(57)【要約】  本発明は、ＵＲＡＴ１阻害剤の結晶形及びその製造方法を公開した。  【化１】2021504353.tif 000018
2021504353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、７．５０±０．２°、１３．０４±０．２°、２１．４３±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する式（I）化合物のＡ結晶形。
【化１】
2021504353.tif 000017
【請求項２】
結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、７．５０±０．２°、９．６６±０．２°、１３．０４±０．２°、１４．４２±０．２°、１７．４６±０．２°、１８．５７±０．２°、２１．４３±０．２°、２６．１８±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項１に記載のＡ結晶形。
【請求項３】
ＸＲＰＤスペクトルが図１で示される通りである、請求項２に記載のＡ結晶形。
【請求項４】
示差走査熱量曲線が、１６９．４２±３℃に一つの吸熱ピークの開始点を有する、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡ結晶形。
【請求項５】
ＤＳＣスペクトルが図２で示される通りである、請求項４に記載のＡ結晶形。
【請求項６】
熱重量分析曲線が１００±３℃といったところで重量損失が０．０４４９１％に達する、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡ結晶形。
【請求項７】
ＴＧＡスペクトルが図３で示される通りである、請求項６に記載のＡ結晶形。
【請求項８】
粉末Ｘ線回折スペクトルが、９．８８±０．２°、１０．５６±０．２°、２０．３８±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する、
式（I）化合物のＢ結晶形。
【請求項９】
粉末Ｘ線回折スペクトルが、９．８８±０．２°、１０．５６±０．２°、１２．２３±０．２°、１３．０４±０．２°、１４．６２±０．２°、１７．５７±０．２°、２０．３８±０．２°、２６．８９±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する、
請求項８に記載のＢ結晶形。
【請求項１０】
ＸＲＰＤスペクトルが図４で示される通りである、請求項９に記載のＢ結晶形。
【請求項１１】
示差走査熱量曲線が、１６３．５１±３℃に一つの吸熱ピークの開始点を有する、
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＢ結晶形。
【請求項１２】
ＤＳＣスペクトルが図５で示される通りである、請求項１１に記載のＢ結晶形。
【請求項１３】
熱重量分析曲線が１２０±３℃といったところの重量損失が０．１１９１％に達し；１２０±３℃から１５３．６０±３℃いったところで重量損失が０．６２８２％に達する、
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＢ結晶形。
【請求項１４】
ＴＧＡスペクトルが図６で示される通りである、請求項１３に記載のＢ結晶形。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の参照
ＣＮ２０１７１１１８１９６０．２、出願日：２０１７．１１．２３
技術分野
本発明は、ＵＲＡＴ１阻害剤の結晶形及びその製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
尿酸は動物体内のプリン類化合物の代謝産物である。人間にとって、尿酸を継続的に酸化分解する尿酸酵素が足りないため、尿酸は人体内でプリン体代謝の最終産物として腸と腎臓を通じて体外に排出され、その中で、腎臓を通じた排泄は人体内の尿酸排出の主要なルートである。人体内の正常な尿酸濃度範囲の上限は：男性は４００μｍｏｌ／Ｌ  （６．８ｍｇ／ｄＬ）、女性は３６０μｍｏｌ／Ｌ  （６ｍｇ／ｄＬ）である。人体内の尿酸レベルの異常は、尿酸の生成の増加又は尿酸排泄の減少によるものが多い。尿酸レベルの異常に関連する病気は高尿酸血症、痛風などがある。
【０００３】
高尿酸血症とは、人体内のプリン体物質の代謝が乱れ、人体の尿酸の合成が増加又は排出が減少して、血液中の尿酸レベルが異常に高くなる病気のことである。痛風性関節炎とは、尿酸が人体血液中の濃度が７  ｍｇ／ｄＬを超える時、モノナトリウム塩の形で関節、軟骨及び腎臓に堆積して、体の免疫システムの過剰反応（敏感）を来たして痛みの炎症を引き起こす病気のことである。一般的な発症部位は、親指関節、足首関節、膝関節等である。急性の痛風の発作部位は赤くなって、腫れて、熱くなって、激しい痛みが現れ、普通は真夜中に発作して、人を睡眠の中から目覚ませる。初期の痛風は下肢の関節に多発する。高尿酸血症は痛風性関節炎の病理的な基礎であり、薬を使って血液の中の尿酸濃度を下げることは痛風性関節炎を予防する通常の方法の一つである。
【０００４】
欧米では、高尿酸血症及び痛風疾患の発作が増加する傾向がある。疫学の研究は、痛風性関節炎の発症者数は総人口の１〜２％を占め、成人男性の最も主要な関節炎のタイプであることを表明した。ブルームバーグ通信は２０２１年には１７７０万人の痛風患者がいると予想した。中国では、調査によると、２０〜７４歳の年齢層の人口のうち、２５．３％の人口の血尿酸含有量が高く、０．３６％の人口が痛風疾患を患っている。現在、臨床治療薬は主に１）例えば、キサンチンオキシダーゼ阻害剤であるアロプリノール及びフェブリク等の尿酸の生成を抑える薬；２）例えば、プロベネシド及びベンズブロマロン等の尿酸の排泄を促進する薬；３）例えば、コルヒチン等の炎症阻害剤がある。これらの薬は治療上では全部一定の欠陥があって、治療効果が悪い、副作用が大きい、費用が高いのはその臨床の応用のいくつかの主要なボトルネックである。報道によれば、４０％〜７０％の患者が標準流れの治療を受けた後、血尿酸の含有量が予想される治療目標（＜６ｍｇ／ｄＬ）に達していなかった。
【０００５】
尿酸排出促進剤として、その作用メカニズムは、近衛曲細尿管ブラシ状縁膜上のＵＲＡＴ  １トランスポーターを抑制することにより、尿酸の再吸収を低減することである。尿酸は体内のプリン体の代謝産物であり、主に原形で糸球体のろ過、細尿管の再吸収及び再分泌を通じて、最後に尿を通じて体外に排除され、ごく一部が腸間膜細胞から腸の中に分泌される。近衛曲細尿管Ｓ  １段は尿酸の再吸収の場所であり、９８％〜１００％のろ過された尿酸はここで細尿管上皮細胞のブラシ状縁膜上の尿酸トランスポーターＵＲＡＴ  １及び有機陰イオントランスポーターＯＡＴ  ４を介して上皮細胞に入る。上皮細胞に入った尿酸は、再び細尿管基底膜を経て細尿管周りの毛細血管に再吸収される。近衛曲細尿管Ｓ  ２段は尿酸再分泌の場所であり、分泌量は糸球体ろ過量の約５０％である。腎間質の尿酸は、まず細尿管上皮細胞基底膜の陰イオントランスポーターＯＡＴ  １、ＯＡＴ  ３を経て上皮細胞内に入る。上皮細胞に入った尿酸はブラシ状縁膜上のもう一種の陰イオントランスポーターＭＲＰ４を経て、細尿管空洞内に排出される。近衛曲細尿管Ｓ  ３段は尿酸が分泌された後の再吸収場所である可能性があり、再吸収量は約糸球体ろ過量の４０％で、且つ、第一回目の吸収と似たように、ＵＲＡＴ  １は重要な重吸収トランスポーターである可能性がある。そのため、尿酸塩トランスポーターＵＲＡＴ  １を著しく抑えることができれば、体内の尿酸の排泄を強化し、これにより、血尿酸レベルを低下させ、痛風発作の可能性を低下させる。
【０００６】
２０１５年１２月、アメリカのＦＤＡは最初のＵＲＡＴ  １抑制剤Ｚｕｒａｍｐｉｃ（Ｌｅｉｎｕｒａｄ）を承認した。その２００  ｍｇの用量とキサンチンオキシダーゼ阻害剤ＸＯＩ（例えば、Ｆｅｂｕｘｏｓｔａｔ等）を併用して高尿酸血症と痛風性関節炎の治療に使用することを承認したが、併用する場合とキサンチンオキシダーゼ阻害剤を単独投与する場合を比較して、その付加的な効果はあまり目立つものではなかった。Ｚｕｒａｍｐｉｃ  ４００ｍｇの用量が承認されてない原因は、容量が高い場合、著しい毒副作用（腎臓に関連する有害な事象が発生する率、特に腎結石の発症率）があるからである。したがって、ＦＤＡはＺｕｒａｍｐｉｃのラベルに黒枠の警告を付け、医療関係者にＺｕｒａｍｐｉｃが急性腎不全のリスクを引き起こし、特にＸＯＩとの併用しない場合にはよりよく見られ、もし許可された容量を超えてＺｕｒａｍｐｉｃを使用する場合、腎臓不全を引き起こすリスクはもっと高くなることを警告するように要求した。同時に、ＦＤＡはＺｕｒａｍｐｉｃが市場にでた後、アスリカンで腎臓と心血管の安全性についての考察を続けことを要請した。そのため、新型の安全的に血尿酸を下げる薬がこの分野の強い需要となった。
【０００７】
ＷＯ２００９０７０７４０はＬｅｉｎｕｒａｄを公開し、その構造は以下の通りである：
【０００８】
【化１】
2021504353.tif 000003
【０００９】
発明の概要
本発明は、結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、７．５０±０．２°、１３．０４±０．２°、２１．４３±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する式（I）化合物のＡ結晶形を提供する。
【００１０】
【化２】
2021504353.tif 000004
【００１１】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、７．５０±０．２°、９．６６±０．２°、１３．０４±０．２°、１４．４２±０．２°、１７．４６±０．２°、１８．５７±０．２°、２１．４３±０．２°、２６．１８±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【００１２】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形のＸＲＰＤスペクトルは図１の通りである。
【００１３】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形のＸＲＰＤスペクトルの解析データは表１の通りである。
【００１４】
【表１】
2021504353.tif 000005
【００１５】
2021504353.tif 000006
【００１６】
2021504353.tif 000007
【００１７】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の示差走査熱量曲線が、１６９．４２±３℃に一つの吸熱ピークの開始点を有する。
【００１８】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形のＤＳＣスペクトルが図２で示される通りである。
【００１９】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の熱重量分析曲線が１００±３℃といったところで重量損失が０．０４４９１％に達する。
【００２０】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形のＴＧＡスペクトルが図３で示される通りである。
【００２１】
また、式（I）化合物のＢ結晶形であって、粉末Ｘ線回折スペクトルが、９．８８±０．２°、１０．５６±０．２°、２０．３８±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【００２２】
本発明の一部の形態において、上述Ｂ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、９．８８±０．２°、１０．５６±０．２°、１２．２３±０．２°、１３．０４±０．２°、１４．６２±０．２°、１７．５７±０．２°、２０．３８±０．２°、２６．８９±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【００２３】
本発明の一部の形態において、上述Ｂ結晶形のＸＲＰＤスペクトルが図４で示される通りである。
【００２４】
本発明の一部の形態において、上述Ｂ結晶形のＸＲＰＤスペクトルの解析データは表２の通りである：
【００２５】
【表２】
2021504353.tif 000008
【００２６】
2021504353.tif 000009
【００２７】
2021504353.tif 000010
【００２８】
本発明の一部の形態において、上述Ｂ結晶形の示差走査熱量曲線が、１６３．５１±３℃に一つの吸熱ピークの開始点を有する。
【００２９】
本発明の一部の形態において、上述Ｂ結晶形のＤＳＣスペクトルが図５で示される通りである。
【００３０】
本発明の一部の形態において、上述Ｂ結晶形の熱重量分析曲線が１２０±３℃といったところの重量損失が０．１１９１％に達し；１２０±３℃から１５３．６０±３℃といったところで重量損失が０．６２８２％に達する。
【００３１】
本発明の一部の形態において、上述Ｂ結晶形のＴＧＡスペクトルが図６で示される通りである。
【００３２】
技術効果
本発明の式（I）化合物はＵＲＡＴ  １（尿酸輸送タンパク質）遺伝子を安定的に転写するＨＥＫ  ２９３細胞系において、ＵＲＡＴ  １が媒介する１４Ｃ−尿酸の輸送に対して、より優れた体外阻害活性を示し；本発明の式（I）化合物はより良い薬物代謝の安定性を有し、同時に薬物の経口吸収のバイオアベイラビリティも大幅に向上させ；その結晶形は溶解度が良く、安定性が比較的に良い。したがって、本発明の化合物は良好な医薬としての将来性を有する。
【００３３】
定義と説明
別途に説明しない限り、本明細書で用いられる以下の用語および連語は以下の意味を含む。一つの特定の連語または用語は、特別に定義されない場合、不確定または不明瞭ではなく、普通の定義として理解されるべきである。本明細書で商品名が出た場合、相応の商品またはその活性成分を指す。
【００３４】
本発明の中間体化合物は当業者に熟知の様々な合成方法によって製造することができ、以下に挙げられた具体的な実施形態、ほかの化学合成方法と合わせた実施形態および当業者に熟知の同等の代替方法を含み、好適な実施形態は本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の具体的な実施形態の化学反応は適切な溶媒で完成され、前記の溶媒は本発明の化学変化およびそれに必要な試薬と材料に適するべきである。本発明の化合物を得るため、当業者が既存の実施形態に基づいて合成工程または反応スキームを変更または選択することが必要であることもある。
【００３６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の何らの制限にもならない。
【００３７】
本発明に使用されたすべての溶媒は市販品で、さらに精製せずにそのままで使用してもよい。
【００３８】
本発明に使用されたすべての溶媒は市販により得られる。本発明は下記略語を使用する：ＤＣＭはジクロロメタンで、ＤＭＦはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドで、ＥｔＯＨはエタノールで、ＭｅＯＨはメタノールで、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸で、ＴｓＯＨはｐ−トルエンスルホンで、ｍｐは融点で、ＥｔＳＯ３Ｈはエタンスルホン酸で、ＭｅＳＯ３Ｈはメタンスルホン酸で、ＡＴＰはアデノシン三リン酸で、ＨＥＰＥＳは４‐ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸で、ＥＧＴＡはエチレングリコールビス（２‐アミノエチルエーテル）四酢酸で、ＭｇＣｌ２は二塩化マグネシウムで、ＭｎＣｌ２は二塩化マンガンで、ＤＴＴはジチオトレイトールを表す。
【００３９】
粉末Ｘ線回折（Ｘ−ｒａｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）
装置型式：ブルカーＤ８  ａｄｖａｎｃｅ  Ｘ線回折装置
測定方法：約１０〜２０  ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出に使用した。
【００４０】
詳細なＸＲＰＤパラメーターは以下の通りである。
【００４１】
Ｘ線管：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）
管電圧：４０  ｋＶ、管電流：４０  ｍＡ
発散スリット：０．６０  ｍｍ
検出器スリット：１０．５０  ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０  ｍｍ
走査範囲：４〜４０度
ステップ幅：０．０２度
ステップ時間：０．１２秒
サンプルプレート回転数：１５  ｒｐｍ
示差走査熱量分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）
装置型式：ＴＡ  Ｑ２０００示差走査熱量計
測定方法：サンプル（〜１  ｍｇ）をＤＳＣアルミニウムパン内に置いて測定し、５０  ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ２の条件において、１０℃／ｍｉｎの升温速度で、サンプルを２５℃から３００℃（または３５０℃）に加熱する。
【００４２】
熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）
装置型式：ＴＡ  Ｑ５０００ＩＲ熱重量分析装置
測定方法：サンプル（２〜５  ｍｇ）をＴＧＡ白金パン内に置いて測定し、２５  ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ２の条件において、１０℃／ｍｉｎの升温速度で、サンプルを室温から重量減少が２０％になるまで加熱する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】Ａ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図２】Ａ結晶形のＤＳＣスペクトルである。
【図３】Ａ結晶形のＴＧＡスペクトルである。
【図４】Ｂ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図５】Ｂ結晶形のＤＳＣスペクトルである。
【図６】Ｂ結晶形のＴＧＡスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
具体的な実施形態
以下、本発明の内容がより良く理解されるように、具体的な実施例と合わせてさらに説明するが、具体的な実施形態は本発明の内容に対する制限ではない。
【００４５】
実施例１：  式（I）化合物の調製
【００４６】
【化３】
2021504353.tif 000011
【００４７】
合成スキーム：
【００４８】
【化４】
2021504353.tif 000012
【００４９】
工程１：化合物２の合成
三口フラスコ（１０  Ｌ）にジメチルスルホキシド４．５  Ｌを入れ、撹拌しながらカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（８３６．６６  ｇ、  ７．４６  ｍｏｌ、  ２  ｅｑ）を添加し、添加完了後全部溶解するまで反応物を１０分間撹拌し、次に氷水浴下で反応液を内部温度が２０〜２５℃になるまでに冷却した。前記溶液に化合物１（５００．０５  ｇ、３．７３  ｍｏｌ、１  ｅｑ）のジメチルスルホキシド（５００  ｍＬ）溶液を滴下し、滴下が完了した後、３０分間撹拌して反応させ、次にその中に二硫化炭素（２８３．８６  ｇ、３．７３  ｍｏｌ、１  ｅｑ）を滴下し、滴下が完了した後、続いて３０分撹拌した。更に、ブロモ酢酸エチル（１２５０  ｇ、  ７．４６  ｍｏｌ、  ２  ｅｑ）を滴下し、滴下が完了した後、続いて２時間撹拌して反応させた。最後に炭酸カリウム（５１５．５２  ｇ、７．４６  ｍｏｌ、１  ｅｑ）を添加し、内部温度が６５℃になるまで温度を上げ、引き続いて８時間撹拌して反応させた。反応完了後、反応液を室温まで冷却させた。反応液を酢酸エチル（１０Ｌ）で希釈し、次に１Ｍ塩酸（２  Ｌ）及び水（２  Ｌ）を入れ、１０分間撹拌し、静置して液を分離させた。水層を分離し、有機相を水（２  Ｌ×３）で洗浄した。水層を合わせ、酢酸エチル（３  Ｌ）で抽出した。全部の有機相を合わせ、飽和食塩水（２  Ｌ×２）で洗浄した。有機相を適量の無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して乾燥剤を除去し、ろ過液を減圧して溶剤を除去して、粗生成物を得た。同じ規模で、６バッチを並行供給し、合わせた後、黒い赤色の油状の粗生成物を得た。粗生成物を７２時間静置して大量の個体が析出し、その中にエタノール（２  Ｌ）を入れ、３０分間撹拌し、ろ過し、ケーキを収集して真空乾燥させ、化合物２を得た。
【００５０】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ：  ４．３２  （ｑ、  Ｊ＝７．２  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ４．１９  （ｑ、  Ｊ＝７．２  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ３．５６  （ｓ、  ２Ｈ）、  ３．２５  （ｔ、  Ｊ＝  ６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ３．１９  （ｔ、  Ｊ＝１４．４  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２６−２．１７  （ｍ、  ２Ｈ）、  １．３７  （ｔ、  Ｊ＝７．２  Ｈｚ、  ３Ｈ）、  １．２７（ｔ、  Ｊ＝７．２Ｈｚ、  ３Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ＝  ３６４．８  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程２：化合物３の合成
化合物２（２４１．００  ｇ、０．６６  ｍｏｌ）をエタノール（１  Ｌ）に溶解し、且つ、高圧釜（５  Ｌ）に置き、アルゴンガスの保護下でラネーニッケル（１２０  ｇ）を添加し、更にエタノール（２  Ｌ）を追加した。高圧釜をよく詰め、アルゴンガスで３回置換し、次に水素で３回置換し、タンク内圧力が２．０  ＭＰになるまで水素を充填し、撹拌しながら釜内温度が８５℃になるまで加熱して２８時間反応させた。反応を停止させ、反応システムを室温まで冷却し、反応液を濾過し、ケーキをエタノールで毎回０．５  Ｌで三回洗浄した。ろ過液を合わせ、次にスピン乾燥して化合物３を得た。
【００５１】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ：  ７．０９  （ｓ、  １Ｈ）、  ４．２６  （ｑ、  Ｊ＝７．２  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ３．２０  （ｔ、  Ｊ＝  ６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ３．１２  （ｔ、  Ｊ＝１４．４  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２０−２．１０  （ｍ、  ２Ｈ）、  １．３０  （ｔ、  Ｊ＝６．８  Ｈｚ、  ３Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ＝２４７．０  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程３：化合物４の合成
化合物３（４０６．２  ｇ、１．６５  ｍｏｌ、１  ｅｑ）をアセトニトリル（６  Ｌ）に溶解し、次にＮ−ブロモスクシンイミド（１４８４．２  ｇ、６．６０  ｍｏｌ、４  ｅｑ）をゆっくりと添加し、得た反応液を２３〜２５℃で１２時間撹して反応させた。反応終了後、反応液を約１．０  Ｌまでに濃縮させた。ろ過して固体を除去し、ろ過液に亜硫酸水素ナトリウム飽和溶液（１  Ｌ）を入れ、１０分間撹拌した。酸エチルを入れ、毎回２  Ｌで３回抽出した。有機相を合わせ、適量の無水硫酸ナトリウムを入れ乾燥させた。ろ過して乾燥剤を除去し、ろ過液を減圧濃縮した。残留物に石油エーテル（３  Ｌ）を入れ、３０℃で３０分間十分に撹拌した。ろ過し、ケーキを石油エーテルで製品が残らないまで毎回２００  ｍＬで５回洗浄した。全部の有機相を合わせ、スピン乾燥して粗生成物を得た。粗生成物に石油エーテル（１００  ｍＬ）を入れ、十分に撹拌し、ろ過し、ケーキを収集して真空乾燥させて化合物４を得た。
【００５２】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ：  ４．２４  （ｑ、  Ｊ＝７．２  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ３．１９  （ｔ、  Ｊ＝６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．９５  （ｔ、  Ｊ＝１４．４  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．１７−２．０７  （ｍ、  ２Ｈ）、  １．２９  （ｔ、  Ｊ＝７．２  Ｈｚ、  ３Ｈ）。
工程４：化合物５の合成
化合物４（３４０．２１  ｇ，１．０５  ｍｏｌ）、シクロプロピルホウ酸（１０８．１２  ｇ，１．２６ｍｏｌ）、無水リン酸カリウム（４４４．９８  ｇ，２．１０  ｍｏｌ）、酢酸パラジウム（１２．０３  ｇ，５３．５８ｍｍｏｌ）及び２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’、４’、６‘−トリイソプロピルビフェニル（２３．８６  ｇ，５０．０５ｍｍｏｌ）をトルエンと水の混合溶媒（１０：１、３．４  Ｌ／３４０  ｍＬ）に入れ、反応フラスコを窒素で６回置換してからオイルバスに入れた。反応液の内部温度が８０℃になるまで加熱し、この温度で１６時間撹拌して反応させた。反応が完了した後、反応液を室温まで冷却し、反応液にトリチオシアヌル酸（６．５１  ｇを３４  ｍＬのエタノールに懸濁させ）を加え、０．５時間撹拌した。似たような規模（３００．００  ｇの化合物４）で、５バッチを並行供給し、合わせて処理した。ろ過し、有機相を分離し、水相は酢酸エチル（２５０  ｍＬ×２）で抽出した。有機相を合わせ、適量の無水硫酸ナトリウムを入れて乾燥させた。ろ過して乾燥剤を除去し、ろ過液を減圧濃縮して、黒い油状の粗生成物を得た。粗生成物２０時間静置した後、黄色の固体が析出し、その中に石油エーテル（３  Ｌ）を入れ、１時間攪拌した。ろ過し、ケーキを真空乾燥させ、化合物５を得た。
【００５３】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ：  ４．２９  （ｑ、  Ｊ＝７．２  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ３．２３  （ｔ、  Ｊ＝６．４  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ３．１６  （ｔ、  Ｊ＝１４．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２４−２．１８  （ｍ、  ２Ｈ）、  １．９５−１．８５  （ｍ、  １Ｈ）、  １．３５  （ｔ、  Ｊ＝６．８Ｈｚ、  ３Ｈ）、  １．０９−１．０７  （ｍ、  ２Ｈ）、  ０．７７−０．７５  （ｍ、  ２Ｈ）。  
工程５：化合物６の合成
化合物５（６１９．２７  ｇ，２．１６  ｍｏｌ）を水酸化ナトリウム（１７３．５５  ｇ、４．３３  ｍｏｌ）のエタノール及び水の混合溶液（３  Ｌ／３  Ｌ）に添加し、反応液を内部温度が６０℃になるまで加熱し、３時間撹拌した。反応完了後、反応液を室温まで冷却させた。似たような規模（７５０．１７  ｇの化合物５）で、１バッチを並行供給し、合わせて処理した。合わせた反応液を石油エーテル（４  Ｌ）で抽出した。有機相を分離し、有機相を水（１．５  Ｌ×２）で２回逆洗した。水相を合わせ、減圧濃縮してエタノールを除去した。水相に水を加えて１３  Ｌに希釈し、希塩酸（３  Ｍ）をゆっくり添加してｐＨ＝２に調節し、大量の薄い黄色の固体が析出した。ろ過し、ケーキを水（３．０  Ｌ×２）でシャワーさせた。ドレインして、ケーキを収集し、真空オーブン６０℃で真空乾燥させて化合物６を得た。
【００５４】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：  １２．７９  （ｂｒｓ、  １Ｈ）、  ３．２３  （ｔ、  Ｊ＝１４．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ３．０７  （ｔ、  Ｊ＝６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２７−２．２０  （ｍ、  ２Ｈ）、  ２．１９−２．０２  （ｍ、  １Ｈ）、  １．０９−１．０４  （ｍ、  ２Ｈ）、  ０．６８−０．６６  （ｍ、  ２Ｈ）。  
工程６：化合物７の合成
攪拌しながら、化合物６（６４１．２７  ｇ、２．４８  ｍｏｌ）、トリエチルアミン（７５４．０７  ｇ、７．４５  ｍｏｌ）及びジフェニルホスホリルアジド（１０２５．３４  ｇ、３．７３  ｍｏｌ）をｔｅｒｔ−ブタノール（６．５  Ｌ）に添加した。反応液を１００℃の油浴に置いて１６時間加熱した。反応終了後、室温まで冷却させた。似たような規模（６５０．００  ｇの化合物６）で、４バッチを並行供給し、合わせて処理した。反応液を合わせ、減圧濃縮してｔｅｒｔ−ブタノールを除去した。残りの黒い残留物を酢酸エチル（１０  Ｌ）で溶解し、得た酢酸エチル溶液を水酸化ナトリウム水溶液（５％，５．０  Ｌ×２）で洗浄し、次に飽和食塩水（５．０  Ｌ）で洗浄した。適量の無水硫酸ナトリウムを入れ、乾燥させた。ろ過して乾燥剤を除去し、ろ過液を減圧濃縮させ、ブラウンブラックの固体の粗生成物を得、静置した後、固体が析出した。石油エーテル（８  Ｌ）を粗生成物に添加し、２時間撹拌した。ろ過し、ケーキは石油エーテル（１  Ｌ）でバッチにシャワーさせ、ケーキを真空オーブン６０℃で真空乾燥させて化合物７を得た。
【００５５】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ：  ６．３１（ｂｒｓ、  １Ｈ）、  ３．１１  （ｔ、  Ｊ＝１４．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．６６  （ｔ、  Ｊ＝６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２３−２．１５  （ｍ、  ２Ｈ）、  １．８２−１．７５  （ｍ、  １Ｈ）、  １．５１  （ｓ、  ９Ｈ）、  ０．９４−０．９０  （ｍ、  ２Ｈ）、  ０．６８−０．６５  （ｍ、  ２Ｈ）。
工程７：化合物８の合成
化合物７（１１９９．１７  ｇ，３．６４  ｍｏｌ）を酢酸エチル（２  Ｌ）に入れ、よく混ぜてから塩化水素の酢酸エチル溶液（４  Ｌ，１６．００  ｍｏｌ，４  Ｍ）を添加した。反応液を１５℃で２．５時間反応させ、その後４０℃の温水浴に置いて続いて２時間反応させた。反応終了後、大量の暗い赤色の固体が析出した。ろ過し、ケーキを酢酸エチル（２．０  Ｌ）でバッチにシャワーさせた。ケーキを真空オーブン６０℃で真空乾燥させて化合物８を得た。
【００５６】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：  ３．１７  （ｔ、  Ｊ＝１４．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．８２  （ｔ、  Ｊ＝６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２５−２．１５  （ｍ、  ２Ｈ）、  ２．００−１．９４  （ｍ、  １Ｈ）、  ０．９９−０．９５  （ｍ、  ２Ｈ）、  ０．５８−０．５４  （ｍ、  ２Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ＝２２９．８  ［Ｍ＋Ｈ−ＨＣｌ］＋。
工程８：化合物９の合成
３  Ｌの三口フラスコの中で、化合物８（３０１．２５  ｇ）をテトラヒドロフラン（６００  ｍＬ）に添加し、内部温度が０〜１０℃になるまで氷水浴の冷却下で撹拌した。ジイソプロピルエチルアミン（６３５．７２  ｇ）を滴下し、滴下完了後、氷水浴を撤収し、内部温度１０〜１５℃で約１０分間撹拌した。ろ過し、ケーキをテトラヒドロフラン（１００  ｍＬ×  ２）で洗浄した。ろ過液を合わせ、予備の溶液Ａを得た。
【００５７】
テトラヒドロフラン（２  Ｌ）を、チオホスゲン（２５７．４８  ｇ）を入れた５  Ｌの反応フラスコに入れた。氷水浴下で撹拌して内部温度が０〜１０℃になるまで冷却し、ゆっくりと溶液Ａを滴下し、保温して約５．５時間内に滴下完了させ、続いて１０分間攪拌した。反応終了後、ろ過し、ケーキをテトラヒドロフラン（１５０  ｍＬ×２）で洗浄した。ろ過液を合わせ、減圧濃縮して溶剤を除去した。残留物にテトラヒドロフラン（４００  ｍＬ）を添加して、予備の溶液Ｂを得た。
【００５８】
ヒドラジン水和物（１１２．９４  ｇ）をテトラヒドロフラン（２．５  Ｌ）に入れ、氷水浴下で攪拌して内部温度が５〜１０℃になるまで冷却した。溶液Ｂを滴下し、保温しながら約２時間以内に滴下を完了させ、続いて１０分間撹拌した。反応が完了した後、反応を停止させた。氷水浴を撤去し、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドのジメチルアセタール（３３３．４５  ｇ）を添加し、内部温度が６０〜６５℃になるまで加熱し、保温しながら３時間反応させ、その後停止させた。
【００５９】
反応液をスピン乾燥させ、残留物に酢酸エチル（２  Ｌ）と純水（１  Ｌ）を入れ、よく混ぜた。１０％の臭化水素酸でｐＨ５〜６まで調整し、続いて５分間攪拌し、１０分間静置した。液を分け、水相を分離した。有機相を純水（５００  ｍＬ×２）で洗浄した。水相を合わせ、酢酸エチル（１  Ｌ）で抽出し、有機相を合わせ、適量の無水硫酸ナトリウムを入れ、乾燥させた。ろ過して乾燥剤を除去し、ろ過液を減圧濃縮して乾燥させ、化合物９の粗生成物を得た。粗生成物にn-ヘプタン（２．０  Ｌ）及びメチルtert-ブチルエーテル（１５０  ｍＬ）を添加し、１８時間スラリー化（攪拌回転速度５５０回転／分）させた。ろ過し、ケーキをｎーヘプタン（１５０  ｍＬ）で洗浄した。ケーキを収集し、真空オーブン６０℃で真空乾燥して化合物９を得た。
【００６０】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ：  ７．８２  （ｓ、  １Ｈ）、  ３．２０  （ｔ、  Ｊ＝１４．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．７４  （ｔ、  Ｊ＝６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２８−２．１０  （ｍ、  ２Ｈ）、  １．９８−１．８２  （ｍ、  １Ｈ）、  １．０６−１．０２  （ｍ、  ２Ｈ）、  ０．７５−０．７１  （ｍ、  ２Ｈ）；  ＭＳ  ｍ／ｚ＝３１３．９  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程９：化合物１０の合成
アセトニトリル（３  Ｌ）を５  Ｌの三口フラスコで入れた。攪拌しながら、まず化合物９（３０３．２５  ｇ）及び炭酸カリウム（２６１．８３  ｇ）を添加した。さらに２−ブロモイソ酪酸メチル（２０３．８５  ｇ）を添加し、反応系を窒素ガスで置換した後、内部温度が６０〜６５℃になるまで加熱し、保温しながら約２時間反応させた。反応が終了した後、加熱を止め、撹拌しながら１５〜２０℃までに自然冷却した。ろ過し、ケーキを酢酸エチル（１００  ｍＬ×３）で洗浄した。ろ過液を合わせ、減圧濃縮し、乾燥させ、粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（移動相：酢酸エチル／ｎ-ヘプタン＝１：５〜２：１）によって精製して化合物１０を得た。
【００６１】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ：  ８．２０  （ｓ、  １Ｈ）、  ３．６８  （ｓ、  ３Ｈ）、  ３．１９  （ｔ、  Ｊ＝１４．４  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．５７  （ｔ、  Ｊ＝６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２２−２．１２  （ｍ、  ２Ｈ）、  １．９３−１．８３  （ｍ、  １Ｈ）、  １．６７  （ｓ、  ６Ｈ）、  １．０８−１．０３  （ｍ、  ２Ｈ）、  ０．７３−０．６９  （ｍ、  ２Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ＝４１４．０  ［Ｍ＋Ｈ］＋。 
工程１０：化合物１１の合成
アセトニトリル（３．１７  Ｌ）を５  Ｌの三口フラスコで入れた。攪拌しながら、化合物１０（３１７．２２  ｇ）及びチオカルボニルジイミダゾール（２６．９４  ｇ）を入れ、１６〜２０℃に保温しながら５分間撹拌した。Ｎ‐ブロモスクシンイミド（１５８．６０  ｇ）を入れ、保温しながら約３０分間撹拌した。反応終了後、反応を中止させた。ろ過し、濾過液を減圧濃縮して黒色の粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（移動相：酢酸エチル／ｎ−ヘプタン＝０〜５０％）によって精製して３４０．６２  ｇの黄色の固体粗生成物を得た。この粗生成物を酢酸エチル（３．５  Ｌ）で溶解し、更に純水（７００  ｍＬ×４）で洗浄した。有機相を分離し、適量の無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過して乾燥剤を除去し、ろ過液を減圧濃縮して乾燥させて化合物１１を得た。
【００６２】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）  δ：  ３．７３  （ｓ、  ３Ｈ）、  ３．２２  （ｔ、  Ｊ＝１４．４  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．５３  （ｔ、  Ｊ＝６．８  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．２４−２．１４  （ｍ、  ２Ｈ）、  １．９５−１．９１  （ｍ、  １Ｈ）、  １．７１  （ｄ、  Ｊ＝  ４．４  Ｈｚ、  ６Ｈ）、  １．１１−１．０７  （ｍ、  ２Ｈ）、  ０．７８−０．７４  （ｍ、  ２Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ＝４９１．７  ［Ｍ＋Ｈ］＋、  ４９３．７  ［Ｍ＋Ｈ＋２］＋。
工程１１：式（I）化合物の合成
５  Ｌの反応フラスコにテトラヒドロフラン（１．２  Ｌ）を入れ、撹拌しながら化合物１１（２４３．０３  ｇ）を添加した。溶解後、純水（１．２  Ｌ）を加え、次に水酸化リチウム一水和物（１２５．４６  ｇ）を入れ、２０〜２５℃に保温しながら約２．５時間撹拌した。反応終了後、反応を中止した。反応液を４０℃で減圧濃縮して有機溶剤を除去した。残留物に純水（１  Ｌ）を添加し、メチルtertブチルエーテル（３００  ｍＬ）でストリッピングし、有機相を分離した。水相を１０  Ｌの三口フラスコに置き、氷浴で温度を５〜１０℃まで下げた。４０％の臭化水素酸溶液でｐＨ２〜３に調整し、大量の薄い黄色の固体が析出した。続いて３０分間攪拌し、再度測定したｐＨは２〜３のままであった。続いて２０分間攪拌し、ろ過した。ケーキを純水（１５０  ｍＬ×３）で洗浄した。ケーキを収集し、純水（１５００  ｍＬ）を入れ、室温で１時間スラリー化した。ろ過し、ケーキを純水（１５０  ｍＬ×２）で洗浄し、ケーキを収集し、４０℃で３時間真空乾燥させ、式（I）化合物を得た。
【００６３】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、  ＣＤ３ＯＤ）  δ：  ３．２７  （ｔ、  Ｊ＝１５．６  Ｈｚ、  ２Ｈ）、  ２．６０−２．４７  （ｍ、  ２Ｈ）、  ２．２７−２．１７  （ｍ、  ２Ｈ）、  ２．１０−２．０３  （ｍ、  １Ｈ）、  １．６８  （ｄ、  Ｊ＝１．２  Ｈｚ、  ６Ｈ）、  １．１５−１．１０  （ｍ、  ２Ｈ）、  ０．８０−０．７１  （ｍ、  ２Ｈ）；ＭＳ  ｍ／ｚ  ＝４７７．９９  ［Ｍ＋Ｈ］＋、  ４８０．１  ［Ｍ＋Ｈ＋２］＋。
【００６４】
実施例２：  式（Ｉ）化合物のＡ結晶形の製造
式（I）化合物（５０  ｍｇ）をガラス瓶に入れ、それぞれメタノール（０．４  ｍＬ）を添加し、懸濁液又は溶液になるまで撹拌した。前記懸濁液サンプルを恒温ミキサー（４０℃）に置き、４０℃で６０時間振動してから遠心し、サンプルを収集した。前記溶解したサンプルを室温で揮発させた後遠心し，サンプルを収集した。前記サンプルを真空乾燥箱（４０℃）に入れ、一晩乾燥させた後、ＸＲＰＤでその結晶形の状態を検査し、得た最終生成物の結晶形は式（I）化合物のＡ結晶形であった。
【００６５】
式（I）化合物（５０  ｍｇ）をガラス瓶に入れ、それぞれ酢酸エチル（０．４  ｍＬ）を添加し、懸濁液又は溶液になるまで撹拌した。前記懸濁液サンプルを恒温ミキサー（４０℃）に置いて、４０℃で６０時間振動してから遠心し、サンプルを収集した。前記溶解したサンプルを室温で揮発させて遠心し，サンプルを収集した。前記サンプルを真空乾燥箱（４０℃）に入れ、一晩乾燥させた後、ＸＲＰＤでその結晶形状態を検査し、得た終生成物の結晶形は式（I）化合物のＡ結晶形であった。
【００６６】
実施例３：式（Ｉ）化合物のＢ結晶形の製造
式（I）化合物（５０  ｍｇ）をガラス瓶に入れ、テトラヒドロフラン（０．４  ｍＬ）を添加し、全部溶解するまでに撹拌した。前記溶解したサンプルを室温で揮発させた後遠心し，サンプルを収集した。サンプルを収集し、真空乾燥箱（４０℃）に入れ、一晩乾燥させた後、ＸＲＰＤでその結晶形状態を検査し、得た終生成物の結晶形は式（I）化合物のＢ結晶形であった。
【００６７】
実施例４：式（Ｉ）化合物のＡ結晶形の溶解度試験
１．希釈剤及び移動相の調製
希釈剤：正確な量の３００  ｍＬの純水と１００  ｍＬの純アセトニトリルを取り、１  Ｌのガラス瓶の中で混合し、超音波で１０分間脱気して、次のステップに使うように用意した。
【００６８】
移動相Ａ：０．１％のリン酸水溶液
例えば：２．０  ｍＬのリン酸を取って２０００  ｍＬの水に添加し、１０分間超音波して、均一に混合し、室温に冷却するまでに置き、移動相Ａとした。
【００６９】
移動相Ｂ：アセトニトリル。
２．対照品溶液の調製（Ａ結晶形自体を対照サンプルとする）
正確に５ｍｇのＡ結晶形を称って取り、試料瓶に入れ、希釈剤１０  ｍＬを入れ、５分間超音波した後、室温に冷却するまでに置き、均一に混合し、作業対照品溶液ＳＴＤ−１として表記した。
【００７０】
正確に５ｍｇのＡ結晶形を称って取り、試料瓶に入れ、希釈剤１０  ｍＬを入れ、５分間超音波した後、室温に冷却するまでに置、均一に混合し、作業対照品溶液ＳＴＤ−２として表記した。
３．線形溶液の調製
前記作業の対照品溶液ＳＴＤ−１を段階的に１倍、１０倍、１００倍、１０００倍及び２０００倍に希釈し、線形溶液Ｌ  １、Ｌ  ２、Ｌ  ３、Ｌ  ４及びＬ  ５と表記した。
４．溶解度テスト試験
それぞれ正確に６ｍｇのＡ結晶形を秤り取り、８ｍＬのガラス瓶に入れ、次に正確に３ｍＬの異なる溶媒（０．１Ｎ塩酸溶液、０．０１Ｎ塩酸溶液、純化水、ｐＨ３．８の緩衝液、ｐＨ４．５の緩衝液、ｐＨ５．５の緩衝液、ｐＨ６．０の緩衝液、ｐＨ７．４の緩衝液、ｐＨ６．８の緩衝液）を入れ、懸濁液に調製した。前記懸濁液に攪拌子を添加し、３７℃で光を避けてよく攪拌した。撹拌後、ｐＨ  ７．４の緩衝液とｐＨ  ６．８の緩衝液の中の固体が全部溶解し、それぞれ６  ｍｇのＡ結晶形を正確に秤り、緩衝液に補足し、再度十分に撹拌して懸濁液を調製した。４時間及び２４時間撹拌した後サンプリングして遠心し、溶液をろ過膜でろ過した後、ＨＰＬＣでその濃度を測定し、ここで、ＨＰＬＣ分析方法は表３に示す通りであった。
【００７１】
【表３】
2021504353.tif 000013
【００７２】
結界は表４に示す通りであった：
【００７３】
【表４】
2021504353.tif 000014
【００７４】
注：ＬＯＱは測定限界を下回ることを表す；前記異なるＰＨの緩衝液は、各ＰＨの特定された塩溶液のことを表す。
【００７５】
結論：式（I）化合物のＡ結晶形はｐＨの高い緩衝液でより良い溶解度有する。
【００７６】
テスト例１：式（I）化合物の体外評価
１．各作業液の調製
１）ＤＭＳＯを２００倍作業液の溶媒とし、備蓄液を各投与濃度の２００倍作業液に希釈した。
【００７７】
Ａ結晶形：０、０．００２、０．００６、０．０２、０．０６、０．２及び０．６  ｍｍｏｌ／Ｌ；
ｌｅｓｉｎｕｒａｄ：０、０．０６、０．２、０．６、２、６及び２０  ｍｍｏｌ／Ｌ。
２）Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液（Ｃｌ−なし）をトランスポートタンパク質ＵＲＡＴ  １の２倍作業液の溶媒とし、１）の２００倍作業液を１００倍に希釈した後、それぞれの投与濃度の２倍の作業液を得た。
３）Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液（Ｃｌ−なし）を使用して、薬物輸送トランスポートタンパク質ＵＲＡＴ１基質の２倍の作業溶液を調製し、次に２）の各濃度の２倍作業溶液と同じ容量で混合し、よく混合して次のステップに使うように用意した。
２．投与方法
２．１．摂取型細胞の阻害実験
摂取阻害実験に使用された細胞培地は、ＤＭＥＭ培地に１０％  ＦＢＳ（ペニシリン及びストレプトマイシンを含む）を添加したものである。
【００７８】
ヒト薬物トランスポーターを過剰発現する細胞株（ＨＥＫ  ２９３  Ａ−ＵＲＡＴ  １）及び空のキャリア細胞（ＨＥＫ  ２９３  Ａ−ｐｃＤＮＡ  ３．１）を蘇生させ及び継代育成した後、成長が良好な接着細胞を選んでバンクレアチンで消化して単細胞懸濁液に分散させ、その後、培地で細胞密度を２．０  〜３．０×１０５セル／ｍＬに調節し、次に細胞懸濁液を１  ｍＬ／穴の量で２４ウェルの細胞培養板に接種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽和空気湿度のインキュベーターで、各ウェルをカバーするまで細胞を２〜３日間インキュベートした。
【００７９】
先ず、培養板内の培養液を取り出し、Ｈａｎｋｓ緩衝塩溶液（Ｃｌ−なし）で一回洗浄し、その後、各ウェルに３７℃のＨａｎｋｓ緩衝塩溶液（Ｃｌ−なし）を入れ１０分間インキュベートし、次に放射性マーカーを含む５００μＬのプローブ基質溶液で２４ウェルプレートの中のＨａｎｋｓ緩衝塩溶液（Ｃｌ−なし）を置換し、薬の投与を開始した；投与終了後（２分）、それぞれの事前に冷却した緩衝塩溶液で反応を終了させ、細胞を３回洗浄した；ウェル当たりに４００μＬ  ０．１  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨを添加して細胞を溶解した；細胞溶解液を点滅瓶に取り、３  ｍＬのＡｑｕａｓｏｌ−２点滅液を添加し、Ｔｒｉ−ＣＳａｒｂ  ２９１０  ＴＲ液体シンチレーションメーターでサンプル中の放射強度を測定した。細胞輸送試験で、各濃度および陽性対照、ブランク対照（ｍｏｃｋ）を、３ウェル（ｎ＝３）を設定した。
２．２．データの処理
２．２．１．阻害作用の計算
標的物投与群のトランスポーター細胞のみを含む摂取値（ベースｂａｃｋｇｒｏｕｎｄグループ、即ち、空のキャリア細胞の摂取値Ｕ０を除く）を１００％（対照，Ｕｃ）と定義し、これを標準として、測定対象化合物を入れた後の、各投与群からベースを差し引いた摂取値Ｕと対照群の摂取値Ｕｃの割合（％）を計算し、トランスポーター活性に対する各濃度の阻害率（ＩＲ）を計算し、これにより化合物がトランスポーターに対する阻害作用の強さを表し、その計算式は以下の通りである：
ＩＲ＝１−［１００×（Ｕ−Ｕ０）／（Ｕｃ−Ｕ０）］％
投与濃度当たり３つの繰り返し（即ち、ｎ＝３）を設定し、Ｍｅａｎ  ±  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  （ＳＤ）をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０ソフトウェアの統計学公式で計算した。
【００８０】
各トランスポーターのそれぞれの投与濃度阻害率（ＩＲ）に基づき、Ｐｒｉｓｍ  ５．０を通して、且つ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ  ２０１０ソフトウェアのＦｏｒｅｃａｓｔ関数と結合して化合物が薬物トランスポーターの転送活性に影響するＩＣ５０を計算した。
２．２．２．統計学方法
各サンプルの平均値の差の分析はｔ−ｔｅｓｔ（Ｐ＜０．０５は有意な差があるとみなされる）を採用した。
３．実験結果
式（I）化合物、ｌｅｓｉｎｕｒａｄは、尿酸トランスポーターＵＲＡＴ  １を媒介する１４Ｃ−ＵＡ摂取に対して有意な抑制作用（Ｐ＜０．００１）があり、ＩＣ５０はそれぞれ０．０３４  μｍｏｌ／Ｌ及び６．０１  μｍｏｌ／Ｌであった。ＵＲＡＴ  １に対する式（I）化合物の阻害作用は、参考化合物ｌｅｓｉｎｕｒａｄの約１７７倍であり、阻害効果がより顕著である。
【００８１】
テスト例２：式（I）化合物の薬物動態学の評価
実験目的：式（I）化合物の単回静脈注射と胃内投与、及び８日間繰り返しして胃内投与した後、雌雄ＳＤラットの体内の血漿の薬物動態学。
実験プロトコル：
１．本実験ではメスオス各半の１２匹のＳＤラットを使用し、ラットは北京ＶＩＴＡＬ  ＲＩＶＥＲ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．が提供した。体重が似たことにより２つのグループに分け、各グループはオス３匹とメス３匹を含み、詳しい投与方案及び採血方法はそれぞれ表５、表６の通りであった：
【００８２】
【表５】
2021504353.tif 000015
【００８３】
【表６】
2021504353.tif 000016
【００８４】
２．サンプルの収集及び分析方法
実験動物は首の静脈を貫通して０．１５  ｍＬの血液サンプルを採取し、直ちにラベルを貼ったＫ２−ＥＤＴＡ（０．５  Ｍ）を含む遠心管に移行し、３０分以内で血漿を遠心分離（遠心条件：３０００  ｇ、４℃、１５分間）させた。検証済みのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析方法を用いて血漿の濃度を測定し；ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．３  （Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、  ＣＡ）の薬物動態学ソフトウェアを用いたノンコンパートメントモデルにより血漿の濃度を処理し、線形対数台形法を用いて薬物動態学パラメーターを計算した。
３．実験結果及び結論
ＳＤラット静脈投与後、式（I）化合物は体内で急速に分布し、且つ、ゆっくりと除去され、オスラットの血漿除去率は９．７６  ±  ２．２９  ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇで、定常状態の見かけの分布容積（Ｖｄｓｓ）は１．６５  ±０．４４０  Ｌ／ｋｇで、Ｔ１／２及びＡＵＣ０−ｉｎｆはそれぞれ２．５２  ±  ０．６７１ｈ及び３５３０  ±  ７２３ｎｇ・ｈ／ｍＬで；メスラットの血漿除去率は６．４１  ±  ０．６５６  ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇで、定常状態の見かけの分布容積（Ｖｄｓｓ）は１．５５  ±０．４０８  Ｌ／ｋｇで、消失半減期（Ｔ１／２）とＡＵＣ０−ｉｎｆはそれぞれ３．０４  ±  １．１２  ｈ及び５２４０  ±  ５４４ｎｇ・ｈ／ｍＬであった。
【００８５】
ＳＤラットに式（I）化合物４．０  ｍｇ／ｋｇを単回胃内投与した後、オスラットのピークに到達する濃度（Ｃｍａｘ）は１１３０  ±  ４８３  ｎｇ／ｍＬ、ＡＵＣ０−ｉｎｆは２５１０  ｎｇ・ｈ／ｍＬ、ピークに到達する時間（Ｔｍａｘ）は０．４１７  ±  ０．１４４  ｈ、消失半減期（Ｔ  １／２）は１．７２  ｈで；メスラットのピークに到達する濃度（Ｃｍａｘ）は２１１０  ±  １３５０ｎｇ／ｍＬ、ＡＵＣ０−ｉｎｆは９０１０  ±  ４６７０ｎｇ・ｈ／ｍＬ、ピークに到達する時間（Ｔｍａｘ）は０．６６７  ±  ０．２８９  ｈ、消失半減期（Ｔ１／２）は３．４８±０．８３５  ｈであった。オスラットのバイオアベイラビリティは３５．６％で、メスラットのバイオアベイラビリティは８６．０％であった（注：ＡＵＣ０−ｉｎｆは０時間から無限大に伸ばした場合の血中濃度−時間曲線下面積を表す。）。
【００８６】
上記のように、式（I）化合物は薬物代謝の安定性を大幅に高め、同時に薬物の経口吸収のバイオアベイラビリティも大幅に向上させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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