(57)【要約】  本明細書に記載されているのは、ボルト粒子内のＡＤＰリボースの密マトリックスにパッセンジャー分子を固定化するための組成物及び方法である。本開示はさらに、強化された安定性及び／またはダウンストリーム機能性のためのパッケージ化されたボルトの物理的機械的性質（例えば密度、圧縮強度、帯電性等）を変化する方法を説明する。加えて、本開示はさらに、パッセンジャー分子をパッケージ化するため、及び／または特定のレセプタにあるいはリガンド対するボルト粒子を標的化するために、アミノ酸変異、アミノ酸挿入及び／またはアミノ酸欠失によって、ボルト粒子中のボルトタンパク質のアミノ酸配列を変化するための、組成物及び方法を説明する。【選択図】図４
2021506733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルト粒子、パッセンジャー分子及びＡＤＰ−リボースのマトリックスを含む組成物であり、パッセンジャー分子及びＡＤＰ−リボースのマトリックスはボルト粒子に囲まれる、組成物。
【請求項２】
ボルト関連タンパク質を含み、前記ボルト関連タンパク質はポリ−アデノシン２リン酸塩（ＡＤＰ）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記パッセンジャー分子はボルト粒子内に位置されるが、特徴、アミノ酸、ドメインあるいはボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質に接続することができるペプチドに接続されないか、または所有しない、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ボルトに囲まれたパッセンジャー分子のＡＤＰ−リボシル化を含み、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子を固定化するまたは捕捉するＡＤＰ−リボースマトリックスをもたらす、ボルト粒子を産生するための、方法。
【請求項５】
ＡＤＰ−リボシル化は操作されたあるいは非操作ポリアデノシン２リン酸塩（ＡＤＰ−）−リボースポリメラーゼタンパク質によって触媒される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
パッセンジャー分子、パッセンジャー賦形剤分子あるいはボルト粒子のボルトタンパク質は、ＡＤＰ−リボースのためのアクセプター部位を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＡＤＰ−リボシル化のための基質としてＮＡＤ＋あるいはＮＡＤ＋アナログの使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ボルト粒子を含む組成物であって、ボルト粒子は、主要ボルトタンパク質（ＭＶＰ）の修飾配列の複数の複製を含み、前記修飾配列は、特定の少なくとも１つのアミノ酸変異あるいは挿入あるいは欠失を含み、局所的な電荷、疎水性、領域の極性及び／または結合パートナーに対する親和性あるいは結合性における変化を結果としてもたらす、組成物。
【請求項９】
前記変異、挿入または欠失は修飾主要ボルトタンパク質を結果としてもたらし、前記修飾主要ボルトタンパク質は前記前記パッセンジャー分子との非共有相互作用を形成し、未修飾主要ボルトタンパク質は形成することができない、請求項８の組成物。
【請求項１０】
前記変異、挿入、及び／または欠失は、レセプタまたはリガンド結合ペプチドの発現を結果として生じる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記変異、挿入及び／または欠失は、ＭＶＰのショルダードメインの非体系的な領域に位置する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ボルト粒子のための、修飾主要ボルトタンパク質を産生する方法であって：
ａ）未修飾主要ボルトタンパク質をコード化する配列を有する少なくとも１つの核酸を得る工程；及び
ｂ）未修飾主要ボルトタンパク質の領域をコード化する配列の領域を修飾する工程であって、前記領域は、ボルト粒子の内部あるいは外部に面する工程、を含む方法。
【請求項１３】
核酸突然変異誘発はアミノ酸置換、アミノ酸欠失及びアミノ酸挿入の少なくとも１つを導入する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記領域はループ、側鎖あるいはショルダードメインを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾主要ボルトタンパク質はパッセンジャー分子と非共有相互作用を形成することができ、前記未修飾主要ボルトタンパク質は形成することができない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ボルト粒子の物理的機械的性質を変化する工程を含む、請求項４及び１２に記載の方法。
【請求項１７】
ボルト粒子は細胞の核に局所化する、請求項４及び１２に記載の方法。
【請求項１８】
必要性のある被験体の疾病を処置する方法であって、被験体へ請求項１−３及び請求項８−１１のうちのいずれか１つの組成物を投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１７年１２月１３日に出願された米国仮特許第６２／５９８，３７８号の有益性を主張し、その全体は、本明細書の参照によって組込まれる。
【０００２】
本開示は、ボルト（ｖａｕｌｔ）粒子あるいはボルトバレル、及びボルト粒子の物理的機械的性質を変化する方法として知られているリボ核タンパク構造に関する。ボルト粒子はパッセンジャー分子（例えば処置薬）をパッケージ化し被験体の標的細胞（例えば癌細胞）へ送達するのに役に立つ。
【０００３】
ボルトナノ粒子はほとんどの真核細胞の細胞質において見られるリボ核タンパク粒子である。天然のボルトは、ポリゾ−ムによって３Ｄナノプリントされた主要ボルトタンパク質（ＭＶＰ）の７８の複製から概して合成される。ＭＶＰのこれらの７８の複製は、ボルト粒子の殻を形成する。ボルトは、ボルトＰＡＲＰ（ＶＰＡＲＰ）として知られるポリアデノシンピロ燐酸塩（ＡＤＰ−）−リボースポリメラーゼ４（ＰＡＲＰ４）；テロメラーゼ関連タンパク質１（ＴＥＰ１）；及び４つのノンコーディングボルトリボ核酸（ｖｔＲＮＡｓ）から概して構成されるかあるいは関係する。
【０００４】
ラットボルトの結晶構造を、２００９年田中ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９年，３２３（５９１２）：３８４−８）が３．５Åに分解した。各ＭＶＰモノマーは、９つの構造的な反復ドメインでそのＮ−末端からショルダードメイン、キャップヘリックスドメインで始まりＣ−末端キャップリングドメインで終わる。ＭＶＰモノマー内の３つの領域を分解することができなかった：１）反復ドメイン８のＬｅｕ４２９−Ｐｒｏ４４８、２）ショルダードメイン（図１１Ａ）のＭｅｔ６０８−Ｐｒｏ６２０、及び、３）キャップリングドメインのＰｈｅ８４６  −  Ｌｙｓ８６１ラットＭＶＰ及びヒトＭＶＰは、全体的な８７．８％のアミノ酸配列同一性及び、有力には、残基１−  ８６１間の９１．１％の同一性を共有する（図９）。したがって、ラット及びヒトＭＶＰは恐らく同様の構造的な特徴を共有し、最も大きな違いはヒトＣ−末端キャップ配列の余分な長さによる。
【０００５】
組み換え型のボルトへパッセンジャー分子をパッケージ化する現在の方法は、パッセンジャー分子、あるいはＮ−末端、あるいはＭＶＰの配列のＣ−末端への物質結合ドメインのためのアミノ酸配列の付加による（図１Ａ、図１Ｂ）。これらの方法の欠点は、Ｎ−末端かＣ−末端のいずれかの付加によってボルト粒子の集合が分裂する場合があるということである。加えて、この方法は、パッケージ化効率を抑制する場合がある、ボルトのウエスト（Ｎ−末端融合）あるいはボルトのキャップ（Ｃ−末端融合）にパッセンジャー分子を制限する。キャップリングドメインのＣ−末端に対しレセプタまたはリガンドペプチドを融合させることは、キャップに分子が集中し、及びそれぞれの結合パートナーと立体的にモノマーの相互作用を妨害する場合がある。ラットＭＶＰの結晶構造に基づいて、キャップリングドメインのＣ−末端は非体系的で、したがって、融合ペプチドが外部環境に部分的にあるいは完全に晒されるかどうかが不確かである。更に、ボルト複合体へのパッセンジャー分子の共有結合は、その分子の接近を制限する場合があり、且つ下流工程においてその機能を制限する場合がある。すべての分子をボルト複合体にリンクできるとは限らない。パッセンジャー分子の受動のパッケージ化（ｐａｓｓｉｖｅ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ）は上に記載された欠点を解決するが、それはボルト複合体から外へ拡散することができる、より小さな分子のパッケージ化を可能にしない。さらに、現在の方法は、循環、摂取及びペイロード配信に影響を与える可能性のある剛性（弾性率）、圧縮強度、総電荷、極性等のボルト粒子の物理的機械的性質を変化させるプロセスには対応していない。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ボルト粒子内のＡＤＰ−リボースの密マトリックスにおけるパッセンジャー分子の固定化を記載する。さらに、本開示は、また強化された安定性及び／または下流機能のためのボルト粒子の物理的機械的性質特性（例えば密度、圧縮強度、帯電性など）を変化させる方法を記載する。本開示は、また特定の細胞への送達のためにボルトを操作する方法を記載する。
【０００７】
幾つかの態様において、ここに開示されるのは、ボルト粒子、パッセンジャー分子及びＡＤＰ−リボースのマトリックスを含む組成物であり、パッセンジャー分子及びＡＤＰ−リボースのマトリックスはボルト粒子に囲まれる。幾つかの実施形態において、組成物はボルト関連タンパク質（ｖａｕｌｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。幾つかの実施形態では、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質はパッセンジャー分子に接続していない。幾つかの実施形態では、パッセンジャー分子はボルト粒子内に位置づけられるが、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質に接続していない。幾つかの実施形態では、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質は、パッセンジャー分子に接続することができるドメインを所有しない。幾つかの実施形態では、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質は、パッセンジャー分子に接続することができるペプチドを所有しない。幾つかの実施形態では、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質は、パッセンジャー分子に接続することができるアミノ酸を所有しない。幾つかの実施形態では、パッセンジャー分子は、ボルト粒子またはボルト関連タンパク質に接続することができる機能を所有しない。幾つかの実施形態において、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質への接続は非共有相互作用あるいは結合を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質への接続は共有相互作用を含む。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子内で遊離している。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、ボルト組立中にボルトによって遊離的に被包される（ｆｒｅｅｌｙ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子のカルボキシル末端に融合される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルトナノ粒子のアミノ末端に融合される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト関連タンパク質のｍＩＮＴドメインに融合される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト関連タンパク質のｍＩＮＴドメインに融合されない。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はＰＡＲＰ４である。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はポリ−アデノシン２リン酸塩（ＡＤＰ−）−リボースポリメラーゼタンパク質を含む。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、約９００ドルトン未満の分子量を有する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、約９００ドルトン以上である分子量を有する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は化学療法薬である。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はドキソルビシンである。
【０００８】
幾つかの態様において、本明細書に開示されるのは、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子のＡＤＰ−リボシル化を含み、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子（ｖａｕｌｔ−ｅｎｃｌｏｓｅｄ  ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を固定化するＡＤＰ−リボースマトリックスをもたらす、ボルト粒子を産生する方法である。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボシル化はＰＡＲＰ４によって触媒される。幾つかの実施形態において、ボルト内のパッセンジャー分子を囲う工程はボルト粒子を産生中にある。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子を産生した後にボルトで囲われる。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、ＡＤＰ−リボースにおけるアクセプター部位を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子のボルトタンパク質は、ＡＤＰ−リボースにおけるアクセプターを含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子を合成する方法はインビトロ無細胞タンパク質発現系を使用する。幾つかの実施形態において、ボルト粒子を合成する方法は細胞ベースのタンパク質発現系を使用する。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボシル化はＰＡＲＰ４タンパク質の存在による。幾つかの実施形態において、ＮＡＤ＋あるいはＮＡＤ＋アナログはＡＤＰ−リボシル化のための基質として使用される。幾つかの実施形態において、方法はパッセンジャー分子をボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質に接続する工程を含まない。幾つかの実施形態において、方法はボルト粒子内にパッセンジャー分子を被包する工程を含むが、パッセンジャー分子をボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質に接続しない。幾つかの実施形態において、方法はボルト粒子のカルボキシル末端へパッセンジャー分子を融合させる工程を含む。幾つかの実施形態において、方法はボルトナノ粒子のアミノ末端へパッセンジャー分子を融合させる工程を含む。
【０００９】
幾つかの態様において、本明細書に記載されているのは、ボルトのＡＤＰ−リボシル化のための方法がボルトに関連するタンパク質によって触媒され、パッセンジャー分子を閉じ込めるＡＤＰ−リボースマトリックスに結果として生じる分子を囲ったということである。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はＰＡＲＰである。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はＰＡＲＰ４あるいはＰＡＲＰ４の操作された変種である。幾つかの実施形態において、ボルト粒子の物理的機械的性質はＡＤＰ−リボシル化によって変化された。幾つかの実施形態において、補助因子は、ボルト粒子の物理的機械的性質を変化するために、ボルトに加えられる。幾つかの実施形態において、脂質は、ボルト粒子の物理的機械的性質を変化するために、ボルトに加えられる。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子を産生する間にボルトで囲われる。幾つかの実施形態において、ボルトに囲われた分子のＡＤＰ−リボシル化のための方法は、ボルト粒子のボルトタンパク質がＡＤＰ−リボースのためのアクセプター部位を有する賦形剤分子と接触する工程を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子を合成する方法はインビトロ無細胞タンパク質発現系を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子を合成する方法は細胞ベースのタンパク質発現系を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子を産生する方法はＡＤＰ−リボシル化のための基質としてＮＡＤ＋あるいはＮＡＤ＋アナログを使用する工程を含む。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質内に被包されるが、接続されない。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子のカルボキシル末端に融合される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルトナノ粒子のアミノ末端に融合される。
【００１０】
幾つかの態様において、本明細書に開示されたのは細胞にボルト粒子を送達する方法であり、ボルト粒子は、ＡＤＰ−リボースのマトリックス内に囲まれ固定されたパッセンジャー分子を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は細胞の核に局所化する。幾つかの実施形態において、細胞は癌細胞である。幾つかの実施形態において、癌細胞は乳がんまたは前立腺癌由来である。
【００１１】
幾つかの態様において、本明細書に開示されたのは、その必要のある被験体の疾病を処置する方法であり、被験体へボルト粒子を投与する方法を含み、ボルト粒子は、ＡＤＰ−リボースのマトリックス内に囲まれ固定されたパッセンジャー分子を含む。
【００１２】
幾つかの態様において、本明細書に開示されるのは、その必要のある被験体の疾病を処置する方法であり、この出願において開示されるように、組成物を投与する工程を含む。
【００１３】
幾つかの態様において、本明細書に開示されるのはボルト粒子を含む組成物であり、ボルト粒子は、主要ボルトタンパク質（ＭＶＰ）の修飾配列の複数の複製を含み、修飾配列は、特定の少なくとも１つのアミノ酸変異あるいは挿入を含み、局所的な電荷、疎水性あるいは領域の極性の変化を結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ＭＶＰの配列は、１つ以上のアミノ酸の変異を含む。幾つかの実施形態において、ＭＶＰの配列は、１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。幾つかの実施形態において、変異あるいは挿入はＭＶＰのショルダードメインに位置する。幾つかの実施形態において、変化あるいは挿入はレセプタまたはリガンド結合ペプチドの発現を結果としてもたらす。
【００１４】
幾つかの態様において、本明細書に記載されているのは、ボルト粒子のための、修飾主要ボルトタンパク質を産生する方法であり、次のものを含む：主要ボルトタンパク質をコード化する配列を有する少なくとも１つの核酸を得る工程；主要ボルトタンパク質の領域をコード化する配列の領域の修飾する工程であって、領域は、ボルト粒子の内部に面する；及び修飾主要ボルトタンパク質を得るために、転写と翻訳の少なくとも１つを果たす工程。幾つかの実施形態において、領域はループを含む。幾つかの実施形態において、領域は側鎖を含む。幾つかの実施形態において、領域はショルダードメインを含む。幾つかの実施形態において、領域の修飾は核酸突然変異誘発を含む。幾つかの実施形態において、核酸突然変異誘発はアミノ酸置換、アミノ酸欠失及びアミノ酸挿入の少なくとも１つを導入する工程を含む。幾つかの実施形態において、変異のための領域は、主要ボルトタンパク質の結晶構造を得る及び調査することにより同定され選択される。幾つかの実施形態において、修飾主要ボルトタンパク質はパッセンジャー分子と非共有相互作用を形成することができ、未修飾主要ボルトタンパク質は形成することができない。
【００１５】
幾つかの態様において、本明細書に開示されるのは、ボルト粒子、パッセンジャー分子及びＡＤＰ−リボースのマトリックスを含む組成物であり、パッセンジャー分子及びＡＤＰ−リボースのマトリックスはボルト粒子に囲まれる。幾つかの実施形態において、組成物はボルト関連タンパク質を含み、ボルト関連タンパク質はポリ−アデノシン２リン酸塩（ＡＤＰ−）を含む−リボースポリメラーゼタンパク質である。幾つかの実施形態において、幾つかの実施形態では、パッセンジャー分子はボルト粒子内に位置づけられるが、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質に接続せず、及び、形質、アミノ酸、ドメインあるいはパッセンジャー分子に接続することができるペプチドを所有しない。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子内で遊離しているか、あるいはパッセンジャー分子は、ボルト組立中にボルトによって遊離的に被包される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子のカルボキシル末端に融合されるか、パッセンジャー分子はボルトナノ粒子のアミノ末端に融合されるか、あるいは、パッセンジャー分子はボルト関連タンパク質のｍＩＮＴドメインに融合される。
【００１６】
幾つかの態様において、本明細書に開示されるのは、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子のＡＤＰ−リボシル化を含み、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子を固定化するまたは捕捉するＡＤＰ−リボースマトリックスをもたらす、ボルト粒子を産生するための方法である。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボシル化は操作されたポリアデノシン２リン酸塩（ＡＤＰ−）−リボースポリメラーゼタンパク質によって触媒される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子、賦形剤分子あるいはボルト粒子のボルトタンパク質は、ＡＤＰ−リボースのためのアクセプター部位を含む。幾つかの実施形態において、ＮＡＤ＋あるいはＮＡＤ＋アナログはＡＤＰ−リボシル化のための基質として使用される。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は変化された物理的機械的性質を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は細胞の核に局所化する。
【００１７】
幾つかの態様において、本明細書に開示されるのはボルト粒子を含む組成物であり、ボルト粒子は、修飾主要ボルトタンパク質（ＭＶＰ）の複数の複製を含み、修飾配列は、少なくとも１つのアミノ酸変異あるいは挿入を含み、局所的な電荷、疎水性、領域の極性及び／または結合パートナーに対する親和性あるいは結合性における変化を結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ＭＶＰの配列は、１つ以上のアミノ酸の挿入または欠失を含む。幾つかの実施形態において、変異、挿入あるいは欠失は修飾主要ボルトタンパク質の発現を結果として生じ、パッセンジャー分子との非共有相互作用の形成し、未修飾主要ボルトタンパク質は形成することができない。幾つかの実施形態において、変異、挿入及び／または欠失はレセプタまたはリガンド結合ペプチドの発現を結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、変異、挿入及び／または欠失はＭＶＰのショルダードメインに位置する。
【００１８】
幾つかの態様において、本明細書に開示されるのは、ボルト粒子のための、修飾主要ボルトタンパク質を産生する方法であり、次のものを含む：未修飾主要ボルトタンパク質をコード化する配列を有する少なくとも１つの核酸を得る工程；主要ボルトタンパク質の領域をコード化する配列の領域の修飾する工程であって、領域は、ボルト粒子の内部に面する；及び修飾主要ボルトタンパク質を得るために、転写と翻訳の少なくとも１つを果たす工程。幾つかの実施形態において、領域はループ、側鎖あるいはショルダードメインを含む。幾つかの実施形態において、核酸突然変異誘発はアミノ酸置換、アミノ酸欠失及びアミノ酸挿入の少なくとも１つを導入する工程を含む。幾つかの実施形態において、修飾主要ボルトタンパク質はパッセンジャー分子と、未修飾主要ボルトタンパク質は形成することができない非共有相互作用を形成することができる。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は変化された物理的機械的性質を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は細胞の核に局所化する。
【００１９】
幾つかの態様において、本明細書に開示されたのは、その必要のある被験体の疾病を処置する方法であり、被験体へボルト粒子を投与する工程を含み、ボルト粒子は、ＡＤＰ−リボースのマトリックス内に囲まれ固定されたパッセンジャー分子を含む。
【００２０】
幾つかの態様において、本明細書に開示されたのは、その必要のある被験体の疾病を処置する方法であり、この出願において開示されるように、組成物を投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】長手方向の断面として表わされる現在のボルトパッケージ化ストラテジー回路図を示す。パッセンジャー分子がボルトナノ粒子のキャップ（カルボキシル末端）に融合されることを示す。
【図１Ｂ】長手方向の断面として表わされる現在のボルトパッケージ化ストラテジー回路図を示す。ボルトナノ粒子のウエスト（アミノ末端）にパッセンジャー分子が融合されることを示す。
【図１Ｃ】長手方向の断面として表わされる現在のボルトパッケージ化ストラテジー回路図を示す。パッセンジャー分子がＰＡＲＰ４のｍＩＮＴドメインに融合されることを示す。
【図１Ｄ】長手方向の断面として表わされる現在のボルトパッケージ化ストラテジー回路図を示す。パッセンジャー分子がボルト組立中にボルトによって遊離的に被包されることを示す。
【図２】ＡＤＰ−リボシル化反応物を示す。エステル結合は、アクセプター分子とＮＡＤ＋の第１のＡＤＰ−リボースとの間に形成される。ＡＤＰ−リボース鎖の重合が２’−１’グリコシド結合形成を介して生じ、直線的な様式において、並びに分岐は密なマトリックスを作り出すために２０ＡＤＰ−リボースユニットの後に発生する場合がある。
【図３Ａ】ヒトＰＡＲＰのＡＤＰ−リボース転移酵素の触媒モチーフ及びそれらの活性状態のアライメントを示す。
【図３Ｂ】アルギニン特定ＡＤＰ−リボース転移酵素（ＡＲＴｓ）の触媒モチーフのアライメントを示す。
【図４】ＰＡＲＰ４のドメイン構造を示す。ＰＡＲＰ４はリンペプチド結合モジュール（ＢＲＣＴ）、ＰＡＲＰ触媒ドメイン、ボルトタンパク質アルファ間トリプシン（ＶＩＴ）ドメイン、フォンウィルブランド（ｖＷＡ）ドメイン、核移行シグナル（ＮＬＳ）及び主要ボルトタンパク質相互作用（ｍＩＮＴ）ドメインから成る。
【図５Ａ】ボルトの空洞の内のＰＡＲＰ４触媒ＡＤＰ−リボシル化のための異なる方法の図式を示す。ボルト合成中のパッセンジャー分子の被包を示す。
【図５Ｂ】ボルトの空洞の内のＰＡＲＰ４触媒ＡＤＰ−リボシル化のための異なる方法の図式を示す。完了したボルトでのパッセンジャー分子の共同インキュベートを示す。
【図５Ｃ】ボルトの空洞の内のＰＡＲＰ４触媒ＡＤＰ−リボシル化のための異なる方法の図式を示す。図５Ａ及び５Ｂで示される形質を記載する凡例を示す。
【図６Ａ】在来のアガロースゲルにおけるボルトの電気泳動の遊走を示す。電荷を基にしたアガロースゲル電気泳動及びボルト可撓性の略図であって；ＡＤＰ−リボシル化バッファーにおいて小分子及びＮＡＤ＋でのインキュベートの後、ＰＡＲＰ４（右レーン）を包含するボルト、及びＰＡＲＰ４（左レーン）なしのボルト。
【図６Ｂ】在来のアガロースゲルにおけるボルトの電気泳動の遊走を示す。電荷を基にした在来のアガロースゲルにおけるボルトの遊走を示す；ＡＤＰ−リボシル化バッファーにおいて小分子及びＮＡＤ＋でのインキュベートの後、ＰＡＲＰ４（右レーン）を包含するボルト、及びＰＡＲＰ４（左レーン）なしのボルト。
【図７Ａ】パッセンジャー分子を包含する酢酸ウラニルで染色されたボルトの電子顕微鏡写真を示す。
【図７Ｂ】空である酢酸ウラニルで染色されたボルトの電子顕微鏡写真を示す。
【図８】典型的に直線的で枝分かれされたＡＤＰ−リボースポリマーを示す。
【図９】ラットＭＶＰ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０７３２０６．２）及びヒトＭＶＰ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０５９４４７．２）のアミノ酸配列のアライメントを示す。ドメインは、２００９年田中ら（サイエンス、２００９年、３２３（５９１２）：３８４−８）によって解明されたラットボルトの結晶構造を基にして注釈される。
【図１０Ａ】図１０Ａ−図１０ＢはラットＭＶＰを絵で表現する。ドメイン構造及び選択した内部に面するループ及び選択したアミノ酸側鎖を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ−図１０ＢはラットＭＶＰを絵で表現する。ボルトバレルの全体にわたって広げられた多数の操作された非共有相互作用を介して、パッセンジャー分子の結合を示す。
【図１１Ａ】ラットＭＶＰを絵で表現し、及びショルダードメインに配列を挿入するためのストラテジーを示す。ショルダードメイン、及びショルダードメイン中の非体系的な外部に面する領域を示す。
【図１１Ｂ】ラットＭＶＰを絵で表現し、及びショルダードメインに配列を挿入するためのストラテジーを示す。ショルダードメイン中へレセプタまたはリガンドペプチドを導入するための２つの制限しないストラテジーの例を示す。
【図１２Ａ】修飾ラットボルトナノ粒子の組立及び機能的な活性を示し、ショルダードメインの非体系的な領域におけるガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）リガンドを表現する。ウサギ抗ガストリン放出ペプチド及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−１０ｎｍ金で染色されたボルトを標的とする野性型及びガストリン放出ペプチドレセプタ（ＧＲＰＲ）の代表的なイノムゴ−ルド電子顕微鏡写真を示す。平均及び標準偏差（両側Ｔ検定）としてボルトの免疫金標識の頻度が図示され、及び代表的な、個々の免疫金標識化されたＧＲＰボルトが下に示される。
【図１２Ｂ】修飾ラットボルトナノ粒子の組立及び機能的な活性を示し、ショルダードメインの非体系的な領域におけるガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）リガンドを表現する。Ｄｙｌｉｇｈｔ−４８８標識化野性型ボルト、あるいはＤｙｌｉｇｈｔ−４８８標識化ＧＲＰＲ標的ボルト及びＧＲＰＲを発現するヒト前立腺癌細胞株、ＰＣ−３、でのインビトロ結合アッセイを示す。Ｃは細胞質；Ｎは核；矢印は単一のボルト粒子を表す。
【００２２】
用語
以下の記載において、一定の特定の詳細を、様々な実施形態の完全な理解を与えるために説明する。しかしながら、当業者は、提供された実施形態がこれらの詳細なく実行し得ることを理解するだろう。
【００２３】
コンテキストが要求しなければ、続く明細書及び請求項の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその一種は、すなわち、「を含むが、これらに限定されずに（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」のような、開放的かつ包括的な意味で解釈される。
【００２４】
本明細書で使用されているように、用語「ボルト」、「ボルト粒子」及び「ボルトナノ粒子」は、内部空洞でのボルトを形成するために合成される主要ボルトタンパク質（ＭＶＰ）の複合体を指すように交換可能に使用される。幾つかの実施形態において、ボルトは３Ｄナノプリント技術で合成される。幾つかの実施形態において、ボルトは卵形を有する。
【００２５】
本明細書で使用されているように用語「ＡＤＰ−リボシル化」は酵素触媒反応を概して指し、それによって基質に由来した１つ（モノ）以上（ポリ）のＡＤＰ−リボースユニットが、アクセプター分子に共有結合で連結され、でなければ留意される。
【００２６】
本明細書で使用されているように、用語「基質」は概してＮＡＤ＋あるいはＮＡＤ＋のアナログを指す、でないならば、そうでなければ注意した。
【００２７】
本明細書で使用されるように、用語「パッセンジャー分子」は、完全にあるいは部分的にボルト粒子内で囲まれるか、ボルト粒子の外側対向面上に発現された１つ以上の分子（例えばタンパク質、炭水化物、核酸、脂質、小分子、医薬品活性成分等及びその組み合わせ）を、概して指す。
【００２８】
本明細書及び添付された請求項において使用されるように、単数形式「１つの」（ａ）「１つの」（ａｎ）及び「その」（ｔｈｅ）は、もし内容が明確にそうでないと指示しなければ、複数の指示物を含む。また、用語「あるい」（ｏｒ）は、もし内容が明確にそうでないと指示しなければ、「及び／または」を含むその意味において概して用いられることも留意されなければならない。さらに、本明細書で提供される見出しは便宜上のものであり、主張される実施形態の範囲や意味を解釈しない。
【００２９】
本明細書に使用されるように、用語「に関して」（ａｂｏｕｔ）約１０％、５％あるいは１％までの規定される量に近い量を指す。
【００３０】
本明細書で使用されているように、用語「相同の」（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、「相同」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、「パーセント相同」（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）あるいは「パーセント相同」（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、が参照配列に対して、アミノ酸配列または核酸配列を説明するために本明細書に使用された場合、Ｋａｒｌｉｎ  及びＡｌｔｓｃｈｕｌによって記載された式（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８，１９９０年，ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７，１９９３年）の使用によって決定される可能性がある。そのような式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０年）のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムの中に組み入れられる。配列のパーセント相同は、本出願の申請日の時点で、ＢＬＡＳＴの最も近時の形式を使用して決定される可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
異常あるいは癌細胞などの細胞に対する処置薬の標的化された送達は、毒性及び自己免疫反応を含むオフターゲット効果を最小化するのに必要不可欠である。パッセンジャー分子（例えば処置薬）を包含するボルトナノ粒子は、そのような標的化された送達に使用されてもよい。細胞に対しボルトナノ粒子を標的とすることは、ボルト粒子の外側対向面上のレセプタあるいはリガンドを典型的には必要とし、そのそれぞれのリガンドあるいは、レセプタと結合するのにアクセス可能である（例えばターゲット細胞上）（図１Ａ）。目的のパッセンジャー分子を、それらをＭＶＰに（図１Ａ及びＢ）、あるいはＰＡＲＰ４の主要なボルト相互作用ドメイン（ｍＩＮＴ）に連結することにより（図１Ｃ）、またはボルト合成の中受動的な被包により（図１Ｄ）、組み換え型のボルトの中にパッケージ化することができる。
【００３２】
酵素のＰＡＲＰファミリーは、ＡＤＰ−リボース転移酵素の１つの下位分類を構築し、これはＡＤＰ−リボシル化を媒介することができる。ＡＤＰ−リボシル化はアクセプター分子上にＡＤＰ−リボースを付加することである（例えば図２参照）。このプロセスはＡＤＰ−リボース転移酵素（例えばＰＡＲＰ４）によって触媒され、基質としてＮＡＤ＋を使用する。ＡＤＰ−リボシル化は、アスパラギン酸上のカルボキシル基、グルタミン酸、及びリジン上のアミン基などのこれらのアクセプター分子上にアクセプター部位を必要とする。ＭＶＰ、ＰＡＲＰ４、ＮＡＤ＋及びＮＡＤ＋アナログは、ある程度までＡＤＰ−リボシル化のためのアクセプターとして働いてもよい。したがって、ボルトの内部でＡＤＰ−リボシル化を達成するために、アクセプター部位は標的パッセンジャー分子、パッセンジャー賦形剤、及び／または、ボルトタンパク質（ＭＶＰ、ＰＡＲＰ、ＴＥＰ）上で存在してもよい。
【００３３】
ＰＡＲＰは、Ｈ−Ｙ−Ｅ触媒モチーフ（例えば図３Ａ参照）によって優生的に定義され、一方でＡＤＰ−リボース転移酵素の他の下位分類はＲ−Ｓ−Ｅモチーフを有する（例えば図３Ｂ参照）。ＰＡＲＰは、カルボン酸アクセプターへＡＤＰ−リボースを蓄積するためにＨ−Ｙ−Ｅ触媒モチーフを使用する。Ｒ−Ｓ−Ｅ触媒モチーフを包含するＡＤＰ−リボース転移酵素は、アクセプターとしてグアニジノ基を使用する。
【００３４】
ＰＡＲＰ４は、ボルトに結合するそのＣ−末端で（例えば図４参照）、主要ボルトタンパク質相互作用（ｍＩＮＴ）ドメインを包含するので、ＡＤＰ−リボース転移酵素間で特異である。パッセンジャー分子あるいはパッセンジャー賦形剤をグアニジノアクセプター基（ｇｕａｎｉｄｉｎｏ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｇｒｏｕｐｓ）に適合するために、ＰＡＲＰ４触媒モチーフはＲ−Ｓ−Ｅに変えられる場合がある。さらに、ＰＡＲＰ４の内の１つ以上のドメインは交換されてもよく、あるいは１つ以上のアミノ酸が加えられるか、削除されるか、あるいは置換されてもよい。
【００３５】
ＡＤＰ−リボシル化は多数の細胞経路で機能する可逆性の翻訳後修飾である。機能的に、それは、特定の機能のための分子を刺激する場合があり、あるいは、細胞に送達されるまで、分子を静める、あるいは保護する場合がある。細胞内におけるＡＤＰ−リボシル化されたボルト内容物の解放は、ポリＡＤＰ−リボースグリコヒドラーゼ（ＰＡＲＧ）などのグリコヒドラーゼにボルトカーゴを曝し、パッセンジャー分子を解放する及び／またはパッセンジャー分子をその本来の状態に戻すためにＡＤＰ−リボースを酵素的に切断する。
【００３６】
代替的に、パッセンジャー分子は、パッセンジャー分子とボルト粒子との間の非共有相互作用を強化する、ボルト構造中の１つ以上のアミノ酸を変異、抹消する及び／または挿入するために部位特異的変異誘発を使用することにより、ボルトによって形成された内部空洞内で適合されてもよい。負電荷分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）を適合するために、正電荷側鎖、例えばアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）、を備えた１つ以上のアミノ酸が、局所的な正電荷を増加させるために、ボルト構造における変異、欠失及び／または挿入によって導入され、（図１０Ａ）、それによって、パッセンジャー分子とボルトとの間の静電的相互作用を強化する（図１０Ｂ）。正電荷パッセンジャー分子を適合するために、
負電荷側鎖、例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、またはグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）を備えた１つ以上のアミノ酸が、局所的な負電荷を増加させるために、ボルト構造における変異、欠失及び／または挿入によって導入され、それによって、パッセンジャー分子とボルトとの間の静電的相互作用を強化する。正電荷パッセンジャー分子を適合するために、極性側鎖、例えばアスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）、またはチロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、を備えた１つ以上のアミノ酸が、局所的な親水性を増加させるために、ボルト構造における変異、欠失及び／または挿入によって導入され、それによって、パッセンジャー分子とボルトとの間の親水性相互作用を強化する。無極性パッセンジャー分子を適合するために、疎水性側鎖、例えばアラニン  （Ａｌａ，Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、またはバリン（Ｖａｌ，Ｖ）、を備えた１つ以上のアミノ酸が、局所的な疎水性を増加させるために、ボルト構造における変異、欠失及び／または挿入によって導入され、それによって、パッセンジャー分子とボルトとの間の疎水的相互作用を強化する。
【００３７】
ボルト粒子は、構造がＸ線結晶学によって解明されていない、３つの独立した領域を包含する。３つの非体系的な領域のうちの１つは、ショルダー域に位置づけられ、ボルト粒子の外部へ配向される（図１１Ａ）。特定のレセプタあるいはリガンドへボルトを標的化するために、標的配列は、非体系的な領域に挿入される場合があり、あるいは、ボルトのショルダードメイン内における非体系的な領域を含む配列を置換することができる（図１１Ｂ）。非体系的ショルダードメイン内における標的リガンドの挿入は、リガンドを認識するレセプタを発現させる細胞に対しボルトの標的化を促進する（例えば図１２参照）。
【００３８】
ボルトを含む組成物が本明細書に記載される。幾つかの実施形態において、組成物はさらにパッセンジャー分子を含む。さらに、より小さなパッセンジャー分子をパッケージ化し、かつボルト粒子の物理的機械的性質を変化する方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載されている幾つかの方法が概してＡＤＰ−リボースマトリックス形成を含む。さらに、疎水性の分子をパッケージ化する方法が本明細書に記載される。さらに、電荷分子をパッケージ化する方法が本明細書に記載される。さらに、極性分子をパッケージ化する方法が本明細書に記載される。本明細書に記載されている幾つかの方法は概してボルト構造における特異的アミノ酸の変異、挿入、あるいは欠失を含む。さらに、特定のレセプタあるいはリガンドに対してボルトを標的化する方法が本明細書に記載される。
【００３９】
組成物
本明細書で提供されるのは、ボルト粒子を含む組成物である。概して、本明細書に開示されるボルト粒子は、１つ以上の変異したあるいは挿入されたアミノ酸で成る、１つ以上の操作された領域を包含するＭＶＰのタンパク質の殻を含む。概して、本明細書に開示されたボルト粒子は、つまり、静電的相互作用、疎水的相互作用及び極性相互作用（水素結合）である、非共有相互作用を介してパッセンジャー分子と結合可能な空洞を含む。概して、本明細書に開示されたボルト粒子は、特異的結合パートナーと結合可能なショルダードメインの操作された領域を含む。
【００４０】
本明細書に開示されたボルト粒子は、（ＭＶＰのタンパク質の）殻、少なくとも１つのボルト関連タンパク質及びＡＤＰ−リボースマトリックスを含んでもよい。幾つかの例において、パッセンジャー分子をＡＤＰ−リボースマトリックス内において包含する。幾つかの例において、パッセンジャー分子はＡＤＰ−リボースマトリックス内において包含されるが、ＡＤＰ−リボースマトリックスに接着しない。幾つかの例において、パッセンジャー分子はＡＤＰ−リボースマトリックス内において包含されるが、ボルト粒子に接着しない。幾つかの例において、パッセンジャー分子は、ＡＤＰ−リボースマトリックスに共有結合で接着される。幾つかの例において、パッセンジャー分子はＡＤＰ−リボースマトリックス内で遊離する。
【００４１】
概して、本明細書に開示されるＡＤＰ−リボースマトリックスはＡＤＰ−リボシル化の結果である。ボルト内のＡＤＰ−リボシル化は、ボルト粒子に新しい特性を与える。第１に、各ＡＤＰ−リボースモノマーの付加は２つの負電荷リン酸基（図２を参照）に一因となり、アクセプター分子の帯電性を変える。粒子レベルでは、帯電性の全体的な変化は、ボルト粒子の生物分散、標的化及び細胞の摂取を変えることができる。ＡＤＰ−リボシル化の程度、及び従った、静電変化はＮＡＤ＋の濃度、反応時間及び反応温度の調節により制御することができる。したがって、ボルト内のＡＤＰ−リボシル化の程度を正確に調節することによって、ボルト粒子機能性の複雑で異なる程度を達成することができる。例えば、ボルトの内部へのＡＤＰ−リボースの付加は、囲まれた分子間の空間を消費する。ＡＤＰ−リボースのモノマー及び／またはポリマーは、ボルト粒子壁にトルゴ−ルのような圧力を生成する、ＡＤＰ−リボースマトリックスを作り出し、ボルトの圧縮力及び引張力を増加させ、それをより変形可能でなくする。
【００４２】
幾つかの実施形態において、幾つかの実施形態では、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質はパッセンジャー分子に接続されない。幾つかの実施形態では、パッセンジャー分子はボルト粒子内に位置づけられるが、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質に接続されない。幾つかの実施形態では、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質はパッセンジャー分子に接続可能なドメインを所有しない。幾つかの実施形態では、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質はパッセンジャー分子に接続可能なペプチドを所有しない。幾つかの実施形態において、ボルト粒子あるいはボルト関連タンパク質は、パッセンジャー分子に接続することができるアミノ酸を所有しない。幾つかの実施形態では、パッセンジャー分子は、ボルト粒子またはボルト関連タンパク質に接続することができる機能を所有しない。幾つかの実施形態では、パッセンジャー分子は、ボルト粒子またはボルト関連タンパク質に共有結合で接続されない。幾つかの実施形態では、パッセンジャー分子は、ボルト粒子またはボルト関連タンパク質に共有結合で相互作用しない幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子内で遊離している。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、ボルト組立中にボルトによって遊離的に被包される（ｆｒｅｅｌｙ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト粒子のＣ−末端に融合される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルトナノ粒子のＮ−末端に融合される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト関連タンパク質のｍＩＮＴドメインに融合される。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はボルト関連タンパク質のｍＩＮＴドメインに融合されない。
【００４３】
幾つかの例において、ＭＶＰあるいはボルト関連タンパク質は、野性型ＭＶＰあるいはボルト関連タンパク質のそれぞれをベースとする。幾つかの例において、ＭＶＰ及びボルト関連タンパク質の少なくとも１つは、野性型ＭＶＰあるいはボルト関連タンパク質に相関するアミノ酸置換をそれぞれ含む。幾つかの例において、ＭＶＰ及びボルト関連タンパク質の少なくとも１つは、野性型発生ＭＶＰ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ＭＶＰ）あるいはボルト関連タンパク質に相関するアミノ酸挿入をそれぞれ含む。幾つかの例において、ＭＶＰ及びボルト関連タンパク質の少なくとも１つは、野性型ＭＶＰあるいはボルト関連タンパク質に相関するアミノ酸欠失をそれぞれ含む。そのような置換、挿入及び欠失は本明細書においてアミノ酸変異と呼ばれる場合がある。
【００４４】
幾つかの実施形態において、ＭＶＰ及びボルト関連タンパク質の少なくとも１つはアミノ酸変異を含み、例えばアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、またはリジン（Ｌｙｓ，Ｋ）の電荷側鎖を有する、アミノ酸へ野性型アミノ酸が変異することを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、例えばアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、またはリジン（Ｌｙｓ，Ｋ）の電荷側鎖基を有する１つ以上のアミノ酸は内側対向面に挿入される。幾つかの実施形態において、変異及び／または挿入は、操作された領域において、局所的で、空間的にクラスター化された負電荷を結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、変異及び／または挿入は、操作された領域において、局所的で、空間的にクラスター化された正電荷を結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、負電荷の操作された領域と非共有結合で結合する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、正電荷の操作された領域と非共有結合で結合する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はタンパク質またはペプチドの分子である。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は小分子である。
【００４５】
幾つかの実施形態において、ＭＶＰ及びボルト関連タンパク質の少なくとも１つは、アミノ酸変異を含み、例えばアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、またはバリン（Ｖａｌ，Ｖ）の、疎水性側鎖を有するアミノ酸へのアミノ酸の変異を結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、例えばアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、またはバリン（Ｖａｌ，Ｖ）の疎水性側鎖基を有する１つ以上のアミノ酸が、内側対向面に挿入される。幾つかの実施形態において、変異及び／または挿入は局所的、空間的にクラスター化された疎水性パッチを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、操作された疎水性パッチと非共有結合で結合する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はタンパク質またはペプチドの分子である。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は小分子である。
【００４６】
幾つかの実施形態において、ＭＶＰ及びボルト関連タンパク質の少なくとも１つは、アミノ酸変異を含み、例えばアスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）の極性側鎖を有するアミノ酸へのアミノ酸の変異を結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、例えばアスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）の極性側鎖基を有する１つ以上のアミノ酸が、内側対向面に挿入される。幾つかの実施形態において、変異及び／または挿入は、水素結合可能な局所的で、空間的にクラスター化された極性パッチを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、操作された極性パッチと非共有結合で結合する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子はタンパク質またはペプチドの分子である。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は小分子である。
【００４７】
幾つかの例において、本明細書に開示されたボルト粒子は、ボルト粒子の内部にパッセンジャー分子の非共有結合に結果として生じるボルト粒子の内部における少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。非共有結合は静電的相互作用を介して生じる場合がある。非共有結合は疎水的相互作用を介して生じる場合がある。非共有結合は極性相互作用を介して生じる場合がある。変異は特異的アミノ酸配列を含む場合がある。変異は非特異的アミノ酸配列を含む場合がある。その変異は、本明細書に記載されているモチーフあるいはドメインの変異を含む場合がある。
【００４８】
アミノ酸配列、モチーフ及びドメインは、静電的相互作用、疎水的相互作用及び極性相互作用の少なくとも１つを介して、核酸、タンパク質あるいは小分子などのパッセンジャー分子が、特異的にあるいは非特異的に結合することを可能にする変異を含む場合がある。制限しない例を経由して、例えばアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）の正電荷側鎖基を有するアミノ酸間の静電的相互作用は、ペプチドまたはタンパク質内でみられる、例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）の負電荷側鎖基を有する核酸及びアミノ酸内でみられるリン酸基などの負電荷分子との結合を促進する場合がある。同様に、例えばアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）及びバリン（Ｖａｌ，Ｖ）の疎水性アミノ酸間の疎水的相互作用は、核酸内で見られる疎水性窒素塩基、疎水性小分子、及びパッセンジャー分子のタンパク質及びペプチド内の補足的な疎水性アミノ酸への結合を促進する場合がある。電荷アミノ酸間と同じように、例えばアスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）、及びチロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）の極性アミノ酸間の水素結合に通じる極性相互作用は、核酸などのパッセンジャー分子における窒素塩基、極性小分子及び、タンパク質並びにペプチド中の他の極性アミノ酸への結合を促進する場合がある。
【００４９】
幾つかの例において、アミノ酸変異を、内部ボルト粒子の空洞に面するループ上に位置する。幾つかの例において、アミノ酸変異を、内部ボルト粒子窪みに面する側鎖に位置する。本明細書に記載されているそれらなどの結晶構造をベースとした、内部ボルト粒子の空洞に面するループ及び側鎖は、パッセンジャー分子を結合するための離散性の領域あるいはパッチを作るための、荷電、疎水性あるいは極性アミノ酸の変異あるいは挿入において重要な場所である場合がある（図１０Ａ）。幾つかの例において、２つ以上のアミノ酸変異が空間的に隣接する。幾つかの例において、２つ以上のアミノ酸変異が連続して隣接する。幾つかの例において、ある場所は、パッセンジャー分子を固定するための結合の強度を単独では有しない場合がある。幾つかの例において、１つのアミノ酸変異は、パッセンジャー分子を固定するための結合の強度を単独では有しない場合がある。幾つかの例において、場所の組み合わせはパッセンジャー分子を固定するための結合力がある。幾つかの例において、アミノ酸変異の結果として生じるアミノ酸の組み合わせは、パッセンジャー分子を固定する結合力を有する。幾つかの例において、ＭＶＰの鎖は複数のアミノ酸変異を含む。幾つかの例において、図１０Ａによって例証されるように、ＭＶＰ鎖の各々はアミノ酸変異を含む。パッセンジャー分子は、ボルト構造全体（図１０Ｂ）を通じてボルト粒子の内部空洞に十分に「取り付けられる（ｔａｃｋｅｄ）」ようになる場合がある。
【００５０】
幾つかの例において、本明細書に開示されたボルト粒子は、ＭＶＰのタンパク質の殻、及びＭＶＰのショルダードメイン内において挿入されたペプチドを含む。幾つかの例において、ショルダードメインは、細胞上に発現したレセプタまたはリガンドに特異的結合ができる操作されたショルダードメインである。幾つかの例において、ショルダードメインは細胞上に発現しないレセプタまたはリガンドに結合ができる。
【００５１】
幾つかの例において、アミノ酸変異は主なボルトタンパク質の外部に面するドメイン上に存在し、外部に面するドメインはショルダードメインである。幾つかの例において、より硬質なドメインを囲むことと比較して、外部に面するドメインは可撓性がある。幾つかの例において、より硬質なドメインは、アルファヘリックスまたはβストランドなどの少なくとも１つの第２の蛋白質構造を含む。幾つかの例において、より硬質なドメインは、アルファヘリックスまたはβストランドなどの少なくとも１つの第３の蛋白質構造を含む。幾つかの例において、可撓性のあるドメインはループ領域を含む。幾つかの例において、可撓性のあるドメインは第２または第３の蛋白質構造を含まない。非限定的な例によって、ラットボルト粒子の結晶構造は、外部に面する領域がショルダードメイン内に存在し、Ｍｅｔ６０８からＰｒｏ６２０まで延びることを明らかにし、この構造は解明されていない（図１１Ａ）。この領域の非体系的性質は、鎖に可撓性があり、並びに特定の細胞に対しボルト粒子を標的化するためのペプチドを挿入する機会を与える介在配列への付加、あるいは完全な置換に適合する場合があることを示す。ショルダードメインの可動部にペプチドを挿入することによって、ペプチドは可動部の側面を守るアミノ酸によってつなぎ留められる場合があり、アルファヘリックス及びβストランドの形成によって組立てられる（図１１Ａ参照）。加えて、ショルダードメイン中へのペプチドの挿入は、キャップリングにて１５７Åの最大周囲に対立するように、約１２５６．６Åの周囲に沿ったペプチドを平等に分配する場合があり、より多くを標的細胞に対して利用可能にする。
【００５２】
ボルト関連タンパク質
概して、本明細書に開示される組成物はボルト粒子及びボルト関連タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質は、ボルト関連タンパク質と主なボルトタンパク質との間の相互作用ためのもたらす主なボルトタンパク質相互作用ドメインを含む。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はポリアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）−リボースポリメラーゼを含む（本明細書では「ＰＡＲＰ」として参照される）。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質は、ＰＡＲＰから根本的には成る。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰはＰＡＲＰ４であり、またボルトＰＡＲＰ（ＶＰＡＲＰ）として分野に公知である。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はアルギニン特異的ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＴ）を含む。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質は、ＡＲＴから根本的には成る。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼファミリーの員を含む。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はグリコシル移転酵素を含む。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質は脂肪酸シンターゼを含む。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はファルネシルトランスフェラーゼを含む。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はポリマーの形成を触媒する酵素である。幾つかの実施形態において、酵素は、ボルト粒子によって受動的に被包される。幾つかの実施形態において、酵素は、インビトロ無細胞タンパク質発現系におけるボルト組立中に受動的に被包される。幾つかの実施形態において、酵素は、インビトロ無細胞タンパク質発現系におけるボルト組立の後にボルトに関連する。幾つかの実施形態において、酵素は、細胞ベースのタンパク質発現系においてボルト組立の後にボルトに関連する。幾つかの実施形態において、酵素はＰＡＲＰ４のｍＩＮＴ領域へ接着される。各酵素については、異なる基質は必要でありしたがって、結果として生じるマトリックスは、酵素と基質に依存する場合がある。
【００５３】
幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰタンパク質は、ＰＡＲＰのためのアミノ酸配列順序を含む。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰタンパク質は、ＰＡＲＰのためのアミノ酸配列順序から本質的に成る。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰタンパク質は、ＰＡＲＰ４のためのアミノ酸配列順序を含む。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＰＡＲＰ４のためのアミノ酸配列順序から本質的に成る。当業者は、集団変異により、ＰＡＲＰ４のための多くのアミノ酸配列順序があると理解する。しかしながら、ＰＡＲＰ４タンパク質の制限しない例は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＰ＿０１１５３３２３３．１、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＰ＿０１１５３３２３４．１及びＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００６４２８．２である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２は表１参照）。
【００５４】
幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ番号：２によって表わされる。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２に少なくとも約９５％相同する配列により表される。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２に少なくとも約９０％相同する配列により表される幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２に少なくとも約８５％相同する配列により表される。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２に少なくとも約８０％相同する配列により表される幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２に少なくとも約７５％相同する配列により表される。
【００５５】
幾つかの実施形態では、ＰＡＲＰ４タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１によってコード化される（表１を参照）。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１に少なくとも約９５％相同する配列によりコードされる。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１に少なくとも約９０％相同する配列によりコードされる。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１に少なくとも約８５％相同する配列によりコードされる。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１に少なくとも約８０％相同する配列によりコードされる。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１に少なくとも約７５％相同する配列によりコードされる。
【００５６】
幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰタンパク質は、ＰＡＲＰのための野性型アミノ酸配列から修飾アミノ酸配列を含む修飾ＰＡＲＰタンパク質を含む。幾つかの実施形態において、修飾ＰＡＲＰタンパク質はＰＡＲＰの操作された変異体と本明細書において呼ばれる。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰタンパク質は、ＰＡＲＰの１つ以上の領域または１つ以上のモチーフ中の少なくとも１つの修飾アミノ酸を包含する。幾つかの実施形態において、ドメインあるいはモチーフはリンペプチド結合モジュール（ＢＲＣＴ）、ＰＡＲＰ触媒ドメイン、ボルトタンパク質アルファ間トリプシン（ＶＩＴ）ドメイン、フォンウィルブランド（ｖＷＡ）ドメイン、核移行シグナル（ＮＬＳ）及び主要ボルトタンパク質相互作用（ｍＩＮＴ）ドメインから選択される。蛋白質配列を修飾する方法は、当技術において公知であり、タンパク質配列をコード化する核酸を修飾する工程を含む。幾つかの実施形態において、修飾ＰＡＲＰタンパク質は、未修飾ＰＡＲＰタンパク質によって遂行された少なくとも１つの活性を遂行することができる。幾つかの実施形態において、修飾ＰＡＲＰタンパク質は、未修飾ＰＡＲＰタンパク質よりも良好に少なくとも１つの活性を遂行することができる。幾つかの実施形態において、修飾ＰＡＲＰタンパク質は、未修飾ＰＡＲＰタンパク質と同じように少なくとも１つの活性を遂行することができない。
【００５７】
幾つかの実施形態において、修飾ＰＡＲＰタンパク質は、未修飾ＰＡＲＰタンパク質に関する少なくとも１つのアミノ酸欠失を含む。幾つかの実施形態において、修飾ＰＡＲＰタンパク質は、未修飾ＰＡＲＰタンパク質に関する少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む。幾つかの実施形態において、修飾ＰＡＲＰタンパク質は、未修飾ＰＡＲＰタンパク質に関する少なくとも１つのアミノ酸の付加を含む。
【００５８】
幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はテロメラーゼ関連タンパク質である。幾つかの実施形態において、テロメラーゼ関連タンパク質はテロメラーゼ関連タンパク質１（ＴＥＰ１）である。
【００５９】
幾つかの実施形態において、組成物はボルト粒子、テロメラーゼ関連タンパク質及びＰＡＲＰを含む。幾つかの実施形態において、組成物はボルト粒子、ＴＥＰ１及びＰＡＲＰ４を含む。
【００６０】
付加的なボルト成分
本明細書に開示された組成物は、主要ボルトタンパク質及びボルト関連タンパク質を越える付加のボルト成分を含む場合がある。幾つかの実施形態において、ボルト粒子はノンコーディングボルトリボ核酸（ｖｔＲＮＡ）を含む。ｖｔＲＮＡは、分野においてそれらによってよく記載されている。簡潔に、ｖｔＲＮＡは、通常長さ約８０から約１５０の塩基を有し、起源の種類による。ヒトｖｔＲＮＡの制限しない例はｈｖｇ１（９８塩基）、ｈｖｇ２（８８塩基）及びｈｖｇ３（８８塩基）を含む。ｖｔＲＮＡｓは、アーチ、空洞のバレル状のフレームワーク、及びステムループから選択されるが、制限されない二次構造を有する。ステムループは、ｖｔＲＮＡの５’及び３’末端を接続する場合がある。したがって、ｖｔＲＮＡｓはｓｉＲＮＡ活性ができる。
【００６１】
幾つかの実施形態において、ボルト粒子はＡＤＰ−リボースマトリックスを含む。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスはＡＤＰ−リボースモノマーから成り、各モノマーは約０．６ｎｍ３から約１．５ｎｍ３のおよその体積を占める。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスは、線状の様式におけるＡＤＰ−リボースの付加によって形成されたポリマーから成る。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスは、線状並びに枝分かれした様式におけるＡＤＰ−リボースの付加によって形成されたポリマーから成る。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスはＡＤＰ−リボースモノマーと線形及び／または枝分かれしたＡＤＰ−リボースポリマーとの組み合わせから成る。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスは約１，０００から約５５，０００のＡＤＰ−リボースモノマーと線形及び／または枝分かれしたＡＤＰ−リボースポリマーとの組み合わせから成る。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスは約１，０００から約５，０００のＡＤＰ−リボースモノマーと線形及び／または枝分かれしたＡＤＰ−リボースポリマーとの組み合わせから成る。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスは約５，０００から約１０，０００のＡＤＰ−リボースモノマーと線形及び／または枝分かれしたＡＤＰ−リボースポリマーとの組み合わせから成る。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスは約１０，０００から約５０，０００のＡＤＰ−リボースモノマーと線形及び／または枝分かれしたＡＤＰ−リボースポリマーとの組み合わせから成る。図８は、典型的な線状の及び／または枝分かれしたＡＤＰ−リボースポリマーを例証する。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスは、ＡＤＰ−リボースモノマー及び／またはポリマーの密マトリックスを産生するために、ボルト粒子と酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）が接触することにより形成される。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックスは、ボルト粒子とＮＡＤ＋のアナログが接触することにより形成される。ＮＡＤ＋のアナログの非限定的な例は次の酸化形式を含む：ニコチン酸アミド１、Ｎ６エテノアデニンジヌクレオチド、ニコチン酸アミドグアニンジヌクレオチド、ニコチン酸アミドヒポキサンチンジヌクレオチド及びニコチン酸アミドヒポキサンチンジヌクレオチド。
【００６２】
幾つかの実施形態において、組成物は、ＡＤＰ−リボシル化のための受容部位を含む。幾つかの実施形態において、受容部位は目的のパッセンジャー分子に位置づけられる。幾つかの実施形態において、受容部位は賦形剤パッセンジャー分子（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に位置付けられる。幾つかの実施形態において、受容部位はＮＡＤ＋またはＮＡＤ＋アナログである。幾つかの実施形態において、受容部位はＭＶＰに位置付けられる。幾つかの実施形態において、受容部位はボルト関連タンパク質に位置付けられる。幾つかの実施形態において、受容部位はＰＡＲＰ４に位置付けられ、ＰＡＲＰ４は、組成物のボルト粒子に関連する。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４はＰＡＲＰ４の操作された変異体である。
【００６３】
幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、ＡＤＰ−リボースのための受容部位を含む。幾つかの実施形態において、方法はＡＤＰ−リボースのための受容部位を有する賦形剤分子（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を備えるボルト粒子のボルトタンパク質と接触する工程を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子のボルトタンパク質は、ＡＤＰ−リボースのための受容体を含む。
【００６４】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、マトリックス形成及び安定性を強化するために補助因子を含む。補助因子の非限定的な例は、カルシウム、または他の多価カチオン及びＡＴＰを含む。幾つかの実施形態において、組成物は脂質（パッセンジャー分子としてでなく）を含み、脂質は、ボルトの物理的機械的性質を変化する。
【００６５】
パッセンジャー分子
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される組成物はパッセンジャー分子を含む。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、ボルトの空洞の内のＡＤＰ−リボースマトリックス内に捕捉される。幾つかの実施形態において、もしそれが捕捉されなければ、パッセンジャー分子は容易にボルト粒子から拡散する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は大きすぎてボルト粒子の空洞から拡散することができない。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は大きすぎて、ボルトの空洞内のＡＤＰ−リボースマトリックスから拡散することができない。
【００６６】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、ＰＡＲＰタンパク質、ＡＤＰ−リボースマトリックス、及びボルト空洞内で保持できるほどに大きいパッセンジャー分子を含む（例えば、大きすぎてボルト複合体から拡散できない）。幾つかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、ＰＡＲＰタンパク質、ＡＤＰ−リボースマトリックス、及びＡＤＰ−リボースマトリックスによって空洞内に補足されるパッセンジャー分子を含む。
【００６７】
パッセンジャー分子の非限定的な例はペプチド（通常１００未満のアミノ酸）、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、小分子（９００ダルトンより概して少ない分子）及び医薬品有効成分を含む。幾つかの実施形態において、パッセンジャー分子は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、小分子、医薬品有効成分及びその組み合わせから選択される。
【００６８】
パッセンジャー分子は約１００ダルトンから約１０メガダルトンの間の分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約１００ダルトンから約９００ダルトンの間の分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約１００ダルトンから約９００ダルトンの間の分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約１００ダルトンから約９０，０００ダルトンの間の分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約１０００ダルトン未満である分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約９００ダルトン未満である分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約８００ダルトン未満である分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約７００ダルトン未満である分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約６００ドルトン未満である分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約５００ダルトン未満である分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約９００ダルトンより大きい分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約５００ダルトンより大きい分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約９００ダルトンより大きい分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約１０００ダルトンより大きい分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約１２００ダルトンより大きい分子量を有してもよい。パッセンジャー分子は約１５００ダルトンより大きい分子量を有してもよい。
【００６９】
ボルト粒子状物質を産生する方法
ボルト粒子を産生する方法が本明細書に提供され、方法は、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子のＡＤＰ−リボシル化を含み、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子を固定するＡＤＰ−リボースマトリックスを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子のＡＤＰ−リボシル化は、インビトロ無細胞タンパク質発現系におけるボルト粒子の合成の後に生じる。幾つかの実施形態において、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子のＡＤＰ−リボシル化は、細胞ベースタンパク質発現系におけるボルト粒子の合成の後に生じる。
【００７０】
幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボシル化はＰＡＲＰによって触媒される。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボシル化はＰＡＲＰ４によって触媒される。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボシル化はＡＲＴによって触媒される。幾つかの実施形態において、方法は、ＡＤＰ−リボシル化のための基質としてＮＡＤ＋またはＮＡＤ＋アナログの使用を含む。本明細書に開示される方法はさらに「反応」と呼ばれる場合がある。
【００７１】
幾つかの実施形態において、方法はＡＤＰ−リボースモノマー及び／またはポリマーの密マトリックスを作成するためにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）またはＮＡＤ＋アナログ、酵素ＰＡＲＰ４または操作されたＰＡＲＰ４変異体をインキュベートすることにより、パッセンジャー分子を固定する工程を含む。
【００７２】
幾つかの実施形態において、方法は、ＡＤＰ−リボースを有する標識パッセンジャー分子（ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、基質ＮＡＤ＋またはＮＡＤ＋アナログ由来且つＰＡＲＰ４酵素または操作されたＰＡＲＰ４変異体によって触媒されたモノマー及び／またはポリマーを含む。
【００７３】
幾つかの実施形態において、方法はボルト粒子を産生する間にボルト中でパッセンジャー分子を囲む工程を含む。幾つかの実施形態において、方法はボルト粒子を産生した後にボルト中でパッセンジャー分子を囲む工程を含む。
【００７４】
幾つかの実施形態において、方法は、ボルト粒子内に包含されている基質またはパッセンジャーの分子（例えばＮＡＤ＋）の付加に先立って、ボルトを有するボルト関連タンパク質をインキュベートする工程を含む。幾つかの実施形態において、ＰＡＲＰ４あるいは操作されたＰＡＲＰ４変異体は、基質が付加される前に、パッセンジャー分子を包含するボルトでインキュベートされる。
【００７５】
幾つかの実施形態において、
方法は、約０．１μＭから約２０ｍＭの基質（例えばＮＡＤ＋、またはそのアナログ）をボルト関連タンパク質に付加する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、約０．１μＭから約１μＭの基質をボルト関連タンパク質に付加する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、約１μＭから約１０μＭの基質をボルト関連タンパク質に付加する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、約１０μＭから約１００μＭの基質をボルト関連タンパク質に付加する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、約０．１ｍＭから約１ｍＭの基質をボルト関連タンパク質に付加する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、約１ｍＭから約１０ｍＭの基質をボルト関連タンパク質に付加する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、約１０ｍＭから約２０ｍＭの基質をボルト関連タンパク質に付加する工程を含む。
【００７６】
幾つかの実施形態において、反応は持続時間を有する。持続時間は、基質が、ＡＤＰ−リボースマトリックスが形成される時間までボルト関連タンパク質に付加される時間として定義される場合がある。持続時間は、基質が、ＡＤＰ−リボースマトリックスが形成される時間までボルト関連タンパク質に付加される時間として定義される場合があり、形成されたＡＤＰ−リボースマトリックスは選択特性（例えば密度、圧縮強度、安定性、帯電性）を有する。幾つかの実施形態において、持続時間は約５分から約２４時間である。幾つかの実施形態において、持続時間は約５分から約１０分である。幾つかの実施形態において、持続時間は約５分から約３０分である。幾つかの実施形態において、持続時間は約３０分から約１時間である。幾つかの実施形態において、持続時間は約１時間から約４時間である。幾つかの実施形態において、持続時間は約４時間から約８時間である。幾つかの実施形態において、持続時間は約８時間から約１２時間である。幾つかの実施形態において、持続時間は約１２時間から約１８時間である。幾つかの実施形態において、持続時間は約１８時間から約２４時間である。
【００７７】
幾つかの実施形態において、方法はボルト関連タンパク質、ボルト、及び緩衝液中の基質をインキュベートする工程を含む。緩衝液はトリス緩衝液であってもよい。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約１０ｍＭから約１００ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約１０ｍＭから約２０ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約２０ｍＭから約３０ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約３０ｍＭから約４０ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約４０ｍＭから約５０ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約５０ｍＭから約６０ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約６０ｍＭから約７０ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約７０ｍＭから約８０ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約８０ｍＭから約９０ｍＭである。幾つかの実施形態において、緩衝液中のトリス緩衝液の濃度は約９０ｍＭから約１００ｍＭである。
【００７８】
幾つかの実施形態において、反応は約２０℃から約３７℃で生じる。幾つかの実施形態において、反応は約２０℃で生じる。幾つかの実施形態において、反応は約２５℃で生じる。幾つかの実施形態において、反応は約３７℃で生じる。
【００７９】
幾つかの実施形態において、ボルト粒子はインビトロ無細胞タンパク質発現系を使用して合成される。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は細胞ベースのタンパク質発現系において合成される。
【００８０】
さらに本明細書に提供されるのは、ボルトに囲まれたパッセンジャー分子のＡＤＰ−リボシル化のための方法であり、ＡＤＰ−リボシル化は、ボルト関連タンパク質よって触媒され、及びパッセンジャー分子を捕捉するＡＤＰ−リボースマトリックスを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はＰＡＲＰである。幾つかの実施形態において、ボルト関連タンパク質はＰＡＲＰ４またはＰＡＲＰ４の操作された変異体である。
【００８１】
幾つかの実施形態において、方法はボルト粒子の物理的機械的性質を変化する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、ボルト粒子の物理的機械的性質を変化するためにＣａ２＋またはＡＴＰなどの補助因子を付加する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、ボルト粒子の物理的機械的性質を変更するために脂質分子を付加する工程を含む。
【００８２】
幾つかの実施形態において、（ＡＤＰ−リボシル化に起因する）ＡＤＰ−リボースモノマー及び／またはポリマーの産生は、ボルト粒子の含有量の密度を変化させる。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースモノマー及び／またはポリマーの付加は、ボルト粒子の帯電性を変化させる。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースモノマー及び／またはポリマーの付加は、圧縮に対してボルト粒子を強化する。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースモノマー及び／またはポリマーの付加は、ボルト粒子を安定させる。幾つかの実施形態において、カルシウムイオン、または他の多価カチオン、及び／またはＡＴＰは、マトリックス形成及び安定性を強化するための補助因子として作用する。幾つかの実施形態において、脂質はボルトの物理的機械的性質を変化するために付加される。幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックス中のパッセンジャー分子の固定は、細胞へのそれらの送達を強化する。
【００８３】
幾つかの実施形態において、ＡＤＰ−リボースマトリックス中のパッセンジャー分子の固定は、細胞の核へのそれらの送達を強化する。ボルト内のＡＤＰ−リボースマトリックスは、細胞へ囲まれたパッセンジャー分子を送達することにおいて重要な役割を果たす場合がある。ＡＤＰ−リボースマトリックスは、ボルト内部からのパッセンジャー分子の核輸送を促進する場合がある。核膜孔を有するボルトの関連は、ボルトキャップの開口を誘発する場合があり、及び、細胞質と核との間の浸透圧の差は、その含有量を有するＡＤＰ−リボースマトリックスのボルト粒子から核内中への排出を誘発する場合がある。
【００８４】
幾つかの実施形態において、方法は、例えば図１Ａを参照するように、パッセンジャー分子をボルト粒子のカルボキシル末端へ融合させる工程を含み、ボルトのキャップとも指される。幾つかの実施形態において、方法は、例えば図Ｂを参照するように、パッセンジャー分子をボルトナノ粒子のアミノ末端へ融合させる工程を含み、ボルトのウエストとも指される。
【００８５】
ボルト粒子を生む方法が本明細書に提供され、方法は配列及び構造分析、部位特異的変異誘発、及びクローニングを含み、多数の非共有結合領域を包含する操作されたボルトを結果として生じる。幾つかの実施形態において、操作されたボルト粒子は、インビトロ無細胞タンパク質発現系において合成される。幾つかの実施形態において、操作されたボルト粒子は、細胞ベースタンパク質発現系において合成される。
【００８６】
幾つかの実施形態において、内部に面するループ及び鎖は１つ以上の電荷あるいは疎水性または極性アミノ酸を包含し、及び、付加の類似のアミノ酸は隣接した配列または空間的に隣接したアミノ酸の突然変異によって導入される。幾つかの実施形態において、内部に面するループ及び鎖は１つ以上の電荷あるいは疎水性または極性アミノ酸を包含せず、及び、付加の類似のアミノ酸は隣接した配列または空間的に隣接したアミノ酸の突然変異によって導入される。
【００８７】
幾つかの実施形態において、内部に面するループ及び鎖は１つ以上の電荷あるいは疎水性または極性アミノ酸を包含し、及び、付加の類似のアミノ酸は隣接した配列または空間的に隣接したアミノ酸の挿入によって導入される。幾つかの実施形態において、内部に面するループ及び鎖は１つ以上の電荷あるいは疎水性または極性アミノ酸を包含せず、及び、付加の類似のアミノ酸は隣接した配列または空間的に隣接したアミノ酸の挿入によって導入される。幾つかの実施形態において、約１から１０のアミノ酸が挿入される。幾つかの実施形態において、約１０から５０のアミノ酸が挿入される。幾つかの実施形態において、約５０から１００のアミノ酸が挿入される。幾つかの実施形態において、約１００から２００のアミノ酸が挿入される。幾つかの実施形態において、約２００から３００のアミノ酸が挿入される。
【００８８】
幾つかの実施形態において、ショルダー領域の非体系的な領域に挿入されたアミノ酸配列順序は受容体結合ペプチドを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ショルダー領域の非体系的な領域に挿入されたアミノ酸配列順序はリガンド結合ペプチドを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ショルダー領域の非体系的な領域に挿入されたアミノ酸配列順序は細胞によって発現された受容体を結合する受容体結合ペプチドを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ショルダー領域の非体系的な領域に挿入されたアミノ酸配列順序は細胞によって発現されたリガンドを結合するリガンド結合ペプチドを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ショルダー領域の非体系的な領域に挿入されたアミノ酸配列順序は細胞によって発現されない受容体を結合する受容体結合ペプチドを結果としてもたらす。幾つかの実施形態において、ショルダー領域の非体系的な領域に挿入されたアミノ酸配列順序は細胞によって発現されないリガンドを結合するリガンド結合ペプチドを結果としてもたらす。
【００８９】
幾つかの実施形態において、挿入ペプチドは、約２から約１０のアミノ酸から成る。幾つかの実施形態において、挿入されたペプチドは、約１０から約５０のアミノ酸からなる。幾つかの実施形態において、挿入されたペプチドは、約５０から約１００のアミノ酸からなる。
幾つかの実施形態において、挿入されたペプチドは、約１００から約２００のアミノ酸からなる。幾つかの実施形態において、挿入されたペプチドは、約２００から約５００のアミノ酸からなる。幾つかの実施形態において、ショルダー領域の非体系的な領域内のアミノ酸は保持される。幾つかの実施形態において、ショルダー領域の非体系的な領域内のアミノ酸は取り除かれる。
【００９０】
ボルト粒子状物質の用途及び処置方法
本明細書に提供されるのは、細胞にボルト粒子を送達する工程を含む方法であり、ボルト粒子は、ＡＤＰ−リボースのマトリックス内に囲まれ固定されたパッセンジャー分子を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は細胞の核に局所化する。さらに本明細書に提供されるのは、その必要性のある被験体の状態を処置する方法であり、被験体へボルト粒子を投与する工程を含む。幾つかの例において、ボルト粒子は、ＡＤＰ−リボースのマトリックス内に囲まれ固定されたパッセンジャー分子を含む。幾つかの例において、ボルト粒子は、ボルト空洞の内側表面に非共有結合で結合された、囲まれたパッセンジャー分子を含む。
【００９１】
幾つかの実施形態において、細胞または被験体は疾病または症状に影響される。疾患と症状の制限しない例は、自己免疫疾患（例えば関節炎）、代謝病（例えば糖尿病、心疾患）、神経性の疾病（例えばアルツハイマ−病、パ−キンソン病、多発性硬化症）及び癌（例えば固形腫瘍、白血病）である。
【００９２】
幾つかの実施形態において、細胞は癌細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は癌に影響される。幾つかの実施形態において、細胞は癌による遺伝子突然変異を含む。幾つかの実施形態において、癌細胞は癌から生じる。
【００９３】
幾つかの例において、方法は、細胞へボルト粒子送達する工程を含み、ボルト粒子は１つ以上の操作された領域を含み、操作された領域は、粒子のボルト粒子タンパク質の領域へ変異を導入する工程により達成され、変異は、領域の非共有結合特性を増加させる。非共有結合特性の非限定的な例は、静電的相互作用、疎水的相互作用及び極性相互作用である。
【００９４】
幾つかの例において、方法は細胞にボルト粒子を送達する工程を含む、そこでは、ボルト粒子は、主なボルトタンパク質のショルダー領域の非体系的な領域において挿入された主なボルトタンパク質及びペプチドを含む。幾つかの実施形態において、ペプチドは操作されていないペプチドである。幾つかの実施形態において、ペプチドは操作されたペプチドである。幾つかの実施形態では、治療用ペプチドは合成物質である。幾つかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも配位子への類似性がある受容体の一部である。幾つかの実施形態において、ペプチドは、受容体に対して類似性があるリガンドの少なくとも一部である。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は、受容体またはリガンドからの操作されたペプチドを含み、及びパッセンジャー分子を含む。幾つかの実施形態において、ボルト粒子は細胞の核に局所化する。
【００９５】
【表１−１】
2021506733.tif 000003
【００９６】
【表１−２】
2021506733.tif 000004
【００９７】
【表１−３】
2021506733.tif 000005
【実施例】
【００９８】
本開示の好ましい実施形態が本明細書中に示される一方、そのような実施形態が一例としてしか提供されていないことは当業者にとって明白だろう。多くの変更、変化及び置換が、本開示から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用され得ることを理解されたい。
【００９９】
実施例１．ＡＤＰ−リボシル化による分子の固定
ボルトに囲まれたパッセンジャー分子のＡＤＰ−リボシル化を達成するために、ボルトは、インビトロ無細胞タンパク質発現系または細胞ベースタンパク質発現系のいずれかを使用して合成される。ボルトに、合成の間、大パッセンジャー分子で受動的に負荷をかける（図５Ａを参照）。代替的にまたは付加的に、ボルト中に容易に拡散することができる小パッセンジャー分子（ｓｍａｌｌ  ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を合成の後に負荷する（図５Ｂを参照）。ＡＤＰ−リボシル化を、ボルト合成の間に、または完了ボルトにＰＡＲＰ４または操作されたＰＡＲＰ４変異体を付加し、並びに基質、ＮＡＤ＋及び受容体分子の存在下においてボルトをインキュベートすることにより実行する。細胞ベース系において生産されたボルトは、特定の適用における目的の場合がある産生細胞からの細胞質分子のプロフィ−ルを包含し、加えて、ボルト合成を完了した後に小パッセンジャー分子を提供する場合がある。ＡＤＰ−リボシル化起こすために、ＰＡＲＰ４または操作されたＰＡＲＰ４変異体を精製の前後にボルトに付加し、次にＮＡＤ＋の存在下においてインキュベートする。
【０１００】
目的のパッセンジャー分子は、ＡＤＰ−リボシル化のための受容部位を天然に包含する。代替的に、パッセンジャー分子は受容部位を包含せず、及び、不活性分子、あるいは賦形剤を目的の分子に加えて付加する。代替的に、ボルトタンパク質は受容部位を包含する。
【０１０１】
実施例２．ボルト粒子状物質の物理的機械的性質の変更
ＡＤＰ−リボシル化を先に記載された方法（Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ，Ｓｉｖａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９年；Ｔｕｌｉｎ，２０１１年）に基づいて実行する。無細胞または細胞ベースタンパク質発現系に置いて合成された、ヒトＰＡＲＰ４を有するまたはＰＡＲＰ４なしの１４μｇの精製ボルトに、の１５μｌＡＤＰ−リボシル化反応緩衝液（５０ｍＭのトリス＝ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのジチオスレイト−ル（ＤＴＴ）及び１μｌのタルトラジン（常水中４０ｍｇ／ｍｌのＴＣＩケミカルズからの小分子（５３３ダルトン））を加える。反応を１μｌの基質ＮＡＤ＋（常水中の７５．３６ｍＭのＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の追加によって発生させ、１５−６０分間室温でインキュベートした。物理的機械的性質の変化を在来のアガロースゲル電気泳動によって測定した。完了した反応を、６Ｘグリセロールブロモフェノールブルーローディングダイと混合し、０．７％のアガロースートリスホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ゲルのそれぞれのウェルに塗布し、電圧をかける。電気泳動度をクマシ−のブル−の染色及びＬＩ−ＣＯＲ画像化によって視覚化する。ＰＡＲＰ４を包含し、タルトラジン及びＮＡＤ＋でインキュベートされたボルトは、ＰＡＲＰ４なしのボルトよりアガロースゲルを介してより速く遊走した。アガロースゲル電気泳動が電荷（図６Ｂを参照）に基づいた分子を分離すると、ＡＤＰ−リボースマトリックスを包含するボルトはより負電荷され、よってより速く遊走する。
【０１０２】
静電的荷電の定量測定をｑＮＡＮＯ  ＧＯＬＤ（（Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、クライストチャ−チ、ニュージーランド）を使用して、ゼ−タ電位として測定する。
【０１０３】
ボルト被包タルトラジンをアガロ−スからボルトバンドを抽出することにより定量化し、タルトラジンでは４２７ｎｍで、及びタンパク質では２８０ｎｍで吸収率を測定する。タルトラジンの濃縮を、タルトラジン標準曲線を使用して測定し、ＰＡＲＰ４有り及びなしの反応とＮＡＤ＋有り及び無しの反応間で比較する。
【０１０４】
実施例３．変更されたボルト粒子状物質の物理的機械的性質の査定
ボルト粒子内においてＡＤＰ−リボースマトリックス（例えば例１における記載されていたように）によって与えられた圧縮強度を査定するために、酢酸ウラニル着色及び電子顕微鏡検査が使用される。ボルト粒子内のＡＤＰリボシル化は、ＰＡＲＰ４を有するまたは有さない１０−１５μｇのボルト、１μｌのタルトラジン（ＴＣＩケミカルズ、常水中４０ｍｇ／ｍｌ）、１５μｌの  ＡＤＰリボシル化反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのジチオスレイト−ル（ＤＴＴ））において１μｌの基質ＮＡＤ＋（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、３．７５ｍＭ）と共に送達される。反応を室温で３０分間インキュベートした。ボルトをアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出によって精製する。精製ボルトを、４℃で１分間、炭素被膜穴開フィルムグリッド上で吸収し、４℃で５間、１％の酢酸ウラニルで染色し、及び、結果として生じるグリッドを、濾紙上で乾かす。酢酸ウラニルに染色サンプルを、電子顕微鏡検査によって評価する。より大きな密度及び圧縮強度を有するボルト粒子状物質は、より滑らかな側面を有する卵形を示し（図７Ａ）、空のボルトまたはＡＤＰ−リボースマトリックスなしのボルトはより水平で、ウエストにおける陥入を明らかにしている（図７Ｂ）。
【０１０５】
実施例４．標的細胞核を有するボルト関連の査定
本明細書に開示されるボルトは、標的細胞の核と有利に関連する場合がある。これを実証するために、蛍光性分子Ｃｙ３カルボン酸であるトリスルホン酸を、ＮＡＤ＋の存在下において、ＰＡＲＰ４を包含するボルトでインキュベートする。インキュベートの後に、Ｃｙ３カルボン酸であるトリスルホン酸の固定は、アガロースゲル中の電気泳動度とｔｙｐｈｏｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇによって特性を明らかにされる。ボルトバンドはゲルから切り取られ溶離される。ゲル精製ボルトを、スライドガラス上で発達したヒト単球ＴＨＰ−１細胞、またはヒト上皮組織２９３Ｔ細胞、ヒト乳房上皮ＭＣＦ７細胞またはヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞でインキュベートする。３０分、１時間、２時間及び６時間後、細胞を洗浄し、染色し、パラホルムアルデヒドで固定した。共焦点レーザー顕微鏡を、Ｃｙ３カルボン酸であるトリスルホン酸分子の細胞内局在性を測定するために使用する。細胞下のコンパ−トメント、特に核、のＣｙ３の相対強度を、処置間で比較する。
【０１０６】
実施例５．遊離治療剤の効能をボルト送達治療剤との比較
ドキソルビシンを、本明細書に記載されたボルト粒子、及び記載されるように精製アガロースゲル内に固定する。固定されたドキソルビシンまたは遊離したドキソルビシンを包含するボルトを、ＭＣＦ７乳癌細胞に適用し、２、６及び２４時間インキュベートする。２及び６時間の後、細胞を共焦点レーザー顕微鏡のために調製する。細胞を、遊離したドキソルビシンまたはドキソルビシン固定ボルトを取り除くために燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、２％のパラホルムアルデヒドを用い室温で１５分間固定化し、ＰＢＳで２回洗浄し、及び室温で１０分間核染色法ヘキスト３３３４２（ＰＢＳにおける５μｇ／ｍｌ）を用いインキュベートした。ドキソルビシンの細胞下の位置を、４８８ｎｍの興奮でのドキソルビシン自己蛍光及び３５０ｎｍの興奮でのヘキスト３３３４２の発光によって視覚する。ボルトによって送達されたドキソルビシンは、ボルトが細胞薬物排出ポンプ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐｓ）からドキソルビシン分子を遮蔽すると、核により急速に入り込み、並びに遊離ドキソルビシンより高い核濃度に達する。２４時間後、ＭＴＴアッセイを細胞の生存率を測定するために使用する；ボルト粒子内のＡＤＰ−リボースマトリックス固定化ドキソルビシン（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を遊離ドキソルビシンと比較する。ボルトによって送達されたドキソルビシンは遊離ドキソルビシンより効果的である。
【０１０７】
実施例６．静電的相互作用による、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいは蛋白分子のパッケージ化
ラットＭＶＰの結晶構造（ＰＢＤ  ＩＤ：  ４Ｖ６０）及び他のＭＶＰの構造における内部ボルトキャビティ中でアクセス可能な電荷、疎水性及び／または極性分子を、座標公式デ−タベース（例えばＲＣＳＢ  ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）及び分子のビジュアル化ソフトウェア（例えばＰｙｍｏｌ、ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を使用して同定する。パッセンジャー分子の特性を基に、Ｉ−  ＩＩＩ領域内のアミノ酸（図１０Ａ）を変異し、または付加的なアミノ酸を、静電、疎水性、あるいは極性の特性で局所的な変化を産出するために挿入する。ＭＶＰ鎖／ボルト粒子の不適当な折畳を抑制するために、挿入が内部ループ内で最初に生じる。
【０１０８】
本明細書に記載されるように、パッセンジャー分子をボルト組立反応、あるいはボルト組立の後に付加する。パッセンジャー分子はプラスミドＤＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲプラスミド）、ＲＮＡ（例えばノンコーディングＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、タンパク質及びペプチドを含む。パッセンジャー分子のパッケージ化及び解放を標準分析法で測定する。
【０１０９】
実施例７．ショルダードメインにおけるペプチドリガンドを発現させるために操作されたボルト粒子の送達
乳がん、卵巣癌、及び前立腺癌を含む多くのタイプの癌において、ガストリン放出ペプチドレセプタ（ＧＲＰ−Ｒ）が過剰発現され、これはＧＲＰ−Ｒを療法と画像診断の両方にふさわしい標的にする。配列Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２を有するリガンドＧＲＰの８−アミノ酸ペプチドは、ＧＲＰ−Ｒに対する類似性を有することが発見された（Ａｃｃａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＪＮＭＭＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１６年１２月６日、１：１７）。ボルトをＧＰＲ−Ｒ過剰発現細胞へ標的化するために、８−アミノ酸ペプチドを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）によって、８つのアミノ酸によって領域を拡張するために、Ｇｌｙ６１３に続く非体系的ショルダー領域中へとクローニングした。発現ベクトルである、Ｇｌｙ６１３とＰｒｏ６１４との間のショルダー領域中のＡｆｅＩ制限部位（ＡＧＣＧＣＴ）で操作されたラット主要ボルトタンパク質（ＭＶＰ）配列を包含するｐＥＵ  Ｅ０１−ＭＣＳ（Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、横浜、日本）を、ＡｆｅＩで消化した（図１１Ｂ）。開放ベクタ−中へクローニングするＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）のための相同の配列によって側面を守られた８−アミノ酸ペプチドをコード化する補足的な５７量体のオリゴヌクレオチドを、挿入を作り出すためにハイブリッド形成する（順方向オリゴヌクレオチド、ＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＴＡＧＣＧＡＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＣＡＣＴＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣ、及び逆方向オリゴヌクレオチド（ＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＴＡＡＧＴＧＣＣＣＣＡＣＣＧＣＣＣＡＣＴＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＡＧ）。挿入を期間分析によって確認する。
【０１１０】
ボルト粒子を、ＷＥＰＲＯ（登録商標）７２４０コムギ麦芽抽出物及びＳＵＢＡＭＩＸ（登録商標）変換バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、横浜、日本）を使用して、インビトロ無細胞翻訳によって生産する。ＧＲＰボルトの組立をイムノゴ−ルド電子顕微鏡検査によって確認する。野生型（ＷＴ）あるいはＧＲＰボルトを、フォルムバ−ル（ｆｏｒｍｖａｒ）被膜ニッケルグリッドに吸着し、炭素に安定化する。グリッドを２度洗浄し、ブロッキングバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０−１００ｍＭのＮａＣｌ−１％ＢＳＡ）でブロックした。グリッドを、ウサギ抗ＧＲＰ、Ｃａｔ＃  ａｂ２２６２３（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）に適応し、ブロッキングバッファーにおいて１：２０に薄め、及び室温で１時間インキュベートし、その後２度洗浄した。グリッドを、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ−１０ｎｍ金、Ｃａｔ＃ａｂ２７２３４（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）に適用し、ブロッキングバッファーにおいて１：２０に薄め、及び室温で１時間インキュベートし、その後２度洗浄した。グリッドを１％の酢酸ウラニルで染色し、その後ＪＥＭ１２００ＥＸ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、東京、日本）を使用して、送信電子顕微鏡検査によって視覚化した（図１２Ａ）。
【０１１１】
特定の標的化（例えばＧＲＰ−Ｒ過剰発現細胞へ）を、ＧＲＰ−Ｒ発現ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞及びＧＲＰ−Ｒ負細胞株（負の制御）でインビトロ結合実験を行なうことにより測定した（図１２Ｂ）。細胞を８−ｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、ロチェスター、ニューヨーク）に蒔き、夜通しインキュベートした。両方の細胞株をＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）−４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）に標識化ボルト粒子で処置し、１組はボンベシンペプチドで、他の組はボンベシンペプチドなしで（負の制御）である。インキュベートを４℃で１時間実行した。細胞を１％のＦＢＳ−ＰＢＳで３回洗浄し、パラホルムアルデヒドで５分間固定化した。ＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｏｕｎｔ  ＤＡＰＩ  及びＤＡＢＣＯ、Ｃａｔ＃  １７９８９−９７（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハットフィールド、ＰＡ）をスライドに塗布し、カバーガラスを付けた。画像は１０００倍拡大（図１２Ｂ）であり落射蛍光顕微鏡によって得た。
【０１１２】
実施例８．ショルダードメインのエピトープタグを発現するために操作されたボルト粒子
エピトープタグは、抗体の確立したレパートリーがそれらを検知するために開発されているタンパク質を標識化するために、一般に使用されるリガンドである。ＤＹＫＤＤＤＤＫである親水性８アミノペプチドを、図１１Ｂにおいて略述されたストラテジー１を使用して、非体系的ショルダードメインに挿入する。相同の配列によって側面を守られた８アミノ酸ペプチドをコード化する補足的な５７量体オリゴヌクレオチドを、挿入物（順方向オリゴヌクレオチド、ＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣ、及び逆方向オリゴヌクレオチド（ＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＡＧ）を作り出すためにハイブリッド形成し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニングによってＡｆｅＩ消化ラットＭＶＰ−ｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳベクタ−中にクローニングする。挿入を期間分析によって確認した。ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ付きボルト粒子を、ＷＥＰＲＯ（登録商標）７２４０コムギ麦芽抽出物及びＳＵＢＡＭＩＸ（登録商標）翻訳バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、横浜（日本））を使用して、インビトロ無細胞翻訳によって産出した。ＤＹＫＤＤＤＤＫボルト粒子組立を在来のアガロースゲル電気泳動及びクマシブルー着色によって確認した。
【図１Ａ】
2021506733.tif 000006
【図１Ｂ】
2021506733.tif 000007
【図１Ｃ】
2021506733.tif 000008
【図１Ｄ】
2021506733.tif 000009
【図２】
2021506733.tif 000010
【図３Ａ】
2021506733.tif 000011
【図３Ｂ】
2021506733.tif 000012
【図４】
2021506733.tif 000013
【図５Ａ】
2021506733.tif 000014
【図５Ｂ】
2021506733.tif 000015
【図５Ｃ】
2021506733.tif 000016
【図６Ａ】
2021506733.tif 000017
【図６Ｂ】
2021506733.tif 000018
【図７Ａ】
2021506733.tif 000019
【図７Ｂ】
2021506733.tif 000020
【図８】
2021506733.tif 000021
【図９】
2021506733.tif 000022
【図１０Ａ】
2021506733.tif 000023
【図１０Ｂ】
2021506733.tif 000024
【図１１Ａ】
2021506733.tif 000025
【図１１Ｂ】
2021506733.tif 000026
【図１２Ａ】
2021506733.tif 000027
【図１２Ｂ】
2021506733.tif 000028
【配列表】
2021506733000001.app
【国際調査報告】
2021506733.tif 000029
2021506733.tif 000030
2021506733.tif 000031