(57)【要約】  本発明は、少なくとも２つの異なるキメラ抗原受容体を発現し、ＣＡＲの一方はＣＤ１３８に特異的に結合し、ＣＡＲの他方はＣＤ３８に特異的に結合する、Ｔ細胞を提供する。具体的に、本発明は、２つの異なるＣＡＲを発現し、ＣＡＲの一方が抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、２番目のＣＡＲが抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含むＴ細胞を提供する。更に本発明は、当該二重ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む医薬組成物、癌、特に多発性骨髄腫の治療におけるその用途、当該細胞の調製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲはＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲはＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、Ｔ細胞。
【請求項２】
前記ＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメイン及び前記ＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインはそれぞれ独立的に一本鎖可変断片である（それぞれ抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３８ｓｃＦｖと表記される）、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項３】
前記抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＬドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＨドメインとを含み、
前記抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖの前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインはペプチドリンカによって結合され、前記類似体は元の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項２に記載のＴ細胞。
【請求項４】
前記抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＬドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＨドメインとを含み、
前記抗ＣＤ３８ｓｃＦｖの前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインはペプチドリンカによって結合され、前記類似体は元の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項２又は３に記載のＴ細胞。
【請求項５】
前記ペプチドリンカは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するペプチド又はその類似体である、請求項３又は４に記載のＴ細胞。
【請求項６】
前記ＣＡＲの少なくとも一方は共刺激ドメインを含み、前記ＣＡＲの他方は活性化ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項７】
前記第１のＣＡＲは活性化ドメインを含んで共刺激ドメインを欠き、前記第２のＣＡＲは共刺激ドメインを含んで活性化ドメインを欠く、請求項６に記載のＴ細胞。
【請求項８】
前記第１のＣＡＲは共刺激ドメインを含んで活性化ドメインを欠き、前記第２のＣＡＲは活性化ドメインを含んで共刺激ドメインを欠く、請求項６に記載のＴ細胞。
【請求項９】
前記ＣＡＲの少なくとも一方は活性化ドメインと共刺激ドメインの両方を含む、請求項６に記載のＴ細胞。
【請求項１０】
前記共刺激ドメインはＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ｉＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ７０の共刺激ドメインから選ばれ、前記活性化ドメインはＦｃＲγ及びＣＤ３−ζ活性化ドメインから選ばれる、請求項６〜９のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項１１】
前記活性化ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列又はその類似体を含むＦｃＲγ活性化ドメインであり、前記共刺激ドメインは配列番号２２のアミノ酸配列又はその類似体を含むＣＤ２８の共刺激ドメインである、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項１２】
前記第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列又はその類似体を有し、前記第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列又はその類似体を有し、前記類似体は元の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項１３】
２つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する設計Ｔ細胞であって、
第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列又はその類似体を有し、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列又はその類似体を有し、前記類似体は元の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する、設計Ｔ細胞。
【請求項１４】
少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上のＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含み、
前記第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、前記  第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項１５】
ＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含み、前記ＤＮＡ構築物は、
（Ａ）５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、並びに
（Ｂ）５’位から３’位の方へ、（ｖ）リーダーペプチド、（ｖｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｖｉｉｉ）活性化ドメイン、共刺激ドメイン、又はその両方をコードし、
（Ａ）及び（Ｂ）は自己切断ペプチドによって分離される、請求項１４のＴ細胞。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）活性化ドメインをコードする、請求項１５に記載のＴ細胞。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｘ）共刺激ドメインをコードする、請求項１５に記載のＴ細胞。
【請求項１８】
前記自己切断ペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプチド、ＩＲＥＳペプチド、又はその類似体から選ばれる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項１９】
前記自己切断ペプチドは、配列番号２７のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる、請求項１８記載のＴ細胞。
【請求項２０】
２つの異なるＤＮＡ構築物を含み、
第１のＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードするＤＮＡ配列を含み、
第２のＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメイン、共刺激ドメイン、又はその両方をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１４に記載のＴ細胞。
【請求項２１】
（ｉ）前記リーダーペプチドは配列番号２０のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｉｉ）前記活性化ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｉｉｉ）前記共刺激ドメインは配列番号２２のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｉｖ）前記抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖドメインは配列番号１８のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｖ）前記抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメインは配列番号１９のアミノ酸配列又はその類似体を有し、
前記類似体は元の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２２】
（ｉ）前記リーダーペプチドは、配列番号３９に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、
（ｉｉ）前記抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号２８に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、
（ｉｉｉ）前記抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号２９に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、
（ｉｖ）前記共刺激ドメインは、配列番号３０に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、
（ｖ）前記活性化ドメインは、配列番号３１に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、
前記変異体は元の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２３】
配列番号３４のＤＮＡ配列又はその変異体を有するＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含む、請求項１４に記載のＴ細胞。
【請求項２４】
配列番号３２のＤＮＡ配列又はその変異体を有するＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製と、配列番号３３のＤＮＡ配列又はその変異体を有するＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製とを含む、請求項１４に記載のＴ細胞。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞から選ばれる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２６】
ＤＮＡ構築物であって、
（Ａ）５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、或いは、
（Ｂ）５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメイン、共刺激ドメイン、又はその両方、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｘ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、をコードする、ＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）活性化ドメインをコードする、請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｘ）共刺激ドメインをコードする、請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
（ｉ）前記自己切断ペプチドは配列番号２６のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｉｉ）前記リーダーペプチドは配列番号２０のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｉｉｉ）前記活性化ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｉｖ）前記共刺激ドメインは配列番号２２のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｖ）前記抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖドメインは配列番号１８のアミノ酸配列又はその類似体を有し、及び／又は、
（ｖｉ）前記抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメインは配列番号１９のアミノ酸配列又はその類似体を有し、
前記類似体は元の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
（ｉ）前記自己切断ペプチドは、配列番号２７のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、
（ｉｉ）前記リーダーペプチドは、配列番号３９のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、
（ｉｉｉ）前記活性化ドメインは、配列番号３１のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、
（ｉｖ）前記共刺激ドメインは、配列番号３０のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、
（ｖ）前記抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖドメインは、配列番号２８のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、
（ｖｉ）前記抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメインは、配列番号２９のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、
前記変異体は元の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
配列番号３２のＤＮＡ配列及び配列番号３３のＤＮＡ配列、又はその変異体を含む、請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３２】
配列番号３４のＤＮＡ配列又はその変異体を含む、請求項２５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３３】
請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の前記ＤＮＡ構築物を含む、ベクタ。
【請求項３４】
請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、又は請求項３３に記載のベクタを含む、細胞。
【請求項３５】
前記細胞はＴ細胞である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
前記Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞から選ばれる、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
請求項１〜２５、３５又は３６のいずれか一項に記載の複数のＴ細胞、並びに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３８】
薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
癌の治療を用途とする、請求項３７又は３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記癌は骨髄腫である、請求項３９に記載の用途のための医薬組成物。
【請求項４１】
骨髄腫は多発性骨髄腫である、請求項４０に記載の用途のための医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１〜２５、３５又は３６のいずれか一項に記載のＴ細胞の有効量を投与することを含む、治療を必要とする被験体の癌を治療する方法。
【請求項４３】
少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法であって、
第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含み、
前記方法は、前記Ｔ細胞を、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物又は請求項３３に記載のベクタでトランスフェクトすることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞であって、ＣＡＲの一方はＣＤ１３８に特異的に結合し、ＣＡＲの他方はＣＤ３８に特異的に結合するＴ細胞に関する。本発明は、更に、該細胞を含む医薬組成物、癌の治療におけるその用途、具体的には多発性骨髄腫の治療における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法は、新しく開発された養子抗腫瘍治療法である。遺伝子改変Ｔ細胞は、一般的にシグナリングエンドドメイン（ＣＤ３ζ、又はＦｃＲのγ鎖など）、膜貫通ドメイン、並びに標的の悪性細胞上の腫瘍関連抗原に対する受容体特異性を与えるモノクローナル抗体に由来する細胞外一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成される、キメラ抗原受容体を発現する。キメラ抗原受容体を介して腫瘍関連抗原を結合すると、Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）に発現するキメラ抗原受容体は、悪性細胞に対して細胞毒性となる免疫応答を開始する。理論的にＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面に発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と相互作用することにより、腫瘍細胞を特異的に局在化して排除することができる。
【０００３】
当該分野で急速に成長しているにも拘らず、効率的且つ安全なＣＡＲ−Ｔ治療法の開発は、多くの課題に直面している。それぞれの試験に、或いはそれぞれの患者の間に見られる臨床反応の変動に寄与し得る要因が、既知や未知を問わず、あまりにも多くある。考慮すべき要因としては、例えば、Ｔ細胞の生体内運命、腫瘍の特性、安全性が挙げられる。安全性と効力を改善するために、１つの抗原に結合すると次善の活性化をもたらすＣＡＲと、２番目の抗原を認識するキメラ共刺激受容体とで形質導入されたＴ細胞を生成することが提案された（Ｋｌｏｓｓら、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３、７１−７５；国際公開第２０１４／０５５６６８号；国際公開第２０１５／１４２３１４号）。更なる要因としては標的の選択が挙げられ、これは癌治療に関して常に主要な障害物の１つとなり得るものである。確実的に腫瘍特異的な表面抗原は特定し難く、生命に係わる予期せぬ標的外毒性を軽減する効果的な機序を探し出すべきでる。
【０００４】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄で発生する不治の形質細胞（ＰＣ）悪性腫瘍で、最終的には腎不全、反復感染による免疫抑制、貧血、骨病変を引き起こす。プロテアソーム阻害剤や免疫調節剤を含む現在の治療法は、多発性骨髄腫の患者の転帰を大幅に改善している。しかし残念ながら、ほとんどの患者は病を再発してしまい、そのような薬剤に曝露された後に選択できる治療法は限られている。ＣＡＲ−Ｔ療法は、原則として、多発性骨髄腫の「通常」治療の問題を幾つか克服することができるが、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の開発における主要な障害となり得るのは、その実質的な標的上・組織外毒性である。悪性細胞のみが発現するタンパク質は少なく、細胞表面抗原は事実上にないため、健康な組織までも標的としてしまう。従って、多発性骨髄腫におけるＣＡＲ標的の特定のためには、まず腫瘍細胞のみに特異的に発現する抗原を探し出さなければならない。ＣＡＲ療法で狙われ得る潜在的な標的として幾つかの骨髄腫関連表面分子が定められた。当該標的には、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＤ２００、ＣＤ３０７等が含まれる（Ａｔａｎａｃｋｏｖｉｃら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１６、１７２、６８５−６９８）。但し、これらの標的はいずれも癌細胞にのみ存在する訳ではないため、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に当該標的を使用すると、相当の標的外効果を伴うことになる。
【０００５】
Ｃｈｅｎら（Ｌｅｕｋｅｍｉａ２０１７，ｄｏｉ：１０．ｌ０３８／ｌｅｕ．２０１７．３０２）は、骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ及びＣＳ１の標的化が骨髄腫巨大病変に対する応答を増強するための効果的な戦略になり得ると語っている。
【０００６】
ＣＤ３８はＩＩ型膜貫通型糖タンパク質の４５−ｋＤであり、脂質ラフトの細胞表面受容体と会合して細胞質のＣａ２＋束を調節し、リンパ系細胞や骨髄系細胞のシグナル伝達を媒介する。ＣＤ３８は、骨髄腫細胞に高度且つ均一に発現する一方、正常なリンパ系細胞や骨髄系細胞、非造血系の一部の組織に比較的に低レベルで発現しているため、骨髄腫の治療における潜在的な標的となる。ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体であるダラツマブ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ３８、ＧｅｎＭａｂ）は、独特なＣＤ３８エピトープに結合する。前臨床研究では、ダラツマブが様々な機序によりＣＤ３８を発現する腫瘍細胞の標的ＴＣ細胞殺害を誘導できることを確認している。当該機序には、補体媒介性・抗体依存性・細胞媒介性細胞傷害作用、抗体依存性細胞食作用、アポトーシスが含まれ、それより頻度は低いがＣＤ３８の酵素活性の阻害も含まれる。抗ＣＤ３８モノクローナル抗体は、例えば米国特許第７８２９６７３号に記載されている。
【０００７】
ＣＤ１３８は、細胞外マトリックス分子のコラーゲンとフィブロネクチンとに結合する接着分子として機能する表面タンパク質である。抗ＣＤ１３８抗体は、例えば米国特許第９２２１９１４号にも記載されている。ＣＤ１３８が最も有望なマーカとして考えられているにも拘らず、免疫複合体ＢＴ０６２を単剤として使用した第１・２相試験では、２３人の患者のうち１人だけが客観的な臨床反応を示した（Ａｔａｎａｃｋｏｖｉｃら）。更に、ＣＤ１３８は多くの成熟上皮細胞にも発現している。但し、上記の臨床試験で肝臓と皮膚の毒性が観察されため、ＣＤ１３８を標的とするＣＡＲ−Ｔ治療により重大な副作用な生じる可能性も予想される。
【０００８】
前述した他の標的にもそれぞれ長所と短所があるが、ほとんどは高度の副作用に関連しているため、標的の選択は相変わらず安全且つ効率的なＣＡＲ−Ｔ療法の開発の障壁として立ちはだかっている。標的外の副作用が少なく、長期に亘って安全な多発性骨髄腫の治療を可能とするＣＡＲ−Ｔ治療システムの開発へのニーズは、未だ満たされていない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、多発性骨髄腫細胞において注意深く選ばれた異なる標的２つ、つまりＣＤ３８及びＣＤ１３８に結合できる２つの別個のＣＡＲを発現することで、癌を効果的に治療して延命を可能にする遺伝子改変Ｔ細胞を開示する。更に、ＣＡＲの１つは活性化ドメインのみを有し、２番目のＣＡＲは共刺激ドメインのみを有するように特別に設計し、Ｔ細胞の「標的上・腫瘍外」結合に係わる副作用の重症度を軽減できるＣＡＲ系を開示する。そのような設計により、副作用が低減された効率的な治療を実現する。一態様によると、本発明は、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲはＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲはＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態によると、ＣＤ１３８又はＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインは、それぞれ、抗ＣＤ３８抗体と抗ＣＤ１３８抗体の一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）である。従って、一実施形態によると、本発明は、２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞を提供する。
【００１０】
一部の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＬドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＨドメインとを含み、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖのＶＬドメイン及びＶＨドメインはペプチドリンカによって結合され、類似体は元の配列（親配列）に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００１１】
他の実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＬドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＨドメインとを含み、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖのＶＬドメイン及びＶＨドメインはペプチドリンカによって結合され、類似体は元の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００１２】
一部の実施形態によると、ＣＡＲの少なくとも一方は共刺激ドメインを含み、ＣＡＲの他方は活性化ドメインを含む。一実施形態によると、共刺激ドメインはＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ｉＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ７０の共刺激ドメインである。他の実施形態によると、活性化ドメインはＦｃＲγ及びＣＤ３−ζ活性化ドメインから選ばれる。
【００１３】
一部の実施形態によると、第１のＣＡＲは共刺激ドメインを含んで活性化ドメインを欠き、第２のＣＡＲは活性化ドメインを含んで共刺激ドメインを欠く。一実施形態によると、活性化ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列又はその類似体を有し、共刺激ドメインは配列番号２２のアミノ酸配列又はその類似体を有する。
【００１４】
一部の実施形態によると、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインは配列番号３５のアミノ酸配列又はその類似体を有し、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインは配列番号３６のアミノ酸配列又はその類似体を有する。
【００１５】
一部の実施形態によると、本発明は、２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する設計ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列又はその類似体を有し、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列又はその類似体を有する、Ｔ細胞を提供する。
【００１６】
一実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。更なる実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。上記の実施形態のうちいずれかによると、Ｔ細胞は本発明のＣＡＲを発現する。
【００１７】
他の態様によると、本発明は、本発明による２つ以上のＣＡＲをコードする１つ以上のＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含むＴ細胞を提供する。一実施形態によると、Ｔ細胞はＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含み、当該ＤＮＡ構築物は、（Ａ）５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、並びに（Ｂ）５’位から３’位の方へ、（ｖ）リーダーペプチド、（ｖｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｖｉｉｉ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードし、（Ａ）及び（Ｂ）は自己切断ペプチドによって分離される。
【００１８】
一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）活性化ドメインをコードする。他の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｘ）共刺激ドメインをコードする。一部の実施形態によると、自己切断ペプチドは、配列番号２７のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。
【００１９】
或いは、Ｔ細胞は本発明のＣＡＲをコードする２つの異なるＤＮＡ構築物を含む。第１のＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードする配列を含み、第２のＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードする配列を含む。
【００２０】
上記の実施形態のうちいずれかによると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号２８に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。他の実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号２９のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。更なる実施形態によると、共刺激ドメインは、配列番号３０のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。更に他の実施形態によると、活性化ドメインは、配列番号３１のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、リーダーペプチドは、配列番号３９のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、膜貫通ドメインＩは、配列番号３７に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、膜貫通ドメインＩＩは、配列番号３８に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。
【００２１】
一実施形態によると、本発明は、配列番号３４のＤＮＡ配列又はその変異体を有するＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含む、Ｔ細胞を提供する。
【００２２】
他の実施形態によると、本発明は、２つのＤＮＡ構築物のそれぞれの少なくとも１つの複製を含み、第１のＤＮＡ構築物は配列番号３２のＤＮＡ配列又はその変異体を有し、第２のＤＮＡ構築物は配列番号３３のＤＮＡ配列又はその変異体を有する、ＣＡＲ−Ｔ細胞を提供する。
【００２３】
他の態様によると、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＤＮＡ構築物であって、第１のＣＡＲはＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲはＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、（ｉｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードする。一実施形態によると、本発明は、配列番号３２のＤＮＡ配列及び配列番号３３のＤＮＡ配列、又はその変異体を含むＤＮＡ構築物を提供する。更なる実施形態によると、本発明は、配列番号３４のＤＮＡ配列又はその変異体を含むＤＮＡ構築物を提供する。
【００２４】
他の態様によると、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含むベクタを提供する。一実施形態によると、ベクタは、配列番号３２のＤＮＡ配列及び配列番号３３のＤＮＡ配列、又はその変異体を含むＤＮＡ構築物を含む。更なる実施形態によると、ベクタは、配列番号３４のＤＮＡ配列又はその変異体を含むＤＮＡ構築物を含む。一部の実施形態によると、ベクタはウイルスベクタである。
【００２５】
更に他の態様によると、本発明は、本発明のベクタのＤＮＡ構築物を含む細胞を提供する。一実施形態によると、細胞は原核細胞である。更なる実施形態によると、細胞は真核細胞である。一部の実施形態によると、細胞はヒト細胞である。更なる実施形態によると、細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞等のＴ細胞である。
【００２６】
他の態様によると、本発明は、本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞を複数含む医薬組成物を提供する。一実施形態によると、Ｔ細胞は遺伝子改変により、本発明の２つのＣＡＲを発現する。一実施形態によると、Ｔ細胞は本発明のＣＡＲを発現する。更なる実施形態によると、Ｔ細胞は、本発明の２つのＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物を含むか、本発明の２つのＣＡＲをコードする２つ以上の異なる構築物を含む。一部の実施形態によると、本発明の医薬組成物は、癌の治療を用途とする。一実施形態によると、癌は多発性骨髄腫である。一部の実施形態によると、Ｔ細胞は遺伝子改変により、配列番号２４及び配列番号２５のアミノ酸配列を有する２つのＣＡＲを発現する。
【００２７】
他の態様によると、本発明は、治療を必要とする被験体の癌、例えば多発性骨髄腫を治療する方法であって、本発明のＴ細胞の有効量を投与することを含む方法を提供する。他の態様によると、本発明は、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、本発明のＤＮＡ構築物でＴ細胞をトランスフェクトすることを含む応報を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】二重ＣＡＲ−ＤＮＡ構築物を図示する図である。ＶＬとＶＨはリンカによって分離されたｓｃＦｖの一部、Ｔ２Ａは自己切断ペプチド、ＣＤ２８はＣＤ２８の共刺激要素、ＦｃＲγは活性化ドメインを指す。
【図２】ＩＦＮ−γ検定で確認した、異なるＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞がＣＤ３８及びＣＤ１３８を発現するＣＡＧ細胞株と相互作用する能力を示す。検定を４回繰り返し、そのうち代表的なものを示した。ＩＦＮ−γの分泌は、図に表記されたように様々な形質導入Ｔ細胞の刺激があったことを示唆している。
【図３Ａ】異なるレベルでＣＤ３８及びＣＤ１３８を発現する標的細胞によるＣＡＲ−Ｔ細胞の刺激を示す。異なる細胞株による刺激を示したものである。結果として、ＩＦＮ−γの濃度をｐｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ）で表した。
【図３Ｂ】異なるレベルでＣＤ３８及びＣＤ１３８を発現する標的細胞によるＣＡＲ−Ｔ細胞の刺激を示す。正常な一次組織に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の活性を比較したものである。結果として、ＩＦＮ−γの濃度をｐｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ）で表した。
【図４】二重ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＣＡＧ−ＬＵＣ細胞の殺害を示す。ルシフェラーゼ発現ＣＡＧ細胞を、形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞とインキュベートした。
【図５】ヒトＣＡＧ多発性骨髄腫細胞株と対照群をそれぞれ移植したＮＳＧマウスから得た組織の抗ヒトＣＤ１３８免疫組織学的特徴の画像を示す。
【図６】ＣＡＧ多発性骨髄腫細胞を注射し、異なるＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞で治療したマウスの生存曲線である。
【図７】ＣＡＧ細胞株を移植され、ＳＷ１又は二重ＣＡＲで治療した生存マウスの組織にヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を施したものである。
【図８】治療を受けたマウスにおけるルシフェラーゼ発現多発性骨髄腫（ＣＡＧ−Ｌｕｃ）の画像を示す。異なるＣＡＲを注射（８日目）し、続いてＭＭ  ＣＡＧ−Ｌｕｃを注射したマウスの治療効果をモニターした。
【図９】マウスの皮膚（左側のマウス：ＣＡＲ−ＣＤ３８−Ｔ細胞で治療）に対するＣＤ１３８−ＣＡＲ−Ｔ細胞の毒性を示す。二重ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療したときは副作用が生じなかった（右側）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
一態様によると、本発明は、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲはヒトＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲはヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、Ｔ細胞を提供する。
【００３０】
本明細書で用いられる「Ｔ細胞」とは、当技術分野で周知の、様々な細胞性免疫反応に関与する胸腺により生成、又は処理される種類のリンパ球を指す。当該用語は、必要に応じてベクタを使用し、ＤＮＡ又はＲＮＡポリペプチドなどの核酸で形質導入されたＴ細胞を網羅する。本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞に対して感染又はエレクトロポレーションにより形質導入を施す、ＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされるＣＡＲ分子を発現できる。
【００３１】
本明細書で用いられる「キメラ抗原受容体」と「ＣＡＲ」は、互いに同様の意味を有し、細胞上で発現される設計受容体、つまりタンパク質を指す。一般的に、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを含む細胞外ドメイン（細胞外部分）を含む。
【００３２】
細胞外ドメインは、抗原結合ドメインを含み、必要に応じてスペーサまたはヒンジ領域を含む。
【００３３】
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、特定の抗原を標的とする。標的領域は、抗体の全長重鎖、Ｆａｂ断片、又は抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み得る。抗原結合ドメインは、ＣＡＲが使用されるのと同一の、或いは相違する種に由来し得る。一実施形態では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。
【００３４】
ＣＡＲの細胞外スペーサ又はヒンジ領域は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にある。細胞外スペーサドメインには、抗体のＦｃ断片、或いはその断片又は誘導体、抗体のヒンジ領域、或いはその断片又は誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、付属タンパク質、人工スペーサ配列、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限られる訳ではない。
【００３５】
本明細書で用いられる「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜を横切り、又は橋渡しするＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質、人工疎水性配列、又はそれらの組み合わせの膜貫通領域である。一部の実施形態によると、当該用語は、細胞外スペーサ又はヒンジ領域を有する膜貫通ドメインも含む。
【００３６】
抗体、その断片、又はＣＡＲの抗原結合ドメインに関して本明細書で用いられる「特異的に結合」又は「特異的」とは、特定の抗原を認識して結合するが、試料における他の分子は実質的に認識せず、結合もしない抗原結合ドメインを指す。当該用語は、抗原結合ドメインがその抗原に高い親和性で結合し、他の抗原に低い親和性で結合することを示唆する。ある種の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインが、別の種の抗原にも結合する場合があるが、このような種間反応性は、特定の抗原結合ドメインの定義に反する訳ではない。
【００３７】
細胞内ドメインとは、Ｔ細胞受容体又は他の受容体（例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー）、或いはその一部の細胞内ドメインであり、細胞内活性化ドメイン（例えば、免疫受容体チロシン系の活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むＴ細胞活性化モチーフ）、細胞内共刺激ドメイン、又はその両方等を指す。
【００３８】
本明細書で用いられる本発明の「遺伝子改変Ｔ細胞」と「ＣＡＲ−Ｔ細胞」は、互いに同様の意味を有する。
【００３９】
本明細書で用いられる「ＣＤ３８」と「ヒトＣＤ３８」は互いに同様の意味を有し、ヒト分化分類３８（ＣＤ３８）、ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ１、ｃＡＤＰｒヒドロラーゼ１、環状ＡＤＰ−リボースヒドロラーゼ１、Ｔ１０と呼ばれ、拡張番号ＥＣ３．２．２．５を有するタンパク質を指す。本明細書で用いられる「抗ＣＤ３８」又は「αＣＤ３８」は、ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインである。一実施形態によると、抗原結合ドメインはＣＡＲの抗原結合ドメインである。他の実施形態によると、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。更なる実施形態によると、抗原結合ドメインはヒトＣＤ３８のエピトープに結合し、具体的には、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインのエピトープに結合する。
【００４０】
本明細書で用いられる「ＣＤ１３８」と「ヒトＣＤ１３８」は互いに同様の意味を有し、Ｓｙｎｄｅｃａｎ１、ＳＤＣ１、ＣＤ１３８、ＳＤＣ、又はＳＹＮＤ１と呼ばれ、アクセッション番号Ｐ１８８２７のタンパク質を指す。本明細書で用いられる「抗ＣＤ１３８」又は「αＣＤ１３８」は、ヒトＣＤ１３８に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインである。一実施形態によると、抗原結合ドメインはＣＡＲの抗原結合ドメインである。他の実施形態によると、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。更なる実施形態によると、抗原結合ドメインはヒトＣＤ１３８のエピトープに結合し、具体的には、ヒトＣＤ１３８の細胞外ドメインのエピトープに結合する。
【００４１】
一部の実施形態によると、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。一実施形態によると、本発明は、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲはヒトＣＤ１３８に特異的に結合するｓｃＦｖ抗原結合ドメイン（抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ）を含み、第２のＣＡＲはヒトＣＤ３８に特異的に結合するｓｃＦｖ抗原結合ドメイン（抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ）を含む、Ｔ細胞を提供する。
【００４２】
一実施形態によると、本発明は、２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞を提供する。本明細書で用いられる「第１のＣＡＲ」とは、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含むＣＡＲを指す。本明細書で用いられる「第２のＣＡＲ」とは、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含むＣＡＲを指す。
【００４３】
上記の実施形態のうちいずれかによると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ結合ドメインと抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ結合ドメインは、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含む。
【００４４】
一実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含む。ＶＬドメインは、配列番号１、２、３の配列を有する、或いはそれからなる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ＶＨドメインは、配列番号４、５、６の配列を有する、或いはそれからなる３つのＣＤＲを含む。
【００４５】
一実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含む。ＶＬドメインは、配列番号７、８、９の配列を有する、或いはそれからなる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ＶＨドメインは、配列番号１０、１１、１２の配列を有する、或いはそれからなる３つのＣＤＲを含む。
【００４６】
一部の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号１、２、３、４、５、６の配列を有する、或いはそれからなる６つのＣＤＲを含む。抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２の配列を有する、或いはそれからなる６つのＣＤＲを含む。
【００４７】
本発明の態様及び実施形態のいずれかによると、本明細書で用いられる「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列を含むペプチド」、「配列番号Ｘを含むペプチド」、「配列番号Ｘを有するペプチド」は、互いに同様の意味を有する。本明細書で用いられる「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列からなるペプチド」、「配列番号Ｘからなるペプチド」、「配列番号Ｘからなるペプチド」は、互いに同様の意味を有する。
【００４８】
上記の実施形態のうちいずれかによると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＬドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＨドメインとを含む。抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖのＶＬドメイン及びＶＨドメインはペプチドリンカによって結合され、類似体は元の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。一実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨドメインとを含む。他の実施形態によると、ＶＬドメインは配列番号１３の類似体である。更なる実施形態によると、ＶＨドメインは配列番号１４の類似体である。一部の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号１３の類似体であるＶＬドメインと、配列番号１４の類似体であるＶＨドメインとを含む。
【００４９】
上記の実施形態のうちいずれかによると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号１５のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＬドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列又はその類似体を有するＶＨドメインとを含む。抗ＣＤ３８ｓｃＦｖのＶＬドメイン及びＶＨドメインはペプチドリンカによって結合され、類似体は元の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。一実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨドメインとを含む。他の実施形態によると、ＶＬドメインは配列番号１５の類似体である。更なる実施形態によると、ＶＨドメインは配列番号１６の類似体である。一部の実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号１５の類似体であるＶＬドメインと、配列番号１６の類似体であるＶＨドメインとを含む。
【００５０】
本明細書で用いられる「ペプチドリンカ」とは、連結される可変ドメインの種類に応じる長さで２つの可変ドメインを連結できる任意のペプチドを指す。一部の実施形態によると、ペプチドリンカは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するペプチドである。更なる実施形態によると、ペプチドリンカは、配列番号１７を有するペプチドの類似体である。
【００５１】
上述した通り、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカによってＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含む。一部の実施形態によると、ＶＨはＶＬのＮ末端に位置する。更なる実施形態によると、ＶＬはＶＨのＮ末端に位置する。
【００５２】
一部の実施形態によると、本発明は、２つのＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞であって、１つのＣＡＲは、配列番号１３を有するＶＬドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨドメインとを含む抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、２番目のＣＡＲは、配列番号１５を有するＶＬドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨドメインとを含む抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ及び／又は抗ＣＤ３８ｓｃＦｖのＶＬドメイン及びＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するペプチドリンカによって結合される。
【００５３】
本発明細書で用いられる「ペプチド」とは、ペプチド結合、つまり１つのアミノ酸のカルボキシル基と隣接するアミノ酸のアミノ基との間に形成される共有結合によって連結されたアミノ酸残基の短鎖を指す。「ペプチド」とは、最大５０個のアミノ酸を有する短い配列を指す。５０個のアミノ酸より長いアミノ酸単量体の鎖は「ポリペプチド」と呼ばれる。当該ポリペプチドは、５０個を超えるアミノ酸残基を有する場合、タンパク質、より具体的には低分子量のタンパク質又は中分子量のタンパク質として分類することもできる。
【００５４】
本明細書で用いられる「ペプチド類似体」、「類似体」、「配列類似体」、「類似配列」、「配列番号Ｘの類似体」は互いに同様の意味を有し、元のペプチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するペプチドの類似体を指す。類似体は元のペプチドの活性を保持し、Ｘは配列の番号を表す。従って「類似体」と「活性類似体」も同様の意味を有すると解釈できる。「類似体」とは、それぞれ元の（親）ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に、それぞれ置換、再配置、欠失、付加、及び／又は化学修飾を施したペプチド又はタンパク質を指す。一部の実施形態によると、ペプチド類似体は、元のペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、或いは少なくとも９９％の配列同一性を有する。一実施形態によると、類似体は、元のペプチドに対して約８０％〜約９９％、約８５％〜約９８％、或いは約９０％〜約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態によると、本発明の類似体は、元のペプチドの配列に対して１、２、３、４、又は５つの置換が行われたものを含む。
【００５５】
アミノ酸の置換は、保存的置換であってもよく、非保存的置換であってもよい。非保存的置換は、１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することを含む。
【００５６】
一部の実施形態によると、「類似体」は「保存的類似体」を網羅する。
【００５７】
当業者にも周知のように、アミノ酸の保存的置換は、本発明の範囲内にある。保存的アミノ酸置換には、１つのアミノ酸を、同じ官能基又は側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、正に荷電したアミノ酸、負に荷電したアミノ酸に取り替えることが含まれる。当業者であれば、個々の置換が「保存的に修飾された類似体」であり、それにより化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換が生じることを認識するはずである。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野では周知である。保存的置換の例を下記に示す。
【００５８】
次の６群にはそれぞれ、互いに保存的置換となるアミノ酸が含まれている。
（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
他の実施形態では、保存的置換は、化学的に類似した非天然アミノ酸での置換を網羅する。
【００５９】
従って一部の実施形態では、類似体は、抗ＣＤ３８又は抗ＣＤ１３８のいずれかのｓｃＦｖの保存的類似体である。一部の実施形態によると、本発明の保存的類似体は、元のｓｃＦｖの配列に対して１、２、３、４、又は５つの保存的置換が行われたものを含む。更なる実施形態によると、類似体は、元のペプチドのアミノ配列に対して１、２、又は３つの保存的置換が行われた配列からなる。従って、類似体は、元のペプチドの、１、２、又は３つの保存的置換が行われたアミノ配列からなる。
【００６０】
一部の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは配列番号１８のアミノ酸配列を有する。他の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは配列番号１８のアミノ酸配列からなる。
【００６１】
他の実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは配列番号１９のアミノ酸配列を有する。他の実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは配列番号１９のアミノ酸配列からなる。
【００６２】
更なる実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは配列番号１８のアミノ酸配列を有し、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは配列番号１９のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは配列番号１８のアミノ酸配列からなり、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは配列番号１９のアミノ酸配列からなる。
【００６３】
上記の実施形態のうちいずれかによると、ＣＡＲの細胞外ドメインはリーダーペプチドを含む。一実施形態によると、リーダーペプチドは、ｓｃＦｖのＮ末端に位置する。本明細書で用いられる「リーダーペプチド」、「リードペプチド」、「シグナルペプチド」は、互いに同様の意味を有し、細胞膜に対して標的タンパク質を転位させる、又は転位を促すペプチドを指す。
【００６４】
一実施形態によると、第１のＣＡＲは、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖのＮ末端に位置する配列番号２０を含むリーダーペプチドを含む。更なる実施形態によると、配列番号２０を含むリーダーペプチドは、配列番号１８を含む、或いはそれからなる抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖのＮ末端に位置する。
【００６５】
一実施形態によると、第２のＣＡＲは、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖのＮ末端に位置する配列番号２０を含むリーダーペプチドを含む。更なる実施形態によると、配列番号２０を含むリーダーペプチドは、配列番号１９を含む、或いはそれからなる抗ＣＤ３８ｓｃＦｖのＮ末端に位置する。
【００６６】
上記の実施形態のうちいずれかによると、ＣＡＲの少なくとも一方は共刺激ドメインを含み、ＣＡＲの少なくとも他方は活性化ドメインを含む。
【００６７】
一部の実施形態によると、第１のＣＡＲは共刺激ドメインを含み、第２のＣＡＲは活性化ドメインを含む。一部の実施形態によると、第１のＣＡＲは活性化ドメインを含み、第２のＣＡＲは共刺激ドメインを含む。
【００６８】
一部の実施形態によると、共刺激ドメインはＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ｉＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ７０の共刺激ドメインから選ばれる。一実施形態によると、共刺激ドメインはＣＤ２８の共刺激ドメインである。他の実施形態によると、共刺激ドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態によると、共刺激ドメインは配列番号２２の類似体である。
【００６９】
本明細書で用いられる「活性化ドメイン」と「活性化要素」は、互いに同様の意味を有し、細胞内シグナリングドメインを指す。一部の実施形態によると、活性化ドメインはＦｃＲγ及びＣＤ３−ζから選ばれる。一実施形態によると、活性化ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列を有する。更なる実施形態によると、活性化ドメインは配列番号２３の類似体である。
【００７０】
本発明の教示のよると、共刺激ドメインと活性化ドメインとを分離し、「標的上・腫瘍外」効果を低減することが好ましい。従って一実施形態によると、ＣＡＲの一方は共刺激ドメインのみを含み、ＣＡＲの他方は活性化ドメインのみを含む。故に、一部の実施形態では、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含む第１のＣＡＲは、共刺激ドメインを含んで活性化ドメインを欠き、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む第２のＣＡＲは、活性化ドメインを含んで共刺激ドメインを欠く。更なる実施形態によると、第１のＣＡＲは、活性化ドメインを含んで共刺激ドメインを欠き、第２のＣＡＲは、共刺激ドメインを含んで活性化ドメインを欠く。
【００７１】
更なる実施形態によると、ＣＡＲの少なくとも一方は活性化ドメインと共刺激ドメインとの両方を含む。
【００７２】
更なる実施形態によると、第２のＣＡＲは活性化ドメインと共刺激ドメインとの両方を含む。当該実施形態によると、第１のＣＡＲは、共刺激ドメインを含んで活性化ドメインを欠く。
【００７３】
一部の実施形態によると、活性化ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列を有し、共刺激ドメインは配列番号２２のアミノ酸配列を有する。一実施形態によると、活性化ドメインは配列番号２３の類似体である。更なる実施形態によると、共刺激ドメインは配列番号２２の類似体である。
【００７４】
一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含む。更なる実施形態によると、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、本発明は、２つのＣＡＲ含む設計ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含み、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む、Ｔ細胞を提供する。
【００７５】
上記の実施形態のうちいずれかによると、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）とヒンジドメインとを含む。本発明の教示によると、ＴＭドメインに関して用いられる場合はヒンジドメインも含まれ、膜貫通ドメインの配列にはヒンジドメインの配列も含まれる。一実施形態によると、第１のＣＡＲは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＴＭドメインＩ（ＴＭ−Ｉ）を含む。更なる実施形態によると、第２のＣＡＲは、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＴＭドメインＩＩ（ＴＭ−ＩＩ）を含む。
【００７６】
一部の実施形態によると、本発明は、２つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する設計Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有し、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列を有する、Ｔ細胞を提供する。一実施形態によると、第１のＣＡＲは、配列番号２４の類似体であるアミノ酸配列を有する。他の実施形態によると、第２のＣＡＲは、配列番号２５の類似体であるアミノ酸配列を有する。更なる実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号２４に類似するアミノ酸配列を有し、第２のＣＡＲは配列番号２５に類似するアミノ酸配列を有する。一実施形態によると、本発明は、２つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する設計Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列からなり、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列からなる、Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態によると、変異体は、元の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。他の実施形態によると、変異体は、元の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【００７７】
上記の実施形態のうちいずれかによると、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞から選ばれる。従って、一実施形態では、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞を提供する。更なる実施形態によると、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含む。更なる実施形態によると、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含み、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列又はその類似体を有し、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列又はその類似体を有する。更なる実施形態によると、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列からなり、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列からなる、Ｔ細胞を提供する。
【００７８】
上記の実施形態のうちいずれかによると、本発明のＴ細胞は、２つの別個のＣＡＲを発現でき、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態によると、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現するＴ細胞であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞から選ばれる。従って、一実施形態では、本発明は、２つの別個ＣＡＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞を提供する。更なる実施形態によると、本発明は、２つの別個ＣＡＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含む。更なる実施形態によると、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含み、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列又はその類似体を有し、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列又はその類似体を有する。更なる実施形態によると、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列からなり、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列からなる、Ｔ細胞を提供する。
【００７９】
他の態様によると、２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上のＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含むＴ細胞であって、第１のＣＡＲはＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲはＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、Ｔ細胞を提供する。一実施形態によると、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。従って、Ｔ細胞は、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上のＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含み、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む。一実施形態によると、２つのＣＡＲは１つのＤＮＡ構築物によりコードされる。更なる実施形態によると、２つのＣＡＲは２つの異なるＤＮＡ構築物によりコードされる。一実施形態によると、Ｔ細胞は、本発明のＣＡＲを発現する、或いは発現することができる。
【００８０】
本明細書で用いられる「ＤＮＡ構築物」とは、人工的に構築された核酸のセグメントを指す。ＤＮＡ構築物は単離物である、或いは、別のＤＮＡ分子に統合されることができる。従って、「組換えＤＮＡ構築物」は実験室手法により生成される。「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖や二本鎖、並びにそれらの化学修飾を網羅する。本明細書で用いられる「核酸」と「ポリヌクレオチド」は、互いに同様の意味を有する。
【００８１】
本発明のＣＡＲは、１つのＤＮＡ構築物、又は２つ以上のＤＮＡ構築物によりコードされてもよい。
【００８２】
一部の実施形態によると、本発明の２つのＣＡＲは１つのＤＮＡ構築物によりコードされる。従って、一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含むＴ細胞であって、当該ＤＮＡ構築物は、（Ａ）５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、並びに（Ｂ）５’位から３’位の方へ、（ｖ）リーダーペプチド、（ｖｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｖｉｉｉ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードし、（Ａ）及び（Ｂ）は自己切断ペプチドによって分離される、Ｔ細胞を提供する。一実施形態によると、本発明は、ＤＮＡ構築物の少なくとも１つの複製を含むＴ細胞であって、当該ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードする、Ｔ細胞を提供する。
【００８３】
一実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）活性化ドメインをコードする。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｘ）共刺激ドメインをコードする。
【００８４】
上述の態様で言及された定義及び実施形態、特にＣＡＲ、それらの一部やドメイン、ＤＮＡ構築物、Ｔ細胞に関する定義及び実施形態は、全て援用され、含まれる。
【００８５】
一実施形態によると、自己切断ペプチドは、配列番号２６を有するペプチド又はその活性類似体である。更なる実施形態によると、自己切断ペプチドはＩＲＥＳペプチド又はその類似体である。更なる実施形態によると、自己切断ペプチドは、配列番号２７のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。
【００８６】
本明細書で用いられる「変異体」、「ＤＮＡ変異体」、「配列変異体」、「ポリヌクレオチド変異体」、「配列番号Ｘの変異体」は互いに同様の意味を有し、元のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＤＮＡポリヌクレオチドを指す。Ｘは配列の番号を表す。変異体は、欠失、付加、又は置換などの突然変異を含んでもよく、但し該突然変異を以ってしても、オープンリーディングフレームは変更されず、ポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドによりコードされたペプチドやタンパク質と実質的に同様の構造や機能を有するペプチドやタンパク質をコードする。一部の実施形態によると、変異体は保存的変異体である。本明細書で用いられる「保存的変異体」とは、所与のコドン位置における１つ以上のヌクレオチドの変化が、その位置でコードされるアミノ酸に変化をもたらさない変異体を指す。従って、保存的変異体によりコードされるペプチドやタンパク質は、元のポリヌクレオチドによりコードされるペプチドやタンパク質に対して１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態によると、変異体は、元のポリヌクレオチドによりコードされるペプチドやタンパク質の保存的類似体であるペプチドやタンパク質をコードする非保存的変異体である。一部の実施形態によると、変異体は、元のポリヌクレオチドに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００８７】
一部の実施形態によると、本発明のＣＡＲは２つ以上の異なるＤＮＡ構築物によりコードされる。従って一部の実施形態では、本発明は、２つの異なるＤＮＡ構築物を含むＴ細胞であって、第１のＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ（ＴＭ−Ｉ）、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードする配列を含み、第２のＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ（ＴＭ−ＩＩ）、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードする配列を含む、Ｔ細胞を提供する。一実施形態によると、第１のＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）ＴＭ−Ｉ、（ｉｖ）共刺激ドメインをコードする配列を含む。更なる実施形態によると、第２のＤＮＡ構築物は、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｉｉｉ）ＴＭ−ＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメインをコードする配列を含む。一実施形態によると、第１のＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ（ＴＭ−Ｉ）、（ｉｖ）共刺激ドメインをコードする配列を含み、第２のＤＮＡ構築物は、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｉｉｉ）ＴＭ−ＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメインをコードする配列を含む。
【００８８】
上記の実施形態のうちいずれかによると、２つのＣＡＲのいずれかが１つ又は２つの別個のＤＮＡ構造によりコードされ、リーダーペプチドは、配列番号２０のアミノ配列又はその類似体を有する。他の実施形態によると、活性化ドメインは、配列番号２３のアミノ配列又はその類似体を有する。更なる実施形態によると、共刺激ドメインは、配列番号２２のアミノ配列又はその類似体を有する。更に他の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号１８のアミノ配列又はその類似体を有する。特定の実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号１９のアミノ配列又はその類似体を有する。一部の実施形態によると、ＴＭ−Ｉは、配列番号３５のアミノ酸配列を有する。更に他の実施形態に、ＴＭ−ＩＩは、配列番号３６のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態によると、リーダーペプチドは配列番号３９に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号２８に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号２９に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、共刺激ドメインは、配列番号３０に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされ、及び／又は、活性化ドメインは、配列番号３１に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、膜貫通ドメインＩは、配列番号３７に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、膜貫通ドメインＩＩは、配列番号３８に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。当該実施形態によると、類似体又は変異体は、元の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００８９】
他の実施形態によると、両方のＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物は、配列番号２８を含む。他の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号２８の変異体、例えば保存的変異体を含む。
【００９０】
一部の実施形態によると、２つのＣＡＲは２つの異なるＤＮＡ構築物によりコードされ、第１のＤＮＡ構築物は配列番号２８を含む。他の実施形態によると、第１のＤＮＡ構築物は、配列番号２８の変異体、例えば保存的変異体を含む。
【００９１】
一部の実施形態によると、両方のＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物は、配列番号２９を含む。他の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号２９の変異体、例えば保存的変異体を含む。
【００９２】
一部の実施形態によると、２つのＣＡＲは２つの異なるＤＮＡ構築物によりコードされ、第２のＤＮＡ構築物は配列番号２９を含む。他の実施形態によると、第２のＤＮＡ構築物は、配列番号２９の変異体、例えば保存的変異体を含む。
【００９３】
一部の実施形態によると、共刺激ドメインは配列番号３０に示されるＤＮＡ配列によりコードされ、活性化ドメインは配列番号３１に示されるＤＮＡ配列によりコードされる。
【００９４】
一実施形態によると、２つのＣＡＲは、５’位から３’位の方へ配列番号２８、３０、２９、３１のＤＮＡ配列を含む１つＤＮＡ構築物によりコードされる。
【００９５】
一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は配列番号３２又はその変異体を含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は配列番号３３又はその変異体を含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は５’位から３’位の方へ配列番号３２と配列番号３３とを含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は５’位から３’位の方へ配列番号３３と配列番号３２とを含む。
【００９６】
一実施形態によると、本発明は、本発明の２つのＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物を含むＴ細胞であって、ＤＮＡ構築物は配列番号３４を有する、Ｔ細胞を提供する。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号３４の変異体、例えば保存的変異体である。他の実施形態によると、変異体は元の配列に対して少なくとも９０％、少なくともの９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【００９７】
一部の実施形態によると、本発明は、本発明の２つのＣＡＲをコードする２つのＤＮＡ構築物を含むＴ細胞であって、第１のＤＮＡ構築物は配列番号３２を含み、第２のＤＮＡ構築物は配列番号３３を含む、Ｔ細胞を提供する。一実施形態によると、第１のＤＮＡ構築物は、配列番号３２の変異体、例えば保存的変異体であるＤＮＡ配列を有する。一実施形態によると、第２のＤＮＡ構築物は、配列番号３３の変異体、例えば保存的変異体であるＤＮＡ配列を有する。更なる実施形態によると、Ｔ細胞は２つのＤＮＡ構築物を含み、第１のＤＮＡ構築物は配列番号３２の変異体であるＤＮＡを含み、第２のＤＮＡ構築物は配列番号３３の変異体であるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態によると、変異体は元の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。他の実施形態によると、変異体は元の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【００９８】
上記の実施形態のうちいずれかによると、本発明のＤＮＡ構築物を含むＴ細胞は、ＤＮＡ構築物によりコードされるＣＡＲを発現する、或いは発現することができる。
【００９９】
本明細書でＤＮＡ構築物に関して用いられる「発現」又は「発現する」とは、その構築物の転写産物及び／又は翻訳産物を指す。細胞におけるＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応ｍＲＮＡの量、又は細胞により生成されたそのＤＮＡによりコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて定められてもよい。一部の実施形態によると、発現は条件付き発現である。
【０１００】
更なる態様によると、本発明は、２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸構築物であって、第１のＣＡＲはＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲはＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、核酸構築物を提供する。一実施形態によると、核酸構築物は２つの別個のキメラ抗原受容体をコードし、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む。一実施形態によると、核酸構築物はＤＮＡである。従って一実施形態では、本発明は、２つの別個のキメラ抗原受容体をコードするＤＮＡ構築物であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、ＤＮＡ構築物を提供する。
【０１０１】
一実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードする。
【０１０２】
一実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）活性化ドメインをコードする。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｖ）活性化ドメイン、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｘ）共刺激ドメインをコードする。一実施形態によると、リーダーペプチドは、配列番号２０のアミノ配列又はその類似体を有する。他の実施形態によると、活性化ドメインは、配列番号２３のアミノ配列又はその類似体を有する。更なる実施形態によると、共刺激ドメインは、配列番号２２のアミノ配列又はその類似体を有する。更に他の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号１８のアミノ配列又はその類似体を有する。特定の実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号１９のアミノ配列又はその類似体を有する。一部の実施形態によると、ＴＭ−Ｉは、配列番号３５のアミノ酸配列を有する。更に他の実施形態に、ＴＭ−ＩＩは、配列番号３６のアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
一部の実施形態によると、リーダーペプチドは配列番号３９に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。他の実施形態によると、抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖは、配列番号２８に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖは、配列番号２９に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、共刺激ドメインは、配列番号３０に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。更に他の実施形態によると、活性化ドメインは、配列番号３１に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、共刺激ドメインは配列番号３０のＤＮＡ配列によりコードされ、活性化ドメインは配列番号３１によりコードされる。一部の実施形態によると、自己切断ペプチドは、配列番号２７のＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、膜貫通ドメインＩは、配列番号３７に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。一部の実施形態によると、膜貫通ドメインＩＩは、配列番号３８に示されるＤＮＡ配列又はその変異体によりコードされる。
【０１０４】
一実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ配列番号２８、３０、２９、３１のＤＮＡ配列を含む。
【０１０５】
一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は配列番号３２又はその変異体を含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は配列番号３３又はその変異体を含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は５’位から３’位の方へ配列番号３２と配列番号３３とを含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は５’位から３’位の方へ配列番号３３と配列番号３２とを含む。一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号３２の配列と配列番号３３の配列との間に、配列番号２７のＤＮＡ配列を有する自己切断配列を含む。
【０１０６】
一部の実施形態によると、本発明は、配列番号３４を含む核酸構築物を提供する。一部の実施形態によると、本発明は、配列番号３４からなる核酸構築物を提供する。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は配列番号３４の変異体、例えば保存的変異体である。
【０１０７】
一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物はプロモータに機能的に連結されている。本明細書で用いられる「プロモータ」とは、下流側の核酸の転写を開始する調節配列を指す。「プロモータ」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始することのできる部位を画定する、より大きなＤＮＡ配列内のＤＮＡ配列を指す。プロモータは、任意の遠位エンハンサ又はリプレッサ要素を含んでもよい。プロモータは、相同、つまり天然に存在しながら所望の核酸を発現させるもの、又は異種、つまり天然に存在しながら所望の核酸以外の遺伝子に由来する核酸を発現させるもののいずれかであってもよい。プロモータは構成的プロモータであってもよく、誘導プロモータであってもよい。構成的プロモータは、ほとんどの環境や発生条件下で活性を示すプロモータである。誘導プロモータは、環境や発生に制限がかけられて活性を示すプロモータである。プロモータは、全体が天然遺伝子に由来してもよく、天然遺伝子のセグメント又は断片を含んでもよく、或いは、天然に見出される異なるプロモータに由来する異なる要素から構成されてもよく、ましてや合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。当業者であれば、異なるプロモータが、異なる組織や細胞型において、或いは発生の異なる段階において、或いは異なる環境や生理学的条件に応じて、遺伝子の発現を惹起してもよいことを理解するはずである。更に、同じプロモータは、異なる組織において差次的に発現され、及び／又は、異なる条件下で差次的に発現されてもよい。
【０１０８】
他の態様によると、本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクタを提供する。一実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、２つの別個のキメラ抗原受容体をコードし、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む。更なる実施形態によると、ベクタは、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方をコードするＤＮＡ構築物を含む。一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、５’位から３’位の方へ配列番号２８、３０、２９、３１のＤＮＡ配列を含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は５’位から３’位の方へ配列番号３２と配列番号３３とを含む。一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号３２の配列と配列番号３３の配列との間に、配列番号２７のＤＮＡ配列を有する自己切断配列を含む。更に他の実施形態によると、本発明は、配列番号３４を含むＤＮＡ構築物を含むベクタを提供する。更なる実施形態によると、本発明は、配列番号３４からなるＤＮＡ構築物を含むベクタを提供する。
【０１０９】
本明細書で用いられる「ベクタ」と「発現ベクタ」は、互いに同様の意味を有し、ウイルスベクタ又は非ウイルスベクタを指す。例としては、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、人工染色体（細菌又は酵母）、ファージ、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状の形状を有するバイナリーベクタ、或いは、宿主細胞を形質転換でき、任意で宿主細胞を複製できる核酸配列が挙げられる。ベクタは細胞ゲノムに組み込まれてもよいし、染色体外に存在してもよい（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）。ベクタは、形質転換細胞の同定に適した任意のマーカ、例えば、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性のものを含んでもよい。クローニングベクタは、発現ベクタとして機能するために必要な機能を備えていてもよく、備えていなくともよい。
【０１１０】
他の実施形態によると、ベクタはウイルス、例えば組換えウイルス又は設計ウイルスである。ベクタの改変は、欠失又は挿入突然変異、遺伝子欠失又は遺伝子封入などの突然変異を含んでもよい。具体的には、突然変異は、ウイルスゲノムの１つ以上の領域で行われてもよい。上記の突然変異は、内部構造タンパク質、複製、又は逆転写機能に関連する領域に導入されてもよい。ベクタ改変の他の例としては、ウイルスの病原性及び／又はその複製能力に係わる遺伝子などの、天然の感染性ベクタを構成する特定の遺伝子の欠失が挙げられる。
【０１１１】
一実施形態によると、ベクタはウイルスベクタである。本明細書に開示される方法により、任意のウイルスを使用することができる。ウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス（例：アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、一本鎖プラス鎖ＤＮＡウイルス（例：パルボウイルス）、二本鎖ＲＮＡウイルス（例：レオウイルス）、一本鎖ＲＮＡウイルス（例：ピコマウイルス、トガウイルス）、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス（例：オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）、ＤＮＡ中間体を有する一本鎖ＲＮＡウイルス（例：レトロウイルス）、又は二本鎖逆転写ウイルス（例：ヘパドナウイルス）であってもよい。本発明における特定の例としては、ポリオウイルス（ＰＶ）、ライノウイルス、鳥インフルエンザを含むインフルエンザウイルス（例：インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１亜型）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、感染性気管支炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、デング熱ウイルス（フラビウイルス血清型）、ウェストナイル熱ウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、黄熱ウイルス、エボラ（エボラウイルス）、水痘（水痘帯状疱疹ウイルス）、はしか（パラミクソウイルス）、おたふく風邪（パラミクソウイルス）、狂犬病（リサウイルス）、ヒトパピローマウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型）、性器ヘルペス（ＨＳＶ２型）が挙げられる（但し、これらの限られる訳ではない）。一部の実施形態によると、ベクタは、レンチウイルス、アデノウイルス、改変アデノウイルス、レトロウイルスから選ばれたウイルスである。特定の実施形態では、ベクタはレンチウイルスである。上記の実施形態のうちいずれかによると、ウイルスは非病原性ウイルス、又は病原性遺伝子を欠く改変ウイルスである。
【０１１２】
他の態様によると、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物又はベクタを含む細胞を提供する。一部の実施形態によると、細胞は原核細胞又は真核細胞である。更なる実施形態によると、細胞は非ヒト又はヒト哺乳類細胞である。一部の実施形態によると、細胞はヒト細胞である。一部の具体的な実施形態によると、細胞はＴ細胞である。一実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞から選ばれる。
【０１１３】
他の態様によると、本発明は、本発明の複数のＴ細胞、並びに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
【０１１４】
上述の態様で言及された定義及び実施形態、特にＣＡＲ、それらの一部やドメイン、ＤＮＡ構築物、Ｔ細胞に関する定義及び実施形態は、全て援用され、含まれる。
【０１１５】
本明細書で用いられる「医薬組成物」とは、１つ以上の薬学的に許容される担体と共に製剤化された本発明のＴ細胞を含む組成物を指す。
【０１１６】
医薬組成物の製剤は、用途に応じて調整してもよい。具体的には、医薬組成物は、哺乳類に投与した後に活性成分が急速放出、連続放出又は遅延放出を起こすように、当技術分野で公知の方法を使用して製剤してもよい。例えば製剤は、膏薬、顆粒、ローション、リニメント、レモネード、芳香水、粉末、シロップ、眼軟膏、液体及び溶液、エアロゾル、抽出物、エリキシル、軟膏、流エキス、乳剤、懸濁液、煎じ薬、注入液、点眼液、錠剤、坐剤、注射、酒精剤、カプセル、クリーム、トローチ、チンキ剤、ペースト、丸薬、軟ゼラチンカプセル剤、硬ゼラチンカプセル剤から選ばれたいずれかでもよい。一実施形態によると、組成物は液体製剤として調剤される。更なる実施形態によると、組成物は注射液として調剤される。
【０１１７】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、溶剤、分散媒、防腐剤、抗酸化剤、糖衣錠、等張剤、吸収遅延剤、界面活性剤、充填剤、崩壊剤、結合剤、希釈剤、潤滑剤、流動促進剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、促進剤、湿潤剤、可溶化剤、界面活性剤、抗酸化剤などであって、医薬品の投与と互換性があるものを指す。医薬活性物質を補助するものとして使用される溶剤や薬剤は、当技術分野では周知のものである。組成物は、補足的な治療機能、追加的な治療機能、又は強化された治療機能を提供する他の活性化合物を含んでもよい。
【０１１８】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される」と「薬理学的に許容される」は、必要に応じて動物又はヒトに投与したときに、有害な反応、アレルギー反応、その他の望ましくない反応を引き起こさない分子体及び組成物を含む。ヒト投与の場合、製剤は、政府の医薬品規制機関、例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の生物製剤基準により求められる無菌性、発熱性、一般的な安全性、純度の基準を満たす必要がある。
【０１１９】
本発明の組成物は、任意の既知の方法により投与してもよい。本明細書において被験体に対する組成物の「投与」は、当業者に周知の様々な方法のうち１つを使用して行ってもよい。例えば、化合物又は薬剤は、静脈内投与、動脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与、舌下投与、経口投与（摂取）、鼻腔内投与（吸入）、脊髄内投与、脳内投与、経皮投与（吸収：例えば皮膚管を介する）により投薬することができる。化合物又は薬剤は更に、再充填型、又は生分解性ポリマーデバイスや他のデバイス、例えば、パッチ及びポンプ、或いは、化合物や薬剤の徐放放出又は制御放出を提供する製剤により適切に導入することもできる。投与は、例えば、１回、複数回、及び／又は長期間にわたって行うことができる。一部の実施形態では、投与には、自己投与を含む直接投与、薬物の処方を含む間接投与の両方が含まれる。例えば、本明細書において、患者に薬物の自己投与を指示する、薬物を別の人に投与するように指示する、及び／又は患者に薬物の処方箋を出す医師は、薬物を患者に投与していると言える。一実施形態によれば、医薬組成物は、非経口的に、つまりは経口ではない方法で投与される。一実施形態によれば、医薬組成物は全身投与により投薬される。更なる実施形態によると、医薬組成物は局所投与により投薬される。一実施形態によれば、医薬組成物は静脈内投与により投薬される。更なる実施形態によると、医薬組成物は筋肉内投与により投薬される。
【０１２０】
更なる実施形態によると、医薬組成物は、本発明のＤＮＡ構築物を含む複数のＴ細胞を含む。一実施形態によると、Ｔ細胞は、本発明の２つのＣＡＲをコードする１つの構築物を含む。更なる実施形態によると、Ｔ細胞は、それぞれ本発明の１つの別個のＣＡＲをコードする、２つの構築物を含む。
【０１２１】
一実施形態によると、医薬比較は、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する複数の遺伝子改変Ｔ細胞を含み、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、或いはそれらの組み合わせから選ばれる。従って、一実施形態では、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む医薬組成物であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、医薬組成物を提供する。更なる実施形態によると、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む医薬組成物であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含む、医薬組成物を提供する。一部の実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含む。更なる実施形態によると、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含み、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列を有する、或いはその類似体であり、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列を有する、或いはその類似体である。更なる実施形態によると、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む医薬組成物であって、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列からなり、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列からなる、医薬組成物を提供する。一部の実施形態によると、Ｔ細胞はＣＡＲを発現することができる。更なる実施形態によると、Ｔ細胞はＣＡＲを発現する。
【０１２２】
一実施形態によると、医薬組成物は、本発明のＤＮＡ構築物を含むＴ細胞を含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築は、５’位から３’位の方へ、（ｉ）リーダーペプチド、（ｉｉ）抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインＩ、（ｉｖ）共刺激ドメイン、活性化ドメイン、又はその両方、（ｖ）自己切断ペプチド、（ｖｉ）リーダーペプチド、（ｖｉｉ）抗ＣＤ３８ｓｃＦｖドメイン、（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメインＩＩ、（ｉｘ）活性化ドメインをエンコードする。一部の実施形態によると、５’位から３’位の方へ配列番号２８、３０、２９、３１のＤＮＡ配列を含む。他の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は５’位から３’位の方へ配列番号３２と配列番号３３とを含む。一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号３２の配列と配列番号３３の配列との間に、配列番号２７のＤＮＡ配列を有する自己切断配列を含む。更に他の実施形態によると、本発明は、配列番号３４を含むＤＮＡ構築物を含むベクタを提供する。更なる実施形態によると、本発明は、配列番号３４からなるＤＮＡ構築物を含むベクタを提供する。
【０１２３】
上記の実施形態のうちいずれかによると、医薬組成物は、癌の治療を用途とする。
【０１２４】
本明細書における症状又は患者の「治療」とは、臨床結果を含む、有益な結果、又は望ましい結果を得るための措置を講じることを指す。有益な結果、又は望ましい結果は、癌の進行の改善、抑止、実質的に阻害、遅延、又は逆転すること；疾病の臨床症状又は審美的症状を実質的に改善又は緩和すること；疾患や疾病の臨床症状又は審美的症状の出現を実質的に予防すること；有害又は不快な徴候から保護することを含む（但し、これらに限られる訳ではない）。更に治療は、（ａ）障害の重症度を軽減すること、（ｂ）治療を受けている障害固有の徴候の発症を抑えること、（ｃ）治療を受けている障害固有の徴候の悪化を抑えること、（ｄ）過去に障害があった患者における障害の再発を抑えること、（ｅ）過去に障害に対して無症候であった患者において徴候の再発を抑えること、のうち１つ以上を達成することを指す。
【０１２５】
一実施形態によると、癌は骨髄腫である。更なる実施形態によると、癌は多発性骨髄腫である。
【０１２６】
「骨髄腫」とは、骨髄の癌を指す。「多発性骨髄腫」とは、血漿白血球の癌を指す。
【０１２７】
従って、一部の実施形態では、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現する複数の遺伝子改変Ｔ細胞を含む医薬組成物であって、第１のＣＡＲは抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを含み、多発性骨髄腫の治療を用途とする医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、当該医薬組成物は、多発性骨髄腫の治療を用途とする。一実施形態では、Ｔ細胞は、２つの別個のＣＡＲを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含む。更なる実施形態によると、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号１８及び配列番号２２のアミノ酸を含み、第２のＣＡＲは配列番号１９及び配列番号２３のアミノ酸を含む。一実施形態によると、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列を有する、或いはその類似体であり、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列を有する、或いはその類似体である。更なる実施形態によると、本発明は、２つの別個のＣＡＲを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞であって、第１のＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列からなり、第２のＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列からなる、Ｔ細胞を提供する。上記の実施形態のうちいずれかによると、Ｔ細胞は２つのＣＡＲを発現する。
【０１２８】
上記の態様のうちいずれかによると、「治療」とは、生存率を少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、又は３倍増加させることを含む。更なる実施形態によると、治療は、従来の治療、又は１つのＣＡＲを発現するＴ細胞による治療と比べ、副作用を低減することを含む。
【０１２９】
一部の実施形態によると、当該医薬組成物を用いる治療は、有害事象の発生率が著しく低い。
【０１３０】
他の態様によると、本発明は、本発明のＴ細胞の有効量を投与することを含む、治療を必要とする被験体の癌を治療する方法を提供する。更なる実施形態によると、当該方法は、本発明のＴ細胞を含む医薬組成物を投与することを含む。一実施形態によると、癌は骨髄腫である。更なる実施形態によると、癌は多発性骨髄腫である。
【０１３１】
更に他の態様によると、本発明は、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞の、治療を必要とする被験体の癌を治療する医薬品を調製における用途を提供し、第１のＣＡＲはＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲはＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態によると、Ｔ細胞は本発明のＤＮＡ構築物を含む。更なる実施形態によると、Ｔ細胞は、ＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲと、ＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲとを、別々にコードする少なくとも２つのＤＮＡ構築物を含む。
【０１３２】
他の態様によると、本発明は、本発明のＴ細胞を調製する方法を提供する。一実施形態によると、本発明は、少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法であって、第１のＣＡＲはＣＤ１３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲはＣＤ３８に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、当該方法は、Ｔ細胞を、本発明のＤＮＡ構築物でトランスフェクトすることを含む。
【０１３３】
上述の態様で言及された定義及び実施形態、特にＣＡＲ、それらの一部やドメイン、ＤＮＡ構築物、Ｔ細胞に関する定義及び実施形態は、全て援用され、含まれる。
【０１３４】
本明細書で用いられる「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェト」は、互いに同様の意味を有し、核酸分子を細胞に導入するプロセスとして定義される。核酸は、非ウイルス系、又はウイルス系の方法を用いて細胞に導入される。核酸分子は、完全なタンパク質、又はその機能的部分をコードする遺伝子配列であってもよい。非ウイルス系トランスフェクション法には、核酸分子を細胞に導入するための送達システムとしてウイルスＤＮＡ又はウイルス粒子を使用しない、任意の適合なトランスフェクション法が含まれる。非ウイルス系トランスフェクション法の例としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショックによるトランスフェクション、マグネティフェクション、エレクトロポレーションが挙げられる。一部の実施形態では、核酸分子は、当技術分野で周知の標準手法に従い、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。ウイルス系トランスフェクション法としては、本明細書に記載の方法において、ウイルスベクタを、有用であれば種類を問わず使用することができる。ウイルスベクタの例としては、レトロウイルスベクタ、アデノウイルスベクタ、レンチウイルスベクタ、アデノ随伴ウイルスベクタが挙げられるが、これらに限られる訳ではない。一部の実施形態では、核酸分子は、当技術分野で周知の標準手法に従い、レトロウイルスベクタを使用して細胞に導入される。
【０１３５】
一実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。更なる実施形態によると、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１３６】
一実施形態によると、当該方法は、２つのＣＡＲをコードする少なくとも１つのＤＮＡ構築物でＴ細胞を形質導入することを含み、構築物は、５’位から３’位の方へ配列番号２８、３０、２９、３１のＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号３２又はその変異体を含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号３３又はその変異体を含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は５’位から３’位の方へ配列番号３２と配列番号３３とを含む。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は５’位から３’位の方へ配列番号３３と配列番号３２とを含む。
【０１３７】
一実施形態によると、２つのＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物は、配列番号３４を有する。更なる実施形態によると、ＤＮＡ構築物は、配列番号３４の変異体、例えば保存的変異体である。
【０１３８】
一実施形態によると、当該方法は、それぞれ本発明の１つ別個のＣＡＲをコードする２つのＤＮＡ構築物でＴ細胞を形質導入することを含み、第１のＤＮＡ構築物は配列番号３２に示されるＤＮＡ配列を含み、第２のＤＮＡ構築物は配列番号３３に示されるＤＮＡ配列を含む。一実施形態によると、第１のＤＮＡ構築物は、配列番号３２の変異体、例えば保存的変異体であるＤＮＡ配列を有する。一実施形態によると、第２のＤＮＡ構築物は、配列番号３３の変異体、例えば保存的変異体であるＤＮＡ配列を有する。更なる実施形態によると、Ｔ細胞は２つのＤＮＡ構築物を含み、第１のＤＮＡ構築物は配列番号３２の変異体であるＤＮＡを含み、第２のＤＮＡ構築物は配列番号３３の変異体であるＤＮＡ配列を含む。
【０１３９】
上記の実施形態のうちいずれかによると、形質導入は、レトロウイルスベクタ、アデノウイルスベクタ、レンチウイルスベクタ、アデノ随伴ウイルスベクタから選ばれたウイルスベクタを用いて行われる。
【０１４０】
一部の実施形態によると、ベクタは、形質転換細胞の同定に使用に適した任意のマーカを含んでもよい。
【０１４１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」、「包含する」は、互いに同様の意味を有し、「少なくとも一部を構成する」と解釈される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を含む本明細書の記述の解釈に当たり、当該用語が付いている構成要素以外の要素も含まれる可能性があることを留意されたい。「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」など、類似の用語も同様に解釈する。「有する」と「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」との意味を網羅してもよく、これらの用語で置き換えられてもよい。「からなる」は、具体的に説明又は記載されていない要素、ステップ、又は手順を除外する。「本質的に〜なる」は、組成物又は成分が追加成分を含む可能性があることを意味するが、追加成分が請求の範囲に記載された組成物又は方法の基本的且つ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【０１４２】
本発明の概要を説明したが、下記により詳細に説明する。説明の際に参照とする実施例は、単なる例示に過ぎず、本発明を限定する訳ではないことを留意されたい。
【実施例】
【０１４３】
（物質及び方法）
（細胞株及び培地）
細胞株（ＣＡＧ／ＣＡＧ−ルシフェラーゼ発現ヒト多発性骨髄腫細胞株、及びヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙクローン）と２ｍＭグルタミンとを補充したＲＰＭＩ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、イスラエル、ベイト・ヘメック）を用いて、５％ＣＯ２を含む加湿３７℃インキュベーターで培養した。２９３Ｔヒト胚細胞（ＡＴＣＣ）とＰＧ１３（Ｇａｇ−Ｐｏｌを発現し、ｐＣＬ−Ａｍｐｈｏウイルスエンベロープタンパク質に感染したマウス細胞株）を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭで培養した。細胞を、加湿したインキュベーターに入れ、３７℃、７．５％ＣＯ２でインキュベートした。ヒトリンパ球を、１０％ＦＣＳと５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ−１６４０で培養し、加湿したインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。全ての培地に、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｂｉｏ−Ｌａｂ社製、イスラエル、エルサレム）を含む混合抗生物質溶液を補充した。ＰＣＲを使用して、全ての細胞のマイコプラズマを確認した。細胞を継代数が少ないときに凍結し、解凍後の継代数を記録した。継代数が約１２となる４週間以下の期間、細胞を培養した。本研究で使用された初代培養細胞株は、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ社に注文し、ＬｏｎｚｏはＡｌｍｏｇ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｂｒｏｓ社に注文した。データシートに示されているように、初代細胞がそれぞれ増殖した。
【０１４４】
（抗体及び試薬）
精製抗ヒトＣＤ３は、ハイブリドーマＯＫＴ３から社内で調製した。精製抗ヒトＣＤ２８は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（バーミンガム、ＵＳＡ）から購入した。ヒトＩＬ−２はＮｏｖａｒｔｉｓ−Ｐｈａｒｍａ（イギリス）から購入した。組換えＨｉｓ又はヒトＦｃタグ付きＣＤ３８及びＣＤ１３８タンパク質はＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入した。抗Ｈｉｓ抗体はＡｂｅａｍから購入した。抗ヒトＦｃ（γ特異的）抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。抗ヒトＣＤ３ＡＰＣはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から入手した。抗ヒトＣＤ３８ＰＥ−ｃｙ７、抗ヒトＣＤ−１３８ＡＰＣ、抗ヒトＥｒｂＢ２ＦＩＴＣはｅＢｉｏｓｃｉｎｃｅ社から購入した。
【０１４５】
（実施例１）
次の実施例では、様々なキメラ抗原受容体で形質導入されたヒトＴ細胞を調製して試験を行った。本実施例の目的は、多発性骨髄腫の治療に臨床的に関連する２つの異なる抗原に特異的に結合する２つの異なるＣＡＲでＴ細胞を形質導入するときの効力を検証することである。当該目的のために、２つの臨床的に関連する抗原としてＣＤ３８とＣＤ１３８を選定し、これらの抗原に特異的に結合することを目的とした２つのＣＡＲを生成した。ＣＡＲの一方は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４の配列を有するＶＬ及びＶＨを有する抗ＣＤ１３８特異的モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖを含む。二番目のＣＡＲは、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６の配列を有するＶＬ及びＶＨを有する抗ＣＤ３８特異的モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖを含む。各ＣＡＲにおけるＶＬ及びＶＨは、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１７）を有するアミノ酸１４個分のリンカで連結した。
【０１４６】
本実験の試験対象は、抗ＣＤ１３８（αＣＤ１３８）ｓｃＦｖを有するＣＡＲと、抗ＣＤ３８（αＣＤ３８）ｓｃＦｖを有するＣＡＲとの２つで形質導入されたＴ細胞であった。「標的上・腫瘍外」毒性を低減するために、２つのＣＡＲ間で共刺激ドメインと活性化シグナリング要素とを分離した。２つのＣＡＲは、共刺激ドメイン（ＣＤ２８の膜貫通及び共刺激ドメインは、それぞれ、配列番号３５及び配列番号２２の配列を有する）のみを持つαＣＤ１３８ｓｃＦｖを有するＣＡＲと、活性化シグナリング要素（ＣＤ８の膜貫通ドメインとＦｃＲ−γドメインは、それぞれ、配列番号３６及び配列番号２６の配列を有する）のみを持つαＣＤ３８ｓｃＦｖを有するＣＡＲとを指す。２つのＣＡＲを、配列番号２６の配列を有する自己切断ペプチドＴ２Ａを挟んで、１つのＤＮＡ構築物に配置した。構築物の概略図を図１に示した。使用した構築物は配列番号２１の配列を有していた。構築物を二重ＣＡＲと称することにする。
【０１４７】
異なるＣＡＲを含む対照群Ｔ細胞を用意した。Ｓｗｉｔｃｈとは、臨床的に関連性のあるＣＡＲの１つ、つまり抗ＣＤ１３８ＣＡＲ又は抗ＣＤ３８ＣＡＲを抗ＥｒｂＢ２ＣＡＲに置き換えた２つのＣＡＲ（Ｎ２９と呼ばれる。ＥｒｂＢ２は多発性骨髄腫では発現されない）を含む対照群を指す。下記のクローンを改変Ｔ細胞の生成に用いた。
αＣＤｌ３８−ＣＤ２８−γ
αＣＤ３８−ＣＤ２８−γ
二重ＣＡＲ：αＣＤ１３８−ＣＤ２８−Ｔ２Ａ−αＣＤ３８−γ
Ｓｗｉｔｃｈ１（対照群１）：Ｎ２９−ＣＤ２８−Ｔ２Ａ−αＣＤ３８−γ
Ｓｗｉｔｃｈ２（対照群２）：αＣＤ１３８−ＣＤ２８−Ｔ２Ａ−Ｎ２９−γ
αＣＤ１３８は抗ＣＤ１３８ｓｃＦｖ、αＣＤ３８は抗ＣＤ３８ｓｃＦｖ、γはＦｃＲｙ活性化ドメイン（疫受容体チロシン系活性化モチーフ：ＩＴＡＭ）、ＣＤ２８はＣＤ２８の共刺激要素、Ｔ２Ａは自己切断ペプチド、Ｎ２９は抗ＥｒｂＢ２ｓｃＦｖをそれぞれ意味する。
【０１４８】
まず、パッケージング細胞に由来するウイルスを用いて、ＣＡＲによる形質導入を受けたＴ細胞の能力について試験を行った。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を４８時間活性化し、関連パッケージング細胞株の上清で形質導入を行った。形質導入から２日後、細胞をタンパク質発現を観測できるように染色し、ＦＡＣＳで分析を行った。
【０１４９】
（Ｔ細胞の形質導入）
人間の健常ドナーから得た末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ勾配（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ社、ノルウェー、オスロ）で遠心分離をかけて分離し、５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充した完全ＲＰＭＩ−１６４０  ４ｍＬで３×１０６細胞／ウェルで培養した。１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体とラット抗ヒトＣＤ２８抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社、ＵＳＡ）の両方をプレコートした非組織培養処理６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）で細胞を２日間刺激した。次に、活性化リンパ球を、ＰＢＳでよく洗浄して採取した。遠心分離により細胞をペレット化し、ウイルス上清に２〜３×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。次に、細胞（１．５ｍｌ）を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（１２μｇ／ｍｌ、４ｍｌ／ウェル、宝酒造株式会社、日本、大津）をプレコートした非組織培養処理６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）のウェルに加えた。３７℃、７．５％ＣＯ２で６時間インキュベーションした後、ウイルス上清をゆっくり除去し、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）を補充したリンパ球培地で置き換え、３７℃・５％ＣＯ２で一晩中インキュベートした。
【０１５０】
翌日、形質導入の手順を繰り返した。２回目の感染の翌日、プレートをＰＢＳでよく洗浄し、リンパ球を採取した。３５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を補充したリンパ球培地に細胞を再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１５１】
ＣＤ３８抗原及びＣＤ１３８抗原を発現するＣＡＧ細胞株による特異的刺激を受けた構築物で形質導入を行われたＴ細胞の能力につき、ＩＮＦ−γ検定ＣＡＧ細胞株を使用して試験を行った。結果を、ＩＦＮ−γの濃度として図２に示した。図２は、手順を４回繰り返し、代表的な結果のみを示したものである。形質導入されたＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌は、とりわけ、形質導入のレベルによって事前に定義されている。図２から視認できるように、異なるＣＡＲで形質導入されたＴ細胞はＩＦＮ−γ分泌を刺激した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の形質導入の比は回数ごとに異なるため、図２にて重要なポイントは、ＣＡＲが刺激され、二重ＣＡＲが著しい刺激を示したとのことである。
【０１５２】
（結果）
まず、異なる抗原を狙う異なるＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、対応抗原を発現する細胞に応答することが分かる。二重ＣＡＲ、つまりαＣＤ１３８−ＣＤ２８−αＣＤ３８−γで形質導入されたＴ細胞の、ＣＤ３８とＣＤ１３８の両方を発現するＣＡＧ細胞に選択的に応答する能力を比較した。ＣＤ３８のみを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を対照群として用いた。図２からわかるように、実験条件下で、Ｔ細胞におけるαＣＤ３８−γＣＡＲの存在は、共刺激とは無関係にＴ細胞に完全な活性化能力を十分与えた。これは、Ｎ２９−ＣＤ２８−Ｔ２Ａ−αＣＤ３８−γ（Ｓｗｉｔｃｈ１）、又はαＣＤ３８ＣＡＲを発現するＴ細胞が、ｊｕｒｋａｔ細胞とのインキュベーションで高いＩＦＮ−γ分泌を記録した結果から容易に結論を導き出せる。
【０１５３】
培地とのインキュベーションでαＣＤ３８ＣＡＲを発現するＴ細胞から見られる比較的高いシグナルは、ＣＤ３８抗原を自然に発現する形質導入Ｔ細胞とαＣＤ３８ＣＡＲの相互作用に基づいて説明できる。
【０１５４】
（実施例２）
実施例１と同様に実験を構成し、異なる細胞株とのインキュベーション時にＣＡＲ−Ｎ２９、Ｓｗｉｔｃｈ１、Ｓｗｔｉｃｈ２、又は二重ＣＡＲ（αＣＤｌ３８−ＣＤ２８−Ｔ２Ａ−αＣＤ３８）で形質導入されたＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を測定した。細胞株は、対照群細胞株（ＣＤ３８、ＥｒｂＢ２又はＣＤ１３８を発現しない）、ＣＡＧ、ＰＣ−３（ＣＤ３８の発現が低い前立腺癌細胞株）の２９３株で、標的細胞を含まないリンパ球の培養（培地のみ）も行った。結果を図３Ａに示した。
【０１５５】
この結果から、ＰＣ３細胞とのインキュベーションにおいて、Ｓｗｉｔｃｈ１と二重ＣＡＲの両方からＩＦＮ−γの分泌が少ないことが分かる。これは、二重ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞からある程度の反応を期待できるが、ＣＤ３８を強く発現する細胞の反応よりは実質的に低いためであると理解できる。但し、二重ＣＡＲの効果はＳｗｉｔｃｈ１の効果より遥かに高かった。Ｓｗｉｔｃｈ２が一切ＩＦＮ−γを分泌しなかったことを鑑みると、これは完全に予想外であった。追加の実験では、二重ＣＡＲの安全性を示すために、正常細胞に対する刺激を調べた。
【０１５６】
正常組織に対する単一ＣＡＲ、又は二重ＣＡＲの潜在毒性を更に分析し、生じ得る「標的上・腫瘍外」の効果を予測するために、正常な一次ヒト組織を用いて、様々なＣＡＲを刺激した。結果を図３Ｂに示す。図示されているように、ＣＤ３８／ＣＤ１３８−ＣＤ２８−γ又は二重ＣＡＲを備えた、人間の健常ドナーに由来する７つの異なる初代細胞を用いた。ＣＤ３８単一ＣＡＲは、二重ＣＡＲに比べ、幾つかの正常組織による強い刺激を示した。二重ＣＡＲは、ＣＤ３８単一ＣＡＲに比べ、試験対象の細胞に対して反応性が低下した。驚くことに、ＣＤ１３８ＣＡＲは、多くの組織型（タンパク質アトラス）で発現することが知られているにもかかわらず、分析された組織に対してＩＦＮ−γ分泌を示さなかった。
【０１５７】
ＩＦＮ−γ分泌とＣＡＲ−Ｔ細胞による標的細胞殺害との関係を示すべく、１：２（標的：エフェクタＣＡＲ）の比で、安定したルシフェラーゼ感染ＣＡＧ細胞を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を刺激し、インキュベーションを２０時間かけた後、生物発光イメージング（ＩＶＩＳ）により培養物を分析した。図４に、対照群と比較した二重ＣＡＲの特異的且つ効率的な殺害を示した。ＣＤ１３８−ＣＤ２８−γＣＡＲは、二重ＣＡＲ−Ｔ細胞と比べ、殺害の程度が低い。Ｓｗｉｔｃｈ１の対照群は、２つのシグナルを完全に活性化できず、シグナル１つのみを活性化した（ＣＡＧ細胞ではＣＤ３８のみが発現されるため）が、殺害能力は一貫して効率的であった。更に、ＣＤ３８フルＣＡＲも同様に殺害効果を示している。しかしながら、抗原認識の重複により、ＣＡＧ細胞株のクリアランスが観測され、ＩＦＮ−γの分泌もより優れたものとなった。
【０１５８】
（実施例３：二重ＣＡＲの生体内効力）
（物質及び方法）
免疫不全マウスのＮＯＤ  ｓｃｉｄ−ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）における多発性骨髄腫細胞株ＣＡＧに基づき、生体内ヒト多発性骨髄腫モデルを較正した。これらのマウスは成熟リンパ球を欠いており、複数のサイトカインシグナリング経路が不足しているため、様々なヒトの細胞や組織を生着できる。研究者らはまず、注入した多発性骨髄腫細胞の最適数、投与経路、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療の許容時間を得るためにレシピエントマウスに対して行った試験準備の影響を定めた（データは提示せず）。7日目に１０６個のＣＡＧ多発性骨髄腫細胞をＩＶ注射で投与し、続いて２００ＲＡＤで照射すると、腫瘍の効率的に発生し、望ましい腫瘍モデルが得られることを確認した。
【０１５９】
約１０６個のＣＡＧ多発性骨髄腫細胞をマウスに注射した（０日目）。７日目にマウスに２００  ＲＡＤを照射し（腫瘍の成長に影響を与えず）、８日目に様々なＣＡＲで形質導入した改変Ｔ細胞の約１０７個を静注した。
【０１６０】
異なるＣＡＲ−Ｔ細胞で治療したマウスの組織を２５日目に採取し、抗ＣＤ１３８染色を用いて組織学的に、且つＦＡＣＳを用いて分析を行った（データは提示せず）。組織学的結果を図５に示す。
【０１６１】
更に、二重ＣＡＲ、Ｓｗｉｔｃｈ１、Ｓｗｔｉｃｈ２、又は単一ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞の抗多発性骨髄腫活性を、治療対象ではないマウスの生存曲線と比較して評価した。結果を図６に示す。
【０１６２】
（結果）
図５によると、ＣＡＧ多発性骨髄腫細胞の注入後、試験を行った組織全て、つまり肝臓、肺、脾臓、骨から腫瘍病変が観測された。
【０１６３】
ＦＡＣＳによりＣＡＲを探索し、ＣＡＧの注入から２６日後、治療を受けたＮＳＧマウスの血液から見つけたリンパ球を記録した（データは提示せず）。その結果、治療用の二重ＣＡＲを構成する形質導入Ｔ細胞が血液中で少なくとも２６日間生存したことが明確に分かった。異なるＣＡＲで形質導入されたＴ細胞で治療を受けたマウスの生存曲線を示す図６からも分かるように、二重ＣＡＲ又はαＣＤ３８ＣＡＲで治療を受けたものを除いて、実験群のマウスは全て、対照群の未治療群で見られるように移植片対宿主病による体重減少や腫瘍のため、ＣＡＧ多発性骨髄腫細胞の注入から約４０〜４５日後に死亡した。αＣＤ３８ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は有意な治療効果を示したが、最終的にはマウスの２０％のみが８５日後まで生存した。二重ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療を受けたマウスは、ＣＤ３８ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療を受けたマウスと比較して、９５日以上生存したもの６０％に達し、有意に優れた生存率を示した。組織学分析やＦＡＣＳ分析のため、９５日目にマウスを安楽死させた。安楽死させたもののうち、腫瘍により死亡したものはなかった。
【０１６４】
Ｈ＆Ｅ染色を用いた組織学検査から確認しているように、実験終了の時点で、ＣＡＲで治療を受けた生存マウス２匹からは腫瘍をみつけることができなかった。生存したＳｗｔｉｃｈ１マウスに、肝臓、肺、骨に腫瘍があった（図７）。
【０１６５】
（実施例４：二重ＣＡＲの生体内効力）
実施例３と同様の条件で行われた本実験では、ＣＡＧ腫瘍／腫瘍体積のモニタリングを容易にすべく、イメージングの前にマウスに注入されるルシフェリンに遭遇すると生物発光を放出するＣＡＧ−ＬＵＣ細胞株を使用した。それにより、各マウスの腫瘍強度を比較し、各群における治療の効力を追跡した。結果を図８に示した。
【０１６６】
図８に図示されているように、αＣＤ３８又は二重ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療を受けた全てのマウス、Ｓｗｉｔｃｈ１（ＳＷ１）で治療を受けたほとんどのマウスには、１３日目まで腫瘍ができなかった。反対に、Ｓｗｔｉｃｈ２（ＳＷ２）、ＣＤ１３８、Ｎ２９ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療を受けたマウスは、１３日目には既に腫瘍を発症した。ＳＷ１とαＣＤ３８ＣＡＲで治療を受けたマウスとは違って、二重ＣＡＲで治療を受けたマウスは４８日目まで癌を発症せず、６０％が６２日目まで癌を発症しなかった。他の群のマウスはほとんどが腫瘍負荷や体重減少により５５日目まで生存できなかった。二重ＣＡＲ−Ｔ細胞による治療が他の治療よりも遥かに効率的であることは明らかである。
【０１６７】
また、Ｓｗｔｉｃｈ２、αＣＤ１３８又はＮ２９ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた治療は、腫瘍の急速な進行を特徴とする同様の結果が得られた。Ｓｗｉｔｃｈ１による治療は、平均して、αＣＤ３８による治療より効率が劣る。つまり、共刺激ドメインと活性化ドメインを分離することにより、改変Ｔ細胞の活性化の効力に影響を及ぼし、「標的外」効果を改善する可能性を示唆している。
【０１６８】
マウスの病状も追跡した。図９からわかるように、ＣＡＲ１３８を投与したマウスは、皮膚に発現するＣＤ１３８マウスとヒト抗原との交差反応性として、皮膚刺激を示した。当該副作用は、マウスを二重ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した場合には見出せなかった。この事象は、二重ＣＡＲを保有するＴ細胞が１つの抗原、つまりＣＤ１３８（皮膚細胞にはＣＤ３８抗原がない）の存在下では完全に活性化していなかったので、副作用が少なくなったということを立証できる証拠となる。
【０１６９】
本発明を好ましい実施形態を参照として以上のように説明したが、下記の請求の範囲で定義された本発明の趣旨や性質から逸脱することなく、更に変更することもできる。
【図１】
2021517820.tif 000002
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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