(57)【要約】  本発明は、コラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物及びこれを含む容器に関し、前記止血用組成物及びこれを含む容器は、単純な使用方法で時間を争う出血患者に適用することができ、毒性がなくて血液の感染に対する問題点がないとともに、生体分解速度が速く、止血効果に優れて、止血剤として有用に使用できる。
2021504097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物であって、
前記コラーゲンとトロンビンの間に安定化剤が配置されてコラーゲンとトロンビンが分離された止血用組成物。
【請求項２】
前記コラーゲンは、架橋されたコラーゲンであることを特徴とする請求項１に記載の止血用組成物。
【請求項３】
前記架橋されたコラーゲンは、
Ｓ１）コラーゲンをエタノール又はメタノールに処理する段階と、
Ｓ２）前記Ｓ１）段階で処理されたコラーゲンに酸を添加してｐＨ２〜４のコラーゲン溶液として製造する段階と、
Ｓ３）前記Ｓ２）段階から製造されたコラーゲン溶液を中性状態にした後、遠心分離してエステル化コラーゲンを製造する段階と、
Ｓ４）前記Ｓ３）段階から製造されたエステル化コラーゲンに架橋剤を添加して架橋されたコラーゲンを製造する段階と、
Ｓ５）前記Ｓ４）段階から製造された架橋されたコラーゲンを精製水に分散させた後、凍結乾燥させる段階とを含む製造方法により製造されたことを特徴とする請求項２に記載の止血用組成物。
【請求項４】
前記架橋されたコラーゲンの分子量は１００，０００ないし１，０００，０００Ｄａｌｔｏｎであることを特徴とする請求項２に記載の止血用組成物。
【請求項５】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記コラーゲンが４０ないし９７重量％で含まれることを特徴とする請求項１に記載の止血用組成物。
【請求項６】
前記安定化剤は、アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、マンニトール、酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3ＮａＯ2）、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びグリシンから選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の止血用組成物。
【請求項７】
前記安定化剤は、マンニトールであることを特徴とする請求項６に記載の止血用組成物。
【請求項８】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記安定化剤が１ないし３０重量％で含まれることを特徴とする請求項１に記載の止血用組成物。
【請求項９】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記トロンビンが２ないし５０重量％で含まれることを特徴とする請求項１に記載の止血用組成物。
【請求項１０】
前記止血用組成物は、粉末剤形態であることを特徴とする請求項１に記載の止血用組成物。
【請求項１１】
請求項１から請求項１０のいずれか１項の止血用組成物を含む容器。
【請求項１２】
コラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物が充填された第１容器と、
希釈液が充填された第２容器とを含む止血用キットであって、
前記第１容器は、コラーゲンとトロンビンの間に安定化剤が配置されてコラーゲンとトロンビンが分離された止血用キット。
【請求項１３】
前記希釈液は、精製水、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）溶液、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、及び酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3ＮａＯ2）溶液からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【請求項１４】
前記希釈液は塩化カルシウム溶液であり、
前記希釈液の総重量に対して、前記塩化カルシウムが０．００１ないし３０重量％で含まれることを特徴とする請求項１３に記載の止血用キット。
【請求項１５】
前記止血用キットは、
第１容器と第２容器が互いに結合して止血用組成物と希釈液が混合されてハイドロゲルを形成し、
前記ハイドロゲルの平均気孔サイズは５０μｍないし２００μｍであることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【請求項１６】
前記ハイドロゲルのｐＨは６ないし８であることを特徴とする請求項１５に記載の止血用キット。
【請求項１７】
前記第１容器にトロンビン、安定化剤、コラーゲンの順に充填されることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【請求項１８】
前記コラーゲンは架橋されたコラーゲンであることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【請求項１９】
前記架橋されたコラーゲンは、
Ｓ１）コラーゲンをエタノール又はメタノールに処理する段階と、
Ｓ２）前記Ｓ１）段階で処理されたコラーゲンに酸を添加してｐＨ２〜４のコラーゲン溶液として製造する段階と、
Ｓ３）前記Ｓ２）段階から製造されたコラーゲン溶液を中性状態にした後、遠心分離してエステル化コラーゲンを製造する段階と、
Ｓ４）前記Ｓ３）段階から製造されたエステル化コラーゲンに架橋剤を添加して架橋されたコラーゲンを製造する段階と、
Ｓ５）前記Ｓ４）段階から製造された架橋されたコラーゲンを精製水に分散させた後、凍結乾燥させる段階とを含む製造方法により製造されることを特徴とする請求項１８に記載の止血用キット。
【請求項２０】
前記架橋されたコラーゲンの分子量は１００，０００ないし１，０００，０００Ｄａｌｔｏｎであることを特徴とする請求項１８に記載の止血用キット。
【請求項２１】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記コラーゲンが４０ないし９７重量％で含まれることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【請求項２２】
前記安定化剤は、アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、マンニトール、酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3ＮａＯ2）、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びグリシンからなる１種以上であることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【請求項２３】
前記安定化剤は、マンニトールであることを特徴とする請求項２２に記載の止血用キット。
【請求項２４】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記安定化剤が１ないし３０重量％で含まれることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【請求項２５】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記トロンビンが２ないし５０重量％で含まれることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【請求項２６】
前記止血用組成物は粉末剤形態であることを特徴とする請求項１２に記載の止血用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１１月２８日付けの大韓民国特許出願第１０−２０１７−０１６０８５８号及び２０１８年１０月２４日付けの大韓民国特許出願第１０−２０１８−０１２７１８３号に基づいた優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
【０００２】
本発明は、止血用組成物及びこれを含む容器に関する。
【背景技術】
【０００３】
シーラント（Sealant）と止血剤（hemostats）を含む組織接着剤分野の研究開発は急速に成長している。１９９８年に米国ＦＤＡでフィブリンシーラント（Ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅａｌａｎｔ）が許可されるにつれて、毎年新しい組織接着剤が開発され続けている。このような組織接着剤は、従来に外科的又は内科的手術において使用されていた縫合術、クリップ術、灸術などの技術を代替できる素材として脚光を浴びている。
【０００４】
縫合術などの従来の外科的な技術は強い伸長力（strong tensile strength）を有するが、患者の苦痛誘発及び施術後に除去などの問題を有している。それに対して、組織接着剤は、速い接着時間、手軽な使用、施術後に除去不要などの数多くの長所を有しているが、低い接着性及び伸張力（low adhesiveness and tensile strength）と、水分が存在する場合は接着性が著しく低下する制限点を有している。このような組織接着剤の限界を克服するための研究が続いている。
【０００５】
組織接着剤は、組織に直接接触するので、生体適合性が要求される。また、医療用接着剤の場合は、通常生体内で使用されるため、接着が本質的に体液と血液中に流れ込むと、生体が直接関与するので、より厳しい条件で毒性と危害性がなく、より厳密な生体適合性と生分解性の素材が要求される。
【０００６】
現在商用化及び／又は実用化されている組織接着剤は、シアノアクリレート瞬間接着剤、フィブリングルー、ゼラチングルー及びポリウレタン系などに大別される。シアノアクリレート瞬間接着剤は、最近になって高機能性及び高性能を有する瞬間接着剤の研究で脚光を浴びている。特に、生体適合性、柔軟性及び低毒性の生体組織縫合用の医療用瞬間接着剤は、止血、抗菌効果だけでなく縫合糸の代替も可能であるので、先進国を中心に研究が活発に行われている。
【０００７】
このようなシアノアクリレート系組織接着剤は、現在、ダーマボンド（Ｄｅｒｍａｂｏｎｄ：Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ社）とインダーミル（Ｉｎｄｅｒｍｉｌ：ＵＳ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ社）などの製品として商用化されている。このようなシアノアクリレート系組織接着剤は、単一物質であって短時間で室温で開始剤なしに水分により硬化し、外観が透明で接着強度が大きいという長所があるが、衝撃に弱く、耐熱性に低下する短所を有している。また、毒性が激しくて現在はほとんど使用されておらず、米国を除いた他の国において臨床で部分的に使用しているが、一部の組織毒性と脆弱性のため、使用が制限されている。
【０００８】
また、フィブリングルー接着剤は、最初に１９９８年に米国ＦＤＡにより心臓外科への応用が許可された。その以後、フィブリン組織接着剤に対する研究開発が活発に行われ、現在Ｔｉｓｓｅｅｌ  ＶＨ（Ｂａｘｅｒ社）とＥｖｉｃｅｌ  ＴＭ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ社）などの製品が商用化されている。フィブリン系組織接着剤は、シアノアクリレート系とともに組織接着剤の市場の大部分を占めている。フィブリン組織接着剤は、フィブリンの架橋反応を利用してフィブリノーゲン、トロンビン、塩化カルシウム及び線溶酵素の阻害剤を組織接着剤として末梢神経の縫合、微小血管の縫合などに適用して縫合の代用又は補強のための臨床応用が実施されている。このようなフィブリングルー接着剤は、接着部位の水分に影響を受けずに速く接着し、血小板と凝固障害がなく生体適合性に優れた長所を有している。しかしながら、接着力が弱く、生分解速度が速く、血液の感染の危険があるという制限点を有している。
【０００９】
また、ゼラチングルーは、生体由来の組織接着剤として、ゼラチン−レゾルシノール−ホルマリン（ＧＲＦ）で架橋させたものが開発された。その他に、ゼラチン−グルタルアルデヒドのような組織接着剤が開発されたが、組織接着性は高いが、架橋剤として使われるホルマリンやグルタルアルデヒドが生体内のタンパク質とも架橋反応を起こして組織毒性を起こす短所を有している。
【００１０】
また、ポリウレタン系接着剤は、硬化後に接合部の柔軟性が維持される弾性接着剤の形態で開発された。この接着剤は、生体組織表面の水を吸収して組織との密着性を高め、水と反応して数分以内に硬化し、硬化物が柔軟性を有する特徴があり、硬化した接着剤が適切に生分解される長所を有している。しかしながら、合成原料である芳香族ジイソシアネートが生体毒性を有するという短所がある。
【００１１】
また、「Ａｖｉｔｅｎｅ」（Ａｌｃｏｎ）、「Ｈｅｌｉｔｅｎｅ」（Ｄａｈａｍｅｄ）のようにコラーゲン単独成分の止血剤は非血液製剤であるが、非常に高価で、単独成分として組織接着効果がないため、止血剤としてのみ使用している。
【００１２】
また他の従来技術として、非特許文献１〜４などが紹介されているが、これらは接着性止血剤の製品にフィブリノーゲン、トロンビン、血液凝固剤、アプロチニンなどの血液製剤及び牛由来タンパク質などを使用することにより、このときに発生し得る特定疾患の感染の恐れ及び原料確保、保存、製造過程などにかかる過大なコストにより製品の価格が高価である問題がある。
【００１３】
また、ゼラチンマトリックス成分を含むＦｌｏｓｅａｌ（Ｂａｘｔｅｒ社）は最も多く使われている製品であり、ゼラチンマトリックスに塩化カルシウム溶液に混合されたトロンビンを加えて止血効果を示す製品である。これは、特に、目以外の部位に対する多くの領域の外科的手術のとき、結紮（ligature）又は一般的な手順において効果的に調節されないか、調節が不可能な出血に使用することができる。ただし、これは、トロンビン、ゼラチン、塩化カルシウム溶液の３つに大別され、その各溶液を一度に混合するのではなく、２段階に分けて混合しなければならないため、多少の時間がかかる。従って、外科的手術のとき、深刻な結紮及び出血が起きる分秒を争うほど切迫した状態では、複雑な製品の指示書に従って混ぜる余裕がなく、順次行われる過程は、時刻を争う出血患者の生命を脅かすことになり、使用者に非常に煩わしいという問題がある。
【００１４】
また、前述したような止血用製品は人に適用されるので、最終生成物及びその成分の品質に対する最高の安全基準、保存安定性及び単純な使用方法を提供する必要がある。特に、２種以上の成分を混合して使用する場合は、「使用用意済の（ready-to-use）」形態にしなければならず、混合が容易な状態で提供しなければならない。
【００１５】
これにより、毒性が非常に少なく、保存及び取扱いが容易であり、使用方法が単純で時間を争う出血患者に適用でき、生体分解性に優れた止血剤の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第５４６４４７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５７７３０３３号明細書
【特許文献３】米国特許第５６０５８８７号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Fibrin monomer based tissue adhesive, US Patent 5464471, 1995
【非特許文献２】Hemostatic and tissue adhesive, US Patent 5883078, 1999
【非特許文献３】Fibrinogen/chitosan hemostatic agents, US Patent 5773033, 1998
【非特許文献４】Therapeu tic fibrinogen compositions, US Patent 5605887, 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明者は、前述したような問題点を解決するために、コラーゲン、安定化剤、トロンビンを含む止血用組成物及びこれを含む容器を開発して、単純な使用方法で時間を争う出血患者に適用でき、毒性がなく、血液の感染に対する問題点がないとともに、生体分解速度が速く、止血効果に優れていることを確認して本発明を完成した。
【００１９】
従って、本発明の目的は、コラーゲン、安定化剤、トロンビンを含む止血用組成物及びこれを含む容器を提供することにある。
【００２０】
また、本発明の他の目的は、前記止血用組成物が充填された第１容器及び希釈液が充填された第２容器を含むキットを提供することにある。
【００２１】
また、本発明のまた他の目的は、前記止血用キットを用いて製造されたハイドロゲルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
前記目的を達成するために、本発明の一実施例によれば、コラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物であって、前記コラーゲンとトロンビンの間に安定化剤が配置されて、コラーゲンとトロンビンが互いに分離された止血用組成物を提供する。
【００２３】
前記コラーゲンは、架橋されたコラーゲンであり得る。
【００２４】
前記架橋されたコラーゲンは、
Ｓ１）コラーゲンをエタノール又はメタノールに処理する段階と、
Ｓ２）前記Ｓ１）段階で処理されたコラーゲンに酸を添加してｐＨ２〜４のコラーゲン溶液として製造する段階と、
Ｓ３）前記Ｓ２）段階から製造されたコラーゲン溶液を中性状態にした後、遠心分離してエステル化コラーゲンを製造する段階と、
Ｓ４）前記Ｓ３）段階から製造されたエステル化コラーゲンに架橋剤を添加して架橋されたコラーゲンを製造する段階と、
Ｓ５）前記Ｓ４）段階から製造された架橋されたコラーゲンを精製水に分散させた後、凍結乾燥させる段階とを含む製造方法により製造されることができる。
【００２５】
前記架橋されたコラーゲンの分子量は、１００，０００ないし１，０００，０００Ｄａｌｔｏｎであり得る。
【００２６】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記コラーゲンが４０ないし９７重量％で含まれてもよい。
【００２７】
前記安定化剤は、アルブミン（human serum albumin）、マンニトール、酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3ＮａＯ2）、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びグリシンからなる群から選択された１種以上であり得る。
【００２８】
前記安定化剤はマンニトールであり得る。
【００２９】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記安定化剤が１ないし３０重量％で含まれてもよい。
【００３０】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記トロンビンが２ないし５０重量％で含まれてもよい。
【００３１】
前記止血用組成物は粉末剤の形態であり得る。
【００３２】
本発明の他の実施例によれば、前記止血用組成物を含む容器を提供する。
【００３３】
本発明の他の実施例によれば、コラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物が充填された第１容器と、希釈液が充填された第２容器とを含む止血用キットであって、前記第１容器はコラーゲンとトロンビンの間に安定化剤が配置されてコラーゲンとトロンビンが互いに分離された止血用キットを提供する。
【００３４】
前記希釈液は、精製水、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）溶液、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液、ヒト血清アルブミン（human serum albumin）、及び酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3ＮａＯ2）溶液からなる群から選択された１種以上であり得る。
【００３５】
ここで、好ましくは、前記希釈液は塩化カルシウム溶液であり、前記希釈液の総重量に対して、前記塩化カルシウムが０．００１ないし３０重量％で含まれてもよい。
【００３６】
前記止血用キットは、第１容器と第２容器が互いに結合して止血用組成物と希釈液が混合されてハイドロゲルを形成する。
【００３７】
前記ハイドロゲルの平均気孔サイズは、５０μｍないし２００μｍであり得る。
【００３８】
前記ハイドロゲルのｐＨは６ないし８であり得る。
【００３９】
前記第１容器にトロンビン、安定化剤、コラーゲンの順に充填されてもよい。
【００４０】
前記止血用キットの止血用組成物は前述の通りであるので、以下には省略する。
【発明の効果】
【００４１】
本発明のコラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物は止血効果に優れている。
【００４２】
また、本発明のコラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物を含む容器は、迅速で簡単に使用することができ、毒性がなく、血液の感染に対する問題点がないとともに、生体分解速度が速く、血液との接触時に膨張し、この膨張率が大きいため、止血効果に優れている。
【００４３】
従って、本発明の止血用組成物及びこれを含む容器は、止血キットとして使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例２、実施例４及び比較例１を塩化カルシウム溶液と混合して作られた各ハイドロゲルに対するＳＥＭイメージである。
【図２】架橋されたコラーゲン及び架橋されたゼラチンに対するそれぞれの膨張速度を測定して得られたグラフである。
【図３】実施例２及び比較例１をウサギ腸間膜切断モデルにそれぞれ処理して止血成功率（左）と止血にかかる時間（右）を測定して得られたグラフである。
【図４】実施例２及び比較例１をブタの上大静脈損傷モデルにそれぞれ処理した後、Ｈ＆Ｅ染色して得られた組織のイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、コラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物であって、前記コラーゲンとトロンビンの間に安定化剤が配置されてコラーゲンとトロンビンが分離された止血用組成物を提供する。
【００４６】
前記コラーゲンは、止血用組成物に含まれ、出血部位の血液を吸収して血小板を引き寄せて止血効果を引き起こす。また、前記コラーゲンは、血小板と付着するときは何もない状態で結合されるのではなく、接着剤のような作用をする物質であるｖＷＦ（von Willebrand’s factor）と結合して血小板の細胞表面上に存在する膜糖蛋白であるＧＰＩｂ／ＩＸ複合体と結合を促進させて一次止血を行う。
【００４７】
前記コラーゲンは、各種動物の組織を酸又はアルカリ処理するか、ペプシンなどの酵素を処理して抽出されるタンパク質であり得る。
【００４８】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記コラーゲンが４０ないし９７重量％で含まれてもよい。ここで、４０重量％未満で含まれる場合は止血効果が非常に低下する恐れがあり、９７重量％超過で含まれる場合は相対的に前記トロンビン及び安定化剤が少なく含まれるため、全体の止血用組成物の化学安定性が低下するか、止血効果が低くなる可能性がある。
【００４９】
また、前記コラーゲンは、架橋されたコラーゲンであり得、ここで、架橋されたコラーゲンは分子量が１００，０００ないし１，０００，０００Ｄａｌｔｏｎであることが好ましいが、これに制限されない。前記架橋されたコラーゲンの分子量が１００，０００Ｄａｌｔｏｎ未満である場合は、血液吸収力は速いが、血液凝固が遅くなって止血効果が低下する可能性があり、１，０００，０００Ｄａｌｔｏｎを超過する場合は、血液吸収力が著しく低下する可能性がある。
【００５０】
前記架橋されたコラーゲンは、化学的架橋法、物理的架橋法、又はこれらの組み合わせによる方法で製造され、このとき、化学的架橋法により架橋されたコラーゲンは、架橋剤を利用して自家架橋結合（crosslinking）されたコラーゲンである。一方、物理的架橋法により架橋されたコラーゲンは、乾熱処理、紫外線照射、ガンマ線照射により架橋されたコラーゲンである。
【００５１】
ここで、前記架橋剤は、ホルムアルデヒド（Formaldehyde）、グルタルアルデヒド（Glutaraldehyde）、カルボジイミド（Carbodiimides（ＥＤＣ））、ポリエポキシ化合物（Polyepoxy compounds）からなる群から選択されたいずれか１種以上の架橋剤であり得る。好ましくは、カルボジイミド（Carbodiimides（ＥＤＣ））であるが、これに制限されない。
【００５２】
前記架橋されたコラーゲンは、機械的強度に優れて物理的圧迫止血効果を示すことができ、多量の出血を止血させることができる。
【００５３】
前記架橋されたコラーゲンは、エステル化されたコラーゲンを架橋して得られたコラーゲンであり得る。
【００５４】
本発明の一実施例において、前記架橋されたコラーゲンは、
Ｓ１）コラーゲンをエタノール又はメタノールに処理する段階と、
Ｓ２）前記Ｓ１）段階で処理されたコラーゲンに酸を添加してｐＨ２〜４のコラーゲン溶液として製造する段階と、
Ｓ３）前記Ｓ２）段階から製造されたコラーゲン溶液を中性状態にした後、遠心分離してエステル化コラーゲンを製造する段階と、
Ｓ４）前記Ｓ３）段階から製造されたエステル化コラーゲンに架橋剤を添加して架橋されたコラーゲンを製造する段階と、
Ｓ５）前記Ｓ４）段階から製造された架橋されたコラーゲンを精製水に分散させた後、凍結乾燥させる段階とを含む製造方法により製造される。
【００５５】
前記Ｓ１）段階は、コラーゲンをエタノール又はメタノールに処理する段階であって、コラーゲンをエタノール又はメタノールに溶解して、後で架橋剤を混合するときに容易にするための段階であり、コラーゲン溶液を製造する段階である。
【００５６】
前記Ｓ１）段階の以前に、コラーゲンを動物の皮膚組織を酸性溶液に処理してアテロコラーゲンを抽出する段階をさらに含んでもよい。
【００５７】
前記Ｓ２）段階は、前記Ｓ１）段階で処理されたコラーゲンに酸を添加してｐＨ２〜４のコラーゲン溶液として製造する段階であり、コラーゲン溶液に酸を添加してコラーゲンを完全にエタノール又はメタノールに溶解された状態を作るための段階である。
【００５８】
前記Ｓ３）段階は、前記Ｓ２）段階から製造されたコラーゲン溶液を中性状態にした後、遠心分離してエステル化コラーゲンを製造する段階であって、コラーゲンの両末端にある約１２〜２７個のアミノ酸で構成された非らせん構造であるテロペプチド（ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ）を除去し、前記テロペプチドが除去された部分をエステル化させる段階である。ここで、テロペプチドは、生体内にコラーゲンが投入されたときに免疫反応を起こす主な原因として知られており、これによって医薬品などの原料として使用するとき、免疫反応を避けるためにテロペプチドを除去してアテロコラーゲン又はエステル化コラーゲンを使用することが好ましい。
【００５９】
前記Ｓ３）段階は、中性状態に作られたコラーゲン溶液にペプシン酵素を処理してテロペプチドが除去され、エステル作用基を有するエステル化コラーゲンを一次的に作った後、遠心分離を利用して高純度のエステル化コラーゲンを分離させる段階であり得る。
【００６０】
ここで、前記遠心分離は、エステル化コラーゲンのみが浸削されるように１０００ｒｐｍないし３０，０００ｒｐｍで、５分ないし３時間の間行うことが好ましいが、これに制限されない。
【００６１】
ここで、前記高純度のエステル化コラーゲンを分離する方法は、
（ａ）テロペプチドが除去されたアテロコラーゲンを含む試料を容器内に用意する段階と、
（ｂ）前記アテロコラーゲンを含む試料を前記容器から濾過メンブレンが備えられた濾過モジュールに流入させ、前記濾過モジュールに圧力を印加して前記試料が前記濾過メンブレンを通過しながら濾過されるようにする限外濾過過程を行う段階と、
（ｃ）前記限外濾過過程により前記濾過メンブレンを通過しながら濾過されて前記濾過モジュールから流出するエステル化コラーゲン溶液を収集する段階と、
（ｄ）前記濾過メンブレンを通過しながら濾過されるエステル化コラーゲン溶液の流量を測定して限外濾過速度を決定する段階と、
（ｅ）前記限外濾過速度が一定速度以下に減少すると、前記限外濾過過程を中止する段階と、
（ｆ）前記試料のうち、前記濾過メンブレンを通過できずに前記容器に復帰する残留物に水を添加した後、これを前記濾過メンブレンが備えられた濾過モジュールに流入させて透析濾過過程を行う段階と、
（ｇ）前記透析濾過過程により前記濾過メンブレンを通過しながら濾過されて前記濾過モジュールから流出するエステル化コラーゲン溶液を収集する段階と、
（ｈ）前記（ｆ）段階と前記（ｇ）段階を繰り返す段階を含むことができる。
【００６２】
前記（ｂ）段階で、ポンプのポンピング作用により前記アテロコラーゲンを含む試料を前記容器から前記濾過メンブレンが備えられた濾過モジュールに流入させ、前記濾過モジュールには約１０〜３０ｐｓｉの圧力を印加することができる。
【００６３】
前記（ｅ）段階で、前記限外濾過速度が約１ｇ／分以下に減少すると、前記限外濾過過程を中止させることができる。
【００６４】
前記（ｆ）段階で、前記容器に復帰する残留物には限外濾過過程により濾過された溶液と同量の精製水を添加することができる。
【００６５】
前記（ｆ）段階及び（ｇ）段階における透析濾過過程は、少なくとも５回行うことが好ましい。
【００６６】
これによって、前記（ａ）ないし（ｈ）段階によりアテロコラーゲンをエステル化させながら、高純度のエステル化コラーゲンが得られる。
【００６７】
一方、前記Ｓ４）段階は、前記Ｓ３）段階から製造されたエステル化コラーゲンに架橋剤を添加して架橋されたコラーゲンを製造する段階であって、エステル化コラーゲンを架橋させて物理的圧迫止血効果を示すことができるとともに、免疫反応を起こさない架橋されたコラーゲンを提供するための段階である。
【００６８】
また、前記Ｓ４）段階での架橋剤は、前述したようにホルムアルデヒド（Formaldehyde）、グルタルアルデヒド（Glutaraldehyde）、カルボジイミド（Carbodiimides（ＥＤＣ））、ポリエポキシ化合物（Polyepoxy compounds）からなる群から選択されたいずれか１種以上の架橋剤であり、以下に詳細な説明は省略する。
【００６９】
前記Ｓ５）段階は、前記Ｓ４）段階から製造された架橋されたコラーゲンを精製水に分散させた後、凍結乾燥させる段階であって、架橋されたコラーゲンに残っている架橋剤及びテロペプチドが除去されていないコラーゲンを除去するための段階である。従って、前記Ｓ５）段階は、前記Ｓ４）段階から製造された架橋されたコラーゲンを精製水に分散させることにより微量の架橋剤及びテロペプチドが除去されていないコラーゲンを精製水に溶解させ、凍結乾燥により精製水に溶解されたまま凍結されて除去されることができる。また、このときの凍結乾燥は、当該技術分野において用いられる通常の方法であり得る。
【００７０】
前記安定化剤は、止血用組成物に含まれて前記コラーゲンとトロンビンが混合しないようにするために前記コラーゲンとトロンビンのタンパク質を間に挟んでこれらのタンパク質の固有特性を維持する。従って、前記安定化剤が止血用組成物に含まれることにより、強い止血効果を有するコラーゲンとトロンビンを分離させるだけでなく、非活性物質として止血用組成物の化学安定性及び生物学的活性を維持することが保障できる。
【００７１】
前記安定化剤は、アルブミン（human serum albumin）、マンニトール、酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3ＮａＯ2）、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びグリシンからなる群から選択された１種以上であり得る。
【００７２】
ここで、前記安定化剤は、アルブミン、マンニトール及び酢酸ナトリウムからなる群から選択された１種以上を含むことにより、トロンビンの化学的安定性及び生物学的活性を維持することができる。
【００７３】
また、前記安定化剤は、マンニトール、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びグリシンからなる群から選択された１種以上を含むことにより、止血時間の延長を抑制し、血液凝固活性を維持させることができる。
【００７４】
前記安定化剤は、好ましくはマンニトールであるが、これに制限されない。
【００７５】
前記マンニトールは、キノコ・ザクロの根などの植物に広範囲に存在する白色の針状又は柱状の結晶であり、水によく溶けて緩下剤として使用されることもあり、グリセロールの代替剤として使用される。
【００７６】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記安定化剤が１ないし３０重量％で含まれることができる。このとき、１重量％未満で含まれる場合、前記コラーゲンとトロンビンを分離しにくくて化学安定性が低下する恐れがあり、３０重量％超過で含まれる場合、相対的に前記コラーゲン及びトロンビンが少なく含まれて全体の止血用組成物の止血効果が低くなる恐れがある。
【００７７】
前記トロンビンは止血用組成物に含まれ、これは、強力な止血因子として血液凝固に関与して血液中の可溶性フィブリノーゲンを加水分解して不溶性のフィブリンに変化させる反応において触媒の役割をする。また、前記トロンビンは、二次止血過程である血液凝固因子の活性化により繊維素が形成される過程において血小板活性化を誘導することができる。
【００７８】
前記止血用組成物の総重量に対して、前記トロンビンが２ないし５０重量％で含まれることがある。このとき、３重量％未満で含まれる場合は止血効果が非常に低下する可能性があり、５０重量％超過で含まれる場合は相対的に前記コラーゲン及び安定化剤が少なく含まれて全体の止血用組成物の化学安定性が低下するか、止血効果が低くなる可能性がある。
【００７９】
前記止血用組成物は、粉末剤形態であり、乾燥した粉末剤形態である止血用組成物は、外部環境及び水分により容易に液体状態に変質しないように製造された粉末剤形態であることが好ましい。前記止血用組成物は、粉末剤形態であって、各成分により化学安定性を有することができ、互いに混合されない状態で維持させることが容易である。また、取扱い及び保管に便利な長所を有する。
【００８０】
本発明の他の実施例によれば、前記止血用組成物を含む容器を提供することができる。
【００８１】
このとき、前記止血用組成物を含む容器は、止血効果を有するコラーゲン、安定化剤及びトロンビンが全て充填された状態であるため、使用方法が非常に単純であるので、時間を争う出血患者に適用できる長所を有する。特に、外科的手術時に深刻な結紮及び出血が起きる緊急な状態、分秒を争う状態でただ希釈液と混ぜて直ちに出血部位に適用できるので、使用者の利便性は勿論、専門的な技術者ではなくても手軽に利用できるほど非常に使用方法が単純であるという長所を有する。
【００８２】
本発明の他の実施例によれば、コラーゲン、安定化剤及びトロンビンを含む止血用組成物が充填された第１容器と、希釈液が充填された第２容器とを含む止血用キットであって、前記第１容器はコラーゲンとトロンビンの間に安定化剤が配置されてコラーゲンとトロンビンが互いに分離された止血用キットを提供する。
【００８３】
前記止血用キットは、前述した止血用組成物を用いているおり、コラーゲン、安定化剤及びトロンビンも同一であるので、以下に詳細な説明は省略する。
【００８４】
前記第１容器は、止血用組成物が充填されており、コラーゲンとトロンビンの間に安定化剤が充填されているもので、外部物理的力により配置された順序が変わらないようにする。また、前記第１容器に充填されたコラーゲン、安定化剤、トロンビンが配置された順序に応じて、後で希釈液と混合して有する流れ性（flowability）が変わるだけでなく、膨張率及び膨張速度が変わる。これにより、前記第１容器は、コラーゲン、安定化剤、トロンビン又はトロンビン、安定化剤、コラーゲンの順に充填されることが好ましい。より好ましくは、トロンビン、安定化剤、コラーゲンの順序であるが、これに制限されない。
【００８５】
前記第２容器は、希釈液が充填されており、ここで、希釈液は、前記第１容器の止血用組成物を溶解するか分散させるためのもので、溶媒又は分散媒として使用されることができる。例えば、精製水、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）溶液、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液、ヒト血清アルブミン（human serum albumin）、及び酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3ＮａＯ2）溶液からなる群から選択された１種以上であり得る。好ましくは、塩化カルシウム溶液又は塩化ナトリウム溶液であるが、これに限定されない。
【００８６】
前記希釈液が塩化カルシウム溶液である場合、前記希釈液の総重量に対して、前記塩化カルシウムが０．００１ないし３０重量％で含まれ、前記止血用組成物と混合がうまく行われる範囲の重量％であれば特に制限されない。
【００８７】
前記第１容器又は第２容器の形状及び素材は特に制限せず、医薬及びバイオ技術の分野において通常使用されるものであり得る。例えば、前記第１容器又は第２容器の形状は注射器であり、前記第１容器又は第２容器の素材はコラーゲン、安定化剤及びトロンビンから選択されたいずれか１つと化学反応を起こさない素材である。
【００８８】
一方、前記止血用キットは、第１容器と第２容器が互いに結合して止血用組成物と希釈液が混合されてハイドロゲルを形成することができる。
【００８９】
前記第１容器と第２容器が互いに結合できるように第１容器の前端部には締結突起を含み、第２容器は第１容器の前端部にある締結突起と結合するように締結溝を含んでもよい。
【００９０】
また、前記ハイドロゲルは多孔性であり、これにより、止血剤として使用するときに血液吸収率が高く、血液を吸収した後もハイドロゲルの形態が維持されるので、止血効果が低下せずに優れた止血効果を発揮できる。
【００９１】
また、前記ハイドロゲルの平均気孔サイズは５０μｍないし２００μｍであり得る。平均気孔サイズが５０μｍ未満であると血液吸収率が低下し、２００μｍを超過すると血液を吸収した後、ハイドロゲルの形態が維持できなくて止血効果が低下する恐れがある。
【００９２】
また、前記ハイドロゲルの形成時間は５秒ないし５分であり、分秒を争うほど切迫した状態に深刻な結紮及び出血を防ぐことができる。また、短時間でハイドロゲルを形成することにより、使用者が手軽に使用することができる。
【００９３】
前記ハイドロゲルは、止血用組成物と希釈液が混合して中性状態のｐＨを有することにより、前記ハイドロゲルを生体に適用するときに生体適合性及び生体安全性を確保することができる。さらに、毒性が少なく、感染安全性を有することができる。これによって、前記ハイドロゲルのｐＨは６ないし８であり得る。
【００９４】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範疇及び技術思想の範囲内で様々な変更及び修正が可能であることは当業者にとって明らかであり、このような変更及び修正が添付の特許請求の範囲に属することも当然である。
【００９５】
製造例１：エステル化コラーゲン粉末製造
【００９６】
以下の過程によりエステル化コラーゲン粉末を製造した。
【００９７】
（１）エタノールにコラーゲンを加えた後、冷蔵状態で撹拌した。
【００９８】
（２）０．５ＭのＨＣｌを用いて試料のｐＨを６．７±０．３に調整した。
【００９９】
（３）前記溶液を透析チューブ（dialysis tubing）に入れ、精製水を利用して透析を行った。
【０１００】
（４）前記溶液を凍結及び凍結乾燥してエステル化コラーゲン粉末を得た。
【０１０１】
製造例２：架橋されたコラーゲン粉末製造
【０１０２】
以下の過程により架橋されたコラーゲン粉末を製造した。
【０１０３】
（１）前記製造例１から製造されたエステル化コラーゲンを精製水に入れて撹拌した。
【０１０４】
（２）十分に混ざったエステル化コラーゲン溶液にＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を入れた。
【０１０５】
（３）ＥＤＣがエステル化コラーゲンと十分反応できるようによく混ぜた。
【０１０６】
（４）冷蔵状態で２〜３日放置した。
【０１０７】
（５）架橋化されて固まった架橋されたコラーゲン溶液を精製水に入れて分散させた。
【０１０８】
（６）前記架橋されたコラーゲン液を放置して層分離が起きたとき、架橋されたコラーゲンのみを取って溶液は捨てた。
【０１０９】
（７）前記（６）の過程を３〜５回繰り返して架橋されたコラーゲンのみを得た。
【０１１０】
（８）Ｂｕｆｆｅｒ（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）に架橋されたコラーゲンを入れ、冷蔵で１〜２日放置してＢｕｆｆｅｒ中和させた。
【０１１１】
（９）Ｂｕｆｆｅｒ中和の後、精製水で洗浄し、コラーゲンを凍結及び凍結乾燥した。
【０１１２】
（１０）凍結乾燥済みの前記試料をブレンダー（blender）に入れてすりつぶした。
【０１１３】
（１１）前記パウダーをふるいにかけて、２００〜３５５μｍのサイズの粒子を選別した。
【０１１４】
製造例３：架橋されたゼラチン
【０１１５】
エステル化コラーゲン粉末の代わりに、市中に止血剤として販売されるゼラチン粉末（ＦｌｏＳｅａｌ  Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｍａｔｒｉｘ、Ｂａｘｔｅｒ  Ａ．Ｇ．、米国）を利用して架橋されたゼラチンを得た。
【０１１６】
実験例１：流れ性（Flowability）の確認
【０１１７】
止血用組成物内のコラーゲン、マンニトール、トロンビンが配置された順序に応じて、希釈液である塩化カルシウム溶液（濃度）と混合時の流れ性の違いを確認するためのものであり、下記の表１のように実施例を用意した。このとき、マンニトール及びトロンビンはパウダータイプで市販されている製品を使用し、エステル化コラーゲンは前記製造例１から得られたものを使用し、架橋されたコラーゲンは前記製造例２から得られたものを使用した。また、流れ性の比較分析のために前記製造例３から得られた架橋されたゼラチンを使用した。
【０１１８】
【表１】
2021504097.tif 000003
【０１１９】
前記表１のように用意された実施例１ないし４及び比較例１は、以下の方法により混合時に必要な力を測定してその結果を表２に示す。
【０１２０】
１）２つのシリンジを用意し、１つのシリンジは前記実施例１ないし４又は比較例１を前記表１のような配置順序に充填し、残りの１つのシリンジは塩化カルシウム溶液を充填した。
【０１２１】
２）２つのシリンジを連結した（筒先を互いに回してはめて結合）。
【０１２２】
３）機械を利用して実施例１ないし４又は比較例１が充填されているシリンジ（ｍａｌｅ  ｔｙｐｅ）を固定させた（つかむ）。
【０１２３】
４）機械を利用して塩化カルシウム溶液が充填されているシリンジ（ｆｅｍａｌｅ  ｔｙｐｅ）のプッシュロッドを押して、実施例１ないし４又は比較例１が入っているシリンジに入れた。
【０１２４】
５）シリンジの位置を変更して機械に空いたシリンジを固定させた（つかむ）。
【０１２５】
６）混合された内容物が充填されているシリンジ（ｍａｌｅ  ｔｙｐｅ）のプッシュロッドを押して、混合された内容物を空いたシリンジに入れた。
【０１２６】
７）４）〜５）を繰り返して、混合時に必要な力を測定した。ここで、４）ステップを行う度に必要な力（Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ７）を測定した。
【０１２７】
一方、シリンジ内に充填された止血用組成物は固体粉末であるため、高い密度でシリンジに充填されているので、塩化カルシウム溶液を止血用組成物が充填されたシリンジ内に注入する力は逆に止血用組成物を塩化カルシウム溶液が充填されたシリンジ内に注入する力に比べて相対的に大きくならざるを得ない。これに塩化カルシウム溶液を止血用組成物が充填されたシリンジ内に注入するのに必要な力（Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ７）を測定することにより、混合時の流れ性の差を確認した。
【０１２８】
【表２】
2021504097.tif 000004
【０１２９】
前記表２に示すように、実施例１ないし４は比較例１に比べて相対的に混合に必要な力、すなわち、混合時に発生する圧力の大きさが全て低く、一方、実施例２が実施例１より平均的に混合時に発生する圧力の大きさが小さかった。これにより、トロンビンとマンニトールが注射器の入口側に配置されたことが、混合初期から原材料の混合に必要な圧力を減らし、原材料がうまく混合するように助けることを確認した。
【０１３０】
それに対して、架橋されたゼラチンが充填された比較例１は、実施例１ないし４とは異なるように発生する圧力が一定のパターンを示していない。架橋されたゼラチンは、混合時に発生する圧力の大きさが架橋されたコラーゲンが充填された実施例１と、実施例２ないし実施例４に比べて平均だけでなく全体的に高く現れ、Ｎ５においては少なくは３倍、多くは約１０倍程度と大きな差があった。
【０１３１】
実験例２：ＳＥＭ（Scanning Electron Microscope）による微細構造の確認
【０１３２】
前記実験例１を行った後、塩化カルシウム溶液と混合した実施例２、実施例４、及び比較例１をＳＥＭを用いてそれぞれの微細構造イメージを得た。このイメージは図１に示す。
【０１３３】
前記図１に示すように、実施例２及び実施例４は微細で密集した多孔性膜構造を確認することができ、それに対して、比較例１においては、実施例２と実施例４に比べて多孔性膜構造が少なく確認され、秩序なく凝っている構造が確認された。これにより、実施例２及び実施例４は相対的に比較例１に比べて塩化カルシウム溶液と混合した後、均一な多孔性構造により血液が吸収されて凝集されて止血を助ける多孔性膜構造を有することが確認できた。
【０１３４】
実験例３：膨張率及び膨張速度の確認
【０１３５】
本発明による止血用組成物が希釈液との混合後に示す膨張速度を確認するために、まず前記実験例１の表１に記載された方式に従って、実施例２及び比較例１をそれぞれ用意した。用意した実施例２及び比較例１の粒子面積をそれぞれ測定した。その次に、各試料を塩化カルシウム溶液と混合した後、１、２、３、５、１０、２０、３０分の間隔で粒子面積を測定して、これに面積変化率を計算して膨張速度を算出した。この結果を図２に示す。
【０１３６】
前記図２に示すように、実施例２と比較例１は初期１分以内に急激に膨張して２、３、５、１０分まで膨張し続けるが、１０分以後は膨張率が飽和状態になることを確認した。また、架橋されたコラーゲンが含まれる実施例２は、比較例１に比べて膨張速度が速く、面積変化が大きいので、架橋されたコラーゲンが架橋されたゼラチンに比べて同一の時間内にさらに速く粒子の膨張による物理的圧迫作用を行うことができるため、止血効果に大きく役立つことを確認した。
【０１３７】
実験例４：分解度試験
【０１３８】
本発明による止血用組成物内に含まれたコラーゲンに対する生体分解性及び分解度を測定して生体適合性を有するか、分解性が低くて感染危険性はないかを確認するために分解度試験を行った。まず、前記製造例１から得られたエステル化コラーゲン、前記製造例２から得られた架橋されたコラーゲン、前記製造例３から得られた架橋されたゼラチンを用意して、それぞれの試料の重さを測定した。その次に、各試料をマイクロ遠心チューブ（micro-centrifuge tube）に入れて２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのコラーゲン分解酵素（Collagenase）が含まれた１ＸＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ  １〜２ｍＬを入れていっぱい充填した。試料が入っているチューブを３７℃の水槽（water bath）に入れて２４〜７２時間放置した。２４、４８、７２時間経過後に試料を取り出して凍結乾燥した後、重さを測定した。分解度試験の前後に測定した試料の重さを下記の計算式を用いて残った重量比を計算した。その結果を表３に示す。
【０１３９】
＜残った重量比の計算式＞
【０１４０】
残った重量比（％）＝分解度試験後の試料の乾燥重量／分解度試験前の試料の乾燥重量＊１００
【０１４１】
【表３】
2021504097.tif 000005
【０１４２】
架橋されたコラーゲン及びエステル化コラーゲンは７２時間以内にコラーゲン分解酵素により試料が完全に分解されたことを確認した。それに対して、架橋されたゼラチンは７２時間後に残った重量比が３．３±１．２%で、コラーゲン分解酵素により試料が完全に分解されなかった。従って、架橋されたゼラチンに比べて架橋されたコラーゲンとエステル化コラーゲンが同一の条件で速い分解能を有することを確認して、生体分解性が高く、感染危険性が非常に少ないことを確認した。
【０１４３】
実験例５：ウサギの腸間膜切断モデルにおける止血性能の比較
【０１４４】
本発明による止血用組成物の止血能を確認するために前記実験例１と同一に実施例２及び比較例１を用意した。止血能の比較は、ウサギの腸間膜切断モデルを用いた。腸間膜を切断して出血を誘導した後、実施例２又は比較例１を適用した後、３０秒間止血圧迫を試みて出血の有無を確認し、出血が起きた場合、追加３０秒の止血圧迫を繰り返した。９０秒以内に止血が成功する確率と止血にかかる時間を測定してその結果を図３に示す。
【０１４５】
前記図３に示すように、実施例２は、１５匹の全てのウサギが９０秒以内に止血に成功した反面、比較例１は１５匹のウサギのうち１０匹のみが９０秒以内に止血が完了した。また、止血にかかる時間において、実施例２は６４±４．９５７秒である反面、比較例１は８６±８．７１８秒と測定され、ｔ−ｔｅｓｔの結果、統計的有意性が確認された（ｐ＜０．０５）。これにより、本発明による止血用組成物を利用する場合、止血成功率が高く、止血時間が短縮されるので、卓越した止血能を有することを確認した。
【０１４６】
実験例６：豚上大静脈損傷モデルにおける体内分解度及び炎症反応の比較
【０１４７】
本発明による止血用組成物の体内分解度及び炎症反応の程度を確認するために、前記実験例１と同一に実施例２及び比較例１を用意した。ブタの上大静脈を部分切開して出血を誘導した後、実施例２又は比較例１を適用して止血した。実験の１週間後、豚を犠牲にして検体を回収し、Ｈ＆Ｅ染色により残っている止血組成物の量と炎症反応を比較した。その結果を下記の表４に示し、Ｈ＆Ｅ染色後の組織のイメージは図４に示した。
【０１４８】
【表４】
2021504097.tif 000006
【０１４９】
（表４の＋はｍｉｌｄ（軽い、若干）、＋＋はｍｏｄｅｒａｔｅ（普通）を意味する。）
前記表４に示すように、ブタの上大静脈損傷モデルにおいて使用された止血剤組成物の残余物は、実施例２は若干残った程度であり、比較例１は普通程度残った状態であり、炎症反応もまた残余物の量に比例して実施例２が弱い炎症反応、比較例１が通常の炎症反応を示した。
【０１５０】
また、前記図４は、それぞれ実施例２及び比較例１のＨ＆Ｅ染色後の組織のイメージであり、実施例２の残余物の量が比較例１の残余物の量より比較的少ないことが確認でき、残余物の量に比例して炎症細胞の数も実施例２が比較例１より少ないことが分かる。これは、前記実験例４の結果と同様に、速い分解能を有する組成物が生体分解性が高く、炎症反応などの感染危険性が少ないことを示す。これによって、本発明による止血用組成物を利用する場合、生体適合性を向上させ、副作用を減らし、止血剤により新しく発生する感染危険性を低くすることができる。
【０１５１】
実験例７：白鼠部分腎切除モデルにおける止血剤組成物の生体適合性の確認
【０１５２】
本発明による止血用組成物の生体適合性を確認するために、前記実験例１と同一に実施例２及び比較例１を用意した。白鼠の腎臓の一部を切除して出血を誘導した後、実施例２又は比較例１を切断面に適用して止血した。実験の１週間後、白鼠を犠牲にして検体を回収し、病理学的検鏡により止血剤組成物の違いによる生体適合性を比較確認して下記の表５に示す。
【０１５３】
【表５】
2021504097.tif 000007
【０１５４】
前記表５において、等級は以下の基準に応じて付けられた。
０：ｎｏ  ｃｈａｎｇｅ（何の変化もない）
１：ｍｉｎｉｍａｌ（極小の変化）
２：ｍｉｌｄ（軽い又は若干の変化）
３：ｍｏｄｅｒａｔｅ（普通）
４：ｍａｒｋｅｄ（目立った変化）
５：ｍａｘｉｍｕｍ（最高の又は極限の変化）
【０１５５】
前記表５に示すように、比較例１を適用した白鼠個体においては術後に組織変形と出血が観察されたが、実施例２を適用した白鼠個体においては術後組織変形や術後出血などが観察されなかった。線維芽細胞の活性度や線維芽細胞の増殖による線維化は、比較例１を適用した個体においてより大きく現れ、細胞間出血も比較例１において大きく現れた。特に、比較例１を適用した腎切除面の周囲の脂肪組織において肉芽腫及び炎症反応が大きく現れた。
【０１５６】
一方、病理学的に有害であることを示す指標であるｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅは、実施例２において平均１７．５を比較例１において平均２６．５であることが分かった。これにより、実施例２の生体適合性が比較例１より優れていることが分かる。
【図１】
2021504097.tif 000008
【図２】
2021504097.tif 000009
【図３】
2021504097.tif 000010
【図４】
2021504097.tif 000011
【国際調査報告】
2021504097.tif 000012
2021504097.tif 000013
2021504097.tif 000014
2021504097.tif 000015
2021504097.tif 000016
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