(57)【要約】  グルクロニル化タンパク質医薬品を特定するための組成物および方法が提供されている。2021512280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する方法であって、
前記タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、
前記脱グリコシル化したタンパク質医薬品を処理して、非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のＦｃ／２断片を含む一つのＦｃ＊断片、および一つのＦａｂ２を含む一つのＦａｂ２断片を生成することと、
イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記Ｆｃ＊複合体およびＦａｂ２複合体を、Ｆｃ＊およびＦａｂ２の酸性画分へと分離することと、
前記酸性画分を乾燥および変性させることと、
前記酸性画分をアルキル化することと、
前記酸性画分をトリプシンで消化してサンプルを形成することと、
前記サンプルをＮａＢＨ４でインキュベートして、還元されたサンプルを形成することと、
前記還元されたサンプルを、逆相液体クロマトグラフィー／マススペクトル分析に供して前記タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間でマススペクトル分析を比較して、前記還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質医薬品がモノクローナル抗体を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｆｃ＊断片およびＦａｂ２断片が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の組換えによって修飾された形態のＩｄｅＳを使用して形成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン交換クロマトグラフィーが強力な陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記酸性画分が、ヨードアセトアミドでアルキル化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のアミノ酸の１０％未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
【請求項８】
前記治療用タンパク質のアミノ酸の５％未満がグルクロニル化されている、請求項７に記載のタンパク質医薬品。
【請求項９】
前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、請求項７または８に記載のタンパク質医薬品。
【請求項１０】
前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、請求項７〜９のいずれか一項に記載のタンパク質医薬品。
【請求項１１】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項１０に記載のタンパク質医薬品。
【請求項１２】
治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のリジンアミノ酸の３％未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
【請求項１３】
タンパク質医薬品の純度を増加させる方法であって、
前記タンパク質医薬品を分析して、前記タンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、
グルクロニル化タンパク質を前記タンパク質医薬品から除去して、精製されたタンパク質医薬品を生成することと
を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記グルクロニル化タンパク質が高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記クロマトグラフィー技法が、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記クロマトグラフィー技法がマススペクトル分析と組み合わされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法であって、
グルクロニル化のために哺乳類細胞培養物から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることを含み、前記タンパク質医薬品の前記グルクロニル化の存在が、前記タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す、前記方法。
【請求項２１】
前記哺乳類細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記グルクロニル化が前記タンパク質医薬品のリジンアミノ酸上にある、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質医薬品が、抗体または融合タンパク質である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して、治療用タンパク質に対する翻訳後修飾を特定するシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
医薬品業界において、組換え型モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はタンパク質治療薬の主要なクラスを構成する。ｍＡｂ構造への変化は、治療用ｍＡｂの治療効果、バイオアベイラビリティ、クリアランス、免疫原性特性に影響を与える場合がある。さらに、ｍＡｂの変化は、薬物安全性および薬物有効性を変える可能性がある。ｍＡｂの一次構造、翻訳後修飾（ＰＴＭ）、ジスルフィド結合を包括的に特性化することは、薬物有効性および薬物安全性の評価にとって重要であるだけでなく、構造／機能の関係を理解するために重要である。
【０００３】
製品およびプロセスの一貫性を確保するために使用される様々なアッセイの中でも、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、ｍＡｂ分子の荷電多様性を評価するための一般的に使用される技法である。ｍＡｂ荷電バリアントは、ｍＡｂ分子の表面荷電を変えることができる翻訳後修飾（ＰＴＭ）に起因する場合がしばしばある。かつてないほど進歩しているＬＣ−ＭＳ技法のため、数多くの既知または新規のＰＴＭが特定されている。さらに、これらによる荷電多様性への寄与が解明されてきた。技術の進歩は多数の新規のＰＴＭを提供してきたが、ｍＡｂ活性および安定性を変えるＰＴＭをさらに特性化し、発見する必要性がある。
【０００４】
従って、ＰＴＭを特定するためのシステムおよび方法を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００５】
グルクロニル化タンパク質医薬品を特定するための組成物および方法が提供されている。一実施形態は、一つのＦｃ＊断片（非共有相互作用を介して結合された二つの同一のＦｃ／２断片）および一つのＦａｂ２を生成するために、タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、脱グリコシル化したタンパク質医薬品を酵素（例えば、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））で処理することとによって、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する方法を提供する。次いで、Ｆｃ＊断片およびＦａｂ２断片は、Ｆｃ＊およびＦａｂ２の酸性画分へと分離される。一実施形態において、Ｆｃ＊断片およびＦａｂ２断片は、イオン交換クロマトグラフィー、例えば強力な陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して分離される。分離されると、酸性画分は収集され、乾燥され、かつ変性される。乾燥され、かつ変性された酸性画分はアルキル化され、次いでトリプシンで消化されてサンプルを形成する。次いで、サンプルはＮａＢＨ４で処理されて、還元されたサンプルを形成する。次いで、還元されたＦｃ＊サンプルおよび還元されたＦａｂ２サンプルの両方は、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定するために、逆相液体クロマトグラフィー／マススペクトル分析に供される。一実施形態において、方法は、マススペクトル分析の結果を還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間で比較して、還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程を含む。医薬品は、モノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。一実施形態において、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で検出される。
【０００６】
一実施形態において、Ｆｃ＊断片およびＦａｂ２断片は、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）の名称で販売されている、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の組換えによって修飾された形態のＩｄｅＳを使用して形成される。
【０００７】
開示された方法は、例えばモノクローナル抗体またはその他の治療用タンパク質などのタンパク質医薬品の純度をモニターするために使用することができる。一実施形態は、タンパク質医薬品を分析してタンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、タンパク質医薬品からグルクロニル化したタンパク質を除去して精製したタンパク質医薬品を生成することとによって、タンパク質医薬品の純度を増加させる方法を提供する。グルクロニル化は、上記および実施例に説明した方法を使用して検出することができる。一実施形態において、グルクロニル化タンパク質は、マススペクトル分析と随意に組み合わされる高速液体クロマトグラフィー技法によって検出される。代表的なクロマトグラフィー技法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。典型的に、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で生じる。
【０００８】
別の実施形態は、グルクロニル化のために哺乳類細胞培養から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることによって、翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法を提供し、タンパク質医薬品のグルクロニル化の存在は、タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す。哺乳類細胞培養は典型的に、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含有する。
【０００９】
さらに別の実施形態は、治療用タンパク質を含有するタンパク質医薬品を提供し、治療用タンパク質のアミノ酸の１．０％未満、２．０％未満、３．０％未満、４．０％未満、５．０％未満、６．０％未満、７．０％未満、８．０％未満、９．０％未満、または１０％未満がグルクロニル化されている。一実施形態において、アミノ酸はリジンである。典型的に治療用タンパク質は、モノクローナル抗体、組換え型タンパク質、または融合タンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】図１Ａ〜Ｃは、例示的なｍＡｂのＦａｂ２荷電バリアント分析を示すクロマトグラムである。
【図１−２】図１Ｄ〜Ｆは、例示的なｍＡｂのＦａｂ２荷電バリアント分析を示すクロマトグラムである。
【図１−３】図１Ｇ〜Ｉは、例示的なｍＡｂのＦｃ荷電バリアント分析を示すクロマトグラムである。
【図１−４】図１Ｊ〜Ｋは、例示的なｍＡｂのＦｃ荷電バリアント分析を示すクロマトグラムである。
【図１−５】図１Ｌ〜Ｎは、例示的なｍＡｂのＦｃ荷電バリアント分析を示すクロマトグラムである。
【図１−６】図１Ｏ〜Ｐは、例示的なｍＡｂのＦｃ荷電バリアント分析を示すクロマトグラムである。
【図２】図２は、酸性Ｆｃ、塩基性Ｆｃ、および酸性Ｆａｂ２分離を示すクロマトグラムである。
【図３】図３Ａは、ＮａＢＨ４処理を用いないサンプルのＭＳ２断片化パターンを示す。図３Ｂは、ＮａＢＨ４処理を用いたサンプルのＭＳ２断片化パターンを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＷＣＸカラムを使用したクロマトグラムである。矢印は強制グルクロン酸処理を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｆａｂ２対照の結果を示すグラフである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、グルクロン酸で処理されたＦａｂ２の結果を示すグラフである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、Ｆｃ対照の結果を示すグラフである。
【図４Ｅ】図４Ｅは、グルクロン酸で処理されたＦｃの結果を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、既存のグルクロニル化を示す天然サンプルからのクロマトグラムである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、強制グルクロニル化を示すグルクロン酸で処理されたサンプルからのクロマトグラムである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、既存のグルクロニル化のＭ２断片化パターンの結果を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、グルクロン酸で処理されたサンプルのＭ２断片化パターンの結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、第二のサンプルからのクロマトグラムである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、強制グルクロニル化を示すグルクロン酸で処理された第二のサンプルからのクロマトグラムである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、既存のグルクロニル化のＭ２断片化パターンの結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、グルクロン酸で処理されたサンプルのＭ２断片化パターンの結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、第三のサンプルからのクロマトグラムである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、強制グルクロニル化を示すグルクロン酸で処理された第三のサンプルからのクロマトグラムである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、既存のグルクロニル化のＭ２断片化パターンの結果を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、グルクロン酸で処理されたサンプルのＭ２断片化パターンの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を意味することを意図する。「可変領域」という用語は、免疫グロブリンのかかるドメインを、抗体（抗体Ｆｃドメインなど）によって広く共有されるドメインと区別することを意図する。可変領域は「超可変領域」を含み、その残基は抗原結合に関与する。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち典型的に、おおよそ軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびにおおよそ重鎖可変ドメイン内の残基２７〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）にある；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、および／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される通りの、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、標的物質に特異的に結合する同一の免疫細胞によって作製される抗体を指す。ｍＡｂは、がん、関節炎、喘息、大腸炎、自己免疫疾患、および感染症が挙げられるがこれらに限定されない、種々の疾患に対する治療薬として、ますます人気が高まってきている。ｍＡｂは、１５０ｋＤａに近い分子量を含む大きいタンパク質であり、かつ二つの同一の約５０ｋＤａの重鎖（ＨＣ）および二つの同一の約２５ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）から構成される。これらはまた、三次元構造および生物学的活性を維持する少なくとも１６個のジスルフィド結合を含有する。類似の二次タンパク質構造を共有するが、異なるｍＡｂは、可変領域の配列で大きく異なっていて、特に抗体−抗原結合の多様性および特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）において大きく異なる。
【００１３】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗体の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と、随意に抗体の「可変領域」抗原認識部位を含むフレームワーク残基とを含有し、また抗原に免疫特異的に結合する能力を示す、抗体の一つ以上の部分を指す。かかる断片としては、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、およびその突然変異体、自然発生バリアント、および融合タンパク質が挙げられ、抗体の「可変領域」抗原認識部位および異種タンパク質（例えば、毒素、異なる抗原の抗原認識部位、酵素、受容体、または受容体リガンド等）が含まれる。
【００１４】
本明細書で使用される「イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）」は、それらの総電荷に基づいてイオン化可能な分子を分離する方法を指す。タンパク質は、正に荷電した化学基と負に荷電した化学基との両方から作り出される。環境のｐＨに応じて、タンパク質は正味の正電荷を運ぶこと、または正味の負電荷を運ぶこと、またはいかなる電荷も運ばないことができる。分子が正味の電荷を有しないときのｐＨは、等電点（ｐＩ）と呼ばれる。対象のタンパク質の正味の電荷は、分子の一次配列に基づいて計算することができる等電点とバッファのｐＨとを組み合わせることによって計算される。ＩＥＸカラムに特定のｐＨでサンプルが装填された時に、適切に荷電されたタンパク質はすべて、カラム内の樹脂に結合する。例えば、正味の負電荷を有するタンパク質は、陰イオン交換樹脂カラムによって捕捉される。
【００１５】
本明細書で使用される「電荷バリアント」とは、修飾されていない形態と比較して、等電点（ｐＩ）または電荷を変えたアイソフォームおよびタンパク質バリアントを指す。比較的より低いｐＩを有する電荷バリアントは、「酸性バリアント」と称される一方、比較的より高いｐＩを有する電荷バリアントは「塩基性バリアント」と称される。電荷バリアントは抗体の特性に影響を及ぼす可能性がある（タンパク質または細胞膜標的に結合するｍＡｂの能力を変化させることを含む）。これは、抗体の組織浸透、組織分布、および薬物動態に影響を与える可能性がある。電荷バリアントの例としては、脱アミド化、Ｎ末端ピログルタミン酸の形成、凝集、異性化、シアル酸付加グリカン、抗体断片化、およびリジン残基での糖化が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
本明細書で使用される「翻訳後修飾（ＰＴＭ）」とは、タンパク質生合成後のタンパク質上の一つ以上のアミノ酸に生じる生化学的修飾を指す。ＰＴＭは、タンパク質折り畳みの調節を介して、特定の細胞区画へのタンパク質の標的化、またはリガンドとその他のタンパク質の間の相互作用の調節を介して、細胞機能において主要な役割を果たす。最も一般的な修飾は、前駆体タンパク質の特異的切断、ジスルフィド結合の形成、または低分子量基の共有結合的付加もしくは除去であり、それ故にアセチル化、アミド化、ビオチン化、システイニル化、脱アミド化、ファルネシル化、ホルミル化、ゲラニル化、グルタチオン化、糖化（炭水化物との非酵素的抱合）、グリコシル化（炭水化物との酵素的抱合）、ヒドロキシル化、メチル化、モノＡＤＰリボシル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、リン酸化、ポリＡＤＰリボシル化、ステアロイル化または硫酸化などの修飾につながる。ユビキチン化は、タンパク質分解経路において重要な別の一般的なＰＴＭである。一部のＰＴＭは、脱抱合酵素の作用によって可逆的である。
【００１７】
本明細書で使用される「Ｎ結合グリコシル化」とは、翻訳後タンパク質修飾を指す。Ｎ結合グリコシル化は、窒素原子へのオリゴ糖の付着であり、通常はアスパラギン残基のＮ４である。すべてのＮ結合炭水化物は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびアミノ酸アスパラギンを介して連結される。
【００１８】
本明細書で使用される「ペプチドマッピング」とは、タンパク質を特性化し、かつそれらの一次アミノ酸構造を解明する技法を指す。モノクローナル抗体およびその他の組換え型タンパク質医薬品を特性化するために広く利用される技法である。
【００１９】
本明細書で使用される「グルクロン酸化」とは、補助因子ＵＤＰ−グルクロン酸に由来するグルクロン酸が求核性官能基を含有する基質に共有結合している抱合反応を指す。
【００２０】
ＩＩ．グルクロニル化を特定する方法およびその使用方法
Ａ． グルクロニル化の特定
グルクロニル化タンパク質医薬品を特定するための組成物および方法が提供されている。実施例１〜３は、治療用タンパク質中のグルクロニル化アミノ酸を検出および特定するために使用される方法の詳細な説明を提供する。一般的に、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定するための一つの方法は、一つのＦｃ＊断片（非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のＦｃ／２断片）および一つのＦａｂ２断片を生成するために、タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、脱グリコシル化したタンパク質医薬品をＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）で処理することとを含む。一実施形態において、Ｆｃ＊断片およびＦａｂ２断片は、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）の名称で販売されている、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の組換え型ＩｄｅＳ酵素を使用して生成される。
【００２１】
次いで、Ｆｃ＊断片およびＦａｂ２断片は、Ｆｃ＊およびＦａｂ２の酸性画分へと分離される。一実施形態において、Ｆｃ＊断片およびＦａｂ２断片は、イオン交換クロマトグラフィー、例えば強力な陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して分離される。実施例１に記載の通り、脱グリコシル化されたｍＡｂサンプル（約５０μｇ）のアリコートを、質量測定のために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＥＭＲ質量分析計、またはＴｈｅｒｍｏ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｓ質量分析計に連結されたＹＭＣ−ＢｉｏＰｒｏ  ＳＰ−Ｆ強力陽イオン交換（ＳＣＸ）カラム（１００×４．６ｍｍ）に注入した。サンプルを分離し、そして酢酸アンモニウムベースの緩衝液（緩衝液Ａ：２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．８、緩衝液Ｂ：２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．６）を用いたｐＨ勾配で２０分間にわたり溶出した。質量検出のための質量分析計の前に分析流量を約２μＬ／分へと減少させるために、分析スプリッター（約２００：１の比率）をＳＣＸカラムの後に接続した。スプリッターからの高流量を、同時ＵＶ検出（２８０ｎｍ）のために、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器に迂回させた。結果として、酸性のショルダーピークが検出され、これはおおよそ１７６Ｄａの質量増加があった抗体のバリアントに起因する。
【００２２】
分離されると、酸性画分は収集され、乾燥され、かつ変性される。一実施形態において、収集された酸性画分は最初にＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）内で乾燥され、次いで５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、８Ｍの尿素、および１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する２０μＬの溶液中で、５０℃にて３０分間の加熱によって変性され、かつ還元された。当然のことながら、当業者は、酸性画分を乾燥および変性するために、その他の還元剤、変性剤、および温度を使用することができることを理解するであろう。
【００２３】
乾燥され、かつ変性された酸性画分はアルキル化され、次いで酵素的に（例えば、トリプシンで）消化されてサンプルを形成する。酸性画分は、それらを１０ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）中で室温にて暗所で３０分間インキュベートすることによってアルキル化することができる。画分の消化は、これらを１７５μＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈し、そして１：１０（ｗ／ｗ）の酵素対基質比で３７℃にて４時間、トリプシンを加えることによって達成することができる。
【００２４】
次いで、トリプシン消化酸性画分を５０ｍＭのＮａＢＨ４で３７℃にて１時間インキュベートし、その後１０％のギ酸（ＦＡ）でクエンチして還元されたサンプルを形成する。次いで、還元されたサンプルを、逆相液体クロマトグラフィー／マススペクトル分析に供して、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する。一実施形態において、方法は、マススペクトル分析の結果を還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間で比較して、還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程を含む。医薬品は、モノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。一実施形態において、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で検出される。
【００２５】
Ｂ．タンパク質医薬品の純度を増加させる方法
開示された方法は、例えばモノクローナル抗体またはその他の治療用タンパク質などのタンパク質医薬品の純度をモニターするために使用することができる。一実施形態は、タンパク質医薬品を分析してタンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、タンパク質医薬品からグルクロニル化したタンパク質を除去して精製したタンパク質医薬品を生成することとによって、タンパク質医薬品の純度を増加させる方法を提供する。グルクロニル化は、上記および実施例に説明した方法を使用して検出することができる。一実施形態において、グルクロニル化タンパク質は、マススペクトル分析と随意に組み合わされる高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される。代表的なクロマトグラフィー技法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。典型的に、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で生じる。
【００２６】
別の実施形態は、グルクロニル化のために哺乳類細胞培養から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることによって、翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法を提供し、タンパク質医薬品のグルクロニル化の存在は、タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す。哺乳類細胞培養は典型的に、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含有する。
【００２７】
Ｃ．タンパク質医薬品
さらに別の実施形態は、治療用タンパク質を含有するタンパク質医薬品を提供し、治療用タンパク質のアミノ酸の１．０％未満、２．０％未満、３．０％未満、４．０％未満、５．０％未満、６．０％未満、７．０％未満、８．０％未満、９．０％未満、または１０％未満がグルクロニル化されている。グルクロニル化パーセントは、開示された方法を使用して決定することができる。一実施形態において、アミノ酸はリジンである。典型的に、治療用タンパク質は、モノクローナル抗体、または融合タンパク質である。
【００２８】
タンパク質医薬品は、抗体もしくはその抗原結合断片、組換え型タンパク質、または融合タンパク質であり得る。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
【実施例】
【００２９】
実施例１：抗体インタクトレベルでの修飾特定
方法
ｍＡｂはオンラインＩＥＸ−ＭＳ分析に供された。脱グリコシル化されたｍＡｂサンプル（約５０μｇ）のアリコートを、質量測定のために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＥＭＲ質量分析計、またはＴｈｅｒｍｏ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｓ質量分析計に連結されたＹＭＣ−ＢｉｏＰｒｏ  ＳＰ−Ｆ強力陽イオン交換（ＳＣＸ）カラム（１００×４．６ｍｍ）に注入した。サンプルを分離し、そして酢酸アンモニウムベースの緩衝液（緩衝液Ａ：２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．８、緩衝液Ｂ：２００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．６）を用いたｐＨ勾配で２０分間にわたり溶出した。質量検出のための質量分析計の前に分析流量を約２μＬ／分へと減少させるために、分析スプリッター（約２００：１の比率）をＳＣＸカラムの後に接続した。スプリッターからの高流量を、同時ＵＶ検出（２８０ｎｍ）のために、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器に迂回させた。
【００３０】
結果
結果として、酸性のショルダーピークが検出され、これはおおよそ１７６Ｄａの質量増加があった抗体のバリアントに起因する。しかしながら、インタクトレベルでの質量測定は正確ではなかった。これは同じ酸性ショルダーピークにおいて溶出され、かつ質量（１６２Ｄａ）が近い糖化修飾からの複雑な要因のためである。
【００３１】
実施例２：抗体サブドメインレベルでの新規の酸性修飾の検出
方法
主ピークに対する酸性ピークの解像度を増加させ、かつ質量測定の精度を改善するために、脱グリコシル化ｍＡｂサンプルを、二つのヒンジ領域ジスルフィド結合のＣ末端にて重鎖を切断する酵素であるＦａｂＲＩＣＡＴＯＲで処理した。
【００３２】
結果
この処理は、一つのＦａｂ２断片および非共有相互作用（Ｆｃ＊）を介して一緒に結合された二つの同一のＦｃ／２断片の生成をもたらした。消化のアリコートは、上記の通りオンラインＩＥＸ−ＭＳ分析に供された。予想の通り、Ｆａｂ２とＦｃ＊の両方の酸性ピークにおいて、約１７６Ｄａの質量増加があった同じ酸性バリアントが検出された（図１Ａ〜１Ｐ）。
【００３３】
実施例３：新規の酸性修飾の特定および確認
方法
アミノ酸残基に対する修飾部位をさらに特定し、かつこの不明な修飾の正確な質量を得るために、Ｆｃ＊断片とＦａｂ２断片の酸性画分をペプチドマッピング分析のためにＳＣＸカラムから収集した。収集された酸性画分は最初にＳｐｅｅｄＶａｃ内で乾燥され、次いで５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、８Ｍの尿素、および１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する２０μＬの溶液中で、５０℃にて３０分間の加熱によって変性され、かつ還元された。次いでサンプルは、１０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で室温にて暗所で３０分間インキュベートすることによってアルキル化された。次いで、還元されたサンプルおよびアルキル化されたサンプルは１７５μＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈され、トリプシンで酵素対基質比１：１０（ｗ／ｗ）にて３７℃で４時間にわたり消化された。消化は１０％のＦＡを４μＬ加えることによって停止した。次いで、消化された各タンパク質サンプルのアリコートをＲＰ−ＵＰＬＣによって分離し、続いてオンラインＭＳ分析を行った。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ実験は、ＭＳ／ＭＳ実験中にペプチド断片化のために、より高エネルギーの衝突解離（ＨＣＤ）を用いて、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＭＳシステムで実施された。次いで、ＭＳの未加工データファイルを、１７０〜１８０Ｄａの質量のｍＡｂ配列および可変ワイルドカード修飾を含有するデータベースに対して検索した。
【００３４】
結果
結果は、この不明な修飾が＋１７６．０３Ｄａのモノアイソトピック質量を示し、またｍＡｂ配列の複数のＬｙｓ残基では低レベルにて生じたことを示した（図２）。正確なデルタ質量に基づいて、この修飾はグルクロン酸化と同じ元素組成物（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）を有すると仮定されたが、しかしながらこれは、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼによって触媒されたＯ結合を通してＳｅｒおよびＴｈｒで生じると報告された。
【００３５】
トリプシン消化酸性画分を５０ｍＭのＮａＢＨ４で３７℃にて１時間インキュベートし、その後１０％のギ酸（ＦＡ）でクエンチした。ＮａＢＨ４で処理されたサンプルは、次いでＲＰ  ＬＣ／ＭＳ分析に供された。結果は、ＮａＢＨ４によってこの修飾（＋１７６  Ｄａ）を減少させる（＋１７８  Ｄａ）ことができることを示し、修飾内のＳｃｈｉｆｆ塩基構造の存在を示唆する（図３Ａ〜図３Ｂ）。
【００３６】
ｍＡｂサンプルを１００ｍＭのグルクロン酸で３７℃にて２４時間インキュベートすることによって強制グルクロニル化を実施した。その後のトリプシン消化およびペプチドマッピング分析では、強制修飾サンプルにおいて非常により高い存在量で提示された一連のグルクロニル化されたペプチドが、未処理のサンプルと同じ正確な質量、ＭＳ２断片化パターン、および保持時間を示したことが分かった（図４Ａ〜図４Ｅ、図５Ａ〜図５Ｄ、図６Ａ〜図６Ｄ、および図７Ａ〜図７Ｄ）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【国際調査報告】
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