(57)【要約】  マススペクトロメトリーによりクロモグラニンＡを検出する方法が提供される。別の態様では、マススペクトロメトリーによりクロモグラニンＡを定量化する方法が本明細書において提供される。別の態様では、マススペクトロメトリーにより神経内分泌腫瘍を予知し、又はサイズを測定する方法が本明細書において提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）の量を決定する方法であって、
（ａ）前記サンプル中のＣｇＡを精製すること、
（ｂ）ＣｇＡをイオン化して、マススペクトロメトリーにより検出可能なＣｇＡの１つ又は複数のイオンを生成すること、
（ｃ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｂ）からの前記イオンの量を決定すること
を含み、前記イオンの量が、前記サンプル中のＣｇＡの量と関連する、方法。
【請求項２】
前記精製することが、固相抽出（ＳＰＥ）による抽出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＰＥが、陰イオン交換固相抽出である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＰＥが、ミックスモード陰イオン交換固相抽出である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抽出されたサンプルが、酵素的に消化される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記消化が、トリプシン消化を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記精製することが、液体クロマトグラフィーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記液体クロマトグラフィーが、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記液体クロマトグラフィーが、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記イオン化が、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
内部標準を添加することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記内部標準が、同位体で標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、脳脊髄液（ＣＳＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
７２９．６±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＣｇＡの断片の量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
測定された前記ＣｇＡ断片が、配列ＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬＳＡＩＥＡＥＬＥＫ（配列番号４）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
８３１．５±０．５又は９８９．５±０．５の質量対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
内部標準を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記内部標準が、同位体で標識されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記内部標準が、Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記内部標準が、ロイシン（Ｌ）又はリジン（Ｋ）において標識されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記内部標準が、配列ＥＧＳＡＮＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬ＊ＳＡＩＥＡＥＬＥＫ＊ＶＡＨＱＬ（配列番号５）を含み、Ｌ＊及びＫ＊は、それぞれＣ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
７３４．６±０．５の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、又は８３９．５±０．５若しくは９９７．６±０．５の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
方法の定量限界が、５０ｎｇ／ｍＬ未満又はそれに等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
方法の検出限界が、３５．５ｎｇ／ｍＬ未満又はそれに等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
５０ｎｇ／ｍＬ〜５０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲にわたり、定量の直線性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＶ≦１５％のアッセイ間及びアッセイ内再現性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記マススペクトロメトリーが、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）マススペクトロメトリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
完全に自動化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
抗体を含まない、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願に対する相互参照
本出願は、２０１８年３月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６４４，２１０号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
クロモグラニン−Ａ（ＣｇＡ）は、神経内分泌組織の分泌顆粒中に発現する５０ｋＤａの酸性糖タンパク質である。現在のところ、ＣｇＡの血液レベルは、様々なイムノアッセイを使用して主に測定される。しかしながら、どのような抗体に基づくアッセイと同様、非特異的結合や、サンプル希釈を必要とすることからダイナミックレンジの低下に起因していくつか制限があり、それが診断検査室においてそのようなテストを実施する際に障害を引き起こす。
【０００３】
クロモグラニンＡを定量化するための正確且つ高感度なアッセイ法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００４】
タンデム型マススペクトロメトリーを含むマススペクトロメトリーにより、サンプル中のクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）を検出又はその量を決定する方法が、本明細書において提供される。
【０００５】
特定の実施形態では、本明細書に提供おいてされる方法は、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）を検出又はその量を決定する方法であって、（ａ）サンプル中のＣｇＡを精製すること；（ｂ）ＣｇＡをイオン化して、マススペクトロメトリーにより検出可能なイオンを生成すること；及び（ｃ）マススペクトロメトリーによりＣｇＡイオンを検出又はその量を決定することを含み；前記ＣｇＡイオンの量が、サンプル中のＣｇＡの量と関連する方法である。
【０００６】
特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）を検出又はその量を決定する方法であって、（ａ）サンプルを固相抽出に供すること；（ｂ）ＣｇＡを酵素的に消化すること；（ｃ）ＣｇＡを液体クロマトグラフィーに供すること；（ｄ）ＣｇＡをイオン化して、マススペクトロメトリーにより検出可能なイオンを生成すること；及び（ｅ）マススペクトロメトリーによりＣｇＡイオンを検出又はその量を決定することを含み；前記ＣｇＡイオンの量が、サンプル中のＣｇＡの量と関連する方法である。
【０００７】
特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）マススペクトロメトリーを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、完全に自動化されている。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、抗体を含まない方法である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される精製することは、固相抽出（ＳＰＥ）を使用した血清の抽出を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、陰イオン交換固相抽出である。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、ミックスモード陰イオン交換固相抽出である。いくつかの実施形態では、抽出されたサンプルは濃縮される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される精製することは、液体クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、抽出されたサンプルは、酵素的に消化される。いくつかの実施形態では、抽出されたサンプルは、トリプシンにより酵素的に消化される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を含む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を含む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、５９３．２±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、７２９．６±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、クロモグラニンＡの断片の量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、測定されたＣｇＡ断片は、配列ＥＬＱＤＬＡＬＱＧＡ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、測定されたＣｇＡ断片は、配列ＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬＳＡＩＥＡＥＬＥＫ（配列番号４）を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、５１６．３±０．５若しくは８１５．５±０．５、又はその両方の質量対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、８３１．５±０．５若しくは９８９．５±０．５、又はその両方の質量対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、内部標準を添加することを更に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は、同位体で標識されている。いくつかの実施形態では、内部標準は、Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、内部標準は、ロイシン（Ｌ）又はリジン（Ｋ）において標識されている。いくつかの実施形態では、内部標準は、配列ＩＬＳＩＬＲＨＱＮＬＬＫＥＬＱＤＬＡＬ＊ＱＧＡＫ＊ＥＲＡＨＱＱＫ（配列番号２）を含み、＊は、Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸である。いくつかの実施形態では、内部標準は、配列ＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬ＊ＳＡＩＥＡＥＬＥＫ＊（配列番号５）を含み、＊は、Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、６００．８±０．５の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、及び／又は６０２．４±０．５、８３０．６±０．５、若しくは９５８．７±０．５の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定することを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、６００．８±０．５の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、及び／又は７３４．６±０．５、８３９．５±０．５、若しくは９９７．６±０．５の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定することを含む。
【００２３】
特定の実施形態では、方法の定量限界は、１００ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、９０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、８０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、７０ｎｇ／ｍＬ未満又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、６０ｎｇ／ｍＬ未満又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、５０ｎｇ／ｍＬ未満又はそれに等しい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、５０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、４０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、３５．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、５０ｎｇ／ｍＬ〜５０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲にわたり定量の直線性を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＣＶ≦１５％のアッセイ間及びアッセイ内再現性を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＣｇＡはマススペクトロメトリー前に誘導体化されない。
【００２８】
特定の実施形態では、サンプルは体液である。いくつかの実施形態では、サンプルは脳脊髄液（ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは血漿又は血清である。いくつかの実施形態では、サンプルは全血である。いくつかの実施形態では、サンプルは唾液又は尿である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルをタンパク質除去するのに十分な量で、薬剤をサンプルに添加することを含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、参照範囲と比較してクロモグラニンＡのレベルが高いということは、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）のリスクが増加していることを指し示す。いくつかの実施形態では、クロモグラニンＡの定量化されたレベルは、神経内分泌腫瘍のサイズを指し示す。いくつかの実施形態では、クロモグラニンＡの定量化されたレベルは、神経内分泌腫瘍の腫瘍負荷を指し示す。いくつかの実施形態では、クロモグラニンＡの定量化されたレベルは、神経内分泌腫瘍の処置に対する応答を指し示す。いくつかの実施形態では、クロモグラニンＡの定量化されたレベルは、神経内分泌腫瘍の予後を指し示す。
【００３１】
本明細書で用いる場合、別途記載がなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数形の意味を含む。従って、例えば、「１つのタンパク質」と言う場合、複数のタンパク質分子も含まれる。
【００３２】
本明細書で用いる場合、用語「精製」又は「精製すること」とは、サンプルから目的とする分析物以外のすべての物質を除去することを意味しない。むしろ、精製とは、目的とする分析物の検出を妨害する可能性がある、サンプル中のその他の成分と比較して、目的とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる手順を意味する。サンプルは、本明細書では、１つ又は複数の妨害物質、例えば、マススペクトロメトリーによる、選択されたＣｇＡの親及び娘イオンの検出を妨害する１つ又は複数の物質の除去を可能にする様々な手段により精製される。
【００３３】
本明細書で用いる場合、用語「試験サンプル」とは、ＣｇＡを含み得る任意のサンプルを指す。本明細書で用いる場合、用語「体液」とは、個人の身体から単離可能な任意の液を意味する。例えば、「体液」として、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、汗等を挙げることができる。
【００３４】
本明細書で用いる場合、用語「誘導体化すること」とは、２つの分子を反応させて新規分子を形成することを意味する。誘導体化薬は、イソチオシアネート基、ジニトロフルオロフェニル基、ニトロフェノキシカルボニル基、及び／又はフタルアルデヒド基等を含み得る。
【００３５】
本明細書で用いる場合、用語「クロマトグラフィー」とは、液体又は気体により搬送される化学的混合物が、静止した液相又は固相の周辺又は上方を流通する際に、化学的実体の差動的分配の結果として成分に分離するプロセスを意味する。
【００３６】
本明細書で用いる場合、用語「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」とは、微細な物質からなるカラムを通じて、又はキャピラリー通路を通じて流体が均一に浸透する際に、流体の溶液の１つ又は複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、１つ又は複数の固定相とバルク液（すなわち、移動相）の間で、この流体が固定相に対して相対的に移動する際に生ずる、混合物中の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィー」の例として、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。
【００３７】
本明細書で用いる場合、用語「高性能液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」とは、固定相、一般的には稠密充填カラムを通じて、加圧条件下で移動相に力を加えることにより、分離度が増加する液体クロマトグラフィーを意味する。
【００３８】
本明細書で用いる場合、用語「高乱流液体クロマトグラフィー」又は「ＨＴＬＣ」とは、分離を実施する基本原理として、カラム充填材を通じてアッセイされる物質の乱流を活用するクロマトグラフィーの一形態を意味する。ＨＴＬＣは、マススペクトロメトリーによる分析前に、２つの無名の薬物を含有するサンプルを調製するのに適用されてきた。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻：２３〜３５頁（１９９９年）を参照；ＨＴＬＣについて更に説明する米国特許第５，９６８，３６７号、同第５，９１９，３６８号、同第５，７９５，４６９号、及び同第５，７７２，８７４号も参照。当業者は「乱流」について理解している。流体がゆっくりとスムーズに流れる場合、この流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムを通じて、低い流速で移動する流体は、層流である。層流内では、流体中の粒子の動きは規律正しく、粒子は直線的に移動するのが一般的である。より高速では、水の慣性力が流体の摩擦力を上回り、その結果乱流が生ずる。不規則な境界と接触しない流体は、摩擦により低速化した、又は不均等な表面により向きが変わった流体を「追い越す」。流体が乱れた状態で流れるとき、ぐるぐる渦巻いて（又は渦状に）流れ、流れが層状の場合よりもより「抵抗性」となる。どの場合に流体の流れが層流又は乱流であるか判断するのに役立つ多くの参考資料が入手可能である（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ  Ｆｌｏｗ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ＆Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２０００年）；Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ  Ｆｌｏｗ  Ｆｌｏｗ、Ｊｅａｎ  Ｍａｔｈｉｅｕ＆Ｊｕｌｉａｎ  Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年））。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「ガスクロマトグラフィー」又は「ＧＣ」とは、サンプル混合物が気化され、そして液体又は微粒子固体から構成される固定相を含有するカラムを通じて移動するキャリヤガス（窒素又はヘリウム）の流れの中に注入され、そして化合物の固定相に対する親和性に基づき、その構成化合物に分離されるクロマトグラフィーを意味する。
【００４０】
本明細書で用いる場合、用語「大型の粒子カラム」又は「抽出カラム」とは、約３５μｍを上回る平均粒子径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。この文脈で使用される場合、用語「約」とは±１０％を意味する。好ましい実施形態では、カラムは、直径約６０μｍの粒子を含有する。
【００４１】
本明細書で用いる場合、用語「分析カラム」は、カラムから溶出するサンプル中の物質について、分析物の存否又は量の決定を可能にするのに十分な分離を有効にする、十分なクロマトグラフプレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。そのようなカラムは、更なる分析用として精製されたサンプルを取得するために、保持された物質を保持されない物質から分離又は抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」から多くの場合区別される。この文脈で使用される場合、用語「約」とは、±１０％を意味する。好ましい実施形態では、分析カラムは、直径約４μｍの粒子を含有する。
【００４２】
本明細書で用いる場合、例えば「オンライン自動化方式」又は「オンライン抽出」として使用されるような用語「オンライン」又は「インライン」とは、オペレーターの介入を必要とせずに実施される手順を意味する。対照的に、用語「オフライン」とは、本明細書で用いる場合、オペレーターの手動介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプルが沈殿処理され、そして次に上清が手作業によりオートサンプラーにロードされる場合、沈殿及びロードステップは後続ステップからオフラインの状態にある。本方法の様々な実施形態では、１つ又は複数のステップが、オンライン自動化方式で実施され得る。
【００４３】
本明細書で用いる場合、用語「マススペクトロメトリー」又は「ＭＳ」とは、化合物をその質量別に識別する分析技法を意味する。ＭＳは、イオンを、その質量対電荷の比、又は「ｍ／ｚ」に基づきフィルター処理、検出、及び測定する方法を意味する。ＭＳ技術は、（１）化合物をイオン化して、荷電した化合物を形成すること；及び（２）荷電した化合物の分子量を検出し、そして質量対電荷の比を計算すること一般的に含む。化合物は、任意の適する手段によりイオン化及び検出され得る。「質量分析装置」は、イオン化装置及びイオン検出器を一般的に含む。一般的に、１つ又は複数の目的とする分子がイオン化され、イオンがその後マススペクトログラフィック装置に導入され、そこでは磁場と電場の組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路をたどる。例えば、「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆｒｏｍ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，１０７，６２３号、「ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，２６８，１４４号、「Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｆｏｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ」と題する同第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第２巻：２６４〜７６頁（１９９９年）；並びにＭｅｒｃｈａｎｔ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２１巻：１１６４〜６７頁（２０００年）を参照。
【００４４】
本明細書で用いる場合、用語「陰イオンモードでの操作」とは、陰イオンが生成及び検出されるマススペクトロメトリー法を意味する。用語「陽イオンモードでの操作」とは、本明細書で用いる場合、陽イオンが生成及び検出されるマススペクトロメトリー法を意味する。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「イオン化」又は「イオン化すること」とは、１又は複数のエレクトロンユニットに等しい正味の電荷を有する分析物イオンを生成するプロセスを意味する。陰イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味負電荷を有するイオンである一方、陽イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味正電荷を有するイオンである。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「電子イオン化法」又は「ＥＩ法」とは、気相〔gaseous phase〕又は気相〔vapor phase〕の目的とする分析物が電子の流れと相互作用する方法を意味する。分析物への電子の衝撃は分析物イオンを産生し、次にマススペクトロメトリー技術の対象となり得る。
【００４７】
本明細書で用いる場合、用語「化学イオン化法」又は「ＣＩ法」とは、試薬気体（例えば、アンモニア）が電子の衝撃を受け、そして試薬気体イオンと分析物分子との相互作用により、分析物イオンが形成される方法を意味する。
【００４８】
本明細書で用いる場合、用語「高速原子衝撃法」又は「ＦＡＢ法」とは、高エネルギー原子（多くの場合Ｘｅ又はＡｒ）のビームが、不揮発性サンプルに衝撃を与え、サンプルに含まれる分子を脱離及びイオン化する方法を意味する。試験サンプルは、粘稠性の液体マトリックス、例えばグリセロール、チオグリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６−クラウンエーテル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミン等に溶解する。化合物又はサンプルに適するマトリックスの選択は、実験に基づいたプロセスである。
【００４９】
本明細書で用いる場合、用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化法」又は「ＭＡＬＤＩ」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々なイオン化経路によって、不揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレーザー照射に曝露される方法を意味する。ＭＡＬＤＩの場合、サンプルは、分析物分子の脱離を促進するエネルギー吸収性マトリックスと混合される。
【００５０】
本明細書で用いる場合、用語「表面増強レーザー脱離イオン化法」又は「ＳＥＬＤＩ法」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々なイオン化経路によって、非揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレーザー照射に曝露される別の方法を意味する。ＳＥＬＤＩでは、サンプルは、１つ又は複数の目的とする分析物を優先的に保持する表面に一般的に結合する。ＭＡＬＤＩと同様に、このプロセスも、イオン化を促進するために、エネルギー吸収性材料を利用し得る。
【００５１】
本明細書で用いる場合、用語「エレクトロスプレーイオン化法」又は「ＥＳＩ法」は、溶液が短尺のキャピラリー管に沿って通過し、そのキャピラリー管の端部に正又は負の高電位が印加される方法を意味する。溶液が管の端部に到達すると気化（噴霧化）されて、溶媒蒸気内で溶液の非常に小さい液滴からなるジェット又はスプレーとなる。この液滴のミストは、凝結を防止し、溶媒を蒸発させるためにわずかに加熱された蒸発チャンバーを流通する。液滴がより小型になるに従い、表面電荷密度は増加し、やがて同一荷電間で自然反発して、イオン並びに中性分子の放出が引き起こされる。
【００５２】
本明細書で用いる場合、用語「大気圧化学イオン化法」又は「ＡＰＣＩ法」とは、ＥＳＩと類似する質量分析法を意味するが、しかしＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に生ずるイオン−分子反応によりイオンを産生する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極の間の放電により維持される。次にイオンは、差次的にポンプ搬送される一連のスキマーステージの使用により質量分析器中に一般的に抽出される。乾燥及び事前加熱されたＮ２ガスの向流を使用して、溶媒の除去を改善することができる。極性がより低い種を分析する場合、ＡＰＣＩにおける気相イオン化の方がＥＳＩよりも有効であり得る。
【００５３】
用語「大気圧光イオン化法」又は「ＡＰＰＩ法」とは、本明細書で用いる場合、分子Ｍを光イオン化する機構が、分子イオンＭ＋を形成する光子吸収及び電子放出である質量分析法の形態を意味する。光子エネルギーは、一般的にイオン化電位のすぐ上にあるので、分子イオンは、それほど解離しやすくない。多くの場合、クロマトグラフィーを必要とせずにサンプルを分析することができると考えられ、従ってかなりの時間及び出費が抑えられる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンは、Ｈを取り出してＭＨ＋を形成することができる。これは、Ｍが高プロトン親和性を有する場合に生ずる傾向がある。Ｍ＋とＭＨ＋の合計は一定なので、これは定量の正確性に影響を及ぼさない。プロトン性溶媒中の薬物化合物は、通常ＭＨ＋として観察される一方、非極性化合物、例えばナフタレン又はテストステロン等は、通常Ｍ＋の形態を採る。Ｒｏｂｂ、Ｄ．Ｂ．、Ｃｏｖｅｙ、Ｔ．Ｒ．及びＢｒｕｉｎｓ、Ａ．Ｐ．（２０００年）：例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２巻（１５号）：３６５３〜３６５９頁を参照。
【００５４】
本明細書で用いる場合、用語「誘導結合プラズマ法」又は「ＩＣＰ法」とは、ほとんどの元素が微粒化及びイオン化されるような十分に高温度において、サンプルが部分的にイオン化した気体と相互作用する方法を意味する。
【００５５】
本明細書で用いる場合、用語「電界脱離法」とは、非揮発性の試験サンプルがイオン化表面上に配置され、そして分析物イオンを生成するのに強電界が使用される方法を意味する。
【００５６】
本明細書で用いる場合、用語「脱離」とは、表面から分析物を取り出すこと、及び／又は分析物を気相に導入することを意味する。
【００５７】
本明細書で用いる場合、用語「定量化限界〔limit of quantification〕」、「定量限界〔limit of quantitation〕」、又は「ＬＯＱ」とは、測定が定量的に意味を有するようになるポイントを意味する。このＬＯＱにおける分析物の応答は、識別可能であり、個別的であり、並びに２０％の精密度及び８０％〜１２０％の正確度で再現性を有する。
【００５８】
本明細書で用いる場合、用語「検出限界」又は「ＬＯＤ」は、測定値が、それと関連した不確実性より大きくなるポイントである。ＬＯＤは、ゼロ濃度から２標準偏差（ＳＤ）として任意に定義される。
【００５９】
本明細書で使用する場合、体液サンプル中のＣｇＡの「量」とは、体液の容積中で検出可能なＣｇＡの質量を反映する絶対値を一般的に意味する。但し、量は、別のＣｇＡの量と比較した相対的な量についても考慮する。例えば、体液中のＣｇＡの量は、通常存在するＣｇＡの対照レベル又は正常なレベルを上回る又はそれ未満である量であり得る。
【００６０】
用語「約」とは、イオン質量測定を除き定量測定と関連して本明細書で用いる場合、表示の数値±１０％を意味する。マススペクトロメトリー装置は、所与の分析物の質量を決定する際に、ほとんど変化し得ない。用語「約」とは、イオンの質量又はイオンの質量／電荷の比の文脈において、±０．５原子質量単位を意味する。
【００６１】
上記した本発明の概要は、非限定的であり、また本発明のその他の特性及び長所は、下記の発明を実施するための形態から、及び特許請求の範囲から明白である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ＣｇＡ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイについて、分析ワークフローを示す。負に荷電したＣｇＡは、それが保持される一方、その他のタンパク質が洗い流される条件下で、静電、親油性、及び親水性相互作用を通じて、ミックスモード陰イオン交換樹脂と結合する。溶出後、単離されたＣｇＡは、トリプシンを用いて消化され、そして代表的なペプチドがＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により定量化される。
【図２】図２は、異なる３日間にわたり測定された３つの校正曲線を示す。直鎖範囲は、５０〜５０，０００ｎｇ／ｍＬであることが実証された。ＣＶは１０％未満であった。
【図３】図３は、患者試料に対応するクロマトグラムを、正常（上段）、及び高値（下段）ＣｇＡ値について示す。
【図４】図４は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより取得された数値と比較した、平均ＥＬＩＳＡイムノアッセイ値を示す。
【図５】図５は、ＣｉｓＢｉｏイムノアッセイ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ＣｇＡアッセイの間の比較を示す（Ｐａｓｓｉｎｇ＆Ｂａｂｌｏｋ曲線近似、３０８例のサンプル）。
【図６】図６は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定された正常及び異常ＣｇＡレベルについて、ピーク面積グラフを示す。
【図７】図７は、クロモグラニン内部標準についてクロマトグラムの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
ＣｇＡのレベルは、神経内分泌由来の腫瘍（ＮＥＴ）の存在下で増加し、それがＣｇＡを、ＮＥＴを有する患者をモニタリングするための有用な血清マーカーとしている。血清ＣｇＡの循環レベルは、腫瘍負荷に比例し、処置応答における予後情報を提供する。ここでは、血清からクロモグラニンＡを定量化するための新規の完全に自動化された、抗体を含まないＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイ法について記載する。ＣｇＡの酸性特性を利用しながら、１００μＬの血清が、陰イオン交換固相抽出プレートを使用して抽出され、その後に内部標準が添加される。抽出されたサンプルは、次に濃縮され、そしてトリプシンを使用して酵素的に消化される。ＣｇＡに固有のペプチドが、次にクロマトグラフ的に分離され、Ｓｃｉｅｘ６５００＋ＱＴｒａｐ上でＳＲＭにより分析される。同位体で標識された内部標準ピーク面積に対するアナライトピーク面積の比が、定量を実現するのに使用される。ＣｇＡは、幅広い範囲（５０〜５００００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ２≧０．９９）にわたる直線性、並びにアッセイ間及びアッセイ内再現性（ＣＶ≦１５％）を示す。Ｃｉｓｂｉｏ  ＣＧＡ−ＥＬＩＳＡ−ＵＳイムノアッセイ法により測定されたＣｇＡ血清値を、記載されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイ法と比較するために、３００例の患者サンプルからなるコホートを分析した。このコホートにおいて、ＣｇＡについて、イムノアッセイ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を比較したとき、０．７１のＲ２が観測され、２つのアッセイプラットフォームの間で良好な相関を示した。
【００６４】
特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）を検出又はその量を決定する方法であって、（ａ）サンプル中のＣｇＡを精製すること；（ｂ）ＣｇＡをイオン化して、マススペクトロメトリーにより検出可能なイオンを生成すること；及び（ｃ）マススペクトロメトリーによりＣｇＡイオンを検出又はその量を決定することを含み；前記ＣｇＡイオンの量が、サンプル中のＣｇＡの量と関連する方法である。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）を検出又はその量を決定する方法であって、（ａ）サンプルを固相抽出に供すること；（ｂ）ＣｇＡを酵素的に消化すること；（ｃ）ＣｇＡを液体クロマトグラフィーに供すること；（ｄ）ＣｇＡをイオン化してマススペクトロメトリーにより検出可能なイオンを生成すること；及び（ｅ）マススペクトロメトリーによりＣｇＡイオンの検出又はその量を決定することを含み；前記ＣｇＡイオンの量が、サンプル中のＣｇＡの量と関連する方法である。
【００６６】
特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）マススペクトロメトリーを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、完全に自動化されている。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、抗体を含まない方法である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される精製することは、固相抽出（ＳＰＥ）を使用した血清の抽出を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、陰イオン交換固相抽出である。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、ミックスモード陰イオン交換固相抽出である。いくつかの実施形態では、抽出されたサンプルは濃縮される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される精製することは、液体クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、抽出されたサンプルは酵素的に消化される。いくつかの実施形態では、抽出されたサンプルは、トリプシンにより酵素的に消化される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を含む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を含む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、５９３．２±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、７２９．６±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、クロモグラニンＡの断片の量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、測定されたＣｇＡ断片は、配列ＥＬＱＤＬＡＬＱＧＡ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、測定されたＣｇＡ断片は、配列ＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬＳＡＩＥＡＥＬＥＫ（配列番号４）を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、５１６．３±０．５若しくは８１５．５±０．５、又はその両方の質量対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、８３１．５±０．５若しくは９８９．５±０．５、又はその両方の質量対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、内部標準を添加することを更に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は、同位体で標識されている。いくつかの実施形態では、内部標準は、Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、内部標準は、ロイシン（Ｌ）又はリジン（Ｋ）において標識されている。いくつかの実施形態では、内部標準は、配列ＩＬＳＩＬＲＨＱＮＬＬＫＥＬＱＤＬＡＬ＊ＱＧＡＫ＊ＥＲＡＨＱＱＫ（配列番号２）を含み、＊は、Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸である。いくつかの実施形態では、内部標準は、配列ＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬ＊ＳＡＩＥＡＥＬＥＫ＊（配列番号５）を含み、＊は、Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、６００．８±０．５の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、及び／又は６０２．４±０．５、８３０．６±０．５若しくは９５８．７±０．５の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定することを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、６００．８±０．５の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、及び／又は７３４．６±０．５、８３９．５±０．５若しくは９９７．６±０．５の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定することを含む。
【００８２】
特定の実施形態では、方法の定量限界は、１００ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、９０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、８０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、７０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、６０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の定量限界は、５０ｎｇ／ｍＬ未満又はそれに等しい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、５０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、４０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、３５．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、５０ｎｇ／ｍＬ〜５０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲にわたり定量の直線性を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＣＶ≦１５％のアッセイ間及びアッセイ内再現性を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＣｇＡは、マススペクトロメトリー前に誘導体化されない。
【００８７】
特定の実施形態では、サンプルは体液である。いくつかの実施形態では、サンプルは脳脊髄液（ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは血漿又は血清である。いくつかの実施形態では、サンプルは全血である。いくつかの実施形態では、サンプルは唾液又は尿である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルをタンパク質除去するのに十分な量で、薬剤をサンプルに添加することを含み得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、参照範囲と比較してクロモグラニンＡのレベルが高いということは、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）のリスクが増加していることを指し示す。いくつかの実施形態では、クロモグラニンＡの定量化されたレベルは、神経内分泌腫瘍のサイズを指し示す。いくつかの実施形態では、クロモグラニンＡの定量化されたレベルは、神経内分泌腫瘍の腫瘍負荷を指し示す。いくつかの実施形態では、クロモグラニンＡの定量化されたレベルは、神経内分泌腫瘍の処置に対する応答を指し示す。いくつかの実施形態では、クロモグラニンＡの定量化されたレベルは、神経内分泌腫瘍の予後を指し示す。
【００９０】
適する試験サンプルは、目的とする分析物を含有し得る任意の試験サンプルを含む。いくつかの好ましい実施形態では、サンプルは、生体サンプルである；すなわち、任意の生物起源物質、例えば動物、細胞培養物、臓器培養物等から得られるサンプルである。特定の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ等から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性のヒトである。特に好ましいサンプルとして、血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙、脳脊髄液、又はその他の組織サンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、例えば患者；すなわち、疾患又は状態を診断、予測、又は処置するために、臨床現場において自己を提示する生存者、男性又は女性から取得され得る。試験サンプルは、好ましくは患者から得られ、例えば血清である。
【００９１】
マススペクトロメトリーのためのサンプル調製
サンプル中のその他の成分（例えば、タンパク質）と比較してそれよりもＣｇＡを富化させるのに利用可能である方法として、例えば、フィルター処理法、遠心分離法、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、免疫親和性分離法を含む親和性分離法、酢酸エチル抽出法及びメタノール抽出法を含む抽出法、及びカオトロピック薬剤の使用、又は上記の任意の組合せ等が挙げられる。
【００９２】
タンパク質沈殿法は、試験サンプルを調製する１つの好ましい方法である。そのようなタンパク質精製法は、当技術分野に周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎらの、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、第７８５巻：２６３〜２７５頁（２００３年）は、本方法で使用するのに適するタンパク質沈殿技術について記載する。タンパク質沈殿法は、上清にＣｇＡを残して、サンプルからほとんどのタンパク質を取り除くのに利用可能である。サンプルは、沈殿したタンパク質から液体上清を分離するために遠心分離され得る。得られた上清は、次に、液体クロマトグラフィー及び後続するマススペクトロメトリー分析に適用され得る。特定の実施形態では、タンパク質沈殿法、例えばアセトニトリルタンパク質沈殿法等を使用すれば、ＨＰＬＣ及びマススペクトロメトリーを行う前に、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又はその他のオンライン抽出を行う必要がなくなる。従って、そのような実施形態では、方法は、（１）目的とするサンプルのタンパク質沈殿を実施すること；及び（２）オンライン抽出又は高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を使用することなく、上清をＨＰＬＣ−質量分析装置に直接ロードすることと関係する。
【００９３】
いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＬＣは、単独で、又は１つ若しくは複数の精製法と組み合わせて、マススペクトロメトリーの前にＣｇＡを精製するのに利用可能である。そのような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉するＨＰＬＣ抽出カートリッジを使用して抽出され、次に溶出され、そして第２のＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフされ得る、又はイオン化前に分析用ＨＰＬＣカラム上に溶出され得る。このようなクロマトグラフィー手順に関与するステップは、自動化方式で連結可能であるので、分析物の精製期間中にオペレーターが関与する必要性は、最低限に抑えることができる。このような特性は、その結果、時間とコストの節約をもたらし、またオペレーターがミスする機会を取り除くことができる。
【００９４】
例えば、ＨＴＬＣカラムや諸方法等が引き起こす乱流は、物質移動速度を増強する可能性があり、分離特性を改善すると考えられている。ＨＴＬＣカラムは、剛性粒子を含有する充填カラムを通じた、クロマトグラフィーの高い流速によって成分を分離する。高速流速（例えば、３〜５ｍＬ／分）を利用することにより、乱流がカラム内に生じ、固定相と目的とする分析物の間でほぼ完全な相互作用を引き起こす。ＨＴＬＣカラムを使用する長所として、高分子量の種は、乱流条件下では保持されないので、生体液マトリックスと関連した高分子の蓄積が回避されることが挙げられる。１つの手順において複数の分離法を組み合わせるＨＴＬＣ法では、サンプル調製を長時間行う必要性が低下し、また著しく高速で作動する。そのような方法は、層流（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィーよりも優れた分離性能も実現する。ＨＴＬＣは、生体サンプル（血漿、尿、等）の直接注入を可能にする。直接注入する場合、変性したタンパク質及びその他の生物学的デブリが分離カラムを急速にブロックするので、従来型のクロマトグラフィーでは実現が難しい。また、ＨＴＬＣは、１ｍＬ未満、好ましくは０．５ｍＬ未満、好ましくは０．２ｍＬ未満、好ましくは０．１ｍＬの非常に少ないサンプルボリュームも可能にする。
【００９５】
マススペクトロメトリーによる分析前に、サンプル調製に適用されるＨＴＬＣの例は、別途記載されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻：２３〜３５頁（１９９９年）を参照；米国特許第５，９６８，３６７号；同第５，９１９，３６８号；同第５，７９５，４６９号；及び同第５，７７２，８７４号も参照。本方法の特定の実施形態では、サンプルは、ＨＴＬＣカラムにロードする前に上記のようなタンパク質沈殿処理がなされる；代替的な好ましい実施形態では、サンプルは、タンパク質沈殿処理されることなく、ＨＴＬＣ上に直接ロードされ得る。ＨＴＬＣ抽出カラムは、好ましくは大型の粒子カラムである。様々な実施形態では、方法の１つ又は複数のステップは、オンラインの自動化された方式で実施され得る。例えば、１つの実施形態では、ステップ（ｉ）〜（ｖ）は、オンラインの自動化された方式で実施される。別の場合、イオン化及び検出のステップは、ステップ（ｉ）〜（ｖ）の後に、オンラインで実施される。
【００９６】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、比較的低速の層流技術に基づく。従来型のＨＰＬＣ分析法は、カラムを通過するサンプルの層流が、サンプルから目的とする分析物を分離する基礎となる、カラム充填材に依存する。当業者は、そのようなカラムにおける分離は、拡散プロセスであると理解している。ＨＰＬＣは、生体サンプル中の化合物の分離に問題なく適用されるが、かなりの量のサンプル調製が、分離及び質量分析装置（ＭＳ）によるその後の分析の前に必要とされ、この技術を労働集約的なものとしている。更に、ほとんどのＨＰＬＣシステムは、質量分析装置をその能力の最大限まで活用しておらず、１つのＨＰＬＣシステムが１つのＭＳ装置に接続可能としているにすぎず、その結果、多数のアッセイを実施するのに冗長な時間を必要とする。
【００９７】
マススペクトロメトリー分析前のサンプル除去を目的としたＨＰＬＣの使用について、様々な方法が記載されている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、第２２巻：６０８〜１２頁（２０００年）；及びＳａｌｍら、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２２巻Ｓｕｐｌ．Ｂ：Ｂ７１〜Ｂ８５頁（２０００年）を参照。
【００９８】
当業者は、ＣｇＡと共に使用するのに適するＨＰＬＣ装置及びカラムを選択し得る。クロマトグラフ用カラムは、化学的部分の分離（すなわち、分画）を促進する媒体（すなわち、充填材料）を一般的に含む。媒体として微細粒子を挙げることができる。粒子は、様々な化学的部分と相互作用して化学的部分の分離を促進する結合表面を備える。１つの適する結合表面は、疎水結合表面、例えばアルキル結合表面等である。アルキル結合表面は、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２、又はＣ−１８結合アルキル基、好ましくはＣ−１８結合基を含み得る。クロマトグラフ用カラムは、サンプルを受け取るための注入ポートと、分画されたサンプルを含む流出物を排出するための排出ポートを備える。１つの実施形態では、サンプル（又は事前精製されたサンプル）が、注入ポートにおいてカラムに適用され、溶媒又は溶媒混合物により溶出され、そして排出ポートから排出される。異なる溶媒モードが、目的とする分析物を溶出させるのに選択され得る。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、又は多型（すなわち、混合）モードを使用して実施され得る。クロマトグラフィー期間中に、材料の分離は、変動要因、例えば溶離液（「移動相」としても知られている）の選択、溶出モード、勾配条件、温度等により影響を受ける。
【００９９】
特定の実施形態では、分析物は、目的とする分析物がカラム充填材料により可逆的に保持される一方、１つ又は複数のその他の物質は保持されない条件下で、サンプルをカラムに適用することにより精製され得る。このような実施形態では、第１の移動相の条件は、目的とする分析物がカラムにより保持されるように設定可能であり、また第２の移動相の条件は、その後、保持されなかった物質が洗い出されたら、保持された物質がカラムから取り出されるように、設定可能である。或いは、分析物は、１つ又は複数のその他の物質と比較して、異なる速度で目的とする分析物が溶出するような移動相の条件下でサンプルをカラムに適用することにより精製され得る。そのような手順は、サンプルの１つ又は複数のその他の成分と比較して、目的とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる可能性がある。
【０１００】
１つの好ましい実施形態では、ＨＴＬＣは、疎水性カラムクロマトグラフィーシステム上のＨＰＬＣに後続し得る。特定の好ましい実施形態では、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｕｒｂｏＦｌｏｗ  Ｃｙｃｌｏｎｅ  Ｐ（登録商標）ポリマーベースカラム（粒径６０μｍ、カラム寸法５０×１．０ｍｍ、ポアサイズ１００Å）が使用される。関連する好ましい実施形態では、親水性エンドキャッピングを有する、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ社製のＳｙｎｅｒｇｉ  Ｐｏｌａｒ−ＲＰ（登録商標）エーテル結合型フェニルの分析カラム（粒径４μｍ、カラム寸法１５０×２．０ｍｍ、ポアサイズ８０Å）が使用される。特定の好ましい実施形態では、ＨＴＬＣ及びＨＰＬＣが、移動相としてＨＰＬＣグレード超純水及び１００％メタノールを使用して実施される。
【０１０１】
慎重なバルブの選択及びコネクター配管作業により、手動ステップを一切必要とせずに、物質が１つのカラムから次のカラムへと通過するように、２つ以上のクロマトグラフィーカラムが、必要に応じて接続され得る。好ましい実施形態では、バルブの選択及び配管作業は、必要なステップを実施するように事前プログラムされたコンピューターにより管理される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムも、検出器システム、例えばＭＳシステムと、そのようなオンライン方式で接続される。従って、オペレーターは、サンプルのトレーをオートサンプラーに配置すればよく、そして残りの作業は、コンピューター制御下で実施され、その結果、選択されたすべてのサンプルの精製及び分析が完了する。
【０１０２】
特定の好ましい実施形態では、サンプル中のＣｇＡ又はそのフラグメントは、イオン化の前に精製され得る。特に好ましい実施形態では、クロマトグラフィーは、ガスクロマトグラフィーではない。
【０１０３】
マススペクトロメトリーによる検出及び定量
様々な実施形態では、ＣｇＡ又はそのフラグメントは、当業者にとって公知の任意の方法によりイオン化することができる。マススペクトロメトリーは、分画されたサンプルをイオン化し、そして更なる分析用として荷電分子を生み出すイオン源を備える質量分析装置を使用して実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、及び粒子ビームイオン化により実施され得る。当業者は、イオン化法の選択は、測定される分析物、サンプルの種類、検出器の種類、ポジティブモードとネガティブモードの選択等に基づき決定され得るものと理解する。
【０１０４】
好ましい実施形態では、ＣｇＡ又はそのフラグメントは、ポジティブモード又はネガティブモードでのエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）によりイオン化する。
【０１０５】
サンプルがイオン化した後、これにより生成した正に荷電したイオン又は負に荷電したイオンは、質量対電荷の比を決定するために分析され得る。質量対電荷の比を決定するための適するアナライザーとして、四重極型アナライザー、イオントラップアナライザー、及び飛行時間アナライザーが挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードを使用して検出可能である。例えば、選択されたイオンは、すなわち、選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を使用して検出可能であるか、また或いは、イオンは、スキャニングモード、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）を使用して検出可能である。好ましくは、質量対電荷の比は、四重極型アナライザーを使用して決定される。例えば、「四重極」又は「四重極型イオントラップ」装置では、電極間に印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅、及び質量／電荷の比に比例した力が、振動性ラジオ周波数場内のイオンに加わる。電圧及び振幅は、特定の質量／電荷の比を有するイオンのみが、四重極の長さを移動する一方、その他のすべてのイオンは外れるように選択され得る。従って、四重極型装置は、装置に注入されたイオンに対して、「マスフィルター」及び「マス検出器」の両方として作用し得る。
【０１０６】
「タンデム型質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」を利用することにより、ＭＳ技術の分解能を強化することができる。この技術では、目的とする分子から生成した前駆イオン（親イオンとも呼ばれる）を、ＭＳ装置内でフィルター処理することができ、そして前駆イオンは、その後フラグメント化されて、次に第２のＭＳ手順において分析の対象とされる１つ又は複数のフラグメントイオン（娘イオン又はプロダクトイオンとも呼ばれる）となる。前駆イオンを慎重に選択することにより、特定の分析物より産生するイオンのみが、フラグメント化チャンバーを通過し、そこで、不活性気体の原子と衝突してフラグメントイオンが産生する。前駆イオン及びフラグメントイオンのいずれも、イオン化／フラグメント化させる一連の所定条件下で再現的に産生するので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分析ツールを提供し得る。例えば、フィルター処理／フラグメント化の組合せは、妨害物質を取り除くのに利用可能であり、また複合サンプル、例えば生体サンプル等において特に有用であり得る。
【０１０７】
質量分析装置は、一般的に、イオンスキャン；すなわち、所定の範囲（例えば、１００〜１０００ａｍｕ）において、特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量をユーザーに提供する。分析物アッセイの結果、すなわち質量スペクトルは、当技術分野において公知の非常に多くの方法により、オリジナルサンプル内の分析物の量と関連付けることができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが慎重に管理されることを前提とすれば、所定のイオンの相対的存在量は、相対的存在量をオリジナル分子の絶対量に変換する表と比較することができる。或いは、分子標準をサンプルと共にランニングすることができ、そしてその標準から生成したイオンに基づき、標準曲線が構築される。そのような標準曲線を使用して、所定のイオンの相対的存在量が、オリジナル分子の絶対量に変換され得る。特定の好ましい実施形態では、内部標準が、ＣｇＡの量を計算するための標準曲線を生成するのに使用される。そのような標準曲線を生成及び使用する方法は、当技術分野に周知であり、また当業者は、適切な内部標準を選択する能力を有する。例えば、ＣｇＡの同位体が、内部標準として利用可能である。イオンの量をオリジナル分子の量と関連付けるための非常に多くのその他の方法が、当業者に周知である。
【０１０８】
方法の１つ又は複数のステップは、自動化された機械を使用して実施され得る。特定の実施形態では、１つ又は複数の精製ステップが、オンラインで実施され、またより好ましくは、精製及びマススペクトロメトリーステップのすべてが、オンライン方式で実施され得る。
【０１０９】
特定の実施形態、例えば前駆イオンが更なるフラグメント化を目的として単離されるようなＭＳ／ＭＳ等では、衝突活性化解離法〔collision activation dissociation〕が、更なる検出を目的としてフラグメントイオンを生成するのに多くの場合使用される。ＣＡＤでは、前駆イオンは、不活性気体との衝突を通じてエネルギーを獲得するが、その後「単分子分解反応」と呼ばれるプロセスによりフラグメント化する。振動エネルギーの増加に起因して、イオン内の特定の結合が破壊され得るように、十分なエネルギーが、前駆イオン内に蓄積しなければならない。
【０１１０】
特に好ましい実施形態では、ＣｇＡが、ＭＳ／ＭＳを使用して、以下のように検出及び／又は定量化される。サンプルは、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣで処理され、クロマトグラフ用カラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳアナライザーの加熱されたネブライザーインターフェースに進入し、そして溶媒／分析物混合物が、インターフェースの加熱されたチューブ内で蒸気に変換される。分析物は、選択されたイオン化装置によりイオン化される。イオン、例えば前駆イオンは、装置の開口部を通過し、そして第１の四重極に進入する。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、質量フィルターであり、その質量対電荷の比（ｍ／ｚ）に基づき、イオン（すなわち、「前駆」及び「フラグメント」イオン）の選択を可能にする。四重極２（Ｑ２）は衝突セルであり、そこでイオンがフラグメント化される。質量分析装置の第１の四重極（Ｑ１）は、ＣｇＡの質量対電荷の比を用いて分子を選択する。ＣｇＡの正しい質量／電荷の比を有する前駆イオンが、衝突チャンバー（Ｑ２）に導入可能となる一方、その他の質量／電荷の比を有する望ましくないイオンはいずれも四重極の側面と衝突し、除去される。Ｑ２に進入する前駆イオンは、中性のアルゴン気体分子と衝突して、フラグメント化する。このプロセスは衝突活性化解離（ＣＡＤ）と呼ばれる。生成したフラグメントイオンは、四重極３（Ｑ３）に導入され、そこでは、ＣｇＡのフラグメントイオンが選択される一方、その他のイオンは除去される。
【０１１１】
方法は、陽イオンモード又は陰イオンモードのいずれかで実施されるＭＳ／ＭＳと関係し得る。当技術分野において周知の標準法を使用して、当業者は、四重極３（Ｑ３）での選択で利用可能な、特定のＣｇＡの前駆イオンの１つ又は複数のフラグメントイオンを識別する能力を有する。
【０１１２】
イオンが検出器と衝突すると、イオンは、デジタルシグナルに変換される電子のパルスを産生する。取得されたデータは、収集されたイオンのカウントを時間に対してプロットするコンピューターに伝達される。得られた質量クロマトグラムは、従来型のＨＰＬＣ法で生成されるクロマトグラムと類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積、又はそのようなピークの振幅が測定され、そして面積又は振幅が、目的とする分析物の量と関連付けられる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び／又は前駆イオンに関する曲線下面積又はピークの振幅が、ＣｇＡの量を決定するために測定される。上記のように、内部分子標準の１つ又は複数のイオンに由来するピークに基づく校正標準曲線を使用して、所定のイオンの相対的存在量は、オリジナルの分析物の絶対量に変換され得る。
【０１１３】
下記の実施例は、本発明を説明する役目を果たす。これらの実施例には、本方法の範囲に制限を設けるような意図は一切存在しない。
【実施例】
【０１１４】
［実施例１］
マススペクトロメトリーによるＣｇＡの定量
試薬の要約
【０１１５】
【表Ａ】
2021518566.tif 000003
【０１１６】
Ｓｃｉｅｘ６５００＋ＱＴｒａｐマススペクトロメーター、Ａｇｉｌｅｎｔポンプを備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ａｒｉａ  Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ＴＬＸ４、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ  Ｓｔａｒ、ＳＰＥｗａｒｅ  ＩＰ８を、ＣｇＡを検出するのに使用した。
【０１１７】
患者血清（１００μＬ）を、１２０ｍＭの炭酸水素アンモニウム６００μＬに添加し、そしてミックスモード陰イオン交換プレートを使用して全容積を抽出した（Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ３０ｍｇ）。サンプルを、次に３％の水酸化アンモニウム及び水をそれぞれ用いて２回洗浄した。次に、ＣｇＡを溶出させ、内部標準（ＩＳ）を添加し、そしてサンプルを加熱窒素下でエバポレートした。
【０１１８】
ドライダウン後、サンプルを再構成し、還元、アルキル化し、そして高速酵素消化マイクロウェーブシステム（Ｈｕｄｓｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）内で２時間トリプシン消化した。
【０１１９】
消化後、サンプルを酸性化し、そしてＡｒｉａ  ＴＬＸ−４  Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ  ＵＰＬＣ上、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。水／アセトニトリル／０．１％ギ酸グラジエントを使用するＴｈｅｒｍｏ  Ａｃｃｕｃｏｒｅ  Ｃ１８  １００×２．１ｍｍ、２．６ミクロンＨＰＬＣカラムを使用してペプチドを分離した。ＭＳ検出器は、Ｓｃｉｅｘ６５００＋Ｑｔｒａｐであった。ＣｇＡの定量は、代表的なトリプシンペプチドに対応する、ＭＳ／ＭＳ期間中に生成したフラグメントイオン及びその対応する重標識されたＩＳのクロマトグラフィーピークに基づいた。分析ワークフローは図１に要約されている。
【０１２０】
アナライト及び内部標準（ＩＳ）の両方を検出するのに、複数の反応モニタリングを使用した。
【０１２１】
クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）の濃度をピーク面積比及び校正曲線を使用して決定した。
ＥＬＱＤＬＡＬＱＧＡＫ（配列番号１）を検出するアッセイでは、標識された翼状化ペプチド内部標準を使用した：ＩＬＳＩＬＲＨＱＮＬＬＫＥＬＱＤＬＡＬ＊ＱＧＡＫ＊ＥＲＡＨＱＱＫ（配列番号２）：＊Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸。消化の後、得られたペプチドは、ＥＬＱＤＬＡＬ＊ＱＧＡＫ＊（配列番号３）であった。
ＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬＳＡＩＥＡＥＬＥＫ（配列番号４）を検出するアッセイでは、標識された翼状化ペプチド内部標準を使用した：ＥＧＳＡＮＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬ＊ＳＡＩＥＡＥＬＥＫ＊ＶＡＨＱＬ（配列番号５）；＊Ｃ１３Ｎ１５標識されたアミノ酸。消化の後、得られたペプチドは、ＲＲＰＥＤＱＥＬＥＳＬ＊ＳＡＩＥＡＥＬＥＫ＊（配列番号６）であった。
【０１２２】
表１：サンプル中のＣｇＡレベル、並びに前駆イオン及びプロダクトイオン（質量対電荷ｍ／ｚ比）を定量化するのに使用されるＣｇＡ断片。
【０１２３】
【表１】
2021518566.tif 000004
【０１２４】
表２：サンプル中のＣｇＡレベル、並びに前駆イオン及びプロダクトイオン（質量対電荷ｍ／ｚ比）を定量化するのに使用されるＣｇＡ断片。
【０１２５】
【表２】
2021518566.tif 000005
【０１２６】
表３：得られた数値を、ＥＬＩＳＡイムノアッセイにより定量化した数値と比較した。図４も参照。
【０１２７】
【表３】
2021518566.tif 000006
【０１２８】
患者３０８例からのサンプルを分析して、Ｃｉｓｂｉｏ  ＣＧＡ−ＥＬＩＳＡ−ＵＳイムノアッセイ（Ｃｏｄｏｌｅｔ、Ｆｒａｎｃｅ）により測定されたＣｇＡ血清値を我らのＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイ法からの数値と比較した。
【０１２９】
測定値を自然対数変換した後、患者３０８例において正規分布が認められた。これらのデータについてペア化ｔ−検定を実施し、そしてアッセイ間の関連性をピアソン相関係数及びＰａｓｓｉｎｇ＆Ｂａｂｌｏｋ曲線近似により測定した。全ての分析を、Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔ  ｖ２．３０において実施した。
【０１３０】
アッセイを妥当性確認した。性能特性を表４に示す：
【０１３１】
【表４】
2021518566.tif 000007
【０１３２】
低及び高濃度の循環性ＣｇＡを含む患者サンプルについて、その代表的な結果を図３に示す。
【０１３３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定されたＣｇＡレベルは、概してＣｉｓＢｉｏアッセイ法に匹敵するが、但し実質的な散乱を認めた（ピアソンの相関０．７６）（図５）。
【０１３４】
結論：我々は、血清由来のＣｇＡを分析するための完全に自動化されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを開発し、妥当性確認した。
【０１３５】
本明細書に記載又は引用する文献、特許、及び特許出願、並びにその他のすべての文書及び電子的に利用可能な情報の内容は、個々の公開資料が参照として組み込まれるものと特別及び個別に示唆されたのと同程度に、参照により本明細書にその全体が援用される。出願者らは、任意のそのような文献、特許、特許出願、又はその他の物理的及び電子的な文書に由来する任意の及びすべての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
【０１３６】
本明細書に事例的に記載する方法は、本明細書に特に開示されない、任意の１つの要素又は複数の要素、１つの制限又は複数の制限が存在しなくても、好適に実践できる。従って、例えば、用語「含む〔comprising〕」、「含む〔including〕」、「含有する〔containing〕」等は、拡大的及び非限定的に解釈されなければならない。更に、本明細書で採用されている用語及び表現は、制限の用語としてではなく、説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、提示及び記載された特性の任意の等価物又はその一部分を排除する意図は存在しない。様々な修正が、主張された本発明の範囲内で可能であると認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択的な特性により特別に開示されているが、本明細書に開示する本発明に取り込まれた本発明の修正及び変更は、当業者により実施可能であるものと理解し、またそのような修正及び変更は、本発明の範囲内であるとみなされるものと理解すべきである。
【０１３７】
本発明は、本明細書において広範且つ全体的に記載されている。一般的な開示の範囲に含まれるより狭い種及び亜属のグルーピングのそれぞれも、本方法の一部をなす。これには、属から主題のいずれかを除去する条件又は否定的限定を伴う方法の一般的な説明が、切り取られた題材が本明細書において特に列挙されるか、又はされないかを問わず含まれる。
【０１３８】
その他の実施形態は、下記の特許請求の範囲内に含まれる。更に、方法の特徴又は態様が、マーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、発明は、これにより、マーカッシュ群の個々のメンバー又はメンバーのサブグループのいずれについても記載されているものと認識する。
【図１】
2021518566.tif 000008
【図２】
2021518566.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2021518566.tif 000013
【図７】
2021518566.tif 000014
【配列表】
2021518566000001.app
【国際調査報告】
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2021518566.tif 000016
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