(57)【要約】【課題】QAを合成するための新規システムが当該技術分野に貢献をもたらす。【解決手段】  本発明は概して、宿主において異種ヌクレオチド配列を発現させることによって宿主においてキラ酸を生合成するための材料及び方法であって、その異種ヌクレオチド配列の各々はQA生合成活性を組み合わせて有するポリペプチドをコードする材料及び方法に関する。例示的なポリペプチドは(i)ベータ−アミリンシンターゼ、(ii)C-28位においてベータ−アミリン又はその酸化誘導体をカルボン酸に酸化することができる酵素、(iii)C-16α位においてベータ−アミリン又はその酸化誘導体をアルコールに酸化することができる酵素、及び(iv)C-23位においてベータ−アミリン又はその酸化誘導体をアルデヒドに酸化することができる酵素を含む。好ましいヌクレオチド配列はQ.サポナリアから得られるか又はそれに由来する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主を、前記宿主が２，３−オキシドスクアレン（ＯＳ）からのキラ酸（ＱＡ）生合成を実行できない表現型から、前記宿主が前記ＱＡ生合成を実行できる表現型に変換する方法であって、
前記宿主又はその１つ又は複数の細胞内で異種核酸を発現させる工程であって、前記核酸を前記宿主又はいずれかの祖先に導入する前工程の後の工程を含み、
前記異種核酸が、各々が前記ＱＡ生合成活性を組み合わせて有するポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項２】
前記核酸が、以下のポリペプチド
（ｉ）トリテルペンへのＯＳの環化のためのβ−アミリンシンターゼ（ｂＡＳ）、
（ｉｉ）Ｃ−２８位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をカルボン酸に酸化することができる酵素（「Ｃ−２８オキシダーゼ」）、
（ｉｉｉ）Ｃ−１６α位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をアルコールに酸化することができる酵素（「Ｃ−１６αオキシダーゼ」）、及び
（ｉｖ）Ｃ−２３位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をアルデヒドに酸化することができる酵素（「Ｃ−２３オキシダーゼ」）
の全てをコードし、
前記ポリペプチドの各々が任意選択によりＱ．サポナリアから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃ−２８オキシダーゼ、Ｃ−１６αオキシダーゼ及びＣ−２３オキシダーゼが、全てＣＹＰ４５０酵素である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記Ｃ−２８オキシダーゼがＣＹＰ７１６であり、
（ｉｉ）前記Ｃ−１６αオキシダーゼが、ＣＹＰ７１６又はＣＹＰ８７であり、
（ｉｉｉ）前記Ｃ−２３オキシダーゼが、ＣＹＰ７１４、ＣＹＰ７２又はＣＹＰ９４である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｂＡＳ、Ｃ−２８オキシダーゼ、Ｃ−１６αオキシダーゼ及びＣ−２３オキシダーゼポリペプチドが、表１又は２におけるそれぞれのポリペプチド、又は任意選択により表４に規定されている、前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片から選択されるか、或いは表１又は２におけるそれぞれのポリヌクレオチド、又は任意選択により表４に規定されている、前記ポリヌクレオチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片によってコードされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号２に示されるβ−アミリンシンターゼ（ｂＡＳ）、
（ｉｉ）配列番号４若しくは１８に示されるか、又は配列番号１９〜２８のいずれかによってコードされるＣ−２８オキシダーゼ、
（ｉｉｉ）配列番号６、１０若しくは１２に示されるＣ−１６αオキシダーゼ、
（ｉｖ）配列番号８、１４若しくは１６に示されるＣ−２３オキシダーゼ
又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片
からなるリストから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号２に示されるβ−アミリンシンターゼ（ｂＡＳ）、
（ｉｉ）配列番号４に示されるＣ−２８オキシダーゼ、
（ｉｉｉ）配列番号６に示されるＣ−１６αオキシダーゼ、
（ｉｖ）配列番号８に示されるＣ−２３オキシダーゼ
又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片
からなるリストから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、以下のポリペプチド：
（ｉ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、
（ｉｉ）スクアレンシンターゼ（ＳＱＳ）、
のうちの１つ又は複数をさらにコードし、
前記ＨＭＧＲ又はＳＱＳは、任意選択により表３におけるそれぞれのポリペプチド又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片から選択されるか、或いは表３におけるそれぞれのポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片によってコードされる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が、２つ又はそれ以上の異なる核酸分子に存在する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸分子が、各々が前記核酸分子の１つ又は複数を保有する複数のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の共インフィルトレーションによって導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子が一過性発現ベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記一過性発現ベクターの各々が、
（ｉ）プロモーターであって、以下と作動可能に連結されている、プロモーター、
（ｉｉ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける標的開始部位が突然変異されている、二分ＲＮＡウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列、
（ｉｉｉ）前記ＱＡ生合成活性を組み合わせて有する前記ポリペプチドのうちの１つをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）転写終結配列、及び任意選択により
（ｖ）前記転写終結配列の上流に位置する３’ＵＴＲ
を含む発現カセットを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
異種核酸を含有するか又は前記異種核酸で形質転換された宿主細胞であって、前記異種核酸が、各々がＱＡ生合成活性を組み合わせて有するポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含み、
前記核酸の発現が、前記形質転換された宿主にＱＡ生合成を実行する能力を付与する、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記核酸を含む複数の組換え構築物を、それを一過性発現するための細胞に共インフィルトレーションさせることによって請求項１３又は１４に記載の宿主細胞を産生するプロセス。
【請求項１６】
ベクターを介して前記核酸を細胞に導入し、前記核酸をゲノムに導入するために前記ベクターと前記細胞ゲノムとの間で組換えを引き起こすか、又は可能にすることによって前記細胞を異種核酸で形質転換することによって請求項１３又は１４に記載の宿主細胞を産生するプロセス。
【請求項１７】
トランスジェニック植物を産生する方法であって、
（ａ）請求項１６に記載のプロセスを実施する工程であって、前記宿主細胞が植物細胞である、工程、
（ｂ）形質転換された植物細胞から植物を再生する工程
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法によって得ることができるトランスジェニック植物、又は前記トランスジェニック植物のクローン、又は自家若しくは雑種後代、又は他の子孫であるトランスジェニック植物であって、
前記異種核酸の発現が、それ以外の点で前記トランスジェニック植物に対応する野生型植物と比較して、ＱＡ生合成を実行する増加した能力を付与する、トランスジェニック植物。
【請求項１９】
作物又は蘚類である、請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
微生物である、請求項１３又は１４に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
酵母である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
各々が植物シトクロムＰ４５０レダクターゼ（CPR）であるポリペプチドをコードする１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む異種核酸をさらに含有するか、又は前記異種核酸で形質転換されている、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記ＣＰＲが、配列番号３５に示されるか、又は前記ポリペプチドの実質的に相同なバリアント若しくは断片である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
細胞懸濁培養物に存在する、請求項１３、１４又は２０から２３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
異種宿主においてＱＡ又はその誘導体である産生物を産生する方法であって、請求項１３、１４又は２０から２４のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、それから産生物を精製することを含む、方法。
【請求項２６】
異種宿主においてＱＡ又はその誘導体である産生物を産生する方法であって、請求項１８又は１９に記載の植物を成長させ、次いで前記植物を採取し、それから産生物を精製することを含む、方法。
【請求項２７】
アジュバントとしての、又はアジュバントの調製における、請求項２５又は２６に記載の方法によって得られるＱＡ又はその誘導体の使用。
【請求項２８】
Ｑ．サポナリア由来のＱＡヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、前記ＱＡヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号２、４、６又は８の全て又は一部をコードするか、
（ｉｉ）配列番号２、４、６又は８と少なくとも約６０％の同一性を共有するそれらの配列番号のいずれかの相同性バリアントであるバリアント配列をコードするか、及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号１、３、５若しくは７又はそれらのゲノム等価物から選択される、核酸分子。
【請求項２９】
前記ＱＡヌクレオチド配列が、１つ又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換によって、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列の誘導体をコードする、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
請求項２８又は２９に記載の核酸によってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２８に記載の核酸を修飾する工程を含む、請求項３０に記載の核酸を産生するプロセス。
【請求項３２】
請求項２８又は２９に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項３３】
前記核酸が、宿主細胞における転写のためのプロモーターと作動可能に連結され、前記プロモーターが任意選択により誘導性プロモーターである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
植物ベクター又は微生物ベクターである、請求項３２又は３３に記載のベクター。
【請求項３５】
（ｉ）プロモーターであって、以下と作動可能に連結されている、プロモーター、
（ｉｉ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける標的開始部位が突然変異されている、二分ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列、
（ｉｉｉ）ＱＡヌクレオチド配列、
（ｉｖ）転写終結配列、及び任意選択により
（ｖ）前記転写終結配列の上流に位置する３’ＵＴＲ
を含む発現カセットを含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含む、方法。
【請求項３７】
請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクターを含有するか、又は前記ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３８】
微生物であり、任意選択により酵母細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
その染色体内に請求項２８又は２９に記載の異種核酸を有する、植物細胞である宿主細胞。
【請求項４０】
請求項３２から３４のいずれか１項に記載のベクターを宿主細胞に導入する工程、及び前記宿主細胞を形質転換するように前記ベクターと前記宿主細胞ゲノムとの間で組換えを引き起こすか、又は可能にする工程を含む、方法。
【請求項４１】
トランスジェニック植物を産生する方法であって、
（ａ）請求項４０に記載の方法を実施する工程であって、前記宿主細胞が植物細胞である、工程、
（ｂ）形質転換された植物細胞から植物を再生する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法によって得ることができるトランスジェニック植物、又は前記トランスジェニック植物のクローン、又は自家若しくは雑種後代、又は他の子孫であるトランスジェニック植物であって、各々の場合、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の異種核酸を含む、トランスジェニック植物。
【請求項４３】
請求項８４に記載の植物又は請求項８０から８２のいずれか１項に記載の宿主細胞であって、
（ｉ）配列番号２に示されるβ−アミリンシンターゼ（bAS）、
（ｉｉ）配列番号４に示されるＣ−２８オキシダーゼ、
（ｉｉｉ）配列番号６に示されるＣ−１６αオキシダーゼ、
（ｉｖ）配列番号８に示されるＣ−２３オキシダーゼ
又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同なバリアント若しくは断片
の全てを含む異種核酸を含む。
【請求項４４】
細胞においてＱＡ生合成に影響又は作用を与える方法であって、前記細胞内で請求項３２から３４のいずれか１項に記載の異種核酸の発現を引き起こすか、又は可能にする工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、宿主細胞におけるキラ酸産生又は加水分解を操作又は修飾する際に有用性を有する遺伝子及びポリペプチドに関する。本発明はさらに、これを利用するシステム、方法及び産生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、メバロン酸（MVA）経路の主要産生物である、ステロール及びトリテルペノイドなどの多種多様な環状トリテルペンを産生する。
【０００３】
ＱＳ−２１は、チリの木であるキラヤ・サポナリア（Quillaja サポナリア）（マメ目）によって合成された複合トリテルペノイドサポニンである。
【０００４】
コアＱＳ−２１トリテルペン骨格はキラ酸（「QA」）であり、この足場は、Ｃ−３位に存在する分枝三糖及びＣ−２８位における直鎖四糖により修飾されている。Ｃ−２８直鎖四糖はまた、複合アラビノシル化アシル鎖を特徴とする（図１）。
【０００５】
ＱＳ−２１は、免疫刺激アジュバントとしての有用性を有する。しかしながら、ＱＳ−２１の生物学的供給源は限られており、その構造の複雑性及びＱＡの複雑性に起因して、化学合成は困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、とりわけＱＳ−２１の調製において有用性を有する、ＱＡを合成するための新規システムが当該技術分野に貢献をもたらすことが、理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＱＳ−２１のコアアグリコン（キラ酸）は、単純なトリテルペンである、β−アミリンの誘導体であり、そしてβ−アミリンはオキシドスクアレンシクラーゼ（OSC）による普遍的直鎖前駆体２，３−オキシドスクアレン（OS）の環化によって合成される（図２）。
【０００８】
β−アミリン足場はさらに、Ｃ−１６α、Ｃ−２３及びＣ−２８位においてそれぞれアルコール、アルデヒド及びカルボン酸により酸化されてキラ酸を形成する。このために提案された直鎖生合成経路を図２に示すが、これらの酸化反応は異なる中間体を介して異なる順序で起こり得ることが理解される（図１１参照）。
【０００９】
したがって、ＯＳからのＱＡ生合成は少なくとも４つの異なる酵素段階を含む。関与する酵素は以下を含む：
・  オキシドスクアレンシクラーゼ、
・  Ｃ−２８位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をカルボン酸に酸化することができる酵素、
・  Ｃ−１６α位においてβ−アミリン又はオレアノール酸などのその酸化誘導体をアルコールに酸化することができる酵素、
・  Ｃ−２３位においてβ−アミリン又はエキノシスト酸などのその酸化誘導体をアルデヒドに酸化することができる酵素。
【００１０】
これらの酵素による連続酸化から生じるβ−アミリンの酸化誘導体を図１１に示し、以下の表にまとめる：
【００１１】
【表１】
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【００１２】
例として、図２の例示的なスキームを使用すると、これらの酵素はそれぞれ以下であってもよい：
・  β−アミリンシンターゼ、
・  β−アミリンをオレアノール酸に酸化することができる酵素、
・  オレアノールをエキノシスト酸に酸化することができる酵素、
・  エキノシスト酸をＱＡに酸化することができる酵素。
【００１３】
本発明者らは、そうでなければＱＡ生産者ではない異種生物内でＱＡ生合成経路全体を操作することに成功した。具体的には、本発明者らは、ベンサミアナタバコ（N.benthamiana）に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株を共インフィルトレーション（co-infiltration）することによって本発明を実証した。これは、生合成遺伝子の共発現によって達成されたキラ酸の異種産生の最初の記載であり、当該技術分野に対する大きな貢献を表す。
【００１４】
より具体的には、本発明者らは、最低でも４つの付加遺伝子がＱＡ生合成に十分であることを実証した（bAS及び3つのCYP450）。これらは有利には任意選択のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼと組み合わせると産生物レベルを増加させた。
【００１５】
さらに、当該技術分野に対するさらなる貢献において、本発明者らは、ＱＡ生合成に作用するポリペプチドをコードするキラヤ・サポナリアにおける遺伝子を同定した。
【００１６】
本明細書に記載される方法及び材料は、とりわけ、野生型宿主によって天然に産生されないとしても、ＱＡを産生することができる組換え宿主生物（例えば植物又は微生物）を産生するために使用することができる。
【００１７】
本発明によるキラ酸のデノボ操作は、例えば、ＱＳ−２１のさらなる化学合成のために後で使用することができる、多量のＱＡを含有する植物又は微生物を産生することができる［１８］。
【００１８】
したがって、本発明の一態様では、宿主を、宿主がＯＳからのＱＡ生合成を実行できない表現型から、宿主が前記ＱＡ生合成を実行できる表現型に変換する方法であって、
宿主又はその１つ又は複数の細胞内で異種核酸を発現させる工程であって、核酸を宿主又はいずれかの祖先に導入する前工程の後の工程を含み、
その異種核酸は、各々が前記ＱＡ生合成活性を組み合わせて有するポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含む、方法が提供される。
【００１９】
好ましくは、核酸は以下の酵素：
・  トリテルペンへの普遍的な直鎖前駆体２，３−オキシドスクアレン（OS）の環化のためのβ−アミリンシンターゼ（bAS）、
・  Ｃ−２８位においてβ−アミリン又はその酸化誘導体をカルボン酸に酸化することができるＣＹＰ４５０、Ｃ−１６α位においてβ−アミリン又はオレアノール酸などのその酸化誘導体をアルコールに酸化することができるＣＹＰ４５０、
・  Ｃ−２３位においてβ−アミリン又はエキノシスト酸などのその酸化誘導体をアルデヒドに酸化することができるＣＹＰ４５０
のうちのいくつか又は全て（１つ、２つ、３つ又は４つ）をコードする。
【００２０】
ある特定の実施形態では、これらのＣＹＰ４５０酵素は、
・  Ｃ−２８位においてβ−アミリンを、オレアノール酸を形成するカルボン酸に酸化することができるＣＹＰ４５０、
・  Ｃ−１６α位においてオレアノール酸を、エキノシスト酸を形成するアルコールに酸化することができるＣＹＰ４５０、
・  Ｃ−２３位においてエキノシスト酸を、ＱＡを形成するアルデヒドに酸化することができるＣＹＰ４５０
であってもよい。
【００２１】
他の可能性がある中間体は、本明細書の開示及び特に図１１に照らして当業者によって理解される。
【００２２】
簡潔さのために、これらの酵素は、本明細書において、それぞれ「ｂＡＳ」、「Ｃ−２８オキシダーゼ」、「Ｃ−１６αオキシダーゼ」及び「Ｃ−２３オキシダーゼ」と称することがある。
【００２３】
さらなる簡潔さのために、これらの酵素は、本明細書においてまとめて「ＱＡポリペプチド」と称することがある。
【００２４】
一実施形態では、ＱＡポリペプチドのうちの少なくとも１つは、Ｑ．サポナリア（Q.サポナリア）が起源である（に由来する）。好ましくは、ＱＡポリペプチドのうちの２つ、３つ又は４つ全ては、Ｑ．サポナリアが起源である。
【００２５】
一実施形態では：
Ｃ−２８オキシダーゼは、ＣＹＰ７１６である
【００２６】
Ｃ−１６αは、ＣＹＰ７１６又はＣＹＰ８７である
【００２７】
Ｃ−２３オキシダーゼは、ＣＹＰ７１４、ＣＹＰ７２又はＣＹＰ９４である
【００２８】
本発明の実施に使用するための好ましい遺伝子又はポリペプチドは配列付録に示される。
【００２９】
好ましい実施形態では、それぞれのポリペプチドのうちの１つ、２つ、３つ又は４つは、例えば以下のように表１に記載されるＱ．サポナリア配列から選択される：
β−アミリンシンターゼ（bAS）＝配列番号２
Ｃ−２８オキシダーゼ＝配列番号４
Ｃ−１６αオキシダーゼ＝配列番号６
Ｃ−２３オキシダーゼ＝配列番号８
又は以下に説明されるようなこれらのバリアント若しくは断片。
【００３０】
他の実施形態では、それぞれのポリペプチドのうちの１つ、２つ又は３つは、例えば以下のように表２ａ、２ｂ又は２ｃに記載される非Ｑ．サポナリア配列から選択される：
Ｃ−２８オキシダーゼ＝配列番号１８
Ｃ−１６αオキシダーゼ＝配列番号１０若しくは１２
Ｃ−２３オキシダーゼ＝配列番号１４若しくは１６
又は以下に説明されるようなこれらのバリアント若しくは断片。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ＱＡポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは１７のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列、又は以下に説明されるようなこれらのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【００３２】
他の実施形態では、Ｃ−２８オキシダーゼは、配列番号１９〜２８：（VvCYP716A15、VvCYP716A17、PgCYP716A52v2、MlCYP716A75、CqCYP716A78、CqCYP716A79、BvCYP716A80、BvCYP716A81、MdCYP716A175又はCrCYP716AL1）として表２ｄに記載される非Ｑ．サポナリア受託のうちの１つによってコードされるポリペプチド又は以下に説明されるようなこれらのバリアント若しくは断片である。これらのヌクレオチド配列はそれぞれ本明細書において配列番号１９〜２８と称される。
【００３３】
簡潔さのために、表１及び２のいずれかのヌクレオチド配列は本明細書において「ＱＡ遺伝子」と称することある。
【００３４】
バリアント
これらのＱＡ遺伝子（及びポリペプチド）の使用に加えて、本発明はこれらの遺伝子（及びポリペプチド）のバリアントの使用を包含する。
【００３５】
「バリアント」ＱＡ核酸又はＱＡポリペプチド分子は、本明細書に説明されるＱＡ遺伝子又はポリペプチドの全て又は一部と相同性を共有するか、又はそれらと同一である。
【００３６】
バリアントポリペプチドは天然ＱＡポリペプチドの関連する生物活性を共有する。バリアント核酸は関連するバリアントポリペプチドをコードする。
【００３７】
この文脈において、ＱＡポリペプチドの「生物活性」は図２に示され、上記されているそれぞれの反応を触媒する能力である（すなわち、シクラーゼ又はオキシダーゼ活性）。関連する生物活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで図２に示される反応（又は例えば図１１のような対応する酸化反応）に基づいてアッセイすることができる。或いはそれらは、実施例に記載されるようにｉｎ  ｖｉｖｏでの活性によって、すなわちＱＡを生成するための複数の異種構築物の導入によってアッセイすることができ、ＱＡはＬＣ−ＭＳなどによってアッセイすることができる。
【００３８】
表８は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（https://www.ebi.ac.ukを介してアクセスしたバージョン1.2.4）を使用して得られた、本明細書に記載されるＰ４５０酵素の一対比較を示す。
【００３９】
本明細書に開示されている配列のバリアントは、好ましくは少なくとも５０％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、又は７０％、又は８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を共有する。このようなバリアントは、本明細書において「実質的に相同」と称することがある。
【００４０】
好ましいバリアントは以下であり得る：
（ｉ）天然に存在する核酸、例えば対立遺伝子（１つ又は複数の塩基において多型又は突然変異を含む）又は偽対立遺伝子（本発明のＱＡ遺伝子と密接した遺伝子座において生じ得る）。また、本発明のＱＡ遺伝子と同じファミリーに属するパラログ、イソ遺伝子、又は他の相同遺伝子も含まれる。また、他の植物種由来のオルソログ又はホモログも含まれる。
【００４１】
表４は、１ＫＰデータセットにおいて見出された遺伝子配列と、本開示におけるＱ．サポナリア植物からＰＣＲによって得られた配列決定クローンとの間で同定されたわずかな配列の相違を示す。これは、約１５００ｂｐのＯＱＨＺ−２０１２０９０でも、１９個の変異（１％超の変異）が同定されたことを実証する。具体的には、それぞれの配列における表４に記載される変異の１つ又は複数を含むＱＡ遺伝子又はポリペプチドの使用が本開示によって想定される。さらに、本発明のＱＡ遺伝子のホモログであるアミノ酸配列をコードする核酸分子が本発明の範囲内に含まれる。相同性は、以下に説明されるように、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列レベルであり得る。
【００４２】
（ｉｉ）本開示に照らして当業者によって調製することができる、人工核酸。このような誘導体は、例えば、部位特異的若しくはランダム突然変異誘発によって、又は直接合成によって調製することができる。好ましくは、バリアント核酸は、本発明のＱＡ遺伝子の配列の全て又は一部を有する元の核酸から直接的又は間接的のいずれかによって（例えば、１つ又は複数の増幅又は複製工程を介して）生成される。
【００４３】
また、上記の核酸に対応するが、３’又は５’末端において伸長された核酸も含まれる。
【００４４】
本明細書に使用されている場合、「ＱＡバリアント核酸」という用語は、これらの可能性の全てを包含する。ポリペプチド又はタンパク質の文脈において使用されている場合、それはバリアント核酸のコードされた発現産物を示す。
【００４５】
各々の場合において、好ましいＱＡ生合成修飾核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７のいずれか、又はこれらの実質的に相同なバリアントである。
【００４６】
好ましいＱＡ生合成修飾ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれか、又はこれらの実質的に相同なバリアントである。
【００４７】
本発明に使用するための他の好ましいＱＡ生合成修飾核酸は、配列番号１９〜２８のいずれか、又はこれらの実質的に相同なバリアント若しくは断片である。他の好ましいＱＡ生合成修飾ポリペプチドは、これらの配列又はバリアント若しくは断片のいずれかによってコードされるポリペプチドである。
【００４８】
補足遺伝子
本発明の実施形態では、本明細書に記載される本発明のＱＡ遺伝子及びバリアント核酸に加えて、ＱＡ産生のフラックスに作用し得る付加遺伝子を導入することが好ましいことがある。
【００４９】
例えば、ＭＶＡはトリテルペノイド合成における重要な中間体である。したがって、ＱＡの収率を最大にするために、宿主内での律速ＭＶＡ経路遺伝子の発現が望ましいことがある。
【００５０】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（HMGR）は、ＭＶＡ経路における律速酵素であると考えられている。
【００５１】
ＨＭＧＲ（tHMGR）の組換えフィードバック非感受性短縮型の使用は、ベンサミアナタバコにおける一過性発現に際してトリテルペン（β−アミリン）含量を増加させることが実証されている［５］、同様に図１０。
【００５２】
したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載されるＱＡ遺伝子と共に異種ＨＭＧＲ（例えば、フィードバック非感受性HMGR）の使用を含む。ＨＭＧＲコード又はポリペプチド配列の例には、配列番号２９〜３２、又はこれらのバリアント若しくは断片が含まれる。バリアントは、上記されているＱＡ遺伝子又はポリペプチドに関連して説明されるように、ホモログ、対立遺伝子、又は人工誘導体などであってもよい。例えば、利用される宿主に固有のＨＭＧＲ、例えば、酵母宿主中の酵母ＨＭＧＲなどが好ましいことがある。ＨＭＧＲ遺伝子は当該技術分野において公知であり、本開示に照らして適切に選択することができる。
【００５３】
また、スクアレンシンターゼ（SQS;図１０参照）が潜在的な律速段階であることも報告されている［５］。
【００５４】
したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載されるＱＡ遺伝子及び任意選択によりＨＭＧＲと共に異種ＳＱＳの使用を含む。
【００５５】
ＳＱＳコード又はポリペプチド配列の例には、配列番号３３〜３４又はそれらのバリアント若しくは断片が含まれる。バリアントは、上記されているＱＡ遺伝子又はポリペプチドに関連して説明されるように、ホモログ、対立遺伝子又は人工誘導体などであってもよい。例えば、利用される宿主に固有のＳＱＳ、例えば酵母宿主中の酵母ＳＱＳなどが好ましいことがある。ＳＱＳ遺伝子は当該技術分野において公知であり、必要に応じて本開示に照らして適切に選択することができる。
【００５６】
ある特定の宿主（例えば、酵母）を使用する場合、ＱＡ産生のフラックスを改善するために付加遺伝子を導入することが望ましいことがある。例には、導入されたＰ４５０に対するレドックスパートナーとして役立つ１つ又は複数の植物シトクロムＰ４５０レダクターゼ（CPR）が含まれ得る。したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載されるＱＡ遺伝子と共に、ＡｔＡＴＲ２（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）シトクロムP450レダクターゼ2）などの異種シトクロムＰ４５０レダクターゼの使用を含む。ＨＡｔＡＴＲ２コード又はポリペプチド配列の例には、配列番号３５〜３６又はこれらのバリアント若しくは断片が含まれる。バリアントは、上記されているＱＡ遺伝子又はポリペプチドに関連して説明されるように、ホモログ、対立遺伝子又は人工誘導体などであってもよい。
【００５７】
付加遺伝子が、さらなる活性を提供し、及び／又は発現若しくは活性を改善するために本発明の実施に利用され得ることは、本開示に照らして当業者によって理解される。これらには、補因子若しくはヘルパータンパク質、又は他の因子を発現するものが含まれる。例には、ＱＡからのＱＳ−２１の合成に関与する遺伝子が含まれ得る。
【００５８】
簡潔さのために、これらの核酸配列（「本発明のQA遺伝子」及び「QAバリアント核酸」、さらにQA合成をもたらす他の遺伝子、又はQAに対する二次修飾）のいずれも、本明細書において「ＱＡ核酸」又は「ＱＡ生合成修飾核酸」と称することがある。同様に、コードされたポリペプチドは、本明細書において「ＱＡポリペプチド」又は「ＱＡ生合成修飾ポリペプチド」と称することがある。
【００５９】
これらの総称がいずれかの態様又は実施形態に関して使用される場合、その意味は、これらの配列のいずれかに個別に適用されると解釈されることが理解される。
【００６０】
ベクター
本発明の一態様として、上記に説明されている生合成経路におけるそれらの協調発現のための上記に説明されているＱＡ核酸の１つ又は複数を各々保有している複数のアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の共インフィルトレーションを利用する方法が開示されている。
【００６１】
一部の実施形態では、例えばＱＡ核酸を各々保有する少なくとも３つ又は４つの異なるアグロバクテリウム・ツメファシエンス株が共インフィルトレーションされる。
【００６２】
これらの遺伝子は一過性発現ベクターから提示され得る。
【００６３】
好ましい発現系は、ＷＯ２００９／０８７３９１に記載される「高翻訳可能（Hyper-Translatable）」ササゲモザイクウイルス（「CPMV-HT」）系と呼ばれているものを利用し、その開示は、ＣＰＭＶ−ＨＴ系、例えばｐＥＡＱ−ＨＴ発現プラスミドに基づくベクターを使用する実施形態の支持として本明細書に具体的に組み込まれる。
【００６４】
したがって、本発明に使用するためのベクター（典型的にバイナリーベクター）は、典型的に
（ｉ）プロモーターであって、以下と作動可能に連結されている、プロモーター、
（ｉｉ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける標的開始部位が突然変異されている、二分ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列、
（ｉｉｉ）上記されているＱＡ核酸配列、
（ｉｖ）転写終結配列、及び任意選択により
（ｖ）前記転写終結配列の上流に位置する３’ＵＴＲ
を含む発現カセットを含む。
【００６５】
本発明の実施に有用なベクター及び発現系のさらなる例は、本明細書以下により詳細に記載されている。
【００６６】
宿主
本発明の態様では、宿主は、宿主がＯＳからの効果的なＱＡ生合成を実行できない表現型から、宿主が前記ＱＡ生合成を実行できる表現型に変換され得、その結果、ＱＡは宿主から回収され得るか、又は下流産生物を合成するためにｉｎ  ｖｉｖｏで利用され得る。宿主の例には、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）などの植物及び酵母などの微生物が含まれる。これらは以下により詳細に説明されている。
【００６７】
本発明は、ベクターを介してＱＡ核酸を宿主細胞に導入し、本発明による核酸をゲノムに導入するためにベクターと宿主細胞ゲノムとの間で組換えを引き起こすか、又は可能にすることによって、宿主を上記されている異種核酸で形質転換することを含むことができる。
【００６８】
本発明の別の態様では、異種核酸で形質転換された宿主細胞であって、異種核酸が、各々が前記ＱＡ生合成活性を組み合わせて有するポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含み、
前記核酸の発現は、形質転換された宿主にＯＳからのＱＡ生合成を実行する能力を付与するか、又は宿主における前記能力を改善する、宿主細胞が提供される。
【００６９】
本発明はさらに、上記されている核酸又はベクターで形質転換された宿主細胞（例えば、ＱＡ生合成修飾ヌクレオチド配列を含む）、特に植物又は微生物細胞を包含する。トランスジェニック宿主細胞（すなわち、問題の核酸についてのトランスジェニック）において、導入遺伝子は、ゲノム外ベクターにあってもよいか、又はゲノム中に、好ましくは安定に組み込まれてもよい。一倍体ゲノム当たり１つより多い異種ヌクレオチド配列が存在してもよい。
【００７０】
本明細書に記載される方法及び材料は、とりわけ、ＱＡを蓄積する安定な作物を生成するために使用され得る。
【００７１】
本発明による植物細胞を含む植物も提供される。
【００７２】
産生物の産生
上記されている方法は、異種宿主においてＱＡを生成するために使用され得る。ＱＡは一般に、それらが導入される種において天然に存在しない。
【００７３】
本発明の植物又は方法からのＱＡは、単離され、商業的に利用され得る。
【００７４】
上記の方法は、宿主においてＱＳ−２１を産生する方法の一部を形成することができ、場合によってはその方法における１つの工程を形成することができる。この方法は、宿主（それが微生物である場合）を培養する工程、又は宿主（それが植物である場合）を成長させ、次いでそれを収集し、それからＱＡ又はＱＳ−２１産生物を精製する工程を含むことができる。このように産生された産生物は本発明のさらなる態様を形成する。ＱＡ又はＱＳ−２１産生物の有用性は上記されている。
【００７５】
或いは、ＱＡはＱＳ−２１のさらなる化学合成を可能にするために回収されてもよい［１８］。
【００７６】
本発明の新規遺伝子
本発明の支持として、本発明者らは、その種におけるＱＡの合成に関与すると考えられるＱ．サポナリア由来の配列（配列番号１〜８参照）を新たに特徴付けた。
【００７７】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、本発明のこれらの新たに特徴付けられたＱＡ核酸（例えば、１つ、２つ、３つ又は４つのこのようなＱＡ核酸）の１つ又は複数の使用を、任意選択により、当該技術分野において公知のＱＡ生合成に作用する他の遺伝子の操作と併用して含む。
【００７８】
Ｑ．サポナリア由来のこれらの新たに特徴付けられたＱＡ配列（配列番号１〜８）は、これらの配列に由来するバリアント及びこれらの配列の材料、並びにそれらを使用する方法と同様に、それら自体で本発明の態様を形成する。
【００７９】
ここで、本発明のいくつかの態様及び実施形態をより詳細に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
種々の実施形態では、本発明は、微生物又は植物などの宿主細胞におけるＱＡの総レベルを操作する手段を提供する。
【００８１】
本発明の一態様では、上記されているＱＡ生合成修飾核酸は、組換え、好ましくは複製可能なベクターの形態である。
【００８２】
「ベクター」は、とりわけ、自己伝達性若しくは可動性であってもよく、又は自己伝達性若しくは可動性でなくてもよく、細胞ゲノムへの組み込み又は染色体外の存在（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）のいずれかによって原核生物又は真核生物宿主を形質転換することができる、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状形態の任意のプラスミド、コスミド、ファージ又はアグロバクテリウムバイナリーベクターを含むと定義される。
【００８３】
当業者に周知のように、「バイナリーベクター」系は、（ａ）所望のヌクレオチド配列の植物細胞ゲノムへの移入を可能にする境界配列；（ｂ）（ｉｉ）必要に応じて標的配列及び／又はエンハンサーと作動可能に連結された（ｉ）植物活性プロモーターの発現カセットを一般に含む、所望のヌクレオチド配列自体を含む。所望のヌクレオチド配列は、境界配列の間に位置し、適切な条件下で植物ゲノムに挿入され得る。バイナリーベクター系は一般に、組み込みを行うために他の配列（Ａ．ツメファシエンスに由来する）を必要とする。一般に、これは、アグロバクテリウム媒介一過性形質転換を使用する、いわゆる「アグロインフィルトレーション（agro-infiltration）」の使用によって達成され得る。簡潔に述べると、この技術は、そのＤＮＡの一部（「T-DNA」）を、それが核ＤＮＡに組み込まれ得る宿主細胞に移入するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの特性に基づく。Ｔ−ＤＮＡは、約２１〜２３ヌクレオチド長である左右の境界配列によって規定される。インフィルトレーションは、例えば、注射基（葉において）又は真空（植物全体）によって達成され得る。本発明では、境界配列は一般に、アグロインフィルトレーションにより植物材料に１つ又は複数のベクターを導入した所望のヌクレオチド配列（T-DNA）付近に含まれる。
【００８４】
一般的に、当業者は、ベクターを構築し、組換え遺伝子発現のためのプロトコールを設計することが十分に可能である。プロモーター配列、転写終結断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。さらなる詳細に関しては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年参照。
【００８５】
具体的には、放線菌及び関連種、細菌及び真核生物（例えば、高等植物、蘚類、酵母又は真菌細胞）から選択され得る、２つの異なる宿主生物における複製を天然に又は設計によって可能とするＤＮＡビヒクルを意味するシャトルベクターが含まれる。
【００８６】
本発明による核酸を含むベクターは、特にベクターがゲノムへの組換えのために核酸を細胞に導入するために使用される場合、プロモーター又は他の調節配列を含む必要はない。
【００８７】
好ましくは、ベクター内の核酸は、微生物、例えば、酵母及び細菌、又は植物細胞などの宿主細胞における転写のための適切なプロモーター又は他の調節エレメントの制御下にあり、それらと作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであってもよい。ゲノムＤＮＡの場合、これは、それ自体のプロモーター又は他の調節エレメントを（任意選択により、以下の実施例に説明されている３５Ｓエンハンサーなどの異種エンハンサーと組み合わせて）含有することができる。天然プロモーターを使用する利点は、これが多面的応答を回避することができることである。ｃＤＮＡの場合、これは、宿主細胞における発現のための適切なプロモーター又は他の調節エレメントの制御下にあり得る。
【００８８】
「プロモーター」とは、下流に（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上の３’方向において）作動可能に連結されたＤＮＡの転写が開始され得るヌクレオチドの配列を意味する。
【００８９】
「作動可能に連結された」とは、プロモーターから開始される転写のために適切に配置され、配向された同じ核酸分子の一部としての結合を意味する。プロモーターと作動可能に連結されたＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。
【００９０】
好ましい実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。
【００９１】
プロモーターに適用される場合、「誘導性」という用語は、当業者によって十分に理解されている。本質的に、誘導性プロモーターの制御下での発現は、与えられた刺激に応答して「オンに切り替えられる」か、又は増加する。刺激の性質は、プロモーター間で変化する。一部の誘導性プロモーターは、適切な刺激の非存在下で、少し又は検出できないレベルの発現を引き起こす（又は発現を引き起こさない）。他の誘導性プロモーターは、刺激の非存在下で検出可能な構成的発現を引き起こす。発現のレベルは刺激の非存在下であるかにかかわらず、あらゆる誘導性プロモーターからの発現は正確な刺激の存在下で増加する。
【００９２】
したがって、本発明による核酸は、発現を使用者の制御下に設定するために外部誘導性遺伝子プロモーターの制御下に配置され得る。特に細胞が植物に含まれる場合、異種遺伝子の植物細胞への導入の利点は、選択に従って、遺伝子発現、それによるＱＡ生合成に影響を与えることができるように、選んだプロモーターの制御下で遺伝子の発現を設定する能力である。さらに、例えば、野生型よりも高い又は低い活性を有する、野生型遺伝子の突然変異体及び誘導体を内在性遺伝子の代わりに使用することができる。
【００９３】
したがって、本発明のこの態様は、本発明によって提供されるヌクレオチド配列、例えばＱＡ生合成修飾遺伝子、最も好ましくは以下に記載されるＱｓ  ＱＡ核酸のうちの１つ、又はこれらの誘導体と作動可能に連結されたプロモーター（任意選択により誘導性）を含む、遺伝子構築物、好ましくは複製可能なベクターを提供する。
【００９４】
本発明の文脈において特に興味深いものは、植物ベクターとして作動する核酸構築物である。植物に広く成功して以前に使用されていた特定の手順及びベクターは、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ及びＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３年）（Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148）によって記載されている。適切なベクターには、植物ウイルス由来ベクターが含まれ得る（例えば、ＥＰ−Ａ−１９４８０９参照）。
【００９５】
好ましくは、植物において使用するための本発明のベクターは、発現カセットの植物ゲノムへの移入及び組み込みを可能にする境界配列を含む。好ましくは、構築物は植物バイナリーベクターである。好ましくは、バイナリー形質転換ベクターはｐＰＺＰに基づく（Hajdukiewicz, et al. 1994）。他の例示的な構築物には、ｐＢｉｎ１９が含まれる（Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller, et al. (1995). 「Complete Sequence of the binary vector Bin 19.」 Plant Molecular Biology 27: 405-409参照）。
【００９６】
植物において作動する適切なプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（CaMV 35S）が含まれる。他の例は、Ｌｉｎｄｓｅｙ  ＆  Ｊｏｎｅｓ（１９８９年）「Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ」  Ｐｕｂ．ＯＵ  Ｐｒｅｓｓ、Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ、ＵＫの１２０頁に開示されている。プロモーターは、発現の発生及び／又は組織特異的調節制御を付与する１つ又は複数の配列モチーフ又はエレメントを含むように選択され得る。誘導性植物プロモーターには、Ｃａｄｄｉｃｋら、（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１７７〜１８０頁のエタノール誘導性プロモーターが含まれる。
【００９７】
所望の場合、抗生物質又は除草剤（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン（phosphinotricin）、クロルスルフロン、メトトレキサート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリホサート）に対する耐性などの選択可能な表現型を付与するものなどの選択可能な遺伝子マーカーが構築物に含まれ得る。Ｈａｌｄｒｕｐら、１９９８年、Ｐｌａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３７、２８７〜２９６頁に記載されるものなどの陽性選択系を使用して抗生物質に依存しない構築物を作製することができる。
【００９８】
上記に解説されているように、好ましいベクターは、ＷＯ２００９／０８７３９１に記載されるような「ＣＰＭＶ−ＨＴ」ベクターである。以下の実施例は、これらのｐＥＡＱ−ＨＴ発現プラスミドの使用を実証する。
【００９９】
本発明に使用するためのこれらのベクター（典型的にバイナリーベクター）は、典型的に
（ｉ）プロモーターであって、以下と作動可能に連結されている、プロモーター、
（ｉｉ）ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける標的開始部位が突然変異されている、二分ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列、
（ｉｉｉ）上記されているＱＡ核酸配列、
（ｉｖ）転写終結配列、及び任意選択により
（ｖ）前記転写終結配列の上流に位置する３’ＵＴＲ
を含む発現カセットを含む。
【０１００】
本明細書において称されている「エンハンサー」配列（又はエンハンサーエレメント）は、標的開始部位が突然変異されているコモウイルスなどの二分ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントに由来する（又はそれと相同性を共有する）配列である。このような配列は、それらが結合している異種ＯＲＦの下流発現を増強することができる。限定されないが、このような配列は、転写ＲＮＡに存在する場合、それらが結合している異種ＯＲＦの翻訳を増強することができると考えられる。
【０１０１】
本明細書において称されている「標的開始部位」は、問題のエンハンサー配列が由来し、野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質の長い方の産生（翻訳）のための開始部位として役立つ、二分ウイルス（例えば、コモウイルス）の野生型ＲＮＡ−２ゲノムセグメントにおける開始部位（開始コドン）である。
【０１０２】
典型的に、ＲＮＡウイルスは本明細書以前に記載されるコモウイルスである。
【０１０３】
最も好ましいベクターは、遺伝子サイレンシングのサプレッサー及びＮＰＴＩＩカセットも含有するＴ−ＤＮＡに位置する、本発明の翻訳エンハンサーを含む発現カセットの５’リーダーと３’ＵＴＲとの間のポリリンカーの使用によって直接クローニングバージョンを可能にするＷＯ２００９／０８７３９１のｐＥＡＱベクターである。
【０１０４】
このような遺伝子発現系における遺伝子サイレンシングのサプレッサーの存在が好ましいが、必須ではない。遺伝子サイレンシングのサプレッサーは当該技術分野において公知であり、ＷＯ／２００７／１３５４８０に記載されている。それらには、ジャガイモＹウイルス由来のＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ由来のＨｅ−Ｐｒｏ、ＴＢＳＶ由来のＰ１９、ｒｇｓＣａｍ、ＦＨＶ由来のＢ２タンパク質、ＣＰＭＶの小コートタンパク質、及びＴＣＶ由来のコートタンパク質が含まれる。安定なトランスジェニック植物を産生する場合の好ましいサプレッサーは、Ｒ４３Ｗ突然変異を組み込んでいるＰ１９サプレッサーである。
【０１０５】
本発明はまた、植物細胞又は微生物（例えば、細菌、酵母又は真菌）細胞へのこのような構築物の導入、及び／又は適切な刺激、例えば効果的な外因性誘導因子の適用によって植物細胞内での構築物の発現の誘導を含む方法も提供する。
【０１０６】
微生物の代替として、蘚類のヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）も含む、ＱＡ産生植物種の細胞懸濁培養物を発酵タンク中で培養することもできる（例えば、Grotewold et al. (Engineering Secondary Metabolites in Maize Cells by Ectopic Expression of Transcription Factors, Plant Cell, 10, 721-740, 1998参照）。
【０１０７】
本発明のさらなる態様では、本発明による異種構築物を含有する宿主細胞、特に植物又は微生物細胞が開示される。
【０１０８】
異種生物におけるＱＡ生合成の再構成に関する上記の宿主細胞の説明をここで準用する。
【０１０９】
したがって、本発明のさらなる態様は、上記されている構築物の植物細胞への導入に関与し、本発明による核酸をゲノムに導入するためにベクターと植物細胞ゲノムとの間で組換えを引き起こすか、又は可能にする植物細胞を形質転換する方法を提供する。
【０１１０】
本発明はさらに、本発明による核酸又はベクター（例えば、ＱＡ生合成修飾ヌクレオチド配列を含む）で形質転換された宿主細胞、特に植物又は微生物細胞を包含する。トランスジェニック植物細胞（すなわち、問題の核酸についてのトランスジェニック）において、導入遺伝子は、ゲノム外ベクターにあってもよいか、又はゲノム中に、好ましくは安定に組み込まれてもよい。一倍体ゲノム当たり１つより多い異種ヌクレオチド配列が存在してもよい。
【０１１１】
酵母はトリテルペン産生宿主として広範に利用されており［６〜８、１９〜２２］、したがってＱＡ生合成に十分に適合する可能性がある。
【０１１２】
したがって、一実施形態では、宿主は酵母である。このような宿主については、上記されているＱＡ産生のフラックスを改善するために付加遺伝子を導入することが望ましいことがある。例には、導入されたＰ４５０に対するレドックスパートナーとして役立つ１つ又は複数の植物シトクロムＰ４５０レダクターゼ（CPR）［６］、並びにＨＭＧＲが含まれ得る。
【０１１３】
上記されているように形質転換された植物細胞を含む植物は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１１４】
所望の場合、植物細胞の形質転換後、植物は、当該技術分野において標準的であるように、例えば、単細胞、カルス組織又は葉片から再生され得る。ほぼあらゆる植物は、植物の細胞、組織及び器官から完全に再生され得る。利用可能な技術は、Ｖａｓｉｌら、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ  Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８４年並びにＷｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に概説されている。
【０１１５】
再生植物に加えて、本発明は以下の全てを包含する：このような植物、種子、自家又は雑種後代及び子孫（例えば、Ｆ１及びＦ２子孫）のクローン。本発明はまた、このような植物からの植物栄養繁殖体、すなわち、挿し木、種子などを含む、生殖又は繁殖、有性又は無性において使用され得る任意の部分も提供する。本発明はまた、これらの植物の任意の部分も提供し、それらは全ての場合において、上記されている植物細胞又は異種ＱＡ生合成修飾ＤＮＡを含む。
【０１１６】
本発明はまた、開示されているコードＱＡ生合成修飾核酸配列のいずれかの発現産物、及びコード核酸からの発現によって、したがって適切な宿主細胞にあり得る、適切な条件下で発現産物を作製する方法も包含する。
【０１１７】
以下に記載されるように、上記のもののような植物背景は、例えば、ＱＡ生合成に関連する、又はそうでなければその表現型若しくは形質に作用する、１つ又は複数の他の遺伝子について天然又はトランスジェニックであってもよい。
【０１１８】
宿主表現型を修飾する際に、本明細書に記載されるＱＡ核酸は、ＱＡの速度若しくは収率、又はその修飾、又は任意の他の表現型形質若しくは所望の特性に作用する導入遺伝子などの任意の他の遺伝子と組み合わせて使用されてもよい。
【０１１９】
遺伝子の組合せの使用によって、植物又は微生物（例えば、細菌、酵母又は真菌）は、所望の前駆体の産生を増強するか、又は望ましくない代謝を減少させるように調整され得る。
【０１２０】
代替として、宿主における遺伝子の下方制御は、例えば、ＱＡ収率に影響を与え得る望ましくない代謝又はフラックスを減少させるために所望され得る。
【０１２１】
このような下方制御は、当該技術分野において公知の方法、例えば、アンチセンス技術を使用することによって達成され得る。
【０１２２】
遺伝子発現を下方制御するためにアンチセンス遺伝子又は部分遺伝子配列を使用する際に、転写が、標的遺伝子の「センス」鎖から転写された正常なｍＲＮＡに相補的なＲＮＡを生じるように、ヌクレオチド配列はプロモーターの制御下に「逆方向」に配置される。例えば、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、１９８７年；Ｓｍｉｔｈら、（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４、７２４〜７２６頁；Ｚｈａｎｇら、（１９９２年）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４、１５７５〜１５８８頁、Ｅｎｇｌｉｓｈら、（１９９６年）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８、１７９〜１８８頁参照。アンチセンス技術は、Ｂｏｕｒｑｕｅ、（１９９５年）、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０５、１２５〜１４９頁、及びＦｌａｖｅｌｌ、（１９９４年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１、３４９０〜３４９６頁においても概説されている。
【０１２３】
アンチセンスの代替は、共抑制によって標的遺伝子の発現の減少を達成するために、センス、すなわち標的遺伝子と同じ方向に挿入された標的遺伝子の全て又は一部の複製を使用することである。例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、（１９９０年）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２、２９１〜２９９頁；Ｎａｐｏｌｉら、（１９９０年）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２、２７９〜２８９頁；Ｚｈａｎｇら、（１９９２年）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４、１５７５〜１５８８頁、及びＵＳ−Ａ−５，２３１，０２０参照。遺伝子サイレンシング又は共抑制技術のさらなる改良は、ＷＯ９５／３４６６８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；Ａｎｇｅｌｌ  ＆  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９７年）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６、１２：３６７５〜３６８４頁；及びＶｏｉｎｎｅｔ  ＆  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：５５３頁に見出され得る。
【０１２４】
二本鎖ＲＮＡ（dsRNA）は、センス鎖のみ又はアンチセンス鎖のみの両方よりも遺伝子サイレンシングにおいてさらにいっそう有効であることが見出されている（Fire A. et al Nature, Vol 391, (1998)）。ｄｓＲＮＡ媒介サイレンシングは、遺伝子特異的であり、多くの場合、ＲＮＡ干渉（RNAi）と呼ばれている（Fire (1999) Trends Genet. 15: 358-363, Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490, Hammond et al. (2001) Nature Rev. Genes 2: 1110-1119 and Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2: 239-245も参照）。
【０１２５】
ＲＮＡ干渉は２段階プロセスである。まず、ｄｓＲＮＡを細胞内で切断して、５’末端リン酸塩及び３’ショートオーバーハング（約２ｎｔ）を有する約２１〜２３ｎｔ長の低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）を得る。ｓｉＲＮＡは、破壊に特異的な対応するｍＲＮＡ配列を標的とする（Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001)）。
【０１２６】
標的配列の下方制御のための当該技術分野において公知の別の方法論は、例えば、Ｓｃｈｗａｂら、２００６年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８、１１２１〜１１３３頁に記載されるような「マイクロＲＮＡ」（miRNA）の使用である。この技術は、適切なオリゴヌクレオチド配列を組み込んでいるステムループ前駆体によってコードされ得る人工ｍｉＲＮＡを利用し、この配列は、本明細書の開示に照らして十分に規定された規則を使用して生成され得る。
【０１２７】
本発明の方法は、１つ又は複数のＱＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの産生又は操作の両方を包含する。例えば、ＱＡポリペプチドは、例えば、大腸菌（E.coli）、酵母及び糸状菌などのような微生物における発現を介する発酵に利用され得る。一実施形態では、本発明の１つ又は複数の新たに特徴付けられたＱｓ  ＱＡ配列は、１つ又は複数の他の生合成遺伝子と併用してこれらの生物において使用され得る。
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ方法は上記に広範に記載され、概して、ＱＡポリペプチドをコードする組換え核酸分子の転写、次いでその組換え核酸分子からの翻訳を引き起こすか又は可能にする工程を含む。
【０１２９】
本発明の他の態様では、ＱＡポリペプチド（酵素）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、単離された、精製された、又は半精製された形態で使用され得る。任意選択により、それらは組換え核酸分子の発現産物であってもよい。
【０１３０】
上記に解説されているように、ＱＳ−２１は、ワクチン抗原に応答する免疫系の能力を増強する精製された植物抽出物である。
【０１３１】
ＱＳ−２１は、体液性及び細胞媒介性免疫の両方を増強すると考えられている免疫学的アジュバントとして有用性を有する。ＱＳ−２１は、ＨＩＶ、マラリア及びがんに対するワクチンを含む、種々の試験ワクチンについての添加物として臨床評価段階にある。それは、ＦＤＡが承認したシングリックス（Shingrix）帯状疱疹ワクチンの成分である。
【０１３２】
キラヤ・サポナリア由来の新たに特徴付けられた配列
上記のように、本発明の支持として、本発明者らは、ＱＡ生合成に作用するポリペプチドをコードすると考えられているＱ．サポナリア由来の遺伝子を同定した（表１の配列番号１〜８参照）。
【０１３３】
本発明のある特定の態様では、ＱＡ核酸は、Ｑ．サポナリア（配列番号１〜８）に由来する。ＱＡ産生（トリテルペンの合成及び酸化）のための本明細書に記載される重要な工程は、小胞体の細胞質側表面において起こる可能性が高いと考えられるが、これらの天然の植物遺伝子は、これらの宿主の適切な区画において最も効果的にプロセシングされ得、機能し得るので、このような遺伝子は特に安定なトランスジェニック植物宿主の調製における使用のために好ましいことがある。
【０１３４】
Ｑ．サポナリア由来の上記の新たに特徴付けられたＱＡ生合成遺伝子。
したがって、それら自体で本発明の態様を形成する。
【０１３５】
本発明のさらなる態様では、ＱＡ核酸のバリアントである核酸は、上記に説明されているＱ．サポナリアに由来することが開示される。
【０１３６】
本明細書に説明される天然のＱＡ遺伝子と同様に、このようなバリアントは、本明細書に開示されている方法によって評価されるように、植物のＱＡ含量を変化させるために使用され得る。例えば、バリアント核酸は、上記に説明されるように、天然のＱＡポリペプチドの関連する生物活性を共有するバリアントＱＡポリペプチドをコードする配列を含み得る。例には、配列番号２、４、６又は８のいずれかのバリアントが含まれる。
【０１３７】
誘導体
本明細書に記載されるのは、上記に開示されている本発明のＱＡ遺伝子のいずれか、特にＱ．サポナリア由来のＱＡ配列を修飾する工程を含む、誘導体核酸を産生する方法である。
【０１３８】
変更は、多くの理由のために望ましいことがある。例えば、変更により、制限エンドヌクレアーゼ部位を導入することができる若しくは取り除くことができるか、又はコドン使用頻度を変化させることができる。これは、Ｑｓ遺伝子が、代替宿主、例えば、酵母などの微生物宿主において発現される場合に特に望ましいことがある。この目的のためのコドン最適化遺伝子の方法は当該技術分野において公知である（例えば、Elena, Claudia, et al. 「Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.」 Frontiers in microbiology 5 (2014)参照）。したがって、酵母発現を最大化するためにコドン修飾を含む本明細書に記載される配列は、本発明の特定の実施形態を表す。
【０１３９】
或いは、配列に対する変化は、コードされたポリペプチドにおける１つ又は複数（例えば、いくつか）のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換を導く、核酸における１つ又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換のうちの１つ又は複数（例えば、いくつか）によって、誘導体を産生することができる。
【０１４０】
このような変更は、コードされたポリペプチドにおける切断部位；リン酸化のためのコードされたポリペプチドにおけるモチーフなどのような翻訳後修飾に必要とされる部位を修飾することができる。微生物系から発現タンパク質を単離することが所望される場合、リーダー又は他のターゲティング配列（例えば、膜又はゴルジ位置決め配列）が、発現後にその位置を決定するために発現タンパク質に付加されてもよい。
【０１４１】
他の望ましい突然変異は、コードされたポリペプチドの活性（例えば、特異性）又は安定性を変化させるためのランダム又は部位特異的突然変異誘発であり得る。変更は、保存的変異、すなわち、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンなどの１つの疎水性残基の別の残基への置換、又は１つの極性残基の別の残基への置換、例えば、アルギニンのリシンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、若しくはグルタミンのアスパラギンへの置換によるものであってもよい。当業者に周知であるように、保存的置換によってポリペプチドの一次構造を変化させることは、配列に挿入されるアミノ酸の側鎖が、置換されて除かれたアミノ酸の側鎖と類似した結合及び接触を形成することができるので、そのペプチドの活性を有意に変化させることはない。これは、置換がペプチド立体配座を決定する際に重要である領域にある場合でさえそうである。また、非保存的置換を有するバリアントも含まれる。当業者に周知であるように、ペプチドの立体配座を決定する際に重要ではないペプチドの領域に対する置換は、それらがペプチドの三次元構造を大きく変化させないので、その活性に大きく作用することはない。ペプチド立体配座又は活性を決定する際に重要である領域において、このような変更はポリペプチドに有利な特性を付与することができる。実際に、上記されているもののような変更は、ペプチドにわずかに有利な特性、例えば、変化した安定性又は特異性を付与することができる。
【０１４２】
断片
本発明は、上記に開示されている本発明のＱＡ遺伝子をコードするポリペプチドの断片、特にＱ．サポナリア由来のＱＡ配列を利用することができる。
【０１４３】
したがって、本発明は、本明細書に開示されている本発明の全長ＱＡポリペプチドの断片、特にその活性部分の産生及び使用を提供する。ポリペプチドの「活性部分」は、前記全長ポリペプチド未満であるが、その本質的な生物活性を保持するペプチドを意味する。
【０１４４】
ポリペプチドの「断片」は、少なくとも約５〜７個の連続するアミノ酸、多くの場合少なくとも約７〜９個の連続するアミノ酸、典型的に少なくとも約９〜１３個の連続するアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０〜３０個又はそれ以上の連続するアミノ酸の一続きのアミノ酸残基を意味する。ポリペプチドの断片は、本明細書に開示されているアミノ酸配列のいずれかの一部に対する抗体を惹起するのに有用な１つ又は複数のエピトープを含み得る。好ましいエピトープは、抗体が特異的に結合することができるエピトープであり、これは、他のポリペプチドの親和性の少なくとも約１０００倍である親和性で本発明のポリペプチド又はその断片に結合すると解釈され得る。
【０１４５】
本明細書に開示されている特定の断片は、ＣＹＰ７１６−２０１２０９０のより短いアイソフォームであり、これは、配列番号６の中に示され、すなわち、配列付録において下線を引いたＮ末端２１アミノ酸を欠くものである。
【０１４６】
簡潔さのために、Ｑ．サポナリア由来のこれらのＱＡ配列又はバリアント（例えば、その断片などの誘導体）のいずれかは、「Ｑｓ  ＱＡ配列（又は核酸、又はポリペプチド）」と称することがある。これらのＱｓ  ＱＡポリペプチド、及びそれらをコードする核酸は、本発明の一態様を形成する。
【０１４７】
この用語が一般的に使用される場合、それはまた、これらの配列のいずれかに個別に適用されることが理解される。
【０１４８】
したがって、本発明の一態様では、これらのポリペプチド（２、４、６、又は８）のいずれかをコードする単離された核酸が開示される。好ましくは、これは１、３、５、又は７の配列を有し得る。本発明の他の核酸には、これらと縮重的に等価であるもの、又はこれらの相同バリアント（例えば、誘導体）が含まれる。
【０１４９】
本発明の態様はさらに、本明細書以下に説明されている配列のいずれかに相補的である配列を含む単離された核酸を包含する。
【０１５０】
Ｑｓ  ＱＡ配列を使用してそのそれぞれの生物活性を触媒することは（図１に記載される）、本発明の別の態様を形成する。簡潔さのために、これらの配列のいずれかは、「Ｑｓ  ＱＡ配列」と称することがある。
【０１５１】
したがって、本発明はさらに、植物などの宿主におけるＱＡ生合成に影響又は作用を与える方法であって、植物の細胞内で上記に説明されている異種Ｑｓ  ＱＡ核酸の転写を引き起こすか、又は可能にする工程を含む、方法を提供する。この工程の前に、Ｑｓ  ＱＡ核酸を植物の細胞又はその祖先に導入する前工程を行ってもよい。
【０１５２】
このような方法は、通常、植物などの宿主においてＱＡを産生する方法の一部、場合によりその方法における１つの工程を形成する。好ましくは、この方法は、上記されている本発明のＱＡ修飾ポリペプチド（例えば、表１）若しくはその誘導体、又はいずれかをコードする核酸を利用する。
【０１５３】
さらなる実施形態では、本発明のＱｓ  ＱＡポリペプチド又はペプチドに対して惹起された抗体が提供される。
【０１５４】
上記に説明されている生合成経路の異種再構成に関連する本発明のいくつかの態様が、ここでより詳細に説明される。
【０１５５】
本発明による「核酸」は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び修飾核酸又は核酸類似体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。例えば、図を参照して、ＤＮＡ配列が特定される場合、文脈が他に必要としない限り、存在する場合、ＴをＵに置換したＲＮＡ等価物が包含される。本発明による核酸分子は、それらの天然環境から、実質的に純粋若しくは均質な形態で、又は起源の種及び二本鎖若しくは一本鎖の他の核酸を含まないか若しくは実質的に含まずに単離及び／又は精製されて提供され得る。本明細書に使用されている場合、「単離された」という用語は、これらの可能性の全てを包含する。核酸分子は完全に又は部分的に合成されてもよい。特に、それらは、天然に一緒に見出されない（連続して伸びていない）核酸配列が、ライゲーションされているか、又はそれ以外の方法で人工的に組み合わされているという点で組換えであってもよい。核酸は、本明細書以下に説明されている配列のいずれかを含んでもよく、それらからなってもよく、又はそれらから実質的になってもよい。
【０１５６】
「異種」という用語は、問題のヌクレオチドの遺伝子／配列（例えば、ＱＡ生合成修飾ポリペプチドをコードする）が、遺伝子工学を使用して、すなわちヒトの介入によって、宿主又はその祖先の前記細胞に導入されていることを示すために本明細書において広範に使用される。宿主細胞に対して異種の核酸は、その型、種類又は種について細胞において天然に存在しない。したがって、異種核酸は、異なる型の植物細胞又は植物の種若しくは種類の状況に置かれた、特定の型の植物細胞又は植物の種若しくは種類のコード配列を含み得るか、又はそれらに由来し得る。さらなる可能性は、核酸配列がそれ又はホモログが天然に見出される細胞内に配置されることであるが、その核酸配列は、その型又は植物の種若しくは種類についてその細胞又は複数の細胞内に天然に存在しない核酸に連結され及び／又は隣接し、例えば、発現の制御のためのプロモーター配列などの１つ又は複数の調節配列と作動可能に連結される。
【０１５７】
この文脈における「形質転換された」とは、異種核酸のヌクレオチド配列が、例えば、ＱＡ生合成に関して、細胞の特徴、したがって表現型のうちの１つ又は複数を変化させることを意味する。このような形質転換は、一過性であってもよく又は安定であってもよい。
【０１５８】
「ＱＡ生合成を実行できない」とは、変換前に、宿主が、宿主の正常な代謝環境下で検出可能又は回収可能なレベルのＱＡを天然に産生しないか、又は産生しないと考えられることを意味する。
【０１５９】
本明細書に提供されているヌクレオチド配列情報は、プロービング又は増幅のためのプローブ及びプライマーを設計するために使用され得る。プロービング又はＰＣＲに使用するためのオリゴヌクレオチドは、約３０又はそれ以下のヌクレオチド長（例えば、１８、２１又は２４）であり得る。一般に、特異的プライマーは１４ヌクレオチド長を超える。最適な特異性及び費用対効果のために、１６〜２４ヌクレオチド長のプライマーが好ましいことがある。当業者は、ＰＣＲなどのプロセスに使用するためのプライマーの設計に精通している。必要に応じて、プロービングは、本明細書に開示されている遺伝子の制限断片全体を用いて行うことができ、それは１００又はさらに１０００ヌクレオチド長であってもよい。必要な場合、「コンセンサス」又は「縮重」プライマーを産生するためにわずかな変異を配列に導入してもよい。
【０１６０】
プロービングは、標準的なサザンブロッティング技術を利用することができる。例えば、ＤＮＡを細胞から抽出し、異なる制限酵素で消化することができる。次いで、制限断片を、変性前にアガロースゲル上での電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターに移すことができる。標識されたプローブはフィルター上の一本鎖ＤＮＡ断片にハイブリダイズすることができ、結合を決定することができる。プロービングのためのＤＮＡは、細胞由来のＲＮＡ調製物から調製することができる。プロービングは任意選択により、いわゆる「核酸チップ」によって行うことができる（概説に関して、Marshall & Hodgson (1998) Nature Biotechnology 16: 27-31参照）。
【０１６１】
一実施形態では、本発明に従ってＱＡ生合成修飾ポリペプチドをコードするバリアントは、以下を含む方法によって得ることができる：
（ａ）例えば、植物細胞から核酸の調製物を準備する工程。試験核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はこれらのいずれかの混合物として、好ましくは適切なベクターにおけるライブラリーとして、細胞から準備され得る。ゲノムＤＮＡが使用される場合、プローブは、本明細書以下に記載されるように、遺伝子の非転写領域（例えば、プロモーターなど）を同定するために使用され得る、
（ｂ）上記に説明されているプローブ又はプライマーである核酸分子を準備する工程、
（ｃ）前記調製物におけるいずれかの前記遺伝子又はホモログとの前記核酸分子のハイブリダイゼーションのための条件下で前記調製物における核酸を前記核酸分子と接触させる工程、及び
（ｄ）存在する場合、前記核酸分子とのそのハイブリダイゼーションによって前記遺伝子又はホモログを同定する工程。標的核酸（例えば、DNA）とのプローブの結合は、当業者が自由に使える種々の技術のいずれかを使用して測定することができる。例えば、プローブは、放射性標識され、蛍光標識され、又は酵素的に標識されてもよい。プローブの標識化を利用しない他の方法は、ＰＣＲ（以下を参照）、ＲＮ’ａｓｅ切断及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングを使用する増幅を含む。成功したハイブリダイゼーションの同定の後に、ハイブリダイズした核酸の単離が続き、これは、適切な宿主におけるベクターのＰＣＲ又は増幅の１つ又は複数の工程を含み得る。
【０１６２】
低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることによって予備実験を実施することができる。プロービングに関して、好ましい条件は、陽性と同定された少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンが存在するのに十分にストリンジェントである条件であり、その条件はさらに調査することができる。
【０１６３】
例えば、ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（以下）の方法に従って、５×ＳＳＣ（ここで、「SSC」＝0.15M塩化ナトリウム；0.15Mクエン酸ナトリウム；pH7）、５×デンハルト試薬、０．５〜１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム及び５０％以下のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を使用して実施することができる。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃にて少なくとも６時間実行する。ハイブリダイゼーション後、フィルターを以下のように洗浄する：（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中で室温にて５分；（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で室温にて１５分；（３）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中で３７℃にて３０分〜１時間；（４）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中で４２〜６５℃にて２時間、溶液を３０分ごとに交換する。
【０１６４】
特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェンシー条件を計算するための１つの一般的な式は、（Sambrook et al., 1989）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（G+C%）−０．６３（ホルムアミド%）−６００／二重鎖における＃ｂｐである。
【０１６５】
上記の式の例として、４２％のＧＣ含量及び２００塩基の平均プローブサイズで［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドを使用して、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％減少するごとに１〜１．５℃減少する。したがって、約７５％を超える配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用して観察される。このような配列は、本発明の核酸配列と実質的に相同であるとみなされる。
【０１６６】
少数の陽性クローンのみが残るまでハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを徐々に増加させることは、当該技術分野において周知である。他の適切な条件には、例えば、約８０〜９０％同一である配列の検出に関して、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中での４２℃にて一晩のハイブリダイゼーション及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での５５℃での最終洗浄が含まれる。約９０％を超える同一性である配列の検出に関して、適切な条件には、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中での６５℃にて一晩のハイブリダイゼーション及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での６０℃での最終洗浄が含まれる。
【０１６７】
さらなる実施形態では、バリアントとの核酸分子のハイブリダイゼーションは、例えば、核酸増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、間接的に決定又は同定され得る。ＰＣＲは、標的核酸を特異的に増幅させるために２つのプライマーの使用を必要とし、したがって、好ましくは、本発明のＱＡ遺伝子の配列特性を有する２つの核酸分子が利用される。ＲＡＣＥ  ＰＣＲを使用して、１つのこのようなプライマーのみが必要とされ得る（「PCR protocols; A Guide to Methods and Applications」, Eds. Innis et al, Academic Press, New York, (1990)参照）。
【０１６８】
したがって、本発明による核酸を得る際のＰＣＲの使用を含む方法は、以下を含むことができる：
（ａ）例えば、種子又は他の適切な組織若しくは器官から植物核酸の調製物を準備する工程、
（ｂ）ＰＣＲに有用な（すなわち、適切な）一対の核酸分子プライマーを準備する工程であって、前記プライマーの少なくとも１つは上記に説明されている本発明によるプライマーである、工程、
（ｃ）ＰＣＲを実施するための条件下で前記調製物における核酸を前記プライマーと接触させる工程、
（ｄ）ＰＣＲを実施し、増幅されたＰＣＲ産物の存在又は非存在を決定する工程。増幅されたＰＣＲ産物の存在は、バリアントの同定を示し得る。
【０１６９】
上記の全ての場合、必要であれば、調査において同定されたクローン又は断片は伸長され得る。例えば、それらが不完全であることが疑われる場合、元のＤＮＡ起源（例えば、クローンライブラリー、mRNA調製物など）は、例えば、重複配列を含有する他のクローンを同定するために既に得られた部分に基づく配列、プローブ又はプライマーを使用して、欠失部分を単離するために再検討され得る。
【０１７０】
例えば、そのためのコード核酸からの発現によって組換えにより産生された本発明による精製されたタンパク質、又はその断片、突然変異体、誘導体若しくはバリアントは、当該技術分野において標準的である技術を利用して抗体を惹起するために使用され得る。抗体の抗原結合断片を含む抗体及びポリペプチドは、以下にさらに説明されるように他の種からホモログを同定する際に使用され得る。
【０１７１】
抗体を産生する方法は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル）をタンパク質又はその断片で免疫化することを含む。抗体は、当該技術分野において公知の種々の技術のいずれかを使用して免疫化動物から得ることができ、好ましくは、目的の抗原への抗体の結合を使用してスクリーニングすることができる。例えば、ウェスタンブロッティング技術又は免疫沈降が使用され得る（Armitage et al, 1992, Nature 357: 80-82）。抗体は、ポリクローナルであってもよいか、又はモノクローナルであってもよい。
【０１７２】
哺乳動物を免疫化するための代替又は補足として、適切な結合特異性を有する抗体を、例えば、それらの表面に機能的免疫グロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを使用して、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換えにより産生されたライブラリーから得ることができる；例えばＷＯ９２／０１０４７参照。
【０１７３】
ポリペプチド又はペプチドに対して惹起された抗体は、相同ポリペプチド、次いでコード遺伝子の同定及び／又は単離に使用され得る。
【０１７４】
抗体は多くの方法で修飾することができる。実際に、「抗体」という用語は、必要な特異性を有する結合ドメインを有するいずれかの特異的結合物質を包含と解釈されるべきである。したがって、この用語は、天然であるか、又は合成であるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含むいずれかのポリペプチドを含む、抗体の抗体断片、誘導体、機能的等価物及びホモログを包含する。
【０１７５】
本発明及び本発明が関係する技術水準をより完全に記載し、開示するために多くの特許及び刊行物が本明細書に引用される。これらの参考文献の各々は、各個々の参考文献が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、本開示にその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
以下の特許請求の範囲を含む本明細書全体にわたって、文脈が別段の要求をしない限り、「含む（comprise）」という語、並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を排除しないことを示すものと理解される。
【０１７７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用されている場合、単数形「一つの（a）」、「一つの（an）」及び「その（the）」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数の参照を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「医薬担体」への参照は、２つ又はそれ以上のこのような担体の混合物などを含む。
【０１７８】
範囲は、多くの場合、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして本明細書において表現される。このような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行する「約」を使用することによって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。
【０１７９】
本明細書における任意のサブタイトルは、便宜上のためだけに含まれ、いかなる方法においても本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１８０】
ここで、本発明を以下の非限定的な図面及び実施例を参照してさらに記載する。本発明の他の実施形態は、これらに照らして当業者に想起される。
【０１８１】
本発明を実施するために当業者によって使用され得る限り、本明細書に引用される全ての参考文献の開示は、相互参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】ＱＳ−２１を示す図である。
【図２】一般的な普遍的前駆体からの、β−アミリンを介するキラ酸の産生を示す図である。β−アミリンからの経路は、３つ（C-16α、C-23及びC-28）の位置での酸化を必要とする。これらの酸化工程は、単純化のためだけに直線的に示されているが、上記に解説したように、それらは原則として他の順序で進行することができる（図１１参照）。
【図３】Ｑ．サポナリアの葉（L）及び根（R）組織における候補遺伝子のＰＣＲ増幅を示す図である。両方の組織において大部分の候補のための産生物を得ることが可能であった。
【図４】ベンサミアナタバコにおけるＱ．サポナリアβ−アミリンシンターゼ（QsbAS）の発現を示す図である。葉抽出物のＧＣ−ＭＳ分析は、クローニングされたβ−アミリンシンターゼを発現する葉においてβ−アミリンのみの産生を明らかにするが、対照（GFP）葉においてはそうではない。
【図５】Ｑ．サポナリアからのＰ４５０によるβ−アミリンの変換を示す図である。ＣＹＰ７１６ファミリーにおける２つのＰ４５０が、β−アミリンを酸化することが見出された。左側：ＣＹＰ７１６−２０７３９３２がβ−アミリンの大部分を１２．０８分にてオレアノール酸として同定された新規産生物に変換したことを示しているベンサミアナタバコ葉抽出物のＧＣ−ＭＳ分析。真正のオレアノール酸標準物に対するこの産生物についての質量スペクトルを右側に示す。ＣＹＰ７１６−２０１２０９０（長い及び短い両方のアイソフォーム）は、１６α−ヒドロキシ−β−アミリンと推定的に同定された少量のβ−アミリンを変換した（＊でマークしている）。この産生物についての質量スペクトルを図５ｓに示す。    ［図５ｓ］推定１６α−ヒドロキシ−β−アミリンについてのＥＩ質量スペクトルを示す図である。微量のこの産生物が、ＱｓｂＡＳ及びＣＹＰ７１６−２０１２０９０の同時発現の際に形成された。
【図６Ａ】ＣＹＰ７１６−２０１２０９０によるオレアノール酸のエキノシスト酸への変換を示す図である。左側：ＱｓｂＡＳ及びＣＹＰ７１６−２０７３９３２とのＱ．サポナリア由来の２つのＣＹＰ７１６メンバーの同時発現が、１２．４２分にてエキノシスト酸として同定された産生物の蓄積を生じることを示しているベンサミアナタバコ葉抽出物のＧＣ−ＭＳ分析。真正のエキノシスト酸標準物に対するこの化合物についての質量スペクトルを右側に示す。
【図６Ｂ】ＯＱＨＺ−２０１８６８７によるオレアノール酸のヘデラゲニンへの変換を示す図である。オレアノール酸酸化活性についてＣ−２３オキシダーゼ候補をスクリーニングする。候補＃６及び＃７（本明細書においてCYP714-7とも称される同じ酵素を保有する）を発現する試料において、新規産生物が観察されたことが明らかになった。この新規産生物は、２３−ヒドロキシ−オレアノール酸（ヘデラゲニン）標準物と同一の保持時間及び質量スペクトルを有し、この酵素がＣ−２３オキシダーゼであることを示唆している。
【図７】ＱｓｂＡＳと、Ｑ．サポナリア由来のＣ−２８（CYP716-2073932）、Ｃ−１６α（CYP716-2012090）及びＣ−２３（CYP714-7）オキシダーゼとの組合せを発現するベンサミアナタバコの葉抽出物のＬＣ−ＭＳ分析を示す図である。キラ酸（１９．８８６分）は、３つ全てのＰ４５０を発現する試料においてのみ観察された。１９．８８６分における種々の試料についての質量スペクトルをキラ酸標準物と共に以下に示す。
【図８】異なるＣ−２３オキシダーゼを発現する植物試料間のキラ酸産生の比較を示す図である。全ての試料は、ｔＨＭＧＲ、ＱｓｂＡＳ、並びにＱ．サポナリアＣ−２８（CYP716-2073932）及びＣ−１６α（CYP716-2012090）オキシダーゼを発現する葉に由来する。Ｃ−２３オキシダーゼは、Ｑ．サポナリア（CYP714-7、一番上）、タルウマゴヤシ（M.truncatula）（CYP72A68、下二番目）又はＡ．ストリゴサ（A.strigosa）（CYP94D65、下三番目）のいずれかに由来した。  ＣＡＤクロマトグラムを上部に示す。目的の質量スペクトル（ネガティブモード）を下部に示す。  ｍ／ｚ４８５（赤色で示す）を有する共通イオンは、ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６−２０７３９３２／ＣＹＰ７１６−２０１２０９０／ＣＹＰ９４Ｄ６５試料においてキラ酸標準物及び新規ピークの両方に共通であった。このイオンはキラ酸の予測分子量（マイナスＨ＋）に適合する。＊第２の化合物は、カウフィロゲニン（cauphyllogenin）（キラ酸に見られるようなアルデヒドの代わりにC-23アルコールを特徴とする）と推定的に同定されたｍ／ｚ４８７を有する高存在量で見出された。これらの産生物についての質量スペクトルを図８ｓに示す。  Ｃ−２３アルコール（カウフィロゲニン（cauphylogenin））及び酸（16α-ヒドロキシ-ギプソゲン酸（16OH-GA））を含む、より少ない別のＣ−２３酸化副産物が、Ｑ．サポナリアＣ−２３発現試料において見出され、アルデヒド産生に対するより高い特異性を示唆している。
【図９】酵母におけるＱ．サポナリア遺伝子の発現を示す図である。ＧＣ−ＭＳトレースを異なる株について上部に示し、目的のピークについての質量スペクトルを下部に示す。
【図１０】Ａ）トリテルペン生合成に必要なメバロン酸（MVA）経路及び潜在的律速酵素の簡略化した概観を示す図である。Ｂ）ベンサミアナタバコにおけるβ−アミリン含量は、オーツ麦β−アミリンシンターゼ（AsbAS）とのｔＨＭＧＲ又はＳＱＳの共発現から改善され得ることを示す図である。Ｃ）ｔＨＭＧＲとのＳＱＳの共発現は、ｔＨＭＧＲ単独よりもβ−アミリン含量をさらに改善することを示す図である。
【図１１】β−アミリンの酸化誘導体を示す図である。
【図１２】２，３−オキシドスクアレンからのキラ酸及びＱ．サポナリア由来の関連酵素の生合成を示す図である。酸化工程は正確にこの順序で起こらなくてもよい。
【図１３】キラ酸（上側）を作製するのに必要とされるＱ．サポナリア由来の４種の特徴的な酵素を発現する代表的な葉のＬＣ−ＣＡＤ分析を示す図である。対照として、Ｃ−１６αオキシダーゼを除外し（下側）、代わりに前駆体ギプソゲニンを蓄積する（図１２参照）。
【図１４】ベンサミアナタバコから単離された産生物に対するキラ酸標準物のＬＣ分析を示す図である。Ａ）単離された産生物（真ん中）及びキラ酸標準物（下側）の分析を示すＬＣ−ＣＡＤトレース。両方の試料は１９．５分で主要なピークを示した。メタノールのみのブランクランを一番上のトレースに示す。Ｂ）ポジティブ（上側）及びネガティブ（下側）モードの両方における１９．５分での産生物のＭＳ（ESI/APC）分析。単離された産生物を左に示し、キラ酸標準物を右に示す。
【図１５】ベンサミアナタバコから単離された産生物に対するキラ酸標準物のＧＣ−ＭＳ分析を示す図である。Ａ）標準物を下側のトレースに示し、単離された産生物を上側のトレースに示す。両方の試料は１５．３分で主要なピークを示した。Ｂ）１５．３分での２つの産生物のＥＩ質量スペクトルの比較。単離された産生物を上部に示し、キラ酸標準物を下部に示す。
【図１６】ベンサミアナタバコから単離された産生物（上部）に対するキラ酸標準物（下部）の１Ｈ  ＮＭＲ（メタノールｄ４）比較を示す図である。
【実施例】
【０１８３】
実施例１  −  Ｑ．サポナリアトランスクリプトームにおけるキラ酸生合成遺伝子候補についてのマイニング
最近、Ｑ．サポナリアからのトランスクリプトームデータセットが、１ＫＰプロジェクトを通じて利用可能になった［１］。このデータセットは、Ｑ．サポナリア葉組織のＨｉＳｅｑシークエンシング（Illumina）に由来する。
【０１８４】
ＱＳ−２１の商業的供給源は、通常、樹皮に由来するが、葉組織もまた、ＱＳ−２１及び他のサポニンの十分な供給源であることが示されているので［２］、本発明者らは、関連する生合成遺伝子がこのデータベースに存在するかもしれないと推論した。トランスクリプトームデータセットを潜在的生合成遺伝子についてマイニングした。
【０１８５】
β−アミリンシンターゼ
最初に検索した候補はβ−アミリンシンターゼ（bAS）ＯＳＣであった。関連するマメ目の種由来を含む、多数のｂＡＳ酵素を特徴付けする。
【０１８６】
スペインカンゾウ（Glycyrrhiza glabra）由来のｂＡＳ酵素（Genbank ID Q9MB42.1）を、ＯＳＣ配列を同定するためのクエリーとして使用した。これは、トリテルペンシンターゼであると予測される単一の全長配列（OQHZ-2074321）（本明細書以下、QsbASと称する）を戻した。
【０１８７】
他の部分ＯＳＣ配列もまた、このデータセットにおいて同定したが、これらはステロール（シクロアルテノール）シンターゼであると予測され、割り引かれた。
【０１８８】
ＱｓｂＡＳの全ヌクレオチド及び予測されるタンパク質配列は、配列付録Ａにおいて配列番号１及び２として示される。
【０１８９】
β−アミリンオキシダーゼ
本発明者らは、β−アミリンの酸化に関与する可能性の高いクラスの酵素はシトクロムＰ４５０（P450）であると推測した。これらの酵素は、通常、単一の植物ゲノムにおいて２００を超える代表がある、非常に大きな遺伝子スーパーファミリーによってコードされる。
【０１９０】
配列相同性に基づいて機能を予測することは困難なことが多いが、近年、ＣＹＰ７１６ファミリーは、トリテルペンオキシダーゼの卓越したファミリーとして現れている［３］。これまでに１１のＣＹＰ７１６が、β−アミリンＣ−２８オキシダーゼとして特徴付けられていた（配列付録B）。これらのＰ４５０は、分類学的に明確な種（マメ目の種を含む）から単離され、Ｑ．サポナリアにおけるＣ−２８β−アミリンオキシダーゼがこのファミリーのメンバーによって触媒される可能性があり得ることを示唆している。
【０１９１】
さらに、ＣＹＰ７１６酵素はまた、ミシマサイコ（Bupleurum falcatum）（配列付録B）からの１つのＣ−１６αオキシダーゼ（CYP716Y1）を含む、β−アミリン足場周囲の他の（非C-28）位置において酸化を触媒することができることが示されている。２つの全長ＣＹＰ７１６を、検索クエリーとしてタルウマゴヤシ（Medicago truncatula）Ｃ−２８オキシダーゼＣＹＰ７１６Ａ１２を使用して、トランスクリプトームデータセットにおいて同定した。これらは、ＯＱＨＺ−２０７３９３２及びＯＱＨＺ−２０１２０９０（本明細書においてCYP716-2073932及びCYP716-2012090と称することがある）である。
【０１９２】
（CYP716-2073932はまた、P450命名委員会によって正式にCYP716A224と指定されていることに留意されたい［３］）。これらのＣＹＰ７１６の全ヌクレオチド及び予測されるタンパク質配列は、配列付録Ａにおいて配列番号３及び４として示される。
【０１９３】
実施例２  −  Ｑ．サポナリア由来のクローニング候補遺伝子
Ｑ．サポナリアの木は、ＵＫ内の種苗場（Burncoose Nurseries, Cornwall）から得た。［２６］に詳述されている改変プロトコールによって、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ抽出キットを使用してＲＮＡを単一の木の葉及び根から抽出した。このＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Invitrogen）を使用してｃＤＮＡ合成についての鋳型としてさらに使用した。
【０１９４】
標的遺伝子の増幅のために、上記されている４つの遺伝子（配列番号１、３、５及び７）の各々についてのプライマーを設計した。ＣＹＰ７１６−２０１２０９０については、Ｎ末端において２１アミノ酸だけ異なる、タンパク質の長い及び短いアイソフォームの両方のクローニングを可能にする２セットのプライマーを設計した。これは、この領域と他の特徴付けられたＣＹＰ７１６との不十分なアラインメントによるものであった。
【０１９５】
プライマーの各々は、方向性Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベースのクローニングを可能にするために５’末端においてａｔｔＢアダプターを組み込んだ。これらのアダプターは５’末端において斜体で示され、遺伝子特異的配列は５’→３’方向に続く。
【０１９６】
【表２】
2021510495.tif 000003
【０１９７】
鋳型として葉又は根のｃＤＮＡのいずれかを利用して、各遺伝子について２つのＰＣＲ反応を実施した。上記されているように、異なるフォワードプライマーを利用して、ＣＹＰ７１６−２０１２０９０の別々の反応のために２セットのＰＣＲを設定した。ＰＣＲは、製造業者の説明書に従って、ＨＦ緩衝液と共にｉＰｒｏｏｆ（BioRad）を使用して５０μＬの総体積で実施した。ＱｓｂＡＳ及びＣＹＰ７１６酵素の増幅のために、ＰＣＲ熱サイクルは、９８℃（３０秒）での初期変性工程、続いて３０サイクルの変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５０℃、１０秒）及び伸長（７２℃、３分）を含み、７２℃（５分）での最終伸長を伴った。これらのパラメーターは、３０サイクルの間の伸長時間が２分に短縮されたことを除いて、ＣＹＰ７１４の増幅について同一であった。
【０１９８】
全ての遺伝子の首尾良い成功が、ＰＣＲ鋳型として根及び葉組織の両方からｃＤＮＡを使用して観察された（図３）。葉ｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物をさらに精製し、以前に記載されるようにｐＤＯＮＲ２０７エントリーベクターに組換えた［５］。得られたプラスミドをＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって配列決定して挿入遺伝子の存在及び配列を検証した。単一の代表的なプラスミドを各遺伝子について選択し、バイナリーベクターｐＥＡＱ−ＨＴ−ＤＥＳＴ１に組換え［４］、その後、以前に記載されるようにコンピテントアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換した［５］。ベンサミアナタバコにおける一過性発現のために、Ａ．ツメファシエンス株を成長させ、以前に記載されるようにインフィルトレーションのために調製した［５、２７］。
【０１９９】
実施例３  −  ベンサミアナタバコにおけるにおけるＱ．サポナリア遺伝子の一過性発現
ＱｓｂＡＳは単機能性β−アミリンシンターゼである
種々のクローニングした遺伝子の一過性発現をベンサミアナタバコにおいて実施した。全ての組合せは、Ａ．ストリゴサＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（tHMGR）のフィードバック非感受性切断型を保有する株の共インフィルトレーションを含んだ。この酵素は、ベンサミアナタバコにおける一過性発現時にトリテルペン含量を増加させることが実証されている［５］。利用した配列を配列番号２９〜３２として示す。
【０２００】
以前に記載されるように、葉を採取し、抽出し、ＧＣ−ＭＳによって分析した［５］。ＱｓｂＡＳを発現する葉のＧＣ−ＭＳ分析により、β−アミリン標準物の保持時間及び質量スペクトルの比較によってβ−アミリンとして同定した化合物の存在が明らかとなった（図４）。他の新規産生物はクロマトグラムにおいて見出されず、ＱｓｂＡＳが単機能性β−アミリンシンターゼであることを示唆している。
【０２０１】
Ｃ−２８及びＣ−１６αオキシダーゼの発見
次に、ＱｓｂＡＳを種々のＰ４５０の組合せにより試験した。これにより、ＣＹＰ７１６酵素の両方がβ−アミリンに対して活性を示すことが明らかになった。ＣＹＰ７１６−２０７３９３２はＣ−２８オキシダーゼであることが見出され、β−アミリンの大部分をオレアノール酸に変換した。ＣＹＰ７１６−２０１２０９０は、少量のβ−アミリンを、１６α−ヒドロキシ−β−アミリンとして推定的に同定した産生物に変換した（以前に公開された質量スペクトルとの比較に基づく［６、７］）（図５；図５ｓ）。
【０２０２】
これらの２つのＣＹＰ７１６酵素を組み合わせると、β−アミリン、さらにＣ−２８カルボン酸及びＣ−１６αアルコールからなるキラ酸の中間体であるエキノシスト酸と同一の保持時間及び質量スペクトルを有する第３の産生物が同定された（図６Ａ）。
【０２０３】
実施例４  −  Ｑ．サポナリア由来のＣ−２３オキシダーゼの発見
Ｃ−２８及びＣ−１６αオキシダーゼの発見に続いて、傑出したＱ．サポナリアＣ−２３オキシダーゼに注目した。Ｃ−２８及びＣ−１６αオキシダーゼの同定は、公知のトリテルペン酸化Ｐ４５０の相同性に基づく検索によって促進された。他の候補は、２つのＣＹＰ７２ファミリーメンバー（OQHZ-2012357及びOQHZ-2019977）を含む、公知のトリテルペンオキシダーゼとの相同性に基づいて考慮され、その候補に関して、関連するマメ科の種であるタルウマゴヤシにおいてＣ−２３オキシダーゼが同定されている。しかしながら、植物体においてクローニング及び試験をすると、これらの候補のいずれも、β−アミリン、又はそのＣ−２８／Ｃ−１６α酸化誘導体に対して明らかな活性を示さなかった（データは示さず）。
【０２０４】
その結果、傑出したＱ．サポナリアＣ−２３オキシダーゼは、以前にトリテルペン酸化に関与していなかったＰ４５０ファミリー内にある可能性があることが推測された。
【０２０５】
したがって、１ＫＰトランスクリプトームデータを、全ての推定シトクロムＰ４５０について検索した。
【０２０６】
約１５０個のＰ４５０をコードするコンティグがデータセットにおいて見出された。これらのうち、３５個が全長酵素をコードしているようであった（約１５００ｂｐ、表５参照）。
【０２０７】
【表３】
2021510495.tif 000004
【０２０８】
表５：Ｑ．サポナリア１ＫＰデータセットにおいて表した３５個全ての全長シトクロムＰ４５０のリスト。推定ファミリー／クラン（clan）をＧｅｎｂａｎｋ  ＢＬＡＳＴ検索に基づいて割り当てた。一次代謝に関与すると予測される候補は、それ以上検討しなかった。この結果、２５個の最終候補が得られた（「クイックリファレンス」欄）。ここで使用した候補の名称は、独立してアセンブルされたトランスクリプトームのコンティグ数から導き出されることに留意されたい。その結果、この数は、ＣＹＰ７１６／ＣＹＰ７２酵素について以前に使用されたものとは異なる命名システムになる。
【０２０９】
これらの全長コンティグの中には、上記されているＣ−２８及びＣ−１６αオキシダーゼが存在した。したがって、傑出したＣ−２３オキシダーゼもまた、これらの配列内に表されている可能性があることが推論された。
【０２１０】
３５個のＰ４５０候補を、他の種由来の命名したＰ４５０に対するそれらの相同性に基づいて推定クラン及びファミリーにさらに割り当てた（表５）。多くの候補は一次代謝に関与することが予測され（そしてシロイヌナズナ属などの関連していない種由来の酵素に対して高度の配列保存性を共有していた）、この後、リストから除外した。
【０２１１】
これにより、２５個の候補の最終リストが得られ、それらについてクローニングプライマーを注文した。参照を容易にするために、これらは、表５において１〜２５の番号が付けられ、これらの番号を使用して本明細書に記載している。
【０２１２】
次に２５個の候補のＰＣＲ増幅を試みた。以前の候補と同様に、２つのＰＣＲを、それぞれ葉（L）及び根（R）の両方に由来するｃＤＮＡ鋳型を使用して各候補について実施した。強力なＰＣＲ産物を、２５個の候補のうち２０個について首尾良く産生した（データは示さず）。続いて、これらを（葉cDNA鋳型試料から）精製し、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＤＯＮＲ２０７にクローニングした。
【０２１３】
候補を配列決定して、正確な遺伝子がクローニングされていることを検証した。ほとんどの場合、クローニングした配列は予測された配列とほぼ一致した。いくらかの冗長性がクローンの間で見出された；＃６及び＃７の配列は、＃１６及び＃１７と同様に同一であることが見出された。元のトランスクリプトームデータにおける予測配列をチェックすると、これらの対についてのコンティグは非常に類似しており、プライマーはそれらを区別するように設計されていなかったことが分かった。それにもかかわらず、クローンを別々として処理し、ｐＥＡＱ−ＨＴ−ＤＥＳＴ１バイナリーベクターにクローニングし、その後、Ａ．ツメファシエンスにおいて形質転換した。
【０２１４】
次に、１５個の候補をベンサミアナタバコにおいて一過性発現させた。まず、候補を、Ｑ．サポナリアβ−アミリンシンターゼ（QsbAS）との共発現によってβ−アミリンを酸化するそれらの可能性について評価した。新規産生物は、ＧＣ−ＭＳ分析によってこれらの試料では検出されなかった。したがって、ＱｓｂＡＳ及びＣ−２８オキシダーゼ（CYP716-2073932）との共発現によって、オレアノール酸を酸化するそれらの能力について候補をさらに評価した。このときに、候補＃６及び＃７を発現する葉の抽出物において明確な新規産生物を検出することができた（６及び７は上記されているように同じ酵素をコードする）。新規産生物は、２３−ヒドロキシ−オレアノール酸（別名ヘデラゲニン）の標準物と同一の保持時間及び質量スペクトルを有した。候補＃７によってコードされた酵素は、ＣＹＰ７１４ファミリーメンバー（まだ正式に命名されていない）であると予測される。現在特許請求されている優先日以前には、このファミリーのメンバーは、トリテルペンオキシダーゼであると報告されていないと考えられる。優先日以降、他の例が報告されている（例えば、Kim et. al (2018). 「A Novel Multifunctional C-23 Oxidase, CYP714E19, Is Involved in Asiaticoside Biosynthesis」. Plant Cell Physiol.）１２００〜１２１３頁。
【０２１５】
配列は、配列番号７及び８として付録Ａに含まれる。
【０２１６】
Ｃ−２３候補はこのデータの本発明者ら自身のアセンブリから誘導されたので、１ＫＰデータセットにおける対応する配列をＢＬＡＳＴｎによって検索した（https://db.cngb.org/blast4onekp/）。驚くべきことに、＃７はこのデータベースにおいて全長配列によって表されていないが、いくつかのより小さいコンティグが戻される（表６）。これらからのトップヒットは、ＯＨＱＺ−２０１８６８７、８２１ｂｐコンティグである。
【０２１７】
【表４】
2021510495.tif 000005
【０２１８】
表６：Ｃ−２３オキシダーゼのＢＬＡＳＴｎクエリーから戻される１ＫＰデータセットからのコンティグのリスト。トップスコアのヒットはＯＱＨＺ−２０１８６８７である。
【０２１９】
実施例５  −  Ｑ．サポナリア酵素によるコンビナトリアル生合成はベンサミアナタバコにおけるキラ酸の合成を可能にする
上記されているＱ．サポナリア由来のβ−アミリンシンターゼ並びにＣ−２８、Ｃ−１６α及びＣ−２３オキシダーゼは、一緒に発現される場合、キラ酸を産生するのに十分でなければならない（図２参照）。
【０２２０】
Ｑ．サポナリア由来のＣ−２３オキシダーゼを試験する前に、Ｑ．サポナリア由来の他の候補遺伝子を、他の種から特徴付けたＣ−２３  β−アミリンオキシダーゼ、すなわち、タルウマゴヤシ（バーレル・メディック（barrel medic））由来のＣＹＰ７２Ａ６８ｖ２及びアウェナ・ストリゴサ（Avena strigosa）（ブラックオーツ麦（black oat））由来のＣＹＰ９４Ｄ６５（配列番号１３〜１６）と組み合わせた。
【０２２１】
この最初の実験では、Ｑ．サポナリア由来のＱｓｂＡＳ及び２つのＣＹＰ７１６酵素を、ベンサミアナタバコにおける一過性発現を使用してタルウマゴヤシ及びＡ．ストリゴサＣ−２３オキシダーゼと組み合わせて、キラ酸をこれらの試料において観察することができるかどうかを決定した。ＬＣ−ＭＳ−ＣＡＤ分析により、
・ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６−２０７３９３２／ＣＹＰ７１６−２０１２０９０／ＣＹＰ７２Ａ６８ｖ２
・ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６−２０７３９３２／ＣＹＰ７１６−２０１２０９０／ＣＹＰ９４Ｄ６５
の組み合わせの両方のセットが、キラ酸標準物の保持時間及び質量スペクトルに一致する新規産生物の出現をもたらすことが明らかになった（結果は示さず）。
【０２２２】
キラ酸の存在量は、ＣＹＰ７２Ａ６８ｖ２を発現する試料において最も多いようであった。
【０２２３】
他の関連産生物もまた、これらの試料において観察された：オーツ麦Ｃ−２３オキシダーゼ（CYP94D65）を発現する組合せでは、最も豊富な新たなピークはカウフィロゲニン（キラ酸に見られるアルデヒドの代わりにＣ−２３アルコール）と同定されたが、ウマゴヤシ属（Medicago）Ｃ−２３オキシダーゼ（CYP72A68v2）は、１６α−ヒドロキシギプソゲニン（キラ酸に見られるアルデヒドの代わりにＣ−２３カルボン酸）の十分な蓄積を生じた。
【０２２４】
Ｑ．サポナリア酵素の排他的使用によりベンサミアナタバコにおいてキラ酸が産生され得ることを検証するために、ＱｓｂＡＳ酵素をＰ４５０の種々の組合せにより一過性発現させた。予測されるように、全てのＰ４５０と共にＱｓｂＡＳを共発現する葉の分析により、キラ酸標準物の保持時間及び質量スペクトルに一致するピークの出現がもたらされた。このピークは、全経路よりも少ない経路を発現する葉由来の試料には存在しなかった（図７）。
【０２２５】
さらに、酵素の完全なＱ．サポナリア相補体を発現する本発明の試料と、タルウマゴヤシ及びオーツ麦由来のＣ−２３オキシダーゼが使用されている同等の（保存された）試料との間で比較を行った。これにより、Ｑ．サポナリアＣ−２３オキシダーゼを発現する試料においてキラ酸の量が最も多いようであることが明らかになった（図８）。Ｑ．サポナリアＣ−２３オキシダーゼを発現する試料はまた、望ましくない推定副産物であるカウフィロゲニン及び１６α−ヒドロキシギプソゲン酸をかなり少なく含有するようであった（図８）。これらの代謝産物は、オーツ麦及びウマゴヤシ属の酵素の異なるＣ−２３オキシダーゼ特異性を反映し、それらはそれぞれ主にＣ−２３アルコール及び酸を作製する。したがって、Ｑ．サポナリアＣ−２３オキシダーゼは、ＱＳ−２１生合成におけるその予測される機能を反映して、Ｃ−２３アルデヒドに対してさらにいっそう特異的であるようである。
【０２２６】
実施例６  −  酵母におけるＱ．サポナリア遺伝子の発現
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、商業的ＱＡ産生のための宿主体（host chassis）として利用することができる。
【０２２７】
したがって、本発明者らは、クローニングしたキラヤ遺伝子がこの宿主において活性であることを実証した。Ｓ２８８Ｃ（遺伝子型：MATa/MATα;ura3Δ0/ura3Δ0;leu2Δ0/leu2Δ0;his3Δ1/his3Δ1;met15Δ0/MET15;LYS2/lys2Δ0;YHR072w/YHR072w::kanM）に由来するＳ．セレビシエの株を使用し、これは３つ以下のプラスミドからの遺伝子の発現を可能にする３つの栄養要求性選択マーカー（-URA/-HIS/-LEU）を含有する。
【０２２８】
ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（ウラシル選択）、ｐＡＧ４２３（ヒスチジン選択）及びｐＡＧ４３５（ロイシン選択）を含む、３つのＧａｔｅｗａｙ適合性酵母発現ベクターを利用した。
【０２２９】
Ｑ．サポナリア酵素を、表７に記載されるようにこれらのベクター内に組換えた。簡潔に述べると、β−アミリンシンターゼ（QsbAS）をｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２ベクター内に組換え、一方、Ｃ−２８オキシダーゼ（CYP716-2073932）及びＣ−１６αオキシダーゼ（長い（L）及び短い（S）アイソフォームの両方）をｐＡＧ４２３内に組換えた。
【０２３０】
シトクロムＰ４５０の機能効率を高めるために、第３のプラスミド（pAG435）を使用してシロイヌナズナシトクロムＰ４５０レダクターゼ２（AtATR2）酵素を発現させた。これは、植物Ｐ４５０を還元して基質酸化後に活性状態に戻すための補酵素として役立つ。全てのベクターは、挿入遺伝子を発現するためのガラクトース誘導性プロモーターを含有する。
【０２３１】
【表５】
2021510495.tif 000006
【０２３２】
表７：生成した酵母株のリスト。
【０２３３】
酵母株を、ガラクトースを含む合成酵母培地中で培養し、３０℃にて２日間インキュベートした。株を遠心分離によってペレット化し、鹸化し、代謝産物を酢酸エチルで抽出した。ＧＣ−ＭＳ分析により、全ての株が１０．６分にてβ−アミリンと同定されたピークを蓄積したことが明らかとなった（図９）。株６３（Ｃ−２８オキシダーゼを発現する）は、オレアノール酸（１２．０１分）及び中間体Ｃ−２８アルコールエリトロジオール（１１．５１分）を含む、Ｃ−２８酸化β−アミリン誘導体と同定された少量のさらなる産生物を蓄積することが見出された（図９、上から２番目のトレース）。株６４又は６５（Ｃ−１６αオキシダーゼアイソフォームを発現する）において、１６−ヒドロキシ−β−アミリンと容易に同定され得る産生物は同定されず、このことは、この酵素についての最適な基質ではないかもしれないことを意味する。
【０２３４】
上記のデータは、酵母がキラ酸前駆体を産生するように操作され得ることを実証する。
【０２３５】
実施例７  −  安定な形質転換によるＱＡの産生
トリテルペンは、操作されたトランスジェニック植物系統（例えば、シロイヌナズナ属、小麦）を使用して以前に産生されている。多重遺伝子ベクターの構築を可能にし、全経路の単一遺伝子座への組込みを可能にする一連のＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ［２３］ベクターが報告されている。これらは、本明細書の開示に照らして、本発明に類似的に適用することができる。
【０２３６】
実施例８  −  実施例１〜７からの結論
キラ酸はトリテルペノイドであり、キラヤ・サポナリアによって産生されるサポニンＱＳ−２１の重要な前駆体である。
【０２３７】
ここで、Ｑ．サポナリア由来の４つの酵素（β−アミリンシンターゼ並びにＣ−１６α、Ｃ−２３及びＣ−２８オキシダーゼ）を同定し、それらは、ベンサミアナタバコにおいて一過性発現させると、キラ酸を産生することができた。これらの酵素は、キラ酸足場の生成に必要とされる、ＱＳ−２１生合成経路の初期段階に関与することが予測される（図１）。
【０２３８】
本明細書に記載される産生物の同定は、真正標準物の使用によって検証され、これらの結果に高い信頼度を与えた。
【０２３９】
キラ酸の生合成におけるβ−アミリンシンターゼ（QsbAS）並びにＣ−２８、Ｃ−２３及びＣ−１６α位にてβ−アミリンを酸化する３つのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（monoxygenase）（それぞれ、本明細書においてCYP716-2073932、CYP714-7及びCYP716-2012090と称する）の活性を図１２に模式的に示す。
【０２４０】
実施例９  −  ベンサミアナタバコにおけるキラ酸産生の推定
一過性発現後のベンサミアナタバコにおけるキラ酸産生を推定するために、ＬＣ−ＣＡＤによる分析を実行した。Ｑ．サポナリアβ−アミリンシンターゼ並びにＣ−１６α、Ｃ−２３及びＣ−２８オキシダーゼを使用して、以前に記載されるように、アグロインフィルトレーションを実施した。対照として、２つのみの（Ｃ−２３及びＣ−２８）オキシダーゼをインフィルトレーションされた葉を使用し、キラ酸の代わりにギプソゲニンを蓄積させた（図１２）。
【０２４１】
オーツ麦ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（tHMGR）もまた、β−アミリンの産生を増加させるので、全てのインフィルトレーションに含まれた。これらの試料からの代表的なクロマトグラムを図１３に示す。異なる植物からの３つの葉を、生物学的複製物として各試験条件について使用した。
【０２４２】
これらの葉におけるキラ酸の産生を推定するために、キラ酸ピークの面積を、内部標準物（１．１ｍｇ／ｇ乾燥葉重量に含まれる）の面積と比較した。３つの複製物からの平均値は、１．４４ｍｇ／ｇであることが見出された。
【０２４３】
実施例１０  −  ベンサミアナタバコからのキラ酸の精製
キラ酸産生がベンサミアナタバコにおいて達成されていることを明確に決定するために、産生物の精製を行った。
【０２４４】
Ｑ．サポナリアβ−アミリンシンターゼ、Ｃ−１６α、Ｃ−２３及びＣ−２８オキシダーゼを有するｐＥＡＱ−ＨＴ−ＤＥＳＴ１構築物を保有するＡ．ツメファシエンスを、合計２０９個のベンサミアナタバコ植物にバキュームインフィルトレーションした。オーツ麦ｔＨＭＧＲもまた、収率を高めるために含んだ。インフィルトレーションの４日後に葉を収集し、凍結乾燥後に１５０．３ｇの乾燥物質を得た。Ｂｕｃｈｉ  Ｓｐｅｅｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｅ−９１４を使用して代謝産物をエタノールで抽出し、数ラウンドのシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを使用して合計３０ｍｇの産生物を単離した。単離した産生物は、ＬＣ−ＭＳ（図１４）及びＧＣ−ＭＳ（図１５）によって真正キラ酸標準物（Extrasynthese）のものと同一の保持時間及び質量スペクトルを有することが見出された。さらに、単離した産生物の１Ｈ  ＮＭＲ分光分析もまた、キラ酸標準物と一致した（図１６）。
【０２４５】
このことにより、キラ酸が、Ｑ．サポナリア酵素の一過性発現を介するベンサミアナタバコにおける一過性発現を介して産生され得ることが確認される。産生物の単離収率は０．２ｍｇ／ｇ乾燥重量の範囲であったが、試料中には少量の不純物が検出された。この収率は、実施例９におけるＬＣ−ＣＡＤからの推定収率よりも低く、この単離プロセスの間の産生物の喪失を示す。それにもかかわらず、これは、現在特徴付けられている酵素を使用してベンサミアナタバコから実用的な量のキラ酸を産生し、単離することができることを実証している。
【０２４６】
方法
インフィルトレーション
以前に記載される（Reed et al., 2017）、無針注射器を使用してアグロインフィルトレーションを実施した。全ての遺伝子は、Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４においてｐＥＡＱ−ＨＴ−ＤＥＳＴ１バイナリー発現ベクター（Sainsbury et al., 2009）から発現させた。全ての植物は、オーツ麦ｔＨＭＧＲ、キラヤβ−アミリンシンターゼ（QsbAS）、並びにβ−アミリンＣ−２８（CYP716-2073932）及びＣ−１６α（CYP716-2012090S）オキシダーゼを共発現した。キラ酸産生のために、緑色蛍光タンパク質（GFP）を対照の代わりに使用しながら、Ｃ−２３（CYP714-7）オキシダーゼも共発現させた。細菌及び植物の培養は、（Reed et al., 2017）に記載される通りである。試験条件ごとに３つの植物がインフィルトレーションされ、生物学的複製物として別々に分析した。
【０２４７】
ＬＣ−ＭＳ分析
葉をアグロインフィルトレーションの５日後に収集し、凍結乾燥した。凍結乾燥した葉材料（試料当たり１０ｍｇ）を１０００ｒｐｍにて１分間粉砕した（Geno/Grinder 2010, Spex SamplePrep）。抽出は、ジギトキシン（内部標準物；Sigma）２０μｇ／ｍＬを含む８０％メタノール５５０μＬ中で、４０℃にて２０分間、１４００ｒｐｍにて振盪（Thermomixer Comfort, Eppendorf）しながら実行した。試料をヘキサン４００μＬで２回分配した。水相を真空下で４０℃にて乾燥させた（EZ-2 Series Evaporator、Genevac）。乾燥材料を１００％メタノール７５μＬ中で再懸濁し、１２，５００ｇにて３０秒間濾過した（0.2μm, Spin-X, Costar）。濾過した試料をガラスバイアルに移し、以下に詳述するように分析した。
【０２４８】
ベンサミアナタバコ葉抽出物の調製
シングル四重極質量分析計ＬＣＭＳ−２０２０（Shimadzu）及びＣｏｒｏｎａ  Ｖｅｏ  ＲＳ荷電化粒子検出器（CAD）（Dionex）を備えるＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムを使用して分析を実行した。検出：ＭＳ（デュアルＥＳＩ／ＡＰＣＩイオン化、ＤＬ温度２５０℃、ネブライザーガス流量１５Ｌ．ｍｉｎ−１、ヒートブロック温度４００℃、スプレー電圧ポジティブ４．５ｋＶ、ネガティブ−３．５ｋＶ）ＣＡＤ：データ収集速度１０Ｈｚ、フィルター定数３．６秒、９２５エバポレーター温度３５℃、イオントラップ電圧２０．５Ｖ。方法：溶媒Ａ：［Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸］溶媒Ｂ：［アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）＋０．１％ギ酸。注入量：１０μＬ。勾配：１５％［Ｂ］０〜１．５分、１５％〜６０％［Ｂ］１．５〜２６分、６０％〜１００％［Ｂ］２６〜２６．５分、１００％［Ｂ］２６．５〜２８．５分、１００％〜１５％［Ｂ］２８．５〜２９分、３５％［Ｂ］２９〜３０分。０．３ｍＬ．ｍｉｎ−１の流速及びＫｉｎｅｔｅｘカラム２．６μｍ  ＸＢ−Ｃ１８  １００Å、５０×２．１ｍｍ（Phenomenex）を使用して方法を実施した。
【０２４９】
ベンサミアナタバコ葉抽出物の分析
ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェア（Shimadzu）を使用して分析を実施した。産生物収率の推定値を得るために、キラ酸についてのピーク面積（CADによって決定した）を内部標準物（ジギトキシン、１．１μｇ／ｍｇ乾燥葉組織）の面積で割った。結果を３つの複製物から平均化した。キラ酸と同じ保持時間を有する内因性ベンサミアナタバコ産生物についての微小ピークが対照において観察された（計算した平均値０．２５μｇ／ｍｇ）。したがって、この値を推定キラ酸収率から差し引いた。
【０２５０】
ラージスケールインフィルトレーション
ｔＨＭＧＲ、ＱｓｂＡＳ、ＣＹＰ７１６−２０７３９３２、ＣＹＰ７１６−２０１２０９０Ｓ及びＣＹＰ７１４−７オキシダーゼを使用して上記に詳述したようにアグロインフィルトレーションを実行した。合計２０９個の植物が以前に記載されるように（Reed et al., 2017）真空によってインフィルトレーションされ、４日後に収集した。
【０２５１】
ベンサミアナタバコからのキラ酸の精製
ラージスケールインフィルトレーションからの葉を収集し、凍結乾燥し、プログラムが４サイクル（１００℃及び１３０バール圧力）を含むことを除いて、（Reed et al., 2017）に詳述されているようにＳｐｅｅｄＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｅ−９１４（Ｂｕｃｈｉ）を使用して抽出を実施した。サイクル１（ヘキサン）は保持時間がゼロであり、サイクル２〜４（エタノール）は保持時間が５分であった。２分の溶媒フラッシュ及び６分のＮ２フラッシュで運転を終了した。抽出物のヘキサン部分を捨て、後続のフラッシュクロマトグラフィーについてエタノール部分を使用し、以下に示した個々のカラムの詳細と共にＩｓｏｌｅｒａ  Ｏｎｅ（Biotage）を使用して実施した。各カラム後のキラ酸について、（Reed et al., 2017）に詳述されているようにＧＣ−ＭＳ及び薄層クロマトグラフィー（TLC）によって画分をチェックした。各段階において、最も純粋な画分をプールし、後続のカラムへ負荷するためにシリカゲル６０（Material Harvest）上で乾燥させた。カラム１：ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ５０ｇ（Biotage）、流速：１００ｍＬ／分、以下の勾配による９０ｍＬ画分：溶媒Ａ：［ヘキサン］溶媒Ｂ：［酢酸エチル］；勾配：１０カラム体積にわたって５％［Ｂ］〜１００％［Ｂ］、及びさらに５カラム体積について１００％［Ｂ］にて保持。カラム２：ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ５０ｇカラム（Biotage）、流速１００ｍＬ／分、以下の勾配による９０ｍＬ画分：溶媒Ａ：［ジクロロメタン］溶媒Ｂ：［酢酸エチル］；１０カラム体積にわたって１０％［Ｂ］〜６０％［Ｂ］、及びさらに２カラム体積について１００％［Ｂ］にて保持。カラム３：ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  １０ｇ（Biotage）、流速：３６ｍＬ／分、カラム２と同じ勾配による１７ｍＬ画分。カラム３の後、画分を活性炭により処理して着色不純物を除去し、カラム４に負荷した。カラム４：２０カラム体積にわたってジクロロメタン中の１５％酢酸エチルのイソクラティック移動相を用いたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  １０ｇカラム（Biotage）（３６ｍＬ／分、１７ｍＬ画分）。プールした画分を、ＴＬＣプレート上のストリーキングを減少させるのに役立つ少量のＨＣｌ（エタノール約４０ｍＬ中の濃ＨＣｌ４００μＬ）により処理した。カラム５：３０カラム体積にわたってジクロロメタン中の１５％酢酸エチルのイソクラティック移動相を用い、５カラム体積にわたって１００％酢酸エチルの最終フラッシュを用いたＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  １０ｇカラム（Biotage）（３６ｍＬ／分、１７ｍＬ画分）。最も純粋な画分をプールし、乾燥させて、少量の黄色不純物を含む３０ｍｇの白色粉末を得た。これを以下のようにＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲによって分析した。
【０２５２】
精製したキラ酸のＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲ分析。
ＧＣ−ＭＳ分析を、（Reed et al., 2017）に記載されるように実施した。ＬＣ−ＭＳ分析をキラ酸定量について上記のように実施した。ＮＭＲスペクトルを、重水素化メタノール中の１Ｈ  ＮＭＲについて４００ＭＨｚの公称周波数にてフーリエ変換モードにおいて記録した。各分析法について、キラ酸標準物（Extrasynthese）を比較のために使用した。
【０２５３】
材料及び方法についての参考文献
Reed J, Stephenson MJ, Miettinen K, Brouwer B, Leveau A, Brett P, Goss RJM, Goossens A, O'Connell MA, Osbourn A. 2017. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metab Eng 42: 185-193.
Sainsbury F, Thuenemann EC, Lomonossoff GP. 2009. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnol J 7(7): 682-693.
【０２５４】
他の参考文献
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3.  Miettinen, K., et al., The ancient CYP716 family is a major contributor to the diversification of eudicot triterpenoid biosynthesis. Nat Commun, 2017. 8: p. 14153.
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5.  Reed, J., et al., A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metab Eng, 2017.
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【０２５５】
付録Ａ：配列表及び配列
表１−Ｑ．サポナリア配列
クローン数とは、元の１ＫＰトランスクリプトームアセンブリからのコンティグ数を指す（https://db.cngb.org/blast4onekp/）
【０２５６】
【表６】
2021510495.tif 000007
【０２５７】
表２−非Ｑ．サポナリア配列
キラル酸に見出される関連位置（１６α、２８、２３）においてβ−アミリン（又はその誘導体）を酸化するシトクロムＰ４５０。太字で命名された酵素は、ベンサミアナタバコにおける一過性発現によって試験され、参照された研究によって報告されたものと一致する産生物を生成することが見出された。
【０２５８】
最初の前にある遺伝子名は以下の通りの種である：Ａｓ−アウェナ・ストリゴサ、Ａｔ−シロイヌナズナ、Ｂｆ−ミシマサイコ、Ｂｖ−ハルザキヤマガラシ（Barbarea vulgaris）、Ｃｑ−キヌア（Chenopodium quinoa）、Ｃｒ−ニチニチソウ（Catharanthus roseus）、Ｍｄ−リンゴ（Malus domestica）、Ｍｌ−マエサ・ランセオラタ（Maesa lanceolata）、Ｍｔ−タルウマゴヤシ、Ｐｇ−オタネニンジン（Panax ginseng）、Ｖｖ−ヨーロッパ・ブドウ（Vitis vinifera）。
【０２５９】
【表７】
2021510495.tif 000008
【０２６０】
【表８】
2021510495.tif 000009
【０２６１】
【表９】
2021510495.tif 000010
【０２６２】
【表１０】
2021510495.tif 000011
【０２６３】
表３−アクセサリー酵素
【０２６４】
【表１１】
2021510495.tif 000012
【０２６５】
表４−１ＫＰデータセットにおいて見出された遺伝子配列と、本開示におけるＱ．サポナリア植物からＰＣＲによって得られた配列決定クローンとの比較
【０２６６】
【表１２】
2021510495.tif 000013
【０２６７】
表８
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（バージョン1.2.4-https://www.ebi.ac.ukを介してアクセスした）を使用して１８個のＰ４５０のペアワイズアラインメントを行った。表の数字は遺伝子間のアミノ酸同一性パーセンテージを表す。配列を機能に従って体系化し、本明細書において特徴付けたＱ．サポナリア遺伝子を太字で示す。全てのペアワイズ値を２回表し、したがって冗長配列を灰色の背景で表に右上に示す。表は、提示を容易にするために２頁に分割されている。
【０２６８】
【表１３】
2021510495.tif 000014
【０２６９】
表８（続き）
【０２７０】
【表１４】
2021510495.tif 000015
【０２７１】
配列番号１−Ｑ．サポナリアβ−アミリンシンターゼ、ＱｓｂＡＳ（OQHZ-2074321）コード配列（２２７７ｂｐ）：
【０２７２】
【化１】
2021510495.tif 000016
【０２７３】
配列番号２−ＱｓｂＡＳ（OQHZ-2074321）翻訳ヌクレオチド配列（７５８ａａ）：
【０２７４】
【化２】
2021510495.tif 000017
【０２７５】
配列番号３−ＱｓＣＹＰ７１６＿２０７３９３２（OQHZ-2073932）（以前にCYP716A224と命名されたＣ−２８オキシダーゼ［３］）コード配列（１４４３ｂｐ）：
【０２７６】
【化３】
2021510495.tif 000018
【０２７７】
配列番号４−ＱｓＣＹＰ７１６＿２０７３９３２（OQHZ-2073932）翻訳ヌクレオチド配列（４８０ａａ）：
【０２７８】
【化４】
2021510495.tif 000019
【０２７９】
配列番号５−ＱｓＣＹＰ７１６＿２０１２０９０（OQHZ-2012090）（Ｃ−１６αオキシダーゼ）コード配列（１５０６ｂｐ／１４４３ｂｐ）：
本明細書に記載されるＮＢの長い及び短いアイソフォームは、以下の配列において下線を引いている最初の６３ヌクレオチド（２１アミノ酸）の存在によって区別される。
【０２８０】
【化５】
2021510495.tif 000020
【０２８１】
配列番号６−ＱｓＣＹＰ７１６＿２０７３９３２翻訳ヌクレオチド配列（５０１ａａ／４８０ａａ）：
【０２８２】
【化６】
2021510495.tif 000021
【０２８３】
配列番号７−ＱｓＣＹＰ７１４＿ｃ３６３６８（Ｃ−２３候補＃７）コード配列（１５２４ｂｐ）：
【０２８４】
【化７】
2021510495.tif 000022
【０２８５】
配列番号８−ＱｓＣＹＰ７１４＿ｃ３６３６８（Ｃ−２３候補＃７）翻訳ヌクレオチド配列（５０７ａａ）：
【０２８６】
【化８】
2021510495.tif 000023
【０２８７】
配列番号９；ＢｆＣＹＰ７１６Ｙ１（ミシマサイコＣ−１６αオキシダーゼ）コード配列（１４３７ｂｐ）：
【０２８８】
【化９】
2021510495.tif 000024
【０２８９】
配列番号１０；ＢｆＣＹＰ７１６Ｙ１（ミシマサイコＣ−１６αオキシダーゼ）コード配列（４７８ａａ）：
【０２９０】
【化１０】
2021510495.tif 000025
【０２９１】
配列番号１１；ＭｌＣＹＰ８７Ｄ１６（マエサ・ランセオラタＣ−１６αオキシダーゼ）コード配列（１４２８ｂｐ）：
【０２９２】
【化１１】
2021510495.tif 000026
【０２９３】
配列番号１２；ＭｌＣＹＰ８７Ｄ１６（マエサ・ランセオラタＣ−１６αオキシダーゼ）コード配列（４７５ａａ）：
【０２９４】
【化１２】
2021510495.tif 000027
【０２９５】
配列番号１３；ＭｔＣＹＰ７２Ａ６８ｖ２（タルウマゴヤシＣ−２３オキシダーゼ）コード配列（１５６３ｂｐ）：
【０２９６】
【化１３】
2021510495.tif 000028
【０２９７】
配列番号１４；ＭｔＣＹＰ７２Ａ６８ｖ２（タルウマゴヤシＣ−２３オキシダーゼ）翻訳ヌクレオチド配列（５２０ａａ）：
【０２９８】
【化１４】
2021510495.tif 000029
【０２９９】
配列番号１５；ＡｓＣＹＰ９４Ｄ６５（アウェナ・ストリゴサＣ−２３オキシダーゼ）コード配列（１５５１ｂｐ）：
【０３００】
【化１５】
2021510495.tif 000030
【０３０１】
配列番号１６；ＡｓＣＹＰ９４Ｄ６５（アウェナ・ストリゴサＣ−２３オキシダーゼ）翻訳ヌクレオチド配列（５１６ａａ）：
【０３０２】
【化１６】
2021510495.tif 000031
【０３０３】
配列番号１７；ＭｔＣＹＰ７１６Ａ１２（タルウマゴヤシＣ−２８オキシダーゼ）コード配列（１４４０ｂｐ）：
【０３０４】
【化１７】
2021510495.tif 000032
【０３０５】
配列番号１８；ＭｔＣＹＰ７１６Ａ１２（タルウマゴヤシＣ−２８オキシダーゼ）コード配列（４７９ａａ）：
【０３０６】
【化１８】
2021510495.tif 000033
【０３０７】
配列番号２９；ＡｓＨＭＧＲ（アウェナ・ストリゴサHMG-CoAレダクターゼ）コード配列（１６８９ｂｐ）：
ＮＢ：全長ＨＭＧＲ配列を以下に提供する。５’領域（下線）を除去して切断型フィードバック非感受性形態（tHMGR）を生成することができる。ｔＨＭＧＲについての配列もまた、以下に別々に示す。
【０３０８】
【化１９】
2021510495.tif 000034
【０３０９】
配列番号３０；ＡｓＨＭＧＲ（アウェナ・ストリゴサHMG-CoAレダクターゼ）翻訳ヌクレオチド配列（５６２ａａ）：
【０３１０】
【化２０】
2021510495.tif 000035
【０３１１】
配列番号３１；ＡｓｔＨＭＧＲ（アウェナ・ストリゴサ切断型HMG-CoAレダクターゼ）コード配列（１２７５ｂｐ）：
【０３１２】
【化２１】
2021510495.tif 000036
【０３１３】
配列番号３２；ＡｓｔＨＭＧＲ（アウェナ・ストリゴサ切断型HMG-CoAレダクターゼ）翻訳ヌクレオチド配列（４２４ａａ）：
【０３１４】
【化２２】
2021510495.tif 000037
【０３１５】
配列番号３３；ＡｓＳＱＳ（アウェナ・ストリゴサスクアレンシンターゼ）コード配列（１２１２ｂｐ）：
【０３１６】
【化２３】
2021510495.tif 000038
【０３１７】
配列番号３４；ＡｓＳＱＳ（アウェナ・ストリゴサスクアレンシンターゼ）翻訳ヌクレオチド配列（４０３ａａ）：
【０３１８】
【化２４】
2021510495.tif 000039
【０３１９】
配列番号３５；ＡｔＡＴＲ２（シロイヌナズナシトクロムP450レダクターゼ2）コード配列（２３２５ｂｐ）：
【０３２０】
【化２５】
2021510495.tif 000040
【０３２１】
配列番号３６；ＡｔＡＴＲ２（シロイヌナズナシトクロムP450レダクターゼ2）翻訳ヌクレオチド配列（７７４ａａ）：
【０３２２】
【化２６】
2021510495.tif 000041
【図１】
2021510495.tif 000042
【図２】
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【図３】
2021510495.tif 000044
【図４】
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【図５】
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【図５Ｓ】
2021510495.tif 000047
【図６Ａ】
2021510495.tif 000048
【図６Ｂ】
2021510495.tif 000049
【図７】
2021510495.tif 000050
【図８】
2021510495.tif 000051
【図９】
2021510495.tif 000052
【図１０】
2021510495.tif 000053
【図１１】
2021510495.tif 000054
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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