(57)【要約】  本発明は、肝保護のためのクルクミノイドおよびガルシノールを含む組成物に関する。詳細には、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、ならびに脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維症および肝硬変などの関連状態の治療管理のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法であって、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物の有効量をそのような治療を必要とする哺乳動物に投与してＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状の低減をもたらすステップを含む、方法。
【請求項２】
ＮＡＦＬＤ関連状態が、ＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を含む、請求項１に記載のＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法。
【請求項３】
ＮＡＦＬの症状が、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＡＳＨ症状が、炎症性浸潤および肝細胞バルーニングを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
線維症の症状が、肝臓におけるヒドロキシプロリンレベルの上昇およびコラーゲンの病理学的沈着を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状が、炎症マーカーの発現の増加、肝臓酵素レベルの上昇、脂質過酸化の増加、抗酸化物質レベルの減少、コラーゲン発現の増加およびアディポネクチンレベルの低減を含む、請求項１に記載のＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法。
【請求項７】
炎症マーカーが、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肝臓酵素が好ましくはＡＬＴである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
抗酸化物質がグルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールが、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
９５％クルクミノイドが、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、薬学的／栄養学的に許容される賦形剤およびアジュバントを用いて製剤化され、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、粉剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー剤または食品の形態で経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、肝臓保護について公知のまたは評価された他の成分と共に製剤化または混合され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物におけるＮＡＦＬＤならびに関連状態および症状の治療管理のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物。
【請求項１６】
ＮＡＦＬＤの関連状態が、ＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＮＡＦＬの症状が、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
ＮＡＳＨ症状が、炎症性浸潤および肝細胞バルーニングを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
線維症の症状が、肝臓におけるヒドロキシプロリンレベルの上昇およびコラーゲンの病理学的沈着を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
ＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状が、炎症マーカーの発現の増加、肝臓酵素レベルの上昇、脂質過酸化の増加、抗酸化物質レベルの減少、コラーゲン発現の増加およびアディポネクチンレベルの低減を含む、請求項１５に記載のＮＡＦＬＤならびに関連状態および症状の治療管理のための組成物。
【請求項２１】
炎症マーカーが、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１を含む群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
肝臓酵素が好ましくはＡＬＴである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
抗酸化物質が、グルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含む群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールが、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２５】
９５％クルクミノイドが、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２６】
哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２７】
薬学的／栄養学的に許容される賦形剤およびアジュバントを用いて製剤化され、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、粉剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー剤または食品の形態で経口投与される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２８】
肝臓保護について公知のまたは評価された他の成分と共に製剤化または混合され得る、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許の相互参照
これは、２０１８年３月２３日出願の米国仮出願第６２６４７０４１号に基づく優先権を主張するＰＣＴ出願である。
発明の分野
本発明は、肝臓保護剤組成物に関する。詳細には、本発明は、肝保護のためのクルクミノイドおよびガルシノールを含む組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および関連状態の治療管理のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、脂肪肝から肝硬変および肝細胞癌にわたるアルコール摂取無しでの脂肪性肝疾患のスペクトラムを含む。ＮＡＦＬＤのさまざまな程度および種類として、ａ）脂肪症、ｂ）非アルコール性脂肪性肝炎（ｓｔｅａｔｏｈｅａｐａｔｉｔｉｓ）（ＮＡＳＨ）、ｃ）線維症およびｄ）肝硬変、ｅ）肝細胞癌が挙げられる。脂肪症は、肝細胞におけるトリグリセリド蓄積または肝臓における過多な脂肪として定義される。正常より、最小で少なくとも５〜１０％過多な脂肪の過剰負荷は、脂肪症の有意な状態とみなされる。
【０００３】
ＮＡＦＬＤ、非アルコール脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の第２ステージは、末期線維症、肝硬変および肝がんまたは肝細胞癌への進行の実質的なリスクを有する潜在的に重篤な状態である。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の病理組織学的特性として、肝細胞脂肪症およびバルーニング、混合急性および慢性炎症ならびに細静脈周囲、類洞周囲のコラーゲン沈着が挙げられる。ＮＡＳＨは、代謝障害の肝臓での徴候と考えられ、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性および全身性の炎症状態に密接に関連している。次の先行技術文献は、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの特徴的な特性を開示している。
2021518845.tif 000002
ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤの病理組織を評価することは、疾患の程度および進行を決定するために重要である。組織学的「グレード分けおよびステージ分類」システムは、脂肪性肝炎の固有の特性、重症度および線維症のグレード分けを反映し、病理組織学の均一な報告を促進するように開発され（Brunt et al., Nonalcoholic steatoheapatitis: definition and pathology; Semin Liver Dis. 2001;21(1):3-16）、そこでは、ステージ分類スコアは、疾患の位置および程度の両方を反映している。
【０００４】
他のＮＡＦＬＤは、ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）脂肪症（０〜３グレード）、小葉炎症（０〜２）および肝細胞バルーニング（０〜２）についての肝生検の病理組織学スコアの合計によってＮＡＳＨから識別され得る。３未満のＮＡＳはＮＡＦＬＤに相当し、３〜４は境界線ＮＡＳＨに相当し、５を超えるとＮＡＳＨに相当する。生検も、線維症（０〜４）についてのスコア化される。同様に、バルーニングおよび小葉炎症、門脈炎症ならびに脂肪症グレードについてのグレード分けシステムは、Kleiner et al., Histology of NAFLD and NASH in adults and children, Clin Liver Dis. 2016; 20(2): 293-312によって十分に説明され、識別されている。
線維症は、さらなる代謝および生化学的異常で生じる。それはコラーゲンの形成と沈着の速度の間の不均衡に依存する。線維症ステージは、Brunt et al., Nonalcoholic steatohepatits: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol. 1999; 94(9):2467-74によって記載される通り、ステージ１、ゾーン３類洞周囲線維症；ステージ２、門脈線維症を有する類洞周囲線維症；ステージ３、ブリッジング線維症を有して上記と同じ；およびステージ４を含む。線維症は、バイオマーカーとしてヒドロキシプロリンおよび酸化ストレスを使用して肝疾患において診断され得る（Gabr et al., Prediction of fibrosis in hepatitis C. patients: assessments using hydroxyproline and oxidative stress biomarkers. Indian Virological Society 2013; 25(1): 91-100）。
【０００５】
酸化ストレスマーカーは、肝臓の健康を維持することに重要な役割も演じている。肝臓線維症の評価のための非侵襲性パラメーターとしての酸化ストレスマーカーの重要性（Novitskiy G et al., Effects of ethanol and acetaldehyde on reactive oxygen species production in rat hepatic stellate cells Alcohol Clin Exp Res. 2006;30(8):1429-35）。酸化ストレスマーカー、抗酸化酵素およびヒドロキシプロリンがＣＨＣの病態形成に関与していることが記載されている。Clichici S et al., Non-invasive oxidative stress markers for liver fibrosis development in the evolution of toxic hepatitis. Acta Physiol Hung.2011;98(2):195-204）
【０００６】
ＮＡＳＨは、通常、最小限の症状を有するサイレントな疾患であるが、体重減少、疲労および虚弱が疾患進行と共に生じる。ＮＡＦＬＤの脂肪肝を有する個体は、肝臓酵素の上昇を有すると定められ、肝臓酵素集団の低下は、肝臓の状態を矯正または改善する。酵素数を管理する当技術分野の技術は、栄養補助食品として使用される天然アミノ酸であるグルタミンを提供することである。
【０００７】
ＮＡＦＬＤの治療管理について緊急の必要性がある。処置のための承認薬を有さないため、それは公衆衛生システムへの重大な負荷である。処置の主な様式は、ライフスタイル管理であり、ピオグリタゾンおよびビタミンＥは、肝細胞損傷、線維症を低減し、脂肪性肝炎を改善する薬物療法として使用されている。他の方法としてインスリン感受性改善薬、ビグアナイド、例えばメトホルミンを使用することが挙げられる。
【０００８】
さまざまな植物原料由来の天然分子も肝保護のためおよびＮＡＦＬＤの管理のために現在使用されている（Madrigal-Santillan et al., Review of natural products with hepatoprotective effects, World J Gastroenterol. 2014; 20(40): 14787-14804）。クルクマ種（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｓｐ．）由来のクルクミンは、ＮＡＳＨの症状を軽減することにおけるその治療効果について周知である（Rahmani et al., Treatment of Non-alcoholic Fatty Liver Disease with Curcumin: A Randomized Placebo-controlled Trial, Phytotherapy Research, 2016; 30(9):1540-1548; Amato et al., NAFLD and Atherosclerosis Are Prevented by a Natural Dietary Supplement Containing Curcumin, Silymarin, Guggul, Chlorogenic Acid and Inulin in Mice Fed a High-Fat Diet, Nutrients 2017, 9(5), 492; https://doi.org/10.3390/nu9050492）。ガルシニア種（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｓｐ．）由来のガルシノールも公知の肝保護剤である（ＷＯ２０１２０９２４３０Ａ１）。しかし、大部分の天然分子は、ＮＡＦＬＤのすべての症状に対して完全保護を付与しない。安全で信頼でき、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨに関連する大部分の症状を軽減することによって肝保護能力を引き出す組成物に対する未充足の産業的必要性が、今なお存在する。
本発明は、ＮＡＦＬＤならびにＮＡＳＨ、線維症および肝硬変などの関連状態の治療管理のためのクルクミノイドおよびガルシノールを含む相乗作用組成物を提供する。
ＮＡＦＤＬおよびその関連状態の管理のための９５％ｗ／ｗクルクミノイドおよび２０％ｗ／ｗガルシノールを含む相乗作用肝保護剤組成物を開示することは、本発明の主な目的である。
９５％ｗ／ｗクルクミノイドおよび２０％ｗ／ｗガルシノールを含む組成物を使用するＮＡＦＬＤならびに脂肪症、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変などの関連状態の治療管理のための方法を開示することは、本発明のさらに別の目的である。
本発明は、上に述べた目的を解決し、さらに関連する有利点をもたらす。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、肝保護剤としての使用のための、９５％ｗ／ｗクルクミノイドおよび２０％ｗ／ｗガルシノールを含む組成物に関する。より具体的には、本発明は、ＮＡＦＬＤならびに脂肪症、ＮＡＳＨ、肝維症および肝硬変などの関連状態の治療管理のための９５％ｗ／ｗクルクミノイドおよび２０％ｗ／ｗガルシノールを含む組成物の使用を開示する。
本発明は、９５％ｗ／ｗクルクミノイドおよび２０％ｗ／ｗガルシノールを含む組成物を投与することによる、ＮＡＦＬＤならびに脂肪症、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変などの関連状態の治療管理のための方法も開示する。
本発明の他の特性および有利点は、例に基づいて本発明の原理を例示する添付の図と合わせた、以下のさらに詳細な説明から明らかになる。
本特許または出願書類は、カラーで出力された少なくとも１つの図を含む。カラーの図（複数可）を含む本特許または特許出願公開の複製物は、請求および必要な手数料の支払いにより当局によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した肝臓の病理組織学的切片を示す図である。
【図２】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物の肝臓切片におけるＮＡＦＬＤスコアを示すグラフ表示である。ＮＡＦＬＤスコアは、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色された組織学的切片に基づいて算出される。
【図３】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物の肝臓切片における脂肪症スコアを示すグラフ表示である。
【図４】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物の肝臓切片におけるバルーニングスコアを示すグラフ表示である。
【図５】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物の肝臓切片における線維症の面積を示すグラフ表示である。
【図６】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物における肝臓ヒドロキシプロリンレベルを示すグラフ表示である。
【図７】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物においてコラーゲン沈着を示す、ピクロシリウスレッドを用いて染色された肝臓切片の病理組織学的顕微鏡像である。
【図８】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物におけるアディポネクチンレベルを示すグラフ表示である。
【図９】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物における血漿ＴＮＦαレベルを示すグラフ表示である。
【図１０】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物における血漿グルタチオンレベルを示すグラフ表示である。
【図１１】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物における血漿グルタチオンペルオキシダーゼレベルを示すグラフ表示である。
【図１２】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物における脂質過酸化の程度を示すグラフ表示である。
【図１３】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物におけるＴＮＦ−α、ＮＦκＢおよびＭＣＰ１の発現を示すグラフ表示である。
【図１４】ガルシノール、クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイドを投与された動物におけるＴＧＦ−βおよびコラーゲン１の発現を示すグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
最も好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法であって、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含有する組成物の有効量をそのような治療を必要とする哺乳動物に投与してＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状の低減をもたらすステップを含む、方法を開示する。関連実施形態では、ＮＡＦＬＤの関連状態は、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維症および肝硬変を含む。関連実施形態では、ＮＡＦＬの症状は、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む。
【００１２】
関連実施形態では、ＮＡＳＨ症状は、これらに限定されるものではないが、炎症性浸潤および肝細胞バルーニングを含む。別の関連実施形態では、線維症の症状は、肝臓におけるヒドロキシプロリンレベルの上昇およびコラーゲンの病理学的沈着を含む。別の関連実施形態では、ＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状として、炎症マーカーの発現の増加、肝臓酵素レベルの上昇、脂質過酸化の増加、抗酸化物質レベルの減少、コラーゲン発現の増加およびアディポネクチンレベルの低減を含む。
さらに別の関連実施形態では、炎症マーカーは、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１を含む群から選択される。
さらに別の態様では、肝臓酵素は好ましくはＡＬＴである。別の関連する態様では、抗酸化物質は、グルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含む群から選択される。関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。
【００１３】
別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。別の関連する態様では、２０％ガルシノールは、ガルシニア種から得られる。好ましい実施形態では、ガルシニア種は、ガルシニア・インディカ（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｉｎｄｉｃａ）である。別の関連する態様では、哺乳動物はヒトである。
さらに別の態様では、組成物は、薬学的／栄養学的（nutraceutically）に許容される賦形剤およびアジュバントを用いて製剤化され、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、粉剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー剤または食品の形態で経口投与される。別の関連する態様では、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物は、肝臓保護のための他の公知の成分と共に製剤化され得る。
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物を開示する。関連実施形態では、ＮＡＦＬＤの関連状態は、ＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を含む。関連実施形態では、ＮＡＦＬの症状は、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む。関連実施形態では、ＮＡＳＨ症状は、これらに限定されるものではないが、炎症性浸潤および肝細胞バルーニングを含む。
【００１４】
別の関連実施形態では、線維症の症状は、肝臓におけるヒドロキシプロリンレベルの上昇およびコラーゲンの病理学的沈着を含む。別の関連実施形態では、ＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状は、炎症マーカーの発現の増加、肝臓酵素レベルの上昇、脂質過酸化の増加、抗酸化物質レベルの減少、コラーゲン発現の増加およびアディポネクチンレベルの低減を含む。さらに別の関連実施形態では、炎症マーカーは、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１を含む群から選択される。
【００１５】
さらに別の態様では、肝臓酵素は、好ましくはＡＬＴである。別の関連する態様では、抗酸化物質は、グルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含む群から選択される。関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。別の関連する態様では、２０％ガルシノールは、ガルシニア種から得られる。好ましい実施形態では、ガルシニア種は、ガルシニア・インディカである。別の関連する態様では、哺乳動物はヒトである。
さらに別の態様では、組成物は、薬学的／栄養学的に許容される賦形剤およびアジュバントを用いて製剤化され、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、粉剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー剤または食品の形態で経口投与される。別の関連する態様では、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物は、肝臓保護のための他の公知の成分と共に製剤化され得る。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＮＡＦＬの治療管理の方法であって、哺乳動物に９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物の有効量を投与して肝臓に貯留された過多な脂肪の脂肪分解をもたらすステップを含む、方法を開示する。関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。
別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＮＡＦＬに関連する症状の治療管理のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物を開示する。関連実施形態では、ＮＡＦＬの症状は、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む。
関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。
別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。さらに別の関連実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＮＡＦＬの治療管理の方法であって、哺乳動物に９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含有する組成物の有効量を投与してＮＡＳＨに関連する症状の低減をもたらすステップを含む、方法を開示する。関連実施形態では、ＮＡＳＨの症状は、これらに限定されるものではないが、炎症性浸潤、肝臓酵素の上昇および肝細胞バルーニングを含む。
別の関連実施形態では、炎症マーカーは、これらに限定されるものではないが、インターロイキン、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βからなる群から選択される。別の関連実施形態では、肝臓酵素は、トランスアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される。関連実施形態では、肝臓酵素は、好ましくはＡＬＴである。
【００１８】
関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。さらに別の関連実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるＮＡＳＨと関連する症状の治療管理のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物を開示する。
【００１９】
関連実施形態では、ＮＡＳＨの症状は、これらに限定されるものではないが、炎症性浸潤、肝臓酵素の上昇および肝細胞バルーニングを含む。別の関連実施形態では、炎症マーカーは、これらに限定されるものではないが、インターロイキン、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βからなる群から選択される。別の関連実施形態では、肝臓酵素は、トランスアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される。関連実施形態では、肝臓酵素は、好ましくはＡＬＴである。
関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。さらに別の関連実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物における肝線維症の治療管理の方法であって、哺乳動物に９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物の有効量を投与して肝線維症のマーカーにおける低減をもたらすステップを含む、方法を開示する。関連実施形態では、肝線維症のマーカーは、これらに限定されるものではないが、炎症性サイトカイン、肝臓酵素およびヒドロキシプロリンの上昇ならびに肝臓におけるコラーゲンの病理学的沈着を含む。
【００２１】
別の関連実施形態では、炎症マーカーは、これらに限定されるものではないが、インターロイキン、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βからなる群から選択される。別の関連実施形態では、肝臓酵素は、トランスアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される。別の関連実施形態では、肝臓酵素は、好ましくはＡＬＴである。関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。さらに別の関連実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００２２】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物における肝線維症に関連する症状およびマーカーの低減のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物を開示する。関連実施形態では、肝線維症のマーカーは、これらに限定されるものではないが、炎症性サイトカイン、肝臓酵素およびヒドロキシプロリンの上昇ならびに肝臓におけるコラーゲンの病理学的沈着を含む。別の関連実施形態では、炎症マーカーは、これらに限定されるものではないが、インターロイキン、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βからなる群から選択される。別の関連実施形態では、肝臓酵素は、トランスアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される。
関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。さらに別の関連実施形態では、哺乳動物はヒトである。
別の最も好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物において肝保護をもたらす方法であて、哺乳動物に９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物の有効量を投与して炎症マーカーおよび肝臓酵素の低減をもたらして肝保護を付与するステップを含む、方法を開示する。
【００２３】
関連実施形態では、組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。関連実施形態では、炎症マーカーは、これらに限定されるものではないが、インターロイキン、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βを含む群から選択される。別の関連実施形態では、肝臓酵素は、トランスアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される。さらに別の関連実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、本発明は、肝保護剤としての使用のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物を開示する。関連実施形態では組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールは、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。別の関連実施形態では、９５％クルクミノイドは、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する。さらに別の関連実施形態では、哺乳動物はヒトである。
以下の例示的実施例は、本発明の技術的特性および有利点を理解するために含まれる。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）
方法
マウスモデル
実験はＮＡＳＨ−ＨＣＣのＳＴＡＭモデルで実行する。ＮＡＳＨ  ＳＴＡＭモデルは、主に、脂肪症からＮＡＳＨおよび肝線維症にわたるヒトＮＡＦＬＤのスペクトラム全体を再現することから広く使用されている。加えて、このモデルにおいて観察される組織学的表現型は、ヒト臨床試料において見られるものと同様であり、このことは、疾患の重症度を評価するために同じスコア化システム（ＮＡＦＬＤ活性スコア；ＮＡＳ）を使用することを可能にする（Kazuki Takakura Et al., Mouse models for investigating the underlying mechanisms of non alcoholic steatoheapatitis-derived hepatocellular carcinoma; World J Gastroenterol; 2018 may 14; 24 (18); 1989-1994）。
ＳＴＡＭマウスモデルでは体重増加はなく、動物は、高脂肪食給餌にもかかわらず肥満を示さない。
【００２６】
プロトコール
病原体未感染妊娠１４日目Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｐａｎ  ＳＬＣ、Ｉｎｃ．（日本）から得て、ＮＡＳＨを、オスマウスにおいて、出生後の２００μｇストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ、米国）の単回皮下注射および自由摂取の高脂肪食（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ、日本）の給餌によって、４週齢（２８±２日齢）に確立した。５週齢（３５±２日齢）のマウスを、処置開始前日に、それぞれマウス８匹の４群に無作為化した。
群
群１（ビヒクル）：ＮＡＳＨマウス８匹に５ｍＬ／ｋｇの体積中のビヒクル０．５％メチルセルロース］を５〜９週齢に１日１回経口投与した。
群２（２０％ガルシノール）：ＮＡＳＨマウス８匹に、２０％２０％ガルシノールを補充したビヒクルを１０ｍｇ／ｋｇの用量で、５〜９週齢に１日１回経口投与した。
群３（９５％クルクミノイド−Ｓａｂｉｎｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国から商業的に入手できるクルクミンＣ３複合体（登録商標））：ＮＡＳＨマウス８匹に、クルクミンＣ３複合体を補充したビヒクルを５０ｍｇ／ｋｇの用量で、５〜９週齢に１日１回経口投与した。
群４（２０％ガルシノールおよびクルクミンＣ３複合体（登録商標）：ＮＡＳＨマウス８匹に、２０％２０％ガルシノールを１０ｍｇ／ｋｇの用量でおよびクルクミンＣ３複合体を５０ｍｇ／ｋｇの用量で補充したビヒクルを、６〜９週齢に１日１回経口投与した。
【００２７】
下の表１に処置スケジュールを要約する。
【表１】
2021518845.tif 000003
すべての動物は、９週齢で人道的に屠殺し、臓器重量、個々の肝臓重量、肝臓対体重比を記録した。
【００２８】
試料回収
血漿試料について、非絶食時血液を抗凝固薬（ノボヘパリン）を含むポリプロピレンチューブに回収し、１，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を回収し、−８０℃で保存した。凍結肝臓試料について、左中葉および尾状葉を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
パラフィン包埋肝臓ブロックについて、左側葉を回収し、６片に切り分けた。左側葉の２片をブアン固定液中で固定しパラフィンに包埋した。
【００２９】
ｃＤＮＡ試料について、左側葉の他の２片を液体窒素中で急速凍結し、使用まで−８０℃で保存した。総ＲＮＡを肝臓試料からＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ、日本）を製造者の説明書に従って使用して抽出した。１μｇのＲＮＡを、４．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、スイス）、４０Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔｏｙｏｂｏ、日本）、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）、６．２８μＭランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５ｘ第１鎖緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｍＭジチオスレイトール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）および２００Ｕ  ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最終体積２０μＬ中に含有する反応混合物を使用して逆転写した。反応を、３７℃で１時間、続いて９９℃で５分間実行した。
全血および血漿生化学の測定
非絶食時血糖を全血中でＳｔａｔ  Ｓｔｒｉｐグルコースメーター（ＮＩＰＲＯ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、日本）を使用して測定した。血漿生化学について、非絶食時血液を抗凝固薬（ノボヘパリン、Ｍｏｃｈｉｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．、日本）を含むポリプロピレンチューブに回収し、１，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を回収し、使用まで−８０℃で保存した。血漿ＡＬＴおよび総コレステロールをＦＵＪＩ  ＤＲＩ−ＣＨＥＭ  ７０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、日本）によって測定した。アディポネクチンの概算をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの取扱説明書に従って行った。
【００３０】
肝臓生化学の測定
肝臓トリグリセリド含有量の測定
肝臓総脂質抽出物をフォルチ法（Folch J. et al., J. Biol. Chem. 1957;226: 497）によって得た。肝臓試料をクロロホルム−メタノール（２：１、ｖ／ｖ）中でホモジナイズし、室温で一晩インキュベートした。クロロホルム−メタノール−水（８：４：３、ｖ／ｖ／ｖ）を用いた洗浄後、抽出物を乾燥するまでエバポレーションし、イソプロパノールに溶解した。肝臓トリグリセリド含有量をトリグリセリドＥテスト（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．、日本）によって測定した。
【００３１】
肝臓ヒドロキシプロリン含有量の測定
肝臓ヒドロキシプロリン含有量を測定するために、凍結肝臓試料をアルカリ−酸加水分解方法によって次の通り処理した。肝臓試料を、１００％アセトンを用いて脱脂し、風乾し、２Ｎ  ＮａＯＨ中６５℃で溶解し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。溶解した試料（４００μＬ）を４００μＬの６Ｎ  ＨＣｌを用いて１２１℃で２０分間、酸加水分解し、１０ｍｇ／ｍＬ活性炭を含有する４００μＬの４Ｎ  ＮａＯＨを用いて中和した。ＡＣ緩衝液（２．２Ｍ酢酸／０．４８Ｍクエン酸、４００μＬ）を試料に加え、続いて、上清を回収するため遠心分離した。ヒドロキシプロリンの標準曲線を、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の１６μｇ／ｍＬから開始する系列希釈物を用いて作成した。調製した試料および標準物（各４００μＬ）を４００μＬクロラミンＴ溶液（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）と混合し、２５分間、室温でインキュベートした。
【００３２】
次に試料をエールリッヒ溶液（４００μＬ）と混合し、６５℃で２０分間加熱して発色させた。試料を氷上で冷却し、沈殿を除くために遠心分離し、各上清の光学密度を５６０ｎｍで測定した。ヒドロキシプロリンの濃度をヒドロキシプロリン標準曲線から算出した。肝臓試料のタンパク質濃度をＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して決定し、算出したヒドロキシプロリン値を標準化するために使用した。肝臓ヒドロキシプロリンレベルは、タンパク質１ｍｇあたりのμｇとして表した。
ＴＮＦ−αのレベルを、製造者（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって記載された通りサイトカインＥＬＩＳＡによって概算した。
【００３３】
抗酸化グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼおよび脂質過酸化を：
Ellman, GL 1959, 'Tissue sulfhydryl groups', Archives Biochemistry Biophysics, vol. 82, pp.70-77 
Paglia, DE & Valentine, WN 1967, 'Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase', Journal of Laboratory and Clinical Medicine, vol.70, pp.158-169.
Buege, JA & Aust, SD 1978, 'Microsomal lipid peroxidation', Methods Enzymol, vol. 52, pp.302-310
によって記載された標準的手順を使用して概算した。
【００３４】
組織学的分析
ＨＥ染色のために、ブアン固定液で予め固定した肝臓組織のパラフィンブロックから切片を切り出し、リリーマイヤーヘマトキシリン（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、日本）およびエオシン溶液（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて染色した。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）をクライナーの基準に従って算出した（Kleiner DE. et al., Hepatology, 2005;41:1313）。
コラーゲン沈着を可視化するために、ブアン固定した肝臓切片を、ピクロシリウスレッド溶液（Ｗａｌｄｅｃｋ、ドイツ）を用いて染色した。線維症面積の定量的分析のために、シリウスレッド染色切片の明視野像をデジタルカメラ（ＤＦＣ２９５；Ｌｅｉｃａ、ドイツ）を２００倍拡大で使用して中心静脈周辺で捕捉し、５視野／切片での陽性面積をＩｍａｇｅＪ  ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、米国）ＳＲ＿ＳＬＭＮ０３９−１７０４−０８／１６を使用して測定した。
統計検定
統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国）でボンフェローニ多重比較検定を使用して実施した。Ｐ値＜０．０５を統計的有意とみなした。片側ｔ検定でＰ値＜０．１の場合に、トレンド（trend）または傾向（tendency）を推定した。結果を平均±ＳＤとして表した。
【００３５】
結果
非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）は、顕著なアルコール摂取歴または他の既知の肝疾患無しでの肝臓の脂肪症によって特徴付けられる。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、ＮＡＦＬＤの進行した形態である。ＮＡＳＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの病理学委員会は、ＮＡＦＬＤの病変のすべてのスペクトラムを扱い、臨床試験使用のためのＮＡＦＬＤ活性スコアを提案する組織学的特性スコア化システムを設計および検証した。ＮＡＦＬＤスコアは、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した組織学的切片に基づいて算出される（図１）。ガルシノール＋クルクミノイドを用いた処置は、低ＮＡＦＬＤスコアを有する脂肪性肝疾患において有意な減少を示した（図２）。さらに、ガルシノール＋クルクミンを用いた処置は、脂肪症（図３）および肝細胞バルーニング（図４）において有意な減少も示した。
【００３６】
結果は、２０％ガルシノールおよび９５％クルクミノイドの混合物を用いた処置が、未処置対照ならびに個々のガルシノール２０％およびクルクミノイド２０％と比較してＮＡＦＬＤ活性スコアにおいて有意な減少を示し、したがって、脂肪性肝疾患における相乗的減少を示し、個々に投与された場合に未処置対照と比較して低いが併用よりは高いＮＡＦＬＤスコアを示す２０％ガルシノールおよびクルクミノイドを含む併用の相乗作用をもたらすことを示している。脂肪症では、肝細胞バルーニングは、細胞傷害を示す特性であり、拡張し腫大した肝細胞によって特徴付けられる。ＮＡＳＨの管理の観点から、２０％ガルシノールおよびクルクミノイドの混合物を用いた処置は、脂肪症および肝細胞バルーニングにおいて有意な相乗的減少を示した。
【００３７】
肝臓における線維症は、多数の代謝および生化学的異常に関連する、コラーゲンの形成と沈着の速度の間の不均衡に依存する。肝線維症は、過多な線維性結合組織の形成の反応性、良性または病理学的状態であり、病理学的状態の際に肝臓の完全性を保護する修復活性である。肝臓組織におけるそれらのレベルが肝線維化の速度および進行を決める。その非侵襲性線維化（non invasic fibrotic）検出活性は、重度の線維症を有する慢性肝疾患におけるバイオマーカーとして働く。線維症の面積は、肝臓切片の形態計測定量のシリウスレッド染色によって測定した。２０％ガルシノールおよび９５％クルクミノイドが、低いコラーゲン沈着を示して線維症の面積を相乗的に低減したことが観察された（図５）。
【００３８】
ヒドロキシプロリンは、線維性コラーゲンの主な構成成分であり、総アミノ酸含有量の約１４％含まれる。線維症の発症は、ヒドロキシプロリンのプロコラーゲンへの組み込みに主に依存する。さらに、ヒドロキシプロリンは、結合組織におけるコラーゲン細線維の合成を制限する唯一のアミノ酸である。コラーゲン分解の際に、肝臓、尿および血清に放出されるヒドロキシプロリン含有量は、線維症と相関し、線維化スコアについての診断マーカーとして使用され得る（Need AG. Bone resorption markers in vitamin D insufficiency; Clin Chim Acta. 2006;368:48-52）。ガルシノール−クルクミノイド組成物の処置は、ヒドロキシプロリンレベル（図６）を相乗的に低減し、それにより、図７に表されるようにピクロシリウスレッドによって染色した場合にコラーゲン沈着を低減した。すべての処置群において対照と比較して、体重および肝臓重量に変化は観察されなかった（表２）。
【００３９】
【表２】
2021518845.tif 000004
【００４０】
生化学パラメーターに関して、対照と比較して処置群における血漿グルコース、総コレステロールおよびトリグリセリドのレベルに変化はなかった（表３）。しかし、ＮＡＦＬＤによって上昇した血漿ＡＬＴレベルは、ガルシノールおよびクルクミノイドを含有する組成物によって有意に低減され（表３）、組成物の肝保護効果を示している。
【００４１】
【表３】
2021518845.tif 000005
アディポネクチンは、糖新生を減少させ、解糖および脂肪酸酸化を増加させることによってグルコースおよび脂質の両方の代謝を制御する。アディポネクチンのレベルは、ＮＡＦＬＤマウスモデルにおいて有意に低減していた。ガルシノールおよびクルクミノイドを含む組成物は、アディポネクチンのレベルを効果的に増加させ（図８）肝保護を付与する。
【００４２】
炎症マーカー、ＴＮＦ−αの血漿レベルは、ＮＡＦＬＤにおいて上昇していた。クルクミノイドおよびガルシノール＋クルクミノイド組成物は、ＴＮＦ−αのレベルを有意に低減する（図９）。組成物は、抗酸化グルタチオン（図１０）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（図１１）のレベルも増加させ、脂質過酸化（図１２）を有意に低減し、抗酸化剤および抗炎症剤としての役割も示している。
【００４３】
（実施例２）
遺伝子発現研究
炎症マーカーＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１の発現を評価した。
β−アクチン
Ｆ−ＧＡＡＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＣＡＡ
Ｒ−ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＡ
ＮＦκＢ
Ｆ−ＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣ
Ｒ−ＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＧ
ＴＮＦ−α
Ｆ−ＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＴ
Ｒ−ＧＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣ
ＭＣＰ−１
Ｆ−ＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡ−
Ｒ−−ＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＴＴＧＧＧＡＴＣＡ
ＴＧＦ−β
Ｆ−−ＴＴＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡ
Ｒ−−ＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＴＡＧＴＡ
コラーゲン１
Ｆ−−ＴＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＧＧＧＴＡＣＴ
Ｒ−−ＴＴＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＧＣＣ
【００４４】
炎症マーカー、主にＴＮＦ−α、ＮＦκＢおよびＭＣＰ１の発現（図１３）は、本発明の組成物を用いて処置した動物の肝臓において低減される。２０％ガルシノールと合わせた９５％クルクミノイドは、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢおよびＭＣＰ１のより高い阻害を示した。線維症についての重要なマーカーであるＴＧＦ−βおよびコラーゲン１の発現も、組成物によって有意に低減された（図１４）。
全体として、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含有する組成物は、ＮＡＦＬＤでの有意な低減、肝臓ヒドロキシプロリンでの有意な減少、脂肪症の有意な減少、線維症およびＮＡＳＨにおける減少動向、肝細胞バルーニングの低減、肝臓におけるコラーゲンの病理学的沈着の低減に影響して相乗的に作用し、それにより肝臓保護を付与する。
本発明は、クルクミノイドおよびガルシノールを含む肝臓保護のための組成物の相乗効果を開示する。当業者は、このことが、前述の組成物が肝臓保護のための公知のまたは評価された他の成分と混合または製剤化された場合に自明であることを理解する。
本発明への他の改変および変形は、前述の開示および教示から当業者に明らかである。したがって、本発明のある特定の実施形態のみが本明細書に具体的に記載されているが、多数の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくそれらに行われ得ることは明らかである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と合わせてのみ解釈される。
【図１】
2021518845.tif 000006
【図２】
2021518845.tif 000007
【図３】
2021518845.tif 000008
【図４】
2021518845.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
2021518845.tif 000012
【図８】
2021518845.tif 000013
【図９】
2021518845.tif 000014
【図１０】
2021518845.tif 000015
【図１１】
2021518845.tif 000016
【図１２】
2021518845.tif 000017
【図１３】
2021518845.tif 000018
【図１４】
2021518845.tif 000019
【配列表】
2021518845000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月20日(2020.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物におけるＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法であって、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物の有効量をそのような治療を必要とする非ヒト哺乳動物に投与してＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状の低減をもたらすステップを含む、方法。
【請求項２】
ＮＡＦＬＤ関連状態が、ＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を含む、請求項１に記載のＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法。
【請求項３】
ＮＡＦＬの症状が、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＡＳＨ症状が、炎症性浸潤および肝細胞バルーニングを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
線維症の症状が、肝臓におけるヒドロキシプロリンレベルの上昇およびコラーゲンの病理学的沈着を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状が、炎症マーカーの発現の増加、肝臓酵素レベルの上昇、脂質過酸化の増加、抗酸化物質レベルの減少、コラーゲン発現の増加およびアディポネクチンレベルの低減を含む、請求項１に記載のＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法。
【請求項７】
炎症マーカーが、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肝臓酵素が好ましくはＡＬＴである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
抗酸化物質がグルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールが、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
９５％クルクミノイドが、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、薬学的／栄養学的に許容される賦形剤およびアジュバントを用いて製剤化され、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、粉剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー剤または食品の形態で経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、肝臓保護について公知のまたは評価された他の成分と共に製剤化または混合され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物におけるＮＡＦＬＤならびに関連状態および症状の治療管理のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物。
【請求項１５】
ＮＡＦＬＤの関連状態が、ＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＮＡＦＬの症状が、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＮＡＳＨ症状が、炎症性浸潤および肝細胞バルーニングを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
線維症の症状が、肝臓におけるヒドロキシプロリンレベルの上昇およびコラーゲンの病理学的沈着を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
ＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状が、炎症マーカーの発現の増加、肝臓酵素レベルの上昇、脂質過酸化の増加、抗酸化物質レベルの減少、コラーゲン発現の増加およびアディポネクチンレベルの低減を含む、請求項１５に記載のＮＡＦＬＤならびに関連状態および症状の治療管理のための組成物。
【請求項２０】
炎症マーカーが、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１を含む群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
肝臓酵素が好ましくはＡＬＴである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
抗酸化物質が、グルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含む群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールが、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２４】
９５％クルクミノイドが、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２５】
哺乳動物がヒトである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２６】
薬学的／栄養学的に許容される賦形剤およびアジュバントを用いて製剤化され、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、粉剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー剤または食品の形態で経口投与される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２７】
肝臓保護について公知のまたは評価された他の成分と共に製剤化または混合され得る、請求項１４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
炎症マーカー、主にＴＮＦ−α、ＮＦκＢおよびＭＣＰ１の発現（図１３）は、本発明の組成物を用いて処置した動物の肝臓において低減される。２０％ガルシノールと合わせた９５％クルクミノイドは、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢおよびＭＣＰ１のより高い阻害を示した。線維症についての重要なマーカーであるＴＧＦ−βおよびコラーゲン１の発現も、組成物によって有意に低減された（図１４）。
全体として、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含有する組成物は、ＮＡＦＬＤでの有意な低減、肝臓ヒドロキシプロリンでの有意な減少、脂肪症の有意な減少、線維症およびＮＡＳＨにおける減少動向、肝細胞バルーニングの低減、肝臓におけるコラーゲンの病理学的沈着の低減に影響して相乗的に作用し、それにより肝臓保護を付与する。
本発明は、クルクミノイドおよびガルシノールを含む肝臓保護のための組成物の相乗効果を開示する。当業者は、このことが、前述の組成物が肝臓保護のための公知のまたは評価された他の成分と混合または製剤化された場合に自明であることを理解する。
本発明への他の改変および変形は、前述の開示および教示から当業者に明らかである。したがって、本発明のある特定の実施形態のみが本明細書に具体的に記載されているが、多数の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくそれらに行われ得ることは明らかである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と合わせてのみ解釈される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕哺乳動物におけるＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法であって、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物の有効量をそのような治療を必要とする哺乳動物に投与してＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状の低減をもたらすステップを含む、方法。
〔２〕ＮＡＦＬＤ関連状態が、ＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を含む、前記〔１〕に記載のＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法。
〔３〕ＮＡＦＬの症状が、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕ＮＡＳＨ症状が、炎症性浸潤および肝細胞バルーニングを含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔５〕線維症の症状が、肝臓におけるヒドロキシプロリンレベルの上昇およびコラーゲンの病理学的沈着を含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔６〕ＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状が、炎症マーカーの発現の増加、肝臓酵素レベルの上昇、脂質過酸化の増加、抗酸化物質レベルの減少、コラーゲン発現の増加およびアディポネクチンレベルの低減を含む、前記〔１〕に記載のＮＡＦＬＤおよび関連状態の治療管理のための方法。
〔７〕炎症マーカーが、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１を含む群から選択される、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕肝臓酵素が好ましくはＡＬＴである、前記〔６〕に記載の方法。
〔９〕抗酸化物質がグルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含む群から選択される、前記〔６〕に記載の方法。
〔１０〕組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールが、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される、前記〔１〕に記載の方法。
〔１１〕９５％クルクミノイドが、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する、前記〔１〕に記載の方法。
〔１２〕哺乳動物がヒトである、前記〔１〕に記載の方法。
〔１３〕組成物が、薬学的／栄養学的に許容される賦形剤およびアジュバントを用いて製剤化され、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、粉剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー剤または食品の形態で経口投与される、前記〔１〕に記載の方法。
〔１４〕組成物が、肝臓保護について公知のまたは評価された他の成分と共に製剤化または混合され得る、前記〔１〕に記載の方法。
〔１５〕哺乳動物におけるＮＡＦＬＤならびに関連状態および症状の治療管理のための、９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールを含む組成物。
〔１６〕ＮＡＦＬＤの関連状態が、ＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を含む、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔１７〕ＮＡＦＬの症状が、肝細胞における脂肪の異常な蓄積を含む、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔１８〕ＮＡＳＨ症状が、炎症性浸潤および肝細胞バルーニングを含む、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔１９〕線維症の症状が、肝臓におけるヒドロキシプロリンレベルの上昇およびコラーゲンの病理学的沈着を含む、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔２０〕ＮＡＦＬＤおよび関連状態の症状が、炎症マーカーの発現の増加、肝臓酵素レベルの上昇、脂質過酸化の増加、抗酸化物質レベルの減少、コラーゲン発現の増加およびアディポネクチンレベルの低減を含む、前記〔１５〕に記載のＮＡＦＬＤならびに関連状態および症状の治療管理のための組成物。
〔２１〕炎症マーカーが、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ＴＧＦ−βおよびＭＣＰ−１を含む群から選択される、前記〔２０〕に記載の組成物。
〔２２〕肝臓酵素が好ましくはＡＬＴである、前記〔２０〕に記載の組成物。
〔２３〕抗酸化物質が、グルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含む群から選択される、前記〔２０〕に記載の組成物。
〔２４〕組成物中の９５％クルクミノイドおよび２０％ガルシノールが、それぞれおおよそ１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔２５〕９５％クルクミノイドが、おおよそ７５〜８１％クルクミン、１５〜１９％デメトキシクルクミンおよび２．２〜６．５％ビスデメトキシクルクミンの割合で存在する、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔２６〕哺乳動物がヒトである、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔２７〕薬学的／栄養学的に許容される賦形剤およびアジュバントを用いて製剤化され、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、グミ剤、粉剤、懸濁剤、乳剤、チュアブル剤、キャンディー剤または食品の形態で経口投与される、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔２８〕肝臓保護について公知のまたは評価された他の成分と共に製剤化または混合され得る、前記〔１５〕に記載の組成物。
【国際調査報告】
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