(57)【要約】本発明は、細菌株由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物、及び疾患の処置におけるそのような組成物の使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチド。
【請求項２】
前記フラジェリンポリペプチドがＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種に由来する、請求項１に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項３】
前記フラジェリンポリペプチドが、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８でＮＣＩＭＢに寄託された菌株に由来する、請求項１または請求項２に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項４】
前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項５】
前記フラジェリンポリペプチドが配列番号１を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項６】
前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項７】
前記フラジェリンポリペプチドが配列番号２を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項８】
前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号３〜４２のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項９】
前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号３〜１６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性をもつ配列を有する、請求項８に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項１０】
前記フラジェリンポリペプチドが、Ｄ３ドメインを含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項１１】
前記フラジェリンポリペプチドが単量体型である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項１２】
前記フラジェリンポリペプチドが、配列番号１の残基８７〜９６及び２９０〜２９５と少なくとも９９％、９９．５％、または９９．９％同一であるＴＬＲ５認識部位を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項１３】
前記フラジェリンポリペプチドが細菌鞭毛アセンブリの一部である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項１４】
治療に使用するためのフラジェリンポリペプチドの断片であって、前記フラジェリンポリペプチドが、請求項１〜１２のいずれか１項に従って定義され、前記断片が、少なくとも７、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、または３５０アミノ酸長である、前記断片。
【請求項１５】
前記断片が、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有し、及び／または（ｉｉ）配列番号１のうちの少なくとも７個の連続したアミノ酸の断片を含む、請求項１４に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチドの断片。
【請求項１６】
病原体抗原または腫瘍抗原などの抗原にコンジュゲートした、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のためのフラジェリンポリペプチド。
【請求項１７】
治療に使用するためのフラジェリンポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、前記フラジェリンポリペプチドが、請求項１〜１５のいずれか１項に従って定義される、前記融合ポリペプチド。
【請求項１８】
病原体抗原または腫瘍抗原などの抗原を含む、請求項１７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１のアミノ酸２〜３２、８７〜９６、１６５〜２７２、２３４〜３５８、２９０〜２９５の区間のうちの１もしくは１または２以上を含むか、あるいは前記断片のうちの１つと少なくとも９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性をもつ配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１６５〜２７２の配列と９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸８７〜９６、１６５〜２７２、及び２９０〜２９５の配列と９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
免疫刺激領域をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記免疫刺激領域が、ＴＬＲ４またはＴＬＲ５活性化領域である、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドがフラジェリンポリペプチドである、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが細菌鞭毛アセンブリの一部である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドがフラジェリンポリペプチドである、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、１または２以上の抗原をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２８】
治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２９】
前記フラジェリンポリペプチドが、請求項２〜２７のいずれか１項に従って定義される、請求項２８に記載の使用のためのポリヌクレオチド配列。
【請求項３０】
前記コードされるポリペプチド配列が、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性を有するか、または配列番号１である、請求項２９に記載の使用のためのポリヌクレオチド配列。
【請求項３１】
治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来の組換えフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項３２】
治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項３３】
前記フラジェリンポリペプチドが、請求項２〜２７のいずれか１項に従って定義される、請求項３１または３２に記載の使用のための宿主細胞。
【請求項３４】
請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターまたはプラスミド。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項３６】
病原体抗原または腫瘍抗原などの異種抗原をさらに発現する、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のフラジェリンポリペプチド、請求項１４または請求項１５に記載のフラジェリンポリペプチドの断片、請求項１７または１８に記載の融合ポリペプチド、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３及び３５のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項３４に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項３８】
がんを処置または防止する方法において使用するための、請求項３７に記載の使用のための組成物。
【請求項３９】
前記組成物が、免疫原性腫瘍の処置に使用するためのものである、請求項３８に記載の使用のための組成物。
【請求項４０】
前記組成物が、肺癌、乳癌、肝臓癌、または結腸癌を処置または防止する方法において使用するためのものである、請求項３８または３９に記載の使用のための組成物。
【請求項４１】
前記組成物が、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、転移の防止、または血管新生の防止の方法において使用するためのものである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項４２】
対象の免疫系を刺激するのに使用するための、請求項３７に記載の使用のための組成物。
【請求項４３】
免疫老化の処置、防止、または遅延に使用するための、請求項３７に記載の使用のための組成物。
【請求項４４】
ワクチンアジュバントとして使用するための、請求項３７に記載の使用のための組成物。
【請求項４５】
ＣＡＲ−Ｔなどの細胞療法を増強するのに使用するための、請求項３７に記載の使用のための組成物。
【請求項４６】
前記組成物が、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させる、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項４７】
前記組成物が経口投与用である、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項４９】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患を処置する方法。
【請求項５０】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを処置または防止する方法。
【請求項５１】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、免疫刺激の低減に関連する疾患または状態を処置または防止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌株由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物、及び疾患の処置におけるそのような組成物の使用の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸は、子宮内では無菌であると考えられているが、出生直後に母体及び環境の様々な微生物に曝露される。その後、微生物のコロニー形成及び継承の動的な期間が生じる。これは、送達形態、環境、食事、及び宿主の遺伝子型などの要素に影響され、これらの要素のすべてが、特に幼年期に腸内細菌叢の組成に影響を与える。その後、細菌叢は安定化し、成人のようになる［１］。ヒトの腸内細菌叢は、細菌の２つの主要な門であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓに本質的に属する５００〜１０００種を超える様々な系統型を含む［２］。ヒトの腸における細菌のコロニー形成から生じる相利共生関係の成功は、多種多様な代謝機能、構造的機能、保護機能、及び他の有益な機能をもたらしている。コロニー形成された腸の代謝活性の増強により、さもなければ難消化性の食物成分が、宿主に重要な栄養源を提供する副産物の放出によって確実に分解されるようになる。同様に、腸内細菌叢の免疫学的重要性は十分に認識されており、共生細菌の導入後に機能的に再構成される障害のある免疫系を有する無菌動物で例示されている［３〜５］。
【０００３】
微生物のコロニー形成自体の影響を受ける腸管分泌型ＩｇＡの生成［６〜７］とは著しく対照的に、Ｔ細胞の発生及び分化は、特定の共生微生物によるコロニー形成を必要とするようである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、特に胞子形成セグメント細菌（ＳＦＢ）は、腸及び結腸のＴｈ１、Ｔｈ１７、及びＴｒｅｇの分化及び成熟のための強力な刺激となるようである［８〜９］。より近年の研究では、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＩＶ及びＸＩＶａならびにＡｌｔｅｒｅｄ  Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ  Ｆｌｏｒａ（ＡＳＦ）のものを含む他の腸内細菌は、Ｔｒｅｇの新規生成を誘導することができ、一方で、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの単一コロニー形成は、Ｔｒｅｇの増殖を促進することによって無菌マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２の不均衡を補正できることが示されている［５］［１０〜１１］。これらのデータは、他の常在腸内細菌の重要な免疫調節効果を暗示する。明らかに、共生細菌がＴ細胞分化経路に及ぼす影響は様々であり、以前に仮定されていたように、特定の細菌に関連して見出された一連のＴＬＲリガンドに影響される可能性がある［１２］。例えば、ＳＦＢがＴ細胞応答に影響を与えるメカニズムは現在不明であるが、フラジェリン遺伝子の存在を裏付ける近年のゲノム研究は、ＴＬＲ５−フラジェリン相互作用によって媒介される先天性応答が関与し得ると示唆している［１３〜１４］。
【０００４】
フラジェリンは、細菌の鞭毛の主成分のうちの１つである。鞭毛は、細菌に運動性を与え、感覚オルガネラとして機能し得る睫毛のような付属器である。細菌のフラジェリンの構造及び組成は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ．ｃｏｌｉなどのモデル生物で包括的に研究されてきた。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ．ｃｏｌｉのフラジェリンは、ＴＬＲ５受容体を介して免疫系を活性化し、様々な炎症誘発性遺伝子及び免疫応答遺伝子の活性化をもたらす［１５］。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンなどのＴＬＲ５アゴニストは、抗がん剤として作用し得ることが示唆されている［１６］。Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｆｉｃｕｓフラジェリンを発現するように操作されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍも抗がん剤として作用することが提唱されている［１７］。さらに、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅに由来するフラジェリンペプチドは、遺伝子改変されている腸内細菌によって発現させると、腸チフス、コレラ、及び赤痢などの感染性疾患に対するワクチンを生成するために使用することができると示唆されている［１８］。しかしながら、他の種の細菌に由来するフラジェリンは、未だ十分に特性評価されておらず、そのような他のフラジェリンは、異なる効果または用途を有する可能性がある。
【０００５】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸障害では、細菌叢組成の劇的な変化が記録されている。例えば、ＩＢＤ患者では、Ｅ．ｃｏｌｉの数が増大する一方でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａ細菌のレベルが低下し、腸内の共生生物と病原性共生生物とのバランスの変化を示唆している［１９〜２２］。興味深いことに、この微生物のディスバイオシスは、Ｔエフェクター細胞集団の不均衡とも関連している。
【０００６】
ある特定の細菌株が動物の腸に及ぼし得る好影響の可能性が認識され、様々な疾患の処置に使用するための様々な菌株が提案されている（例えば、［２３〜２６］を参照されたい）。また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を主に含むある特定の菌株を、腸に直接関係しない様々な炎症性疾患及び自己免疫疾患の処置に使用することが提案されている（総説については［２７］及び［２８］を参照されたい）。しかしながら、様々な疾患と様々な細菌株との間の関係、そして特定の細菌株が腸及び全身レベルにおいて、また任意の特定のタイプの疾患に及ぼす正確な影響は、十分に特性評価されていない。例えば、ある特定のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種は、がんの発生に関与するとされている［２９］。
【０００７】
ある特定のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ菌株、そして比較的程度は低いがＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ菌株は、インビトロで様々なサイトカインに対して効果の異なる免疫調節効果を有することが示唆されている。しかしながら、様々な疾患と様々な細菌株との間の関係、そして特定の細菌株が腸及び全身レベルにおいて、また任意の特定のタイプの疾患に及ぼす正確な影響は、十分に特性評価されていない。
【０００８】
当技術分野では、疾患を処置する新しい方法が必要である。また、新しい療法を開発できるように腸内細菌の潜在的な影響の特性評価を行う必要もある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、疾患を処置及び防止するための新しい療法を開発した。特に、本発明者らは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが治療に有用であることを特定した。実施例で示されるように、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、周知のＴＬＲ５アゴニストであるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンよりも著しく高いレベルでＴＬＲ５応答を強力に活性化することができる。
【００１０】
好ましい実施形態では、本発明は、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。さらに好ましい実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８でＮＣＩＭＢに寄託された菌株に由来する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは配列番号１である。実施例は、菌株ＭＲｘ０５１８（受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託された菌株）に由来するフラジェリンポリペプチドが、他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株に由来するフラジェリンポリペプチドと比較してより強力にＴＬＲ５応答を活性化し得ることを示す。したがって、菌株ＮＣＩＭＢ  ４２４８８由来のフラジェリンポリペプチドは、治療に使用するのに特に有効である。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明のフラジェリンポリペプチドは単量体型であり、これにより、ポリペプチドがＴＬＲ５受容体とより効果的に結合することが可能になる。
【００１２】
実施例は、菌株ＮＣＩＭＢ  ４２４８８由来のフラジェリンポリペプチドが、ＴＬＲ５応答を活性化するのに特に有効であることを示す。菌株ＮＣＩＭＢ  ４２４８８由来のフラジェリンポリペプチドはＤ３ドメインを含まない場合があり、本発明者らは、異なるフラジェリンポリペプチド間の配列多様性の大部分がＤ２−Ｄ３領域で観察されることに気付いた。好ましい実施形態では、本発明は、Ｄ３ドメインを含まないＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
【００１３】
ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、細菌鞭毛アセンブリ（bacterial flagellar assembly）の一部である。ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドを含む細菌鞭毛アセンブリを提供する。好ましい実施形態では、細菌鞭毛アセンブリは、タンパク質ＦｌｉＬ及びＦｌａＧを含む。ＦｌｉＬ及びＦｌａＧタンパク質は、ＭＲｘ０５１８の細菌鞭毛アセンブリに存在する。実施例は、ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドが、ＴＬＲ５応答を活性化するのに特に有効であることを示す。
【００１４】
本発明はまた、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドをコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、治療に使用するための、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドをコードする。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来の組換えフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。他の実施形態では、本発明はまた、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。
【００１６】
本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。さらに、本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を含む組成物を提供する。
【００１７】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンによるＴＬＲ５の活性化は、細胞増殖及び腫瘍成長を抑制することが知られている［４８］。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株を含む組成物は、がんの処置及び防止に有効である［５０］。本発明者らは、驚くべきことに、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株の抗がん活性に寄与し得る強力なＴＬＲ５応答を刺激できることを示した。したがって、本発明者らは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種のフラジェリンポリペプチドが治療に有用であり、特にがんの処置及び防止に有効であることを示した。
【００１８】
好ましい実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、免疫原性腫瘍及び／または固形腫瘍の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、肺癌、乳癌、肝臓癌、または結腸癌（colon cancer）を処置または防止する方法において使用するためのものである。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、がんの処置において腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の防止に特に有効であり得る。
【００１９】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、注射により、好ましくは皮下に、あるいは静脈内または腹腔内に投与される。
【００２０】
ある特定の実施形態において、例えば組成物が本発明の宿主細胞を含む場合、本発明の組成物は経口投与用である。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。
【００２１】
さらに、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患を処置する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌株に由来するフラジェリンポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを処置または防止する方法を提供する。
【００２２】
本発明者らは、免疫系の刺激ならびに疾患の処置及び防止に使用することのできる、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来、好ましくはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む新しい組成物を開発した。本発明者らは、そのような組成物が免疫系を強力に活性化することができ、がんを処置することができることを特定した。これは、そのような組成物が、免疫系の活性化が有用であり得る他の疾患を処置することもできる可能性があることを示している。
【００２３】
したがって、本発明は、対象の免疫系を刺激するのに使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、免疫老化（immunosenescence）の処置、防止、または遅延に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、ＣＡＲ−Ｔなどの細胞療法を増強する（enhancing）のに使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】フラジェリンの構造ならびに鞭毛フィラメントの断面図及び上面図。鞭毛フィラメントは、単一のタンパク質であるフラジェリンから構成されている。ＴＬＲ５認識領域はＤ１ドメインにあり、鞭毛フィラメントでフラジェリンが重合している場合はアクセスできない。画像の出典は参考文献［３０］である。
【図１Ｂ】フラジェリンの構造ならびに鞭毛フィラメントの断面図及び上面図。鞭毛フィラメントは、単一のタンパク質であるフラジェリンから構成されている。ＴＬＲ５認識領域はＤ１ドメインにあり、鞭毛フィラメントでフラジェリンが重合している場合はアクセスできない。画像の出典は参考文献［３０］である。
【図１Ｃ】フラジェリンの構造ならびに鞭毛フィラメントの断面図及び上面図。鞭毛フィラメントは、単一のタンパク質であるフラジェリンから構成されている。ＴＬＲ５認識領域はＤ１ドメインにあり、鞭毛フィラメントでフラジェリンが重合している場合はアクセスできない。画像の出典は参考文献［３０］である。
【図２Ａ】Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種及びモデル生物のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに由来する２４種のフラジェリンポリペプチドのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図２Ｂ】Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種及びモデル生物のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに由来する２４種のフラジェリンポリペプチドのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図２Ｃ】Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種及びモデル生物のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに由来する２４種のフラジェリンポリペプチドのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ａ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｂ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｃ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｄ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｅ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｆ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｇ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｈ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｉ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図３Ｊ】菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドと、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種の２３種のフラジェリンポリペプチドとのタンパク質配列のアライメント。菌株ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドのＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメイン、ならびに予測されるＴＬＲ５結合部位が強調表示されている。
【図４】鞭毛アセンブリのＫＥＧＧ経路図。灰色で強調表示された遺伝子はその種に存在する。
【図５Ａ】予測されるＭＲｘ０５１８フラジェリン（ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８）のタンパク質構造と、既知のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンのタンパク質構造との比較。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンタンパク質構造の出典は、参考文献［３０］である。
【図５Ｂ】予測されるＭＲｘ０５１８フラジェリン（ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８）のタンパク質構造と、既知のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンのタンパク質構造との比較。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンタンパク質構造の出典は、参考文献［３０］である。
【図６】ＴＬＲ５レポーター細胞のＭＲｘ０５１８活性化。
【図７】ＴＬＲ５レポーター細胞の菌株特異的活性化。
【図８】トリプシン処理後のＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ１００１１０のＣＦＳによるＴＬＲ５応答。
【図９Ａ】Ｅ．ｃｏｌｉで組換えフラジェリンタンパク質を生成するためのクローニング戦略。
【図９Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける精製された組換えフラジェリンタンパク質のＦｌａＡＭＲｘ０５１８及びＦｌａＡＤＳＭ１００１１０の品質評価。
【図１０】ＦｌａＡＭＲｘ０５１８、ＦｌａＡＤＳＭ１００１１０、ならびにＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ１００１１０のＣＦＳによるＴＬＲ５活性化の比較。
【図１１】ＭＲｘ０５１８ｆｌａＡ−変異体の表現型特性評価。
【図１２】ＭＲｘ０５１８ｆｌａＡ−変異体ＣＦＳによるＴＬＲ５活性化。
【図１３】ｆｌａＡ変異戦略。
【図１４】ＭＲｘ０５１８の電子顕微鏡観察。
【図１５】ＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ  １００１１０の組換えフラジェリンタンパク質によるマウスＴＬＲ５の活性化。データは３つの独立した反復試験の代表である。
【図１６】ＣＬＵＴＡＬ  ＯＭＥＧＡ  ｖ２．１の複数配列アライメントソフトウェアを使用して行った、ＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ  １００１１０のフラジェリンタンパク質の配列アライメント。
【図１７】運動性Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ菌株によるヒトＴＬＲ５の活性化。データは、３つの生物学的反復試験の平均及び標準偏差を表す。有意性は一元配置分散分析検定によって評価した。「ａ」はｐ＜０．０００１を示す。
【図１８】ＭＲｘ０５１８によるＮＦ−κＢの活性化。
【図１９】サイトカインを添加していない（サイトカインなし）対照としてのＭＲｘ５１８及びＲＰＭＩ培地の上清を使用した、（Ａ）Ｔヘルパー細胞及び（Ｂ）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の集団におけるＴ細胞分化の誘導。
【図２０】代替的なｆｌａＡ変異戦略。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
フラジェリン
細菌鞭毛の主成分であるフラジェリンは、哺乳動物、昆虫、及び植物を含む様々な生物において宿主防御を刺激する。細菌のフラジェリンの構造及び組成は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ．ｃｏｌｉなどのモデル生物で包括的に研究されてきた。しかしながら、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種に由来するフラジェリンについて説明する入手可能なデータは非常に限られている。
【００２９】
フラジェリンは、単量体タンパク質として存在する場合もあれば、または重合して鞭毛フィラメントを形成している場合もある。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの細菌鞭毛フィラメントは、およそ２０，０００個のフラジェリンタンパク質単位から構成されている。鞭毛フィラメントは、完全にアセンブルされた細菌鞭毛の一部を形成する。
【００３０】
フラジェリンタンパク質は通常、３〜４個のドメイン（Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）を含み、Ｄ０及びＤ１ドメインはＮ末端及びＣ末端の折り重ねからなる［３１］。鞭毛フィラメントのアセンブリ中、Ｄ０及びＤ１ドメインが鞭毛フィラメント内に埋め込まれ、Ｄ２及び／またはＤ３ドメインが外を向く（図１）。
【００３１】
保存されたドメインＤ１内のアミノ酸モチーフは、ＴＬＲ５の認識及び相互作用に必要であることが示されている［３２〜３３］。Ｄ０ドメインは、ＴＬＲ５シグナル伝達に影響を与えることも示されている［３４］。ＴＬＲ５認識部位は、通常、鞭毛フィラメントにおいてアクセスできない。フラジェリンは、単量体型である場合にＴＬＲ５とより効果的に相互作用する。これは、フィラメントにアセンブルされるとＴＬＲ５結合部位がアクセスできなくなるためである［３０］。フラジェリンタンパク質の中央領域は配列の多様性を示し、広く研究されてはいないが、タンパク質の抗原性かつ免疫原性の領域であると考えられている。
【００３２】
Ｄ０及びＤ１ドメインは高度に保存されているが、Ｄ２及びＤ３ドメインはより可変性が高い［３５］。図２は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンタンパク質と、広く研究されているＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来の鞭毛タンパク質との配列アライメントである。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のフラジェリンタンパク質とＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンタンパク質との間の配列多様性の大部分は、中央領域（Ｄ２−Ｄ３ドメイン）に存在する。異なるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株間（例えば菌株ＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ１００１１０のフラジェリンタンパク質間）の配列多様性の大部分も、この領域で観察される（図３）。
【００３３】
鞭毛フィラメントは、細菌鞭毛の成分である。細菌鞭毛アセンブリに関与することが知られている遺伝子を図４にまとめる。灰色の影が付いたものは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍに存在するものである。フラジェリンタンパク質は、本明細書では交換可能にＦｌａＡとも呼ばれるＦｌｉＣによってコードされる。
【００３４】
本発明は、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、治療に使用するための、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なＴＬＲ５応答を活性化し得ることを示し、これは、フラジェリンポリペプチドが治療に有用、特にがんの処置に有用であり得ることを示す。
【００３５】
本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが、がんの処置及び防止に有用である強力なＴＬＲ５応答を誘導できることを示す。特に、実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種、特に菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドが、非常に高いＴＬＲ５応答を生成することを示す。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明は、治療に使用するための、特にがんの処置または防止のための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ種に由来する。最も好ましい実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種に由来する。
【００３７】
実施例では、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを試験した。ＭＲｘ０５１８は、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８で寄託されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ細菌の菌株である。菌株ＭＲｘ０５１８は、国際寄託機関ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２５  ２ＺＳ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）により、２０１５年１１月１６日に「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ」として寄託され、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２４８８を割り当てられた。
【００３８】
ある特定の実施形態において、本発明は、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性をもつフラジェリンポリペプチド、及び治療における、特にがんの処置または防止におけるそのようなポリペプチドの使用を提供する。実施例は、そのようなフラジェリンポリペプチドが特に有効であることを示す。特に、本発明は、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性をもつ配列を有するフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明のフラジェリンポリペプチドは、配列番号１を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性をもつ配列を有する。本発明のフラジェリンポリペプチドは、配列番号２を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。実施例はまた、そのようなポリペプチドが有用であることを示す。
【００３９】
ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号３〜４２のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性をもつフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、配列番号３〜１６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性をもつ配列を有する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種に由来する。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明のフラジェリンは、ＴＬＲ５に、例えば少なくとも１０−２、少なくとも１０−３、少なくとも１０−４、少なくとも１０−５、少なくとも１０−６、少なくとも１０−７、少なくとも１０−８、少なくとも１０−９、少なくとも１０−１０、または少なくとも１０−１１のＫＤ値で結合する。ＴＬＲ５への結合は、電気化学的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）、走査型電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）［３６］、または組換えＴＬＲ５タンパク質を使用した未変性ＰＡＧＥ及びゲル濾過クロマトグラフィー分析［３７］を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって測定することができる。
【００４１】
本発明のフラジェリンポリペプチドは、Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３の４つのドメインを含み得る。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、Ｄ３ドメインを含まない。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２の３つのドメインからなる。図３には、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍフラジェリンポリペプチドにおけるＤ０、Ｄ１及びＤ２ドメインの位置を示す。図５には、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチド（ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８）の予測される形状を示す。ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８の予測される構造は、公的に利用可能な構造との相同性に基づいてタンパク質構造を予測するＰｈｙｒｅ２ツール［３８］を使用して生成し、グラフィックは、ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａパッケージ［３９］を用いて生成した。予測されるＤ３ドメインの欠如は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＬ１３４４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ１７９８３）由来のフラジェリンポリペプチドと比較したタンパク質構造の立体構造変化をもたらす。予測されるＤ３ドメインの欠如は、ＴＬＲ５認識部位の露出が増えることにつながる場合があり、これは、ＴＬＲ５応答を活性化するフラジェリンポリペプチドの能力の増大につながる。予測されるＤ３ドメインの欠如は、フラジェリンポリペプチドが重合して鞭毛フィラメントになる能力に影響を及ぼす可能性もある。フラジェリンポリペプチドは、単量体型においてＴＬＲ５応答をより効果的に活性化するため、フラジェリンポリペプチドの重合の防止または低減が有益である。
【００４２】
本発明のフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５の認識及び相互作用に必要とされ得るＤ１ドメインを含み得る。ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号１の残基４３〜１６４及び２７３〜３１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の配列同一性を有するＤ１ドメインを含むフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、Ｄ１ドメインにＴＬＲ５認識部位を有するフラジェリンポリペプチドを提供する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドにおけるＴＬＲ認識部位は、配列番号１の８７〜９６位及び２９０〜２９５位に位置する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドのＴＬＲ５認識部位は、配列番号１の残基８７〜９６及び２９０〜２９５と少なくとも９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する。さらに好ましい実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、配列番号１の残基８７〜９６及び２９０〜２９５のＴＬＲ５認識部位を含む。
【００４３】
本発明のフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５シグナル伝達に影響を及ぼし得るＤ０ドメインを含んでもよい。ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号１の残基２〜３２及び２３４〜３５８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有するＤ０ドメインを含むフラジェリンポリペプチドを提供する。
【００４４】
本発明のフラジェリンポリペプチドはまた、Ｄ２ドメインを含み得る。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の鞭毛ポリペプチド間の配列多様性の大部分は、中央領域（Ｄ２−Ｄ３ドメイン）に存在する。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のフラジェリンポリペプチドと比較して低い投与量で、より強力なＴＬＲ５応答を生成できることを示す。Ｄ２またはＤ３ドメインの配列多様性は、ＴＬＲ５応答を活性化するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドの能力の増大に寄与し得る。本発明のフラジェリンポリペプチドはまた、ＴＬＲ５シグナル伝達に影響を及ぼし得るＤ０ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号１の残基１６５〜２７２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有するＤ２ドメインを含むフラジェリンポリペプチドを提供する。
【００４５】
フラジェリンポリペプチドは、単量体として存在してもよいし、または鞭毛フィラメントとして重合した形態で存在してもよい。このフィラメントは、細菌鞭毛の一部である。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、鞭毛フィラメント状に配されている。本発明は、鞭毛フィラメント状に配されていないフラジェリンポリペプチドにも関する。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、その単量体型である。単量体型のフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５とより強力に相互作用することができるため有利である。諸実施形態において、本発明のフラジェリンは、単量体型になるための脱落及び脱凝集を助けるために、グリコシル化されていない。
【００４６】
ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、細菌鞭毛の一部である。ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、ＦｌｉＤ、ＦｌｇＬ、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＥ、ＦｌｉＫ、ＦｌｇＤ、ＦｌｇＧ、ＭｏｔＢ、ＭｏｔＡ、ＦｌｉＦ、ＦｌｉＧ、ＦｌｉＭ、ＦｌｉＮ、ＦｌｈＡ  ＦｌｈＢ、ＦｌｉＨ、ＦｌｉＩ、ＦｌｉＯ、ＦｌｉＰ、ＦｌｉＱ、ＦｌｉＲ、ＦｌｉＬ、ＦｌｉＪ、及びＦｌｉＳから選択される１または２以上のタンパク質を含む細菌鞭毛の一部である。好ましい実施形態では、細菌鞭毛アセンブリは、ＦｌｉＤ、ＦｌｇＬ、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＥ、ＦｌｉＫ、ＦｌｇＤ、ＦｌｇＧ、ＭｏｔＢ、ＭｏｔＡ、ＦｌｉＦ、ＦｌｉＧ、ＦｌｉＭ、ＦｌｉＮ、ＦｌｈＡ  ＦｌｈＢ、ＦｌｉＨ、ＦｌｉＩ、ＦｌｉＯ、ＦｌｉＰ、ＦｌｉＱ、ＦｌｉＲ、ＦｌｉＬ、ＦｌｉＪ、及びＦｌｉＳを含む。ある特定の実施形態において、細菌鞭毛アセンブリは、タンパク質ＦｌｉＬ及びＦｌａＧを含む。ＦｌｉＬは、遊走中の鞭毛の回転方向を制御する鞭毛基底小体関連タンパク質であり、ＦｌａＧは、ＦｌａＦとともにフラジェリンアセンブリを調節する。ＦｌｉＬ及びＦｌａＧタンパク質は、ＭＲｘ０５１８に存在する。実施例は、ＭＲｘ０５１８のフラジェリンポリペプチドが、別のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種のフラジェリンポリペプチドと比較して、より強力なＴＬＲ５応答を活性化し得ることを示す。
【００４７】
本発明のフラジェリンポリペプチドは、組換え発現されてもよいし、またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞から単離されてもよい。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞に結合していない。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、細菌細胞を実質的に含まない組成物中にある。
【００４８】
ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、熱処理され、場合により変性されている。実施例は、そのようなフラジェリンポリペプチドが依然として強力に有効であることを示す。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、８０℃まで熱安定性があり、例えば、８０℃まで、例えば４０分間加熱した後、活性を維持することができる。ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、トリプシンによって消化される。言い換えると、ある特定の実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、トリプシン切断部位を含む。ＭＲＸ５１８フラジェリンは、３６個のトリプシン切断部位を含むと予測される。
【００４９】
本発明に係るフラジェリンポリペプチドは、フラジェリンポリペプチドと見なされるために、通常のフラジェリンポリペプチドとして機能する必要はない。本発明に係るフラジェリンポリペプチドは、ある特定の活性を除去する変異または欠失を含み得る。概して、本発明のフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５アゴニストである。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、重合して鞭毛フィラメントになることができない。他の実施形態では、本発明のフラジェリンポリペプチドは、細菌鞭毛アセンブリの一部を形成することができない。
【００５０】
ある特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、フラジェリンポリペプチドではない。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、上述のように、配列番号１との配列同一性を有するか、または配列番号１を含むか、もしくはそれからなる。
【００５１】
本発明はまた、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本組成物は、治療に使用するためのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、本組成物は、治療に使用するための菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを含む。
【００５２】
本発明のすべての実施形態の代替的な態様では、本発明のフラジェリンポリペプチドは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ種のものである。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍと非常によく似ており、有鞭毛性でもある。
【００５３】
断片
実施例で試験したものとの配列同一性を有するフラジェリンポリペプチドも、治療に有用であると予想され、前のセクションで述べたように、本発明に包含される。さらに、本発明のフラジェリンポリペプチドの断片もまた有用であると予想される。
【００５４】
好ましくは、いずれの断片も、少なくとも７、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、または３５０アミノ酸長である。
【００５５】
好ましい断片は、配列番号１のアミノ酸２〜３２、８７〜９６、１６５〜２７２、２３４〜３５８、２９０〜２９５の区間（stretch）のうちの１または２以上を含むか、または該断片のうちの１つと少なくとも９０％、９２％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性をもつ配列を含む。
【００５６】
好ましい断片は、配列番号１のアミノ酸１６５〜２７２と少なくとも９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性をもつ配列を含む。さらに好ましい断片は、配列番号１のアミノ酸８７〜９６、１６５〜２７２、もしくは２９０〜２９５と、または好ましくは配列番号１のアミノ酸８７〜９６、１６５〜２７２、及び２９０〜２９５と、少なくとも９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性をもつ配列を含む。
【００５７】
本発明に係る使用のための断片は、通常、（ｉ）配列番号１と少なくともｗ％の配列同一性を有し、及び／または（ｉｉ）配列番号１の少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片を含む。ｗの値は、少なくとも８５（例えば８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００以上）である。ｘの値は、少なくとも７（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００）であり、この断片は通常、配列番号１のエピトープを含む。この断片は通常、ＴＬＲ５に結合することができる。
【００５８】
本発明に係る使用のための他の断片は、通常、（ｉ）配列番号２と少なくともｗ％の配列同一性を有し、及び／または（ｉｉ）配列番号２の少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片を含む。ｗの値は、少なくとも８５（例えば８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００以上）である。ｘの値は、少なくとも７（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００）であり、この断片は通常、配列番号２のエピトープを含む。この断片は通常、ＴＬＲ５に結合することができる。
【００５９】
本発明に係る使用のための他の断片は、通常、（ｉ）配列番号３〜４２のうちの１つと少なくともｗ％の配列同一性を有し、及び／または（ｉｉ）配列番号３〜４２のうちの１つの少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片を含む。ｗの値は、少なくとも８５（例えば８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００以上）である。ｘの値は、少なくとも７（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００）であり、この断片は通常、配列番号３〜４２のうちの１つのエピトープを含む。この断片は通常、ＴＬＲ５に結合することができる。
【００６０】
融合物
本発明のフラジェリンポリペプチドを含む融合物も、治療に有用であると予想される。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、場合により治療に使用され、特にがんの処置に使用される、上述のフラジェリンポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。好ましい融合パートナーには、標的化部分及び半減期を延長することを意図した部分が含まれる。ある特定の実施形態において、本発明は、上述のフラジェリンポリペプチドと、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、組換えＰＥＧ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン−アラニン−セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはカルボキシ末端ペプチド［ＣＴＰ；絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ｂ鎖のもの］からなる群から選択されるポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを提供する。
【００６１】
本発明のフラジェリンポリペプチドは、その特徴及び治療有用性を向上させるために、非ポリペプチド部分に融合またはコンジュゲートしていてもよい。例えば、ある特定の実施形態において、本発明は、ＰＥＧまたはヒアルロン酸に共有結合した上述のフラジェリンポリペプチドを提供する。
【００６２】
本発明のフラジェリンポリペプチドは、例えば、ワクチンとして使用するために、抗原に融合またはコンジュゲートしていてもよい。本発明のフラジェリンに近接して抗原を提示することにより、それらの免疫刺激（immunostimulatory）活性が最大化し、抗原に対して発生する防御免疫応答がさらに増強し得る。さらに、抗原及び本発明のフラジェリンを含む治療薬の製造及び送達は、それらが融合またはコンジュゲートしている場合、より効率的かつ効果的であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、上述のフラジェリンポリペプチド及び抗原を含む融合ポリペプチドを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、抗原にコンジュゲートした上述のフラジェリンポリペプチドを提供する。
【００６３】
本発明の融合物及びコンジュゲートに含めるための好ましい抗原は、病原体抗原及び腫瘍抗原である。抗原は、病原体による感染から保護したり、腫瘍を攻撃したりするのに有効な、抗原に特異的な免疫応答を誘発する。抗原は、例えば、ペプチドまたは多糖であり得る。本発明の融合物及びコンジュゲートで使用するための例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原、タンパク質及び／または糖類抗原などの細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ならびに腫瘍抗原が含まれる。本発明の融合物及びコンジュゲートで使用するためのさらなる抗原には、糖タンパク質及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Ｔａｕ、ＰＣＳＫ９、ならびに習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、またはアヘン剤が含まれる。
【００６４】
本発明の融合ポリペプチドは、フラジェリンと抗原との間にリンカー配列を含み得る。好ましいリンカー配列には、（Ｇｌｙ４）ｎモチーフ（複数可）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモチーフ（複数可）、及びＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモチーフ（複数可）を含むペプチドが含まれる。リンカー配列は、１〜５０、１〜３０、１〜２０、５〜２０、５〜１０、または１０〜２０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、フラジェリン及び融合パートナー（例えば抗原）がそれぞれの役割を果たし、例えば免疫系によってアクセスされることを可能にする。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、上述のフラジェリンポリペプチド、リンカー配列、及び病原体に由来する抗原または腫瘍抗原などの抗原を含む融合ポリペプチドを提供する。
【００６５】
本発明のフラジェリンポリペプチドは、多糖抗原などの非ポリペプチド部分にコンジュゲートした場合に特に有用であり得る。好適なコンジュゲーション方法としては、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＣＤＡＰ、またはＴＳＴＵの使用が挙げられる。
【００６６】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、治療に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドをコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、治療に使用するための、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドをコードする。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なＴＬＲ５応答を活性化し得ることを示す。したがって、そのようなフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、治療に有用、特にがんの処置に有用であり得る。
【００６７】
本発明はまた、がんを処置または防止する方法において使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、がんを処置または防止する方法において使用するための、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが、がんの処置及び防止に有用である強力なＴＬＲ５応答を誘導できることを示す。特に、実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種、特に菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドが、非常に高いＴＬＲ５応答を生成することを示す。
【００６８】
好ましい実施形態では、治療に使用するための本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、または配列番号１と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性をもつポリペプチド配列をコードする。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、有用であることが実施例において示される上述の特定のＤ０、Ｄ１及び／またはＤ２配列を含むフラジェリンをコードする。
【００６９】
他の実施形態では、治療に使用するための本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、または配列番号２と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性をもつポリペプチド配列をコードする。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、有用であることが実施例において示される上述の特定のＤ０、Ｄ１及び／またはＤ２配列を含むフラジェリンをコードする。
【００７０】
他の実施形態では、治療に使用するための本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３〜４２のうちの１つ、または配列番号３〜４２のうちの１つと７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％の配列同一性をもつポリペプチド配列をコードする。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、有用であることが実施例において示される上述の特定のＤ０、Ｄ１及び／またはＤ２配列を含むフラジェリンをコードする。
【００７１】
本発明に係る核酸は、様々な形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクターなど）をとることができる。本発明の核酸は、環状であっても分枝状であってもよいが、概して線状である。
【００７２】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、一本鎖及び二本鎖の両方のヌクレオチドポリマーを含む。核酸を構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型であり得る。該修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、及びホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が含まれる。
【００７３】
核酸は、例えば、全体的または部分的な化学合成（例えばＤＮＡのホスホラミダイト合成）、ヌクレアーゼ（例えば制限酵素）を使用したより長い核酸の消化、より短い核酸またはヌクレオチドの結合（例えばリガーゼまたはポリメラーゼを使用したもの）、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからなど、多くの方法で調製することができる。
【００７４】
本発明の核酸は、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、例えば本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする配列を含む。典型的には、本発明の核酸は、組換え形態、すなわち自然には発生しない形態である。例えば、核酸は、少なくともフラジェリンポリペプチドをコードする配列に加えて、１または２以上の異種核酸配列（例えば、別の抗原をコードする配列及び／またはプロモーターもしくは配列内リボソーム進入部位などの制御配列）を含み得る。そのような実施形態では、本発明の核酸は、上述のフラジェリンポリペプチドと、病原体抗原または腫瘍抗原などの抗原とをコードする。場合により、核酸はまた、リンカー配列をコードする。
【００７５】
宿主細胞
本発明はまた、治療に使用するための、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。実施例は、本発明のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓフラジェリンを発現する、ＭＲｘ０５１８などのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株が、ＴＬＲ５を活性化することができ、したがって強力な治療効果を有し得ることを示す。本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞は、治療用組成物に含めるためのフラジェリンポリペプチドを生成するために有用であり得るか、またはそのような宿主細胞は、フラジェリンポリペプチドを発現して直接的な治療効果を発揮するように患者に投与するために有用であり得る。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、本発明のフラジェリンポリペプチドを組換えにより発現する。言い換えると、本発明の宿主細胞は、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属のものではないか、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種のものではないか、または菌株ＭＲｘ０５１８のものではない。好ましい実施形態では、組換えＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓフラジェリンポリペプチドを発現するための宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００７７】
例えば宿主細胞が患者に投与するためのものである代替的な実施形態では、宿主細胞は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株などの生菌株である。
【００７８】
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、宿主細胞は、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。
【００７９】
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、細菌鞭毛アセンブリ遺伝子ＦｌｉＤ、ＦｌｇＬ、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＥ、ＦｌｉＫ、ＦｌｇＤ、ＦｌｇＧ、ＭｏｔＢ、ＭｏｔＡ、ＦｌｉＦ、ＦｌｉＧ、ＦｌｉＭ、ＦｌｉＮ、ＦｌｈＡ  ＦｌｈＢ、ＦｌｉＨ、ＦｌｉＩ、ＦｌｉＯ、ＦｌｉＰ、ＦｌｉＱ、ＦｌｉＲ、ＦｌｉＬ、ＦｌｉＪ、及びＦｌｉＳのうちの１または２以上、好ましくはすべてをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、ポリペプチドＦｌｉＤ、ＦｌｇＬ、ＦｌｇＫ、ＦｌｇＥ、ＦｌｉＫ、ＦｌｇＤ、ＦｌｇＧ、ＭｏｔＢ、ＭｏｔＡ、ＦｌｉＦ、ＦｌｉＧ、ＦｌｉＭ、ＦｌｉＮ、ＦｌｈＡ  ＦｌｈＢ、ＦｌｉＨ、ＦｌｉＩ、ＦｌｉＯ、ＦｌｉＰ、ＦｌｉＱ、ＦｌｉＲ、ＦｌｉＬ、ＦｌｉＪ、及びＦｌｉＳのうちの１または２以上、好ましくはすべてを発現する。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＦｌｉＬ及びＦｌａＧを含む細菌鞭毛アセンブリをコードするポリヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、ポリペプチドＦｌｉＬ及びＦｌａＧを発現する。
【００８０】
好ましくは、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する任意の細胞、特に患者に投与するための任意の細胞は、フラジェリンポリペプチドを脱落させるのに有効である。実施例は、そのような細胞がより強力なＴＬＲ５応答を誘導することを示す。フラジェリンは、その単量体単位の漏出を通じて鞭毛のアセンブリ中に「能動的に」脱落し得る。しかしながら、ほとんどの場合、単量体のフラジェリンは、解離した鞭毛の受動的分解から生じる。鞭毛の解離は、機械的ひずみの後に、または自発的なプロセスとして発生し得る。いくつかの細菌種では、例えばＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓにおいて、フラジェリンは、フィラメントの安定性を増強し、無制御の脱落を防止するようにグリコシル化されている［４０］。好ましい実施形態では、宿主細胞によって発現されるフラジェリンは、単量体型になるための脱落及び脱凝集を助けるために、グリコシル化されていない。
【００８１】
ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチド及び／または細菌鞭毛アセンブリは、宿主細胞から容易に脱落する。
【００８２】
フラジェリンポリペプチド及び／または鞭毛アセンブリの脱落の容易さは、ｉ）本発明のフラジェリンを発現する細胞と、ｉｉ）本発明のフラジェリンと同じ細菌種に属する同じまたは異なる菌株に由来する参照フラジェリンを発現する１または２以上の（例えば１、２、３、４、５、１０種の、または１０種を超える）細胞とを、別々に、ａ）定常期で１８時間にわたり、それぞれの細胞の１％接種材料を使用して増殖させ、次に、ｂ）後期対数期で定常期の細胞の１０％接種材料を３時間増殖させることにより、決定することができる。次に、本発明のフラジェリンを発現する細胞、及び参照フラジェリンを発現する細胞の１０ｍｌ培養物を、５０００×ｇで５分間にわたり、室温で遠心分離して、細菌ペレットを除去することができる。次に、得られた上清を無菌条件下で濾過することができる（０．２２ｕｍ）。本発明のフラジェリンポリペプチド及び／または細菌鞭毛アセンブリの脱落が良好である実施形態では、本発明のフラジェリンを発現する細胞から得られる上清中のフラジェリンタンパク質の濃度は、参照フラジェリンを発現する細胞から得られる上清中のフラジェリンタンパク質の濃度より高くなる（例えば１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、７倍以上、または１０倍以上）。
【００８３】
好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、フラジェリンポリペプチド及び／または鞭毛アセンブリを環境に放出し、これには化学的または物理的破壊が必要である。好ましい実施形態では、フラジェリンポリペプチドの発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養すると、フラジェリンポリペプチドが細胞から環境に放出される。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する細胞が、より強力なＴＬＲ５応答を誘導することを示す。他の実施形態では、本発明の宿主細胞は、細菌鞭毛アセンブリを良好に脱落させる。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、細菌鞭毛フィラメントを良好に脱落させ、特にフラジェリンポリペプチドを良好に脱落させる。ある特定の実施形態において、本発明の細菌鞭毛アセンブリは、単量体のフラジェリンを能動的に脱落させる。ある特定の実施形態において、本発明の鞭毛フィラメントは、単量体のフラジェリンを能動的に脱落させる。単量体のフラジェリンは、ＴＬＲ５応答を誘導するのにより有効である。
【００８４】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドまたは鞭毛アセンブリを発現する細胞を培養することと、該フラジェリンポリペプチドまたは鞭毛アセンブリを培養することとを含み、別々のフラジェリンポリペプチドまたは鞭毛アセンブリを細胞表面から除去するためのいかなるステップも行うことなく、本発明のフラジェリンポリペプチドまたは鞭毛アセンブリを得る方法を提供する。
【００８５】
現在、鞭毛（またはフラジェリン）の脱落のプロセスは、特定のサブセット遺伝子の発現とは関連付けられておらず、環境条件に大きく影響される可能性が高い。しかしながら、いくつかの遺伝子は、鞭毛の剛性及び安定性に関与することが示されている。例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて、ｆｌｉＦ及びｆｌｉＬ変異体は、粘性培地で増殖させると鞭毛をより容易に脱落させることが示されている［４１、４２］。いずれの場合も、鞭毛は遠位のロッド付近で壊れた［４３］。したがって、好ましい実施形態において、宿主細胞はｆｌｉＦ及び／またはｆｌｉＬを発現しない。他の実施形態では、宿主細胞はｆｌｉＬを発現する。
【００８６】
ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、熱処理されている。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する細胞が、熱処理後も依然として強力に有効であることを示す。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、８０℃まで熱安定性があり、例えば、８０℃まで、例えば４０分間加熱した後、活性を維持することができる。
【００８７】
本発明はさらに、フラジェリンポリペプチドの生成を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、そのように生成されたフラジェリンポリペプチドを回収することにより、本発明のフラジェリンポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００８８】
ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、１または２以上の抗原をさらに発現する。概して、この抗原は、組換えにより発現され、宿主細胞に対して異種である。抗原は、本発明のフラジェリンポリペプチドとともに発現される融合ポリペプチドの一部であってもよいし、または宿主細胞は、異なるオープンリーディングフレームからフラジェリン及び抗原を別々に発現してもよい。したがって、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチド及び異種抗原を発現する宿主細胞を提供する。本発明で使用される例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原、タンパク質及び／または糖類抗原などの細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ならびに腫瘍抗原が含まれる。宿主細胞において本発明のフラジェリンとともに発現させるさらなる抗原には、糖タンパク質及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Ｔａｕ、ＰＣＳＫ９、ならびに習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、またはアヘン剤が含まれる。
【００８９】
ベクター、プラスミド、及び他の核酸
本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、１または２以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、または組換えウイルスもしくはウイルス様粒子の生成をもたらすように設計された「ウイルスベクター」であり得る。
【００９０】
あるいは、またはさらに、フラジェリンポリペプチドをコードする天然に存在する配列と比較して、核酸の配列または化学構造を修飾してもよい。核酸分子の配列は、例えば、核酸の発現もしくは複製の効力を増大させるために、または分解に対するさらなる安定性もしくは耐性をもたらすために修飾され得る。例えば、核酸分子の配列は、哺乳動物（例えばヒト）細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化され得る。コドン使用頻度に関し、そのような修飾は、核酸の翻訳効力及び半減期を増大させる可能性がある。ポリＡテール（例えば、約３０個以上のアデノシン残基のもの）を、ＲＮＡの３’末端に結合させて、その半減期を増大させることができる。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎの構造（キャップ０構造）を有する修飾されたリボヌクレオチドまたはその誘導体で、ＲＮＡの５’末端をキャッピングしてもよい。この構造は、ＲＮＡ合成中に組み込むこともできるし、またはＲＮＡ転写後に（例えば、Ｎ７−モノメチル化キャップ０構造の構築を触媒するｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、及びグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）を使用することによって）酵素的に操作することもできる。キャップ０構造は、ＲＮＡ分子の安定性及び翻訳効力を維持する上で重要な役割を果たす。ＲＮＡ分子の５’キャップは、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾されてもよく、これにより、キャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）が生成され、効力がさらに増大し得る。
【００９１】
核酸は、１または２以上のヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド類似体」または「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素含有塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））の中または上に１または２以上の化学修飾（例えば置換）を含むヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員糖類似体、もしくは開鎖糖類似体）、またはリン酸の中または上にさらなる化学修飾を含むことができる。ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドならびにヌクレオシドの調製は、当技術分野において、例えば米国特許第４３７３０７１号、同第４４５８０６６号、同第４５００７０７号、同第４６６８７７７号、同第４９７３６７９号、同第５０４７５２４号、同第５１３２４１８号、同第５１５３３１９号、同第５２６２５３０号、同第５７００６４２号から周知であり、多くの修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドが市販されている。
【００９２】
本発明はさらに、フラジェリンポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子のうちのいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。
【００９３】
本発明はさらに、上述のベクターのうちのいずれかが導入されている宿主細胞を提供する。本発明はさらに、フラジェリンポリペプチドの生成を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、そのように生成されたフラジェリンポリペプチドを回収することにより、本発明のフラジェリンポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００９４】
フラジェリンポリペプチドをコードする核酸配列を含む、本明細書に開示される組成物は、核酸ベースの治療薬であり得る。
【００９５】
核酸は、例えば、ＲＮＡ（すなわち、ＲＮＡベースの治療薬）であってもよいし、またはＤＮＡ（すなわち、プラスミドＤＮＡ治療薬などのＤＮＡベースの治療薬）であってもよい。ある特定の実施形態において、核酸ベースの治療薬は、ＲＮＡベースの治療薬である。ある特定の実施形態において、ＲＮＡベースの治療薬は、自己複製ＲＮＡ分子を含む。自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス由来のＲＮＡレプリコンであり得る。
【００９６】
自己複製ＲＮＡ分子は当技術分野で周知であり、例えば、アルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で構造ウイルスタンパク質を置換することによって生成することができる。自己複製ＲＮＡ分子は、典型的には、細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス（＋）鎖分子であり、この翻訳はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをもたらし、これが次に、送達されたＲＮＡからアンチセンス及びセンスの両方の転写物を生成する。したがって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これらの娘ＲＮＡ、ならびに共線的な（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）サブゲノムの転写物は、コードされた抗原（すなわちフラジェリンポリペプチド）のインサイチュ発現をもたらすように、それら自体が翻訳されてもよいし、または、抗原のインサイチュ発現をもたらすように翻訳される送達されたＲＮＡと同じセンスのさらなる転写物をもたらすように転写されてもよい。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンＲＮＡの数が大きく増幅されるため、コードされた抗原が細胞の主要なポリペプチド産物になることである。
【００９７】
このようにして自己複製を達成するための好適なシステムの１つは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。これらのレプリコンは、細胞への送達後にレプリカーゼ（またはレプリカーゼ転写酵素）の翻訳をもたらすプラス鎖ＲＮＡである。レプリカーゼがポリタンパク質として翻訳され、これが自己切断することで、送達されたプラス鎖ＲＮＡのゲノムのマイナス（−）鎖コピーを作出する複製複合体がもたらされる。これらのマイナス鎖転写物自体を転写して、プラス鎖の親ＲＮＡのさらなるコピーをもたらし、抗原をコードするサブゲノムの転写物をもたらすこともできる。したがって、サブゲノムの転写物の翻訳は、感染細胞による抗原のインサイチュ発現をもたらす。好適なアルファウイルスレプリコンは、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。レプリコンには、変異型または野生型のウイルス配列を使用することができ、例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異体が使用されている。
【００９８】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉ）フラジェリンポリペプチドをコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４のうちの１または２以上を含む、アルファウイルスレプリカーゼであり得る。
【００９９】
核酸ベースの治療薬は、ウイルス性または非ウイルス性の送達系を含み得る。送達系（本明細書では送達ビヒクルともいう）は、コードされたフラジェリンポリペプチドの免疫原性を増強するアジュバント効果を有し得る。例えば、核酸分子は、リポソーム、非毒性の生分解性ポリマー微粒子もしくはウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）にカプセル封入されるか、またはカチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合され得る。いくつかの実施形態では、核酸ベースの治療薬は、カチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）送達系または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を含む。あるいは、核酸ベースの治療薬は、ウイルスレプリコン粒子を含んでもよい。他の実施形態では、核酸ベースの治療薬は、ネイキッドＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）などのネイキッド核酸を含んでもよいが、ＬＮＰを介した送達が好ましい。
【０１００】
ある特定の実施形態において、核酸ベースの治療薬は、カチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）送達系を含む。ＣＮＥ送達系及びそれらの調製方法は、当技術分野で説明されている。ＣＮＥ送達系では、抗原をコードする核酸分子（例えばＲＮＡ）を、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合させる。カチオン性水中油型エマルジョンは、ＲＮＡ分子などの負に帯電した分子を細胞に送達するために使用することができる。エマルジョン粒子は、油性コア及びカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に帯電した分子と相互作用することにより、分子をエマルジョン粒子に固定することができる。有用なＣＮＥのさらなる詳細は、当技術分野に見出すことができる。
【０１０１】
したがって、本発明の核酸ベースの治療薬において、フラジェリンポリペプチドをコードするＲＮＡ分子は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合させることができる。粒子は典型的に、２５Ｃで液相である油性コア（例えば、植物油またはスクアレン）と、カチオン性脂質（例えばリン脂質）と、場合により、界面活性剤（例えば、トリオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０）とを含み、ポリエチレングリコールを含めることもできる。いくつかの実施形態では、ＣＮＥは、スクアレンと、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）などのカチオン性脂質とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、送達系は、ＣＮＥなどの非ウイルス性送達系であり、核酸ベースの治療薬は、自己複製ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。これは、体液性及び細胞性の免疫応答を誘発するのに特に有効であり得る。利点には、限定的な抗ベクター免疫応答がないこと、及びゲノムの組み込みのリスクがないことも含まれる。
【０１０２】
ＬＮＰ送達系及び非毒性の生分解性ポリマー微粒子、ならびにそれらの調製方法は、当技術分野で説明されている。ＬＮＰは、ビリオンではないリポソーム粒子で、核酸分子（例えばＲＮＡ）をカプセル封入することができるものである。粒子は何らかの外部ＲＮＡを（例えば粒子の表面上に）含むことができるが、ＲＮＡの少なくとも半分（理想的にはそのすべて）がカプセル封入される。リポソーム粒子は、例えば、飽和または不飽和であり得る双性イオン性、カチオン性、及びアニオン性脂質、例えば、ＤＳＰＣ（双性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、及び／またはＤＭＧ（アニオン性、飽和）の混合物から形成され得る。本発明で使用される好ましいＬＮＰには、場合により少なくとも１種のカチオン性脂質（例えばＤＯＴＡＰ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡなど）と組み合わせてリポソームを形成することができる両親媒性脂質が含まれる。ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びコレステロールの混合物が特に有効である。他の有用なＬＮＰが当技術分野で開示されている。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＲＶ０１リポソームである。
【０１０３】
ＮＦ−κＢ
ＴＬＲシグナル伝達経路は、最終的に、転写因子の核内因子カッパＢ（ＮＦ−ｋＢ）の活性化をもたらす。ＮＦ−ｋＢは、ＴＮＦ−αを含む数々の炎症性サイトカイン遺伝子の発現を制御する。フラジェリンはＴＬＲ５の二量体化を誘導し、これがその後、ＭｙＤ８８を動員し、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、及びＩＲＡＫ−Ｍを含むプロテインキナーゼを活性化する。これらのキナーゼの活性化は、炎症性サイトカインであるＮＦ−ｋＢの核局在化をもたらす［４４］。
【０１０４】
実施例（図１８）において示されるように、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢの発現の増大をもたらす。本発明の組成物の投与は、炎症性サイトカインであるＮＦ−κＢの発現を増大させるため、本発明の組成物は、免疫応答を刺激するのに有用であり得る。さらに、本発明の組成物は、疾患、特に免疫活性化の低減を特徴とする疾患、及び／または免疫応答の増大によって処置可能な疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させることにより、免疫刺激剤として使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させることにより、免疫活性化の低減を特徴とする疾患を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答の増大によって処置可能な疾患を処置するのに使用するためのものである。
【０１０５】
特に、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢの発現及び／または活性化の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢの発現及び／または活性化の減少を特徴とする疾患を処置するのに使用するためのものである。
【０１０６】
ＮＦ−ｋＢの活性化は、自然免疫応答を誘発し、その後、適応免疫応答を発生させるために重要である。したがって、フラジェリンなどのＴＬＲのアゴニストは、自然免疫応答と適応免疫応答との両方を促進することにより、感染性疾患、アレルギー、及び腫瘍を処置するためのアジュバントとして有用である可能性が高い［４４］。一実施形態において、本発明の組成物は、感染性疾患、アレルギー、及び／または腫瘍を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦ−κＢのレベル及び／または活性を上昇させることにより、感染性疾患、アレルギー、及び／または腫瘍を処置するのに使用するためのものである。
【０１０７】
がんの処置
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、主に自然免疫細胞で発現し、自然免疫系と適応免疫系との両方で重要な役割を果たす膜結合型受容体である。ＴＬＲは、特定の微生物の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に応答する。ＴＬＲは細菌の細胞壁成分を感知し、ＴＬＲ５は、細菌のフラジェリンを認識することが公知である。フラジェリンは、上皮細胞、内皮細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、及びＴ細胞を含む様々なヒト細胞の表面で発現する受容体タンパク質であるＴＬＲ５の唯一の既知のリガンドである［４５〜４７］。細菌フラジェリンによるＴＬＲ５の活性化は、様々な炎症誘発性遺伝子及び免疫応答遺伝子の活性化をもたらす［１５］。
【０１０８】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンによるＴＬＲ５の活性化は、細胞増殖及び腫瘍成長を抑制することが知られている［４８］。Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓフラジェリンＢ（ＦｌａＢ）を分泌するように操作されたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株は、マウスモデルにおいて腫瘍成長及び転移を効果的に抑制することが示されており、ＴＬＲ４及びＴＬＲ５シグナル伝達経路の２ステップの活性化によって生存期間を延長させた［４９］。他の種に由来するフラジェリンポリペプチドががんを処置する効力は未知である。化合物がＴＬＲ５応答を活性化する能力をアッセイすることにより、その化合物ががんの処置に有効であり得るかが示される。
【０１０９】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株、特に菌株ＭＲｘ０５１８を含む組成物は、がんの処置及び防止に有効である［５０］。本発明者らは、驚くべきことに、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株の抗がん活性に寄与し得る強力なＴＬＲ５応答を刺激できることを示した。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのフラジェリンポリペプチドは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのフラジェリンポリペプチドと、配列に大きな相違点がある。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のフラジェリンポリペプチドよりも強力なＴＬＲ５応答を生成できることを示す。したがって、本発明者らは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが治療に有用であり、特にがんの処置及び防止に有効であることを示した。
【０１１０】
ＴＬＲ５は、乳癌、結腸直腸癌、及び胃癌を含むいくつかの異なるがんで発現することが示されている。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なＴＬＲ５応答を生成できることを示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、または胃癌の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、乳癌、結腸直腸癌、または胃癌の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、乳癌、結腸直腸癌、または胃癌における、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、乳癌の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、結腸直腸癌の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、胃癌の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、本発明は、ＴＬＲ５関連癌の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１１２】
本発明は、がんの処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明はまた、がんの処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、がんの処置または防止に使用するための、特に配列番号１の配列を有する、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
【０１１３】
本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。さらに、本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を含む組成物を提供する。
【０１１４】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物による処置は、腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の低減をもたらす。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、腫瘍サイズの低減または腫瘍成長の低減に使用するためのものである。本発明の組成物は、腫瘍のサイズまたは成長を低減させるのに有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、固形腫瘍を有する患者の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、がんの処置において血管新生を低減または防止するのに使用するためのものである。本発明の組成物は、血管新生において中心的な役割を果たす免疫系または炎症系に影響を及ぼし得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、転移の防止に使用するためのものである。
【０１１５】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、乳癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献［５０］は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株が乳癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、乳癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、乳癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは乳癌である。好ましい実施形態では、がんはステージＩＶ乳癌である。
【０１１６】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、肺癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献［５０］は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株が肺癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、肺癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、肺癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは肺癌である。
【０１１７】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、肝臓癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献［５０］は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株が肝臓癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、肝臓癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、肝臓癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは肝細胞腫（肝細胞癌）である。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、結腸直腸癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献［５０］は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株が結腸直腸癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、結腸直腸癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、結腸直腸癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは結腸直腸腺癌である。
【０１１９】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、結腸癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献［５０］は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株が結腸癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、結腸癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、結腸癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは結腸腺癌である。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、直腸癌の処置または防止に使用するためのものである。参考文献［５０］は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株が直腸癌に対して強力な効果を有することを示しているため、本願のデータに従えば、本発明のフラジェリンポリペプチドは、直腸癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、直腸癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは直腸腺癌である。好ましい実施形態では、本発明は、直腸癌の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１２１】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、胃癌の処置または防止に使用するためのものである。胃癌は高レベルのＴＬＲ５を発現し、フラジェリンによる処置は強力な抗腫瘍活性を誘発することが示されている［５１］。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドが強力なＴＬＲ５応答を生成できることを示しており、したがって本発明のフラジェリンポリペプチドは、胃癌に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、胃癌の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、がんは胃腺癌である。好ましい実施形態では、本発明は、胃癌の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１２２】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、メラノーマの処置または防止に使用するためのものである。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのフラジェリンは、主要組織適合抗原クラスＩＩ制限Ｐ１０ペプチドと組み合わせると、マウスメラノーマモデルで肺転移の数を低減させることが示されている［５２］。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも強力なＴＬＲ５応答を生成できることを示しており、したがって本発明のフラジェリンポリペプチドは、メラノーマに対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、メラノーマの処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、メラノーマの処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、神経芽腫の処置または防止に使用するためのものである。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンによるＴＬＲ５の活性化は、細胞増殖及び腫瘍成長を抑制することが知られている［５３］。実施例は、本発明のフラジェリンポリペプチドがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも強力なＴＬＲ５応答を生成できることを示しており、したがって本発明のフラジェリンポリペプチドは、神経芽腫に対して特に有効であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、神経芽腫の処置において、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の低減、または血管新生の低減に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、神経芽腫の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、がんは、腸のがんである。いくつかの実施形態では、がんは、腸ではない身体の一部のがんである。いくつかの実施形態では、がんは、腸癌ではない。いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸癌ではない。いくつかの実施形態では、がんは、小腸癌ではない。いくつかの実施形態では、処置または防止は、腸以外の部位で起こる。いくつかの実施形態では、処置または防止は、腸でも、また腸以外の部位でも起こる。
【０１２５】
ＴＬＲ５の発現は、多発性骨髄腫［５４］及び急性骨髄性白血病［５５］を含む血液癌細胞株において検出されている。本発明者らは、実施例において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なＴＬＲ５応答を活性化するのに特に有効であることを示した。したがって、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５を発現する多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病などの血液癌の処置または防止に有用であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、及び急性単球性白血病などの急性及び慢性の白血病、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、ならびに骨髄異形成症候群などの血液学的悪性疾患の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、急性骨髄性白血病の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１２６】
ある特定の実施形態において、本発明は、多発性骨髄腫の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、急性骨髄性白血病の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１２７】
幅広い腫瘍モデル及び臨床試験において様々なＴＬＲアゴニストが試験されている［５６］。例えば、ＴＬＲ５アゴニストＣＢＬＢ５０２は、Ｔ細胞リンパ腫及びＢ細胞リンパ腫のマウスモデルにおいて腫瘍クリアランスを促進することが示されている［５７］。ＴＬＲ５アゴニストであるエントリモド（薬理学的に最適化されたフラジェリン誘導体）の全身投与は、マウスモデルにおいて結腸直腸細胞の肝転移を抑制した。肝臓は、ＴＬＲ５アゴニストであるエントリモドの投与後に最も強力なＴＬＲ５活性化応答を示す［５８］。本発明者らは、実施例において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なＴＬＲ５アゴニストとして作用することを示した。したがって、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、Ｔ細胞リンパ腫及びＢ細胞リンパ腫、結腸直腸癌ならびに肝臓癌の処置または防止に特に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｔ細胞リンパ腫及びＢ細胞リンパ腫の処置または防止に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、Ｔ細胞リンパ腫及びＢ細胞リンパ腫の処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１２８】
他の実施形態では、本発明の組成物は、転移の処置または防止に有用であり得る。他の実施形態では、本発明の組成物は、転移癌の処置に有用であり得る。他の実施形態では、本発明の組成物は、進行癌の処置に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明は、転移の処置、低減、または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、転移増殖を減少または防止し得る。好ましい実施形態では、本発明は、転移の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、転移癌の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、進行癌の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、癌腫の処置または防止に使用するためのものである。
【０１３０】
Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓフラジェリンＢ（ＦｌａＢ）は、ＴＬＲ４及びＴＬＲ５シグナル伝達経路の２ステップの活性化によって腫瘍成長を効果的に抑制することが示されている。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ４及びＴＬＲ５シグナル伝達経路を活性化することができる。他の実施形態では、本発明のフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５シグナル伝達経路のみを活性化する。
【０１３１】
ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチドは、ＮＦκＢシグナル伝達経路を活性化することができる。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＴＬＲ９シグナル伝達経路を活性化することができる。参考文献［５９］は、フラジェリンとＴＬＲ９アゴニストのＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドとの間の相乗効果が腫瘍抑制につながることを示す。ある特定の実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＴＬＲ５及びＴＬＲ９シグナル伝達経路を活性化することができる。ある特定のそのような実施形態では、本発明の組成物は、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドを含むか、またはＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドと組み合わせて投与される。
【０１３２】
がんに対する本発明の組成物の治療効果は、炎症誘発性メカニズムによって媒介され得る。フラジェリンによるＴＬＲ５の活性化は、炎症誘発性シグナルカスケードを開始する。参考文献［５９］は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンと高免疫原性腫瘍との相互作用がＴｈ１応答及びＴｒｅｇの抑制を誘導し、腫瘍成長の阻害をもたらすことを示す。対照的に、低免疫原性腫瘍の成長率は、フラジェリン投与の影響を受けなかった。したがって、ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチド及び組成物は、免疫原性腫瘍、特に高免疫原性腫瘍の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、がんの処置において炎症を促進するのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、がんの処置においてＴｈ１炎症を促進するのに使用するためのものである。Ｔｈ１細胞はＩＦＮγを生成し、強力な抗がん作用を有する［６０］。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、転移していないがん、またはステージ０もしくはステージ１のがんなど、初期がんの処置に使用するためのものである。炎症の促進は、初期がんに対してより有効であり得る［６０］。
【０１３３】
参考文献［５９］は、腫瘍移植後のフラジェリンの投与が抗原性腫瘍の成長を著しく阻害したことを示す。腫瘍成長に対するフラジェリンの様々な効果は、誘導される免疫応答と相関する。移植後のフラジェリン投与は、ＩＦＮ−γ：ＩＬ−４比の増大及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の発生頻度の減少と関連した。したがって、ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチド及び組成物は、ＩＦＮ−γ：ＩＬ−４比を増大させる。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンポリペプチド及び組成物は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の発生頻度を減少させる。他の実施形態では、本発明のフラジェリンポリペプチド及び組成物は、ＩＦＮ−γ：ＩＬ−４比を減少させず、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞発生頻度を増大させない。炎症はがん抑制作用を有する可能性があり［６０］、ＴＮＦαなどの炎症性サイトカインは、がん療法として研究されている［６１］。ＴＮＦなどの遺伝子の上方制御は、本発明の組成物が同様のメカニズムを介してがんを処置するのに有用であり得ることを示し得る。ＣＸＣＲ３リガンド（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０）及びＩＦＮγ誘導性遺伝子（ＩＬ−３２）の上方制御は、本発明の組成物がＩＦＮγ型応答を誘発することを示し得る。ＩＦＮγは、殺腫瘍活性を刺激することができる強力なマクロファージ活性化因子であり［６２］、例えばＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０も、抗がん作用を有する［６３〜６５］。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、炎症を促進して第２の抗がん剤の効果を増強するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、がんの処置または防止は、１または２以上のサイトカインの発現レベルを上昇させることを含む。例えば、ある特定の実施形態において、がんの処置または防止は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αのうちの１または２以上、例えば、ＩＬ−１β及びＩＬ−６、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α、またはＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの３つすべての発現レベルを上昇させることを含む。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αのうちのいずれかの発現レベルの上昇は、がんの処置における効力を示すことが知られている。
【０１３５】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、以前に化学療法を受けた患者を処置するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法処置に耐容性を示さなかった患者を処置するのに使用するためのものである。本発明の組成物は、そのような患者に特に好適であり得る。
【０１３６】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、再発を防止するためのものである。本発明の組成物は、長期投与に好適であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、がんの進行の防止に使用するためのものである。
【０１３７】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、非小細胞肺癌の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、小細胞肺癌の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、扁平上皮癌の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、腺癌の処置に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、腺管腫瘍、カルチノイド腫瘍、または未分化癌の処置に使用するためのものである。
【０１３８】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウイルス感染に起因する肝芽腫、胆管細胞癌、胆管細胞嚢胞腺癌、または肝臓癌の処置に使用するためのものである。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、または浸潤性小葉癌の処置に使用するためのものである。
【０１４０】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞性腫瘍、小児における視覚路及び視床下部のグリオーマ、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、咽頭癌、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍、前立腺癌、腎細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌の処置または防止に使用するためのものである。
【０１４１】
本発明の組成物は、さらなる治療剤と組み合わせて使用した場合に特に有効であり得る。本発明の組成物の免疫調節効果は、より直接的な抗がん剤と組み合わせると有効であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチド（またはコーディングポリヌクレオチドもしくは発現宿主細胞）と、抗がん剤とを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤、標的化抗体免疫療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス、または細胞増殖抑制薬である。好ましくは、抗がん剤はＫｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ、Ｍｅｒｃｋ）である。さらに好ましい実施形態において、本組成物は、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ、ＢＭＳ）、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ、ＢＭＳ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トレメリムマブ（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＣＴ−０１１（ピディリズマブ、ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＢＭＳ−９８６０１５（リリルマブ、ＢＭＳ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）、ＰＦ−０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＢＭＳ−９８６０１６（ＢＭＳ）、ＢＭＳ−６６３５１３（ウレルマブ、ＢＭＳ）、ＩＭＰ３２１（Ｐｒｉｍａ  Ｂｉｏｍｅｄ）、ＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＲＧＸ−１１０（ａｒＧＥＮ−Ｘ）、ＰＦ−０５０８２４６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＤＸ−１１２７（バルリルマブ、ＣｅｌｌＤｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＴＲＸ−５１８（ＧＩＴＲ  Ｉｎｃ．）、ＭＫ−４１６６（Ｍｅｒｃｋ）、ＪＴＸ−２０１１（Ｊｏｕｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＡＲＧＸ−１１５（ａｒＧＥＮ−Ｘ）、ＮＬＧ−９１８９（インドキシモド、ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ）、ＩＰＨ２２０１（Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＡＺ）、ＮＬＧ−９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、抗ＶＩＳＴＡ（ＪｎＪ）、エパカドスタット（ＩＮＣＢ２４３６０、Ｉｎｃｙｔｅ）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ／ＢＭＳ）、ＣＰ  ８７０８９３（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、ＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｘ）、エマクツヅマブ（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ガルニセルチブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ウロクプルマブ（ＢＭＳ）、ＢＫＴ１４０／ＢＬ８０４０（Ｂｉｏｋｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、バビツキシマブ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＣ  ９０００２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、８５２Ａ（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＶＴＸ−２３３７（ＶｅｎｔｉＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＭＯ−２０５５（Ｈｙｂｒｉｄｏｎ、Ｉｄｅｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＬＹ２１５７２９９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＥＷ−７１９７（Ｅｗｈａ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｏｒｅａ）、ベムラフェニブ（Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ）、ダブラフェニブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＧＳＫ）、ＢＭＳ−７７７６���７（ＢＭＳ）、ＢＬＺ９４５（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ）、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ（ジヌツキシマブ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（ブリナツモマブ、Ａｍｇｅｎ）、Ｃｙｒａｍｚａ（ラムシルマブ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、Ｇａｚｙｖａ（オビヌツズマブ、Ｒｏｃｈｅ／Ｂｉｏｇｅｎ）、Ｋａｄｃｙｌａ（アド−トラスツズマブエムタンシン、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブベドチン、Ｔａｋｅｄａ／Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ、ＧＳＫ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ、Ａｍｇｅｎ）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ、ＢＭＳ／Ｍｅｒｃｋ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ−Ｉ１３１、ＧＳＫ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ、Ｂａｙｅｒ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ）、ボロシキシマブ（Ａｂｂｖｉｅ）、エナバツズマブ（Ａｂｂｖｉｅ）、ＡＢＴ−４１４（Ａｂｂｖｉｅ）、エロツズマブ（Ａｂｂｖｉｅ／ＢＭＳ）、ＡＬＸ−０１４１（Ａｂｌｙｎｘ）、オザラリズマブ（Ｏｚａｒａｌｉｚｕｍａｂ）（Ａｂｌｙｎｘ）、Ａｃｔｉｍａｂ−Ｃ（Ａｃｔｉｎｉｕｍ）、Ａｃｔｉｍａｂ−Ｐ（Ａｃｔｉｎｉｕｍ）、ミラツズマブ−ｄｏｘ（Ａｃｔｉｎｉｕｍ）、Ｅｍａｂ−ＳＮ−３８（Ａｃｔｉｎｉｕｍ）、ナプツモマブエスタフェナトクス（Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＡＦＭ１３（Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＡＧＳ−１６Ｃ３Ｆ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＧＳ−１６Ｍ８Ｆ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＧＳ−２２ＭＥ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＧＳ−１５ＭＥ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＧＳ−６７Ｅ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＬＸＮ６０００（サマリズマブ、Ａｌｅｘｉｏｎ）、ＡＬＴ−８３６（Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＬＴ−８０１（Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＬＴ−８０３（Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＭＧ７８０（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ２２８（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ８２０（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ１７２（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ５９５（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ１１０（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ２３２（アデカツムマブ、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ２１１（Ａｍｇｅｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＢＡＹ２０−１０１１２（Ａｍｇｅｎ／Ｂａｙｅｒ）、リロツムマブ（Ａｍｇｅｎ）、デノスマブ（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＰ−５１４（Ａｍｇｅｎ）、ＭＥＤＩ５７５（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ３６１７（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ６３８３（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ５５１（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、モキセツモマブパスードトクス（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ５６５（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥ��Ｉ０６３９（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＥＤＩ５６２（ＡＺ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＡＶ−３８０（ＡＶＥＯ）、ＡＶ２０３（ＡＶＥＯ）、ＡＶ２９９（ＡＶＥＯ）、ＢＡＹ７９−４６２０（Ｂａｙｅｒ）、アネツマブラブタンシン（Ｂａｙｅｒ）、バンチクツマブ（Ｂａｙｅｒ）、ＢＡＹ９４−９３４３（Ｂａｙｅｒ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ）、ＢＩ−８３６８４５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ）、Ｂ−７０１（ＢｉｏＣｌｉｎ）、ＢＩＩＢ０１５（Ｂｉｏｇｅｎ）、オビヌツズマブ（Ｂｉｏｇｅｎ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＩ−５０５（Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ）、ＢＩ−１２０６（Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ）、ＴＢ−４０３（Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ）、ＢＴ−０６２（Ｂｉｏｔｅｓｔ）ＢＩＬ−０１０ｔ（Ｂｉｏｓｃｅｐｔｒｅ）、ＭＤＸ−１２０３（ＢＭＳ）、ＭＤＸ−１２０４（ＢＭＳ）、ネシツムマブ（ＢＭＳ）、ＣＡＮ−４（Ｃａｎｔａｒｇｉａ  ＡＢ）、ＣＤＸ−０１１（Ｃｅｌｌｄｅｘ）、ＣＤＸ１４０１（Ｃｅｌｌｄｅｘ）、ＣＤＸ３０１（Ｃｅｌｌｄｅｘ）、Ｕ３−１５６５（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、パトリツマブ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ティガツズマブ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ニモツズマブ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ＤＳ−８８９５（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ＤＳ−８８７３（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ＤＳ−５５７３（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）、ＭＯＲａｂ−００４（Ｅｉｓａｉ）、ＭＯＲａｂ−００９（Ｅｉｓａｉ）、ＭＯＲａｂ−００３（Ｅｉｓａｉ）、ＭＯＲａｂ−０６６（Ｅｉｓａｉ）、ＬＹ３０１２２０７（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ２８７５３５８（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ２８１２１７６（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ３０１２２１７（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ２４９５６５５（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ３０１２２１２（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ３０１２２１１（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ３００９８０６（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、シズツムマブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、フランボツマブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＩＭＣ−ＴＲ１（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ラムシルマブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、タバルマブ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ザノリムマブ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＦＧ−３０１９（ＦｉｂｒｏＧｅｎ）、ＦＰＡ００８（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＦＰ−１０３９（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＦＰＡ１４４（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カツマキソマブ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩＭＡＢ３６２（Ｇａｎｙｍｅｄ）、ＩＭＡＢ０２７（Ｇａｎｙｍｅｄ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ７４（Ｇｅｎｍａｂ）、ＨｕＭａｘ−ＴＦＡＤＣ（Ｇｅｎｍａｂ）、ＧＳ−５７４５（Ｇｉｌｅａｄ）、ＧＳ−６６２４（Ｇｉｌｅａｄ）、ＯＭＰ−２１Ｍ１８（デミシズマブ、ＧＳＫ）、マパツズマブ（ＧＳＫ）、ＩＭＧＮ２８９（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＧＮ９０１（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＧＮ８５３（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＧＮ５２９（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＭＵ−１３０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ミラツズマブ−ｄｏｘ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１１５（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１３２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１０６（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１０２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、エプラツズマブ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、クリバツズマブ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＰＨ４１（Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ダラツムマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ／Ｇｅｎｍａｂ）、ＣＮＴＯ−９５（インテツムマブ、Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＣＮＴＯ−３２８（シルツキシマブ、Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＫＢ００４（ＫａｌｏＢｉｏｓ）、モガムリズマブ（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｉｒｒｉｎ）、ＫＷ−２８７１（エクロメキシマブ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）（Ｌｐａｔｈ）、マルジェツキシマブ（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、エノブリツズマブ（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＧＤ００６（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＧＦ００７（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＫ−０６４６（ダロツズマブ、Ｍｅｒｃｋ）、ＭＫ−３４７５（Ｍｅｒｃｋ）、Ｓｙｍ００４（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ／Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ＤＩ１７Ｅ６（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＭＯＲ２０２（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、Ｘｍａｂ５５７４（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＢＰＣ−１Ｃ（エンシツキシマブ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＴＡＳ２６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＬＦＡ１０２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＨＱ８８０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＱＧＥ０３１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＨＣＤ１２２（ルカツムマブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＬＪＭ７１６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＴ３５５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＯＭＰ−２１Ｍ１８（デミシズマブ、ＯｎｃｏＭｅｄ）、ＯＭＰ５２Ｍ５１（Ｏｎｃｏｍｅｄ／ＧＳＫ）、ＯＭＰ−５９Ｒ５（Ｏｎｃｏｍｅｄ／ＧＳＫ）、バンチクツマブ（Ｏｎｃｏｍｅｄ／Ｂａｙｅｒ）、ＣＭＣ−５４４（イノツズマブオゾガマイシン、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−０３４４６９６２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−０４８５６８８４（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＳＭＡ−ＡＤＣ（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＲＥＧＮ１４００（Ｒｅｇｅｎｅ
ｒｏｎ）、ＲＥＧＮ９１０（ネスバクマブ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ）、ＲＥＧＮ４２１（エノチクマブ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ）、ＲＧ７２２１、ＲＧ７３５６、ＲＧ７１５５、ＲＧ７４４４、ＲＧ７１１６、ＲＧ７４５８、ＲＧ７５９８、ＲＧ７５９９、ＲＧ７６００、ＲＧ７６３６、ＲＧ７４５０、ＲＧ７５９３、ＲＧ７５９６、ＤＣＤＳ３４１０Ａ、ＲＧ７４１４（パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ））、ＲＧ７１６０（イムガツズマブ）、ＲＧ７１５９（オビンツズマブ（ｏｂｉｎｔｕｚｕｍａｂ））、ＲＧ７６８６、ＲＧ３６３８（オナルツズマブ）、ＲＧ７５９７（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＳＡＲ３０７７４６（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ５６６６５８（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ６５０９８４（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ１５３１９２（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ３４１９（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＡＲ２５６２１２（Ｓａｎｏｆｉ）、ＳＧＮ−ＬＩＶ１Ａ（リンツズマブ、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−７５（ボルセツズマブマホドチン、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−１９Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ＳＧＮ−ＣＤ７０Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＥＡ−ＣＤ４０（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、イブリツモマブチウキセタン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、ＭＬＮ０２６４（Ｔａｋｅｄａ）、ガニツマブ（Ｔａｋｅｄａ／Ａｍｇｅｎ）、ＣＥＰ−３７２５０（Ｔｅｖａ）、ＴＢ−４０３（Ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ）、ＶＢ４−８４５（Ｖｉｖｅｎｔｉａ）、Ｘｍａｂ２５１２（Ｘｅｎｃｏｒ）、Ｘｍａｂ５５７４（Ｘｅｎｃｏｒ）、ニモツズマブ（ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カルルマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲ（Ａｄａｐｔｉｍｍｕｎｅ）、ＭＡＧＥ−Ａ−１０  ＴＣＲ（Ａｄａｐｔｉｍｍｕｎｅ）、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＪＣＡＲ０１５（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＫＴＥ−Ｃ１９  ＣＡＲ（Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）、ＵＣＡＲＴ１９（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）、ＢＰＸ−４０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＰＸ−６０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＴＴＣＫ２０（Ｕｎｕｍ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＡＲ−ＮＫＧ２Ｄ（Ｃｅｌｙａｄ）、Ｏｎｙｘ−０１５（Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｈ１０１（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｕｎｗａｙｂｉｏ）、ＤＮＸ−２４０１（ＤＮＡｔｒｉｘ）、ＶＣＮ−０１（ＶＣＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃｏｌｏ−Ａｄ１（ＰｓｉＯｘｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＰｒｏｓｔＡｔａｋ（Ａｄｖａｎｔａｇｅｎｅ）、Ｏｎｃｏｓ−１０２（Ｏｎｃｏｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ  Ｇｅｎｅｓｙｓ）、Ｐｅｘａ−ｖａｃ（ＪＸ−５９４、Ｊｅｎｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＧＬ−ＯＮＣ１（Ｇｅｎｅｌｕｘ）、Ｔ−ＶＥＣ（Ａｍｇｅｎ）、Ｇ２０７（Ｍｅｄｉｇｅｎｅ）、ＨＦ１０（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）、ＳＥＰＲＥＨＶＩＲ（ＨＳＶ１７１６、Ｖｉｒｔｔｕ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＯｒｉｅｎＸ０１０（ＯｒｉｅｎＧｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＳＶＶ−００１（Ｎｅｏｔｒｏｐｉｘ）、Ｃａｃａｔａｋ（ＣＶＡ２１、Ｖｉｒａｌｙｔｉｃｓ）、Ａｌｉｍｔａ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、シスプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、フォリン酸、メトトレキサート、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、Ｚｙｋａｄｉａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｔａｆｉｎｌａｒ（ＧＳＫ）、Ｘａｌｋｏｒｉ（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｉｒｅｓｓａ（ＡＺ）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｔａｒｃｅｖａ（Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ）、Ｈａｌａｖｅｎ（Ｅｉｓａｉ  Ｐｈａｒｍａ）、ベリパリブ（Ａｂｂｖｉｅ）、ＡＺＤ９２９１（ＡＺ）、アレクチニブ（Ｃｈｕｇａｉ）、ＬＤＫ３７８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ゲネテスピブ（Ｇｅｎｅｔｅｓｐｉｂ）（Ｓｙｎｔａ  Ｐｈａｒｍａ）、テルゲンプマツセル−Ｌ（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＧＶ１００１（Ｋａｅｌ−ＧｅｍＶａｘ）、チバンチニブ（ＡｒＱｕｌｅ）、Ｃｙｔｏｘａｎ（ＢＭＳ）、Ｏｎｃｏｖｉｎ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｇｅｍｚａｒ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、Ｘｅｌｏｄａ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｘｅｍｐｒａ（ＢＭＳ）、Ａｂｒａｘａｎｅ（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、Ｔｒｅｌｓｔａｒ（Ｄｅｂｉｏｐｈａｒｍ）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（Ｓａｎｏｆｉ）、Ｎｅｘａｖａｒ（Ｂａｙｅｒ）、ＩＭＭＵ−１３２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、Ｅ７４４９（Ｅｉｓａｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｄｏｘ（Ｃｅｌｓｉｏｎ）、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（Ｅｘｅｌｌｘｉｓ）、Ｌｏｎｓｕｒｆ（Ｔａｉｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＵＦＴ（Ｔａｉｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、及びＴＳ−１（Ｔａｉｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）からなる群から選択される抗がん剤を含む。
【０１４２】
さらに好ましい実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、他のフラジェリンとの有用な効果を示している［５９］、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドと組み合わせて（同時または連続的に）投与される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、本発明の組成物における唯一の治療活性剤（複数可）である。
【０１４４】
有毒な化学物質、病原体または放射線への曝露からの保護
ある特定の実施形態において、本発明は、有毒な化学物質、病原体または放射線への曝露に関連する症状の防止または処置に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチド、好ましくはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチド、好ましくは菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明のフラジェリンは、有毒な化学物質、病原体もしくは放射線への曝露のリスクがある対象、または有毒な化学物質、病原体もしくは放射線に最近曝露された対象、例えば１、２、３、４、または５時間前に曝露された対象に投与することができる。
【０１４５】
化学物質、病原体、または放射線にヒト集団が突然曝露されると、かなりの病的状態が生じる可能性がある。ヒト集団を保護するための戦略の１つは、生来の宿主防御経路、特に細胞保護遺伝子及び／または抗菌遺伝子の発現を急速に誘導するものを活性化することである。この領域における多くの研究はＴＬＲ４アゴニストのＬＰＳ／エンドトキシンに焦点を当ててきたが、ＬＰＳの投与は、敗血症または重度の肺傷害を含む重度の炎症性病態を引き起こす可能性がある。さらに、ＬＰＳは、病原体または化学物質の負荷と相互作用する最初の細胞である上皮細胞を十分に刺激することができない。
【０１４６】
フラジェリンは、哺乳動物、昆虫、及び植物を含む様々な生物において宿主防御を刺激する。ＬＰＳとは対照的に、フラジェリンは、上皮細胞における自然免疫シグナル伝達経路の強力な活性化因子であるが、概して、マクロファージ及び樹状細胞などの造血細胞の活性化因子としては不十分であることが観察されている。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンは、ＬＰＳに関連する有害作用を媒介するＴＮＦ−αなどの「マスター」炎症性サイトカインを有意なレベルで刺激しないことが観察されている。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンは、マウスのＴＬＲ５媒介性自然免疫を活性化し、化学物質、病原体または放射線への曝露からマウスを保護することが観察されている［６６］。
【０１４７】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンの投与は、ＴＬＲ５を必要とするメカニズムを介して放射線曝露から保護することが示されている［６６］。照射の２時間前にフラジェリンを予防的に投与した場合に最適な保護が観察されたが、照射の４時間後までにフラジェリンを投与した場合にも依然として有意な程度の保護が観察された。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも強力なＴＬＲ５応答を刺激できることを示す。したがって、本発明者らは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが放射線防護剤として有用であり得ることを示した。
【０１４８】
本発明は、放射線防護剤として使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明はまた、放射線防護剤として使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、放射線防護剤として使用するための、特に配列番号１の配列を有する、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
【０１４９】
ＴＬＲ５アゴニストのエントリモドによる処置も、放射線感受性組織の３つの主要なタイプである造血組織、消化器系組織、及び皮膚組織のすべてにおいて、放射線誘発性損傷を低減させることが示されている。また、頭頸部照射のマウスモデルにおいて放射線誘発性の上皮損傷を軽減することも示されている［６７］。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが強力なＴＬＲ５アゴニストとして作用することを示す。したがって、本発明者らは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが、放射線誘発性損傷を低減させるのに有用であり得ることを示した。ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、造血組織、消化器系組織、または皮膚組織における放射線誘発性損傷を低減させるのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、放射線誘発性の上皮損傷を低減させるのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明は、放射線誘発性損傷を低減させるのに使用するため、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１５０】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、放射線療法の前に、好ましくは経口的に投与され得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、放射線療法の後に、好ましくは経口的に投与され得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、放射線療法を最近受けた患者、または放射線療法を受ける予定である患者に投与される。
【０１５１】
好ましい実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、照射曝露の前に投与される。他の実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、放射線曝露の後、好ましくは曝露後４時間以内に投与される。
【０１５２】
細菌感染の処置
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンの投与は、細菌感染に対する免疫応答を刺激することが示されている。参考文献［６８］は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンを抗生物質とともに予防的に鼻腔内投与するとマウスの呼吸器がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌から保護されることを示し、参考文献［６６］は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍによる感染の２時間前にＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリンを経口投与すると死亡率が低減したことを示す。フラジェリンは、ＴＬＲ５自然免疫応答を活性化することにより、これらの応答を誘導した。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも強力なＴＬＲ５応答を刺激できることを示す。したがって、本発明者らは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが、細菌感染の処置または防止に有用であり得ることを示した。
【０１５３】
本発明は、細菌感染の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明はまた、細菌感染の処置または防止に使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、細菌感染の処置または防止に使用するための、特に配列番号１の配列を有する、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
【０１５４】
ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、細菌感染の処置に使用するための抗生物質と組み合わせて使用される。ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、細菌感染の処置に使用するための組成物における唯一の治療剤として使用される。
【０１５５】
ワクチンアジュバント
微生物成分は、低免疫原性ワクチンの免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用することができる。フラジェリンは、細菌、ウイルス、及び寄生虫の感染のためのワクチンにおけるアジュバントとして作用することが示されているが、これらの研究のほとんどは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＶｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓのフラジェリンを使用するものであった［１５］。他の種、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に由来するフラジェリンポリペプチドがワクチンアジュバントとして作用する効力は未知である。
【０１５６】
フラジェリンは、ＴＬＲ５受容体を介して自然免疫応答を刺激することにより、アジュバントとして作用する。本発明者らは、驚くべきことに、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも強力なＴＬＲ５応答を刺激できることを示した。したがって、本発明者らは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドが、ワクチンアジュバントとして有用であり得ることを示した。ワクチンアジュバントとしてのフラジェリンポリペプチドの使用は、フラジェリンポリペプチドが、概して、別々の抗原に対する免疫応答を増強することにより、例えば、感染因子からの保護を提供するため、または感染因子による感染を防止するために使用されることを意味する。
【０１５７】
本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。本発明はまた、ワクチンアジュバントとして使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、特に配列番号１の配列を有する、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
【０１５８】
本発明はまた、本発明のフラジェリンポリペプチドをアジュバントとして含むワクチン組成物を提供する。ある特定の実施形態において、ワクチン組成物は、細菌感染の処置または防止に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、処置または防止される細菌性病原体は、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、ｔｅｔａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、またはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。ある特定の実施形態において、ワクチン組成物は、ウイルス感染の処置または防止に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、処置または防止されるウイルス病原体は、インフルエンザ、ＨＩＶ、狂犬病、または口蹄疫ウイルスである。ある特定の実施形態において、ワクチン組成物は、寄生虫感染の処置または防止に使用するためのものである。ある特定の実施形態において、寄生虫は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ、またはＥｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａである。そのような任意の実施形態において、本組成物は、関連する病原体に由来する少なくとも１つの抗原を含む。そのような好ましい実施形態において、本組成物は、関連する病原体に由来する少なくとも１つの抗原に融合またはコンジュゲートした本発明のフラジェリンを含む。そのような実施形態では、本発明は、本発明のフラジェリンと、任意選択のリンカーと、病原体または寄生虫由来の抗原とを含む、融合ポリペプチドを提供する。
【０１５９】
粘膜経路による投与は、魅力的なワクチン投与経路である。フラジェリンは、上皮細胞における自然免疫シグナル伝達経路の強力な活性化因子であり、上皮細胞は、粘膜経路によって投与される薬剤に最初に遭遇する最初の主要な細胞型である。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＶｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓのフラジェリンタンパク質は、インフルエンザ、西ナイルウイルス、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに対する粘膜ワクチンにおいて強力なアジュバント活性を示している［１５］。他の種に由来するフラジェリンポリペプチドが粘膜ワクチンアジュバントとして作用する効力は未知である。
【０１６０】
フラジェリンは、ＴＬＲ５受容体を介して自然免疫応答を刺激することにより、アジュバントとして作用する。本発明者らは、驚くべきことに、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも強力なＴＬＲ５応答を刺激できることを示した。したがって、本発明は、粘膜ワクチンアジュバントとして使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、粘膜ワクチンアジュバントとして使用するための、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。より好ましくは、本発明は、粘膜ワクチンアジュバントとして使用するための、特に配列番号１の配列を有する、菌株ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチドを提供する。
【０１６１】
ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、細菌感染の処置または防止に使用するための粘膜ワクチンに使用するためのものである。好ましい実施形態では、細菌感染は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである。ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、ウイルス感染の処置または防止に使用するための粘膜ワクチンに使用するためのものである。好ましい実施形態では、ウイルス感染はインフルエンザまたは西ナイルウイルスである。
【０１６２】
本発明の組成物の投与は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現の増大をもたらし得る。ＴＮＦ−αは、ワクチン応答に重要であることが知られている。例えば、ＴＮＦ−αは、高齢者集団のインフルエンザワクチン接種における効率的なワクチン応答に必要であることが示されている［６９］。本発明の組成物の投与はＴＮＦ−α発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αのレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、インフルエンザ治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答を増強するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明は、抗原と組み合わせて投与される組成物を提供する。本発明のそのような実施形態において、本発明のフラジェリンは、抗原に融合またはコンジュゲートしていてもよい。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワクチン接種の直前または直後に患者に投与するためのものである。
【０１６３】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、特に菌株ＭＲＸ５１８は有鞭毛性であり、フラジェリンはＴＬＲ５アゴニストであり得る。ＴＬＲアゴニストは、特に高齢者集団において、様々な抗原タイプに対するワクチンアジュバントとして開発中である［７０］。また、ＭＲＸ５１８はＴＬＲ５アゴニストである。したがって、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして、特に免疫系の活性が低減している場合がある高齢患者（例えば、４０、５０、６０、７０または８０歳超）に投与されるワクチンのために有用であり得る。ＴＬＲ５シグナル伝達は、年齢に関連した自然免疫応答においても重要な役割を果たす［７１］。ある特定の実施形態において、本組成物は、自然免疫応答を増強するのに使用するためのものである。ＴＬＲ５アゴニストはワクチンアジュバントとして開発中であるが、これらはすべて既知の病原体に由来し、及び／または合成である。対照的に、本発明の組成物は、共生細菌を含む。
【０１６４】
本発明の組成物の投与は、ＩＬ−６の発現の増大をもたらし得る。Ｉｌ−６の発現の増大は、多くの疾患でワクチン応答に関連付けられてきた。例えば、成人にインフルエンザワクチンを投与した後、ＩＬ−６がＣＤ１４＋ＣＤ１６−炎症性単球によって生成され［７２］、より高いレベルのＩＬ−６は、インフルエンザワクチンに対するワクチン応答の達成に関連付けられた［７３］。さらに、ＡＳ０３アジュバント系の注射後にＩｌ−６が生成され［７４］、結核ワクチンの投与後には、マウスにおけるＩＬ−６の下方制御がヘルパーＴ細胞応答を低減させることが示された［７５］。本発明の組成物の投与はＩＬ−６発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、結核治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
【０１６５】
さらに、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの発現は、治療用ＨＩＶワクチン［Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ］、結核ワクチン及びクラミジアワクチンの効力と相関することが示されている［７６］。Ｓｕら［７７］は、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αをＦＭＤＶ  ＤＮＡワクチンと同時接種すると、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ発現が増大し、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−４の発現が高まり、抗原特異的細胞傷害性応答が高まったことを示した。本発明の組成物の投与はＩＬ−６及びＴＮＦ−αの発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αのレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＨＩＶ治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、クラミジア治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
【０１６６】
本発明の組成物の投与は、ＩＬ−１βの発現の増大をもたらし得る。Ｌｉら［７８］は、アジュバントの水酸化アルミニウムがＩＬ−１βの分泌を活性化したことを示し、ＩＬ−β自体がアジュバントとして作用し得ることを示唆した。本発明の組成物の投与はＩＬ−１β発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。実施例は、本発明の組成物の投与が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対する比を増大させ得ることを示す。アジュバントはＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することが示されており［７９］、本発明の組成物の投与はＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対する比を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対する比を増大させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
【０１６７】
本発明の組成物の投与は、ＣＸＣＲ３リガンドのＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の発現またはレベルの上昇をもたらし得る。ＡＳＯ３、ＣｐＧ、ＧＬＡ−ＳＥ、αＧａｌＣｅｒなどの既知のアジュバントはすべて、ＣＸＣＬ９及び１０を増大させ［８０、８１］、これは、本発明の組成物がアジュバントとして有効であることを示唆している。また、ＣＸＣＬ９及び１０は、ＩＦＮγ／Ｔｈ１応答に関連し、抗体応答を促進する［８２］。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原、特に病原性抗原またはがん抗原に対する抗体応答を促進するのに使用するためのものである。また、ＣＸＣＬ９は、治験薬のマラリアワクチンを受けたボランティアにおいて、ＩＦＮ−γよりも感度の高いワクチン誘発性Ｔ細胞応答の指標である［８３］。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原、特に病原性抗原またはがん抗原に対するＴ細胞応答を促進するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本組成物は、マラリアからの保護に使用するためのものである。
【０１６８】
本発明の組成物の投与は、ＩＬ−１２ｐ７０の発現またはレベルの上昇をもたらし得る。この効果はワクチンアジュバントの効率に関連付けられており、ＩＬ−１２自体がアジュバントとして提案されている［８４］。これは、本発明の組成物がアジュバントとして有効であることを示唆している。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
【０１６９】
概して、ワクチンアジュバントとして使用する場合、本発明の組成物は、患者に別々に投与された抗原に対するアジュバント効果をもたらすために単独で投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は経口投与され、抗原は非経口的に注射される。代替的な実施形態では、本発明のフラジェリンは、抗原に融合またはコンジュゲートしていてもよい。
【０１７０】
本発明の組成物は、任意の有用な抗原に対する免疫応答を増強するために使用され得る。本発明で使用される例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原、タンパク質及び／または糖類抗原などの細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、ならびに腫瘍抗原が含まれる。本発明は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、クラミジア、ＳＡＲＳコロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルスなどに対するワクチンに特に有用である。ある特定の実施形態において、本発明のフラジェリンは、これらの抗原のうちの１または２以上に融合またはコンジュゲートしている。
【０１７１】
本発明のフラジェリンとともに使用されるさらなる抗原には、糖タンパク質及びリポグリカン抗原が含まれる。ある特定の実施形態において、抗原は古細菌抗原である。例示的な腫瘍関連抗原には、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、及び腫瘍性タンパク質が含まれる。
【０１７２】
本発明のフラジェリンはまた、アルツハイマー病及び他の神経変性障害などの非伝染性疾患に対するワクチンへの応答を増強するために有用であり得、この場合、本発明で使用する抗原はアミロイドベータまたはＴａｕであり得る。非伝染性疾患に対する他のかかる抗原としては、ＰＣＳＫ９（コレステロール上昇の処置用）が挙げられる。本発明のフラジェリンはまた、習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、またはアヘン剤に対するワクチンへの応答を増強するために有用であり得る。
【０１７３】
本発明はまた、患者の免疫応答を高めるための薬物の製造における、（ｉ）抗原の水性調製物、及び（ｉｉ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む組成物の使用を提供する。
【０１７４】
これらの方法及び使用によって高められる免疫応答には、概して、抗体応答、好ましくは防御抗体応答が含まれる。
【０１７５】
免疫系の刺激
本発明の組成物は、免疫刺激をもたらし得る。本発明の組成物の投与は免疫刺激効果を有し得るため、本発明の組成物は、疾患、特に免疫活性化の低減を特徴とする疾患、及び免疫応答の増大によって処置可能な疾患の処置に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激することにより、疾患を処置するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【０１７６】
本発明の組成物は、細胞集団におけるＴｒｅｇのパーセンテージの増大を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＴｒｅｇのパーセンテージの増大を特徴とする疾患を処置または防止するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−細胞のパーセンテージの増大を特徴とする疾患を処置または防止するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＴｒｅｇのパーセンテージを減少させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇによる免疫応答の抑制を低減させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇの選択的低減によって免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫刺激に使用するためのものであり、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇの数またはパーセンテージを低減させる。
【０１７７】
本発明の組成物は、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ及び／または活性化ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、活性化ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比を増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、活性化ＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比を増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
【０１７８】
本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ１９＋ＣＤ３−細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＢ細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものであり、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
【０１７９】
本発明の組成物は、ＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものであり、ＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８  Ｔ細胞傷害性細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
【０１８０】
本発明の組成物は、ＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものであり、ＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋活性化細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
【０１８１】
本発明の組成物の投与は、炎症性サイトカインなどの炎症誘発性分子の発現の増大をもたらし得る。本発明の組成物を投与すると発現レベルの上昇を示し得る炎症誘発性分子の例としては、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６が挙げられる。本発明の組成物の投与は炎症誘発性分子の発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、炎症性サイトカインなどの炎症誘発性分子の発現の減少を投与する疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、炎症誘発性分子の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患、特に炎症性サイトカインの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及び／またはＩＬ−６の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及び／またはＩＬ−６の発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及び／またはＩＬ−６の発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【０１８２】
本発明の組成物の投与は、ＩＬ−１βの発現の増大をもたらし得る。ＩＬ−１βは炎症性サイトカインである［８５］。ＩＬ−１βの生成及び分泌は、炎症応答の活性化に関連するタンパク質複合体であるインフラマソームによって調節される［８６］。本発明の組成物の投与はＩＬ−１βの発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。
【０１８３】
本発明の組成物の投与は、ＩＬ−２３の発現の増大をもたらし得る。ＩＬ−２３は、炎症に関係付けられている［８７、８８］。免疫応答において提唱されているＩＬ−２３の機能には、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の増殖の促進、及び樹状細胞（ＤＣ）によるＩＦＮ−γの分泌の促進が含まれる［８９］。本発明の組成物の投与はＩＬ−２３の発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ＩＬ−２３の発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−２３の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−２３の発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−２３の発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【０１８４】
本発明の組成物の投与は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現の増大をもたらし得る。ＴＮＦ−αは、細胞死を促進する様々なシグナル伝達経路に関与することが知られている炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αは、その同族受容体であるＴＮＦＲ−１に結合することによりアポトーシスを開始し、アポトーシス経路における一連の切断事象を引き起こす［９０］。ＴＮＦ−αは、ＲＩＰキナーゼ依存性メカニズムを介して壊死を誘発することもできる［９１］。本発明の組成物の投与はＴＮＦ−α発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、疾患の処置、特にＴＮＦ−αの発現の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−α発現の減少を特徴とする疾患の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【０１８５】
本発明の組成物の投与は、ＩＬ−６の発現の増大をもたらし得る。ＩＬ−６は、炎症時に生成され、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の分化、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性Ｔ細胞への分化を促進する炎症性サイトカインである［９２］。本発明の組成物の投与はＩＬ−６の発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または防止に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または防止するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
【０１８６】
Ｂｅｔｔｅｌｌｉら［９３］は、ＩＬ−６がＴｒｅｇの生成を阻害すると報告した。本発明の組成物はＩＬ−６の発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現を増大させることにより、Ｔｒｅｇの数またはパーセンテージを選択的に減少させ得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−６の発現を増大させることにより、免疫刺激に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇの数またはパーセンテージを減少させることにより、免疫刺激に使用するためのものである。
【０１８７】
実施例はまた、本発明の組成物がＴヘルパー細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球の分化を促進することも示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｔヘルパー細胞及び／または細胞傷害性Ｔリンパ球の分化を刺激するのに使用するためのものである。
【０１８８】
細胞療法
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法
本発明の組成物の投与は、ＩＬ−６の発現の増大をもたらし得る。Ｉｌ−６発現の増大は、慢性リンパ球性白血病のＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ療法に対する応答と相関付けられている。血清ＩＬ−６の増大はＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖と関連付けられ、一方、ＩＬ−６の阻害はＣＡＲ−Ｔ細胞増殖の阻害と関連付けられた［９４］。本発明の組成物の投与はＩＬ−６発現を増大させ得るため、本発明の組成物は、細胞療法、特にＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、慢性リンパ球性白血病の処置に使用するためのものである。
【０１８９】
Ｔｒｅｇの選択的枯渇は、細胞傷害性リンパ球の効力を増強することが示されている［９５］。ＣＡＲ−Ｔ細胞は細胞傷害性リンパ球のサブセットであり、したがって、Ｔｒｅｇの選択的枯渇はＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有効であると考えられている。本発明の組成物の投与はＴｒｅｇを枯渇させ得るため、本発明の組成物は、細胞療法、特にＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有用であり得る。
【０１９０】
したがって、本発明の組成物は、細胞療法において、特に細胞療法に対する応答を増強するのに有用であり得る。
【０１９１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法には免疫刺激特性があることが報告されている。ＭＳＣをＬＰＳで処理すると、炎症性サイトカインのＩＬ−６及びＩＬ−８が上方制御され、Ｂ細胞増殖の増大がもたらされる［９６］。したがって、本発明の組成物はＩＬ−６の発現を増大させ得るため、本組成物はＭＳＣ細胞療法との組み合わせにおいて有用であり得る。
【０１９２】
幹細胞移植療法
幹細胞移植療法において未分化幹細胞を使用する代わりに、移植前に幹細胞をある程度まで分化させることが有益であり得ることが報告されている。例えば、Ｈｅｎｇら［９７］は、幹細胞の心筋形成分化が、比較的高い生着効率、筋細胞の再生の増強、及び心臓機能の回復の増大をもたらすことにより有益であり得ることを報告した。本発明の組成物の投与は、未分化神経芽腫細胞のニューロン分化を開始し得るため、本発明の組成物は、幹細胞移植療法における幹細胞分化に有用であり得る。
【０１９３】
造血幹細胞移植
造血幹細胞移植は、通常は骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する多能性造血幹細胞の移植である。同種造血幹細胞移植前にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）が腸にコロニー形成すると、無再発死亡率が減少するため、患者の２年生存率が著しく向上することが示されている［９８］。したがって、実施例において示される免疫調節効果は、造血幹細胞移植療法において有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植後、特に同種造血幹細胞移植後の生存率を向上させるのに有用であり得る。
【０１９４】
本発明の組成物は、同種造血幹細胞移植との組み合わせにおいて有用であり得る。本発明の組成物は、同種造血幹細胞移植に対する患者の応答成功を後押しするのに効果的であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植の前に投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植を受ける予定である患者に投与するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植の後に投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、造血幹細胞移植を受けた患者に投与するためのものである。
【０１９５】
免疫老化
Ｆｕｌｏｐら［９９］は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大及びＢ細胞数の減少が適応免疫系の老化に関連していることを特定した。したがって、本発明の組成物は、免疫老化を防止または遅延させるために使用され得る。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化の防止に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｂ細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大及びＢ細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数を減少させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞数を増大させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数を増大させ、Ｂ細胞数を減少させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化に起因する疾患の処置に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化を遅延させること及び／または防止することにより、老化関連疾患の処置に使用するためのものである。
【０１９６】
さらに、ワクチンアジュバントが免疫老化を克服し得ることが提唱されている［１００］。本発明の組成物はワクチンアジュバントとして使用するのに好適であるため、本発明の組成物は、免疫老化を防止または遅延させるのに有用であり得る。別の実施形態では、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして免疫老化を遅延させること及び／または防止することに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものであり、本組成物は、免疫老化を遅延させ、及び／または防止する。
【０１９７】
免疫老化に関連する疾患としては、循環器疾患、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患、がん、真性糖尿病２型［１０１］、ならびに自己免疫障害［１０２］が挙げられる。
【０１９８】
投与形態
好ましくは、本発明の組成物は、注射により、好ましくは皮下に、あるいは静脈内または腹腔内に投与される。注射による投与に好適な組成物に関するさらなる詳細は、次のセクションに提示する。代替的な実施形態では、本発明の組成物は、消化管に投与される。免疫系は、消化管における細菌及び細菌タンパク質の存在によって調節されることが知られている。本発明の組成物は経口投与されるが、直腸内、鼻腔内、または頬側もしくは舌下経路を介して投与してもよい。
【０１９９】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、泡状物、スプレーまたはゲルとして投与してもよい。
【０２００】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えばカカオ油（カカオバター）、合成硬質脂肪（例えばｓｕｐｐｏｃｉｒｅ、ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、グリセロゼラチン、ポリエチレングリコール、またはセッケングリセリン組成物の形態における肛門坐剤などの坐剤として投与してもよい。
【０２０１】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、経鼻胃管、経口胃管、胃管、空腸瘻管（Ｊチューブ）、経皮内視鏡的胃瘻造設術（ＰＥＧ）などの管、または胃、空腸、及び他の好適なアクセスポートへのアクセスを提供する胸壁ポートなどのポートを介して、消化管に投与される。
【０２０２】
本発明の組成物は、１回投与されてもよいし、または処置レジメンの一部として連続的に投与されてもよい。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は連日投与される。
【０２０３】
本発明のある特定の実施形態では、本発明に係る処置は、患者の腸内細菌叢の評価を伴う。
【０２０４】
本発明の組成物は、がんと診断された患者、またはがんのリスクがあると特定された患者に投与され得る。本組成物はまた、健康な患者におけるがんの発生を防止するための予防手段として投与されてもよい。
【０２０５】
本発明の組成物は、異常な腸内細菌叢を有すると特定された患者に投与され得る。例えば、患者において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのコロニー形成が低減しているか、または存在しない場合がある。
【０２０６】
概して、本発明の組成物はヒトの処置のためのものであるが、家禽、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、またはウサギなどの単胃哺乳動物を含む動物を処置するのに使用してもよい。本発明の組成物は、動物の成長及び能力を増強するために有用であり得る。動物に投与する場合は、強制経口投与を使用してもよい。
【０２０７】
組成物
概して、本発明の組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドを含む。
【０２０８】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、腸へのフラジェリンの送達を可能にするようにカプセル封入されている。カプセル封入は、例えば、ｐＨの変化によって誘発され得る圧力、酵素活性、または物理的崩壊などの化学的または物理的な刺激による破裂によって標的位置で送達されるまで、組成物を分解から保護する。任意の適切なカプセル封入方法を使用してよい。例示的なカプセル封入技術には、多孔性マトリックスへの封入、固体担体表面への結合または吸着、凝結または架橋剤による自己凝集、及び微孔性膜またはマイクロカプセルへの機械的封じ込めが含まれる。
【０２０９】
したがって、組成物は薬学的に許容され得る。組成物は通常、フラジェリンポリペプチド（または核酸）以外の成分を含む。例えば、組成物は典型的に、１または２以上の薬学的担体（複数可）及び／または賦形剤（複数可）を含む。
【０２１０】
組成物は、水性形態でヒトに投与され得る。しかしながら、そのような実施形態では、投与前に、組成物は非水性形態であってもよい。例えば、いくつかの治療薬は水性形態で製造され、次に充填及び分配ならびに投与も水性形態で行われるが、他の治療薬は、製造中に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成される。したがって、本発明の組成物は、凍結乾燥製剤のように乾燥していてもよい。
【０２１１】
本組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかしながら、治療薬は水銀物質を実質的に含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサール不含であることが好ましい。水銀を含まない治療薬がより典型的である。保存剤不含の治療薬が特に好ましい。
【０２１２】
熱安定性を向上させるために、組成物に温度保護剤を含めてもよい。そのような薬剤のさらなる詳細を以下に提示する。
【０２１３】
張性を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含めることが一般的である。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が一般的に使用され、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ濃度で存在し得る。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【０２１４】
組成物は概して、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より多くの場合では２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より典型的には２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内の浸透圧を有する。
【０２１５】
組成物は、１または２以上の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムのアジュバントを含むもの）、またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は典型的に５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０２１６】
組成物のｐＨは概して、５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５、または７．０〜７．８である。
【０２１７】
本組成物は典型的には無菌である。本組成物は、典型的には非発熱性でもあり、例えば１用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準規格）、例えば１用量当たり＜０．１ＥＵを含む。本組成物は、多くの場合グルテンを含まない。
【０２１８】
本組成物は、単回投与用の材料を含んでもよいし、または複数回投与用の材料を含んでもよい（すなわち「複数用量」キット）。保存剤の含有は、複数用量の構成では典型的である。複数用量組成物に保存剤を含めることの代替として（またはそれに加えて）、本組成物は、材料を取り出すための無菌アダプターを有する容器に収容されてもよい。
【０２１９】
ヒトタンパク質治療薬は、典型的には約０．５ｍｌの投与量で投与されるが、小児には半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を投与してもよい。
【０２２０】
本発明の組成物はまた、１または２以上の免疫調節剤を含み得る。多くの場合、免疫調節剤のうちの１または２以上は、１または２以上のアジュバントを含む。アジュバントは、以下にさらに記載するＴＨ１アジュバント及び／またはＴＨ２アジュバントを含み得る。
【０２２１】
本組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され得る。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに好適な固体形態（例えば凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）を調製することもできる。本組成物は、局所投与用に、例えば軟膏、クリーム、または粉末として調製してもよい。本組成物は、経口投与用に、例えば錠剤もしくはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ（場合により風味付けされる）として調製してもよい。本組成物は、肺投与用に、例えば微粉またはスプレーを使用した吸入剤として調製してもよい。本組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製してもよい。本組成物は、鼻、耳、または眼への投与用に、例えば点滴薬として調製してもよい。本組成物は、合わさった組成物が哺乳動物への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であってもよい。そのようなキットは、液体形態の１または２以上の抗原、及び１または２以上の凍結乾燥された抗原を含み得る。ある特定の実施形態において、組成物中に存在する本発明のフラジェリンは、１または２以上の抗原に融合またはコンジュゲートしていてもよい。
【０２２２】
組成物が使用前に即座に調製され（例えば、成分が凍結乾燥形態で提供される場合）、キットとして提供される場合、このキットは２つのバイアルを含んでもよいし、または、注射前にバイアルの内容物を再活性化するためにシリンジの内容物が使用されるような１つの充填済みシリンジ及び１つのバイアルを含んでもよい。
【０２２３】
治療薬として使用される組成物は、免疫学的有効量のポリペプチドまたはコーディング核酸のほかに、必要に応じて任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、単回投与または一連の投与の一部としてのその量の個体への投与が、処置または防止に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康及び体調、年齢、処置される個体の分類学的グループ（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、治療医師による医学的状況の評価、ならびに他の関連要因に応じて異なる。この量は、通例の試験によって決定され得る比較的広い範囲に含まれると予想される。２つ以上の抗原が組成物に含まれる場合、２つの抗原は、互いに同じ用量で存在してもよいし、または異なる用量で存在してもよい。
【０２２４】
上述のように、組成物は温度保護剤を含んでもよく、この成分は、アジュバント添加組成物（特にアルミニウム塩などのミネラルアジュバントを含むもの）において特に有用であり得る。参考文献１０３に記載されているように、凝固点を下げるために、例えば凝固点を０℃未満に下げるために、液体の温度保護剤を水性ワクチン組成物に添加してもよい。したがって、本組成物は、熱的破壊を阻害するために、０℃未満だがその凝固点を超える温度で保管され得る。また温度保護剤は、凍結及び解凍後の凝集または沈降から無機塩アジュバントを保護しながら組成物を凍結することを可能にし、例えば４０℃を超える高温で組成物を保護することもできる。出発時の水性ワクチン及び液体の温度保護剤は、液体の温度保護剤が最終混合物の１〜８０体積％を形成するように混合され得る。好適な温度保護剤は、ヒトに投与するのに安全であり、水に容易に混和／溶解する必要があり、組成物中の他の成分（例えば抗原及びアジュバント）を損傷してはならない。例としては、グリセリン、プロピレングリコール、及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。好適なＰＥＧは、２００〜２０，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有し得る。一実施形態において、ポリエチレングリコールは、約３００Ｄａの平均分子量を有し得る（「ＰＥＧ−３００」）。
【０２２５】
本発明は、（ｉ）１または２以上のフラジェリンポリペプチド（複数可）と、（ｉｉ）温度保護剤とを含む組成物を提供する。この組成物は、（ｉ）１または２以上の抗原（複数可）を含む水性組成物を、（ｉｉ）温度保護剤と混合することによって形成することができる。次にこの混合物を、例えば０℃未満、０〜２０℃、２０〜３５℃、３５〜５５℃、またはそれ以上で保管してもよい。これは液体形態で保管してもよいし、または凍結形態で保管してもよい。この混合物を凍結乾燥してもよい。この組成物は、代替的に、（ｉ）１または２以上の抗原（複数可）を含む乾燥組成物を、（ｉｉ）温度保護剤を含む液体組成物と混合することによって形成してもよい。したがって、成分（ｉｉ）は、成分（ｉ）を再構成するために使用され得る。
【０２２６】
この組成物は経口投与されてもよく、錠剤、カプセル、または粉末の形態であってもよい。インビボの送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成及び生存率を向上させるための脱酸素剤及びプレバイオティクス基質として、他の成分（例えばビタミンＣなど）を含めてもよい。
【０２２７】
本発明の組成物は、治療有効量の本発明のフラジェリンポリペプチドを含む。フラジェリンポリペプチドの治療有効量は、患者に有益な効果を及ぼすのに十分である。
【０２２８】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。そのような好適な賦形剤の例は、参考文献［１０４］に見出すことができる。治療用途に許容される担体または希釈剤は製薬分野において周知であり、例えば参考文献［１０５］に記載されている。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬務との関連で選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、もしくは希釈剤として、またはそれに加えて、任意の好適な結合剤（複数可）、滑沢剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含み得る。好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、天然及び合成のガム、例えばアカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。好適な滑沢剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。保存剤、安定剤、色素、及びさらには香味料を医薬組成物中に供給してもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁化剤を使用してもよい。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本組成物は、がんの処置または防止に使用するためのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来の２種以上のフラジェリンポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、本組成物は、配列番号１を有するフラジェリンポリペプチドと、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来の少なくとも１種のさらなるフラジェリンポリペプチドとを含む。ある特定の実施形態において、本組成物は、配列番号１を有するフラジェリンポリペプチドと、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来の少なくとも１種のフラジェリンポリペプチドとを含む。ある特定の実施形態において、本組成物は、配列番号１を有するフラジェリンポリペプチドと、配列番号２〜４２からなる群から選択される少なくとも１種のフラジェリンポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、本組成物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５種のフラジェリンポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する５０種未満のフラジェリンポリペプチド（例えば４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４または３種未満の菌株）を含み、場合により、いずれかの他の種に由来するフラジェリンポリペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、６〜３０、６〜１５、１６〜２５、または３１〜５０種のフラジェリンポリペプチドを含み、場合により、いずれかの他の種に由来するフラジェリンポリペプチドを含まない。
【０２３０】
本発明の組成物が２種以上のフラジェリンポリペプチドを含むいくつかの実施形態では、個々のフラジェリンポリペプチドは、別々の投与、同時投与、または連続的投与のためのものであってよい。例えば、本組成物がフラジェリンポリペプチドのすべてを含んでもよいし、またはフラジェリンポリペプチドが別々に保管され、別々に、同時に、もしくは連続的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、２種以上のフラジェリンポリペプチドは別々に保管されるが、使用前にひとつに混合される。
【０２３１】
本発明に従って使用するための組成物は、販売承認を必要とする場合と必要としない場合がある。
【０２３２】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。
【０２３３】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用されるフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在する。
【０２３４】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用されるフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、乳癌である。好ましい実施形態では、がんは乳癌である。好ましい実施形態では、がんはステージＩＶ乳癌である。
【０２３５】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用されるフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、肺癌である。好ましい実施形態では、がんは肺癌である。
【０２３６】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明で使用されるフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、肝臓癌である。好ましい実施形態では、がんは肝細胞腫（肝細胞癌）である。
【０２３７】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、結腸癌である。好ましい実施形態では、がんは結腸直腸腺癌である。
【０２３８】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、癌腫である。
【０２３９】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、非免疫原性癌である。
【０２４０】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、免疫原性癌である。
【０２４１】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、腺癌、腺管腫瘍、カルチノイド腫瘍、未分化癌からなる群から選択される。
【０２４２】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、ウイルス感染に起因する肝芽腫、胆管細胞癌、胆管細胞嚢胞腺癌、または肝臓癌からなる群から選択される。
【０２４３】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、または浸潤性小葉癌からなる群から選択される。
【０２４４】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のフラジェリンポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、フラジェリンポリペプチドは、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在し、この障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞性腫瘍、小児における視覚路及び視床下部のグリオーマ、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌、白血病、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、咽頭癌、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍、前立腺癌、腎細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌からなる群から選択される。
【０２４５】
核酸（例えば核酸ベースの治療薬）の用量は、１００μｇ以下、例えば１０〜１００μｇ、例えば約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、または１００μｇの核酸を有し得るが、例えば１μｇ以下／用量、１００ｎｇ以下／用量、１０ｎｇ以下／用量、１ｎｇ以下／用量などを使用したはるかに低いレベルでも発現を見ることができる。同様に、タンパク質抗原の用量は、１００μｇ以下、例えば１０〜１００μｇ、例えば約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、または１００μｇのタンパク質を有し得る。ポリペプチドは、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されてもよい。
【０２４６】
ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、単回投与で、またはより好ましくは反復投与で投与することができる。好ましくは、反復投与は、約２、５、１０、７、１０、または１５日毎に投与される。ある特定の実施形態において、本発明は、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、または５００ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）の用量で投与される、上記の医薬組成物を提供する。好適な単位用量には、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、１０００ｍｇ、１００〜５００ｍｇ、５００〜１０００ｍｇ、２００〜４００ｍｇ、５００〜７５０ｍｇ、７５０〜１０００ｍｇが含まれる。
【０２４７】
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の宿主細胞を含む、上記の医薬組成物を提供する。例えば成人の場合の宿主細胞の好適な一日用量は、約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）、例えば、約１×１０７〜約１×１０１０ＣＦＵ、別の例では約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵであり得る。
【０２４８】
ある特定の実施形態において、本組成物は、組成物の重量に対して約１×１０６〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、例えば、約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの量の宿主細胞を含む。用量は、例えば、１ｇ、３ｇ、５ｇ、及び１０ｇであり得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、生きた宿主細胞と死滅した宿主細胞との混合物を含む。
【０２４９】
ある特定の実施形態において、本発明は、経口、直腸内、皮下、経鼻、頬側、舌下、皮下、静脈内、及び筋肉内からなる群から選択される方法で投与される、上記の医薬組成物を提供する。
【０２５０】
ある特定の実施形態において、本発明は、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、及びソルビトールからなる群から選択される担体を含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０２５１】
ある特定の実施形態において、本発明は、エタノール、グリセロール、及び水からなる群から選択される希釈剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０２５２】
ある特定の実施形態において、本発明は、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムからなる群から選択される賦形剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０２５３】
ある特定の実施形態において、本発明は、保存剤、抗酸化剤、及び安定剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０２５４】
ある特定の実施形態において、本発明は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルからなる群から選択される保存剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
【０２５５】
ある特定の実施形態において、本発明は、上記の医薬組成物であって、約４℃または約２５℃の密封容器に組成物を保管し、容器を相対湿度５０％の雰囲気に置いた場合、少なくとも約１か月、３か月、６か月、１年、１．５年、２年、２．５年、または３年の期間が経過した後に、コロニー形成単位で測定した細菌株の少なくとも８０％が残る、医薬組成物を提供する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される組成物を含む密封容器で提供される。いくつかの実施形態では、密封容器は小袋またはボトルである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される組成物を含むシリンジで提供される。
【０２５７】
本発明の組成物は、いくつかの実施形態では、医薬製剤として提供されてもよい。例えば、本組成物は、錠剤またはカプセルとして提供され得る。いくつかの実施形態では、カプセルはゼラチンカプセル（「ゲルキャップ」）である。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は経口投与される。経口投与は、化合物が消化管に入るような嚥下、及び／または化合物が口から直接的に血流に入る頬側、経舌、もしくは舌下投与を含み得る。
【０２５９】
経口投与に好適な医薬製剤としては、固体プラグ、固体微粒子、半固体及び液体（多相または分散系を含む）、例えば錠剤、多粒子もしくはナノ粒子、液体（例えば水溶液）、エマルジョン、または粉末を含む軟カプセルまたは硬カプセル、ロゼンジ（液体充填型を含む）、咀嚼薬、ゲル、高速分散剤形、フィルム、オビュール（ｏｖｕｌｅｓ）、スプレー、ならびに頬側／粘膜付着性パッチが挙げられる。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、腸溶性製剤、すなわち本発明の組成物を経口投与によって腸に送達するのに好適な胃耐性製剤（例えば、胃のｐＨに耐性がある）である。腸溶性製剤は、細菌または組成物の別の成分が酸感受性である場合、例えば胃条件下で分解しやすい場合に特に有用であり得る。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、腸溶性製剤は腸溶コーティングを含む。いくつかの実施形態では、製剤は腸溶コーティングされた剤形である。例えば、製剤は、腸溶コーティングされた錠剤または腸溶コーティングされたカプセルなどであり得る。腸溶コーティングは、従来の腸溶コーティング、例えば、経口送達用の錠剤、カプセルなどのための従来のコーティングであってよい。製剤は、フィルムコーティング、例えば、腸溶性ポリマー、例えば酸不溶性ポリマーの薄膜層を含み得る。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、腸溶性製剤は、腸溶コーティングを必要とせずに、本質的に腸溶性、例えば、胃耐性である。したがって、いくつかの実施形態では、製剤は、腸溶コーティングを含まない腸溶性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、熱ゲル化材料から作製されたカプセルである。いくつかの実施形態では、熱ゲル化材料は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）などのセルロース材料である。いくつかの実施形態では、カプセルは、いかなるフィルム形成ポリマーも含まないシェルを含む。いくつかの実施形態では、カプセルはシェルを含み、シェルはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含み、いかなるフィルム形成ポリマーも含まない（例えば［１０６］を参照されたい）。いくつかの実施形態では、製剤は、本質的に腸溶性のカプセル（例えば、ＣａｐｓｕｇｅｌのＶｃａｐｓ（登録商標））である。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、製剤は軟カプセルである。軟カプセルは、カプセルシェルに存在する、例えばグリセロール、ソルビトール、マルチトール、及びポリエチレングリコールなどの軟化剤の添加により、一定の弾性及び柔軟性を有し得るカプセルである。軟カプセルは、例えば、ゼラチンまたはデンプンに基づいて生成することができる。ゼラチンベースの軟カプセルは、様々な供給元から市販されている。例えば、経口または直腸内などの投与方法に応じて、軟カプセルは様々な形状を有することができ、例えば、円形、楕円形、長方形、または魚雷型であってよい。軟カプセルは、例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒプロセス、Ａｃｃｏｇｅｌプロセス、または液滴もしくは発泡プロセスなどの従来のプロセスによって生成することができる。
【０２６４】
概説
本発明の実践には、特記なき限り、当業者が備えている技能の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学、及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、参考文献［１０７］及び［１０８〜１１４］などを参照されたい。
【０２６５】
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」ならびに「からなる（consisting）」を包含する。例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘだけからなる場合もあれば、何らかの追加要素を含む、例えばＸ＋Ｙである場合もある。
【０２６６】
数値ｘに関する「約」という用語は任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２６７】
「実質的に」という用語は「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という用語は本発明の定義から省略されてもよい。
【０２６８】
「Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチド」という用語には、免疫刺激特性を呈する、例えばＴＬＲ５応答を効果的に活性化することができる、野生型フラジェリンポリペプチド及び変異型フラジェリンポリペプチドが包含される。「フラジェリンポリペプチド」という用語には、免疫刺激特性を呈する、例えばＴＬＲ５応答を効果的に活性化することができる、野生型フラジェリンポリペプチド及び変異型フラジェリンポリペプチドの断片も包含される。
【０２６９】
２つのタンパク質配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アライメントしたとき、そのパーセンテージのアミノ酸残基が２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアライメント及び相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献［１１５］に記載されているものを使用して決定することができる。好ましい方法は、タンパク質配列のＭＵＳＣＬＥアライメントを使用し、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（７８．０２％のペアワイズ同一性）、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２スコア行列、閾値＝１を用いて行うことができる。
【０２７０】
２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アライメントしたとき、そのパーセンテージのヌクレオチドが２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアライメント及び相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献［１１６］のセクション７．７．１８に記載されているものを使用して決定することができる。好ましいアライメントは、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭ行列が６２のアフィンギャップ検索を使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献［１１７］に開示されている。
【０２７１】
一般に、特に指定しない限り（例えば断片に関して）、配列同一性は、クエリ配列の長さではなく、参照配列（例えば配列番号１）の長さにわたって計算される。したがって、短くて無関係な配列は、本発明の配列に対して高い配列同一性を有するとは見なされない。
【０２７２】
特に明記しない限り、多数のステップを含むプロセスまたは方法は、方法の最初もしくは最後に追加のステップを含んでもよいし、または途中に追加のステップを含んでもよい。また、必要に応じて、ステップを組み合わせたり、省略したり、または代替的な順序で行ったりしてもよい。
【０２７３】
本明細書では、本発明の様々な実施形態を記載している。各実施形態で規定した特徴を他の規定の特徴と組み合わせて、さらなる実施形態をもたらすことができることは理解されよう。特に、本明細書で好適、典型的、または好ましいと強調された実施形態は、互いに組み合わせることができる（それらが相互排他的である場合を除く）。
【実施例】
【０２７４】
実施例１−ＭＲｘ０５１８によるＴＬＲ５レポーター細胞の活性化
要旨
この試験では、ＴＬＲ５レポーター細胞を活性化する細菌株ＭＲｘ０５１８の効力を調べた。
【０２７５】
ＴＬＲ５活性化アッセイ
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＬＲ５細胞は、ヒトＴＬＲ５遺伝子及び誘導性ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子をコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞である。ＳＥＡＰ遺伝子は、５つのＮＦ−κＢ及びＡＰ−１結合部位に融合したＩＦＮ−βミニマルプロモーターの制御下に置かれている。ＴＬＲ５リガンドでの刺激によりＮＦ−κＢ及びＡＰ−１が活性化され、これによりＳＥＡＰの生成が誘導される。したがって、アルカリホスファターゼのレベルはＴＬＲ５活性に関連する。
【０２７６】
・材料
レポーター細胞株：ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ５（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｈｋｂ−ｈｔｌｒ５）
細胞増殖培地：１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ９６６５）、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ７５１３）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４３３３）、１００ｕｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ａｎｔ−ｎｒ−１）、ならびに選択的抗生物質のブラストサイジン（３０ｕｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ａｎｔ−ｂｌ−０５）及びゼオシン（１００ｕｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ａｎｔ−ｚｎ−１）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ６１７１）
抗生物質不含培地：１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び４ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ
【０２７７】
・細菌の増殖条件
細菌の増殖条件：すべてのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５１８培養物は、酵母抽出物−カゼイン加水分解物−脂肪酸（ＹＣＦＡ）ブロス（Ｅ＆Ｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫ）において、嫌気条件下にて３７℃で増殖させた。
定常期ＭＲｘ０５１８細胞：菌株ＭＲｘ０５１８の１６〜１８時間の培養物は、ワーキング細胞バンクとして−８０℃で凍結保管したＭＲｘ０５１８細胞の１％接種材料を使用し、上述の条件下で増殖させた。
後期対数期ＭＲｘ０５１８細胞：菌株ＭＲｘ０５１８の３時間（約）の培養物は、定常期ＭＲｘ０５１８細胞の１０％接種材料を使用して、上述の条件下で増殖させた。
【０２７８】
・手順
ＴＬＲ５活性化アッセイは、１０：１（３×１０５細菌）または１００：１（３×１０６細菌）の２つの投与量で以下の処理を用いて行った：
−  生きたＭＲｘ０５１８細菌
−  ＭＲｘ０５１８加熱死菌
−  ＭＲｘ０５１８のＣＦＳ
【０２７９】
陽性対照は、２０ｎｇ／ｍｌ及び５ｎｇ／ｍｌの濃度で超高純度ＦＬＡ−ＳＴを用いて行った。陰性対照は、レポーター細胞以外によるアルカリホスファターゼの生成を制御するため、レポーター細胞を含まない抗生物質不含培地を用いて行った。ＹＣＦＡ及び水を用いて、２つのさらなる対照を行った。すべての処理について、３つの反復試験を行った。
【０２８０】
・ＭＲｘ０５１８の生菌及び無細胞上清（ＣＦＳ）の調製
生菌処理物及びＣＦＳ処理物の両方を、後期対数期ＭＲｘ０５１８細胞の培養物１０ｍｌから、細胞を室温で５０００×ｇにて５分間遠心分離した後に調製した。細菌ペレットをＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ８５３７）で１回洗浄し、１．４×１０８ＣＦＵ／ｍｌ（２倍希釈）及び１．４×１０７ＣＦＵ／ｍｌ（２０倍希釈）の推定密度まで抗生物質不含培地に再懸濁した。細菌上清を収集し、無菌条件下で濾過し（０．２２ｕｍ）、Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ、Ｗ３５００）を使用して１０倍及び２０倍に希釈して、上記に概説した細菌懸濁液の同等物を得た。ＣＦＳには、上清に脱落したＭＲｘ０５１８の鞭毛が含まれる。
【０２８１】
・加熱死（ＨＫ）細胞の調製
後期対数期ＭＲｘ０５１８細胞の培養物１０ｍｌを８０℃で４０分間インキュベートすることにより、ＨＫ細胞を別に生成した。遠心分離（上述の条件）に続いて、培養上清を廃棄し、細胞ペレットをＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ８５３７）で１回洗浄し、１．４×１０８ＣＦＵ／ｍｌ（２倍希釈）及び１．４×１０７ＣＦＵ／ｍｌ（２０倍希釈）の推定密度まで抗生物質不含培地に再懸濁した。調製したら、すべての処理物を使用まで氷上で保管した。すべての生細胞及び加熱死ＭＲｘ０５１８細胞の調製物について、１ｍｌ当たりの生存細胞数を決定した。
【０２８２】
・陽性対照の調製
ＴＬＲ５の既知のアゴニストであるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリン（超高純度、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの超高純度ＦＬＡ−ＳＴ、ｔｌｒｌ−ｅｐｓｉｔｆｌａ）を、Ｈ２Ｏ中２００ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌで調製した。
【０２８３】
・ＴＬＲ５アッセイ条件
２０μｌの適切な処理物（細菌細胞、無細胞上清、陽性対照リガンド、組換えフラジェリン、陰性対照、例えばＹＣＦＡ、抗生物質不含培地、Ｈ２Ｏ、ＰＢＳ）を、９６ウェル細胞培養プレート（Ｓｉｇｍａ、ＣＬＳ３５９６）に二連または三連で播種した。１８０μｌのレポーター細胞懸濁液を各ウェルに加え、２００ｕｌの最終体積及びＨＥＫ−ｂｌｕｅ  ＴＬＲ５細胞３×１０４の最終濃度とした。アッセイは３７℃、５％ＣＯ２で２２時間インキュベートした。
【０２８４】
インキュベーション後、新しい９６ウェルプレートで２０μｌのアッセイを１８０μｌのＱｕａｎｔｉｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｒｅｐ−ｑｂ１）基質に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。Ｑｕａｎｔｉｂｌｕｅを含むプレートを、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｉＭａｒｋ）で、６５５ｎｍの光学密度で測定して画像化した。技術的反復試験の結果を平均し、その後、独立した実験を平均して、最終的なグラフのデータを得た。
【０２８５】
結論
生きたＭＲｘ０５１８及び熱失活したＭＲｘ０５１８による処理は、中等度及び高いレベルのＴＬＲ５応答をもたらした。これらのデータは、ＭＲｘ０５１８菌株がＴＬＲ５応答を誘導できること、及びこの応答が熱失活によって消失しないことを示す。これらのデータは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリン、特にＭＲｘ０５１８フラジェリンがＴＬＲ５応答を誘発できること、及びこのフラジェリンに熱安定性があることを示唆している。
【０２８６】
最も高いレベルのＴＬＲ５活性は、ＭＲｘ０５１８−ＣＦＳによる処理後に観察され、既知のＴＬＲ５アゴニストであるＦＬＡ−ＳＴよりもさらに高かった（図６）。ＣＦＳには、上清に脱落したＭＲｘ０５１８の鞭毛が含まれる。これらのデータは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来、特にＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンが非常に強力なＴＬＲ５応答を生成するため、治療において、特にがんの処置において有用であり得ることを示す。これらのデータはまた、ＭＲｘ０５１８がそのフラジェリンを上清に脱落させるのに有効であることを示す。
【０２８７】
実施例２−ＣＦＳによるＴＬＲ５活性化はＭＲｘ０５１８で特に強力である
要旨
この試験では、ＣＦＳを使用したＴＬＲ５活性化が菌株間で異なるかどうかを調べた。ＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ１００１１０はいずれも有鞭毛性のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株である。これら両方の菌株のＣＦＳがＴＬＲ５応答をもたらすかどうかを観察するために試験を行った。
【０２８８】
ＴＬＲ５活性化アッセイ
実施例１に記載したようなＴＬＲ５アッセイを行った。
【０２８９】
・手順
ＴＬＲ５活性化アッセイは、１０：１及び１００：１の２つの投与量で以下の処理を用いて行った：
−  ＭＲｘ０５１８−ＣＦＳ
−  ＤＳＭ１００１１０−ＣＦＳ
【０２９０】
抗生物質不含培地、ＹＣＦＡ、及び水を用い、３つの陰性対照を行った。陽性対照は、超高純度のＦＬＡ−ＳＴを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて行った。すべての処理について、３つの反復試験を行った。
【０２９１】
結論
ＭＲｘ０５１８−ＣＦＳは、高いＴＬＲ５応答を刺激することができた。ＤＳＭ１００１１０−ＣＦＳも、ＭＲｘ０５１８−ＣＦＳと比べて低かったものの、１００：１のＭＯＩでＴＬＲ５応答を生成した。これらのデータは、両方の菌株の上清が免疫刺激応答を誘発したが、これは菌株によって異なることを示す。菌株ＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ１００１１０はいずれも有鞭毛性のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株であるため、これらのデータは驚くべきものである。ＭＲｘ０５１８−ＣＦＳがＤＳＭ１００１１０−ＣＦＳと比較して高いＴＬＲ５応答を生成するのは、おそらく、ＭＲｘ０５１８がそのフラジェリンを上清に脱落させる能力が他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株と比較して向上しているからであると考えられ、このため、ＭＲｘ０５１８は治療に特に有用であり得る。
【０２９２】
これらのデータは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドが、がん、特にＴＬＲ５に関連する乳癌、結腸直腸癌、及び胃癌などのがんの処置または防止に使用するために有効であり得ることを示唆している。
【０２９３】
実施例３−トリプシン処理後のＴＬＲ５活性化
要旨
この試験では、ＴＬＲ５のＭＲｘ０５１８−ＣＦＳによる活性化がトリプシン依存性であるかどうかを調べた。
【０２９４】
ＴＬＲ５活性化アッセイ
実施例１に記載したようなＴＬＲ５アッセイを行った。
【０２９５】
・手順
ＴＬＲ５活性化アッセイは、１０：１及び１００：１の２つの投与量で、以下の処理を単独またはトリプシンとの組み合わせで用いて行った：
−  ＭＲｘ０５１８−ＣＦＳ
−  ＤＳＭ１００１１０−ＣＦＳ
−  ＹＣＦＡ
すべての処理について、３つの反復試験を行った。
【０２９６】
ＣＦＳを、５００μｇ／ｍｌのトリプシン（０．２２ｕｍのフィルターにかけたもの、Ｓｉｇｍａ、Ｔ３９２４）により、または模擬消化対照として同等量のトリプシンビヒクル（ハンクス平衡塩類溶液、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１７５１２９）により、３７℃、５％ＣＯ２で１時間にわたって消化した。インキュベーション後、トリプシン活性を阻害するために、ＣＦＳの消化試料及び模擬消化試料にＦＢＳを補充し、最終濃度を１０％（ｖ／ｖ）とした。
【０２９７】
抗生物質不含培地、ＨＢＳＳ、及び水を用い、３つの陰性対照を行った。陽性対照は、超高純度のＦＬＡ−ＳＴを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて行った。
【０２９８】
結論
ＭＲｘ０５１８−ＣＦＳによるＴＬＲ５の活性化は、トリプシンによる処理によって無効になった（図８）。これらのデータは、ＴＬＲ５応答がＭＲｘ０５１８−ＣＦＳ中のタンパク質によって活性化されることを示す。トリプシンでこれらのタンパク質を分解すると、ＴＬＲ５応答が無効になる。ＭＲｘ０５１８フラジェリンタンパク質（ＦｌａＡＭＲｘ０５１８）は３６個のトリプシン切断部位を含み、そのうちのいくつかはＴＬＲ５相互作用ドメイン内に位置している。
【０２９９】
実施例４−精製されたフラジェリンタンパク質によるＴＬＲ５活性化
要旨
この試験では、精製されたＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ１００１１０フラジェリンの刺激プロファイルを調べた。
【０３００】
組換えフラジェリンタンパク質の生成
クローニング戦略の概略は、図９ａに示してある。制限酵素消化を使用し、ＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ１００１１０フラジェリンの全長遺伝子を組換え発現構築物ｐＱＥ−３０（Ｎ末端６ｘＨｉｓタグを有する）にクローニングして、ｐＱＥ−３０−ＦｌａＡＭＲｘ０５１８及びｐＱＥ−３０−ＦｌａＡＤＳＭ１００１１０構築物を生成した。当技術分野で周知のコロニーＰＣＲ、制限酵素消化、及びＤＮＡシーケンシング技術を使用して、陽性コロニーを特定した。
【０３０１】
組換えフラジェリンタンパク質であるＦｌａＡＭＲｘ０５１８及びＦｌａＡＤＳＭ１００１１０をＥ．ｃｏｌｉ細胞で発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー及びイミダゾール溶出を使用して精製した後、エンドトキシン除去を行った（以下の表を参照されたい）。これにより、エンドトキシンレベルが最低限に抑えられた高純度の調製物が得られる。タンパク質のサイズ及び純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して確認した（図９ｂ）。
【０３０２】
【表１】
2021518129.tif 000002
【０３０３】
精製された組換えＦｌａＡＭＲｘ０５１８及びＦｌａＡＤＳＭ１００１１０タンパク質に対する用量応答
実施例１に記載したようなＴＬＲ５アッセイを行った。
【０３０４】
・手順
ＴＬＲ５活性化アッセイは、以下の処理を用いて行った：
・５、１、０．２、０．０４及び０．００８ｎｇ／ｍｌの濃度の組換え精製ＦｌａＡＭＲｘ０５１８
・５、１、０．２、０．０４及び０．００８ｎｇ／ｍｌの濃度の組換え精製ＦｌａＡＤＳＭ１００１１０
【０３０５】
陰性対照は、ＦＬＡビヒクルを５ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて行い、陽性対照は、超高純度のＦＬＡ−ＳＴを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて行った。各処理について、３つの反復試験を行った。
【０３０６】
結論
組換えＦｌａＡＭＲｘ０５１８及びＦｌａＡＤＳＭ１００１１０はいずれも、ＴＬＲ５応答を活性化することができる。図１０は、実施例３及び４に記載した処理を用いた、組換えＦｌａＡＭＲｘ０５１８及びＦｌａＡＤＳＭ１００１１０の様々な投与量によるＴＬＲ５活性化を比較する。５ｎｇ／ｍｌの濃度において、両方の組換えフラジェリンタンパク質が、より高い濃度（２０ｎｇ／ｍｌ）で使用された周知のＴＬＲ５アゴニストＦＬＡ−ＳＴが生成するものよりも高いＴＬＲ５応答を生成することができる。これらのデータは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりもＴＬＲ５応答を活性化するのに有効であることを示す。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのフラジェリンポリペプチドは、ＴＬＲ５活性化によって腫瘍成長を抑制することが知られている。したがって、これらのデータは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来のフラジェリンポリペプチドが、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のフラジェリンポリペプチドよりも、がんの処置または防止に有効であることを示唆している。
【０３０７】
ＦｌａＡＭＲｘ０５１８及びＦｌａＡＤＳＭ１００１１０は、異なる免疫刺激プロファイルを有する。１ｎｇ／ｍｌ及び０．２ｎｇ／ｍｌの濃度において、ＦｌａＡＭＲｘ０５１８は、ＦｌａＡＤＳＭ１００１１０よりもおよそ５倍強力なＴＬＲ５応答を生成する。ＭＲｘ０５１８とＤＳＭ１００１１０とは、関連性の高い菌株である。いずれも有鞭毛性のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株であるが、異なる免疫刺激プロファイルを有する本質的に異なるフラジェリンを発現する。ＦｌａＡＭＲｘ０５１８が強力なＴＬＲ５活性化因子であるという驚くべき所見は、このフラジェリンポリペプチドが、がんの処置または防止に特に有効であることを示している。
【０３０８】
これらの実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドがＴＬＲ５のアゴニストであることを示している。ＴＬＲ５アゴニストは、Ｔ細胞リンパ腫及びＢ細胞リンパ腫の処置に関係付けられてきた。したがって、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドは、Ｔ細胞リンパ腫及びＢ細胞リンパ腫の処置または防止に特に有効であり得る。
【０３０９】
ＴＬＲ５の活性化は、放射線による組織損傷を改善することが示されている。実施例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来のフラジェリンポリペプチドがＴＬＲ５応答の強力な活性化因子であることを示す。したがって、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ種由来のフラジェリンポリペプチドは、放射線による組織損傷を改善するのに特に有効であり得る。
【０３１０】
実施例５−ＭＲｘ０５１８  ｆｌａＡ−変異体の生成
要旨
ＭＲｘ０５１８の挿入変異体を作出し、フラジェリン遺伝子を破壊した。
【０３１１】
実験条件
ｆｌａＡの内部断片をベクターｐＯＲＩ１９（ｒｅｐＡ−）にクローニングした。得られたベクターのｆｌａＡＭＲｘ０５１８ｉｎｔ−ｐＯＲＩ１９をＭＲｘ０５１８に形質転換し、相同組換えを使用してインサートを細菌ゲノムに組み込んだ（図１３参照）。
【０３１２】
ＰＣＲを使用し、ｅｍ遺伝子の存在について陽性コロニーをスクリーニングし、さらにシーケンシングを使用して確認した。運動性アッセイを使用した変異体の表現型分析でも、挿入変異体ＭＲｘ０５１８ｆｌａＡ−を確認した。インサートには、ｐＯＲＩ１９ベクターのエリスロマイシン耐性が含まれる。図１１は、ＭＲｘ０５１８ｆｌａＡ−変異体が、野生型と比較して、２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＢＢＬ運動性寒天において非運動性であることを示す。
【０３１３】
実施例６−ＭＲｘ０５１８変異体ではＴＬＲ５の活性化が消失する
要旨
ＭＲｘ０５１８ｆｌａＡ−変異体のＣＦＳがＴＬＲ５応答を活性化する能力について調べた。
【０３１４】
ＴＬＲ５活性化アッセイ
実施例１に記載したようなＴＬＲ５アッセイを行った。
【０３１５】
・手順
ＴＬＲ５活性化アッセイは、１０：１及び１００：１の２つの投与量で以下の処理を用いて行った：
−  ＭＲｘ０５１８−ＣＦＳ
−  ＭＲｘ０５１８ｆｌａＡ−−ＣＦＳ
【０３１６】
陽性対照は、超高純度のＦＬＡ−ＳＴを５ｎｇ／ｍｌ及び２０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて行った。陰性対照は、１０：１及び１００：１の２つの投与量でＹＦＣＡを用いて行った。すべての処理について、３つの反復試験を行った。
【０３１７】
結論
ＴＬＲ５応答を刺激するＭＲｘ０５１８−ＣＦＳの能力は、ＭＲｘ０５１８ｆｌａＡ−変異体では消失した（図１２）。これらのデータは、フラジェリンポリペプチドがＭＲｘ０５１８−ＣＦＳによるＴＬＲ５応答の活性化に不可欠であることを示す。
【０３１８】
実施例７−ＭＲｘ０５１８の特性評価
要旨
サイズ、フィンブリア／鞭毛／線毛の存在もしくは非存在、または細胞外マトリックスの存在といった細菌の形態学的特徴は、運動性と付着性の両方に影響を与えるため、細菌の特性評価において重要である。
【０３１９】
従来の光学顕微鏡法で可能なものよりも高い解像度及び倍率において細菌構造を可視化できるようにするため、電子顕微鏡レベル（走査及び透過）でＭＲｘ０５１８培養物を検査した。
【０３２０】
方法論
・透過型電子顕微鏡法
指数増殖期のＭＲｘ０５１８細菌培養物のアリコートを、嫌気性フードから密封したＥｐｐｅｎｄｏｒｆに直接受けた。培養物を、作りたての氷冷２．５％グルタルアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．２で固定した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆを数回穏やかに反転させた後、氷上に置き、３〜５分間放置して固定した。固定後、細菌を手短に遠心分離してペレット化し、ｍｉｌｌｉ純水中に再懸濁した。ガラスピペットを使用して、１滴の固定培養液をＦｏｒｍｖａｒコーティングした３００メッシュＣｕグリッドに適用した。細菌をおよそ１〜２分間にわたって沈殿及び吸着させ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ３濾紙を使用してグリッドから過剰な溶液を除去した。１０μｌの２％酢酸ウラニルをグリッドに数秒間適用し、上記の濾紙を使用して毛管作用により除去した。グリッドを完全に乾燥させてから、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１００  ＴＥＭで様々なｋＶにおいて検査した。
【０３２１】
・走査型電子顕微鏡法
上記と同じ培養物から、アリコートをＳＥＭ分析のために採取した。細菌は上記のように固定したが、ペレット化はしなかった。ＳＰＩ  ＰＯＲＥ  ＦＩＬＴＥＲ（直径２５ｍｍ、孔径０．２ｕｍ）を０．０１％のポリリジンで前処理した直後に、Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋシリンジを使用して、固定された細菌をフィルター上に押し出した。その後、１ｍｌのｍｉｌｌｉ純水をフィルターに穏やかに押し込んだ。フィルターは所定のサイズにカットし、一連のエタノール溶液（５０％、７０％、９０％、及び３×１００％）で脱水した。次にフィルターを漸増濃度のヘキサメチルジシラザン（エタノール中ＨＭＤＳ  ２５％、５０％、７５％）に連続的に浸し、最終的な脱水ステップは１００％  ＨＭＤＳを使用して実施した。これを一晩蒸発させた。フィルターを臨界点乾燥させ、１０ｎｍのパラジウムゴールドでコーティングした後、Ｚｅｉｓｓ  ＥＶＯ  ＭＡ１０走査型電子顕微鏡で検査した。
【０３２２】
結論
電子顕微鏡レベルにおける両方の可視化方法により、ＭＲｘ０５１８に鞭毛があることが示された（図１４）。ＴＥＭ分析とＳＥＭ分析の両方で、ＭＲｘ０５１８に鞭毛（白い実線の矢印）があることが示された。細胞サイズは１〜２μｍの範囲であった。外膜小胞の存在は、ＭＲｘ０５１８のＳＥＭ画像でのみ明らかであった。ＳＥＭ画像は、外膜小胞のようなもの（白い破線の矢印）を示している。
【０３２３】
実施例８−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株ＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ  １００１１０由来の組換えフラジェリンタンパク質によるマウスＴＬＲ５の活性化
要旨
ＭＲｘ０５１８はヒト試料から単離された細菌株であり、一方、ＤＳＭ  １００１１０はマウス由来である。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株のＭＲｘ０５１８及びＤＳＭ  １００１１０に由来する組換えフラジェリンタンパク質がマウスＴＬＲ５を活性化する能力について調べた。
【０３２４】
方法論
組換え精製ＭＲｘ０５１８（ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８）及びＤＳＭ  １００１１０（ＦｌｉＣＤＳＭ１００１１０）を実施例４に記載したように生成した。
【０３２５】
実施例１に記載したようなＴＬＲ５アッセイを行った。ＴＬＲ５活性化アッセイは、以下の処理を用いて行った：
−５、１、０．２、０．０４及び０．００８ｎｇ／ｍｌの濃度の組換え精製ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８
−５、１、０．２、０．０４及び０．００８ｎｇ／ｍｌの濃度の組換え精製ＦｌｉＣＤＳＭ１００１１０
３つの独立した反復試験を行った。
【０３２６】
結論
ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８及びＦｌｉＣＤＳＭ１００１１０の両方がマウスＴＬＲ５を活性化し、いずれの用量においてもＦｌｉＣＭＲｘ０５１８とＦｌｉＣＤＳＭ１００１１０との間で活性化レベルに差はなかった（図１５）。この効果は、ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８及びＦｌｉＣＤＳＭ１００１１０によるヒトＴＬＲ５の活性化について観察された結果とは異なる。実施例４、図１０に示すように、ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８は、１ｎｇ／ｍｌ及びそれ以下の濃度において、ＦｌｉＣＤＳＭ１００１１０よりも高いレベルまでヒトＴＬＲ５を刺激することができる。いずれかの特定の理論に束縛されるものではないが、異なるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株に由来する組換えフラジェリンタンパク質によるヒトＴＬＲ５及びマウスＴＬＲ５の活性化プロファイルの差は、ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８とＦｌｉＣＤＳＭ１００１１０との間の配列の違い、ならびにヒトＴＬＲ５とマウスＴＬＲ５との間の結合部位のばらつきに起因する可能性がある。
【０３２７】
図３に示すように、本発明者らは、異なるフラジェリンポリペプチド間の配列多様性の大部分がＤ２−Ｄ３領域で観察されることに気付いた。ＦｌｉＣＭＲｘ０５１８とＦｌｉＣＤＳＭ１００１１０との配列アライメントは、Ｄ２−Ｄ３ドメインにおいて大きな多様性を示す（図１６）。アライメントは、ＣＬＵＴＡＬ  ＯＭＥＧＡ  ｖ１．２．４の複数配列アライメントソフトウェアを使用して行った。
【０３２８】
実施例９−ヒト由来の運動性Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ菌株の免疫刺激能力
要旨
ヒト由来の運動性Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ菌株がインビトロでヒトＴＬＲ５を活性化する能力について評価した。
【０３２９】
方法論
・試験した細菌株
【０３３０】
【表２】
2021518129.tif 000003
【０３３１】
ＭＲＸ及び試験菌株は、４Ｄ  Ｐｈａｒｍａの培養物コレクションにおける４つのドナー（ドナー番号Ｆ００、Ｆ１４、Ｆ１９及びＦ２２）のうちの１つから単離した。
【０３３２】
・ＴＬＲ５アッセイ条件
細菌株は、定常増殖期に達するまでＹＣＦＡブロス（Ｅ＆Ｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｏｎｎｙｂｒｉｄｇｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）で培養した。細胞及び上清を５，０００×ｇで５分間の遠心分離によって分離した。上清を０．２２μｍフィルターに通し、水で希釈した。
【０３３３】
１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｍｇ／ｍｌのグルコース、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、３０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、及び１００μｇ／ｍｌのゼオシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を補充したＤＭＥＭ中で、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ５細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、密度９０％までルーチン的に培養した。細胞株は３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。特に明記されていない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫから供給された。
【０３３４】
共培養の場合、密度９０％まで増殖させた細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１回洗浄し、抗生物質を含まない増殖培地中に１４０，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。上清を１００：１相当の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞に加えた。アッセイ陽性対照であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍフラジェリン（ＦＬＡ−ＳＴ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は２０ｎｇ／ｍｌで使用した。細胞を上清とともに、５％ＣＯ２雰囲気にて３７℃で２２時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を加え、プレートをさらに２時間インキュベートし、６５５ｎｍでの光学密度を記録した。すべての菌株について、３つの独立した生物学的反復試験を実施した。
【０３３５】
図１８のデータは、３つの独立した反復試験を表す。
【０３３６】
結論
試験したＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ菌株の上清はすべて、未処理の対照と比較してＴＬＲ５応答を強力に活性化することができた。試験した３つのＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ菌株のうち、試験株６はＴＬＲ５応答を強力に活性化することが見出されたが、試験株５及びＤＳＭ２５７８１は、さほど強力でないＴＬＲ５応答を誘発した。
【０３３７】
実施例１０−ＭＲｘ５１８によるＮＦ−κＢの活性化
ＮＦ−κＢを活性化する細菌株ＭＲｘ０５１８の能力を調べた。結果を図１８に提示する。ＭＲｘ０５１８上清がＮＦ−κＢの最も強力な活性化因子であった。ＮＦ−κＢの活性化は、トリプシンによる処理後に消失した。
【０３３８】
これらのデータは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属由来、特にＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンが非常に強力なＮＦ−κＢ応答を生成するため、治療に有用であり得ることを示す。
【０３３９】
実施例１１−Ｔ細胞分化
Ｔ細胞分化を誘導するＭＲｘ０５１８の能力について、インビトロで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号７００２５）を用いて調査した。
【０３４０】
方法論
ウェル当たり５０μｌのｃＲＰＭＩ培地中、４００，０００／ウェルで、抗ＣＤ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３クローン）、機能的グレード、カタログ番号１６−００３７−８１）を播種した９６ウェルプレートに、ＰＢＭＣを播種した（ｃＲＰＭＩは、ＲＰＭＩ  １６４０（＋Ｌ−Ｇｌｕｔ、２１８７５−０３４）２ｍＭ最終濃度ストック２００ｍＭ、１０％のＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１００８２−１４７）、５０μｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１９８５−０２３）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ４３３３、１０ｍｇ／ｍｌ）を含む）。次に、ＭＲｘ５１８上清を、１００μｌ中４，０００，０００／ウェルで各ウェルに加えた。上清を０．２２μｍフィルターに通し、共培養で適切に希釈した。
【０３４１】
３７℃のインキュベータに３日間入れた後、細胞を取り出し、ＰＭＡ−（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８１３９）、イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３９０９）、及びＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（ＢＤ、カタログ番号５５４７２４）を含む培地に５時間再懸濁した。ＰＭＡストックはＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌであり、これを１００ｕｇ／ｍｌにさらに希釈し（各試料でｃＲＰＭＩ中５０ｎｇ／ｍｌが必要であった）、イオノマイシンストックはＤＭＳＯ中１ｍＭであり（ｃＲＰＭＩ中１μＭを使用した）、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ濃度は４μｌ／６ｍｌで使用した。
【０３４２】
次に細胞をフローサイトメトリー染色に供した。
【０３４３】
洗浄後、これらの細胞を、ＰＢＳ中で、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃのＶｉｏｂｉｌｉｔｙ  ４０５／５２０  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｙｅ（１μｌ／試料）とヒトＦｃブロック（カタログ番号５６４２１９）（１μｌ／試料）とともに、暗所で室温において１０分間インキュベートした。次に、ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｖｉｏ  ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１３−１３６）、ＣＤ４−ＶｉｏＢｌｕｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１４−５３４）、及びＣＤ２５−ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１３−２８３）の表面抗体（各２μｌ）を、暗所で室温において、１０分間にわたってウェルに直接加えた。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３００ｇ／５分／室温でスピンダウンした。
【０３４４】
次に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦｏｘＰ３転写因子染色緩衝液（カタログ番号００−５５２３）を使用して、細胞の固定及び透過処理を行った。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのプロトコールに従い、１倍濃縮液及び３倍希釈剤を使用して、透過処理／固定緩衝液を調製した。細胞を室温で１時間固定し、次に１倍の透過洗浄液で２回洗浄し、３００ｇ／５分／室温でスピンダウンした。以下の細胞内染色抗体または転写因子抗体を、透過洗浄液（１倍）中の試料に加え、４５分／暗所／室温で、または冷蔵庫で一晩（最長１８時間）おいた後、透過洗浄液（３００μｌ）を使用して抗体を２回洗浄し、ＰＢＳ（２５０μｌ）に再懸濁して、サイトメーターで取得した。
【０３４５】
【表３】
2021518129.tif 000004
【０３４６】
・抗ＩＦＮｙ−ＰＥ  Ｖｉｏ７７０ヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１４−０２５）
・抗ＩＬ１０−ＰＥヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１２−７２８）
・抗ＩＬ１７ａ−ＡＰＣヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９９−２０２）
・抗ＲｏＲｙｔ−ＰＥヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１０３−８３７）
・抗Ｔｂｅｔ−ＡＰＣヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９８−６５５
・Ｆｏｘｐ３モノクローナル抗体（２３６Ａ／Ｅ７）、Ｐｅ  ｃｙ７（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カタログ番号２５−４７７７−４１
【０３４７】
結論
図１９に見られるように、ＭＲｘ５１８上清（ＳＰ５１８）は、Ｔヘルパー細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の分化を誘導することができる。
【０３４８】
実施例１２−Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５１８フラジェリン遺伝子挿入変異体の生成
この実施例は、フラジェリン遺伝子を不活性化するための実施例５に対する代替戦略を提示する。ｆｌｉＣ遺伝子は、自殺プラスミドｐＯＲＩ１９の相同性挿入によって破壊された（図２０参照）。ｆｌｉＣ遺伝子内へのｐＯＲＩ１９の挿入がＤＮＡシーケンシングにより確認され、得られた変異型菌株の非運動性表現型がインビトロで確認された。
【０３４９】
方法論
非複製的プラスミドｐＯＲＩ１９（Ｅｍｒ  ｒｅｐＡ−Ｏｒｉ＋；クローニングベクター［１１８］）を使用し、フラジェリン挿入変異体を作出した。プライマーＤＣ０２０（配列番号４３：ＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＣＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧ）及びＤＣ０２１（配列番号４４：ＡＣＧＡＣＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＴＴＡＧＧＧＣＧＴＡＴＧＣＧ）を使用して、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５１８ｆｌｉＣ遺伝子の内部断片を増幅し、ｐＯＲＩ１９にクローニングした。メーカーの説明に従って、制限酵素及びＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した。この構築物を化学的形質転換［１１８］によりＥ．ｃｏｌｉ  ＥＣ１０１において増殖させ、Ｇｅｎｏｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して５００ｍｌの培養液から単離した。０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２及びエタノールを使用し、単離したプラスミドＤＮＡを２０μｌまで濃縮した。
【０３５０】
阻害濃度以下のグリシン中で細菌培養物を増殖させた後、ムタノリジン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）及びリゾチームで処理して細胞壁のペプチドグリカン層をさらに弱めることにより、エレクトロコンピテント細胞を生成することに成功した。Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５１８エレクトロコンピテント細胞を調製するために、以前に公開された方法［１１９］を応用したプロトコールを開発した。簡潔に述べると、０．５Ｍのスクロース及び３％（ｗ／ｖ）のグリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＧＭ１７ブロス中で１８時間にわたり、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５１８を増殖させた。次に、細胞を０．５Ｍのスクロース及び１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールで２回洗浄し、３７℃で３０分にわたり、１０μｇ／ｍｌのリゾチーム及び１０Ｕ／ｍｌのムタノリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。次に、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５１８細胞を１０μｇのプラスミドＤＮＡの電気穿孔によって形質転換し、ＢＨＩブロスに回収した後、選択的ＢＨＩ寒天に播種した。プライマーＤＣ０４７（配列番号４５：ＣＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＧＴＴＡＴＡＡＴＧＡＡＣＧＡＧ）及びＤＣ０４８（配列番号４６：ＧＡＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣ）を使用し、ｅｍ遺伝子の存在について陽性コロニーをスクリーニングした。プラスミド挿入の成功した形質転換体は、プライマーＤＣ０１３（配列番号４７：ＣＣＧＡＴＡＡＡＴＡＧＴＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＣ）及びＤＣ０１４（配列番号４８：ＧＧＣＴＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＣ）を使用したＰＣＲ増幅及びシーケンシング（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｋｏｎｓｔａｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確認した。
【０３５１】
０．００５％（ｗ／ｖ）の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＢＤ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）を補充したＢＢＬ（商標）運動性試験培地を使用し、フラジェリン挿入変異体のインビトロでの運動性を評価した。簡潔に述べると、新鮮なコロニーを２０ｍｌの平衡培地に穿刺接種し、嫌気条件下にて３７℃で４８時間インキュベートした。すべてのアッセイを三連で行った。
【０３５２】
配列
配列番号１−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５１８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ１００１１０由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５５４由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号４−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ０５５６由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号５−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ１５４８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号６−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ１６５０由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号７−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ１７６３由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号８−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ１７６６由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号９−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ１７７５由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１０−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ１８８６由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１１−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ２Ａ８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１２−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ９４０２由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１３−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  Ａ６９８１由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１４−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＭＲｘ１６４９由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１５−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＥＧ２由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１６−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＳＫＦ１由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１７−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＤＳＭ  ７３７０由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１８−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  １ａ６Ａ由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号１９−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ３ｈ１０Ｂ由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２０−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  １４−ＭＢ−Ｗ−１４由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２１−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＡＴＣＣ１２７５５由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２２−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＤＳＭ４８４１由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２３−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＤＳＭ２０６８０由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２４−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＥＣ１０由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２５−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＥＣ２０由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２６−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＥＣ３０由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２７−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  Ｆ１１２９由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２８−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  Ｆ１１２９Ｆ  ４６由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号２９−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＮＢＲＣ  １００４７８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３０−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＰＡＶＥＴ１５由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３１−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＮＬＡＥ−ｚｌ−Ｇ２６８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３２−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＮＬＡＥ−ｚｌ−Ｃ４１４由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３３−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＦＤＡＡＲＧＯＳ−１６３由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３４−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＭＲｘ０８５８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３５−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＤＳＭ２５７８１由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３６−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ２８５６４由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３７−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ２８５６５由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３８−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  Ｆ１２１３Ｆ  ２２８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号３９−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ２０７１８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号４０−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ２０６２８由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号４１−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＮＢＲＣ１００６７５由来のフラジェリンポリペプチド
配列番号４２−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ２４８４１由来のフラジェリンポリペプチド
【０３５３】
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2021518129.tif 000009
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４】
2021518129.tif 000021
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
2021518129.tif 000029
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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