(57)【要約】  本発明は、医療分野、特に、神経障害の処置に関する。より具体的には、本発明は、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源に曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は処置に使用するためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体であって、該ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体に関する。更に、本発明は、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源に曝すことなく、このようなナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含む組成物及びキット、並びにそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を電場にも、任意の他の外部活性化源にも曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は処置に使用するためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体であって、
前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料、及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択され、
ここで、
ｉ）前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの集団についての最大サイズ中央値は、該材料が導体材料、半導体材料又は２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料である場合、少なくとも３０nmであり、ここで、
ｉｉ）前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアは、電解質濃度０．００１〜０．２M、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料濃度０．０１〜１０g/L及びｐＨ６〜８を有する水溶液中で測定された場合に、中性又は負の表面電荷を提供する生体適合性コーティングによりコーティングされている、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項２】
前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、０．２超の標準還元電位Ｅ°を有する金属及び、構造中に連続するｓｐ２混成炭素中心を有する有機材料から選択される導体材料である、請求項１記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項３】
前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、金属元素がＩｒ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ａｕである金属ナノ粒子又はそれらの混合物、並びにポリアニリン、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリカルバゾール及び／もしくはポリピレンからなる有機ナノ粒子から選択される、請求項２記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項４】
前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、３．０eVを下回るバンドギャップＥｇを有する半導体材料である、請求項１記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項５】
前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、メンデレエフ周期表のＩＶＡ族からの元素、又はメンデレエフ周期表のＩＩＩ族及びＶ族からの元素の混合組成、又はメンデレエフ周期表のＩＩ族及びＶＩ族からの元素の混合組成からなる、請求項４記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項６】
前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、メンデレエフ周期表のＩＶＡ族からの元素からなり、Ａｌ、Ｂ、Ｇａ、Ｉｎ及びＰから選択される電荷キャリアによりドーピングされている、請求項５記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項７】
前記材料が、３．０eV以上のバンドギャップＥｇを有する絶縁体材料であり、比誘電率εｉｊｋが、２０℃〜３０℃及び１０２Hz〜赤外周波数までの間で測定される、請求項１記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項８】
前記材料が、３．０eV以上のバンドギャップＥｇを有する絶縁体材料であり、比誘電率εｉｊｋが、２００以上であり、前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、ＢａＴｉＯ３、ＫＴａＮｂＯ３、ＫＴａＯ３、ＳｒＴｉＯ３及びＢａＳｒＴｉＯ３から選択される混合金属酸化物である誘電体材料である、請求項７記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項９】
前記材料が、３．０eV以上のバンドギャップＥｇを有する絶縁体材料であり、比誘電率εｉｊｋが１００以下であり、前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、ＲｅＯ２、ＺｒＯ２及びＨｆＯ２から選択される金属酸化物である、請求項７記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項１０】
前記神経疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、強迫性障害、自閉症圏障害、抑うつ障害、ジストニア、トゥーレット症候群、統合失調症、脳卒中、失語症、認知症、耳鳴り、ハンチントン病、本態性振戦、双極性障害、不安障害、中毒障害、意識植物状態（ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｎｅｓｓ  ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｅ）及びそれらの少なくとも１つの症状から選択される、請求項１〜９のいずれか一項記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載のナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体と、薬学的に許容し得る支持体と、を含む組成物であって、
該組成物は、前記ナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を、電場にも、任意の他の外部活性化源にも曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は処置に使用するための組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、少なくとも２種の異なる、請求項１〜９のいずれか一項記載のナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含む、請求項１１記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
少なくとも２種の異なる、請求項１〜９のいずれか一項記載のナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含む、キット。
【請求項１４】
前記ナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を、電場にも、任意の他の外部活性化源にも曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は処置に使用するための、請求項１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野、特に、神経障害の処置に関する。より具体的には、本発明は、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は処置に使用するためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体に関するものであり、該ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。更に、本発明は、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、このようなナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含む組成物及びキット、並びにそれらの使用に関する。
【０００２】
背景
神経障害は、主要な健康上の懸念事項である（Neurological disorders public health challenges. WHO, 2006）。神経ネットワーク機能の障害は、異なる起源を有する場合がある。パーキンソン病は、中脳に位置する黒質におけるドーパミンニューロンの死により引き起こされる運動障害である。脳卒中は、脳の血液供給の遮断に対応する。酸欠により影響を受けた領域のニューロンは死滅し、これらの細胞により制御される身体の部分は機能することができなくなる。ハンチントン病は、遺伝性障害である。てんかんは、種々の脳領域における多くのニューロン群の異常な興奮により引き起こされる障害である。アルツハイマー病は、海馬、大脳皮質及び他の脳領域におけるニューロンの死を特徴とする神経変性障害である。自閉症圏障害の原因は、遺伝性、環境性等の多因性である。
【０００３】
神経障害は、患者に影響を及ぼす主要な症状に応じて分類することができる。本明細書において以下で更に説明されるように、運動障害、精神（心的状態／社交）障害及び認知障害の３つの主要なタイプの症状が観察される。
【０００４】
運動障害は、振戦、運動機能低下症、例えば、運動緩徐（bradykinesia）又は運動機能異常（dyskinesia）、筋捻転、硬直、姿勢不安定性、すくみ足歩行等を包含する。運動障害を呈する疾患は、典型的には、パーキンソン病、ジストニア、てんかん、ハンチントン病及びトゥーレット症候群を含む。
【０００５】
精神障害は、心的状態／社交障害の症状を呈する各種の疾患を構成する。自閉症圏障害、統合失調症障害、双極性障害、抑うつ障害、不安障害、強迫性障害、物質関連障害及び／又は中毒障害を含むが、これらに限定されない（the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 2013, fifth edition, the American Psychiatric Associationからの定義による）。運動障害、例えば、パーキンソン病及びジストニアを患う患者の中には、疾患の後期に精神障害を発症する場合がある。
【０００６】
認知障害は、全てではないにしても多くの精神障害（例えば、統合失調症、双極性障害）に存在する。基本的特徴が認知性である障害のみが、認知障害カテゴリーに含まれる。認知障害は患者の日常生活に影響を及ぼし、単純な仕事を達成することが困難である。認知症は代表的な認知障害であり、日常生活に支障をきたすほどの重度の精神能力低下の総称である。アルツハイマー病は、神経変性局面を伴う特有なタイプの認知症である。
【０００７】
神経障害は、可能な場合、脳における神経伝達物質レベルの調節、及びそれらの特定の神経伝達物質レセプターとの相互作用の制御の役割を果たす薬剤により処置される。関与する主な神経伝達物質は、グルタメート、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ドーパミン及びアセチルコリンである。グルタメート及びＧＡＢＡ神経伝達物質が特に興味深い。それらは、神経興奮性の増大（Platt et al., The Veterinary Journal, 2007, 173, 278-286: The role of glutamate in central nervous system health and disease - a review）及び神経興奮性の低下（Holmes et al., Mental Retardation and Developmental Disabilities, 1995, 1, 208-219: Role of glutamate and GABA in the pathophysiology of epilepsy）のそれぞれにおいて主要な役割を果たすためである。ドーパミンはいくつかの脳機能に関与する。すなわち、基底核を介した運動の制御（基底核における不適切なドーパミンのレベルによる抑えきれない運動の帰結）、快楽報酬を求める行動（障害による機能不全中毒がもたらされるおそれ）、認知（前頭葉におけるドーパミンの障害による神経認知機能の低下のおそれ）等である（Alcaro et al., Brain Res. ReV., 2007, 56(2), 283-321: Behavioral functions of the mesolimbic dopaminergic system: an affective neuroethological perspective）。アセチルコリンは、中枢神経系レベルにおける学習及び記憶に関与する神経伝達物質である（Hasselmo et al., Curr Opin Neurobiol, 2006, 16(6), 710-715: The role of acetylcholine in learning and memory）。
【０００８】
パーキンソン病の運動症状を軽減するための一般的な薬剤はレボドパであり、レボドパは脳内でドーパミンに変換され、このようにして、ドーパミンの欠乏のバランスをとるのに役立つ。レボドパは、カルビドパに関連しており、カルビドパは、レボドパが全身においてドーパミンに変換されるのを回避するのに役立つ。レボドパ処置の１つの問題は、「オン−オフ」現象であり、同現象により、高揚への緩和（ｊｕｂｉｌａｎｔ  ｔｈａｗ）と交互に起こる、うつ病に関連する停滞期及び作業不能期がもたらされる（Lees et al., J   Neurology Neurosurgery Psychiatry, Special Supplement, 1989, 29-37: The on-off phenomenon）。この処置に対する後期パーキンソン病患者の無反応性が問題である（Fabbri et al., Parkinsonism and related disorders, 2016: Do patients with late-stage Parkinson’s disease still respond to levodopa?）。統合失調症における「陽性」症状、妄想及び幻覚等の神経精神障害の症状を処置するための他の一般的な薬剤は、抗精神病剤である。
【０００９】
しかしながら、これらの薬剤による神経障害の症状の治療的処置は、非特異的であるため、重篤な有害事象を誘発するおそれがある。加えて、使用された薬剤に対する不応性が現れる場合がある。
【００１０】
神経科学の理解が進むにつれて、脳は、その電線であるニューロンを介して情報を符号化し伝送する電気ネットワークと考えることができる。ニューロン間の接続性は、単純であると同時に複雑である。単純であるとは、ニューロン内でのイオンの流入／流出により、活動電位（又は電気活動の「スパイク」）が生じるためである。複雑であるとは、脳ネットワークが数千億のニューロンから構成され、これらがノード、ハブ及びモジュールを形成して、種々の空間的及び時間的スケールで、協調した相互作用を示すためである（Fornito et al., Nature Reviews Neuroscience, 2015, 16, 159-172: The connectomics of brain disorders）。神経伝達は、個々のニューロンを接続する解剖学的コンポーネント（構造）と、情報を伝達するプロセス（機能）とにより決まる。両方の側面が、神経系の性能全体に影響を及ぼす。神経相互作用は、脳電気活動パターンの振動により伝えられる。この振動は、典型的には脳波図（ＥＥＧ）により測定可能である。振動の異なる周波数帯域、すなわちデルタ、シータ、アルファ、ベータ、ガンマ周波数帯域が観察される（Ward et al., Trends in Cognitive Sciences, 2003, 7(12), 553-559: Synchronous neural oscillations and cognitive processes）。構造的には、脳の最も顕著な神経解剖学的特徴は、ニューロン間の豊富な接続性であり、これは、神経伝達の重要性を反映している。１つの脳領域と別の脳領域との間の振動の同期（「同期性」）により、時空間協調をもたらす最高度の情報符号化レベル［第１のレベル（ニューロン）：活動電位；第２のレベル（ニューロンネットワーク）：ニューロン振動］が構成されると考えられる（Engel et al., Nature Reviews Neuroscience, 2001, 2, 704-716: Dynamic predictions: oscillations and synchrony in top-down processing）。空間及び時間における同期及び非同期の微妙にバランスのとれたパターンが、神経系の機能的性能にとっての基本であるという証拠が出現していることは重要である（Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain）。
【００１１】
異常な同期プロセス（高すぎる及び／もしくは長すぎる同期性（すなわち、過同期とも呼ばれる）又は低すぎる同期（すなわち、同期障害とも呼ばれる））は、幾つかの脳障害、例えば、てんかん、統合失調症、認知症及びパーキンソン病に関連している（Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain）。
【００１２】
現在、ニューロンの電気活動パターンの変調（神経変調）は、電気刺激により誘発することができる。脳内に電気刺激を生成するための現在の技術は、直接電気刺激、又は磁気コイルを通る電流の印加による電場誘発のいずれかを利用する。特定の神経障害は脳深部の領域に影響を及ぼし、電場の浸透深さが弱いため、電気刺激を連続的に送達するように、脳内への電極の外科的埋め込みが実施されており、「脳深部刺激」（ＤＢＳ）技術を構成する。その有効性は、刺激に使用されるパラメータ、特に、周波数により決まる。１９８７年に、埋め込まれた電極による腹側中間部（ＶＩＭ）の高周波刺激（≧１００Hz）により、パーキンソン病を患う患者の振戦症状が軽減されることが見出された（Benabid et al., Applied Neurophysiology, 1987, 50, 344-346: Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease）。また、サルでは、高周波刺激（＞１００Hz）により、低周波刺激（＜５０Hz）と比較して、外側淡蒼球（ＧＰｅ）及び内側淡蒼球（ＧＰｉ）におけるニューロンの一時性の放電パターンの変化（刺激に同期した規則的な放電パターン）が可能となり、この変化により、視床及び脳幹におけるそのターゲット構造への、基底核における神経活動の変化したパターンの伝達が遮断されるため、運動緩徐状及び硬直症状が軽減されることが示されている（Hashimoto et al., The Journal of Neuroscience, 2003, 23(5), 1916-1923: Stimulation of the subthalamic nucleus changes the firing pattern of pallidal neurons）。ＤＢＳは、現在、幾つかの運動障害（パーキンソン病、ジストニア、本態性振戦、てんかん）及び精神障害（強迫性障害、うつ病）を処置するために承認されている。
【００１３】
しかしながら、幾つかの欠点が、ＤＢＳに関連している場合がある。第１の欠点は、この技術の侵襲性及び種々の合併症、例えば、出血、てんかん発作、感染、導線移動、導線破損等のリスクである（Fenoy et al., J Neurosurg, 2014, 120, 132-139: Risks of common complications in DBS surgery: management and avoidance）。
【００１４】
ターゲット内に生成された電場の焦点性（すなわち、空間解像能）は、別の懸念事項である。電気刺激の広がりは、抑うつ等の副作用にも関連している。多くの研究では、刺激をシフトさせ、特定の領域内に閉じ込めることができる新たなタイプの電極を設計することに専念してきた（Luan et al., Frontiers in Neuroengineering, 2014, 7(27), 1-9: Neuromodulation: present and emerging methods）。他の技術的側面：電極（又は導線）、そのサイズ、ＤＢＳ装置の侵襲性、導線を構成する材料、（磁気共鳴）撮像技術との適合性、連続刺激の必要性に関連する内部パルス発生器（ＩＰＧ）のバッテリー寿命は、評価中である。
【００１５】
他の主要な既存のタイプの電気刺激、すなわち、経頭蓋電気刺激又は経頭蓋磁気刺激は、侵襲性ではないという利点を有するが、電場の浸透深さが弱い。したがって、それらの用途は、大脳皮質の刺激に限定される（脳深部には到達できない）。更に、空間解像能は低いままである。
【００１６】
本発明は、神経疾患（典型的には、ニューロンネットワークの障害）又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための使用／これらの予防又は処置における使用のためのナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体（ナノ粒子の凝集体）を扱う。
【００１７】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体により、ニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間並びに脳の異なる領域内及び／又は領域間のニューロン振動の同期が正常化される（同期性が改善される）。このため、本発明者らにより本明細書に記載されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、対象体／患者が健康／正常な状態に戻るのに役立つ。
【００１８】
本発明者らにより本明細書に記載されたナノ粒子及びナノ粒子凝集体は、電流又は電場／電気刺激の印加／誘導を必要とせず、好ましくは、それらの機能を発揮する（すなわち、効率的である）ために、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源への曝露を必要としない。本明細書に記載されたナノ粒子及びナノ粒子凝集体は、本明細書に記載された使用の文脈において機能的であるために、電流又は電場／電気刺激への暴露を必要とせず、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源への曝露を必要としない。本発明者らは、これらのナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電流又は電場／電気刺激に晒されることなく、すなわち、それらが投与される対象体への電流又は電場／電気刺激への暴露なしに、典型的には、例えば、脳深部刺激（ＤＢＳ）、経頭蓋電気刺激（ＴＥＳ）又は経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）により印可される電流又は電場／電気刺激の前記対象体への暴露なしに、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源への曝露なしに、有利に、かつ驚くべきことに効率的に使用することができることを発見した。このことは、本発明により、処置される対象が、電流もしくは電場／刺激、又は任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場もしくは超音波源への曝露の負の副作用を被らないであろうことを意味する。
【００１９】
当業者に周知のように、ナノ粒子は、向上した／高い表面／体積比を有し、典型的には、約３５％〜４０％ 原子が１０nmナノ粒子の表面に局在しており、３０nm超のサイズを有するナノ粒子では２０％未満であるのと対比できる。この高い表面／体積比は、サイズに依存する強い表面反応性に関連する。その結果、ナノ粒子（特に、２０nm未満 ナノ粒子）は、バルク材料と比較して優れた特性を示す場合がある。例えば、金粒子は巨視的スケールでは、化学的に不活性であり、酸化に対して抵抗性であることが公知であるが、１０nm未満のサイズを有する金粒子は、化学的に活性な表面を有する。金属ナノ粒子の化学的不安定化に関連する毒性メカニズムは、（ｉ）溶液中での金属の直接放出（溶解プロセス）、（ｉｉ）金属ナノ粒子の触媒特性及び（ｉｉｉ）タンパク質を酸化し、反応性酸素種（ＲＯＳ）を発生させ、酸化ストレスを誘発し得る、ナノ粒子表面の酸化還元性の発生であろう（参照．M. Auffan et al., Environmental Pollution 157 (2009) 1127-1133: Chemical Stability of metallic nanoparticles: a parameter controlling their potential cellular toxicity in vitro）。
【００２０】
触媒特性を示す本明細書で上記された金ナノ粒子に加えて、酸化セリウム（７nm-ＣｅＯ２粒子）又は酸化鉄（２０nm-Ｆｅ３Ｏ４粒子）ナノ粒子は、管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で酸化ストレスに関連する細胞傷害作用につながる表面上の酸化還元性の変容を示した（参照．M. Auffan et al., Environmental Pollution 157 (2009) 1127-1133: Chemical Stability of metallic nanoparticles: a parameter controlling their potential cellular toxicity in vitro）。同様に、１１nmシリカナノ構造は、生物学的媒体により浸蝕される（参照．S-A Yang et al., Scientific Reports 2018 8:185: Silica nanoparticle stability in biological media revisited）。
【００２１】
このため、本発明者らにより以下に説明されるように、３０nm未満のサイズを有するナノ粒子は、対象体、典型的には、ほ乳類、特に、ヒトにおいて体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での使用が意図される場合、注意深く選択されるべきである。
【００２２】
簡単な説明
本明細書において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、予防又は処置を必要とする対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための使用／これらの予防又は処置における使用のための、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の有益性について、初めて記載される。ナノ粒子材料又はナノ粒子凝集体材料は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【００２３】
本明細書において、本発明者らは、特定の態様において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を電場、又は任意の他の外部活性化源に曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は処置に使用するためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体を記載する。該ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択され、ここで、
ｉ）集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値が、該材料が導体材料、半導体材料又は２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料である場合、少なくとも３０nmであり、ここで、
ｉｉ）ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアは、電解質濃度０．００１〜０．２M、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料濃度０．０１〜１０g/L及びｐＨ６〜８を有する水溶液中で測定された場合に、中性又は負の表面電荷を提供する生体適合性コーティングによりコーティングされている。
【００２４】
また、本明細書において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、予防又は処置を必要とする対象体における本明細書に記載された神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための組成物を製造するためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体の使用も記載される。
【００２５】
また、本明細書において、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置に使用するための／対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置する際の使用のための組成物であって、該組成物が、ナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体と薬学的に許容し得る支持体とを含むか、又はこれらからなり、ここで、ナノ粒子材料又はナノ粒子凝集体材料が、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択され、ここで、該予防又は処置が、該組成物を介して対象体に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体を電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく行われる、組成物も記載される。
【００２６】
更に、本明細書において、少なくとも２種の異なるナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含むか又はこれらからなり、各ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から典型的に選択される異なる材料からなる、キット及び、典型的には、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は処置／これらを予防し又は処置するための方法におけるその使用が記載される。
【００２７】
詳細な説明
ヒト神経系は、およそ８００億〜１２００億個の神経細胞からなると推定される（Herculano-Houzel S. Frontier in Human Neuroscience (2009), 3(31): 1-11, The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain）。ニューロン（又は神経細胞）を定義する特性は、活動電位の形態で電気信号を伝達するその能力である。
【００２８】
ニューロン／神経細胞は、脳の基本ノードを構成する。神経細胞は、高度に構造化された様式で互いに伝達して、ニューロンネットワークを形成することができる。ニューロンは、シナプス結合を介して情報伝達する。ニューロン内では、ナノ回路が、重要なニューロン特性、例えば、学習及び記憶並びにニューロン周期性の発生を媒介するための基礎となる生化学的機構を構成する。
【００２９】
マイクロ回路は、ほんの数個の相互接続されたニューロンにより形成することができ、高度な作業、例えば、媒介反射、プロセス感覚情報、運動開始並びに学習及び記憶の媒介を行うことができる。マクロ回路は、複数の埋め込みマイクロ回路からなるより複雑なネットワークである。マクロ回路は、より高い脳機能、例えば、物体認識及び認知を媒介する。したがって、複数のレベルのネットワークが神経系を占めている。
【００３０】
神経ネットワークの興奮性
ニューロンは、電気化学的にメッセージを送信する（すなわち、化学物質／イオンにより、電気信号が生じる）。神経系における重要なイオンは、ナトリウム及びカリウム、カルシウム及び塩化物である。ニューロンが信号を送信していない時は、「静止状態」である。ニューロンが静止している時は、ニューロンの内部は外部に対して負である。種々のイオンの濃度は膜の両側で釣り合わせようと試みられるが、釣り合わすことはできない。細胞膜により、一部のイオンのみがチャンネル（イオンチャンネル）を通過することができるためである。これらの選択的イオンチャンネルに加えて、エネルギーを使用して、ニューロンに入った２つのカリウムイオン毎にニューロンから３つのナトリウムイオンを外に移動させるポンプが存在する。最後に、これらの力が全て釣り合い、ニューロンの内部と外部との間の電圧の差が測定された場合、ニューロンの静止膜電位（また「静止電位」）は、約−７０mVである。これは、ニューロンの内部が外部よりも７０mV低いことを意味する。静止時には、ニューロンの外部には、比較的多くのナトリウムイオンが存在し、そのニューロンの内部には、より多くのカリウムイオンが存在する。活動電位（「スパイク」又は「インパルス」としても特定される）は、ニューロンが細胞体から離れて軸索を下って情報を送信する時に生じる。これは、何らかの事象（刺激）が静止電位を０mVに向かって移動させることを意味する。脱分極が約−５５mVに達すると、ニューロンは、活動電位によって放電する。脱分極がこの臨界閾値レベルに達しない場合には、活動電位によっては放電しない（オン／オフ機構）。また、閾値レベルに達すると、固定された大きさの活動電位により、常に放電する。したがって、脱分極が閾値に達しないか又は完全な活動電位が生成されるかのいずれかである。
【００３１】
活動電位の伝播速度には、大きな変動が見られる。実際に、神経における活動電位の伝播速度は、毎秒１００メートルから毎秒１０分の１メートル未満まで変化することができる。時定数は、膜が刺激に対して時間的にどのくらい迅速に応答するであろうかの指標であるが、空間定数（また長さ定数）は、電位が距離の関数としての軸索に沿ってどのくらい良好に広がるであろうかの指標である。
【００３２】
ニューロンネットワーク内及びニューロンネットワーク間の接続性
脳内及び脳を横切る伝達を調査するために使用される３つの接続性ネットワークタイプが存在する。構造的接続性は、脳の領域を物理的に接続する繊維構造径路の検出に基づいている。これらは、信号が脳内を移動することができる可能性のある経路を示す解剖学的ネットワークマップである。機能的接続性は、相関する活動の類似の周波数、位相及び／又は振幅を有する脳領域における活動を特定する。効果的接続性は、機能的な接続性情報を使用し、更に一工程進み、１つの神経系が別の神経系に対して有することができる直接的又は間接的な影響、より具体的には脳内の動的な情報フローの方向を決定する（Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present）。
【００３３】
ニューロンネットワーク内の同期された活動は、脳磁気図（ＭＥＧ）、脳波図（ＥＥＧ）、機能的磁気共鳴撮像（ＦＭＲＩ）又はポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）、ついで、画像をネットワーク接続性分析に使用して、検出することができる。ＭＥＧ（脳磁気図）又はＥＥＧ（脳波図）が好ましい。情報の動的なフローを解像するのに高い時間解像能を有するためである。脳の接続性分析は、脳が機能するのに必要な伝達ネットワークをマッピングするために行われる。脳内の特定の領域は、特定のタイプの情報を処理するために特化している。画像化技術は、これらの領域が脳内のネットワークを横切って他の特化した領域と接続され、伝達することを明らかにした。「コヒーレンス」（Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present.）は、振動する脳活動のニューロンパターンの同期性（同期している状態又は同期された状態）の周波数及び振幅を定量化する数学的技法である。ニューロンの同期活動の検出は、ヒトの脳における機能的接続性の健全性又は完全性を決定するのに使用することができる。機能的接続性マップを構造的接続性画像上に重ね合わせ、有効接続性から導出された情報フローの方向を使用することにより、脳がどのように機能するかの包括的な理解が提供される。これらの技法は、処置前後の脳接続性画像化に基づいて、治療処置を評価するのに役立つ。
【００３４】
損傷を受けていない（すなわち、「正常」又は「健康」な）脳は、遅いデルタ波（０．５〜４Hz）からシータ（４〜８Hz）、アルファ（８〜１２Hz）、ベータ（１５〜３０Hz）及びガンマ（３０〜７０Hz）波までの、生物の異なる「状態」に関連する（「正常」又は「健康」な）同期活動の複雑なパターンを表わす。興味深いことに、皮質構造の分離された培養物は、緻密に相互接続されたニューロンの集団におけるネットワーク放電（スパイク）及びネットワークバースト（一団のスパイク）の出現、発生及び広がりを制御する規則性の試験のための便利なシステムを提供する。ネットワーク活動は、非侵襲的な様式で、多電極アレイを使用して有限の時間解像能により、長期間記録することができる。二次元分離培養物は、脳におけるネットワーク活動の形成及び維持を制御する規則性を研究するための実行可能な試験システムとして使用することができ、このシステムにより、損傷を受けていない脳において対処することができない仮説の試験が可能となる（Cohen E. et al., Brain Research, 2008, 1235, 21-30: Determinants of spontaneous activity in networks of cultured hippocampus）。
【００３５】
本明細書において初めて、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、予防又は処置を必要とする対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための使用／これらの予防又は処置における使用のための、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の利点が記載される。（治療的又は診断的）電場へのこのような暴露、又は任意の他の（治療的又は診断的）外部活性化源、例えば、光源、磁場もしくは超音波源へのこのような暴露は、典型的には、本明細書において、医療スタッフにより、例えば、医師又は看護師により典型的に行われる治療的又は診断的暴露であると理解されたい。
【００３６】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【００３７】
「処置」という用語は、本明細書に記載された疾患、障害又は機能不全状態を予防し、軽減し又は治癒することができる治療的処置又は手段を指す。このような処置は、同処置を必要とするほ乳類の対象体、好ましくは、ヒトの対象体に対して意図される。このように、本明細書に記載された疾患、障害もしくは機能不全状態を患っていると既に特定されている（診断されている）対象体、又は処置が予防的処置、又は予防を意図する処置であるこのような疾患、障害もしくは機能不全状態に「進行するリスクがある」と考えられる対象体が考えられる。
【００３８】
特定の態様では、対象体は、てんかんを患っている対象体ではない。
【００３９】
ニューロン間の振動伝達の異常な変調は、実際には、異なるタイプの神経疾患又は障害（本明細書では、「神経（ｎｅｕｒａｌ）疾患又は障害」としても特定される）に存在する（Uhlhaas et al., Neuron, 2006, 52, 155-168: Neural synchrony in brain disorders: relevance for cognitive dysfunctions and pathophysiology；Basar E. et al. International Journal of Psychophysiology 103 (2016) 135-148, What does the broken brain say to the neuroscientist? Oscillations and connectivity in schizophrenia, Alzheimer’s disease, and bipolar disorder）。
【００４０】
ヒトの神経系は、中枢神経系（ＣＮＳ）と末梢神経系（ＰＮＳ）とに分けられる。次に、ＣＮＳは脳と脊髄とに分けられ、それぞれ頭蓋の頭蓋腔と脊柱管に存在する。ＣＮＳ及びＰＮＳは協調して動作し、感覚情報を統合し、運動及び認知機能を制御する。図１に、脳構造の簡略図を示す。
【００４１】
ニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間の同期（又は同期化）、脳の異なる領域内及び／又は領域間における同期（又は同期化）は、ニューロン振動の協調を通じて時間的に行われる（Buzsaki et al., Science, 2004, 304, 1926-1929: Neuronal oscillations in cortical networks）。
【００４２】
運動障害は、典型的には、過同期によるものであり、過同期は、脳波図（ＥＥＧ）において典型的に観察される脳の異なる領域内及び／又は領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間の振動の同期化が、健康／正常な対象体と比較した場合、高すぎる及び／又は長すぎる（過剰である）ことを意味する。
【００４３】
対象体における精神障害及び認知障害は、典型的には、同期障害によるものであり、同期障害は、ＥＥＧにおいて典型的に観察される脳の異なる領域内及び／又領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間の振動の同期が、健康／正常な対象体と比較した場合、低下し（典型的には、活性の低下を示し）又は消失さえする、すなわち、検出できないことを意味する［参照．表１：神経障害における異常な神経同期（Uhlhaas et al., Neuron, 2006, 52, 155-168: Neural synchrony in brain disorders: relevance for cognitive dysfunctions and pathophysiologyから採用）］。
【００４４】
【表１】
2021506873.tif 000002
【００４５】
「コヒーレンス」は、振動する脳活動のニューロンパターンの対象体における同期性（同期している状態または同期された状態）の周波数および振幅を定量化する数学的技法であるため、健康／正常な対象体と比較した場合、高すぎるコヒーレンス及び低すぎるコヒーレンスはそれぞれ、運動障害及び精神／認知障害に関与すると考えることができる（Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present）（参照．図２）。
【００４６】
特定の態様では、本発明の文脈においてターゲットとされる神経疾患又は障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、強迫性障害、自閉症圏障害、抑うつ障害、ジストニア、トゥーレット症候群、統合失調症、脳卒中、失語症、認知症、耳鳴り、ハンチントン病、本態性振戦、双極性障害、不安障害、中毒障害、意識植物状態（ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｎｅｓｓ  ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｅ）から選択され、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、強迫性障害、自閉症圏障害、抑うつ障害、ジストニア、トゥーレット症候群、統合失調症、脳卒中、失語症、認知症、耳鳴り、ハンチントン病、本態性振戦、双極性障害、中毒障害、意識植物状態及びそれらの少なくとも１つの症状から選択される。
【００４７】
本明細書において上記で既に説明されたように、神経疾患又は障害は、本明細書において以下で更に詳述されるように、運動障害、精神（心的状態／社交）障害及び認知障害である患者に影響を及ぼす主要な症状に応じて分類することができる。
【００４８】
運動障害の例
パーキンソン病
パーキンソン病（ＰＤ）は、世界中で約７００万〜１，０００万人が罹患し、振戦、運動機能異常、運動緩徐、すくみ足歩行等を特徴とする。ＰＤは、ゆっくり進行する脳の変性疾患である。ＰＤは、基底核及び黒質と呼ばれる脳の領域の神経細胞に影響を及ぼす。黒質における神経細胞はドーパミンを産生し、ドーパミンは、身体運動を意図し制御するのに重要な脳回路内の化学メッセンジャーとして作用する神経伝達物質である。ＰＤでは、黒質のドーパミン産生神経細胞は、一部の個体において早期に死滅する（Corti et al., Physiol Rev, 2011, 91, 1161-1218: What genetics tells us about the causes and mechanisms of Parkinson’s disease）。線条体におけるドーパミンレセプターが十分に刺激されない場合、基底核の一部は、過少刺激又は過剰刺激のいずれかとなる。特に、視床下核（ＳＴＮ）は過剰活性になり、内側淡蒼球（ＧＰｉ）上の促進体として作用する。ＧＰｉの過剰刺激は、視床に対して過剰阻害作用を有し、この作用により、次に、その出力が低下し、運動の減速及び硬直が生じる（Guo et al., Frontiers in Computational Neuroscience, 2013, 7, 124, 1-11: Basal ganglia modulation of thalamocortical relay in Parkinson’s disease and dystonia）。
【００４９】
ＰＤにおけるドーパミンの欠如は、皮質−基底核運動ネットワーク全体にわたるベータ周波数における過剰な振動同期に関連している。実際に、基底核におけるドーパミンレベルは、β同期性を抑制すると予測され、同抑制は、次に、運動の事前処理に必要なドーパミン作動性の関与を調節する（Jenkinson et al., Trends in Neuroscience, 2011, 34(12), 611-618: New insights into the relationship between dopamine, beta oscillations and motor function）。基底核におけるドーパミンレベルが十分に高くない場合には、ベータ振動の同期性がもはや制御されず、運動の遅延が現れる場合がある。パーキンソン病患者における別の観察から、ベータ帯域における皮質振動が、基底核におけるベータ振動をもたらし、駆動するという結論が導かれる（Lalo et al., The Journal of Neuroscience, 2008, 28(12), 3008-3016: Patterns of bidirectional communication between cortex and basal ganglia during movement in patients with Parkinson disease）。
【００５０】
深部脳刺激（ＤＢＳ）は、振戦及び硬直の症状を処置するのに使用することができる（Eusebio et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2011, 82, 569-573: Deep brain stimulation can suppress pathological synchronization in parkinsonian patients）。ＤＢＳによるＰＤ症状の処置は、２００２年からＦＤＡにより承認されている（本態性振戦については１９９７年から）。電気刺激は典型的には、基底核、ＳＴＮ及びＧＰｉにおいて行われる。上記で言及したように、皮質ベータ振動も、疾患の病態生理に関与するため、皮質の経頭蓋刺激（例えば、経頭蓋磁気刺激−ＴＭＳ）を使用して、パーキンソン病の症状を処置することもできる（Cantello et al., Brain Research Reviews, 2002, 38, 309-327: Transcranial magnetic stimulation and Parkinson’s disease）。
【００５１】
ジストニア
ジストニアは、運動系機能の障害を反映する、異常な、不随意の捻転及び回転運動を特徴とする神経障害である。症状に冒された身体の部分、それらの遺伝的起源、関与する神経伝達物質のタイプ等に応じて、幾つかの形態のジストニアが存在する。ジストニアの中枢神経系（ＣＮＳ）の抑制が不完全となり、これにより、対向する筋肉間の相互脊椎抑制喪失が引き起こされる。例えば、上部ジストニアの場合、入力信号を前腕拮抗筋に与えるニューロン／神経の異常な同期により、これらの拮抗筋の共収縮（ジストニアの症状）がもたらされる（Farmer et al., Brain, 1998, 121, 801-814: Abnormal motor unit synchronization of antagonist muscles underlies pathological co-contraction in upper limb dystonia）。
【００５２】
興味深い抗ジストニア作用を示すＤＢＳ標的点は、内側淡蒼球である（ＧＰｉ−ＤＢＳ）。ＧＰｉ−ＤＢＳは、慢性の医学的難治性ジストニアを患う患者に対して２００３年にＦＤＡにより承認された（Hu et al., Translational Neurodegeneration, 2014, 3(2), 1-5: Deep brain stimulation for dystonia）。視床の腹側部中間（ＶＩＭ）核の刺激（ＶＩＭ−ＤＢＳ）の効果は、はるかに弱い。視床下核を使用する刺激（ＳＴＮ−ＤＢＳ）は、経験的なものであった。ＧＰｉ−ＤＢＳにより、ジストニアの主な症状が軽減されるが、治療効果が完全に発現するのには、数週間から数ヶ月かかる場合がある（Dressler et al., J Neural Transm, 2015, DOI 10.1007/s00702-015-1453-x: Strategies for treatment of dystonia）。
【００５３】
てんかん
てんかんは、世界中で約５０００万人が罹患する脳障害であり主に、てんかん発作と呼ばれる正常な脳機能の再発性かつ予測不能な中断により特徴付けられる。てんかんは単独の疾患実体ではなく、多くの異なる原因（遺伝的突然変異、脳腫瘍、頭部外傷、脳卒中、アルコール中毒、脳の炎症；髄膜炎、ＨＩＶ又はウイルス性脳炎等の感染症）に起因するであろう基礎脳機能障害を反映する各種の障害である（Fisher et al., Neurology, 2015, 28(2), 130-135: Redefining epilepsy）。てんかん発作は、脳における過剰な同期性ニューロン活動による徴候及び／又は症状の一過性の発生と定義される（Fisher et al., Epilepsia, 2005, 46(4), 470-472: Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE)）。大脳皮質は、てんかん発作の発生における主要な要素であり、多くの人々は、限局性前頭葉発作又は内側側頭葉発作と診断される（National Institute of Neurological Disorders and Stroke: http://www.ninds.nih.gov/disorders/epilepsy/detail_epilepsy.htm#3109_7）。皮質における上昇した局所同期領域又は「過同期」領域の特定から、局所過同期が発作発生領域のマーカーである場合があることが示唆される（Schevon et al., Neuroimage, 2007, 35(1), 140-148: Cortical abnormalities in epilepsy revealed by local EEG synchrony）。
【００５４】
てんかんの処置のための神経刺激は、末梢神経刺激、例えば、迷走神経刺激（ＶＮＳ）、脊髄刺激、経頭蓋脳刺激（ＴＥＳ又はＴＭＳ）又は深部脳刺激（ＤＢＳ）の形態をとることができる。応答性神経刺激は、別の戦略である。この場合、刺激は、発作開始が検出された場合にのみ実行される。ＶＮＳ及び応答性神経刺激は両方とも、米国において特定のタイプのてんかんの処置について、ＦＤＡにより承認されている。視床前核（ＡＮＴ）のＤＢＳは、欧州連合諸国で承認されている（Fisher et al., Nature Reviews Neurology, 2014, 10, 261-270: Electrical brain stimulation for epilepsy）。
【００５５】
精神障害（心的状態／社交障害）の例
強迫性障害（ＯＣＤ）
強迫性障害（ＯＣＤ）は、多くの場合、慢性的で、重度で、極端に衰弱する一般的な精神障害である。また、強迫性障害は、通常、処置に対して無反応であり、かなりの割合の患者が、応答しないか又は部分的な軽減を得るのみである。
【００５６】
機能的神経画像処理研究により、眼窩前頭皮質、基底核及び線条体における機能不全が実証されている。
【００５７】
ある研究により、急性ＯＣＤ症状が視床下核（ＳＴＮ）、特に、左半球及びデルタ−アルファ（１〜１２Hz）周波数範囲における異常な高振動活動に関連する場合があることが示された（Bastin et al., Cortex, 2014, 60, 145-150: Changes of oscillatory activity in the subthalamic nucleus during obsessive-compulsive disorder symptoms: two case reports）。更に、一部の視床下ニューロンは、確認作業の間に疑いが生じた場合に、それらの放電速度を特異的に増加させた（Burbaud et al., brain, 2013, 136(1), 304-317: Neuronal activity correlated with checking behavior in the subthalamic nucleus of patients with obsessive-compulsive disorder）。
【００５８】
内包の腹側前脚（ＶＣ）及び隣接する腹側線条体（ＶＳ）のＤＢＳは、重症かつ高度処置抵抗性ＯＣＤ（ＶＣ／ＶＳ−ＤＢＳ）の処置についてＥＵにおいて承認された。
【００５９】
自閉症圏障害
自閉症は、社会的相互関係及びコミュニケーションの欠損、並びに異常に制限された反復行動により定義される神経発達症候群である。自閉症は、通常、乳児期、遅くとも生後３年以内に始まる障害である。自閉症は、不均一な状態であり（自閉症を患っているどの２名の小児又は成人も同様のプロファイルを有することはない）、この状態から、「自閉症圏障害」の概念がもたらされ、言語欠損の程度又は全体的な認知遅延に従って、及び社会的又は行動的症状の重症度に従って、疾患をいくつかのレベルに分類する（Lord et al., Neuron, 2000, 28, 355-363: Autism spectrum disorders）。この圏内の一端では、自閉症を有する個体は高機能であり、自分自身で生活し、雇用を維持することが可能である。低機能として特徴付けられる個体は、より重篤な症状、すなわち、言語（又は非言語も）に対する困難、貧弱な社会的コミュニケーション、自傷行動（ＳＩＢ）、癇癪及び潜在的に生命を脅かすおそれがある攻撃性を示す。社会感情的処理のためのネットワークの関与、すなわち辺縁系、顔面処理系及びミラーニューロンネットワークの関与が、自閉症における脳の構造的及び機能的研究における重要な傾向となっている。ガンマ帯域振動の同期性の欠損は、症状の出現に関与することが示されている（Sinha et al., Neurosurgery Focus, 2015, 38(6), E3: Deep brain stimulation for severe autism: from pathophysiology to procedure）。
【００６０】
重度の自閉症における処置を必要とする場合がある２つの主要な症状範囲は、会話に対する非言語性及び非応答性、並びに生命を脅かすおそれがあるＳＩＢを含む、社会的欠損である。扁桃体は、これらの異常な病態生理において重要な役割を果たしていると考えられる。興奮性又は抑制性制御の変化は、自閉症の病態生理の異常を含意している。ＤＢＳによる扁桃体をターゲットとする神経変調は、重度の自閉症患者に対する治療的介在に相当するといえる。３例のＤＢＳ処置が文献に報告された。処置の目的は、主に、疾患に関連する運動障害、例えば、定型行動（反復運動パターン）及び自傷行動（ＳＩＢ）を軽減することであった（Sinha et al., Neurosurgery Focus, 2015, 38(6), E3: Deep brain stimulation for severe autism: from pathophysiology to procedure；Stocco et al., Parkinsonism and related disorders, 2014, 20, 1035-1036: Deep brain stimulation for severe secondary stereotypies）。３例のうち１例では、外側基底核におけるＤＢＳにより、自閉症関連症状、例えば、社会的接触の顕著な改善がもたらされ、変調及び夜間睡眠に影響を及ぼすことが報告された（Sturm et al., Frontiers in Human Neuroscience, 2013, 6, 341, 1-10）。
【００６１】
統合失調症
統合失調症は、とりわけ、下記症状、すなわち、異常な精神活動を反映する陽性症状（幻覚及び妄想）；通常存在する精神機能の欠損に対応する陰性症状（思考障害、感情鈍化、言語困難）により特徴付けられる慢性精神疾患である。生涯にわたる障害の原因として、統合失調症は、上位１０位以内に位置する。
【００６２】
脳表面上での顕著な脳室拡大及び脳脊髄液の増加から、脳が萎縮していることが示唆される。この灰白質の喪失及びニューロン上のシナプス構造数の減少から、統合失調症が神経発達障害であることが示唆される、このことは、脳の異常が（神経変性障害とは対照的に）初期症状を有する患者に既に存在することを意味する。
【００６３】
統合失調症患者において、観察された神経回路の障害は、ガンマ帯域同期化の機能不全に起因することが実証されている（Spencer et al., The Journal of Neuroscience, 2003, 23(19), 7407-7411: Abnormal neural synchrony in schizophrenia；Gallinat et al., Clinical Neurophysiology, 2004, 115, 1863-1874: Reduced oscillatory gamma-band responses in unmedicated schizophrenic patients indicate impaired frontal network processing）。
【００６４】
電気痙攣療法（ＥＣＴ）、すなわちショック処置は、統合失調症における最も成功した非薬理学的処置の１つであることが実証されている（Payne et al., J. Psychiatr. Pract., 2009, 15(5), 346-368: Electroconvulsive therapy part I: a perspective on the evolution and current practice of ECT）。電気痙攣療法（ＥＣＴ）は、脳への電流の連続的な印加を含み、この印可により、てんかん発作に匹敵する発作が引き起こされる。
【００６５】
統合失調症の対症療法のための電気刺激も、ＤＢＳにより可能である。例えば、抑うつ状態における側坐核（ＮＡｃｃ）のＤＢＳにより、無快感の寛解傾向、すなわち、快感の回復がもたらされる（Schlaepfer et al., Neuropsychopharmacology, 2008, 33, 368-377: Deep brain stimulation to reward circuitry alleviates anhedonia in refractory major depression）。
【００６６】
認知障害の例
アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経変性障害であり、精神的、行動的、機能的低下及び学習能力の進行性喪失をもたらす。２０１３年現在、推定５２０万人の米国人が、ＡＤを患っており、約２００，０００人が、６５歳未満であり、５００万人が、６５歳以上である（Alzheimers Dement. 2013, 9(2), 208-245: 2013 Alzheimer’s disease facts and figures）。
【００６７】
近年の証拠から、アルツハイマー病に見られる認知障害が神経−認知ネットワークの機能的切断に関連することが示されている。大域的ＥＥＧ同期化の分析から、デルタ帯域同期化の増加に付随して、アルファ帯域、ベータ帯域及びガンマ帯域同期化の広範な減少が明らかとなっている。軽度のアルツハイマー病の患者において、ベータ帯域同期化の喪失は、認知障害と相関することが示されている（Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain）。アルツハイマー病の処置のためのＤＢＳの可能性を評価するために、臨床研究が進行中である。
【００６８】
ナノ粒子
本明細書において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための／これらの予防又は処置における使用のための本発明に従った使用のための、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が記載される。ここで、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【００６９】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の寸法又はサイズ
本発明の趣旨において、「ナノ粒子」又は「ナノ粒子凝集体」という用語は、ナノメートル範囲、典型的には、１nm〜１０００nm又は１nm〜５００nm、例えば、少なくとも１０nm〜約５００nmもしくは約１０００nm、少なくとも３０nm〜約５００nmもしくは約１０００nm、少なくとも４０nm〜約５００nmもしくは約１０００nm、少なくとも４５nm〜約５００nmもしくは約１０００nm、好ましくは、５００nm未満のサイズを有する製品、特に、合成製品を指す。
【００７０】
「ナノ粒子凝集体」又は「ナノ粒子凝集体」という用語は、互いに強く結合、典型的には、共有結合したナノ粒子の集合体を指す。
【００７１】
電子顕微鏡、例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）又は低温ＴＥＭを使用して、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のサイズ、より具体的には、ナノ粒子又はナノ粒子の凝集体のコア、すなわち、その生体適合性コーティングを含まないナノ粒子又はナノ粒子凝集体のサイズを測定することができる。実際に、生体適合性コーティングは、一般的には、主に軽い構成要素からなる化合物（ポリマー又は有機化合物）から調製され、そのエネルギー電子との弾性相互作用は比較的弱く、その結果、画像コントラストが低くなる。ＴＥＭは、電子透過性基板上に堆積した粒子の投影像を測定する。典型的には、サンプル当たりに約５０超、好ましくは、約１００、１５０又は２００超 ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の記録を、サイズ評価のために測定するべきである。したがって、約５０超又は好ましくは約１００、１５０もしくは２００超 のナノ粒子又はナノ粒子凝集体の記録により、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値、並びにナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアサイズを確認することが可能となる。典型的なアッセイプロトコールは、「NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-7; Measuring the size of using transmission electron microscopy (TEM); version 1.1 December 2009」に見出すことができる。
【００７２】
同様に、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、溶液中のナノ粒子又はナノ粒子凝集体の流体力学的直径（すなわち、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のそのコア及びその生体適合性コーティングの両方を含む直径）を測定することができる。流体力学的直径は、分析物と同じ速度で拡散する等価硬質球体の直径である。典型的なアッセイプロトコールは、「NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-1; Measuring the size of nanoparticles in aqueous media using batch-mode dynamic light scattering; version 1.1 February 2010」に見出すことができる。ＤＬＳ測定から得られる粒径の結果は、他の技術（例えば、電子顕微鏡法）から得られる結果と一致しない場合がある。これは部分的には、実際に測定される物性の違い（例えば、流体力学的拡散  対  投影面積）による。更に、ＤＬＳは、少量の大粒子又は小粒子の集合体の存在に敏感である。一方、電子顕微鏡法は典型的には、一次粒子のサイズ（すなわち、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアサイズ）を反映する（参照．NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-1; Measuring the size of nanoparticles in aqueous media using batch-mode dynamic light scattering; version 1.1 February 2010）。
【００７３】
これらの２つの方法、ＤＬＳ及び電子顕微鏡法は、更に、サイズ測定値を比較し、前記サイズを確認するために、次々に使用することができる。ナノ粒子及びナノ粒子凝集体のサイズを測定するのに好ましい方法は、ＤＬＳである（参照．International Standard ISO22412 Particle Size Analysis- Dynamic Light Scattering, International Organisation for Standardisation (ISO) 2008）。溶液中のＤＬＳにより測定されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の平均流体力学的直径は、強度によるサイズ分布として表わされ（光散乱強度は粒径に比例する）、室温（約２５℃）で測定される。
【００７４】
典型的には、最大寸法又はサイズは、丸形もしくは球形のナノ粒子の直径又は卵形もしくは楕円形のナノ粒子の最長の長さである。
【００７５】
本明細書で定義されたナノ粒子又は凝集体の最大寸法は、典型的には、約２nm〜約２５０nm又は約５００nm、好ましくは、約４nm又は１０nm〜約１００nm又は約２００nm、更により好ましくは、約（好ましくは少なくとも）１０nm〜約１５０nm、約（好ましくは少なくとも）３０nm〜約１５０nm、約（好ましくは少なくとも）４０nm〜約５００nm、約（好ましくは少なくとも）４５nm〜約５００nm、好ましくは、５００nm未満である。
【００７６】
溶液中のナノ粒子又はナノ粒子凝集体の平均流体力学的直径が測定される場合、ＤＬＳ技術が典型的に使用される。ＤＬＳを使用すると、溶液中のナノ粒子又はナノ粒子凝集体の平均流体力学的直径は、典型的には、約１０nm〜約５００nm、好ましくは、約１０nm又は約３０nm〜約１００nm又は約５００nm、更により好ましくは、約１０nm又は約３０nm〜約１００nm、約１５０nm、約２００nm、約２５０nm、約３００nm、約３５０nm、約４００nm、約４５０nm又は約５００nmである。
【００７７】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアが測定される場合、電子顕微鏡技術が典型的に使用される。電子顕微鏡法を使用すると、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値（本明細書において、「最大寸法中央値」とも特定される）は、典型的には、約５nm〜約２５０nm又は約５００nm、好ましくは、約５nm、約６nm、約７nm、約８nm、約９nm、約１０nm、約１１nm、約１２nm、約１３nm、約１４nm、約１５nm、約１６nm、約１７nm、約１８nm、約１９nm、約２０nm、約２１nm、約２２nm、約２３nm、約２４nm、約２５nm、約２６nm、約２７nm、約２８nm、約２９nm、約３０nm、約３１nm、約３２nm、約３３nm、約３４nm、約３５nm、約３６nm、約３７nm、約３８nm、約３９nm、約４０nm、約４１nm、約４２nm、約４３nm、約４４nm又は約４５nm〜約７５nm、約７６nm、約７７nm、約７８nm、約７９nm、約８０nm、約８１nm、約８２nm、約８３nm、約８４nm、約８５nm、約８６nm、約８７nm、約８８nm、約８９nm、約９０nm、約９１nm、約９２nm、約９３nm、約９４nm、約９５nm、約９６nm、約９７nm、約９８nm、約９９nm、約１００nm、約１０１nm、約１０２nm、約１０３nm、約１０４nm、約１０５nm、約１０６nm、約１０７nm、約１０８nm、約１０９nm、約１１０nm、約１１１nm、約１１２nm、約１１３nm、約１１４nm、約１１５nm、約１１６nm、約１１７nm、約１１８nm、約１１９nm、約１２０nm、約１２１nm、約１２２nm、約１２３nm、約１２４nm、約１２５nm、約１３０nm、約１４０nm、約１５０nm、約２００nm、約２５０nm、約３００nm、約３５０nm、約４００nm、約４５０nm又は約５００nmである。
【００７８】
典型的には、電子顕微鏡ツールを使用して、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアのサイズを測定する場合、ナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアのサイズは、約５nm、約６nm、約７nm、約８nm、約９nm、約１０nm、約１１nm、約１２nm、約１３nm、約１４nm、約１５nm、約１６nm、約１７nm、約１８nm、約１９nm、約２０nm、約２１nm、約２２nm、約２３nm、約２４nm、約２５nm、約２６nm、約２７nm、約２８nm、約２９nm、約３０nm、約３１nm、約３２nm、約３３nm、約３４nm、約３５nm、約３６nm、約３７nm、約３８nm、約３９nm、約４０nm、約４１nm、約４２nm、約４３nm、約４４nm又は約４５nm〜約７５nm、約７６nm、約７７nm、約７８nm、約７９nm、約８０nm、約８１nm、約８２nm、約８３nm、約８４nm、約８５nm、約８６nm、約８７nm、約８８nm、約８９nm、約９０nm、約９１nm、約９２nm、約９３nm、約９４nm、約９５nm、約９６nm、約９７nm、約９８nm、約９９nm、約１００nm、約１０１nm、約１０２nm、約１０３nm、約１０４nm、約１０５nm、約１０６nm、約１０７nm、約１０８nm、約１０９nm、約１１０nm、約１１１nm、約１１２nm、約１１３nm、約１１４nm、約１１５nm、約１１６nm、約１１７nm、約１１８nm、約１１９nm、約１２０nm、約１２１nm、約１２２nm、約１２３nm、約１２４nm、約１２５nm、約１３０nm、約１４０nm、約１５０nm、約２００nm、約２５０nm、約３００nm、約３５０nm、約４００nm、約４５０nm、約５００nm又は約５２０nmに含まれる。
【００７９】
ナノ粒子の組成
導体材料から調製されるナノ粒子
導体材料から調製されるナノ粒子は、有機ナノ粒子又は無機ナノ粒子である。
【００８０】
導体材料から調製される無機ナノ粒子は、典型的には、標準水素電極に対して２５℃及び圧力１atmで典型的に測定された場合（「reduction reactions having E° values more positive than that of the standard hydrogen electrode」, 8-25, Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88thEditionの表２を参照のこと）、約０．０１以上、より好ましくは、約０．１、０．２、０．３、０．４又は０．５以上の標準還元電位Ｅ°値を有する金属元素により調製される。ナノ粒子を調製するのに使用される代表的な金属元素は、Ｔｌ、Ｐｏ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ及びそれらの混合物から選択することができる。好ましくは、ナノ粒子を調製するための導体材料として使用可能な金属元素は、Ｉｒ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ａｕ及びそれらの混合物から選択され、更により好ましくは、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ及びそれらの任意の混合物から選択される。特に好ましい材料は、Ａｕ及びＰｔである。
【００８１】
典型的には、金ナノ粒子が、それらのサイズが数nmに小さくなった場合に、触媒活性を示した（参照．M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective）。表面／体積比を小さくすることにより、触媒活性に対する無機ナノ粒子の表面の寄与を最小にするために、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値が、少なくとも３０nm、典型的には、少なくとも４０nm又は少なくとも４５nmであることが好ましい。興味深いことに、本発明者らは、集団のナノ粒子もしくはナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値が４５nmに等しい、及び／又はナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子もしくはナノ粒子凝集体のコアサイズが４２nm〜４９nmの金ナノ粒子が、試験された金ナノ粒子が同じ金濃度を含有する（参照．実施例９及び１０）にも拘らず、集団のナノ粒子のコアの最大サイズ中央値が１５nmに等しい、及び／又はナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子もしくはナノ粒子凝集体のコアサイズが１４nm〜１６nmの金ナノ粒子よりも、ニューロンネットワークに対するＭＰＰ＋誘発機能的効果を予防し／該ＭＰＰ＋誘発機能的効果から救済するのに、より効率的であったことを発見した。
【００８２】
導体材料から調製される有機ナノ粒子は、典型的には、その構造中に連続するｓｐ２混成炭素中心（すなわち、炭素二重結合又又は芳香環であって、芳香環内もしくは芳香環外に、ヘテロ原子、典型的には、ＮもしくはＳを含む）を有する有機材料により調製される。好ましい有機材料は、ポリアニリン、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリカルバゾール、ポリピレン、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）及び／又はポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリスチレンスルホネートから選択される。
【００８３】
特定の態様では、該材料が本明細書に上記された導体材料である場合、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値は、本明細書に上記されたように、少なくとも３０nm又は少なくとも４０nm、好ましくは、５００nm未満、例えば、４５nmであり；前記導体材料は特に、金属材料、典型的には０．２超の標準還元電位Ｅ°を有する金属、又は有機材料、典型的には、その構造中に連続するｓｐ２混成炭素中心を有する有機材料、好ましくは、本明細書に上記された金属材料、特に、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄのいずれか１つ及びそれらの任意の混合物である。
【００８４】
半導体材料から調製されるナノ粒子
半導体材料から調製されるナノ粒子は、典型的には、無機ナノ粒子である。
【００８５】
無機ナノ粒子は、典型的には、その価電子帯と伝導帯との間に比較的小さいエネルギーバンドギャップ（Ｅｇ）を示す半導体材料により調製される。典型的には、半導体材料は、室温（約２５℃）で典型的に測定された場合、３．０eV未満のバンドギャップＥｇを有する（例えば、Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88th Editionの表１２〜７７、表３を参照のこと）。特定の態様では、該材料は、本明細書において以下で更に説明されるように、真性半導体材料又は外因性半導体材料である。
【００８６】
真性半導体材料は、典型的には、メンデレエフ周期表のＩＶＡ族からの元素、例えば、ケイ素（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）、メンデレエフ周期表のＩＩＩ族及びＶ族からの元素の混合組成、例えば、ＡｌＳｂ、ＡｌＮ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＰ、ＩｎＮ等、又はメンデレエフ周期表のＩＩ族及びＶＩ族からの元素の混合組成、例えば、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ等からなる。
【００８７】
外因性半導体材料は、典型的には、高度の化学純度で調製された真正半導体を含み又はそれからなり、ここで、真正半導体材料がドーパントを含む。特定の態様では、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の外因性半導体材料が、メンデレエフ周期表のＩＶＡ族からの元素からなる場合、Ａｌ、Ｂ、Ｇａ、Ｉｎ及びＰから選択される電荷キャリアによりドーピングされる。このような外因性半導体材料は、負の電荷キャリアが優勢であるｎ型、又は正の電荷キャリアが優勢であるｐ型のいずれかであることができる。典型的な外因性ｐ型半導体材料は、アルミニウム（Ａｌ）、ホウ素（Ｂ）、ガリウム（Ｇａ）及びインジウム（Ｉｎ）から選択される荷電キャリアによりドーピングされたケイ素（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）からなる。典型的な外因性ｐ型半導体材料は、リン（Ｐ）により典型的にドーピングされたケイ素（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）からなる。
【００８８】
典型的には、ナノ粒子のサイズが１０nm未満に減少した場合、半導体ナノ粒子のバンドギャップエネルギーは増大することが示された（参照．M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective）。低い表面／体積比を確保し、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のバルクバンドギャップを３．０eV未満で維持するために、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値が、少なくとも３０nm、好ましくは、少なくとも４０nmであるのが好ましい。
【００８９】
このため、特定の態様では、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値は、該材料が本明細書に上記された半導体材料である場合、少なくとも３０nm又は少なくとも４０nm、好ましくは、５００nm未満であり、前記半導体材料は、特に、バンドギャップＥｇが３．０eV未満の半導体材料、典型的には、メンデレエフ周期表のＩＶＡ族からの元素、特に、Ａｌ、Ｂ、Ｇａ、Ｉｎ及びＰから選択される電荷キャリアでドーピングされたメンデレエフ周期表のＩＶＡ族からの元素、又はメンデレエフ周期表のＩＩＩ族及びＶ族からの元素の混合組成もしくはメンデレエフ周期表のＩＩ及びＶＩ族からの元素の混合組成からなる材料である。
【００９０】
高い比誘電率（比誘電率（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｅｒｍｉｔｔｉｖｉｔｙ））、すなわち、２００以上の比誘電率を有する絶縁体材料から調製されるナノ粒子
高い比誘電率εｉｊｋ（比誘電率とも呼ばれる）を有する絶縁体材料から調製され又はそれからなるナノ粒子は、典型的には、室温（約２５℃）で典型的に測定された場合、３．０eV以上のバンドギャップＥｇと、２０℃〜３０℃及び１０２Hz〜赤外周波数で典型的に測定された（例えば、「Permittivity (dielectric constant) of inorganic solid」; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88th Edition; Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid. K.F. Young and H.P.R. Frederikse. J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol. 2, No. 2, 1973の表１２〜４５を参照のこと）２００以上の比誘電率εｉｊｋとを有する材料により調製される。
【００９１】
このようなナノ粒子は、典型的には混合金属酸化物である誘電体材料により調製され、該混合金属酸化物は、好ましくはＢａＴｉＯ３、ＰｂＴｉＯ３、ＫＴａＮｂＯ３、ＫＴａＯ３、ＳｒＴｉＯ３、ＢａＳｒＴｉＯ３等から選択される。
【００９２】
典型的には、ペロブスカイトベースの構造であるＰｂＴｉＯ３ナノ粒子は、２０nm〜３０nm未満のナノ粒子サイズについて、それらの常誘電体から強誘電体への転移温度の変化を示す（参照．M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective）。低い表面／体積比を確保し、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の誘電特性を維持するために、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値は、少なくとも３０nm、典型的には、少なくとも４０nmであるのが好ましい。
【００９３】
このため、特定の態様では、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値は、該材料が２００以上の高比誘電率εｉｊｋを有する本明細書に上記された絶縁体材料、特に、３．０eV以上のバンドギャップＥｇを有する絶縁体材料、好ましくは、ＢａＴｉＯ３、ＫＴａＮｂＯ３、ＫＴａＯ３、ＳｒＴｉＯ３及びＢａＳｒＴｉＯ３から選択される混合金属酸化物である場合、少なくとも３０nm又は少なくとも４０nm、好ましくは、５００nm未満である。
【００９４】
低い比誘電率（比誘電率）、すなわち、１００以下の比誘電率を有する絶縁体材料から調製されるナノ粒子
低い比誘電率を有する絶縁体材料から調製されるか又はそれからなるナノ粒子は、通常、室温（２５℃）で測定された場合の３．０eV以上のバンドギャップＥｇと、通常、２０℃〜３０℃及び１０２Hz〜赤外周波数で測定された場合（例えば、「Permittivity (dielectric constant) of inorganic solid」; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88th Edition; Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid. K.F. Young and H.P.R. Frederikse. J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol. 2, No. 2, 1973の表１２〜４５を参照のこと）の１００以下、好ましくは、５０以下又は２０以下の比誘電率εｉｊｋとを有する材料により、調製されるのが典型的である。
【００９５】
このようなナノ粒子は、典型的には、金属酸化物、混合金属酸化物（前記化合物の金属元素は、メンデレエフ周期表の周期３、５もしくは６からの金属元素又はランタニドに由来）及び炭素材料から選択される誘電体材料を用いて調製される。誘電体材料は、好ましくは、Ａｌ２Ｏ３、ＬａＡｌＯ３、Ｌａ２Ｏ３、ＳｉＯ２、ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５、ＲｅＯ２、ＺｒＯ２、ＨｆＯ２及びカーボンダイヤモンドから選択される。より好ましくは、誘電体材料は、ＲｅＯ２、ＺｒＯ２、ＨｆＯ２及びこれらの任意の混合物から選択される金属酸化物である。ＺｒＯ２及びＨｆＯ２から選択される誘電体材料が特に好ましい。特定の好ましい態様では、誘電体材料又は金属酸化物は、ＣｅＯ２（酸化セリウム）、Ｆｅ３Ｏ４（酸化鉄）、ＳｉＯ２（シリカ）や、これらの任意の混合物ではない。
【００９６】
ジルコニウム（Ｚｒ）及びハフニウム（Ｈｆ）の両元素は、４＋酸化状態にあり、Ｚｒ４＋及びＨｆ４＋の元素は、サイズ及び化学的性質がほぼ同一である。このため、これら２つのイオンは、それらの水溶性化学を確証する際に共に考慮される（chapter 8, section 8.2 Zr4+ and Hf4+, p. 147 「The hydrolysis of cations」, Baes C.F. & Mesmer R.E.; John Wiley and Sons, Inc. reprint Edition 1986を参照のこと）
【００９７】
特定の態様では、集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値は、該材料が本明細書に上記されたように、ＲｅＯ２、ＺｒＯ２、ＨｆＯ２、好ましくは、ＺｒＯ２及びＨｆＯ２並びにこれらの任意の混合物から選択される場合、本明細書に上記されたように、少なくとも１０nm、好ましくは、５００nm未満である。
【００９８】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の形状
該粒子又は凝集体の形状は、その「生体適合性」に影響を及ぼす可能性があるため、極めて均質な形状を有する粒子又は凝集体が好ましい。このため、薬物動態学的理由から、形状が本質的に球形、円形又は卵形であるナノ粒子又は凝集体が好ましい。このような形状は、ナノ粒子もしくは凝集体の細胞との相互作用又は細胞による取り込みにも有利である。球形又は円形が特に好ましい。
【００９９】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の形状は、典型的には、電子顕微鏡法、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して評価される。
【０１００】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の生体適合性コーティング
好ましい実施態様では、目的の組成物を調製するために本発明の文脈において使用されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアは、ステルス特性を示す薬剤から選択される生体適合性材料によりコーティングすることができる。ステルス特性を示す薬剤は、立体基を示す薬剤であることができる。このような基は、例えば、ポリアクリレート；ポリアクリルアミド（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド））；ポリカルバミド；生体高分子；多糖類、例えば、デキストラン又はキシラン；及びコラーゲンから選択することができる。別の好ましい実施態様では、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアは、生物学的ターゲットとの相互作用を可能にする薬剤から選択される生体適合性材料によりコーティングすることができる。このような薬剤は、典型的には、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面上に正又は負の電荷をもたらすことができる。ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面上に正電荷を形成する薬剤は、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン又はポリリシンであることができる。ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面上に負電荷を形成する薬剤は、例えば、ホスフェート（例えば、ポリホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェート等）、カルボキシレート（例えば、クエン酸塩又はジカルボン酸、特に、コハク酸）又はサルフェートであることができる。
【０１０１】
好ましい実施態様では、本発明の文脈において使用されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアは、親水性中性表面電荷を与え、又はナノ粒子に中性表面電荷を付与する親水性剤から選択される生体適合性材料（すなわち、コーティング剤）によりコーティングされる。実際に、本発明のナノ粒子が対象体に投与される場合、親水性中性表面電荷を与えるナノ粒子、又はナノ粒子に中性表面電荷を付与する親水性剤から選択される生体適合性剤によりコーティングされたナノ粒子のコアは、神経疾患を処置するための本明細書に記載されたナノ粒子の使用を最適化するのに特に有利である。
【０１０２】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアに中性表面電荷を付与する親水性剤は、アルコール（Ｒ−ＯＨ）、アルデヒド（Ｒ−ＣＯＨ）、ケトン（Ｒ−ＣＯ−Ｒ）、エステル（Ｒ−ＣＯＯＲ）、酸（Ｒ−ＣＯＯＨ）、チオール（Ｒ−ＳＨ）、糖（例えば、グルコース、フルクトース、リボース）、酸無水物（ＲＣＯＯＯＣ−Ｒ）及びピロールから選択される官能基を示す薬剤であることができる。ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアに中性表面電荷を付与する親水性剤は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、ポリマー又はコポリマーであることができる。該薬剤がオリゴマーである場合、オリゴマーは、オリゴ糖、例えば、シクロデキストリンであることができる。該薬剤がポリマーである場合、ポリマーは、ポリエステル（例えば、ポリ（乳酸）又はポリヒドロキシアルカン酸）、ポリエーテル、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトン、ポリビニルピロリドン；多糖類、例えば、セルロース；ポリピロール等であることができる。
【０１０３】
加えて、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアに中性表面電荷を付与する親水性剤は、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面と相互作用可能な特定の基（Ｒ−）を示す薬剤であることができる。Ｒは、典型的には、チオール、シラン、カルボン酸基及びホスフェート基から選択される。
【０１０４】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアが、導体又は半導体及び金属ナノ粒子である場合、Ｒは、好ましくは、チオール、チオエーテル、チオエステル、ジチオラン又はカルボン酸基である。好ましくは、親水性中性コーティング剤は、チオグルコース、２−メルカプトエタノール、１−チオグリセロール、チオジグリコール及びヒドロキシ酪酸から選択される。
【０１０５】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアが、絶縁体及び酸化物又は混合酸化物ナノ粒子である場合、Ｒは、好ましくは、シラン又はホスフェート基である。好ましくは、親水性中性コーティング剤は、ヒドロキシメチルトリエトキシシラン、フルクトース  ６−ホスフェート又はグルコース  ６−ホスフェート化合物である。
【０１０６】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアに中性表面電荷を付与する親水性剤は、双性イオン化合物、例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ビタミン又はリン脂質であることができる。
【０１０７】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面電荷は、典型的には、当業者に周知のように、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料濃度０．０１〜１０g/L、ｐＨ６〜８及び典型的には、電解質濃度（水中）０．００１〜０．２M、例えば、０．０１M又は０．１５Mを有する水（水溶液）中で、ゼータ電位測定により決定されるのが通常である。本明細書において上記定義された条件下で、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面電荷は、典型的には、−１０mV〜＋１０mV（中性表面電荷に対応）、−２０mV〜＋２０mV又は−３５mV〜＋３５mVに含まれる。中性の場合、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面電荷は、典型的には、−１０mV、−９mV、−８mV、−７mV、−６mV、−５mV、−４mV、−３mV、−２mV又は−１mV〜１mV、２mV、３mV、４mV、５mV、６mV、７mV、８mV、９mV又は１０mVに含まれる。負の場合、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面電荷は、典型的には、−１１mV、−１２mV、−１３mV、−１４mV、−１５mV、−１６mV、−１７mV、−１８mV、−１９mV、−２０mV、−２１mV、−２２mV、−２３mV、−２４mV、−２５mV、−２６mV、−２７mV、−２８mV、−２９mV、−３０mV、−３１mV、−３２mV、−３３mV、−３４mV又は−３５mV未満である。
【０１０８】
ナノ粒子又は凝集体の完全な生体適合性コーティングは、ナノ粒子が親水性中性表面電荷を示す場合、本発明の文脈において、ナノ粒子の表面上のいかなる電荷をも回避するのに有利であることができる。「完全なコーティング」とは、粒子の表面上に少なくとも完全な単層を形成可能なほどの、生体適合性分子の非常に高い密度／緊密さの存在を意味する。
【０１０９】
生体適合性コーティングにより、特に、生理学的流体（血液、血漿、血清等）等の流体又は医薬品投与に必要な任意の等張性媒体もしくは生理学的媒体中での、ナノ粒子の安定化が可能となる。
【０１１０】
安定性は、乾燥オーブンを使用する乾燥抽出物定量化により確認することができ、典型的には、０．４５μmフィルターでのろ過前後のナノ粒子懸濁液において測定することができる。
【０１１１】
コーティングにより、体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での粒子の完全性が保存され、その生体適合性を保証又は改善し、その任意の機能化（例えば、スペーサー分子、生体適合性ポリマー、ターゲット化剤、タンパク質等による）が容易になる利点がある。
【０１１２】
本発明の生体適合性ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与（すなわち、生理学的ｐＨでの投与）後に、毒性種を溶解放出すべきではなく、酸化還元挙動を示すべきでもない。典型的には、前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が生体適合性であると考えられるように、すなわち、対象体、特にほ乳類、好ましくは、ヒトに安全に使用されると考えられるようにするためである。
【０１１３】
本明細書に記載された別の特定の目的は、上記定義されたナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含み、好ましくは、更に薬学的に許容し得る担体又は媒体を共に含む、組成物、特に、医薬組成物に関する。
【０１１４】
特に、本明細書において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、対象体における本明細書に記載された神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための使用／これらの予防又は処置における使用のための組成物が記載される。ここで、該組成物は、ナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体と、薬学的に許容し得る支持体とを含み又はこれらからなり、ここで、ナノ粒子材料又はナノ粒子凝集体材料は、典型的には、本明細書の上記で説明された、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【０１１５】
好ましい態様では、該組成物は、少なくとも２種の異なるナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含み又はこれらからなり、異なる材料からなる各ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【０１１６】
本発明の典型的な態様では、本明細書に記載されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、（活性）治療化合物又は薬剤の担体としては使用されない。
【０１１７】
特定の態様では、該組成物は、本発明のナノ粒子又はナノ粒子凝集体を含み、更に治療剤を共に含むことができる。本発明の文脈において、このような治療剤は、典型的には、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体ではない。治療剤は、神経障害処置に使用される任意の薬剤から選択することができる。治療剤は、典型的には、抗精神病剤、抗ドーパミン作動剤、ドーパミン作動剤、抗コリン作動剤、コリン作動剤、抗グルタミン酸作動剤、グルタミン酸作動剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチル  Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターアンタゴニスト、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、ボツリヌス毒素、抗ジストニア剤、抗てんかん剤、抗痙攣剤、気分安定剤、抗うつ剤及び鎮静剤から選択される。
【０１１８】
該組成物は、固体、液体（懸濁液中の粒子）、エアロゾル、ゲル、ペースト等の形態にあることができる。好ましい組成物は、液体又はゲルの形態にある。特に好ましい組成物は、液体形態にある。
【０１１９】
利用される薬学的に許容し得る支持体又は担体は、当業者に任意の古典的な支持体、例えば、生理食塩水、等張性無菌緩衝溶液、非水性媒体溶液等であることができる。
【０１２０】
また、該組成物は、安定剤、甘味料、界面活性剤、ポリマー等も含むことができる。
【０１２１】
該組成物は、例えば、アンプル、エアロゾル、ボトル、錠剤、カプセル剤として、当業者に公知の医薬製剤の技術を使用して製剤化することができる。
【０１２２】
本発明のナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、種々の可能な経路、例えば、頭蓋内、静脈内（ＩＶ）、気道（吸入）、髄腔内、眼内又は経口経路（経口）、脳室内（ＩＣＶ）を使用し、好ましくは、頭蓋内又は髄腔内を使用して、対象体に投与することができる。
【０１２３】
ナノ粒子の反復注射又は投与を、必要に応じて行うことができる。好ましくは、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、１回で投与されるべきである。
【０１２４】
ナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体が投与されると、典型的には、ニューロンの対象体と相互作用する。好ましい態様では、この相互作用は、延長された相互作用、すなわち、数時間、数日、数週間又は数か月の相互作用である。特定の態様では、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、対象体内に留まる。
【０１２５】
本明細書に記載されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体、及びこのようなナノ粒子又はナノ粒子凝集体を含む組成物は、対象体において、典型的には、動物において、好ましくは、ほ乳類において、更により好ましくは、ヒトにおいて、典型的には、ヒトの患者において、その年齢又は性別にかかわらず、使用するためのものである。
【０１２６】
対象体の大脳皮質、海馬及び／又は偏桃体に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の典型的な量は、１０５〜１０１７個、１０５〜１０１６個又は１０５〜１０１５個、好ましくは、１０７〜１０１４個、より好ましくは、１０９〜１０１２個である。また、対象体の大脳皮質、海馬及び／又は偏桃体に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の典型的な量は、１cm3あたりにナノ粒子又はナノ粒子凝集体１０２〜１０１２個である。
【０１２７】
対象体の脳深部に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の典型的な量は、１０４〜１０１７個、１０４〜１０１６個、１０４〜１０１５個又は１０４〜１０１４個、好ましくは、１０６〜１０１２個、より好ましくは、１０８〜１０１１個である。また、対象体の脳深部に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の典型的な量は、１cm3あたりにナノ粒子又はナノ粒子凝集体１０１〜１０１１個である。
【０１２８】
また、本明細書において、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための方法であって、本明細書に記載されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体のいずれか１つを対象に投与する工程を含む、方法が記載される。この方法は、典型的には、対象体、より正確には、前記対象体に投与されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体を電場に曝す工程を何ら含まず、好ましくは、対象体、より正確には、前記対象体に投与されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体を任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝す工程も何ら含まない。
【０１２９】
本明細書に記載された更なる目的は、本明細書に記載された少なくとも２種の異なるナノ粒子及び／又は少なくとも２種の異なるナノ粒子凝集体を含み、又はこれらからなり、異なる材料からなる各ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が、典型的には、本明細書に記載された、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される、キットに関する。
【０１３０】
特定の実施態様では、キットは、異なる容器内に、本明細書に記載された異なるナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体（これらは、接触する、典型的には、そのままの位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、すなわち、ターゲット部位上での混合；又はターゲット部位での混合物の堆積前に管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）もしくは体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での混合、のいずれかとされることが意図される）を含む。
【０１３１】
更なる目的は、本明細書に記載されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体とは異なる、少なくとも１種の更なる治療剤を更に含むキットに関する。該治療剤は、例えば、抗精神病剤、抗ドーパミン作動剤、ドーパミン作動剤、抗コリン作動剤、コリン作動剤、抗グルタミン酸作動剤、グルタミン酸作動剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチル  Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターアンタゴニスト、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、ボツリヌス毒素、抗ジストニア剤、抗てんかん剤、抗痙攣剤、気分安定剤、抗うつ剤及び鎮静剤であり、当業者であればターゲット疾患の性質に応じて選択することができるであろう。本明細書において、上記説明されたように、このような更なる治療剤は、典型的には、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体ではない。
【０１３２】
また、本明細書において、対象体に投与されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、対象体における本明細書に記載された神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための方法における、このようなキットの体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での使用が記載される。また、本明細書において、対象体に投与されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、対象体における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は処置における使用のための、本明細書に記載されたキットが開示される。
【０１３３】
ニューロンレベルでは、ナノ粒子は、ニューロンの電気的興奮性を向上させ、又は阻害するように記載されている。例えば、酸化亜鉛、カーボンナノチューブ及び金ナノ粒子は、ニューロンの電気的興奮性を向上させることが見出され、一方、酸化銅、銀、カーボンブラック、酸化鉄及び酸化チタンは、ニューロンの電気的興奮性を阻害することが見出された（Polak P & Shefi O. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 11 (2015) 1467-1479, Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles）。
【０１３４】
コーティングされた銀ナノ粒子（ｃＡｇＮＰ）−両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコールを使用−［純水中での流体力学的直径１３nm±２nm（動的光散乱技術）及びゼータ電位−６９mV（Zetasizer Nano）を有するｃＡｇＮＰ］のニューロン系での全身的影響に関する研究から、ナノ粒子が、興奮性に影響する機構の変化を誘発することが示された。その上、ニューロンネットワークシミュレーションから、局所的にｃＡｇＮＰ誘発された変化により、ネットワーク全体においてネットワーク活性の変化がもたらされ、このことから、ｃＡｇＮＰの局所適用により、ネットワーク全体の活性が影響を受ける場合があることが示された（Busse M. et al. International Journal of Nanomedicine 2013:8 3559-3572, Estimating the modulatory effects of nanoparticles on neuronal circuits using computational upscaling）。
【０１３５】
また、細胞内金ナノ粒子に関連するニューロンの興奮性の向上は、病理学的状態、例えば、発作下でニューロンに対して有害な効果を潜在的に有することが記載されている（Jung S, et al. PLOS ONE 2014, 9(3) e91360, Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain）。
【０１３６】
本発明のナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、脳の異なる領域内及び／又は領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間での振動の同期化を正常化することにより、前記ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を、電場に曝すことなく、好ましくは、任意の他の外部活性化源、例えば、光源、磁場又は超音波源に曝すことなく、神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は処置するための使用／これらの予防又は処置における使用のためのものである。
【０１３７】
図２及び図３に図示するように、脳の異なる領域内及び／又は領域間の伝達は、神経疾患において影響を受ける。神経障害及び関連症状によれば、本発明のナノ粒子への脳の特定領域の曝露により、脳の異なる領域内及び／又は領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間での振動の同期化の正常化（すなわち、コヒーレンスの正常化）により、伝達が改善されるであろう（図４及び図５）。
【０１３８】
下記実施例及びそれらの対応する図面は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１．脳の模式図（矢状面）。
【図２】図２．２つのニューロンネットワーク間の過同期及び同期障害。
【図３】図３．種々の神経疾患に関与する脳領域。
【図４】図４．ナノ粒子（ＮＰ）の過同期（運動障害）の正常化についての効果。
【図５】図５．ナノ粒子（ＮＰ）の同期障害（精神障害及び認知障害）の正常化についての効果。
【図６】図６．ＭＰＰ＋処理及び電気活動記録を伴うパーキンソン病誘発の実験スキーム。マウス腹側中脳／皮質共培養物をＥ１４．５  ＮＭＲＩマウスから調製し、４８ウェルのＭＥＡにおいて３週間培養した（総培養期間）。この培養物を培養７日後（７日目）、ナノ粒子懸濁液（「ナノ粒子」群）、ＧＤＮＦ（２０ng/ml）（「参照」群）又は水（「対照」群及び「ＭＰＰ＋」群）で処理し、８日目に、ＭＰＰ＋（２０μM）（「ナノ粒子」群、「参照」群及び「ＭＰＰ＋」群）又は水（「対照」群）で処理した。自発活動を２１日目に記録した。
【図７】図７．電気活動記録から抽出することができる幾つかのパラメータを概説する２つの単純化されたバーストのスキーム。全体的な活動（スパイク、バースト、バースト間隔（ＩＢＩ）及びバースト周期）及びバースト構造（バースト持続時間、バースト安定期、バースト振幅、バースト間スパイク間隔（ＩＳＩ）及びバースト面積）を説明するパラメータを示す。これらのパラメータの標準偏差（ＳＤ）はそれぞれ、全体的な活動及びバースト構造の規則性の尺度である。時間の変動係数（ＣＶｔｉｍｅ）は、各単位の活動パターンの時間的規則性を反映する。ＣＶｔｉｍｅは、パラメータの標準偏差と平均との比により計算される。ネットワーク間の変動係数（ＣＶｎｅｔ）は、ネットワーク内のニューロン間の同期を反映する。ＣＶｎｅｔは、ネットワークにわたる平均によるパラメータの標準偏差の比により計算される。大きなＣＶｎｅｔ値は、ネットワーク全体にわたる活動の広範囲の変動を意味し、より少ない同期化を意味する。
【図８−１】図８−１．中脳／皮質ネットワーク活動における「対照」群及び「ＭＰＰ＋」群と比較した「ナノ粒子」群（実施例１からのナノ粒子）及び「参照」群で観察された機能的効果。データから、ＭＰＰ＋誘発機能的効果が示され、本発明のナノ粒子又はＧＤＮＦにより可能となる予防／救済効果（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を予防し／救済する能力）が実証される。
【図８−２】図８−２．中脳／皮質ネットワーク活動における「対照」群及び「ＭＰＰ＋」群と比較した「ナノ粒子」群（実施例２からのナノ粒子）及び「参照」群で観察された機能的効果。データから、ＭＰＰ＋誘発機能的効果が示され、本発明のナノ粒子又はＧＤＮＦにより可能となる予防／救済効果（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を予防し／救済する能力）が実証される。
【図９】図９．中脳／皮質ネットワーク活動における「対照」群及び「ＭＰＰ＋」群と比較した「ナノ粒子」群（実施例５及び６からのナノ粒子）で観察された機能的効果。データから、ＭＰＰ＋誘発機能的効果が示され、本発明のナノ粒子により可能となる予防／救済効果（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を予防し／救済する能力）が実証される。
【図１０】図１０．「ナノ粒子」群、「参照」群、「対照」群及び「ＭＰＰ＋」群についての効果スコア分析。
【図１１】図１１．アミロイドベータ１−４２（Ａベータ１−４２）を用いたアルツハイマー病の誘発、処置及び電気活動記録の実験スキーム。４週間の培養（培養期間）後、Ａベータ１−４２（１００nM）（「ナノ粒子」群、「参照」群及び「Ａベータ」群）又は水（「対照」群）（Ｔ０）をニューロンネットワークに加えた。４時間後、ナノ粒子懸濁液（「ナノ粒子」群）、ドネペジル（３００nM）（「参照」群）又は水（「対照」群及び「Ａベータ」群）を加えた。自発活動を下記のように記録した。    −Ｔ０（Ａベータ１−４２の添加前）    −Ｔ０＋１ｈ、＋２ｈ、＋３ｈ、＋４ｈ（ナノ粒子、ドネペジル又は水の添加前）、＋５ｈ及び＋６ｈ
【図１２−１】図１２−１．皮質ネットワーク活動における「対照」群及び「Ａベータ１−４２」群と比較した「ナノ粒子」群及び「参照」群で観察された機能的効果。データから、Ａベータ１−４２機能的効果が示され、本発明のナノ粒子（実施例１）又はドネペジルにより可能となる救済効果（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を救済する能力）が実証される。
【図１２−２】図１２−２．皮質ネットワーク活動における「対照」群及び「Ａベータ１−４２」群と比較した「ナノ粒子」群及び「参照」群で観察された機能的効果。データから、Ａベータ１−４２機能的効果が示され、本発明のナノ粒子（実施例２，３）又はドネペジルにより可能となる救済効果（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を救済する能力）が実証される。
【図１２−３】図１２−３．皮質ネットワーク活動における「対照」群及び「Ａベータ１−４２」群と比較した「ナノ粒子」群及び「参照」群で観察された機能的効果。データから、Ａベータ１−４２機能的効果が示され、本発明のナノ粒子（実施例４，５）又はドネペジルにより可能となる救済効果（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を救済する能力）が実証される。
【図１２−４】図１２−４．皮質ネットワーク活動における「対照」群及び「Ａベータ１−４２」群と比較した「ナノ粒子」群及び「参照」群で観察された機能的効果。データから、Ａベータ１−４２機能的効果が示され、本発明のナノ粒子(実施例６) 又はドネペジルにより可能となる救済効果（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を救済する能力）が実証される。
【図１３】図１３．「ナノ粒子」群、「参照」群、「対照」群（効果スコア＝０）及び「Ａベータ」群（効果スコア＝１）についての効果スコア分析。
【図１４】図１４．実施例９からの金ナノ粒子の代表的なＴＥＭ画像。集団のナノ粒子のコアの最大サイズ中央値は、それぞれ１０８nm（金−１１０）、８３nm（金−８０）、４５nm（金−４５）、３４nm（金−３０）及び１５nm（金−１５）に等しい。
【図１５】図１５．「ナノ粒子」群（実施例９からの金−４５及び金−１５ナノ粒子）、「対照」群（効果スコア＝０）及び「ＭＰＰ＋」群（効果スコア＝１）についての効果スコア分析。
【図１６】図１６．実施例１１からのＰＥＤＯＴナノ粒子の代表的な走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。
【図１７】図１７．「ナノ粒子」群（実施例１１からのＰＥＤＯＴナノ粒子）、「対照」群（効果スコア＝０）及び「ＭＰＰ＋」群（効果スコア＝１）についての効果スコア分析。
【０１４０】
実施例
ニューロンの管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）研究
ニューロンレベルでは、パッチクランプ技術が、ニューロンの膜電位の同時直接測定及び制御が可能であるため、活動電位を検出するのに非常に有用である。
【０１４１】
この技術を使用して、単一のニューロンにおけるナノ粒子の効果を評価する。
【０１４２】
ニューロンネットワークの管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）研究
多電極アレイ（ＭＥＡ）に結合した分離されたニューロン培養物は、脳ネットワークの複雑さをより良好に理解するのに広く使用されている。加えて、分離されたニューロン集合の使用により、ネットワークの接続性の操作及び制御が可能となる。ＭＥＡシステムにより、リアルタイムでのニューロンネットワークにおける複数の部位からの非侵襲的で、長期間持続する同時細胞外記録が可能となり、空間解像能が向上し、もってネットワーク活動の安定した測定が提供される。長期間にわたる活動電位及び電場電位データの同時収集により、時空間パターン生成を担う全ての細胞機構の相互作用から生じるネットワーク機能のモニタリングが可能となる（Johnstone A. F. M. et al., Neurotoxicology (2010), 31: 331-350, Microelectrode arrays: a physicologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century）。パッチクランプ及び他の単一電極記録技術と比較して、ＭＥＡにより、ネットワーク全体の応答が測定され、ネットワークに存在する全てのレセプター、シナプス及びニューロン型の相互作用に関する全体的な情報が統合される（Novellino A. et al., Frontiers in Neuroengineering. (2011), 4(4), 1-14, Development of micro-electrode array based tests for neurotoxicity: assessment of interlaboratory reproducibility with neuroactive chemicals.）。したがって、ＭＥＡ記録は、ニューロン培養におけるニューロン伝達、情報符号化、伝播及び処理を理解するのに利用されてきた（Taketani,M and Baudry,M.(2006). Advances in Network Electrophysiology. New York, NY: Springer；Obien et al., Frontiers in Neurosciences, 2015, 8(423): Revealing neuronal functions through microelectrode array recordings）。ＭＥＡ技術は、電気的に活性な細胞の培養におけるネットワーク活動の機能的変化を特徴付けるための高度な表現型ハイコンテンツ・スクリーニング法であり、神経発生並びに神経再生及び神経変性の局面に対して非常に精度が高い。更に、ＭＥＡ上で成長したニューロンネットワークは、損傷を受けていないほ乳類の神経系の機能を変化させるのとほぼ同じ濃度範囲で、神経活性化合物又は神経毒性化合物に応答可能であることが公知である（Xia et al., Alcohol, 2003, 30, 167-174: Histiotypic electrophysiological responses of cultured neuronal networks to ethanol；Gramowski et al., European Journal of Neuroscience, 2006, 24, 455-465: Functional screening of traditional antidepressants with primary cortical neuronal networks grown on multielectrode neurochips；Gramowski et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation）。
【０１４３】
この技術を使用して、ニューロンネットワークにおけるナノ粒子の効果を評価する。
【０１４４】
ニューロンネットワークの体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）研究
本発明のナノ粒子の、動物のニューロンネットワークにおける効果を評価するのに適した動物モデルが考慮される。
【０１４５】
例えば、パーキンソン病のマウスモデルを使用して、行動障害（運動障害）の軽減について、ナノ粒子の効果を評価する。また、アルツハイマー病のラット又はマウスモデルを使用して、動物の空間学習及び記憶機能障害（認知障害）について、ナノ粒子の効果を評価する。
【０１４６】
実施例１．導体材料により調製されたナノ粒子：中性表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた金ナノ粒子の合成
金ナノ粒子を、塩化金塩（ＨＡｕＣｌ４）をキャップ剤（クエン酸ナトリウム）で還元することにより合成した（プロトコールは、G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21から適応させた）。典型的な実験では、ＨＡｕＣｌ４溶液を加熱して沸騰させた。続けて、クエン酸ナトリウム溶液を加えた。得られた溶液を沸騰下で更に５分間維持した。ナノ粒子懸濁液の０．２２μmろ過（フィルターメンブレン：ポリ（エーテルスルホン）（ＰＥＳ））を行い、懸濁液中での金濃度を５３０nmでのＵＶ−可視分光分析アッセイにより決定した。
【０１４７】
表面コーティングを、α−メトキシ−ω−メルカプトポリ（エチレングリコール）２０kDa（「チオール−ＰＥＧ  ２０kDa」）を使用して行った。十分な量の「チオール−ＰＥＧ  ２０kDa」をナノ粒子懸濁液に加えて、金ナノ粒子表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ｐＨを７〜７．２に調節し、ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌した。
【０１４８】
ナノ粒子懸濁液を水中で希釈し（最終濃度：［Ａｕ］＝０．１g/L）、６３３nmで発光するレーザーによる、１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）による動的光散乱（ＤＬＳ）により、室温（約２５℃）で、流体力学的直径（強度の尺度）を決定した。このようにして得られた生体適合性金ナノ粒子の懸濁液中での流体力学的直径は、１１８nmに等しく、多分散性指数（サイズについてのナノ粒子の集団の分散）は、０．１３であることが見出された。
【０１４９】
ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈し（最終濃度：［Ａｕ］＝０．１g/L）、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより、ゼータ電位を決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−１mVに等しいことが見出された。
【０１５０】
実施例２．導体材料により調製されたナノ粒子：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた金ナノ粒子の合成
金ナノ粒子を実施例１に記載されたように調製した（同じ金無機コア）。
【０１５１】
ＰＥＳメンブレンフィルターでの０．２２μmろ過を行い、懸濁液中での金濃度を５３０nmでのＵＶ−可視分光分析アッセイにより決定した。
【０１５２】
生体適合性表面コーティングを、メソ−２、３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を使用して行った。十分な量のＤＭＳＡをナノ粒子懸濁液に加えて、表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ｐＨを７〜７．２に調節し、ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌した。
【０１５３】
ナノ粒子懸濁液を水中で希釈し（最終濃度：［Ａｕ］＝０．１g/L）、６３３nmで発光するレーザーによる、１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）による動的光散乱（ＤＬＳ）により、室温（約２５℃）で、流体力学的直径（強度の尺度）を決定した。このようにして得られたナノ粒子の懸濁液中での流体力学的直径は、７６nmに等しく、多分散性指数（サイズについてのナノ粒子の集団の分散）は、０．４６であった。
【０１５４】
ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈し（最終濃度：［Ａｕ］＝０．１g/L）、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより、ゼータ電位を決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−２３mVに等しいことが見出された。
【０１５５】
実施例３．１００以下の低い比誘電率を有する絶縁体材料により調製されたナノ粒子：中性表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた酸化ジルコニウムナノ粒子の合成
酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）ナノ粒子を、塩基性ｐＨにおいて、塩化ジルコニウム（ＺｒＣｌ４）を水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＯＨ）を用いて沈殿させることにより合成した。得られた懸濁液をオートクレーブに移し、１１０℃超の温度で加熱した。冷却後、懸濁液を脱イオン水で洗浄し、酸性にした。
【０１５６】
集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値、並びにナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアのサイズを、透過型電子顕微鏡法を使用して評価し、それぞれ１０nm及び８nm〜１２nmに等しいことが見出された。４４６個のナノ粒子を計数し、それらの最大寸法を測定した。
【０１５７】
ＰＥＳメンブレンフィルター上での０．２２μmろ過を行い、（ＺｒＯ２）ナノ粒子濃度を、水溶液を粉末に乾燥させ、かつ、得られたままの質量を秤量することにより測定した。生体適合性コーティングを、シラン−ポリ（エチレン）グリコール  ２kDa（「Ｓｉ−ＰＥＧ  ２kDa」）を使用して調製した。十分な量の「Ｓｉ−ＰＥＧ  ２kDa」をナノ粒子懸濁液に加えて、表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌し、続けて、ｐＨを７に調節した。
【０１５８】
ナノ粒子懸濁液を水中で希釈し（ナノ粒子のコアを構成するＺｒＯ２の最終濃度：［ＺｒＯ２］＝０．１g/L）、６３３nmで発光するレーザーによる、１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）による動的光散乱（ＤＬＳ）により、室温（約２５℃）で、流体力学的直径（強度の尺度）を決定した。ナノ粒子の流体力学的直径は５５nmに等しく、多分散性指数（サイズについてのナノ粒子の集団の分散）は、０．１であることが見出された。
【０１５９】
ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈し（最終濃度：［ＺｒＯ２］＝０．１g/L）、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより、ゼータ電位を決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−１mVに等しいことが見出された。
【０１６０】
実施例４．１００以下の低い比誘電率を有する絶縁体材料により調製されたナノ粒子：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた酸化ジルコニウムナノ粒子の合成
酸化ジルコニウムナノ粒子を実施例３に記載されたように調製した（同じ無機コア）。
【０１６１】
ＰＥＳメンブレンフィルター上での０．２２μmろ過を行い、（ＺｒＯ２）ナノ粒子濃度を、水性懸濁液を粉末に乾燥させ、かつ、得られたままの質量を秤量することにより測定した。
【０１６２】
表面官能化を、ヘキサメタリン酸ナトリウムを使用して行った。十分な量のヘキサメタリン酸ナトリウムをナノ粒子懸濁液に加えて、表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌し、続けて、ｐＨを７に調節した。
【０１６３】
ナノ粒子懸濁液を水中で希釈し（ナノ粒子のコアを構成するＺｒＯ２の最終濃度：［ＺｒＯ２］＝０．１g/L）、６３３nmで発光するレーザーによる、１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）による動的光散乱（ＤＬＳ）により、室温（約２５℃）で、流体力学的直径（強度の尺度）を決定した。ナノ粒子の流体力学的直径は７０nmに等しく、多分散性指数（サイズについてのナノ粒子の集団の分散）は、０．１１であることが見出された。
【０１６４】
ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈し（最終濃度：［ＺｒＯ２］＝０．１g/L）、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより、ゼータ電位を決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−３３mVに等しいことが見出された。
【０１６５】
実施例５．半導体材料により調製されたナノ粒子：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされたケイ素（Ｓｉ）ナノ粒子
【０１６６】
ケイ素（Ｓｉ）ナノ粒子（粉末）をUS Research Nanomaterials Inc.から入手した。それらをＰＶＰ（１重量％）によりコーティングし、これは表面上に０．１分子/nm2未満を表わす。
【０１６７】
それらを（プローブによる）超音波処理下、３０g/Lで水中に分散させた。
【０１６８】
ＰＥＳメンブレンフィルター上での０．２２μmろ過を行い、（Ｓｉ）ナノ粒子濃度を、懸濁液を粉末に乾燥させ、かつ、得られたままの質量を秤量することにより測定した。
【０１６９】
ナノ粒子懸濁液を水中で希釈し（ナノ粒子のコアを構成するＳｉの最終濃度：［Ｓｉ］＝０．１g/L）、６３３nmで発光するレーザーによる、１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）による動的光散乱（ＤＬＳ）により、室温（約２５℃）で、流体力学的直径（強度の尺度）を決定した。ナノ粒子の流体力学的直径は、１６４nmに等しく、多分散性指数（サイズについてのナノ粒子の集団の分散）は、０．１６であることが見出された。
【０１７０】
集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値、並びにナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアのサイズを、透過型電子顕微鏡法を使用して評価し、それぞれ５３nm及び４５nm〜６１nmに等しいことが見出された。７１個のナノ粒子を計数し、それらの最大寸法を測定した。
【０１７１】
ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈し（最終濃度：［Ｓｉ］＝０．１g/L）、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより、ゼータ電位を決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−１９mVに等しいことが見出された。
【０１７２】
実施例６．２００以上の高い比誘電率を有する絶縁体材料により調製されたナノ粒子：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされたチタン酸バリウムナノ粒子
チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）ナノ粒子の懸濁液（水中の２０重量％）をUS Reseach Materials Inc.（US3835）から入手した。
【０１７３】
表面官能化を、シラン−ポリ（エチレン）グリコール  １０kDa（「Ｓｉ−ＰＥＧ  １０kDa」）を使用して行った。簡潔には、「Ｓｉ−ＰＥＧ  １０kDa」をエタノール／水溶液（１／３v/v）に、まず溶解させ、ＢａＴｉＯ３懸濁液（水中の２０重量％）に加え、ナノ粒子の表面上に完全な単層被覆を達成した。この懸濁液を超音波処理し、続けて、一晩撹拌した。０．２２μmろ過（フィルターメンブレン：ポリ（エーテルスルホン））後、未反応の「Ｓｉ−ＰＥＧ  １０kDa」ポリマーを除去するために、洗浄工程を行った。
【０１７４】
ナノ粒子懸濁液を水中で希釈し（ナノ粒子のコアを構成するＢａＴｉＯ３の最終濃度：［ＢａＴｉＯ３］＝０．１g/L）、６３３nmで発光するレーザーによる、１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）による動的光散乱（ＤＬＳ）により、室温（約２５℃）で、流体力学的直径（強度の尺度）を決定した。ナノ粒子の流体力学的直径は１６４nmに等しく、多分散性指数（サイズについてのナノ粒子の集団の分散）は、０．１６であることが見出された。
【０１７５】
ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈し（最終濃度：［ＢａＴｉＯ３］＝０．１g/L）、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより、ゼータ電位を決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−１１mVであることが見出された。
【０１７６】
集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値、並びにナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアのサイズを、透過型電子顕微鏡法を使用して評価し、それぞれ６７nm及び６０〜７７nmに等しいことが見出された。５１個のナノ粒子を計数し、それらの最大寸法を測定した。
【０１７７】
実施例７．表現型ＭＥＡスクリーニング技術を使用する、ＭＰＰ＋誘発ニューロンネットワークにおける、実施例１、２、５及び６からのナノ粒子の予防／救済効力の評価
４８ウェルＭＥＡ上で３週間培養した、ＭＰＰ＋処理マウスの腹側中脳／皮質共培養物上で、本発明のナノ粒子の予防／救済効力を試験した。このモデルは、ＭＥＡ上で増殖している障害を有する中脳／皮質培養物を使用したドーパミン作動性ニューロンの機能的救済に基づいて、化合物をスクリーニングするための管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）パーキンソンモデルを表わす。中脳は、黒質を含む脳領域であり、黒質は基底核の一部であり、ドーパミン作動性ニューロンの大部分を含む。ナノ粒子の予防／救済効果の評価を、微小電極アレイ（ＭＥＡ）チップ上に播種されたニューロンの共培養物の細胞外電気活動の測定により行った。
【０１７８】
マウスニューロンにおけるパーキンソン表現型の管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）誘発を１−メチル−４−フェニルピリジニウムヨウ化物（ＭＰＰ＋）を用いて行った。ミトコンドリア障害がパーキンソン病（ＰＤ）の病因において役割を果たすという強力な証拠が存在する。ＭＰＰ＋は、電子伝達酵素複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ）の遮断を介して細胞呼吸を阻害するミトコンドリア毒であることが見出された。ＰＤ患者の死後組織の黒質中のミトコンドリア電子伝達鎖の複合体Ｉに選択的欠損が存在し、初期ＰＤ患者の血小板にも複合体Ｉ活性が低下していることが、幾つかの研究室から報告されている。薬剤、例えば、グリア細胞系神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は神経保護剤として作用し、ＭＰＰ＋の効果を予防し／救済する良好な前臨床結果を得ている。ＧＤＮＦは、多くの場合、実験的な前臨床プロトコールにおいて参照として使用されている（Peng J. et al., Journal of Biomolecular screening, 2013, 18(5), 522-533: Using human pluripotent stem cell-derived dopaminergic neurons to evaluate candidate Parkinson’s disease therapeutic agents in MPP+ and rotenone models.）。
【０１７９】
材料及び方法
初代細胞培養、処理条件
中脳及び前頭皮質組織を、胎生期１４．５日目のｃｈｒ：ＮＭＲＩマウス（Charles River）から採取した。マウスを頸椎脱臼により殺処分した。組織を酵素消化（１３３，３ Kunitz単位/ml ＤＮａｓｅ；１０単位/ml パパイン）及び機械的粉砕により解離し、計数し、生命力を制御し;ラミニン（１０μg/ml）、１０％ ウシ胎児血清及び１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭの２０μl滴中において、ＭＥＡ上に播種した。ＭＥＡ上での培養物を使用の準備ができるまで、１０％ ＣＯ２雰囲気中、３７℃でインキュベーションした。１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭを培養培地に週２回補充した。
【０１８０】
「ナノ粒子」群において、ウェルを７日目に、実施例１（［Ａｕ］＝８００μM）、２（［Ａｕ］＝８００μM）、５（［Ｓｉ］＝８００μM）からのナノ粒子懸濁液及び実施例６（［ＢａＴｉＯ３］＝２０００μM）からのナノ粒子懸濁液、続けて８日目に、２０μM ＭＰＰ＋で処理した。「対照」群では、７日目に、水をウェルに加え、続けて、８日目に水を加えた。「ＭＰＰ＋」群では、７日目に、水をウェルに加え、続けて、８日目に２０μM ＭＰＰ＋を加えた。「参照」群では、７日目に、ＧＤＮＦ（２０ng/ml）をウェルに加え、続けて、８日目に２０μM ＭＰＰ＋を加えた。
【０１８１】
ＭＰＰ＋（又は「対照」群については水）添加の２４時間後に、培地を交換して、ＭＰＰ＋の洗い落しを達成した。その後、培地を週２回交換した。ＧＤＮＦを各培地交換において、「参照」群のみに加えた。
【０１８２】
２１日目に、１２０分のニューロン活動を記録し、３０分の安定活動を分析した（図６）。
【０１８３】
微小電極アレイ・ニューロチップ
４８ウェルの微小電極アレイ・ニューロチップをAxion Biosystems Inc.から購入した。これらのチップは、ウェルあたりに１６個の受動電極を有する。表面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ホウ酸バッファー中の５０％）により１時間コーティングし、洗浄し、風乾した。
【０１８４】
多重チャンネル記録、及び多重パラメータ・データ分析
記録には、Axion Biosystems（USA）による多重チャンネルMAESTRO記録システムを使用した。細胞外記録には、４８ウェルのＭＥＡをMAESTRO記録ステーションに入れ、３７℃に維持した。ＤＭＥＭ／１０％ 熱不活化ウマ血清中で記録を行った。１０％ ＣＯ２を含むろ過され、加湿された気流の継続的な流れにより、ｐＨを７．４に維持した。
【０１８５】
各単位は、１つの電極で記録された１つのニューロンから生じる活動を表わす。記録の開始時に単位を分離する。各単位について、活動電位（すなわち、スパイク）をスパイク列として記録した。同スパイク列は、いわゆる「バースト」と呼ばれる状態の群である。バーストを、プログラムSpike WrangLer及びNPWaveX（両方ともNeuroProof GmbH, Rostock, Germany製）を使用する直接スパイク列分析により定量的に記述した。バーストを、短いスパイク事象の開始及び終了により定義した（図７）。
【０１８６】
ネットワーク活動パターンの多重パラメーター・ハイコンテンツ分析により、２０４の活動記述スパイク列パラメータを抽出した。これらのパラメータにより、以下の４つのカテゴリー：全体的活動、バースト構造、振動挙動及び同期性における活動変化の正確な記述を得ることが可能となる。
−「全体的活動パラメータ」の変化は、活動電位放電速度（スパイク速度）、バースト速度及びバースト間の時間としてのバースト周期についての効果を記述する。
−「バースト構造パラメータ」は、高周波スパイク期（「バースト」）内のスパイクの内部構造、例えば、バースト内のスパイク頻度、バースト内のスパイク速度及びバーストスパイク密度だけでなく、バーストの全体構造、例えば、持続時間、面積及び安定期も定義する。
−「振動パラメータ」は、バーストの発生又は構造の規則性を定量化し、この規則性は、実験事例内のパラメータ（全体的活動、バースト構造）の変動性を記述する主要な活動パラメータの変動係数により計算される（Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays）。より高い値は、より規則的でないバースト構造又はより規則的でない全体的活動（例えば、スパイク、バースト）を示す。
−スパイク列における同期性の尺度として、「ＣＶｎｅｔパラメータ」は、ネットワーク内のニューロン間の「同期化」を反映する（Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays）。ＣＶｎｅｔは、ネットワーク全体ににわたる変動係数である。大きなＣＶｎｅｔ値は、ネットワーク全域にわたる活動の広範囲の変動を意味し、より少ない同期化を意味する（Gramowski A. et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation）。
【０１８７】
ＭＰＰ＋により、ニューロンネットワーク上に誘発される機能的効果及び本発明のナノ粒子の予防／救済効力を、上記パラメータを介して評価した（また、それらのいくつかについては、以下の表２に要約する）。
【０１８８】
【表２】
2021506873.tif 000003
【０１８９】
２１日目における自発的自然活動に関連する値を、３０分間の活動安定化後、３０分の時間範囲から得られた６０秒の区分データから得た。結果（パラメータ値）を独立したネットワークの平均±ＳＥＭとして表わした。各「ナノ粒子」群については、少なくとも８個のアクティブウェル、「対照」群については、少なくとも３０個のアクティブウェル、「ＭＰＰ＋」群については、少なくとも２６個のアクティブウェル（「アクティブ」は、電気活動を測定するのに十分な数の電極を有するウェルを意味する）を分析に含めた。絶対パラメータ分布の正常性について試験し、群間の統計的有意差を一方向ＡＮＯＶＡにより評価した。
【０１９０】
図８及び９に、下記カテゴリー：全体的活動、振動挙動及び同期性からの幾つかの代表的なパラメータを示す。これらのパラメータにより、ＭＰＰ＋誘発機能的効果及び本発明のナノ粒子又はＧＤＮＦの予防／救済効力（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を予防し／救済する能力）が特徴付けられる。
【０１９１】
化合物の効果を評価するために、２０４のパラメータの選択である多重パラメーターの結果を「効果スコア」と呼ばれる単一パラメータに表現した。これは、選択された特徴の線形結合であり、データセットを「０」の平均値の「対照」群と、「１」の平均値の「ＭＰＰ＋」群とを有するベクトルに変換する。効果スコアのＺ因子の計算は、２０４のパラメータのうち１８の特徴の選択により行われ、「対照」群と「ＭＰＰ＋」群との間の最良の区別を見出すように最適化された（Kuemmel A, et al. J Biomol Screen., 2010, 15(1), 95-101: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment）。
【０１９２】
効果スコア分析を図１０に示す。
【０１９３】
本発明のナノ粒子の予防／救済効力を表３に示す。
【０１９４】
【表３】
2021506873.tif 000004
【０１９５】
図８、９及び１０並びに表３に、本発明のナノ粒子によるニューロンネットワークの前処理により、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果が予防され／救済されることを示す。興味深いことに、予防／救済効力は、振動挙動及び同期性に関連するカテゴリーのパラメータについて観察され、「対照」群で観察されるレベルまで達することができる。これらの振動挙動及び同期化パラメータを、典型的には、変更されたネットワーク発達の尺度としてモニタリングする。これらのパラメータにより、本発明のナノ粒子の存在下で救済することができるので有利である。
【０１９６】
これらの結果は、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果を予防し／救済する、本願に記載されたナノ粒子の有利な性能を際立たせている。
【０１９７】
実施例８：表現型ＭＥＡスクリーニング技術を使用する、初代マウスニューロンネットワークにおけるアミロイドベータ１−４２誘発機能的効果における実施例１、２、３、４、５及び６からのナノ粒子の効果の評価
本発明のナノ粒子の救済効力を、マウスニューロンの前頭皮質培養物におけるアルツハイマー病のアミロイドベータ１−４２（Ａベータ１−４２）誘導モデルにおいて、ＭＥＡを介して管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で試験した。
【０１９８】
アルツハイマー病（ＡＤ）患者にみられる神経斑の主要構成成分であるβ−アミロイドペプチド１−４２は、大グリア細胞グルタメート・トランスポーターを阻害することにより、シナプス間隙中に過剰量のグルタメートを誘発し、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）レセプター活性の向上を介して、細胞内Ｃａ２＋レベルを上昇させることが公知である。興奮毒性を引き起こす他の機序は、酸化ストレスの誘引、及びグルタミン酸作動性ＮＭＤＡレセプターに対するａベータの直接的な影響を含むことができる。正確な基礎的病因過程が何であれ、グルタメート及び細胞内カルシウム蓄積による神経細胞の過剰刺激により、最終的にニューロンのアポトーシスが引き起こされ、シナプス可塑性が破壊され、このような調節異常の結果、学習及び記憶機能が著しく損なわれるであろう（Nyakas C. et al., Behavioural Brain Research, 2011, 221, 594-603: The basal forebrain cholinergic system in aging and dementia. Rescuing cholinergic neurons from neurotoxic amyloid-β42 with memantine.）。現在、ＦＤＡ承認の抗ＡＤ剤は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤及びＮＭＤＡレセプターアンタゴニストに限られている。伝統的なＡＣｈＥ阻害剤は、主にＡＣｈＥの中枢作用部位に作用するドネペジルを含む。
【０１９９】
材料及び方法
初代細胞培養
前頭皮質組織を胎生期１５／１６日目のｃｈｒ：ＮＭＲＩマウス（Charles River）から採取した。マウスを頸椎脱臼により殺処分した。組織を酵素消化（１３３，３Kunitz単位/ml ＤＮａｓｅ；１０単位/ml パパイン）及び機械的粉砕により解離し、計数し、生命力を制御し、ラミニン（１０μg/ml）、１０％ ウシ胎児血清及び１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭの２０μl滴中において、ＭＥＡ上に播種した。ＭＥＡ上での培養物を、使用の準備ができるまで、１０％ ＣＯ２雰囲気中、３７℃でインキュベーションした。１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭを培養培地に週２回補充した。発育中の共培養物を、播種後５日目に有糸分裂阻害剤である５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（２５μM）及びウリジン（６３μM）により処理して、更なるグリア細胞増殖を防止した。
【０２００】
アルツハイマー関連機能表現型を誘発するために、合成ＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）処理Ａベータ１−４２ペプチド（ＨＦＩＰ処理によりアミロイドベータのモノマーが生成される）を亜毒性用量（１００nM）で使用した。
【０２０１】
「ナノ粒子」群において、まず、ウェルをＡベータ１−４２（合成ＨＦＩＰ処理アミロイド−ベータ１−４２ペプチド）により、Ｔ０時（Ｔ０は、２８日間の管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）培養期間の最後である）に処理した。ついで、独立及び平行実験において、ウェルを実施例１（［Ａｕ］＝８００μM）、２（［Ａｕ］＝８００μM）、３（［ＺｒＯ２］＝８００μM）、４（［ＺｒＯ２］＝８００μM）、５（［Ｓｉ］＝８００μM）及び実施例６（［ＢａＴｉＯ３］＝２０００μM）からのナノ粒子懸濁液で、Ｔ０＋４時間時に処理した。「対照」群では、Ｔ０、ついで、Ｔ０＋４時間時に、水をウェルに加えた。「Ａベータ」群では、Ａベータ１−４２をウェルにＴ０時に加え、ついで、水をウェルにＴ０＋４時間時に添加した。「参照」群では、Ａベータ１−４２をウェルにＴ０時に加え、ドネペジル（３００nM）をウェルにＴ０＋４時間時に添加した。
【０２０２】
ニューロン活動を下記のように記録した（参照．図１１）。
−Ｔ０時、Ａベータ１−４２（又は「対照」群における水）の添加前。
−Ｔ０＋１ｈ時、Ｔ０＋２ｈ時、Ｔ０＋３ｈ時、Ｔ０＋４ｈ時（＜＜ナノ粒子＞＞群ではナノ粒子添加前；「参照」群ではドネペジル添加前；対照群では「水」添加前）、Ｔ０＋５ｈ時及びＴ０＋６ｈ時。
【０２０３】
３０分の活動安定後、３０分の時間範囲から採られた６０秒の区分データから値を得た。
【０２０４】
微小電極アレイ・ニューロチップ
４８ウェルの微小電極アレイ・ニューロチップをAxion Biosystems Inc.から購入した。これらのチップは、ウェルあたりに１６個の受動電極を有する。表面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ホウ酸緩衝液中の５０％）により１時間コーティングし、洗浄し、風乾した。
【０２０５】
多重チャンネル記録及び多重パラメーター・データ分析
記録には、Axion Biosystems（USA）からの多重チャンネルMAESTRO記録システムを使用した。細胞外記録のために、４８ウェルのＭＥＡをMAESTRO記録ステーションに入れ、３７℃に維持した。ＤＭＥＭ／１０％ 熱不活化ウマ血清中で記録を行った。１０％ ＣＯ２を含むろ過され、加湿された気流の継続的な流れにより、ｐＨを７．４に維持した。活動電位又は「スパイク」をスパイク列で記録した。同スパイク列は、いわゆる「バースト」と呼ばれる状態の群である。プログラムSpike WrangLer及びNPWaveX（両方ともNeuroProof GmbH, Rostock, Germany）を使用する直接スパイク列分析により、バーストを定量的に記述した。バーストは、短いスパイク事象の開始及び終了により定義した。
【０２０６】
ネットワーク活動パターンの多重パラメーター・ハイコンテンツ分析により、２０４の活動記述スパイク列パラメータを抽出した。これらのパラメータにより、以下の４つのカテゴリー：全体的活動、バースト構造、振動挙動及び同期性における、活動変化の正確な記述を得ることが可能となる。
【０２０７】
ニューロンネットワークにおけるアミロイドベータ１−４２の機能的効果及び本発明のナノ粒子によるニューロンネットワークの機能的効果の救済効力を、上記パラメータを通して評価した（また、それらの幾つかについては、以下の表４に要約する）。
【０２０８】
【表４】
2021506873.tif 000005
【０２０９】
３０分間の活動安定化後、３０分の時間範囲から得られた６０秒の区分データから、自発的な自然活動に関連する値を得た。結果（パラメータ値）を、独立したネットワークの平均±ＳＥＭとして表わした。各「ナノ粒子」群については、少なくとも９個のアクティブウェル、「対照」群については、少なくとも１８個のアクティブウェル、「Ａベータ」群については、少なくとも１８個のアクティブウェル（「アクティブ」は、電気活動を測定するのに十分な数の電極を有するウェルを意味する）を分析に含めた。絶対パラメータ分布の正常性について試験し、群間の統計的有意差を一方向ＡＮＯＶＡにより評価した。
【０２１０】
図１２に、下記カテゴリー：全体的活動、バースト構造、振動挙動及び同期性からの幾つかの代表的なパラメータを示す。これらのパラメータにより、本発明のナノ粒子又はドネペジルにより可能となるＡベータ１−４２機能的効果及び救済効力（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を救済する能力）が特徴付けられる。
【０２１１】
化合物効果を評価するために、２０４のパラメータを選択する多重パラメーター結果を「効果スコア」と呼ばれる単一パラメータに表現した。これは、選択された特徴の線形結合であり、データセットを、「０」の平均値の「対照」群と、「１」の平均値の「Ａベータ」群とを有するベクトルに変換する。効果スコアのＺ因子の計算は、２０４のパラメータから１５の特徴を選択することにより行われ、「対照」群と「Ａベータ」群との間の最良の区別を見出すように最適化されたし、（Kuemmel A, et al. J Biomol Screen., 2010, 15(1), 95-10: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment）。
【０２１２】
効果スコア分析を図１３に示す。
【０２１３】
本発明のナノ粒子の救済効力を表５に示す。
【０２１４】
【表５】
2021506873.tif 000006
【０２１５】
図１２及び１３並びに表５に、本発明のナノ粒子によるニューロンネットワークの処理により、ニューロンネットワークのＡベータ１−４２誘発機能的効果が救済されることを示す。救助効力は、振動挙動及び同期性に関連するカテゴリーのパラメータについて観察され、「対照」群で観察されるレベルまで有利に達することができる。これらの振動挙動及び同期化パラメータは、古典的には、変更されたネットワーク発達を検出するのに評価される。振動挙動及び同期化は、本発明のナノ粒子の存在下で救済することができる。
【０２１６】
これらの結果は、ニューロンネットワークにおけるＡベータ１−４２誘発機能的効果を救済する際の、本願に記載されたナノ粒子の有利な性能を際立たせている。
【０２１７】
実施例９：中性表面電荷を有する異なるサイズの金ナノ粒子の合成及び物理化学的特性決定
水溶液中でのクエン酸ナトリウムによる塩化金の還元により、金ナノ粒子を得る。プロトコールは、G. Frens Nature Physical Science 241(1973)21から適合させた。
【０２１８】
典型的な実験では、ＨＡｕＣｌ４溶液を加熱して沸騰させる。続けて、クエン酸ナトリウム溶液を加える。得られた懸濁液を沸騰下にさらに５分間維持する。
【０２１９】
ナノ粒子サイズは、クエン酸塩と金前駆体との比を注意深く変更することにより、約１５nm〜約１１０nmで調整する（参照．表６）。
【０２２０】
ついで、調製したままの金ナノ粒子懸濁液を、適切な分子量排除（ＭＷＣＯ）機能を有するセルロースメンブレンを備えた限外ろ過装置（Millipore製のAmicon撹拌セルモデル８４００）を使用して濃縮し、層流フード下で、０．２２μｍ排除メンブレンフィルター（Millipore製のＰＥＳメンブレン）を通してろ過する。
【０２２１】
表面コーティングを、α−メトキシ−ω−メルカプトポリ（エチレングリコール）２０kDa（「チオール−ＰＥＧ  ２０kDa」）を使用して行う。十分な量の「チオール−ＰＥＧ  ２０kDa」をナノ粒子懸濁液に加えて、金ナノ粒子表面上の単層被覆を得る。ｐＨを６．８〜７．４に調節し、ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌する。過剰のチオール−ＰＥＧ  ２０kDaを、適切なＭＷＣＯメンブレンを有する限外ろ過遠心分離フィルター（Sartorius製のVivaspin又はMerck Millipore製のAmicon Ultra）を使用して、層流フード下で除去し、最終懸濁液を４℃で保存する。
【０２２２】
透過型電子顕微鏡を使用して、少なくとも２００個のナノ粒子を計数し、サイズ測定のために最大のナノ粒子寸法をとることにより、粒径を測定する。集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアの最大サイズ中央値、並びにナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアサイズを、表６に報告する。誘導結合発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）により測定された金（［Ａｕ］）の濃度、及びナノ粒子の懸濁液を１mM ＮａＣｌ溶液中で、金濃度（［Ａｕ］）０．０１〜０．０５g/L及びｐＨ約７に希釈してナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより決定されたゼータ電位も共に、表６に報告する。
【０２２３】
【表６】
2021506873.tif 000007
【０２２４】
図１４に、表６に記載された金ナノ粒子の代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。
【０２２５】
実施例１０．表現型ＭＥＡスクリーニング技術を使用した、ＭＰＰ＋誘発ニューロンネットワークに対する、実施例９からのナノ粒子金−１５及び金−４５の予防／救済効力の評価
本発明のナノ粒子の予防／救済効力を、４８ウェルＭＥＡで３週間培養されたＭＰＰ＋処理マウス腹側中脳／皮質共培養物で試験した。ナノ粒子の予防／救助効果の評価を、微小電極アレイ（ＭＥＡ）チップ上に播種されたニューロンの共培養物の細胞外電気活動の測定により行った。
【０２２６】
マウスニューロンにおけるパーキンソン表現型の管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）誘発を、１−メチル−４−フェニルピリジニウムヨウ化物（ＭＰＰ＋）により行った。
【０２２７】
材料及び方法
初代細胞培養、処理条件
中脳及び前頭皮質組織を胎生期１４．５日目のｃｈｒ：ＮＭＲＩマウス（Charles River）から採取した。マウスを頸椎脱臼により殺処分した。組織を酵素消化（１３３，３Kunitz単位/ml ＤＮａｓｅ；１０単位/ml パパイン）及び機械的粉砕により解離し、計数し、生命力を制御し、ラミニン（１０μg/ml）、１０％ ウシ胎児血清及び１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭの２０μl滴中において、ＭＥＡ上に播種した。使用の準備ができるまで、１０％ ＣＯ２雰囲気中、３７℃で、ＭＥＡ上での培養物をインキュベーションした。１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭを、培養培地に週２回補充した。
【０２２８】
「ナノ粒子」群において、ウェルを７日目に、実施例９（金−１５及び金−４５）からのナノ粒子懸濁液（［Ａｕ］＝３１０＋／−４０μM）、続けて８日目に、２０μM ＭＰＰ＋で処理した。「対照」群では、７日目に、水をウェルに加え、続けて、８日目に水を加えた。「ＭＰＰ＋」群では、７日目に、水をウェルに加え、続けて、８日目に２０μM ＭＰＰ＋を加えた。
【０２２９】
ＭＰＰ＋（又は「対照」群については水）添加の２４時間後に、培地を交換して、ＭＰＰ＋の洗い落としを達成した。その後、培地を週２回交換した。
【０２３０】
２１日目に、１２０分のニューロン活動を記録し、３０分の安定活動を分析した。
【０２３１】
微小電極アレイ・ニューロチップ
４８ウェルの微小電極アレイ・ニューロチップをAxion Biosystems Inc.から購入した。これらのチップは、ウェルあたりに１６個の受動電極を有する。表面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ホウ酸緩衝液中の５０％）により１時間コーティングし、洗浄し、風乾した。
【０２３２】
多重チャンネル記録及び多重パラメーター・データ分析
記録には、Axion Biosystems（USA）製の多重チャンネル記録システムを使用した。細胞外記録には、４８ウェルのＭＥＡをMAESTRO記録ステーションに入れ、３７℃に維持した。記録をＤＭＥＭ／１０％ 熱不活化ウマ血清中で行った。１０％ ＣＯ２を含むろ過され、加湿された気流の継続的な流れにより、ｐＨを７．４に維持した。
【０２３３】
各単位は、１つの電極で記録された１つのニューロンから生じる活動を表わす。単位を記録の開始時に分離する。各単位について、活動電位（すなわち、スパイク）をスパイク列として記録した。同スパイク列は、いわゆる「バースト」と呼ばれる状態の群である。プログラムSpike Wrangler及びNPWaveX（両方ともNeuroProof GmbH, Rostock, Germany）を使用する直接スパイク列分析により、バーストを定量的に記述した。バーストを短いスパイク事象の開始及び終了により定義した。
【０２３４】
ネットワーク活動パターンの多重パラメーター・ハイコンテンツ分析により、２０４の活動記述スパイク列パラメータを抽出した。これらのパラメータにより、以下の４つのカテゴリー：全体的活動、バースト構造、振動挙動及び同期性、における活動変化の正確な記述を得ることが可能となる。
【０２３５】
ニューロンネットワークにＭＰＰ＋により誘発される機能的効果、及び本発明のナノ粒子の予防／救済効力を、上記パラメータを通して評価した
【０２３６】
２１日目に、自発的な自然活動に関連する値を活動安定化３０分後の３０分の時間範囲から得られた６０秒区分のデータから得た。結果（パラメータ値）を、独立したネットワークの平均±ＳＥＭとして表わした。各「ナノ粒子」群、「対照」群及び「ＭＰＰ＋」群については、少なくとも１９個のアクティブウェル（「アクティブ」は、電気活動を測定するのに十分な数の電極を有するウェルを意味する）を分析に含めた。絶対パラメータ分布の正常性について試験し、群間の統計的有意差を一方向ＡＮＯＶＡにより評価した。
【０２３７】
化合物効果を評価するために、２０４のパラメータを選択する多重パラメーター結果を「効果スコア」と呼ばれる単一パラメータに表現した。これは、選択された特徴の線形結合であり、データセットを、「０」の平均値の「対照」群と、「１」の平均値の「ＭＰＰ＋」群とを有するベクトルに変換する。効果スコアのＺ因子の計算は、測定された２０４のパラメータから２０の特徴を選択することによって行い、「対照」群と「ＭＰＰ＋」群との間の最良の区別を見出すように最適化された（Kuemmel A, et al. J Biomol Screen., 2010, 15(1), 95-101: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment）。
【０２３８】
効果スコア分析を図１５に示す。
【０２３９】
本発明のナノ粒子の予防／救済効力を表７に示す。
【０２４０】
【表７】
2021506873.tif 000008
【０２４１】
図１５及び表７に、本発明のナノ粒子によるニューロンネットワークの前処理により、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果が予防され／救済されることを示す。興味深いことに、１５nmに等しい集団のナノ粒子のコアの最大サイズ中央値を有する金ナノ粒子は、４５nmに等しい集団のナノ粒子のコアの最大サイズ中央値を有する金ナノ粒子より、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果を予防し／救済する際の効率が低い。
【０２４２】
これらの結果から、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果を予防し／救済する際の、両金ナノ粒子の能力が際立っている。ここで、４５nmの最大サイズ中央値を有する金ナノ粒子は、１５nmの最大サイズ中央値を有する金ナノ粒子より効率的である。
【０２４３】
実施例１１．導体材料により調製されたナノ粒子の合成：負の表面電荷を有するポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ナノ粒子（ＰＥＤＯＴナノ粒子）
水中のポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ナノ粒子（ＰＥＤＯＴナノ粒子）分散液（１．１重量％）をSigma（Sigma675288）から入手し、そのまま使用した。
【０２４４】
ゼータ電位を、ｐＨ７．３において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈し（最終ＰＥＤＯＴ濃度：１g/L）、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより決定した。ｐＨ７．３でのゼータ電位は、−５３mVに等しいことが見出された。
【０２４５】
集団のナノ粒子又はナノ粒子凝集体の最大寸法中央値、並びにナノ粒子及びナノ粒子凝集体の集団の３０％〜７０％を表わすナノ粒子又はナノ粒子凝集体のコアのサイズを、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して評価し、それぞれ４０８nm及び３１１nm〜５１８nmに等しかった（５６個のナノ粒子を計数し、それらの最大寸法を測定した）。
【０２４６】
実施例１２．表現型ＭＥＡスクリーニング技術を使用する、ＭＰＰ＋誘発ニューロンネットワークにおける、実施例１１からのＰＥＤＯＴナノ粒子の予防／救済効力の評価
本発明のナノ粒子の予防／救済効力を、４８ウェルＭＥＡ上で３週間培養した、ＭＰＰ＋処理マウスの腹側中脳／皮質共培養物で試験した。ナノ粒子の予防／救済効果の評価を、微小電極アレイ（ＭＥＡ）チップ上に播種されたニューロンの共培養物の細胞外電気活動の測定により行った。
【０２４７】
マウスニューロンにおけるパーキンソン表現型の管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）誘発を１−メチル−４−フェニルピリジニウムヨウ化物（ＭＰＰ＋）により行った。
【０２４８】
材料及び方法
初代細胞培養、処理条件
中脳及び前頭皮質組織を胎生期１４．５日目のｃｈｒ：ＮＭＲＩマウス（Charles River）から採取した。マウスを頸椎脱臼により殺処分した。組織を酵素消化（１３３，３Kunitz単位/ml ＤＮａｓｅ；１０単位/ml パパイン）及び機械的粉砕により解離し、計数し、生命力を制御し、ラミニン（１０μg/ml）、１０％ ウシ胎児血清及び１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭの２０μl滴中において、ＭＥＡ上に播種した。ＭＥＡ上での培養物を使用の準備ができるまで、１０％ ＣＯ２雰囲気中、３７℃でインキュベーションした。１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭを培養培地に週２回補充した。
【０２４９】
「ナノ粒子」群において、ウェルを７日目に、実施例１１からのナノ粒子懸濁液（［ＰＥＤＯＴ］＝５００μM）、続けて８日目に、２０μM ＭＰＰ＋で処理した。「対照」群では、７日目に、水をウェルに加え、続けて、８日目に水を加えた。「ＭＰＰ＋」群では、７日目に、水をウェルに加え、続けて、８日目に２０μM ＭＰＰ＋を加えた。
【０２５０】
ＭＰＰ＋（又は「対照」群については水）添加の２４時間後に、培地を交換して、ＭＰＰ＋の洗い落としを達成した。その後、培地を週２回交換した。
【０２５１】
２１日目に、１２０分のニューロン活動を記録し、３０分の安定活動を分析した。
【０２５２】
微小電極アレイ・ニューロチップ
４８ウェルの微小電極アレイ・ニューロチップをAxion Biosystems Inc.から購入した。これらのチップは、ウェルあたりに１６個の受動電極を有する。表面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ホウ酸緩衝液中の５０％）により１時間コーティングし、洗浄し、風乾した。
【０２５３】
多重チャンネル記録及び多重パラメーター・データ分析
記録には、Axion Biosystems（USA）による多重チャンネルMAESTRO記録システムを使用した。細胞外記録には、４８ウェルのＭＥＡをMAESTRO記録ステーションに入れ、３７℃に維持した。記録をＤＭＥＭ／１０％ 熱不活化ウマ血清中で行った。１０％ ＣＯ２を含むろ過され、加湿された気流の継続的な流れにより、ｐＨを７．４に維持した。
【０２５４】
各単位は、１つの電極で記録された１つのニューロンから生じる活動を表わす。単位を記録の開始時に分離する。各単位について、活動電位（すなわち、スパイク）をスパイク列として記録した。同スパイク列は、いわゆる「バースト」と呼ばれる状態の群である。バーストを、プログラムSpike WrangLer及びNPWaveX（両方ともNeuroProof GmbH, Rostock, Germany製）を使用する直接スパイク列分析により定量的に記述した。バーストを短いスパイク事象の開始及び終了により定義した。
【０２５５】
ネットワーク活動パターンの多重パラメーター・ハイコンテンツ分析により、２０４の活動記述スパイク列パラメータを抽出した。これらのパラメータにより、以下の４つのカテゴリー：全体的活動、バースト構造、振動挙動及び同期性における、活動変化の正確な記述を得ることが可能となる。
【０２５６】
ＭＰＰ＋により誘発されるニューロンネットワーク上の機能的効果、及び本発明のナノ粒子の予防／救済効力を、上記パラメータを通して評価した
【０２５７】
２１日目に、自発的な自然活動に関連する値を、３０−９０分の活動安定化後の３０分の時間範囲から得られた、６０秒の区分データから得た。結果（パラメータ値）を独立したネットワークの平均±ＳＥＭとして表わした。「ナノ粒子」群については、少なくとも５個のアクティブウェル、「対照」群については、少なくとも２０個のアクティブウェル、「ＭＰＰ＋」群については、少なくとも２０個のアクティブウェル（「アクティブ」は、電気活動を測定するのに十分な数の電極を有するウェルを意味する）を分析に含めた。絶対パラメータ分布の正常性について試験し、群間の統計的有意差を一方向ＡＮＯＶＡにより評価した。
【０２５８】
化合物効果を評価するために、２０４のパラメータの選択の多重パラメーター結果を、「効果スコア」と呼ばれる単一パラメータに表現した。これは、選択された特徴の線形結合であり、データセットを「０」の平均値の「対照」群と、「１」の平均値の「ＭＰＰ＋」群とを有するベクトルに変換する。効果スコアのＺ因子の計算は、２０４のパラメータのうち２０の特徴選択を通して行い、「対照」群と「ＭＰＰ＋」群との間の最良の区別を見出すように最適化された（Kuemmel A, et al. J Biomol Screen., 2010, 15(1), 95-101: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment）。
【０２５９】
効果スコア分析を図１７に示す。
【０２６０】
本発明のナノ粒子の予防／救済効力を表８に示す。
【０２６１】
【表８】
2021506873.tif 000009
【０２６２】
図１７及び表８に、本発明のＰＥＤＯＴナノ粒子によるニューロンネットワークの前処理により、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果が予防され／救済されることを示す。
【０２６３】
これらの結果は、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果を予防し／救済する際の、本願に記載されたナノ粒子の能力を際立たせている。
【０２６４】
実施例１３．１００以下の低い比誘電率を有する絶縁体材料により調製されたナノ粒子の合成：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた酸化ハフニウムナノ粒子の合成
塩基性ｐＨにおいて、塩化ハフニウム（ＨｆＣｌ４）を水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＯＨ）を使って沈殿させることにより、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）ナノ粒子を合成した。得られた懸濁液をオートクレーブに移し、１１０℃超の温度で加熱した。冷却後、懸濁液を脱イオン水で洗浄し、酸性にした。
【０２６５】
表面官能化を、ヘキサメタリン酸ナトリウムを使用して行った。十分な量のヘキサメタリン酸ナトリウムをナノ粒子懸濁液に加えて、表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌し、続けて、ｐＨを７に調節した。
【図１】
2021506873.tif 000010
【図２】
2021506873.tif 000011
【図３】
2021506873.tif 000012
【図４】
2021506873.tif 000013
【図５】
2021506873.tif 000014
【図６】
2021506873.tif 000015
【図７】
2021506873.tif 000016
【図８−１】
2021506873.tif 000017
【図８−２】
2021506873.tif 000018
【図９】
2021506873.tif 000019
【図１０】
2021506873.tif 000020
【図１１】
2021506873.tif 000021
【図１２−１】
2021506873.tif 000022
【図１２−２】
2021506873.tif 000023
【図１２−３】
2021506873.tif 000024
【図１２−４】
2021506873.tif 000025
【図１３】
2021506873.tif 000026
【図１４】
2021506873.tif 000027
【図１５】
2021506873.tif 000028
【図１６】
2021506873.tif 000029
【図１７】
2021506873.tif 000030
【国際調査報告】
2021506873.tif 000031
2021506873.tif 000032
2021506873.tif 000033
2021506873.tif 000034
2021506873.tif 000035