吸器症候群コロナウイルスの人体内感染に必要なｈＤＰＰ４（ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４）受容体過発現マウス（ｈＤＰＰ４  ＴＧ  ｍｏｕｓｅ）に、抗体５、陽性対照群抗体４、および陰性対照群抗体をそれぞれ腹腔内注射し、翌日に韓国分離種の中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ／Ｋｏｒｅａ／ＫＮＩＨ／００２＿０５＿２０１５）を感染させた。そして、感染後に特定日になった時にマウスの肺組織を摘出し、前記ウイルスの量を定量した（図４）。
【００８５】
定量ＰＣＲ（図４Ａ）およびプラークアッセイ（図４Ｂ）による中東呼吸器症候群コロナウイルスの定量結果、抗体５が、陽性対照群抗体４に比べて優れた予防効能を有することを確認した。
【００８６】
また、感染７日目のマウスの肺を摘出した後、Ｈ＆Ｅ染色して組織内での変化を直接観察した（図５）。その結果、陰性対照群抗体処理群では、気道の隔膜が厚くなっており、多くの炎症細胞が流入されていて、激しい組織の病理学的変化が現れたことを確認した（図５のａおよびｄ）。陽性対照群抗体処理群では、陰性対照群抗体処理よりは激しくなかったが、炎症細胞の流入および厚くなった気道隔膜を確認した（図５のｂおよびｅ）。これに対し、抗体５を処理した群では、他の処理群に比べて組織の病理学的変化がより少なく現れることを確認した（図５のｃおよびｆ）。
【００８７】
尚、治療効能を評価するために、前記ウイルスを動物に感染させ、翌日に抗体５、陽性対照群抗体４、および陰性対照群抗体をそれぞれ腹腔内注射した。特定感染日が経過した後、マウスの体重減少の程度、マウス生存率を測定し、また、マウスの肺組織を摘出して前記ウイルスの量を定量した（図６）。マウスの体重減少（図６ａ）およびマウス生存率（図６ｂ）を評価した結果、陰性対照群抗体および抗体５の最も低い投与量（２ｕｇ）でのみ、体重減少および致死率が観察された。また、定量ＰＣＲ（図６ｃ）およびプラークアッセイ（図６ｄ）による中東呼吸器症候群コロナウイルスの定量結果、抗体５が、陽性対照群抗体４に比べて優れるか類似の治療効能を有することを確認した。
【図１】
2021512599.tif 000013
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月30日(2020.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）の表面のスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合する、中和結合分子。
【請求項２】
下記ｉ）〜ｖｉ）の結合分子：
ｉ）ａ）配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域、および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域、および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；
ｉｉ）ａ）配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域、および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；
ｉｉｉ）ａ）配列番号１３のＣＤＲ１領域、配列番号１４のＣＤＲ２領域、および配列番号１５のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１６のＣＤＲ１領域、配列番号１７のＣＤＲ２領域、および配列番号１８のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；
ｉｖ）ａ）配列番号１９のＣＤＲ１領域、配列番号２０のＣＤＲ２領域、および配列番号２１のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号２２のＣＤＲ１領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域、および配列番号２４のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；
ｖ）ａ）配列番号２５のＣＤＲ１領域、配列番号２６のＣＤＲ２領域、および配列番号２７のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号２８のＣＤＲ１領域、配列番号２９のＣＤＲ２領域、および配列番号３０のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子；および
ｖｉ）ａ）配列番号３１のＣＤＲ１領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域、および配列番号３３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ｂ）配列番号３４のＣＤＲ１領域、配列番号３５のＣＤＲ２領域、および配列番号３６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含む結合分子
からなる群から選択される何れか１つである、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
下記ｉ）〜ｖｉ）：
ｉ）ａ）配列番号３７のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号３８のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；
ｉｉ）ａ）配列番号３９のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４０のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；
ｉｉｉ）ａ）配列番号４１のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４２のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；
ｉｖ）ａ）配列番号４３のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４４のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；
ｖ）ａ）配列番号４５のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４６のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子；および
ｖｉ）ａ）配列番号４７のポリペプチド配列の重鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号４８のポリペプチド配列の軽鎖可変領域と９５％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、結合分子
から構成された群から選択される何れか１つである、請求項１に記載の結合分子。
【請求項４】
Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子。
【請求項５】
請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子にさらに１つ以上のタグが結合された、イムノコンジュゲート。
【請求項６】
請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子が挿入された発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターが宿主細胞に形質転換され、中東呼吸器症候群コロナウイルスに結合して中和能力を有する結合分子を生産する、細胞株。
【請求項９】
前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ボーズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする、請求項８に記載の細胞株。
【請求項１０】
請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子を含む、中東呼吸器症候群コロナウイルス感染の予防または治療用組成物。
【請求項１１】
滅菌注射溶液、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）剤型、プレフィルドシリンジ（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）溶液剤、経口剤型、外用剤、または坐剤であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
中東呼吸器症候群コロナウイルス感染により発生する疾患を有する対象に治療学的に有効な量で投与される、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から３の何れか一項に記載の結合分子を含む、中東呼吸器症候群コロナウイルス診断用キット。
【国際調査報告】
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