(57)【要約】  本発明は、複合試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を定量化する方法に関する。装置、キットならびに上記装置および上記キットの使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を定量化する方法であって、以下のステップ：
ａ）基材上にタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する捕捉分子Ａを配置するステップ；
ｂ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含む複合試料を選択するステップであって、前記凝集体が凝集体の表面に単量体のエピトープを有するステップ；
ｃ）試料から不溶性成分を除去するステップ；
ｄ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含むステップｃ）後の試料を、基材の一つの部分で捕捉分子Ａと接触させ、そこに含まれる単量体を捕捉分子Ａに配置するステップ；
ｅ）較正標準を基材の他の部分で捕捉分子Ａと接触させ、そこに配置するステップであって、較正標準の表面に、検出されるべきタンパク質ミスフォールディング疾患の定義された数の単量体が配置されるステップ；
ｆ）タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する少なくとも１つの捕捉分子Ｂを、試料の凝集体にも較正標準にも接触させ、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に配置するステップであって、捕捉分子Ｂが検出可能なシグナルを発することができるステップ；
ｇ）試料凝集体に配置された１つまたは複数の捕捉分子Ｂのシグナルを、較正標準に配置された捕捉分子Ｂのシグナルと、試料凝集体の定量化のために比較するステップ、
を特徴とし、ステップａ）〜ステップｇ）は順々に実施する必要はない、方法。
【請求項２】
ステップａ）による捕捉分子Ａおよびステップｆ）による捕捉分子Ｂとして、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体の同じ標的領域に結合する分子を選択することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
捕捉分子Ａおよび捕捉分子Ｂとして、モノクローナル抗体を選択することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する少なくとも２つのモノクローナル抗体を含む捕捉分子Ｂを選択することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）において、アルツハイマー型認知症のアミロイドβ単量体を含む複合試料を使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）における捕捉分子Ａおよびステップｆ）における捕捉分子Ｂとして、単量体の同じ標的領域としてアミロイドβ３−８を有するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップｅ）において、較正標準としてタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体のサイズを有する粒子を使用することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップｅ）において、較正標準として、検出されるべき凝集体の定義された数の単量体を粒子表面に有する粒子を使用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
ステップｅ）において、較正標準として、約２０ｎｍのサイズおよび表面上に約３０個のアミロイドβ単量体を有するシリカナノ粒子を使用することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）において、複合試料として、動物の脳ホモジネート、特にアルツハイマー型認知症を伴うトランスジェニックマウスの脳ホモジネートを選択することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
複合試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を定量化するための装置であって、
タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体のための捕捉分子Ａが配置されて存在する基材を備え、前記基材の一つの部分で、タンパク質ミスフォールディング疾患の定義された数の単量体を有する較正標準としての粒子が捕捉分子Ａに配置されており、定義された数が、検出されるべき凝集体中の単量体エピトープの数に相当し、かつ基材の他の部分で捕捉分子Ａが複合試料からのタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体のための結合部位を提供することを特徴とする、装置。
【請求項１２】
較正標準として、検出されるべき凝集体のサイズを有する粒子が配置されることを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
較正標準としてのシリカナノ粒子を特徴とする、請求項１１または１２に記載の装置。
【請求項１４】
基材としてのマイクロタイタープレートを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の装置であって、マイクロタイタープレートが、捕捉分子Ａに配置された較正標準が底部に配置されている少なくとも１つの反応チャンバーを有し、前記装置が、試料の検出されるべき凝集体のための捕捉分子Ａが底部に配置されている少なくとも１つの更なる反応チャンバーを有する、装置。
【請求項１５】
タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体の定量化のためのキットであって、
−  タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体のための捕捉分子Ａが配置されて存在し、かつ固定化された捕捉分子Ａの一つの部分に、タンパク質ミスフォールディング疾患の定義された数の単量体を有する較正標準が配置されている基材；
−  タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体のための少なくとも１つの捕捉分子Ｂ、
を含み、捕捉分子Ａおよび捕捉分子Ｂが、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体の同じ標的領域に結合する、キット。
【請求項１６】
タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体の濃度に対する作用物質の影響を検出するための、請求項１１〜１４のいずれか一つに記載の装置または請求項１５に記載のキットの使用。
【請求項１７】
試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を検出する方法であって、以下のステップ：
ａ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含む複合試料を選択するステップであって、凝集体が凝集体の表面上に単量体のエピトープを有するステップ；
ｂ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含むステップａ）の後の試料を、基材と接触させ、そこに含まれる単量体を基材上に配置するステップ；
ｃ）タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する捕捉分子Ｂを、基材上の試料の凝集体と接触させ、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に配置するステップであって、捕捉分子Ｂが検出可能なシグナルを発することができるステップ、
を特徴とする、方法。
【請求項１８】
ステップａ）の前にタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する捕捉分子Ａを基材上に配置し、ステップｂ）において単量体を捕捉分子Ａに配置することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
不溶性成分が予め除去された試料を選択することを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
基材の一つの部分で較正標準を捕捉分子Ａと接触させて配置し、較正標準の表面に、検出されるべきタンパク質ミスフォールディング疾患の定義された数の単量体が配置されることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料凝集体に配置された捕捉分子Ｂのシグナルを、較正標準に配置された捕捉分子Ｂのシグナルと、試料凝集体の定量化のために比較することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を定量化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術から、混合物中のタンパク質を互いに分離するために、サイズ排除クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー分離法および超遠心分離法に基づく分離法が公知である。
【０００３】
種々の遠心分離技術を用いて、例えば、異なる画分中に異なるアミロイドβ種が存在するように、アミロイドβを含む試料を分画することができる。引き続き、これらの画分を、例えばＦｕｎｋｅらから公知であるように、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＵＶ−ＶＩＳ、質量分析法またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる（Ｓ．  Ａ．  Ｆｕｎｋｅ、Ｔ．  ｖａｎ  Ｇｒｏｅｎ、Ｉ．  Ｋａｄｉｓｈ、Ｄ．  Ｂａｒｔｎｉｋ、Ｌ．  Ｎａｇｅｌ−Ｓｔｅｇｅｒ、Ｏ．  Ｂｒｅｎｅｒ、Ｔ．  Ｓｅｈｌ、Ｒ．  Ｂａｔｒａ−Ｓａｆｆｅｒｌｉｎｇ、Ｃ．  Ｍｏｒｉｓｃｏｔ、Ｇ．  Ｓｃｈｏｅｈｎ、Ａ．  Ｈ．  Ｃ．  Ｈｏｒｎ、Ａ．  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ、Ｃ．  Ｋｏｒｔｈ、Ｈ．  Ｓｔｉｃｈｔ、Ｄ．  Ｗｉｌｌｂｏｌｄ．  Ｏｒａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｄ−Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄ３  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ．  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  （２０１０）、１、６３９〜６４８頁（非特許文献１））。
【０００４】
Ｓｅｈｌｉｎら（Ｄａｇ  Ｓｅｈｌｉｎ、Ｈｉｌｌｅｖｉ  Ｅｎｇｌｕｎｄ、Ｂａｒｂｒｏ  Ｓｉｍｕ、Ｍｉｋａｅｌ  Ｋａｒｌｓｓｏｎ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｉｎｇｅｌｓｓｏｎ、Ｆｒｅｄｒｉｋ  Ｎｉｋｏｌａｊｅｆｆ、Ｌａｒｓ  Ｌａｎｎｆｅｌｔ、Ｆｒｉｄａ  Ｅｋｈｏｌｍ  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ．  ２０１２．  Ｌａｒｇｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  Ａｒｅ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａβ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ＡＤ  Ｂｒａｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．  Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ、７巻、ｅ３２０１４（非特許文献２））から、密度勾配遠心分離により分画されたアルツハイマー型認知症脳において、大きな凝集体がアミロイドβ種の主要な起源であることが公知である。定量化のために、Ｅｌｉｓａ法が示されている。
【０００５】
Ｗａｒｄら（Ｒｏｂｉｎ  Ｖ．  Ｗａｒｄ、Ｋｅｖｉｎ  Ｈ．  Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊｅｐｒａｓ、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｎｅｖｉｌｌｅ、Ｄａｖｉｎａ  Ｅ．  Ｏｗｅｎ、Ｊｕｌｉｅ  Ｈａｗｋｉｎｓ、Ｇａｒｙ  Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｊｏｈｎ  Ｂ．  Ｄａｖｉｓ、Ａｓｈｌｅｙ  Ｇｅｏｒｇｅ、Ｅｒｉｃ  Ｈ．  ＫａｒｒａｎおよびＤａｖｉｄ  Ｒ．  Ｈｏｗｌｅｔｔ．  ２０００．  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ，  ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４８、１３７〜１４４頁（非特許文献３））から、アミロイドβ凝集体を定量化するために、密度勾配遠心分離後にモノクローナル抗体ｍＡｂ１５８を用いたイムノアッセイを使用したことが公知である。
【０００６】
不利なことに、使用されるＥｌｉｓａ法において開示された抗体では、複合試料および混合物からのアミロイドβの高感度の定量化は不可能である。上述の刊行物は、このために単にマイクロモル範囲までのアミロイドβの検出を挙げているにすぎない。したがって、これらの方法は感度が良くない。最も高感度のＥｌｉｓａ法でさえも、タンパク質を約１００ピコモルの濃度までしか検出することができない。現在の視点からは、アルツハイマー型認知症の治療のための潜在的な作用物質の僅かな作用をその有効性についても検査するためには十分ではないように思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓ．  Ａ．  Ｆｕｎｋｅ、Ｔ．  ｖａｎ  Ｇｒｏｅｎ、Ｉ．  Ｋａｄｉｓｈ、Ｄ．  Ｂａｒｔｎｉｋ、Ｌ．  Ｎａｇｅｌ−Ｓｔｅｇｅｒ、Ｏ．  Ｂｒｅｎｅｒ、Ｔ．  Ｓｅｈｌ、Ｒ．  Ｂａｔｒａ−Ｓａｆｆｅｒｌｉｎｇ、Ｃ．  Ｍｏｒｉｓｃｏｔ、Ｇ．  Ｓｃｈｏｅｈｎ、Ａ．  Ｈ．  Ｃ．  Ｈｏｒｎ、Ａ．  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ、Ｃ．  Ｋｏｒｔｈ、Ｈ．  Ｓｔｉｃｈｔ、Ｄ．  Ｗｉｌｌｂｏｌｄ．  Ｏｒａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｄ−Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄ３  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ．  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  （２０１０）、１、６３９〜６４８頁
【非特許文献２】Ｄａｇ  Ｓｅｈｌｉｎ、Ｈｉｌｌｅｖｉ  Ｅｎｇｌｕｎｄ、Ｂａｒｂｒｏ  Ｓｉｍｕ、Ｍｉｋａｅｌ  Ｋａｒｌｓｓｏｎ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｉｎｇｅｌｓｓｏｎ、Ｆｒｅｄｒｉｋ  Ｎｉｋｏｌａｊｅｆｆ、Ｌａｒｓ  Ｌａｎｎｆｅｌｔ、Ｆｒｉｄａ  Ｅｋｈｏｌｍ  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ．  ２０１２．  Ｌａｒｇｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  Ａｒｅ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａβ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ＡＤ  Ｂｒａｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．  Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ、７巻、ｅ３２０１４
【非特許文献３】Ｒｏｂｉｎ  Ｖ．  Ｗａｒｄ、Ｋｅｖｉｎ  Ｈ．  Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊｅｐｒａｓ、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｎｅｖｉｌｌｅ、Ｄａｖｉｎａ  Ｅ．  Ｏｗｅｎ、Ｊｕｌｉｅ  Ｈａｗｋｉｎｓ、Ｇａｒｙ  Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｊｏｈｎ  Ｂ．  Ｄａｖｉｓ、Ａｓｈｌｅｙ  Ｇｅｏｒｇｅ、Ｅｒｉｃ  Ｈ．  ＫａｒｒａｎおよびＤａｖｉｄ  Ｒ．  Ｈｏｗｌｅｔｔ．  ２０００．  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ，  ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４８、１３７〜１４４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、複合試料または試料混合物中の個々のタンパク質凝集体を定量化するための高感度の方法および装置を提供するとともに、該方法の更なる使用を示すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、主請求項および従属請求項に記載される方法により解決される。そのために有利な実施形態は、それぞれ従属する特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を定量化する方法であって、以下の（複数の）工程を特徴とする方法に関する。
【００１１】
ａ）基材上にタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する捕捉分子Ａを配置する工程。
【００１２】
タンパク質ミスフォールディング疾患としては、特にヒトおよび動物のタンパク質ミスフォールディング疾患が該当する。
【００１３】
【表１】
2021504675.tif 000002
【００１４】
一実施形態では、基材の材料は、プラスチック、ケイ素および二酸化ケイ素を含むまたはそれらからなる群から選択される。好ましい代替形態では、基材としてガラスが使用される。
【００１５】
基材としては、特に、しかし限定されるものではないが、多くの反応チャンバーを備えたマイクロタイタープレートが使用される。有利にはこれらの反応チャンバーは、例えば顕微鏡により読み取り可能である。反応チャンバーの表面上には、好ましくは捕捉分子Ａが配置されている。
【００１６】
一代替形態では、このために、親水性表面を有する基材が使用される。一代替形態ではこれは、工程ａ）の前に親水性層を基材へ施与することにより達成される。したがって、捕捉分子Ａの分子は、基材にまたは基材に担持される親水性層に、特に共有結合で、結合する。
【００１７】
親水性層は生体分子がくっつきにくい層であるため、基材への生体分子の非特異的結合は有利には最小限に抑えられる。この層上に、好ましくは捕捉分子Ａの分子が、好ましくは共有結合的に、固定化される。これらの分子はタンパク質凝集体中の特徴に対して親和性がある。
【００１８】
一実施形態では、親水性層はポリエチレングリコール、ポリリジン、好ましくはポリ−Ｄ−リジンおよびデキストランまたはその誘導体、好ましくはカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を含むまたはそれらからなる群から選択される。本発明の意味における誘導体は、幾つかの置換基が親化合物とは異なる化合物であって、その置換基が本発明による方法に対して不活性な化合物である。
【００１９】
本発明の一実施形態では、基材の表面を、親水性層の施与前にまずヒドロキシル化し、引き続きアミノ基で活性化させる。一代替形態では、このアミノ基での活性化は、基材をＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）またはエタノールアミンと接触させることにより行われる。
【００２０】
基材を被覆する準備のために、以下の工程：
・ガラス製基材またはガラス担体を超音波浴またはプラズマクリーナーにおいて洗浄するか、その代わりに５ＭのＮａＯＨ中で少なくとも３時間インキュベートする工程、
・水ですすぎ、引き続き窒素下で乾燥させる工程、
・比率３：１の濃硫酸と過酸化水素とからの溶液中に浸漬して、ヒドロキシル基を活性化させる工程、
・中性のｐＨになるまで水ですすぎ、引き続きエタノールですすぎ、窒素雰囲気下で乾燥させる工程、
・好ましくは乾燥トルエン中の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（１％〜７％）を含む溶液またはエタノールアミンの溶液中に浸漬する工程、
・アセトンまたはＤＭＳＯおよび水ですすぎ、窒素雰囲気下で乾燥させる工程
の１つまたは複数が実施され得る。
【００２１】
一代替形態では、基材とＡＰＴＥＳとの接触は気相中で行われ、したがって、任意選択で前処理された基材がＡＰＴＥＳで蒸気処理される。
【００２２】
デキストラン、好ましくはカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）で被覆するために、基材を１０ｍｇ／ｍｌまたは２０ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＭＤの水溶液ならびに任意選択でＮ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（２００ｍＭ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５０ｍＭ）と一緒にインキュベートし、引き続き洗浄する。
【００２３】
一変形形態では、カルボキシメチルデキストランは、まずヒドロキシル化された後にアミノ基で官能化されたガラス表面に共有結合的に結合される。
【００２４】
基材として、好ましくはガラス底を有する、マイクロタイタープレートが使用され得る。ポリスチレンフレームが使用される場合には濃硫酸を使用することができないので、ガラス表面の活性化は、本発明の実施形態変形例において同様に行われる。
【００２５】
本発明の更なる実施形態では、捕捉分子Ａは基材に共有結合で結合される。
【００２６】
例えば親水性層上に、検出されるべきタンパク質凝集体の特徴に対して親和性である捕捉分子Ａが、好ましくは共有結合で、固定化される。この特徴は、タンパク質凝集体のエピトープまたは部分配列であり得る。
【００２７】
１種類のみの捕捉分子Ａが使用される。それにより有利には、唯一のタンパク質ミスフォールディング疾患の１種類の凝集体を感度よく定量的に検出することができることとなる。
【００２８】
本発明の一実施形態では、捕捉分子Ａ、好ましくは抗体は、任意選択でＣＭＤで被覆された担体のＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ｍＭまたは５０ｍＭ）の混合物による活性化後に、基材上に固定化される。
【００２９】
捕捉分子Ａの分子が結合していない残りのカルボキシレート末端基は、不活性化され得る。ＣＭＤスペーサー上のこのカルボキシレート末端基の不活性化のために、エタノールアミンが使用される。試料を施与する前に、基材または担体を、任意選択でバッファーによりすすぐ。
【００３０】
捕捉分子Ａとしては、特に、しかし限定されるものではないが、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対するモノクローナル抗体が使用される。アルツハイマー型認知症の場合に、例えばモノクローナル抗体Ｎａｂ２２８が使用され、基材上に配置され得る。
【００３１】
捕捉分子Ａは、以下に記載される捕捉分子Ｂとは異なり、本発明による方法では検出のために適した検出分子または分子部分を有しない。
【００３２】
主請求項における「配置」という用語には、特に、しかし限定されるものではないが、共有結合が含まれている。抗体の場合には、これらの結合は特異的である。
【００３３】
上記方法は、工程ｂ）を含む。
【００３４】
ｂ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含む複合試料を準備する工程であって、凝集体が凝集体表面に単量体のエピトープを有する工程。
【００３５】
複合試料の準備とは、特に、タンパク質ミスフォールディング疾患を有するまたは対応する凝集体の存在の有無が検査されるべきである罹患した動物および／または罹患したヒトに由来する既に準備された試料を選択することを意味する。
【００３６】
このために、例えば動物、特にアルツハイマー型認知症に罹患したトランスジェニックマウスからの試料が選択される。試料は、動物の死後に少なくとも一方の脳の半分を処理することにより得ることができる。処理とは、特に脳組織の均質化を意味する。
【００３７】
このように、試料は罹患した動物から得られ、選択され、タンパク質ミスフォールディング疾患の存在について調査される。
【００３８】
しかしながら、試料は細胞培養物であってもよく、または動物もしくはヒトから採取した器官であってもよく、または生検からの試料であってもよい。試料は、タンパク質ミスフォールディング疾患の内因的に形成されたペプチド凝集体もしくはタンパク質凝集体を含有し、またはそれに対して調査される。
【００３９】
上記方法は、特に、そして特に有利には、そして驚くべきことに、同じ試料中のタンパク質および／またはタンパク質断片の混合物からのタンパク質ミスフォールディング疾患の特定の凝集体の高選択的な検出に関する。選択された試料において、有利には、１種より多くのタンパク質またはタンパク質断片を有する混合物から、タンパク質ミスフォールディング疾患の特異的に検出されるべき凝集体を高感度で検出することができる。
【００４０】
特に、試料は、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種より多くの、またはそれどころか１０種、２０種、３０種、４０種、５０種、６０種、７０種、８０種、９０種より多くの、またはそれどころか１００種、２００種、３００種、４００種、５００種、６００種、７００種、８００種、９００種より多くの、またはそれどころか１０００種より多くの異なるタンパク質またはタンパク質断片を含有してよい。試料は、何千種ものタンパク質および／またはタンパク質断片を含有してよい。この意味において、試料は複合試料と呼ばれる。
【００４１】
「複合試料」という用語には、特に死亡した動物またはヒトの脳の、完全な可溶性タンパク質分を有する完全なホモジネートが含まれている。
【００４２】
工程ｂ）において、複合試料として、特に、動物、特にアルツハイマー型認知症に罹っているトランスジェニックマウスの脳ホモジネートが準備される。このホモジネートは、同様に何千種もの異なるタンパク質および／またはタンパク質断片を含む。
【００４３】
したがって、工程ｂ）において、アルツハイマー型認知症のアミロイドβ凝集体を含有する複合試料が選択され得る。
【００４４】
特に、小さな可溶性Ａβ凝集体（Ａβオリゴマー）は、数年来アルツハイマー型認知症の発症および進行に関する主な原因としての役割を担っているので、これによって、候補作用物質を、毒性の凝集体を減らす効率について高感度でフェムトモル範囲に至るまでも検出する、またはそれどころか完全な排除を検出するという課題が解決される。作用物質が凝集体を排除する能力について作用物質が調査される場合に、この凝集体をフェムトモル範囲まで検出することが可能である。オリゴマー凝集体がもはや検出されない場合に、該方法によりアルツハイマー型認知症の治癒または少なくとも疾患の経過の改善が立証される。
【００４５】
凝集体として、例えばアルツハイマー型認知症に際して生ずるフィブリル等のより高分子の構造物も検出可能である。
【００４６】
他のタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を検出するべきである場合にも、同じことが当てはまる。
【００４７】
最も簡単な場合には、請求項１における「定量化可能」という用語は、タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体をあり／なしの答えで検出することにより、定性的に解釈することもできる。
【００４８】
ｃ）工程ｃ）は、選択された試料から不溶性成分を除去することを意図している。
【００４９】
したがって、工程ｃ）は、可溶性成分を試料から除去するために、例えば濾過または超遠心分離を必要とする。当業者がその既存の専門知識に従って同様に使用可能である他の方法も考えられる。
【００５０】
このために、特に密度勾配遠心分離が好ましい。それにより、有利には試料が工程ｃ）により分画されることとなる。
【００５１】
有利には、密度勾配遠心分離が実施され、それにより試料は最大３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、より適切には最大１０個、特に有利には１１個、１２個、１３個、１４個、更に特に有利には最大１５個の画分に分画される。
【００５２】
これにより、有利にはそのｓ値が他の画分の他の成分とは明らかに異なる特定の画分が準備され、更に使用され得る。したがって、例えばプロトフィブリルまたは他の前駆体、例えばオリゴマー等の特定の画分の選択を選択可能であり、更に調査することができる。
【００５３】
したがって、アミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質から形成されている粒子が互いに分離される。
【００５４】
このように、有利には、試料から多数の画分が得られることとなる。画分中にはそれぞれ特定の凝集体サイズおよび−形状を有するアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の粒子が含まれている。この粒子の分離は、有利にはｓ値によって密度勾配遠心分離により行うことができる。
【００５５】
特に有利には、試料溶液中に存在するアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の分画は、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、ショ糖または類似の密度勾配材料を使用した密度勾配遠心分離によって行われる。この場合に、凝集体は、サイズおよび任意選択で形状（沈降係数）に従って互いに分離される。この方法は、特に凝集性のＡβ（１−４２）凝集体およびタウ凝集体の場合に有利である。
【００５６】
代替的には、流体力学半径に従って分離されるサイズ排除クロマトグラフィーを使用することもできる。代替的には、分画は、非対称フローフィールドフロー分画またはキャピラリー電気泳動によって行われる。これらの方法はまた、有利には較正のために適している。
【００５７】
凝集体の他の物理的パラメーター、例えば粒子の流体力学半径も同様に、実施される分画の基礎として考慮することができる。画分は、例えばピペットで取り出すことによって空間的に互いに分離される。
【００５８】
すなわち、密度勾配遠心分離に限定されるものではない。しかしながら、密度勾配遠心分離は、試料中に当初存在していた全てのアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の凝集体が、更なる定量的分析のために提供されるという利点を有する。
【００５９】
密度勾配遠心分離自体は較正されるので、画分はそのｓ値に関して正確に決定される。したがって、「正確に決定」という用語は、公知の種類および挙動の分子の分画による較正工程を含む。分画後には、各々の画分に１つだけの特定の（すなわち公知の）種類の配座異性体、例えばタンパク質ミスフォールディング疾患の場合に生ずるオリゴマーまたはフィブリル等が存在する。
【００６０】
さらに、試料は、工程ｃ）において当業者に公知の種々の処理工程を経ることができる。
【００６１】
本発明の変形形態では、試料が捕捉分子Ａに配置される前に、以下の方法工程：
・水またはバッファーによる希釈、
・酵素、例えばプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼによる処理、
・遠心分離、
・沈殿、
・プローブとの競合による、存在し得る抗体の排除、
の１つまたは複数に従って試料の前処理が行われる。
【００６２】
上記方法は、工程ｄ）を必要とする。
【００６３】
ｄ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含む工程ｃ）後の試料を、基材の一つの部分で工程ａ）による捕捉分子Ａと接触させ、そこに含まれるタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体および／または凝集体を捕捉分子Ａに配置する工程。
【００６４】
配置は捕捉分子Ａに特異的に行われる。
【００６５】
配置は、好ましくは上記の捕捉分子Ａとしてのモノクローナル抗体に特異的に行われる。これによって、有利には、試料の凝集体および単量体から形成される凝集体の表面上のそのエピトープと捕捉分子Ａとの間で、非常に特異的な結合に至ることとなる。こうして、有利には、例えば他のタンパク質、特に同等のｓ値を有する他のタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体が除外されることとなる。すなわち、１つだけの特異的な凝集体が捕捉分子Ａによって検出される。
【００６６】
すなわち、測定されるべき試料を、こうして調製された基材と接触させ、任意選択的にインキュベートする。調査されるべき試料として、他方で内因性流体または組織が使用され得る。本発明の一実施形態では、試料は、脳ホモジネート、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿および尿から選択される。しかしながら、器官の生検試料（生検）または器官全体、例えば脳のホモジネートであってもよい。
【００６７】
本発明の一実施形態では、試料または凝集体の配置は、捕捉分子Ａに直接的に行われる。
【００６８】
非特異的に結合された物質は、少なくとも１回の洗浄工程によって除去され得る。
【００６９】
上記方法は、工程ｅ）を伴って継続される。
【００７０】
ｅ）較正標準を、基材の他の部分で工程ａ）による捕捉分子Ａに接触させて配置する工程であって、較正標準の表面に、定義された数の検出されるべきタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体が配置されている工程。
【００７１】
較正標準としては、有利にはほぼタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体のサイズを有する粒子が使用される。そのサイズは、当業者にとっては負担なく文献から導き出すことができる。
【００７２】
工程ｅ）において、較正標準として、検出されるべき凝集体の単量体エピトープの数に相当する定義された数の単量体を表面に有する粒子が使用される。
【００７３】
それにより、有利には
１．較正標準のサイズが凝集体と同じであるため、基材上の較正標準によるタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体のシミュレーションの改善がもたらされ、かつ
２．凝集体の表面上の実際に凝集体中に存在する単量体エピトープに関する凝集体の後の正確な定量化に対して較正が可能となり、というのも較正標準は、凝集体とほぼ同じ数のエピトープを有するからである。
【００７４】
アルツハイマー型認知症のアミロイドβ凝集体の検出のためには、較正標準として約２０ｎｍの直径を有する粒子が配置されるべきであるとみなされ、というのも、アミロイドβ凝集体はこのサイズをとり得るからである。その際、較正標準の表面に、約２０個〜３０個のアミロイドβ単量体が配置されて存在すること、例えば共有結合的に配置されていることが望まれる。
【００７５】
工程ｅ）においては、較正標準として、好ましくは約２０ｎｍのサイズおよび約３０個のアミロイドβ単量体を表面上に有するシリカナノ粒子が使用される。それは、アミロイドβ凝集体のサイズおよびオリゴマーまたは凝集体中のアクセス可能な単量体エピトープの数に相当する。
【００７６】
較正標準は、示された目的のために以下のように合成され得るが、これらの方法に限定されるものではない。
【００７７】
方法１：
Ａ）ほぼタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体のサイズを有する無機ナノ粒子を準備する工程、
Ｂ）ナノ粒子の表面に遊離のアミノ基を形成させてナノ粒子表面を官能化することで、アミン官能化されたナノ粒子を得る工程、
Ｃ１）工程Ｂ）からの遊離のアミノ基に遊離のカルボキシル基を形成させて、ナノ粒子の表面に遊離のカルボキシル基を形成させる工程、
Ｄ１）例えばカルボキシル基にＮＨＳエステルを形成させることによって、工程Ｃ１）からの遊離のカルボキシル基を活性化させる工程、および
Ｅ１）単量体または単量体の部分の遊離のアミンを、工程Ｄ１）からのＮＨＳエステルに結合させる工程。
【００７８】
代替法２：
Ａ）ほぼタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体のサイズを有する無機ナノ粒子を準備する工程、
Ｂ）ナノ粒子の表面に遊離のアミノ基を形成させてナノ粒子表面を官能化することで、アミン官能化されたナノ粒子を得る工程、
Ｃ２）マレインイミド−スペーサー−カルボン酸を、工程Ｂ）の遊離のアミノ基に結合させる工程、
Ｄ２）タンパク質凝集体の単量体を、単量体の遊離末端のスルフヒドリル基を介して工程Ｃ２）からのマレインイミド−スペーサー−カルボン酸に結合させる工程。
【００７９】
更なる方法が考えられる。
【００８０】
さらに、本発明による方法の工程ｆ）が実施される。
【００８１】
ｆ）タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する捕捉分子Ｂを、基材上の試料の凝集体だけでなく較正標準とも接触させ、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に配置する工程であって、捕捉分子Ｂが検出可能なシグナルを発することができる工程。
【００８２】
したがって、捕捉分子Ｂはプローブを表す。「捕捉分子Ｂ」および「プローブ」という用語は同義に使用される。
【００８３】
他方で、試料からの検出されるべきタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体は、既に捕捉分子Ａに配置されており、それにより基材上に固定化されている。
【００８４】
本発明の一実施形態では、捕捉分子Ａおよび１つまたは複数の捕捉分子Ｂは、同じ親和性の分子または分子部分を有し得る。更なる代替形態では、異なる親和性の分子または分子部分と異なる検出分子または部分とが組み合わされていてよく、または代替的には、異なる親和性の分子または部分と同じ検出分子または部分とが組み合わされていてよい。
【００８５】
異なる捕捉分子Ｂの混合物を使用することもできる。
【００８６】
異なる検出分子または分子部分に結合する複数の異なる捕捉分子Ｂを使用することで、一方ではシグナル（相関シグナル）の特異性が高められ、他方ではそれにより１つまたは複数の特徴が異なるタンパク質凝集体の特定が可能となる。それにより、タンパク質凝集体の選択的な定量化および特性決定が可能となる。捕捉分子Ａおよび１つまたは複数の捕捉分子Ｂは、単量体の同じエピトープまたは同じ重複するエピトープの部分へと結合する。
【００８７】
更なる工程において、捕捉分子Ａに固定化されたタンパク質凝集体は、更なる検出のために役立つ１つまたは複数のプローブ、つまり捕捉分子Ｂで標識される。上記のように、個々の工程は、本発明によれば他の順序で実施することもできる。
【００８８】
有利には、タンパク質凝集体の単量体に結合する１つまたは複数の捕捉分子Ｂが選択され得、捕捉分子Ｂはまた、凝集体へと結合した後にはじめて特異的なシグナルを放出することができる。
【００８９】
本発明の意味においては、「定量的測定」は、まずはタンパク質凝集体の濃度の測定を意味するため、つまりは、その存在および／または非存在の測定も意味する。
【００９０】
適切な洗浄工程によって、タンパク質凝集体に結合していない過剰の捕捉分子Ｂが除去される。それにより、バックグラウンドシグナルの減少によって感度を更に高めることができる。
【００９１】
上記方法の代替形態では、これらの過剰の捕捉分子Ｂは除去されない。それにより、洗浄工程は省略され、また平衡シフトはタンパク質凝集体−プローブ−複合体または−化合物が解離する方向では起こらない。空間分解検出によって、評価に際して過剰のプローブは把握されない。
【００９２】
一実施形態では、タンパク質凝集体の結合部位はエピトープであり、捕捉分子は抗体および／または抗体部分および／またはそのフラグメントである。
【００９３】
本発明の一実施形態では、捕捉分子Ａおよび１つまたは複数の捕捉分子Ｂは異なっている。
【００９４】
そうして、例えば異なる抗体および／または抗体部分および／またはフラグメントが捕捉分子Ｂとして使用され得る。本発明の更なる実施形態では、捕捉分子Ａおよび場合による（色素）標識を除いて互いに同一である１つまたは複数の捕捉分子Ｂが使用される。
【００９５】
本発明の更なる代替形態では、例えば異なる抗体を含み、また任意選択で異なる色素標識を有する、少なくとも２つの捕捉分子Ｂが使用される。
【００９６】
上記の全ての場合において、１種類だけの捕捉分子Ａが使用される。
【００９７】
検出のために、捕捉分子Ｂは、好ましくは、蛍光−、生物発光−および化学発光−放出ならびに吸収からなる群から選択される光学的に検出可能なシグナルを発するように特徴付けられている。
【００９８】
したがって、一代替形態では、プローブとしての捕捉分子Ｂは、蛍光色素で標識されている。蛍光色素としては、当業者に公知の色素が使用され得る。代替的には、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、そのコンジュゲートおよび／または融合タンパク質ならびに量子ドットが使用され得る。
【００９９】
捕捉分子Ａは、捕捉分子Ｂのようなプローブ機能を有しない。単に表面の品質管理のためだけに、例えば捕捉分子Ａによる被覆の均一性の検出のために、蛍光色素を有する捕捉分子Ａを使用することもできる。このために、好ましくはタンパク質凝集体上のプローブの蛍光色素の検出と干渉しない色素が使用される。それにより、後続の基材の構成の制御だけでなく、測定結果の標準化も可能である。
【０１００】
１つまたは複数の捕捉分子Ｂは、個々のタンパク質凝集体の特徴の存在が測定結果に影響を及ぼさないように選択され、使用され得る。
【０１０１】
特に、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する捕捉分子Ｂとしての蛍光性モノクローナル抗体を、結合された凝集体および較正標準と接触させて、そこに配置することができる。
【０１０２】
したがって、捕捉分子Ａおよび１つまたは複数の捕捉分子Ｂとして、特にモノクローナル抗体が選択され得る。それにより、有利には、凝集体および／または較正標準への配置の十分な感度および強度が定められることとなる。
【０１０３】
捕捉分子Ｂとしては、例えばＣＦ−６３３で標識されたｍＡｂ  ＩＣ１６およびＣＦ−４８８で標識されたＮａｂ２２８等のモノクローナル抗体からの混合物が使用され得る。
【０１０４】
工程ａ）による捕捉分子Ａおよび工程ｆ）による１つまたは複数の捕捉分子Ｂとしては、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体の同じ標的領域に結合する分子が選択されるべきである。それにより、特に有利には、試料中の単量体はもはや１つまたは複数の捕捉分子Ｂによって結合され得ないこととなり、というのも、標的領域は既に捕捉分子Ａによって占有されているからである。
【０１０５】
例えば、アミロイドβの場合に、工程ａ）による捕捉分子Ａおよび工程ｆ）による捕捉分子Ｂ／抗体は、両者ともアミノ酸３〜８（Ｎ’末端から見て）に結合し得る。例えば、アミロイドβ１−４２凝集体を含む試料が基材の捕捉分子Ａに存在する場合に、工程ｆ）の後に、更なるエピトープが存在する場合にのみ、すなわち更なる表面エピトープを有する凝集体が結合される場合にのみ、捕捉分子Ｂのアミロイドβへの結合が行われ得る。
【０１０６】
これらの実施形態は、単に例示的な性質を有するにすぎず、限定されるべきでないと解釈される。
【０１０７】
上記方法により、有利には自発的に、もはや検出されない単量体が区別される。
【０１０８】
上記方法の工程ｇ）は、以下のように実施することができる。
【０１０９】
ｇ）試料凝集体上の捕捉分子Ｂのシグナルを較正標準に配置された捕捉分子Ｂのシグナルと比較することで、試料凝集体を定量化する工程。
【０１１０】
その際、工程ｇ）はシグナル、特に、例えば捕捉分子Ｂとしての蛍光性モノクローナル抗体から発される蛍光シグナルの検出を必要とする。このために、例えばＴＩＲＦ（英語で、Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（全反射蛍光））システムが使用され得る。
【０１１１】
一実施形態では、プローブシグナルの空間分解測定、つまりプローブから放出されるシグナルの空間分解検出が行われる。したがって、本発明のこの実施形態では、非空間分解シグナルに基づく方法、例えばＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡは除外されている。
【０１１２】
検出に際して、高い空間分解能が非常に有利である。本発明による方法の一実施形態では、この場合に、例えば装置特異的なノイズ、他の非特異的なシグナルまたは非特異的に結合するプローブによって引き起こされるバックグラウンドシグナルに対してタンパク質凝集体の検出を可能にするほどの数のデータ点が収集される。このように、空間分解イベント（ピクセル）と同じ数の値が読み出される（読み出し値）。空間分解能によって、どのイベントもその都度のバックグラウンドに対して測定されるため、こうして空間分解シグナルのないＥＬＩＳＡ法と比較して有利である。
【０１１３】
一実施形態では、プローブシグナルの空間分解測定は、全反射照明蛍光顕微鏡法（ｔｉｒｆｍ）および数フェムトリットルから１フェムトリットル未満までの範囲の試料の体積と比較した小さい体積要素、または５００ｎｍ、好ましくは３００ｎｍ、特に好ましくは２５０ｎｍ、特に２００ｎｍの高さを有する捕捉分子の接触表面上の体積範囲の調査に基づく。
【０１１４】
固定化されて標識されたタンパク質凝集体の検出は、例えばレーザー走査型顕微鏡による、表面の結像によって行われる。空間分解能ができる限り高いことにより、多数の画素が測定され、それにより上記方法の感度および選択性を更に高めることができ、というのも、構造的特徴が一緒に結像および分析され得るからである。したがって、特異的シグナルが、例えば非特異的に結合したプローブのバックグラウンドシグナルに対して高められる。
【０１１５】
検出は、例えば好ましくは、ＴＩＲＦ顕微鏡による空間分解蛍光顕微鏡法およびその対応する超分解能の変形例、例えばＳＴＯＲＭおよび／またはｄＳＴＯＲＭ等を用いて行われる。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、例えばレーザー走査型顕微鏡法で使用されるようなレーザー収束またはＦＣＳ（蛍光相関分光法システム）がそのために使用されるだけでなく、例えばＳＴＥＤ、ＰＡＬＭまたはＳＩＭ等の対応する超分解能の変形例も使用される。
【０１１７】
またしてもＥＬＩＳＡとは異なって、この方法により、存在する空間分解イベント（例えば、ピクセル）と同じ数の読み出し値が生ずる。異なるプローブの数に依存して、この情報は有利には何倍にも増大する。この増大は全ての検出イベントに当てはまり、情報ゲインをもたらす。それというのも、その情報は更なる特性、例えばタンパク質凝集体に関する第２の特徴を明らかにするからである。このような構成により、シグナルの特異性をイベントごとに高めることができる。
【０１１８】
評価のために、空間分解性の情報、例えば全ての使用および検出されるプローブの蛍光強度を取り出すことで、例えばタンパク質凝集体の数、そのサイズおよびその特徴が決定される。
【０１１９】
この場合に、更なる評価およびパターン認識のために、例えばバックグラウンドの最小化のアルゴリズムおよび／または強度閾値を使用することもできる。
【０１２０】
更なる画像分析の選択肢には、例えば、画像情報から検出されたタンパク質凝集体の数を取得し、また粒子サイズを決定し得るための局所強度最大値の捜索が含まれる。
【０１２１】
洗浄工程は、工程ａ）、工程ｄ）、工程ｅ）および工程ｆ）の後に実施され得る。
【０１２２】
請求項１における工程順序ａ）〜ｇ）は、上記のように単に明瞭化のために用いられているにすぎず、工程の時間的に連続した順序を表すものではないと解釈される。工程ｂ）および工程ｃ）は、例えば工程ａ）の前に容易に行うことができる。
【０１２３】
したがって、例えば、上記方法の他の変形形態では、タンパク質凝集体を捕捉分子Ｂと接触させて配置した後に、凝集体を捕捉分子Ａと接触させることにより、したがってプローブで標識されたタンパク質凝集体の基材上での固定化が行われる。
【０１２４】
その際、上記方法は、例えば以下のように実施されるべきである。
【０１２５】
複合試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を定量化する方法であって、
ａ）基材上にタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する捕捉分子Ａを配置する工程と、
ｂ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含む複合試料を選択する工程であって、その凝集体が凝集体表面に単量体のエピトープを有する工程と、
ｃ）試料から不溶性成分を除去する工程と、
ｄ）較正標準を、基材の一つの部分で工程ａ）による捕捉分子Ａと接触させて配置する工程であって、較正標準の表面に、定義された数の検出されるべきタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体のエピトープを有する単量体または単量体の部分が存在する工程と、
ｅ）タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する少なくとも１つの捕捉分子Ｂを、試料の凝集体と接触させ、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に配置する工程であって、１つまたは複数の捕捉分子Ｂが検出可能なシグナルを発することができる工程と
ｆ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体上の１つまたは複数の捕捉分子Ｂを、基材の一つの部分の捕捉分子Ａおよび基材の他の部分の較正標準と接触させ、凝集体を捕捉分子Ａおよび較正標準に配置する工程と、
ｇ）試料凝集体上の捕捉分子Ｂのシグナルを、較正標準に配置される捕捉分子Ｂのシグナルと比較することで、試料凝集体を定量化する工程と
を特徴とする、方法。
【０１２６】
したがって、１つまたは複数の捕捉分子Ｂを凝集体に結合させた後に、これを捕捉分子Ａと接触させ、基材へと固定化させることができる。
【０１２７】
ここでも、任意の順序が可能であり、例えば工程ｂ）、工程ｃ）および工程ｅ）を全ての他の工程の前に行うことができる。
【０１２８】
上記方法の更なる変形形態では、試料は、タンパク質凝集体と捕捉分子Ｂとの接触後に、例えばホルムアルデヒドによって、化学的に固定される。
【０１２９】
驚くべきことに、本発明の範囲において、上記方法は、マウス脳ホモジネート等の複合試料における凝集体の検出に際して非常に高い感度を示し、内因的に存在する単量体に対して完全に非感受性であることがわかった。
【０１３０】
試料が複雑であるにもかかわらず、野生型マウスからの試料に対する干渉シグナルが測定されなかったことも特に驚くべきことである。それは、干渉バックグラウンドシグナルが存在しないことを示している。野生型動物にはヒトＡβ１−４２が存在しないので、そこでは抗体は反応しない。
【０１３１】
上記方法は、その都度のタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体をフェムトモル範囲で、特に１０００ｆＭ〜５００ｆＭ、特に有利には１００ｆＭ〜５００ｆＭ、特に５０ｆＭ〜１００ｆＭおよび５ｆＭ〜１０ｆＭの範囲まで検出する。これはＥｌｉｓａに拘束された方法ではないので、この方法と比較して最大１００００倍検出が改善されている。
【０１３２】
較正標準上の定義された数のエピトープについての比較により、有利にはタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体中のエピトープの正確な定量化が可能となる。
【０１３３】
工程ａ）における捕捉分子Ａおよび工程ｆ）における１つまたは複数の捕捉分子Ｂとして、例えばアミロイドβ３−８を単量体の同じ標的領域として有するモノクローナル抗体を使用することができる。それにより、試料の単量体をもはや結合しないという上述の目的が満たされる。
【０１３４】
したがって、上記方法は、タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体の検出のために特に良く適しているが、それというのも、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体が検出され得ないからである。
【０１３５】
本発明は、驚くべきことに、何千種もの異なるタンパク質およびタンパク質断片を有する脳ホモジネート等の複雑なマトリックスにおいても上記課題を解決する。この場合に、上記方法により、非常に少量のタンパク質凝集体でさえその単量体の存在下であっても検出されるが、それというのも、この単量体は１つまたは複数の捕捉分子Ｂにより結合され得ないからである。
【０１３６】
解決される更なる課題は、１種より多くのタンパク質からなる異種タンパク質凝集体も、凝集体として一義的に同定され得ることである。
【０１３７】
本発明はそれには限定されない。
【０１３８】
複合試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を定量化する装置も提供される。この装置は、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体のための捕捉分子Ａが配置されて存在する基材を備える。基材上の捕捉分子Ａの一つの部分で、較正標準として、検出されるべき凝集体中のエピトープの数に相当する定義された数のタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体を有する粒子が配置されている。基材の他の部分の捕捉分子Ａの他の部分は、複合試料からのタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体の単量体のための結合部位を提供する。
【０１３９】
上記装置は、有利にはフェムトモル範囲までの凝集体の定量化を可能にする較正標準を含む。
【０１４０】
上記装置は、好ましくは、較正標準として、検出されるべき凝集体のサイズを有する粒子が配置されていることを特徴とする。
【０１４１】
上記装置は、特に、較正標準としてのシリカナノ粒子を特徴とする。
【０１４２】
上記装置は、特に有利には、基材の部分として少なくとも１つの反応チャンバーを有し、その底部に捕捉分子Ａに配置された較正標準が配置されており、かつ基材の部分として少なくとも１つの更なる反応チャンバーを有し、その底部に検出されるべきタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体のための捕捉分子Ａが配置されているマイクロタイタープレートである。
【０１４３】
さらに、上記課題は、タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体の定量化のためのキットであって、
−  タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体のための捕捉分子Ａが配置されて存在し、かつ捕捉分子Ａの一つの部分に定義された数のタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体を有する較正標準が配置されている基材、
−  それとは別個に、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体のための基材上の捕捉分子Ｂ、
を含み、上記捕捉分子Ａおよび上記捕捉分子Ｂが、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体の同じ標的領域に結合する、キットによって解決される。
【０１４４】
捕捉分子Ｂのための混合皿およびバッファーが任意に存在する。
【０１４５】
さらにまた、本発明の主題は、以下の構成要素：
−  任意に親水性表面を有する基材、
−  少なくとも１つの捕捉分子Ａ、
−  代替的に、捕捉分子Ａおよび／または較正標準を有する基材、
−  １つまたは複数の捕捉分子Ｂ、
−  溶液、
−  較正標準、
−  バッファー、
の１つまたは複数を含むキットである。
【０１４６】
本発明のキットの化合物および／または構成要素は、任意選択でバッファーおよび／または溶液と一緒に／その中で容器内に包装されていてよい。
【０１４７】
代替的に、幾つかの構成要素は同じ容器内に包装されていてよい。それに加えてまたはその代わりに、構成要素の１つまたは複数が、例えばガラスプレート、チップもしくはナイロン膜等の固体担体としての基材上またはマイクロタイタープレートの凹部に既に吸収されていてもよい。その際、基材はそのようなマイクロタイタープレートを含む。
【０１４８】
さらに、キットは、任意の実施形態のためのキットの使用説明書を含み得る。
【０１４９】
キットの更なる変形形態では、基材上に上記の捕捉分子が既に固定化されている。さらに、キットは溶液および／またはバッファーを含み得る。被覆および／またはその上に固定化された捕捉分子の保護のために、これらは溶液またはバッファーで覆われて存在し得る。
【０１５０】
本発明の更なる主題は、任意の試料中のタンパク質凝集体を検出することで、タンパク質凝集体を定量化し、それにより力価測定する方法である。
【０１５１】
タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体の濃度の定量的検出のために、装置またはキットの使用ならびに方法の拡張が示されている。
【０１５２】
このように、装置またはキットを使用することで、（動物）試験の最後に、例えば均質化された脳等の複合試料においてタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を検出し得るために十分に感度の良い方法を実施することが可能となる。
【０１５３】
例えば、密度勾配遠心分離によって、全ての所望の画分を作用物質を添加してもまたは添加しなくても濃度変化について調査することができる。上記方法は、密度勾配遠心分離からの１個より多くの画分を濃度変化または凝集体のサイズもしくは他のパラメーターの変化について調査することができる方法工程を提供する。
【０１５４】
密度勾配遠心分離によって、好ましくは、３個より多くの、４個より多くのまたは５個より多くの画分が得られ、これらは濃度変化に関してだけでなく、定量的にも定性的にも調査され得る。上記方法の意味において「所望の画分」という用語は、特に、しかし限定されるものではないが、分離の前に凝集するまたは凝集したペプチドおよび／またはタンパク質構成単位、特に毒性のオリゴマーも含んでいた画分を含む。
【０１５５】
上記方法は、因果関係上それに向けられていないが、当然ながら作用物質を、種々の凝集体サイズおよび形状を有するアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料に添加することができる。あるいはそれは、試料として用いられる動物研究の最後に採取された器官（例えば、脳）である。この場合に、プラセボで処理された動物の試料を、作用物質で処理された動物の試料と比較することができる。
【０１５６】
作用物質または作用物質による処理により、サイズ分布が変化し、それにより器官内の、したがって均質化された試料中の特定の凝集体の濃度が変化する。その際、この濃度変化は定量的に確認される。その変化は、検出可能な凝集体サイズまたは粒子サイズを有する特定の毒性種の減少またはそれどころか完全な排除のための尺度である。すなわち、上記方法では、特定のアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の濃度の増加または減少は、試料中の凝集体サイズ分布の変化を介して検出される。
【０１５７】
したがって、種々の凝集体サイズおよび形状を有するアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の組成は、処理の間に作用物質の影響下で変化する。他の粒子サイズは、作用物質の影響下で増加するか、または一定のままである。
【０１５８】
それにより、有利には、それぞれ特定のサイズを有するアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の濃度変化は、作用物質の影響を伴ってもまたはさらにその影響なしで定量的に認識可能となる。作用物質を含まない対照との比較によって、それぞれの画分におけるアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の凝集体の分布に対する作用物質の影響を定量的に測定することができる。これにより、とりわけ、作用物質が特定の種、例えば毒性オリゴマーを処理相の間に排除する能力に関する作用物質の有効性に関する尺度が得られる。
【０１５９】
１つだけの単独の画分をこのように調査することも可能である。その際、本発明による方法により、作用物質が画分からの特定の配座異性体を定量的に変化させる能力、例えば動物モデルにおいて毒性オリゴマーを排除する能力に関する尺度が得られる。
【０１６０】
本発明の一実施形態では、作用物質の影響下でのペプチドおよび／またはタンパク質の形状分布の変化も、好ましくは蛍光顕微鏡法によって調査される。
【０１６１】
それにより、任意に動物モデルにおける分子作用物質活性の検出も可能である。非常に有利なのは、作用物質による処理に依存する凝集したＡβ（Ａ−ベータ）の減少を定量的にフェムトモル範囲まで検出する動物研究の最後の迅速かつ確実な調査である。
【０１６２】
したがって、密度勾配遠心分離に基づく分画と、蛍光顕微鏡法、特にレーザー走査型顕微鏡法およびＴＩＲＦ顕微鏡法を用いた濃度測定との特に有利な組合せにより、Ａβ（１−４２）ペプチドまたは他のペプチドおよび／またはタンパク質の毒性のオリゴマー種の割合に対する潜在的な作用物質の影響を、単量体形状を測定しないため特に感度よく定量化する方法が開発された。
【０１６３】
任意に、動物研究において作用物質が使用され、対照に対して、試料の粒子サイズ分布に対するその用量に依存する影響に関してｉｎ  ｖｉｖｏで試験される。更に特に有利には、上記方法は、作用物質の影響下での毒性アミロイドβ（Ａβ）オリゴマーの調節に基づくアルツハイマー型認知症（ＡＤ）に対する潜在的な作用物質のスクリーニングのために適している。この研究が動物の行動調査を伴う場合に特に有利である。
【０１６４】
さらに、本発明による方法は、作用物質の影響下でのアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の粒子サイズ分布または凝集体サイズ分布の変化に関する包括的な定量的な結果をもたらす。それにより、例えばＡβオリゴマー等の可溶性の毒性成分の濃度を減少させるべきアルツハイマー型認知症の治療のための有望な作用物質が、動物モデルにおけるその作用について調査される。
【０１６５】
上記方法はそれには限定されない。方法を制限するものではないが、この方法は、さらにまた、作用物質が動物モデルにおいて他の潜在的に毒性の種または所望の種の増加をもたらすかどうかの確認も可能にする。好ましくは、上記方法は、現在の知識水準によれば他の毒性成分の増加がもたらされない作用物質の測定に際して使用される。このためには、特に有利には得られた複数の画分が、構成単位の濃度変化に関して本発明により調査される。
【０１６６】
対照と作用物質または天然のリガンドを含む試料との比較により、例えばオリゴマー等の特定の種の排除および減少に対する作用物質有効性の再現可能で迅速な測定が可能となり、したがって動物モデルにおける、そして後に臨床試験段階におけるその作用の推定が可能となる。
【０１６７】
本発明による方法により、多数の潜在的な作用物質が、試料中のアミロイド性および／または凝集性のペプチドおよび／またはタンパク質の粒子サイズ分布に対するその影響に関して迅速かつ再現可能に定量化されると考えられる。この場合に試料は合成的な種類であってよい。しかしながらまた、天然の作用物質または採取された試料をこのようにして調査することもできる。
【０１６８】
本発明は、これまでの実施形態に限定されるものではない。むしろ、上記方法を簡略化された変形形態で、以下のように実施することもできる。
【０１６９】
試料中のタンパク質ミスフォールディング疾患のタンパク質凝集体を検出する方法であって、
ａ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含む複合試料を選択する工程であって、その凝集体が凝集体表面に単量体のエピトープまたはその検出可能な部分を有する工程と、
ｂ）タンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を含む工程ａ）の後の試料を、基材と接触させ、そこに含まれる単量体を基材上に配置する工程と、
ｃ）少なくとも１つの捕捉分子Ｂを、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する検出のためのプローブとして試料の凝集体と接触させ、タンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に配置する工程であって、捕捉分子Ｂが検出可能なシグナルを発することができる工程と
を含む、方法。
【０１７０】
この方法の一実施形態では、工程ａ）の前にタンパク質ミスフォールディング疾患の単量体に対する捕捉分子Ａが基材上に配置され、工程ｂ）において凝集体の単量体が捕捉分子Ａに配置される。
【０１７１】
本発明の更なる実施形態では、このために、不溶性成分が予め除去された試料が選択される。
【０１７２】
本発明の更なる有利な実施形態では、較正標準は、基材の他の部分または捕捉分子Ａの他の部分に配置され、ここで、較正標準の表面上に検出されるべきタンパク質ミスフォールディング疾患の正確に定義された数の単量体が配置されている。
【０１７３】
本発明の特に有利な実施形態では、試料凝集体に配置された捕捉分子Ｂのシグナルを較正標準に配置された捕捉分子Ｂのシグナルと比較することで、試料凝集体を定量化する。
【０１７４】
工程ａ）〜工程ｇ）を有する特別な方法の上述の特徴が工程ａ）〜工程ｃ）による簡略化された方法に適用されれば、更なる有利な実施形態または効果が現れることがわかる。
【０１７５】
したがって、本発明は、最も単純な場合には、対応するプローブである捕捉分子Ｂを用いて、基材上のタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を検出することである。
【０１７６】
例
さらに、本発明を、例および添付の図面に基づきより詳細に説明するが、これにより本発明の限定がもたらされるべきではない。
【０１７７】
較正標準を、詳細には以下の通りに準備する。
【０１７８】
工程Ａ：無機ナノ粒子の調製
丸底フラスコにおいて、２００ｍｌのエタノール、３．８ｍｌの３０％水酸化アンモニウム、３．５ｍｌの脱イオン水および４．４ｍｌのテトラエトキシシランを２日間にわたり持続的に撹拌する。反応生成物は、約２０ｎｍの直径を有するシリカナノ粒子である。サイズを透過型電子顕微鏡法により測定したところ、アミロイドβ凝集体のサイズに相当する。溶剤の蒸発および秤量により収率を測定する。
【０１７９】
工程Ｂ：第一級アミンでの表面修飾による遊離のアミノ基の形成
４５ｍｌの工程Ａからの反応溶液を、１０μｌの氷酢酸および１６５μｌの３−アミノプロピルトリエトキシシランと混合し、４時間にわたり撹拌する。引き続き、何回か遠心分離して再びエタノール中に取ることによって、粒子を精製する。溶剤の蒸発および秤量により収率を測定する。
【０１８０】
工程Ｃ１：カルボキシル官能基での表面修飾
５０ｍｌの工程Ｂからの精製された粒子を遠心分離し、５０ｍｌのジメチルホルムアミド中に取り、丸底フラスコへと移す。その溶液に５ｍｍｏｌの無水コハク酸を加えた後に、溶液をアルゴン雰囲気下で１時間にわたり９０℃に撹拌および加熱する。時間の経過後にその溶液を２４時間にわたり更に撹拌する。遠心分離して再び脱イオン水中に取ることによって、カルボキシル化された粒子を精製し、溶剤の蒸発および秤量によって収率を測定する。
【０１８１】
工程Ｃ２：マレインイミド官能基での表面修飾
２００ｐｍｏｌの工程Ｂからの粒子を、１０容量％のジメチルホルムアミドを含む１ｍｌの１００ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸バッファー（ｐＨ６）中に取り、４０μｍｏｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１０μｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、４０μＭの６−マレイミドヘキサン酸を加え、１時間にわたり混合する。何回か遠心分離して再び上述のバッファー中に取ることによって、粒子を精製する。
【０１８２】
Ｄ１：アミロイドβ（１−４２）のカルボキシシリカナノ粒子への生体共役反応
１００ｐｍｏｌのカルボキシル化された粒子を、１ｍｌの脱イオン水中に取り、２０μｍｏｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、５μｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加え、１時間にわたり混合する。何回か遠心分離して再び脱イオン水中に取ることによって、活性化された粒子を精製する。最後に、粒子ペレットをリン酸バッファー中に取り、０．３ｍｇの組み換えアミロイドβ１−４２ペプチドに加え、一晩振盪させる。遠心分離して再びヘキサフルオロプロパノール中に取り、そして１時間インキュベートすることによって、生体共役化粒子を精製する。引き続き、何回か遠心分離して再び脱イオン水中に取ることによって、溶剤を精製する。遠心分離して再び脱イオン水中に取ることによって、アミロイドβ（１−４２）粒子を精製し、溶剤の蒸発および秤量によって収率を測定する。市販のビシンコニン酸試験により、エピトープ数を測定し、粒子濃度と関連付ける。
【０１８３】
Ｄ２：アミロイドβ（ここでは１−１５）ペプチドとＣ末端スルフヒドリル修飾との生体共役反応
１ｍｌの工程Ｃ２からの粒子を遠心分離し、１０容量％のジメチルホルムアミドおよび５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む１ｍｌの１００ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸バッファー（ｐＨ６）中に取り、１５ｎｍｏｌのペプチド（配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＣ、追加のシステイン修飾を有するアミロイドβ１−１５）を加え、１０分間にわたり振盪させる。時間の経過後に、その溶液に５０μｍｏｌのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを加え、溶液を一晩振盪させる。翌日に、遠心分離して再び脱イオン水中に取ることによって、粒子を精製し、溶剤の蒸発および秤量によって収率を測定する。市販のビシンコニン酸試験により、エピトープ数を測定し、粒子濃度と関連付ける。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】密度勾配遠心分離（ＤＧＺ）によって分画され、均質化された２つのマウス脳試料の凝集体アッセイの結果
【図２】ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９トランスジェニックマウスの脳ホモジネートの個々の画分中のタンパク質の銀染色
【図３】ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９トランスジェニックマウスの脳ホモジネートの個々の画分中のアミロイドβタンパク質のウェスタンブロット
【０１８５】
図１は、密度勾配遠心分離（ＤＧＺ）によって分画された均質化された２つのマウス脳試料（全半球）の凝集体アッセイの結果を示す。両方のマウスは、器官採取の時点で２４ヶ月齢であった。トランスジェニック動物と呼ばれるマウスは、ヒトアミロイドβを強く発現するＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９二重突然変異であった。野生型動物は、ヒトアミロイドβを発現しないため、ヒトアミロイドβに対する抗体の使用によるアッセイにおいて認識されない。
【０１８６】
画分の区別が可能であり、ウェスタンブロット（図３）と同じ分布を示す。これは、図１に示される濃度がウェスタンブロット（図３）におけるパターンとほぼ対応することを意味するが、本発明による方法によれば正確な定量的表現という利点がある。
【０１８７】
図２で無数のバンドによって弱く示されるような複合試料による強力なバックグラウンドにもかかわらず、測定に成功した。ウェスタンブロットとは対照的に、本発明による方法により（ゲル上で）更に分離することなく特異的なアミロイドβ凝集体を直接検出することが可能となり、これらは有利には較正標準を用いて絶対定量化も可能である。
【０１８８】
試料準備、均質化および密度遠心分離
均質化のために、それぞれ右半球を使用し、６５００ｒｐｍで２×２０秒間にわたり（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）２４、Ｂｅｒｔｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）、トリスバッファー（ｐＨ８．３、２０ｍＭのトリス、２５０ｍＭのＮａＣｌならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（両者ともＲｏｃｈｅ社、バーゼル、スイス）で処理した。
【０１８９】
１５０μｌのホモジネートをもう一度１２００ｇで１０分間遠心分離し、１００μｌの上清を密度勾配にかけた。密度勾配は、５％（重量／容量）〜５０％（重量／容量）のイオジキサノールからなっていた（ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社、ノルウェー）。遠心分離（３時間、２５９０００×ｇ、４℃）（Ｏｐｔｉｍａ  ＴＬ−１００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国）の後に、１４個の画分（各１４０μｌ）を上から下に向かって取り出し、液体窒素中で凍結させ、分析まで−８０℃で保管した。
【０１９０】
プレートの準備および測定
アッセイのために、まず１７０μｍの厚さのガラス底を有する３８４ウェルマイクロタイタープレート（Ｓｅｎｓｏｐｌａｔｅ  Ｐｌｕｓ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ社、フリッケンハウゼン、ドイツ）を準備した。
【０１９１】
プレートのガラス底を、ＡＰＴＥＳ（９９％；（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）で蒸気処理によりシラン化した。このために、プレートをデシケーター内でトルエン（９９％  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）中の５％ＡＰＴＥＳからなる５ｍｌの溶液上にアルゴン雰囲気中で１時間置いた。その後にＡＰＴＥＳ溶液を除去し、プレートを真空下で２時間乾燥させた。プレートの反応チャンバー（ＲＫ）内に、二回蒸留Ｈ２Ｏ中の２ｍＭのスクシンイミジルカーボネート−ポリ−（エチレングリコール）−カルボキシメチル（ＭＷ３４００、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ社、アラブ、米国）を満たし、４時間インキュベートした。時間の経過後に、反応チャンバーを水で３回洗浄した。引き続き、その被覆を２００ｍＭのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸（９８％；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）および５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（９８％；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）で活性化させ、３０分間インキュベートした。二回蒸留Ｈ２Ｏで３回洗浄した後に、ＰＢＳ中のアミロイドβのＮ末端に対する１０μｇ／ｍｌの捕捉抗体（捕捉分子Ａ）（Ｎａｂ２２８モノクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、米国）を反応チャンバーに加え、１時間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）およびＴＢＳで３回洗浄した後に、ＲＫをＳｍａｒｔｂｌｏｃｋ溶液で一晩ブロッキングした（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ドイツ）。翌日に、プレートをＴＢＳで３回洗浄し、試料および標準をトリプレットとしてプレート上に施与し、１時間インキュベートした。
【０１９２】
脳ホモジネート試料をＴＢＳ中で１０倍希釈した後に、それらをプレートに塗布した。アミロイドβオリゴマーのための較正標準として、上記のように合成された２０ｎｍの直径および約３０個のエピトープ（Ａβ１−４２）を有するＡβ１−４２−ＳｉＮａＰ（シリカナノ粒子）を用いた。
【０１９３】
ＴＢＳで３回洗浄した後に、捕捉分子Ｂとしての２つの異なるプローブ抗体（各１．２５μｇ／ｍｌ）、すなわちＣＦ−６３３で標識されたｍＡｂ  ＩＣ１６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）およびＣＦ−４８８で標識されたＮａｂ２２８（エピトープＡβ１−１０）（両者ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）を使用した。プローブは、プレートへの添加前に混合し、遠心分離（１０００００ｇ、１時間、４℃）し、１時間インキュベートした。
【０１９４】
インキュベート後に、反応チャンバーをＴＢＳで３回洗浄し、プレートを密封した。測定は、Ｌｅｉｃａ  ｍｕｌｔｉ−ｃｏｌｏｕｒ  ＴＩＲＦ（全反射照明蛍光）システム（ＡＭ  ＴＩＲＦ  ＭＣ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ヴェツラー、ドイツ）において行った。ＴＩＲＦシステムは、自動式ｘｙｚステージと１００倍の油浸対物レンズ（１．４７  ｏｉｌ  ＣＯＲＲ  ＴＩＲＦ、Ｌｅｉｃａ社）を備えていた。画像は、Ｅｘ／Ｅｍ＝６３３ｎｍ／７０５ｎｍおよび４８８ｎｍ／５２５ｎｍにおいて、両方のチャンネルについて５００ミリ秒の露光時間および８００の濃さで連続して記録した。ＴＩＲＦ浸透深さは２００ｎｍに設定した。顕微鏡は、各チャンネルにおいてＲＫにつき５×５の画像を撮影した。各画像は、１１６ｎｍの横方向分解能および１４ビットの強度分解能で１０００×１０００ピクセルからなる。
【０１９５】
強度限界値を、各チャンネルにおける陰性対照に基づいて評価した。次に、この限界値を全ての画像に適用し、両方のチャンネルの同じ位置（共局在）で強度限界値を上回る画素のみをカウントした。Ａβ１−４２−ＳｉＮａＰ標準を評価することにより、閾値を上回る共局在した画素の数をオリゴマー濃度に変換することができる。
【０１９６】
図２は、ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９トランスジェニックマウスの脳ホモジネートの個々の画分中の全タンパク質の銀染色を示す。
【０１９７】
銀染色のために、ＤＧＺの１２μｌの各画分（１〜１４）を、１６．５％のトリス−トリシンゲルにおけるゲル当たり４５ｍＡの一定の電流強度での１１０分間にわたるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）においてＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、米国）で分離した。ポリアクリルアミドゲルを５０％エタノール／１０％酢酸中で一晩固定した後に、ゲルを１０％エタノール／５％酢酸中で２回５分間の長さでインキュベートした。次に、ゲルを４．７ｍＭのＮａ２ＣＯ３、４．６ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６および１９ｍＭのチオ硫酸ナトリウムＮａ２Ｓ２Ｏ３中で６０秒間インキュベートし、二回蒸留Ｈ２Ｏで２０秒間３回洗浄した。引き続き、ゲルを１２ｍＭのＡｇＮＯ３中で２０分間処理し、再び二回蒸留Ｈ２Ｏで２０秒間３回洗浄した。染色を０．０５％のホルマリン（３７％のホルムアルデヒド溶液）を含む２８０ｍＭのＮａ２ＣＯ３中で所望の強度に至るまで現像した。１％の酢酸での５分間の処理によって、ゲルの更なる現像を停止させた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、米国）を用いて撮影を行った。
【０１９８】
図３は、これに加えてＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９トランスジェニックマウスの脳ホモジネートの個々の画分中のアミロイドβタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【０１９９】
銀染色のために、密度勾配遠心分離の１２μｌの各画分（１〜１４）を、１６．５％のトリス−トリシンゲルにおけるゲル当たり４５ｍＡの一定の電流強度での１１０分間にわたるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）においてＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、米国）で分離した。
【０２００】
タンパク質を、０．２μｍの細孔サイズを有するＰＶＤＦメンブレン（Ｒｏｔｉ−ＰＶＤＦ  ０．２、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ社、ドイツ）に２５Ｖおよび１Ａで３０分間転写した。そのために、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、米国）を使用した。メンブレンを、転写後５分間にわたりＰＢＳ中で煮沸した。冷却後に、メンブレンをＰＢＳおよびＴＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中で５分間インキュベートした。メンブレンを１０％の脱脂粉乳／ＴＢＳＴ（１時間、室温）でブロッキングし、抗Ａβ抗体ｍＡｂ  ＩＣ１６（ＴＢＳＴ中１：１０００、４℃で一晩）インキュベートした。引き続き、メンブレンをＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、米国）（ＴＢＳＴ中１：１００００）と一緒にインキュベートした。ＴＢＳＴで各１０分間３回洗浄した後に、タンパク質バンドを、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、米国）においてＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、リトル・チャルフォント、英国）を使用することによって可視化した。
【０２０１】
請求項１７〜２１に観念的に示されているように、タンパク質ミスフォールディング疾患の検出のための例から個々の工程を省略することにより簡略化された方法が得られることがわかる。
【０２０２】
したがって、本発明は、最も簡単な場合には、対応する定量化工程なしに、対応するプローブである捕捉分子Ｂを用いて基材上でのタンパク質ミスフォールディング疾患の凝集体を検出する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2021504675.tif 000009
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