(57)【要約】  本発明は、関節リウマチの予防または治療のための医薬組成物に関し、さらに詳しくは、関節リウマチの予防または治療のための有効成分としてミトコンドリアを含む医薬組成物に関する。本発明の外因性ミトコンドリア医薬組成物は、関節リウマチに罹患している対象に投与されると、対象は浮腫および紅斑症状を緩和することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、炎症性サイトカインIL-6の発現レベルを低下させるが、対象における抗炎症性サイトカインIL-10の発現レベルを増加させる。したがって、本発明の医薬組成物は、関節リウマチの予防または治療に有効に使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてミトコンドリアを含む、関節リウマチを予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２】
ミトコンドリアが、細胞または組織から単離される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
細胞が、体細胞、生殖細胞、幹細胞およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
体細胞が、筋細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板、粘膜細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
生殖細胞が、精子、卵子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
幹細胞が、間葉系幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、輪部幹細胞、組織由来幹細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
間葉系幹細胞が、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、胎盤、睾丸、骨膜、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ミトコンドリアが、0.1〜500μg/mlの濃度で医薬組成物に含まれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか1つに記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、関節リウマチを予防または治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの予防または治療のための医薬組成物に関し、さらに詳しくは、関節リウマチの予防または治療のための有効成分としてミトコンドリアを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチは、関節の滑膜を増殖させ、骨または軟骨を破壊する慢性炎症性疾患である。初期段階では、関節を覆う滑膜において炎症が起こり、炎症が周囲の軟骨および骨に徐々に広がり、関節の破壊および変形を引き起こす。さらに、関節リウマチは、さまざまな臓器ならびに関節に炎症反応を引き起こす可能性があり、皮下結節、肺線維症、血管炎、皮膚潰瘍、発疹、体重減少などの症状を示す可能性がある。関節リウマチの正確な原因はまだ判明しておらず、自己免疫反応が主要なメカニズムとして知られている。
【０００３】
関節リウマチの治療には、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド、抗リウマチ薬、および腫瘍壊死因子阻害剤が使用されている。非ステロイド性抗炎症薬およびステロイドは、炎症を和らげて、病気の症状を緩和するが、疾患の進行は抑えない。抗リウマチ薬は、非ステロイド性抗炎症薬およびステロイドと比較して効果を発揮するために所定の時間を必要とし、直接的な鎮痛効果はほとんどない；しかしながら、抗リウマチ薬は、根本的に疾患を改善するために使用されてきた。現在、関節リウマチの治療では、抗リウマチ薬の効果が得られるまで、抗リウマチ薬は、非ステロイド性抗炎症薬またはステロイドと併用されている。
【０００４】
しかしながら、抗リウマチ薬の効果が得られる前に、非ステロイド性抗炎症薬の使用により、胃腸障害などの副作用が発生する可能性があり、ステロイドの使用により、免疫力低下、耐性上昇、および合併症などの副作用が発生する可能性がある。さらに、抗リウマチ薬は、関節炎の治療に焦点を当てているが、さまざまな副作用を引き起こす可能性がある。したがって、定期的な血液検査などの経過観察が必要である。
【０００５】
さらに、腫瘍壊死因子阻害剤が、抗リウマチ薬に反応しない関節リウマチ患者に処方されている。腫瘍壊死因子阻害剤は、関節リウマチを引き起こすメディエーターである腫瘍壊死因子を遮断することにより、炎症反応を抑制する治療薬である。腫瘍壊死因子阻害剤は、従来の抗リウマチ薬に反応しない関節リウマチの症状において70％以上が軽減され、その効果が従来の治療薬よりも速く得られるという点において有利である。しかしながら、腫瘍壊死因子阻害剤は、半減期が短く、疾患の根本的な原因を治療する治療薬ではないという欠点がある。さらに、潜伏性結核の活性化などの腫瘍壊死因子阻害剤の副作用が報告されている。
【０００６】
一方、ミトコンドリアは、真核細胞の細胞小器官であり、細胞内エネルギー源であるアデノシン三リン酸(ATP)の合成および調節に関与している。ミトコンドリアは、細胞シグナル処理、細胞分化、細胞死、ならびに細胞周期および細胞増殖の制御などの生体内のさまざまな代謝経路に関連する。関節リウマチに関しては、研究は、関節の滑膜の増殖がミトコンドリア機能不全を引き起こし、ミトコンドリア機能不全が活性酸素種の産生を増加させて炎症反応を活発に誘発することを報告している(Fearon et al.、Nat Rev Rheomatoid.、2016、(12): 385-397)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
関節リウマチの治療を目的とした研究が行われているが、治療範囲の制限または副作用の発生などの問題があり、革新的な治療法はまだ開発されていない。安全で有効な関節リウマチ治療薬の継続的な研究開発が必要である。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、関節リウマチを治療するための医薬組成物およびそれを使用する関節リウマチを治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この問題を解決するために、本発明は、有効成分としてミトコンドリアを含む、関節リウマチを予防または治療するための医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、医薬組成物を個体に投与することを含む、関節リウマチを予防または治療するための方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による外因性ミトコンドリアを含有する医薬組成物を関節リウマチに罹患している個体に投与すると、個体の腫れおよび発赤の症状を軽減することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、個体における炎症性サイトカインIL-6の発現レベルを低下させ、抗炎症性サイトカインIL-10の発現レベルを上昇させる。したがって、本発明による医薬組成物は、関節リウマチの予防または治療に有用でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】正常群、対照群、または外因性ミトコンドリアを投与された実験群のマウスの足の肉眼での腫れおよび発赤の症状を比較するために撮った写真である。
【図２】正常群、対照群、または外因性ミトコンドリアを投与された実験群のマウスの疾患症状の程度を採点することによって示すグラフである。
【図３】正常群、対照群、または外因性ミトコンドリアを投与された実験群のマウスの背軸における足の厚みの測定値を示すグラフである。
【図４】正常群、対照群、または外因性ミトコンドリアを投与された実験群のマウスのIL-6発現レベルを比較したグラフである。
【図５】正常群、対照群、または外因性ミトコンドリアを投与された実験群のマウスのIL-10発現レベルを比較したグラフである。
【図６】外因性ミトコンドリアを投与された関節リウマチ誘発マウスの体内における外因性ミトコンドリアの分布状態を撮影することによって得られた写真である。
【図７】外因性ミトコンドリアの投与による関節リウマチの重症度を評価するための組織学的状態を撮影することによって得られた写真である。
【図８】LPSの存在下でも外因性ミトコンドリアの投与によってマクロファージが増殖したことを示すグラフである。
【図９】LPSの存在下でも外因性ミトコンドリアの投与によってTNF-αの分泌レベルが低下したことを示すグラフである。
【図１０】図は、LPSの存在下でも外因性ミトコンドリアの投与によってIL-6の分泌レベルが低下したことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の1つの態様は、有効成分としてミトコンドリアを含む、関節リウマチを予防または治療するための医薬組成物を提供する。
【００１５】
本明細書で特に明記しない限り、「有効成分」という用語は、単独で、またはそれ自体では活性を有さないアジュバント(担体)と組み合わせて活性を示す成分を示す。
【００１６】
ミトコンドリアは、哺乳類または人間から得られる場合がある。具体的には、ミトコンドリアは、細胞または組織から単離される場合がある。たとえば、ミトコンドリアは、体細胞、生殖細胞、または幹細胞から得られる場合がある。ミトコンドリアは、ミトコンドリアの生物学的活性が正常である細胞から得られる場合がある。さらに、ミトコンドリアは、インビトロで培養することができる。
【００１７】
また、ミトコンドリアは、自家、同種、または異種で得られる場合がある。具体的には、「自家ミトコンドリア」という用語は、同じ個体の組織または細胞から得られたミトコンドリアを示す。また、「同種ミトコンドリア」とは、ミトコンドリアが適用される個体と同じ種に属するが、対立遺伝子の遺伝子型が異なる個体から得られたミトコンドリアを示す。また、「異種ミトコンドリア」とは、ミトコンドリアが適用される個体とは異なる種に属する個体から得られたミトコンドリアを示す。
【００１８】
具体的には、体細胞は、筋細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板、または粘膜細胞でありうる。
【００１９】
また、生殖細胞は、減数分裂や有糸分裂をしている細胞であり、精子や卵子である場合がある。幹細胞は、間葉系幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、輪部幹細胞、および組織由来幹細胞からなる群から選択されたもののいずれかでありうる。間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、胎盤からなる群から選択されたもののいずれかでありうる。
【００２０】
一方、特定の細胞からミトコンドリアを単離する場合、ミトコンドリアは、特定の緩衝液を使用するか、または電位差と磁場を使用するなど、さまざまな既知の方法によって単離することができる。
【００２１】
ミトコンドリアの分離は、ミトコンドリアの活性を維持することを考慮して、細胞を破砕し、遠心分離することによって達成されうる。1つの実施態様では、ミトコンドリアの単離は、細胞を培養し、培養細胞を含む医薬組成物で最初の遠心分離を行ってペレットを生成すること；ペレットを緩衝液に再懸濁し、ペレットを均質化すること；均質化された溶液で2回目の遠心分離を行い、上清を生成すること；および上清を3回目の遠心分離を行い、ミトコンドリアを精製すること；によって行うことができる。この場合、細胞活性の維持を考慮して、2回目の遠心分離にかかる時間を1回目と3回目の遠心分離にかかる時間よりも短くすることが好ましく、かつ、1回目の遠心分離から3番目の遠心分離まで速度を上げてもよい。
【００２２】
具体的には、1回目から3回目までの遠心分離は、0〜10℃、好ましくは3〜5℃の温度で行うことができる。また、遠心分離は、1〜50分間行ってもよく、遠心分離回数、サンプルの含有量などに応じて、遠心分離時間を適宜調整することができる。
【００２３】
また、1回目の遠心分離は、100〜1,000×g、200〜700×g、300〜450×gの速度で行ってもよい。また、2回目の遠心分離は、1〜2000×g、25〜1800×g、500〜1600×gの速度で行ってもよい。また、3回目の遠心分離は、100〜20,000×g、500〜18,000×g、800〜15,000×gの速度で行ってもよい。
【００２４】
さらに、ミトコンドリアは、0.1〜500μg/ml、0.2〜450μg/ml、または0.5〜400μg/mlの濃度で医薬組成物に含まれていてもよい。ミトコンドリアを上記範囲内とすることにより、投与中のミトコンドリア量を容易にコントロールすることができ、患者の関節リウマチの症状をさらに改善することができる場合がある。
【００２５】
特に、本発明による医薬組成物は、ミトコンドリアとともに、投与される個体の体重に基づいて、1回あたり0.01〜5mg/kg、0.1〜4mg/kg、または0.25〜2.5mg/kgの量で投与することができる。すなわち、関節リウマチが誘発される個体の体重に基づいて、ミトコンドリアの量が上記範囲内となるように医薬組成物を投与することが、細胞活性の観点から最も好ましい。さらに、医薬組成物は、1〜10回、3〜8回、または5〜6回、好ましくは5回投与することができる。この場合、投与間隔は1〜7日、または2〜5日、好ましくは3日である。
【００２６】
さらに、本発明による医薬組成物は、関節リウマチに罹りやすいか、または関節リウマチに関連する疾患または障害に罹患しているヒトまたは他の哺乳動物に投与することができる。また、医薬組成物は、静脈内投与可能な注射剤であってもよく、好ましくは注射剤である。
【００２７】
したがって、本発明による医薬組成物は、注射用製剤の流通中の製品の安定性を確保するために、注射剤において使用することができる酸性水溶液またはリン酸塩などの緩衝液によって組成物のpHを調整することによって、物理的または化学的に非常に安定な注射用製剤として調製することができる。
【００２８】
具体的には、本発明の医薬組成物は、注射用水を含んでもよい。注射用水は、固形注射用製剤を溶解するか、または水溶性注射用製剤を希釈するために調製された蒸留水であり、ブドウ糖注射液、キシリトール注射液、D-マンニトール注射液、フルクトース注射液、生理食塩水、デキストラン40注射液、デキストラン70注射液、アミノ酸注射液、リンガー液、乳酸リンガー液、pH3.5〜7.5のリン酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウム・クエン酸緩衝液などであっもよい。
【００２９】
さらに、本発明の医薬組成物は、安定剤または溶解補助剤を含んでもよい。たとえば、安定剤は、ピロ亜硫酸ナトリウムまたはエチレンジアミン四酢酸であってもよく、溶解補助剤は、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムであってもよい。
【００３０】
さらに、本発明は、上記の医薬組成物を個体に投与することを含む、関節リウマチを予防または治療する方法を提供することができる。ここで、個体は哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。
【００３１】
この場合、静脈内投与により投与されてもよい。したがって、本発明による医薬組成物は、関節リウマチに罹患している個体の静脈に正常な活性を有する外因性ミトコンドリアを供給することができ、それにより、ミトコンドリア機能が低下した細胞の活性を増加させ、ミトコンドリア機能不全を有する細胞を再生するのに有用であり、関節リウマチを予防または治療するのに有用である。
【００３２】
発明の形態
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施態様を提示する。しかしながら、以下の実施例は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例1：ミトコンドリアを含む組成物の調製
CHA Bundang Medical Centerから提供された臍帯由来間葉系幹細胞を、10% (v/v)ウシ胎児血清(FBS、Gibco)、100μg/mlのストレプトマイシン、および100 U/mlのアンピシリンを含むアルファ-最小必須培地(Alpha-MEM)に播種し、72時間培養した。培養が完了した後、細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、Gibco)で2回洗浄した。洗浄した細胞を0.25％(v/v)のトリプシン-EDTA(TE、Gibco)で処理して、細胞を得た。
【００３４】
ミトコンドリアを抽出するために、得られた細胞を、血球計算盤を使用して1×107細胞/mlの濃度で収集した。細胞株を、約4℃の温度にて10分間、350×gの速度で最初の遠心分離に付した。得られたペレットを回収し、緩衝液に再懸濁し、10〜15分間ホモジナイズした。次に、ペレットを含む組成物を、約4℃の温度にて3分間、1,100×gの速度で2回目の遠心分離に付し、それによって上清を得た。上清を、約4℃の温度にて12,000×gの速度で15分間、3回目の遠心分離に付し、細胞株からミトコンドリアを単離した。このようにして得られた5μgまたは50μgのミトコンドリアを、それぞれ100μlの注射用水と混合し、次に、インスリン注射器に充填した。
【００３５】
製造例1：間葉系幹細胞を含む組成物の調製
CHA Bundang Medical Centerから提供された臍帯由来間葉系幹細胞を、10% (v/v)ウシ胎児血清(FBS、Gibco)、100μg/mlのストレプトマイシン、および100 U/mlのアンピシリンを含むアルファ-MEMに播種し、72時間培養した。培養が完了した後、細胞をDPBSで2回洗浄した。洗浄した細胞を0.25％(v/v)のトリプシン-EDTA(TE、Gibco)で処理して、細胞を得た。得られた細胞を再度DPBSで2回洗浄し、1×106細胞の量で100μlの注射用水と混合し、次に、インスリン注射器に充填した。
【００３６】
製造例2：腫瘍壊死因子阻害剤を含む組成物の調製
CHA Bundang Medical Centerから提供された腫瘍壊死因子阻害剤、エンブレル(エタネルセプト)を希釈して、20gのマウスの体重に基づいて8.3μgの用量で投与し、100μlの注射用水と混合し、次に、インスリン注射器に充填した。この用量は、ヒトに投与される量で計算して、ヒトの体重60 kgに基づいて25mgの用量に相当する。
【００３７】
実験例1：関節リウマチ誘発マウスの準備および組成物の投与
6〜8週齢のDBA-1/jマウスを、Orient Bio Co., Ltd. (ソウル、韓国)から購入した。購入したマウスをCHA大学実験動物センターのクリーンゾーンで馴化させ、次に、実験を行った。順応期間中、マウスが住む環境を、12時間の明/暗サイクル、室温23±2℃、湿度40〜60%に維持した。そのような順応期間の7日後、マウスを実験に付した。
【００３８】
順応期間を受けたマウスに関節リウマチを誘発するために、4mg/mlのニワトリ由来2型コラーゲンを、0.05〜0.1 Mの酢酸に4℃の温度にて溶解し、同量の完全 フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)をそれぞれ混合して、一次免疫誘導懸濁液(CFA)および二次免疫誘導懸濁液(IFA)を調製した。調製した一次免疫誘導懸濁液(CFA)0.1mlをマウスの尾の付け根に皮下投与し、3週間後、二次免疫誘導懸濁液(IFA)0.1mlをマウスの尾の付け根にさらに皮下投与して、関節リウマチの動物モデルを作成した。
【００３９】
次に、製造例2で調製したエンブレル含有組成物100μlを、関節リウマチ誘発マウスに皮下注射(SC))によって3日間隔で合計5回投与することにより、実験群1を準備した。さらに、製造例1で調製した臍帯由来間葉系幹細胞を含む組成物と、実施例1で調製したミトコンドリアを含む組成物を、静脈内注射(IV)によって3日間隔で100μlの量で合計5回投与することにより、実験群2〜4を準備した。さらに、投与を受けなかった正常マウスを正常群として準備した。さらに、注射用水100μlを静脈注射(IV)によって3日間隔で合計5回投与する以外は実験群2と同様にして、対照群を準備した(表1)。
【００４０】
[表1]
【表１】
2021512874.tif 000003
【００４１】
一方、エンブレルは、成体に対して、1回当たり25mgの用量を1週間に2回、および一般的には、エンブレルを用いた動物実験の場合、投与量および投与スケジュールにしたがって、合計5回、25mgの用量を1週間に2回で投与される。
【００４２】
実験例2：外因性ミトコンドリアの投与による腫れおよび発赤の減少の確認
実験例1で準備した各実験群の30日後の視覚的に観察される症状を評価するために、正常群、対照群、および実験群1〜4のマウスの足を撮影し、図1に示した。
図1に示すように、正常群のマウスの足に腫れおよび発赤は観察されなかった。一方、対照群のマウスの足には大小の関節が激しく腫れ、全体的に発赤の症状が観察された。エンブレルまたは間葉系幹細胞を投与した実験群1と2のマウスの足では、大小の関節が前足で大きく腫れ、全体的に発赤の症状が観察された。実験群1および2のマウスの後足の腫れは比較的良好であり、部分的に発赤の症状が観察された。ミトコンドリアを投与した実験群3と4のマウスの足では、前足と後足の腫れは比較的良好であり、部分的に発赤の症状が観察された。したがって、ミトコンドリアを含む組成物は、腫瘍壊死因子阻害剤であるエンブレルよりも、腫れおよび発赤の抑制において優れた効果を有することが肉眼で確認された。
【００４３】
実験例3：外因性ミトコンドリアの投与による関節リウマチの症状を改善する効果の確認
実験例1の各実験群において、スコア参照表(表2)に基づいて30日後の関節リウマチ症状の程度をスコア化し、結果を図2に示す。
【００４４】
[表2]
【表２】
2021512874.tif 000004
【００４５】
図2に示すように、正常群のマウスの足には、腫れまたは発赤は見られず、疾患症状に応じたスコアは0点と判定された。一方、対照群のマウスの大小の関節には、非常に重度の腫れおよび発赤が生じ、疾患症状に応じたスコアは、15〜16点と判定された。さらに、エンブレルまたは間葉系幹細胞を投与した実験群1と実験群2のマウスの足には、大関節に重度の腫れおよび発赤が生じ、小関節に中程度の腫れおよび発赤が生じ、疾患症状に応じたスコアは、11〜12点と判定された。対照的に、ミトコンドリアを投与した実験群3と実験群4には、マウスの大関節または小関節に中程度の腫れおよび/または発赤が生じ、疾患症状に応じたスコアは、8〜10点と判定された。したがって、ミトコンドリアを含む組成物は、腫瘍壊死因子阻害剤であるエンブレルよりも良好な治療効果を有することが確認された。
【００４６】
実験例4：外因性ミトコンドリアの投与による腫れ軽減効果の確認
実験例1で準備した各実験群の30日後の足の腫れの程度を定量化するために、ノギスを用いて背軸の足の厚さをノギスによって分析し、図3に示す。ここで、背軸の前足と後足の足の厚さを測定し、平均化して、その結果をグラフに示す。
【００４７】
図3に示すように、対照群のマウスの背軸の足の厚さは、正常群のマウスの足の厚さよりも約28％大きいと測定された。さらに、エンブレルを投与された実験群1のマウスの背軸の足の厚さは、正常群のマウスの足の厚さよりも約23％大きいと測定された。間葉系幹細胞を投与した実験群2のマウスの背軸の足の厚さは、正常群のマウスの足の厚さよりも約6.8％大きいと測定された。対照的に、ミトコンドリアを投与した実験群3と4のマウスの背軸の足の厚さは、正常群のマウスの足の太さよりも約0.7〜6％大きいと測定されたしたがって、ミトコンドリアを含む組成物を投与した実験群では、腫れが抑制されることが確認された。
【００４８】
実験例5：外因性ミトコンドリアの投与によるサイトカイン発現レベルの変化の確認
正常群、対照群、実験例1で準備した実験群1〜4のマウスの血清中に存在する炎症性サイトカインを評価するため、0.4mlの血液をマウスの心臓から採取し、次に、室温にて20〜30分間凝固させた。凝固した血液を2,500〜3,000rpmで遠心分離して、上清の血清を分離した。分離した血清を分析して、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により、炎症性サイトカインIL-6と抗炎症性サイトカインIL-10の発現レベルを確認した。
【００４９】
図4に示すように、正常群のマウスのIL-6発現レベルは、約29pg/mlと測定された。一方、対照群のマウスのIL-6発現レベルは、約85 pg/mlであり、正常群の約2.9倍であった。さらに、エンブレルを投与された実験群1のマウスと間葉系幹細胞を投与された実験群2のマウスのIL-6発現レベルは、それぞれ約79 pg/mlと約81 pg/mlと測定され、それは対照群のものと類似していた。対照的に、ミトコンドリアを含む組成物を投与された実験群3および4のマウスのIL-6発現レベルは、それぞれ約42 pg/mlおよび約17 pg/mlと測定され、これは正常群または対照群よりも約2倍低かった。これは、ミトコンドリアを含む組成物が炎症性サイトカインIL-6の発現レベルを低下させることを実証した。
【００５０】
また、図5に示すように、正常群のマウスのIL-10発現レベルは、約19 pg/mlと測定された。一方、対照群のマウスのIL-6発現レベルは、約21pg/mlと測定された。また、エンブレルを投与した実験群1のマウスのIL-10発現レベルは、約20 pg/mlであり、対照群と同様であった。間葉系幹細胞を投与した実験群2のマウスのIL-10発現レベルは、約26 pg/mlと測定され、正常群および対照群よりも高かった。ミトコンドリアを含む組成物を投与された実験群3および4のマウスのIL-10発現レベルは、約23 pg/mlおよび約30 pg/mlと測定され、正常群および対照群よりも高かった。これは、ミトコンドリアを含む組成物が抗炎症性サイトカインIL-10の発現レベルを増加させることを実証した。
【００５１】
実験例6：ミトコンドリア投与後の関節リウマチ誘発マウスにおける生体内分布の確認
関節リウマチ誘発マウスに投与したミトコンドリアの生体内分布を確認するために、ミトコンドリアを近赤外蛍光試薬、CellVueTM NIR815蛍光色素(Thermo Fisher Scientific、USA)で標識し、次に、マウスの尾静脈から投与した。3時間後のミトコンドリア分布を観察するため、インパルス近赤外線装置を用いてミトコンドリアの生体内分布を撮影し、その結果を図6に示した。
【００５２】
図6に示すように、マウスの尾静脈から投与されたミトコンドリアは、肝臓、肺、および脾臓の静脈血管に沿って分布し、特にマウスの足に存在することが観察された。
【００５３】
実験例7：組織学的評価による外因性ミトコンドリアの投与による関節リウマチ重症度の改善の確認
実験例1で準備した各実験群における30日後の関節リウマチの重症度を分析するために、マウスの足を切除し、4％パラホルムアルデヒドで2日間固定した。固定された足組織を、脱灰溶液Lite(Sigma)で脱灰して、パラフィンブロックを調製した。調製した足組織のパラフィンブロックを10μmのスライスに切り、固定した。次に、スライスをヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡で撮影し、結果を図7に示す。
【００５４】
図7に示すように、正常群のマウスの足組織において、関節の形態は維持され、炎症反応によって引き起こされた滑膜線維芽細胞の関節内浸潤は観察されなかった。一方、対照群のマウスの足組織において、炎症反応により引き起こされた炎症性細胞および滑膜線維芽細胞の関節内浸潤が、発生し、それにより関節の形態が損傷された。また、エンブレルを投与した実験群1および間葉系幹細胞を投与した実験群2のマウスの足組織において、対照群と同様の炎症細胞と滑膜線維芽細胞の関節内浸潤が観察された 。
【００５５】
一方、ミトコンドリアを含む組成物を投与した実験群3および4のマウスの足組織においては、炎症細胞および滑膜線維芽細胞の関節内浸潤が減少し、関節の形態は正常群と同様であった。これは、ミトコンドリアを含む組成物が、炎症性細胞浸潤および炎症反応を介した滑膜線維芽細胞の異常増殖を阻害することを実証した。
【００５６】
実験例8：ミトコンドリアトランスファーによるマクロファージ増殖の確認
マウス由来のRaw 264.7(マクロファージ)細胞をLPS(2μgml；L4391、Sigma)で6時間処理して、炎症反応を誘発した。次に、ヒトUC-MSCから抽出した健康なミトコンドリアを、さまざまな濃度(0.1、0.5、0.75、1、5μg)でそれに移し、24ウェルプレートに播種して、37℃のCO2インキュベーター中でインキュベートした。24時間経過後、サンプルの上清を採取し、1,500rpmで5分間遠心分離し、上清のみを新しいチューブに移した。細胞増殖能を比較するために、EZ-cytoXキット(EZ-3000、Dogen)が使用された。試験キットに含まれる反応溶液を、10：1(反応溶液(体積)＝サンプルの1/10)の割合で、得られた各サンプルと混合し、CO2インキュベーター中で37℃にて2時間反応させ、その後、450 nmにて吸光度を測定した。結果として、図8に示すように、ミトコンドリア脱水素酵素活性は、サンプル中の生存細胞の数が増加するにつれて増加した。
【００５７】
実験例9：ミトコンドリアトランスファーによるマクロファージの炎症誘発性サイトカイン分泌の抑制効果の確認
実験例8と同様に、マウス由来のRaw 264.7(マクロファージ)細胞をLPS(2μg/ml)で6時間処理して、炎症反応を誘発した。次に、ヒトUC-MSCから抽出した健康なミトコンドリアを、さまざまな濃度(0.1、0.5、0.75、1、5μg)でそれに移し、24ウェルプレートに播種して、37℃のCO2インキュベーター中でインキュベートした。24時間経過後、サンプルの上清を採取し、1,500rpmで5分間遠心分離し、上清のみを新しいチューブに移した。マクロファージにおける炎症誘発性サイトカインであるTNF-αおよびIL-6の発現レベルを確認するために、それぞれマウスTNF-α ELISAキット(Sigma、＃RAB0477)およびマウスIL-6 ELISAキット(Sigma、＃RAB0308)を用いて発現レベルを分析した。
【００５８】
各条件用の上清サンプルは、ELISAキットに含まれる希釈液を用いてサンプルを1/10の比率で希釈することによって調製された。調製したサンプルおよび標準液それぞれを、抗体をコーティングした96ウェルプレートに入れ、4℃にて一晩インキュベートした。翌日、96ウェルアッセイプレートに残っている溶液を、アッセイキットに含まれている洗浄液を使用して除去した。続いて、調製したビオチン標識検出抗体を各ウェルに加え、室温にて1時間反応させた。反応完了後、96ウェルアッセイプレートに残っている溶液を洗浄液で取り除いた。次に、調製したストレプトアビジン溶液を各ウェルに加え、撹拌機を使用して室温にて45分間反応させた後、96ウェルアッセイプレートに残っている溶液を洗浄液で除去した。最後に、基質試薬液を加え、遮光条件下で攪拌機を用いて室温にて30分間反応させた。反応から30分後、各ウェルに停止液を加え、450 nmにて吸光度を測定した。
【００５９】
結果として、図9および10に示すように、細胞がLPSで処理されたにもかかわらず、TNF-αおよびIL-6の発現レベルは、ミトコンドリア処理によって効果的に減少することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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