(57)【要約】  【解決手段】  免疫細胞によって発現されるプログラム可能な受容体複合体であって、プログラム可能な受容体複合体は、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットを含み、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットのうちの少なくとも１つは、ＦｃγＲＩを含むように操作または改変される。受容体成分またはビオチン結合成分であり、ＦｃγＲＩ受容体成分またはビオチン結合成分は、所定の標的に結合するか、さもなければ相互作用する標的検出器分子に結合するように機能する。  【選択図】    図７
2021518428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞によって発現されるプログラム可能な受容体複合体であって、
前記プログラム可能な受容体複合体は、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットを含み、前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットのうちの少なくとも１つは、ビオチン−結合成分を含むように操作または改変され、および前記ビオチン結合成分は、所定の標的に結合するか、さもなければ相互作用する標的検出器分子に結合するように機能する、プログラム可能な受容体複合体。
【請求項２】
請求項１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体において、前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットは、Ｔ細胞受容体サブユニットである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体。
【請求項３】
請求項２記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体において、前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットは、少なくとも１つのＣＤ３−デルタ、ＣＤ３−ガンマ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、２つのＣＤ３−ゼータおよび２つのＣＤ３−イプシロンを含む、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体。
【請求項４】
請求項３記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体において、ビオチン結合成分を含むように操作または改変された前記天然または内因的に発現される受容体サブユニットは、前記ＣＤ３−イプシロンサブユニットである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体。
【請求項５】
請求項１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体において、前記免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、または同種異系細胞である、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体。
【請求項６】
請求項１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体において、前記ビオチン結合成分は、単量体ストレプトアビジン２または増強モノアビジンである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体。
【請求項７】
請求項１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体において、前記ビオチン結合成分は、ニワトリアビジンである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体。
【請求項８】
請求項１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体において、前記標的検出器分子は、ビオチン部分、安定化コア構造、および前記所定の標的に特異的なパラトープまたは他のリガンドを含む、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体。
【請求項９】
請求項１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体において、前記所定の標的は、既知のタイプの癌細胞または癌細胞決定基、あるいは感染症剤または既知のタイプの感染症剤の決定基である、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体。
【請求項１０】
プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムであって、
（ａ）免疫細胞と、および
（ｂ）前記免疫細胞によって発現されるプログラム可能な受容体複合体と、を含み、
（ｉ）前記プログラム可能な受容体複合体は、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットを含み、
（ｉｉ）前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットのうちの少なくとも１つは、ビオチン結合成分を含むように操作または改変されており、
（ｉｉｉ）前記ビオチン結合成分は、所定の標的に結合するか、さもなければ相互作用する標的検出器分子に結合するように機能する、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項１１】
請求項１０記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットは、Ｔ細胞受容体サブユニットである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体細胞システム。
【請求項１２】
請求項１１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットは、少なくとも１つのＣＤ３−デルタ、ＣＤ３−ガンマ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、２つのＣＤ３−ゼータおよび２つのＣＤ３−イプシロンを含む、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体細胞システム。
【請求項１３】
請求項１２記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、ビオチン結合成分を含むように操作または改変された前記天然または内因的に発現された受容体サブユニットは、前記ＣＤ３−イプシロンサブユニットである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項１４】
請求項１０記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、または同種異系細胞である、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体細胞システム。
【請求項１５】
請求項１０記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記ビオチン結合成分は、単量体ストレプトアビジン２または増強モノアビジンである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体細胞系。
【請求項１６】
請求項１０記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記ビオチン結合成分は、ニワトリアビジンである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項１７】
請求項１０記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記標的検出器分子は、ビオチン部分、安定化コア構造、および所定の標的に特異的なパラトープまたは他のリガンドを含む、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項１８】
請求項１０記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記所定の標的は、既知のタイプの癌細胞または癌細胞決定基、あるいは感染症剤または既知のタイプの感染症剤の決定基である、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項１９】
請求項１０記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記システムは、診断的使用に適合される、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項２０】
請求項１０記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記システムは、治療的使用に適合される、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項２１】
プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムであって、
（ａ）免疫細胞と、および
（ｂ）前記免疫細胞によって発現されるプログラム可能な受容体複合体と、を含み、
（ｉ）前記プログラム可能な受容体複合体は、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットを含み、
（ｉｉ）前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットのうちの少なくとも１つは、ＦｃγＲＩ受容体成分を含むように操作または改変されており、
（ｉｉｉ）前記ＦｃγＲＩ受容体成分は、所定の標的に結合するか、さもなければ相互作用する標的検出器分子に結合するように機能する、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項２２】
請求項２１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットは、Ｔ細胞受容体サブユニットである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体細胞システム。
【請求項２３】
請求項２２記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットは、少なくとも１つのＣＤ３−デルタ、ＣＤ３−ガンマ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、２つのＣＤ３−ゼータおよび２つのＣＤ３イプシロンを含む、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項２４】
請求項２３記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、ビオチン結合成分を含むように操作または改変された前記内因的に発現される受容体サブユニットは、前記ＣＤ３−イプシロンサブユニットである、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項２５】
請求項２１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、または同種異系細胞である、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体細胞系。
【請求項２６】
請求項２１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記標的検出器分子は、ＩｇＧ抗体である、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項２７】
請求項２１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記所定の標的は、既知のタイプの癌細胞または癌細胞決定基、あるいは感染症剤または既知のタイプの感染症剤の決定基である、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項２８】
請求項２１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記システムは、診断用途に適合される、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【請求項２９】
請求項２１記載のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムにおいて、前記システムは、治療的使用に適合される、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
コンピューター可読形式（ＣＲＦ）の配列表がファイルにある。配列表は、２０１９年３月１４日に作成されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１−１８＿ＳＴ２５．ｔｘｔというタイトルのＡＳＣＩＩテキスト（．ｔｘｔ）ファイルにあり、サイズは４７ＫＢである。配列表は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。
【０００２】
記載された発明は、一般にキメラ抗原免疫受容体、より具体的には、診断および治療用途の両方の目的の標的に特異的な標的検出器分子と共に使用され得るプログラム可能な免疫細胞受容体複合体システムに関する。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体、またはＣＡＲ  Ｔとも呼ばれる）は、免疫エフェクター細胞（すなわち、Ｔ細胞）に任意の特異性（例えば、モノクローナル抗体）を与える操作された受容体である。このような受容体は、これらの受容体が異なる供給源に由来する成分を含むため、「キメラ」と呼ばれる。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、癌治療において最も重要なツールの１つになる。その基本的な形では、ＣＡＲ療法は、ヒトの免疫細胞を適応させて、癌性の細胞や体内に危険な病原体を抱える細胞を認識して殺す。このプロセスは、Ｔリンパ球や他の免疫細胞の表面に組換え受容体を生成する遺伝子工学によって達成され、それによってそれらの機能と特異性をリダイレクトする。
【０００４】
養子細胞移植と呼ばれる技術を使用する癌のＣＡＲ療法は、急性リンパ芽球性白血病を治療するために使用されてきた。この治療法では、患者からＴ細胞を取り除き、それらの細胞を改変して、患者の癌に特異的な受容体を発現させる。癌細胞を効果的に認識して殺すことができる修飾Ｔ細胞が患者に再導入される。キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の養子移入は、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が事実上すべての腫瘍関連抗原を標的とするように操作できるため、抗癌治療薬として非常に有望である。
【０００５】
癌免疫療法のためのＣＡＲ  Ｔ細胞の操作には、導入遺伝子を宿主細胞ゲノムに組み込むレトロウイルス、レンチウイルス、またはトランスポゾンなどのウイルスベクターの使用が含まれる場合がある。ただし、このアプローチは、Ｔ細胞の内因性遺伝子発現に悪影響を与える可能性があり、遺伝毒性を引き起こし、操作された細胞が腫瘍形成性になる可能性がある。別のアプローチでは、プラスミドやｍＲＮＡなどの非組み込みベクターを利用する。ただし、これらのタイプのエピソームＤＮＡ／ＲＮＡは通常、細胞分裂を繰り返すと失われ、操作されたＣＡＲ  Ｔ細胞は比較的短時間でＣＡＲ発現を失う可能性がある。別のアプローチは、そのゲノムに組み込まれることなく、Ｔ細胞で安定して維持されるベクターの使用を含む。この方法は、挿入型遺伝子変異や遺伝毒性のリスクなしに長期の導入遺伝子発現を可能にし、それによって癌免疫療法用のＣＡＲ  Ｔ細胞を生産するためのより安全なアプローチを提供する。
【０００６】
マクロファージ、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞が使用されてきたが、ＣＡＲ細胞の構築は、圧倒的にＴ細胞に依存してきた。ほとんどのＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原認識のために表面に抗体一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むが、さまざまなタンパク質を使用することもできる。ＣＡＲ  Ｔ細胞内では、これらの抗原認識ドメインは細胞内シグナル伝達のためにＣＤ３ζ鎖にリンクされる。ＣＤ３ζ鎖は、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）からのシグナルの主要な伝達物質である。表面受容体が特定の抗原に結合すると、シグナル伝達ドメインはサイトカイン放出、標的細胞溶解、Ｔ細胞増殖を活性化する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の安全性と抗腫瘍効果を改善するためにさまざまな設計戦略が使用され、４世代のＣＡＲ設計が実現した。第１世代のＣＡＲには、ターゲット検出ドメインと１つのシグナリングドメインが含まれる。第２世代のＣＡＲには、ターゲット検出ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳなど）が含まれる。前臨床試験では、第２世代がＴ細胞の抗腫瘍活性を改善することが示された。第３世代のＣＡＲには、ターゲット検出ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および２つの共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−ＯＸ４０など）が含まれる。図１は、６つのＩＴＡＭおよび標的化のための永続的な共有結合されたｓｃＦｖのみを示す標準的な第３世代のＣＡＲの図を提供する。この技術の進化の間に、使用されたＰＩ３Ｋ結合部位は補助受容体ＣＤ２８で同定され、ＩＴＡＭモチーフはＣＤ４−およびＣＤ８−ｐ５６ｌｃｋ複合体の標的として同定された。第４世代のＣＡＲは、サイトカイン放出機能のため、最初の３世代とは大きく異なる。
【０００７】
免疫腫瘍学における小分子薬物コンジュゲート（ＳＭＤＣ）プラットフォームには、ＦＩＴＣ分子と呼ばれる良性分子に非常に高い親和性で結合する単一のユニバーサルＣＡＲ  Ｔ細胞のエンジニアリングが含まれる。これらの細胞は、二重特異性ＳＭＤＣアダプター分子と同時投与されると、さまざまな種類の癌の治療に使用される。これらのユニークな二重特異性アダプターは、ＦＩＴＣ分子と腫瘍ホーミング分子で構成されており、ユニバーサルＣＡＲ  Ｔ細胞を癌細胞に正確に誘導し、局所的なＴ細胞の活性化をもたらす。抗腫瘍活性は、ユニバーサルＣＡＲＴ細胞と正しい抗原特異的アダプター分子の両方が存在する場合にのみ誘導される。抗腫瘍活性および毒性は、投与されるアダプター分子の投与量を調整することによって制御することができる。抗原的に不均一な腫瘍の治療は、所望の抗原特異的アダプターの混合物の投与によって達成することができる。ただし、この治療方法に関連する制限と困難には、次の、（ｉ）サイトカイン放出と腫瘍崩壊の速度の不制御、（ｉｉ）腫瘍の根絶が完了した際に細胞毒性活性を終わらせることができる「オフスイッチ」の不在が含まれる。
【０００８】
第２および第３世代のＣＡＲ  Ｔを使用する間に有害事象が発生した。１人の患者はシクロホスファミド化学療法に続いて抗原ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）を認識するＣＡＲＴを注入した５日後に死亡した。毒性は、炎症誘発性サイトカインの臨床的に有意な放出、肺毒性、多臓器不全、および最終的な患者の死亡につながった。この「サイトカインストーム」（サイトカイン放出症候群）は、低レベルのＥＲＢＢ２を発現することが知られる正常な肺上皮細胞に対するＣＡＲＴ細胞の細胞毒性が原因であると考えられた。このおよび他の有害事象は、腫瘍関連抗原に対する抗体とは異なり、これらの細胞が体から迅速に除去されないため、ＣＡＲＴを利用する際の注意の必要性を強調する。良好な臨床転帰にはＣＡＲＴへの長期暴露が必要であるが、副作用のために実行可能ではない。癌免疫療法の大きな期待は、従来の治療法の毒性なしに腫瘍を取り除くことである。ＣＡＲ  Ｔによる癌の治療には、いくつかの利点：ＨＬＡに依存しない抗原の認識、多くの患者への幅広い適用性、および迅速な送達である。ＣＡＲ  Ｔの適用を成功させるには、腫瘍細胞にのみ発現する腫瘍関連抗原を特定する必要があり、それによって毒性リスクを最小限に抑えることができる。
【０００９】
大きな成功にもかかわらず、ＣＡＲ  Ｔ細胞システムの開発と改善の取り組みは、複数の課題によって妨げられた：（ｉ）システムの機能には、さまざまな検出器の迅速な適応性のためのプラットフォームがないため、ターゲット抗原ごとに個別の細胞開発パスが必要である（ｉｉ）ＣＡＲ  Ｔ細胞系の単一抗原特異性は、腫瘍の不均一性の場合、および癌細胞がＣＡＲを標的とするマーカーの一部の発現を停止し、それによって免疫応答を回避する場合に問題となる可能性がある（ｉｉｉ）ＣＡＲ活性の無秩序な持続は、サイトカイン放出症候群および他の毒性を引き起こす可能性がある（ｉｖ）現在のシステムは、Ｔ細胞の使用に重点を置いており、その分野のごく一部が他の細胞タイプを使用しようとする。（ｖ）ほとんどのＣＡＲ  Ｔ細胞は、感染症の治療にほとんどまたはまったく注意を払わずに癌治療のために開発される（ｖｉ）ＣＡＲ  Ｔ細胞は、弱く発現したオフ腫瘍標的に結合して反応し、望ましくない効果（「オンターゲットオフ腫瘍」反応）を引き起こすことがある。（ｖｉｉ）操作された細胞は、シグナル伝達能力が低く、細胞増殖と持続性が低下する可能性がある。したがって、より予測可能で、効果的で、信頼性の高い別の世代のＣＡＲ  Ｔ細胞、または前述の欠陥を克服する別のシステムに対する継続的な必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以下は、本発明の特定の例示的な実施形態の要約を提供する。この要約は、広範な概要ではなく、本発明の重要または重要な側面または要素を特定すること、またはその範囲を描写することを意図するものではない。しかしながら、本発明を説明および主張するために使用される言語での不定冠詞の使用は、説明されたシステムを限定することを決して意図していないことを理解されたい。むしろ、「ａ」または「ａｎ」の使用は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである。
【００１１】
本発明の一態様によれば、免疫細胞によって発現されるプログラム可能な免疫細胞受容体複合体が提供される。このプログラム可能な免疫細胞受容体複合体は、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットを含み、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットの少なくとも１つは、ビオチン結合成分（またはビオチン類似体結合成分）を含むように操作または改変され、前記ビオチン結合成分は、所定の標的に結合するか、さもなければ相互作用する標的検出器分子に結合するように機能する。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムが提供される。このプログラム可能な免疫細胞受容体複雑細胞システムには、免疫細胞が含まれる。免疫細胞によって発現されるプログラム可能な受容体複合体であって、プログラム可能な受容体複合体は、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットを含み、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットのうちの少なくとも１つは、ビオチン結合成分（またはビオチン類似体結合成分）を含むように操作または改変され、ビオチン結合成分は、所定の標的に結合するか、そうでなければ相互作用する標的検出器分子に結合するように機能する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムが提供される。このプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムには、免疫細胞が含まれ、前記プログラム可能な受容体複合体は、複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットを含み、前記複数の天然または内因的に発現される受容体サブユニットのうちの少なくとも１つは、ＦｃγＲＩ受容体成分を含むように操作または改変され、および、前記ＦｃγＲＩ受容体成分は、所定の標的に結合するか、さもなければ相互作用する標的検出器分子に結合するように機能する。
【００１４】
本発明の追加の特徴および態様は、例示的な実施形態の以下の詳細な説明を読んで理解すると、当業者には明らかになるだろう。当業者によって理解されるように、本発明のさらなる実施形態は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく可能である。したがって、図面および関連する説明は、例示的であり、本質的に限定的ではないと見なされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
明細書に組み込まれ、その一部を形成する添付の図面は、本発明の１つまたは複数の例示的な実施形態を概略的に示し、上記の一般的な説明および以下の詳細な説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ、および：
【図１】図１は、６つのＩＴＡＭおよび標的化のための永続的な共有結合されたｓｃＦｖを示す標準的な第３世代（先行技術）ＣＡＲの図である。
【図２】図２は、抗原結合領域を示すマウスＩｇＧ抗体の図である。
【図３】図３は、標的エピトープに結合するためのパラトープ、安定性のための全体的なコア構造、および本発明の操作された受容体の一部に結合するビオチンを示す、本発明の例示的な標的検出器分子の図である。
【図４】図４は、例示的な天然または内因的に発現されたαβＴ細胞受容体複合体の図である。
【図５】図５は、例示的な天然または内因的に発現されたγδＴ細胞受容体複合体の図である。
【図６−２７】図６〜図２７は、内因性αβＴ細胞受容体複合体または内因性γδＴ細胞受容体複合体のいずれかに基づく、本発明の操作された受容体のマウスＦｃγＲＩ変異体の例示的な実施形態の図である。
【図２８−４５】図２８〜図４５は、内因性αβＴ細胞受容体複合体または内因性γδＴ細胞受容体複合体のいずれかに基づく、本発明の操作された受容体のｍＳＡ２変異体の例示的な実施形態の図である。
【図４６−５７】図４６〜図５７は、内因性αβＴ細胞受容体複合体または内因性γδＴ細胞受容体複合体のいずれかに基づく、本発明の操作された受容体のｅＭＡ変異体の例示的な実施形態の図である。
【図５８−６９】図５８〜図６９は、内因性αβＴ細胞受容体複合体または内因性γδＴ細胞受容体複合体のいずれかに基づく、本発明のＦｃγＲＩ／ｍＳＡ２組み合わせ変異体の例示的な実施形態の図である。
【図７０−８９】図７０〜図８９は、内因性αβＴ細胞受容体複合体または内因性γδＴ細胞受容体複合体のいずれかに基づく、本発明のＦｃγＲＩ／ｅＭＡ組み合わせ変異体の例示的な実施形態の図である。
【図９０Ａ】図９０Ａは、本発明の例示的な実施形態による、発光レポーター酵素エクオリンの遺伝子構築物の図である。
【図９０Ｂ】図９０Ｂは、本発明の例示的な実施形態による、ユニバーサルまたはプログラム可能なＴＣＲ複合体ｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζの遺伝子構築物の図である。
【図９０Ｃ】図９０Ｃは、本発明の別の例示的な実施形態による、ユニバーサルまたはプログラム可能なＴＣＲ複合体ｍＳＡ２−ＣＤ３ζの遺伝子構築物の図である。
【図９０Ｄ】図９０Ｄは、本発明のさらに別の例示的な実施形態による、ユニバーサルまたはプログラム可能なＴＣＲ複合体ｅＭＡ−ＣＤ３εの遺伝子構築物の図である。
【図９１】図９１は、プラスミドｐＦＳＣ００５（ｐＥＦ１−Ａｅｑ）の図である。
【図９２】図９２は、プラスミドｐＦＳＣ０４８（ｐＶｉｔｒｏ−ｂｌａｓｔｉ−Ａｅｑ−ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ）（ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ）の図である。
【図９３】図９３は、プラスミドｐＦＳＣ０７４ｂ（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ−２Ａ−Ｂｌａｓｔｉ）（ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ）の図である。
【図９４】図９４は、プラスミドｐＦＳＣ０８６（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）の図である。
【図９５】図９５は、プラスミドｐＦＳＣ１００（ｐＦＳＣ０９５−ｅＭＡ−ＬＬ−ＣＤ３ｅ−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔ）（ｅＭＡ−ＣＤ３ε）の図である。
【図９６】図９６は、プラスミドｐＦＳＣ０９７（ｐＦＳＣ０９５−ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ε−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）の図である。
【図９７】図９７は、プラスミドｐＦＳＣ０９８（ｐＦＳＣ０９５−ＦｃγＲＩ−ＴＲＡＣ−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）の図である。
【図９８】図９８は、プラスミドｐＦＳＣ０９４（ｐＦＳＣ０４８−ＦｃγＲＩ−ＴＲＢＣ１−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）の図である。
【図９９】図９９は、プラスミドｐＦＳＣ１０３（ｐＦＳＣ１０２−ｅＭＡ−ＬＬ−ＴＲＢＣ１−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）の図である。
【図１００】図１００は、プラスミドｐＦＳＣ０８５（ｐＦＳＣ０８３ａ−ｅＭＡ−ＬＬ−ＣＤ３ζ−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）の図である。
【図１０１Ａ−１０１Ｃ】図１０１Ａ〜図１０１Ｃは、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の未染色、陰性、および染色サンプルにおけるｅＭＡ−ＣＤ３ε受容体の発現レベルを比較するフローサイトメトリープロットである。図１０１Ａは未染色のサンプルである。図１０１Ｂは二次Ａｂのみである。および図１０１Ｃは一次Ａｂと二次Ａｂである。
【図１０２】図１０２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するビオチン化マウスｍＡｂを使用した荷電ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の活性化を示すグラフであり、陰性対照は、非特異的抗原であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  ＬＰＳであった。
【図１０３】図１０３は、ビオチンを使用したｅＭＡ受容体の阻害を示すグラフであり、ビオチンは受容体に結合し、ビオチン化抗体が結合するのを防ぐ。
【図１０４】図１０４は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するビオチン化マウスｍＡｂと混合した場合、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞が活性化されて光シグナルを放出する、ビオチン競合アッセイの結果を示すグラフである。
【図１０５】図１０５は、シグナル出力に対するビオチン濃度の影響を示すグラフであり、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞上のｅＭＡ受容体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳと混合したＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対してビオチン化マウスｍＡｂを使用して細胞を活性化する細胞活性化中にビオチン濃度を変化させることによって阻害された。
【図１０６−１０７】図１０６〜図１０７は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳ（１Ｆ１１）ＩｇＧ２ａに対する精製されビオチン化マウスｍＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロット分析の画像である。ここで、図１０６は、レーン１のタンパク質標準、レーン２の精製された非ビオチン化タンパク質、およびレーン３の精製されたビオチン化タンパク質を示す４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。ここで、図１０７は、レーン１のタンパク質標準、レーン２の精製された非ビオチン化タンパク質、およびレーン３の精製されたビオチン化タンパク質を示すウエスタンブロット分析の写真である。
【図１０８】図１０８は、ビオチン化１Ｆ１１（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するマウスｍＡｂ）精製からの溶出画分のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す棒グラフであり、画分は、ＨＲＰ結合抗ビオチンＩｇＧに対して試験された。
【図１０９】図１０９は、フリースタイル２９３−Ｆ細胞上清における１Ｆ１１（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するマウスｍＡｂ）ＩｇＧ２ａ抗体発現のＥＬＩＳＡ時間経過特性を示す棒グラフである。
【図１１０】図１１０は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７特異的抗体（ｍＡｂ  ＦＦ７５４）のＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１への結合のビアコア分析の結果を示すグラフであり、その結果は、ｍＡｂＦＦ７５４がＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７に特異的であることを確認する。
【図１１１】図１１１は、異なる濃度の抗体を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７特異的抗体とＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７との間の相互作用の動態のビアコア分析の結果を示すグラフである。
【図１１２】図１１２は、サイトカイン放出研究（ＩＬ−２を放出するためのｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の活性化）の結果を示すグラフであり、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するビオチン化抗体と細胞をインキュベートすると、細胞活性化およびＩＬ−２放出が起こる。
【図１１３】図１１３は、サイトカイン放出研究（ＩＬ−２を放出するためのｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の活性化）の結果を示すグラフであり、ＩＬ−２放出は、抗体濃度依存性であることが示された。
【図１１４−１１６】図１１４〜図１１６は、活性化マーカー発現アッセイ（マウス抗Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１ＬＰＳを使用した活性化時のｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞におけるＣＤ６９の発現レベル）の結果を示すグラフであり、図１１４は、ＬＰＳのみでインキュベートされた細胞の結果を示す。図１１５は抗体のみとインキュベートした細胞の結果を示す。抗体およびＬＰＳとともにインキュベートされた細胞の結果を示す。
【図１１７−１１９】図１１７〜図１１９は、は、活性化マーカー発現アッセイ（マウス抗Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳを使用した活性化時のｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞上のＣＤ６２Ｌの発現レベル）の結果を示すグラフである。図１１７は、ＬＰＳのみでインキュベートされた細胞の結果を示す。図１１８は抗体のみとインキュベートした細胞の結果を示す。および図１１９は、抗体およびＬＰＳとインキュベートした細胞の結果を示す。
【図１２０】図１２０は、ＸＴＴ試薬と２時間インキュベートした後の、さまざまなサンプルのＯＤ４５０での平均吸光度測定値を示すグラフである：Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞；Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＥＧＦＲ＋エフェクターＴ細胞；Ｒａｊｉ＋抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞；およびＫ５６２＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞、及び
【図１２１】図１２１は、さまざまなサンプルで計算された標的細胞の生存率％を示すグラフである：Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞。Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＥＧＦＲ＋エフェクターＴ細胞；Ｒａｊｉ＋抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞；およびＫ５６２＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ここで、本発明の例示的な実施形態を、図を参照して説明する。参照番号は、さまざまな要素および構造を参照するために詳細な説明全体で使用される。以下の詳細な説明は、例示の目的で多くの詳細を含むが、当業者は、以下の詳細に対する多くの変形および変更が本発明の範囲内にあることを理解するだろう。したがって、本発明の以下の実施形態は、クレームされた発明に対する一般性を失うことなく、またそれに制限を課すことなく説明される。
【００１７】
前述のように、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）は癌治療において非常に重要である。ＣＡＲ療法では、ヒトの免疫細胞を適応させて、癌性の細胞や体内に危険な病原体を抱える細胞を認識して殺す。このプロセスは、Ｔリンパ球や他の免疫細胞の表面に組換え受容体を生成する遺伝子工学によって達成され、それによってそれらの機能と特異性をリダイレクトする。この変更に続いて、細胞は特定の既知の「固定された標的」を探すために患者に再導入される。これらの細胞は、これらの「固定された標的」を運ぶ体内の「悪い」細胞を識別して殺すことができる。ただし、現在のＣＡＲ  Ｔシステムには、さまざまな検出器を迅速に適応させるためのプラットフォームがなく、「固定ターゲット」ごとに個別の細胞開発パスが必要である。さらに、一度投与されると、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性を調節またはオフにし、上記のような有害反応を停止させることはできない。さらに、Ｔ細胞の過剰なエンジニアリングと高侵襲性の操作は、細胞のシグナル伝達能力、細胞の増殖、生存および持続性を低下させる。したがって、本発明のプログラム可能な、普遍的な、適応可能なＴＣＲ複合体は、プログラム可能な免疫細胞受容体複合体を含む新規の細胞システムを提供することによって、既存のＣＡＲ  Ｔシステムの欠陥を克服するように設計される。
【実施例１】
【００１８】
実施例Ｉ：ｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ
本発明の第１の例示的な実施形態は、マウスＦｃγＲＩ（ｍＦｃγＲＩ）をヒトＴＣＲ複合体のＣＤ３ζに融合してｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζを生成することによるＴＣＲ複合体の改変を含む、プログラム可能で普遍的な適応可能なＴＣＲ複合体システムを含む。発現したユニバーサル受容体（ｍＦｃγＲＩ）は、一部のマウス免疫グロブリンのＦｃ領域に高い親和性で結合し、アダプターＴＣＲ複合細胞を特定の抗原を標的とするようにリダイレクトする。図２は、抗原結合領域を示すｍＩｇＧ抗体の図である。ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ遺伝子は、エレクトロポレーションによってＣＤ４＋Ｔ細胞に送達され、ランダムインサートとして追加された。図６〜２７は、内因性αβＴ細胞受容体複合体または内因性γδＴ細胞受容体複合体のいずれかに基づく、本発明の操作された受容体のｍＦｃγＲＩ変異体の例示的な実施形態の図である。この実施形態の変形は、米国特許第９，７５２，１９９号、９，８５０，５４６、９，８５０，５４７、および９，８５０，５４８にさらに記載され、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例２】
【００１９】
実施例ＩＩ：ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ
本発明の第２の例示的な実施形態は、単量体ストレプトアビジン２（ｍＳＡ２）およびヒトＴＣＲ複合体の内因性ＣＤ３ζを融合することによるＴＣＲ複合体の改変を通じて開発された、プログラム可能で、普遍的で、適応可能なＴＣＲ複合体システムを含む。ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ遺伝子は、エレクトロポレーションによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーを使用して内因性ＣＤ３ζを置き換えることにより、ヘテロ接合インサートとしてＣＤ４＋Ｔ細胞に導入された。この設計では、表面発現ユニバーサル受容体（ｍＳＡ２）は、ビオチン化標的検出器分子（ＴＤＭ）に結合し、アダプターＴＣＲ複合体細胞を特定の抗原を標的とするようにリダイレクトできる。図３は、標的エピトープに結合するためのパラトープ（または他のリガンド）、安定性およびビオチンのための全体的なコア構造、操作された受容体に結合するための結合部位を示す例示的な標的検出器分子の図である。このバージョンのアダプターＴＣＲ複合体は、次の点で標準のＣＡＲ  Ｔ細胞とは異なる：（ｉ）ｍＳＡ２受容体は普遍的（任意のビオチン化ＴＤＭに結合できる）、（ｉｉ）ｍＳＡ２受容体は、設計された細胞は複合体の１０個のＩＴＡＭすべてを利用するため、最大のシグナル伝達能力のためにＴＣＲ複合体を利用するように設計された方法で、ＣＤ３ζＴＣＲ複合体に直接結合する。図２８〜４５は、内因性αβＴ細胞受容体複合体または内因性γδＴ細胞受容体複合体のいずれかに基づく、本発明の操作された受容体のｍＳＡ２−ＣＤ３ζ変異体の例示的な実施形態の例示である。この実施形態の変形は、米国特許第９，７５２，１９９号、９，８５０，５４６；９，８５０，５４７、および９，８５０，５４８にさらに記載され、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例３】
【００２０】
実施例ＩＩＩ：ｅＭＡ−ＣＤ３ε
本発明の第３の例示的な実施形態は、増強されたモノアビジン（ｅＭＡ）およびヒトＴ細胞受容体複合体の内因性ＣＤ３εを融合してｅＭＡ−ＣＤ３ε（１０個の保持されたＩＴＡＭすべてを示すｅＭＡ−ＣＤ３εアダプターＴＣＲ複合体発現コンストラクトの設計を示す、図４６および４８を参照）を形成することによるＴＣＲ複合体の改変を通じて開発された、プログラム可能で、普遍的で、適応可能なＴＣＲ複合体システムを含む。ユニバーサル受容体ｅＭＡは、ビオチン結合ＴＤＭに非常に高い親和性で結合できるため、修飾Ｔ細胞はビオチン化ＴＤＭがロードされる抗原をターゲットにすることができる。この実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞表面上にｅＭＡ−ＣＤ３εを発現するように遺伝子操作される。活性化に続いて、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、他の免疫細胞を動員し、さまざまな癌標的または病原体を追跡する。ｅＭＡ−ＣＤ３ε遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーを使用して内因性ＣＤ３εを置き換えることによりホモ接合挿入としてＴ細胞に導入され、設計上、Ｔ細胞受容体複合体の両方のＣＤ３εが利用される（図４６および４８参照）。遺伝子構築物は、エレクトロポレーションによって送達された。この操作された細胞は、３つの基本的な点で標準のＣＡＲ  Ｔ細胞とは異なる：（ｉ）ｅＭＡ受容体は普遍的である（ビオチン化ＴＤＭに結合できる）（ｉｉ）ｅＭＡ受容体は、内因性ＣＤ３εを介してＴＣＲ複合体に直接結合し、これは、設計された細胞が複合体の１０個のＩＴＡＭをすべて利用するため、ＴＣＲ複合体を利用して最大のシグナル伝達能力を発揮するように設計される（ｉｉｉ）ｅＭＡをＴＣＲ複合体の内因性ＣＤ３εにリンクすることにより、ＴＣＲ複合体ごとに２つのユニバーサル受容体が作成される。図４６〜５７は、内因性αβＴ細胞受容体複合体または内因性γδＴ細胞受容体複合体のいずれかに基づく、本発明の操作された受容体のｅＭＡ−ＣＤ３ε変異体の例示的な実施形態の図である。
【００２１】
ｅＭＡ−ＣＤ３εの実施形態は、非侵襲的であり、ＴＣＲ複合体に干渉せず、ＴＣＲ複合体の１０個のＩＴＡＭすべてを利用し、それにより、最大のシグナル伝達をもたらす。一連のインビトロ実験において、ビオチン化ＴＤＭおよび特定の標的を使用して、アダプターＴＣＲ複合体細胞を活性化した（図１０２参照）。実験は、３つの例示的な実施形態すべての活性化がサイトカイン産生をもたらすことを実証した（図７５〜７６参照）。さらに、ビオチン競合および阻害アッセイは、本発明に従って改変された細胞の活性を調節できることを示した（図６６〜６８参照）。
【００２２】
第３の実施形態に関して、ユニバーサル受容体（ｅＭＡ）は、任意のビオチン結合プログラミングＴＤＭに結合することができ、それにより、特定の／正しいビオチン化ＴＤＭが細胞表面に結合するとき、改変Ｔ細胞が任意の抗原または癌細胞を標的化することを可能にする。図４７は、標的検出器分子と相互作用する完全にロードされたｅＭＡ−ＣＤ３εを示し、ここで、すべてのＴＣＲ複合体に対して２つの普遍的な受容体があり、ＴＣＲ複合体の１０個のＩＴＡＭすべてが保持される。安全対策として、これらの操作された細胞を体内に投与した後、ビオチンを阻害剤／競合物質として使用して、副作用の場合に細胞活性を調節することができる。標準のＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、この設計は非侵襲的であり、改変されたＴ細胞が最大のシグナル伝達能力で自然に機能することを可能にし、細胞の増殖、生存、持続性を改善する。ｅＭＡ−ＣＤ３εの実施形態を開発する際に、ｅＭＡ−ＣＤ３εを発現するＴ細胞は、標的抗原としてＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１細菌に対するビオチン化ｍＡｂを使用して活性化された。さらに、以下で説明するように、ビオチンは、細胞の活性化を調節するための競合および阻害研究で使用された。本発明のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体を含むＴ細胞は、癌のより安全で適応性のある治療として、および診断における病原体検出器として、治療において使用することができる。改変されたＴ細胞で実施された細胞活性化およびサイトカイン放出アッセイ（図６５および７５〜７６参照）は、細胞の機能性および性能を首尾よく実証した。
【００２３】
本発明のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体は、現在のＣＡＲ  Ｔ細胞システムに影響を与える多くの課題に効果的に対処し、既存のシステムおよび方法に比べて大幅な改善を提供する。既存のＣＡＲ  Ｔ細胞システムに対する利点と改善点は次のとおりである：（ｉ）「固定ターゲット」ごとに個別の細胞開発パスは必要ない；（ｉｉ）異なるターゲットの多重化ブレンドを適用できる；（ｉｉｉ）既存のＣＡＲ  Ｔ細胞に関連する「オンターゲットオフ腫瘍」の問題は、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞および腫瘍抗原に対してより高い特異性を持つＴＤＭを使用することによって回避できる；（ｉｖ）記載されるプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞は、任意のサンプルの抗原検出に使用でき、同時に体内で検出された病原体／バイオマーカーを標的とする治療として投与できるため、コンパニオン診断で使用するように設計される；（ｖ）記載されるプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムは、さまざまな癌、感染症（結核やＨＩＶなど）およびその他の患者固有のニーズに対処するための普遍的／プログラム可能な構成として使用できる；（ｖｉ）本発明は、投与後にシステム活性を調節またはオフにすることができ（ビオチンを使用して）、有害反応を停止する能力を有するため、より安全な展開を提供する；（ｖｉｉ）追加の安全対策として、記載されるシステムの活性は、ビオチン化ＴＤＭの用量依存的投与で調節することができる；（ｖｉｉｉ）記述されたシステムの多様性と改善された安全性は、より良い結果と加速された臨床試験のより良い見通し、そしてより広い範囲の標的を積極的に追跡する能力を可能にする；（ｉｘ）設計の安全機能により、長い（そしてしばしば誤解を招く）動物研究を経ることなく、ヒトの生物学的標的のより迅速な検証を達成することができる；（ｘ）記述されたシステムの再利用可能なコンポーネントは、基礎となるユニバーサルテクノロジーを維持しながら、ターゲティング抗体を変更することにより、新しい構成を市場に出すことを可能にする；（ｘｉ）本発明の普遍的なアダプター受容体システムは、異なる免疫細胞タイプに容易に適応可能である。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞。（ｘｉｉ）記載されたシステムは、Ｔ細胞（すなわち、Ｔ細胞への最小限の添加）において実質的に「非侵襲的」である。
【００２４】
プログラム可能な免疫細胞受容体複合体の構築
ジャーカットクローンＥ６−１細胞［Ｃａｔ．ＡＴＣＣ  ＴＩＢ１５２］はＡＴＣＣから購入した。以下の細胞株および試薬は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州、ウォルサム）：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標登録）ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞［Ｃａｔ．Ｒ７９００７］；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標登録）２９３発現培地［Ｃａｔ．１２３３８００１］；ＯｐｔｉＰＲＯ（商標登録）ＳＦＭ  ｍｅｄｉｕｍ［Ｃａｔ．１２３０９０１９］；ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標登録）ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ［Ｃａｔ．１６４４７７５０］；ビオチン化マウス抗ヤギＩｇＧ［Ｃａｔ．３１７３０］；Ｐｉｅｒｃｅ（商標登録）プロテインＧプラスアガロース；過ヨウ素酸ナトリウム；ヒドラジド−ＰＥＧ４−ビオチン；ＢＣＡタンパク質アッセイキット；およびピアスビオチン定量キットを注文した。すべての制限酵素は、ニューイングランドバイオラボから入手した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７［Ｃａｔ．１１５−６０５−０６２］はＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入した。Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ−ｈ［Ｃａｔ．Ｓ２００１１］およびＷｉｚａｒｄ（商標登録）ＳＶゲルおよびＰＣＲクリーンアップキット［Ｃａｔ．Ａ９２８１］はＰｒｏｍｅｇａから注文した。ＱｉａＦｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｄｉおよびＭａｘｉ  Ｋｉｔ［Ｃａｔ．１２２４３］およびＤＮｅａｓｙ（商標登録）Ｂｌｏｏｄ&Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ［カタログ番号６９５０４］は、Ｑｉａｇｅｎから購入した。Ａｍａｘａ（商標登録）Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標登録）Ｋｉｔ  Ｖ［カタログ番号ＶＣＡ−１００３］はＬｏｎｚａから供給された。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８［カタログ番号Ａ１２８８］はＡｐｐｌｉｃｈｅｍから入手し、ＢｉｒＡ−５００  Ｋｉｔはコロラド州、オーロラのＡｖｉｄｉｔｙから購入した。ビオチン化１Ｆ１１  ｓｃＦｖ抗体は、マサチューセッツ州、バーリントンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘで抽出し、セントルイス、ミズーリ州、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、からストレプトアビジンムテインマトリックスを使用して精製した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ［Ｃａｔ．８５８７８］およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳ［カタログ：Ｌ３０２４−５ＭＧ］もＳｉｇｍａから調達し、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７  ＬＰＳはＬｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［カタログ：２０６］から購入した。ＨＲＰ結合抗ビオチン抗体はＡｂｃａｍ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から購入した。ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ  スパイクタンパク質は、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ（北京、中国）から購入し、ＲＰＭＩ  １６４０はＧｉｂｃｏ（カタログ：Ａ１０４９−０１）から購入した。いくつかの実施形態では、ニワトリアビジンを使用することができる。
【００２５】
遺伝子は、Ｔ細胞からユニバーサルアダプターＴＣＲ複合体細胞を生成するように設計および構築された。発光レポーター酵素であるエクオリン、および３つの異なるユニバーサル（プログラム可能な）受容体：マウスＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ；ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ；およびｅＭＡ−ＣＤ３εは、以下に説明するように異なるベクターを使用して構築された。受容体構築物は、受容体発現をもたらすジャーカット細胞のトランスフェクションに使用された。エクオリン遺伝子構築物は、細胞活性化を検出するためのレポーター遺伝子としてジャーカット細胞をトランスフェクトするためにも使用された。ｅＭＡ−ＣＤ３εとｍＳＡ２−ＣＤ３ζの２つのコンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーによって挿入され、ｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζとエクオリンはランダム挿入によって導入された。すべての構築物はエレクトロポレーションによって送達された。
【００２６】
図９０Ａは、発光レポーター酵素エクオリンの遺伝子構築物の図解である。図９０Ｂは、ユニバーサルまたはプログラム可能なＴＣＲ複合体ｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζの遺伝子構築物の図である。図９０Ｃは、ユニバーサルまたはプログラム可能なＴＣＲ複合体ｍＳＡ２−ＣＤ３ζの遺伝子構築物の図である。および図９０Ｄは、ユニバーサルまたはプログラム可能なＴＣＲ複合体ｅＭＡ−ＣＤ３εの遺伝子構築物の図である。
【００２７】
図９１は、Ａｅｑ発現ベクターであるプラスミドｐＦＳＣ００５（ｐＥＦ１−Ａｅｑ）を示す。ＤＮＡ２．０から注文されたＡｅｑＤＮＡ配列は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＥＦ１／ｍｙｃ−ＨｉｓＢベクターにクローニングされた。配列ＩＤ番号１は、ＡＥＱのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号２は、ＡＥＱのアミノ酸配列を提供する。
【００２８】
プラスミドｐＦＳＣ００５は、以下の成分を含む。最初のコンポーネントはＥＦ−１αプロモーターであり、これは、広範囲の種および細胞タイプにわたる高レベルの発現のためのヒト伸長因子１αサブユニット（ｈＥＦ−１α）プロモーターである。２番目の成分はＡＥＱで、これはエクオリン遺伝子である。エクオリン遺伝子はクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）のカルシウム活性化発光タンパク質をコードし、ＤＮＡ２．０によってコドン最適化および合成された。活性エクオリン酵素は、アポエクオリン（ＡＰＯ）、酸素、および外部から注入されたセレンテラジンの間の複合体によって形成される。アポエクオリンが小胞体から放出される細胞内カルシウムに結合すると、酵素が活性化されてセレンテラジンが酸化され、発光して遊離のアポエクオリンとセレンテラジンが放出される。
【００２９】
ｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζの構築
図９２は、ｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ融合タンパク質発現ベクターであるプラスミドｐＦＳＣ０４８（ｐＶｉｔｒｏ−ｂｒａｓｔｉ−Ａｅｑ−ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ）（ｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ）を示す。Ｔ細胞ＣＤ３ζサブユニットは、ＣＤ３ζの細胞外ドメインがマウスＦｃ  ＲＩと融合した融合タンパク質として発現するように遺伝子操作される。表面発現したｍＦｃ  ＲＩは、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域への結合に特異的である。短いＧＳリンカーを遺伝的に導入して、抗体結合ドメインｍＦｃ  ＲＩをシグナル伝達タンパク質エレメントＣＤ３ζから分離した。ＣＤ３ζシグナルペプチド配列は、ｍＦｃγＲＩ−リンカー−ＣＤ３ζ融合タンパク質Ｔ細胞表面発現に使用された。配列ＩＤ番号３は、ＣＤ３ζＳＳ−ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζおよび配列番号のＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号４はＣＤ３ζＳＳ−ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζのアミノ酸配列を提供する。
【００３０】
プラスミドｐＦＳＣ０４８には以下の成分が含まれる。最初の成分は、ＣＤ３ζシグナルペプチド配列であるＣＤ３ζＳＰである。ＤＮＡ配列はＤＮＡ２．０によって合成された。ＣＤ３ζシグナルペプチドは、ｅＭＡ−リンカー−ＣＤ３ε融合タンパク質Ｔ細胞表面の発現に使用される。２番目の成分ＣＤ３ζは、Ｔ細胞ＣＤ３ゼータサブユニットコード配列である。ＣＤ３ζｃＤＮＡはＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ（ＣＡＴ＃：ＭＢＳ１２７８１５３）から購入した。３番目のコンポーネントは、ｍＦｃγＲＩ（ＦｃｇａｍｍａＲＩ）で、これはマウスＴ細胞表面のＦｃγＲＩ受容体である。ＤＮＡはＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、Ｉｎｃ（ＣＡＴ＃：ＥＸ−Ｍｍ０２４６２−Ｍ０２）に注文した。４番目のコンポーネントは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ｐＶＩＴＲＯ１−ｂｌａｓｔｉ−ｍｃｓベクターに由来し、ラット由来のｒＥＦ１プロモーターである。そのヒトの対応物のように、このプロモーターは、同様のレベルの発現をもたらす強力な活性を示す。ＥＦ−１αプロモーターは、すべての細胞周期で高レベルで発現し、Ｇ０期では低レベルで発現する。ＥＦ−１αプロモーターも組織特異的ではなく、すべての細胞タイプで高度に発現する。５番目のコンポーネントはＣＭＶエンハンサーであり、これは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の主要な前初期エンハンサーであり、ヌクレオチド−１１８と−５２４の間に位置し、固有の繰り返し配列モチーフで構成される。ＨＣＭＶエンハンサーはＳＶ４０の７２ｂｐリピートの代わりに使用でき、ＳＶ４０エンハンサーよりも数倍活性がある。６番目のコンポーネントはＦＭＤ  ＶＩＲＥＳであり、これは、口蹄疫ウイルスの内部リボソーム侵入部位であり、１つのｍＲＮＡから２つのオープンリーディングフレームを高レベルで翻訳できるようにする。７番目のコンポーネントはＥＭ７であり、これは、Ｅ．ｃｏｌｉで抗生物質耐性遺伝子の構成的発現を可能にする細菌プロモーターである。８番目の成分はＢｌａｓｔｉで、ブラストサイジンＳに対する耐性はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓのｂｓｒ遺伝子によって付与される。細菌では、ｂｓｒは構成的Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＭ７プロモーターから発現する。哺乳類細胞では、ｂｓｒはラットＥＦ−１αプロモーターからポリシストロン性ｍＲＮＡとして転写され、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳを介して翻訳される。９番目の成分はＥＦ１ｐＡｎで、これは強力なポリアデニル化シグナルである。ＩｎｖｉｖｏＧｅｎは、ＥＦ１  ｃＤＮＡの終止コドンの後に始まり、ＧＴが豊富な曲がった構造の後に終わる配列を使用する。
【００３１】
ｍＳＡ２−ＣＤ３ζの構築
図９３〜９４は、ドナープラスミドのＣＤ３ζ遺伝子座ノックであるプラスミドｐＦＳＣ０７４ｂ（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ−２Ａ−Ｂｌａｓｔｉ）（ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ）およびｐＦＳＣ０８６（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）を示す。これらのプラスミドは、ＧＳリンカーを介してＣＤ３ζのＮ末端でビオチン結合タンパク質ｍＳＡ２（単量体ストレプトアビジン２）と遺伝的に融合したＴ細胞ＣＤ３ζサブユニット遺伝子に隣接するＣＤ３ζ相同性アームを含む。ｍＳＡ２−ｌｉｎｋｅｒ−ＣＤ３ζカセットはｐＦＳＣ０７４ｂのヒトＥＦ１αプロモーターによって駆動され、ラットＥＦ１αプロモーターはｐＦＳＣ０８６でｍＳＡ２−ｌｉｎｋｅｒ−ＣＤ３ζの転写を駆動するために使用された。ＣＤ３ζからのシグナルペプチドをｍＳＡ２−リンカー−ＣＤ３ε融合タンパク質Ｔ細胞表面発現に使用し、ブラストサイジン遺伝子を選択マーカーとして使用した。フューリン−Ｐ２Ａペプチド配列をｐＦＳＣ０７４ｂで使用してブラストサイジンをｍＳＡ２−リンカー−ＣＤ３ζと共発現させ、ＩＲＥＳをｐＦＳＣ０８６で使用してブラストサイジンをｍＳＡ２−リンカー−ＣＤ３ζと共発現させた。配列ＩＤ番号５は、ＣＤ３ζＳＳ−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζおよび配列ＩＤ番号のＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号６は、ＣＤ３ζＳＳ−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζのアミノ酸配列を提供する。
【００３２】
プラスミドｐＦＳＣ０７４ｂおよびｐＦＳＣ０８６には以下の成分が含まれる。最初の成分は、ＣＤ３ζシグナルペプチド配列であるＣＤ３ζＳＰである。ＤＮＡ配列はＤＮＡ２．０によって合成された。ＣＤ３ζシグナルペプチドは、ｍＳＡ２リンカー−ＣＤ３ε融合タンパク質Ｔ細胞表面の発現に使用される。２番目の成分はＣＤ３ζであり、これはＣＤ３ゼータコード配列である。ＣＤ３ζｃＤＮＡはＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ（ＣＡＴ＃：ＭＢＳ１２７８１５３）から購入した。３番目の成分はｍＳＡ２ビオチン結合タンパク質ｍＳＡ２（単量体ストレプトアビジン２）である。ｍＳＡ２のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ２．０によって合成された。ｍＳＡ２アミノ酸配列は、科学文献から入手した（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、タンパク質標識および一価ビオチン検出用の安定した高親和性ストレプトアビジンモノマー、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．（１１０）：５７−６７（２０１３）参照）。４番目のコンポーネントはＣＤ３ζｃｒｉｓｐｒの左ＨＡと右ＨＡで、配列はＮＣＢＩ（アクセス番号：ＮＧ＿００７３８４．１）から取得され、ＤＮＡ配列はＤＮＡ２．０によって合成された。ＣＤ３ζ相同性アームは、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９遺伝子編集システムでＣＤ３ζ遺伝子座を改変するために使用された。内因性ＣＤ３ζサブユニットは、ｍＳＡ２リンカー−ＣＤ３ζが相同組換えによってＣＤ３ζ遺伝子座に組み込まれた後に破壊された。ＣＤ３ζｃｒｉｓｐｒ相同性アームの合成ＤＮＡ配列に変異が導入され、目的の編集が導入された後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９がターゲット配列を再修飾するのを防ぎた。４番目の成分はＥＦ−１αプロモーターであり、これは、広範囲の種および細胞タイプにわたる高レベルの発現のためのヒト伸長因子１αサブユニット（ｈＥＦ−１α）プロモーターである。５番目の成分はＰ２Ａで、これはブタのテッショウウイルス−１に由来する２Ａペプチドである。６番目の成分は、フューリン切断部位であるフューリンである。７番目の成分はｒＥＦ１プロモーターで、これはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ｐＶＩＴＲＯ１−ｂｌａｓｔｉ−ｍｃｓベクターに由来し、ラット由来である。人間と同様に、同様のレベルの発現をもたらす強力な活性を示す。ＥＦ−１αプロモーターは、すべての細胞周期で高レベルで発現し、Ｇ０期では低レベルで発現する。ＥＦ−１αプロモーターも組織特異的ではなく、すべての細胞タイプで高度に発現する。８番目の成分はＣＭＶエンハンサーであり、これは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の主要な前初期エンハンサーであり、ヌクレオチド−１１８と−５２４の間に位置し、固有の繰り返し配列モチーフで構成される。ＨＣＭＶエンハンサーはＳＶ４０の７２ｂｐリピートの代わりに使用でき、ＳＶ４０エンハンサーよりも数倍活性がある。９番目の成分はＦＭＤＶ  ＩＲＥＳである。これは、口蹄疫ウイルスの内部リボソーム侵入部位であり、１つのｍＲＮＡから２つのオープンリーディングフレームを高レベルで翻訳できるようにする。１０番目の成分はＥＭ７であり、これは、Ｅ．ｃｏｌｉで抗生物質耐性遺伝子の構成的発現を可能にする細菌プロモーターである。１１番目の成分はＢｌａｓｔｉであり、ブラストサイジンＳに対する耐性��セレウス菌のｂｓｒ遺伝子によって付与される。細菌では、ｂｓｒは構成的Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＭ７プロモーターから発現する。哺乳類細胞では、ｂｓｒはラットＥＦ−１ａαプロモーターからポリシストロン性ｍＲＮＡとして転写され、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳを介して翻訳される。１２番目の成分はＥＦ１ｐＡｎで、これは強力なポリアデニル化シグナルである。ＩｎｖｉｖｏＧｅｎは、ＥＦ１  ｃＤＮＡの終止コドンの後に始まり、ＧＴが豊富な曲がった構造の後に終わる配列を使用する。
【００３３】
ｅＭＡ−ＣＤ３εの構築
図９５は、プラスミドｐＦＳＣ１００（ｐＦＳＣ０９５−ｅＭＡ−ＬＬ−ＣＤ３ｅ−ＩＲＥＳ−ブラスト）（ｅＭＡ−ＣＤ３ε）を示す。このプラスミドは、ＧＳリンカーを介したＣＤ３εのＮ末端にあるビオチン結合タンパク質ｅＭＡ遺伝子と遺伝子的に融合されたＴ細胞ＣＤ３εサブユニットコード配列に隣接するＣＤ３ε相同性アームを含むドナープラスミドのＣＤ３ε遺伝子座ノックインである。ｅＭＡ−ｌｉｎｋｅｒ−ＣＤ３εカセットは、ラットＥＦ１αプロモーターｒＥＦ１によって駆動される。ＣＤ３ζからのシグナルペプチドをｅＭＡ−リンカー−ＣＤ３ε融合タンパク質Ｔ細胞表面発現に使用した。ブラストサイジン遺伝子を選択マーカーとして使用した。配列ＩＤ番号７は、ＣＤ３ζＳＳ−ｅＭＡ−ＣＤ３εおよび配列番号のＤＮＡ配列を提供する。配列ＩＤ番号８は、ＣＤ３ζＳＳ−ｅＭＡ−ＣＤ３εのアミノ酸配列を提供する。
【００３４】
プラスミドｐＦＳＣ１００は、以下の成分を含む。最初のコンポーネントはｅＭＡで、これは拡張モノアビジン（ｅＭＡ）である。アミノ酸配列は科学文献に由来する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａ  Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｎｅａｒｌｙ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  Ａｖｉｄｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ。Ｅｄ．（５５）：３３９３−３３９７（２０１６）参照。ＤＮＡ配列はコドン最適化され、ＤＮＡ２．０によって合成された。ｅＭＡはビオチンに対して強い結合親和性を持つ。２番目の成分はＣＤ３ζシグナルペプチド配列であるＣＤ３ζＳＰである。ＤＮＡ配列はＤＮＡ２．０によって合成された。ＣＤ３ζシグナルペプチドを使用してｅＭＡ−ＣＤ３ε融合タンパク質をＴ細胞表面にエクスポートした。３番目の成分はＣＤ３εであり、これはＣＤ３イプシロンコーディング配列である。ＣＤ３εコーディング配列はＮＣＢＩ（アクセス番号：ＮＭ＿０００７３３．３）から入手した。ＤＮＡ配列はＩＤＴによって合成された。ＣＤ３εはＴ細胞受容体複合体の一部であり、シグナル伝達に使用される。４番目の成分はＣＤ３ε相同性アームであるＣＤ３εｃｒｉｓｐｒ左ＨＡと右ＨＡである。配列はＮＣＢＩから入手し（アクセス番号：ＮＧ＿００７３８３．１）、ＤＮＡシーケンスｅｎｃｅはＩＤＴによって合成された。ＣＤ３ε相同性アームは、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９遺伝子編集システムでＣＤ３ε遺伝子座を修飾するために使用される。内因性ＣＤ３εサブユニットは、ｅＭＡ−リンカー−ＣＤ３εが相同組換えによってＣＤ３ε遺伝子座に組み込まれた後に破壊された。ＣＤ３εＣＲＩＳＰＲホモロジーアームの合成ＤＮＡ配列に変異が導入され、目的の編集が導入された後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９がターゲット配列を再修飾するのを防いだ。５番目の成分はｒＥＦ１プロモーターであり、これはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ｐＶＩＴＲＯ１−ｂｌａｓｔｉ−ｍｃｓベクターに由来し、ラット由来である。そのヒトの対応物のように、このプロモーターは、同様のレベルの発現をもたらす強力な活性を示す。ＥＦ−１αプロモーターは、すべての細胞周期で高レベルで発現し、Ｇ０期では低レベルで発現する。ＥＦ−１αプロモーターも組織特異的ではなく、すべての細胞タイプで高度に発現する。６番目の成分はＣＭＶエンハンサーである。これは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の主要な前初期エンハンサーであり、ヌクレオチド−１１８と−５２４の間に位置し、固有の繰り返し配列モチーフで構成される。ＨＣＭＶエンハンサーはＳＶ４０の７２ｂｐリピートの代わりに使用でき、ＳＶ４０エンハンサーよりも数倍活性がある。７番目の成分はＦＭＤＶ  ＩＲＥＳである。これは、口蹄疫ウイルスの内部リボソーム侵入部位であり、１つのｍＲＮＡから２つのオープンリーディングフレームを高レベルで翻訳できるようにする。８番目のコンポーネントはＥＭ７である。これは、Ｅ．ｃｏｌｉで抗生物質耐性遺伝子の構成的発現を可能にする細菌プロモーターである。９番目の成分は、Ｂｌａｓｔｉであり、ブラストサイジンＳに対する耐性がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓからのｂｓｒ遺伝子によって付与されるブラストである。細菌では、ｂｓｒは構成的Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＭ７プロモーターから発現する。哺乳類細胞では、ｂｓｒはラットＥＦ−１ａαプロモーターからポリシストロン性ｍＲＮＡとして転写され、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳを介して翻訳される。１０番目の成分はＥＦ１  ｐＡｎで、これは強力なポリアデニル化シグナルである。ＩｎｖｉｖｏＧｅｎは、ＥＦ１  ｃＤＮＡの終止コドンの後に始まり、ＧＴが豊富な曲がった構造の後に終わる配列を使用する。
【００３５】
追加のプラスミドを使用して、本発明の様々な実施形態および変異体を構築した。図９６に示すようなプラスミドｐＦＳＣ０９７（ｐＦＳＣ０９５−ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ε−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）。図６および図８に示されるように、ｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３εを構築するために９６を使用した。配列ＩＤ番号９は、ＣＤ３ζＳＳ−ＦｃγＲＩ−ＣＤ３εのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号１０は、ＣＤ３ζＳＳ−ＦｃγＲＩ−ＣＤ３εのアミノ酸配列を提供する。図９７に示されるようなプラスミドｐＦＳＣ０９８（ｐＦＳＣ０９５−ＦｃγＲＩ−ＴＲＡＣ−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）は、図２０に示されるようなｍＦｃγＲＩ−ＴＲＡＣを構築するために使用された。配列ＩＤ番号１１は、ＣＤ３ζＳＳ−ＦｃγＲＩ−ＴＲＡＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号１２は、ＣＤ３ζＳＳ−ＦｃγＲＩ−ＴＲＡＣのアミノ酸配列を提供する。図９８に示されるようなプラスミドｐＦＳＣ０９４（ｐＦＳＣ０４８−ＦｃγＲＩ−ＴＲＢＣ１−ＩＲＥＳ−ブラスティ）は、図２２に示されるようなｍＦｃγＲＩ−ＴＲＢＣ１を構築するために使用された。配列ＩＤ番号１３は、ＣＤ３ζＳＳ−ＦｃγＲＩ−ＴＲＢＣ１のＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号１４は、ＣＤ３ζＳＳ−ＦｃγＲＩ−ＴＲＢＣ１のアミノ酸配列を提供する。図９９に示されるようなプラスミドｐＦＳＣ１０３（ｐＦＳＣ１０２−ｅＭＡ−ＬＬ−ＴＲＢＣ１−ＩＲＥＳ−ブラスティ）は、図５２に示されるようなｅＭＡ−ＴＲＢＣ１を構築するために使用された。配列ＩＤ番号１５は、ＣＤ３ζＳＳ−ｅＭＡ−ＴＲＢＣ１のＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号１６はＣＤ３ζＳＳ−ｅＭＡ−ＴＲＢＣ１のアミノ酸配列を提供する。図１００に示されるようなプラスミドｐＦＳＣ０８５（ｐＦＳＣ０８３ａ−ｅＭＡ−ＬＬ−ＣＤ３ζ−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ）はまた、本発明の特定の実施形態および変形を構築するために使用された。配列ＩＤ番号１７は、ＣＤ３ζＳＳ−ｅＭＡ−ＣＤ３ζのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号１８は、ＣＤ３ζＳＳ−ｅＭＡ−ＣＤ３ζのアミノ酸配列を提供する。
【００３６】
細胞とソースの選択
本発明のプログラム可能な免疫細胞受容体複合体は、治療、治療の事前試験、および診断に有用である。受容体複合体は、以下：Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞を含むがこれらに限定されない、異なるヒト免疫細胞において遺伝子操作され得る。これらの細胞は、一次細胞（治療および診断用）または不死化細胞（診断用）のいずれかである。このシステムは診断、治療、コンパニオン診断の両方に対応するように設計されているため、操作された細胞の機能とパフォーマンスがＴＤＭのカクテルに対してテストされる。本発明の例示的な実施形態において、ジャーカット細胞（クローンＥ６１、ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ１５２（商標））は、普遍的またはプログラム可能な受容体、ｅＭＡ−ＣＤ３εを発現する改変ＴＣＲ複合体を生成するように操作される。これらの細胞は、標的誘導性の細胞活性化、サイトカイン放出を実証し、ビオチン阻害アッセイを実行するために使用されてきた。本発明の別の実施形態は、普遍的／プログラム可能な受容体とクラゲ（Ａｅｋｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）からのカルシウム活性化可能な発光タンパク質であるエクオリンを同時に発現する操作された細胞を含む。この実施形態は、操作された細胞が病原体検出のためのバイオセンサーとして機能する診断用途に特に有用である。２つの初代Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）も、ユニバーサル／プログラム可能な受容体であるｅＭＡ−ＣＤ３εを発現するように設計される。得られた適応型ＴＣＲ複合細胞は、細胞活性化研究、標的細胞溶解、および活性化マーカーの発現に役立つ。他の免疫細胞は、本発明の普遍的で適応可能な受容体を発現するように操作することができる。免疫細胞は、ヒト以外の動物からも選択できる。このプロセスは、細胞自体の受容体を改変することで達成できるが、場合によっては、受容体の可動性（ある細胞から別の細胞への受容体成分の移動）が関係する。治療用途では、自家、同系または同種の一次細胞を個体から採取し、活性化、単離、および遺伝子操作して、ユニバーサル／プログラム可能／適応型受容体発現細胞を生成し、患者に注入する。本発明はまた、処理プロセスにおける柔軟性を可能にするために、操作された細胞のための安全で効果的な凍結プロセスを含む。
【００３７】
遺伝子の送達と編集
一過性で安定した遺伝子発現法が本発明で利用されてきた。遺伝子構築物は、所望の発現様式に応じて、線状または環状プラスミドのいずれかのエレクトロポレーションによって送達されてきた。他の遺伝子構築物は、レンチウイルスシステムを使用した形質導入によって送達される。遺伝子構築物はまた、リポフェクションを介して細胞に送達される。遺伝子の部位特異的取り込みは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーによって達成されるが、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼなどの他のヌクレアーゼテクノロジーを利用することもできる。さらに、ＲＮＡ送達法も使用することができる。遺伝子発現細胞は、細胞選別（クローン株の開発）および抗生物質の選択によって濃縮される。ただし、抗生物質耐性遺伝子は治療用細胞には望ましくないため、抗生物質の選択は通常、診断ベースの細胞にのみ使用される。
【００３８】
トランスフェクション
ＤＮＡの線形化および精製のために、ｒＥＦ１−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ−ＩＲＥＳ−ＢｌａｓｔｉＣＲＩＳＰＲコンストラクトを含むプラスミドＤＮＡｐＦＳＣ０８６ａのマキシプレップ、ｒＥＦ１−ｅＭＡ−ＬＬ−ＣＤ３ε−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ  ＣＲＩＳＰＲコンストラクトを含むｐＦＳＣ１００ａおよびエクオリン発現用のＥＦ−１α−Ａｅｑコンストラクトを含むｐＦＳＣ００５は、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉａＦｉｌｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｄｉおよびＭａｘｉ  Ｋｉｔを使用して調製した。次に、プラスミドＤＮＡを制限酵素消化によって線形化し、Ｊｕｒｋａｔ細胞への染色体統合の効率を高めた。プラスミドｐＦＳＣ０８６ａおよびｐＦＳＣ００５はＳｓｐＩによる制限酵素消化によって線形化され、プラスミドｐＦＳＣ１００ａはＡｐａＬＩによる制限酵素消化によって線形化された。線形化されたプラスミドＤＮＡは、ＭＦ  Ｊｕｒｋａｔ／ｐＥＦ１−Ａｅｑ細胞へのトランスフェクションの準備としてＰｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ（商標登録）ＳＶ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔを使用して精製した。品質管理チェックは、各線形化サンプルと非線形化コントロールサンプルを０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲル電気泳動で分析して各プラスミドの正しいＤＮＡバンドサイズを確認することにより、線形化精製コンストラクトプラスミドで実施した。
【００３９】
イクオリン発現プラットフォーム細胞（ＭＦ  Ｊｕｒｋａｔ／ｐＥＦ１−Ａｅｑプラットフォーム細胞）を生成するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣガイドラインに従って培養した。精製された線形ｐＦＳＣ００５のＪｕｒｋａｔ細胞へのトランスフェクションは、ＬｏｎｚａＡｍａｘａ（商標登録）Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標登録）Ｋｉｔ  Ｖに最適化されたＪｕｒｋａｔクローンＥ６−１細胞のトランスフェクションプロトコルに従って実施した。トランスフェクションは、最大のトランスフェクション効率を得るためにＬｏｎｚａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｘ−００５を使用して、４μｇの線形化されたＤＮＡで実行された。トランスフェクション後、細胞を１２ウェルプレートで室温で２０分間インキュベートした後、培地を添加した。トランスフェクションの翌日、細胞を１５０  ＲＣＦで８分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを３ｍＬ  ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、１ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐに再懸濁し、培養を開始するために６ウェルプレートに移した。Ｊｕｒｋａｔ／ｐＥＦ１−Ａｅｑ細胞を培養し、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、１ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで１週間、細胞生存率が９０％を超えるまで３０ｍＬに増殖させた。次に、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して、ｐＥＦ１−Ａｅｑ遺伝子コンストラクトが染色体に組み込まれた細胞を選択した。Ｊｕｒｋａｔ／ｐＥＦ１−Ａｅｑ細胞は、細胞生存率が少なくとも９０％に回復するまで、Ｇ４１８選択下で２〜３週間培養された。
【００４０】
ｅＭＡ−ＣＤ３εおよびｍＳＡ２−ＣＤ３ζ発現細胞の生成のために、各線形化プラスミドＤＮＡ（ｐＦＳＣ１００ａおよびｐＦＳＣ０８６ａ）および対応するＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡプラスミドを、Ｊｕｒｋａｔ、ＣｌｏｎｅＥ６−１細胞用に最適化されたトランスフェクションプロトコルであるＬｏｎｚａＡｍａｘａ（商標登録）細胞株  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標登録）キットＶに従ってＭＦ  Ｊｕｒｋａｔ／ｐＥＦ１−Ａｅｑ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションは、Ｌｏｎｚａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｘ−００５を使用して、トランスフェクションごとに２μｇの線形化コンストラクトプラスミドと２μｇのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡプラスミドを添加して実施した。トランスフェクトされた細胞をキュベットから１２ウェルプレートに移し、培地を加える前に室温で２０分間インキュベートした。トランスフェクションの翌日、細胞を１５０  ＲＣＦで８分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを３ｍＬ  ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、１ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐに再懸濁し、６ウェルプレートに移した。次に、トランスフェクトされた細胞を、５％または８％のＣＯ２とともに３７℃で培養した。
【００４１】
トランスフェクトされた細胞の選択、検証および保存
トランスフェクトされた細胞の選択および濃縮のために、トランスフェクション後、ＭＦ  Ｊｕｒｋａｔ／ｐＥＦ１−Ａｅｑ／ｒＥＦ１−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ  ＣＲＩＳＰＲ細胞株（以下、ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ）およびＭＦ  Ｊｕｒｋａｔ／ｐＥＦ１−Ａｅｑ／ｒＥＦ１−ｅＭＡ−ＬＬ−ＣＤ３ε−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ  ＣＲＩＳＰＲ細胞株（以下、ｅＭＡ−ＣＤ３ε）を培養し、徐々に３０ｍＬの容量まで増殖させ、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、１ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで、細胞生存率が９０％を超えるまで、約１週間培養した。次に、ブラストサイジンを最終濃度３μｇ／ｍＬになるように添加して、ｒＥＦ１−ｍＳＡ２−ＣＤ３ζＩＲＥＳ−ＢｌａｓｔｉまたはｒＥＦ１−ｅＭＡ−ＬＬ−ＣＤ３ε−ＩＲＥＳ−Ｂｌａｓｔｉ  ＣＲＩＳＰＲコンストラクトが染色体に組み込まれた細胞を選択した。細胞をＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ、１ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、３μｇ／ｍＬブラストサイジンで２〜３週間培養し、検証テストを実施する前に、選択を行い、細胞生存率を少なくとも９０％に回復させた。クローンラインは、フローサイトメーターでの単一細胞選別によって生成された。
【００４２】
トランスフェクトされた細胞の検証
ＰＣＲによる検証のために、ゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  &  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用して、ｅＭＡ−ＣＤ３εおよびｍＳＡ２−ＣＤ３ζ細胞の混合集団から抽出された。ＰＣＲは、各コンストラクトの挿入接合部をターゲットとするプライマーを使用して、抽出されたゲノムＤＮＡに対して実行され、事前に決定されたゲノム位置への正しい染色体統合を確認した。
【００４３】
フローサイトメトリーによる検証のために、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞をフローサイトメトリーによって分析して、受容体発現のレベルを評価した。トリパンブルー染色により細胞をカウントし、２×１０６細胞のサンプルに分注した。各サンプルをビオチンを含まないＤＭＥＭに再懸濁し、最終濃度５．２μｇ／ｍＬのストレプトアビジンとともに室温で３０分間インキュベートし、培地に存在する、またはｅＭＡ受容体に結合した過剰なビオチンを除去した。サンプルをＤＭＥＭで洗浄してストレプトアビジンを除去した後、１００μＬのＤＭＥＭ２％ＢＳＡに再懸濁した。染色したサンプルを１．５μｇの一次抗体、ビオチン化マウス抗ヤギＩｇＧとインキュベートし、ｅＭＡ受容体に３０分間結合させた。一次抗体とのインキュベーション後、陰性および染色されたサンプルを１．５μｇの二次抗体であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧで染色し、一次抗体に結合させた。染色されたサンプルは、フローサイトメトリーを使用して受容体発現について分析され、染色されていないおよび陰性対照サンプルと比較された。この実験を繰り返し、ｍＳＡ２−ＣＤ３ζ細胞におけるｍＳＡ２受容体の発現を確認した。図１００Ａ−１００Ｃは、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の未染色、陰性、および染色サンプルにおけるｅＭＡ−ＣＤ３ε受容体の発現レベルを比較するフローサイトメトリープロットである。図１００Ａは未染色のサンプルである。図１００Ｂは二次Ａｂのみである。および図１００Ｃは一次Ａｂと二次Ａｂである。染色されたサンプルは、ビオチン化マウス抗ヤギＩｇＧ＋ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧで染色された。陰性サンプルは、二次抗体の非特異的結合を説明するためにのみ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧで染色された。
【００４４】
細胞活性化アッセイによる検証のために、２つの細胞株、ｅＭＡ−ＣＤ３εおよびｍＳＡ２−ＣＤ３ζもまたエクオリンを発現するように操作されたので、それらをセレンテラジン−ｈと共に２４時間インキュベートし（充電）、次いで試験して、ｍＳＡ２およびｅＭＡ受容体は、ビオチン化抗体にうまく結合する。ビオチン化抗体および標的抗原の添加は、シグナル伝達経路を活性化する受容体凝集を引き起こし、ルミノメーターで検出されたエクオリン光シグナルをもたらした（図１０２参照）。
【００４５】
アダプターＴＣＲ複雑細胞の機能と性能のデモンストレーション
ｅＭＡ−ＣＤ３εプログラム可能な免疫細胞受容体複合体の機能性および性能は、以下に記載される実験によって実証された。
【００４６】
細胞活性化アッセイ：ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞は、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）からのカルシウム活性化可能な発光タンパク質であるエクオリンを発現するように遺伝子操作された。活性エクオリン酵素は、「帯電」と呼ばれるプロセスで、アポエクオリン（ＡＰＯ）、酸素、および外部から注入されたセレンテラジンの間の複合体によって形成される。「帯電した」細胞を活性化するために、ビオチン化された標的検出器分子を加えて、ｅＭＡ受容体に結合させた。次に、標的抗原を加えて、細胞表面にすでに結合するＴＤＭに結合させ、受容体を凝集させた。これは細胞内シグナルのカスケードを引き起こし、小胞体から細胞質ゾルへのカルシウムの放出をもたらした。放出されたカルシウムは、化学反応を触媒する発光酵素であるエクオリンを活性化し、ルミノメーターによって検出される光信号を生成する。この実験では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対する１０μｇ／ｍＬのビオチン化マウスモノクローナル抗体をｅＭＡ−ＣＤ３εエフェクター細胞（８００，０００細胞／９０μＬ  ＲＰＭＩ）と混合し、３０分間結合させた。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳ（２５０μｇ／ｍＬ）を添加して細胞を活性化した。ネガティブコントロールとして、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  ＬＰＳを同様の設定で使用した。信号は、ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して記録された。図１０２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するビオチン化マウスｍＡｂを使用した荷電ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の活性化を示すグラフであり、陰性対照はＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  ＬＰＳ、光を放出しなかった非特異的抗原であった。
【００４７】
受容体阻害アッセイ：受容体阻害アッセイは、ビオチンを使用して細胞表面のｅＭＡユニバーサル受容体をブロックすることにより、「荷電」ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞で実施された。１３．３μｇ／ｍＬビオチンをｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（８００，０００細胞／９０μＬ  ＲＰＭＩ）と混合し、室温で３０分間ｅＭＡ受容体に結合させた。次に、同様の濃度（１３．３μｇ／ｍＬ）のＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体を混合物に添加し、３０分間インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳ（２５０μｇ／ｍＬ）を混合物に添加し、ＧｌｏＭａｘ２０／２０ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してシグナルを記録した。図１０３は、ビオチンを使用するｅＭＡ受容体の阻害を示すグラフであり、ビオチンは受容体に結合し、ビオチン化抗体が結合するのを防ぐ。ブロックされたｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞は、ビオチン化抗体および対応する標的／病原体が添加された場合、活性化されなかった。しかし、ポジティブコントロールアッセイでは、ブロックされていないｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞が活性化された。
【００４８】
ビオチン競合アッセイ：ビオチンおよび他のビオチンコンジュゲートを使用し、アダプターＴＣＲ複合体細胞の活性化を調節することができる。細胞活性化を調節するための「オン／オフ」スイッチとしてビオチンを使用して、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞で競合アッセイを実施した。ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞を５μｇ／ｍＬのビオチン化ｓｃＦｖとともにＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対して３０分間インキュベートし、ｓｃＦｖを結合させた。ビオチン（１３．３μｇ／ｍＬ）を混合物に加え、室温で３０分間インキュベートした後、２５０μｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳを加えて細胞を活性化した。ビオチンを添加せずに繰り返しアッセイを行った。ビオチンを添加せずに、非特異的標的である２５０μｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  ＬＰＳを使用して、ネガティブコントロールアッセイも実施した。すべてのアッセイは３回行い、すべてのシグナルをＧｌｏＭａｘ２０／２０ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に記録した。図１０２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するビオチン化ｓｃＦｖと混合したときにｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞が活性化されて光シグナルを放出するビオチン競合アッセイの結果を示すグラフである。ただし、ビオチンの添加は、ｅＭＡ受容体への競合的結合のためにクエンチされたシグナルをもたらした。非特異的標的（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  ＬＰＳ）と組み合わせたビオチン化ｓｃＦｖの添加は、細胞を活性化しなかった。
【００４９】
図１０５は、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞上の普遍的な受容体が、細胞活性化中にビオチンの濃度を変化させることによって阻害されたことを示すグラフである。ビオチン濃度と活性化シグナルの間には相関関係があった。ビオチンの添加は、ｅＭＡ受容体への競合的結合のためにクエンチされたシグナルをもたらした。このビオチン競合アッセイでは、ビオチンおよび他のビオチンコンジュゲートを使用して、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞の活性化を調節した。このアッセイは、ビオチン化１Ｆ１１−ＩｇＧ２ａ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するｍＡｂ）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳを使用してｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞で実施した。さまざまな濃度のビオチンを使用して、細胞の活性化を調節した。この実験では、信号出力とビオチン濃度の間の傾向を明らかにしようとした。１６０万個の細胞／９０μＬのＲＰＭＩをさまざまな濃度のビオチンとともに３０分間インキュベートした。１０μｇ／ｍＬのビオチン化１Ｆ１１−ＩｇＧ２ａを添加し、さらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞／抗体／ビオチン混合物を２５０μｇ／ｍＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに添加して、細胞の活性化を引き起こした。培地中に存在するビオチンの量は最初から多かったので、添加されたビオチンの量はわずかな増加だった。結果は、シグナル出力とビオチン濃度の相関関係を示す。ビオチンの濃度が高いほど、活性化シグナルは低くなるため、ビオチンは本発明におけるシグナル活性化の優れたモジュレーターである。
【００５０】
サイトカイン放出研究：ビオチン化標的検出器分子は、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞表面のｅＭＡを認識して結合することができる。それらの特定の標的が導入されると、細胞が活性化され、サイトカイン産生をもたらす。図１１２は、サイトカイン放出研究（ＩＬ−２を放出するためのｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の活性化）の結果を示すグラフであり、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対するビオチン化抗体と細胞をインキュベートすると、細胞が活性化され、ＩＬ−２リリース；および図１１３は、サイトカイン放出研究（ＩＬ−２を放出するためのｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の活性化）の結果を示すグラフであり、ＩＬ−２放出は抗体濃度依存性であることが示された。これらの実験では、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（１ｘ１０６細胞／２ｍＬ  ＲＰＭＩ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよび１５０μｇ／ｍＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対する１０μｇ／ｍＬビオチン化マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）と１０分ごとに穏やかに混合しながら室温で３０分間混合した。次に、細胞を５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターに１８時間移した。上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２の存在について分析した。アッセイは３回行い、平均ＩＬ−２産生を標準偏差でプロットした。同様の実験をビオチン化抗体の濃度を変えて：２．５μｇ／ｍＬ  ５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬ繰り返した。図１１２の結果は、ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞が標的抗原に結合した抗体、ＬＰＳに結合することによって活性化され、ＩＬ−２を放出することを示す。図１１３において、結果は、ＩＬ−２放出が抗体濃度依存性であり、１０μｇ／ｍＬ抗体が最も多くの放出をもたらしたことを示す。
【００５１】
活性化マーカー発現アッセイ：プログラム可能な免疫細胞受容体細胞をビオチン化標的検出器分子およびそれらの特定の標的とインキュベートすると、細胞が活性化される。活性化されると、Ｔ細胞は予測可能なパターンでさまざまなＴ細胞活性化マーカーをアップレギュレートまたはダウンレギュレートする。このアッセイでは、２つのＴ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９およびＣＤ６２Ｌ）が、細胞活性化後の分析のために選択された。図７７〜７９は、活性化マーカー発現アッセイ（ビオチン化マウス抗Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳ抗体およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳを使用した活性化時のｅＭＡ−ＣＤ３細胞上のＣＤ６９の発現レベル）の結果を示すグラフである。図１１４は、ＬＰＳのみでインキュベートされた細胞の結果を示す。図１１５は、抗体のみとインキュベートした細胞の結果を示す。図１１６は、抗体およびＬＰＳとともにインキュベートされた細胞の結果を示す。および図８０〜８２は、活性化マーカー発現アッセイ（ビオチン化マウス抗Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳ抗体およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳを使用した活性化時のｅＭＡ−ＣＤ３細胞上のＣＤ６２Ｌの発現レベル）の結果を示すグラフである。図１１７は、ＬＰＳのみでインキュベートされた細胞の結果を示す。図１１８は抗体のみとインキュベートした細胞の結果を示す。および図１１９は、抗体およびＬＰＳとインキュベートした細胞の結果を示す。ＣＤ６９の発現レベルを測定するために、細胞（１ｘ１０６細胞／サンプル）を１２ウェルプレートに播種し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳに対して１０μｇ／ｍＬのビオチン化マウスｍＡｂを添加して活性化した。Ｔ細胞活性化マーカーの発現を可能にするために、サンプルを３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＣＤ６９およびＣＤ６２Ｌの発現レベルは、マーカーに対するマウスｍＡｂを一次抗体として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用するフローサイトメトリーによって分析された。
【００５２】
標的細胞溶解アッセイ．ＸＴＴ（ナトリウム３'−［１−［（フェニルアミノ）−炭素］−３，４−テトラゾリウム］−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼン−スルホン酸水和物）細胞生存率アッセイ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、は、活発に呼吸する生存細胞によるＸＴＴの減少に基づく比色分析である。ＸＴＴ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを使用して、標的細胞によって発現された細胞表面マーカーに対するビオチン化抗体を添加した後、操作されたＪｕｒｋａｔｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（エフェクターＴ細胞）による標的細胞の溶解を評価した。
【００５３】
アッセイデザイン：Ｒａｊｉ細胞は表面にＣＤ１９（癌マーカー）を発現するが、Ｋ５６２細胞はこのマーカーを発現しない。この実験の目的は、ビオチン化抗ＣＤ１９抗体およびＪｕｒｋａｔｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（エフェクターＴ細胞）とインキュベートしたときのＲａｊｉ（ＣＤ１９＋）細胞の溶解を確認することだった。正しいビオチン化抗体とインキュベートした場合のＲａｊｉ細胞に対するＪｕｒｋａｔｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（エフェクターＴ細胞）の特異的細胞毒性を評価するために、３つのネガティブコントロール条件を設計した；（ｉ）最初のネガティブコントロールはビオチン化された抗ＣＤ１９抗体およびＪｕｒｋａｔｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（エフェクターＴ細胞）とインキュベートしたＫ５６２（ＣＤ１９−）細胞であった；（ｉｉ）２番目のネガティブコントロールは、ＪｕｒｋａｔｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（エフェクターＴ細胞）およびＲａｊｉ細胞で発現されないマーカー（ＥＧＦＲ）に対するビオチン化抗体とインキュベートしたＲａｊｉ細胞であった；（ｉｉｉ）３番目のネガティブコントロールは、ＪｕｒｋａｔｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（エフェクターＴ細胞）およびＪｕｒｋａｔｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞のｅＭＡ−ＣＤ３ε受容体に結合しなかった非ビオチン化抗ＣＤ１９抗体（エフェクターＴ細胞）とインキュベートしたＲａｊｉ細胞であった。抗ＣＤ１９および抗ＥＧＦＲ組換えモノクローナルマウスＩｇＧ２ａ抗体は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙから購入し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＢｉｏｔｉｎＫｉｔを使用しビオチン化した。ＩｇＧの分子あたりのビオチンの数は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して４〜５と決定された。
【００５４】
手順：ＲａｊｉおよびＫ５６２細胞をＡＴＣＣから入手し、この実験で標的細胞として使用するために、ＡＴＣＣ仕様に従ってＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１Ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで培養した。エフェクター細胞と標的細胞を２：１の比率で合計１００μＬのＤＭＥＭ、９６ウェルプレートのウェルあたり１０％ＦＢＳに播種した。特定の抗体を１０μｇ／ｍＬの最終濃度で適切なサンプルに添加した。バックグラウンド吸光度を考慮して、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳのみを含む追加のサンプルを追加した。実験サンプルと同じ数でプレーティングされた、標的細胞のみを含むサンプルが、標的細胞によるＸＴＴの最大の減少を説明するために加えられた。実験サンプルと同じ数でプレーティングされたエフェクター細胞のみのサンプルが、エフェクター細胞によってもたらされたＸＴＴの減少を説明するために追加された。すべてのサンプルを３連でプレーティングし、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ＸＴＴ溶液を調製し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが提供するプロトコルに従ってサンプルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。細胞の生存率は、４５０ｎｍの波長と６５０ｎｍの参照波長でＯＤを測定することによって評価された。各サンプルタイプの平均ＯＤと標準偏差を計算した。生存可能な標的細胞のパーセントは、以下：標的細胞の生存率％＝（（ＯＤ実験ウェル−ＯＤエフェクターのみのウェル）／（ＯＤ標的細胞のみのウェル−ＯＤ培地））×１００で計算された。
【００５５】
結果：図１２０は、ＸＴＴ試薬と２時間インキュベートした後の、さまざまなサンプルのＯＤ４５０での平均吸光度測定値を示すグラフである：Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞；Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＥＧＦＲ＋エフェクターＴ細胞；Ｒａｊｉ＋抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞；およびＫ５６２＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞。図１２１は、さまざまなサンプルで計算された標的細胞の生存率％を示すグラフである：Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞；Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＥＧＦＲ＋エフェクターＴ細胞；Ｒａｊｉ＋抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞；およびＫ５６２＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクターＴ細胞。図１２０の結果は、Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクター細胞サンプルのＯＤ４５０での吸光度の読み取り値が他のサンプル（３．２５−３．３６）よりも低く（２．７４）、標的細胞の溶解による細胞生存率の低下を示す。図１２１の結果は、１００％に正規化した後の標的細胞の生存率の計算値を示す。Ｒａｊｉ＋ビオチン化抗ＣＤ１９＋エフェクター細胞サンプルは、図１２１に示すように６９．２％から１００％の標的細胞生存率を有する対照サンプルと比較した場合、標的細胞の有意に低いパーセント生存率（１８．６％）を有した。これらの結果は、ＪｕｒｋａｔｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞（エフェクターＴ細胞）が標的Ｒａｊｉ細胞を溶解し、その溶解が、選択したマーカーとそのマーカーに対する対応するビオチン化抗体の添加を伴う細胞に特異的であることを示す。
【００５６】
細胞の保存
本発明はまた、操作された細胞を使用時まで−８０℃で凍結することを可能にする、改変／操作されたＴＣＲ複合体細胞保存のための方法を含む。細胞を使用するには、細胞を冷凍庫から取り出し、室温で１５分間解凍してから、活性化に使用する。ｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞は−８０℃で凍結し、室温で１５分間解凍し、ビオチン化ＴＤＭと標的抗原を使用して活性化することができる。
【００５７】
治療のために、操作された細胞を解凍し、次に、機能するものが見つかるまでビオチン化ＴＤＭのカクテルに対して試験することができ、次いで、細胞を患者に注入することができる。この種の配置は、治療プロセスに柔軟性をもたらす。細胞が個体から採取されると、それらは単離され、活性化され、遺伝子操作されてユニバーサルアダプター受容体発現細胞を生成し、次いで本発明を使用して増殖および凍結される。細胞を凍結するために、増殖した細胞を０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８および７％グリセロールと１．６×１０６細胞／９０μＬ  ＲＰＭＩの濃度で混合し、−８０℃で凍結する。細胞は少なくとも６ヶ月以上生存し続ける。
【００５８】
ターゲット検出分子（ＴＤＭ）
本発明のプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムは、任意のビオチン化標的検出分子（ＴＤＭ）に結合することができ、それにより、ビオチン化ＴＤＭは、操作された細胞を癌細胞などの特定の標的に向ける。操作された細胞は、ターゲットに結合すると活性化される。診断および治療用途の両方のための本発明の機能は、高品質の手術可能なＴＤＭの使用を含む。したがって、本発明は、免疫細胞受容体複合細胞システムと共に使用するために設計された異なるＴＤＭのための製造スキームを含む。市販のＴＤＭも本発明と互換性がある。ＴＤＭは、以下を含むがこれらに限定されないさまざまな病原体を検出することができる：細菌、ウイルス、真菌、原生動物、バイオマーカー、細胞受容体、タンパク質、核酸、ペプチド、代謝物、またはその他の小分子。ＴＤＭには、１つまたは複数のターゲットの異なるエピトープに対する複数の結合ドメインが含まれる場合がある。ＴＤＭには、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ナノボディ、ミニボディ、ＶＨＨ、ラクダ重鎖ＩｇＧ、Ｖ−ＮＡＲ、サメＩｇＮＡＲ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど；オリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＸＮＡ、ペプチドなどのアプタマー、炭水化物；または他の合成分子などの抗体が含まれる。ＴＤＭは、免疫応答をトリガーするエフェクター部分として機能するビオチンまたはビオチン誘導体（調整可能なリンカーアーム付き）に結合させることができ、Ｆｃを介したエフェクター機能の代替手段を提供する。これは、健康に悪影響を与える可能性のあるＦｃ受容体を持つ細胞（樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージなど）への非特異的結合を排除するため、臨床応用にとって大きな利点である（Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．８（１）：８０-８６（２００９））。ＴＤＭは、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される抗原決定基またはエピトープに結合するか、認識する。このような抗原決定因子には、次のような線形エピトープが含まれる。また、コンフォメーションエピトープ、およびＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のコンテキストで提示されるものなどの抗原提示細胞で認識されるエピトープを含む。
【００５９】
ＴＤＭは、免疫化と血清収集、ハイブリドーマ選択、単一Ｂ細胞選別、単一形質細胞選別、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母ツーハイブリッドシステム、ＳＥＬＥＸなどのさまざまなテクノロジーによって生成できる。ＴＤＭの配列が特定されると、さまざまな形（ｓｃＦｖなど）に遺伝子改変することができる。ＴＤＭは、形質転換された細菌（Ｅ．ｃｏｌｉなど）またはトランスフェクトされた哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３など）から発現および精製して、さらに応用することができる。ＴＤＭは、分子が適切なグリコシル化またはリジン残基を持っているかどうか、およびＡｖｉＴａｇ（商標登録）を含むかどうかに応じて、化学的または酵素的にビオチン化することができる（例えば、米国特許第５，９３２，４３３号、第５，８７４，２３９号、および第５，７２３，５８４号参照、それらの全体において、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。ＴＤＭのＦｃ部分の炭水化物残基は過ヨウ素酸ナトリウムとそれに続くヒドラジド−ＰＥＧ４−ビオチンへの結合によってアルデヒドに酸化される可能性があるため、化学的ビオチン化は高度にグリコシル化された抗体のビオチン化に理想的である。あるいは、ＡｖｉＴａｇ（商標登録）は、パラトープから離れたＴＤＭのＣ末端に遺伝的に融合させることができる。特にリジン残基がＴＤＭのパラトープ領域にある場合、標的化されていない、制御されていないビオチン化は、望ましくないＴＤＭをもたらす可能性がある。ＡｖｉＴａｇｇｅｄ抗体は、ビオチンリガーゼを使用してビオチン化できる。ＢｉｒＡ−５００キット（Ａｖｉｄｉｔｙ）は次のとおりである：簡単に説明すると、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、５０μＭＤ−ビオチンおよびビオチンリガーゼを０．０５Ｍビシンバッファー（ｐＨ８．３）で抗体と混合し、３０℃で１時間インキュベートする。本発明は、以下のＴＤＭを含む。
【００６０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１（以下、１Ｆ１１）に対するｍＡｂ（ＩｇＧ２ｃ）：この抗体は、ハイブリドーマシステムを介して生成され、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１検出およびエフェクター細胞活性化のためにｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ細胞と共に使用された。
【００６１】
ＡｖｉＴａｇｄ  １Ｆ１１（ＩｇＧ２ａ）：このＴＤＭは、１Ｆ１１のＩｇＧ２ｃからＩｇＧ２ａへのクラススイッチおよびＦｃ領域のＣ末端へのＡｖｉＴａｇの付加によって生成された。ＩｇＧ２ｃバージョンよりもはるかに高い親和性でｍＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζに結合するため、１Ｆ１１の改良バージョンである。この抗体はクローン化され、培養液への分泌を通じてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標登録）２９３−Ｆ細胞で発現された。プロテインＧレジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、細胞上清から抗体を精製した。
【００６２】
ビオチン化、ＡｖｉＴａｇｇｅｄ  １Ｆ１１（ＩｇＧ２ａ）：これはＡｖｉＴａｇｇｅｄ  １Ｆ１１（ＩｇＧ２ａ）のビオチン化バージョンであり、ＦｃγＲＩ−ＣＤ３ζ細胞とｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞の両方で使用できる。このＴＤＭをＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１の検出とエフェクター細胞の活性化に使用する。これは、ビオチンリガーゼを使用した精製ＡｖｉＴａｇｇｅｄ  １Ｆ１１のビオチン化によって生成された。
【００６３】
ビオチン化、ＡｖｉＴａｇｄ  １Ｆ１１  ｓｃＦｖ：このＴＤＭは、１Ｆ１１  ｍＡｂの元の可変領域配列から設計および構築された。これはＡｖｉＴａｇで構築され、Ｅ．ｃｏｌｉ  株でビオチンリガーゼ酵素（ＢｉｒＡ）と共発現する。どちらの遺伝子もＩＰＴＧ誘導性であるため、ＩＰＴＧとビオチンを培地に添加してタンパク質の発現とビオチン化を誘導した。ビオチン化ｓｃＦｖは、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）によって抽出され、ストレプトアビジンムテインマトリックス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって精製された。
【００６４】
ＡｖｉＴａｇｄ  １Ｆ１１  Ｆａｂ：１Ｆ１１のＦａｂバージョンは、ＡｖｉＴａｇおよびシグナル伝達配列を用いて設計および構築され、ＦｒｅｅＳｔｉｌｅ（商標登録）２９３−Ｆ細胞での発現中に培地に輸出および分泌される。
【００６５】
ＰＢＰ２Ａに対するＶ−ＮＡＲ抗体：サメＩｇＮＡＲ抗体ライブラリーを、ＭＲＳＡ（ＰＢＰ２Ａ）に対する特定のより高い結合剤についてスクリーニングした（Ｅｘｏｍｍｕｎｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。７つの配列が生成され、ＡｖｉＴａｇを使用してＴＤＭを構築し、Ｅ．ｃｏｌｉ株で発現およびビオチン化するために使用された。得られたＴＤＭはストレプトアビジンカラムで精製され、ＭＲＳＡの検出とエフェクター細胞の活性化に使用された。
【００６６】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質に対するＩｇＮＡＲ抗体：７つの配列をＥｘｏｍｍｕｎｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から入手し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスおよびエフェクター細胞活性化の検出のためのＴＤＭを構築するために使用した。発現したＴＤＭは、使用前にストレプトアビジンカラムで精製した。
【００６７】
ＰＢＰ２Ａタンパク質に対するヒトＦａｂ：ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージライブラリーを、ＰＢＰ２Ａ（ＭＲＳＡ）タンパク質を認識するヒトＦａｂ抗体についてスクリーニングした。高結合剤からの配列を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で発現されるＨｉｓＴａｇｇｅｄ、ＡｖｉＴａｇｇｅｄ  Ｆａｂ抗体を構築および発現させた。ＴＤＭを抽出し、Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡカラムで精製した。抗体はビオチンリガーゼを使用してビオチン化され、ストレプトアビジンカラムで精製された後、ターゲットの検出とエフェクター細胞の活性化のためにｅＭＡ−ＣＤ３ε細胞とともに使用された。
【００６８】
ピアスビオチン定量化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、標識されたＴＤＭのビオチン化レベルを決定した。ＨＡＢＡ（２−（４−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸）／アビジン複合体を超純水に溶解した。溶液の吸光度を５００ｎｍで測定した。次に、ビオチン化抗体をＨＡＢＡ／アビジン複合体に導入し、５００ｎｍでの吸光度を変化させた。５００ｎｍでの吸光度の変化を使用して、タンパク質１モルあたりのビオチンのモル数を計算した。
【００６９】
精製およびビオチン化に続いて、すべてのＴＤＭは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってビオチン化および純度について分析される。マウス抗体を検出するために、ブロッティング中にヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＡＰ５０３Ｐ）を直接使用した。Ａｖｉ−Ｔａｇで抗体を検出するために、ビオチンリガーゼエピトープタグ抗体（ロックランドカタログ番号１００−４０１−Ｂ２１）を一次抗体として使用し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（サンタクルスカタログ番号ＳＣ−２９２２）をウエスタンブロット中の二次抗体として使用した。ビオチン化抗体を検出するために、Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＨＲＰ（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ６６５１）をウエスタンブロット中に直接使用した。クマシー染色ゲルおよび対応するウエスタンブロットの例を図１０６および１０７に示す。図１０６−１０７は、精製されたビオチン化１Ｆ１１  ＩｇＧ２ａのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の画像である。ここで、図１０６は、レーン１のタンパク質標準、レーン２の精製された非ビオチン化タンパク質、およびレーン３の精製されたビオチン化タンパク質を示す４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。ここで、図１０７は、レーン１のタンパク質標準、レーン２の精製された非ビオチン化タンパク質、およびレーン３の精製されたビオチン化タンパク質を示すウエスタンブロット分析の写真である。抽出および精製後の抗体の濃度を決定するために、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号２３２２７）を使用した。
【００７０】
抗体−抗原相互作用はＥＬＩＳＡによって分析された。９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃で一晩抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１ＬＰＳ）でコーティングした。プレートを洗浄して未結合の抗原を除去した後、５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ（または脱脂粉乳）で室温で１時間ブロッキングした。標準、ポジティブおよびネガティブコントロール、未知数を含むサンプルの段階希釈をプレートに追加した。１時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄し、ＨＲＰ標識検出抗体を添加して１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、発色のために３，３'、５，５'−テトラメチルベンジジン基質溶液を加えた。反応を１Ｍ  ＨＣｌで停止し、プレートリーダーを使用してＯＤ４５０でプレートを直ちに読み取った。図１０９は、ビオチン化１Ｆ１１  ｓｃＦｖ精製からの溶出画分のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフであり、画分はＨＲＰ結合抗ビオチンＩｇＧに対して試験された。各ウェルは、５００μｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳで３回コーティングされた。４つの溶出画分を１Ｆ１１  ｓｃＦｖの存在についてテストした。抗体保存バッファーをブランクとして使用した。図１１０は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞上清における１Ｆ１１  ＩｇＧ２ａ抗体発現のＥＬＩＳＡタイムコース特性を示すグラフである。ＥＬＩＳＡプレートをＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  ＬＰＳでコーティングした。サンプルを７日間にわたって収集し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧγ鎖抗体を使用して１Ｆ１１  ＩｇＧ２ａ抗体の存在を分析した。新鮮な細胞培養培地をブランクとして使用した。
【００７１】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲを使用して、使用前に生成されたＴＤＭおよび他の市販の抗体を分析した。このプロセスにより、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムで使用するのに最適なＴＤＭのランク付けと選択が可能になった。各抗体について、ＴＤＭ−標的相互作用、結合親和性、および速度論的速度定数を測定し、それによって各ＴＤＭの速度論的および平衡定数を決定することを可能にした。図１０９は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７特異的抗体（ｍＡｂ  ＦＦ７５４）のＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１への結合のビアコア分析の結果を示すグラフであり、その結果は、ｍＡｂＦＦ７５４がＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７に特異的であることを確認された。図７４は、異なる濃度の抗体を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７特異的抗体とＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７との間の相互作用の動力学のビアコア分析の結果を示すグラフである。
【００７２】
本発明は、任意のビオチン化標的検出器分子（ＴＤＭ）と共に使用することができる、普遍的で、適応可能で、および／またはプログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞システムを提供する。これらの操作された細胞は、サイトカイン放出を誘発するために適切なＴＤＭと特定の標的で活性化される。操作された細胞は、凍結され、室温で１５分間解凍され、すぐに活性化アッセイに使用される。このシステムは、現在のＣＡＲＴ細胞システムに比べて多くの利点を提供する。本発明は、人工受容体を作製するのではなく、複合体の単純な改変を通じて、天然のＴ細胞受容体複合体シグナル伝達能力を利用する。これにより、操作された細胞が可能な限り正常に近く機能することが可能になり、ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、シグナル伝達、細胞増殖、伸長、持続性が改善される。ｅＭＡとｍＳＡ２をユニバーサル受容体として使用することにより、ＴＤＭ投与量を調整するか、必要に応じて「オン／オフ」または信号「ボリュームコントロール」スイッチとしてビオチン（またはビオチン類似体）を使用して、細胞の活性化を調節できる。さらに、操作された細胞を使用して、より望ましいＴＤＭをすばやくスクリーニングし、患者に注入する前にそれらをペアリングすることができる。ＴＤＭのライブラリは、既知の癌マーカーを使用して生成できるため、抽出され、操作された患者の細胞をＴＤＭのカクテルに対してすばやくテストして、最も効果的な治療法を見つけることができる。本発明はまた、それらを体内に注入する前に、インビトロで操作された細胞を試験するより良く、より速くそしてより安全な方法のためのツールとしてのエクオリンの使用を含む。抽出された細胞のごく一部を、ＴＤＭに対する患者の反応を決定するためのサンプル分析としてエクオリンとともに使用できまる。人工細胞を凍結する開示された方法は、人工細胞を使用する治療方法に柔軟性を与える。この新しいアダプターＴＣＲ複合システムは堅牢であり、ｅＭＡおよびｍＳＡ２の潜在的な免疫原性は、タンパク質への小さな変異によって簡単に処理できる。本発明は、健康な人が自分の抽出された細胞を提出して、プログラム可能な免疫細胞受容体複合細胞を生成するように設計され、その後、その人に病気が現れたときに特定のＴＤＭで将来の使用またはプログラミングのためにテストおよびバンクされるシステムを企図する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、免疫細胞受容体複合体は、天然の未修飾受容体の結合特異性を示さず、例えば、修飾Ｔ細胞受容体は、標的検出器分子によって提供される特異性のみを実質的に示す。これは、受容体の抗原結合部位を形成する１つまたは複数のサブユニットへの置換によって、または天然の抗原結合部位に必須の残基の修飾によって達成することができる。天然ＴＣＲ機能を欠くＣＡＲＴ細胞は、元のＴ細胞株の特異性に起因するオフターゲット効果の可能性を排除する。これとは別に、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ表面タンパク質の除去は、入ってくる治療用Ｔ細胞を標的とする宿主適応免疫システムの能力を低下させ、時間の経過とともに迅速な応答拒絶を構築する。これはまた、異体字Ｔ細胞を非自己として拒絶する身体の能力を低下させる。ＭＨＣのないＴ細胞は、自然免疫系の一部、例えばＮＫ細胞による標的化の強化の対象となるが、これらは治療用Ｔ細胞上のキメラタンパク質を特異的に標的化する能力を獲得しない。
【００７４】
ＢＬＡＳＴＰは、ＢＬＯＳＵＭ４５が密接に関連する配列、ミッドレンジ配列の場合はＢＬＯＳＵＭ６２、より遠い関連の配列の場合はＢＬＯＳＵＭ８０のために使用されるＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２、またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似性マトリックスを使用して、参照アミノ酸と少なくとも９５％、９７．５％、９８％、９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を同定するために使用できる。特に明記しない限り、本明細書に開示される配列の類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ４５の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、パーセント類似性は、ＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づいており、パーセント配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコアの配列対における全残基の数および割合を示す。ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アラインメントスコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数および割合を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列に対するこれらの程度の同一性または類似性、または任意の中間の程度の同一性または類似性を有するアミノ酸配列が企図され、本開示に包含される。期待しきい値１０、ワードサイズ３、マトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップペナルティ１１（存在）および１（拡張）、および条件付き構成スコアマトリックス調整を使用する代表的なＢＬＡＳＴＰ設定する。ＢＬＡＳＴＰのデフォルト設定は、ｈｔｔｐｓ：／／＿ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ&ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ&ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（最終アクセス日：２０１８年３月１３日）によって説明され、参照によって組み込まれる。好ましくは、本明細書に開示される配列と類似するか、または少なくとも９５％の同一性を有する配列は、開示された配列の少なくとも１つの機能を保持するだろう。
【００７５】
本発明は、その例示的な実施形態の説明によって説明されており、実施形態は特定の詳細に説明されるが、添付の特許請求の範囲をそのような詳細に限定する、または何らかの方法で限定する意図はない。追加の利点および修正は、当業者に当然明らかだろう。したがって、そのより広い態様における本発明は、特定の詳細、代表的な装置および方法、ならびに／または示され説明された例示的な例のいずれにも限定されない。したがって、一般的な発明概念の精神または範囲から逸脱することなく、そのような詳細から逸脱することができる。
【００７６】
さらに、ここでのセクション見出しは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７７の下での提案との一貫性を保つために提供され、またはそれ以外の場合は組織的な手がかりを提供する。これらの見出しは、本開示から発行される可能性のあるクレームに記載されている発明を限定または特徴づけてはならない。具体的には、例として、「背景」における技術の説明は、特定の技術が本開示における任意の実施形態の先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。また、「要約」は、発行された特許請求の範囲に記載された実施形態の網羅的な特徴付けと見なされるべきではない。さらに、本開示における単数形の「発明」への言及は、本開示において新規性の単一の点しかないことを主張するために使用されるべきではない。本開示から発行される複数の請求項の限定に従って複数の実施形態を説明することができ、したがって、そのような請求項は、それによって保護される実施形態およびそれらの同等物を定義する。すべての場合において、そのような請求の範囲は、この開示に照らしてそれ自体のメリットで考慮されるものとするが、本明細書に記載された見出しによって制約されるべきではありません。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９３】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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