(57)【要約】  本開示は、広くは、がん免疫療法の分野に関する。例えば、本開示は、一般には、抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域、可変重鎖（ＶＨ）領域、定常重鎖１（ＣＨ１）領域および軽鎖定常（ＣＬ）領域を含む結合分子であって、これらの領域が、２つの抗原結合Ｆａｂ領域と抗原結合Ｆｖ領域とを形成するよう構成されており、したがって、２つの異なる抗原に結合する結合分子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）２つの抗体Ｆａｂ領域を含み、各々が、
（ｉ）抗体可変重鎖（ＶＨ）領域と抗体ＣＨ１領域とを含む第１の部分であって、抗体ＣＨ２領域および抗体ＣＨ３領域を含有しない第１の部分と、
（ｉｉ）抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域と抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む抗体軽鎖（ＬＣ）を含む第２の部分と
を含み、前記２つの抗体Ｆａｂ領域各々が抗原に結合する、
第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＶＨ領域とＶＬ領域とを含む抗体Ｆｖ領域を含む第２の抗原結合ドメインと
を含む結合分子であって、
前記第２の抗原結合ドメインが、免疫細胞上に存在する抗原に結合し；
前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインが連結されている、
結合分子。
【請求項２】
前記第１の抗原結合ドメインの各Ｆａｂ領域の前記第１の部分および前記第２の部分が、同じポリペプチド上にある、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
少なくとも１つのＦａｂ領域が、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されている：ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＬ、請求項２に記載の結合分子。
【請求項４】
少なくとも１つのＦａｂ領域が、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されている：ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＨ１、請求項２に記載の結合分子。
【請求項５】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分および前記第２の部分が、別々のポリペプチド上に存在する、請求項１に記載の結合分子。
【請求項６】
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域および前記ＶＬ領域が、同じポリペプチド上にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項７】
前記Ｆｖ領域が、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されている：ＶＨ−ＶＬ、請求項６に記載の結合分子。
【請求項８】
前記Ｆｖ領域が、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されている：ＶＬ−ＶＨ、請求項６に記載の結合分子。
【請求項９】
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域および前記ＶＬ領域が、別々のポリペプチド上にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１０】
前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインが、柔軟なペプチド領域により連結されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、請求項１０に記載の結合分子。
【請求項１２】
前記抗体ヒンジ領域が、ＩｇＧヒンジ領域である、請求項１１に記載の結合分子。
【請求項１３】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ１サブタイプのものである、請求項１２に記載の結合分子。
【請求項１４】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ２サブタイプのものである、請求項１２に記載の結合分子。
【請求項１５】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ３サブタイプのものである、請求項１２に記載の結合分子。
【請求項１６】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ４サブタイプのものである、請求項１２に記載の結合分子。
【請求項１７】
前記柔軟なペプチド領域が、前記抗体ヒンジ領域と前記第２の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む、請求項１１に記載の結合分子。
【請求項１８】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の結合分子。
【請求項１９】
前記第２の抗原結合ドメインが、前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域に連結されている第１のＣＨ３領域と、前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域に連結されている第２のＣＨ３領域とをさらに含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２０】
１つまたは複数のアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２１】
前記ＡＢＳが、前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域のＣ末端に連結されている、請求項２０に記載の結合分子。
【請求項２２】
前記ＡＢＳが、前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域のＣ末端に連結されている、請求項２０に記載の結合分子。
【請求項２３】
前記ＡＢＳが、前記Ｆａｂ領域のうちの少なくとも１つの前記ＣＬ領域に連結されている、請求項２０に記載の結合分子。
【請求項２４】
１つまたは複数のアルブミンドメインをさらに含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項２５】
前記２つのＦａｂ領域が、異なる抗原に結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２６】
前記２つのＦａｂ領域が、同じ抗原に結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２７】
前記２つのＦａｂ領域が、同じ抗原の同じエピトープに結合する、請求項２６に記載の結合分子。
【請求項２８】
前記２つのＦａｂ領域が、同じ抗原の異なるエピトープに結合する、請求項２６に記載の結合分子。
【請求項２９】
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、同じ抗原に結合する、請求項２６に記載の結合分子。
【請求項３０】
前記第２の抗原結合ドメインが、前記第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも１つと同じエピトープに結合する、請求項２６に記載の結合分子。
【請求項３１】
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原に結合し、前記第２の抗原結合ドメインが、第２の抗原に結合する、請求項２６に記載の結合分子。
【請求項３２】
前記第１の抗原が、がん抗原である、請求項３１に記載の結合分子。
【請求項３３】
前記第１の抗原が、がん抗原でない、請求項３１に記載の結合分子。
【請求項３４】
第２の抗原が、リンパ球および単球からなる群から選択される免疫細胞上に発現される、請求項３１に記載の結合分子。
【請求項３５】
前記第２の抗原が、エフェクター細胞上に発現される、請求項３１に記載の結合分子。
【請求項３６】
前記第２の抗原が、Ｔ細胞上に発現される、請求項３４に記載の結合分子。
【請求項３７】
前記第２の抗原が、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される、請求項３６に記載の結合分子。
【請求項３８】
前記第２の抗原が、ヘルパーＴ細胞上に発現される、請求項３７に記載の結合分子。
【請求項３９】
前記第２の抗原が、調節性Ｔ細胞上に発現される、請求項３７に記載の結合分子。
【請求項４０】
前記第２の抗原が、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される、請求項３７に記載の結合分子。
【請求項４１】
前記第２の抗原が、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される、請求項３６に記載の結合分子。
【請求項４２】
前記第２の抗原が、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される、請求項３６に記載の結合分子。
【請求項４３】
前記第２の抗原が、細胞外ドメインを含む、請求項３４に記載の結合分子。
【請求項４４】
前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項３５に記載の結合分子。
【請求項４５】
前記第１の抗原が、がん抗原であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項３１に記載の結合分子。
【請求項４６】
前記第１の抗原が、ＰＤ−Ｌ１であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項４５に記載の結合分子。
【請求項４７】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項４６に記載の結合分子。
【請求項４８】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号８のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項４６に記載の結合分子。
【請求項４９】
前記第１の抗原が、ＣＤ２０であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項４５に記載の結合分子。
【請求項５０】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項４９に記載の結合分子。
【請求項５１】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項４９に記載の結合分子。
【請求項５２】
前記第１の抗原が、ＥＧＦＲであり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項４５に記載の結合分子。
【請求項５３】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項５２に記載の結合分子。
【請求項５４】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項５２に記載の結合分子。
【請求項５５】
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成する、
結合分子。
【請求項５６】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、請求項５５に記載の結合分子。
【請求項５７】
前記柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、請求項５６に記載の結合分子。
【請求項５８】
前記抗体ヒンジ領域が、ＩｇＧヒンジ領域である、請求項５７に記載の結合分子。
【請求項５９】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ１サブタイプのものである、請求項５８に記載の結合分子。
【請求項６０】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ２サブタイプのものである、請求項５８に記載の結合分子。
【請求項６１】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ３サブタイプのものである、請求項５８に記載の結合分子。
【請求項６２】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ４サブタイプのものである、請求項５８に記載の結合分子。
【請求項６３】
前記柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、請求項５７に記載の結合分子。
【請求項６４】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の結合分子。
【請求項６５】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、異なる抗原に結合する、請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項６６】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、同じ抗原に結合する、請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項６７】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、同じ抗原の同じエピトープに結合する、請求項６６に記載の結合分子。
【請求項６８】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、同じ抗原の異なるエピトープに結合する、請求項６６に記載の結合分子。
【請求項６９】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原結合ドメインを形成し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原結合ドメインである、請求項６６に記載の結合分子。
【請求項７０】
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、同じ抗原に結合する、請求項６９に記載の結合分子。
【請求項７１】
前記第２の抗原結合ドメインが、前記第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも１つと同じエピトープに結合する、請求項６９に記載の結合分子。
【請求項７２】
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原に結合し、前記第２の抗原結合ドメインが、第２の抗原に結合する、請求項６９に記載の結合分子。
【請求項７３】
前記第１の抗原が、がん抗原である、請求項７２に記載の結合分子。
【請求項７４】
前記第１の抗原が、がん抗原でない、請求項７２に記載の結合分子。
【請求項７５】
第２の抗原が、リンパ球および単球からなる群から選択される免疫細胞上に発現される、請求項７２に記載の結合分子。
【請求項７６】
前記第２の抗原が、エフェクター細胞上に発現される、請求項７２に記載の結合分子。
【請求項７７】
前記第２の抗原が、Ｔ細胞上に発現される、請求項７５に記載の結合分子。
【請求項７８】
前記第２の抗原が、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される、請求項７７に記載の結合分子。
【請求項７９】
前記第２の抗原が、ヘルパーＴ細胞上に発現される、請求項７８に記載の結合分子。
【請求項８０】
前記第２の抗原が、調節性Ｔ細胞上に発現される、請求項７８に記載の結合分子。
【請求項８１】
前記第２の抗原が、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される、請求項７８に記載の結合分子。
【請求項８２】
前記第２の抗原が、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される、請求項７７に記載の結合分子。
【請求項８３】
前記第２の抗原が、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される、請求項７７に記載の結合分子。
【請求項８４】
前記第２の抗原が、細胞外ドメインを含む、請求項７５に記載の結合分子。
【請求項８５】
前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項７５に記載の結合分子。
【請求項８６】
前記第１の抗原が、がん抗原であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項７２に記載の結合分子。
【請求項８７】
前記第１の抗原が、ＰＤ−Ｌ１であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項８６に記載の結合分子。
【請求項８８】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項８７に記載の結合分子。
【請求項８９】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号８のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項８７に記載の結合分子。
【請求項９０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド各々が、配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記第３のポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記第４のポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項８７に記載の結合分子。
【請求項９１】
前記第１の抗原が、ＣＤ２０であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項７２に記載の結合分子。
【請求項９２】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項９１に記載の結合分子。
【請求項９３】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項９１に記載の結合分子。
【請求項９４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド各々が、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、前記第３のポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、前記第４のポリペプチドが、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、請求項９１に記載の結合分子。
【請求項９５】
前記第１の抗原が、ＥＧＦＲであり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項７２に記載の結合分子。
【請求項９６】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項９５に記載の結合分子。
【請求項９７】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項９５に記載の結合分子。
【請求項９８】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド各々が、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、前記第３のポリペプチドが、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、前記第４のポリペプチドが、配列番号３８のアミノ酸配列を有する、請求項９５に記載の結合分子。
【請求項９９】
１つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、結合分子を作製する方法であって、
前記１つまたは複数のベクターが、
（ａ）各々が抗体軽鎖である第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとをコードする第１の核酸と、
（ｂ）第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第２の核酸と、
（ｃ）第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第３の核酸と
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成することができる、
方法。
【請求項１００】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記抗体ヒンジ領域が、ＩｇＧヒンジ領域である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ１サブタイプのものである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ２サブタイプのものである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ３サブタイプのものである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ４サブタイプのものである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、異なる抗原に結合する、請求項１００〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、同じ抗原に結合する、請求項１００〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、同じ抗原の同じエピトープに結合する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、同じ抗原の異なるエピトープに結合する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原結合ドメインを形成し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原結合ドメインである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、同じ抗原に結合する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記第２の抗原結合ドメインが、前記第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも１つと同じエピトープに結合する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原に結合し、前記第２の抗原結合ドメインが、第２の抗原に結合する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記第１の抗原が、がん抗原である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記第１の抗原が、がん抗原でない、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
第２の抗原が、リンパ球および単球からなる群から選択される免疫細胞上に発現される、請求項１１６に記載の結合分子。
【請求項１２０】
前記第２の抗原が、エフェクター細胞上に発現される、請求項１１６に記載の結合分子。
【請求項１２１】
前記第２の抗原が、Ｔ細胞上に発現される、請求項１１９に記載の結合分子。
【請求項１２２】
前記第２の抗原が、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される、請求項１２１に記載の結合分子。
【請求項１２３】
前記第２の抗原が、ヘルパーＴ細胞上に発現される、請求項１２２に記載の結合分子。
【請求項１２４】
前記第２の抗原が、調節性Ｔ細胞上に発現される、請求項１２２に記載の結合分子。
【請求項１２５】
前記第２の抗原が、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される、請求項１２２に記載の結合分子。
【請求項１２６】
前記第２の抗原が、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される、請求項１２１に記載の結合分子。
【請求項１２７】
前記第２の抗原が、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される、請求項１２１に記載の結合分子。
【請求項１２８】
前記第２の抗原が、細胞外ドメインを含む、請求項１１９に記載の結合分子。
【請求項１２９】
前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１３０】
前記第１の抗原が、がん抗原であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１３１】
前記第１の抗原が、ＰＤ−Ｌ１であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号８のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド各々が、配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記第３のポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記第４のポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記第１の核酸が、配列番号２２のヌクレオチド配列を有し、前記第２の核酸が、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、前記第３の核酸が、配列番号２１のヌクレオチド配列を有する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３６】
前記第１の抗原が、ＣＤ２０であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３７】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド各々が、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、前記第３のポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、前記第４のポリペプチドが、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第１の核酸が、配列番号３６のヌクレオチド配列を有し、前記第２の核酸が、配列番号３４のヌクレオチド配列を有し、前記第３の核酸が、配列番号３５のヌクレオチド配列を有する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４１】
前記第１の抗原が、ＥＧＦＲであり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１４２】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
各Ｆａｂ領域の前記第１の部分の前記ＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、
各Ｆａｂ領域の前記第２の部分の前記ＶＬ領域が、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、
請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド各々が、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、前記第３のポリペプチドが、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、前記第４のポリペプチドが、配列番号３８のアミノ酸配列を有する、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４５】
前記第１の核酸が、配列番号５０のヌクレオチド配列を有し、前記第２の核酸が、配列番号４８のヌクレオチド配列を有し、前記第３の核酸が、配列番号４９のヌクレオチド配列を有する、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４６】
請求項１〜９８のいずれか一項に記載の結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１４７】
対象における疾患または状態の処置に使用するための、請求項１４６に記載の医薬組成物。
【請求項１４８】
前記疾患または状態が、がんである、請求項１４７に記載の医薬組成物。
【請求項１４９】
前記がんが、肺がんである、請求項１４８に記載の医薬組成物。
【請求項１５０】
前記肺がんが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１４９に記載の医薬組成物。
【請求項１５１】
前記がんが、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である、請求項１４８に記載の医薬組成物。
【請求項１５２】
前記疾患または状態が、ＰＤ−Ｌ１陽性がんである、請求項１４７に記載の医薬組成物。
【請求項１５３】
対象における疾患または状態を処置する方法であって、請求項１〜９８のいずれか一項に記載の結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１５４】
前記疾患または状態が、がんである、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５５】
前記がんが、肺がんである、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５６】
前記肺がんが、ＮＳＣＬＣである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記がんが、ＤＬＢＣＬである、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５８】
前記疾患または状態が、ＰＤ−Ｌ１陽性がんである、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５９】
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
結合分子。
【請求項１６０】
結合分子を作製する方法であって、
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
ものである、こと；および
（ｉｉ）前記結合分子を精製すること
を含む方法。
【請求項１６１】
結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
医薬組成物。
【請求項１６２】
対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
方法。
【請求項１６３】
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む、第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合し、前記Ｆｖ領域が、表面抗原分類３（ＣＤ３）に結合する、
結合分子。
【請求項１６４】
結合分子を作製する方法であって、
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、各々のポリペプチドが抗体軽鎖を含む、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
ものである、こと；および
（ｉｉ）前記結合分子を精製すること
を含む方法。
【請求項１６５】
結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
医薬組成物。
【請求項１６６】
対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
方法。
【請求項１６７】
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０または上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
結合分子。
【請求項１６８】
結合分子を作製する方法であって、
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
ものである、こと；および
（ｉｉ）前記結合分子を精製すること
を含む方法。
【請求項１６９】
結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
医薬組成物。
【請求項１７０】
対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１８年４月１０日に出願した米国特許仮出願第６２／６５５，７６２号および２０１８年８月１７日に出願した米国特許仮出願第６２／７１９，４８４号からの優先権の利益を主張するものである。本願は、さらに、２０１９年４月１日に出願した米国特許出願第１６／３７２，１７２号、２０１９年４月１日に出願した米国特許出願第１６／３７２，１９０号、および２０１９年４月１日に出願した米国特許出願第１６／３７２，１９６号からの優先権の利益を主張するものである。上述の出願の各々は、それら全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本願には、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出したＡＳＣＩＩテキスト書式でのコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表が参照により組み込まれる。１４４８９−００４−２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔと題するＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出した前記配列表テキストファイルは、２０１９年４月２日に作成したものであり、サイズ１４０，８６２バイトである。
【０００３】
技術分野
本開示は、一般に、細胞エンゲージ結合分子（ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、前記結合分子を作製する方法、前記結合分子を含む組成物、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗体および／または抗体に基づく薬剤は、今や、多種多様な疾患および障害に対する治療の選択肢である。現在、米国および／または欧州連合において少なくとも７０の抗体が承認されており、多数の新たな分子が前臨床研究および臨床試験中である。しかし、研究および臨床コミュニティ内では、新たな、より良好で、より安全な治療剤の探索が続いている。
【０００５】
天然に存在する抗体は、単一特異性であり、１つのエピトープまたは抗原に結合する。多重特異性抗体は、複数の抗体の特異性を併せ持ち、異なる抗原またはエピトープに結合する能力を有する。しかし、多くの技術的障害が、多重特異性抗体の開発を阻んできた。それ故、治療薬として承認されている多重特異性抗体は殆どない。したがって、より良好な多重特異性抗体、および機能的かつ安定な多重特異性抗体を効率的に産生する方法が、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は一部分において、複数の結合ドメインを有する細胞エンゲージ結合分子、前記結合分子を作製する方法、および前記結合分子を含む医薬組成物を提供する。前記結合分子を投与することを含む処置の方法も本明細書で提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、細胞エンゲージ結合分子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ（ＶＨ）ｒｅｇｉｏｎ）と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｈｅａｖｙ  １（ＣＨ１）ｒｅｇｉｏｎ）と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ（ＶＬ）ｒｅｇｉｏｎ）とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
細胞結合分子が、提供される。
【０００８】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｈｅａｖｙ  ３（ＣＨ３）ｒｅｇｉｏｎ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００１０】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００１１】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００１２】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００１３】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、結合分子が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、融合によってＦｖ領域に連結されている。
【００１４】
一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域である。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジ領域からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列の２つのタンデムコピーを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、第１の抗原の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、第２の抗原は、免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、免疫細胞は、リンパ球および単球からなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫細胞は、エフェクター細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、顆粒細胞、自然リンパ系細胞、巨核球、単球、骨髄系由来サプレッサー細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、がん抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。一部の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３またはＴＮＦアルファである。一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、がん抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される。
【００１８】
別の態様では、結合分子を製造する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子を作製する方法であって、
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
ものである、こと；および
（ｉｉ）前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
【００１９】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００２０】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００２１】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００２２】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００２３】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００２４】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に形成された鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される。
【００２６】
さらに別の態様では、結合分子を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
医薬組成物が、提供される。
【００２７】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００２８】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００２９】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００３０】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００３１】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００３２】
さらに別の態様では、結合分子を投与することを含む、疾患または状態を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
方法が、提供される。
【００３３】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００３４】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００３５】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００３６】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００３８】
一態様では、細胞エンゲージ結合分子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合し、前記Ｆｖ領域が、表面抗原分類３（ＣＤ３）に結合する、
結合分子が、提供される。
【００３９】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００４０】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００４１】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００４２】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００４４】
一部の実施形態では、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
結合分子が、提供される。
【００４５】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、融合によってＦｖ領域に連結されている。
【００４６】
一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域である。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジ領域からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧのアミノ酸配列を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
【００４９】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号９５のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドは、配列番号９６のアミノ酸配列を含み、前記第４のポリペプチドは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号９５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号９８のアミノ酸配列を有し、前記第４のポリペプチドは、配列番号９９のアミノ酸配列を有する。
【００５２】
別の態様では、結合分子を製造する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子を作製する方法であって、
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、各々のポリペプチドが抗体軽鎖を含む、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
ものである、こと；および
（ｉｉ）前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
【００５３】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００５４】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００５５】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００５６】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００５７】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００５８】
一部の実施形態では、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
方法が、提供される。
【００５９】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域である。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧのアミノ酸配列を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、
第１および第２のＦａｂ領域の各々のＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、
第１および第２のＦａｂ領域の各々のＶＬ領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、
Ｆｖ領域のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
Ｆｖ領域のＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
【００６２】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号３のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００６３】
さらに別の態様では、結合分子を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
医薬組成物が、提供される。
【００６４】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００６５】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００６６】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００６７】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００６８】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００６９】
さらに別の態様では、結合分子を投与することを含む、疾患または状態を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
方法が、提供される。
【００７０】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００７１】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００７２】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００７３】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００７４】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００７５】
一態様では、細胞エンゲージ結合分子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０または上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
結合分子が、提供される。
【００７６】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００７７】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００７８】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００７９】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００８０】
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００８１】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、ＣＤ２０に結合し、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。
【００８３】
一部の実施形態では、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
【００８４】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【００８５】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、ＥＧＦＲに結合し、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【００８６】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。
【００８７】
一部の実施形態では、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
【００８８】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。
【００８９】
別の態様では、結合分子を製造する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子を作製する方法であって、
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
ものである、こと；および
（ｉｉ）前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
【００９０】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００９１】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【００９２】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【００９３】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【００９４】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【００９５】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、ＣＤ２０に結合し、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。
【００９７】
一部の実施形態では、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
【００９８】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【００９９】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、ＣＤ２０に結合し、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１００】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
【０１０２】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
さらに別の態様では、結合分子を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
医薬組成物が、提供される。
【０１０４】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【０１０５】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【０１０９】
さらに別の態様では、結合分子を投与することを含む、疾患または状態を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
方法が、提供される。
【０１１０】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域をさらに含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＡＢＳをさらに含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドは、第２のＶＨ領域のＣ末端側に定常重鎖３（ＣＨ３）領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第４のポリペプチドは、ＶＬ領域のＣ末端側にＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの両方は、それぞれ、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ３領域およびＡＢＳをさらに含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第３のポリペプチドおよび／または第４のポリペプチドは、それぞれ、第２のＶＨ領域および／またはＶＬ領域のＣ末端側に、ＣＨ１領域とＡＢＳの両方をさらに含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、ＡＢＳをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端側にＡＢＳをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第１および／または第２のポリペプチドは、抗体軽鎖のＣ末端にＡＢＳをさらに含む。
【０１１５】
本開示は一部分において、複数の結合ドメインを有する細胞エンゲージ結合分子を提供する。一態様では、
（ａ）２つの抗体Ｆａｂ領域を含み、各々が、
（ｉ）抗体可変重鎖（ＶＨ）領域と抗体ＣＨ１領域とを含む第１の部分であって、抗体ＣＨ２領域および抗体ＣＨ３領域を含有しない第１の部分と、
（ｉｉ）抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域と抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む抗体軽鎖（ＬＣ）を含む第２の部分と
を含み、前記２つの抗体Ｆａｂ領域各々が抗原に結合する、
第１の抗体結合ドメインと、
（ｂ）ＶＨ領域と抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む抗体Ｆｖ領域を含む第２の抗原結合ドメインと
を含む結合分子であって、
前記第２の抗原結合ドメインが、免疫細胞上に存在する抗原に結合し；
前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインが連結されている、
結合分子が、本明細書で提供される。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインの各Ｆａｂ領域の第１の部分および第２の部分は、同じポリペプチド上にある。一部の実施形態では、少なくとも１つのＦａｂ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されている：ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＬ。他の実施形態では、少なくとも１つのＦａｂ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されている：ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＨ１。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分および第２の部分は、別々のポリペプチド上に存在する。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、Ｆｖ領域のＶＨ領域およびＶＬ領域は、同じポリペプチド上にある。一部の実施形態では、Ｆｖ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されている：ＶＨ−ＶＬ。他の実施形態では、Ｆｖ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されている：ＶＬ−ＶＨ。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、Ｆｖ領域のＶＨ領域およびＶＬ領域は、別々のポリペプチド上にある。
【０１２０】
一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインは、柔軟なペプチド領域により連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、ＩｇＧヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ２サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ３サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ４サブタイプのものである。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、追加のアミノ酸を含む。例えば、一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第２の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆｖ領域のＶＨ領域に連結されている第１のＣＨ３領域と、Ｆｖ領域のＶＬ領域に連結されている第２のＣＨ３領域とをさらに含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、結合分子は、１つまたは複数のアルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＢＳは、Ｆｖ領域のＶＨ領域のＣ末端に連結されている。他の実施形態では、ＡＢＳは、Ｆｖ領域のＶＬ領域のＣ末端に連結されている。さらに他の実施形態では、Ｆｖ領域のＶＬおよびＶＨ領域の各々のＣ末端は、ＡＢＳに連結されている。他の実施形態では、ＡＢＳは、Ｆａｂ領域のうちの少なくとも１つのＣＬ領域に連結されている。さらに他の実施形態では、結合分子は、１つまたは複数のアルブミンドメインをさらに含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、２つのＦａｂ領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、２つのＦａｂ領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、２つのＦａｂ領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、２つのＦａｂ領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
【０１２５】
一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも１つと同じエピトープに結合する。
【０１２６】
他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の抗原に結合する。
【０１２７】
一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原でない。
【０１２８】
一部の実施形態では、第２の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｂ細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、ＮＫ細胞上に発現される。
【０１２９】
一部の実施形態では、第２の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、調節性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞外ドメインを含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、同じＣＤＲアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、異なるＣＤＲアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、同じＣＤＲアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、異なるＣＤＲアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、同じＣＤＲアミノ酸配列を含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、同じＣＤＲアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、同じＣＤＲアミノ酸配列を含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、異なるＣＤＲアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、異なるＣＤＲアミノ酸配列を含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、同じＣＤＲアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、異なるＣＤＲアミノ酸配列を含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、異なるＣＤＲアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
一部の特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１３３】
一部のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１３４】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１３６】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２０であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１３７】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１３９】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＥＧＦＲであり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１４０】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１４２】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｈｅｒ２であり、第２の抗原は、ＴＮＦアルファである。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。
【０１４３】
別の態様では、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成する、
結合分子が、本明細書で提供される。
【０１４４】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、ＩｇＧヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ２サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ３サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ４サブタイプのものである。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第２の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、第１の抗原結合ドメインを形成し、Ｆｖ領域は、第２の抗原結合ドメインを形成する。
【０１４７】
一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも１つと同じエピトープに結合する。
【０１４８】
他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の抗原に結合する。
【０１４９】
一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原でない。
【０１５０】
一部の実施形態では、第２の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｂ細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、ＮＫ細胞上に発現される。
【０１５１】
一部の実施形態では、第２の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、調節性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞外ドメインを含む。
【０１５２】
一部の特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１５３】
一部のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１５４】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１５６】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号３のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記第４のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【０１５７】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２０であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１５８】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１６０】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【０１６１】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＥＧＦＲであり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１６２】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１６３】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１６４】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。
【０１６５】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｈｅｒ２であり、第２の抗原は、ＴＮＦアルファである。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。
【０１６６】
さらに別の態様では、本明細書で提供される結合分子を作製する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、結合分子を作製する方法であって、
前記１つまたは複数のベクターが、
（ａ）各々が抗体軽鎖である第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとをコードする第１の核酸と、
（ｂ）第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第２の核酸と、
（ｃ）第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第３の核酸と
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成することができる、
方法が、本明細書で提供される。
【０１６７】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、ＩｇＧヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ２サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ３サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ４サブタイプのものである。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第２の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、第１の抗原結合ドメインを形成し、Ｆｖ領域は、第２の抗原結合ドメインを形成する。
【０１７０】
一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも１つと同じエピトープに結合する。
【０１７１】
他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の抗原に結合する。
【０１７２】
一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原でない。
【０１７３】
一部の実施形態では、第２の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｂ細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、ＮＫ細胞上に発現される。
【０１７４】
一部の実施形態では、第２の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、調節性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞外ドメインを含む。
【０１７５】
一部の特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１７６】
一部のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１７７】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１７９】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号３のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【０１８０】
一部の実施形態では、第１の核酸は、配列番号２２のヌクレオチド配列を有し、第２の核酸は、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、第３の核酸は、配列番号２１のヌクレオチド配列を有する。
【０１８１】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２０であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１８２】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１８４】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【０１８５】
一部の実施形態では、第１の核酸は、配列番号３６のヌクレオチド配列を有し、第２の核酸は、配列番号３４のヌクレオチド配列を有し、第３の核酸は、配列番号３５のヌクレオチド配列を有する。
【０１８６】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＥＧＦＲであり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０１８７】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０１８９】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々は、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。
【０１９０】
一部の実施形態では、第１の核酸は、配列番号５０のヌクレオチド配列を有し、第２の核酸は、配列番号４８のヌクレオチド配列を有し、第３の核酸は、配列番号４９のヌクレオチド配列を有する。
【０１９１】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｈｅｒ２であり、第２の抗原は、ＴＮＦアルファである。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。
【０１９２】
さらに別の態様では、本明細書で提供される結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象における疾患または状態の処置に使用するためのものである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。他の実施形態では、疾患または状態は、ＰＤ−Ｌ１陽性がんである。
【０１９３】
さらに別の態様では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書で提供される結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。他の実施形態では、疾患または状態は、ＰＤ−Ｌ１陽性がんである。
【０１９４】
本開示の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の選択肢集団によって記載されている場合、本開示は、挙げられている群全体を総じて包含するばかりでなく、個々に群の各構成員も包含し、主群の全ての可能なサブグループも包含し、群の構成員の１つまたは複数が非存在である主群も包含する。本開示は、特許請求の範囲に記載の開示における群構成員のいずれかの１つまたは複数の明示的除外も想定している。
【０１９５】
例示的実施形態
１．（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
結合分子。
２．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、実施形態１の結合分子。
３．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、融合によってＦｖ領域に連結されている、実施形態２の結合分子。
４．柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態２の結合分子。
５．抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域である、実施形態４の結合分子。
６．抗体ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジ領域からなる群から選択される、実施形態５の結合分子。
７．抗体ヒンジ領域が、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態４の結合分子。
８．柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態４の結合分子。
９．リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態８の結合分子。
１０．リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列の２つのタンデムコピーを含む、実施形態９の結合分子。
１１．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、第１の抗原の同じエピトープに結合する、実施形態１の結合分子。
１２．第２の抗原が、免疫細胞上に発現される、実施形態１の結合分子。
１３．免疫細胞が、リンパ球および単球からなる群から選択される、実施形態１２の結合分子。
１４．免疫細胞が、エフェクター細胞である、実施形態１２の結合分子。
１５．免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、顆粒細胞、自然リンパ系細胞、巨核球、単球、骨髄系由来サプレッサー細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、実施形態１２の結合分子。
１６．第１の抗原が、がん抗原である、実施形態１の結合分子。
１７．がん抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である、実施形態１６の結合分子。
１８．第１の抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される、実施形態１の結合分子。
１９．第２の抗原が、ＣＤ３またはＴＮＦアルファである、実施形態１２の結合分子。
２０．第１の抗原が、がん抗原であり、第２の抗原が、ＣＤ３である、実施形態１６の結合分子。
２１．がん抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される、実施形態２０の結合分子。
２２．以下のことを含む、結合分子を作製する方法：
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
ものである、こと；および
２３．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、実施形態２２の方法。
２４．抗体ヒンジ領域が、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に形成された鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態２３の方法。
２５．柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態２３の方法。
２６．リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態２５の方法。
２７．第１の抗原が、がん抗原であり、第２の抗原が、ＣＤ３である、実施形態２２の方法。
２８．第１の抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される、実施形態２２の方法。
２９．結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
医薬組成物。
３０．対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原に結合し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原に結合し、前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、
方法。
３１．（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合し、前記Ｆｖ領域が、表面抗原分類３（ＣＤ３）に結合する、
結合分子。
３２．（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｂ）第３のペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
実施形態３１の結合分子。
３３．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、実施形態３２の結合分子。
３４．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、融合によってＦｖ領域に連結されている、実施形態３３の結合分子。
３５．柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態３３の結合分子。
３６．抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域である、実施形態３５の結合分子。
３７．抗体ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジ領域からなる群から選択される、実施形態３６の結合分子。
３８．抗体ヒンジ領域が、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態３５の結合分子。
３９．柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態３５の結合分子。
４０．リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態３９の結合分子。
４１．リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む、実施形態４０の結合分子。
４２．リンカーが、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧのアミノ酸配列を含む、実施形態４０の結合分子。
４３．（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
実施形態３２の結合分子。
４４．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々が、配列番号３のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態３２の結合分子。
４５．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々が、配列番号９５のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号９６のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチドが、配列番号９７のアミノ酸配列を含む、実施形態３２の結合分子。
４６．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々が、配列番号９５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドが、配列番号９８のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドが、配列番号９９のアミノ酸配列を有する、実施形態３２の結合分子。
４７．結合分子を作製する方法であって、
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、各々のポリペプチドが抗体軽鎖を含む、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
ものである、こと；および
（ｉｉ）前記結合分子を精製すること
を含む方法。
４８．（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
実施形態４７の方法。
４９．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、実施形態４８の方法。
５０．柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態４９の方法。
５１．抗体ヒンジ領域が、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態５０の方法。
５２．抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ヒンジ領域である、実施形態５０の方法。
５３．柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態２０の方法。
５４．リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む、実施形態５３の方法。
５５．リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む、実施形態５４の方法。
５６．リンカーが、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧのアミノ酸配列を含む、実施形態５４の方法。
５７．第１および第２のＦａｂ領域の各々のＶＨ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、
第１および第２のＦａｂ領域の各々のＶＬ領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、
Ｆｖ領域のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
Ｆｖ領域のＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
実施形態４８の方法。
５８．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々が、配列番号３のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、実施形態４８に記載の方法。
５９．結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
医薬組成物。
６０．対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
方法。
６１．（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０または上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
結合分子。
６２．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、ＣＤ２０に結合し、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
実施形態６１の結合分子。
６３．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、実施形態６２の結合分子。
６４．柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態６３の結合分子。
６５．抗体ヒンジ領域が、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態６４の結合分子。
６６．柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態６４の結合分子。
６７．（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
実施形態６２の結合分子。
６８．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々が、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドが、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、実施形態６２の結合分子。
６９．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、ＥＧＦＲに結合し、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
実施形態６１の結合分子。
７０．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、実施形態６９の結合分子。
７１．柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態７０の結合分子。
７２．抗体ヒンジ領域が、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態７１の結合分子。
７３．柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態７０の結合分子。
７４．（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
実施形態６９の結合分子。
７５．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々が、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドが、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドが、配列番号３８のアミノ酸配列を有する、実施形態６９の結合分子。
７６．結合分子を作製する方法であって、
（ｉ）宿主細胞において１つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記１つまたは複数のベクターは、
（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸であって、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第１の核酸および第２の核酸と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し、
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
ものである、こと；および
（ｉｉ）前記結合分子を精製すること
を含む方法。
７７．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、ＣＤ２０に結合し、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
実施形態７６の方法。
７８．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、実施形態７７の方法。
７９．柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態７８の結合分子。
８０．柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態７９の結合分子。
８１．（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
実施形態７７の方法。
８２．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々が、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドが、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、請求項７７に記載の方法。
８３．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、ＣＤ２０に結合し、
（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
実施形態８７の方法。
８４．第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、実施形態８３の方法。
８５．柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態８４の方法。
８６．柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態８５の方法。
８７．（ａ）第１および第２のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、
（ｂ）第３のポリペプチドにおいて、第１のＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、第２のＶＨ領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第４のポリペプチドにおいて、第３のＶＨ領域が、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
実施形態８３の方法。
８８．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド各々が、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドが、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドが、配列番号３８のアミノ酸配列を有する、請求項８３に記載の方法。
８９．結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
医薬組成物。
９０．対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第１の可変重鎖（ＶＨ）領域と第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に向かって順番に第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域と可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成し；
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域各々が、ＣＤ２０またはＥＧＦＲに結合し、前記Ｆｖ領域が、ＣＤ３に結合する、
方法。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１Ａは、本明細書で提供される結合分子（ＡＬｉＣＥ）を例示する。図１Ｂは、ＣＨ３領域を含有する、本明細書で提供される例示的結合分子を例示する。図１Ｃは、アルブミン結合部位（ＡＢＳ）を含有する、本明細書で提供される例示的結合分子を例示する。図１Ｄは、がん抗原を標的化する結合ドメインを有する本明細書で提供される例示的結合分子を例示し、本明細書で提供される可動性ペプチド領域のための例示的選択肢も例示する。図１Ｅは、がん抗原を標的化する結合ドメインおよびＣＤ３標的化をする結合ドメインを有する本明細書で提供される例示的結合分子を例示する。
【図２】図２Ａは、ＡＣＥ−００のアセンブリーパターンを例示する。「ＢｉＰ」は、露出されているＡＣＥ−００のＣＨ１またはＶＨドメインに結合する結合免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｂｉｎ）タンパク質（ＢｉＰ）を例示する。図２Ｂは、ＡＣＥ−００のアセンブリーパターンを同定するために実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。矢印は、還元条件下での「ＡＣＥ−００＋軽鎖」試料中のＡＣＥ−００−ＶＬのバンドならびに「ＡＣＥ−００−ＶＨ＋ＡＣＥ−００−ＶＬ＋軽鎖」試料中のＡＣＥ−００−ＶＨおよびＡＣＥ−００−ＶＬの２つのバンドを示す。図２Ｃは、アダリムマブの野生型重鎖（ＨＣ）、ＣＨ１−切断型重鎖（ΔＣＨ１）およびＶＨ−ＣＨ１−切断型重鎖（ΔＶＨ−ＣＨ１）の同時免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）結果を示す。図２Ｄは、ＢｉＰが重鎖のＶＨおよび／またはＣＨ１ドメインとの相互作用によって重鎖のアセンブリーおよび分泌を制御できることを例示する。「ＥＲＡＤ」は、小胞体関連タンパク質分解を表す。図２Ｅは、抗体アセンブリーへの抗体ＶＨドメインの寄与およびＡＣＥ−００分子の適切なアセンブリーへのＡＣＥ−００−ＶＨ鎖の寄与を例示する。「Ｘ」はアセンブリーしないことを表す；「Ｏ」はアセンブリーすることを表す。図２Ｆは、ＡＣＥ−００の構造を例示する。図２Ｇは、Ｈｉｔｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を使用するＡＣＥ−００およびＡＣＥ−００−ＶＬ２タンパク質についての親和性クロマトグラフィーの結果を示す。図２Ｈは、ＡＣＥ−００−ＶＬ２とＡＣＥ−００との間の分子サイズ区別を同定するために実施されたキャピラリー電気泳動の結果を示す。図２Ｉは、ＡＣＥ−００およびＡＣＥ−００−ＶＬ２分子のコンホメーションを示すキャピラリー電気泳動の結果を示す。実線矢印は、ＡＣＥ−００の結果を示す；破線矢印は、ＡＣＥ−００−ＶＬ２の結果を示す。図２Ｊは、ＡＣＥ−００−ＶＨ鎖とＡＣＥ−００−ＶＬ鎖との間のヘテロ二量体化を実証するために実施されたキャピラリー等電点電気泳動の結果を示す。図２Ｋは、ＡＣＥ−００のアセンブリーパターンを同定するために実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびキャピラリー電気泳動の結果を示す。「Ｒ」は還元を表す；「ＮＲ」は非還元を表す。図２Ｌは、ＡＣＥ−００のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。
【図３】図３は、ＡＣＥ−０２、ＡＣＥ−０２−ＶＬ２、ＡＣＥ−０３、ＡＣＥ−０３−ＶＬ２、ＡＣＥ−００およびＡＣＥ−０１の発現およびアセンブリーを同定するために実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ［還元（左）および非還元（右）条件下］の結果を示す。ＡＣＥ−０２はヒト化１２Ｆ６（ｈ１２Ｆ６、抗ＣＤ３抗体）として第２の抗原を含有し、ＡＣＥ−０３は、ヒト化ＯＫＴ３（ｈＯＫＴ３、抗ＣＤ３抗体）として第２の抗原を含有する。矢印は非還元条件下でのアセンブルしたＡＣＥ−０２、ＡＣＥ−０３およびＡＣＥ−０３−ＶＬ２のバンドをそれぞれ示す。
【図４】図４Ａは、ＡＣＥ−０４の構造を例示する。「Ａ」は、抗ＰＤ−Ｌ１を指す。ＵＣＨＴ１は、抗ＣＤ３抗体である。図４Ｂは、ＡＣＥ−０５の構造を例示する。「Ａ」は、抗ＰＤ−Ｌ１を指す。ＯＫＴ３は抗ＣＤ３抗体である。図４Ｃは、ＡＣＥ−０４、ＡＣＥ−０４−ＶＬ２、ＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０５−ＶＬ２のアセンブリーパターンを同定するために実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。矢印は、還元および非還元条件下でのＡＣＥ−０４およびＡＣＥ−０５のバンドを示す。図４Ｄは、ＡＣＥ−０５のアセンブリーパターン（上）を同定するために実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ＡＣＥ−０５アセンブリー（下）における可能な制御機構を例示する。図４Ｅ〜４Ｆは、ＡＣＥ−０５のコンホメーションおよび、ＡＣＥ−０５−ＶＨとＡＣＥ−０５−ＶＬ鎖との間のヘテロ二量体化効率を同定するために実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびキャピラリー電気泳動の結果を示す。「Ｍ」はマーカーを表す；「Ｒ」は還元を表す；「ＮＲ」は非還元を表す；「ＩＮ」はインプットを表す；「ＦＴ」は素通りを表す；「Ｗ」は洗浄を表す；「Ｅｌｕ．」は溶出を表す。図４Ｇは、ＡＣＥ−０５の純度を同定するために実施されたサイズ排除クロマトグラフィーを示す。図４Ｈは、ＡＣＥ−０５のゲル濾過分析のためのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。図４Ｉは、ＡＣＥ−０５の構造コンホメーションを同定するために実施された陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）の結果を示す。
【図５】図５は、ＡＣＥ−０９およびＡＣＥ−０５のアセンブリーパターンを同定するために３７℃および３２℃（上）で実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ＡＣＥ−０９およびＡＣＥ−０５の特性を要約している（下）。上の図において「ＡＣＥ−０５」と表示されたレーンは、ＡＣＥ−０５の結果を示している；他のレーンは、ＡＣＥ−０９の結果を示している；「Ｒ」は還元を表す；「Ｎ．Ｒ」は「非還元」を表す；「ＩＰ」はインプットを表す；「Ｆ．Ｔ」は素通りを表す；「Ｗ」は洗浄を表す；「ＯＰ」はアウトプットを表す。
【図６】図６Ａは、ＡＣＥ−１０の構造を例示する。図６Ｂ〜６Ｃは、ＡＣＥ−１０分子［還元（左）および非還元（右）条件下］の発現およびアセンブリー分析を示す。図６Ｂでは、矢印は、還元および非還元条件下でのＡＣＥ−１０のバンドを示す。「ＡＣＥ−１０透析」は、透析されたＤＮＡを用いたトランスフェクションを介して生成されたＡＣＥ−１０を表す。図６Ｃでは、抗Ｋａｐｐａ条件からの結果における矢印は、非還元条件下のＡＣＥ−１０−ＶＬ／ＡＣＥ−１０−ＬＣ二量体およびＡＣＥ−１０−ＶＨ／ＡＣＥ−１０−ＬＣ二量体複合体を示し；抗ＣＨ１条件からの結果における矢印は、非還元条件下でアセンブルしたＡＣＥ−１０を示す。
【図７】図７Ａは、ＡＣＥ−１１の構造を例示する。図７Ｂは、ＡＣＥ−１１およびＡＣＥ−１１−ＶＬ２の発現およびアセンブリーパターンを同定するために実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す［クーマシーブルー染色（左）およびウエスタンブロット（右）による分析］。「Ｍ」はマーカーを表す。矢印は非還元条件下でアセンブルしたＡＣＥ−１１のバンドを示す。
【図８】図８はＡＣＥ−１２、ＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０９のアセンブリーパターンを同定するために実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。矢印はウエスタンブロットにおいて抗Ｋａｐｐａ（左）および抗ＣＨ１（右）抗体を使用した非還元条件下でのＡＣＥ−０５−ＶＨ＋ＬＣ二量体およびＡＣＥ−０５−ＶＬ＋ＬＣ二量体のバンドを示す。
【図９】図９は、ＡＣＥ−００およびＡＣＥ−００−ＶＬ２のＴＮＦアルファへの親和性を決定するための酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＥＬＩＳＡを使用したＰＤ−Ｌ１（１０Ａ）およびＣＤ３（１０Ｂ〜１０Ｃ）へのＡＣＥ−０５の結合親和性の分析を示す。
【図１１】図１１は、ＥＬＩＳＡを使用したＣＤ３へのＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０９の結合親和性の分析を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用するＰＤ−Ｌ１（１２Ａ、１２Ｃ）およびＣＤ３（１２Ｂ、１２Ｃ）へのＡＣＥ−０５の結合動態の分析を示す。図１２Ｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用するＰＤ−Ｌ１およびＣＤ３に同時に結合するＡＣＥ−０５の動態分析を示す。
【図１３】図１３Ａは、ＨＥＫ２９３Ｅ−ＰＤ−Ｌ１細胞および親ＨＥＫ２９３Ｅ細胞でのＰＤ−Ｌ１発現レベル（右パネル）ならびに種々のＣＤ３抗体によって測定されたジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞でのＣＤ３発現レベル（左パネル）を示す。図１３Ｂ〜１３Ｅは、ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５についてのＴ細胞再方向付け（活性）アッセイの結果を示す。図１３Ｆは、さまざまなＴ細胞ステージにおけるＡＣＥ−０５、ＢｉＴＥ−０５またはＹＢＬ−００７の存在下でのＴ細胞活性化を示す。図１３Ｇ〜１３Ｈは、ＡＣＥ−０５についてのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイの結果を示す。図１３Ｉ〜１３Ｊは、ＡＣＥ−０５、ＢｉＴＥ−０５、ＵＣＨＴ１（抗ＣＤ３抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡから）またはＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡから）によるＴ細胞活性化を示す。図１３Ｋは、ＡＣＥ−０５媒介Ｔ細胞細胞傷害性を決定するためのＴ細胞細胞傷害性アッセイの結果を示す。図１３Ｌは、ＡＣＥ−０５、ＢｉＴＥ−０５、ＹＢＬ−００７またはＵＣＨＴ１によって媒介されるＴ細胞細胞傷害性の結果を示す。「ＩｇＧ」は、陰性対照として使用される正常ヒトＩｇＧを表す。図１３Ｍは、ＡＣＥ−０５またはＹＢＬ−００７の存在下でＰＢＭＣ細胞と直接接触した場合の腫瘍細胞でのＴ細胞細胞傷害性を示す。矢印は、標的ＨＣＣ８２７がん細胞を示す。図１３Ｎは、同時培養されたＰＢＭＣおよびＨＣＣ８２７細胞におけるＡＣＥ−０５、ＢｉＴＥ−０５またはＹＢＬ−００７の存在下でのＩＬ−２およびＩＮＦ−γレベルを示す。「ＩｇＧ」は、陰性対照として使用された正常ヒトＩｇＧを表す。図１３Ｏは、ＡＣＥ−０５、ＢｉＴＥ−０５、ＹＢＬ−００７およびＵＣＨＴ１の熱力学的安定性結果を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＡＣＥ−１０媒介Ｔ細胞活性化を決定するために実施されたＴ細胞再方向付けアッセイの結果を示す。「ｈＩｇＧ」は、対照として使用された正常ヒトＩｇＧを表す。
【図１５】図１５は、ＡＣＥ−１１媒介Ｔ細胞細胞傷害性を決定するためのＴ細胞細胞傷害性アッセイの結果を示す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、スプラーグドーリー（ＳＤ）ラットにおけるＡＣＥ−０５薬物動態研究の結果を示す。
【図１７】図１７Ａは、ヒト化マウスモデルにおけるＨＣＣ８２７（ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍）異種移植研究の結果を示す。図１７Ｂは、ＰＢＭＣドナーＡおよびドナーＢにおけるＡＣＥ−０５および他の被験物質の抗腫瘍効果を示す。図１７Ｃは、ドナーＡおよびドナーＢの体重変化を示す。図１７Ｄは、個々の抗腫瘍有効性応答を示す。図１７Ｅは、個々の体重減少（％）（副作用）を示す。図１７Ｆは、ＢｉＴＥとＡＣＥ−０５との抗腫瘍有効性の比較、ならびに親ＰＤ−Ｌ１抗体とＡＣＥ−０５との比較を示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｄは、ＨＣＣ８２７（ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍）異種移植片を接種されたヒト化マウスモデルでの、ＰＢＭＣドナーＡおよびドナーＢにおいてＡＣＥ−０５および他の被験物質の抗腫瘍効果を示す用量制限研究の結果を示す。図１８Ａは、ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５についての抗腫瘍有効性の用量応答を示す。図１８Ｂおよび図１８Ｃは、ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５について、各用量群における個々の（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）マウスの抗腫瘍有効性をそれぞれ示す。図１８Ｄは、ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５処置群の個体体重減少（副作用）（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１９７】
本開示は、複数の結合ドメインを有する新規細胞エンゲージ結合分子を提供する。これらの結合分子は、本明細書において、「抗体様細胞エンゲージャー」（ＡＬｉＣＥ）と呼ばれる。本明細書で提供されるＡＬｉＣＥ分子は、２つの抗原結合ドメインを有する。第１の抗原結合ドメインは、２つのＦａｂ領域を有する。第２の抗原結合ドメインは、Ｆｖ領域を有する。通常のＡＬｉＣＥ分子は、図１Ａに表されている。一般的に、このような分子では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ領域を含み、第２の抗原結合ドメインは、一般的に、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが、天然抗体構造において一般的に位置するであろう位置で、第１の抗原結合ドメインに付着される（直接的または間接的に）。例えば、示される実施形態では、重鎖のＣ末端は、ＣＨ２ドメインではなくＶＨドメインを含み、第２の重鎖のＣ末端は、ドメインではなくＶＬドメインを含む。
【０１９８】
本明細書で開示される結合分子は、従来の抗体および既存の多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を上回る多数の利点を提供する。本明細書で提供される結合分子は、その複数の抗原結合ドメインおよび全体的な立体配置設計のために、複数の細胞を互いに近づける細胞エンゲージャーとして使用できる。例えば、第１の抗原結合ドメインは、第１の細胞上に発現される抗原と結合でき、第２の抗原結合ドメインは、第２の細胞上に発現される抗原と結合でき、それによって、２つの細胞を互いに近づける。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、エンゲージされる細胞（ｅｎｇａｇｅｄ  ｃｅｌｌｓ）の１種は、免疫細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞である。これらの実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、免疫細胞を方向付け、活性化するために特に有用である。例えば、ある特定の実施形態では、ＡＬｉＣＥ分子の二価Ｆａｂ部分が、従来の抗体の機能性を保持しながら、第２のＦｃを欠く一価抗原結合領域（すなわち、Ｆｖ領域）が、免疫系のエフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を認識し、エンゲージし（ｅｎｇａｇｅ）、再度方向付け、および／または活性化できる。例えば、以下の実施例の節において実証されるように、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ３ドメインから構成されるＡＬｉＣＥ分子であるＡＣＥ−０５は、ＰＤ−Ｌ１依存性（媒介性）Ｔ細胞活性化ならびにＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１遮断有効性の両方に対して相乗効果を示す。
【０２００】
ある特定の実施形態では、十分に機能的なＦｃ領域がないことまたは完全ＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域がないことは、ある特定の望ましくないＦｃ媒介性エフェクター細胞傷害性を無効にするかまたは低減する。ある特定の実施形態では、Ｆｖ部分のＶＨ鎖とＶＬ鎖の間の天然相互作用が、人工的な操作によって望ましくない免疫原性を付与することなくＡＬｉＣＥ分子のヘテロ二量体化を促進する。
【０２０１】
本明細書で提示される薬物動態（ＰＫ）研究は、ＡＬｉＣＥ分子の、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）またはＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）などのその他の形態よりも高い安定性を示す（Campagne O. et al. Integrated Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Model of a Bispecific CD3xCD123 DART Molecule in Nonhuman Primates: Evaluation of Activity and Impact of Immunogenicity. Clin Cancer Res. 2018 Jun 1;24(11):2631-2641; Moore P. A. et al. Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma. Blood. 2011 Apr 28;117(17):4542-51; Moore P. A. et al. Development of MGD007, a gpA33 x CD3-Bispecific DART Protein for T-Cell Immunotherapy of Metastatic Colorectal Cancer. Mol Cancer Ther. 2018 Aug;17(8):1761-1772; Yuraszeck T. et al. Translation and Clinical Development of Bispecific T-cell Engaging Antibodies for Cancer Treatment. Clin Pharmacol Ther. 2017 May;101(5):634-645．これらの各々は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、例示的ＡＬｉＣＥ分子のインビボ有効性研究は、有意な抗がん効果を示す。これらの結果は、ＡＬｉＣＥが、例えば、がん療法のための抗体工学における有利なプラットフォーム技術であることを実証する。
【０２０２】
Ｉ．定義
本明細書で記載または参照される技術および手順は、当業者によって、一般的に十分に理解されているものおよび／または従来の方法論、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010);およびAntibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Duebel eds., 2d ed. 2010)に記載される広く利用される方法論を使用して一般に使用されるものを含む。
【０２０３】
本明細書において別に定義されない限り、本記載において使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書を解釈するという目的のために、以下の用語の説明は、適当な場合には常に当てはまり、単数形で使用される用語はまた、複数を含み、逆もまた同様である。示される用語の任意の説明が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する事象では、以下に示される用語の説明が支配するものとする。
【０２０４】
用語「結合分子」とは、標的または抗原と、適宜、結合部分が、結合タンパク質のポリペプチド、断片またはエピトープとの結合を促進するコンホメーションをとることを可能にするスキャフォールドまたはフレームワーク部分（例えば、１つまたは複数のスキャフォールドまたはフレームワーク領域）と結合する部分（例えば、１つまたは複数の結合領域、例えば、ＣＤＲ）とを含むタンパク質を指す。本開示との関連で、結合分子は、例えば、解離定数（ＫＤ）が≦１０−７Ｍである場合に、抗原と特異的に結合する、または選択的に結合すると言われる。一部の実施形態では、結合分子は、約１０−７Ｍ〜約１０−１２ＭのＫＤで抗原と特異的に結合し得る。ある特定の実施形態では、結合分子は、ＫＤが≦１０−８ＭであるかまたはＫＤが≦１０−９Ｍである場合に、高親和性で抗原と特異的に結合し得る。一実施形態では、結合分子は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）によって測定されるような１×１０−９Ｍ〜１０×１０−９ＭのＫＤで精製ヒト抗原と特異的に結合し得る。さらに別の実施形態では、結合分子は、０．１×１０−９Ｍ〜１０×１０−９ＭのＫＤで、細胞上に発現されたヒト抗原と特異的に結合する。ある特定の実施形態では、結合分子は、約０．１×１０−９Ｍ、約０．５×１０−９Ｍ、約１×１０−９Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０×１０−９Ｍまたはそれらの任意の範囲もしくは間隔で、細胞上に発現されたヒト抗原と特異的に結合する。用語「結合分子」は、抗体および抗体に由来する分子を含む。
【０２０５】
用語「抗体」、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、本明細書において同義的に使用され、最も広い意味で使用され、例えば、以下に記載されるような、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長または無傷のモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープまたはモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナルまたは一価抗体、多価抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、所望の生物活性を示す限りの二重特異性抗体）、一本鎖抗体およびその断片を具体的に対象とする。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラおよび／または親和性成熟された抗体ならびにその他の種、例えば、マウスおよびウサギなどに由来する抗体であり得る。用語「抗体」は、特定の分子抗原と結合でき、ポリペプチド鎖の２つの同一対から構成されるポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のＢ細胞のポリペプチド産物を含むものとし、各対は、１つの重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）と、１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖の各アミノ末端部分は、約１００〜約１３０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。例えば、Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995); および Kuby, Immunology (3d ed. 1997)を参照されたい。特定の実施形態では、特定の分子抗原には、ポリペプチドまたはエピトープを含む本明細書で提供される抗体が結合し得る。抗体はまた、それだけには限らないが、合成抗体、組換えによって産生された抗体、ラクダ化抗体、細胞内抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体および断片が由来した抗体の結合活性の一部またはすべてを保持する抗体重鎖または軽鎖ポリペプチドの一部を指す上記のいずれかの機能性断片（例えば、抗原結合性断片）も含む。機能性断片（例えば、抗原結合性断片）の限定されない例として、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびミニボディーが挙げられる。特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原結合ドメインまたは抗原と結合する抗原結合部位を含有する分子（例えば、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ）を含む。このような抗体断片は、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995); Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224; Plueckthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515;およびDay, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990）において見出すことができる。本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであり得る。抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体であり得る。
【０２０６】
「抗原」は、抗体が選択的に結合できる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたはその他の天然に存在する化合物もしくは合成化合物であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、抗原は、細胞と関連している、例えば、細胞、例えば、免疫細胞上またはその中に存在する。
【０２０７】
用語「抗原結合性断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」および同様の用語とは、抗原と相互作用し、結合物質に、抗原（例えば、ＣＤＲ）に対するその特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含む結合分子のその部分を指す。
【０２０８】
用語「結合する」または「結合」とは、例えば、複合体を形成することを含む、分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用および／またはファンデルワールス相互作用をはじめとする非共有結合性相互作用であり得る。複合体はまた、共有結合性または非共有結合性結合、相互作用または力によって持ち寄られた２種またはそれより多い分子の結合を含み得る。抗体上の単一抗原結合部位と標的分子、例えば、抗原の単一エピトープの間の総非共有結合性相互作用の力は、抗体または機能性断片のそのエピトープに対する親和性である。結合分子（例えば、抗体）の一価抗原との会合速度（ｋｏｎ）に対する解離速度（ｋｏｆｆ）の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、解離定数ＫＤであり、これは、親和性に対して逆相関する。ＫＤ値が低いほど、抗体の親和性は高い。ＫＤの値は、抗体および抗原の種々の複合体に対して変わり、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの両方に応じて変わる。本明細書で提供される抗体の解離定数ＫＤは、本明細書で提供される任意の方法または当業者に周知の任意の他の方法を使用して決定できる。ある結合部位での親和性は、抗体および抗原の間の相互作用の真の力を常に反映するわけではない。複数の反復抗原決定基を含有する複合抗原、例えば、多価抗原が、複数の結合部位を含有する抗体と接触すると、ある部位での抗体の抗原との相互作用が、第２の部位での反応の可能性を増大する。多価抗体と抗原の間のこのような複数の相互作用の力は、結合力と呼ばれる。
【０２０９】
本明細書に記載される結合分子に関連して、「と結合する」、「と特異的に結合する」などの用語および類似の用語はまた、本明細書において同義的に使用され、抗原、例えば、ポリペプチドと特異的に結合する抗原結合ドメインの結合分子を指す。抗原と結合するかまたは特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、関連抗原と交差反応性であり得る。ある特定の実施形態では、抗原と結合するかまたは特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、他の抗原と交差反応しない。抗原と結合するかまたは特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）または当業者に公知のその他の技術によって同定できる。結合分子または抗原結合ドメインは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を使用して決定されるような、任意の交差反応性抗原とよりも高親和性で抗原と結合する場合に、抗原と結合するかまたは特異的に結合する。通常、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍となり、バックグラウンドの１０倍超であり得る。例えば、結合特異性に関する考察については、Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed.、2d ed. 1989)を参照されたい。ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインの「非標的」タンパク質との結合の程度は、例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）解析またはＲＩＡによって決定されるような、結合分子または抗原結合ドメインのその特定の標的抗原との結合の約１０％未満である。「特異的結合」、「と特異的に結合する」または「に対して特異的である」などの用語に関して、非特異的相互作用とは測定可能に異なっている結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般的に、結合活性を有さない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定できる。例えば、特異的結合は、標的に対して同様である対照分子、例えば、過剰の非標識標的との競合によって決定できる。この場合には、特異的結合は、標識標的のプローブとの結合が、過剰の非標識標的によって競合的に阻害される場合に示される。抗原と結合する結合分子または抗原結合ドメインは、結合分子が、例えば、抗原の標的化において診断薬として有用であるような十分な親和性で抗原と結合可能であるものを含む。ある特定の実施形態では、抗原と結合する結合分子または抗原結合ドメインは、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭまたは０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、異なる種に由来する抗原の間（例えば、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）種の間）で保存される抗原のエピトープと結合する。
【０２１０】
「結合親和性」とは、一般的に、分子（例えば、抗体などの結合タンパク質）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合性相互作用の合計の力を指す。別に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。用語「Ｂｍａｘ」とは、実験結果から推定された最大結合親和性を指す。Ｂｍａｘは、当技術分野で公知の曲線フィッティング法、例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア７において提供される曲線フィッティングを使用して算出できる。結合分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定できる。低親和性抗体は、一般的に、抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般的に、抗原と迅速に結合し、長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定するさまざまな方法は当技術分野で公知であり、そのいずれも、本開示の目的のために使用できる。特定の例示的実施形態として、以下が挙げられる。一実施形態では、「ＫＤ」または「ＫＤ値」は、当技術分野で公知のアッセイによって、例えば、結合アッセイによって測定してもよい。ＫＤは、例えば、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて実施されるＲＩＡにおいて測定してもよい（Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293:865-81）。ＫＤまたはＫＤ値はまた、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫ３８４システムを使用するＯｃｔｅｔ（登録商標）による、もしくは例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ−２０００もしくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ−３０００を使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用することによって測定してもよい。「結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」はまた、同じバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫ３８４、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ−２０００もしくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ−３０００システムを使用する上記の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて決定してもよい。
【０２１１】
本明細書において使用される、用語「還元性」とは、例えば、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）の添加によって、タンパク質内の鎖間または鎖内ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）橋が変性または還元され、その結果、複数のポリペプチド鎖をもたらす状態を指す。本明細書において使用される用語「非還元性」とは、タンパク質内の鎖間または鎖内ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）橋が、変性剤または還元剤、例えば、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）の非存在下で無傷のままである状態を指す。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同であり、鎖（複数可）の残部が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」配列ならびにそれらが所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片を含み得る（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55を参照されたい）。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、天然ＣＤＲ残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の対応するＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（例えば、レシピエント抗体）を含むキメラ抗体である非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態の部分を含み得る。一部の例では、ヒト免疫グロブリンの１つまたは複数のＦＲ領域残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、またはドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに規定するために行われる。ヒト化抗体重鎖または軽鎖は、少なくとも１つまたは複数の可変領域の実質的にすべてを含むことができ、ＣＤＲのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Jones et al., 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-29; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89;米国特許第６，８００，７３８号、同６，７１９，９７１号、同６，６３９，０５５号、同６，４０７，２１３号および同６，０５４，２９７号を参照されたい。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」の部分を含むことができ、この用語は、本明細書において同義的に使用され、ヒト可変領域、例えば、ヒト定常領域を含む抗体を指す。特定の実施形態では、この用語は、ヒト起源の可変領域および定常領域を含む抗体を指す。「完全ヒト」抗体はまた、ある特定の実施形態では、ポリペプチドと結合し、ヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞変異体である核酸配列によってコードされる抗体も包含し得る。用語「完全ヒト抗体」は、Ｋａｂａｔらによって記載されるようなヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変および定常領域を有する抗体を含む（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）。「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される、および／またはヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製されている抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に排除する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581）および酵母ディスプレイライブラリー（Chao et al.、2006、Nature Protocols 1: 755-68）を含む当技術分野で公知の種々の技術を使用して産生することができる。また、ヒトモノクローナル抗体の調製のために、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147(1):86-95;およびvan Dijk and van de Winkel, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74に記載される方法は利用可能である。ヒト抗体は、抗原を、抗原投与に応じてこのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物、例えば、マウスに投与することによって調製できる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する、Jakobovits, 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66; Brueggemann and Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58;および米国特許第６，０７５，１８１号および同６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体に関するLi et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62も参照されたい。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「組換えヒト抗体」の部分を含むことができ、この語句は、組換え手段によって調製、発現、作出または単離されるヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックの、および／または導入染色体を有する動物（例えば、マウスまたはウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：６２８７−６２９５を参照されたい）またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製、発現、作出または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有し得る（Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）。しかし、ある特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）に付され、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在しない可能性がある配列である。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「モノクローナル抗体」の部分を含むことができ、この用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、例えば、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性ある天然に存在する突然変異を除いて同一であり、各モノクローナル抗体は、通常、抗原上の単一エピトープを認識する。特定の実施形態では、「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、単一ハイブリドーマまたは他の細胞によって産生される抗体である。用語「モノクローナル」は、抗体を作製するための任意の特定の方法に制限されない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., 1975, Nature 256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ方法論によって調製でき、または細菌もしくは真核生物動物もしくは植物細胞において組換えＤＮＡ法を使用して作製できる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., 1991, Nature 352:624-28およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97に記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離できる。クローン細胞株を調製する、およびそれによって発現されるモノクローナル抗体を調製するその他の方法は、当技術分野で周知である。例えば、Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5th ed. 2002)を参照されたい。
【０２１７】
通常の４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同じ重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合には、４鎖ユニットは、一般的に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、一方で、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結している。各ＨおよびＬ鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く、αおよびγ鎖の各々について３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμおよびεアイソタイプについて４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＬ）と、それに続く、その他の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨとアラインされ、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬの対合は、単一抗原結合部位を一緒に形成する。種々のクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al. eds., 8th ed. 1994);およびImmunobiology (Janeway et al. eds., 5th ed. 2001)を参照されたい。
【０２１８】
用語「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、抗原と結合する抗体領域を指す。従来のＩｇＧは、普通、２つのＦａｂ領域を含み、各々は、Ｙ型ＩｇＧ構造の２つのアームのうち一方上に存在する。各Ｆａｂ領域は、通常、重鎖および軽鎖の各々の１つの可変領域および１つの定常領域から構成される。より詳しくは、Ｆａｂ領域中の重鎖の可変領域および定常領域は、ＶＨおよびＣＨ１領域であり、Ｆａｂ領域中の軽鎖の可変領域および定常領域は、ＶＬおよびＣＬ領域である。Ｆａｂ領域中のＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬは、本開示に従って抗原結合能を付与するために種々の方法で配置され得る。例えば、従来のＩｇＧのＦａｂ領域と同様に、ＶＨおよびＣＨ１領域は、１つのポリペプチド上にあってもよく、ＶＬおよびＣＬ領域は、別個のポリペプチド上にあってもよい。あるいは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ領域は、すべて同じポリペプチド上にあり、以下の節により詳細に記載されるような種々の順序で配列されてもよい。
【０２１９】
用語「可変領域」、「可変ドメイン」、「Ｖ領域」または「Ｖドメイン」とは、一般的に、軽鎖または重鎖のアミノ末端に位置し、重鎖では約１２０〜１３０個のアミノ酸および軽鎖では約１００〜１１０個のアミノ酸の長さを有し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と呼ばれることがある。用語「可変」とは、可変領域のある特定のセグメントが、抗体間で配列において広範に異なるという事実を指す。Ｖ領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、可変性は、可変領域の１１０個のアミノ酸スパン中で均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各約９〜１２個のアミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる、より多い可変性（例えば、極度の可変性）のより短い領域によってわけられた、約１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、あまり可変ではない（例えば、比較的不変の）ストレッチからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、各々、βシート構造をつなぐ、一部の場合には、その一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によってつながれた、大部分はβシート立体配置をとる４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって、互いに近接するように保持され、他の鎖に由来する超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)を参照されたい）。定常領域は、抗体の抗原との結合において直接的に関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）における抗体の酸化を示す。可変領域は、異なる抗体間で配列において広範に異なる。特定の実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。
【０２２０】
用語「Ｋａｂａｔによる可変領域残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにおけるようなアミノ酸位置番号付け」およびその変形は、Ｋａｂａｔら、前掲において抗体の編集の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のために使用された番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮または挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有する場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、残基５２の後に単一アミノ酸挿入部分（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および残基８２の後に３個の挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準」のＫａｂａｔ番号付けされた配列との抗体の配列の相同性の領域でのアラインメントによって所与の抗体について決定され得る。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般的に、可変ドメイン中の残基（およそ、軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）に言及する場合に使用される（例えば、Kabat et al.、前掲）。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を参照する場合に使用される（例えば、Kabat et al.、前掲において報告されたＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。その他の番号付けシステムは、例えば、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴおよびＡＨｏｎによって記載されている。
【０２２１】
「無傷の」抗体は、抗原結合部位ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常領域は、ヒト定常領域またはそのアミノ酸配列変異体を含み得る。ある特定の実施形態では、無傷の抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【０２２２】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、例えば、無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例として、制限するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディーおよびジダイアボディー（ｄｉ−ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6444-48; Lu et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:19665-72; Hudson et al., 2003, Nat. Med. 9:129-34、ＷＯ９３／１１１６１および米国特許第５，８３７，２４２号および同６，４９２，１２３号を参照されたい）、一本鎖抗体分子（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、同５，２６０，２０３号、同５，４８２，８５８号および同５，４７６，７８６号を参照されたい）、二重可変ドメイン抗体（例えば、米国特許第７，６１２，１８１号を参照されたい）、単一可変ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101; および Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49を参照されたい）ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【０２２３】
用語「重鎖」は、抗体に関連して使用される場合、約５０〜７０ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分は、約１２０〜１３０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる５つの別個の種類（例えば、アイソタイプ）のうちの１つであり得る。別個の重鎖は、大きさが異なる：α、δおよびγは、およそ４５０個のアミノ酸を含有するのに対し、μおよびεは、およそ５５０個のアミノ酸を含有する。重鎖のこれらの別個の種類は、軽鎖と組み合わされると、抗体の５つの周知のクラス（例えば、アイソタイプ）、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを生じさせ、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。
【０２２４】
用語「軽鎖」とは、抗体に関連して使用される場合、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分は、約１００〜約１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。軽鎖のおよその長さは、２１１〜２１７個のアミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの別個の種類がある。
【０２２５】
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、同義的に使用される。「ＣＤＲ」とは、免疫グロブリン（Ｉｇまたは抗体）ＶＨ  βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｈ１、Ｈ２またはＨ３）のうちの１つまたは抗体ＶＬ  βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｌ１、Ｌ２またはＬ３）のうちの１つを指す。したがって、ＣＤＲは、フレームワーク領域配列内で散在する可変領域配列である。
【０２２６】
ＣＤＲ領域は、当業者にとって周知であり、周知の番号付けシステムによって規定されている。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づいており、最もよく使用される（例えば、Kabat et al.、前掲を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造的ループの位置を指す（例えば、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、Ｋａｂａｔ番号付け慣習を使用して番号付けされた場合、ループの長さに応じてＨ３２からＨ３４の間で変わる（これがＫａｂａｔ番号付けスキームがＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入部分を位置づける理由であり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合には、ループは３２で終了し、３５Ａのみが存在する場合には、ループは、３３で終了し、３５Ａおよび３５Ｂの両方が存在する場合には、ループは、３４で終了する）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの間の妥協点を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（例えば、Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and Duebel eds., 2d ed. 2010)を参照されたい）によって使用されている。「接触」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づいている。開発され、広く採用されている別のユニバーサル番号付けシステムとして、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  （ＩＭＧＴ）  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Lafranc et al., 2003、Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77）がある。ＩＭＧＴは、ヒトおよび他の脊椎動物の免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に特化した総合情報システムである。本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列および軽鎖または重鎖内の位置の両方の点で言及される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」は、種間で保存されており、ループと呼ばれる構造中に存在するので、構造的特徴に従って可変ドメイン配列をアラインする番号付けシステムを使用することによって、ＣＤＲおよびフレームワーク残基は容易に同定される。この情報は、ある種の免疫グロブリンに由来するＣＤＲ残基の、通常、ヒト抗体に由来するアクセプターフレームワークへのグラフトおよび置換において、使用できる。さらなる番号付けシステム（ＡＨｏｎ）が、Honegger and Plueckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70によって開発されている。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けおよびＩＭＧＴ特有番号付けシステムをはじめとする番号付けシステム間の対応関係は、当業者に周知である（例えば、Kabat、前掲；Chothia and Lesk、前掲；Martin、前掲；Lefranc et al.、前掲を参照されたい）。これらの超可変領域またはＣＤＲの各々に由来する残基を以下に記載する。
【０２２７】
表１：超可変領域またはＣＤＲの残基
【表１】
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【０２２８】
所与のＣＤＲの境界は、同定に使用されるスキームに応じて変わり得る。したがって、特に断りのない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、可変領域ならびに抗体またはその領域の個々のＣＤＲ（例えば、「ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２）の、用語「ＣＤＲ」および「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、本明細書において上記の公知のスキームのいずれかによって定義されるような相補性決定領域を包含すると理解されなくてはならない。一部の例では、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＣｏｎｔａｃｔ法によって定義されるようなＣＤＲなど、特定のＣＤＲ（単数または複数）を同定するスキームは指定されている。その他の場合には、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列は、示されている。
【０２２９】
超可変領域は、以下のような「伸長された超可変領域」を含み得る：ＶＬでは、２４〜３６または２４−〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）およびＶＨでは、２６〜３５または２６〜３５Ａ（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）および９３〜１０２、９４〜１０２または９５〜１０２（Ｈ３）。
【０２３０】
用語「定常領域」または「定常ドメイン」とは、抗体の抗原との結合に直接的に関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体との相互作用を示す、軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、免疫グロブリンの他の部分、抗原結合部位を含有する可変領域と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域ならびに軽鎖のＣＬ領域を含有し得る。
【０２３１】
用語「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、ＣＤＲの両端に位置する可変領域残基を指す。ＦＲ残基は、例えば、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディー、線形抗体および二重特異性抗体中に存在する。ＦＲ残基は、超可変領域残基またはＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【０２３２】
本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、例えば、天然配列Ｆｃ領域、組換えＦｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端へ延びると定義されることも多い。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）が、例えば、抗体の製造または精製の際に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって除去されることもある。したがって、無傷の抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団ならびにＫ４４７残基を有するおよび有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」として、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などが挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般的に、Ｆｃ領域が、結合領域または結合ドメイン（例えば、抗体可変領域またはドメイン）と組み合わされることを必要とし、当業者に公知の種々のアッセイを使用して評価され得る。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、付加または欠失）によって、天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中の、約１〜約１０個のアミノ酸置換または約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書において、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と、および／もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性を、またはそれらと少なくとも約９０％の相同性を、例えば、それらと少なくとも約９５％の相同性を有し得る。
【０２３３】
ポリペプチド「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」とは、膜貫通および細胞質ドメインを本質的に含まないポリペプチドの形態または部分を指す。例えば、ＥＣＤは、このような膜貫通および／または細胞質ドメインの１％未満を有することがあり、このようなドメインの０．５％未満を有する場合もある。
【０２３４】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、当技術分野の用語であり、結合分子（例えば、抗体）が特異的に結合し得る、抗原の局在化領域を指す。エピトープは、線形エピトープまたはコンホメーション、非線形もしくは不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合には、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続アミノ酸（「線形」エピトープ）であり得る、またはエピトープは、ポリペプチドの２つまたはそれより多い非連続領域に由来するアミノ酸を含み得る（「コンホメーション」、「非線形」または「不連続」エピトープ）。一般に、線形エピトープは、二次、三次または四次構造に依存する場合も、依存しない場合もあるということは、当業者によって理解される。例えば、一部の実施形態では、結合分子は、アミノ酸の群と、それらが天然三次元タンパク質構造にフォールディングされているか否かに関わらず結合する。他の実施形態では、結合分子は、エピトープを認識し、結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定のコンホメーション（例えば、屈曲、ねじれ、ターンまたはフォールディング）を示すことを必要とする。
【０２３５】
用語「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線形である場合も、分岐している場合もあり、修飾されたアミノ酸を含むこともあり、また、非アミノ酸によって中断されている場合もある。用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意のその他の操作もしくは修飾によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、それだけには限らないが、非天然アミノ酸を含む、１つまたは複数のアミノ酸の類似体ならびに当技術分野で公知のその他の修飾を含有するポリペプチドも定義内に含まれる。本開示のポリペプチドは、抗体または免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づいたものであり得るので、ある特定の実施形態では、「ポリペプチド」は、単一鎖として、または２つもしくはそれより多い会合した鎖として生じ得るということは理解される。
【０２３６】
用語「ベクター」とは、核酸配列を宿主細胞に導入するために、例えば、本明細書に記載されるような結合分子（例えば、抗体）をコードする核酸配列を含む核酸配列を保持するかまたは含むために使用される物質を指す。使用に適用可能なベクターとして、例えば、宿主細胞の染色体への安定組込みのために作動可能な選択配列またはマーカーを含み得る発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が挙げられる。したがって、ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および適当な発現制御配列を含み得る。含まれ得る選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質または毒素に対する耐性を提供し、栄養要求性の欠損を補完し、または培養培地中にない重大な栄養素を供給する。発現制御配列は、当技術分野で周知である、構成および誘導プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含むことができる。２種またはそれより多い核酸分子が同時発現される予定である場合には（例えば、抗体重鎖および軽鎖または抗体ＶＨおよびＶＬの両方）、両核酸分子を、例えば、単一発現ベクター中に、または別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクター発現のために、コードする核酸を１つの共通発現制御配列に作動可能に連結することができる、または異なる発現制御配列、例えば、１つの誘導プロモーターおよび１つの構成プロモーターに連結することができる。核酸分子の宿主細胞への導入は、当技術分野で周知の方法を使用して確認できる。このような方法として、例えば、核酸解析、例えば、ノーザンブロットまたはｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、遺伝子産物の発現のための免疫ブロット法または導入された核酸配列またはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の適した解析方法が挙げられる。核酸分子が目的生成物を産生するのに十分な量で発現されることは、当業者によって理解され、また、当技術分野で周知の方法を使用して、十分な発現を得るために、発現レベルを最適化できることがさらに理解される。
【０２３７】
用語「宿主」とは、本明細書で使用される場合、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。
【０２３８】
用語「宿主細胞」とは、本明細書で使用される場合、核酸分子を用いてトランスフェクトされ得る特定の対象細胞およびこのような細胞の後代または潜在的後代を指す。このような細胞の後代は、核酸分子を用いてトランスフェクトされた親細胞とは、その後の世代において起こり得る突然変異もしくは環境の影響または核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組込みのために同一ではない場合もある。
【０２３９】
「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡ配列ならびに天然配列に天然に付随するタンパク質またはリボソームおよびポリメラーゼなどの複合体から実質的に分離されている核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合核酸である。「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然供給源中に存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって産生される場合には、他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成される場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるような抗体をコードする１つまたは複数の核酸分子が、単離または精製される。用語は、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を包含し、組換えまたはクローニングされたＤＮＡ単離物および化学合成された類似体または異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離された形態を含み得る。
【０２４０】
本明細書において同義的に使用されるような「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、もしくは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、必ずしもそうではないが、一般的に、約２００ヌクレオチドよりも少ない長さの、短い、一般的に、一本鎖合成ポリヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、オリゴヌクレオチドに等しく、十分に適用可能である。本開示の結合分子を産生する細胞は、抗体をコードする核酸が導入されている、親のハイブリドーマ細胞ならびに細菌および真核生物宿主細胞を含み得る。別に明記されない限り、本明細書で開示される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写物の５’から５’末端であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写物の３’から３’末端であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【０２４１】
「担体」は、本明細書で使用される場合、使用される投与量および濃度で、それに曝露されている細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を含む。生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例として、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸をはじめとする抗酸化物質；低分子量（例えば、約１０個より少ないアミノ酸残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンをはじめとする単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。用語「担体」はまた、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全または不完全））、賦形剤または媒体を指すこともある。医薬品担体を含むこのような担体は、滅菌液体、例えば、水および石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む油であり得る。水は、組成物（例えば、医薬組成物）が静脈内に投与される場合には例示的担体である。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に、注射用溶液のための液体担体として使用できる。適した賦形剤（例えば、医薬品賦形剤）として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物もまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。製剤を含む経口組成物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどといった標準担体を含むことができる。適した医薬品担体の例は、Remington and Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)に記載されている。医薬品化合物を含む組成物は、結合分子（例えば、抗体）を、例えば、単離または精製された形態で、適した量の担体とともに含有し得る。
【０２４２】
用語「薬学的に許容される」とは、本明細書で使用される場合、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されることまたは米国薬局方、欧州薬局方もしくは動物において、より詳しくは、ヒトにおいて使用するための他の一般に認識されている薬局方に列挙されることを意味する。
【０２４３】
用語「有効量」とは、本明細書で使用される場合、所望のアウトカムをもたらすのに十分である、本明細書で提供される結合分子（例えば、抗体）または医薬組成物の量を指す。
【０２４４】
用語「対象」および「患者」は、同義的に使用され得る。本明細書で使用される場合、ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サルおよびヒト）である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、状態または障害を有すると診断された哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態では、対象は、状態または障害を発生するリスクにある、哺乳動物、例えば、ヒトである。
【０２４５】
「投与する」または「投与」とは、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内デリバリーおよび／または本明細書に記載される、もしくは当技術分野で公知の任意のその他の物理的デリバリー方法によって、物質を注入するまたはそうでなければ身体の外側に存在するので患者に物理的にデリバリーする行為を指す。
【０２４６】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」とは、１つまたは複数の療法の投与に起因する疾患または状態の進行、重症度および／または持続期間の低減または改善を指す。
【０２４７】
用語「約」および「およそ」とは、所与の値もしくは範囲の２０％内、１５％内、１０％内、９％内、８％内、７％内、６％内、５％内、４％内、３％内、２％内、１％内またはそれより少ないものを意味する。
【０２４８】
本開示および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別に明確に示されない限り、複数形を含む。
【０２４９】
実施形態が用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて本明細書に記載される場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」に関して記載される他の類似の実施形態も提供されると理解される。実施形態が、語句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を用いて本明細書に記載される場合に常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」に関して記載される他の類似の実施形態も提供されるということも理解される。
【０２５０】
用語「および／または」は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される場合、ＡおよびＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）ならびにＢ（単独）を含むものとする。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するものとする：Ａ、ＢおよびＣ、Ａ、ＢまたはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、ＡおよびＣ、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）およびＣ（単独）。
【０２５１】
ＩＩ．結合分子
複数の抗原結合ドメイン（例えば、２つの抗原結合ドメイン）を含む結合分子（ＡＬｉＣＥ）が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の複数の抗原結合ドメインは、細胞をエンゲージする、細胞を免疫細胞に互いに近づける、または免疫細胞を再度方向付けするために有用である。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、２つの抗原結合ドメインを含み、第１の抗原結合ドメインは、２つの抗体Ｆａｂ領域を含み、第２の抗原結合ドメインは、抗体Ｆｖ領域を含む。２つのＦａｂ領域の各々は、２つの部分：抗体可変重鎖（ＶＨ）領域および抗体ＣＨ１領域を有する第１の部分ならびに抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域および抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む抗体軽鎖（ＬＣ）を含む第２の部分を有する第２の部分を含有する。２つのＦａｂ領域の各々は、抗原と結合する。第２の抗原結合ドメイン中のＦｖ領域は、ＶＨ領域および抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む。２つのＦａｂ領域は、Ｆｖ領域に連結されている。
【０２５３】
したがって、一態様では、本開示は、
（ａ）２つの抗体Ｆａｂ領域を含み、各々が、
（ｉ）抗体重鎖可変（ＶＨ）領域と抗体ＣＨ１領域とを含む第１の部分であって、抗体ＣＨ２領域および抗体ＣＨ３領域を含有しない第１の部分と、
（ｉｉ）抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域と抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む抗体軽鎖（ＬＣ）を含む第２の部分と
を含み、
前記２つの抗体Ｆａｂ領域が各々抗原に結合する、第１の抗体結合ドメインと、
（ｂ）ＶＨ領域と抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む抗体Ｆｖ領域を含む第２の抗原結合ドメインと
を含む結合分子であって、
前記第２の抗原結合ドメインが、免疫細胞上に存在する抗原に結合し、
前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインが連結されている、
結合分子を提供する。
【０２５４】
Ｆａｂ領域（すなわち、抗原結合性断片）は、抗原と結合する抗体領域である。従来のＩｇＧは、普通、２つのＦａｂ領域を含み、各々、Ｙ型ＩｇＧ構造の２つのアームの一方上にある。各Ｆａｂ領域は、通常、重鎖および軽鎖の各々の１つの可変領域および１つの定常領域から構成される。より詳しくは、Ｆａｂ領域中の重鎖の可変領域および定常領域は、ＶＨおよびＣＨ１領域であり、Ｆａｂ領域中の軽鎖の可変領域および定常領域は、ＶＬおよびＣＬ領域である。Ｆａｂ領域中のＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬは、本開示に従って抗原結合能を付与するように種々の方法で配列できる。例えば、従来のＩｇＧのＦａｂ領域と同様に、ＶＨおよびＣＨ１領域は、１つのポリペプチド上にあってもよく、ＶＬおよびＣＬ領域は、別々のポリペプチド上にあってもよい。あるいは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ領域は、すべて同じポリペプチド上にあり、以下により詳細に記載されるように種々の順序で配列されてもよい。
【０２５５】
Ｆｖ領域は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む抗原結合領域である。Ｆｖ領域中のＶＨおよびＶＬ領域は、本開示に従って抗原結合能を付与するように種々の方法で配列できる。例えば、ＶＨおよびＶＬ領域は、同じまたは別々のポリペプチド上にあってもよい。ＶＨおよびＶＬ領域が同じポリペプチド上にある場合は、それらは以下により詳細に記載されるように種々の順序で配列されてもよい。
【０２５６】
上記の節Ｉにおいて説明されるように、用語「可変領域」とは、一般的に、軽鎖または重鎖のアミノ末端に位置し、重鎖では約１２０〜１３０個のアミノ酸および軽鎖では約１００〜１１０個のアミノ酸の長さを有し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される抗体の軽鎖または重鎖の部分を指す。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と呼ばれることがある。
【０２５７】
用語「定常領域」とは、抗体の抗原との結合に直接的に関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体との相互作用を示す、軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、免疫グロブリンの他の部分、抗原結合部位を含有する可変領域と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、抗原を破壊するために使用される機序を決定できる。抗体は、定常領域構造および免疫機能に基づいて５つの主要なクラス、ＩｇＭ、ＩｇＧ、Ｉｇａ、ＩｇＤおよびＩｇＥにわけられる。ＩｇＧは、γ重鎖を特徴とする免疫グロブリンのクラスである。それは、血漿において見出される免疫グロブリンの最も豊富なクラスである。軽鎖の定常領域は、「ＣＬ」と呼ばれる。複数の重鎖Ｃドメイン（ＣＨドメイン）は、アミノ末端からカルボキシ末端に番号付けられる、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３など。これらの抗体クラスの任意のＣＬおよびＣＨ１領域を、本開示において使用できる。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＬおよびＣＨ１領域は、ＩｇＧ種（例えば、ＩｇＧ１）のものである。本明細書で提供されるＦａｂ領域の代表的なＣＬ領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号５９）
本明細書で提供されるＦａｂ領域の代表的なＣＨ１領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV（配列番号６０）
【０２５８】
「第１の部分は、抗体ＣＨ２領域および抗体ＣＨ３領域を含有しない」という文言は、第１の部分は、完全抗体ＣＨ２領域または完全ＣＨ３領域を含有しないということを意味するように本明細書において使用される。しかし、この文言は、ＣＨ２領域および／またはＣＨ３領域の一部が第１の部分中に含まれる実施形態を排除しない。さらに、ある特定の実施形態では、完全ＣＨ２および／またはＣＨ３活性（例えば、エフェクター機能）を示さないＣＨ２および／またはＣＨ３変異体または末端切断も含まれ得る。Ｆｃ受容体結合アッセイまたはＡＤＣＣ活性アッセイまたはＦｃ領域関連機能を決定するための他の周知のアッセイなどのアッセイを、ＣＨ２および／またはＣＨ３活性（またはＦｃ領域活性）が十分に保持されているか否かを決定するために本明細書において使用できる。
【０２５９】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分および第２の部分は、別々のポリペプチド上に存在する。２つのＦａｂ領域の各々はまた、単一鎖Ｆａｂ領域であってもよい。したがって、他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインの両Ｆａｂ領域の第１の部分および第２の部分は、同じポリペプチド上にある。他の実施形態では、２つのＦａｂ領域のうち一方の第１の部分および第２の部分は、同じポリペプチド上にある。Ｆａｂ領域が単一鎖Ｆａｂである（すなわち、Ｆａｂ領域の第１の部分および第２の部分が同じポリペプチド上にある）それらの実施形態では、Ｆａｂ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されてもよい：ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＬ。あるいは、単一鎖Ｆａｂ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されてもよい：ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＨ１。
【０２６０】
同様に、ある特定の実施形態では、Ｆｖ領域のＶＨ領域およびＶＬ領域は、別々のポリペプチド上にある。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインのＦｖ領域は、単一鎖Ｆｖである（すなわち、Ｆｖ領域のＶＨ領域およびＶＬ領域は、同じポリペプチド上にある）。このような単一鎖Ｆｖ実施形態では、Ｆｖ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されてもよい：ＶＨ−ＶＬ、またはＮ末端からＣ末端に向かって次の順番で配列されてもよい：ＶＬ−ＶＨ。
【０２６１】
一部の特定の実施形態では、各Ｆａｂ領域の２つの部分は、別々のポリペプチド上にあり、Ｆｖ領域のＶＨおよびＶＬ領域もまた、別々のポリペプチド上にある。
【０２６２】
一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインは、柔軟なペプチド領域によって連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、ＩｇＧヒンジ領域である。本明細書で提供されるＩｇＧヒンジ領域は、種々のＩｇＧサブタイプの抗体ヒンジ領域から選択され得る。以下の表２には、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域中に含まれ得るコアヒンジ配列を有する例示的ＩｇＧサブタイプが列挙されている。
【０２６３】
表２：例示的ＩｇＧサブタイプ
【表２】
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【０２６４】
したがって、一部のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ２サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ３サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ４サブタイプのものである。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、追加のアミノ酸を含む。例えば、一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第２のＦｖ抗原結合ドメインの間にリンカー（例えば、Ｇ４Ｓ）をさらに含む。抗体ヒンジ領域と第２のＦｖドメインの間の柔軟なリンカーは、第２のＦｖドメインの結合親和性に影響を及ぼし得る。第２のＦｖドメインの結合親和性の改善は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含むエフェクター細胞）を標的細胞（例えば、がん細胞）へ再度方向付けする効率の増大につながり得る。ＡＬｉＣＥの第２のＦｖドメインのパラトープは、ＡＬｉＣＥの第１のＦａｂドメインによって構造的にマスクされているので、第２のＦｖドメインは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含むエフェクター細胞）上に提示される表面抗原と相互作用し、結合できるように屈曲する必要がある。したがって、立体障害を低減し、第２のＦｖドメインの免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含むエフェクター細胞）との結合を最適化するために、Ｇ４Ｓなどの柔軟なリンカーを抗体ヒンジ領域と第２のＦｖドメインの間に導入できる。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）１のアミノ酸配列を含む。一部のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）２のアミノ酸配列を含む。他のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３のアミノ酸配列を含む。さらに他のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４のアミノ酸配列を含む。種々の柔軟性を有するリンカーを設計および構築する他の方法は、例えば、各々その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Klein et al., Protein Engineering, Design & Selection, 2014, 27(10): 325-330, および DiGiammarino et al., Landes Bioscience, 2011, 3(5): 487-494により詳細に記載されている。
【０２６６】
本明細書で提供される結合分子は、ＣＨ３ドメインを含んでもよい。図１Ｂは、このような例示的結合分子を例示する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆｖ領域のＶＨ領域に連結されている第１のＣＨ３領域と、Ｆｖ領域のＶＬ領域に連結されている第２のＣＨ３領域とをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＨ領域は、Ｆｖ領域のＶＨおよびＶＬ領域のＣ末端に連結されている。ＣＨ３領域の存在は、本明細書で提供される結合分子のＦｃ受容体結合能を提供する。一部の実施形態では、Ｆｖ領域に連結されるＣＨ３領域は、ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）（ＫｉＨ）技術または静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）などの既存の技術を使用して、２つのＣＨ３領域間の会合を促進または強制するように操作される。例えば、ノブイントゥーホールは、隣接するα−へリックス間のアミノ酸側鎖のパッキングのためのモデルとして元々提案され、ヘテロ二量体化のために抗体重鎖二量体を操作するための有効な設計戦略であると後に実証された。手短には、このアプローチのある特定の実施形態では、「ノブ（ｋｎｏｂ）」変異体を、１つのＩｇＧ  ＣＨ３ドメイン中の小さいアミノ酸のより大きなものとの置換（例えば、ＴからＹへの置換）によって最初に得ることができる。ノブは、大きな残基の、より小さいものとの置換（例えば、ＹからＴへの置換）によって作出された別のＩｇＧ  ＣＨ３ドメイン中の「ホール（ｈｏｌｅ）」中に挿入するように設計された。ノブイントゥーホール技術は、例えば、各々その全文が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９６／０２７０１１、Ridgway et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621, および Merchant et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681においていくつかの実施例を用いて詳細に記載されている。２つのＣＨ３領域の間の会合を促進または強制するためにＣＨ３領域を修飾する他の周知の技術も、本開示において企図される。
【０２６７】
アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）は、生物学的製剤の血清半減期を増大するために使用されている。Dennis et al., The Journal of Biological Cheminstry, 2002, 277 (38): 35035-35043; Adams et al., MABS, 2016, 8(7): 1336-1346を参照されたい。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が利用されてきた。ＨＳＡは、血液において最も豊富なタンパク質であり、組織において広く分布しており、非急性機能を有する。それは、１９日の半減期（ｈａｌｆ  ｌｉｋｅ）を有する。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の半減期を増大するために、本明細書においてアルブミン（例えば、ＨＳＡ）を使用できる。アルブミン（Ａｌｕｍｉｎ）はいくつかの方法で使用できる。１つの例示的アプローチは、アルブミンドメイン（例えば、ＨＳＡ）を、遺伝子的にまたは化学的にのいずれかで本明細書で提供される結合分子に直接カップリングすることである。別の例示的アプローチは、アルブミン結合ドメインまたは部位（ＡＢＤまたはＡＢＳ）を使用することである。
【０２６８】
したがって、本明細書で提供される結合分子はまた、１つまたは複数のアルブミン結合ドメインまたはアルブミン結合部位（ＡＢＤまたはＡＢＳ）を含んでもよい。図１Ｃは、このような例示的結合分子を例示する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子のＡＢＳは、内因性アルブミンとの結合を媒介し、それによって、本明細書で提供される結合分子の半減期を延長することおよび／またはその治療効果を増強することを補助する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子のＡＢＳはまた、アルブミンとの非共有結合性会合を介して薬物動態を改善するのに役立ち得る。一部の実施形態では、ＡＢＳは、Ｆｖ領域のＶＨ領域のＣ末端に連結される。他の実施形態では、ＡＢＳは、Ｆｖ領域のＶＬ領域のＣ末端に連結される。さらに他の実施形態では、Ｆｖ領域のＶＬおよびＶＨ領域の各々のＣ末端は、ＡＢＳに連結される。他の実施形態では、ＡＢＳは、Ｆａｂ領域の少なくとも１つのＣＬ領域に連結される。
【０２６９】
ある特定の実施形態では、結合分子は、１つまたは複数のアルブミンドメイン（例えば、ＨＳＡ）をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、アルブミンドメインは、Ｆｖ領域のＶＨ領域のＣ末端に連結される。他の実施形態では、アルブミンドメインは、Ｆｖ領域のＶＬ領域のＣ末端に連結される。さらに他の実施形態では、Ｆｖ領域のＶＬおよびＶＨ領域の各々のＣ末端は、アルブミンドメインに連結される。他の実施形態では、アルブミンドメインは、Ｆａｂ領域の少なくとも１つのＣＬ領域に連結される。
【０２７０】
本明細書で提供される結合分子の２つのＦａｂ領域およびＦｖ領域は、各々抗原に結合する。一部の実施形態では、２つのＦａｂ領域は、異なる抗原に結合する。
【０２７１】
他の実施形態では、２つのＦａｂ領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、２つのＦａｂ領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、２つのＦａｂ領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
【０２７２】
２つのＦａｂ領域が、同じ抗原−第１の抗原に結合する場合には、第１の抗原は、Ｆｖ領域が結合する抗原（第２の抗原）と同じであってもよく、異なっていてもよい。したがって、一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じ抗原と結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも１つと同じエピトープに結合する。
【０２７３】
他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第１の抗原結合ドメインは第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の抗原に結合する。図１Ｅは、このようなＡＬｉＣＥ分子の例示を提供し、第１の抗原結合ドメイン（２つのＦａｂ領域）は、がん抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３のような抗原を介してＴ細胞などの免疫細胞に結合する。このようなＡＬｉＣＥ分子は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）をがん細胞にエンゲージでき、したがって、がん処置のための治療薬として使用できる。
【０２７４】
したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、（ａ）第１の抗原に対する結合親和性を提供する２つのＦａｂ領域（第１の抗原結合ドメイン中）および（ｂ）第２の抗原に対する結合親和性を提供するＦｖ領域（第２の抗原結合ドメイン中）を含む二重特異性結合分子である。第１の抗原結合ドメインは、ある細胞上の表面タンパク質の細胞外ドメインと結合でき、第２の抗原結合ドメインは、免疫細胞上の表面タンパク質の細胞外ドメインと結合でき、それによって、２種の細胞を互いに近づける。
【０２７５】
第１の抗原結合ドメイン（２つのＦａｂ領域を有する）は、がん細胞に結合できる。それは、非がん細胞にも結合できる。したがって、一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原（例えば、ＰＤ−Ｌ１）である。他の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原ではない。
【０２７６】
一部の実施形態では、第２の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｂ細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、ＮＫ細胞上に発現される。
【０２７７】
一部の実施形態では、第２の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、調節性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞外ドメインを含む。
【０２７８】
一部の特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０２７９】
一部のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０２８０】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０２８１】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０２８２】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２０であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０２８３】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０２８４】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０２８５】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＥＧＦＲであり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０２８６】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０２８７】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０２８８】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｈｅｒ２であり、第２の抗原は、ＴＮＦアルファである。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。
【０２８９】
一部の特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、Ｎ末端にあり、Ｎ末端の天然抗体構造を維持し、一方で、第２の抗原結合ドメインは、Ｃ末端にあり、両重鎖のＣ末端ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、それぞれ、単一ＶＨおよびＶＬドメインで各々置換されている。図１Ａは、このような例示的ＡＬｉＣＥ分子の例示である。より詳しくは、各Ｆａｂ領域の第１の部分および第２の部分は、別々のポリペプチド上にあり、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原に結合し、Ｆｖ領域のＶＨ領域およびＶＬ領域は、別々のポリペプチド上にあり、第２の抗原結合ドメインは、免疫細胞上に存在する第２の抗原に結合し、第１の抗原と第２の抗原は、異なる抗原である。
【０２９０】
したがって、特定の一実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、
（ａ）２つの抗体Ｆａｂ領域を含み、各々が、
（ｉ）抗体可変重鎖（ＶＨ）領域と抗体ＣＨ１領域とを含む第１の部分であって、抗体ＣＨ２領域および抗体ＣＨ３領域を含有しない第１の部分と、
（ｉｉ）抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域と抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む抗体軽鎖（ＬＣ）を含む第２の部分と
を含み、
前記第１の部分および第２の部分が、別々のポリペプチド上にあり、
第１の抗原に結合する、第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＶＨ領域と抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む抗体Ｆｖ領域を含む第２の抗原結合ドメインであって、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、別々のポリペプチド上にあり、免疫細胞上に存在する第２の抗原に結合する、第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１の抗原および第２の抗原は、異なる抗原である。
【０２９１】
一部の実施形態では、１つのＦａｂ領域の第１の部分およびＦｖ領域のＶＨ領域が、同じポリペプチド上にあり、他のＦａｂ領域の部分およびＦｖ領域のＶＬ領域が、同じポリペプチド上にある。したがって、一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、
（ａ）第１の抗体Ｆａｂ領域および第２の抗体Ｆａｂ領域を含み、各々が
（ｉ）抗体可変重鎖（ＶＨ）領域と抗体ＣＨ１領域とを含む第１の部分であって、抗体ＣＨ２領域および抗体ＣＨ３領域を含有しない第１の部分と、
（ｉｉ）抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域と抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む抗体軽鎖（ＬＣ）を含む第２の部分と
を含み、
第１の抗原に結合する、第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＶＨ領域および抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む抗体Ｆｖ領域を含み、免疫細胞上に存在する第２の抗原と結合する第、２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１の抗原および前記第２の抗原は、異なる抗原であり、
第１のＦａｂ領域の第１の部分およびＦｖ領域のＶＨ領域は、同じポリペプチド上にあり、第２のＦａｂ領域の第１の部分およびＦｖ領域のＶＬ領域は、同じポリペプチド上にある。
【０２９２】
一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原（例えば、ＰＤ−Ｌ１）である。他の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原ではない。
【０２９３】
一部の実施形態では、第２の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｂ細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、ＮＫ細胞上に発現される。
【０２９４】
一部の実施形態では、第２の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、調節性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞外ドメインを含む。
【０２９５】
一部の特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０２９６】
一部のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０２９７】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０２９８】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０２９９】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２０であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０３００】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０３０１】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０３０２】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＥＧＦＲであり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０３０３】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０３０４】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０３０５】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｈｅｒ２であり、第２の抗原は、ＴＮＦアルファである。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。
【０３０６】
別の態様では、本明細書で提供される結合分子は、４つのペプチド（２つの抗体軽鎖および２つの重鎖様鎖）を含み、その全体構造は、ＩｇＧのＦｃ領域がＦｖ領域と置換されている点を除いて伝統的なＩｇＧと同様である。この構造は、種々の特性を付与する変種を作製するためにさらに修飾され得る。より詳しくは、一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドと
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とは、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とは、第２の抗原Ｆａｂ領域を形成し、
前記第３のポリペプチドの第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドのＶＬ領域とは、抗原結合Ｆｖ領域を形成する。
【０３０７】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、同じアミノ酸配列を有する。これらの実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、２つの同一の軽鎖（第１および第２のポリペプチド）および２つの異なる重鎖様鎖（第３および第４のポリペプチド）を含む。
【０３０８】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ２サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ３サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ４サブタイプのものである。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【０３０９】
ある特定の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、追加のアミノ酸を含む。例えば、一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第２のＦｖ抗原結合ドメインの間にリンカー（例えば、Ｇ４Ｓ）をさらに含む。抗体ヒンジ領域と第２のＦｖドメインの間の柔軟なリンカーは、第２のＦｖドメインの結合親和性に影響を及ぼし得る。第２のＦｖドメインの結合親和性の改善は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含むエフェクター細胞）を標的細胞（例えば、がん細胞）へ再方向付けする効率の増大につながり得る。ＡＬｉＣＥの第２のＦｖドメインのパラトープは、ＡＬｉＣＥの第１のＦａｂドメインによって構造的に（ｓｔｒｕｒｕｃｔｕａｌｌｙ）マスクされているので、第２のＦｖドメインは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含むエフェクター細胞）上に提示される表面抗原と相互作用し、結合できるように屈曲する必要がある。したがって、立体障害（ｓｔｒｅｉｃ  ｈｉｎｄｅｒａｃｅ）を低減し、第２のＦｖドメインの免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含むエフェクター細胞）との結合（ｂｉｎｉｄｎｇ）を最適化するために、Ｇ４Ｓなどの柔軟なリンカー（ｌｉｎｉｋｅｒ）を抗体ヒンジ領域と第２のＦｖドメインの間に導入できる。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）１のアミノ酸配列を含む。一部のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）２のアミノ酸配列を含む。他のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３のアミノ酸配列を含む。さらに他のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４のアミノ酸配列を含む。
【０３１０】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原の異なるエピトープと結合する。
【０３１１】
ある特定の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、第１の抗原結合ドメインを形成し、Ｆｖ領域は、第２の抗原結合ドメインを形成する。
【０３１２】
一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じ抗原と結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうち少なくとも１つと同じエピトープに結合する。
【０３１３】
他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の抗原に結合する。
【０３１４】
一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原ではない。
【０３１５】
一部の実施形態では、第２の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｂ細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、ＮＫ細胞上に発現される。
【０３１６】
一部の実施形態では、第２の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ヘルパーＴ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、調節性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、細胞外ドメインを含む。
【０３１７】
一部の特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０３１８】
一部のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０３１９】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０３２０】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０３２１】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、各々、配列番号３のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【０３２２】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原はＣＤ２０であり、第２の抗原はＣＤ３である。
【０３２３】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０３２４】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０３２５】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、各々、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【０３２６】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原はＥＧＦＲであり、第２の抗原はＣＤ３である。
【０３２７】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０３２８】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０３２９】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、各々、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。
【０３３０】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｈｅｒ２であり、第２の抗原は、ＴＮＦアルファである。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。
【０３３１】
上記のように、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、２つの同一の軽鎖および２つの異なる重鎖様鎖を含む。ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３のような哺乳動物細胞において組換えタンパク質を作製するために、ＥＲにおいて生じた抗体アセンブリーおよび品質管理システムを理解することは極めて重要である。抗体は、四量体Ｈ２Ｌ２としてアセンブルされ、分泌され、品質管理機構は、ＢｉＰおよびＰＤＩによってＥＲにおいて極めて厳重に調節されている。重鎖のフォールディングしていないＣＨ１ドメインは、ＢｉＰ依存性に抗体アセンブリーの調節の役割を有することはわかっていた。実施例の節において以下に記載されるように、本開示は、抗体ＶＨドメインがまた、抗体アセンブリーの役割を有することを実証し、２つのＶＨ領域（Ｆａｂ領域中に１つおよびＦｖ領域中に１つ）を含有する本明細書で提供される結合分子の重鎖様鎖が、結合分子の適切なアセンブリーに寄与することを示す。
【０３３２】
Ｃ末端Ｆｖはまた、２つの異なる重鎖様鎖（第３および第４のポリペプチド）のヘテロ二量体化の重要な役割を有する。ＶＨとＶＬ領域間の相互作用は、ＶＬ−ＶＬ相互作用よりも強力であるので、ＶＨ−ＶＬ相互作用は、２つの異なる重鎖様鎖（第３および第４のポリペプチド）間のヘテロ二量体化を作製するように選択された。ヘテロ二量体化の効率は、極めて高いと見出され、哺乳動物細胞において発現および精製された結合分子のほとんどは、ヘテロ二量体化形態であった（９９％近くのヘテロ二量体化効率）。
【０３３３】
さらに、この構造は、標的とエフェクター細胞の間に最適シナプス距離を提供する。Ｎ末端の２つのＦａｂ領域と、Ｃ末端Ｆｖ領域の距離は、４０Åであると推定された。さらに、本明細書で提供される結合分子は、他の公知の二重特異性抗体、例えば、ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴおよび他のＳｃＦｖベースの二重特異性抗体形態よりも大きなフォールディング複雑性（分子の大きさ）を有し、したがって、改善された熱力学的安定性を有すると予測される。
【０３３４】
さらに、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、２つのＦａｂ領域（Ｎ末端Ｆ（ａｂ’）２）が、第１の抗原（例えば、がん抗原）に結合し、Ｆｖ領域が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に結合する二重特異性結合分子である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、例えば、最大抗腫瘍活性のために、抗体機能および免疫再方向付け（例えば、Ｔ細胞再方向付け）の相乗効果を提供するようにＹ型で設計および構築される。ＡＬｉＣＥ分子（主に、Ｙ型で存在する）の立体配置は、２つの抗原結合ドメイン（２つの標的パラトープ）間に最適免疫学的シナプス距離を付与し、細胞（例えば、Ｔ細胞）の他の細胞（例えば、腫瘍細胞）への機能的再方向付けを最大にするように設計される。さらに、高親和性および二価Ｎ末端（２つのＦａｂ領域）が提供され、同時に、免疫細胞抗原に対するＦｖ領域の一価の低い親和性のために、望まれない標的依存性Ｔ細胞活性化は低減される。
【０３３５】
結合分子は、異なる立体配置を有することができ、これは、結合分子中のドメイン間の距離に影響を及ぼし得るということが報告されている（両方とも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Zhang X. et al. 3D Structural Fluctuation of IgG1 Antibody Revealed by IndividualParticle Electron Tomography.  Scientific Reports 5, Article number: 9803 (2015); Klein J. S. et al. Examination of the contributions of size and avidity to the neutralization mechanisms of the anti-HIV antibodies b12 and 4E10. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 May 5;106(18):7385-90)。ある特定の実施形態では、ＡＬｉＣＥ分子は、異なる立体配置を有し得る、例えば、ＡＬｉＣＥ分子は、Ｙ型で、またはＴ型で存在し得る。ある特定の実施形態では、ＡＬｉＣＥ分子の異なる立体配置は、ＡＬｉＣＥ分子中のＮ末端の２つのＦａｂ領域とＣ末端Ｆｖ領域間の異なる距離に寄与し得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子中のＮ末端の２つのＦａｂ領域とＣ末端Ｆｖ領域間の距離は、およそ４０Åからおよそ７０Åの間の範囲にあると推定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子中のＮ末端の２つのＦａｂ領域とＣ末端Ｆｖ領域間の距離は、およそ４２Åであると推定され得る。一部の他の実施形態では、本明細書で提供される結合分子中のＮ末端の２つのＦａｂ領域とＣ末端Ｆｖ領域間の距離は、およそ６０Åであると推定され得る。
【０３３６】
したがって、本明細書で提供される種々の二重特異性結合分子では、第１の抗原に対する第１の抗原結合ドメインの結合親和性は、第２の抗原に対する第２の抗原結合ドメインの結合親和性よりも高い。例えば、以下の実施例３に示されるように、ＡＣＥ−０５のヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合動態は、親の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（すなわち、Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．製のＹＢＬ−００７）に匹敵していた（図１２Ａ〜１２Ｃを参照されたい）。対照的に、ＡＣＥ−０５のＣＤ３に対する結合親和性は、親の抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，  ＵＳＡ製のＵＣＨＴ１）よりもかなり低かった（図１２Ａ〜１２Ｃを参照されたい）。
【０３３７】
一般的に言えば、抗原−抗体相互作用は、非共有結合性であり、可逆性であり、水素結合、疎水性相互作用、静電力およびファンデルワールス力の組合せによって形成される。抗原−抗体複合体の強度を説明する場合には、親和性および／または結合力が普通記載される。上記のように、抗体のその抗原との結合は、可逆的プロセスであり、結合の親和性は、通常、平衡解離定数（ＫＤ）として報告される。ＫＤは、抗体会合速度（ｋｏｎまたはｋａ）（抗原に結合する速度）に対する抗体解離速度（ｋｏｆｆまたはｋｄ）（抗原から解離する速度）の比である。一部の実施形態では、ＫＤ値は、特定の抗体／抗原相互作用のｋｏｎおよびｋｏｆｆ速度を測定し、次いで、これらの値の比を使用して、ＫＤ値を算出することによって決定される。ＫＤ値は、個々の抗体／抗原相互作用の強度を評価し、ランク付けするために使用できる。抗体のＫＤが低いほど、抗体のその標的に対する親和性は高い。結合力は、抗体−抗原複合体の全体的な力の尺度を与える。それは３つの主要なパラメータ：（ｉ）抗体のエピトープに対する親和性、（ｉｉ）抗体と抗原療法の結合価および（ｉｉｉ）相互作用する部分の構造的配置に依存する。
【０３３８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、１つまたは複数の標的、抗原またはエピトープに約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下、５０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下または１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに、約２０ｎＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約１ｎＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約０．５ｎＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約０．１ｎＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約５０ｐＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約２５ｐＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約１０ｐＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約１ｐＭ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の標的または抗原に対する解離定数は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）チップ上に固定化された標的タンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質を使用して決定される解離定数である。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の標的または抗原に対する解離定数は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）チップ上の抗ヒトＩｇＧ抗体によって捕捉された結合物質および可溶性標的タンパク質を使用して決定される解離定数である。
【０３３９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下または約０．１ｎＭ以下の半最大有効濃度（ＥＣ５０）で結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下または約０．１ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する。
【０３４０】
ある特定の実施形態では、結合分子の第１の抗原に対するＫＤは、結合分子の第２の抗原に対するＫＤの約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍またはそれより大きい。一部の実施形態では、結合分子の第１の抗原に対するＫＤは、結合分子の第２の抗原に対するＫＤの約１０、１０２、１０３または１０４倍である。
【０３４１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子（例えば、二重特異性結合分子）は、１種または複数の「親」抗体の少なくとも部分を含む。一部の実施形態では、親抗体は、組換え抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ポリクローナル抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、キメラ抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ヒト抗体または完全ヒト抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体である。ある特定の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ１抗体である。ある特定の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ３抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ４抗体である。
【０３４２】
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子（例えば、二重特異性結合分子）は、単離されている。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子（例えば、二重特異性結合分子）は、実質的に純粋である。
【０３４３】
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子（例えば、二重特異性結合分子）またはその部分は、少なくとも１種のモノクローナル抗体に由来する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体を、当業者に公知のハイブリドーマ法を使用して調製する。例えば、免疫処置抗原に特異的に結合する抗体の産生を誘発するために、ハイブリドーマ法を使用して、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を、上記のように免疫処置する。一部の実施形態では、リンパ球をインビトロで免疫処置する。一部の実施形態では、免疫処置抗原は、ヒトタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、免疫抗原は、マウスタンパク質またはその断片である。
【０３４４】
免疫処置後、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを使用して適した骨髄腫細胞株と融合する。ハイブリドーマ細胞を当技術分野で公知のような特殊化培地を使用して選択し、非融合リンパ球および骨髄腫細胞は選択プロセスを生き残れない。選択された抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、それだけには限らないが、免疫沈降、免疫ブロット法およびインビトロ結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ）をはじめとするさまざまな方法によって同定できる。ひとたび、所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定すると、クローンを、制限希釈技術によってサブクローニングできる。ハイブリドーマは、標準方法を使用してインビトロ培養で、または動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、それだけには限らないが、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および透析をはじめとする当技術分野の標準方法に従って培養培地または腹水から精製できる。
【０３４５】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体を、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製できる。例えば、ある特定の例では、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲなどによって成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離し、その配列は、標準技術を使用して決定する。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、適した発現ベクターにクローニングし、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされた場合に、これがモノクローナル抗体を産生する。
【０３４６】
ある特定の他の実施形態では、組換えモノクローナル抗体またはその断片を、所望の種の可変ドメインまたはＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離できる。ファージライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の種々の技術によって達成できる。
【０３４７】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体を、例えば、組換えＤＮＡ技術を使用することによって修飾して、代替抗体を作製する。一部の実施形態では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、例えば、ヒト抗体の定常領域と置換して、キメラ抗体を作製できる、または非免疫グロブリンポリペプチドと置換して、融合抗体を作製できる。一部の実施形態では、定常領域は、末端切断型であるか、またはモノクローナル抗体の所望の抗体断片を作製するように除去される。一部の実施形態では、モノクローナル抗体の特異性および／または親和性を最適化するために、可変領域（複数可）の部位指定または高密度突然変異誘発が使用される。
【０３４８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子（例えば、二重特異性結合分子）またはその部分は、ヒト化抗体に由来する。ヒト化抗体を作製するための種々の方法が、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ヒト化は、１つまたは複数の非ヒトＣＤＲ配列をヒト抗体の対応するＣＤＲ配列と置換することによって実施される。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、親の非ヒト抗体（例えば、げっ歯類）の６つのＣＤＲすべてを、ヒト抗体の対応するＣＤＲ配列と置換することによって作製される。
【０３４９】
ヒト化抗体の作製において使用されるべきヒト重鎖可変領域および軽鎖可変領域の選択は、さまざまな因子に基づいて、さまざまな方法によって行うことができる。一部の実施形態では、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の可変領域の配列が、既知ヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる「ベスト−フィット」法が使用される。非ヒト配列のものに最も類似しているヒト配列が、ヒト化抗体のヒト可変領域骨格として選択される。一部の実施形態では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定の可変領域骨格が選択される方法が使用される。一部の実施形態では、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスのコンセンサス配列に由来する。一部の実施形態では、ヒト生殖系列遺伝子は、可変領域フレームワーク配列の供給源として使用される。
【０３５０】
ヒト化のための他の方法として、それだけには限らないが、ＣＤＲのヒト生殖系列フレームワークへの直接導入として記載される「スーパーヒト化」と呼ばれる方法、抗体「ヒト性」の計量に基づくヒトストリング含量（ＨＳＣ）と呼ばれる方法、ヒト化変異体（ファージ、リボソーマルおよび酵母ディスプレイライブラリーを含む）の大きなライブラリーの作製に基づく方法およびフレームワーク領域シャッフリングに基づく方法が挙げられる。
【０３５１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子（例えば、二重特異性結合分子）またはその部分は、ヒト抗体に由来する。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を使用して直接調製できる。一部の実施形態では、ヒト抗体は、インビトロで免疫処置された不死化ヒトＢリンパ球から作製される。一部の実施形態では、ヒト抗体は、免疫処置された個体から単離されたリンパ球から作製される。任意の場合において、標的抗原に対する抗体を産生する細胞を作製し、単離できる。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して免疫処置していないドナーから得た免疫グロブリン可変領域遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を産生できる。抗体ファージライブラリーを作製および使用する技術は、当技術分野で周知である。ひとたび、抗体が同定されると、それだけには限らないが、鎖シャッフリングおよび部位特異的突然変異誘発をはじめとする当技術分野で公知の親和性成熟戦略を使用して、より高い親和性ヒト抗体を作製できる。
【０３５２】
一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて産生される。これらのマウスは、免疫処置すると、内因性免疫グロブリン産生がなくとも、ヒト抗体の完全レパートリーを産生可能である。
【０３５３】
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子（例えば、二重特異性結合分子）または本明細書に記載されるその部分は、少なくとも１つまたは複数の定常領域において修飾を含む抗体（例えば、全長抗体またはその断片）に由来する。一部の実施形態では、抗体は、３つの重鎖定常領域のうち１つまたは複数（例えば、ＣＨ１）への、および／または軽鎖定常領域（ＣＬ）への修飾を含む。一部の実施形態では、修飾された抗体の重鎖定常領域は、少なくとも１つのヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、修飾された抗体の重鎖定常領域は、１つより多いヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、定常領域への修飾は、１つまたは複数の領域における１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の領域が、修飾された抗体の定常領域から部分的にまたは完全に欠失している。一部の実施形態では、全ＣＨ２ドメインが、抗体から除去されている（ΔＣＨ２コンストラクト）。一部の実施形態では、全ＣＨ３ドメインが、抗体から除去されている（ΔＣＨ３コンストラクト）。一部の実施形態では、省略された定常領域は、不在の定常領域によって通常付与される分子柔軟性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０個のアミノ酸残基）によって置き換えられる。
【０３５４】
本明細書に記載される抗体（例えば、親抗体）および／または本明細書で提供される結合分子（例えば、二重特異性抗体）の定常領域への修飾は、周知の生化学または分子工学技術を使用して行うことができる。一部の実施形態では、変異体は、適当なヌクレオチド変化をコードするＤＮＡに導入することによって、および／または所望のポリペプチドまたは物質の直接合成によって調製できる。この点において、修飾された結合物質の構造、結合活性および他の所望の特徴を実質的に維持しながら、特定の配列または領域によって提供される活性またはエフェクター機能を破壊することが可能であり得る。
【０３５５】
本開示は、本明細書に記載される結合分子に対して実質的に相同である、追加の変異体および均等物をさらに包含する。一部の実施形態では、それだけには限らないが、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低減または溶解度をはじめとする、結合分子の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい。当業者ならば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの翻訳後プロセスを変更し得ることは理解されよう。
【０３５６】
変動は、親結合物質の配列と比較してアミノ酸配列の変化をもたらす、多重特異性結合物質をコードする１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得る。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、同様の構造および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換えること、例えば、ロイシンのセリンでの置き換え、例えば、保存的アミノ酸置き換えの結果であり得る。一部の実施形態では、挿入または欠失は、約１〜５個のアミノ酸の範囲にある。ある特定の実施形態では、置換、欠失または挿入は、親分子に対して２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換または２個未満のアミノ酸置換を含む。生物学的に有用であるおよび／または関連しているアミノ酸配列における変動は、配列において挿入、欠失または置換を系統的に作製することおよび得られた変異体タンパク質を親タンパク質と比較して活性について試験することによって決定できる。
【０３５７】
一部の実施形態では、変異体は、本明細書で提供される結合分子を構成する１つまたは複数のポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端でのアミノ酸残基の付加を含み得る。追加のアミノ酸残基の長さは、１残基から数百個またはそれより多い残基の範囲であり得る。一部の実施形態では、変異体は、Ｎ末端メチオニル残基を含む。一部の実施形態では、追加のポリペプチド／タンパク質を含む変異体、すなわち、融合タンパク質。ある特定の実施形態では、変異体は、検出可能であるように操作されており、検出可能な標識および／またはタンパク質（例えば、酵素）を含み得る。
【０３５８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の適切なコンホメーションの維持に関与しないシステイン残基は、物質の特徴をモジュレートするために、例えば、酸化安定性を改善するためにおよび／または異常なジスルフィド架橋を防ぐために置換される、または欠失される。逆に、一部の実施形態では、１つまたは複数のシステイン残基は、安定性を改善するためにジスルフィド結合（複数可）を作出するように付加される。
【０３５９】
一部の実施形態では、本開示の結合分子は「脱免疫処置」される。抗体などの物質の脱免疫処置は、一般に、物質の結合親和性または他の所望の活性を大幅に低減することなくＴ細胞エピトープを除去するために特定の突然変異を導入することからなる。
【０３６０】
本明細書に記載される変異体結合分子またはポリペプチドは、それだけには限らないが、部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャニング突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発をはじめとする当技術分野で公知の方法を使用して作製できる。
【０３６１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される結合分子は、化学修飾される。一部の実施形態では、結合分子は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断および／または細胞性リガンドもしくは他のタンパク質との連結によって化学的に修飾されている二重特異性抗体である。多数の化学修飾のいずれも、既知技術によって実施できる。
【０３６２】
本明細書に記載される多重特異性結合物質を構成するポリペプチドは、当技術分野で公知の、ならびに以下の節ＩＩＩおよび節ＩＶにおいてより詳細に記載される任意の適した方法によって製造できる。
【０３６３】
本開示はまた、本明細書に記載される結合分子（例えば、二重特異性抗体）のうちいずれか１つを含むコンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、追加の分子と結合される。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、細胞傷害性薬剤または部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされて、ＡＤＣ（抗体−薬物コンジュゲート）を形成する。一部の実施形態では、細胞傷害性部分は、それだけには限らないが、メトトレキサート、アドリアマイシン／ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、ダウノルビシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）または他のインターカレート剤をはじめとする化学療法薬である。一部の実施形態では、細胞傷害性部分は、それだけには限らないが、アウリスタチン、マイタンシノイド（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）およびツブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎｓ）をはじめとする微小管阻害剤である。一部の実施形態では、細胞傷害性部分は、それだけには限らないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）をはじめとする、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素またはその断片である。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、１つまたは複数の小分子毒、例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅｓ）およびＣＣ１０６５にコンジュゲートされる。誘導体が細胞傷害性活性を保持する限り、コンジュゲートにおいてこれらの毒素のうちいずれか１種の誘導体を使用できる。
【０３６４】
本明細書で提供される結合分子を含むコンジュゲートは、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して作製できる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール（ｐｙｒｉｄｙｉｄｉｔｈｉｏｌ））プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製される。
【０３６５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される結合分子（例えば、二重特異性抗体）は、抗体が診断および／または検出のために使用されることを可能にする検出可能な物質または分子にコンジュゲートされる。検出可能な物質として、それだけには限らないが、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、ビオチンおよびフラビン類；蛍光材料、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、シアニン（Ｃｙ３）およびフィコエリトリン；生物発光物質、例えば、ルシフェラーゼ；放射性物質、例えば、２１２Ｂｉ、１４Ｃ、５７Ｃｏ、５１Ｃｒ、６７Ｃｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ、６８Ｇｅ、３Ｈ、１６６Ｈｏ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ、１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１４０Ｌａ、１７７Ｌｕ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、３２Ｐ、１０３Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、３５Ｓ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ、１５３Ｓｍ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、８５Ｓｒ、９９ｍＴｃ、２０１Ｔｉ、１３３Ｘｅ、９０Ｙ、６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、６５Ｚｎ；ポジトロン放出金属；および磁性金属イオンを挙げることができる。
【０３６６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される本明細書で提供される結合分子は、標的抗原（複数可）のイムノアッセイまたは精製にとって特に有用である固相支持体に付着される。このような固相支持体として、それだけには限らないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０３６７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、医薬組成物に製剤化される。したがって、さらに別の態様では、本明細書で提供される結合分子の治療有効量と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。本明細書で提供される医薬組成物は、以下の節Ｖにより詳細に記載される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象における疾患または状態の処置において使用するためのものである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんは、ＰＤ−Ｌ１陽性がんである。一部の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。一部の実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。一部の実施形態では、がんは、乳がんである。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、卵巣がんである。
【０３６８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、疾患または状態の処置のために使用される。したがって、さらに別の態様では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書で提供される結合分子の治療有効量を対象に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんは、ＰＤ−Ｌ１陽性がんである、一部の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。一部の実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。一部の実施形態では、がんは、乳がんである。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、卵巣がんである。本結合分子を投与する方法のより詳細な説明は、以下の節ＶＩに示されている。
【０３６９】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される結合分子をコードするポリヌクレオチドを包含する。用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびに追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態である場合も、ＤＮＡの形態である場合もある。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含み、二本鎖である場合も一本鎖である場合もあり、一本鎖は、コーディング鎖である場合も、非コーディング（アンチセンス）鎖である場合もある。
【０３７０】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌において補助するポリヌクレオチドと同じリーディングフレームに融合されたポリペプチドのコード配列を含む（例えば、ポリペプチドの輸送を管理するために分泌配列として機能するリーダー配列）。ポリペプチドは、ポリペプチドの「成熟した」形態を形成するために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有することもある。
【０３７１】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マーカーまたはタグ配列と．同じリーディングフレームに融合されるポリペプチドのコード配列を含む。例えば、一部の実施形態では、マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合されたポリペプチドの効率的な精製を可能にするベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグである。一部の実施形態では、マーカーは、他の親和性タグとともに使用される。
【０３７２】
本開示はさらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの変異体に関し、変異体は、例えば、ポリペプチドの断片、類似体および／または誘導体をコードする。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される結合分子を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％同一である、少なくとも約８５％同一である、少なくとも約９０％同一である、少なくとも約９５％同一である、一部の実施形態では、少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０３７３】
本明細書で使用される場合、語句「参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり最大５点の突然変異を含み得る点を除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に対して同一であることを意味するものとする。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大５％は、欠失または別のヌクレオチドと置換されてもよく、いくつかのヌクレオチド、参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％が、参照配列中に挿入されてもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、または参照配列においてヌクレオチドの間に個々に、もしくは参照配列内の１つもしくは複数の連続する基で散在するそれらの末端位置の間のどの場所でも生じ得る。
【０３７４】
ポリヌクレオチド変異体は、コーディング領域、非コーディング領域または両方中に変更を含有し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加または欠失をもたらすが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変更しない変更を含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない（遺伝暗号の縮重のために）サイレント置換を含む。ポリヌクレオチド変異体は、さまざまな理由のために、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化するために（すなわち、ヒトｍＲＮＡ中のコドンを、大腸菌などの細菌宿主によって好まれるものに変更する）製造され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、配列の非コーディングまたはコーディング領域中に少なくとも１つのサイレント突然変異を含む。
【０３７５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現（または発現レベル）をモジュレートまたは変更するために製造される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現を増大するために製造される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現を減少させるために製造される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされるポリペプチドの発現を増大した。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされるポリペプチドの発現を減少させた。
【０３７６】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離されている。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
【０３７７】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞も、提供される。一部の実施形態では、発現ベクターは、ポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む１つまたは複数の発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子を含む。
【０３７８】
ＩＶ．結合分子を作製する方法
さらに別の態様では、本明細書で提供される種々の結合分子を作製する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、結合分子を作製する方法であって、１つまたは複数のベクターが、
（ａ）各々が抗体軽鎖である第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとをコードする第１の核酸と、
（ｂ）第１のＶＨ領域と第１のＣＨ１領域と第２のＶＨ領域とを含む第３のポリペプチドをコードする第２の核酸と、
（ｃ）第３のＶＨ領域と第２のＣＨ１領域とＶＬ領域とを含む第４のポリペプチドをコードする第３の核酸と
を含み、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ、
前記第３のポリペプチドの第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドのＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成することができる、
方法が、本明細書において提供される。
【０３７９】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、ＩｇＧヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ２サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ３サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ４サブタイプのものである。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第２の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）１のアミノ酸配列を含む。一部のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）２のアミノ酸配列を含む。他のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３のアミノ酸配列を含む。さらに他のより特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４のアミノ酸配列を含む。
【０３８０】
一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
【０３８１】
ある特定の実施形態では、第１のＦａｂ領域および第２のＦａｂ領域は、第１の抗原結合ドメインを形成し、Ｆｖ領域は、第２の抗原結合ドメインを形成する。
【０３８２】
一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じ抗原と結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうち少なくとも１つと同じエピトープに結合する。
【０３８３】
他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の抗原に結合する。
【０３８４】
一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原ではない。
【０３８５】
一部の実施形態では、第２の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上に発現される。一部の実施形態では、第２の抗原は、Ｂ細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第２の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第２の抗原は、ＮＫ細胞上に発現される。
【０３８６】
一部の特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、第１の抗原は、がん抗原であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０３８７】
一部のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＰＤ−Ｌ１であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０３８８】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０３８９】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０３９０】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、各々、配列番号３のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【０３９１】
一部の実施形態では、第１の核酸は、配列番号２２のヌクレオチド配列を有し、第２の核酸は、配列番号２０のヌクレオチド配列を有し、第３の核酸は、配列番号２１のヌクレオチド配列を有する。
【０３９２】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２０であり、第２の抗原は、ＣＤ３である。
【０３９３】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０３９４】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０３９５】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、各々、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【０３９６】
一部の実施形態では、第１の核酸は、配列番号３６のヌクレオチド配列を有し、第２の核酸は、配列番号３４のヌクレオチド配列を有し、第３の核酸は、配列番号３５のヌクレオチド配列を有する。
【０３９７】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原はＥＧＦＲであり、第２の抗原はＣＤ３である。
【０３９８】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む。
【０３９９】
一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【０４００】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、各々、配列番号３９のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列を有し、第４のポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。
【０４０１】
一部の実施形態では、第１の核酸は、配列番号５０のヌクレオチド配列を有し、第２の核酸は、配列番号４８のヌクレオチド配列を有し、第３の核酸は、配列番号４９のヌクレオチド配列を有する。
【０４０２】
他のより特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｈｅｒ２であり、第２の抗原は、ＴＮＦアルファである。一部の実施形態では、各Ｆａｂ領域の第１の部分のＶＨ領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、各Ｆａｂ領域の第２の部分のＶＬ領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＨ領域は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、Ｆｖ領域のＶＬ領域は、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。
【０４０３】
本明細書で提供される結合分子の組換え発現は、結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とし得る。ひとたび、本明細書で提供される結合分子、抗体重鎖または軽鎖またはその断片（例えば、必ずしもそうではないが、重鎖および／または軽鎖可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、当技術分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって、結合分子を産生するためのベクターを製造できる。したがって、コードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法が、本明細書に記載される。当業者に周知の方法を使用して、コード配列と適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法として、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。また、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書で提供される結合分子もしくはその断片または重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターも提供される。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、国際公開番号ＷＯ８６／０５８０７およびＷＯ８９／０１０３６ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、全重鎖、全軽鎖または全重鎖および全軽鎖の両方の発現のために、抗体の可変ドメインを、このようなベクターにクローニングできる。
【０４０４】
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に導入され、トランスフェクトされた細胞は次いで、本明細書で提供される結合分子を産生するように従来の技術によって培養される。したがって、異種プロモーターに作動可能に連結された本明細書で提供される結合分子もしくはその断片またはその重鎖もしくは軽鎖もしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞も本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の種々の部分をコードするポリヌクレオチドを含む複数のベクターが、以下に詳述されるように、全結合分子の発現のために宿主細胞において同時発現され得る。
【０４０５】
本明細書で提供される結合分子を発現させるために、さまざまな宿主発現ベクター系を利用できる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、その後精製され得る媒体に相当するが、また、適当なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされた場合に、本明細書で提供される結合分子をインサイツで発現し得る細胞にも相当する。これらとして、それだけには限らないが、コード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、大腸菌および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、もしくはコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現コンストラクトを有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０および３Ｔ３細胞）が挙げられる。特に、組換え抗体分子全体の発現のための大腸菌または真核細胞などの細菌細胞を、組換え結合分子の発現のために使用できる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと協力して、抗体またはその変異体のための有効な発現系である（Foecking et al., 1986, Gene 45:101; and Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2）。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＨＯ細胞において産生される。特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成プロモーター、誘導プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節される。
【０４０６】
細菌系では、発現されている結合分子に対して意図される使用に応じていくつかの発現ベクターが選択され得ることが有利である。例えば、結合分子の医薬組成物の作製のために大量のこのような結合分子が産生される予定である場合には、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいものであり得る。このようなベクターとして、それだけには限らないが、コード配列を、ｌａｃ  Ｚコーディング領域とインフレームでベクターに個々にライゲーションすることができ、その結果、融合タンパク質が産生される大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用できる。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合と、それに続く、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ切断部位を含み、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように設計される。
【０４０７】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。ウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において増殖する。コード配列を、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへ?リンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０４０８】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を利用できる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的のコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素リーダー配列にライゲーションできる。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスゲノム（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）の非必須領域への挿入は、感染宿主において生存可能であり、結合分子を発現可能である組換えウイルスをもたらすであろう（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359を参照されたい）。挿入されたコード配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルも必要である場合がある。これらのシグナルとして、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が挙げられる。さらに、全挿入部分の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと同相でなくてはならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、さまざまな起源のもの、両方とも天然および合成であり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る（例えば、Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照されたい）。
【０４０９】
さらに、挿入された配列の発現をモジュレートする、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択できる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的な、特定の機序を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために、適当な細胞株または宿主系を選択できる。この目的のために、遺伝子産物の一次転写物、グリコシル化およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真核細胞宿主細胞を使用できる。このような哺乳動物宿主細胞として、それだけには限らないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を内因性に全く産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。
【０４１０】
組換えタンパク質の長期の、高収率産生のためには、安定な発現が利用され得る。例えば、結合分子を安定に発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されたＤＮＡを用いて、宿主細胞を形質転換できる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を濃縮培地で１〜２日間増殖させることができ、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定に組み込み、成長して病巣を形成し、次いで、クローニングされ、細胞株中に拡大され得ることを可能にする。この方法は、結合分子を発現する細胞株を操作するために使用され得ることが有利である。このような操作された細胞株は、結合分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０４１１】
それだけには限らないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17）をはじめとするいくつかの選択系が使用されることができ、遺伝子は、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る：メトトレキサートに対する耐性を付与する、ｄｈｆｒ（Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与する、ｇｐｔ（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する、ｎｅｏ（Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932;およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-2 15）；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与する、ｈｙｇｒｏ（Santerre et al., 1984, Gene 30:147）。組換えＤＮＡ技術の当技術分野で一般に公知の方法を、所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用することができ、このような方法は、例えば、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されており、それらは、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１２】
結合分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（概要については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the の発現 cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987）を参照されたい）。結合分子を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合には、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増大が、マーカー遺伝子のコピー数を増大する。増幅された領域は、結合分子遺伝子と関連しているので、結合分子の産生も増大する（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０４１３】
宿主細胞は、本明細書で提供される複数の発現ベクターを用いて同時トランスフェクトされ得る。ベクターは、それぞれのコードするポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有し得る。あるいは、複数のポリペプチドをコードし、発現することが可能である単一ベクターが使用され得る。コード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０４１４】
ひとたび、本明細書で提供される結合分子が組換え発現によって産生されると、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインＡ後特異的抗原に対する親和性によって、サイジングカラムクロマトグラフィーおよびカッパセレクト（ｋａｐｐａ−ｓｅｌｅｃｔ）親和性クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差によって、またはタンパク質の精製のための任意のその他の標準技術によって精製され得る。特定の実施形態では、Ｆａｂ（カッパ）断片またはＦａｂ断片を含有する結合分子の精製のために、カッパセレクト（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅによって開発されたカッパセレクト（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ））が使用される。さらに、本明細書で提供される結合分子は、本明細書に記載される、またはそうでなければ、精製を促進するために当技術分野で公知の、異種ポリペプチド配列に融合され得る。
【０４１５】
Ｖ．医薬組成物
一態様では、本開示は、本開示の少なくとも１つの結合分子を含む医薬組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される結合分子の治療有効量および薬学的に許容される担体を含む。
【０４１６】
結合分子を含む医薬組成物は、水溶液または凍結乾燥もしくは他の乾燥形態で、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤［例えば、Remington, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1980)を参照されたい］と望ましい程度の純度を有する結合分子とを混合することによって保存のために調製される。
【０４１７】
本開示の結合分子は、標的細胞／組織へのデリバリーのために、例えば、マイクロカプセルまたはマクロエマルジョンとして（Remington、上記；Park et al., 2005, Molecules 10:146-61；Malik et al., 2007, Curr. Drug. Deliv. 4:141-51)、徐放性製剤として（Putney and Burke, 1998, Nature Biotechnol. 16:153-57）またはリポソーム中に（Maclean et al., 1997, Int. J. Oncol. 11:325-32；Kontermann, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8:39-45）任意の好適な形態で製剤化され得る。
【０４１８】
本明細書で提供される結合分子は、例えばコアセルベーション技術によってまたは界面ポリマー化によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド性薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに封入されてもよい。そのような技術は、例えば、Remington,上記に開示されている。
【０４１９】
種々の組成物およびデリバリーシステムは、周知であり、本明細書に記載の結合分子を含んで使用されてよく、これだけに限らないが、リポソームへの封入、微小粒子、マイクロカプセル、結合分子を発現できる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-32を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸のコンストラクトなどが挙げられる。別の実施形態では、組成物は、放出制御または徐放システムとして提供され得る。一実施形態では、ポンプは、放出制御または徐放を達成するために使用され得る（例えば、Langer、上記；Sefton, 1987, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507-16；およびSaudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:569-74を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー性材料は、予防剤または治療剤（例えば、本明細書に記載の結合分子）または本明細書で提供される組成物の放出制御または徐放を達成するために使用され得る［例えば、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., 1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., 1984)；Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126；Levy et al., 1985, Science 228:190-92；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351-56；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105-12；米国特許第５，６７９，３７７号；第５，９１６，５９７号；第５，９１２，０１５号；第５，９８９，４６３号；および第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４およびＷＯ９９／２０２５３を参照されたい］。徐放性製剤において使用されるポリマーの例として、これだけに限らないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態では、徐放性製剤において使用されるポリマーは、不活性、溶出性不純物不含有、保存において安定、滅菌および生分解性である。
【０４２０】
さらに別の実施形態では、放出制御または徐放システムは、具体的な標的組織、例えば、鼻腔または肺に近接するように位置させてよく、それにより全身用用量の一部だけを必要とする［例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984)を参照されたい］。放出制御システムは、例えば、Langer, 1990, Science 249:1527-33によって考察されている。当業者に周知の任意の技術は、１つまたは複数の本明細書に記載の結合分子を含む徐放性製剤を産生するために使用され得る（例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８およびＷＯ９６／２０６９８、Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-89;Song et al., 1995, PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97；Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54;およびLam et al., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60を参照されたい）。
【０４２１】
ＶＩ．投与方法
具体的な実施形態では、本明細書で提供される結合分子を含む、疾患または状態の予防、管理、処置および／または改善における使用のための組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の予防における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんはＰＤ−Ｌ１陽性がんである。一部の実施形態では、がんは肺がんである。一部の実施形態では、がんは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。一部の実施形態では、がんは結腸直腸がんである。一部の実施形態では、がんは乳がんである。一部の実施形態では、がんはリンパ腫である。一部の実施形態では、がんは黒色腫である。一部の実施形態では、がんは卵巣がんである。ある特定の実施形態では、対象はそれを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の予防、管理、処置または改善をもたらす。
【０４２２】
一実施形態では、疾患または状態の症状の予防、管理、処置および／または改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の症状の予防における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の症状の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の症状の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の症状の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患はがんである。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の症状の予防、管理、処置または改善をもたらす。
【０４２３】
別の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を予防する、管理する、処置するおよび／または改善する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を予防する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を管理する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を処置する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を改善する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態はがんである。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の予防、管理、処置または改善をもたらす。
【０４２４】
別の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態の症状を予防する、管理する、処置するおよび／または改善する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態の症状を予防する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態の症状を管理する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態の症状を処置する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を改善する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態は、がんである。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の症状の予防、管理、処置または改善をもたらす。
【０４２５】
同様に、本明細書で提供される結合分子または本明細書で提供される結合分子を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することによって、疾患または状態を予防する、管理する、処置するおよび／または改善する方法が本明細書で提供される。一態様では、結合分子は、実質的に精製されている（すなわち、その効果を制限するまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。ある特定の実施形態では、結合分子は、１つまたは複数の完全なヒトモノクローナル抗体に由来する。治療を投与される対象は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）などのサルもしくはヒト）などの哺乳動物であってよい。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は疾患または状態、例えばがんを有するヒトである。
【０４２６】
種々のデリバリーシステムが周知であり、予防剤または治療剤（例えば、本明細書で提供される結合分子）を投与するために使用でき、これだけに限らないが、リポソームへの封入、微小粒子、マイクロカプセル、結合分子を発現できる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス［例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照されたい］、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸のコンストラクションなどが挙げられる。予防剤もしくは治療剤（例えば、本明細書で提供される結合分子）または医薬組成物を投与する方法として、これだけに限らないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外ならびに粘膜（例えば、鼻腔内および経口経路）が挙げられる。具体的な実施形態では、予防剤もしくは治療剤（例えば、本明細書で提供される結合分子）または医薬組成物は、鼻腔内に、筋肉内に、静脈内にまたは皮下に投与される。予防剤もしくは治療剤または組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば注入もしくはボーラス注射によって、上皮もしくは粘膜皮膚内膜（例えば、経口粘膜、鼻腔内粘膜、直腸内および腸管粘膜など）を通じた吸収によって投与されてよく、他の生物学的活性剤と共に投与されてよい。投与は、全身性または局所的であってよい。加えて、肺内投与も、例えば、吸入剤またはネブライザーおよびエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって使用され得る。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０１９，９６８号，第５，９８５，３２０号，第５，９８５，３０９号，第５，９３４，２７２号，第５，８７４，０６４号，第５，８５５，９１３号，第５，２９０，５４０号および第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３を参照されたい。
【０４２７】
具体的な実施形態では、本明細書で提供される予防剤もしくは治療剤または医薬組成物を処置を必要とする領域に局所的に投与することは望ましい場合がある。これは、例えば、限定の目的ではなく、局所注入によって、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与によって（例えば、鼻腔内スプレーによって）、注射によって、またはインプラントの手段によって達成でき、前記インプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜または繊維などの膜が挙げられる多孔性、非多孔性またはゼラチン性材料である。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体を投与する場合、抗体を吸収しない材料を使用することに注意が払われるべきである。
【０４２８】
別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤もしくは治療剤または組成物は、小胞中、特にリポソーム中でデリバリーされ得る［Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989)；Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327を参照されたい；一般に同書を参照されたい]。
【０４２９】
別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤もしくは治療剤または組成物は、放出制御または徐放システムにおいてデリバリーされ得る。一実施形態では、ポンプは、放出制御または徐放を達成するために使用され得る（Langer, 上記；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー性材料は、予防剤もしくは治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体）または本明細書で提供される組成物の放出制御または徐放を達成するために使用され得る［例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい；Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照されたい］；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０２５３。徐放性製剤において使用されるポリマーの例として、これだけに限らないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態では、徐放性製剤において使用されるポリマーは、不活性、溶出性不純物不含有、保存において安定、滅菌および生分解性である。さらに別の実施形態では、放出制御または徐放システムは、治療標的、すなわち、鼻腔または肺に近接するように位置させてよく、それにより全身用用量の一部だけを必要とする［例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 上記, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい］。放出制御システムは、Ｌａｎｇｅｒによる概説（1990, Science 249:1527-1533）において考察されている。当業者に周知の任意の技術は、１つまたは複数の本明細書で提供される結合分子を含む徐放性製剤を産生するために使用され得る。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２０６９８、Ning et al., 1996, “Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179- 189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854およびLam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。
【０４３０】
具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物が予防剤または治療剤（例えば、本明細書で提供される結合分子）をコードする核酸である場合、核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部としてコンストラクトし、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）または直接注射によって、または微小粒子銃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）もしくは脂質を用いてコーティングすることもしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤の使用によって、または核に侵入することが周知であるホメオボックス様ペプチドとの関連でそれを投与することによって（例えば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照されたい）など、それが細胞内になるように投与することによって、そのコードされた予防剤または治療剤の発現を促進するようにインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）に投与され得る。代替的に、核酸は、相同組換えによって発現のために、細胞内に導入され、宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０４３１】
具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される１つ、２つまたはそれ以上の結合分子を含む。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される１つ、２つまたはそれ以上の結合分子および本明細書で提供される結合分子以外の予防剤または治療剤を含む。一実施形態では、薬剤は、疾患または状態の予防、管理、処置および／または改善のために有用であることが周知である、または使用されているもしくは現在使用されている。予防剤または治療剤に加えて、本明細書で提供される組成物は、担体も含む場合がある。
【０４３２】
本明細書で提供される組成物として、単位投与形態の調製において使用され得る医薬組成物（例えば、対象または患者への投与のために好適である組成物）の製造において有用なバルク薬物組成物を含む。一実施形態では、本明細書で提供される組成物は、医薬組成物である。かかる組成物は１つまたは複数の予防剤または治療剤（例えば、本明細書で提供される結合分子または他の予防剤もしくは治療剤）および薬学的に許容される担体の予防または治療有効量を含む。医薬組成物は、対象への投与の経路のために好適であるように製剤化され得る。
【０４３３】
具体的な実施形態では、用語「担体」は、それと共に治療剤が投与される希釈剤、アジュバント［例えば、フロイントのアジュバント（完全および不完全）］、賦形剤または媒体を指す。かかる医薬品担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成由来のものを含む水および油などの滅菌液体であってよい。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の例示的担体である。生理食塩水およびブドウ糖水溶液およびグリセリン溶液も液体担体として、特に注射可能な溶液のために、使用され得る。好適な医薬品賦形剤として、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて少量の湿潤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁物、乳液、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放製剤などの形態をとる場合がある。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体も含む場合がある。好適な医薬品担体の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAに記載されている。かかる組成物は、精製された形態などでの本明細書で提供される結合分子の予防または治療有効量を、患者への適切な投与のための形態を提供するための好適な量の担体と共に含有する。製剤は、投与様式に適していなければならない。
【０４３４】
一実施形態では、組成物は、日常的手順により、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるためにリグノカムン（ｌｉｇｎｏｃａｍｎｅ）などの局所麻酔も含む場合がある。しかし、かかる組成物は、静脈内以外の経路によって投与される場合もある。
【０４３５】
一般に、本明細書で提供される組成物の成分は、別々にまたは単位投与形態中に合わせて混合されてのいずれかで、活性剤の量を表示しているアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密閉シールされている容器中に、例えば、乾燥した凍結乾燥粉剤または水不含有濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルに分注されていてもよい。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与の前に混合され得るように提供されてもよい。
【０４３６】
本明細書で提供される結合分子は、抗体の量を表示しているアンプルまたはサシェなどの密閉シールされている容器に包装されてよい。一実施形態では、結合分子は、密閉シールされている容器中の乾燥した滅菌凍結乾燥粉剤または水不含有濃縮物として供給され、対象への投与のために好適な濃度に、例えば、水または生理食塩水を用いて復元されてよい。凍結乾燥結合分子は、その元の容器中で２から８℃の間で保存されてよく、結合分子は、復元後６時間以内、５時間以内、３時間以内または１時間以内などの１２時間以内に投与されてよい。代替的実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、抗体の量および濃度を表示している密閉シールされている容器に液体形態で供給される。
【０４３７】
本明細書で提供される組成物は、中性または塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来のものなどのアニオンと形成されたものおよびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のものなどのカチオンと形成されたものが挙げられる。
【０４３８】
疾患または状態の予防、管理、処置および／または改善において有効である、本明細書で提供される予防剤もしくは治療剤（例えば、本明細書で提供される結合分子）または組成物の量は、標準的臨床技術によって決定され得る。加えて、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイは、最適な投与量範囲を決定することを助けるために使用されてもよい。製剤において使用される正確な用量は、投与の経路および疾患または状態の重症度にも依存し、開業医の判断および各患者の事情に応じて決められるべきである。
【０４３９】
有効用量は、インビトロまたは動物モデル検査システム由来の用量応答曲線から外挿され得る。
【０４４０】
ある特定の実施形態では、患者への本明細書で提供される結合分子の用量のための投与の経路は、鼻腔内、筋肉内、静脈内、またはこれらの組合せであるが、本明細書に記載の他の経路も許容される。各用量は、同一の投与の経路によって投与されてもされなくてもよい。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、複数の投与の経路を介して、本明細書で提供される同じもしくは異なる結合分子の他の用量と同時にまたは続いて投与されてよい。
【０４４１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、予防的にまたは治療的に対象に投与される。本明細書で提供される抗体は、疾患またはその症状を予防、和らげるまたは改善するために予防的にまたは治療的に対象に投与され得る。
【０４４２】
簡潔さのために、ある特定の略号が本明細書において使用される。一例は、アミノ酸残基を表すための１文字略号である。アミノ酸およびそれらの対応する３文字および１文字略号は以下のとおりである：
【０４４３】
【表Ａ】
2021517904.tif 000004
【０４４４】
本発明は、一般に、多数の実施形態を記載するために肯定的な用語を使用して本明細書に開示されている。本発明は、物質または材料、方法ステップおよび条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、プロトコール、手順、アッセイまたは分析などの特定の対象物が完全にまたは部分的に除外されている実施形態も明確に含む。したがって、本発明は、本発明が含まないものに関して本明細書において一般に表されていないが、本発明に明確に含まれるとされていない態様は、しかしながら本明細書に開示されている。
【０４４５】
本発明の多数の実施形態が記載された。しかしながら、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることは理解される。したがって、以下の実施例は、例示の目的であり、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例１】
【０４４６】
例示的結合分子のコンストラクションおよび発現
本実施例は、本明細書で提供される例示的結合分子（図１Ａ〜１Ｅに例示する）、特に、結合分子ＡＣＥ−００、ＡＣＥ−０２、ＡＣＥ−０３、ＡＣＥ−０４、ＡＣＥ−０５、ＡＣＥ−０９、ＡＣＥ−１０、ＡＣＥ−１１およびＡＣＥ−１２のコンストラクションおよび発現を例示する。例示的結合分子のそれぞれにおいて第１および第２の抗原を標的化する構成成分を下の表に要約する。
【０４４７】
表３：例示的結合分子において第１および第２の抗原を標的化する構成成分
【表３】
2021517904.tif 000005
【０４４８】
アミノ酸配列において使用する形式：
太字：ＶＨまたはＶＬ；
太字および下線：ＣＤＲ；
斜字体：抗体ヒンジ領域；
小文字：可動性リンカー；
［角括弧］：ＣＨ１；
［角括弧および下線］：ＣＬ
【０４４９】
１．１．ＡＣＥ−００のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を、その第２の抗原結合Ｆｖ領域がＴＮＦアルファに結合し、その第１の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ領域）がＨｅｒ２抗原に結合するＡＣＥ−００を発現させるために使用した（図２Ｆを参照されたい）。ＡＣＥ−００は、図１Ａに例示する例示的結合分子と同じ全体構造を有する。簡潔には、ＡＣＥ−００は、２つの異なる重鎖様鎖（ＡＣＥ−００−ＶＨおよびＡＣＥ−００−ＶＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−００−ＬＣ）を含有する。ＡＣＥ−００の抗Ｈｅｒ２ドメインをコンストラクトするために使用した親抗体は、トラスツズマブであり、ＡＣＥ−００の抗ＴＮＦアルファドメインをコンストラクトするために使用した親抗体は、アダリムマブである。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−００−ＶＨアミノ酸配列：
【化１】
2021517904.tif 000006
（配列番号１１５）
ＡＣＥ−００−ＶＬアミノ酸配列：
【化２】
2021517904.tif 000007
（配列番号１１６）
ＡＣＥ−００−ＬＣアミノ酸配列（抗ＣＤ１９抗体軽鎖）：
【化３】
2021517904.tif 000008
（配列番号１１７）
【０４５０】
Ｈｅｒ２を標的化する二価Ｆａｂ領域およびＴＮＦアルファを標的化する一価Ｆｖ領域についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を下の表に列挙する：
【０４５１】
表４：ＡＣＥ−００のＶＨおよびＶＬ
【表４】
2021517904.tif 000009
【０４５２】
ＡＣＥ−００−ＶＨ、ＡＣＥ−００−ＶＬおよびＡＣＥ−００−ＬＣをコードするＤＮＡのトリトランスフェクション（ｔｒｉ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を下に簡潔に記載のとおり実施した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクション試薬として使用した（ＤＮＡ：ＰＥＩ＝１：４（ｗ／ｗ）の比で使用）。トランスフェクション６から７日後、細胞生存率が約６０％から７０％であると測定された際に、バッチ培養を中止し、発現培地を回収し、デブリを除去するために遠心分離した（４，８００ｒｐｍ、３０分間、４℃）。次いで上清を０．２２μｍＴＯＰ−ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して濾過した。続いて、ＡＣＥ−００分子を含む濾過上清にＨｉｔｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して親和性クロマトグラフィー精製工程を行い、溶出緩衝剤変更のためにＳｌｉｄｅ−Ａ  ＬｙｚｅｒＤｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を使用し、ｐＨ７．４  ＰＢＳを用いた透析が続いた。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。精製したＡＣＥ−００分子をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）を使用してそれらの純度についても分析した。純度分析を製造者によって提供されたプロトコールを使用して実施した。
【０４５３】
対照として、ＡＣＥ−００−ＶＬおよびＡＣＥ−００−ＬＣをコードするＤＮＡのＨＥＫ−２９３細胞へのバイトランスフェクション（ｂｉ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＡＣＥ−００（２つの異なる重鎖様鎖ＡＣＥ−００−ＶＨおよびＡＣＥ−００−ＶＬを含有する）とＡＣＥ−００−ＶＬ２（２つの同一の重鎖様鎖ＡＣＥ−００−ＶＬを含有する）とのアセンブリーパターンの差異を同定するために実施した（図２Ａ〜２Ｂ）。
【０４５４】
抗体は、四量体Ｈ２Ｌ２としてアセンブルおよび分泌され、品質管理機構は、小胞体（ＥＲ）において、内腔結合タンパク質（ｌｕｍｉｎａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢｉＰ）およびタンパク質ジスルフィド異性化酵素（ＰＤＩ）などのＥＲシャペロンによって非常にしっかりと制御されている。重鎖のフォールディングしていないＣＨ１ドメインがＢｉＰ依存性様式で抗体アセンブリーの制御において役割を有することは周知である。ＢｉＰは、ＣＨ１およびＣＬのヘテロ二量体形成および、小胞体関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）の制御による抗体アセンブリーにおける品質管理機構において役割を演じている可能性がある［Lee Y. K. et al. BiP and immunoglobulin light chain cooperate to control the folding of heavy chain and ensure the fidelity of immunoglobulin assembly. Mol Biol Cell. 1999 Jul;10(7):2209-19；Feige M. J. et al. An unfolded CH1 domain controls the assembly and secretion of IgG antibodies. Mol Cell. 2009 Jun 12;34(5):569-79；Feige M. J. et al. How antibodies fold. Trends Biochem Sci. 2010 Apr;35(4):189-98、これらそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる]。ＶＨドメインとＢｉＰとの間の可能性がある相互作用を、２つの異なるＡＬｉＣＥ重鎖がＶＨ−ＶＬの特異的相互作用によってヘテロ二量体を形成できるかどうかを検討するために調査した。ＣＨ１またはＶＨ−ＣＨ１切断型重鎖、ΔＣＨ１もしくはΔＶＨ−ＣＨ１をＨＥＫ２９３細胞にクローニングし、デリバリーした。野生型ＨＣまたは切断型ＨＣコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞にデリバリーした。各トランスフェクタントから得られた細胞可溶化物を、抗Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）および抗ＢｉＰ−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＢｉＰに結合できる抗体ドメインを同定するためにプロテインＡビーズを用いて沈殿させた。
【０４５５】
いかなる具体的な機構または理論にも束縛されることなく、次の結果が得られた。共沈殿ＢｉＰがΔＣＨ１およびＷＴ−ＨＣクローントランスフェクトした可溶化物においてウエスタンブロットによって見出され、ＶＨとＢｉＰとの相互作用を示している（図２Ｃ）。さらに、分泌されたポリペプチドがΔＶＨ−ＣＨ１トランスフェクトした発現培地において検出され、ＢｉＰが重鎖のＶＨおよび／またはＣＨ１ドメインとの相互作用によって重鎖のアセンブリーおよび分泌を制御できることを示している（図２Ｃ〜２Ｅ）。潜在的に、抗体ＶＨドメインもこの研究のＢｉＰ依存性様式において抗体アセンブリーの役割を有することが見出された（図２Ｃ〜２Ｅを参照されたい）。図２Ｆに示すとおり、２つのＶＨ領域（Ｆａｂ領域に１つおよびＦｖ領域に１つ）を含有する本明細書で提供される結合分子の重鎖様鎖、すなわち、この研究でのＡＣＥ−００−ＶＨは、哺乳動物発現系において本明細書で提供される結合分子の適切なアセンブリーに寄与する。この品質管理システムがなければ、ポリペプチド鎖の多数の望ましくないさまざまな組合せが発現培地に見出されるであろう。
【０４５６】
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔをＡＣＥ−００およびＡＣＥ−００−ＶＬ２タンパク質についての親和性クロマトグラフィーのために使用した。図２Ｇに示すとおり、素通り（Ｆ．Ｔ）レーンに未結合ＡＣＥは検出されなかった。
【０４５７】
次にキャピラリー電気泳動をＡＣＥ−００−ＶＬ２とＡＣＥ−００との間の分子サイズの区別を同定するために実施した。図２Ｈでは、図（左）における各ピークのサイズは表（右）に示されている。ピーク７はＡＣＥ−００−ＶＬ／ＡＣＥ−００−ＬＣ二量体複合体を表し、ピーク８は、ＡＣＥ−００−ＶＨ／ＡＣＥ−００−ＬＣ二量体複合体を表す。ＡＣＥ−００の分子量は、ＡＣＥ−００−ＶＬ２（ピーク１２）より４ｋＤａ高かった。
【０４５８】
キャピラリー電気泳動結果もＡＣＥ−００およびＡＣＥ−００−ＶＬ２分子のコンホメーションを示した。図２Ｉに示すとおり、大部分（およそ９９％）のＡＣＥ−００分子は、ヘテロ二量体形態で存在する。次にキャピラリー等電点電気泳動を実施し、ＡＣＥ−００−ＶＨ鎖とＡＣＥ−００−ＶＬ鎖との間のヘテロ二量体化を実証した。ｐＩ値を、ＡＣＥ−００およびＡＣＥ−００−ＶＬ２のそれぞれについてｃＩＥＦによって測定した。結果を図２Ｊに示す。ＡＣＥ−００−ＶＨとＡＣＥ−００−ＶＬ鎖との間の高効率のヘテロ二量体化は、図２Ｋに示すＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびキャピラリー電気泳動結果で実証された。図２Ｌに示すとおり、少量のタンパク質凝集物がＡＣＥ−００のサイズ排除クロマトグラフィーにおいて見出され、大部分のＡＣＥ−００は、可溶性で均一な構造にあり、ヘテロ二量体化の高効率をさらに実証した。
【０４５９】
これらの結果は、ＡＣＥ−００が適切に発現され、アセンブルされたことを示している。これらの結果は、２つのＶＨ領域（Ｆａｂ領域に１つおよびＦｖ領域に１つ）を含有する本明細書で提供される結合分子の重鎖様鎖が、哺乳動物発現系における本明細書で提供される結合分子の適切なアセンブリーに寄与し、Ｆｖ領域におけるＶＨ−ＶＬ相互作用が２つの重鎖様鎖のヘテロ二量体化を促進する主な推進力であることも示している。同様の検査を下に記載する他の例示的結合分子（例えば、ＡＣＥ−０５、ＡＣＥ−１０およびＡＣＥ−１１）についても実施し、これらの分子について同じ結論に達した。
【０４６０】
１．２．ＡＣＥ−０２のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を本明細書で提供されるＡＬｉＣＥ分子ＡＣＥ−０２を発現させるために使用した。ＡＣＥ−０２は、抗ＣＤ１９およびヒト化抗ＣＤ３  １２Ｆ６ドメインからなる。ＡＣＥ−０２は、２つの異なる重鎖様鎖（ＡＣＥ−０２−ＶＨおよびＡＣＥ−０２−ＶＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−０２−ＬＣ）を含有する。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＡＣＥ−０２−ＶＨアミノ酸配列：
【化４】
2021517904.tif 000010
（配列番号８８）
ＡＣＥ−０２−ＶＬアミノ酸配列：
【化５】
2021517904.tif 000011
（配列番号８９）
ＡＣＥ−０２−ＬＣアミノ酸配列（抗ＣＤ１９抗体軽鎖）：
【化６】
2021517904.tif 000012
（配列番号９０）
【０４６１】
ＣＤ１９を標的化する第１の抗原結合ドメイン二価Ｆａｂ領域およびヒト化１２Ｆ６の第２の抗原結合ドメイン一価Ｆｖ領域についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列ならびにそのＣＤＲ配列を下の表に列挙する：
【０４６２】
表５：ＡＣＥ−０２のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ
【表５】
2021517904.tif 000013
【０４６３】
ＡＣＥ−０２−ＶＨ、ＡＣＥ−０２−ＶＬおよびＡＣＥ−０２−ＬＣをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−０２−ＶＨヌクレオチド配列：
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccGCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTACACCAAGTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGCTTCACCATCAGCGCCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGGCGTGTACTTCTGCGCCCGCTGGCAGGACTACGACGTGTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA（配列番号１００）
ＡＣＥ−０２−ＶＬヌクレオチド配列：
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTTCTGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA（配列番号１０１）
ＡＣＥ−０２−ＬＣヌクレオチド配列（抗ＣＤ１９抗体軽鎖ヌクレオチド配列）：
GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA（配列番号１０２）
【０４６４】
図３では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、ＡＣＥ−０２、ＡＣＥ−０３、ＡＣＥ−００およびＡＣＥ−０１の発現を示している。ＡＣＥ−０２とＡＣＥ−０２−ＶＬ２とのアセンブリーパターンにおける差異ならびにＡＣＥ−０３とＡＣＥ−０３−ＶＬ２とのアセンブリーパターンにおける差異も示している。ＡＣＥ−０１は、第１の抗原を標的化する抗ＣＤ１９  Ａｂの親抗体および第２の抗原を標的化するマウスＯＫＴ３を有する。これらの結果は、ＡＣＥ−０２が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。
【０４６５】
１．３．ＡＣＥ−０３のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を本明細書で提供されるＡＬｉＣＥ分子ＡＣＥ−０３を発現させるために使用した。ＡＣＥ−０３は、抗ＣＤ１９およびヒト化抗ＣＤ３  ＯＫＴ３ドメインからなる。ＡＣＥ−０３は、２つの異なる重鎖様鎖（ＡＣＥ−０３−ＶＨおよびＡＣＥ−０３−ＶＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−０３−ＬＣ）を含有する。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−０３−ＶＨアミノ酸配列：
【化７】
2021517904.tif 000014
（配列番号９１）
ＡＣＥ−０３−ＶＬアミノ酸配列：
【化８】
2021517904.tif 000015
（配列番号９２）
ＡＣＥ−０３−ＬＣアミノ酸配列（抗ＣＤ１９抗体軽鎖）：
【化９】
2021517904.tif 000016
（配列番号９０）
【０４６６】
ＣＤ１９を標的化する第１の抗原結合ドメイン二価Ｆａｂ領域およびヒト化ＯＫＴ３の第２の抗原結合ドメイン一価Ｆｖ領域についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列ならびにそのＣＤＲ配列を下の表に列挙する：
【０４６７】
表６：ＡＣＥ−０３のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ
【表６】
2021517904.tif 000017
【０４６８】
ＡＣＥ−０３−ＶＨ、ＡＣＥ−０３−ＶＬおよびＡＣＥ−０３−ＬＣをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−０３−ＶＨヌクレオチド配列：
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGGTGAAGGACCGCTTCACCATCAGCACCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA（配列番号１０３）
ＡＣＥ−０３−ＶＬヌクレオチド配列：
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA（配列番号１０４）
ＡＣＥ−０３−ＬＣヌクレオチド配列（抗ＣＤ１９抗体軽鎖ヌクレオチド配列）：
GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA（配列番号１０２）
【０４６９】
図３では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、ＡＣＥ−０２、ＡＣＥ−０３、ＡＣＥ−００およびＡＣＥ−０１の発現を示している。ＡＣＥ−０２とＡＣＥ−０２−ＶＬ２とのアセンブリーパターンにおける差異およびＡＣＥ−０３とＡＣＥ−０３−ＶＬ２とのアセンブリーパターンにおける差異も示している。これらの結果は、ＡＣＥ−０３が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。
【０４７０】
１．４．ＡＣＥ−０４のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を本明細書で提供されるＡＬｉＣＥ分子ＡＣＥ−０４を発現させるために使用した。ＡＣＥ−０４は、抗ＰＤ−Ｌ１およびキメラＯＫＴ３  Ｆａｂドメインからなる（図４Ａを参照されたい）。ＡＣＥ−０４は、２つの異なる重鎖様鎖ＡＣＥ−０４−ＶＨ（ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＨ１）およびＡＣＥ−０４−ＶＬ（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−０４−ＬＣ）を含有する。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＡＣＥ−０４−ＶＨアミノ酸配列：
【化１０】
2021517904.tif 000018
（配列番号９３）
ＡＣＥ−０４−ＶＬアミノ酸配列：
【化１１】
2021517904.tif 000019
（配列番号９４）
ＡＣＥ−０４−ＬＣアミノ酸配列（抗ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖）：
【化１２】
2021517904.tif 000020
（配列番号９５）
【０４７１】
ＰＤ−Ｌ１を標的化する第１の抗原結合ドメイン二価Ｆａｂ領域およびキメラＯＫＴ３  Ｆａｂ領域の第２の抗原結合ドメイン一価Ｆｖ領域についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列ならびにそのＣＤＲ配列を下の表に列挙する：
【０４７２】
表７：ＡＣＥ−０４のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ
【表７】
2021517904.tif 000021
【０４７３】
ＡＣＥ−０４−ＶＨ、ＡＣＥ−０４−ＶＬおよびＡＣＥ−０４−ＬＣをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−０４−ＶＨヌクレオチド配列：
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGAGCCGAGCTCGCCAGGCCAGGAGCCTCCGTCAAAATGTCATGCAAGGCCTCAGGGTACACATTTACGCGATATACCATGCACTGGGTGAAACAAAGACCAGGTCAGGGACTTGAATGGATCGGTTACATTAACCCCTCTAGAGGCTATACGAATTACAACCAGAAATTCAAAGACAAAGCAACACTTACGACTGACAAATCCAGTAGTACGGCTTACATGCAGCTCTCATCTTTGACTTCAGAAGACTCTGCTGTATATTATTGTGCCCGCTATTACGATGACCATTACTGCCTTGATTACTGGGGCCAGGGCACTACTGTTACCGTAAGTGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTTGA（配列番号１０５）
ＡＣＥ−０４−ＶＬヌクレオチド配列：
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGATCGTCCTCACTCAAAGTCCTGCTATTATGTCCGCAAGCCCTGGTGAAAAGGTTACCATGACTTGCTCCGCATCTAGTTCTGTCTCTTACATGAACTGGTACCAGCAAAAGTCTGGAACGTCCCCGAAAAGGTGGATATATGATACGAGCAAATTGGCAAGCGGAGTACCCGCGCATTTTAGGGGTTCAGGCAGCGGTACGTCATATAGCCTGACTATTAGCGGAATGGAGGCGGAGGATGCTGCAACATATTATTGCCAACAATGGTCATCAAATCCTTTTACTTTCGGCTCAGGCACAAAACTTGAAATAAATAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGcTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA（配列番号１０６）
ＡＣＥ−０４−ＬＣ（抗ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖ヌクレオチド配列）：
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG（配列番号１０７）
【０４７４】
図４Ｃにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、ＡＣＥ−０４およびＡＣＥ−０５の発現、ＡＣＥ−０４とＡＣＥ−０４−ＶＬ２とのアセンブリーパターンにおける差異ならびにＡＣＥ−０５とＡＣＥ−０５−ＶＬ２とのアセンブリーパターンにおける差異を示している。結果は、ＡＣＥ−０４が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。
【０４７５】
１．５．ＡＣＥ−０５のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を本明細書で提供される別のＡＬｉＣＥ分子ＡＣＥ−０５（抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ３ドメインからなる結合分子；図４Ｂを参照されたい）を発現させるために使用した。ＡＣＥ−０５は、２つの異なる重鎖様鎖（ＡＣＥ−０５−ＶＨおよびＡＣＥ−０５−ＶＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−０５−ＬＣ）を含有する。ＡＣＥ−０５は、可動性ペプチド領域中にＧ４Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列、配列番号１１２）を含有する。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−０５−ＶＨアミノ酸配列：
【化１３】
2021517904.tif 000022
（配列番号１）
ＡＣＥ−０５−ＶＬアミノ酸配列：
【化１４】
2021517904.tif 000023
（配列番号２）
ＡＣＥ−０５−ＬＣアミノ酸配列：
【化１５】
2021517904.tif 000024
（配列番号３）
【０４７６】
ＰＤ−Ｌ１を標的化する第１の抗原結合ドメイン二価Ｆａｂ領域およびＣＤ３を標的化する第２の抗原結合ドメイン一価Ｆｖ領域についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列およびそのＣＤＲ配列を下の表に列挙する：
【０４７７】
表８：ＡＣＥ−０５のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ
【表８】
2021517904.tif 000025
【０４７８】
トリトランスフェクションをＡＣＥ−０５−ＶＨ、ＡＣＥ−０５−ＶＬおよびＡＣＥ−０５−ＬＣのＤＮＡを用いて（０．５：０．５：１ｗ／ｗ比）宿主細胞をトランスフェクトするために実施した。ＡＣＥ−０５−ＶＨ、ＡＣＥ−０５−ＶＬおよびＡＣＥ−０５−ＬＣをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−０５−ＶＨヌクレオチド配列：
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA（配列番号２０）
ＡＣＥ−０５−ＶＬヌクレオチド配列：
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA（配列番号２１）
ＡＣＥ−０５−ＬＣヌクレオチド配列：
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGAaccGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA（配列番号２２）
【０４７９】
トランスフェクションを上のセクション１．１に記載のとおり実施した。さらに具体的には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクション試薬として使用した（ＤＮＡ：ＰＥＩ＝１：４（ｗ／ｗ）の比で使用）。トランスフェクション６から７日後、細胞生存率が約６０％から７０％であると測定された際に、バッチ培養を中止し、発現培地を回収し、デブリを除去するために遠心分離した（４，８００ｒｐｍ、３０分間、４℃）。次いで上清を０．２２μｍＴＯＰ−ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して濾過した。続いてＡＣＥ−０５分子を含む濾過上清にＨｉｔｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を使用する親和性クロマトグラフィー精製工程を行い、溶出緩衝剤交換のためにＳｌｉｄｅ−Ａ  Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を使用し、ｐＨ７．４  ＰＢＳを用いた透析が続いた。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。ＨＥＫ−２９３Ｆ一過性発現系を使用した発現のレベルは、この実験ではおよそ５０ｍｇ／Ｌであると判定された。Ｈｉｔｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔを使用する精製アッセイは、培地に発現された大部分の分子が回収されたことを示した。精製されたＡＣＥ−０５分子をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）を使用してそれらの純度についても分析した。純度分析を製造者によって提供されたプロトコールを使用して実施した。
【０４８０】
図４Ｃにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、ＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０４の発現、ＡＣＥ−０５とＡＣＥ−０５−ＶＬ２とのアセンブリーパターンにおける差異ならびにＡＣＥ−０４とＡＣＥ−０４−ＶＬ２とのアセンブリーパターンにおける差異を示している。図４Ｄは、ＡＣＥ−０５（上）のアセンブリーパターンを同定するために実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ＡＣＥ−０５アセンブリーにおける可能な制御機構を例示している。
【０４８１】
図４Ｅ〜４Ｆは、ＡＣＥ−０５のコンホメーションおよびＡＣＥ−０５−ＶＨとＡＣＥ−０５−ＶＬ鎖との間のヘテロ二量体化効率を同定するために実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびキャピラリー電気泳動を示している。図４Ｅ〜４Ｆの左パネルは、精製されたＡＣＥ−０５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示している。図４Ｅの左パネルは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔを使用したＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０５−ＶＬ２タンパク質についての親和性クロマトグラフィーの結果を示している。図４Ｅ〜４Ｆの右の４つのパネルは、ほとんど同じ量のＡＣＥ−０５−ＶＨおよびＡＣＥ−０５−ＶＬ鎖、ＡＣＥ−０５−ＬＣの量およびＡＣＥ−０５−ＶＨとＡＣＥ−０５−ＶＬ鎖との間の高効率のヘテロ二量体化を示している。キャピラリー電気泳動結果も、ＡＣＥ−０５が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。図４Ｇは、ＡＣＥ−０５の純度を同定するために実施したサイズ排除クロマトグラフィーを示している。示すとおり、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ精製した試料は、遊離軽鎖を含有している。次いで第２のゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）ステップを遊離軽鎖を除去するために適用し、純粋で適切にアセンブルされたＡＣＥ−０５分子を生じた。予測されたとおり、ＡＣＥ−０５−ＶＨおよびＡＣＥ−０５−ＬＣの二量体ならびにＡＣＥ−０５−ＶＬおよびＡＣＥ−０５−ＬＣの二量体がＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像のＮＲレーンに観察された。ＡＣＥ−０５−ＶＨとＡＣＥ−０５−ＶＬとの間の疎水性相互作用は、ＳＤＳ界面活性剤によって破壊された。
【０４８２】
図４Ｈは、ＡＣＥ−０５のゲル濾過分析のためのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示している。ゲル濾過分析をｋａｐｐａｓｅｌｅｃｔ親和性精製後のＡＣＥ−０５コンホメーションを検討するために実施した。ＡＣＥ−０５の約１９％凝集がＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ａカラムクロマトグラフィーによって検出された。図４Ｉは、ＡＣＥ−０５の構造的コンホメーションを同定するために実施した陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）の結果を示している。ゲル濾過から単離された主なピークをＣＥＸカラムを通して分析し、２つのピークに分離した。高い方のピーク（６７．８７％）は、アセンブルしたＡＣＥ−０５であり、低い方のピーク（３２％）は、ヒンジ領域に遊離チオール基を有するＡＣＥ−０５−ＶＨ鎖である。
【０４８３】
１．６．ＡＣＥ−０９のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を上のセクションにおいて記載したのと同様の方法を使用して、ＡＣＥ−０９（抗ＰＤ−Ｌ１およびＵＣＨＴ１ドメインからなる結合分子）の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ＡＣＥ−０９は、２つの異なる重鎖様鎖（ＡＣＥ−０９−ＶＨおよびＡＣＥ−０９−ＶＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−０９−ＬＣ）を含有する（図５下）。ＡＣＥ−０５と比較して、ＡＣＥ−０９は、ＡＣＥ−０５が可動性ペプチド領域に含有するＧ４Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列）を含有しない（図５下）。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は下のとおりである：
ＡＣＥ−０９−ＶＨアミノ酸配列（Ｇ４Ｓリンカーを含まない）：
【化１６】
2021517904.tif 000026
（配列番号９６）
ＡＣＥ−０９−ＶＬアミノ酸配列（Ｇ４Ｓリンカーを含まない）：
【化１７】
2021517904.tif 000027
（配列番号９７）
ＡＣＥ−０９−ＬＣアミノ酸配列（抗ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖）：
【化１８】
2021517904.tif 000028
（配列番号９５）
【０４８４】
ＰＤ−Ｌ１を標的化する二価Ｆａｂ領域およびＵＣＨＴ１についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列ならびにそのＣＤＲ配列を下の表に列挙する：
【０４８５】
表９：ＡＣＥ−０９のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ
【表９】
2021517904.tif 000029
【０４８６】
ＡＣＥ−０９−ＶＨ、ＡＣＥ−０９−ＶＬおよびＡＣＥ−０９−ＬＣをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−０９−ＶＨヌクレオチド配列（Ｇ４Ｓリンカーを含まない）：
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA（配列番号１０８）
ＡＣＥ−０９−ＶＬヌクレオチド配列（Ｇ４Ｓリンカーを含まない）：
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA（配列番号１０９）
ＡＣＥ−０９−ＬＣヌクレオチド配列（抗ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖ヌクレオチド配列）：
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG（配列番号１０７）
【０４８７】
図５は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔを使用するＡＣＥ−０９の親和性クロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果ならびに３７℃および３２℃でのＡＣＥ−０９およびＡＣＥ−０５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。結果は、ＡＣＥ−０９が適切に発現され、アセンブルされたことを示している。さらに、ＡＣＥ−０９は、ＡＣＥ−０５と同じＶＨおよびＶＬをＦａｂおよびＦｖ領域中に有する（表８および９に示す）が、ＡＣＥ−０９は、ＡＣＥ−０５において抗体ヒンジ領域と第２のＦｖドメインとの間にＧ４Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列）を含有しない（図５下）。Ｇ４Ｓ可動性リンカーは、立体障害を低減し、第２のＦｖドメインの免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含むエフェクター細胞）への結合を最適化でき、それにより免疫細胞の標的細胞（例えば、がん細胞）への再方向付け効率の増加をもたらす。予想外に、ＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０９は、同様のレベルの発現を示し、Ｇ４ＳリンカーがＡＬｉＣＥ分子の活性に、それらの発現およびアセンブリーに影響を与えることなく、役立つ可動性を与え得ることを示唆している。
【０４８８】
１．７．ＡＣＥ−１０のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）も上のセクション１．１およびセクション１．２に記載されたのと同様の方法を使用してＡＣＥ−１０（抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３ドメインからなる結合分子；図６Ａを参照されたい）の適切な発現およびアセンブリーを実証するために使用した。ＡＣＥ−１０は、２つの異なる重鎖様鎖（ＡＣＥ−１０−ＶＨおよびＡＣＥ−１０−ＶＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−１０−ＬＣ）を含有する。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−１０−ＶＨアミノ酸配列：
【化１９】
2021517904.tif 000030
（配列番号２３）
ＡＣＥ−１０−ＶＬアミノ酸配列：
【化２０】
2021517904.tif 000031
（配列番号２４）
ＡＣＥ−１０−ＬＣアミノ酸配列：
【化２１】
2021517904.tif 000032
（配列番号２５）
【０４８９】
ＣＤ２０を標的化する二価Ｆａｂ領域およびＣＤ３を標的化する一価Ｆｖ領域についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列ならびにそのＣＤＲ配列を下の表に列挙する：
【０４９０】
表１０：ＡＣＥ−１０のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ
【表１０】
2021517904.tif 000033
【０４９１】
ＡＣＥ−１０−ＶＨ、ＡＣＥ−１０−ＶＬおよびＡＣＥ−１０−ＬＣをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−１０−ＶＨヌクレオチド配列：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA（配列番号３４）
ＡＣＥ−１０−ＶＬヌクレオチド配列：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA（配列番号３５）
ＡＣＥ−１０−ＬＣヌクレオチド配列：
CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCtGCtATCCTGAGCGCCAGCCCtGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGAGTGCCTGTGCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGACGCCGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG（配列番号３６）
【０４９２】
図６Ｂ〜６Ｃは、ＡＣＥ−１０分子の発現分析を示す。示されるとおり、ＡＣＥ−１０は、適切に発現され、アセンブルされた。加えて、結果は、ＡＣＥ−１０のアセンブリーがＶＨ−ＢｉＰ依存性様式で制御されることを示している。
【０４９３】
１．８．ＡＣＥ−１１のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を、上のセクション１．１およびセクション１．２に記載されたのと同様の方法を使用してＡＣＥ−１１（抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ３ドメインからなる結合分子；図７Ａを参照されたい）の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ＡＣＥ−１１は、ＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−１０と同じ全体構造を有し、２つの異なる重鎖様鎖（ＡＣＥ−１１−ＶＨおよびＡＣＥ−１１−ＶＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−１１−ＬＣ）を含有する。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−１１−ＶＨアミノ酸配列：
【化２２】
2021517904.tif 000034
（配列番号３７）
ＡＣＥ−１１−ＶＬアミノ酸配列：
【化２３】
2021517904.tif 000035
（配列番号３８）
ＡＣＥ−１１−ＬＣアミノ酸配列：
【化２４】
2021517904.tif 000036
（配列番号３９）
【０４９４】
ＥＧＦＲを標的化する第１の抗原結合ドメイン二価Ｆａｂ領域およびＣＤ３を標的化する第２の抗原結合ドメイン一価Ｆｖ領域についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列ならびにそのＣＤＲ配列を下の表に列挙する：
【０４９５】
表１１：ＡＣＥ−１１のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ
【表１１】
2021517904.tif 000037
【０４９６】
ＡＣＥ−１１−ＶＨ、ＡＣＥ−１１−ＶＬおよびＡＣＥ−１１−ＬＣをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−１１−ＶＨヌクレオチド配列：
CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA（配列番号４８）
ＡＣＥ−１１−ＶＬヌクレオチド配列：
CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA（配列番号４９）
ＡＣＥ−１１−ＬＣヌクレオチド配列：
GATATTCTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATCCTGAGTGTTTCCCCGGGCGAACGTGTGTCATTTTCGTGTCGCGCGAGCCAGTCTATTGGTACCAATATCCACTGGTATCAGCAACGTACGAACGGCTCTCCGCGCCTGCTGATTAAATACGCCAGTGAATCCATTTCAGGCATCCCGAGCCGCTTTTCGGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACGCTGAGTATTAACTCCGTGGAATCAGAAGATATCGCAGACTATTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCGACCACGTTTGGTGCTGGCACCAAACTGGAACTGAAAAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA（配列番号５０）
【０４９７】
図７Ｂは、ＡＣＥ−１１およびＡＣＥ−１１−ＶＬ２の発現およびアセンブリーを示す。矢印は、アセンブルしたＡＣＥ−１１のバンドを示す。結果は、ＡＣＥ−１１が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。
【０４９８】
１．９．ＡＣＥ−１２のコンストラクションおよび発現
ＨＥＫ−２９３一過性発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を、上のセクションに記載したのと同様の方法を使用してＡＣＥ−１２（抗ＰＤ−Ｌ１およびＵＣＨＴ１ドメインからなる結合分子）の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ＡＣＥ−１２は、２つの異なる重鎖様鎖（ＡＣＥ−１２−ＶＨおよびＡＣＥ−１２−ＶＬ）ならびに２つの同一の軽鎖（ＡＣＥ−１２−ＬＣ）を含有する。ＡＣＥ−１２は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１３）およびＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を有するＧ４Ｓリンカーを含有する、一方でＡＣＥ−０５は、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を可動性ペプチド領域に有するＧ４Ｓリンカーを含有する。これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−１２−ＶＨアミノ酸配列（１０残基ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む）：
【化２５】
2021517904.tif 000038
（配列番号９８）
ＡＣＥ−１２−ＶＬアミノ酸配列（９残基ＧＧＳＧＧＧＧＳＧを含む）：
【化２６】
2021517904.tif 000039
（配列番号９９）
ＡＣＥ−１２−ＬＣアミノ酸配列（抗ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖）：
【化２７】
2021517904.tif 000040
（配列番号９５）
【０４９９】
ＰＤ−Ｌ１を標的化する第１の抗原結合ドメイン二価Ｆａｂ領域およびＵＣＨＴ１の第２の抗原結合ドメイン一価Ｆｖ領域についてのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列ならびにそのＣＤＲ配列を下の表に列挙する：
【０５００】
表１２：ＡＣＥ−１２のＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ
【表１２】
2021517904.tif 000041
【０５０１】
ＡＣＥ−１２−ＶＨ、ＡＣＥ−１２−ＶＬおよびＡＣＥ−１２−ＬＣをコードするＤＮＡ配列は以下のとおりである：
ＡＣＥ−１２−ＶＨヌクレオチド配列（１０残基ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む）：
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGGAGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA（配列番号１１０）
ＡＣＥ−１２−ＶＬヌクレオチド配列（９残基ＧＧＳＧＧＧＧＳＧを含む）：
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGATCCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA（配列番号１１１）
ＡＣＥ−１２−ＬＣヌクレオチド配列（抗ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖ヌクレオチド配列）：
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG（配列番号１０７）
【０５０２】
図８は、ＡＣＥ−１２、ＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０９のアセンブリーを同定するために実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。結果は、ＡＣＥ−１２が適切に発現され、アセンブルされたことを示している。さらに、ＡＣＥ−１２、ＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０９は、ＦａｂおよびＦｖ領域中に同じＶＨおよびＶＬを有し（表８、９および１２に示す）、それらの構造は抗体ヒンジ領域と第２のＦｖドメインとの間のＧ４Ｓリンカーの長さにおいて異なっている（図８下）。Ｇ４Ｓ可動性リンカーは、立体障害を低減でき、第２のＦｖドメインの免疫細胞（例えば、Ｔ細胞を含むエフェクター細胞）への結合を最適化でき、それにより免疫細胞の標的細胞（例えば、がん細胞）への再方向付け効率の増加をもたらす。予想外に、ＡＣＥ−１２、ＡＣＥ−０５およびＡＣＥ−０９は、同様のレベルの発現を示した。長さが異なるリンカーは、それらの発現およびアセンブリーに影響を与えることなくＡＬｉＣＥ分子の活性に役立つ異なるレベルの可動性を与えることができる。
【０５０３】
要約すると、上の実験は、本明細書で提供される例示的結合分子の良好なコンストラクションおよび発現を例示し、これらのＡＬｉＣＥ分子が適切に発現され、アセンブルされ得ることを示している。
【実施例２】
【０５０４】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用する例示的結合分子の結合親和性の分析
ＡＣＥ−００およびＡＣＥ−００−ＶＬ２のＴＮＦアルファへの親和性を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。Ｂｍａｘは、実験結果から外挿された最大結合親和性である（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ７で提供されるカーブフィッティング法を使用した算出した）。図９に示すとおり、親抗体アダリムマブのＴＮＦアルファへのＫＤは、１．１２５ｎＭであると判定され；ＴＮＦアルファに対して一価結合ドメインだけを有するＡＣＥ−００のＫＤは、３０．０３ｎＭであると判定され；ＡＣＥ−００−ＶＬホモ二量体からなるＡＣＥ−００−ＶＬ２は、ＴＮＦアルファに対して親和性を有さないことが決定された。
【０５０５】
各抗原（例えば、ＡＣＥ−０５についてのＰＤ−Ｌ１およびＣＤ３）へのＡＣＥ−０５および対照抗体の親和性をＥＬＩＳＡを使用して測定した。さらに詳細には、ヒトＰＤ−Ｌ１（ＹＢＬ−００７、Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．により作製）およびＣＤ３（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）などの抗原を免疫プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に１から１０μｇ／ｍｌ（１００から１０００ｎｇ／ウエル）の濃度でｐＨ７．４  ＰＢＳをコーティング緩衝剤として使用して４℃、一晩固定した。翌日、プレートを２００μｌのＰＢＳＴを用いて１度洗浄し、次いで表面ブロッキングを室温で５％脱脂粉乳を用いて１〜２時間実施した。続いて、各ウエルを２００μｌのＰＢＳＴを用いて２回洗浄後、ＡＣＥ−０５および対照抗体を１／２から１／５の比で希釈し、室温で１〜２時間反応させた。次いで各ウエルを未結合試料を除去するために２００μｌのＰＢＳＴを用いて３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を室温での反応のためにウエルに１：１０００の比で加えた。２００ｕｌのＰＢＳＴを用いた３回洗浄後、ＨＲＰの呈色反応を１００μｌ／ウエルの容量でＴＭＢ溶液（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して誘導した。反応を停止溶液（２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４、１００μｌ／ウエル）を使用することによって終結させた。分光光度計を結合親和性を算出するためにＡ４５０の波長での吸光度を測定するために使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ７をＡＣＥ−０５および他の対照抗体とそれらそれぞれの標的との親和性を分析するために使用した。結果を図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃに示す。
【０５０６】
ＡＣＥ−０９、ＡＣＥ−０５および対照抗体のＣＤ３への親和性を上に記載のものと同様の方法を使用して測定した。図１１に示すとおり、ＡＣＥ−０９は、ＡＣＥ−０５と同様のレベルの結合親和性を示した。
【実施例３】
【０５０７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用するＡＣＥ−０５の結合動態の分析
ＡＣＥ−０５のヒトＰＤ−Ｌ１およびＣＤ３への結合動態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を使用して測定した。ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＱＫｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を使用する標識フリー動態（タンパク質−タンパク質相互作用）の測定をヒトＰＤ−Ｌ１について抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）、およびＣＤ３εδ鎖についてアミン反応性（ＡＲＧ２）バイオセンサーを使用して実施した。ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ３εδをそれらそれぞれのバイオセンサー表面に固定し、さまざまな濃度に動態緩衝剤を用いて希釈したＡＣＥ−０５を用いて連続的に反応させた。センサーグラムを経時的に回収した。ＡＣＥ−０５［すなわち、抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体（ＹＢＬ−００７、当技術分野において周知の従来の方法を使用して所内で産生）を作製するために使用した親抗体と抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡから）］とを検査し、この実験においてＡＣＥ−０５と比較した。図１２Ａ〜１２Ｃに示すとおり、ＡＣＥ−０５のヒトＰＤ−Ｌ１への結合動態は親抗ＰＤ−Ｌ１抗体（すなわちＹＢＬ−００７、Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．から）に匹敵し、ＫＤは１．０９×１０−１１未満であった（図１２Ａ〜１２Ｃを参照されたい）。対照的におよび予測されたとおり、ＡＣＥ−０５のＣＤ３への結合親和性は、親抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡからのＵＣＨＴ１）よりさらに低く、ＫＤは６．８２×１０−９であると判定された（図５Ｃを参照されたい）。図１２Ａ〜１２Ｃに示すとおり、ＡＣＥ−０５の結合動態を二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、すなわち、ＢｉＴＥ−０５とも比較した。ＢｉＴＥは、異なる抗体の２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質を、約５５キロダルトンの単一ペプチド鎖上に生成する既存の二重特異性抗体技術である。ＢｉＴＥ技術のさらに詳細な記載は、例えば、Huehls et al., Immunol Cell Biol., 2015, 93(3): 290-296；Baeuerle et al., Drug Discovery Today, 2005, 10: 1237-1244;およびKufer et al., Trends in Biotechnology, 2004, 22(5): 238-244に見出すことができる。ＡＣＥ−０５は、ＢｉＴＥ−０５よりもヒトＰＤ−Ｌ１により高い親和性を有することが実証された。一方、ＡＣＥ−０５は、ＢｉＴＥ−０５よりもＣＤ３に低い親和性を有することが実証され、それによりＢｉＴＥ−０５よりも少ない細胞傷害性を有することが予測された。
【０５０８】
図１２Ｄでは、標識フリー動態ＯＣＴＥＴ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）をＡＣＥ−０５のｈＰＤ−Ｌ１およびｈＣＤ３の同時結合を検討するために使用した。リガンドとして、ヒスチジン標識組換えリガンドタンパク質（例えば、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｉｓ、ｈＣＤ３εδ−ｈｉｓ）およびＦｃ−標識組換えリガンドタンパク質（例えば、ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、ｈＣＤ３εδ−Ｆｃ）を調製した。第１の抗原をバイオセンサーチップ上に捕捉（固定）するために、ヒスチジン捕捉ＮＴＡチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を使用した。第１のリガンドがＮＴＡチップ上に完全に捕捉された後、動態緩衝剤を用いて希釈したＡＣＥ−０５を分析した。続いて、動態緩衝剤に同様に希釈した第２のリガンドもＡＣＥ−０５の第２のリガンドへの同時結合を評価するために分析した。
【実施例４】
【０５０９】
Ｔ細胞再方向付け（活性）およびＴ細胞細胞傷害性
ＡＣＥ−０５をＴ細胞を再方向付けるおよび活性化するその活性について検査した。Ｔ細胞再方向付け（活性）アッセイにおいて、ＰＤ−Ｌ１を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｅ−ＰＤ−Ｌ１細胞系を生成し、抗原ドナーとして使用した。ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターシステムを含有するように操作したＣＤ３陽性ジャーカット細胞系をエフェクター細胞（ジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞、当技術分野において周知の従来の方法を使用して所内で産生した）として使用した。
【０５１０】
次いで、ＦＡＣＳ解析を上に述べた細胞系でＰＤ−Ｌ１およびＣＤ３発現レベルを決定するために使用した。ＨＥＫ２９３Ｅ−ＰＤ−Ｌ１細胞および親ＨＥＫ２９３Ｅ細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現レベルを図１３Ａ（右パネル）に示す。種々のＣＤ３抗体によって測定したジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞におけるＣＤ３発現レベルも図１３Ａ（左パネル）に示す。
【０５１１】
Ｔ細胞再方向付け（活性）アッセイを以下のとおり実施した：ＨＥＫ２９３Ｅ細胞およびＨＥＫ２９３Ｅ−ＰＤ−Ｌ１細胞（細胞７×１０４個／ウエル）をポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）コート白底プレートに播種し、２４時間インキュベートした。翌日、ジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞（細胞１．４×１０５個／ウエル）をＡＣＥ−０５、ＵＣＨＴ１（親抗ＣＤ３抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡから）および対照分子の系列希釈物を用いて処置し、次に３７℃、７時間インキュベートした。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）をジャーカット活性化の程度を検出するために実施した。ＡＣＥ−０５の場合、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用遮断およびＰＤ−Ｌ１標的化Ｔ細胞再方向付けの両方の相乗効果を同定するために、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイをＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して実施した。データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して処理し、分析した。
【０５１２】
図１３Ｂに示すとおり、ＰＤ−Ｌ１（ＨＥＫ２９３Ｅ−ＰＤ−Ｌ１細胞）を発現する標的細胞を使用する場合、ＡＣＥ−０５はエフェクターＴ細胞（ジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞）を活性化できた一方で；ＰＤ−Ｌ１（ＨＥＫ２９３Ｅ）を発現しない標的細胞を使用した場合、エフェクターＴ細胞は、ＡＣＥ−０５によって効果的に活性化され得なかった。これらの結果は、ＡＣＥ−０５がＴ細胞の標的細胞依存性活性化を実証することを示している。この研究ではＡＣＥ−０５をＢｉＴＥ−０５とも比較した。図１３Ｂに示すとおり、ＡＣＥ−０５は、ＰＤ−Ｌ１の存在下でＢｉＴＥ−０５よりもさらに効率的なＴ細胞活性化を実証した。しかし、ＰＤ−Ｌ１の非存在下では、ＢｉＴＥ−０５の存在でのＴ細胞活性化は、ＡＣＥ−０５より高かった。したがって、ＢｉＴＥ−０５は、ＡＣＥ−０５よりも高い細胞非依存性Ｔ細胞活性化を示している。
【０５１３】
図１３Ｃは、図１３Ｂと同じデータであり、それぞれＰＤ−Ｌ１を含んでまたは含まずに、ＡＣＥ−０５（左パネル）およびＢｉＴＥ−０５（右パネル）について別々にプロットしており、ＡＣＥ−０５媒介Ｔ細胞活性化のダイナミックレンジがＢｉＴＥ−０５媒介Ｔ細胞活性化よりも十分高く（縦点線矢印によって示されている）、図１３Ｂからの観察と一致することを示している。図１３Ｄ〜１３Ｅは、図１３Ｃに示した同じデータを使用して、ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５の標的媒介（ＰＤ−Ｌ１を発現するＨＥＫ）Ｔ細胞活性化だけを示している。
【０５１４】
がんに対するＴ細胞応答は、がん免疫サイクルにおいて変動する。ＨＣＣ８２７  ＰＤ−Ｌ１陽性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および、ＰＤ−１発現を有するまたは有さないジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞をがんに対するＴ細胞応答を測定するために使用した。図１３Ｆにおいて、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化段階をＪｕｒｋａｔ−ＰＤ−１［−］と表し、Ｔ細胞の休止およびトレランス段階をＪｕｒｋａｔ−ＰＤ−１［＋］を表した。示すとおり、結果は、ＡＣＥ−０５の抗がん有効性がＴ細胞の両方の発達段階においてＢｉＴＥ−０５よりもさらに高いと予測されることを示している。
【０５１５】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用およびＰＤ−Ｌ１標的化Ｔ細胞再方向付けの両方を遮断することの相乗効果を同定するために、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）をＡＣＥ−０５の生物学的能力を測定するために使用した。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイを製造者によって提供される次のプロトコールに従って実施した。ＡＣＥ−０５がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用およびＴ細胞再方向付けを遮断できることを実証している、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイの結果を図１３Ｇに示す。図１３Ｈは、ＢｉＴＥ−０５と並べて比較した場合に、同時のＰＤ−Ｌ１遮断およびＴ細胞再方向付けの相乗効果のためにＡＣＥ−０５が最も高いＴ細胞活性化シグナルを示すことをさらに示している。ＹＢＬ−００７は抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり、ＵＣＨＴ１は抗ＣＤ３抗体である。
【０５１６】
加えて、図１３Ｉに示すとおり、ＡＣＥ−０５は、抗ＣＤ３抗体よりも標的非依存性Ｔ細胞活性化をあまり示さない。この結果は、親抗ＣＤ３抗体と比較してＣＤ３へのＡＣＥ−０５の低く観察された親和性と一致している。したがって、これらの結果は、一価抗ＣＤ３ドメイン単独がＴ細胞を活性化するために不十分であることから、ＡＣＥ−０５が抗ＣＤ３抗体よりも低い細胞傷害性を呈することを示している。図１３Ｊは、ＡＣＥ−０５とＢｉＴＥ−０５とを並べて比較する同じアッセイからのデータを示し、ＢｉＴＥ−０５のＣＤ３に対する親和性がＡＣＥ−０５のものよりもさらに高いことからＢｉＴＥ−０５がＰＤ−Ｌ１標的の非存在下で最も高いＴ細胞活性化シグナルを示し、高いレベルの細胞傷害性に関与することを示している。
【０５１７】
ＡＣＥ−０５媒介Ｔ細胞細胞傷害性をＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）アッセイを使用して決定した。健康なドナー由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＰＤ−Ｌ１を過発現しているＨＣＣ８２７非小細胞肺がん細胞（ＡＴＣＣ）を標的細胞として使用した。死腫瘍細胞から放出されたＬＤＨをＬＤＨアッセイシステムによって測定し、さまざまな比のＴ：Ｅ（標的：エフェクター）をＡＣＥ−０５の存在下で検査した（図１３Ｋ）。さらに、ＡＣＥ−０５は、健康なドナーから単離されたＰＢＭＣと同時インキュベートしたＨＣＣ８２７細胞（ＰＤ−Ｌ１陽性）に対して用量依存性殺腫瘍能力を示した（図１３Ｌ）。図１３Ｍは、ＡＣＥ−０５またはＹＢＬ−００７の存在下でＰＢＭＣと直接接触した場合の腫瘍細胞でのＴ細胞細胞傷害性を示している。２４時間で、標的ＨＣＣ８２７がん細胞は、ＡＣＥ−０５の存在下で死滅した一方で、標的ＨＣＣ８２７細胞は、無処置でまたはＹＢＬ−００７の存在下で増殖した。
【０５１８】
活性化白血球によって放出された免疫サイトカインのレベルは、オフターゲットＴ細胞活性化に関連する有害事象を反映している可能性がある。したがって、ＡＣＥ−０５またはＢｉＴＥ−０５の存在下でのＩＬ−２およびＩＮＦ−γレベルを健康なドナー由来のＰＢＭＣおよびＨＣＣ８２７細胞を同時培養しＩＬ−２またはＩＦＮ−γアッセイキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）を使用してモニターした。ＢｉＴＥ−５のものより低いレベルのＩＬ−２がＡＣＥ−０５の存在下で観察され、ＡＣＥ−０５は、ＩＬ−２分泌の主な供給源であるＣＤ３＋Ｔ細胞をあまり活性化しないことを示唆している。したがって、ＡＣＥ−０５は、ＢｉＴＥ−０５よりもＴ細胞のオフターゲット活性化をあまり誘導しない可能性がある。加えて、ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５の存在は、ＮＫＴまたはＮＫ細胞によって放出されるのと同様のレベルのＩＮＦ−γをもたらした（図１３Ｎ）。
【０５１９】
ＡＣＥ−０５の熱力学的安定性をＣＦＸ  ９６ＴＭ  ＯＲＭ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）と共にＣ１０００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを使用して評価した。３μＭ結合分子を１０μｌの１／２５希釈ＣＹＰＲＯ  ｏｒａｎｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と混合し、５０μｌの混合物を３０分間、２５℃でインキュベートした。試料を１℃／分で室温から９９℃に加熱することによって変性させた。ＣＹＰＲＯ染色変性タンパク質の量を記録し、融解温度（ＴＭ）をＣＦＸ  ｍａｎａｇｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅによって算出した。図１３Ｏに示すとおり、ＡＣＥ−０５は、ＢｉＴＥ−０５よりも高い熱力学的安定性を有した。
【０５２０】
Ｔ細胞再方向付けアッセイをＣＤ２０を標的化を介するＡＣＥ−１０媒介Ｔ細胞活性化を決定するために実施した。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を抗原ドナー標的細胞として使用し、Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞をＣＤ２０陰性対照として使用した。ＡＣＥ−１０は、ＢｉＴＥ−１０のものよりさらに有効なＴ細胞活性化を示す。ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞での結果とＣＤ２０陰性Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞での結果との比較は、Ｔ細胞活性化が標的細胞におけるＣＤ２０発現に依存していることを示唆している（図１４Ａ〜１４Ｂを参照されたい）。
【０５２１】
ＡＣＥ−１１媒介Ｔ細胞細胞傷害性もＬＤＨアッセイを使用して決定した。健康なドナー由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＥＧＦＲ陽性ＳＷ４８、ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６結腸がん細胞を標的細胞として使用した。死腫瘍細胞から放出されるＬＤＨをＬＤＨアッセイシステムによって測定した。ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６がん細胞は、増殖シグナルの継続的活性化をもたらし得るＲａｓおよびＲａｆ突然変異を有する。ＡＣＥ−１１は、３種すべてのがん細胞系において細胞傷害性を示した。結果を図１５に示す。
【実施例５】
【０５２２】
スプラーグドーリー（ＳＤ）ラットでの薬物動態研究
ＡＣＥ−０５および対照抗体の薬物動態研究をＳＤラットで実施した。研究は、ｔｈｅ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された（Ａｐｐｒｏｖａｌ  ｎｕｍｂｅｒ：ＱＢＳＩＡＣＵＣ−Ａ１７０９９）。
【０５２３】
ＳＤラットは、尾静脈を介して１０ｍｇ／ｋｇのＡＣＥ−０５または対照抗体（ＹＢＬ−００７もしくはアベルマブ）の単一静脈内用量を受けた（ｎ＝３  オスラット／群）。合計５００μｌの血清を各動物から次の時点：ＡＣＥ−０５または対照抗体の投与後１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、３日、５日および９日で回収した。試料を１０，０００〜１３，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、各試料から７０μｌの血漿を分け、さらなる分析まで−８０℃で保存した。各試料の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。９６ウエル免疫プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）をＰＤ−Ｌ１（Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．によって生成）を用いてコートした。１：１０００、１：４０００または１：８０００に希釈したラット血漿試料をウエルに加えた。結合試料をＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いて検出した。ウエルをＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）によって製造者のプロトコールに従って１：５００の比で発色させた。次いでＡ４５０を測定した。ＡＣＥ−０５および対照抗体の濃度を既知の濃度の試料タンパク質を使用した標準曲線と比較することによって決定した。観察データをＢＡ  Ｃａｌｃ  ２００７ソフトウェアによって分析した。薬物動態研究結果を図１６Ａに示す。示されたとおり、ＡＣＥ−０５の半減期は１０．１１３時間と測定された。しかし、この実験において親抗体の半減期が、そのような抗体についての典型的な半減期（７または１０日間）よりかなり短かった９８および７３時間と判定されたことから、ＡＣＥ−０５の実際の半減期は１０時間より長い可能性がある。図１６Ｂに示すとおり、ＡＣＥ−０５は、ＢｉＴＥ−０５より長い半減期を示し、ＡＣＥ−０５がＢｉＴＥよりも高い血漿安定性を有することを示唆している。
【実施例６】
【０５２４】
ヒト非小細胞肺がんの処置におけるＡＣＥ−０５の有効性の評価
ヒト非小細胞肺がんの処置におけるＡＣＥ−０５の有効性を評価し、ＮＣＧマウス（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、ＵＳＡ）におけるＨＣＣ８２７細胞系を使用して他の抗体と比較した。研究は、下の表に示すとおり設計した：
【０５２５】
表１３：研究設計
【表１３】
2021517904.tif 000042
【０５２６】
図１７Ａ〜１７Ｆは、ヒト化マウスモデルにおけるＨＣＣ８２７（ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍）異種移植片研究の結果を示す。６〜８週齢メスＮＣＧマウスをＰＢＭＣ再構成のために選択した。表１３に示すとおり、４つの研究群（マウス１０匹／群）および２種のＰＢＭＣドナー（マウス５匹／ドナー）があった。被験体をＡＣＥ−０５、ＢｉＴＥ−０５、ＩｇＧおよびＹＢＬ−００７を用いて腫瘍接種（ＴＶのサイズ＝５０ｍｍ３）４日後に処置し、各ドナーから単離したＰＢＭＣを腫瘍接種の前日に再構成した。ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５を４日目、６日目、８日目（合計３回）注射した。ＩｇＧおよびＹＢＬ−００７を４日目、７日目および１０日目（合計３回）注射した。この研究の１２日目に、１０匹のマウスの内の９匹の腫瘍は、ＡＣＥ−０５処置後に完全に無くなった。ＢｉＴＥ処置群の体重減少（ＢＷＬ）（％）は、ＡＣＥ−０５処置群よりも高かった。ＢｉＴＥ処置群の１０匹のマウスの内の３匹は、この研究中の２０％を超えるＢＷＬのために打ち切られた。結果は、ＡＣＥ−０５が観察された肺がんの処置において有効であることを示し、ＡＣＥ−０５が、ＢｉＴＥ−０５、ＢｉＴＥ技術を使用して生成された二重特異性抗体よりも大きな安全性を呈することも示している。
【実施例７】
【０５２７】
ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５の抗がん有効性についての用量制限研究
ＡＣＥ−０５の有効用量を見出すために、用量制限研究（ｄｏｓｅ  ｌｉｍｉｔｓ  ｓｔｕｄｙ）をＨＣＣ８２７ヒト化異種移植モデルで実施した（図１８Ａ〜１８Ｄ）。ＮＣＧメスマウス（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、ＵＳＡ）６〜８週齢をＰＢＭＣ再構成ヒト化のために選択し、１４の研究群（マウス６匹／群）に分けた。群分けおよび処置の前に、すべての動物の重量を量り、腫瘍体積をキャリパーを使用して測定した。腫瘍体積が任意の所与の処置の有効性に影響を与え得ることから、腫瘍体積を、選択した動物を特定の群に無作為化するための数値パラメータとして使用した。群分けをＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｔｕｄｙｌｏｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使用して実施した。腫瘍体積において最小の群間差異を示した「分布一致」無作為化法を群割り当てのために使用した。
【０５２８】
２名のドナー由来のヒトＰＢＭＣを腫瘍細胞接種の３日前にｉ．ｖ．を介してインプラントした。各マウスに腫瘍発達のための０．１ｍｌのＰＢＳ中のＨＣＣ８２７腫瘍細胞（５×１０６）を右側腹領域に皮下接種した。０．５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）から０．０００５ｍｐｋ（０．５、０．１、０．０５、０．００５および０．０００５ｍｐｋ）の５種の異なる濃度のＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５でＨＣＣ８２７接種の４日後に処置した。被験物質投与を図１８Ａにおいてｘ軸上の４本の縦矢印で示すとおり３日間ごと、すなわち、４日目、７日目、１０日目および１３日目（Ｑ３ｄ、合計４用量）にスケジュール化した。
【０５２９】
腫瘍の大きさ（図１８Ａ〜１８Ｃ）および体重（図１８Ｄ）を検査分子の初回投与後２または３日間ごとにスコア化した。各群についての腫瘍体積および体重の変化の平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を、図１８Ａにそれぞれ時間に対してプロットした。図１８Ｂ〜１８Ｃは、それぞれＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５を用いて処置した各用量群における個々のマウス抗腫瘍有効性を示している。ＢｉＴＥ−０５処置群のマウス４匹は１５日目に打ち切ったが、ＡＣＥ−０５処置群ではマウス１匹だけを打ち切った。ＢｉＴＥ−０５を用いた処置群（図１８Ｃ）とは対照的に、０．５ｍｐｋ、０．１ｍｐｋおよび０．０５ｍｐｋのＡＣＥ−０５を用いて処置した大部分の動物では、腫瘍は完全に消えた（図１８Ｂ）。
【０５３０】
表１４は、ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５の抗腫瘍活性を要約している。１５日目の平均腫瘍体積（ＴＶ）を平均値の標準誤差と共に示す。腫瘍成長阻害パーセンテージ（ＴＧＩ％）は、検査群と対照群の平均腫瘍体積の間の差異であり、以下の式を使用して算出される：ＴＧＩ（％）＝（対照の平均ＴＶ−処置の平均ＴＶ）／対照の平均ＴＶ×１００。Ｔ／Ｃ（％）を以下の式を使用して算出した：Ｔ／Ｃ（％）＝処置の平均ＴＶ／対照の平均ＴＶ×１００。結果は、ＡＣＥ−０５が、観察された肺がんの処置において、濃度範囲にわたってＢｉＴＥ−０５よりも有効であることを示している。
【０５３１】
表１４：ＡＣＥ−０５およびＢｉＴＥ−０５の抗腫瘍活性
【表１４】
2021517904.tif 000043
【０５３２】
先の記述から、具体的な実施形態が例示の目的のために本明細書に記載されているが、種々の改変が本明細書で提供される精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることは理解される。上に参照するすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2021517904.tif 000044
【図１Ｂ】
2021517904.tif 000045
【図１Ｃ】
2021517904.tif 000046
【図１Ｄ】
2021517904.tif 000047
【図１Ｅ】
2021517904.tif 000048
【図２Ａ】
2021517904.tif 000049
【図２Ｂ】
2021517904.tif 000050
【図２Ｃ】
2021517904.tif 000051
【図２Ｄ】
2021517904.tif 000052
【図２Ｅ】
2021517904.tif 000053
【図２Ｆ】
2021517904.tif 000054
【図２Ｇ】
2021517904.tif 000055
【図２Ｈ】
2021517904.tif 000056
【図２Ｉ】
2021517904.tif 000057
【図２Ｊ】
2021517904.tif 000058
【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
2021517904.tif 000060
【図３】
2021517904.tif 000061
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021517904.tif 000063
【図４Ｃ】
2021517904.tif 000064
【図４Ｄ】
2021517904.tif 000065
【図４Ｅ】
2021517904.tif 000066
【図４Ｆ】
2021517904.tif 000067
【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
2021517904.tif 000069
【図４Ｉ】
2021517904.tif 000070
【図５】
2021517904.tif 000071
【図６Ａ】
2021517904.tif 000072
【図６Ｂ】
2021517904.tif 000073
【図６Ｃ】
2021517904.tif 000074
【図７Ａ】
2021517904.tif 000075
【図７Ｂ】
2021517904.tif 000076
【図８】
2021517904.tif 000077
【図９】
2021517904.tif 000078
【図１０Ａ】
2021517904.tif 000079
【図１０Ｂ】
2021517904.tif 000080
【図１０Ｃ】
2021517904.tif 000081
【図１１】
2021517904.tif 000082
【図１２Ａ】
2021517904.tif 000083
【図１２Ｂ】
2021517904.tif 000084
【図１２Ｃ】
2021517904.tif 000085
【図１２Ｄ】
2021517904.tif 000086
【図１３Ａ】
2021517904.tif 000087
【図１３Ｂ】
2021517904.tif 000088
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2021517904.tif 000090
【図１３Ｅ】
2021517904.tif 000091
【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１３Ｍ】
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【図１３Ｎ】
2021517904.tif 000100
【図１３Ｏ】
2021517904.tif 000101
【図１４Ａ】
2021517904.tif 000102
【図１４Ｂ】
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【図１５】
2021517904.tif 000104
【図１６Ａ】
2021517904.tif 000105
【図１６Ｂ】
2021517904.tif 000106
【図１７Ａ】
2021517904.tif 000107
【図１７Ｂ】
2021517904.tif 000108
【図１７Ｃ】
2021517904.tif 000109
【図１７Ｄ】
2021517904.tif 000110
【図１７Ｅ】
2021517904.tif 000111
【図１７Ｆ】
2021517904.tif 000112
【図１８Ａ】
2021517904.tif 000113
【図１８Ｂ】
2021517904.tif 000114
【図１８Ｃ】
2021517904.tif 000115
【図１８Ｄ】
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【配列表】
2021517904000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月9日(2020.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗体軽鎖を各々が含む、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと、
（ｂ）第１の可変重鎖（ＶＨ）領域、第１の定常重鎖１（ＣＨ１）領域および第２のＶＨ領域を含む第３のポリペプチドと、
（ｃ）第３のＶＨ領域、第２のＣＨ１領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む第４のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成し；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成する、
結合分子。
【請求項２】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、柔軟なペプチド領域によってＦｖ領域に連結されている、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、請求項２に記載の結合分子。
【請求項４】
前記柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、請求項３に記載の結合分子。
【請求項５】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の結合分子。
【請求項６】
ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含まない、請求項１に記載の結合分子。
【請求項７】
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域に連結されている第１のＣＨ３領域と、前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域に連結されている第２のＣＨ３領域とをさらに含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項８】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、異なる抗原または同じ抗原に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項９】
前記第１のＦａｂ領域および前記第２のＦａｂ領域が、第１の抗原結合ドメインを形成し、前記Ｆｖ領域が、第２の抗原結合ドメインである、請求項８に記載の結合分子。
【請求項１０】
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原に結合し、前記第２の抗原結合ドメインが、第２の抗原に結合する、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記第１の抗原が、がん抗原である、請求項１０に記載の結合分子。
【請求項１２】
第２の抗原が、リンパ球および単球からなる群から選択される免疫細胞上に発現される、請求項１１に記載の結合分子。
【請求項１３】
前記第２の抗原が、Ｔ細胞上に発現される、請求項１０に記載の結合分子。
【請求項１４】
前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１３に記載の結合分子。
【請求項１５】
前記第１の抗原が、がん抗原であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１０に記載の結合分子。
【請求項１６】
前記第１の抗原が、ＰＤ−Ｌ１であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１５に記載の結合分子。
【請求項１７】
各Ｆａｂ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号５、配列番号６および配列番号７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有する３つＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項１６に記載の結合分子。
【請求項１８】
前記第１の抗原が、ＣＤ２０であり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１５に記載の結合分子。
【請求項１９】
各Ｆａｂ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項１８に記載の結合分子。
【請求項２０】
前記第１の抗原が、ＥＧＦＲであり、前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１５に記載の結合分子。
【請求項２１】
各Ｆａｂ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
各Ｆａｂ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＨ領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記Ｆｖ領域の前記ＶＬ領域が、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む、
請求項２０に記載の結合分子。
【請求項２２】
１つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項１に記載の結合分子を製造する方法であって、
前記１つまたは複数のベクターが、
（ａ）各々が抗体軽鎖を含む第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとをコードする第１の核酸と、
（ｂ）第１のＶＨ領域、第１のＣＨ１領域および第２のＶＨ領域を含む第３のポリペプチドをコードする第２の核酸と、
（ｃ）第３のＶＨ領域、第２のＣＨ１領域およびＶＬ領域を含む第４のポリペプチドをコードする第３の核酸と
を含み；
前記第１のポリペプチドと、前記第３のポリペプチドの前記第１のＶＨ領域および前記第１のＣＨ１領域とが、第１の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ；
前記第２のポリペプチドと、前記第４のポリペプチドの前記第３のＶＨ領域および前記第２のＣＨ１領域とが、第２の抗原結合Ｆａｂ領域を形成することができ；
前記第３のポリペプチドの前記第２のＶＨ領域と、前記第４のポリペプチドの前記ＶＬ領域とが、抗原結合Ｆｖ領域を形成することができる、
方法。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む、対象における疾患または状態の処置に使用するための、医薬組成物。
【請求項２４】
前記疾患または状態が、がんである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記がんが、肺がんまたはびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記疾患または状態が、ＰＤ−Ｌ１陽性がんである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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