(57)【要約】  抗４−１ＢＢ抗体、その抗原結合フラグメント、およびその医学的使用が提供される。さらに、抗４−１ＢＢ抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体およびヒト化抗体、およびヒト抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにその抗癌剤としての使用が提供される。特に、４−１ＢＢにより仲介される疾患または状態の処置用医薬の製造におけるヒト化抗４−１ＢＢ抗体の使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体重鎖可変領域が、
（Ｉ）それぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
（II）それぞれ配列番号３、配列番号４５および配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
（III）それぞれ配列番号３、配列番号１１および配列番号１２で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
（IV）それぞれ配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３
を含み、および／または抗体軽鎖可変領域が、
（Ｉ）それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
（II）それぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
（III）それぞれ配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む、抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
下記（Ｉ）〜（IV）からなる群から選択される任意の１つを含む、請求項１に記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント：
（Ｉ）それぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（II）それぞれ配列番号３、配列番号４５および配列番号５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（III）それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
それぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（IV）それぞれ配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
それぞれ配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項３】
重鎖可変領域が配列番号１で示され、軽鎖可変領域が配列番号２で示されるか；または
重鎖可変領域が配列番号９で示され、軽鎖可変領域が配列番号１０で示されるか；または
重鎖可変領域が配列番号３７で示され、軽鎖可変領域が配列番号３８で示される、
請求項１または２に記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはそのフラグメントである、請求項１〜３のいずれかに記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖フレームワーク領域が、配列番号２１および配列番号２３からなる群から選択される配列で示される重鎖に由来し；および／または
軽鎖フレームワーク領域が、配列番号２２および配列番号２４からなる群から選択される配列で示される軽鎖に由来する、
請求項４に記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
下記（Ｉ）〜（Ｖ）からなる群から選択される任意の１つを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント：
（Ｉ）配列番号２５〜２７および配列番号３１〜３３からなる群から選択される配列で示される重鎖可変領域；および／または
配列番号２８〜３０および配列番号３４〜３６からなる群から選択される配列で示される軽鎖可変領域；
（II）配列番号２５〜２７からなる群から選択される配列で示される重鎖可変領域；および／または
配列番号２８〜３０からなる群から選択される配列で示される軽鎖可変領域；
（III）配列番号３１〜３３からなる群から選択される配列で示される重鎖可変領域；および／または
配列番号３４〜３６からなる群から選択される配列で示される軽鎖可変領域；
（IV）配列番号２７で示される重鎖可変領域；および／または
配列番号３０で示される軽鎖可変領域；および
（Ｖ）配列番号３３で示される重鎖可変領域；および／または
配列番号３６で示される軽鎖可変領域。
【請求項７】
下記（Ｉ）〜（Ｖ）からなる群から選択される任意の１つを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント：
（Ｉ）配列番号１７またはそのバリアント配列、配列番号１９またはそのバリアント配列で示される、抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖；および／または
配列番号１８またはそのバリアント配列、配列番号２０またはそのバリアント配列で示される軽鎖；
（II）バリアント配列が、軽鎖可変領域における０〜１０のアミノ酸変異、および／または重鎖可変領域における０〜１０のアミノ酸変異を含む、上記項（Ｉ）の抗体またはその抗原結合フラグメント；
（III）配列番号１７のバリアント配列が、位置５３、７５および１１２における変異の任意の１つ、またはその任意の組み合わせを含み；および／または
配列番号１８のバリアント配列が、位置４７および６２における変異の任意の１つ、またはその組み合わせを含み；および／または
配列番号１９のバリアント配列が、位置４８、９５および１１２における変異の任意の１つ、またはその任意の組み合わせを含み；および／または
配列番号２０のバリアント配列が、位置４および６２における変異の任意の１つ、またはその組み合わせを含む、
上記項（Ｉ）または（II）の抗体またはその抗原結合フラグメント；
（IV）配列番号１７のバリアント配列が、Ｅ５３Ｄ、Ａ７５ＳおよびＲ１１２Ｑ変異の任意の１つ、またはその任意の組み合わせを含み；および／または
配列番号１８のバリアント配列が、Ｐ４７ＡおよびＶ６２Ｉ変異の任意の１つ、またはその組み合わせを含み；および／または
配列番号１９のバリアント配列が、Ｍ４８Ｉ、Ｙ９５ＦおよびＱ１１２Ｔ変異の任意の１つ、またはその任意の組み合わせを含み；および／または
配列番号２０のバリアント配列が、Ｍ４ＬおよびＶ６２Ｉ変異の任意の１つ、またはその組み合わせを含む、
上記項（III）の抗体またはその抗原結合フラグメント；
（Ｖ）配列番号１７における変異がＥ５３Ｄである、上記項（II）〜（IV）のいずれかの抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ヒト化抗体の重鎖可変領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖フレームワーク領域またはそのバリアントを含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖フレームワーク領域を含み、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖フレームワーク領域を含む、請求項４に記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
４−１ＢＢまたはそのエピトープへの結合を請求項１〜８のいずれかに記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、二重特異性抗体または多重特異性抗体。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む一本鎖抗体。
【請求項１２】
抗体−薬物コンジュゲートであって、抗体が請求項１〜９のいずれかに記載される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体、請求項１１に記載の一本鎖抗体、請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体、をコードする、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡであるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、好ましくはウイルスベクターであり、より好ましくは腫瘍溶解性ウイルスベクターである、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターが導入された、好ましくは細菌、酵母、哺乳動物細胞であり、より好ましくは大腸菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはヒト胎児腎２９３細胞である、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の宿主細胞において抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップ；および
宿主細胞から抗４−１ＢＢ抗体またその抗原結合フラグメントを単離するステップ
を含む、抗４−１ＢＢ抗体またその抗原結合フラグメントを調製する方法。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体、請求項１１に記載の一本鎖抗体、請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲート、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、および請求項１４に記載の発現ベクター、からなる群から選択される任意の１つまたは任意の組み合わせ；および
薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤または担体
を含む医薬組成物。
【請求項１８】
４−１ＢＢが仲介するかまたは４−１ＢＢＬが仲介する疾患または状態、好ましくは癌、より好ましくは黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸部癌、甲状腺癌、食道癌、子宮頸癌、肉腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、胆嚢癌および膠芽腫からなる群から選択される癌を治療または予防するための医薬または医薬組成物の製造における、下記のものの任意の１つの使用：
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体、請求項１１に記載の一本鎖抗体、請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲート、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、および請求項１４に記載の発現ベクター、またはその任意の組み合わせ。
【請求項１９】
４−１ＢＢが仲介するかまたは４−１ＢＢＬが仲介する疾患または状態、好ましくは癌、より好ましくは黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸部癌、甲状腺癌、食道癌、子宮頸癌、肉腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、胆嚢癌および膠芽腫からなる群から選択される癌を治療または予防する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１０に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体、請求項１１に記載の一本鎖抗体、請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲート、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載の発現ベクター、もしくは請求項１７に記載の医薬組成物、またはその任意の組み合わせを、治療または予防に有効な量で対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、抗４−１ＢＢ抗体および抗原結合フラグメント、キメラ抗体、抗４−１ＢＢ抗体のＣＤＲ領域を含むヒト化抗体、およびヒト抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、およびその抗癌剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、長らく人間社会における健康上の大きな課題である。
従来の治療法（例えば手術、化学療法および放射線療法）は、播種性の固形腫瘍の処置においてあまり効果がない。癌治療の分野において、Ｔ細胞免疫療法を中心とする、腫瘍の免疫療法が注目されている。腫瘍免疫療法では、腫瘍の死滅のために腫瘍患者におけるキラーＴ細胞を大きく活用および召集する。腫瘍免疫療法は、腫瘍治療の最も有効で最も安全な方法でありうる。腫瘍免疫療法は現在、播種性の転移腫瘍を包含するいくつかの異なる種類の癌の治療のために特に有望視されている。
【０００３】
人体におけるＴ細胞活性化において、２つのシグナル伝達経路が関与する。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介するＴ細胞へのＭＨＣ抗原ペプチドの提示によって供される第１のシグナルに加えて、一連の共刺激分子によって供される第２のシグナルも、Ｔ細胞が正常な免疫反応を起こすために必要である。この二重のシグナル伝達経路の系は、インビボの免疫系のバランスにおいて重要な役割を果たす。これは、自己抗原および非自己抗原に対する免疫反応を厳密に調節する。共刺激分子により供される第２のシグナルの不存在下において、Ｔ細胞の不応答または特定の免疫反応持続が、寛容をもたらしうる。
【０００４】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９とも称される）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳ）の膜貫通タンパク質である。ヒト４−１ＢＢは、シグナル配列（アミノ酸残基１〜１７）、細胞外ドメイン（１６９アミノ酸）、膜貫通ドメイン（２７アミノ酸）、および細胞内ドメイン（４２アミノ酸）を含む２５５アミノ酸のタンパク質を有する。４−１ＢＢは、細胞表面上に単量体または二量体として発現され、リガンド（４−１ＢＢＬ）との結合により三量体化することによって、シグナル伝達を仲介する。
【０００５】
４−１ＢＢは通常、活性化依存性であり、活性化ＮＫおよびＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、刺激されたマスト細胞、分化したミエロイド細胞、単球、好中球および好酸球を包含する免疫細胞において広く存在する。４−１ＢＢのイニシエーションが、細胞増殖、生存性およびサイトカイン産生を高めうることが研究により示されている。
【０００６】
４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体は、多くのモデルにおいて共刺激分子の発現を高め、細胞溶解性Ｔリンパ球の反応を顕著に高め、それによって抗腫瘍効果をもたらす。一方、腫瘍モデルにおいて、４−１ＢＢを標的とする単独療法および併用療法による持続的な抗腫瘍防御Ｔ細胞メモリー反応も観察されている。
【０００７】
４−１ＢＢに関する医学的要求は未だ満たされていないので、複数の国際的製薬会社が４−１ＢＢに対するモノクローナル抗体を鋭意開発中である。関連する特許には、ＷＯ２００００２９４４５、ＷＯ２００５０３５５８４、ＷＯ２０１２０３２４３３、ＷＯ２００３０４９７５５、ＷＯ２０１７２０５７４５Ａ等がある。これまでに、Bristol-Myers Squibb（BMS）およびPfizerの抗４−１ＢＢ抗体が第Ｉ／ＩＩ相臨床試験に付されており、Pierisの同様の生成物が第Ｉ相臨床試験に付されている。
【０００８】
本願は、４−１ＢＢおよびその経路を刺激して免疫活性化をもたらすことによる癌処置において使用するための、親和性が高く、選択性が高く、生物学的活性の高い抗４−１ＢＢ抗体、ならびにその医薬、組成物および方法を提供するものである。
【発明の概要】
【０００９】
本願は、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択される少なくとも１つのＬＣＤＲを含む抗体軽鎖可変領域；および
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号４５からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲを含む抗体重鎖可変領域；
を含む、抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１０】
本願の前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントの一態様において、抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。
【００１１】
本願の前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントの一態様において、抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。
【００１２】
本願の前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントの一態様において、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３、配列番号４５および配列番号５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むか、またはそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００１３】
本願の前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントの一態様において、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００１４】
本願の前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントの一態様において、抗体軽鎖可変領域は、
それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
それぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含み；抗体重鎖可変領域は、
それぞれ配列番号３、配列番号４５および配列番号５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
それぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３
を含む。
【００１５】
本願の一態様において、抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の任意の１つから選択されうる：
（１）抗体軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；抗体重鎖可変領域が、それぞれ配列番号３、配列番号４５および配列番号５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む；または
（２）抗体軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；抗体重鎖可変領域が、それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００１６】
本願の一態様において、抗体軽鎖可変領域の配列は配列番号２のものであり、重鎖可変領域の配列は配列番号１のものである。
【００１７】
本願の一態様において、抗体軽鎖可変領域の配列は配列番号１０で示され、重鎖可変領域の配列は配列番号９で示される。
【００１８】
本願はまた、
それぞれ配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；および
それぞれ配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域
を含む、抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１９】
本願はまた、軽鎖可変領域ＬＣＶＲが配列番号３８のものであり、重鎖可変領域ＨＣＶＲが配列番号３７のものである、抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２０】
本願の一態様において、前記の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスの抗体またはそのフラグメントである。
【００２１】
本願の一態様において、前記マウス抗体またはそのフラグメントの抗体軽鎖可変領域は、マウスκ、λ鎖の軽鎖ＦＲ領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００２２】
本願の一態様において、前記マウス抗体またはそのフラグメントは、マウスκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００２３】
本願の一態様において、前記マウス抗体またはそのフラグメントの重鎖可変領域は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖ＦＲ領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００２４】
本願の一態様において、前記マウス抗体またはそのフラグメントは、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００２５】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体またはそのフラグメントである。
【００２６】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢキメラ抗体またはそのフラグメントは、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００２７】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢキメラ抗体またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００２８】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはそのフラグメントである。
【００２９】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはそのフラグメントである。
【００３０】
前記抗４−１ＢＢヒト抗体またはそのフラグメントの一態様において、ヒト化抗体の軽鎖は配列番号１８のものまたはそのバリアントであり、バリアントは軽鎖において０〜１０個のアミノ酸変異を含む。重鎖配列は配列番号１７のものまたはそのバリアントであり、バリアントは重鎖において０〜１０個のアミノ酸変異を含む。
【００３１】
前記抗４−１ＢＢヒト抗体またはそのフラグメントの一態様において、ヒト化抗体の軽鎖は配列番号２０のものまたはそのバリアントであり、バリアントは軽鎖において０〜１０個のアミノ酸変異を含む。重鎖配列は配列番号１９のものまたはそのバリアントであり、バリアントは重鎖において０〜１０個のアミノ酸変異を含む。
【００３２】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢキメラ抗体またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の定常領域またはそのバリアントをさらに含み、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域を含む。
【００３３】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはそのフラグメントである。
【００３４】
前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの一態様において、ヒト化抗体軽鎖可変領域は、ヒトκ、λ鎖の軽鎖ＦＲ領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００３５】
前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの一態様において、ヒト化抗体軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ領域配列は、配列番号２２のヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧｋＶ３−１１配列に由来するか、または配列番号２４のヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧｋＶ４−１配列に由来する。
【００３６】
前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの一態様において、ヒト化抗体軽鎖可変領域配列は、配列番号３０もしくは配列番号３６のもの、またはそのバリアントである。
【００３７】
前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの一態様において、ヒト化抗体軽鎖配列は、配列番号１８もしくは配列番号２０のもの、またはそのバリアントである。
【００３８】
前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの一態様において、ヒト化抗体軽鎖可変領域のバリアントは、好ましくは、軽鎖可変領域中に０〜１０（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）個のアミノ酸変異を有し；より好ましくは、アミノ酸位置４、４７および６２またはその任意の組み合わせにおいてアミノ酸変異を有し；より好ましくは、Ｍ４Ｌ、Ｐ４７Ａ、Ｖ６２Ｉ変異またはその任意の組み合わせ、より好ましくはＰ４７ＡおよびＶ６２Ｉ変異、Ｍ４ＬおよびＶ６２Ｉ変異を有する
【００３９】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントは、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００４０】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントのヒト化抗体重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖ＦＲ領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００４１】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域は、配列番号２１のヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ３−３０配列に由来するか、または配列番号２３のヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１−４６配列に由来する。
【００４２】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントのヒト化抗体重鎖可変領域は、配列番号２７もしくは配列番号３３のもの、またはそのバリアントである。
【００４３】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントのヒト化抗体重鎖は、配列番号１７もしくは配列番号１９のもの、またはそのバリアントであり、バリアントは好ましくは、重鎖可変領域中に０〜１０個のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸位置４８、５３、７５、９５もしくは１１２またはその任意の組み合わせにおいてアミノ酸変異を有し、より好ましくは、Ｍ４８Ｉ、Ｅ５３Ｄ、Ａ７５Ｓ、Ｙ９５Ｆ、Ｑ１１２Ｔ／Ｒ１１２Ｑまたはその任意の組み合わせ、より好ましくはＥ５３Ｄ、Ａ７５ＳおよびＲ１１２Ｑ、より好ましくはＭ４８Ｉ、Ｙ９５ＦおよびＱ１１２Ｔを有する。
【００４４】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントは、さらにヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントを含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖ＦＲ領域を含み、より好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖ＦＲ領域を含む。
【００４５】
本願の一態様において、軽鎖および重鎖を含み、
重鎖が、配列番号２５、２６、２７、３１、３２および３３からなる群から選択される重鎖可変領域を含み、
軽鎖が、配列番号２８、２９、３０、３４、３５および３６からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、
抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
【００４６】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの軽鎖可変領域は配列番号３６のものであり、重鎖可変領域は配列番号３３のものである。
【００４７】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの軽鎖可変領域は配列番号３０のものであり、重鎖可変領域は配列番号２７のものである。
【００４８】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの軽鎖は配列番号２０のものであり、重鎖は配列番号１９のものである。
【００４９】
本願の一態様において、前記抗４−１ＢＢヒト化抗体またはそのフラグメントの軽鎖は配列番号１８のものであり、重鎖は配列番号１７のものである。
【００５０】
前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントの一態様において、抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、リニア（linear）抗体、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、ペプチボディ（peptibody）、ドメイン抗体および多重特異性抗体（二重特異性抗体、ディアボディ、トリアボディおよびテトラボディ、タンデム ジ−ｓｃＦｖ、タンデム トリ−ｓｃＦｖ）である。
【００５１】
本願はさらに、４−１ＢＢまたはそのエピトープとの結合を前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５２】
本願はさらに、前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。
【００５３】
本願はさらに、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供し、発現ベクターはウイルスベクターであり得、ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスでありうる。
【００５４】
本願はさらに、前記発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。
【００５５】
本願の一態様において、前記宿主細胞は細菌、好ましくは大腸菌である。
【００５６】
本願の一態様において、前記宿主細胞は酵母、好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。
【００５７】
本願の一態様において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。
【００５８】
本願はまた、前記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む多重特異性抗体を提供する。
【００５９】
本願はまた、前記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む一本鎖抗体を提供する。
【００６０】
本願はまた、前記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。抗体−薬物コンジュゲートは、抗体−リンカー−薬物（毒素）を連結することによって形成される。よく知られているリンカーとしては、切断可能なリンカー、非切断可能なリンカー、例えばＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ等があるが、それに限定されない。毒素も当分野においてよく知られており、その例には、ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ等がある。
【００６１】
本願はまた、抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、前記宿主細胞において抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるステップ、および宿主細胞から抗体またはその抗原結合フラグメントを単離するステップを含む方法を提供する。
【００６２】
本願はさらに、前記抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００６３】
本願はさらに、医薬の製造における、
本願の抗４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメント、本願の医薬組成物、および本願の抗体−薬物コンジュゲート
の任意の１つまたは組み合わせの使用を提供し；ここで、医薬は４−１ＢＢまたは４−１ＢＢＬが仲介する疾患または状態の治療または予防のためのものであり；疾患は好ましくは癌であり；癌は最も好ましくは、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸部癌、甲状腺癌、食道癌、子宮頸癌、肉腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、胆嚢癌および膠芽腫からなる群から選択される。
【００６４】
本願はさらに、４−１ＢＢまたは４−１ＢＢＬが仲介する疾患または状態の治療または予防のための方法であって、本願の抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本願の医薬組成物、または本願の抗体−薬物コンジュゲートを治療または予防に有効な量で対象に投与することを含む方法を提供し；ここで、疾患は好ましくは癌であり；癌は最も好ましくは、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸部癌、甲状腺癌、食道癌、子宮頸癌、肉腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、胆嚢癌および膠芽腫からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】各ハイブリドーマからの被験抗４−１ＢＢマウス抗体がいずれも、ヒト４−１ＢＢ−ｈｉｓに効果的に結合することを示す、マウス抗体のインビトロ キャプチャーＥＬＩＳＡアッセイ。
【図２】４−１ＢＢＬリガンドをブロックするマウス抗体のＥＬＩＳＡアッセイ。結果は、Ｂ１Ｅ７およびＢ１Ａ７抗体はリガンドをブロックし、Ｂ１Ｅ１０および２つの参照抗体はブロックしないことを示した。
【図３】マウス抗体の４−１ＢＢレポーター遺伝子活性化アッセイ。活性化の強度がＢ１Ｅ１０＞ＭＯＲ７４８０参照抗体＞Ｂ１Ｅ７＞Ｂ１Ａ７の順であることが示される。
【図４】２つのヒト化抗体のＰＢＭＣ細胞増殖機能活性化アッセイ。結果は、活性化強度は、ｈｕＢ１Ｅ７およびｈｕＢ１Ｅ１０が参照抗体ＭＯＲ７４８０よりも高く、ｈｕＢ１Ｅ７はより高いことを示す。
【図５】ヒト化抗体の４−１ＢＢレポーター遺伝子活性化アッセイ。結果は、活性化の強度が、マウス抗体と一致して、Ｂ１Ｅ１０＞ＭＯＲ７４８０参照抗体＞Ｂ１Ｅ７の順であることを示した。
【図６】ＭＣ３８大腸癌細胞が移植されたｈｕ４−１ＢＢトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、各被験抗４−１ＢＢ抗体の投与後の腫瘍増殖曲線。
【図７】ＭＣ３８大腸癌細胞が移植されたｈｕ４−１ＢＢトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスの、各被験抗４−１ＢＢ抗体の投与後の体重変化曲線。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
１．用語
本発明のより容易な理解のために、以下、いくつかの技術用語および科学用語を定義する。本書において用いられる他の技術用語および科学用語はいずれも、本書のどこかで特に定義されない限り、本発明が属する分野の通常の技術を有する者が通常理解する意味を有する。
【００６７】
本書において用いられるアミノ酸の１文字コードおよび３文字コードは、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558に記載されるものである。
【００６８】
本書において用いられる用語「抗体」は、２つの同じ重鎖および２つの同じ軽鎖のジスルフィド結合による連結によって形成される４ペプチド鎖構造である免疫グロブリンをさす。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は異なるアミノ酸組成および配列順序を示し、それによって異なる種類の抗原性を示す。したがって、免疫グロブリンは５つのカテゴリー、いわゆる免疫グロブリンアイソタイプ、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥに分類することができ、それらの重鎖はそれぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。そのヒンジ領域のアミノ酸組成ならびに重鎖ジスルフィド結合の数および位置にしたがって、同じ種類のＩｇを異なるサブカテゴリーに分類することができ、例えば、ＩｇＧをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、定常領域の違いによりκまたはλ鎖に分類することができる。５つのＩｇのそれぞれがκまたはλ鎖を有しうる。
【００６９】
本願において、本書に記載される抗体軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域をさらに含み、これは、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖またはそのバリアントを含む。
【００７０】
本発明において、本書に記載される抗体重鎖可変領域は、重鎖定常領域をさらに含み、これは、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、２、３、４またはそのバリアントを含む。
【００７１】
抗体重鎖および軽鎖配列のＮ末端側において、約１１０アミノ酸の配列が大きく異なり、可変領域（Ｖ領域）と称される。残りのＣ末端側のアミノ酸配列は比較的一定で、定常領域（Ｃ領域）と称される。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）、および比較的保存された配列を有する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）およびそれぞれの重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）が、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、その並びは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４である。３つの軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３をいい、３つの重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３をいう。本書に記載される抗体または抗原結合フラグメントのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号および位置は、知られているＫａｂａｔナンバリング基準に対応するか（ＬＣＤＲ１〜３、ＨＣＤＲ２〜３）、またはｋａｂａｔおよびｃｈｏｔｈｉａ（ＡＢＭ）ナンバリング基準に対応する（ＨＣＤＲ１）。
【００７２】
用語「組換えヒト抗体」は、組換え法により調製、発現、作製または単離されたヒト抗体を包含し、これに関する技術および方法は当分野においてよく知られており、例えば、
（１）ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニックもしくはトランスクロモソーマル動物（例えばマウス）またはそれから作製されるハイブリドーマから単離される抗体；
（２）抗体を発現する遺伝子導入宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離される抗体；
（３）組換えコンビナトリアル ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体；および
（４）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、別のＤＮＡ配列等へのスプライシングにより調製、発現、作製または単離される抗体
である。
【００７３】
そのような組換えヒト抗体は、可変領域および定常領域を含み、そのような領域は、生殖細胞系列遺伝子によりコードされる特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を伴い、また、抗体成熟中に起こるような後からの再構成および変異をも伴う。
【００７４】
本願において用語「マウス抗体」とは、ヒト４−１ＢＢまたはそのエピトープに対するモノクローナル抗体をさし、これは当分野における知識および技術にしたがって調製される。調製に際し、試験対象に４−１ＢＢ抗原を注射し、次いで、所望の配列または機能的特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離する。本願の一態様において、マウス４−１ＢＢ抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含むか、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００７５】
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を有する可変および定常領域を有する抗体を包含する。本願のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含みうる（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的変異導入によって、またはインビボで体細胞突然変異によって導入される変異）。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、他の哺乳動物種の生殖細胞系列（例えばマウス生殖細胞系列）に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体（すなわち、「ヒト化抗体」）を包含しない。
【００７６】
用語「ヒト化抗体」は、ＣＤＲグラフト抗体とも称されるが、ヒト抗体の可変領域フレームワークにマウスＣＤＲ配列をグラフトすることによって作製される抗体をさす。ヒト化抗体は、多量のマウスタンパク質成分を含むキメラ抗体によって誘導される強い抗体反応を克服する。免疫原性低下に伴う活性低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域は活性を維持するための最小限の復帰変異に付される。
【００７７】
用語「キメラ抗体」とは、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を融合することによって形成される抗体をさし、キメラ抗体はマウス抗体により誘導される免疫反応を低減することができる。キメラ抗体を確立するために、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に確立し、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローン化し、次いで所望によりヒト抗体の定常領域遺伝子をクローン化し、マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と連結してキメラ遺伝子を形成し、これをヒトベクターに挿入することができ、最後に、真核生物または原核生物の生産系においてキメラ抗体分子を発現させる。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアント、好ましくはヒトＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域、またはアミノ酸変異によりＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）を示さないＩｇＧ１のそれから選択される。
【００７８】
本書において「抗原結合フラグメント」とは、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびヒト４−１ＢＢに結合するＦｖフラグメント、ｓＦｖフラグメントをさす。Ｆｖフラグメントは、すべての抗原結合部位を有する最小の抗体フラグメントで、重鎖可変領域、軽鎖可変領域を含むが定常領域を含まない。一般に、Ｆｖ抗体は、ＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、抗原結合のために必要な構造を形成することができる。また、２つの抗体の可変領域を連結して、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）と称されるポリペプチドを形成するために、異なるリンカーを使用することができる。
【００７９】
本書において「４−１ＢＢに結合する」とは、ヒト由来でありうる４−１ＢＢまたはそのエピトープと相互作用する能力をさす。本書において用いられる用語「抗原結合部位」とは、本願の抗体または抗原結合フラグメントによって認識される、抗原上の不連続な三次元部位をさす。
【００８０】
用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンまたは抗体に特異的に結合する抗原上の部位をさす。エピトープは、隣接するアミノ酸によって、またはタンパク質の三次折り畳みによって近接させられた非隣接アミノ酸によって、形成されうる。隣接アミノ酸によって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への暴露後に保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒での処理後に失われる。エピトープは典型的には、独特の立体コンフォメーションにおいて少なくとも３〜１５アミノ酸を含む。特定の抗体によって結合されたエピトープを決定する方法は、当分野においてよく知られており、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイ等が含まれる。エピトープの立体コンフォメーションを決定する方法は、当分野における技術および本書に記載される技術、例えばＸ線結晶学および二次元核磁気共鳴を包含する。
【００８１】
本書において「特異的に結合する」、「選択的に結合する」は、予め決定された抗原上のエピトープへの抗体の結合をいう。典型的には、抗体は、予め決定された抗原またはそのエピトープに、およそ１０−７Ｍまたはそれ以下よりも小さい平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、予め決定された抗原またはそのエピトープに結合する抗体の親和性は、予め決定された抗原（またはそのエピトープ）以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ）に結合する場合、または関連性の高い抗原に結合する場合と比較して、組換えヒト４−１ＢＢまたはそのエピトープをアナライトとし抗体をリガンドとして使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術による装置において測定したとき、少なくとも２倍高い。本書において、用語「抗原を認識する抗体」は、用語「特異的に結合する抗体」と互換的に使用されうる。
【００８２】
用語「交差反応」とは、異なる種に由来する４−１ＢＢに結合する本願の抗体の能力をいう。例えば、ヒト４−１ＢＢに結合する本願の抗体は、他の種に由来する４−１ＢＢにも結合することができる。交差反応性は、精製された抗原との特異的反応性を結合アッセイ（例えば、ＳＰＲまたはＥＬＩＳＡ）において検出することによって、または生理学的に４−１ＢＢを発現する細胞との結合もしくは機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を測定する方法は、本書に記載されるような標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴分析、またはフローサイトメトリーを包含する。
【００８３】
用語「阻害」または「遮断」は、互換的に使用され、部分的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。４−１ＢＢの阻害／遮断は、好ましくは、阻害または遮断なく４−１ＢＢに結合したときに生じる正常なレベルまたは種類の活性を低下または変化させる。阻害および遮断はまた、抗４−１ＢＢ抗体が不存在の場合と比較した、抗４−１ＢＢ抗体との接触の際の４−１ＢＢへの結合親和性の測定可能な低下を包含することが意図される。
【００８４】
「増殖を阻害する」（例えば細胞に関して）という表現は、細胞増殖の測定可能な低下を包含することが意図される。
【００８５】
「免疫反応を誘導する」および「免疫反応を高める」という表現は互換的に使用され、特定の抗原の刺激に対する免疫反応（すなわち、受動または適応）をいう。ＣＤＣまたはＡＤＣＣに関して、「誘導する」とは、直接に細胞を殺す特定のメカニズムを刺激することをいう。
【００８６】
本書において、用語「ＡＤＣＣ」、すなわち抗体依存性細胞介在性細胞傷害とは、Ｆｃ受容体を発現する細胞が、抗体で覆われた標的細胞を、抗体Ｆｃセグメントを認識することによって直接に殺すことをいう。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃセグメントの改変によって低下または喪失されうる。改変とは、抗体重鎖定常領域の変異、例えばＩｇＧ１におけるＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；ＩｇＧ２／４キメラ；ＩｇＧ４におけるＦ２３５ＥまたはＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａ変異から選択される変異をさす。
【００８７】
抗体および抗原結合フラグメントを生産および精製する方法は、当分野でよく知られており、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Chapter 5-8 and 15に記載されている。例えば、マウスをヒト４−１ＢＢまたはそのフラグメントで免疫し、生じた抗体を、当分野でよく知られる通常の方法を用いて再生（renature）、精製およびシーケンスすることができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法で調製することができる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、１つまたはそれ以上のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を非ヒト由来ＣＤＲに付加するように組換えられる。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ImMunoGeneTics（IMGT）からウェブサイトhttp://imgt.cines.frを通じて、またはThe Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351から得ることができる。
【００８８】
本発明の組換え抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法で調製および精製しうる。例えば、重鎖（配列番号１７）および軽鎖（配列番号１８）をコードするｃＤＮＡ配列をクローン化し、ＧＳ発現ベクター中に組換えうる。次いで、組換えた免疫グロブリン発現ベクターで、ＣＨＯ細胞を安定にトランスフェクトしうる。当分野でよく知られる、より推奨される方法として、哺乳動物発現系は、典型的にはＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端において、抗体のグリコシル化をもたらしうる。ヒト抗原に特異的に結合する抗体の発現から、安定なクローンが得られうる。陽性のクローンを、バイオリアクター中で抗体生産のために無血清培養培地において増殖しうる。抗体が分泌されている培養培地を、従来の方法で収集および精製しうる。抗体を、一般的な技術を用いて濾過および濃縮に付しうる。分子篩またはイオン交換を包含する一般的技術によって、可溶性混合物およびマルチマーを効果的に除去しうる。得られた生成物は、直ちに冷凍、例えば−７０℃に冷凍するか、または凍結乾燥しうる。
【００８９】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。本書においてモノクローナル抗体またはｍＡｂとは、真核生物、原核生物またはファージクローンを包含するがそれに限定されない単一のクローンに由来する抗体をさす。モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントは、例えばハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えばＣＤＲグラフト）、または当分野で知られる他の技術によって組換えられうる。
【００９０】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に対する「投与」および「処置」とは、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に、外来の医薬、処置、診断剤または組成物を接触させることをいう。「投与」および「処置」は、例えば、治療、薬物動態学、診断、研究および実験の方法をさしうる。細胞の処置は、薬剤を細胞と接触させること、および薬剤を細胞と接触している流体と接触させることを包含する。「投与」および「処置」は、インビトロおよびエクスビボの処置、例えば細胞の、薬剤、診断、結合組成物または他の細胞によるインビトロおよびエクスビボの処置をも意味する。ヒト、動物または研究対象に対する「処置」は、治療処置、予防または抑制手段、研究および診断適用をさす。
【００９１】
「処置する」とは、処置剤（例えば、本発明の任意の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物）を、該処置剤が処置活性を示すことがわかっている１つまたはそれ以上の疾患症状を患っているか、患っている可能性があるか、または患う傾向のある対象に、内用または外用で投与することを意味する。典型的には、処置剤は、処置される対象または集団において１つまたはそれ以上の疾患症状を、その回復を臨床的に測定可能な程度に誘導するかまたはその進行を臨床的に測定可能な程度に抑制することによって、軽減するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な処置剤の量（「処置有効量」とも称する）は、対象の疾患の状態、年齢および体重、および対象において所望の反応を引き起こす薬剤の能力といった因子によって異なりうる。疾患症状が軽減されたかは、該症状の重篤度または進行状態を評価するために医師または他の熟練ヘルスケア提供者により通常用いられる任意の臨床的測定によって評価することができる。本願のある一つの態様（例えば、ある処置方法または製造物品）は、関心の疾患症状の軽減においてすべての対象において有効ではないかもしれないが、それは、当分野で知られる任意の統計学的検定法、例えばスチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン-ホイットニーのＵ検定、クラスカル-ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール-タプストラ検定、およびウィルコクソン検定によって評価されるとき、関心の標的疾患症状を、統計学的に有意な数の対象において軽減するべきである。
【００９２】
「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を改善または抑制するのに十分な量を包含する。有効量は、診断を可能にするかまたは促進するのに十分な量をも意味する。ある特定の対象または動物対象に対する有効量は、処置される状態、対象の全身的健康状態、投与経路および投与量、ならびに副作用の強さ、といった因子によって異なりうる。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を回避する最大の投与量または投与プロトコルであることができる。
【００９３】
「外来」とは、文脈に応じて、生物、細胞または人体の外で産生される物質をさす。「内因」とは、文脈に応じて、細胞、生物または人体の内部で産生される物質をさす。
【００９４】
「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド間の配列類似性をさす。比較される２つの配列において、ある１つの位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマー単位で占められているとき、例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれにおいて、ある１つの位置がアデニンで占められている場合、それら分子は該位置において相同である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列間でマッチするまたは相同である位置の数を比較される位置の数で除して１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列を最適にアラインしたときに配列の１０の位置のうちの６がマッチするまたは相同である場合、２つの配列間の同一性は６０％である。通常、比較は、２つの配列が、同一性パーセントが最大となるようにアラインされたときに行われる。
【００９５】
本書において用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は互換的に使用され、いずれもその子孫を包含する。したがって、「形質転換体」および「形質転換された細胞」は、初代の対象細胞、および継代数を問わず、それに由来する培養物を包含する。また、意図的な変異またはランダム変異のため、子孫は必ずしも、ＤＮＡの内容において正確に同一でなくてもよいと理解される。元の形質転換細胞と同じ機能または生物学的活性を有する、スクリーニングによって得られる変異体子孫もまた意図される。用語の区別が意図される場合、それは文脈から明らかになる。
【００９６】
「任意の」または「任意に」とは、それに係る事象または状況が起こるかもしれないが必ずしも起こらないことを意味し、その記載は、事象または状況が起こる場合または起こらない場合を包含する。例えば、「任意に１〜３の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在しうるが必ずしも存在しないことを意味する。
【００９７】
「医薬組成物」とは、１つもしくはそれ以上の本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはその他の化学的成分との生理学的／薬学的に許容しうる塩もしくはプロドラッグと、さらなる成分、例えば生理学的／薬学的に許容しうる担体および賦形剤との混合物を含むものをさす。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収を促進し、それによって生物学的効果を発揮することを目的とするものである。
【００９８】
以下、本発明を実施例を参照してさらに説明するが、本発明の範囲はそれに限定されない。本発明の実施例において、特定の条件を記載していない場合、実験は全般に、Antibodies, A Laboratory Manualand Molecular Cloning Manual, by Cold Spring Harborに記載されるような通常の条件下に、または材料もしくは製品の製造者によって提示される条件下に行われる。試薬の入手先を特定していない場合、該試薬は通常市販される試薬である。
【実施例１】
【００９９】
抗体の調製
マウスを免疫することにより、抗ヒト４−１ＢＢモノクローナル抗体ライブラリーを作成した。実験には、８週齢のＢａｌＢ／ＣおよびＡ／Ｊ株の雌マウス（Comparative Medical Center of Yangzhou University, animal production license number: SCXK (Su) 2017-007）を使用した。飼育環境：ＳＰＦレベル。マウスを購入後、動物を、１２／１２時間の明暗サイクル、２０〜２５℃の温度、４０〜６０％の湿度の実験室内に１週間維持した。
【０１００】
免疫用の抗原は、Acro Biosystemsから購入したＦｃタグ付きのヒト４−１ＢＢ組換えタンパク質（ヒト４−１ＢＢ−Ｆｃ）（Cat No #41B-H5258: expressed in HEK293, AA Gln 25-Gln 186 (http://www.acrobiosystems.cn/P150-Human_4-1BB_%7CTNFRSF9_ProteinC-Fc_TagHEK293_expressed.html; Accession number #NP_001552.2)）であった。抗原をフロイントアジュバント（Sigma, Cat No: F5881/F5506）で乳化した：初回の免疫は完全フロイントアジュバントを用いて行い、それ以外の追加免疫は不完全フロイントアジュバントを用いて行った。抗原とアジュバントとの比は１：１とし、各免疫のために２５μｇタンパク質／２００μｌ／マウスを注射した。乳化した抗原を、複数の部位における皮下注射（通例、背中の６〜８部位）、および前足裏の単一部位における注射により、０、２１、３５および４９日目（初回免疫および３回の追加免疫）に接種した。最終の追加免疫を、し、すなわち、ある時点での対象群に対する処置群の腫瘍体積または腫瘍重量のパーセンテージを意味する。ＴおよびＣはそれぞれ、ある特定の時点での処置群の腫瘍体積（ＴＶ）または腫瘍重量（ＴＷ）、およびＩｇＧ１対象群の腫瘍体積（ＴＶ）または腫瘍重量（ＴＷ）である。５０μｇタンパク質／マウスで、生理食塩液を用いて調製した抗原溶液を腹腔内（ＩＰ）注射することにより、脾細胞融合の３日前に行った。
【０１０１】
４２および５６日目に、免疫したマウスから採血し、抗血清を単離した。マウス血清の抗体価を決定するため、および４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬ結合の阻害における中和活性を決定するために、マウス血清を実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法に付した。
【０１０２】
４回目の免疫の後、血清抗体価がより高く、４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬ阻害活性がより高いマウスを、脾細胞融合のために選択した。脾臓リンパ球をミエローマ細胞Ｓｐ２／０細胞（ATCC（登録商標）CRL-8287（商標））と、最適化したＰＥＧ仲介融合手順を用いて融合し、次いで、融合細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＨＡＴ培地中で、ハイブリドーマ細胞の増殖が見られるまで１０〜１４日間培養した。細胞融合から約２週間後、ハイブリドーマ培養培地の４−１ＢＢ組換えタンパク質に対する結合反応性を、実施例２に記載の間接ＥＬＩＳＡアッセイによって検出し、陽性のハイブリドーマ細胞上清は、４−１ＢＢ組換えタンパク質を認識し結合することができた。
【０１０３】
一次スクリーニングで特定した４−１ＢＢ陽性ハイブリドーマ細胞を採り、新たな９６ウェルプレートに移し、融合プレートの位置にしたがって番号付けした。さらに３〜４日間培養後、培養上清を採取し、陽性ウェルを再度確認するために、試験実施例１に記載の間接ＥＬＩＳＡアッセイに付した。培養培地を採取後、培地を補充した。陽性のウェルについて、活性化された抗４−１ＢＢ抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を選択するための、３〜４日後の細胞ベースの機能スクリーニングのために、上清を再度採取した。機能スクリーニング手順を簡単に述べると、次のとおりであった：対数増殖期にある４−１ＢＢレポーターを有する細胞株（HEK293F-h4-1BB-NFkb）を採取し、９６ウェルプレートに２０μｌ／ウェルの体積（およそ１００００個の細胞を含む）で播種する。マウスＦｃ特異的二次抗体（終濃度１５ｎＭ、上清抗体の架橋結合用）および６０μｌの試験する細胞上清または抗体液を加え、５時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性をONE-Glo（商標）Luciferase Assay System（Promega, E6120）を用いて測定し、測定値にしたがって、その抗４−１ＢＢ抗体が活性化された初代ハイブリドーマ細胞を選択する。本試験において、抗体ウレルマブ（BMS）およびＭＯＲ７４８０（Pfizer）を陽性参照として使用し、ｈＩｇＧを陰性参照として使用した。上位１７のハイブリドーマのスクリーニングデータを次表に示す。
【０１０４】
【表１】
2021510533.tif 000002
【０１０５】
３つの最も好ましい元のハイブリドーマ細胞を、２ラウンドのサブクローニングで限外希釈して、モノクローナル細胞株を得（Ｂ１Ｅ１０、Ｂ１Ｅ７およびＢ１Ａ７）、これを次いでクローン化し、シーケンスした。従来のＲＮＡ抽出技術によって全細胞ＲＮＡを得、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってモノクローナル抗体可変領域のＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離および回収し、遺伝子ベクター中にクローン化し、大腸菌に導入した。複数の形質転換コロニーをランダムに選択し、遺伝子シーケンシング用にモノクローナル抗体可変領域を増幅するためにＰＣＲ増幅に付した。
【０１０６】
マウスｍＡｂ Ｂ１Ｅ１０の重鎖および軽鎖可変領域配列は、次のとおりであった：
2021510533.tif 000003
【０１０７】
これは下記のＣＤＲ配列を含む。
【表２】
2021510533.tif 000004
【０１０８】
マウスｍＡｂ Ｂ１Ｅ７の重鎖および軽鎖可変領域配列は、次のとおりであった：
2021510533.tif 000005
【０１０９】
これは下記のＣＤＲ配列を含む。
【表３】
2021510533.tif 000006
【０１１０】
マウスｍＡｂ Ｂ１A７の重鎖および軽鎖可変領域配列は、次のとおりであった：
2021510533.tif 000007
【０１１１】
これは下記のＣＤＲ配列を含む。
【表４】
2021510533.tif 000008
【実施例２】
【０１１２】
ＥＬＩＳＡアッセイによる抗体の確認およびスクリーニング
１．インビトロ間接ＥＬＩＳＡによる結合アッセイ
ヒト４−１ＢＢ−Ｆｃタンパク質を炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルの量で入れ、３７℃のインキュベーター内に２時間置いた。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Tween-20を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１回洗い、ＰＢＳＴで希釈した５％スキムミルク（スキムミルク粉末、Bright Dairy）ブロッキング液を２００μｌ／ウェルで加え、３７℃で２時間、または４℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートしてブロックした。ブロッキング完了後、ブロッキング液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液で４回洗った。
【０１１３】
試験するマウス血清（または抗体、細胞培養上清）を、５％ＮＨＳを含むサンプル希釈液（ＰＢＳＴ中２．５％スキムミルク）でさまざまな濃度に希釈し（すなわち、正常ヒトＩｇＧの終濃度は１ｍｇ／ｍｌ）、室温で４０分間インキュベートし、マイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗い、ＰＢＳＴで希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体（Jackson Immuno Research, cat #115-036-071）を１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で４０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗い、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（Huzhou Innoreagents Biotechnology Co., Ltd.）を加え、暗所にて室温で１０〜１５分間インキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Beijing Prang New Technology Co., Ltd., Model DNM-9602）により４５０ｎｍで吸光度を測定し、得られたデータを分析した。
【０１１４】
２．インビトロ キャプチャーＥＬＩＳＡによる結合アッセイ
ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Jackson Immuno Research, cat #115-006-071）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、１００μｌ／ウェルの量で９６ウェルマイクロタイタープレートに入れ、３７℃のインキュベーター内に２時間置いた。プレートをＰＢＳＴで１回洗い、ＰＢＳＴで希釈した５％スキムミルク（スキムミルク粉末、Bright Dairy）ブロッキング液を２００μｇ／ウェルの量で加え、３７℃で２時間、または４℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートしてブロックした。ブロッキング完了後、ブロッキング液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで４回洗った。
【０１１５】
試験するマウス血清または抗体を、５％ＮＨＳサンプル希釈液（ＰＢＳＴ中２．５％スキムミルク）でさまざまな濃度に希釈し、室温で４０分間インキュベートし、プレートに１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗い、サンプル希釈液で希釈したビオチン化４−１ＢＢ−ｈｉｓタンパク質（Sinobiological, Beijing #10041-H08H）を１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗い、ＰＢＳＴで希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Jackson Immuno Research, cat#016-030-084）を１００μｌ／ウェルの量で加え、３７℃で４０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗い、ＴＭＢ発色基質（Huzhou Innoreagents Biotechnology Co., Ltd.）を１００μｌ／ウェルの量で加え、暗所にて室温で１０〜１５分間インキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Beijing Prang New Technology Co., Ltd., Model DNM-9602）により４５０ｎｍで吸光度を測定し、得られたデータを分析した。３つのハイブリドーママウス抗体ならびにPfizerの参照抗体ＭＯＲ７４８０およびＢＭＳの参照抗体ウレルマブのキャプチャーＥＬＩＳＡの結果を、図１に示す。ＥＣ５０値を次表に示す。
【０１１６】
【表５】
2021510533.tif 000009
【０１１７】
３．抗体による４−１ＢＢの４−１ＢＢＬへの結合の阻害のＥＬＩＳＡアッセイ
４−１ＢＢリガンド（すなわち、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー９、ＴＮＦＳＦ９）は、Ｔ細胞表面上の４−１ＢＢに結合することができ、陽性共刺激シグナルとしてＴ細胞免疫機能を活性化することができる。本アッセイにおいて、選択した抗ヒト４−１ＢＢ抗体を、ヒト４−１ＢＢタンパク質のヒト４−１ＢＢリガンドへの結合を阻害する能力について、インビトロ阻害アッセイとして試験した。
【０１１８】
具体的には、ヒト４−１ＢＢ−ｈｉｓタンパク質を９６ウェルプレート上にコートし、抗ヒト４−１ＢＢ抗体（またはマウス血清）を加えてインキュベートし、ヒト４−１ＢＢＬ−Ｆｃタンパク質を加え、インキュベートし、洗った。プレート底部にコートされた４−１ＢＢへの４−１ＢＢＬ−Ｆｃ結合の量を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Jackson Immuno Research, cat#109-036-098）により測定し、４−１ＢＢ活性エピトープをブロックする４−１ＢＢ抗体のＩＣ５０値を計算した。
【０１１９】
４−１ＢＢ−ｈｉｓタンパク質を炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルの量で入れ、３７℃のインキュベーター内に２時間置いた。プレートをＰＢＳＴで１回洗い、ＰＢＳＴで希釈した５％スキムミルク（スキムミルク粉末、Bright Dairy）ブロッキング液を２００μｌ／ウェルの量で加え、３７℃で２時間、または４℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートしてブロックした。ブロッキング完了後、ブロッキング液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液で４回洗った。
【０１２０】
試験するマウス血清または抗体および内部対照４−１ＢＢＬを、サンプル希釈液（ＰＢＳＴ中２．５％スキムミルク）でさまざまな濃度に希釈し、プレートに１００μｌ／ウェルで加え、３７℃のインキュベーター内で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗い、サンプル希釈液で希釈した０．８ｎｇ／ｍｌの４−１ＢＢＬ−Ｆｃ（Acro, #41L-H5257）を１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗い、ＰＢＳＴで希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Jackson Immuno Research, cat #109-036-098）を１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で４０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗い、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（Huzhou Innoreagents Biotechnology Co., Ltd.）を加え、暗所にて室温で１０〜１５分間インキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Beijing Prang New Technology Co., Ltd., Model DNM-9602）により４５０ｎｍで吸光度を測定し、得られたデータを分析した。３つのハイブリドーママウス抗体およびPfizerの参照抗体の４−１ＢＢＬブロッキングの結果を、図２に示す。ＥＣ５０値を次表に示す。
【０１２１】
【表６】
2021510533.tif 000010
【０１２２】
表からわかるように、Ｂ１Ｅ７およびＢ１Ａ７はいずれも、４−１ＢＢＬのエピトープを効果的にブロックするが、Ｂ１Ｅ１０、ＭＯＲ７４８０およびウレルマブは４−１ＢＢＬへの結合をブロックすることができない。
【実施例３】
【０１２３】
抗４−１ＢＢ組換えキメラ抗体の作成および発現
本願のマウス抗体Ｂ１Ｅ１０およびＢ１Ｅ７それぞれの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のＦＲ領域（フレームワーク領域）に、部位特異的アミノ酸変異を導入した。アミノ酸変異の異なる組み合わせによって、異なるヒト化抗体重鎖および軽鎖をデザインし、異なる軽鎖および重鎖の組み合わせを有するプラスミドを、ヒト化抗体産生のために細胞に導入した。
【０１２４】
重鎖ベクターを次のようにデザインした：シグナルペプチド＋変異した重鎖可変領域配列＋ヒトＩｇＧ１定常領域配列。軽鎖ベクターを次のようにデザインした：シグナルペプチド＋変異した軽鎖可変領域配列＋ヒトκ定常領域配列。前記配列をそれぞれｐＣＥＰ４ベクターに挿入した。ベクタープラスミドを確認した後、プラスミドを抽出し、確認のためのシーケンシングに付した。確認されたプラスミドを、ヒト２９３Ｆ細胞にＰＥＩを用いてトランスフェクトした。継続して培養された２９３Ｆ細胞を、無血清培地（Shanghai Aupmaxi, OPM-293CD03）中で対数増殖期に達するまで培養し、細胞トランスフェクションに使用した。ヒト化抗体軽鎖を含むプラスミド２１．４μｇおよびヒト化抗体重鎖を含むプラスミド２３．６μｇをOpti-MEM（登録商標）I Reduced Serum Medium（GIBCO, 31985-070）１０ｍｌに溶解し、よく混合した後、ＰＥＩを２００μｇ加え、ＲＴで１５分間インキュベートし、５０ｍｌの細胞に加えた。細胞培養条件；５％ＣＯ２、３７℃、１２５ｒｐｍ／分。培養中、補充物質を１日目および３日目に加え、細胞生存性が７０％未満になったら、細胞上清を採取し遠心分離した。遠心分離した細胞培養培地を、抗体精製アフィニティーカラムにロードし、リン酸緩衝液で洗い、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．７、０．１Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣｌ）で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ９．０）で中和し、リン酸緩衝液に対して透析して、最終的に精製されたキメラ抗体ＣｈＢ１Ｅ１０およびＣｈＢ１Ｅ７を得た。
【実施例４】
【０１２５】
抗４−１ＢＢ抗体のインビトロ細胞レポーターアッセイ
安定な細胞株ＨＥＫ２９３Ｆ−ｈ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ（Shanghai ChemPartner Chemistry）をＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地で解凍し、継代した細胞を９６ウェルプレートに４×１０３細胞／ウェルで播種した。各抗体（被験抗体、参照抗体、ＩｇＧ陰性対照等を含む）を、ある比で抗Ｆ（ａｂ’）２と混合し、連続希釈し、細胞培養インキュベーター内で３７℃で０．５時間インキュベートした。その後、抗体を細胞プレートに加え、インキュベーター内で５時間インキュベートし、細胞溶解のために検出バッファー１００μｌを加え、暗所にて室温で１０分間インキュベートした。Envisionで蛍光を測定し、活性−濃度曲線をプロットした。３つのマウス抗体のインビトロレポーターアッセイの結果を、図３に示す。Ｂ１Ｅ１０のレポーター測定値は、Pfizerの参照抗体ＭＯＲ７４８０のものよりも高かった。Ｂ１Ｅ７の値は、参照抗体のものよりもやや低かった。
【実施例５】
【０１２６】
組換え抗体のインビトロ結合親和性およびカイネティクス
Biacoreは、タンパク質の親和性およびカイネティクスを客観的に検出するためのよく知られた方法である。本発明者は、Biacore T200（GE）によって、本願の被験４−１ＢＢ抗体の特徴的な親和性および結合カイネティクスを分析した。
【０１２７】
本願の被験組換え抗４−１ＢＢ抗体を、Biacoreから入手可能なキットを用いるＮＨＳ標準アミノカップリング法によって、ＣＭ５（GE）チップに共有結合により結合させた。次いで、同じバッファーで希釈した一連の勾配濃度のヒト４−１ＢＢ Ｈｉｓタンパク質（Sinobiological, Beijing #10041-H08H）を、流速１０μｌ／分で注入した。キットに提供される再生試薬を用いて再生を行った。抗原−抗体の結合カイネティクスを３分間追跡し、解離カイネティクスを１０分間追跡した。得られたデータを、GEから入手可能なBIAevaluationソフトウェアを用い、１：１（ラングミュア）結合モデルを用いて分析した。本方法により測定されたキメラ抗体のｋａ（ｋｏｎ）、ｋｄ（ｋｏｆｆ）およびＫＤ値を次表に示す。
【表７】
2021510533.tif 000011
【実施例６】
【０１２８】
マウス抗体のヒト化
本実施例において、得られたマウス抗体の中で最も高い機能活性を有する２つの株（Ｂ１Ｅ１０およびＢ１Ｅ７）をヒト化した。得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬＣＤＲの典型的構造に基づき、重鎖および軽鎖の可変領域配列を、抗体生殖細胞系列データベースに開示されるものに対してアラインして、相同性の高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。
【０１２９】
ヒト生殖細胞系列軽鎖フレームワーク領域はヒトκ軽鎖遺伝子に由来し、本願において使用したヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートは好ましくはＩＧＫＶ３−１１＊０１（Ｂ１Ｅ１０用）およびＩＧＫＶ４−１＊０１（Ｂ１Ｅ７用）であった。ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖に由来し、本願において使用したヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートは好ましくはＩＧＨＶ３−３０＊０１（Ｂ１Ｅ１０用）およびＩＧＨＶ１−４６＊０１（Ｂ１Ｅ７用）であった。
【０１３０】
ヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ３−３０＊０１（配列番号２１）：
2021510533.tif 000012
ヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートＩＧＫＶ３−１１＊０１（配列番号２２）：
2021510533.tif 000013
ヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号２３）：
2021510533.tif 000014
ヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートＩＧＫＶ４−１＊０１（配列番号２４）：
2021510533.tif 000015
【０１３１】
選択したヒト化テンプレートに、ヒト化可変領域の代替としてマウス抗体のＣＤＲ領域をグラフトし、次いでＩｇＧ定常領域と組み合わせた。次いで、マウス抗体の三次元構造に基づき、埋め込んだ残基、ＣＤＲ領域と直接に相互作用する残基、ならびにＶＬおよびＶＨのコンフォメーションに重要な影響を及ぼす残基を、復帰変異に付した。さらに、抗体Ｂ１Ｅ１０については、ＣＤＲ領域中の化学的に不安定なアミノ酸残基を最適化し、すなわち、ＨＣＤＲ２：
ＴＩＳＤＧＧＳＹＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号４）
を
ＴＩＳＥＧＧＳＹＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号４５）
として最適化した。一連のヒト化分子を得た。
【０１３２】
２つの抗体の重鎖可変領域配列をそれぞれ配列番号２５〜２７および配列番号３１〜３３に示し、軽鎖可変領域配列をそれぞれ配列番号２８〜３０および配列番号３４〜３６に示す。
【０１３３】
2021510533.tif 000016
【０１３４】
2021510533.tif 000017
【０１３５】
2021510533.tif 000018
【０１３６】
2021510533.tif 000019
【０１３７】
前記の各軽鎖および重鎖の組み合わせについての小規模の発現試験（実施例３に記載）、復帰変異数の比較、ならびに包括的評価を行った後、ヒト化ｈｕＢ１Ｅ１０（ＶＨ−ｃ重鎖およびＶＬ−ｃ軽鎖を有する）およびｈｕＢ１Ｅ７抗体分子（ＶＨ−ｃ重鎖およびＶＬ−ｃ軽鎖を有する）を最終的に選択した。これら抗体のインタクトな軽鎖および重鎖配列（ＩｇＧ１サブタイプ）を、配列番号１７〜２０に示す。
【０１３８】
2021510533.tif 000020
【０１３９】
2021510533.tif 000021
【実施例７】
【０１４０】
インビトロＰＢＭＣ細胞活性化の機能アッセイ
新鮮なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖アッセイにより、抗４−１ＢＢ抗体存在下の細胞生存性を検出した。
【０１４１】
Ficoll密度勾配遠心分離によって、抗凝固剤ヘパリンを含む新鮮な血液から新鮮なヒトＰＢＭＣを単離した。勾配希釈によるさまざまな濃度の抗４−１ＢＢ抗体および３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体をＥＬＩＳＡプレートにコートし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗い、末梢血単核細胞を２×１０５／ウェルの密度で加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で７日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣの増殖をＣＣＫ−８キットを用いて検出した。ＯＤ４５０の値を検出し、ＯＤ４５０値からＥＣ５０値を計算した。
【０１４２】
その結果、図４に示すように、ヒト化抗体ｈｕＢ１Ｅ７およびｈｕＢ１Ｅ１０（いずれもＩｇＧ１サブタイプ）は、参照抗体ＭＯＲ７４８０と比較して、ＰＢＭＣ増殖活性化に高い効果を示し、ｈｕＢ１Ｅ７は、より強い活性化機能を示した。
【実施例８】
【０１４３】
ヒト化抗体の活性データ
ヒト化抗体について、インビトロレポーター活性アッセイを行った（手順は実施例４に記載）。結果を図５に示す。マウス抗体において示された傾向に一致して、ｈｕＢ１Ｅ１０は参照抗体ＭＯＲ７４８０と比較して、レポーター活性化において高い活性を示し、ｈｕＢ１Ｅ７は該参照抗体よりも弱い活性を示した。この傾向は、ＰＢＭＣ増殖活性において見られた傾向とは一致しなかった。
【０１４４】
ヒト化抗体について、インビトロ親和性動態アッセイを行った（方法は実施例５に記載）。結果を次表に示す。
【０１４５】
【表８】
2021510533.tif 000022
【０１４６】
この結果は、ヒト化抗体ｈｕＢ１Ｅ７およびｈｕＢ１Ｅ１０がいずれも、４−１ＢＢへの結合活性を維持し、ｈｕＢ１Ｅ１０の親和性は参照抗体ＭＯＲ７４８０のほぼ２倍であり、ｈｕＢ１Ｅ７の親和性はやや低かったことを示している。
【実施例９】
【０１４７】
抗４−１ＢＢ抗体による、トランスジェニックマウスにおける腫瘍細胞増殖抑制
ｈｕ４−１ＢＢトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（雌）をAnimal Center of Beijing Biotech Co., LtdにおいてＳＰＦ施設環境で、個別換気ケージＩＶＣを用いて飼育した。マウスを実験前に３〜７日間の順応飼育に付した。温度：２０〜２６℃；湿度４０〜７０％；照明：１２／１２時間の明暗サイクル。
【０１４８】
ＭＣ３８細胞をShanghai Shunran Biotechnology Co., Ltd.から購入し、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で、１０％の不活化ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。
【０１４９】
細胞を３〜４日毎に、完全なコンフルエンスに近づいたら継代した。ｈｕ４−１ＢＢヒト化ホモ接合体マウスの右脇腹に、ＰＢＳ中に再懸濁した５×１０６／ｍｌの濃度のＭＣ３８腫瘍細胞を、０．１ｍｌ／マウスの量で皮下接種し、全部で５０匹のマウスに接種を行った。
【０１５０】
腫瘍体積をカリパスで２回測定し、腫瘍の長径および短径を測定した。腫瘍体積を次のように計算した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（長径×短径２）。
【０１５１】
相対腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）：ＴＧＩ（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００％。Ｔ／Ｃ％は、相対腫瘍増加率を意味し、すなわち、ある時点での対象群に対する処置群の腫瘍体積または腫瘍重量のパーセンテージを意味する。ＴおよびＣはそれぞれ、ある特定の時点での処置群の腫瘍体積（ＴＶ）または腫瘍重量（ＴＷ）、およびＩｇＧ１対照群の腫瘍体積（ＴＶ）または腫瘍重量（ＴＷ）である。
【０１５２】
平均腫瘍体積が１４０ｍｍ３に達したら、腫瘍体積が中程度のマウスを選択し、腫瘍体積にしたがって各試験群にランダムに振り分けた。グループ分けした日に薬物投与を開始した。投与レジメンを次表に示す。最終投与の後、動物の体重および腫瘍増殖の観察を９日行い、その後、試験を終了した。観察中に、腫瘍体積および動物体重の測定を週２回行い、表１０に示すように測定値を記録した。試験終了時に腫瘍をマウスから摘出し、重量測定した。動物を安楽死させ、腫瘍の写真を撮影した。
【０１５３】
【表９】
2021510533.tif 000023
【０１５４】
薬理試験の結果を表１０、図６および図７に示した。抗体ｈｕＢ１Ｅ１０−ＩｇＧ２サブタイプの効果は、同じ用量のPfizerの参照抗体ＭＯＲ７４８０と同様であったが、ｈｕＢ１Ｅ１０−ＩｇＧ１サブタイプの効果は顕著に高く、マウス体重に対する顕著な作用は無かった。
【０１５５】
抗体ｈｕＢ１Ｅ７−ＩｇＧ１は、顕著により高い効果を示し、腫瘍を有するマウス６匹のうちの２匹が腫瘍の完全な消失を示した。
【０１５６】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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