(57)【要約】  a)免疫グロブリン結合細菌タンパク質に由来する固体担体及びアルカリ安定リガンドを用意する工程;b)前記アルカリ安定リガンドを前記固体担体と反応させて、共有結合アルカリ安定リガンドを有する分離マトリックスを形成する工程;並びにc)共有結合アルカリ安定リガンドを有する前記分離マトリックスを、少なくとも10mMのアルカリ金属水酸化物を含む洗浄溶液で洗浄する工程を含む、分離マトリックスの調製方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)固体担体及び細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来するアルカリ安定リガンドを用意する工程;
b)前記アルカリ安定リガンドを前記固体担体と反応させて、共有結合アルカリ安定リガンドを有する分離マトリックスを形成する工程;並びに
c)共有結合アルカリ安定リガンドを有する前記分離マトリックスを、少なくとも10mMのアルカリ金属水酸化物、例えばNaOH若しくはKOH又はそれらの任意の混合物を含む洗浄溶液で洗浄する工程を含む、分離マトリックスの調製方法。
【請求項２】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインAリガンドである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインLリガンドである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインGリガンドである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記固体担体が、複数の多孔質担体粒子等の複数の担体粒子を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程c)が、少なくとも1回繰り返される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程c)が、少なくとも5回繰り返される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程c)の後に、前記分離マトリックスを保存溶液に移す工程d)を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程d)の後に、前記分離マトリックスを輸送容器に分配する工程を更に含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
工程c)が、工程b)の後24時間以内に行われる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程c)において、前記洗浄溶液が、25mM〜1Mのアルカリ金属水酸化物、例えば、NaOH若しくはKOH又はそれらの任意の混合物を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程c)において、前記洗浄溶液が、40mM〜1Mのアルカリ金属水酸化物、例えば90mM〜0.5Mのアルカリ金属水酸化物、又は50〜200mMのアルカリ金属水酸化物を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程c)において、前記洗浄溶液が、40mM〜1M NaOH又はKOH、例えば90mM〜0.5M NaOH若しくはKOH、又は50〜200mM NaOH若しくはKOHを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程c)において、前記分離マトリックスが、2〜60分間、例えば5〜30分間、洗浄溶液でインキュベートされる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
インキュベーション後、前記洗浄溶液が濾過により除去される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
工程c)において、温度が、2〜40℃、例えば15〜30℃又は20〜25℃である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程b)の前に、前記固体担体を活性化する工程a')を更に含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程a')が、前記固体担体上でのアルデヒド基の形成を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
工程a')が、前記固体担体上でのエポキシド基の形成を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
工程b)の後、前記分離マトリックスが、残留エポキシド基を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、前記アルデヒド基又はエポキシド基と反応することができるリジン残基を含む、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、前記エポキシド基と反応することができるチオールを持つシステイン残基を含む、請求項19又は20に記載の方法。
【請求項２３】
前記システイン残基が、細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドのC末端又はN末端に近接する、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、IgGへの結合能力において45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.1M NaOHでのインキュベーションに耐えることができる、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、IgGへの結合能力において45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.5M NaOHでのインキュベーションに耐えることができる、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、少なくとも1つのアルカリ安定プロテインAドメインを含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインAドメインの多量体を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記多量体が、少なくとも4つのアルカリ安定プロテインAドメインを含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記多量体が、少なくとも6つのアルカリ安定プロテインAドメインを含む、請求項27又は28に記載の方法。
【請求項３０】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、少なくとも1つのアルカリ安定プロテインLドメインを含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインAドメインの多量体を含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、少なくとも1つのアルカリ安定プロテインGドメインを含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインGドメインの多量体を含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記固体担体が、架橋多糖を含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記固体担体が、架橋寒天又はアガロースを含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記分離マトリックスが、マトリックス1mLあたり少なくとも11mgの共有結合リガンド、例えばマトリックス1mLあたり少なくとも15mgの共有結合リガンドを含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
工程c)の後、前記分離マトリックスが、IgG溶出物プールにおけるELISA分析によって測定して、IgG1mgあたり40ng未満のリガンドのリガンド漏れを生じる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
非共有結合プロテインAリガンドを前記分離マトリックスから除去する方法である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記分離マトリックスの調製中に非共有結合プロテインAリガンドを前記分離マトリックスから除去する方法である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する共有結合アルカリ安定リガンドを含み、前記細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する非共有結合リガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
共有結合アルカリ安定プロテインAリガンドを含み、非共有結合プロテインAリガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
共有結合アルカリ安定プロテインLリガンドを含み、非共有結合プロテインLリガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
共有結合アルカリ安定プロテインGリガンドを含み、非共有結合プロテインGリガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティ分離マトリックスの製造に関し、特に、スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA(SpA)、ペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)プロテインL(PpL)又はストレプトコッカス(Streptococcus)プロテインG(SpG)等の細菌の免疫グロブリン結合タンパク質に由来する共有結合リガンドを含むアフィニティ分離マトリックスの製造に関する。本発明は、特に、これらの免疫グロブリン結合タンパク質のアルカリ安定変異体を含むマトリックスの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
新しい医薬品の最も重要なクラスの1つは、治療用モノクローナル抗体(mAb)である。これらの製造では、共有結合したスタフィロコッカスプロテインA(SpA)又はSpAの変異体を含むマトリックスのアフィニティクロマトグラフィーが、mAbを含む細胞培養液から由来するほとんどの混入物を除去するための第1の分離工程としてほぼ普遍的に使用される。最終的なmAb製品に対する純度の要求は高く、マトリックスからのいかなるSpAリガンドの漏れも最小限に抑えて、次に続くクロマトグラフィー工程によって漏れたリガンドを除去しなければならないことを避けることが不可欠である。そのような工程は、例えば、US6121428、US7223848、US7847071、US20080312425、US8053565、及びUS7714112に記載されており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。使用中にマトリックスから漏れるリガンドの量を低減する方法は、US7485704、US7589183及びUS20030148540に開示されており、参照によりそれらの全体もまた本明細書に組み込まれる。
【０００３】
SpAは、E V Sidorin及びT F Soloveva、Biochemistry (Moscow)、76巻、3号、295〜308頁(2011)にレビューされているように、細菌免疫グロブリン結合タンパク質(IBP)のクラスのメンバーである。上記のように、SpAは完全な抗体のアフィニティクロマトグラフィーで使用される最も一般的なIBPであるが、これは、インタクトな免疫グロブリンのFc部分への高選択性の結合によるものである。しかしながら、Fc部分を欠く抗体断片及び他の抗体構築物を開発する強い傾向もある。この場合、Fc部分以外の部分に結合するIBP、特に、κ型IgGの軽鎖に結合するペプトストレプトコッカス・マグナス(Peptostreptococcus magnus)プロテインL(PpL)及びFab断片の重鎖に結合するストレプトコッカス・プロテインG(SpG)が使用される。
【０００４】
SpA、PpL、SpG等のIBPリガンドを含むアフィニティ分離マトリックスの製造では、典型的には、多孔質担体粒子等の固体担体が活性化されてIBPリガンドと反応できる基を生成し、その後、活性化された担体粒子がIBPリガンドと反応して所望の共有結合が達成される。しかしながら、ある程度過剰のリガンドを適用しなければならないため、マトリックスは自由に溶解するか、又はマトリックスと物理的に会合することができる非共有結合リガンドもまた含むことになる。遊離リガンドは潜在的に毒性があり、これらの非共有結合リガンドを、無視し得るのに必要な程度まで又は最小限の漏れまで除去するためには、大がかりな洗浄操作が必要であり、製造プロセスの複雑さとコストを増す。
【０００５】
したがって、SpA、PpL又はSpG等のIBPリガンドの漏れが少ない、アフィニティ分離マトリックス製造の改善方法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US6121428
【特許文献２】US7223848
【特許文献３】US7847071
【特許文献４】US20080312425
【特許文献５】US8053565
【特許文献６】US7714112
【特許文献７】US7485704
【特許文献８】US7589183
【特許文献９】US20030148540
【特許文献１０】US20170334954
【特許文献１１】US6399750
【特許文献１２】US8114611
【特許文献１３】US8674073
【特許文献１４】US2010221844
【特許文献１５】US9040661
【特許文献１６】US6602990
【特許文献１７】US7396467
【特許文献１８】US7834158
【特許文献１９】WO2017194594A1
【特許文献２０】US8329860
【特許文献２１】US9018305
【特許文献２２】WO2013109302
【特許文献２３】US9403883
【特許文献２４】US20160237124
【特許文献２５】WO2016152946
【特許文献２６】WO2012083425
【特許文献２７】EP1992692A1
【特許文献２８】CN105481954A
【特許文献２９】US20160159855
【特許文献３０】US 14/961164
【特許文献３１】WO2016079034A1
【特許文献３２】WO2018029158
【特許文献３３】WO2016096643A1
【特許文献３４】US20180305414
【特許文献３５】WO2017191748A1
【特許文献３６】WO2018180204A1
【特許文献３７】WO2018180205A1
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】E V Sidorin及びT F Soloveva、Biochemistry (Moscow)、76巻、3号、295〜308頁(2011)
【非特許文献２】Altshulら(1990) J. Mol. Biol.、215: 403〜410頁
【非特許文献３】http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome、米国国立医学図書館
【非特許文献４】G T Hermanson、A K Mallia、P K Smith:Immobilized Affinity Ligand Techniques、Academic Press 1992、51〜136頁及び195〜251頁
【非特許文献５】Gel Filtration Principles and Methods、Pharmacia LKB Biotechnology 1991、6〜13頁
【非特許文献６】S Hjerten:Biochim Biophys Acta 79(2)、393〜398頁(1964)
【非特許文献７】「Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization」(R Arshady:Chimica e L'Industria 70(9)、70〜75頁(1988)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一態様は、SpA、PpL又はSpG等のIBPリガンドの漏れが少ない分離マトリックスの効率的な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これは、以下の工程を含む方法で達成される:
a)固体支持体及びアルカリ安定IBP、プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを用意する工程;
b)アルカリ安定IBP、プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドを固体担体と反応させ、共有結合アルカリ安定IBP、プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドを有する分離マトリックスを形成する工程;並びに
c)共有結合アルカリ安定IBP、プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを有する分離マトリックスを、少なくとも10mM、例えば少なくとも25mMのアルカリ金属水酸化物を含む洗浄溶液で洗浄する工程。アルカリ金属水酸化物は、例えば、NaOH若しくはKOH又はそれらの任意の混合物であり得る。
【００１０】
1つの利点は、工程c)におけるアルカリ/NaOH/KOH洗浄により、いかなる非共有結合リガンドも効率的に除去されるため、リガンドの漏れを許容されるレベルまで下げるためには、限られた数のみの洗浄工程が必要とされることである。さらなる利点は、エポキシド基等のいかなる残りの反応基も、アルカリ/NaOH/KOH洗浄によって不活性化されることである。
【００１１】
本発明のさらなる適切な実施形態は、従属する特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】異なる洗浄溶液で18時間インキュベートした後のアルカリ安定プロテインA分離マトリックスの、残存している静的IgG結合能力を示す図である。
【図２】a)5及びb)10回の後続の10分の洗浄工程の間の、アルカリ安定プロテインA分離マトリックスからの非結合リガンドの除去を示す図である。
【図３】10回のNaOH洗浄工程、3回のHAc/EtOH工程、及び5回のNaAc工程のシーケンスの間の、アルカリ安定プロテインA分離マトリックスからの非結合リガンドの除去を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書で使用される場合、「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含有する(containing)」、「有する(having)」等の用語は、米国特許法でそれらに帰する意味を有することができ、「含む(includes)」、「含んでいる(including)」等を意味することができる;「から本質的になる」又は「本質的になる」は同様に米国特許法に帰する意味を有し、その用語はオープンエンドであり、記載されたものの基本的な又は新規の特徴が、記載されている以上の存在によって変化しないが、先行技術の実施形態を除外する限り、記載されている以上の存在を許容する。
【００１４】
アミノ酸配列の比較に関する用語「%同一性」は、例えば、Altshulら(1990) J. Mol. Biol.、215: 403〜410頁に記載されているBasic Local Alignment Tool (BLAST(商標))等の標準的な整列アルゴリズムによって決定される。このためのWebベースのソフトウェアは、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomeの米国国立医学図書館から無料で入手できる。ここで、クエリ配列を対象の配列と整列し、とりわけ、%同一性を決定するために、アルゴリズム「blastp(タンパク質-タンパク質BLAST)」を使用する。
【００１５】
実施形態の詳細な説明
一態様では、本発明は、a)〜c)の工程を含む、分離マトリックスの調製方法を開示する。この方法は、調製中又は調製直後に、非共有結合プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドを分離マトリックスから除去する方法として説明することもできる。そのため、それは共有結合アルカリ安定プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドを含み、非共有結合プロテインA、プロテインL、又はプロテインGリガンドが実質的に無い分離マトリックスの調製方法でもある。
【００１６】
a)固体担体及びアルカリ安定プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを用意する工程。固体担体は、複数の多孔質担体粒子を含んでもよく、それは、例えば、寒天又はアガロース等の架橋多糖を含んでいてもよい。多孔質担体粒子は、適切には、例えば球形度が少なくとも0.9のビーズ形状であってもよく、ここで球形度は、与えられた粒子と同じ体積の球の表面積の、その粒子の表面積に対する比として定義される。粒子の体積加重メジアン径(volume-weighted median diameter)(d50、v)は、20〜150マイクロメートル等、10〜200マイクロメートルであり得る。多孔質担体粒子のさらなる特性は、以下に議論される。或いは、固体担体は、多孔質膜又は多孔質モノリス、例えば、不織ナノファイバー膜等の繊維膜を含み得る。アルカリ安定プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドの性質についてもまた、以下で更に議論される。リガンドは、適切には、固体担体又は多孔質担体粒子上の反応基と化学反応することができるアミノ酸残基を含む。このようなアミノ酸残基は、反応性アミンを持つリジン、反応性イミダゾールを持つヒスチジン及び/又は反応性チオールを持つシステインであり得る。
【００１７】
b)アルカリ安定プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを固体担体又は多孔質担体粒子と反応させて、共有結合アルカリ安定プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを有する分離マトリックスを形成する工程。工程b)の前に、固体担体又は多孔質担体粒子を活性化する工程a')があってもよい。これは、例えばビシナルジオールの過ヨウ素酸酸化によるか、又はエピクロロヒドリン又はブタンジオールジグリシジルエーテル等の二官能性エポキシドとの反応による、担体粒子上でのアルデヒド又はエポキシド基の形成を例えば含み得る。アルデヒド基は還元アミノ化によるリガンド(例えば、リジン残基)上でのアミンのカップリングに使用でき、エポキシド基はアミン(例えば、リジン残基)、イミダゾール(ヒスチジン)又はチオール(例えば、システイン残基)等の求核性基のカップリングに使用できる。工程b)の後にエポキシド基が残っている場合、それらは工程c)のアルカリ洗浄によって非反応性ジオールに変換される。このことにより、チオール(典型的には、チオグリセロール若しくはメルカプトエタノール)又はアミン(例えば、エタノールアミン)等、いかなる特定の失活試薬も適用する必要が無くなり、最終製品からの失活剤のいかなる漏れの可能性も監視する必要が無くなる。活性化及びカップリング方法は、一般に当技術分野で周知であり、例えば、G T Hermanson、A K Mallia、P K Smith:Immobilized Affinity Ligand Techniques、Academic Press 1992、51〜136頁及び195〜251頁に記載されている。工程b)でアルカリ安定プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドで使用できる活性化及びカップリング方法の特定の例は、例えば、US20170334954、US6399750、US8114611、US8674073、US2010221844、及びUS9040661に提供されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。分離マトリックスのリガンド含量は、分離マトリックス1mLあたり少なくとも11mgの共有結合リガンド、例えば、分離マトリックス1mLあたり少なくとも15mg/mL、11〜20mg/mL又は15〜20mgのリガンドが適切であり得る。リガンドの含量が高いと、リガンド漏れのリスクが高くなり、洗浄方法に対する効率の要求が高まる。
【００１８】
c)共有結合したアルカリ安定プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを有する分離マトリックスを、少なくとも50mMのアルカリ水酸化物、例えばNaOH又はKOHを含む洗浄溶液で洗浄する工程。洗浄溶液は、40mM〜1M NaOH若しくはKOH、50mM〜1M NaOH若しくはKOH、又は90mM〜1M NaOH若しくはKOH、例えば、90mM〜0.5M NaOH若しくはKOH又は90〜200mM NaOH若しくはKOH又は40〜200mM NaOH若しくはKOHを含んでいてもよい。NaOH及びKOHの混合物が使用される場合、これらの値はアルカリ金属水酸化物の総濃度を指す。洗浄工程において、分離マトリックスは、2〜30分、例えば5〜30分又は5〜15分等の間に、例えば、洗浄溶液とインキュベートしてもよい。インキュベーション後、濾過によって粒子マトリックスから洗浄溶液を除去してもよいが、沈降等の他の方法もまた可能である。後者の場合、遅い重力沈降工程を避けるために、例えば、遠心分離(例えば、デカンター遠心分離機内で)による促進した沈降が好ましい。濾過は、フィルタープレート、クロマトグラフィーカラム等を使用できる小規模なラボスケール、例えば、ガラスフィルター漏斗又はブフナー漏斗の中規模なラボスケールの両方で使用でき、大規模な生産規模では、攪拌されたNutschフィルターを便利に使用することができる。工程c)の間の温度は、例えば、15〜30℃又は20〜25℃等の2〜40℃であってもよい。工程c)は、少なくとも1回、例えば少なくとも5回又は5〜15回等、適切に繰り返すことができる。洗浄工程は、工程b)の後の24時間以内に適切に行ってもよい。
【００１９】
工程c)の後、方法は、分離マトリックスを保存溶液に移す工程d)を更に含んでもよい。この後、分離マトリックスは更に、顧客への輸送のための輸送容器に分配されてもよい。工程c)の後、分離マトリックスは、非共有結合プロテインA、プロテインL又はプロテインGリガンドを適切には実質的に含まない。これは、ここでプロテインAについて説明するリガンド漏れ試験(22+/-2℃で適切に行われる)で評価できる。ここで、分離マトリックスをクロマトグラフィーカラムに充填し、マトリックス1mlあたり16.65mgのポリクローナルIgG(0.020M NaH2PO4、pH7.0ローディング緩衝液)をロードし、0.1MグリシンpH3.0溶出緩衝液で溶出して溶出液を生成し、ここで、全てのIgG含有溶出画分をプールしてIgGプールを形成し、IgGプール内のリガンド含量は、プロテインA ELISA分析で測定される。リガンド含量がプール中のIgG1mgあたりリガンド約40ng未満、好ましくは約30ng未満である場合、分離マトリックスは非共有結合プロテインAリガンドが実質的に存在しないと見なされる。類法を使用して、プロテインL又はプロテインGリガンドの漏れ及び対応する非共有結合で結合したそのようなリガンドの非存在を決定できる。
【００２０】
多孔質担体粒子
多孔質担体粒子は、任意の適切な周知の種類のものであり得る。従来のアフィニティ分離マトリックスは、多くの場合、有機性であり、使用される水性媒体に親水性表面を曝すポリマー、すなわち、それらの外部表面上及び存在する場合は更に内部表面上のヒドロキシ(-OH)、カルボキシ(-COOH)、カルボキサミド(-CONH2、おそらくN-置換型で)、アミノ(-NH2、おそらく置換型で)、オリゴ又はポリエチレンオキシ基を曝すポリマーに基づいている。担体粒子の多孔質の性質は、それらの内部がリガンド及び免疫グロブリンにアクセス可能であることを意味する。定量的には、多孔質の性質は、逆サイズ排除クロマトグラフィーによって、例えば、Gel Filtration Principles and Methods、Pharmacia LKB Biotechnology 1991、6〜13頁に記載される方法に従って測定されたKav又はKd値(特定のサイズのプローブ分子が利用できる細孔容積の割合)として表すことができる。Kavは、比(Ve-V0)/(Vt-V0)として決定され、ここで、Veはプローブ分子(例:Dextran 110kD)の溶出容量であり、V0はカラムのボイド容量(例えば、未加工デキストラン等の高Mwボイドマーカーの溶出容量)であり、Vtはカラムの総容量である。Kdは、(Ve-V0)/Viとして決定でき、ここで、Viは、マトリックス容量(マトリックスポリマー分子が占める容量)を除くすべての容量にアクセスできる塩(例えば、NaCl)の溶出容量である。定義により、Kd値とKav値の両方は常に0から1の範囲内にある。Kav値は、Mw 110kDaのデキストランをプローブ分子として用いて測定した場合、有利に0.6〜0.95であってよく、例えば、0.7〜0.90又は0.6〜0.8であってよい。Mw 110kDaのデキストランを用いて測定したKd値は、適切には、0.68〜0.85又は0.70〜0.85等、0.68〜0.90であってよい。このことの利点は、担体が、リガンド及びリガンドに結合する免疫グロブリンの両方を収容することができ、免疫グロブリンの結合部位への及び結合部位からの大量輸送を提供することができる、細孔の大部分を有することである。或いは、担体粒子は、Mw 110kDaのデキストランについてのKd値が0.1未満又は0.05未満である場合のように、本質的に非多孔質であり得る。そのような粒子は、主に分析分離に関して興味深く、1〜10又は1〜5マイクロメートル等、10マイクロメートル未満の体積加重メジアン径(d50、v)を有する可能性がある。
【００２１】
特定の実施形態では、固体担体又は担体粒子は、多糖等のポリヒドロキシポリマーを含む。多糖類の例としては、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロース等が挙げられる。多糖類は本質的に親水性であり、非特異的相互作用の程度は低く、高含量の反応性(活性化可能)ヒドロキシル基を提供し、一般にアルカリ洗浄に対して安定である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、担体粒子は寒天又はアガロースを含む。このような粒子は、逆懸濁ゲル化等の標準的な方法(S Hjerten:Biochim Biophys Acta 79(2)、393〜398頁(1964)に従って容易に調製できる。或いは、担体粒子は、SEPHAROSE(商標)FF(GE Healthcare社)の名前で販売される、架橋アガロースビーズ等の市販の製品である。大規模分離に特に有利な実施形態では、担体粒子は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるUS6602990又はUS7396467に記載された架橋方法を使用して剛性を高めるように適合されており、したがって、粒子を高流速に更に適したものにする。
【００２３】
特定の実施形態では、ポリマー、多糖又はアガロース担体粒子等の固体担体又は担体粒子は、ヒドロキシアルキルエーテル架橋等で架橋される。そのような架橋を生成する架橋剤試薬は、例えば、エピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、ハロゲン化アリルやアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であり得る。架橋は、担体粒子の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋はアルカリ安定であり、いかなる顕著な非特異的吸着をも生じさせない。
【００２４】
或いは、固体担体又は多孔質担体粒子は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等の合成ポリマーに基づくことができる。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼンに基づく粒子等の疎水性ポリマーの場合、マトリックスの表面は、上に定義の親水性基を周囲の水性液体に曝すために、しばしば親水性化される。そのようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に生成される。例えば、「Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization」(R Arshady:Chimica e L'Industria 70(9)、70〜75頁(1988))参照。或いは、SOURCE(商標)(GE Healthcare社)等の市販される製品が使用される。別の代替例では、担体粒子は磁性である。そのような担体粒子の一例は、例えば、磁気バッチ分離でビーズを使用できるようなマグネタイト粒子を含む多糖又は合成ポリマービーズである。
【００２５】
アルカリ安定プロテインAリガンド
アルカリ安定プロテインAリガンドは、IgGへの結合能力がインキュベーション前のIgG結合能力と比較して45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.5又は0.1M NaOHとのインキュベーションに耐えることができ得る。IgG結合能力の減少は、例えば20%未満又は10%未満等、45%未満が適切であり得る。これは、表面プラズモン共鳴(SPR)チップ、例えばUS20170334954に記載されているようなBiacore CM5センサーチップ(GE Healthcare Bio-Sciences AB社)に、例えばNHSカップリング化学を使用して、リガンドを結合させ、Biacore機器(GE Healthcare Bio-Sciences AB社)内でチップの免疫グロブリン結合能力を、典型的にはポリクローナルヒトIgGを使用して、チップのインキュベーションの前後に0.5M NaOHで100×10分間サイクルで測定することにより適切に測定することができる。或いは、アルカリ安定性は、共有結合したリガンドを含む分離マトリックスが、インキュベーション前のIgG結合能力と比較したIgGに対する結合能力の20%未満の減少で、22+/-2℃で100×15分間の0.5M又は0.1M NaOHとのインキュベーションに耐えることができると定義できる。IgG結合能力の減少は、適切には15%未満、例えば10%未満又は5%未満であり得る。US20170334954に記載されるように、2.4又は6分の滞留時間で10%ブレイクスルー動的能力(Qb10%)を測定することにより、評価を行うことができる。
【００２６】
アルカリ安定プロテインAリガンドは、SpAの1つ又は複数の変異IgG結合ドメインを適切に含むことができる。ネイティブSpAドメインは、Eドメイン(配列番号1)、Dドメイン(配列番号2)、Aドメイン(配列番号3)、Bドメイン(配列番号4)及びCドメイン(配列番号1)である。変異は、1つ又は複数のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基による置換を含むことができるが、他の変異もまた可能である。アルカリ安定プロテインAリガンドの構造は、典型的には、プロテインL-(ドメイン-S)n-Tであり、ここでLはN末端を含む1〜10アミノ酸リーダー配列であり、ドメインは(変異)IgG結合ドメインであり、Sは任意選択の1〜15アミノ酸スペーサー配列であり、nは1〜10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10等、例えば3〜7又は4〜6であり、Tは0〜10アミノ酸テール配列であり、C末端を含む(Tに少なくとも1つのアミノ酸残基がある場合)。終点カップリングについては、L又はTは、カップリング部分、例えば、システイン又は複数のリジン若しくはヒスチジンを含んでもよい。C末端は、例えば、システインであってもよい。
【００２７】
アルカリ安定プロテインAリガンドは、原則として、アルカリ安定性の程度が異なる2つの層に分けることができる。第1層には、上記で議論したように0.5M NaOHでのインキュベーションに耐えられるリガンドが含まれ、第2層には、上記で議論したように、0.1M NaOHでのインキュベーションに耐えられるが0.5M NaOHでは耐えられないリガンドが含まれる。本発明の方法では、第1及び第2層のリガンドの両方を使用することができるが、第1層のリガンドは、洗浄条件のより自由な選択を可能にする。第1層のリガンドは、以下のドメイン配列を含むリガンドを含む:配列番号8〜11、17〜23、32、34、36〜47、49〜50、54〜62、65〜69、71、136〜138及び142〜147。第2層のリガンドは、以下のドメイン配列を含むリガンドを含む:配列番号5、7、12〜15、24〜31、33、35、48、51〜53、63〜64、70、72〜135及び139〜141。リガンドは、例えば、配列番号5及び7〜141からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、例えば少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有するドメインを含んでもよい。或いは、それらは、例えば、配列番号8〜11、17〜23、32、34、36〜47、49〜50、54〜62、65〜69、71及び136〜138からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、例えば少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有するドメインを含んでもよい。適切には、リガンド中のすべてのドメインは、上記で議論したような配列を含む。更に、任意のL、S及び/又はT配列は、適切には、例えばいかなるアスパラギン残基も含まないことによりアルカリ安定であり得る。ドメイン配列を、それらのアルカリ安定性についての情報が示される表示とともに以下に列挙する。
【００２８】
配列番号1 (SpA Eドメイン)
【００２９】
【数１】
2021506928.tif 000002
【００３０】
配列番号2 (SpA Dドメイン)
【００３１】
【数２】
2021506928.tif 000003
【００３２】
配列番号3 (SpA Aドメイン)
【００３３】
【数３】
2021506928.tif 000004
【００３４】
配列番号4 (SpA Bドメイン)
【００３５】
【数４】
2021506928.tif 000005
【００３６】
配列番号5 (SpA Cドメイン)
【００３７】
【数５】
2021506928.tif 000006
【００３８】
配列番号6 (プロテインZ) US7834158
【００３９】
【数６】
2021506928.tif 000007
【００４０】
配列番号7 (Zvar) US7834158
【００４１】
【数７】
2021506928.tif 000008
【００４２】
配列番号8 Zvar(Q9A、N11E、N43A) WO2017194594A1
【００４３】
【数８】
2021506928.tif 000009
【００４４】
配列番号9 Zvar(Q9A、N11E、N28A、N43A) WO2017194594A1
【００４５】
【数９】
2021506928.tif 000010
【００４６】
配列番号10 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43E、L44I) WO2017194594A1
【００４７】
【数１０】
2021506928.tif 000011
【００４８】
配列番号11 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【００４９】
【数１１】
2021506928.tif 000012
【００５０】
配列番号12 Zvar(N11E、Q32A) WO2017194594A1
【００５１】
【数１２】
2021506928.tif 000013
【００５２】
配列番号13 Zvar(N11E) WO2017194594A1
【００５３】
【数１３】
2021506928.tif 000014
【００５４】
配列番号14 Zvar(N11E、Q32E、Q40E) WO2017194594A1
【００５５】
【数１４】
2021506928.tif 000015
【００５６】
配列番号15 Zvar(N11E、Q32E、K50R) WO2017194594A1
【００５７】
【数１５】
2021506928.tif 000016
【００５８】
配列番号16 Zvar(N11K) WO2017194594A1
【００５９】
【数１６】
2021506928.tif 000017
【００６０】
配列番号17 Zvar(N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y) WO2017194594A1
【００６１】
【数１７】
2021506928.tif 000018
【００６２】
配列番号18 Zvar(Q9A、N11E、N28A、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【００６３】
【数１８】
2021506928.tif 000019
【００６４】
配列番号19 Zvar(Q9A、N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y) WO2017194594A1
【００６５】
【数１９】
2021506928.tif 000020
【００６６】
配列番号20 Zvar(N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I) WO2017194594A1
【００６７】
【数２０】
2021506928.tif 000021
【００６８】
配列番号21 Zvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I) WO2017194594A1
【００６９】
【数２１】
2021506928.tif 000022
【００７０】
配列番号22 Zvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R) WO2017194594A1
【００７１】
【数２２】
2021506928.tif 000023
【００７２】
配列番号23 Zvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R) WO2017194594A1
【００７３】
【数２３】
2021506928.tif 000024
【００７４】
配列番号24 Zvar(D37E) WO2016079034A1
【００７５】
【数２４】
2021506928.tif 000025
【００７６】
配列番号25 C(Q9A、N11E、E43A) WO2017194594A1
【００７７】
【数２５】
2021506928.tif 000026
【００７８】
配列番号26 Zvar(N11Y) WO2017194594A1
【００７９】
【数２６】
2021506928.tif 000027
【００８０】
配列番号27 Zvar(N11T) WO2017194594A1
【００８１】
【数２７】
2021506928.tif 000028
【００８２】
配列番号28 Zvar(N11F) WO2017194594A1
【００８３】
【数２８】
2021506928.tif 000029
【００８４】
配列番号29 Zvar(N11L) WO2017194594A1
【００８５】
【数２９】
2021506928.tif 000030
【００８６】
配列番号30 Zvar(N11W) WO2017194594A1
【００８７】
【数３０】
2021506928.tif 000031
【００８８】
配列番号31 Zvar(N11I) WO2017194594A1
【００８９】
【数３１】
2021506928.tif 000032
【００９０】
配列番号32 Zvar(N11M) WO2017194594A1
【００９１】
【数３２】
2021506928.tif 000033
【００９２】
配列番号33 Zvar(N11V) WO2017194594A1
【００９３】
【数３３】
2021506928.tif 000034
【００９４】
配列番号34 Zvar(N11A) WO2017194594A1
【００９５】
【数３４】
2021506928.tif 000035
【００９６】
配列番号35 Zvar(N11H) WO2017194594A1
【００９７】
【数３５】
2021506928.tif 000036
【００９８】
配列番号36 Zvar(N11R) WO2017194594A1
【００９９】
【数３６】
2021506928.tif 000037
【０１００】
配列番号37 Zvar(Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１０１】
【数３７】
2021506928.tif 000038
【０１０２】
配列番号38 Zvar(Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42R、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１０３】
【数３８】
2021506928.tif 000039
【０１０４】
配列番号39 Zvar(Q9A、N11E、A29G、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１０５】
【数３９】
2021506928.tif 000040
【０１０６】
配列番号40 Zvar(Q9A、N11E、A29S、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１０７】
【数４０】
2021506928.tif 000041
【０１０８】
配列番号41 Zvar(Q9A、N11E、A29Y、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１０９】
【数４１】
2021506928.tif 000042
【０１１０】
配列番号42 Zvar(Q9A、N11E、A29Q、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１１１】
【数４２】
2021506928.tif 000043
【０１１２】
配列番号43 Zvar(Q9A、N11E、A29T、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１１３】
【数４３】
2021506928.tif 000044
【０１１４】
配列番号44 Zvar(Q9A、N11E、A29N、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１１５】
【数４４】
2021506928.tif 000045
【０１１６】
配列番号45 Zvar(Q9A、N11E、A29F、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１１７】
【数４５】
2021506928.tif 000046
【０１１８】
配列番号46 Zvar(Q9A、N11E、A29L、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１１９】
【数４６】
2021506928.tif 000047
【０１２０】
配列番号47 Zvar(Q9A、N11E、A29W、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１２１】
【数４７】
2021506928.tif 000048
【０１２２】
配列番号48 Zvar(Q9A、N11E、A29I、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１２３】
【数４８】
2021506928.tif 000049
【０１２４】
配列番号49 Zvar(Q9A、N11E、A29M、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１２５】
【数４９】
2021506928.tif 000050
【０１２６】
配列番号50 Zvar(Q9A、N11E、A29V、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１２７】
【数５０】
2021506928.tif 000051
【０１２８】
配列番号51 Zvar(Q9A、N11E、A29D、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１２９】
【数５１】
2021506928.tif 000052
【０１３０】
配列番号52 Zvar(Q9A、N11E、A29E、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１３１】
【数５２】
2021506928.tif 000053
【０１３２】
配列番号53 Zvar(Q9A、N11E、A29H、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１３３】
【数５３】
2021506928.tif 000054
【０１３４】
配列番号54 Zvar(Q9A、N11E、A29R、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１３５】
【数５４】
2021506928.tif 000055
【０１３６】
配列番号55 Zvar(Q9A、N11E、A29K、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１３７】
【数５５】
2021506928.tif 000056
【０１３８】
配列番号56 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53F) WO2017194594A1
【０１３９】
【数５６】
2021506928.tif 000057
【０１４０】
配列番号57 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53Y) WO2017194594A1
【０１４１】
【数５７】
2021506928.tif 000058
【０１４２】
配列番号58 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53W) WO2017194594A1
【０１４３】
【数５８】
2021506928.tif 000059
【０１４４】
配列番号59 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53K) WO2017194594A1
【０１４５】
【数５９】
2021506928.tif 000060
【０１４６】
配列番号60 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、D53R) WO2017194594A1
【０１４７】
【数６０】
2021506928.tif 000061
【０１４８】
配列番号61 Zvar(Q9del、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１４９】
【数６１】
2021506928.tif 000062
【０１５０】
配列番号62 Zvar(Q9A、N11E、Q40del、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１５１】
【数６２】
2021506928.tif 000063
【０１５２】
配列番号63 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42del、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１５３】
【数６３】
2021506928.tif 000064
【０１５４】
配列番号64 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43del、L44I) WO2017194594A1
【０１５５】
【数６４】
2021506928.tif 000065
【０１５６】
配列番号65 Zvar(D2del、A3del、K4del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１５７】
【数６５】
2021506928.tif 000066
【０１５８】
配列番号66 Zvar(V1del、D2del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、K58del) WO2017194594A1
【０１５９】
【数６６】
2021506928.tif 000067
【０１６０】
配列番号67 Zvar(K4del、F5del、D6del、K7del、E8del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１６１】
【数６７】
2021506928.tif 000068
【０１６２】
配列番号68 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、A56del、P57del、K58del) WO2017194594A1
【０１６３】
【数６８】
2021506928.tif 000069
【０１６４】
配列番号69 Zvar(V1del、D2del、A3del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１６５】
【数６９】
2021506928.tif 000070
【０１６６】
配列番号70 Zvar(V1del、D2del、A3del、K4del、F5del、D6del、K7del、E8del、Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I) WO2017194594A1
【０１６７】
【数７０】
2021506928.tif 000071
【０１６８】
配列番号71 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I、K58_insYEDG) WO2017194594A1
【０１６９】
【数７１】
2021506928.tif 000072
【０１７０】
配列番号72 C(G29A) US8329860
【０１７１】
【数７２】
2021506928.tif 000073
【０１７２】
配列番号73 C(N3del、K4del、F5del、N6del) US8329860
【０１７３】
【数７３】
2021506928.tif 000074
【０１７４】
配列番号74 C(N3del、K4del、F5del、N6del、G29A) US8329860
【０１７５】
【数７４】
2021506928.tif 000075
【０１７６】
配列番号75 C(A1del、D2del、N3del、K4del) US9018305
【０１７７】
【数７５】
2021506928.tif 000076
【０１７８】
配列番号76 C(A1del、D2del、N3del) US9018305
【０１７９】
【数７６】
2021506928.tif 000077
【０１８０】
配列番号77 C(A1del、D2del、N3del、K4del、G29K) WO2013109302
【０１８１】
【数７７】
2021506928.tif 000078
【０１８２】
配列番号78 C(A1del、D2del、N3del、G29K) WO2013109302
【０１８３】
【数７８】
2021506928.tif 000079
【０１８４】
配列番号79 C(A1V、G29A) US9040661
【０１８５】
【数７９】
2021506928.tif 000080
【０１８６】
配列番号80 C(G29E) US9403883
【０１８７】
【数８０】
2021506928.tif 000081
【０１８８】
配列番号81 C(G29R) US9403883
【０１８９】
【数８１】
2021506928.tif 000082
【０１９０】
配列番号82 C(G29I) US9403883
【０１９１】
【数８２】
2021506928.tif 000083
【０１９２】
配列番号83 C(G29L) US9403883
【０１９３】
【数８３】
2021506928.tif 000084
【０１９４】
配列番号84 C(G29F) US9403883
【０１９５】
【数８４】
2021506928.tif 000085
【０１９６】
配列番号85 C(G29Y) US9403883
【０１９７】
【数８５】
2021506928.tif 000086
【０１９８】
配列番号86 C(G29M) US9403883
【０１９９】
【数８６】
2021506928.tif 000087
【０２００】
配列番号87 C(G29W) US9403883
【０２０１】
【数８７】
2021506928.tif 000088
【０２０２】
配列番号88 C(G29V) US9403883
【０２０３】
【数８８】
2021506928.tif 000089
【０２０４】
配列番号89 C(G29T) US9403883
【０２０５】
【数８９】
2021506928.tif 000090
【０２０６】
配列番号90 C(G29D) US9403883
【０２０７】
【数９０】
2021506928.tif 000091
【０２０８】
配列番号91 C(G29H) US9403883
【０２０９】
【数９１】
2021506928.tif 000092
【０２１０】
配列番号92 C(G29S) US9403883
【０２１１】
【数９２】
2021506928.tif 000093
【０２１２】
配列番号93 C(G29K) WO2013109302
【０２１３】
【数９３】
2021506928.tif 000094
【０２１４】
配列番号94 C(N3G、N6E、G29A、V40Q、K42T、E43N、I44V、A46G) US20160237124
【０２１５】
【数９４】
2021506928.tif 000095
【０２１６】
配列番号95 C(N3G、N6E、G29A、Q32K、L34I、K35R、V40Q、K42T、E43N、I44V、A46G) US20160237124
【０２１７】
【数９５】
2021506928.tif 000096
【０２１８】
配列番号96 C(A1V、N3insF、G29A) WO2016152946
【０２１９】
【数９６】
2021506928.tif 000097
【０２２０】
配列番号97 C(A1V、N3insL、G29A) WO2016152946
【０２２１】
【数９７】
2021506928.tif 000098
【０２２２】
配列番号98 C(A1V、N3insI、G29A) WO2016152946
【０２２３】
【数９８】
2021506928.tif 000099
【０２２４】
配列番号99 C(A1V、N3insP、G29A) WO2016152946
【０２２５】
【数９９】
2021506928.tif 000100
【０２２６】
配列番号100 C(A1V、N3insQ、G29A) WO2016152946
【０２２７】
【数１００】
2021506928.tif 000101
【０２２８】
配列番号101 C(A1V、N3insH、G29A) WO2016152946
【０２２９】
【数１０１】
2021506928.tif 000102
【０２３０】
配列番号102 C(A1V、N3insR、G29A) WO2016152946
【０２３１】
【数１０２】
2021506928.tif 000103
【０２３２】
配列番号103 C(A1V、N3insT、G29A) WO2016152946
【０２３３】
【数１０３】
2021506928.tif 000104
【０２３４】
配列番号104 C(A1V、N3insY、G29A) WO2016152946
【０２３５】
【数１０４】
2021506928.tif 000105
【０２３６】
配列番号105 C(A1V、N3insA、G29A) WO2016152946
【０２３７】
【数１０５】
2021506928.tif 000106
【０２３８】
配列番号106 C(A1V、N3insM、G29A) WO2016152946
【０２３９】
【数１０６】
2021506928.tif 000107
【０２４０】
配列番号107 C(A1V、N3insD、G29A) WO2016152946
【０２４１】
【数１０７】
2021506928.tif 000108
【０２４２】
配列番号108 C(A1V、N3insW、G29A) WO2016152946
【０２４３】
【数１０８】
2021506928.tif 000109
【０２４４】
配列番号109 C(A1V、N3insE、G29A) WO2016152946
【０２４５】
【数１０９】
2021506928.tif 000110
【０２４６】
配列番号110 C(A1V、N3insV、G29A) WO2016152946
【０２４７】
【数１１０】
2021506928.tif 000111
【０２４８】
配列番号111 C(A1V、N3insIT、G29A) WO2016152946
【０２４９】
【数１１１】
2021506928.tif 000112
【０２５０】
配列番号112 Z(N23H) WO2012083425
【０２５１】
【数１１２】
2021506928.tif 000113
【０２５２】
配列番号113 Z(N23S) WO2012083425
【０２５３】
【数１１３】
2021506928.tif 000114
【０２５４】
配列番号114 Z(N3H、N23S) WO2012083425
【０２５５】
【数１１４】
2021506928.tif 000115
【０２５６】
配列番号115 Z(N3H、N23T) WO2012083425
【０２５７】
【数１１５】
2021506928.tif 000116
【０２５８】
配列番号116 Z(N3H、N6D、N23S) WO2012083425
【０２５９】
【数１１６】
2021506928.tif 000117
【０２６０】
配列番号117 C(G29A、P57del) EP1992692A1
【０２６１】
【数１１７】
2021506928.tif 000118
【０２６２】
配列番号118 Z(N3D、N6L、L19del、N23T) CN105481954A
【０２６３】
【数１１８】
2021506928.tif 000119
【０２６４】
配列番号119 Z(N3A、N6D、Q9A、N23T) US20160159855
【０２６５】
【数１１９】
2021506928.tif 000120
【０２６６】
配列番号120 Z(N3A、N6D、Q9A、E15K、N23T) US20160159855
【０２６７】
【数１２０】
2021506928.tif 000121
【０２６８】
配列番号121 Z(N3A、N6D、Q9A、N23T、E47T) US20160159855
【０２６９】
【数１２１】
2021506928.tif 000122
【０２７０】
配列番号122 Z(N3A、N6D、Q9A、N23T、D36T) US20160159855
【０２７１】
【数１２２】
2021506928.tif 000123
【０２７２】
配列番号123 Z(N3A、N6D、Q9A、N23T、D36A) US20160159855
【０２７３】
【数１２３】
2021506928.tif 000124
【０２７４】
配列番号124 Z(N3A、N6D、Q9T、N23T、D36T) US20160159855
【０２７５】
【数１２４】
2021506928.tif 000125
【０２７６】
配列番号125 Z(N3A、N6D、Q9A、N23T、Q26A、D36A、E47A) US20160159855
【０２７７】
【数１２５】
2021506928.tif 000126
【０２７８】
配列番号126 Z(N3A、N6D、Q9A、N23T、E47T、K49E、N52S) US20160159855
【０２７９】
【数１２６】
2021506928.tif 000127
【０２８０】
配列番号127 Z(N3A、N6D、Q9T、N23T、E47T) US20160159855
【０２８１】
【数１２７】
2021506928.tif 000128
【０２８２】
配列番号128 Z(N3A、N6D、Q9W、N23T) US 14/961164
【０２８３】
【数１２８】
2021506928.tif 000129
【０２８４】
配列番号129 Z(N3A、N6D、Q9L、N23T) US 14/961164
【０２８５】
【数１２９】
2021506928.tif 000130
【０２８６】
配列番号130 Z(N3A、N6D、Q9E、N23T) US 14/961164
【０２８７】
【数１３０】
2021506928.tif 000131
【０２８８】
配列番号131 Z(N3A、N6D、Q9K、N23T) US 14/961164
【０２８９】
【数１３１】
2021506928.tif 000132
【０２９０】
配列番号132 Z(N3A、N6D、Q9V、N23T) US 14/961164
【０２９１】
【数１３２】
2021506928.tif 000133
【０２９２】
配列番号133 Zvar(A42R) WO2016079034A1
【０２９３】
【数１３３】
2021506928.tif 000134
【０２９４】
配列番号134 Zvar(S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y) WO2016079034A1
【０２９５】
【数１３４】
2021506928.tif 000135
【０２９６】
配列番号135 Zvar(H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y) WO2016079034A1
【０２９７】
【数１３５】
2021506928.tif 000136
【０２９８】
配列番号136 Zvar(N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y) WO2016079034A1
【０２９９】
【数１３６】
2021506928.tif 000137
【０３００】
配列番号137 Zvar(Q9A、N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y) WO2016079034A1
【０３０１】
【数１３７】
2021506928.tif 000138
【０３０２】
配列番号138 Zvar(N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I) WO2016079034A1
【０３０３】
【数１３８】
2021506928.tif 000139
【０３０４】
配列番号139 Z(N23T) US7834158
【０３０５】
【数１３９】
2021506928.tif 000140
【０３０６】
配列番号140 Z(N3A、N23T) US7834158
【０３０７】
【数１４０】
2021506928.tif 000141
【０３０８】
配列番号141 Z(K4G、N23T) US7834158
【０３０９】
【数１４１】
2021506928.tif 000142
【０３１０】
配列番号143 WO2018029158
【０３１１】
【数１４２】
2021506928.tif 000143
【０３１２】
配列番号144 WO2018029158
【０３１３】
【数１４３】
2021506928.tif 000144
【０３１４】
配列番号145 WO2018029158
【０３１５】
【数１４４】
2021506928.tif 000145
【０３１６】
配列番号146 WO2018029158
【０３１７】
【数１４５】
2021506928.tif 000146
【０３１８】
配列番号147 WO2018029158
【０３１９】
【数１４６】
2021506928.tif 000147
【０３２０】
配列番号148 WO2018029158
【０３２１】
【数１４７】
2021506928.tif 000148
【０３２２】
アルカリ安定プロテインLリガンド
アルカリ安定プロテインLリガンドは、PpLの1つ又は複数の変異IgG結合ドメインを適切に含むことができる。ネイティブPpLドメインは、ドメインB1(配列番号149)、ドメインB2(配列番号150)、ドメインB3(配列番号151)、ドメインB4(配列番号152)、ドメインB5(配列番号153)、ドメインC1(配列番号168)、ドメインC2(配列番号169)、ドメインC3(配列番号170)、ドメインC4(配列番号171)及びドメインD1(配列番号172)である。変異は、1つ又は複数のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基による置換を含むことができるが、他の変異もまた可能である。アルカリ安定プロテインLリガンドの構造は、典型的には、タンパク質L'-(ドメイン' -S ')n-T'であり、ここでL'はN末端を含む1〜10アミノ酸リーダー配列であり、ドメイン'は(変異)IgG結合ドメインであり、S'は任意選択の1〜15アミノ酸スペーサー配列であり、nは1〜10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10等、例えば3〜7又は4〜6であり、T'は、0〜10アミノ酸テール配列であり、C末端を含む(T'に少なくとも1つのアミノ酸残基がある場合)。
【０３２３】
配列番号149 プロテインLドメインB1 WO2016096643A1
【０３２４】
【数１４８】
2021506928.tif 000149
【０３２５】
配列番号150 プロテインLドメインB2 WO2016096643A1
【０３２６】
【数１４９】
2021506928.tif 000150
【０３２７】
配列番号151 プロテインLドメインB3 WO2016096643A1
【０３２８】
【数１５０】
2021506928.tif 000151
【０３２９】
配列番号152 プロテインLドメインB4 WO2016096643A1
【０３３０】
【数１５１】
2021506928.tif 000152
【０３３１】
配列番号153 プロテインLドメインB5 WO2016096643A1
【０３３２】
【数１５２】
2021506928.tif 000153
【０３３３】
配列番号168 プロテインLドメインC1
【０３３４】
【数１５３】
2021506928.tif 000154
【０３３５】
配列番号169 プロテインLドメインC2
【０３３６】
【数１５４】
2021506928.tif 000155
【０３３７】
配列番号170 プロテインLドメインC3
【０３３８】
【数１５５】
2021506928.tif 000156
【０３３９】
配列番号171 プロテインLドメインC4
【０３４０】
【数１５６】
2021506928.tif 000157
【０３４１】
配列番号172 プロテインLドメインD1
【０３４２】
【数１５７】
2021506928.tif 000158
【０３４３】
アルカリ安定プロテインLリガンドは、IgGへの結合能力がインキュベーション前のIgG結合能力と比較して45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.1M NaOHとのインキュベーションに耐えることができ得る。これは、表面プラズモン共鳴(SPR)チップ、例えばUS20170334954に記載されているようなBiacore CM5センサーチップ(GE Healthcare Bio-Sciences AB社)に、例えばNHSカップリング化学を使用して、リガンドを結合させ、Biacore機器(GE Healthcare Bio-Sciences AB社)内でチップの免疫グロブリン結合能力を、典型的にはポリクローナルヒトIgGを使用して、チップのインキュベーションの前後に0.5M NaOHで100×10分間サイクルで測定することにより適切に測定することができる。或いは、アルカリ安定性は、共有結合したリガンドを含む分離マトリックスが、IgGへの結合能力がインキュベーション前のIgG結合能力と比較して20%未満の減少で、22+/-2℃で100×15分間の0.5M又は0.1M NaOHとのインキュベーションに耐えることができると定義できる。IgG結合能力の減少は、適切には15%未満、例えば10%未満又は5%未満であり得る。US20170334954に記載されるように、2.4又は6分の滞留時間で10%ブレイクスルー動的能力(Qb10%)を測定することにより、評価を行うことができる。
【０３４４】
上で議論したアルカリ安定プロテインLリガンドには、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるWO2016096643A1、US20180305414及びWO2017191748A1に記載される以下の変異ドメインの単量体及び多量体L'-(ドメイン' -S')n-T'構築物が含まれる。
【０３４５】
配列番号154 プロテインLドメインB3(N10Q、N45A) WO2016096643A1
【０３４６】
【数１５８】
2021506928.tif 000159
【０３４７】
配列番号155 プロテインLドメインB3(N45A、N60Q) WO2016096643A1
【０３４８】
【数１５９】
2021506928.tif 000160
【０３４９】
配列番号156 プロテインLドメインB3(N10Q、N45A、N60Q) WO2016096643A1
【０３５０】
【数１６０】
2021506928.tif 000161
【０３５１】
配列番号157 US20180305414
【０３５２】
【数１６１】
2021506928.tif 000162
【０３５３】
配列番号158 WO2017191748
【０３５４】
【数１６２】
2021506928.tif 000163
【０３５５】
アルカリ安定プロテインGリガンド
アルカリ安定プロテインGリガンドは、SpGの1つ又は複数の変異IgG結合ドメインを適切に含むことができる。変異は、1つ又は複数のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基による置換を含むことができるが、他の変異もまた可能である。アルカリ安定プロテインGリガンドの構造は、典型的には、タンパク質L''-(ドメイン'' -S'')n-T''であり、ここでL''はN末端を含む1〜10アミノ酸リーダー配列であり、ドメイン''は(変異)IgG結合ドメインであり、S''は任意選択の1〜15アミノ酸スペーサー配列であり、nは1〜10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10等、例えば3〜7又は4〜6であり、T''は、0〜10アミノ酸テール配列であり、C末端を含む(T''に少なくとも1つのアミノ酸残基がある場合)。
【０３５６】
上で議論したアルカリ安定プロテインGリガンドには、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるWO2018180204A1及びWO2018180205A1に記載される以下の変異ドメインの単量体及び多量体L''-(ドメイン''-S'')n-T''構築物が含まれる。
【０３５７】
配列番号159 WO2018180204 配列1(N8D)
【０３５８】
【数１６３】
2021506928.tif 000164
【０３５９】
配列番号160 WO2018180204 配列1(N8L)
【０３６０】
【数１６４】
2021506928.tif 000165
【０３６１】
配列番号161 WO2018180204 配列4(N8I)
【０３６２】
【数１６５】
2021506928.tif 000166
【０３６３】
配列番号162 WO2018180204 配列4(N8K)
【０３６４】
【数１６６】
2021506928.tif 000167
【０３６５】
配列番号163 WO2018180204 配列4(N8L)
【０３６６】
【数１６７】
2021506928.tif 000168
【０３６７】
配列番号164 WO2018180205 配列3
【０３６８】
【数１６８】
2021506928.tif 000169
【０３６９】
配列番号165 WO2018180205 配列4
【０３７０】
【数１６９】
2021506928.tif 000170
【０３７１】
配列番号166 WO2018180205 配列11
【０３７２】
【数１７０】
2021506928.tif 000171
【０３７３】
配列番号167 WO2018180205 配列13
【０３７４】
【数１７１】
2021506928.tif 000172
【実施例】
【０３７５】
プロトタイプマトリックス
およそ130mLのアルカリ安定プロテインAマトリックスプロトタイプは、L=AQGT(配列番号142)、ドメイン=配列番号11及びT=C末端システインである構造L-(ドメイン)6-Tを有する六量体の高度アルカリ安定リガンドを、高架橋アガロースビーズにカップリングさせることにより調製された。カップリングの前にビーズをエピクロロヒドリンでエポキシ活性化し、US6399750に記載されるようにカップリングを行った。カップリング後のリガンド含量は18mg/mlマトリックスであり、固定化後、ゲルを1ゲル容量の蒸留水で2回洗浄した。
【０３７６】
活性化
使用した多孔質担体粒子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるUS6602990の方法に従って調製された62マイクロメートル(体積加重、d50V)メジアン径の硬質架橋アガロースビーズであり、孔径は、Gel Filtration Principles and Methods、Pharmacia LKB Biotechnology 1991、6〜13頁に記載の方法に従って、Mw 110kDaのデキストランについて逆ゲル濾過クロマトグラフィーKav値0.70に相当する。
【０３７７】
25mL(g)の排水したベースマトリックス、10.0mLの蒸留水、及び2.02gのNaOH(s)を、100mLフラスコ内で25℃で10分間機械的に攪拌しながら混合した。4.0mLのエピクロロヒドリンを添加し、2時間、反応を進行させた。活性化されたゲルを10ゲル沈降体積(gel sediment volume; GV)の水で洗浄した。
【０３７８】
カップリング
50mlファルコンチューブ内の20mLのリガンド溶液(50mg/mL)に、169mgのNaHCO3、21mgのNa2CO3、175mgのNaCl及び7mgのEDTAを添加した。ファルコンチューブをローラーテーブルに5〜10分間置き、77mgのDTEを添加した。還元は45分以上進行させた。次に、リガンド溶液をSephadex G-25を充填したPD10カラムで脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含量を、276nmのUV吸収を測定することにより決定した。
【０３７９】
活性化されたゲルを3〜5GV{0.1Mリン酸塩/1mM EDTA pH8.6}で洗浄し、次に、その全体が参照により本明細書に組み込まれるUS6399750に記載された方法に従って、リガンドをカップリングさせた。実験で使用したすべての緩衝液は、少なくとも5〜10分間、窒素ガスにより脱気されていた。
【０３８０】
(実施例1)
アフィニティ分離マトリックスのIgG結合能力に対する異なる洗浄溶液の影響
プロトタイプマトリックスの10mlフィルターケーキから10%ゲルスラリーを調製し、90.0mLの20%エタノール(90×0.97=87.3g)を添加した(20%エタノールの密度は0.97g/mL)。その後、Gilsonロボットを用いて96ウェルフィルタープレート(GE Healthcare社)に、スラリーを分注し、200μLスラリー/ウェル(20μLゲル/ウェル)とした。その後、プレートを真空で排水した。フィルタープレートの底を密閉し、互換性研究用の溶液を200μL/ウェルのフィルタープレートにピペットで移した。その後、プレートを室温(22+/-2℃)で18時間一晩保存した。真空を使用して溶液を除去し、ウェルをPBS緩衝液で約10×200μL洗浄し、最後の排水を500gで1分間の遠心分離により行った。
【０３８１】
これらの化学物質への曝露後、静的結合能力を次のように試験した。IgGサンプル溶液は、Gammanorm(Octapharma社、ポリクローナルヒトIgG)をPBS緩衝液で10倍希釈して調製した。PBS緩衝液で洗浄/平衡化した後、250μLサンプル/ウェルをロードし、プレートをシェーカー上で60分間インキュベートした。ウェルを遠心分離で空にしてUVプレートに移し、吸光度がリーダーの線形範囲内にあることを確証するために1:1に希釈した後、未結合のIgGサンプルの量を、UVリーダーを使用して280nmの吸光度として検出した。静的結合能力を計算し、インキュベーション前のプロトタイプの静的IgG容量で割った。
【０３８２】
1M NaOHを含む試験した溶液が、プロトタイプの静的IgG結合能力にいかなる悪影響も与えなかったことを示すデータを図1に表示する。
【０３８３】
(実施例2)
アフィニティ分離マトリックスからの未結合リガンドの除去に対する異なる洗浄溶液の影響
上記のようにして、プロトタイプマトリックスの(水中の)10%ゲルスラリーを、Gilsonロボットを用いて、96ウェルフィルタープレート(GE Healthcare社)に、200μLスラリー/ウェル(20μLゲル/ウェル)で調製した。その後、プレートを真空で排水した。フィルタープレートの底を密閉し、洗浄効率研究用の溶液を200μL/ウェルでフィルタープレートにピペットで移した。その後、プレートを室温(22+/-2℃)で、1時間、1200rpmで振とうしながら保存した。1分間、500gの遠心分離を使用して溶液を除去し、上記の洗浄効率研究用の溶液を用いてプレートを再び調製した。溶出溶液をLC-MS(Zorbax 300SB-C8 2.1×50mmカラムを備えたWater社のAquity UPLCシステム及びWaters社のXevo G2 Q-TOF MS)で試験して、総イオン電流(TIC)及び溶液中の遊離リガンドで調製した較正曲線としてのリガンド濃度を決定した。LC-MS法の詳細は以下の通りである:
【０３８４】
緩衝液A: MilliQ(商標)水中に0.1%ギ酸及び0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)
緩衝液B: 80:20のアセトニトリル:2-プロパノール中に0.1%ギ酸及び0.05%TFA
【０３８５】
カラムを60℃に保った。サンプルの濃度に依存して10〜50μLの容量のサンプルを注入し、MS法に与えられた全MSサーベイモードでMSデータを収集した。
【０３８６】
MS法
時間:0〜12分
極性:正
アナライザーモード:解像度
m/z範囲:50〜4000
スキャン時間:1秒
衝突エネルギー:なし
【０３８７】
データ分析及びMwデコンボリューション
クロマトグラムの各ピークについてのMwの決定は、MassLynxソフトウェア中に提供されたMaxEnt1関数によって行った。
【０３８８】
サンプルは以下に示すように中和した:
0.5M及び1M NaOH:150μLのサンプル+20μLの1Mジチオトレイトール(DTT)&2M Tris HCl&10%ギ酸+2.5μLのギ酸
0.1M NaOH:200μLのサンプル+20μLの1M DTT&2M Tris-HCl
0.05M NaOH:200μLのサンプル+10μLの1M DTT&2M Tris-HCl
0.5M酢酸pH2.5:150μLのサンプル+15μLの1M DTT&2M Tris pH8.5+5μLの50% NaOH
0.1M HAc+40% EtOH:200μL溶液+20μLの1M DTT+2M Tris塩基(NaOH後の最初の洗浄はpH13〜14、したがってサンプル調製は異なる方法で行われる:たとえば、200μLサンプル+ + 10μLの1M DTT+2M Tris HCl)
0.5M HAc+40% EtOH:200μL溶液+20μLの1M DTT+2M Tris塩基+2.5μLの50% NaOH
0.025M NaAc pH5:200μLのサンプル+20μLの1M DTT&2M Tris塩基
MQ:200μLのサンプル+20μLの1M DTT及び2M Tris-HCl
上記のサンプルとは別に、残りのサンプルは0.025M NaAcと同じサンプル調製、つまり200μLのサンプル+20μLの1M DTT及び2M Tris塩基であった。
全ての中和されたサンプルを37℃で30分間インキュベートし、LC-MSに注入した。
【０３８９】
50〜1000mM NaOHが他の全ての溶液と比較して著しく効率的であることを示す結果をTable 1(表1)に表示する。これは、リガンドがアルカリ安定であり、使用される条件下で加水分解しないという点で驚くべきことである。<LOD(検出限界)は、洗い流されたリガンドが検出することができなかったことを意味する。
【０３９０】
【表１】
2021506928.tif 000173
【０３９１】
(実施例3)
NaOH溶液及びHAc/EtOH溶液間の除去効率の比較
プロトタイプマトリックスをガラスフィルターファネル(no 3)から排出し、0.7〜0.8g(mL)のフィルターケーキのアリコートを空の10mlプラスチックカラム(PD-10、GE Healthcare社)に充填した。10分のサイクル(5サイクル、Table 2(表2)を参照)のインキュベーション後、溶出液を収集し、サンプルを上記のようにLC-MSにより分析した。液体の完全な除去のために、シリンジを使用して空気圧をカラムに加えて、各カラム内の樹脂を排水した。
【０３９２】
【表２】
2021506928.tif 000174
【０３９３】
50及び100mM NaOHの両方が水及びHAc/EtOH溶液よりもはるかに効率的であることが確かめられた結果を図2 a)に示す。
【０３９４】
Table 3(表3)に従った10サイクルの設定で実験を繰り返した。
【０３９５】
【表３】
2021506928.tif 000175
【０３９６】
この設定の結果を図2 b)に表示するが、これは10×10分のサイクル後にいずれのNaOH溶液でもゼロに非常に近いプラトーレベルに達していることを示している。
【０３９７】
40%エタノールを含有する0.1M NaOH溶液を用い、洗浄サイクルを10分の代わりに30分に延長して、いくつかのさらなる実験を行った。これらの実験の結果は、10分のサイクル時間で水中の0.1M NaOHを用いたものと有意には異ならなかった。
【０３９８】
(実施例4)
NaOH洗浄、続いてHAc/EtOH及びNaAc洗浄
実施例3を、50又は100mM NaOHのいずれかで10回の洗浄サイクル、100mM HAc+40% EtOHの3サイクル及び25mM NaAc、pH5で5サイクルのシーケンスで繰り返し、その後、20%EtOH保存水溶液に移した。
【０３９９】
【表４】
2021506928.tif 000176
【０４００】
ほとんどすべての非結合リガンドがNaOH工程で除去され、少量が最初のHAc/EtOH工程で起きたことを示す結果を図3に表示する。
【０４０１】
(実施例5)
リガンド漏れ-従来のHAc及び緩衝液洗浄との比較
リガンド漏れ試験方法
2.0mLのゲル沈殿物を、20%エタノール+0.2M NaClをパッキング液として用い、パッキングフローを3.5mL/minとして、5×100mm Tricorn 5/100カラム(GE Healthcare社)に充填した。ベッドの高さは9.7cmであった。カラムを0,020M NaH2PO4、pH7.0(A-緩衝液)で平衡化し、6分間の滞留時間でA-緩衝液に16.65CV 2g/LポリクローナルヒトIgG溶液(Octapharma Gammanorm社)をロードし、続いてA-緩衝液で3CV洗浄し、IgGを5CVの0.1Mグリシン、pH3.0(B-緩衝液)で溶出し、溶出液をELISAでの後の分析のために収集した。IgGを含有する溶出液をプールし、プール内の漏れリガンドの濃度を、プロテインAのELISAイムノ分析(Repligen社  #9000-1)で測定した。
【０４０２】
実施例4のシーケンスでは、20%EtOH保存水溶液に移す前に0.5M HAcでの12×10分のサイクル、0.1M Tris/0.15M NaCl pH8.5での15×10分のサイクル、0.1M Tris/0.15M NaCl pH8.5/20% EtOHでの1×17時間のサイクル、0.5M HAcでの3×10分のサイクル、0.1M Tris/0.15M NaCl pH8.5での5×10分のサイクル、及び蒸留水での10×10分のサイクルを含む参照シーケンスで洗浄したマトリックスとほぼ同じ漏れレベル(IgG1mgあたり<30ngリガンド)の分離マトリックスが得られた。NaOH法は、45×10分のサイクル+1×17時間、すなわち、合計時間24.5時間(7.5時間+17時間)の参照法と比較して、合計3時間の18×10分のサイクルを含んだ。
【０４０３】
本書面は、最良の形態を含む本発明を開示し、また、当業者が本発明を実践できるようにするために実施例を使用しており、それには任意のデバイス又はシステムの作成及び使用、並びに任意の組み込まれた方法の実行を含む。本発明の特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって定義されるが、当業者が想到する他の例を含み得る。そのような他の例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素がある場合、又は特許請求の範囲の文言と実質的な差異が無い均等の構造要素を含む場合、特許請求の範囲の範囲内にあるものとされる。本文中で言及されているいかなる特許又は特許出願は、あたかもそれらが個々に組み込まれているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021506928.tif 000177
【図２】
2021506928.tif 000178
【図３】
2021506928.tif 000179
【配列表】
2021506928000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月20日(2020.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)固体担体及び細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来するアルカリ安定リガンドを用意する工程;
b)前記アルカリ安定リガンドを前記固体担体と反応させて、共有結合アルカリ安定リガンドを有する分離マトリックスを形成する工程;並びに
c)共有結合アルカリ安定リガンドを有する前記分離マトリックスを、少なくとも10mMのアルカリ金属水酸化物、例えばNaOH若しくはKOH又はそれらの任意の混合物を含む洗浄溶液で洗浄する工程を含む、分離マトリックスの調製方法。
【請求項２】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、アルカリ安定プロテインAリガンド、アルカリ安定プロテインLリガンド又はアルカリ安定プロテインGリガンドである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程c)が、少なくとも1回、例えば少なくとも5回繰り返される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
工程c)の後に、前記分離マトリックスを保存溶液に移す工程d)、及び任意選択で、工程d)の後に、前記分離マトリックスを輸送容器に分配する工程を更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程c)が、工程b)の後24時間以内に行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程c)において、前記洗浄溶液が:
i) 25mM〜1Mのアルカリ金属水酸化物、例えばNaOH若しくはKOH又はそれらの任意の混合物;
ii) 40mM〜1Mのアルカリ金属水酸化物、例えば90mM〜0.5Mのアルカリ金属水酸化物若しくは50〜200mMのアルカリ金属水酸化物;あるいは
iii) 40mM〜1M NaOH若しくはKOH、例えば90mM〜0.5M NaOH若しくはKOH、又は50〜200mM NaOH若しくはKOHを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程b)の前に、前記固体担体を活性化する工程a')を更に含み、任意選択で、工程a')が、前記固体担体上でのエポキシド基の形成を含み、更に任意選択で、工程b)の後に、前記分離マトリックスが残留エポキシド基を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、前記エポキシド基と反応することができるリジン残基、又は前記エポキシド基と反応することができるチオールを持つシステイン残基を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが:
i) IgGへの結合能力において45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.1M NaOHでのインキュベーションに耐えること;又は
ii) IgGへの結合能力において45%未満の減少で、22+/-2℃で100×10分間の0.5M NaOHでのインキュベーションに耐えることができる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、少なくとも1つのアルカリ安定プロテインAドメイン、又はアルカリ安定プロテインAドメインの多量体、例えば少なくとも4つのアルカリ安定プロテインAドメインを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する前記アルカリ安定リガンドが、少なくとも1つのアルカリ安定プロテインLドメイン又はアルカリ安定プロテインGドメインを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体担体が、架橋多糖、例えば架橋寒天又はアガロースを含み;及び/又は、前記分離マトリックスが、マトリックス1mLあたり少なくとも11mgの共有結合リガンド、例えばマトリックス1mLあたり少なくとも15mgの共有結合リガンドを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程c)の後、前記分離マトリックスが、IgG溶出物プールにおけるELISA分析によって測定して、IgG1mgあたり40ng未満のリガンドのリガンド漏れを生じる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
非共有結合プロテインAリガンドを前記分離マトリックスから、例えば前記分離マトリックスの調製中に、除去する方法である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する共有結合アルカリ安定リガンドを含み、前記細菌免疫グロブリン結合タンパク質に由来する非共有結合リガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
共有結合アルカリ安定プロテインAリガンド、共有結合アルカリ安定プロテインGリガンド又は共有結合アルカリ安定プロテインLリガンドを含み、非共有結合プロテインAリガンド、非共有結合プロテインGリガンド又は非共有結合プロテインLリガンドを実質的に含まない、分離マトリックスを調製する方法である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2021506928.tif 000180
2021506928.tif 000181