(57)【要約】  自動抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）システムおよび方法が提供され、サンプル（複数）は１つまたは複数の繰り返し操作または非確定的操作を通過し、区分してまとめられて、または再び区分してまとめられて、後続の確定的操作シーケンスのリソースの利用を最適化する。確定的ワークフローと非確定的ワークフローが空間的に分離されている自動ＡＳＴシステムも提供される。
2021510513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳＴカセットに対して繰り返し操作を実行するように構成される第１部分と、
ＡＳＴカセットに対して既定の操作シーケンスを実行するように構成される第２部分と、を備え、第２部分が、第１部分から空間的に分離されている、自動ＡＳＴシステム。
【請求項２】
第１部分と第２部分との間でＡＳＴカセットを移動させるためのアセンブリをさらに備える、請求項１に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項３】
第１部分と第２部分が垂直に分離され、第１部分と第２部分との間でＡＳＴカセットを移動させるためのアセンブリがエレベータを備える、請求項２に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項４】
培養器アセンブリと光信号を測定するアセンブリとの間でＡＳＴカセットを移動させるための、ガントリと、エフェクタアームとをさらに備える、請求項３に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項５】
第１部分と第２部分が水平に分離され、第１部分と第２部分との間でＡＳＴカセットを移動させるためのアセンブリが、２つの端部からアクセス可能な培養器を含み、各端部がシステムの１つの部分に面する、請求項２に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項６】
繰り返し操作が、微生物の増殖が所定のレベルに達するまでの、ＡＳＴカセットの少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖の評価である、請求項１に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項７】
微生物の増殖の評価が、（ａ）微生物の増殖に適した条件下で、培養器アセンブリ内でＡＳＴカセットを培養することと、（ｂ）微生物の増殖と相関するＡＳＴカセットの少なくとも１つのウェル内の光信号を測定することとを含む、請求項６に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項８】
（ａ）第３の軸で動作する伸長可能なプラッタを備えた２軸プラットフォーム、または（ｂ）培養器アセンブリと光信号を測定するアセンブリとの間でＡＳＴカセットを移動させるエンドエフェクタを備えるアームのいずれか１つをさらに備える、請求項６に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項９】
既定の操作シーケンスが、複数のウェルのそれぞれのウェルの微生物を表面結合試薬と接触させることと、試薬が撹拌の有無にかかわらず結合するのを待つことと、非結合の表面結合試薬から微生物を分離することとを含む、請求項１に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項１０】
既定の操作シーケンスが、個々のＡＳＴカセット内の異なるＡＳＴカセットまたは領域に対して異なる、請求項９に記載の自動ＡＳＴシステム。
【請求項１１】
抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実行する方法であって、
複数のＡＳＴカセットを自動ＡＳＴシステムに挿入することと、
複数のＡＳＴカセットを第１の所定の時間間隔で微生物の増殖に適した条件下で培養することと、
微生物の増殖のレベルが所定の閾値を超えるまで、各ＡＳＴカセットの少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖のレベルを繰り返し評価し、次いでＡＳＴカセットを解放することと、
繰り返し評価ステップから解放された１つまたは複数のＡＳＴカセットをＡＳＴカセットのマルチプレートバッチにグループ化することと、
ＡＳＴカセットのマルチプレートバッチが、アクセスが制限されたリソースを使用して確定的処理シーケンスにより処理されることであって、アクセスが制限されたリソースが、任意選択で遠心分離機、流体処理ステーション、または光信号測定ステーションである、確定的処理シーケンスにより処理されることと、を含む、方法。
【請求項１２】
確定的処理シーケンスが、ＡＳＴカセットのマルチプレートバッチ内の各ＡＳＴカセット内の複数のウェルについて、
ウェル内の微生物を、表面結合試薬を含む溶液と接触させ、撹拌の有無にかかわらず試薬が結合するのを待つことと、
表面結合試薬を含む溶液から微生物を分離することと、
表面結合試薬を含まない溶液の中で微生物を少なくとも１回洗浄することと、
ウェルに存在する表面結合試薬のレベルを評価することと、
ＡＳＴカセットの異なるウェルに存在する表面結合試薬の比較に基づいて、ＡＳＴカセットごとに、ＡＳＴカセットの複数のウェル内に異なる量で存在する抗菌薬の定性的感受性結果（ＱＳＲ）または最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の少なくとも１つを決定し、自動ＡＳＴシステムのユーザに前記ＱＳＲまたはＭＩＣを報告することと、を含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
各ＡＳＴカセットの少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖のレベルを繰り返し評価することが、ＡＳＴカセットのマルチプレートバッチに解放されていない各ＡＳＴカセットを、第１の所定の時間間隔より短い第２の所定の時間間隔で培養することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
表面結合試薬を含む溶液から微生物を分離するステップが、遠心分離機でＡＳＴカセットを遠心分離することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
アクセスが制限されたリソースによって実行される操作が、アクセス制限されたリソースに偶数のＡＳＴカセットが装填されることを必要とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
アクセス制限されたリソースには、第１および第２のマルチプレートバッチが装填され、第１および第２マルチプレートバッチが、確定的処理シーケンスの異なる段階にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
確定的処理シーケンスが、複数の操作サイクルに編成され、確定的処理シーケンス中のアクセスが制限されたリソースに出入りするマルチプレートバッチの動作が、パイプラインシーケンスに従っており、これはアクセスが制限されたリソースがアイドル状態である確定的処理シーケンス中の操作サイクル数を最小化する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
確定的処理シーケンサが、パイプラインシーケンスに基づいて、および任意選択でバッチアグリゲータパイプラインシーケンスからの入力に基づいて、新しいマルチプレートバッチが確定的処理シーケンスに入る速度を制御する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
確定的処理シーケンスが、複数のサブシーケンスに分割される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
複数のサブシーケンス内の各サブシーケンスが、複数のマルチプレートバッチが確定的処理シーケンスで実行されているときに並行して実行される１つまたは複数のタスクを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
単一のマルチプレートバッチに対してサブシーケンスが同時には実行されない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＳＴカセットのマルチプレートバッチのサイズが、自動ＡＳＴシステムによって処理されているカセットの数に基づいて、バッチが確定的処理シーケンスを受ける前に定められ、最大バッチサイズが１つのプレートから複数（例えば、２、４、６、８、１０、１２）のプレートに増加する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
アクセスが制限されたリソースが、一度に最大６、１０、１２、１４または１６のＡＳＴカセットを遠心分離するようにサイズ設定された遠心分離機である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
複数のＡＳＴカセットを培養し、微生物の増殖のレベルを繰り返し評価するステップ中に、複数のＡＳＴカセットが単一プレートのバッチにグループ化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
複数のＡＳＴカセットを挿入するステップが、少なくともＡＳＴカセットを、８、１０、または１２分ごとに最大４プレートの速度で自動ＡＳＴシステムに挿入することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＳＴカセットをシステムに挿入するステップと、同じＡＳＴカセットについてＱＳＲまたはＭＩＣを自動ＡＳＴシステムのユーザに報告するステップとの間の平均経過時間が８時間未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
平均経過時間が６時間未満である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１８年１月１２日に提出された米国仮特許出願第６２／６１７，１６３号および２０１８年４月２５日に提出された米国仮特許出願第６２／６６２，５９２号に対して、米国特許法第１１９条に基づく優先権の利益を主張する。これらの出願はそれぞれ、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、体外診断装置、システム、および方法、特に微生物学的診断装置に関する。本明細書に記載されるシステムおよび方法は、微生物学的サンプルの自動化された培養および処理に関連することができる。
【背景技術】
【０００３】
抗菌薬は、医療行為を変革してきており、かつては致命的であった感染症をより簡単に治療できるようにし、何百万人もの命を救っている。抗菌薬の迅速な投与は、特に敗血症などの重篤な感染症で死亡率を低下させることが証明されている。これらの深刻なケースでは、微生物（例えば種）に関する情報が一般的に知られていないため、非常に強力で薬効範囲が広い抗菌薬が最もよく使用される。これらの薬効範囲が広い抗菌薬には深刻な副作用がある可能性があり、臓器の損傷を引き起こし、回復と入院を長期化させ、場合によっては死亡率を上昇させてしまう。さらに、抗菌薬の過剰使用は、抗菌薬耐性菌の発生を引き起こし、それは公衆衛生に対する深刻かつ増大する脅威となっている。増加する一連の証拠は、対象を絞った抗菌療法を使用することにより、患者の死亡率を低減（例えば最小化）でき、回復期間を短縮でき、病院は患者の入院、および高価な抗菌薬の使用の最小化の両方で費用を節約できることを示唆している。
【０００４】
ただし、対象を絞った抗菌療法に通常必要な完全な情報は、通常、サンプルを採取してから２〜３日後に提供される。現在の抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）では、関連する有用な情報を決定して提供するのに８時間を超えてかかる場合があり、これは通常、同日中に結果を提供するには不十分である。多くの臨床検査室は１２時間シフトで稼働しているため、これは、翌日まで処方者が実用的なＡＳＴ情報を入手できないことを意味する。
【０００５】
一部のシステムは、患者のサンプルを一連の抗菌薬希釈系列に曝露し、経時的にその増殖を測定することにより、表現型ＡＳＴ試験を実行する。微生物の代謝によって引き起こされる染料の溶液の濁度または蛍光を測定することによって、増殖を間接的かつ最も頻繁に光学的に測定できる。光信号を定量的に比較することにより、これらのシステムは、試験された微生物の増殖を正常に阻害する各抗菌薬の希釈系列の最低濃度を決定する。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）として知られるこの値は、最も効果的な抗菌薬と投薬量を決定するために、つまり、対象となる抗菌療法を実施するために、臨床医によってしばしば使用される。さらに、感受性（Ｓ）、中間（Ｉ）、または耐性（Ｒ）の定性的感受性結果（ＱＳＲ）が、ＭＩＣとともに、またはＭＩＣの代わりに報告される場合がある。
【０００６】
ＭＩＣおよびＱＳＲの結果に到達するために、標準化された栄養ブロス（例えば、ミューラーヒントンブロス）での所与の微生物の増殖を、複数の抗菌薬希釈条件（例えば２倍希釈系列全体）での増殖と比較する。手作業で、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）により規定されたとおり、増殖は１６〜２４時間後に典型的には一度だけ測定される。前述のように、一部の自動システムでは、定期的（例えば２０分）に各試験ウェルにおいて微生物の増殖を問い合わせることにより、この時間を短縮する。このプロセスは面倒な場合があり、技術者は通常は実行しない。次いで、増殖曲線のウェル、レート、積分などの間における絶対値、相対値の分析を含む独自アルゴリズムを使用して増殖曲線が分析される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
歴史的に、自動化と新しいアッセイの開発によってサンプルから結果までの時間が短縮された臨床化学および血液学の分野に比べて、微生物学の臨床検査室における自動化は遅れていた。過去３０年間で３つの主要な自動ＡＳＴシステムが開発された。これらはすべて、通常は高度な訓練を受けた技術者によって行われる操作を自動化するように設計されている。これらの自動システムは、免疫アッセイ、核酸検査、細胞学などの分野で開発された自動システムによって実行される操作（例えばサンプルの培養、液体処理など）と表面的に同じような操作を実行する。しかしながら、表現型ＡＳＴアプリケーションでは、これらの操作を、既存の自動化デバイスの設計上の制限と互換性がないことが多い条件下で実行する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、自動ＡＳＴシステムにおけるプロセスフローを合理化し、スループットを最大化し、結果までの時間を最小化するためのシステムおよび方法を提供する。
【０００９】
一態様では、本開示は、２つの部分を含む自動ＡＳＴシステムに関する。この２つの部分は、繰り返し操作（例えば、その中の微生物の増殖がＡＳＴ試験シーケンスの実行に十分になるまでのサンプルの培養）を実行するように構成された第１部分、および、第１部分から空間的に分離されており、ＡＳＴカセットに対して既定の操作シーケンス（例えばＡＳＴ試験シーケンス）を実行するように構成される第２部分である。このシステムは、システムの第１および第２部分が垂直に分離されている場合のエレベータなど、第１部分と第２部分との間でＡＳＴカセットを移動させるためのアセンブリを含み得る。または水平に分離されたシステムの場合、培養器は２つの端部で開いており、各開口部はシステムの一部分からアクセスできる（例えば、第１開口部はシステムの第１部分からアクセスでき、第２開口部はシステムの第２部分からアクセスできる）。いくつかの実施形態では、システムは、培養器アセンブリと光信号を測定するアセンブリとの間でＡＳＴカセットを移動させるためのガントリとエフェクタアームとを含む。
【００１０】
本発明のこの態様に続いて、いくつかの実施形態では、所定のレベルの微生物の増殖に達するまで、ＡＳＴカセットの少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖の繰り返し操作評価が行われる。その操作は、（ａ）微生物の増殖に適した条件下で、培養器アセンブリ内でＡＳＴカセットを培養することと、（ｂ）微生物の増殖と相関するＡＳＴカセットの少なくとも１つのウェル内の光信号を測定することと、を含むことができる。これらの場合、自動システムには、任意選択で、第３の軸で動作する拡張可能なプラッタを備えた２軸プラットフォーム、または培養器アセンブリと光信号を測定するアセンブリとの間でＡＳＴカセットを移動させるエフェクタを備えたアームが含まれる。既定の操作シーケンスは、場合によっては、複数のウェルのそれぞれの微生物を表面結合試薬と接触させ、非結合の表面結合試薬から微生物を分離することを含む。これらの場合のサブセットでは、異なるＡＳＴカセットごと、または個々のＡＳＴカセット内の領域ごとに、操作の固定シーケンスが異なる。
【００１１】
別の態様では、本開示は抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実行する方法に関する。この方法は、複数のＡＳＴカセットを自動ＡＳＴシステムに挿入し、次いで複数のＡＳＴカセットを第１の所定の時間間隔で微生物の増殖に適した条件下で培養することと、微生物の増殖のレベルが所定の閾値を超えるまで、各ＡＳＴカセットの少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖のレベルを（例えば、代謝アッセイおよび／または光学測定によって）繰り返し評価し、次いでＡＳＴカセットを解放することと、繰り返し評価ステップから解放された１つまたは複数のＡＳＴカセットをＡＳＴカセットのマルチプレートバッチにグループ化することと、アクセスが制限されたリソース、任意選択で遠心分離機、流体処理ステーション、または光信号測定ステーションを使用して、ＡＳＴカセットのマルチプレートバッチが確定的処理シーケンスにより処理されることと、を含む）。場合によっては、確定的処理シーケンスは、ＡＳＴカセットのマルチプレートバッチ内の各ＡＳＴカセット内の複数のウェルについて、ウェル内の微生物を、表面結合試薬を含む溶液と接触させることと、表面結合試薬を含む溶液から微生物を分離することと、表面結合試薬を含まない溶液の中で微生物を少なくとも１回洗浄することと、ウェルに存在する表面結合試薬のレベルを評価することと、ＡＳＴカセットの異なるウェルに存在する表面結合試薬の比較に基づいて、ＡＳＴカセットごとに、ＡＳＴカセットの複数のウェル内に異なる量で存在する抗菌薬の定性的感受性結果（ＱＳＲ）または最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の少なくとも１つを決定し、自動ＡＳＴシステムのユーザに前記ＱＳＲまたはＭＩＣを報告することと、を含む。いくつかの例では、各ＡＳＴカセットの少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖のレベルを繰り返し評価するステップは、ＡＳＴカセットのマルチプレートバッチに解放されていない各ＡＳＴカセットを、第１の所定の時間間隔より短い第２の所定の時間間隔で培養することを含む。表面結合試薬を含む溶液から微生物を分離するステップは、遠心分離機でＡＳＴカセットを遠心分離することを含み得る。場合によっては、アクセスが制限されたリソースによって実行される操作は、アクセスが制限されたリソースに偶数のＡＳＴカセットを装填する必要があり、任意選択で、アクセスが制限されたリソースに、確定的処理シーケンスの異なるステージにある第１と第２のマルチプレートバッチが装填される。
【００１２】
本開示のこの態様において、いくつかの実施形態では、確定的処理シーケンスは複数の操作サイクルに編成され、確定的処理シーケンス中のアクセスが制限されたリソースに出入りするマルチプレートバッチの動作は、パイプラインシーケンスに従っており、これはアクセスが制限されたリソースがアイドル状態である確定的処理シーケンス中の操作サイクル数を最小化する。場合によっては、例えば、確定的処理シーケンサは、パイプラインシーケンスに基づいて、および任意選択でバッチアグリゲータパイプラインシーケンスからの入力に基づいて、新しいマルチプレートバッチが確定的処理シーケンスに入る速度を制御する。これらの実施形態における確定的処理シーケンスは、複数のサブシーケンスに分割されることができ、そのそれぞれは、複数のマルチプレートバッチが確定的処理シーケンスを実行しているときに、機器の同じステーションで並行して実行される１つまたは複数のタスクを任意選択で含む。あるいは、この方法は、単一のマルチプレートバッチに対してサブシーケンスが同時に実行されないように実施されてもよい。
【００１３】
本開示のこの態様によるいくつかの実施形態では、自動ＡＳＴシステムによって処理されているカセットの数に基づいてバッチが確定的処理シーケンスを受ける前に、ＡＳＴカセットのマルチプレートバッチのサイズは定められる。最大バッチサイズは、１つのプレートから複数（例えば２、４、６、８、１０、１２）のプレートに増加する。いくつかの実施形態は、以下のうちの１つまたは複数を特徴とする：すなわち、アクセスが制限されたリソースは、一度に最大６、１０、１２、１４または１６のＡＳＴカセットを遠心分離するサイズの遠心分離機であること；複数のＡＳＴカセットを培養し、微生物の増殖のレベルを繰り返し評価するステップ中に、複数のＡＳＴカセットが単一プレートのバッチにグループ化されること；複数のＡＳＴカセットを挿入するステップは、１２分ごとに最大４つのプレートの速度で少なくともＡＳＴカセットを自動ＡＳＴシステムに挿入すること；および／またはＡＳＴカセットをシステムに挿入するステップと、同じＡＳＴカセットの自動ＡＳＴシステムのユーザにＱＳＲまたはＭＩＣを報告するステップとの間の平均経過時間は８時間未満、または６時間未満であること。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本開示の実施形態による例示的なプロセスフローを示す図である。
【図２】本開示の実施形態による例示的なプロセスフローを示す図である。
【図３】本開示の特定の実施形態によるバッチアグリゲータによるサンプルのキューイングおよび再キューイングを示す図である。
【図４】本開示の実施形態による例示的なプロセスフローを示す図である。
【図５】本開示のいくつかの実施形態による例示的なプロセスフローを示す図である。
【図６Ａ】本開示による例示的な自動ＡＳＴシステムを示す図である。
【図６Ｂ】本開示による例示的な自動ＡＳＴシステムを示す図である。
【図６Ｃ】本開示による例示的な自動ＡＳＴシステムを示す図である。
【図６Ｄ】本開示による例示的な自動ＡＳＴシステムを示す図である。
【図７】自動ＡＳＴシステムの最適にスケジュールされたワークフローを示す図である。
【図８】自動ＡＳＴシステムの最適にスケジュールされたワークフローを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
概要
本開示全体を通して、サンプル、シリーズ、およびジョブが参照される。サンプルという用語は、マルチウェルプレートまたはカートリッジ形式を含む、任意の適切な形式で本開示のシステムまたは方法によって処理される任意のサンプルを指す。シリーズという用語は、個々のサンプルに対して本開示のシステムによって実行される一連のプロセスステップを指す。個々のサンプルのシリーズの各セットは、ジョブと呼ばれる。サンプルプレート、ＡＳＴパネル、ＡＳＴカセット、および／またはＡＳＴカートリッジについても言及されている。これらの用語は、以下の開示の様々な実施形態による、患者サンプルが接種され、自動ＡＳＴシステムによって処理されるマルチウェル容器を指すために互換的に使用される。
【００１６】
Ｓｅｌｕｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（マサチューセッツ州ボストン）は最近、現在利用可能な商用システムで使用されている増殖曲線ではなく、１つまたは複数のエンドポイントアッセイに基づいて迅速な表現型ＡＳＴ結果を得ることができる自動ＡＳＴシステムを開発した。これらのシステムの動作は、参照により本明細書に組み込まれている、Ｖａｃｉｃらによる米国特許第１０，１６１，９４８号明細書に記載されている。既定のシーケンスでおよび／または決められた時間で実行される確定的操作（例えばメディア交換、光学的問い合わせなど）と、十分な微生物の増殖のためのチェックポイントなどの、非確定的操作および／または繰り返し操作と、の統合に、臨床検査室でこのようなシステムを実装する際の１つの課題は関する。
【００１７】
図１を参照すると、いくつかの実施形態では、本開示による単一のプロセスフローは、決定ポイント１２０によって、非確定的サブプロセス１１０（ジョブＡ）と、確定的サブプロセス１３０（ジョブＢ）とのグループに論理的に分割され得る。場合によっては、プロセスフローは、それぞれが複数のそれぞれの決定点１２０ａ〜１２０ｎによって分離された、複数の並列する非確定的プロセス１１０ａ〜１１０ｎと、複数の並列する確定的プロセス１３０ａ〜１３０ｎとを含む。あるいは、本開示によるプロセスフローは、非確定的プロセス（ジョブＡ）１１１と、決定点１２１と、決定点１２１の後に実行され得る複数の操作１３１、１３２、１３３とを含み得る。プロセスフローは、個々のサンプルに対して実行できるか、または、決定点のいずれかの側でバッチ処理され得る。
【００１８】
図２を参照すると、本開示による１つのタイプのワークフローでは、サンプルはデバイス２１０（例えば、以下に記載されるような抗菌薬感受性試験システム）に装填される。サンプル数は２２０で取得され、サンプルは順次キューイングされるか、または非確定的サブプロセス（ジョブＡ）のバッチ（複数）でスケジュールされ、データ構造（例えば配列、リスト）に保存される。ジョブＡ２３０の実行、および決定ポイント２４０（例えば、試験中のサンプルの光学的問い合わせ）の通過後、サンプルのキューは、現在の操作から解放されてジョブＡ２３０に再キューイング２５０されるか、または確定的サブプロセス２６０に解放されるかの準備状況に基づいて、ソートされることができる。解放されたサンプルのリストが作成された後、サンプルは最適なバッチ２７０に配置され、ジョブＢ２９０に対してスケジュール２８０される。確定的サブプロセスの完了後、分析結果が報告３００される。
【００１９】
ここで説明するワークフローでは、プロセスの非確定的部分に続いて、サンプルをキューイングすることができる。所与の期間（例えば、２、５、１０、２０、３０、６０分ごと、または１、２、３、４、５、６、７、８時間ごと）に、プロセスの必要に応じて、サンプル（複数）のバッチ（複数）はキューから解放され、プロセスの確定的部分に入れられる。
【００２０】
サブプロセスの非確定的シーケンスが確定的シーケンスに続く場合、バッチ（複数）は再び個別のサンプル（複数）（または最も論理的なバッチ（複数））に分割され、非確定的シーケンスを通じて個別に処理され得る。プロセスの確定的部分と非確定的部分のバッチを作成および分割するこのフローは、プロセスがすべてのサンプルに対して完了するまで継続できる。
【００２１】
スケジューリングは、最短の処理時間、最短のアイドル時間、ヒューリスティックルールなどの、しかしこれらに限定されない、１つまたは複数のジョブショップ最適化アルゴリズムに基づいて実行されることができる。同様に、ジョブＡは複数のサンプルに対して並行して実行され得る。この場合、第１のスケジューリングはジョブＡの開始前に行われ、スケジューリングアルゴリズムおよびシステム設計によって最適なバッチ（複数）が決定される。各決定ポイントで、サンプルリストがソートされ、新しいサンプルが追加される。解放の準備ができているサンプル（複数）は区分してまとめられ、ジョブＢのキューにスケジュールされる。
【００２２】
図３の例示的なフローチャートは、本明細書で説明される例示的なスケジューリングプロセスを示している。ｔ＝０で、いくつかのプレート（例えば、１０プレート）がシステムに装填される。決定ポイントの後のｔ＝Ｔで、この例では、サンプルＳ２、Ｓ５、Ｓ６およびＳ３は次のジョブの準備ができていると判断されるが、サンプルＳ４、Ｓ１およびＳ１０はｔ＝Ｔ＋１で準備ができる（または準備できることが期待される）、またサンプルＳ７、Ｓ９、Ｓ８は、ｔ＝Ｔ＋２で準備ができる（または準備できることが期待される）と判断される。バッチアグリゲータは、プレートの第１のグループを解放し、それらをジョブＢにスケジュールするが、グループ２および３は元のキューに戻される。追加のプレート（例えばＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４）がシステムに追加されると、新しいキューは（Ｓ４、Ｓ１、Ｓ１０、Ｓ７、Ｓ９、Ｓ８、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４）のようになる。次の決定ポイントでは、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４などの取得情報に基づいて、別の再キューイングが発生する場合がある。
【００２３】
図４は、時間依存のチェックポイントによってゲートされた非確定的前半の一般的なアッセイを示している。チェックポイント後、サンプル（複数）は再び区分してまとめられ、最適にスケジュールされ処理のために送られる。図５は、表面結合エンドポイントアッセイに基づく抗菌薬感受性アッセイの例を示している。この前に、十分な増殖チェックと代謝アッセイが行われている。十分な増殖アッセイにより、手動のブロス微量希釈アッセイと同様に、指示染料なしで細菌と抗生物質を培養できる。染料が存在しないことにより、細菌の増殖（すなわち代謝）に対する前記染料の干渉を低減（例えば、最小限に）することが可能になる。細菌の増殖を監視するための染料を含むコントロールウェルはごくわずかである。別の実施形態では、増殖は、吸光度、前方または後方光散乱、または細菌の自己蛍光を使用して、染料なしで測定することができる。アッセイのこの部分は、プレートの装填時は非確定的であり、図１〜図４のジョブＡに対応する。このプロセスは連続的に実行することも、ハードウェアで可能にされている場合は論理バッチ処理を使用することもできる。十分な増殖が達成されると、プレート（複数）は新しい論理バッチ（複数）のセットに区分してまとめられることができ、再スケジュールされて、最適なスループットを可能にする。
【００２４】
上述のスループット最適化ステップが実施された場合でも、他の要因の中でも特に、物理システムの制約のために、いずれのプロセスでもボトルネックが発生する可能性があることを当業者は理解するであろう。例えば、上記の自動ＡＳＴプロセスでは、再び区分してまとめられたサンプルが機器の培養ステーションを占有し、同ステーションによる追加のカートリッジの処理を制限する場合がある。非確定的操作に基づいてサンプルを移動させるガントリとグリッパアームと間の物理的な干渉の可能性があるため、ボトルネックが発生することもある。このようなボトルネックを軽減する１つのメカニズムは、例えば、これらの操作に関係するステーションを機器の異なる側面または高さに配置することにより、確定的操作と非確定的操作を物理的に分離することである。垂直階層化機器は非階層化機器よりも占有床面積が少なく、多くの臨床検査室では床面積が貴重であるため、構成部品の垂直的層状構造は特に有利であり得る。
【００２５】
図６は、本明細書で説明される１つまたは複数のスケジューリング手法を実施しながら、ＡＳＴサンプルシーケンスの異なる操作を分離する自動ＡＳＴシステムの一例を示している。例えば、サンプルスケジューリング手法は、図５に示すワークフロー例に基づいて、サブプロセスの確定的シーケンスおよび非確定的シーケンスの両方を含むことができる。システム６００は、２つのサブシステムまたは領域（例えばフロア）、上階６１０、下階６５０に分割されている。上階６１０は、ワークフローの非確定的部分の処理専用のステーションを含み、下階６５０は、ワークフローの確定的部分の処理専用のステーションを含む。システム６００は、オペレータが処理のために新しいサンプルを挿入するサンプル装填領域６２０を含むことができる。場合によっては、オペレータは１つまたは複数のウェルプレート、トレイ、またはカートリッジをシステムに装填できる。上階６１０は、エンドエフェクタ（例えばグリッパ）６２５と、光学リーダ６３０と、１つまたは複数の培養器（例えば震盪培養器）６１５と、流体処理ステーションまたはシステム６０５とを備えたガントリ（台）を含み得る。非確定的サブプロセスで十分な増殖が達成されると、プレートはバッチ（複数）（例えば、より良い（例えば、より効率的な）シーケンスとスループットのために区分してまとめられた）にキューイングされ、それらを処理のために下階に送ることができる。場合によっては、エレベータ６４０（例えば、垂直ロボット装置）を使用して、プレートは下階に送られることができ、これは、２つの階の２つのサブシステム間のハンドシェイクまたは同期ツールとして機能することができる。条件１とバッチアグリゲータ間のアッセイの一部（図５に示されている）は、どちらのフロアでも実行できる。場合によっては、追加の培養により、アッセイのその部分を上階に割り当てるとスペース効率が向上し、下階の培養器からのサンプルの導入と除去の繰り返しを減らすことができる。スペースが問題にならない場合など、一部のケースでは、アッセイのその部分を下階に割り当てることができる。場合によっては、エレベータ６４０の制御は、より複雑なプロセスを実行するフロア（例えば下階）に割り当てることができる。これにより、そのフロアの入来するプレートの速度が制御されて、そのフロア、そしてそれによってシステム全体に最適な定常状態のバッチ処理（例えば、最も高いスループット）を実現できる。
【００２６】
下階６５０は、プレートを効率的な（例えば最適な）バッチにグループ化するように構成され、エンドエフェクタ／グリッパ６５５を備えたガントリと、ミキサおよびフルイディクスステーション６６０と、光学リーダ６６５と、サンプル分離ステーション６７０（例えば遠心分離機）とを含み得る。システム６００はまた、流体貯蔵器６８０と、廃棄物容器６９０とを含む。場合によっては、バッファとして機能する他のステーション間でプレートを保持するための待機ステーション６５５が追加されて、それらのステーション（例えばグリッパを備えたガントリ、ミキサなど）をより有効に利用できる。
【００２７】
バッチサイズは、遠心分離機などの限られた処理能力のリソースを最大限に活用するための処理シーケンスの最適化に特に役立つ変数の１つである。図７および図８は、遠心分離ベースの処理シーケンスのスケジューリングシーケンスの例を示している。図７は、８プレート容量の遠心分離機を必要とする４プレートバッチの最適化されたスケジューリングを示している。図８は、２プレートバッチを使用して最適化された同じシーケンスを示しており、同じ全体スループットを達成するには、６プレート容量の遠心分離機が必要である。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、図８の最適化されたシーケンスの遠心分離機は一度に最大３つのバッチを処理する能力があるため、遠心分離機（または他のアクセス制限されたシステムリソース）が実行するバッチがより少ない他のシステムの場合よりも、そのパイプライン効果は顕著であると考えられる。さらに、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、図５に示されるワークフローが３つの遠心分離工程を含み、少なくとも３つのバッチの処理能力を持つ遠心分離機を利用することにより、プロセスの３つの段階すべてで高度にパイプライン化された方法でバッチを処理できるため、遠心分離機の使用率（稼働時間をシステムの合計時間で割ったものとして定義される）が向上することを、当業者は理解するであろう。当業者はまた、最適なバッチサイズは、アクセスが制限されたリソース（遠心分離機など）の処理能力だけでなく、他のサブシステムの処理時間などのいくつかの要因の影響を受けることも理解するであろう。
【００２８】
自動化されたエンドポイントベースのＡＳＴシステムおよび方法
本明細書に記載のシステムおよび方法は、マルチアッセイ試験シーケンスを実行するための自動化された迅速な抗菌薬感受性試験システムに関連することができ、試験システムは少なくとも以下のように構成されることができる：すなわち、装填されたテストプレートを受け取る；装填されたテストプレートを培養アセンブリに移動する；培養アセンブリのテストプレート内で、接種されたサンプルを培養して撹拌する；少なくとも１回、定期的にテストプレートの複数のコントロールウェル内のサンプルの増殖量を測定する；コントロールウェル内の増殖レベルが増殖の閾値レベルに達した、または超えたと判断したことに応答して培養を停止する；テストプレートで培養されたサンプルに対して１つまたは複数のエンドポイントアッセイを実行する；前記エンドポイントアッセイから得られた試験プレートの複数のウェル内のサンプルからの１つまたは複数の光出力を測定する、この光出力は、複数のウェルのそれぞれに残存する微生物の量に相当する；複数のウェルおよび複数の抗菌薬のそれぞれに残っている微生物の最小発育阻止濃度および／または定性的感受性解釈の少なくとも１つを報告する。
【００２９】
例えば、いくつかの実施形態では、試験されるサンプルは、試験パネル（例えば、カートリッジ（例えば、試験トレイ（例えば、ウェルプレート（例えば、マイクロウェルプレート（例えば、９６または３８４マイクロウェルプレート（例えば、マイクロタイタープレート））））））に接種され得る。場合によっては、カートリッジがシステムに装填され、プロセス終了まで、人の介入なしに（例えば、ロボット工学を使用して）実質的に自動的に処理されることができる。プロセスの結果は、例えば、ディスプレイ画面で報告されたり、臨床検査情報システム（ＬＩＳ）に通信されたりできる。さらに、各カートリッジは、バーコードまたは他の固有のマーキング（レーザー彫刻、ダイレクトパーツマーキング、ＲＦＩＤ、または他のマーキング／識別）によって一意に規定でき、バーコードまたは他の固有のマーキングは、カートリッジとカートリッジの中で試験されるサンプルを識別するために、装填前にユーザによって、またはシステムによって自動的にスキャンされることができる。さらに、１つのＡＳＴパネル（例えばマイクロウェルプレート（例えば、９６または３８４マイクロウェルプレート））は、２つ以上の臨床サンプル（例えば多重化パネル）を含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、カートリッジは、それぞれが液体または乾燥形態の抗菌薬を含む複数の試験カートリッジチャンバ（例えばウェル（複数））を含むことができる。場合によっては、各ウェルは、異なる抗菌薬の種類および／または濃度を含むことができる。場合によっては、カートリッジがシステムに装填される前に、カートリッジはウェル（複数）に乾燥抗菌薬を有することができる。場合によっては、カートリッジは、培地（例えば、栄養ブロス、ミューラーヒントンブロスなどの流体）中に懸濁された抗菌薬を有することができる。場合によっては、カートリッジは抗菌フィルムの形態の抗菌薬を有することができる。場合によっては、カートリッジは固形の抗菌薬を有することができる。カートリッジは、微生物を含むサンプルを接種され、迅速ＡＳＴ診断装置に装填されることができる。本明細書に記載される微生物は、生物学的サンプルに由来し得る。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、臨床サンプルに由来する（例えば、患者サンプルに由来し得る）。生体サンプルの例には、全血、血漿、血清、痰、尿、便、白血球、赤血球、軟膜、涙、粘液、唾液、精液、膣液、リンパ液、羊水、脊髄液、または脳脊髄液、腹水、胸水、滲出液、斑点、上皮塗抹標本、生検、骨髄サンプル、嚢胞または膿瘍からの液体、滑液、硝子体液または房水、眼洗浄液または吸引液、気管支肺胞洗浄液、気管支洗浄液、または肺洗浄液、肺吸引液、および、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓などを含むがこれに限定されない臓器および組織、スワブ（創傷スワブ、口腔スワブ、喉スワブ、鼻腔スワブ、膣腔スワブ、尿道スワブ、子宮頸管スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブなどを含むがこれらに限定されない）、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。細菌培養物または細菌分離物、真菌培養物または真菌分離物も含まれる。場合によっては、微生物接種の前に、１つまたは複数の希釈、単離、および／または培養ステップが実行されることができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、自動ＡＳＴシステムへの装填前に、カートリッジが、所望の培養温度に対応する温度に予熱されることができる。標準の空気対流式培養器では、試験プレートを所望の作動温度にするのに通常３０〜６０分かかるため、場合によっては、予熱は有用である場合がある。予熱は、本明細書で説明するシステムおよび方法を使用して迅速ＡＳＴを実行する場合に特に役立つ場合がある。これは、通常の望ましい培養時間は８時間未満、ほとんどの場合は７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、または３時間未満であるためである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗菌薬の存在下での微生物の培養は、カートリッジを予熱してから３０分以内に行われる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、カートリッジ内の複数の液体含有ウェルは、約３０℃から約４０℃の温度に予熱されることができる。場合によっては、予熱は、カートリッジのウェルを実質的に均一に加熱することができる。いくつかの実施形態では、カートリッジの最高温度ウェルとカートリッジの最低温度ウェルとの間の温度のパーセント差が約５％未満になるように、ウェルの実質的に均一な加熱はカートリッジを加熱することを含むことができる。すなわち、いくつかの実施形態では、カートリッジ全体にわたる（例えば、ウェル間の）温度の変動は、約５％未満である。場合によっては、カートリッジに少なくとも約２５℃の温度で少なくとも１つの流体を加えることによってカートリッジが予熱される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、カートリッジは、約１５分未満予熱されることができる。場合によっては、カートリッジは約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、または約１５分間予熱される。いくつかの実施形態では、カートリッジは、放射加熱、伝導加熱、および／または対流加熱のうちの少なくとも１つによって予熱される。例えば、放射加熱は、赤外線放射加熱を含むことができる。いくつかの例では、カートリッジは伝導および対流加熱によって予熱されることができる。例えば、少なくとも１つの加熱表面が、伝導および対流加熱を実行することができる。いくつかの実施形態では、カートリッジは、放射加熱と伝導および対流加熱の両方によって予熱されることができる。いくつかの実施形態では、カートリッジは、対流加熱のみでは予熱されない。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本明細書のシステムおよび方法は、接種されたカートリッジの技術者による装填から結果（例えば、最小発育阻止濃度およびＣＬＳＩブレークポイント解釈）までの迅速なＡＳＴの自動化を提供する。場合によっては、カートリッジは技術者によって装填され、「黄色ブドウ球菌」などの微生物識別（ＩＤ）情報（種など）が、入力され得るか、あるいは、システムのソフトウェアインターフェースで自動的に取得され得る。このように、質量分析（例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出（例えば蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨ）および／またはマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験などの他の方法を使用して取得したＩＤ情報を利用できる。場合によっては、生化学的試験として当業者に既知である、比色色素および蛍光色素を有するカートリッジが微生物ＩＤに使用されることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムは、カートリッジ（複数）を培養することができ、１つのカートリッジがシステムに装填された後、所定の期間（例えば、少なくとも２時間）後、単一の時点または定期的に増殖チェックウェルに問い合わせて、チェックポイントアッセイを実行することができる。増殖チェックウェル内のサンプルの十分な増殖が検出されると、本明細書に記載のシステムはエンドポイントアッセイを開始できる。チェックポイントアッセイは通常、増殖（栄養ブロス中の微生物を使用）から増殖なし（微生物を含まない栄養ブロスを使用）までの直接（例えば、吸光度、比濁分析）または間接光学測定（例えば、代謝色素の蛍光読み取り）を含む、および／または「時間凍結」（ＦＩＴ）コントロール（生理食塩水などの非栄養培地中の微生物を含む別のコントロールウェルと比較して、増殖コントロールウェルまたは非増殖コントロールウェルを測定）を含む。間接測定は、ウェルの蛍光測定を含むことができ、レポータは、微生物の代謝を介して蛍光形態に変換される酸化還元色素（例えばレサズリン）であることができる。そのような場合、ウェルに存在する微生物が多いほど、蛍光形態に変換される色素の量が多くなるため、より高いレベルの蛍光が測定される。すなわち、ウェルに存在する微生物が多いほど、蛍光形態への変換が速くなり、結果として蛍光生成物の濃度が高くなり、したがって、より高いレベルの蛍光を測定することができる。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性染料（例えばフェノールレッド）が使用可能である。
【００３６】
増殖ウェルにおけるサンプルの十分な増殖が達成されたと決定すると、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、１つまたは複数のエンドポイントアッセイを開始することができる。エンドポイントアッセイには、１つまたは複数の液体処理（例えば、微生物に結合するように設計された増幅剤（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）の追加）、サンプル分離（例えば、遠心分離、磁気分離、または真空濾過）、および吸引ステップが含まれ、その間、前の液体添加ステップで微生物の表面に結合された、非結合の増幅剤は洗い流されることができ、最後に光信号が測定されて抗菌薬希釈液と相関させ、ＭＩＣおよび／またはＱＳＲが決定され得る。複数のエンドポイントアッセイは、同じウェルおよび／または異なるウェルで実行できる。複数のエンドポイントアッセイは、正確なＭＩＣおよび／またはＱＳＲデータを取得するのに有利であり得る。
【００３７】
最終ステップでは、時間ゲート発光（例えば、時間分解蛍光）が利用されて、増幅剤からの光信号を測定できる。場合によっては、方法が、増幅剤分子の励起および放出された光の検出を可能にすることができ、放出された光は時間的（例えば、検出が遅延され、励起後にすべての自家蛍光が消えたときに、検出は起こり得る）、およびスペクトル的（例えば、励起波長が１００ナノメートル（ｎｍ）を超えて放出光から離れることができるため、より安価なバンドパスフィルタを使用できる）の両方で分離されることができる。いくつかの実施形態では、増幅は、結合した分子によって触媒的に修飾された培養基の添加によって達成されることができ、光出力が測定されることができる。この光信号は、吸光度信号、蛍光信号および／または化学発光信号を含むことができる。いくつかの実施形態では、信号は、電気化学発光（ＥＣＬ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、アップコンバーティングナノ粒子がレポータ分子として使用されることができる。
【００３８】
システムによって実行され得るエンドポイントアッセイは、以下を含むが、これらに限定はされない：すなわち、代謝アッセイ、表面結合プローブアッセイ、化学プローブアッセイ、生化学プローブアッセイ、ＡＴＰアッセイ、核酸プローブアッセイ、二本鎖核酸プローブアッセイ、光学密度アッセイ、視覚アッセイ、およびｐＨ分子プローブアッセイ。
【００３９】
いくつかの実施形態では、非結合の増幅剤を微生物表面から分離するために、分離（例えば遠心分離）ステップが使用される。遠心分離では、微生物と周囲の流体の密度の差を利用して微生物ペレットを作成する。当業者が理解するように、これらの分離方法は、１００から２０，０００ｇ（ここで、ｇは地球の重力加速度である）の相対遠心力（ＲＣＦ）を使用することができる。ＲＣＦが大きいほど、分離に必要な時間は通常短くなる。９６マイクロウェルプレートまたは３８４マイクロウェルプレートなどのカートリッジの典型的な上限値（例えば、予想される最も高い妥当な値）は、カートリッジが物理的に劣化する（例えば、欠けたり壊れたりする）可能性を減らすために、約５，０００ｇである。いくつかの実施形態では、遠心分離サブシステムは、約２，０００ｇから約５，０００ｇ（例えば約２，５００ｇから約４，０００ｇ（例えば約２，５００ｇ））であり得る、遠心分離システムにおいて発生される所望の相対遠心力を生成し得る。いくつかの実施形態では、遠心分離は、少なくとも２．５分間行われることができる。場合によっては、２．５分は、所望の遠心分離速度を達成するための時間（例えばランプアップ時間）を含み得るが、この時間は例えば約４５秒であり得る。分離システムを遠心分離システム設計であるように構成すると、ロボットグリッパによりサンプル（例えばカートリッジ）に簡単にアクセスし、カートリッジを装填および取り出すことができる。これにより、サンプル処理の完全な自動化が可能になる。いくつかの実施形態では、遠心分離システムは、遠心分離機ロータ位置ごとに複数のプレートを収容するように（例えば、プレートを相互に積み重ねることにより）構成されることができる。このような積み重ねにより、４位置の遠心分離機で少なくとも４つのカートリッジ、および最大１６のカートリッジの同時の遠心分離を可能にする。場合によっては、奇数のカートリッジが処理されている場合、１つまたは複数のバラストプレートを使用して遠心分離機のバランスを取ることができる。ロボットローダと互換性があり、本明細書で説明する試験システムと互換性があり実装できるように変更できる市販の遠心分離機は、米国マサチューセッツ州ビバリーおよびドイツのトゥットリンゲンのＨｅｔｔｉｃｈ  Ｌａｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンノゼのＢｉｏＮｅｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ、および米国カリフォルニア州サンタクララのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって製造されている。
【００４０】
代替的に、または追加的に、本明細書で考察されるように、いくつかの実施形態では、磁気分離を使用して微生物のペレット化が実現されることができる。例えば、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルのサイズであることができるとともに、適切な表面機能を備える磁性粒子が、微生物表面に結合するように添加されることができる。エンドポイントアッセイの結合は、磁性粒子の結合と同時に（競合アッセイ）、または磁気捕捉後に（ペレットへの結合として、または溶液に再懸濁した後に）実行できる。場合によっては、磁気捕捉装置は、再懸濁を可能にするため格納式であることができ、軌道または軸方向の撹拌を可能にするスタンドに組み込まれることができる。場合によっては、例えば真空濾過などの濾過を使用して分離を行うことができる。他の場合では、非結合のプローブを分離するための分離が必要でない場合がある。
【００４１】
前述の開示は、ほんの一握りの例示的なワークフローおよびシステムに焦点を当ててきたが、当業者は、その開示の精神から逸脱することなく特定の修正を行うことができることを理解するであろう。当業者は、本明細書に記載された特定の実施形態の特定の同等物を認識し、または通常の実験を使用するだけでもそれを確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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