(57)【要約】  本発明は急性および/または慢性鼻炎、ならびに急性および/または慢性副鼻腔炎の治癒的または予防的処置のための鼻腔および副鼻腔を洗浄するための組成物であって、塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、ケルセチン、ならびに化合物：ケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸から選択されるポリフェノール基の少なくとも1つの活性剤、を含み、前記ケルセチンが、約302g/モルの分子量を有する無水形態、または約320g/モルの分子量を有するケルセチン水和物の形態、または約338g/モルの分子量を有するケルセチン二水和物の形態である組成物に関する。本発明はまた、これらの組成物を調製するための方法、ならびにこれらの組成物を使用して急性および慢性鼻副鼻腔炎を処置するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性および/または慢性鼻炎、ならびに急性および/または慢性副鼻腔炎の治癒的または予防的処置のための鼻腔および副鼻腔を洗浄するための組成物であって、
塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウムと
ケルセチンと
化合物:ケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、プロトカテク酸、から選択されるポリフェノール基の少なくとも1つの活性剤と
を含み、前記ケルセチンが、約302g/モルの分子量を有する無水形態、または約320g/モルの分子量を有するケルセチン水和物の形態、または約338g/モルの分子量を有するケルセチン二水和物の形態であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記活性剤の総量の5%を超えない量で、ケルセチン-3'-グリコシド、ケルセチン-7'-グリコシド、ケルセチンのジグリコシドおよびトリグリコシド、ケルセチンの二量体から選択される、ケルセチンに由来する不純物をさらに含む、請求項1に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
94〜99.99重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.000001〜3重量%のケルセチン、および0.000001〜3重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む、請求項1に記載の使用のための乾燥組成物。
【請求項４】
91〜99.99重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.000001〜3重量%のケルセチン、0.000001〜3重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、および0.000001〜3重量%のケルセチン-4'-グリコシドを含む、請求項1に記載の使用のための乾燥組成物
【請求項５】
91〜99.77重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.23〜3重量%のケルセチン、0.000001〜3重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、および0.000001〜3重量%のプロトカテク酸を含む、請求項1に記載の使用のための乾燥組成物
【請求項６】
86〜99.77重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、およびフラボノイドを含有する植物の抽出物を含み、前記抽出物が0.23〜3重量%のケルセチン、0.000001〜3重量%のケルセチン-4'-グリコシド、0.000001〜3重量%のプロトカテク酸、およびケルセチンに由来する不純物を前記活性剤の総質量の5%までの量で含む、請求項2に記載の使用のための乾燥組成物。
【請求項７】
83〜99.77重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、およびフラボノイドを含む植物の抽出物を含み、前記抽出物が0.23〜3重量%のケルセチン、0.000001〜3重量%のケルセチン-4'-グリコシド、0.000001〜3重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、0.000001〜3重量%のプロトカテク酸、およびケルセチンに由来する不純物を前記活性剤の総質量の5%までの量で含む、請求項2に記載の使用のための乾燥組成物。
【請求項８】
溶液または懸濁液が、0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.00000001〜0.03重量%のケルセチン、および0.00000001〜0.03重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含有する、請求項3に記載の乾燥組成物を含む液体水性組成物。
【請求項９】
溶液または懸濁液が、0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.00000001〜0.03重量%のケルセチン、0.00000001〜0.03重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、および0.00000001〜0.03重量%のケルセチン-4'-グリコシドを含む、請求項4に記載の乾燥組成物を含む液体水性組成物。
【請求項１０】
溶液または懸濁液が、0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.0023〜0.03重量%のケルセチン、0.00000001〜0.03重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、および0.00000001〜0.03重量%のプロトカテク酸を含む、請求項5に記載の乾燥組成物を含む液体水性組成物。
【請求項１１】
溶液または懸濁液が、0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.0023〜0.03重量%のケルセチン、0.00000001〜0.03重量%のケルセチン-4'-グリコシド、および0.00000001〜0.03重量%のプロトカテク酸、ならびに前記ケルセチンに由来する不純物を前記活性剤の総重量の5%までの量で含む、請求項6に記載の乾燥組成物を含む液体水性組成物。
【請求項１２】
溶液または懸濁液が、0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.0023〜0.03重量%のケルセチン、0.00000001〜0.03重量%のケルチン-4'-グリコシド、0.00000001〜0.03重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、および0.00000001〜0.03重量%のプロトカテク酸、ならびにケルセチンに由来する不純物を前記活性剤の総重量の5%までの量で含む、請求項7に記載の乾燥組成物を含む液体水性組成物。
【請求項１３】
0.5重量%までの重炭酸ナトリウムもしくは重炭酸カリウムまたは両方の混合物をさらに含む、請求項8〜12のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項１４】
抗生物質、コルチコステロイドおよび/または銅、マンガンおよび硫黄塩、精油、ならびに医薬担体、安定剤、界面活性剤、防腐剤から選択される賦形剤、から選択される1つ以上の治療成分をさらに含む、請求項8〜13のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項１５】
急性および慢性鼻炎ならびに/または急性および慢性副鼻腔炎の予防及び治療のための、請求項8〜13のいずれかに記載の液体組成物の使用。
【請求項１６】
乾燥組成物の調製方法であって、ａ）からｄ）までのいずれかの方法：
a) 80〜100℃に加熱した水中で活性剤および塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを溶解し、次に、溶液の凍結および凍結乾燥する；
b) 80〜100℃に加熱された水中で活性剤を溶解し、次に、冷却後の溶液に塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを添加して混合し、凍結し、そして凍結乾燥する；
c) 活性剤を、有機溶媒、好ましくは、水で希釈したエタノールまたはメタノールに、有機溶媒/水の比を50/50〜90/10で溶解し、また塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを水に溶解し、2つの溶液を室温で混合し、次いで凍結し、凍結乾燥する；
d) 活性剤の粉末を塩化ナトリウムまたは塩化カリウムと混合する；
を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の乾燥組成物の調製方法。
【請求項１７】
粉末タマネギ皮を使用して調製される抽出物に由来する活性剤を、0.1〜2g/50mLの割合で冷水と混合し、沸騰温度で30分間煮沸し、次に、その液体を冷却し、濾過し、凍結乾燥する、ことを特徴とする請求項16に記載の乾燥組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の組成物および鼻副鼻腔炎の治療におけるその使用に関する。また、本発明は、このような組成物を得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鼻副鼻腔炎(RS)は、鼻閉/うっ血または鼻汁、顔面痛および圧迫、嗅覚の減少または消失および/または主に中鼻道からの嗅覚粘液膿性分泌物、主に中鼻道の領域における浮腫/粘膜閉塞を特徴とする鼻腔および副鼻腔の炎症である。
【０００３】
鼻副鼻腔炎は、罹病期間が12週未満の急性RS(ARS)、罹病期間が12週を超える慢性RS(CRS)、鼻茸を伴うもの(CRSwNP)、鼻茸を伴わないもの(CRSsNP)に分類される。
【０００４】
本発明において、鼻副鼻腔炎という用語は、急性および慢性鼻炎ならびに鼻茸を伴うまたは伴わない急性および慢性副鼻腔炎を含む、あらゆる形態の疾患を包含する。
【０００５】
WHOが編集した国際疾患分類には、疾患単位として鼻副鼻腔炎という用語は含まれていない。代わりに、急性(J30)および慢性(J31)鼻炎、急性(J01)および慢性(J32)副鼻腔炎は別々に分類されている(IDC WHO，http://apps.who.int/classifications/icd10/browse/2016/en#/J30-J39)。それにもかかわらず、欧州アレルギー・臨床免疫学会、欧州鼻科学会および米国耳鼻咽喉頭頸部外科学会財団（the American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery Foundation）は、鼻副鼻腔炎の管理に関するガイドラインを発表し、「鼻副鼻腔炎」という用語を使用することで合意している。しかし、ほとんどの場合、副鼻腔炎と鼻炎は付随する疾患であり、常に共存している。「副鼻腔炎」よりも「鼻副鼻腔炎」という言葉が広く普及したことは、気道、あるいはおそらくは鼻咽頭から持ち込まれた異物がまず鼻粘膜に作用し、副鼻腔粘膜に直接的・間接的な二次的影響を及ぼすという観点を間接的に支持している(European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps 2012; Rhinology supplement 23 :1-298, 2012) 。
【０００６】
鼻副鼻腔炎は、世界で最も蔓延している疾患の1つであり、平均罹患率は世界人口の10％以上である。
米国では、鼻副鼻腔炎は8人に1人が罹患しており、年間の医療費は110億ドルを超えている（Rosenfeld、RM et al. Clinical Practice Guideline （Update）： Adult Sinusitis. Otolaryngology-Head and Neck Surgery Vol. 152(2S), 2015, pp1-39)。慢性鼻副鼻腔炎患者（ＣＲＳ）の治療総費用は米国では年間2609ドルであり、ヨーロッパでは大学の病院で慢性鼻副鼻腔炎の治療を受けた患者の総費用は1861ドル/年であった。鼻副鼻腔炎は、米国の雇用者にとって最もコストのかかる健康状態の1つである。慢性疾患の中で、鼻副鼻腔炎患者の総医療費と世帯医療支出が高くなっている。間接費用の主な構成要素は、アブセンティズム（欠勤日）とプレゼンティズム（職場での生産性の低下）に起因する。1997年から2006年にかけて行われたNational Health Interview Surveyによる調査では、ほぼ315,000人が対象となっており、鼻副鼻腔炎患者は年間平均5.7日の勤務を見逃していると報告している(European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps 2012; Rhinology supplement 23:1-298, 2012)。
【０００７】
現在、鼻副鼻腔炎の管理のための特定の治療法は存在しない。一部の抗生物質は急性細菌性鼻副鼻腔炎の適応を表示しており、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、αアドレナリン充血緩和薬などの他の薬剤群が推奨されているが、いずれもFDAにより承認されていない(Guidance for Industry. Sinusitis: Designing Clinical Development Programs of Nonantimicrobial Drugs for Treatment. U. S. DHHS FDA Center for Drug Evaluation and Research November 2006 )。
【０００８】
鼻副鼻腔炎の治療に関するガイドラインは、欧州アレルギー免疫臨床アカデミーや欧州鼻科学会などの国際的な専門家グループによって作成されている。これらの協会が制定したプロトコル(European Position Paper on 20 Rhinosinusitis and Nasal 5 Polyps 2012; Rhinology supplement 23: 1-298, 2012)によれば、異なる形態の鼻副鼻腔炎は以下のように管理される。
−  急性鼻副鼻腔炎(＜12週)：初期治療は対症療法であり、鎮痛薬、生理食塩水洗浄、抗ヒスタミン薬、充血緩和薬が有効性のエビデンスがないにもかかわらず提案されることがある。7〜14日で改善がみられない場合は、鼻腔内コルチコイドが推奨される。細菌性RS合併症の場合は、一次抗生物質（アモキシシリン単独またはクラブラン酸との併用）を処方することが推奨される。細菌性鼻副鼻腔炎を確認し、合併症がないことを検証するために、放射線画像検査を同時に行う必要がある。効果が認められない場合は、抗生物質を変更する(マクロライドなど)。治療が失敗した場合、局所鼻腔内コルチコイドの継続および/または外科的介入が推奨されことがある。
−  慢性副鼻腔炎(＞12週)：鼻茸の有無にかかわらず、推奨される治療プロトコルは次のとおり。内視鏡検査およびCTスキャン後、鼻腔内コルチコステロイドが処方される。3カ月経過しても改善がみられない場合は、長期の抗生物質療法を追加する。なお改善がみられない場合は、外科的介入が推奨される。
【０００９】
鼻腔内コルチコステロイドの有効性は非常に限られており、治療を受けた14例中1例で有効であった(Hayward, G et al. Intranasal Corticosteroids in Management of Acute Sinusitis: A Systematic Review and Meta-Analysis. Ann Fam Med Vol. 10: 2012, pp241-249)。
臨床医には、抗生物質を処方する前に、抗生物質治療の適度な利点と有害作用の可能性を比較検討することを強く勧められる。さらに、最新の米国のガイドラインでは、鼻副鼻腔炎の細菌起源が確認されても、抗生物質療法を開始する前に「注意深い経過観察」を推奨している。これはRSに対する抗生物質の効力が低いためであり、それらは治療された20人中1人で有効であった(Rosenfeld, RM et al. Clinical Practice Guideline (Update): Adult Sinusitis. Otolaryngology-Head and Neck Surgery Vol. 152(2S), 2015, pp1-39) 。
【００１０】
緩和的治療には充血緩和薬の局所投与が用いられることがあるが、持続的投与(3〜5日以上)は薬物性鼻炎を引き起こすことがある。
鼻洗浄のための等張または高張性の生理食塩水は、日常の衛生習慣に広く使用されている。これには、一般に、生理食塩水が主に使用されている。点鼻用洗浄液の量は5mLから500mLまで様々である。等張食塩水の効果は、鼻腔から刺激性異物および炎症性メディエータを除去する能力によって説明される。現在、緩衝液を含有するいくつかの鼻用製剤が開発されている。鼻洗浄のための製剤の1つはTed Keller (US2013/0156871, Ted Keller, June 20, 2013) によって開発され、そこで、彼は塩化ナトリウムと、アスコルビン酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムからなる緩衝液とを含む鼻溶液を発見している。水に溶解した後、この組成物を用いて鼻腔および副鼻腔を洗浄することができる。しかしながら、多くの既存の溶液と同様に満足のいくものではなく、このような組成物は鼻副鼻腔炎の治療には十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第2013-0156871
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は既存の解決策の問題を克服し、鼻腔および副鼻腔を洗浄し、急性および慢性副鼻腔炎を効果的に治療するための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このために、本発明は、塩とケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、プロトカテク酸から選択されるポリフェノール基の活性剤とを含み、ケルセチン-3'-グリコシド、ケルセチン-7'-グリコシド、ケルセチンのジグリコシドおよびトリグリコシド、ケルセチン二量体を含むケルセチン由来の不純物を、前記活性剤の総量の5重量%未満の量で含有することができる、組成物に関する。
本発明によれば、ケルセチンをケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸などのケルセチン誘導体と組み合わせることが必要である。この組み合わせは、鼻副鼻腔炎の治療における組成物の有効性を増加させる相乗効果を提供する。
【００１４】
本発明はまた、鼻副鼻腔炎の予防および治療のためのこれらの組成物の使用に関する。
最後に、本発明の別の目的は、これらの組成物の調製方法を提供することである。  
【発明を実施するための形態】
【００１５】
次に、本発明を詳細に説明する。
定義
本発明における「活性剤」という用語は、所望の治療作用を生じる化合物または成分を意味する。
本発明における「不純物」という用語は、薬物の組成物中に少量で存在する、活性剤に付随する治療効果のない化合物または成分を指す。
本発明における「治療有効量」は、処置された被験体において治療効果を生じ得る活性薬剤の量を意味する。
本発明における「患者」または「対象」という用語は、本発明が適用され得る動物またはヒトを含む哺乳動物を指す。
発明の詳細な説明
【００１６】
本発明の目的は、急性および慢性鼻炎ならびに急性および慢性副鼻腔炎の予防または治療のために鼻腔および副鼻腔を洗浄するための組成物であって以下を含む。
−  塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム
−  ケルセチン
−  ケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸から選択されるポリフェノール基の少なくとも1つの活性剤
前記ケルセチンは、約302g/モルの分子量を有する無水形態であるか、または約320g/モルの分子量を有するケルセチン水和物であるか、または約338g/モルの分子量を有するケルセチン二水和物である。
本発明は、鼻副鼻腔炎の治療のための有効性が証明された活性成分を含有する鼻用組成物に関する。
【００１７】
本発明によれば、組成物の分子をタマネギの皮から抽出することができる。実験的に誘導された鼻副鼻腔炎を有する動物モデルにおいて、粗抽出物およびそれから精製された化合物の有効性を研究した。この調査の結果を実施例に記載している。本研究の結果は、タマネギ皮抽出物およびそれから単離された化合物：ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸の鼻副鼻腔炎に対する有効性を証明している。これらの結果はまた、これらの薬剤を含有する製剤を開発すること、および治療方法を開発することも可能にした。
【００１８】
抽出および調製条件に応じて、ケルセチンは、約302g/モルの分子量を有する無水形態で、または約320g/モルの分子量を有するケルセチン水和物の形態で、または約338g/モルの分子量を有するケルセチン二水和物の形態で使用することができる。
本発明によれば、いくつかの種類の組成物が可能である。
１．塩とケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸を含む鼻用組成物
【００１９】
一実施形態によれば、経鼻製剤は、塩とフラボノイドを含有する植物の抽出物：ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸を含む。塩は、低張、等張または高張溶液を生成するのに十分な量の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、またはその両方であってもよい。塩の量は、乾燥組成物の83〜99.77重量%であり得る。乾燥組成物中のケルセチンの量は、0.23〜3重量%であり得る。乾燥組成物中のケルセチン-4'-グリコシドの量は、0.000001〜3重量%の間であり得る。乾燥組成物中の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンの量は、0.000001〜3重量%であり得る。乾燥組成物中のプロトカテク酸の量は、0.000001〜3重量%とすることができる。
【００２０】
一実施形態によれば、ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸を含む活性剤はフラボノイドを含有する植物から、例えばタマネギの皮から抽出する方法によって調製することができる。活性剤を含有する抽出物の調製方法は、以下の段階を含むことができる。
−  タマネギ皮粉末を0.1〜2g/50mL(m/v)の割合で冷水と混合する。
−  混合物を沸騰させ、沸騰温度で30分間煮沸する。
−  混合物を冷却し、濾過し、凍結乾燥する。
【００２１】
この方法は、活性剤：ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸からなる粗抽出物を得ることを可能にする。粗抽出物はまたケルセチンに由来する他の不純物、例えば、ケルセチン-3'-グリコシド、ケルセチン-7'-グリコシド、ケルセチンのジグリコシドおよびトリグリコシド、ケルセチン二量体を、活性剤の総重量の5%を超えない量で含有することができる。
【００２２】
別の抽出方法は、有機溶媒、好ましくは50/50〜90/10(v/v)の比で水で希釈したメタノールまたはエタノールを使用することからなる。この方法によれば、規定量のタマネギ皮粉末を有機溶媒と1〜10g/30mL(m/v)の割合で混合し、室温で24時間撹拌する。得られた溶液を濾過し、次いで蒸発乾固させる。得られた粗抽出物は、高速液体クロマトグラフィー法によって分離することができる。
【００２３】
分離条件は、次のようにできる。
粗抽出物50mg〜200mgをHPLC装置のPhenomenex C18カラム(21.2mm ×150mm、5μm、100A)に注入する。次の溶媒を使用することができる。溶媒A：H2O/ TFA 0.5%(1L/5mL)。溶媒B: ACN。流量は、15mL/分とすることができる。
組成物の定性的および定量的分析は、UPLC-DAD-MS技術(Agilent technologies, USA)によって行うことができる。溶出条件は次のようにできる。1μLの溶液を、25℃の温度でUPLCのAgilent C18カラム(2.1mm、1.8μm)に注入する。使用される溶媒は、溶媒A：H2O/HCOOH 0.1%および溶媒B：ACN/HCOOH 0.1%とすることができる。流量は、0.4mL/分とすることができる。単離された化合物は、最初にダイオードアレイ検出器によって、次いで質量分析計アナライザによって検出され得る。質量分析は、ネガティブモードまたはポジティブモードで実施され得る。UPLC-DAD-MS法による分離・分析技術は、すべての組成について同一とすることができる。
【００２４】
一実施形態によれば、組成物は、市販の化合物：ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシド、プロトカテク酸、および塩化ナトリウムまたは塩化カリウムから選択される塩を混合することによって調製することができる。
【００２５】
乾燥組成物は、以下の方法の1つによって調製することができる。
a) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシド、プロトカテク酸および塩を80〜100℃に加熱した水に溶かす。次に、溶液を室温に冷却し、凍結し、凍結乾燥する。
b) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシド、プロトカテク酸を80〜100℃に加熱した水に溶かす。次いで、溶液を室温に冷却し、塩を加えて溶解する。次に、その溶液を凍結し、凍結乾燥する。
c) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸を有機溶媒、好ましくは水で希釈したエタノールまたはメタノールに溶解する。有機溶媒/水の比は、50/50〜90/10であってよい。塩を水に溶解する。次に、2つの溶液を室温で混合し、凍結し、凍結乾燥する。
d) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸の粉末を塩化ナトリウムまたは塩化カリウムと混合する。
【００２６】
組成物は、滅菌されてもされなくてもよく、単回用量または複数回用量容器に分配された乾燥形態または液体形態で提供されてもよい。この組成物は、治療と一致する1つ以上の生物学的活性成分、ならびに医薬担体、安定剤、界面活性剤、防腐剤、および精油から選択される添加剤を含むことができる。生物学的活性成分は、抗生物質、コルチコステロイド、および/または銅、マンガンおよび硫黄塩から選択され得る。精油は、ユーカリ油、ローズマリー油、ティーツリー油またはメントールから選択することができる。
【００２７】
一実施形態によれば、乾燥組成物は、その後、水と混合されてもよい。
得られた溶液または懸濁液は濃度0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、濃度0.0023〜0.03重量%のケルセチン、濃度0.00000001〜0.03重量%のケルセチン-4'-グリコシド、濃度0.00000001〜0.03重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、および濃度0.00000001〜0.03重量%のプロトカテク酸を含み、ケルセチンに由来する他の不純物を活性剤の総重量の0.5%まで含有することができる。
【００２８】
別の実施形態では、乾燥組成物が重炭酸塩を含有する溶液と混合することができる。重炭酸塩は、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムまたはその両方であってもよい。重炭酸塩濃度は、0.5重量%まで、好ましくは0.1〜0.5重量%、より好ましくは0.25〜0.5重量%の間で変化し得る。
水または重炭酸塩溶液の温度は、30℃〜38℃の間とすることができる。この温度では、特定の化合物、例えばケルセチンが懸濁液中に残存し、他の化合物が完全に溶解することがある。１つの特定の変形によれば、水を沸騰させ、次いで混合前に37℃に冷却してもよい。
【００２９】
液体組成物の調製に使用される水は、蒸留、脱イオン、精製、および滅菌することができる。
組成物における防腐剤および他の賦形剤の使用は排除されないが、防腐剤を含まない滅菌調製物が製造され得る。これは、組成物を無菌状態に保ち、防腐剤の存在による望ましくない効果を制限することを可能にする。無菌条件下で単回用量プラスチック容器またはプレフィルドシリンジを使用するブローフィルシール技術が好ましい。
【００３０】
一実施形態では、組成物を次のように提示することができる。
2つの部分からなる組成物
−  パートA：塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸を含む、乾燥粉末を含有する。
−  パートB：20mLの水または重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウム溶液を含有する。
２．塩とケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸を含む鼻用組成物
【００３１】
一実施形態によれば、経鼻製剤は、塩とフラボノイドを含有する植物の抽出物：ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸を含む。塩は、低張、等張または高張溶液を生成するのに十分な量の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、またはその両方であってもよい。塩の量は、乾燥組成物の86〜99.77重量%であり得る。乾燥組成物中のケルセチンの量は、0.23〜3重量%であり得る。乾燥組成物中のケルセチン-4'-グリコシドの量は、0.000001〜3重量%の間であり得る。乾燥組成物中のプロトカテク酸の量は、0.000001〜3重量%とすることができる。
【００３２】
一実施形態によれば、ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸を含む活性剤はフラボノイドを含有する植物から、例えばタマネギの皮から抽出する方法によって調製することができる。活性剤を含有する抽出物の調製方法は、以下の段階を含むことができる。
−  タマネギ皮粉末を0.1〜2g/50mL(m/v)の割合で冷水と混合する。
−  混合物を沸騰させ、沸騰温度で30分間煮沸する。
−  混合物を冷却し、濾過し、凍結乾燥する。
【００３３】
この方法は、活性剤：ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸からなる粗抽出物を得ることを可能にする。粗抽出物はまた、ケルセチンに由来する他の不純物、例えば、ケルセチン-3'-グリコシド、ケルセチン-7'-グリコシド、ケルセチンのジグリコシドおよびトリグリコシド、ケルセチン二量体を、活性剤の総重量の5%を超えない量で含有することができる。
【００３４】
別の抽出方法は、有機溶媒、好ましくは50/50〜90/10(v/v)の比で水で希釈されたメタノールまたはエタノールを使用することからなる。この方法によれば、規定量のタマネギ皮粉末を有機溶媒と1〜10g/30mL(m/v)の割合で混合し、室温で24時間撹拌する。得られた溶液を濾過し、次いで蒸発乾固させる。得られた粗抽出物は、高速液体クロマトグラフィー法によって分離することができる。
【００３５】
分離条件は次のようにできる。
粗抽出物50mg〜200mgをHPLC装置のPhenomenex C18カラム(21.2mm ×150mm、5μm、100 A)に注入する。次の溶媒を使用することができる。溶媒A：H2O/ TFA 0.5%(1L/5mL)。溶媒B：ACN。流量は、15mL/分とすることができる。
組成物の定性的および定量的分析は、UPLC-DAD-MS技術(Agilent technologies, USA)によって行うことができる。溶出条件は次のようにできる。1μLの溶液を、25℃の温度でUPLCのAgilent C18カラム(2.1mm、1.8μm)に注入する。使用される溶媒は、溶媒A：H2O/HCOOH 0.1%および溶媒B：ACN/HCOOH 0.1%とすることができる。流量は、0.4mL/分とすることができる。単離された化合物は、最初にダイオードアレイ検出器によって、次いで質量分析計アナライザによって検出され得る。質量分析は、ネガティブモードまたはポジティブモードで実施され得る。UPLC-DAD-MS法による分離・分析技術は、すべての組成物について同一であることができる。
【００３６】
一実施形態によれば、組成物は、市販の化合物：ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、プロトカテク酸、および塩化ナトリウムまたは塩化カリウムから選択される塩を混合することによって調製することができる。
【００３７】
乾燥組成物は、以下の方法の1つによって調製することができる。
a) ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、プロトカテク酸および塩を80〜100℃に加熱した水に溶解する。次に、その溶液を室温に冷却し、凍結し、凍結乾燥する。
b) ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、プロトカテク酸を80〜100℃に加熱した水に溶解する。次に、溶液を室温に冷却し、塩を添加し、溶解する。次に、その溶液を凍結し、凍結乾燥する。
c) ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸を有機溶媒、好ましくは水で希釈したエタノールまたはメタノールに溶解する。その有機溶媒/水の比は、50/50〜90/10であってよい。塩を水に溶解する。次に、2つの溶液を室温で混合し、凍結し、凍結乾燥する。
d) ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸の粉末を塩化ナトリウムまたは塩化カリウムと混合する。
【００３８】
この組成物は、滅菌されてもされなくてもよく、単回用量または複数回用量の容器に分配された乾燥形態または液体形態で提供されてもよい。この組成物は、治療と一致する1つ以上の生物学的活性成分、ならびに医薬担体、安定剤、界面活性剤、防腐剤、および精油から選択される添加剤を含むことができる。生物学的活性成分は、抗生物質、コルチコステロイド、および/または銅、マンガンおよび硫黄塩から選択され得る。精油は、ユーカリ油、ローズマリー油、ティーツリー油またはメントールから選択することができる。
【００３９】
一実施形態によれば、乾燥組成物は、その後、水と混合されてもよい。
得られた溶液または懸濁液は0.4〜2重量%の濃度の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、0.0023〜0.03重量%の濃度のケルセチン、0.00000001〜0.03重量%の濃度のケルセチン-4'-グリコシド、および0.00000001〜0.03重量%の濃度のプロトカテク酸を含み、ケルセチンに由来する他の不純物を活性剤の総重量の5%まで含有することができる。
【００４０】
別の実施形態によれば、乾燥組成物は、重炭酸塩を含有する溶液と混合することができる。重炭酸塩は、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムまたはその両方であってもよい。重炭酸塩濃度は、0.5重量%まで、好ましくは0.1〜0.5重量%、より好ましくは0.25〜0.5重量%の間で変化し得る。水または重炭酸塩溶液の温度は、30℃〜38℃の間であり得る。この温度では、特定の化合物、例えばケルセチンが懸濁液中に残存し、他の化合物が完全に溶解することがある。一つの特定の変形によれば、水を沸騰させ、次いで混合前に37℃に冷却することができる。
【００４１】
液体組成物の調製に使用される水は、蒸留、脱イオン、精製、および滅菌することができる。
組成物における防腐剤および他の賦形剤の使用は排除されないが、防腐剤を含まない滅菌調製物が製造され得る。これは、組成物を無菌状態に保ち、防腐剤の存在による望ましくない効果を制限することを可能にする。無菌条件下で単回用量プラスチック容器またはプレフィルドシリンジを使用するブローフィルシール技術が好ましい。
【００４２】
一実施形態では、組成物は次のように提示することができる。
2つの部分からなる組成物
−  パートA：塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸を含む乾燥粉末を含有する。
−  パートB：20mLの水または重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウム溶液を含有する。
３．塩とケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンとプロトカテク酸を含む鼻用組成物。
【００４３】
一実施形態によれば、経鼻製剤は、塩とケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸を含む。塩は、低張、等張または高張溶液を生成するのに十分な量の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、またはその両方であってもよい。塩の量は、乾燥組成物の91〜99.77重量%であり得る。乾燥組成物中のケルセチンの量は、0.23〜3重量%であり得る。乾燥組成物中の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンの量は、0.000001〜3重量%であり得る。乾燥組成物中のプロトカテク酸の量は、0.000001〜3重量%とすることができる。
【００４４】
一実施形態によれば、ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸を含む活性剤はフラボノイドを含有する植物から、例えばタマネギの皮から抽出する方法によって調製することができる。活性剤を含有する抽出物の調製方法は、以下の段階を含むことができる。
−  タマネギ皮粉末を0.1〜2g/50mL(m/v)の割合で冷水と混合する。
−  混合物を沸騰させ、沸騰温度で30分間煮沸する。
−  混合物を冷却し、濾過し、凍結乾燥する。
【００４５】
この方法は、活性剤：ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸からなる粗抽出物を得ることを可能にする。粗抽出物はまた、ケルセチンに由来する他の不純物、例えば、ケルセチン-3'-グリコシド、ケルセチン-7'-グリコシド、ケルセチンのジグリコシドおよびトリグリコシド、ケルセチン二量体を、活性剤の総重量の5%を超えない量で含有することができる。
【００４６】
別の抽出方法は、有機溶媒、好ましくは50/50〜90/10(v/v)の比で水で希釈されたメタノールまたはエタノールを使用することからなる。この方法によれば、規定量のタマネギ皮粉末を有機溶媒と1〜10g/30mL(m/v)の割合で混合し、室温で24時間撹拌する。得られた溶液を濾過し、次いで蒸発乾固させる。得られた粗抽出物は、高速液体クロマトグラフィー法によって分離することができる。
【００４７】
分離条件は次のようにすることができる。
粗抽出物50mg〜200mgをHPLC装置のPhenomenex C18カラム(21.2mm ×150mm、5μm、100 A)に注入する。次の溶媒を使用することができる。溶媒A：H2O/ TFA 0.5%(1L/5mL)。溶媒B：ACN。流量は、15mL/分とすることができる。
組成物の定性的および定量的分析は、UPLC-DAD-MS技術(Agilent technologies, USA)によって行うことができる。溶出条件は次のようにできる。1μLの溶液を、25℃の温度でUPLCのAgilent C18カラム(2.1mm、1.8μm)に注入する。使用される溶媒は、溶媒A：H2O/HCOOH 0.1%および溶媒B：ACN/HCOOH 0.1%とすることができる。流量は、0.4mL/分とすることができる。単離された化合物は、最初にダイオードアレイ検出器によって、次いで質量分析計アナライザによって検出され得る。質量分析は、ネガティブモードまたはポジティブモードで実施され得る。UPLC-DAD-MS法による分離・分析技術は、すべての組成物について同一とすることができる。
【００４８】
一実施形態によれば、組成物は、市販の化合物ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、プロトカテク酸、および塩化ナトリウムまたは塩化カリウムから選択される塩を混合することによって調製することができる。
【００４９】
乾燥組成物は、以下の方法の1つによって調製することができる。
a) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、プロトカテク酸および塩を80〜100℃に加熱した水に溶かす。次に、溶液を室温に冷却し、凍結し、凍結乾燥する。
b) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、プロトカテク酸を80〜100℃に加熱した水に溶かす。次いで、溶液を室温に冷却し、塩を添加し、溶解する。次に、溶液を凍結し、凍結乾燥する。
c) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸を有機溶媒、好ましくは水で希釈したエタノールまたはメタノールに溶解する。有機溶媒/水の比は、50/50〜90/10であり得る。塩を水に溶解する。次に、2つの溶液を室温で混合し、凍結し、凍結乾燥する。
d) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸の粉末を塩化ナトリウムまたは塩化カリウムと混合する。
【００５０】
組成物は、滅菌されてもされなくてもよく、単回用量または複数回用量容器に分配された乾燥形態または液体形態で提供されてもよい。この組成物は、治療と一致する1つ以上の生物学的活性成分、ならびに医薬担体、安定剤、界面活性剤、防腐剤、および精油から選択される添加剤を含み得る。生物学的に活性な成分は、抗生物質、コルチコステロイド、および/または銅、マンガンおよび硫黄塩から選択され得る。精油は、ユーカリ油、ローズマリー油、ティーツリー油またはメントールから選択することができる。
【００５１】
一実施形態によれば、乾燥組成物は、その後、水と混合されてもよい。
得られた溶液または懸濁液は、濃度0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、濃度0.0023〜0.03重量%のケルセチン、濃度0.00000001〜0.03重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、および濃度0.00000001〜0.03重量%のプロトカテク酸を含む。
別の実施形態では、乾燥組成物が重炭酸塩を含有する溶液と混合されてもよい。重炭酸塩は、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムまたはその両方であってもよい。重炭酸塩濃度は、0.5重量%まで、好ましくは0.1〜0.5重量%、より好ましくは0.25〜0.5重量%の間で変化し得る。水または重炭酸塩溶液の温度は、30℃〜38℃の間であり得る。この温度では、特定の化合物、例えばケルセチンが懸濁液中に残存し、他の化合物が完全に溶解することがある。一実施形態によれば、水を沸騰させ、次いで混合前に37℃に冷却することができる。
【００５２】
液体組成物の調製に使用される水は、蒸留、脱イオン、精製、および滅菌することができる。
組成物における防腐剤および他の賦形剤の使用は排除されないが、防腐剤を含まない滅菌調製物が製造され得る。これは、組成物を無菌状態に保ち、防腐剤の存在による望ましくない効果を制限することを可能にする。無菌条件下で単回用量プラスチック容器またはプレファイルドシリンジを使用するブローフィルシール技術が好ましい。
【００５３】
一実施形態では、組成物が以下のように提示することができる。
2つの部分からなる組成物
−  パートA：塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびプロトカテク酸を含む、乾燥粉末を含有する。
−  パートB：20mLの水または重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウム溶液を含有する。
４．塩とケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む鼻用組成物
【００５４】
一実施形態によれば、経鼻製剤は、塩とケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、および2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む。塩は、低張、等張または高張溶液を生成するのに十分な量の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、またはその両方であってよい。塩の量は、乾燥組成物の91〜99.99重量%であり得る。乾燥組成物中のケルセチンの量は、0.000001〜3重量%の間であり得る。乾燥組成物中のケルセチン-4'-グリコシドの量は、0.000001〜3重量%の間であり得る。乾燥組成物中の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンの量は、0.000001〜3重量%であり得る。
【００５５】
一実施形態によれば、ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む活性剤はフラボノイドを含有する植物から、例えばタマネギの皮から抽出する方法によって調製することができる。
活性剤を含有する抽出物の調製方法は、以下の段階を含むことができる。
−  タマネギ皮粉末を0.1〜2g/50mL(m/v)の割合で冷水と混合する。
−  混合物を沸騰させ、沸騰温度で30分間煮沸する。
−  混合物を冷却し、濾過し、凍結乾燥する。
【００５６】
この方法は、活性剤：ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸からなる粗抽出物を得ることを可能にする。粗抽出物はまた、ケルセチンに由来する他の不純物、例えば、ケルセチン-3'-グリコシド、ケルセチン-7'-グリコシド、ケルセチンのジグリコシドおよびトリグリコシド、ケルセチン二量体を、活性剤の総重量の5%を超えない量で含有することができる。
【００５７】
別の抽出方法は、有機溶媒、好ましくは50/50〜90/10(v/v)の比で水で希釈されたメタノールまたはエタノールを使用することからなる。この方法によれば、規定量のタマネギ皮粉末を有機溶媒と1〜10g/30mL(m/v)の割合で混合し、室温で24時間撹拌する。得られた溶液を濾過し、次いで蒸発乾固させる。得られた粗抽出物は、高速液体クロマトグラフィー法によって分離することができる。
【００５８】
分離条件は、以下のようにできる。
粗抽出物50mg〜200mgをHPLC装置のPhenomenex C18カラム(21.2mm ×150mm、5μm、100A)に注入する。次の溶媒を使用することができる。溶媒A：H2O/ TFA 0.5%(1L/5mL)。溶媒B：ACN。流量は、15mL/分とすることができる。
組成物の定性的および定量的分析は、UPLC-DAD-MS技術(Agilent technologies, USA)によって行うことができる。溶出条件は次のようにできる。1μLの溶液を、25℃の温度でUPLCのAgilent C18カラム(2.1mm、1.8μm)に注入する。使用される溶媒は、溶媒A：H2O/HCOOH 0.1%および溶媒B：ACN/HCOOH 0.1%であり得る。流量は、0.4mL/分とすることができる。単離された化合物は、最初にダイオードアレイ検出器によって、次いで質量分析計アナライザによって検出され得る。質量分析は、ネガティブモードまたはポジティブモードで実施され得る。UPLC-DAD-MS法による分離・分析技術は、すべての組成について同一とすることができる。
【００５９】
一実施形態によれば、組成物は、市販の化合物：ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシド、および塩化ナトリウムまたは塩化カリウムから選択される塩を混合することによって調製することができる。
【００６０】
乾燥組成物は、以下の方法の1つによって調製することができる。
a) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドおよび塩を80〜100℃に加熱した水に溶かす。次に、溶液を室温に冷却し、凍結乾燥する。
b) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン及びケルセチン-4'-グリコシドを80〜100℃に加熱した水に溶かす。次いで、溶液を室温に冷却し、塩を添加し、溶解する。次に、その溶液を凍結し、凍結乾燥する。
c) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびケルセチン-4'-グリコシドを有機溶媒、好ましくは水で希釈したエタノールまたはメタノールに溶解する。有機溶媒/水の比は、50/50〜90/10とすることができる。塩を水に溶解する。次に、2つの溶液を室温で混合し、次いで凍結し、凍結乾燥する。
d) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびケルセチン-4'-グリコシドの粉末を塩化ナトリウムまたは塩化カリウムと混合する。
【００６１】
組成物は、滅菌されてもされなくてもよく、単回用量または複数回用量容器に分配された乾燥形態または液体形態で提供されてもよい。
組成物は、治療と一致する1つ以上の生物学的活性成分、ならびに医薬担体、安定剤、界面活性剤、防腐剤、および精油から選択される添加剤を含み得る。生物学的活性成分は、抗生物質、コルチコステロイド、および/または銅、マンガンおよび硫黄塩から選択され得る。精油は、ユーカリ油、ローズマリー油、ティーツリー油またはメントールから選択することができる。
【００６２】
一実施形態によれば、乾燥組成物は、その後、水と混合されてもよい。得られた溶液または懸濁液は、濃度0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、濃度0.00000001〜0.03重量％のケルセチン、濃度0.00000001〜0.03重量%のケルセチン-4'-グリコシド、濃度0.00000001〜0.03重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む。
【００６３】
別の実施形態によれば、乾燥組成物は、重炭酸塩を含有する溶液と混合されてもよい。重炭酸塩は、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムまたはその両方であってもよい。重炭酸塩濃度は、0.5重量%まで、好ましくは0.1〜0.5重量%、より好ましくは0.25〜0.5重量%の間で変化し得る。水または重炭酸塩溶液の温度は、30℃〜38℃の間であり得る。この温度では、特定の化合物、例えばケルセチンが懸濁液中に残存し、他の化合物が完全に溶解することがある。１つの特定の変形によれば、水を沸騰させ、次いで混合前に37℃に冷却することができる。
【００６４】
液体組成物の調製に使用される水は、蒸留、脱イオン、精製、および滅菌することができる。組成物における防腐剤および他の賦形剤の使用は排除されないが、防腐剤を含まない滅菌調製物が製造され得る。これは、組成物を無菌状態に保ち、防腐剤の存在による望ましくない効果を制限することを可能にする。無菌条件下で単回用量プラスチック容器またはプレフィルドシリンジを使用するブローフィルシール技術が好ましい。
【００６５】
一実施形態では、組成物が次のように提示することができる。
2つの部分からなる組成物
−  パートA：塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよびケルセチン-4'-グリコシドを含む乾燥粉末を含有する。
−  パートB：20mLの水または重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウム溶液を含有する。
５．塩とケルセチンおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む鼻用組成物。
【００６６】
一実施形態によれば、経鼻製剤は、塩とケルセチンおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む。塩は、低張、等張または高張溶液を生成するのに十分な量の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、またはその両方であってもよい。塩の量は、乾燥組成物の94〜99.99重量%であり得る。乾燥組成物中のケルセチンの量は、0.000001〜3重量%の間であり得る。乾燥組成物中の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンの量は、0.000001〜3重量%とすることができる。
【００６７】
一実施形態によれば、ケルセチンおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む活性剤はフラボノイドを含有する植物から、例えばタマネギの皮から抽出する方法によって調製することができる。活性剤を含有する抽出物の調製方法は、以下の段階を含むことができる。
−  タマネギ皮粉末を0.1〜2g/50mL(m/v)の割合で冷水と混合する。
−  混合物を沸騰させ、沸騰温度で30分間煮沸する。
−  混合物を冷却し、濾過し、凍結乾燥する。
この方法により、活性剤：ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸からなる粗抽出物を得ることができる。粗抽出物はまた、ケルセチンに由来する他の不純物、例えば、ケルセチン-3'-グリコシド、ケルセチン-7'-グリコシド、ケルセチンのジグリコシドおよびトリグリコシド、ケルセチン二量体を、活性剤の総重量の5%を超えない量で含有することができる。
【００６８】
別の抽出方法は、有機溶媒、好ましくは50/50〜90/10(v/v)の比で水で希釈されたメタノールまたはエタノールを使用することからなる。この方法によれば、規定量のタマネギ皮粉末を有機溶媒と1〜10g/30mL(m/v)の割合で混合し、室温で24時間撹拌する。得られた溶液を濾過し、次いで蒸発乾固させる。得られた粗抽出物は、高速液体クロマトグラフィー法によって分離することができる。
【００６９】
分離条件は以下のようにすることができる。
粗抽出物50mg〜200mgをHPLC装置のPhenomenex C18カラム(21.2mm ×150mm、5μm、100A)に注入する。次の溶媒を使用することができる。溶媒A：H2O/ TFA 0.5%(1L/5mL)。溶媒B：ACN。流量は、15mL/分とすることができる。
組成物の定性的および定量的分析は、UPLC-DAD-MS技術(Agilent technologies, USA)によって行うことができる。溶出条件は次の通りであり得る。1μLの溶液を、25℃の温度でUPLCのAgilent C18カラム(2.1mm、1.8μm)に注入する。使用される溶媒は、溶媒A：H2O/HCOOH 0.1%および溶媒B：ACN/HCOOH 0.1%であり得る。流量は、0.4mL/分とすることができる。単離された化合物は、最初にダイオードアレイ検出器によって、次いで、質量分析計アナライザによって検出され得る。質量分析は、ネガティブモードまたはポジティブモードで実施され得る。UPLC-DAD-MS法による分離・分析技術は、すべての組成について同一とすることができる。
【００７０】
一実施形態によれば、組成物は、市販の化合物：ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、および塩化ナトリウムまたは塩化カリウムから選択される塩を混合することによって調製することができる。
【００７１】
乾燥組成物は、以下の方法の1つによって調製することができる。
a) ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンおよび塩を80〜100℃に加熱した水に溶かす。次に、溶液を室温に冷却し、凍結し、凍結乾燥する。
b) ケルセチンおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを80〜100℃に加熱した水に溶かす。次いで、溶液を室温に冷却し、塩を添加し、溶解する。次に、溶液を凍結し、凍結乾燥する。
c) ケルセチンおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを有機溶媒、好ましくは水で希釈したエタノールまたはメタノールに溶解する。有機溶媒/水の比は、50/50〜90/10であり得る。塩を水に溶解する。次に、2つの溶液を室温で混合し、次いで凍結し、凍結乾燥する。
d) ケルセチンおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンの粉末を塩化ナトリウムまたは塩化カリウムと混合する。
【００７２】
組成物は、滅菌されてもされなくてもよく、単回用量または複数回用量容器に分配された乾燥形態または液体形態で提供されてもよい。組成物は、治療と一致する1つ以上の生物学的活性成分、ならびに医薬担体、安定剤、界面活性剤、防腐剤、および精油から選択される添加剤を含むことができる。生物学的活性成分は、抗生物質、コルチコステロイド、および/または銅、マンガンおよび硫黄塩から選択され得る。精油は、ユーカリ油、ローズマリー油、ティーツリー油またはメントールから選択され得る。
【００７３】
一実施形態によれば、乾燥組成物は、その後、水と混合されてもよい。
得られた溶液または懸濁液は、濃度0.4〜2重量%の塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、濃度0.00000001〜0.03重量%のケルセチン、濃度0.00000001〜0.03重量%の2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む。
【００７４】
別の実施形態によれば、乾燥組成物は、重炭酸塩を含有する溶液と混合されてもよい。重炭酸塩は、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムまたはその両方であってもよい。重炭酸塩濃度は、0.5重量%まで、好ましくは0.1〜0.5重量%、より好ましくは0.25〜0.5重量%の間で変化し得る。水または重炭酸塩溶液の温度は、30℃〜38℃の間であり得る。この温度では、特定の化合物、例えばケルセチンが懸濁液中に残存し、他の化合物が完全に溶解することがある。一つの特定の変形によると、水を沸騰させ、次いで混合前に37℃に冷却することができる。
【００７５】
液体組成物の調製に使用される水は、蒸留、脱イオン、精製、および滅菌することができる。組成物における防腐剤および他の賦形剤の使用は排除されないが、防腐剤を含まない滅菌調製物が製造され得る。これは、組成物を無菌状態に保ち、防腐剤の存在による望ましくない効果を制限することを可能にする。無菌条件下で単回用量プラスチック容器またはプレフィルドシリンジを使用するブローフィルシール技術が好ましい。
【００７６】
一実施形態では、組成物が以下のように提示することができる。
2つの部分からなる組成物
−  パートA：塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、ケルセチンおよび2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを含む乾燥粉末を含有する。
−  パートB：20mLの水または重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウム溶液を含有する。
【００７７】
本発明を、鼻副鼻腔炎の治療における本発明の有効性に関する実施例および試験によって説明する。
【実施例１】
【００７８】
タマネギの皮からの抽出
粉砕したタマネギの皮40gを冷水2Lと混合し、沸騰するまで加熱し、沸騰温度で30分間煮込んだ。混合物を冷却し、濾過し、凍結乾燥した。5.0gの乾燥抽出物を得た。
エタノール抽出
200gの粉砕したタマネギの皮を6LのEtOH /H2O(70/30; v/v)と混合し、室温で24時間混合した。得られた溶液を濾過し、次いで蒸発乾固した。25.5gの乾燥抽出物を得た。
【００７９】
両方の抽出物の定性的および定量的分析を、UPLC-DAD-MS技術(Agilent technologies, USA)を用いて行った。溶出条件：溶液1μLを25℃の温度でUPLCカラムAgilent C18(2.1mm、1.8μm)に注入した。使用した溶媒は、溶媒A：H2O/HCOOH 0.1%および溶媒B：ACN/HCOOH 0.1%であった。流量:0.4mL/分。分離された化合物は、最初にダイオードアレイ検出器(DAD)によって検出され、次に質量分析法によって分析された。質量分析は、ポジティブおよびネガティブモードで行った。
LC-MSスペクトラは、100から1400の範囲の全質量(m/z)で"Full scan"で取得した。得られたデータを収集し、Hystarソフトウェアバージョン3.0によって分析した。
タマネギの皮から得られたアルコール抽出物および水抽出物の定性的および定量的分析の結果を表1および表2に示す。
【００８０】
【表１】
2021504325.tif 000002
【００８１】
【表２】
2021504325.tif 000003
【実施例２】
【００８２】
純粋な化合物の単離
粗アルコール抽出物をHPLC技術により分離した。
粗抽出物50mg〜200mgをHPLC装置のC18 Phenomenexカラム(21.2mm×150mm、5μm、100A)に注入した。使用した溶媒は、溶媒A：H2O/TFA 0.5%(1L/5mL)。溶媒B：ACN。流量：15mL/分。
3つの主要な化合物が単離された。
１．プロトカテク酸(純度98.6%)、92.5mg
２．ケルセチン(98.9%純度)295mg
３．ケルセチン-4'-グリコシド(96.5%純度)、143mg
【００８３】
組成物を調製するためのプロセス
１．40mgのケルセチンおよび3gのNaClを150mLの沸騰水と混合した。次に、溶液を冷却し、凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を、197.6mgずつ、無菌条件下で単回用量容器に分配した。
２．40mgのケルセチンを150mLの沸騰水と混合した。次いで、溶液を冷却し、3gのNaClを添加し、溶解した。得られた溶液を凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を、197.6mgずつ、無菌条件下で単回用量容器に分配した。
３．50mgのケルセチンを50mLのMeOH/H2O(50/50: v/v)に溶解した。
3.75gのNaClを150mLのH2Oに溶解した。次いで、得られた2つの溶液を室温で一緒に混合し、次いで凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を、無菌条件下で、単回投与容器中に200mgずつ分配した。
４．40mgのケルセチンを3gのNaClと混合した。得られた粉末を、無菌条件下で、単回投与容器中に200mgずつ分配した。
【実施例３】
【００８４】
溶媒調製
3つの異なる溶媒を調製した。
１．0.625gのNaClを250mLの蒸留水に溶解した。得られた溶液を、直径0.22μmの孔を有するフィルターを通す濾過によって滅菌し、滅菌条件で単回用量容器に分配した。
２．0.625gのNaHCO3を250mLの蒸留水に溶解した。得られた溶液を、直径0.22μmの孔を有するフィルターを通す濾過によって滅菌し、滅菌条件で単回用量容器に分配した。
３．蒸留水は、滅菌条件下で単回用量容器に分配した。
【００８５】
製剤
実施例1および2に記載の実験結果に基づいて、20mL中のタマネギの皮から抽出された活性成分の初期量(単回使用のための容量)を以下のように決定した。
タマネギの皮エキス - 10mg/20mL
ケルセチン - 0.485mg/20 mL
ケルセチン-4'-グリコシド - 0.283mg/20mL
プロトカテク酸 - 0.722mg/20mL
水、NaClまたはNaCl+NaHCO3および活性剤(タマネギ皮抽出物、ケルセチン、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン-4'-グリコシドまたはプロトカテク酸)を用いて、異なる医薬組成物を調合した。
【００８６】
実験に使用したケルセチンの定性的および定量的特性は以下の通りであった。
ケルセチン - 98%
2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン - 0.5%
ケルセチン-4'-グリコシド - 0.1%
発明の効果を実証する試験結果
【００８７】
鼻副鼻腔炎の治療
材料および方法
研究デザイン
本研究には雄ウサギ42匹を用いた。動物を、それぞれ6匹のウサギを含む7つの群に分けた。第1群は未処理対照として働き、第2群は0.9% NaCl溶液で処理され、5つの実験群が異なる製剤を試験するために使用された：タマネギ皮抽出物、ケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン、ケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸。
【００８８】
鼻副鼻腔炎の誘発
3日間、ウサギの各鼻腔に100μLの1%リポ多糖(LPS)を導入することにより、鼻副鼻腔炎を誘発した(Dong-Hyun Kim et all, 2011)。
【００８９】
化合物
次の濃度の組成物を試験した。
タマネギ皮水抽出液 - 1mg/mL
ケルセチンの混液 - 0.009mg/mL及び2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン - 0.001mg/mL
ケルセチン - 0.01mg/mL
ケルセチン-4'-グリコシド - 0.25mg/mL
プロトカテク酸 - 0.25mg/mL
化合物を、0.9〜1%塩化ナトリウムの溶液、または投与前に37℃に加熱した0.75% NaCl + 0.25% NaHCO3を含有する溶液中で希釈した。ケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンの混合物(これは懸濁液であった)を除いて、全ての製剤はわずかに乳白色の溶液であった。
【００９０】
治療計画
2 mLの溶液は、7日間、1日1回、各鼻腔内に投与した。試験した物質と鼻腔との最大接触を得るために、ウサギを、投与の間、「ヘッドダウン」位置に維持した。
【００９１】
治療後の検査
物質の最終投与の翌日、動物は全身麻酔薬：ゾレチル(Virbac、フランス)とロメタル(Bioveta、チェコ共和国)の過量投与により犠牲にされた。
動物の鼻腔を安楽死直後に視覚検査に供した。
肉眼検査後、ウサギの頭部の鼻部分を10%ホルムアルデヒド中で24時間固定し、次いで塩酸/水(25:1)溶液中で14日間脱石灰した。次に、動物の鼻を、4つのレベル：A - 切歯のレベルで、B - 切歯の後方のゾーンで、C - 第２の口蓋稜のレベルで、およびD - 第１の小臼歯のレベルで横方向に切断した。次に、組織を水で12時間洗浄し、従来の方法を用いてパラフィンに包埋した。ミクロトームを用いてこれらの組織から3〜5μmの組織切片を調製した。杯細胞およびそれらのグルコサミン含量を試験するために、組織切片をpH 2.5のアルシアンブルーで染色した。いくつかの組織切片を、さらなる組織学的試験のためにヘマトキシリンおよびエオシンで再染色した。
【００９２】
光学顕微鏡CarlZeisseAxioScopeA1(ドイツ)を用いて、25×、50×、100×、200×および400×の倍率で、組織学的調製物の形態学的調査を行った。サンプルの顕微鏡写真を、デジタルカメラAxioCamICc 1およびソフトウェアAxioVisionRel.4.8(ドイツ)を使用して作成した。形態測定は、AxioVisionRel.4.8ソフトウェア(ドイツ)を用いて行った。
【００９３】
上皮細胞の呼吸域から1mm以内の杯細胞を計数した。
外観、急性カタル性鼻副鼻腔炎の重症度、急性化膿性鼻副鼻腔炎および杯細胞の炎症後過形成の発生について、前庭、呼吸領域、嗅覚領域、副鼻腔の各領域における炎症性病変の程度を検討することにより評価した。
上皮の落屑および粘膜線毛腺の損傷の程度を、0〜3の尺度に沿ってスコア化した。
0  - 損傷がない
1  - 若干の損傷
2  - 中等度の損傷
3  - 強い損傷
単核細胞および白血球細胞の浸潤の程度は、0〜3のスコアで評価した。
0  - 検査領域に単核細胞が存在しない。
1  - 1〜5個の単核細胞が検査ゾーンに存在する。
2  - 6〜10個の単核細胞が検査ゾーンに存在する。
3  - 10以上の単核細胞が検査ゾーンに存在する。
【００９４】
統計解析
全てのデータは、記述統計を用いて分析した。データ分布の正規性は、シャピロ-ウィルク検定（Shapiro-Wilks test）によって検証した。正規性の場合、平均および平均の標準誤差(s.e.m)を計算し、n(値の数)と共に表に示した。データが正規性基準を満たさなかった場合、中央値と1番目と3番目の四分位数間の範囲を計算した。群間の差異は、分布タイプに応じてパラメトリックまたはノンパラメトリック検定を用いて分析した。正規分布データの分析は単因子分散分析試験(ANOVA)を用いて行い、さらに、テューキーの検定（Tukey’s method）を用いて事後分析を行った。正規分布に対応しないデータをノンパラメトリック  クラスカル・ウォリス検定（Kruskal-Wallis test）を用いて分析し、群間の差をマン・ホイットニー検定（Mann-Whitney test）を用いて分析した。差は、0.05の有意水準で決定した。
統計解析は、Statistica 10.0 sofware (StatSoftInc, USA)を用いて行った。
結果
【００９５】
視診所見
ウサギの全群はLPSの初回投与後に鼻炎と同じ徴候：くしゃみと鼻の引掻き傷、を示した。これは鼻副鼻腔炎の第1段階に相当する。投与3日目に、LPSは鼻閉と鼻腔の可視領域における粘膜の浮腫を引き起こした。試験化合物の最初の投与後、浮腫および鼻からの漿液性分泌物が観察された。調査9日目および10日目に、投与群で鼻腔の乾燥および分泌物を伴わないくしゃみのまれな症例(6例中1例)が観察された。
【００９６】
組織学的検査所見
鼻前庭の粘膜は重層扁平上皮に代表される典型的な組織構造を有し、次第に単層呼吸上皮に移行してきた。
内鼻は呼吸と臭覚の領域に対応する2種類の粘膜で覆われていた。呼吸領域の粘膜は多列円柱線毛上皮、基底膜およびその下の疎性結合組織で表された。呼吸領域の上皮は、繊毛上皮細胞、基底細胞および杯細胞から構成されていた。アルシアンブルーでの組織化学的染色はほとんどの杯細胞においてグルコサミンを含有する大きな小胞の存在が明らかになり、これは、これらの細胞の増加した機能的活性を指す。基底膜に多数の血清粘液腺を観察した。
嗅覚領域は背側鼻甲介と鼻腔の天蓋部に位置していた。嗅上皮は支持細胞、嗅細胞および基底細胞から形成されていた。
【００９７】
【表３】
2021504325.tif 000004
【００９８】
一次データは正規分布基準を満たした。単因子分散分析試験(ANOVA)およびテューキーの検定（Tukey’s test）によって行われたさらなる事後分析は、以下の差異を明らかにした(表3)。
−  タマネギ皮粗抽出物およびケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン投与後のウサギにおける杯細胞の総数に対するアルシアン陽性細胞の比率の対照と比較した減少。
−  ケルセチン-4'-グリコシド投与後のウサギの上皮1mm上の杯細胞数の対照と比較した増加。
【００９９】
【表４】
2021504325.tif 000005
【０１００】
【表５】
2021504325.tif 000006
【０１０１】
クラスカル・ウォリス検定（Kruskal-Wallis test）およびマン・ホイットニー検定（Mann-Whitney）を用いたスコア0から3までのスコアによる病理学的炎症の程度のノンパラメトリック解析では、群間で以下の有意差が示された。
−  タマネギ皮粗抽出物、ケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンまたはプロトカテク酸を投与した群では、白血球の粘膜浸潤は対照群よりも低かった。
−  ケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンまたはケルセチン-4'-グルコシドを投与した群では、上皮落屑は観察されなかった。
−  呼吸領域の炎症性病変の程度はタマネギ皮粗抽出物を投与した群で有意に低かった。
−  ケルセチンを投与した群では杯細胞の炎症後過形成および急性化膿性鼻副鼻腔炎の兆候はなかった。
−  急性カタル性鼻副鼻腔炎の頻度は、ケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンまたはタマネギ皮粗抽出物を投与した群で低かった。
−  急性化膿性鼻副鼻腔炎の出現に群内差は認められなかった。
【０１０２】
杯細胞はすべて、アルシアンブルーで染色されたムコ多糖類を含有している。杯細胞の数は炎症時に増加し、治療後には減少しなければならない。得られたデータから、これらの細胞の割合は炎症誘発後に有意に増加したと結論できる。一般に、この過程は粘膜の浸潤を伴う。浸潤はないが杯細胞数が高いままであれば、これは炎症後過形成と考えられ、改善の徴候である。
【０１０３】
対照群。対照群では肉眼的変化は認められなかった。
顕微鏡検査では、LPSの投与が呼吸および嗅覚領域に炎症を引き起こしたことを示した。粘膜とその下層組織における浮腫と白血球浸潤が前庭に認められた。呼吸領域に上皮の落屑と粘液腺の萎縮を認めた。アルシアンブルーで染色したところ、呼吸領域に杯細胞の塊状過形成帯が認められた。上皮の形態測定評価は、杯細胞の総数に関連してグルコサミンおよびムコ多糖を含有する杯細胞の有意な増加を示した。また、粘膜およびその下の組織における中等度のリンパ球およびマクロファージの浸潤も観察された。鋤鼻器に中等度の炎症性変化を認めた。以上より、炎症誘発剤LPSの投与後、ウサギにおいて急性カタル性鼻副鼻腔炎が認められた(表5)。
【０１０４】
0.9%塩化ナトリウム溶液で処置した第2の群の動物は、目視観察で肉眼的変化を示さなかった。
顕微鏡検査では、粘膜の呼吸および臭覚領域における上皮落屑の徴候、中等度から重大な白血球浸潤、好中球量の増加を伴う滲出液の存在、および細胞残屑がいくつか明らかにされた。1mmの上皮上のアルシアン陽性細胞数、ならびに杯細胞数は、非処理動物よりも低かった。これは粘膜の壊死と上皮の炎症性病変によるものであった。一般に、この群では急性カタル性鼻副鼻腔炎および化膿性鼻副鼻腔炎の徴候が観察された。
【０１０５】
タマネギ皮粗抽出物およびケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを投与された第3群および第4群の動物は、肉眼(目視)検査中に疾患の徴候を示さなかった。
顕微鏡検査では、非投与群と比較して炎症の徴候が非常に軽度であることが明らかになった。リンパ球浸潤は粘膜にわずかに出現し、下層組織には実質的に認められなかった。上皮落屑の徴候はこれら2群で認められなかった。呼吸および嗅覚領域と粘液腺に再生の徴候を観察した。一部の動物では杯細胞の炎症後過形成が認められた。ケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノン投与群では急性化膿性鼻副鼻腔炎はなかった。
【０１０６】
NaCl中のケルセチン、ケルセチン-4'-グリコシドおよびプロトカテク酸をそれぞれ投与した第5、第6および第7群の動物の肉眼検査後に変化は観察されなかった。
顕微鏡検査により、タマネギ皮粗抽出物およびケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンを投与した動物より強いが、未処理ウサギよりはわずかである炎症過程の徴候が明らかになった。化膿性鼻副鼻腔炎の徴候はこれらの群では観察されなかった。
【０１０７】
結論
タマネギ皮抽出物およびそれから単離された化合物で処理した後の動物の組織学的試験の結果は、タマネギ皮抽出物およびケルセチン + 2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンが非処理またはプラセボ処理動物と比較して最良の治療効果を示したことを明らかにした。タマネギ皮粗抽出物の最良の治療効果はいくつかの化合物の合計によって説明することができ、それらの各々は多かれ少なかれ抗炎症活性を示し、おそらく増強能力を有する。
意外にも、ケルセチンと2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンとの混合物は、ケルセチン単独と比較して最良の治療効果を示した。これは、2つの理由によって説明することができる。第一に、2-(3,4-ジヒドロキシベンゾイル)-2,4,6-トリヒドロキシ-3(2H)-ベンゾフラノンの存在である。第2に、懸濁液の形態のケルセチンは、溶液中のケルセチンと比較して、長期間持続する効果がある。
【０１０８】
ケルセチン‐4'‐グリコシド(GCA)とプロトカテク酸は鼻副鼻腔炎に対して中等度の活性を示した。各試験物質の用量と達成された治療効果を相関させると、我々は、NaClまたはNaCl/NaHCO3を含有する溶液中の懸濁液の形態のケルセチンが鼻副鼻腔炎の治療のための好ましい薬物であり得ると結論した。
【国際調査報告】
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