(57)【要約】  本出願は、対象の疾患、例えばポンペ病を処置する方法であって、対象へのメトトレキセートおよび治療剤の投与の後に対象の試料の中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること、ならびに赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を同時に投与して、または投与しないで、さらなる処置を投与することを含む方法を提供する。対象へのメトトレキセートおよび治療剤の投与の後の赤血球形成バイオマーカーの検出に基づいて、対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを調査するための方法およびキットが、本出願によりさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療剤による処置を必要とする対象を処置する方法であって、
（ａ）該対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程と；
（ｂ）該対象に該治療剤の有効量を投与する工程と；
（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に該対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程と；
（ｄ）対照のそれと比較した該赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、該治療剤によるさらなる処置を継続する工程と
を含む前記方法。
【請求項２】
赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は赤血球形成の誘導と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
赤血球形成バイオマーカーはヘマトクリットまたは血液ヘモグロビン含有量である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することであり、ここで、赤血球形成に関連する該遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連する遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、Ｌｙ７６（Ｔｅｒ−１１９のための抗原）、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
トランスフェリン受容体はトランスフェリン受容体１（ＣＤ７１）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
赤血球形成に関連する遺伝子を検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子のＲＮＡ転写物を検出すること、または赤血球形成に関連する遺伝子のタンパク質生成物を検出することを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質生成物はヘモグロビンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
赤血球形成バイオマーカーは赤血球形成に関連する補因子である、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
赤血球形成に関連する補因子は、ポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
試料は血液試料である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
血液試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む血液画分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血液試料は血清試料または血漿試料であり、バイオマーカーを検出することは赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対照は既存対照またはプラセボ対照である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
対象はヒトである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
メトトレキセートは、単一サイクルで投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
メトトレキセートのサイクルは、１日のメトトレキセート投与または２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日連続のメトトレキセート投与からなる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
メトトレキセートは、治療剤の投与の前、間および後の１つまたはそれ以上から選択される時間に対象に投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
メトトレキセートは、治療剤の投与の４８時間前から４８時間後の間に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
メトトレキセートは治療剤の投与と同時に、ならびに治療剤の投与の約２４時間後および約４８時間後に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
メトトレキセートは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
試料は、メトトレキセートの最終投与の少なくとも約１日後から約３０日後に対象から得られる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
試料は、メトトレキセートの最終投与の約７日後から約１４日後に対象から得られる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
試料は、メトトレキセートの最終投与後の複数の日に得られる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
試料は、メトトレキセートの最終投与から１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１４日目、２１日目または２８日目のうちの１日またはそれ以上の日に得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｄ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞または形質細胞を枯渇させる薬剤を投与することを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｄ）は：
（ａ）リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレートおよびコルチコステロイドの１つまたはそれ以上の有効量を投与すること；および
（ｂ）抗原特異的寛容性戦略を投与すること
の１つまたはそれ以上を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
抗原特異的寛容性戦略は、治療剤のより高頻度の投薬または治療剤のより高い用量を投与することまたはその両方を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
治療剤のより高い用量は、ＩＶＩＧと同時投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
治療剤は、ポリペプチド、核酸、ウイルス、遺伝子療法、脂質、リポソームまたは炭水化物である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
治療剤は治療ポリペプチドである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
治療ポリペプチドは抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
抗体はモノクローナル抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体はリンパ球枯渇剤である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗体はアレムツズマブである、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
治療ポリペプチドは酵素である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
酵素はヒトアルファガラクトシダーゼＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
酵素はヒト酸性α−グルコシダーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
対象はリソソーム蓄積症を有する、請求項１〜３４および３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
対象はポンペ病を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ポンペ病は小児発症ポンペ病である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ポンペ病は古典的な小児発症ポンペ病である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
対象は交差反応性免疫物質（ＣＲＩＭ）陰性である、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
最初の免疫寛容性誘導療法を治療剤の投与と同時に投与することをさらに含み、ここで、治療剤はヒト酸性α−グルコシダーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
最初の免疫寛容性誘導療法はリツキシマブおよびＩＶＩＧの１つまたはそれ以上を投与することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
それを必要とする対象においてポンペ病を処置する方法であって、
（ａ）該対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程と；
（ｂ）該対象にヒト酸性α−グルコシダーゼの有効量を投与する工程と；
（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に該対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程と；
（ｄ）対照のそれと比較した該赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、該ヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続する工程と
を含む前記方法。
【請求項５０】
赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は赤血球形成の誘導と関連する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、ヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずにヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
赤血球形成バイオマーカーはヘマトクリットである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することであり、ここで、赤血球形成に関連する該遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連する遺伝子である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、Ｌｙ７６（Ｔｅｒ−１１９のための抗原）、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
トランスフェリン受容体はトランスフェリン受容体１（ＣＤ７１）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
赤血球形成に関連する遺伝子を検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子のＲＮＡ転写物を検出すること、または赤血球形成に関連する遺伝子のタンパク質生成物を検出することを含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
タンパク質生成物はヘモグロビンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
赤血球形成バイオマーカーは赤血球形成に関連する補因子である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
赤血球形成に関連する補因子は、ポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
試料は血液試料である、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
血液試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む血液画分である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
対象はヒトである、請求項４９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ポンペ病は小児発症ポンペ病である、請求項４９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ポンペ病は古典的な小児発症ポンペ病である、請求項４９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
対象はＣＲＩＭ陰性である、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
対照は既存対照またはプラセボ対照である、請求項４９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される、請求項４９〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
メトトレキセートの有効量は、単一サイクルで投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
メトトレキセートのサイクルは、１日のメトトレキセート投与または２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日連続のメトトレキセート投与からなる、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
メトトレキセートの有効量は、治療剤の投与の前、間および後の１つまたはそれ以上から選択される時間に対象に投与される、請求項４９〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
メトトレキセートの有効量は、治療剤療法の投与の４８時間前から４８時間後の間に投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
メトトレキセートは治療剤の投与と同時に、ならびに治療剤の投与の約２４時間後および約４８時間後に投与される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
メトトレキセートの有効量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである、請求項４９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、メトトレキセートの最終投与の少なくとも約１日後から約３０日後である、請求項４９〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、メトトレキセートの最終投与の約７日後から約１４日後である、請求項４９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
試料は、メトトレキセートの最終投与後の複数の日に得られる、請求項４９〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
試料は、メトトレキセートの最終投与から１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１４日目、２１日目または２８日目のうちの１日またはそれ以上の日に得られる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
工程（ｄ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞または形質細胞を枯渇させる薬剤を投与することをさらに含む、請求項４９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
形質細胞を枯渇させる薬剤はボルテゾミブである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
工程（ｄ）は、
（ａ）リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレートおよびコルチコステロイドの１つまたはそれ以上の有効量を投与すること；ならびに
（ｂ）抗原特異的寛容性戦略を投与すること
の１つまたはそれ以上を含む、請求項４９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
抗原特異的寛容性戦略は、治療剤のより高頻度の投薬または治療剤のより高い用量を投与することまたはその両方を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
治療剤のより高い用量は、ＩＶＩＧと同時投与される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
抗ヒト酸性α−グルコシダーゼ抗体、ＣＤ１９レベルまたは疾患進行の１つまたはそれ以上をモニタリングすることをさらに含む、請求項４９〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
ポンペ病を有する対象における免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、
（ａ）少なくとも１サイクルのメトトレキセート処置および治療剤の少なくとも１用量を以前に投与されている該対象から試料を得る工程と；
（ｂ）該試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する該試料中の該赤血球形成バイオマーカーのレベルは免疫寛容性の誘導を示す、工程と
を含む前記方法。
【請求項８６】
工程（ｂ）は試料を赤血球形成バイオマーカーに結合する薬剤と接触させることを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
治療剤を必要とする対象における該治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、
（ａ）該対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程と；
（ｂ）該対象に該治療剤の有効量を投与する工程と；
（ｃ）該対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する該試料中の該赤血球形成バイオマーカーのレベルは該対象における該治療剤への免疫寛容性の誘導を示す、工程と
を含む前記方法。
【請求項８８】
治療剤を必要とする対象における該治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、
（ａ）該対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程と；
（ｂ）該対象に該治療剤の有効量を投与する工程と；
（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に該対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程と；
（ｄ）工程（ｃ）において検出されるバイオマーカーのレベルに基づいて該対象における該治療剤への免疫寛容性のレベルを同定する工程と
を含む前記方法。
【請求項８９】
赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は赤血球形成の誘導と関連する、請求項８５〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない、請求項８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により完全に本明細書で組み入れられる、２０１７年１２月２２日に出願の米国特許仮出願第６２／６０９，９８６号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に免疫学に、より具体的には治療剤によって対象を処置する方法、および赤血球形成バイオマーカーの検出に基づいてメトトレキセートによって誘導される治療剤への免疫寛容性を調査する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
メトトレキセートは、悪性の自己免疫性疾患の処置において確立された歴史を有する（例えば、非特許文献１を参照）。それは１９４０年代にがんの処置のために最初に記載され、メトトレキセートの高用量クールはいくつかの新生物状態を処置するために使用し続けられている。自己免疫では、とりわけ、慢性関節リウマチおよび乾癬などの疾患を処置するために、連続的週単位の低用量メトトレキセートが使用される（非特許文献２；非特許文献３、にレビューされる）。しかし、より近年の研究は、免疫寛容性の誘導におけるメトトレキセートの代替使用を発見した。一時的な低用量メトトレキセート免疫寛容誘導（ＩＴＩ）レジメンは、組換えヒト酸性−α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ、アルグルコシダーゼアルファ）などの酵素補充療法（ＥＲＴ）への免疫寛容性を誘導することが示された（非特許文献４；非特許文献５）。同種心臓移植における移植体拒絶反応を処置するために使用されたマウスの抗胸腺細胞グロブリンで実証されたように、一時的な低用量メトトレキセート処置および治療用バイオ医薬品の同時投与は、バイオ医薬品への長期免疫寛容性を誘導することも示された（非特許文献６）。高リスクの古典的な小児発症ポンペ患者における臨床観察では、一時的な低用量メトトレキセートがリツキシマブ（Ｂ細胞を枯渇させるモノクローナル抗体）および、場合により、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）と一緒に同時投与された免疫寛容性プロトコールは、ｒｈＧＡＡに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の長期低減の実現に成功した（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。リツキシマブだけで長期免疫寛容性を再現的に誘導することが一般的にできなかったので、メトトレキセートが臨床レジメンにおいて良好な免疫寛容性に寄与すると考えられる（非特許文献１０、非特許文献１１）。
【０００４】
ポンペ病は、リソソーム酸α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子の欠損によって引き起こされる。高リスクの古典的な小児発症ポンペ患者は、リソソーム内のグリコーゲンを分解する酵素である内在性ＧＡＡを欠いている。機能的ＧＡＡの欠如は、筋肉組織におけるグリコーゲンの過剰蓄積から生じる神経筋病状をもたらす。処置無しでは、これらの患者における疾患進行は急速であり、一般的に生後１年以内に、侵襲性の換気を究極的に必要とする呼吸衰弱、心不全および死につながる筋肉劣化（ミオパシー）を伴う。ｒｈＧＡＡによる酵素補充療法は、ポンペ病の処置において有効だった（非特許文献１２）。しかし、高リスクの古典的な小児発症ポンペ患者におけるｒｈＧＡＡ単独療法は、処置に干渉して効能を低減する、ｒｈＧＡＡに対するＡＤＡの高力価に一般的につながる。今日まで、一時的な低用量メトトレキセートとリツキシマブおよびＩＶＩＧの同時投与によって、少数の古典的小児発症ポンペ患者における臨床試験で、ｒｈＧＡＡへの長期免疫寛容性が首尾よく誘導されている。これらの研究では、患者は継続した処置によって３５カ月を超える年齢までＡＤＡ無しの状態である（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。しかし、ＡＤＡ応答を軽減するために必要とされる免疫モジュレーションの程度は、前の酵素補充療法の程度によって患者の間で異なった：免疫寛容性処置の前にＥＲＴを事前投与された患者は、さらなる免疫モジュレーションを必要とした（非特許文献８）。臨床観察は数が限定されたままであるが、ｒｈＧＡＡへのＡＤＡ免疫応答の発達および潜在的確立を制限するために、高リスクの小児発症ポンペ患者における良好なＥＲＴは、ＥＲＴにおいて免疫寛容性が達成されるのがより早いほど良好である可能性がより高いことが明らかである（非特許文献９）。しかし、免疫調節療法を誘導するために免疫寛容性をモニタリングするために利用可能なツールは、これらの患者では有用性が限定される可能性がある：抗薬物抗体は寛容性の程度（または欠如）の一次マーカーであるが、そのような抗体は治療用バイオ医薬品による処置の開始後数週から数カ月の間一般的に出現しない。この点で、免疫寛容性を効果的に誘導して維持するための重要な時間が、既に失われていることがある。治療の早期に生じる免疫寛容性のマーカーの不在は、有効な療法の不在下で急速に悪化する、高リスクの小児発症ポンペ患者などの患者のために特に懸念される。
【０００５】
したがって、ポンペ病のためのｒｈＧＡＡなどの治療用バイオ医薬品を含む、免疫応答の誘発が可能な治療薬を受ける患者において望ましくない免疫応答を低減するための戦略を誘導するために、免疫寛容性（免疫寛容性の早期の誘導など）を調査する改善された方法の必要性がある。
【０００６】
本明細書で参照される全ての刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示は、ここに参照により本明細書に完全に組み入れられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｒｅｍｅｒ  ２００４
【非特許文献２】Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ  ２００５
【非特許文献３】Ｔａｙｌｏｒら  ２００８
【非特許文献４】Ｇａｒｍａｎ、Ｍｕｎｒｏｅら  ２００４
【非特許文献５】Ｊｏｓｅｐｈ、Ｍｕｎｒｏｅら  ２００８
【非特許文献６】Ｊｏｓｅｐｈ、Ｎｅｆｆら  ２０１２
【非特許文献７】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒら  ２００９
【非特許文献８】Ｍｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら  ２０１２
【非特許文献９】Ｂａｎｕｇａｒｉａ、Ｐｒａｔｅｒら  ２０１３
【非特許文献１０】Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ、Ｍｅｎｇｏｌｉら  ２００８
【非特許文献１１】Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｍａｔｈｉａｓら  ２００９
【非特許文献１２】Ｋｉｓｈｎａｎｉ、Ｃｏｒｚｏら  ２００７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、処置の方法および赤血球形成バイオマーカーの検出に基づいて治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法を提供する。
【０００９】
したがって、本出願の一態様は、治療剤による処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、治療剤によるさらなる処置を継続することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか、または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか、または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、治療剤による処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；（ｄ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与すること；または（ｅ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数（ｉｎｎｎａｔｕｒｅ  ｒｅｌｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、未熟な有核赤血球のレベルが未熟な有核赤血球のレベルが上昇する前に最初に低下する場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置が継続される。一部の実施形態では、メトトレキセートが単一サイクルで投与される場合、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１、約２、約３、約４、約５、約６または約７日前までに低下する。一部の実施形態では、メトトレキセートが２サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される場合、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１日から約１４日前までに低下する。一部の実施形態では、メトトレキセートが２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される場合、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１日から約１４日前までに低下する。
【００１１】
一部の実施形態では、治療剤による処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；（ｄ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与すること；または（ｅ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。
【００１２】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することであり、ここで、赤血球形成に関連する遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上である。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、Ｌｙ７６（Ｔｅｒ−１１９のための抗原）、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、トランスフェリン受容体は、トランスフェリン受容体１（ＣＤ７１）である。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子を検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子のＲＮＡ転写物を検出すること、または赤血球形成に関連する遺伝子のタンパク質生成物を検出することを含む。一部の実施形態では、タンパク質生成物は、ヘモグロビンである。
【００１３】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子である。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する補因子は、ポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。
【００１４】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、治療剤は、ポリペプチド、核酸、ウイルス、遺伝子療法、脂質、リポソームまたは炭水化物である。一部の実施形態では、治療剤は、治療ポリペプチドである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、リンパ球枯渇剤である。一部の実施形態では、抗体は、アレムツズマブである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、酵素である。一部の実施形態では、酵素は、ヒトアルファガラクトシダーゼＡである。一部の実施形態では、酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼである。
【００１５】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、対象は、リソソーム蓄積症を有する。一部の実施形態では、対象は、ポンペ病を有する。一部の実施形態では、対象は、古典的な小児発症ポンペ病などの小児発症ポンペ病を有する。一部の実施形態では、ポンペ病は、交差反応免疫物質（ＣＲＩＭ）陰性である。一部の実施形態では、本方法は、最初の免疫寛容性誘導療法を治療剤の投与と同時に投与することをさらに含み、ここで、治療剤はヒト酸性α−グルコシダーゼである。一部の実施形態では、最初の免疫寛容性誘導療法は、リツキシマブおよびＩＶＩＧの１つまたはそれ以上を投与することを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、それを必要とする対象（例えば、ヒト）においてポンペ病を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象にヒト酸性α−グルコシダーゼの有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；（ｄ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、ヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置と同時に投与すること；または（ｅ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずにヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、未熟な有核赤血球のレベルが未熟な有核赤血球のレベルが上昇する前に最初に低下する場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置が継続される。一部の実施形態では、メトトレキセートが単一サイクルで投与される場合、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１、約２、約３、約４、約５、約６または約７日前までに低下する。一部の実施形態では、メトトレキセートが２サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される場合、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１日から約１４日前までに低下する。一部の実施形態では、メトトレキセートが２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される場合、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１日から約１４日前までに低下する。
【００１７】
一部の実施形態では、それを必要とする対象（例えば、ヒト）においてポンペ病を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象にヒト酸性α−グルコシダーゼの有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；（ｄ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法をヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置と同時に投与すること；または（ｅ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずにヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することであり、ここで、赤血球形成に関連する遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連する遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子を検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子のＲＮＡ転写物を検出すること、または赤血球形成に関連する遺伝子のタンパク質生成物を検出することを含む。一部の実施形態では、タンパク質生成物は、ヘモグロビンである。
【００１８】
一部の実施形態では、それを必要とする対象（例えば、ヒト）においてポンペ病を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象にヒト酸性α−グルコシダーゼの有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；（ｄ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、ヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置と同時に投与すること；または（ｅ）赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずにヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することであり、ここで、赤血球形成に関連する遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連する遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、Ｌｙ７６（Ｔｅｒ−１１９のための抗原）、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、トランスフェリン受容体は、トランスフェリン受容体１（ＣＤ７１）である。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子を検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子のＲＮＡ転写物を検出すること、または赤血球形成に関連する遺伝子のタンパク質生成物を検出することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子である。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する補因子は、ポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。
【００１９】
上記のポンペ病を処置する方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、ポンペ病は、小児発症ポンペ病である。一部の実施形態では、ポンペ病は、古典的な小児発症ポンペ病である。一部の実施形態では、対象は、ＣＲＩＭ陰性である。
【００２０】
ポンペ病を処置する方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、方法は抗ヒト酸性α−グルコシダーゼ抗体、ＣＤ１９レベルまたは疾患進行の１つまたはそれ以上をモニタリングすることをさらに含む。
【００２１】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、試料は、血液試料である。一部の実施形態では、血液試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む血液画分である。一部の実施形態では、血液試料は、血清試料または血漿試料であり、バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することである。
【００２２】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、対照は既存対照またはプラセボ対照である。
【００２３】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００２４】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、単一サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートのサイクルは、１日のメトトレキセート投与または２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日連続のメトトレキセート投与からなる。
【００２５】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療剤の投与の前、間および後の１つまたはそれ以上から選択される時間に対象に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療剤療法の投与の４８時間前から４８時間後の間に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは治療剤の投与と同時に、ならびに治療剤の投与の約２４時間後および約４８時間後に投与される。
【００２６】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、メトトレキセートは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇで投与される。
【００２７】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、試料は、メトトレキセートの最終投与の少なくとも約１日後から約３０日後に対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、メトトレキセートの最終投与の約７日後から約１４日後に対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、メトトレキセートの最終投与後の複数の日に得られる。一部の実施形態では、試料は、メトトレキセートの最終投与から１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１４日目、２１日目または２８日目のうちの１日またはそれ以上の日に得られる。
【００２８】
上記の方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、工程（ｄ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞または形質細胞を枯渇させる薬剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、形質細胞を枯渇させる薬剤は、ボルテゾミブである。一部の実施形態では、工程（ｄ）は、（ａ）リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレートおよびコルチコステロイドの１つまたはそれ以上の有効量を投与すること；ならびに（ｂ）抗原特異的寛容性戦略を投与することの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、抗原特異的寛容性戦略は、治療剤のより高頻度の投薬または治療剤のより高い用量を投与することまたはその両方を含む。一部の実施形態では、治療剤のより高い用量は、ＩＶＩＧと同時投与される。
【００２９】
本出願の一態様は、ポンペ病を有する対象における免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）対象から試料を得る工程であって、対象は、少なくとも１サイクルのメトトレキセート処置および治療剤の少なくとも１用量を以前に投与されている、工程；ならびに（ｂ）試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルは免疫寛容性の誘導を示す、工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、工程（ｂ）は、赤血球形成バイオマーカーに結合する薬剤と試料を接触させることを含む。
【００３０】
本出願の一態様は、治療剤を必要とする対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与する工程；および（ｃ）対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルは、対象における治療剤への免疫寛容性の誘導を示す、工程を含む方法を提供する。
【００３１】
本出願の一態様は、治療剤を必要とする対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）工程（ｃ）において検出されるバイオマーカーのレベルに基づいて対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを同定することを含む方法を提供する。
【００３２】
上記の調査方法のいずれか１つによる一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；またはここで赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたは低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。
【００３３】
本明細書に記載される方法のいずれか１つで使用するための、組成物、キットおよび製造品がさらに提供される。
【００３４】
本発明のこれらおよび他の態様と利点は、以降の詳細な記載および添付の特許請求の範囲から明らかになる。本明細書に記載される様々な実施形態の性質の１つ、いくつかまたは全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成することができることを理解すべきである。
【００３５】
特許または出願ファイルは、色刷りの少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有するこの特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な手数料の支払いによって特許庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】様々な実験群の中のマウスの脾臓試料における、赤血球形成に関連する遺伝子発現レベルのサブセットのヒートマップを示す図。
【図１Ｂ】様々な実験群の中のマウスの血液試料における、赤血球形成に関連する遺伝子発現レベルのサブセットのヒートマップを示す図。１群につき４〜９匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１に記載の通りに、低用量メトトレキセートの有る無しでｒｈＧＡＡで処置した。メトトレキセートの有る無しでＦＢ（製剤緩衝液）で処置したマウスの実験対照群が含まれた。ｒｈＧＡＡ開始から７日目に、脾臓（Ａ）および血液（Ｂ）試料を、ＲＮＡ増幅の後にＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨＩＳＥＱ２０００（登録商標）でＲＮＡシークエンシングによって調べた。示した遺伝子は、赤血球形成に関連する全遺伝子のサブセットである。ＲＮＡシークエンシングデータセットは、変化倍率（ＦＣ）≧２およびｐ値≦０．０５によって差別的発現についてスクリーニングした。赤色は高度に上方制御された遺伝子を意味し、青色は下方制御された遺伝子を示す。結果は、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンは、脾臓および血液における赤血球形成の転写サインを上方制御することを実証する。
【図１Ｃ】実施例１〜４に記載される試験計画の概略図を示す図。
【図２】例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンに応答した、脾臓におけるトランスフェリンおよびトランスフェリン受容体１の上方制御を示す図。１群につき８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１に記載の通りに、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンの不在下または存在下で、ｒｈＧＡＡで処置した。ｒｈＧＡＡ開始から７日目に、脾臓および血液試料を、ＬＣ／ＭＳタンパク質質量分析によって調べた。差別的に発現された遺伝子を、ＦＣ≧２およびｐ値≦０．０５でスクリーニングした。
【図３−１】図３Ａは、ｒｈＧＡＡ＋ＭＴＸ群における有意に富化したＢ１０調節Ｂ細胞を示す。図３Ｂは、ｒｈＧＡＡ＋ＭＴＸ群における有意に富化した活性化濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞を示す。図３Ｃは、ｒｈＧＡＡ＋ＭＴＸ群における有意に富化した全活性化Ｂ細胞を示す。図３Ｄは、生きているＣＤ１９＋事象について選択するためのフローサイトメトリーにおけるゲーティング戦略を示す。以降のゲーティングは、Ｂ１０調節Ｂ細胞（上：ＣＤ１９＋、ＣＤ１ｄｈｉｇｈ  ＣＤ５＋）、活性化濾胞性Ｂ細胞（２列目：ＣＤ１９＋、ＩｇＭｌｏｗ／ｈｉｇｈ  ＣＤ２３＋、ＣＤ８６＋）、および全活性化Ｂ細胞（下：ＣＤ１９＋  ＣＤ８６＋）について選択した。１群につき４〜１０匹のＣ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、実施例１に記載の通りに、ｒｈＧＡＡ単独でまたは単一サイクルの低用量メトトレキセートと一緒に処置した。実施例２に記載の通りに、ｒｈＧＡＡ開始の７日後に、脾臓を死後抽出し、単一細胞懸濁液にホモジナイズし、ＲＢＣ溶解に付し、フローサイトメトリーによって調べた。これらのデータは、３つまたはそれ以上の別個の実験からのものである。スチューデントｔ検定を実行し、有意性は＊≦０．０５で表す。富化したＢ細胞サブセットは、一時的な低用量メトトレキセート処置の後の免疫寛容性のパターンを実証した。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】図４Ａは、異なる実験群のマウスからの脾臓の代表的な像（黒色バー＝１ｃｍ）を示す。図４Ｂは、ｒｈＧＡＡ開始の７日後のマウスの脾臓重量のグラフ表示を示す。図４Ｃは、５、６、７および８日目にフローサイトメトリーによって測定した脾臓試料中の細胞総数を示す。１群につき４〜６匹のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．のｒｈＧＡＡ単独でまたは単一サイクルの低用量メトトレキセートと組み合わせて処置した（ｒｈＧＡＡ処置の１５分以内の５ｍｇ／ｋｇの３回の連続した毎日のｉ．ｐ．処置）。実施例２に記載の通りに、脾臓を単一細胞懸濁液にホモジナイズし、フローサイトメトリーによって調べた。図４Ｄは、マウスの脾臓試料のフローサイトメトリーにおけるゲーティング戦略を示す。生きている全ＲＢＣ（Ｔｅｒ−１１９＋）および未熟な有核ＲＢＣサブセット（Ｔｅｒ−１１９＋  ＣＤ７１＋）を選択した。図４Ｅは、ｒｈＧＡＡ開始から２、６、７および９日目のマウスの脾臓における全ＲＢＣの数を示す。図４Ｆは、ｒｈＧＡＡ開始から２、６、７および９日目のマウスの脾臓における未熟な有核ＲＢＣの数を示す。マウスに、ｒｈＧＡＡだけ（ｒｈＧＡＡ）または単一サイクルの低用量メトトレキセートと組み合わせたｒｈＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ＋１サイクルのＭＴＸ）を投与した。図４Ｇは、ｒｈＧＡＡ開始から２、７および９日目のマウスの脾臓における全ＲＢＣの数を示す。図４Ｈは、ｒｈＧＡＡ開始から２、７および９日目のマウスの脾臓における未熟な有核ＲＢＣの数を示す。メトトレキセートの有る無しでビヒクル対照ＦＢ（製剤緩衝液）で処置したマウスの実験対照群が含まれた。これらのデータは、３つまたはそれ以上の別個の実験からのものである。スチューデントｔ検定を実行し、有意性は＊≦０．０５で表す。縦のバーは、標準偏差を表す。結果は、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンが、全体のおよび未熟な有核ＲＢＣの早期の短期低減および続く富化、ならびに脾臓の拡張を引き起こしたことを実証する。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図４−４】図４−３の続き。
【図５−１】図５Ａは、フローサイトメトリーで判定した、ｒｈＧＡＡ開始から２、４、７、９、１４および２８日目のマウスの血液における全ＲＢＣの数を示す。図５Ｂは、ｒｈＧＡＡ開始から２、４、７、９、１４および２８日目のマウスの血液における未熟な有核ＲＢＣの数を示す。１群につき５〜１０匹のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、単一サイクルの低用量メトトレキセートの有る無しでｒｈＧＡＡで処置した。実施例２に記載の通りに、収集された血液の２５μＬアリコートから赤血球系細胞の総数を導き、フローサイトメトリーによって調べた。マウスに、ｒｈＧＡＡだけ（ｒｈＧＡＡ）または単一サイクルの低用量メトトレキセートと同時のｒｈＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ＋１サイクルのＭＴＸ）を投与した。図５Ｃは、２日目のマウスの血液における全ＲＢＣの数を示す。図５Ｄは、７日目のマウスの血液における全ＲＢＣの数を示す。図５Ｅは、９日目のマウスの血液における全ＲＢＣの数を示す。図５Ｆは、２日目のマウスの血液における未熟な有核ＲＢＣの数を示す。図５Ｇは、７日目のマウスの血液における未熟な有核ＲＢＣの数を示す。図５Ｈは、９日目のマウスの血液における未熟な有核ＲＢＣの数を示す。例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンの有る無しでＦＢで処置したマウスの実験対照群が含まれた。これらのデータは、３つまたはそれ以上の別個の実験からのものである。スチューデントｔ検定を実行し、有意性は＊≦０．０５で表す。縦のバーは、標準偏差を表す。結果は、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンが、脾臓におけるそれと比較して全身血液コンパートメントにおいて類似しているが遅延したＲＢＣ応答を生じさせることを実証した。
【図５−２】図５−１の続き。
【図５−３】図５−２の続き。
【図５−４】図５−３の続き。
【図６−１】図６Ａは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの全身血液コンパートメントにおける全ＲＢＣ数を示す。図６Ｂは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの全身血液コンパートメントにおけるヘモグロビンレベルを示す。図６Ｃは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの全身血液コンパートメントにおけるヘマトクリットの百分率を示す。図６Ｄは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの全身血液コンパートメントにおける成熟網赤血球の数を示す。図６Ｅは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの全身血液コンパートメントにおける成熟網赤血球の頻度を示す。図６Ｆは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの全身血液コンパートメントにおける網赤血球成熟指数を示す。１群につき６匹のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、単一サイクルの低用量メトトレキセートの有る無しでｒｈＧＡＡで処置した。例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンの有る無しでＦＢで処置したマウスの実験対照群が含まれた。眼窩後ブリードによって試料をＥＤＴＡ抗凝固収集チューブに収集し、７２時間以内、２〜８℃で保存した。ＣＢＣ、ＷＢＣ画分分析および網赤血球算定を、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＴ２０００ｉＶで実行した。スチューデントｔ検定を実行し、有意性は＊≦０．０５で表す。縦のバーは、標準偏差を表す。結果は、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンが、全身血液コンパートメントにおいて７日目に再生性の赤血球応答を生じさせることを実証する。
【図６−２】図６−１の続き。
【図６−３】図６−２の続き。
【図７】図７Ａは、フローサイトメトリーで判定した、ｒｈＧＡＡ開始後のマウスの骨髄試料における４、５、７および９日目の全ＲＢＣの数を示す。図７Ｂは、フローサイトメトリーで判定した、ｒｈＧＡＡ開始後のマウスの骨髄試料における４、５、７および９日目の未熟な有核ＲＢＣサブセットの数を示す。１群につき６匹のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、単一サイクルの低用量メトトレキセートの不在下または存在下で、ｒｈＧＡＡで処置した。実施例２に記載の通りに、単一の大腿骨から赤血球系細胞の総数を導き、フローサイトメトリーによって調べた。マウスに、ｒｈＧＡＡだけ（ｒｈＧＡＡ）または単一サイクルの低用量メトトレキセートと同時のｒｈＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ＋１サイクルのＭＴＸ）を投与した。これらのデータは、２つの別個の実験からのものである。スチューデントｔ検定を実行し、有意性は＊≦０．０５で表す。縦のバーは、標準偏差を表す。結果は、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンが、全体のおよび未熟な有核ＲＢＣの早期の一時的な枯渇につながるが、ＲＢＣは骨髄において恒常レベルにすぐに戻ることを実証した。
【図８−１】図８Ａは、発達の異なる段階における赤血球系細胞について選択するためのフローサイトメトリーにおけるゲーティング戦略を示す。同定された生きているＴｅｒ−１１９＋の生きている事象からのＣＤ４４およびＦＳＣ（前方散乱）の差別的発現および：（Ｉ）前赤芽球（Ｔｅｒ−１１９ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ）、（ＩＩ）塩基親和性赤芽球（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ４４ｈｉｇｈ  ＦＳＣｈｉｇｈ）、（ＩＩＩ）多染性赤芽球（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ４４ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＦＳＣｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）、（ＩＶ）正染性赤芽球および網赤血球（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ４４ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＦＳＣｌｏｗ）、および（Ｖ）成熟した赤血球（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ４４ｌｏｗ  ＦＳＣｌｏｗ）。図８Ｂは、ｒｈＧＡＡ開始から２日目のマウスの脾臓試料における赤血球系細胞の数を示す。図８Ｃは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの脾臓試料における赤血球系細胞の数を示す。各脾臓試料は、単一の均質化脾臓に由来した。図８Ｄは、ｒｈＧＡＡ開始から２日目のマウスの血液試料における赤血球系細胞の数を示す。図８Ｅは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの血液試料における赤血球系細胞の数を示す。各血液試料は、全身血液コンパートメントからの２５μＬ収集物に由来した。図８Ｆは、ｒｈＧＡＡ開始から４日目のマウスの骨髄試料における赤血球系細胞の数を示す。図８Ｇは、ｒｈＧＡＡ開始から５日目のマウスの骨髄試料における赤血球系細胞の数を示す。図８Ｈは、ｒｈＧＡＡ開始から７日目のマウスの骨髄試料における赤血球系細胞の数を示す。図８Ｉは、ｒｈＧＡＡ開始から９日目のマウスの骨髄試料における赤血球系細胞の数を示す。各骨髄試料は、単一の大腿骨に由来した。１群につき５〜１０匹のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスに、単一サイクルの低用量メトトレキセートから１５分以内にｒｈＧＡＡで処置した。マウスは、ｒｈＧＡＡだけ（ｒｈＧＡＡ）または単一サイクルの低用量メトトレキセートと一緒にｒｈＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ＋１サイクルのＭＴＸ）を投与した。これらのデータは、２つまたはそれ以上の別個の実験からのものである。スチューデントｔ検定を実行し、有意性は＊≦０．０５で表す。縦のバーは、標準偏差を表す。結果は、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンによって誘発される赤血球形成は、マウスの脾臓で主に起こることを実証した。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−２の続き。
【図８−４】図８−３の続き。
【図８−５】図８−４の続き。
【図９Ａ】図９Ａは、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンが、脾臓の赤色髄における有核細胞（造血前駆体を含む）の出現を増加させることを示す。１群につき４〜６匹のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、単一サイクルの低用量メトトレキセートの有る無しでｒｈＧＡＡで処置した。例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンの有る無しでＦＢで処置したマウスの実験対照群が含まれた。脾臓試料はｒｈＧＡＡ開始の７日後に収集し、免疫蛍光法のために処理した。脾臓試料はｒｈＧＡＡ開始の７日後に収集し、ＯＣＴ培地での低温切片作製、ＣＤ７１およびＴｅｒ−１１９のための免疫蛍光染色、ならびに、マルチチャネル蛍光画像化のために構成され、ＰｌａｎＡｐｏ２０ｘ、０．８ＮＡ対物レンズを備えているＡｘｉｏＳｃａｎスライドスキャナ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ；Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）での分析に付した。（Ａ）ＣＤ７１免疫蛍光染色が赤色（ＰＥ）およびＴＥＲ１１９が緑色（ＦＩＴＣ）で示される代表的な全スライドスキャンを示した。試料は、核を可視化するために、ＤＡＰＩ（青色）でも染色した。ＣＤ７１またはＴｅｒ−１１９染色を欠いた領域は、白色髄を表す。ＣＤ７１および／またはＴｅｒ−１１９染色を有する領域は、赤色髄を表す。スケールバーは、５００μｍを表す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、赤色髄対白色髄の面積比（上）および全組織面積（下）の形態測定定量化の結果のグラフ表示を示す。縦のバーは、＊≦０．０５のボンフェローニ調整ｐ値による平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図１０】図１０は、タンパク質赤血球アンキリンおよびグリコホリンＣが、例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンで処置したマウスの脾臓において減少することを示す。１群につき４〜６匹のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、単一サイクルの低用量メトトレキセートの有る無しでｒｈＧＡＡで処置した。例示的な一時的な低用量メトトレキセートレジメンの有る無しでＦＢで処置したマウスの実験対照群が含まれた。脾臓試料はｒｈＧＡＡ開始の７日後に収集し、組織質量分析画像化のために処理した。赤血球アンキリンおよびグリコホリンＣのためのシグナルを示す、１０μＭ脾臓切片を示す。空間分解能は、３０μＭである。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ドナーマウスの血液からの２００，０００，０００個の全赤血球を受けたマウスにおける、血清抗ｒｈＧＡＡ抗体価を示す。ｒｈＧＡＡ開始の７日後に一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンで処置したマウスから単離した脾臓の未熟な有核ＲＢＣは、ナイーブマウスにおいて免疫寛容性誘導の傾向を提示するようである。一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメン有りのｒｈＧＡＡ（免疫寛容マウス）および一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメン無しのｒｈＧＡＡ（非免疫寛容マウス）で処置したマウスから全赤血球系細胞を単離し、ナイーブなレシピエントマウスに導入した。輸血後およびその後毎週、レシピエントマウスにｉ．ｖ．  ｒｈＧＡＡを投与した。ｒｈＧＡＡの以降の投与には、ジフェンヒドラミンの予防的投与が付随した。ＥＬＩＳＡによる抗ｒｈＧＡＡ  ＩｇＧ抗体価の評価のために、血清を収集した。（図１１Ａ）ｒｈＧＡＡ開始の９日後、ドナーマウスの血液からの２００，０００，０００個の全赤血球を、白血球除去によって精製した。血液から精製したドナー赤血球は、≧９９．９％純粋だった。（図１１Ｂ）ｒｈＧＡＡ開始の７日後、ドナーマウスの脾臓からの７５，０００，０００個の全赤血球を、Ｔｅｒ−１１９ミクロビーズによる正の選択によって精製した。脾臓から精製したドナー赤血球は、≧９３．３％純粋だった。（図１１Ｃ）一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンの存在下および不在下のｒｈＧＡＡによる投与された対照マウス。最も高い力価は除去した。このデータは、単一の実験からのものである。スチューデントｔ検定を実行し、有意性は＊≦０．０５で表す。縦のバーは、平均値の標準誤差を表す。ＡＵＣ：曲線下面積。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本出願は、治療剤によって対象の疾患（ポンペ病など）を処置する方法、ならびにメトトレキセートおよび治療剤の投与の後に対象において赤血球形成バイオマーカーの検出を含む治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法を提供する。
【００３８】
抗薬物抗体（ＡＤＡ）免疫応答は、薬物効能を低減すること、および患者の安全性にマイナスの影響を及ぼす可能性がある。ＡＤＡの蓄積を軽減するために、治療用バイオ医薬品による処置と一緒の、およびその後の第１週内の投与のために、一時的な低用量メトトレキセート処置を含む免疫寛容性誘導（「ＩＴＩ」）レジメンが開発された（Ｇａｒｍａｎ、Ｍｕｎｒｏｅら  ２００４；Ｊｏｓｅｐｈ、Ｍｕｎｒｏｅら  ２００８）。酵素補充療法（アルグルコシダーゼアルファなど）および抗体療法（抗胸腺細胞グロブリンなど）への長期の免疫寛容性が、一時的な低用量メトトレキセートレジメンで実証された（同書；Ｊｏｓｅｐｈ、Ｎｅｆｆら  ２０１２）。
【００３９】
本発明の態様は、一時的な低用量メトトレキセート投与によって誘発される赤血球形成が、免疫寛容性の誘導と関連することの発見に関する。本明細書に記載される方法およびキットは、抗薬物抗体（ＡＤＡ）を生成する酵素補充療法などの治療薬を受ける患者における、望ましくない免疫応答の低減のために有益である。
【００４０】
本開示は、治療用バイオ医薬品、すなわち、ポンペ病を処置するために使用される酵素補充療法である組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ、アルグルコシダーゼアルファ）処置による処置との関連で、一時的な低用量メトトレキセート（例示的なＩＴＩレジメン）に対する、脾臓、血液および骨髄における分子的および細胞性の応答を記載する。本明細書に記載される転写およびプロテオーム分析は、一時的な低用量メトトレキセート（例示的なＩＴＩレジメン）による処置の後の赤血球形成を示す、血液および脾臓における転写およびタンパク質サインの上方制御を明らかにした。細胞研究は、一時的な低用量メトトレキセート処置の後の脾臓および血液におけるＴｅｒ−１１９＋ＣＤ７１＋の未熟な有核赤血球（ＲＢＣ）のかなりの増大を確認した。さらに、免疫蛍光分析は、脾臓の赤色髄における造血前駆体を含む有核細胞の割合の増加を示唆した。反対に、組織質量分析画像化（ｔＭＳＩ）は、脾臓における成熟ＲＢＣに関連するタンパク質の検出の低減を示した。注目すべきことに、これらのＲＢＣの増大のタイミングは、処置ナイーブ動物において免疫寛容性を付与する能力を有することが以前に実証された調節Ｂ細胞のかなりの富化と一致した。本明細書に記載されるさらなる分析は、一時的な低用量メトトレキセートで処置した動物に由来する赤血球系細胞の輸血が、ナイーブレシピエントに免疫寛容性を付与したことを示す。したがって、本明細書に記載される赤血球形成バイオマーカーは、治療剤への免疫寛容性を調査するために、および／またはメトトレキセートおよび治療剤を受けた患者において治療剤のさらなる投与と共に追加の免疫寛容性誘導または免疫抑制療法の投与を誘導するために使用することができる。
【００４１】
したがって、本出願の一態様は、治療剤による処置を必要とする対象（例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼによる処置を必要とするポンペ病を有する対象）を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、治療剤によるさらなる処置を継続することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法をまたは投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。
【００４２】
本出願の別の態様では、治療剤を必要とする対象（例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼによる処置を必要とするポンペ病を有する対象）における治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程；（ｂ）治療剤の治療有効量を対象に投与する工程；および（ｃ）対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルは、対象における治療剤への免疫寛容性の誘導を示す、工程を含む方法が提供される。
【００４３】
本明細書に記載される方法のために有益である、キットおよび製造品も提供される。
【００４４】
Ｉ．定義
用語「検出する」は、標的分子の定性的および定量的な測定を含むように最も広い意味で本明細書において使用される。検出することは、試料中の標的分子の単なる存在を同定することだけでなく、標的分子が検出可能なレベルで試料中に存在するかどうかについて判定することを含む。
【００４５】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合体を指す。重合体は線状または分枝状であってもよく、それは改変アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸が割り込んでもよい。本用語は、天然にまたは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変、例えば標識構成成分とのコンジュゲーションによって改変されているアミノ酸重合体も包含する。例えば、アミノ酸の１つまたはそれ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）ならびに当技術分野で公知の他の改変を含有するポリペプチドも、この定義の中に含まれる。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、抗体を具体的に包含する。一部の例では、タンパク質は、複数のポリペプチドまたは重合鎖を含む。
【００４６】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」は、試料中で検出することができる指標、例えば、予測的、診断的および／または予後診断的指標を指す。バイオマーカーは、ある特定の分子的、病理的、組織学的および／または臨床的特性によって特徴付けられる、特定のサブタイプの疾患、状態または生物学的応答（例えば、治療剤への望ましくない免疫応答）の指標の役割をすることができる。一部の実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子である。一部の実施形態では、バイオマーカーは、細胞の集団またはサブセットである。バイオマーカーには、限定されずに、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、ポリヌクレオチドコピー数の変化（例えば、ＤＮＡコピー数）、ポリペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの修飾（例えば、翻訳後修飾）、炭水化物、糖脂質をベースとした分子マーカー、細胞および／または細胞の集団が含まれる。
【００４７】
個体への臨床有益性の増加に関連するバイオマーカーの「量」または「レベル」は、生体試料中で検出可能なレベルである。これらは、当業技術者に公知であり、本明細書に開示されてもいる方法によって測定することができる。調査されるバイオマーカーの発現レベルまたは量は、処置への応答を判定するために使用することができる。
【００４８】
用語「ハウスキーピングバイオマーカー」は、全ての細胞型に一般に同じように存在するバイオマーカー（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）またはバイオマーカー群を指す。一部の実施形態では、ハウスキーピングバイオマーカーは、「ハウスキーピング遺伝子」である。本明細書において、「ハウスキーピング遺伝子」は、その活性が細胞機能の維持のために必須であり、全ての細胞型に一般に同じように存在するタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子群を指す。
【００４９】
本明細書で互換的に使用されるように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によって重合体に組み込むことができる任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は重合体のアセンブリーの前後に付与することができる。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド構成成分が割り込むことができる。ポリヌクレオチドは、合成の後に、例えば標識とのコンジュゲーションによってさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたはそれ以上の類似体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合によるもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート等）、および荷電結合によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシン等）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するもの、アルキル剤を含有するもの、改変された結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸等）、ならびにポリヌクレオチドの未改変形態が含まれる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えばホスホネート基、リン酸基と置き換えるか、標準の保護基によって保護するか、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の結合を用意するために活性化することができるか、または固体もしくは半固体の支持体にコンジュゲートすることができる。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化するか、または炭素原子数１から２０のアミンもしくは有機キャップ形成基部分で置換することができる。他のヒドロキシルを、標準の保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で一般に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似形、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体および無塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含有することもできる。１つまたはそれ以上のホスホジエステル結合を、代替の連結基と置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されずに、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置き換えられる実施形態が含まれ、ここで、各ＲまたはＲ’は独立してＨであるか、また���エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを場合により含有する置換型もしくは非置換型のアルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチドの中の全ての結合が同一である必要があるとは限らない。上の記載は、本明細書において言及される、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」は、そうとは限らないが長さが約２５０ヌクレオチド未満である、短い一本鎖ポリヌクレオチドを一般に指す。オリゴヌクレオチドは合成物であってもよい。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互いに排他的でない。ポリヌクレオチドの上の記載は、オリゴヌクレオチドに等しくおよび完全に適用できる。
【００５１】
用語「プライマー」は、核酸とハイブリダイズすることができ、その後、一般に遊離の３’−ＯＨ基を提供することによって相補核酸の重合を促進する、一本鎖ポリヌクレオチドを指す。
【００５２】
用語「小分子」は、約２０００ダルトンまたはそれ未満、好ましくは約５００ダルトンまたはそれ未満の分子量の任意の分子を指す。
【００５３】
本明細書で使用される用語「試料」は、例えば物理的、生化学的、化学的および／または生理的特徴に基づいて特徴付けるおよび／または同定する細胞性および／または他の分子実体を含有する、目的の対象および／または個体から得られるかそれに由来する組成物を指す。試料には、限定されずに、一次もしくは培養された細胞または細胞系、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、小胞液、精液、羊水、乳汁、全血、血液由来細胞、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物および組織培地、組織抽出物、例えばホモジナイズされた組織、腫瘍組織、細胞抽出物、およびその組合せが含まれる。
【００５４】
「組織試料」または「細胞試料」は、対象または個体の組織またはコンパートメントから得られた類似の細胞の集合を意味する。組織または細胞試料の供与源は、新鮮な凍結されたおよび／もしくは保存された臓器、組織の試料、生検および／または吸引物などからの固体組織；血液または血漿などの任意の血液成分；体液、例えば脳脊髄液、羊水、腹水または間質液；対象の妊娠または発達の任意の時間からの細胞であってよい。組織試料は、一次または培養された細胞もしくは細胞系であってもよい。場合により、組織または細胞試料は、疾患組織／臓器から得られる。組織試料は、保存剤、抗凝固薬、緩衝液、固定剤、栄養素、抗生物質などの天然において組織と本来混合していない化合物を含有することができる。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「対照試料」、「対照細胞」または「対照組織」は、比較目的のために使用される試料、細胞、組織、標準またはレベルを指す。
【００５６】
本明細書の目的のために、組織試料の「切片」は、組織試料の単一の部分または断片、例えば組織試料から切り取られた組織または細胞の薄切片を意味する。組織試料の同じ切片を形態学的および分子的レベルで分析することができるか、またはポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方に関して分析することができるものと理解される場合には、組織試料の複数の切片をとり、分析にかけることができるものと理解される。
【００５７】
「相関する」または「相関している」は、どんな形であれ、第１の分析またはプロトコールの成績および／または結果を、第２の分析またはプロトコールの成績および／または結果と比較することを意味する。例えば、第１の分析もしくはプロトコールの結果を第２のプロトコールの実行で使用することができ、および／または第２の分析もしくはプロトコールを実行するべきであるかどうか判定するために第１の分析もしくはプロトコールの結果を使用することができる。ポリペプチドの分析またはプロトコールの実施形態に関して、特定の治療レジメンを実行するべきであるかどうか判定するために、ポリペプチド発現の分析またはプロトコールの結果を使用することができる。ポリヌクレオチドの分析またはプロトコールの実施形態に関して、特定の治療レジメンを実行するべきであるかどうか判定するために、ポリヌクレオチド発現の分析またはプロトコールの結果を使用することができる。
【００５８】
本明細書で使用される用語「実質的に同じ」は、２つの値の間の差が、前記値（例えば、Ｋｄ値または発現）で測定される生物学的特性の面で生物学的および／または統計的にほとんどまたはまったく有意でないと当業者がみなすような、２つの数値の間の十分に高い程度の類似性を表す。前記２つの値の間の差は、例えば、参照／コンパレーター値に対して、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満および／または約１０％未満である。
【００５９】
本明細書で使用される語句「実質的に異なる」は、２つの値の間の差が前記値（例えば、Ｋｄ値）で測定される生物学的特性の面で統計的に有意であると当業者がみなすような、２つの数値の間の十分に高い程度の差を表す。前記２つの値の間の差は、例えば、参照／コンパレーター分子の値に対して、約１０％を超え、約２０％を超え、約３０％を超え、約４０％を超え、および／または約５０％を超える。
【００６０】
薬剤の「有効量」は、必要な投薬量および期間で、所望の生理学的結果を達成するのに有効な量を指す。
【００６１】
「治療的有効量」は、対象で疾患または状態を処置または予防するための治療剤の量を指す。一部の実施形態では、治療剤の治療的有効量は、生存期間（全生存期間および無進行生存を含む）を延長すること；客観的な応答（完全寛解または部分寛解を含む）をもたらすこと；疾患または状態の１つまたはそれ以上の徴候または症状を少なくとも一部緩和すること；および／または対象の生活の質を向上させることができる。
【００６２】
用語「医薬組成物」は、そこに含まれる有効成分の生物活性を有効にさせるような形態であり、製剤が投与される対象に許容されないほど毒性である追加の構成成分を含有しない調製物を指す。
【００６３】
「薬学的に許容される担体」は、医薬製剤中の、有効成分以外の対象に無毒である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されずに、緩衝液、賦形剤、安定剤または保存剤が含まれる。
【００６４】
本明細書で使用されるように、「処置」（および「処置する」または「処置すること」などの文法上のその変形）は、処置する個体の自然経過を変化させる企てにおける臨床介入を指し、臨床病理の過程で実行することができる。処置の望ましい効果には、限定されずに、疾患の再発を予防すること、症候の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の減少、疾患進行の速度を低下させること、病態の改善または緩和、および寛解または予後の向上が含まれる。
【００６５】
本明細書で使用されるように、用語「予防的処置」は、個体が障害を有するかそれを有する危険があることが知られているか疑われているが、障害の症状も最小限の症状も示していない場合の処置を指す。予防的処置を受ける個体は、症状の発症の前に処置することができる。
【００６６】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されずに、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
【００６７】
本明細書において用語「同時に」は、２つまたはそれ以上の治療剤の投与を指すために使用され、ここで、投与の少なくとも一部は時間的に重複するか、または投与は厳密には時間的に重複しないが、少なくとも第２の薬剤が投与される間、１つの薬剤が生理作用を発揮し続けるのに十分な全身レベルで残存する。したがって、同時投与は、１つまたはそれ以上の薬剤の投与が１つまたはそれ以上の他の薬剤の投与を中止した後にも継続する投与レジメン、または１つまたはそれ以上の薬剤が、１つまたはそれ以上の他の薬剤が投与された後であるが生理作用を発揮し続けるのに十分な全身レベルで残存している間に投与される投与レジメンを含む。
【００６８】
「低減または阻害する」は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のいずれかの全体の減少を引き起こす能力を意味する。
【００６９】
「増加または上昇する」は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のいずれかの全体の増加を引き起こす能力を意味する。
【００７０】
用語「添付文書」は、適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症および／またはそのような治療製品の使用に関する警告に関する情報を含む、治療製品の市販パッケージに慣習的に含まれる説明書を指すために使用される。
【００７１】
「製造品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患もしくは状態（例えば、がん）の処置のための医薬、または本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）またはキットである。ある特定の実施形態では、製品またはキットは、本明細書に記載される方法を実行するためのユニットとして促進されるか、配給されるか、販売される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、語句「基づく」は、１つまたはそれ以上のバイオマーカーに関する情報は、処置決定、添付文書で提供される情報またはマーケッティング／プロモーションの指針等を知らせるために使用されることを意味する。
【００７３】
目的の抗原、例えば宿主細胞タンパク質に「結合する」抗体は、抗体が検定用試薬として、例えば、捕捉抗体または検出抗体として有益であるように十分な親和性で抗原に結合するものである。一般的に、そのような抗体は、他のポリペプチド（例えば、他の抗原）と有意に交差反応しない。
【００７４】
標的分子へのポリペプチドの結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的の上のエピトープへの「特異的結合」またはそれに「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、非特異的相互作用と測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般的に結合活性を有しない類似の構造的エレメントで構成される分子である対照分子（例えば、標的タンパク質と同一でない対照タンパク質）の結合と比較した、標的分子の結合を判定することによって測定することができる。
【００７５】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用されるように、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。そのパートナーＹへの分子Ｘの親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって一般的に表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の一般方法によって測定することができる。
【００７６】
本明細書の用語「抗体」は最も広い意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、半抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および、それらが所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書で抗体と互換的に使用される。
【００７７】
本明細書に記載される発明の実施形態は、実施形態「からなる」および／または「から事実上なる」ことを含むと理解される。
【００７８】
本明細書で「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変形体を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【００７９】
本明細書で使用されるように、値またはパラメータ「ではない」への言及は、一般的に値またはパラメータ「以外」を意味し、記載する。例えば、その方法はタイプＸのがんを処置するために使用されないとは、その方法がＸ以外のタイプのがんを処置するために使用されることを意味する。
【００８０】
本明細書で使用される用語「約Ｘ〜Ｙ」は、「約Ｘから約Ｙ」と同じ意味を有する。
【００８１】
本明細書および添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「または」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれる。
【００８２】
ＩＩ．処置および調査の方法
治療剤による処置を必要とする対象を処置する方法であって、治療剤およびメトトレキセートの投与の後の対象からの試料中の赤血球形成バイオマーカーの検出に基づく方法が本明細書で提供される。
【００８３】
一部の実施形態では、治療剤による処置を必要とする対象（例えばヒト対象）を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後（例えば約７日後から約１４日後）の間に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、治療剤によるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、前記の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することを含み、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療剤療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。
【００８４】
一部の実施形態では、治療ポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体または酵素）による処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療ポリペプチドの有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後（例えば約７日後から約１４日後）の間に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、治療ポリペプチドによるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療ポリペプチドによるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療ポリペプチドによるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療ポリペプチドによるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療ポリペプチドによるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、前記の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することを含み、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療ポリペプチド療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、リンパ球を枯渇させる薬剤、例えばアレムツズマブである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、酵素、例えばヒトアルファガラクトシダーゼＡまたはヒト酸性α−グルコシダーゼである。
【００８５】
一部の実施形態では、治療ポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体または酵素）による処置を必要とする対象（例えば、ヒト対象）を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療ポリペプチドの有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に対象から得た試料中の未熟な有核赤血球を検出すること；および（ｄ）未熟な有核赤血球のレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療ポリペプチドによるさらなる処置と同時に投与すること；または未熟な有核赤血球のレベルが対照のそれに対して上昇している場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療ポリペプチドによるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療ポリペプチド療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。
【００８６】
一部の実施形態では、治療ポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体または酵素）による処置を必要とする対象（例えば、ヒト対象）を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療ポリペプチドの有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に対象から得た試料中の赤血球形成に関連する遺伝子（例えば、ＲＮＡ転写物またはタンパク質）を検出すること；および（ｄ）赤血球形成に関連する遺伝子のレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療ポリペプチドによるさらなる処置と同時に投与すること；または赤血球形成に関連する遺伝子のレベルが対照のそれに対して上昇している場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療ポリペプチドによるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療ポリペプチド療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。
【００８７】
一部の実施形態では、治療ポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体または酵素）による処置を必要とする対象（例えば、ヒト対象）を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療ポリペプチドの有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に対象から得た試料中の赤血球形成に関連する補因子を検出すること；および（ｄ）赤血球形成に関連する補因子のレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療ポリペプチドによるさらなる処置と同時に投与すること；または赤血球形成に関連する補因子のレベルが対照のそれに対して上昇している場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療ポリペプチドによるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する補因子は、ポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療ポリペプチド療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。
【００８８】
一部の実施形態では、治療剤（例えば、酵素）による処置を必要とするリソソーム蓄積症を有する対象を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後（例えば約７日後から約１４日後）の間に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、治療剤によるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、前記の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することを含み、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療剤療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、ヒトアルファガラクトシダーゼＡまたはヒト酸性α−グルコシダーゼである。一部の実施形態では、対象は、ゴーシェ病を有し、ヒトアルファガラクトシダーゼＡを必要とする。
【００８９】
一部の実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）においてポンペ病（例えば、小児発症および／またはＣＲＩＭ陰性のポンペ病）を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象に治療剤（例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼ）の有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後（例えば約７日後から約１４日後）に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、治療剤によるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、前記の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することを含み、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、���トトレキセートは、治療剤療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。一部の実施形態では、工程（ｄ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞または形質細胞を枯渇させる薬剤、例えばボルテゾミブを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、治療剤に対する抗体のレベル、ＣＤ１９のレベルおよび疾患進行の１つまたはそれ以上をモニタリングすることをさらに含む。
【００９０】
一部の実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）において小児発症ポンペ病（例えば、古典的小児発症ポンぺ病）を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象にヒト酸性α−グルコシダーゼの有効量を最初の免疫寛容性誘導療法（例えば、リツキシマブおよび／またはＩＶＩＧ）と同時に投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後（例えば約７日後から約１４日後）に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、ヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法をヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずにヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法をヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずにヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、前記の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することを含み、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、ヒト酸性α−グルコシダーゼ療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。一部の実施形態では、工程（ｄ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞または形質細胞を枯渇させる薬剤、例えばボルテゾミブを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、抗ヒト酸性α−グルコシダーゼ抗体（例えば、抗ｒｈＧＡＡ  ＩｇＧ抗体）およびＣＤ１９レベル、および疾患進行の１つまたはそれ以上をモニタリングすることをさらに含む。一部の実施形態では、小児発症ポンペ病は、ＣＲＩＭ陰性のポンペ病である。
【００９１】
一部の実施形態では、ポンペ病（例えば、小児発症および／またはＣＲＩＭ陰性のポンペ病）を有する対象を処置する方法であって、（ａ）少なくとも１サイクルのメトトレキセート処置および治療剤（例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼ）の少なくとも１用量を以前に投与されている対象から試料を得ること；（ｂ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後（例えば約７日後から約１４日後）に試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｃ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、治療剤によるさらなる処置を継続することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｃ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｃ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｃ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、前記の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することを含み、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセート���、治療剤療法の投与の４８時間前から４８時間後の間（例えば約２４時間から約４８時間後の間）に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与することは、リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレート、コルチコステロイドの１つまたはそれ以上を投与すること；および、抗原特異的寛容性戦略（例えば、場合により同時のＩＶＩＧと一緒のより頻繁なおよび／またはより高い用量の治療薬）を投与することを含む。一部の実施形態では、工程（ｄ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞または形質細胞を枯渇させる薬剤、例えばボルテゾミブを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、治療剤に対する抗体のレベル、ＣＤ１９のレベルおよび疾患進行の１つまたはそれ以上をモニタリングすることをさらに含む。
【００９２】
本出願の一態様は、治療剤を必要とする対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程；（ｂ）治療剤の治療有効量を対象に投与する工程；および（ｃ）対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルは、対象における治療剤への免疫寛容性の誘導を示す、工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する遺伝子であり、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたは低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。
【００９３】
一部の実施形態では、治療剤を必要とする対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程；（ｂ）治療剤の治療有効量を対象に投与する工程；および（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後（例えば約７日後から約１４日後）に赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、赤血球形成バイオマーカーの上昇したレベルの検出は、対象における治療剤への免疫寛容性の誘導を表す、工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する遺伝子であり、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたは低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。
【００９４】
一部の実施形態では、ポンペ病を有する対象における免疫寛容性を調査する方法であって、（ａ）少なくとも１サイクルのメトトレキセート処置および治療剤の少なくとも１用量を以前に投与されている対象から試料を得る工程；および（ｂ）試料を赤血球形成バイオマーカーに結合する薬剤と接触させる工程であって、対照に対して赤血球形成バイオマーカーの上昇したレベルの検出は、免疫寛容性の誘導を示す、工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する遺伝子であり、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子、例えばポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたは低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。一部の実施形態では、試料は、血液試料、または末梢血単核細胞を含む血液画分の試料である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。
【００９５】
Ａ．赤血球形成バイオマーカー
本出願は、試料中の１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーを検出する方法を提供する。本明細書に記載される赤血球形成バイオマーカーは、免疫寛容性誘導をモニタリングするために、処置の任意の好適な時間に単独でまたは組み合わせで使用することができる。一部の実施形態では、対照のそれより高いレベルの赤血球形成バイオマーカーの検出は、対象においてメトトレキセート投与によって誘導される治療薬への免疫寛容性を示す。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーが上昇レベルで検出される場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法が同時に投与されない治療剤によるさらなる処置に対象が応答する可能性がより高い。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーが対照のレベルまたはそれ以下で検出される場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法の治療剤によるさらなる処置との同時投与から対象が利益を受ける可能性がある。
【００９６】
一部の実施形態では、対照における赤血球形成バイオマーカーのレベルは、前もって決められる。一部の実施形態では、対照における赤血球形成バイオマーカーのレベルは、メトトレキセートおよび／または治療剤を受ける前の個体における赤血球形成バイオマーカーの平均または中間レベルに基づく。一部の実施形態では、対照における赤血球形成バイオマーカーのレベルは、一人またはそれ以上の健康な個体における赤血球形成バイオマーカーの平均または中間レベルに基づく。一部の実施形態では、対照における赤血球形成バイオマーカーのレベルは、治療剤を受ける個体と同じ疾患または状態（例えばポンペ病）を有する一人またはそれ以上の個体における赤血球形成バイオマーカーの平均または中間レベルに基づく。一部の実施形態では、対照における赤血球形成バイオマーカーのレベルは、メトトレキセートおよび／または治療剤を受ける前に、またはそれ無しに治療剤を必要とする、一人またはそれ以上の個体における赤血球形成バイオマーカーの平均または中間レベルに基づく。一部の実施形態では、対照における赤血球形成バイオマーカーのレベルは、メトトレキセート処置によって治療剤への免疫寛容性が誘導された、一人またはそれ以上の個体における赤血球形成バイオマーカーの平均または中間レベルに基づく。一部の実施形態では、対照における赤血球形成バイオマーカーのレベルは、治療剤による処置を受けたが、その治療剤に対する免疫応答（ＡＤＡなど）を有していない一人またはそれ以上の個体における赤血球形成バイオマーカーの平均または中間レベルに基づく。一部の実施形態では、対照における赤血球形成バイオマーカーのレベルは、対照試料に基づいて決められる。
【００９７】
本出願は、免疫寛容性を養子的に導入することができる７日時点で単離される試料の転写、プロテオームおよび細胞分析による、メトトレキセート誘導免疫寛容性の機構のさらなる評価を一部開示する。この評価は、免疫寛容性の誘導のためのバイオマーカーとして、赤血球形成に関連する様々な遺伝子を同定した。本開示は、脾臓の赤色髄における未熟な有核ＲＢＣのより高い頻度および出現によって実証される通り、メトトレキセートが赤血球（ＲＢＣ）を一時的に枯渇させ、それによって赤血球形成を誘導することの発見にも関する。
【００９８】
一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に検出される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートの投与の後に複数回検出される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートの投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日後のうちの１日またはそれより多い日に検出される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、サイクルで投与される。例えば、メトトレキセートの単一サイクルは、メトトレキセートの単回投与、またはメトトレキセートの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日のうちのいずれか１つの連続投与からなることができる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、サイクルの最後のメトトレキセート投与の１日後から約３０日後の間に検出される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、サイクルの最初のメトトレキセート投与の１日後から約３０日後の間に検出される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、単一サイクル、２サイクルまたは３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、単一サイクルまたは複数のサイクルの最初のサイクルの最後のメトトレキセート投与の１日後から約３０日後の間に検出される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、単一サイクルまたは複数のサイクルの最初のサイクルの最初のメトトレキセート投与の１日後から約３０日後の間に検出される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、第３サイクルの最後のメトトレキセート投与の１日後から約３０日後の間に検出される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、単一または第３のサイクルの最初のメトトレキセート投与の１日後から約３０日後の間に検出される。
【００９９】
一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベルである。一部の実施形態では、未熟な有核赤血球のレベルはメトトレキセート投与の後に低下するが、その後経時的に上昇し、そのため、未熟な有核赤血球のレベルは参照試料と比較して上昇する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６もしくは７日後のいずれかまたは約１日後から７日後の間の任意の時期に低下する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与のサイクルの中の最後のメトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６もしくは７日後のいずれかまたは約１日後から７日後の間の任意の時期に低下する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与のサイクルの中の最初のメトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６もしくは７日後のいずれかまたは約１日後から７日後の間の任意の時期に低下する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８もしくは３０のいずれかを超える日数の後、または約１日後から３０日後の間の任意の時期に上昇する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与のサイクルの中の最後のメトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８もしくは３０のいずれかを超える日数の後、または約１日後から３０日後の間の任意の時期に上昇する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与のサイクルの中の最初のメトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８もしくは３０のいずれかを超える日数の後、または約１日後から３０日後の間の任意の時期に上昇する。
【０１００】
赤血球形成は、さもなければ赤血球前駆体として知られる未熟な有核ＲＢＣが、無核の円板状の成熟した赤血球に発達する過程である（Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら、２０１６）。未熟な有核ＲＢＣは、細胞表面トランスフェリン受容体ＣＤ７１によって同定することができる（ＰａｎおよびＪｏｈｎｓｔｏｎｅ  １９８３）。造血組織における最も初期の未熟な有核ＲＢＣまたは赤芽球は、前赤芽球である。有糸分裂の連続した段階を通して、最終的に有糸分裂の複数の段階を通して形態学的に異なったものに分化する前赤芽球は、連続して好塩基、多染性に、次に正染性赤芽球になり、次に網赤血球（核が放出された）になり、最後に成熟した赤血球になる（Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら、２０１６）。赤血球特異的モノクローナル抗体Ｔｅｒ−１１９は、有核前赤芽球から核摘出成熟赤血球までの様々な分化段階を通して赤血球系細胞と反応する（Ｋｉｎａら、２０００）。初期の有核赤芽球および網赤血球はトランスフェリン受容体ＣＤ７１を発現するが、成熟赤血球または赤血球は発現しない（ＰａｎおよびＪｏｈｎｓｔｏｎｅ  １９８３）。前赤芽球および赤血球形成発達の異なった連続的段階は、ＣＤ７１の発現を通して明白に、または接着分子ＣＤ４４の差別的発現を通して同様に同定することができる（Ｃｈｅｎら、２００９、Ｋｏｕｌｎｉｓら、２０１１）。マウスでは、成熟した赤血球は体内を最高４０日間循環することができ、その後、それらは加齢および自然劣化により老化を経る（Ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  １９５８）。加齢ＲＢＣはエリプトーシスと呼ばれる特殊形態のアポトーシスを経、循環から取り除かれる（Ｄａｕｇａｓら、２００１、Ｔｅｓｔａ  ２００４）。重要なことに、成熟したＲＢＣおよび未熟な有核ＲＢＣは、独立した機構を通して免疫調節能力を有すると示唆されている（Ｓｃｈａｋｅｌら、２００６；Ｃｒｅｍｅｌら、２０１３；Ｇｅｔｔｓら、２０１３；Ｃｒｅｍｅｌら、２０１５；Ｇｒｉｍｍら、２０１５；Ｌｏｒｅｎｔｚら、２０１５；Ｙｉら、２０１５）。
【０１０１】
成熟したＲＢＣの除去は、自己抗原への持続的な継続した免疫寛容性を提供すると考えられている（Ｃｒｅｍｅｌら、２０１３；Ｇｅｔｔｓら、２０１３）。理論的には、エリプトーシスを経る加齢ＲＢＣは免疫寛容原性的に取り除かれ、それによってＲＢＣおよびその抗原ペイロード全体への寛容性を誘導する。この天然の現象を利用することによって、いくつかのグループは、成熟した赤血球を封入するかまたは標的タンパク質配列に結合させることによって、マウスにおいて生物学的療法への免疫寛容性を達成した（Ｋｏｎｔｏｓら、２０１３；Ｃｒｅｍｅｌら、２０１５；Ｇｒｉｍｍら、２０１５；Ｌｏｒｅｎｔｚら、２０１５）。あるいは、ＣＤ７１を発現する未熟な有核ＲＢＣは、新生児における固有の免疫抑制を直接的に媒介することが示唆されている（Ｅｌａｈｉら、２０１３）。さらに、新興の文献は、ＲＢＣの上のＣＤ４７の樹状細胞の上のシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）との相互作用を通してＴ細胞活性化および抗体応答を促進する樹状細胞の能力を、ＲＢＣが阻害することができることを示している（Ｓｃｈａｋｅｌら、２００６；Ｙｉら、２０１５）。
【０１０２】
上記のおよび／または他の機構を通して、理論によって束縛されること無しに、本明細書に記載されるメトトレキセートによって誘導される赤血球形成は、生物学的療法への免疫寛容性誘導をさらに促進することができる。したがって、本明細書に記載される赤血球形成バイオマーカーは、一時的な低用量メトトレキセート処置によって誘導される免疫寛容性のレベルの正確で便利な早期の評価を提供することができ、これは、治療剤による処置のさらなるサイクルを追加するために免疫寛容性誘導および／または免疫抑制療法の選択を導くために使用することができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、全体の赤血球系細胞集団または赤血球系細胞のサブセットである。当業者が理解するように、所与の赤血球系細胞集団のレベルは、いくつかの方法で表すことができる。例えば、集団のレベルは、比較百分率、割合もしくは頻度（例えば、全体の血液細胞または全体の末梢血単核細胞の）、絶対数または濃度（例えば、細胞数／ｍｌ）で表すことができる。赤血球系細胞は全血または細胞性血液画分から一般的に得られるが、赤血球系細胞は脾臓、骨髄または他の組織から得ることもできる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。本明細書で使用されるように、「ヘマトクリット」は、赤血球の体積の血液の全体積に対する比を指す。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球系細胞のサブセットのレベルである。本明細書で言及されるように、「赤血球系細胞」および「赤血球」（すなわち「ＲＢＣ」）は、赤血球系統における全ての細胞型を指すために互換的に使用され、それらは、マウスＲＢＣの細胞表面のＬｙ７６（すなわち、抗体Ｔｅｒ−１１９の抗原）またはヒトＰＢＭＣの細胞表面のＣＤ２３５ａの発現によって特徴付けられる。赤血球系細胞には、前赤芽球、塩基親和性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、未熟網赤血球を含む網赤血球、および赤血球（すなわち、成熟した赤血球）が含まれる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球系前駆体細胞のレベルである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球（ＲＢＣ）のレベルである。「未熟な有核赤血球」は、細胞表面のＬｙ７６（Ｔｅｒ−１１９の抗原）およびトランスフェリン受容体ＣＤ７１の発現によって特徴付けられる、核を有する赤血球前駆体である。未熟な有核ＲＢＣには、前赤芽球から未熟網赤血球までの核を含むＲＢＣ前駆体が含まれる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、網赤血球成熟指数（別名、「ＩＲＦ」）である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、成熟赤血球のレベルである。成熟網赤血球は、核を放出した網赤血球であり、成熟赤血球に形質転換する。
【０１０４】
一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、細胞性核酸の含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、血液試料中の全血液細胞のＲＮＡ含有量などの細胞性ＲＮＡ含有量である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、血液試料中の全血液細胞のＤＮＡ含有量などの細胞性ＤＮＡ含有量である。血液試料中の網赤血球レベルは、血液試料中の血液細胞のＲＮＡおよび／またはＤＮＡ含有量と相関する。
【０１０５】
赤血球系細胞亜集団の様々なレベルおよび全血液細胞の核酸含有量は、当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。ＳＹＳＭＥＸ（登録商標）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓなどの市販の自動細胞計数システムは、未熟な有核ＲＢＣレベル、網赤血球成熟指数、ヘマトクリットおよび全血液細胞のＲＮＡ／ＤＮＡ含有量を含む血液パラメータを判定するために利用可能である。
【０１０６】
本明細書で同定される赤血球形成バイオマーカーには、赤血球形成に関連する遺伝子および／または赤血球系細胞の１つまたはそれ以上のサブセットが含まれ、これらは、「赤血球形成バイオマーカー遺伝子」と本明細書において呼ばれる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、例えば造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝を含む、赤血球形成における１つまたはそれ以上の生化学経路に関連する遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、図１Ａおよび１Ｂに示すｒｈＧＡＡ＋ＭＴＸ群の上方制御された遺伝子の群から選択される遺伝子である。例示的な遺伝子には、限定されずに、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２およびＧＡＴＡ−１が含まれる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球系細胞または赤血球系細胞のサブセットによって発現される細胞表面マーカーをコードする遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、Ｌｙ７６（Ｔｅｒ−１１９のための抗原）またはＣＤ２３５ａである。ＣＤ２３５ａは、グリコホリンＡ、ＧＹＰＡ、ＭＮ、ＭＮＳ、ＧＰＳＡＴ、ＰＡＳ−２、ＧＰＥｒｉｋ、ＨｇｐＭｉｖ、ＨｇｐＭｉＸＩまたはＨｇｐＳｔａ（Ｃ）としても知られる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、トランスフェリン受容体である。一部の実施形態では、赤血球形成は、トランスフェリン受容体１である。トランスフェリン受容体１は、ＴｆＲ１、分化抗原群７１、ＣＤ７１、Ｔ９、ＴＲ、ＴＦＲ、ｐ９０、ＴＲＦＲまたはＩＭＤ４６としても知られる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、トランスフェリンである。トランスフェリンは、ＴＦ、ＴＦＱＴＬ１、ＰＲＯ１５５７、ＰＲＯ２０８６またはＨＥＬ−Ｓ−７１ｐとしても知られる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ＣＤ４４である。ＣＤ４４は、ＩＮ、ＬＨＲ、ＭＣ５６、ＭＤＵ２、ＭＤＵ３、ＭＩＣ４、Ｐｇｐ１、ＣＤＷ４４、ＣＳＰＧ８、ＨＣＥＬＬ、ＨＵＴＣＨ−１またはＥＣＭＲ−ＩＩＩとしても知られる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球系細胞または赤血球系細胞のサブセットによって発現される遺伝子である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘモグロビンである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、成熟した赤血球によって発現される遺伝子、例えば赤血球アンキリンまたはグリコホリンＣである。
【０１０７】
赤血球形成に関連しているかまたは赤血球系細胞の細胞表面マーカーをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現レベルは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片および／または遺伝子コピー数を限定されずに含む、当技術分野で公知の任意の好適な基準に基づいて定性的および／または定量的に判定することができる。バイオマーカー遺伝子の「発現レベル」および「量」は、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態では、第１の試料中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルは、第２の試料中の発現レベルと比較して増加または上昇する。一部の実施形態では、第１の試料中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルは、第２の試料中の発現レベルと比較して低下または低減する。ある特定の実施形態では、第２の試料は、参照（例えば、参照試料、参照細胞または参照組織）または対照（例えば、対照試料、対照細胞または対照組織）である。一部の実施形態では、対照は、既存対照またはプラセボ対照である。「既存対照」は、１つまたはそれ以上の以前の実験で得た対照を指す。一部の実施形態では、既存対照は、１つまたはそれ以上の治験に基づく対照である。プラセボ対照は、メトトレキセート処置もしくは治療剤療法を受けないか、またはメトトレキセート処置無しで治療剤療法を受ける対象から得られる対照を指す。対照試料における発現レベルと比較した第１の試料におけるバイオマーカー遺伝子の「上昇した」または「増加した」発現レベルの検出は、第１の試料におけるバイオマーカー遺伝子の「存在」を示すことができる。対照試料における発現レベルと比較した第１の試料におけるバイオマーカー遺伝子の「低減した」または「低下した」発現レベルの検出は、第１の試料におけるバイオマーカー遺伝子の「不在」を示すことができる。バイオマーカー遺伝子の発現レベルを判定するための追加の開示が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２および／またはＧＡＴＡ−１である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘモグロビン、赤血球アンキリンおよび／またはグリコホリンＣである。
【０１０８】
一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する補因子である。赤血球形成に関連する例示的な補因子には、ポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールが限定されずに含まれる。補因子のレベルは、例えば、質量分析およびＨＰＬＣを含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球の存在である。一部の実施形態では、未熟な有核赤血球のレベルはメトトレキセート投与の後に低下するが、その後経時的に上昇し、そのため、未熟な有核赤血球のレベルは参照試料と比較して上昇する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６もしくは７日後のいずれかまたは約１日後から７日後の間の任意の時期に低下する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与のサイクルの中の最後のメトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６もしくは７日後のいずれかまたは約１日後から７日後の間の任意の時期に低下する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与のサイクルの中の最初のメトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６もしくは７日後のいずれかまたは約１日後から７日後の間の任意の時期に低下する。一部の実施形態では、メトトレキセートが単一サイクルで投与される場合、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１、約２、約３、約４、約５、約６または約７日前までに低下する。一部の実施形態では、メトトレキセートが２サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される場合、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１日から約１４日前までに低下する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８もしくは３０のいずれかを超える日数の後、または約１日後から３０日後の間の任意の時期に上昇する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与のサイクルの中の最後のメトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８もしくは３０のいずれかを超える日数の後、または約１日後から３０日後の間の任意の時期に上昇する。一部の実施形態では、未熟な赤血球のレベルは、メトトレキセート投与のサイクルの中の最初のメトトレキセート投与の約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８もしくは３０のいずれかを超える日数の後、または約１日後から３０日後の間の任意の時期に上昇する。
【０１１０】
赤血球系細胞の１つまたはそれ以上のサブセットのレベルは、例えば、好適な細胞表面マーカー、組織像マーカーの発現、および形態（例えば、細胞体積および核の有無）を含む、当技術分野で公知の任意の好適な基準に基づいて定性的および／または定量的に判定することができる。本明細書で使用されるように、赤血球系細胞のサブセットの「レベル」は、細胞の数、全ての赤血球系細胞の中の赤血球系細胞のサブセットの割合、または全血液細胞もしくはＰＢＭＣにおける赤血球系細胞の頻度を指す。一部の実施形態では、第１の試料中の赤血球系細胞のサブセットのレベルは、第２の試料中のレベルと比較して増加または上昇する。一部の実施形態では、第１の試料中の赤血球系細胞のサブセットのレベルは、第２の試料中のレベルと比較して低下または低減する。ある特定の実施形態では、第２の試料は、参照（例えば、参照試料または参照組織）または対照（例えば、対照試料または対照組織）である。一部の実施形態では、対照試料／組織は、既存対照またはプラセボ対照である。対照試料のレベルと比較した第１の試料における赤血球系細胞のサブセットの「上昇した」または「増加した」レベルの検出は、第１の試料における赤血球系細胞のサブセットの「存在」を示すことができる。対照試料のレベルと比較した第１の試料における赤血球系細胞のサブセットの「低減した」または「低下した」レベルの検出は、第１の試料における赤血球系細胞のサブセットの「不在」を示すことができる。赤血球系細胞のサブセットのレベルを判定するための追加の開示が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核ＲＢＣのレベル（例えば、数、割合または頻度）である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、網赤血球成熟指数である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。
【０１１１】
方法のいずれか１つの一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの上昇したレベルは、参照または対照と比較したときの、本明細書に記載されるものなどの当技術分野で公知の標準方法によって検出される、赤血球形成バイオマーカーのレベル、例えば赤血球形成に関連する遺伝子もしくは赤血球系細胞の細胞表面マーカーをコードする遺伝子の発現レベル（例えば、タンパク質またはｍＲＮＡ）、または赤血球系細胞のサブセットのレベル（例えば、数、割合または頻度）における、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のいずれかの全体的増加を指す。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの上昇したレベルは、試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルの増加を指し、ここで、増加は、参照または対照におけるそれぞれの赤血球形成バイオマーカーのレベルの少なくとも約１．５×、１．７５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２５×、５０×、７５×または１００×のいずれかである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの上昇したレベルは、参照または対照と比較して、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍または約３．２５倍を超える全体的増加を指す。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルは、特定の試料または試料群におけるバイオマーカーのレベルの中間値である対照に対するものである。例えば、一部の実施形態では、対照は、治療剤への免疫寛容性がメトトレキセート処置によって、例えば一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンによって誘導されている対象の試料からの赤血球形成バイオマーカーの中間レベルである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの中間レベルは、治療剤への免疫寛容性がメトトレキセート処置によって誘導された特定の疾患を有する患者のデータベースから導かれる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの中間レベルは、治療剤への免疫寛容性がメトトレキセートによって誘導された特定の治療剤による処置を必要とする患者のデータベースから導かれる。例えば、ｒｈＧＡＡ処置を必要とするポンペ病患者に関する赤血球形成バイオマーカー遺伝子の発現レベルは、メトトレキセート処置のためにｒｈＧＡＡへの免疫寛容性を獲得したかまたはｒｈＧＡＡへの免疫応答を起こさないポンペ病患者のデータベース中のデータに基づく赤血球形成バイオマーカー遺伝子の中間発現レベルと比較することができる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、トランスフェリン受容体（例えば、ＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核ＲＢＣのレベル（例えば、数、割合または頻度）である。
【０１１２】
方法のいずれかの一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの低減したレベルは、参照または対照と比較した、本明細書に記載されるものなど標準の当技術分野で公知の方法によって検出される赤血球形成バイオマーカーのレベル、例えば赤血球形成に関連する遺伝子もしくは赤血球系細胞の細胞表面マーカーをコードする遺伝子の発現レベル（例えば、タンパク質またはｍＲＮＡ）、または赤血球系細胞のサブセットのレベル（例えば、数、割合または頻度）における、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のいずれかの全体的低減を指す。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの低減したレベルは、試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルの低下を指し、ここで、低下は、参照または対照におけるそれぞれの赤血球形成バイオマーカーのレベルの少なくとも約０．９×、０．８×、０．７×、０．６×、０．５×、０．４×、０．３×、０．２×、０．１×、０．０５×または０．０１×のいずれかである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘモグロビン、赤血球アンキリンまたはグリコホリンＣである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、全体の赤血球系細胞または成熟ＲＢＣのレベルである。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、網赤血球成熟指数である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘマトクリットである。
【０１１３】
一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートおよび／または治療剤の最初の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４または２８日後のいずれかの日に、上昇したレベルを有する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートおよび／または治療剤の最初の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４または２８日後のいずれかの日に、低減したレベルを有する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートの最後の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４または２８日後のいずれかの日に、上昇したレベルを有する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートの最後の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４または２８日後のいずれかの日に、低減したレベルを有する。一部の実施形態では、メトトレキセートは、単一サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、最初のサイクルまたは第３のサイクルの中のメトトレキセートの最後の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４または２８日後のいずれかの日に、上昇したレベルを有する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、第１、第２、第３、第４または第５のサイクルの中のメトトレキセートの最後の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４または２８日後のいずれかの日に、上昇したレベルを有する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、最初のサイクルまたは第３のサイクルの中のメトトレキセートの最後の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４または２８日後のいずれかの日に、低減したレベルを有する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、第１、第２、第３、第４または第５のサイクルの中のメトトレキセートの最後の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４または２８日後のいずれかの日に、低減したレベルを有する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルは先ず低下し、その後、メトトレキセートおよび／または治療剤の最初の投与の後に増加する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカー、例えば、未熟な有核ＲＢＣ、網赤血球成熟指数、細胞性核酸の含有量、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、Ｌｙ７６（Ｔｅｒ−１１９のための抗原）、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２およびＧＡＴＡ−１から選択される遺伝子、または赤血球形成に関連する補因子は、治療剤による処置の開始の６日目から１６日目の間（例えば、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目および１４日目のいずれか）に、対象の血液試料（ＰＢＭＣまたは血漿試料など）において上昇したレベルを有する。
【０１１４】
試料中の様々な赤血球形成バイオマーカー遺伝子の発現レベルは、その多くは当技術分野で公知であり、当業者によって理解される、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞分取（「ＦＡＣＳ」）、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）、プロテオミクス、質量分析、組織質量分析画像化（ｔＭＳＩ）、定量的な血液ベースのアッセイ（例えば血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）および他の増幅型検出方法、例えば分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリング、ならびに／または遺伝子発現の連続分析（「ＳＡＧＥ」）、ならびにタンパク質、遺伝子および／もしくは組織アレイ分析によって実行することができる多種多様なアッセイのいずれか１つを限定されずに含む、いくつかの方法によって分析することができる。遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための一般的なプロトコールは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ユニット２（ノーザンブロッティング）、４（サザンブロッティング）、１５（イムノブロッティング）および１８（ＰＣＲ分析）に見出される。Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ＭｅｄｉｃｉｎｅまたはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）から入手できるものなどの、多重化イムノアッセイを使用することもできる。
【０１１５】
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカー遺伝子の発現レベルは、（ａ）試料（例えば、対象からのＰＢＭＣまたは血漿試料）に対して遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（例えばｒｔＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）技術、またはＦＩＳＨを実行すること；および（ｂ）試料中の１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカー遺伝子の生成物の発現レベルを判定することを含む方法を使用して判定される。一部の実施態様では、マイクロアレイ方法は、上で指摘した遺伝子をコードする核酸分子にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる１つまたはそれ以上の核酸分子を有するか、または上で指摘した遺伝子によってコードされるタンパク質の１つまたはそれ以上に結合することができる１つまたはそれ以上のポリペプチド（ペプチドまたは抗体など）を有するマイクロアレイチップの使用を含む。一部の実施形態では、遺伝子発現は、マイクロアレイによって測定される。一部の実施形態では、遺伝子発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される。一部の実施形態では、遺伝子発現は、多重ＰＣＲによって測定される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、トランスフェリン受容体（例えば、ＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１である。
【０１１６】
細胞の中のｍＲＮＡの評価の方法は周知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、１つまたはそれ以上の遺伝子に特異的な標識リボプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連した技術）、および、様々な核酸増幅アッセイ（例えば、遺伝子の１つまたはそれ以上に特異的である相補的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅型の検出方法、例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が含まれる。対応する遺伝子の発現を評価するために、翻訳前の遺伝子生成物（例えば、スプライシングされたか、スプライシングされていないか、または部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ）の定量的な調査を実行することができる。そのような方法は、生物学的試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを判定することを可能にする、１つまたはそれ以上の工程を含むことができる（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較用対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に検査することによる）。場合により、増幅された標的ｃＤＮＡの配列を決定してもよい。
【０１１７】
任意選択の方法は、マイクロアレイ技術により組織または細胞試料中の標的ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡを検査または検出するプロトコールを含む。核酸マイクロアレイを使用して、検査および対照組織試料からの検査および対照ｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識し、ｃＤＮＡプローブを生成する。次に固体支持体の上に固定化された核酸のアレイに、プローブをハイブリダイズさせる。アレイは、アレイの各メンバーの配列および位置が既知であるように構成される。例えば、赤血球形成に関連する遺伝子のセレクションを固体支持体の上に配列することができる。標識プローブと特定のアレイメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。
【０１１８】
免疫凝集、免疫沈降（例えば、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫固定）、免疫染色、および／または免疫結合検出技術（例えば、ウエスタンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫組織化学、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫細胞化学、免疫蛍光法、免疫アフィニティークロマトグラフィー、酵素免疫検定法を含む）などを利用することによって、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカー遺伝子の発現レベルを、タンパク質レベルで判定することもできる。混合物中の特定のポリペプチドを定量化するこれらのおよびさらなる方法は、例えば抗体の特異的結合に頼ることができ、定量的に（例えば、組織および／または細胞試料の定量的組織形態計測によって）実行することができる。精製されたポリペプチドの量は、物理的方法、例えば、測光または質量分析方法（例えば、組織質量分析画像化）によって判定することもできる。
【０１１９】
一部の実施形態では、試料中の赤血球形成バイオマーカータンパク質の発現レベルは、ＩＨＣおよび染色プロトコールを使用して検査される。組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質の存在を判定または検出するための信頼できる方法であることが示されている。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、免疫組織化学によって検出される。一部の実施形態では、個体からの試料中の赤血球形成バイオマーカーの発現レベルの上昇は、タンパク質発現レベルの上昇であり、さらなる実施形態では、ＩＨＣを使用して判定される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの発現レベルは、（ａ）試料（例えば、対象からのＰＢＭＣまたは血漿試料）のＩＨＣ分析を抗体で実行すること；および（ｂ）試料中の赤血球形成バイオマーカー遺伝子の発現レベルを判定することを含む方法を使用して判定される。一部の実施形態では、ＩＨＣ染色強度は、参照と比較して判定される。一部の実施形態では、参照は参照値（例えば、免疫療法への完全な応答体および部分的な応答体のデータベースからの）である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、トランスフェリン受容体（例えば、ＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１である。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、ヘモグロビン、赤血球アンキリンまたはグリコホリンＣである。
【０１２０】
ＩＨＣは、形態学的染色および／または蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの追加の技術と組み合わせて実行することができる。ＩＨＣの２つの一般的方法、直接的および間接的アッセイが利用可能である。第１のアッセイによると、標的抗原への抗体の結合は、直接的に判定される。この直接的なアッセイは、蛍光性タグまたは酵素標識一次抗体などの、さらなる抗体相互作用無しで可視化することができる標識試薬を使用する。一般的な間接アッセイでは、非コンジュゲート型一次抗体が抗原に結合し、次に標識二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートされる場合、抗原の可視化を提供するために発色性または蛍光発生基質が加えられる。いくつかの二次抗体が一次抗体の上の異なるエピトープと反応することができるので、シグナル増幅が起こる。
【０１２１】
本明細書に記載される検出方法で使用するために、当業者は、本発明に包含されるポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドを標識する能力を有する。当技術分野で日常的に実施されるように、ｍＲＮＡレベルの検出で使用するためのハイブリダイゼーションプローブおよび／またはＩＨＣ方法で使用するための抗体もしくは抗体断片は、当技術分野で公知の標準方法により標識し、可視化することができる。一般的に使用されるシステムの非限定例には、放射性標識、酵素標識、蛍光性タグ、ビオチン−アビジン複合体、化学発光などの使用が含まれる。
【０１２２】
ＩＨＣのために使用される一次および／または二次抗体は、検出可能な部分で一般に標識される。多数の標識が利用可能であり、それらは以下のカテゴリーに一般に分類することができる：（ａ）放射性同位体、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ；（ｂ）コロイド金粒子；（ｃ）希土類キレート（ユウロピウムキレート）、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコクリセリン、フィコシアニンまたは市販の蛍光体、例えばＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）およびＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ（商標）ならびに／または上記のいずれか１つまたはそれ以上の誘導体を限定されずに含む蛍光標識；（ｄ）米国特許第４，２７５，１４９号に記載される標識を限定されずに含む酵素−基質標識；ならびに（ｅ）例えば、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；例えば、米国特許第４，７３７，４５６号を参照）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む酵素標識。
【０１２３】
酵素−基質の組合せの例には、例えば、水素ペルオキシダーゼを基質とする西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）；パラニトロフェニルリン酸塩を発色基質とするアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）；およびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と発色性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光原基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−−Ｄ−ガラクトシダーゼ）が含まれる。これらの一般的なレビューのために、米国特許第４，２７５，１４９号および第４，３１８，９８０号を参照する。
【０１２４】
方法のいずれの一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカー遺伝子の発現は、赤血球形成バイオマーカー遺伝子発現生成物に対する診断用抗体（すなわち、一次抗体）を使用して免疫組織化学によって検出される。一部の実施形態では、診断用抗体はヒト赤血球形成バイオマーカー遺伝子の生成物に特異的に結合する。一部の実施形態では、診断用抗体は、非ヒト抗体である。一部の実施形態では、診断用抗体は、ラット、マウスまたはウサギの抗体である。一部の実施形態では、診断用抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、診断用抗体は、直接的に標識される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、トランスフェリン受容体（例えば、ＣＤ７１）、トランスフェリン、Ｌｙ７６、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１である。一部の実施形態では、診断用抗体は、Ｔｅｒ−１１９である。
【０１２５】
試料を上記の診断用抗体のいずれか１つと接触させることによってＩＨＣ試料を調製することができ、それは、マウントしてカバーガラスを被せることができる。次に、例えば顕微鏡を使用してスライドの評価を判定し、当技術分野で通常使用される染色強度基準を用いることができる。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーの存在は、ＩＨＣによって試料の＞０％で、試料の少なくとも１％で、試料の少なくとも５％で、試料の少なくとも１０％で検出される。
【０１２６】
代替の方法では、抗体−バイオマーカー複合体が形成するのに十分な条件の下で試料を前記バイオマーカーに特異的な抗体と接触させ、次に前記複合体を検出することができる。バイオマーカーの存在は、血漿または血清を含む各種の組織および試料を分析するためのウエスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ法などのいくつかの方法で検出することができる。そのようなアッセイフォーマットを使用する各種のイムノアッセイ技術が利用でき、例えば米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号および４，０１８，６５３号を参照されたい。これらには、非競合型の単一部位および２部位または「サンドウィッチ」アッセイ、ならびに伝統的な競合結合アッセイが含まれる。これらのアッセイには、標的バイオマーカーへの標識抗体の直接結合も含まれる。
【０１２７】
組織または細胞試料中の赤血球形成バイオマーカー遺伝子の発現レベルは、機能的または活性ベースのアッセイを通して検査することもできる。例えば、バイオマーカーが酵素である場合は、組織または細胞試料中の所与の酵素活性の存在を判定または検出するために、当技術分野で公知のアッセイを実行することができる。
【０１２８】
一部の実施形態では、赤血球系細胞のサブセットまたは全赤血球系細胞のレベルは、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して、当技術分野で公知の方法または本明細書に記載される方法を使用して判定される。赤血球系細胞の各サブセットは、それらの特異な形態（例えば、細胞体積および形態学的複雑性）によって、ならびにＣＤ４４およびＣＤ７１などの特異的細胞表面マーカーの発現によって特徴付けられる。細胞体積は、フローサイトメトリーを使用して前方散乱光（すなわち、「ＦＳＣ」）を使用して測定することができる。赤血球系細胞およびそのサブセットは、以下のゲーティング戦略を使用してフローサイトメトリーによって同定し、単離することができる：全ＲＢＣ（マウスの場合Ｔｅｒ−１１９＋またはヒトの場合ＣＤ２３５ａ＋）、未熟な有核ＲＢＣ（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ７１＋）、成熟したＲＢＣ（Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ７１−またはＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ４４ｌｏｗ  ＦＳＣｌｏｗ）、前赤芽球（Ｔｅｒ−１１９ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ／ＣＤ２３５ａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ）、塩基親和性赤芽球（Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ４４ｈｉｇｈ  ＦＳＣｈｉｇｈ）、多染性赤芽球（Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ４４ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＦＳＣｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）、正染性赤芽球および網赤血球（Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ４４ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＦＳＣｌｏｗ）。Ｃｈｅｎ、Ｌｉｕら  ２００９およびＫｏｕｌｎｉｓ、Ｐｏｐら  ２０１１を参照する。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、試料は、分析した赤血球形成バイオマーカーのレベルの差および使用した試料の品質の変動性の両方に関して、ならびにアッセイ操作の間の変動性に関して正規化される。そのような正規化は、周知のハウスキーピング遺伝子を含むある特定の正規化バイオマーカーを検出し、組み込むことによって達成することができる。あるいは、正規化は、分析した遺伝子の全てまたはその大きなサブセット（包括的正規化アプローチ）の平均または中間シグナルに基づくことができる。遺伝子ごとに、対象におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の測定された、正規化された量は、参照セットまたは既存対照において見出される量と比較される。１対象あたりの１試験試料あたりの各ｍＲＮＡまたはタンパク質の正規化された発現レベルは、参照セットまたは既存対照で測定される発現レベルの百分率として表すことができる。分析する特定の対象試料で測定されるレベルは、この範囲内の何らかのパーセンタイルにあり、それは当技術分野で周知である方法によって判定することができる。
【０１３０】
赤血球形成バイオマーカーのレベルは、試料の中で検出される。試料は、対象からの細胞もしくは細胞の集団、または組織もしくは体液の量を一般的に含有する。本明細書で企図される試料には、生検および剖検試料などの組織の切片、ならびに組織学的目的のための凍結切片が含まれる。生体試料には、血液および血液画分または生成物（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球など）も含まれる。「生検」は、診断または予後診断評価のための組織試料を取り出す過程、および組織検体それ自体を指す。当技術分野で公知である任意の生検技術を、本発明の診断および予後診断方法に適用することができる。適用される生検技術は、他の因子もある中で、評価される組織タイプ（例えば、脾臓、骨髄、血液細胞等）に依存する。代表的な生検技術には、限定されずに、摘出生検、切開生検、針生検、外科的生検および骨髄生検が含まれる。生検技術は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｋａｓｐｅｒら編、第１６版、２００５、第７０章およびパートＶ全体で議論される。
【０１３１】
一部の実施形態では、試料は、臨床試料である。一部の実施形態では、試料は、対象の脾臓から得られる。一部の実施形態では、試料は、対象の骨髄から得られる。一部の実施形態では、組織試料はホルマリン固定およびパラフィン包埋され、新鮮なままでまたは冷凍されて保管される。一部の実施形態では、試料は、全血である。一部の実施形態では、試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む血液画分である。一部の実施形態では、試料は、血漿試料または血清試料である。
【０１３２】
一部の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、検査試料を得るときと異なる１時点またはそれより多い時点で得られる、同じ対象または個体からの単一の試料または組み合わせた試料である。例えば、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、検査試料を得るときより早い時点で同じ対象または個体から得られる既存対照である。そのような参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、対象におけるバイオマーカーのベースラインレベルを提供するために対象へのメトトレキセートおよび治療剤の投与の前に参照試料が得られる場合に役立つことができる。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、処置する対象でも個体でもない１人またはそれより多くの健康な個体からの組み合わせた試料である。一部の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、処置する対象でも個体でもない、疾患または状態（例えば、ポンペ病）を有する１人またはそれより多くの個体からの組み合わせた試料である。ある特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、処置する対象でも個体でもない１人またはそれより多くの個体からのプールされたＰＢＭＣまたは血漿試料からのプールされた試料（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質試料）である。一部の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、処置する対象でも個体でもないが、メトトレキセート処置によって治療剤への免疫寛容性が誘導された、１人またはそれより多くの個体からの組み合わせた試料である。ある特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、処置する対象でも個体でもないが、メトトレキセート処置によって治療剤への免疫寛容性が誘導された（例えば、陽性対照）１人またはそれより多くの個体からのプールされた血漿またはＰＢＭＣ試料からのプールされた試料（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質試料）である。ある特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、対象でも個体でもなく、治療剤への免疫寛容性を示さない（例えば、陰性対照）、１人またはそれより多くの個体からのプールされた血漿またはＰＢＭＣ試料からのプールされた試料（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質試料）である。一部の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、治療剤療法をメトトレキセートと一緒に受けない（「プラセボ対照」）、１人またはそれより多くの個体からの組み合わせた試料である。ある特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、治療剤療法をメトトレキセートと一緒に受けない（「プラセボ対照」）、１人またはそれより多くの個体からのプールされたＰＢＭＣまたは血漿試料からのプールされた試料（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質試料）である。一部の実施形態では、１人またはそれより多くの個体からのプラセボ対照試料は、処置する対象と同じ疾患または障害（例えば、ポンぺ病）を有する。
【０１３４】
一部の実施形態では、試料は、メトトレキセートの最後の投与の約１、２、４、７、９、１４または２８日後のいずれか１日を含む、少なくとも約１日後から約３０日後に対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、メトトレキセートの最後の投与の約７日後から約１４日後に対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、治療剤の最初の投与の約１、２、４、７、９、１４または２８日後のいずれか１日を含む、少なくとも約１日後から約３０日後に対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、治療剤の開始の約７日後から約１４日後に対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、メトトレキセートおよび治療剤の最初の投与の少なくとも約１日後から約３０日後、例えば、約７、９および／または１４日後に対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、メトトレキセートおよび治療剤の開始の約７日後から約１４日後に対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、１回を超えて（例えば、約２、３、４またはそれより多くの回数のいずれか）対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、メトトレキセート処置（例えば、メトトレキセート処置のサイクルの最後のメトトレキセート投与）から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日目のうちの１日またはそれより多い日に得られる。一部の実施形態では、試料は、追加の免疫寛容性誘導療法および／または免疫抑制療法が対象に投与される前に対象から得られる。
【０１３５】
Ｂ．治療剤
本明細書に記載される方法は、対象において治療剤に対する望ましくない免疫応答をモニタリング、調査および／または制御するために有益である。多くの場合、治療剤に対する望ましくない免疫応答は、患者の転帰に様々な影響を引き起こすことができる。そのような応答は、生物学的治療薬が、例えば、ヒト患者に異物であるエピトープを構成する配列および高次構造をしばしば含有するので起こる。例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）は、治療的効能に干渉することおよび／または安全性リスクを増加させることがある。ＡＤＡ応答は、過敏性反応、アナフィラキシー、血清病、免疫複合体病、急性腎不全を引き起こすことができる。ＡＤＡは、タンパク質療法を受ける患者において、ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学を含む十分に確立された方法を使用して、臨床医がモニタリングすることができる。
【０１３６】
様々な治療剤が望ましくない免疫応答を誘導することが知られており、それは、抗薬物抗体（ＡＤＡ）ならびに他の望ましくないＴ細胞および／またはＢ細胞媒介免疫応答を含むことができる。一部の実施形態では、治療剤は、バイオ医薬品、例えば、タンパク質、核酸、ウイルス、遺伝子療法、脂質、リポソーム、炭水化物、その代謝産物または組合せである。
【０１３７】
一部の実施形態では、治療剤は、タンパク質療法である。タンパク質療法は、治療剤が、ペプチドまたはタンパク質を含むタンパク性物質である療法を指す。タンパク質治療薬は、例えば、酵素、サイトカイン、増殖因子、免疫調節物質、血栓溶解剤、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む）、抗体断片または改変された抗体（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖおよびｄＡｂ）であってよい。
【０１３８】
一部の実施形態では、治療剤は、治療ポリペプチドである。一部の実施形態では、治療剤は、酵素である。例えば、ファブリー病のためのＦＡＢＲＡＺＹＭＥ（登録商標）（組換えヒトアルファ−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病のためのＣＥＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（イミグルセラーゼ）、ムコ多糖体症Ｉ（ＭＰＳＩ）のためのＡＬＤＵＲＡＺＹＭＥ（登録商標）（ラロニダーゼ）ならびにポンペ病のためのＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）およびＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ）を含めて、ある特定の遺伝病を有する患者のために多くの酵素補充療法が開発されている。一部の実施形態では、治療剤は、ヒトアルファガラクトシダーゼＡである。一部の実施形態では、酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ、アルファ−グルコシダーゼ、アルファ−１，４−グルコシダーゼまたは酸性アルファ−１，４−グルコシダーゼと様々に呼ばれる）である。一部の実施形態では、酵素は、米国特許第７，００１，９９４号；米国特許第７，７２３，２９６号；米国特許第７，７８６，２７７号；米国特許第８，３９９，６５７号；米国特許第８，８４１，４２７号；米国特許第９，６８７，５３１号；米国特許第８，７５９，５０１号；および米国特許第９，４６９，８５０号に記載の通りに、酸性アルファ−グルコシダーゼ−オリゴ糖コンジュゲートまたは他の酵素−オリゴ糖コンジュゲートを含む、酵素−オリゴ糖コンジュゲートである。
【０１３９】
一部の実施形態では、治療剤は、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連の障害を有する個体で欠損しているか突然変異しているポリペプチド、抗酸化剤、抗アポトーシス因子、抗血管形成因子および抗炎症性因子、アルファ−シヌクレイン、酸性ベータ−グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ−ガラクトシダーゼ−１（ＧＬＢ１）、イズロネート２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ−Ｄ−マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、偽アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン−ピックＣタンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ−１，４−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ−アルファ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチルＣｏＡ、アルファ−グルコサミニダーゼＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーマル酸リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイントランスポータ、酸性セラミダーゼ、酸性アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、カテプシンＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸塩、酸性ベータ−ガラクトシダーゼまたはアルファ−ノイラミダーゼである。一部の実施形態では、治療剤は、ニューロンアポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経膠由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、脳由来増殖因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、抗酸化剤、抗血管形成ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチドおよびアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）からなる群から選択されるポリペプチドである。
【０１４０】
一部の実施形態では、治療剤は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、ジストロフィン、ジスフェルリンおよび嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）である。
【０１４１】
一部の実施形態では、治療剤は、抗体またはその抗原結合性断片である。抗体治療薬の例には、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（登録商標）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）（ナタリズマブ）、ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標）（バシリキシマブ）、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）、ＯＫＴ３（登録商標）（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）およびＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）（ベリムマブ）が含まれる。他のタンパク質治療薬の例には、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト）および他の融合タンパク質が含まれる。
【０１４２】
一部の実施形態では、治療剤は、リンパ球枯渇剤である。リンパ球枯渇は、リンパ球減少をもたらす、循環リンパ球、例えば、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の低減による免疫抑制のタイプである。リンパ球枯渇剤には、例えば、ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（登録商標）、ヒト化抗ＣＤ５２モノクローナル抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（登録商標）（アレムツズマブ）およびリツキシマブが含まれる。リンパ球枯渇は、多発性硬化症（Ｃｏｌｅｓら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６、２９６〜３０４頁（１９９９）；Ｃｏｌｅｓら、２００８）、慢性関節リウマチ、血管炎およびループスを含むいくつかの自己免疫性状態の処置において所望される。リンパ球枯渇療法は、二次自己免疫を引き起こすことができる。自己免疫は、それが第１の（「一次」）疾患、例えば、「一次」自己免疫性疾患の発症の後に生じる場合、本明細書において「二次自己免疫」と呼ばれる。二次自己免疫は、例えば、リンパ球枯渇療法の後にリンパ球減少を有するかまたは有したＭＳ患者において時々生じる。一部の個体では、二次自己免疫は、リンパ球枯渇療法（例えば、アレムツズマブによる処置）の直後に生じる。他の個体では、二次自己免疫は、リンパ球枯渇療法から数カ月または数年後まで起こることができない；それらの個体の一部では、彼らが二次免疫を起こすまでに実質的なリンパ球回復（全リンパ球数）が起こっている可能性があり、そのため彼らはもはやリンパ球減少性でない可能性がある。リンパ球枯渇は、抗体治療薬または小分子治療薬による処置との関連で起こることがある。
【０１４３】
一部の場合には、治療剤は、核酸治療薬を送達するためにウイルスベクターが使用されるウイルス療法である。そのような療法で使用される例示的なウイルスには、限定されずに、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスが含まれる。ウイルスのカプシドタンパク質に対して抗体が発達して、効能を低減し、そのような療法の安全性リスクを増加させることがある。本出願の方法は、ウイルス療法において望ましくない免疫学的応答（例えば、ＡＤＡ応答ならびに他の望ましくないＴ細胞および／またはＢ細胞媒介免疫応答）を制御するためにも有益である。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書に記載される治療剤のいずれかをコードする。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連の障害を有する個体で欠損または突然変異しているポリペプチド、抗酸化剤、抗アポトーシス因子、抗血管形成因子、抗炎症性因子、アルファ−シヌクレイン、酸性ベータ−グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ−ガラクトシダーゼ−１（ＧＬＢ１）、イズロネート２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ−Ｄ−マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、偽アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン−ピックＣタンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ−１，４−グルコシダーゼ（ＧＡＡ、例えばアルグルコシダーゼアルファ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ−アルファ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチルＣｏＡ、アルファ−グルコサミニダーゼＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーマル酸リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイントランスポータ、酸性セラミダーゼ、酸性アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、カテプシンＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸塩、酸性ベータ−ガラクトシダーゼまたはアルファ−ノイラミダーゼをコードする。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ニューロンアポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経膠由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、脳由来増殖因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、抗酸化剤、抗血管形成ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチドおよびアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、ジストロフィン、ジスフェルリンまたは嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）をコードする。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、抗体またはその抗原結合性断片をコードする。抗体治療薬の例には、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（登録商標）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）（ナタリズマブ）、ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標）（バシリキシマブ）、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）、ＯＫＴ３（登録商標）（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）およびＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）（ベリムマブ）が含まれる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、融合タンパク質、例えば、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト）をコードする。
【０１４４】
本出願の方法は、非タンパク生物学的療法における望ましくない免疫学的応答を制御するために使用することもできる。例示的な非タンパク生物療法には、限定されずに、核酸療法（例えば、アンチセンス療法、ｓｉＲＮＡ療法およびｍｉＲＮＡ療法）が含まれる。
【０１４５】
Ｃ．メトトレキセート、他の免疫寛容性誘導療法および免疫抑制療法
本明細書に記載される方法は、対象にメトトレキセートの有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、メトトレキセートは、対象において治療剤への免疫寛容性を誘導するために使用される。免疫寛容性を誘導するために、連続的な週単位の反復投与レジメン（Ｇａｒｍａｎら  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７（３）：４９６〜５０２頁（２００４）；Ｊｏｓｅｐｈら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２（１）：１３８〜４６頁（２００８）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３６０（２）：１９４〜５頁（２００９））、および一時的な低用量レジメン（米国特許出願公開第２０１４０１３５３３７号を参照する）を含む、利用可能な投与レジメンのいずれも使用することができる。一部の実施形態では、メトトレキセートの有効量は、３サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、単一サイクルで投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、１、２、３、４、５サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与される。
【０１４６】
免疫寛容性の誘導のための一時的な低用量メトトレキセートの使用は、リウマチ病における化学療法剤として、または連続的免疫抑制剤としてのその十分に認知された役割から特異である（Ｋｒｅｍｅｒ  ２００４）。メトトレキセートは１９４０年代にがんの処置のために最初に記載され、メトトレキセートの高用量クールはいくつかのがんおよび新生物を処置するために処方され続けられている。自己免疫障害では、とりわけ、慢性関節リウマチおよび乾癬を処置するために、連続的な週単位の低用量メトトレキセートが使用される（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ  ２００５；Ｔａｙｌｏｒら、２００８）。一時的な低用量メトトレキセートレジメンでは、単一サイクルまたは３サイクルの低用量メトトレキセートが、バイオ医薬品療法の開始と同時に投与される。一部の実施形態では、１サイクルは、０、２４および４８時間時に投与される低用量メトトレキセートの３日連続の日用量と同等である。本来３サイクルレジメンとして設計されているが、単一サイクルの低用量メトトレキセートは、永続的免疫寛容性を提供することにおいて全く同様に有効であることがマウスにおいて実証されている（Ｊｏｓｅｐｈ、Ｎｅｆｆら  ２０１２、Ｊｏｌｙ、Ｍａｒｔｉｎら  ２０１４）。
【０１４７】
メトトレキセートは、ヌクレオシドチミジンの新規の合成ならびにプリンおよびピリミジンの生合成のために必須であるジヒドロ葉酸レダクターゼを競合的に阻害する葉酸アンタゴニストとして機能する。ＤＮＡ合成は細胞周期にとって決定的に重要であるので、高用量メトトレキセートは高度に増殖する細胞を死滅させることによってがんを処置すると考えられる。対照的に、連続的な週単位の低用量メトトレキセートが自己免疫性障害を制御すると考えられる機構は、Ｔ細胞の枯渇または抗原依存性Ｔ細胞増殖の阻害につながるプリン代謝への影響によると考えられている（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ  ２００５）。さらに、メトトレキセートは、炎症性障害においてＴ調節細胞を媒介することができる抗炎症性媒介物アデノシンの蓄積を誘導することが示されている（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ  ２００５、Ｅｒｎｓｔ、Ｇａｒｒｉｓｏｎら  ２０１０、Ｈａｎ、Ｔｈｏｍａｓら  ２０１３）。
【０１４８】
マウスにおいて免疫寛容性が一時的な低用量メトトレキセート処置によって達成される機構は、メトトレキセートの連続的な週単位の反復投与を通した免疫抑制のそれと異なるように見える。一時的な投与レジメンと比較したとき、メトトレキセートの週単位の反復投与は異なる免疫学的帰結を有する可能性がある。
【０１４９】
本明細書で使用されるように、単一サイクルは、連続的または非連続的日々の処置レジメンまたは処置単位を指し、治療剤の投与の好ましくは５日後以内（例えば、３日後以内）に開始される。メトトレキセートの単一サイクルは、メトトレキセートの単回投与、またはメトトレキセートの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日のうちのいずれか１つの連続投与からなることができる。治療剤が複数の期間に投与される場合、メトトレキセートによる処置の単一サイクルは、好ましくは治療剤投与の第１の期間を越えて延長しない。例として、週単位、月単位または年単位の治療剤では、メトトレキセートの単一サイクルは、治療剤が初めて患者に与えられる日である０日目から開始して、３日連続のメトトレキセート摂取（例えば、経口的）からなる。その後、患者は１日目（約２４時間後）および２日目（約４８時間後）にメトトレキセートの単回投与を受ける。一部の実施形態では、メトトレキセートの単一サイクルは、約８日より長く持続しない。
【０１５０】
メトトレキセートおよび治療剤は、適当と考えられる任意の順序で投与することができる。例えば、メトトレキセートは治療剤の投与の前、その間および／または後に対象に投与することができる。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療剤療法の投与の約４８時間前から約４８時間後の間に投与される。例えば、メトトレキセートは、治療剤療法の投与の約４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、同時、１２時間後、２４時間後、３６時間後または４８時間後のいずれかに投与することができる。一部の実施形態では、メトトレキセートは、治療剤と同時に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは治療剤の投与と同時に、ならびに治療剤の投与の約２４時間後および約４８時間後に投与される。一部の実施形態では、治療剤はアルグルコシダーゼアルファであり、メトトレキセートは治療剤の投与と同時に、ならびに治療剤の投与の約２４時間後および約４８時間後に投与される。
【０１５１】
メトトレキセートは、望ましくない免疫学的応答、例えば抗体または細胞性応答の低減において有効である任意の用量で投与することができる。ヒト患者におけるメトトレキセートの有効量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれか１つ以下であってよい。一部の実施形態では、有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１２ｍｇ／ｋｇ〜約１．２８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇのいずれか１つである。一部の実施形態では、メトトレキセートの投薬量は最小限の安全性リスクしかもたらさないことができるが、その理由は、投与レジメンが、低い新生物用量よりも慢性関節リウマチの用量と類似している用量レベルのメトトレキセートの短時間クールだけを含むからである。慢性関節リウマチ患者は、有意な毒性を被ること無しに、１週につき最高２５ｍｇのメトトレキセートを受けることができる。メトトレキセートの低い新生物用量は、３０ｍｇ／ｍ２であると考えられる。
【０１５２】
一部の実施形態では、メトトレキセートは、低い全投薬量であるが複数のサイクルで投与される。例えば、メトトレキセートは、２サイクルまたはそれ以上（例えば、３、４、５、６等）のサイクルで、しかし患者における全合計投薬量が５ｍｇ／ｋｇ以下で投与することができる。
【０１５３】
メトトレキセートの低用量レジメンは、成人で十分寛容されるであろう。メトトレキセートの正確な投薬量およびレジメンは、患者の身体的状態、年齢、体重、性、服用中の他の医薬品およびそれらの公知の副作用、ならびに任意の他の関連する因子を考慮することによって、臨床医によって確立されるべきである。
【０１５４】
一部の実施形態では、メトトレキセートに加えて、対象は最初の免疫寛容性誘導療法を治療剤の投与と同時に投与される。本明細書で言及されるように、「最初の免疫寛容性誘導療法」は、治療剤による処置のさらなるサイクルにおいて投与される免疫寛容性誘導療法に対して、治療剤の開始後に対象に投与される免疫寛容性誘導レジメンを指す。一部の実施形態では、最初の免疫寛容性誘導療法は、メトトレキセートと同時に投与される。一部の実施形態では、最初の免疫寛容性誘導療法は、メトトレキセートの投与の後に、例えばメトトレキセートの投与の１、２、３、４、５、６、７日またはそれ以上後のいずれか１日に投与される。一部の実施形態では、最初の免疫寛容性誘導療法は、メトトレキセートの投与の前に、例えばメトトレキセートの投与の１、２、３、４、５、６、７日またはそれ以上前のいずれか１日に投与される。一部の実施形態では、対象は、ポンペ病、例えばＣＲＩＭ陰性のポンペ病および／または小児発症ポンペ病（例えば、古典的小児発症ポンペ病）を有する。一部の実施形態では、メトトレキセートは、経腸的に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、週単位で投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、皮下に投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、約０．４ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、メトトレキセートは、３週の間に１週につき３用量で投与される。
【０１５５】
一部の実施形態では、最初の免疫寛容性誘導療法は、リツキシマブ、ＩＶＩＧまたはその組合せを含む。一部の実施形態では、最初の免疫寛容性誘導療法は、リツキシマブの投与を含む。一部の実施形態では、リツキシマブは、約３７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。一部の実施形態では、例えば対象の体表面積（ＢＳＡ）が０．５ｍ２未満である場合、リツキシマブは約１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、リツキシマブは、静脈内投与される。一部の実施形態では、リツキシマブは、週単位で投与される。一部の実施形態では、最初の免疫寛容性誘導療法は、ＩＶＩＧの投与を含む。一部の実施形態では、ＩＶＩＧは、約０．５ｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ＩＶＩＧは、約４００〜５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ＩＶＩＧは、約４週ごとに投与される。一部の実施形態では、ＩＶＩＧは、月単位で投与される。一部の実施形態では、最初の免疫寛容性誘導療法は、リツキシマブとＩＶＩＧの両方の投与を含む。
【０１５６】
一部の実施形態では、対象は、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて治療剤によるさらなる処置を投与される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を投与される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して低減している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法および／または免疫抑制療法の投与と同時に治療剤によるさらなる処置を投与される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球を含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーは、赤血球形成に関連する遺伝子を含み、ここで、遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連している。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーは、トランスフェリン受容体（例えばＣＤ７１）、トランスフェリン、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子を含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートの最終投与の約７日後から約１４日後に対象から得られる試料で検出される。一部の実施形態では、試料は、血液試料、ＰＢＭＣ試料または血漿試料である。
【０１５７】
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しい（例えば、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上のいずれか１つ）か、またはそれ未満である（すなわち、それに対して低減している）場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を投与される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法および／または免疫抑制療法の投与と同時に治療剤によるさらなる処置を投与される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーは、成熟赤血球を含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーは、全赤血球系細胞を含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーは、ヘモグロビン、赤血球アンキリンまたはグリコホリンＣを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートの最終投与の約１日後から約３０日後（例えば、約７日後から約１４日後）に対象から得られる試料で検出される。一部の実施形態では、試料は、血液試料、ＰＢＭＣ試料または血漿試料である。
【０１５８】
当技術分野で公知の免疫寛容性誘導療法および／または免疫抑制療法のいずれも、治療剤によるさらなる処置と併用して対象に投与することができる。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法は、小分子治療剤、タンパク質治療剤またはその組合せを含む。例示的な免疫抑制剤には、限定されずに、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ＢＡＦＦ抗体（例えば、ベリムマブ）、抗ＣＤ３抗体（例えば、ムロモナブまたはオテリキシズマブ）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＩｇＥ抗体（例えば、オマリズマブ）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン）、ラパマイシン、メトトレキセート、ＷＩＧ、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチルおよびプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）が含まれる。これらの追加の免疫調節剤またはそれらの誘導体には、抗原提示および／または体液性もしくは細胞媒介免疫応答を標的にする／変更する薬剤が含まれる。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法は、静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）の投与を含む。一部の実施形態では、免疫抑制療法は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および／または形質細胞を枯渇させるリンパ球枯渇剤を含む。一部の実施形態では、形質細胞を枯渇させる薬剤は、ボルテゾミブである。
【０１５９】
一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法は、抗原特異的寛容性戦略を含む。例えば、抗原ペプチド、抗原またはペプチドに結合した細胞、変更ペプチドリガンド（ＡＰＬ）およびその誘導体を使用して、様々な抗原特異的寛容性療法が開発されている。抗原特異的寛容性療法は、例えば、Ｍｉｌｌｅｒら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７．９（２００７）：６６５〜６７７頁に記載されている。一部の実施形態では、抗原特異的寛容性療法は、治療剤のより高頻度の投与または治療剤のより高い用量を投与することまたはその両方を含む。例えば、治療剤は、最初の用量の少なくとも約１．５×、２×、３×、５×、１０×またはそれ以上のいずれか１つの用量で投与することができる。一部の実施形態では、治療剤は、最初の頻度の少なくとも約１．５×、２×、３×、５×またはそれ以上高い頻度のいずれか１つの頻度で投与される。一部の実施形態では、治療剤のより高い用量は、ＩＶＩＧと同時投与される。
【０１６０】
一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法は、メトトレキセートの投与を含む。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法は、メトトレキセートの投与を含まない。一部の実施形態では、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法は、以下の１つまたはそれ以上を含む：リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレートおよびコルチコステロイドの１つまたはそれ以上の有効量を投与すること；ならびに、抗原特異的寛容性戦略の投与。
【０１６１】
追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法は、治療剤のさらなる投与の前に、または治療剤のさらなる投与と同時に対象に投与することができる。一部の実施形態では、治療剤によるさらなる処置は、少なくとも約１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１年、２年、３年またはそれ以上のいずれかの期間持続する。追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法は、治療剤のさらなる処置の全期間で、またはさらなる処置の一部で（例えば、最初だけ）投与することができる。治療剤による処置の各サイクルのために、異なるタイプおよび／またはレジメンの追加の免疫寛容性誘導療法および／または免疫抑制療法を投与することができる。追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法の処置の投与レジメンおよび期間は、疾患進行、抗薬物抗体のレベルおよび／または１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、医師が選択することができる。
【０１６２】
患者における望ましくない抗体応答の管理に及ぼすメトトレキセートならびに場合により他の免疫寛容性誘導療法および免疫抑制療法の効果は、患者の臨床検査、症状、抗薬物抗体価を検査する血液検査および免疫組織化学的アッセイ（例えば、Ｃ４沈着アッセイおよび他の固相抗体検出方法、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびビーズベースの蛍光定量アッセイ）を含む、周知の方法によってモニタリングすることができる。効果は、そのレベルはメトトレキセート処置によって低減されることが示されている、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１３、ＩＬ−６およびＩＬ−１２などのバイオマーカーのレベル、ならびに、その数はメトトレキセート処置によって増加することが示されている、移行性２Ｂ細胞、移行性３Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、周辺帯Ｂ細胞、Ｂ１０  Ｂ細胞およびＢ１  Ｂ細胞を測定することによってモニタリングすることもできる。さらに、ＴＧＦ−ベータ、ＦｏｘＰ３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５およびＧＭ−ＣＳＦは、必要に応じて望ましくない免疫応答に及ぼすメトトレキセートの効果をモニタリングするためのバイオマーカーとして使用することができる。バイオマーカーのレベルは、治療剤（例えば、治療ポリペプチド）へのＴ細胞応答に及ぼすメトトレキセートの効果をモニタリングするために使用することもできる。Ｔ細胞応答に及ぼすメトトレキセートの効果のための読み出しとして、ＩＬ−２、インターフェロン−γおよびＴＮＦ−αなどのＴ細胞活性化のためのバイオマーカーをモニタリングすることもできる。一部の実施形態では、望ましくない免疫応答をモニタリングするために、ＣＤ１９のレベルがさらに検出される。一部の実施形態では、対象は、抗薬物抗体レベル（例えば、抗ｒｈＧＡＡ  ＩｇＧ抗体レベル）、ＣＤ１９レベルおよび疾患進行の１つまたはそれ以上について、処置の全体を通じてモニタリングされる。
【０１６３】
Ｄ．疾患および状態
本明細書に記載される方法は、タンパク質治療剤などの治療剤によって処置することができる疾患または状態を有する対象を処置するために有益である。例えば、多くの疾患および状態を処置するために酵素補充療法が開発されたが、酵素補充療法を受ける対象において抗薬物抗体などの望ましくない免疫応答が発達することがある。
【０１６４】
一部の実施形態では、対象は、リソソーム蓄積症を有する。リソソーム蓄積症は、通常遺伝子突然変異の結果として特定のリソソーム酵素の欠損から各々もたらされる、４０を超える遺伝子障害のクラスを記載する（例えば、Ｈｏｌｔｏｎ、Ｊ．Ｂ．、ＴＨＥ  ＩＮＨＥＲＩＴＥＤ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ２０５〜２４２頁（第２版、１９９４）；Ｓｃｒｉｖｅｒら、２  ＴＨＥ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＩＮＨＥＲＩＴＥＤ  ＤＩＳＥＡＳＥ（第７版、１９９５）を参照）。リソソーム酵素は、細胞のリソソームの中でタンパク質、糖脂質および炭水化物代謝産物を分解するために必要である。これらの酵素の１つまたはそれ以上が遺伝性の突然変異のために罹患者において欠損している場合、罹患者の細胞の中のリソソームは、ほとんどリポサッカライドおよび炭水化物である未消化基質のサブセットを、欠損した酵素が消化することができない貯蔵物質として蓄積する。例えば、ゴーシェ病では、ベータ−グルコセレブロシダーゼの欠損がグルコシルセラミドの蓄積を引き起こし、ファブリー病では、欠損したアルファ−ガラクトシダーゼＡがグロボトリアオシルセレミドの蓄積をもたらし、ポンペ病では、酸性アルファ−グルコシダーゼの欠如は、グリコーゲンアルファ−１−４結合オリゴ糖の蓄積を引き起こし、テイ−サックス病では、ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの欠損が、ＧＭ２ガングリオシドの蓄積につながる。臨床的には、これらの症候群の患者は、リソソームにおけるこれらの貯蔵物質の蓄積に関連する様々な症状を示し、それらは、ヒト体内の臓器の機能不全をもたらす、細胞または組織の正常な機能に最終的に影響を及ぼす。疾患の重症度は、残存する酵素活性によって異なる。酵素活性がほとんどまたはまったくない重度の症例では、生涯の早期に死に至ることがある。
【０１６５】
一部の実施形態では、対象はゴーシェ病を有し、ベータ−グルコセレブロシダーゼによる処置を必要とする。一部の実施形態では、対象はファブリー病を有し、アルファ−ガラクトシダーゼＡによる処置を必要とする。一部の実施形態では、対象はテイ−サックス病を有し、ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを必要とする。一部の実施形態では、対象はポンペ病を有し、酸性α−グルコシダーゼを必要とする。
【０１６６】
一部の実施形態では、対象はポンペ病（酸性マルターゼ欠損症およびグリコーゲン蓄積症ＩＩ型と様々に知られる）を有する。本明細書に記載される方法は、早発性（小児）および遅発性（若年および成人）ポンペ病の両方を有する対象のために有効である。一部の実施形態では、対象は、遺伝的継承ポンペ病を有する。一部の実施形態では、対象は、小児発症ポンペ病を有する。一部の実施形態では、対象は、非古典的小児発症ポンペ病を有する。一部の実施形態では、対象は、遅発性ポンペ病、例えば児童発症、若年発症または成人発症ポンペ病を有する。一部の実施形態では、対象は、成人発症型のポンペ病を有する。
【０１６７】
古典的小児発症ポンペ病は、生後数カ月以内に始まる。この障害を有する小児は、全ての臓器におけるグリコーゲン蓄積に付随して、筋力低下（ミオパシー）、劣った筋緊張（緊張低下）、拡大した肝臓（肝腫大）および心臓肥大を含む心臓欠損を一般的に経験する。罹患小児は、体重増加および予想される速度での成長も不良であり（生育不全）、呼吸系の問題を有することもある。臨床検査では、筋肉消耗を伴う全身性緊張低下、胸骨の退縮による呼吸数の増加、肝臓の中等度の拡大および舌の突出がある。心臓の超音波検査は、最終的に不十分な心拍出量につながる、進行性の肥大型心筋症を示す。ＥＣＧは、著しい左側の軸偏位、短いＰＲ間隔、大きなＱＲＳ群、反転したＴ波およびＳＴ下降によって特徴付けられる。この疾患は、生後１年以内に心呼吸系不全につながる急進行性の経過を示す。剖検時の組織学的検査では、リソソームグリコーゲン蓄積が様々な組織で観察され、心臓および骨格筋で最も顕著である。未処置の場合、この形態のポンペ病は、生後１年以内に心不全から死に一般的につながる。
【０１６８】
非古典的な小児発症ポンペ病は、通常１歳までに出現する。それは、遅延された運動技能（例えば、転がることおよび座ること）および進行性の筋力低下によって特徴付けられる。心臓は異常に大きくなることがある（心臓肥大症）が、罹患者は通常心不全を経験しない。この障害における筋力低下は、重大な呼吸系の問題につながり、未処置の場合、非古典的小児発症ポンペ病のほとんどの児童は、初期児童期までにしか生きない。
【０１６９】
遅発性ポンペ病は、児童後期、青年期または成人期まで明らかにならない可能性がある。遅発性ポンペ病は、通常この障害の小児発症型より軽度であり、心臓を巻き込む可能性は低い。遅発性ポンペ病のほとんどの個体は、特に呼吸を制御する筋肉を含む脚および胴体における、進行性の筋力低下を経験する。障害の進行にしたがい、呼吸系の問題は呼吸不全につながることがある。
【０１７０】
ヒト酸性アルファグルコシダーゼによる処置は、そのような患者の寿命を長くすることができる（例えば、１年、２年または５年を超えて正常な寿命まで）。処置は、上記のような、ポンペ病の臨床および生化学的特徴を消去または低減することもできる。処置は出産直後に、または彼らの子孫を危険にさらす変異したアルファグルコシダーゼ対立遺伝子を親が有することが知られている場合は、出産前に投与される。
【０１７１】
遅発性成人型ポンペ病を有する患者は、生涯の最初の２０年以内に症状を経験しないかもしれない。この臨床サブタイプでは、特に肢帯、胴体および横隔膜の筋肉における、骨格筋に対する効果が卓越している。階段を登ることにおける困難が、しばしば最初の愁訴である。呼吸障害は、かなり変動する。それは臨床像を支配することもあるか、または患者は生涯の後期までそれを経験しないかもしれない。ほとんどの遅発性患者は、最終的に呼吸機能不全のために死ぬ。若年性サブタイプの患者では、症状は、通常生涯の最初の１０年に明らかになる。成人ポンペ病におけるように、骨格の筋力低下が主要な問題であり、心臓肥大症、肝腫大および大舌症が見られることがあるが、稀である。多くの場合、夜間の換気サポートが最終的に必要である。肺感染症は、呼吸筋の消耗と一緒に生命を脅かし、一般的に生涯の第３の１０年間の前に致命的になる。本方法による処置は、若年または成人の遅発性ポンペ病患者の生命を正常な寿命まで長くする。処置は、疾患の臨床および生化学的症状をさらに消去または有意に低減させる。
【０１７２】
一部の実施形態では、ポンペ病を有する対象は、ＣＲＩＭ陰性である。ポンペ病との関連で本明細書において使用されるように、「ＣＲＩＭ」は患者の内在性ＧＡＡタンパク質の免疫反応性を指す。例えば、野生型ヒトＧＡＡタンパク質に対する抗体を使用してウエスタンブロットによって判断されるように、ＧＡＡの２つの有害突然変異を有する患者およびＧＡＡが完全にない患者は、交差反応性免疫物質（ＣＲＩＭ）陰性として分類される。ウエスタンブロットによって検出可能なＧＡＡタンパク質を有する患者は、ＣＲＩＭ陽性として分類される。大半のＣＲＩＭ陽性患者はＥＲＴに対して持続的治療応答を有するが、ＣＲＩＭ陰性患者はｒｈＧＡＡに対する持続的な高力価抗体の発達のためにほとんど一様に劣り、急速な臨床上の衰退を経験する。Ｋｉｓｈｎａｎｉ  ＰＳら  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．２０１０；９９：２６〜３３頁を参照。このＡＤＡは、一部のＣＲＩＭ陽性患者でも観察されている（Ｂａｎｕｇａｒｉａら  ２０１１）。一部の実施形態では、ＣＲＩＭ状態は、皮膚線維芽細胞のウエスタンブロット分析による確認の有無にかかわらず、ＧＡＡ突然変異分析を通して同定される。
【０１７３】
一部の実施形態では、対象は、多発性硬化症（ＭＳ）などの自己免疫性疾患を有する。一部の実施形態では、対象は、抗ＣＤ５２抗体による処置を必要とする。一部の実施形態では、この抗体は、アレムツズマブである。
【０１７４】
一部の実施形態では、対象は遺伝病を有する。一部の実施形態では、対象は、バイオ医薬品（例えば、ポリペプチド、核酸等）の投与により処置される疾患または障害を有する。一部の場合には、対象は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答または免疫応答を誘導することができる化合物（例えば、バイオ医薬品）で処置される疾患または障害を有する。一部の実施形態では、対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、ハンチントン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病を有する。一部の実施形態では、対象は、核酸を送達するためにウイルスベクターが使用される、ウイルス療法により処置される疾患または障害を有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペス、ワクシニアまたはアデノ随伴ウイルスに由来する。
【０１７５】
ＩＩＩ．キット、アッセイおよび製造品
さらに、メトトレキセートおよび治療剤の投与の後に対象から得られる試料の中の赤血球形成バイオマーカーを検出するための、１つまたはそれ以上の試薬を含むキットが本明細書で提供される。一部の実施形態では、キットは、治療剤および／またはメトトレキセートをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、個体が赤血球形成バイオマーカーの低減したレベルを有する場合、疾患または障害を処置するための医薬（例えば、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法）を選択するためにキットを使用するための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、２つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーを検出するための試薬を含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、ポンペ病の対象において治療剤（例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼ）への免疫寛容性のレベルを調査するためのアッセイであって、少なくとも１サイクルのメトトレキセート処置および治療薬の少なくとも１用量を以前に投与されている対象から試料を得る工程；および試料を赤血球形成バイオマーカーに結合する薬剤と接触させる工程であって、対照のレベルに対する赤血球形成バイオマーカーの上昇したレベルの検出は免疫寛容性の誘導を示す、工程を含む方法が提供される。
【０１７７】
一部の実施形態では、治療薬を必要とする対象において治療剤への免疫寛容性のレベルを調査するアッセイであって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程；（ｂ）治療剤の治療有効量を対象に投与する工程；および（ｃ）対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルは、対象における治療剤への免疫寛容性の誘導を示す、工程を含むアッセイが提供される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーは、メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に対象から得られる試料中で検出される。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は、赤血球形成の誘導と関連する。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。一部の実施形態では、赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたは低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない。
【０１７８】
本明細書において、一緒に包装されている、治療剤（例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼ）を含む医薬組成物、メトトレキセート、および、治療剤が、治療剤およびメトトレキセートの投与の後の赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて疾患または状態を有する患者を処置するためのものであることを示す添付文書を含む医薬組成物を含む製造品も提供される。一部の実施形態では、製造品は、追加の免疫寛容性誘導療法および／または免疫抑制療法をさらに含む。処置方法には、本明細書に開示される処置方法のいずれも含まれる。
【０１７９】
製造品は、容器、および容器の上にまたはそれに付随して、ラベルまたは添付文書を含む。適する容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で作ることができる。容器は、治療剤を有効成分として含む組成物を保持または含有し、無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。
【０１８０】
製造品は、薬学的に許容される希釈緩衝液、例えば静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液を含む第２の容器をさらに含むことができる。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの見地から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
【０１８１】
本発明の製造品は、組成物が、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて疾患または状態を処置するために使用されることを示す、例えば添付文書の形の情報も含む。挿入文書またはラベルは、紙、またはフラッシュメモリ（例えば、ＵＳＢフラッシュドライブなど）、磁気記録媒体（例えば、フロッピーディスク）またはＣＤ−ＲＯＭを含むデータ記憶装置などの電子媒体などの、任意の形態をとることができる。ラベルまたは挿入文書は、医薬組成物および剤形に関する他の情報をキットまたは製造品に含むこともできる。
【０１８２】
本発明は、製造品を製造する方法であって、パッケージの中で、治療剤（例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼ）を含む医薬組成物、メトトレキセートを含む医薬組成物、および、治療剤が、治療剤およびメトトレキセートの投与の後の赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて疾患または状態（例えば、ポンペ病）を有する患者を処置するためのものであることを示す添付文書を組み合わせることを含む方法にも関する。一部の実施形態では、製造品は、追加の免疫寛容性誘導療法および／または免疫抑制療法をさらに含む。
【０１８３】
ＩＶ．例示的な実施形態
本発明は、以下の実施形態を提供する：
実施形態１。治療剤による処置を必要とする対象を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与する工程；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後の間に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、治療剤によるさらなる処置を継続する工程を含む方法。
【０１８４】
実施形態２。赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は赤血球形成の誘導と関連する、実施形態１の方法。
【０１８５】
実施形態３。赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む、実施形態２の方法。
【０１８６】
実施形態４。赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置を継続することを含む、実施形態２の方法。
【０１８７】
実施形態５。赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である、実施形態３の方法。
【０１８８】
実施形態６。赤血球形成バイオマーカーはヘマトクリットである、実施形態４の方法。
【０１８９】
実施形態７。未熟な有核赤血球のレベルが未熟な有核赤血球のレベルが上昇する前に最初に低下する場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置が継続される、実施形態５の方法。
【０１９０】
実施形態８。メトトレキセートは、単一サイクルで投与され、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１、約２、約３、約４、約５、約６または約７日前までに低下する、実施形態７の方法。
【０１９１】
実施形態９。メトトレキセートは２サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与され、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１日から約１４日前までに低下する、実施形態７の方法。
【０１９２】
実施形態１０。赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することであり、ここで、赤血球形成に関連する遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連する遺伝子である、実施形態３または４の方法。
【０１９３】
実施形態１１。赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、Ｌｙ７６（Ｔｅｒ−１１９のための抗原）、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である、実施形態１０の方法。
【０１９４】
実施形態１２。トランスフェリン受容体はトランスフェリン受容体１（ＣＤ７１）である、実施形態１１の方法。
【０１９５】
実施形態１３。赤血球形成に関連する遺伝子を検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子のＲＮＡ転写物を検出すること、または赤血球形成に関連する遺伝子のタンパク質生成物を検出することを含む、実施形態１０〜１２のいずれか１つの方法。
【０１９６】
実施形態１４。タンパク質生成物はヘモグロビンである、実施形態１３の方法。
【０１９７】
実施形態１５。赤血球形成バイオマーカーは赤血球形成に関連する補因子である、実施形態３の方法。
【０１９８】
実施形態１６。赤血球形成に関連する補因子は、ポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである、実施形態１５の方法。
【０１９９】
実施形態１７。試料は血液試料である、実施形態１〜１６のいずれか１つの方法。
【０２００】
実施形態１８。血液試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む血液画分である、実施形態１７の方法。
【０２０１】
実施形態１９。血液試料は血清試料または血漿試料であり、バイオマーカーを検出することは赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することである、実施形態１８の方法。
【０２０２】
実施形態２０。対照は既存対照またはプラセボ対照である、実施形態１〜１９のいずれか１つの方法。
【０２０３】
実施形態２１。対象はヒトである、実施形態１〜２０のいずれか１つの方法。
【０２０４】
実施形態２２。メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される、実施形態１〜２１のいずれか１つの方法。
【０２０５】
実施形態２３。メトトレキセートは、単一サイクルで投与される、実施形態２２の方法。
【０２０６】
実施形態２４。メトトレキセートのサイクルは、１日のメトトレキセート投与または２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日連続のメトトレキセート投与からなる、実施形態２２または実施形態２３の方法。
【０２０７】
実施形態２５。メトトレキセートは、治療剤の投与の前、間および後の１つまたはそれ以上から選択される時間に対象に投与される、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法。
【０２０８】
実施形態２６。メトトレキセートは、治療剤の投与の４８時間前から４８時間後の間に投与される、実施形態２５の方法。
【０２０９】
実施形態２７。メトトレキセートは治療剤の投与と同時に、ならびに治療剤の投与の約２４時間後および約４８時間後に投与される、実施形態２６の方法。
【０２１０】
実施形態２８。メトトレキセートは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇで投与される、実施形態１〜２７のいずれか１つの方法。
【０２１１】
実施形態２９。試料は、メトトレキセートの最終投与の少なくとも約１日後から約３０日後に対象から得られる、実施形態１〜２８のいずれか１つの方法。
【０２１２】
実施形態３０。試料は、メトトレキセートの最終投与の約７日後から約１４日後に対象から得られる、実施形態１〜２９のいずれか１つの方法。
【０２１３】
実施形態３１。試料は、メトトレキセートの最終投与後の複数の日に得られる、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法。
【０２１４】
実施形態３２。試料は、メトトレキセートの最終投与から１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１４日目、２１日目または２８日目のうちの１日またはそれ以上の日に得られる、実施形態３０の方法。
【０２１５】
実施形態３３。工程（ｄ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞または形質細胞を枯渇させる薬剤を投与することを含む、実施形態１〜３２のいずれか１つの方法。
【０２１６】
実施形態３４。工程（ｄ）は、実施形態１〜３３のいずれか１つの方法：（ａ）リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレートおよびコルチコステロイドの１つまたはそれ以上の有効量を投与すること；ならびに（ｂ）抗原特異的寛容性戦略を投与することの１つまたはそれ以上を含む。
【０２１７】
実施形態３５。抗原特異的寛容性戦略は、治療剤のより高頻度の投薬または治療剤のより高い用量を投与することまたはその両方を含む、実施形態３４の方法。
【０２１８】
実施形態３６。治療剤のより高い用量は、ＩＶＩＧと同時投与される、実施形態３５の方法。
【０２１９】
実施形態３７。治療剤は、ポリペプチド、核酸、ウイルス、遺伝子療法、脂質、リポソームまたは炭水化物である、実施形態１〜３６のいずれか１つの方法。
【０２２０】
実施形態３８。治療剤は治療ポリペプチドである、実施形態１〜３７のいずれか１つの方法。
【０２２１】
実施形態３９。治療ポリペプチドは抗体またはその抗原結合性断片である、実施形態３８の方法。
【０２２２】
実施形態４０。抗体はモノクローナル抗体である、実施形態３９の方法。
【０２２３】
実施形態４１。抗体はリンパ球枯渇剤である、実施形態３９また４０の方法。
【０２２４】
実施形態４２。抗体はアレムツズマブである、実施形態４０または実施形態４１の方法。
【０２２５】
実施形態４３。治療ポリペプチドは酵素である、実施形態３８の方法。
【０２２６】
実施形態４４。酵素はヒトアルファガラクトシダーゼＡである、実施形態４２の方法。
【０２２７】
実施形態４５。酵素はヒト酸性α−グルコシダーゼである、実施形態４２の方法。
【０２２８】
実施形態４６。対象はリソソーム蓄積症を有する、実施形態１〜３８および４３〜４５のいずれか１つの方法。
【０２２９】
実施形態４７。対象はポンペ病を有する、実施形態４６の方法。
【０２３０】
実施形態４８。ポンペ病は小児発症ポンペ病である、実施形態４７の方法。
【０２３１】
実施形態４９。ポンペ病は古典的な小児発症ポンペ病である、実施形態４６の方法。
【０２３２】
実施形態５０。対象は交差反応性免疫物質（ＣＲＩＭ）陰性である、実施形態４６〜４９のいずれか１つの方法。
【０２３３】
実施形態５１。最初の免疫寛容性誘導療法を治療剤の投与と同時に投与することをさらに含み、ここで、治療剤はヒト酸性α−グルコシダーゼである、実施形態５０の方法。
【０２３４】
実施形態５２。最初の免疫寛容性誘導療法はリツキシマブおよびＩＶＩＧの１つまたはそれ以上を投与することを含む、実施形態５１の方法。
【０２３５】
実施形態５３。それを必要とする対象においてポンペ病を処置する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与すること；（ｂ）対象にヒト酸性α−グルコシダーゼの有効量を投与すること；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出すること；および（ｄ）対照のそれと比較した赤血球形成バイオマーカーのレベルに基づいて、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与して、または投与しないで、ヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む方法。
【０２３６】
実施形態５４。赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は赤血球形成の誘導と関連する、実施形態５３の方法。
【０２３７】
実施形態５５。赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法をヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずにヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む、実施形態５４の方法。
【０２３８】
実施形態５６。赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法をヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置と同時に投与することを含むか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたはそれより低い場合、工程（ｄ）は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずにヒト酸性α−グルコシダーゼによるさらなる処置を継続することを含む、実施形態５４の方法。
【０２３９】
実施形態５７。赤血球形成バイオマーカーは、未熟な有核赤血球のレベル、網赤血球成熟指数または細胞性核酸の含有量である、実施形態５５の方法。
【０２４０】
実施形態５８。赤血球形成バイオマーカーはヘマトクリットである、実施形態５６の方法。
【０２４１】
実施形態５９。未熟な有核赤血球のレベルが未熟な有核赤血球のレベルが上昇する前に最初に低下する場合、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を投与せずに治療剤によるさらなる処置が継続される、実施形態５７の方法。
【０２４２】
実施形態６０。メトトレキセートは、単一サイクルで投与され、未熟な有核赤血球のレベルが、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１、約２、約３、約４、約５、約６または約７日前までに低下する、実施形態５９の方法。
【０２４３】
実施形態６１。メトトレキセートは２サイクルまたはそれより多くのサイクルで投与され、未熟な有核赤血球のレベルは、未熟な有核赤血球のレベルが上昇する約１日から約１４日前までに低下する、実施形態５９の方法。
【０２４４】
実施形態６２。赤血球形成バイオマーカーを検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子の発現を検出することであり、ここで、赤血球形成に関連する遺伝子は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝の１つまたはそれ以上に関連する遺伝子である、実施形態５５または５６の方法。
【０２４５】
実施形態６３。赤血球形成に関連する遺伝子は、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、Ｌｙ７６（Ｔｅｒ−１１９のための抗原）、ＣＤ４４、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＡＳ２またはＧＡＴＡ−１をコードする遺伝子である、実施形態６２の方法。
【０２４６】
実施形態６４。トランスフェリン受容体はトランスフェリン受容体１（ＣＤ７１）である、実施形態６３の方法。
【０２４７】
実施形態６５。赤血球形成に関連する遺伝子を検出することは、赤血球形成に関連する遺伝子のＲＮＡ転写物を検出すること、または赤血球形成に関連する遺伝子のタンパク質生成物を検出することを含む、実施形態６２〜６４のいずれか１つの方法。
【０２４８】
実施形態６６。タンパク質生成物はヘモグロビンである、実施形態６５の方法。
【０２４９】
実施形態６７。赤血球形成バイオマーカーは赤血球形成に関連する補因子である、実施形態５５の方法。
【０２５０】
実施形態６８。赤血球形成に関連する補因子は、ポルフィリン、ポルフィリン含有化合物またはテトラピロールである、実施形態６７の方法。
【０２５１】
実施形態６９。試料は血液試料である、実施形態５３〜６８のいずれか１つの方法。
【０２５２】
実施形態７０。血液試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む血液画分である、実施形態６９の方法。
【０２５３】
実施形態７１。対象はヒトである、実施形態５３〜７０のいずれか１つの方法。
【０２５４】
実施形態７２。ポンペ病は小児発症ポンペ病である、実施形態５３〜７１のいずれか１つの方法。
【０２５５】
実施形態７３。ポンペ病は古典的な小児発症ポンペ病である、実施形態７２の方法。
【０２５６】
実施形態７４。対象はＣＲＩＭ陰性である、実施形態７２または７３の方法。
【０２５７】
実施形態７５。対照は既存対照またはプラセボ対照である、実施形態５３〜７４のいずれか１つの方法。
【０２５８】
実施形態７６。メトトレキセートの有効量は、単一サイクルまたは３サイクルで投与される、実施形態５３〜７５のいずれか１つの方法。
【０２５９】
実施形態７７。メトトレキセートの有効量は、単一サイクルで投与される、実施形態７６の方法。
【０２６０】
実施形態７８。メトトレキセートのサイクルは、１日のメトトレキセート投与または２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１日連続のメトトレキセート投与からなる、実施形態７６または７７の方法。
【０２６１】
実施形態７９。メトトレキセートの有効量は、治療剤の投与の前、間および後の１つまたはそれ以上から選択される時間に対象に投与される、実施形態５３〜７８のいずれか１つの方法。
【０２６２】
実施形態８０。メトトレキセートの有効量は、治療剤療法の投与の４８時間前から４８時間後の間に投与される、実施形態７９の方法。
【０２６３】
実施形態８１。メトトレキセートは治療剤の投与と同時に、ならびに治療剤の投与の約２４時間後および約４８時間後に投与される、実施形態８０の方法。
【０２６４】
実施形態８２。メトトレキセートの有効量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである、実施形態５３〜８１のいずれか１つの方法。
【０２６５】
実施形態８３。試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、メトトレキセートの最終投与の少なくとも約１日後から約３０日後である、実施形態５３〜８２のいずれか１つの方法。
【０２６６】
実施形態８４。試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出することは、メトトレキセートの最終投与の約７日後から約１４日後である、実施形態５３〜８３のいずれか１つの方法。
【０２６７】
実施形態８５。試料はメトトレキセートの最終投与後の複数の日に得られる、実施形態５３〜８４のいずれか１つの方法。
【０２６８】
実施形態８６。試料は、メトトレキセートの最終投与から１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１４日目、２１日目または２８日目のうちの１日またはそれ以上の日に得られる、実施形態８５の方法。
【０２６９】
実施形態８７。工程（ｄ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞または形質細胞を枯渇させる薬剤を投与することをさらに含む、実施形態５３〜８６のいずれか１つの方法。
【０２７０】
実施形態８８。形質細胞を枯渇させる薬剤はボルテゾミブである、実施形態８７の方法。
【０２７１】
実施形態８９。工程（ｄ）は、（ａ）リツキシマブ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、シクロホスファミド、ボルテゾミブ、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノレートおよびコルチコステロイドの１つまたはそれ以上の有効量を投与すること；ならびに（ｂ）抗原特異的寛容性戦略を投与することの１つまたはそれ以上を含む、実施形態５３〜８８のいずれか１つの方法。
【０２７２】
実施形態９０。抗原特異的寛容性戦略は、治療剤のより高頻度の投薬または治療剤のより高い用量を投与することまたはその両方を含む、実施形態８９の方法。
【０２７３】
実施形態９１。治療剤のより高い用量は、ＩＶＩＧと同時投与される、実施形態９０の方法。
【０２７４】
実施形態９２。抗ヒト酸性α−グルコシダーゼ抗体、ＣＤ１９レベルまたは疾患進行の１つまたはそれ以上をモニタリングすることをさらに含む、実施形態５３〜９１のいずれか１つの方法。
【０２７５】
実施形態９３。ポンペ病を有する対象における免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）少なくとも１サイクルのメトトレキセート処置および治療剤の少なくとも１用量を以前に投与されている対象から試料を得る工程；および（ｂ）試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルは、免疫寛容性の誘導を示す、工程を含む方法。
【０２７６】
実施形態９４。工程（ｂ）は試料を赤血球形成バイオマーカーに結合する薬剤と接触させることを含む、実施形態９３の方法。
【０２７７】
実施形態９５。治療剤を必要とする対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与する工程；および（ｃ）対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程であって、対照のレベルに対する試料中の赤血球形成バイオマーカーのレベルは、対象における治療剤への免疫寛容性の誘導を示す、工程を含む方法。
【０２７８】
実施形態９６。治療剤を必要とする対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを調査する方法であって、（ａ）対象にメトトレキセートの有効量を投与する工程；（ｂ）対象に治療剤の有効量を投与する工程；（ｃ）メトトレキセートの投与の少なくとも１日後から約３０日後に対象から得た試料中の赤血球形成バイオマーカーを検出する工程；および（ｄ）工程（ｃ）において検出されるバイオマーカーのレベルに基づいて対象における治療剤への免疫寛容性のレベルを同定する工程を含む方法。
【０２７９】
実施形態９７。赤血球形成バイオマーカーのレベルの変化は赤血球形成の誘導と関連する、実施形態９３〜９６のいずれか１つの方法。
【０２８０】
実施形態９８。赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに概ね等しいかまたはそれより低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない、実施形態９７の方法。
【０２８１】
実施形態９９。赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに対して概ね上昇している場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法または免疫抑制療法を、治療剤によるさらなる処置と同時に必要とするか；または赤血球形成バイオマーカーのレベルが対照のそれに等しいかまたは低い場合、対象は、追加の免疫寛容性誘導療法も免疫抑制療法も必要としない、実施形態９７の方法。
【０２８２】
この明細書で開示される機能の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。この明細書で開示される各機能は、同じか、同等であるかまたは類似の目的の役目をする代替の機能と置き換えることができる。したがって、明示的に特記されない限り、開示される各機能は、一般的な一連の同等または類似の機能の例にすぎない。
【０２８３】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例で例示される。明細書中の全ての参考文献の開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０２８４】
下の実施例は本発明の単なる例示が目的であり、したがって、本発明を限定するものと決して考えるべきでない。以下の実施例および詳細な記載は、例示として提供され、限定するものではない。
【実施例１】
【０２８５】
一時的な低用量メトトレキセート免疫寛容性誘導レジメンで処置したマウスの脾臓および血液における転写およびタンパク質レベルの応答
序論
一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンによる免疫寛容性誘導の作用機構を理解するために、低用量メトトレキセートの有る無しのｒｈＧＡＡで処置したマウスおよび対照群のマウスの脾臓および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調べるために、次世代シークエンシングおよびタンパク質質量分析研究を実行した。試験計画の概略図を、図１Ｃに示す。
【０２８６】
材料および方法
マウス、ｒｈＧＡＡおよびメトトレキセートの低用量誘導レジメン
８から１２週齢の間のＣ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）またはＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）雌マウスを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅの下でＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って収容し、維持した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、全ての動物手順を承認した。マウスを、前述の通り、メトトレキセートの単一サイクルの低用量誘導レジメンにより、ｒｈＧＡＡ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｓａｎｏｆｉ社）注射と同時に処置した（Ｊｏｌｙら、２０１４）。簡潔には、年齢が一致し、性が一致したマウスに、ｒｈＧＡＡ、２０ｍｇ／ｋｇ、の尾静脈静脈内注射から１５分以内に、メトトレキセートの単一サイクル（０、２４および４８時間時に３日連続投与）の低用量誘導レジメン、５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射により与えた。３０ｍｇ／ｋｇジフェンヒドラミン（Ｗｅｓｔ−ｗａｒｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の予防的腹腔内投与の１５分後に、ｒｈＧＡＡの以降の週単位の投与（最高１６週）を与えた。ｒｈＧＡＡのためのビヒクル対照または製剤緩衝液（ＦＢ）を、再構成したｒｈＧＡＡと同様に投与した。麻酔をかけたマウスからの眼窩後ブリードによるかまたは終末ブリードによって、ウェットアイスの上のＥＤＴＡ抗凝固剤Ｃａｐｉｊｅｃｔマイクロ収集管（Ｔｅｒｕｍｏ）の中に血液を収集した。ＲＢＣ溶解の有る無しで、脾臓をガラススライドの間の単一細胞懸濁液に調製した。ウェットアイスの上で、単一の大腿骨から骨髄を収集した。
【０２８７】
転写分析
年齢が一致し、性が一致したマウスを、上記の通りメトトレキセートの単一サイクルの低用量誘導レジメンの有る無しの注射の１５分前に、ｒｈＧＡＡまたは製剤緩衝液（ＦＢ）で処置した。動物は、ｒｈＧＡＡ開始の７日目に屠殺した。血液は、上記の通り終末の眼窩後ブリードによって収集した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離のために、ＰＢＳによって２部に１部で希釈した全血をＦｉｃｏｌｌの上に重ねた。脾臓をガラススライドの間の単一細胞懸濁液に調製した。ＲＢＣ溶解（ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ）のために、試料を処理した。ＴＲＩＺＯＬ（商標）（フェノール、グアニジンイソチオシアネート溶液、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中で試料を瞬間冷凍し、次世代シークエンシング分析のためにＢＧＩ（ワールドワイドウェブｂｇｉ．ｃｏｍ／ｕｓ／）にかけるまで−８０℃で保存した。ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ値）は、ＲＮＡ  ６０００ナノキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）またはＲＮＡ  ６０００ピコキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーで評価した。ＲＮＡ増幅は、ＳＭＡＲＴＥＲ（商標）ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）で実行した。シークエンシング断片の検出は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングキットを備えたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００で実行した。ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットはアダプターおよび低品質読み出しを除去するためにフィルター処理し、２の変化倍率およびｐ値≦０．０５で差別的発現のために調査した。差別的に発現された遺伝子は、ＮｅｘｔＢｉｏ生物学データマイニングソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって注釈し、調べた。
【０２８８】
タンパク質質量分析
年齢が一致し、性が一致したマウスを、ｒｈＧＡＡまたはＦＢ注射と同時のメトトレキセートの単一サイクルの低用量誘導レジメンの有る無しで処置し、上記の通り、動物は、ｒｈＧＡＡ開始の７日後に屠殺した。血液は、上記の通り終末の眼窩後ブリードによって収集し、その後、遠心分離による血漿およびＰＢＭＣの分離が続いた。上記の通り、脾臓を単一細胞懸濁液に調製した。脾臓および血液試料を瞬間冷凍し、ＬＣ／ＭＳタンパク質質量分析によって処理するためにＭＳ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ（ワールドワイドウェブｍｓｂｉｏｗｏｒｋｓ．ｃｏｍ）にかけた。ＭＳ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓで、複数の親和性除去遠心回転カートリッジマウス３（ＭＡＲＳ３）を使用して、血漿からアルブミン、ＩｇＧおよびトランスフェリンを枯渇させた。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する改変ＲＩＰＡ緩衝液の中で細胞を溶解した。試料ペプチド消化物ごとに、ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に連結されているＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ）タンデム質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で、単一のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実行した。ピークの検出のために、データをＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって分析した。１０ｐｐｍ前駆体および０．０５Ｄａ生成物（Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ）のカットオフにより、Ｍａｓｃｏｔデータベース（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅバージョン２．４）を通してタンパク質の同定および特徴付けを実行した。Ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅソフトウェアバージョン４．０）を通して、偽陰性および陽性をフィルター処理した。タンパク質定量化は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓを通して実行した。各実験群のために、変化倍率およびｐ値を平均の正規化タンパク質存在度データから計算した。差別的に発現されるタンパク質は、２の変化倍率およびｐ値≦０．０５によって規定した。ＧＯプロセスおよびＭｅｔａＣｏｒｅ（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｒｅｕｔｅｒｓ）における他の生物学的カテゴリーにおける富化スコアについて、データを分析した。
【０２８９】
結果
低用量メトトレキセート誘導レジメンは、赤血球形成における転写サインを上方制御する。
上記の通り、低用量メトトレキセートの有る無しで、マウスをｒｈＧＡＡで処置した。メトトレキセートの存在下または不在下でマウスにビヒクル対照（製剤緩衝液、ＦＢ）を投与した実験対照群が、含まれた。ｒｈＧＡＡ開始の７日後、脾臓および血液を収集し、脾細胞およびＰＢＭＣにそれぞれ加工した。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって、処置群間の差をこれらの組織調製物において調べた。ＲＮＡシークエンシングデータは、低用量メトトレキセートと併用してｒｈＧＡＡで処置したマウスの脾臓（図１Ａ）およびＰＢＭＣ（図１Ｂ）における赤血球形成の転写サインの上方制御を示した。図１Ａおよび１Ｂは、全データセットからの、赤血球形成と関連している差別的に発現された遺伝子の代表的サブセットを示す。ｒｈＧＡＡおよび低用量メトトレキセートで処置したマウスの脾臓およびＰＢＭＣにおける赤血球形成関連遺伝子の発現サインの上方制御は、他の群と、さらにメトトレキセート単独で処置したマウスとも、顕著に異なっている。
【０２９０】
転写モジュール分析は、ｒｈＧＡＡ単独で処置したマウスと比較したときの、ｒｈＧＡＡおよび低用量メトトレキセートで処置したマウスの脾臓における、影響を受けた細胞周期経路を示した。細胞周期の変化の他に、転写モジュール分析は、造血、鉄イオンホメオスタシス、赤血球分化の調節およびヘム代謝を含む赤血球増殖関連経路における富化を示した（下の表１）。対照的に、血液試料は細胞性ストレス応答の徴候（データは示さず）を示したが、ヘム代謝における富化も示した（表１）。全体として、脾臓および血液の転写分析は、ｒｈＧＡＡ開始の７日後にｒｈＧＡＡおよびメトトレキセートで処置した群における、赤血球形成関連経路における上方制御を示した。
【０２９１】
低用量メトトレキセート誘導レジメンは、赤血球形成におけるタンパク質サインを上方制御する。
低用量メトトレキセート処置がモジュレートすることができるタンパク質レベルの経路を同定するために、プロテオーム分析も実行した。試験計画は上記の転写研究に類似していたが、タンパク質質量分析によって調べた。プロテオームデータセットは、造血および鉄イオンホメオスタシス関連経路における富化を示した（表１）。関連タンパク質には、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１、別名ＣＤ７１、未熟の有核ＲＢＣのマーカーで高度に発現される［Ｄｏｎｇら、２０１１］）およびそのリガンドトランスフェリンが含まれる（図２）（ＴｆＲ１は転写データセットにおける上方制御も示した）。トランスフェリン受容体１は、トランスフェリンから細胞への鉄移入のために必要である。これらのタンパク質は、赤血球系細胞の発達におけるヘム生合成での必須の役割である、鉄取り込みを媒介する。これらのタンパク質の上方制御は、活性ヘモグロビン生合成が発達中のＲＢＣにおいて起こっているかもしれないことを示唆する。赤血球の産生および機能に関与する遺伝子およびタンパク質の富化は、ｒｈＧＡＡ単独を与えた群と比較して、ｒｈＧＡＡおよび低用量メトトレキセートで処置した群の間の脾臓における差別的発現を測定した実験データセットの各々にわたって一般的に観察された。したがって、脾臓のプロテオーム分析は、ｒｈＧＡＡ開始の７日後にｒｈＧＡＡおよびメトトレキセートで処置した群における、赤血球形成関連経路における上方制御を示した。
【０２９２】
【表１】
2021506929.tif 000002
【実施例２】
【０２９３】
一時的な低用量メトトレキセート免疫寛容誘導レジメンで処置したマウスの脾臓、血液および骨髄における赤血球系細胞への効果
序論
脾臓、血液および骨髄における一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンによる免疫寛容性誘導の効果を評価し、理解するために、一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンの有る無しのｒｈＧＡＡで処置したマウスおよび対照群のマウスの脾臓、血液および骨髄試料を調べるために、フローサイトメトリー研究を実行した。さらに、一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンの有る無しのｒｈＧＡＡで処置したマウスおよび対照群のマウスの脾臓試料における赤血球形成をさらに調査するために、免疫組織化学および組織質量分析画像化研究を実行した。
【０２９４】
材料および方法
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために使用される抗マウス抗体には、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ抗体ＰＥ−Ｔｅｒ−１１９（カタログ１１６２０８）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＣＤ７１（カタログ１１３８１６）、ＰＥ−Ｃｙ７−ＩｇＭ（カタログ４０６５１６）、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（ＰＢ）−ＣＤ８６（カタログ１０５０２２）およびアロフィコシアニン−ＣＤ４５（カタログ１０３１１６）が含まれる。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗体には、ＦＩＴＣ−ＣＤ４４（カタログ５５３１３３）、アロフィコシアニン−ＣＤ５（カタログ５５００３５）、アロフィコシアニン−ＣＤ１９またはアロフィコシアニン−Ｃｙ７−ＣＤ１９（カタログ５５７６５５および５５０９９２）、ＦＩＴＣ−ＣＤ１ｄ（カタログ５５３８４５）、ＦＩＴＣ−ＣＤ２３（カタログ５５３１３８）およびアロフィコシアニン−Ｃｙ７−ＣＤ３ε（カタログ５５７５９６）が含まれる。生／死の識別は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキットで染色することによって判定した。試料をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流し、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアで取得した。サイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）で分析した。細胞集団の絶対数は、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から計算した。調査した細胞型には、全ＲＢＣ（Ｔｅｒ−１１９＋）、未熟な有核ＲＢＣ（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ７１＋）、成熟ＲＢＣ（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ７１−）、前赤芽球（Ｔｅｒ−１１９ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ）、塩基親和性赤芽球（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ４４ｈｉｇｈ  ＦＳＣｈｉｇｈ）、多染性赤芽球（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ４４ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＦＳＣｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）、正染性赤芽球および網赤血球（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ４４ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＦＳＣｌｏｗ）、成熟赤血球（Ｔｅｒ−１１９＋、ＣＤ４４ｌｏｗ  ＦＳＣｌｏｗ）、全活性化Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋）、活性化濾胞性Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、ＩｇＭｌｏｗ／ｈｉｇｈＣＤ２３＋、ＣＤ８６＋）、活性化周辺帯Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、ＩｇＭｈｉｇｈ  ＣＤ２３−、ＣＤ８６＋）およびＢ１０調節Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ１ｄｈｉｇｈ  ＣＤ５＋）が含まれる（Ａｌｌｍａｎら、２００４；Ｃｈｅｎら、２００９；Ｋｏｕｌｎｉｓら、２０１１；Ｊｏｌｙら、２０１４）。
【０２９５】
血液学
上記の通り眼窩後ブリードによって試料をＥＤＴＡ抗凝固Ｃａｐｉｊｅｃｔマイクロ収集チューブに収集し、７２時間以内、２〜８℃で保存した。ＣＢＣ、ＷＢＣ画分分析および網赤血球算定を、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＴ２０００ｉＶ（Ｓｙｓｍｅｘ）で実行した。
【０２９６】
組織像、免疫組織化学（ＩＨＣ）
免疫蛍光法または組織像のために、脾臓試料をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、３０％スクロースで浸潤させ、最適切断温度（ＯＣＴ）培地に包埋し、急速冷凍した。あるいは、組織像のために試料をパラフィンで処理した。前に記載の通りヘマトキシリンおよびエオシン染色を実行し、光学顕微鏡検査によって調べた（Ｂｕｒｒｏｗ、Ｓｕｎら  ２０１５）。免疫蛍光法のために、試料をＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのラット抗マウスＴｅｒ−１１９（カタログ１１６２０２）またはＣＤ７１（カタログ１１３８０２）モノクローナル抗体とインキュベートし、ビオチン化ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体で検出した。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色システム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）の上のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅで、Ｔｅｒ−１１９またはＣＤ７１抗体によって染色した切片の免疫蛍光分析を実行した。検出のために、Ｖｅｎｔａｎａ  ＩＨＣ  ＤＡＢ  ＭａｐＫｉｔを使用した。Ｍｉｒａｘスキャナ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）の２０×対物レンズを使用して、免疫蛍光スライドをスキャンした。組織切片をヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡検査によって分析した。代表的な１００×デジタル像を、ＨＡＬＯ画像分析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ）を使用したＴｅｒ−１１９またはＣＤ７１陽性領域数量化または定量的組織形態計測に付した。
【０２９７】
組織質量分析画像化（ｔＭＳＩ）
ｔＭＳＩのための新鮮な脾臓試料を１０％ゼラチン（Ａｌｆａ  ＡｅｓａｒカタログＪ６２６９９）に収集し、一括で冷凍し、１０μＭ切片に切り分け、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラススライドの上に置いた。ｔＭＳＩのために、ＩＴＯガラススライドをマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）マトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）でコーティングした。質量分析画像化は、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ４８００  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ、Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦおよび７Ｔ  ＳｏｌａｒｉＸ  ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ質量分析計で実行した。画像化データセットを、ＴｉｓｓｕｅＶｉｅｗ、ｆｌｅｘＩｍａｇｉｎｇまたはＭｕｌｔｉｍａｇｉｎｇ  １．１（ＩｍａＢｉｏｔｅｃｈ）で分析した。
【０２９８】
結果
一時的な低用量メトトレキセート処置に応答した活性化Ｂ細胞サブセットの増大
調節Ｂ細胞は、一時的な低用量メトトレキセートによる免疫寛容性の誘導にとって重要であることが以前に実証されている（Ｊｏｌｙら、２０１４）。実施例１に記載される転写研究を含む、本明細書に記載される全ての実験では、免疫寛容性誘導のパターン、特に免疫寛容性誘導に以前に関連付けられた活性化Ｂ細胞サブセットの増大は、フローサイトメトリーによって実証された（図３Ａ〜３Ｄ）。
【０２９９】
一時的な低用量メトトレキセート処置は、赤血球系細胞の短期枯渇につながり、その後、脾臓におけるＴｅｒ−１１９＋ＣＤ７１＋未熟有核ＲＢＣの富化が続く
単一サイクルの低用量メトトレキセートと同時にｒｈＧＡＡで処置したマウスは、重量で有意に拡大した脾臓を示し（図４Ａ〜４Ｂ）、ｒｈＧＡＡ開始の７日後にフローサイトメトリーによって測定したときに有意により大きな脾臓細胞性を有していた（図４Ｃ）。オーミクスデータに示される赤血球形成のサインの上方制御と一緒に観察された脾腫大は、一時的な低用量メトトレキセート誘導処置の間のＲＢＣの細胞性検査を促した。
【０３００】
年齢が一致し、性が一致したマウスを、メトトレキセートの単一サイクルの低用量レジメンの有る無しでｒｈＧＡＡで処置し、動物はフローサイトメトリーによる分析のために逐次屠殺した。全体の生きているＲＢＣを調べるために、赤血球特異的モノクローナル抗体Ｔｅｒ−１１９を使用した（図４Ｄ）。未熟な有核ＲＢＣは、トランスフェリン受容体ＣＤ７１によって成熟ＲＢＣから識別された（ＰａｎおよびＪｏｈｎｓｔｏｎｅ  １９８３）。ｒｈＧＡＡ開始から２日目であるが第２のメトトレキセート投与より前に、全赤血球系細胞（Ｔｅｒ−１１９＋）の有意な低減、および未熟な有核ＲＢＣ（Ｔｅｒ−１１９＋ＣＤ７１＋）のほとんど完全な低減が低用量メトトレキセート処置群の脾臓で観察された（図４Ｅ）。６日目に、群の間で差は観察されなかった。７日目に見られた全赤血球系細胞の大きく有意な富化は、未熟な有核ＲＢＣの同時の有意な増大によっても示された（図４Ｆ）。全赤血球系細胞および未熟な有核ＲＢＣのより小さいが有意な富化が９日目に観察された。単独の一時的な低用量メトトレキセートで処置した群では、赤血球応答は、ｒｈＧＡＡと一緒に一時的な低用量メトトレキセートで処置した群のそれに類似していた（図４Ｇ、４Ｈ）。
【０３０１】
したがって、脾臓では、低用量メトトレキセートの最初の投与の２４時間以内に、未熟な有核ＲＢＣおよび成熟ＲＢＣにおける一時的であるが有意な低減が観察されるかもしれない。これの後に、免疫寛容マウスの脾臓において未熟な有核ＲＢＣが有意に富化する超過応答が続く。未熟な有核ＲＢＣの富化は７日目にピークに達し、このことで、この日に観察された有意に拡大した脾臓を説明することができる。一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンと一緒にｒｈＧＡＡを与えた群と一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメン単独で処置した群を比較したとき、赤血球応答は類似していた。これは、一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンが、観察された赤血球応答に支配的に寄与したことを示唆する。
【０３０２】
赤血球応答は低用量メトトレキセート誘導レジメン後に血液中で遅延した
血液コンパートメントの検査は、単一サイクル低用量メトトレキセート処置群において２日目に全体（図５Ａ）および未熟な有核ＲＢＣ（図５Ｂ）の有意な枯渇も示した。４日目までには、単一サイクル低用量メトトレキセート処置群の血液には、未熟な有核ＲＢＣはほとんど無かった。７日目までには、全ＲＢＣは血液中で有意に低減したが、未熟な有核ＲＢＣは有意に富化した。全体のおよび未熟な有核ＲＢＣが血液中で有意に富化したのは、９日目であった。１４日目までには、単一サイクル低用量メトトレキセート処置群の血液で未熟な有核ＲＢＣの小さいが有意な富化が見られ、それは２８日目までに無くなった。
【０３０３】
一時的な低用量メトトレキセート単独の効果も、血液において調べた。全ＲＢＣを調べたとき、メトトレキセート単独処置群とビヒクル対照処置群の間で観察された差はなかった（図５Ｃ〜５Ｅ）。しかし、単一サイクルの低用量メトトレキセート単独で処置したマウスにおける未熟な有核ＲＢＣの応答は、バイオ医薬品ｒｈＧＡＡと一緒に単一サイクル低用量メトトレキセートで処置したマウスにおける応答と類似していた（図５Ｆ〜５Ｈ）。
【０３０４】
我々の知見を確認するために、ｒｈＧＡＡ開始の７日後のマウスからの血液を、完全血球算定（ＣＢＣ）および網赤血球算定のためにＳｙｓｍｅｘ  ＸＴ２０００ｉＶで調べた。一時的な低用量メトトレキセートで処置した群において、全ＲＢＣ数は有意に低減した（図６Ａ）。一時的な低用量メトトレキセートで処置した群において、ヘモグロビン含量（図６Ｂ）およびヘマトクリット（図６Ｃ）も有意に低減した。成熟網赤血球の頻度および数において観察された差はなかった（図６Ｄ〜６Ｅ）。しかし、一時的な低用量メトトレキセートで処置した群において、網赤血球成熟指数（ＩＲＦ）の頻度は有意に富化した（図６Ｆ）。
【０３０５】
したがって、赤血球応答は、遅延しているが血液中で類似している。ｒｈＧＡＡ開始から７日目の血液の血液学分析は、網赤血球成熟指数の頻度増加と共に低減した全ＲＢＣ数、ヘマトクリットおよびヘモグロビンを示した。このパターンは、赤血球減少の後の、再生赤血球応答と一貫している。
【０３０６】
低用量メトトレキセート誘導レジメンの後、赤血球系細胞は減少するが、骨髄においてホメオスタシスレベルに戻る
骨髄における単一サイクル低用量メトトレキセートへの赤血球系細胞応答は、ｒｈＧＡＡを単独で与えられたマウスと比較したとき、４日目に全ＲＢＣの差を示さなかった（図７Ａ）。しかし、免疫寛容群では、４日目に未熟な有核ＲＢＣは有意に低減した（図７Ｂ）。５日目、全体のおよび未熟な有核ＲＢＣは免疫寛容群で有意に低減した。７日目および９日目までに、全体のおよび未熟な有核ＲＢＣは、免疫寛容マウスとｒｈＧＡＡを単独で投与されたマウスの間で差を示さなかった。したがって、骨髄では、ＲＢＣの早期の有意な低減も観察されるが、赤血球レベルは７日目までにホメオスタシスレベルに戻る。
【０３０７】
一時的な低用量メトトレキセートは脾臓において赤血球形成を誘導する
図８Ａに示すように、一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンの間、前赤芽球から成熟赤血球まで赤血球形成の異なる段階を調べるために、接着分子ＣＤ４４の差別的発現を利用した。ｒｈＧＡＡ開始の２日後、前赤芽球、塩基親和性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球および網赤血球を含む全ての段階の初期赤血球系細胞は、単一サイクル低用量メトトレキセート群の脾臓において有意に減少している（図８Ｂ）。２日目、成熟ＲＢＣも免疫寛容群で有意に低減している。ｒｈＧＡＡ開始の７日後、単一サイクル低用量メトトレキセート群において、前赤芽球、好塩基性、多染性および正染性赤芽球ならびに網赤血球の有意な富化を観察することができる（図８Ｃ）。７日目、脾臓における成熟ＲＢＣに差はない。脾臓におけるｒｈＧＡＡ開始の７日後の未熟な有核ＲＢＣの富化は、レシピエントのナイーブマウスにおいて免疫寛容性を付与することが可能な複数のＢ細胞集団、すなわち、Ｂ１０調節Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞ならびにＦｏｘｐ３、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０を発現するＢ細胞の富化と一致する（Ｊｏｌｙら、２０１４）。
【０３０８】
血液では、単一サイクル低用量メトトレキセート群において、ｒｈＧＡＡ開始の２日後に、塩基親和性赤芽球、正染性赤芽球、網赤血球および成熟赤血球における小さいが有意な低減を観察することができる（図８Ｄ）。しかし、ｒｈＧＡＡ開始の７日後の血液に、未熟な有核ＲＢＣの変化は観察されない（図８Ｅ）。７日目、免疫寛容マウスの血液において成熟ＲＢＣの有意な低減を観察することができる。
【０３０９】
一時的な低用量メトトレキセート群において、ｒｈＧＡＡ開始の４日後、骨髄は、前赤芽球、塩基親和性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球および網赤血球を含む全ての段階の初期赤血球系細胞の有意な減少を示すが、成熟ＲＢＣの統計的に有意な差は示さない（図８Ｆ）。免疫寛容群において、５日目に初期のおよび成熟したＲＢＣを含む全ての赤血球系細胞段階における枯渇を観察できるかもしれない（図８Ｇ）。７日目までに、免疫寛容群において、前赤芽球および多染性赤芽球の小さいが有意な富化を観察することができる（図８Ｈ）。しかし、成熟ＲＢＣは免疫寛容群で有意に低減している。９日目、免疫寛容群において、前赤芽球および多染性赤芽球の小さいが有意な富化を観察することができるが、群間で、骨髄における成熟ＲＢＣに差はない（図８Ｉ）。
【０３１０】
免疫寛容マウスの脾髄の赤色髄において有核細胞の頻度は増加する
一時的な低用量メトトレキセートを与えたマウスにおける拡大した脾臓は、脾臓形態における可能な変化を示唆した。これを評価するために、マウスに一時的な低用量メトトレキセート（例えば、ＩＴＩレジメン）の有る無しでｒｈＧＡＡを与え、ｒｈＧＡＡ開始の７日後に脾臓を収集した。脾臓の顕微鏡評価は、ｒｈＧＡＡを単独で与えたマウスと比較したとき、一時的な低用量メトトレキセートを与えたマウスにおける、白色髄領域に対して有意に増加した赤色髄領域を明らかにした（図９Ａ〜９Ｂ）。ＦＢを単独で与えたマウスと比較したとき、一時的な低用量メトトレキセートをＦＢと一緒に与えたマウスは、白色髄領域に対して有意に増加した赤色髄領域を同様に示した。フローサイトメトリーを使用した細胞性研究が示唆するように、有核細胞は造血前駆体である可能性がある。
【０３１１】
免疫寛容マウスの脾臓において、成熟ＲＢＣに関連するタンパク質の出現は低減している
脾臓におけるタンパク質の空間分布は、組織質量分析画像化によって調べた。上記の通り、メトトレキセートの存在下および不在下で、マウスをｒｈＧＡＡで処置した。メトトレキセートの有る無しでＦＢ緩衝液で処置したマウスの実験対照群が含まれた。ｒｈＧＡＡ開始の７日後に脾臓を収集し、一括で冷凍した。１０μＭの脾臓切片の検査は、タンパク質赤血球アンキリンおよびグリコホリンＣが、ｒｈＧＡＡ単独でまたはＦＢと処置した群において脾臓全体に均一に分布していることを示す（図１０）。ｒｈＧＡＡまたはＦＢを一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンと一緒に与えた群では、赤血球アンキリンおよびグリコホリンＣシグナルは減少した。赤血球アンキリンおよびグリコホリンＣは、成熟ＲＢＣにおいて高度に発現される赤血球特異的タンパク質である（Ｃｈｅｎら、２００９）。これらのタンパク質の低減は、成熟ＲＢＣの一時的な減少、および続く一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンによる脾臓における新しいＲＢＣの生成と一貫している。
【実施例３】
【０３１２】
免疫寛容マウスからナイーブマウスへの赤血球系細胞輸血
序論
未熟な有核ＲＢＣおよび成熟ＲＢＣを含む免疫寛容マウスからの全赤血球が、免疫寛容性を付与するかどうか判定するために、一時的な低用量メトトレキセートの有る無しでｒｈＧＡＡで処置したマウスから赤血球をナイーブマウスに輸血するために、赤血球輸血研究を実行した。赤血球輸血を受けたナイーブマウスの血清中の抗ｒｈＧＡＡ抗体価を測定することによって、免疫寛容性を調査した。
【０３１３】
材料および方法
血清中の抗ｒｈＧＡＡ抗体価
マウス血清からの抗ｒｈＧＡＡ抗体価の定量化は、前述の通りＥＬＩＳＡによって測定した（Ｊｏｌｙ、Ｍａｒｔｉｎら  ２０１４）。簡潔には、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ２９４４２−３２２）を一晩コーティングし（酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中の５ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＧＡＡ）、ブロッキング試薬（ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ）で処理し、マウス血清の段階希釈と２反復でインキュベートした（３７℃で１時間）。洗浄の後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓカタログ１０３０−０５）で試料を処理し、洗浄し、室温で１５分の間、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質（ＢｉｏＦＸ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログＴＭＢＷ−１０００−０１）の添加によって発色させた。１Ｎ  ＨＣｌの添加によって反応を中止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により４５０／６５０ｎｍで吸光度を直ちに測定した。試料希釈の逆数から終点力価を導き、０．２の吸光度値をもたらした。
【０３１４】
赤血球系細胞輸血
年齢が一致し、性が一致したドナーマウスからの赤血球系細胞の採収は、上記の通り単一サイクルの一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンの有る無しのｒｈＧＡＡ処置から７日目（脾臓からの赤血球系細胞の単離）および９日目（血液からの赤血球系細胞の単離）に実行した。血液および脾臓を無菌的に収集し、上記の通りに処理した。血液を無菌のＥＤＴＡ  Ｍｏｎｏｊｅｃｔ血液収集チューブ（Ｃｏｖｉｄｉｅｎカタログ８８８１３１１１４９）の中に収集した。プールした血液は、白血球除去のためのＬｅｕｋｏｓｏｒｂ媒体（ＰａｌｌカタログＡＰ−４８５１）を備えたマウス適合Ａｃｒｏｄｉｓｋ  ＰＳＦ  ２５ｍｍ  ＷＢＣフィルターに通した。プールした脾臓試料からの赤血球系細胞は、製造業者の説明書により、正の選択によってマウス抗Ｔｅｒ−１１９ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃカタログ１３０−０４９−９０１）で単離した。血液（≧９９．９％、フローサイトメトリーによって検証された）および脾臓（≧９３．３％、フローサイトメトリーによって検証された）からの精製された赤血球系細胞を、無菌のＰＢＳで洗浄した。精製された赤血球系細胞は、ｉ．ｖ．尾静脈投与によってレシピエントマウスに注射した。マウスは、上記の通りジフェンヒドラミンの予防的投与の後、ｒｈＧＡＡの週単位の投与を受けた。上記の通りＥＤＴＡ抗凝固Ｃａｐｉｊｅｃｔマイクロ収集チューブへの眼窩後ブリードによって、隔週の血液収集を実行した。ＥＬＩＳＡによる抗ｒｈＧＡＡ抗体価の評価のために、血清を収集した。
【０３１５】
結果
メトトレキセートによるｒｈＧＡＡへの免疫寛容マウスから単離された脾臓の未熟な有核ＲＢＣは、ナイーブマウスに免疫寛容性を付与する
未熟な有核ＲＢＣおよび成熟ＲＢＣを含む全赤血球系細胞が免疫寛容性を付与することができるかどうか判定するために、一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンの有る無しのｒｈＧＡＡで処置したマウスからの全赤血球系細胞の輸血をナイーブマウスで実行した。ｒｈＧＡＡ開始の７日後のドナーマウスの脾臓からの７５，０００，０００個の赤血球系細胞（≧９３．３％）、またはｒｈＧＡＡ開始の９日後の血液から精製された２００，０００，０００個のドナー赤血球（≧９９．９％）を、ナイーブなレシピエントマウスに送達した。輸血後およびその後毎週、レシピエントマウスにｉ．ｖ．  ｒｈＧＡＡを投与した。ＥＬＩＳＡによる抗ｒｈＧＡＡ  ＩｇＧ抗体価の評価のために、第２０週まで隔週で血清を収集した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。投与対照（図１１Ｃ）では、ｒｈＧＡＡ単独で処置した群と比較したとき、一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンと一緒にｒｈＧＡＡで処置した群（ｒｈＧＡＡ＋ＭＴＸ）において、第１４、１６、１８および２０週の力価ならびに曲線下面積（ＡＵＣ；ＡＵＣにおける３８％の低減）は有意に低減した。一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンと組み合わせてｒｈＧＡＡで処置したドナーマウスからの血液（免疫寛容血液、ＡＵＣにおける３８％の低減）（図１１Ａ）または脾臓（免疫寛容脾臓、ＡＵＣにおける３６％の低減）（図１１Ｂ）からの全赤血球を受けたマウスで、第１４、１６、１８および２０週の低減した力価および低減したＡＵＣの傾向が観察された。各群から外れ値（最も高いｒｈＧＡＡ力価値）を除き、それぞれの群の間のＡＵＣの差を比較することによって、統計的有意性を調査した。
【０３１６】
一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンと組み合わせたｒｈＧＡＡで処置したマウスからの全赤血球系細胞が免疫寛容性を付与することができるかどうか判定するために、ナイーブなレシピエントマウスへの輸血研究を実行した。既存データは、ｒｈＧＡＡ単独で処置した群と比較したとき、一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンと一緒にｒｈＧＡＡで処置した群が、有意に低減したｒｈＧＡＡ力価およびＡＵＣを有することを示している。しかし、おそらく高い外れ値のために、投与対照群の群の間で差は観察されなかった（データは示さず）。外れ値を除いたとき、群の間で有意差が観察された。バイアスを回避するために、高い外れ値は各群から除いた。輸血研究は、一時的な低用量メトトレキセートＩＴＩレジメンと組み合わせたｒｈＧＡＡで処置したドナーマウスからの単離された全赤血球系細胞は、血液から単離されたものであれ脾臓から単離されたものであれ、ナイーブなレシピエントマウスへの付与された免疫寛容性の傾向を示すようであることを示唆する。輸血研究は、１回実行した。
【０３１７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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