(57)【要約】  抗体ベースのＧｎＲＨ受容体アンタゴニストと、それを作製および使用する方法とが開示される。抗体ベースのＧｎＲＨ受容体アンタゴニストは、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体（ＧＨＲ−１０６）またはその抗原結合断片である。ＧＨＲ−１０６またはそのＩｇＧ断片は、デカペプチドＧｎＲＨアンタゴニストを現在使用している男性または女性の対象における癌の治療およびある範囲の性ホルモン関連疾患または症状の治療における治療用途に利用できる。
2021512957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌または性ホルモン関連症状または疾患の治療におけるＧｎＲＨアンタゴニストとしてのＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２】
ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の、抗体ベースのＧｎＲＨアンタゴニストとしての使用であって、前記ＧＨＲ−１０６抗体が既知のデカペプチドＧｎＲＨアンタゴニストと同様に作用して癌または性ホルモン関連症状または疾患を治療する、使用。
【請求項３】
前記既知のデカペプチドＧｎＲＨアンタゴニストは、アンタイドまたはセトロレリックスを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がエフェクター機能を持つ、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３サブタイプを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が癌治療のために使用される、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、あるタイプの癌を治療するために使用され、前記タイプの癌は、当該タイプの癌細胞におけるＧｎＲＨ受容体が当該タイプの正常細胞よりも過剰発現されるタイプの癌である、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記癌は、前立腺、乳房、卵巣、子宮内膜、子宮頸部、胎盤、膵臓、結腸、肺、肝臓、腎臓、または脳の癌、または膠芽腫、リンパ腫、白血病、黒色腫または神経芽細胞腫である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がエフェクター機能を持たない、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が補体活性化を阻害する、請求項１〜３または９のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧ４サブタイプを含む、請求項１〜３、９または１０のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体の重鎖に、ＩｇＧ４  Ｆａｂアーム交換を阻害するためのＳ２２８Ｐ変異または同等の変異を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が性ホルモン関連症状または疾患の治療のために使用される、請求項１〜３または９〜１２のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記性ホルモン関連症状または疾患が生殖器疾患、トランスジェンダーの人のための医学的移行、不妊症、生殖補助医療、避妊、子宮内膜症、子宮内膜菲薄化、腺筋症、子宮内膜増殖症、子宮平滑筋腫、月経前症候群、良性前立腺肥大症、卵巣障害、多嚢胞性卵巣疾患、または思春期早発症である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記性ホルモン関連症状または疾患は、既知のＧｎＲＨアンタゴニストの投与によって治療可能であることが知られる症状であって、前記既知のＧｎＲＨアンタゴニストは、任意選択的に、アンタイドまたはセトロレリックスを含む、請求項１〜３または９〜１３のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記癌または前記性ホルモン関連症状または疾患は、既知のデカペプチドＧｎＲＨアンタゴニストよりも循環における活性治療剤の半減期が長いことが望ましい癌または性ホルモン関連症状または疾患である、請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記対象が男性または女性である、請求項１〜１６のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が排卵制御のために使用される、請求項１〜３または９〜１６のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体の前記抗原結合断片がＩｇＧ抗体断片を含み、前記ＩｇＧ抗体断片は任意選択的に、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、またはＳｃＦｖを含む、請求項１〜１８のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記対象がヒトであって、前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がヒト化ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜１９のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体がヒトの循環において５〜２２日の半減期を有する、請求項１〜２０のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＧＨＲ−１０６抗体が配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を有するヒト化ＧＨＲ−１０６抗体を含むか、または、前記ヒト化ＧＨＲ−１０６抗体が配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を有するか、または、前記ＧＨＲ−１０６抗体が配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を有するヒト化ＧＨＲ−１０６抗体を含みかつ前記ヒト化ＧＨＲ−１０６抗体が配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明のいくつかの実施形態は免疫学および医学の分野に関連し、それには、癌および性ホルモン関連の健康状態または疾患の治療ための医薬が含まれる。本発明のいくつかの実施形態は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）受容体を標的にし、ＧｎＲＨアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体またはそれの抗原−結合断片、および、それらを作成する方法および使用する方法の分野に関連する。
【背景技術】
【０００２】
性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）は、ＧｎＲＨ受容体への特異的な結合を介して下垂体前葉から性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するデカペプチドホルモンである。ＧｎＲＨ受容体は、多くの細胞タイプおよび組織、主に癌細胞、下垂体前葉および生殖器官または生殖組織の外膜に位置する。癌細胞におけるＧｎＲＨ受容体の機能は、下垂体前葉細胞におけるＧｎＲＨ受容体の機能とは異なるが、これらの異なるタイプの細胞間でのＧｎＲＨ受容体の配列および構造は同じである。
【０００３】
ＧｎＲＨの正常機能に対して拮抗するＧｎＲＨアナログの投与は、生殖器疾患（男性および女性の両方）、不妊症、体外受精（ＩＶＦ）または卵子提供（例えば卵巣刺激を制御するためなど）などの生殖補助医療、排卵の阻害を含む避妊、トランスジェンダーの人のための医学的移行または性転換療法（男性から女性へであるか女性から男性へであるか性転換手術との併用の有無を問わない）、子宮内膜症、子宮内膜菲薄化、腺筋症、子宮内膜増殖症、子宮平滑筋腫（子宮筋腫）、月経前症候群、良性前立腺肥大症、卵巣障害、多嚢胞性卵巣疾患、思春期早発症などの様々な性ホルモン関連症状または疾患の治療に使用されている。
【０００４】
ＧｎＲＨアナログは、また、前立腺、乳房、および卵巣の癌、ならびに、子宮内膜、子宮頸部、胎盤、膵臓、結腸、肺、肝臓、腎臓、または脳の癌、または膠芽腫、リンパ腫、白血病、黒色腫または神経芽細胞腫を含むいくつかのタイプの癌の治療に使用されている。ＧｎＲＨは、多くの異なるタイプの癌の、特にそのような癌のより進行したステージにおいて、細胞表面に高発現している汎癌マーカーであることが確立されている（例えば、あらゆる目的でその全てが参照によって本明細書に援用される特許文献１を参照）。ＧｎＲＨアナログ（アゴニストおよびアンタゴニスト両方）は、癌細胞においてアポトーシスを誘導することも確立されている。
【０００５】
合成ＧｎＲＨアンタゴニストの例には、とりわけ、アンタイド、セトロレリックス、アバレリクス、デガレリクス、ガニレリックスおよびエラゴリックスが含まれる。
ＧｎＲＨアンタゴニストとして一般に使用されるいくつかの合成ＧｎＲＨアナログは、構造的に改変させたＧｎＲＨのデカペプチドアナログである。いくつかのＧｎＲＨデカペプチドのアナログの構造は、ＧｎＲＨの構造とは実質的に異なり、その１０個のアミノ酸のうち５個は非天然でありＤ配置のものである。ＧｎＲＨのアンタゴニストとして作用するＧｎＲＨデカペプチドのアナログは、ＧｎＲＨ受容体への結合に関して内因性ＧｎＲＨと直接競合し、投与するとＬＨおよびＦＳＨの急速な減少を伴う。ＧｎＲＨデカペプチドのアナログは、したがって、即時かつ直接的な効果を生むことが知られている。ＧｎＲＨデカペプチドのアナログは、少なくともこの理由で、不妊問題の治療のための臨床応用において一般に使用される。
【０００６】
ＧｎＲＨは、ヒトの循環において約２〜４分の短い半減期を有する。一般的に、ＧｎＲＨデカペプチドアナログは、ヒトの循環において、例えばおよそ３〜６３時間の範囲の短い半減期を有する。したがって、ＧｎＲＨデカペプチドアナログは、短期治療のみを必要とする症状の治療に有用である。長期治療を達成するためには、ＧｎＲＨデカペプチドアナログの日々の投与が必要であろう。
【０００７】
ＧＨＲ−１０６は、ＧｎＲＨ受容体に結合するモノクローナル抗体である。元来、ＧＨＲ−１０６は、ヒトＧｎＲＨ受容体の細胞外ドメインにあるアミノ酸残基１〜２９に存在するエピトープに対応する合成オリゴペプチドに対して免疫化されたマウスから生成された。この元のマウスｍＧＨＲ−１０６は、ヒトへの投与のためにヒト化型に改変されてきている。ヒト化ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体（ｈＧＨＲ−１０６）は、マウスモノクローナルＧＨＲ−１０６（ｍＧＨＲ−１０６）と生物学的に同等であることが示されている。マウスｍＧＨＲ−１０６およびヒト化ｈＧＨＲ−１０６は、それらの可変領域のアミノ酸配列を含め、特許文献２および３に開示されており、それらはあらゆる目的で参照によって本明細書に援用される。
【０００８】
あらゆる目的でそれらの全てが参照によって本明細書に援用されるＬｅｅの先行米国特許（特許文献１、３、４）は、ヒトの癌および性ホルモン関連症状または疾患の治療におけるＧＨＲ−１０６およびそのヒト化型の潜在的な臨床応用に関連する。モノクローナル抗体は、ヒトの循環において比較的長い半減期を有しており、例えば循環におけるモノクローナルＧＨＲ−１０６の半減期は約５日〜約２２日であると推定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８１６３２８３号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１１／０２６２４２号
【特許文献３】米国特許第９２７３１３８号明細書
【特許文献４】米国特許第８３６１７９３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＧｎＲＨデカペプチドアナログの代替として使用するための改良ＧｎＲＨアンタゴニスト、特に、抗体ベースのＧｎＲＨアンタゴニストが依然として必要とされている。癌および性ホルモン関連症状または疾患の治療における使用に好適な改良ＧｎＲＨアンタゴニストが依然として必要とされている。
【００１１】
前述の関連技術の例およびそれに関連する限定事項は、例示的であり、排他的ではないことが意図されている。関連技術の他の限定事項は、明細書を読み、図面を検討すると、当業者には明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下の実施形態およびそれらの態様は、範囲を限定するのではなく、例証的および例示的であることを意味するシステム、ツール、および方法とともに記載および例示される。様々な実施形態では上記問題のうちの１つ以上を低減または排除するが、他の実施形態は他の改良に向けられている。
【００１３】
本発明の一態様は、癌または性ホルモン関連症状または疾患を治療するためにＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を抗体ベースのＧｎＲＨアンタゴニストとして使用する方法を提供する。
【００１４】
本発明の一態様は、治療有効量のＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片をＧｎＲＨアンタゴニストとして対象に投与することにより、対象における癌または性ホルモン関連症状または疾患を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体は、ヒト化ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体の抗原結合断片は、ヒト化ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体に由来する。
【００１５】
いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を活性化できる、エフェクター機能を有する。いくつかのそのような態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３サブタイプを有する。いくつかの態様において、エフェクター機能を有するＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、癌治療のために使用される。いくつかの態様において、そのタイプの健康な細胞と比べて、そのタイプの癌細胞においてはＧｎＲＨ受容体が過剰発現している癌である。
【００１６】
いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を活性化できず、エフェクター機能を活性化しない。いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、補体活性化を阻害する。いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ４サブタイプである。いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体の重鎖に、ＩｇＧ４  Ｆａｂアーム交換を阻害するためのＳ２２８Ｐ変異または同等の変異を有する。
【００１７】
いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、性ホルモン関連症状または疾患を治療するために使用される。いくつかの態様では、性ホルモン関連症状または疾患は、既知のＧｎＲＨアンタゴニスト、例えば、アンタイドまたはセトロレリックスなどのデカペプチドＧｎＲＨアンタゴニストの投与によって治療可能であることが知られる症状である。いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、活性治療剤の循環におけるより長い半減期が望ましい症状または疾患を治療するために使用される。いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、排卵を制御するために使用される。
【００１８】
いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体の抗原結合断片は、ＩｇＧ抗体断片である。いくつかの態様において、ＩｇＧ抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂまたはｓｃＦｖである。いくつかの態様において、抗原結合断片は、およそ１２〜２０時間の範囲のヒト循環における半減期を有する。いくつかの態様において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体は、およそ５〜２２日の範囲のヒト循環における半減期を有する。
【００１９】
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態は、図面を参照することによって、および以下の詳細な説明を検討することによって明らかになるであろう。
【００２０】
例示的な実施形態は、参照される図面に示される。本明細書に開示される実施形態および図は、限定的ではなく例示的であると見なされるべきであることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＯＣ−３−ＶＧＨ癌細胞でコーティングされたマイクロウェルへの結合に関して、ｍＧＨＲ１０６と、ｈＧＨＲ１０６またはヒト（Ｈｕ−Ｐ）、サル（Ｍｏ−Ｐ）またはマウス（Ｍｕ−Ｐ）からのＧｎＲＨ受容体の細胞外ドメインのＮ１−２９合成ペプチドとの競合を示す図。図１Ａ中の白棒および黒棒は、各アッセイで使用したｍＧＨＲ１０６の異なる濃度（それぞれ０．５０μｇ／ｍｌおよび０．２５μｇ／ｍｌ）を表す。
【図１Ｂ】ＯＣ−３−ＶＧＨ癌細胞でコーティングされたマイクロウェルへの結合に関する、ｈＧＨＲ１０６とＨｕ−Ｐ、Ｍｏ−ＰまたはＭｕ−Ｐとの競合を示す図。
【図２Ａ】ｍＧＨＲ−１０６、ｈＧＨＲ−１０６またはアンタイドによるＯＣ−３−ＶＧＨ癌細胞の処理に応答した癌細胞のアポトーシスのパーセント増加を示す図。黒棒はアッセイ結果を示し、白棒は、陰性対照の結果を示す。
【図２Ｂ】ｍＧＨＲ−１０６によるＰＣ−３前立腺癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞の処理と、アンタイドによるＰＣ−３前立腺癌細胞の処理とに応答した癌細胞のアポトーシスのパーセント増加を示す図。黒棒はアッセイ結果を示し、白棒は、陰性対照の結果を示す。
【図３】ヒト、サルおよびマウス種由来のＧｎＲＨ受容体の細胞外ドメインのアミノ酸配列の比較分析を示す図。各種のＧｎＲＨ受容体（ＧｎＲＨＲ）のＮ末端細胞外部分のアミノ酸位置１〜３０のアミノ酸配列がリストされ、アミノ酸置換が太字で示されている。３種間で比較したＧｎＲＨＲ  Ｎ末端細胞外部分のペプチド位置１〜３０のアミノ酸配列内のアミノ酸置換の数もまとめてある。
【図４】ＧＨＲ−１０６またはアンタイドによるＯＣ−３−ＶＧＨ癌細胞の処理に応答した細胞増殖、タンパク質合成および細胞周期調節に関与する特定の遺伝子の発現に対する影響を示す図。
【図５】ヒト化ＧＨＲ１０６−ｈＩｇＧ４コンストラクトＨ７８２４のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図。
【図６】ヒト化ＧＨＲ１０６−ｈカッパ（ｋａｐｐａ）コンストラクトＬ７８２４のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下の説明全体にわたって、当業者により完全な理解を提供するために具体的な詳細が述べられる。しかしながら、開示を不必要に不明瞭にすることを避けるために、よく知られる要素は示されていないか、または詳細に説明されていない場合がある。したがって、説明および図面は、限定的な意味ではなく例示的な意味においてみなされるべきである。
【００２３】
本明細書に使用されるとき、用語「ＧＨＲ−１０６」は、任意の種に由来するＧＨＲ−１０６抗体を包含し、マウスＧＨＲ−１０６（ｍＧＨＲ−１０６）およびヒト化ＧＨＲ−１０６（ｈＧＨＲ−１０６）の両方を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態は、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原−結合断片の分野に関連する。ＧＨＲ−１０６は、ヒトＧｎＲＨ受容体の細胞外ドメインに、特に１〜２９位のＮ末端アミノ酸に結合する。ｍＧＨＲ−１０６抗体またはｈＧＨＲ−１０６抗体は、ＧｎＲＨ受容体に対しておよそ２〜４ｎＭの親和定数（ＫＤ）の親和性を有する。ＧＨＲ−１０６は、ＧｎＲＨ受容体への結合に関して内因性ＧｎＲＨと競合し、ＧｎＲＨアンタゴニストとして作用することが本開示内において実証される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態は、モノクローナル抗体ＧＨＲ−１０６が生物学的な効果において、ＧｎＲＨアンタゴニストとして使用されているＧｎＲＨデカペプチドアナログと同様、ＧｎＲＨアンタゴニストとして作用するという発見に関連する。アンタイドおよびセトロレリックスのようなデカペプチドＧｎＲＨアンタゴニストは、ヒトの癌および性ホルモン関連症状または疾患の治療に使用されており、本明細書内のデータに基づき、ＧｎＲＨ受容体のＮ末端の細胞外アミノ酸に結合するＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、ヒトの癌および性ホルモン関連症状または疾患の治療に同様に使用され得ることが十分に予測できる。いくつかの実施形態においては、ｍＧＨＲ−１０６またはｈＧＨＲ−１０６は、ＧｎＲＨのアンタゴニストであるＧｎＲＨデカペプチドアナログと、ＧｎＲＨ受容体に対する同様の結合親和性および特異性を示す。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６は、癌細胞の表面に発現しているＧｎＲＨ受容体に結合して、癌細胞のアポトーシスおよび関連する細胞傷害性殺傷を誘導する。いくつかの実施形態において、ｍＧＨＲ−１０６およびｈＧＨＲ−１０６は、ＧｎＲＨアンタゴニストとして作用するＧｎＲＨデカペプチドアナログと、生物学的作用において同様の有効性を示す。これは、ｍＧＨＲ−１０６およびｈＧＨＲ−１０６が、癌細胞の標的化において、ＧｎＲＨアンタゴニストとして作用するＧｎＲＨデカペプチドアナログを超えて効果的ではなくても、少なくとも同等に効果的であることを示唆する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６は、ＧｎＲＨ受容体に結合すると、ＧｎＲＨアンタゴニストであるＧｎＲＨデカペプチドアナログと同一または非常に類似した分子作用機序を示す。いくつかの実施形態において、ｈＧＨＲ−１０６およびＧｎＲＨアンタゴニストであるＧｎＲＨデカペプチドアナログは、癌細胞とそれぞれ相互作用すると、同一または非常に類似した遺伝子調節パターンを示す。いくつかの実施形態において、ｈＧＨＲ−１０６またはＧｎＲＨデカペプチドアナログと癌細胞とがそれぞれ相互作用するときの癌細胞の増殖または生存に関与する遺伝子の発現レベルは、実質的に同一である。一例示的実施形態において、癌細胞と相互作用するとき、ｈＧＨＲ−１０６が実質的に同一の生物学的効果を示すＧｎＲＨデカペプチドアナログはアンタイドである。
【００２８】
本発明のいくつかの態様は、癌を治療するためのＧＨＲ−１０６またはその抗原−結合断片の使用に関連する。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体の結晶化可能断片領域（Ｆｃ領域）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３サブタイプのうちのいずれか１つである。これらのＩｇＧのサブタイプが補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのプロセスを活性化することが知られているという事実に基づき、これらのサブタイプのＧＨＲ−１０６抗体が癌細胞の殺傷において有用性を有するであろうことは十分に予測できる。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３サブタイプを有するｈＧＨＲ−１０６を含むＧＨＲ−１０６の治療的有効な量は、ヒトを含む哺乳類の癌治療に臨床的に使用される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片によって治療される癌は、そのタイプの健康な細胞と比較してそのタイプの癌細胞においてＧｎＲＨ受容体が過剰発現される癌である。いくつかの実施形態において、癌細胞のＧｎＲＨ受容体の発現または過剰発現のレベルは、癌がその様々なステージを進むにつれて増加する。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片によって治療される癌は、前立腺、乳房、卵巣、子宮内膜、子宮頸部、胎盤、膵臓、結腸、肺、肝臓、腎臓または脳の癌であるか、または膠芽腫、リンパ腫、白血病、黒色腫または神経芽細胞腫である。例えば、あらゆる目的でその全てが参照によって本明細書に援用される、Ｎａｇｙら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７３（５）：８５１−８５９（２００５）を参照されたい。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体のサブタイプは、抗体のエフェクター機能を調節するために選択される。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、例えば、エフェクター機能を持たない抗体の抗原結合断片を使用することにより、抗体のエフェクター機能をさらに調節するように構造的に改変される。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ４サブタイプのものである。いくつかの実施形態において、エフェクター機能を持たないＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、性ホルモン関連の健康状態または疾患の治療に使用される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４サブタイプを有するＧＨＲ−１０６抗体は、性ホルモン関連の健康状態または疾患の治療に使用される。
【００３１】
理論に拘泥されるものではないが、ＩｇＧ４抗体サブタイプは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化しないため、生殖障害を含む性ホルモン関連の健康状態または疾患の治療へのＩｇＧ４抗体サブタイプの使用は、ＧＨＲ−１０６抗体の下垂体前葉に結合時のＣＤＣ反応およびＡＤＣＣ反応の可能性を最小化または排除すると考えられる。例えば、あらゆる目的で参照によって本明細書に援用される、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１４，５：５２０を参照されたい。
【００３２】
さらに、ＩｇＧ４抗体は実際に補体活性化を阻害することができることが示される（あらゆる目的で参照によって本明細書に援用される、例えばｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６、６４（２）：４１５−４２２を参照）。したがって、いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、補体活性化を阻害するように選択される。いくつかの実施形態において、補体活性化を阻害するＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、性ホルモン関連症状または疾患の治療に使用される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４サブタイプを有するｈＧＨＲ−１０６の重鎖をコードするポリヌクレオチドは、図５に示される配列番号４として示される配列と、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％などのより高い類似度の配列類似性を含む、少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するＦｃ領域を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４サブタイプを有するｈＧＨＲ−１０６の重鎖は、図５に示される配列番号５として示されるアミノ酸配列と、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％などのより高い類似度の配列類似性を含む、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ｈＧＨＲ−１０６抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、図６に示される配列番号６として示される配列と、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％などのより高い類似度の配列類似性を含む、少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４サブタイプを有するｈＧＨＲ−１０６の軽鎖は、図６に示される配列番号７として示されるアミノ酸配列と、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％などのより高い類似度の配列類似性を含む、少なくとも９０％の配列同一性アミノ酸配列を有する。
【００３５】
一例示的実施形態において、Ｓ２２８Ｐまたは他の同様の変異がＩｇＧ４抗体の重鎖に組み込まれる。理論に拘泥されるものではないが、Ｓ２２８Ｐ変異または他の同等の変異は、抗体がＩｇＧ４  Ｆａｂアーム交換として知られる組換えプロセスを受けるのを妨げると考えられる。Ｆａｂアーム交換は、望ましくない二重特異性抗体の形成をもたらし、これは、標的受容体に対する抗体の特異性に望ましくない影響を与えることが知られている。例えば、あらゆる目的で参照によって本明細書に援用される、Ｓｉｌｖａら、ＪＢＣ、２０１５、２９０（９）：５４６２−５４６９を参照されたい。Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４重鎖の一例示的実施形態は、配列番号４（ヌクレオチド配列）および配列番号５（アミノ酸配列、ＥＵナンバリングシステムによるＳ２２８はアミノ酸配列番号５の２５０位にあることに留意されたい）として図５に示される。
【００３６】
理論に拘泥されるものではないが、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣの活性化を回避するためのＧＨＲ−１０６抗体のＦｃ領域での改変は、下垂体前葉におけるＧｎＲＨ受容体への結合時に抗体の望ましくないエフェクター機能の排除をもたらすと本発明者は考える。望ましくないエフェクター機能のうちのいくつかには、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が含まれる。これらのエフェクター機能は、癌細胞を殺傷するための癌治療に有用であるが、生殖能タイプや性ホルモン関連の治療には望ましくない場合がある。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片の半減期は、抗体のサイズを構造的に改変することおよび／または縮小することによって調整される。例えば、いくつかの実施形態において、抗体は、約１２〜約２０時間の範囲の半減期を有するＦ（ａｂ’）２断片として提供される。いくつかの実施形態において、抗体は、約１２〜約２０時間の範囲の半減期を有するＦａｂ断片として提供される。いくつかの実施形態において、抗体は、少なくとも約１２時間の範囲の半減期を有するｓｃＦａｂ断片として提供される。いくつかの実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖ断片として提供される。
【００３８】
ＧＨＲ−１０６抗体の異なる抗原結合断片の提供により、多くの生殖能関連または性ホルモン関連の適応症の臨床治療で使用するための、異なる半減期を有する薬として使用するための一連の抗体ベースのＧｎＲＨアンタゴニストの生成が可能になる。加えて、デカペプチドＧｎＲＨアナログは、ＧｎＲＨ受容体への結合を介して癌細胞のアポトーシスを誘導できることが知られているため、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ＳｃＦｖなどの抗体断片もＧｎＲＨ受容体への結合を介した癌細胞のアポトーシスを誘導し得ると予測でき、したがって、癌の治療に有用でありうる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体は、性ホルモン関連の健康状態または疾患の治療に使用するためのＧＨＲ−１０６の１つ以上の活性な抗原結合断片として提供される。いくつかの実施形態において、断片はＧＨＲ−１０６の可変領域の一本鎖断片である。いくつかの実施形態において、断片は、ＩｇＧアイソタイプのＧＨＲ−１０６の断片である。いくつかの実施形態において、断片はＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２断片は、１１０ＫＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、断片はＦａｂ断片である。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片は、５５ＫＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、断片はｓｃＦａｂ断片である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦａｂ断片は、２５ＫＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、断片はｓｃＦｖ断片である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ断片は、２５ＫＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、異なる抗原結合断片の組み合わせ、例えば上記の２つ以上の断片は、癌または性ホルモン関連症状または疾患の治療のための薬として使用され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体の循環半減期は、およそ５〜２１日であり、その間の任意の値、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１７、１８、１９、または２０日を含み、または、１２０〜５００時間であり、その間の任意の値、例えば、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、または４７５時間を含む。対照的に、セトロレリックスの循環半減期はおよそ１０〜６３時間の範囲である。ＧＨＲ−１０６は、デカペプチドＧｎＲＨアンタゴニストであるセトロレリックスと比較して半減期がはるかに長く、したがって、少ない投与頻度でよく、患者のコンプライアンスおよび／または提案された治療計画の実現可能性を向上させうる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ１０６に由来するＩｇＧ抗原−結合断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＳｃＦａｂ、またはＳｃＦｖは、それぞれ、およそ１２〜２０時間の循環半減期を有し、その間の任意の値、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９時間を含む。ｍＧＨＲ−１０６またはｈＧＨＲ−１０６の抗原−結合断片は、ｍＧＨＲ−１０６またはｈＧＨＲ１０６と比較して半減期が短い。いくつかの実施形態において、タンパク質工学は、望ましい範囲内の半減期を有するＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片を提供するために使用される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原−結合断片の結合親和性および／または特異性は、望ましい特性、例えば改善された望ましいレベルの結合親和性および／または特異性を提供するために任意の好適な方法で設計される。例えば、抗体は、合成抗体ライブラリーなどの人工システムを使用することによって、または計算方法またはタンパク質設計方法論を使用して、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の結合親和性および／または特異性を変更するように遺伝子操作することができる。例えば、あらゆる目的でその全てが参照によって本明細書に援用される、Ｋｕｒｏｄａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２５（１０）：５０７−５２２（２０１２）を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ以上をそのような方法を使用して改変して、それらの結合特性を改善する。
【００４３】
本明細書に記載されるモノクローナル抗体またはその抗原−結合断片は、例えば、微生物宿主細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または昆虫細胞を含む好適な宿主細胞における組換え産生および発現を介するなどの任意の好適な方法で産生可能である。
【００４４】
本明細書に記載されるＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、医薬としての投与に適した任意の方法で処方することが可能である。したがって、それらは、癌または性ホルモン関連の健康状態または疾患の治療に有用な医薬組成物を提供するよう薬学的に許容される賦形剤または他の薬学的に好適な化合物と組み合わされ得る。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、癌の治療のために、ヒトを含む哺乳動物に治療有効量で投与される。いくつかの実施形態において、その癌は、前立腺、乳房、卵巣、子宮内膜、子宮頸部、胎盤、膵臓、結腸、肺、肝臓、腎臓、または脳の癌である。いくつかの実施形態において、その癌は、膠芽腫、リンパ腫、白血病、黒色腫または神経芽細胞腫である。いくつかの実施形態において、その癌は、健康な細胞と比べてＧｎＲＨ受容体が過剰発現している癌である。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、ｈＧＨＲ−１０６に由来する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、癌の治療のために投与されるＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、エフェクター機能を持つ。エフェクター機能を持つ抗体は、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化して、癌細胞の殺傷を増強することができる。いくつかの実施形態において、エフェクター機能を持つＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３アイソタイプを有する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、ヒトを含む哺乳動物における性ホルモン関連の健康状態または疾患の治療のために治療有効量で投与される。ヒトは男性でも女性でもよい。いくつかの実施形態において、性ホルモン関連の健康状態または疾患は、男性または女性の対象における）生殖器疾患、性転換手術と併用しようがしまいが男性から女性へ（ＭＴＦ）または女性から男性へ（ＦＴＭ）の性転換療法を含むトランスジェンダーの人の医学的移行、体外受精（ＩＶＦ）または卵子の提供（卵巣刺激を制御するためなど）、排卵阻害を含む避妊、子宮内膜症、子宮内膜菲薄化、腺筋症、子宮内膜増殖症、子宮平滑筋腫（子宮筋腫）、月経前症候群、良性前立腺肥大症、卵巣障害、多嚢胞性卵巣疾患、思春期早発症など、および前立腺、乳房、卵巣の癌を含むいくつかのタイプの癌である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、アンタイドまたはセトロレリックスを含む、既知のＧｎＲＨアンタゴニストによって治療可能な任意の症状の治療においてＧｎＲＨアンタゴニストとして作用する。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、アンタイドまたはセトロレリックスを含む、既知のＧｎＲＨアンタゴニストよりも長い半減期が望ましい症状の治療に使用される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、性ホルモン関連の健康状態または疾患の治療のために投与されるＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、エフェクター機能を持たない。エフェクター機能を持たない抗体は、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路を活性化できない。いくつかの実施形態において、エフェクター機能を持たないＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ４サブタイプを有する。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、補体活性化を阻害する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４サブタイプを有する抗体の重鎖は、Ｆａｂアーム交換を妨げるようにＳ２２８Ｐまたは同等の変異を有する。いくつかの実施形態において、エフェクター機能を持たないＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、ＧＨＲ−１０６抗体のＩｇＧ抗原−結合断片である。いくつかの実施形態において、エフェクター機能を持たない抗原結合断片は、ＧＨＲ−１０６のＩｇＧ断片のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、またはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、ｈＧＨＲ−１０６由来である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量レベルでヒト対象者に投与され、または０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の量で、またはそれらの範囲内の任意の中間値、例えば、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．５０、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、または１９．５ｍｇ／ｋｇで投与される。所望の治療効果を達成するための好適な投与量は、当業者によって選択されてもよく、示された範囲よりも高くても低くてもよい。ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片の結合親和性および／または特異性が改善されたいくつかの実施形態において、改変された抗体またはその抗原結合断片の投与量レベルは適宜変更される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片は、間隔をあけて繰り返して、例えば５〜３０日ごと、またはその間の任意の値で、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９日ごと；２〜８週間ごと、またはその間の任意の値、例えば３、４、５、６または７週間ごと、または２〜６か月ごと、またはその間の任意の値、例えば３、４、または５か月ごとに投与される。いくつかの実施形態において、ヒトに投与されるＧＨＲ−１０６またはその抗原結合断片は、ヒト化ＧＨＲ−１０６抗体またはその抗原結合断片である。
【００５２】
抗体を含む医薬組成物の典型的な投与経路は、注射、典型的には静脈注射による。しかしながら、任意の好適な投与様式を様々な実施形態で使用することができる。
実施例
本発明の実施形態は、以下の例示的であって、本質的に限定的ではない実施例を参照してさらに説明される。
【００５３】
実施例１．０−競合結合アッセイ
競合結合アッセイは、例えば特許文献４に記載される、容認されているプロトコルに従って実施された。図１Ａでは、ＯＣ−３−ＶＧＨ癌細胞でコーティングされたマイクロウェルを使用し、ｍＧＨＲ−１０６とｈＧＨＲ−１０６との間、およびｍＧＨＲ−１０６とヒト（Ｈｕ−Ｐ）ＧｎＲＨ受容体、サル（Ｍｏ−Ｐ）ＧｎＲＨ受容体およびマウス（Ｍｕ−Ｐ）ＧｎＲＨ受容体から別々に由来するＮ１−２９オリゴペプチドとの間の結合特異性を比較した。Ｎ１−２９オリゴペプチドは、各種からのＧｎＲＨ受容体のＮ末端細胞外ドメインに由来する。Ｈｕ−Ｐ、Ｍｏ−ＰおよびＭｕ−Ｐのそれぞれのアミノ酸配列は、図３にそれぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３として示される。図１Ｂでは、ＯＣ−３−ＶＧＨ癌細胞でコーティングされたマイクロウェルを使用し、ｈＧＨＲ−１０６とＨｕ−Ｐペプチド、Ｍｏ−ＰペプチドおよびＭｕ−Ｐペプチドのそれぞれとの間の結合特異性を比較した。
【００５４】
図１Ａに関して、ｈＧＨＲ１０６抗体、Ｈｕ−Ｐペプチド、Ｍｏ−ＰペプチドおよびＭｕ−Ｐペプチドによる、ＯＣ−３−ＶＧＨ癌細胞でコーティングされたマイクロウェルへのｍＧＨＲ１０６抗体結合の阻害パーセントを示す。図１Ａ中の白棒および黒棒は、各アッセイで使用した異なる濃度のｍＧＨＲ１０６（それぞれ０．５０μｇ／ｍｌおよび０．２５μｇ／ｍｌ）を表す。図１Ｂに関して、Ｈｕ−Ｐ、Ｍｏ−ＰおよびＭｕ−Ｐ（それぞれ１μｇ／ｍｌ）による、ＯＣ−３−ＶＧＨ癌細胞でコーティングされたマイクロウェルへのｈＧＨＲ１０６抗体結合の阻害パーセントを示す。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ標識）をプローブとして使用し、２回のアッセイのエラーバーを示す。
【００５５】
図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、ｍＧＨＲ１０６とｈＧＨＲ１０６とは、培養癌細胞（ＯＣ−３−ＶＧＨ）の表面に発現しているＧｎＲＨ受容体ならびに合成ペプチドへの結合において互いに競合的である。ヒトおよびサルのＧｎＲＨ受容体の細胞外ドメインのＮ１−２９合成ペプチドは、培養癌細胞の表面に発現したヒトＧｎＲＨ受容体へのｍＧＨＲ１０６およびｈＧＨＲ１０６の結合と競合するが、マウス由来の合成ペプチドとは競合しないことも見出された。理論に拘泥されるものではないが、このような異なる結合は、ヒトのＮ１−２９ペプチドとサルのＮ１−２９ペプチドとの間では高い配列相同性が観察された（相同性≧９４％）が、ヒトのＮ１−２９ペプチドとマウスのＮ１−２９ペプチドとの間では観察されなかった（相同性≦７９％）という事実によって説明され得る。
【００５６】
実施例２．０−癌細胞のアポトーシスの誘導
癌細胞に対するｍＧＨＲ１０６またはｈＧＨＲ１０６とアンタイドとの間の抗増殖効果（またはアポトーシス）を比較するために、インビトロで培養および処理された癌細胞のアポトーシスの検出および定量にＩｎ  Ｓｉｔｕ細胞死検出キット、ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ、カナダ）を用いた。手短に言えば、すべての癌細胞がマイクロウェルに付着するまで、癌細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、ＣＯ２（５％）インキュベーター内で２４時間および／または４８時間培養した。細胞培養培地を除去した後、ＣＯ２インキュベーターでさらに３時間インキュベートするために、新しい無血清培地を追加した。
【００５７】
無血清飢餓期間の後、１０％ウシ胎児血清を含む新しい培地で細胞をインキュベートし、既知の濃度のｈＧＨＲ１０６、ｍＧＨＲ１０６またはアンタイドを追加して、２４〜７２時間共培養した。陰性対照として、同じ濃度の正常なマウスＩｇＧまたは正常なヒトＩｇＧを同じインキュベーション期間使用した。
【００５８】
インキュベーションの終わりに、付着した細胞を適切な細胞剥離液によって組織培養ウェルから除去した。処理された癌細胞のアポトーシスは、細胞死検出キット、ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ、カナダ）によって提供された指示を用いたＴＵＮＥＬアッセイによって定量的に決定された。ｈＧＨＲ１０６、ｍＧＨＲ１０６、およびアンタイドのいずれかで処理した後のアポトーシスを伴う細胞の増加率は、陰性対照から自然に起こるアポトーシスを差し引くことにより得られた。
【００５９】
図２Ａおよび図２Ｂは、比較ＴＵＮＥＬアポトーシスアッセイの結果を示す。図２Ａおよび図２Ｂの黒棒は、ｍＧＨＲ−１０６、ｈＧＨＲ−１０６またはアンタイドでの処理後のアポトーシスを伴う細胞のパーセント増加を表す。白棒は対応する実験セットごとに、１０μｇ／ｍＬの正常なマウスＩｇＧまたは１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧのいずれかである陰性対照を表す。提示されたすべての結果はｐ＜０．０１またはｐ＜０．００１で統計的に有意だった。
【００６０】
図２Ａおよび図２Ｂに関して、ｍＧＨＲ−１０６またはｈＧＨＲ−１０６およびアンタイドは、モルベース（ＧＨＲ−１０６およびアンタイドの分子量は、それぞれ８０ｋＤａおよび１．５ｋＤａ）で非常に類似した程度の誘導アポトーシスを示す。これらの結果は、ｍＧＨＲ−１０６またはｈＧＨＲ−１０６がその機能的特性の点で既知のＧｎＲＨアンタゴニストと同様に作用することを実証する。
【００６１】
実施例３．０−比較遺伝子調節研究
ｈＧＨＲ１０６またはデカペプチドＧｎＲＨアナログアンタイドの投与時の比較遺伝子調節を、例えば特許文献４に記載されるような従来のプロトコルを使用して調べた。図４は、癌細胞上のヒトＧｎＲＨ受容体への結合時のｈＧＨＲ−１０６とアンタイドの遺伝子調節パターンの比較を示す。癌細胞の増殖または生存に関与するいくつかの選択された遺伝子の発現を比較した。選択された遺伝子には、ＧｎＲＨ、ＧｎＲＨＲ、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｌ３７、およびＥＧＦ、ｃ−ｆｏｓ、Ｐ２１、サイクリンＤ１が含まれる。Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、およびＬ３７はリボソームタンパク質である。
【００６２】
図４に関して、調べた遺伝子の発現は、ｈＧＨＲ−１０６またはアンタイドのいずれかの結合後に有意に変化することが見出された。それぞれのリガンド処理時に、ｈＧＨＲ−１０６およびアンタイドはＧｎＲＨ発現を上方制御する（≧５０％）が、ＧｎＲＨ受容体（ＧｎＲＨＲ）の発現は変化しないことが見出された。ＥＧＦ（上皮成長因子）とサイクリンＤ１（細胞周期調節因子）は、いずれかのリガンドによる癌細胞の処理時に両方とも下方制御された。図４に示すように、ｈＧＨＲ−１０６およびアンタイドは、癌細胞上のＧｎＲＨ受容体に結合時に、リストされた遺伝子と同一の遺伝子調節パターンの変化を示すことが見出された。
【００６３】
この比較遺伝子調節研究の結果は、ｈＧＨＲ−１０６が例示的なＧｎＲＨデカペプチドアンタゴニストであるアンタイドと同様に作用することを実証する。これらの結果はまた、２つのリガンドが、同様の分子作用機序、すなわち癌細胞との相互作用時に、ＧｎＲＨアンタゴニストとしての作用機序を有することを裏付ける。
【００６４】
実施例４．０−半減期の比較
表１は、ｈＧＨＲ−１０６およびそのＩｇＧ断片、ならびに選択されたＧｎＲＨデカペプチド類似体アナログ、および臨床的に使用されているヒト抗体薬の推定半減期の比較である。
【００６５】
【表１】
2021512957.tif 000003
表１に示すように、ＧｎＲＨアンタゴニストとして機能する一連の異なる抗体ベースの断片が異なる循環半減期の範囲を示すことが示されている。本発明者は、ｈＧＨＲ−１０６がより長い循環半減期を有し、リガンドが下垂体前葉に結合するとＣＤＣ反応およびＡＤＣＣ反応などのエフェクター機能を刺激するので、ｈＧＨＲ−１０６抗体は癌の治療に特に有用でありうると見込んでいる。対照的に、ｈＧＨＲ−１０６のＩｇＧ断片の中程度の半減期は、生殖能関連症状を含む様々な性ホルモン関連症状の治療などの短期治療に特定の用途がある可能性がある。その一例は、下垂体前葉におけるＬＨ／ＦＳＨ放出を遮断する排卵抑制である。
【００６６】
いくつかの例示的な態様および実施形態が上述されてきたが、当業者は、それらの特定の変更、交換、追加およびサブコンビネーションを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲および将来導入される請求項には、明細書全体としての最も広い解釈と一致するすべてのそのような変更、交換、追加およびサブコンビネーションが含まれると解釈されることが意図される。
【００６７】
限定ではないが、そのような態様には以下が含まれる：
・ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原−結合断片を含む性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）受容体アンタゴニストを含む第１の態様。
・第１の態様のアンタゴニストを含み、ＧＨＲ−１０６抗体の結晶化可能断片領域（Ｆｃ）がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３サブタイプのいずれかを含む第２の態様。
・第１の態様のアンタゴニストを含み、ＧＨＲ−１０６抗体のＦｃ領域がＩｇＧ４サブタイプを含む第３の態様。
・第１の態様のアンタゴニストを含み、ＧＨＲ−１０６抗体の抗原結合断片がＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、またはｓｃＦｖ断片のうちの１つである第４の態様。
・第１の態様のアンタゴニストを含み、ＧＨＲ−１０６抗体は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を有するヒト化ＧＨＲ−１０６抗体を含む第５の態様。
・第５の態様のアンタゴニストを含み、ヒト化ＧＨＲ−１０６抗体は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を有する第６の態様。
・第３の態様のアンタゴニストを含み、ＩｇＧ４抗体の重鎖の結晶化可能断片（Ｆｃ）領域が、（抗体のＥＵナンバリング規則による）２２８位置のＳからＰへの変異またはＦａｂアーム交換を阻害する同等の変異を含む第７の態様。
・第１の態様のアンタゴニストを含み、ＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原−結合断片のＣＤＲ領域の１つ以上は、その結合親和性および／または特異性を改善するように遺伝子操作されたものである第８の態様。
・添付の請求項のうちのいずれか１つに定義された使用における、先述態様のうちのいずれかで定義されたＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用を含む第９の態様。
・対象に、添付の請求項のうちのいずれか１つに定義された使用を実施するように、先行の態様のうちのいずれかで定義された治療有効量のＧＨＲ−１０６モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を投与する方法を含む第１０の態様。
【図１Ａ】
2021512957.tif 000004
【図１Ｂ】
2021512957.tif 000005
【図２Ａ】
2021512957.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021512957.tif 000010
【図６】
2021512957.tif 000011
【配列表】
2021512957000001.app
【国際調査報告】
2021512957.tif 000012
2021512957.tif 000013
2021512957.tif 000014