(57)【要約】  本開示は、代謝を調節するマイクロＲＮＡの活性を阻害する薬剤を投与することにより、代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のｍｉＲ−２２阻害剤の投与を必要とする対象に、有効量のｍｉＲ−２２阻害剤を投与することを含む、代謝障害を治療又は予防する方法。
【請求項２】
前記阻害剤の投与後の前記対象においてｍｉＲ−２２の発現及び／又は活性が低減される、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲ−２２阻害剤がオリゴヌクレオチド系阻害剤である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が、ｍｉＲ−２２の成熟配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の相補性を有する配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤がデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が一本鎖である、請求項３〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が二本鎖である、請求項３〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が１又は複数の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項３〜請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記化学修飾ヌクレオチドがＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が、約２５個以下、約２０個以下、約１５個以下、約１０個以下、約９個以下、約８個以下、約７個以下、約６個以下、又は約５個以下のヌクレオチドを含む、請求項３〜請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が１又は複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に結合している、請求項３〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項３〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項３〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチド系阻害剤がアプタマーである、請求項３〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲ−２２阻害剤がペプチド系阻害剤又はタンパク質系阻害剤である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質系阻害剤が抗体又はその抗原結合部分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍｉＲ−２２阻害剤が小分子系阻害剤である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記代謝障害が肥満症である、請求項１〜請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象がプラダー・ウィリー症候群に罹患している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が高コレステロール血症に罹患している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）のバリアントを有している、並びに／又は、ＦＴＯの発現及び／若しくは活性のアップレギュレーションを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が肥満であり、肥満度指数が約３０超である、請求項１８〜請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が過体重であり、肥満度指数が約２５〜２９．９である、請求項１８〜請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
体重減少を誘発する、請求項１８〜請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象において約１％以上、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、又は約２５％以上の総体重減少を誘発する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
体重増加を予防する、請求項１８〜請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
脂肪組織の増殖を低減又は予防する、請求項１８〜請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
脂肪細胞分化を障害する、請求項１８〜請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記代謝障害が脂肪性肝疾患である、請求項１〜請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂肪性肝疾患が、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
脂肪肝を低減又は予防する、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
肝線維症を低減又は予防する、請求項２９〜請求項３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）、ＡＬＫＢホモログ５（ＡＬＫＢＨ５）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰα）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、ＰＰＡＲγコアクチベーターα（ＰＧＣ１−α）、特異性タンパク質１（ＳＰ１）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）、ＤＮＡ損傷包含転写物４（ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｉｎｃｌｕｄｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４）（ＤＤＩＴ−４、ＲＥＤＤ１）、腫瘍タンパク質ｐ６３（ＴＰ６３）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、及び／又はメチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）の活性及び／又は発現を低減する、請求項１〜請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）及び／又はｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）の活性及び／又は発現を増強する、請求項１〜請求項３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／６４２，９３４号の利益とそれに基づく優先権を主張するものであり、当該米国仮特許出願はその内容全体が参照によって本明細書に援用されるものとする。
【０００２】
開示の分野
本開示は、マイクロＲＮＡの活性又はマイクロＲＮＡの発現を調節する薬剤を投与することによる、代謝障害の治療及び予防に関する。
【０００３】
電子ファイルで提出されたテキストファイルの説明
本願で電子ファイルで提出されたテキストファイルの全内容は参照によって本明細書に援用される：コンピュータで読み取り可能な書式の配列表コピー（ファイル名：ＢＩＤ−００５ＰＣ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；作成日：２０１９年３月１４日；ファイルサイズ：３２３，９７６バイト）。
【背景技術】
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ）は、標的遺伝子の発現を調節する核酸分子である。ｍｉＲＮＡは通常は短く（通常１８〜２４ヌクレオチド）、ｍｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡの配列が完全相補である場合は標的ｍＲＮＡの分解を促進することによって、且つ／又は、ｍｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡの配列がミスマッチを含む場合は翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡの抑制因子として働く。ｍｉＲＮＡの機能解析により、これらの低分子ノンコーディングＲＮＡが、代謝障害関連遺伝子の調節をはじめとした、様々な生理的及び代謝的プロセスに寄与していることが明らかとなっている。代謝障害は、身体の代謝機能における１又は複数の異常を特徴とする。代謝障害はまた、肥満症と体重増加、インスリン産生の欠乏、又はインスリン感受性の欠陥を特徴とする。いくつかの代謝障害は身体による血糖使用の異常と関係があり、異常に高い血糖値をもたらす。代謝障害は世界中で数百万人に発症しており、生命を脅かす障害にもなり得る。合衆国で肥満症の発生は増加の一途を辿っており、健康リスクを低減し、肥満症、過食、過剰な体重増加、又は過剰な脂肪蓄積と関連した症状を改善する、より効果的な治療法の開発が強く求められている。したがって、代謝障害を治療する、予防する、又はその発症を遅延するための、方法及び組成物が求められている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、マイクロＲＮＡの活性又は発現を調節する薬剤を投与することによる、例えばマイクロＲＮＡの発現及び／又は活性を阻害することによる、代謝障害を治療又は予防するための新規方法を提供する。このような阻害は、配列特異的な化学修飾オリゴヌクレオチドを介して行うことができ、例えば、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。ＬＮＡ技術に基づいた阻害剤は、特に本明細書で開示される代謝関連遺伝子を制御しているｍｉＲＮＡを標的とする場合、代謝障害を治療又は予防する効果的な方法を可能にする。
【０００６】
一つの態様において、本開示は、有効量のｍｉＲ−２２阻害剤の投与を必要とする対象に、有効量のｍｉＲ−２２阻害剤を投与することを含む、代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、上記阻害剤の投与後の対象においてｍｉＲ−２２の発現及び／又は活性が低減される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤はオリゴヌクレオチド系阻害剤である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は、ｍｉＲ−２２の成熟配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤はデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は一本鎖である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は二本鎖である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は１又は複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、化学修飾ヌクレオチドはＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は、約２５個以下、約２０個以下、約１５個以下、約１０個以下、約９個以下、約８個以下、約７個以下、約６個以下、又は約５個以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は、１又は複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分に結合している。
【００１２】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤はアプタマーである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤はペプチド系阻害剤又はタンパク質系阻害剤である。いくつかの実施形態では、タンパク質系阻害剤は抗体又はその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は小分子系阻害剤である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、代謝障害は肥満症である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、対象はプラダー・ウィリー症候群に罹患している。
【００１６】
いくつかの実施形態では、対象は高コレステロール血症に罹患している。
【００１７】
いくつかの実施形態では、対象は、脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ；ｆａｔ  ｍａｓｓ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のバリアントを有しており、並びに／又は、ＦＴＯの発現及び／若しくは活性のアップレギュレーションを示す。
【００１８】
いくつかの実施形態では、対象は肥満であり、肥満度指数が約３０超である。いくつかの実施形態では、対象は過体重であり、肥満度指数は約２５〜２９．９である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、上記方法は体重減少を誘発する。いくつかの実施形態では、上記方法は、対象において約１％以上、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、又は約２５％以上の総体重減少を誘発する。いくつかの実施形態では、上記方法は体重増加を予防する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪組織の増殖を低減又は予防する。いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪細胞分化を障害する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、代謝障害は脂肪性肝疾患である。いくつかの実施形態では、脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される。いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪肝（ｌｉｖｅｒ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）を低減又は予防する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、上記方法は肝線維症を低減又は予防する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、上記方法は、ＦＴＯ、ＡＬＫＢホモログ５（ＡＬＫＢＨ５）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰα）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、及び／又はＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）の活性及び／又は発現を低減する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、上記方法は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）及び／又はｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）の活性及び／又は発現を増強する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、上記方法は、ＰＰＡＲγコアクチベーターα（ＰＧＣ１−α）、特異性タンパク質１（ＳＰ１）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）、ＤＮＡ損傷包含転写物４（ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｉｎｃｌｕｄｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４）（ＤＤＩＴ−４、ＲＥＤＤ１）、腫瘍タンパク質ｐ６３（ＴＰ６３）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、及び／又はメチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）の活性及び／又は発現を変化させる。いくつかの実施形態では、上記方法は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのメチル化レベルを変化させるか、又はＲＮＡレベルでｍ６Ａのレベルに影響を与える。
【００２６】
本明細書に記載のいずれの態様又は実施形態も、本明細書において開示されるいずれの他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含んでいる。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１ＣはｍｉＲ−２２の制御プロファイルを示す模式図である。図１Ａは、ノンコーディング転写物ＭＧＣ１４３７６の第３エクソンにおけるｍｉＲ−２２の位置を示す模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＰＴＥＮを標的とするｍｉＲＮＡを示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｍｉＲ−２２がＰＴＥＮ及びＴＥＴを直接標的とし、腫瘍形成及び転移を促進することを示している。
【００２９】
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｄは、ｍｉＲ−２２の過剰発現がマウスの体重に影響を与えることを示している。図２Ａは、野生型（ＷＴ）マウス及びトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの給餌法を示す写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＷＴマウス肝臓及びｍｉＲ−２２Ｔｇマウス肝臓の免疫組織化学染色である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＷＴマウス及びｍｉＲ−２２Ｔｇマウスの平均体重を示すグラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＷＴマウスコロニー及びｍｉＲ−２２Ｔｇマウスコロニーの平均体重を示す棒グラフである。これらのデータは、ｍｉＲ−２２の過剰発現がマウスの体重に影響を与えることを示している。各データペアの右側（赤色）のデータバーは、ｍｉＲ−２Ｔｇマウスを用いた場合についてのものである。
【００３０】
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｃは、ｍｉＲ−２２ヌルマウスが高脂肪食（ＨＦＤ；ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ）下で体重増加できないことを示す一対の棒グラフ及び線グラフである。図３Ａは、ＨＦＤ下で２週間後のコロニー全体における体重増加率を示している。
【図３Ｂ】図３ＢはＨＦＤ下で４週間後のコロニー全体における体重増加率を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＨＦＤの開始後第１週〜第８週までのＫＯ及びＷＴにおける変化量（グラム）を示している。
【００３１】
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｆは、ｍｉＲ−２２ヌルマウスがＨＦＤ下で体重増加できないことを示す一連の棒グラフである。図４Ａは、ＨＦＤ下２週間後の雌マウスにおける体重増加率を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＨＦＤ下４週間後の雌マウスにおける体重増加率を示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＦＤ下８週間後の雌マウスにおける体重増加率を示している。
【図４Ｄ】図４Ｄは、２週間後のＫＯマウス及びＷＴマウスにおける変化量（グラム）を示している。
【図４Ｅ】図４Ｅは、４週間後のＫＯマウス及びＷＴマウスにおける変化量（グラム）を示している。
【図４Ｆ】図４Ｆは、８週間後のＫＯマウス及びＷＴマウスにおける変化量（グラム）を示している。
【００３２】
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｄは、ｍｉＲ−２２ヌルマウスが、ＨＦＤを給餌された場合、ＷＴと比較して異なる代謝を示すことを示す一連のグラフである。図５Ａは、ＨＦＤ前（０日目）及びＨＦＤ下８週間後の、ｍｉＲ−２２ＫＯマウス及びＷＴマウスの、体脂肪量の割合及び除脂肪量の割合（図５Ｂ）（総体重に対する％）を示している。ｍｉＲ−２２ＫＯコホートは、ＨＦＤ下８週間後のＷＴコホートと比較して、統計的に有意に低い体脂肪量を有する。ＨＦＤ後に体脂肪量（％）を増加させ、除脂肪量（％）を減少させているＷＴコホートとは異なり、ｍｉＲ−２２ＫＯコホートの除脂肪量はＨＦＤによる影響を受けていない。
【図５Ｂ】同上
【図５Ｃ】図５Ｃ及び図５Ｄは代謝ケージで収集された一連のパラメーターを示している。定常状態では、ｍｉＲ−２２ＫＯマウス及びＷＴマウスは共に同じ代謝を示している。上記マウスをＨＦＤに曝すと、ｍｉＲ−２２ＫＯコホートはエネルギー消費を減らさずにすむが、一方、ＷＴコホートはエネルギー消費を減らしている。ＫＯマウスはＷＴマウスよりも活動性が低いが、ＷＴコホートと比較してｍｉＲ−２２ＫＯコホートにおいて、ＶＣＯ２及びＶＯ２がいずれも有意に高い。図５Ｃと図５Ｄの各棒グラフの右側（赤色）のデータバーは、ｍｉＲ−２２ＫＯマウスを用いた場合についてのものである。
【図５Ｄ】同上
【００３３】
【図６】図６は、ＷＴコホートとＫＯコホートとの間で摂食量（ＨＦＤ）に差異がないことを示す棒グラフである。
【００３４】
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｂは、ｍｉＲ−２２のダウンレギュレーションによって、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）の、脂肪細胞に分化する能力が障害されることを示す棒グラフ及びオイルレッドＯ染色である。図７Ａは、ＭＥＦにおける脂肪細胞分化を示す棒グラフであり、ＷＴ  ＭＥＦと比較して、ｍｉＲ−２２−／−ＭＥＦが示す脂肪細胞が２７％少ないことを表している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、脂肪細胞分化用培地中で５日間培養された、ＷＴ、ｍｉＲ−２２＋／−、及びｍｉＲ−２２−／−からのＭＥＦを示すオイルレッドＯ染色である。
【００３５】
【図８】図８は、抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡの設計を示している。
【００３６】
【図９】図９は、ビヒクル（ＶＣＨ）、スクランブルコントロールＲＮＡ（ＳＣＲ）、及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）でのトランスフェクションの後、ＨＦＤ処置を行ったｍｉＲ−２２−／−マウス及びＷＴマウスについての、インビボ実験計画及び条件を示す絵図である。
【００３７】
【図１０】図１０は、（△）ビヒクル、（◇）ＳＣＲ、（□）抗ｍｉＲ−２２について、処置マウスと非処置マウスの摂食量に差異がないことを示す棒グラフである。
【００３８】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｂは、インビボにおけるｍｉＲ−２２の薬理学的阻害が、マウスが肥満になることを予防することを示す線グラフである。図１１Ａは、最終的な体重増加率を示している。図１１Ｂは、インビボにおける、食事性肥満（ＤＩＯ）マウスのｍｉＲ−２２のサイレンシングを示している。両方の図面の最終時点において、データの順番は、上から下に、ビヒクル（緑色）、ＳＣＲ（赤色）、及び抗ｍｉＲ−２２（青色）である。
【図１１Ｂ】同上
【００３９】
【図１２】図１２は、インビボでの抗ｍｉＲ−２２療法が肝臓における主要なｍｉＲ−２２標的のタンパク質レベルを増加させ得ることを示すウェスタンブロットである。
【００４０】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、抗ｍｉＲ−２２処置が、肝臓の脂質組成には影響を与えないが、脂肪肝を大いに抑制することを示す、一連の棒グラフ（図１３Ａ）及び免疫組織化学染色（図１３Ｂ）である。
【図１３Ｂ】同上
【００４１】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＶＨＬ、ＳＣＲ  ＬＮＡ、又は抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡで処置されたマウスの肝臓における相対的なｍＲＮＡレベルを示す一連の棒グラフである。図１４Ａは、ＴＥＴ２及びＰＴＥＮのｍＲＮＡ発現を示している。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＦＴＯ、ＦＴＯ、及びＣＥＢＰαのｍＲＮＡ発現を示している。
【００４２】
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＶＨＬ、ＳＣＲ  ＬＮＡ、又は抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡで処置されたマウスの褐色脂肪組織（ＢＡＴ）における相対的なｍＲＮＡレベルを示す一連の棒グラフである。図１５Ａは、ＴＥＴ２及びＰＴＥＮのｍＲＮＡ発現を示している。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＦＴＯ、ＣＥＢＰα、及びＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現を示している。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＵＣＰ１及びＣＤ３６のｍＲＮＡ発現を示している。
【００４３】
【図１６Ａ】図１６Ａ〜図１６Ｃは、ＶＨＬ、ＳＣＲ  ＬＮＡ、又は抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡで処置されたマウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）における相対的なｍＲＮＡレベルを示す一連の棒グラフである。図１６Ａは、ＴＥＴ２及びＰＴＥＮのｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＦＴＯ、ＣＥＢＰα、及びＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＵＣＰ１及びＣＤ３６の発現レベルを示す棒グラフである。
【００４４】
【図１７】図１７は、ｍｉＲ−２２−／−マウス及びＷＴマウスを、ＨＦＤ下に置いて抗ｍｉＲ−２２−ＬＮＡ、ＳＣＲ、及びＶＨＬで処置し、第二のＨＦＤ処置に置いたことを示している、治療アプローチの絵図である。
【００４５】
【図１８】図１８は、上記治療アプローチの結果を示す線グラフであり、それによると、既に肥満であった、ＨＦＤを給餌されたマウスにおいて有意な体重減少が見られる。治療の３．５か月後、ＨＦＤを給餌された肥満マウス（平均体重４０ｇ超）において、有意な体重減少が確認された。マウスを屠殺し、組織を摘出し、肝臓から得たＲＮＡをＲＮＡｓｅｑに用いた。
【００４６】
【図１９Ａ】図１９Ａ〜図１９Ｃは、ｍｉＲ−２２の薬理学的阻害がマウスの肥満表現型を戻していることを示す、３枚の写真である。図１９Ａは、ＶＨＬで処置されたマウスから得られた脂肪パッドを示している。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、抗ｍｉＲ−２２で処置されたマウスから得られた脂肪パッドを示している。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ＳＣＲで処置されたマウスから得られた脂肪パッドを示している。
【００４７】
【図２０】図２０は、マウス肝臓からの階層クラスター分析を示すＲＮＡシークエンシングプロットであり、ｍｉＲ−２２の薬理学的阻害と遺伝子ノックアウト（ＫＯ）とが密集していることを示しており、これは、処置がオンターゲットで行われていることと、ＬＮＡコンストラクトを用いることでＫＯ表現型を模倣できることを示している。
【００４８】
【図２１】図２１は、マウス肝臓における遺伝子オントロジー解析を示すＲＮＡシークエンシングプロットであり、ＫＯマウス及びＬＮＡ処置マウスにおけるトップダウンの被調節経路が、脂質の代謝及び生合成に関連したものであることを示している。
【００４９】
【図２２】図２２は、インビボにおける抗ｍｉＲ−２２療法がＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）を強くダウンレギュレートすることを示すウェスタンブロットである。インビボにおける抗ｍｉＲ−２２療法によってＡＣＬが強くダウンレギュレートされている。
【００５０】
【図２３】図２３は、ｍｉＲ−２２の薬理学的阻害が、ＭＥＦの脂肪細胞分化を障害するのに有効であることを示す、オイルレッドＯ染色である。
【００５１】
【図２４Ａ】図２４は、抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡの存在下又は非存在下で、脂肪細胞分化用培地中で２週間培養されたヒト初代間葉系細胞における、抗ｍｉＲ−２２処置を示すオイルレッドＯ染色（図２４Ａ）及び棒グラフ（図２４Ｂ）である。導入試薬非補助下の取り込み（ｕｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）で、５００ｎＭ（ＬＮＡは２日毎に加えた）とした。図２４Ｂで、各棒グラフの右側（赤色）のデータバーは、ＬＮＡ＃１０処理細胞を用いた場合についてのものである。
【図２４Ｂ】同上
【００５２】
【図２５】図２５は、ｍｉＲ−２２の薬理学的阻害が、ＭＥＦの脂肪細胞分化を障害するのに有効であることを示す、棒グラフである。棒グラフ内のデータの順番は、左から右に、凡例（グラフの右側）を上から下に読んだ場合に対応している。
【００５３】
【図２６】図２６は、ｍｉＲ−２２がとりまとめる代謝ネットワークを模式的に表している。ｍｉＲ−２２は代謝に関与する因子を（直接的又は間接的に）複数同時に標的とすることができる。
【００５４】
【図２７Ａ】図２７Ａ〜図２７Ｂは、脂肪分化誘導の際に、脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）の発現が、ｍｉＲ−２２欠損ＭＥＦでは大きくダウンレギュレートされているが、ＷＴ  ＭＥＦではダウンレギュレートされていないことを示している。図２７Ａは、ＦＴＯ遺伝子を表している。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、定常状態及び分化用培地の条件下での、ＦＴＯ  ｍＲＮＡの発現レベルを示す棒グラフである。図２７Ｂにおいて、棒グラフ内のデータの順番は、左から右に、ＷＴ（黒色）、ｍｉＲ−２２＋／−（灰色）、及びｍｉＲ−２２−／−（青色）である。
【００５５】
【図２８Ａ】図２８Ａ〜図２８Ｄは、ｍｉＲ−２２のダウンレギュレーション（遺伝子的又は薬理学的）がＲＮＡ  ｍ６Ａレベルを増加させることを示している。図２８Ａは、化学反応を示している。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、ＨＦＤ下のマウスにおけるｍ６Ａレベルの割合及び相対量を示す棒グラフである。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、ＨＦＤ下のマウスにおけるｍ６Ａレベルの割合及び相対量を示す棒グラフである。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、ＨＦＤ下のマウスにおけるｍ６Ａレベルの割合及び相対量を示す棒グラフである。
【００５６】
【図２９】図２９は、２か月齢マウス（ｎ＝８）において、ｍｉＲ−２２の遺伝子的な欠乏が肝機能に影響を与えていないことを示す、一連の免疫組織化学画像である。
【００５７】
【図３０】図３０は、老齢時に、ｍｉＲ−２２の遺伝子的な欠乏が肝機能に影響を与えていないこと、及び、ｍｉＲ−２２ＫＯマウスが肝臓関連の疾患も機能障害も示していないことを示す、一連の免疫組織化学画像である。
【００５８】
【図３１】図３１は、抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡ処置が食事性肥満マウスにおいて脂肪肝を予防していることを示す、一連の免疫組織化学画像である。画像は１０倍の倍率である。
【００５９】
【図３２】図３２は、ｍｉＲ−２２の高発現及び低発現の肝線維症に対する影響を示す一連の免疫組織化学画像である。
【００６０】
【図３３Ａ】図３３Ａ〜図３３Ｃは、ｍｉＲ−２２の高発現が通常の飼料を給餌された場合の肝機能に影響を与えていることを示している。ＷＴマウスにおける脂肪肝及び肝線維症（図３３Ａ）。
【図３３Ｂ】ｍｉＲ−２２Ｔｇマウスにおける脂肪肝及び肝線維症（図３３Ｂ）。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、ＷＴマウス及びｍｉＲ−２２Ｔｇマウスにおける、通常食餌下のマウスから得られた肝臓における、ＦＳＰ−１陽性細胞を示している。
【００６１】
【図３４Ａ】図３４Ａ〜図３４Ｃは、ｍｉＲ−２２高発現が肝機能に影響を与えていることを示している。ＷＴ−マウスにおける脂肪肝及び肝線維症（図３４Ａ）。
【図３４Ｂ】ｍｉＲ−２２＋／−マウスにおける脂肪肝及び肝線維症（図３４Ｂ）。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、ＷＴマウス及びｍｉＲ−２２＋／−マウスにおける、ＨＦＤ下のマウスから得られた肝臓における、ＦＳＰ−１陽性細胞を示している。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本開示は、ｍｉＲ−２２をはじめとするｍｉＲＮＡが、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、非脂肪酸肝疾患（Ｎｏｎ−Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＮＡＦＬＤ）、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を包含する種々の代謝障害と関連がある標的を制御可能であるという発見に基づくものである。
【００６３】
本開示は、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、ＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨを包含する代謝障害などの、その病因が代謝調節によって影響を受け得る疾患の治療及び／又は予防のための、種々の阻害剤によるｍｉＲ−２２をはじめとするｍｉＲＮＡのターゲティングを包含する。
【００６４】
ｍｉＲ−２２は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）及びｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ（ＴＥＴ）を直接標的とすることで、腫瘍形成、転移及び代謝障害を増進する。ＰＴＥＮを標的とする６０種類を超えるｍｉＲＮＡと少なくとも３０種の新規の癌原遺伝子座がヒト癌で研究されている。ＰＴＥＮを標的とするｍｉＲＮＡは進化的に脊椎動物間で高度に保存されており、種々の組織で普遍的に発現されている（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ２００２；  Ｎｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＰＴＥＮの減少はワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起し、ＰＴＥＮの増加は抗ワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起するため、ｍｉＲ−２２は、ＰＴＥＮを標的とすることで、代謝において意味のある存在であり続けている。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２を標的とする遺伝子は、代謝と脂肪酸の酸化又は生合成を制御するものである。
【００６５】
一つの態様において、本開示の方法は、有効量のｍｉＲ−２２阻害剤の投与を必要とする対象に有効量のｍｉＲ−２２阻害剤を投与することを含む、代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。
【００６６】
例えば、このような阻害は、配列特異的な化学修飾オリゴヌクレオチドを介して行うことができる。例示的な修飾物としてＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられ、ＬＮＡにおいては、核酸のリボース部分が２’位の酸素と４’位の炭素を接続する外部架橋で修飾されており、この外部架橋によって、当該リボースが３’−エンド型構造に固定される。このＬＮＡ阻害剤は、特に本明細書で開示される代謝遺伝子を制御するｍｉＲＮＡを標的とする場合に、種々の代謝障害の治療及び予防のために、効率的な送達が可能であり、十分な生物学的利用能を有する、対費用効果の高い薬剤を実現する。
【００６７】
本開示はさらに、疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の任意の方法又は組み合わせの使用を提供する。そのような疾患として、例えば、代謝（例えば、脂肪関連代謝及び合成経路）の調節によって影響を受ける代謝障害又は代謝疾患が挙げられる。
【００６８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２をはじめとするｍｉＲＮＡは、脂肪関連性の代謝及び合成経路の標的及び／又は遺伝子を制御するものである。いくつかの実施形態では、脂肪関連性の代謝及び合成遺伝子としては、例えば、脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰα）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）、ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、及び／又はサーチュイン１（ＳＩＲＴ−１）が挙げられる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、脂肪関連性の代謝及び合成遺伝子はＦＴＯを包含する。いくつかの実施形態では、上記方法は、脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）、ＣＥＢＰα、及び／又はＰＰＡＲγの活性及び／又は発現を低減する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、上記方法は、ＡＬＫＢホモログ５（ＡＬＫＢＨ５）の活性及び／又は発現を低減する。いくつかの実施形態では、上記方法は、ＰＴＥＮ及び／又はＴＥＴ２の活性及び／又は発現を増強する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、上記方法は、ＰＰＡＲγコアクチベーターα（ＰＧＣ１−α）、特異性タンパク質１（ＳＰ１）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）、ＤＮＡ損傷包含転写物４（ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｉｎｃｌｕｄｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４）（ＤＤＩＴ−４、ＲＥＤＤ１）、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、腫瘍タンパク質ｐ６３（ＴＰ６３）、及び／又は線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）の活性及び／又は発現を変化させる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、上記方法は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのメチル化レベルを変化させるか、又はＲＮＡレベルでｍ６Ａのレベルに影響を与える。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｍｉＲＮＡの阻害を介して、対象における代謝障害（特に限定されないが、例えば、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨ）を治療又は予防する。ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を制御することができる短い核酸分子である。Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎらによるレビュー、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  ３０１（５６３１）：３３６−３３８，  ２００３を参照されたい。ｍｉＲＮＡは１８〜２４ヌクレオチド長程度である場合が多い。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡの配列が完全相補である場合は標的ｍＲＮＡの分解を促進することによって、且つ／又は、ｍｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡの配列がミスマッチを含む場合は翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡの抑制因子として働く。
【００７４】
理論に制限されるものではないが、成熟ｍｉＲＮＡは、Ｐｏｌ  ＩＩ又はＰｏｌ  ＩＩＩによって生成され、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる一次転写産物から生じると考えられている。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、多くの場合、数千塩基長であるため、プロセシングされてより短い成熟ｍｉＲＮＡが作製される。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはマルチシストロン性である場合があり、多くのｍｉＲＮＡへと発生し得るものを構築する、いくつかのクラスター化した配列の転写によって生じる。ｍｉＲＮＡを生み出すためのプロセシングは二段階であり得る。１段階目に、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが核内でＲＮａｓｅのＤｒｏｓｈａによってプロセシングされ、約７０〜約１００ヌクレオチド長のヘアピン形前駆物質（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が産生され得る。２段階目に、細胞質に移動後、このヘアピン形ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが、ＲＮａｓｅのＤｉｃｅｒによってさらなるプロセシングを受けて、二本鎖ｍｉＲＮＡが産生され得る。その後、この成熟ｍｉＲＮＡ鎖が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、塩基対相補性によってその標的ｍＲＮＡと結合することで、タンパク質発現が抑制され得る。ＲＩＳＣサイレンシング複合体への進入用に優先的に選択されないｍｉＲＮＡ二本鎖の他方の鎖は、パッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）又はマイナーｍｉＲＮＡ（ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ）又はスター（＊）鎖（ｓｔａｒ  ｓｔｒａｎｄ）として知られている。この鎖は分解される場合がある。特に明記されていない限り、本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及び／又は成熟ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡのマイナー（スター）鎖及び／又は二本鎖型ｍｉＲＮＡを指し得ると理解されたい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ遺伝子は、タンパク質コード遺伝子のイントロン内、又はノンコーディング転写単位のイントロン内若しくはエクソン内に位置するものであり得る。イントロン性ｍｉＲＮＡの発現はホスト転写単位の発現と同時に起こり得るが、これは、イントロン性ｍｉＲＮＡとホスト転写単位が同じ向きをしており、これらを内包するＲＮＡ前駆体と協調的に発現されるからである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の配列に結合するものであり得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の３’ＵＴＲの外側の配列に結合するものであり得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の３’ＵＴＲの内側及び外側の両方に結合するものであり得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、標的認識において、ｍｉＲＮＡの第２〜第７ヌクレオチド（ｍｉＲＮＡのシード配列（ｓｅｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ））と、標的３’ＵＴＲ沿いの対応配列とのヌクレオチド対合（シードマッチ（ｓｅｅｄ  ｍａｔｃｈ））が起こり得る。従って、ｍｉＲＮＡと標的との結合は、５ヌクレオチド程度の塩基対合を含み得る。さらに、ｍｉＲＮＡと標的との結合は、５ヌクレオチドよりも多い塩基対合を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡとそれが制御する遺伝子との結合は、ｍｉＲＮＡが、２以下、４以下、６以下、８以下、又は１０以下の標的核酸部位と結合することを介して行われ得る。
【００７８】
本開示のｍｉＲＮＡは、直接的な結合により、代謝障害の病因に関連したマーカーの遺伝子などの代謝において非常に重要な遺伝子を含むがこれらに限定されない核酸を制御するものであり得る。この結合は、標的核酸に対して完全相補であってもよいし、ミスマッチを含んでいてもよい。この結合の作用は、標的の分解促進及び／又は翻訳阻害であり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−２２などのｍｉＲＮＡの阻害を介して、対象における代謝障害を治療又は予防する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２をコードする核酸は、ＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＵＧＡＡＧＡＡＣＵＧＵ（配列番号１）を含むか、それからなる。
【００８０】
ｍｉＲ−２２のヘアピン形前駆物質と予想されるものは、その全体が、ノンコーディング転写物Ｃｌ７ｏｒｆ９１のエクソン２内に含まれており、タンパク質をコードする能力を欠くにもかかわらず、そのスプライシングパターンはヒト及びマウスで概して保存されている。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ｏｃｔ；１４（１０Ａ）：１９０２−１０を参照されたい。マウスモデルにおいてｍｉｒ−２２を内包するＣ１７ｏｒｆ９１のエクソン２を欠失させることより、ｍｉＲ−２２が、ＳＩＲＴ１（ＮＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｓｉｒｔｕｉｎ−１）、ＨＤＡＣ４（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ４）、ＰＵＲＢ  （ｐｕｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）、及びＰＴＥＮを標的とすることで、心臓の肥大とリモデリングに関与している可能性が明らかとなった。Ｇｕｒｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２２  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２０１２  Ｊｕｎ  ５；１２５（２２）：２７５１−６１；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｉｃｒｏＲＮＡ−２２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ２０１３  Ａｐｒ  ２６；１１２（９）：１２３４−４３を参照されたい。
【００８１】
さらに、ＰＴＥＮの下流標的であるＡＫＴがｍｉｒ−２２転写を活性化することが確認され、発癌性ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル経路における調節ループが示唆された。Ｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ｍｉＲ−２２  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｏｏｐ  ｉｎ  ＰＴＥＮ／ＡＫＴ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１０；５（５）：  ｅ１０８５９を参照されたい。
【００８２】
本発明は、いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−２２が、Ｐｔｅｎを標的とする能力とは独立して、エピジェネティック修飾因子及びＥＭＴ促進因子として機能し得ることを示している。いくつかの実施形態では、本開示は、脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）バリアントの増加の予防及び／又はＦＴＯバリアントの減少の誘発を介した、対象における代謝障害の治療又は予防を包含し、且つ／あるいは、ＦＴＯの発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを示す。ＦＴＯは、ヒトにおいては１６番染色体に位置するＦＴＯ遺伝子にコードされる酵素である。ＡｌｋＢファミリータンパク質中の１つのホモログとして、ＦＴＯは、最初に同定されたｍＲＮＡデメチラーゼである。特定のＦＴＯ遺伝子バリアントはヒトの肥満症と関連している。
【００８３】
いくつかの実施形態では、阻害剤の配列は種間で保存されたものである。いくつかの実施形態では、阻害剤の配列は、部分的に、ヒト転写物の配列から取り出されたものである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、対象における標的ｍｉＲＮＡ（特に限定されないが、例えば、ｍｉＲ−２２）の発現及び／又は活性を低減するように選択される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド又はその組み合わせを含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学修飾（特に限定されないが、例えば、糖又は主鎖の修飾）を少なくとも１つ有してもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、上記の化学修飾は、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル、又は２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット（例えば、限定されないが、２’位にフッ素への置換（２’Ｆ）を有するＤＮＡ類似体）、ＬＮＡユニット、ＰＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡユニット、及び２’ＭＯＥ  ＲＮＡユニットのうちの１又は複数である。
【００８６】
好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、高次構造が制限される二環式の糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）を１又は複数含むものとすることができ、これは当該ＢＳＮを含むオリゴヌクレオチドとそれに相補的なｍｉＲＮＡ標的鎖との間で形成された複合体の熱安定性を増強する。例えば、１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を少なくとも１つ含む。ＬＮＡは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含み、そのリボース糖部分の高次構造が固定されている。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’、４’−Ｃ−架橋２’デオキシリボヌクレオシド（ＣＤＮＡ、構造Ｂ）を少なくとも１つ含む。例えば、米国特許第６，４０３，５６６号及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  Ｖｏｌ．  ９：  １１４７−１１５０（共にその全体が参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造Ｃに示される構造を有する修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む。脂肪関連性の代謝及び合成経路の標的を制御するｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ＣＤＮＡなど）又は他の修飾ヌクレオチドと、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせを含ませることができる。
【００８７】
【化１】
2021518841.tif 000003
【００８８】
あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドには、糖−リン酸骨格ではなくペプチドベースの骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含ませることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する他の修飾糖又はリン酸ジエステル修飾も企図される。他の化学修飾としては特に限定されないが、例えば、２’−Ｏ−アルキル修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾）、２’−フルオロ修飾、及び４’−チオ修飾、並びに１又は複数のホスホロチオエート結合、モルフォリノ結合、又はホスホノカルボン酸結合などの主鎖修飾（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される米国特許第６，６９３，１８７号及び同第７，０６７，６４１号を参照）を挙げることができる。１つの実施形態では、発癌性ｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各塩基に２’−Ｏ−メチル糖修飾を含み、ホスホロチオエート結合によって連結されている。アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にヌクレオチド長がより短い（例えば、１６ヌクレオチド長未満、７〜８ヌクレオチド長）のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ＬＮＡ修飾、二環式ヌクレオシド修飾、ホスホノギ酸修飾、２’Ｏ−アルキル修飾などを含むがこれらに限定されない、親和性を増強する修飾を１又は複数を含ませることができる。いくつかの実施形態では、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを５’末端と３’末端の両方に含み、少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを中央に有する、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマーである。これらのギャップマーは、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ  Ｈ依存型分解機構を惹起することが可能である。安定性を増強し有効性を向上させる他のアンチセンスオリゴヌクレオチド修飾は、その全体が参照によって本明細書に援用される米国特許第６，８３８，２８３号に記載される修飾など、当該技術分野において公知であり、本発明の方法における使用に適したものである。例えば、限定されることを意図するものではないが、インビボにおける送達と安定性を促すために、アンチセンスオリゴヌクレオチドには、その３’末端に、ステロイド（コレステロール部分など）、ビタミン、脂肪酸、炭水化物若しくはグリコシド、ペプチド、又は他の小分子リガンドを連結することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−２２、の活性阻害に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約２５ヌクレオチド長、約１０〜約３０ヌクレオチド長、又は約２０〜約２５ヌクレオチド長である。ある実施形態では、発癌性ｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは約８〜約１８ヌクレオチド長であり、他の実施形態では約１２〜約１６ヌクレオチド長であり、他の実施形態では約７〜約８ヌクレオチド長である。発癌性ｍｉＲＮＡに対し相補性を有する７塩基長以上の任意のアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、当該ｍｉＲＮＡの５’末端に相補的であり、且つ当該ｍｉＲＮＡの完全相補配列を横切る、任意の抗ｍｉＲを使用してよい。特に限定されないが、例えば、発癌性ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−２２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５ヌクレオチド長、又は約６ヌクレオチド長、又は約７ヌクレオチド長、又は約８ヌクレオチド長、又は約９ヌクレオチド長、又は約１０ヌクレオチド長、又は約１１ヌクレオチド長、又は約１２ヌクレオチド長、又は約１３ヌクレオチド長、又は約１４ヌクレオチド長、又は約１５ヌクレオチド長、又は約１６ヌクレオチド長、又は約１７ヌクレオチド長、又は約１８ヌクレオチド長、又は約１９ヌクレオチド長、又は約２０ヌクレオチド長、又は約２１ヌクレオチド長、又は約２２ヌクレオチド長、又は約２３ヌクレオチド長、又は約２４ヌクレオチド長、又は約２５ヌクレオチド長、又は約２６ヌクレオチド長、又は約２７ヌクレオチド長、又は約２８ヌクレオチド長、又は約２９ヌクレオチド長、又は約３０ヌクレオチド長である。
【００９０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドには、成熟鎖側又はマイナー鎖側（すなわち、スター鎖側）の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対し少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、成熟鎖側又はマイナー鎖側（すなわち、スター鎖側）の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対し少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％相補的な配列、を含ませることができる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的な、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％相補的なものとすることができる。１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対し１００％相補的な配列を含む。
【００９１】
本明細書で使用される場合、実質的に相補的とは、標的ポリヌクレオチド配列（特に限定されないが、例えば、ｍｉＲ−２２などの、成熟ｍｉＲＮＡ配列、マイナーｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ前駆体配列、又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列）に対し、配列が少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％相補的であること表す。
【００９２】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンタゴミルである。アンタゴミルは一本鎖の化学的に修飾されたリボヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡに対し少なくとも部分的に相補的であることで、そのｍｉＲＮＡをサイレンシングし得る。例えば、Ｋｒｉｉｔｚｆｅｌｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （２００５）  ４３８  （７０６８）：  ６８５−９を参照されたい。アンタゴミルは、２’−Ｏ−メチル−糖修飾などの修飾ヌクレオチドを１又は複数含み得る。いくつかの実施形態では、アンタゴミルは、修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴミルには、１又は複数のホスホロチオエート結合を含ませることで、部分的又は完全なホスホロチオエート骨格を与えることもできる。インビボにおける送達及び安定性を促すために、上記のアンタゴミルを、その３’末端において、コレステロール部分又は他の部分と連結することができる。阻害に適したアンタゴミルは、約１５〜約５０ヌクレオチド長のアンタゴミル、約１８〜約３０ヌクレオチド長のアンタゴミル、及び約２０〜約２５ヌクレオチド長のアンタゴミルであり得る。アンタゴミルは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対し少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％相補的なものとすることができる。いくつかの実施形態では、アンタゴミルは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的な、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対し少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％相補的なものとしてもよい。他の実施形態では、アンタゴミルは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対し１００％相補的である。
【００９３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンタゴミルには、発癌性ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ前駆体配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）又はプライマリーｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に対し実質的に相補的な配列を含ませてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記ｍｉＲＮＡの標的の３’非翻訳領域の外側に位置する配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記ｍｉＲＮＡの標的の３’非翻訳領域の内側に位置する配列を含む。
【００９４】
ｍｉＲ−２２を含むがこれに限定されない本明細書に記載の発癌性ｍｉＲＮＡの阻害剤又は作動剤のいずれも、ｍｉＲＮＡの阻害剤又は作動剤をコードする発現ベクターの細胞への送達によって、標的細胞に送達することができる。ベクターは目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る組成物である。多数のベクターが当該技術分野において公知であり、例えば、直鎖ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性の化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、ベクターという用語には、自己複製するプラスミド、ウイルスが包含される。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。発現コンストラクトは、生細胞において複製可能なものであっても、合成によって作製可能なものであってもよい。これを適用する目的のために、発現コンストラクト、発現ベクター、及びベクターという用語は、一般的で実例的な意味での本発明における適用を示すため、同義的に用いられ、本発明を限定する意図はない。
【００９５】
１つの実施形態では、発癌性ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−２２、の阻害剤を発現するための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む。発現されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、発癌性ｍｉＲＮＡの成熟側又はマイナー側配列に対し部分的に相補的であっても、完全に相補的であってもよい。機能的に連結した、又は転写調節下の、という表現は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼによる転写及びポリヌクレオチドの発現の開始を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正しい位置と向きにあることを意味している。
【００９６】
本明細書で使用される場合、プロモーターとは、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識される、特定の遺伝子転写を開始するために必要とされるＤＮＡ配列を指す。好適なプロモーターとしては、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩ、及びウイルス性プロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス末端反復配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
ある実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするポリヌクレオチド、又は代謝遺伝子を制御するｍｉＲＮＡ及び／若しくは代謝性病因に関連したマーカーの遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、に機能的に連結したプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、当該技術分野において公知であり、例えば、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、及び誘導性マウス乳癌ウイルスＬＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
発現コンストラクトや核酸を細胞に送達する方法は当該技術分野において公知であり、特に限定されないが、例えば、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、ポリアミン系トランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション法、細胞超音波処理法、高速度微粒子を用いた遺伝子銃法（ｇｅｎｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、及び受容体介在性トランスフェクション法を挙げることができる。
【００９９】
本発明は、治療後に発癌性ｍｉＲＮＡの阻害剤を捕捉又は除去することも包含する。捕捉剤としては、ｍｉＲＮＡ阻害物質又はそれを発現するベクターに相補的な単離核酸を挙げることができる。すなわち、捕捉剤は、ｍｉＲＮＡ阻害物質又はそれを発現するベクターに結合することで、ｍｉＲＮＡと標的との結合を阻止することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害の治療又は予防を必要とする対象の、代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象における、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。
【０１０１】
代謝障害
用語「代謝障害」とは、本発明に関連して用いられる場合、褐色脂肪組織、血漿グルコース濃度、血漿インスリン値、及び／又は体脂肪含有量の有無、値、又は活性に影響を受ける疾患又は異常を指す。いくつかの実施形態では、代謝障害又は代謝異常としてはまた、例えば、メタボリックシンドローム、耐糖能障害、血漿インスリン濃度及びインスリン抵抗性の上昇、脂質異常症、高血糖症、高脂血症、高血圧症、脂肪異栄養症、心血管疾患、呼吸器系の問題又は異常等が挙げられるが、これらに限定されない。特に重要な代謝障害は、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、例えば、非脂肪酸肝疾患（Ｎｏｎ−Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＮＡＦＬＤ）及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。
【０１０２】
肥満症
いくつかの実施形態では、本開示は肥満症に関する。肥満は、現代社会において高度に蔓延した慢性疾患であり、社会的不名誉を伴うだけでなく、寿命の短縮や、さらには真性糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧症、高コレステロール血症、胆石症、変形性関節症、整形外科的外傷、血栓塞栓性疾患、がん、及び冠動脈心疾患をはじめとした多くの医学的問題とも関連付けられている。Ｒｉｓｓａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３０１：  ８３５−８３７  （１９９０）。いくつかの実施形態では、肥満は、肥満度指数（ＢＭＩ：体重／身長（ｍ）２）を用いて算出され得る。いくつかの実施形態では、肥満症は、他の点では健常な対象が３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有していること、又は、少なくとも１つの合併性を有する対象が２７ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有している状態と定義される。本開示の方法のいくつかの実施形態では、対象は、肥満であり、約３０超の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、対象は過体重であり、肥満度指数は約２５〜２９．９である。いくつかの実施形態では、上記方法は体重減少を誘発する。いくつかの実施形態では、上記方法は体重増加を予防する。いくつかの実施形態では、上記方法は、脂肪組織の増殖を予防し、脂肪細胞分化を障害する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本開示は、肥満症及び過体重、並びに関連疾患の治療における、又はそれらに対する医薬の製造における、ｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）を投与することを含む治療方法、及び／又はｍｉＲ−２２（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、有効量のｍｉＲ−２２（及びｍｉＲ−２２の阻害に関連した化合物）の投与を必要とする患者に、有効量のｍｉＲ−２２（及びｍｉＲ−２２の阻害に関連した化合物）を投与することを含む、肥満症を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、体重減少の誘発及び／又は体重増加の予防を必要とする患者において、体重減少を誘発するため、及び／又は体重増加を予防するために、有効量のｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２の阻害に関連した化合物）を投与することを含む、体重管理法を提供する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本開示は、消化器系の外科手術を受けたことがある又は受けることとなる患者；約８０〜１００ポンドを超えて過体重である患者；約３５超のＢＭＩを有する患者；又は肥満症に関連した健康問題を有する患者に、有効量のｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）を投与することを含む、体重減少を誘発又は体重増加を予防する方法（又は、カロリー摂取量を実質的に変化させない患者において、肥満症を治療若しくは予防、若しくは体重減少を誘発若しくは体重増加を予防する方法）に関する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、前記消化器系の外科手術は、ＩＣＤ−９−ＣＭに基づいて消化器系への手術に分類されるもののうちの１又は複数であり、すなわち例えば、食道への手術；胃の切開及び切除；胃への他の手術；腸の切開、切除、及び吻合；腸への他の手術；虫垂への手術；直腸、直腸Ｓ状部、及び直腸周囲組織への手術；肛門への手術；肝臓への手術；胆嚢及び胆道への手術；膵臓への手術；ヘルニアの修復；並びに腹部への他の手術が挙げられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、消化器系の外科手術は、食事量制限手術（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）及び／又は吸収阻害手術（ｍａｌａｂｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）のうちの１又は複数であり、例えば、垂直遮断胃形成術（ＶＢＧ、例えば、胃のステープリング）；胃バンディング術（例えば、ＬＡＰ−ＢＡＮＤ又はＲＥＡＬＩＺＥ）；スリーブ状胃切除術；胃バイパス術（例えば、ルーワイ胃バイパス術）、胆膵路転換手術及び美容外科（例えば、吸引アシスト脂肪吸引（ＳＡＬ）；超音波アシスト脂肪吸引（ＵＡＬ）；パワーアシスト吸引（ＰＡＬ）；ツインカニューレ（アシスト）脂肪吸引（ＴＣＡＬ又はＴＣＬ）；外部超音波アシスト脂肪吸引（ＸＵＡＬ又はＥＵＡＬ）；水アシスト脂肪吸引（ＷＡＬ）；レーザーアシスト脂肪吸引；チューメセント脂肪吸引；及びクライオリポライシス、などの脂肪吸引）が挙げられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、肥満症に関連した健康問題は、心血管疾患（例えば、高コレステロール、高コレステロール血症、低ＨＤＬ、高ＨＤＬ、高血圧症、冠動脈疾患、心不全）、睡眠時無呼吸（閉塞性睡眠時無呼吸を含む）、変形性関節症、甲状腺の問題、認知症、痛風、喘息、胃食道逆流性疾患、及び慢性腎不全から選択される。いくつかの実施形態では、肥満症に関連した健康問題は、心疾患、睡眠時無呼吸、又は高コレステロールである。
【０１０８】
いくつかの態様において、本開示は、有効量のｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２の阻害に関連する化合物）の投与を必要とする患者に、有効量のｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２の阻害に関連した化合物）を投与することを含む、体重減少を誘発又は体重増加を予防するための使用又は方法であって；上記患者がカロリー摂取量を実質的に変化させない、上記の使用及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記のカロリー摂取量は、米農務省の表などの基準に対して高い。いくつかの実施形態では、患者のカロリー摂取量は、２０００〜１００００カロリー／日、又は、約２０００カロリー／日超、若しくは約２２００カロリー／日超、若しくは約２４００カロリー／日超、若しくは約２６００カロリー／日超、若しくは約２８００カロリー／日超、若しくは約３０００カロリー／日超、若しくは約３２００カロリー／日超、若しくは約３４００カロリー／日超、若しくは約３６００カロリー／日超、若しくは約３８００カロリー／日超、若しくは約４０００カロリー／日超、若しくは約５０００カロリー／日超、若しくは約６０００カロリー／日超である。いくつかの実施形態では、患者は高カロリーを摂取しても体重を増加させず、又はむしろ減少させさえする。従って、本開示は、患者のアドヒアランスをしばしば減じる生活様式の変化（例えば、ダイエットの失敗）なしに効果を奏することができる。いくつかの実施形態では、患者のカロリー摂取量は、治療開始時の患者のカロリー摂取量の約２０％を超えて、又は約１０％を超えて、又は約５％を超えては制限されない。いくつかの実施形態では、患者のカロリー摂取量は高い割合で「エンプティカロリー」であり、すなわち、固形脂肪及び／又は添加された糖類からのカロリーである。いくつかの実施形態では、患者のカロリー摂取量の約１５％超、又は約２０％超、又は約２５％超、又は約３０％超、又は約３５％超、又は約５０％超がエンプティカロリーである。これらの実施形態においても、患者は、体重を増加させず、又はむしろ減少させさえする。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本開示の患者は過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、本開示の患者は中心性肥満に罹患している。いくつかの実施形態では、肥満は、単純性肥満（食事性肥満；通常、身体が利用できるよりも多くのカロリーを消費することによるもの）、症候性肥満（通常、根底にある医学的状態によって引き起こされるもの、例えば、クッシング症候群及び多嚢胞性卵巣症候群など）、及び小児肥満のうちの１つである。いくつかの実施形態では、肥満症は、ＢＭＩ３０〜３４．９９が含まれるクラス１；ＢＭＩ３５〜３９．９９が含まれるクラス２；ＢＭＩ４０超が含まれるクラス３に分類される。さらに、本開示は、クラス１、クラス２、又は重度肥満、病的肥満、及び超肥満にさらに分類されるクラス３のいずれかの肥満症、を対象とする。いくつかの実施形態では、患者は、例えば一日カロリー摂取量などで評価した場合に、さらなる体重増加のリスクがある。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）の体重管理効果／体重減少効果／抗肥満効果は、種々の手法及び指標を用いて評価することができる。いくつかの実施形態では、治療の前、間、及び後に評価が行われる。いくつかの実施形態では、身長を考慮に入れた人の体重の尺度である肥満度指数（ＢＭＩ）が使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の患者は「過体重」に分類されるＢＭＩ、すなわち、２５〜２９．９のＢＭＩを有し、例えば、約２５、又は約２５．５、又は約２６、又は約２６．５、又は約２７、又は約２７．５、又は約２８、又は約２８．５、又は約２９、又は約２９．５などのＢＭＩを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の患者は、「肥満」に分類されるＢＭＩ、すなわち、３０超のＢＭＩを有し、例えば、約３０、又は約３１、又は約３２、又は約３３、又は約３４、又は約３５、又は約３６、又は約３７、又は約３８、又は約３９、又は約４０、又は約５０などのＢＭＩを有する。いくつかの実施形態では、ボディ体積指数（ＢＶＩ）が用いられる。ＢＶＩは３Ｄソフトウェアを用いて人の３Ｄイメージを作成するため、ＢＶＩは、ＢＭＩ評点は同じであるが体つきが異なり重量分布も異なる人々を区別することが可能である。ＢＶＩは、総重量や総脂肪含有量ではなく、人の体重及び脂肪が身体のどこに位置しているかを測定するものであり、中心性肥満として一般に知られている腹部周辺の体重に重点を置いている。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）の体重管理効果／体重減少効果／抗肥満効果を評価するために、全身空気置換プレチスモグラフィー（ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ  ａｉｒ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＡＤＰ）が用いられる。本発明のいくつかの実施形態では、単純な計量法が用いられる。いくつかの実施形態では、皮下脂肪計すなわち「ピンチ検査法」、生体電気インピーダンス法、水中体重測定、又は二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）が使用され得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、単純な身体円周測定が用いられ得る。いくつかの実施形態では、本開示の患者の腹囲は、約３５インチ超、又は約３６インチ超、又は約３７インチ超、又は約３８インチ超、又は約３９インチ超、又は約４０インチ超、又は約４１インチ超、又は約４２インチ超、又は約４３インチ超、又は約４４インチ超、又は約４５インチ超、又は約４６インチ超、又は約４７インチ超、又は約４８インチ超、又は約５０インチ超、又は約５５インチ超、又は約６０インチ超である。いくつかの実施形態では、患者は腹囲４０インチ超のヒト男性である。いくつかの実施形態では、患者は腹囲３５インチ超のヒト女性である。
【０１１２】
本開示の方法は、推奨される体脂肪率を上回る体脂肪率を有するヒト、すなわち、少なくとも「過体重」の範囲内、又は少なくとも「肥満」の範囲内にあるヒト、を治療するために用いることができる。体脂肪率は女性と男性では異なるものである。具体的に、女性については、本開示の方法は、少なくとも約２５％、２５％超、少なくとも約３２％、又は３２％超の体脂肪率を有するヒト女性を治療するために用いることができる。男性については、本開示の方法は、少なくとも約１４％、１４％超、少なくとも約１８％、１８％超、少なくとも約２５％、又は２５％超の体脂肪率を有するヒト男性を治療するために用いることができる。体脂肪率は、当該技術分野に受け入れられている任意の方法を用いて評価することができ、例えば、近赤外インタラクタンス法、二重エネルギーＸ線吸収測定法、身体密度測定法、生体電気インピーダンス法などが挙げられる。
【０１１３】
本開示の方法は、１００ポンドを超えて過体重である、且つ／又は４０インチ超の腹囲を有する男性患者を治療するために用いることができる。本開示の方法は、８０ポンドを超えて過体重である、且つ／又は３５インチ超の腹囲を有する女性患者を治療するために用いることができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２の阻害に関連した化合物）の、過体重であることに関連した特定の障害を治療及び／又は予防するための使用を提供する。例えば、ｍｉＲ−２２（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）は、心血管疾患（例えば、高コレステロール、高コレステロール血症、低ＨＤＬ、高ＨＤＬ、高血圧症、冠動脈疾患、心不全）、睡眠時無呼吸（閉塞性睡眠時無呼吸を含む）、変形性関節症、甲状腺の問題、認知症、痛風、喘息、胃食道逆流性疾患、及び慢性腎不全に用いられる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）の投与及び／又は使用により、脂肪組織の増殖が阻止又は低減される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）は、内臓脂肪組織（ＶＡＴ）、腹部皮下脂肪組織（ＡＳＡＴ）、又は異所性脂肪などの、白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）のうちの１又は複数に作用する。このような作用は、例えば、本明細書に記載される任意の手法（例えば、ＢＭＩ、身長対体重指数、皮下脂肪測定、電気的生体インピーダンス分析など）、並びにコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ；水平ボディスキャンなど）、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）などの種々の画像処理技術を用いて、評価することができる。
【０１１６】
ｍｉＲ−２２（及びｍｉＲ−２２に関連した化合物）は、食事療法、行動療法、理学療法、運動、及び減量手術、又は２つ以上のこのような治療法の組み合せと組み合わせて用いることもできる。いくつかの実施形態では、対象はカロリー制限食下にある。いくつかの実施形態では、対象は、身体運動又は理学療法レジメンに参加している、又は参加予定である。いくつかの実施形態では、対象は、減量手術を受けた経験又は受ける予定がある。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤（及びｍｉＲ−２２の阻害に関連した化合物）は、追加の薬剤と組み合わされてもよく、各種薬剤を用いて治療を受けている患者に投与されてもよい。
【０１１７】
上記の追加の薬剤としては、例えば、肥満症及び／又は体重減少／減量に係る実施形態を含むがこれらに限定されず、オルリスタット（例えば、アライ（ＡＬＬＩ）、ゼニカル（ＸＥＮＩＣＡＬ））、ロルカセリン（例えば、ベルヴィーク（ＢＥＬＶＩＱ））、フェンテルミン／トピラマート（例えば、キューシミア（ＱＳＹＭＩＡ））、シブトラミン（例えば、リダクティル（ＲＥＤＵＣＴＩＬ）又はメリディア（ＭＥＲＩＤＩＡ））、リモナバン（アコンプリア（ＡＣＯＭＰＬＩＡ））、エクセナチド（例えば、バイエッタ（ＢＹＥＴＴＡ））、プラムリンチド（例えば、シムリン（ＳＹＭＬＩＮ））、フェンテルミン、ベンズフェタミン、ジエチルプロピオン、フェンジメトラジン、ブプロピオン、及びメトホルミンのうちの１又は複数を挙げることができる。
【０１１８】
上記の追加の薬剤としては、身体が食物中の特定の栄養分を吸収する能力に干渉する薬剤も挙げられ、例えば、オルリスタット（例えば、アライ（ＡＬＬＩ）、ゼニカル（ＸＥＮＩＣＡＬ））、グルコマンナン、及びグアーガムなどが挙げられる。上記の追加の薬剤としては、食欲を抑制する薬剤も挙げられ、例えば、カテコールアミン類及びそれらの誘導体（フェンテルミン及び他のアンフェタミン系薬剤など）、種々の抗うつ薬及び気分安定剤（例えば、ブプロピオン及びトピラマート）、食欲低下薬（例えば、デキセドリン、ジゴキシン）などが挙げられる。上記の追加の薬剤としては、身体の代謝を増進する薬剤も挙げられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、食欲抑制薬、神経伝達物質再取り込み阻害剤、ドパミン作動薬、セロトニン作動薬、ＧＡＢＡ作動性シグナル伝達の調節薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、サブスタンスＰ（ＮＫｌ）受容体拮抗薬、メラノコルチン受容体の作動薬及び拮抗薬、リパーゼ阻害薬、脂肪吸収の阻害薬、エネルギー摂取又は代謝の調節薬、カンナビノイド受容体調節薬、嗜癖治療薬、メタボリックシンドローム治療薬、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）調節薬；ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）拮抗薬、心血管疾患治療薬、高レベルトリグリセリド治療薬、低ＨＤＬ治療薬、高コレステロール血症治療薬、並びに高血圧症治療薬の中から選択されてもよい。いくつかの心血管疾患薬として、スタチン系薬剤（例えば、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びプラバスタチン）、及びω−３系薬剤（例えば、ロバザ（ＬＯＶＡＺＡ）、エパノバ（ＥＰＡＮＯＶＡ）、バスセパ（ＶＡＳＣＥＰＡ）、エステル化ω−３、通常、魚油、クリルオイル、藻類油）が挙げられる。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、アンフェタミン類、ベンゾジアゼピン類、スルホニル尿素類、メグリチニド類、チアゾリジンジオン類、ビグアナイド類、β遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、利尿薬、硝酸塩薬、カルシウムチャネル遮断薬、フェンテルミン、シブトラミン、ロルカセリン、セチリスタット、リモナバン、タラナバント、トピラマート、ガバペンチン、バルプロ酸塩、ビガバトリン、ブプロピオン、チアガビン、セルトラリン、フルオキセチン、トラゾドン、ゾニサミド、メチルフェニデート、バレニクリン、ナルトレキソン、ジエチルプロピオン、フェンジメトラジン、レパグリニド、ナテグリニド、グリメピリド、メトホルミン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、及びシタグリプチンの中から選択されてもよい。
【０１２０】
プラダー・ウィリー症候群
いくつかの実施形態では、上記方法はプラダー・ウィリー症候群に関する。プラダー・ウィリー症候群は多くの身体部位に影響を与える複雑な遺伝学的状態である。乳児期において、この状態は、筋緊張の弱さ（筋緊張低下）、哺乳困難、成長不良、及び発達遅延を特徴とする。小児期初期では、罹患した個体は満足のできない食欲を発症し始め、これが慢性的な過食（過食症）及び肥満症につながる。いくつかの実施形態では、対象はプラダー・ウィリー症候群に罹患した対象である。いくつかの実施形態では、プラダー・ウィリー症候群、特に肥満症を伴う対象は、２型糖尿病も発症している対象である。
【０１２１】
脂肪性肝疾患
いくつかの実施形態では、本開示の方法は脂肪性肝疾患に関する。人口のかなりの割合が脂肪性肝疾患、別名非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している。ＮＡＳＨは肥満症及び糖尿病としばしば関連している。トリグリセリド小滴が肝細胞と共に存在する脂肪肝（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）は、肝臓を慢性炎症（生検標本で炎症性白血球浸潤として検出）に罹り易くし、線維症と肝硬変に繋がるおそれがある。脂肪性肝疾患は、通常、肝細胞傷害の指標となる、アミノ基転移酵素のＡＬＴやＡＳＴなどの肝臓特異的酵素の血清中濃度の上昇が確認されること、並びに、疲労及び肝臓領域の疼痛を含む症状が現れること、によって発見され、確定的な診断には生検がしばしば必要とされる。肝臓の炎症及び脂肪含有量を低減することで、ＮＡＳＨの線維症及び肝硬変への進行を減衰、停止、又は回復することが、恩恵として期待されるものである。いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪肝を低減又は予防する。いくつかの実施形態では、上記方法は肝線維症を低減又は予防する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、上記方法は、本明細書に記載のｍｉＲ−２２阻害剤を投与することによりＮＡＳＨを治療する方法である。ＮＡＳＨ患者はハイリスクＮＡＳＨ患者であり得る。「ハイリスクＮＡＳＨ患者」とは、以下のうちの１又は複数を特徴とするものを指す：ＮＡＳ≧４；ベースライン時の線維症がステージ２又は３；又はベースライン時の線維症がステージ１であり、合併性（２型糖尿病、ＢＭＩ≧３０ｋｇ／ｍ２又はＡＬＴ≧６０Ｕ／Ｌ）を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、脂肪変性（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、混合性の細葉炎症、及び肝細胞の風船様化、並びに／又は細胞周囲線維化のうちの１又は複数を低減する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は脂肪変性の１又は複数を低減する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、その全体が参照によって援用されるＢｒｕｎｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ９４，  Ｎｏ．  ９  （１９９９）に記載されているような、軽度のグレード１  ＮＡＳＨ、又は中等度のグレード２  ＮＡＳＨ、又は重度のグレード３  ＮＡＳＨを治療する。
【０１２６】
【表１】
2021518841.tif 000004
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は下記の任意のステージのＮＡＳＨを治療する：ステージ０、線維化無し；ステージ１、ゾーン３における細胞周囲／類洞周囲の線維化、局所的又は広範囲；ステージ２、ステージ１の状態に加え、門脈の線維化、局所的又は広範囲；ステージ３、架橋線維化（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、局所的又は広範囲；ステージ４、肝硬変（±残りの細胞周囲線維化）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、その全体が参照によって援用されるＫｌｅｉｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２００５．  ４１（６）：  ｐ．  １３１３−２１に記載されているような、任意の活性スコア（ＮＡＳ）のＮＡＳＨを治療する。
【０１２９】
【表２】
2021518841.tif 000005
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、ＮＡＳＨを、８未満、又は７未満、又は６未満、又は５未満、又は４未満、又は３未満、又は２未満、又は１未満に低減する。いくつかの実施形態では、ＡＰをベースとするもの（ＡＰ−ｂａｓｅｄ）が、ＮＡＳを約７、又は約６、又は５未満、４未満、又は約３、又は約２、又は約１に低減する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、脂肪変性を約５％、又は約１０％、又は約１５％、又は約２０％、又は約２５％、又は約３０％、又は約３５％、又は約４０％、又は約４５％、又は約５０％、又は約５５％、又は約６０％、又は約６５％、又は約７０％、又は約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０％、又は約９５％低減する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、小葉炎症を４病巣未満、又は３病巣未満、又は２病巣未満、又は１病巣未満に減少させる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、風船様化を上記のスコアで０又は１のスコアに低減させる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、肥満症、糖尿病（例えば、２型）、高トリグリセリド血症、急速な体重減少、及び栄養失調などの種々の後天性代謝疾患に罹患した対象などの、ＮＡＳＨのリスクがある対象を治療する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、ウィルソン病、チロシン血症、及び無βリポタンパク質血症などの種々の遺伝的代謝疾患に罹患した対象などの、ＮＡＳＨのリスクがある対象を治療する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、脂肪異栄養症及び空腸回腸バイパスなどの種々の他の要因を患っている対象などの、ＮＡＳＨのリスクがある対象を治療する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤は、アミオダロン、化学療法剤（例えば、イリノテカン）、タモキシフェン、ステロイド類、エストロゲン類、ジエチルスチルベストロール、メトトレキサート、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ニフェジピン、ベラパミル、及びジルチアゼム）のうちの１又は複数による治療を受けている対象などの、ＮＡＳＨのリスクがある対象を治療する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本開示は、線維症を低減又は予防する方法を提供する。線維症の直接的なマーカーには、例えば、プロコラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型）、マトリックスメタロプロテアーゼ、サイトカイン、及びケモカインが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明は、活性化した星細胞などによる細胞外マトリックス合成を低減する、又はその増強を予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＭＰ−１のレベルを調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、血清中ヒアルロン酸濃度を減少又は予防する方法を提供する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２２阻害剤の効果は、ヒアルロン酸、組織メタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ−１）、及びα−２−マクログロブリンを組み合わせた１又は複数をモニターする検査（例えば、ＦＩＢＲＯＳｐｅｃｔ  ＩＩ）を用いてモニターされる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、肝硬変を低減又は予防する方法を提供する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本開示は、血小板数、プロトロンビン時間、アルブミン、総ビリルビン、及び血清アミノトランスフェラーゼのうちの１又は複数を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びα−２−マクログロブリンなどの血清中線維症マーカーを調節する方法を提供する。
【０１３９】
高コレステロール血症
いくつかの実施形態では、本開示の方法は高コレステロール血症に関する。高コレステロール血症は血清コレステロール上昇を特徴とする状態である。血清コレステロール値の上昇は人口のかなりの割合に見られ、アテローム性動脈硬化及び心筋梗塞の重要なリスク因子である。本発明の薬剤に加えて、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチン系薬剤）などのコレステロール降下剤を、所望により同じ医薬品に組み入れて、高コレステロール血症患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、低コレステロール血症は、単一遺伝子変異の結果ではない血清コレステロール上昇を特徴とする状態である、オン家族性高コレステロール血症（ｏｎ−ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）である。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、種々の遺伝因子の影響を原因とするコレステロール上昇を特徴とする状態である、多遺伝子性高コレステロール血症である。ある実施形態では、多遺伝子性高コレステロール血症は、脂質の食事摂取によって悪化し得る。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）遺伝子の変異、ＬＤＬ−Ｃの顕著な増加、及びアテローム性動脈硬化の早発を特徴とする常染色体優性代謝障害である、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）である。個人が下記の基準のうちの１又は複数を満たしている場合に、家族性高コレステロール血症の診断がなされる：遺伝子検査により２つの変異型ＬＤＬ受容体遺伝子が確認される；遺伝子検査により１つの変異型ＬＤＬ受容体遺伝子が確認される；未治療の５００ｍｇ／ｄＬ超の血清ＬＤＬ−コレステロールの病歴の報告；１０歳より前に腱黄色腫及び／若しくは皮膚黄色腫が見られる；又は、家族性高コレステロール血症ヘテロ接合体と一致して、両方の親で、脂質低下治療前に血清ＬＤＬ−コレステロールの上昇が報告されている。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、母系及び父系の両方のＬＤＬ−Ｒ遺伝子の変異を特徴とする状態である、家族性高コレステロール血症ホモ接合体、すなわちＨｏＦＨである。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、母系又は父系のいずれかのＬＤＬ−Ｒ遺伝子変異を特徴とする状態である、家族性高コレステロール血症ヘテロ接合体、すなわちＨｅＦＨである。
【０１４０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＦＴＯ遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１０８０４３２．２；配列番号１３）からなるか、又はそれを含む。
【０１４１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＦＴＯ遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１０７３９０１．１；配列番号１４）からなるか、又はそれを含む。
【０１４２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＣＥＢＰα遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００４３６４．４、転写バリアント１；配列番号１５）からなるか、又はそれを含む。
【０１４３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＣＥＢＰα遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００４３５５．２、転写バリアント１；配列番号１６）からなるか、又はそれを含む。
【０１４４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＣＥＢＰα遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１２８５８２９．１、転写バリアント２；配列番号１７）からなるか、又はそれを含む。
【０１４５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＣＥＢＰα遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１２８５８２９．１、転写バリアント２；配列番号１８）からなるか、又はそれを含む。
【０１４６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＣＥＢＰα遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１２８７４２４．１、転写バリアント３；配列番号１９）からなるか、又はそれを含む。
【０１４７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＣＥＢＰα遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１２７４３５３．１、転写バリアント３；配列番号２０）からなるか、又はそれを含む。
【０１４８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＣＥＢＰα遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１２８７４３５．１、転写バリアント４；配列番号２１）からなるか、又はそれを含む。
【０１４９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＣＥＢＰα遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１２７４３６４．１、転写バリアント４；配列番号２２）からなるか、又はそれを含む。
【０１５０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＰＡＲγ遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿１３８７１２．３、転写バリアント１；配列番号２３）からなるか、又はそれを含む。
【０１５１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＰＡＲγ遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿６１９７２６．２、転写バリアント１；配列番号２４）からなるか、又はそれを含む。
【０１５２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＰＡＲγ遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１５８６９．４、転写バリアント２；配列番号２５）からなるか、又はそれを含む。
【０１５３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＰＡＲγ遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０５６９５３．２、転写バリアント２；配列番号２６）からなるか、又はそれを含む。
【０１５４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＰＡＲγ遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿１３８７１１．３、転写バリアント３；配列番号２７）からなるか、又はそれを含む。
【０１５５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＰＡＲγ遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿６１９７２５．２、転写バリアント３；配列番号２８）からなるか、又はそれを含む。
【０１５６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＰＡＲγ遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００５０３７．５、転写バリアント４；配列番号２９）からなるか、又はそれを含む。
【０１５７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＰＡＲγ遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００５０２８．４、転写バリアント４；配列番号３０）からなるか、又はそれを含む。
【０１５８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＴＥＮ遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０００３１４．６、転写バリアント１；配列番号３１）からなるか、又はそれを含む。
【０１５９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＴＥＮ遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０００３０５．３、転写バリアント１；配列番号３２）からなるか、又はそれを含む。
【０１６０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＴＥＮ遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１３０４７１７．２、転写バリアント１；配列番号３３）からなるか、又はそれを含む。
【０１６１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＴＥＮ遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１２９１６４６．２、転写バリアント１；配列番号３４）からなるか、又はそれを含む。
【０１６２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＴＥＮ遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１３０４７１８．１、転写バリアント２；配列番号３５）からなるか、又はそれを含む。
【０１６３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＴＥＮ遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１２９１６４７．１、転写バリアント２；配列番号３６）からなるか、又はそれを含む。
【０１６４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＴＥＴ２遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１１２７２０８．２、転写バリアント１；配列番号３７）からなるか、又はそれを含む。
【０１６５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＴＥＴ２遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１１２０６８０．１、転写バリアント１；配列番号３８）からなるか、又はそれを含む。
【０１６６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＴＥＴ２遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１７６２８．４、転写バリアント２；配列番号３９）からなるか、又はそれを含む。
【０１６７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＴＥＴ２遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０６００９８．３、転写バリアント２；配列番号４０）からなるか、又はそれを含む。
【０１６８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＢＭＰ−７遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１７１９．２、転写バリアント１；配列番号４１）からなるか、又はそれを含む。
【０１６９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＢＭＰ−７遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１７１０．１、転写バリアント１；配列番号４２）からなるか、又はそれを含む。
【０１７０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＳＩＲＴ−１遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１２２３８．４、転写バリアント１；配列番号４３）からなるか、又はそれを含む。
【０１７１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＳＩＲＴ−１遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０３６３７０．２、転写バリアント１；配列番号４４）からなるか、又はそれを含む。
【０１７２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＳＩＲＴ−１遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１１４２４９８．１、転写バリアント２；配列番号４５）からなるか、又はそれを含む。
【０１７３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＳＩＲＴ−１遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１１３５９７０．１、転写バリアント２；配列番号４６）からなるか、又はそれを含む。
【０１７４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＳＩＲＴ−１遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１３１４０４９．１、転写バリアント３；配列番号４７）からなるか、又はそれを含む。
【０１７５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＳＩＲＴ−１遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００１３００９７８．１、転写バリアント３；配列番号４８）からなるか、又はそれを含む。
【０１７６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＧＣ１−α遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿００１３３０７５１、転写バリアント１；配列番号４９）からなるか、又はそれを含む。
【０１７７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＧＣ１α遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿００１３１７６８０：転写バリアント２；配列番号５０）からなるか、又はそれを含む。
【０１７８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＧＣ１−α遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿０１３２６１、転写バリアント２；配列番号５１）からなるか、又はそれを含む。
【０１７９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＧＣ１α遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿０３７３９３：転写バリアント２；配列番号５２）からなるか、又はそれを含む。
【０１８０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＧＣ１−α遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿００１３３０７５２．１、転写バリアント３；配列番号５３）からなるか、又はそれを含む。
【０１８１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＧＣ１α遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿００１３１７６８１．１、転写バリアント３；配列番号５４）からなるか、又はそれを含む。
【０１８２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＧＣ１−α遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿００１３３０７５３．１、転写バリアント４；配列番号５５）からなるか、又はそれを含む。
【０１８３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＰＧＣ１α遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿００１３１７６８２、転写バリアント４；配列番号５６）からなるか、又はそれを含む。
【０１８４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＳＰ−１遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿１３８４７３．２；配列番号５７）からなるか、又はそれを含む。
【０１８５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＳＰ−１遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿６１２４８２；配列番号５８）からなるか、又はそれを含む。
【０１８６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＦＧＦ−２１遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿０１９１１３．３；配列番号５９）からなるか、又はそれを含む。
【０１８７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＦＧＦ−２１遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿０６１９８６．１；配列番号６０）からなるか、又はそれを含む。
【０１８８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＵＣＰ１遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿０２１８３３．４；配列番号６１）からなるか、又はそれを含む。
【０１８９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＵＣＰ１遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿０６８６０５．１；配列番号６２）からなるか、又はそれを含む。
【０１９０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＤＤＩＴ−４遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿０１９０５８．３；配列番号６３）からなるか、又はそれを含む。
【０１９１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＤＤＩＴ−４遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿０６１９３１．１；配列番号６４）からなるか、又はそれを含む。
【０１９２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＭＥＴＴＬ３遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿０１９８５２．４；配列番号６５）からなるか、又はそれを含む。
【０１９３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＭＥＴＴＬ３遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿０６２８２６．２；配列番号６６）からなるか、又はそれを含む。
【０１９４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＦＧＦ１遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿０００８００．４；配列番号６７）からなるか、又はそれを含む。
【０１９５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＦＧＦ１遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿０００７９１．１；配列番号６８）からなるか、又はそれを含む。
【０１９６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＴＰ６３遺伝子は、核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＭ＿００１１１４９７８．１；配列番号６９）からなるか、又はそれを含む。
【０１９７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトＴＰ６３遺伝子は、アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿００１１０８４５０．１；配列番号７０）からなるか、又はそれを含む。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、対象又は患者という用語は、任意の脊椎動物を指し、例えば、ヒト及び他の霊長類（例えば、チンパンジー、並びに他の類人猿及びサル種）、農用動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ）、家畜哺乳類（例えば、イヌ及びネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、及びモルモットなどのげっ歯類）、及び鳥類（例えば、家禽、野生鳥、及び狩猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ類の鳥類、アヒル、ガチョウなど）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【０１９９】
本発明の別の実施形態は、ｍｉＲ−２２などのｍｉＲＮＡの阻害剤と、薬剤的に許容できる担体とを含む、医薬組成物、又は医薬組成物の使用である。臨床応用が企図されている場合、意図された用途に適した形態の医薬組成物が調製され得る。通常、これは、発熱物質（パイロジェン）、及びヒトや動物に有害であり得る他の不純物を実質的に含まない組成物を調製することを伴う。
【０２００】
１つの実施形態では、医薬組成物は、ｍｉＲ−２２を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを特に限定されない例とする、有効量のｍｉＲＮＡ阻害剤と、薬剤的に許容できる担体と、を含む。有効量とは、有益又は所望の臨床結果を奏するのに十分な量である。本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。何を有効量と見なすかの厳密な決定は、患者のサイズ、年齢、代謝障害の種類、及び阻害剤又は作動薬（特に限定されないが、例えば、アンタゴミル、発現コンストラクト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド二本鎖、などが挙げられる）の性質を含む、各患者の個々の要因に基づいて行われ得る。したがって、当業者は、本開示及び当該技術分野における知識から、用量を適宜確認することができる。例えば、その全体の内容が参照によって援用される医師用卓上参考書、第６６版、ＰＤＲネットワーク；２０１２年版（２０１１年１２月２７日）を参照して、用量を決定してもよい。
【０２０１】
有益又は所望の治療結果としては、阻害剤の投与が行われなかった場合に確認されるものと比較した場合の、特に、肥満度指数の減少、体重減少、又は代謝障害の存在と関連したマーカーの減少、が挙げられる。また、有益又は所望の治療結果としては、阻害剤の投与が行われなかった場合に確認されるものと比較した場合の、特に、代謝障害の低減と関連したマーカー又は遺伝子の存在の増加又は減少も挙げられる。いくつかの実施形態では、上記のマーカー又は遺伝子は、脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）、ＣＥＢＰα、及び／又はＰＰＡＲγ、ＡＬＫＢＨ５、及びＡＣＬＹである。いくつかの実施形態では、ＦＴＯ、ＣＥＢＰα、ＰＰＡＲα、ＡＣＬＹ、ＳＰ−１、ＰＧＣ１α、ＡＬＫＢＨ５、ＳＩＲＴ−１、ＴＰ６３、ＦＧＦ１、及び／又はＤＤＩＴ４の活性及び／又は発現に変動が生じる。いくつかの実施形態では、上記のマーカー又は遺伝子は、脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）である。
【０２０２】
発癌性ｍｉＲＮＡ機能のオリゴヌクレオチド阻害剤用、脂肪関連代謝及び合成経路標的のｍｉＲＮＡ作動薬をコードするポリヌクレオチド用、又は特定のｍｉＲＮＡ阻害物質若しくは作動薬を発現するコンストラクト用の送達媒体（送達ビヒクル）として、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、及びリポソームなどの脂質をベースとした系、などのコロイド分散系を用いることができる。本開示の核酸を脂肪組織（例えば、脂肪細胞）に送達するのに好適な市販の脂肪乳剤として、イントラリピッド（ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤＯ）、リポシン（ＬＩＰＯＳＹＮ）（登録商標）、リポシン（登録商標）ＩＩ、リポシン（登録商標）ＩＩＩ、ニュートリピッド（Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ）、及び他の同様の脂質乳剤が挙げられる。インビボで送達媒体として使用されるコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工の膜小胞）である。このような系の調製及び使用は、当該技術分野において周知である。例示的な製剤が、全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，９８１，５０５号；同第６，２１７，９００号；同第６，３８３，５１２号；同第５，７８３，５６５号；同第７，２０２，２２７号；同第６，３７９，９６５号；同第６，１２７，１７０号；同第５，８３７，５３３号；同第６，７４７，０１４号；及び国際公開第０３／０９３４４９号にも開示されている。
【０２０３】
送達媒体に安定性を付与し、標的細胞による取り込みを可能にするために、通常、適切な塩及び緩衝液の使用が望まれることとなる。本発明の水性組成物は、薬剤的に許容できる担体又は水性媒体に溶解又は分散した、阻害剤ポリヌクレオチドを含む送達媒体（例えば、リポソーム又は他の複合体又は発現ベクター）を有効量で含む。薬剤的に許容できる、又は薬理学的に許容できるという表現は、動物又はヒトに投与された場合に、有害反応も、アレルギー反応も、他の不都合な反応も引き起こさない、分子種及び組成物を指す。本明細書で使用される場合、薬剤的に許容できる担体としては、例えば、ヒトへの投与に好適な医薬品などの医薬品の製剤化での使用に許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗細菌剤、抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤などが挙げられる。薬剤的に活性な物質へのこのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が本発明の有効成分と相溶性がない場合を除き、治療用組成物中のその使用が企図される。補足的な有効成分を上記組成物に組み入れることもできるが、ただし、それらは組成物のベクターやポリヌクレオチドを不活性化しないものである。
【０２０４】
本発明の活性組成物は古典的な医薬製剤を含み得る。本発明のこれらの組成物の投与は、その経路を介して標的組織に到達可能である限り、いかなる一般的経路を介した投与であってもよい。これは、例えば、経口投与、経鼻投与、又は頬側投与が挙げられる。あるいは、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、又は静脈内注射によるものであってもよく、あるいは、脂肪組織への直接的な注射によるものであってもよい。本明細書で開示される薬剤は、カテーテルシステムで投与されてもよい。このような組成物は、通常、本明細書に記載されているような薬剤的に許容できる組成物として投与される。
【０２０５】
活性化合物は非経口投与又は腹腔内投与されてもよい。例として、遊離塩基又は薬理学的に許容できる塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水において調製され得る。グリセロール、液状ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物、並びに油中に分散系を調製することもできる。通常の保存及び使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために、保存剤を通常含有する。
【０２０６】
注射剤用途又はカテーテル送達に好適な剤形としては、例えば、無菌注射液又は無菌分散液を即時調製するための、無菌水溶液、無菌水性分散液、及び無菌粉末が挙げられる。通常、これらの製剤は無菌であり、且つ容易な注射が可能である程度に液状である。製剤は、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の混入行為から保護されているべきである。適切な溶媒又は分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、及び植物油を含有し得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合において必要な粒径の維持によって、及び、界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの種々の抗細菌剤及び抗真菌剤によって、微生物の作用を防止することができる。多くの場合、糖類又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に使用することで可能となる。
【０２０７】
無菌注射液は、適切な量の活性化合物を、適宜任意の他の成分（例えば上記で列挙した成分）と一緒に溶媒に混合し、その後濾過滅菌することで、調製することができる。通常、分散液は、種々の滅菌後活性成分を、基礎となる分散媒と、例えば上記で列挙されたような所望の他の成分と、を含有する無菌媒体中に混合することによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法として、真空乾燥法及び凍結乾燥法があり、これらにより、予め滅菌濾過した溶液から、任意の追加の所望成分を加えた有効成分の粉末が得られる。
【０２０８】
製剤後、液剤は、投与剤形に適合した方法で、且つ、治療効果のある量で、投与され得る。製剤は、注射液、薬剤放出カプセルなどの種々の剤形で容易に投与され得る。例えば、水溶液の状態での非経口投与の場合、通常、溶液は適切に緩衝化され、液体希釈剤は十分な食塩水又はグルコースなどでまず等張化される。静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与などには、このような水溶液が使用され得る。特に本開示を踏まえると、当業者に公知の通りに、無菌の水性媒体を使用することが好ましい。例として、一回量が１ｍｌの等張ＮａＣｌ液に溶解され、１０００ｍｌの皮下注射液に添加されるか、又は予定された注入部位に注射され得る（例えば、その内容が参照によって本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、頁１０３５〜１０３８及び頁１５７０〜１５８０を参照）。治療される対象の状態に応じて、いくらかの用量変動は必然的に生じることとなる。いずれの場合も、投与責任者が個々の対象に適した用量を決定するものとする。さらに、ヒト投与に投与する場合、製剤は、ＦＤＡ生物製剤基準（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）により規定されている、無菌性、発熱原性、一般的安全性、及び純度の基準を満たしていなければならない。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害の治療又は予防を必要とする対象の、代謝障害を治療又は予防する方法であって、第一のｍｉＲＮＡの第一の阻害剤と、第二のｍｉＲＮＡの第二の阻害剤とを対象に投与することを含み、上記第一のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２２であり、上記第二のｍｉＲＮＡは代謝関連遺伝子の制御因子である、上記方法を包含する。いくつかの実施形態では、第二のｍｉＲＮＡは公知のｍｉＲ阻害剤であり、特に限定されないが、例えば、その内容の全体が参照によって本明細書に援用される国際公開第２０１２／１４２３１３号に開示されているものが挙げられる。いくつかの実施形態では、第一の阻害剤及び第二の阻害剤は、どのような順番（例えば、第一から第二、又は第二から第一）で投与されてもよく、あるいは同時に投与されてもよい。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害の治療又は予防を必要とする対象の、代謝障害を治療又は予防する方法であって、ｍｉＲ−２２阻害剤であるかそれを含む第一の薬剤と、少なくとも１つの他の、代謝障害に対する生物製剤、治療薬、又は薬剤であるかそれを含む第二の薬剤と、を対象に投与することを含む、上記方法を包含する。いくつかの実施形態では、第一の阻害剤及び第二の阻害剤は、どのような順番（例えば、第一から第二、又は第二から第一）で投与されてもよく、あるいは同時に投与されてもよい。
【０２１１】
本発明はまた、ｍｉＲ−２２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの発癌性ｍｉＲＮＡの阻害剤などの、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を簡素化することができるキットを提供する。例示的な本発明のキットは、本明細書に記載の任意の組成物を単位剤形の形態で含む。１つの実施形態では、単位剤形は、無菌とすることができるプレフィルドシリンジなどの容器に、本明細書に記載の任意の薬剤と薬剤的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、又は媒体とを含有させたものである。キットには、本明細書に記載の任意の薬剤の使用を指導するラベル又は印刷された説明書をさらに含ませることができる。キットには、開瞼器、局所麻酔剤、及び投与部位洗浄剤を含ませてもよい。キットには、発癌性ｍｉＲＮＡの第二の阻害剤、又は本明細書に記載の生物製剤、治療薬、化学療法薬、若しくは薬剤などの、１又は複数の追加の薬剤をさらに含ませることができる。１つの実施形態では、キットは、有効量の本発明の組成物と、本明細書に記載されるものなどの、有効量の別の組成物と、を含有する容器を含む。
【実施例】
【０２１２】
本明細書で開示される本発明をより効率的に理解できるように、実施例を以下に記載する。これらの実施例が、説明のみを目的としており、いかなる形であれ、本発明を限定するものと解釈されるべきではないことは理解されるべきである。
【０２１３】
（実施例１：肥満症におけるｍｉＲ−２２の役割）
ｍｉＲ−２２はＰＴＥＮ及びＴＥＴを直接標的とし、腫瘍形成、転移、及び他の代謝障害を促す。ＰＴＥＮを標的とする６０種類を超えるｍｉＲＮＡと少なくとも３０種の新規の癌原遺伝子座がヒト癌で研究されている。ＰＴＥＮを標的とするｍｉＲＮＡは進化的に脊椎動物間で高度に保存されており、種々の組織で普遍的に発現されている（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ２００２；  Ｎｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＰＴＥＮの減少はワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起し、ＰＴＥＮの増加は抗ワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起するため、ｍｉＲ−２２は、ＰＴＥＮを標的とすることで、代謝において意味のある存在であり続けている。図２Ａ〜図２Ｄは、ｍｉＲ−２２の過剰発現がマウスの体重に影響を与えることを示している。
【０２１４】
ｍｉＲ−２２ノックアウト法
マウスの体重及び脂肪蓄積に対する影響がｍｉＲ−２２の高発現によるものかどうかを評価するために、また、その際のマウスの体重増加の差異及び食物消費の差異を評価するために、２か月齢（開始日）の野生型（Ｗｔ）マウス及びｍｉＲ−２２トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを、高脂肪（６０％）食下に置いた。マウスの体重を週に２回モニターし、食物利用を週に１回モニターした。（図３Ａ〜図３Ｃ及び図４Ａ〜図４Ｆを参照）。トランスジェニックｍｉＲ−２２（Ｔｇ）マウスは非食餌（Ｎｏｎ−Ｄｉｅｔ）（ＮＤ）下で肥満表現型を発現したが、一方で、ｍｉＲ−２２ノックアウト（ＫＯ）マウスは高脂肪食（ＨＦＤ）下で体重を増加させることができなかった。ｍｉＲ−２２欠失細胞であるマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）は、脂肪細胞に分化する能力の障害を示した。この表現型は、脂肪細胞分化や広く脂肪代謝に関連した種々の遺伝子のパネルにおける、遺伝子発現の差異と相関していた。さらに、結果から、ｍｉＲ−２２の体重増加に対する影響がレプチン（又はレプチン様分子）に非依存的であることが示されている（図５Ａ〜図５Ｄ及び図６を参照）。
【０２１５】
（実施例２：肥満の治療法としてのｍｉＲ−２２の阻害）
抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡは全て、ヒト及びマウスの両方で有用である。宿主遺伝子はヒトとマウスの間で４９％の相補性を示し、抗ＨＧ−ｍｉＲ−２２  ＬＮＡはヒトにおいて優位に働く。
【０２１６】
抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の設計
ＬＮＡは、シード配列を包含し、８ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長であり、許容される長さ特異的なＬＮＡ部分を有し、ｍｉＲ−２２に対する結合親和性が可能な限り高くなるように、設計した。
【０２１７】
ＬＮＡの、導入試薬補助下の取り込み（ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）（Ｌｉｐｏ２００トランスフェクション）用のプロトコルの最適化により、この配列をアッセイで確認し、接着細胞株、ＦＡＭ標識ＬＮＡを使用し、その生物学的効果を、接着細胞株の、導入試薬補助下の取り込み（ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）及び導入試薬非補助下の取り込み（ｕｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）において最も強力な抗ｍｉＲ−２２を特定することにより検証した（処理前後のｍｉＲ−２２レベル、並びにＴＥＴ２の活性及びタンパク質レベルの分析）。この目的は、インビボ処置での使用において最も強力な抗ｍｉＲを用いて、マウスモデルで抗ｍｉＲを使用することであり、確認の結果については図３３Ａ〜図３３Ｃを参照されたい。下記の配列において、大文字はＬＮＡ修飾を受けており、小文字は未修飾である。ｍｉＲ−２２（配列番号１）及び抗ｍｉＲ−２２オリゴヌクレオチド（配列番号２〜配列番号１０）の向きは、５’→３’の向きである。図８は、ｍｉＲ−２２へのハイブリダイゼーション時の配向となるように、抗ｍｉＲ−２２オリゴヌクレオチドを３’→５’方向で示している。５’→３’方向の配列番号１１及び配列番号１２のオリゴヌクレオチドは、スクランブル配列であり、ｍｉＲ−２２（配列番号１）にハイブリダイズしない。
【０２１８】
【表３】
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【０２１９】
インビボにおける抗ｍｉＲ−２２療法
予防を目的としたインビボ実験計画において、図９を参照して、高脂肪食（ＨＦＤ）下にある２か月齢のｍｉＲ−２２−／−及びＷＴに、ビヒクル（ＶＣＨ）、スクランブルコントロールＲＮＡ（ＳＣＲ）、及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）をトランスフェクトし、腹腔内（ＩＰ）投与による導入試薬非補助下の取り込み（ｕｎａｓｓｉｓｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）で、初期量２０ｍｇ／ｋｇ（初回）及び週１回の維持用量１０ｍｇ／ｋｇで処置した。処置マウスと非処置マウスの摂食量に差異は無かった（図１０参照）。インビボにおけるｍｉＲ−２２の薬理学的阻害はマウスが肥満になることを予防し、さらに、インビボにおける抗ｍｉＲ−２２療法は肝臓内の主要なｍｉＲ−２２標的のタンパク質レベルを増加させることができた。抗ｍｉＲ−２２処置は肝臓の脂質組成に影響を与えなかったが、脂肪肝を大いに抑制した。
【０２２０】
処置群マウス及び無処置群マウスにおける、脂肪代謝、合成、分化の遺伝子発現の可能性を評価するため、ＶＨＬ、ＳＣＲ  ＬＮＡ又は抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡで処置されたマウスから、肝臓、白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）由来のＲＮＡを抽出し、脂肪関連性の代謝及び合成経路に関与しているＴＥＴ２、ＰＴＥＮ（ポジティブコントロール）、ＦＴＯ、ＣＥＢＰα、ＰＰＡＲγ、並びにＵＣＰ１及びＣＤ３６（褐色脂肪細胞マーカーとして）のｍＲＮＡ発現を測定した（図１２参照）。
【０２２１】
治療アプローチでは、ｍｉＲ−２２−／−マウス及びＷＴマウスを高脂肪食（ＨＦＤ）下に置き、抗ｍｉＲ−２２−ＬＮＡ、ＳＣＲ、及びＶＨＬで処置し、第二のＨＦＤ処置下に置いた。治療の３．５か月後、ＨＦＤを給餌された肥満マウス（平均体重４０ｇ超）において、有意な体重減少が確認された。マウスを屠殺し、組織を摘出し、肝臓から得たＲＮＡをＲＮＡｓｅｑに用いた（図１６Ａ〜図１６Ｃ、図１７）。ｍｉＲ−２２の薬理学的阻害によって、マウスの肥満表現型が元に戻されることが示された（図１８）。図１９Ａ〜図１９Ｃは、マウス肝臓からの階層クラスター分析を示すＲＮＡシークエンシングプロットであり、ｍｉＲ−２２の薬理学的阻害と遺伝子ノックアウト（ＫＯ）とが密集していることを示しており、これは、上記の処置がオンターゲットで行われていることと、ＬＮＡコンストラクトを用いることでＫＯ表現型を模倣できることを示している。そして図２０は、マウス肝臓における遺伝子オントロジー解析を示すＲＮＡシークエンシングプロットであり、ＫＯマウス及びＬＮＡ処置マウスにおけるトップダウンの被調節経路が、脂質の代謝及び生合成に関連したものであることが示されている。インビボにおける抗ｍｉＲ−２２療法によってＡＣＬが強くダウンレギュレートされ、ｍｉＲ−２２の薬理学的阻害がＭＥＦの脂肪細胞分化を障害するのに有効であることが示された。
【０２２２】
これらの結果は、抗ｍｉＲ−２２療法が、高脂肪食（ＨＦＤ）給餌時のマウスの体重増加を予防すること、ＨＦＤを給餌された肥満マウスの肥満表現型を元に戻すこと、摂食量には影響を与えないこと、並びに、インビボで肝臓及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）を効率的に標的とすること、を示している。さらに、抗ｍｉＲ−２２治療は、ｍｉＲ−２２標的遺伝子のタンパク質レベルに影響を与え、いかなる特定の脂質クラスにも影響を与えずに、マウスにおける全体的な脂質総量を減少させることができる。
【０２２３】
（実施例３：ｍｉＲ−２２は肥満症及び脂肪量・肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）を調節する）
ｍｉＲ−２２はＰＴＥＮ及びＴＥＴを直接標的とし、腫瘍形成及び転移を促す。ＰＴＥＮは、ＳＩＲＴ−１、ＢＭＰ−７、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ、ＳＰ−１、ＰＧＣ１α、ＦＧＦ−２１、ＵＣＰ１、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３、及びＤＤＩＴ４などを含む他の多くのｍｉＲ−２２標的遺伝子と同様、代謝と脂肪酸の酸化又は生合成に関与している。脂肪分化誘導の際に、ＦＴＯの発現は、ｍｉＲ−２２欠損ＭＥＦでは大きくダウンレギュレートされたが、ＷＴ  ＭＥＦではダウンレギュレートされなかった（図２６）。ｍｉＲ−２２のダウンレギュレーション（遺伝子的又は薬理学的）は、ＲＮＡ  ｍ６Ａのレベルを増加させた（図２７Ａ〜図２７Ｂ）。老齢時に、ｍｉＲ−２２のダウンレギュレーションは、肝機能に影響を与えないことと、いかなる肝臓関連の疾患も機能障害も示さないことが示された（図２８Ａ〜図２８Ｂ、図２９）。
【０２２４】
ｍｉＲ−２２の過剰発現が肝機能、脂肪肝及び肝線維症に影響を与えるかどうかを評価するため、８〜１０か月齢のマウスに通常食を給餌した。ｍｉＲ−２２過剰発現（ＯＥ）は、脂肪肝をもたらし、ＦＳＰ−１陽性細胞の存在を増加させることが示された。ＦＳＰ−１により、線維症に関連した、肝臓内のマクロファージ亜集団が同定される。
【０２２５】
全体として、ｍｉＲ−２２は発癌性ｍｉＲ（ｏｎｃｏ−ｍｉＲ）（ＰＴＥＮ標的、ＭＥＦ形質転換、ＥＭＴ）であり、ｍｉＲ−２２はヒト及びマウスで１００％保存されており、ｍｉＲ−２２の過剰発現（ＯＥ）は通常食（ＮＤ）下で肥満表現型をもたらし、ｍｉＲ−２２  ＫＯマウスはＨＦＤ下で体重を増加させず、ｍｉＲ−２２の薬理学的サイレンシングはＭＥＦ及びヒトＭＥＳの脂肪細胞への分化を障害し、抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡ処置は予防の条件下でマウスが肥満化すること予防し、抗ｍｉＲ−２２  ＬＮＡ処理はＨＦＤを給餌された肥満マウスの肥満表現型を元に戻し、ｍｉＲ−２２のサイレンシングはいかなる肝臓毒性も示さず、ｍｉＲ−２２のサイレンシングは肝臓の脂肪変性及び線維症化を予防し、ｍｉＲ−２２は代謝及び脂質の生合成に関連した複数の遺伝子を同時に標的にすることができる。
【０２２６】
他の実施形態
本開示をその詳細な説明と関連させて説明してきたが、上記の説明は例示を意図しており、本開示の範囲の限定は意図しておらず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定されることを理解されたい。他の態様、利点、及び変更形態も下記の特許請求の範囲に包含される。
【０２２７】
参照による援用
本明細書で参照された全ての特許及び公報は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。
【０２２８】
本明細書に記載された刊行物は、単に本願の出願日に先立つ開示として提供されている。本明細書における何ものも、先行発明の理由で、本発明が係る刊行物に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。
【０２２９】
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に構成のみを目的としており、本開示の限定は全く意図していない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
2021518841.tif 000063
【図２８Ｄ】
2021518841.tif 000064
【図２９】
2021518841.tif 000065
【図３０】
2021518841.tif 000066
【図３１】
2021518841.tif 000067
【図３２】
2021518841.tif 000068
【図３３Ａ】
2021518841.tif 000069
【図３３Ｂ】
2021518841.tif 000070
【図３３Ｃ】
2021518841.tif 000071
【図３４Ａ】
2021518841.tif 000072
【図３４Ｂ】
2021518841.tif 000073
【図３４Ｃ】
2021518841.tif 000074
【配列表】
2021518841000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年1月14日(2021.1.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ａ】
2021518841.tif 000075
【図１Ｂ】
2021518841.tif 000076
【図１Ｃ】
2021518841.tif 000077
【図２Ａ】
2021518841.tif 000078
【図２Ｂ】
2021518841.tif 000079
【図２Ｃ】
2021518841.tif 000080
【図２Ｄ】
2021518841.tif 000081
【図３Ａ】
2021518841.tif 000082
【図３Ｂ】
2021518841.tif 000083
【図３Ｃ】
2021518841.tif 000084
【図４Ａ】
2021518841.tif 000085
【図４Ｂ】
2021518841.tif 000086
【図４Ｃ】
2021518841.tif 000087
【図４Ｄ】
2021518841.tif 000088
【図４Ｅ】
2021518841.tif 000089
【図４Ｆ】
2021518841.tif 000090
【図５Ａ】
2021518841.tif 000091
【図５Ｂ】
2021518841.tif 000092
【図５Ｃ】
2021518841.tif 000093
【図５Ｄ】
2021518841.tif 000094
【図６】
2021518841.tif 000095
【図７Ａ】
2021518841.tif 000096
【図７Ｂ】
2021518841.tif 000097
【図８】
2021518841.tif 000098
【図９】
2021518841.tif 000099
【図１０】
2021518841.tif 000100
【図１１Ａ】
2021518841.tif 000101
【図１１Ｂ】
2021518841.tif 000102
【図１２】
2021518841.tif 000103
【図１３Ａ】
2021518841.tif 000104
【図１３Ｂ】
2021518841.tif 000105
【図１４Ａ】
2021518841.tif 000106
【図１４Ｂ】
2021518841.tif 000107
【図１５Ａ】
2021518841.tif 000108
【図１５Ｂ】
2021518841.tif 000109
【図１５Ｃ】
2021518841.tif 000110
【図１６Ａ】
2021518841.tif 000111
【図１６Ｂ】
2021518841.tif 000112
【図１６Ｃ】
2021518841.tif 000113
【図１７】
2021518841.tif 000114
【図１８】
2021518841.tif 000115
【図１９Ａ】
2021518841.tif 000116
【図１９Ｂ】
2021518841.tif 000117
【図１９Ｃ】
2021518841.tif 000118
【図２０】
2021518841.tif 000119
【図２１】
2021518841.tif 000120
【図２２】
2021518841.tif 000121
【図２３】
2021518841.tif 000122
【図２４Ａ】
2021518841.tif 000123
【図２４Ｂ】
2021518841.tif 000124
【図２５】
2021518841.tif 000125
【図２６】
2021518841.tif 000126
【図２７Ａ】
2021518841.tif 000127
【図２７Ｂ】
2021518841.tif 000128
【図２８Ａ】
2021518841.tif 000129
【図２８Ｂ】
2021518841.tif 000130
【図２８Ｃ】
2021518841.tif 000131
【図２８Ｄ】
2021518841.tif 000132
【図２９】
2021518841.tif 000133
【図３０】
2021518841.tif 000134
【図３１】
2021518841.tif 000135
【図３２】
2021518841.tif 000136
【図３３Ａ】
2021518841.tif 000137
【図３３Ｂ】
2021518841.tif 000138
【図３３Ｃ】
2021518841.tif 000139
【図３４Ａ】
2021518841.tif 000140
【図３４Ｂ】
2021518841.tif 000141
【図３４Ｃ】
2021518841.tif 000142
【国際調査報告】
2021518841.tif 000143
2021518841.tif 000144