(57)【要約】  外来性蛋白質を含む操作されたナノベシクル及び操作された血小板、並びにそれを対象へ投与することを含む、癌を処置するための方法が開示されている。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル又は操作された血小板。
【請求項２】
前記１つ以上の外来性蛋白質受容体が、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、又はＴＩＭ３を含む、請求項１に記載の操作されたナノベシクル又は操作された血小板。
【請求項３】
前記ナノベシクルが、樹状細胞、幹細胞、免疫細胞、巨核球前駆細胞、又はマクロファージに由来する、請求項１に記載の操作されたナノベシクル又は操作された血小板。
【請求項４】
請求項１に記載の操作されたナノベシクル又は操作された血小板を含む、医薬組成物。
【請求項５】
治療薬をさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記治療薬が、前記操作されたナノベシクル又は操作された血小板の中に封入されている、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記治療薬が、小分子、ｓｉＲＮＡ、ぺプチド、ペプチド模倣体、又は抗体である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記治療薬が、１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）、ノルハルマン、ロスマリン酸、エパカドスタット、ナボキシモド（ｎａｖｏｏｘｉｍｏｄ）、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンブラスチン、又は５−フルオロウラシルを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記治療薬が、抗ＰＤＬ−１抗体を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体が、アテゾリズマブ（Ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、又はアベルマブである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療薬が、シクロホスファミドを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌に罹患している患者に、請求項１〜１０のいずれかに記載の操作されたナノベシクル又は医薬組成物を投与することを含む、対象における癌を処置する方法。
【請求項１３】
前記癌が、黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺癌、又は膀胱癌を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物が、前記患者に少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８時間ごとに１回、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１日ごとに１回、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月ごとに１回投与される、請求項１２に記載の癌を処置する方法。
【請求項１５】
前記操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物が、１週間あたり少なくとも１、２、３、４、５、６、７回投与される、請求項１２に記載の癌を処置する方法。
【請求項１６】
前記操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物の用量が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１２に記載の癌を処置する方法。
【請求項１７】
化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項１２に記載の癌を処置する方法。
【請求項１８】
前記操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物が、前記腫瘍の手術による切除の後で投与される、請求項１２に記載の癌を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第１Ｌ１ＴＲ００１１１１号に基づく政府支援によって行われた。米国政府は、本発明にある特定の権利を有する。本出願は、２０１８年２月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６３０，９５６号の利益を主張し、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ．背景技術
手術は、臨床処置におけるほとんどの固形腫瘍にとって主な選択肢である。しかしながら、手術は、腫瘍の不完全な切除のため、再発の危険性に苦しむことがよくある。さらに、手術が時折、癌の転移を促進し得ることも示されてきた。この故に、手術後に癌を処置又は癌の再発を予防するための有効な戦略を開発することに多大な関心が集められてきた。癌の免疫療法は、ヒト免疫系を利用して癌細胞を除去することを目的とする。好ましいことに、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞は、残存腫瘍細胞を根絶することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍に対する最も重要なリンパ球応答のうちの１つであり、特に突然変異遺伝子を保有する。実際、これらの新生抗原（突然変異蛋白質由来抗原）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍内へと浸潤して正の免疫療法結果をもたらすことができる。しかしながら、腫瘍内でのプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の発現は、Ｔ細胞応答を抑制し、Ｔ細胞を消耗させる原因となる（Ｔｅｘ）。Ｔｅｘ細胞は、抑制性受容体であるプログラム死１（ＰＤ−１）を経てＰＤ−Ｌ１リガンドによって抑止した。加えて、Ｔｅｘ細胞は、腫瘍の根絶をし損なわせるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、グランザイムＢ及びパーフォリンなどの免疫サイトカインの産生を不能にする。チェックポイント抗体によってＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を遮断することは、臨床処置においてＴｅｘ細胞に活力をもたらすことができ、かつ多くの種類のヒトの癌、特に黒色腫にとって、陽性応答を呈することができる。チェックポイント抗体療法は、黒色腫患者において約３７〜３８％の率を、並びに腎細胞癌、非小細胞肺癌及び膀胱癌などの他の種類の癌において同様の応答率を達成した。しかしながら、抗ＰＤ−１療法は、全種類の癌に対して有効であるというものではない。事実、半分を超える患者は、ＰＤ−１抗体療法に対する耐性を示し、少数の患者のみが、多重免疫遮断により、この処置から利益を受けている。その一方で、利用可能なヒト化抗体のほとんどは、マウスから産生されており、複雑な設計及び単離を必要とする。結果として、チェックポイント抗体療法の費用は、多くの患者にとって高過ぎて支払うことができないままである。それゆえ、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害軸の拮抗作用となる代替的なアプローチを開発する必要がある
【発明の概要】
【０００３】
ＩＩ．概要
癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル又は操作された血小板に関する方法及び組成物が開示されている。
【０００４】
一態様において、１つ以上の外来性蛋白質受容体は、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、又はＴＩＭ３を含むことができる。
【０００５】
何らかの先行する態様の、操作されたナノベシクル又は操作された血小板も本明細書に開示されており、操作されたナノベシクル又は操作された血小板は、樹状細胞、幹細胞、免疫細胞、巨核球前駆細胞、又はマクロファージに由来する。
【０００６】
一態様において、何らかの先行する態様の操作されたナノベシクル又は操作された血小板を含む医薬組成物が本明細書で開示される。
【０００７】
例えば、小分子（１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）、ノルハルマン、ロスマリン酸、エパカドスタット、ナボキシモド（ｎａｖｏｏｘｉｍｏｄ）、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンブラスチン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルを含むがこれらに限定されない）、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、ペプチド模倣体、又は抗体（例えば、アテゾリズマブ（Ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、及びアベルマブを含むがこれらに限定されない抗ＰＤＬ−１抗体など）をさらに含む何らかの先行態様の医薬組成物も本明細書で開示される。
【０００８】
一態様において、何らかの先行する態様の医薬組成物が本明細書で開示され、治療薬は、操作されたナノベシクル又は操作された血小板の中に封入されている。
【０００９】
また、癌患者に、何らかの先行態様の、操作されたナノベシクル、操作された血小板又は医薬組成物を投与することを含む、対象における癌（黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺癌、及び／又は膀胱癌を含むがこれらに限定されない）を処置する方法が本明細書で開示される。
【００１０】
一態様において、何らかの先行態様の、対象における癌を処置する方法が本明細書で開示され、操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物は、患者に少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８時間ごとに１回、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１日ごとに１回、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月ごとに１回投与される。
【００１１】
また、何らかの先行態様の、対象における癌を処置する方法が開示され、操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物は、１週間あたり少なくとも１、２、３、４、５、６、７回投与される。
【００１２】
一態様において、何らかの先行態様の、対象における癌を処置する方法が開示され、投与された操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物の用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００１３】
また、化学療法薬を投与することをさらに含む、何らかの先行態様の、対象における癌を処置する方法が本明細書で開示される。
【００１４】
また、何らかの先行態様の、対象における癌を処置する方法が開示され、操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物は、腫瘍の手術による切除の後で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
ＩＩＩ．図面の簡単な説明
添付図面は、本明細書の一部に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、いくつかの実施形態を表し、明細書とともに、本開示の組成物及び方法を説明する。
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｈ、及び図１Ｉは、癌免疫療法のためのＰＤ−１遮断の概略図及び特徴づけを示す。図１Ａは、１−ＭＴを負荷したＰＤ−１のＮＶの調製物を示す概略図を示す。（ｉ）細胞膜上でマウスＰＤ−１受容体を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の操作。（ｉｉ）ＰＤ−１受容体を発現する細胞膜の収穫。（ｉｉｉ）押出を経たＰＤ−１のＮＶの調製。図１Ｂは、ＰＤ−Ｌ１が、ＰＤ−１受容体と相互作用することによってＣＤ８＋Ｔ細胞を消耗させることを示す。ＩＤＯの発現は、Ｔｒｅｇ細胞によって誘導され、このことがＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を阻害する。図１Ｃは、ＰＤ−１のＮＶによるＰＤ−Ｌ１の遮断が、消耗したＣＤ８＋細胞を元に戻して、腫瘍細胞を攻撃するようにすることを示す。ＩＤＯ阻害剤１−ＭＴの放出はまた、消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞を元に戻す。図１Ｄは、細胞膜上でマウスＰＤ−１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の確立を示す。ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８色素を使用して、細胞膜を標識した。スケールバーは、１０μｍである。図１Ｅは、ＴＥＭ画像がＰＤ−１のＮＶの形状及び大きさを示したことを示す。スケールバーは、１００ｎｍである。図１Ｆは、凍結した走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像が、ＰＤ−１のＮＶの自然な形状を示したことを示す（スケールバーは、１００ｎｍである）。図１Ｇは、共焦点画像が、赤色のスポットによってＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１のＮＶの存在を示したことを示す。スケールバーは、１μｍである。図１Ｈは、ＤＬＳによって測定されるＰＤ−１のＮＶの大きさの分布を示す。図１Ｉは、ウェスタンブロットアッセイが、ＮＶ上でのマウスＰＤ−１受容体の発現、及び安定した細胞株の全細胞溶解物（ＷＣＬ）を呈したことを示す。Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼを負荷対照として使用した。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、ＰＤ−１のＭＶの特徴づけを示す。図２Ａは、共焦点画像が、赤色のスポットによってＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１のＭＶの存在を示したことを示す。スケールバーは、１０００ｎｍである。図２Ｂは、ＤＬＳによって測定されるＰＤ−１のＭＶの大きさの分布を示す。図２Ｃは、非含有ＮＶ及びＰＤ−１のＮＶのゼータ電位を示す（ｎ＝３）。エラーバーは、平均±標準偏差である。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ、及び図３Ｉは、ＰＤ−１のＮＶの  試験管内  生物学的挙動及び  生体内  生物分布  を示す。図３Ａは、Ｂ１６Ｆ１０癌細胞の細胞膜上で結合したＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１のＮＶを示す。ＰＤ−１のＮＶ（５０μｇ／ｍＬ）又はＣｙ５．５で標識したＰＤ−１非含有ＮＶ（５０μｇ／ｍＬ）を、Ｂ１６Ｆ１０細胞とともに２時間インキュベートした。ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８色素を用いて、Ｂ１６Ｆ１０細胞膜を検出した（スカーバーは１０μｍである）。図３Ｂは、ＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１のＮＶがＤＣによって取り入れられたことを示す。ＰＤ−１のＮＶ（５０μｇ／ｍＬ）をＤＣとともに２時間インキュベートした。ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８色素を使用して、細胞膜を検出した。スカーバーは、１０μｍである。図３Ｃは、Ｂ１６Ｆ１０細胞にＥＧＦＰ−ＰＤ−Ｌ１プラスミドを２０時間トランスフェクトした後、ＰＤ−１のＮＶ（５０μｇ／ｍＬ）とともに５時間インキュベートし、ＰＤ−１のＮＶとＰＤ−Ｌ１蛋白質との共局在を検出したことを示す（スカ―バーは、１０μｍである）。先の画像は、下側の画像上の白色の襟部分において拡大したものである。図３Ｄは、ＰＤ−１のＮＶとＢ１６Ｆ１０細胞との結合の代表的なフローサイトメトリー分析画像を示す（ＤｓＲｅｄ＋に関してゲート）。ＰＤ−１のＮＶ（５０μｇ／ｍＬ）をＢ１６Ｆ１０細胞とともに２時間インキュベートした。又はａＰＤ−Ｌ１抗体（２０μｇ／ｍＬ）を細胞とともに４時間インキュベートした後、ＰＤ−１のＮＶを培地中に、示す通り添加した。図３Ｅは、ＣＯ−ＩＰ及びウェスタンブロットを使用して、ＰＤ−１（ＮＶ上）とＰＤ−Ｌ１（Ｂ１６Ｆ１０細胞上）との間の相互作用を検討した。図３Ｆは、Ｃｙ５．５標識した非含有ＮＶ（２００μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）及びＰＤ−１のＮＶ（２００μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を、マウスの尾静脈を経て注射した。示す通りの異なる時点で蛍光を測定した（ｎ＝３）エラーバーは、平均±標準偏差である。図３Ｇは、腫瘍及び主要器官における非含有ＮＶ及びＰＤ−１のＮＶの分布のＩＶＩＳスペクトル画像を示す。左は、肺、心臓及び肝臓である。右は、脾臓、腎臓及び腫瘍である。図３Ｈは、示すように、腫瘍及び主要器官における組織１グラム当たりの蛍光強度を示す（ｎ＝３）。エラーバーは、平均±標準偏差である。図３Ｉは、共焦点顕微鏡を用いて、器官及び腫瘍の切片におけるＰＤ−１のＮＶの分布を検出したことを示す。スカーバーは、１００μｍである。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、尾静脈注射を経た異なる薬用量を用いたＰＤ−１のＮＶの  生体内  抗腫瘍効果  を示す。図４Ａは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍の生体内生物発光撮像を示す。図４Ｂは、異なる処置を用いたマウスの平均腫瘍量を示す（ｎ＝７）。エラーバーは、平均±平均の標準誤差である。ＮＳは、有意ではなく、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｔｕｋｅｙの事後検定を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）による。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｉ、及び図５は、ＰＤ−１のＮＶの  生体内  抗腫瘍効果を示す。図５Ａは、非含有ＮＶ、ＰＤ−１のＮＶ及びＰＤ−Ｌ１抗体の尾静脈注射後の異なる時点での異なるマウス群のＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍の生体内生物発光撮像を示す。０日目は、処置の第１の回についての日である。図５Ｂは、異なる群における処置されたマウスの平均腫瘍量を示す（ｎ＝７）。エラーバーは、平均±平均の標準誤差である。図５Ｃは、異なる群の安楽死させたマウスから摘出した代表的な腫瘍像を示す（ｎ＝７）。エラーバーは、平均±標準偏差である。図５Ｄは、ＰＤ−１のＮＶ、ＰＤ−Ｌ１抗体及び非含有ＮＶの処置を受けたマウスについての生存曲線を示す（ｎ＝１０）。図５Ｅは、処置を受けたマウス及び対照マウスの体重を示す。エラーバーは、平均±標準偏差である。図５Ｆは、マウスが第１に示した処置を受けた後、２０日目で単離されたマウス由来血清中のＩＦＮ−γレベルを示す（ｎ＝３）。エラーバーは、平均±標準偏差である。図５Ｇ及び図５Ｈは、フローサイトメトリーによって分析された、処置した腫瘍におけるＴ細胞の代表的なプロット（５Ｇ）及び定量的な分析（５Ｈ）を示す（ＣＤ３＋細胞に関してゲート）（ｎ＝３）。エラーバーは、平均±標準偏差である。図５Ｉ及び図５Ｊは、浸潤されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を示す腫瘍切片の免疫蛍光染色の代表的な画像（５Ｉ）及び定量的な解析（５Ｊ）を示す（ｎ＝３）。エラーバーは、平均±標準偏差である。スカーバーは、１００μｍである。全体を通じて、ＮＳ：有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（５Ｂ、５Ｃ、５Ｆ、５Ｈ、５Ｊ）又は対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定（５Ｄ）による。
【図６】図６は、ＩＤＯ酵素活性を非含有１−ＭＴ、１−ＭＴ＠ＮＶ及び１−ＭＴ＠ＰＤ−１  ＮＶの処置後のキヌレニン産生の阻害として測定したことを示す。
【図７】図７は、示した異なる時点における腫瘍組織１グラム当たりの蛍光強度を示す（ｎ＝３）。エラーバーは、平均±標準偏差である。
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、及び図８Ｆは、１−ＭＴを負荷したＰＤ−１のＮＶによる腫瘍成長の  生体内  抑制を示す。図８Ａは、異なる処置を受けたマウスのＢ１６Ｆ１０腫瘍の生体内生物発光撮像を示す。ＰＢＳ（第１の群）、非含有ＮＶ（第２の群）、１−ＭＴ（第３の群）、ＰＤ−１のＮＶ（第４の群）、１−ＭＴ＠ＮＶ（第５の群）、１−ＭＴ＋ａＰＤ−Ｌ１（第６の群）、１−ＭＴ＠ＰＤ−１  ＮＶ（第７の群）。０日目は、処置の第１の回についての日である。図８Ｂは、示した通り、異なる群における処置されたマウスの平均腫瘍量を示す（ｎ＝７）。エラーバーは、平均±平均の標準誤差である。図８Ｃは、示した通り、異なる処置を受けたマウスについての生存曲線を示す（ｎ＝１０）。図８Ｄ及び図８Ｅは、異なる処置群からの腫瘍におけるＴ細胞の代表的なフローサイトメトリープロット（８Ｄ）及び定量的な解析（８Ｅ）を示す（ｎ＝３。細胞を陽性ＣＤ３＋発現について事前にゲートした。エラーバーは、平均±標準偏差である。図８Ｆは、腫瘍の免疫蛍光が、浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を示したことを示す。スカーバーは、１００μｍである。全体を通して、ＮＳ：有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、２つの二元配置分散分析を実施して解析をした（８Ｂ及び８Ｅ）。Ｔｕｋｅｙの事後検定を用いた第１の二元配置分散分析の解析は、非含有ＮＶ（第２の群）、ＰＤ−１のＮＶ（第４の群）、１−ＭＴ＠ＮＶ（第５の群）及び１−ＭＴ＠ＰＤ１−ＮＶ（第７の群）の群間で実施した。考えられた２つの因子は、１−ＭＴ及びＰＤ−１であった。Ｔｕｋｅｙの事後検定を用いた第２の二元配置分散分析は、ＰＢＳ対照（第１の群）、ａＰＤ−Ｌ１、１−ＭＴ（第３の群）及びａＰＤ−Ｌ１＋１−ＭＴ（第６の群）の群間で実施した。このモデルにおける２つの因子は、１−ＭＴ及びａＰＤ−Ｌ１であり（８Ｂ及び８Ｅ）又は対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によるものとした（８Ｃ）。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃは、ＰＤ−１発現血小板の産生及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活力付与の概略図を示す。図９Ａは、マウスＰＤ−１を安定して発現するＬ８０５７細胞株、及び血小板の産生を示す。図９Ｂは、ＰＤ−１発現血小板が手術創内で腫瘍細胞を標的とすることを示す。図９Ｃは、ＰＤ−１発現血小板によるＰＤ−Ｌ１遮断が、消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞を逆転させて腫瘍細胞を攻撃することを示す。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇ、図１０Ｈ、図１０Ｉ、図１０Ｊ、及び図１０Ｋは、ＰＤ−１発現Ｌ８０５７安定細胞株からの血小板の産生及び特徴づけを示す。図１０Ａは、共焦点画像が、マウスＥＧＦＰ−ＰＤ−１を細胞膜上で安定して発現するＬ８０５７細胞株を表すことを示す。ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ５９４色素を使用して、細胞膜を染色した（スケールバーは、１０μｍである）。図１０Ｂは、Ｌ８０５７細胞株におけるＰＤ−１の発現を評価するためのウェスタンブロット分析を示す。Ｌ８．は、Ｌ８０５７細胞の略である。図１０Ｃは、ＥＧＦＰ−ＰＤ−１発現Ｌ８０５７細胞を５００ｎＭのＰＭＡで３日間刺激し、免疫染色してＣＤ４２ａ発現を検出したことを示す。図１０Ｄは、Ｌ８０５７細胞を５００ｎＭのＰＭＡで３日間刺激し、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ色素で染色したことを示す（スケールバーは、１０μｍである）。図１０Ｅは、ＰＤ−１発現血小板前駆細胞の進化の過程がＭＫから伸びていることを示す（スケールバーは、１０μｍである）。図１０Ｆは、ＰＤ−１血小板前駆細胞の形態が、５００ｎＭのＰＭＡによる刺激の６日間後にＬ８０５７細胞から伸びたことを示す。ＰＤ−１血小板前駆細胞は、Ｌ８０５７細胞から伸びた（スケールバーは、１０μｍである）。図１０Ｇは、精製したＰＤ−１発現血小板の代表的な共焦点画像を示す（スケールバーは、１０μｍである）。図１０Ｈは、ＤＬＳによって測定されたＰＤ−１発現血小板の大きさの分布を示す。図１０Ｉは、ＣＳＥＭ画像がＰＤ−１発現血小板の形態的特徴を示すことを示す（スケールバーは、１μｍである）。図１０Ｊは、代表的なＴＥＭ画像が、ＰＤ−１発現血小板の形態的特徴及び大きさを示すことを示す（スケールバーは、１μｍである）。図１０Ｋは、５００ｎＭのＰＭＡで刺激した後のＰＤ−１発現Ｌ８０５７細胞から放出された血小板の数を示す（ｎ＝５）。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、及び図１１Ｉは、ＰＤ−１血小板の  試験管内  及び  生体内  の生物学的挙動  を示す。図１１Ａ及び図１１Ｂは、コラーゲンをコーティングした又はコーティングしていない組織培養スライド上での血小板の保持を示す。スケールバーは、５０μｍである。図１１Ｃは、トロンビンで刺激したＰＤ−１血小板の共焦点ＳＥＭ画像及びＴＥＭ画像を示す。血小板微粒子（ＰＭＰ）が血小板から放出された。図１１Ｄは、トロンビンによる３０分間の処理による活性化の後のＰＤ−１血小板の大きさの分布の測定結果を示す。ＰＭＰが血小板から産生された。図１１Ｅは、Ｂ１６Ｆ１０細胞の細胞膜上に結合したＥＧＦＰ−ＰＤ−１血小板を示す。ＰＤ−１血小板又はＣｙ５．５で標識した非含有血小板をＢ１６Ｆ１０細胞とともに２０時間インキュベートした。ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ５９４色素を使用して、Ｂ１６Ｆ１０細胞膜を染色した（スカーバーは、１０μｍである）。図１１Ｆは、ＤｓＲｅｄ−ＰＤ−Ｌ１プラスミドを２０時間トランスフェクトした後、ＥＧＦＰ−ＰＤ−１血小板とともに５時間インキュベートし、ＥＧＦＰ−ＰＤ−１血小板とＤｓＲｅｄ−ＰＤ−Ｌ１との共局在を検出したＢ１６Ｆ１０細胞を示す（スカーバーは、１０μｍである）。図１１Ｇは、Ｃｙ５．５標識した非含有血小板、及びＰＤ−１血小板をマウスの尾静脈へ注射したことを示す。示した通りの異なる時点で蛍光を測定した（ｎ＝３）。エラーバーは、平均±標準偏差である。図１１Ｈは、主要器官及び残存腫瘍における非含有血小板及びＰＤ−１血小板の分布の生体内蛍光画像を示す。図１１Ｉは、示した通りの主要器官及び腫瘍における組織１グラム当たりの蛍光強度を示す（ｎ＝３）。エラーバーは、平均±標準偏差である。
【図１２】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１２Ｆ、図１２Ｇ、図１２Ｈ、及び図１２Ｉは、ＰＤ−１血小板が不完全手術腫瘍モデルにおける腫瘍の進行を抑制することを示す。図１２Ａは、不完全手術腫瘍モデルにおける療法に使用したＰＤ−１血小板の概略図を示す。図１２Ｂは、異なる処置を受けた手術マウスからのＢ１６Ｆ１０腫瘍の生体内生物発光撮像を示す。それぞれ、ＰＢＳ、非含有血小板、及びＰＤ−１血小板である。図１２Ｃは、示した通りの異なる群における処置したマウスの平均腫瘍量を示す。データは、平均±平均の標準誤差として示されている。図１２Ｄは、示した通りの異なる処置を受けたマウスについての生存曲線を示す。図１２Ｅは、腫瘍切片の免疫蛍光がＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を示したことを示す（スカーバーは、１００μｍである）。図１２Ｆ及び図１２Ｇは、フローサイトメトリーによって分析した異なる処置群の腫瘍におけるＴ細胞の代表的なプロット（１２Ｆ）及び定量（１２Ｇ）を示す（ＣＤ３＋Ｔ細胞に関してゲート）。図１２Ｈ及び図１２Ｉは、フローサイトメトリーによって分析した異なる処置群の腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧｚｍＢの代表的なプロット（１２Ｈ）及び定量（１２Ｉ）を示す（ＣＤ８＋Ｔ細胞に関してゲート）。全体を通して、ＮＳ：有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｔｕｋｅｙの事後検定を用いた一元配置分散分析を実施して解析をした（１２Ｃ、１２Ｇ、及び１２Ｉ）か又は対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によった（１２Ｄ）。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅ、図１３Ｆ、図１３Ｇ、図１３Ｈ、図１３Ｉ、図１３Ｊ、及び図１３Ｋは、不完全手術腫瘍モデルにおけるシクロホスファミド負荷ＰＤ−１発現血小板の  生体内  抗腫瘍効果を示す。図１３Ａは、以下で処置したマウス（ｎ＝８）の平均腫瘍量を示す。ＰＢＳ（第１の群）、シクロホスファミド（ＣＰ）（第２の群）、ＰＤ−１発現血小板（第３の群）、ＣＰ非含有血小板（第４の群）、及びＣＰ負荷ＰＤ−１発現血小板（第５の群）。データは、平均±平均の標準誤差として示されている。＊＊＊ＰＢＳ対照と比較。図１３Ｂは、処置したマウスの生存曲線を示す。図１３Ｃは、フローサイトメトリーによって解析された腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３発現の定量を示す（ＣＤ４＋Ｔ細胞に関してゲート）（ｎ＝３）。図１３Ｄ及び図１３Ｅは、フローサイトメトリーによって解析した腫瘍内でのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７の代表的なプロット（１３Ｄ）及び定量（１３Ｅ）を示す（ＣＤ８＋Ｔ細胞に関してゲート）（ｎ＝３）。図１３Ｆ及び図１３Ｇは、フローサイトメトリーによって解析された腫瘍内でのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なプロット（１３Ｆ）及び定量（１３Ｇ）を示す（ＣＤ３＋Ｔ細胞に関してゲート）（ｎ＝３）。図１３Ｈ及び図１３Ｉは、フローサイトメトリーによって解析された腫瘍内でのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧｚｍＢの代表的なプロット（１３Ｈ）及び定量（１３Ｉ）を示す（ＣＤ８＋Ｔ細胞に関してゲート）（ｎ＝３）。図１３Ｊ及び図１３Ｋは、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を示す腫瘍の免疫蛍光を示す（スケールバーは、１００μｍである）。全体を通して、ＮＳ：有意ではない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、Ｔｕｋｅｙの事後検定を用いた二元配置分散分析を実施して解析をした（１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｇ、１３Ｉ、１３ｋ）か又は対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によった（１３Ｂ）。
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂ、及び図１４Ｃは、部分的腫瘍摘除後にＰＤ−１発現血小板で処置したマウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍成長を示す。図１４Ａは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の生体内腫瘍生物発光を示す。図１４Ｂは、フローサイトメトリーによって解析した腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３発現の代表的なプロットを示す（ＣＤ４＋Ｔ細胞に関してゲート）（ｎ＝３）。図１４Ｃは、処置マウス及び対照マウスの体重を示す。エラーバーは、±標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ＩＶ．発明を実施するための形態
本化合物、組成物、物品、機器及び／又は方法が開示及び説明される前に、これらは、別段の明示がなければ、特定の合成方法若しくは特定の組換えバイオテクノロジー法に、又は別段の明示がなければ、特定の試薬に限定されるものではなく、それ故、当然、変わり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００１７】
Ａ．  定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。このため、例えば、「薬学的担体（ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ）」という表記は、２つ以上のこのような担体の混合物などを含む。
【００１８】
本明細書において、範囲は、「約」を用いたある特定値から及び／又は「約」を用いた別の特定値までとして表すことができる。このような範囲が表されるとき、別の実施形態は、ある特定値から及び／又は他の特定値までを含む。同様に、先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」を使用することによって、値が近似値として表されるとき、特定値により別の実施形態が形成されることが理解されるであろう。さらに、各範囲の端点は、他の端点に関連する場合でも、他の端点とは独立している場合でも、有意であることは理解されよう。本明細書に開示したいくつかの値があり、各値はまた、本明細書において、その値自体に加えて、「約」を用いたその特定値、としても開示されていると理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、値が開示されているときには、その値「以下」、「その値以上」及び値間の可能な範囲も開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０以下」及び「１０以上」も開示されている。本出願全体を通じて、データはいくつかの異なる形式で提供されていることと、このデータは終点及び開始点並びにデータ点の何らかの組み合わせに対する範囲を表すことと、も理解される。例えば、特定のデータ点「１０」と特定のデータ点１５とが開示されている場合、１０及び１５よりも大きい、１０及び１５以上、１０及び１５よりも小さい、１０及び１５以下、並びに１０及び１５に等しいことが、１０と１５の間と同様に開示されているとみなされることが理解される。２つの特定の単位間の各単位も開示されていることも理解される。例えば、１０及び１５が開示されている場合、１１、１２、１３、及び１４も開示されている。
【００１９】
対象への「投与」は、作用薬を対象に導入又は送達する何らかの経路を含む。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、細静脈内、皮内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、移植された貯蔵器を介した、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術）などを含む何らかの適切な経路によって実施することができる。本明細書において使用される「同時の投与」、「併用投与」、「同時投与」又は「同時に投与された」は、同じ時点で、又は本質的に互いの直後に化合物が投与されることを意味する。後者の場合には、観察される結果が、化合物が同じ時点で投与されたときに達成される結果と区別できないほど十分に近い時刻で、２つの化合物が投与される。「全身投与」は、例えば、循環系又はリンパ系中への進入を経て、対象の身体の広範な領域（例えば、身体の５０％超）に作用薬を導入又は送達する経路を介して作用薬を対象に導入又は送達することを指す。これとは対照的に、「局所投与」は、投与点の領域又は投与点に直接隣接した領域に作用を導入又は送達し、かつ治療上有意な量で作用薬を全身に導入することがない経路を介して、作用薬を対象に導入し、又は送達することを指す。例えば、局所的に投与された作用薬は、投与点の局所的近傍においては容易に検出可能であるが、対象の身体の遠位部では検出不能であり、又は無視できる量で検出可能である。投与には、自己投与及び他者による投与が含まれる。
【００２０】
「生体適合性」は概して、レシピエントに対して概して非毒性であり、かつ対象に対して有意な有害作用を引き起こさない材料及びその何らかの代謝産物又は分解産物を指す。
【００２１】
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物、方法などが、列挙された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味するよう意図されている。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、組成物及び方法を定義するために使用されるとき、列挙された要素を含むが、その組み合わせに対する何らかの必須の有意性をもつ他の要素を排除することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法、並びにリン酸緩衝塩類溶液、防腐剤などのような医薬として許容され得る担体からの微量混入物を排除しないであろう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、その他の成分、及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法ステップの、微量を超える要素を排除することを意味するものとする。これらの各変化用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００２２】
「対照」とは、比較目的のための実験において使用される、代替の対象又は試料である。対照は、「陽性」又は「陰性」であり得る。
【００２３】
「放出制御」又は「徐放」は、生体内で所望の薬物動態特性を達成するために、制御された様式における、所与の剤形からの作用薬の放出を表す。「放出制御」作用薬送達の一態様は、所望される作用薬放出の動態を確立するために、製剤及び／又は剤形を操作する能力である。
【００２４】
作用薬の「有効量」は、所望の効果を提供するための作用薬の十分な量を指す。「有効」である作用薬の量は、対象の年齢及び全身状態、個別の１種類又は複数種類の作用薬などの多くの因子に応じて、対象ごとに異なるであろう。したがって、定量化された「有効量」を定めることは必ずしも可能ではない。しかしながら、いかなる対象の症例においても適切な「有効量」は、日常的な実験を用いて当業者が決定してもよい。また、本明細書で使用する場合、別段の明記がなければ、作用薬の「有効量」はまた、治療有効量及び予防有効量の両方に及ぶ量を指すことができる。治療効果を達成するために必要な作用薬の「有効量」は、対象の齢、性別及び体重などの因子によって変わり得る。投薬療法は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、数回に分けた用量を毎日投与してもよいか又は治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例して低減してもよい。
【００２５】
「医薬として許容され得る」構成要素は、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない構成要素を指すことができ、すなわち、該構成要素は、有意な望ましくない生物学的効果も引き起こすか、又は製剤中に他の構成要素が含有される該製剤の該他の構成要素のうちのいずれかと有害な様式で相互作用することなく、本発明の医薬製剤に組み込まれ、かつ本明細書に説明するように対象に投与することができる。ヒトへの投与に関して使用するとき、本用語は、概して、構成要素が毒性試験及び製造試験の所要標準を満たしていること、又は該構成要素が、米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイド（Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ）に掲載されていることを、暗に意味する。
【００２６】
「医薬として許容され得る担体」（時に「担体」と称される。）は、概して安全かつ非毒性である、医薬組成物又は治療用組成物を調製する上で有用である担体又は賦形剤を意味し、獣医学での及び／又はヒトでの、医薬としての又は治療上の使用にとって許容され得る担体を含む。「担体」又は「医薬として許容され得る担体」という用語は、リン酸緩衝塩類溶液、水、エマルション（油／水エマルション又は水／油エマルションなど）及び／又は種々の種類の湿潤剤を含むことができるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、「担体」という用語は、いかなる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、又は医薬製剤において使用するために、当技術分野において周知の及び本明細書でさらに説明するようなその他の材料を包含するが、これらに限定されない。
【００２７】
「薬理学的に活性のある」誘導体又は類似体におけるような「薬理学的に活性のある」（又は単に「活性のある」）は、親化合物と同じ種類の薬理学的活性をほぼ同程度で有する誘導体又は類似体（例えば、塩、エステル、アミド、複合体、代謝産物、異性体、断片など）を指すことができる。
【００２８】
「ポリマー」は、その構造を、繰り返された小単位、すなわちモノマーによって表すことができる、天然又な合成の比較的高分子量の有機化合物を指す。ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレン、ゴム、セルロースが含まれる。合成ポリマーは、典型的には、モノマーの付加重合又は縮合重合によって形成される。「コポリマー」という用語は、２種類以上の異なる繰り返し単位（モノマー残基）から形成されたポリマーを指す。例としてであって限定するものではないが、コポリマーは、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー又はグラフトコポリマーであることができる。ある特定の態様において、ブロックコポリマーの種々のブロックセグメントは、それ自体がコポリマーを含むことができることも企図される。「ポリマー」という用語は、天然ポリマー、合成ポリマー、ホモポリマー、ヘテロポリマー又はコポリマー、付加ポリマーなどを含むがこれらに限定されない全ての形態のポリマーを包含する。
【００２９】
「治療薬」は、有益な生物学的効果を有するいかなる組成物も指す。有益な生物学的効果には、治療効果、例えば、障害又は他の望ましくない生理学的容態の処置、及び予防効果、例えば、障害又は他の望ましくない生理学的容態（例えば、非免疫原性癌）の予防の両方が含まれる。これらの用語は、塩、エステル、アミド、作用薬前駆体（ｐｒｏａｇｅｎｔ）、活性のある代謝産物、異性体、断片、類似体などを含むがこれらに限定されない、本明細書に具体的に言及されている有益な作用薬の医薬として許容され得る、薬理学的に活性のある誘導体も包含する。「治療薬」という用語が使用されるとき、加えて、又は詳しい作用薬が具体的に特定されているとき、該用語は、その作用薬自体、並びに医薬として許容され得る、薬理学的に活性のある塩、エステル、アミド、作用薬前駆体、複合体、活性のある代謝産物、異性体、断片、類似体などを含むことが理解されるべきである。
【００３０】
組成物（例えば、作用薬を含む組成物）の「治療有効量」又は「治療有効用量」は、所望の治療結果を達成するために有効である量を指す。いくつかの実施形態において、所望の治療結果とは、Ｉ型糖尿病の制御である。いくつかの実施形態において、所望の治療結果とは、肥満の制御である。所与の治療薬の治療有効量は、典型的には、処置される障害又は疾患の種類及び重症度、並びに対象の齢、性別及び体重などの因子に関して異なるであろう。該用語はまた、疼痛緩和など、所望の治療効果を促進するために有効な、治療薬の量又は治療薬の送達速度（例えば、経時的な量）を指すこともできる。正確な所望の治療効果は、処置されるべき容態、対象の耐性、投与されるべき作用薬及び／又は作用薬製剤（例えば、治療薬の効力、製剤中の作用薬濃度など）、並びに当業者によって認識されている種々のその他の因子によって異なるであろう。いくつかの場合において、所望の生物学的応答又は医学的応答は、数日間、数週間、又は数年間にわたって対象に、組成物の複数の薬用量を投与した後に達成される。
【００３１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有するように定義されるいくつかの用語に言及する。
【００３２】
「場合による」又は「場合により」は、その後に説明された事象又は状況が発生することがあってもなくてもよいこと、及び該説明には、該事象又は状況が発生する場合と、該事象又は状況が発生しない場合とを含むことを意味する。
【００３３】
本出願の全体を通して、種々の公表物が参照されている。本出願が属する技術分野の水準をより完全に説明するために、これらの公表物の開示内容の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。開示された参考文献はまた、該参考文献が依拠している文中で論じられている、該参考文献に含まれる材料について、参照により個別的にかつ具体的に本明細書中に組み込まれる。
【００３４】
Ｂ．  組成物
開示された組成物を調製するために使用されるべき構成要素は、本明細書に開示された方法の中で使用されるべき組成物自体と同様に開示されている。これら及び他の材料は、本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、部分セット、相互作用、群などが開示されているとき、これらの化合物の、各種々の個別の及び集合的な組み合わせ及び並べ替えへの具体的な言及は、明示して開示されていないことがあるが、各々は本明細書において具体的に企図及び説明されていることが理解される。したがって、分子Ａ、Ｂ、及びＣが、分子Ｄ、Ｅ及びＦのクラスと同様に開示されており、かつ分子Ａ〜Ｄの組み合わせ例が開示されている場合、各々が個別に列挙されていない場合でさえ、各々は、組み合わせＡ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜Ｅ、及びＣ〜Ｆは開示されているとみなされることを意味するよう企図されている。同様に、これらのいかなる部分セット又は組み合わせも開示されている。したがって、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、及びＣ〜Ｅの部分群は、開示されているものとみなされるであろう。この考え方は、開示された組成物を作製及び使用する方法のステップを含むがこれらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実行されることができる様々な追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップの各々は、開示された方法の何らかの具体的な実施形態又は実施形態の組み合わせによって実行されることができることは理解される。
【００３５】
チェックポイント阻害薬遮断などの免疫療法が、癌の処置又は腫瘍の手術切除後の再発において有効であり得ることは理解され、本明細書に企図されている。しかしながら、これらの遮断において使用される抗体は結果として、多くの患者にとって制限を生じ、より多くの場合において有効ではない。本明細書で開示されている、エキソソームなどの天然の細胞膜由来のベシクル、マクロベシクル、及び細胞膜を排除したベシクルは、生物医学にとって大いに前途有望となる。同様に、抗癌免疫の増強のための有望な方法として生物工学戦略がある。本明細書では、細胞膜由来のナノベシクル（ＮＶ）を操作して、ＰＤ−１受容体を提示し、該ＰＤ−１受容体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫阻害軸を妨害するのを中断させることを経て、癌免疫療法を増強する（図１ａ）。同様に、抗ＰＤ−Ｌ１と複合体形成するよう操作されたものは、腫瘍手術創（ｗｏｕｌｄｓ）を標的として、消耗したＴ細胞に活力（ｒｅｉｎｖｉｇｏｒａｔｅ）をもたらすことができる。したがって、一態様（ｉｎ  ｏｎ  ａｓｐｅｃｔ）において、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板が本明細書で開示されている。
【００３６】
先に記載した通り、免疫阻害相互作用の遮断は、Ｔ細胞の消耗を救出又は防止することができ、免疫系に腫瘍を除去しかつ腫瘍の増殖及び／若しくは転移を単独で又は手術切除後に防止することができる。プログラム死１（ＰＤ−１）／プログラム死リガンド１（ＰＤＬ−１）、Ｉｇドメイン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）／ＣＤ１５５を有するＴ細胞免疫受容体、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ−３）／ガレクチン９、ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌ  ｓｅｒｉｎｅ）（ＰｔｄＳｅｒ）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、若しくは高移動度蛋白質群１（ＨＭＧＢ１）、並びに／又はリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）／ＭＨＣクラスＩＩを含む、当技術分野で公知のいくつかの免疫系遮断がある。したがって、一態様において、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板が本明細書で開示されており、１つ以上の外来性蛋白質受容体は、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、及び／又はＴＩＭ３を含むことができる。
【００３７】
操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板は、これらの製造を支援することができる樹状細胞、幹細胞、免疫細胞、巨核球前駆細胞、巨核球、又はマクロファージを含むがこれらに限定されない何らかの細胞に由来することができる。したがって、一態様において、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板が本明細書で開示されており、操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板は、樹状細胞、幹細胞、免疫細胞、巨核球前駆細胞、又はマクロファージに由来する。
【００３８】
１．医薬担体／医薬製品の送達
一態様において、本明細書に開示される操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板は、癌若しくは転移を処置、予防、阻害、若しくは低減するための、又は手術切除（すなわち、摘除）後の再発若しくは転移を処置、予防、阻害、若しくは低減するための対象への投与のために企図されている。したがって、本明細書に開示される操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板を含む医薬組成物を含む医薬組成物が、本明細書で開示される。例えば、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板を含む医薬組成物が本明細書で開示されており、１つ以上の外来性蛋白質受容体は、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、及び／又はＴＩＭ３を含むことができる。
【００３９】
一態様において、その他の免疫調節経路のその他の阻害剤は、開示された操作されたナノベシクル、操作された巨核球、及び操作された血小板との組み合わせで癌の処置に追加の利益を有することができることは理解され、かつ本明細書で企図されている。例えば、例として１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）を用いたインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤は、癌に対する免疫応答を増強することができる。同様に、抗ＰＤＬ−１抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（Ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、及びアベルマブを含むがこれらに限定されない抗ＰＤＬ−１抗体など）は、操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板が結合し損ねている何らかのＰＤＬ−１を結合し得る。したがって、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板を含む医薬組成物が本明細書に開示されており、１つ以上の外来性蛋白質受容体は、例えば、小分子（１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）を含むがこれに限定されない）、ノルハルマン、ロスマリン酸、エパカドスタット、ナボキシモド（ｎａｖｏｏｘｉｍｏｄ）、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンブラスチン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルを含む）、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、ペプチド模倣体、又は抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（Ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、及びアベルマブを含むがこれらに限定されない抗ＰＤＬ−１抗体など）などの１つ以上の治療薬をさらに含むＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、又はＴＩＭ３を含むことができる。
【００４０】
１つ以上の治療薬は、医薬組成物中に、操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板とともに提供されることができる。あるいは、１つ以上の治療薬は、操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板の中に封入することができる。したがって、一態様において、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板を含む医薬組成物が本明細書で開示され、１つ以上の外来性蛋白質受容体は、例えば、小分子（１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）、ノルハルマン、ロスマリン酸、エパカドスタット、ナボキシモド（ｎａｖｏｏｘｉｍｏｄ）、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンブラスチン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルを含むがこれらに限定されない）、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、ペプチド模倣体、又は抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（Ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、及びアベルマブを含むがこれらに限定されない抗ＰＤＬ−１抗体など）などの１つ以上の治療薬をさらに含むＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、又はＴＩＭ３を含むことができ、１つ以上の治療薬は、操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板の中に封入される。
【００４１】
先に説明したように、組成物は、医薬として許容され得る担体中で、生体内投与することもできる。「医薬として許容され得る」が意味するのは、生物学的に又はその他に望ましくないことがない材料であり、すなわち、該材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こすことなく、又は材料が中に含まれている医薬組成物の他の構成要素のうちのいずれとも有害な様式で相互作用することなく、核酸又はベクターとともに、対象に投与され得る。担体は、当業者に周知であるであろうとおり、当然、有効成分のいかなる分解も最小限にするように、かつ対象におけるいかなる有害な副作用も最小限にするように選択されるであろう。
【００４２】
組成物は、局所鼻腔内投与又は吸入剤による投与を含む、経口で、非経口で（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外に、局所的になどで投与され得る。本明細書で使用する場合、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔のうちの片方又は両方を経た鼻及び鼻道内への組成物の送達を意味し、噴霧機構若しくは液滴機構による、又は核酸若しくはベクターのエアロゾル化を経た送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧機構又は液滴機構による送達を介した鼻又は口を経ることができる。送達は、挿管を介して、呼吸器系の何らかの領域（例えば、肺）へ直接的でもあることができる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、齢、体重及び全身状態、処置されているアレルギー性障害の重症度、使用されている具体的な核酸又はベクター、その投与様式などに応じて、対象ごとに異なるであろう。したがって、あらゆる組成物に対して正確な量を特定することは可能でない。しかしながら、適切な量は、本明細書中の教示が与えられれば、日常的な実験のみを用いて、当業者が判断することができる。
【００４３】
組成物の非経口投与は、使用される場合、概して注射を特徴とする。注射剤は、液状の液剤若しくは懸濁剤のいずれかとして、注射前に液剤中の懸濁液の溶液に適した固体形態、又はエマルションとして、従来の形で調製することができる。非経口投与のための、より最近に改変されたアプローチは、一定した薬用量が維持されるように、緩徐放出又は徐放の系の使用を包含する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【００４４】
材料は、液剤、懸濁剤中であり得る（例えば、微粒子、リポソーム又は細胞中に取り込まれている）。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して、特定の細胞型を標的とし得る。以下の参考文献は、腫瘍組織を標的として特定の蛋白質を誘導するためのこの技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）、Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）、Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）、Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）、及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」及びその他の抗体を結合したリポソームなどのビヒクル（結腸癌を標的とする脂質媒介性薬剤を含む。）、細胞特異的リガンドを経たＤＮＡの受容体媒介性ターゲティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲティング及び生体内でのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルスターゲティングがある。以下の参考文献は、腫瘍組織を標的として特定の蛋白質を誘導するためのこの技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）、及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。概して、受容体は、構成性の又はリガンド誘導性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与している。これらの受容体は、クラスリンで被覆された窪み中で群を形成し、クラスリンで被覆されたベシクルを介して細胞の中に入り、酸性化されたエンドソームを通過し、その中で受容体が選別され、次いで、細胞表面へと再利用されるか、細胞内に保存されるか、又はリソソーム中で分解される。内部移行経路は、栄養素の取り込み、活性化された蛋白質の除去、高分子の排除、ウイルス及び毒素の日和見的進入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベルの調節など、種々の機能を担っている。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの価数及びリガンド濃度に応じて、１を超える細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子レベル及び細胞レベルの機序は総説にまとめられている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【００４５】
ａ）医薬として許容され得る担体
抗体を含む、組成物は、医薬として許容され得る担体と組み合わせて治療上使用することができる。
【００４６】
適切な担体及びその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５において説明されている。典型的には、製剤を等張性にするために、適切な量の医薬として許容され得る塩が製剤中で使用される。医薬として許容され得る担体の例には、塩類溶液、リンガー溶液及びデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、成形された物品、例えば、フィルム、リポソーム又は微粒子の形態である半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれる。例えば、投与の経路及び投与される組成物の濃度に応じて、ある特定の担体がより好ましいことがあり得ることは、当業者に自明であろう。
【００４７】
医薬担体は、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、無菌水、塩類溶液及び生理学的ｐＨの緩衝された溶液などの溶液を含む、ヒトに薬物を投与するための標準的な担体であろう。組成物は、筋肉内に又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順によって投与されるであろう。
【００４８】
医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含み得る。医薬組成物は、抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬などの１種以上の有効成分も含んでもよい。
【００４９】
医薬組成物は、局所処置又は全身処置が所望であるかどうか、及び処置されるべき領域に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的に（眼に、膣に、直腸に、鼻腔内にを含む）、経口的に、吸入によって、又は非経口的に、例えば、点滴静注、皮下注射、腹腔内注射又は筋肉内注射によってであり得る。開示されている抗体は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、又は経皮的に投与することができる。
【００５０】
非経口投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、塩類溶液及び緩衝された媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁剤が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンガー液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンガー液、又は不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養素補充液、電解質補充液（デキストロースリンガー液に基づくものをなど）などが含まれる。例えば、抗菌薬、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性ガスなど、防腐剤及びその他の助剤も存在し得る。
【００５１】
局所投与用の製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤及び散剤が含まれ得る。慣用の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり得、又は望ましくあり得る。
【００５２】
経口投与用の組成物には、散剤又は顆粒剤、水若しくは非水性媒体中の懸濁剤若しくは液剤、カプセル剤、サシェ剤、又は錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいことがある。
【００５３】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸などの有機酸との反応によって、又は水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、並びにモノアルキル、ジアルキル、トリアルキル及びアリールアミン、及び置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される医薬として許容され得る酸付加塩又は塩基付加塩として結果がもたらされるように投与され得る。
【００５４】
ｂ）治療上の使用
組成物を投与するために有効な薬用量及びスケジュールは実験により決定され得、このような決定を行うことは当技術分野における技術の範疇である。組成物の投与のための薬用量範囲は、障害の症状がもたらされる所望の効果を生じるのに十分大きな薬用量範囲である。薬用量は、不必要な交差反応、アナフィラキシー型反応などの有害な副作用を引き起こす程多いものであってはならない。概して、薬用量は、患者の齢、容態、性別、及び疾患の程度、投与経路、又は、他の薬剤が療法に含まれているか否かで異なっており、当業者により決定することができる。薬用量は、何らかの禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｏｎ）の場合には、個別の医師により調整することができる。薬用量は変えることができ、１日１回以上の用量投与で１日又は数日間投与することができる。手引きは、所与の部類の医薬品に適切な薬用量についての文献において認めることができる。例えば、抗体に適切な用量を選択する上での手引きは、抗体の治療上の使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，，Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２  ａｎｄ  ｐｐ．３０３−３５７、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５−３８９において認めることができる。単独で使用される抗体の典型的な１日薬用量は、先に記載の因子に応じて、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重又はそれを超える範囲であり得る。
癌を処置する方法
【００５５】
本明細書に記載する通り、開示されている操作されたナノベシクル、操作された巨核球、操作された血小板、及び／又は医薬組成物は、癌などの制御されていない細胞増殖が生じるいかなる疾患も処置するために使用することができる。したがって、一態様において、癌に罹患している患者に、本明細書に開示する操作されたナノベシクル、操作された巨核球、操作された血小板、並びに／又は医薬組成物を投与することを含む、対象における癌（黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺癌、及び／若しくは膀胱癌を含むがこれらに限定されない）、癌（黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺癌、及び／若しくは膀胱癌を含むがこれらに限定されない）、の増殖、癌（黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺癌、及び／若しくは膀胱癌を含むがこれらに限定されない）の転移を処置、低減、阻害、及び／若しくは予防する方法、並びに／又は腫瘍（黒色腫、腎細胞癌、非小細胞肺癌、及び／若しくは膀胱癌を含むがこれらに限定されない）の手術切除後の癌の再発、増殖若しくは転移を処置、低減、阻害、若しくは予防する方法が本明細書に開示されている。したがって、一態様において、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板を対象へ投与することを含む、対象における癌、癌の増殖、の転移を処置、低減、阻害、若しくは予防する方法、及び／又は腫瘍の手術切除後の癌の再発、増殖若しくは転移を処置、低減、阻害、若しくは予防する方法が本明細書に開示されており、１つ以上の外来性蛋白質受容体は、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、又はＴＩＭ３を含むことができる。開示された方法において使用される操作されたナノベシクル、操作された巨核球、操作された血小板、及び／又は医薬組成物は、操作されたナノベシクル、操作された巨核球、操作された血小板、及び／又は医薬組成物の免疫治療効果を増強するために１つ以上の治療薬をさらに含むことができる。例えば、開示された方法において使用される操作されたナノベシクル、操作された巨核球、操作された血小板、及び／又は医薬組成物は、小分子（１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）、ノルハルマン、ロスマリン酸、エパカドスタット、ナボキシモド（ｎａｖｏｏｘｉｍｏｄ）、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンブラスチン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルを含むがこれらに限定されない）、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、ペプチド模倣体、又は抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（Ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ、デュルバルマブ、及びアベルマブを含むがこれらに限定されない抗ＰＤＬ−１抗体など）をさらに含むことができる。１つ以上の治療薬は、操作されたナノベシクル、操作された巨核球、及び／若しくは操作された血小板の中に封入することができ、又は操作されたナノベシクル、操作された巨核球、及び／若しくは操作された血小板とともに医薬組成物において供給することができる。したがって、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断として使用することができる１つ以上の外来性蛋白質受容体をコードする操作されたナノベシクル、操作された巨核球、又は操作された血小板を対象に投与することを含む、対象における癌、癌の増殖、の転移を処置、低減、阻害、若しくは予防する方法、及び／又は腫瘍の手術切除後の癌の再発、増殖若しくは転移を処置、低減、阻害、若しくは予防する方法が本明細書で開示されており、１つ以上の外来性蛋白質受容体は、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、又はＴＩＭ３を含むことができ、かつ操作されたナノベシクル、操作された巨核球、操作された血小板、及び／又は医薬組成物は、小分子（１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）、ノルハルマン、ロスマリン酸、エパカドスタット、ナボキシモド（ｎａｖｏｏｘｉｍｏｄ）、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンブラスチン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルを含むがこれらに限定されない）、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、ペプチド模倣体、又は抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（Ａｔｅｘｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、及びアベルマブを含むがこれらに限定されない抗ＰＤＬ−１抗体など）をさらに含む。
【００５６】
先に記載の通り、開示された方法は、癌の処置において有用である（ｏｒ  ｕｓｅｆｕｌ）。処置するために開示された組成物を使用することができる癌の代表的な、但し非限定的なリストは、以下のものである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部の扁平上皮細胞癌、腎癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、肝癌、黒色腫、口、咽頭、喉頭、及び肺の扁平上皮細胞癌、結腸癌、子宮頚癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頚癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、及び上皮癌、腎癌、尿路性器、肺癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、頭頚部癌、大腸癌、造血器癌、精巣癌、結腸及び直腸の癌、前立腺癌、又は膵癌。
【００５７】
一態様において、対象に、本明細書に開示する操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物のうちのいずれかを投与することを含む、癌を処置する開示された方法は、対象における特定の癌の処置に適した何らかの頻度での、操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物の投与を含むことができる。例えば、操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物は、患者に少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８時間ごとに１回、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１日ごとに１回、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月ごとに１回投与することができる。一態様において、操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物は、１週間あたり少なくとも１、２、３、４、５、６、７回投与される。
【００５８】
一態様において、開示された方法における使用のために対象に投与される操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物の量は、医師によって判断された通り、特定の癌のための対象の処置に適した何らかの量を含むことができる。例えば、操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物の量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、投与される操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、又は１００ｍｇ／ｋｇであり得る。したがって、一態様において、対象における癌を治療する方法が本明細書に開示されており、投与された操作されたナノベシクル、操作された血小板、又は医薬組成物の用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
【実施例】
【００５９】
Ｃ．実施例
以下の実施例は、本明細書で主張された化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法がどのようにつくられ及び評価されるかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために提案されており、純粋に例示的であるよう意図されており、本開示を限定するよう意図するものではない。数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくつかの誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段に明記しない限り、部分は、重量部分であり、温度は、℃であるか又は外界温度であり、圧力は、大気圧であるか又は大気圧に近い。
【００６０】
１．実施例１：癌免疫療法のためのＰＤ−１遮断細胞ベシクル
エキソソームなどの天然の細胞膜由来のベシクル、マクロベシクル、及び細胞膜を排除したベシクルは、生物医学にとって大いに前途有望となる。同様に、抗癌免疫の増強のための有望な方法として生物工学戦略がある。本明細書では、細胞膜由来のナノベシクル（ＮＶ）を操作して、ＰＤ−１受容体を提示し、該ＰＤ−１受容体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫阻害軸を妨害することを経て、癌免疫療法を増強する（図１Ａ）。ＰＤ−１のＮＶは、腫瘍細胞の表面に結合することができ、ＰＤ−Ｌ１遮断を達成することができる（図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃ）。この遮断は、消耗した腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋を有効に逆転させて、腫瘍細胞を攻撃すると期待される。加えて、ＮＶはまた、併用送達を行うために、他の治療薬のための担体として機能することができる。インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、腫瘍によって過剰発現してエフェクターＴ細胞の増殖及び機能を制限する免疫抑制分子である。ここで、ＩＤＯの小分子阻害剤である１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）をＰＤ−１のＮＶ中へと封入して、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を同時に遮断し、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内でのエフェクターＴ細胞に対する腫瘍関連ＩＤＯの阻害効果を克服した（図１Ｃ）。
【００６１】
ＰＤ−１のＮＶを調製するために、細胞膜上でマウスＰＤ−１受容体を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を確立した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、細胞生物学の研究及び生物工学産業において広く使用されてきており、その理由は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を頑強にトランスフェクトすることができ、該細胞株が多量の組換え蛋白質を産生するからである。ＤｓＲｅｄ蛋白質−タグは、ＰＤ−１受容体蛋白質のＣ末端部分の中に含まれており、蛋白質−タグを細胞膜の内側リーフレットの近くにする一方で、該受容体の機能ドメインは細胞外である（図１Ａ）。それゆえ、マウスＰＤ−１受容体ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクター内へとクローン化した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をハイグロマイシンＢで選択して、安定細胞株を確立した。特筆すべきことに、死受容体ＰＤ−１が主として発現し、細胞膜上に局在した（図１Ｄ）。ハイグロマイシンＢの選択圧の下、細胞株は、２０を超える継代の間、ＤｓＲｅｄ  ＰＤ−１受容体を発現し続けた。さらに、細胞膜をＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８複合体コムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ）で標識して、ＰＤ−１受容体の局在を確認した。期待した通り、ＤｓＲｅｄ蛋白質の赤色蛍光は、細胞膜上でＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８色素の緑色蛍光と共局在した（図１Ｄ）。
【００６２】
次に、操作されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、溶解して細胞膜を単離した。ＰＤ−１受容体を発現する細胞膜ベシクルを、０．８及び０．２２μｍ孔径のポリカーボネート膜フィルタによるベシクルの連続押出によって調製した。０．８μｍ孔径のポリカーボネート膜フィルタによる押出の後、大きな細胞膜ベシクル（ＭＶ）を取得した。共焦点画像における赤色光スポットは、ＭＶ上でのＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１の存在を実証した（図２Ａ）。ＭＶの大きさの分布を動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって測定した（図２Ｂ）。次に、ＭＶを０．２２μｍ孔径のポリカーボネート膜フィルタによって押出した。収穫したＮＶを２工程ＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配超遠心法によってさらに精製した。次に、ＮＶの形態的特徴を電子顕微鏡によって特徴づけた。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、陰性染色したＮＶは、閉鎖したベシクルであることが明らかとなった（図１Ｅ）。また、ＮＶを凍結走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって走査し、ＮＶが球状であることが示された（図１Ｆ）。ＮＶのゼータ電位は、−１０ｍＶと測定された（図２Ｃ）。その上、ＮＶ上でのＰＤ−１受容体の発現を、共焦点撮像法及びウェスタンブロットを用いて検出した。共焦点画像は、赤色スポットがＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１  ＮＶの存在を示すことを呈した（図１Ｇ）。ＤＬＳ解析は、ＮＶの平均直径が約９０〜１００ｎｍであることを示した（図１Ｈ）。加えて、ウェスタンブロット分析は、精製したＮＶがＰＤ−１受容体を提示していることを示した（図１Ｉ）。ＰＤ−１受容体がＮＶ表面上でのアウトサイドアウトの向きを維持しているかどうかを検証するために、免疫沈降アッセイ（ＩＰ）を行った。本アッセイは、ＰＤ−１抗体がＰＤ−１のＮＶの大部分を沈降させたことを示し、ＰＤ−１受容体がほとんどのＰＤ−１のＮＶ上で正しいアウトサイドアウトの向きであることを実証した。
【００６３】
癌細胞は、ＰＤ−１授与体と相互作用するＰＤ−Ｌ１リガンドの過剰発現を経て、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を消耗させる。ＰＤ−１のＮＶが黒色腫細胞に結合するかどうかを調べるため、ＰＤ−１のＮＶをＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞とともに試験管内でインキュベートした。ＰＤ−１受容体と融合したＤｓＲｅｄ蛋白質は赤色蛍光を提供し、これをＰＤ−１のＮＶの蛍光シグナル標識として使用した。ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８色素を使用して、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞の細胞膜を染色した。顕著なことに、ＰＤ−１のＮＶが２時間のインキュベーションの後にＢ１６Ｆ１０細胞の細胞膜表面の周りに有効に結合していたことが観察された（図３Ａ）。対照的に、非含有ＮＶを標識したＣｙ５，５の膜結合親和性は低かった（図３Ａ）。加えて、ＰＤ−１のＮＶと樹状細胞（ＤＣ）の間の相互作用も検出した。ＰＤ−１のＮＶを骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）とともに２時間インキュベートした。共焦点画像は、ＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１  ＮＶが有効に結合することができ、２時間後にＢＭＤＣによって内部移行することができることを示した（図３Ｂ）。Ｂ１６Ｆ１０細胞上でのＰＤ−１のＮＶの結合がＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を経ているのかどうかを調べるために、ＮＶ上でのＰＤ−１受容体とＢ１６Ｆ１０細胞上でのＰＤ−Ｌ１の共局在をまず検出した。ＰＤ−１のＮＶを，ＥＧＦＰ−ＰＤ−Ｌ１発現Ｂ１６Ｆ１０細胞とともに５時間インキュベートした。特筆すべきことに、ＰＤ−１のＮＶは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞上でＥＧＦＰ−ＰＤ−Ｌ１と共局在していた（図３Ｃ）。ＮＶ上でのＰＤ−１受容体とＢ１６Ｆ１０細胞上でのＰＤ−Ｌ１の間の分子の結合を確認するために、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を添加して、Ｂ１６Ｆ１０細胞上でのＰＤ−Ｌ１を遮断した。共焦点画像は、ＰＤ−Ｌ１抗体（ａＰＤ−Ｌ１）を細胞とともにプレインキュベートしたとき、ＰＤ−１  ＮＶ結合が劇的に低減することを示した。その上、フローサイトメトリーデータも、ＰＤ−Ｌ１抗体をＢ１６Ｆ１０細胞とともにプレインキュベートしたとき、該細胞とのＰＤ−１  ＮＶ結合の量が有意に低減することを示した（図３Ｄ）。ＰＤ−１受容体とＰＤ−Ｌ１の分子相互作用を検出するために、共免疫沈降（ＣＯ−ＩＰ）アッセイも採用した。ＰＤ−１  ＮＶとＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞との２０時間のインキュベーションの後、細胞を収穫した。ＰＤ−１一次抗体を使用して、ＮＶ上のＰＤ−１受容体を沈降させた。顕著なことに、ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１受容体とともに、ＰＤ−１抗体によって沈降し（図３Ｅ）、ＰＤ−１のＮＶがＢ１６Ｆ１０細胞によって発現したＰＤ−Ｌ１と物理的に相互作用することを示した。まとめると、これらの結果は、表面上にＰＤ−１を提示するＮＶが、ＰＤ−１受容体とＰＤ−Ｌ１の結合を経て腫瘍細胞と有効に相互作用することができることを具体化した。
【００６４】
ＰＤ−１のＮＶの全身の生体分布及び動態を調べるために、非含有ＮＶ及びＰＤ−１のＮＶをＣｙ５，５で標識した。非含有ＮＶ及びＰＤ−１のＮＶをマウスに尾静脈で注射した。図３Ｆに示すように、ＰＤ−１のＮＶは、非含有ＮＶと比較して血液保持が高かった。ＰＤ−１のＮＶは、それぞれ８時間及び２４時間での非含有のＮＶの１２％及び１．７％の保持と比較して、２９％及び１３％の全体的な保持を呈した。次に、ＰＤ−１のＮＶの生体内組織分布を検討した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍保有マウスは、Ｃｙ５．５標識ＰＤ−１  ＮＶを、尾静脈注射を介して受けた。特筆すべきことに、ＰＤ−１  ＮＶのＣｙ５．５蛍光の蓄積は、主として肝臓、腎臓及び腫瘍の部位で観察された（図３Ｇ及び図３Ｈ）。ＰＤ−１のＮＶの生体分布をさらに評価するために、Ｃｙ５．５標識ＮＶを器官及び腫瘍の切片において共焦点撮像によって定量した。ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８色素を使用して、組織切片における細胞膜を染色した。ＰＤ−１  ＮＶの分布は、腫瘍組織切片におけるＰＤ−１  ＮＶの集中した蓄積を示す撮像データと並行していた（図３Ｉ）。
【００６５】
ＰＤ−１  ＮＶが黒色腫腫瘍に対するマウス免疫応答を促進するかどうかを判定するため、Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて皮下接種した黒色腫腫瘍モデルを確立した。腫瘍接種の５日間後、２５ｍｇ／ｋｇの非含有ＮＶ及び２０〜３０ｍｇ／ｋｇのＰＤ−１  ＮＶをマウスに尾静脈注射を経て接種した。腫瘍の成長を生物発光シグナル及び腫瘍の大きさの両方を測定することによって監視した。特筆すべきことに、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の成長は、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇの薬用量において、ＰＤ−１  ＮＶで処置したマウスにおいて有意に遅延していた（図４）。ＰＤ−Ｌ１抗体は、黒色腫腫瘍の処置のためにＰＤ−Ｌ１を遮断する臨床治療用抗体である。ＰＤ−１  ＮＶの生体内抗腫瘍効果を確認するために、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与を陽性対照として用いる処置を採用した。マウスを以下の３つの群へと分けた。２５ｍｇ／ｋｇの非含有ＮＶ（第１の群）及びＰＤ−１  ＮＶ（第２の群）をマウスに、尾静脈注射を経て３日ごとに５周期間注射した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ａＰＤ−Ｌ１、第３の群）もマウスへと２ｍｇ／ｋｇで陽性対照群として注射した。腫瘍の成長は、生物発光シグナル及び腫瘍の大きさの両方を用いて監視した。特筆すべきことに、ＰＤ−１  ＮＶは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍の成長を有意に遅延させ、これはａＰＤ−Ｌ１による処置に相当した。（図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃ）。結果的に、ＰＤ−１  ＮＶは、マウスの生存率を改善し（図５Ｄ）、マウスのうちの２０％がＰＤ−１  ＮＶ処置に際して６０日を超えて生存した。その上、処置中、明白な体重減少はなかった（図５Ｅ）。有意な抗腫瘍効果は、非含有ＮＶを用いて処置したマウスにおいて観察されなかった。
【００６６】
消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞では、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３を含む、阻害性受容体蛋白質を発現し、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αなどの免疫サイトカインを産生する能力が低減した。ＰＤ−１  ＮＶ処置がＴ細胞の消耗を低減させ、かつ抗腫瘍機能を維持するかどうかを評価するために、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのレベルを処置したマウスの血清において、第５の周期の終了まで測定した。ＰＤ−１  ＮＶ又はａＰＤ−Ｌ１のいずれかで処置したマウスの血清中のＩＦＮ−γレベルは、有意に上昇した（図５Ｆ）のに対し、ＴＮＦ−αレベルは変わらないままであった。収穫した腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤をフローサイトメトリーによって解析した。活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率及び数は、対照群と比較して、ＰＤ−１  ＮＶ又はａＰＤ−Ｌ１群のいずれかで処置したマウスから収集した腫瘍において有意に上昇した（図５Ｇ及び図５Ｈ）。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い密度が、ＰＤ−１  ＮＶ又はａＰＤ−Ｌ１のいずれかで処置したマウスから収集した腫瘍における免疫蛍光によって検出された（図５Ｉ及び図５Ｊ）。最後に、ＰＤ−１  ＮＶによって生じる潜在的な毒性も評価した。処置５周期後、血球数（ＣＢＣ）は、リンパ球及び単球量がＰＤ−１  ＮＶで処置したマウスにおいてわずかに低下したのに対し、リンパ球比は影響を受けなかったことを示した。加えて、免疫系によって産生される免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の血漿レベルは、アレルゲンに対して過剰反応し、ＰＤ−１  ＮＶによる処置５周期後に有意に上昇しなかった。
【００６７】
次に、ＩＤＯ阻害剤である１−ＭＴをＰＤ−１  ＮＶ内へと負荷し、ＩＤＯ阻害剤及び免疫チェックポイント遮断の併用療法を調べた。１−ＭＴの高い負荷効率（２４．５％）は、従来のインキュベーション法（１６．５％）と比較して電気ショック法を採用することによって達成された。ＰＤ−１  ＮＶからの１−ＭＴの放出も検査した。１−ＭＴは、試験管内で２４時間以内にＮＶから迅速に放出することができる。さらに、１−ＭＴ負荷ＰＤ−１  ＮＶによって放出される１−ＭＴの阻害効果を決定するために、ＩＦＮ−γ刺激後にＩＤＯを発現するＨｅＬａ細胞を用いて、ＩＤＯ阻害アッセイを行った。顕著なことに、ＰＤ−１負荷１−ＭＴは、非含有１−ＭＴ及び１−ＭＴ負荷非含有ＮＶと比較して、阻害効果は良好であった（図６）。腫瘍内での生体内薬剤放出を評価するために、腫瘍内でのＰＤ−１  ＮＶの蓄積を検出した。Ｃｙ５．５標識ＰＤ−１  ＮＶを腫瘍内に注射後３０分以内に蓄積し、この蓄積は経時的に徐々に上昇し、このことは、１−ＭＴが腫瘍内で有効に放出することができることを示した（図７）。
【００６８】
１−ＭＴ負荷ＰＤ−１  ＮＶによって同時に提供されるＩＤＯ阻害及びＰＤ−Ｌ１遮断が抗腫瘍活性を増強することを実証するために、Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃ腫瘍保有マウスをＰＢＳ（第１の群）、非含有ＮＶ（第２の群）、非含有１−ＭＴ（第３の群）、ＰＤ−１  ＮＶ（第４の群）、１−ＭＴ負荷非含有ＮＶ（第５の群）、１−ＭＴ＋ａＰＤ−Ｌ１（第６の群）又は１−ＭＴ負荷ＰＤ−１  ＮＶ（第７の群）のいずれかで３日ごとに５周期間処置した。腫瘍の成長を腫瘍の生物発光シグナル及び大きさの両方を測定することによって監視した。非含有１−ＭＴ及び１−ＭＴ負荷非含有ＮＶ（６０％）で処置したマウスにおける高い応答率（８０％超）が認められたが、腫瘍成長の限定された抑制が観察された（図８Ａ及び図８Ｂ）。この非理想的な有効性は、複数の免疫抑制機序がＴＭＥ内に存在するからであり得る。特筆すべきことに、ＰＤ−１  ＮＶは、１−ＭＴと比較して、抗腫瘍効果が良好であった（図８Ａ及び図８Ｂ）。１−ＭＴ＋ａＰＤ−Ｌ１で処置したマウスは、黒色腫腫瘍の進行を有意に遅延させたことを呈する（図８Ａ及び図８Ｂ）。重要なことに、１−ＭＴ負荷ＰＤ−１  ＮＶによる処置は、黒色腫腫瘍に対する８０％超の応答を示し、該処置は、１−ＭＴ又はＰＤ−１  ＮＶ単独による処置よりも非常に効率的であり（図８Ａ及び図８Ｂ）、かつ１−ＭＴ＋ａＰＤ−Ｌ１による処置に匹敵する（図８Ａ及び図８Ｂ）。さらに、１−ＭＴ負荷ＰＤ−１  ＮＶによるＩＤＯ及びＰＤ−Ｌ１の二重阻害は、明白な体重減少のないまま、処置されたマウスの生存を改善した（図８Ｃ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を、異なる処置群の腫瘍の縁において検討した。処置群全てにおける腫瘍からの腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を収穫し、フローサイトメトリー及び免疫蛍光によって分析した。非含有１−ＭＴ及び１−ＭＴ負荷ＮＶによる処置は、ＰＢＳ処置群と比較しておよそ１５〜２０％ほど浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞数を増加させたことを実証した（図８Ｄ及び図８Ｅ）。免疫蛍光染色では、ＰＤ−１及び１−ＭＴ負荷ＰＤ−１  ＮＶが、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔの密度を有意に増強させたことを確認した（図８Ｆ）。併用処置の治療有効性は、個々の治療有効性よりも良好であった。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の浸潤も試験した。特筆すべきことに、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞は、対照群と比較して、１−ＭＴ負荷ＰＤ−１  ＮＶ群において同様に低減した。最後に、肝臓、脾臓、腎臓、心臓及び肺などの主要器官を収集し、器官損傷のいかなる明白な徴候も示すことなく、免疫組織化学によって評価した。これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１遮断ＰＤ−１  ＮＶと組み合わせたＩＤＯ阻害が、ＴＭＥの免疫抑制を有意に中断させ、癌細胞の排除を宿主の免疫系によって増強したことを明らかにした。
【００６９】
要約すると、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１に有効に結合しかつＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害軸を中断させるＰＤ−１受容体を提示する細胞内ナノ担体を操作した。ＰＤ−１  ＮＶによるＰＤ−Ｌ１遮断は、生体内での黒色腫腫瘍に対する免疫応答を有意に増強した。さらに、ＰＤ−１  ＮＶはまた、種々の治療薬を運搬して、相乗的な有効性を達成するのに適している可能性がある。ＩＤＯ阻害及びＰＤ−Ｌ１遮断は、１−ＭＴ負荷ＰＤ−１  ＮＶによって達成された。腫瘍内での二重免疫耐性機序の同時中断は、生体内での抗職種腫瘍成長を顕著に抑制した。したがって、ＰＤ−１細胞内ＮＶによるＰＤ−Ｌ１遮断は、送達ビヒクル及び免疫療法を増強するための封入された薬剤の両方の機能に影響を及ぼす有望な戦略を提供する。
【００７０】
ａ）方法及び材料
（１）化学物質及び試薬：
１−ＭＴ、ハイグロマイシンＢ、ホスファターゼ阻害剤カクテル、ＯｐｔｉＰｒｅｐ液をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈへ注文し、ｍＧＭ−ＳＦ、ｍＩＬ−４及びｍＴＮＦ−αをｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃへ注文した。ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製とした。ウェスタンブロット用の抗ＰＤ−１抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製とした。免疫蛍光染色用のマウスＣＤ４及びＣＤ８抗体をＡｂｃａｍへ注文した。生体内で使用した抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ａＰＤ−Ｌ１）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．から購入した。プロテインＡ／Ｇ−アガロースビーズは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した。コムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８及び５９４色素は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。染色用抗体は、ＦＡＣＳ分析用のＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８を含んでおり、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．へ注文した。
【００７１】
（２）プラスミド及び細胞株：
マウスＰＤ−１をｐＣＭＶ６哺乳動物発現ベクター内へとクローン化した。プラスミドを自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。マウスＥＧＦＰ−ＰＤ−Ｌ１プラスミドをＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。製造元の説明書により、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドを一過性にトランスフェクトした。安定細胞を確立するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＣＭＶ６−ＯＲＦ−ＰＤ−１をトランスフェクトし、ハイグロマイシンＢでさらに選択した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８３２４０１２）を用いて、Ｂ１６Ｆ１０細胞にＥＧＦＰ−ＰＤ−Ｌ１プラスミドをトランスフェクトした。
【００７２】
（３）細胞培養：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。マウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を米国培養細胞系統保存機関から購入した。生体内生物発光腫瘍撮像用の、Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃ細胞は、ＵＮＣのＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇ博士からの寄贈品であった。ＨｅＬａ細胞をＵＮＣ  Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから取得した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から単離した細胞を、２０ｎｇのｍＧＭ−ＣＳＦ及び１０ｎｇのＩＬ−４を補充した１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ１６４０中で培養して、骨髄由来ＤＣを取得した。
【００７３】
（４）細胞膜ナノベシクルを調製する：
ＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞をトリプシンで収穫した。細胞を冷ＰＢＳで３回、１０００ｒｐｍで遠心分離することによって洗浄した。次に、０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する均質化培地（ＨＭ）で懸濁した。その後、ダウンスホモジナイザーを氷上で少なくとも５０回用いることによって、細胞を破壊した。溶液全体を１０００×ｇで５分間スピンダウンした。次に、ペレットを廃棄し、上清を１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。形質膜材料を含有するペレットをＨＭ緩衝液で３回洗浄した。細胞膜ナノベシクルを調製するために、ＨＭ緩衝液中の細胞膜を０．８μｍのフィルタに少なくとも１０回かけ、次に、０．２２μｍのフィルタにさらに１０回かけた。ナノベシクルをさらに精製するために、押出した試料を５０％イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ）の段階勾配へ供し、次に、４℃、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。
【００７４】
（５）マウス骨髄からのＤＣ細胞の単離：
骨髄由来ＤＣを骨髄から単離した。簡潔にいうと、大腿骨及び脛骨をＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で氷上で維持した。各骨の末端をはさみで切り落とし、骨髄を２ｍＬ  ＲＰＭＩ１６４０培地で、注射器を用いてさっと洗い流した。細胞を含有する培地をＮｙｔｅｘメッシュにかけ、大きな粒子を除去した。細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を赤色細胞溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で懸濁して、赤色細胞を室温で５分間溶解した。骨髄細胞をＲＰＭＩ１６４０で２回、毎回室温、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって、洗浄する。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地含有培養皿の中に播種し、マウス顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ｍＧＭ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充した。細胞の凝集物は、５日目〜８日目で観察することができる。取り出した凝集物をＲＰＭＩ１６４０培地によって緩徐に分散させ、ｍＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−４を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を含有する６ウェルプレート中に細胞を播種して、さらに使用した。
【００７５】
（６）１−ＭＴ負荷：
１−ＭＴをＰＤ−１  ＮＶへ負荷するために、１ｍｇの精製したベシクル及び５００μｇの１−ＭＴ（ｐＨ１０のＰＢＳ中に希釈した１００ｍｇ／ｍＬ）を１ｍｌの電気穿孔緩衝液（１．１５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２、２５ｍＭ塩化カリウム、２１％ＯｐｔｉＰｒｅｐ）中に４℃で緩徐に混合した。ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）を用いて、０．４ｃｍ電気穿孔キュベット中で試料を３００Ｖ及び１５０μＦの電気穿孔に供した。その後、試料を含有する電気穿孔キュベットを氷上で３０分間、膜回収のためにインキュベートした。次にＮＶを冷ＰＢＳで、１００，０００×ｇの３回の超遠心分離によって洗浄した。１−ＭＴをナノベシクルへ負荷する他の方法については、１ｍｇの精製したベシクル及び５００μｇの１−ＭＴを１ｍｌのＰＢＳ中で緩徐に混合して、３７℃で２時間インキュベートした。次に、ナノベシクルをＰＢＳで３回洗浄した。
【００７６】
（７）ウェスタンブロット：
免疫ブロット法分析を行った。省略のためにＤｓＲｅｄ−ＰＤ１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解した。次に、細胞溶解物及び精製した膜ベシクル試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＤ−１抗体及びβアクチン抗体を用いた免疫ブロット法に続いて高感度化学発光（ＥＣＬ）検出（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。
【００７７】
（８）共免疫沈降アッセイ：
ナノベシクル（ＮＶ）上のＰＤ−１とＢ１６Ｆ１０細胞上のＰＤ−Ｌ１との相互作用を検出するために、共免疫沈降アッセイを実施した。簡単にいうと、１ｍＬ（７００μｇ／ｍＬ）のＰＤ−１  ＮＶを添加し、Ｂ１６Ｆ１０細胞（１０ｃｍ皿）とともに２０時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、未結合のＮＶを除去した。次に、細胞を、ホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する１ｍｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶解した。細胞溶解物を４℃、１５０００×ｇで１０分間の遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解物をプロテインＧ−アガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で４℃で１時間、穏やかに回転させながら、あらかじめ透明にした。次に、細胞溶解物をＰＤ−１一次抗体とともに、４℃で一晩振盪させながらインキュベートした翌日、１０μＬのプロテインＧ−アガロースビーズとともに４℃で２時間とした。ビーズを氷冷ＲＩＰＡ緩衝液で５回穏やかに洗浄した。結合した蛋白質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、示される抗体を用いて免疫ブロット法によって分析した。
【００７８】
（９）免疫沈降アッセイ（ＩＰアッセイ）：
ＰＤ−１受容体の向きを検出するために、免疫沈降（ＩＰ）アッセイを行った。簡単にいうと、１ｍＬ（５００μｇ／ｍＬ）のＰＤ−１  ＮＶをプロテインＡ／Ｇビーズとともに室温で１時間プレインキュベートして、非特異的結合蛋白質を除去した。次に、ＰＤ−１  ＮＶを２μｇのＰＤ−１一次抗体とともに４℃で５時間インキュベートした。その後、１０μＬのプロテインＡ／Ｇ−アガロースビーズを添加して、室温で２時間インキュベートしたビーズをＰＢＳで３回穏やかに洗浄した。結合した蛋白質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、示される抗体を用いて免疫ブロット法によって分析した。
【００７９】
（１０）ナノベシクル細胞結合アッセイ：
Ｂ１６Ｆ１０細胞を共焦点皿の中に播種した。ＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１のＮＶ（５０μｇ／ｍＬ）又はＣｙ５．５で標識したＰＤ−１非含有ＮＶ（５０μｇ／ｍＬ）を培地へ添加して、２０時間インキュベートした。ａＰＤ−Ｌ１抗体（２０μｇ／ｍＬ）を細胞とともに４時間インキュベートした後、ＰＤ−１のＮＶを培地中に、示す通り添加した。その後、コムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８複合体を添加して、細胞膜を１０分間標識した。ＢＭＤＣ（骨髄からの単離７日後）を共焦点ウェルの中に播種し、１０ＵのＴＮＦ−αを添加して、ＤＣ細胞を成熟化のために刺激した。次に、ＤｓＲｅｄ−ＰＤ−１  ＮＶ（５０μｇ／ｍＬ）を添加し、ＤＣ細胞とともにさらに２０時間インキュベートした。その後、コムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８複合体を添加して、細胞膜を１０分間標識した。次に、核をヘキストで１０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。共焦点顕微法を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）において、６３倍の対物レンズを用いて連続走査モードで行った。Ｂ１６Ｆ１０細胞とのＰＤ−１  ＮＶ結合のフローサイトメトリー分析のために、ＰＤ−１  ＮＶ（５０μｇ．／ｍＬ）をＢ１６Ｆ１０細胞とともに２時間インキュベートした。またはａＰＤ−Ｌ１抗体（２０μｇ／ｍＬ）を細胞とともに４時間インキュベートした後、ＰＤ−１のＮＶを培地中に、示す通り添加した。ＤｓＲｅｄ＋に関してゲートした。
【００８０】
（１１）薬物放出：
ＮＶ（１ｍｇ／ｍＬ）の１−ＭＴ放出をＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で３７℃で分析した。放出された１−ＭＴの量をＨＰＬＣにより検出した。１．０ｍＬ／分の流量を用いてアセトニトリルの増加勾配による分離を酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．２）中で行った。カラム溶離液の吸光度を２８０ｎｍで監視した。
【００８１】
（１２）ＩＤＯ活性についての細胞アッセイ：
ＩＤＯ酵素活性アッセイについて、ＩＤＯに及ぼす１−ＭＴの阻害効果を検出するために、８０μＭのＬ−トリプトファン、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／フェノールレッド非含有培地中に、ＨｅＬａヒト腫瘍細胞を４．０×１０４個／ウェルで播種した。翌日、１−ＭＴ又は１−ＭＴ＠ＰＤ−１  ＮＶをＤＭＳＯ／０．１Ｎ  ＨＣｌ中で可溶化し、アッセイウェルの中で連続希釈し、その一方で、ＤＭＳＯ／ＨＣｌ希釈定数を１：１０００に維持した。１００ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＦＮ−γ（カタログ番号５７０２０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州サンディエゴ市）を次に１ウェル当たりに添加して、ＩＤＯ発現を刺激した。トリプトファンを２８５ｎｍの励起波長及び３６５ｎｍの発光波長で蛍光検出器によって、又は２８０ｎｍでＨＰＬＣによって定量した。
【００８２】
（１３）循環：
非含有ＮＶ及びＰＤ−１  ＮＶをＰＢＳ緩衝液中でＮＨＳ−Ｃｙ５．５によって標識した。４℃で一晩のインキュベーション後、Ｃｙ５．５標識ＰＤ−１  ＮＶをＰＢＳで３回洗浄した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２００μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）のＣｙ５．５標識非含有ＮＶ及びＰＤ−１  ＮＶを、それぞれ尾静脈から注射した。マウスの血液を注射後の異なる時点（それぞれ、２分、２時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間）で眼窩から収集した。次に、血清の蛍光シグナルを測定した。
【００８３】
（１４）生体分布：
ＰＤ−１  ＮＶをＰＢＳ緩衝液中のＮＨＳ−Ｃｙ５．５で標識した。４℃で一晩のインキュベーション後、Ｃｙ５．５標識ＰＤ−１  ＮＶをＰＢＳで３回洗浄した。黒色腫腫瘍を保有しているＣ５７ＢＬ／６マウスに２００μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）のＣｙ５．５標識ＰＤ−１  ＮＶを尾静脈から注射した。対照群にＰＢＳを注射した。２４時間及び４８時間の後、マウスの主要器官及び腫瘍を収穫した。最後に、蛍光撮像及び平均蛍光強度を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ撮像システムを用いて記録した。
【００８４】
（１５）生体内抗腫瘍有効性試験：
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ（米国）から購入した。マウス試験は全て、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ校の動物実験委員会によって承認された動物プロトコルの脈絡において行った。マウスを体重測定し、異なる群へと無作為に分けた。１×１０６個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞をマウスの腹部内へと皮下移植した５日後（腫瘍は４０〜５０ｍｍ３に到達する）、ＰＢＳ、非含有ナノベシクル（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ−１ナノベシクル（２５ｍｇ／ｋｇ）、１−ＭＴ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、１−ＭＴ負荷ＰＤ−１ナノベシクル（２５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ−Ｌ１（ａｎｙｉ−ＰＤ−Ｌ１）抗体（２ｍｇ／ｋｇ）をマウスへと尾静脈注射によって投与した。腫瘍の発生率を、身体検査によって監視し、また、大きさをデジタルカリパーによって経時的に測定した。腫瘍を、鋭利なカリパーを用いることによって測定し、量（Ｖ）をＶ＝ｄ２×Ｄ／２として計算し、ｄは最短の、及びＤは最長の、腫瘍のそれぞれの直径（ｍｍ）とする。潜在的な毒性を評価するために、マウスを体重減少について毎日監視した。生存アッセイについて、本実験を個別に行った。
【００８５】
（１６）生体内生物発光及び撮像：
生物発光画像をＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて収集した。動物内へのＤＰＢＳ（１５ｍｇ／ｍＬ）中のｄ−ルシフェリン（Ｐｉｅｒｃｅ）の腹腔内注射（１０μＬ／ｇ体重）から１０分後に、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いてデータを得た。
【００８６】
（１７）組織免疫蛍光アッセイ：
腫瘍をマウスから摘出し、至適切断培地（Ｏ．Ｃ．Ｔ）中で瞬間凍結した。クリオトームを用いて数マイクロメートルの切片を切り出し、スライド上に載せた。凍結器官（肺、肝臓、心臓、腎臓、脾臓）及び腫瘍の切片をＰＢＳ中で１５分間インキュベートして、包埋培地を除去した。標本を、３％ＢＳＡ及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する緩衝液で３０分間でブロッキングした。器官については、標本をＷＧＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で１０分間インキュベートした。腫瘍標本について、腫瘍切片をその後、ＣＤ４及びＣＤ８一次抗体（１．５％ＢＳＡ中１：５０）とともに一晩インキュベートした後、ＰＢＳで各５分間、３回洗浄した。次に、切片を、１．５％ＢＳＡ中に希釈したＴＲＩＴＣ二次抗体（ＫＰＬ）とともに室温、暗所中で１時間インキュベートした。最後に、核をＤＡＰＩで染色し、組織をＰＢＳで各５分間、３回洗浄した。共焦点顕微法をＦＬＵＯ−ＶＩＥＷレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）において、４０倍の対物レンズを用いて連続走査モードで行った。
【００８７】
（１８）サイトカイン検出：
血漿試料をマウスから種々の処置後に単離し、分析用に希釈した。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元のプロトコルにより、ＥＬＩＳＡキットで分析した。
【００８８】
（１９）ヘマトキシリン・エオシン染色：
異なる処置を受けたマウスの主要器官（肝臓、脾臓、腎臓、心臓及び肺）を収穫し、１０％中性ホルマリン緩衝液中で固定した。次に、器官をパラフィン中へと所定の通り加工し、８μｍで切片化し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、最後にデジタル顕微鏡によって検査した。
【００８９】
（２０）統計分析：
全ての結果は、示される通り、平均±標準偏差又は平均±平均の標準誤差として表されている。別段の記載がない限り、全ての実験において、生物学的複製物を使用した。２を超える群を示す通り比較するとき（多重比較）、一元配置又は二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙの事後検定を使用した。生存利益を、対数順位検定を用いて求めた。全ての統計分析は、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ統計１９を用いて行った。統計的有意性についての閾値は、Ｐ＜０．０５とした。
【００９０】
２．実施例２：癌免疫療法のためのＰＤ−１を発現する血小板
腫瘍抗原発現の喪失、ＣＴＬＡ−４及び他の免疫チェックポイント、並びに免疫抑制細胞集団（Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ、ＩＩ型マクロファージ）を含む、ＰＤ−Ｌ１以外の免疫療法に対する耐性に関して多くの内在性機序及び外来性機序が存在する。これらの免疫遮断のうち、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、腫瘍微小環境内でＩＬ−２の消費に参加し、このことが腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制する。その上、活性化したＴｒｅｇ細胞はまた、パーフォリンを経てＴ細胞を直接殺滅させることができる。したがって、腫瘍組織において豊富なＴｒｅｇ細胞は、癌免疫療法の成功に関する特に重要な障害物である。Ｔｒｅｇ細胞の消耗は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の応答速度を有意に改善する。
【００９１】
脈管損傷、血流中の侵襲性微小環境及び循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のモニターとして、血小板は近年、ナノ担体を設計するために使用されてきた。抗ＰＤ−Ｌ１と結合した血小板は、腫瘍手術創を標的として、消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞に活力付与することができ、したがって、術後の腫瘍の再発及び転移を低減させることができる。しかしながら、血液由来血小板は、処置の間、宿主と適合した多量の血小板が必要であることにより、生体安全性及び不十分性という難題を提示する。加えて、血小板は無核であり、増殖したり遺伝子操作したりすることができない。それに代わるものとして、巨核球（ＭＫ）からの試験管内作製は、大規模な血小板源を提供することができる。本明細書では、巨核球を遺伝子操作して、マウスＰＤ−１を安定して発現させ、その後ＰＤ−１を提示する血小板を試験管内で作製した。次に、これらの細胞を、消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞への活力付与を介して、手術創へ適用した（図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃ）。ＰＤ−Ｌ１遮断に加えて、ＰＤ−１発現血小板はまた、腫瘍の微小環境内でＴｒｅｇの枯渇を可能にするシクロホスファミドを担持及び輸送することもでき、手術の腫瘍の微小環境内でのＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞の抗腫瘍効果をさらに増強することもできる。
【００９２】
遮断ＰＤ−Ｌ１の他に、ＰＤ−１血小板はまた、プラットフォームとして機能することができ、他の免疫遮断阻害剤と組み合わせて、応答速度を改善することができる。それゆえ、シクロホスファミドを血小板内へ同時に負荷して、Ｔｒｅｇ細胞を消耗させた。シクロホスファミド負荷ＰＤ−１血小板製剤は、ＰＤ−Ｌ１及びＴｒｅｇ細胞の免疫遮断を中断させ、このことは、手術の腫瘍の微小環境において活力付与されたＣＤ８＋Ｋｉ６７＋ＧｒｚｍＢ＋リンパ球細胞の頻度を有意に上昇させた。したがって、他の免疫遮断阻害剤と組み合わされた細胞プラットフォームとしてのＰＤ−１血小板は、応答速度を改善することができ、かつ術後の腫瘍の再発の割合を低減させることができる。
【００９３】
（１）ＰＤ−１を安定して発現するＭＫ細胞株の作製
血小板は、骨髄及び肺にあるＭＫから放出される。血小板を大規模に作製するために、マウスＭＫ前駆細胞Ｌ８０５７をホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）で処理した。刺激後、細胞量は有意に増加するとともに、血小板前駆細胞が拡大し、かつ血小板が放出された。細胞の体積がより大きなＭＫは、複数の核を含有しており、成熟化と血小板を放出する用意ができていることとを示している。ＰＤ−１血小板を作製するために、マウスＥＧＦＰ−ＰＤ−１を安定して発現するＬ８０５７細胞株を、レンチウイルスを形質導入することによって確立し、ピューロマイシンで事後スクリーニングした。顕著なことに、ＰＤ−１受容体が細胞膜上に発現及び局在しており、ＥＧＦＰからの蛍光と、細胞膜色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４複合体コムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ５９４）との共局在によって示された（図１０Ａ）。ＥＧＦＰ−ＰＤ−１  Ｌ８０５７細胞上でのＰＤ−１の発現をウェスタンブロットによって確認した（図１０Ｂ）。ＭＫのマーカーであるＣＤ４１ａは、ＰＤ−１  Ｌ８０５７細胞株上で多量に発現していた。ＰＭＡによる刺激の後、ＰＤ−１発現Ｌ８０５７細胞は成熟化を受け、典型的な末梢の核及び細胞質体積増大を形態学的に示した。ＭＫの成熟化のマーカーであるＣＤ４２ａは、細胞膜上で発現していた（図１０Ｃ）。その上、血小板表面受容体ＧＰＶＩ（コラーゲン受容体）及びＰ−セレクチンは、成熟ＰＤ−１  Ｌ８０５７細胞内で発現していた。Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色で、成熟ＰＤ−１  Ｌ８０５７細胞が多倍数体核を含有していることが明らかとなった（図１０Ｄ）。
【００９４】
（２）ＭＫ由来のＰＤ−１血小板の試験管内作製
成熟ＭＫは典型的には、骨髄及び肺の出芽ポドソーム内に存在し、長く血小板前駆細胞を形成する。血小板前駆細胞は類洞内皮を横断し、血小板を血流内へと放出する。同様に、成熟ＰＤ−１発現Ｌ８０５７細胞は、出芽ポドソームを有しており、長く血小板前駆細胞を形成した（図１０Ｅ）。顕著なことに、血小板前駆細胞は細胞膜から出芽及び伸長して、真珠様構造を形成した（図１０Ｆ）。血小板前駆細胞は最終的にばらばらになり、血小板を放出した。ＥＧＦＰ−ＰＤ−１＋膜ベシクルを含有するＭＫ細胞質は、血小板前駆細胞形成のための膜貯蔵器として存在した（図１０Ｆ）。これらのＰＤ−１発現膜ベシクルは融合して管状構造を形成し、細胞表面から出芽した（図１０Ｆ）。培地から精製された血小板は、ＰＤ−１が血小板内に存在することを示す緑色蛍光を示した（図１０Ｇ）。ＧＰＶＩ及びＰ−セレクチンを含む結合受容体はまた、Ｌ８０５７細胞から放出される血小板内で発現した。その上、ＤＬＳ分析は、血小板の平均直径が約２μｍであり、かつゼータ電位が−１０±２．６ｍＶであることを示した（図１０Ｈ）。凍結走査電子顕微鏡（ＣＳＥＭ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって示されるように、精製された血小板は球状の形態的特徴を示した（図１０Ｉ及び図１０Ｊ）。さらに、ＰＤ−１  Ｌ８０５７細胞からの血小板産生を定量的に測定し、血小板の産生は、ＰＭＡによる刺激後の６日目に有意に上昇した（図１０Ｋ）。
【００９５】
（３）ＰＤ−１血小板の生物学的挙動。
血小板は止血を達成することができ、宿主防御応答のために他の白血球を動員することができ、かついくつかの免疫活性分子を放出することができる。血小板の活性化は、血管病変への接着後に生じる。コラーゲンは、活性のある血小板の結合のための主要な内皮下構成要素である。それゆえ、ＰＤ−１血小板のコラーゲン結合特性を検査した。実際、ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５９４色素で標識した非含有血小板及びＰＤ−１血小板のコラーゲン接着能は強かった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。対照的に、コラーゲン受容体ＧＰＶＩを抗ＧＰＶＩ抗体で遮断すると、血小板のコラーゲン接着能を強く低減した。血小板凝集による血栓の形成は、止血応答のための別の重要な事象である。トロンビンによるアゴニスト刺激に応じて、非含有血小板及びＰＤ−１血小板は、トロンビンによるアゴニスト性刺激に応答して、該血小板間で効率的に凝集した。加えて、血小板微粒子（ＰＭＰ）は、ケモカイン及び接着分子を保持する活性化した血小板から生じ、炎症及び粥状硬化部位において単球を亢進した。ＰＭＰが刺激の際に活性化したＰＤ−１血小板から産生されることができるかどうかを検討するために、血小板を試験管内でトロンビンで処理した。ＣＬＳＭ、ＳＥＭ、及びＴＥＭの画像は、活性化した血小板からのＰＭＰの産生を示した（図１１Ｃ）。血小板の形態的特徴が、トロンビンによる処理の後でより樹状性となり拡大するのかも観察した（図１１Ｃ）。さらに、ＤＬＳ分析では、より小さな粒子の産生が検出され、活性化した血小板からＰＭＰが放出されるのを示した（図１１Ｄ）。
【００９６】
腫瘍細胞上でのＰＤ−Ｌ１発現の上昇によってＴ細胞が消耗した（Ｔｅｘ）。ＰＤ−１血小板が黒色腫癌細胞の表面に結合することができ、かつＰＤ−Ｌ１を遮断することができるかどうかを調べるために、ＰＤ−１血小板をＢ１６Ｆ１０黒色腫癌細胞とともに試験管内でインキュベートした。特筆すべきことに、ＰＤ−１血小板は有効にＢ１６Ｆ１０細胞に結合し、次に癌細胞によって内部移行した（図１１Ｅ）。対照的に、非含有血小板は、Ｂ１６Ｆ１０細胞に結合する能力が制限されていることを示した（図１１Ｅ）。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用が血小板の内部移行を媒介するのかどうかを検討するために、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を添加して、Ｂ１６Ｆ１０細胞上のＰＤ−Ｌ１を遮断した。共焦点画像は、ＰＤ−Ｌ１抗体を細胞とともにプレインキュベートすると、ＰＤ−１血小板結合が有意に低減することを示した。さらに、ＥＧＦＰ−ＰＤ−１血小板はＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞上のＰＤ−Ｌ１リガンドと共局在しており、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を示した（図１１Ｆ）。非含有血小板及びＰＤ−１血小板の系統的な生体内循環時間を調べるために、血小板をＣｙ５．５で標識し、その後マウスへと尾静脈注射を経て注射した。非含有血小板（１４％、２４時間）は、ＰＤ−１血小板（８％、２４時間）と比較して血液保持特性がわずかに長かった（図１１Ｇ）。Ｂ１６Ｆ１０主要保持マウスにおける主要切除の後、Ｃｙ５．５標識血小板を静脈内接種すると、非含有血小板もＰＤ−１血小板も、残存腫瘍床において蓄積することができた（図１１Ｈ及び図１１Ｉ）。その間、血小板は肝臓及び脾臓において著しく蓄積した（図１１Ｈ及び図１１Ｉ）。糖蛋白質ＶＩ（ＧＰＶＩ）は、血小板上にあるコラーゲン受容体であり、血小板が創傷を標的にする原因となる。ＰＤ−１血小板及び非含有血小板は、コラーゲン上で同様の結合能を示した（図１１Ａ）。それゆえ、手術腫瘍における蓄積能は、非含有血小板とＰＤ−１血小板の間で同様である（図１１Ｈ）。
【００９７】
（４）ＰＤ−１血小板の生体内抗腫瘍効果
黒色腫細胞に及ぼすＰＤ−Ｌ１の上方調節によってＴ細胞が消耗し、増殖及び活性におけるＴ細胞の機能不全を呈した。ＰＤ−１血小板がＰＤ−Ｌ１を遮断して手術後の残存腫瘍を退化させることができるかどうかを調べるために、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫の不完全な腫瘍切除モデルを使用して、術後の局所的な再発を模倣した（図１２Ａ）。腫瘍量が約１００ｍｍ３となったとき、マウスに単回用量のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、非含有血小板（１×１０８個）、ＰＤ−１血小板（１×１０８個）を静脈内注射した。マウスが血小板注射を受けた後、腫瘍の手術を即時実施して、腫瘍のほとんど（約９０％）を除去した。術後、マウスは創傷治癒の期間中、追加の処置を受けた（図１２Ａ）。顕著なことに、腫瘍の生物発光を監視し、腫瘍の大きさを測定することによって評価されるように、ＰＤ−１血小板を受けたマウスにおいて高い応答速度を達成した。（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。残存腫瘍の進行は、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生物発光シグナルを監視すること及び腫瘍の大きさの測定によって、ＰＤ−１血小板を受けたマウスにおいて有意に遅延した（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。対照的に、非含有血小板又はＰＢＳを受けたマウスにおいては、残存黒色腫腫瘍が迅速に進行した（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。ＰＤ−１血小板による処置からの利益で、マウスの２５％が明白な体重減少又は他の毒性の徴候がないまま６０日を超えて生存した（図１２Ｄ）。器官損傷の明白な徴候は、血小板で処置したマウスにおいて観察されなかった。ＣＤ８＋ＴＩＬの蓄積を検討するために、腫瘍を収集し、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）及び免疫蛍光によって分析した。顕著なことに、ＣＤ８＋ＴＩＬの頻度は、ＰＤ−１血小板処置したマウスの腫瘍において著しく上昇し（図１２Ｅ、図１２Ｆ、及び図１２Ｇ）、Ｔ細胞は、細胞毒性蛋白質グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の発現上昇を呈しており、ＰＤ−１発現血小板が、腫瘍微小環境内でＴ細胞の消耗を逆転することができることを示した（図１２Ｈ及び図１２Ｉ）。
【００９８】
（５）シクロホスファミド負荷ＰＤ−１血小板の生体内抗腫瘍効果
低用量のシクロホスファミドは、種々のマウス腫瘍モデル及び患者において免疫応答を改善することができ、このことは、Ｔｒｅｇの選択的枯渇に概して起因する。腫瘍部位におけるＴｒｅｇに対向するために、本発明者らは、血小板内へシクロホスファミドを負荷した。試験管内で、血小板が内部移行することができ、かつ２４時間以内にシクロホスファミドを放出することができることがわかった。ＰＤ−Ｌ１遮断とＴｒｅｇのシクロホスファミド誘導枯渇が同時の場合の抗腫瘍効果を調べるために、不完全腫瘍切除をした同じＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルを使用した。このモデルにおいて、シクロホスファミド及びＰＤ−１発現血小板は、単一の作用薬として使用すると制限のある結果を示した（図１３Ａ及び図１４Ａ）が、腫瘍の進行は、シクロホスファミド負荷ＰＤ−１発現血小板で処置したマウスにおいて有意に抑制された（Ｐ＜０．００１）（図１３Ａ及び図１４Ａ）。シクロホスファミド及びＰＤ−Ｌ１の同時の遮断によるＴｒｅｇ枯渇によって、処置したマウスの生存が改善された（図１３Ｂ）。
【００９９】
処置の際の腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ８＋ＴＩＬの頻度も調べた。シクロホスファミドのない血小板及びシクロホスファミド負荷血小板は、腫瘍内でＴｒｅｇを選択的に枯渇させ（図１３Ｃ及び図１４Ｂ）、Ｋｉ６７＋Ｔ細胞の頻度を上昇させた（図１３Ｄ、図１３Ｅ）。特筆すべきことに、ＰＤ−１発現血小板が、Ｔｒｅｇを低減させる上で効果が限定されていたにもかかわらず、該血小板は、Ｋｉ６７＋Ｔ細胞の頻度をなおも上昇させた（図１３Ｄ、図１３Ｅ）。顕著なことに、ＣＤ８＋ＴＩＬの頻度は、シクロホスファミド負荷ＰＤ−１発現血小板で処置したマウスから収集した腫瘍において有意に上昇し（図１３Ｆ、図１３Ｇ）、これらの細胞はＧｚｍＢ発現を示した（図１３Ｈ、図１３Ｉ）。また、免疫蛍光染色によって、シクロホスファミドを負荷したＰＤ−１発現血小板で処置したマウスでは、対照マウスと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤の密度が高まったことが明らかとなった（図１３Ｊ、図１３Ｋ）。低用量のシクロホスファミド、及びシクロホスファミドを負荷した血小板で処置したマウスは、腹部の毛髪成長の遅延及びわずかな体重減少を示した（図１４Ａ、図１４Ｃ）。これらの結果は、ＰＤ−１発現血小板及びシクロホスファミドの併用が、ＰＤ−Ｌ１の免疫遮断を有効に中断させ、Ｔｒｅｇを枯渇させて、術後の腫瘍再発率低減をもたらすことを実証した。
【０１００】
ｂ）結論
要約すると、ＰＤ−１を提示する血小板を遺伝子操作したところ、手術創部位において蓄積することができ、かつ残存腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１を遮断することができ、消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞を強く逆転させて、残存腫瘍細胞を根絶させることができる。巨核球前駆細胞を操作して、マウスＰＤ−１を発現させ、ＰＤ−１を提示する血小板を作製するよう誘導した。ＰＤ−Ｌ１を遮断することの他に、ＰＤ−１血小板はまた、プラットフォームとして機能することができ、他の免疫遮断阻害剤と併用して、応答速度を改善することができる。シクロホスファミド負荷ＰＤ−１血小板製剤は、ＰＤ−Ｌ１及びＴｒｅｇ細胞の免疫遮断を中断させ、このことは、手術の腫瘍の微小環境において活力付与されたＣＤ８＋Ｋｉ６７＋ＧｒｚｍＢ＋リンパ球細胞の頻度を有意に上昇させた。活力付与されたＣＤ８＋は、残存腫瘍細胞を根絶させ、術後の腫瘍の再発率を低減した。
【０１０１】
ｃ）方法
（１）化学物質及び試薬。
シクロホスファミド、トロンビン、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ液及びホスファターゼ阻害剤カクテルを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈに注文した。ＰＤ−１抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製とした。ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製とした。マウスＣＤ４１ａ（ａｂ６３９８３）抗体及びＣＤ４２ａ（ａｂ１７３５０３）抗体は、Ａｂｃａｍ製とした。ｐ−セレクチン（ｓｃ−８４１９）は、Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製とした。マウスＧＰＶＩ（ＭＡＢ６７５８）抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製とした。免疫蛍光用のマウスＣＤ４及びＣＤ８抗体を、Ａｂｃａｍへ注文した。ＦＡＣＳ分析用にＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｋｉ６７、Ｆｏｘｐ３を含んだ染色抗体を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．に注文した。コムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８及び５９４色素を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃへ注文購入した。
【０１０２】
（２）細胞培養。
ＨＥＫ２９３Ｔを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。マウス巨核球細胞株Ｌ８０５７は、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ及びＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｌａｎ  Ｃａｎｔｏｒ教授によって親切にも提供され、２０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。マウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を米国培養細胞系統保存機関から購入した。生物発光生体内腫瘍撮像用に、Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃ細胞は、ＵＮＣのＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇ博士からの寄贈品であった。Ｂ１６Ｆ１０細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１０３】
（３）プラスミド及び安定細胞株
Ｃ末端モノマーＧＦＰタグつきマウスＰＤ−１を含有するレンチベクター（ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−ｍＧＦＰ−ＰＤ−１−ｐｕｒｏ）及びパッケージングプラスミド及びトランスフェクション試薬を含有するＬｅｎｔｉ−ｖｐａｋパッケージングキットを、Ｏｒｉｇｅｎｅに注文した。製造元の説明書により、ｌｅｎｔｉ−ｖｐａｋパッケージングキットからのトランスフェクション試薬を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドを一過性にトランスフェクトした。Ｌ８０５７細胞にＨＥＫ２９３Ｔ細胞からパッケージングしたレンチウイルスを感染させ、６μｇ／ｍｌのポリブレンとともにインキュベートした。９６時間のインフェクションの後、Ｌ８０５７細胞を１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充した２０％ＦＢＳを含有しているＲＰＭＩ１６４０中で培養して、マウスＰＤ−１の細胞株安定発現をスクリーニングした。その後、確立したＬ８０５７細胞安定発現マウスＥＧＦＰ−ＰＤ−１を、０．５〜１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充した２０％ＦＢＳ中で維持した。
【０１０４】
（４）Ｌ８０５７細胞から血小板を調製する。
Ｌ８０５７細胞及びＰＤ−１  Ｌ８０５７細胞を２０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。成熟化及び分化のため、Ｌ８０５７細胞を１００〜５００ｎＭ  ＰＭＡで３日間刺激した。次に、細胞をさらに６日間培養して、血小板前駆細胞及び血小板を作製した。血小板を単離するために、培地を１５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞を除去した次に、上清を、室温、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけた。血小板の沈殿物を、１μＭのＰＧＥ１を含有する、Ｔｙｒｏｄｅの緩衝液（１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭ  ＫＣｌ、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）又はＰＢＳの中で注意深く再懸濁した。活性のある血小板に対し、０．５Ｕのトロンビンｍｌ−１を血小板懸濁液に添加した。ＰＧＥ１を除去した後、血小板を活性化させた。
【０１０５】
（５）Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色。
Ｌ８０５７細胞は、１００〜５００ｎＭ  ＰＭＡで３日間刺激した。次に、細胞を収穫し、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。その後、細胞を無水メタノール中で５分間固定した。細胞をＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色液中で５分間染色した。次に、染色した細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、染色した細胞を、４０倍の対物レンズ付きの顕微鏡下で観察した。
【０１０６】
（６）細胞免疫蛍光アッセイ。
ＥＧＦＰ−ＰＤ−１のＬ８０５７細胞安定発現をＰＢＳで３回洗浄した。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間インキュベートした。次に、細胞を、３％ＢＳＡを含有する緩衝液で１時間ブロッキングした。その後、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ａ及びｐ−セレクチン一次抗体をＬ８０５７細胞とともに、それぞれ４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次に、切片を、１．５％ＢＳＡ中に希釈したローダミン結合二次抗体（ＫＰＬ）とともに室温、暗所中で１時間インキュベートした。最後に、核をＤＡＰＩで１０分間染色した。最後に、細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した。共焦点顕微法をＦＬＵＯ−ＶＩＥＷレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）において６３倍の対物レンズを用いて連続走査モードで行った。
【０１０７】
（７）ウェスタンブロット。
免疫ブロット法分析を行った。省略のために、ＥＧＦＰ−ＰＤ１を安定して発現するＬ８０５７細胞及びＬ８０５７細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解した。次に、細胞溶解物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＤ−１、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ａ、ｐ−セレクチン、ＧＰＶＩ及びβアクチンの抗体を用いた免疫ブロット法に続いて高感度化学発光（ＥＣＬ）検出（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。
【０１０８】
（８）Ｂ１６Ｆ１０細胞結合アッセイ：
Ｂ１６Ｆ１０細胞を共焦点ウェルの中に播種した。ＥＧＦＰ−ＰＤ−１発現血小板（約０．５×１０８個）又はｃｙ５．５で標識した非含有血小板（約０．５×１０８）を培地へ添加し、Ｂ１６Ｆ１０細胞とともに一晩インキュベートした。次に、コムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４複合体をＢ１６Ｆ１０の細胞膜を染色することに１０分間添加した。その後、核をヘキストで１０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。共焦点顕微法を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）において、６３倍の対物レンズを用いて連続走査モードで行った。
【０１０９】
（９）コラーゲン結合アッセイ
マウス由来のＩ型／ＩＩＩ型コラーゲン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を０．２５％酢酸中の２．０ｍｇ  ｍｌの濃度に再構成した。次に、２００μｌのコラーゲン溶液を９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。コラーゲン結合試験に先立って、プレートを２％ＢＳＡでブロッキングし、ＰＢＳで３回洗浄した。コラーゲン結合試験のために、血小板をＷＧＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４で３０分間染色した後、ＰＢＳで３回洗浄した。標識した血小板（約１×１０７個）を添加して、コラーゲンで被覆した又はコラーゲンで被覆していないプレートのウェルを複製した。３０秒のインキュベーションの後、プレートを３回洗浄した。次に、保持したナノ粒子を１００μｌのＤＭＳＯで溶解して、ＴｅＣａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００読み取り装置を用いた蛍光の定量を行った。
【０１１０】
共焦点撮像のため、コラーゲン溶液を共焦点ウェルへ添加し、４℃で一晩インキュベートした。（約１×１０８個）。ウェルを２％ＢＳＡでブロッキングし、ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４標識した血小板をコラーゲンとともに２分間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。共焦点顕微法を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）において、６３倍の対物レンズを用いて連続走査モードで行った。
【０１１１】
（１０）凝集アッセイ
血小板の凝集を、分光法を用いて評価した。ＰＢＳ中の血小板をキュベット内へと負荷した。０．５ＩＵ−１のトロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を血小板へ、示す通り添加した。すぐにキュベットをＴｅＣａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００読み取り装置の中に入れ、６５０ｎｍの延長時間での吸光度の変化について監視した。共焦点撮像のために、血小板をＷＧＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４で標識した。次に、血小板を共焦点ウェルへ負荷し、０．５ＩＵ−１のトロンビンを添加して３０分間置いた。共焦点顕微法を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）において、６３倍の対物レンズを用いて連続走査モードで行った。
【０１１２】
（１１）薬物の負荷及び放出
シクロホスファミドを血小板へ負荷するために、１００μｇの精製血小板（約１×１０８個）及び１００μｇのシクロホスファミドを１ｍｌのＰＢＳ中で穏やかに混合して、３７℃で２時間インキュベートした。次に、１２，０００ｒｐｍでの遠心分離により血小板をＰＢＳで３回洗浄した。電気穿孔ショック法のために、１００μｇの精製血小板（約１×１０８個）及び１００μｇのシクロホスファミドは、１ｍｌの電気穿孔緩衝液（１．１５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２、２５ｍＭ塩化カリウム、２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）中で穏やかに混合した。ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）を用いて、０．４ｃｍ電気穿孔キュベット中で試料を３００Ｖ及び１５０μＦの電気穿孔に供した。その後、試料を含有する電気穿孔キュベットを３０分間、膜回収のためにインキュベートした。次に、１，２０００ｒｐｍでの遠心分離により血小板をＰＢＳで３回洗浄した。血小板（１００μｇ／ｍＬ）からのシクロホスファミドの放出を３７℃で異なる時点で（それぞれ、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間で）ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で分析した。放出されたシクロホスファミドの量を、紫外−可視分光計を用いて２０２ｎｍのｋ最大値で分析した。
【０１１３】
（１２）循環。
Ｌ８０５７細胞から作製されたＰＤ−１血小板及び非含有血小板をＮＨＳ−Ｃｙ５．５によって標識した。次に、血小板をＰＢＳで３回洗浄した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２００μＬの標識した非含有血小板（約２×１０８個）又はＰＤ−１血小板（約２×１０８個）をそれぞれ尾静脈から注射した。マウスの血液を注射後の異なる時点で（それぞれ、２分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間で）で眼窩から収集した。次に、血清の蛍光を測定した。
【０１１４】
（１３）生体分布。
Ｌ８０５７細胞から作製した非含有血小板及びＰＤ−１血小板をＰＢＳ緩衝液中のＮＨＳ−Ｃｙ５．５によって標識した。４℃で一晩のインキュベーションの後、Ｃｙ５．５標識血小板をＰＢＳで３回洗浄した。黒色腫腫瘍を保有しているＣ５７ＢＬ／６マウスに２００μＬのＣｙ５．５標識ＰＤ−１血小板（約２×１０８個）を尾静脈から注射した。対照群にＰＢＳを注射した。２４時間後、マウスを安楽死させ、癌及び主要器官を収穫した。最後に、蛍光撮像結果及び平均放射線強度を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ撮像システムを用いて記録した。
【０１１５】
（１４）生体内抗腫瘍有効性試験。
Ｂ１６Ｆ１０ルシフェラーゼタグ付きＢ１６Ｆ１０（１×１０６個）黒色腫腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部内へ移植した。腫瘍接種８日後、腫瘍量は約約１５０ｍｍ３に到達する。次に、これらの腫瘍を摘出し、約１５ｍｍ３（１０％）の腫瘍量にして、手術ベッドにおいて残存腫瘍を模倣した。簡潔にいうと、動物を誘導チャンバの中でイソフルラン（誘導用最大５％、維持用１〜３％）を用いて麻酔し、鼻先を介して麻酔を維持した。腫瘍領域を摘み、無菌的に準備した。腫瘍のおよそ９０％を除去するために、無菌の器具を使用した。Ａｕｔｏｃｌｉｐ創傷閉鎖システムによって、創傷を閉鎖した。示す通り、マウスを８匹のマウス（ｎ＝８）からなるいくつかの為に分けた。マウスにまず、以下の異なる処置製剤を静脈内注射した：ＰＢＳ、非含有血小板（約２×１０８個）、ＰＤ−１血小板（約２×１０８個）、シクロホスファミド（２０ｍｇ／ｋｇ）、シクロホスファミド負荷非含有血小板（約２×１０８個）又はシクロホスファミド負荷ＰＤ−１血小板（約２×１０８個）。注射直後に、手術をマウス１匹ごとに１０分以内で実施した。腫瘍量を、癌細胞の生物発光によって監視した。マウスを固定し、脱毛クリームを用いて剃毛した後、撮像した。ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ撮像システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、画像を撮影した。腫瘍の大きさをデジタルカリパーで測定した。腫瘍量（ｍｍ３）は、（長径×短径２）／２として計算した。健康が損なわれた徴候を呈しているとき、又は腫瘍量が２ｃｍ３を超えたときに、動物を安楽死させた。
【０１１６】
（１５）組織免疫蛍光アッセイ。
腫瘍をマウスから摘出し、至適切断培地（Ｏ．Ｃ．Ｔ）中で瞬間凍結した。クリオトームを用いて数マイクロメートルの切片を切り出し、スライド上に載せた。凍結腫瘍切片をＰＢＳ中で１５分間インキュベートして、包埋培地を除去した。標本を、３％ＢＳＡを含有する緩衝液でブロッキングした。その後、標本は、ＣＤ４及びＣＤ８一次抗体（３％ＢＳＡ中１：５０）とともに一晩インキュベートした後、ＰＢＳで各５分間、３回洗浄した。その後、標本を、３％ＢＳＡ中に希釈したＴＲＩＴＣ二次抗体（ＫＰＬ）とともに室温、暗所中で１時間インキュベートした。最後に、核をＤＡＰＩで染色し、組織をＰＢＳで各５分間、３回洗浄した。共焦点顕微法をＦＬＵＯ−ＶＩＥＷレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）において、４０倍の対物レンズを用いて連続走査モードで行った。
【０１１７】
（１６）統計分析。
全ての結果は、示される通り、平均±標準偏差又は平均±平均の標準誤差として表されている。別段の記載がない限り、全ての実験において、生物学的複製物を使用した。２を超える群を比較するとき（多重比較）、一元配置又は二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＴｕｋｅｙの事後検定を使用した。延命効果は、対数順位検定を用いて求めた。全ての統計分析は、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ統計１９を用いて行った。統計的有意性についての閾値は、Ｐ＜０．０５とした。
【０１１８】
Ｄ．参考文献
Ａ．Ｄ．Ｆｅｓｎａｋ，Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｅ，Ｂ．Ｌ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１６，１６，５６６−５８１。
Ａ．Ｈｏｏｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６，１５，２３５−２４７。
Ａ．Ｋ．Ｐａｌｕｃｋａ，Ｌ．Ｍ．Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｃｅｌｌ  ２０１６，１６４，１２３３−１２４７
Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，３４１−３４５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１８０７（２０１１）。
Ａｍｅｚｑｕｉｔａ，Ｒ．Ａ．＆Ｋａｅｃｈ，Ｓ．Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  ｃｈｒｏｎｉｃｌｅｓ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４３，１９０−１９１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１５０８（２０１７）。
Ａｎｓｅｌｍｏ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｌｉｋｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｓｈａｐｅ，ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ８，１１２４３−１１２５３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｎ５０３７３２ｍ（２０１４）。
Ｂ．Ｔ．Ｌｕｋ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１５，２２０，６００−６０７
Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ  ｑｕａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ５５１，５１２−５１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４４６２（２０１７）。
Ｂｅｒｄ，Ｄ．＆Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ，Ｍ．Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｄｏｓｅ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋，２Ｈ４＋ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｒ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８，１６７１−１６７５（１９８８）。
Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＤ−１  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７５，１７６７−１７７８，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｒａ１５１４２９６（２０１６）。
Ｃ．Ｍ．Ｈｕ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ａｒｙａｌ，Ｃ．Ｃｈｅｕｎｇ，Ｒ．Ｈ．Ｆａｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１，１０８，１０９８０−１０９８５
Ｃ．Ｍ．Ｈｕ，Ｒ．Ｈ．Ｆａｎｇ，Ｋ．Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｔ．Ｌｕｋ，Ｓ．Ｔｈａｍｐｈｉｗａｔａｎａ，Ｄ．Ｄｅｈａｉｎｉ，Ｐ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｐ．Ａｎｇｓａｎｔｉｋｕｌ，Ｃ．Ｈ．Ｗｅｎ，Ａ．Ｖ．Ｋｒｏｌｌ，Ｃ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｍ．Ｒａｍｅｓｈ，Ｖ．Ｑｕ，Ｓ．Ｈ．Ｐａｔｅｌ，Ｊ．Ｚｈｕ，Ｗ．Ｓｈｉ，Ｆ．Ｍ．Ｈｏｆｍａｎ，Ｔ．Ｃ．Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｇａｏ，Ｋ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃｈｉｅｎ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５，５２６，１１８−１２１
Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ａ．Ｒｉｂａｓ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｆ．Ｓ．Ｈｏｄｉ，Ｏ．Ｈａｍｉｄ，Ｒ．Ｋｅｆｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．Ｗｅｂｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｊｏｓｈｕａ，Ｗ．Ｊ．Ｈｗｕ，Ｔ．Ｃ．Ｇａｎｇａｄｈａｒ，Ａ．Ｐａｔｎａｉｋ，Ｒ．Ｄｒｏｎｃａ，Ｈ．Ｚａｒｏｕｒ，Ｒ．Ｗ．Ｊｏｓｅｐｈ，Ｐ．Ｂｏａｓｂｅｒｇ，Ｂ．Ｃｈｍｉｅｌｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ｍａｔｅｕｓ，Ｍ．Ａ．Ｐｏｓｔｏｗ，Ｋ．Ｇｅｒｇｉｃｈ，Ｊ．Ｅｌａｓｓａｉｓｓ−Ｓｃｈａａｐ，Ｘ．Ｎ．Ｌｉ，Ｒ．Ｉａｎｎｏｎｅ，Ｓ．Ｗ．Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓ，Ｓ．Ｐ．Ｋａｎｇ，Ａ．Ｄａｕｄ，Ｌａｎｃｅｔ  ２０１４，３８４，１１０９−１１１７
Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｇ．Ｖ．Ｌｏｎｇ，Ｂ．Ｂｒａｄｙ，Ｃ．Ｄｕｔｒｉａｕｘ，Ｍ．Ｍａｉｏ，Ｌ．Ｍｏｒｔｉｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｈａｓｓｅｌ，Ｐ．Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｃ．ＭｃＮｅｉｌ，Ｅ．Ｋａｌｉｎｋａ−Ｗａｒｚｏｃｈａ，Ｋ．Ｊ．Ｓａｖａｇｅ，Ｍ．Ｍ．Ｈｅｒｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｌｅｂｂｅ，Ｊ．Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｃ．Ｍｉｈａｌｃｉｏｉｕ，Ｖ．Ｃｈｉａｒｉｏｎ−Ｓｉｌｅｎｉ，Ｃ．Ｍａｕｃｈ，Ｆ．Ｃｏｇｎｅｔｔｉ，Ａ．Ａｒａｎｃｅ，Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｈ．Ｇｏｇａｓ，Ｌ．Ｌｕｎｄｇｒｅｎ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｃ．Ｈｏｒａｋ，Ｂ．Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｉ．Ｍ．Ｗａｘｍａｎ，Ｖ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ａ．Ａｓｃｉｅｒｔｏ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１５，３７２，３２０−３３０．
Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｊ．Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｇ．Ｖ．Ｌｏｎｇ，Ａ．Ａｒａｎｃｅ，Ｊ．Ｊ．Ｇｒｏｂ，Ｌ．Ｍｏｒｔｉｅｒ，Ａ．Ｄａｕｄ，Ｍ．Ｓ．Ｃａｒｌｉｎｏ，Ｃ．ＭｃＮｅｉｌ，Ｍ．Ｌｏｔｅｍ，Ｊ．Ｌａｒｋｉｎ，Ｐ．Ｌｏｒｉｇａｎ，Ｂ．Ｎｅｙｎｓ，Ｃ．Ｕ．Ｂｌａｎｋ，Ｏ．Ｈａｍｉｄ，Ｃ．Ｍａｔｅｕｓ，Ｒ．Ｓｈａｐｉｒａ−Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｍ．Ｋｏｓｈ，Ｈ．Ｚｈｏｕ，Ｎ．Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｓ．Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓ，Ａ．Ｒｉｂａｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１５，３７２，２５２１−２５３２
Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｓｕｎ，Ｙ．Ｙｅ，Ｑ．Ｈｕ，Ｈ．Ｎ．Ｂｏｍｂａ，Ｚ．Ｇｕ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２０１７，１，００１１
Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｙｅ，Ｑ．Ｈｕ，Ａ．Ｂｅｌｌｏｔｔｉ，Ｚ．Ｇｕ，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２０１７，２９．
Ｄ．Ｈ．Ｍｕｎｎ，Ａ．Ｌ．Ｍｅｌｌｏｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７，１１７，１１４７−１１５４。
Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．＆Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｓ．Ｅ．Ｃａｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ？  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，６３９８−６４０３，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１３−０７３４（２０１３）。
Ｅ．Ｊ．Ｗｈｅｒｒｙ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，１２，４９２−４９９。
Ｅ．Ｊ．Ｗｈｅｒｒｙ，Ｓ．Ｊ．Ｈａ，Ｓ．Ｍ．Ｋａｅｃｈ，Ｗ．Ｎ．Ｈａｉｎｉｎｇ，Ｓ．Ｓａｒｋａｒ，Ｖ．Ｋａｌｉａ，Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ｊ．Ｎ．Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｂａｒｂｅｒ，Ｒ．Ａｈｍｅｄ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００７，２７，６７０−６８４。
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７，２１１２−２１２６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１（２０１２）。
Ｇ．Ｆｒｕｍｅｎｔｏ，Ｒ．Ｒｏｔｏｎｄｏ，Ｍ．Ｔｏｎｅｔｔｉ，Ｇ．Ｄａｍｏｎｔｅ，Ｕ．Ｂｅｎａｔｔｉ，Ｇ．Ｂ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２，１９６，４５９−４６８。
Ｇ．Ｍ．Ｌｙｎｎ，Ｒ．Ｌａｇａ，Ｐ．Ａ．Ｄａｒｒａｈ，Ａ．Ｓ．Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ａ．Ｊ．Ｂａｌａｃｉ，Ａ．Ｅ．Ｄｕｌｃｅｙ，Ｍ．Ｐｅｃｈａｒ，Ｒ．Ｐｏｌａ，Ｍ．Ｙ．Ｇｅｒｎｅｒ，Ａ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｃ．Ｒ．Ｂｕｅｃｈｌｅｒ，Ｋ．Ｍ．Ｑｕｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．Ｓｍｅｌｋｉｎｓｏｎ，Ｏ．Ｖａｎｅｋ，Ｒ．Ｃａｗｏｏｄ，Ｔ．Ｈｉｌｌｓ，Ｏ．Ｖａｓａｌａｔｉｙ，Ｋ．Ｋａｓｔｅｎｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｆｒａｎｃｉｃａ，Ｌ．Ｓｔｕｔｔｓ，Ｊ．Ｋ．Ｔｏｍ，Ｋ．Ａ．Ｒｙｕ，Ａ．Ｐ．Ｅｓｓｅｒ−Ｋａｈｎ，Ｔ．Ｅｔｒｙｃｈ，Ｋ．Ｄ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌ．Ｗ．Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｒ．Ａ．Ｓｅｄｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３，１２０１−１２１０
Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｕｓｅ  ｔｈｅ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｃａｕｓｅ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２１，５８９−６０１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００４．０９．００２（２００４）。
Ｇｕｂｉｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１５，５７７−５８１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３９８８（２０１４）。
Ｇｕｌｆａｍ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｇｌｉａｄｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ：ｔｈｅ  ＡＣＳ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ２８，８２１６−８２２３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｌａ３００６９１ｎ（２０１２）。
Ｈ．Ｌｉｕ，Ｋ．Ｄ．Ｍｏｙｎｉｈａｎ，Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．Ｌ．Ｓｚｅｔｏ，Ａ．Ｖ．Ｌｉ，Ｂ．Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｓ．Ｖａｎ  Ｅｇｅｒｅｎ，Ｃ．Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｊ．Ｉｒｖｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５０７，５１９−５２２
Ｈ．Ｚｈｏｕ，Ｚ．Ｆａｎ，Ｐ．Ｋ．Ｌｅｍｏｎｓ，Ｈ．Ｃｈｅｎｇ，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ２０１６，６，１０１２−１０２２。
Ｈｏｏｓ，Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｄｒｕｇｓ−ｆｒｏｍ  ＣＴＬＡ４  ｔｏ  ＰＤ１  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １５，２３５−２４７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ．２０１５．３５（２０１６）。
Ｈｕ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｉｎｇ  ｂｙ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｌｏａｋｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２６，１１８−１２１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５３７３（２０１５）。
Ｈｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  Ｎａｎｏｖｅｈｉｃｌｅｓ．Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ  ２７，７０４３−７０５０，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｄｍａ．２０１５０３３２３（２０１５）．
Ｈｕａｎｇ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ  ｒａｔｉｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４５，６０−６５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２２０７９（２０１７）。
Ｉ．Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｃｏｕｋｏｓ，Ｇ．Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４８０，４８０−４８９
Ｊ．Ｋｉｍ，Ｗ．Ａ．Ｌｉ，Ｙ．Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ａ．Ｌｅｗｉｎ，Ｃ．Ｓ．Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｇ．Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３，６４−７２
Ｊ．Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｈ．Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ，Ｅ．Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．Ｌｏｏｋ，Ｊ．Ｃｒｉｓｃｉｏｎｅ，Ｒ．Ｒａｇｈｅｂ，Ｓ．Ｍ．Ｊａｙ，Ｓ．Ｌ．Ｄｅｍｅｎｔｏ，Ａ．Ａｇａｗｕ，Ｐ．Ｌ．Ｌｉｍｏｎ，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１２，１１，８９５−９０５
Ｊ．Ｒ．Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｓ．Ｓ．Ｔｙｋｏｄｉ，Ｌ．Ｑ．Ｃｈｏｗ，Ｗ．Ｊ．Ｈｗｕ，Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｐ．Ｈｗｕ，Ｃ．Ｇ．Ｄｒａｋｅ，Ｌ．Ｈ．Ｃａｍａｃｈｏ，Ｊ．Ｋａｕｈ，Ｋ．Ｏｄｕｎｓｉ，Ｈ．Ｃ．Ｐｉｔｏｔ，Ｏ．Ｈａｍｉｄ，Ｓ．Ｂｈａｔｉａ，Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｋ．Ｅａｔｏｎ，Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｓａｌａｙ，Ｓ．Ａｌａｐａｒｔｈｙ，Ｊ．Ｆ．Ｇｒｏｓｓｏ，Ａ．Ｊ．Ｋｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．Ｍ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ，Ａ．Ｇｕｐｔａ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，２４５５−２４６５
Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｔｏ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒｓ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ７，７６９８−７７１０，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｎ４０２２３２ｇ（２０１３）．
Ｋ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．Ｓａｉｔｏｈ，Ｋ．Ｔａｂａｔａ，Ｈ．Ｏｍｏｒｉ，Ｔ．Ｓａｔｏｈ，Ｎ．Ｋｕｒｏｔｏｒｉ，Ｉ．Ｍａｅｊｉｍａ，Ｋ．Ｓｈｉｒａｈａｍａ−Ｎｏｄａ，Ｔ．Ｉｃｈｉｍｕｒａ，Ｔ．Ｉｓｏｂｅ，Ｓ．Ａｋｉｒａ，Ｔ．Ｎｏｄａ，Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００９，１１，３８５−３９６．
Ｋｅｎｓｌｅｒ，Ｔ．Ｔ．，Ｂｅｈｍｅ，Ｒ．Ｊ．＆Ｂｒｏｏｋｅ，Ｄ．Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６８，１７２−１７４（１９７９）．
Ｌ．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ，Ｙ．Ｓｅｏｗ，Ｈ．Ｙｉｎ，Ｃ．Ｂｅｔｔｓ，Ｓ．Ｌａｋｈａｌ，Ｍ．Ｊ．Ｗｏｏｄ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１，２９，３４１−３４５、
Ｌ．Ｃ．Ｗｕ，Ａ．Ａ．Ｚａｒｒｉｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４，１４，２４７−２５９。
Ｌ．Ｇｕ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１６，１６，５６−６６
Ｌ．Ｊｅａｎｂａｒｔ，Ｍ．Ａ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１５，１１２，１４４６７−１４４７２
Ｌ．Ｍ．Ｋｒａｎｚ，Ｍ．Ｄｉｋｅｎ，Ｈ．Ｈａａｓ，Ｓ．Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｃ．Ｌｏｑｕａｉ，Ｋ．Ｃ．Ｒｅｕｔｅｒ，Ｍ．Ｍｅｎｇ，Ｄ．Ｆｒｉｔｚ，Ｆ．Ｖａｓｃｏｔｔｏ，Ｈ．Ｈｅｆｅｓｈａ，Ｃ．Ｇｒｕｎｗｉｔｚ，Ｍ．Ｖｏｒｍｅｈｒ，Ｙ．Ｈｕｓｅｍａｎｎ，Ａ．Ｓｅｌｍｉ，Ａ．Ｎ．Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｂｕｃｋ，Ｅ．Ｄｅｒｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，Ｒ．Ｒａｅ，Ｓ．Ａｔｔｉｇ，Ｊ．Ｄｉｅｋｍａｎｎ，Ｒ．Ａ．Ｊａｂｕｌｏｗｓｋｙ，Ｓ．Ｈｅｅｓｃｈ，Ｊ．Ｈａｓｓｅｌ，Ｐ．Ｌａｎｇｇｕｔｈ，Ｓ．Ｇｒａｂｂｅ，Ｃ．Ｈｕｂｅｒ，Ｏ．Ｔｕｒｅｃｉ，Ｕ．Ｓａｈｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１６，５３４，３９６−４０１；
Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８，３３２，３２３−３２７
Ｌｅｆｒａｎｃａｉｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ｉｓ  ａ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｆｏｒ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４４，１０５−１０９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１７０６（２０１７）。
Ｍ．Ｓ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｃｅｌｌ  ２０１５，１６１，２０１−２０４
Ｍ．Ｔ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｊ．Ｊ．Ｍｏｏｎ，Ｓ．Ｈ．Ｕｍ，Ａ．Ｂｅｒｓｈｔｅｙｎ，Ｄ．Ｊ．Ｉｒｖｉｎｅ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１０，１６，１０３５−１０４１、
Ｍ．Ｘｉｅ，Ｈ．Ｙｅ，Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｃｈａｒｐｉｎ−Ｅｌ  Ｈａｍｒｉ，Ｃ．Ｌｏｒｍｅａｕ，Ｐ．Ｓａｘｅｎａ，Ｊ．Ｓｔｅｌｌｉｎｇ，Ｍ．Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６，３５４，１２９６−１３０１、
Ｍａｃｈｌｕｓ，Ｋ．Ｒ．＆Ｉｔａｌｉａｎｏ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．Ｔｈｅ  ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ  ｊｏｕｒｎｅｙ：Ｆｒｏｍ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１，７８５−７９６，ｄｏｉ：１０．１０８３／ｊｃｂ．２０１３０４０５４（２０１３）。
Ｍａｊ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ＰＤ−Ｌ１−ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８，１３３２−１３４１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．３８６８（２０１７）。
Ｍａｕｓｅ，Ｓ．Ｆ．，ｖｏｎ  Ｈｕｎｄｅｌｓｈａｕｓｅｎ，Ｐ．，Ｚｅｒｎｅｃｋｅ，Ａ．，Ｋｏｅｎｅｎ，Ｒ．Ｒ．＆Ｗｅｂｅｒ，Ｃ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ａ  ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＡＮＴＥＳ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５，１５１２−１５１８，ｄｏｉ：１０．１１６１／０１．ＡＴＶ．００００１７０１３３．４３６０８．３７（２００５）。
Ｍｏｒｅａｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ７，１１２０８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１１２０８（２０１６）。
Ｏ．Ｈａｍｉｄ，Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ａ．Ｄａｕｄ，Ｆ．Ｓ．Ｈｏｄｉ，Ｗ．Ｊ．Ｈｗｕ，Ｒ．Ｋｅｆｆｏｒｄ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｐ．Ｈｅｒｓｅｙ，Ｒ．Ｗ．Ｊｏｓｅｐｈ，Ｊ．Ｓ．Ｗｅｂｅｒ，Ｒ．Ｄｒｏｎｃａ，Ｔ．Ｃ．Ｇａｎｇａｄｈａｒ，Ａ．Ｐａｔｎａｉｋ，Ｈ．Ｚａｒｏｕｒ，Ａ．Ｍ．Ｊｏｓｈｕａ，Ｋ．Ｇｅｒｇｉｃｈ，Ｊ．Ｅｌａｓｓａｉｓｓ−Ｓｃｈａａｐ，Ａ．Ａｌｇａｚｉ，Ｃ．Ｍａｔｅｕｓ，Ｐ．Ｂｏａｓｂｅｒｇ，Ｐ．Ｃ．Ｔｕｍｅｈ，Ｂ．Ｃｈｍｉｅｌｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｗ．Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓ，Ｘ．Ｎ．Ｌｉ，Ｓ．Ｐ．Ｋａｎｇ，Ａ．Ｒｉｂａｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１３，３６９，１３４−１４４
Ｏｔｔ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４７，２１７−２２１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２２９９１（２０１７）．
Ｐ．Ｃ．Ｔｕｍｅｈ，Ｃ．Ｌ．Ｈａｒｖｉｅｗ，Ｊ．Ｈ．Ｙｅａｒｌｅｙ，Ｉ．Ｐ．Ｓｈｉｎｔａｋｕ，Ｅ．Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｂ．Ｃｈｍｉｅｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｓｐａｓｉｃ，Ｇ．Ｈｅｎｒｙ，Ｖ．Ｃｉｏｂａｎｕ，Ａ．Ｎ．Ｗｅｓｔ，Ｍ．Ｃａｒｍｏｎａ，Ｃ．Ｋｉｖｏｒｋ，Ｅ．Ｓｅｊａ，Ｇ．Ｃｈｅｒｒｙ，Ａ．Ｊ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｔ．Ｒ．Ｇｒｏｇａｎ，Ｃ．Ｍａｔｅｕｓ，Ｇ．Ｔｏｍａｓｉｃ，Ｊ．Ａ．Ｇｌａｓｐｙ，Ｒ．Ｏ．Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｈ．Ｒｏｂｉｎｓ，Ｒ．Ｈ．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｄ．Ａ．Ｅｌａｓｈｏｆｆ，Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔ，Ａ．Ｒｉｂａｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１５，５６８−５７１
Ｐ．Ｓｈａｒｍａ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｃｅｌｌ  ２０１５，１６１，２０５−２１４
Ｐ．Ｓｈａｒｍａ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，３４８，５６−６１
Ｐ．Ｖａｄｅｒ，Ｅ．Ａ．Ｍｏｌ，Ｇ．Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１６，１０６，１４８−１５６
Ｐ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｚｅｎｇ，Ｃ．Ｓｈｅｎ，Ｒ．Ｌｉ，Ｚ．Ｇｕｏ，Ｓ．Ｌｉ，Ｑ．Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．Ｃｈｕ，Ｚ．Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｚｈｅｎｇ，Ｒ．Ｔｉａｎ，Ｓ．Ｇｅ，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｎ．Ｓ．Ｘｉａ，Ｇ．Ｌｉｕ，Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１５，１１２，Ｅ６１２９−６１３８。
Ｑ．Ｈｕ，Ｗ．Ｓｕｎ，Ｃ．Ｑｉａｎ，Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｎ．Ｂｏｍｂａ，Ｚ．Ｇｕ，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２０１５，２７，７０４３−７０５０．
Ｒ．Ｈ．Ｆａｎｇ，Ｃ．Ｍ．Ｈｕ，Ｂ．Ｔ．Ｌｕｋ，Ｗ．Ｇａｏ，Ｊ．Ａ．Ｃｏｐｐ，Ｙ．Ｔａｉ，Ｄ．Ｅ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１４，１４，２１８１−２１８８、
Ｒ．Ｋｕａｉ，Ｌ．Ｊ．Ｏｃｈｙｌ，Ｋ．Ｓ．Ｂａｈｊａｔ，Ａ．Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，Ｊ．Ｊ．Ｍｏｏｎ，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１６。
Ｒ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｌ，Ｍ．Ｈ．Ｆｅｎｓ，Ｐ．Ｖａｄｅｒ，Ｗ．Ｗ．ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅ，Ｏ．Ｅｎｉｏｌａ−Ａｄｅｆｅｓｏ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１４，１９５，７２−８５
Ｒｏｌｌｉｎｇｈｏｆｆ，Ｍ．，Ｓｔａｒｚｉｎｓｋｉ−Ｐｏｗｉｔｚ，Ａ．，Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ，Ｋ．＆Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４５，４５５−４５９（１９７７）。
Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．＆Ｍｅｎｄｏｌｉｃｃｈｉｏ，Ｇ．Ｌ．Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １００，１６７３−１６８５，ｄｏｉ：１０．１１６１／０１．ＲＥＳ．００００２６７８７８．９７０２１．ａｂ（２００７）。
Ｓ．Ｂ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ａ．Ｍ．Ｔａｂｅｒ，Ｉ．Ｊｉｌｅａｅｖａ，Ｅ．Ｐ．Ｐｅｇｕｅｓ，Ｃ．Ｌ．Ｓｅｎｔｍａｎ，Ｍ．Ｔ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３，９７−１０１
Ｓ．Ｃ．Ｊａｎｇ，Ｏ．Ｙ．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｍ．Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｓ．Ｃｈｏｉ，Ｔ．Ｙ．Ｒｏｈ，Ｊ．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｊ．Ｌｏｔｖａｌｌ，Ｙ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．Ｇｈｏ，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１３，７，７６９８−７７１０。
Ｓ．Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，Ｙ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｌａｋｈａｌ−Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，Ｊ．Ｌｉ，Ｙ．Ｓｅｏｗ，Ｃ．Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｌ．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ，Ｉ．Ｌ．Ｓａｒｇｅｎｔ，Ｍ．Ｊ．Ｗｏｏｄ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２，７，２１１２−２１２６、
Ｓ．Ｋ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．Ｓｉｅｐｍａｎｎ，Ｋ．Ｋｕｈｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｅ．Ｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｓ．Ｐｕｄｅｌｋｏ，Ｍ．Ｌｅｉｎｅｗｅｂｅｒ，Ｗ．Ｄａｕｂｅｎｅｒ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２，７，ｅ４４７９７。
Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｔａｕｂｅ，Ｒ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１６，１６，２７５−２８７
Ｓ．Ｓ．Ｔａｎｅｊａ，Ｊ．Ｕｒｏｌ．２０１２，１８８，２１４８−２１４９
Ｓ．Ｓ．Ｔａｎｅｊａ，Ｊ．Ｕｒｏｌ．２０１２，１８８，２１４９。
Ｓ．Ｔ．Ｋｏｓｈｙ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６，４０，１−８
Ｓ．Ｔａｎ，Ｔ．Ｗｕ，Ｄ．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｚｈａｎｇ，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ２０１５，５，８６３−８８１
Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．＆Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，６９−７４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａａ４９７１（２０１５）。
Ｓｅｍｐｌｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｉｔａｌｉａｎｏ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．＆Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１，２６４−２７４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ２９５６（２０１１）。
Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．＆Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｏｗａｒｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｕｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｃｅｌｌ  １６１，２０５−２１４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０３．０３０（２０１５）。
Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．＆Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，５６−６１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａａ８１７２（２０１５）。
Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．，Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ，Ｓ．，Ｗａｒｇｏ，Ｊ．Ａ．＆Ｒｉｂａｓ，Ａ．Ｐｒｉｍａｒｙ，Ａｄａｐｔｉｖｅ，ａｎｄ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ  １６８，７０７−７２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０１．０１７（２０１７）。
Ｓｉｌｊａｎｄｅｒ，Ｐ．Ｒ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２７  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ３０−３３，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４９−３８４８（１０）７０１５２−３（２０１１）。
Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３，９７−１０１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１０４（２０１５）。
Ｓｔｒｏｎｃｅｋ，Ｄ．Ｆ．＆Ｒｅｂｕｌｌａ，Ｐ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７０，４２７−４３８，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（０７）６１１９８−２（２００７）。
Ｔ．Ｒ．Ｆａｄｅｌ，Ｆ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｎ．Ｖｕｄａｔｔｕ，Ｒ．Ｒａｇｈｅｂ，Ｊ．Ｇａｒｙｕ，Ｄ．Ｋｉｍ，Ｅ．Ｐ．Ｈｏｎｇ，Ｎ．Ｌｉ，Ｇ．Ｌ．Ｈａｌｌｅｒ，Ｌ．Ｄ．Ｐｆｅｆｆｅｒｌｅ，Ｓ．Ｊｕｓｔｅｓｅｎ，Ｋ．Ｃ．Ｈｅｒｏｌｄ，Ｔ．Ｍ．Ｆａｈｍｙ，Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４，９，７２３−７２３
Ｔｉａｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３５，２３８３−２３９０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３．１１．０８３（２０１４）。
Ｔｏｈｍｅ，Ｓ．，Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｒ．Ｌ．＆Ｔｓｕｎｇ，Ａ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ：Ａ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７７，１５４８−１５５２，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１６−１５３６（２０１７）。
Ｔｕｍｅｈ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ＰＤ−１  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１５，５６８−５７１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３９５４（２０１４）。
Ｔｗｙｍａｎ−Ｓａｉｎｔ  Ｖｉｃｔｏｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｕａｌ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，３７３−３７７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９２（２０１５）。
ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｈ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，３３８−３４４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ１１８０（２００５）。
Ｗ．Ｗ．Ｇｉｂｂｓ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２００５，２９３，７８−８３。
Ｗ．Ｚｏｕ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１６，８，３２８ｒｖ３２４。
Ｙ．Ｔｉａｎ，Ｓ．Ｌｉ，Ｊ．Ｓｏｎｇ，Ｔ．Ｊｉ，Ｍ．Ｚｈｕ，Ｇ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗｅｉ，Ｇ．Ｎｉｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１４，３５，２３８３−２３９０。
Ｙ．Ｙｅ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｑ．Ｈｕ，Ｇ．Ｍ．Ｈｏｃｈｕ，Ｈ．Ｘｉｎ，Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｇｕ，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１６，１０，８９５６−８９６３。
Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｎｏｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｈｉｍｅｎｏ，Ｋ．＆Ｔａｋｅｙａ，Ｋ．Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｏｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｉ．Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｆｏｏｔｐａｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８，２１１−２１７（１９７９）。
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３５，１９３２−１９４３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３．１０．０３４（２０１４）。
Ｚｏｕ，Ｗ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，２９５−３０７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ１８０６（２００６）。
Ｚｏｕ，Ｗ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．＆Ｃｈｅｎ，Ｌ．ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）ａｎｄ  ＰＤ−１  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，３２８ｒｖ３２４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｄ７１１８（２０１６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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