(57)【要約】  本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の産生において有用であるプラスミドの産生に関する。具体的には、本発明はｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を含む核酸分子であって、ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子の双方が同じプロモーターと機能的に関連する核酸分子を提供する。また本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞およびその使用のための方法も提供する。【選択図】２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子であって：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）ｃａｐ遺伝子、および
（ｉｉｉ）ｒｅｐ遺伝子を、
上記の５’→３’の順で含み、前記ｃａｐ遺伝子および前記ｒｅｐ遺伝子の双方が前記プロモーターと機能的に関連し、且つ前記ｒｅｐ遺伝子がＩＲＥＳとも機能的に関連する前記核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子であって：
（ａ）前記ｒｅｐ遺伝子がＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする；または
（ｂ）前記ｒｅｐ遺伝子がＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のうち１つ、２つ、または３つのみをコードする前記核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記ｒｅｐ遺伝子が：
（ａ）Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２をコードするが、Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ４０をコードしない；
（ｂ）Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０をコードするが、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ５２をコードしない；
（ｃ）Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２をコードするが、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ４０をコードしない；または
（ｄ）Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ４０をコードするが、Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ５２をコードしない前記核酸分子。
【請求項４】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の核酸分子であって、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０が前記プロモーターから転写されない前記核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子であって、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０がｐ１９プロモーターから転写される前記核酸分子。
【請求項６】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の核酸分子であって、前記ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の核酸配列がＡＡＶ  ｒｅｐまたはｃａｐ遺伝子、好ましくはＡＡＶ血清型２ｒｅｐまたはｃａｐ遺伝子に由来するかまたはこれより誘導される前記核酸分子。
【請求項７】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の核酸分子であって、前記プロモーターがサイトメガロウイルス即時初期（ＣＭＶ）プロモーターまたはこれより誘導されるプロモーターである前記核酸分子。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１つに記載の核酸分子であって、前記プロモーターが誘導可能プロモーターである前記核酸分子。
【請求項９】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の核酸分子であって、前記ＩＲＥＳがピコルナウイルスＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルス、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）またはアフトウイルスＩＲＥＳ（口蹄疫ウイルス、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ）またはその誘導体である前記核酸分子。
【請求項１０】
ＲＮＡ分子であって：
（ｉ）ｃａｐ遺伝子、および
（ｉｉ）ｒｅｐ遺伝子を、
上記の５’→３’の順で含み、前記ｒｅｐ遺伝子が前記ＩＲＥＳと機能的に関連する前記核酸分子。
【請求項１１】
請求項１から９のうちいずれか１つに定義される核酸分子を含むプラスミドまたはベクター。
【請求項１２】
キットであって
（ａ）請求項１１に記載のプラスミドまたはベクターを：
（ｂ）ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を含むＡＡＶ導入プラスミド；
（ｃ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡから選択される１つ以上の遺伝子を含むヘルパープラスミドの一方または双方と共に含む前記キット。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキットであって、前記ヘルパープラスミドがＥ２Ａ遺伝子を含まない前記キット。
【請求項１４】
キットであって
（ａ）請求項１１に定義されるプラスミドまたはベクターを、以下の一方または双方と共に含む前記キット：
（ｂ）ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を含むＡＡＶ導入プラスミド；
（ｃ）哺乳類宿主細胞（好ましくはＨＥＫ２９３）であって、前記宿主細胞ゲノムから発現可能であるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡから選択される１つ以上のウイルス遺伝子を含む前記宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載のキットであって、前記哺乳類宿主細胞が前記宿主細胞ゲノムから発現可能なＥ２Ａを含まない前記キット。
【請求項１６】
請求項１から９または１１のうちいずれか１つに記載の核酸分子、プラスミドまたはベクターを含む哺乳類細胞であって、好ましくは前記哺乳類細胞がヒト細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞またはその誘導株である前記細胞。
【請求項１７】
ＡＡＶ粒子の産生における請求項１６に記載の哺乳類細胞の使用。
【請求項１８】
ＡＡＶパッケージング細胞を生成するためのプロセスであって、前記プロセスが：
（ａ）哺乳類細胞に請求項１から９のうちいずれか１つに記載の核酸分子または請求項１１に記載のプラスミドまたはベクターを安定的に組込み、
それによりウイルスｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現する哺乳類細胞を生成するステップを含む前記プロセス。
【請求項１９】
ＡＡＶを産生するためのプロセスであって、前記プロセスが：
（ａ）導入遺伝子と隣接する５’−および３’−ＡＡＶ  ＩＴＲを含む導入プラスミドをＡＡＶパッケージング細胞に導入するステップであって、前記ＡＡＶパッケージング細胞が請求項１から９のうちいずれか１つに記載の核酸分子および前記導入プラスミドをパッケージングするのに十分な（好ましくはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡのうち１つ以上から選択される）ヘルパー遺伝子を含み、前記ヘルパー遺伝子が前記細胞内のエピソームヘルパープラスミドに存在するか、または前記パッケージング細胞ゲノムに組込まれる前記ステップ；
（ｂ）ＡＡＶが構築されて前記細胞から分泌されるような条件下で前記細胞を培養するステップ；および
（ｃ）上清からパッケージングされたＡＡＶを回収し、且つ任意に前記の回収したＡＡＶを精製するステップを含む前記プロセス。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプロセスであって、前記ヘルパー遺伝子がＥ２Ａ遺伝子を含まない前記プロセス。
【請求項２１】
請求項１９または請求項２０に記載のプロセスであって、前記導入遺伝子がＣＲＩＳＰＲ酵素（好ましくはＣａｓ９またはＣｐｆ１、またはその誘導体）またはＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡをコードする前記プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の産生において有用であるプラスミドの産生に関する。具体的には、本発明はｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を含む核酸分子であって、ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子の双方が同じプロモーターと機能的に関連する核酸分子を提供する。また本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞およびその使用のための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＡＶベクターは、パルボウイルス科に属する単鎖ＤＮＡウイルスから発生する。このウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の双方を含む幅広い宿主細胞に感染することが可能である。さらに、大半の患者において限定的な免疫応答のみを生成する非病原性ウイルスである。
【０００３】
ＡＡＶゲノムは、それぞれが複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする２つの遺伝子を含み：ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ生活環およびウイルスゲノムの部位特異的組込みに必要とされる非構造的タンパク質をコードし；またｃａｐ遺伝子は構造的カプシドタンパク質をコードする。さらに、これら２つの遺伝子は、ヘアピン構造を形成する能力を有し、１４５塩基からなる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する。これらのヘアピン配列は、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存的合成、およびウイルスＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込みに必要とされる。
【０００４】
ウイルスのあらゆる組込み能力を消失させるために、組換えＡＡＶベクターではウイルスゲノムのＤＮＡからｒｅｐおよびｃａｐを除去する。このようなベクターを産生するために、所望の導入遺伝子を、導入遺伝子の転写を駆動するプロモーターと共に、逆位末端反復（ＩＴＲ）間に挿入し；さらに第２のプラスミドにｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をトランスに提供する。アデノウイルスＥ４、Ｅ２ａおよびＶＡ遺伝子などのヘルパー遺伝子を提供する第３のプラスミドも用いられる。３つのプラスミドは、その後ＨＥＫ２９３などの培養「パッケージング」細胞に全てトランスフェクトされる。
【０００５】
最近数年の間に、ＡＡＶベクターは極めて有用且つ有望な遺伝子送達の様式として出現している。これは、これらのベクターの以下の特性によるものである：
−ＡＡＶは小型の無エンベロープウイルスであり、２つの固有遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ）のみを有する。したがって、それらは異なる遺伝子治療のためのベクターを発生するよう容易に操作することができる。
−ＡＡＶ粒子は剪断力、酵素または溶媒によって容易に分解されない。これは、これらのウイルスベクターの容易な精製および最終的な製剤化を円滑化する。
−ＡＡＶは非病原性であり且つ免疫原性が低い。さらに、これらのベクターを用いることにより、有害な炎症性反応のリスクが低減される。レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスなどの他のウイルスベクターと異なり、ＡＡＶは無害であり、何らかのヒト疾患を引き起こす原因とは考えられない。
−ＡＡＶベクターを用いて、最大４０００ｂｐの遺伝子配列を患者に送達することができる。
−野生型ＡＡＶベクターは、時にヒト第１９染色体に遺伝物質を挿入することが示されているものの、ウイルスゲノムからｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を除去することにより、この特性は大半のＡＡＶベクターから概ね消失している。そのような例においては、ウイルスは宿主細胞内部でエピソーム型を維持している。これらのエピソームは非分裂細胞において無変化であるが、分裂細胞においては細胞分裂時に失われる。
【０００６】
しかし発明者らは、ベクター産生プロセスの間に存在するＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の比率と量を最適化することによって、ＡＡＶベクターの産生のための方法を改善することが可能であることを認識している。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、本発明の目的の１つは、単一のプロモーターの制御下にあるｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を含む核酸分子を提供することであり；これによりＣａｐおよびＲｅｐポリペプチドが同じｍＲＮＡ内にコードされる。ｃａｐ遺伝子の翻訳は、ｃａｐ  ｍＲＮＡの５’末端にあるメチルグアニル酸ｃａｐ（ｍ７Ｇ）の、リボソームにおけるドッキングによって開始されるであろう。ｒｅｐ遺伝子の翻訳は、ｒｅｐ遺伝子の上流に配置された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）におけるリボソームのドッキングによって開始されるであろう。
【０００８】
本発明の核酸分子の使用により、より高いウイルス力価が得られることがある。
【０００９】
本発明の一部の実施形態においては、ＩＲＥＳで野生型ｐ５プロモーターを置換する。ｐ５プロモーターの除去のさらなる利点は、野生型ウイルスにおいてはｐ５プロモーターがＥ２Ａ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）と結合してこれにより活性化されることである。したがって、ｐ５プロモーターの除去は、ウイルス粒子の産生にＥ２Ａ遺伝子が必要とされないこと（ヘルパープラスミドにおいてなど）を意味する。
【００１０】
１つの実施形態において本発明は、核酸分子であって：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）ｃａｐ遺伝子、および
（ｉｉｉ）ｒｅｐ遺伝子を、
上記の５’−３’の順で含み、ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子の双方がプロモーターと機能的に関連し、且つｒｅｐ遺伝子がＩＲＥＳとも機能的に関連する核酸分子を提供する。
【００１１】
また本発明は、核酸分子であって：
（ｉ）ｃａｐ遺伝子、および
（ｉｉ）ｒｅｐ遺伝子を、
上記の５’−３’の順で含み、ｒｅｐ遺伝子がＩＲＥＳと機能的に関連する核酸分子も提供する。
【００１２】
核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡでありうる。核酸分子は単鎖または二重鎖、好ましくは二重鎖でありうる。
【００１３】
本発明の核酸分子はｒｅｐ遺伝子を含む。本願で用いる用語「ｒｅｐ遺伝子」は、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子であって、前記ＯＲＦのそれぞれがＡＡＶ  Ｒｅｐ非構造タンパク質、またはその変異体または誘導体をコードする遺伝子を意味する。これらのＡＡＶ  Ｒｅｐ非構造タンパク質（またはその変異体または誘導体）は、ＡＡＶゲノム複製および／またはＡＡＶゲノムパッケージングに関与する。
【００１４】
野生型ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の構成を例示する野生型ＡＡＶゲノムの構造を図１に示す。
【００１５】
野生型ｒｅｐ遺伝子は３つのプロモーター：ｐ５、ｐ１９およびｐ４０を含む。ｐ５およびｐ１９から長さの異なる２種類の重複メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を産生することができる。これらのｍＲＮＡのそれぞれは、スプライシングで除去されるか、単一のスプライスドナー部位を用いず２種類の異なるスプライスアクセプター部位を用いるイントロンを含有する。したがって、異なる６種類のｍＲＮＡを形成することが可能であり、そのうち４種類のみが機能的である。イントロンを除去できない２つのｍＲＮＡ（一方はｐ５から、もう一方はｐ１９から転写される）は、共有される転写終結配列までリードスルーされ、またそれぞれＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２をコードする。イントロンの除去および５’−末端スプライスアクセプター部位の使用では、機能的Ｒｅｐタンパク質の産生はもたらされず−残りの配列のフレームがシフトするため正しいＲｅｐ６８またはＲｅｐ４０タンパク質を産生することができず、またその転写終結コドンがスプライシングで除去されるためＲｅｐ７８またはＲｅｐ５２の正しいＣ末端が産生されることもないであろう。反対に、イントロンを除去して３’スプライスアクセプターを用いることによりＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０の正しいＣ末端が含まれる一方、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２の転写終結コドンがスプライシングで除去されるであろう。したがって、機能的なスプライシングのみが全てのイントロンをスプライシングで除去することを回避するか（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２を産生）、または３’スプライスアクセプターを使用する（Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０を産生）。その結果、これらのプロモーターからは重複配列を有する異なる４つの機能的Ｒｅｐタンパク質を合成することができる。
【００１６】
野生型ｒｅｐ遺伝子において、ｐ４０プロモーターは３’末端に位置する。Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）の転写は、野生型ＡＡＶゲノムではこのプロモーターによって開始される。
【００１７】
４種類の野生型タンパク質はＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０である。したがって、野生型ｒｅｐ遺伝子は、４種類のＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０コードするものである。
【００１８】
Ｒｅｐ７８および６８は、ＩＴＲによって形成されるヘアピンと特異的に結合し、ヘアピン内の特定の領域（すなわち末端分解部位）でこれを開裂することができる。野生型ウイルスにおいては、それらはＡＡＶゲノムのＡＡＶ特異的組込みにとっても必要である。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、野生型ウイルスにおいてはｐ５プロモーターの制御下で転写され、またそれらの間の差異はスプライシングによるイントロンの除去（または除去のないこと）を反映し、それゆえそれらは異なるＣ末端タンパク質組成を有する。
【００１９】
Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０はゲノムパッケージングに関与する。野生型ウイルスにおいては、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０はｐ１９プロモーターの制御下で転写され、またそれらの間の差異はスプライシングによるイントロンの除去（または除去のないこと）を反映し、それゆえそれらは異なるＣ末端タンパク質組成を有する。
【００２０】
４種類のＲｅｐタンパク質は、いずれもＡＴＰと結合し且つヘリカーゼ活性を有する。それらはｐ４０プロモーターからの転写をアップレギュレートするが、ｐ５およびｐ１９プロモーターはいずれもダウンレギュレートする。
【００２１】
本願で用いる用語「ｒｅｐ遺伝子」は、野生型ｒｅｐ遺伝子およびその誘導体；および同等の機能を有する人工的ｒｅｐ遺伝子を含む。
【００２２】
１つの実施形態においては、ｒｅｐ遺伝子は機能的Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする
【００２３】
この実施形態の好ましい実施例においては、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８が、５’をＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８  ＡＴＧ開始コドンにドッキングするリボソームによって翻訳されるので、これらのタンパク質の双方の産生を可能とする。この実施例においては、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８オープンリーディングフレームは、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０の双方の発現を提供する活性ｐ４０プロモーターを含む。
【００２４】
本発明の一部の実施形態においては、そのプロモーターからの望まれない転写の開始を防止するために、たとえばコドン変更および／またはＴＡＴＡボックスの除去などにより、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０プロモーターのうち１つ以上の機能が除去される／不能となる。
【００２５】
好ましくは、ｐ５プロモーターは非機能性である（すなわち転写の開始に用いることができない）。より好ましくは、ｐ５プロモーターはＩＲＥＳによって置換される（したがってｐ５プロモーターの機能を除去する）。これにより、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８がｃａｐ遺伝子と同じｍＲＮＡに転写されることが可能となるが、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質の翻訳はＩＲＥＳの制御下となるであろう
【００２６】
ｐ５プロモーターの除去のさらなる利点は、野生型ウイルスにおいてはｐ５プロモーターがＥ２Ａ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）と結合してこれにより活性化されることである。したがって、ｐ５プロモーターの除去は、ウイルス粒子の産生にＥ２Ａ遺伝子が必要とされないこと（ヘルパープラスミドにおいてなど）を意味する。
【００２７】
１つの実施形態においては、ｒｅｐ遺伝子の上流にｐ５プロモーターがない。他の実施形態においては、ｐ５プロモーターはＡＡＶパッケージングに用いられない。
【００２８】
好ましくは、ｒｅｐ遺伝子内のｐ１９プロモーターは機能的である。
【００２９】
一部の実施形態においては、ｐ４０プロモーターの機能は、Ｒｅｐ遺伝子内で１つ以上のコドン変更により除去される／不能にされる。
【００３０】
好ましくは、ｃａｐ遺伝子は再配置され、またその転写は代替的なプロモーター（ＣＭＶ即時初期プロモーターなど）の制御下におかれる。
【００３１】
異なるＲｅｐタンパク質の機能の間にはある程度の冗長性が存在するので、本発明の一部の実施形態においては、全てのＲｅｐタンパク質が必要とされるわけではない。
【００３２】
一部の実施形態においては、ｒｅｐ遺伝子はＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のうち１つ、２つ、３つまたは４つ、好ましくはＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のうち１つ、２つまたは４つのみをコードする。
【００３３】
一部の実施形態においては、ｒｅｐ遺伝子はＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のうち１つ以上をコードしない。
【００３４】
一部の実施形態においては、ｒｅｐ遺伝子はＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２をコードするが、Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ４０はコードしない。この実施形態においては、スプライスドナー部位はＤＮＡにとどまるが、５’および３’スプライスアクセプター部位は除去される。したがって、イントロンはスプライシングによって除去することができず、またＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２については転写終結配列まで転写が継続される（双方に共通）。Ｒｅｐ７８タンパク質はｃａｐ遺伝子と同じｍＲＮＡに転写され（したがって同じプロモーターによって駆動され）、またＲｅｐ７８の翻訳はＩＲＥＳによって駆動される。Ｒｅｐ５２の転写はｐ１９プロモーターによって駆動され；したがって別のｍＲＮＡを形成し、リボソームにおいて５’ｍ７Ｇ  ｃａｐ依存性ドッキングにより翻訳される。したがって、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０はこの実施形態において産生することができない。
【００３５】
他の実施形態においては、ｒｅｐ遺伝子はＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０をコードするが、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ５２はコードしない。この実施形態においては、スプライスドナーと３’スプライスアクセプターの間のイントロン配列はＤＮＡレベルで除去され、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０のＣ末端を上流のコード配列と共にフレーム内に配置させる。それゆえＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０が産生される（ただしＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２は産生されない）。明確にすると、Ｒｅｐ６８はＣａｐタンパク質と同じｍＲＮＡに転写され、且つＩＲＥＳの制御下で翻訳される。対照的に、Ｒｅｐ４０はｐ１９プロモーターによって別のｍＲＮＡに転写され、且つリボソームにおいて５’ｍ７Ｇ  ｃａｐドッキングにより翻訳される。
【００３６】
一部の実施形態においては、ｒｅｐ遺伝子はＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８をコードするが、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０はコードしない。これは、ｐ１９プロモーターを変異させることによって（ｐ１９  ＴＡＴＡボックスに変異を挿入するなど）達成しうる。
【００３７】
一部の実施形態においては、ｒｅｐ遺伝子はＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするが、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８はコードしない。これは、Ｒｅｐ５２／４０のＡＴＧ由来のコード配列を含めるだけで達成しうる。
【００３８】
上記で用いる用語「コードする」は、ｒｅｐ遺伝子がそのＲｅｐタンパク質の機能的形態をコードすることを意味する。同様に、用語「コードしない」は、ｒｅｐ遺伝子がそのＲｅｐタンパク質の機能的形態をコードしないことを意味する。
【００３９】
十分なＲｅｐタンパク質が欠如していると、パッケージングされるＩＴＲプラスミドがより少なく、また有効にパッケージングされないという事実により、低力価（ゲノムコピーなど）が観察されるであろう（これはｑＰＣＲによって判定可能である）。所見には、極度に高い空：充填粒子比率も含まれることもあり；これはＥＬＩＳＡまたは光学密度測定によって判定することが可能である。
【００４０】
野生型ＡＡＶ（血清型２）ｒｅｐ遺伝子ヌクレオチド配列を配列番号１に示す。野生型ＡＡＶ（血清型２）Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０アミノ酸配列を配列番号２、３、４および５にそれぞれ示す。Ｒｅｐ７８をコードする野生型ＡＡＶ（血清型２）ヌクレオチド配列を配列番号６に示す。Ｒｅｐ６８をコードする野生型ＡＡＶ（血清型２）ヌクレオチド配列を配列番号７に示す。Ｒｅｐ５２をコードする野生型ＡＡＶ（血清型２）ヌクレオチド配列を配列番号８に示す。Ｒｅｐ４０をコードする野生型ＡＡＶ（血清型２）ヌクレオチド配列を配列番号９に示す。
【００４１】
１つの実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ１つ以上のＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。
【００４２】
他の実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号６と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ機能的Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ５２ポリペプチドをコードする（且つ好ましくはＲｅｐ６８またはＲｅｐ４０ポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を意味する。
【００４３】
他の実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号７と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ機能的Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ４０ポリペプチドをコードする（且つ好ましくは機能的Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ５２ポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を意味する。
【００４４】
他の実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号８と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ機能的Ｒｅｐ５２ポリペプチドをコードする（且つ好ましくは機能的Ｒｅｐ７８ポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を意味する。
【００４５】
他の実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号９と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ機能的Ｒｅｐ４０ポリペプチドをコードする（且つ好ましくは機能的Ｒｅｐ６８ポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を意味する。
【００４６】
他の実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ機能的Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ５２ポリペプチドをコードする（且つ好ましくは機能的Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ４０ポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を意味する。
【００４７】
他の実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号３をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ機能的Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ４０ポリペプチドをコードする（且つ好ましくは機能的Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ５２ポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を意味する。
【００４８】
他の実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ機能的Ｒｅｐ５２ポリペプチドをコードする（且つ好ましくは機能的Ｒｅｐ７８ポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を意味する。
【００４９】
他の実施形態においては、用語「ｒｅｐ遺伝子」は、配列番号５をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し且つ機能的Ｒｅｐ４０ポリペプチドをコードする（且つ好ましくは機能的Ｒｅｐ６８ポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を意味する。
【００５０】
一部の実施形態においては、本発明の核酸分子は機能的Ｒｅｐ７８ポリペプチドをコードしない。一部の実施形態においては、本発明の核酸分子は機能的Ｒｅｐ６８ポリペプチドをコードしない。一部の実施形態においては、本発明の核酸分子は機能的Ｒｅｐ５２ポリペプチドをコードしない。一部の実施形態においては、本発明の核酸分子は機能的Ｒｅｐ４０ポリペプチドをコードしない。
【００５１】
核酸分子はｃａｐ遺伝子も含む。本願で用いる用語「ｃａｐ遺伝子」は、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子であって、前記ＯＲＦのそれぞれがＡＡＶ  Ｃａｐ構造タンパク質、またはその変異体または誘導体をコードする遺伝子を意味する。これらのＡＡＶ  Ｃａｐ構造タンパク質（またはその変異体または誘導体）は、ＡＡＶカプシドを形成する。
【００５２】
適切な細胞に感染することが可能である感染性ＡＡＶウイルス粒子の産生を可能とするには、３種類のＣａｐタンパク質が機能しなければならない。３種類のＣａｐタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３であり、それぞれのサイズは概ね８７ｋＤａ、７２ｋＤａおよび６２ｋＤａである。したがって、ｃａｐ遺伝子は３種類のＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするものである。
【００５３】
野生型ＡＡＶにおいては、これら３種類のタンパク質はｐ４０プロモーターから翻訳されて単一のｍＲＮＡを形成する。このｍＲＮＡが合成された後、長いイントロンまたは短いイントロンのいずれかを切り取り、２．３ｋｂまたは２．６ｋｂのｍＲＮＡの形成をもたらすことができる。
【００５４】
通常、特にアデノウイルスの存在下では、長いイントロンが切り取られる。この形態では、そこからＶＰ１タンパク質の合成が開始する第１ＡＵＧコドンが切り離され、ＶＰ１タンパク質合成の全般的なレベルの低下がもたらされる。残りの第１ＡＵＧコドンはＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかし、同じオープンリーディングフレーム内のそのコドンの上流には、最適なＫｏｚａｋコンテキストに囲まれたＡＣＧ配列（チロシンをコード）が位置する。これは、実際にはＶＰ１と同様に追加的Ｎ末端残基を伴うＶＰ３タンパク質である、ＶＰ２タンパク質の低い合成レベルに寄与する。
【００５５】
長いイントロンがスプライシングで除去される場合、またメジャースプライスにおいてＡＣＧコドンはより弱い翻訳開始シグナルであるので、ＡＡＶ構造タンパク質がインビボで合成される比率は約１：１：１０であり、成熟ウイルス粒子におけるものと同じである。ＶＰ１タンパク質のＮ末端にある特異なフラグメントは、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性を有することが示され、これはおそらく後期エンドソームからのＡＡＶ粒子の放出に必要とされる。
【００５６】
ＡＡＶカプシドは、比率１：１：１０で正二十面体対称に配列され、推定サイズが３．９ＭＤａである６０のカプシドタンパク質サブユニット（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）から構成される。
【００５７】
本願で用いる用語「ｃａｐ遺伝子」は、野生型ｃａｐ遺伝子およびその誘導体、および同等の機能を有する人工的ｃａｐ遺伝子を含む。ＡＡＶ（血清型２）ｃａｐ遺伝子ヌクレオチド配列およびＣａｐポリペプチド配列を配列番号１０および１１にそれぞれ示す。
【００５８】
本願で用いる用語「ｃａｐ遺伝子」は、好ましくは配列番号１０に示す配列を有するヌクレオチド配列または配列番号１１をコードするヌクレオチド配列、または配列番号１０と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性または配列番号１１をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有し、且つＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。
【００５９】
ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、好ましくはウイルス遺伝子であるかまたはウイルス遺伝子より誘導される。より好ましくは、それらはＡＡＶ遺伝子であるかまたはＡＡＶ遺伝子から誘導される。一部の実施形態においては、ＡＡＶはアデノ随伴デペンドパルボウイルスＡである。他の実施形態においては、ＡＡＶはアデノ随伴デペンドパルボウイルスＢである。
【００６０】
異なる１１種類のＡＡＶ血清型が知られている。全ての既知の血清型は、複数の多様な組織型に由来する細胞に感染することができる。組織特異性はカプシド血清型によって決定される。ＡＡＶは血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１に由来しうる。好ましくは、ＡＡＶは血清型１、２、５、６、７または８である。最も好ましくは、ＡＡＶ血清型は２（すなわちＡＡＶ２）である。
【００６１】
ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（およびそこにおけるタンパク質コードＯＲＦのそれぞれ）は、１つ以上の異なるウイルス（２、３または４種類の異なるウイルスなど）に由来することがある。たとえば、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来することがある一方で、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来することがある。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子はクレードおよび分離株によって異なることが、当業者により認識されている。このような全てのクレードおよび分離株に由来するこれらの遺伝子の配列は、その誘導体と共に本願に包含される。
【００６２】
ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子は、核酸中にこの５’→３’の順で存在する。しかし、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０はそれ自身のｐ１９プロモーターから転写されることがあるので、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０をコードするコード配列の位置は変動することがある。たとえば、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０をコードするコード配列は、ｃａｐ遺伝子およびＲｅｐ７８／６８をコードするｒｅｐ遺伝子の上流または下流；または実際には本発明の核酸の逆の鎖または異なる核酸上に配置されることもある。
【００６３】
ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、いずれも同じプロモーターと機能的に関連する。好ましくは、プロモーターはｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子の５’（すなわち上流）にある。一部の実施形態においては、プロモーターは構成的プロモーターである。他の実施形態においては、プロモーターは誘導可能であるかまたは抑制可能である。
【００６４】
構成的プロモーターの例は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ（ヒトまたはマウス）、ＨＳＶ  ＴＫ、ＳＦＦＶ、ユビキチン、延長因子α、ＣＨＥＦ−１、ＦｅｒＨ、Ｇｒｐ７８、ＲＳＶ、アデノウイルスＥ１Ａ、ＣＡＧまたはＣＭＶ−βグロビンプロモーター、またはこれから誘導されるプロモーターを含む。好ましくは、プロモーターはサイトメガロウイルス即時初期（ＣＭＶ）プロモーター、またはこれから誘導されるプロモーターであるか、またはヒト細胞およびヒト細胞株（ＨＥＫ２９３細胞など）におけるＣＭＶプロモーターと比較して同等またはより強度の高いプロモーターである。
【００６５】
一部の実施形態においては、プロモーターは誘導可能または抑制可能な調節（プロモーター）エレメントを含むことにより、誘導可能であるかまたは抑制可能である。たとえば、プロモーターはドキシサイクリン、テトラサイクリン、ＩＰＴＧまたはラクトースによって誘導可能なものであり得る。
【００６６】
好ましくは、誘導可能プロモーターエレメントは、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）がそこに結合することのできる複数のＴｅｔオペレーター配列を含む。結合状態においては、厳格な転写の抑制が得られる。しかし、ドキシサイクリン（より好ましくなくは、テトラサイクリン）の存在下では抑制が緩和されるので、プロモーターは完全な転写活性を得る。そのような誘導可能プロモーターエレメントは、好ましくはＣＭＶプロモーターなどのもう１つのプロモーターの下流に配置される。
【００６７】
ＴｅｔＲ結合部位は、その多くが技術上既知である野生型配列を有することがある。好ましくは、ＴｅｔＲ結合部位はわずかな配列変更を取り入れることによって１つ以上の改善を受けている。本発明の実施形態において用いることのできる好ましい変種は配列ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号１２）を有する。
【００６８】
ＴｅｔＲリプレッサータンパク質が使用するＴｅｔＲ結合配列変種と結合するのであれば、ＴｅｔＲタンパク質またはＴｅｔＲタンパク質の誘導体と結合するリプレッサーエレメントの代替的な変種も、本発明の実施形態において使用しうる。一部のリプレッサー／結合部位変種は、互いに対する親和性が野生型よりも高くなり；これらは本発明の実施形態の１つにおいて好ましい。
【００６９】
ＴｅｔＲ遺伝子は、概ねヒト（宿主）細胞の染色体に組込まれる。遺伝子は、ｃａｐまたはｒｅｐ遺伝子に隣接して、またはこれと連携して組込まれることもあれば、そうでないこともある。一部の実施形態においては、ＴｅｔＲ遺伝子はｃａｐ遺伝子またはｒｅｐ遺伝子と共発現する。
【００７０】
本発明の１つの実施形態においては、ＴｅｔＲタンパク質のヌクレオチド配列は配列番号１３に示すものであるか、またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、かつＴｅｔＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００７１】
本発明の他の実施形態においては、ＴｅｔＲタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１４に示すものであるか、またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、かつＴｅｔＲタンパク質をコードするアミノ酸配列である。
【００７２】
好ましくは、ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子と機能的に関連するプロモーターはＣＭＶ即時初期プロモーターまたはその誘導体である。一部の特に好ましい実施形態においては、プロモーターは国際公開第ＷＯ２０１７／１４９２９２号に定義されるプロモーター（より好ましくは、これにおいて「ｐ５６５」と定義されるプロモーター）である。好ましくは、ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子と機能的に関連するプロモーターはＡＡＶプロモーターでなく、たとえばＡＡＶ  ｐ５、ｐ１９またはｐ４０プロモーターでない。
【００７３】
ｃａｐ遺伝子の翻訳は、好ましくはｍＲＮＡの５‘末端において標準的な５’ｍ７Ｇ−ｃａｐから開始される。
【００７４】
ｒｅｐ遺伝子は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とも機能的に関連する。ＩＲＥＳはｒｅｐ  ｍＲＮＡの翻訳を調節する。ＩＲＥＳは、ｃａｐ非依存的翻訳と呼ばれるプロセスにおいて、真核細胞リボソームをｍＲＮＡに動員することが可能な、核酸分子の特異な領域である。ＩＲＥＳは一般にＲＮＡウイルスの５’−ＵＴＲに位置する。それらはウイルスＲＮＡの翻訳をｃａｐ非依存的に促進する。
【００７５】
ウイルスＩＲＥＳの例は、ピコルナウイルスＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルス、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）、アフトウイルスＩＲＥＳ（口蹄疫ウイルス、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、クリパウイルス配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｐａｄｉウイルス配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および即時初期転写物（ＩＲＥＳ）１の１．８ｋｂファミリー内５’−リーダーＩＲＥＳおよびシストロン間ＩＲＥＳを含む。
【００７６】
また本発明は、真核細胞リポソームをｍＲＮＡに動員する能力を保持した、上記のＩＲＥＳの非天然誘導体も包含する。一部の好ましい実施形態においては、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳである。本発明の１つの実施形態においては、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳのヌクレオチド配列は配列番号１５に示すものであるか、またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、かつＩＲＥＳをコードするヌクレオチド配列である。
【００７７】
他の実施形態においては、ＩＲＥＳは口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ＩＲＥＳである。本発明の１つの実施形態においては、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳのヌクレオチド配列は配列番号１６に示すものであるか、またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、かつＩＲＥＳをコードするヌクレオチド配列である。
【００７８】
ｒｅｐ遺伝子はＩＲＥＳと機能的に関連する。好ましくは、ＩＲＥＳはｃａｐ遺伝子の下流且つＲｅｐ７８／６８の翻訳開始部位の上流に位置する。
【００７９】
哺乳類培養における安定細胞株の生成には、典型的には、任意の外因的に添加されるＤＮＡを含有する細胞の増殖を促進する選択の方法が必要である。
【００８０】
好ましくは、本発明の核酸分子は選択遺伝子または抗生物質耐性遺伝子を追加的に含む。この目的を達成するために、それをコードするＤＮＡが哺乳類細胞ゲノムに挿入されるとき特定の化合物に対する耐性を提供する、多様な遺伝子が知られている。
【００８１】
好ましくは、選択遺伝子はピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｐｕｒｏ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｈｙｇｒｏ）、ブラストサイジンのデアミナーゼ（Ｂｌａｓｔ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳ）、ゼオシン耐性遺伝子（Ｓｈ  ｂｌｅ）またはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。これらの遺伝子のそれぞれは、哺乳類細胞に対して毒性であることがわかっている低分子に対する耐性を提供し、あるいはＧＳの場合は、増殖培地にグルタチオンが存在しない場合に、グルタチオンを産生する方法を細胞に提供する。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態においては、耐性遺伝子はＰｕｒｏである。一般的な組織培養に用いられる細胞株の多くがＰｕｒｏに対して耐性でないので、この遺伝子は特に有効であり；Ｎｅｏの場合は多くの、特にＨＥＫ２９３誘導株が、研究者らによる過去の遺伝子操作によってすでにＮｅｏ耐性となっているので（ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞など）、これが当てはまらない。Ｐｕｒｏ選択は、毒性である時間が短い（＜７２時間）という長所もあるので、変数を迅速に試験することが可能であり、且つゲノムに挿入しようとする外因性ＤＮＡを保持しない細胞は培養系から迅速に除去される。このことは、毒性の発現がより遅いＨｙｇｒｏなどの他の一部の選択方法には当てはまらない。
【００８３】
選択遺伝子（Ｐｕｒｏなど）を用いた安定細胞株の発生は、耐性遺伝子が必ず細胞で発現されることが要件である。これは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ開裂系、オルタナティブスプライシング、および専用プロモーターを含むがこれに限定されない多様な方法によって達成することができる。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態においては、選択遺伝子は専用プロモーターから発現される。このプロモーターは、ヒト細胞において、好ましくはｒｅｐまたはｃａｐ遺伝子を駆動する専用プロモーターよりも低いレベルで転写するであろう。
【００８５】
ポリペプチドまたはＲＮＡをコードする核酸分子内の各遺伝子は、好ましくは１つ以上の調節エレメントと機能的に関連するであろう。これにより、ポリペプチドまたはＲＮＡが所望のレベル且つ所望の時期に発現されることが担保される。この文脈において、用語「調節エレメント」はエンハンサー、プロモーター、イントロン、ｐｏｌｙＡ、インシュレーターまたは転写終結コドンのうち１つまたはそれ以上を含む。
【００８６】
本願に開示されるＡＡＶプラスミドまたはベクターに用いられるウイルスは、好ましくは、他の遺伝子への転写リードスルーを最小限とする取組みにおいて、ｐｏｌｙＡシグナルおよび／またはインシュレーターによって分離される。
【００８７】
同じ調節エレメント（プロモーター配列など）の複数のコピーを、２つ以上のポリペプチドまたはＲＮＡコードヌクレオチド配列と共に用いることにより（その協調発現という点で）いくつかの利点が得られるが、本発明の状況においては、各ポリペプチドまたはＲＮＡコードヌクレオチド配列と共に異なる調節エレメントを用いることが非常に望ましい。
【００８８】
したがって好ましくは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、異なるプロモーター、異なるイントロン、異なるｐｏｌｙＡ、異なるインシュレーターおよび／または異なる転写終結配列などの、異なる調節エレメントと機能的に関連する。より好ましくは、ｒｅｐプロモーターとｃａｐプロモーターの間のヌクレオチド配列同一性の度合いは９５％未満または９０％未満、より好ましくは８５％、８０％、７０％または６０％未満である。より好ましくは、ｒｅｐ転写終結コドンとｃａｐ転写終結コドンの間のヌクレオチド配列同一性の度合いは９５％未満または９０％未満、より好ましくは８５％、８０％、７０％または６０％未満である。こうして、これらの調節エレメント間の相同組換えのリスクが低減される。
【００８９】
本発明の核酸分子は、大半の実施形態で、ＡＡＶの産生に有用であるプラスミドまたはベクターであろう。したがって、大半の実施形態においては、本発明の核酸分子（またはそれを含むベクターまたはプラスミド）は逆位末端反復（ＩＴＲ）を含まないであろう。
【００９０】
一部の実施形態においては、本発明の核酸分子（またはそれを含むベクターまたはプラスミド）はアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４、Ｅ２ＡまたはＶＡから選択される１つ以上の遺伝子を含まないであろう。一部の好ましい実施形態においては、本発明の核酸分子（またはそれを含むベクターまたはプラスミドまたはプラスミド系）はアデノウイルスＥ２Ａ遺伝子を含まない。本願で用いる用語「Ｅ２Ａ」または「Ｅ２Ａ遺伝子」は、ウイルスＥ２Ａ遺伝子またはその変異体または誘導体を意味する。好ましくは、Ｅ２Ａ遺伝子はＡｄ５などのヒトアデノウイルスに由来するか、またはこれより誘導される。本発明の１つの実施形態においては、アデノウイルスＥ２Ａのヌクレオチド配列は配列番号１７に示すものであるか、またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、且つウイルスＤＮＡ複製の延伸を補助するＤＮＡ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００９１】
他の実施形態においては、本発明の核酸分子を含むプラスミドまたはベクターが提供される。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態の例は、以下のエレメントをこの順で含む核酸分子を含む：
ＣＭＶプロモーター−ＡＡＶ２  ｃａｐ遺伝子−ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ−ｒｅｐ遺伝子
ｐ５６５プロモーター−ＡＡＶ２  ｃａｐ遺伝子−ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ−ｒｅｐ遺伝子
ＣＭＶプロモーター−ＡＡＶ２  ｃａｐ遺伝子−ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ−ｒｅｐ遺伝子
【００９３】
一部の好ましい実施形態においては、用語「ｒｅｐ  ｇｅｎｅ」はＲｅｐ７８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０ポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。他の好ましい実施形態においては、用語「ｒｅｐ  ｇｅｎｅ」はＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２ポリペプチドをコードする（ただし好ましくは機能的Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ４０ポリペプチドをコードしない）遺伝子を意味する。
【００９４】
２つのアミノ酸または核酸配列を整合するために利用可能な数多くの確立されたアルゴリズムが存在する。典型的には、一方の配列が、被験配列と比較することのできる参照配列の機能を果たす。配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列と比較した被験配列の配列同一性百分率を算出する。比較を目的としたアミノ酸または核酸配列の整合は、たとえばコンピューター実装アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡまたはＴＦＡＳＴＡ）、またはＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムによって実施することができる。
【００９５】
アミノ酸配列同一性および核酸配列同一性の百分率は、ＢＬＡＳＴ整合法を用いて得ることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）、「ギャップＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新世代」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。好ましくは、標準またはデフォルト整合パラメーターを用いる。
【００９６】
標準タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）を用いて、タンパク質データベース内の類似した配列を発見することができる。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様に、ｂｌａｓｔｐは類似した局所領域を発見するよう設計されている。配列の類似性が全配列に及ぶ場合、ｂｌａｓｔｐは全般的整合も報告し、これはタンパク質同定の目的にとって好ましい結果である。好ましくは、標準またはデフォルト整合パラメーターを用いる。一部の場合では、「低複雑度フィルター」を外すこともある。
【００９７】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施することもある。比較を目的としたギャップ整合を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９の記載に従ってギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を利用することができる．またその代わりに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を用いて、分子間の遠隔関係を検出する累次検索を実施することができる。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）前掲を参照）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。
【００９８】
ヌクレオチド配列の比較については、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔおよびｂｌａｓｔｎを用いてこの目標を達成してもよい。好ましくは、標準またはデフォルト整合パラメーターを用いる。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、非常に類似した配列間で長い整合を効率よく発見するよう特に設計されている。不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを用いて、本発明の核酸と類似しているが、同一ではないヌクレオチド配列を発見することができる。
【００９９】
ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似した配列を発見する。プログラムは、始めにクエリワードとの完全な一致を特定する（ワードヒット）。次に、ＢＬＡＳＴプログラムはこれらのワードヒットを多段階で拡張し、最終ギャップ整合を生成する。一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。
【０１００】
ＢＬＡＳＴ検索の感度を支配する重要なパラメーターの１つはワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも感度が高い最も重要な理由は、より短いデフォルトワードサイズ（１１）を用いることである。このためｂｌａｓｔｎは、他の生物に由来する関連ヌクレオチド配列に対する整合の発見において、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも優れている。ｂｌａｓｔｎではワードサイズを調節することが可能であり、デフォルト値より短縮して最小で７とし、検索感度を高めることができる。
【０１０１】
新たに導入された不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔページを用いることにより、より感度の高い検索を遂行することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｎｅｗｓｌｔｒ／ＦａｌｌＷｉｎｔｅｒ０２／ｂｌａｓｔｌａｂ．ｈｔｍｌ）。このページはＭａ他によって報告されたもの（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００２Ｍａｒ；１８（３）：４４０−５）と同様のアルゴリズムを用いる。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔは、整合拡張のシードとして完全ワードマッチを必要とするのではなく、テンプレートのより長いウインドウ内で非連続ワードを用いる。コーディングモードでは、第１および第２コドン位置での一致の発見に集中する一方で第３の位置の不一致を無視することにより、第３塩基のゆれを考慮に入れる。同じワードサイズを用いた不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴにおける検索は、同じワードサイズを用いた標準的ｂｌａｓｔｎよりも感度および効率が高い。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔに固有のパラメーターは：ワードサイズ：１１または１２；テンプレート：１６、１８、または２１；テンプレートタイプ：コーディング（０）、非コーディング（１）、または両者（２）である。
【０１０２】
一部の実施形態においては、デフォルトパラメーターを用いたＢＬＡＳＴＰ  ２．５．０＋アルゴリズム（ＮＣＢＩから入手できるものなど）を用いることがある。他の実施形態においては、ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ１１およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎ１による２タンパク質配列のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ整合を用いたＢＬＡＳＴ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを用いることがある（ＮＣＢＩから入手できるものなど）。
【０１０３】
組換えＡＡＶの産生のための１つの方法は、ＡＡＶ産生に必要とされる全てのエレメントの、ＨＥＫ２９３細胞などの宿主細胞への一過性トランスフェクションに基づく。これは、３種類のプラスミドによるＡＡＶ産生細胞の共トランスフェクションを全般的に包含する。
（ａ）目的の遺伝子を担持するＡＡＶ  ＩＴＲ含有プラスミド；
（ｂ）ＡＡＶ  ｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子を担持するプラスミド；および
（ｃ）アデノウイルスから分離された必要なヘルパー遺伝子を提供するプラスミド。
【０１０４】
一部の場合においては、ヘルパー遺伝子は宿主細胞ゲノムに安定に組込まれ（且つこれより発現可能であり）；それゆえプラスミド（ｃ）は必要とされない。
【０１０５】
したがって本発明は：
（ａ）本発明の核酸分子を含むプラスミドまたはベクターを、以下のうち１つ以上−
（ｂ）ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を含むＡＡＶ導入プラスミド；
（ｃ）アデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４およびＶＡから選択される１つ以上の遺伝子を含むヘルパープラスミドと共に含むキットを提供する。
【０１０６】
本発明の一部の実施形態においては、ヘルパープラスミドはＥ２Ａ遺伝子を追加的に含む。他の実施形態においては、ヘルパープラスミドはＥ２Ａ遺伝子を含まない。後者の場合、Ｅ２Ａ遺伝子の脱落により、ヘルパープラスミドによって必要とされるＤＮＡの量が相当減少する。
【０１０７】
また本発明は：
（ａ）本発明の核酸分子を含むプラスミドまたはベクターを、以下のうち１つ以上−
（ｂ）ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を含むＡＡＶ導入プラスミド；
（ｃ）哺乳類宿主細胞（ＨＥＫ２９３など）ゲノムから発現可能である、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４およびＶＡから選択される１つ以上のウイルス遺伝子を含む宿主細胞と共に含むキットも含む。
【０１０８】
本発明の一部の実施形態においては、哺乳類宿主細胞は、宿主細胞ゲノムから発現可能なＥ２Ａ遺伝子を追加的に含む。他の実施形態においては、哺乳類宿主細胞はアデノウイルスＥ２Ａ遺伝子を含まない。
【０１０９】
またキットは、１本以上の遠心管、イオジキサノール、透析バッファーおよび透析カセットなどの、ウイルス粒子の密度バンディングおよび精製に関与するものなどの、ＡＡＶ粒子の精製のための材料も含む。
【０１１０】
また本発明は、本発明の核酸分子、プラスミドまたはベクターを含む哺乳類細胞も提供する。本発明の核酸分子は、哺乳類細胞の核ゲノムに安定的に組込まれるか、または細胞内のベクターまたはプラスミド（エピソームなど）内に存在しうる。
【０１１１】
好ましくは、本発明の核酸分子は、哺乳類細胞の核ゲノム内に安定的に組込まれる（且つこれよりｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が発現可能である）。
【０１１２】
細胞は、たとえば生存動物または哺乳動物に位置しない分離細胞であってもよい。哺乳類細胞の例は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、ウサギ、ロバ、ウマ、ヒツジ、ウシおよび類人猿に由来する任意の臓器または組織に由来するものを含む。好ましくは、細胞はヒト細胞である。細胞は初代細胞であっても不死化細胞であってもよい。
【０１１３】
好ましい細胞はＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ−２９３Ｅ、ＨＥＫ−２９３ＦＴ、ＨＥＫ−２９３Ｓ、ＨＥＫ−２９３ＳＧ、ＨＥＫ−２９３ＦＴＭ、ＨＥＫ−２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ−２９３Ａ、ＭＤＣＫ、Ｃ１２７、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、マウス骨髄腫、ＰｅｒＣ６、９１１およびＶｅｒｏ細胞株を含む。ＨＥＫ−２９３細胞はＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を含有するよう修飾されており、またこれにより、ヘルパープラスミドでこれらのタンパク質を供給する必要性がなくなる。同様に、ＰｅｒＣ６および９１１細胞は同様の修飾を含み、これもまた使用することができる。最も好ましくは、ヒト細胞はＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＰｅｒＣ６または９１１である。他の好ましい細胞はＣＨＯおよびＶＥＲＯ細胞を含む。
【０１１４】
好ましくは、本発明の細胞はｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を誘導可能に発現することが可能である。
【０１１５】
また本発明は、ＡＡＶパッケージング細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞）であって、（ａ）本発明の核酸分子、および任意に（ｂ）ＩＴＲと隣接する導入遺伝子を含むＡＡＶ導入プラスミド、および（ｃ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４およびＶＡから選択される１つ以上の遺伝子を含むヘルパープラスミドの一方または双方を含む細胞も提供する。本発明の一部の実施形態においては、ヘルパープラスミドはＥ２Ａ遺伝子を追加的に含む。他の実施形態においては、ヘルパープラスミドはＥ２Ａ遺伝子を含まない。後者の場合、Ｅ２Ａ遺伝子の脱落により、ヘルパープラスミドによって必要とされるＤＮＡの量が相当減少する。
【０１１６】
本発明の核酸分子、プラスミドおよびベクターは任意の適切な技術によって作製しうる。本発明の核酸分子およびパッケージング細胞の生成を目的とした組換え法は、技術上周知である（例『分子クローニング：実験室マニュアル』（第４版）、Ｇｒｅｅｎ，ＭＲとＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，（２０１４年更新））。
【０１１７】
本発明の核酸分子からのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現は、（本願の実施例に記載されるような）ｑＰＣＲによって１ｍＬあたりのゲノムコピー数を測定することなどによる、任意の適切な測定法によって測定することができる。
【０１１８】
さらなる実施形態においては、ＡＡＶパッケージング細胞を生成するためのプロセスであって、プロセスが：
（ａ）本発明の核酸分子を哺乳類細胞に安定的に組込み、それによりウイルスｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現する哺乳類細胞を生成するステップを含むプロセスが提供される。
【０１１９】
また本発明は、ＡＡＶ粒子の産生における本発明のＡＡＶパッケージング細胞の使用も提供する。
【０１２０】
また本発明は、ＡＡＶを産生するためのプロセスであって、プロセスが：
（ａ）導入遺伝子と隣接する５’−および３’−ＡＡＶ  ＩＴＲを含む導入プラスミドをＡＡＶパッケージング細胞に導入するステップであって、ＡＡＶパッケージング細胞が本発明の核酸分子、および導入プラスミドをパッケージングするのに十分な（好ましくはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４およびＶＡのうち１つ以上から選択される）ヘルパー遺伝子を含み、ヘルパー遺伝子が細胞内のエピソームヘルパープラスミドに存在するか、またはパッケージング細胞ゲノムに組込まれるステップ；
（ｂ）ＡＡＶが構築されて細胞から分泌されるような条件下で細胞を培養するステップ；および
（ｃ）上清からパッケージングされたＡＡＶを回収するステップを含むプロセスも提供する。
【０１２１】
本発明の一部の実施形態においては、ヘルパー遺伝子はＥ２Ａ遺伝子を追加的に含む。他の実施形態においては、前記ヘルパー遺伝子はＥ２Ａ遺伝子を含まない。
【０１２２】
好ましくは、回収されたＡＡＶは続いて精製される。
【０１２３】
本願で用いる用語である、１つ以上のプラスミドまたはベクターを細胞に「導入すること」は、形質転換、およびとりわけ任意の形態のエレクトロポレーション、コンジュゲーション、感染、形質導入、またはトランスフェクションを含む。
【０１２４】
一部の好ましい実施形態においては、導入遺伝子はＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）またはＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡをコードする。
【０１２５】
このような導入のプロセスは技術上周知である（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９５Ａｕｇ１；９２（１６）：７２９７−３０１など）。
【０１２６】
本願に記載された各参照文献の開示は、参照文献として本願にその全文を個別に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】野生型ＡＡＶゲノムにおけるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質遺伝子の構成を示す。
【図２Ａ】本発明の核酸分子の３つの実施形態を示す。図２Ｂにおいては、「ＯＸＧＰ３」は２つのＴｅｔオペレーター部位を有するＣＭＶプロモーター変異体を意味する。
【図２Ｂ】同上
【図２Ｃ】同上
【図３】多様なｒｅｐ−ｃａｐプラスミドでトランスフェクトした細胞において産生されたＡＡＶゲノムの、１ｍＬあたりのコピー数の測定の結果を示す。ＯｘＧ＝遠位に配置されたｐ５プロモーターを含む、野生型ウイルスにみられるような標準的ＲｅｐＣａｐ構造；ＣＭＶ−ＣＭＶ＝ＲｅｐおよびＣａｐ配列の双方がＣＭＶプロモーターの下で５’−３’順にＣＭＶ−Ｃａｐ−ＣＭＶ−Ｒｅｐと配置されている構造；ＣＭＶ−ＰＧＫ＝ＲｅｐおよびＣａｐ配列が、それぞれＰＧＫおよびＣＭＶプロモーターの下で５’−３’順にＣＭＶ−Ｃａｐ−ＰＧＫ−Ｒｅｐと配置される構造；ＣＭＶ−ＥＭＣＶ＝Ｃａｐ配列がＣＭＶプロモーターの下にあり且つＲｅｐ配列がＩＲＥＳ  ＥＭＣＶの制御下にあって５’−３’順にＣＭＶ−Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−Ｒｅｐと配置される構造。図４では、ウイルスを含有する細胞ライセートを５００倍希釈し、ｑＰＣＲを用いて定量した。これは物理的力価を示す。
【図４】同上
【図５】ＡＡＶ粒子感染７２時間後におけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析後の結果を示す。データは、Ｐ１におけるＧＦＰ陽性細胞の百分率として示す。Ｐ１はサンプル中の生存可能細胞に対応する。
【図６】図５の結果および感染細胞数により算出した、感染ウイルスサンプル１ｍＬあたりの形質導入単位を示す。これは感染力価を示す。
【図７】多様なｒｅｐ−ｃａｐプラスミドでトランスフェクトした細胞において産生されたＡＡＶゲノムの、１ｍＬあたりのコピー数の測定の結果を示す。プラスミドの詳細については、上記の図３〜４を参照されたい。Ｃｌｏｎｔｅｃｈは、クロンテックより供給される３プラスミド系を意味する（ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ；ｐＨｅｌｐｅｒ；ｐＲｅｐＣａｐ−ｍｉＲ３４２）。
【図８】ａ）本発明の３プラスミドＡＡＶ系；ｂ）ｐＳＦ−ヘルパープラスミドがＣＭＶ−Ｅ４ｏｒｆ６（コード配列）のみを含むプラスミドで置換えられたａ）の系；ｃ）ｐＳＦ−ヘルパープラスミドがｐＳＦ−Ｅ４ｏｒｆ６−ＶＡＩで置換えられたａ）の系；およびｄ）ｐＳＦ−ヘルパープラスミドが除去され且つスタッファーＤＮＡで置き換えられたａ）の系（対照）から産生されるウイルスから得られる力価（ＧＣ、ゲノムコピー）を示す。
【実施例】
【０１２８】
本発明は以下の実施例によってさらに例示され、別段の言及がない限りその割合および百分率は重量によるものであり、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示を目的としてのみ提示されることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例により、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その主旨および範囲を逸脱することなく、本発明に多様な変更および変法を行って多様な用途および条件に適合させることができる。したがって、本願に提示および記載するものに加えて、本発明の多様な変法が、先行する記述により当業者に明らかになるであろう。そのような変法もまたは付属の請求項の範囲内となることを意図している。
【実施例１】
【０１２９】
（ＡＡＶ  ｃａｐ−ｒｅｐプラスミドの産生）
図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示す遺伝因子を有する以下のプラスミドが産生された：
ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＡＡＶ２Ｃａｐ−ＦＭＤＶ−ＡＡＶ２Ｒｅｐ
ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＡＡＶ２Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−ＡＡＶ２Ｒｅｐ
ｐＳＦ−ｐ５６５＿２ｘＴｅｔＯ−ＡＡＶ２Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−ＡＡＶ２Ｒｅｐ
【０１３０】
ＯｘＧＰ３プロモーターは、国際公開第２０１７／１４９２９２号に定義されるｐ５６５プロモーターである。ＦＭＤＶは口蹄疫ウイルスＩＲＥＳである。ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターである。ＡＡＶ２Ｃａｐ  はアデノ随伴ウイルス２  ｃａｐ遺伝子である。Ｒｅｐは、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２のみをコードするアデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子である。
【０１３１】
（ｐＳＦ−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ）
このプラスミドは、ＣＭＶプロモーターによって駆動され、２つのＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に隣接し、ＩＴＲ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＴＲ配列のＡＡＶカプシドシェルへのパッケージングを可能とするＥＧＦＰタンパク質をコードする。
【０１３２】
（ｐＳＦ−ヘルパー）
このプラスミドは、アデノウイルス５配列Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡＩ  ＲＮＡを含み、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ産生に必要とされるヘルパー機能を提供する。
【０１３３】
（ｐＳＦ−ＲｅｐＣａｐ）
このプラスミドは、野生型構造のＲｅｐＣａｐ配列を含み、Ｒｅｐ７８／６８の全体的発現を低下させるためにｐ５プロモーターが削除されて遠位に配置されている。
【０１３４】
（ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＣＭＶ−Ｒｅｐ７８／５２）
このプラスミドは、ＣＭＶによって駆動されるＣａｐ配列、およびＣＭＶプロモーターによって別に駆動されるＲｅｐ７８／５２配列を含む。これは、２つのコード配列の同等に強い発現をもたらす。
【０１３５】
（ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＰＧＫ−Ｒｅｐ７８／５２）
このプラスミドは、ＣＭＶによって駆動されるＣａｐ配列、およびＰＧＫプロモーターによって別に駆動されるＲｅｐ７８／５２配列を含み、これはＣＭＶプロモーターよりも低い発現をもたらす。
【０１３６】
（ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−Ｒｅｐ７８／５２）
このプラスミドは、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＣａｐ配列、およびＩＲＥＳ  ＥＭＣＶより産生されるＲｅｐ７８／５２タンパク質を含む。ＥＭＣＶは、ＣＭＶプロモーターよりもさらに低い発現レベルをもたらす
【実施例２】
【０１３７】
（ゲノムコピー（ＧＣ）を測定すること）
プラスミドベクターｐＳＦ−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＳＦ−ヘルパーおよび：ｐＳＦ−ＲｅｐＣａｐ；ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＣＭＶ−Ｒｅｐ７８／５２；ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＰＧＫ−Ｒｅｐ７８／５２またはｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−Ｒｅｐ７８／５２のうち１つを、６ウェルプレート内の＞８０％コンフルエントＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、総ＤＮＡが２．５μｇ／ウェルとなるよう、１：１：１モル比でトランスフェクトした。トランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００を、リポフェクタミンに対する総ＤＮＡ質量比率１：２．４で用いた。４８時間後にウェルの全内容物を回収し、フローサイトメトリーおよびｑＰＣＲの双方で分析した。データは、ライセート１ｍＬあたりの形質導入単位（ＴＵ）（図６）およびライセート１ｍＬあたりのゲノムコピー（図３〜４）の双方で提示する。
【０１３８】
プラスミドｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−Ｒｅｐ７８／５２を用いることにより、感染力価および物理的力価は、いずれもＯｘＧ陽性対照において用いた野生型構造と比較して改善した。
【０１３９】
図５は、ＡＡＶによるインキュベーションの７２時間後にＧＦＰ陽性である生存可能細胞の百分率を示す。ウイルス溶液を１→５００、１→２５００、および１→１２５００に希釈した。５％と２５％の間のＧＦＰ陽性細胞をもたらす希釈を用いて、ウイルス溶液１ｍＬあたりの形質導入単位を算出した。
【実施例３】
【０１４０】
プラスミドベクターｐＳＦ−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＳＦ−ヘルパーおよび：ｐＳＦ−ＲｅｐＣａｐ；ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−Ｒｅｐ７８／５２またはｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＦＭＤＶ−Ｒｅｐ７８／５２のうち１つを、６ウェルプレート内の７０〜８０％コンフルエントＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、総ＤＮＡが２．５μｇ／ウェルとなるよう、１：１：１モル比でトランスフェクトした。これは、クロンテック３−プラスミド系（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＧＢ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｖｉｒａｌ＿Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ／ＡＡＶ＿Ｖｅｃｔｏｒ＿Ｓｙｓｔｅｍｓ／Ｈｅｌｐｅｒ＿Ｆｒｅｅ＿Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿Ｓｙｓｔｅｍ？ｓｉｔｅｘ＝１００３０：２２３７２：ＵＳ）に沿って実行し、総ＤＮＡ質量２．５μｇとなるようモル比１：１：１でトランスフェクトした。リポフェクタミンに対する総ＤＮＡ質量比率１：２．４で用いたトランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００。４８時間後にウェルの全内容物を回収し、ｑＰＣＲで分析した。データはライセート１ｍＬあたりのゲノムコピーとして提示し（図７）、誤差棒は平均値の標準誤差を表した。
【０１４１】
この実験は、ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−Ｒｅｐ７８／５２が、ｐＳＦ−ＲｅｐＣａｐおよびクロンテックｐＲｅｐＣａｐ−ｍｉＲ３４２の双方で用いられる標準的な野生型構造よりも、高い信頼度で優れていることを示す。代替的なＩＲＥＳであるＦＭＤＶを用いることで、野生型構造と比較してウイルス力価が上昇することも示す。
【実施例４】
【０１４２】
（Ｅ２Ａを用いることなく高い力価が得られる）
本発明のＡＡＶ産生系からのＥ２Ａの有無の影響を、Ａｄ５  Ｅ２Ａ遺伝子を含む／含まないプラスミド群を用いて判定した。
【０１４３】
全ての実験には以下のプラスミドを含めた：
（ｉ）実施例１に定義するｐＳＦ−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ。
（ｉｉ）ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｃａｐ−ＥＭＣＶ−Ｒｅｐ。このプラスミドはＣＭＶプロモーターによって駆動されるＣａｐ配列、およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳより産生されるＲｅｐタンパク質を含む。
【０１４４】
上記の（ｉ）および（ｉｉ）に加えて、続く実験には以下のプラスミドを含めた：
ａ）ｐＳＦ−ヘルパー（これはＡｄ５領域Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ  ＲＮＡ  Ｉを含む）；
ｂ）ｐＳＦ−ｎａｎｏ−ＣＭＶ−Ｅ４ｏｒｆ６（これはＥ４ｏｒｆ６タンパク質のコード配列のみを含む）；
ｃ）ｐＳＦ−Ｅ４ｏｒｆ６−ＶＡ  Ｉ（これはＥ４ｏｒｆ６領域全体およびＶＡ  ＲＮＡ  Ｉ配列全体を含む）；および
ｄ）ＯＧ１０（これは空のｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｋａｎである）。
【０１４５】
結果は図８に示し、実験ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）を（ゲノムコピー／ｍＬとして）それぞれ「ＯｘＧ  Ｐｒｏ」、「Ｅ４Ｏｒｆ６／Ｐｒｏ」、「ｎｏ  Ｅ２Ａ」および「ｎｏ  Ａｄ５  Ｈｅｌｐ」とラベリングして示す。
【０１４６】
結果より、ＡＡＶ産生系において、本発明のＣａｐ／Ｒｅｐプラスミドを用いてＥ２Ａを用いないことにより、より高いウイルス力価を得ることができることが示される。
【０１４７】
［配列表］
配列番号１−Ｒｅｐヌクレオチド配列（ＡＡＶ血清型２）
atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaaTAG
【０１４８】
配列番号２−Ｒｅｐ７８アミノ酸配列（ＡＡＶ血清型２）
MPGFYEIVIKVPSDLDGHLPGISDSFVNWVAEKEWELPPDSDMDLNLIEQAPLTVAEKLQRDFLTEWRRVSKAPEALFFVQFEKGESYFHMHVLVETTGVKSMVLGRFLSQIREKLIQRIYRGIEPTLPNWFAVTKTRNGAGGGNKVVDECYIPNYLLPKTQPELQWAWTNMEQYLSACLNLTERKRLVAQHLTHVSQTQEQNKENQNPNSDAPVIRSKTSARYMELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRYQNKCSRHVGMNLMLFPCRQCERMNQNSNICFTHGQKDCLECFPVSESQPVSVVKKAYQKLCYIHHIMGKVPDACTACDLVNVDLDDCIFEQ*
【０１４９】
配列番号３−Ｒｅｐ６８アミノ酸配列（ＡＡＶ血清型２）
MPGFYEIVIKVPSDLDEHLPGISDSFVNWVAEKEWELPPDSDMDLNLIEQAPLTVAEKLQRDFLTEWRRVSKAPEALFFVQFEKGESYFHMHVLVETTGVKSMVLGRFLSQIREKLIQRIYRGIEPTLPNWFAVTKTRNGAGGGNKVVDECYIPNYLLPKTQPELQWAWTNMEQYLSACLNLTERKRLVAQHLTHVSQTQEQNKENQNPNSDAPVIRSKTSARYMELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYAD*
【０１５０】
配列番号４−Ｒｅｐ５２アミノ酸配列（ＡＡＶ血清型２）
MELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRYQNKCSRHVGMNLMLFPCRQCERMNQNSNICFTHGQKDCLECFPVSESQPVSVVKKAYQKLCYIHHIMGKVPDACTACDLVNVDLDDCIFEQ*
【０１５１】
配列番号５−Ｒｅｐ４０アミノ酸配列（ＡＡＶ血清型２）
MELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRLARGHSL*
【０１５２】
配列番号６−Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列（ＡＡＶ血清型２）
atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgggcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtacctcagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaaTAG
【０１５３】
配列番号７−Ｒｅｐ６８ヌクレオチド配列（ＡＡＶ血清型２）
ATGCCGGGGTTTTACGAGattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtGGACTAATATGGAACAGTACCTCAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacagTAG
【０１５４】
配列番号８−Ｒｅｐ５２ヌクレオチド配列：
CATGGAGCTGGTCGGGTGGctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgaCTGCATCTTTGAACAATAG
【０１５５】
配列番号９−Ｒｅｐ４０ヌクレオチド配列
ATGGAGCTGGTCGGGTGGctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacagattggctcgaggacactctctcTAG
【０１５６】
配列番号１０−Ｃａｐヌクレオチド配列（ＡＡＶ血清型２）
CagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaA
【０１５７】
配列番号１１−Ｃａｐアミノ酸配列（ＡＡＶ血清型２）
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*
【０１５８】
配列番号１２：ＴｅｔＲ結合部位
tccctatcagtgatagaga 
【０１５９】
配列番号１３：ＴｅｔＲタンパク質のヌクレオチド配列
Atgtcgcgcctggacaaaagcaaagtgattaactcagcgctggaactgttgaatgaggtgggaattgaaggactcactactcgcaagctggcacagaagctgggcgtcgagcagccaacgctgtactggcatgtgaagaataaacgggcgctcctagacgcgcttgccatcgaaatgctggaccgccatcacacccacttttgccccctggagggcgaatcctggcaagattttctgcggaacaatgcaaagtcgttccggtgcgctctgctgtcccaccgcgatggcgcaaaagtgcacctgggcactcggcccaccgagaaacaatacgaaaccctggaaaaccaactggctttcctttgccaacagggattttcactggagaatgccctgtacgcactatccgcggtcggccactttaccctgggatgcgtcctcgaagatcaggagcaccaagtcgccaaggaggaaagagaaactcctaccactgactcaatgcctccgctcctgagacaagccatcgagctgttcgaccaccagggtgctgaacctgcatttctgttcgggcttgaactgattatctgcggcctggagaaacagttgaagtgcgagtcgggatcctag 
【０１６０】
配列番号１４：ＴｅｔＲタンパク質のアミノ酸配列
MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGS
【０１６１】
配列番号１５：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ
CGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCCCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGAC
【０１６２】
配列番号１６：ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ
AGCAGGTTTCCCCAACTGACACAAAACGTGCAACTTGAAACTCCGCCTGGTCTTTCCAGGTCTAGAGGGGTAACACTTTGTACTGCGTTTGGCTCCACGCTCGATCCACTGGCGAGTGTTAGTAACAGCACTGTTGCTTCGTAGCGGAGCATGACGGCCGTGGGAACTCCTCCTTGGTAACAAGGACCCACGGGGCCAAAAGCCACGCCCACACGGGCCCGTCATGTGTGCAACCCCAGCACGGCGACTTTACTGCGAAACCCACTTTAAAGTGACATTGAAACTGGTACCCACACACTGGTGACAGGCTAAGGATGCCCTTCAGGTACCCCGAGGTAACACGCGACACTCGGGATCTGAGAAGGGGACTGGGGCTTCTATAAAAGCGCTCGGTTTAAAAAGCTTCTATGCCTGAATAGGTGACCGGAGGTCGGCACCTTTCCTTTGCAATTACTGACCAC
【０１６３】
配列番号１７：Ａｄ５  Ｅ２Ａ
GGTACCCAACTCCATGCTCAACAGTCCCCAGGTACAGCCCACCCTGCGTCGCAACCAGGAACAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCACTCGCCCTACTTCCGCAGCCACAGTGCGCAGATTAGGAGCGCCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGAGACACTTTCAATAAAGGCAAATGCTTTTATTTGTACACTCTCGGGTGATTATTTACCCCCACCCTTGCCGTCTGCGCCGTTTAAAAATCAAAGGGGTTCTGCCGCGCATCGCTATGCGCCACTGGCAGGGACACGTTGCGATACTGGTGTTTAGTGCTCCACTTAAACTCAGGCACAACCATCCGCGGCAGCTCGGTGAAGTTTTCACTCCACAGGCTGCGCACCATCACCAACGCGTTTAGCAGGTCGGGCGCCGATATCTTGAAGTCGCAGTTGGGGCCTCCGCCCTGCGCGCGCGAGTTGCGATACACAGGGTTGCAGCACTGGAACACTATCAGCGCCGGGTGGTGCACGCTGGCCAGCACGCTCTTGTCGGAGATCAGATCCGCGTCCAGGTCCTCCGCGTTGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTAGCTGCCTTCCCAAAAAGGGCGCGTGCCCAGGCTTTGAGTTGCACTCGCACCGTAGTGGCATCAAAAGGTGACCGTGCCCGGTCTGGGCGTTAGGATACAGCGCCTGCATAAAAGCCTTGATCTGCTTAAAAGCCACCTGAGCCTTTGCGCCTTCAGAGAAGAACATGCCGCAAGACTTGCCGGAAAACTGATTGGCCGGACAGGCCGCGTCGTGCACGCAGCACCTTGCGTCGGTGTTGGAGATCTGCACCACATTTCGGCCCCACCGGTTCTTCACGATCTTGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTTTCGCTCGTCACATCCATTTCAATCACGTGCTCCTTATTTATCATAATGCTTCCGTGTAGACACTTAAGCTCGCCTTCGATCTCAGCGCAGCGGTGCAGCCACAACGCGCAGCCCGTGGGCTCGTGATGCTTGTAGGTCACCTCTGCAAACGACTGCAGGTACGCCTGCAGGAATCGCCCCATCATCGTCACAAAGGTCTTGTTGCTGGTGAAGGTCAGCTGCAACCCGCGGTGCTCCTCGTTCAGCCAGGTCTTGCATACGGCCGCCAGAGCTTCCACTTGGTCAGGCAGTAGTTTGAAGTTCGCCTTTAGATCGTTATCCACGTGGTACTTGTCCATCAGCGCGCGCGCAGCCTCCATGCCCTTCTCCCACGCAGACACGATCGGCACACTCAGCGGGTTCATCACCGTAATTTCACTTTCCGCTTCGCTGGGCTCTTCCTCTTCCTCTTGCGTCCGCATACCACGCGCCACTGGGTCGTCTTCATTCAGCCGCCGCACTGTGCGCTTACCTCCTTTGCCATGCTTGATTAGCACCGGTGGGTTGCTGAAACCCACCATTTGTAGCGCCACATCTTCTCTTTCTTCCTCGCTGTCCACGATTACCTCTGGTGATGGCGGGCGCTCGGGCTTGGGAGAAGGGCGCTTCTTTTTCTTCTTGGGCGCAATGGCCAAATCCGCCGCCGAGGTCGATGGCCGCGGGCTGGGTGTGCGCGGCACCAGCGCGTCTTGTGATGAGTCTTCCTCGTCCTCGGACTCGATACGCCGCCTCATCCGCTTTTTTGGGGGCGCCCGGGGAGGCGGCGGCGACGGGGACGGGGACGACACGTCCTCCATGGTTGGGGGACGTCGCGCCGCACCGCGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCGACTGGCCATTTCCTTCTCCTATAGGCAGAAAAAGATCATGGAGTCAGTCGAGAAGAAGGACAGCCTAACCGCCCCCTCTGAGTTCGCCACCACCGCCTCCACCGATGCCGCCAACGCGCCTACCACCTTCCCCGTCGAGGCACCCCCGCTTGAGGAGGAGGAAGTGATTATCGAGCAGGACCCAGGTTTTGTAAGCGAAGACGACGAGGACCGCTCAGTACCAACAGAGGATAAAAAGCAAGACCAGGACAACGCAGAGGCAAACGAGGAACAAGTCGGGCGGGGGGACGAAAGGCATGGCGACTACCTAGATGTGGGAGACGACGTGCTGTTGAAGCATCTGCAGCGCCAGTGCGCCATTATCTGCGACGCGTTGCAAGAGCGCAGCGATGTGCCCCTCGCCATAGCGGATGTCAGCCTTGCCTACGAACGCCACCTATTCTCACCGCGCGTACCCCCCAAACGCCAAGAAAACGGCACATGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCCGTATTTGCCGTGCCAGAGGTGCTTGCCACCTATCACATCTTTTTCCAAAACTGCAAGATACCCCTATCCTGCCGTGCCAACCGCAGCCGAGCGGACAAGCAGCTGGCCTTGCGGCAGGGCGCTGTCATACCTGATATCGCCTCGCTCAACGAAGTGCCAAAAATCTTTGAGGGTCTTGGACGCGACGAGAAGCGCGCGGCAAACGCTCTGCAACAGGAAAACAGCGAAAATGAAAGTCACTCTGGAGTGTTGGTGGAACTCGAGGGTGACAACGCGCGCCTAGCCGTACTAAAACGCAGCATCGAGGTCACCCACTTTGCCTACCCGGCACTTAACCTACCCCCCAAGGTCATGAGCACAGTCATGAGTGAGCTGATCGTGCGCCGTGCGCAGCCCCTGGAGAGGGATGCAAATTTGCAAGAACAAACAGAGGAGGGCCTACCCGCAGTTGGCGACGAGCAGCTAGCGCGCTGGCTTCAAACGCGCGAGCCTGCCGACTTGGAGGAGCGACGCAAACTAATGATGGCCGCAGTGCTCGTTACCGTGGAGCTTGAGTGCATGCAGCGGTTCTTTGCTGACCCGGAGATGCAGCGCAAGCTAGAGGAAACATTGCACTACACCTTTCGACAGGGCTACGTACGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTCTGCAACCTGGTCTCCTACCTTGGAATTTTGCACGAAAACCGCCTTGGGCAAAACGTGCTTCATTCCACGCTCAAGGGCGAGGCGCGCCGCGACTACGTCCGCGACTGCGTTTACTTATTTCTATGCTACACCTGGCAGACGGCCATGGGCGTTTGGCAGCAGTGCTTGGAGGAGTGCAACCTCAAGGAGCTGCAGAAACTGCTAAAGCAAAACTTGAAGGACCTATGGACGGCCTTCAACGAGCGCTCCGTGGCCGCGCACCTGGCGGACATCATTTTCCCCGAACGCCTGCTTAAAACCCTGCAACAGGGTCTGCCAGACTTCACCAGTCAAAGCATGTTGCAGAACTTTAGGAACTTTATCCTAGAGCGCTCAGGAATCTTGCCCGCCACCTGCTGTGCACTTCCTAGCGACTTTGTGCCCATTAAGTACCGCGAATGCCCTCCGCCGCTTTGGGGCCACTGCTACCTTCTGCAGCTAGCCAACTACCTTGCCTACCACTCTGACATAATGGAAGACGTGAGCGGTGACGGTCTACTGGAGTGTCACTGTCGCTGCAACCTATGCACCCCGCACCGCTCCCTGGTTTGCAATTCGCAGCTGCTTAACGAAAGTCAAATTATCGGTACCTTTGAGCTGCAGGGTCCCTCGCCTGACGAAAAGTCCGCGGCTCCGGGGTTGAAACTCACTCCGGGGCTGTGGACGTCGGCTTACCTTCGCAAATTTGTACCTGAGGACTACCACGCCCACGAGATTAGGTTCTACGAAGACCAATCCCGCCCGCCTAATGCGGAGCTTACCGCCTGCGTCATTACCCAGGGCCACATTCTTGGCCAATTGCAAGCCATCAACAAAGCCCGCCAAGAGTTTCTGCTACGAAAGGGACGGGGGGTTTACTTGGACCCCCAGTCCGGCGAGGAGCTCAACCCAATCCCCCCGCCGCCGCAGCCCTATCAGCAGCAGCCGCGGGCCCTTGCTTCCCAGGATGGCACCCAAAAAGAAGCTGCAGCTGCCGCCGCCACCCACGGACGAGGAGGAATACTGGGACAGTCAGGCAGAGGAGGTTTTGGACGAGGAGGAGGAGGACATGATGGAAGACTGGGAGAGCCTAGACGAGGAAGCTTCCGAGGTCGAAGAGGTGTCAGACGAAACACCGTCACCCTCGGTCGCATTCCCCTCGCCGGCGCCCCAGAAATCGGCAACCGGTTCCAGCATGGCTACAACCTCCGCTCCTCAGGCGCCGCCGGCACTGCCCGTTCGCCGACCCAACCGTAGATGGGACACCACTGGAACCAGGGCCGGTAAGTCCAAGCAGCCGCCGCCGTTAGCCCAAGAGCAACAACAGCGCCAAGGCTACCGCTCATGGCGCGGGCACAAGAACGCCATAGTTGCTTGCTTGCAAGACTGTGGGGGCAACATCTCCTTCGCCCGCCGCTTTCTTCTCTACCATCACGGCGTGGCCTTCCCCCGTAACATCCTGCATTACTACCGTCATCTCTACAGCCCATACTGCACCGGCGGCAGCGGCAGCAACAGCAGCGGCCACACAGAAGCAAAGGCGACCGGATAGCAAGACTCTGACAAAGCCCAAGAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGCAGGAGGAGGAGCGCTGCGTCTGGCGCCCAACGAACCCGTATCGACCCGCGAGCTTAGAAACAGGATTTTTCCCACTCTGTATGCTATATTTCAACAGAGCAGGGGCCAAGAACAAGAGCTGAAAATAAAAAACAGGTCTCTGCGATCCCTCACCCGCAGCTGCCTGTATCACAAAAGCGAAGATCAGCTTCGGCGCACGCTGGAAGACGCGGAGGCTCTCTTCAGTAAATACTGCGCGCTGACTCTTAAGGACTAGTTTCGCGCCCTTTCTCAAATTTAAGCGCGAAAACTACGTCATCTCCAGCGGCCACACCCGGCGCCAGCACCTGTTGTCAGCGCCATTATGAGCAAGGAAATTCCCACGCCCTACATGTGGAGTTACCAGCCACAAATGGGACTTGCGGCTGGAGCTGCCCAAGACTACTCAACCCGAATAAACTACATGAGCGCGGGACCCCACATGATATCCCGGGTCAACGGAATACGCGCCCACCGAAACCGAATTCCCTTGGAACAGGCGGCTATTACCACCACACCTCGTAATAACCTTAATCCCCGTAGTTGGCCCGCTGCCCTGGTGTACCAGGAAAGTCCCGCTCCCACCACTGTGGTACTTCCCAGAGACGCCCAGGCCGAAGTTCAGATGACTAACTCAGGGGCGCAGCTTGCGGGCGGCTTTCGTCACAGGGTGCGGTCGCCCGGGC
【０１６４】
配列番号１８：ＣＭＶプロモーターＷＴ
AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTC
【０１６５】
配列番号１９：ＣＭＶ誘導可能プロモーター（ｐ５６５−２ｘＴｅｔＯ）
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCACTAGTCGCCGTGAACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGtccctatcagtgatagagatgtccctatcagtgatagagatcgtcgagcagctcGTTTAGTGAACCGTCAGATC
【０１６６】
配列番号２０：５’−ＵＴＲ配列：Ｃａｐ配列
CagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaA
【０１６７】
配列番号２１：３’−ＵＴＲ：ポリアデニル化配列（ＳＶ４０）
CAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTT
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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