(57)【要約】本明細書は、脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液と；トロンビンを含む第２液と；を含む、軟骨再生用バイオインク組成物、これを用いたオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法、および該製造方法を利用して製造されたオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液と、
トロンビンを含む第２液と、を含む、軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項２】
前記脂肪組織由来間質血管分画の含量は、１ｍｌの第１液当たり１０５個〜１０７個であることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項３】
前記硝子軟骨パウダーの濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項４】
前記第１液は、アプロチニンをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項５】
前記第２液は、塩化カルシウム溶液内にトロンビンが分散したものであることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項６】
前記脂肪組織由来間質血管分画は、自己由来脂肪組織から抽出したものであることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項７】
前記硝子軟骨パウダーは、同種の硝子軟骨に由来したものであることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項８】
前記硝子軟骨パウダーの粒径は、３０μｍ以上３００μｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項９】
前記硝子軟骨パウダーは、肋軟骨（ｃｏｓｔａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）に由来したものであることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項１０】
（ａ）３Ｄスキャナを用いて、欠損された軟骨部位の３次元データを収得し、３Ｄプリンタを用いてスキャフォールド用モールドを製造する段階と、
（ｂ）脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液を用いて前記スキャフォールド用モールド内に塗布して第１層を形成する段階と、
（ｃ）トロンビンを含む第２液を前記第１層上に塗布して第２層を形成する段階と、
（ｄ）前記第１層および前記第２層が反応して、軟骨再生用スキャフォールドを形成する段階と、を含む、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）および段階（ｃ）は、２回以上交互に反復して行われることを特徴とする、請求項１０に記載のオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法。
【請求項１２】
段階（ｄ）は、１０分以内に完了することを特徴とする、請求項１０に記載のオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法。
【請求項１３】
段階（ｂ）および 段階（ｃ）は、インクジェットプリンティングまたは３Ｄプリンティングを用いて行われることを特徴とする、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の製造方法を用いて製造された、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、２０１８年１月３１日に韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０−２０１８−００１２２２１号の出願日の利益を主張し、その内容の全部は、本明細書に含まれる。
【０００２】
本発明は、軟骨再生用バイオインク組成物、これを用いたオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法、および該製造方法を用いて製造されたオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドに関する。
【背景技術】
【０００３】
退行性関節炎（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は、関節軟骨がすり減り、局所的な退行性変化が現れる疾患であって、骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）または骨関節症ともいう。退行性関節炎は、慢性関節炎の一つであって、体重負荷を多く受ける関節軟骨で退行性変化が起こり、関節面の骨が過剰成長して発生する疾患であり、中壮年期の成人に多く現れる。この疾患は、まず、軟骨組成成分を作る軟骨細胞が老化によって機能が低下して軟骨が弾力性を失うことになる。そして、時間が経過するにつれて軟骨の表面が荒くなり、関節膜で包まれた関節腔の内部に様々な種類の物質が流入して炎症が生じることになる。臨床的には、反復的な疼痛、関節の強直感、関節の漸進的な運動障害などが現れる。退行性関節炎の原因は、老化現象や過多体重と関係が深く、年齢が高くなるほど、女性においてさらに多く、また、さらに深刻に現れる。初期の症状は、一つまたは二つの関節が強直と共にうずくような疼痛が現れ、長期化すると、軟骨下骨の硬化、関節周辺に骨の過剰形成、関節の変形などを招くことになる。
【０００４】
関節軟骨の退行性変化の原因は、まだ糾明されていないが、軟骨細胞数の絶対的減少と軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）で起こる軟骨基質の合成と分解の不均衡が一つの原因として知られている。したがって、関節軟骨の退行性変化は、軟骨基質の分解によって軟骨強度とクッションとしての能力が減少する。
【０００５】
従来の細胞治療剤は、移植された細胞が重力により一方向に集まるので、欠損部位に均等に分布しにくい短所があり、細胞生着の困難があるので、軟骨欠損部の細胞再生を減少させる。また、自己軟骨細胞移植術および幹細胞移植術の場合には、組織を抽出した後、培養過程を経て患者に適用されるので、２回の手術が必要であり、約４週間の細胞培養期間または操作を必要とする。また、移植された細胞が重力により欠損部位に均等に分布および生着されにくく、硝子軟骨の分化でなく線維軟骨への分化が誘導されて、以後に軟骨がよく破れる現象が生じる問題がある。したがって、軟骨欠損部の細胞再生を効果的に行うことができる方法の開発が必要であるのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国特許公開第１０−２０１７−００１２０９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、欠損された軟骨部位の軟骨再生のためのオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造のための軟骨再生用バイオインク組成物を提供しようとする。ひいては、前記軟骨再生用バイオインク組成物を用いて、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法およびこれを用いて製造されたオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施態様は、脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液と、トロンビンを含む第２液と、を含む、軟骨再生用バイオインク組成物を提供する。
【０００９】
本発明の他の実施態様は、（ａ）３Ｄスキャナを用いて、欠損された軟骨部位の３次元データを収得し、３Ｄプリンタを用いてスキャフォールド用モールドを製造する段階と、（ｂ）脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液を用いて前記スキャフォールド用モールド内に塗布して第１層を形成する段階と、（ｃ）トロンビンを含む第２液を前記第１層上に塗布して第２層を形成する段階と、（ｄ）前記第１層および前記第２層が反応して、軟骨再生用スキャフォールドを形成する段階と、を含む、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらに他の実施態様は、前記製造方法を用いて製造された、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による軟骨再生用バイオインク組成物は、患者オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを製造することができるという長所がある。
【００１２】
本発明による軟骨再生用バイオインク組成物を用いて製造されたオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドは、移植された脂肪組織由来間質血管分画の軟骨分化能を高め、ひいては、移植部位での軟骨再生を増加させて効果的な軟骨治療が可能である。
【００１３】
本発明によるオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドは、患部に対し優れた接合力を有し、これによって、軟骨分化能および軟骨再生効果に優れているという長所がある。
【００１４】
本発明によるオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法は、手術室で患部の軟骨欠損部を３Ｄスキャニングしてすぐにオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを製造することができるので、一度の手術過程を通じてスキャフォールドを移植することができるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実験例１の軟骨分化能力を確認するためのペレットの製造過程を示すものである。
【図２】実験例１による比較例１（ＭＣＣＭ  ０ｍｇ）のペレットにサフラニンＯ染色を行った結果を示すものである。
【図３】実験例１による実施例１（ＭＣＣＭ  １０ｍｇ）のペレットにサフラニンＯ染色を行った結果を示したのである。
【図４】実験例１による実施例２（ＭＣＣＭ  ５０ｍｇ）のペレットにサフラニンＯ染色を行った結果を示したのである。
【図５】実験例１による実施例３（ＭＣＣＭ  １００ｍｇ）のペレットにサフラニンＯ染色を行った結果を示したのである。
【図６】実験例２の軟骨再生の可否を確認するための動物実験過程を示すものである。
【図７】実験例２による実施例４の動物実験過程中のイメージおよびスキャフォールド移植後６週後の欠陥領域に対するマイクロＣＴ撮影イメージを示したのである。
【図８】実験例２による比較例２の動物実験過程中のイメージおよびスキャフォールド移植後６週後の欠陥領域に対するマイクロＣＴ撮影イメージを示したのである。
【図９】実験例２による比較例２の移植後６週後の欠陥領域に対して、サフラニンＯ染色した結果を示すものである。
【図１０】実験例２による実施例４の移植後６週後の欠陥領域に対して、サフラニンＯ染色した結果を示すものである。
【図１１】実験例２による比較例２の移植後６週後の欠陥領域に対して、１型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  １）で免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）処理した結果を示すものである。
【図１２】実験例２による実施例４の移植後６週後の欠陥領域に対して、１型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  １）で免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）処理した結果を示すものである。
【図１３】実験例２による比較例２の移植後６週後の欠陥領域に対して、２型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ２）で免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）処理した結果を示すものである。
【図１４】実験例２による実施例４の移植後６週後の欠陥領域に対して、２型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ２）で免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）処理した結果を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において、任意の部材が他の部材「上に」位置しているというとき、これは、任意の部材が他の部材に接している場合だけでなく、二つの部材の間にさらに他の部材が存在する場合をも含む。
【００１７】
本明細書において、任意の部分が或る構成要素を「含む」とするというとき、これは、特に反対になる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明の一実施態様は、脂肪組織由来間質血管分画、硝子軟骨パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液と、トロンビンを含む第２液と、を含む、軟骨再生用バイオインク組成物を提供する。
【００２０】
本発明による軟骨再生用バイオインク組成物は、２液型として、前記第１液と前記第２液が順次に塗布された後に反応して軟骨再生用スキャフォールドが形成され得る。具体的に、前記第２液内のトロンビンと前記第１液内のフィブリノーゲンが反応してフィブリンネットワークを形成することができ、これは、前記脂肪組織由来間質血管分画、硝子軟骨パウダーが十分に固定されるようにする役割をすることができる。
【００２１】
前記脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を含む。好ましくは、前記脂肪組織由来間質血管分画は、脂肪組織由来幹細胞以外の他の細胞（例えば、脂肪細胞、赤血球細胞および他の間質細胞など）および細胞外マトリックス物質を実質的に含まなくてもよく、より好ましくは他の細胞および細胞外マトリックス物質を全く含まなくてもよい。
【００２２】
前記脂肪組織由来間質血管分画は、同種動物または異種動物の脂肪組織から抽出されたものでありうる。好ましくは、前記脂肪組織由来間質血管分画は、自己由来脂肪組織から抽出されたものでありうる。より具体的に、前記脂肪組織由来間質血管分画は、施術対象である患者または動物の脂肪細胞を用いて抽出されたものでありうる。
【００２３】
本発明の一実施態様によれば、前記脂肪組織由来間質血管分画の含量は、１ｍｌの第１液当たり１０５個〜１０７個でありうる。前記脂肪組織由来間質血管分画の含量が前記範囲内である場合、製造されるスキャフォールドの軟骨分化能力および軟骨再生能力が大きく向上することができる。
【００２４】
前記脂肪組織由来間質血管分画は、硝子軟骨パウダーとともに使用されることによって、軟骨細胞に分化し得、これによって、前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドは、患部に移植される場合、軟骨細胞への分化が活発に誘導され得る。
【００２５】
前記硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダーは、前記軟骨再生用バイオインク組成物を用いて製造されたスキャフォールドの支持体を構成する要素になりうる。具体的に、前記フィブリノーゲンとトロンビンの反応を通したフィブリンマトリックスは、前記硝子軟骨パウダーの粒子を互いに結合させることができる。
【００２６】
前記硝子軟骨パウダーは、同種または異種の硝子軟骨に由来したものでありうる。好ましくは、前記硝子軟骨パウダーは、同種の硝子軟骨に由来したものでありうる。具体的に、軟骨施術対象がヒトである場合、ヒトの硝子軟骨から抽出した硝子軟骨パウダーを使用することができる。また、軟骨施術対象が動物である場合、同じ種の動物の硝子軟骨から抽出した硝子軟骨パウダーを使用することができる。
【００２７】
前記硝子軟骨パウダーは、軟骨再生関連成長因子を排出して、前記脂肪組織由来間質血管分画が軟骨細胞に分化することを誘導することができる。ひいては、前記硝子軟骨パウダーに含まれるタンパク質は、患部の軟骨再生が活発になされるように助ける役割をすることができる。
【００２８】
本発明の一実施態様によれば、前記硝子軟骨パウダーは、肋軟骨（ｃｏｓｔａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）に由来したものでありうる。具体的に、前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの適用対象がヒトである場合、前記硝子軟骨パウダーは、ヒトの肋軟骨に由来することができる。また、前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの適用対象が動物である場合、前記硝子軟骨パウダーは、対象である動物と同じ種の肋軟骨に由来することができる。例えば、前記硝子軟骨パウダーは、市販されている同種異系の肋骨軟骨（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｓｔａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）をパウダー化して使用することができる。
【００２９】
本発明の一実施態様によれば、前記硝子軟骨パウダーの粒径は、３０μｍ以上３００μｍ以下でありうる。前記硝子軟骨パウダーの平均粒径が前記範囲内である場合、軟骨細胞の分化および再生が効果的になされる長所がある。
【００３０】
本発明の一実施態様によれば、前記硝子軟骨パウダーの濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．１％（ｗ／ｖ）でありうる。すなわち、前記硝子軟骨パウダーは、前記第１液１ｍｌ当たり０．００５ｇ〜０．１ｇで含まれ得る。前記硝子軟骨パウダーの濃度は、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０７％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０３％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは０．００７％（ｗ／ｖ）〜０．０３％（ｗ／ｖ）でありうる。前記硝子軟骨パウダーの濃度が前記範囲内である場合、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの移植後、軟骨細胞の生存性、軟骨細胞への分化およびモルフォロジーが最も良好に具現され得る。
【００３１】
本発明の一実施態様によれば、前記硝子軟骨パウダー５ｍｇ〜１００ｍｇに対して、前記脂肪組織由来間質血管分画の個数は、１０５〜１０７個でありうる。好ましくは、前記硝子軟骨パウダー５ｍｇ〜７０ｍｇに対して、前記脂肪組織由来間質血管分画の個数は、１０５〜１０７個でありうる。より好ましくは、前記硝子軟骨パウダー５ｍｇ〜３０ｍｇに対して、前記脂肪組織由来間質血管分画の個数は、１０５〜１０７個でありうる。
【００３２】
本発明の一実施態様によれば、前記第１液は、アプロチニンをさらに含むことができる。前記アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）は、すい臓から分泌されるプロテイン分解酵素の抑制剤であって、総５８個のアミノ酸からなるポリペプチドである。主に牛の肺から抽出され、血液中ではフィブリンの分解を阻止して、止血作用をすると知られている。
【００３３】
本発明の一実施態様によれば、前記フィブリノーゲンは、１ｍｌの第１液当たり６５ｍｇ〜１１５ｍｇで含まれ得る。
【００３４】
本発明の一実施態様によれば、前記アプロチニンは、１ｍｌの第１液当たり９００ＫＩＵ〜１，１００ＫＩＵ（ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｕｎｉｔ）、具体的に１０００ＫＩＵで含まれ得る。
【００３５】
具体的に、本発明の一実施態様によれば、前記第１液は、１ｍｌ当たり、１０５〜１０７個の脂肪組織由来間質血管分画、５ｍｇ〜１００ｍｇの硝子軟骨パウダー、６５ｍｇ〜１１５ｍｇのフィブリノーゲンおよび９００ＫＩＵ〜１，１００ＫＩＵのアプロチニンを含むことができる。
【００３６】
本発明の一実施態様によれば、前記第２液は、塩化カルシウム溶液内にトロンビンが分散したものでありうる。具体的に、前記第２液は、１ｍｌ当たり、４００ＩＵ〜６００ＩＵのトロンビン、５ｍｇ〜６．５ｍｇの塩化カルシウムを含むことができる。
【００３７】
前記第１液および第２液の溶媒は、水、具体的には、生理食塩水でありうる。また、前記第１液内のフィブリノーゲンと前記第２液内のトロンビンは、常用のフィブリン糊キットを通じて入手することができる。
【００３８】
前記第１液と第２液は、１０分以内、好ましくは５分以内に反応が完了するので、前記軟骨再生用バイオインク組成物は、施術現場で３Ｄプリンタを用いて患者オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを即席で製造することができるという長所がある。
【００３９】
本発明は、フィブリノーゲンおよびフィブリンから構成されるフィブリン糊を接着剤として使用し、これは、ヒアルロン酸接着剤またはコラーゲン接着剤より高い粘性を確保することができるので、前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドは、患部との優れた接着力を有し、ひいては、高い強度を維持することができる。
【００４０】
本発明の他の実施態様は、（ａ）３Ｄスキャナを用いて、欠損された軟骨部位の３次元データを収得し、３Ｄプリンタを用いてスキャフォールド用モールドを製造する段階と、（ｂ）脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液を用いて前記スキャフォールド用モールド内に塗布して第１層を形成する段階と、（ｃ）トロンビンを含む第２液を前記第１層上に塗布して第２層を形成する段階と、（ｄ）前記第１層および前記第２層が反応して、軟骨再生用スキャフォールドを形成する段階と、を含む、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法を提供する。
【００４１】
段階（ａ）は、当業界において知られた３Ｄスキャナ装備および３Ｄプリンタ装備を用いることができる。また、前記スキャフォールド用モールドは、前記第１液および第２液の塗布時に立体的形態を固定できるようにする役割をすることができる。前記スキャフォールド用モールドは、前記軟骨再生用スキャフォールドの形成後に除去され得る。前記スキャフォールド用モールドは、当業界において一般的に使用される生体適合性高分子を用いて形成され得る。
【００４２】
本発明の一実施態様によれば、段階（ｂ）および段階（ｃ）は、インクジェットプリンティングまたは３Ｄプリンティングを用いて行われ得る。具体的に、段階（ｂ）および段階（ｃ）は、当業界において知られた２以上のノズルを有するプリンティング装置を用いることができ、それぞれのノズルから前記第１液および第２液をそれぞれ吐出して立体形状を作ることができる。
【００４３】
本発明の一実施態様によれば、段階（ｂ）および段階（ｃ）は、２回以上交互に反復して行われ得る。具体的に、体積が大きい軟骨再生用スキャフォールドの形成が必要な場合、段階（ｂ）および段階（ｃ）が交互に行われ、「第１層／第２層／第１層／第２層」のように積層された後、凝固して、軟骨再生用スキャフォールドが形成され得る。
【００４４】
本発明の一実施態様によれば、段階（ｄ）は、１０分以内に完了することができ、好ましくは５分以内に完了することができる。具体的に、段階（ｄ）は、３分〜７分間反応して前記第１層および前記第２層が反応して、軟骨再生用スキャフォールドを形成するものでありうる。
【００４５】
従来の自己軟骨細胞移植術および幹細胞移植術の場合、患者の欠損された軟骨領域の組織を抽出するために、患部を１次切開した後、前記組織の培養過程を経て患部に移植するための２次切開が必要であるので、２回の手術過程が必要であるという問題があった。反面、前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法は、１次切開を通じて欠損された軟骨領域を確認した後、短時間内に欠損された軟骨領域に対応するスキャフォールドを製造して欠損された軟骨領域に移植することができるという長所がある。すなわち、本発明によるオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法は、１回の切開だけで患部にオーダーメード型スキャフォールドを移植することができるという長所がある。
【００４６】
本発明のさらに他の実施態様は、前記製造方法を用いて製造された、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを提供する。
【００４７】
前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドは、前述したように、短時間内に欠損された軟骨領域に対応する形状に製造されて移植され得る。前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドは、細胞のための培養過程を必要とせず、移植後に前記スキャフォールド内の脂肪組織由来間質血管分画は、軟骨細胞に分化し、硝子軟骨パウダーは、軟骨の再生を活性化させ、再生した軟骨細胞の生存率を高めることができる。
【００４８】
前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドは、患部に移植される場合、前記硝子軟骨パウダーから分泌される硝子軟骨成長因子およびタンパク質により軟骨（具体的には膝軟骨）本来の硝子軟骨が再生するように誘導することができる。これを通じて、前記オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドが患部に適用される場合、効果的に従来の軟骨と同一または類似の状態に回復され得る。
【００４９】
以下、本発明を具体的に説明するために実施例により詳細に説明することとする。しかしながら、本発明による実施例は、様々な他の形態に変形され得、本発明の範囲が下記で記述する実施例に限定されると解されない。本明細書の実施例は、当業界において平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００５０】
脂肪組織由来間質血管分画（ＳＶＦ）細胞の分離
脂肪組織由来間質血管分画（ＳＶＦ）細胞は、下記の段階を通じて収得した。
【００５１】
１．無菌手術室で医師の主導の下に脂肪吸引術を実施して、約６０ｃｃの脂肪組織を抽出し、これと同じ量で０．０７５％のコラゲナーゼ脂質ファージ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｌｉｐｉｄ  ｐｈａｇｅ）を添加し、これを３７℃の温度で２３０ｒｐｍの振とう培養（Ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）で３０分間反応させた。
【００５２】
２．上記のように反応後、４２０ｇの反応物を２５℃で１０分間遠心分離を行い、遠心分離結果、ＳＶＦペレット層、コラゲナーゼ層およびオイル層の３層に区分された。
【００５３】
３．ＳＶＦペレット層を除いた上部液を除去し、ＳＶＦペレット層をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で再懸濁した後、１００μｍのナイロンフィルタ（Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）を用いて再懸濁したＳＶＦ層の繊維質と残っている不純物を除去した。
【００５４】
４．フィルタリングされたＳＶＦを含む溶液を再懸濁しつつ３回遠心分離を行った後、最下層のペレットのみを残して除去した後、セルカウンター（Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて細胞核（ｎｕｃｌｅｕｓ  ｃｅｌｌ）を計算した結果、１０５個〜１０７個のＳＶＦが収得されたことを確認することができた。
【００５５】
硝子軟骨パウダーの製造
硝子軟骨パウダーは、市場で入手可能な肋軟骨（Ｃｏｓｔａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）を用いて、３０μｍ〜３００μｍの粒子サイズを有するパウダーに製造した。以下、前記硝子軟骨パウダーは、ＭＣＣＭ（ｍｉｃｒｏｎｉｚｅｄ  ｃｏｓｔａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｍａｔｒｉｘ）と称する。
【００５６】
実験例１：軟骨形成分化（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の可否の確認のためのペレット製造（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
［実施例１〜実施例３］
図１は、軟骨分化能力を確認するためのペレットの製造過程を示した。具体的に、軟骨分化能力を確認するための実験は、下記のように実施した。
【００５７】
１．前記収得されたＳＶＦ（１０５個〜１０７個）を前記製造された硝子軟骨パウダー（ＭＣＣＭ）１０ｍｇ（実施例１）、５０ｍｇ（実施例２）および１００ｍｇ（実施例３）が分散した生理食塩水と混合した。
【００５８】
２．前記混合液を４℃で５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した後、生理食塩水の上澄み液を除去して、ＭＣＣＭ／ＳＶＦ混合物を収得した。
【００５９】
３．ＭＣＣＭ／ＳＶＦ混合物をフィブリノーゲンが混合されたアプロチニン液１ｍｌと混合注射器（ｍｉｘ  ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて混合した。
【００６０】
４．ＭＣＣＭ／ＳＶＦ／フィブリノーゲン溶液１ｍｌとトロンビンが分散した塩化カルシウム溶液１ｍｌをそれぞれＹ字状ピースに連結し、１５ｍｌ円錐型チューブ（ｃｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅ）にそれぞれ２００μｌずつ分注して、常温で５分間固めてペレットを形成した。
【００６１】
５．ペレットが十分に浸る程度に生長因子フリー培地（Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ）を１週間に３回交換投与し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で５週間インキュベートした後、サフラニンＯ染色を実施して、軟骨形成分化を確認した。
【００６２】
［比較例１］
ＭＣＣＭなしにＳＶＦのみをフィブリノーゲンが混合されたアプロチニン液と混合（ＭＣＣＭ  ０ｍｇ、比較例１）して、前記のような方法でペレットを形成し、インキュベートした後、サフラニンＯ染色を実施して、軟骨形成分化を確認した。
【００６３】
図２〜図５は、それぞれ、比較例１（ＭＣＣＭ  ０ｍｇ）、実施例１（ＭＣＣＭ  １０ｍｇ）、実施例２（ＭＣＣＭ  ５０ｍｇ）、および実施例３（ＭＣＣＭ  １００ｍｇ）によるペレットにサフラニンＯ染色を行った結果を示すものである。図２〜図５において、サフラニンＯ染色によって軟骨部分およびＭＣＣＭは、赤色で染色され、実施例１〜３のＭＣＣＭの周辺に軟骨細胞の核が観察されることを確認することができ、多数の生きている軟骨細胞が存在していることを確認することができた。ただし、ＭＣＣＭを使用しない比較例１の場合には、軟骨細胞が分化したことを確認することができなかった。前記結果を通じて、ＭＣＣＭのタンパク質および生長因子などが放出され、ＳＶＦの軟骨細胞への分化を誘導したものと類推され得る。ひいては、ＭＣＣＭの含量と関連して、実施例１（ＭＣＣＭ  １０ｍｇ）が、実施例２および実施例３に比べて、軟骨細胞の生存性および軟骨細胞への分化が最も活発に行われたことを確認することができた。すなわち、ＭＣＣＭの含量が過度に多い場合、軟骨細胞に分化しうる空間が少なくなるので、軟骨細胞への分化が遅くなるものと判断される。
【００６４】
実験例２：軟骨再生（Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の可否の確認のための動物実験（Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
［実施例４］
図６は、軟骨再生の可否を確認するための動物実験過程を示した。具体的に、軟骨再生の可否を確認するための動物実験は、下記のように進行された。
【００６５】
１．前記収得されたＳＶＦ（１０５個〜１０７個）を前記製造された硝子軟骨パウダー（ＭＣＣＭ）１０ｍｇが分散した生理食塩水と混合した。
【００６６】
２．前記混合液を４℃で５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した後、生理食塩水の上澄み液を除去してＭＣＣＭ／ＳＶＦ混合物を収得した。
【００６７】
３．ＭＣＣＭ／ＳＶＦ混合物をフィブリノーゲンが混合されたアプロチニン液１ｍｌと混合注射器（ｍｉｘ  ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて混合した。
【００６８】
４．ＭＣＣＭ／ＳＶＦ／フィブリノーゲン溶液１ｍｌとトロンビンが分散した塩化カルシウム溶液１ｍｌをそれぞれ準備した。
【００６９】
５．実験用ビーグルの膝大腿部の関節丘を露出させ、これに直径約６ｍｍ、深さ約２ｍｍのサイズの欠陥（ｄｅｆｅｃｔ）領域を形成した。
【００７０】
６．スキャフォールド用モールドを製造するために、３Ｄスキャナを用いて実験用ビーグルの欠損された軟骨部位の３次元データを収得し、これを基礎として３Ｄ  Ｂｉｏ  ３Ｄプリンタ（ＩＮＶＩＶＯ，ＲＯＫＩＴ）を使用して医療等級のＰＣＬ（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）外壁を出力した。ひいては、ＭＣＣＭ／ＳＶＦ／フィブリノーゲン溶液とトロンビンが分散した塩化カルシウム溶液をそれぞれ３Ｄ  Ｂｉｏ  ３Ｄプリンタ（ＩＮＶＩＶＯ，ＲＯＫＩＴ）を用いて前記スキャフォールド用モールド内に順次に塗布した後、５分間固めて、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを製造した。
【００７１】
７．実験用ビーグルの欠陥領域にフィブリン糊（ベリプラスト）１００μｌを注入し、製造されたオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを移植した後、手術部位を縫い合わせた。
【００７２】
８．６週後、移植されたオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールド内に軟骨細胞が形成されるかを確認した。
【００７３】
［比較例２］
ＭＣＣＭなしにＳＶＦのみをフィブリノーゲンが混合されたアプロチニン液と混合して、前記のような方法で動物実験を進めた。
【００７４】
図７および図８は、それぞれ、実験例２による実施例４および比較例２の動物実験過程中のイメージおよびスキャフォールド移植後６週後の欠陥領域に対するマイクロＣＴ撮影イメージを示した。図７および図８において、実施例４によるマイクロＣＴ撮影結果は、比較例２によるマイクロＣＴ撮影結果に比べて非常に高い骨密度を示すことを確認することができる。これを通じて、ＭＣＣＭを用いた実施例４の場合、高い軟骨生成能力があることを確認することができる。
【００７５】
図９および図１０は、それぞれ、実験例２による比較例２および実施例４の移植後６週後の欠陥領域に対して、サフラニンＯ染色した結果を示すものである。サフラニンＯ染色結果、実施例４の場合のみが、欠陥領域の軟骨が再生することを確認することができた。これは、図１０の矢印で表示された部分の赤く発現したボリュームが生じた部分から確認することができる。ひいては、図９での赤く発現した部分は、欠陥領域を製作したときに正常軟骨が残っている部分に過ぎない領域である。
【００７６】
図１１および図１２は、それぞれ、実験例２による比較例２および実施例４の移植後６週後の欠陥領域での軟骨再生がいかなる種類の軟骨に再生されるかを確認するために、１型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  １）で免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）処理した結果を示すものである。前記１型コラーゲンは、線維軟骨（ｆｉｂｒｏ−ｃａｒｔｉｌａｇｅ）の確認のための抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）が結合されたものであって、線維軟骨のみを検出して茶色に発現させる役割をする。図１２によれば、欠陥領域で再生した部分が青色に発現することを確認することができ、これは、再生した軟骨が線維軟骨でなく硝子軟骨として欠陥領域に適合した軟骨細胞に再生されたものであることが分かる。反面、図１１の場合、硝子軟骨に分化した領域を確認することができなかった。
【００７７】
図１３および図１４は、それぞれ、実験例２による比較例２および実施例４の移植後６週後の欠陥領域での軟骨再生がいかなる種類の軟骨に再生されるかを確認するために、２型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ２）で免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）処理した結果を示すものである。前記２型コラーゲンは、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）の確認のための抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）が結合されたものであって、硝子軟骨のみを検出して茶色に発現させる役割をする。図１４によれば、欠陥領域で再生された部分が茶色に発現することを確認することができ、これは、再生された軟骨が線維軟骨でなく硝子軟骨であって、欠陥領域に適合した軟骨細胞に再生されたものであることが分かる。反面、図１３の場合、硝子軟骨に分化した領域を確認することができなかった。
【００７８】
前記実施例および比較例の結果を通じて、実施例のように脂肪組織由来間質血管分画と硝子軟骨パウダーを同時に使用した本発明によるオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドを移植する場合、軟骨細胞への分化が効果的に行われ、ひいては、軟骨細胞の拡散および再生が向上することを確認することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月30日(2020.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液と、
トロンビンを含む第２液と、を含む、軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項２】
前記脂肪組織由来間質血管分画の含量は、１ｍｌの第１液当たり１０５個〜１０７個であることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項３】
前記硝子軟骨パウダーの濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項４】
前記第１液は、アプロチニンをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項５】
前記第２液は、塩化カルシウム溶液内にトロンビンが分散したものであることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項６】
前記脂肪組織由来間質血管分画は、自己由来脂肪組織から抽出したものであることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項７】
前記硝子軟骨パウダーは、同種の硝子軟骨に由来したものであることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項８】
前記硝子軟骨パウダーの粒径は、３０μｍ以上３００μｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項９】
前記硝子軟骨パウダーは、肋軟骨（ｃｏｓｔａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）に由来したものであることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨再生用バイオインク組成物。
【請求項１０】
（ａ）３Ｄスキャナを用いて、欠損された軟骨部位の３次元データを収得し、３Ｄプリンタを用いてスキャフォールド用モールドを製造する段階と、
（ｂ）脂肪組織由来間質血管分画（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）パウダー、およびフィブリノーゲンを含む第１液を用いて前記スキャフォールド用モールド内に塗布して第１層を形成する段階と、
（ｃ）トロンビンを含む第２液を前記第１層上に塗布して第２層を形成する段階と、
（ｄ）前記第１層および前記第２層が反応して、軟骨再生用スキャフォールドを形成する段階と、を含む、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）および段階（ｃ）は、２回以上交互に反復して行われることを特徴とする、請求項１０に記載のオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法。
【請求項１２】
段階（ｄ）は、１０分以内に完了することを特徴とする、請求項１０に記載のオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法。
【請求項１３】
段階（ｂ）および 段階（ｃ）は、インクジェットプリンティングまたは３Ｄプリンティングを用いて行われることを特徴とする、請求項１０に記載のオーダーメード型軟骨再生用スキャフォールドの製造方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の製造方法を用いて製造された、オーダーメード型軟骨再生用スキャフォールド。
【国際調査報告】
2021512681.tif 000017
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