(57)【要約】本発明は、以下の工程：ａ）前記の試料を少なくとも第１および第２検出化合物と接触させ；ｂ）少なくとも１種類の検出化合物を含む複合体の量を決定し；そしてｃ）工程ｂ）の結果に基づいて試料中の前記の分析物を決定する；を含む、試料中の分析物を決定するための方法に関し、ここで、前記の第１検出化合物は第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物は第２結合部分および第２標識を含み、かつここで、第１標識および第２標識は同一ではない。本発明はさらに、試料中の分析物を検出するためのキットであって、前記の分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物を含み、前記の第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が同一ではない、前記キットに；ならびに試料中の分析物を決定するためのデバイスであって、前記の分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物を含み、前記の第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が同一ではなく、そして前記の第１標識および前記の第２標識から得られる少なくとも１つのシグナルを決定するための手段を含む、前記デバイスに；ならびに分析物を検出するための少なくとも第１および第２検出化合物を含む組成物の使用であって、前記の第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が同一ではない、前記使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物を決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）試料を少なくとも第１および第２検出化合物と接触させ；
ｂ）少なくとも１種類の検出化合物を含む複合体の量を決定し；そして
ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて該試料中の分析物を決定する；
を含み、該第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、該第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、そして該第１標識および該第２標識が同一ではない、前記方法。
【請求項２】
前記第１標識および前記第２標識が、同じ検出可能な特性を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および／または前記第２検出化合物によって提供される検出可能な特性が、放射特性、一態様において発光特性、さらなる態様において化学発光特性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１検出化合物中の標識が、Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ−ＯＳｕ（ＣＡＳ登録番号１３７３２３−７６−３）を含み、そして／または前記第２検出化合物中の標識が、スルホ−ＢＰＲｕ  ＮＨＳエステル（ＣＡＳ登録番号４８２６１８−４２−８）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ｂ）において複合体の量を決定することが、第１検出化合物の検出可能な特性および第２検出化合物の検出可能な特性を検出することを含み、一態様において第１検出化合物の検出可能な特性および第２検出化合物の検出可能な特性を同時に検出することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記の方法が免疫アッセイである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記の試料が、体液、一態様において血液、血清または血漿試料である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記の分析物がポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記の分析物が、抗体、一態様において抗Ａ型肝炎抗体または抗トキソプラズマ抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記の分析物が、病原性生物由来の抗原であり、一態様においてウイルス抗原または細菌抗原である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の分析物を検出するためのキットであって、少なくとも分析物に関する第１および第２検出化合物を含み、該第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、該の第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、そして該第１標識および該第２標識が同一ではない、前記キット。
【請求項１２】
前記のキットが、さらに前記の分析物に関する少なくとも１種類の捕捉化合物および／または該捕捉化合物もしくは少なくとも該分析物を含む試料の構成要素を固定化するための固体支持体を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
試料中の分析物を決定するためのデバイスであって、分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物、ここで、該第１検出化合物は第１結合部分および第１標識を含み、そして該第２検出化合物は第２結合部分および第２標識を含み、そして、ここで、該第１標識および該第２標識は同一ではない、そして該第１標識および該第２標識から得られる少なくとも１種類のシグナルを決定するための手段を含む、前記デバイス。
【請求項１４】
分析物を検出するための、少なくとも第１および第２検出化合物を含む組成物の使用であって、該第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、該第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、そして該第１標識および該第２標識が同一ではない、前記使用。
【請求項１５】
前記第１および前記第２検出化合物の結合部分が同一である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法、請求項１１または１２に記載のキット、請求項１３に記載のデバイスおよび／または請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下の工程：ａ）前記の試料を少なくとも第１および第２検出化合物と接触させ；ｂ）少なくとも１種類の検出化合物を含む複合体の量を決定し；そしてｃ）工程ｂ）の結果に基づいて試料中の前記の分析物を決定する；を含む、試料中の分析物を決定するための方法に関し、ここで、前記の第１検出化合物は、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物は、第２結合部分および第２標識を含み、かつここで、第１標識および第２標識は、同一ではない。本発明はさらに、試料中の分析物を検出するためのキットであって、前記の分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物を含み、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が同一ではない、前記キットに；ならびに試料中の分析物を決定するためのデバイスであって、前記の分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物を含み、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が同一ではなく、そして前記の第１標識および前記の第２標識から得られる少なくとも１つのシグナルを決定するための手段を含む、前記デバイスに；ならびに分析物を検出するための少なくとも第１および第２検出化合物を含む組成物の使用であって、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が同一ではない使用に関する。
【発明の概要】
【０００２】
臨床検査、特に免疫学的検査は、疾患の診断において非常に貴重なツールになっている。特に免疫アッセイは、複雑な混合物、例えば体液、例えば血液、血清または血漿中の単一の分析物または分析物の群を特異的に検出する可能性を提供してきた。しかし、免疫アッセイにおける干渉のいくつかの原因、例えば（少し例を挙げれば）干渉物質の捕捉化合物との交差反応性、検出化合物の固相への非特異的結合、ヘテロ親和性抗体またはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）による捕捉化合物および検出化合物の“架橋”結合が、同定されている（例えば国際公開第２０１６０９７１１６  Ａ１号；Park & Kricka (2013), David Wildにより編集されたThe Immunoassay Handbook (第４版)（Elsevier, Oxford: 403）中の第5.3章- Interferences in Immunoassay；Schiettecatte (2012), Interferences in Immunoassays, Advances in Immunoassay Technology, Dr. Norman H.L. Chiu (編者)）。干渉のさらなる標的は、標識、すなわちアッセイにおけるシグナル生成単位であることができる（例えば、Buijs et al. (2011), Ann Clin Biochem. 48(Pt 3):276; Heijboer et al. (2009), Ann Clin Biochem.46(Pt 3):263; Ando et al. (2007), Intern Med. 46(15):1225）。
【０００３】
競合免疫アッセイでは、試料中に含まれる分析物は、標識された分析物（特定剤（ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ））と捕捉化合物への結合に関して競合し、それは、しばしば抗体であり、または例えば病原体に対する抗体の存在が試験されるべきである場合、前記の病原体の抗原である。試料中の分析物の濃度が高い場合、特定剤の捕捉化合物への減少した結合をもたらし、シグナルの低減を引き起こす強い競合が存在し、それは、検査形式に応じて、定量的または定性的な検査結果をもたらす。抗標識干渉により引き起こされるシグナルの低減が存在する場合、これは、偽陽性の結果を引き起こし得る。
【０００４】
非競合免疫アッセイでは、分析物は、分析物を、分析物に特異的に結合し、かつ標識自体を担持しているかまたは標識を担持する第２の分子の標的であるかのどちらかである化合物に接触させることにより検出される。従って、非競合免疫アッセイでは、分析物の量は、分析物および標識を担持している検出化合物の間に形成された複合体の量を決定することにより決定される。従って、類似の特異性の問題が、上記のように直面され得る。抗標識干渉は、標識に結合してシグナル収率における低減、それにより偽陰性の結果をもたらすことによりシグナルを低減する傾向がある。ある場合には、抗標識干渉は、非競合アッセイ形式においてもシグナルを増大させ、それにより偽陽性の結果をもたらし得る。
【０００５】
現在、抗標識干渉をどのように低減するかに関して２つの異なる戦略が、知られている：最も一般的に使用されている方法は、干渉物質の標的（標識またはシグナルを生成することができないわずかに修飾された標的（標識類似体））をアッセイに通常は元の標識濃度を超える濃度で添加することである。標識または標識類似体の添加は、干渉物質に関する代替標的の役目を果たし、それは、干渉物質による標識への結合の低減をもたらし、干渉を排除または低減する。しかし、例えば活性な標識の添加はアッセイに干渉すると考えられるため、より多くの活性な標識を添加することによって干渉を十分に低減させることは、不可能である可能性がある。この場合に選択される方法は、シグナルを発生しないが干渉物質により標的とされる不活性な標識類似体を添加することである。しかし、反応性標識および標識類似体の間には構造的な違いがあるため、標識類似体の抗標識干渉を低減する効率は、限定され得る。
【０００６】
標識特異的干渉を低減するための第２の可能性は、影響を受ける標識を、アッセイにおいて非反応性であるが干渉物質が標識に結合するのを遮蔽し、従って干渉の低減にもつながるアッセイに添加される結合パートナーにより、特異的に標的化することである。(例えばＤＥ１９５１９９７３Ａ１、国際公開第２０１７０９３２７１Ａ１号; Sapin et al. (2007), Clin Chern Lab Med. 45(3):416; DeForge (2010), J Immunol Methods. 362(1-2):70を参照)。しかし、そのような処置は、シグナル収率の著しい低減を必然的に伴い、それによって検出限界の低下または障害を引き起こし得る。
【０００７】
解決しようとする課題
従って、本発明の目的は、上記のような問題を回避する改善した免疫アッセイを提供することである。
【０００８】
課題を解決するための手段
これらの問題は、独立請求項の特徴を有する方法、キット、デバイスおよび組成物によって解決される。孤立した様式で、またはあらゆる任意の組み合わせで実現され得る典型的な態様が、従属請求項において列挙されている。
【０００９】
従って、本発明は、以下の工程：
ａ）試料を少なくとも第１および第２検出化合物と接触させ；
ｂ）少なくとも１種類の検出化合物を含む複合体の量を決定し；そして
ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて試料中の前記の分析物を決定する；
を含む試料中の分析物を決定するための方法であって、前記の第１検出化合物が結合部分および第１標識を含み、かつ前記の第２検出化合物が結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が同一ではない方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下で使用される際、用語“有する”、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”もしくは“含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）”またはそれらのあらゆる任意の文法的バリエーションは、非排他的な方法で使用される。従って、これらの用語は、これらの用語によって導入された特徴の他にこの文脈で記載された実体にさらなる特徴が存在しない状況および１以上のさらなる特徴が存在する状況の両方を指すことができる。例として、“ＡはＢを有する”、“ＡはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”および“ＡはＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）”という表現は、Ｂの他に他の要素がＡに存在しない状況（すなわち、ＡがＢ単独からなる、およびＡが排他的にＢからなる状況）およびＢの他に１以上のさらなる要素、例えば要素Ｃ、要素ＣおよびＤ、またはさらに別の要素が実体Ａに存在する状況の両方を指すことができる。
【００１１】
さらに、以下で用いられる際、用語“好ましくは”、“より好ましくは”、“最も好ましくは”、“特に”、“より詳細には”、“具体的には”、“より具体的には”または類似の用語は、さらなる可能性を制限することなく任意の特徴と合わせて使用される。従って、これらの用語によって導入される特徴は、任意の特徴であり、特許請求の範囲を制限することは一切意図されていない。当業者は理解するであろうように、本発明は、代替の特徴を使用することにより実施されることができる。同様に、“本発明のある態様において”または類似の表現によって導入される特徴は、本発明のさらなる態様に関するいかなる制限もなく、本発明の範囲に関するいかなる制限もなく、かつそのようにして導入された特徴を本発明の他の任意の、または任意ではない特徴と組み合わせる可能性に関するいかなる制限もなく、任意の特徴であることが意図されている。
【００１２】
別途示されていない場合、用語“約”は、関連分野における一般的に受け入れられている技術的正確さでの示された値に関し、好ましくは示された値±２０％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％に関する。さらに、用語“本質的に”は、示された結果または使用に対する影響を有する逸脱が存在しないこと、すなわち可能性のある逸脱が、示された結果を±２０％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％より大きく逸脱させないことを示す。従って、“から本質的になる”は、明記された構成要素を含むが、不純物として存在する物質、その構成要素を提供するために使用されたプロセスの結果として存在する不可避な物質、および本発明の技術的作用を達成する以外の目的のために添加された構成要素を除く他の構成要素を除外することを意味する。例えば、句“から本質的になる”を使用して定義された組成物は、あらゆる既知の許容可能な添加剤、賦形剤、希釈剤、キャリヤー等を包含する。好ましくは、構成要素のセットから本質的になる組成物は、５重量％未満、より好ましくは３重量％未満、さらにもっと好ましくは１重量％未満、最も好ましくは０．１重量％未満の明記されていない構成要素（単数または複数）を含むであろう。
【００１３】
本発明の方法は、一態様において、インビトロの方法である。さらに、それは、具体的に言及された工程に加えて工程を含むことができる。特に、工程ａ）は、試料を提供する工程により先行されることができ、または工程ａ）および／もしくはｂ）は、結合および検出を容易にするためにさらなる化合物の添加を含むことができる。さらに、一部または全部の工程は、自動化された装置によって支援されることができる。一態様において、方法は、免疫学的方法であり、すなわち、一態様において、分析物および検出化合物の少なくとも一方は、抗体であるか、または抗体を含む。
【００１４】
用語“生物学的分子”は、当業者に既知であり、典型的には少なくとも１つの生物の代謝によって生成された分子に関する。従って、用語“生物学的高分子”は、一態様において単量体性前駆体から生物によって生成されたポリマーに関する。典型的な生物学的高分子は、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは多糖類である。
【００１５】
用語“ポリペプチド”は、本明細書で使用される際、一態様において、具体的に示されたポリペプチドのバリアントおよびフラグメントを含む。バリアントは、具体的に示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。パーセント同一性の値は、好ましくは、アミノ酸配列領域全体にわたって計算される。様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、異なる配列を比較するために当業者に利用可能である。この文脈では、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈまたはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムが特に信頼できる結果を与える。配列のアラインメントを実施するために、プログラムＰｉｌｅＵｐ(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153)またはプログラムＧａｐおよびＢｅｓｔＦｉｔ[Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))およびSmith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))]（それは、ＧＣＧソフトウェアパケット[Genetics Computer Group, 575 Science Drive, 米国ウィスコンシン州マディソン 53711 (1991)]の一部である）が、用いられるべきである。上記でパーセント（％）で引用された配列同一性の値は、好ましくは以下の設定：Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ：５０、Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ：３、Ａｖｅｒａｇｅ  Ｍａｔｃｈ：１０．０００およびＡｖｅｒａｇｅ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ：０．０００で配列領域全体にわたってプログラムＧＡＰを使用して決定されるべきであり、それは、別途明記されない限り、常に配列アライメントに関する標準設定として使用されるものとする。前記のポリペプチド配列のいずれかのフラグメントを含むポリペプチドも、一態様において、本発明のポリペプチドとして包含される。フラグメントは、分析物として、または本明細書の他の箇所で明記されているような検出化合物中での使用に関してなお適している、例えば本明細書の他の箇所で明記されているような結合部分である活性を有するポリペプチドである。従って、ポリペプチドは、前記の生物学的活性を付与する本発明のポリペプチドのドメインを含むかまたはそれからなることができる。本明細書で意図されるようなフラグメントは、好ましくは、前記のアミノ酸配列のいずれか１つの少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも８０、少なくとも１００または少なくとも１５０個の連続したアミノ酸を含む、前記のアミノ酸配列のいずれか１つの少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０または少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基を含む。本発明のポリペプチドは、さらにポリペプチド配列も含有することができる。具体的には、本発明のポリペプチドは、融合タンパク質であることができ、ここで、融合タンパク質の１つのパートナーは、本明細書で明記されたポリペプチドである。そのような融合タンパク質は、追加の部分として、発現をモニタリングするためのポリペプチド（例えば緑色、黄色、青色または赤色の蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ等）または検出可能なマーカーもしくは精製目的もしくは前��のポリペプチドを固体表面に結合させるのための補助手段の役目を果たすことができるいわゆる“タグ”を含むことができる。異なる目的のためのタグは、当技術分野で周知であり、ＦＬＡＧタグ、６−ヒスチジンタグ、ＭＹＣタグ、ビオチン等を含む。
【００１６】
用語“抗体”は、本明細書で使用される際、モノクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成された多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体フラグメントを、それらが本明細書の他の箇所で明記された所望の結合活性を示す限り、含む。一態様において、抗体は、抗血清中に含まれる抗体ではなく、典型的にはポリクローナル抗体またはポリクローナル血清ではない。従って、一態様において、抗体は、混合物中に含まれる抗体であり、ここで、前記の混合物中に含まれる抗体分子の少なくとも８０％、一態様において少なくとも９０％、さらなる態様において少なくとも９５％が、本発明の検出化合物である。一態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。一態様において、抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントである。
【００１７】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てられることができる。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが、存在し、これらのいくつかは、さらに下位クラス（イソ型）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は、周知であり、例えばAbbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 第４版, W.B. Saunders, Co. (2000)において一般的に記載されている。抗体は、抗体の１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的会合によって形成されるより大きな融合分子の一部であることができる。
【００１８】
用語“完全長抗体”、“完全な抗体”および“抗体全体”は、その実質的に完全な形態の抗体を指し、下記で定義されるような抗体フラグメントは指さないように、本明細書で互換的に使用される。その用語は、特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。“抗体フラグメント”は、一態様において、その抗原結合領域を含む完全な抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多特異性抗体を含む。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する“Ｆａｂ”フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントおよび残りの“Ｆｃ”フラグメントを生成し、その名前は、その容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する。“Ｆｖ”は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。一態様において、二本鎖Ｆｖ種は、緊密な非共有結合で会合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインが、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造に類似した“二量体”構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合的に連結されていることができる。それぞれの可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用して抗原結合部位を定めることは、この構成においてである。６つのＨＶＲは、全体として、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、結合部位全体よりは低い親和性においてではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。用語“ダイアボディ”は、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されたもの（ＶＨ−ＶＬ）を含む。
【００１９】
用語“モノクローナル抗体”は、本明細書で使用される際、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能性のある変異、例えば天然に存在する変異を除いて同一である。従って、修飾子“モノクローナル”は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。特定の態様において、そのようなモノクローナル抗体は、典型的には分析物に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで、分析物に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の分析物に結合するポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールからの独特のクローンの選択であることができる。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的にはそれらに他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。
【００２０】
用語“分析物”は、本明細書で使用される際、分析物／検出化合物複合体の検出を可能にするために十分な親和性で本発明の検出化合物に結合する化学分子、一態様において有機分子に関する。一態様において分析物／検出化合物複合体の解離定数（Ｋｄ）は、最大で１０−７ｍｏｌ／Ｌ、さらなる態様において最大で１０−８ｍｏｌ／ｌ、さらなる態様において最大で１０−９ｍｏｌ／Ｌである。一態様において、分析物は、生物学的分子であり、さらなる態様において、分析物は、生物学的高分子である。さらなる態様において、分析物は、ポリペプチドである。
【００２１】
一態様において、分析物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、感染因子、例えば、ウイルス、細菌もしくは原生動物によって生成された抗原であり；または分析物は、感染因子、例えば、ウイルス、細菌もしくは原生動物によって生成された抗原に対して対象により生成された抗体である。
【００２２】
一態様において、分析物は、細菌性抗原、例えばトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）抗原、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）抗原、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）抗原、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）抗原または原生動物のような単細胞生物由来の抗原、一態様においてトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）抗原である。一態様において、分析物は、細菌抗原に対する抗体であり、さらなる態様において細菌性ポリペプチドに対する抗体である。一態様において、抗体は、抗トレポネーマ・パリダム抗体、抗ボレリア属抗体、抗ブルセラ属抗体、抗クラミジア属抗体、抗マイコプラズマ属抗体または抗リステリア属抗体である。さらに別の態様において、分析物は、単細胞生物に対する抗体であり、一態様において抗トリパノソーマ・クルージ抗体である。さらなる態様において、分析物は、抗自己抗体、すなわち対象者自身によって生成された抗原を認識する抗体であり、一態様において疾患、一態様において自己免疫疾患を診断および／または予後決定する抗自己抗体である。診断および予後決定用抗自己抗体は、当該技術で既知であり、例えば全身性エリテマトーデスまたは多発性筋炎を示す抗核抗体、橋本甲状腺炎またはグレイブ病を示す抗甲状腺抗体、貧血を示す抗内因性因子抗体およびセリアック病またはグルテン過敏症を示す抗組織トランスグルタミナーゼ抗体を含む。
【００２３】
一態様において、分析物は、ウイルス抗原、例えばウイルスの抗原であり、一態様において、肝炎ウイルス、アルボウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、ムンプスウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルスおよびエンテロウイルスからなるリストから選択されるウイルスの抗原である。一態様において、分析物は、一態様において本明細書において上記で明記されたリストから選択される、一態様において医学的に関連するウイルスの、ウイルス抗原に対する、さらなる態様においてウイルスポリペプチドに対する、またはさらなる態様においてウイルスカプシドポリペプチドに対する抗体である。一態様において、ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスである。一態様において、ウイルスカプシドポリペプチドは、肝炎ウイルスカプシドポリペプチドであり、一態様において、Ａ型肝炎（ＨＡ）ウイルスカプシドポリペプチドである。従って、分析物は、一態様において、肝炎ウイルスカプシドポリペプチドに対する、例えばＡ型肝炎ウイルスカプシドポリペプチドに対する抗体である。
【００２４】
一態様において、分析物は、例えばトキソプラズマ、一態様においてＴ・ゴンディ（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）からの原生動物抗原である。一態様において、分析物は、原生動物抗原に対する、さらなる態様において原生動物ポリペプチドに対する抗体である。一態様において、分析物は、Ｔ・ゴンディ  ｐ３０ポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号：Ｓ８５１７４．１）に対する抗体である。
【００２５】
しかし、分析物が検出化合物との複合体形成によって決定可能な低分子量化合物であることも、想定される。一態様において、分析物は、少なくとも１００の分子質量（１００原子質量単位に、１００Ｄａに対応し；１Ｄａは、１．６６×１０−２７ｋｇに対応する）を有し、さらなる態様において少なくとも２５０、さらなる態様において少なくとも５００、またはさらなる態様において少なくとも１０００の分子質量を有する。一態様において、分析物は、チロキシン（Ｔ４）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、葉酸、葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２または内因性因子である。
【００２６】
本明細書で使用される際、用語“検出化合物”は、両方とも本明細書において他の箇所で明記されるような結合部分および標識を含む化合物に関する。一態様において、結合部分および標識は、前記の検出化合物中で親和性複合体を形成し、一態様においてここで、結合部分／標識複合体の解離定数（Ｋｄ）は、最大で１０−８ｍｏｌ／Ｌ、さらなる態様において最大で１０−９ｍｏｌ／Ｌ、さらなる態様において最大で１０−１０ｍｏｌ／Ｌである。一態様において、結合部分および標識は、共有結合的に連結されている。一態様において、分析物を決定するための方法は、非競合的免疫アッセイである。さらなる態様において、分析物を決定するための方法は、競合的免疫アッセイであり；理解されるであろうように、そのような場合、検出化合物は、アッセイの化合物であり、それは、当該技術において“特定剤”とも呼ばれ、すなわち、標識に結合した化合物であり、捕捉化合物への結合に関して分析物と競合する。
【００２７】
用語“結合部分”は、本明細書で使用される際、本明細書において他の箇所で明記されるような標識ではない検出化合物の構造に関する。従って、例えば検出化合物が色素標識された抗体である場合、抗体が、結合部分であると考えられ；検出化合物が色素標識されたＦ（ａｂ）フラグメントである場合、Ｆ（ａｂ）フラグメントが、結合部分であろう。対照的に、用語“親和性ドメイン”は、検出化合物の分析物に対する親和性を媒介する検出化合物の部分構造に関するように用いられる。従って、親和性ドメインは、検出化合物／分析物複合体中の分析物と接触する原子を含む結合部分の部分構造である。従って、結合部分は、１個より多くの親和性ドメインを含むことができ、例えば一態様において結合部分がＩｇＧである場合には２個の同一の親和性ドメイン、さらなる態様において結合部分がＩｇＭである場合には１０個の同一の親和性ドメイン、さらなる態様において結合部分がダイアボディである場合には２個の異なる親和性ドメインを含むことができる。さらなる態様において、結合部分は、結合部分がポリエピトープ抗原である場合には、多数、すなわち２より大きいあらゆる数の同一の、または同一ではない親和性ドメインを含むことができる。
【００２８】
一態様において、第１検出化合物の結合部分は、第２検出化合物の結合部分と同一ではない。従って、一態様において、第１および第２検出化合物は、一態様において抗体の同じエピトープを認識する異なるモノクローナル抗体であることができる。一態様において、そのような場合、第１検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数ならびに第２検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数は、５倍より大きくない；一態様において２倍より大きくない；さらなる態様において１．５倍より大きくない差がある。一態様において、第１検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数は、第２検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数の７０％〜１３０％の値を有する。さらなる態様において、第１検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数は、第２検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数の８０％〜１２０％の値を有する。さらなる態様において、第１検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数は、第２検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数の９０％〜１１０％の値を有する。さらなる態様において、第１検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数ならびに第２検出化合物および分析物の間に形成される複合体の解離定数は、本質的に等しいか、または等しい。
【００２９】
さらなる態様において、第１検出化合物の結合部分および第２検出化合物の結合部分は、本質的に同一であり、すなわち、分析物の結合に無関係な構造決定因子においてのみ異なる。さらなる態様において、第１検出化合物の結合部分および第２検出化合物の結合部分は、同一であり；従って、一態様において、第１検出化合物および第２検出化合物は、標識においてのみ異なる。当業者には理解されるであろうように、この違いは、一態様において第１標識および第２標識の異なるカップリング化学によって規定される違いを含むことができる。
【００３０】
用語“標識”は、本明細書で使用される際、前記の標識を含む分子または複合体の存在を検出可能にするために適合された化合物に関する。典型的には、標識は、検出可能な特性、典型的には光学的特性または／および酵素的特性を有する。しかし、前記の検出可能な特性が放射能を放出する特性であることも、想定されている。理解されるであろうように、前記の検出可能な特性を検出するために決定されるパラメータは、“シグナル”または“検出可能なシグナル”とも呼ばれるであろう。疑義の回避のために、シグナルは、ゼロまたは検出限界未満であることが検出される可能性もあることが、特筆される。
【００３１】
用語“酵素的特性”は、本明細書で使用される際、生物学的触媒作用によって基質から検出可能な生成物を生成する標識の特性に関する。従って、酵素的特性は、典型的には前記の標識中の前記の酵素的特性を有するポリペプチドの存在により付与される。典型的には、酵素的特性は、（例えばアルカリホスファターゼにおける）ホスファターゼ活性、（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼにおける）ペルオキシダーゼ活性および（例えばベータ−ガラクトシダーゼにおける）グリコシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性である。酵素活性に関する典型的な基質は、当該技術で周知である。典型的には、前記の酵素活性は、本明細書において上記で明記された検出可能な光学的特性を有する生成物を生成するか、または／および前記の酵素活性は、電気機器によって検出可能である生成物を生成する。
【００３２】
用語“光学的特性”は、本明細書で使用される際、光学機器によって検出されることができるあらゆる特性に関する。具体的には、光学的に決定可能な特性は、反射特性、透過特性、発光特性、散乱特性、蛍光特性、燐光特性、回折特性および偏光特性からなる群から選択される少なくとも１つの特性であることができ、またはそれを含むことができる。本発明により想定されるさらなる光学特性は、色、蛍光、発光または屈折である。一態様において、本明細書で言及されるような光学的に決定可能な特性は、光学的に検出されることができる化学化合物の特性、例えば光吸収、発光、再発光（ｌｉｇｈｔ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）またはそれらと関係する特性を指す。本明細書で使用される光学的に決定可能な特性の検出は、以前には検出可能ではなかった特性の存在の検出、以前に検出されている特性の非存在の検出および特性の定量的変化の検出、すなわち少なくとも１つの光学的特性の変化の程度に相関するシグナル強度の変化の検出を包含することは、理解されるであろう。用語“光学特性”は、一態様において、発光、一態様において化学発光、さらなる態様において電気生成化学発光としても知られている電気化学発光にも関することは、理解されている。従って、一態様において、検出可能なシグナルは、発光シグナル、一態様において化学発光シグナル、さらなる態様において電気化学発光シグナルであることができる。上記に従って、一態様において、標識は、色素であり、一態様において、化学発光性化合物である。
【００３３】
本明細書で言及されるように、第１検出化合物は、第１結合部分および第１標識を含み、第２検出化合物は、第２結合部分および第２標識を含み、第１標識および第２標識は、同一ではない。本発明の第１および第２標識は、同一ではなく、すなわち、２つの標識は、少なくとも１つの物理的、生物学的および／または化学的特性において区別され得る。例えば、第１および第２標識は、それらの特定の抗血清もしくは抗体との相互作用によって、またはクロマトグラフィーおよび／もしくは質量分析によって区別され得る。一態様において、前記の区別する特性は、構造特性である。従って、一態様において、第１および第２標識は、それらの化学構造の少なくとも１つの特徴において、例えば少なくとも１つの原子、化学結合および／または電荷によって異なる。一態様において、第１および第２標識を区別する特徴は、第１および第２標識の検出可能な特性とは無関係であり；従って、一態様において、第１および第２標識の検出可能な特性は同一であるが、第１および第２標識は、構造的に異なる。さらなる態様において、第１および第２標識を区別する特徴は、第１および第２標識の検出可能な特性に関連し；従って、一態様において、第１および第２標識の検出可能な特性は、同一ではなく、第１および第２標識は、構造的に異なる。
【００３４】
一態様において、（同一ではない）第１および第２標識は、検出可能な特性の同じ質を提供する。本明細書で使用される際、用語“検出可能な特性の質”は、その検出の方式を規定する検出可能な特性の物理的性質に関し；従って、検出可能な特性の同じ質を有する２つの標識は、同じ測定原理、すなわち放射、透過、化学発光を含む発光、吸光度等の測定によるそれらの検出可能な特性の検出を可能にする２つの標識である。さらなる態様において、第１および第２標識は、本質的に同じ検出可能な特性を提供し、すなわち、本質的に同じ方法によるそれらの検出可能な特性の検出を可能にし、２つの方法は、最大で１つの測定パラメーター、例えば検出波長が、最大で２、一態様において最大で１．５、さらなる態様において最大で１．２、さらなる態様において１．１の倍率で再調整される場合に、“本質的に同じ”である。さらなる態様において、第１および第２標識は、同じ検出可能な特性を提供し、すなわち、同じ方法によるそれらの検出可能な特性の検出を可能にする。理解されるであろうように、後者の場合には、第１および第２標識の検出可能な特性は、同時に検出されることができる。さらに理解されるであろうように、第１および／または第２標識の検出可能な特性の検出は、一方または両方の標識に関して非最適な条件下で実施されることができ；例えば、２つの標識が重複する吸収スペクトルを有する場合には、吸収は、両方の標識が同じモル吸光係数を有する非最大吸収の波長において測定されることができる。従って、一態様において、工程ｂ）における複合体の量の決定は、第１検出化合物の特性および第２検出化合物の特性を検出することを含み、一態様において、第１検出化合物の特性および第２検出化合物の特性を同時に検出することを含む。
【００３５】
一態様において、第１標識は、Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ−ＯＳｕ（“ＢＰ−Ｒｕ”とも呼ばれる；ＣＡＳ登録番号１３７３２３−７６−３、＝ルテニウム（２＋）、ビス（２，２’−ビピリジン−κＮ１，κＮ１’）［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−、（ＯＣ−６−３３）  Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ２Ｈ（＝ＢＰＲｕまたはＲｕ−ｂｐｙ）の反応性エステル、ＣＡＳ登録番号１１５２３９−５９−３））であり、第２標識は、スルホ−ＢＰＲｕ  ＮＨＳエステル（“スルホ−Ｒｕ”とも呼ばれる；ＣＡＳ登録番号４８２６１８−４２−８、当該技術においてルテネート（２−）、ビス［［２，２’−ビピリジン］−４，４’−ジメタンスルホナト（２−）−κＮ１，κＮ１’］［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−、ナトリウム（１：２）、（ＯＣ−６−３１）としても知られている）である。
【００３６】
本明細書で使用される際、用語“決定すること”は、試料中の本発明の方法によって決定されるべき分析物の少なくとも１つの検出可能な特徴を決定することを指す。一態様において、本発明の方法は、本明細書で明記される少なくとも１種類の検出化合物の使用および検出を含むあらゆる決定に適用可能である。従って、一態様において、決定することは、分析物の特徴の検出化合物との直接的または間接的な相互作用を決定することを含む。一態様において、分析物の特徴は、検出化合物に結合する、一態様において特異的に結合する結合ドメインである。従って、一態様において、分析物の検出可能な特徴は、受容体またはその受容体ドメイン、レクチン、アプタマー（ペプチドアプタマーまたはポリヌクレオチドアプタマーであることができる）、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）または免疫グロブリンもしくはその結合サブドメインであり、検出化合物は、前記の検出可能な特徴により特異的に結合される化学構造を含む。逆に、一態様において、検出化合物は、受容体またはその受容体ドメイン、レクチン、アプタマー（ペプチドアプタマーまたはポリヌクレオチドアプタマーであることができる）、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、設計されたアンキリンリピートタンパク質または免疫グロブリンもしくはその結合サブドメインを含み、分析物の検出可能な特徴は、前記の検出化合物によって特異的に結合される化学構造を含む。
【００３７】
本発明の文脈において、“アプタマー”は、その相互作用パートナーに特異的に結合する高分子である。アプタマーは、ペプチドまたはポリヌクレオチドアプタマーであることができ、原理的に当業者に既知である。用語“ペプチドアプタマー”は、本明細書で使用される際、その相互作用パートナーに特異的に結合し、８〜８０アミノ酸、一態様において１０〜５０アミノ酸、さらなる態様において１５〜３０アミノ酸を含むペプチドに関する。それらは、例えばパン酵母のような適当な宿主系におけるランダム化されたペプチド発現ライブラリーから単離されることができる（例えばKlevenz et al., Cell Mol Life Sci. 2002, 59: 1993-1998を参照）。
【００３８】
本明細書で使用される際、用語“ａｎｔｉｃａｌｉｎ”は、その相互作用パートナーに特異的に結合するリポカリンに由来する人工ポリペプチドに関する。同様に、“設計されたアンキリンリピートタンパク質”または“ＤＡＲＰｉｎ”は、本明細書で使用される際、いくつかのアンキリンリピートモチーフを含みその相互作用パートナーに特異的に結合する人工ポリペプチドである。
【００３９】
一態様において、分析物および／または検出化合物の検出可能な特徴は、免疫グロブリンまたはその結合サブドメインを含む。従って、一態様において、決定することは、分析物の免疫学的特徴の検出化合物との直接的もしくは間接的な相互作用および／または分析物の特徴の検出化合物の免疫学的特徴との直接的もしくは間接的な相互作用を決定することを含む。従って、一態様において、方法は、免疫アッセイである。本発明に従う免疫学的特徴は、一態様において、免疫学的手段によって試料中の分析物の検出を容易にする分析物の構造的特徴である。一態様において、前記の免疫学的特徴は、免疫学的手段による分析物の同定、さらなる態様において定量化を容易にする。従って、典型的な免疫学的特徴は、前記の分析物の試料中の他の化学化合物との区別を容易にする特徴である。一態様において、分析物を決定することは、分析物が方法の検出限界を超える濃度で試料中に存在するかまたは存在しないかを確立することである。検出限界を決定する方法は、当業者に既知である。さらなる態様において、決定することは、試料中の分析物の量または濃度を半定量的または定量的に決定することである。定量的決定に関して、分析物の絶対量または正確な量が、決定されると考えられ、または分析物の相対量が、決定されるであろう。相対量は、分析物の正確な量が決定されることができない、または決定されてはならない場合に、決定され得る。前記の場合には、前記の分析物を第２の量で含む第２試料に関して分析物が存在する量が増加しているかまたは減少しているかが、決定されることができる。
【００４０】
当業者には理解されるであろうように、典型的には、第１検出化合物／分析物および第２検出化合物／分析物複合体を別々に決定する必要は、ないであろう。従って、一態様において、第１検出化合物および分析物の複合体ならびに第２検出化合物および分析物の複合体は、一緒に、すなわち、前記の第１検出化合物および前記の第２検出化合物の間で無差別に決定される。従って、一態様において、第１検出化合物または第２検出化合物または両方のいずれかとの複合体中に存在する分析物の総量が、決定される。これは、一態様において、本明細書において上記で明記されたように、工程ｂ）において第１および第２標識の検出可能な特性を同時に決定することにより；または工程ｂ）において第１および第２標識の検出可能な特性を別々に決定するが工程ｃ）において第１検出化合物の特性の合計値および第２検出化合物の特性の合計値を決定することにより成し遂げられることができる。上記から理解されるように、第１および第２標識は、同じタイプの結合部分に結合していることができ；従って、第１および第２結合部分は、同一ではないことができるが、同一であることもできる。従って、決定することは、試料を、その第１フラクションが第１標識に結合し、その第２フラクションが第２標識に結合しているモノクローナル抗体と接触させることによって達成されることができる。同じことが、必要な変更を加えてポリクローナル抗体調製物に適用された。
【００４１】
当業者にはさらに理解されるであろうように、分析物／捕捉化合物複合体の決定は、さらなる工程および／またはさらなる化合物の使用を含むことができる。例えば、少なくとも標識に関して第１および第２検出化合物と同一ではない１種類以上のさらなる検出化合物が、使用されることができる。一態様において、第１および第２検出化合物は、１：５〜５：１、典型的には１：２〜２：１、約１：１、または１：１の比率で使用される。さらなる態様において、３種類の検出化合物が、約２：１：１、１：２：１または１：１：２、約１：１：１または１：１：１の比率で使用される。従って、一態様において、第１および第２検出化合物および潜在的に存在するさらなる検出化合物が、反応混合物中に、およそ同じ量で、さらなる態様において同じ量で存在する。一態様において２〜１０種類の検出化合物、一態様において２〜５種類の検出化合物、一態様において２〜４種類の検出化合物、一態様において２〜３種類の検出化合物が、使用され、使用されるすべての検出化合物の標識は、互いに同一ではない。一態様において、検出化合物は、本質的に等しい、一態様において等しい量で使用される。
【００４２】
さらに、選択されるアッセイ形式に応じて、捕捉抗体が、分析物および分析物／検出化合物（単数または複数）複合体を固体表面に結合させるために用いられることができる。一態様において、アッセイは、競合免疫アッセイ、典型的には競合異種免疫アッセイ、すなわち免疫アッセイであり、ここで、分析物は、固体表面に結合した捕捉化合物への結合に関して前記の分析物の標識された誘導体と競合し、ここで、前記の捕捉化合物に結合した前記の分析物の標識された誘導体の量が、決定される。従って、そのような場合、その方法は、さらに試料に特定剤を混合することを含む。一態様において、本発明の方法は、異種競合免疫アッセイであり、前記の特定剤および前記の同一ではない捕捉化合物の間に形成された複合体の量を決定することにより、分析物および２種類の同一ではない捕捉化合物の間に形成された複合体の量を間接的に決定することを含む。一態様において、競合アッセイは、抗ＨＡＶ（抗Ａ型肝炎ウイルス）、抗ＨＢｃ（抗Ｂ型肝炎コア抗原）、抗ＨＢｅ（抗Ｂ型肝炎ｅ−抗原）、葉酸、葉酸ＲＢＣ（赤血球）、抗ＴＳＨ−Ｒ、総ビタミンＤ、ビタミンＢ１２、チロキシンＴ４、ＦＴ４（遊離チロキシン）、チロキシンＴ３、ＦＴ３（遊離トリヨードチロニン）、テストステロン、プロゲステロン、ジギトキシン、抗ＴＧ、抗ＴＰＯ（抗甲状腺ペルオキシダーゼ）、ＤＧＥＡまたはエストラジオールに関するアッセイである。
【００４３】
さらなる態様において、免疫アッセイは、二重抗原サンドイッチアッセイ（“ＤＡＧＳ”）であり、ここで、二価の分析物、例えば抗体が、固体表面に結合した捕捉化合物に結合し、そしてここで、分析物／捕捉化合物複合体の量は、本明細書において下記で明記されるような検出化合物の前記の分析物／捕捉化合物複合体への結合により決定される。一態様において、ＤＡＧＳアッセイは、抗トキソプラズマＩｇＧ、抗風疹ＩｇＧ、抗ＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）抗体、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）コア抗原または抗ＨＣＶ抗体、ＣＭＶ抗体（サイトメガロウイルス）ＩｇＧ、梅毒（トレポネーマ・パリダム）抗体、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルス）抗体またはシャーガス（アメリカトリパノソーマ症）抗体に関するアッセイである。
【００４４】
本明細書で使用される際、用語“捕捉化合物”は、本明細書において上記で明記された分析物に直接または間接的に結合する化学分子に関する。一態様において、捕捉化合物は、固体表面に結合しているか、または固体表面に結合するように適合している。一態様において、捕捉化合物は、有機分子であり、さらなる態様において、本明細書において上記で明記された生物学的高分子、例えば本明細書において上記で明記されたポリペプチドである。一態様において、捕捉化合物は、分析物および捕捉化合物を含む複合体の検出を可能にするために十分な親和性を有する本発明の分析物に間接的に結合し；すなわち、そのような場合、捕捉化合物は、間接的なリガンドである。用語“間接的結合”は、本明細書で使用される際、リガンドが分析物に直接接触するのではなく、分析物に結合する、一態様において分析物に特異的に結合する化学分子と接触する結合に関し、ここで、一態様において、分析物に結合する前記の分子は、分析物に直接結合する分子であり、すなわち直接的なリガンドである。従って、一態様において、分析物、分析物に結合する化学分子および間接的なリガンドは、上記で示された特性を有する、特に示された解離定数を有する複合体を形成する。さらなる態様において、捕捉化合物は、本明細書において上記で明記されたように、本発明の分析物に、分析物／捕捉化合物複合体の検出を可能にするために十分な親和性で直接結合する。従って、一態様において、捕捉化合物は、直接的なリガンドである。
【００４５】
本明細書で使用される際、用語“固体表面”は、本発明の捕捉化合物に結合するために適合した、そして試料から例えば物理的手段によって分離されるために適合したあらゆる適切な固体表面に関する。一態様において、前記の固体表面は、ビーズ、一態様においてマイクロビーズ、例えば磁気マイクロビーズまたは常磁性マイクロビーズの表面である。一態様において、前記の表面は、例えば捕捉化合物の部分構造に結合する分子を共有結合的または非共有結合的に取り付けることによって捕捉化合物の結合を改善するように適合している。捕捉化合物の部分構造に結合する典型的な分子は、例えば抗体、ストレプトアビジン、錯体形成したニッケルイオン、化合物“Ｘ”が“抗Ｘ”に特異的に結合するあらゆるＸ−抗Ｘ系の構成要素（例えば糖および糖結合タンパク質／レクチンまたはホルモンおよびその受容体のようなもの）等である。さらなる態様において、固体表面は、共有結合または非共有結合によって、例えば疎水性相互作用によって、前記の捕捉化合物に結合する。従って、一態様において、前記の固体表面は、マルチクラスタープレートの表面である。一態様において、マルチクラスタープレートの表面は、捕捉化合物の結合に関する親和性および／または容量を増大させるために前処理される。適切な前処理は、当該技術で既知である。
【００４６】
生物学的分子、典型的にはポリペプチドを固体表面に結合させる方法は、当該技術で周知であり、例えば疎水性相互作用による結合、ビオチン化および固定されたストレプトアビジンを介した結合、共有結合、抗体−抗原相互作用等、またはこれらの相互作用の組み合わせ、例えば抗体および病原体のポリペプチドの間の抗体−抗原相互作用を含み、ここで、前記の抗体は、ビオチン化されており、固定化されたストレプトアビジンを介して固体表面に結合している。従って、捕捉抗体は、好ましくは捕捉複合体であることもできる。一態様において、捕捉化合物は、分析物に直接結合する捕捉複合体の化合物である。当業者は、選択された固体表面に応じてどのように捕捉化合物または複合体を固体表面に結合させるかを知っている。一態様において、捕捉化合物は、ウイルスポリペプチド、例えばウイルスカプシドポリペプチドである。一態様において、前記の捕捉化合物は、肝炎ウイルスカプシドポリペプチドであり、一態様において、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）カプシドポリペプチドである。しかし、捕捉化合物が抗体であることも、想定されている。
【００４７】
用語“試料”は、本明細書で使用される際、体液の試料、組織もしくは臓器からの試料、または洗浄／すすぎ液の試料もしくは外側もしくは内側体表面から得られたスワブもしくはスメアに関する。一態様において、試料は、本明細書で明記された分析物を含むことが疑われる。試料は、一態様において、本明細書の他の箇所で明記されるような少なくとも１種類の分析物を含む。一態様において、試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液または涙液試料である。試料は、ブラシ、（綿）スワブ、ヘラ、すすぎ／洗浄液、パンチ生検デバイスの使用、針もしくはランセットによる腔の穿刺により、または外科的器具使用により得られることができる。しかし、一態様において尿生殖器管、肛門周囲領域、肛門管、口腔、上部気道消化管および表皮からのスクレープ（ｓｃｒａｐｅｓ）、スワブまたは生検を含む周知の技法によって得られた試料も、本発明の試料として含まれる。無細胞流体は、ホモジナイゼーションのような溶解技法により、および／または濾過もしくは遠心分離のような分離技法により体液または組織または臓器から得られることができる。一態様において、試料は、ＨＡウイルスポリペプチドまたは／および少なくとも１種類のＨＡウイルスポリペプチドに対する抗体を含むことが知られている体液、すなわち、一態様において血液、血漿、血清、唾液等から、一態様において血漿または血清から得られる。試料は、本発明の方法を実施するためにさらに処理されることができることは、理解されるべきである。特に、細胞は、当該技術で知られている方法および手段によって試料から除去されることができる。さらに、少なくとも１種類の分析物は、当該技術で知られている方法および手段によって試料から抽出および／または精製されることができる。従って、試料という用語は、試料から希釈、富化、精製および／または抽出された少なくとも１種類の分析物を含む、または含むことが疑われる調製物に関することもできる。
【００４８】
本発明の方法の文脈で使用される用語“接触させること”は、当業者には理解されている。一態様において、その用語は、本発明の化合物を試料と、またはさらなる化合物と物理的に接触させ、それにより、例えば試料および化合物を相互作用させることに関する。
【００４９】
用語“対象”は、本明細書で使用される際、脊椎動物、一態様において哺乳類の対象に関する。一態様において、対象は、家畜、コンパニオンアニマルまたは実験動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、モルモット、マウスまたはラットである。一態様において、対象は、ヒトである。さらなる態様において、対象は、本明細書で明記される分析物を含むことが疑われるヒトである。
【００５０】
好都合には、免疫アッセイにおいて本質的に同じ量および／または質のシグナルを提供し得る異なる標識を使用することにより、試料からの抗標識化合物による干渉が低減され得ることが、本発明の基礎となる研究において発見された。例えば、競合免疫アッセイにおいて、偽陽性の結果を引き起こす抗標識干渉により引き起こされたシグナルの低減が、低減され得る。同様に、サンドイッチ／二重抗原サンドイッチ免疫アッセイでは、抗標識干渉が標識への結合によりシグナルを低減させる傾向があり、それは、シグナル収率における低減を引き起こし、それにより偽陰性の結果をもたらす。ある場合には、シグナルの増大も観察されており、それにより偽陰性の結果を引き起こしている。少なくともこれらの場合の全てにおいて、少なくとも２種類の異なる標識の使用は、干渉が偽の結果を引き起こすことを回避する。
【００５１】
上記でなされた定義は、必要な変更を加えて以下に適用される。下記でさらになされる追加の定義および説明も、必要な変更を加えて本明細書で記載された全ての態様に適用される。
【００５２】
本発明は、アッセイにおける分析物の検出の特異性を向上させるための方法であって、第１検出化合物の１０％〜９０％を同一ではない標識を有する第２検出化合物により置き換えることを含む方法にも関する。
【００５３】
本明細書で使用される際、用語“第１検出化合物のある割合を第２検出化合物により置き換える”は、アッセイから第１検出化合物の示された割合を省略し、そして省略された第１検出化合物の量に対応する量の第２検出化合物を新たに含めることに関する。一態様において、第１および第２検出化合物の割合および量は、モルベースで計算され；従って、アッセイ中の第１検出化合物の濃度が最初に１０ｐＭであり、５０％が置き換えられた場合、第２検出化合物は、５ｐＭの濃度で含まれるであろう。さらなる態様において、第１および第２検出化合物の割合および量は、シグナル収率に基づいて計算される。従って、例えば元のアッセイにおける第１検出化合物の濃度は、１００％の任意のシグナル収率に設定されることができ；従って、シグナル収率に基づいて第１検出化合物の５０％が置き換えられるものとする場合、第１検出化合物の量は、シグナル収率が５０％に低減するように省略され、第２検出化合物は、シグナル収率が再び１００％に上昇するように添加される。理解されるであろうように、上記は、第１検出化合物が１種類より多くのさらなる検出化合物により置き換えられる場合および１種類より多くの検出化合物が１種類以上のさらなる検出化合物（単数または複数）により置き換えられる場合に、必要な変更を加えて適用される。
【００５４】
典型的には、置き換えられる捕捉化合物または検出化合物の割合は、置き換えの測定可能な作用が理論的に期待され得るように選択されるであろう。当業者には理解されるであろうように、測定可能な作用の期待値は、置き換えに使用される同一ではない標識の数に依存するであろう。例えば、改良後のアッセイにおいて１種類ではなく３種類の検出化合物が使用される場合、例えば初期の検出化合物の６６％が置き換えられることが、好ましい。原則として、所与の検出化合物の割合は、（１００％／ｎ）±５０％であり、ｎ＝（アッセイで使用される同一ではない検出化合物の数）であることが、想定される。別の態様において、（１００％／ｎ）±２０％の割合が、使用される。当業者には理解されるであろうが、使用される割合の合計は、１００％まで加算されるであろう。従って、一態様において、置き換えられる検出化合物の割合は、１０％〜９０％の割合、一態様において２５％〜７５％の割合、さらなる態様において４０％〜６０％の割合、さらなる態様において約５０％の割合である。
【００５５】
本発明は、さらに、試料中の分析物を検出するためのキットであって、前記の分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物を含み、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が、同一ではないキットに関する。
【００５６】
用語“キット”は、本明細書で使用される際、本発明の前記の化合物、手段または試薬の集合体を指し、それは、一緒に包装されていることができ、または一緒に包装されていない可能性もある。キットの構成要素は、別々のバイアルによって（すなわち別々の部品のキットとして）構成されることができ、または単一のバイアルで提供されることもできる。さらに、一態様において、本発明のキットは、本明細書において上記で言及された方法を実施するために使用されるためのものである。一態様において、全ての構成要素が、上記で言及された方法を実施するためにすぐに使用可能な様式で提供されることが、想定される。さらに、キットは、一態様において、前記の方法を実施するための指示を含む。指示は、紙または電子形式での取扱説明書によって提供され得る。例えば、説明書は、本発明のキットを用いて前記の方法を実施する際に得られた結果を解釈するための指示を含むことができる。一態様において、少なくとも２種類の同一ではない検出化合物を含む試料中の分析物を検出するためのキットは、さらに少なくとも１種類の捕捉化合物を含む。さらなる態様において、キットは、さらに前記の捕捉化合物を固定化するため、または分析物を固定化するための固体支持体を含む。一態様において、前記の分析物に関する２〜１０種類の検出化合物、一態様において前記の分析物に関する２〜５種類の検出化合物、一態様において２〜４種類の検出化合物、一態様において前記の分析物に関する２〜３種類の検出化合物が、前記のキット中に含まれる。
【００５７】
さらに、本発明は、試料中の分析物を決定するためのデバイスであって、前記の分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物（ここで、前記の第１検出化合物は、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物は、第２結合部分および第２標識を含み、かつここで、第１標識および第２標識は、同一ではない）ならびに前記の第１標識および前記の第２標識から得られる少なくとも１種類のシグナルを決定するための手段を含むデバイスに関する。
【００５８】
用語“デバイス”は、本明細書で使用される際、少なくとも決定を可能にするように互いに作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された前記の手段を含む手段のシステムに関する。分析物の量を決定するための典型的な手段および決定を実施するための手段、例えば少なくとも１種類のシグナルを決定するための手段は、本発明の方法に関連して上記で開示されている。当業者には理解されるように、少なくとも１種類のシグナルを決定するための手段は、１種類のシグナルを決定することができる手段を含み；同様に当業者には理解されるように、シグナルを決定するための手段は、シグナルがゼロまたは特定の試料に関する検出限界未満である場合でさえも、前記のシグナルを検出する能力を有する手段である。
【００５９】
操作方法において手段をどのように連結するかは、デバイス中に含まれる手段のタイプに依存するであろう。一態様において、手段は、単一のデバイスに含まれる。従って、前記のデバイスは、（ｉ）適用された試料中の分析物の量の測定のための分析ユニットおよび（ｉｉ）評価のための結果として得られるデータを処理するためのコンピュータユニットを含むことができる。検出のための典型的な手段が、上記の本発明の方法に関する態様に関連して開示されている。そのような場合、手段は、システムの使用者が説明書において与えられた指示および解釈に基づいて標識の検出可能な特性（一態様において標識の光学的または／および電気化学的に決定可能な特性）の決定の結果をまとめるという点で作動的に連結されており；または前記の指示および解釈は、決定の結果として適用された試料中の分析物の量もしくは濃度が使用者に出力されるように、デバイス中に含まれる実行可能なプログラムコード中に含まれている。当業者は、手段をどのように連結するかを、それ以上の説明無しで（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ａｄｏ）理解するであろう。典型的なデバイスは、専門技術者の特別な知識を用いずに適用されることができるデバイス、例えば試料を装填することのみを必要とする試験細片または電子デバイスである。結果は、技術者による解釈を必要とする生データの出力として与えられることができる。しかし、一態様において、デバイスの出力は、処理された、すなわち評価された生データであり、その解釈は、技術者を必要としない。さらなる典型的なデバイスは、分析ユニット／デバイス（例えばバイオセンサー、アレイ、ペプチドを特異的に認識するリガンドに結合された固体支持体、表面プラズモン共鳴デバイス、ＮＭＲ分光計、質量分析計等）または本発明の方法に従う上記で言及された評価ユニット／デバイスを含む。一態様において、前記の分析物に関する２〜１０種類の検出化合物、一態様において前記の分析物に関する２〜５種類の検出化合物、一態様において２〜４種類の検出化合物、一態様において前記の分析物に関する２〜３種類の検出化合物が、前記のデバイス中に含まれる。
【００６０】
さらに、本発明は、分析物を検出するための少なくとも第１および第２検出化合物を含む組成物の使用に関し、ここで、前記の第１検出化合物は、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物は、第２結合部分および第２標識を含み、かつここで、第１標識および第２標識は、同一ではなく；本発明は、診断用組成物または診断デバイスの製造のための分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物の使用に関し、ここで、前記の第１検出化合物は、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物は、第２結合部分および第２標識を含み、かつここで、第１標識および第２標識は、同一ではなく；そして、本発明は、試料中の前記の分析物を決定するための分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物を含む組成物の使用に関し、ここで、前記の第１検出化合物は、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物は、第２結合部分および第２標識を含み、かつここで、第１標識および第２標識は、同一ではない。
【００６１】
上記の観点から、以下の態様が、特に想定される。
１．  試料中の分析物を決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）前記の試料を少なくとも第１および第２検出化合物と接触させ；
ｂ）少なくとも１種類の検出化合物を含む複合体の量を決定し；そして、
ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて試料中の前記の分析物を決定する；
を含み、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が、同一ではない方法。
【００６２】
２．  態様１の方法であって、第１および第２標識が、検出可能な特性の同じ質を提供する方法。
３．  態様１または２の方法であって、第１および第２標識が、同じ検出可能な特性を提供する方法。
【００６３】
４．  態様１〜３のいずれか１つの方法であって、第１および第２標識が、検出可能な特性の本質的に同じ質を提供する方法。
５．  態様１〜４のいずれか１つの方法であって、第１および／または第２検出化合物によって提供される検出可能な特性が、放射特性、一態様において発光特性、さらなる態様において化学発光特性である方法。
【００６４】
６．  態様１〜５のいずれか１つの方法であって、第１検出化合物中の標識が、Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ−ＯＳｕ（ＣＡＳ登録番号１３７３２３−７６−３）を含む方法。
【００６５】
７．  態様１〜６のいずれか１つの方法であって、第２検出化合物中の標識が、スルホ−ＢＰＲｕ  ＮＨＳエステル（ＣＡＳ登録番号４８２６１８−４２−８）である方法。
８．  態様１〜７のいずれか１つの方法であって、工程ｂ）における複合体の量の決定が、第１検出化合物の特性および第２検出化合物の特性を検出することを含み、一態様において第１検出化合物の特性および第２検出化合物の特性を同時に検出することを含む方法。
【００６６】
９．  態様１〜８のいずれか１つの方法であって、工程ｃ）において前記の分析物を決定することが、第１検出化合物の特性の合計値および第２検出化合物の特性の合計値を決定することを含む方法。
【００６７】
１０．  態様１〜９のいずれか１つの方法であって、結合部分が、前記の分析物に特異的に結合する、または分析物に特異的に結合する捕捉化合物に特異的に結合する方法。
１１．  態様１〜９のいずれか１つの方法であって、結合部分が、捕捉化合物への結合において分析物と競合する方法。
【００６８】
１２．  態様１〜１１のいずれか１つの方法であって、前記の結合部分が、生物学的分子またはそのフラグメントであり、一態様においてポリペプチドまたはそのフラグメントである方法。
【００６９】
１３．  態様１〜１２のいずれか１つの方法であって、前記の結合部分が、抗体またはそのフラグメントである方法。
１４．  態様１〜１３のいずれか１つの方法であって、前記の方法が、免疫アッセイである方法。
【００７０】
１５．  態様１〜１４のいずれか１つの方法であって、前記の方法が、競合アッセイである方法。
１６．  態様１〜１４のいずれか１つの方法であって、前記の方法が、サンドイッチアッセイであり、一態様において二重抗原サンドイッチアッセイである方法。
【００７１】
１７．  態様１〜１６のいずれか１つの方法であって、前記の方法が、定性的または半定量的アッセイである方法。
１８．  態様１〜１７のいずれか１つの方法であって、前記の方法が、定量的アッセイである方法。
【００７２】
１９．  態様１〜１８のいずれか１つの方法であって、前記の分析物が、ポリペプチドである方法。
２０．  態様１〜１９のいずれか１つの方法であって、前記の分析物が、抗体、一態様において病原性生物の抗原に対する抗体、一態様においてウイルス抗原に対する抗体、一態様において原生動物抗原に対する抗体である方法。
【００７３】
２１．  態様１〜２０のいずれか１つの方法であって、前記の分析物が、抗Ａ型肝炎抗体または抗トキソプラズマ抗体である方法。
２２．  態様１〜１９のいずれか１つの方法であって、前記の分析物が、病原性生物由来の抗原であり、一態様において細菌抗原である方法。
【００７４】
２３．  態様１〜２２のいずれか１つの方法であって、２〜１０種類の検出化合物、一態様において２〜５種類の検出化合物、一態様において２〜４種類の検出化合物、一態様において２〜３種類の検出化合物が、使用され、かつ全ての検出化合物の標識が、相互に同一ではない方法。
【００７５】
２４．  アッセイにおける分析物の検出の特異性を向上させるための方法であって、第１検出化合物の１０％から９０％を同一ではない標識を有する第２検出化合物により置き換えることを含む方法。
【００７６】
２５．  態様２４の方法であって、前記の第１検出化合物の２５％〜７５％、さらなる態様において４０％〜６０％、さらなる態様において約５０％が、置き換えられる方法。
２６．  第１標識を有する検出化合物による分析物の決定を混乱させる干渉物質を含む試料を同定するための方法であって、以下の工程：
ａ）前記の試料の分割量を、前記の第１標識を有する第１検出化合物と接触させ；
ｂ）前記の試料の分割量を、第２標識を有する第２検出化合物と接触させ；
ｃ）第１標識によって生成された第１シグナルを決定し；
ｄ）第２標識によって生成された第２シグナルを決定し；
ｅ）工程ｃ）の第１シグナルを工程ｄ）の第２シグナルと比較することにより、第１標識を有する検出化合物による分析物の決定を混乱させる干渉物質を含む試料を同定する；
を含む方法。
【００７７】
２７．  態様２６の方法であって、さらに複数の分析物を決定することを含む方法。
２８．  試料中の分析物を検出するためのキットであって、前記の分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物を含み、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が、同一ではないキット。
【００７８】
２９．  態様２８のキットであって、前記のキットが、さらに前記の分析物に関する少なくとも１種類の捕捉化合物を含むキット。
３０．  態様２８または２９のキットであって、前記のキットが、さらに前記の捕捉化合物または少なくとも前記の分析物を含む前記の試料の構成要素を固定化するための固体支持体を含むキット。
【００７９】
３１．  試料中の分析物を決定するためのデバイスであって、前記の分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物（ここで、前記の第１検出化合物は、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物は、第２結合部分および第２標識を含み、かつここで、第１標識および第２標識は、同一ではない）ならびに前記の第１標識および前記の第２標識から得られる少なくとも１つのシグナルを決定するための手段を含むデバイス。
【００８０】
３２．  分析物を検出するための少なくとも第１および第２検出化合物を含む組成物の使用であって、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が、同一ではない使用。
【００８１】
３３．  診断用組成物または診断デバイスの製造のための分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物の使用であって、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ第１標識および第２標識が、同一ではない使用。
【００８２】
３４．  態様３２または３３の使用であって、前記の分析物が、態様１９〜２２のいずれか１つにおいて明記されている分析物である使用。
３５．  試料中の前記の分析物を決定するための分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物を含む組成物の使用であって、前記の第１検出化合物が、第１結合部分および第１標識を含み、前記の第２検出化合物が、第２結合部分および第２標識を含み、かつ前記の第１標識および前記の第２標識が、同一ではない使用。
【００８３】
３６．  態様１〜２７のいずれか１つの方法、態様２８〜３０のいずれか１つのキット、態様３１のデバイスおよび／または態様３２〜３５のいずれか１つの使用であって、第１および第２検出化合物の親和性ドメインおよび／または結合部分が、同一である方法、キット、デバイスおよび／または使用。
【００８４】
３７．  態様１〜２７のいずれか１つの方法、態様２８〜３０のいずれか１つのキット、態様３１のデバイスおよび／または態様３２〜３５のいずれか１つの使用であって、第１および第２検出化合物の親和性ドメインおよび／または結合部分が、同一ではない方法、キット、デバイスおよび／または使用。
【００８５】
本明細書で引用されたすべての参考文献は、それらの全開示内容および本明細書で具体的に言及された開示内容に関して、参照により本明細書に援用される。
以下の実施例は、単に本発明を説明するものである。それらは、いかなる場合でも本発明の範囲を限定するように解釈されてはならない。
【実施例】
【００８６】
実施例１：定性的および競合的Ｅｌｅｃｓｙｓ抗Ａ型肝炎ウイルス（抗ＨＡＶ）アッセイにおける特異性の増大
抗ＨＡＶ抗体のインビトロ決定のための免疫アッセイを、自動化されたＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ｃｏｂａｓ分析計（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）上で製造業者の指示に従って実施した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅグループの登録商標である。
【００８７】
アッセイを、競合原理に従って実施した。第１インキュベーションでは、５０μｌの試料を、添加されたＨＡＶ抗原と共に、試料の抗ＨＡＶがＨＡＶ抗原に結合するようにインキュベートした。第２（その後の）インキュベーション工程では、ＨＡＶ抗原に特異的なビオチン化抗体およびルテニウム標識抗体を、ストレプトアビジンでコーティングした微粒子と一緒に、ＨＡＶ抗原上のまだ遊離している結合部位が占有されるように、試料−ＨＡＶ抗原混合物に添加した。複合体全体が、ビオチンおよびストレプトアビジンの相互作用により、固相（微粒子）に結合した。次に、反応混合物を測定セル中に吸引し、ここで、微粒子は、電極の表面上に磁気的に捕捉された。次いで、未結合の物質を、ＰｒｏＣｅｌｌ／ＰｒｏＣｅｌｌ  Ｍ（シグナル生成に必要なトリプロピルアミン（ｔｒｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎ）を含む緩衝液）により除去した。次いで、電極への電圧の印加は、化学発光を誘導し、それは、光電子増倍管により測定された。結果を、２点較正（Ｃａｌ１＝ヒト抗ＨＡＶ陰性血清を含む陰性較正物質；Ｃａｌ２＝ヒト血清中のヒト抗ＨＡＶを含む陽性較正物質）により機器特異的に生成された較正曲線により決定した。詳細には、モノクローナルＭＡＫ＜ＨＡＶ＞Ｍ−２．１５７−Ｆ（ａｂ’）２−抗体フラグメントを使用し、一方の分割量をＢＰ−Ｒｕで標識し、他方の分割量をＳｕｌｆｏ−Ｒｕで標識し；これらを用いて抗ＨＡＶアッセイの３つの異なるバージョンを生成した：
アッセイ１：Ｒ２で使用されたＭＡＫ＜ＨＡＶ＞Ｍ−２．１５７−Ｆ（ａｂ’）２の１００％が、スルホ−Ｒｕで標識されている。
【００８８】
アッセイ２：Ｒ２で使用されたＭＡＫ＜ＨＡ  Ｖ＞Ｍ−２．１５７−Ｆ（ａｂ’）２の１００％が、ＢＰ−Ｒｕで標識されている。
アッセイ３：アッセイ１  Ｒ２およびアッセイ２  Ｒ２の１＋１混合物（ＢＰ−Ｒｕおよびスルホ−Ｒｕの混合物を意味する）を使用した。ＢＰ−Ｒｕおよびスルホ−Ｒｕのシグナルのシグナル全体への寄与は、類似していた。
【００８９】
第１標識は、Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ−ＯＳｕとも呼ばれる“ＢＰ−Ｒｕ”（ＣＡＳ登録番号１３７３２３−７６−３、＝ルテニウム（２＋），ビス（２，２’−ビピリジン−κＮ１，κＮ１’）［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−，（ＯＣ−６−３３）  Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ２Ｈ（＝ＢＰＲｕまたはＲｕ−ｂｐｙ）の反応性エステル、ＣＡＳ登録番号１１５２３９−５９−３））であり、第２標識は、スルホ−ＢＰＲｕ  ＮＨＳエステルとも呼ばれる“スルホ−Ｒｕ”（ＣＡＳ登録番号４８２６１８−４２−８、当該技術においてルテネート（２−），ビス［［２，２’−ビピリジン］−４，４’−ジメタンスルホナト（２−）−κＮ１，κＮ１’］［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−，ナトリウム（１：２）、（ＯＣ−６−３１）としても知られている）である。
【００９０】
較正物質および標準試料を用いた結果を、表１に示す。さらに、抗スルホ−Ｒｕ干渉試料のような２７種類の既知の抗標識干渉試料ならびに１種類の既知の抗ＢＰ−Ｒｕ干渉試料を、３つのアッセイ全てにより試験した（表２）。これらの試料は、それぞれの抗ＨＡＶアッセイバリアントにおける使用の際に偽陽性結果をもたらすことが知られている。予想されたように、抗Ｓｕｌｆｕ−Ｒｕ干渉試料は、アッセイ１では偽陽性であるが、アッセイ２では正しい陰性であり、抗ＢＰ−Ｒｕ干渉試料は、アッセイ１では正しい陰性であるが、アッセイ２では偽陽性である。興味深いことに、１つの抗Ｓｕｌｆｏ  Ｒｕ干渉試料（ＰＮ０２０６＿０９２５）を除く全ての試料は、ＢＰ−ＲｕおよびスルホＲｕの標識混合物を含有するアッセイ３で正しい陰性であり、これは、特異性における有意な改善を意味する。
【００９１】
カットオフ指数（ＣＯＩ）は、以下のように計算される：
カットオフは、陰性（Ｃａｌ１）および陽性（Ｃａｌ２）較正物質を使用した２点較正を使用して決定された。カットオフ指数（ＣＯＩ）は、カウント数（試料）をカットオフで割ることにより決定された。結果は、ＣＯＩ≦１の場合は反応性であると解釈され、ＣＯＩ＞１の場合は非反応性であると解釈される。
【００９２】
実施例２：定量的ＤＡＧＳ  Ｅｌｅｃｓｙｓ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＧアッセイの感度の増大
Ｔｏｘｏ−ＩｇＧ抗体のインビトロ決定のための免疫アッセイを、自動化されたＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ｃｏｂａｓ分析計（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）上で製造業者の指示に従って実施した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅグループの登録商標である。
【００９３】
アッセイを、サンドイッチ原理（ＩｇＧ抗体が２つのＴｏｘｏ−ｐ３０抗原の間に挟まれる）に従って実施した。第１インキュベーションでは、１０μｌの試料（ビオチン化された組換えＴ・ゴンディ特異的抗原およびルテニウム複合体で標識されたＴ・ゴンディ特異的組換え抗原）が、サンドイッチ複合体を形成する。第２工程では、ストレプトアビジンでコーティングされた微粒子を、試料抗体およびＴｏｘｏ抗原の免疫複合体がビオチンおよびストレプトアビジンの相互作用を介して固相に結合するように添加した。次に、反応混合物を測定セル中に吸引し、ここで、微粒子は、電極の表面上に磁気的に捕捉された。次いで、未結合の物質を、ＰｒｏＣｅｌｌ／ＰｒｏＣｅｌｌ  Ｍ（シグナル生成に必要なトリプロピルアミン（ｔｒｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎ）を含む緩衝液）により除去した。次いで、電極への電圧の印加は、化学発光を誘導し、それは、光電子増倍管により測定された。結果を、２点較正（Ｃａｌ１＝抗トキソプラズマ陰性であるヒト血清を含む陰性較正物質；Ｃａｌ２＝抗トキソプラズマＩｇＧに反応性のヒト血清を含む陽性較正物質）により機器特異的に生成された較正曲線により決定した。
【００９４】
詳細には、２種類の異なる標識を施された組換えＴｏｘｏ−ｐ３０抗原の質を使用し、一方は、ＢＰ−Ｒｕで標識され、他方は、スルホ−Ｒｕで標識されていた（標識の化学名は実施例１を参照）。２種類の組換えＴｏｘｏ−ｐ３０抗原の質を用いて、Ｔｏｘｏ  ＩｇＧアッセイの３つの異なるバージョンを生成した：
アッセイ１：Ｒ２で使用された組換えＴｏｘｏ−ｐ３０抗原の１００％が、スルホ−Ｒｕで標識されている。
【００９５】
アッセイ２：Ｒ２で使用された組換えＴｏｘｏ−ｐ３０抗原の１００％が、ＢＰ−Ｒｕで標識されている。
アッセイ３：アッセイ１  Ｒ２およびアッセイ２  Ｒ２の１＋１混合物（ＢＰ−ＲｕおよびＳｕｌｆｏ−Ｒｕの混合物を意味する）を使用した。ＢＰ−Ｒｕおよびスルホ−Ｒｕのシグナルのシグナル全体への寄与は、類似していた。
【００９６】
結果は、製造業者の指示に従って、１  ＩＵ／ｍＬ未満の場合は非反応性、１  ＩＵ／ｍＬ以上３  ＩＵ／ｍＬ未満の場合は不確定、そして３  ＩＵ／ｍＬ以上の場合は反応性と解釈された。較正物質および標準試料を用いた結果を表３に示す。さらに、それぞれのアッセイバリアントにおいて偽陰性または偽不確定の結果をもたらすいくつかの抗スルホ−Ｒｕおよび抗ＢＰ−Ｒｕ干渉試料を、３つのアッセイ全てで試験した（表４）。予想された通り、抗Ｓｕｌｆｕ−Ｒｕ干渉試料は、アッセイ１では偽陰性または偽不確定であるが、アッセイ２では正しい不確定または正しい陽性である。その逆も同様であり、同じことが、アッセイ２に干渉する抗ＢＰＲｕ干渉試料に関しても当てはまる。興味深いことに、全ての試料は、ＢＰ−ＲｕおよびスルホＲｕの標識混合物を含有するアッセイ３において正しい不確定または正しい陰性であることが分かり、これは、感度の著しい増加を意味する。
【００９７】
引用された参考文献：
Ando et al. (2007), Intern Med. 46(15):1225
Buijs et al. (2011), Ann Clin Biochem. 48(Pt 3):276
DE 19519973 A1
DeForge (2010), J Immunol Methods. 362(1-2):70)
Heijboer et al. (2009), Ann Clin Biochem.46(Pt 3):263
Klevenz et al., Cell Mol Life Sci. 2002, 59: 1993-1998
Park & Kricka (2013), David Wildにより編集されたThe Immunoassay Handbook (第４版), Elsevier, Oxford: 403中の第5.3章- Interferences in Immunoassay
Sapin et al. (2007), Clin Chern Lab Med. 45(3):416
Schiettecatte (2012), Interferences in Immunoassays, Advances in Immunoassay Technology, Dr. Norman H.L. Chiu (編者)
国際公開第２０１６０９７１１６  Ａ１号
国際公開第２０１７０９３２７１  Ａ１号
【００９８】
【表１】
2021517641.tif 000002
【００９９】
【表２−１】
2021517641.tif 000003
【０１００】
【表２−２】
2021517641.tif 000004
【０１０１】
【表３−１】
2021517641.tif 000005
【０１０２】
【表３−２】
2021517641.tif 000006
【０１０３】
【表４−１】
2021517641.tif 000007
【０１０４】
【表４−２】
2021517641.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月13日(2020.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物を決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）試料を少なくとも第１および第２検出化合物と接触させ；
ｂ）少なくとも１種類の検出化合物を含む複合体の量を決定し；そして
ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて該試料中の分析物を決定する；
を含み、該第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、該第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、そして該第１標識および該第２標識が同一ではない、前記方法。
【請求項２】
前記第１標識および前記第２標識が、同じ検出可能な特性を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および／または前記第２検出化合物によって提供される検出可能な特性が、放射特性、一態様において発光特性、さらなる態様において化学発光特性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１検出化合物中の標識が、Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ−ＯＳｕ（ＣＡＳ登録番号１３７３２３−７６−３）を含み、そして／または前記第２検出化合物中の標識が、スルホ−ＢＰＲｕ  ＮＨＳエステル（ＣＡＳ登録番号４８２６１８−４２−８）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ｂ）において複合体の量を決定することが、第１検出化合物の検出可能な特性および第２検出化合物の検出可能な特性を検出することを含み、一態様において第１検出化合物の検出可能な特性および第２検出化合物の検出可能な特性を同時に検出することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記の方法が免疫アッセイである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記の試料が、体液、一態様において血液、血清または血漿試料である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記の分析物がポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記の分析物が、抗体、一態様において抗Ａ型肝炎抗体または抗トキソプラズマ抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記の分析物が、病原性生物由来の抗原であり、一態様においてウイルス抗原または細菌抗原である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の分析物を検出するためのキットであって、少なくとも分析物に関する第１および第２検出化合物を含み、該第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、該の第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、そして該第１標識および該第２標識が同一ではない、前記キット。
【請求項１２】
前記のキットが、さらに前記の分析物に関する少なくとも１種類の捕捉化合物および／または該捕捉化合物もしくは少なくとも該分析物を含む試料の構成要素を固定化するための固体支持体を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
試料中の分析物を決定するためのデバイスであって、分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物、ここで、該第１検出化合物は第１結合部分および第１標識を含み、そして該第２検出化合物は第２結合部分および第２標識を含み、そして、ここで、該第１標識および該第２標識は同一ではない、そして該第１標識および該第２標識から得られる少なくとも１種類のシグナルを決定するための手段を含む、前記デバイス。
【請求項１４】
分析物を検出するための、少なくとも第１および第２検出化合物を含む組成物の使用であって、該第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、該第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、そして該第１標識および該第２標識が同一ではない、前記使用。
【請求項１５】
前記第１および前記第２検出化合物の結合部分が同一である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法、請求項１１または１２に記載のキット、請求項１３に記載のデバイスおよび／または請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
アッセイにおける分析物の検出の特異性を向上させるための方法であって、第１検出化合物の１０％〜９０％を同一ではない標識を有する第２検出化合物により置き換えることを含む、前記方法。
【請求項１７】
第１標識を有する検出化合物による分析物の決定を混乱させる干渉物質を含む試料を同定するための方法であって、以下の工程：
ａ）試料の分割量を、第１標識を有する第１検出化合物と接触させ；
ｂ）該試料の分割量を、第２標識を有する第２検出化合物と接触させ；
ｃ）該第１標識によって生成された第１シグナルを決定し；
ｄ）該第２標識によって生成された第２シグナルを決定し；
ｅ）工程ｃ）の第１シグナルを工程ｄ）の第２シグナルと比較することにより、第１標識を有する検出化合物による分析物の決定を混乱させる干渉物質を含む試料を同定する；
を含む、前記方法。
【請求項１８】
診断用組成物または診断デバイスの製造のための分析物に関する少なくとも第１および第２検出化合物の使用であって、該第１検出化合物が第１結合部分および第１標識を含み、該第２検出化合物が第２結合部分および第２標識を含み、そして該第１標識および該第２標識が同一ではない、前記使用。
【国際調査報告】
2021517641.tif 000009
2021517641.tif 000010
2021517641.tif 000011