(57)【要約】  本発明は、対象に、有効量のＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）関連エンドヌクレアーゼ、および対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む、アンジェルマン症候群を処置する方法および組成物に関する。
2021513866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化を必要とするヒト対象において、父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化する方法であって、前記対象に有効量のＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）関連エンドヌクレアーゼ、および前記対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列（配列番号１）に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
アンジェルマン症候群の処置を必要とする対象において、アンジェルマン症候群を処置する方法であって、前記対象に、有効量のＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）関連エンドヌクレアーゼ、および前記対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列（配列番号１）に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法。
【請求項３】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２、またはそれらの変異体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、ヒト最適化Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２、またはそれらの変異体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２、またはそれらの変異体が、失活している、かつ／または触媒的に不活性である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記失活したＣａｓ９、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２、またはその変異体が、転写リプレッサードメインに融合されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の前記標的ヌクレオチド配列が、１つまたは複数のＳＮＯＲＤ１１５（ヒトにおけるＨＢＩＩ−５２、マウスにおけるＭＢＩＩ−５２）および／またはＳＮＯＲＤ１１５ＨＧ遺伝子中にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の前記標的ヌクレオチド配列が、１つまたは複数のＳＮＨＧ１４遺伝子中にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の前記標的ヌクレオチド配列が、１つまたは複数のＳＮＯＲＤ１０９Ｂ遺伝子中にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の前記標的ヌクレオチド配列が、１つまたは複数のＳＮＯＲＤ１１６遺伝子および／またはＳＮＯＲＤ１１６ＨＧ遺伝子中にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３〜配列番号９０のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび前記１つまたは複数のガイドＲＮＡが、１つまたは複数の核酸分子として前記対象に導入される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が、ベクター中に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化が必要なヒト対象において、父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化する方法であって、前記対象に、有効量の失活したＳｐＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合体および／または失活したＳａＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合体、ならびに前記対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中のＳｎｏｒｄ１１５内の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化が必要なヒト対象において、父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化する方法であって、前記対象に、有効量の失活したＳｐＣａｓ９および／または失活したＳａＣａｓ９、ならびに前記対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中のＳｎｏｒｄ１１５内の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法。
【請求項１８】
アンジェルマン症候群（ＡＳ）の処置を必要とする対象において、ＡＳを処置する方法であって、前記対象に、有効量の失活したＳｐＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合体および／または失活したＳａＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合体、ならびに前記対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中のＳｎｏｒｄ１１５内の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
アンジェルマン症候群（ＡＳ）の処置を必要とする対象において、ＡＳを処置する方法であって、前記対象に、有効量の失活したＳｐＣａｓ９および／または失活したＳａＣａｓ９、ならびに前記対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中のＳｎｏｒｄ１１５内の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、およびＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を、薬学的に許容される担体に含む組成物。
【請求項２１】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、およびＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸分子を、薬学的に許容される担体に含む組成物。
【請求項２２】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする前記核酸分子、および前記１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子をコードする前記核酸分子が、単一の核酸構築物に存在する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする前記核酸分子、および前記１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子をコードする前記核酸分子が、２つ以上の別個の核酸構築物に存在する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸構築物が、ウイルスベクター中にある、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記核酸構築物がそれぞれ、ウイルスベクター中に存在する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
ＡＡＶベクターである、請求項２４または２５に記載のウイルスベクター。
【請求項２７】
前記ＡＡＶベクターが、血清型ＡＡＶ９に由来する、請求項２６に記載のウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の陳述］
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１８年２月２７日出願の米国仮特許出願第６２／６３５，８１５号の優先権を主張する。この出願は、その全体の内容が、参照によって本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
［政府支援の陳述］
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）による、認可第ＥＳ０２４０８８号の政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、アンジェルマン症候群を処置する方法および組成物に関する。
【０００４】
［配列表の電子提出に関する陳述］
米国特許法施行規則第１．８２１条の下で提出される、ＡＳＣＩＩテキストフォーマットの配列表（表題５４７０−８３９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、５７７，２２７バイトのサイズ、２０１９年２月２７日に作成、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出）を、紙コピーの代わりに提供する。この配列表は、これにより、本明細書中での参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
［発明の背景］
アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、ＵＢＥ３Ａの母系アレルの欠失または変異によって引き起こされる、重度の神経発達障害である。ＵＢＥ３Ａは体のほぼ全ての細胞において両アレルにより（ｂｉａｌｌｅｌｉｃａｌｌｙ）発現しているが、成熟神経細胞は例外であり、そこでは、父系アレルはＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳと呼ばれる極めて長いノンコーディングＲＮＡによってサイレンシングされている。この生物学を考慮すれば、ＡＳと関連する、神経および行動の機能不全を処置する最も直接的な方法は、インタクトの父系ＵＢＥ３Ａアレルを非サイレンス化（ｕｎｓｉｌｅｎｃｅ）することである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、例えば活性Ｃａｓ９が用いられる場合に、哺乳動物ゲノムの特定の領域を恒久的に修飾することができる。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、例えば失活したＣａｓ９を単独で用いた場合に、またはリプレッサードメインに融合された場合に、哺乳動物ゲノムの特定の領域での転写を抑制することができる。
【０００６】
本発明は、アンジェルマン症候群等の神経発達障害を処置する方法および組成物を提供することによって、当該技術における以前の弱点を克服する。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本発明は、父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化を必要とするヒト対象において父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化する方法であって、対象に、有効量のＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）関連エンドヌクレアーゼ（触媒的に活性であるか、または不活性である／失活している）、および対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列と相補性を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を投与するステップを含む方法を提供する。
【０００８】
更なる態様において、本発明は、アンジェルマン症候群（ＡＳ）の処置を必要とする対象においてＡＳを処置する方法であって、対象に、有効量のＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）関連エンドヌクレアーゼ（触媒的に活性であるか、または不活性である／失活している）、および対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列と相補性を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】インタクトの父系ＵＢＥ３Ａアレルを非サイレンス化する分子経路の図である。
【図２Ａ−Ｂ】（２Ａ）Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳが、転写干渉／衝突機構（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を介して、神経細胞において父系Ｕｂｅ３ａをブロックする図である。（２Ｂ）境界要素が、非神経細胞細胞においてＵｂｅ３ａ−ＡＴＳをトランケートする図である。Ｘ＝メチル化／インプリント領域。
【図３Ａ】ｇＲＮＡライブラリーにおける遺伝子および調節エレメントに対するｇＲＮＡの位置の図である。
【図３Ｂ】遺伝子アノテーションの図である。
【図３Ｃ】皮質神経細胞由来のＲｉｂｏｚｅｒｏ  ＲＮＡ−ｓｅｑの図である。
【図３Ｄ】調節エレメントマークの図である。
【図４】ＳｐＣａｓ９およびｊｗ３３−ｇＲＮＡが、父系Ｕｂｅ３ａを上方制御する一方、Ｓｎｏｒｄ１１５およびＵｂｅ３ａ−ＡＴＳを、近くの他の遺伝子に影響を与えることなく、下方制御することを示すグラフである。（パネルＡ）ＳｐＣａｓ９、およびマウスＳｎｏｒｄ１１５またはヒトＳＮＯＲＤ１１５を標的とするｇＲＮＡ（陰性対照、破線で標準化）を有するレンチウイルスで形質導入した野生型マウス神経細胞由来の総ＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ。（パネルＢ）パネルＡと同じウイルスで形質導入したＵｂｅ３ａＷＴ／ＹＦＰ神経細胞。母系アレル（ｗｔ  Ｕｂｅ３ａ）または父系アレル（Ｕｂｅ３ａ：ＹＦＰ）の発現を選択的に調べるプライマーを用いたＲＴ−ｑＰＣＲ。父系アレル（黒色）および母系アレル（灰色）。
【図５】活性ＳｐＣａｓ９、失活した（ｄ）ＳｐＣａｓ９、ＫＲＡＢリプレッサードメインに融合されたｄＳｐＣａｓ９、活性ＳａＣａｓ９、およびｄＳａＣａｓ９は全て、培養されたマウス神経細胞において父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することができることを示したグラフである。Ｃａｓ９プラスミドおよびｇＲＮＡを、ｔｄＴｏｍａｔｏと一緒に、Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐａｔＹＦＰ神経細胞培養にトランスフェクトした。Ｓｃｒ．＝スクランブルｇＲＮＡ；ｊｗ３３  ｇＲＮＡ；Ｓａｊｗ３３  ｇＲＮＡ。ＹＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏ間の共局在パーセントを、ハイコンテントイメージングを用いて定量化した。Ｎ＝４。＊Ｐ＜０．０００５。
【図６】ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳにおける一塩基多型（ＳＮＰ）が、ヒト神経細胞において、強いアレルバイアスを示すことを示すグラフである。父系アレル（黒色）および母系アレル（灰色）。
【図７】ＵＢＥ３ＡにおけるＳＮＰが、ヒト神経細胞において、強いアレルバイアスを示すグラフである。始原ヒト神経前駆細胞（ｐｈＮＰＣ）、および神経細胞分化後８週のｐｈＮＰＣ由来神経細胞における鎖特異的ＲＮＡ−ｓｅｑを用いて、ＵＢＥ３Ａのリーディングフレームにおいて同定された一塩基多型。父系アレル（黒色）および母系アレル（灰色）。
【図８】（パネルＡ）ＳｐＣａｓ９およびｈｓａ−ｊｗ３３のレンチウイルス送達を示すデータは、ｐｈＮＰＣから分化したヒト神経細胞において父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化するが、スクランブルｇＲＮＡ陰性対照は、父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化しなかったことを示すグラフである。ＵＢＥ３Ａのエキソン５内のＡ／Ｔ−ＳＮＰ（Ｃｈｒ１５：２５，３７１，６９７；ｒｓ５３００５４９４８）に特異的なＴａｑＭａｎ遺伝子型特定プローブを用いて、各アレル間の発現差異を定量化した。Ｃａｓ９−：Ｃａｓ９で形質導入されなかった神経細胞。Ｃａｓ９＋：Ｃａｓ９で形質導入された神経細胞。（パネルＢ）ｐｈＮＰＣ由来神経細胞におけるＳｐＣａｓ９およびｈｓａ  ｊｗ３３のレンチウイルス送達後のガイドＲＮＡ標的部位近くの遺伝子の発現を示すグラフである。破線は、スクランブルｇＲＮＡ（陰性）対照に対する発現値を示す。
【図９】ＳａＣａｓ９およびＳａｊｗ３３−ｇＲＮＡの子宮内エレクトロポレーションが、マウス脳内で父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することを示す図である。Ｅ１５．５  ｐａｔＵｂｅ３ａ：ＹＦＰ胚を、ＡＡＶ−ｈＳｙｎ１：：ＳａＣａｓ９−Ｓａｊｗ３３およびｐＣＡＧＧ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドで子宮内エレクトロポレーションした。Ｐ３０にて、マウス脳を、ｍＣｈｅｒｒｙ（パネルＡ）および父系ＵＢＥ３Ａ−ＹＦＰ（パネルＢ）について共標識した。
【図１０】ＳａＣａｓ９およびＳａｊｗ３３−ｇＲＮＡを含有するＡＡＶ２遺伝子治療ベクターが、マウス脳内で父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することを示す図である。（パネルＡ）Ｅ１６．５  ｐａｔＵｂｅ３ａ：ＹＦＰ胚に、ＡＡＶ２−ｈＳｙｎ１−ＳａＣａｓ９−Ｓａｊｗ３３を脳室内注射した。Ｐ３０にて、マウス脳を切り出し、ＹＦＰに対する抗体で染色した。（パネルＢ〜Ｃ）神経細胞内でのｐａｔＵＢＥ３Ａ：ＹＦＰの発現の増大を示す拡大図である。なお、均一な最大発現レベルおよび顕著な核局在化は、父系Ｕｂｅ３ａプロモーターからの適切な発現および適切なアイソフォーム使用を示す。
【図１１】ＳａＣａｓ９およびＳａｊｗ３３  ｇＲＮＡを含有するＡＡＶ９遺伝子治療ベクターを１５．５日目の胚に脳室内注射した場合、マウス脳内で父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することを示す図である。（パネルＡ）Ｅ１５．５  ｐａｔＵｂｅ３ａ：ＹＦＰ胚に、ＡＡＶ９−ｈＳｙｎ１−ＳａＣａｓ９−Ｓａｊｗ３３を子宮内注射した。Ｐ３０にて、マウス脳を切り出して、ＹＦＰに対する抗体で染色した。（パネルＢ）海馬神経細胞内でのｐａｔＵＢＥ３Ａ：ＹＦＰの発現の増大を示す拡大図である。（パネルＣ〜Ｄ）大脳皮質神経細胞内でのｐａｔＵＢＥ３Ａ：ＹＦＰの発現の増大を示す拡大図である。なお、均一な最大発現レベルおよび顕著な核局在化は、父系ＵＢＥ３Ａプロモーターからの適切な発現および適切なアイソフォーム使用を示す。このベクターは、脳の範囲全体にわたって、ＵＢＥ３Ａ非サイレンス化を達成する。
【図１２】ＳａＣａｓ９およびＳａｊｗ３３  ｇＲＮＡを含有するＡＡＶ９遺伝子治療ベクターを出生後１日目に脳室内注射した場合、マウス脳内で父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することを示した図である。（パネルＡ）出生後１日目（Ｐ１）のｐａｔＵｂｅ３ａ：ＹＦＰマウスに、ＡＡＶ９−ｈＳｙｎ１−ＳａＣａｓ９−Ｓａｊｗ３３を注射した。Ｐ３０にて、マウス脳を切り出して、ＹＦＰに対する抗体で染色した。（パネルＢ）海馬神経細胞内でのｐａｔＵＢＥ３Ａ：ＹＦＰの発現の増大を示す拡大図である。（パネルＣ〜Ｄ）大脳皮質神経細胞内でのｐａｔＵＢＥ３Ａ：ＹＦＰの発現の増大を示す拡大図である。
【図１３】ＳａＣａｓ９およびＳａｊｗ３３  ｇＲＮＡを含有するＡＡＶ９遺伝子治療ベクターを出生後１日目に脳室内注射した場合、アンジェルマン症候群モデルマウス（Ｕｂｅ３ａｍ−／ｐ＋）内で父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することを示した図である。（パネルＡ）出生後１日目（Ｐ１）のＵｂｅ３ａｍ−／ｐ＋マウスを、脳室内注射によりＡＡＶ９−ｈＳｙｎ１−ＳａＣａｓ９−Ｓａｊｗ３３  ｇＲＮＡで処置した。Ｐ３０にて、処置したマウスを灌流して、脳を切り出して、ＵＢＥ３Ａタンパク質について染色した。（パネルＢ）海馬神経細胞内でのｐａｔＵＢＥ３Ａの発現の増大を示す拡大図である。（パネルＣ〜Ｄ）大脳皮質神経細胞内でのｐａｔＵＢＥ３Ａの発現の増大を示す拡大図である。
【図１４】ＳａＣａｓ９およびＳａｊｗ３３  ｇＲＮＡを含有するＡＡＶ９遺伝子治療ベクターが、アンジェルマン症候群モデルマウス（Ｕｂｅ３ａｍ−／ｐ＋）における下肢の握り行動表現型を奪回することを示す図及びグラフである。（パネルＡ）下肢の握り行動表現型を、０（表現型なし）から、１（軽度）、２（重度）のスケールでスコア化した。（パネルＢ）ＷＴおよびＵｂｅ３ａｍ−／ｐ＋アンジェルマン症候群モデルマウスに、ＡＡＶ９：ＳａＣａｓ９＋Ｓａｊｗ３３（またはスクランブルｇＲＮＡ）をＰ１にて注射し、下肢の握り行動をＰ３０にてスコア化した。Ｎ＝６〜１０／群。ｎ．ｓ．＝有意でない。＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［本発明の詳細な説明］
本発明を、本発明の好ましい実施形態を示す添付の図面および明細書を参照して、以降でより完全に説明することとする。しかしながら、本発明は、様々な形態で具体化されてもよく、本明細書中に示される実施形態に制限されると解釈されるべきではない。
【００１１】
定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、この発明の属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、本発明の制限であることは意図されていない。
【００１２】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の引用文献は、それらの全体が、引用文献が示される文章および／または段落に関連する教示について、参照により本明細書の一部をなすものとする。
【００１３】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）技術を使用するプロトコルを用いて、父系ＵＢＥ３Ａ遺伝子を非サイレンス化することができるという予想外の発見に基づく。ゆえに、一態様において、本発明は、父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化を必要とするヒト対象において父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化する方法であって、対象に、有効量のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、および対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列と相補性を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
更なる態様において、本発明は、アンジェルマン症候群（ＡＳ）の処置を必要とする対象においてＡＳを処置する方法であって、対象に、有効量のＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）関連エンドヌクレアーゼ、および対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列と相補性を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
細菌において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動遺伝因子（ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド）に対するＲＮＡにガイドされる適応免疫系をコードする。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、前述の移動要素と相補的な配列であるスペーサーを含有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写されて、成熟ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に属し、そして標的ＤＮＡを切断する強いエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、約２０塩基対（ｂｐ）の独特の標的配列（スペーサーと呼ばれる）を含有する成熟ｃｒＲＮＡ、およびプレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩに支援されるプロセシングのガイドとして機能するトランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）によってガイドされる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的ＤＮＡ上の相補配列（プロトスペーサと呼ばれる）間の相補塩基対形成を介してＤＮＡを標的とするように導く。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離されるＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識して、切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現されてもよいし、天然のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣するように、合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工融合小ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる）に操作されてもよい。そのようなｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡのように、直接的ＲＮＡトランスフェクション用に合成されてもインビトロで転写されてもよいし、Ｕ６またはＨ１−プロモーターから発現されてもよいが、人工ｓｇＲＮＡの切断効率は、別々に発現されるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡによる系についての切断効率よりも低い。
【００１６】
更なる実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、およびＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列と相補性を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼをコードする核酸分子として組成物中に存在する。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、および１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子は、単一の核酸構築物中に存在する。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、および１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）の別々の核酸構築物に存在する。
【００１７】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは触媒活性状態である。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはその変異体、ヒト最適化Ｃａｓ９であり、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、ＢｌａｔＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＦｎＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ９ベースエディタ、Ｃ２Ｃ２  ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ、および／またはＲＮＡ標的化ヌクレアーゼ（例えば標的化ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ）が挙げられる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼおよび／またはその変異体である。例示的なＣｐｆ１変異体として、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１および／またはＬｂＣｐｆ１が挙げられる。例示的なＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓヌクレアーゼおよびＣｐｆ１ヌクレアーゼとして、限定されないが、Ｎａｋａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ８（３）：２６５−２７３（２０１７）に記載されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼが挙げられる。
【００１８】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、ＣａｓＸヌクレアーゼおよび／またはその変異体である。例示的なＣａｓＸ変異体として、限定されないが、ＤｐｂＣａｓＸおよび／またはＰｌｍＣａｓＸが挙げられる（Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５６６（７７４３）：２１８−２２３（２０１９））。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼおよび／またはその変異体である。例示的なＣａｓ１２変異体として、限定されないが、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｇが挙げられる（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６３（６４２２）：８８−９１（２０１９））。
【００１９】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に不活性状態である、かつ／または失活している。触媒的に不活性であり、かつ／または失活している例示的なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとして、限定されないが、失活したＳａＣａｓ９、失活したＳｐＣａｓ９、および失活したＣａｓＸが挙げられる。
【００２０】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、リプレッサードメインに融合されている。一実施形態において、リプレッサー遺伝子は、ＫＲＡＢリプレッサーである（Ｕｒｒｕｔｉａ．“ＫＲＡＢ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４（１０）：２３１（２００３））。そのようなＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの例として、限定されないが、失活したＳｐＣａｓ９−ＫＲＡＢおよび／または失活したＳａＣａｓ９−ＫＲＡＢ（例えば、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中のヌクレオチド配列（例えばＳｎｏｒｄ１１５）を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と組み合わされている）が挙げられる。
【００２１】
ゆえに、一実施形態において、本発明は、父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化を必要とするヒト対象において父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化する方法であって、対象に、有効量の失活したＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、失活したＳｐＣａｓ９および／または失活したＳａＣａｓ９）、および対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列（例えば、Ｓｎｏｒｄ１１５）と相補性を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態において、失活したＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、リプレッサードメインに融合されている（例えば、失活したＳｐＣａｓ９−ＫＲＡＢおよび／または失活したＳａＣａｓ９−ＫＲＡＢ）。
【００２２】
更なる態様において、本発明は、アンジェルマン症候群（ＡＳ）の処置が必要な対象においてＡＳを処置する方法であって、対象に、有効量の失活したＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、失活したＳｐＣａｓ９および／または失活したＳａＣａｓ９）、および／またはリプレッサードメインに融合された失活したＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、失活したＳｐＣａｓ９−ＫＲＡＢおよび／または失活したＳａＣａｓ９−ＫＲＡＢ）、ならびに対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列（例えば、Ｓｎｏｒｄ１１５）と相補性を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子を提供し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼである。一実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードする核酸分子、および対象の細胞のＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的配列と相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸分子を提供する。
【００２４】
本発明は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列と相補的である配列を含む１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を提供する。ｇＲＮＡ分子は、コード配列および／または非コード配列と相補的であってよい。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、約１〜約３０ヌクレオチド、約５〜約２５ヌクレオチド、または約１０〜約２０ヌクレオチド（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドが挙げられる）を含んでもよい。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはその一部は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成することができる。例えば、一実施形態において、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成するヌクレオチドの数は、約１から約１０、または約１から約２０ヌクレオチド（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドが挙げられる）であってもよい。
【００２５】
更なる実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列に結合するように操作されたヌクレアーゼを含む組成物を提供する。一実施形態において、そのようなヌクレアーゼは、１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子の不在下で、本発明の標的ヌクレオチド配列に直接結合する。そのようなヌクレアーゼの例として、限定されないが、ＴＡＬヌクレアーゼ（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７３１−７３４（２０１２）；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３（６０４０）：１−８）（２０１１））、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および現在知られているか、後に同定される他のあらゆるヌクレアーゼが挙げられる。一実施形態において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列は、本発明の１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子によって標的とされる、同じ標的配列である。ＴＡＬヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的配列に対して配列特異性がある一連のＴＡＬまたはジンクフィンガーＤＮＡ認識ドメインを共に融合することによって、当該技術において知られている方法を用いて操作することができる。
【００２６】
本発明の一実施形態において、父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化を必要とするヒト対象において父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化する方法であって、対象に、対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列に結合する、有効量の転写アクティベータ様エフェクタ（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、および／またはジンクフィンガーヌクレアーゼを投与するステップを含む方法が提供される。
【００２７】
更なる態様において、本発明は、アンジェルマン症候群（ＡＳ）の処置が必要な対象においてＡＳを処置する方法であって、対象に、対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列に結合する、有効量の転写アクティベータ様エフェクタ（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、および／またはジンクフィンガーヌクレアーゼを投与するステップを含む方法を提供する。
【００２８】
一実施形態におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列としては、限定されないが、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの発現レベルおよび／または転写レベルを引き下げることができるあらゆるヌクレオチド配列が挙げられる。一実施形態において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列としては、限定されないが、本明細書中で同定される、または後に同定される、アンジェルマン症候群を処置することができるあらゆるヌクレオチド配列が挙げられる。そのような標的ヌクレオチド配列は、種の全体にわたって保存されていても保存されていなくてもよい。標的ヌクレオチド配列が種の全体にわたって保存されていない本発明の実施形態において、そのような標的配列の対応する転写産物は、種の全体にわたって保存されている（例えば、表１〜表４参照）。一実施形態において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列は、Ｓｎｏｒｄ１１５（ヒトにおいてＨＢＩＩ−５２、マウスにおいてＭＢＩＩ−５２としても知られている）、Ｓｎｏｒｄ１１５ＨＧ、ＳＮＨＧ１４、ＳＮＲＰＮ、Ｓｎｏｒｄ６４、ＩＰＷ、Ｓｎｏｒｄ１１６、および／またはＳｎｏｒｄ１１６ＨＧの１つまたは複数の遺伝子中にある。一実施形態において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のＳｎｏｒｄ１１５遺伝子である。一実施形態において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のＳｎｏｒｄ  １１５遺伝子である。Ｓｎｏｒｄ  １１５遺伝子は、数字で表した接尾辞を加えることによって区別する場合がある（例えば、Ｓｎｏｒｄ１１５−１、Ｓｎｏｒｄ１５５−２など）。一実施形態において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のＳｎｏｒｄ１１６（ヒトにおいてＨＢＩＩ−８５、マウスにおいてＭＢＩＩ−８５としても知られている）遺伝子である。
【００２９】
一実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、ヒトＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳのヌクレオチド配列全体（配列番号１）、または配列番号１のヌクレオチド配列中の少なくとも約１０ヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０などであり、本明細書中で明示的に示されない、配列番号１中のヌクレオチドの、最大で総数の、ヌクレオチドの任意の数が挙げられる）の連続したあらゆる領域である。このヒト配列（配列番号１）は、ＩＰＷ転写産物の３’末端、全ｓｎｏｒｄ１１５反復の初めから終わりまで、そしてＵＢＥ３Ａのアノテーションされた３’ＵＴＲの直前の末端を包含する。
【００３０】
本発明のｇＲＮＡ分子は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中のあらゆる標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでもよく、標的ヌクレオチド配列は、ＳＮＯＲＤ１１６、ＳＮＯＲＤ１１５、および／もしくはＩＰＷ、またはそれらのあらゆる部分であってもよい。一実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、マウスＵｂｅ３ａ−ＡＴＳ（配列番号２）のヌクレオチド配列全体、または配列番号２のヌクレオチド配列中の少なくとも約１０ヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０などであり、本明細書中で明示的に示されない、配列番号２中のヌクレオチドの、最大で総数の、ヌクレオチドの任意の数が挙げられる）の連続したあらゆる領域である。このマウス配列（配列番号２）は、ＩＰＷ転写産物の３’末端、全ｓｎｏｒｄ１１５反復の初めから終わりまで、そしてｕｂｅ３ａのアノテーションされた３’ＵＴＲの直前の末端を包含する。
【００３１】
本発明のｇＲＮＡ分子は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中のあらゆる標的ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含んでもよく、標的ヌクレオチド配列は、Ｓｎｏｒｄ１１６、Ｓｎｏｒｄ１１５、および／もしくはＩＰＷ、またはそれらのあらゆる部分であってもよい。
【００３２】
一実施形態において、標的ヌクレオチド配列および／または遺伝子の位置は、Ｈｇ転写産物アノテーションの形態で提供される（表８）。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、表１〜表５内のｇＲＮＡ配列から選択されてもよい。例えば、一実施形態において、本発明のｇＲＮＡ分子は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０のいずれかのヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００３３】
一実施形態において、本発明の核酸分子は、ベクター中に存在してもよく、当該ベクターは、非ウイルスベクターであってもウイルスベクターであってもよい。本発明のウイルスベクターの非限定的な例として、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、当該技術において知られている、または後に同定されるその他のものが挙げられる。
【００３４】
一実施形態において、本発明の核酸分子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に存在してもよく、当該ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ベクターおよび／もしくはＡＡＶ９ベクター、または他のあらゆるＡＡＶ血清型のウイルスベクターであってもよい。一実施形態において、核酸分子は、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、およびＣｊＣａｓ９から選択されるＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むＡＶＶ９ベクターであってもよく、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子をさらにコードしてもよい。
【００３５】
一実施形態において、本発明のベクターは、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド、リポソーム、または現在知られている、もしくは後に同定される他のあらゆる核酸送達ビヒクル）であってもよい。
【００３６】
一実施形態において、本発明の核酸構築物は、例えば、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列の上流に位置決めされたプロモーターおよびイントロン、ならびにｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の上流に位置決めされた別個のＵ６プロモーターを含んでもよいベクターである。一実施形態において、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列の上流のプロモーターは、細胞型特異的プロモーターであってもよく、例えば、限定されないが、シナプシン（すなわち、神経細胞内での発現を駆動するためのもの）および／または遍在性プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および／またはニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）ハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター）がある。
【００３７】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、および１つまたは複数のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９リボ核タンパク複合体を含むナノ粒子またはマイクロ粒子に付着または結合されてもよい。
【００３８】
さらに、本発明のベクターは、例えば、当該技術において周知であるように、複製、パッケージング、および／または送達などに必要とされるウイルスｃｉｓエレメントの活性を増強するように、野生型ベクターゲノムに対して最適化されたベクターゲノムを含んでもよい。そのような最適化されたベクターは、当該技術において周知であるように、最適化された転写カセット、最適化された末端反復などを含んでもよい。
【００３９】
一実施形態において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列との、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子の相補性は、異なってもよいが、典型的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一実施形態において、単一の塩基対ミスマッチは許容され得るが、標的化効率が低下する場合がある。
【００４０】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、野生型配列と同一のヌクレオチド配列を有してもよい。例えば、一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）のヌクレオチド配列は、野生型化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）配列と同一のヌクレオチド配列を有し得る（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７１（７３４０）：６０２−６０７（２０１１）；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６（２０１３））；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８１９−８２３（２０１３））。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種由来のヌクレオチド配列であってもよく、他の種として、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等が挙げられ、または他の配列決定された細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核微生物等がであってもよい。例として、限定されないが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２０（７４５６）：１８６−１９１（２０１５）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：２５７（２０１５））；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）（ＮｍＣａｓ９）（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １１０（３９）：１５６４４−１５６４９（２０１３））；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（ＣｊＣａｓ９）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ  ８：１−１２（２０１７））；進化型ＳｐＣａｓ９（ｘＣａｓ９）（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５５６（７６９９）：５７−６３（２０１８））；アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（ＡｓＣｐｆ１）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（８）：８６９−８７４（２０１６））；ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａ）科細菌（ＬｂＣｐｆ１）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（８）：８６９−８７４（２０１６））；Ｃａｓ１２（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６３（６４２２）：８８−９１（２０１９））；デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＤｐｂＣａｓＸ）；およびプランクトミケス（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）（ＰｌｍＣａｓＸ）（Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５６６（７４３）：２１８−２２３（２０１９））が挙げられる。
【００４１】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとして、ＣＲＩＳＰＲｉ（例えば、失活したＳｐＣａｓ９、失活したＳｐＣａｓ９−ＫＲＡＢ（Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５５（６３２０）：１−１９（２０１７）、Ｍａｎｄｅｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  １８（４）：５４１−５５３（２０１６））；Ｃａｓ９ベースエディタ（Ｋｏｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３３（７６０３）：４２０−４２４（２０１６））；および／またはＣ２Ｃ２  ＲＮＡガイドＲＮＡ標的化（標的化ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ等（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３（６２９９）：１−２３（２０１６）、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５９（３）：６４７−６６１（２０１４））を挙げることができる。
【００４２】
あるいは、一実施形態において、野生型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、修飾されていることもある。例えば、一実施形態において、野生型Ｃａｓ９配列（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列）は、修飾されてることもある。核酸配列は、哺乳動物の細胞における効率的な発現のために最適化された、すなわち、「ヒト化された」コドンであってもよい。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；ＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５；および／またはＬＰ８８５３０５．１として識別される発現ベクターのいずれかによってコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼ配列であり得る。
【００４３】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ配列は、市販のベクター中に提供され得る。例えば、一実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、限定されないが、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）のＰＸ３３０、ＰＸ２６０、ＰＸ６００、またはＰＸ６０１等の市販のベクター内に含有され得る。一実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；もしくはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列、またはＰＸ３３０、ＰＸ２６０、ＰＸ６００、もしくはＰＸ６０１（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）のＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかの変異体またはフラグメントであるアミノ酸配列を有し得る。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列は、生物学的に活性な変異体をコードするように改変されていることがあり、そしてこれらの変異体は、例えば、１つまたは複数の変異（例えば、付加、挿入、欠失、および／もしくは置換、またはそのような変異のいずれかの組合せ）を含むことによって、野生型と異なるアミノ酸配列を有し得るし、含み得る。例えば、一実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列（例えばＣａｓ９）は、Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）の生物学的に活性な変異体をコードするように改変されていることがあり、そしてそのような変異体は、１つまたは複数の変異（例えば、付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはそのような変異の組合せ）の存在に起因して、野生型Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）と異なるアミノ酸配列を有し得るし、含み得る。変異の１つ以上が、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換のあらゆる組合せであり得る。例えば、Ｃａｓポリペプチド（例えばＣａｓ９）等のＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）ポリペプチド等の野生型ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチドと少なくとも約５０％の配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）があるアミノ酸配列を有してもよい。保存的アミノ酸置換として、典型的に、グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニン；リシン、ヒスチジン、およびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンの群内の置換が挙げられる。
【００４４】
天然に存在するアミノ酸残基として、遺伝コードによって本来コードされているもの、および非標準的なアミノ酸（例えば、Ｌ配置の代わりにＤ配置を有するアミノ酸）が挙げられる。本発明のポリペプチドは、標準的な残基の改変バージョンであるアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、ピロリシンは、リシンの代わりに用いられてよく、そしてセレノシステインは、システインの代わりに用いられてもよい）。
【００４５】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド（例えばＣａｓ９）アミノ酸配列のアミノ酸残基は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことがある。天然に存在しないアミノ酸残基は、自然界には見出されていないがアミノ酸の基本式に準じ、かつアミノ酸配列に組み込まれ得るものである。これらには、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸、およびＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸が挙げられる。
【００４６】
一実施形態において、Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）ヌクレアーゼは、鎖特異的切断に関与する保存ＨＮＨおよびＲｕｖＣドメインにおいて、変異されていてもよい。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパルタートからアラニンへの（Ｄ１０Ａ）変異により、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異（Ｃａｓ９ｎ）は、一本鎖切断が生じるようにＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡにニックを入れることを可能にし、そしてＨＤＲを通しての以降の優先的な回復により、オフターゲット二本鎖切断由来の不所望のインデル変異の頻度が潜在的に引き下げられ得る。
【００４７】
一実施形態において、Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を担うＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの双方の保存ドメインにおける変異により、触媒的に不活性にされ得る。例えば、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのそれぞれＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａの変異は、触媒的に不活性な、すなわち、失活したＣａｓ（例えば失活したＣａｓ９）をもたらす。一実施形態において、失活したＣａｓ（例えば失活したＣａｓ９）にリプレッサードメインを融合することで、転写が、異質染色質化を誘導することによってさらに抑制され得る。例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインは、失活したＣａｓ（例えば失活したＣａｓ９）に融合されて、標的遺伝子の転写を抑制することができる。
【００４８】
本発明のポリペプチドのアミノ酸残基間の結合は、従来のペプチド結合または別の共有結合（例えば、エステル結合またはエーテル結合）であってもよく、そしてポリペプチドは、アミド化、リン酸化、および／またはグリコシル化によって修飾されていてもよい。修飾は、ポリペプチド骨格および／または１つもしくは複数の側鎖に影響を与えてもよい。化学修飾は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳後にインビボでなされる、天然に存在する修飾（例えば、細菌宿主におけるグリコシル化）であっても、インビトロでなされる合成修飾であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的に活性な変異体は、天然に存在する（すなわち、本来インビボでなされる）修飾および／または合成修飾（すなわち、インビトロでなされる、天然に存在する修飾または天然に存在しない修飾）のあらゆる組合せから生じる１つまたは複数の構造的な修飾を含んでもよい。修飾の例として、限定されないが、アミド化（例えば、アミノ基による、Ｃ末端での遊離カルボキシル基の置換）；ビオチン化（例えば、リシンまたは他の反応性アミノ酸残基の、ビオチン分子によるアシル化）；グリコシル化（例えば、糖タンパク質またはグリコペプチドを生成するための、アスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン、またはトレオニン残基へのグリコシル基の付加）；アセチル化（例えば、典型的にはポリペプチドのＮ末端でのアセチル基の付加）；アルキル化（例えば、アルキル基の付加）；イソプレニル化（例えば、イソプレノイド基の付加）；リポイル化（例えば、リポアート部分の付着）；およびリン酸化（例えば、セリン、チロシン、トレオニン、またはヒスチジンへのリン酸基の付加）が挙げられる。
【００４９】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本方法において有用である十分な生物活性を保持することとなる。生物学的に活性な変異体は、標的ＤＮＡ切断において機能するほど十分な活性を保持することとなる。生物活性は、当業者に知られている方法で評価されてよく、限定されないが、インビトロ切断アッセイまたは機能アッセイが挙げられる。
【００５０】
また、本発明は、当該技術において知られている、薬学的に許容される担体および／または適切な希釈剤中の、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、および／またはジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ガイドＲＮＡ分子、ベクター、核酸構築物、核酸分子、ナノ粒子、またはマイクロ粒子などの組成物（例えば医薬組成物）を提供する。そのような組成物は、バッファ、例えば、中性の緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、滅菌生理食塩水等；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡおよび／もしくはグルタチオン；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、ならびに／または保存剤を、単独で、またはあらゆる組合せで含んでもよい。
【００５１】
一実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、および配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０のいずれかのヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のｇＲＮＡ分子を含んでも、これらから本質的になっても、これらからなってもよい。
【００５２】
一実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、および配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０のいずれかのヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子を含んでも、これらから本質的になっても、これらからなってもよい。
【００５３】
一実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中に、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０のいずれかの１つまたは複数のヌクレオチド配列を認識するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸分子を含んでも、これらから本質的になっても、これらからなってもよい。
【００５４】
一実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中に、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０のいずれかの１つまたは複数のヌクレオチド配列を認識するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸分子を含んでも、これらから本質的になっても、これらからなってもよい。
【００５５】
本発明の組成物の、対象への投与は、いくつかの異なる経路のいずれかによって達成することができる。特定の実施形態において、組成物は、静脈内に、髄腔内に、筋肉内に、皮下に、腹膜内に、皮内に、鼻腔内に、頭蓋内に、舌下に、膣内に、直腸内に、かつ／または経口的に投与され得る。一実施形態において、本発明の組成物は、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（すなわち脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ））注射または脳室内送達を介して投与され得る。一実施形態において、組成物および／または医薬組成物は、単回用量として、または複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回など）用量で投与され得る。対象に投与されるべき本発明の組成物の投薬量は、投与形式、送達されるべき特定の核酸等によって決まり、そして当業者によってルーチン的な様式に決定され得る。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｋｇ、場合によっては約１０８〜約１０１４ｖｇ／ｋｇの力価である。
【００５６】
本発明の核酸分子の送達または投与の非限定的な例として、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム、および／または当該技術において知られている、または後に同定される他のあらゆる方法の、あらゆる組合せが挙げられる。一実施形態において、本発明の核酸分子は、裸の核酸分子として投与または送達されることもある。
【００５７】
一実施形態において、本発明のベクターは、いくつかの異なる経路を介して対象に導入することができ、静脈内投与、髄腔内投与、および／または脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび１つまたは複数のガイドＲＮＡは、対象に、核酸分子として導入することができ、これは、例えば、核酸構築物中に、未修飾（ｎａｋｅｄ）のＤＮＡとして、プラスミドとして、かつ／またはウイルスベクターとして存在し得る。一実施形態において、本発明の核酸分子は、本発明のヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである場合がある。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、１つまたは複数の操作されたカプシドタンパク質を含んでもよい。例示的なカプシドタンパク質として、限定されないが、典型的には自然界に見出されないキメラカプシドタンパク質が挙げられ、そして例示的なカプシドタンパク質は、当該技術において知られているように、組織送達および細胞送達を増強し、かつ／または形質導入などを増強するように操作されている。特定の実施形態において、核酸分子は、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、もしくはＣｊＣａｓ９であり得るＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、および／または１つもしくは複数のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ９ベクター（場合によっては、操作されたカプシドタンパク質を含む）中にある。
【００５９】
一実施形態において、本発明は、ヒト対象（例えば、父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化を必要とする対象）において父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化する方法であって、対象に、有効量の、Ｓｎｏｒｄ１１５および／またはＳｎｏｒｄ１１６と結合するヌクレアーゼ、ならびに対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態において、ヒト対象は、胎児、乳児、児童、または成人であり得る。一実施形態において、Ｓｎｏｒｄ１１５および／またはＳｎｏｒｄ１１６と結合するヌクレアーゼ、ならびに対象の細胞におけるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中の標的ヌクレオチド配列に相補的である１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子は、乳児に出生前（すなわち、妊娠第１期、妊娠第２期、および／または妊娠第３期）に、かつ／または出生後（すなわち、出生後約０〜約３０日目）に投与されることもある。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、ヒト対象において父系ＵＢＥ３Ａを、少なくとも３、６、９、１２、もしくは１５ヵ月間、または少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは少なくとも１５年間、非サイレンス化する方法を提供する。
【００６１】
一実施形態において、本発明の方法は、父系ＵＢＥ３Ａの非サイレンス化を必要とするヒト対象において、父系ＵＢＥ３Ａを少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％非サイレンス化することができる。
【００６２】
［定義］
本明細書中で用いられる１つ（「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」）は、１つ以上を意味し得る。例えば、１つの（「ａ」）細胞は、単一の細胞または多数の細胞を意味し得る。
【００６３】
また、本明細書中で用いられる「および／または」は、関連するリストされた項目の１つまたは複数のあらゆる全ての考えられる組合せ、および択一的（「または」）に解釈される場合には組合せの欠如を指し、かつ包含する。
【００６４】
測定可能な値、例えば用量（例えば、非ウイルスベクターの量）等を指す場合の、本明細書中で用いられる用語「約」は、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％の変量を包含することを意味する。
【００６５】
本明細書中で用いられる移行句「から本質的になる」は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に列挙される指定された材料または工程、および特許請求される発明の「基本的かつ新規の特徴に具体的に影響を与えないもの」を包含すると解釈されるべきであることを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９，５５１−５２，１９０  ＵＳＰＱ  ４６１，４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）を参照（原文に注目）；また、米国特許審査便覧§２１１１．０３も参照。ゆえに、本発明の特許請求の範囲で用いられる場合の用語「から本質的になる」は、「含む」と等価であると解釈されることは意図されない。
【００６６】
本明細書中で用いられる用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ガイド配列、トレーサ配列、およびトレーサメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」は、標的部位を特定化するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に用いられ得る。また、用語「トレーサメイト配列」は、用語「直接反復」と互換的に用いられてもよい。
【００６７】
用語「天然に存在しない」または「操作された」は、互換的に用いられており、人の手の関与を示す。核酸分子またはポリペプチドを指す場合の当該用語は、核酸分子またはポリペプチドが、自然界で本来結合されて自然界に見出される少なくとも１つの他の構成要素から、少なくとも実質的に解放されていることを意味する。
【００６８】
「相補性」は、伝統的なワトソン−クリック塩基対形成または他の非伝統的なタイプのものによって、別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）することができる、核酸分子内の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個中５、６、７、８、９、１０個であると、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％相補的である）。「完全に相補的な」は、核酸配列の連続する残基が全て、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することとなることを意味する。本明細書中で用いられる「実質的に相補的な」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【００６９】
本明細書中で用いられる「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写産物に）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ばれる場合がある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するならば、発現は、真核生物細胞において、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００７０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書中で、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指すのに互換的に用いられる。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸によって中断されていてもよい。また、当該用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他のあらゆるマニピュレーション、例えば標識成分とのコンジュゲートを包含する。本明細書中で用いられる用語「アミノ酸」は、天然のアミノ酸および／または非天然もしくは合成のアミノ酸が挙げられ、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の双方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む。
【００７１】
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書中で互換的に用いられて、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物として、限定されないが、ネズミ科動物、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットが挙げられる。一実施形態において、対象は、ヒトである。一実施形態において、対象は、新生児であり、新生児は、約２８日齢未満の乳児である。
【００７２】
インビボで得られる、またはインビトロで培養される生物学的実体の組織、細胞、およびその後代もまた包含される。
【００７３】
本明細書中で用いられる用語「核酸」は、５’末端から３’末端にと読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを指す。また、「核酸」は、場合によっては、ポリメラーゼによる正確なリードスルーを可能にし、かつ当該核酸によってコードされるポリペプチドの発現を低下させない、天然に存在しないヌクレオチド塩基または変更されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。用語「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、個々の一本鎖としての、または二重鎖中の核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の双方を指す。用語「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、ＲＮＡｉ（阻害ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ、対応するアシル化されたアミノ酸で帯電しているか帯電していないかに拘らない）、およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含み、そして用語「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、ならびにＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。
【００７４】
用語「核酸セグメント」、「ヌクレオチド配列」、またはより一般的には「セグメント」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現する、または発現するように適合され得る、双方のゲノム配列、リボソームＲＮＡ配列、トランスファーＲＮＡ配列、メッセンジャーＲＮＡ配列、小さな調節ＲＮＡ、オペロン配列、および操作されたより小さなヌクレオチド配列を含む機能的用語として、当業者によって理解されるであろう。また、本開示の核酸は、完全に、または部分的に、当該技術において知られている方法によって合成されてもよい。ゆえに、現行のコドンの核酸の全てまたは一部が、選択された宿主によって好まれるコドンを用いて合成されてもよい。種に好まれるコドンは、例えば、特定の宿主種において発現されるタンパク質に最も頻繁に用いられるコドンから決定され得る。ヌクレオチド配列の他の改変により、活性が僅かに変更された変異体が生じ得る。
【００７５】
「ベクター」は、外来の遺伝的材料を別の細胞中に運び、そこで複製かつ／または発現され得るビヒクルとして用いられる核酸分子を指す。外来の核酸を含有するクローニングベクターは、組換えベクターと呼ばれる。ベクターの例として、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体がある。組換えベクターは典型的に、複製起点、マルチクローニングサイト、および選択マーカーを含有する。核酸配列は、典型的に、挿入物（組換え核酸または導入遺伝子）、およびベクターの「骨格」として機能するより大きな配列からなる。遺伝的情報を別の細胞に運搬するベクターの目的は、典型的に、標的細胞内で挿入物を単離し、増大させ、または発現させることである。発現ベクター（発現構築物）は、標的細胞内での導入遺伝子の発現のためにあり、通常、導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。標的細胞中へのベクターの挿入は、細菌細胞および真核生物細胞について、形質転換またはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入は、多くの場合、形質導入と呼ばれる。
【００７６】
用語「調節エレメント」は、核酸配列の発現の一部の態様を制御する遺伝的要素を指す。例えば、プロモーターは、作動可能に連結されたコーディング領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどである。
【００７７】
真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」要素および「エンハンサー」要素を含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなる。プロモーター要素およびエンハンサー要素が、酵母、昆虫、哺乳動物、および植物の細胞の遺伝子を含む種々の真核生物源から単離されてきた。また、プロモーター要素およびエンハンサー要素は、ウイルスから単離され、類似した制御要素、例えばプロモーターが、原核生物においても見出されている。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、注目するタンパク質を発現するのに用いられる細胞型に依存する。一部の真核生物プロモーターおよびエンハンサーは、宿主範囲が広いものもあるが、限られたサブセットの細胞型で機能的であるものもあることが、当該技術において周知である。
【００７８】
本明細書中で用いられる用語「プロモーター要素」、「プロモーター」、または「プロモーター配列」は、ＤＮＡポリマーのタンパク質コーディング領域の５’末端に位置決めされる（すなわち先行する）ＤＮＡ配列を指す。自然界で知られているほとんどのプロモーターの位置は、転写領域に先行する。プロモーターは、スイッチとして機能して、遺伝子の発現を活性化する。遺伝子が活性化されれば、遺伝子が転写されている、または転写に関与している、といわれる。転写は、遺伝子からのｍＲＮＡの合成を意味する。したがって、プロモーターは、転写調節エレメントとして機能し、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写の開始のための部位も提供する。プロモーターに用いられる用語「細胞型特異的」は、同じ組織内で、特定の細胞型における注目するヌクレオチド配列の選択的発現を、異なる細胞型における注目する同じヌクレオチド配列の発現の相対的な不在下で、導くことができるプロモーターを指す。プロモーターは、構成的プロモーターであっても調節可能プロモーターであってもよい。
【００７９】
プロモーターに関してなされる場合の用語「構成的」は、プロモーターが、刺激（例えば、ヒートショック、化学物質、光など）の不在下で、作動可能に連結された核酸配列の転写を導くことができることを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的にあらゆる細胞およびあらゆる組織において、導入遺伝子の発現を導くことができる。これに対して、「調節可能」または「誘導性」プロモーターは、刺激（例えば、ヒートショック、化学物質、光など）の存在下での作動可能に連結された核酸配列の転写を、刺激の不在下での作動可能に連結された核酸配列の転写のレベルと異なるレベルで導くことができるものである。
【００８０】
「配列同一性」は、２つ以上の核酸またはタンパク質間の相関性の尺度を指し、典型的には、総比較長さに関するパーセンテージとして与えられる。同一性の計算は、同一であり、かつそれぞれのより大きな配列内の同じ相対的位置内にあるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を考慮する。
【００８１】
同一性の計算は、「ＧＡＰ」（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）および「ＡＬＩＧＮ」（ＤＮＡＳｔａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）等のコンピュータープログラム内に含有されるアルゴリズムによって、デフォルトパラメータを用いて実行されてもよい。特定の実施形態において、配列「同一性」は、アラインメントの２つの配列間の配列アラインメント内の正確にマッチする残基の数（パーセンテージとして表される）を指す。特定の実施形態において、アラインメントの同一性パーセンテージは、最も短い配列のうちより大きな方で割った同一位置の数、またはオーバーハングを除いた等しい位置の数（内部のギャップは、等しい位置としてカウントされる）を用いて算出されることもある。例えば、ポリペプチドＧＧＧＧＧＧおよびＧＧＧＧＴは、５つ中４つ、または８０％の配列同一性を有する。例えば、ポリペプチドＧＧＧＰＰＰおよびＧＧＧＡＰＰＰは、７つ中６つ、または８５％の配列同一性を有する。特定の実施形態において、企図されるあらゆる配列同一性パーセンテージについて、配列は、同じパーセンテージの配列類似性を有し得ることが企図される。
【００８２】
「類似性」パーセントは、アラインメントの２つの配列間のアミノ酸の類似性、例えば、疎水性、水素結合能、静電電荷の程度を定量化するのに用いられる。この方法は、特定のアミノ酸が、マッチを有するのに同一である必要がないこと以外は、同一性の判定と同様である。特定の実施形態において、配列類似性は、周知のコンピュータープログラムにより、デフォルトパラメータを用いて算出されることもある。典型的には、アミノ酸は、特性が類似する群のものであるならば対等のもの（ｍａｔｃｈｅｓ）として分類される。例えば、以下のアミノ酸であれば：芳香族  −Ｆ  Ｙ  Ｗ；
【００８３】
本明細書中で用いられる「有効量」は、治療効果であり得る所望の効果をもたらすのに十分な、本発明の集団、組成物、または製剤の量を指す。有効量は、年齢、対象の全身状態、処置されることとなる症状の重症度、投与される特定の薬剤、処置の継続期間、あらゆる同時処置の性質、用いられた薬学的に許容される担体、ならびに当業者の知識および専門技術の範囲内のその他の要因によって変わることとなる。必要に応じて、個々のあらゆる症例における「有効量」は、関連する本文および文献を参照して、かつ／またはルーチンの実験を用いて、当業者によって決定され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．２０００）を参照）。
【００８４】
「処置する（治療する）」、「処置している（治療している）」、または「処置（治療）」は、障害、疾患、または疾病に悩む対象に、例えば有益な効果であり得る調整効果をもたらすあらゆるタイプの作用を指し、当該技術において周知であろう、対象の症状（例えば、１つまたは複数の病徴）の改善、症状の進行の遅延もしくは減退、障害、疾患、もしくは疾病の発症の遅延、および／または障害、疾患、もしくは疾病の臨床パラメータのいずれかの変化などが挙げられる。
【００８５】
「薬学的に許容される」によって、生物学的に、またはそれ以外でも望ましくない材料が意味され、すなわち、材料は、かなりの有害な生物学的作用を引き起こすことも、含有される組成物の他の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することもなく、選択された粒子および／またはその集団と共に対象に投与され得る。薬学的に許容される担体は、本発明の、ヒトおよび他の対象への投与または送達に適している。担体は本来、当業者に周知であるように（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；最新の版を参照）、活性成分のいかなる分解も最小にし、かつ対象における不利ないかなる副作用も最小にするように選択されることとなる。本発明のワクチンまたは他の免疫原性組成物等の医薬製剤は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、本発明の免疫原性量のアルファウイルス粒子を含んでもよい。例示的な薬学的に許容される担体として、限定されないが、滅菌パイロジェンフリー水および滅菌パイロジェンフリー生理食塩水が挙げられる。
【００８６】
次に、本主題を以降で、本開示の主題の代表的な実施形態を示す添付の実施例を参照して、より完全に説明することとする。しかしながら、本開示の主題は、様々な形態で具体化することができ、本明細書中で示される実施形態に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が、完全かつ完結なものとなり、そして本開示の主題の範囲を当業者に完全にもたらすこととなるように、提供される。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、実例となる実施形態を提供する。以下の実施例の特定の態様は、実施形態の実施において十分に機能するような、本発明者らによって見出され、または考えられた技術および手順に関して開示される。本開示、および当該技術における一般的な技術レベルを考慮して、当業者であれば、以下の実施例が、例示的なものであることしか意図されず、そして多数の変化、改変、および変更が、特許請求される本主題の要旨を逸脱しない範囲で使用され得ることを理解するであろう。
【００８８】
［実施例１］
＜アンジェルマン症候群のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子治療＞
アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、効果的な処置も治療も現在存在しない、重度の神経発達障害である。ＡＳは、発達遅延、重度の知的障害、言語障害、衰弱性の発作、ならびに運動および平衡感覚に関する問題によって特徴付けられる。ＡＳは、表現型の重複のため、自閉症スペクトラムと分類される。１：１５，０００の有病率、および全寿命にわたってのコンスタントなケアの必要性があり、家族の負担および医療費は、莫大なものとなる。この小児発症遺伝的障害と関連する一部または全ての病徴を処置する治療薬を開発する著しい生物医学的ニーズがある。
【００８９】
ほとんどの場合、ＡＳは、母系遺伝のＵＢＥ３Ａアレルの欠失または変異によって引き起こされる。ＵＢＥ３Ａは、成熟神経細胞を除いて、体のほぼ全ての細胞において両アレルにより発現される（図２Ａ〜図２Ｂ）。神経細胞内では、ＵＢＥ３Ａは、母系遺伝のアレルからのみ発現される。この生物学は、なぜ母系アレルのロスがＡＳを引き起こして、脳機能を損なうかについて説明している。父系アレルは、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ（父系ＵＢＥ３Ａ転写をシスで干渉する極めて長いアンチセンス転写産物）によってサイレンシングされる。この生物学を考慮して、ＡＳと関連する神経機能不全および行動機能不全を処置する最も直接的な方法は、インタクトの父系ＵＢＥ３Ａアレルを非サイレンス化することである（図１）。本発明は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの破壊またはトランケーションにより、父系ＵＢＥ３Ａに干渉しなくなるという科学的な前提に基づいて、父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化して、ＡＳと関連する行動表現型を処置するものである。
【００９０】
以前に、発明者らの１人が、＞２，３００個の薬物のスクリーニングを実行して、トポテカンを含むトポイソメラーゼインヒビタが、マウスおよびヒトの神経細胞で、Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳ発現を引き下げることによって、父系Ｕｂｅ３ａアレルを強力に非サイレンス化することを見出した。トポテカンは、培養された神経細胞で、脳（脳室内またはｉ．ｃ．ｖ．経路）内で、そして脊髄内で、父系ＵＢＥ３Ａをほぼ正常なレベルにまで増大させた。しかしながら、トポイソメラーゼインヒビタは、ヒトにおいて副作用があり、そして発明者らが見出したことだが、自閉症にリンクしたシナプス遺伝子を含む他の長い遺伝子を下方制御する。
【００９１】
以降の研究で、転写停止カセットにノッキングインすることによって、Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳをトランケートした。ＡＳモデルマウスにおいて、この生殖系列改変により、神経細胞内の父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化して、行動欠陥を救出した。Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳの類似の領域に向けたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、トポテカンほど効果的ではなかったが、父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化した。成体ＡＳマウス（２〜４ヵ月齢）にｉ．ｃ．ｖ．送達した場合、このＡＳＯは控え目に、１つの行動表現型（文脈的恐怖アッセイでのフリージング％）を救出して、体重を部分的に正常化した。しかしながら、他の行動表現型は救出されず、より完全な表現型救出のため、より若い動物においてＵｂｅ３ａを回復させるという必要性は一貫している（表６）。さらに、ＡＳＯの効果は一過性であり（１６週）、生活の全体を通して侵襲性の注射を繰り返すことを必要とし、これは、とりわけ小児において、実際的でなく、所望されない。
【００９２】
本明細書中に記載する研究において、発明者らは、ＡＳモデルにおいて、ＡＡＶ９を用いて、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを脳に送達した。オンターゲットおよびオフターゲットの影響を調査した。当該実験は、Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳを標的とするＣａｓ９およびｇＲＮＡの送達が、ＡＳモデルにおいて、Ｕｂｅ３ａを長期間（例えば、少なくとも６ヵ月）非サイレンス化して、表現型を救出することができるという実証実験を提供する。一実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質またはＲＮＡを送達する非ウイルスアプローチが、本発明のｇＲＮＡとともに用いられ得る。
【００９３】
ＡＳモザイクは、ＵＢＥ３Ａが全神経細胞の僅か１０％でしか回復されなかったとしても、一部の行動回復を達成することができることを示す。稀であるが、欠陥のインプリントが、母系ＵＢＥ３Ａを不活化して、ＡＳを引き起こす場合がある。欠陥のインプリントは典型的にはモザイクであり、「正常な」母系ＵＢＥ３Ａを発現する神経細胞もあれば、母系ＵＢＥ３Ａ発現が欠如する神経細胞もあることを意味する。全細胞の僅か１０％しか正常なレベルのＵＢＥ３Ａを含有しない場合、ＡＳ病徴は、「非常に軽度である」と分類される。軽度の表現型としては、ほぼ正常な言語能力、ほぼ正常な運動パフォーマンス、および発作の不在が挙げられる。発明者らは、ＡＡＶ９により脳にＣａｓ９およびｇＲＮＡを送達することによって、全大脳皮質神経細胞の＞５０％で、父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することができたので、既に、普通であれば重度の表現型を、非常に軽度なものにするのに必要とされる１０％の閾値を上回った。このマグニチュードの向上は、ＡＳの個体およびその介護者の生活を著しく向上させるであろう。
【００９４】
本発明において、Ｃａｓ９の標的とされ、神経細胞内で父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することができるＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ内の領域を同定した。当該研究において、Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳおよびすぐ近くの遺伝子を標的とする２８８個のＳｐＣａｓ９適合ｇＲＮＡを設計した（図３Ａ〜図３Ｂ；オフターゲット効果の可能性が低いｇＲＮＡを同定するためにＭＩＴ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌを使用）。また、潜在的調節領域を標的とするｇＲＮＡも設計した。トポテカン処置に感受性が高いＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ内の領域が、Ｃａｓ９による破壊にも感受性が高いかもしれないと仮定した。そのような領域を同定するために、発明者らは、大脳皮質の神経細胞培養物を、ビヒクルまたはトポテカンで処置してから、Ｒｉｂｏ−ｚｅｒｏ  ＲＮＡ−ｓｅｑを用いて、発生期の（選択した非ポリＡ）転写産物を、極めて深いカバー率（＞２億８０００万のマップドリード／条件；３反復／条件）にて調べた（図３Ｃ）。また、発明者らは、ＣＴＣＦ結合部位、ＤＮａｓｅ過敏部位、クロマチンエピジェネティックマーク、ポリアデニル化部位、ＲＮＡ二次構造の予測される部位、および転写因子ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合部位（ＥＮＣＯＤＥおよび他の一般公開されているデータセットから同定）が挙げられる推定の調節エレメントも標的とした（図３Ｄ）。全てのｇＲＮＡを、ｐＬｅｎｔｉ  ＣＲＩＳＰＲ  ｖ２プラスミド中にクローニングした。これは、一過性のトランスフェクションまたはレンチウイルス送達に用いることができる。発明者らは、ＰＣＲベースのアプローチを用いて、各プラスミドが、正しいｇＲＮＡを含有することを確認した。
【００９５】
発明者らは、ハイコンテント３８４ウェルフォーマットアッセイを用いて、Ｕｂｅ３ａ黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ノックインリポーターマウス由来の神経細胞を培養した。発明者らは、ＣａｍＫＩＩα−ｔｄＴｏｍａｔｏ（トランスフェクションされた神経細胞を同定するためのもの、ＣａｍＫＩＩαプロモーターは神経細胞選択的である）、ＳｐＣａｓ９、およびそれらのライブラリー由来の各ｇＲＮＡで、Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐａｔＹＦＰ一次大脳皮質神経細胞を一過性に共トランスフェクションした。ハイコンテントイメージャー（ＧＥ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２２００、ウェルあたり９フレーム））により、ウェルの全体を画像化した。ＹＦＰ＋（非サイレンス化ＵＢＥ３Ａ−ＹＦＰ）であるＣａｍＫＩＩα−ｔｄＴｏｍａｔｏ＋トランスフェクション神経細胞のパーセンテージを、Ｃｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒを用いて定量化した。発明者らは、トポテカン、ベンチマーク陽性対照に対して、そして他の陽性対照および陰性対照に対して、ｇＲＮＡを全てランク付けした。トポテカンと同程度効果的に父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化したいくつかのｇＲＮＡを同定した。いくつかの「ヒット」が、Ｓｎｏｒｄ１１５遺伝子およびＳｎｏｒｄ１１６遺伝子（それぞれＨ／ＭＢＩＩ−５２およびＨ／ＭＢＩＩ−８５としても知られている）、Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳのイントロンから処理されたＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡの２つのクラスター内に、またはそれらの近くに、位置決めされた。
【００９６】
［実施例２］
＜ＡＳ用の第１の治療薬候補ｇＲＮＡの同定＞
ＳＮＯＲＤ１１６遺伝子の欠失は、プラーダー・ヴィリ症候群（ＰＷＳ）を引き起こす。ＰＷＳクリティカル領域は重なっており、ＳＮＯＲＤ１１６遺伝子に制限される（Ｂｉｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２３：２５２−２５５（２０１５）；ｄｅＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １８：３２５７−３２６５（２００９））。ゆえに、全てのＳＮＯＲＤ１１６遺伝子を欠失させる、またはＵｂｅ３ａ−ＡＴＳ転写産物全体を下方制御する（ＳＮＯＲＤ１１６遺伝子を全て除去することとなる）ｇＲＮＡは、おそらく、治療有用性がない。これに対して、ＰＷＳクリティカル領域の外側（３’）の領域を標的とするｇＲＮＡは、おそらく、少ない副作用で、または副作用なく、ＡＳを処置するのに有効である（この領域内のｇＲＮＡを、「治療薬候補ｇＲＮＡ」と定義する）。当該領域を標的化することによって、発明者らは同時に、他の治療アプローチと関連する主要な制限を克服することができる一方、以下を達成することもできる：
【００９７】
１．単回の処置による父系Ｕｂｅ３ａの長期にわたる非サイレンス化。ＡＡＶは、霊長類の脳内の発現および少なくとも１５年間にわたる行動回復を駆動する。失活したＣａｓ９およびＳｎｏｒｄ１１５−ｇＲＮＡのＡＡＶ媒介送達は、非常に長い間、転写を阻害し、とりわけ新生児に投与されれば、脳発達の全てのクリティカル期間とまではいかないが、ほとんどのクリティカル期間をカバーすることとなる。ＡＡＶは、単回注射後の長期にわたる遺伝子発現を駆動し、これは、ＡＳＯ、小分子、およびタンパク質ベースのリプレッサーの一過性の作用とは対照的である。
【００９８】
２．父系Ｕｂｅ３ａ発現の変化を神経細胞に制限するビルトイン冗長性（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）。Ｃａｓ９発現は、神経細胞特異的プロモーター、ｈＳｙｎ１を用いることによって、制限することができる。Ｃａｓ９が非神経細胞細胞内で発現される場合には、基礎をなす生物学により、制限の追加の層が提供される。非神経細胞において、ＰＷＳクリティカル領域内でＵｂｅ３ａ−ＡＴＳをトランケートする境界要素がある（図２Ａ〜図２Ｂ）。神経細胞内で、Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳは、この境界要素を越えて広がり、転写衝突機構を介して父系Ｕｂｅ３ａをサイレンシングする（図２Ａ〜図２Ｂ）。この境界要素のＵｂｅ３ａ−ＡＴＳ下流側を標的とするｇＲＮＡに焦点を合わせることによって、父系Ｕｂｅ３ａ発現の変化を神経細胞に制限することができる。
【００９９】
３．ＳＮＯＲＤ１１５遺伝子の極端な冗長性を利用することによる、副作用の限定。ＳＮＯＲＤ１１５遺伝子は、脳内のいくつかの遺伝子の選択的スプライシングを調節する一方、高度に冗長でもある。ヒトにおいて４８個のＳＮＯＲＤ１１５遺伝子およびマウスにおいて１１０個のＳｎｏｒｄ１１５遺伝子がある。Ｓｎｏｒｄ１１５遺伝子の配列およびゲノム編成は、種間で保存されている。Ｓｎｏｒｄ１１５遺伝子は、ＰＷＳクリティカル領域の３’に位置決めされているので、それらの欠失は、ＰＷＳを引き起こさない。Ｓｎｏｒｄ１１５および他の近くの遺伝子を包含した大きな欠失があるマウスは、生存可能である。このことは、全てのＳｎｏｒｄ１１５遺伝子が、生存度に影響を与えることなく欠失され得ることを示す。
【０１００】
重要なイノベーションとして、最も効果的なＳｎｏｒｄ１１５−ｇＲＮＡ（ｊｗ３３；活性のあるＳｐＣａｓ９によりトランスフェクションした（表１〜表５））は、Ｓｎｏｒｄ１１５および３’Ｕｂｅ３ａ−ＡＴＳ領域の下方制御によって明示されるように、オンターゲット効果があった（図４）。ｊｗ３３は、上流遺伝子（Ｓｎｒｐｎ、Ｓｎｏｒｄ１１６；図４）のレベルを変更しなかった。このアプローチは、他のＳｎｏｒｄ１１５機能を損なうことなく父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化する特有の潜在力があり、Ｓｎｒｐｎ機能およびＳｎｏｒｄ１１６機能をまず全く損ないそうにはない。これらの研究は、ＡＳの処置のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、Ｓｎｏｒｄ１１５遺伝子の高度に冗長なクラスターを標的とする治療の可能性を実証している。
【０１０１】
他の有効なｇＲＮＡは、Ｓｎｏｒｄ１１６遺伝子を標的とし（表１〜表５）、ＡＳＯがＳｎｏｒｄ１１６に標的とされる結果を再現している。Ｓｎｏｒｄ１１６遺伝子が高度に冗長である一方、その完全な欠失は、ＰＷＳ病因にリンクしており、ＡＳの処置について、危険な標的となっている。
【０１０２】
４．正常なレベルへのＵｂｅ３ａの回復。ＵＢＥ３Ａレベルは、母系ＵＢＥ３ＡのロスがＡＳを引き起こす一方、ＵＢＥ３Ａの重複が自閉症のリスクを増大させるという事実によって明示されるように、正常な脳の発達のために、狭い範囲内で強固に維持されなければならない。ゆえに、伝統的な遺伝子置換治療は、理想的でない。というのも、多くの場合、異常に高いレベルで単一のＵｂｅ３ａアイソフォームの遺伝子発現を駆動し、ベクターコピー数に起因する細胞間の変動を伴うからである。これに対して、本発明において、父系Ｕｂｅ３ａの発現は、内因性プロモーター（母系プロモーターと同一である）から駆動される。結果として、タンパク質レベルおよびアイソフォーム分配は、母系コピーに等しく、母系Ｕｂｅ３ａを欠いている全てのＡＳ個体の圧倒的多数にとって最適な処置を提供することとなる。
【０１０３】
［実施例３］
＜ヒト神経細胞におけるＵＢＥ３ＡおよびＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳのアレル特異的発現を評価する予備的研究＞
Ｓｎｏｒｄ１１５遺伝子は、マウスとヒトとの間で保存されており、本発明において記載される研究を、ヒト神経細胞にトランスレートすることを可能にする。ヒトＵＢＥ３Ａのアレル特異的発現は、母系染色体と父系染色体間で異なる（すなわち、ヘテロ接合である）一塩基多型（ＳＮＰ）または反復長多型を用いて、定量化することができる。神経学的機能が正常と推定される胎児ヒト脳由来の１０７の始原ヒト神経細胞前駆細胞（ｐｈＮＰＣ）株を評価した。当該株は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）よりも高いフィデリティで、神経細胞に分化させることができる。全てのｐｈＮＰＣ株について、一塩基多型（ＳＮＰ）チップを用いて遺伝子型を特定し、神経細胞への分化の前後に、ほとんどのｐｈＮＰＣ株から鎖ＲＮＡ−ｓｅｑデータを収集した。
【０１０４】
これらのＲＮＡ−ｓｅｑデータを分析することによって、ＳＮＰを、ＵＢＥ３Ａのイントロンと重なる領域における、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ中で同定し（図６）、そして７つのＳＮＰを、ＵＢＥ３Ａのエキソン中で同定した（図７、表７）。これらは、ドナー細胞株のいくつかにおいて、ヘテロ接合である。これらのＳＮＰを用いて、前駆体内のＵＢＥ３Ａの両アレルによる発現、および成熟神経細胞内のＵＢＥ３Ａの１アレルによる（おそらく母系）発現を検出することができる（図７）。また、発明者らは、成熟神経細胞内（この領域は、予想されるように、前駆体内で発現されなかった（図７））で、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの１アレルによる（おそらく父系）発現を定量化することができる。次に、発明者らは、ｐｈＮＰＣ由来神経細胞を、活性ＳｐＣａｓ９、およびｊｗ３３（「ｈｓａ  ｊｗ３３」、例えばＳｎｏｒｄ１１５−６）と類似するヒトｇＲＮＡを含有するレンチウイルスにより処置した。重要なことには、この処置は、ヒト神経細胞内で、父系ＵＢＥ３Ａを非サイレンス化した（図８）。
【０１０５】
追加のアプローチとして、ヒトＵＢＥ３Ａのイントロン９における反復長多型を用いて、ＩＰＳＣ内で父系発現から母系発現を識別することができる（アレル特異的ＲＴ−ＰＣＲを、センスプレｍＲＮＡ転写産物およびアンチセンスプレｍＲＮＡ転写産物に用いる）。予備的研究において、ドナー株のいくつかが、ヒトＵＢＥ３Ａのイントロン９において多型であり、イントロン９における反復長多型およびプレｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＵＢＥ３Ａのアレル発現を定量化することができることが確認された。
【０１０６】
［実施例４］
＜分化したヒト神経細胞内でのアレル特異的発現の定量化＞
始原ヒト神経前駆細胞（ｐｈＮＰＣ）を増殖させて、ウェルあたり４×１０５細胞の密度にて、６ウェルプレートに播種する。播種４８時間後に、増殖培地を、ヒト組換えＮＴ３およびＢＤＮＦを含有する分化培地と入れ替える。８週間、細胞は、２〜３日毎に、５０％の培地交換を受ける。４週目に、細胞を、ｐＬＣ２−ＳｐＣａｓ９：ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｓｎｏｒｄ１１５  ｇＲＮＡ（または陰性対照）およびｐＬｅｎｔｉ  ＣａｍｋＩＩａ：ｅＧＦＰを含有するレンチウイルスカクテルに感染させて、神経細胞をマークする。分化後８週目に細胞を収集し、ｍＣｈｅｒｒｙ＋／ｅＧＦＰ＋／ＤＡＰＩ＋事象についてソートする。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌを用いて抽出して、ＤＮａｓｅＩで処理する。ランダムヘキサマーおよびｐｏｌｙｄＴプライマーの組合せを用いて、ｃＤＮＡを合成する。ＲＮＡｓｅｑから同定したＳＮＰを用いて、ＴａｑＭａｎ遺伝子型決定プローブによって、アレル特異的発現をアッセイする（表７）。特定のドナー株における分化後の予想されるアレル発現パターンを、図７に示す。ｇＲＮＡによるＳＮＯＲＤ１１５の標的化に応じたＳＮＰ発現の相対変化を、図８に示す。
【０１０７】
ＵＢＥ３Ａ−ｍＲＮＡにおける各ＳＮＰの２つのアレル間での発現の差異を定量化するために、発明者らは、アレル特異的ＴａｑＭａｎプローブを用いてΔΔＣｔ法ｑＰＣＲ実験を用いた。具体的には、発明者らは、ａ）ＳｐＣａｓ９スクランブルｇＲＮＡおよびｂ）ＳｐＣａｓ９の種々のＳＮＯＲＤ１１５標的化ｇＲＮＡで処理したｐｈＮＰＣ分化神経細胞間の推定される父系／母系アレルの発現レベルを比較した。本アプローチを用いた予備的実験は、ＵＢＥ３Ａの推定される父系アレルを非サイレンス化する、ヒトＳＮＯＲＤ１１５標的化ｇＲＮＡの実現可能性および有効性を実証する（表５）。
【０１０８】
［実施例５］
＜活性Ｃａｓ９および失活したＣａｓ９は、父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化するのに有効である＞
活性Ｃａｓ９、失活したＣａｓ９（何にも融合されない）、およびＫＲＡＢリプレッサードメインに融合された失活したＣａｓ９は、父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化するのに等しく有効であった（図５）。これらのデータは、Ｃａｓ９が、Ｓｎｏｒｄ１１５遺伝子に結合して、転写を阻害することによって、父系Ｕｂｅ３ａを非サイレンス化することができることを示している。本発見により、失活したＣａｓ９を用いて、ＡＳを処置し、かつ副作用を最小限に抑えることが可能となる。失活したＣａｓ９は、クロマチン修飾ドメインを含有せず、ゲノムを切断しないので、変異誘発、がん、またはｐ５３活性化／２本鎖切断のリスクがほとんどないか全くない。発明者らは、失活したＣａｓ９を用いて、治療薬としてのＣＲＩＳＰＲの主な弱点を回避することができることを発見した。さらに、可逆性が所望されるはずである場合に、失活したＣａｓ９を、抗ＣＲＩＳＰＲまたは他の技術と組み合わせて、ｄＣａｓ９を不活化することができる。
【０１０９】
［実施例６］
＜ＡＡＶ２−ｈｓｙｎ１−ＳａＣａｓ９−Ｓａｊｗ３３またはＡＡＶ９−ｈｓｙｎ１−ＳａＣａｓ９−Ｓａｊｗ３３の胎児期脳室内注射＞
ウイルス株を、２．４×１０１３個のウイルス分子／ｍｌにて、注射部位の視覚化のために、滅菌ＰＢＳで調製した１０％Ｆａｓｔ  ｇｒｅｅｎと混合した。Ｃ５７ＢＬ／６雄とＵｂｅ３ａｍａｔ＋／ｐａｔ−雌、またはＵｂｅ３ａｍ＋／ｐａｔＵｂｅ３ａ雄とＣ５７ＢＬ／６雌マウスを用いて、時限交配（ｔｉｍｅｄ  ｍａｔｉｎｇ）をセットアップする。Ｅ１５．５にて、妊娠している雌を、全て手順通りに、２％イソフルランで麻酔した。子宮内の胚にウイルス溶液を、腔中１μｌ／半球にて注射した。おおよそ２．２×１０１０個のウイルス分子を、脳の両側に注射した。注射した胚は、腹腔で再配置された。手術した雌を、５ｍｇ／Ｋｇケタミンで毎日、３日間処置した。仔を自然分娩で出産させて、離乳まで里親と共に飼育した。Ｐ３０にて、Ｕｂｅ３ａｍａｔ＋／ｐａｔＹＦＰまたはＵｂｅ３ａｍａｔ−／ｐａｔ＋の子を、ＰＢＳ中４％ＰＦＡで灌流した。マウスの脳を切り出して、４％ＰＦＡ中で、４℃での一晩のインキュベーションを介してポスト固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）した。脳を、Ｌｅｉｃａ  Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを用いて１００μｍスライスに切片化した。次に、脳スライスを、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｕｂｅ３ａｍａｔ＋／ｐａｔＹＦＰ）またはマウス抗ＵＢＥ３Ａ抗体（Ｕｂｅ３ａｍａｔ−／ｐａｔ＋）で染色して、Ｚｅｉｓｓ７８０共焦点顕微鏡により１０倍の倍率にて画像化した（図１０、図１１）。
【０１１０】
［実施例７］
＜ＡＡＶ９−ｈｓｙｎ１−ＳａＣａｓ９−Ｓａｊｗ３３の出生後の脳室内注射＞
ウイルス株を、２．４×１０１３個のウイルス分子／ｍＬにて、注射部位の視覚化のために、滅菌ＰＢＳで調製した１０％Ｆａｓｔ  ｇｒｅｅｎと混合した。Ｐ１新生児Ｕｂｅ３ａｍａｔ＋／ｐａｔＹＦＰまたはＵｂｅ３ａｍａｔ−／ｐａｔ＋の子を、３．５分間の冷凍麻酔を介して不動化した。ウイルスを、脳室の両側に、２５μｌ注射シリンジに取り付けた３２Ｇ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ針で注射した。１μｌのウイルス溶液（おおよそ２．２×１０１０個のウイルス分子）を、脳の両側に注射した。注射した子を、３７℃に加熱したマット上で回復させて、ホームケージに戻した。ウイルス注射したＵｂｅ３ａｍａｔ＋／ｐａｔＹＦＰまたはＵｂｅ３ａｍａｔ−／ｐａｔ＋の子を、Ｐ３０にてＰＢＳ中４％ＰＦＡで灌流して、脳を切り出して、４％ＰＦＡ中で、４℃にて一晩のインキュベーションを介してポスト固定した。脳を、Ｌｅｉｃａ  Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを用いて１００μｍスライスに切片化した。次に、脳スライスを、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｕｂｅ３ａｍａｔ＋／ｐａｔＹＦＰ）またはマウス抗ＵＢＥ３Ａ抗体（Ｕｂｅ３ａｍａｔ−／ｐａｔ＋）で染色し、Ｚｅｉｓｓ７８０共焦点顕微鏡により１０倍の倍率にて画像化した（図１２、図１３）。
【０１１１】
前述のものは、本発明の実例であり、その制限であると解釈されるべきでない。本発明の少数の例示的な実施形態を説明してきたが、当業者であれば、本発明の新規の教示および利点から具体的に逸脱することなく、例示的な実施形態において多くの改変が可能であると容易に理解するであろう。したがって、そのような改変は全て、特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内に含まれることが意図される。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、その中に特許請求の範囲の均等物が含まれ得る。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
【表５】
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【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
【表７】
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【０１１９】
【表８】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2021513866000001.app
【国際調査報告】
2021513866.tif 000282
2021513866.tif 000283