(57)【要約】本発明は、調節要素、ならびに特定の組織型における対象となる遺伝子の転写を刺激するために使用され得る、それを含むベクターを提供する。本明細書に記載の転写調節要素は、筋肉細胞、肝細胞、またはニューロンなどの細胞におけるＧＡＡ導入遺伝子の発現を促進するために、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）などの導入遺伝子に作動可能に連結され得る。本明細書に記載の転写調節要素は、治療的導入遺伝子に作動可能に連結され、リソソーム蓄積症、特にポンペ病などの様々な障害の治療に使用され得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２のセグメントに作動可能に連結された第１のセグメントを含む核酸調節要素であって、前記第１のセグメントが、アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ）またはその機能部分を含み、前記第２のセグメントが、デスミンプロモーターまたはその機能部分を含む、前記核酸調節要素。
【請求項２】
前記第１のセグメントの３’末端が、前記第２のセグメントの５’末端に作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸調節要素。
【請求項３】
前記第１のセグメントの５’末端が、前記第２のセグメントの３’末端に作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸調節要素。
【請求項４】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項５】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項４に記載の核酸調節要素。
【請求項６】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項５に記載の核酸調節要素。
【請求項７】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号４の核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項６に記載の核酸調節要素。
【請求項８】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項９】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項８に記載の核酸調節要素。
【請求項１０】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項９に記載の核酸調節要素。
【請求項１１】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号１の核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項１０に記載の核酸調節要素。
【請求項１２】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項１３】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項１２に記載の核酸調節要素。
【請求項１４】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項１３に記載の核酸調節要素。
【請求項１５】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号２の核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項１４に記載の核酸調節要素。
【請求項１６】
前記第１のセグメントが、配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項１７】
前記第１のセグメントが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項１６に記載の核酸調節要素。
【請求項１８】
前記第１のセグメントが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項１７に記載の核酸調節要素。
【請求項１９】
前記第１のセグメントが、配列番号４の核酸配列を有する核酸を含む、請求項１８に記載の核酸調節要素。
【請求項２０】
前記第１のセグメントが、配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項２１】
前記第１のセグメントが、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項２０に記載の核酸調節要素。
【請求項２２】
前記第１のセグメントが、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項２１に記載の核酸調節要素。
【請求項２３】
前記第１のセグメントが、配列番号１の核酸配列を有する、請求項２２に記載の核酸調節要素。
【請求項２４】
前記第１のセグメントが、配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項２５】
前記第１のセグメントが、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項２４に記載の核酸調節要素。
【請求項２６】
前記第１のセグメントが、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項２５に記載の核酸調節要素。
【請求項２７】
前記第１のセグメントが、配列番号２の核酸配列を有する、請求項２６に記載の核酸調節要素。
【請求項２８】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項２９】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項２８に記載の核酸調節要素。
【請求項３０】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項２９に記載の核酸調節要素。
【請求項３１】
前記第１のセグメントが、配列番号３の核酸配列を有する、請求項３０に記載の核酸調節要素。
【請求項３２】
前記第２のセグメントが、配列番号５の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する５’領域を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項３３】
前記５’領域が、配列番号５の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項３２に記載の核酸調節要素。
【請求項３４】
前記５’領域が、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項３３に記載の核酸調節要素。
【請求項３５】
前記５’領域が、配列番号５の核酸配列を有する、請求項３４に記載の核酸調節要素。
【請求項３６】
前記第２のセグメントが、配列番号６の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する３’領域を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項３７】
前記３’領域が、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項３６に記載の核酸調節要素。
【請求項３８】
前記３’領域が、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項３７に記載の核酸調節要素。
【請求項３９】
前記３’領域が、配列番号６の核酸配列を有する、請求項３８に記載の核酸調節要素。
【請求項４０】
前記第２のセグメントが、配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項４１】
前記第２のセグメントが、配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項４０に記載の核酸調節要素。
【請求項４２】
前記第２のセグメントが、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項４１に記載の核酸調節要素。
【請求項４３】
前記第２のセグメントが、配列番号７の核酸配列を有する、請求項４２に記載の核酸調節要素。
【請求項４４】
前記第１及び第２のセグメントに対して５’に位置し、それに作動可能に連結された第３のセグメントをさらに含み、前記第３のセグメントが、シナプシンプロモーターまたはその機能部分を含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項４５】
前記第３のセグメントが、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項４４に記載の核酸調節要素。
【請求項４６】
前記第３のセグメントが、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項４５に記載の核酸調節要素。
【請求項４７】
前記第３のセグメントが、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項４６に記載の核酸調節要素。
【請求項４８】
前記第３のセグメントが、配列番号８の核酸配列を有する、請求項４７に記載の核酸調節要素。
【請求項４９】
前記核酸調節要素が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する、請求項１に記載の核酸調節要素。
【請求項５０】
前記核酸調節要素が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４９に記載の核酸調節要素。
【請求項５１】
前記核酸調節要素が、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項５０に記載の核酸調節要素。
【請求項５２】
前記核酸調節要素が、配列番号１０の核酸配列を有する、請求項５１に記載の核酸調節要素。
【請求項５３】
前記核酸調節要素が、配列番号１２の核酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する、請求項１に記載の核酸調節要素。
【請求項５４】
前記核酸調節要素が、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項５３に記載の核酸調節要素。
【請求項５５】
前記核酸調節要素が、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項５４に記載の核酸調節要素。
【請求項５６】
前記核酸調節要素が、配列番号１２の核酸配列を有する、請求項５５に記載の核酸調節要素。
【請求項５７】
前記核酸調節要素が、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する、請求項１に記載の核酸調節要素。
【請求項５８】
前記核酸調節要素が、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項５７に記載の核酸調節要素。
【請求項５９】
前記核酸調節要素が、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項５８に記載の核酸調節要素。
【請求項６０】
前記核酸調節要素が、配列番号１１の核酸配列を有する、請求項５９に記載の核酸調節要素。
【請求項６１】
第２のセグメントに作動可能に連結された第１のセグメントを含む核酸調節要素であって、前記第１のセグメントが、デスミンプロモーターまたはその機能部分を含み、前記第２のセグメントが、シナプシンプロモーターまたはその機能部分を含む、前記核酸調節要素。
【請求項６２】
前記第１のセグメントの３’末端が、前記第２のセグメントの５’末端に作動可能に連結されている、請求項６１に記載の核酸調節要素。
【請求項６３】
前記第１のセグメントの５’末端が、前記第２のセグメントの３’末端に作動可能に連結されている、請求項６１に記載の核酸調節要素。
【請求項６４】
前記第１のセグメントが、配列番号５の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する５’領域を含む、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項６５】
前記５’領域が、配列番号５の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項６４に記載の核酸調節要素。
【請求項６６】
前記５’領域が、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項６５に記載の核酸調節要素。
【請求項６７】
前記５’領域が、配列番号５の核酸配列を有する、請求項６６に記載の核酸調節要素。
【請求項６８】
前記第１のセグメントが、配列番号６の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する３’領域を含む、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項６９】
前記３’領域が、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項６８に記載の核酸調節要素。
【請求項７０】
前記３’領域が、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項６９に記載の核酸調節要素。
【請求項７１】
前記３’領域が、配列番号６の核酸配列を有する、請求項７０に記載の核酸調節要素。
【請求項７２】
前記第１のセグメントが、配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項６１〜７１のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項７３】
前記第１のセグメントが、配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項７２に記載の核酸調節要素。
【請求項７４】
前記第１のセグメントが、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項７３に記載の核酸調節要素。
【請求項７５】
前記第１のセグメントが、配列番号７の核酸配列を有する、請求項７４に記載の核酸調節要素。
【請求項７６】
前記第２のセグメントが、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列を有する、請求項６１〜７５のいずれか１項に記載の核酸調節要素。
【請求項７７】
前記第２のセグメントが、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する、請求項７６に記載の核酸調節要素。
【請求項７８】
前記第２のセグメントが、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する、請求項７７に記載の核酸調節要素。
【請求項７９】
前記第２のセグメントが、配列番号８の核酸配列を有する、請求項７８に記載の核酸調節要素。
【請求項８０】
請求項１〜７９のいずれか１項に記載の核酸調節要素を含むベクターであって、前記核酸調節要素が、導入遺伝子に作動可能に連結されており、前記核酸調節要素が、細胞への前記ベクターの導入時に前記導入遺伝子の発現を誘導する、前記ベクター。
【請求項８１】
前記導入遺伝子が、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である、請求項８０に記載のベクター。
【請求項８２】
前記細胞が、筋肉細胞、ニューロン、または肝細胞である、請求項８０または８１に記載のベクター。
【請求項８３】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８４】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項８３に記載のベクター。
【請求項８５】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項８４に記載のベクター。
【請求項８６】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ７４血清型である、請求項８５に記載のベクター。
【請求項８７】
前記ウイルスベクターが、偽型ＡＡＶである、請求項８３に記載のベクター。
【請求項８８】
前記偽型ＡＡＶが、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９である、請求項８７に記載のベクター。
【請求項８９】
請求項１〜７９のいずれか１項に記載の核酸調節要素を含む核酸分子を含む組成物であって、前記組成物が、リポソーム、小胞、合成小胞、エキソソーム、合成エキソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子である、前記組成物。
【請求項９０】
前記核酸調節要素が、導入遺伝子に作動可能に連結されており、前記核酸調節要素が、細胞への前記組成物の導入時に前記導入遺伝子の発現を誘導する、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞における前記導入遺伝子の転写をシミュレートするのに十分な時間、前記細胞を、請求項８０〜８８のいずれか１項に記載のベクターあるいは請求項８９または９０に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項９２】
前記導入遺伝子が、ＧＡＡである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
治療を必要とするヒト患者におけるポンペ病を治療する方法であって、前記患者に、治療有効量の請求項８０〜８８のいずれか１項に記載のベクターあるいは請求項８９または９０に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項９４】
請求項８０〜８８のいずれか１項に記載のベクターあるいは請求項８９または９０に記載の組成物を含むキットであって、前記ベクターまたは組成物を細胞と接触させ、それにより調節制御要素に作動可能に連結された導入遺伝子を発現させるように、前記キットのユーザーに指示する添付文書をさらに含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸バイオテクノロジーの分野に関し、対象となる遺伝子の発現を促進するための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ポンペ病は、リソソームグリコーゲンの処理に関与する酵素をコードする酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子の変異によって引き起こされるリソソーム蓄積障害である。ポンペ病の患者は、細胞内のグリコーゲンの蓄積、心臓、呼吸器、及び骨格筋の機能障害、ならびに中枢神経系の病理を含む、様々な組織にわたって臨床表現型を示す。これらの障害のうちのいくつかは、組換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）を使用した酵素補充療法（ＥＲＴ）によって大幅に寛解される。臨床的有効性は、ｈＧＡＡ  ＥＲＴの免疫原性及びいくつかの罹患組織へのｒｈＧＡＡの取り込みの欠如によって制限されている。遺伝子療法もまた、この疾患の潜在的な治療パラダイムとして調査されている。ポンペの治療のための遺伝子治療法の開発は、免疫系が抗ＧＡＡ免疫応答を増加するのを防止しながら、罹患組織で治療有効量のＧＡＡの発現を達成することに伴う困難さによって妨げられている。このバランスを達成することができる転写調節要素に対する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、ポンペ病に冒されている細胞を含む特定の組織の細胞において、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）などの対象となる遺伝子の発現を促進するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載の組成物及び方法は、筋肉細胞（例えば、心筋細胞）、肝細胞、及び／または中枢神経系の細胞におけるＧＡＡなどの導入遺伝子の転写を刺激する核酸調節要素に関する。本明細書に記載の核酸調節要素は、ＧＡＡなどの導入遺伝子に作動可能に連結され得、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害の治療のために患者（例えば、ヒト患者）に投与され得る。有利には、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、リソソーム蓄積障害に冒されている、筋肉細胞及び／またはニューロンにおけるポンペ病を有する患者などの患者におけるＧＡＡの発現を促進することができ、肝臓での発現を同時に刺激し得る。これは、驚くべき治療効果をもたらす。機構によって限定されることなく、本開示は、本明細書に記載の転写調節要素が、部分的に、（ｉ）リソソーム蓄積障害に冒されている細胞における導入遺伝子の発現を促進して、病理を寛解し、（ｉｉ）免疫寛容を促進する役割を果たす肝臓での発現を刺激することができるという発見に基づいている。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法は、患者におけるリソソーム酵素欠乏症（例えば、ＧＡＡ欠乏症）の有害な影響を軽減しながら、遺伝子療法によって導入された酵素に対する免疫応答の増加を防ぐまたは減少させる方法において、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害を治療するために使用することができる。
【０００４】
第１の態様では、本発明は、第２のセグメントに作動可能に連結された第１のセグメントを含む核酸調節要素を特徴とし、第１のセグメントは、アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ）またはその機能部分を含み、第２のセグメントは、デスミンプロモーターまたはその機能部分を含む。第１のセグメントの３’末端は、第２のセグメントの５’末端に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、第１のセグメントの５’末端は、第２のセグメントの３’末端に作動可能に連結されている。
【０００５】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号４の核酸配列を有するその機能部分を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号１の核酸配列を有するその機能部分を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有するその機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列を有するＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー、または配列番号２の核酸配列を有するその機能部分を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号４の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、第１のセグメントは、配列番号４に示される核酸を含み得る。
【０００９】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、第１のセグメントは、配列番号１の核酸配列を有し得る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号２の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。第１のセグメントは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有し得る。例えば、第１のセグメントは、配列番号２の核酸配列を有し得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、第１のセグメントは、配列番号３の核酸配列を有し得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号５の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する５’領域を含む。いくつかの実施形態において、５’領域は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、５’領域は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、５’領域は、配列番号５の核酸配列を有し得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号６の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する３’領域を含み得る。いくつかの実施形態において、３’領域は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、３’領域は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、３’領域は、配列番号６の核酸配列を有し得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、３’領域は、配列番号７の核酸配列を有し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１０の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１０の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、核酸調節要素は、配列番号１０の核酸配列を有し得る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１２の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、核酸調節要素は、配列番号１２の核酸配列を有し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、第１及び第２のセグメントに対して５’または３’に位置している第３のセグメントをさらに含む。第３のセグメントは、第１及び第２のセグメントに作動可能に連結され得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、第３のセグメントは、とりわけ、ニューロン、グリア細胞、または星状細胞などの、中枢神経系の細胞内でそれに作動可能に連結された導入遺伝子の発現を刺激するプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、第３のセグメントは、シナプシンプロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩＩプロモーター、チューブリンαＩプロモーター、マイクロチューブリン関連タンパク質ＩＢ（ＭＡＰ  ＩＢ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、ニューロフィラメント軽鎖プロモーター、ニューロン特異的ＶＧＦ遺伝子プロモーター、ニューロン核（ＮｅｕＮ）プロモーター、大腸腺腫様性ポリポーシス（ＡＰＣ）プロモーター、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）プロモーター、及びホメオボックスタンパク質９（ＨＢ９）プロモーターから選択されるプロモーター、またはそれらのバリアント（例えば、野生型プロモーター遺伝子座の核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性）を有し、中枢神経系の細胞への導入時にそれに作動可能に連結された導入遺伝子の転写を刺激することができるバリアント）、またはその機能部分を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、第３のセグメントは、ニューロンにおいてそれに作動可能に連結された導入遺伝子の発現を刺激するプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、第３のセグメントは、シナプシンプロモーター、またはその機能部分を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、第３のセグメントは、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第３のセグメントは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第３のセグメントは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第３のセグメントは、配列番号８の核酸配列を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１１の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸調節要素は、配列番号１１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、核酸調節要素は、配列番号１１の核酸配列を有し得る。
【００２２】
別の態様では、本発明は、第２のセグメントに作動可能に連結された第１のセグメントを含む核酸調節要素を特徴とし、第１のセグメントは、デスミンプロモーターまたはその機能部分を含み、第２のセグメントは、プロモーター、または、ニューロン、グリア細胞、または星状細胞などの中枢神経系の細胞においてそれに作動可能に連結された導入遺伝子の発現を刺激する、その機能部分を含む。いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、シナプシンプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩＩプロモーター、チューブリンαＩプロモーター、ＭＡＰ  ＩＢプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、ニューロフィラメント軽鎖プロモーター、ニューロン特異的ＶＧＦ遺伝子プロモーター、ＮｅｕＮプロモーター、ＡＰＣプロモーター、Ｉｂａ−１プロモーター、及びＨＢ９プロモーターから選択されるプロモーター、またはそのバリアント（例えば、野生型プロモーター遺伝子座の核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性）を有し、中枢神経系の細胞への導入時にそれに作動可能に連結された導入遺伝子の転写を刺激することができるバリアント）、またはその機能部分を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、ニューロンにおいてそれに作動可能に連結された導入遺伝子の発現を刺激するプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、シナプシンプロモーター、またはその機能部分を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントの３’末端は、第２のセグメントの５’末端に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、第１のセグメントの５’末端は、第２のセグメントの３’末端に作動可能に連結されている。
【００２５】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号５の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する５’領域を含む。いくつかの実施形態において、５’領域は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、５’領域は、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、５’領域は、配列番号５の核酸配列を有し得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号６の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する３’領域を含む。いくつかの実施形態において、３’領域は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、３’領域は、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、３’領域は、配列番号６の核酸配列を有し得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のセグメントは、配列番号７の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。例えば、第１のセグメントは、配列番号７の核酸配列を有し得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号８の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第２のセグメントは、配列番号８の核酸配列を有する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、前述の態様またはその実施形態のうちのいずれかの核酸調節要素を含むベクターを特徴とする。核酸調節要素は、導入遺伝子に作動可能に連結され得、細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）へのベクターの導入時に導入遺伝子の発現を誘導し得る。細胞は、例えば、筋肉細胞（例えば、心筋細胞または骨格筋細胞）、ニューロン、または肝細胞であり得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＧＡＡなどのリソソーム酵素をコードする。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルスなどのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ７４血清型である。ウイルスベクターは、偽型ＡＡＶ、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）２／８またはｒＡＡＶ２／９であり得る。
【００３０】
別の態様では、本発明は、上記の態様またはその実施形態のうちのいずれかの核酸調節要素を含む組成物を特徴とする。組成物は、例えば、リポソーム、小胞、合成小胞、エキソソーム、合成エキソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子であり得る。組成物において、核酸調節要素は、導入遺伝子（例えば、ＧＡＡなどのリソソーム酵素をコードする導入遺伝子）に作動可能に連結され得る。
【００３１】
さらに別の態様では、本発明は、細胞における導入遺伝子の転写をシミュレートするのに十分な時間、細胞を、前述の態様またはその実施形態のうちのいずれかのベクターまたは組成物と接触させることによって、細胞において導入遺伝子を発現させる方法を特徴とする。
【００３２】
別の態様では、本発明は、患者に、治療有効量の本明細書に記載のベクターまたは組成物を投与することによって、治療を必要とする患者（例えば、ヒト患者などの哺乳動物患者）におけるポンペ病などのリソソーム蓄積症を治療する方法を特徴とする。
【００３３】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のベクターまたは組成物を含むキットを特徴とする。キットは、例えば、ベクターまたは組成物を細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）と接触させ、それにより調節要素に作動可能に連結された導入遺伝子を発現するように、キットのユーザーに指示する添付文書を含み得る。
【００３４】
定義
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載されている値の上下１０％以内の値を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー」という用語は、ヒトアポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域を指し、その核酸配列が配列番号３に示されており、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、８６％、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％もしくはそれ以上の同一性）を有し、導入遺伝子がエンハンサーに作動可能に連結されている場合、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはヒト肝細胞などの真核細胞）における導入遺伝子の発現を促進する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「保存的変異」、「保存的置換」、または「保存的アミノ酸置換」という用語は、極性、静電帯電、及び立体体積などの類似の物理化学的特性を示す１つ以上の異なるアミノ酸に対する１つ以上のアミノ酸の置換を指す。これらの特性は、以下の表１にある２０個の天然アミノ酸のそれぞれについて要約される。
【００３７】
【表１】
2021512649.tif 000003
【００３８】
この表から、保存的アミノ酸ファミリーには、例えば、（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、及びＭ、（ｉｉ）Ｄ及びＥ、（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ、及びＴ、（ｉｖ）Ｈ、Ｋ、及びＲ、（ｖ）Ｎ及びＱ、ならびに（ｖｉ）Ｆ、Ｙ、及びＷが含まれることが考えられる。したがって、保存的変異または置換は、同じアミノ酸ファミリーのメンバーによる１つのアミノ酸に置換するものである（例えば、ＴｈｒによるＳｅｒ、またはＡｒｇによるＬｙｓの置換）。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「デスミンプロモーター」という用語は、配列番号７に示される核酸、ならびに配列番号７の核酸配列と少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、８６％、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％もしくはそれ以上の同一性）を有し、導入遺伝子がエンハンサーに作動可能に連結されている場合、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはヒト肝細胞などの真核細胞）における導入遺伝子の発現を促進する、核酸を指す。
【００４０】
転写調節要素との関連で、本明細書で使用される場合、「機能部分」という用語は、標的細胞において対象となる遺伝子の転写を刺激する能力を保持する、より大きな核酸の部分を指す。例えば、アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ）は、７７４ヌクレオチドのエンハンサーであり、その配列は配列番号３に示されている。１９３ヌクレオチド（その核酸配列は、配列番号１に記載されている）を含むこの遺伝子座の一部は、より大きな遺伝子座の転写活性化特性を保持することができる。したがって、配列番号１に示される１９３ヌクレオチド部分は、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ遺伝子座の「機能部分」である。追加の例として、全長エンハンサーの転写活性化特性を保持することができるＡｐｏＥ−ＨＣＲ遺伝子座の別の部分は、配列番号２に示される３２０ヌクレオチドセグメントである。したがって、配列番号２に示される３２０ヌクレオチドの部分は、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ遺伝子座の「機能部分」である。さらなる例として、全長エンハンサーの転写活性化特性を保持することができるＡｐｏＥ−ＨＣＲ遺伝子座の別の部分は、配列番号４に示される５０ヌクレオチドセグメントである。したがって、配列番号４に示される５０ヌクレオチドの部分はまた、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ遺伝子座の「機能部分」である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、第２の分子に結合された第１の分子を指し、その分子は、第１の分子が第２の分子の機能に影響を及ぼすように配置される。２つの分子は、単一の隣接する分子の一部であってもなくてもよく、隣接しても隣接しなくてもよい。例えば、プロモーターが細胞において対象となる転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調節する場合、プロモーターは、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている。追加的に、ある部分の転写活性化機能が他の部分の存在によって悪影響を受けないように、それらが結合されている場合、転写調節要素の２つの部分は、互いに作動可能に連結されている。２つの転写調節要素は、リンカー核酸（例えば、介在する非コード核酸）を介して互いに作動可能に連結され得るか、または介在するヌクレオチドが存在せずに互いに作動可能に連結され得る。
【００４２】
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における核酸またはアミノ酸と同一である候補配列における核酸またはアミノ酸の割合として定義される。核酸またはアミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野における技術の範囲内である様々な方式で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアなどの、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較されている配列の完全長にわたる最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするために適切なパラメータを決定することができる。例えば、配列同一性パーセントの値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成され得る。例として、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比した、所与の核酸またはアミノ酸配列Ａの配列同一性パーセント（代替的に、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比したある特定の配列同一性パーセントを有する、所与の核酸またはアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、次のように算出される：
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、ＡとＢのそのプログラムのアライメントにおいて、配列アライメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって同一のマッチとしてスコア付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂにおける核酸の総数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性パーセントは、Ａに対するＢのパーセントアミノ酸配列同一性と等しくないと認識されるであろう。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、対象に罹患しているまたは罹患し得る特定の疾患または状態を予防、治療、または制御するために、哺乳動物などの対象、例えばヒトに投与される治療化合物を含む混合物を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、及び妥当な利益／リスク比に見合った他の合併症なしに、哺乳動物（例えば、ヒト）などの対象の組織との接触に適している、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、対象から単離された検体（例えば、血液、血液成分（例えば、血清または血漿）、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織（例えば、胎盤または皮膚）、膵液、絨毛膜絨毛サンプル、または細胞）を指す。対象は、例えば、リソソーム蓄積障害（例えば、ポンペ病）などの本明細書に記載の疾患に罹患している患者であってよい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」及び「結合する」という語句は、例えば、詳細に抗体またはその抗原結合断片などのリガンドによって認識される、ポリペプチド及び他の生体分子の不均一な集団における、ポリペプチドなどの特定の分子の存在を決定する結合反応を指す。タンパク質に特異的に結合するリガンド（例えば、相補的ポリヌクレオチド）は、例えば、１００ｎＭ未満のＫＤでタンパク質に結合し得る。例えば、タンパク質に特異的に結合するリガンドは、最大１００ｎＭ（例えば、１ｐＭ〜１００ｎＭ）のＫＤでタンパク質に結合し得る。別の分子またはそのドメインへの特異的結合を示さないリガンドは、特定の分子またはそのドメインに対して１００ｎＭを超える（例えば、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎｍ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、１００μＭ、５００μＭ、または１ｍＭを超える）ＫＤを示し得る。様々なアッセイ形式を使用して、特異タンパク質に対するリガンドの親和性を決定し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡアッセイは、標的タンパク質に特異的に結合するリガンドを特定するために日常的に使用されている。特異タンパク質結合を決定するために使用することができるアッセイ形式及び条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）及びＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載の特定の疾患または状態（リソソーム蓄積障害、例えばポンペ病など）の治療を受ける生物を指す。対象及び患者の例には、本明細書に記載の疾患または状態の治療を受けている、ヒトなどの哺乳動物が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「シナプシンプロモーター」という用語は、配列番号８に示される核酸、及び配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、８６％、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％もしくはそれ以上の同一性）を有し、導入遺伝子がエンハンサーに作動可能に連結されている場合、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはヒト肝細胞などの真核細胞）における導入遺伝子の発現を促進するそのバリアントを指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「転写調節要素」という用語は、少なくとも部分的に、対象となる遺伝子の転写を制御する核酸を指す。転写調節要素には、プロモーター、エンハンサー、及び遺伝子転写を制御するまたは制御するのを助ける他の核酸（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれ得る。転写調節要素の例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）に記載されている。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、目的が、とりわけ、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害の進行などの望ましくない生理学的変化または障害を阻止または遅延（低下）させることである、治療的処置を指す。有益または所望の臨床結果としては、検出可能であるか検出不能であるかに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の病態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患病態の寛解または緩和、及び（部分的か完全かに関わらず）緩解が挙げられるが、これらに限定されない。ポンペ病などのリソソーム蓄積障害との関連で、患者の治療は、例えば、ＧＡＡをコードする酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）の濃度の増加、またはＧＡＡ活性の増加（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍またはそれ以上などの１つ以上の検出可能な変化として現れ得る。ＧＡＡタンパク質の濃度は、本明細書に記載のＥＬＩＳＡアッセイを含む、当該技術分野で知られているタンパク質検出アッセイを使用して決定され得る。ＧＡＡをコードする核酸の濃度は、本明細書に記載の核酸検出アッセイ（例えば、ＲＮＡ  Ｓｅｑアッセイ）を使用して決定され得る。ＧＡＡタンパク質及び核酸の検出のための例示的なプロトコルは、以下の実施例１に提供されている。追加的に、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害に罹患している患者の治療は、患者の筋肉機能（例えば、心臓または骨格筋機能）の改善、ならびに筋肉協調の改善として現れ得る。筋肉機能を測定するための例示的な手順は、以下の実施例１に記載されている。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、例えば、複製及び／または発現のために、細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）への対象となる遺伝子の送達のためのビヒクルとして機能し得る、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて有用な例示的なベクターは、プラスミド、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ビリオン、または他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）である。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に送達するための様々なベクターが開発されている。そのような発現ベクターの例は、例えば、ＷＯ１９９４／１１０２６に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、ならびに例えば、タンパク質の発現及び／または哺乳動物細胞のゲノムへのこれらのポリヌクレオチド配列の統合に使用されるさらなる配列要素を含む。本明細書に記載の導入遺伝子の発現に使用することができる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するプロモーター及びエンハンサー領域などの調節配列を含むプラスミドが含まれる。導入遺伝子の発現に対して他の有用なベクターには、これらの遺伝子の翻訳速度を高める、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性もしくは核輸出を改善するポリヌクレオチド配列が含まれる。これらの配列要素には、例えば、発現ベクター上で運ばれる遺伝子の効率的な転写を指示するために、５’及び３’非翻訳領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及びポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載の発現ベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞の選択のためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含み得る。適切なマーカーの例には、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノウルセオトリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】様々なベクター内の要素の配置を示す図である。ＧＡＡｃｏ、ヒトコドン最適化酸性α−グルコシダーゼ遺伝子（ＧＡＡ）、ＩＴＲ、逆方向末端反復、ＳＤ、スプライスドナー、ＳＡ；スプライス受容体。
【図２】１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）からの大腿四頭筋組織に投与してから１カ月後に評価されるＧＡＡ活性を示すグラフである。
【図３】ＲＮＡ−ｓｅｑ分析による１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（丸）及び雌マウス（三角）からの肝組織において測定されるｈＧＡＡ転写産物を示すグラフである。内因性マウスＧＡＡの中央値発現レベルは、横線で示される。
【図４】１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）からの肝組織に投与してから１カ月後に評価されるＧＡＡ活性を示すグラフである。
【図５】Ａ及びＢは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図５Ａ）または３×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図５Ｂ）で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（丸）及び雌マウス（三角）からの血清に投与してから１カ月後に評価される抗ＧＡＡ抗体レベルを示すグラフである。
【図６】Ａ及びＢは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図６Ａ）または３ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ（図６Ｂ）で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（丸）及び雌マウス（三角）からの血清に投与してから１カ月後に評価されるＧＡＡ活性を示すグラフである。
【図７】Ａ及びＢは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図７Ａ）または３×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図７Ｂ）で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（丸）及び雌マウス（三角）からの大腿四頭筋組織切片に投与してから１カ月後に評価される病理学的スコア（表５に報告される）を示すグラフである。
【図８】代表的なマウスのＨ＆Ｅ及びＰＡＳで染色した切片からの画像を示し、ハイブリッドプロモーター及び肝臓を標的としたプロモーターによって指示されるｈＧＡＡ導入遺伝子を含むベクターを投与したマウスにおける、ＧＡＡ活性の上昇、グリコーゲンレベルの低下、及び筋肉の病理学的修復を示す対応する測定を示す。３×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した代表的な対照及びベクターで処置したマウスを、血清及び大腿四頭筋におけるＧＡＡ活性、ならびに大腿四頭筋におけるグリコーゲン蓄積について分析した。グリコーゲン蓄積スコアは、標準的な手順に従って、切断し、Ｈ＆Ｅ及びＰＡＳで染色したイソペンタンで凍結した四頭筋からの組織切片から評価した。
【図９】３×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）からの脊髄に投与してから１カ月後に評価されるＧＡＡ活性を示すグラフである。
【図１０】ＲＮＡ−ｓｅｑ分析による１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（丸）及び雌マウス（三角）からの脊髄組織において測定されるｈＧＡＡ転写産物の定量化を示すグラフである。内因性マウスＧＡＡの中央値発現レベルは、横線で示される。
【図１１】肝臓またはＣＮＳ組織におけるベクターごとの発現レベルの比率をそれぞれ推定するために、肝臓または脳組織における平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）で除算した、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析によって決定されるように、投与から１カ月後に、肝臓及び脊髄におけるＲＮＡ発現のレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
特定の組織の細胞における、リソソーム酵素（例えば、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ））をコードする遺伝子などの対象となる遺伝子の転写を刺激する転写調節要素が、本明細書に記載されている。特に、本明細書に記載の転写調節要素は、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害に冒されている組織における標的リソソーム酵素遺伝子の発現を促進し得る。そのような組織には、筋肉組織（例えば、心臓及び骨格筋組織）ならびに中枢神経系組織が含まれる。本明細書に記載の核酸調節要素は、ＧＡＡなどの導入遺伝子に作動可能に連結され、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害の治療のために患者（例えば、ヒト患者）に投与するためのビヒクルに組み込まれ得る。送達ビヒクルは、本明細書に記載のウイルスベクターなどのベクター、または核酸を対象となる細胞に導入するための他の薬剤（例えば、本明細書に記載のリポソーム、小胞、エキソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子）であり得る。
【００５４】
本発明は、部分的に、（ｉ）リソソーム蓄積障害に冒されている細胞における導入遺伝子の発現を促進して、病状を寛解させ、（ｉｉ）免疫寛容を促進する役割を果たす肝臓での発現を刺激するために使用することができるという発見に基づいている。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法は、リソソーム酵素欠乏症（例えば、ＧＡＡ欠乏症）の筋肉組織への有害な影響を治療しながら、導入された酵素（例えばＧＡＡ）に対する免疫反応を防ぐまたは減少させるために、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害を治療するために使用することができる。
【００５５】
以下の項では、前述の有利な特性を示す転写調節要素について説明する。以下の項はまた、本明細書に記載の転写調節要素と併せて使用し得る様々な導入遺伝子、ウイルスベクター、及びトランスフェクション試薬、ならびに様々な障害の治療に本明細書に記載の組成物を使用する方法についても説明する。
【００５６】
転写調節要素
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得る転写調節要素は、互いに作動可能に連結された様々な部分を含み得る。例えば、本明細書に記載の転写調節要素は、配列番号３に示されるようなアポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ）またはその機能部分を含み得る。ＡｐｏＥ−ＨＣＲの例示的な機能部分は、Ｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２５７７−２２５８５（１９９５）に記載の配列番号２に示される３２０ヌクレオチド部分であり、その開示は、それがＡｐｏＥ−ＨＣＲ遺伝子座及びその機能部分に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得るＡｐｏＥ−ＨＣＲ核酸の別の例は、ＡｐｏＥ−ＨＣＲの１９３ヌクレオチドセグメントであり、その核酸配列は、配列番号１に示されている。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得るＡｐｏＥ−ＨＣＲ核酸のさらなる例は、配列番号４に示される５０ヌクレオチドセグメントである。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なさらなる核酸調節要素は、上記の核酸配列に関して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９，９％もしくはそれ以上の配列同一性）を有する核酸分子を含む。
【００５７】
追加的または代替的に、本明細書に記載の転写調節要素は、デスミンプロモーターまたはその機能部分を含み得る。例えば、調節要素は、デスミン転写開始部位に対して、ヒトデスミン遺伝子座の核酸−９８４〜−６４４を含むデスミンプロモーターを含み得る。この構築物の核酸配列は、配列番号５に示されている。調節要素は、デスミン転写開始部位に対して、ヒトデスミン遺伝子座の核酸−２６９〜＋７６を含むデスミンプロモーターを含み得る。この構築物の核酸配列は、配列番号６に示されている。調節要素は、デスミン転写開始点に対して、ヒトのデスミン遺伝子座のヌクレオチド−９８４〜ヌクレオチド−６４４及びヌクレオチド−２６９〜ヌクレオチド＋７６を含むデスミンプロモーターを形成するために、介在する核酸なしで、配列番号６の核酸に融合された配列番号５の核酸を含み得る。この調節要素の核酸配列は、配列番号７に示されている。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なさらなる核酸調節要素には、上記の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９，９％もしくはそれ以上の配列同一性）を有する核酸分子を含む。
【００５８】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得る転写調節要素は、とりわけ、ニューロン、グリア細胞、または星状細胞などの中枢神経系の細胞内でそれに作動可能に連結された導入遺伝子の発現を刺激するプロモーターを含む。そのようなプロモーターの例は、シナプシンプロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩＩプロモーター、チューブリンαＩプロモーター、マイクロチューブリン関連タンパク質ＩＢ（ＭＡＰ  ＩＢ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、ニューロフィラメント軽鎖プロモーター、ニューロン特異的ＶＧＦ遺伝子プロモーター、ニューロン核（ＮｅｕＮ）プロモーター、大腸腺腫様性ポリポーシス（ＡＰＣ）プロモーター、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）、及びホメオボックスタンパク質９（ＨＢ９）プロモーター、またはそれらのバリアント（例えば、野生型プロモーター遺伝子座の核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性）を有し、中枢神経系の細胞への導入時にそれに作動可能に連結された導入遺伝子の転写を刺激することができるバリアント）、またはその機能部分を含む。
【００５９】
例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得る転写調節要素は、シナプシンプロモーターまたはその機能部分を含み得る。シナプシンプロモーター領域を含む例示的な調節要素は、配列番号８に示されている。この構築物は、シナプシン転写開始部位に対して、ヒトシナプシン遺伝子座のヌクレオチド−４６５〜ヌクレオチド−９０を含む。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なさらなる核酸調節要素には、この核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９，９％もしくはそれ以上の配列同一性）を有する核酸分子が含まれる。
【００６０】
前述の核酸調節要素を、以下の表２に要約する。
【００６１】
【表２】
2021512649.tif 000004
2021512649.tif 000005
2021512649.tif 000006
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【００６２】
上記の調節要素に加えて、本明細書に記載の調節要素には、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ要素またはその機能部分をデスミンプロモーター及び／またはシナプシンプロモーターに組み合わせることによって形成されたもの、またはその機能部分が含まれる。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用な調節要素には、デスミンプロモーターまたはその機能部分に作動可能に連結された、配列番号１に示されるＡｐｏＥ−ＨＣＲの１９３ヌクレオチドセグメントを含むものが含まれる。デスミンプロモーターの機能部分は、例えば、デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−９８４〜−６４４に及ぶ核酸、またはデスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−２６９〜＋７６に及ぶ核酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ要素またはその機能部分は、デスミン転写開始部位に対して、ヒトのデスミン遺伝子座のヌクレオチド−９８４〜ヌクレオチド−６４４、及びヌクレオチド−２６９〜ヌクレオチド＋７６を含むデスミンプロモーターに作動可能に連結されている。本明細書に記載の転写調節要素はまた、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ及び／またはデスミン調節要素と組み合わせて、シナプシンプロモーターまたはその機能部分も含み得る。
【００６３】
転写調節要素の例示的な組み合わせを、以下の表３に示す。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なさらなる核酸調節要素には、表３に示される核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９，９％もしくはそれ以上の配列同一性）を有する核酸分子が含まれる。
【００６６】
標的細胞への外因性核酸の送達のための方法
トランスフェクション技術
本明細書に記載の転写調節要素に作動可能に連結された導入遺伝子などの導入遺伝子を標的細胞に導入するために使用することができる技術は、当該技術分野で知られている。例えば、エレクトロポレーションを使用して、対象となる細胞に静電電位を印加することによって、哺乳動物細胞（例えば、ヒト標的細胞）を浸透させることができる。このようにして外部電場にさらされたヒト細胞などの哺乳動物細胞は、その後、外因性核酸の取り込みを起こしやすくなる。哺乳動物細胞のエレクトロポレーションは、例えば、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１３１１（１９８７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。同様の技術であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）は、外因性ポリヌクレオチドの真核細胞の核への取り込みを刺激するために、印加電場を利用する。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）及びこの技術を実行するために有用なプロトコルは、例えば、Ｄｉｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １４：３１５（２００５）、ならびにＵＳ２０１０／０３１７１１４に詳細に記載されており、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
標的細胞のトランスフェクションに有用な追加の技術には、スクイズポレーション法が含まれる。この技術は、負荷応力に応答して形成される膜状の孔を通して外因性ＤＮＡの取り込みを刺激するために、細胞の急速な機械的変形を誘発する。この技術は、ヒト標的細胞などの細胞への核酸の送達にベクターが必要とされないという点で有利である。スクイズポレーションは、例えば、Ｓｈａｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ８１：ｅ５０９８０（２０１３）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
リポフェクションは、標的細胞のトランスフェクションに有用な別の技術である。この方法は、リポソーム外部に向かって、第四級アミンまたはプロトン化アミンなどのカチオン性官能基を提示することが多い、リポソームへの核酸の負荷を伴う。細胞膜がアニオン性であるので、これにより、リポソームと細胞との間の静電相互作用が促進され、最終的に、例えば、リポソームと細胞膜との直接的な融合によって、または複合体のエンドサイトーシスによって外因性核酸が取り込まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第７，４４２，３８６号に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。外来核酸の取り込みを誘発するために細胞膜とのイオン相互作用を利用する同様の技法には、細胞とカチオン性ポリマー−核酸複合体との接触が含まれる。細胞膜との相互作用に好ましい正電荷を付与するようにポリヌクレオチドと会合する例示的なカチオン性分子は、活性化デンドリマー（例えば、Ｄｅｎｎｉｇ，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２８：２２７（２００３）に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランであり、トランスフェクション剤としてのその使用は、例えば、Ｇｕｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：Ｉ：９．２：９．２．１（１９９７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。磁気ビーズは、この方法では、核酸の取り込みを誘導するために磁場印加を利用するので、穏やかで、かつ効率的な方法で標的細胞をトランスフェクトするのに使用することができる別のツールである。この技術は、例えば、ＵＳ２０１０／０２２７４０６に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
標的細胞による外因性核酸の取り込みを誘導するのに有用な別のツールは、細胞を穏やかに透過処理し、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透するようにするために、特定の波長の電磁放射線に細胞を曝露することを伴う技法であるレーザーフェクションである。この技術は、例えば、Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８２：３０９（２００７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
微小胞は、本明細書に記載の方法に従って標的細胞ゲノムを改変するのに使用することができる可能性のある別のビヒクルである。例えば、遺伝子または調節配列などの対象となるポリヌクレオチドを共有結合によって組み込むために細胞ゲノムを調製するために、糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇと、例えば、ゲノム改変タンパク質、例えば、ヌクレアーゼとの同時過剰発現によって誘導された微小胞を用いて、内因性ポリヌクレオチド配列の部位特異的切断を後で触媒するタンパク質を細胞に効率的に送達することができる。真核細胞の遺伝子組換えのための、ジェシクル（Ｇｅｓｉｃｌｅ）とも呼ばれる、このような小胞の使用は、例えば、Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ［ａｂｓｔｒａｃｔ］、ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ；２０１５  Ｍａｙ  １３，ＡｂｓｔｒａｃｔＮｏ．１２２に詳述に記載されている。
【００７１】
遺伝子編集技術による標的遺伝子の取り込み
上記に加えて、対象となる遺伝子をヒト細胞などの標的細胞に組み込むために使用することができる様々なツールが開発されている。標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に組み込むために使用することができるそのような方法の１つは、トランスポゾンの使用を含む。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードし、５’切除部位及び３’切除部位に隣接する対象となるポリヌクレオチド配列または遺伝子を含有するポリヌクレオチドである。トランスポゾンが細胞内に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が開始し、トランスポゾンから対象となる遺伝子を切断する活性酵素を生じる。この活性は、トランスポザーゼがトランスポゾン切除部位を部位特異的に認識することによって媒介される。場合によっては、これらの切除部位は、末端反復でもよく逆方向末端反復でもよい。対象となる遺伝子は、トランスポゾンから切り出されると、哺乳動物細胞の核ゲノム内に存在する同様の切除部位の、トランスポザーゼによって触媒される切断によって哺乳動物細胞ゲノムに組み込むことができる。これにより、切断された核ＤＮＡの相補的な切除部位に対象となる遺伝子が挿入され、その後に、対象となる遺伝子を哺乳動物細胞ゲノムのＤＮＡにつなぐホスホジエステル結合の共有結合連結によって組み込みプロセスが完了する。ある特定の場合では、トランスポゾンは、標的遺伝子をコードする遺伝子が最初にＲＮＡ生成物に転写され、次いで、ＤＮＡに逆転写された後に、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれるようなレトロトランスポゾンでもよい。例示的なトランスポゾン系には、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン（例えば、ＷＯ２０１０／０８５６９９に詳細に記載されている）及びｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン（例えば、ＵＳ２００５／０１１２７６４で詳細に説明されている）であり、それらのそれぞれの開示は、対象となる細胞への遺伝子送達に使用するためのトランスポゾンに関係するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
標的遺伝子を標的細胞ゲノムに組み込むための別のツールは、元々、ウイルス感染に対する細菌及び古細菌の適応防御機構として進化した系である、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、プラスミドＤＮＡ内の回文配列リピート配列と、関連するＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。この一組のＤＮＡとタンパク質は、最初に、外来ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むことによって、標的配列の部位特異的なＤＮＡ切断を誘導する。次いで、これらの外来配列を含有するポリヌクレオチドと、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピートスペーサー要素は、ガイドＲＮＡを作り出すために宿主細胞内で転写され、その後に、ガイドＲＮＡは標的配列にアニールして、この部位にＣａｓ９ヌクレアーゼを局在化することができる。このように、高度に部位特異的なｃａｓ９を介したＤＮＡ切断は、ｃａｓ９を標的ＤＮＡ分子に近づける相互作用はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションによって支配されるため、外来ポリヌクレオチドにおいて起こすことができる。結果として、対象となる任意の標的ＤＮＡ分子を切断するようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を設計することができる。この技法は、真核生物ゲノムを編集するために利用されており（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：２２７（２０１３））、ＤＮＡを切断した後に、標的遺伝子をコードする遺伝子を組み込むために標的細胞ゲノムを部位特異的に編集する効率的な手段として使用することができる。遺伝子発現を調節するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用することは、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号に記載されており、その開示は、ゲノム編集のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。標的細胞においてゲノムＤＮＡを部位特異的に切断した後に対象となる遺伝子を組み込むための代替方法には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系とは異なり、これらの酵素は、特異的な標的配列に局在させるためにガイドポリヌクレオチドを含有しない。その代わりに、標的特異性は、これらの酵素内のＤＮＡ結合ドメインによって制御される。ゲノム編集用途におけるＺＦＮとＴＡＬＥＮの使用は、例えば、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：６３６（２０１０）及びＪｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：４９（２０１３）に記載されており、それらのそれぞれの開示は、ゲノム編集のための組成物及び方法に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込むために使用することができるさらなるゲノム編集技術には、ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断するように合理的に設計することができるＡＲＣＵＳ（商標）メガヌクレアーゼの使用が含まれる。そのような酵素について確立されている規定された構造活性相関を考慮すると、標的遺伝子をコードする遺伝子を哺乳動物細胞のゲノムに組み込むためにこれらの酵素を使用することは、有利である。望ましい場所でＤＮＡを選択的に切断して、標的遺伝子を標的細胞の核ＤＮＡに部位特異的に組み込むのを可能にするヌクレアーゼを作り出すために、単鎖メガヌクレアーゼを、ある特定のアミノ酸位置において改変することができる。これらの単鎖ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，０２１，８６７号及びＵＳ８，４４５，２５１において広範に説明されており、これらのそれぞれの開示は、ゲノム編集のための組成物及び方法に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
標的細胞への外因性核酸の送達のためのベクター
核酸送達のためのウイルスベクター
ウイルスゲノムは、対象となる遺伝子を標的細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）のゲノムに効率的に送達するために使用することができる豊富なベクター供給源を提供する。ウイルスゲノム内に含まれるポリヌクレオチドは、典型的には、一般化または特殊化された形質導入によって標的細胞のゲノムに組み込まれるため、このようなゲノムは、特に、遺伝子送達に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として行われ、遺伝子組み込みを誘導するために追加のタンパク質または試薬を必要としない。ウイルスベクターの例には、ＡＡＶ、レトロウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルス及びアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルス、ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘、及びカナリアポックス）が含まれる。本発明の抗体軽鎖及び重鎖または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを送達するのに有用な他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルスが含まれる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。他の例には、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソン・ファイザー（Ｍａｓｏｎ  Ｐｆｉｚｅｒ）サルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。ベクターの他の例は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号に記載されており、その開示は、遺伝子療法で使用するためのウイルスベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
核酸送達のためのＡＡＶベクター
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法の核酸は、細胞へのそれらの導入を促進するために、ｒＡＡＶベクター及び／またはビリオンに組み込まれる。本発明において有用なｒＡＡＶベクターは、（１）発現される導入遺伝子（例えば、ＧＡＡタンパク質をコードするポリヌクレオチド）及び（２）異種遺伝子の組み込み及び発現を促進するウイルス核酸を含む組換え核酸構築物である。ウイルス核酸は、ビリオンへのＤＮＡの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされるＡＡＶのそれらの配列を含み得る。典型的な用途では、導入遺伝子は、ＧＡＡをコードし、これは、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害に罹患している患者のＧＡＡ欠乏症を修正するのに有用である。そのようなｒＡＡＶベクターはまた、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含み得る。有用なｒＡＡＶベクターは、全体的または部分的に欠失したＡＡＶ  ＷＴ遺伝子のうちの１つ以上を有するが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、特定の用途に適している任意の血清型（例えば、血清型２に由来する）であり得る。ｒＡＡＶベクターを使用するための方法は、例えば、Ｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７：２７９−２９１（２０００）及びＭｏｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ７：２４−３０（２０００）に記載されており、それらのそれぞれの開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
本明細書に記載の核酸及びベクターは、細胞への核酸またはベクターの導入を促進するために、ｒＡＡＶビリオンに組み込むことができる。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ビリオンの外部の非核酸部分を構成し、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子によってコードされる。ｃａｐ遺伝子は、ビリオンのアセンブリに必要な３つのウイルスコートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶビリオンの構築は、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，９４１号、同第５，８６３，５４１号、同第５，８６９，３０５号、同第６，０５７，１５２号、及び同第６，３７６，２３７号、ならびにＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１−８０１（２００２）及びＢｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３−４３２（２００３）に記載されており、それらのそれぞれの開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なｒＡＡＶビリオンには、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、及び９を含む様々なＡＡＶ血清型に由来するものが含まれる。筋肉細胞を標的とするために、少なくとも１つの血清型１カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンが特に有用であり得る。血清型６カプシドタンパク質が血清型１カプシドタンパク質と構造的に類似しており、筋肉細胞でのＧＡＡの高度発現をもたらすことが期待されるため、少なくとも１つの血清型６カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンもまた、特に有用であり得る。ｒＡＡＶ血清型９はまた、筋肉細胞の効率的なトランスデューサーであることが分かっている。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、例えば、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９−６２３（２０００）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３４２８−３４３２（２０００）、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４−２２３２（１９９８）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４−１５３２（２０００）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５−６６２４（２００１）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５−３０８１（２００１）、それらのそれぞれの開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
偽型ｒＡＡＶベクターもまた、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用である。偽型ベクターには、所定の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８など）以外の血清型に由来するカプシド遺伝子で偽型化された所定の血清型（例えば、ＡＡＶ９）のＡＡＶベクターが含まれる。例えば、代表的な偽型ベクターは、ＡＡＶ血清型２由来のカプシド遺伝子で偽型化にされた治療用タンパク質をコードするＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである。偽型ｒＡＡＶビリオンの構築及び使用を含む技術は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７６６２−７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４−１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８：１５８−１６７（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１０：３０７５−３０８１（２００１）に記載されている。
【００７９】
ビリオンカプシド中に変異を有するＡＡＶビリオンは、変異していないカプシドビリオンよりも効果的に特定の細胞型に感染させるために使用され得る。例えば、好適なＡＡＶ変異体は、ＡＡＶの特異的細胞型への標的化を促進するために、リガンド挿入変異を有し得る。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、及びエピトープタグ変異体を含むＡＡＶカプシド変異体の構築及び特徴付けは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５−４５（２０００）に記載されている。本発明の方法で使用することができる他のｒＡＡＶビリオンには、ウイルスの分子育種ならびにエキソンシャッフリングによって生成されたカプシドハイブリッドが含まれる。例えば、Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３６−４３９（２０００）及びＫｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４２３−４２８（２００１）を参照のこと。
【００８０】
治療の方法
ポンペ病
ポンペ病（ＩＩ型糖原病またはＧＳＤ  ＩＩとして知られている）は、リソソーム酵素ＧＡＡの欠乏によって引き起こされる。この疾患は、ＧＡＡ欠乏症は、最終的には、すべての組織、特に横紋筋細胞にグリコーゲン蓄積をもたらす、先天性の代謝異常である。加えて、中枢神経系内のグリコーゲン蓄積の効果及び骨格筋機能へのその効果が、文書化されている。
【００８１】
この障害には、乳児、若年、及び成人の３つの臨床形態が知られている。乳児ポンペ病は、出生直後に発症し、進行性の筋力低下及び心不全を呈する。ポンペの乳児型は、心筋症が急速に発症することも特徴としており、患者は多くの場合、典型的には人生の最初の年に死に至るミオパシー及び神経障害を示す。成人及び若年患者の症状は、後年に発生し、骨格筋及びニューロンが主に関与する。この形態のポンペ病を示す患者は、呼吸不全により最終的に死亡する。患者は、６０年以上も例外的に生存し得る。疾患の重症度と残存酸性α−グルコシダーゼ活性との間には相関関係があり、その活性は、疾患の後期発症では正常の１０〜２０％であり、早期発症型が２％未満である。
【００８２】
ヒト酸性α−グルコシダーゼ
野生型ＧＡＡのアミノ酸配列は、以下の配列番号１４に示されている。
ＭＧＶＲＨＰＰＣＳＨＲＬＬＡＶＣＡＬＶＳＬＡＴＡＡＬＬＧＨＩＬＬＨＤＦＬＬＶＰＲＥＬＳＧＳＳＰＶＬＥＥＴＨＰＡＨＱＱＧＡＳＲＰＧＰＲＤＡＱＡＨＰＧＲＰＲＡＶＰＴＱＣＤＶＰＰＮＳＲＦＤＣＡＰＤＫＡＩＴＱＥＱＣＥＡＲＧＣＣＹＩＰＡＫＱＧＬＱＧＡＱＭＧＱＰＷＣＦＦＰＰＳＹＰＳＹＫＬＥＮＬＳＳＳＥＭＧＹＴＡＴＬＴＲＴＴＰＴＦＦＰＫＤＩＬＴＬＲＬＤＶＭＭＥＴＥＮＲＬＨＦＴＩＫＤＰＡＮＲＲＹＥＶＰＬＥＴＰＨＶＨＳＲＡＰＳＰＬＹＳＶＥＦＳＥＥＰＦＧＶＩＶＲＲＱＬＤＧＲＶＬＬＮＴＴＶＡＰＬＦＦＡＤＱＦＬＱＬＳＴＳＬＰＳＱＹＩＴＧＬＡＥＨＬＳＰＬＭＬＳＴＳＷＴＲＩＴＬＷＮＲＤＬＡＰＴＰＧＡＮＬＹＧＳＨＰＦＹＬＡＬＥＤＧＧＳＡＨＧＶＦＬＬＮＳＮＡＭＤＶＶＬＱＰＳＰＡＬＳＷＲＳＴＧＧＩＬＤＶＹＩＦＬＧＰＥＰＫＳＶＶＱＱＹＬＤＶＶＧＹＰＦＭＰＰＹＷＧＬＧＦＨＬＣＲＷＧＹＳＳＴＡＩＴＲＱＶＶＥＮＭＴＲＡＨＦＰＬＤＶＱＷＮＤＬＤＹＭＤＳＲＲＤＦＴＦＮＫＤＧＦＲＤＦＰＡＭＶＱＥＬＨＱＧＧＲＲＹＭＭＩＶＤＰＡＩＳＳＳＧＰＡＧＳＹＲＰＹＤＥＧＬＲＲＧＶＦＩＴＮＥＴＧＱＰＬＩＧＫＶＷＰＧＳＴＡＦＰＤＦＴＮＰＴＡＬＡＷＷＥＤＭＶＡＥＦＨＤＱＶＰＦＤＧＭＷＩＤＭＮＥＰＳＮＦＩＲＧＳＥＤＧＣＰＮＮＥＬＥＮＰＰＹＶＰＧＶＶＧＧＴＬＱＡＡＴＩＣＡＳＳＨＱＦＬＳＴＨＹＮＬＨＮＬＹＧＬＴＥＡＩＡＳＨＲＡＬＶＫＡＲＧＴＲＰＦＶＩＳＲＳＴＦＡＧＨＧＲＹＡＧＨＷＴＧＤＶＷＳＳＷＥＱＬＡＳＳＶＰＥＩＬＱＦＮＬＬＧＶＰＬＶＧＡＤＶＣＧＦＬＧＮＴＳＥＥＬＣＶＲＷＴＱＬＧＡＦＹＰＦＭＲＮＨＮＳＬＬＳＬＰＱＥＰＹＳＦＳＥＰＡＱＱＡＭＲＫＡＬＴＬＲＹＡＬＬＰＨＬＹＴＬＦＨＱＡＨＶＡＧＥＴＶＡＲＰＬＦＬＥＦＰＫＤＳＳＴＷＴＶＤＨＱＬＬＷＧＥＡＬＬＩＴＰＶＬＱＡＧＫＡＥＶＴＧＹＦＰＬＧＴＷＹＤＬＱＴＶＰＶＥＡＬＧＳＬＰＰＰＰＡＡＰＲＥＰＡＩＨＳＥＧＱＷＶＴＬＰＡＰＬＤＴＩＮＶＨＬＲＡＧＹＩＩＰＬＱＧＰＧＬＴＴＴＥＳＲＱＱＰＭＡＬＡＶＡＬＴＫＧＧＥＡＲＧＥＬＦＷＤＤＧＥＳＬＥＶＬＥＲＧＡＹＴＱＶＩＦＬＡＲＮＮＴＩＶＮＥＬＶＲＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫＶＴＶＬＧＶＡＴＡＰＱＱＶＬＳＮＧＶＰＶＳＮＦＴＹＳＰＤＴＫＶＬＤＩＣＶＳＬＬＭＧＥＱＦＬＶＳＷＣ（配列番号１４）
【００８３】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得るＧＡＡポリペプチドをコードする例示的な遺伝子には、配列番号１４に示される野生型ＧＡＡタンパク質をコードする遺伝子、ならびに配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％同一である）機能的ＧＡＡ酵素が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得るＧＡＡポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するものなど、１つ以上のアミノ酸置換を有するものをさらに含む。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得るＧＡＡポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有するものを含む。
【００８４】
本明細書に記載の転写調節要素は、ポンペ病に罹患している患者などのリソソーム蓄積症患者に欠乏しているＧＡＡなどの導入遺伝子に作動可能に連結することができる。本明細書に記載の調節要素の転写制御下にあるリソソーム酵素を含む構築物は、ベクター（または本明細書に記載の他のトランスフェクション剤）に組み込まれ、リソソーム蓄積障害を治療するために患者に投与され得る。有利には、本明細書に記載の転写調節要素は、筋肉細胞及び中枢神経系の細胞などの疾患に冒されている細胞における欠損リソソーム酵素（例えば、ＧＡＡ）をコードする遺伝子の転写を促進し得る。さらに、本明細書に記載の調節要素は、患者が欠乏している酵素をコードする遺伝子の導入に他の方法で伴う可能性がある免疫応答を低減または排除するというさらなる利点を伝える。本明細書に記載の転写調節要素の有利な特性は、以下の実施例１でさらに詳細に報告されている。
【００８５】
薬学的組成物、投与経路、及び単位用量
本明細書に記載の転写調節要素は、リソソーム酵素（例えば、ＧＡＡ）などの導入遺伝子に作動可能に連結され、リソソーム蓄積障害（例えば、ポンペ病）に罹患しているヒト患者などの患者に投与するためのビヒクルに組み込まれ得る。治療用導入遺伝子に作動可能に連結された、本明細書に記載の転写調節要素を含むウイルスベクターなどのベクターを含む薬学的組成物は、当該技術分野で知られている方法を使用して調製することができる。例えば、そのような組成物は、例えば、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）、参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、例えば凍結乾燥製剤または水溶液の形で所望の形態で調製することができる。
【００８６】
治療用導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節要素を含む、本明細書に記載のＡＡＶベクター及び他のものなどのウイルスベクターは、様々な投与経路によって患者（例えば、ヒト患者）に投与され得る。投与経路は、疾患の発症及び重症度によって変わり得、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、血管内、吸入、灌流、洗浄、及び経口投与が含まれ得る。血管内投与には、患者の血管系への送達が含まれる。いくつかの実施形態において、投与は、血管内（静脈内）と見なされる血管への投与であり、いくつかの投与では、投与は、動脈（動脈内）と見なされる血管への投与である。静脈には、内頸静脈、末梢静脈、冠状静脈、肝臓静脈、門脈、大伏在静脈、肺静脈、上大静脈、下大静脈、胃静脈、脾臓静脈、下腸間膜静脈、上腸間膜静脈、頭側静脈、及び／または大腿静脈が含まれるが、これらに限定されない。動脈には、冠状動脈、肺動脈、上腕動脈、内頸動脈、大動脈弓、大腿動脈、末梢動脈、及び／または毛様体動脈が含まれるが、これらに限定されない。送達は、細動脈または毛細血管を介して、またはそれらに対するものであってよいことが企図される。
【００８７】
治療レジメンは、変動し、多くの場合、疾患重症度ならびに患者の年齢、体重、及び性別に応じて異なり得る。治療には、対象となる遺伝子を様々な単位用量で標的細胞に導入するのに有用であると本明細書に記載のベクター（例えば、ウイルスベクター）または他の薬剤の投与が含まれ得る。各単位用量は、通常、所定の量の治療用組成物を含む。投与される量、ならびに特定の投与経路及び製剤は、臨床分野の当業者の技術の範囲内である。単位用量は、単回注射として投与される必要はないが、設定された期間にわたる連続的注入を含み得る。本明細書に記載のウイルスベクターの単位用量は、都合よく、ウイルス構築物のプラーク形成単位（ｐｆｕ）で記載され得る。単位用量は、例えば、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２から１０１３ｐｆｕ及びそれ以上の範囲であり得る。追加的または代替的に、ウイルスの種類及び達成可能な力価に応じて、１〜１００、１０〜５０、１００〜１，０００、あるいは最大約または少なくとも約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、または１×１０１５もしくはそれ以上の感染性ウイルス粒子（ｖｐ）を送達し得、それらの間にあるすべての値及び範囲を含む。
【００８８】
本明細書に記載の核酸及びウイルスベクターの混合物は、１つ以上の賦形剤、担体、または希釈剤と好適に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中、及び油中で調製され得る。これらの調製物は、通常の保存条件及び使用条件下で、微生物の発育を阻止するための保存剤を含有し得る。注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液もしくは分散液、及び滅菌注射可能溶液もしくは分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる（ＵＳ５，４６６，４６８に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。どんな場合でも、製剤は、滅菌であり得て、簡単にシリンジに入れることができる程度に流体であり得る。製剤は、製造及び貯蔵の条件下で安定し得り、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保存され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物及び／または植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中の使用によってもたらされ得る。
【００８９】
例えば、本明細書に記載の薬学的組成物を含む溶液は、必要に応じて、適切に緩衝化され得、液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張化される。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の投与に適している。この点について、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして、当業者に知られている。例えば、１用量を１ｍｌのＮａＣｌ等張液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下注射液に加えるか、予定注射部位に注射することができる。用量については、治療がなされる対象の状態に応じて、いくらかの変動が必然的に生じ得る。いずれにせよ、投与を担当する者が個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、ＦＤＡ生物学的製剤評価オフィスが要求する、滅菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たす必要がある。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、評価され得るかについての説明を当業者に行うために示されるものであり、単に例示的なものであるように意図されており、本発明者が本発明として見なす範囲を限定するようには意図されていない。
【００９１】
実施例１．ポンペ病患者における酸性α−グルコシダーゼ遺伝子送達のために最適な組織発現の確立
目的
いくつかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ポンペのマウスモデルにおける一連の用量で、異なる組織（例えば、筋肉及び肝臓）での発現を標的とするように設計された。ポンペマウスモデルでの全身投与後、一連の用量で、異なる組織及び／または組織の組み合わせへのヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子（ｈＧＡＡ）の発現を誘導するように設計された６つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの結果を比較した。ポンペ病の治療のために全身投与されたＡＡＶ−ＧＡＡの臨床試験への翻訳のために、最適な多組織発現プロファイルを持つベクターが、選択された。
【００９２】
この研究では、ベクター用量及び標的組織発現プロファイルを調べて、呼吸、心臓、及び骨格筋の機能、ならびに組織でのＧＡＡ活性及びグリコーゲンの蓄積を含む、患者におけるポンペ病に関連するこのモデルの様々なエンドポイントにどのように影響したかを判断した。本明細書に記載の発見は、ＡＡＶ遺伝子療法のために最適化されたｈＧＡＡベクターの臨床翻訳を支持する。
【００９３】
材料及び方法
ベクター及びベクター生成
ベクター２（ＡＡＶ９−Ｄｅｓ−ｈＧＡＡｃｏ）、ベクター３（ＡＡＶ８−ＬＤｅｓ−ｈＧＡＡｃｏ）、ベクター４（ＡＡＶ８−ＬＮＤｅｓ−ｈＧＡＡｃｏ）、ベクター５（ＡＡＶ８−ＬＤｅｓ２−ｈＧＡＡｃｏ）、及びベクター６（ＡＡＶ８−Ｄｅｓ３−ｈＧＡＡｃｏ）は、標準的な分子生物学技術を介してクローン化され、哺乳動物細胞への２−プラスミド一過性トランスフェクションに基づいたスケール化された生産方法で製造された。各ベクターのゲノム力価は、ｄｄＰＣＲにより決定した。候補ベクターを、以下の表４に要約する。構築物の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域の一般的な構成の略図を、図１に示す。
【００９４】
【表４】
2021512649.tif 000012
【００９５】
転写調節要素
ベクター番号１のＧＡＡ導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節要素の核酸配列は、５’から３’に、ヒトα−１抗トリプシンプロモーター（以下の配列番号１３に示されている）に作動可能に連結された、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号１に示されている）の１９３ヌクレオチドセグメントを含む。この構築物で使用された、組み合わせられたＡｐｏＥ−ＨＣＲ／ヒトα−１抗トリプシン調節要素の核酸配列は、配列番号９に示されている。
ＣＣＣＣＴＡＡＡＡＴＧＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧｃＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴＣ（配列番号９）
ＧＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧｃＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴＣ（配列番号１３）
【００９６】
ベクター番号２のＧＡＡ導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節要素の核酸配列は、短縮されたデスミンプロモーターである。この短縮されたデスミンプロモーターは、（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−２６９〜＋７０を含む）配列番号６の核酸配列を有する３’領域に融合された（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−９８４〜−６４４を含む）配列番号５の核酸配列を有する５’領域を含む。この構築物で使用される転写調節要素の核酸配列は、配列番号７に示されている。
【００９７】
ベクター番号３のＧＡＡ導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節要素の核酸配列は、５’から３’に、短縮されたデスミンプロモーターに作動可能に連結された、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号１に示されている）の１９３ヌクレオチドセグメントを含む。この短縮されたデスミンプロモーターは、（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−２６９〜＋７０を含む）配列番号６の核酸配列を有する３’領域に融合された（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−９８４〜−６４４を含む）配列番号５の核酸配列を有する５’領域を含む。この構築物で使用される組み合わせられたデスミンプロモーターの核酸配列は、配列番号７に示されている。この構築物で使用される組み合わせられたＡｐｏＥ−ＨＣＲ／デスミン転写調節要素の核酸配列は、配列番号１０に示されている。
【００９８】
ベクター番号４のＧＡＡ導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節要素の核酸配列は、５’から３’に、短縮されたデスミンプロモーターに作動可能に連結された、ＡｐｏＥ−ＨＣＲの１９３ヌクレオチドセグメントに作動可能に連結されたシナプシンプロモーターを含む。この構築物で使用されるシナプシンプロモーターの核酸配列は、（シナプシン転写開始部位に対してヌクレオチド−４６５〜−９０を含む）配列番号８に示されている。この構築物で使用されるＡｐｏＥ−ＨＣＲ領域のセグメントの核酸配列は、配列番号１に示されている。この構築物で使用される短縮されたデスミンプロモーターは、（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−２６９〜＋７０を含む）配列番号６の核酸配列を有する３’領域に融合された（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−９８４〜−６４４を含む）配列番号５の核酸配列を有する５’領域を含む。この構築物で使用される組み合わせられたデスミンプロモーターの核酸配列は、配列番号７に示されている。この構築物で使用される組み合わせられたシナプシン／ＡｐｏＥ−ＨＣＲ／デスミン転写調節要素の核酸配列は、配列番号１１に示されている。
【００９９】
ベクター番号５のＧＡＡ導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節要素の核酸配列は、５’から３’に、短縮されたデスミンプロモーターに作動可能に連結された、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号４に示されている）の５０ヌクレオチドセグメントを含む。この短縮されたデスミンプロモーターは、（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−２６９〜＋７０を含む）配列番号６の核酸配列を有する３’領域に融合された（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−９８４〜−６４４を含む）配列番号５の核酸配列を有する５’領域を含む。この構築物で使用される組み合わせられたデスミンプロモーターの核酸配列は、配列番号７に示されている。この構築物で使用される組み合わせられたＡｐｏＥ−ＨＣＲ／デスミン転写調節要素の核酸配列は、配列番号１２に示されている。
【０１００】
ベクター番号６のＧＡＡ導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節要素の核酸配列は、短縮されたデスミンプロモーターである。この短縮されたデスミンプロモーターは、（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−２６９〜＋７０を含む）配列番号６の核酸配列を有する３’領域に融合された（デスミン転写開始部位に対してヌクレオチド−９８４〜−６４４を含む）配列番号５の核酸配列を有する５’領域を含む。この構築物で使用される転写調節要素の核酸配列は、配列番号７に示されている。
【０１０１】
インビボ研究
動物のすべての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥによって承認され、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥで行われた。Ｂ６．１２９−Ｇａａｗｔマウス及びＢ６．１２９−Ｇａａｔｍ１Ｒａｂｎホモ接合性変異マウスは、ジャクソン研究所から入手した。ＡＡＶロットは、ビヒクルで希釈することによって注射用に調製され、用量は、マウスの体重測定に従って、ベクターまたはビヒクルの単回静脈内投与によって、示されるように３×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または１×１０１４ｖｇ／ｋｇで投与された。臨床観察及び死亡率観察は、投与から研究の終了まで毎日行われた。投与から４週間または１２週間後に、マウスを殺処分にし、剖検した。採取された組織は、処理され、その後の分析のために第三者開発業務受託機関に送られた。
【０１０２】
ＧＡＡ活性
α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性は、マウス組織（例えば、肝臓、心臓、脳、及び脊椎）ならびに血清で評価された。血清または組織ホモジネートを、ＧＡＡによって加水分解されて加水分解生成物４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を生成する蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）とインキュベートした。４−ＭＵは、蛍光プレートリーダーで検出され、サンプルの酵素活性は、４−ＭＵ標準曲線を使用して定量化された。
【０１０３】
抗ＧＡＡ抗体分析
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、組換えｈＧＡＡタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした。ブロッキング後、１：２００で希釈した血漿サンプルを、プレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＨＲＰにコンジュゲートした抗マウス二次抗体を、検出のために使用した。次いで、蛍光発生基質をウェルに加え、光強度をプレートリーダーで評価した。
【０１０４】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析
全ＲＮＡを組織から単離し、ポリＡを選択した標準的なイルミナ鎖特異的プロトコルを使用してシークエンシングライブラリーを調製した。ライブラリーは、サンプルごとにインデックス化され、組織型ごとにプールし、４レーン（２×１５０ｂｐリード）にわたってＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑによって配列決定した。アダプター配列は、最初にＳｋｅｗｅｒを使用してＦＡＳＴＱファイルからトリミングされ、次いでｈＧＡＡを含む転写産物量を、Ｓａｌｍｏｎ（ＧＣバイアス及びストランド情報を考慮）を使用してトリミングされたＦＡＳＴＱファイルから定量化し、最後に転写数を、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒからのＤＥＳｅｑ２パッケージを使用してライブラリーサイズに対して正規化した。
【０１０５】
病理学的評価
イソペンタンで凍結した組織を切断し、標準的な手順に従って、Ｈ＆Ｅ及びＰＡＳで染色した。次いで、切片を、訓練された病理学者が盲目的に分析し、以下の注釈（表５も参照のこと）に従ってスコアを評価した：１．正常、２．繊維の１０〜４９％に見られる大小のグリコーゲン凝集体、３．繊維の５０〜９０％に見られる大小のグリコーゲン凝集体、４．小さなグリコーゲンが繊維の９０％超凝集し、大きなグリコーゲンがまれな繊維でのみ凝集する、５．小さなグリコーゲンが繊維の９０％超凝集し、大きなグリコーゲンが繊維の３０％超凝集する。
【０１０６】
結果
ハイブリッドプロモーターは、肝臓及び筋肉のＧＡＡ発現バランスを調整する
ＧＡＡ活性は、筋肉及び肝臓組織で評価された。筋肉中のＧＡＡ活性を決定するために、１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した対照及びベクターで処置したマウスについて雄（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）からの大腿四頭筋組織におけるＧＡＡ活性は、投与から１カ月後に評価した（材料及び方法を参照のこと）（図２）。肝組織中のＧＡＡ活性を決定するために、１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）からの肝組織に投与してから１カ月後にＧＡＡ活性を評価した（図４）。追加的に、ｈＧＡＡ転写産物は、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析によって１×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（丸）及び雌マウス（三角）からの肝組織において測定された（図３）。内因性マウスＧＡＡの中央値発現レベルは、横線で示される。
【０１０７】
これらの結果は、ハイブリッドプロモーター構築物が肝臓及び筋肉で発現されたことを示す。ＧＡＡ活性は、筋肉を標的としたハイブリッドプロモーター構築物で大腿四頭筋に保存された。遺伝子操作された肝臓で増強されたプロモーター設計と一致して、ベクター１ならびにハイブリッドベクター３及び４は、肝臓で最高レベルの発現及び活性を示した。
【０１０８】
ｈＧＡＡへの抗体反応性に対する肝臓発現の影響も評価された。抗ＧＡＡ抗体レベルは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図５Ａ）または３×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図５Ｂ）で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）からの血清に投与してから１カ月後に評価した。さらに、ＧＡＡ活性は、１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ（図６Ａ）または３×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図６Ｂ）で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）からの血清に投与してから１カ月後に評価した。
【０１０９】
肝臓の発現が上昇すると、ｈＧＡＡに対する抗体反応性が低下する。ｈＧＡＡに対する抗体反応性が低下すると、ベクター１、３、及び４の血清ＧＡＡが上昇した。要約すると、プロモーターの肝活性が上昇すると、用量依存的に抗ＧＡＡ免疫原性が低下し、血清中のＧＡＡ活性レベルが上昇した。
【０１１０】
肝臓のみのプロモーターベクターと比較してハイブリッドプロモーターからの大腿四頭筋の病変の改善
筋肉の病変は、酵素補充療法によってヒトで修正することは古典的に困難である。筋肉の病変の改善における各ベクターの影響を判断するために、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図７Ａ）または３×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図７Ｂ）で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）から切断した大腿四頭筋の病理学的スコア（表５）を、評価した。
【０１１１】
ＧＡＡ活性、グリコーゲンレベル、及び筋肉の病理学的修復を、ハイブリッドプロモーターによって指示されるｈＧＡＡ導入遺伝子を含むベクターを投与したマウスにおいて評価した。３×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与した代表的な対照及びベクターで処置したマウスを、血清及び大腿四頭筋におけるＧＡＡ活性、ならびに大腿四頭筋におけるグリコーゲン蓄積について分析し、これらに対する値を図８に報告される。グリコーゲン蓄積スコアは、標準的な手順に従って、切断し、Ｈ＆Ｅ及びＰＡＳで染色したイソペンタンで凍結した大腿四頭筋からの組織切片から評価し、これらの値を図８に報告される。代表的なマウスからのＨ＆Ｅ及びＰＡＳで染色した切片からの画像もまた、図８に示されている。
【０１１２】
筋肉の発現は、インビボでの筋肉の病変の改善に必要であった。ハイブリッドプロモーターで投与したマウスは、ＧＡＡマウスモデルで筋肉の病変スコアの改善を達成した。いくつかのベクターは、３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で雄マウス及び雌マウスにおける病理学的スコアの改善をもたらした。
【０１１３】
【表５】
2021512649.tif 000013
【０１１４】
脊髄におけるベクター３に関連するＧＡＡ活性及びデノボＧＡＡ転写産物の証拠
ハイブリッドベクターがＣＮＳベースのポンペの症状を修復する能力を評価するために、ＧＡＡ活性を、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図９）で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（黒丸）及び雌マウス（灰色三角）からの脊髄に投与してから１カ月後に評価した。追加的に、ｈＧＡＡ転写産物は、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析による１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（図１０）で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス（丸）及び雌マウス（三角）からの脊髄組織において測定された。内因性マウスＧＡＡの中央値発現レベルは、横線で示される。肝臓またはＣＮＳ組織におけるベクターごとの発現レベルの比率をそれぞれ推定するために、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析によって決定されるように、肝臓または脊髄におけるＲＮＡ発現のレベルを、肝臓または脳組織における平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）で除算した（図１１）。
【０１１５】
これらの結果は、脊髄組織におけるベクター３からのＧＡＡ活性及びデノボＧＡＡ転写産物の証拠を示す。ベクター３における脊髄での発現は、ＶＣＮごとに、肝臓での発現と同等であった
【０１１６】
結論
この実施例によって示されるように、ベクター３のような操作された合成ハイブリッドプロモーターは、筋肉、肝臓、及びＣＮＳ組織における真正なｈＧＡＡ発現を指示した。肝臓の寄与により、例えば、ベクター３に対して好ましい免疫原性プロファイルをもたらした。筋肉の寄与により、例えばベクター３に対して好ましいＧＡＡ活性、グリコーゲンの回復、及び筋肉の病理学的観察結果をもたらす。追加的に、脊髄及びデノボ転写産物におけるＧＡＡ活性に基づいてＣＮＳ活性（例えば、ベクター３に対する）が証明されている。本発明者らの所見は、ポンペ病のＡＡＶ遺伝子療法のために最適化されたｈＧＡＡベクターとして本明細書に記載のベクターの臨床翻訳を支持する。
【０１１７】
実施例２．転写調節要素に作動可能に連結されたＧＡＡ導入遺伝子を含むベクターの投与によるポンペ病の治療
当該技術分野で知られている従来の分子生物学技術を使用して、ＧＡＡなどの治療用タンパク質をコードする遺伝子は、転写調節要素（例えば、上記の実施例１に記載の転写調節要素）に作動可能に連結することができる。その後、遺伝子を、ウイルスベクターなどのベクターに組み込み、遺伝子の欠損に関連する疾患に罹患している患者に投与することができる。例えば、ＧＡＡの欠乏を特徴とするポンペ病、リソソーム蓄積障害に罹患している患者は、筋肉細胞、ニューロン、及び肝細胞におけるＧＡＡを促進する転写調節要素の制御下でＧＡＡ遺伝子を含むウイルスベクターを投与することができる。例えば、偽型ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９ベクターなどのＡＡＶベクターは、ベクターの５’逆方向末端反復と３’逆方向末端反復との間にＧＡＡ遺伝子を組み込むベクターを生成することができ、遺伝子は、上記の実施例１に記載の転写調節要素の制御下に置くことができる。ＡＡＶベクターは、とりわけ、静脈内、筋肉内、または皮下などの様々な投与経路によって対象に投与することができる。
【０１１８】
ベクターを患者に投与した後、当業者は、様々な方法によって、ＧＡＡ遺伝子の発現、及び療法に応答した患者の改善をモニタリングすることができる。例えば、医師は、治療法に対する患者の反応を確認するために、患者の筋肉機能（例えば、心筋機能）及び／またはグリコーゲン蓄積をモニタリングすることができる。患者の筋肉機能が改善し、及び／または療法を施した後のグリコーゲン蓄積レベルが低下したという所見は、患者が治療に好意的に反応することを示し得る。その後の用量は、必要に応じて決定及び投与することができる。
【０１１９】
他の実施形態
この本明細書に記述されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各独立した刊行物または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
本発明は、その具体的な実施形態と関連して説明してきたが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に本発明の原理に従う、本発明のいかなる変形形態、用途、または適合も、本発明が関連する技術の範囲内で知られているまたは通例の実施の範囲内に入るような、以下で記載され、特許請求項の範囲内にある、基本的な特徴に適用され得るような本発明からの逸脱も含めて、包含することを意図するものであることを理解されよう。
【０１２１】
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。
【図１】
2021512649.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2021512649.tif 000019
【図７】
2021512649.tif 000020
【図８】
2021512649.tif 000021
【図９】
2021512649.tif 000022
【図１０】
2021512649.tif 000023
【図１１】
2021512649.tif 000024
【配列表】
2021512649000001.app
【国際調査報告】
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