(57)【要約】  本開示は、抗ＬＡＧ−３重鎖抗体またはその抗原結合ドメイン、それをコードする単離されたポリヌクレオチド、それを含む医薬組成物、およびその使用を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＧ−３と特異的に結合する重鎖可変ドメインを含む単離された抗体ポリペプチドであって、重鎖可変ドメインが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ１が、ＧＬＴＬＳＱＹＴＭＧのアミノ酸配列（配列番号１）またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する相同配列を含み、
ＣＤＲ２が、ＡＩＨＷＴＳＳＶＴＤＹＡＤＳＶＸ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号３３）またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有する相同配列を含み、かつ
ＣＤＲ３が、ＴＸ２ＹＹＴＨＲＧＸ３ＦＤＹのアミノ酸配列（配列番号３４）またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有する相同配列を含み、
Ｘ１がＫ、Ｙ、Ｍ、Ｄ、またはＲであり、Ｘ２が、ＨまたはＷであり、かつＸ３がＳまたはＰである、単離された抗体ポリペプチド。
【請求項２】
ＣＤＲ１が、配列番号１の配列を含み、
ＣＤＲ２が、配列番号２、４、８、９、および１０から選択される配列を含み、かつ
ＣＤＲ３が、配列番号３、５、６、および７から選択される配列を含む、
請求項１に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項３】
ａ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；
ｂ）配列番号１、配列番号４、および配列番号５から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；
ｃ）配列番号１、配列番号４、および配列番号６から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；
ｄ）配列番号１、配列番号４、および配列番号７から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；
ｅ）配列番号１、配列番号８、および配列番号７から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；
ｆ）配列番号１、配列番号９、および配列番号５から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；
ｇ）配列番号１、配列番号９、および配列番号６から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；
ｈ）配列番号１、配列番号９、および配列番号７から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；
ｉ）配列番号１、配列番号１０、および配列番号５から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；または
ｊ）配列番号１、配列番号４、および配列番号３から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域
を含む、請求項１または２に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１  、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、および配列番号３１からなる群から選択されるアミノ酸配列、および少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＬＡＧ−３に対する特異的結合親和性を依然として保持するその相同配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項５】
ＬＡＧ−３に対する特異的結合親和性を依然として保持する、１つまたは複数のアミノ酸残基置換または修飾をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項６】
置換または修飾の少なくとも１つが、ＣＤＲ配列の１つまたは複数にあり、および／またはＶＨ配列の１つまたは複数にあるが、ＣＤＲ配列のいずれにもない、請求項５に記載の抗体ポリペプチド。
【請求項７】
単一ドメイン抗体または重鎖抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項８】
重鎖可変ドメインが、ＶＨＨドメインに由来する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項９】
免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒトＩｇの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧのＦｃ領域をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１０】
ラクダ類起源である、またはヒト化されている、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１１】
ナノボディーである、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して５×１０−９、２×１０−１０、２．５×１０−１２Ｍ以下のＫＤ値で、ヒトＬＡＧ−３と特異的に結合することが可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１３】
フローサイトメトリーによって測定して１０−９、５×１０−１０、６×１０−１１Ｍ以下のＫＤ値で、細胞表面上に発現されたヒトＬＡＧ−３と特異的に結合することが可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１４】
カニクイザルＬＡＧ−３、および／またはマウスＬＡＧ−３と特異的に結合することが可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１５】
１つまたは複数のコンジュゲート部分に連結された、先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１６】
コンジュゲート部分が、クリアランス改変剤、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、ランタニド、発光標識、蛍光標識、酵素−基質標識、ＤＮＡ−アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン結合剤、または他の抗癌剤を含む、先行する請求項１５のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１７】
先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチドと同じエピトープについて競合する抗体ポリペプチド。
【請求項１８】
先行する請求項のいずれかに記載の抗体ポリペプチド、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに／または少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するその相同配列、ならびに／または縮重置換のみを有するその変異体を含む、請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２１に記載のベクターが発現される条件下で、請求項２２に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体ポリペプチドを発現させる方法。
【請求項２４】
ＬＡＧ−３活性の調節より恩恵を受ける対象における疾患または状態を処置する方法であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体ポリペプチド、または請求項１８に記載の医薬組成物の治療上有効な量を対象に投与することを含む方法。
【請求項２５】
疾患または状態がＬＡＧ−３関連の疾患または状態である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
疾患または状態が、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
癌が、膠芽腫、血液新生物、転移性黒色腫、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、急性ＢおよびＴリンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、腎癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、肝細胞癌、皮膚癌、子宮内膜癌、カルチノイド癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿道の癌、腎盂腎癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、始原神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星細胞種、退形成性星細胞種、乏突起膠腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板減少症、特発性骨髄線維症〔myelfibrosis〕、軟部組織肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、環境誘発癌、アスベストによって誘発される癌、および転移性癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
感染性疾患が、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ型）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌〔Staphylococcus aureus〕、緑膿菌〔Pseudomonas aeruginosa〕、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、ＲＳウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス脳炎ウイルス、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、破傷風、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、ライム病菌、赤痢アメーバ〔Entamoeba histolytica〕、大腸バランジウム〔Balantidium coli〕、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ種、ランブル鞭毛虫〔Giardia lambia〕、クリプトスポリジウム種、ニューモシスチスカリニ〔Pneumocystis carinii〕、三日熱マラリア原虫〔Plasmodium vivax〕、バベシアミクロチ〔Babesia microti〕、ブルーストリパノソーマ〔Trypanosoma brucei〕、クルーズトリパノソーマ〔Trypanosoma cruzi〕、ドノバンリーシュマニア〔Leishmania donovani〕、トキソプラズマゴンディ〔Toxoplasma gondii〕、およびブラジル鉤虫〔Nippostrongylus brasiliensis〕である、請求項２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
自己免疫疾患が、アルツハイマー病、アレルギー、喘息、セリアック病、クローン病、グレーブス病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス、多発性硬化症、重症筋無力症、リウマチ性多発筋痛症、リウマチ性関節炎、Ｉ型糖尿病、および血管炎である、請求項２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
対象がヒトである、請求項２４〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
投与が、経口、鼻腔内、静脈内、皮下、舌下、または筋肉内投与による、請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ＬＡＧ−３発現細胞におけるＬＡＧ−３活性を調節する方法であって、ＬＡＧ−３発現細胞を、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体ポリペプチドに対して曝露することを含む方法。
【請求項３３】
サンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を検出する方法であって、サンプルを、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体ポリペプチドと接触させること、およびサンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を決定することを含む方法。
【請求項３４】
対象におけるＬａｇ−３関連の疾患または状態を診断する方法であって、ａ）対象から得たサンプルを、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体ポリペプチドと接触させること；ｂ）サンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を決定すること；およびｃ）ＬＡＧ−３の存在または量を、対象におけるＬＡＧ−３関連の疾患または状態の存在または状況と相関させることを含む方法。
【請求項３５】
対象におけるＬＡＧ−３関連の疾患または状態を処置するための医薬の製造における、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体ポリペプチドの使用。
【請求項３６】
ＬＡＧ−３関連の疾患または状態を診断するための診断試薬の製造における、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体ポリペプチドの使用。
【請求項３７】
ＬＡＧ−３の検出において有用である、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体ポリペプチドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１８年３月２０日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７９６８２の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、概して、新規抗ヒトＬＡＧ−３抗体ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
リンパ球活性化遺伝子−３、またはＬＡＧ−３（ＣＤ２２３としても知られる）は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、細胞外領域に４つの免疫グロブリンドメインを含有するＣＤ４と構造的に類似であるが、両者のアミノ酸配列は、わずか２０％の相同性を共有するに過ぎない（Ｄｉｊｋｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：４１０〜４１９）。ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ−３は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用するが、より高い親和性で相互作用する（Ｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２７１８〜２７２１）。ＣＤ４とは異なり、ＬＡＧ−３は、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０タンパク質とは相互作用しない（Ｂａｉｘｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：３２７−３３７）。
【０００４】
ＬＡＧ−３は、休止期末梢血リンパ球には発現されないが、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞において発現される。ＬＡＧ−３の主要なリガンドはＭＨＣ−ＩＩである。さらに、試験により、ＬＡＧ−３のリガンドはまた、主に腫瘍の微小環境において非免疫細胞によって生成されるガレクチン−３、ならびに肝細胞および腫瘍細胞によって生成される洞様毛細血管内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）も含むことが示されている（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｐ．Ａｎｄｒｅｗｓ（２０１７）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ；２７６：８０〜９６）。ＬＡＧ−３およびＭＨＣ−ＩＩの結合は、樹状細胞の機能を制御することができる（Ａｎｄｒｅａｅ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：３８７４〜３８８０）。Ｔ細胞の場合、そのＬＡＧ−３の発現アップレギュレーションおよび活性化は、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の増殖および機能を阻害することができる（Ｍｏｎｉｃａ  Ｖ．ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＣｈａｒｌｅｓ  Ｇ．Ｄｒａｋｅ（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４４：２６９〜２７８）。Ｔｒｅｇ細胞のＬＡＧ−３を遮断すると、Ｔｒｅｇの阻害機能を除去することができる（Ｗｏｒｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｖｉｇｎａｌｉ（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：６８８−６９５）。したがって、ＬＡＧ−３は、免疫療法の有効な候補標的であると考えられる。
【０００５】
免疫チェックポイント阻害剤抗体である抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ４は、臨床において腫瘍に関してすばらしい処置効果を有することが示されている。しかし、ほとんどの患者は、これらの免疫チェックポイント阻害剤の単剤療法に対して不十分な応答率を有する。新規候補標的と組み合わせた応用の発見は、既存の免疫療法の効果を大きく増強および改善し、ＬＡＧ−３は、現在最も有望な候補標的である。したがって、免疫療法の分野では、新規抗ＬＡＧ−３抗体または抗体ポリペプチドの開発が大いに必要とされている。高い親和性を有する重鎖単一ドメイン抗体の開発は、その安定性および組織浸透性が良好なので（Ｈａｒｍｓｅｎ  ＭＭ，Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ＨＪ（２００７）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７（１）：１３〜２２）、免疫療法の分野の拡大に著しく恩恵をもたらすであろう。
【発明の概要】
【０００６】
本開示を通じて、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、本明細書において、冠詞の文法的対象の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１種の抗体」は、１種の抗体または１種より多い抗体を意味する。
【０００７】
本開示は、新規モノクローナル抗ＬＡＧ−３抗体、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列ならびにその使用を提供する。
【０００８】
一態様では、本開示は、ＬＡＧ−３と特異的に結合する重鎖可変ドメインを含む単離された抗体ポリペプチドであって、重鎖可変ドメインが、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、
ＣＤＲ１が、ＧＬＴＬＳＱＹＴＭＧのアミノ酸配列（配列番号１）、またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する相同配列を含み、
ＣＤＲ２が、ＡＩＨＷＴＳＳＶＴＤＹＡＤＳＶＸ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号３３）、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有する相同配列を含み、かつ
ＣＤＲ３が、ＴＸ２ＹＹＴＨＲＧＸ３ＦＤＹのアミノ酸配列（配列番号３４）、またはそれと少なくとも７５％の配列同一性を有する相同配列を含み、
Ｘ１が、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｄ、またはＲであり、Ｘ２が、ＨまたはＷであり、かつＸ３が、ＳまたはＰである、
単離された抗体ポリペプチドを提供する。
【０００９】
特定の実施形態では、本開示は、ＬＡＧ−３と特異的に結合する重鎖可変ドメインを含む単離された抗体ポリペプチドであって、重鎖可変ドメインが、配列番号１の配列を含むＣＤＲ１、配列番号２、４、８、９、および１０から選択される配列を含むＣＤＲ２、ならびに配列番号３、５、６、および７から選択される配列を含むＣＤＲ３を含む、単離された抗体ポリペプチドを提供する。
【００１０】
特定の実施形態では、本開示は、ＬＡＧ−３と特異的に結合する重鎖可変ドメインを含む単離された抗体ポリペプチドであって、重鎖可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択される１、２、または３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む、単離された抗体ポリペプチドを提供する。
【００１１】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、ａ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；ｂ）配列番号１、配列番号４、および配列番号５から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；ｃ）配列番号１、配列番号４、および配列番号６から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；ｄ）配列番号１、配列番号４、および配列番号７から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；ｅ）配列番号１、配列番号８、および配列番号７から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；ｆ）配列番号１、配列番号９、および配列番号５から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；ｇ）配列番号１、配列番号９、および配列番号６から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；ｈ）配列番号１、配列番号９、および配列番号７から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；ｉ）配列番号１、配列番号１０、および配列番号５から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域；またはｊ）配列番号１、配列番号４、および配列番号３から選択される１、２、または３つのＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、および配列番号３１からなる群から選択される配列、ならびに少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＬＡＧ−３に対する特異的結合親和性を依然として保持するその相同配列を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、ＬＡＧ−３に対する特異的結合親和性を依然として保持する、１つまたは複数のアミノ酸残基置換または修飾をさらに含む。特定の実施形態では、置換または修飾の少なくとも１つは、１つまたは複数のＣＤＲ配列にあり、および／または１つまたは複数のＶＨ配列にあるが、ＣＤＲ配列のいずれにもない。
【００１４】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、単一ドメイン抗体または重鎖抗体である。
【００１５】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドの重鎖可変ドメインは、ＶＨＨドメインに由来する。
【００１６】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒトＩｇの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ４）のＦｃ領域をさらに含む。
【００１７】
特定の実施形態では、重鎖可変ドメインは、ラクダ類〔camelid〕起源であるか、またはヒト化されている。
【００１８】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、ナノボディーである。
【００１９】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、ヒトＬＡＧ−３、マウスＬＡＧ−３、およびカニクイザルＬＡＧ−３と特異的に結合することが可能である。特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、ヒトＬＡＧ−３、マウスＬＡＧ−３、およびカニクイザルＬＡＧ−３の、そのリガンドとの結合を特異的に遮断することが可能である。
【００２０】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して５×１０−９、２×１０−１０、２．５×１０−１２Ｍ以下のＫＤ値で、細胞表面上に発現されたヒトＬＡＧ−３と特異的に結合することが可能である。
【００２１】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、フローサイトメトリーによって測定して１０−９、５×１０−１０、６×１０−１１Ｍ以下のＫＤ値で、細胞表面上に発現されたヒトＬＡＧ−３と特異的に結合することが可能である。
【００２２】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、カニクイザルＬＡＧ−３、および／またはマウスＬＡＧ−３と特異的に結合することが可能である。
【００２３】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、１つまたは複数のコンジュゲート部分と連結している。特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、クリアランス改変剤、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、ランタニド、発光標識、蛍光標識、酵素−基質標識、ＤＮＡ−アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン結合剤、または他の抗癌剤を含む。
【００２４】
別の態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体ポリペプチドと同じエピトープについて競合する抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。
【００２５】
別の態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体ポリペプチド、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００２６】
別の態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに／または少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するその相同配列、ならびに／または縮重置換のみを有するその変異体を含む。
【００２７】
別の態様では、本開示は、本明細書において提供される単離されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。
【００２８】
別の態様では、本開示は、本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【００２９】
別の態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体ポリペプチドを発現させる方法であって、本明細書において提供されるベクターが発現される条件下で本明細書において提供される宿主細胞を培養することを含む方法をさらに提供する。
【００３０】
別の態様では、本開示は、ＬＡＧ−３活性の調節より恩恵を受ける対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書において提供される抗体ポリペプチドまたは本明細書において提供される医薬組成物の治療上有効な量を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。特定の実施形態では、疾患または状態は、ＬＡＧ−３関連の疾患または状態である。特定の実施形態では、疾患または状態は、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患である。
【００３１】
特定の実施形態では、癌は、膠芽腫、血液新生物、転移性黒色腫、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、急性ＢおよびＴリンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、黒色腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、腎癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、肝細胞癌、皮膚癌、子宮内膜癌、カルチノイド癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿道の癌、腎盂腎癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、始原神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星細胞種、退形成性星細胞種、乏突起膠腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板減少症、特発性骨髄線維症〔myelfibrosis〕、軟部組織肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、環境誘発癌、アスベストによって誘発される癌、および転移性癌である。
【００３２】
特定の実施形態では、感染性疾患は、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ型）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌〔Staphylococcus aureus〕、緑膿菌〔Pseudomonas aeruginosa〕、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、ＲＳウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス脳炎ウイルス、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、破傷風、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、ライム病菌、赤痢アメーバ〔Entamoeba histolytica〕、大腸バランジウム〔Balantidium coli〕、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ種、ランブル鞭毛虫〔Giardia lambia〕、クリプトスポリジウム種、ニューモシスチスカリニ〔Pneumocystis carinii〕、三日熱マラリア原虫〔Plasmodium vivax〕、バベシアミクロチ〔Babesia microti〕、ブルーストリパノソーマ〔Trypanosoma brucei〕、クルーズトリパノソーマ〔Trypanosoma cruzi〕、ドノバンリーシュマニア〔Leishmania donovani〕、トキソプラズマゴンディ〔Toxoplasma gondii〕、およびブラジル鉤虫〔Nippostrongylus brasiliensis〕である。
【００３３】
特定の実施形態では、自己免疫疾患は、アルツハイマー病、アレルギー、喘息、セリアック病、クローン病、グレーブス病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス、多発性硬化症、重症筋無力症、リウマチ性多発筋痛症、リウマチ性関節炎、Ｉ型糖尿病、および血管炎である。
【００３４】
特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００３５】
特定の実施形態では、投与は、経口、鼻腔内、静脈内、皮下、舌下、または筋肉内投与による。
【００３６】
別の態様では、本開示はさらに、ＬＡＧ−３発現細胞におけるＬＡＧ−３活性を調節する方法であって、ＬＡＧ−３発現細胞を、本明細書において提供される抗体ポリペプチドに対して曝露することを含む方法を提供する。
【００３７】
別の態様では、本開示は、サンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を検出する方法であって、サンプルを本明細書において提供される抗体ポリペプチドと接触させること、およびサンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を決定することを含む方法をさらに提供する。
【００３８】
別の態様では、本開示は、対象におけるＬＡＧ−３関連の疾患または状態を診断する方法であって、ａ）対象から得たサンプルを、本明細書において提供される抗体ポリペプチドと接触させること；ｂ）サンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を決定すること；およびｃ）ＬＡＧ−３の存在または量を、対象におけるＬＡＧ−３関連の疾患または状態の存在または状況と相関させることとを含む方法をさらに提供する。
【００３９】
別の態様では、本開示は、対象におけるＬＡＧ−３関連の疾患または状態を処置するための医薬の製造における、本明細書において提供される抗体ポリペプチドの使用をさらに提供する。
【００４０】
別の態様では、本開示は、ＬＡＧ−３関連の疾患または状態を診断するための診断試薬の製造における本明細書において提供される抗体ポリペプチドの使用をさらに提供する。
【００４１】
別の態様では、本開示は、ＬＡＧ−３の検出において有用な、本明細書において提供される抗体ポリペプチドを含むキットをさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＩＬ−２ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）によって測定して、９種の親和性成熟ＶＨＨ抗体（Ａｂ）（Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３およびＷ３３９６−Ｒ２−２６Ｈ２）が、ヒト化親ＶＨＨ  Ａｂ（Ｗ３３９６−Ｚ４）と比較して増強された反応性を示すことを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−２が、ベンチマーク抗体（ＢＭＫ  Ａｂ）（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７、Ｗ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＥＣ５０で細胞表面ヒトＬＡＧ−３と結合することを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＦＡＣＳによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−２が、０．１、または０．１３ｎＭのＥＣ５０で、細胞表面マウスＬＡＧ−３と結合することを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＦＡＣＳによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、２．３４、または２．１６ｎＭのＥＣ５０で、細胞表面カニクイザルＬＡＧ−３と結合することを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＦＡＣＳによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３の細胞表面ヒトＭＨＣ−ＩＩとの結合を遮断することを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＦＡＣＳによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３の細胞表面ヒトＭＨＣ−ＩＩとの結合を遮断することを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＦＡＣＳによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、２．９、または２．４ｎＭのＩＣ５０で、マウスＬＡＧ−３の細胞表面マウスＭＨＣ−ＩＩとの結合を遮断することを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３の洞様毛細血管内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）との結合を遮断することを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３の洞様毛細血管内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）との結合を遮断することを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３のガレクチン−３（Ｇａｌ−３）との結合を遮断することを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３のガレクチン−３（Ｇａｌ−３）との結合を遮断することを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３がヒトＣＤ４と結合しないことを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３がヒトＣＤ４と結合しないことを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、ＦＡＣＳによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８からの異なるエピトープビンを有することを示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＲＧＡアッセイによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＥＣ５０でＩＬ−２経路活性を増強することを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＲＧＡアッセイによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等のまたはそれより良好なＥＣ５０でＩＬ−２経路活性を増強することを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ヒトリンパ球混合培養（ＭＬＲ）アッセイによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ヒトＴ細胞ＩＦＮ−γ分泌の促進においてＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）と同等またはそれより強力であることを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ヒトリンパ球混合培養（ＭＬＲ）アッセイによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ヒトＴ細胞ＩＦＮ−γ分泌の促進においてＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）と同等またはそれより強力であることを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＡＤＣＣアッセイによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘導しないことを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＡＤＣＣアッセイによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘導しないことを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＣＤＣアッセイによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞に対してＣＤＣ効果を誘導しないことを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＣＤＣアッセイによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞に対してＣＤＣ効果を誘導しないことを示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、血清安定性試験におけるＦＡＣＳによって測定して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、３７℃のヒト血清中で１日間、４日間、７日間、および１４日間インキュベーション後の抗原結合能が安定なままであることを示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、エピトープマッピングの結果を示す。図１２Ａは、ＬＡＧ−３のモデリングを示す（ＰＤＢ：５ＦＬＵに基づく）。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、エピトープマッピングの結果を示す。図１２Ｂは、モデル構造において表示されたＷ３３９−ＢＭＫ１のホットスポットを示す（黒色：変化倍率＜０．５５、白い点を伴う灰色：変化倍率０．５５〜０．７５）。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、エピトープマッピングの結果を示す。図１２Ｃは、モデル構造において表示されたＷ３３９−ＢＭＫ７のホットスポットを示す（黒色：変化倍率＜０．５５、白い点を伴う灰色：変化倍率０．５５〜０．７５）。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、エピトープマッピングの結果を示す。図１２Ｄは、モデル構造において表示されたＷ３３９−ＢＭＫ８のホットスポットを示す（黒色：変化倍率＜０．５５、白い点を伴う灰色：変化倍率０．５５〜０．７５）。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、エピトープマッピングの結果を示す。図１２Ｅは、モデル構造において表示されたＷ３３９６−Ｒ２−２のホットスポットを示す（黒色：変化倍率＜０．５５、白い点を伴う灰色：変化倍率０．５５〜０．７５）。
【図１３】図１３は、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９−ＢＭＫ１が、マウスにおいて同様の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示すことを示す。
【図１４】図１４は、Ｗ３３９６−Ｒ２−２が、カニクイザルにおけるＰＫ調査によって実証される、約２１２時間のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期をサルにおいて有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本開示の以下の説明は、単に、本開示の種々の実施形態を例示するよう意図される。したがって、論じられる特定の改変は、本開示の範囲に対する制限と解釈されてはならない。本開示の範囲から逸脱することなく、種々の均等物、変法および改変が行われ得ることは当業者には明らかであり、また、このような同等な実施形態は、本明細書に含まれるべきであるということが理解される。刊行物、特許および特許出願を含む本明細書において引用されたすべての参考文献は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
定義
用語「抗体」は、本明細書において使用される場合、任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、二価抗体、一価抗体、または特異的抗原と結合する抗体を含む。本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、従来の４つの鎖の抗体と、４つの鎖を有しない非従来の抗体（例えば軽鎖を天然に欠く抗体）の両方を広く包含するよう意図される。
【００４５】
従来のインタクトな抗体は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むヘテロ四量体である。哺乳動物重鎖は、α、δ、ε、γおよびμとして分類され、各重鎖は、可変領域（ＶＨ）および第１の、第２の、および第３の定常領域（それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなり、哺乳動物軽鎖は、λまたはκとして分類され、各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）および定常領域からなる。従来の抗体は、「Ｙ」型を有し、Ｙのステムは、ジスルフィド結合を介して一緒に結合している２つの重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙの各アームは、単一軽鎖の可変および定常領域と結合している単一重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両鎖中の可変領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度可変ループを含有する。本明細書において開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉの慣習（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４），９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｄｅｃ  ５；１８６（３）：６５１−６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ  ２１−２８；３４２（６２５２）：８７７−８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：  ５５−７７（２００３）；Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１（３），（２００５）；Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ（ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），ｃｈａｐｔｅｒ  ２６，４８１−５１４，（２０１５））によって定義または同定され得る。３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりもより高度に保存され、超可変ループを支持するスキャフォールドを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）として知られる、両端に位置するストレッチの間に挿入されている。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５種の主要なクラスまたはアイソタイプとして、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらは、α、δ、ε、γおよびμ重鎖それぞれの存在を特徴とする。主要な抗体クラスのうちいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖��、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）またはＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分割される。
【００４６】
ヘテロ四量体である従来の抗体とは異なり、ホモ二量体免疫グロブリンが存在し、これらは天然に軽鎖を欠く。そのような抗体は、例えばラクダ類（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカなど）において見られ、分子量約８０ｋＤの重鎖抗体とも呼ばれる（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，６３：４４６−４４８）。
【００４７】
用語「抗体ポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、抗原結合タンパク質または抗体断片（例えば、ＣＤＲ、および／または可変領域配列）を含むポリペプチドを指す。抗体ポリペプチドは、例えば重鎖抗体（ＶＨＨ抗体）、重鎖抗体の可変ドメイン、ＶＨＨドメイン、または単一の可変ドメインを含有する単一ドメイン抗体を含み得るか、またはそれらであり得る。抗体ポリペプチドは、さらなるドメイン、例えば定常領域、Ｆｃドメイン、および／または異なる抗原もしくは異なるエピトープと特異的に結合する第２の可変ドメインをさらに含み得る。
【００４８】
「重鎖抗体」および「ＶＨＨ抗体」は、本明細書において互換的に使用され、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ  １０；２３１（１−２）：２５−３８（１９９９）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊｕｎ；７４（４）：２７７−３０２（２００１）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。軽鎖を欠くが、重鎖抗体は、信頼のおける抗原結合レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６−４４８；Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｐｒ；５４（１）：３９−４７（２００２）；Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍａｙ；１０９（１）：９３−１０１（２００３））。
【００４９】
「ＶＨＨドメイン」は、本明細書において使用される場合、重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメインを指す。ＶＨＨドメインは、適応免疫応答によって生じた最小の既知抗原結合単位に相当する（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．Ｎｏｖ；２１（１３）：３４９０−８．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｊｕｎ  １５（２００７））。
【００５０】
「単一ドメイン抗体」は、重鎖の単一の可変領域または軽鎖の単一の可変領域のみを含有する抗体断片を指す。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、重鎖抗体の単一の重鎖可変ドメインのみを有する、またはそれからなる。
【００５１】
「ナノボディー」とは、重鎖抗体に由来するＶＨＨドメインおよび２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体断片を指す。
【００５２】
特定の例では、２つまたはそれ以上のＶＨＨドメインをペプチドリンカーと共有結合によって結合して、二価または多価ドメイン抗体を作製することができる。二価ドメイン抗体の２つのＶＨＨドメインは、同じまたは異なる抗原を標的とし得る。
【００５３】
用語「二価」とは、本明細書において使用される場合、２つの抗原結合部位を有する抗体または抗体ポリペプチドを指し、用語「一価」とは、１つのみの単一抗原結合部位を有する抗体または抗体ポリペプチドを指し、用語「多価」とは、複数の抗原結合部位を有する抗体または抗体ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、抗体または抗体ポリペプチドは、二価または多価である。
【００５４】
用語「キメラ」とは、本明細書において使用される場合、ある種に由来する配列の一部と、別の種に由来する配列の残りとを有する抗体または抗体ポリペプチドを意味する。例示的例では、キメラ抗体は、ヒトに由来する定常領域および非ヒト動物に由来する、例えばラクダ科に由来する可変領域を含み得る。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、ラクダ科、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはハムスターである。
【００５５】
用語「ヒト化」とは、本明細書において使用される場合、抗体が、非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来するＦＲ領域、および適用可能な場合には、ヒトに由来する定常領域、を含むことを意味する。
【００５６】
「ＬＡＧ−３」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物、例えば霊長類（例えば、ヒト、サル）、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む任意の脊椎動物起源に由来し得る。ヒトＬＡＧ−３の例示的な配列は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質（部分的、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＧＩ：４３７９０３８）を含む。ＬＡＧ−３の例示的な配列は、ハツカネズミ（マウス）ＬＡＧ−３タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＧＩ：１１１３０８７４３）；クマネズミ（ラット）ＬＡＧ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＧＩ：３７９２１５４７）を含む。
【００５７】
用語「ＬＡＧ−３」は、本明細書において使用される場合、ＬＡＧ−３の任意の形態、例えば１）天然の非プロセシングＬＡＧ−３分子、例えばスプライス変異体または対立形質変異体を含む「全長」のＬＡＧ−３鎖またはＬＡＧ−３の天然に存在する変異体；２）細胞におけるプロセシングに起因する任意の形態のＬＡＧ−３；または３）組換え法によって作製されたＬＡＧ−３サブユニットの全長、断片（例えば、切断形態、細胞外／膜貫通型ドメイン）または修飾された形態（例えば、変異形態、グリコシル化／ＰＥＧ化、Ｈｉｓタグ／免疫蛍光融合された形態）を包含するものとする。
【００５８】
用語「抗ＬＡＧ−３」抗体ポリペプチドは、ＬＡＧ−３（例えば、ヒトまたはサルまたはマウスまたはラットＬＡＧ−３）と特異的結合可能である抗体ポリペプチドを指す。
【００５９】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、本明細書において使用される場合、例えば、抗体および抗原の間などの２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、ヒトおよび／またはＬＡＧ−３と、≦１０−６Ｍ（例えば、≦５×１０−７Ｍ、≦２×１０−７Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦５×１０−８Ｍ、≦２×１０−８Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦５×１０−９Ｍ、≦４×１０−９Ｍ、≦３×１０−９Ｍ、≦２×１０−９Ｍまたは≦１０−９Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）で特異的に結合する。本明細書において使用されるＫＤとは、会合速度に対する解離速度の割合（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、これは、それだけには限らないが、表面プラズモン共鳴法、マイクロスケール熱泳動法、ＨＰＬＣ−ＭＳ法およびフローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）法を含む当技術分野で公知の任意の従来法を使用することによって決定することができる。特定の実施形態では、ＫＤ値は、フローサイトメトリーを使用することによって適宜決定できる。
【００６０】
「結合を遮断する」または「同一エピトープについて競合する」能力とは、本明細書において使用される場合、抗体ポリペプチドの、２つの分子（例えば、ヒトＬＡＧ−３および抗ＬＡＧ−３抗体）の間の結合相互作用を、任意の検出可能な程度に阻害する能力を指す。特定の実施形態では、２つの分子間の結合を遮断する抗体ポリペプチドは、２つの分子間の結合相互作用を少なくとも８５％または少なくとも９０％阻害する。特定の実施形態では、この阻害は、８５％超または９０％超であり得る。
【００６１】
用語「エピトープ」とは、本明細書において使用される場合、抗体が結合する、抗原上の原子またはアミノ酸の特定の群を指す。２種の抗体は、抗原について競合結合を示す場合には、抗原内の同一または密接に関連するエピトープと結合し得る。例えば、抗体ポリペプチドが、参照抗体の、抗原との結合を少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％遮断する場合には、抗体ポリペプチドは、参照抗体と同じ／密接に関連するエピトープと結合すると考えられ得る。
【００６２】
当業者ならば、所与の抗体が、本開示の抗体（例えば、ラクダ類モノクローナル抗体Ｗ３３９６−親、およびヒト化抗体Ｗ３３９６−Ｚ４、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、およびＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２）と同じエピトープと結合するか否かを、後者がＬＡＧ−３抗原ポリペプチドと結合するのを前者が防ぐか否かを確認することによって過度に実験することなく決定することが可能であるということを認識するであろう。本開示の抗体によるＬＡＧ−３抗原ポリペプチドとの結合が減少することによって示されるように、所与の抗体が本開示の抗体と競合する場合には、その２種の抗体は、同じまたは密接に関連するエピトープと結合する。または、所与の抗体のＬＡＧ−３抗原ポリペプチドとの結合が、本開示の抗体によって阻害された場合には、その２種の抗体は、同じまたは密接に関連するエピトープと結合する。
【００６３】
「保存的置換」とは、アミノ酸配列に関して、アミノ酸残基を、同様の生理化学的特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換することを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）の間で、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）の間で、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の間で、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）の間で行われ得る。当技術分野で公知であるように、保存的置換は、通常、タンパク質のコンホメーション構造において重大な変化を引き起こさず、したがって、タンパク質の生物活性を保持し得る。
【００６４】
用語「相同体」および「相同な」は、本明細書において、互換的であり、最適にアラインされた場合に別の配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する核酸配列（またはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。
【００６５】
「配列同一性パーセント（％）」とは、アミノ酸配列（または核酸配列）に関して、配列をアラインし、必要に応じて、ギャップを導入して、同一アミノ酸（または核酸）の最大数を達成した後に、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基に対して同一である、候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基と考えられる場合も、考えられない場合もある。アミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）も参照のこと）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで入手可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３−４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７−８（２００７）も参照のこと）およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なツールを使用することによって達成できる。当業者は、ツールによって提供されたデフォルトパラメータを使用してもよく、またはアラインメントのために必要に応じて、例えば、適したアルゴリズムを選択することなどによって、パラメータをカスタマイズしてもよい。
【００６６】
「エフェクター機能」とは、本明細書において使用される場合、抗体のＦｃ領域の、そのエフェクター、例えばＣ１複合体およびＦｃ受容体との結合に起因する生物活性を指す。例示的エフェクター機能として、抗体と、Ｃ１複合体上のＣ１ｑとの相互作用によって誘導される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体のＦｃ領域の、エフェクター細胞上のＦｃ受容体との結合によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および食作用が挙げられる。
【００６７】
状態の「処置すること」または「処置」とは、本明細書において使用される場合、状態を予防することもしくは軽減すること、状態の発症もしくはその発生の速度を減速すること、状態の発生のリスクを低減すること、状態と関連する症状の発生を予防もしくは遅延すること、状態と関連する症状を低減もしくは終結させること、状態の完全または部分退縮をもたらすこと、状態を治癒することまたはそれらのいくつかの組合せを含む。
【００６８】
「単離された」物質は、天然状態から人の手によって変更されている。「単離された」組成物または物質が天然に生じる場合には、元の環境から変化している、または取り出されている、または両方である。例えば、生存する動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、実質的に純粋な状態で存在するようにその天然状態の共存する材料から十分に分離されている場合には「単離されている」。「単離された核酸配列」とは、単離された核酸分子の配列を指す。特定の実施形態では、「単離された抗体ポリペプチド」は、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動など）またはクロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣなど）によって決定される、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度を有する抗体ポリペプチドを指す。
【００６９】
用語「ベクター」は、本明細書において使用される場合、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現を引き起こすように作動可能に挿入され得る媒体を指す。ベクターは、宿主細胞内に運ぶ遺伝要素の発現を引き起こすように、宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用され得る。ベクターの例として、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージおよび動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーとして、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能要素およびリポーター遺伝子を含む、発現を制御するための種々のエレメントを含有し得る。さらに、ベクターは、複製起点を含有し得る。ベクターはまた、限定されるものではないが、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質コーティングを含む、細胞へのその侵入を補助するための材料を含み得る。ベクターは、発現ベクターまたはクローニングベクターであり得る。本開示は、抗体ポリペプチドをコードする本明細書において提供される核酸配列、その核酸配列と作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）および少なくとも１つの選択マーカーを含有する、ベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。ベクターの例として、それだけには限らないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、λファージおよびＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８−Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ−Ｈｙｇ−ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ２．１、ｐＥＦ−１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ−Ｂｏｓなどが挙げられる。
【００７０】
語句「宿主細胞」は、本明細書において使用される場合、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入されている細胞を指す。
【００７１】
「ＬＡＧ−３関連」疾患または状態とは、本明細書において使用される場合、ＬＡＧ−３の発現または活性の増大または減少によって引き起こされる、増悪する、またはそうでなければ、関連している任意の疾患または状態を指す。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３関連状態として、免疫関連障害、例えば、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患などがある。
【００７２】
「癌」とは、本明細書において使用される場合、悪性細胞成長または新生物、異常な増殖、浸潤または転移を特徴とする任意の医学的状態を指し、固形腫瘍および非固形癌（血液悪性腫瘍）、例えば白血病、の両方を含む。本明細書において使用される場合、「固形腫瘍」とは、新生物および／または悪性細胞の固体塊を指す。癌または腫瘍の例として、血液悪性腫瘍、口腔癌（例えば、口唇、舌、または咽頭）、消化器（例えば、食道、胃、小腸、結腸、大腸、または直腸）、腹膜、肝臓および胆管経路、膵臓、呼吸器系、例えば喉頭または肺（小細胞および非小細胞）、骨、結合組織、皮膚（例えば、黒色腫）、乳房、生殖器（卵管、子宮、子宮頸部、精巣、卵巣、または前立腺）、尿路（例えば、膀胱または腎臓）、脳、および内分泌腺、例えば甲状腺が挙げられる。特定の実施形態では、癌は、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、腎癌、膀胱癌、肝細胞癌、および結腸直腸癌から選択される。特定の実施形態では、癌は、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびＢ細胞リンパ腫から選択される。
【００７３】
用語「医薬上許容される」は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（複数可）および／または塩が、一般に、製剤を含むその他の成分と化学的におよび／または物理的に適合しており、そのレシピエントと生理学的に適合していることを示す。
【００７４】
抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチド
一態様では、本開示は、ＬＡＧ−３（例えば、ヒトＬＡＧ−３）と特異的に結合する重鎖可変ドメインを含む抗体ポリペプチドであって、重鎖可変ドメインが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１がＧＬＴＬＳＱＹＴＭＧ（配列番号１）を含み、ＣＤＲ２がＡＩＨＷＴＳＳＶＴＤＹＡＤＳＶＸ１Ｇ（配列番号３３）を含み、およびＣＤＲ３がＴＸ２ＹＹＴＨＲＧＸ３ＦＤＹ（配列番号３４）を含み、Ｘ１が、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｄ、またはＲであり、Ｘ２が、ＨまたはＷであり、およびＸ３が、ＳまたはＰである抗体ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号１、３３および３４のいずれかに対して１、２、または３つ以下のアミノ酸残基置換を有する抗体ポリペプチドであって、Ｘ１が、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｄ、またはＲであり、Ｘ２が、ＨまたはＷであり、およびＸ３が、ＳまたはＰである抗体ポリペプチドをさらに包含する。
【００７５】
特定の実施形態では、本開示は、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ抗体Ｗ３３９６−親、Ｗ３３９６−Ｚ４、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、およびＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２の、１つまたは複数（例えば１、２、または３つ）のＣＤＲ配列を含む抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドを提供する。
【００７６】
「Ｗ３３９６−親」は、本明細書において使用される場合、配列番号１１の配列を含む重鎖可変領域を有するＶＨＨ抗体を指す。
【００７７】
「Ｗ３３９６−Ｚ４」は、本明細書において使用される場合、配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６に基づくヒト化ＶＨＨ抗体を指す。
【００７８】
「Ｗ３３９６−Ｒ２−１」は、本明細書において使用される場合、配列番号１５の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づく親和性成熟ＶＨＨ抗体を指す。
【００７９】
「Ｗ３３９６−Ｒ２−２」は、本明細書において使用される場合、配列番号１７の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づく親和性成熟ＶＨＨ抗体を指す。
【００８０】
「Ｗ３３９６−Ｒ２−３は、本明細書において使用される場合、配列番号１９の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づく親和性成熟ＶＨＨ抗体を指す。
【００８１】
「Ｗ３３９６−Ｒ２−６」は、本明細書において使用される場合、配列番号２１の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づく親和性成熟ＶＨＨ抗体を指す。
【００８２】
「Ｗ３３９６−Ｒ２−１０」は、本明細書において使用される場合、配列番号２３の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づく親和性成熟ＶＨＨ抗体を指す。
【００８３】
「Ｗ３３９６−Ｒ２−１１」は、本明細書において使用される場合、配列番号２５の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づく親和性成熟ＶＨＨ抗体を指す。
【００８４】
「Ｗ３３９６−Ｒ２−１２」は、本明細書において使用される場合、配列番号２７の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づく親和性成熟ＶＨＨ抗体を指す。
【００８５】
「Ｗ３３９６−Ｒ２−１３」は、本明細書において使用される場合、配列番号２９の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づく親和性成熟ＶＨＨ抗体を指す。
【００８６】
「Ｗ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２」は、本明細書において使用される場合、配列番号３１の配列を含む重鎖可変領域を含むＷ３３９６−Ｚ４に基づくヒト化ＶＨＨ抗体を指す。
【００８７】
ヒト化抗体Ｗ３３９６−Ｚ４は、その親抗体Ｗ３３９６と比較してＬＡＧ−３に対して同等の親和性を有する。親和性成熟抗体Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、および／またはＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２は、そのヒト化親抗体Ｗ３３９６−Ｚ４と比較してＬＡＧ−３に対してより良好な親和性を有する。
【００８８】
表１は、これら１１種の抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体のＣＤＲ配列を示す。重鎖可変領域配列はまた、以下の表２および表３にも提供される。
【００８９】
【表１】
2021518166.tif 000003
【００９０】
【表２】
2021518166.tif 000004
【００９１】
【表３−１】
2021518166.tif 000005
【表３−２】
2021518166.tif 000006
【００９２】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。
【００９３】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドの重鎖可変ドメインは、ＶＨＨドメインに由来する。ＶＨＨドメインは、天然に軽鎖を欠く抗体、例えばラクダ科の種（例えば、ＷＯ９４０４６７８を参照のこと）、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコに由来する抗体に由来する重鎖可変ドメインである。ＶＨＨドメインは、単一のポリペプチドであり、安定である。
【００９４】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドの重鎖可変ドメインは、ラクダ類起源のドメインである。
【００９５】
ＣＤＲは、抗原結合に関与していることが知られているが、６つのＣＤＲのすべてが不可欠である、または不変であるのではないということがわかっている。言い換えれば、抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体Ｗ３３９６−親、Ｗ３３９６−Ｚ４、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、またはＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２中の１つまたは複数のＣＤＲを置き換える、または変更する、または修飾するが、ＬＡＧ−３に対する特異的結合親和性を実質的に保持することが可能である。
【００９６】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体Ｗ３３９６−親、Ｗ３３９６−Ｚ４、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、またはＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２のうちの１種の重鎖ＣＤＲ３配列を含む。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、配列番号３、５、６、および７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。重鎖ＣＤＲ３領域は、抗原結合部位の中心に位置し、したがって、抗原と最も接触し、抗体の抗原に対する親和性に最大の自由エネルギーを提供すると考えられる。また、重鎖ＣＤＲ３は、複数の多様化機序（Ｔｏｎｅｇａｗａ  Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３０２：５７５−８１）により、長さ、アミノ酸組成およびコンホメーションの点で、抗原結合部位のうち群を抜いて最も多様なＣＤＲであると考えられる。重鎖ＣＤＲ３の多様性は、ほとんどの抗体特異性（Ｘｕ  ＪＬ，Ｄａｖｉｓ  ＭＭ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１３：３７−４５）ならびに望ましい抗原結合親和性（Ｓｃｈｉｅｒ  Ｒ，ｅｔｃ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−６７）をもたらすのに十分である。
【００９７】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、抗体ポリペプチドが、ＬＡＧ−３と特異的に結合できる限り、適したフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。表１に提供されるＣＤＲ配列は、ラクダ類抗体から得られるが、それらは、当技術分野で公知の適した方法、例えば、組換え技術を使用して任意の適した種、例えば、中でもマウス、ヒト、ラット、ウサギの任意の適したＦＲ配列にグラフトできる。
【００９８】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、ヒト化される。ヒト化抗体ポリペプチドは、ヒトにおけるその低減された免疫原性において望ましい。ヒト化抗体ポリペプチドは、非ヒトＣＤＲ配列が、ヒトまたは実質的にヒトＦＲ配列にグラフトされることから、その可変領域においてキメラである。抗体ポリペプチドのヒト化は、非ヒト（マウスなど）ＣＤＲ遺伝子で、ヒト免疫グロブリン遺伝子における対応するヒトＣＤＲ遺伝子を置換することによって本質的に実施できる（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。
【００９９】
当技術分野で公知の方法を使用して、適したヒト重鎖可変ドメインを選択して、この目的を達成できる。例示的例では、「ベストフィット」アプローチを使用でき、非ヒト（例えば、ラクダ類）抗体可変ドメイン配列を、既知ヒト可変ドメイン配列のデータベースに対してスクリーニングまたはＢＬＡＳＴ検索し、非ヒトクエリー配列に対して最も近いヒト配列を同定し、非ヒトＣＤＲ配列をグラフトするためのヒトスキャフォールドとして使用する（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｔ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１を参照のこと）。あるいは、すべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワークを、非ヒトＣＤＲのグラフトのために使用してもよい（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３を参照のこと）。
【０１００】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるヒト化抗体ポリペプチドは、非ヒトであるＣＤＲ配列を除いて、実質的にすべてのヒト配列から構成されている。いくつかの実施形態では、可変領域ＦＲおよび存在する場合には定常領域は、完全に、または実質的に、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒトＦＲ配列およびヒト定常領域配列は、異なるヒト免疫グロブリン遺伝子に由来してもよく、例えば、ＦＲ配列はあるヒト抗体に由来し、定常領域は別のヒト抗体に由来してもよい。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体ポリペプチドは、ヒトＦＲ１〜４を含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるヒト化抗体ポリペプチドは、Ｗ３３９６−Ｚ４、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、またはＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２の、１つまたは複数のＦＲ配列を含む。
【０１０２】
１０種の例示的なヒト化抗ＬＡＧ−３単一ドメイン抗体Ｗ３３９６−Ｚ４、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、またはＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２はすべて、ＬＡＧ−３に対して特異的結合親和性を保持し、その態様において親ラクダ類抗体と少なくとも同等であるか、またはそれよりさらに良好である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ヒトに由来するＦＲ領域は、それが由来するヒト免疫グロブリンと同じアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒトＦＲの１つまたは複数のアミノ酸残基は、親の非ヒト抗体に由来する対応する残基で置換される。これは、特定の実施形態では、ヒト化抗体ポリペプチドを非ヒト親抗体構造と密接に近似させるために望ましいことであり得る。特定の実施形態では、本明細書において提供されるヒト化抗体ポリペプチドは、各ヒトＦＲ配列中に１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を含む、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインのすべてのＦＲ中に１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基におけるこのような変化は、重鎖ＦＲ領域中のみに、軽鎖ＦＲ領域中のみに、または両鎖に存在し得る。
【０１０４】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、または配列番号３１からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、重鎖可変ドメインのすべてまたは一部を含む。一実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、本明細書において提供される重鎖可変ドメインのすべてまたは一部からなる単一ドメイン抗体である。このような単一ドメイン抗体のさらなる情報は、当技術分野で入手可能である（例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照のこと）。
【０１０６】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジおよび／またはＣＨ２−ＣＨ３領域を含む。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、Ｆｃ領域を含む。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ２−ＣＨ３領域を含む、またはＣＨ２−ＣＨ３領域である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）、任意選択でヒトＩｇ、任意選択でヒトＩｇＧの定常領域を有する。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘導できるＩｇＧ１アイソタイプの定常領域、または低減されたもしくは枯渇したエフェクター機能を有するＩｇＧ４もしくはＩｇＧ２アイソタイプの定常領域を含む。ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどのエフェクター機能はＬＡＧ−３を発現する細胞に対する細胞傷害性をもたらし得る。エフェクター機能は、Ｆｃ受容体結合アッセイ、Ｃ１ｑ結合アッセイおよび細胞溶解アッセイなどの種々のアッセイを使用して評価できる。
【０１０８】
本明細書において提供される抗体ポリペプチドの結合親和性は、抗原と抗原結合分子間の結合が平衡に達する時の会合速度に対する解離速度の割合（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を表すＫＤ値によって表すことができる。抗原結合親和性（例えば、ＫＤ）は、例えば、フローサイトメトリーアッセイを含む当技術分野で公知の適した方法を使用して適切に決定できる。いくつかの実施形態では、種々の濃度の抗体ポリペプチドの抗原との結合を、フローサイトメトリーによって決定でき、決定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）をまず、抗体濃度に対してプロットすることができ、次いで、Ｐｒｉｓｍバージョン５（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用して、特異的結合蛍光強度（Ｙ）および抗体の濃度（Ｘ）の依存関係を１サイト飽和方程式：Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（ＫＤ＋Ｘ）に適合させることによって、ＫＤ値を算出でき、式中、Ｂｍａｘは、試験抗体ポリペプチドの、抗原との最大特異的結合を指す。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはフローサイトメトリーアッセイによって測定して、５ｘ１０−９Ｍ以下、４×１０−９Ｍ以下、３×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、４×１０−１０Ｍ以下、３×１０−１０Ｍ以下、２×１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、または４×１０−１１Ｍ以下、３×１０−１１Ｍ以下、２．５×１０−１１Ｍ以下、２×１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、４×１０−１２Ｍ以下、３×１０−１２Ｍ以下、２．５×１０−１２Ｍ以下、２×１０−１２Ｍ以下、または１０−１２Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）値で、ヒトＬＡＧ−３と特異的に結合可能である。
【０１１０】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、カニクイザルＬＡＧ−３、およびマウスＬＡＧ−３と交差反応する。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、ヒトＬＡＧ−３のものと同様の結合親和性でカニクイザルまたはマウスＬＡＧ−３と結合する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはフローサイトメトリーアッセイによって測定して、５×１０−９Ｍ以下、４×１０−９Ｍ以下、３×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、４×１０−１０Ｍ以下、３×１０−１０Ｍ以下、２×１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、または４×１０−１１Ｍ以下、３×１０−１１Ｍ以下、２．５×１０−１１Ｍ以下、２×１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、４×１０−１２Ｍ以下、３×１０−１２Ｍ以下、２．５×１０−１２Ｍ以下、２×１０−１２Ｍ以下、または１０−１２Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）値で、カニクイザルＬＡＧ−３と特異的に結合可能である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはフローサイトメトリーによって測定して、５×１０−９Ｍ以下、４×１０−９Ｍ以下、３×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、４×１０−１０Ｍ以下、３×１０−１０Ｍ以下、２×１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、または４×１０−１１Ｍ以下、３×１０−１１Ｍ以下、２．５×１０−１１Ｍ以下、２×１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、４×１０−１２Ｍ以下、３×１０−１２Ｍ以下、２．５×１０−１２Ｍ以下、２×１０−１２Ｍ以下、または１０−１２Ｍ以下、５×１０−１３Ｍ以下、４×１０−１３Ｍ以下、３×１０−１３Ｍ以下、２．５×１０−１３Ｍ以下、２×１０−１３Ｍ以下、または１０−１３Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）値で、マウスＬＡＧ−３と特異的に結合可能である。
【０１１３】
抗体ポリペプチドのヒトＬＡＧ−３との結合は、その最大効果（例えば、結合または阻害など）の５０％が観察される抗体の濃度を指す「半数最大効果濃度」（ＥＣ５０）値によっても表すことができる。ＥＣ５０値は、当技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチアッセイ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリーアッセイおよびその他の結合アッセイによって測定できる。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、フローサイトメトリーによる０．１ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．２５ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、３ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＬＡＧ−３と特異的に結合する。
【０１１４】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、ヒトＬＡＧ−３のものと同様の結合親和性でカニクイザルまたはマウスＬＡＧ−３と結合する。例えば、例示的な単一ドメイン抗体Ｗ３３９６−Ｚ４、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、またはＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２のカニクイザルまたはマウスＬＡＧ−３との結合は、ヒトＬＡＧ−３のものと同様の親和性またはＥＣ５０値である。
【０１１５】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、フローサイトメトリーによる０．１ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下、３ｎＭ以下、３．５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、または４．５ｎＭ以下のＥＣ５０で、組換えカニクイザルＬＡＧ−３と特異的に結合する。
【０１１６】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、フローサイトメトリーによる０．０１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＥＣ５０で、組換えマウスＬＡＧ−３と特異的に結合する。
【０１１７】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、診断的および／または治療的使用を提供するのに十分である、ヒトＬＡＧ−３に対する特異的結合親和性を有する。
【０１１８】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、ヒトＬＡＧ−３のそのリガンドとの結合を遮断し、したがってエフェクター細胞の活性を回復し、Ｔｒｅｇのサプレッサー活性を減少させ、および／または抗腫瘍活性を増強する。ＬＡＧ−３のリガンドは、例えばＭＨＣ−ＩＩ、ＬＳＥＣｔｉｎおよびガレクチン−３を含む。ＬＳＥＣｔｉｎは、Ｃ末端Ｃ型炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）が中間のネックドメインによって膜表面から突出しているＩＩ型膜貫通タンパク質である。受容体は、ジスルフィド連結二量体であるようであり、洞様内皮細胞上に発現され、ウイルス感染を容易にするが、エンドサイトーシス機能を欠くＣ型レクチンファミリーの他のメンバーのモデルとしての役目を果たす。ガレクチン−３は、ヒトにおいてＬＧＡＬＳ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。ガレクチン−３は、レクチンファミリーメンバーであり、そのうちの１４種の哺乳動物ガレクチンが同定されている。ガレクチン−３（Ｇａｌ−３）はまた、細胞接着、細胞活性化、および化学誘引、細胞成長および分化、細胞周期、ならびにアポトーシスにおいて重要な役割を果たすβ−ガラクトシド結合タンパク質ファミリーメンバーでもある。ガレクチン−３（Ｇａｌ−３）の広い生物機能を考慮すると、これは癌、炎症および線維症、心疾患、および卒中に関与することが実証されている。ガレクチン−３の発現が、筋線維芽細胞増殖、線維化、組織修復、炎症、および心室リモデリングを含む心不全に関連する種々の過程に関係していることも、研究により示されている。ＬＡＧ−３のＭＨＣ−ＩＩ、ＬＳＥＣｔｉｎ、およびＧａｌｅｃｔｉｎ−３との結合の遮断は、当技術分野で公知の方法、例えばＥＬＩＳＡを使用して決定することができる。
【０１１９】
本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、モノクローナル、ヒト化、キメラ、組換え、標識、二価、または抗イディオタイプであり得る。組換え抗体ポリペプチドは、組換え法を使用して動物においてではなくｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製された抗体ポリペプチドである。
【０１２０】
抗体変異体
本明細書において提供される抗体ポリペプチドはまた、その種々の変異体も包含する。特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、本明細書において提供される例示的な抗体の種々のタイプの変異体、すなわちＷ３３９６−親、Ｗ３３９６−Ｚ４、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、またはＷ３３９６−Ｒ１−２６Ｈ２を包含する。
【０１２１】
特定の実施形態では、抗体ポリペプチド変異体は、表１に提供されるような１つまたは複数のＣＤＲ配列、表２に提供される１つまたは複数の可変領域配列（しかし、ＣＤＲ配列のいずれにも存在しない）、および／または定常領域（例えば、Ｆｃ領域）において１つまたは複数の修飾または置換を含む。このような変異体は、その親抗体のＬＡＧ−３に対する特異的結合親和性を保持するが、修飾（複数可）または置換（複数可）によって付与される１つまたは複数の望ましい特性を有する。例えば、抗体ポリペプチド変異体は、改善された抗原結合親和性、改善された生産性、改善された安定性、改善されたグリコシル化パターン、低減されたグリコシル化のリスク、低減された脱アミノ化、低減されたまたは枯渇したエフェクター機能（複数可）、改善されたＦｃＲｎ受容体結合、増大された薬物動態半減期、ｐＨ感受性および／またはコンジュゲーション（例えば、１つまたは複数の導入されたシステイン残基）に対する適合性を有し得る。
【０１２２】
当技術分野で公知の方法、例えば、「アラニンスキャニング変異誘発」を使用して、親抗体配列を、スクリーニングして、修飾または置換されるために適したまたは好ましい残基を同定してもよい（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５を参照のこと）。手短には、標的残基（例えば、電荷を有する残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕ）を同定し、中性または負電荷を有するアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えることができ、修飾された抗体ポリペプチドを製造し、対象とする特性についてスクリーニングする。特定のアミノ酸位置の置換が、対象とする機能的変化を示す場合には、その位置を修飾または置換にとって有望な残基と同定できる。有望な残基を、異なる種類の残基（例えば、システイン残基、正電荷を有する残基等）で置換することによってさらに評価してもよい。
【０１２３】
親和性変異体
親和性変異体は、表１に提供されるような１つまたは複数のＣＤＲ配列、１つまたは複数のＦＲ配列、または表２に提供される重鎖可変領域配列において修飾または置換を含有し得る。可変領域においてＣＤＲ配列の両端に２つのＦＲ領域が位置することは当技術分野で周知であることから、ＦＲ配列は、表１におけるＣＤＲ配列および表２における可変領域配列に基づいて当業者によって容易に同定できる。親和性変異体は、その親抗体のＬＡＧ−３に対する特異的結合親和性を保持する、または親抗体を上回る、改善されたＬＡＧ−３特異的結合親和性をさらに有する。特定の実施形態では、ＣＤＲ配列中、ＦＲ配列中または可変領域配列中の少なくとも１つの（またはすべて）の置換は、保存的置換を含む。
【０１２４】
当業者ならば、表１および表２に提供されるＣＤＲ配列および可変領域配列において、１つまたは複数のアミノ酸残基が置換されてもよいが、得られた抗体ポリペプチドは、ＬＡＧ−３に対する結合親和性を依然として保持する、または改善された結合親和性さえ有するということは理解するであろう。当技術分野で公知の種々の方法を使用して、この目的を達成できる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、抗体変異体（ＦａｂまたはｓｃＦｖ変異体など）のライブラリーを作製し、発現させ、次いで、ヒトＬＡＧ−３に対する結合親和性についてスクリーニングできる。別の例のために、コンピュータソフトウェアを使用して、抗体のヒトＬＡＧ−３との結合を実質的にシミュレートし、結合面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定できる。このような残基は、結合親和性の低減を防ぐために置換において避けられる場合もあり、より強い結合を提供するために置換の標的とされる場合もある。
【０１２５】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるヒト化抗体ポリペプチドは、１つもしくは複数のＣＤＲ配列および／または１つもしくは複数のＦＲ配列中に１つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む。特定の実施形態では、親和性変異体は、ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列中に合計１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下の置換を含む。
【０１２６】
特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、表１に列挙されるもの（複数可）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１、２または３つのＣＤＲ配列を含み、一方で、その親抗体と同様の、またはさらに高いレベルでＬＡＧ−３に対する結合親和性を保持する。
【０１２７】
特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、表２に列挙されるもの（複数可）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１つまたは複数の可変領域配列を含み、一方で、その親抗体と同様の、またはさらに高いレベルでＬＡＧ−３に対する結合親和性を保持する。いくつかの実施形態では、表２に記載される可変領域配列において、合計で１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入、または欠失されている。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲ（例えば、ＦＲ）外の領域で起こる。
【０１２８】
グリコシル化変異体
本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドはまた、グリコシル化変異体を包含し、これは、抗体ポリペプチドのグリコシル化の程度を増大または減少するために得ることができる。
【０１２９】
抗体ポリペプチドは、炭水化物部分（例えば、オリゴ糖構造）が結合され得る側鎖を有する、１つまたは複数のアミノ酸残基を含み得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、炭水化物部分の、アスパラギン残基、例えば、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）などのトリペプチド配列中のアスパラギン残基の側鎖との結合を指す。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち１種の、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンとの結合を指す。天然グリコシル化部位の除去は、例えば、配列中に存在する、上記のトリペプチド配列のうち１種（Ｎ結合型グリコシル化部位について）またはセリンもしくはトレオニン残基（Ｏ結合型グリコシル化部位について）が置換されるようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成できる。新規グリコシル化部位は、このようなトリペプチド配列またはセリンもしくはトレオニン残基を導入することによって同様の方法で作製できる。
【０１３０】
システインが遺伝子操作された変異体
本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドはまた、システインが遺伝子操作された変異体を包含し、これは、１つまたは複数の導入された遊離システインアミノ酸残基を含む。
【０１３１】
遊離システイン残基は、ジスルフィド橋の一部ではないものである。システインが遺伝子操作された変異体は、例えば、中でも、遺伝子操作されたシステインの部位での、例えば、マレイミドまたはハロアセチルを介した、細胞傷害性および／またはイメージング化合物、標識または放射性同位元素とのコンジュゲーションにとって有用である。遊離システイン残基を導入するために抗体ポリペプチドを遺伝子操作する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ２００６／０３４４８８を参照のこと。
【０１３２】
Ｆｃ変異体
本明細書において提供される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドはまた、そのＦｃ領域および／またはヒンジ領域に１つまたは複数のアミノ酸残基修飾または置換を含むＦｃ変異体を包含する。
【０１３３】
特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とのｐＨ依存性結合を改善する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。このような変異体は、リソソームにおける分解から逃れ、次いで、移動し、細胞の外に放出されることを可能にする酸性ｐＨでＦｃＲｎと結合するので、薬物動態半減期の延長を有し得る。抗体ポリペプチドを遺伝子操作して、ＦｃＲｎに対する結合親和性を改善する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６（１）：６３−７３，１９９８；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  １，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２７：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＰＫ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１０；Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７０：３２６９−３２７７（２０１０）；ａｎｄ  Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７６：３４６−３５６（２００６）を参照のこと。
【０１３４】
特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を変更する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのある特定のアミノ酸残基を、置換して、増強されたＡＤＣＣ活性を提供できる。あるいは、またはさらに、抗体上の炭水化物構造を変更して、ＡＤＣＣ活性を増強できる。抗体エンジニアリングによってＡＤＣＣ活性を変更する方法は、当技術分野で記載されている、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１．２７６（９）：６５９１−６０４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ＥＥ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．１６４（８）：４１７８−８４；Ｓｔｅｕｒｅｒ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，１５５（３）：１１６５−７４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ＥＥ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，１６６（４）：２５７１−５；Ｌａｚａｒ  ＧＡ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（１１）：４００５−４０１０；Ｒｙａｎ  ＭＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２００７，６：３００９−３０１８；Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＪＯ，．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００８，７（８）：２５１７−２７；Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００２，２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００３，２７８：３４６６−３４７３を参照のこと。特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、２２８番目のアミノ酸残基が変更されており、例えばＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ、鎖の交換を妨げ得るまたは低減させ得る）であり、および／または例えばＬｅｕ２３５Ｇｕ（Ｌ２３５Ｆ、これはＦｃ受容体相互作用を変更し得る）から２３５番目のアミノ酸残基が変更されている、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む。
【０１３５】
特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、例えば、Ｃ１ｑ結合および／またはＣＤＣを改善または減少することによって補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変更する、１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む（例えば、ＷＯ９９／５１６４２；Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号、およびＦｃ領域変異体のその他の例に関してはＷＯ９４／２９３５１を参照のこと）。
【０１３６】
特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、ヘテロ二量体化を容易にするおよび／または促進するためにＦｃ領域の界面における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。これらの修飾は、第１のＦｃポリペプチドへの隆起および第２のＦｃポリペプチドへの空洞の導入を含み、ここでは、第１および第２のＦｃポリペプチドの相互作用を促進して、ヘテロ二量体または複合体を形成するために、隆起を空洞中に位置させることができる。これらの修飾を有する抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている。
【０１３７】
種々の技術をＶＨＨまたは単一ドメイン抗体の生成のために使用することができる。例えば、ＶＨＨは、ラクダを免疫すること、およびそこからハイブリドーマを得ること、または当技術分野で公知の分子生物学技術を使用して単一ドメイン抗体のライブラリーをクローニングすること、その後ファージディスプレイを使用することによって選択することなど、公知の方法によって得られ得る。
【０１３８】
本開示の別の態様では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、結合されている２つまたはそれ以上の単一ドメイン抗体を含み得る。単一ドメイン抗体は、配列が同一であり得、同じ標的または抗原に対する抗体であり得る。連結されたＶＨＨの数に応じて、抗体ポリペプチドは、二価（２ＶＨＨ）、三価（３ＶＨＨ）、四価（４ＶＨＨ）であり得、またはそれより高い価数の分子を有し得る。
【０１３９】
コンジュゲート
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、コンジュゲート部分をさらに含む。コンジュゲート部分は、抗体ポリペプチドと連結することができる。コンジュゲート部分は、抗体ポリペプチドと結合することができる非タンパク質性部分である。種々のコンジュゲート部分を、本明細書において提供される抗体ポリペプチドと連結してもよいということが考慮される（例えば、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（ｅｄｓ．），Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照のこと）。これらのコンジュゲート部分を、その他の方法の中でも、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、会合、ブレンドまたは付加によって抗体ポリペプチドと連結してもよい。
【０１４０】
特定の実施形態では、本明細書において開示される抗体ポリペプチドを、１つまたは複数のコンジュゲート部分との結合に利用され得る特定の部位をエピトープ結合部分の外側に含有するように、遺伝子操作してもよい。例えば、このような部位は、コンジュゲート部分との共有結合を容易にするために、１つまたは複数の反応性アミノ酸残基、例えば、システインまたはヒスチジン残基などを含み得る。
【０１４１】
特定の実施形態では、抗体を、コンジュゲート部分と間接的に、または別のコンジュゲート部分を介して連結してもよい。例えば、抗体ポリペプチドを、ビオチンにコンジュゲートしてもよく、次いで、アビジンにコンジュゲートされている第２のコンジュゲートに間接的にコンジュゲートしてもよい。コンジュゲートは、クリアランス改変剤、毒素（例えば、化学療法剤）、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素、ランタニド、発光標識、蛍光標識または酵素−基質標識）、または精製部分であり得る。
【０１４２】
「毒素」は、細胞にとって有害である、または細胞に損傷を与え得る、もしくは死滅させ得る任意の薬剤であり得る。毒素の例として、制限するものではないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＤＭＩ、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカププリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ〔thioepa〕クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、トポイソメラーゼ阻害剤、ならびにチューブリン結合剤が挙げられる。
【０１４３】
検出可能な標識の例として、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼまたはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉおよび３２Ｐ、その他のランタニド）、発光標識、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または検出用金を挙げることができる。
【０１４４】
特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、抗体の半減期を増大するのに役立つクリアランス変性部分であり得る。例示的例として、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐していても、非分岐であってもよい。抗体と結合しているポリマーの数は、変わることがあり、１つより多いポリマーが結合される場合には、同一分子である場合も、異なる分子である場合もある。
【０１４５】
特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、磁性ビーズなどの精製部分であり得る。
【０１４６】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、コンジュゲートの基材として使用される。
【０１４７】
ポリヌクレオチドおよび組換え法
本開示は、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１４８】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびに一本鎖または二本鎖型のそのポリマーを指す。特に限定していなければ、用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。特に示していなければ、特定のポリヌクレオチド配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルトログ、ＳＮＰ、および相補的配列ならびに明白に示された配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換されている配列を作成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４）を参照のこと）。
【０１４９】
特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および／もしくは３２に示される１つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびに／または少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するその相同配列、ならびに／または縮重置換のみを有し、本明細書において提供される例示的な抗体の可変領域をコードするその変異体を含む。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、シーケンシングされる。コードするＤＮＡはまた、合成法によって得ることもできる。
【０１５０】
抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド（例えば、表３に示されるような配列を含む）を、当技術分野で公知の組換え技術を使用して、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のために、ベクター中に挿入できる。多数のベクターが入手可能である。ベクター構成成分は、一般に、それだけには限らないが、以下のうち１つまたは複数を含む：シグナル配列、複製起点、１種または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）および転写終結配列。
【０１５１】
本開示は、抗体ポリペプチドをコードする本明細書において提供される核酸配列、核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）、および少なくとも１つの選択マーカーを含有するベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。ベクターの例としては、それだけには限らないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、λファージ、およびＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８−Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ−Ｈｙｇ−ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ  ２．１、ｐＥＦ−１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ−Ｂｏｓ等が挙げられる。
【０１５２】
抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞に導入できる。本明細書においてベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現させるための適した宿主細胞として、上記の原核生物、酵母またはより高度の真核生物細胞がある。この目的のために適した原核生物として、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリキア属〔Escherichia〕、例えば、大腸菌〔E. coli〕、エンテロバクター属〔Enterobacter〕、エルウィニア属〔Erwinia〕、クレブシエラ属〔Klebsiella〕、プロテウス属〔Proteus〕、サルモネラ属〔Salmonella〕、例えば、サルモネラ・チフィリウム〔Salmonella typhimurium〕、セラチア属〔Serratia〕、例えば、セラチア・マルセッセンス〔Serratia marcescans〕および赤痢菌属〔Shigella〕などの腸内細菌科〔Enterobacteriaceae〕、ならびにＢ．スブチリス〔subtilis〕およびＢ．リケニフォルミス〔licheniformis〕などのバチルス属〔Bacilli〕、Ｐ．エルジノーサ〔aeruginosa〕などのシュードモナス属〔Pseudomonas〕およびストレプトマイセス属〔Streptomyces〕が挙げられる。
【０１５３】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核細胞微生物は、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドを発現させるための適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ〔Saccharomyces cerevisiae〕または一般的なパン酵母は、下等真核細胞宿主微生物の中で最もよく使用されている。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ〔Schizosaccharomyces pombe〕；例えば、Ｋ．ラクチス〔lactis〕、Ｋ．フラギリス〔fragilis〕（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス〔bulgaricus〕（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッカーアミー〔wickeramii〕（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチー〔waltii〕（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム〔drosophilarum〕（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス〔thermotolerans〕およびＫ．マーキシアヌス〔marxianus〕などのクリベロミセス属〔Kluyveromyces〕宿主；ヤロウイア属〔yarrowia〕（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス〔Pichia pastoris〕（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属〔Candida〕；トリコデルマ・リーゼイ〔Trichoderma reesia〕（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ〔Neurospora crassa〕；シュワニオミセス・オクシデンタリス〔Schwanniomyces occidentalis〕などのシュワニオミセス属〔Schwanniomyces〕；および例えば、アカパンカビ属〔Neurospora〕、アオカビ属〔Penicillium〕、トリポクラジウム属〔Tolypocladium〕ならびにＡ．ニデュランス〔A.nidulans〕およびクロコウジカビ〔A.niger〕などのアスペルギルス属〔Aspergillus〕宿主などの糸状菌などの、いくつかのその他の属、種および株が一般に入手可能であり、本明細書において有用である。
【０１５４】
本明細書において提供されるグリコシル化抗体または抗原断片の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにヨトウガ〔Spodoptera frugiperda〕（イモムシ）、ネッタイシマカ〔Aedes aegypti〕（蚊）、ヒトスジシマカ〔Aedes albopictus〕（蚊）、キイロショウジョウバエ〔Drosophila melanogaster〕（ショウジョウバエ）およびカイコ〔Bombyx mori〕などの宿主に由来する対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ〔Autographa californica〕ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコ〔Bombyx mori〕ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、本明細書において、本発明に従って、特に、ヨトウガ〔Spodoptera frugiperda〕細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして使用され得る。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主として使用され得る。
【０１５５】
しかし、関心は、脊椎動物細胞において最大であり、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、２９３Ｆ細胞である。
【０１５６】
宿主細胞は、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチド生成のために上記の発現またはクローニングベクターを使用して形質転換され、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて改変された従来の栄養培地で培養される。別の実施形態では、抗体ポリペプチドは、当技術分野で公知の相同組換えによって生成され得る。
【０１５７】
本明細書において提供される抗体ポリペプチドを生成するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または再発行米国特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を補給され得る。任意のその他の必要な栄養補助剤もまた、当業者に公知であろう適当な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどといった培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共にこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかとなろう。
【０１５８】
組換え技術を使用する場合には、抗体ポリペプチドは、細胞内、細胞膜周辺腔において生成され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生成される場合には、第１のステップとして、微粒子状細片、宿主細胞または溶解した断片のいずれかが例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。手短には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞細片は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合には、このような発現系から得られた上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用してまず濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が前記のステップのいずれにも含まれることがあり、外来性の混入物質の成長を防ぐために、抗生物質が含まれることがある。
【０１５９】
細胞から調製される抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドは、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。
【０１６０】
特定の実施形態では、固相で固定化されたプロテインＡは、抗体ポリペプチドの免疫親和性精製のために使用される。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに応じて変わる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖をベースとする抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプに対して、およびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７  １５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着されるマトリックスは、最も多くはアガロースであるが、その他のマトリックスが利用可能である。コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの力学的に安定なマトリックスは、アガロースを使用して達成され得るものよりも迅速な流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州、フィリップスバーグ）が有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のためのその他の技術も、回収されるべき抗体に応じて利用可能である。
【０１６１】
任意の予備的精製ステップ（複数可）後に、対象とする抗体および混入物質を含む混合物は、約２．５〜４．５の間のｐＨの溶出バッファーを使用する、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付され得る。
【０１６２】
医薬組成物
本開示は、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドおよび１種または複数の医薬上許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【０１６３】
本明細書において開示される医薬組成物において使用するための医薬上許容される担体として、例えば、医薬上許容される液体、ゲルまたは固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、バッファー、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分配剤、封鎖剤またはキレート化剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または非毒性補助物質、当技術分野で公知のその他の成分またはそれらの種々の組合せを挙げることができる。
【０１６４】
適した成分として、例えば、抗酸化剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、バッファー、保存料、滑沢剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤または糖およびシクロデキストリンなどの安定化剤を挙げることができる。適した抗酸化剤として、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルを挙げることができる。本明細書において開示されるように、本明細書において提供されるような抗体ポリペプチドおよびコンジュゲートを含む組成物中に、メチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤を含めることによって、抗体ポリペプチドの酸化が減少する。この酸化の低減は、結合親和性の喪失を防ぐまたは低減し、それによって、抗体安定性を改善し、有効期間を最大化する。したがって、特定の実施形態では、本明細書において開示されるような１種または複数の抗体ポリペプチドおよびメチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤を含む組成物が提供される。抗体ポリペプチドを、メチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤と混合することによって、本明細書において提供されるような抗体ポリペプチドの酸化を防ぐための、有効期間を延長するための、および／または有効性を改善するための方法がさらに提供される。
【０１６５】
さらに例示するために、医薬上許容される担体として、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液またはデキストロースおよび乳酸リンゲル注射液などの水性ビヒクル、植物起源の不揮発性油、綿実油、トウモロコシオイル、ゴマ油またはピーナッツオイルなどの非水性ビヒクル、静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張剤、リン酸またはクエン酸バッファーなどのバッファー、重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、塩酸プロカインなどの局所麻酔剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの懸濁剤および分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）などの封鎖剤またはキレート化剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を挙げることができる。担体として利用される抗菌剤を、複数回用量容器中の医薬組成物に添加してもよく、これとして、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。適した賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールを挙げることができる。適した非毒性補助物質として、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解促進剤、または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンもしくはシクロデキストリンなどの薬剤を挙げることができる。
【０１６６】
医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、丸剤、カプセル剤、錠剤、徐放性製剤または散剤であり得る。経口製剤として、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどといった標準担体を挙げることができる。
【０１６７】
特定の実施形態では、医薬組成物は、注射用組成物に製剤化される。注射用医薬組成物は、例えば、液体溶液、懸濁液、エマルジョンまたは液体溶液、懸濁液またはエマルジョンを作製するのに適した固体形態などの任意の従来の形態で調製され得る。注射のための調製物として、注射用に準備された滅菌および／または非発熱性溶液、皮下錠剤を含む、使用直前に溶媒と組み合わされるべく準備された凍結乾燥散剤などの滅菌乾燥可溶性製剤、注射用に準備された滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルと組み合わされるべく準備された滅菌乾燥不溶性製剤、ならびに滅菌および／または非発熱性エマルジョンを挙げることができる。溶液は、水性であっても、非水性であってもよい。
【０１６８】
特定の実施形態では、単位用量非経口調製物は、アンプル、バイアルまたはニードルを備えたシリンジ中にパッケージングされる。非経口投与用のすべての調製物は、当技術分野で公知であり、実施されるように滅菌および非発熱性でなくてはならない。
【０１６９】
特定の実施形態では、滅菌、凍結乾燥散剤は、適した溶媒中に本明細書において開示される抗体ポリペプチドを溶解することによって調製される。溶媒は、散剤または散剤から調製された復元された溶液の安定性またはその他の薬理学的成分を改善する賦形剤を含有し得る。使用され得る賦形剤として、それだけには限らないが、水、デキストロース、ソルビトール〔solbital〕、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたはその他の適した薬剤が挙げられる。溶媒は、クエン酸、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウムなどのバッファー、または一実施形態ではおよそ中性のｐＨの、当業者に公知のその他のこのようなバッファーを含有し得る。当業者に公知の溶液のその後の滅菌濾過と、それに続く標準条件下での凍結乾燥によって、望ましい製剤が提供される。一実施形態では、得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアル中に配分される。各バイアルは、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドまたはその組成物の単一投与量または複数回投与量を含有し得る。バイアルに用量または用量のセットに必要なものを上回る少量（例えば、約１０％）を過剰充填することは、正確なサンプル引き出しおよび正確な投薬を促進するために許容される。凍結乾燥散剤は、約４℃〜室温などの適当な条件下で保存され得る。
【０１７０】
注射水による凍結乾燥散剤の復元は、非経口投与において使用するための製剤を提供する。一実施形態では、復元のために滅菌および／または非発熱性水またはその他の液体の適した担体が、凍結乾燥散剤に添加される。正確な量は、与えられている選択された療法に応じて変わり、経験的に決定され得る。
【０１７１】
使用方法
本開示は、本明細書において提供される抗体ポリペプチドの治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与し、それによって、ＬＡＧ−３関連状態または障害を処置または予防することを含む治療方法もまた提供する。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３関連状態または障害は、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患である。
【０１７２】
癌の例として、それだけには限らないが、リンパ腫、膀胱癌、骨癌、脳および中枢神経系の癌、乳癌、子宮癌または子宮内膜癌、直腸癌、食道癌、頭頸部癌、肛門癌、消化管癌、上皮内新生物、腎臓癌または腎癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌および小細胞肺癌）、黒色腫、骨髄腫、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、外陰癌、内分泌系の癌、副甲状腺癌、副腎癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、下垂体腺腫、または類表皮癌が挙げられる。
【０１７３】
自己免疫疾患の例として、それだけには限らないが、後天性免疫不全症候群（自己免疫成分を有するウイルス疾患であるＡＩＤＳ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアックスプルーヘルペス状皮膚炎；慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素病、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スチル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性〔pemacious〕貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨大細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１７４】
感染性疾患の例として、それだけには限らないが、真菌感染症、寄生虫／原虫感染症または慢性ウイルス感染症、例えば、マラリア、コクシジオイオドマイコシスイミティス〔coccidioiodmycosis immitis〕、ヒストプラスマ症、爪真菌症、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症アルビカンス〔candidiasis albicans〕、パラコクシジオイデス症〔paracoccidioiomycosis〕、微胞子虫症、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、バイリサスカリアシス〔Baylisascariasis〕、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ属〔Cochliomyia〕、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコッカス症、象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、鞭虫症、トリパノソーマ症、蠕虫感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ、カポジウエスト肉腫関連ヘルペスウイルス伝染病、シンリングウイルス（トルクテノウイルス〔Torquetenovirus〕）、ヒトＴリンパ増殖性ウイルスＩ、ヒトＴリンパ増殖性ウイルスＩＩ、水痘帯状疱疹、ＪＣウイルスまたはＢＫウイルスの感染症が挙げられる。
【０１７５】
本明細書において提供されるような抗体ポリペプチドの治療上有効な量は、当技術分野で公知の種々の因子、例えば、対象の体重、年齢、過去の病歴、現在の薬物適用、健康状態および交差反応の可能性、アレルギー、感受性および有害な副作用、ならびに投与経路および疾患発達の程度などに応じて変わる。投与量は、これらおよびその他の状況または必要条件によって示されるように、当業者（例えば、医師または獣医師）によって比例的に低減または増大され得る。
【０１７６】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるような抗体ポリペプチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの治療上有効な投与量で投与され得る。これらの実施形態のうち特定のものでは、抗体ポリペプチドは、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で投与され、これらの実施形態のうち特定のものでは、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、３ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の実施形態では、投薬量は、治療過程にわたって変化し得る。例えば、特定の実施形態では、初期投薬量は、その後の投薬量よりも高い場合がある。特定の実施形態では、投薬量は、対象の反応に応じて処置過程にわたって変わり得る。
【０１７７】
投与計画は、最適な望ましい応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回用量が投与される場合も、または数回の分割用量が経時的に投与される場合もある。
【０１７８】
本明細書において開示される抗体ポリペプチドは、例えば、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内注入を含む静脈内、筋肉内または皮内注射）または非経口ではない（例えば、経口、鼻腔内、眼球内、舌下、直腸内または局所）経路などの当技術分野で公知の任意の経路によって投与され得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される抗体ポリペプチドは、単独で、または１種もしくは複数のさらなる治療手段または薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書において開示される抗体ポリペプチドは、別の治療薬、例えば、化学療法剤または抗癌剤と組み合わせて投与され得る。
【０１８０】
これらの実施形態の特定のものでは、１種または複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与される本明細書において開示される抗体ポリペプチドは、１種または複数のさらなる治療薬と同時に投与されてもよく、これらの実施形態の特定のものでは、抗体ポリペプチドおよびさらなる治療薬（複数可）は、同じ医薬組成物の一部として投与されてもよい。しかし、別の治療薬と「組み合わせて」投与される抗体ポリペプチドは、薬剤と同時に、または薬剤と同じ組成物中で投与されなくてもよい。別の薬剤に先立って、またはその後に投与される抗体ポリペプチドは、抗体ポリペプチドおよび第２の薬剤が、異なる経路によって投与される場合でさえ、その語句が本明細書において使用される場合、その薬剤と「組み合わせて」投与されると考えられる。可能であれば、本明細書において開示される抗体ポリペプチドと組み合わせて投与されるさらなる治療薬は、さらなる治療薬の添付文書に列挙されるスケジュールに従って、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２００３年（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ  Ｅｄ；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；５７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００２））もしくは当技術分野で周知のプロトコールに従って投与される。
【０１８１】
本開示は、抗ＬＡＧ−３抗体ポリペプチドを使用する方法をさらに提供する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本開示は、サンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を検出する方法であって、サンプルを、抗体ポリペプチドと接触させることと、サンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を決定することとを含む方法をさらに提供する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるＬＡＧ−３関連の疾患または状態を診断する方法であって、ａ）対象から得られたサンプルを、本明細書において提供される抗体ポリペプチドと接触させること；ｂ）サンプル中のＬＡＧ−３の存在または量を決定すること；およびｃ）ＬＡＧ−３の存在を、対象におけるＬＡＧ−３関連の疾患または状態と相関させることを含む方法をさらに提供する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本開示は、任意選択で検出可能な部分にコンジュゲートされた、本明細書において提供される抗体ポリペプチドを含むキットを提供する。キットは、ＬＡＧ−３の検出またはＬＡＧ−３関連の疾患の診断において有用であり得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるＬＡＧ−３関連の疾患または状態を処置するための医薬の製造における、ＬＡＧ−３関連の疾患または状態を診断するための診断用試薬の製造における、本明細書において提供される抗体ポリペプチドの使用も提供する。
【０１８６】
利点
本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、多くの態様において既存の治療に優り、有利である。例えば、既存のＬＡＧ−３抗体と比較すると、本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、ヒトおよびサルＬＡＧ−３に対してより良好な結合親和性を有し、細胞表面ＭＨＣ−ＩＩに対するＬＡＧ−３の結合の遮断においてより有効であり、ＬＳＥＣｔｉｎおよびガレクチン−３に対するＬＡＧ−３結合の遮断においてより有効であり、ＩＬ−２経路活性を増強し、およびＩＦＮγ産生の誘導においてより有効である。本明細書において提供される抗体ポリペプチドはまた、それが、対照抗体が結合するものとは異なるエピトープに結合するという点においても有利である。本明細書において提供される抗体ポリペプチドは、ピコモル濃度レベルに達する親和性でマウスＬＡＧ−３と結合し、これはマウスモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ機能的アッセイにとって有利である。
【実施例】
【０１８７】
以下の実施例は、特許請求された本発明をより良好に例示するために提供され、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。以下に記載されるすべての特定の組成物、材料および方法は、全体で、または一部で本発明の範囲内に入る。これらの特定の組成物、材料および方法は、本発明を制限するものではなく、単に、本発明の範囲内に入る特定の実施形態を例示するものである。当業者は、発明の能力を行使することなく、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料および方法を開発し得る。本発明の範囲内にとどまりながら本明細書に記載される手順において多数の変法を行うことができるということが理解されよう。このような変法が本発明の範囲内に含まれることは本発明者らの意図である。
【０１８８】
［実施例１］
材料および方法
１．１  免疫原の作製
ヒトＬＡＧ−３  ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２２７７）、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＬＡＧ−３  ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿００５５７００１１．１）、およびマウスＬＡＧ−３  ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３２５０５）をコードする核酸配列は、Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。合成した核酸から増幅したＬＡＧ−３遺伝子断片を、ヒトＦｃ−、マウスＦｃ−、またはＨｉｓ−タグをそれぞれ含有する発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に挿入した。Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ａ１４５２７）に、精製ＥＣＤ発現ベクターをトランスフェクトし、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中、３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。回収した上清をタンパク質精製のために使用した。Ｈｉｓタグタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−１７−５２４７−０１）を使用して精製し、Ｆｃタグタンパク質をプロテインＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−１７−５４３８−０２）を使用して精製した。
【０１８９】
１．２  ベンチマーク抗体（ＢＭＫ  Ａｂ）（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７、Ｗ３３９−ＢＭＫ８）の生成
抗ヒトＬＡＧ−３ベンチマーク抗体Ｗ３３９−ＢＭＫ１およびＷ３３９−ＢＭＫ７は、特許米国特許出願公開第２０１１０１５０８９２号Ａ１および米国特許出願公開第２０１７／０１０１４７２号Ａ１にそれぞれ開示される情報に基づいて合成した。Ｗ３３９−ＢＭＫ１は、クローン「２５Ｆ７」の配列に基づき、Ｗ３３９−ＢＭＫ７は、クローン「Ｈ４ｓＨ１５４８２Ｐ」の配列に基づいた。Ｗ３３９−ＢＭＫ８は、ＷＯ２０１５１３８９２０Ａ１におけるクローン「ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１」の配列に基づいた。ベンチマーク抗体はすべて、Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのヒト定常領域によって改変されている。
【０１９０】
合成された遺伝子配列を、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３に挿入し、ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトした。５日間培養後、一過性にトランスフェクトした細胞培養から回収した上清を、タンパク質精製のために使用した。ベンチマーク抗体を、プロテインＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−１７−５４３８−０２）によって上清から精製した。
【０１９１】
１．３  安定な細胞株の確立
ヒト、マウス、およびカニクイザルＬＡＧ−３トランスフェクタント細胞株を作製した。手短には、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３またはＣＨＯ−Ｋ１に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ−１１６６８０２７）を使用して、製造元のプロトコールに従って全長のヒトＬＡＧ−３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２２７７）を含有するｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターをトランスフェクトした。Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯおよび２９３Ｆ細胞をそれぞれ、マウスおよびカニクイザルＬＡＧ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３２５０５およびＸＰ＿００５５７００１１．１）によるトランスフェクションのために使用した。トランスフェクションの４８〜７２時間後、トランスフェクトした細胞を選択のためにブラスチシジンを含有する培地中で培養した。ＬＡＧ−３発現をフローサイトメトリーによって試験した。ヒト、カニクイザル、およびマウスＬＡＧ−３を発現する安定な細胞株を、限界希釈によって得た。
【０１９２】
２．ＶＨＨの作製
２．１  免疫
ラクダ類動物においてＬＡＧ−３に対する液性免疫応答を誘導するために、動物に、組換えｍＦｃタグを有するヒトＬＡＧ−３  ＥＣＤおよび組換えｈＦｃタグを有するマウスＬＡＧ−３  ＥＣＤタンパク質をそれぞれ皮下注射した。免疫は１〜３週間の間隔で、注射１回あたり５０μｇ〜２００μｇの範囲の用量で、合計８用量によって行った。
【０１９３】
２．２  血清中力価の検出
免疫動物血清中の抗ヒトＬＡＧ−３および抗マウスＬＡＧ−３力価をそれぞれ、ヒトＬＡＧ−３．ＥＣＤ．ｈｉｓおよびマウスＬＡＧ−３．ＥＣＤ．ｈｉｓタンパク質を使用してＥＬＩＳＡによって検出した。９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、ヒトまたはマウスＬＡＧ−３  ＥＣＤの可溶性タンパク質によって４℃で一晩コーティングした。コーティングしたプレートをブロッキングおよび洗浄後、免疫前または免疫血清の連続希釈液をコーティングプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、その後二次抗体であるヤギ抗ラマＩｇＧ−ＨＲＰ（ＮＢ７２４２）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、呈色反応を２Ｍ  ＨＣｌによって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
【０１９４】
２．３  ライブラリーの構築
血液サンプル５０ｍｌを、最後の２回の注射の６〜７日後にそれぞれ回収した。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）中での密度勾配遠心分離によって精製し、およそ８×１０７個のＰＢＭＣを単離した。総ＲＮＡを、これらのＰＢＭＣから抽出し、オリゴ−ｄＴおよびランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して製造元の推奨に従ってｃＤＮＡに転写した。
【０１９５】
次いで、精製ｃＤＮＡを鋳型として使用して、シグナルペプチドドメイン特異的プライマーおよびＣＨ２ドメイン特異的プライマーを使用することによって、Ｉｇ重鎖コード遺伝子セグメントのレパートリーを増幅した。この増幅によって、およそ９００ｂｐ（従来のＩｇＧを表す）および７００ｂｐ（ＣＨ１ドメインを欠く重鎖のみのＩｇＧを表す）のＰＣＲ断片が得られた。重鎖コード遺伝子の２つのクラスをアガロースゲル上でサイズ分離し、重鎖のみのＩｇＧをコードする遺伝子を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。精製した断片を鋳型として使用し、フレームワーク１（ＦＲ１）およびフレームワーク４（ＦＲ４）特異的プライマー対を使用してＶＨＨレパートリーを増幅した。この増幅手順は、ＦＲ１の５’末端にＳｆｉＩ部位を導入し、ＦＲ４の３’末端にＮｏｔＩ制限部位を導入した。約３００〜４００ｂｐのＰＣＲ増幅ＶＨＨ遺伝子のレパートリーをアガロースゲルにロードし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって精製した。次に、精製断片を、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩによって切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。ＶＨＨ遺伝子断片を最終的にファージミドベクターｐＦＬ２４９にライゲートし、大腸菌ＴＧ１に電気的形質転換した。形質転換後、ＴＧ１細胞を、ＳＯＣ培地中、２００ｒｐｍで振とうさせながら１時間培養した後、大腸菌ＴＧ１を、１００μｇ／ｍＬ炭水化物および１％（重量／体積）グルコースを補充した２ＹＴ寒天プレート上に播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、コロニーを、１／３（体積／体積）の８０％グリセロールを補充した液体２ＹＴ培地にこすり取り、−８０℃で保存した。
【０１９６】
２．４  パニング
ＬＡＧ−３と有効に結合するＶＨＨ断片を選択するため、タンパク質パニング法を使用した。ＬＡＧ−３  ＥＣＤタンパク質２０μｇを５ｍｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ〔immune tube〕（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ、ＵＳＡ）中、４００ｒｐｍで振とうさせながら４℃で一晩固定化した。翌日、非結合タンパク質を洗浄して除去後、チューブを１０％スキムミルクによって２５℃で１時間ブロッキングした。免疫ファージライブラリからのおよそ１０１２ｃｆｕのファージを、１０％スキムミルクによってブロッキングした非コーティングＩｍｍｕｎｏｔｕｂｅに添加し、非特異的結合ファージを枯渇させた後、上記のように処置したファージを、ＬＡＧ−３  ＥＣＤタンパク質でコーティングしたチューブに添加し、２５℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴによって十分に洗浄後、非特異的に吸着したファージを捨て、標的に特異的に結合したファージをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）によって溶出した後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によって中和し、指数的に成長するＴＧ１細胞に感染させた。感染したＴＧ１細胞を、２％（重量／体積）グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ＹＴ寒天プレート上に播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、２ＹＴを有するプレートからコロニーをこすり取り、１／３（体積／体積）の８０％グリセロール中に添加することによって−８０℃で凍結した。こすり取った細菌ライブラリーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ＹＴ−炭水化物に接種し、ファージ救出のために５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを有する２ＹＴ培地中でヘルパーファージＭ１３Ｋｏ７を感染させ、これを次のラウンドのパニングのための投入物として使用した。サルおよびマウスＬＡＧ−３と交差反応するファージ粒子を探り出すため、サルＬＡＧ−３およびマウスＬＡＧ−３タンパク質による代替のパニングを使用することができる。
【０１９７】
２．５  スクリーニング
所望のパニングステップの後、プレート上で成長させたファージ感染ＴＧ１細胞コロニーをこすり取り、ＶＨＨ断片を含有するｐＦＬ２４９ファージミドを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミド（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して抽出した。ＶＨＨ断片を、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ（１０〜２０Ｕ／μｇ、ＮＥＢ）によるｐＦＬ２４９プラスミドの消化によってクローニングし、次いで６−ｈｉｓおよびｃ−Ｍｙｃ−タグの遺伝子を含有する発現ベクターｐＥＴｂａｃにライゲートした。ライゲーション産物を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（ＴＩＡＮＧＥＮ）において形質転換した後、ＺＹＭ−５０５２培地中、２３０ｒｐｍで振とうさせながら２５℃で４８時間培養した。大腸菌ＢＬ２１培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を収集した。ＬＡＧ−３陽性ＶＨＨクローンを同定するために、上清をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ結合アッセイによってスクリーニングした。
【０１９８】
ＥＬＩＳＡアッセイを第１のスクリーニング方法として使用して、ＶＨＨ大腸菌培養上清のＬＡＧ−３  ＥＣＤタンパク質との結合を試験した。手短には、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、ヒトまたはマウスＬＡＧ−３  ＥＣＤタンパク質の可溶性タンパク質によって４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、大腸菌上清をコーティングプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄した後、二次抗体であるヤギ抗−ｃ−Ｍｙｃ−ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、呈色反応を２Ｍ  ＨＣｌによって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
【０１９９】
細胞膜上に発現されたコンホメーショナルＬＡＧ−３分子上のＬＡＧ−３抗体の天然の結合を確認するために、フローサイトメトリー分析を、ＬＡＧ−３トランスフェクト細胞株および親の対照細胞株について実施した。細胞を最初に、９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ）において１×１０５個／ウェルの密度でＶＨＨ大腸菌上清サンプルと共に４℃で１時間インキュベートした後、二次抗体であるマウス抗ｃ−Ｍｙｃ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で３０分間インキュベートし、その後ストレプトアビジンＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に４℃の暗所で２０分間インキュベートした。各ステップの間に２回の洗浄を行い、細胞をフローサイトメトリー（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）分析のために１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に浮遊させた。
【０２００】
２．６  シーケンシング
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳスクリーニングによって選択した陽性大腸菌クローンを、ＶＨＨ遺伝子のヌクレオチドシーケンシングのためにＢｉｏｓｕｎｅ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）に送付した。シーケンシング結果を、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。
【０２０１】
２．７  ＶＨＨタンパク質生成
ＶＨＨ遺伝子を保有するＢＬ２１大腸菌クローンを、ＺＹＭ−５０５２培地４０ｍｌ中、２３０ｒｐｍで振とうさせながら２５℃で４８時間培養した。ＢＬ２１上清中のｈｉｓ−およびｃ−Ｍｙｃ−タグ融合ＶＨＨタンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用して精製した。ＶＨＨの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析用ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定した。低い上清発現クローンに関して、大腸菌細胞の超音波（Ｓｃｉｅｎｔｚ、Ｎｉｎｇｂｏ、Ｃｈｉｎａ）破壊を使用して、可溶性ＶＨＨタンパク質を放出させ、全細胞ライセートを精製した。
【０２０２】
２．８  キメラＶＨＨ−Ｆｃ（ｈＩｇＧ４）タンパク質の生成
対象とするクローンをＶＨＨ−Ｆｃ（ｕＩｇＧ４）融合抗体に変換した。手短には、ＶＨＨ遺伝子を、適切な制限部位を含有するＶＨＨ特異的クローニングプライマーを使用してｐＥＴ−ｂａｃベクターからＰＣＲ増幅し、次に改変ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（Ｓ２２８Ｐ）発現ｐｃＤＮＡ３．３ベクターへの融合によってクローニングし、ＶＨＨ−Ｆｃ（ｕＩｇＧ４）キメラ抗体の対応するクローンを作製した。２９３Ｆ細胞に、抗体発現のためにベクターを一過性にトランスフェクトした。抗体を含有する細胞培養上清を回収し、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。
【０２０３】
３．抗体の最適化
３．１  ヒト化
ＬＡＧ−３に対して高い親和性および特異性を有するＶＨＨを、ヒト化のために選択した。ＶＨＨ鎖をヒト化するために「最良適合」アプローチを使用した。ＶＨＨフレームワーク領域のアミノ酸配列を、ヒト生殖系列Ｖ−遺伝子データベースに対してｂｌａｓｔ検索し、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ定義を使用して、上位ヒットのヒトＣＤＲ配列をＶＨＨ  ＣＤＲ配列で置き換えることによって、ヒト化ＶＨＨ配列を作製した。フレームワーク領域における特定の残基を、親和性を維持するためにラクダ起源の残基に復帰変異させた。ヒト化遺伝子は、ＧＥＮＥＷＩＺによって逆翻訳され、哺乳動物発現に関してコドン最適化され、合成された。これらの遺伝子を、適切な制限部位を含有するクローニングプライマーと共に再増幅し、改変ｐｃＤＮＡ３．３ベクターにクローニングし、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（Ｓ２２８Ｐ）領域に連結したヒト化ＶＨＨを発現させた。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＬＡＧ−３結合に関して試験した後、適切な親和性を有する変異体をヒト化抗体リードとして選択した。
【０２０４】
３．２  親和性成熟
親ＶＨＨクローンの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の各アミノ酸を、部位特異的変異誘発法を使用して他の２０個のアミノ酸へと個々に変異させた。２０個のアミノ酸をコードするＮＮＳコドンを含有するＤＮＡプライマーを使用して、各々の標的化ＣＤＲ位置に変異を導入した。個々の縮重プライマーを部位特異的変異誘発反応において使用した。反応産物２００ｎｇをＢＬ２１にエレクトロポレーションし、９６ウェル深底プレート（Ａｘｙｇｅｎ）において発現させた。ＶＨＨ変異体を、９６ウェル深底プレートにおいて成長させた細菌の上清を用いたＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングした。親クローンの１．５倍超のＯＤ４５０を示すクローンを、変異体の親和性のＳＰＲによってさらにスクリーニングした。
【０２０５】
抗原に対する結合にとって有益であることが決定されたＶＨＨにおける点変異を、増強された親和性相乗効果を得るためにさらに組み合わせた。組み合わせた変異体を、ＧＥＮＥＷＩＺにおいて合成し、ＢＬ２１において発現させた。変異体の上清をＳＰＲによって検出した。親和性成熟後、リポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）反応において強い応答を示す合計で９つのヒト化ＶＨＨ抗体を選択し、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（Ｓ２２８Ｐ）領域と融合させた。９つの変異ＶＨＨ−Ｆｃキメラ抗体（ＶＨＨ  Ａｂ）を、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、Ｗ３３９６−Ｒ２−３、Ｗ３３９６−Ｒ２−６、Ｗ３３９６−Ｒ２−１０、Ｗ３３９６−Ｒ２−１１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１２、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３およびＷ３３９６−Ｒ２−２６Ｈ２として省略して表す。図１Ａおよび１Ｂに示すように、９つの親和性成熟ＶＨＨ  Ａｂは、ＲＧＡアッセイにおいて親ＶＨＨ  Ａｂ（Ｗ３３９６−Ｚ４と略される）と比較して増強された反応性を示す。
【０２０６】
４．抗体の特徴付け
４．１  ＬＡＧ−３抗体の細胞表面ＬＡＧ−３との結合
試験抗体（Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１）、ベンチマーク抗体（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）、および陰性対照抗体（アイソタイプＩｇＧ４）の連続希釈液をそれぞれ、ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞と共にインキュベートし、抗体の細胞表面ＬＡＧ−３との結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を介してＰＥ標識二次抗体によって検出した。同様に、カニクイザルまたはマウスＬＡＧ−３に対する交差反応性を、カニクイザルまたはマウスＬＡＧ−３トランスフェクト細胞株によりＦＡＣＳによって試験した。図２Ａおよび２Ｂは、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１の両方がそれぞれ、細胞表面のヒトおよびマウスＬＡＧ−３に結合することを示す。ヒトＬＡＧ−３との結合ＥＣ５０は、ベンチマーク抗体（ＢＭＫ  Ａｂ）のものより良好であった。ＢＭＫ  ＡｂはマウスＬＡＧ−３に結合しない（図２Ｂ）。Ｗ３３９６−Ｒ２−１３およびＷ３３９６−Ｒ２−１はまた、細胞表面のサルＬＡＧ−３との結合に関しても試験され、ＢＭＫ  Ａｂのものと同等またはそれより良好なＥＣ５０値を示した（図２Ｃを参照のこと）。
【０２０７】
４．２  ＦＡＣＳによる、ＬＡＧ−３抗体によるＬＡＧ−３の細胞表面ＭＨＣ−ＩＩとの遮断
抗体の連続希釈液を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中でマウスＦｃ（ｍＦｃ）タグを有するヒトＬＡＧ−３と共に４℃で３０分間予め混合した。混合物を、Ｒａｊｉ細胞を播種した９６ウェルプレートに移した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＰＥ抗体を使用して、ＬＡＧ−３タンパク質のＲａｊｉ細胞との結合を検出した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、フローサイトメトリーによって評価し、ＦｌｏｗＪｏによって分析した。マウスＬＡＧ−３のマウス細胞表面ＭＨＣ−ＩＩとの結合の遮断を試験するために、ｍＦｃタグを有するマウスタンパク質およびＡ２０細胞を使用した。図３Ａは、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７、Ｗ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等またはそれより良好なＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３の、Ｒａｊｉ細胞上のＭＨＣ−ＩＩとの結合を遮断することを示している。図３Ｃは、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、２．４〜２．９ｎＭのＩＣ５０で、マウスＬＡＧ−３の、Ａ２０細胞上のマウスＭＨＣ−ＩＩとの結合を遮断することを示している。図３Ｂは、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−２が、０．９９〜１．７８ｎＭのＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３の、Ａ２０細胞上のヒトＭＨＣ−ＩＩとの結合を遮断することを示している。
【０２０８】
４．３  ＥＬＩＳＡによるＬＡＧ−３のＬＳＥＣｔｉｎおよびガレクチン−３との遮断
９６ウェルプレートを、０．５μｇ／ｍｌのヒトＬＳＥＣｔｉｎまたはガレクチン−３によってそれぞれ、４℃で一晩コーティングした。試験抗体（Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３）、ベンチマーク抗体（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８）、および陰性対照抗体（アイソタイプＩｇＧ４）の連続希釈液を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中でｍＦｃタグを有するヒトＬＡＧ−３と４℃で３０分間予め混合した。ブロッキングおよび洗浄後、混合物をプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰと共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、呈色反応を２Ｍ  ＨＣｌによって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して読み取った。図４Ａおよび図４Ｂは、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂのものと同等であるかまたはそれより良好なＩＣ５０で、ヒトＬＡＧ−３のＬＳＥＣｔｉｎとの結合を遮断することを示す。図４Ｃおよび４Ｄは、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ヒトＬＡＧ−３のガレクチン−３との結合を遮断することを示す。
【０２０９】
４．４  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験したＬＡＧ−３の結合速度論親和性
抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋを使用するＳＰＲアッセイによって、ヒトＬＡＧ−３に対する親和性および結合速度論に関する特徴を調べた。ヤギ抗ヒトＦｃをセンサーチップ（ＣＭ５）に予め固定化し、抗ＬＡＧ−３抗体を、チップに注入した際に捕捉した。種々の濃度のヒトＬＡＧ−３タンパク質およびランニングバッファーを、結合相３００秒の間、センサーチップの中に流速３０μＬ／分で流し、その後３６００秒間解離させた。結合曲線（Ｋｏｎ）および解離曲線（Ｋｏｆｆ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィットさせた。平衡解離定数（ＫＤ）は、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比から計算される。表４Ａおよび４Ｂは、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３のヒトＬＡＧ−３に対する親和性、およびマウスＬＡＧ−３に対する親和性を示す。
【０２１０】
【表４Ａ】
2021518166.tif 000007
【０２１１】
【表４Ｂ】
2021518166.tif 000008
【０２１２】
４．５  ＦＡＣＳによって試験した細胞表面ＬＡＧ−３分子に対するＬＡＧ−３抗体の結合親和性
細胞表面ＬＡＧ−３に対する抗体結合親和性をＦＡＣＳ分析によって測定した。ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞を、９６ウェルＵ底プレートに５×１０５個／ｍｌの密度で移した。試験抗体を洗浄バッファー（１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）中で連続希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。二次抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ（３．５モルＦＩＴＣ／モルＩｇＧ）を添加し、４℃の暗所で０．５時間インキュベートした。次に細胞を１回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再浮遊させ、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光強度を、定量的ビーズ（ＱｕａｎｔｕｍＴＭ  ＭＥＳＦ  Ｋｉｔｓ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）に基づいて結合分子／細胞に変換する。表５Ａおよび５Ｂは、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７、Ｗ３３９−ＢＭＫ８）と比較した場合の、異なるバッチの実験における細胞表面のヒト、カニクイザル、およびマウスＬＡＧ−３に対するＷ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３の親和性を示す。
【０２１３】
【表５Ａ】
2021518166.tif 000009
【０２１４】
【表５Ｂ】
2021518166.tif 000010
【０２１５】
４．６  ヒトＣＤ４に対する交差反応性
ヒトＣＤ４に対する交差反応性をＥＬＩＳＡによって測定した。プレートを１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ４によって４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、１μｇ／ｍｌのＬＡＧ−３抗体をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、その後ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰと共に４５分間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、呈色反応を２Ｍ  ＨＣｌによって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して読み取った。このアッセイは、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３がヒトＣＤ４に対して交差反応性がないことを示している（図５Ａおよび５Ｂ）。
【０２１６】
４．７  Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８に対するエピトープビニング
ＬＡＧ−３抗体の結合エピトープを、ＦＡＣＳアッセイによってベンチマーク抗体Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８に対してビニングした。手短には、０．３μｇ／ｍｌのビオチン化Ｗ３３９−ＢＭＫ１を、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１３、またはＷ３３９−ＢＭＫ１  Ａｂの連続希釈液と予め混合した後、混合物をヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞と共に１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−ＰＥ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）を使用して、ベンチマーク抗体の細胞との結合を検出した。同様に、Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８に対するビニング試験を上記のように実施した（ビオチン化Ｗ３３９−ＢＭＫ７およびＷ３３９−ＢＭＫ８は１μｇ／ｍｌで使用した）。ＭＦＩをフローサイトメトリーによって評価し、ＦｌｏｗＪｏによって分析した。図６は、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３がそれぞれ、Ｗ３３９−ＢＭＫ１（図６Ａ）、Ｗ３３９−ＢＭＫ７（図６Ｂ）、およびＷ３３９−ＢＭＫ８（図６Ｃ）とは異なるエピトープビンを有することを示している。
【０２１７】
４．８  エピトープマッピング
ヒトＬＡＧ−３に関するアラニンスキャニング実験を行って、抗体結合に対するその効果を評価した。ヒトＬＡＧ−３上のアラニン残基をグリシンコドンに変異させて、他のすべての残基（システイン残基を除く）をアラニンコドンに変異させた。ヒトＬＡＧ−３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の各々の残基に関して、２つの連続的ＰＣＲステップを使用して点アミノ酸置換を行った。ヒトＬＡＧ−３のＥＣＤドメイン１およびドメイン２ならびにＣ末端ｍＦＣタグをコードするｐｃＤＮＡ３．３−ＬＡＧ−３−Ｄ１２．ｍＦＣプラスミドを鋳型として使用して、一組の変異誘発プライマーを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅライトニングマルチサイト特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して第１ステップＰＣＲのために使用した。変異体鎖合成反応の後に、Ｄｐｎ  Ｉエンドヌクレアーゼを使用して親鋳型を消化した。第２ステップＰＣＲにおいて、ＣＭＶプロモーター、ＬＡＧ−３の細胞外ドメイン１およびドメイン２（Ｄ１２）、ｍＦｃ−タグおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリアデニル化で構成される線形のＤＮＡ発現カセットを増幅し、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）において３７℃で一過性に発現させ、プロテインＡ−ＨＰＬＣおよびｍＦＣ−ＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ、ＵＳＡ）によって定量した。モノクローナル抗体Ｗ３３９６−Ｒ２−２および３  ＢＭＫ  Ａｂ（すなわち、Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７、Ｗ３３９−ＢＭＫ８）（２μｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡ結合アッセイのためにプレートにコーティングした。定量したＬＡＧ−３変異体またはヒトＬＡＧ−３−ＥＣＤ．Ｄ１２．ｍＦＣタンパク質を含有する上清と相互作用させた後、ＨＲＰコンジュゲート抗ｍＦＣ抗体（１：５０００；ＢｅｔＨｙｌ、ＵＳＡ）を検出抗体として添加した。対照変異体の平均値に従って吸光度を正規化した。追加のカットオフを結合の変化倍率（＜０．７５）に設定後、最終的に決定されたエピトープ残基を同定した。
【０２１８】
結果は、ＬＡＧ−３が、４２２アミノ酸（Ｖ２９〜Ｌ４５０）の細胞外ドメインを有することを示し、ドメイン１の１３２アミノ酸（Ｇ３７〜Ｑ１６８）を、エピトープマッピングのためにアラニンスキャニング実験において実施した。既存のＬＡＧ−３構造がないことから、ＬＡＧ−３（アミノ酸：３１〜４３１）の構造を、ミエリン関連糖タンパク質（ＰＤＢ：５ＦＬＵ、配列同一性１８％）の公知の構造に基づいてモデルとした。アラニンスキャニング結果に基づいて、ホットスポットを、表６Ａ〜６Ｄおよび図１２Ａ〜１２Ｅに示すように同定した。結論すると、ＬＡＧ−３は、４２２アミノ酸（Ｖ２９〜Ｌ４５０）の細胞外ドメインを有し、ドメイン１の１３２アミノ酸（Ｇ３７〜Ｑ１６８）を、エピトープマッピングのためにアラニンスキャニング実験において実施した。配列同一性がわずか１８％であることから、モデルおよび表示のホットスポットは単なる参照である。ＢＭＫ  Ａｂの中では、Ｗ３３９−ＢＭＫ１（ＢＭＳ）が、本発明者らのエピトープマッピング結果と一致するそのエピトープを主張した。Ｗ３３９−ＢＭＫ１／ＢＭＫ７様Ａｂの１つの特徴は、エクストラループ（Ｇ７０〜Ｙ９９）に属するＷ９２に結合することであるが、Ｗ３３９−ＢＭＫ８様ＡｂはＬ１３４〜Ｐ１３８領域に結合する。Ｗ３３９６−Ｒ２−２は、Ｗ３３９−ＢＭＫ８様Ａｂに属するが、Ｗ３３９６−Ｒ２−２はユニークエピトープ、すなわちＶ１０４に結合し、これは３つの試験したベンチマーク抗体では見られない。
【０２１９】
【表６Ａ】
2021518166.tif 000011
【０２２０】
【表６Ｂ】
2021518166.tif 000012
【０２２１】
【表６Ｃ】
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【０２２２】
【表６Ｄ】
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【０２２３】
４．９  リポーター遺伝子アッセイにおけるヒトＬＡＧ−３抗体の効果
ヒトＬＡＧ−３およびＩＬ−２ルシフェラーゼリポーター遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ）を安定に同時トランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を実験室内で調製した。細胞を、Ｒａｊｉ細胞と共にブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ＥＴ４０４）の存在下で９６ウェルプレートに播種した。試験抗体の連続希釈液を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。インキュベーション後、復元したルシフェラーゼ基質を添加し、ルシフェラーゼ強度をマイクロプレート分光光度計によって測定した。図７Ａ〜７Ｂに示すデータは、Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７、Ｗ３３９−ＢＭＫ８）のものと同等であるかまたはそれより良好なＥＣ５０で、ＲＧＡアッセイにおけるＩＬ−２経路活性を増強することを示している。
【０２２４】
４．１０  ヒト同種異系リンパ球混合反応に及ぼすヒトＬＡＧ−３抗体の効果
ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ密度勾配遠心を使用して健康なドナーから新たに単離した。ヒト単球濃縮キットを使用して、製造元の説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ｂｉｏｔｅｃ−１３０−０５０−２０１）に従って単球を単離した。単球を、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）およびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ）を含有する培地中で５〜７日間培養し、未成熟な樹状細胞（ｉＤＣ）を生成した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キットを使用して、製造元のプロトコール（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１９０５２）に従って単離した。同種異系ｉＤＣと同時培養した精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、種々の濃度のＬＡＧ−３抗体と共に９６ウェルプレートにおいてインキュベートした。５日目に、培養上清をＩＦＮ−γ試験のために回収した。ヒトＩＦＮ−γを、マッチさせた抗体対を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。組換えＩＦＮ−γを標準物質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）として使用した。プレートを、ヒトＩＦＮ−γに対して特異的な捕捉抗体（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｍ７００Ａ）によって予めコーティングした。ビオチンコンジュゲート抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｍ７０１Ｂ）を、検出抗体として使用した。結果は、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３が、ＭＬＲアッセイにおいてＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７、Ｗ３３９−ＢＭＫ８）より強力であることを示している（図８Ａ）。別のアッセイでは、アイソタイプ対照と比較すると、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−２は、ヒトＴ細胞ＩＦＮ−γ分泌を約５０％促進し、その効力はＢＭＫ  Ａｂ（Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９−ＢＭＫ７、Ｗ３３９−ＢＭＫ８）と同等である（図８Ｂ）。
【０２２５】
４．１１  ＡＤＣＣ
ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞および種々の濃度のＬＡＧ−３抗体を９６ウェル丸底プレートにおいて３０分間プレインキュベートし、次いでエフェクターとしてのＰＢＭＣをエフェクター／標的比５０：１で添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４時間維持した。標的細胞の溶解を、ＬＤＨに基づく細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ−１１６４４７９３００１）によって決定した。４９２ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して読み取った。ハーセプチンおよびＨＥＲ２発現細胞株ＳＫ−Ｂｒ−３を、陽性対照として使用した。Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３  Ａｂは、ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘導しない（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０２２６】
４．１２  ＣＤＣ試験
ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞および種々の濃度のＬＡＧ−３抗体を、９６ウェル丸底プレートにおいて混合した。ヒト補体を１：５０の最終希釈で添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２時間維持した。標的細胞溶解は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定した。マイクロプレートリーダーを使用して発光を読み取った。リツキシマブおよびＣＤ２０発現細胞株Ｒａｊｉを陽性対照として使用した。Ｗ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、およびＷ３３９６−Ｒ２−１３は、ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞に対してＣＤＣ効果を誘導しない（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０２２７】
４．１３  血清安定性試験
Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３を、新たに単離したヒト血清（血清含有量＞９５％）中、３７℃でインキュベートした。表記の時点（０日目、１日目、４日目、７日目、および１４日目）で、血清処置したサンプルのアリコートをインキュベーターから採取して、液体窒素Ｎ２中で瞬間凍結し、試験の準備ができるまで−８０℃で保存した。サンプルはすべて安定性試験の前に急速解凍した。ヒトＬＡＧ−３トランスフェクト細胞を、倍希釈して血清処置したＷ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３と共に４℃で１時間インキュベートした。ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−１３の細胞との結合を検出した。細胞のＭＦＩを、フローサイトメトリーによって測定し、ＦｌｏｗＪｏによって分析した。結果は、Ｗ３３９６−Ｒ２−１（図１１Ａ）およびＷ３３９６−Ｒ２−１３（図１１Ｂ）が、ヒト血清安定性試験において安定であることを示している。
【０２２８】
４．１４  示差走査蛍光光度（ＤＳＦ）アッセイによる熱安定性
ＤＳＦアッセイを、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７  Ｆｌｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。手短には、抗体溶液１９μＬを６２．５×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬと混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添加した。プレートを、２６℃から９５℃に２℃／分の速度で加熱し、得られた蛍光データを収集した。異なる温度に関する蛍光変化の負の導関数を計算し、最大値を、融解温度Ｔｈとして定義した。タンパク質が複数の変性転移を有する場合、最初の２つのＴｈを報告し、Ｔｍ１およびＴｍ２と名付けた。Ｔｍ１は、異なるタンパク質間の比較のための融解温度Ｔｍである。データ収集およびＴｈ計算は、操作ソフトウェア（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）リアルタイムＰＣＲ  ＰＣＲソフトウェアｖ１．３）によって自動的に実施した。異なるバッファー中のＷ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９６−Ｒ２−１３のＴｍ１およびＴｍ２値を表７に示す。
【０２２９】
【表７】
2021518166.tif 000015
【０２３０】
４．１５  マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態（ＰＫ）調査
試験抗体のＰＫ調査をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて実施した。６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）を調査に使用した。
【０２３１】
動物３０匹（１０匹／群）を３つの群に分けた：群１、群２および群３。動物に、Ｗ３３９−ＢＭＫ１、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−２をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射によって１回投与した。ＡｂはＰＢＳ中で製剤化した。ＰＫ血液サンプルを投与前、０．３時間、２時間、６時間、２４時間、Ｄ２（４８時間）、Ｄ４（９６時間）、Ｄ７（１４４時間）、Ｄ１０（２４０時間）、Ｄ１４（３１２時間）、Ｄ２１（４８０時間）に収集した。血清サンプル中のＷ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−２の血清中濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。注射日を０日目と見なした。調査における動物の取り扱い、ケアおよび処置に関連する手段はすべて、国際実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスによる、生物モデルの実験動物の管理と使用に関する施設内委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインに従って実施した。
【０２３２】
マウスにおけるＷ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９−ＢＭＫ１の血清中濃度を、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（バージョン６．３、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用することによってノンコンパートメント薬物動態解析に供した。
【０２３３】
調査の間、有害事象は観察されなかった。
【０２３４】
ＰＫパラメータの概要を表８および図１３に記載した。結果は、Ｗ３３９６−Ｒ２−２およびＷ３３９−ＢＭＫ１がマウスにおいて類似のＰＫプロファイルを示すことを示す。
【０２３５】
【表８】
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【０２３６】
４．１６  ナイーブの雄性および雌性カニクイザルにおけるＷ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−２の１回投与調査
４匹のナイーブカニクイザルは、Ｈａｉｎａｎ  Ｊｉｎｇａｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄから供給された。体重は、雄性サルに関して２．４６〜２．７２ｋｇ、雌性サルに関して２．５０〜２．５８ｋｇの範囲であった。
【０２３７】
動物４匹（２匹／群）を２群に分けた：群１および群２。群１および群２の動物にそれぞれ、Ｗ３３９６−Ｒ２−１およびＷ３３９６−Ｒ２−２を３０ｍｇ／ｋｇで１回、３０分間の静脈内注入によって投与した。製剤はＰＢＳ中で製剤化した。ＰＫ血液サンプルを投与前、０．２５時間、１時間、４時間、８時間、２４時間、Ｄ３（４８時間）、Ｄ５（９６時間），Ｄ７（１４４時間）、Ｄ９（１９２時間）、Ｄ１１（２４０時間）、Ｄ１４（３１２時間）、Ｄ２１（４８０時間）、Ｄ２８（６４８時間）に収集した。抗薬物抗体（ＡＤＡ）サンプルを投与前、Ｄ１４、およびＤ２８に収集した。血清サンプル中のＷ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２、およびＡＤＡの血清中濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。血液学および臨床科学試験のサンプルを、投与前、２４時間、３日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目に収集した。
【０２３８】
全身健康および外観のケージ越しの観察、特に皮膚の刺激感を観察した。血液学（ＣＢＣ）に関する全血サンプル分析および化学物質検出に関する血清分析をそれぞれ、血液学分析器（ＡＤＶＩＡ２１２０）および化学物質分析器（ＨＩＴＡＣＨＩ  ７１８０）によって決定した。
【０２３９】
ＰＫのために血液およそ１．０ｍＬおよび抗薬物抗体（ＡＤＡ）のために血液１．０ｍＬを、各時点で、各調査動物から腹腔静脈または伏在静脈を介して収集した。各サンプル収集の実際の時間を記録した。すべてのサンプリング時間が許容された（サンプリング時間の変動は、投与前または投与後１時間の時点で１分未満であり、投与後１時間より後で名目時間の５％未満であった）。血液サンプルはすべて、ポリマーシリカ活性化因子を含有する市販のチューブに移した。血液サンプルを含有するチューブを室温で１時間以内放置した後、遠心分離した（血清が出現するまで）。血液サンプルをおよそ４℃、２０００ｇで２０分間遠心分離することによって、血清サンプルを調製した。血清サンプルはすべて、ドライアイス上で急速に凍結し、ＥＬＩＳＡ分析まで−６０℃以下で維持した。
【０２４０】
調査における動物の取り扱い、ケア、および処置に関連する手順はすべて国際実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスによる、ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃ（Ｓｕｚｈｏｕ）の実験動物の管理と使用に関する施設内委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインに従って実施した。
【０２４１】
サルにおけるＷ３３９６−Ｒ２−１、Ｗ３３９６−Ｒ２−２の血清中濃度を、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（バージョン６．３、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用することによってノンコンパートメント薬物動態解析に供した。ＰＫパラメータを得るために線形／対数台形則を適用した。すべてのＢＬＱ値をＰＫパラメータの計算から除外した。すべての血清中濃度および薬物動態パラメータは、３桁の有効数字で報告した。個々のＢＬＱは、平均濃度の計算から除外した。名目上の用量レベルおよび名目上のサンプリング時間を、すべての薬物動態パラメータの計算に使用した。
【０２４２】
結果は、調査の間に副作用が観察されなかったことを示している。飼料の消費および体重に明白な変化はなかった。血液学、ならびにＡＳＴ、ＡＬＴ、ＷＢＣ、ＨＧＢおよびＨＣＴを含む臨床化学パラメータは、一般的に参照範囲内である（データは示していない）。ＰＫパラメータの要約を表９および図１４に記載する。血液中のＡＤＡ力価を表１０に要約する。結論すると、Ｗ３３９６−Ｒ２−２は、サルにおいて約２１２時間の良好なＴ１／２を示す。Ｗ３３９６−Ｒ２−２のＡＤＡ力価は、サルにおいてＷ３３９６−Ｒ２−１の力価より低い。
【０２４３】
【表９】
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【０２４４】
略語
【０２４５】
【表Ａ】
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【０２４６】
【表１０】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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