(57)【要約】本発明の態様は、とりわけ、新規の合成ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｓＲＧＮ）を使用して、細胞におけるＤＮＡを標的化、編集または操作するための新規の系に関する。ｓＲＧＮは、野生型または親低分子ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する。本開示は、全般的には、分子生物学の分野に関し、これは、ＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼ、関連するガイドＲＮＡおよび／または標的配列を含む新規の系に関する組成物および方法、ならびに転写を調節するための方法ならびに細胞におけるＤＮＡを標的化、編集および／または操作するための方法を含む、様々な適用においてこれらを産生および使用するための方法を含む。
2021518139.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端に向かって：
１）配列番号３４〜３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３４〜３７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１と、
２）配列番号３８〜４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３８〜４１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン２と、
３）配列番号４２〜４５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４２〜４５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン３と、
４）配列番号４６〜４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４６〜４９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン４と、
５）配列番号５０〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５０〜５３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン５と、
６）配列番号５４〜５７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５４〜５７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン６と、
７）配列番号５８〜６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５８〜６１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン７と、
８）配列番号６２〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６２〜６５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン８と
を含み、
前記ミニドメインのうちの少なくとも２つが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  Ｃａｓ９（配列番号３０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９（配列番号３１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９（配列番号３３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９（配列番号３２）からなる群から選択される異なる親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する、
合成ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｓＲＧＮ）ポリペプチド。
【請求項２】
前記ミニドメインのうちの少なくとも３つが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  Ｃａｓ９（配列番号３０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９（配列番号３１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９（配列番号３３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９（配列番号３２）からなる群から選択される異なる親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する、請求項１に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項３】
ミニドメイン８が、配列番号６２のアミノ酸配列、または配列番号６２に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１または２に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項４】
ミニドメイン８が、配列番号６３のアミノ酸配列、または配列番号６３に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１または２に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項５】
ミニドメイン１が、配列番号３４のアミノ酸配列、または配列番号３４に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項６】
Ｎ末端からＣ末端に向かって：
１）配列番号６６〜６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６６〜６９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１と、
２）配列番号７０〜７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７０〜７３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン２と、
３）配列番号７４〜７７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７４〜７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン３と、
４）配列番号７８〜８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７８〜８１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン４と、
５）配列番号８２〜８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８２〜８５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン５と、
６）配列番号８６〜８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８６〜８９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン６と、
７）配列番号９０〜９３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９０〜９３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン７と、
８）配列番号９４〜９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９４〜９７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン８と、
９）配列番号９８〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９８〜１０１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン９と、
１０）配列番号１０２〜１０５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０２〜１０５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１０と、
１１）配列番号１０６〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０６〜１０９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１１と、
１２）配列番号１１０〜１１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１０〜１１３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１２と
を含み、
前記ミニドメインのうちの少なくとも２つが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  Ｃａｓ９（配列番号３０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９（配列番号３１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９（配列番号３３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９（配列番号３２）からなる群から選択される異なる親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する、
ｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項７】
前記ミニドメインのうちの少なくとも３つが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  Ｃａｓ９（配列番号３０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９（配列番号３１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９（配列番号３３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９（配列番号３２）からなる群から選択される異なる親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する、請求項６に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項８】
ミニドメイン１２が、配列番号１１０のアミノ酸配列、または配列番号１１０に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項６または７に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項９】
ミニドメイン１２が、配列番号１１１のアミノ酸配列、または配列番号１１１に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項６または７に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項１０】
（ｉ）ミニドメイン１が、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含み、（ｉｉ）ミニドメイン２が、配列番号７０のアミノ酸配列、または配列番号７０に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項１１】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１ポリペプチド、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−１ポリペプチド、
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−２ポリペプチド、
ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−３ポリペプチド、
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＰ２Ｈ１２ポリペプチド、
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＥ２ポリペプチド、
ｇ）配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＥ２＋Ｋ７４１Ｄ＋Ｌ７４３Ｋポリペプチド、
ｈ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＥ２＋Ｓ６７０Ｔ＋Ｎ６７５Ｄポリペプチド、
ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＥ２＋Ｋ７４１Ｎ＋Ｌ７４３Ｎポリペプチド、
ｊ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＦ８ポリペプチド；
ｋ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＦ８＋Ｋ７３７Ｄ＋Ｌ７３９Ｋポリペプチド、および
ｌ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１２に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＦ８＋Ｋ７３７Ｎ＋Ｌ７３９Ｎポリペプチド
からなる群から選択されるｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項１２】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１ポリペプチド、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−１ポリペプチド、および
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−３ポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１１に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項１３】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＧｉｂ１１ポリペプチド、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−１ポリペプチド、および
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−３ポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１２に記載のｓＲＧＮポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
配列番号１３〜２９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号１３〜２９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１４または１５に記載の核酸。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチド、または前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と
を含み、前記ｇＲＮＡが、前記ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、系。
【請求項１８】
異種ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型をさらに含み、前記異種ポリヌクレオチド配列が、前記標的ポリヌクレオチド配列に挿入され得る、請求項１７に記載の系。
【請求項１９】
前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、および／または前記異種ポリヌクレオチド配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１７または１８に記載の系。
【請求項２０】
前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の系。
【請求項２１】
前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の系。
【請求項２２】
前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードするＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項２１に記載の系。
【請求項２３】
前記ドナー鋳型が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の系。
【請求項２４】
前記ｓＲＧＮポリペプチド、または前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、リポソームまたは脂質ナノ粒子内に製剤化されている、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の系。
【請求項２５】
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子が、前記ｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸も含む、請求項２４に記載の系。
【請求項２６】
前記ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成しているｓＲＧＮポリペプチドを含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の系。
【請求項２７】
標的遺伝子座における標的ＤＮＡを標的化、編集、改変または操作する方法であって、
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチド、または前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と
を前記標的ＤＮＡに提供するステップを含み、
前記ｇＲＮＡが前記ｓＲＧＮポリペプチドを前記標的遺伝子座へとガイドすることができる、方法。
【請求項２８】
異種ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型を前記標的ＤＮＡに提供するステップをさらに含み、前記異種ポリヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子座に挿入され得る、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、および／または前記異種ポリヌクレオチド配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードするＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ドナー鋳型が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｓＲＧＮポリペプチド、または前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、リポソームまたは脂質ナノ粒子内に製剤化されている、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子が、前記ｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸も含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＲＮＰ複合体として前記ｇＲＮＡと予め複合体化されたｓＲＧＮポリペプチドを標的ＤＮＡに提供するステップを含む、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチド、または前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはｇＲＮＡをコードする核酸と
を含み、前記ｇＲＮＡが、前記ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、改変された細胞。
【請求項３８】
異種ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型をさらに含み、前記異種ポリヌクレオチド配列が、前記標的ポリヌクレオチド配列に挿入され得る、請求項３７に記載の改変された細胞。
【請求項３９】
細胞のゲノムが、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載の方法により編集されている、遺伝子改変された細胞。
【請求項４０】
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチド、または前記ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはｇＲＮＡをコードする核酸と
を含むキットであって、
前記ｇＲＮＡが、前記ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、キット。
【請求項４１】
異種ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型をさらに含み、前記異種ポリヌクレオチド配列が、前記標的ポリヌクレオチド配列に挿入され得る、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月１９日に出願した欧州特許出願第１８１６２６８１．３号、２０１８年３月１９日に出願した欧州特許出願第１８１６２６８３．９号、２０１８年５月１６日に出願した欧州特許出願第１８１７２６２５．８号、２０１８年５月１６日に出願した欧州特許出願第１８１７４７０７．２号、２０１８年７月４日に出願した欧州特許出願第１８１８１６８０．２号、２０１８年１０月１２日に出願した米国特許出願第６２／７４５，２３８号、２０１８年１０月１２日に出願した米国特許出願第６２／７４５，２３９号、２０１８年１０月１２日に出願した米国特許出願第６２／７４５，２４０号、および２０１８年１０月１２日に出願した米国特許出願第６２／７４５，２４６号に対する優先権を主張し、これらの特許出願の各々の内容は、全図面を含むその全体が明確に参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、全般的には、分子生物学の分野に関し、これは、ＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼ、関連するガイドＲＮＡおよび／または標的配列を含む新規の系に関する組成物および方法、ならびに転写を調節するための方法ならびに細胞におけるＤＮＡを標的化、編集および／または操作するための方法を含む、様々な適用においてこれらを産生および使用するための方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびリボヌクレアーゼ等のエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的化、ゲノム編集、遺伝子サイレンシング、転写調節、組換え促進、および他の分子生物学的技法のための部位特異的ヌクレアーゼとして利用されてきた。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）系は、新規ヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの供給源を提供するものであり、これにはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が含まれる。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ系は、原核生物にファージなどの外来遺伝子エレメントに対する耐性を与える原核細胞系である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて実証される通り、成熟活性化ｔｒａｃｒ  ＲＮＡおよび標的化ｃｒＲＮＡの間に形成された二重鎖によってガイドされるＣａｓ９は、侵入同族ＤＮＡにおいて部位特異的な二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断を導入する。Ｃａｓ９は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを使用して標的鎖（ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に対して相補的として定義）を切断し、ＲｕｖＣ様ドメインを使用して非標的鎖を切断するマルチドメイン酵素であり、選択的モチーフ不活性化によるｄｓＤＮＡ切断Ｃａｓ９からニッカーゼへの変換を可能にする。ＤＮＡ切断特異性は、２種のパラメーターによって決定される：プロトスペーサー配列（ｃｒＲＮＡのスペーサーに対して非相補的なＤＮＡ標的における配列）を標的とするｃｒＲＮＡの可変的なスペーサー由来配列と、非標的ＤＮＡ鎖におけるプロトスペーサーのすぐ３’（下流）に位置する、短い配列、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）。
【０００５】
ＷＯ２０１３／１７６７２２に記載されているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの、ＲＮＡガイドＤＮＡ標的化原理を使用したゲノムの編集は、過去数年間にわたって広く活用されてきた。研究により、ＲＮＡガイドＣａｓ９を、ヒト細胞、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、虫、植物、酵母および細菌、ならびに様々な他の種においてゲノム編集ツールとして用いることができることが実証された。この系は、多用途であり、複数のガイドＲＮＡを使用することによりゲノムにおけるいくつかの部位を同時に編集するようにＣａｓ９をプログラミングすることにより、マルチプレックスゲノム操作を可能にする。Ｃａｓ９からニッカーゼへの変換は、変異原性活性を低下しつつ、哺乳動物ゲノムにおける相同性により導かれる修復を容易にすることが示された。加えて、Ｃａｓ９触媒不活性突然変異体のＤＮＡ結合活性は、例えば、ＲＮＡプログラム可能転写サイレンシングおよび活性化デバイスまたはエピジェネティックモディファイヤーを操作するように活用されてきた。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は遺伝子編集に有望であるにもかかわらず、この系の使用にはいくつかの問題が付随する。例えば、それらは、次の不利益のうち１つまたは複数を有する：
ａ）そのサイズは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等の確立された治療に適したウイルストランスフェクション系のゲノム内に運ばれるには大き過ぎる。
ｂ）異種環境におけるその活性は、一般に、これらの環境における使用にとって低過ぎ、例えば、真核生物、特に、哺乳動物環境における効率的な使用にとって低過ぎる。
ｃ）そのヌクレアーゼ活性は、忠実度を欠き、望まれないオフ標的効果をもたらし、このことは、この系を、例えば、高い精度を要求する遺伝子療法での使用または他の適用に不適なものとするであろう。
ｄ）哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ適用のためのその使用を限定し得る、免疫応答を誘発することがある。
ｅ）ＤＮＡ標的化セグメントのための標的選択を制限する、複雑なおよび／または長いＰＡＭを要求する。
ｆ）プラスミドまたはウイルスベクターからの不良な発現を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１７６７２２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本セクションは、本開示の一般概要を示し、その全範囲またはその特色の全てを網羅するものではない。
【０００８】
一部の実施形態では、新規ＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼに関する組成物および方法、ならびにそのようなヌクレアーゼを使用するための系が、本明細書に提供される。本発明は、ガイドＲＮＡおよび／または標的配列を含む他の構成成分、ならびに様々な適用においてそれらを産生および使用するための方法にも関する。そのような適用の例は、新規ヌクレアーゼならびに他の構成成分、例えば核酸および／またはポリペプチドを使用してＤＮＡを標的化、編集および／または操作するための方法はもちろん転写を調節するための方法も含む。本開示の一部の実施形態はまた、本明細書に開示されている系のエレメントのうち１つまたは複数を含む、組換え細胞およびキットに関する。
【０００９】
一態様では、Ｎ末端からＣ末端に向かって、１）配列番号３４〜３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３４〜３７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１と、２）配列番号３８〜４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３８〜４１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン２と、３）配列番号４２〜４５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４２〜４５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン３と、４）配列番号４６〜４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４６〜４９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン４と、５）配列番号５０〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５０〜５３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン５と、６）配列番号５４〜５７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５４〜５７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン６と、７）配列番号５８〜６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５８〜６１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン７と、８）配列番号６２〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６２〜６５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン８とを含み、ミニドメインのうちの少なくとも２つが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  Ｃａｓ９（配列番号３０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９（配列番号３１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９（配列番号３３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９（配列番号３２）からなる群から選択される異なる親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する、合成ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｓＲＧＮ）ポリペプチドが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ミニドメインのうちの少なくとも３つは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  Ｃａｓ９（配列番号３０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９（配列番号３１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９（配列番号３３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９（配列番号３２）からなる群から選択される異なる親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する。一部の実施形態では、ミニドメイン８は、配列番号６２のアミノ酸配列、または配列番号６２に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ミニドメイン８は、配列番号６３のアミノ酸配列、または配列番号６３に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ミニドメイン１は、配列番号３４のアミノ酸���列、または配列番号３４に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。
【００１０】
別の態様では、Ｎ末端からＣ末端に向かって、１）配列番号６６〜６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６６〜６９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１と、２）配列番号７０〜７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７０〜７３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン２と、３）配列番号７４〜７７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７４〜７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン３と、４）配列番号７８〜８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７８〜８１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン４と、５）配列番号８２〜８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８２〜８５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン５と、６）配列番号８６〜８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８６〜８９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン６と、７）配列番号９０〜９３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９０〜９３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン７と、８）配列番号９４〜９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９４〜９７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン８と、９）配列番号９８〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９８〜１０１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン９と、１０）配列番号１０２〜１０５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０２〜１０５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１０と、１１）配列番号１０６〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０６〜１０９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１１と、１２）配列番号１１０〜１１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１０〜１１３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１２とを含み、ミニドメインのうちの少なくとも２つが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  Ｃａｓ９（配列番号３０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９（配列番号３１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９（配列番号３３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９（配列番号３２）からなる群から選択される異なる親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する、ｓＲＧＮポリペプチドが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ミニドメインのうちの少なくとも３つは、��ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ  Ｃａｓ９（配列番号３０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９（配列番号３１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９（配列番号３３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９（配列番号３２）からなる群から選択される異なる親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する。一部の実施形態では、ミニドメイン１２は、配列番号１１０のアミノ酸配列、または配列番号１１０に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ミニドメイン１２は、配列番号１１１のアミノ酸配列、または配列番号１１１に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、（ｉ）ミニドメイン１は、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含み、（ｉｉ）ミニドメイン２は、配列番号７０のアミノ酸配列、または配列番号７０に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。
【００１１】
別の態様では、ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１ポリペプチド、ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−１ポリペプチド、ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−２ポリペプチド、ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−３ポリペプチド、ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＰ２Ｈ１２ポリペプチド、ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＥ２ポリペプチド、ｇ）配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＥ２＋Ｋ７４１Ｄ＋Ｌ７４３Ｋポリペプチド、ｈ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＥ２＋Ｓ６７０Ｔ＋Ｎ６７５Ｄポリペプチド、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＥ２＋Ｋ７４１Ｎ＋Ｌ７４３Ｎポリペプチド、ｊ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＦ８ポリペプチド；ｋ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＦ８＋Ｋ７３７Ｄ＋Ｌ７３９Ｋポリペプチド；およびｌ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１２に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＦ８＋Ｋ７３７Ｎ＋Ｌ７３９Ｎポリペプチド、からなる群から選択されるｓＲＧＮポリペプチドが、本明細書に提供される。
【００１２】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１ポリペプチド、ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−１ポリペプチド、およびｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−３ポリペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＧｉｂ１１ポリペプチド、ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−１ポリペプチド、およびｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−３ポリペプチドからなる群から選択される。
【００１３】
別の態様では、上に記載されている実施形態のいずれかに記載のｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１３〜２９のいずれか１つのヌクレオチド配列、または配列番号１３〜２９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。
【００１４】
別の態様では、（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチド、またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはｇＲＮＡをコードする核酸とを含み、ｇＲＮＡがｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、系が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、系は、異種ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型をさらに含み、異種ポリヌクレオチド配列は、標的ポリヌクレオチド配列に挿入され得る。
【００１５】
一部の実施形態では、上に記載されている系のいずれかに従って、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、および／または異種ポリヌクレオチド配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【００１６】
一部の実施形態では、上に記載されている系のいずれかに従って、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００１７】
一部の実施形態では、上に記載されている系のいずれかに従って、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
【００１８】
一部の実施形態では、上に記載されている系のいずれかに従って、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。
【００１９】
一部の実施形態では、上に記載されている系のいずれかに従って、ｓＲＧＮポリペプチド、またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子内に製剤化されている。一部の実施形態では、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸も含む。
【００２０】
一部の実施形態では、上に記載されている系のいずれかに従って、系は、ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成しているｓＲＧＮポリペプチドを含む。
【００２１】
別の態様では、標的遺伝子座における標的ＤＮＡを標的化、編集、改変または操作する方法であって、（ａ）上に記載されている実施形態のいずれかに記載のｓＲＧＮポリペプチド、またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはｇＲＮＡをコードする核酸とを標的ＤＮＡに提供するステップを含み、ｇＲＮＡがｓＲＧＮポリペプチドを標的遺伝子座へとガイドすることができる、方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、異種ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型を標的ＤＮＡに提供するステップをさらに含み、異種ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に挿入され得る。
【００２２】
一部の実施形態では、上に記載されている方法のいずれかに従って、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、および／または異種ポリヌクレオチド配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【００２３】
一部の実施形態では、上に記載されている方法のいずれかに従って、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００２４】
一部の実施形態では、上に記載されている方法のいずれかに従って、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
【００２５】
一部の実施形態では、上に記載されている方法のいずれかに従って、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。
【００２６】
一部の実施形態では、上に記載されている方法のいずれかに従って、ｓＲＧＮポリペプチド、またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子内に製剤化されている。一部の実施形態では、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸も含む。一部の実施形態では、方法は、ＲＮＰ複合体としてｇＲＮＡと予め複合体化されたｓＲＧＮポリペプチドを標的ＤＮＡに提供するステップを含む。
【００２７】
別の態様では、（ａ）上に記載されている実施形態のいずれかに記載のｓＲＧＮポリペプチド、またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはｇＲＮＡをコードする核酸とを含み、ｇＲＮＡがｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、改変された細胞が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、改変された細胞は、異種ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型をさらに含み、異種ポリヌクレオチド配列は、標的ポリヌクレオチド配列に挿入され得る。
【００２８】
別の態様では、細胞のゲノムが、上に記載されている実施形態のいずれかに記載の方法によって編集されている、遺伝子改変された細胞が、本明細書に提供される。
【００２９】
別の態様では、（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｓＲＧＮポリペプチド、またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはｇＲＮＡをコードする核酸とを含み、ｇＲＮＡがｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、キットが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、キットは、異種ポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型をさらに含み、異種ポリヌクレオチド配列は、標的ポリヌクレオチド配列に挿入され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、Ｇｉｂ１１、Ｐ２Ｈ１２、Ｅ２およびＦ８を作出するために使用される遺伝子ファミリーシャフリング技法のグラフィック表示を示す。
【００３１】
【図２Ａ】図２Ａは、Ｇｉｂ１１についての蛍光偏光アッセイである、破壊アッセイにおける蛍光偏光に基づく生化学的活性の結果（一部の場合では、ＳｌｕＣａｓ９などの野生型Ｃａｓ９のものを超える活性）を示す。菱形は、ｓｇＲＮＡを用いた条件を描写し、四角形は、ｓｇＲＮＡなしの対照条件を描写する。
【００３２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＳｌｕＣａｓ９についての蛍光偏光に基づく生化学的切断アッセイの結果を示す。菱形は、ｓｇＲＮＡを用いた条件を描写し、四角形は、ｓｇＲＮＡなしの対照条件を描写する。
【００３３】
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ａおよび図２Ｂにそれぞれ示されているｓｇＲＮＡを用いた条件についての曲線の初期勾配により判定された、切断アッセイにおけるＧｉｂ１１およびＳｌｕＣａｓ９の相対活性を示す。
【００３４】
【図３】図３は、液体培養での「ｌｉｖｅ−ｄｅａｄ」アッセイにより判定された、Ｇｉｂ１１による「ＮＮＧＧ」ＰＡＭモチーフの認識についての結果を示す。
【００３５】
【図４】図４は、Ｐ２Ｈ１２についての蛍光偏光に基づく生化学的切断アッセイの結果を示す。菱形は、ｓｇＲＮＡを用いた条件を描写し、四角形は、ｓｇＲＮＡなしの対照条件を描写する。
【００３６】
【図５】図５は、Ｅ２についてのＢＦＰ破壊に基づく切断アッセイの結果を示す。
【００３７】
【図６】図６は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓタンパク質のドメイン構成に基づくＧｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２およびＧｉｂ１１Ｓｐａ−３の予測ドメイン構造を示す。角括弧に付いている名称ＰＩは、基礎Ｇｉｂ１１配列のＰＩドメインを示す。対応するｃＲＧＮ−Ａ部分は、斜線の入った四角形として（この場合はＧｉｂ１１について）示されており、ｃＲＧＮ−Ｂ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ部分は、白い四角形として示されている。アミノ酸位置は、Ｇｉｂ１１タンパク質（配列番号１）に準拠している。
【００３８】
【図７】図７は、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２およびＧｉｂ１１Ｓｐａ−３についてのＢＦＰ破壊に基づく切断アッセイの結果を示す。
【００３９】
【図８】図８は、Ｆ８についてのＢＦＰ破壊に基づく切断アッセイの結果を示す。
【００４０】
【図９】図９は、生化学的切断アッセイを使用して評価された、Ｇｉｂ１１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−３、Ｅ２およびＦ８の特異性プロファイルを示す。
【００４１】
【図１０】図１０は、Ｇｉｂ１１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−３、Ｅ２およびＦ８についてのそれらの特異性プロファイルに基づく全体的特異性を示す。
【００４２】
【図１１】図１１は、生化学的切断アッセイを使用して評価された、Ｇｉｂ１１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−３、Ｅ２およびＦ８の活性プロファイルの分布を示す。ｘ軸上には、左から右に見て、示されているヌクレアーゼごとに活性の降順によりソートした標的ＤＮＡ基質がある。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
大部分の現存するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の酵素に基づき、これは、ＡＡＶとしてのウイルスベクターへのパッケージングにとって大き過ぎる（１６３８アミノ酸）という特定の不利益を有する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のヌクレアーゼに基づく代替のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系が存在し（ＥＰ２８９８０７５）、これは、サイズが有意により小さい。しかし、このヌクレアーゼは、複雑なＰＡＭを要求し、これにより、遺伝子編集適用のためのその使用が大いに制限される。さらに、小さいヌクレアーゼのほうが遺伝子編集法に有用であり得るが、同定されているそのような小さいヌクレアーゼの数は限られており、遺伝子編集のためのそれらの最適な特徴は、少なくとも殆どの場合、遺伝子編集における使用について十分に定義されていない。
【００４４】
４つの異なるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼの人工的に規定されたミニドメインに由来する新規の合成ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリペプチド（本明細書では「ｓＲＧＮポリペプチド」とも称される）、ならびに異なるかつ有利な特徴および機能性を有するそれらのバリアントが、本明細書に提供される。これらのｓＲＧＮは、以前には存在していなかったゲノム編集のさらなる機会を提供する。Ｃａｓヌクレアーゼは、それらが使用される系に依存して異なる活性を有することができる。本発明の１つの特徴は、遺伝子編集に利用可能なヌクレアーゼのツールボックスを増加させるさらなる操作されたヌクレアーゼ、および関連する方法を提供することである。
【００４５】
多くの場合、天然に存在する公知のＣａｓヌクレアーゼは、ＮＮＡＡＡＡなどの、より長いＰＡＭを標的とし、これによりそれらのヌクレアーゼの有用性が制限され得る。本発明は、天然に存在する小さいヌクレアーゼに由来するがＮＮＧＧ  ＰＡＭを認識することができる合成ヌクレアーゼ（例えば、小さいヌクレアーゼ）を提供する。
【００４６】
本発明は、さらに、原核生物、真核生物およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境における使用に適したＰＡＭ配列および適したガイド、例えば単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など、を提供する。
【００４７】
本明細書に提供されるｓＲＧＮポリペプチドは、例えば、原核生物、真核生物および／もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境におけるより高い活性、ならびに／または例えばヒト宿主細胞などの真核生物環境における核酸からのｓＲＧＮポリペプチドのより多い発現などの、既に報告されているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼよりも有利な特徴を示すことができる。一部の場合では、ｓＲＧＮは、小さいサイズ、高い編集活性、および短いＰＡＭ配列のみを要求することのうちの１つまたは複数を併せ持つ。ＲＮＡガイドヌクレアーゼに関する小さいサイズは、長さが約１１００アミノ酸以下であるヌクレアーゼを意味する。
【００４８】
細胞におけるＤＮＡを標的化、編集または操作するための系であって、ｓＲＧＮポリペプチド、またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、例えば１つもしくは複数の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、または１つもしくは複数のｇＲＮＡをコードする核酸とを含む系も、提供される。
【００４９】
次の詳細な説明において、その一部を形成する添付の図面の参照が為される。図面において、文脈がそれ以外を指示しない限り、同様の記号は、典型的に、同様の構成成分を同定する。詳細な説明、図面および特許請求の範囲に記載されている説明的な代替は、限定を意味するものではない。本明細書に提供されている主題の精神または範囲から逸脱することなく、他の代替を使用することができ、他の変化を為すことができる。本明細書に全般的に記載され図中に説明されている態様は、全て明快に企図されて本願の一部を為す多種多様な異なる構成において、配置、置換、組合せおよび設計することができることが容易に理解されるであろう。
【００５０】
他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる専門用語、表示法および他の科学用語または用語法は、本願が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意義を有することが意図される。一部の事例では、一般的に理解されている意義を有する用語は、明瞭さおよび／または即時参照のために本明細書で定義されており、本明細書における斯かる定義の包含は、本技術分野で一般に理解されているものからの大幅な差を表すものと必ずしも解釈するべきではない。本明細書に記載または参照されている技法および手順の多くは、十分に理解されており、当業者によって従来の方法論を使用して一般的に用いられている。
【００５１】
定義
本明細書で同義的に使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指す。したがって、この用語には、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、もしくは多鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド／３重ヘリックス、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む重合体が含まれる。
【００５２】
「オリゴヌクレオチド」とは、一般的に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの、約５〜約１００ヌクレオチドの間のポリヌクレオチドを指す。しかし、本開示の目的上、オリゴヌクレオチドの長さには上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても公知であり、当技術分野において公知の方法によって、遺伝子から単離、または化学的に合成することができる。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」には、記載されている実施形態に適用可能な場合、一本鎖ポリヌクレオチド（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれるものと理解すべきである。
【００５３】
「ゲノムＤＮＡ」とは、限定はされないが、細菌、真菌、古細菌（archea）、原生生物、ウイルス、植物または動物のゲノムのＤＮＡを含む、生物のゲノムのＤＮＡを指す。
【００５４】
ＤＮＡを「操作すること」は、結合すること、ＤＮＡの一方の鎖をニッキングすること、もしくは両方の鎖を切断すること（すなわち、カッティングすること）を包含、またはＤＮＡもしくはＤＮＡと会合しているポリペプチドを改変することもしくは編集することを包含する。ＤＮＡを操作することで、ＤＮＡによりコードされたＲＮＡまたはポリペプチドの発現をサイレンシング、活性化、または調節する（増加するまたは減少するのことのいずれか）こと、あるいは、ポリペプチドのＤＮＡへの結合を防止または増強することができる。
【００５５】
「ステムループ構造」とは、主に一本鎖のヌクレオチド（ループ部分）の領域によって一方の端で連結されている二本鎖（ステム部分）を形成することが公知であるまたは予想される、ヌクレオチド領域を含む二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン」および「フォールドバック」構造も、ステムループ構造を指すために、本明細書で使用される。そのような構造は、当技術分野において周知であり、これらの用語は当技術分野において公知のそれらの意味と共に、一貫して使用される。当技術分野で公知であるように、ステムループ構造は正確な塩基対合を必要としない。したがって、ステムは１つまたは複数の塩基ミスマッチを含む場合がある。あるいは、塩基対合は正確であり、すなわち、いかなるミスマッチも含まない場合がある。
【００５６】
「ハイブリッド可能な」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えばＲＮＡ）が、温度および溶液イオン強度が適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、配列特異的、逆平行的に、別の核酸に、非共有結合的に結合すること、すなわち、ワトソン・クリック塩基対および／もしくはＧ／Ｕ塩基対を形成する、「アニール」、または「ハイブリダイズ」することを可能にするヌクレオチド配列を含む（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ことを意味する。当技術分野で公知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）の対合、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）の対合、およびグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の対合［ＤＮＡ、ＲＮＡ］が含まれる。加えて、２つのＲＮＡ分子間の（例えば、ｄｓＲＮＡ）ハイブリダイゼーションにおいては、グアニン（Ｇ）とウラシル（Ｕ）との塩基対も当技術分野において公知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ内のコドンとのｔＲＮＡのアンチコドン塩基対合に関連して、遺伝コードの縮重（すなわち、冗長性）に部分的に関与している。本開示に照らして、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であるとみなされ、逆の場合も同じである。したがって、Ｇ／Ｕ塩基対がガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置で作製できる場合、位置は非相補的であるとはみなされず、代わりに、相補的であるとみなされる。
【００５７】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrook,  J.  and  Russell,  W.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Third  Edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor  (2001)；およびGreen,  M.  R.,  and  Sambrook,  J.,  Molecular  cloning:  A  Laboratory  Manual,  Fourth  Edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor  (2012)に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００５８】
ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補配列を含有することが必要であるが、塩基間のミスマッチの可能性がある。２つの核酸の間のハイブリダイゼーションに適した条件は、当技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補の程度によって異なる。２つのヌクレオチド配列の間の相補の程度が高い程、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値はより高くなる。短いストレッチの相補性（例えば、３５もしくはそれ未満、３０もしくはそれ未満、２５もしくはそれ未満、２２もしくはそれ未満、２０もしくはそれ未満、または１８もしくはそれ未満のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置が重要となる（Sambrook  et  al.、上記、11.7〜11.8を参照）。一般的に、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さは、少なくとも１５ヌクレオチド；少なくとも２０ヌクレオチド；少なくとも２２ヌクレオチド；少なくとも２５ヌクレオチド；および少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、温度および洗浄液の塩濃度が、相補の領域の長さおよび相補の程度などの要素に応じ、必要に応じて調整することができることは当業者であれば認識している。
【００５９】
ポリヌクレオチド配列が、特異的にハイブリッド可能であるように、その標的核酸のポリヌクレオチド配列に対して１００％相補的である必要はないことは、当技術分野において理解されている。さらに、ポリヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に含まれないように（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）、１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズさせることができる。ポリヌクレオチドは、標的化される標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、アンチセンス化合物の２０中１８のヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、９０パーセントの相補性を示し得る。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化しているか、または相補的ヌクレオチドと共に散在している場合があり、互いに、または相補的ヌクレオチドに近接している必要はない。核酸内の特定のストレッチの核酸配列間の相補性パーセントは、当技術分野において公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Altschul  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  1990,215,  403-410；Zhang  and  Madden,  Genome  Res.,  1997,7,  649-656）を使用して、またはＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を使用することによって、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Adv.  Appl.  Math.  1981(2)  482-489）のアルゴリズムを使用するデフォルト設定を使用して、慣例的に決定することができる。
【００６０】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」とは、本明細書で同義的に使用され、任意の長さである、アミノ酸の重合体形態を指し、これは、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。
【００６１】
「結合」とは、本明細書で使用される場合（例えばポリペプチドのＲＮＡ結合ドメインに関連して）、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の非共有結合の相互作用を指す。非共有結合の相互作用の状態において、高分子は、「会合」または「相互作用」または「結合」していると言われる（例えば、分子Ｘが分子Ｙと相互作用すると言われる場合、分子Ｘが非共有結合で分子Ｙに結合することを意味する）。結合性相互作用の全ての構成成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基と接触する）が、結合性相互作用の一部の部分は配列特異的である場合がある。結合性相互作用は、一般的に、１０〜６Ｍ未満、１０〜７Ｍ未満、１０〜８Ｍ未満、１０〜９Ｍ未満、１０〜１０Ｍ未満、１０〜１１Ｍ未満、１０〜１２Ｍ未満、１０〜１３Ｍ未満、１０〜１４Ｍ未満、または１０〜１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」とは結合の強さを指し、結合親和性の増加はより低いＫｄと相関する。
【００６２】
「結合ドメイン」とは、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質ドメインを意味する。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質ドメイン結合タンパク質の場合、これは、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、かつ／または、異なるタンパク質（単数または複数）の１つまたは複数の分子に結合することができる。
【００６３】
用語「保存的アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群はセリンおよびスレオニンからなる；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンからなる；芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる；塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリシン、アルギニン、およびヒスチジンからなる；酸性側鎖を有するアミノ酸群はグルタメートおよびアスパルテートからなる；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステインおよびメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６４】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の「配列同一性」パーセントを有し、このことは、アライメントされた場合、２つの配列を比較すると、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが、同一であり、かつ、同一の相対位置にあることを意味する。配列同一性は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、種々の方法およびｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ、ｅｂｉ．Ａｃ．Ｕｋ！Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ、ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅを含むサイトにてワールドワイドウェブにおいて利用可能なコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴなど）を使用して、配列をアライメントすることができる。例えば、Altschul  et  al.  (1990),  J.  Mol.  Biol.  215:403-10を参照されたい。当技術分野において標準の配列アラインメントを本発明に従って使用して、別のｓＲＧＮバリアントのアミノ酸残基に「対応する」１つのｓＲＧＮバリアントのアミノ酸残基を決定する。他のｓＲＧＮバリアントのアミノ酸残基に対応するｓＲＧＮバリアントのアミノ酸残基は、配列のアラインメントの同一の位置に現れる。
【００６５】
特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする場合もあり、あるいはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ；「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも称される）をコードする場合もある。「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、（ＤＮＡの場合）ｍＲＮＡに転写され、（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳される、核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）での開始コドンおよび３’末端（Ｃ末端）での翻訳終止ナンセンスコドンによって決定される。コード配列には、限定はされないが、原核または真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核または真核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成核酸が含まれ得る。転写終結配列は通常、コード配列の３’に位置する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」または「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼを結合する、および下流（３’方向）のコードまたは非コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列を、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な塩基またはエレメントの最小数を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物のプロモーターはしばしば、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む、種々のプロモーターを使用して、本発明の種々のベクターを駆動させることができる。プロモーターは、恒常的活性型プロモーター（すなわち、恒常的に活性「ＯＮ」状態であるプロモーター）とすることができ、誘導性プロモーター（すなわち、その状態、活性／「ＯＮ」または不活性／「ＯＦＦ」が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であってもよく、空間限定型プロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であってもよく、時間限定型プロモーター（すなわち、プロモーターは、胚発生の特定の段階の間、または生物学的プロセスの特定の段階、例えば、マウスにおける毛包周期の間、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にある）であってもよい。適切なプロモーターは、ウイルス由来であってもよく、したがってウイルスプロモーターと称されてもよく、または原核もしくは真核生物を含む任意の生物に由来することができる。適切なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  Ｉｌｌ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、限定はされないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ超初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）（Miyagishi  et  al.,  Nature  Biotechnology  20,  497-  500  (2002)）、強化されたＵ６プロモーター（例えば、Xia  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  2003  Sep  1;31(17)）、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、限定はされないが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなどが挙げられる。したがって誘導性プロモーターは、限定はされないが���ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エストロゲン受容体融合物などを含む、分子によって調節することができる。
【００６７】
一部の実施形態では、プロモーターは、多細胞生物においてプロモーターが特定の細胞のサブセット内で活性（すなわち、「ＯＮ」）であるような、空間限定型プロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）である。空間限定型プロモーターは、エンハンサー、転写制御エレメント、制御配列などとも称され得る。好都合な任意の空間限定型プロモーターを使用することもでき、適切なプロモーター（例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンのサブセットにおける発現を駆動するプロモーター、生殖細胞系列における発現を駆動するプロモーター、肺における発現を駆動するプロモーター、筋肉における発現を駆動するプロモーター、膵臓の島細胞における発現を駆動するプロモーターなど）の選択は、生物によって異なる。例えば、植物、ハエ、虫、哺乳動物、マウスなどについて、種々の空間限定型プロモーターが公知である。したがって、空間限定型プロモーターを使用して、生物に応じて、種々様々な異なる組織および細胞型においてｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸の発現を調節することができる。一部の空間限定型プロモーターはまた、プロモーターが、胚発生の特定の段階の間、または生物学的プロセスの特定の段階（例えば、マウスにおける毛包周期）の間、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にあるように、時間限定型である。例示を目的として、空間限定型プロモーターの例としては、限定はされないが、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容器特異的プロモーターなどが挙げられる。ニューロン特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ  ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター；神経フィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Chen  et  al.  (1987)  Cell  51:7-19；およびLlewellyn,  et  al.  (2010)  Nat.  Med.  16(10):1161-1166）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ６２２８３）；チロシン水酸化酵素プロモーター（ＴＨ）（例えば、Oh  et  al.  (2009)  Gene  Ther.  16:437；Sasaoka  et  al.  (1992)  Mol.  Brain  Res.  16:274；Boundy  et  al.  (1998)  J.  Neurosci.  18:9989；およびKaneda  et  al.  (1991)  Neuron  6:583-594）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Radovick  et  al.  (1991)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:3402-3406）；Ｌ７プロモーター（例えば、Oberdick  et  al.  (1990)  Science  248:223-226）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Bartge  et  al.  (1988)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:3648-3652）；エンケファリンプロモーター（例えば、Comb  et  al.  (1988)  EMBO  J.  17:3793-3805）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ１１−アルファ（ＣａｍＫＩＭ）プロモーター（例えば、Mayford  et  al.  (1996)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  93:13250；およびCasanova  et  al.  (2001)  Genesis  31:37）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−ｐプロモーター（例えば、Liu  et  al.  (2004)  Gene  Therapy  11:52-60）などが挙げられる。
【００６８】
脂肪細胞特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂ〜＋２１ｂｐの領域（例えば、Tozzo  et  al.  (1997)  Endocrinol.  138:1604；Ross  et  al.  (1990)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  87:9590；およびPavjani  et  al.  (2005)  Nat.  Med.  11:797）；グルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Knight  et  al.  (2003)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  100:14725）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Kuriki  et  al.  (2002)  Biol.  Pharm.  Bull.  25:1476；およびSato  et  al.  (2002)  J.  Biol.  Chem.  277:15703）；ステアロイル（stearoyi）ＣｏＡ不飽和酵素−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Taboret  al.  (1999)  J.  Biol.  Chem.  274:20603）；レプチンプロモーター（例えば、Mason  et  al.  (1998)  Endocrinol.  139:1013；およびChen  et  al.  (1999)  Biochem.  Biophys.  Res.  Comm.  262:187）；アディポネクチンプロモーター（例えば、Kita  et  al.  (2005)  Biochem.  Biophys.  Res.  Comm.  331:484；およびChakrabarti  (2010)  Endocrinol.  151:2408）；アディプシンプロモーター（例えば、Platt  et  al.  (1989)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86:7490）；レジスチンプロモーター（例えば、Seo  et  al.  (2003)  Molec.  Endocrinol.  17:1522）などが挙げられる。
【００６９】
心筋細胞特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、以下の遺伝子に由来する制御配列が挙げられる：ミオシン軽鎖−２、ａ−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ、心筋アクチンなど。Franz  et  al.  (1997)  Cardiovasc.  Res.  35:560-566；Robbins  et  al.  (1995)  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.  752:492-505；Linn  et  al.  (1995)  Circ.  Res.  76:584591；Parmacek  et  al.  (1994)  Mol.  Cell.  Biol.  14:1870-1885；Hunter  et  al.  (1993)  Hypertension  22:608-617；および  Sartorelli  et  al.  (1992)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:4047-4051．
【００７０】
平滑筋特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、ＳＭ２２ａプロモーター（例えば、Akyiirek  et  al.  (2000)  Mol.  Med.  6:983；および米国特許第７，１６９，８７４号）；スムーセリンプロモーター（例えば、ＷＯ２００１／０１８０４８）；ａ−平滑筋アクチンプロモーターなどが挙げられる。例えば、ＳＭ２２ａプロモーターの０．４ｋｂ領域は、その中に２つのＣＡｒＧエレメントが存在しており、血管平滑筋細胞特異的な発現を媒介することが示されている（例えば、Kim,  et  al.  (1997)  Mol.  Cell.  Biol.  17,  2266-2278;  Li,  et  al.,  (1996)  J.  Cell  Biol.  132,  849-859；およびMoessler,  et  al.  (1996)  Development  122,  2415-2425）。
【００７１】
光受容器特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Young  et  al.  (2003)  Ophthalmol.  Vis.  Sci.  44:4076）；ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Nicoud  et  al.  (2007)  J.  Gene  Med.  9:1015）；網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Nicoud  et  al.  (2007)、上記）；光受容器間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Nicoud  et  al.  (2007)、上記）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Yokoyama  et  al.  (1992)  Exp  Eye  Res.  55:225）などが挙げられる。
【００７２】
本明細書で同義的に使用される用語「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、および「調節エレメント」とは、例えば、非コード配列（例えば、ガイドＲＮＡ）もしくはコード配列（例えば、ｓＲＧＮポリペプチド）の転写をもたらしかつ／もしくは調節する、ならびに／またはコードされるポリペプチドの翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの、転写および翻訳の制御配列を指す。
【００７３】
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用されて本明細書で使用される場合、用語「天然に存在する」または「未改変の」とは、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。例えば、天然源から単離することができ、実験室でヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が、天然に存在するものである。
【００７４】
核酸またはポリペプチドに適用されて本明細書で使用される場合、用語「キメラ」とは、異なる供給源に由来する構造から構成される１つの実体を指す。例えば、「キメラ」が、キメラポリペプチド（例えば、キメラｓＲＧＮポリペプチド）に関連して使用される場合、キメラポリペプチドは、例えば、ＤＮＡ改変活性、転写因子活性および／またはＤＮＡ関連ポリペプチド改変活性を有するポリペプチドを含む、Ｃａｓヌクレアーゼ以外の機能を有するポリペプチドなどの、異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。キメラポリペプチドは、改変された、または天然に存在するポリペプチド配列のいずれかを含んでもよい（例えば、改変または未改変ｓＲＧＮタンパク質由来の第１のアミノ酸配列；およびｓＲＧＮタンパク質以外の第２のアミノ酸配列）。同様に、キメラポリペプチドをコードする核酸に関連して「キメラ」は、異なるコード領域に由来するヌクレオチド配列を含む（例えば、改変または未改変ｓＲＧＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；およびｓＲＧＮタンパク質以外のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列）。
【００７５】
用語「キメラポリペプチド」とは、天然に存在しない、例えば、ヒトの介在によるアミノ配列の、本来なら別々の２つまたはそれより多いセグメントの人工的な組合せ（すなわち、「融合」）によって、作製される、ポリペプチドを指す。キメラアミノ酸配列を含むポリペプチドは、キメラポリペプチドである。一部のキメラポリペプチドを「融合バリアント」と称することができる。
【００７６】
「異種」とは、本明細書で使用される場合、それぞれ、本来の核酸またはタンパク質に見出されないヌクレオチドまたはペプチドを意味する。例えば、キメラｓＲＧＮタンパク質では、天然に存在する細菌ｓＲＧＮポリペプチド（またはそのバリアント）のＲＮＡ結合ドメインは、異種ポリペプチド配列（すなわち、ｓＲＧＮ以外のタンパク質由来のポリペプチド配列または別の生物由来のポリペプチド配列）に融合されている場合がある。異種ポリペプチドは、キメラｓＲＧＮタンパク質によっても示される活性（例えば、酵素活性）を示すことができる（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸を天然に存在する核酸（またはそのバリアント）に連結して（例えば、遺伝子操作によって）、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸を作出することができる。別の例として、融合バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドでは、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドを、異種ポリペプチド（すなわち、ｓＲＧＮ以外のポリペプチド）に融合することができ、これにより、融合バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドによっても示される活性が示される。異種核酸をバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドに連結して（例えば、遺伝子操作によって）、融合バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードする核酸を作出することができる。「異種」とは、本明細書で使用される場合、その本来の細胞ではない細胞中の、ヌクレオチドまたはポリペプチドをさらに意味する。
【００７７】
用語「同族の」とは、通常、天然において相互作用または共存する、２つの生体分子を指す。
【００７８】
「組換え」とは、本明細書で使用される場合、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはベクターが、天然系に見出される内在性核酸と区別可能な構造コードまたは非コード配列を有する構築物をもたらす、クローニング、拘束、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／またはライゲーションのステップの種々の組合せの産物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡ断片からまたは一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てて、細胞内または無細胞の転写および翻訳系内に含有される組換え転写単位からの発現が可能な合成核酸を提供することができる。関連配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え遺伝子または転写単位の形成においても使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーディングフレームからの５’または３’に存在することができ、そのような配列は、コード領域の操作または発現に干渉せず、実際には、種々の機構による所望の産物の産生を調節するように作用することができる（下記の「ＤＮＡ調節配列」を参照）。あるいは、翻訳されないＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列も、組換えとみなすことができる。したがって、例えば、用語「組換え」核酸とは、天然に存在しない、例えば、ヒトの介在による配列の、本来なら別々の２つのセグメントの人工的な組合せによって、作製されるものを指す。この人工的な組合せは、化学合成手段によって、または核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって達成される。通常、そのような人工的組合せを行って、コドンを、同一のアミノ酸、保存的アミノ酸、または非保存的アミノ酸をコードするコドンに置き換える。あるいは、人工的な組合せを行って、所望の機能の核酸セグメントと共に接合させて、所望の機能の組合せを作出する。この人工的な組合せは、化学合成手段によって、または核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって達成される。組換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドの配列は、天然に存在しても（「野生型」）よいし、天然に存在する配列のバリアント（例えば、突然変異体）であってもよい。したがって、用語「組換え」ポリペプチドとは、必ずしも、その配列が天然に存在しないポリペプチドを指すわけではない。むしろ、「組換え」ポリペプチドは組換えＤＮＡ配列によってコードされるが、ポリペプチドの配列は、天然に存在しても（「野生型」）、天然に存在しなくても（例えば、バリアント、突然変異体など）よい。したがって、「組換え」ポリペプチドは、ヒトの介在の結果であるが、天然に存在するアミノ酸配列であってもよい。用語「天然に存在しない」には、化学的に改変したまたは突然変異させた分子を含む、その天然に存在するカウンターパートとは顕著に異なる分子が含まれる。
【００７９】
「ベクター」または「発現ベクター」とは、別のＤＮＡセグメント、すなわち「インサート」が付加され、その結果、細胞内で、付加されたセグメントの複製を引き起こし得る、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンである。
【００８０】
「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡコード配列を含む。「作動可能に連結されている」とは、そのように記載された構成成分が、それらの意図される様式でそれらが機能することを可能とする関係にある、並置を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼしている場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。用語「組換え発現ベクター」、または「ＤＮＡ構築物」とは、本明細書で同義的に使用されて、ベクターおよび少なくとも１つのインサートを含むＤＮＡ分子を指す。組換え発現ベクターは通常、インサートを発現させるおよび／もしくは増やすため、または他の組換えヌクレオチド配列の構築のために、作出される。核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結されていてもいなくてもよく、ＤＮＡ調節配列に作動可能に連結されていてもいなくてもよい。
【００８１】
細胞は、外来性ＤＮＡ、例えば、組換え発現ベクターが細胞内に導入されている場合、そのようなＤＮＡによって「遺伝子改変されている」または「形質転換されている」または「トランスフェクトされている」。外来性ＤＮＡの存在は、恒久的または一過性の遺伝子変化をもたらす。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれ（共有結合的に連結し）ていてもいなくてもよい。
【００８２】
例えば、原核生物、酵母、および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメント上に維持されている場合がある。真核細胞について、安定に形質転換された細胞とは、染色体複製を通じて娘細胞に遺伝されるように形質転換ＤＮＡが染色体内に組み込まれた細胞である。この安定性は、真核細胞の、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞集団を含む細胞系またはクローンを樹立する能力によって実証される。「クローン」とは、有糸分裂によって単一細胞または共通の祖先に由来する細胞集団である。「細胞系」とは、何世代にもわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定な成長が可能な初代細胞のクローンである。
【００８３】
遺伝子改変（「形質転換」とも称される）の適切な方法としては、限定はされないが、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注射、ナノ粒子媒介性核酸送達（例えば、Panyam  et  al.,  Adv  Drug  Deliv  Rev.  2012  Sep  13.  pp:  S0169-409X(12)00283-9.  doi:10.1016/j.addr.2012.09.023）などが挙げられる。
【００８４】
遺伝子改変の方法の選択は一般に、形質転換される細胞の種類および形質転換が行われている状況（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ）に左右される。これらの方法の一般的な議論は、Ausubel,et  al.,  Short  Protocols  in  Molecular  Biology,  3rd  ed.,  Wiley  &  Sons,  1995に見出すことができる。
【００８５】
「宿主細胞」とは、本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける真核細胞、原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）、または単細胞の実体として培養される多細胞生物由来の細胞（例えば、細胞系）を示し、その真核細胞または原核細胞は核酸のレシピエントとして使用することができ、または使用されており、核酸によって形質転換された原細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、自然の、偶発的、または意図的な突然変異に起因して、モルホロジーにおいて、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも称される）とは、異種核酸、例えば、発現ベクターを導入された宿主細胞である。例えば、細菌宿主細胞とは、適切な細菌宿主細胞への外来性核酸（例えば、プラスミドまたは組換え発現ベクター）の導入による遺伝子改変された細菌宿主細胞であり、真核宿主細胞とは、適切な真核宿主細胞への外来性核酸の導入による遺伝子改変された真核宿主細胞（例えば、哺乳動物生殖細胞）である。
【００８６】
本明細書で使用される場合「標的ＤＮＡ」とは、「標的部位」または「標的配列」を含むＤＮＡポリヌクレオチドである。用語「標的部位」、「標的配列」、「標的プロトスペーサーＤＮＡ」または「プロトスペーサー様配列」とは、本明細書では同義的に使用されて、結合に十分な条件が存在する場合にガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列を指す。例えば、標的ＤＮＡ内の標的部位（または標的配列）５’−ＧＡＧＣＡＴＡＴＣ−３’は、ＲＮＡ配列５’−ＧＡＵＡＵＧＣＵＣ−３’によって標的化される（またはこれによって結合される、またはこれとハイブリダイズする、またはこれに相補的である）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当技術分野において公知である；例えば、Sambrook、上記。ガイドＲＮＡに相補的であり、これとハイブリダイズする標的ＤＮＡ鎖は「相補鎖」と称され、「相補鎖」に相補的である（したがってガイドＲＮＡに相補的でない）標的ＤＮＡ鎖は「非相補鎖（non-complementary  strand）」または「非相補鎖（noncomplementary  strand）」と称される。「部位指向型修飾ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位指向型ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位指向型改変ポリペプチド」または「部位指向型ポリペプチド」とは、ＲＮＡを結合し、特定のＤＮＡ配列に標的化されるポリペプチドを意味する。本明細書に記載の部位指向型改変ポリペプチドは、それが結合しているＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列に標的化される。ＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ内の標的配列を結合、これにハイブリダイズ、またはこれに相補的である配列を含み、したがって、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定の位置（標的配列）に標的化する。「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合の骨格の破壊を意味する。切断は、限定はされないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含む、いろいろな方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断は両方とも可能であり、二本鎖切断を別々の２つの一本鎖切断事象の結果として行うことができる。ＤＮＡ切断は平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび部位指向型改変ポリペプチドを含む複合体が標的化二本鎖ＤＮＡの切断のために使用される。
【００８７】
「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」とは、本明細書で同義的に使用されて、ポリヌクレオチド切断用のヌクレオチド鎖切断の触媒活性を保有する酵素を意味する。
【００８８】
ヌクレアーゼの「切断ドメイン」または「活性ドメイン」または「ヌクレアーゼドメイン」とは、ＤＮＡ切断用の触媒活性を保有するヌクレアーゼ内のポリペプチド配列またはドメインを意味する。単一ポリペプチド鎖が切断ドメインを含有する場合もあり、切断活性が２つの（またはこれより多い）ポリペプチドの会合によってもたらされる場合もある。単一のヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内の１つよりも多い単離されたアミノ酸のストレッチからなり得る。
【００８９】
「部位指向型ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位指向型ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位指向型ポリペプチド」とは、ＲＮＡを結合し特定のＤＮＡ配列に標的化されるポリペプチドを意味する。本明細書に記載の部位指向型ポリペプチドは、それが結合しているＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列に標的化される。ＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ内の標的配列に相補的である配列を含み、したがって、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定の位置（標的配列）に標的化する。
【００９０】
「ガイド配列」またはＤＮＡ標的化セグメント（または「ＤＮＡ標的化配列」）は、本明細書で「プロトスペーサー様」配列と指定される、標的ＤＮＡ内の特定の配列に相補的であるヌクレオチド配列（標的ＤＮＡの相補鎖）を含む。タンパク質結合セグメント（または「タンパク質結合配列」）は、部位指向型改変ポリペプチドと相互作用する。部位指向型改変ポリペプチドがｓＲＧＮまたはｓＲＧＮ関連ポリペプチド（下でより詳細に記載）である場合、標的ＤＮＡの部位特異的切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合の相補性；および（ｉｉ）標的ＤＮＡの短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される）の両方によって決定される位置で起こる。
【００９１】
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、一部、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する、ヌクレオチドの２つの相補的ストレッチを含む。
【００９２】
一部の実施形態では、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；部位指向型ポリペプチドをコードする核酸など）は、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または調節された安定性；細胞内標的化；追跡、例えば、蛍光標識；タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位など）をもたらす改変または配列を含む。非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節、ならびに／またはタンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接触のし易さの調節を可能にする）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン））；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変または配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を促進する部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）をもたらす改変または配列；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する改変または配列；およびそれらの組合せが挙げられる。
【００９３】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、上記の特徴のうちのいずれかをもたらす追加的なセグメントを５’または３’末端のいずれかに含む。例えば、適切な第３のセグメントは、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節、ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体による接触のし易さの調節を可能にする）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン））；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を促進する部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）をもたらす改変または配列；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する改変または配列；およびそれらの組合せを含み得る。
【００９４】
ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドは、複合体を形成する（すなわち、非共有結合の相互作用によって結合する）。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むことによって、標的特異性を複合体に提供する。複合体のｓＲＧＮポリペプチドは、部位特異的活性を提供する。言い換えれば、ｓＲＧＮポリペプチドは、そのガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとの会合によって、標的ＤＮＡ配列（例えば、染色体核酸の標的配列；染色体外核酸、例えば、エピソーム核酸、ミニサークルなどの標的配列；ミトコンドリア核酸の標的配列；葉緑体核酸の標的配列；プラスミドの標的配列など）に誘導される。ＲＮＡアプタマーは、当技術分野において公知であり、一般的にリボスイッチの合成バージョンである。用語「ＲＮＡアプタマー」および「リボスイッチ」は本明細書で同義的に使用されて、それらが一部であるＲＮＡ分子の構造（および、したがって、特定の配列の利用能）の誘導性調節をもたらす合成核酸配列および天然核酸配列の両方を包含する。ＲＮＡアプタマーは通常、特定の構造（例えば、ヘアピン）に折り畳まれる配列を含み、その配列が特定の薬物（例えば、小分子）を特異的に結合する。薬物の結合は、ＲＮＡの折り畳みにおける構造変化を起こし、このことによって、アプタマーが一部である核酸の特徴が変化する。非限定的な例として、（ｉ）アプタマーを有する活性化因子−ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬物によって結合されない限り、同族のターゲター−ＲＮＡに結合することができない場合があり；（ｉｉ）アプタマーを有するターゲター−ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬物によって結合されない限り、同族の活性化因子−ＲＮＡに結合することができない場合があり；（ｉｉｉ）異なる薬物を結合する異なるアプタマーをそれぞれ含むターゲター−ＲＮＡおよび活性化因子−ＲＮＡは、両方の薬物が存在しない限り、互いに結合することができない場合がある。これらの例によって例示される通り、２分子ガイドＲＮＡを誘導性となるように設計することができる。
【００９５】
アプタマーおよびリボスイッチの例は、例えば、Nakamura  et  al.,  Genes  Cells.  2012  May;17(5):344-64；Vavalle  et  al.,  Future  Cardiol.  2012  May;8(3):371-82；Citartan  et  al.,  Biosens  Bioelectron.  2012  Apr  15;34(1):1-11；およびLiberman  et  al.,  Wiley  lnterdiscip  Rev  RNA.  2012  May-Jun;3(3):369-84に見出すことができ、これらは全てそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９６】
用語「幹細胞」とは、自己再生し、分化細胞型を発生させる両方の能力を有する細胞（例えば、植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を指して本明細書で使用される（Morrison  et  al.  (1997)  Cell  88:287-298を参照）。細胞の個体発生に関連して、形容詞「分化型の」、または「分化中の」とは、相対語である。「分化細胞」は、比較されている細胞よりも発生経路をさらに進行した細胞である。したがって、多能性幹細胞（下記）は、系統が限定された始原細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化することができ、系統が限定された始原細胞はその後、さらに限定された細胞（例えば、ニューロン前駆細胞）に分化することができ、さらに限定された細胞は最終段階の細胞（すなわち、最終分化型細胞、例えば、ニューロン、心筋細胞など）に分化することができ、最終段階の細胞はある特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持していてもしていなくてもよい。幹細胞は、特定のマーカー（例えば、タンパク質、ＲＮＡなど）の存在および特定のマーカーの非存在の両方によって特徴付けることができる。また幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の機能アッセイ、特に、複数の分化した子孫を生じさせる幹細胞の能力に関したアッセイによって同定することができる。
【００９７】
目的の幹細胞には多能性幹細胞（ＰＳＣ）が含まれる。用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」とは、生物の全ての細胞型を産生することが可能な幹細胞を意味して、本明細書では使用される。したがって、ＰＳＣは、生物の全ての胚葉（例えば、脊椎動物の内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞を生じさせることができる。多能性細胞は、生存生物において、奇形腫を形成する、および外胚葉、中胚葉、または内胚葉の組織に寄与することが可能である。植物の多能性幹細胞は、植物の全ての細胞型（例えば、根、茎、葉などの細胞）を生じさせることが可能である。
【００９８】
動物のＰＳＣはいくつかの様々な方式で導出することができる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は胚の内部細胞塊に由来し（Thomson  et.  al,  Science.  1998  Nov  6;282(5391):1145-7）、一方、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は体細胞に由来する（Takahashi  et.  al,  Cell.  2007  Nov  30;131(5):861-72；Takahashi  et.  al,  Nat  Protoc.  2007;2(12):3081-9；Yu  et.  al,  Science.  2007  Dec  21;318(5858):1917-20.  Epub  2007  Nov  20）。
【００９９】
用語ＰＳＣとはそれらの由来にかかわらず多能性幹細胞を指すので、用語ＰＳＣは、用語ＥＳＣおよびｉＰＳＣ、ならびにＰＳＣの別の例である用語胚性生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）を包含する。ＰＳＣは株化細胞系の形態であってもよいし、一次胚組織から直接得てもよいし、体細胞に由来していてもよい。ＰＳＣは本明細書に記載の方法の標的細胞であり得る。
【０１００】
「胚性幹細胞」（ＥＳＣ）とは、胚から、通常、胚盤胞の内部細胞塊から単離されたＰＳＣを意味する。ＥＳＣ系は、ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されており、例えば、ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））。目的の幹細胞には、アカゲザル幹細胞およびマーモセット幹細胞などの他の霊長類由来の胚性幹細胞も含まれる。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などから得られてもよい（Thomson  et  al.  (1998)  Science  282:1145；Thomson  et  al.  (1995)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  92:7844；Thomson  et  al.  (1996)  Biol.  Reprod.  55:254；Shamblott  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  95:13726,  1998）。培養では、ＥＳＣは通常、大きな核−細胞質比、明確な境界および顕著な核小体を有する平坦なコロニーとして成長する。加えて、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ−１は発現しない。ＥＳＣを作出および特徴付けする方法の例は、例えば、米国特許第７，０２９，９１３号、米国特許第５，８４３，７８０号、および米国特許第６，２００，８０６号に見出すことができ、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。未分化型のｈＥＳＣを増殖させるための方法は、ＷＯ９９／２０７４１、ＷＯ０１／５１６１６、およびＷＯ０３／０２０９２０に記載されている。「胚性生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）または「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」とは、生殖細胞および／または生殖細胞前駆細胞、例えば始原生殖細胞、すなわち、精子および卵子になるであろうものに由来するＰＳＣを意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上記の胚性幹細胞と類似した特性を有すると考えられている。ＥＧ細胞を作出および特徴付けする方法の例は、例えば、米国特許第７，１５３，６８４号；Matsui,  Y.,  et  al.,  (1992)  Cell  70:841；Shamblott,  M.,  et  al.  (2001)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  98:  113；Shamblott,  M.,  et  al.  (1998)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  95:13726；およびKoshimizu,  U.,  et  al.  (1996)  Development,  122:1235に見出すことができ、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、ＰＳＣではない細胞（すなわち、細胞であってＰＳＣと比べて分化した細胞由来）に由来するＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣは、最終分化型細胞を含む、複数の様々な細胞型に由来し得る。ｉＰＳＣはＥＳ細胞様モルホロジーを有し、大きな核−細胞質比、明確な境界および顕著な核を有する平坦なコロニーとして成長する。加えて、ｉＰＳＣは、当業者に公知の、１つまたは複数の重要な多能性マーカーを発現し、限定はされないが、これには、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｆｏｘ０３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２が含まれる。
【０１０２】
ｉＰＳＣを作出および特徴付けする方法の例は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００９００４７２６３号、第ＵＳ２００９００６８７４２号、第ＵＳ２００９０１９１１５９号、第ＵＳ２００９０２２７０３２号、第ＵＳ２００９０２４６８７５号、および第ＵＳ２００９０３０４６４６号に見出すことができ、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。一般的に、ｉＰＳＣを作出するために、体細胞は、当技術分野において公知の再プログラム化因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８など）を具備しており、多能性幹細胞になるように体細胞を再プログラムする。
【０１０３】
「体細胞」とは、実験的操作の非存在下では、生物における全細胞型を通常生じさせない、生物における任意の細胞を意味する。言い換えれば、体細胞とは、体の３つ全ての胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉および内胚葉、の細胞を自然には発生しない程十分に分化した細胞である。例えば、体細胞はニューロンおよび神経前駆細胞の両方を含み得、その後者は、中枢神経系の全てまたは一部の細胞型を自然に生じさせることが可能性であり得るが、中胚葉または内胚葉系統の細胞を生じさせることはできない。
【０１０４】
「有糸分裂細胞」とは、有糸分裂を受けている細胞を意味する。有糸分裂とは、真核細胞が、その核中の染色体を２つの別個の核において同一の２つのセットに分離するプロセスである。通常、その直後に細胞質分裂が起こり、これによって、核、細胞質、細胞小器官および細胞膜が、これらの細胞構成成分のおおよそ等しい取分を含有する２つの細胞に分割される。
【０１０５】
「分裂終了細胞」とは、有糸分裂から脱出した、すなわち、「静止」にある、すなわち、もはや分裂を受けていない細胞を意味する。この静止状態は一時的、すなわち可逆的な場合もあり、恒久的な場合もある。
【０１０６】
「減数分裂細胞」とは、減数分裂を受けている細胞を意味する。減数分裂とは、細胞が配偶子または胞子を産生することを目的としてその核内物質を分割する、プロセスである。有糸分裂と異なり、減数分裂では、染色体は染色体間で遺伝物質をシャッフルする組換えステップを受ける。さらに、有糸分裂から産生される２個の（遺伝的に同一の）二倍体細胞と比較して、減数分裂の成果は４個の（遺伝的に特有の）一倍体細胞である。
【０１０７】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを意味する。本明細書で使用される場合、「相同組換え修復（ＨＤＲ）」とは、例えば、細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、特殊な形態のＤＮＡ修復を指す。このプロセスはヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復に使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらす。相同組換え修復は、ドナーポリヌクレオチドが標的分子と異なり、ドナーポリヌクレオチド配列の一部または全てが標的ＤＮＡ内に組み込まれた場合に、標的分子配列の変更（例えば、挿入、欠失、突然変異）をもたらし得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部分が、標的ＤＮＡに組み込まれる。
【０１０８】
「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）」とは、相同的鋳型を必要とせずに（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的）、切断末端を互いに直接ライゲーションすることによる、ＤＮＡの二本鎖切断の修復を意味する。ＮＨＥＪは多くの場合、二本鎖切断部位の近くのヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。
【０１０９】
用語「処置」、「処置すること」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを概して意味して、本明細書では使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にまたは部分的に防止するという点から予防的であってもよく、および／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害効果の部分的もしくは完全な治癒という点から治療的であってもよい。本明細書で使用される場合「処置」は、哺乳動物における疾患または症状の任意の処置をカバーし、（ａ）疾患または症状にかかりやすい傾向があるが、まだそれを有しているとは診断されていない対象において、疾患または症状が発症することを防止すること；（ｂ）疾患または症状を抑制すること、すなわち、その発生を止めること；あるいは（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすこと、を含む。治療剤は、疾患または傷害の発生の前、発生中、または発生後に投与されてもよい。進行中の疾患の処置であって、患者の望ましくない臨床症状を安定化または低下させる処置は、特に興味深いものである。そのような処置は、患部組織における完全な機能喪失の前に行われることが望ましい。治療は、疾患の症状段階の間、および一部の場合では疾患の症状段階の後に、投与されることが望ましい。
【０１１０】
用語「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」とは、本明細書で同義的に使用され、診断、処置、または治療が望ましい任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。
【０１１１】
分子および細胞生化学における一般的な方法は、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  3rd  Ed.  (Sambrook  et  al.,  Harboor  Laboratory  Press  2001)；Short  Protocols  in  Molecular  Biology,  4th  Ed.  (Ausubel  et  al.  eds.,  John  Wiley  &  Sons  1999)；Protein  Methods  (Bollag  et  al.,  John  Wiley  &  Sons  1996)；Nonviral  Vectors  for  Gene  Therapy  (Wagner  et  al.  eds.,  Academic  Press  1999)；Viral  Vectors  (Kaplift  &  Loewy  eds.,  Academic  Press  1995)；Immunology  Methods  Manual  (1.  Lefkovits  ed.,  Academic  Press  1997)；およびCell  and  Tissue  Culture:  Laboratory  Procedures  in  Biotechnology  (Doyle  &  Griffiths,  John  Wiley  &  Sons  1998)のような標準的な教科書に見出すことができ、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
値の範囲が与えられた場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈によって特に明示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの、間に挟まれた各値、およびその記載の範囲内の任意の他の記載された、または間に挟まれた値は、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、そのより小さい範囲内に独立して含まれてもよく、また、記載範囲に何らかの具体的に除外された境界値がある場合も本発明に含まれる。記載範囲が一方または両方の境界値を含む場合、それらの含まれる境界値の一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
【０１１３】
「から本質的になる」という句は、本明細書では、系の指定された活性構成成分（単数または複数）ではないあらゆるもの、または分子の指定された活性部分（単数または複数）ではないあらゆるものを除外することを意味する。
【０１１４】
ある特定の範囲は、「約」という用語に先行された数値を用いて、本明細書で提供される。本明細書において「約」という用語は、それに続く正確な数、および用語に続く数に近いまたは近似した数のための字義通りのサポートを提供するのに使用される。ある数が具体的に記載された数に近いまたは近似しているかどうかを決定する際、近いまたは近似している未記載の数は、それが示された文脈において、具体的に記載された数の実質的な等価物を提供する数であり得る。
【０１１５】
明確化のために別々の実施形態に関連して記載される本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わされて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態に関連して記載される本発明の種々の特徴は、別々に、または任意の適切な副組合せで提供されてもよい。本発明に関連する全ての実施形態の組合せは、それぞれおよび全ての組合せがあたかも個々にかつ明示的に開示されたかの如く、本発明により具体的に包含され、本明細書で開示される。加えて、種々の実施形態およびその要素の全ての副組合せも、それぞれおよび全てのそのような副組合せがあたかも個々にかつ明示的に本明細書で開示されたかの如く、本発明に具体的に包含され、本明細書で開示される。
【０１１６】
合成ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｓＲＧＮ）
合成ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｓＲＧＮ）は、例えば、異なる種、例えば４つの異なるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ）、のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの人工的に規定されたミニドメインの相同性に基づく遺伝子ファミリーシャフリングを使用して、作出することができる。１つのそのような遺伝子ファミリーシャフリングプロトコールが図１に模式的に描かれている。手短に述べると、異なるＣａｓ９エンドヌクレアーゼの配列を比較して、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの各々を複数（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多く）の対応するミニドメインに分割するアンカーポイントとして役立つ高度な相同性を有する領域を同定する。元のＣａｓ９エンドヌクレアーゼのうちの１つに由来する各々のミニドメインをランダムに割り当てることにより、遺伝子ファミリーシャフリングされたｓＲＧＮのライブラリーを調製する。一部の事例では、単一ＰＡＭ配列がライブラリー構築物の各々により認識されるように固定された状態にＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを保つことが望ましい。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの各々を、固定されたＣ末端ミニドメインを保持して８つのミニドメインに切断することにより、ライブラリーを調製することができ、この結果として、理論的複雑度は８１９２になる。別の例では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの各々を、固定されたＣ末端ミニドメインを保持して１２のミニドメインに切断することにより、ライブラリーを調製することができ、この結果として、理論的複雑度は１．３×１０５になる。細菌ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイおよびレポーター遺伝子破壊アッセイなどの、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの活性についての公知のアッセイを使用してライブラリーをスクリーニングして、高い活性を有するｓＲＧＮを同定することができる。
【０１１７】
一態様では、相同性に基づく遺伝子ファミリーシャフリングプロコールに従って設計された候補ｓＲＧＮが、本明細書に提供される。候補ｓＲＧＮは、いかなる活性を有することもまだ示されていない。少なくとも１つの活性を有することが実証されているｓＲＧＮも提供される。一部の実施形態では、少なくとも１つの活性は、例えば、切断アッセイ、例えば蛍光偏光に基づく生化学的切断アッセイ、遺伝子編集アッセイ、例えばＧＦＰからＢＦＰへの変換（Glaser  et  al.,  2016、下記）、遺伝子挿入アッセイ、または他の好適なパラメーターのアッセイにおける活性を含む。一部の実施形態では、オン標的カッティングがアッセイされ、オフ標的カッティングがアッセイされ、および／またはオン標的編集（例えば、遺伝子または遺伝子の部分の突然変異または挿入の矯正）がアッセイされ、これがオフ標的編集と比較され得る。一部の場合では、活性は、野生型Ｃａｓ９などの参照または対照ヌクレアーゼと比較される。アッセイは、当技術分野で説明されており、商業資源から入手可能である。生物、例えば、有害な突然変異を有する動物において適切なアッセイを行うことができ、ｓＲＧＮ系が投与された動物における突然変異に関連する１つまたは複数の症状の改善により、ｓＲＧＮの有効性がアッセイされる。一部の実施形態では、少なくとも１つの活性は、ｓＲＧＮが由来する親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのうちの１つまたは複数における対応する活性より大きい。一部の実施形態では、少なくとも１つの活性は、ＳｌｕＣａｓ９などの別の野生型Ｃａｓ９における対応する活性より大きい。
【０１１８】
一部の実施形態では、８つのミニドメインを含む候補ｓＲＧＮであって、ミニドメインが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、１）配列番号３４〜３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３４〜３７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１、２）配列番号３８〜４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３８〜４１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン２、３）配列番号４２〜４５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４２〜４５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン３、４）配列番号４６〜４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４６〜４９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン４、５）配列番号５０〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５０〜５３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン５、６）配列番号５４〜５７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５４〜５７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン６、７）配列番号５８〜６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号５８〜６１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン７、および８）配列番号６２〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６２〜６５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン８である、候補ｓＲＧＮが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、候補ｓＲＧＮは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈ���ｉｃｕｓ  Ｃａｓ９からのミニドメインを含む。一部の実施形態では、候補ｓＲＧＮは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓの４つ全て未満（例えば、２つまたは３つ）のＣａｓ９からのミニドメインを含む。一部の実施形態では、ミニドメイン８は、配列番号６２のアミノ酸配列、または配列番号６２に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ミニドメイン８は、配列番号６３のアミノ酸配列、または配列番号６３に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ミニドメイン１は、配列番号３４のアミノ酸配列、または配列番号３４に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、１２のミニドメインを含む候補ｓＲＧＮであって、ミニドメインが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、１）配列番号６６〜６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６６〜６９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１、２）配列番号７０〜７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７０〜７３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン２、３）配列番号７４〜７７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７４〜７７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン３、４）配列番号７８〜８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号７８〜８１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン４、５）配列番号８２〜８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８２〜８５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン５、６）配列番号８６〜８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８６〜８９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン６、７）配列番号９０〜９３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９０〜９３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン７、８）配列番号９４〜９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９４〜９７のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン８、９）配列番号９８〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号９８〜１０１のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン９、１０）配列番号１０２〜１０５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０２〜１０５のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１０、１１）配列番号１０６〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０６〜１０９のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１１、および１２）配列番号１１０〜１１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１０〜１１３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むミニドメイン１２である、候補ｓＲＧＮが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、候補ｓＲＧＮは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９からのミニドメインを含む。一部の実施形態では、候補ｓＲＧＮは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓの４つ全て未満（例えば、２つまたは３つ）のＣａｓ９からのミニドメインを含む。一部の実施形態では、ミニドメイン１２は、配列番号１１０のアミノ酸配列、または配列番号１１０に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ミニドメイン１２は、配列番号１１１のアミノ酸配列、または配列番号１１１に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、（ｉ）ミニドメイン１は、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含み、（ｉｉ）ミニドメイン２は、配列番号７０のアミノ酸配列、または配列番号７０に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。
【０１２０】
本明細書で開示されるｓＲＧＮポリペプチドＧｉｂ１１（配列番号１）、Ｐ２Ｈ１２（配列番号５）、Ｅ２（配列番号６）、およびＦ８（配列番号１０）は、遺伝子ファミリーシャフリングプロトコールを使用して同定され、Ｇｉｂ１１Ｓｐａバリアント（配列番号２〜４）は、一般に、Ｇｉｂ１１の異なるＣ末端部分をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９の対応する部分に置き換えることにより作出された。
【０１２１】
本明細書で開示されるｓＲＧＮポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９（本明細書では「ＳｐＣａｓ９」または「ＳｐｙＣａｓ９」とも称される）と比較して小さく、ＮＮＧＧ  ＰＡＭ配列と相互作用する。
【０１２２】
一態様では、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含むｓＲＧＮポリペプチドが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、配列番号１〜１２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、配列番号１〜１２のいずれか１つの部分配列に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓＲＧＮポリペプチドであって、部分配列が１つまたは複数の機能的ｓＲＧＮドメインを含む、ｓＲＧＮポリペプチドが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つの部分配列を含む（またはこれからなる）。一部の実施形態では、１つまたは複数のｓＲＧＮドメインは、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＨＮＨまたはＲｕｖＣドメイン）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のｓＲＧＮドメインは、ＲＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｒｅｃ  Ｉドメイン）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のｓＲＧＮドメインは、ＰＡＭ相互作用ドメインを含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、以下のものを含むＧｉｂ１１バリアントが、本明細書に提供される：
（Ｉ）配列番号１のその全長にわたってのアミノ酸配列に対してまたは配列番号１の７８７位〜１０５７位の配列にわたってのアミノ酸配列に対し少なくとも９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するバリアント；
（ＩＩ）無細胞反応でまたは原核細胞でのみならず、例えば植物または動物のような生存生物などの真核細胞環境でも、Ｇｉｂ１１  ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための、例えば核局在化シグナルなどの、構成成分をさらに含む、（Ｉ）に記載のバリアント；
（ＩＩＩ）Ｇｉｂ１１ならびに（Ｉ）および（ＩＩ）に記載のバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化されたバリアント；
（ＩＶ）（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに記載のバリアントであって、
（ａ）有意に低下したまたは検出不能なヌクレアーゼ活性を有する、例えば、配列番号１に関して１０位（例えば、Ｄ１０Ａ）、５６２位（例えば、Ｈ５６２Ａ）および／または５８５位（例えば、Ｎ５８５Ａ）に、アラニン、または有意に低下したヌクレアーゼ活性をもたらす他の任意の交換を有する、ｓＲＧＮを生じさせる結果となる、１つまたは複数の改変または突然変異と、
（ｂ）ヌクレオチド塩基編集活性またはデアミナーゼ活性を有し、例えばリンカーペプチドを介して、ＣまたはＮ末端に結合しているポリペプチドと
をさらに含むバリアント。
【０１２５】
一部の実施形態では、以下のものを含むＰ２Ｈ１２バリアントが、本明細書に提供される：
（Ｉ）配列番号５のその全長にわたってのアミノ酸配列に対してまたは配列番号５の７８４位〜１０５５位の配列にわたってのアミノ酸配列に対し少なくとも９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するバリアント；
（ＩＩ）無細胞反応でまたは原核細胞でのみならず、例えば植物または動物のような生存生物などの真核細胞環境でも、Ｐ２Ｈ１２  ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための、例えば核局在化シグナルなどの、構成成分をさらに含む、（Ｉ）に記載のバリアント；
（ＩＩＩ）Ｐ２Ｈ１２ならびに（Ｉ）および（ＩＩ）に記載のバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化されたバリアント；
（ＩＶ）（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに記載のバリアントであって、
（ａ）有意に低下したまたは検出不能なヌクレアーゼ活性を有する、例えば、配列番号５に関して１０位（例えば、Ｄ１０Ａ）、５５９位（例えば、Ｈ５５９Ａ）および／または５８２位（例えば、Ｎ５８２Ａ）に、アラニン、または有意に低下したヌクレアーゼ活性をもたらす他の任意の交換を有する、ｓＲＧＮを生じさせる結果となる、１つまたは複数の改変または突然変異と、
（ｂ）ヌクレオチド塩基編集活性またはデアミナーゼ活性を有し、例えばリンカーペプチドを介して、ＣまたはＮ末端に結合しているポリペプチドと
をさらに含むバリアント。
【０１２６】
一部の実施形態では、以下のものを含むＥ２バリアントが、本明細書に提供される：
（Ｉ）配列番号６のその全長にわたってのアミノ酸配列に対してまたは配列番号６の１位〜７８９位の配列にわたってのアミノ酸配列に対し少なくとも９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するバリアント；
（ＩＩ）無細胞反応でまたは原核細胞でのみならず、例えば植物または動物のような生存生物などの真核細胞環境でも、Ｅ２  ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための、例えば核局在化シグナルなどの、構成成分をさらに含む、（Ｉ）に記載のバリアント；
（ＩＩＩ）Ｅ２ならびに（Ｉ）および（ＩＩ）に記載のバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化されたバリアント；
（ＩＶ）（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに記載のバリアントであって、
（ａ）有意に低下したまたは検出不能なヌクレアーゼ活性を有する、例えば、配列番号６に関して１０位（例えば、Ｄ１０Ａ）、５６２位（例えば、Ｈ５６２Ａ）および／または５８５位（例えば、Ｎ５８５Ａ）に、アラニン、または有意に低下したヌクレアーゼ活性をもたらす他の任意の交換を有する、ｓＲＧＮを生じさせる結果となる、１つまたは複数の改変または突然変異と、
（ｂ）ヌクレオチド塩基編集活性またはデアミナーゼ活性を有し、例えばリンカーペプチドを介して、ＣまたはＮ末端に結合しているポリペプチドと
をさらに含むバリアント。
【０１２７】
一部の実施形態では、以下のものを含むＦ８バリアントが、本明細書に提供される：
（Ｉ）配列番号１０のその全長にわたってのアミノ酸配列に対してまたは配列番号１０の１位〜７８９位の配列にわたってのアミノ酸配列に対し少なくとも９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するバリアント；
（ＩＩ）無細胞反応でまたは原核細胞でのみならず、例えば植物または動物のような生存生物などの真核細胞環境でも、Ｆ８  ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための、例えば核局在化シグナルなどの、構成成分をさらに含む、（Ｉ）に記載のバリアント；
（ＩＩＩ）Ｆ８ならびに（Ｉ）および（ＩＩ）に記載のバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化されたバリアント；
（ＩＶ）（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに記載のバリアントであって、
（ａ）有意に低下したまたは検出不能なヌクレアーゼ活性を有する、例えば、配列番号１０に関して１０位（例えば、Ｄ１０Ａ）、５６２位（例えば、Ｈ５６２Ａ）および／または５８５位（例えば、Ｎ５８５Ａ）に、アラニン、または有意に低下したヌクレアーゼ活性をもたらす他の任意の交換を有する、ｓＲＧＮを生じさせる結果となる、１つまたは複数の改変または突然変異と、
（ｂ）ヌクレオチド塩基編集活性またはデアミナーゼ活性を有し、例えばリンカーペプチドを介して、ＣまたはＮ末端に結合しているポリペプチドと
をさらに含むバリアント。
【０１２８】
一部の実施形態では、以下のものを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−１バリアントが、本明細書に提供される：
（Ｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するバリアント；
（ＩＩ）無細胞反応でまたは原核細胞でのみならず、例えば植物または動物のような生存生物などの真核細胞環境でも、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１  ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための、例えば核局在化シグナルなどの、構成成分をさらに含む、（Ｉ）に記載のバリアント；
（ＩＩＩ）Ｇｉｂ１１Ｓｐａならびに（Ｉ）および（ＩＩ）に記載のバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化されたバリアント；
（ＩＶ）（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに記載のバリアントであって、
（ａ）有意に低下したまたは検出不能なヌクレアーゼ活性を有する、例えば、配列番号２に関して１０位（例えば、Ｄ１０Ａ）、５６２位（例えば、Ｈ５６２Ａ）および／または５８５位（例えば、Ｎ５８５Ａ）に、アラニン、または有意に低下したヌクレアーゼ活性をもたらす他の任意の交換を有する、ｓＲＧＮを生じさせる結果となる、１つまたは複数の改変または突然変異と、
（ｂ）ヌクレオチド塩基編集活性またはデアミナーゼ活性を有し、例えばリンカーペプチドを介して、ＣまたはＮ末端に結合しているポリペプチドと
をさらに含むバリアント。
【０１２９】
一部の実施形態では、以下のものを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−２バリアントが、本明細書に提供される：
（Ｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するバリアント；
（ＩＩ）無細胞反応でまたは原核細胞でのみならず、例えば植物または動物のような生存生物などの真核細胞環境でも、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２  ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための、例えば核局在化シグナルなどの、構成成分をさらに含む、（Ｉ）に記載のバリアント；
（ＩＩＩ）Ｇｉｂ１１Ｓｐａならびに（Ｉ）および（ＩＩ）に記載のバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化されたバリアント；
（ＩＶ）（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに記載のバリアントであって、
（ａ）有意に低下したまたは検出不能なヌクレアーゼ活性を有する、例えば、配列番号３に関して１０位（例えば、Ｄ１０Ａ）、５６２位（例えば、Ｈ５６２Ａ）および／または５８５位（例えば、Ｎ５８５Ａ）に、アラニン、または有意に低下したヌクレアーゼ活性をもたらす他の任意の交換を有する、ｓＲＧＮを生じさせる結果となる、１つまたは複数の改変または突然変異と、
（ｂ）ヌクレオチド塩基編集活性またはデアミナーゼ活性を有し、例えばリンカーペプチドを介して、ＣまたはＮ末端に結合しているポリペプチドと
をさらに含むバリアント。
【０１３０】
一部の実施形態では、以下のものを含むＧｉｂ１１Ｓｐａ−３バリアントが、本明細書に提供される：
（Ｉ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するバリアント；
（ＩＩ）無細胞反応でまたは原核細胞でのみならず、例えば植物または動物のような生存生物などの真核細胞環境でも、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−３  ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための、例えば核局在化シグナルなどの、構成成分をさらに含む、（Ｉ）に記載のバリアント；
（ＩＩＩ）Ｇｉｂ１１Ｓｐａならびに（Ｉ）および（ＩＩ）に記載のバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化されたバリアント；
（ＩＶ）（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに記載のバリアントであって、
（ａ）有意に低下したまたは検出不能なヌクレアーゼ活性を有する、例えば、配列番号４に関して１０位（例えば、Ｄ１０Ａ）、５６２位（例えば、Ｈ５６２Ａ）および／または５８５位（例えば、Ｎ５８５Ａ）に、アラニン、または有意に低下したヌクレアーゼ活性をもたらす他の任意の交換を有する、ｓＲＧＮを生じさせる結果となる、１つまたは複数の改変または突然変異と、
（ｂ）ヌクレオチド塩基編集活性またはデアミナーゼ活性を有し、例えばリンカーペプチドを介して、ＣまたはＮ末端に結合しているポリペプチドと
をさらに含むバリアント。
【０１３１】
例えば、酵素活性の文脈において使用される「有意に低下された」という用語は、斯かる酵素活性が、参照タンパク質（例えば、配列番号１〜１２のいずれか１つ）の活性の約１０％よりも低い、例えば、斯かる参照酵素活性の５％よりも低い、２％よりも低い、１％よりも低いまたは０．１％よりも低いことを意味する。
【０１３２】
（ＩＶ）（ｂ）における適したポリペプチド、ならびに（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）におけるｓＲＧＮのＣ末端ドメインへのその結合は、例えば、ＷＯ２０１７／０７０６３２、Gaudelli  et  al.,  Nature  551(23  November  2017),  464-471；Komor  et  al.,  Sci.  Adv.  2017;  3eaao4774；Kim  et  al.,  Nature  Biotechnol.  2017  April;  35(4)  371-376；Komor  et  al.,  Nature  533(7603);  420-424に記載されている。
【０１３３】
標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断を導入する代わりに、（ＩＶ）におけるｓＲＧＮ変異体は、いずれかの塩基対からいずれか可能な他の塩基対への変換を可能にすることができる。１つの非限定的な例は、シトシン、グアニンまたはアデニン塩基に作用し得るデアミナーゼ活性、脱アミノ化された部位を通してのそれらをその後の複製、および細胞内でグアニン、チミンおよびグアニンをそれぞれ生じさせるための修復である。
【０１３４】
他に指定がなければ、ｓＲＧＮという用語は、配列番号１〜１２のいずれか１つのｓＲＧＮポリペプチド、ならびに本明細書に記載されるあらゆるバリアント、例えば、（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）において指定されたものを含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、配列番号６に関して、ａ）７４１位にアスパラギン酸残基および７４３位にリシン残基を含む、Ｅ２の突然変異体（Ｅ２＋Ｋ７４１Ｄ＋Ｌ７４３Ｋ、配列番号７）；またはｂ）６７０位にスレオニン残基および６７５位にアスパラギン酸残基を含む、Ｅ２の突然変異体（Ｅ２＋Ｓ６７０Ｔ＋Ｎ６７５Ｄ、配列番号８）；またはｃ）７４１位にアスパラギン残基および７４３位にアスパラギン残基を含む、Ｅ２の突然変異体（Ｅ２＋Ｋ７４１Ｎ＋Ｌ７４３Ｎ、配列番号９）；またはｄ）上記（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せが本明細書に提供される。
【０１３６】
一部の実施形態では、ｉ）配列番号６に記載の配列に対してその全長にわたって、または配列番号６の１位〜７８９位の配列に対して、少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）アミノ酸同一性；およびｉｉ）表１のａ１の５つ前の位置で始まってａ１の５つ後の位置で終わる連続ストレッチにアラインメントされたときに、表１に示されているようなａ１位のアミノ酸残基を示す；およびｉｉｉ）表１のａ２の５つ前の位置で始まってａ２の５つ後の位置で終わる連続ストレッチにアラインメントされたときに、表１に示されているようなａ２位のアミノ酸残基を示す、Ｅ２の突然変異体が、本明細書に提供され、この場合、アラインメントされたとは、例えば、標準的なパラメーターを使用してＰｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［２０１８年５月１７日に引用］Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Altschul,  S.F.,  Gish,  W.,  Miller,  W.,  Myers,  E.W.  &  Lipman,  D.J.  (1990)  "Basic  local  alignment  search  tool."  J.  Mol.  Biol.  215:403-410.）を含む、標準的な局所的アラインメントツールまたはアルゴリズムを使用する、配列番号６に記載の配列への１１アミノ酸残基のストレッチのアラインメントを意味し、ａ１またはａ２に先行する５つのアミノ酸のうちの少なくとも４つ、およびａ１またはａ２の後の５つのアミノ酸のうちの４つは、同一である。
【表１】
2021518139.tif 000003
【０１３７】
他に指定がなければ、Ｅ２という用語は、Ｅ２＋Ｋ７４１Ｄ＋Ｌ７４３Ｋ；Ｅ２＋Ｓ６７０Ｔ＋Ｎ６７５Ｄ；およびＥ２＋Ｋ７４１Ｎ＋Ｌ７４３Ｎを含む、Ｅ２突然変異体を含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、配列番号１０に関して、ａ）７３７位にアスパラギン酸残基および７３９位にリシン残基を含む、Ｆ８の突然変異体（Ｆ８＋Ｋ７３７Ｄ＋Ｌ７３９Ｋ、配列番号１１）；またはｂ）７３７位にアスパラギン残基および７３９位にアスパラギン残基を含む、Ｆ８の突然変異体（Ｆ８＋Ｋ７３７Ｎ＋Ｌ７３９Ｎ、配列番号１２）が、本明細書に提供される。
【０１３９】
一部の実施形態では、ｉ）配列番号１０に記載の配列に対してその全長にわたって、または配列番号１０の１位〜７８７位の配列に対して、少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）アミノ酸同一性；およびｉｉ）表２のａ１の５つ前の位置で始まってａ１の５つ後の位置で終わる連続ストレッチにアラインメントされたときに、表２に示されているようなａ１位のアミノ酸残基を示す；およびｉｉｉ）表２のａ２の５つ前の位置で始まってａ２の５つ後の位置で終わる連続ストレッチにアラインメントされたときに、表２に示されているようなａ２位のアミノ酸残基を示す、Ｆ８の突然変異体が、本明細書に提供され、この場合、アラインメントされたとは、例えば、標準的なパラメーターを使用してＰｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［２０１８年５月１７日に引用］Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Altschul,  S.F.,  Gish,  W.,  Miller,  W.,  Myers,  E.W.  &  Lipman,  D.J.  (1990)  "Basic  local  alignment  search  tool."  J.  Mol.  Biol.  215:403-410.）を含む、標準的な局所的アラインメントツールまたはアルゴリズムを使用する、配列番号１０に記載の配列への１１アミノ酸残基のストレッチのアラインメントを意味し、ａ１またはａ２に先行する５つのアミノ酸のうちの少なくとも４つ、およびａ１またはａ２の後の５つのアミノ酸のうちの４つは、同一である。
【表２】
2021518139.tif 000004
【０１４０】
他に指定がなければ、Ｆ８という用語は、Ｆ８＋Ｋ７３７Ｄ＋Ｌ７３９Ｋ；およびＦ８＋Ｋ７３７Ｎ＋Ｌ７３９Ｎを含む、Ｆ８突然変異体を含む。
【０１４１】
所与のライブラリーを使用して遺伝子ファミリーシャフリングにより作出された高活性ｓＲＧＮにおいてミニドメインの対での組合せを同定すること、および残りのｓＲＧＮミニドメインがライブラリーから選択される合理的に設計されたｓＲＧＮにこれらの対での組合せのうちの少なくとも１つを含めることにより、さらなるｓＲＧＮを作出することができる。残りのミニドメインは、対での組合せのミニドメインと同じ親Ｃａｓ９に由来するものから選択することができる。合理的に設計されたｓＲＧＮは、高活性ｓＲＧＮ中のミニドメインの１つまたは複数のさらなる対での組合せをさらに含むことができる。例えば、合理的に設計されたｓＲＧＮは、高活性ｓＲＧＮ中に存在するミニドメインの２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの対での組合せを含むことができる。
【０１４２】
キメラＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｃＲＧＮ）
Ａ）ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓ９、または本明細書に記載されているｓＲＧＮのいずれかなどの、２つもしくはそれより多くのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓタンパク質の配列のＤＮＡシャフリングにより作出された合成ＲＮＡガイドヌクレアーゼのどちらかから得られる、Ｎ末端部分（ｃＲＧＮ−Ａ）と、ｂ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑ  ＷＰ＿０２３３７４３６５．１）からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓ９から得られるＣ末端部分（ｃＲＧＮ−Ｂ）とを含む、キメラＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｃＲＧＮ）であって、ｃＲＧＮ−Ｂが、ｉ）ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑ  ＷＰ＿０２３３７４３６５．１に記載の配列の９０５アミノ酸位から始まって１０５４アミノ酸位で終わる配列である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑ  ＷＰ＿０２３３７４３６５．１）からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓ９の全ＰＩドメインを含むか、またはｉｉ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑ  ＷＰ＿０２３３７４３６５．１）からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓ９の全ＰＩドメインと、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑ  ＷＰ＿０２３３７４３６５．１に記載の配列の７８４アミノ酸位〜９０４アミノ酸位に位置する全ＷＥＤドメインとを含み；ｃＲＧＮ−Ａが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉからのＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑ  ＷＰ＿０２３３７４３６５．１のそれぞれの部分とアミノ酸レベルで９９．９％を超えて同一、一部の場合には、９９．５％を超えて同一である配列を除いて、最初の７３９アミノ酸または最初の７８３アミノ酸などの、それぞれのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓ９配列の最初の７００アミノ酸を含み；ｃＲＧＮ−Ａが、直接的にせよ、リンカーペプチド配列によるにせよ、ｃＲＧＮ−Ｂに結合されている、キメラＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｃＲＧＮ）も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｃＲＧＮ−Ａは、それぞれのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓ９配列の最初の７００より多くのアミノ酸、例えば、最初の７３９アミノ酸、または最初の７８３アミノ酸を含む。
【０１４３】
Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓ９についてのＰＩドメインおよびＷＥＤドメインは、Nishimasu  et  al.,  Cell.  2015  August  27;  162(5):  1113-1126に記載されている。両方のドメインの潜在的局在は、さらに図６に示されている。
【０１４４】
本特許出願の中でのＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑデータベースへのいずれの言及も、次の引用を参照する：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）［インターネット］。Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＵＳ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；［１９８８］−［２０１８年５月１１日に引用］。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎから入手可能。例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑ  ＷＰ＿０４８８０３０８５については、これは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＷＰ＿０４８８０３０８５である。
【０１４５】
単独でのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓへのいずれの言及も、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属を意味する。
【０１４６】
本発明に関してＤＮＡシャフリングは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの活性などの、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの活性を有する合成タンパク質をコードするキメラＤＮＡ配列を生じさせるための、異なる（例えば、異なるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種からの）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列間の配列断片の交換を意味する。そのような技法は、とりわけ、Joern  J.M.  (2003)  DNA  Shuffling.  In:  Arnold  F.H.,  Georgiou  G.  (eds)  Directed  Evolution  Library  Creation.  Methods  in  Molecular  BiologyTM,  vol  231.  Humana  Press,  as  well  as  in  Gibbs  et  al.,  Gene.  2001  Jun  13;271(1):13-20に記載されている。
【０１４７】
一部の実施形態では、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓからのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ  Ｃａｓ９は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑデータベースの以下の登録のうちの１つにより特定される：ＷＰ＿０５３０１９７９４、ＷＰ＿０７１８５９９８５、ＷＰ＿０４９４３７６２７、ＷＰ＿０８１３２９７３８、ＷＰ＿０８１３３０６３４、ＷＰ＿０８８９２２８０４、ＷＰ＿０６１８５４０９９、ＷＰ＿０９６７９２１１６、ＷＰ＿１０７５８８４２２、ＷＰ＿１０７５４３４０６、ＷＰ＿１０５９６６９１０、ＷＰ＿０８３３２６９３１、ＷＰ＿１０５９７７７２９、ＷＰ＿１０７５７８６５７、ＷＰ＿１０７５３３９５５、ＷＰ＿１０７５９７０６６、ＷＰ＿１０５９８０２９３、ＷＰ＿１０５９７８４００、ＷＰ＿１０７５３９７８４、ＷＰ＿０８３３２６８３５、ＷＰ＿０９６７５４３８０、ＷＰ＿１０７５８０５５０、ＷＰ＿１０７５３０４３１、ＷＰ＿１０７５９７６４３、ＷＰ＿１０７５９６３０１、ＷＰ＿０８２７３２２６５、ＷＰ＿０８３３１０２５０、ＷＰ＿０８２７０９４４７、ＷＰ＿１０５９９４７００、ＷＰ＿１０７５６８０９１、ＷＰ＿１０７５４４００７、ＷＰ＿１０３３６１９５７、ＷＰ＿００１５７３６３４、ＷＰ＿１０７５７６３１０、ＷＰ＿１０７５７１６１１、ＷＰ＿１０７５９３７２８、ＷＰ＿１０３１６７０２８、ＷＰ＿１０７５３２８５０、ＷＰ＿００２４６０８４８、ＷＰ＿１０７５０６２０６、ＷＰ＿１０４６８１５０１、ＷＰ＿１０７５４６５３９、ＷＰ＿０５８７１０２２０、ＷＰ＿０７５７７７７６１、ＷＰ＿０５０３３１０７３、ＷＰ＿０５０３４５６８１、ＷＰ＿０５３０１７９３４、ＷＰ＿０４９４１５４４９、ＷＰ＿０６０８２９９７７、ＷＰ＿０７０８５５１４１、ＷＰ＿１０７６４１１５４、ＷＰ＿１０７３９２９３３、ＷＰ＿１０７３８９５８２、ＷＰ＿１０７３９０３５６、ＷＰ＿１０７３７８４０１、ＷＰ＿１０７３７８６７６、ＷＰ＿０６０５５２０３２、ＷＰ＿１０７３７６４４７、ＷＰ＿０３９６４３６７９、ＷＰ＿１０１４５７３６４、ＷＰ＿１０４０３９１６８、ＷＰ＿１０４０５２０３０、ＷＰ＿０８５２３７５３９、ＷＰ＿１０３３５７３４３、ＷＰ＿０４４３６１５０１、ＷＰ＿１０７３６６４１５、ＷＰ＿１０７３９３３０９、ＷＰ＿１０７６３３６８９、ＷＰ＿１０７３９７００３、ＷＰ＿１０７３８６９５４、ＷＰ＿１０７３７１５０８、ＷＰ＿１０７５３８２７１、ＷＰ＿１０７６４２９１４、ＷＰ＿１０７５３６０６１、ＷＰ＿１０７６０５８５２、ＷＰ＿１０７５４７８７７、ＷＰ＿１０７６３４６７５、ＷＰ＿１０７５３２０８２、ＷＰ＿１０７６０４００７、ＷＰ＿１０３３５６７４５、ＷＰ＿１０７６４２８１１、ＷＰ＿１０３２９８９０１、ＷＰ＿１０７６１１９８３、ＷＰ＿１０７６２３８１５、ＷＰ＿１０７５２２２８１、ＷＰ＿１０７５６００７６、ＷＰ＿１０７３６８５４２、ＷＰ＿０８１５０２２４０、ＷＰ＿１０７６０４００２、ＷＰ＿１０７３７７５１６、ＷＰ＿０１６４２４９８０、ＷＰ＿００９３８２３６２、ＷＰ＿００１５７３６３３、ＷＰ＿０１６４２４９８１、ＷＰ＿１０３２９８６８７、ＷＰ＿１０３３６１９５６、ＷＰ＿１０７６３７９７９、ＷＰ＿１０７６１２６２１、ＷＰ＿１０７６４２８１７、ＷＰ＿１０３３５６７２３、ＷＰ＿１０７５９３７１９、ＷＰ＿０７０５９２９９２、ＷＰ＿１０７５３６２４５、ＷＰ＿１０３２０９６１３、ＷＰ＿０６３２８４６６７、ＷＰ＿１０１４５７４６３、ＷＰ＿１０５５０３１５６、ＷＰ＿０９６５４８２４９、ＷＰ＿０９６５３６５６７、ＷＰ＿０１４６１３２５９、ＷＰ＿０６３２７８９４８、ＷＰ＿０９６６０１６７１、ＷＰ＿１０３８６３３２０、ＷＰ＿０９６５５９６４４、ＷＰ＿０１９１６７９１８、ＷＰ＿０８６４２８２１０、ＷＰ＿０９６６６５６１５、ＷＰ＿１０５９７６２９５、ＷＰ＿１０７５７６３０２、ＷＰ＿１０５９７７８６３、ＷＰ＿１０７５４４００６、ＷＰ＿１０７５３８３３０、ＷＰ＿０７０８４８７７１、ＷＰ＿０９６６０５７１６、ＷＰ＿０９５１０５８２４、ＷＰ＿１０５９６６８０９、ＷＰ＿０７０４６９１１９、ＷＰ＿０９６５８９０３２、ＷＰ＿１０５９９６４４２、ＷＰ＿１０７５５２５５６、ＷＰ＿０６０８０３９３４、ＷＰ＿１０７５４９４３７、ＷＰ＿１０７５７９０８０、ＷＰ＿１０７５４７８１３、ＷＰ＿１０７５９１７４７、ＷＰ＿１０５９７８３４８、ＷＰ＿０９６５９８４７６、ＷＰ＿１０７５８７１０２、ＷＰ＿１０７５３３８２５、ＷＰ＿１０７５８８３０８、ＷＰ＿１０７５６７９８９、ＷＰ＿０９６５４４３４７、ＷＰ＿０２３０１５７６４、ＷＰ＿１０３３２２０５３、ＷＰ＿０６０８０３５５９、ＷＰ＿０４８８０３０８５、ＷＰ＿１０７５３０４３３、ＷＰ＿１０７５８０７３１、ＷＰ＿１０７３６８９７１、ＷＰ＿１０７５５９９１２、ＷＰ＿１０７３７１３８７、ＷＰ＿１０７５７１６０９、ＷＰ＿１０７５５９９１１、ＷＰ＿１０７５７１６１０、ＷＰ＿１０７５３０４３６、ＷＰ＿１０７５８０４７２、ＷＰ＿０１７０００５９７、ＷＰ＿０２３３７４３６５、ＷＰ＿０６２１９７３４３、ＷＰ＿０３５５１２５０７、ＷＰ＿０７９７０８８２８、ＷＰ＿１０１０４０３０７、ＷＰ＿０５３２１６９９７、ＷＰ＿１０６５８８２９３、ＷＰ＿１０７５８５０２１、ＷＰ＿０８２０９９３２２、ＷＰ＿０１７１８５７３１、ＷＰ＿１０１６６２７６１、ＷＰ＿０８４７８０１６２、ＷＰ＿０１６８３７３３１、ＷＰ＿０８４７８１８９３、ＷＰ＿１０６４９４５５６、ＷＰ＿０８８８２５４３４、ＷＰ＿０８８８１６２７１、ＷＰ＿０５９１４０１４８、ＷＰ＿００７５４７５２５、ＷＰ＿０８４３４７８３５、ＷＰ＿０７０７１０４７５、ＷＰ＿０７７９０７９８１、ＷＰ＿０３５７２３５５２、ＷＰ＿０５８０９５０１７、ＷＰ＿００６４４６５６６、ＷＰ＿０７４６９３６７６、ＷＰ＿０５０９８０５４３、ＷＰ＿００１２７１０９３、ＷＰ＿００１２７１０９２、ＷＰ＿０８７９７１０２１、ＷＰ＿０６１６６８０６０、ＷＰ＿０１６１１９５６６、ＷＰ＿０１６１０６８８５、ＷＰ＿０８８０３１３６４、ＷＰ＿０８８０３８７１６、ＷＰ＿００７４７６４７３、ＷＰ＿００３３４３６３２、ＷＰ＿０８８０４９４２４、ＷＰ＿００３３５４１９６、ＷＰ＿０６６１４８４６７、ＷＰ＿０８２８０６５８８、ＷＰ＿０８７０９４９６８、ＷＰ＿０４８７２３０１４、ＷＰ＿０３３８４４７０７、ＷＰ＿０５５３５８８９１、ＷＰ＿０８１２０９８３６、ＷＰ＿０３３０１８７８０、ＷＰ＿０２３６３３３５０、ＷＰ＿０４６５８０８１１、ＷＰ＿０８１１５７４３３、ＷＰ＿０８７９５９８２４、ＷＰ＿０４１２６７８２３、ＷＰ＿０１８９２２７９１、ＷＰ＿０６３５７７９０５、ＷＰ＿０６６２２７２８５、ＷＰ＿０４４７３６０７２、ＷＰ＿０３３０１６９３６、ＷＰ＿１００６６４５１８、ＷＰ＿０６４２１３５８０、ＷＰ＿０５３５３２２２３、ＷＰ＿０４２２２４７１８、ＷＰ＿０８４１３８９９３、ＷＰ＿０１０６３２７２９、ＷＰ＿０１８１３０２０１、ＷＰ＿０８８０２７７９３、ＷＰ＿０６５２１２５２９、ＷＰ＿０４８５３９４５２、ＷＰ＿００１１０５０８３、ＷＰ＿００１１０５０８２、ＷＰ＿０８６３９７１１６、ＷＰ＿０８６３９０１５８、ＷＰ＿０７０００６５６７、ＷＰ＿００３７３９８３８、ＷＰ＿０７００３４６３４、ＷＰ＿０７５７０２５２１、ＷＰ＿０２９０９０９０５、ＷＰ＿０３８４０９２１１、ＷＰ＿０６９１２５６０１、ＷＰ＿０４６３２３３６６、ＷＰ＿０６９８８７４０１、ＷＰ＿０６９１３４５２３、ＷＰ＿０６１６６５４７２、ＷＰ＿０７０２９４２９３、ＷＰ＿００３７４９６６５、ＷＰ＿０７０７８４９８１、ＷＰ＿０３１６６９２０９、ＷＰ＿１０６７８７１６３、ＷＰ＿０７７２８７０２１、ＷＰ＿０８５３９２４５１、ＷＰ＿０２３５４８３２３、ＷＰ＿０６１１０８４９３、ＷＰ＿１０１１５２９６４、ＷＰ＿１０１１４３８４３、ＷＰ＿１０１１４３４５３、ＷＰ＿１０１１４０８１７、ＷＰ＿０６６４６５４３２、ＷＰ＿０３３９２０８９８、ＷＰ＿０６９００１０７２、ＷＰ＿０８５４００８８４、ＷＰ＿１０１０５７３６８、ＷＰ＿０８８８３８８２６、ＷＰ＿０７２２４０９４６、ＷＰ＿０３３８３８５０４、ＷＰ＿０１０９９１３６９、ＷＰ＿０７２２１８７６０、ＷＰ＿０７２２３８９３３、ＷＰ＿０７０２２７９６６、ＷＰ＿０６１６６３０１５、ＷＰ＿００３７３３０２９、ＷＰ＿１０１１４２２５２、ＷＰ＿０７００３１６９３、ＷＰ＿０７０７８５８２６、ＷＰ＿００３７３０７８５、ＷＰ＿０７０２７４５７５、ＷＰ＿００３７２７７０５、ＷＰ＿０６９８９０５０１、ＷＰ＿０７０２３３２４３、ＷＰ＿０７００３９３１２、ＷＰ＿０３１６６５３３７、ＷＰ＿０７０２２２８０２、ＷＰ＿０７０２６４５９２、ＷＰ＿１０３６８２１８８、ＷＰ＿０７０２９９１５３、ＷＰ＿０７０３０７３５５、ＷＰ＿０６１３９５９５９、ＷＰ＿０７０７６４１９９、ＷＰ＿０６１１２８８８９、ＷＰ＿０７０２８３５１９、ＷＰ＿０６９００９７２４、ＷＰ＿０７０２２８８４２、ＷＰ＿０１４６０１１７２、ＷＰ＿１０３７５７６７１、ＷＰ＿０７０２９３３９４、ＷＰ＿０６０５８７９３６、ＷＰ＿０７０２３８６０３、ＷＰ＿０７０２１５４６５、ＷＰ＿００３７２３６５０、ＷＰ＿０７０２１４４８１、ＷＰ＿０５８８７６４４５、ＷＰ＿０６０５６７９４１、ＷＰ＿０２９４９９８６１、ＷＰ＿０２７１２９６１３、ＷＰ＿００３１４５３７９、ＷＰ＿０８０１５１６２４、ＷＰ＿０２１７５２４４１、ＷＰ＿０６９１３２０１２、ＷＰ＿０８４０３８５１１、ＷＰ＿００４６３２１９６、ＷＰ＿０６６２３０９７５、ＷＰ＿０７２５２０２０７、ＷＰ＿０８２７２９１３７、ＷＰ＿０８０１４９０３８、ＷＰ＿０７２２３３０９１、ＷＰ＿０７２２４０４４５、ＷＰ＿０７２２１８４６５、ＷＰ＿０７２２３９６２４、ＷＰ＿０８０１５１６７０、ＷＰ＿０７７９１４２６５、ＷＰ＿０８０１５１７１２、ＷＰ＿０５２０２５６８２、ＷＰ＿０７７９１４２６４、ＷＰ＿１００３５３９６４、ＷＰ＿０４６５１７０４６、ＷＰ＿００８３４１３２４。
【０１４８】
一部の実施形態では、ｃＲＧＮ−Ａは、Ｇｉｂ１１（配列番号１）からのものである。一部の実施形態では、ｃＲＧＮは、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１（配列番号２）、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２（配列番号３）、またはＧｉｂ１１Ｓｐａ−３（配列番号４）である。
【０１４９】
他の小さいＣａｓヌクレアーゼ
一態様では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓからのＣａｓ９が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉからのものであり、配列番号３１のアミノ酸配列、または配列番号３１に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ  Ｃａｓ９、または「ＳｐａＣａｓ９」は、ＰＡＭ配列ＮＮＧＧを認識する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉからのものであり、配列番号３３のアミノ酸配列、または配列番号３３に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｔｉ  Ｃａｓ９、または「ＳｍｉＣａｓ９」は、ＰＡＭ配列ＮＮＧＧを認識する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓからのものであり、配列番号３２のアミノ酸配列、または配列番号３２に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアントを含む。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ  Ｃａｓ９、または「ＳｈｙＣａｓ９」は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＡＡＡを認識する。一部の場合では、これらの小さいＣａｓ９を、本明細書に記載されている系、組成物および方法のいずれかにおいてｓＲＧＮの代替として使用することができる。
【０１５０】
ｓＲＧＮポリペプチドに基づくＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系
一部の実施形態では、（ａ）ｓＲＧＮポリペプチド、もしくは配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するそのバリアント、またはｓＲＧＮポリペプチドもしくはそのバリアントをコードする核酸と、（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはｇＲＮＡをコードする核酸とを含む系であって、ｇＲＮＡが、ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、系が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、系は、ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む（またはこれからなる）。一部の実施形態では、系は、ｓＲＧＮをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１３〜２９に対して少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１３〜２９の配列を含む（またはこれからなる）。一部の実施形態では、系は、ｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、系は、ｇＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、系は、１つもしくは複数のさらなるｇＲＮＡ、または１つもしく複数のさらなるｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸のいずれかに従って、ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）細胞環境もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境での発現に適したプロモーターに、および／または（ｉｉ）適した核局在化シグナルに作動可能に連結されている。
【０１５２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡをコードする核酸のいずれかに従って、核酸は、（ｉ）細胞環境もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境での発現に適したプロモーターに、および／または（ｉｉ）適した核局在化シグナルに作動可能に連結されている、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、（ａ）配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むｓＲＧＮポリペプチド、または配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも９０％配列同一性を有するそのバリアントと、（ｂ）ｇＲＮＡとを含む系であって、ｇＲＮＡが、ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、系が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。
【０１５４】
一部の実施形態では、（ａ）配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むｓＲＧＮポリペプチド、または配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも９０％配列同一性を有するそのバリアントと、（ｂ）ｇＲＮＡをコードする核酸とを含む系であって、ｇＲＮＡが、ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、系が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。
【０１５５】
一部の実施形態では、（ａ）配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むｓＲＧＮポリペプチドをコードするかまたは配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも９０％配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸と、（ｂ）ｇＲＮＡとを含む系であって、ｇＲＮＡが、ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、系が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１３〜２９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号１３〜２９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。
【０１５６】
一部の実施形態では、（ａ）配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むｓＲＧＮポリペプチドをコードするかまたは配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも９０％配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸と、（ｂ）ｇＲＮＡをコードする核酸とを含む系であって、ｇＲＮＡが、ｓＲＧＮポリペプチドまたはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列へとガイドすることができる、系が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１３〜２９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号１３〜２９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。一部の実施形態では、系は、（ｉ）ｓＲＧＮポリペプチドをコードするかまたはそのバリアントをコードする核酸、および（ｉｉ）ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている系のいずれかに従って、系は、ドナー鋳型をさらに含む。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、標的ポリヌクレオチド配列への挿入のためのドナー配列を含む。一部の実施形態では、ドナー配列は、標的における発現のための導入遺伝子などの、外因性配列である。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、標的ポリヌクレオチド配列中の１つまたは複数の塩基を改変するためのドナー配列を含む。一部の実施形態では、系は、１つまたは複数のさらなるドナー鋳型をさらに含む。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、系内のｇＲＮＡに物理的に連結されている。
【０１５８】
本発明に係る一実施形態は、
（ａ）ｓＲＧＮポリペプチドまたは斯かるｓＲＧＮをコードする核酸；
（ｂ）単一異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｉｎ  ｓｉｔｕでの斯かるｓｇＲＮＡの作製を可能にする核酸（例えば、ＤＮＡ）（例えば、ｓｇＲＮＡをコードする核酸）であって、ｓｇＲＮＡが、
ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座における標的配列にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡ標的化セグメント、
ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、および
ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列
を含み、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、５’から３’への方向で配置されている、ｓｇＲＮＡまたは核酸
を含む組成物を提供する。
【０１５９】
ｓｇＲＮＡ内で、ｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列は、一般に、適したループ配列によって接続され、ステムループ構造を形成する。
【０１６０】
さらに、一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはｓｇＲＮＡをコードする核酸は、細胞もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境における発現に適したプロモーター、および／または適した核局在化シグナルを含有する。
【０１６１】
本発明に係る別の実施形態は、細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、１つまたは複数の位置における標的ＤＮＡを標的化、編集、改変または操作する方法であって、
（ａ）異種ｓＲＧＮポリペプチドまたはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸を、細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境に導入するステップと、
（ｂ）単一異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｉｎ  ｓｉｔｕでの斯かるｓｇＲＮＡの作製に適した核酸（例えば、ＤＮＡ）（例えば、ｓｇＲＮＡをコードする核酸）を導入するステップであって、ｓｇＲＮＡが、
ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座における標的配列にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡ標的化セグメント、
ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、および
ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列
を含み、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、５’から３’への方向で配置されている、ステップと、
（ｃ）標的ＤＮＡに１つまたは複数のカット、ニックまたは編集を創出するステップであって、ｓＲＧＮポリペプチドが、そのプロセシングされたまたはプロセシングされていない形態でのｇＲＮＡによって、標的ＤＮＡに方向付けられる、ステップと
を含む方法を提供する。
【０１６２】
本発明に係る別の実施形態は、細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）または無細胞系における、１つまたは複数の位置における標的ＤＮＡの標的化、編集、改変または操作のための、
（ａ）ｓＲＧＮポリペプチドまたは斯かるｓＲＧＮをコードする核酸と；
（ｂ）単一異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｉｎ  ｓｉｔｕでの斯かるｓｇＲＮＡの作製に適した核酸（例えば、ＤＮＡ）（例えば、ｓｇＲＮＡをコードする核酸）であって、ｓｇＲＮＡが、
ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座における斯かる標的配列にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡ標的化セグメント、
ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、および
ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列
を含み、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、５’から３’への方向で配置されている、ｓｇＲＮＡまたは核酸
を含む組成物の使用である。
【０１６３】
本発明に係る別の実施形態は、
（ａ）異種ｓＲＧＮポリペプチド、またはこれをコードする核酸、
（ｂ）単一異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｉｎ  ｓｉｔｕでの斯かるｓｇＲＮＡの作製に適した核酸（例えば、ＤＮＡ）（例えば、ｓｇＲＮＡをコードする核酸）であって、ｓｇＲＮＡが、
ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座における斯かる標的配列にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡ標的化セグメント、
ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、および
ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列
を含み、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、５’から３’への方向で配置されている、ｓｇＲＮＡまたは核酸
を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞
または、そのゲノムが、上述の（ａ）および（ｂ）を使用して標的化、編集、改変または操作された、斯かる細胞である。
【０１６４】
本発明に係る追加的な実施形態は、
（ａ）ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸であって、プロモーターまたはリボソーム結合部位に作動可能に連結されている核酸と；
（ｂ）単一異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｉｎ  ｓｉｔｕでの斯かるｓｇＲＮＡの作製に適した核酸（例えば、ＤＮＡ）（例えば、ｓｇＲＮＡをコードする核酸）であって、ｓｇＲＮＡが、
ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座における斯かる標的配列にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡ標的化セグメント、
ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、および
ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列
を含み、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、５’から３’への方向で配置されている、ｓｇＲＮＡまたは核酸と
または
（ａ）ｓＲＧＮポリペプチドと；
（ｂ）１つまたは複数の単一異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ｓｇＲＮＡのそれぞれが、
ｉｖ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座における斯かる標的配列にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡ標的化セグメント、
ｖ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、および
ｖｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列
を含み、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）が、５’から３’への方向で配置されている、ｓｇＲＮＡと
を含む、キットを含む。
【０１６５】
本発明に係るさらに別の実施形態は、細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）または無細胞系における、１つまたは複数の位置における１つまたは複数の標的ＤＮＡを標的化、編集、改変または操作するための組成物および方法であって、
（ａ）ｓＲＧＮポリペプチド、またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸と；
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはｉｎ  ｓｉｔｕでの斯かるｇＲＮＡの作製に適した核酸（例えば、ＤＮＡ）（例えば、ｇＲＮＡをコードする核酸）であって、ｇＲＮＡが、
ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座における斯かる標的配列にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡ標的化セグメント、
ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列
を含み、（ｉ）および（ｉｉ）が単一のＲＮＡ分子上に存在し、（ｉｉｉ）が別のＲＮＡ分子上に存在する、ｇＲＮＡまたは核酸と
を含む組成物および方法を含む。
【０１６６】
突然変異体
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、変更されたエンドリボヌクレアーゼ活性、またはプレｃｒＲＮＡ、中間体ｃｒＲＮＡもしくは成熟ｃｒＲＮＡの関連する半減期を有する突然変異体ポリペプチドである。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、実質的に縮小もしくは増強されたエンドリボヌクレアーゼ活性またはＤＮＡに対する結合親和性がない、変更または抑止されたＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する突然変異体ポリペプチドである。斯かる改変は、転写調節、活性化もしくは抑圧；メチル化、脱メチル化、アセチル化もしくは脱アセチル化によるエピジェネティック改変もしくはクロマチン改変、または当技術分野で公知のＤＮＡ結合および／またはＤＮＡ改変タンパク質の他のいずれかの改変の目的での、ｓＲＧＮポリペプチドの配列特異的ＤＮＡ標的化を可能にすることができる。
【０１６７】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性がない突然変異体ポリペプチドである。
【０１６８】
一部の実施形態では、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、原生生物、植物細胞または動物細胞である。
【０１６９】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドおよび単一異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）等の１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ポリペプチドおよび核酸をコードする同じまたは異なる組換えベクターによって、細胞に導入される。
【０１７０】
一部の実施形態では、ポリペプチド、核酸、またはポリペプチドおよび核酸の両方をコードする核酸は、改変される。
【０１７１】
一部の実施形態では、方法または系は、ドナーＤＮＡ配列を付加するステップをさらに含み、標的ＤＮＡ配列は、相同性により導かれる修復によって編集される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドドナー鋳型は、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに物理的に連結される。
【０１７２】
別の態様では、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはＲＮＡおよびＤＮＡのヘテロ二重鎖に対する活性を持たない、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖標的ＤＮＡを改変または編集するための方法が本明細書に提供される。
【０１７３】
マルチプレックス化
別の態様では、細胞における複数の位置におけるＤＮＡを編集または改変するための方法であって、ｉ）ｓＲＧＮポリペプチドまたはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入するステップと、ｉｉ）ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコードされ１つのプロモーターの制御下に置かれた、２つまたはそれよりも多いプレＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）を含む単一の異種核酸を細胞に導入するステップであって、各プレｃｒＲＮＡが、リピート−スペーサーアレイまたはリピート−スペーサーを含み、スペーサーが、ＤＮＡにおける標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートが、ステムループ構造を含み、ｓＲＧＮポリペプチドが、ステムループ構造の上流の２つまたはそれよりも多いプレｃｒＲＮＡを切断して、２つまたはそれよりも多い中間体ｃｒＲＮＡを作製し、２つまたはそれよりも多い中間体ｃｒＲＮＡが、２つまたはそれよりも多い成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされ、２つまたはそれよりも多い成熟ｃｒＲＮＡのそれぞれが、ＤＮＡに２つまたはそれよりも多い二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすようにｓＲＧＮポリペプチドをガイドする、ステップとから本質的になる方法が本明細書に提供される。例えば、ｓＲＧＮポリペプチドの利点の１つは、いくつかのリピート−スペーサー単位を含む１つのみのプレｃｒＲＮＡを導入することが可能であることであり、このいくつかのリピート−スペーサー単位は、導入後に、ｓＲＧＮポリペプチドによって、ＤＮＡにおけるいくつかの異なる配列を標的とする活性リピート−スペーサー単位へとプロセシングされる。
【０１７４】
一部の実施形態では、単一の異種核酸におけるプレｃｒＲＮＡ配列は、特異的な位置、方向、配列で、または特異的な化学的連結により一体に結合されて、異なるｃｒＲＮＡ配列によって指定される部位のそれぞれにおけるｓＲＧＮポリペプチドのエンドヌクレアーゼ活性を方向付けるまたは差次的に調節する。
【０１７５】
別の態様では、細胞における複数の位置におけるＤＮＡの構造または機能を編集または改変するための一般方法であって、ｉ）ポリペプチドとしてまたはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードする核酸として、ｓＲＧＮ等のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを細胞に導入するステップと、ｉｉ）ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコードされ１つまたは複数のプロモーターの制御下に置かれた、２つまたはそれよりも多いガイドＲＮＡを含むまたはコードする単一の異種核酸を導入するステップであって、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの活性または機能が、単一の異種核酸におけるガイドＲＮＡ配列によって方向付けられる、ステップとから本質的になる一般方法の例が本明細書に提供される。
【０１７６】
ｓＲＧＮポリペプチドのコドン最適化されたＤＮＡ配列
本方法の一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸配列は、改変された核酸である、例えば、コドン最適化されている。本方法の一部の実施形態では、単一の異種核酸は、改変された核酸である。本方法の一部の実施形態では、本方法は、細胞にポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドドナー鋳型は、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに物理的に連結される。本方法の一部の実施形態では、ＤＮＡは、相同性により導かれる修復、非相同末端結合またはマイクロホモロジー媒介性末端結合のいずれかによって、ＤＳＢにおいて修復される。
【０１７７】
本方法の一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、局所的環境において成熟ｃｒＲＮＡとより容易に複合体形成し、よって、局所的環境においてプレｃｒＲＮＡから同ｓＲＧＮポリペプチドによってプロセシングされたｃｒＲＮＡの帰結として、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を方向付けるためにより容易に利用できる。
【０１７８】
本方法の一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ発現構築物内で１つまたは複数のｃｒＲＮＡ配列に対し５’または３’に異種配列が取り込まれている、改変されたプレｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチド配列からの、１つまたは複数の成熟ｃｒＲＮＡ配列の切断、単離または精製に使用される。異種配列は、安定性、半減期、発現レベルもしくはタイミング、ｓＲＧＮポリペプチドもしくは標的ＤＮＡ配列との相互作用、または当技術分野で公知の他のいずれかの物理的もしくは生化学的特徴を改変するために取り込むことができる。
【０１７９】
本方法の一部の実施形態では、プレｃｒＲＮＡ配列は、プレｃｒＲＮＡ配列内の２つまたはそれよりも多い成熟ｃｒＲＮＡ配列の差次的調節を提供するために改変されて、安定性、半減期、発現レベルもしくはタイミング、ｓＲＧＮポリペプチドもしくは標的ＤＮＡ配列との相互作用、または当技術分野で公知の他のいずれかの物理的もしくは生化学的特徴を差次的に改変する。
【０１８０】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチド（またはその核酸コード変異体）は、機能、活性、反応速度、半減期またはその他等、所望の特徴を改善するために改変される。斯かる改変の斯かる非限定的な例の１つは、ｓＲＧＮポリペプチドの「切断ドメイン」を、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９由来のＲｕｖＣまたはＨＮＨドメイン等の異なるヌクレアーゼ由来の相同または異種切断ドメインに置き換えることである。
【０１８１】
一態様では、細胞におけるＤＮＡを標的化、編集または操作するための方法であって、インタクトなまたは部分的にもしくは完全に欠損したｓＲＧＮポリペプチドまたはプレｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ部分を二量体ＦＯＫ１ヌクレアーゼに連結して、１つまたは複数のｃｒＲＮＡ分子によって１つまたは複数の特異的ＤＮＡ標的部位に方向付けられるように、エンドヌクレアーゼ切断を方向付けるステップを含む方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、ＦＯＫ１ヌクレアーゼ系は、ニッカーゼもしくは温度感受性突然変異体または当技術分野で公知の他のいずれかの変異体である。
【０１８２】
一部の実施形態では、二量体ＦＯＫ１ヌクレアーゼと連結されたｓＲＧＮポリペプチドは、ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコードされ１つのプロモーターの制御下に置かれた、２つまたはそれよりも多いプレＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）を含む単一の異種核酸と共に、細胞に導入され、各プレｃｒＲＮＡは、リピート−スペーサーアレイを含み、スペーサーは、ＤＮＡにおける標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートは、ステムループ構造を含み、ｓＲＧＮポリペプチドは、ステムループ構造の上流の２つまたはそれよりも多いプレｃｒＲＮＡを切断して、２つまたはそれよりも多い中間体ｃｒＲＮＡを作製する。
【０１８３】
一態様では、細胞におけるＤＮＡを標的化、編集または操作するための方法であって、インタクトなまたは部分的にもしくは完全に欠損したｓＲＧＮポリペプチドまたはプレｃｒＲＮＡ、中間体ｃｒＲＮＡ、成熟ｃｒＲＮＡ部分もしくはｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡとまとめて称される）をドナー一本または二本鎖ＤＮＡドナー鋳型に連結して、１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ分子によって１つまたは複数の特異的ＤＮＡ標的部位に方向付けられるように、外因性ＤＮＡ配列の相同組換えを容易にするステップを含む方法が本明細書に提供される。
【０１８４】
さらに別の態様では、相同組換えまたは相同性により導かれる修復のために、ＤＮＡ鋳型を、遺伝子編集の特異的部位に方向付けるための方法が本明細書に提供される。この点に関して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ鋳型は、化学的にまたは当技術分野で公知の他の手段によって、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに連結される。一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに連結されたままである；さらに他の例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡを切断し、ＤＮＡ鋳型を遊離させて、相同組換えを可能にするまたは容易にする。
【０１８５】
さらに別の態様では、細胞におけるＤＮＡを標的化、編集または操作するための方法であって、１つまたは複数のｃｒＲＮＡ分子によって１つまたは複数の特異的ＤＮＡ標的部位に方向付けられるように、インタクトなまたは部分的にもしくは完全に欠損したｓＲＧＮポリペプチドまたはプレｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ部分を、転写活性化因子もしくは抑圧因子、またはメチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼもしくはデアセチラーゼ等のエピジェネティックモディファイヤー、またはシグナル伝達もしくは検出分子に連結するステップを含む方法が本明細書に提供され、これらの全態様は、Ｃａｓ９系に関して以前に記載された。
【０１８６】
別の態様では、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに連結されたポリヌクレオチドドナー鋳型を含む組成物が本明細書に提供される。細胞におけるＤＮＡを標的化、編集または操作するための方法であって、１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ分子によって１つまたは複数の特異的ＤＮＡ標的部位に方向付けられるように、ドナー鋳型が、ｓＲＧＮポリペプチドによってプレｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡから切断され、これにより、ドナー鋳型による相同性により導かれる修復を容易にするように、プレｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡをドナー一本または二本鎖ポリヌクレオチドドナー鋳型に連結するステップを含む方法。
【０１８７】
ｓＲＧＮポリペプチドを使用して、他のドメインおよび活性が導入された、キメラ結合タンパク質を形成することもできる。説明として、Ｆｏｋｌドメインは、触媒活性があるエンドヌクレアーゼドメインを含有し得るｓＲＧＮタンパク質に融合させることができる、またはＦｏｋｌドメインは、ｓＲＧＮポリペプチドエンドヌクレアーゼドメインを不活性にするように改変されたｓＲＧＮタンパク質に融合させることができる。ｓＲＧＮポリペプチドとのキメラタンパク質を作製するために融合され得る他のドメインは、転写モジュレーター、エピジェネティックモディファイヤー、タグおよび他の標識または造影剤、ヒストン、および／または遺伝子配列の構造もしくは活性を調節もしくは改変する当技術分野で公知の他のモダリティを含む。
【０１８８】
核酸および／またはアミノ酸改変
一部の実施形態では、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、さらに本明細書に記載され、当技術分野で公知の通り、例えば、活性、安定性もしくは特異性の増強、送達の変更、宿主細胞における自然免疫応答の低下、タンパク質サイズのさらなる低下、または他の増強のために使用することができる１つまたは複数の改変を含む。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、改変されたポリヌクレオチドは、ｓＲＧＮに基づくＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において使用され、この場合、細胞に導入されるガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、下に記載および説明されている通りに改変することができる。斯かる改変されたポリヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において使用して、いずれか１つまたは複数のゲノム遺伝子座を編集することができる。
【０１９０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の構成成分
Ａ．ガイドＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ
本発明の態様では、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ＤＮＡ標的化セグメント、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」または「ＤＮＡ標的化配列」は、標的部位を指定する、ガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐ配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用することができる。用語「ｔｒａｃｒメイト配列」は、用語「ダイレクトリピート」と互換的に使用することもできる。
【０１９１】
一部の態様では、本発明に係る単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、
ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座における標的配列にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡ標的化セグメントまたはＤＮＡ標的化配列、
ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、および
ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列
を含み、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、５’から３’への方向で配置されている。一部の実施形態では、構成成分（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、単一のキメラＲＮＡに存在する。
【０１９２】
ｓｇＲＮＡ内で、ｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列は、適したループ配列によって接続され、ステムループ構造を形成することができる。
【０１９３】
一般に、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒ配列と、次のうち１つまたは複数を促進するのに十分な相補性を有するいずれかの配列を含む：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞におけるｔｒａｃｒメイト配列に隣接するＤＮＡ標的化セグメントの切除；および（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成であって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされたｔｒａｃｒメイト配列を含む、形成。一般に、相補性の程度は、２配列の短い方の長さに沿った、ｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の最適アラインメントの参照による。最適アラインメントは、いずれか適したアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、ｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列のいずれかの内の自己相補性等の二次構造をさらに説明することができる。一部の実施形態では、最適にアライメントされた場合の２配列の短い方の３０ヌクレオチドの長さに沿ったｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列の間の相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれを超える値またはそれよりも高い。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれを超える値またはそれよりも多いヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列は、両者の間のハイブリダイゼーションが、ヘアピン等の二次構造を有する転写物を産生するように、単一の転写物内に含有される。本発明のある実施形態では、転写物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２個またはそれよりも多いヘアピンを有する。
【０１９４】
一部の実施形態では、転写物は、２、３、４または５個のヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、転写物は、多くても５個のヘアピンを有する。ヘアピン構造において、最終の「Ｎ」の５’およびループの上流の配列の部分は、ｔｒａｃｒメイト配列に対応し、ループの３’の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。ＤＮＡ標的化セグメント、ｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列を含む単一のポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、次の通りであり（５’から３’に収載）、「Ｎ」は、ＤＮＡ標的化セグメントの塩基を表し、小文字の第１のブロックは、ｔｒａｃｒメイト配列を表し、小文字の第２のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最終ポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：
【０１９５】
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。換言すると、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）による配列特異的様式で、標的ＤＮＡと相互作用する。そのようなものとして、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変動する場合があり、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用するであろう標的ＤＮＡ内の位置を決定する。ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内のいずれか所望の配列にハイブリダイズするように改変することができる（例えば、遺伝子操作により）。
【０１９６】
ＤＮＡ標的化セグメントは、１０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さを有することができる。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化セグメントは、１３ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さを有する。
【０１９８】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化セグメントは、１５ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの長さを有する。
【０１９９】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化セグメントは、２０〜２２ヌクレオチド等、１８ヌクレオチド〜２２ヌクレオチドの長さを有する。
【０２００】
ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列および標的ＤＮＡの標的配列の間のパーセント相補性は、２０〜２２ヌクレオチドにわたり、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）となることができる。
【０２０１】
標的ＤＮＡにおける標的配列に相補的なプロトスペーサー配列は、その３’末端におけるｓＲＧＮポリペプチドに適したＰＡＭ配列に隣接し得る、または斯かるＰＡＭ配列は、ＤＮＡ標的化セグメントの３’部分の一部となることができる。
【０２０２】
斯かる使用の非限定的な説明目的のためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、ガイドＲＮＡの改変を使用して、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮ等のＣａｓエンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集複合体の形成または安定性を増強することができる。ガイドＲＮＡの改変は、同様にまたはその代わりに、ゲノムにおける標的配列とゲノム編集複合体との間の相互作用の開始、安定性または反応速度の増強に使用することができ、これは、例えば、オン標的活性の増強に使用することができる。ガイドＲＮＡの改変は、同様にまたはその代わりに、特異性、例えば、他の（オフ標的）部位における効果と比較したオンターゲット部位におけるゲノム編集の相対的比率の増強に使用することができる。
【０２０３】
改変は、同様にまたはその代わりに、例えば、細胞に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対するその耐性を増加させ、これにより、細胞におけるその半減期を増加させることにより、ガイドＲＮＡの安定性の増加に使用することができる。エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期の増加は、ガイドＲＮＡおよびコードされるＣａｓエンドヌクレアーゼが細胞において共存する時間の増加に使用することができるため、ガイドＲＮＡ半減期を増強する改変は、ｓＲＧＮポリペプチドを作製するために翻訳されることが必要なＲＮＡにより編集されるべき細胞にｓＲＧＮポリペプチド等のＣａｓエンドヌクレアーゼが導入される実施形態において、特に有用となることができる。
【０２０４】
Ｂ．プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭまたはＰＡＭ配列）
ｓＲＧＮポリペプチドに適したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列は、「ＡＮＧＧ」および「ＮＮＧＧ」を含む。
【０２０５】
切断の部位は、一般に、ＰＡＭ配列の上流１もしくは３塩基対内、ＰＡＭ配列の３塩基対内、またはＰＡＭ配列「ＮＮＧＧ」の上流３塩基対内等、ＰＡＭ配列の上流１〜３塩基対内に発生する。他のＰＡＭは当技術分野で公知であり、斯かるＰＡＭを標的化するようにｓＲＧＮを操作することができる。
【０２０６】
Ｃ．真核細胞における使用
本発明に係る一実施形態では、本明細書に記載されているｓＲＧＮ系は、哺乳動物細胞等、真核細胞において使用することができる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト胎児細胞ではなく、ヒト胎児細胞に由来もしない。一部の実施形態では、細胞は、ヒト胚細胞ではなく、ヒト胚細胞に由来もしない。一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法は、ヒト胎児またはヒト胚の破壊を含まない。一部の実施形態では、対象（または個体、本明細書中の何を使用することになるにせよ）は、ヒト胎児でもヒト胚でもない。
【０２０７】
本発明の他の特色
改変は、細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を惹起する可能性または程度を低下させるために、同様にまたは代替的に、使用することができる。斯かる応答は、下で説明されるようなおよび当技術分野で説明されているような、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関して十分に特徴付けられており、ＲＮＡの半減期減少および／またはサイトカインもしくは免疫応答に関連する他の因子の惹起を伴う傾向がある。
【０２０８】
細胞に導入されるｓＲＧＮポリペプチドなどのエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに、１つまたは複数のタイプの改変を加えることもでき、そのような改変には、限定ではないが、ＲＮＡの安定性を（例えば、細胞に存在するＲＮａｓｅによるその分解を減少させることにより）増強する改変、結果として生じる産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を増進する改変、および／または細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を惹起する可能性もしくは程度を低下させる改変が含まれる。前述のものおよび他のものなどの改変の組合せを同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの場合、例えば、１つもしくは複数のタイプの改変をガイドＲＮＡ（上で例示したものを含む）に加えることができ、および／または１つもしくは複数のタイプの改変を、ＣＡＳエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上で例示したものを含む）に加えることができる。
【０２０９】
実例として、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において使用されるガイドＲＮＡまたは他のより小さいＲＮＡを、下で例証されるようなおよび当技術分野で説明されているような、いくつかの改変の容易な組み込みを可能する化学的手段によって、容易に合成することができる。化学合成手順は増え続けているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの手順による斯かるＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長がおよそ１００ヌクレオチドを超えて有意に増加するとより困難になる傾向がある。より長い長さの化学的に改変されたＲＮＡを作出するために使用される１つの手法は、互いにライゲーションされる２つまたはそれより多くの分子を産生する手法である。ｓＲＧＮポリペプチドをコードするものなどの、よりいっそう長いＲＮＡは、より容易に酵素的に作出される。酵素的に産生されるＲＮＡにおいて使用するための利用可能な改変のタイプは一般により少ないが、それでも、下でさらに説明されるようにおよび当技術分野で説明されているように、例えば、安定性を増強するために、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低下させるために、および／または他の特質を増強するために、使用することができる改変があり、新しいタイプの改変が定期的に開発され続けている。様々なタイプの改変、特に、より小さい化学合成ＲＮＡで頻繁に使用されているものの実例として、改変は、糖の２’位が改変された１つまたは複数のヌクレオチド、一部の実施形態では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ改変ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ改変は、ＲＮＡの３’末端のピリミジン、塩基性残基または逆方向塩基のリボースに対する２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’Ｏ−メチル改変を含む。斯かる改変は、オリゴヌクレオチドに日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（すなわち、高い標的結合親和性）を有することが示されている。
【０２１０】
いくつかのヌクレオチドおよびヌクレオシド改変は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ネイティブオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対する耐性を高くすることが示されており、これらの改変オリゴヌクレオチドは、未改変オリゴヌクレオチドより長時間にわたって存在し続ける。改変オリゴヌクレオチドの具体的な例としては、改変された骨格、例えば、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合を含むものが挙げられる。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、ヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格としても公知）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格；アミド骨格［De  Mesmaeker  et  al.,  Ace.  Chem.  Res.,  28:366-374  (1995)を参照］；モルホリノ骨格構造（Summerton  and  Weller、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格に置き換えられており、ヌクレオチドがポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合している；Nielsen  et  al.,  Science  1991,  254,  1497を参照）を有するものである。リン含有結合は、ホスホロチオエート；キラルホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；リン酸トリエステル；アミノアルキルリン酸トリエステル；メチルホスホネート、ならびに３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート；ホスフィネート；３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含む、ホスホロアミデート；チオノホスホロアミデート；チオノアルキルホスホネート；チオノアルキルリン酸トリエステル；ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ；ならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’で結合されている、逆の方向性を有するものを含むが、それらに限定されない；米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、および同第５，６２５，０５０号を参照されたい。
【０２１１】
モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、Braasch  and  David  Corey,  Biochemistry,  41(14):  4503-4510  (2002)；Genesis,  Volume  30,  Issue  3,  (2001)；Heasman,  Dev.  Biol.,  243:209-214  (2002)；Nasevicius  et  al.,  Nat.  Genet.,  26:216-220  (2000)；Lacenra  eta!.,  Proc.  Nat/.  Acad.  Sci.,  97:  9591-9596  (2000)；および１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。シクロへキシル核酸オリゴヌクレオチド模倣体は、Wang  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  122:  8595-8602  (2000)に記載されている。
【０２１２】
リン原子を内部に含まない改変オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの混合型ヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するもの、ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分部分を有する他のものを含む。米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号を参照されたく、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
１つまたは複数の置換糖部分、例えば、以下のもののうちの１つを２’位に含むものも、含むことができる：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２もしくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは、１〜１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリル（ａｌｋａｒｙｌ）もしくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル：ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基および同様の特性を有する他の置換基。一部の実施形態では、改変は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても公知）（Martin  et  al.,  Helv.Chim.Acta,  1995,  78,  486）を含む。他の改変は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２  ＣＨ２ＣＨ３）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。オリゴヌクレオチドの他の位置、特に、３’末端ヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位に、同様の改変を加えることもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体を有することもある。一部の実施形態では、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が、新規の基に置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つの斯かるオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物の場合、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えばアミノエチルグリシン骨格、に置き換えられる。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合されている。ＰＮＡ化合物の調製が教示されている代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号および同第５，７１９，２６２号を含むが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsen  et  al,  Science,  254:  1497-1500  (1991)に見出すことができる。
【０２１４】
ガイドＲＮＡは、加えてまたは代わりに、核酸塩基（代わりに「塩基」とも称される）改変または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「無改変」または「天然」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。改変された核酸塩基は、天然核酸にはまれにしかまたは一時的にしか見られない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、当技術分野では５−Ｍｅ−Ｃとも称されることもある）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲンチオビオシル（gentobiosyl）ＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンを含む。Kornberg,  A,  DNA  Replication,  W.  H.  Freeman  &  Co.,  San  Francisco,  pp75-77  (1980);  Gebeyehu  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.  15:4513  (1997)。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンも、含むことができる。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸の二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Sanghvi,  Y.  S.,  in  Crooke,  S.  T.  and  Lebleu,  B.,  eds.,  Antisense  Research  and  Applications,  CRC  Press,  Boca  Raton,  1993,  pp.  276-278）、塩基置換の実施形態である。
【０２１５】
改変された核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン；５−ウラシル（シュードウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他のａ−置換アデニンおよびグアニン；５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニン（methylquanine）および７−メチルアデニン；８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン；ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。
【０２１６】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、'The  Concise  Encyclopedia  of  Polymer  Science  And  Engineering',  pages  858-859,  Kroschwitz,  J.l.,  ed.  John  Wiley  &  Sons,  1990に開示されているもの、Englisch  et  al.,  Angewandte  Chemie,  International  Edition',  1991,  30,  page  613により開示されているもの、およびSanghvi,  Y.  S.,  Chapter  15,  Antisense  Research  and  Applications',  pages  289-  302,  Crooke,  S.T.  and  Lebleu,  B.  ea.,  CRC  Press,  1993により開示されているものを含む。これらの核酸塩基のうちのいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Sanghvi,  Y.S.,  Crooke,  S.T.  and  Lebleu,  B.,  eds,  'Antisense  Research  and  Applications',  CRC  Press,  Boca  Raton,  1993,  pp.  276-278）、塩基置換の、よりいっそう詳細には２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせられる場合の、実施形態である。改変された核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第５，７５０，６９２号、同第５，７６３，５８８号、同第５，８３０，６５３号、同第６，００５，０９６号、および米国特許出願公開第２００３０１５８４０３号に記載されている。
【０２１７】
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に改変される必要はなく、実際、前述の改変のうち１つより多くが、単一のオリゴヌクレオチドにまたはさらにはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込まれることもある。
【０２１８】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドなどのエンドヌクレアーゼをコードする、ガイドＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ（もしくはＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する１つまたは複数の部分またはコンジュゲートに化学的に連結される。斯かる部分は、コレステロール部分などの脂質部分［Letsinger  et  al.,  Proc.  Nat/.  Acad.  Sci.  USA,  86:  6553-6556  (1989)］；コール酸［Manoharan  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  Let.,  4:  1053-1060  (1994)］；チオエーテル、例えば、ヘキシル（hexyi）−Ｓ−トリチルチオール［Manoharan  eta/,  Ann.  N.  Y  Acad.  Sci.,  660:  306-309  (1992)およびManoharan  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  Let.,  3.  2765-2770  (1993)］；チオコレステロール［Oberhauser  et  al.,Nucl.  Acids  Res.,  20:  533-538  (1992)］；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Kabanov  et  al.,  FEBS  Lett.,  259:  327-330  (1990)およびSvinarchuk  et  al.,  Biochimie,  75:  49-  54  (1993)］；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Manoharan  et  al.,  Tetrahedron  Lett.,  36:3651-3654  (1995)およびShea  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  18:  3777-3783  (1990)］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Mancharan  et  al.,  Nucfeosides  &  Nucleotides,  14:  969-973  (1995)］；アダマンタン酢酸［Manoharan  et  at.,  Tetrahedron  Lett.,  36:  3651-3654  (1995)］；パルミチル部分［(Mishra  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta,  1264:  229-237  (1995)］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分［Crooke  et  al.,  J.  Pharmacal.  Exp.  Ther.,  277:  923-937  (1996)］を含むが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２���、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号も参照されたい。
【０２１９】
糖および他の部分を使用して、タンパク質、ならびにヌクレオチドを含む複合体、例えばカチオン性ポリソームおよびリポソームを、特定の部位に標的化することができる。例えば、肝細胞に方向づけられた移入は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）によって媒介され得る；例えば、Hu,  et  al.,  Protein  Pept  Lett.  21(1  0):1025-30  (2014)。当技術分野で公知であり、定期的に開発されている他の系を使用して、本件に使用される生体分子および／またはその複合体を、目的の特定の標的細胞に標的化することができる。
【０２２０】
これらの標的化部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基と共有結合しているコンジュゲート基を含み得る。本発明のコンジュゲート基は、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基を含む。典型なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられる。本発明に関して、薬力学的特性を増強する基は、取込みを改善する、分解に対する耐性を増強する、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明に関して、薬物動態学的特性を増強する基は、本発明の化合物の取込み、分布、代謝または排泄を改善する基を含む。代表的なコンジュゲート基は、参照により本明細書に組み込まれる、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６、および米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。コンジュゲート部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
【０２２１】
化学合成にあまり適しておらず、一般に酵素合成により産生される、より長いポリヌクレオチドを、様々な手段により改変することができる。斯かる改変は、例えば、ある特定のヌクレオチドアナログの導入、分子の５’もしくは３’末端への特定の配列もしくは他の部分の組み込み、および他の改変を含み得る。実例として、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、長さおよそ３ｋｂ〜３．３ｋｂであり、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により合成することができる。ｍＲＮＡに対する改変を適用して、例えば、その翻訳もしくは安定性を増大させることができ（例えば、細胞での分解に対するその耐性を増大させることにより）、または外因性ＲＮＡの導入後に現れる自然免疫応答を惹起する、ＲＮＡ、特に、ｓＲＧＮをコードするものなどのより長いＲＮＡの傾向を、低減させることができる。
【０２２２】
非常に多くの斯かる改変、例えば、ポリＡ尾部、５’キャップアナログ（例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）もしくはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、改変５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、改変塩基（例えば、シュード−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）もしくはＮ６−メチル−ＡＴＰ）の使用、または５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼでの処理が、当技術分野で説明されている。これらおよび他の改変は当技術分野で公知であり、ＲＮＡの新しい改変が開発され続けている。
【０２２３】
改変ＲＮＡは、例えば、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｘｏｌａｂｓ、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎおよび多くの他の会社を含む、供給業者から得ることができる。Ｔｒｉｌｉｎｋにより説明されているように、例えば、５−メチル−ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼ安定性の増大、翻訳の増加、または自然免疫受容体とｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡとの相互作用の低減などの、望ましい特徴を付与することができる。５’−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、ならびにシュード−ＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰは、下で言及するKonmannらおよびWarrenらによる公表文献において例証されているように、培養下およびｉｎ  ｖｉｖｏで自然免疫刺激を低減させる一方で翻訳を増進することも示されている。
【０２２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏで送達される化学的に改変されたｍＲＮＡを使用して治療効果の改善を達成することができることが示されている；例えば、Kormann  et  al.,  Nature  Biotechnology  29,  154-157  (2011)。斯かる改変を使用して、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増大させることおよび／またはその免疫原性を低下させることができる。化学的改変、例えば、シュード−Ｕ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、および５−メチル−Ｃを使用して、ウリジンおよびシチジン残基の４分の１だけを２−チオ−Ｕおよび５−メチル−Ｃでそれぞれ置換することで、マウスにおけるｍＲＮＡのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介性認識が著しく減少することになることが判明した。したがって、自然免疫系の活性化を低減させることにより、これらの改変を使用してｉｎ  ｖｉｖｏでｍＲＮＡの安定性および寿命を効果的に増加させることができる；例えば、Konmann  et  al.、上記。
【０２２５】
先天的な抗ウイルス応答を回避するように設計された改変を含んでいる合成メッセンジャーＲＮＡの反復投与は、分化したヒト細胞を多能性に再プログラムすることができることも示されている。例えば、Warren,  et  al.,  Cell  Stem  Cell,  7(5):618-30  (2010)を参照されたい。主要な再プログラミングタンパク質として作用する斯かる改変ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラムする有効な手段であり得る。斯かる細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称され、５−メチル−ＣＴＰ、シュード−ＵＴＰおよびアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を含んでいる酵素的に合成されたＲＮＡを使用して、細胞の抗ウイルス応答を効果的に逃れることができることが判明した；例えば、Warren  et  al.、上記。当技術分野で説明されているポリヌクレオチドの他の改変は、例えば、ポリＡ尾部の使用、５’キャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））の付加、５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、または５’末端リン酸−を除去するためのホスファターゼによる処理を含み、新しい手法が定期的に開発され続けている。
【０２２６】
本明細書で使用される改変ＲＮＡの作出に適用可能ないくつかの組成物および技法が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の改変に関連して開発されてきた。ｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは特定の課題を提示する。なぜなら、ｍＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングに対するそれらの効果が一般に一時的なものであり、これにより反復投与が必要とされ得るからである。加えて、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、ウイルス感染の副産物であることが多いｄｓＲＮＡを検出および中和するように進化した免疫応答を有する。それ故、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）などの哺乳動物酵素、および潜在的にｄｓＲＮＡへの細胞応答を媒介することができるレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、ならびに斯かる分子に応答してサイトカインの誘導を誘発することができるＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）がある；例えば、Angart  et  al.,  Pharmaceuticals  (Basel)  6(4):  440-468  (2013)；Kanasty  et  al.,  Molecular  Therapy  20(3):  513-524  (2012)；Burnett  et  al.,  Biotechnol  J.  6(9):1130-46  (2011)；Judge  and  Maclachlan,  Hum  Gene  Ther  19(2):111-24  (2008)による概説、およびそこに引用されている参考文献。
【０２２７】
当技術分野で説明されている改変は、ＲＮＡ安定性を増強するために、自然免疫応答を低減させるために、および／または本明細書に記載されているようなヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用であり得る他の恩恵を得るために開発され、適用されてきた；例えば、Whitehead  KA  et  al.,  Annual  Review  of  Chemical  and  Biomolecular  Engineering,  2:77-96  (2011)；Gaglione  and  Messere,  Mini  Rev  Med  Chem,  10(7):578-95  (2010)；Chernolovskaya  et  al,  Curr  Opin  Mol  Ther.,  12(2):158-67  (2010)；Deleavey  et  al.,  Curr  Protoc  Nucleic  Acid  Chem  Chapter  16:Unit  16.3  (2009)；Behlke,  Oligonucleotides  18(4):305-19  (2008)；  Fucini  et  al.,  Nucleic  Acid  Ther  22(3):  205-210  (2012)；Bremsen  et  al.,  Front  Genet  3:154  (2012)による概説。
【０２２８】
前述の通り、改変ＲＮＡのいくつかの供給業者があり、これらの多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された改変を専門にしている。文献で報告された様々な発見に基づいて、様々な手法が提案されている。例えば、Dharmaconは、硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）での非架橋酸素の置き換えが、Kale,  Nature  Reviews  Drug  Discovery  11:125-140  (2012)により報告されたように、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために広範に使用されてきたことに注目している。リボースの２’位の改変は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方で二重鎖安定性（Ｔｍ）を増大させることが報告されており、これは、免疫活性化からの保護をもたらすことも示されている。適度なＰＳ骨格改変と、良好な耐容性を示した小さい２’置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との組合せは、Soutschek  et  al.  Nature  432:173-178  (2004)により報告されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用のための安定性の高いｓｉＲＮＡに関連付けられており；２’−Ｏ−メチル改変は、Volkov,  Oligonucleotides  19:191-202  (2009)により報告されているように、安定性の改善に有効であると報告されている。自然免疫応答の誘導を減少させることに関して、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロで特定の配列の改変は、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を減少させるが一般にサイレンシング活性を維持することが報告されている；例えば、Judge  et  al.,  Mol.  Ther.  13:494-505  (2006)；およびCekaite  et  al.,  J  Mol  Biol.  365:90-108  (2007)。２−チオウラシル、シュードウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシルおよびＮ６−メチルアデノシンなどの、さらなる改変は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８により媒介される免疫効果を最小限に抑えることも示されている；例えば、Kariko,  K.  et  al.,  Immunity  23:165-175  (2005)。
【０２２９】
当技術分野でも公知であり、市販されているような、いくつかのコンジュゲートを、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドに、細胞によるそれらの送達および／または取込みを増進することができる本明細書での使用のために、適用することができ、そのようなコンジュゲートには、例えば、コレステロール、トコフェロールおよび葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカーおよびアプタマーが含まれる；例えば、Winkler,  Ther  Deliv.  4:791-809  (2013)による概説、およびそこに引用されている参考文献。
【０２３０】
模倣体
核酸は、核酸模倣体となることができる。用語「模倣体」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、フラノース環のみまたはフラノース環とヌクレオチド間連結の両方が非フラノース基に置き換えられたポリヌクレオチドを含むことが意図され、フラノース環のみの置換えは、当技術分野では、糖代理であるとも称される。複素環塩基部分または改変された複素環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。斯かる核酸の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格に置き換えられる。ヌクレオチドは、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合される。
【０２３１】
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されたポリヌクレオチド模倣体の１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物における骨格は、２つまたはそれよりも多い連結されたアミノエチルグリシン単位であり、これは、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える。複素環塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製について記載する代表的な米国特許として、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３２】
研究されてきたポリヌクレオチド模倣体の別のクラスは、モルホリノ環に結合した複素環塩基を有する連結されたモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸においてモルホリノ単量体単位を連結するいくつかの連結基が報告された。連結基のクラスの１つが、非イオン性オリゴマー化合物を生じるように選択された。非イオン性モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との間に望まれない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、細胞タンパク質との間に望まれない相互作用を形成する可能性が低い、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣物である（Braasch,  D.  A.,  and  Corey,  D.  R.,  Biochemistry,  2002,  41(14),  4503-4510）。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。単量体サブユニットを結合する種々の異なる連結基を有する、ポリヌクレオチドのモルホリノクラス内の種々の化合物が調製された。
【０２３３】
ポリヌクレオチド模倣体のさらに別のクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＧｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に正常に存在するフラノース環は、シクロヘキセニル（cydohexenyl）環に置き換えられる。ＧｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホラミダイト単量体は、古典的ホスホラミダイト化学に続くオリゴマー化合物合成のために調製および使用された。完全に改変されたＧｅＮＡオリゴマー化合物、およびＧｅＮＡにより改変された特異的な位置を有するオリゴヌクレオチドが、調製および研究された（Wang  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2000,  122,  8595-8602を参照）。一般に、ＤＮＡ鎖へのＧｅＮＡ単量体の取込みは、そのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド安定性を増加させる。ＧｅＮＡオリゴアデニル酸塩は、ネイティブ複合体と同様の安定性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ相補体と複合体を形成した。天然核酸構造へのＧｅＮＡ構造の取込みの研究は、容易な立体構造適応を進めることがＮＭＲおよび円二色性によって示された。
【０２３４】
さらに別の改変は、２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、これにより２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン連結を形成し、これにより二環式糖部分を形成した、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。連結は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨｚ−）基となることができ、式中、ｎは１または２である（Singh  et  al.,  Chem.  Commun.,  1998,  4,  455-456）。ＬＮＡおよびＬＮＡアナログは、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡと非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼ的分解に対する安定性、および良好な溶解性特性を呈する。ＬＮＡを含有する強力で無毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて記載された（Wahlestedt  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A,  2000,  97,  5633-5638）。
【０２３５】
ＬＮＡ単量体、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシルの合成および調製は、それらのオリゴマー形成、また、核酸認識特性と共に記載されている（Koshkin  et  al.,  Tetrahedron,  1998,  54,  3607-3630）。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６にも記載されている。
【０２３６】
改変された糖部分
核酸は、１つまたは複数の置換された糖部分を含むことができる。適したポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含み、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルとなることができる。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨｚ）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨｚ）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２が特に適しており、ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の適したポリヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯｚ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。適した改変は、−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）としても公知の、２’−メトキシエトキシ２’−Ｏ−ＣＨ２  ＣＨｚＯＣＨ３（Martin  et  al.,  Hely.  Chim.  Acta,  1995,  78,  486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに適した改変は、下文の例に記載されている、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知の、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨｚ）ｚＯＮ（ＣＨ３）ｚ基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では、２’−Ｏ−ジメチルアミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨｚ−Ｏ−ＣＨｚ−Ｎ（ＣＨ３）ｚを含む。
【０２３７】
他の適した糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−Ｏ−ＣＨｚＣＨｚＣＨｚＮＨｚ）、アリル（−ＣＨｚ−ＣＨ＝ＣＨｚ）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨｚ−ＣＨ＝ＣＨｚ）およびフルオロ（Ｆ）を含む。２’−糖置換基は、アラビノ（上（up））位またはリボ（下（down））位に存在し得る。適した２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。同様の改変は、オリゴマー化合物における他の位置、特に、３’末端ヌクレオシドまたは２’−５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位に為すこともできる。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有することもできる。
【０２３８】
塩基改変および置換
核酸は、核酸塩基（当技術分野では、単純に「塩基」と称される場合もある）改変または置換を含むこともできる。本明細書で使用される場合、「無改変」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。改変された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等、他の合成および天然核酸塩基を含む。さらに改変された核酸塩基は、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）等、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ（clamp）等の三環系ピリミジンを含む。
【０２３９】
複素環塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンに置き換えられた部分を含むこともできる。さらに別の核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されている核酸塩基、The  Concise  Encyclopedia  Of  Polymer  Science  And  Engineering,  pages  858-859,  Kroschwitz,  J.  1.,  ed.  John  Wiley  &  Sons,  1990に開示されている核酸塩基、Englisch  et  al.,  Angewandte  Chemie,  International  Edition,  1991,  30,  613によって開示されている核酸塩基、およびSanghvi,  Y.  S.,  Chapter  15,  Antisense  Research  and  Applications,  pages  289-302,  Crooke,  S.  T.  and  Lebleu,  B.,  ed.,  CRC  Press,  1993によって開示されている核酸塩基を含む。これらの核酸塩基のうちある特定は、オリゴマー化合物の結合親和性の増加に有用である。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示され（Sanghvi  et  al.,  eds.,  Antisense  Research  and  Applications,  CRC  Press,  Boca  Raton,  1993,  pp.  276-278）、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合に、適した塩基置換である。
【０２４０】
「相補的」は、天然に存在するもしくは天然に存在しない（例えば、上に記載されている通りに改変された）塩基（ヌクレオシド）またはそのアナログを含む２配列の間の、塩基積み重ねおよび特異的水素結合による、対形成のための能力を指す。例えば、核酸のある１つの位置における塩基が、標的の対応する位置における塩基と水素結合することができる場合、塩基は、当該位置において互いに相補的であると考慮される。核酸は、水素結合に肯定的な寄与も否定的な寄与ももたらさない、ユニバーサル塩基または不活性脱塩基スペーサーを含むことができる。塩基対形成は、カノニカルのワトソン・クリック塩基対形成および非ワトソン・クリック塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成）の両方を含むことができる。
【０２４１】
相補的塩基対形成に関して、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）に相補的であり、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドール等のユニバーサル塩基は、いずれかＡ、Ｃ、ＵまたはＴとハイブリダイズすることができ、これと相補的であると考慮されることが理解される。Nichols  et  al.,  Nature,
【０２４２】
1994;369:492-493およびLoakes  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.,  1994;22:4039-4043。イノシン（Ｉ）も、当技術分野で、ユニバーサル塩基であると考慮されており、いずれかＡ、Ｃ、ＵまたはＴに相補的であると考慮される。Watkins  and  Santalucia,  Nucl.  Acids  Research,  2005;  33  (19):  6258-6267を参照されたい。
【０２４３】
コンジュゲート
核酸の別の可能な改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する１つまたは複数の部分またはコンジュゲートをポリヌクレオチドへと化学的に連結することが関与する。このような部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基等の官能基へと共有結合により結合されるコンジュゲート基を含むことができる。コンジュゲート基として、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基が挙げられるがこれらに限定されない。適したコンジュゲート基として、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられるがこれらに限定されない。薬力学的特性を増強する基は、取込みを改善する、分解に対する耐性を増強する、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態学的特性を増強する基は、核酸の取込み、分布、代謝または排泄を改善する基を含む。
【０２４４】
コンジュゲート部分として、コレステロール部分等の脂質部分（Letsinger  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  1989,  86,  6553-6556）、コール酸（Manoharan  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  Let.,  1994,4,  1053-1060）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan  et  al.,  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.,  1992,  660,  306-309；Manoharan  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  Let.,  1993,  3,  2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  1992,  20,  533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール（dodecandiol）もしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras  et  al.,  EMBO  J.,  1991,  10,  1111-1118；Kabanov  et  al.,  FEBS  Lett.,  1990,  259,  327-330；Svinarchuk  et  al.,  Biochimie,  1993,  75,  49-54）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan  et  al.,  Tetrahedron  Lett.,  1995,  36,  3651-3654；Shea  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  1990,  18,  3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan  et  al.,  Nucleosides  &  Nucleotides,  1995,  14,  969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan  et  al.,  Tetrahedron  Lett.,  1995,  36,  36513654）、パルミチル部分（Mishra  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta,  1995,  1264,  229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke  et  al.,  J.  Pharmacal.  Exp.  Ther.,  1996,277,  923-937）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４５】
コンジュゲートは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜または小胞膜の横断を容易にするポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物または有機もしくは無機化合物を指すことができる、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞膜透過ペプチドとしても公知）を含むことができる。小型極性分子から大きい巨大分子および／またはナノ粒子に及び得る、別の分子に結合したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間へと、またはサイトゾルからオルガネラ内へと、分子が膜を横断することを容易にする。一部の実施形態では、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば、ｓＲＧＮポリペプチド）のアミノ末端に共有結合により連結される。一部の実施形態では、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば、ｓＲＧＮポリペプチド）のＣ末端またはＮ末端に共有結合により連結される。一部の実施形態では、ＰＴＤは、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードする核酸、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸等）に共有結合により連結される。例示的なＰＴＤとして、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２６）モチーフ（同定のためであって、本願内の開示を目的とするものではない）を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応）；細胞への進入を方向付けるのに十分ないくつかのアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０〜５０個のアルギニン）；ＶＰ２２ドメイン（Zender  et  al.  (2002)  Cancer  Gene  Ther.  9(6):489-96）；ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Noguchi  et  al.  (2003)  Diabetes  52(7):1732-1737）；トランケートされたヒトカルシトニンペプチド（Trehin  et  al.  (2004)  Pharm.  Research  21:1248-1256）；ポリリシン（Wender  et  al.  (2000)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA97:13003-13008）が挙げられるがこれらに限定されない；一部の実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Aguilera  et  al.  (2009)  Integr  Biol  (Camb)  June;  1(5-6):  371-381）。ＡＣＰＰは、マッチするポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に切断可能なリンカーを介して接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、この構成は、正味電荷をほとんどゼロに低下させ、これにより、接着および細胞への取込みを阻害する。リンカーの切断後に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその固有の接着性を局所的にアンマスクし、これにより、膜を横断するようにＡＣＰＰを「活性化」する。一部の実施形態では、ＰＴＤは、ＰＴＤのバイオアベイラビリティを増加させるために化学的に改変される。例示的な改変は、Expert  Opin  Drug  Deliv.  2009  6(11):1195-205に開示されている。
【０２４６】
ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸
本開示は、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡコード核酸は、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターである。
【０２４７】
一部の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸を、標的ＤＮＡと接触させるステップまたは細胞（または細胞の集団）に導入するステップが関与する。一部の実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにある。一部の実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにある。ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適した核酸は、発現ベクターを含み、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組換え発現ベクター」である。
【０２４８】
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物等である。［００２４８］適した発現ベクターとして、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li  et  al.,  Invest  Opthalmol  Vis  Sci  35:2543  2549,  1994；Borras  et  al.,  Gene  Ther  6:515  524,  1999；Li  and  Davidson,  PNAS  92:7700  7704,  1995；Sakamoto  et  al.,  H  Gene  Ther  5:1088  1097,  1999；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali  et  al.,  Hum  Gene  Ther  9:81  86,  1998、Flannery  et  al.,  PNAS  94:6916  6921,  1997；Bennett  et  al.,  Invest  Opthalmol  Vis  Sci  38:2857  2863,  1997；Jomary  et  al.,  Gene  Ther4:683  690,  1997、Rolling  et  al.,  Hum  Gene  Ther  10:641  648,  1999；Ali  et  al.,  Hum  Mol  Genet  5:591  594,  1996；Srivastava、ＷＯ９３／０９２３９、Samulski  et  al.,  J.  Vir.  (1989)  63:3822-3828；Mendelson  et  al.,  Viral.  (1988)  166:154-165；およびFlotte  et  al.,  PNAS  (1993)  90:10613-10617）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi  et  al.,  PNAS  94:10319  23,  1997；Takahashi  et  al.,  J  Viral  73:7812  7816,  1999）に基づくウイルスベクター；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳房腫瘍ウイルス等のレトロウイルスに由来するベクター）；およびその他が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４９】
多数の適した発現ベクターが当業者にとって公知であり、その多くが市販されている。次のベクターを例として提示する；真核生物宿主細胞のために：ｐＸＴ１、ｐＳＧＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｎｍａｃｉａ）。しかし、宿主細胞と適合性である限り、他のいずれかのベクターを使用してもよい。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含む、いくつかの適した転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクターにおいて使用することができる（例えば、Bitter  et  al.  (1987)  Methods  in  Enzymology,  153:516-544）。
【０２５０】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーター等の転写制御エレメントに作動可能に連結される。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞；または原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）のいずれかにおいて機能的となることができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核および真核細胞の両方におけるガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に連結される。
【０２５１】
適した真核生物プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにマウスメタロチオネイン−１由来のプロモーターが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の技能水準内にある。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含有することもできる。発現ベクターは、発現の増幅に適切な配列を含むこともできる。発現ベクターは、ｓＲＧＮポリペプチドに融合され、これによりキメラポリペプチドをもたらす、タンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。
【０２５２】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。
【０２５３】
核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、斯かる方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を細胞に導入することができる。適した方法は、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達（例えば、Panyam  et  al.,  Adv  Drug  Deliv  Rev.  2012  Sep  13.  pii:  S0169-409X(12)00283-9.doi:  10.1016/j.addr.2012.09.023）およびその他を含む。
【０２５４】
キメラポリペプチド
本開示は、ｓＲＧＮポリペプチドに由来する配列を含むキメラ部位指向型（site-directed）改変ポリペプチドを提供する。キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（上に記載されている）と相互作用する（例えば、これに結合する）。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の標的配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列、無細胞ポリヌクレオチド等）へと、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをガイドする。キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ（例えば、標的ＤＮＡの切断またはメチル化）および／または標的ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストンテイルのメチル化またはアセチル化）を改変する。キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、本明細書において、「キメラ部位指向型ポリペプチド」または「キメラＲＮＡ結合部位指向型改変ポリペプチド」とも称される。
【０２５５】
キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、２種の部分、ＲＮＡ結合部分および活性部分を含む。キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、少なくとも２種の異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、改変されたおよび／または天然に存在するポリペプチド配列を含むことができる（例えば、改変されたまたは無改変のｓＲＧＮタンパク質由来の第１のアミノ酸配列；およびｓＲＧＮタンパク質以外の第２のアミノ酸配列）。
【０２５６】
ＲＮＡ結合部分
一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドのＲＮＡ結合部分は、配列番号１〜１２のいずれか１つに表記されているポリペプチドのＲＮＡ結合部分に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２５７】
活性部分
ＲＮＡ結合部分に加えて、キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、「活性部分」を含む。一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドの活性部分は、部位指向型改変ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはｓＲＧＮ）の活性部分を含む。他の実施形態では、対象キメラ部位指向型改変ポリペプチドの活性部分は、部位指向型改変ポリペプチドの天然に存在する活性部分の改変されたアミノ酸配列（例えば、置換、欠失、挿入）を含む。目的の天然に存在する活性部分は、当技術分野で公知の部位指向型改変ポリペプチドに由来する。キメラ部位指向型改変ポリペプチドの活性部分は、可変的であり、本明細書に開示されている方法において有用となり得る、いずれかの異種ポリペプチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドの活性部分は、配列番号１〜１２のいずれか１つの活性部分と少なくとも９０％同一であるｓＲＧＮポリペプチドの部分を含む。一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、（ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分であって、ガイドＲＮＡが、標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ結合部分；（ｉｉ）部位指向型酵素活性（例えば、ＲＮＡ切断のための活性）を示す活性部分であって、酵素活性の部位が、プレｃｒＲＮＡのリピートによって形成されたパリンドロームヘアピン構造によって決定され、ヘアピンの４ｎｔ上流でプレｃｒＲＮＡを切断し、リピートスペーサー（５’−３’）で構成されるｃｒＲＮＡの中間体形態を作製する、活性部分；および（ｉｉｉ）部位指向型酵素活性（例えば、ＤＮＡ切断のための活性）を示す活性部分であって、酵素活性の部位が、ガイドＲＮＡによって決定される、活性部分を含む。
【０２５８】
例示的なキメラ部位指向型改変ポリペプチド
一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドの活性部分は、ｓＲＧＮオルソログのいずれかの改変形態を含む、ｓＲＧＮタンパク質の改変形態を含む。一部の実例では、ｓＲＧＮタンパク質の改変形態は、ｓＲＧＮタンパク質の天然に存在するヌクレアーゼ活性を低下または増加させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入または置換）を含む。例えば、一部の実例では、ｓＲＧＮタンパク質の改変形態は、対応する野生型ｓＲＧＮポリペプチドのヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満を有する。一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドの改変形態は、実質的なヌクレアーゼ活性がない。他の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドの改変形態は、５０％、２倍、４倍または最大で１０倍超大きいヌクレアーゼ活性を有することができる。
【０２５９】
一部の事例では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つに対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、部位指向型改変ポリペプチドの活性部分は、ＤＮＡ改変活性および／または転写因子活性および／またはＤＮＡ関連ポリペプチド改変活性を有する異種ポリペプチドを含む。一部の事例では、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性をもたらすｓＲＧＮポリペプチドの部分を置き換える。他の実施形態では、部位指向型改変ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を正常にもたらすｓＲＧＮポリペプチドの部分（また、当該部分は、完全に活性となり得る、またはその代わりに、対応する野生型活性の１００％未満を有するように改変され得る）、および異種ポリペプチドの両方を含む。換言すると、一部の事例では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を正常にもたらすｓＲＧＮポリペプチドの部分、および異種ポリペプチドの両方を含む融合ポリペプチドである。他の事例では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、ｓＲＧＮポリペプチドの活性部分の改変された変異体（例えば、アミノ酸変化、欠失、挿入）、および異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。さらに他の事例では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドは、異種ポリペプチド、および天然に存在するまたは改変された部位指向型改変ポリペプチドのＲＮＡ結合部分を含む融合ポリペプチドである。
【０２６０】
例えば、キメラｓＲＧＮタンパク質において、天然に存在する（または改変された、例えば、突然変異、欠失、挿入）ｓＲＧＮポリペプチドは、異種ポリペプチド配列（すなわち、ｓＲＧＮ以外のタンパク質由来のポリペプチド配列、または別の生物由来のポリペプチド配列）に融合することができる。異種ポリペプチド配列は、活性（例えば、酵素活性）を示すことができ、これは、キメラｓＲＧＮタンパク質によっても示されるであろう（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性等）。異種核酸配列を別の核酸配列に連結して（例えば、遺伝子操作により）、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を作製することができる。一部の実施形態では、キメラｓＲＧＮポリペプチドは、ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、野生型ｓＲＧＮまたはｓＲＧＮ変異体、例えば、低下もしくは不活性化されたヌクレアーゼ活性を有するｓＲＧＮ）を、細胞下局在化をもたらす異種配列（例えば、核に標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアに標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に標的化するための葉緑体局在化シグナル：ＥＲ保留シグナル；およびその他）と融合することにより作製される。一部の実施形態では、異種配列は、追跡または精製し易くするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびその他；ＨＩＳタグ、例えば、６×Ｈｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；およびその他）を提供することができる。一部の実施形態では、異種配列は、増加または減少された安定性を提供することができる。一部の実施形態では、異種配列は、結合ドメイン（例えば、別の目的のタンパク質（例えば、ＤＮＡまたはヒストン改変タンパク質、転写因子または転写抑圧因子、リクルートタンパク質等）または目的のヌクレオチド（例えば、アプタマーまたはヌクレオチド結合タンパク質の標的部位）に結合するキメラｓＲＧＮポリペプチドの能力をもたらすための）を提供することができる。
【０２６１】
キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードする核酸
本開示は、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターである。
【０２６２】
一部の実施形態では、方法は、キメラ部位指向型改変ポリペプチドを含む１つまたは複数の核酸を、標的ＤＮＡと接触させるステップまたは細胞（または細胞の集団）に導入するステップが関与する。キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適した核酸は、発現ベクターを含み、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組換え発現ベクター」である。
【０２６３】
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物等である。適した発現ベクターとして、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li  et  al.,  Invest  Opthalmol  Vis  Sci  35:2543  2549,  1994；Borras  et  al.,  Gene  Ther  6:515  524,  1999；Li  and  Davidson,  PNAS  92:7700  7704,  1995；Sakamoto  et  al.,  H  Gene  Ther  5:1088  1097,  1999；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９：ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali  et  al.,  Hum  Gene  Ther  9:81  86,  1998、Flannery  et  al.,  PNAS  94:6916  6921,  1997；Bennett  et  al.,  Invest  Opthalmol  Vis  Sci  38:2857  2863,  1997；Jomary  et  al.,  Gene  Ther  4:683  690,  1997、Rolling  et  al.,  Hum  Gene  Ther  10:641  648,  1999；Ali  et  al.,  Hum  Mol  Genet  5:591  594,  1996；Srivastava、ＷＯ９３／０９２３９、Samulski  et  al.,  J.  Vir.  (1989)  63:3822-3828；Mendelson  et  al.,  Viral.  (1988)  166:154-165；およびFlotte  et  al.,  PNAS  (1993)  90:10613-10617）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi  et  a1.,  PNAS  94:10319  23,  1997；Takahashi  et  al.,  J  Virol73:7812  7816,  1999）に基づくウイルスベクター；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳房腫瘍ウイルス等のレトロウイルスに由来するベクター）；およびその他が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６４】
多数の適した発現ベクターが当業者にとって公知であり、その多くが市販されている。次のベクターを例として提示する；真核生物宿主細胞のために：ｐＸＴ１、ｐＳＧＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、宿主細胞と適合性である限り、他のいずれかのベクターを使用してもよい。
【０２６５】
利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含む、いくつかの適した転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクターにおいて使用することができる（例えば、Bitter  et  al.  (1987)  Methods  in  Enzymology,  153:516-544を参照）。
【０２６６】
一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーター等の転写制御エレメントに作動可能に連結される。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞；または原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）のいずれかにおいて機能的となることができる。一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核および真核細胞の両方におけるキメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に連結される。
【０２６７】
適した真核生物プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにマウスメタロチオネイン−１由来のプロモーターを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者の技能水準内にある。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含有することもできる。発現ベクターは、発現の増幅に適切な配列を含むこともできる。発現ベクターは、キメラ部位指向型改変ポリペプチドに融合されたタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質等）等）をコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。
【０２６８】
一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーター等）に作動可能に連結される。一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、空間的に制限および／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）に作動可能に連結される。一部の実施形態では、キメラ部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。
【０２６９】
核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、いずれか公知の方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を幹細胞または前駆細胞に導入することができる。適した方法は、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達（例えば、Panyam  et.,  al  Adv  Drug  Deliv  Rev.  2012  Sep  13.  pp:  50169-409X(12)00283-9.  doi:  10.1016/j.addr.2012.09.023）およびその他を含む。
【０２７０】
方法
本開示は、標的ＤＮＡおよび／または標的ＤＮＡ関連ポリペプチドを改変するための方法を提供する。一般に、方法は、標的ＤＮＡを複合体（「標的化複合体」）と接触させるステップが関与し、この複合体は、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドを含む。
【０２７１】
上に記す通り、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドは、複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことにより、複合体に標的特異性を提供する。複合体のｓＲＧＮポリペプチドは、部位特異的活性を提供する。一部の実施形態では、複合体は、標的ＤＮＡを改変し、例えば、ＤＮＡ切断、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復等をもたらす。他の実施形態では、複合体は、標的ＤＮＡに関連する標的ポリペプチド（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質等）を改変し、例えば、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンユビキチン化およびその他をもたらす。標的ＤＮＡは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるネイキッド（すなわち、ＤＮＡ関連タンパク質に結合されていない）ＤＮＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞における染色体ＤＮＡ、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞における染色体ＤＮＡ等となることができる。
【０２７２】
様々な種由来のｓＲＧＮタンパク質は、標的ＤＮＡにおける異なるＰＡＭ配列を要求することができる。よって、最適な特定のｓＲＧＮタンパク質のために、ＰＡＭ配列要件は、上に記載されているＰＡＭ配列とは異なる場合がある。
【０２７３】
次のものを含むｓＲＧＮオルソログの特徴を活用する、例示的な方法が提供される。
【０２７４】
ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを切断して、二本鎖切断を産生する。次に、このような切断は、２種の仕方：非相同末端結合および相同性により導かれる修復のうち一方において細胞によって修復される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）において、二本鎖切断は、互いに対する切断末端の直接的ライゲーションによって修復される。このプロセスにおいて、切断部位において数塩基対を挿入または欠失させることができる。相同性により導かれる修復において、切断された標的ＤＮＡ配列に対し相同性を有するドナーポリヌクレオチドが、切断された標的ＤＮＡ配列の修復のための鋳型として使用され、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移入をもたらす。そのようなものとして、部位に新たな核酸材料を挿入／コピーすることができる。一部の事例では、標的ＤＮＡは、ドナーポリヌクレオチドと接触される。一部の事例では、ドナーポリヌクレオチドは、細胞に導入される。ＮＨＥＪおよび／または相同性により導かれる修復による標的ＤＮＡの改変は、例えば、遺伝子矯正、遺伝子置換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、遺伝子破壊、遺伝子突然変異、配列置換え等をもたらす。したがって、標的ＤＮＡ配列を切断し、細胞に、外因的に提供されたドナーポリヌクレオチドの非存在下で配列を修復させることにより、ｓＲＧＮポリペプチドによるＤＮＡの切断を使用して、標的ＤＮＡ配列から核酸材料を欠失させることができる（例えば、細胞を感染に対し感受性にする遺伝子を破壊するために（例えば、Ｔ細胞をＨＩＶ感染に対し感受性にするＣＣＲＳまたはＣＸＣＲ４遺伝子）、ニューロンにおける疾患を引き起こすトリヌクレオチドリピート配列を除去するために、研究における疾患モデルとして遺伝子ノックアウトおよび突然変異を創出するために、等）。よって、本方法を使用して、遺伝子をノックアウトすることができる（転写の完全な欠如または変更された転写をもたらす）、または標的ＤＮＡにおける最適な遺伝子座に遺伝的材料をノックインすることができる。
【０２７５】
その代わりに、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドが、標的ＤＮＡ配列に対し相同性を有する少なくともセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列と共に、細胞に同時投与される場合、対象方法を使用して、標的ＤＮＡ配列に核酸材料を付加、すなわち、挿入または置き換えることができる（例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等をコードする核酸を「ノックイン」する）、タグ（例えば、６×Ｈｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質等）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等）を付加することができる、遺伝子に調節配列を付加することができる（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナル等）、核酸配列を改変する（例えば、突然変異を導入する）ことができる、およびその他ができる。そのようなものとして、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドを含む複合体は、例えば、疾患を処置するための、または抗ウイルス、抗病原性もしくは抗がん療法としての遺伝子療法、農業における遺伝子改変された生物の産生、治療、診断または研究目的での細胞によるタンパク質の大規模産生、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、欠失または置換えのための病原体の遺伝子の標的化等において例えば使用されるように、部位特異的な、すなわち「標的化された」仕方でＤＮＡを改変することが望ましい、いずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ適用、例えば遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付け、配列置換え等において有用である。
【０２７６】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、ｓＲＧＮタンパク質の改変形態を含む。一部の実例では、ｓＲＧＮタンパク質の改変形態は、ｓＲＧＮタンパク質の天然に存在するヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入または置換）を含む。例えば、一部の実例では、ｓＲＧＮタンパク質の改変形態は、対応する野生型ｓＲＧＮポリペプチドのヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満を有する。一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドの改変形態は、実質的なヌクレアーゼ活性がない。ｓＲＧＮポリペプチドが、実質的なヌクレアーゼ活性がないｓＲＧＮタンパク質の改変形態である場合、「ｄｓＲＧＮ」と称することができる。
【０２７７】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、異種配列を含む（例えば、融合）。一部の実施形態では、異種配列は、ｓＲＧＮポリペプチドの細胞下局在化を提供することができる（例えば、核に標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアに標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に標的化するための葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保留シグナル；およびその他）。一部の実施形態では、異種配列は、追跡または精製し易くするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびその他；ｈｉｓタグ、例えば、６×Ｈｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；およびその他）を提供することができる。一部の実施形態では、異種配列は、増加または減少した安定性を提供することができる。
【０２７８】
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ、および／またはｓＲＧＮポリペプチドもしくはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡもしくはＲＮＡを、下で説明および例証されるように改変することができる、本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲ−ｓＲＧＮ系において、改変ポリヌクレオチドが使用される。斯かる改変ポリヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ−ｓＲＧＮ系において使用して、例えば、任意の１つまたは複数のゲノム遺伝子座を編集することができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの斯かる改変は、コドン最適化、例えば、コードされているポリペプチドが発現されることになる特定の宿主細胞に基づくコドン最適化によって、達成される。本開示の任意のヌクレオチド配列および／または組換え核酸を、目的の任意の種における発現のためにコドン最適化することができることは、当業者には理解されるであろう。コドン最適化は、当技術分野で周知であり、種特異的コドン使用頻度表を使用するコドン使用頻度の偏りのためのヌクレオチド配列の改変を含む。コドン使用頻度表は、目的の種について最も高度に発現される遺伝子の配列解析に基づいて作成される。非限定的な例では、ヌクレオチド配列が宿主細胞において翻訳されることになったとき、目的の種について高度に発現される核遺伝子の配列解析に基づいてコドン使用頻度表が作成される。ヌクレオチド配列の改変は、種特異的コドン使用頻度表とネイティブポリヌクレオチド配列中に存在するコドンとを比較することにより決定される。例えば、意図される標的細胞がヒト細胞である場合、ｓＲＧＮ（またはｓＲＧＮバリアント、例えば、酵素的に不活性なバリアント）をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチド配列が適するであろう。別の非限定的な例として、意図される宿主細胞がマウス細胞である場合には、ｓＲＧＮ（またはｓＲＧＮバリアント、例えば、酵素的に不活性なバリアント）をコードするマウスコドン最適化ポリヌクレオチド配列が適するであろう。
【０２７９】
コドン最適化のための戦略および方法論は、当技術分野で公知であり、酵母（Outchkourov  et  al.,  Protein  Expr  Purif,  24(1):18-24  (2002)）およびＥ．ｃｏｌｉ（Feng  et  al.,  Biochemistry,  39(50):15399-15409  (2000)）を含むがこれらに限定されない様々な系について記載されている。一部の実施形態では、コドン最適化は、ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＴＵＭ）を使用することおよび製造業者の推奨発現最適化アルゴリズムを使用することにより行われる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現増加のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における発現増加のためコドン最適化されている。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、昆虫細胞における発現増加のためコドン最適化されている。一部の実施形態では、コドン最適化手順において使用される発現最適化アルゴリズムは、推定的ポリＡシグナル（例えば、ＡＡＴＡＡＡおよびＡＴＴＡＡＡ）を回避するように、およびポリメラーゼスリッページにつながり得るＡの長い（４を超える）ストレッチを回避するように、定義される。ポリアデニル化シグナルが、意図される宿主における発現を最適化するために選択されることもある。ポリアデニル化シグナルが、意図される宿主における発現を最適化するために選択されることもある。
【０２８０】
当技術分野で十分に理解されているように、ヌクレオチド配列のコドン最適化によって、ネイティブヌクレオチド配列に対して１００％未満の同一性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％未満）を有するヌクレオチド配列であって、しかしそれでもなお、元のネイティブヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと同じ機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が得られる。したがって、本開示の代表的実施形態では、本開示のヌクレオチド配列および／または組換え核酸を、目的の特定の種における発現のためにコドン最適化することができる。
【０２８１】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１５、１８、２０、２２および２７のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、または１００％配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、標的細胞におけるコードされたｓＲＧＮポリペプチドの発現増加のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現増加のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における発現増加のためコドン最適化されている。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、昆虫細胞における発現増加のためコドン最適化されている。
【０２８２】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、コドン最適化することができる。この種類の最適化は、当技術分野で公知であり、同じタンパク質をコードしたまま、意図される宿主生物または細胞のコドン優先度を模倣する外来起源のＤＮＡの突然変異を伴う。よって、コドンは変化されるが、コードされるタンパク質は、未変化のままである。例えば、意図される標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトにコドン最適化されたｓＲＧＮ（または変異体、例えば、酵素的に不活性な変異体）が適するであろう。いずれか適したｓＲＧＮポリペプチド（例えば、配列番号１〜１２のいずれか１つに表記されている配列等、いずれかのｓＲＧＮ）をコドン最適化することができる。別の非限定的な例として、意図される宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスにコドン最適化されたｓＲＧＮ（または変異体、例えば、酵素的に不活性な変異体）が適するであろう。
【０２８３】
一態様では、ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド）または配列番号１〜１２のいずれか１つに対し少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有するその変異体をコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド配列を含む核酸が本明細書に提供される。ｓＲＧＮまたはその変異体をコードする斯かるコドン最適化された核酸は、本明細書において、「コドン最適化されたｓＲＧＮポリペプチド」または「コドン最適化されたｓＲＧＮ」とも称される。一部の実施形態では、コドン最適化されたｓＲＧＮは、配列番号１〜１２のいずれか１つのｓＲＧＮポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、コドン最適化されたｓＲＧＮは、細菌細胞等の原核細胞における発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、コドン最適化されたｓＲＧＮは、昆虫または哺乳動物細胞等の真核細胞における発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、コドン最適化されたｓＲＧＮは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、コドン最適化は、ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）最適化（ＡＴＵＭ）に従って行われる。一部の実施形態では、コドン最適化は、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒプロセス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って行われる。一部の実施形態では、コドン最適化されたｓＲＧＮは、配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つに対し少なくとも約９０％（少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれかまたはそれよりも多い等）配列同一性を有する。一部の実施形態では、コドン最適化されたｓＲＧＮは、配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つの配列を含む（またはこれからなる）。
【０２８４】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドまたはその変異体をコードするコドン最適化されたポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載されている核酸のいずれかに従って、核酸は、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターである。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つのコドン最適化されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つのコドン最適化されたポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２８５】
一部の実施形態では、配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つに対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であって、本明細書に記載されているｓＲＧＮポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つのコドン最適化されたポリヌクレオチド配列を含む（またはこれからなる）。
【０２８６】
一部の実施形態では、配列番号１５、１８、２０、２２および２７のいずれか１つの部分配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、ポリヌクレオチド配列が１つまたは複数の機能的ｓＲＧＮドメインをコードする、核酸が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つの部分配列を含む（またはこれからなる）。一部の実施形態では、１つまたは複数のｓＲＧＮドメインは、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＨＮＨまたはＲｕｖＣドメイン）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のｓＲＧＮドメインは、ＲＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｒｅｃ  Ｉドメイン）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のｓＲＧＮドメインは、ＰＡＭ相互作用ドメインを含む。
【０２８７】
一部の実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載されている核酸のいずれかに従って、核酸からのｓＲＧＮポリペプチドまたはその変異体の宿主細胞における発現は、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列が由来する参照ポリヌクレオチド配列を含む対応する核酸からのｓＲＧＮポリペプチドまたはその変異体の宿主細胞における発現と比較して増加される。一部の実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つのコドン最適化されたポリヌクレオチド配列、または配列番号１５、１８，２０、２２および２７のいずれか１つのコドン最適化されたポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％配列同一性を有するその変異体を含む。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号１３、１４，１６、１７、１９、２１、２３〜２６、２８および２９のいずれか１つ由来のｓＲＧＮコードポリヌクレオチド配列、または配列番号１３、１４，１６、１７、１９、２１、２３〜２６、２８および２９のいずれか１つ由来のｓＲＧＮコードポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％配列同一性を有するその変異体を含む。一部の実施形態では、宿主細胞におけるコドン最適化されたポリヌクレオチド配列からのｓＲＧＮポリペプチドまたはその変異体の発現は、参照ポリヌクレオチド配列からのｓＲＧＮポリペプチドまたはその変異体の宿主細胞における発現と比較して、少なくとも約１０％（少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％のいずれかまたはそれよりも多い等）増加される。
【０２８８】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドは、細菌細胞における遺伝子発現を停止するための誘導性の系として使用される。一部の事例では、適切なガイドＲＮＡおよび／または適切なｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸は、標的細胞の染色体に取り込まれ、誘導性プロモーターの制御下にある。ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドが誘導されると、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドの両方が存在し複合体を形成する場合、標的ＤＮＡは、目的の位置（例えば、別々のプラスミドにおける標的遺伝子）において切断される（そうでなければ改変される）。そのようなものとして、一部の事例では、細菌発現系統は、細菌ゲノムにおいて適切なｓＲＧＮポリペプチドを、および／またはプラスミドにおいて（例えば、誘導性プロモーターの制御下における）適切なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含むように操作され、いずれかの標的化された遺伝子の発現（系統に導入された別々のプラスミドから発現される）が、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドの発現を誘導することにより制御され得る、実験を可能にする。一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、二本鎖切断導入以外の仕方で標的ＤＮＡを改変する酵素活性を有する。標的ＤＮＡの改変に使用され得る（例えば、酵素活性を有する異種ポリペプチドをｓＲＧＮポリペプチドに融合し、これにより、キメラｓＲＧＮポリペプチドを作製することによる）目的の酵素活性として、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性が挙げられるがこれらに限定されない。メチル化および脱メチル化は、エピジェネティック遺伝子調節の重要な機序として当技術分野で認識されている一方、ＤＮＡ損傷および修復活性は、細胞生存および環境ストレスに応答した適正なゲノム維持に必須である。そのようなものとして、本明細書における方法は、標的ＤＮＡのエピジェネティック改変における用途を見出し、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントに所望の相補的核酸配列を遺伝子操作することにより、標的ＤＮＡにおけるいずれかの位置における標的ＤＮＡのエピジェネティック改変の制御に用いることができる。本明細書における方法は、また、標的ＤＮＡ内のいずれか所望の位置におけるＤＮＡの意図的かつ制御された損傷における用途を見出す。本明細書における方法は、また、標的ＤＮＡ内のいずれか所望の位置におけるＤＮＡの配列特異的かつ制御された修復における用途を見出す。標的ＤＮＡにおける特異的位置にＤＮＡ改変酵素活性を標的化する方法は、研究および臨床適用の両方における用途を見出す。
【０２８９】
一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、標的ＤＮＡの転写を調節する活性を有する（例えば、キメラｓＲＧＮポリペプチドの場合等）。一部の事例では、転写を増加または減少させる能力を示す異種ポリペプチド（例えば、転写活性化因子または転写抑圧因子ポリペプチド）を含むキメラｓＲＧＮポリペプチドは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントによってガイドされる、標的ＤＮＡにおける特異的位置における標的ＤＮＡの転写の増加または減少に使用される。転写調節活性を有するキメラｓＲＧＮポリペプチドを提供するための供給源ポリペプチドの例として、光誘導性転写調節因子、小分子／薬物応答性転写調節因子、転写因子、転写抑圧因子等が挙げられるがこれらに限定されない。一部の事例では、本方法は、標的化されたコードＲＮＡ（タンパク質コード遺伝子）および／または標的化された非コードＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、長いｎｃＲＮＡ等）の発現の制御に使用される。一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性を有する。一部の実施形態では、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性（すなわち、ユビキチン化活性）、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ由来の）または脱グリコシル化活性である。本明細書に収載されている酵素活性は、タンパク質に対する共有結合改変を触媒する。斯かる改変は、標的タンパク質の安定性または活性を変更することが当技術分野で公知である（例えば、キナーゼ活性によるリン酸化は、標的タンパク質に応じてタンパク質活性を刺激またはサイレンシングすることができる）。ヒストンがタンパク質標的として特に興味深い。ヒストンタンパク質は、ＤＮＡに結合し、ヌクレオソームとして公知の複合体を形成することが当技術分野で公知である。ヒストンは、周囲のＤＮＡに構造変化を誘発し、これにより、転写因子、ポリメラーゼおよびその他等の相互作用因子へのＤＮＡの潜在的に大きい部分の到達性を制御するように改変することができる（例えば、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、リン酸化による）。単一のヒストンは、多くの異なる仕方で、多くの異なる組合せにおいて改変することができる（例えば、ヒストン３のリシン２７のトリメチル化、Ｈ３Ｋ２７は、抑圧された転写のＤＮＡ領域に関連する一方、ヒストン３のリシン４のトリメチル化、Ｈ３Ｋ４は、活性な転写のＤＮＡ領域に関連する）。よって、ヒストン改変活性を有する部位指向型改変ポリペプチドは、ＤＮＡ構造の部位特異的制御における用途を見出し、標的ＤＮＡの選択された領域におけるヒストン改変パターンの変更に使用することができる。斯かる方法は、研究および臨床適用の両方における用途を見出す。
【０２９０】
一部の実施形態では、複数のガイドＲＮＡは、同時に使用されて、同じ標的ＤＮＡまたは異なる標的ＤＮＡにおける異なる位置を同時に改変する。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いガイドＲＮＡは、同じ遺伝子または転写物または遺伝子座を標的とする。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いガイドＲＮＡは、異なる無関係の遺伝子座を標的とする。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いガイドＲＮＡは、異なるが関係する遺伝子座を標的とする。
【０２９１】
一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、タンパク質として直接的に提供される。非限定的な一例として、真菌（例えば、酵母）は、スフェロプラスト形質転換を使用して、外因性タンパク質および／または核酸により形質転換することができる（両者共にそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kawai  et  al.,  Bioeng  Bugs.  2010  Nov-  Dec;1(6):395-403  :  'Transformation  of  Saccharomyces  cerevisiae  and  other  fungi:  methods  and  possible  underlying  mechanism"；およびTanka  et  al.,  Nature.  2004  Mar  18;428(6980):323-8:  "Conformational  variations  in  an  infectious  protein  determine  prion  strain  differences"；を参照）。よって、ｓＲＧＮポリペプチドをスフェロプラストに取り込むことができ（ガイドＲＮＡをコードする核酸ありまたはなしで、ドナーポリヌクレオチドありまたはなしで）、スフェロプラストを使用して、内容物を酵母細胞に導入することができる。ｓＲＧＮポリペプチドは、いずれか簡便な方法によって細胞に導入することができる（細胞に提供される）；斯かる方法は、当業者にとって公知である。別の非限定的な例として、ｓＲＧＮポリペプチドは、細胞、例えば、ゼブラフィッシュ胚の細胞、受精したマウス卵母細胞の前核等に直接的に注射することができる（例えば、ガイドＲＮＡをコードする核酸ありまたはなしで、ドナーポリヌクレオチドありまたはなしで）。
【０２９２】
目的の標的細胞
上述の適用の一部では、本方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、有糸分裂または有糸分裂後細胞においてＤＮＡ切断、ＤＮＡ改変および／または転写調節を誘導することができる（例えば、個体に再導入することができる遺伝子改変された細胞を産生するために）。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることにより特異性を提供するため、開示されている方法における目的の有糸分裂および／または有糸分裂後細胞は、いずれかの生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．Ａｇａｒｄｈおよびその他、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物由来の細胞、齧歯類由来の細胞、霊長類由来の細胞、ヒト由来の細胞等）を含むことができる。
【０２９３】
いかなる型の細胞が、目的の細胞となってもよい（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞；いずれかのステージの胚、例えば、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期等のゼブラフィッシュ胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ胚性細胞；等）。細胞は、確立された細胞系に由来することができる、または初代細胞となることができ、「初代細胞」、「初代細胞系」および「初代培養物」は、生物に由来し、限られた数の継代、すなわち、培養物の分割においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた、細胞および細胞培養物を指すように本明細書で互換的に使用される。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回または１５回継代されていてよいが、クライシスステージを経験するのに十分な回数継代されていない培養物である。一般に、本発明の初代細胞系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０回よりも少ない継代に維持される。標的細胞は、多くの実施形態では、単細胞生物である、または培養において成長させられる。
【０２９４】
細胞は、初代細胞である場合、いずれか簡便な方法によって個体から収集することができる。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス（leukocytapheresis）、密度勾配分離等によって簡便に収集することができる一方、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃等の組織由来の細胞は、生検によって最も簡便に収集される。適切な溶液を、収集された細胞の分散または懸濁のために使用することができる。斯かる溶液は、一般に５〜２５ｍＭの低濃度の許容される緩衝剤と併せて、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を簡便に補充した、一般に、平衡塩類溶液、例えば、規定生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液等となるであろう。簡便な緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩緩衝剤、乳酸塩緩衝剤等を含む。細胞は、直ちに使用することができる、または長期間、凍結した状態で貯蔵することができ、解凍し、再使用することができる。斯かる事例では、細胞は、通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地または斯かる凍結温度での細胞の保存に一般的に当技術分野で使用されるような一部の他の斯かる溶液において凍結され、凍結した培養細胞を解凍するための一般的に当技術分野で公知の様式で解凍されるであろう。
【０２９５】
ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸
一部の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸を、標的ＤＮＡと接触させるステップまたは細胞（または細胞の集団）に導入するステップが関与する。ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適した核酸は、発現ベクターを含み、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組換え発現ベクター」である。
【０２９６】
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物等である。
【０２９７】
適した発現ベクターとして、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li  et  al.,  Invest  Opthalmol  Vis  Sci  35:2543  2549,  1994；Borras  et  al.,  Gene  Ther  6:515  524,  1999；Li  and  Davidson,  PNAS  92:7700  7704,  1995；Sakamoto  et  al.,  H  Gene  Ther  5:1088  1097,  1999；ＷＯ９４１１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali  et  al.,  Hum  Gene  Ther  9:81  86,  1998、Flannery  et  al.,  PNAS  94:6916  6921,  1997；Bennett  et  al.,  Invest  Opthalmol  Vis  Sci  38:2857  2863,  1997；Jomary  et  al.,  Gene  Ther  4:683  690,  1997、Rolling  et  al.,  Hum  Gene  Ther  10:641  648,  1999；Ali  et  al.,  Hum  Mol  Genet  5:591  594,  1996；Srivastava、ＷＯ９３／０９２３９、Samulski  et  al.,  J.  Vir.  (1989)  63:3822-3828；Mendelson  et  al.,  Viral.  (1988)  166:154-165；およびFlotte  et  al.,  PNAS  (1993)  90:10613-10617）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi  et  al.,  PNAS  94:10319  23,  1997；Takahashi  et  al.,  J  Virol73:7812  7816,  1999）に基づくウイルスベクター；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳房腫瘍ウイルス等のレトロウイルスに由来するベクター）；およびその他が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９８】
多数の適した発現ベクターが当業者にとって公知であり、その多くが市販されている。次のベクターを例として提示する；真核生物宿主細胞のために：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、宿主細胞と適合性である限り、他のいずれかのベクターを使用してもよい。
【０２９９】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーター等の転写制御エレメントに作動可能に連結される。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞または原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）のいずれかにおいて機能的となることができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核および真核細胞の両方におけるガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に連結される。
【０３００】
利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含む、いくつかの適した転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクターにおいて使用することができる（例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等；上述を参照）（例えば、Bitter  et  al.  (1987)  Methods  in  Enzymology,  153:516-544を参照）。
【０３０１】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドは、ＲＮＡとして提供することができる。斯かる事例では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするＲＮＡは、直接的化学合成によって産生することができる、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写することができる。ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成する方法は、当技術分野で周知である。一部の事例では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドをコードするＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ等）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されるであろう。合成されると、ＲＮＡは、標的ＤＮＡに直接的に接触させることができる、または核酸を細胞に導入するための周知技法（例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、トランスフェクション等）のいずれかによって細胞に導入することができる。
【０３０２】
ガイドＲＮＡ（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして導入）および／またはｓＲＧＮポリペプチド（ＤＮＡまたはＲＮＡとして導入）および／またはドナーポリヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、十分に開発されたトランスフェクション技法を使用して細胞に提供することができる；例えば、Angel  and  Yanik  (2010)  PLoS  ONE  5(7):  e  11756、ならびにＱｉａｇｅｎ製の市販のＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ製のＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡトランスフェクションキット、およびＭｉｍｓ  Ｂｉｏ製のＴｒａｎｓｉＴ（登録商標）−ｍＲＮＡトランスフェクションキット。Beumer  et  al.  (2008)  Efficient  gene  targeting  in  Drosophila  by  direct  embryo  injection  with  zinc-finger  nucleases.  PNAS  105(50):19821-19826も参照されたい。その代わりに、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはキメラｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸は、ＤＮＡベクターにおいて提供することができる。標的細胞への核酸の移入に有用な多くのベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージ、ウイルス等が利用できる。核酸を含むベクターは、エピソームにより、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス等のウイルス等として維持することができる、または相同組換えもしくはランダム組込みを介して標的細胞ゲノムに組み込むことができる、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶ等のレトロウイルス由来ベクター等。
【０３０３】
ベクターは、細胞に直接的に提供することができる。換言すると、ベクターが細胞によって取り入れられるように、細胞は、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはキメラｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を含むベクターと接触させられる。電気穿孔、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクションおよびリポフェクションを含む、プラスミドである核酸ベクターと細胞を接触させるための方法は、当技術分野で周知である。ウイルスベクター送達のため、細胞は、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはキメラｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触させられる。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本発明の方法に特に適する。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠損」している、すなわち、増殖性感染に要求されるウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞系における成長を要求する。目的の核酸を含むウイルス粒子を作製するために、核酸を含むレトロウイルス核酸が、パッケージング細胞系によってウイルスカプシド中にパッケージングされる。異なるパッケージング細胞系は、カプシド中に取り込まれる、異なるエンベロープタンパク質（同種指向性、両種指向性または異種指向性）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウスおよびラットに対する同種指向性；ヒト、イヌおよびマウスを含む大部分の哺乳動物細胞型に対する両種指向性；ならびにマウス細胞を除く大部分の哺乳動物細胞型に対する異種指向性）。適切なパッケージング細胞系を使用して、細胞が、パッケージングされたウイルス粒子によって標的化されることを確実にすることができる。再プログラミング因子をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞系に導入するための方法、およびパッケージング系列によって作製されたウイルス粒子を採取する方法は、当技術分野で周知である。核酸は、直接的マイクロインジェクション（例えば、ゼブラフィッシュ胚へのＲＮＡの注射）によって導入することもできる。
【０３０４】
ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはキメラｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸の細胞への提供に使用されるベクターは、一般に、目的の核酸の発現の駆動、すなわち、転写活性化に適したプロモーターを含むであろう。換言すると、目的の核酸は、プロモーターに作動可能に連結されるであろう。これは、遍在性に作用するプロモーター、例えば、ＣＭＶ−１３−アクチンプロモーター、または特定の細胞集団において活性である、もしくはテトラサイクリン等の薬物の存在に応答するプロモーター等の誘導性プロモーターを含むことができる。転写活性化とは、転写が、標的細胞において基底レベルを上回って、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、より通常は、少なくとも１０００倍増加されるであろうことが意図される。加えて、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはキメラｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの細胞への提供に使用されるベクターは、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはキメラｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを取り入れた細胞を同定することができるように、標的細胞における選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含むことができる。
【０３０５】
ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはキメラｓＲＧＮポリペプチドは、その代わりに、ＤＮＡの接触に使用することができる、またはＲＮＡとして細胞に導入することができる。細胞にＲＮＡを導入する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、直接的注射、トランスフェクション、またはＤＮＡの導入に使用される他のいずれかの方法を含むことができる。
【０３０６】
ｓＲＧＮポリペプチドは、ポリペプチドとして細胞に提供することができる。斯かるポリペプチドは、必要に応じて、産物の溶解性を増加させるポリペプチドドメインに融合することができる。ドメインは、定義されるプロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって切断されるＴＥＶ配列を介してポリペプチドに連結することができる。リンカーは、１つまたは複数の可動性配列、例えば、１〜１０個のグリシン残基を含むこともできる。一部の実施形態では、融合タンパク質の切断は、産物の溶解性を維持する緩衝剤中で、例えば、０．５〜２Ｍ尿素の存在下で、溶解性を増加させるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在下で、ならびにその他で行われる。目的のドメインは、エンドソーム溶解性（endosomolytic）ドメイン、例えば、インフルエンザＨＡドメイン；ならびに産生に役立つ他のポリペプチド、例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインおよびその他を含む。ポリペプチドは、安定性改善のために製剤化することができる。例えば、ペプチドは、ペグ化することができ、ポリエチレンオキシ基は、血流中の寿命増強を提供する。
【０３０７】
その上またはその代わりに、ｓＲＧＮポリペプチドは、ポリペプチド浸透性ドメインに融合して、細胞による取込みを促進することができる。いくつかの浸透性ドメインが当技術分野で公知であり、ペプチド、ペプチド模倣体および非ペプチド担体を含む、本発明の非組込みポリペプチドにおいて使用することができる。例えば、浸透性ペプチドは、J.  Biol.  Chem.,  271  (1996),  pp.  18188-18193にも開示されているアミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ(配列番号１２７)モチーフ（同定するためであって、本願内の開示を目的とするものではない）を含む、ペネトラチンと称されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子アンテナペディアの第３のアルファヘリックスに由来することができる。別の例として、浸透性ペプチドは、例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含むことができる、ＨＩＶ−１  ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含む。
【０３０８】
他の浸透性ドメインは、ポリアルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１  ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６の領域、ノナアルギニン、オクタアルギニンおよびその他を含む（例えば、転位置ペプチドおよびペプトイドの教示のために特に参照により本明細書に組み込まれる、Futaki  et  al.  (2003)  Curr  Protein  Pept  Sci.  2003  Apr;  4(2):  87-9  and  446；およびWender  et  al.  (2000)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  2000  Nov.  21;  97(24):13003-8；公開された米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号；同第２００３００８３２５６号；同第２００３００３２５９３号；および同第２００３００２２８３１号を参照）。ノナアルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けされた、より効率的なＰＴＤの１つである（Wender  et  al.  2000；Uemura  et  al.  2002）。融合が為される部位は、ポリペプチドの生物活性、分泌または結合特徴を最適化するために選択することができる。最適部位は、ルーチン実験法によって決定されるであろう。一部の実施形態では、ポリペプチド浸透性ドメインは、ＰＴＤのバイオアベイラビリティを増加させるために化学的に改変される。例示的な改変は、Expert  Opin  Drug  Deliv.  2009  Nov;6(11):1195-205に開示されている。
【０３０９】
ｓＲＧＮポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または真核細胞によって、原核細胞によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳（ＩＶＴＴ）によって産生することができ、アンフォールディング、例えば、熱変性、ＯＴＴ還元等によってさらにプロセシングすることができ、当技術分野で公知の方法を使用してさらにリフォールディングさせることができる。
【０３１０】
一次配列を変更しない目的の改変は、ポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化等を含む。グリコシル化の改変、例えば、その合成およびプロセシング中にまたはさらなるプロセシングステップにおいてポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって為される改変も含まれる；例えば、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素等、グリコシル化に影響を及ぼす酵素にポリペプチドを曝露することによる。リン酸化されたアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレオニンを有する配列も包含される。
【０３１１】
タンパク質分解性の分解に対するそれらの耐性を改善することができるように、標的配列特異性を変化させることができるように、溶解性特性を最適化することができるように、タンパク質活性（例えば、転写調節活性、酵素活性等）を変更することができるように、またはそれらを治療剤としてより適したものとすることができるように、通常の分子生物学的技法および合成化学を使用して改変されたガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドも本発明に含まれる。斯かるポリペプチドのアナログは、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｏ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有するアナログを含む。Ｄ−アミノ酸を、アミノ酸残基の一部または全てに代えて置換することができる。ｓＲＧＮポリペプチドは、当技術分野で公知の通りに従来方法を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって調製することができる。様々な商業的合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動合成機を利用できる。合成機を使用することにより、天然に存在するアミノ酸を、非天然アミノ酸に置換することができる。特定の配列および調製様式は、要求される利便性、経済、純度およびその他によって決定されるであろう。
【０３１２】
所望に応じて、合成または発現の際に、様々な基をペプチドに導入することができ、これにより、他の分子または表面への連結が可能となる。よって、システインを使用して、チオエーテルを作製することができ、ヒスチジンを、金属イオン錯体への連結に、カルボキシル基を、アミドまたはエステルの形成に、アミノ基を、アミドの形成に、およびその他に使用することができる。
【０３１３】
ｓＲＧＮポリペプチドを、公知の組換え合成方法に従って単離および精製することもできる。ライセートは、発現宿主から調製することができ、ライセートは、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーまたは他の精製技法を使用して精製される。大半では、使用される組成物は、産物の調製方法およびその精製に関係する夾雑物に関して、少なくとも約７５重量％または少なくとも約９５重量％等、少なくとも２０重量％の所望の産物を含み、治療目的では、少なくとも９９．５重量％を含むであろう。通常、パーセンテージは、総タンパク質に基づくであろう。ＤＮＡ切断および組換え、または標的ＤＮＡに対するいずれか所望の改変、または標的ＤＮＡに関連するポリペプチドに対するいずれか所望の改変を誘導するために、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、核酸として導入されるのであれポリペプチドとして導入されるのであれ、約３０分間〜約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分間〜約２４時間の他のいずれかの期間、細胞に提供され、これは、約毎日〜約４日毎の頻度で、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、または約毎日〜約４日毎の他のいずれかの頻度でリピートすることができる。薬剤は、１または複数回、例えば、１回、２回、３回または３回超、細胞に提供することができ、細胞は、各接触事象後にある時間量、例えば、１６〜２４時間、薬剤と共にインキュベートされ、この時間の後に、培地は新鮮培地に置き換えられ、細胞はさらに培養される。２種またはそれよりも多い異なる標的化複合体が細胞に提供される（例えば、同じまたは異なる標的ＤＮＡ内の異なる配列に相補的な２種の異なるガイドＲＮＡ）場合、複合体は、同時に提供することができる（例えば、２種のポリペプチドおよび／または核酸として）、または同時に送達することができる。その代わりに、これらは、連続的に提供することができ、例えば、当該標的化複合体が先ず提供され、続いて、第２の標的化複合体が提供される、等、またはその逆もまた同じである。
【０３１４】
一般に、有効量のガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドが、標的ＤＮＡまたは細胞に提供されて、標的改変を誘導する。有効量のガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、陰性対照、例えば、空ベクターまたは無関係ポリペプチドと接触された細胞と比べて、２種の相同配列の間に観察される標的改変の量の２倍またはそれよりも多い増加を誘導する量である。すなわち、有効量または用量のガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ領域に観察される標的改変の量の２倍増加、３倍増加、４倍またはそれよりも多い増加、一部の実例では、観察される組換えの量の５倍増加、６倍またはそれよりも多い増加、時には、観察される組換えの量の７倍もしくは８倍またはそれよりも多い増加、例えば、１０倍、５０倍もしくは１００倍またはそれよりも多い増加、一部の実例では、２００倍、５００倍、７００倍もしくは１０００倍またはそれよりも多い増加、例えば、５０００倍もしくは１０，０００倍増加を誘導するであろう。標的改変の量は、いずれか簡便な方法によって測定することができる。例えば、組換えを行うときに活性レポーターをコードする核酸を再構成するであろう、リピート配列に挟まれたガイドＲＮＡの標的化セグメント（標的化配列）に対する相補配列を含むサイレントレポーター構築物を、細胞に同時トランスフェクトすることができ、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドとの接触後に、例えば、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドとの接触から２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間またはそれよりも多い時間の後に、レポータータンパク質の量が評価される。別の、より高感度のアッセイとして、例えば、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドとの接触後に、例えば、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドとの接触から２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間またはそれよりも多い時間の後に、標的ＤＮＡ配列を含む目的のゲノムＤＮＡ領域における組換えの程度を、領域のＰＣＲまたはサザンハイブリダイゼーションによって評価することができる。
【０３１５】
ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドと細胞との接触は、細胞の生存を促進するいずれかの培養培地においていずれかの培養条件下で、発生することができる。例えば、細胞は、ウシ胎仔血清または熱不活性化ヤギ血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に、２−メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０等、簡便ないずれか適切な栄養培地に懸濁することができる。培養物は、細胞が応答性である増殖因子を含有することができる。本明細書に定義されている増殖因子は、培養物またはインタクトな組織のいずれかにおいて、膜貫通受容体における特異的な効果を介して、細胞の生存、成長および／または分化を促進することができる分子である。増殖因子は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。細胞の生存を促進する条件は、一般に、非相同末端結合および相同性により導かれる修復を許容する。ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列に挿入することが望ましい適用において、挿入されるべきドナー配列を含むポリヌクレオチドも、細胞に提供される。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」とは、ｓＲＧＮポリペプチドによって誘導された切断部位に挿入されるべき核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、切断部位におけるゲノム配列に対し十分な相同性、例えば、例えば、切断部位の約５０塩基またはそれ未満内、例えば、約３０塩基内、約１５塩基内、約１０塩基内、約５塩基内で、または切断部位をすぐに接して挟む、切断部位を挟むヌクレオチド配列と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相同性を含有して、ドナーポリヌクレオチドと、ドナーポリヌクレオチドが相同性を有するゲノム配列との間の相同性により導かれる修復を支持するであろう。ドナーおよびゲノム配列の間の配列相同性のおよそ２５、５０、１００もしくは２００ヌクレオチドまたは２００ヌクレオチド超（または１０〜２００ヌクレオチドの間のいずれかの整数値またはそれよりも多く）は、相同性により導かれる修復を支持するであろう。ドナー配列は、いずれかの長さ、例えば、１０ヌクレオチドまたはそれよりも多い、５０ヌクレオチドまたはそれよりも多い、１００ヌクレオチドまたはそれよりも多い、２５０ヌクレオチドまたはそれよりも多い、５００ヌクレオチドまたはそれよりも多い、１０００ヌクレオチドまたはそれよりも多い、５０００ヌクレオチドまたはそれよりも多い等となることができる。
【０３１６】
ドナー配列は、一般に、それが置き換わるゲノム配列と同一ではない。むしろ、相同性により導かれる修復を支持するのに十分な相同性が存在する限りにおいて、ドナー配列は、ゲノム配列に関して、少なくとも１つまたは複数の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位または再編成を含有することができる。一部の実施形態では、標的ＤＮＡ領域および２つの挟む配列の間の相同性により導かれる修復が、標的領域における非相同配列の挿入をもたらすように、ドナー配列は、２つの相同性の領域に挟まれた非相同配列を含む。ドナー配列は、目的のＤＮＡ領域と相同でない、目的のＤＮＡ領域への挿入に意図されない配列を含有するベクター骨格を含むこともできる。一般に、ドナー配列の相同領域は、組換えが所望されるゲノム配列に対し少なくとも５０％配列同一性を有するであろう。ある特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．９％配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％〜１００％配列同一性の間のいずれかの値が存在し得る。ドナー配列は、ゲノム配列と比較して、ある特定の配列の差、例えば、切断部位におけるドナー配列の挿入成功の評価に使用することができる、または一部の事例では、他の目的（例えば、標的化されたゲノム遺伝子座における発現を知らせるため）のために使用することができる、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素等）等を含むことができる。一部の事例では、コード領域に位置する場合、斯かるヌクレオチド配列の差は、アミノ酸配列を変化させないであろう、またはサイレントなアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響を及ぼさない変化）を作製するであろう。その代わりに、このような配列の差は、マーカー配列の除去のためにその後に活性化され得る、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列またはその他等、隣接する組換え配列を含むことができる。
【０３１７】
ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡとして細胞に提供することができる。ドナー配列は、直鎖状または環状形態で細胞に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者にとって公知の方法によって保護されていてよい（例えば、エキソヌクレアーゼ的分解から）。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に付加される、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Chang  et  al.  (1987)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  84:4959-4963；Nehls  et  al.  (1996)  Science  272:886-889を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法として、末端アミノ基の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（phosphoramidate）および０−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の改変されたヌクレオチド間連結の使用が挙げられるがこれらに限定されない。直鎖状ドナー配列の末端の保護の代替として、追加的な長さの配列が相同性の領域の外側に含まれてよく、これは、組換えに影響することなく分解され得る。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子等の追加的な配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ドナー配列は、ネイキッド（すなわち、無改変）核酸として、リポソームもしくはポロクサマー等の薬剤と複合体形成した核酸として導入することができる、またはガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について上に記載されている通り、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達することができる。
【０３１８】
上に記載されている方法に従って、目的のＤＮＡ領域を切断および改変することができる、すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏで「遺伝子改変」することができる。一部の実施形態では、選択可能なマーカーが目的のＤＮＡ領域に挿入されると、遺伝子改変された細胞を残りの集団から分離することにより、細胞の集団は、遺伝子改変を含む細胞を濃縮することができる。濃縮に先立ち、「遺伝子改変された」細胞は、細胞集団の約１％またはそれよりも多く（例えば、２％またはそれよりも多く、３％またはそれよりも多く、４％またはそれよりも多く、５％またはそれよりも多く、６％またはそれよりも多く、７％またはそれよりも多く、８％またはそれよりも多く、９％またはそれよりも多く、１０％またはそれよりも多く、１５％またはそれよりも多く、または２０％またはそれよりも多く）のみを構成することができる。「遺伝子改変された」細胞の分離は、使用されている選択可能なマーカーに適切ないずれか簡便な分離技法によって達成することができる。例えば、蛍光マーカーが挿入された場合、細胞は、蛍光標識細胞分取によって分離することができ、一方で、細胞表面マーカーが挿入された場合、細胞は、固体マトリックスに取り付けられた親和性試薬を用いた、親和性分離技法、例えば、磁気分離、親和性クロマトグラフィー、「パニング」、または他の簡便な技法によって不均一集団から分離することができる。正確な分離を提供する技法は、変動する程度の精密化を有することができる、蛍光標示式細胞分取器を含む。複数の色チャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル等。細胞は、死細胞に関連する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることにより、死細胞に対して選択することができる。遺伝子改変された細胞の生存率にとって過度に有害でない、いずれかの技法を用いることができる。改変されたＤＮＡを含む細胞が高度に濃縮された細胞組成が、この様式で達成される。「高度に濃縮された」とは、遺伝子改変された細胞が、細胞組成の７０％またはそれよりも多く、７５％またはそれよりも多く、８０％またはそれよりも多く、８５％またはそれよりも多く、９０％またはそれよりも多く、例えば、細胞組成の約９５％もしくはそれよりも多く、または９８％もしくはそれよりも多くなるであろうことを意味する。換言すると、組成は、遺伝子改変された細胞の実質的に純粋な組成となることができる。
【０３１９】
本明細書に記載されている方法によって産生された遺伝子改変された細胞は、直ちに使用することができる。その代わりに、細胞は、液体窒素温度で凍結し、長期間貯蔵することができ、解凍して、再使用することができる。斯かる事例では、細胞は、通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、または斯かる凍結温度での細胞の保存に一般的に当技術分野で使用されるような一部の他の斯かる溶液中で凍結され、凍結した培養細胞を解凍するための一般的に当技術分野で公知の様式で解凍されるであろう。
【０３２０】
遺伝子改変された細胞を、当技術分野で公知の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。細胞は、培養において増やすことができる、すなわち、その増殖を促進する条件下で成長させることができる。培養培地は、例えば、寒天、メチルセルロース等を含有する、液体または半固体となることができる。細胞集団は、ウシ胎仔血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に、２−メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを通常補充した、イスコフ（lscove）改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０等、適切な栄養培地に懸濁することができる。培養物は、それぞれの細胞が応答性である増殖因子を含有することができる。本明細書に定義されている増殖因子は、培養物またはインタクトな組織のいずれかにおいて、膜貫通受容体における特異的な効果を介して、細胞の生存、成長および／または分化を促進することができる分子である。増殖因子は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。このような仕方で遺伝子改変された細胞は、例えば、疾患を処置するための、または抗ウイルス、抗病原性もしくは抗がん療法としての遺伝子療法、農業における遺伝子改変された生物の産生のため、または生物学的研究のため等の目的で、対象に移植することができる。一部の場合では、ヒトにおける使用のための細胞は、ゼノフリー培地で培養される。対象は、新生児、若年または成人となることができる。哺乳動物対象が特に興味深い。本方法で処置することができる哺乳動物種は、イヌおよびネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ；等、ならびに霊長類、特にヒトを含む。動物モデル、特に小型哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ目動物（例えば、ウサギ）等）を実験調査に使用することができる。
【０３２１】
細胞は、単独で、または例えば、移植される組織におけるその成長および／または組織化を支持するための適した基材またはマトリックスと共に、対象に提供することができる。通常、少なくとも１×１０３個の細胞、例えば５×１０３個の細胞、１×１０４個の細胞、５×１０４個の細胞、１×１０５個の細胞、１×１０６個の細胞またはそれよりも多くが投与されるであろう。細胞は、次の経路のいずれかを介して対象に導入することができる：非経口的、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、または髄液中。細胞は、注射、カテーテルまたはその他によって導入することができる。局所的送達、すなわち、傷害の部位への送達のための方法の例として、例えば、くも膜下腔内送達のための、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーによる（例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許第５，２２２，９８２号および同第５，３８５，５８２号）；例えば、関節への、例えば、シリンジによるボーラス注射による；例えば、対流を用いた、例えば、カニューレ処置による、持続注入による（例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００７０２５４８４２号）；または細胞が可逆的に貼られたデバイスの植込みによる（例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００８００８１０６４号および同第２００９０１９６９０３号）方法が挙げられる。細胞は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）を作製する目的で、胚（例えば、胚盤胞）に導入することもできる。
【０３２２】
ｓＲＧＮ系の送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはｓＲＧＮポリペプチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達媒体によって送達することができる。
【０３２３】
ポリヌクレオチドを、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正荷電ペプチド、小分子ＲＮＡ−コンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、およびＲＮＡ−融合タンパク質複合体を含むがこれらに制限されない、非ウイルス送達媒体により送達することができる。一部の例示的な非ウイルス送達媒体は、Peer  and  Lieberman,  Gene  Therapy,  18:  1127-1133  (2011)に記載されている（これは、他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス送達媒体に焦点を当てている）。
【０３２４】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを送達に使用することができる。送達すべきポリヌクレオチドを含むパッケージされるＡＡＶゲノムとｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子とヘルパーウイルス機能とを細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を産生する技法は、当技術分野では標準的である。ｒＡＡＶの産生は、次の構成成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別の（すなわち、ｒＡＡＶゲノムに存在しない）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞と表示される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得るいずれのＡＡＶ血清型からのものであってもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３およびＡＡＶ  ｒｈ．７４を含むがこれらに制限されない、ｒＡＡＶゲノムのＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からのものであってもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。
【表３】
2021518139.tif 000005
【０３２５】
パッケージング細胞を作出する方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な構成成分全てを安定的に発現する細胞系の創出である。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いているｒＡＡＶゲノムを含むプラスミド（または複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子を、細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Samulski  et  al.,  1982,  Proc.  Natl.  Acad.  S6.  USA,  79:2077-2081）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Laughlin  et  al.,  1983,  Gene,  23:65-73）などの手順により、または直接的な平滑末端ライゲーション（Senapathy  &  Carter,  1984,  J.  Biol.  Chem.,  259:4661-4666）により、細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞系にアデノウイルスなどのヘルパーウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大量生産に適していることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを利用する。
【０３２６】
ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Carter,  1992,  Current  Opinions  in  Biotechnology,  1533-539；およびMuzyczka,  1992,  Curr.  Topics  in  Micro  Biol.  and  Immunol.,  158:97-129において概説されている。様々な手法が、Ratschin  et  al.,  Mol.  Cell.  Bio.  4:2072  (1984)；Hermonat  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  81:6466  (1984)；Tratschin  et  al.,  Mol.  Cell.  Biol.  5:3251  (1985)；Mclaughlin  et  al.,  J.  Virol.,  62:1963  (1988)；およびLebkowski  et  al.,  1988  Mol.  Cell.  Biol.,  7:349  (1988)；Samulski  et  al.  (1989,  J.  Virol.,  63:3822-3828)；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５および対応米国特許第５，６５８，７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Perrin  et  al.(1995)  Vaccine  13:1244-1250；Paul  et  al.(1993)  Human  Gene  Therapy  4:609-615；Clark  et  al.(1996)  Gene  Therapy  3:1124-1132；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。
【０３２７】
ＡＡＶベクター血清型を標的細胞型に対応させることができる。例えば、数ある中でも特に示されているＡＡＶ血清型によって形質導入される、以下の例示的細胞型。
【表４】
2021518139.tif 000006
【０３２８】
対象への処置の投与数は、変動し得る。対象への遺伝子改変された細胞の導入は、１回限りの事象となることができるが；ある特定の状況では、斯かる処置は、限られた期間での改善を誘発することができ、進行中の一連のリピートされる処置を要求する。他の状況では、効果が観察される前に、遺伝子改変された細胞の複数の投与が要求され得る。正確なプロトコールは、疾患または状態、疾患のステージ、および処置されている個々の対象のパラメーターに依存する。
【０３２９】
本開示の他の態様では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞ＤＮＡの改変に用いられ、例えば、例えば、疾患を処置するための、または抗ウイルス、抗病原性もしくは抗がん療法としての遺伝子療法、農業における遺伝子改変された生物の産生のため、または生物学的研究のため等を目的とする。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、個体に直接的に投与される。ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを、対象へのペプチド、小分子および核酸の投与のための当技術分野で公知のいくつかの方法のうちのいずれかにより、投与することができる。ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、種々の製剤へと取り込むことができる。より具体的には、本発明のガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤との組合せによって、医薬組成物へと製剤化することができる。一部の場合では、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮは、ｅｘ  ｖｉｖｏ送達用に製剤化されている。
【０３３０】
医薬調製物は、薬学的に許容される媒体中に存在する１つまたは複数のガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを含む組成物である。「薬学的に許容される媒体」は、ヒト等の哺乳動物における使用のための、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認された、または米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方に収載された媒体となることができる。用語「媒体」は、本発明の化合物が、それと共に哺乳動物への投与のために製剤化される、希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体を指す。斯かる医薬品媒体は、脂質、例えば、リポソーム、例えば、リポソームデンドリマー；ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油およびその他等、石油、動物、植物または合成起源の油を含む、水および油等の液体、生理食塩水；アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素、ならびにその他となることができる。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することができる。医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射、吸入剤、ゲル、マイクロスフェアおよびエアロゾル等、固体、半固体、液体または気体の形態の調製物へと製剤化することができる。そのようなものとして、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの投与は、経口、頬側、直腸、非経口的、腹腔内、皮内、経皮、気管内、眼内等の投与を含む、様々な仕方で達成することができる。活性薬剤は、投与後に全身性となることができる、または領域性投与、壁内投与の使用によって、もしくは植込み部位に活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって局在化することができる。活性薬剤は、即時活性のために製剤化することができる、または徐放のために製剤化することができる。
【０３３１】
一部の状態、特に、中枢神経系状態に関して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するように薬剤を製剤化することが必要となる場合がある。ＢＢＢを通る薬物送達のための戦略の１つは、マンニトールもしくはロイコトリエン等の浸透圧的手段による、またはブラジキニン等の血管作動性物質の使用による生化学的な、ＢＢＢの破壊を伴う。特異的薬剤を脳腫瘍に標的化するためのＢＢＢ開通の使用の潜在力も、オプションである。組成物が、血管内注射によって投与される場合、ＢＢＢ破壊剤は、本発明の治療組成物と同時投与することができる。ＢＢＢを通る送達のための他の戦略は、カベオリン−１媒介性トランスサイトーシス、グルコースおよびアミノ酸担体等の担体媒介性トランスポーター、インスリンまたはトランスフェリンのための受容体媒介性トランスサイトーシス、ならびにｐ−糖タンパク質等の活性排出トランスポーターを含む、内因性輸送系の使用を伴う場合がある。活性輸送部分は、本発明における使用のための治療化合物にコンジュゲートして、血管の内皮壁を越えた輸送を容易にすることもできる。その代わりに、ＢＢＢの裏側で、治療剤の薬物送達は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーによる、例えば、くも膜下腔内送達による（例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許第５，２２２，９８２号および同第５３８５５８２号を参照）；例えば、硝子体内もしくは頭蓋内に、例えば、シリンジによるボーラス注射による；例えば、対流を用いた、例えば、カニューレ処置による、持続注入による（例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００７０２５４８４２号を参照）；または薬剤が可逆的に貼られたデバイスの植込みによる（例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００８００８１０６４号および同第２００９０１９６９０３号を参照）、局所的送達によって為すことができる。
【０３３２】
一般に、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量が提供される。ｅｘ  ｖｉｖｏ方法に関して上に記す通り、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効用量は、陰性対照、例えば、空ベクターまたは無関係ポリペプチドと接触された細胞と比べて、２種の相同配列の間に観察される組換えの量に２倍またはそれよりも多い増加を誘導する量である。組換えの量は、例えば、上に記載されており当技術分野で公知の、いずれか簡便な方法によって測定することができる。投与されるべきガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効用量の計算は、当業者の技能範囲内にあり、当業者にとってルーチンとなるであろう。投与されるべき最終量は、投与経路、および処置されるべき障害または状態の性質に依存するであろう。
【０３３３】
特定の患者に与えられる有効量は、種々の因子に依存し、これらの因子のうちいくつかは、患者間で異なるであろう。適格な臨床医であれば、要求に応じて疾患状態の進行を停止または反転するために患者に投与する、治療剤の有効量を決定することができるであろう。ＬＤ５０動物データおよび薬剤に利用できる他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体の最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内投与される用量は、くも膜下腔内投与される用量より、治療組成物が投与されている流体の量が多いことを考慮すると、多い量の治療剤を有し得る。同様に、身体から急速に排除される組成物は、治療濃度を維持するために、より高用量で、またはリピートされる用量で投与することができる。通常の技能を利用して、適格な臨床医であれば、ルーチン臨床試験の経過において特定の治療薬の投薬量を最適化することができるであろう。
【０３３４】
医薬中に包含するため、ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、適した商業的供給源から得ることができる。一般命題として、用量当たりの、非経口的に投与されるガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの総薬学的有効量は、用量応答曲線によって測定され得る範囲内にあるであろう。
【０３３５】
ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドに基づく治療法、すなわち、治療的投与に使用されるべきガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの調製物は、滅菌されていなければならない。滅菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２  １−１ｍ膜）を通した濾過によって容易に達成される。治療組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能な（pierceable）ストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルの中に置かれる。ガイドＲＮＡおよび／またはｓＲＧＮポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドに基づく治療法は、単位または複数用量容器、例えば、封着されたアンプルまたはバイアル内に、水溶液または再構成のための凍結乾燥された製剤として貯蔵することができる。凍結乾燥された製剤の例として、１０ｍｌバイアルに、５ｍｌの滅菌濾過された、化合物の１％（ｗ／ｖ）水溶液を充填し、その結果得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、静菌的な注射用の水を使用して、凍結乾燥された化合物を再構成することにより調製される。
【０３３６】
医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与のための医薬組成物の製剤化に一般的に使用される媒体として定義される、薬学的に許容される無毒性担体または希釈剤を含むことができる。希釈剤は、組合せの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。斯かる希釈剤の例は、蒸留水、緩衝した水、生理的食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒性で、非治療的で、非免疫原性の安定剤、賦形剤およびその他を含むことができる。組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、ならびに洗剤等、生理的条件に近似するための追加的な物質を含むこともできる。
【０３３７】
組成物は、例えば、抗酸化剤等、種々の安定化剤のいずれかを含むこともできる。医薬組成物が、ポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増強する、さもなければ、その薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低下させる、溶解性または取込みを増強する）様々な周知化合物と複合体形成することができる。斯かる改変または複合体形成剤の例として、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩が挙げられる。組成物の核酸またはポリペプチドは、そのｉｎ  ｖｉｖｏ特質を増強する分子と複合体形成することもできる。斯かる分子は、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）および脂質を含む。
【０３３８】
様々な種類の投与に適している製剤に関するさらなるガイダンスは、当技術分野、例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  Mace  Publishing  Company,  Philadelphia,  Pa.,  21st  ed.  (2006)にて公知である。薬物送達のための方法の短い総説については、Langer,  Science  249:1527-1533  (1990)を参照されたい。
【０３３９】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。活性成分の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）の決定を含む、細胞培養物および／または実験動物において標準医薬品手順に従って決定することができる。毒性および治療効果の間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる。大きい治療指数を示す治療法が、好まれ得る。
【０３４０】
細胞培養および／または動物研究から得られるデータは、ヒトのためのある範囲の投薬量の製剤化において使用することができる。活性成分の投薬量は、一般に、低毒性によるＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。医薬組成物の製剤化に使用される構成成分は、一部の実施形態では、高純度であり、潜在的に害を及ぼす夾雑物を実質的に含まない（例えば、少なくとも国の食品（ＮＦ）グレード、一般に、少なくとも分析グレード、これは少なくとも医薬品グレードを含む）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用に意図される組成物は通常、滅菌されている。使用前に所与の化合物が合成される必要がある程度まで、その結果得られる産物は、一般に、合成または精製プロセスの際に存在し得る、いかなる潜在的に毒性の薬剤、特に、いかなるエンドトキシンも実質的に含まない。非経口的（parental）投与のための組成物もまた、滅菌されており、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。
【０３４１】
特定の患者に与えられるべき治療組成物の有効量は、種々の因子に依存し、これらの因子のうちいくつかは、患者間で異なるであろう。適格な臨床医であれば、要求に応じて疾患状態の進行を停止または反転するために患者に投与する、治療剤の有効量を決定することができるであろう。ＬＤ５０動物データおよび薬剤に利用できる他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体の最大安全用量を決定することができる。例えば、治療組成物が投与されている流体の量が多いことを考慮すると、静脈内投与される用量は、くも膜下腔内投与される用量を超えることができる。同様に、身体から急速に排除される組成物は、治療濃度を維持するために、より高用量で、またはリピートされる用量で投与することができる。通常の技能を利用して、適格な臨床医であれば、ルーチン臨床試験の経過において特定の治療薬の投薬量を最適化することができるであろう。
【０３４２】
遺伝子改変された宿主細胞
本開示は、単離された遺伝子改変された宿主細胞を含む遺伝子改変された宿主細胞であって、次のものを含む（これにより遺伝子改変された）、遺伝子改変された宿主細胞を提供する：
【０３４３】
１）外因性ガイドＲＮＡ；２）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸；３）外因性ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）；４）ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸；または５）上述のいずれかの組合せ。遺伝子改変された細胞は、例えば：１）外因性ガイドＲＮＡ；２）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸；３）外因性ｓＲＧＮポリペプチド；４）ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸；または５）上述のいずれかの組合せにより宿主細胞を遺伝子改変することにより作製される。
【０３４４】
標的細胞に適したあらゆる細胞は、遺伝子改変された宿主細胞にも適する。例えば、目的の遺伝子改変された宿主細胞は、いずれかの生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．Ａｇａｒｄｈおよびその他、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒト等）由来の細胞等となることができる。
【０３４５】
一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸により遺伝子改変された。遺伝子改変された宿主細胞のＤＮＡは、ガイドＲＮＡ（または改変されるべきゲノム位置／配列を決定する、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）および必要に応じてドナー核酸を細胞に導入することにより、改変のために標的化することができる。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーター等）に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、空間的に制限および／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、細胞周期特異的プロモーター）に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。
【０３４６】
一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにある。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにある。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、原核細胞である、または原核細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、細菌細胞である、または細菌細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、古細菌細胞である、または古細菌細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、真核細胞である、または真核細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、植物細胞である、または植物細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、動物細胞である、または動物細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、無脊椎動物細胞である、または無脊椎動物細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、脊椎動物細胞である、または脊椎動物細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、哺乳動物細胞である、または哺乳動物細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、齧歯類細胞である、または齧歯類細胞に由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ヒト細胞である、またはヒト細胞に由来する。
【０３４７】
本開示は、さらに、遺伝子改変された細胞の後代であって、これが由来する遺伝子改変された細胞と同じ外因性核酸またはポリペプチドを含むことができる、後代を提供する。本開示は、さらに、遺伝子改変された宿主細胞を含む組成物を提供する。
【０３４８】
遺伝子改変された幹細胞および遺伝子改変された前駆細胞
一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、遺伝子改変された幹細胞または前駆細胞である。適した宿主細胞は、例えば、幹細胞（成体幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞等）および前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞等）を含む。適した宿主細胞は、例えば、齧歯類幹細胞、齧歯類前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞等を含む、哺乳動物幹細胞および前駆細胞を含む。適した宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ宿主細胞、例えば、単離された宿主細胞を含む。
【０３４９】
一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、外因性ガイドＲＮＡ核酸を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、外因性ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、１）ガイドＲＮＡおよび２）ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。
【０３５０】
一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、配列番号１〜１２における配列のいずれかに対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％もしくは１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、または少なくとも１００、１５０、２００、３００、３５０、４００もしくは５００アミノ酸長であるその活性部分を含む。一部の実施形態では、活性部分は、ＲＮａｓｅドメインを含む。他の実施形態では、活性部分は、ＤＮａｓｅドメインを含む。
【０３５１】
組成物
本開示は、ガイドＲＮＡおよび／または部位指向型改変ポリペプチドを含む組成物を提供する。一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、キメラポリペプチドである。組成物は、本開示の方法、例えば、標的ＤＮＡの部位特異的改変のための方法；標的ＤＮＡに関連するポリペプチドの部位特異的改変のための方法；等の実行に有用である。
【０３５２】
ガイドＲＮＡを含む組成物
本開示は、ガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。組成物は、ガイドＲＮＡに加えて、次のうち１つまたは複数を含むことができる：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、等；緩衝剤、例えば、トリス緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ＭＥＳナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル（methy1）−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、等；可溶化剤；洗剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０等の非イオン性洗剤、等；ヌクレアーゼ阻害剤；およびその他。例えば、一部の事例では、組成物は、ガイドＲＮＡおよび核酸を安定化するための緩衝剤を含む。
【０３５３】
一部の実施形態では、組成物中に存在するガイドＲＮＡは、純粋、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または９９％超純粋であり、「％純度」は、ガイドＲＮＡが、列挙されているパーセントだけ、ガイドＲＮＡの産生の際に存在し得る他の巨大分子または夾雑物を含まないことを意味する。
【０３５４】
キメラポリペプチドを含む組成物
本開示は、キメラポリペプチドの組成物を提供する。組成物は、ガイドＲＮＡに加えて、次のうち１つまたは複数を含むことができる：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、等；緩衝剤、例えば、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、等；可溶化剤；洗剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０等の非イオン性洗剤、等；プロテアーゼ阻害剤；還元剤（例えば、ジチオスレイトール）；およびその他。
【０３５５】
一部の実施形態では、組成物中に存在するキメラポリペプチドは、純粋、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または９９％超純粋であり、「％純度」は、部位指向型改変ポリペプチドが、列挙されているパーセントだけ、キメラポリペプチドの産生の際に存在し得る他のタンパク質、他の巨大分子または夾雑物を含まないことを意味する。
【０３５６】
ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドを含む組成物
本開示は、（ｉ）ガイドＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡ核酸；および（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸を含む組成物を提供する。一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、キメラｓＲＧＮポリペプチドである。他の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、天然に存在するｓＲＧＮポリペプチドである。一部の実例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、標的ＤＮＡを改変する酵素活性を示す。他の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、標的ＤＮＡに関連するポリペプチドを改変する酵素活性を示す。また他の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、標的ＤＮＡの転写を調節する。
【０３５７】
本開示は、（ｉ）ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、上に記載されているガイドＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡ核酸；ならびに（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）部位指向型酵素活性を示す活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸を含む組成物であって、酵素活性の部位が、ガイドＲＮＡによって決定される、組成物を提供する。
【０３５８】
一部の実例では、組成物は、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡ；ならびに（ｉｉ）（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）部位指向型酵素活性を示す活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドを含み、酵素活性の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。
【０３５９】
他の実施形態では、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）部位指向型改変ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡをコードする核酸；ならびに（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）部位指向型酵素活性を示す活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸を含み、酵素活性の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。
【０３６０】
本開示は、（ｉ）ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡ核酸；ならびに（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸を含む組成物であって、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位が、ガイドＲＮＡによって決定される、組成物を提供する。
【０３６１】
例えば、一部の事例では、組成物は、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡ；ならびに（ｉｉ）（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドを含み、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。
【０３６２】
別の例として、一部の事例では、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ核酸；ならびに（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含む、部位指向型改変ポリペプチドをコードする核酸を含み、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。組成物は、ｉ）ガイドＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡ核酸；およびｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸に加えて、次のうち１つまたは複数を含むことができる：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、等；緩衝剤、例えば、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、等；可溶化剤、洗剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等の非イオン性洗剤、等；プロテアーゼ阻害剤；還元剤（例えば、ジチオスレイトール）；およびその他。
【０３６３】
一部の事例では、組成物の構成成分は、個々に純粋である、例えば、構成成分のそれぞれは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９％純粋である。一部の事例では、組成物の個々の構成成分は、組成物に添加される前に純粋である。
【０３６４】
例えば、一部の実施形態では、組成物中に存在するｓＲＧＮポリペプチドは、純粋、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または９９％超純粋であり、「％純度」は、ｓＲＧＮポリペプチドが、列挙されているパーセントだけ、ｓＲＧＮポリペプチドの産生の際に存在し得る他のタンパク質（例えば、ｓＲＧＮポリペプチド以外のタンパク質）、他の巨大分子または夾雑物を含まないことを意味する。
【０３６５】
キット
本開示は、方法を実行するためのキットを提供する。キットは、次のうち１つまたは複数を含むことができる：ｓＲＧＮポリペプチド；部位指向型改変ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸；ガイドＲＮＡ；ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。キットは、次のうち２つまたはそれよりも多くを含む複合体を含むことができる：ｓＲＧＮポリペプチド；ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸；ガイドＲＮＡ；ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。一部の実施形態では、キットは、ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドは、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位を決定する。一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドの活性部分は、低下または不活性化されたヌクレアーゼ活性を示す。一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、キメラｓＲＧＮポリペプチドである。
【０３６６】
一部の実施形態では、キットは、ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸、ならびにｓＲＧＮポリペプチドを再構成および／または希釈するための試薬を含む。他の実施形態では、キットは、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、キットは、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）；ならびにｓＲＧＮポリペプチドを再構成および／または希釈するための試薬を含む。
【０３６７】
ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸を含むキットは、１つまたは複数の追加的な試薬をさらに含むことができ、斯かる追加的な試薬は、細胞にｓＲＧＮポリペプチドを導入するための緩衝剤；洗浄緩衝剤；対照試薬；対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド；ＤＮＡからのｓＲＧＮポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のための試薬、およびその他から選択することができる。一部の事例では、キット中に含まれる部位指向型改変ポリペプチドは、上に記載されているキメラｓＲＧＮポリペプチドである。
【０３６８】
一部の実施形態では、キットは、ガイドＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡ核酸を含み、ガイドＲＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）部位指向型改変ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む。一部の実施形態では、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡ核酸；ならびに（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）部位指向型酵素活性を示す活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸を含み、酵素活性の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドの活性部分は、酵素活性を示さない（例えば、突然変異により、不活性化されたヌクレアーゼを含む）。一部の事例では、キットは、ガイドＲＮＡおよびｓＲＧＮポリペプチドを含む。他の事例では、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；および（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。別の例として、キットは、
【０３６９】
（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡ核酸；ならびに（ｉｉ）（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドまたはこれをコードする核酸を含むことができ、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。一部の事例では、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡ；およびｓＲＧＮポリペプチドを含む。他の事例では、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；および（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。本開示は、（１）（ｉ）ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）部位指向型酵素活性を示す活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターであって、酵素活性の部位が、ガイドＲＮＡによって決定される、組換え発現ベクター；ならびに（２）発現ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含むキットを提供する。
【０３７０】
本開示は、（１）（ｉ）ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｂ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含む、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターであって、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位が、ガイドＲＮＡによって決定される、組換え発現ベクター；ならびに（２）組換え発現ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含むキットを提供する。
【０３７１】
本開示は、（１）（ｉ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；および（ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントを含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え発現ベクター；ならびに（２）組換え発現ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含むキットを提供する。本キットの一部の実施形態では、キットは、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含み、ｓＲＧＮポリペプチドは、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）部位指向型酵素活性を示す活性部分を含み、酵素活性の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。本キットの他の実施形態では、キットは、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含み、ｓＲＧＮポリペプチドは、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。
【０３７２】
上述のキットのいずれかの一部の実施形態では、キットは、単一分子ガイドＲＮＡを含む。上述のキットのいずれかの一部の実施形態では、キットは、２種またはそれよりも多い単一分子ガイドＲＮＡを含む。上述のキットのいずれかの一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ（例えば、２種またはそれよりも多いガイドＲＮＡを含む）は、アレイ（例えば、ＲＮＡ分子のアレイ、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子のアレイ、等）として提供することができる。斯かるキットは、例えば、ｓＲＧＮポリペプチドを含む上に記載されている遺伝子改変された宿主細胞と併せた使用に有用となることができる。上述のキットのいずれかの一部の実施形態では、キットは、所望の遺伝子改変をもたらすためのドナーポリヌクレオチドをさらに含む。キットの構成成分は、別々の容器内に存在することができる；または単一の容器内で組み合わせることができる。
【０３７３】
一部の事例では、キットは、野生型ｓＲＧＮと比べて低下したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す、１つまたは複数の変異体ｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをさらに含む。
【０３７４】
一部の事例では、キットは、野生型ｓＲＧＮと比べて低下したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す、変異体ｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸をさらに含む。
【０３７５】
上に記載されているキットのいずれかは、１つまたは複数の追加的な試薬をさらに含むことができ、斯かる追加的な試薬は、希釈緩衝剤；再構成溶液；洗浄緩衝剤；対照試薬；対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド；ＤＮＡからのｓＲＧＮポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のための試薬、およびその他から選択することができる。
【０３７６】
前述の構成成分に加えて、キットは、キットの構成成分を使用して、本方法を実施するための使用説明書をさらに含むことができる。本方法を実施するための使用説明書は、一般に、適した記録媒体に記録される。例えば、使用説明書は、紙またはプラスチック等の基材に印刷することができる。そのようなものとして、使用説明書は、添付文書として、キットまたはその構成成分の容器の標識において（すなわち、パッケージまたはパッケージの一部と関連付けて）、等で、キット中に存在することができる。他の実施形態では、使用説明書は、適したコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の使用説明書は、キット中に存在しないが、例えば、インターネット経由で、遠隔にある供給源から使用説明書を得るための手段が提供される。本実施形態の例は、使用説明書を閲覧することができる、および／または使用説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。使用説明書と同様に、このような、使用説明書を得るための手段は、適した基材に記録されている。
【０３７７】
非ヒトの遺伝子改変された生物
一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸により遺伝子改変された。斯かる細胞が、真核単一細胞生物である場合、改変された細胞は、遺伝子改変された生物と考慮することができる。一部の実施形態では、非ヒトの遺伝子改変された生物は、ｓＲＧＮトランスジェニック多細胞生物である。
【０３７８】
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト宿主細胞（例えば、部位指向型改変ポリペプチド、例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸により遺伝子改変された細胞）は、遺伝子改変された非ヒト生物（例えば、マウス、魚類、カエル、ハエ、虫等）を作製することができる。例えば、遺伝子改変された宿主細胞が、多能性幹細胞（すなわち、ＰＳＣ）または胚細胞（例えば、精子、卵母細胞等）である場合、遺伝子改変された宿主細胞から遺伝子改変された生物全体を得ることができる。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、遺伝子改変された生物を生じることができる、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかにおける、多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、多能性植物幹細胞等）または胚細胞（例えば、精子細胞、卵母細胞等）である。一部の実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、脊椎動物ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ等）であり、遺伝子改変された生物の作製に使用される（例えば、ＰＳＣを胚盤胞に注射して、キメラ／モザイク動物を産生することによる；次いでこの動物を交配して、非キメラ／非モザイクの遺伝子改変された生物を作製することができる；植物の場合は接木；等）。本明細書に記載されている方法を含む、遺伝子改変された生物を産生するためのいずれか簡便な方法／プロトコールは、ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む遺伝子改変された宿主細胞の産生に適する。遺伝子改変された生物を産生する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Cho  et  al.,  Curr  Protoc  Cell  Biol.  2009  Mar;  Chapter  19:Unit  19.11：Generation  of  transgenic  mice;  Gama  et  al.,  Brain  Struct  Funct.  2010  Mar;  214(2-3):91-109.  Epub  2009  Nov  25：Animal  transgenesis:  an  overview;  Husaini  et  al.,  GM  Crops.  2011  Jun-Dec;2(3):150-62.  Epub  2011  Jun  1:  Approaches  for  gene  targeting  and  targeted  gene  expression  in  plantsを参照されたい。
【０３７９】
一部の実施形態では、遺伝子改変された生物は、本発明の方法のための標的細胞を含み、よって、標的細胞の供給源と考慮することができる。例えば、部位指向型改変ポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む遺伝子改変された細胞が、遺伝子改変された生物の作製に使用される場合、遺伝子改変された生物の細胞は、ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。一部の斯かる実施形態では、細胞（単数または複数）にガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）および必要に応じてドナー核酸を導入することにより、遺伝子改変された生物の細胞（単数または複数）のＤＮＡを、改変のために標的化することができる。例えば、遺伝子改変された生物の細胞（例えば、脳細胞、腸細胞、腎臓細胞、肺細胞、血液細胞等）のサブセットへのガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）の導入は、改変のために斯かる細胞のＤＮＡを標的とすることができ、そのゲノム位置は、導入されるガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化配列に依存するであろう。
【０３８０】
一部の実施形態では、遺伝子改変された生物は、本発明の方法のための標的細胞の供給源である。例えば、ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸により遺伝子改変された細胞を含む遺伝子改変された生物は、遺伝子改変された細胞、例えば、ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、精子、卵母細胞等）、ニューロン、前駆細胞、心筋細胞等の供給源を提供することができる。
【０３８１】
一部の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含むＰＳＣである。そのようなものとして、ＰＳＣにガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）および必要に応じてドナー核酸を導入することにより、ＰＳＣのＤＮＡを改変のために標的化することができるように、ＰＳＣは、標的細胞となることができ、改変のゲノム位置は、導入されるガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化配列に依存するであろう。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、遺伝子改変された生物に由来するＰＳＣのＤＮＡを改変する（例えば、いずれか所望のゲノム位置を欠失させるおよび／または置き換える）ことができる。次に、斯かる改変されたＰＳＣを使用して、（ｉ）ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸、および（ｉｉ）ＰＳＣに導入されたＤＮＡ改変の両方を有する生物を作製することができる。
【０３８２】
ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸は、未知のプロモーターの制御下に置かれて（すなわち、これに作動可能に連結されて）よい（例えば、核酸が、宿主細胞ゲノムにランダムに組み込む場合）、または公知プロモーターの制御下に置かれて（すなわち、これに作動可能に連結されて）よい。適した公知プロモーターは、いかなる公知プロモーターであってもよく、構成的に活性があるプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーター等）、空間的に制限および／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）等を含む。
【０３８３】
遺伝子改変された生物（例えば、その細胞が、ｓＲＧＮポリペプチド、例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等をコードするヌクレオチド配列を含む、生物）は、例えば、植物；藻類；無脊椎動物（例えば、刺胞動物、棘皮動物、虫、ハエ等）；脊椎動物（例えば、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、フグ、キンギョ等）、両生類（例えば、サンショウウオ、カエル等）、爬虫類、鳥類、哺乳動物等）；有蹄動物（例えば、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ等）；齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）；ウサギ目動物（例えば、ウサギ）；等を含む、いずれかの生物となることができる。
【０３８４】
一部の事例では、ｓＲＧＮポリペプチドは、配列番号１〜１２に対し少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３８５】
トランスジェニック非ヒト動物
上に記載されている通り、一部の実施形態では、核酸（例えば、ｓＲＧＮポリペプチド、例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等をコードするヌクレオチド配列）または組換え発現ベクターが、導入遺伝子として使用されて、ｓＲＧＮポリペプチドを産生するトランスジェニック動物を作製する。よって、本開示は、さらに、トランスジェニック非ヒト動物であって、上に記載されている通り、部位指向型改変ポリペプチド、例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む導入遺伝子を含む動物を提供する。一部の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子改変に関してホモ接合型である。一部の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子改変に関してヘテロ接合型である。一部の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、キンギョ、フグ、洞窟魚等）、両生類（カエル、サンショウウオ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ等）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲ等）、哺乳動物（例えば、有蹄動物、例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等；ウサギ目動物（例えば、ウサギ）；齧歯類（例えば、ラット、マウス）；非ヒト霊長類；等）等である。
【０３８６】
ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸は、未知のプロモーターの制御下に置かれて（すなわち、これに作動可能に連結されて）よい（例えば、核酸が、宿主細胞ゲノムにランダムに組み込む場合）、または公知プロモーターの制御下に置かれて（すなわち、これに作動可能に連結されて）よい。適した公知プロモーターは、いかなる公知プロモーターであってもよく、構成的に活性があるプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーター等）、空間的に制限および／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）等を含む。
【０３８７】
トランスジェニック植物
上に記載されている通り、一部の実施形態では、核酸（例えば、ｓＲＧＮポリペプチド、例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等をコードするヌクレオチド配列）または組換え発現ベクターが、導入遺伝子として使用されて、ｓＲＧＮポリペプチドを産生するトランスジェニック植物を作製する。よって、本開示は、さらに、トランスジェニック植物であって、上に記載されている通り、ｓＲＧＮポリペプチド、例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む導入遺伝子を含む植物を提供する。一部の実施形態では、トランスジェニック植物のゲノムは、核酸を含む。一部の実施形態では、トランスジェニック植物は、遺伝子改変に関してホモ接合型である。一部の実施形態では、トランスジェニック植物は、遺伝子改変に関してヘテロ接合型である。
【０３８８】
外因性核酸を植物細胞に導入する方法は、当技術分野で周知である。斯かる植物細胞は、上に定義される通り、「形質転換された」と考慮される。適した方法は、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルス等）、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、シリコンカーバイドウィスカー技術、アグロバクテリウム媒介性形質転換およびその他を含む。方法の選択は、一般に、形質転換されている細胞の型、および形質転換が行われる状況（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）に依存する。土壌細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに基づく形質転換方法が、維管束植物への外因性核酸分子の導入に特に有用である。アグロバクテリウムの野生型形態は、宿主植物における腫瘍原性クラウンゴール成長の産生を方向付ける、Ｔｉ（腫瘍誘導性）プラスミドを含有する。植物ゲノムへのＴｉプラスミドの腫瘍誘導性Ｔ−ＤＮＡ領域の移入は、Ｔｉプラスミドコードビルレンス遺伝子と共に、移入されるべき領域を描写するダイレクトＤＮＡリピートのセットであるＴ−ＤＮＡ境界を要求する。アグロバクテリウムに基づくベクターは、腫瘍誘導性機能が、植物宿主に導入されるべき目的の核酸配列によって置き換えられた、Ｔｉプラスミドの改変形態である。
【０３８９】
アグロバクテリウム媒介性形質転換は、一般に、同時組込みベクターまたはバイナリーベクター系を用い、この系において、Ｔｉプラスミドの構成成分は、アグロバクテリウム宿主に恒久的に存在しビルレンス遺伝子を保有するヘルパーベクターと、Ｔ−ＤＮＡ配列によって囲まれた目的の遺伝子を含有するシャトルベクターとの間に分割されている。種々のバイナリーベクターが、当技術分野で周知であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。アグロバクテリウムを、培養植物細胞、または例えば葉組織、根外植片、胚軸片もしくは塊茎等の傷のついた組織と共培養する方法も、当技術分野で周知である。例えば、Glick  and  Thompson,  (eds.),  Methods  in  Plant  Molecular  Biology  and  Biotechnology,  Boca  Raton,  Fla.:  CRC  Press  (1993)  を参照されたい。
【０３９０】
マイクロプロジェクタイル媒介性形質転換を使用して、トランスジェニック植物を産生することもできる。Klein  et  al.  (Nature  327:70-73  (1987))によって最初に記載されたこの方法は、塩化カルシウム、スペルミジンまたはポリエチレングリコールによる沈殿によって所望の核酸分子でコーティングされた金またはタングステン等のマイクロプロジェクタイルに頼る。マイクロプロジェクタイル粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＤ−１０００（Ｂｉｏｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｃａｌｉｆ．）等のデバイスを使用して、被子植物組織へと高速で加速される。
【０３９１】
核酸は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏプロトコールにより、核酸が植物細胞中に進入することができるような様式で植物に導入することができる。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、核酸が、植物の生体に投与されること、例えば、浸潤を意味する。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」とは、細胞または外植片が、植物の外側で改変され、次いで、斯かる細胞または臓器が、植物へと再生されることを意味する。Weissbach  and  Weissbach,  (1989)  Methods  for  Plant  Molecular  Biology  Academic  PressおよびGelvin  et  al.,  (1990)  Plant  Molecular  Biology  Manual,  Kluwer  Academic  Publishersに記載されているもの含む、植物細胞の安定した形質転換またはトランスジェニック植物の確立に適したいくつかのベクターが記載されている。具体例として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来するものと共に、Herrera-Estrella  et  al.  (1983)  Nature  303:  209、Bevan  (1984)  Nucl  Acid  Res.  12:  8711-8721、Klee  (1985)  Bio/Technolo  3:  637-642によって開示されているものが挙げられる。その代わりに、非Ｔｉベクターを使用して、遊離（free）ＤＮＡ送達技法を使用することにより、ＤＮＡを植物および細胞に移入することができる。これらの方法を使用することにより、コムギ、イネ（Christou  (1991)  Bio/Technology  9:957-9  and  4462）およびトウモロコシ（Gordon-Kamm  (1990)  Plant  Cell  2:  603-618）等のトランスジェニック植物を産生することができる。未成熟胚も、パーティクルガンを使用することによる直接的ＤＮＡ送達技法（Weeks  et  al.  (1993)  Plant  Physiol  102:  1077-1084；Vasil  (1993)  Bio/Technolo  10:  667-674；Wan  and  Lemeaux  (1994)  Plant  Physiol104:  37-48）および
【０３９２】
アグロバクテリウム媒介性ＤＮＡ移入（Ishida  et  al.  (1996)  Nature  Biotech  14:  745-750）のために、単子葉植物にとって良好な標的組織となることができる。葉緑体へのＤＮＡの導入のための例示的な方法は、微粒子銃（biolistic  bombardment）、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、およびマイクロインジェクションである（Daniell  et  al.  Nat.  Biotechnol  16:345-348,  1998；Staub  et  al.  Nat.  Biotechnol  18:  333-338,  2000；O’Neill  et  al.  Plant  J.  3:729-738,  1993；Knoblauch  et  al.  Nat.  Biotechnol17:  906-909；米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１７号、同第５，５４５，８１８号および同第５，５７６，１９８号；国際（Inti.）出願番号ＷＯ９５／１６７８３；ならびにBoynton  et  al.,  Methods  in  Enzymology  217:  510-536  (1993)、Svab  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90:  913-917  (1993)およびMcBride  et  al.,  Proc.  Nati.  Acad.  Sci.  USA  91:  7301-7305  (1994)）。微粒子銃、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、およびマイクロインジェクションの方法に適したいずれかのベクターは、葉緑体形質転換のための標的化ベクターとして適するであろう。特に、導入方法がアグロバクテリウムを利用しない場合、いずれかの二本鎖ＤＮＡベクターを形質転換ベクターとして使用することができる。
【０３９３】
遺伝子改変することができる植物は、子実、飼料作物、果実、野菜、油糧種子作物、ヤシ、林業およびブドウの木（vine）を含む。改変することができる植物の具体例を次に示す：トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、フィールドピー、ヒマワリ、トマト、キャノーラ、タバコ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーション、ソルガム、ルピナスおよびイネ。
【０３９４】
本開示によって、形質転換された植物細胞、形質転換された植物細胞を含有する組織、植物および産物も提供される。形質転換された細胞、ならびにこれを含む組織および産物の特色は、ゲノムに組み込まれた核酸の存在、および植物細胞による、ｓＲＧＮポリペプチド、例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等の産生である。本発明の組換え植物細胞は、組換え細胞の集団として、または組織、種子、全草（whole  plant）、茎、果実、葉、根、花、茎、塊茎、子実、動物飼料、植物の圃場、およびその他として有用である。
【０３９５】
ｓＲＧＮポリペプチド（例えば、天然に存在するｓＲＧＮ；改変された、すなわち、突然変異したまたは変異体のｓＲＧＮ；キメラｓＲＧＮ；等）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、未知のプロモーターの制御下に置かれて（すなわち、これに作動可能に連結されて）よい（例えば、核酸が、宿主細胞ゲノムにランダムに組み込む場合）、または公知プロモーターの制御下に置かれて（すなわち、これに作動可能に連結されて）よい。適した公知プロモーターは、いかなる公知プロモーターであってもよく、構成的に活性があるプロモーター、誘導性プロモーター、空間的に制限および／または時間的に制限されたプロモーター等を含む。
【０３９６】
本開示は、宿主細胞における標的核酸の転写を調節する方法を提供する。本方法は、一般に、酵素的に不活性なｓＲＧＮポリペプチドおよびガイドＲＮＡと標的核酸とを接触させるステップが関与する。本方法は、種々の適用において有用であり、これらの適用もまた提供される。
【０３９７】
本開示の転写調節方法は、ＲＮＡｉが関与する方法の弱点のいくつかを克服する。本開示の転写調節方法は、研究適用、創薬（例えば、ハイスループットスクリーニング）、標的検証、産業適用（例えば、作物操作；微生物操作等）、診断適用、治療適用およびイメージング技法を含む、多種多様な適用における用途を見出す。
【０３９８】
転写を調節する方法
本開示は、宿主細胞における標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する方法を提供する。本方法は、一般に、ａ）宿主細胞に、ｉ）ガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；およびｉｉ）変異体ｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチド（「変異体ｓＲＧＮポリペプチド」）、または変異体ｓＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入するステップが関与し、変異体ｓＲＧＮポリペプチドは、低下したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す。
【０３９９】
ガイドＲＮＡ（本明細書において、「ガイドＲＮＡ」；または「ｇＲＮＡ」とも称される）は、ｉ）標的ＤＮＡにおける標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；ｉｉ）ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメント；およびｉｉｉ）転写ターミネーターを含む。標的ＤＮＡにおける標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメントは、本明細書において、「標的化セグメント」と称される。ｓＲＧＮポリペプチドと相互作用する第２のセグメントは、本明細書において、「タンパク質結合配列」または「ｄｓＲＧＮ結合ヘアピン」または「ｄｓＲＧＮハンドル」とも称される。「セグメント」とは、分子のセグメント／セクション／領域、例えば、ＲＮＡにおけるヌクレオチドの近接した区間を意味する。「セグメント」の定義は、特定の文脈で特に他の定義がされていない限り、特異的な数の総塩基対に限定されるものではなく、いずれかの長さ総計のＲＮＡ分子の領域を含むことができ、他の分子に対し相補性を有する領域を含んでも含まなくてもよい。変異体ｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および低下したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す活性部分を含む。
【０４００】
ガイドＲＮＡおよび変異体ｓＲＧＮポリペプチドは、宿主細胞において複合体を形成する；複合体は、宿主細胞において標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する。
【０４０１】
一部の事例では、本開示の転写調節方法は、宿主細胞における標的核酸の選択的調節（例えば、低下または増加）を提供する。例えば、標的核酸の転写の「選択的」低下は、ガイドＲＮＡ／変異体ｓＲＧＮポリペプチド複合体の非存在下における標的核酸の転写のレベルと比較して、標的核酸の転写を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または９０％超低下させる。標的核酸の転写の選択的低下は、標的核酸の転写を低下させるが、非標的核酸の転写を実質的に低下させない、例えば、非標的核酸の転写は、ガイドＲＮＡ／変異体ｓＲＧＮポリペプチド複合体の非存在下における非標的核酸の転写のレベルと比較して、仮にあるとしても、１０％未満低下される。
【０４０２】
増加された転写
標的ＤＮＡの「選択的に」増加された転写は、ガイドＲＮＡ／変異体ｓＲＧＮポリペプチド複合体の非存在下における標的ＤＮＡの転写のレベルと比較して、標的ＤＮＡの転写を、少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍または少なくとも２０倍）増加させることができる。標的ＤＮＡの転写の選択的増加は、標的ＤＮＡの転写を増加させるが、非標的ＤＮＡの転写を実質的に増加させない、例えば、非標的ＤＮＡの転写は、ガイドＲＮＡ／変異体ｓＲＧＮポリペプチド複合体の非存在下における非標的ＤＮＡの転写のレベルと比較して、仮にあるとしても、約５倍未満（例えば、約４倍未満、約３倍未満、約２倍未満、約１．８倍未満、約１．６倍未満、約１．４倍未満、約１．２倍未満または約１．１倍未満）増加される。
【０４０３】
非限定的な例として、増加された転写は、ｄｓＲＧＮを異種配列に融合することにより達成することができる。適した融合パートナーとして、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストンまたは他のＤＮＡ結合タンパク質）に直接的に作用することにより転写を間接的に増加させる活性を提供するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。適した融合パートナーとして、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、クロトニル化（crotonylation）、脱クロトニル化、プロピオニル化（propionylation）、脱プロピオニル化、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０４０４】
追加的な適した融合パートナーとして、標的核酸の増加された転写を直接的に提供するポリペプチド（例えば、転写活性化因子またはその断片、転写活性化因子をリクルートするタンパク質またはその断片、小分子／薬物応答性転写調節因子等）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４０５】
原核生物における転写を増加させるためにｄｓＲＧＮ融合タンパク質を使用した方法の非限定的な例として、細菌ワンハイブリッド（one-hybrid）（Ｂ１Ｈ）またはツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）系の改変が挙げられる。Ｂ１Ｈ系において、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）は、細菌転写活性化ドメイン（ＡＤ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼのアルファサブユニット（ＲＮＡＰａ））に融合される。よって、ｄｓＲＧＮは、ＡＤを含む異種配列に融合させることができる。ｄｓＲＧＮ融合タンパク質が、プロモーターの上流領域に到達すると（ガイドＲＮＡによって当該箇所に標的化される）、ｄｓＲＧＮ融合タンパク質のＡＤ（例えば、ＲＮＡＰａ）は、ＲＮＡＰホロ酵素をリクルートし、転写活性化をもたらす。Ｂ２Ｈ系において、ＢＤは、ＡＤに直接的に融合されない；代わりに、それらの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、ＧＡＬ１１Ｐ−ＧＡＬ４相互作用）によって媒介される。本方法における使用のために斯かる系を改変するために、ｄｓＲＧＮは、タンパク質−タンパク質相互作用を提供する第１のタンパク質配列（例えば、酵母ＧＡＬ１１Ｐおよび／またはＧＡＬ４タンパク質）に融合させることができ、ＲＮＡａは、タンパク質−タンパク質相互作用を完成させる第２のタンパク質配列（例えば、ＧＡＬ１１ＰがｄｓＲＧＮに融合される場合はＧＡＬ４、ＧＡＬ４がｄｓＲＧＮに融合される場合はＧＡＬ１１Ｐ、等）に融合させることができる。ＧＡＬ１１ＰおよびＧＡＬ４の間の結合親和性は、結合効率および転写発射率（firing  rate）を増加させる。
【０４０６】
真核生物における転写を増加させるためにｄｓＲＧＮ融合タンパク質を使用した方法の非限定的な例として、活性化ドメイン（ＡＤ）（例えば、ＧＡＬ４、ヘルペスウイルス活性化タンパク質ＶＰ１６またはＶＰ６４、ヒト核内因子ＮＦ−ＫＢ  ｐ６５サブユニット等）へのｄｓＲＧＮの融合が挙げられる。系を誘導性にするため、ｄｓＲＧＮ融合タンパク質の発現は、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦ等）によって制御することができる。ガイドＲＮＡは、公知転写応答エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー等）、公知上流活性化配列（ＵＡＳ）、標的ＤＮＡの発現を制御することができると疑われる未知または公知機能の配列、等を標的化するように設計することができる。
【０４０７】
追加的な融合パートナー
増加または減少された転写を達成するための融合パートナーの非限定的な例として、転写活性化因子および転写抑圧因子ドメイン（例えば、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）；Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑圧因子ドメイン（ＥＲＤ）等）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の斯かる事例では、ｄｓＲＧＮ融合タンパク質は、ガイドＲＮＡによって、標的ＤＮＡにおける特異的位置（すなわち、配列）へと標的化され、プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼ結合の遮断（これは、転写活性化因子機能を選択的に阻害する）、および／または局所的クロマチン状態の改変（例えば、標的ＤＮＡを改変する、または標的ＤＮＡに関連するポリペプチドを改変する融合配列が使用される場合）等、遺伝子座特異的調節を発揮する。一部の事例では、変化は、一過性である（例えば、転写抑圧または活性化）。一部の事例では、変化は、遺伝性である（例えば、エピジェネティック改変が、標的ＤＮＡに、または標的ＤＮＡに関連するタンパク質、例えば、ヌクレオソームヒストンに為される場合）。一部の実施形態では、異種配列は、ｄｓＲＧＮポリペプチドのＣ末端に融合させることができる。一部の実施形態では、異種配列は、ｄｓＲＧＮポリペプチドのＮ末端に融合させることができる。一部の実施形態では、異種配列は、ｄｓＲＧＮポリペプチドの内側部分（すなわち、ＮまたはＣ末端以外の部分）に融合させることができる。ｄｓＲＧＮ融合タンパク質を使用した方法の生物学的効果は、いずれか簡便な方法（例えば、遺伝子発現アッセイ；クロマチンに基づくアッセイ、例えば、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、クロマチンｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（ＣｉＡ）等）によって検出することができる。
【０４０８】
一部の事例では、方法は、２種またはそれよりも多い異なるガイドＲＮＡの使用が関与する。例えば、２種の異なるガイドＲＮＡを、単一の宿主細胞において使用することができ、２種の異なるガイドＲＮＡは、同じ標的核酸における２種の異なる標的配列を標的化する。よって、例えば、転写調節方法は、宿主細胞に、第２のガイドＲＮＡ、または第２のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入するステップをさらに含むことができ、第２のガイドＲＮＡは、ｉ）標的ＤＮＡにおける第２の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；ｉｉ）部位指向型ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント；およびｉｉｉ）転写ターミネーターを含む。一部の事例では、同じ標的核酸における２種の異なる標的配列を標的化する２種の異なるガイドＲＮＡの使用は、標的核酸の転写における増加された調節（例えば、低下または増加）を提供する。
【０４０９】
別の例として、２種の異なるガイドＲＮＡを、単一の宿主細胞において使用することができ、２種の異なるガイドＲＮＡは、２種の異なる標的核酸を標的化する。よって、例えば、転写調節方法は、宿主細胞に、第２のガイドＲＮＡ、または第２のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入するステップをさらに含むことができ、第２のガイドＲＮＡは、ｉ）少なくとも第２の標的ＤＮＡにおける標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；ｉｉ）部位指向型ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント；およびｉｉｉ）転写ターミネーターを含む。
【０４１０】
一部の実施形態では、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、例えば、単一分子ガイドＲＮＡ；ドナーポリヌクレオチド；ｓＲＧＮポリペプチドをコードする核酸；等）は、追加的な望ましい特色（例えば、改変または調節された安定性；細胞下標的化；追跡、例えば、蛍光標識；タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位；等）を提供する改変または配列を含む。非限定的な例として、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化テイル（すなわち、３’ポリ（Ａ）テイル）；リボスイッチ配列またはアプタマー配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節された到達性を可能にするための）；ターミネーター配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列）；ＲＮＡを細胞下位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体、およびその他）に標的化する改変または配列；追跡を提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接的コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列、等）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑圧因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼおよびその他を含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する改変または配列；ＲＮＡ自身、結果的に、ｓＲＧＮリボヌクレオタンパク質の構造を変更するＲＮＡの改変；ならびにこれらの組合せが挙げられる。
【０４１１】
ＤＮＡ標的化セグメント
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（または「ＤＮＡ標的化配列」）は、標的ＤＮＡ内の特異的配列に相補的なヌクレオチド配列（標的ＤＮＡの相補的鎖）を含む。
【０４１２】
換言すると、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）による配列特異的様式で、標的ＤＮＡと相互作用する。そのようなものとして、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変動する場合があり、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用するであろう標的ＤＮＡ内の位置を決定する。ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内のいずれか所望の配列にハイブリダイズするように改変することができる（例えば、遺伝子操作により）。
【０４１３】
安定性制御配列（例えば、転写ターミネーターセグメント）
安定性制御配列は、ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）の安定性に影響する。適した安定性制御配列の一例は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）である。ガイドＲＮＡの転写ターミネーターセグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、例えば、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔまたは約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さ総計を有することができる。例えば、転写ターミネーターセグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することができる。
【０４１４】
一部の事例では、転写終結配列は、真核細胞において機能的な配列である。一部の事例では、転写終結配列は、原核細胞において機能的な配列である。
【０４１５】
安定性制御配列に（例えば、転写終結セグメント、または増加された安定性を提供するためのガイドＲＮＡのいずれかのセグメントに）含まれ得るヌクレオチド配列は、例えば、Ｒｈｏ非依存性ｔｒｐ終結部位を含む。
【０４１６】
追加的な配列
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、５’または３’末端のいずれかに少なくとも１つの追加的なセグメントを含む。例えば、適した追加的なセグメントは、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化テイル（すなわち、３’ポリ（Ａ）テイル）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節された到達性を可能にするための）；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン））を形成する配列；ＲＮＡを細胞下位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体およびその他）に標的化する配列；追跡を提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接的コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列、等）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑圧因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼおよびその他を含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する改変または配列、増加された、減少されたおよび／または制御可能な安定性を提供する改変または配列；ならびにこれらの組合せを含むことができる。
【０４１７】
複数の同時ガイドＲＮＡ
一部の実施形態では、複数のガイドＲＮＡが、同じ細胞において同時に使用されて、同じ標的ＤＮＡまたは異なる標的ＤＮＡにおける異なる位置における転写を同時に調節する。一部の実施形態では、２種またはそれよりも多いガイドＲＮＡは、同じ遺伝子または転写物または遺伝子座を標的とする。一部の実施形態では、２種またはそれよりも多いガイドＲＮＡは、異なる無関係の遺伝子座を標的とする。一部の実施形態では、２種またはそれよりも多いガイドＲＮＡは、異なるが関係する遺伝子座を標的とする。
【０４１８】
ガイドＲＮＡは、小型かつ頑強であるため、それを望むのであれば、同じ発現ベクターに同時に存在することができ、同じ転写制御下に置くことさえできる。一部の実施形態では、２種またはそれよりも多い（例えば、３種もしくはそれよりも多い、４種もしくはそれよりも多い、５種もしくはそれよりも多い、１０種もしくはそれよりも多い、１５種もしくはそれよりも多い、２０種もしくはそれよりも多い、２５種もしくはそれよりも多い、３０種もしくはそれよりも多い、３５種もしくはそれよりも多い、４０種もしくはそれよりも多い、４５種もしくはそれよりも多いまたは５０種もしくはそれよりも多い）ガイドＲＮＡは、標的細胞において同時に発現される（同じまたは異なるベクターから／同じまたは異なるプロモーターから）。一部の事例では、複数のガイドＲＮＡは、ターゲターＲＮＡの天然に存在するＣＲＩＳＰＲアレイを模倣するアレイにおいてコードされ得る。標的化セグメントは、およそ３０ヌクレオチド長配列（約１６〜約１００ｎｔとなり得る）としてコードされ、ＣＲＩＳＰＲリピート配列によって分離される。アレイは、ＲＮＡをコードするＤＮＡによって、またはＲＮＡとして細胞に導入することができる。
【０４１９】
複数のガイドＲＮＡを発現させるために、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって媒介される人工ＲＮＡプロセシング系を使用することができる。例えば、複数のガイドＲＮＡは、前駆体転写物（例えば、Ｕ６プロモーターから発現される）においてタンデムアレイへと連鎖状にし、Ｃｓｙ４特異的ＲＮＡ配列によって分離することができる。同時発現されたＣｓｙ４タンパク質は、前駆体転写物を複数のガイドＲＮＡへと切断する。ＲＮＡプロセシング系を使用するための利点は、次のものを含む：第一に、複数のプロモーターを使用する必要がないこと；第二に、全てのガイドＲＮＡが、前駆体転写物からプロセシングされるため、それらの濃度が、同様のｄｓＲＧＮ結合に対し正規化されること。
【０４２０】
Ｃｓｙ４は、細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来する小型のエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）タンパク質である。Ｃｓｙ４は、最小１７ｂｐ  ＲＮＡヘアピンを特異的に認識し、急速（＜１分間）かつ高度に効率的な（＞９９．９％）ＲＮＡ切断を示す。大部分のＲＮａｓｅとは異なり、切断されたＲＮＡ断片は、安定しており機能的に活性なままである。Ｃｓｙ４に基づくＲＮＡ切断は、人工ＲＮＡプロセシング系において別の目的で使うことができる。この系において、１７ｂｐ  ＲＮＡヘアピンは、単一のプロモーターから前駆体転写物として転写された複数のＲＮＡ断片の間に挿入される。Ｃｓｙ４の同時発現は、個々のＲＮＡ断片の作製において有効である。
【０４２１】
バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチド
上で言及したように、ガイドＲＮＡおよびバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むことにより、複合体に対する標的特異性を提供する。バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、低下したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。例えば、本開示の転写調節法で使用するのに適したバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、参照ｓＲＧＮポリペプチド、例えば、配列番号１〜１２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む参照ｓＲＧＮポリペプチドのエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性の、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満を示す。一部の実施形態では、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、検出可能なエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性（ｄｓＲＧＮ）を実質的に有さない。一部の実施形態では、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドが低下した触媒活性を有する場合、ポリペプチドは、ガイドＲＮＡと相互作用する能力を保持している限り、部位特異的様式で標的ＤＮＡに依然として結合することができる（ポリペプチドはガイドＲＮＡによって標的ＤＮＡ配列に依然として誘導されるため）。一部の場合では、適切なバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれよりも多いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０４２２】
一部の場合では、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低下しているニッカーゼである。
【０４２３】
一部の場合では、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が低下しているニッカーゼである。
【０４２４】
一部の場合では、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖と非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。例えば、アラニン置換が企図されている。
【０４２５】
一部の場合では、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、融合ポリペプチド（「バリアントｓＲＧＮ融合ポリペプチド」）、すなわち、ｉ）バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチド；およびｉｉ）共有結合的に連結された異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称される）を含む融合ポリペプチドである。
【０４２６】
異種ポリペプチドは、バリアントｓＲＧＮ融合ポリペプチドによっても示される活性（例えば、酵素活性）を示すことができる（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸配列を別の核酸配列に連結して（例えば、遺伝子操作によって）、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を作出することができる。一部の実施形態では、バリアントｓＲＧＮ融合ポリペプチドは、バリアントｓＲＧＮポリペプチドを、細胞内局在化をもたらす異種配列（すなわち、異種配列は、細胞内局在化配列、例えば、核に標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアに標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に標的化するための葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保留シグナルなどである）と融合することによって作出される。一部の実施形態では、異種配列は、追跡および／または精製を容易にするためのタグ（すなわち、異種配列は検出可能な標識である）を提供し得る（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；赤血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）。一部の実施形態では、異種配列は、安定性の増加または減少をもたらし得る（すなわち、異種配列は安定性制御ペプチド、例えば、一部の場合では制御可能なデグロン（例えば、温度感受性のまたは薬物により制御可能なデグロン配列、下を参照）である）。一部の実施形態では、異種配列は、標的ＤＮＡからの転写の増加または減少をもたらし得る（すなわち、異種配列は、転写調節配列、例えば、転写因子／活性化因子またはその断片、転写因子／活性化因子をリクルートするタンパク質またはその断片、転写抑制因子またはその断片、転写抑制因子をリクルートするタンパク質またはその断片、小分子／薬物応答性転写調節因子などである）。一部の実施形態では、異種配列は、結合ドメインを提供し得る（すなわち、異種配列は、例えば、キメラｄｓＲＧＮポリペプチドを目的の別のタンパク質、例えば、ＤＮＡまたはヒストン修飾タンパク質、転写因子または転写抑制因子、リクルートタンパク質など、に結合する能力を提供する、タンパク質結合配列である）。
【０４２７】
安定性の増加または減少をもたらす適切な融合パートナーには、限定はされないが、デグロン配列が含まれる。デグロンとは、それらが一部であるタンパク質の安定性を制御するアミノ酸配列であることが、当業者に理解される。例えば、デグロン配列を含むタンパク質の安定性は、デグロン配列によって少なくとも部分的に制御される。一部の場合では、適切なデグロンは、デグロンが実験的制御に関係なくタンパク質安定性にその影響を及ぼすように、恒常性である（すなわち、デグロンは薬物誘導性、温度誘導性などではない）。一部の場合では、デグロンは、バリアントｓＲＧＮポリペプチドが所望の条件に依存して「オン」（すなわち、安定な）または「オフ」（すなわち、不安定な、低下した）を切り替えることができるように、バリアントｓＲＧＮポリペプチドに制御可能な安定性を提供する。例えば、デグロンが温度感受性デグロンである場合、バリアントｓＲＧＮポリペプチドは、閾値温度（例えば、４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃など）未満では機能的（すなわち、「オン」、安定）であるが、閾値温度を超えると非機能的（すなわち、「オフ」、低下した）であり得る。別の例として、デグロンが薬物誘導性デグロンである場合、薬物の存在または非存在によって、タンパク質を「オフ」（すなわち、不安定な）状態から「オン」（すなわち、安定な）状態へ、またはその逆に切り替えることができる。例示的な薬物誘導性デグロンはＦＫＢＰ１２タンパク質に由来する。デグロンの安定性はデグロンに結合する小分子の存在または非存在によって制御される。
【０４２８】
適切なデグロンの例としては、限定はされないが、Ｓｈｉｅｌｄ−１、ＤＨＦＲ、オーキシン、および／または温度によって制御されるデグロンが挙げられる。適切なデグロンの非限定的な例は当技術分野において公知である（例えば、Dohmen  et  al.,  Science,  1994.  263(5151):  p.  1273-1276:  Heat-inducible  degron:  a  method  for  constructing  temperature-sensitive  mutants；Schoeber  et  al.,  Am  J  Physiol  Renal  Physiol.  2009  Jan;296(1):F204-11  :Conditional  fast  expression  and  function  of  multimeric  TRPV5  channels  using  Shield-1；Chu  et  al.,  Bioorg  Med  Chem  Lett.  2008  Nov  15;18(22):5941-4:  Recent  progress  with  FKBP-derived  destabilizing  domains；Kanemaki,  Pflugers  Arch.  2012  Dec  28:  Frontiers  of  protein  expression  control  with  conditional  degrons；Yang  et  al.,  Mol  Cell.  2012  Nov  30;48(4):487-8:  Titivated  for  destruction:  the  methyl  degron；Barbour  et  al.,  Biosci  Rep.  2013  Jan  18;33(1).:  Characterization  of  the  bipartite  degron  that  regulates  ubiquitin-independent  degradation  of  thymidylate  synthase；およびGreussing  et  al.,  J  Vis  Exp.  2012  Nov  10;(69):  Monitoring  of  ubiquitin-proteasome  activity  in  living  cells  using  a  Degron  (dgn)-destabilized  green  fluorescent  protein  (GFP)-based  reporter  protein；これらは全て、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０４２９】
例示的なデグロン配列は、細胞および動物の両方において十分に特徴付けされ、試験されている。したがって、ｓＲＧＮをデグロン配列に融合することにより、「調整可能」かつ「誘導性」のｓＲＧＮポリペプチドが産生される。本明細書に記載の融合パートナーのいずれも、望ましい任意の組合せで使用することができる。この点を例示するための１つの非限定的な例として、ｓＲＧＮ融合タンパク質は、検出のためのＹＦＰ配列、安定性のためのデグロン配列、および標的ＤＮＡの転写を増加させる転写活性化因子配列を含み得る。さらに、ｓＲＧＮ融合タンパク質中で使用することができる融合パートナーの数は無制限である。一部の場合では、ｓＲＧＮ融合タンパク質は、１つまたは複数（例えば、２つもしくはそれよりも多い、３つもしくはそれよりも多い、４つもしくはそれよりも多い、または５つもしくはそれよりも多い）の異種配列を含む。
【０４３０】
適切な融合パートナーとしては、限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、クロトニル化活性、脱クロトニル化活性、プロピオニル化活性、脱プロピオニル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性をもたらすポリペプチドが挙げられ、これらの活性はいずれも、ＤＮＡの直接改変（例えば、ＤＮＡのメチル化）に、またはＤＮＡ会合ポリペプチドの改変（例えば、ヒストンまたはＤＮＡ結合タンパク質）に当てることができる。さらに、適切な融合パートナーとしては、限定はされないが、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）、末梢動員を提供するタンパク質およびその断片（例えば、ラミンＡ、ラミンＢなど）、ならびにタンパク質ドッキングエレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ１など）が挙げられる。
【０４３１】
一部の実施形態では、ｓＲＧＮポリペプチドはコドン最適化することができる。この種の最適化は、当技術分野において公知であり、同一のタンパク質をコードしたまま意図される宿主生物または細胞のコドン選択を模倣するために、外来性ＤＮＡの突然変異を必要とする。したがって、コドンは変化されるが、コードされるタンパク質は未変化のままである。例えば、意図される標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化ｄｓＲＧＮ（またはｄｓＲＧＮバリアント）が適切な部位指向型改変ポリペプチドであろう。別の非限定的な例として、意図される宿主細胞がマウス細胞である場合には、マウスコドン最適化ｓＲＧＮ（またはバリアント、例えば、酵素的に不活性なバリアント）が適切なｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドであろう。コドン最適化は必要なものではないが、ある特定の場合では受け入れられるものであり、好ましい場合がある。
【０４３２】
ポリアデニル化シグナルも、意図される宿主における発現を最適化するように選択することができる。
【０４３３】
宿主細胞
転写を調節するための本開示の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて有糸分裂または分裂終了細胞内の転写調節を誘導するために用いることができる。ガイドＲＮＡは標的ＤＮＡにハイブリダイズすることにより特異性を提供するので、有糸分裂および／または分裂終了細胞は、いろいろな宿主細胞のいずれかであってよく、適切な宿主細胞としては、限定はされないが、細菌細胞；古細菌細胞；単細胞真核生物；植物細胞；藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ（Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）など；真菌細胞；動物細胞；無脊椎動物（例えば、昆虫、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）由来の細胞；真核原虫（例えば、マラリア原虫、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｋｉｐａｒｕｍ；蠕虫など）；脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類動物、鳥類、哺乳動物）由来の細胞；哺乳動物細胞、例えば、げっ歯動物細胞、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞などが挙げられる。適切な宿主細胞としては、天然に存在する細胞；遺伝子改変細胞（例えば、実験室で、例えば、「ヒトの手」によって遺伝子改変された細胞）；および任意の方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された細胞が挙げられる。一部の場合では、宿主細胞は単離されている。
【０４３４】
いかなる種類の細胞も目的になり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける、あらゆる段階の胚の胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞などの段階のゼブラフィッシュ胚など）。細胞は株化細胞系由来でもよいし、あるいは初代細胞であってもよく、「初代細胞」、「初代細胞系」、および「初代培養物」とは、本明細書で同義的に使用されて、対象に由来し、培養物の、限定された回数の継代、すなわち、分裂に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて成長が可能となった、細胞および細胞培養物を指す。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されている場合があるが、危機期を経験するには十分な回数継代されていない、培養物を含む。初代細胞系はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０継代未満に維持することができる。標的細胞は、多くの実施形態では、単細胞生物であるか、または培養で成長させる。
【０４３５】
細胞が初代細胞である場合、そのような細胞は任意の好都合な方法によって個体から採取することができる。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって好都合に採取され得るが、例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織由来の細胞は、生検によって最も好都合に採取される。適切な溶液を、採取した細胞を分散または懸濁させるために使用してもよい。そのような溶液は、一般的に、低濃度、例えば５〜２５ｍＭでの許容可能な緩衝液と共に、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を好都合に補充されている、平衡塩類溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液などである。好都合な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが含まれる。細胞は直ちに使用してもよいし、長期間保存、凍結し、解凍し、再使用することが可能であってもよい。そのような場合、細胞を、通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、または細胞をそのような凍結温度において保存するために当技術分野において一般的に使用されるいくつかの他のそのような溶液中で凍結し、凍結培養細胞を解凍するための当技術分野において一般に公知の様式で解凍する。
【０４３６】
宿主細胞への核酸の導入
ガイドＲＮＡ、またはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いろいろな周知の方法のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。同様に、方法が、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入するステップを含む場合、そのような核酸は、いろいろな周知の方法のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。
【０４３７】
核酸を宿主細胞に導入する方法は当技術分野において公知であり、任意の公知の方法を使用して核酸（例えば、発現構築物）を幹細胞または始原細胞に導入することができる。適切な方法としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注射、限定はされないが、エキソソーム送達を含む、ナノ粒子媒介性核酸送達（例えば、Panyam  et.,  al  Adv  Drug  Deliv  Rev.  2012  Sep  13.  pii:  50169-409X(12)00283-9.  doi:  10.1016/j.addr.2012.09.023）などが挙げられる。
【０４３８】
核酸
本開示は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。一部の場合では、核酸は、バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含む。
【０４３９】
一部の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡおよび／またはバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸を宿主細胞（または宿主細胞の集団）に導入するステップを含む。一部の実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏである。一部の実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞はｉｎ  ｖｉｖｏである。ガイドＲＮＡおよび／またはバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、発現ベクターはガイドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０４４０】
発現ベクター
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物などである。適切な発現ベクターとしては、限定はされないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスに基づくウイルスベクター；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li  et  al.,  Invest  Opthalmol  Vis  Sci  35:2543  2549,  1994；Borras  et  al.,  Gene  Ther  6:515  524,  1999；Li  and  Davidson,  PNAS  92:7700  7704,  1995；Sakamoto  et  al.,  H  Gene  Ther  5:10881097,  1999；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali  et  al.,  Hum  Gene  Ther  9:81  86,1998,  Flannery  et  al.,  PNAS  94:6916  6921,  1997；Bennett  et  al.,  Invest  Opthalmol  Vis  Sci  38:2857  2863,  1997；Jomary  et  al.,  Gene  Ther  4:683-690,  1997,  Rolling  et  al.,  Hum  Gene  Ther  10:641  648,  1999；Ali  et  al.,  Hum  Mol  Genet  5:591  594,  1996；ＷＯ９３／０９２３９のSrivastava,  Samulski  et  al.,  J.  Vir.  (1989)  63:3822-3828；Mendelson  et  al.,  Viral.  (1988)  166:154-165；およびFlotte  et  al.,  PNAS  (1993)  90:10613-10617)；ＳＶ４０；単純疱疹ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi  et  al.,  PNAS  94:10319  23,  1997；Takahashi  et  al.,  J  Virol  73:7812  7816,  1999）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルス由来のベクター）などが挙げられる。
【０４４１】
多数の適切な発現ベクターが当業者に公知であり、多くは市販されている。例として以下のベクターを提示する；真核宿主細胞の場合：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、宿主細胞に適合している限り、他の任意のベクターを使用してもよい。
【０４４２】
利用される宿主／ベクター系に応じて、恒常性および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクター内で使用してもよい（例えば、Bitter  et  al.  (1987)  Methods  in  Enzymology,  153:516-544を参照）。
【０４４３】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞；または原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）のいずれかにおいて機能的であり得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／またはバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核細胞および真核細胞の両方においてガイドＲＮＡおよび／またはバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に連結されている。
【０４４４】
プロモーターは、恒常的活性型プロモーター（すなわち、恒常的に活性／「ＯＮ」状態であるプロモーター）であり得、誘導性プロモーター（すなわち、その状態、活性／「ＯＮ」または不活性／「ＯＦＦ」が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であってもよく、空間限定型プロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であってもよく、時間限定型プロモーター（すなわち、プロモーターは、胚発生の特定の段階の間、または生物学的プロセスの特定の段階、例えば、マウスにおける毛包周期の間、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にある）であってもよい。
【０４４５】
適切なプロモーターは、ウイルス由来であってもよく、したがってウイルスプロモーターと称されてもよく、または原核もしくは真核生物を含む任意の生物に由来することができる。適切なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、限定はされないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ超初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）（Miyagishi  et  al.,  Nature  Biotechnology  20,  497-  500  (2002)）、強化されたＵ６プロモーター（例えば、Xia  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  2003  Sep  1;31(17)）、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが挙げられる。
【０４４６】
誘導性プロモーターの例としては、限定はされないが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦなど）、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなどが挙げられる。したがって誘導性プロモーターは、限定はされないが、ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エストロゲン受容体融合物などを含む分子によって調節することができる。
【０４４７】
一部の実施形態では、プロモーターは、多細胞生物においてプロモーターが特定の細胞のサブセット内で活性（すなわち、「ＯＮ」）であるような、空間限定型プロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）である。空間限定型プロモーターは、エンハンサー、転写制御エレメント、制御配列などとも称され得る。好都合な任意の空間限定型プロモーターを使用することもでき、適切なプロモーター（例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンのサブセットにおける発現を駆動するプロモーター、生殖細胞系列における発現を駆動するプロモーター、肺における発現を駆動するプロモーター、筋肉における発現を駆動するプロモーター、膵臓の島細胞における発現を駆動するプロモーターなど）の選択は、生物によって異なる。例えば、植物、ハエ、虫、哺乳動物、マウスなどについて、種々の空間限定型プロモーターが公知である。したがって、空間限定型プロモーターを使用して、生物に応じて、種々様々な異なる組織および細胞型においてバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節することがでる。一部の空間限定型プロモーターはまた、プロモーターが、胚発生の特定の段階の間、または生物学的プロセスの特定の段階（例えば、マウスにおける毛包周期）の間、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にあるように、時間限定型である。
【０４４８】
例示を目的として、空間限定型プロモーターの例としては、限定はされないが、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容器特異的プロモーターなどが挙げられる。ニューロン特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ  ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター；神経フィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Chen  et  al.  (1987)  Ce/151:7-19；およびLlewellyn,  et  al.  (2010)  Nat.  Med.  16(10):1161-1166）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ６２２８３）；チロシン水酸化酵素プロモーター（ＴＨ）（例えば、Oh  et  al.  (2009)  Gene  Ther  16:437；Sasaoka  et  al.  (1992)  Mol.  Brain  Res.  16:274；Boundy  et  al.  (1998)  J.  Neurosci.  18:9989；およびKaneda  et  al.  (1991)  Neuron  6:583-594）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Radovick  et  al.  (1991)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:3402-3406）；Ｌ７プロモーター（例えば、Oberdick  et  al.  (1990)  Science  248:223-226）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Bartge  et  al.  (1988)  Proc.  Nat/.  Acad.  Sci.  USA  85:3648-3652）；エンケファリンプロモーター（例えば、Comb  et  al.  (1988)  EMBO  J.  17:3793-3805）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ１１−アルファ（ＣａｍＫＩＩａ）プロモーター（例えば、Mayford  et  al.  (1996)  Proc.  Nat/.  Acad.  Sci.  USA  93:13250；およびCasanova  et  al.  (2001)  Genesis  31:37）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−０プロモーター（例えば、Liu  et  al.  (2004)Gene  Therapy  11:52-60）などが挙げられる。
【０４４９】
脂肪細胞特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂ〜＋２１ｂｐの領域（例えば、Tozzo  et  al.  (1997)  Endocrinol.  138:1604;  Ross  et  al.  (1990)  Proc.  Nat!.  Acad.  Sci.  USA  87:9590;  and  Pavjani  et  al.  (2005)  Nat.  Med.  11:797）；グルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Knight  et  al.  (2003)  Proc.  Nat/.  Acad.  Sci.  USA  100:14725）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Kuriki  et  al.  (2002)  Biol.  Pharm.  Bull.  25:1476；およびSato  et  al.  (2002)  J.  Biol.  Chem.  277:15703）；ステアロイルＣｏＡ不飽和酵素−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Taboret  al.  (1999)  J.  Biol.  Chem.  274:20603）；レプチンプロモーター（例えば、Mason  et  al.  (1998)  Endocrinol.  139:1013；およびChen  et  al.  (1999)  Biochem.  Biophys.  Res.  Comm.  262:187）；アディポネクチンプロモーター（例えば、Kita  et  al.  (2005)  Biochem.  Biophys.  Res.  Comm.  331:484；およびChakrabarti  (2010)  Endocrinol.  151:2408）；アディプシンプロモーター（例えば、Platt  et  al.  (1989)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86:7490）；レジスチンプロモーター（例えば、Seo  et  al.  (2003)  Malec.  Endocrinol.  17:1522）などが挙げられる。
【０４５０】
心筋細胞特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、以下の遺伝子に由来する制御配列が挙げられる：ミオシン軽鎖−２、ａ−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ、心筋アクチンなど。Franz  et  al.  (1997)  Cardiovasc.  Res.  35:560-566；Robbins  et  al.  (1995)  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.  752:492-505；Linn  et  al.  (1995)  Circ.  Res.  76:584591；Parmacek  et  al.  (1994)  Mol.  Cell.  Biol.  14:1870-1885；Hunter  et  al.  (1993)  Hypertension  22:608-617；および  Sartorelli  et  al.  (1992)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:4047-4051．
【０４５１】
平滑筋特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、ＳＭ２２ａプロモーター（例えば、Akyilrek  et  al.  (2000)  Mol.  Med.  6:983；および米国特許第７，１６９，８７４号）；スムーセリンプロモーター（例えば、ＷＯ２００１／０１８０４８）；ａ−平滑筋アクチンプロモーターなどが挙げられる。例えば、ＳＭ２２ａプロモーターの０．４ｋｂ領域は、その中に２つのＣＡｒＧエレメントが存在しており、血管平滑筋細胞特異的な発現を媒介することが示されている（例えば、Kim,  et  al.  (1997)  Mol.  Cell.  Biol.  17,  2266-2278；Li,  et  al.,  (1996)  J.  Cell  Biol.  132,  849-859；およびMoessler,  et  al.  (1996)  Development  122,  2415-2425）。
【０４５２】
光受容器特異的空間限定型プロモーターとしては、限定はされないが、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Young  et  al.  (2003)  Ophthalmol.  Vis.  Sci.  44:4076）；ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Nicoud  et  al.  (2007)  J.  Gene  Med.  9:1015）；網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Nicoud  et  al.  (2007)、上記）；光受容器間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Nicoud  et  al.  (2007)、上記）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Yokoyama  et  al.  (1992)  Exp  Eye  Res.  55:225）などが挙げられる。
【０４５３】
使用
本開示による転写を調節するための方法は、同様に提供されるいろいろな用途における使用を見出す。用途には、研究用途；診断用途；産業的用途；および治療用途が含まれる。
【０４５４】
研究用途には、例えば、例えば発生、代謝、下流遺伝子の発現などに対する、標的核酸の転写を低下または増加する効果を決定することが含まれる。ハイスループットゲノム解析は転写調節法を使用して実行することができ、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントのみを変化させる必要がある一方、タンパク質結合セグメントおよび転写終結セグメントは（一部の場合では）一定に保つことができる。ゲノム解析に使用される複数の核酸を含むライブラリー（例えば、ライブラリー）は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーターを含み、各核酸は、共通のタンパク質結合セグメント、異なるＤＮＡ標的化セグメント、および共通の転写終結セグメントを含み得る。チップは、５×１０４個を超える独特なガイドＲＮＡを含有し得る。用途としては、大規模表現型検査、遺伝子−機能マッピング、およびメタゲノム解析が挙げられ得る。
【０４５５】
本明細書で開示の方法は、代謝工学の分野に使用を見出す。転写レベルを、本明細書に開示のように、適切なガイドＲＮＡを設計することによって効率的かつ予想通りに制御することができるため、代謝経路（例えば、生合成経路）の活性は、目的の代謝経路内の特定の酵素のレベルを（例えば、転写の増加または減少を介して）制御することによって、正確に制御および調整することができる。目的の代謝経路としては、化学物質（精密化学製品、燃料、抗生物質、毒素、アゴニスト、アンタゴニストなど）および／または薬物製造に使用される経路が挙げられる。
【０４５６】
目的の生合成経路としては、限定はされないが、（１）メバロン酸経路（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路）（アセチル−ＣｏＡを、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換し、これらは、テルペノイド／イソプレノイドを含む種々様々な生体分子の生合成に使用される）、（２）非メバロン酸経路（すなわち、「２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸経路」または「ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路」または「ＤＸＰ経路」）（これも、メバロン酸経路の代替経路によって、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド３−リン酸をＤＭＡＰＰおよびＩＰＰに変換することにより、代わりにＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを産生する）、（３）ポリケチド合成経路（種々のポリケチド合成酵素により種々のポリケチドを産生する）（ポリケチドには、化学療法に使用される天然に存在する小分子（例えば、テトラサイクリン、およびマクロライド）が含まれ、産業上重要なポリケチドとしては、ラパマイシン（免疫抑制剤）、エリスロマイシン（抗生物質）、ロバスタチン（抗コレステロール薬）、およびエポシロンＢ（抗がん薬）が挙げられる）、（４）脂肪酸合成経路、（５）ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸７−リン酸）合成経路、（６）有望なバイオ燃料（例えば、短鎖アルコールおよびアルカン、脂肪酸メチルエステルおよび脂肪アルコール、イソプレノイドなど）を産生する経路などが挙げられる。
【０４５７】
ネットワークおよびカスケード
本明細書で開示の方法は、制御の統合ネットワーク（すなわち、１つのカスケードまたは複数のカスケード）を設計するために使用することができる。例えば、ガイドＲＮＡ  Ｉ  バリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドは、別のＤＮＡ標的化ＲＮＡまたは別のバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドの発現を制御する（すなわち、調節する、例えば、増加する、低下する）ために使用することができる。例えば、第１のガイドＲＮＡは、第１のバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドと異なる機能（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性など）を有する第２のキメラｄｓＲＧＮポリペプチドの転写の調節を標的化するように設計することができる。加えて、異なるｄｓＲＧＮタンパク質（例えば、異なる種に由来する）は異なるｓＲＧＮハンドル（すなわち、タンパク質結合セグメント）を必要とする場合があるため、第２のキメラｄｓＲＧＮポリペプチドは、上記の第１のｄｓＲＧＮポリペプチドとは異なる種に由来し得る。したがって、一部の場合では、第２のキメラｄｓＲＧＮポリペプチドは、第１のガイドＲＮＡと相互作用できないように、選択することができる。他の場合において、第２のキメラｄｓＲＧＮポリペプチドは、第１のガイドＲＮＡと相互作用するように、選択することができる。一部のそのような場合では、２つ（またはこれよりも多い）ｄｓＲＧＮタンパク質の活性は、競合する（例えば、ポリペプチドが逆の活性を有する場合）場合もあり、相乗的に作用する（例えば、ポリペプチドが類似の、または相乗的な活性を有する場合）場合もある。同様に、上記のように、ネットワーク内の複合体（すなわち、ガイドＲＮＡ  Ｉ  ｄｓＲＧＮポリペプチド）のいずれも、他のガイドＲＮＡまたはｄｓＲＧＮポリペプチドを制御するように設計することができる。ガイドＲＮＡおよびバリアントｓＲＧＮ部位指向型ポリペプチドを所望の任意のＤＮＡ配列に標的化することができるため、本明細書に記載の方法は、所望の任意の標的の発現を制御および調節するために使用することができる。設計することができる統合ネットワーク（すなわち、相互作用のカスケード）は、非常に単純なものから非常に複雑なものまで幅があり、限定されない。
【０４５８】
２つまたはそれより多い構成成分（例えば、ガイドＲＮＡまたはｄｓＲＧＮポリペプチド）がそれぞれ別のガイドＲＮＡ／ｄｓＲＧＮポリペプチド複合体の調節制御下にあるネットワークでは、ネットワークの１つの構成成分の発現レベルは、ネットワークの別の構成成分の発現レベルに影響を及ぼすことができる（例えば、発現を増加または減少させ得る）。この機構を通して、１つの構成成分の発現は、同一ネットワーク内の異なる構成成分の発現に影響を及ぼす場合があり、ネットワークは、他の構成成分の発現を増加させる構成成分ならびに他の構成成分の発現を減少させる構成成分の混成物を含み得る。当業者には理解されるように、１つの構成成分の発現レベルが１つまたは複数の異なる構成成分の発現レベルに影響を及ぼし得る上記の例は、説明を目的としたものであって、限定するものではない。必要に応じて、１つまたは複数の構成成分が操作可能となるように（すなわち、実験制御、例えば、温度制御；薬物制御、すなわち、薬物誘導性制御；光制御下などで）、（上記のように）改変される場合には追加的な層での複雑性をネットワークに導入することができる。
【０４５９】
１つの非限定的な例として、第１のガイドＲＮＡは、標的の治療／代謝遺伝子の発現を制御する、第２のガイドＲＮＡのプロモーターに結合することができる。そのような場合、第１のガイドＲＮＡの条件付き発現は、治療／代謝遺伝子を間接的に活性化する。このタイプのＲＮＡカスケードは、例えば、抑制因子を活性化因子に変換するのに有用であり、標的遺伝子の発現の論理またはダイナミクスを制御するために使用することができる。
【０４６０】
転写調節法は、創薬およびターゲットバリデーションに使用することもできる。
【０４６１】
本発明の種々の態様は、以下の材料および方法を使用し、以下の非限定的な例によって例示される。
【０４６２】
ゲノム編集
ゲノム編集とは概して、正確なまたは所定の様式でなどの、ゲノムのヌクレオチド配列を改変するプロセスを指す。本明細書で記載されるゲノム編集の方法の例には、部位指向型ヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の正確な標的位置においてＤＮＡをカットし、それによってゲノム内の特定の位置において二本鎖または一本鎖ＤＮＡ切断を創出する方法が含まれる。そのような切断は、Cox  et  al.,  Nature  Medicine  21(2),  121-31  (2015)において近年概説されている通り、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの天然の内因性細胞プロセスによって修復することができ、また通常それらによって修復される。ＮＨＥＪは、ヌクレオチド配列の喪失または付加を有することもある二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接合し、これは、遺伝子発現を破壊または強化し得る。ＨＤＲは、切断点において定義されたＤＮＡ配列を挿入するための鋳型として、相同配列、またはドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体などの内因性ゲノム内にあり得る。あるいは、ドナーは、ヌクレアーゼ切断遺伝子座と高相同性の領域を有するが、切断された標的遺伝子座内に組み込まれ得る追加的な配列または欠失を含む配列変化も含有し得る外因性核酸、例えば、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスとであり得る。第３の修復機構は、「代替ＮＨＥＪ」とも称される、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり、遺伝的成果が、小さい欠失および挿入を切断部位において行うことができるという点でＮＨＥＪに類似している。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用してより好ましいＤＮＡ末端結合修復成果を駆動し、近年の報告によって、このプロセスの分子機構がさらに解明されている；例えば、Cho  and  Greenberg,  Nature  518,  174-76  (2015)  ；Kent  et  al.,  Nature  Structural  and  Molecular  Biology,  Adv.  Online  doi:10.1038/nsmb.2961(2015)；Mateos-Gomez  et  al.,  Nature  518,254-57  (2015)；Ceccaldi  et  al.,  Nature  528,  258-62  (2015)を参照されたい。一部の場合では、ＤＮＡ切断の部位における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復成果を予測することができる。
【０４６３】
これらのゲノム編集機構はそれぞれ、所望のゲノム変更を創出するために使用することができる。ゲノム編集プロセスは、意図される突然変異の部位に可能な限り近くの標的遺伝子座内に１つまたは２つのＤＮＡ切断を一般には創出する。これは、本明細書に説明および例示される通り、部位指向型ポリペプチドの使用を介して達成することができる。
【０４６４】
部位指向型ポリペプチドによって、核酸内（例えば、ゲノムＤＮＡ）に、二本鎖切断または一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存性修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または代替非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同鋳型を必要とすることなく切断した標的核酸を修復することができる。これは、切断部位における標的核酸内に小さい欠失または挿入（インデル）をもたらすことができる場合があり、遺伝子発現の破壊または変更を導くことができる。ＨＤＲは、相同修復鋳型、またはドナーが利用可能である場合に行うことができる。相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同である配列を含む。姉妹染色分体は、一般に、修復鋳型として細胞によって使用される。しかし、ゲノム編集の目的のために、修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸として供給されることが多い。外因性ドナー鋳型を用いて、隣接する相同領域間に追加的な核酸配列（導入遺伝子など）または改変（単一の塩基変化または欠失など）を導入することは一般的であり、したがって、追加的なまたは変化された核酸配列もまた標的遺伝子座内に組み込まれるようになる。ＭＭＥＪは、小さい欠失および挿入を切断部位で行うことができるという点でＮＨＥＪに類似した遺伝的成果をもたらす。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復成果を駆動する。一部の場合では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復成果を予測する可能性があり得る。したがって、一部の場合では、相同の組換えを使用して、標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入する。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書では、ドナーポリヌクレオチドと名付けられている。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部分が、標的核酸切断部位に挿入される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において天然には存在しない配列である。
【０４６５】
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変によって、例えば、突然変異、欠失、変更、統合、遺伝子修正、遺伝子置換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座、および／または遺伝子突然変異を導くことができる。ゲノムＤＮＡを欠失させるおよび非ネイティブ核酸をゲノムＤＮＡへ統合するプロセスは、ゲノム編集の例である。
【実施例】
【０４６６】
（実施例１Ａ）
ｓＲＧＮポリペプチドＧｉｂ１１の活性の確認
Ｇｉｂ１１およびＳｌｕＣａｓ９を蛍光偏光に基づく生化学的切断アッセイで試験した。
プロトコール蛍光偏光アッセイ：
【０４６７】
オリゴヌクレオチド二重鎖を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．８）５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で１０μＭ溶液として調製し（１００μＭストックから）、９５℃で５分間アニールし、次いで、サーモサイクラー（毎分６℃）でゆっくりと冷却した。続いて、ストックを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．８）５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％プルロニック（登録商標）に希釈した。２０ｎＭオリゴ（２０μＬ）をストレプトアビジンコーティングプレートに固定化し、５分後に２回洗浄し、次いで、試料２０μＬと一緒に６０分の反応速度でインキュベートした（励起波長：６３５ｎｍ、発光波長：６７０ｎｍ）。切断の前に、反応ＲＮＰを形成した。ヌクレアーゼと、ｐＣａｓ６０６（配列番号１１８）から転写したｓｇＲＮＡＶＥＧＦＡ（配列番号１１４）とを、１×ＰＢＳ  ＭｇＣｌ２  ８１７．６μｌに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。ＲＮＰ  ２０μｌを各ウェルに添加し、偏光を３７℃で６０分間測定した。例えば、Methods  Enzymol.2014;546:1-20を参照されたい。
【０４６８】
タンパク質の量をｓｇＲＮＡの一定レベルに対してタイトレーションした。ＶＥＧＦＡオリゴヌクレオチド配列を標的化するＧｉｂ１１−またはＳｌｕＣａｓ９−ＲＮＰ複合体のインキュベーション後に、蛍光偏光および蛍光強度シグナルの変化（切断成功に基づく経時的な偏光値の減少および蛍光強度の増大）により、切断を観察することができる。切断反応の定量的推定量として、グラフの初期勾配を解析した。結果（図２Ａおよび２Ｂに表示されている）は、Ｇｉｂ１１およびＳｌｕＣａｓ９がオリゴヌクレオチド基質を首尾よく切断することを示す。切断反応速度を図２Ｃに示す。
【０４６９】
（実施例１Ｂ）
Ｇｉｂ１１「ＮＮＧＧ」ＰＡＭモチーフの確認  
Ｇｉｂ１１の活性を液体培養でおよび寒天プレート上で確認した。
液体培養では：
【０４７０】
毒素レポータープラスミド（ＶＥＧＦＡ標的部位と「ＮＮＧＧ」ＰＡＭとを有するアラビノース誘導性ｃｃｄＢ毒素遺伝子をコードするｐＣａｓ６３４、配列番号１１９）と、ＶＥＧＦＡを標的化するｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（ｐＣａｓ６０６、配列番号１１８）とを内包するＢＬ２１ＤＥ３  ｏｒｉｇａｍｉ細胞を、ＩＰＴＧ誘導性Ｔｒｃプロモーターの下で、キメラ構築物１（配列番号１２２に記載の、ＰＩ／ＷＥＤＧＥドメイン交換したｐＣａｓ８８９）またはキメラ構築物２（配列番号１２１に記載の、ＰＩドメイン交換したｐＣａｓ８８８）をコードするプラスミドで、形質転換した。形質転換後、細胞懸濁液をＳＯＣ  １ｍｌでレスキューし、１０００ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ）。２００μｌを使用してＬＢ培地（カナマイシン、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを補充）に接種し、液体培養物を１９０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。この一晩の培養物２００μｌを使用して、０．５％Ｌ−アラビノース有り／無しで、０．０５ｍＭ  ＩＰＴＧ有り／無しで、カナマイシンおよびアンピシリンを補充した、ＬＢ培地５ｍｌに接種した。１９０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩（１８時間）インキュベートした後、ＯＤ６００を決定した。
【０４７１】
Ｇｉｂ１１、ＳｌｕＣａｓ９および陰性対照について得たＯＤ６００値を用いて、ＯＤ６００測定を図３に棒グラフで視覚化する。
プレート上：
【０４７２】
毒素レポータープラスミド（ＶＥＧＦＡ標的部位と「ＮＮＧＧ」ＰＡＭとを有するアラビノース誘導性ｃｃｄＢ毒素遺伝子をコードするｐＣａｓ６３４、配列番号１１９）と、ＶＥＧＦＡを標的化するｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（ｐＣａｓ６０６、配列番号１１８）とを内包するＢＬ２１ＤＥ３  ｏｒｉｇａｍｉ細胞を、ＩＰＴＧ誘導性Ｔｒｃプロモーター（ｐＣａｓ８１、配列番号１２０）の下で、キメラ構築物１（配列番号１２２に記載の、ＰＩ／ＷＥＤＧＥドメイン交換したｐＣａｓ８８９）またはキメラ構築物２（配列番号１２１に記載の、ＰＩドメイン交換したｐＣａｓ８８８）をコードするプラスミドで、形質転換した。形質転換後、細胞懸濁液をＳＯＣ培地１ｍｌでレスキューし、１０００ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートした（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ）。２００μｌをカナマイシン、アンピシリン、０．０５ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．５％Ｌ−アラビノースを補充したＬＢ寒天プレートにプレーティングした。３７℃で１８時間インキュベーション後、コロニーを数えた。
【０４７３】
Ｇｉｂ１１をコードするプラスミドを内包するＢＬ２１ＤＥ３  ｏｒｉｇａｍｉ細胞は、毒素レポータータンパク質ｃｃｄＢの誘導後、毒素レポータープラスミドを首尾よく切断し、インキュベーションを生き延びた。生存を、液体培養でのＯＤ６００値増加によりおよび寒天プレート上でのコロニー形成により測定する。
【表５】
2021518139.tif 000007
【０４７４】
（実施例１Ｃ）
哺乳動物細胞におけるＧｉｂ１１媒介ゲノム編集の確認
哺乳動物細胞におけるＧｉｂ１１の活性を、以下のアッセイで実証した：
ガイド標的化ＢＦＰ遺伝子を使用するＢＦＰ破壊アッセイ：
【０４７５】
記載の通りに、ＡＡＶＳ１遺伝子座に青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードする遺伝子を内包するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、記載通りに、Ｇｉｂ１１とＢＦＰゲノム配列のリバース鎖を標的化するｓｇＲＮＡ（ＢＦＰ標的化ガイドＲＮＡ［配列番号１１７］およびＳｌｕＣａｓ９  ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ［配列番号１２３］）とを発現するプラスミドを、トランスフェクトした。プラスミドのトランスフェクションは、供給元による記載の通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３００００１５）を使用して行った。トランスフェクションの７日後に、ＢＦＰシグナル破壊のフローサイトメトリー解析を実行した。細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳを補充した１×ＰＢＳ）２００μｌに再懸濁することにより調製した。１０，０００個の細胞からのＢＦＰシグナルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（登録商標）ＩＩにセットされたＶ４５０フィルターを使用してアッセイした（Glaser  et  al.,  2016）。
【０４７６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｇｉｂ１１とＢＦＰ遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡとをコードするプラスミドを、トランスフェクトした。青色蛍光の有意な減少が観察された（ＢＦＰ破壊の％として定量化した）。Ｃａｓ９タンパク質の機能に沿って、これの考えられる理由は、Ｇｉｂ１１促進のＤＮＡ切断と、これに続く、ＢＦＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）での挿入／欠失、その結果として生じるＢＦＰ  ＯＲＦの破壊である。Ｇｉｂ１１は、３４．３５％±７．１５％ＢＦＰ破壊をもたらす。
【表６】
2021518139.tif 000008
【０４７７】
（実施例２Ａ）
ｓＲＧＮポリペプチドＰ２Ｈ１２の活性の確認
プロトコール蛍光偏光アッセイ：
オリゴヌクレオチド二重鎖を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．８）５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で１０μＭ溶液として調製し（１００μＭストックから）、９５℃で５分間アニールし、次いで、サーモサイクラー（毎分６℃）でゆっくりと冷却した。続いて、ストックを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．８）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％プルロニック（登録商標）に希釈した。２０ｎＭオリゴ（２０μＬ）をストレプトアビジンコーティングプレートに固定化し、５分後に２回洗浄し、次いで、試料２０μＬと一緒に６０分の反応速度でインキュベートした（励起波長：６３５ｎｍ、発光波長：６７０ｎｍ）。切断の前に、反応ＲＮＰを形成した。ヌクレアーゼと、ｐＣａｓ６０６（配列番号１１８）から転写したｓｇＲＮＡＶＥＧＦＡ（配列番号１１４）とを、１×ＰＢＳ  ＭｇＣｌ２  ８１７．６μｌに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。ＲＮＰ  ２０μｌを各ウェルに添加し、偏光を３７℃で６０分間測定した。例えば、Methods  Enzymol.2014;546:1-20を参照されたい。
【０４７８】
ＶＥＧＦＡオリゴヌクレオチド配列を標的化するＰ２Ｈ１２−ＲＮＰ複合体のインキュベーション後に、図４に表示されているように、蛍光偏光および蛍光強度シグナルの著しい変化（切断成功に基づく経時的な偏光値の減少および蛍光強度の増大）により切断が観察された。
【０４７９】
（実施例２Ｂ）
哺乳動物細胞におけるＰ２Ｈ１２媒介ゲノム編集の確認
哺乳動物細胞におけるＰ２Ｈ１２の活性を、以下のアッセイで実証した：
ガイド標的化ＢＦＰ遺伝子を使用するＢＦＰ破壊アッセイ：
【０４８０】
記載の通りに、ＡＡＶＳ１遺伝子座にＢＦＰをコードする遺伝子を内包するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｐ２Ｈ１２とＢＦＰゲノム配列のリバース鎖を標的化するｓｇＲＮＡ（ＢＦＰ標的化ガイドＲＮＡ［配列番号１１７］およびＳｌｕＣａｓ９  ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ［配列番号１２３］）とを発現するプラスミドを、トランスフェクトした。プラスミドのトランスフェクションは、供給元による記載の通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３００００１５）を使用して行った。トランスフェクションの７日後に、ＢＦＰシグナル破壊のフローサイトメトリー解析を実行した。細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳを補充した１×ＰＢＳ）２００μｌに再懸濁することにより調製した。１０，０００個の細胞からのＢＦＰシグナルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩにセットされたＶ４５０フィルターを使用してアッセイした（Glaser  et  al.,  2016）。
【０４８１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｐ２Ｈ１２とＢＦＰ遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡとをコードするプラスミドを、トランスフェクトした。青色蛍光の有意な減少が観察された（ＢＦＰ破壊の％として定量化した）。Ｃａｓ９タンパク質の機能に沿って、これの考えられる理由は、Ｐ２Ｈ１２促進のＤＮＡ切断と、これに続く、ＢＦＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）での挿入／欠失で、その結果として生じるＢＦＰ  ＯＲＦの破壊である。Ｐ２Ｈ１２は、２２．９％±４．４％ＢＦＰ破壊をもたらす。
【表７】
2021518139.tif 000009
【０４８２】
（実施例３）
哺乳動物細胞におけるＥ２媒介ゲノム編集の確認  
哺乳動物細胞におけるＥ２の活性を、以下のアッセイで実証した：
ガイド標的化ＢＦＰ遺伝子を使用するＢＦＰ破壊アッセイ：
【０４８３】
記載の通りに、ＡＡＶＳ１遺伝子座にＢＦＰをコードする遺伝子を内包するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｅ２とＢＦＰゲノム配列のリバース鎖を標的化するｓｇＲＮＡ（ＢＦＰ標的化ガイドＲＮＡ［配列番号１１７］およびＳｌｕＣａｓ９  ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ［配列番号１２３］）とを発現するプラスミドを、トランスフェクトした。プラスミドのトランスフェクションは、供給元による記載の通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３００００１５）を使用して行った。トランスフェクションの７日後に、ＢＦＰシグナル破壊のフローサイトメトリー解析を実行した。細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳを補充した１×ＰＢＳ）２００μｌに再懸濁することにより調製した。１０，０００個の細胞からのＢＦＰシグナルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩにセットされたＶ４５０フィルターを使用してアッセイした（Glaser  et  al.,  2016）。
【０４８４】
Ｅ２、３つのＥ２突然変異体、陰性対照でのこの実験の三反復の結果、および参照ＳｌｕＣａｓ９（配列番号１２５）についての結果を、表８に示し、図５に描く。これらの結果は、Ｅ２および３つの突然変異体が標的ＤＮＡ切断を媒介することができることを示す。
【表８】
2021518139.tif 000010
【０４８５】
（実施例４）
哺乳動物細胞におけるＧｉｂ１１Ｓｐａ媒介ゲノム編集の確認
哺乳動物細胞におけるＧｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２およびＧｉｂ１１Ｓｐａ−３の活性を、以下のアッセイで実証した：
ガイド標的化ＢＦＰ遺伝子を使用するＢＦＰ破壊アッセイ：
【０４８６】
記載の通りに、ＡＡＶＳ１遺伝子座にＢＦＰをコードする遺伝子を内包するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２またはＧｉｂ１１Ｓｐａ−３とＢＦＰゲノム配列のリバース鎖を標的化するｓｇＲＮＡ（ＢＦＰ標的化ガイドＲＮＡ（配列番号１１７）およびＳｌｕＣａｓ９  ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（配列番号１２３））とを発現するプラスミドを、トランスフェクトした。プラスミドのトランスフェクションは、供給元による記載の通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３００００１５）を使用して行った。トランスフェクションの７日後に、ＢＦＰシグナル破壊のフローサイトメトリー解析を実行した。細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳを補充した１×ＰＢＳ）２００μｌに再懸濁することにより調製した。１０，０００個の細胞からのＢＦＰシグナルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩにセットされたＶ４５０フィルターを使用してアッセイした（Glaser  et  al.,  2016,  Molecular  Therapy  Nucleic  Acids  5,  e334）。
【０４８７】
Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２およびＧｉｂ１１Ｓｐａ−３を使用する哺乳動物細胞における編集
Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２またはＧｉｂ１１Ｓｐａ−３とＢＦＰ遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡとをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすると、青色蛍光の有意な減少が観察された（ＢＦＰ破壊の％として定量化した）。Ｃａｓ９タンパク質の機能に沿って、これの考えられる理由は、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ促進のＤＮＡ切断、これに続く、ＢＦＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）での挿入／欠失、および結果として生じるＢＦＰ  ＯＲＦの破壊である。結果を表９におよび棒グラフで図７に示す。
【表９】
2021518139.tif 000011
【０４８８】
（実施例５）
哺乳動物細胞におけるＦ８媒介ゲノム編集の確認
哺乳動物細胞におけるＦ８の活性を、以下のアッセイで実証した：
ガイド標的化ＢＦＰ遺伝子を使用するＢＦＰ破壊アッセイ：
【０４８９】
記載の通りに、ＡＡＶＳ１遺伝子座にＢＦＰをコードする遺伝子を内包するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｆ８とＢＦＰゲノム配列のリバース鎖を標的化するｓｇＲＮＡ（ＢＦＰ標的化ガイドＲＮＡ［配列番号１１７］およびＳｌｕＣａｓ９  ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ［配列番号１２３］）とを発現するプラスミドを、トランスフェクトした。プラスミドのトランスフェクションは、供給元による記載の通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３００００１５）を使用して行った。トランスフェクションの７日後に、ＢＦＰシグナル破壊のフローサイトメトリー解析を実行した。細胞は、１×ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳを補充した１×ＰＢＳ）２００μｌに再懸濁することにより調製した。１０，０００個の細胞からのＢＦＰシグナルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩにセットされたＶ４５０フィルターを使用してアッセイした（Glaser  et  al.,  2016）。
【０４９０】
Ｆ８、２つのＦ８突然変異体、陰性対照でのこの実験の三反復の結果、および参照ＳｌｕＣａｓ９（配列番号１２５）についての結果を、表１０に示し、図８に描く。これらの結果は、Ｆ８および２つの突然変異体が標的ＤＮＡ切断を媒介することができることを示す。
【表１０】
2021518139.tif 000012
【０４９１】
（実施例６）
ｓＲＧＮについての生化学的特異性プロファイルの判定
Ｇｉｂ１１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−３、Ｅ２およびＦ８の特異性プロファイルを評価するために、オン標的配列、および全６０の単一ヌクレオチドミスマッチｄｓＤＮＡ由来の基質（対として使用した配列番号１２９〜２５０に記載のもの、例えば、配列番号１２９および１３０をそれぞれ有するＲ０１−１−ＡおよびＲ０１−１−Ｂが１つの二重鎖対を表す）の、生化学的切断を判定した。オリゴヌクレオチド二重鎖を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で１０μＭ溶液として調製し（１００μＭストックから）、９５℃で５分間アニールし、次いで、サーモサイクラー（毎分６℃）でゆっくりと冷却した。続いて、ストックを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０５％プルロニック（登録商標）に希釈した。２０μｌの各オリゴヌクレオチド（２０ｎＭ）をストレプトアビジンコーティングプレートに固定化し、１０分後に２回洗浄し、次いで、試料２０μＬと一緒に６０分の反応速度でインキュベートした（励起波長：６３５ｎｍ、発光波長：６７０ｎｍ）。切断の前に、反応ＲＮＰを形成した。ｓｇＲＮＡ（配列番号１２８；最終濃度６０ｎＭ）を含有するおよび含有しない、１×ＰＢＳ＋５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３２００μｌ中で、それぞれのｓＲＧＮタンパク質（１．２１μｇ／μｌ）の１２．０３μｌを混合することにより、ＲＮＰを組み立て、反応の前に５分間、３７℃でＲＮＰをインキュベートした。ＲＮＰ  ２０μｌを各ウェルに添加し、偏光を３７℃で６０分間測定した。
【０４９２】
切断反応速度を、オリゴヌクレオチド切断反応の初期勾配を計算することにより解析した。勾配を、６１の基質各々について計算し、オン標的基質の値（１として定義した）に正規化した。次いで、全６０のオフ標的基質についての正規化切断値をそれらの位置に従って分類した。標的配列内の２０のヌクレオチド位置ごとに３つの単一ヌクレオチドミスマッチについての正規化切断値をブロットして、試験したヌクレアーゼに対する位置特異的ヌクレオチド許容度を示した。
【０４９３】
結果を図９に示す。このガイド／標的の組合せを使用して、Ｅ２の特異性プロファイルは、ＳｌｕＣａｓ９のものと同等であった。Ｇｉｂ１１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１およびＧｉｂ１１Ｓｐａ−３は、ＳｐａＣａｓ９と同等の特異性プロファイルを有していた。
ｓＲＧＮの全体的特異性：
【０４９４】
ａ）Ｇｉｂ１１、ｂ）Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、ｃ）Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−２、ｄ）Ｅ２、ｅ）Ｆ８、ｆ）ＳｌｕＣａｓ９、ｇ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ野生型（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、およびｈ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓについての切断反応速度を、オリゴヌクレオチド切断反応の初期勾配を計算することにより解析した。勾配を、６１の基質各々について計算し、オン標的基質の値（１として定義した）に正規化した。６０のオフ標的基質の全パネルにわたっての全ての正規化値を合算して、全体的特異性値（図１０に棒グラフで描いた通り）を得た。このガイド／標的の組合せを使用して、ｓＲＧＮは、ＳｐｙＣａｓ９より特異性が高かった。
【０４９５】
（実施例７）
ｓＲＧＮについての活性プロファイルの判定
Ｇｉｂ１１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−１、Ｇｉｂ１１Ｓｐａ−３、Ｅ２およびＦ８の活性プロファイルを評価するために、様々なＧＣ含量を有する９６のオン標的ＤＮＡ基質（対として使用した配列番号３４７〜５３８に記載のもの、例えば、配列番号３４７および３４８をそれぞれ有するＥｘｔ−Ａ−Ｐ−１−ＡおよびＥｘｔ−Ａ−Ｐ−１−Ｂが１つの二重鎖対を表す）の生化学的切断を判定した。
プロトコール蛍光偏光アッセイ：
【０４９６】
オリゴヌクレオチド二重鎖を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．８）５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で１０μＭ溶液として調製し（１００μＭストックから）、９５℃で５分間アニールし、次いで、サーモサイクラー（毎分６℃）でゆっくりと冷却した。続いて、ストックを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．８）５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％プルロニック（登録商標）に希釈した。２０ｎＭオリゴ（２０μＬ）をストレプトアビジンコーティングプレートに固定化し、５分後に２回洗浄し、次いで、試料２０μＬと一緒に６０分の反応速度でインキュベートした（励起波長：６３５ｎｍ、発光波長：６７０ｎｍ）。切断の前に、反応ＲＮＰを形成した。配列番号２５１〜３４６の各ガイド配列について、ヌクレアーゼと、ガイド配列を含有するｓｇＲＮＡとを、１×ＰＢＳ  ＭｇＣｌ２  ８１７．６μｌに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。ＲＮＰ中のｓｇＲＮＡについてのそれぞれのＤＮＡ基質を含有するウェルにＲＮＰ  ２０μｌを添加し、偏光を３７℃で６０分間測定した。例えば、Methods  Enzymol.2014;546:1-20を参照されたい。
【０４９７】
示したバリアントを、蛍光偏光に基づく生化学的切断アッセイで試験した。タンパク質の量をｓｇＲＮＡの一定レベルに対してタイトレーションした。ＶＥＧＦＡオリゴヌクレオチド配列を標的化するバリアント−ＲＮＰ複合体のインキュベーション後に、蛍光偏光および蛍光強度シグナルの変化（切断成功に基づく経時的な偏光値の減少および蛍光強度の増大）により、切断を観察することができる。切断反応の定量的推定量として、グラフの初期勾配を解析した。１つの、ＲＮＡガイドヌクレアーゼについての、最も活性が高い基質に、データを正規化した。結果を図１１に示す。Ｇｉｂ１１Ｓｐａ１／３およびＧｉｂ１１は、他のｓＲＧＮおよびＳｐｙＣａｓ９と比較して、より広範囲の標的にわたってより高い活性を呈した。
配列表
【表１１−１】
2021518139.tif 000013
【表１１−２】
2021518139.tif 000014
【表１１−３】
2021518139.tif 000015
【表１１−４】
2021518139.tif 000016
【表１１−５】
2021518139.tif 000017
【表１１−６】
2021518139.tif 000018
【表１１−７】
2021518139.tif 000019
【表１１−８】
2021518139.tif 000020
【表１１−９】
2021518139.tif 000021
【表１１−１０】
2021518139.tif 000022
【表１１−１１】
2021518139.tif 000023
【表１１−１２】
2021518139.tif 000024
【表１１−１３】
2021518139.tif 000025
【表１１−１４】
2021518139.tif 000026
【表１１−１５】
2021518139.tif 000027
【表１１−１６】
2021518139.tif 000028
【表１１−１７】
2021518139.tif 000029
【表１１−１８】
2021518139.tif 000030
【表１１−１９】
2021518139.tif 000031
【表１１−２０】
2021518139.tif 000032
【表１１−２１】
2021518139.tif 000033
【表１１−２２】
2021518139.tif 000034
【表１１−２３】
2021518139.tif 000035
【表１１−２４】
2021518139.tif 000036
【表１１−２５】
2021518139.tif 000037
【表１１−２６】
2021518139.tif 000038
【表１１−２７】
2021518139.tif 000039
【表１１−２８】
2021518139.tif 000040
【表１１−２９】
2021518139.tif 000041
【表１１−３０】
2021518139.tif 000042
【表１１−３１】
2021518139.tif 000043
【表１１−３２】
2021518139.tif 000044
【表１１−３３】
2021518139.tif 000045
【表１１−３４】
2021518139.tif 000046
【表１１−３５】
2021518139.tif 000047
【表１１−３６】
2021518139.tif 000048
【表１１−３７】
2021518139.tif 000049
【表１１−３８】
2021518139.tif 000050
【表１１−３９】
2021518139.tif 000051
【表１１−４０】
2021518139.tif 000052
【表１１−４１】
2021518139.tif 000053
【表１１−４２】
2021518139.tif 000054
【表１１−４３】
2021518139.tif 000055
【表１１−４４】
2021518139.tif 000056
【表１１−４５】
2021518139.tif 000057
【表１１−４６】
2021518139.tif 000058
【表１１−４７】
2021518139.tif 000059
【表１１−４８】
2021518139.tif 000060
【表１１−４９】
2021518139.tif 000061
【表１１−５０】
2021518139.tif 000062
【表１１−５１】
2021518139.tif 000063
【図１】
2021518139.tif 000064
【図２Ａ】
2021518139.tif 000065
【図２Ｂ】
2021518139.tif 000066
【図２Ｃ】
2021518139.tif 000067
【図３】
2021518139.tif 000068
【図４】
2021518139.tif 000069
【図５】
2021518139.tif 000070
【図６】
2021518139.tif 000071
【図７】
2021518139.tif 000072
【図８】
2021518139.tif 000073
【図９】
2021518139.tif 000074
【図１０】
2021518139.tif 000075
【図１１】
2021518139.tif 000076
【配列表】
2021518139000001.app
【国際調査報告】
2021518139.tif 000077
2021518139.tif 000078
2021518139.tif 000079