(57)【要約】  標的分析物の検出のための方法、組成物、およびシステムが提供される。流体溶液中の１つまたは複数の標的分析物の濃度を決定するための方法、組成物、およびシステムもまた提供される。組成物は、ナノポアタンパク質単量体が捕獲タグと連結されているナノポアコンジュゲートを含む。ナノポアタンパク質コンジュゲートへ繋がれるのは、特定の分析物へ方向づけられた分析物リガンドである。ナノポアコンジュゲートを含むナノポアアセンブリに渡って電圧が加えられた場合、ナノポアは捕獲タグを所定の捕獲速度で捕獲する。しかしながら、分析物リガンドに対する分析物の存在下では、捕獲タグの捕獲速度は変化し、それにしたがって、ナノポアアセンブリによる分析物の検出を可能にする。さらに、分析物と分析物リガンドの間の結合に関連した捕獲速度に基づいて、分析物の濃度を、会合／解離速度式を用いて、決定することができる。【選択図】図３
2021513962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアタンパク質単量体および捕獲タグを含むナノポアタンパク質コンジュゲート。
【請求項２】
捕獲タグが、配列番号８（捕獲タグ配列）として示される配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のナノポアタンパク質コンジュゲート。
【請求項３】
ナノポアタンパク質コンジュゲートのナノポアタンパク質単量体が、配列番号１６（α−ＨＬ）または配列番号６（ＯＭＰＧ）として示される配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のナノポアタンパク質コンジュゲート。
【請求項４】
ナノポアタンパク質コンジュゲートのナノポアタンパク質単量体が、アルファ−ヘモリシン単量体を含み、捕獲タグが、配列番号８（捕獲タグ配列）として示される配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のナノポアタンパク質コンジュゲート。
【請求項５】
ナノポアタンパク質コンジュゲートが、配列番号４または配列番号７として示される配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のナノポアタンパク質コンジュゲート。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノポアタンパク質コンジュゲート、および前記ナノポアタンパク質コンジュゲートと連結している分析物リガンドを含む、分析物検出複合体。
【請求項７】
分析物リガンドがナノボディである、請求項６に記載の分析物検出複合体。
【請求項８】
分析物リガンドがナノポアタンパク質コンジュゲートとイソペプチド結合を介して連結している、請求項６または７に記載の分析物検出複合体。
【請求項９】
イソペプチド結合がＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合である、請求項８に記載の分析物検出複合体。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの分析物検出複合体を含むナノポアアセンブリ。
【請求項１１】
ナノポアアセンブリが七量体ナノポアアセンブリであり、前記七量体ナノポアアセンブリの各単量体がアルファ−ヘモリシン単量体を含む、請求項１０に記載のナノポアアセンブリ。
【請求項１２】
流体溶液において分析物を検出するための方法であって、
請求項１０または１１に記載のナノポアアセンブリを含むチップを供給するステップであって、前記ナノポアアセンブリが膜内に配置されている、前記ステップ；
検知電極を前記膜に隣接してまたはその近くに位置づけるステップ；
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、ナノポアアセンブリの捕獲タグの第１の捕獲速度を決定するステップ；
ナノポアアセンブリを分析物と接触させるステップであって、前記分析物が、分析物検出複合体の分析物リガンドに対する結合親和性を含む、前記ステップ；ならびに
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、ナノポアアセンブリと会合した捕獲タグの第２の捕獲速度を決定するステップであって、前記第２の捕獲速度が、前記分析物が分析物検出複合体の分析物リガンドと結合しており、それにより、流体溶液中に存在するという指標を提供する、前記ステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
第２の捕獲速度が第１の捕獲速度より高いかまたは低い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
分析物リガンドの同一性に基づいて、および分析物が分析物リガンドと結合しているという指標に基づいて、分析物を同定するステップをさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
流体溶液中の分析物の濃度を決定するための方法であって、
請求項１０または１１に記載のナノポアアセンブリを含むチップを供給するステップであって、前記ナノポアアセンブリが膜内に配置されている、前記ステップ；
検知電極を前記膜に隣接してまたはその近くに位置づけるステップ；
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、ナノポアアセンブリの捕獲タグの第１の捕獲速度を決定するステップ；
ナノポアアセンブリを分析物と接触させるステップであって、前記分析物が、分析物検出複合体の分析物リガンドに対する結合親和性を含む、前記ステップ； 
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、分析物検出複合体の捕獲タグの第１の捕獲速度から第２の捕獲速度への第１の遷移を同定するステップ；
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、第２の捕獲速度からおよそ第１の捕獲速度への第２の遷移を同定するステップ；ならびに
第１の遷移および第２の遷移の同定に少なくとも部分的に基づいて、流体溶液中の分析物の濃度を決定するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
第２の捕獲速度が第１の捕獲速度より高いかまたは低い、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
流体溶液中の分析物の濃度を決定することが、第１の遷移と第２の遷移との間の時間間隔を測定するステップをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
流体溶液中の分析物の濃度を決定することが、分析物と、ナノポアアセンブリの分析物検出複合体の分析物リガンドとの間の会合速度を決定するステップをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
流体溶液中の分析物の濃度を決定するためのシステムであって、
ナノポアアセンブリを含むチップであって、前記ナノポアアセンブリが前記チップの膜内に配置されており、前記ナノポアアセンブリの少なくとも１個のナノポアタンパク質単量体が捕獲タグおよび分析物リガンドを含む、前記チップ；
前記膜に隣接してまたはその近くに位置づけられた検知電極であって、ナノポアアセンブリからのシグナルを検出するように構成されている、検知電極；および
コンピュータープロセッサーであって、前記コンピュータープロセッサーおよび検知電極が、ナノポアアセンブリに関連した第１の遷移および第２の遷移を同定するように構成されており、前記第１の遷移が、分析物の分析物リガンドとの結合に対応し、前記第２の遷移が、分析物の分析物リガンドからの解離に対応する、前記コンピュータープロセッサー；
を含む、前記システム。
【請求項２０】
流体溶液中の分析物の濃度が、同定された第１の遷移および同定された第２の遷移に少なくとも部分的に基づいて決定される、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
ナノポアタンパク質単量体がアルファ−ヘモリシン単量体である、請求項１９または２０に記載のシステム。
【請求項２２】
ナノポアタンパク質単量体が、配列番号４（α−ＨＬ単独）または配列番号７（ＯＭＰＧ単独）として示される配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９または２０に記載のシステム。
【請求項２３】
捕獲タグが、配列番号８（捕獲タグ配列）として示される配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001]この出願は、名称が「分析物の検出および分析のためのナノポアタンパク質コンジュゲート」である、２０１８年２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／６３０，９９３号の優先権の恩恵を主張する。上記で特定された優先権出願の全開示は、全体として参照により本明細書に完全に組み入れられている。
【０００２】
配列表
[002]本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、かつ全体として参照により本明細書に組み入れられている配列表を含有する。２０１９年１月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０８４８５＿００１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズが２９，３５４バイトである。
【０００３】
[003]本開示は、一般的には、標的分析物の検出のための方法、組成物、およびシステムに関し、より具体的には、流体溶液において分析物を同定するための、およびその溶液中の分析物の濃度を決定するためのナノポアタンパク質コンジュゲートの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
[004]小分子、タンパク質、抗原、免疫グロブリン、および核酸などの生物活性成分は、多数の生物学的過程および機能に関与している。したがって、そのような成分のレベルにおけるいかなる異常も疾患をもたらし、または疾患過程を加速し得る。このため、患者診断および処置に用いられる生物活性成分を迅速に検出し、かつ同定するための信頼のおける方法を開発するのに、多くの努力が払われてきた。例えば、血液または尿試料においてタンパク質または小分子を検出することは、患者の代謝状態を評価するために用いることができる。同様に、血液または尿試料における抗原の検出は、患者が曝露されている病原体を同定し、それにしたがって、適切な処置を促進するために用いることができる。そして、胎児性無細胞ＤＮＡの同定における最近の進歩に伴って、母親の血液試料からある特定の遺伝性障害を出生前に診断する能力が、無細胞ＤＮＡの検出を通して、今や可能である。溶液中の分析物の濃度を決定できることは、さらに有益である。例えば、血液または尿成分の濃度を決定することは、その成分を参照値と比較し、それにしたがって、患者の健康状態のさらなる評価を促進することを可能にし得る。
【０００５】
[005]それにも関わらず、多数の検出および同定方法が利用可能であるが、多くは高額であり、かつ幾分、時間がかかり得る。例えば、多くの診断試験は、完了するのに数日かかり得、かつかなりの検査室資源を必要とし得る。そして、場合によっては、心筋梗塞に関連したマーカーの分析においてなどの診断の遅れは、患者治療にマイナスの影響を及ぼし得る。さらに、生物活性成分を同定することを目的とした多くの診断試験の複雑さは、誤差に加担し、それにしたがって、精度を低下させる。そして、多くの検出および同定方法は、一度に１個または数個の生物活性成分を分析できるだけである（しかも、濃度を決定することができない）。
【０００６】
[006]必要とされていることは、生物活性成分を、特に効率的かつ費用効果の高い様式で、迅速に検出および同定することができるさらなる方法、組成物、およびシステムである。同時に複数の生物活性成分をアッセイすることができ、それにしたがって、費用を低減する、方法、組成物、およびシステムもまた必要とされている。さらに、流体溶液中の生物活性成分の濃度を決定するための方法、組成物、およびシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
[007]ある特定の例的態様において、ナノポアタンパク質単量体および捕獲タグを含むナノポアタンパク質コンジュゲートが提供される。例えば、ナノポアタンパク質コンジュゲートは、配列番号４または配列番号７として示される配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０００８】
[008]ある特定の例的態様において、ナノポアタンパク質コンジュゲートを含む分析物検出複合体が提供される。例えば、分析物検出複合体は、イソペプチド結合を介してなど、ナノポアタンパク質コンジュゲートと連結している分析物リガンドを含む。
【０００９】
[009]ある特定の例的態様において、少なくとも１つの分析物検出複合体を含むナノポアアセンブリが提供される。例えば、ナノポアアセンブリは、分析物検出複合体を含む七量体ナノポアアセンブリであり得る。ある特定の例的態様において、コンジュゲートのナノポア単量体は、アルファ−ヘモリシン単量体であり、七量体のその他の６個の単量体のそれぞれは、アルファ−ヘモリシン単量体である。
【００１０】
[0010]ある特定の例的態様において、流体溶液において分析物を検出するための方法が提供される。方法は、本明細書に記載されているようなナノポアアセンブリを含むチップを供給するステップを含む。例えば、ナノポアアセンブリは分析物検出複合体を含み、前記分析物検出複合体が、ナノポア単量体、捕獲タグ、および分析物リガンドを含む。さらに、ナノポアアセンブリは、チップの膜内に配置される。その後、検知電極がその膜に隣接して、またはその近くに置かれる。その後、捕獲タグの第１の捕獲速度が、コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、決定される。その後、ナノポアアセンブリは、分析物と接触し、その分析物は、分析物検出複合体の分析物リガンドに対する結合親和性を有する。その後、コンピュータープロセッサーおよび検知電極を用いて、捕獲タグの第２の捕獲速度が決定される。例えば、第２の捕獲速度は、分析物が分析物検出複合体の分析物リガンドと結合しているという指標、および、したがって、その分析物が流体溶液中に存在するという指標を提供する。例えば、第２の捕獲速度は、第１の捕獲速度より低く、または高くあり得る。さらに、分析物リガンドの同一性、および分析物が分析物リガンドに結合しているという指標に基づいて、分析物の同一性を決定することができる。
【００１１】
[0011]さらなる例的態様において、流体溶液中の分析物の濃度を決定するための方法が提供される。方法は、本明細書に記載されているようなナノポアアセンブリを有するチップを供給するステップを含み、前記ナノポアアセンブリが膜内に配置されている。ナノポアアセンブリは、例えば、分析物検出複合体を含み、前記分析物検出複合体が、ナノポア単量体、捕獲タグ、および分析物リガンドを含む。検知電極がその膜に隣接して、またはその近くに位置づけられる。その後、コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、ナノポアアセンブリの捕獲タグの第１の捕獲速度が決定される。その後、ナノポアアセンブリは、分析物と接触し、その分析物は、分析物検出複合体の分析物リガンドに対する結合親和性を有する。コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、分析物検出複合体の捕獲タグの第１の捕獲速度から第２の捕獲速度への第１の遷移が同定される。その後、コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、第２の捕獲速度から、第１の捕獲速度に近似する捕獲速度への第２の遷移が同定される。その後、第１の遷移および第２の遷移の同定に少なくとも部分的に基づいて、流体溶液中の分析物の濃度が決定される。例えば、遷移速度間の時間間隔は、分析物の濃度を決定するために用いることができる。
【００１２】
[0012]なおさらなる例的態様において、流体溶液中の分析物の濃度を決定するためのシステムが提供される。システムはまた、溶液において分析物を検出するために用いることができる。システムは、例えば、チップの膜内に配置されているナノポアアセンブリを有するチップを含む。ナノポアアセンブリは、例えば、捕獲タグおよび分析物リガンドを有する少なくとも１個のナノポアタンパク質単量体を含む。システムはさらに、膜に隣接して、またはその近くに位置づけられた検知電極を含む。検知電極は、例えば、ナノポアアセンブリからのシグナルを検出するように構成される。システムはさらに、ナノポアアセンブリに関連した第１の遷移および第２の遷移を同定するように、検知電極と共に構成されるコンピュータープロセッサーを含む。第１の遷移は、例えば、分析物の分析物リガンドとの結合に対応する。第２の遷移は、例えば、分析物の分析物リガンドからの解離に対応する。
【００１３】
[0013]システムのある特定の例的態様において、流体溶液中の分析物の濃度が、同定された第１の遷移および同定された第２の遷移に少なくとも部分的に基づいて、決定される。システムのある特定の例的態様において、ナノポアタンパク質単量体は、アルファ−ヘモリシン単量体またはＯｍｐＧ単量体である。システムのある特定の例的態様において、ナノポアタンパク質単量体は、配列番号４または配列番号７として示される配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。システムのある特定の例的態様において、捕獲タグは、配列番号８として示される配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
[0014]例的実施形態のこれらを始めとする態様、目的、特徴、および利点は、例示された例的実施形態の以下の詳細な説明を考慮すれば、当業者にとって明らかになると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】[0015]ある特定の例的実施形態による、ナノポアタンパク質コンジュゲートを示す図である。
【図２】[0016]ある特定の例的実施形態による、分析物検出複合体を示す図である。
【図３】[0017]ある特定の例的実施形態による、分析物検出複合体を含むナノポアアセンブリを示す図である。
【図４Ａ】[0018]図４Ａ〜４Ｃは、ある特定の例的実施形態による、異なる捕獲速度に関連する異なるポア状態を示す図である。より具体的には、図４Ａは、ナノポアタンパク質コンジュゲートを含むが、分析物リガンドを含まない（および、したがって、分析物検出複合体を含まない）ナノポアアセンブリを示す。そのようなポアは、捕獲タグ（捕獲を示す点線に対する実線）のベースライン捕獲速度に関連する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、分析物リガンド（例えば、ナノボディ）が付着していることを除いて、同じナノポアアセンブリを示す。したがって、図４Ｂのナノポアアセンブリは、分析物検出複合体を含む。図４Ｂのナノポアアセンブリは、捕獲タグ（捕獲を示す点線に対する実線）の第１の捕獲速度と関連する。
【図４Ｃ】図４Ｃは、分析物（例えば、ナノボディに対する抗原）が付着していることを除いて、図４Ｂにおけるものと同じポアを示す。そのようなポアは、捕獲タグ（捕獲を示す点線に対する実線）の第２の捕獲速度に関連する。
【図５Ａ】[0019]図５Ａ〜５Ｃは、ある特定の例的実施形態による、捕獲速度がナノポアアセンブリの結合状態に対応するように様々な捕獲速度を示すグラフである。より具体的には、図５Ａは、ベースライン捕獲速度の測定を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、分析物リガンドがナノポアアセンブリのナノポアタンパク質コンジュゲートと結合し、それにより、分析物検出複合体を形成している状態における、第１の捕獲速度の測定を示すグラフである。図５Ｂにおいて、分析物は存在しない。
【図５Ｃ】図５Ｃは、第１の捕獲速度（分析物が結合していない）および第２の捕獲速度（分析物が結合している）についての捕獲速度の測定を示す。第１の捕獲速度から第２の捕獲速度への第１の遷移、および第２の捕獲速度から第１の捕獲速度へ戻る第２の遷移もまた示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0020]本明細書に記載された実施形態は、以下の詳細な説明、実施例、および特許請求の範囲、ならびにそれらの前および後の記載への参照により、より容易に理解することができる。本システム、デバイス、組成物、および／または方法が開示および記載される前に、本明細書に記載された実施形態は、他に指定がない限り、開示された特定のシステム、デバイス、組成物、および／または方法に限定されず、そのようなものとして、当然のことながら、変化し得ることは、理解されるべきである。本明細書で用いられる専門用語は、特定の態様のみを記載するためであり、限定することを意図されないこともまた理解されるべきである。
【００１７】
[0021]さらに、以下の説明は、様々な実施形態のそれらの最善の現在知られている態様での実施可能な教示として提供される。この開示の有益な結果をなお獲得しながら、記載された態様に多くの変化がなされ得ることを当業者は認識していると予想される。本発明の所望の利益の一部は、他の特徴を利用することなく、様々な実施形態の特徴の一部を選択することにより獲得できることもまた明らかと予想される。したがって、本明細書に記載された様々な実施形態への多くの改変および適応が、可能であり、かつある特定の状況においてはさらに望ましくあり得、かつ本開示の一部であることは、当業者は認識していると予想される。このように、以下の説明は、これに限定されず、本明細書に記載された実施形態の原理の実例として提供される。
【００１８】
概要
[0022]本明細書に開示されているように、標的分析物の検出のための方法、組成物、およびシステムが提供される。流体溶液中の１つまたは複数の標的分析物の濃度を決定するための方法、組成物、およびシステムもまた提供される。組成物は、ナノポアタンパク質単量体が捕獲タグと連結しているナノポアタンパク質コンジュゲートを含む。ナノポアタンパク質コンジュゲートへ繋がれるのは、特定の分析物へ方向づけられ得る分析物リガンドである。本明細書に記載されているように、ナノポアコンジュゲートを含むナノポアアセンブリに渡って電圧が加えられた場合、ナノポアは捕獲タグを所定の捕獲速度で捕獲する。しかしながら、分析物リガンドに対する分析物の存在下では、捕獲タグの捕獲速度は変化し、それにしたがって、ナノポアアセンブリによる分析物の検出を可能にする。さらに、ある特定の例においては、分析物と分析物リガンドの間の結合に関連した捕獲速度に基づいて、分析物の濃度を決定することができる。
【００１９】
[0023]より具体的には、本明細書に記載されたナノポアコンジュゲートのナノポアタンパク質単量体は、任意の型の生物学的ナノポアタンパク質単量体であり得る。例えば、ナノポアタンパク質単量体は、アルファ−ヘモリシン（α−ＨＬ）単量体、ＯｍｐＧ単量体、または他のタンパク質ナノポア単量体であり得る。ナノポアタンパク質単量体が、例えば、アルファ−ヘモリシンである場合、その結果として生じたナノポアタンパク質コンジュゲートは、アルファ−ヘモリシン／捕獲タグタンパク質コンジュゲートである。
【００２０】
[0024]例えば、コンジュゲートを形成するためにアルファ−ヘモリシンナノポア単量体を用いることにより、コンジュゲートのアルファ−ヘモリシン単量体は、他のα−ＨＬ単量体とオリゴマー形成し、それにより、七量体ナノポアアセンブリを形成するために利用できる。例えば、七量体アセンブリは、１個のアルファ−ヘモリシン／捕獲タグコンジュゲート、および６個のアルファ−ヘモリシン単量体、例えば、６個の野生型アルファ−ヘモリシン単量体を有し得る。そのような例において、タンパク質コンジュゲートの捕獲タグは、電圧の存在下で、七量体ナノポアアセンブリと相互作用するように構成される。ある特定の例において、捕獲タグは、アルファ−ヘモリシン単量体の合成中、アルファ−ヘモリシンとリンカー配列を介して融合され、それにより、ナノポアタンパク質コンジュゲートを形成する。例えば、捕獲タグは、ナノポアが捕獲および放出することができる任意の分子であり、それによって、検出可能な捕獲速度を生じる。
【００２１】
[0025]捕獲タグを含むことに加えて、ナノポアタンパク質コンジュゲートは、分析物リガンドと繋がれている。分析物リガンドは、例えば、分析物を結合する任意のリガンドであり得る。ある特定の例において、分析物リガンドは、抗原の存在下にある場合、抗原またはその断片を結合する抗体またはその断片などのナノボディである。分析物リガンドは、ナノポアタンパク質コンジュゲートと、直接的に、またはペプチドリンカー配列を介してなど間接的に結合することができる。例えば、ナノポアタンパク質コンジュゲートは、分析物リガンドをナノポアアセンブリへ繋げるための領域を含み得る。ある特定の例において、ナノポアタンパク質コンジュゲートはＳｐｙＴａｇ配列を含み得る。そのような例において、分析物リガンドは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列と連結され得る。したがって、分析物リガンドは、ナノポアタンパク質コンジュゲートにＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合を介して繋がれ得る。ある特定の例において、本明細書に記載された捕獲タグは、分析物リガンドと連結され得る。
【００２２】
[0026]チップの膜へとアセンブルされた場合、本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲートおよび分析物リガンドを含むナノポアタンパク質アセンブリは、流体溶液において分析物を同定し、および／またはその分析物の濃度を決定するために用いることができる。いかなる特定の理論によっても縛られるつもりはないが、チップが、分析物を含有する流体溶液と接触する場合、分析物−リガンド結合ペアの捕獲タグとの近接が、捕獲タグのポアとの相互作用を変化させ、それにしたがって、捕獲タグの捕獲速度に影響すると考えられる。その後、膜の近くにある電極は、捕獲速度の変化を検出することができ、それにしたがって、分析物が分析物リガンドと結合しているという指標、および、したがって、リガンドが流体溶液中に存在するという指標を提供する。さらに、会合／解離速度式を用いて、分析物の濃度を、捕獲タグの捕獲速度に基づいて決定することができる。すなわち、捕獲速度の変化を用いて、分析物についてのＫａおよび／またはＫｄを、および他の公知の変数と共に、決定することができ、その決定されたＫａおよび／またはＫｄを用いて、流体溶液中の分析物の濃度を決定することができる。
【００２３】
[0027]他の例において、異なる分析物に方向づけられる異なるナノポアタンパク質アセンブリが、単一のチップ上で用いられ、その同じチップ上で異なる分析物を検出し、および／またはその濃度を決定することができる。そのような例において、異なるナノポアタンパク質アセンブリは、検知電極によって検出可能である異なるシグナルを生じるように構成され得る。例えば、ポアの開口ポアチャネルのサイズ、異なる捕獲タグ、および／または追加の捕獲タグの配置、膜のトランス側などの様々なパラメータを、所定のポアセットが発生するベースラインシグナルを変化させるために用いることができる。そのような構成に関して、例えば、より大きい開口を有するポアは、より小さい開口を有するポアより強いシグナルを提供することができ、それにしたがって、同じチップ上でポアの区別を可能にする。その後、異なるポアは、それらが検出するように構成されている分析物と相関し得、それにしたがって、同じチップ上での異なる分析物の同定を可能にする。さらに、各検出された分析物の濃度は、会合／解離速度式を用いて、本明細書に記載されているように決定することができる。
【００２４】
用語の要約
[0028]本発明をここで、以下の定義および例を用いて、参照としてのみ、詳細に記載する。本明細書において他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似したまたは等価の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が記載される。この発明は、記載された特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことは理解されるべきであり、これらは様々であり得るためである。
【００２５】
[0029]本明細書に提供された見出しは、全体として本明細書を参照することにより有し得る本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、すぐ下に定義された用語は、全体として本明細書を参照することによってより完全に定義される。
【００２６】
[0030]本明細書で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指図しない限り、複数の指示物を含む。
【００２７】
[0031]範囲または値は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして、本明細書で表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、その範囲の１つの特定の値から、および／またはその範囲のその他の特定の値までを含む。その範囲のそれぞれの端点が、他方の端点に関係する場合と、他方の端点とは無関係である場合のどちらにおいても有意であることは、さらに理解される。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似値として表現される場合、その特定の値は別の側面を形成することは理解される。ある特定の例的実施形態において、用語「約」は、所定の測定について当技術分野において一般公差の範囲内、例えば、平均から２標準偏差以内として理解される。ある特定の例的実施形態において、測定に依存して、「約」は、表示された値から１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内、０．１％以内、０．０５％以内、または０．０１％以内として理解することができる。文脈からそうではないことが明らかではない限り、本明細書に提供された全ての数値は、約という用語によって修飾され得る。さらに、「例」、「例示的な」、または「例示された」などの本明細書で用いられた用語は、優先を示すことを意図されず、むしろ、その後に論じられた態様が、単に、提示された態様の１つの例にすぎないことを説明することを意図される。
【００２８】
[0032]本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である、４つのポリペプチド鎖で構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子の必須エピトープ結合の特徴を保持する任意の機能性断片、変異体、バリアント、もしくは誘導体を広く指す。そのような変異体、バリアント、または誘導体の抗体実体は当技術分野において知られている。例えば、抗体の機能性断片は、全体としての抗体から分離された場合、その抗体が方向づけられている抗原を結合し、または部分的に結合する能力を保持する抗体の一部分を含む。例えば、「ナノボディ」は、単一ドメインの抗体断片である。
【００２９】
[0033]本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ペプチドまたはポリペプチドは、２個以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的のために、アミノ酸には、２０個の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体（すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。
【００３０】
[0034]本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意の重合体鎖を指す。用語「ペプチド」および「タンパク質」は、ポリペプチドという用語と交換可能に用いられ、同様に、アミノ酸の重合体鎖を指す。用語「ポリペプチド」は、天然または人工タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは単量体または重合体であり得、いくつかの修飾を含み得る。一般的に、ペプチドまたはポリペプチドは、長さが２個以上のアミノ酸であり、一般的に、長さが４０個以下のアミノ酸である。
【００３１】
[0035]本明細書で用いられる場合、「アルファ−ヘモリシン」、「α−ヘモリシン」、「α−ＨＬ」、「ａ−ＨＬ」、および「ヘモリシン」は、交換可能に用いられ、七量体の、水で満たされた膜貫通チャネルへと自己アセンブルする単量体タンパク質（すなわち、ナノポア）を指す。文脈によっては、その用語はまた、７個の単量体のタンパク質によって形成された膜貫通チャネルを指し得る。ある特定の例的実施形態において、アルファ−ヘモリシンは、「修飾型アルファ−ヘモリシン」であり、それは、そのアルファ−ヘモリシンが別の（すなわち、親の）アルファ−ヘモリシンから生じ、親アルファ−ヘモリシンと比較して１つまたは複数のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸置換、欠失、または挿入）を含有することを意味する。いくつかの例的実施形態において、本発明の修飾型アルファ−ヘモリシンは、天然に存在する、または野生型アルファ−ヘモリシンから生じ、または修飾されている。いくつかの例的実施形態において、修飾型アルファ−ヘモリシンは、組換え型または操作型アルファ−ヘモリシンから生じ、または修飾され、それには、キメラのアルファ−ヘモリシン、融合アルファ−ヘモリシン、または別の修飾型アルファ−ヘモリシンが挙げられるが、それらに限定されない。典型的には、修飾型アルファ−ヘモリシンは、親アルファ−ヘモリシンと比較して少なくとも１つの変化した表現型を有する。ある特定の例的実施形態において、アルファ−ヘモリシンは、「バリアントヘモリシン遺伝子」から生じ、または「バリアントヘモリシン」であり、それは、本明細書に記載された本発明と一貫して、それぞれ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のアルファ−ヘモリシン遺伝子の核酸配列が、そのコード配列を除去、付加、および／もしくは操作することにより変化しており、またはその発現したタンパク質のアミノ酸配列が修飾されていることを意味する。
【００３２】
[0036]本明細書で用いられる場合、用語「分析物」または「標的分析物」は、検出、同定、または特徴付けされるべき目的の任意の化合物、分子、または他の物質を広く指す。例えば、用語「分析物」または「標的分析物」は、検出および／または測定されることになっている特定の物質または成分である、目的の任意の生理学的分子または作用物質を含む。ある特定の例的実施形態において、分析物は、目的の生理学的分析物である。追加としてまたは代替として、分析物は、例えば生理学的作用を有する化学物質、または薬物もしくは薬理学的物質であり得る。追加としてまたは代替として、分析物または標的分析物は、環境的物質または他の化学的物質もしくは実体であり得る。用語「作用物質」は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作製された抽出物を示すように本明細書で用いられる。例えば、作用物質は細胞毒性物質であり得る。
【００３３】
[0037]ある特定の例的実施形態において、用語「分析物」または「標的分析物」は、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、糖質、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療を目的として投与されるものおよび違法な目的として投与されるものを含む）、脂質、ウイルス粒子、および上記物質のいずれかの代謝産物または上記物質のいずれかに対する抗体を含む。例えば、分析物には、フェリチン；クレアチニンキナーゼＭＩＢ（ＣＫ−ＭＩＢ）；ジゴキシン；フェニトイン；フェノバルビトール（phenobarbitol）；カルバマゼピン；バンコマイシン；ゲンタマイシン；テオフィリン；バルプロ酸；キニジン；黄体形成ホルモン（leutinizing hormone）（ＬＨ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；エストラジオール、プロゲステロン；ＩｇＥ抗体；ビタミン；β（B）２ミクログロブリン；糖化ヘモグロビン（Ｇｌｙ．Ｈｂ）；コルチゾール；ジギトキシン；Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）；プロカインアミド；風疹ＩｇＧおよび風疹ＩｇＭなどの風疹に対する抗体；トキソプラズマ症ＩｇＧ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＧ）およびトキソプラズマ症ＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＭ）などのトキソプラズマ症に対する抗体；テストステロン；サリシレート；アセトアミノフェン；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；抗Ｂ型肝炎コア抗原ＩｇＧおよびＩｇＭなどのＢ型肝炎コア抗原に対する抗体（抗ＨＢＣ）；ヒト免疫不全ウイルス１型および２型（ＨＴＬＶ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原に対する抗体（抗Ｈｂｅ）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；チロキシン（Ｔ４）；総トリヨードサイロニン（Ｔｏｔａｌ  Ｔ３）；遊離トリヨードサイロニン（Ｆｒｅｅ  Ｔ３）；癌胎児抗原（ＣＥＡ）；およびアルファ胎児タンパク質（ＡＦ）；ならびに乱用薬物および規制物質、例として、非限定的に、アンフェタミン；メタンフェタミン；アモバルビタール、セコバルビタール（seobarbital）、ペントバルビタール、フェノバルビタール、およびバルビタールなどのバルビツレート（barbituates）；リブリウムおよびバリウムなどのベンゾジアゼピン；ハシッシュおよびマリファナなどのカンナビノイド；コカイン；フェンタニル（fetanyl）；ＬＳＤ；メタカロン（methapualone）；ヘロイン、モルヒネ、コデイン（codine）、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、メサドン、オキシコドン、オキシモルホン、およびアヘンなどのオピエート；フェンサイクリジン；ならびにプロポキシフェン（propoxyhene）を挙げることができる。分析物という用語はまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、高分子、およびそれらの組合せを含む。
【００３４】
[0038]他の例的分析物または標的分析物には、葉酸塩、葉酸ＲＢＣ、鉄、可溶性トランスフェリン受容体、トランスフェリン、ビタミンＢ１２、乳酸デヒドロゲナーゼ、骨カルシウム、Ｎ−ＭＩＤオステオカルシン、Ｐ１ＮＰ、リン、ＰＴＨ、ＰＴＨ（１〜８４）、β（b）−ＣｒｏｓｓＬａｐｓ、ビタミンＤ、心臓アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ、コレステロール、ＣＫ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＢ（ｍａｓｓ）、ＣＫ−ＭＢ（ｍａｓｓ）  ＳＴＡＴ、ＣＲＰ  ｈｓ、シスタチンＣ、Ｄ−Ｄｉｍｅｒ、心臓ジギトキシン、ジゴキシン、ＧＤＦ−１５４、ＨＤＬコレステロール直接法、ホモシステイン、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＬコレステロール直接法、リポタンパク質（ａ）、ミオグロビン、ミオグロビンＳＴＡＴ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  ＳＴＡＴ、トロポニンＩ、トロポニンＩ  ＳＴＡＴ、トロポニンＴ  ｈｓ、トロポニンＴ  ｈｓ  ＳＴＡＴ、凝固ＡＴ  ＩＩＩ、Ｄ−Ｄｉｍｅｒ、乱用薬物検査アンフェタミン（エクスタシー）、ベンゾジアゼピン、ベンゾジアゼピン（血清）、カンナビノイド、コカイン、エタノール、メサドン、メサドン代謝産物（ＥＤＤＰ）、メタカロン、オピエート、オキシコドン、３、フェンサイクリジン、プロポキシフェン、アミラーゼ、ＡＣＴＨ、抗Ｔｇ、抗ＴＰＯ、抗ＴＳＨ−Ｒ、カルシトニン、コルチゾール、Ｃ−ペプチド、ＦＴ３、ＦＴ４、ｈＧＨ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＩＧＦ−１４、インスリン、リパーゼ、ＰＴＨ  ＳＴＡＴ、Ｔ３、Ｔ４、サイログロブリン（Thyreoglobulin）（ＴＧ  ＩＩ）、サイログロブリン（Thyreoglobulin）確認、ＴＳＨ、Ｔ−摂取率、受精能抗ミュラー管ホルモン、ＤＨＥＡ−Ｓ、エストラジオール、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ｈＣＧ  ｐｌｕｓ  ｂｅｔａ、ＬＨ、プロゲステロン、プロラクチン、ＳＨＢＧ、テストステロン、肝臓学ＡＦＰ、アルカリホスファターゼ（ＩＦＣＣ）、アルカリホスファターゼ（最適化）、３、Ｐｙｐ有りでのＡＬＴ／ＧＰＴ、ＰｙｐなしでのＡＬＴ／ＧＰＴ、アンモニア、抗ＨＣＶ、Ｐｙｐ有りでのＡＳＴ／ＧＯＴ、ＰｙｐなしでのＡＳＴ／ＧＯＴ、直接ビリルビン、総ビリルビン、アセチルコリンエステラーゼ、３、ブチリルコリンエステラーゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、乳酸デヒドロゲナーゼ、感染性疾患  抗ＨＡＶ、抗ＨＡＶ  ＩｇＭ、抗ＨＢｃ、抗ＨＢｃ  ＩｇＭ、抗ＨＢｅ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｇ確認、ＨＢｓＡｇ定量、抗ＨＣＶ、Ｃｈａｇａｓ  ４、ＣＭＶ  ＩｇＧ、ＣＭＶ  ＩｇＧ結合力、ＣＭＶ  ＩｇＭ、ＨＩＶ  ｃｏｍｂｉ  ＰＴ、ＨＩＶ−Ａｇ、ＨＩＶ−Ａｇ確認、ＨＳＶ−１  ＩｇＧ、ＨＳＶ−２  ＩｇＧ、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ、風疹ＩｇＧ、風疹ＩｇＭ、梅毒、Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ、Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ結合力、Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ、ＴＰＬＡ（梅毒）、抗ＣＣＰ、ＡＳＬＯ、Ｃ３ｃ、Ｃ４、セルロプラスミン、ＣＲＰ（ラテックス）、ハプトグロビン、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリンＡ  ＣＳＦ、免疫グロブリンＭ  ＣＳＦ、インターロイキン６、カッパ軽鎖、遊離カッパ軽鎖６，２，３、ラムダ軽鎖、遊離ラムダ軽鎖６，２，３、プレアルブミン、プロカルシトニン、リウマトイド因子、α１−酸性糖タンパク質、α１−アンチトリプシン、重炭酸塩（ＣＯ２）、カルシウム、クロリド、フルクトサミン、グルコース、ＨｂＡ１ｃ（溶血血液）、ＨｂＡ１ｃ（全血）、インスリン、ラクテート、ＬＤＬコレステロール直接法、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、総タンパク質、トリグリセリド、トリグリセリド  グリセロール消去法、総ビタミンＤ、酸性ホスファターゼ、ＡＦＰ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、カルシトニン、Ｃｙｆｒａ  ２１−１、ｈＣＧ  ｐｌｕｓ  ｂｅｔａ、ＨＥ４、遊離カッパ軽鎖６，２，３、遊離ラムダ軽鎖６，２，３、ＮＳＥ、ｐｒｏＧＲＰ、遊離ＰＳＡ、総ＰＳＡ、ＳＣＣ、Ｓ−１００、サイログロブリン（Thyreoglobulin）（ＴＧ  ＩＩ）、サイログロブリン（Thyreoglobulin）確認、β２−ミクログロブリン、アルブミン（ＢＣＧ）、アルブミン（ＢＣＰ）、アルブミン  免疫性、クレアチニン（酵素法）、クレアチニン（Ｊａｆｆｅ）、シスタチンＣ、カリウム、ＰＴＨ、ＰＴＨ（１−８４）、総タンパク質、総タンパク質、尿／ＣＳＦ、尿素／ＢＵＮ、尿酸、α１−ミクログロブリン、β２−ミクログロブリン、アセトアミノフェン（パラセタモール）、アミカシン、カルバマゼピン、サイクロスポリン、ジギトキシン、ジゴキシン、エベロリムス、ゲンタマイシン、リドカイン、リチウム、ＩＳＥミコフェノール酸、ＮＡＰＡ、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、プロカインアミド、キニジン、サリシレート、シロリムス、タクロリムス、テオフィリン、トブラマイシン、バルプロ酸、バンコマイシン、抗ミュラー管ホルモン、ＡＦＰ、β−Ｃｒｏｓｓｌａｐｓ、ＤＨＥＡ−Ｓ、エストラジオール、ＦＳＨ、遊離βｈＣＧ、ｈＣＧ、ｈＣＧ  ｐｌｕｓ  ｂｅｔａ、ｈＣＧ  ＳＴＡＴ、ＨＥ４、ＬＨ、Ｎ−ＭＩＤオステオカルシン、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰｌＧＦ、ｓＦＩｔ−１、Ｐ１ＮＰ、プロゲステロン、プロラクチン、ＳＨＢＧ、テストステロン、ＣＭＶ  ＩｇＧ、ＣＭＶ  ＩｇＧ結合力、ＣＭＶ  ＩｇＭ、風疹ＩｇＧ、風疹ＩｇＭ、Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ、Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ結合力、および／またはＴｏｘｏ  ＩｇＭが挙げられる。
【００３５】
[0039]本明細書で用いられる場合、用語「リガンド」または「分析物リガンド」は、別の実体（例えば、受容体）と結合して、より大きい複合体を形成する任意の化合物、分子、分子群、または他の物質を広く指す。例えば、分析物リガンドは、その用語が当技術分野において理解され、本明細書で広く定義されているように、分析物に対する結合親和性を有する実体である。分析物リガンドの例には、ペプチド、糖質、核酸、抗体、または受容体と結合する任意の分子が挙げられるが、それらに限定されない。ある特定の例において、リガンドは、生物学的目的を果たすために、分析物と複合体を形成する。当業者が認識しているように、リガンドとその結合パートナー（例えば、分析物）の間の関係は、電荷、疎水性、および分子構造と相関している。結合は、イオン結合、水素結合、およびファン・デル・ワールス力などの様々な分子間力を介して起こり得る。ある特定の例において、リガンドまたは分析物リガンドは、抗原との結合親和性を有する抗体またはその機能的断片である。
【００３６】
[0040]本明細書で用いられる場合、用語「ＤＮＡ」は、当技術分野において一般的に理解されているように、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。「デオキシリボヌクレオチド」は、β−Ｄ−デオキシリボフラノース部分の２’位においてヒドロキシル基を含まず、代わりに水素を含む、ヌクレオチドである。その用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖領域と一本鎖領域の両方を有するＤＮＡ、部分的に精製されたＤＮＡなどの単離されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えで産生されたＤＮＡ、加えて、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または修飾によって天然に存在するＤＮＡとは異なる、変化したＤＮＡまたは類似体ＤＮＡを包含する。
【００３７】
[0041]本明細書で用いられる場合、用語「連結する（ｊｏｉｎ）」、「連結された（ｊｏｉｎｅｄ）」、「連結する（ｌｉｎｋ）」、「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」、または「繋がれた」は、タンパク質をＤＮＡ分子と、またはタンパク質をタンパク質と接続することなど、２つ以上の実体を機能的に接続するための、当技術分野において公知の任意の方法を指す。例えば組換え型融合タンパク質において、介在配列またはドメイン有りまたはなしで、１つのタンパク質が別のタンパク質と共有結合を介して連結され得る。共有結合の例は、例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇ相互作用、システイン−マレイミドコンジュゲーション、またはアジド−アルキンクリックケミストリー、加えて、当技術分野において公知の他の手段を通して、形成され得る。さらに、１個のＤＮＡ分子は、別のＤＮＡと、相補ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションを介して連結され得る。
【００３８】
[0042]本明細書で用いられる場合、用語「ナノポア」は、一般的には、膜内に形成された、またはそれ以外の方法で提供されたポア、チャネル、または通路を指す。膜は、脂質二分子層などの有機膜、または重合体材料で形成された膜などの合成膜であり得る。膜は、重合体材料であり得る。ナノポアは、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路などの検知回路、または検知回路と結合した電極に隣接して、またはその近くに配置され得る。いくつかの例的実施形態において、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍのような固有幅または直径を有する。いくつかのナノポアはタンパク質である。例えば、アルファ−ヘモリシン単量体は、オリゴマー形成して、タンパク質を形成する。膜は、トランス側（すなわち、検知電極に対面する側）およびシス側（すなわち、対電極に対面する側）を含む。
【００３９】
[0043]用語「核酸分子」または「核酸」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびｃＤＮＡ分子を含む。遺伝暗号の縮重の結果として、アルファ−ヘモリシンおよび／またはそのバリアントなどの所定のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列が生じ得ることは理解されると予想される。本開示は、バリアントのアルファ−ヘモリシンをコードするあらゆる可能なバリアントヌクレオチド配列を企図し、そのバリアントヌクレオチド配列の全ては、遺伝暗号の縮重を考慮すれば、可能である。
【００４０】
[0044]用語「ヌクレオチド」は、当技術分野において認識されているように、天然の塩基（標準）および当技術分野において周知の修飾型塩基を含むように本明細書で用いられる。そのような塩基は、一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは、一般的に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。
【００４１】
[0045]本明細書で用いられる場合、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関してなどの「合成」は、組換え方法により、および／または化学合成方法により産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
【００４２】
[0046]本明細書で用いられる場合、組換えＤＮＡ方法を用いることによる組換え方法による産生は、クローン化ＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を指す。例えば、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）について標準技術が用いられ得る。酵素反応および精製技術は、製造会社の仕様書にしたがって、または当技術分野において一般的に達成されているように、または本明細書に記載されているように、実施され得る。前述の技術および手順は、当技術分野において周知の通常の方法にしたがって、ならびに本明細書を通して引用され、および論じられている様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されているように、一般的には実施され得る。例えば、任意の目的のために参照により本明細書に組み入れられている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
【００４３】
[0047]本明細書で用いられる場合、「ベクター」（またはプラスミド）は、異種性核酸をその発現かまたは複製かのいずれかのために細胞へ導入するために用いられる個別のＤＮＡエレメントを指す。ベクターは、典型的には、エピソームのままであるが、遺伝子またはその部分のゲノムの染色体への組込みをもたらすように設計することができる。細菌人工染色体、酵母人工染色体、および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターもまた企図される。そのような媒体の選択および使用は当業者によく知られている。
【００４４】
[0048]本明細書で用いられる場合、「発現」は、一般的に、核酸がｍＲＮＡへ転写され、かつペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳される過程を指す。核酸がゲノムＤＮＡから導き出される場合、発現は、適切な真核生物の宿主細胞または生物体が選択されるならば、ｍＲＮＡのスプライシングなどのプロセシングを含み得る。
【００４５】
[0049]本明細書で用いられる場合、「発現ベクター」は、そのようなＤＮＡ断片の発現をもたらす能力があるプロモーター領域などの制御配列と作動可能に連結されているＤＮＡを発現する能力があるベクターを含む。そのような追加のセグメントには、プロモーターおよびターミネーター配列を挙げることができ、任意で、１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを挙げることができる。発現ベクターは、一般的に、プラスミドもしくはウイルスＤＮＡから導き出され、または両方のエレメントを含有できる。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞への導入により、クローン化ＤＮＡの発現を生じる、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を指す。適切な発現ベクターは、当業者によく知られており、それには、真核細胞および／もしくは原核細胞において複製可能であるもの、ならびにエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノムへ統合されるものが挙げられる。本明細書で用いられる場合、ベクターにはまた、「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」または「ウイルスのベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」が挙げられる。ウイルスベクターは、外因性遺伝子と、その外因性遺伝子を細胞へ（媒体またはシャトルとして）移入するように作動可能に連結されている操作型ウイルスである。
【００４６】
[0050]用語「宿主細胞」とは、ベクターを含有し、その発現構築物の複製、ならびに／または転写、もしくは転写および翻訳（発現）を支える細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）などの原核細胞、または酵母、植物、昆虫、両生類、もしくは哺乳類細胞などの真核細胞であり得る。一般的に、宿主細胞は原核生物、例えば、大腸菌である。
【００４７】
[0051]用語「細胞発現」または「細胞遺伝子発現」は、一般的に、細胞において、生物活性ポリペプチドがＤＮＡ配列から産生され、かつ生物活性を示す細胞過程を指す。そのようなものとして、遺伝子発現は、転写および翻訳の過程を含むが、遺伝子または遺伝子産物の生物活性に影響を及ぼし得る転写後および翻訳後の過程もまた含み得る。これらの過程は、例えば、ＲＮＡ合成、プロセシング、および輸送、加えて、ポリペプチド合成、輸送、ポリペプチドの翻訳後修飾を含む。追加として、細胞内でのタンパク質−タンパク質の相互作用に影響する過程もまた、本明細書に定義されているような遺伝子発現に影響し得る。
【００４８】
[0052]本明細書で用いられる場合、用語「任意の」または「任意で」は、その後に記載された事象または状況が起こり、または起こらないこと、ならびにその記載が、前記事象または状況が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、分析物検出複合体をナノポアアセンブリ単量体と連結する任意のステップは、その分析物検出複合体が連結され得、または連結され得ないことを意味する。
【００４９】
[0053]本明細書で用いられる場合、用語「リン脂質」は、少なくとも１個のリン基を含む疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リン含有基、および任意でＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、または置換型もしくは非置換型アリル基で置換された、飽和または不飽和アルキル基を含み得る。
【００５０】
[0054]本明細書で用いられる場合、用語「膜」は、膜タンパク質が埋め込まれている、脂質分子の連続二重層のシートまたは層を指す。膜脂質分子は、典型的には、両親媒性であり、最も自然発生的には、水中に置かれた場合、二分子層を形成する。「リン脂質膜」は、脂質の疎水性頭部が一方向を向き、同時に親水性尾部が反対方向を向くように整列したリン脂質で構成された任意の構造を指す。リン脂質膜の例には、細胞膜の脂質二分子層が挙げられる。
【００５１】
[0055]本明細書で用いられる場合、「同一性」または「配列同一性」は、配列の関連において、２つの核酸配列または２つのアミノ酸配列の間での類似性を指し、その配列間での類似性という言葉で表されるが、そうでなければ、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性または相同性）に関して測定される場合が多い；パーセンテージが高ければ高いほど、その２つの配列はより類似している。例えば、８０％相同性は、規定のアルゴリズムにより決定された８０％配列同一性と同じことを意味し、したがって、所定の配列の相同体は、その所定の配列の長さに関して８０％より高い配列同一性を有する。配列同一性のレベルの例として、例えば、所定の配列、例えば、本明細書に記載されているような発明ポリペプチドのいずれか１つについてのコード配列との８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性が挙げられる。
【００５２】
[0056]比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野においてよく知られている。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが以下に記載されている：Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．  ２：４８２、１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３、１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７〜２４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３、１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６、１０８８１〜９０、１９８８；Ｈｕａｎｇら  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．  Ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８、１５５〜６５、１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら  Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．  ２４、３０７〜３１、１９９４。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜４１０、１９９０）は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察を提示している。
【００５３】
[0057]ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜４１０、１９９０）は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの発信元から利用可能であり、インターネット上で、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮなどのＢＬＡＳＴプログラム一式を含む配列解析プログラムと接続して用いられる。
【００５４】
[0058]所定の核酸配列をＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ配列および他の公共データベースにおける核酸配列に対して評価する場合、配列検索は、典型的には、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行われる。全てのリーディングフレームで翻訳されている核酸配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列および他の公共データベースにおけるアミノ酸配列に対して検索するためには、ＢＬＡＳＴＸプログラムが好ましい。ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸのどちらも、１１．０のオープンギャップペナルティおよび１．０の伸長ギャップペナルティのデフォルトパラメータを用いて実行され、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９〜３４０２、１９９７参照）。
【００５５】
[0059]ある特定の例的実施形態において、２つ以上の配列間の「％同一性」を決定するための、選択された配列の好ましいアラインメントは、例えば、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１の伸長ギャップペナルティ、およびＢＬＯＳＵＭ  ３０類似性マトリックスを含むデフォルトパラメータで操作される、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  バージョン１３．０．７におけるＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを用いて、実施される。
【００５６】
[0060]本明細書で用いられる場合、用語「バリアント」は、親タンパク質と比較した場合、変化した特性、例えば、変化したイオン伝導度を示す修飾型タンパク質を指す。
【００５７】
[0061]本明細書で用いられる場合、用語「試料」は、その最も広い意味で用いられる。本明細書で用いられる場合、「生物学的試料」には、対象由来など、生きているものまたは以前は生きていたもの由来の任意の量の物質が挙げられるが、それに限定されない。生物学的試料は、インビボまたはインビトロで得られた生物学的組織または流体を源とする試料を含み得る。そのような試料は、非限定的に、生物学的対象から単離された、体液、器官、組織、画分、および細胞に由来し得る。生物学的試料にはまた、例えば、生物学的流体（例えば、血液または尿）からの抽出物など、生物学的試料からの抽出物も挙げることができる。
【００５８】
[0062]本明細書で用いられる場合、「生物学的流体」または「生物学的流体試料」は、任意の生理学的流体（例えば、血液、血漿、痰、洗浄液、接眼レンズ液、脳脊髄液、尿、精液、汗、涙、乳、唾液、滑液、腹水、羊水）、加えて、１つもしくは複数の公知のプロトコールを通して流体形へ少なくとも部分的に変換されている固体組織、または流体が抽出されている固体組織を指す。例えば、生検からなどの、液状組織抽出物は、生物学的流体試料であり得る。ある特定の例において、生物学的流体試料は、対象から収集された尿試料である。ある特定の例において、生物学的流体試料は、対象から収集された血液試料である。本明細書で用いられる場合、用語「血液」、「血漿」、および「血清」は、画分またはその処理された部分を含む。同様に、試料が生検、スワブ、スメアなどから採取される場合、「試料」は、その生検、スワブ、スメアなどに由来した、処理画分または部分を包含する。
【００５９】
[0063]さらに、「流体溶液」、「流体試料」、または「流体」は、生物学的流体を包含するが、環境試料に存在し得る任意の分析物などの非生理学的成分もまた含み得、かつ包含し得る。例えば、試料は、河川、湖、池、または他の貯水池からであり得る。ある特定の例的実施形態において、流体試料は改変され得る。例えば、流体試料にバッファーまたは保存剤を加えることができ、または流体試料を希釈することができる。他の例的実施形態において、流体試料は、その溶液中の１つまたは複数の溶質の濃度を増加させるために、当技術分野において公知の一般的な手段によって改変することができる。それでも、その流体溶液はなお、本明細書に記載されているような流体溶液である。
【００６０】
[0064]本明細書で用いられる場合、「対象」は、脊椎動物を含む動物を指す。脊椎動物は、哺乳類、例えば、ヒトであり得る。ある特定の例において、対象はヒト患者であり得る。対象は、「患者」、例えば、疾患または状態を患っており、または患っているのではないかと疑われる患者であり得、処置もしくは診断を必要とし得、または疾患もしくは状態の進行についてモニターすることを必要とし得る。患者はまた、効力についてモニターする必要がある処置治療に関与し得る。哺乳類は、例えば、ヒト、チンパンジー、家畜および農業用動物、加えて、動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ブタなどを含む、哺乳類として分類される任意の動物を指す。
【００６１】
[0065]本明細書で用いられる場合、用語「野生型」は、天然に存在する源から単離された場合のその遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００６２】
[0066]本明細書で用いられる場合、アミノ酸残基についての通常の１文字および３文字コードが用いられる。参照しやすいように、配列バリアントは、以下の命名法を用いて記載される：最初のアミノ酸：位置：置換アミノ酸。この命名法にしたがって、例えば、位置１７におけるスレオニンのアルギニンによる置換は、Ｔｈｒ１７ＡｒｇまたはＴ１７Ｒとして示される。複数の変異は、プラス記号によって分離され、例えば、Ｔｈｒ１７Ａｒｇ＋Ｇｌｕ３４ＳｅｒまたはＴ１７Ｒ＋Ｅ３４Ｓは、位置１７および３４において、スレオニンおよびグルタミン酸をそれぞれ、アルギニンおよびセリンで置換する、変異を表す。
【００６３】
例的実施形態
[0067]例的実施形態をここで、一部、添付の図を参照して、詳細に記載する。図が参照される場合、同様の数字は、図を通して同様（ただし、必ずしも同一とは限らない）の要素を示す。
【００６４】
ナノポアタンパク質コンジュゲート
[0068]ナノポアタンパク質コンジュゲートを含む組成物が本明細書に提供される。図１に示されているように、コンジュゲート１は、ある特定の例的実施形態により、捕獲タグ５と連結されているナノポア単量体２を含み得る。ナノポアタンパク質コンジュゲート１はまた、分析物リガンド付着部位４を含み得る。したがって、その結果として生じたナノポアタンパク質コンジュゲート１は、ナノポア単量体ドメイン、分析物リガンド付着ドメイン、および捕獲タグドメインを含み得る。そのようなナノポアタンパク質コンジュゲート１は、例えば、本明細書に記載されているような分析物と、本明細書に記載されているように、相互作用し、かつその検出を促進することができる分析物検出複合体を形成するために用いることができる。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１はまた、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の様々な成分を連結する１つまたは複数のリンカードメイン３を含み得る。
【００６５】
[0069]ナノポアタンパク質コンジュゲート１のナノポアタンパク質単量体２は、膜などの基質内に位置する場合、分子のその基質を通っての通過を可能にする任意のナノポアタンパク質を含み得る。ナノポアの例には、タンパク質性もしくはタンパク質に基づいたポアまたは合成ポアが挙げられる。ある特定の例的実施形態において、ナノポアは、１〜１０ｎｍまたは１〜５ｎｍまたは１〜３ｎｍの内径を有し得る。タンパク質ポアの例には、例えば、アルファ−ヘモリシン、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＧ、ＯｍｐＣ、ＭｓｐＡ、およびＬａｍＢ（マルトポリン）が挙げられる（例えば、Ｒｈｅｅ，Ｍ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（４）（２００７）：１７４〜１８１参照）。ある特定の例的実施形態において、ポアタンパク質は、修飾型天然タンパク質または合成タンパク質などの修飾型タンパク質であり得る。
【００６６】
[0070]ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のナノポアタンパク質単量体２ドメインは、アルファ−ヘモリシン単量体である。したがって、そのような実施形態において、その結果として生じたナノポアタンパク質コンジュゲート１は、アルファ−ヘモリシンドメイン（すなわち、そのコンジュゲートのアルファ−ヘモリシン単量体部分）、分析物リガンド付着部位４、および捕獲タグ５を含む（図１）。ある特定の例的実施形態において、そのようなナノポアタンパク質コンジュゲートはまた、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の様々なドメインを連結する１つまたは複数のリンカー領域３を含み得る。
【００６７】
[0071]当業者が認識しているように、アルファ−ヘモリシンは、脂質二分子層へとアセンブルして、七量体ポアを形成する水溶性単量体として黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって分泌される２９３アミノ酸のポリペプチドである。例えば、その七量体は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中、最高６５℃まで安定である。アルファ−ヘモリシンの、その中央のグリシンリッチ配列における変異誘発または標的化学修飾による変化により、その分子のこの部分が、脂質二分子層を貫き、膜貫通チャネルの管腔を裏打ちすることが実証されている。七量体を通るチャネルは、中央のステムドメイン配列によって与えられたサブユニットあたり２つの鎖を有する、１４鎖のβバレルである。
【００６８】
[0072]ナノポア単量体２がアルファ−ヘモリシンである例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のアルファ−ヘモリシンドメインは、配列番号１（野生型アルファ−ヘモリシン）として示される核酸配列によってコードされ得る。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のアルファ−ヘモリシンドメインは、配列番号１として示される核酸配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列によってコードされ得る。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のアルファ−ヘモリシンドメインは、配列番号２または配列番号３として示されるアミノ酸配列を有する。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のアルファ−ヘモリシンドメインは、配列番号２または配列番号３として示される配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００６９】
[0073]ナノポア単量体２がアルファ−ヘモリシンである例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のアルファ−ヘモリシンドメインは、配列番号１６（成熟の親野生型アルファ−ヘモリシン；ＡＡＡ２６５９８）として示されるアミノ酸配列を有し得る。ある特定の例的実施形態において、本明細書に記載されたナノポアタンパク質コンジュゲート１のアルファ−ヘモリシンドメインは、配列番号１６として示される配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のアルファ−ヘモリシンドメインは、特定のアルファ−ヘモリシンバリアントであり得る。例えば、アルファ−ヘモリシンバリアントは、配列番号１６と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより高い配列同一性を有し得るが、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【００７０】
[0074]ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のナノポアタンパク質単量体２の一部は、外膜タンパク質Ｇ（または「ＯｍｐＧ」）単量体である。したがって、そのような実施形態において、その結果として生じたナノポアタンパク質コンジュゲート１は、ＯｍｐＧドメイン（すなわち、そのコンジュゲートのＯｍｐＧ単量体部分）、分析物リガンド付着部位４、捕獲タグ５、および、ある特定の例的実施形態においては、１つまたは複数のリンカー領域３を含む。当業者が認識しているように、ＯｍｐＧは、１４鎖のベータ−バレルを形成する３４ｋＤａのポリンタンパク質である。例えば、そのバレルは、グラム陰性細菌において、栄養分、イオン、およびタンパク質の受動的だが、選択的な取り込みおよび分泌を可能にする。そのようなポリンは、一般的に、周辺質側に短いターン、および細胞外側に長いループを有する。しかし、たいていのポリンとは違って、ＯｍｐＧは単量体として機能すると理解されている。
【００７１】
[0075]ナノポア単量体２がＯｍｐＧ単量体である例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のＯｍｐＧドメインは、配列番号６として示される配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のＯｍｐＧドメインは、ＯｍｐＧバリアントであり得る。例えば、ＯｍｐＧバリアントは、配列番号６と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより高い配列同一性を有し得るが、１つまたは複数の特定のアミノ酸置換を含み、それにより、ＯｍｐＧバリアントを形成する。
【００７２】
[0076]ナノポアタンパク質コンジュゲート１の捕獲タグ５は、ナノポアアセンブリのポアと、ナノポアアセンブリからの検出可能なシグナルが同定され得るように、相互作用する任意のポリペプチド配列であり得る。例えば、約２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個のリジンアミノ酸などの約３０個のリジンアミノ酸のホモ重合体。ある特定の例的実施形態において、捕獲タグは、ＥＰＰＰタグ（配列番号１７）である。ある特定の例的実施形態において、捕獲タグ５は、配列番号８として示されるアミノ酸配列を有し得る。他の例的実施形態において、捕獲タグ５は、配列番号８として示されるアミノ酸配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００７３】
[0077]ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１はまた、分析物付着ドメイン４などの分析物リガンドを付着するための領域を含む（図１）。分析物付着ドメイン４は、例えば、本明細書に記載されているようなナノポアアセンブリの機能に干渉しない、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に沿うどこにでも位置することができる。例えば、分析物付着ドメイン４は、本明細書に記載されているような、ナノポアタンパク質単量体２のナノポアアセンブリへのアセンブリにも、捕獲タグ５のそのアセンブリとの相互作用にも干渉すべきではない。図１に示されているように、ある特定の例的実施形態において、分析物付着ドメイン４は、ナノポアタンパク質単量体２と捕獲タグ５の間に位置し得る。
【００７４】
[0078]ある特定の例的実施形態において、分析物付着ドメイン４は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒアミノ酸配列を含み得る。例えば、Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｊａｎ  ２３；４２６（２）：３０９〜１７参照。例えば、分析物付着ドメイン４は、配列番号１１として示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。そのような例的実施形態において、ＳｐｙＴａｇ配列は、分析物リガンドを付着させ、それにより、本明細書に記載されているような分析物検出複合体９を形成するために用いることができる（図２参照）。他の例的実施形態において、分析物リガンド付着部位４は、分析物リガンドをナノポアタンパク質コンジュゲートに付着させるために用いることができる他の構造またはペプチド配列を含み得る。例えば、分析物リガンド付着部位４は、システイン−マレイミドコンジュゲートまたはアジド−アルキンクリックケミストリーペア、加えて当技術分野において公知の他の連結成分などの他の共有結合性ペアの成分を含み得る。ある特定の例的実施形態において、分析物付着ドメイン４は、分析物リガンドをナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させるための分子ステープル配列を含み得る（下記参照）。
【００７５】
[0079]ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１はまた、１つまたは複数のリンカー領域３を含み得る（図１）。例えば、リンカー領域３は、ナノポアタンパク質単量体２をナノポアタンパク質コンジュゲート１の他の機能性領域に連結するが、ナノポアタンパク質コンジュゲートドメインの独立した機能に干渉しない、任意のアミノ酸配列であり得る。例えば、リンカー領域３は、本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質アセンブリへのナノポアタンパク質単量体２のアセンブリに干渉しない。リンカー領域３は、本明細書に記載されているようなアセンブリとの捕獲タグ５の会合にも、分析物リガンドの分析物リガンド付着ドメインとの会合にも干渉しない。
【００７６】
[0080]ある特定の例的実施形態において、リンカー領域３は、ナノポアタンパク質単量体２を分析物付着ドメイン４に連結するために用いることができる（図１）。ある特定の例的実施形態において、リンカー領域３は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸を含む。ある特定の例的実施形態において、リンカー領域３は、約１〜１０個のアミノ酸などの約１５個未満のアミノ酸である。ある特定の例的実施形態において、リンカー領域３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のいずれか１つとして示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００７７】
[0081]ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１は、第２のリンカー領域を含み得る（示されていない）。そのような実施形態において、第２のリンカー領域は、本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲート１の機能性を保存しながら、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の他の機能性領域を一緒に連結し得る。例えば、第２のリンカー領域は、第１のリンカー領域３を分析物付着ドメイン４に連結し得る。第１のリンカー領域３のように、第２のリンカー領域（示されていない）は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸を含み得る。ある特定の例的実施形態において、第２のリンカー領域は、約１〜１０個のアミノ酸などの約１５個未満のアミノ酸である。ある特定の例的実施形態において、第２のリンカー領域は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のいずれか１つとして示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。ある特定の例的実施形態において、第１のリンカー領域３および第２のリンカー領域は、ポリヒスチジンタグなどの非機能性タグによって分離され得る。
【００７８】
[0082]ある特定の例的実施形態において、本明細書に記載されたナノポアタンパク質コンジュゲート１は、配列番号４として示されるアミノ酸配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。そのような例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１は、ナノポア単量体２としてのアルファ−ヘモリシン単量体、リンカー領域３、分析物リガンド付着部位４としてのＳｐｙＴａｇ配列、ヒスチジンタグ、および捕獲タグ５領域を連続的に含み得る（図１および配列番号４を参照）。例えば、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のアルファ−ヘモリシン単量体ドメインは、配列番号１６として示されるアミノ酸配列に対応し得、リンカー領域３は、配列番号１２として示されるアミノ酸配列に対応し得る。さらに、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の分析物リガンド付着部位４は、配列番号１１（ＳｐｙＴａｇ配列）として示されるアミノ酸配列に対応し得、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の捕獲タグ５は、配列番号８として示されるアミノ酸配列に対応し得る。
【００７９】
[0083]ある特定の例的実施形態において、本明細書に記載されたナノポアタンパク質コンジュゲート１は、配列番号７として示されるアミノ酸配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。そのような例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１は、ナノポア単量体２としてのＯｍｐＧ配列、第１のリンカー領域３、ヒスチジンタグ、第２のリンカー領域、分析物リガンド付着部位４としてのＳｐｙＴａｇ配列、および捕獲タグ５領域を含み得る。例えば、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のＯｍｐＧ単量体ドメインは、配列番号６として示されるアミノ酸配列に対応し得、第１のリンカー領域３は配列番号１３として示されるアミノ酸配列に対応し得、第２のリンカー領域は、配列番号１４として示されるアミノ酸配列に対応し得る。さらに、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の分析物リガンド付着部位４は、配列番号１１（ＳｐｙＴａｇ配列）として示されるアミノ酸配列に対応し得、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の捕獲タグ５は、配列番号８として示されるアミノ酸配列に対応し得る。
【００８０】
[0084]ある特定の例的実施形態において、本明細書に記載されたナノポアタンパク質コンジュゲート１は、任意の数のタンパク質修飾を含み得る。当業者が認識しているように、そのような修飾は、例えば、ホスフェート（リン酸化）、糖質（グリコシル化）、ＡＤＰ−リボシル（ＡＤＰリボシル化）、脂肪酸（プレニル化、例えば、ミリストイル化およびパルミチル化が挙げられるが、それらに限定されない）、ユビキチン（ユビキチン化）、およびセントリン（セントリン化；ユビキチン化様タンパク質修飾）を含み得る。翻訳後修飾の追加の例には、メチル化、アセチル化（actylation）、ヒドロキシル化、ヨウ素化、およびフラビン結合が挙げられる。
【００８１】
[0085]ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の全部または一部を形成するアミノ酸は立体異性体であり得る。追加として、または代替として、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の全部または一部を形成するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸の修飾、天然に存在しないアミノ酸、翻訳後修飾されたアミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、アミノ酸を模倣するようにデザインされた構築物または構造などであり得る。ナノポアタンパク質コンジュゲート１のペプチドを形成するアミノ酸は、天然に存在するタンパク質中に見出される２０個の一般的なアミノ酸のうちの１個もしくは複数、または修飾型および異常アミノ酸のうちの１個もしくは複数であり得る。ある特定の例的実施形態において、そのアミノ酸はＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸であり得る。
【００８２】
[0086]ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１のアミノ酸配列はまた、１個または複数の修飾型および／または異常アミノ酸を含み得る。修飾型および異常アミノ酸の例には、２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３−アミノアジピン酸（Ｂａａｄ）、β−アミノ−プロピオン酸（Ｂａｌａ、β−アラニン）、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ、ピペリジン酸）、４−アミノ酪酸（４Ａｂｕ）、６−アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３−アミノイソ酪酸（Ｂａｉｂ）、２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、デスモシン（Ｄｅｓ）、２，２’−ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、Ｎ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）、Ｎ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、アロ−ヒドロキシリジン（ＡＨｙｌ）、３−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４−ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、イソデスモシン（Ｉｄｅ）、アロ−イソロイシン（Ａｌｌｅ）、Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｍｅｌｌｅ）、６−Ｎ−メチルリジン（ＭｅＬｙｓ）、Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）が挙げられるが、それらに限定されない。修飾型および異常アミノ酸の他の例は、一般的には、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、第２版、Ａｐｒｉｌ  ２００２、Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｒｕｂｙ  Ｖ  Ｊ、Ａｌ−ｏｂｅｉｄｉ  Ｆ、およびＫａｚｍｉｅｒｓｋｉ  Ｗ：Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６８：２４９〜２６２、１９９０；ならびにＴｏｎｉｏｌｏ  Ｃ：Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３５：２８７〜３００、１９９０（それらの全ての教示は、参照により本明細書に明確に組み入れられている）に記載されている。
【００８３】
分析物検出複合体
[0087]図２は、ある特定の例的実施形態による分析物検出複合体９を示すイラストである。図２を参照して、ナノポアタンパク質コンジュゲート１は、分析物リガンド８と連結されて、分析物検出複合体９を形成することができる。例えば、分析物リガンド８は、ナノポアタンパク質コンジュゲート１と、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の分析物リガンド付着部位４、例えば、付着メンバー６を介して、連結され得る。ある特定の例的実施形態において、リンカーメンバー７は、分析物リガンド８をナノポアタンパク質コンジュゲート１の分析物付着部位４へ間接的に付着させるために用いることができる。
【００８４】
[0088]分析物検出複合体９の分析物リガンド８は、分析物に対する結合親和性を有する任意のリガンドであり得、その分析物は、本明細書に記載されているような任意の分析物である。例えば、分析物リガンド８は、特定の抗原に対する親和性を有する抗体であり得、その抗原が分析物である。この開示を鑑みれば、当業者は理解するように、任意の抗体またはその機能性断片を分析物リガンドとして用いることができる。他の例的実施形態において、分析物検出複合体９の分析物リガンド８は、環境分析物を検出するために用いることができる。ある特定の例的実施形態において、分析物検出複合体９の分析物リガンド８は、複雑な生物学的流体試料、例えば、組織および／または体液において、タンパク質分析物を同定するために用いることができる。
【００８５】
[0089]ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド９が方向づけられる分析物は、生物学的試料、パーソナルケア製品、医薬品、水試料、食品試料、飲料試料、大気試料、栄養培地試料、臨床試料などを含む様々な試料型に存在し得る。ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド９が方向づけられる分析物は、試料の他の成分と比較して低濃度で存在し得る。ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド９はまた、分析物の立体構造または機能的性質に基づいて、高分子分析の亜集団を標的にするように用いることができる。分析物リガンド８の例には、例えば、本明細書に定義されたもの、加えて、アプタマー、抗体もしくはその機能性断片、受容体、および／または標的分析物と結合することが知られているペプチドが挙げられる。アプタマーに関して、アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／または核酸類似体を含む核酸アプタマーであり得る。ある特定の例的実施形態において、アプタマーは、スキャフォールドへ両端において付着した可変性ペプチドループを含むペプチドアプタマーなどのペプチドアプタマーであり得る。アプタマーは、例えば、特定の標的タンパク質分析物と結合するように、選択することができる。
【００８６】
[0090]当業者が認識しているように、分析物と分析物リガンド８は、結合ペアの２つのメンバー、すなわち、２つの異なる分子の１つが第２の分子と化学作用または物理作用を通して特異的に結合する２つの異なる分子を表す。周知の抗原−抗体結合ペアメンバーに加えて、他の結合ペアには、例えば、ビオチンとアビジン、糖質とレクチン、相補性ヌクレオチド配列、相補性ペプチド配列、エフェクターと受容体分子、酵素補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素、ペプチド配列とその配列またはそのタンパク質全体に特異的な抗体、ポリマー酸と塩基、色素とタンパク質結合剤、ペプチドと特異的なタンパク質結合剤（例えば、リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチド、およびリボヌクレアーゼＳ−タンパク質）、糖とボロン酸、および結合アッセイにおいて会合を可能にする親和性を有する類似した分子が挙げられる。
【００８７】
[0091]さらに、分析物リガンド／分析物の結合ペアは、最初の結合メンバーの類似体であるメンバー、例えば、組換え技術または分子操作により作製された、分析物類似体または結合メンバーを含むことができる。分析物リガンドが免疫反応物である場合には、それは、例えば、抗体、抗原、ハプテン、またはその複合体であり得、抗体が用いられる場合には、それは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、組換えタンパク質または抗体、キメラ抗体、それらの混合物または断片、加えて、抗体と他の結合メンバーの混合物であり得る。そのような抗体、ペプチド、およびヌクレオチドの調製、ならびにそれらの結合アッセイにおける結合メンバーとしての使用についての適合性の詳細は、当技術分野においてよく知られている。
【００８８】
[0092]ある特定の例的実施形態において、図２に図解されているように、分析物リガンド８は、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に、付着メンバー６およびリンカーメンバー７を介して連結され得る。付着メンバー６は、分析物リガンド８をナノポアタンパク質コンジュゲート１へ直接的または間接的に付着させるために用いることができる任意のタンパク質、核酸配列、または他の実体であり得る。ある特定の例的実施形態において、付着メンバー６は、ナノポアタンパク質コンジュゲートとイソペプチド結合を形成するために用いることができる。例えば、分析物リガンド付着部位４がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインまたはＳｐｙＴａｇドメインである場合、対応する付着メンバー６は、それぞれ、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列であり得る。したがって、そのような例的実施形態において、分析物リガンド８は、ナノポアタンパク質コンジュゲート１とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇイソペプチド結合を介して繋がれ得る。他の例的実施形態において、付着メンバー６には、システイン−マレイミドコンジュゲートまたはアジド−アルキンクリックケミストリーペアなどの他の共有結合性結合ペアの成分、加えて、トランスグルタミナーゼおよびソルターゼ媒介性付着などの当技術分野において公知の他の連結成分を挙げることができる。
【００８９】
[0093]リンカーメンバー７を含む例的実施形態において、リンカーメンバー７は、分析物リガンド８を付着メンバー６に連結するが、本明細書に記載されているような分析物検出複合体９の機能に干渉しない任意の構造であり得る（図２）。例えば、リンカーメンバーは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーであり得る。ある特定の例的実施形態において、リンカーメンバー７は、約１〜１０個のアミノ酸などの約１５個未満のアミノ酸である。ある特定の例的実施形態において、リンカーメンバーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のいずれか１つとして示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００９０】
[0094]ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド８、リンカーメンバー７、および付着メンバー６は、図２に図解されているように、連続的に配置され得る。追加としてまたは代替として、分析物リガンド８、リンカー７、および付着メンバー６を、単一の実体として調製し、その後、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の分析物付着ドメイン４と付着させることができる。分析物リガンド８、リンカー７、および付着メンバー６のタンパク質成分の遺伝子融合体は、当業者にとって標準の方法を用いて、それらのタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターへ連結させ、その結果として生じたタンパク質を精製することにより作製することができる。
【００９１】
ナノポア構築およびアセンブリ
[0095]図３を参照して、ある特定の例的実施形態による、分析物検出複合体９を含むナノポアアセンブリ１０が提供される。ナノポアアセンブリ１０は、典型的には、脂質膜１１などの基質に埋め込まれた多量体タンパク質構造である。ナノポアアセンブリ１０のタンパク質サブユニットの少なくとも１つが、本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲート１を含む。本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲート１を含むことにより、分析物リガンド８がナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着することができる。さらに、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の使用と共に、ナノポアアセンブリ１０のナノポアタンパク質サブユニットの少なくとも１つは、捕獲タグ５およびナノポア単量体２を含み、ナノポア単量体２は、他のナノポアサブユニットと相互作用して多量体ナノポアを形成する単量体サブユニットの部分である。例えば、捕獲タグ５は、ポアと相互作用するように利用可能であり、そのポアとの相互作用が、本明細書に記載されているような分析物の存在下で改変され得る。
【００９２】
[0096]ナノポアアセンブリ１０のナノポアタンパク質コンジュゲート１は、本明細書に記載されたナノポアタンパク質コンジュゲートのいずれかであり得る。例えば、アルファ−ヘモリシンの場合、ナノポアアセンブリは、７個のアルファ−ヘモリシン単量体のオリゴマー（すなわち、七量体ナノポアアセンブリ）である。七量体ナノポアアセンブリの単量体アルファ−ヘモリシンサブユニットは、同じポリペプチド配列の同一のコピーであり得、またはそれらは、アルファ−ヘモリシンサブユニットの少なくとも１個が、本明細書に記載されているような捕獲タグ５と会合する限り、異なるアルファ−ヘモリシンポリペプチド配列であり得る。例えば、ナノポアアセンブリは、（合計７個のオリゴマー形成されたアルファ−ヘモリシンサブユニットとして）１個のナノポアタンパク質コンジュゲート１、および捕獲タグ５と連結されていない６個のアルファ−ヘモリシン単量体を含み得る。そのような実施形態において、７個のサブユニットのそれぞれのアルファ−ヘモリシンドメインは同じであり得、またはアルファ−ヘモリシンは、アルファ−ヘモリシン単量体とそのバリアントの混合物であり得る。
【００９３】
[0097]ある特定の例的実施形態において、ナノポアアセンブリ１０のナノポアタンパク質コンジュゲート１（七量体の「１個」の成分）は、配列番号４として示される配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列である。さらに、ある特定の例的実施形態において、他のナノポア単量体のうちの１個または複数（すなわち、七量体の「６個」の成分のうちの１個または複数）は、配列番号５として示される配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【００９４】
[0098]ナノポアアセンブリ２は、当技術分野において公知の任意の方法により調製することができる。例えば、本明細書に記載されたナノポアアセンブリは、ＷＯ２０１４／０７４７２７に記載された方法にしたがって、アセンブルされ得、そのＷＯ２０１４／０７４７２７は、規定数の修飾型サブユニットを有する多量体タンパク質を形成するための方法を提供する（ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２７参照；ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７４３３もまた参照）。ある特定の例的実施形態において、ナノポアアセンブリ１０は、ナノポアタンパク質コンジュゲート１をナノポアタンパク質単量体と混合することにより形成することができる。例えば、アルファ−ヘモリシンナノポアの場合、界面活性剤（例えば、デオキシコール酸）が、アルファ−ヘモリシン単量体をポア立体構造の形をとるように誘発することができる。ナノポアはまた、例えば、脂質（例えば、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）または１，２−ジ−０−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ））および中等度の温度（例えば、約１００℃未満）を用いて、形成することができる。場合によっては、ＤＰｈＰＣをバッファー溶液と混合することが、大型多層状ベシクル（ＬＭＶ）を生じ、この溶液にアルファ−ヘモリシンサブユニットを加えて、その混合物を４０℃で３０分間、インキュベートすることが、ポア形成を生じる。
【００９５】
[0099]本明細書に記載された方法およびシステムは捕獲タグ５のナノポアセンブリ１０との相互作用に依存するため、ナノポアセンブリ１０と会合した単一の捕獲タグ５のみを有することが（複数の捕獲タグ５よりむしろ）有益であり得る。ＯｍｐＧアセンブリなどの非多量体ナノポアアセンブリに関して、ＯｍｐＧナノポアドメインを含む単一のナノポアタンパク質コンジュゲート１が、ナノポアアセンブリを形成するために用いることができる。アルファ−ヘモリシンナノポアアセンブリなどの多量体ナノポアアセンブリの場合、ナノポアアセンブリ１０は、単一のナノポアタンパク質コンジュゲート１のみが、そのアセンブリ内に含まれる（および、したがって、単一の捕獲タグ５のみが存在する）ように調製することができる。
【００９６】
[00100]ある特定の例的実施形態において、ＳｐｙＴａｇドメインなどの、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の分析物リガンド付着部位４は、単一のナノポアタンパク質コンジュゲート１（および、したがって、単一の捕獲タグ５）を含むアルファ−ヘモリシン七量体について選択するために用いることができる。例えば、ナノポアタンパク質コンジュゲート１をアルファ−ヘモリシンタンパク質単量体と混合することが、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のナノポアタンパク質コンジュゲートを有する七量体を生じる。しかし、各七量体と会合した異なる数（０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個）のＳｐｙＴａｇ配列のために、七量体は異なる電荷を有する。したがって、ある特定の例的実施形態において、七量体は、陽イオン交換クロマトグラフィでの溶出によるなど、当技術分野において公知の方法によって分離することができる。その後、溶出した画分は、どの画分が単一のＳｐｙＴａｇを有するアセンブリを含むかを決定するために調べることができる。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７４３３参照。
【００９７】
[00101]どの七量体画分が単一のＳｐｙＴａｇを含有する（および、したがって、七量体あたり単一のポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質のみを結合する能力がある）かを決定するのに様々な方法が適し得るが、ある特定の例的実施形態において、異なる七量体画分は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによるなどの分子量に基づいて分離することができる。その後、各画分と会合したＳｐｙＴａｇの存在を確認するために試薬が用いられ得る。例えば、参照により本明細書に明確に組み入れられている、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７４３３に記載されているように、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分離前に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が画分に加えられ得る。
【００９８】
[00102]より少ない数のナノポアタンパク質コンジュゲート（および、したがって、より少ないＳｐｙＴａｇ）を有する七量体は、より多い数のナノポアタンパク質コンジュゲート（および、したがって、より多いＳｐｙＴａｇ）を有する七量体より小さいため、単一のＳｐｙＴａｇ、および、したがって、単一のナノポアタンパク質コンジュゲート１を有する画分は、そのバンドに対応するＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにおいて、最も遠いバンド泳動およびＧＦＰ蛍光の存在によって証明されるように、同定することができる。例えば、７個のアルファ−ヘモリシン単量体を含有する（しかし、ナノポアタンパク質コンジュゲートを含まない）画分は、最も遠くに泳動するが、その七量体に結合したＳｐｙＴａｇの非存在のためにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰと混合した場合に蛍光を発しないと予想される。しかし、単一のＳｐｙＴａｇを含有する画分は、（他の蛍光バンドと比較して）その次に最も遠く泳動し、かつ蛍光を発し、それにより、単一のナノポアタンパク質コンジュゲート１（および、したがって、単一の捕獲タグ５）を含有する画分の同定を容易にする。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７４３３参照。追加の捕獲タグ５を有するナノポアセンブリが望まれ得る例的実施形態において、そのような泳動シフト分析が同様に、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のナノポアタンパク質コンジュゲート１（および、したがって、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個の捕獲タグ５）を有するアルファ−ヘモリシンナノポア画分を同定するために用いることができる。
【００９９】
分析物検出複合体を形成するための分析物リガンドの付着
[00103]分析物検出複合体９を含むナノポアアセンブリ１０を調製するために（図３）、分析物リガンド８をナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させる。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１が膜へ組み入れられる前に、分析物リガンド８を、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させることができる。他の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート１が膜へ組み入れられた後に、分析物リガンド８をナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させることができる。例えば、ナノポアアセンブリ１０が、ＯｍｐＧ単量体などの他の単量体とオリゴマー形成しないポリン単量体を含む場合、ナノポアタンパク質コンジュゲート１が脂質膜へ組み入れられる前に、またはナノポアタンパク質コンジュゲート１がその膜へ組み入れられた後に、分析物リガンド８を、ＯｍｐＧナノポアタンパク質単量体２を含むナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させることができる。
【０１００】
[00104]同様に、ナノポアアセンブリ１０が、例えば、アルファ−ヘモリシンナノポアである場合、ナノポアタンパク質コンジュゲート１が多量体ナノポアアセンブリ１０へ組み入れられる前または後に、分析物リガンド８を、アルファ−ヘモリシンナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させることができる。例えば、アルファ−ヘモリシン七量体ナノポアは、アルファ−ヘモリシンナノポアタンパク質単量体２を有する単一のナノポアタンパク質コンジュゲート１を含むように、本明細書に記載されているようにアセンブルされ得る。その後、アルファ−ヘモリシン七量体ナノポアのアセンブリの後、そのナノポアアセンブリ１０がアセンブルされた後、分析物リガンド８を、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させ、それにより、ナノポアの一部としての分析物検出複合体９を含むナノポアアセンブリ１０を形成することができる。他の例的実施形態において、アルファ−ヘモリシン七量体ナノポアアセンブリの形成前に、分析物リガンド８を、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させることができる。その後、アルファ−ヘモリシン分析物検出複合体９を、本明細書に記載されているような他のナノポアタンパク質単量体と混合して、アルファ−ヘモリシンナノポアアセンブリ１０を形成することができる。
【０１０１】
[00105]分析物リガンド８は、当技術分野において公知の任意の方法により、ナノポアタンパク質コンジュゲート１（および、したがって、ナノポアアセンブリ１０）に付着させることができる。ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド８をナノポアタンパク質コンジュゲート１に付着させることは、一般的に、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の分析物リガンド付着部位４としてリンカー配列またはリンカー分子を含むことを含む。その後、分析物リガンド８が、分析物リガンド付着部位４のリンカー配列への付着メンバー６の付着を介して、分析物リガンド付着部位４に付着することができる。例えば、付着メンバー６は、ナノポアタンパク質コンジュゲート１の分析物リガンド付着部位４に分析物リガンド８を連結するように、分析物リガンド付着部位４と結合し、または相互作用する配列または他の分子であり得る。
【０１０２】
[00106]追加としてまたは代替として、分析物リガンド８を、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に、任意の適切な化学作用（例えば、共有結合および／またはリンカー）を用いて、付着させることができる。ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド８を、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に、分子ステープルを用いて付着させる。ある特定の例的実施形態において、分子ステープルは、３つのアミノ酸配列（リンカーＡ、Ｂ、およびＣと表示される）を含む。リンカーＡは、ナノポアタンパク質コンジュゲート１から、例えば、分析物リガンド付着部位４から伸び得る。リンカーＢは、分析物リガンド８から、例えば、分析物リガンド８と会合した付着メンバー６から伸び得る。そして、リンカーＣは、リンカーＡとリンカーＢを（例えば、リンカーＡとリンカーＢの両方に巻き付くことにより）結合し、それにしたがって、分析物リガンド８をナノポアタンパク質コンジュゲート１に連結することができる。リンカーＣはまた、リンカーＡまたはリンカーＢの一部であるように構築することができ、したがって、リンカー分子の数が減らされる。
【０１０３】
[00107]ある特定の例的実施形態において、生理学的条件下で自発的に共有結合性イソペプチド結合を形成するＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系が、ナノポアタンパク質コンジュゲート１を分析物リガンド８に連結するために用いることができる。例えば、Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｊａｎ  ２３；４２６（２）：３０９〜１７参照。例えば、分析物リガンド付着部位４としてＳｐｙＴａｇドメインを有するナノポアタンパク質コンジュゲート１が発現し得る。さらに、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に連結されるべき分析物リガンド８は、付着メンバー６としてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを含み得る。ＳｐｙＴａｇ／ナノポアタンパク質コンジュゲート１をＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／分析物リガンド８と混合することにより、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質は相互作用して、共有結合性イソペプチド結合を介して分析物リガンド８に連結されているナノポアタンパク質コンジュゲート１を形成し、それにより、本明細書に記載されているような分析物検出複合体９を形成する。例えば、Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｊａｎ  ２３；４２６（２）：３０９〜１７参照。
【０１０４】
分析物を検出するためのシステムおよび方法
[00108]本明細書に記載されているような分析物検出複合体９を含むナノポアアセンブリ１０を用い、かつそれに頼ることにより、ある特定の例的実施形態において、流体溶液などの試料において分析物を検出するためのシステムおよび方法が提供される。分析物を検出するために、ある特定の例的実施形態において、分析物検出複合体１０を含むナノポアアセンブリ１０は、膜内に埋め込まれ、検知電極が、その膜に隣接して、またはその近くに位置づけられる。例えば、本明細書に記載されたナノポアアセンブリ１０は、集積回路などの検知回路の検知電極に隣接して配置された膜内に形成されるか、またはそれ以外の方法で埋め込まれ得る。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であり得る。ある特定の例的実施形態において、集積回路は、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検知回路は、ナノポアを含むチップもしくは他のデバイスに、またはオフチップ構成としてなどチップもしくはデバイスから離れて、置くことができる。半導体は、任意の半導体であり得、それには、非限定的に、ＩＶ族（例えば、シリコン）およびＩＩＩ−Ｖ族半導体（例えば、ガリウムヒ素）が挙げられる。本明細書に記載された組成物および方法にしたがって用いることができる装置およびデバイス設定について、例えば、ＷＯ２０１３／１２３４５０（その全内容は参照により本明細書に明確に組み入れられている）を参照されたい。
【０１０５】
[00109]当業者が認識しているように、ポアに基づいたセンサー（例えば、バイオチップ）は、単一分子の電子的問い合わせ分析について用いることができる。ポアに基づいたセンサーは、検知電極に隣接してまたはその近くに配置される膜内に形成される本明細書に記載されているようなナノポアアセンブリ１０を含み得る。センサーは、例えば、対電極を含み得る。膜は、トランス側（すなわち、検知電極に対面する側）およびシス側（すなわち、対電極に対面する側）を含む。したがって、膜内に配置されるナノポアアセンブリもまた、トランス側（すなわち、検知電極に対面する側）およびシス側（すなわち、対電極に対面する側）を含み得る。分析物検出複合体９の分析物リガンド８は、例えば、膜のシス側に位置する。
【０１０６】
[00110]分析物を検出するために、本明細書に提供された方法、システム、および組成物は、捕獲タグ５のナノポアアセンブリ１０による捕獲速度の測定および分析に依存する。捕獲事象は、全体として本明細書に組み入れられている、「Ｐｅｒｉｏｄ−ｔｏ−Ｐｅｒｉｏｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＣ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」という名称である、ＷＯ／２０１７／２２０７３２に記載されているように、期間対期間（またはｐ２ｐ）の差分法を用いて同定することができる。簡単に延べれば、捕獲事象は、ＡＣサイクルの明期部分または暗期部分のいずれかのＡＤＣシグナルが、閾値ｐ２ｐ差分値より上である場合に検出される。時間の任意の所定のスライドウィンドウにおける捕獲事象の数が、捕獲速度を示す。捕獲タグが正味負電荷を有する場合、捕獲は、ＡＣサイクルの明期部分にあり、一方、正味正電荷を有する捕獲タグは、ＡＣサイクルの暗期部分で捕獲されると予想される。ＷＯ／２０１７／２２０７３２参照。
【０１０７】
[00111]ある特定の例的実施形態において、ナノポアアセンブリ１０およびその会合した分析物検出複合体９が膜内に配置された時点で（図３参照）、捕獲タグ５の第１の捕獲速度が検知電極によって決定され得る。第１の捕獲速度は、例えば、結合される分析物リガンド８単独の存在下での（すなわち、分析物リガンドと結合されることになっている分析物の存在なしでの）捕獲タグ５の捕獲速度に対応する。すなわち、本明細書で用いられる場合、第１の捕獲速度は、分析物リガンド８が結合親和性を有する任意の分析物を分析物リガンドが結合する前の、ナノポアアセンブリ１０による捕獲タグ５の捕獲速度に対応する。したがって、第１の捕獲速度は、ナノポアアセンブリを含むチップが、分析物を含む試料と接触する前に決定され得る。他の例的実施形態において、第１の捕獲速度は、分析物が分析物検出複合体の分析物リガンド８から解離しているポアの状態を表す。いずれにしろ、第１の捕獲速度は、分析物リガンドが非結合状態である（すなわち、リガンドが結合していない）、分析物検出複合体９を含むナノポアアセンブリ１０を示し得る。
【０１０８】
[00112]ある特定の例的実施形態において、第１の捕獲速度は、分析物リガンド８がナノポアタンパク質コンジュゲート１、および、したがって、ナノポアアセンブリと結合しているという指標を提供するために、ベースライン捕獲速度から区別することができる。例えば、分析物リガンド８が、ナノポアの形成後、ナノポアタンパク質コンジュゲート１と連結される例的実施形態において、ナノポアの捕獲速度は、分析物リガンド８がナノポアタンパク質コンジュゲート１に連結される前に決定され得る。すなわち、ナノポアの捕獲速度は、分析物リガンド８の非存在下で決定され得る。その後、分析物リガンド８が、ナノポアタンパク質コンジュゲート１に連結されて、分析物検出複合体９を形成することができ、第１の捕獲速度がそのナノポアから決定され得る。
【０１０９】
[00113]いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲート１への分析物リガンド８の付着に関して、分析物リガンド８と捕獲タグ５との近接が、捕獲タグ５のナノポアとの相互作用を変化させると考えられる。例えば、分析物リガンド８が、捕獲タグ５のナノポアとの会合を立体的に邪魔し得る。したがって、ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド８の存在が、捕獲タグ５のナノポアアセンブリ１０による捕獲速度を減少させ得る。ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド８の存在が、捕獲タグ５のナノポアアセンブリによる捕獲速度を増加させ得る。いずれにしろ、そのような捕獲速度の増加または減少が、例えば、第１の捕獲速度（すなわち、分析物リガンド８がナノポアタンパク質コンジュゲート１と結合している）をベースライン捕獲速度（分析物リガンドはナノポアタンパク質コンジュゲート１と結合していない）と比較することにより、決定することができる。例えば、ベースライン捕獲速度と第１の捕獲速度の間でのそのような捕獲速度の変化は、ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド８が、ナノポアタンパク質コンジュゲート１と成功裏に結合しているという指標を提供し得る。
【０１１０】
[00114]ある特定の例的実施形態において、第１の捕獲速度（すなわち、分析物リガンド８が結合している）とベースライン捕獲速度（分析物リガンド８が付着しているが、分析物は結合していない）の差は、捕獲タグ５への干渉のレベルに基づいて非常に変動しやすいと考えられる。ある特定の例的実施形態において、第１の捕獲速度は、ベースライン捕獲速度より約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％大きいか、またはそれより大きくてもよい。ある特定の例的実施形態において、第１の捕獲速度は、ベースライン捕獲速度と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、もしくは２００％減少しているか、またはそれより多く減少していてもよい。
【０１１１】
[00115]第１の捕獲速度を決定した後、ナノポアアセンブリ１０および会合した分析物検出複合体９を含有するチップを、標的分析物について試験される試料溶液などの流体溶液と接触させ得る。標的分析物の存在について流体溶液を試験するために、流体溶液を、ナノポアアセンブリ１０を含むチップに渡って流し、それにより、ナノポアアセンブリ１０を流体溶液と接触させることができる。例えば、ナノポアアセンブリ１０は、本明細書に記載されているような少なくとも１つの分析物検出複合体９を含むように配置され、分析物検出複合体９の分析物リガンド８が標的分析物に対する結合親和性を有する。流体を、ナノポアに渡って流した場合、（存在する場合）標的分析物は、分析物リガンド８と相互作用することができ、それにより、分析物リガンド８を結合することができる。逆に、標的分析物が流体溶液に存在しない場合には、そのような分析物リガンド８との結合は起こり得ない。試験され得る流体溶液は、例えば、標的分析物を含む（または含む可能性がある）、本明細書に記載されているような任意の生物学的流体、流体試料、または他の試料を含み、またはそれからなり得る。
【０１１２】
[00116]ナノポアアセンブリが流体溶液と接触した時点で、捕獲タグ５のナノポアアセンブリ１０による第２の捕獲速度が決定され得る。その後、第２の捕獲速度は、分析物検出複合体９の分析物リガンド８が標的分析物と結合したかどうかという指標を提供し得る。したがって、第２の捕獲速度は、標的分析物が、試験された流体溶液に存在するかどうかという指標を提供し得る。例えば、標的分析物が分析物リガンド８と結合している場合、第２の捕獲速度は、第１の捕獲速度とは異なり得る。ある特定の例的実施形態において、分析物が分析物リガンド８と結合している場合、第２の捕獲速度は、第１の捕獲速度に対して増加し得る。他の例的実施形態において、標的分析物が分析物リガンド８と結合している場合、第２の捕獲速度は、第１の捕獲速度に対して減少し得る。いずれにしろ、第１の捕獲速度と比較した場合の、異なる第２の捕獲速度は、標的分析物がナノポアアセンブリ１０の分析物リガンド８と結合している（および、したがって、標的分析物が流体溶液に存在する）という指標を提供し得る。
【０１１３】
[00117]いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、標的分析物の分析物リガンド８との結合に関して、標的分析物／分析物リガンドの結合ペアと捕獲タグ５との近接が、捕獲タグ５のナノポアとの相互作用を変化させると考えられる。例えば、標的分析物／分析物リガンドの結合ペアは、捕獲タグ５のナノポアとの会合を立体的に邪魔し、それにより、（第１の捕獲速度に対して）減少した第２の捕獲速度を生じ得る。あるいは、やはり再び、いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ある特定の例的実施形態において、（結合ペアを形成し得る）標的分析物と分析物リガンド８の結合は、（結合した分析物がない）分析物リガンド８単独によって課せられる立体障害を低下させ、それにより、（第１の捕獲速度に対して）増加した第２の捕獲速度を生じ得る。したがって、第１の捕獲速度から第２の捕獲速度への捕獲速度の変化は、流体溶液において分析物を検出するために用いることができる。
【０１１４】
[00118]ある特定の例的実施形態において、第２の捕獲速度（すなわち、分析物が存在し、かつ結合している）と第１の捕獲速度（分析物リガンド８が付着しているが、分析物は結合していない）の間の差は、捕獲タグ５への干渉のレベルに基づいて非常に変動しやすいと考えられる。ある特定の例的実施形態において、第２の捕獲速度は、第１の捕獲速度より約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、もしくは２００％より大きいか、またはそれより大きくてもよい。ある特定の例的実施形態において、第２の捕獲速度は、第１の捕獲速度と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、もしくは２００％減少しているか、またはそれより多く減少していてもよい。
【０１１５】
[00119]ある特定の例的実施形態において、分析物を検出することに加えて、検出された分析物の特定の同一性が、分析物リガンド８の同一性に基づいて決定することができる。例えば、分析物リガンド８が、特定のペプチドへ方向づけられたナノボディであり、かつ第２の捕獲速度が、そのペプチドが、試験された試料に存在するという指標を提供したならば、試料に存在するペプチドの同一性が決定され得る。換言すれば、分析物を検出するために本明細書に記載されているように用いられる任意の公知の分析物リガンド８が、分析物の同一性を決定するために用いることができる。
【０１１６】
[00120]この開示に基づいて当業者が認識しているように、本明細書に記載された方法、システム、および組成物は、様々な実践的適用に用いることができる。例えば、本明細書に記載された方法、システム、および組成物は、未知の分析物についての試料のスクリーニングを促進するために用いることができる。そのような例的実施形態において、分析物検出複合体９は、分析物リガンド８として公知の細胞受容体の結合ドメインを含むように構成することができる。ナノポアアセンブリ１０を含むチップに適用される流体溶液は、例えば、その受容体の潜在的アゴニストまたはアンタゴニストなどの分析物を含有する画分の１つまたは複数を有する、複数の画分のうちの１つであり得る。本明細書に記載されているような各画分を試験することにより、分析物リガンド８（すなわち、受容体ドメイン）に対する分析物を含む画分が決定され得る。
【０１１７】
[00121]ある特定の例的実施形態において、本明細書に記載された方法、組成物、およびシステムは、単一のチップ上で、単一の流体試料における複数の異なる分析物の存在についてスクリーニングするために用いることができる。当業者が認識しているように、現在のチップテクノロジーは、単一チップ上の何十万個（またはそれより多く）ものナノポアの沈着を可能にする。したがって、本明細書に記載された方法および組成物を用いることにより、それぞれが分析物検出複合体を含む複数の異なるナノポアアセンブリ１０は、複数の異なる分析物について流体試料を試験するために同じチップ上で用いることができる。例えば、ナノポアアセンブリ１０の個々のセットが、各セットが異なる分析物を検出するように配置されて、本明細書に記載されているようにアセンブルされ得る。
【０１１８】
[00122]そのような例的実施形態において、ナノポアアセンブリ１０の１つのセットは、分析物Ａに対する分析物リガンド８を含み得、一方、ナノポアアセンブリ１０の別のセットは、分析物Ｂに対する分析物リガンド８を含み得る。分析物Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆなどに対して方向づけられたものなど、複数の他のナノポアアセンブリ１０が、同様に、同じチップ上に配置され得、その結果、チップは、複数の異なる分析物を検出することができる。ある特定の例的実施形態において、ベースライン捕獲速度は、各ナノポアアセンブリについて決定され得、ベースライン捕獲速度は、分析物リガンド８が本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲート１と連結されているという指標を提供するために、本明細書に記載されているように第１の捕獲速度と比較することができる。
【０１１９】
[00123]追加としてまたは代替として、単一の流体試料を、本明細書に記載されているようなチップ（および、したがって、複数の異なるナノポアアセンブリ）と接触させることができる。その後、ナノポアアセンブリ１０のそれぞれについて、第２の捕獲速度が、本明細書に記載されているように、決定され、第１の捕獲速度と比較され、それにしたがって、ナノポアアセンブリ１０の各異なるセットについての異なる分析物リガンドの検出を可能にすることができる。その後、各ポアについて、第２の捕獲速度は、それに対して、そのポアの分析物リガンド８が方向づけられている標的分析物が試料に存在するかどうかという指標を提供することができる。したがって、複数のポアは、複数の異なる分析物を検出するために用いることができる。
【０１２０】
[00124]チップ上に配置された異なるナノポアアセンブリを区別するために、様々な技術を用いることができ、かつ利用可能である。例えば、ナノポアアセンブリの異なる群に異なる捕獲タグ５を用いることができ、その結果、異なるベースライン捕獲速度が、異なるナノポアアセンブリ１０を同定するために用いることができる。例えば、公知のベースライン捕獲速度を有する捕獲タグ５は、分析物Ａに方向づけられたナノポアアセンブリ１０の１つのセットに関して用いることができ、一方、異なるベースライン捕獲速度を有する異なる捕獲タグ５が、分析物Ｂに方向づけられたナノポアアセンブリ１０のセットと共に用いることができる。その後、その２つの異なるナノポア集団は、異なるベースライン捕獲速度によって区別することができる。
【０１２１】
[00125]追加としてまたは代替として、より小さいまたはより大きいポアサイズを有するポアなどの異なるポアタイプを用いることができ、当技術分野において公知の技術に基づいて容易に区別することができる。そのような構成に関して、例えば、より大きい開口を有するナノポアは、より小さい開口を有するポアより大きい電流シグナルを与え、それにしたがって、同じチップ上でのポアの区別を可能にすることができる。その後、異なるポアは、それらが検出するように構成されている分析物と相互に関連付けられ、それにしたがって、同じチップ上で異なる分析物の同定を可能にすることができる。区別の他の方法には、捕獲タグの遮断レベル、本明細書に記載されているような分析物の非存在下での捕獲タグ捕獲の速度、およびナノポアの電流−電圧プロファイルが挙げられる。
【０１２２】
[00126]他の例的実施形態において、１つまたは複数の異なる捕獲タグが、ナノポアのトランス側に位置し、それにより、異なるポアのセットを同じチップ上で区別することができるという追加の方法を提供することができる。そのような例において、第２の捕獲タグが、ナノポアのトランス側に付着して、ＡＣサイクルの暗期中に遮断を生じ得る。これらの暗期側捕獲もまた、捕獲の速度および捕獲タグのレベルによりお互いから区別され得る。ＷＯ／２０１７／２２０７３２参照。
【０１２３】
[00127]図４Ａ〜４Ｃは、ある特定の例的実施形態により、ベースライン捕獲速度、第１の捕獲速度、および第２の捕獲速度と関連しているナノポアアセンブリの様々な状態を示すイラストである。図４Ａに示されているように、ナノポアアセンブリは、捕獲タグ（すなわち、図示されているようなペプチドタグ５）と共に、（図１に示されているような）ナノポアタンパク質コンジュゲート１を含む。点線は、ペプチドタグとナノポアのポアとの相互作用を図示し、その相互作用は、結果として、検出可能なベースライン捕獲速度を生じる。示されているように、分析物リガンド（例えば、ナノボディ）は、ナノポアアセンブリにまだ連結されていない（図４Ａ）。図４Ｂに示されているように、ナノポアアセンブリは、（図１に記載されているような）ナノポアタンパク質コンジュゲート１を、付着したナノボディ８と共に含む。したがって、ナノポアアセンブリは、本明細書に記載されているような分析物検出複合体を含む。捕獲タグ（すなわち、ペプチドタグ５）もまた示され、点線が捕獲タグのナノポアとの相互作用を示し、その相互作用の結果として、検出可能な第１の捕獲速度を生じる（図４Ｂ）。図４Ｃに示されているように、分析物（例えば、抗原）が、分析物検出複合体の分析物リガンド（例えば、ナノボディ８）とここで、結合しており、その結果として、捕獲タグの検出可能な第２の捕獲速度（図示されているように、ペプチドタグの捕獲）を生じる。
【０１２４】
分析物濃度を決定するための方法
[00128]分析物を検出および同定することに加えて、本明細書に記載された方法、システム、および組成物は、流体溶液中の分析物の濃度を決定するために用いることができる。例えば、第１の捕獲速度および第２の捕獲速度は、それぞれ、非結合状態から分析物が結合した状態へ遷移する所定のナノポアに対応するため、第１の捕獲速度から第２の捕獲速度へ、そして、第１の捕獲速度へ戻る、捕獲速度の変化は、分析物リガンドと分析物の間での会合／解離速度を決定するために用いることができる。その後、分析物リガンドと分析物の間の公知の結合特性に加えて、会合／解離速度が、試料中の分析物についての濃度情報を決定するために、公知の速度論的方法と共に用いることができる。
【０１２５】
[00129]分析物の濃度を決定するために、本明細書に記載されているような分析物の存在を検出するための方法を実施することができ、分析物／リガンドのペアの間での会合／解離速度が、第１および第２の捕獲速度遷移から決定される。例えば、本明細書に記載されているような分析物検出複合体９を含むナノポアアセンブリ１０は、チップの膜内に配置される。その後、１つまたは複数の検知電極が、分析物検出複合体９を含むナノポアアセンブリ１０の近くに置かれる。その後、第１の捕獲速度が、本明細書に記載されているようなナノポアアセンブリ１０について決定され、その第１の捕獲速度が、結合した分析物の非存在下で分析物リガンド８がナノポアアセンブリ１０のナノポアタンパク質コンジュゲート１と結合しているポア状態に対応する。
【０１２６】
[00130]その後、チップ（および、したがって、その上に配置されたナノポアアセンブリ１０）を、分析物リガンドを含む試料などの流体試料と接触させ、捕獲速度を連続的にモニターすることができる。ナノポアアセンブリ１０を分析物と接触させることは、分析物の分析物リガンド８との結合を可能にし、したがって、本明細書に記載されているような第１の捕獲速度から第２の捕獲速度への遷移の同定を可能にする。例えば、第２の捕獲速度は、分析物がここで、本明細書に記載されているような分析物リガンドと結合しているポア状態に対応する。
【０１２７】
[00131]第１の捕獲速度から第２の捕獲速度への遷移の同定後、第２の捕獲速度の連続的測定により、第２の遷移、すなわち、第２の捕獲速度が遷移して、第１の捕獲速度（またはおよそそれくらい）へ戻る時点の同定が可能になる。すなわち、捕獲速度の連続的測定を用いて、第１の捕獲速度（またはおよそそれくらい）への復帰を同定することができ、第１の捕獲速度への復帰は、分析物と分析物リガンド８が結合しなくなったポア状態に対応する。換言すれば、第２の捕獲速度から第１の捕獲速度（またはおよそそれくらい）へ戻る第２の遷移は、分析物−リガンド結合ペアの解離に対応する。
【０１２８】
[00132]ある特定の例的実施形態において、分析物−リガンドのペアについての結合状態で費やされる時間は、第１の遷移と第２の遷移の間の時間間隔を測定することにより決定することができる。同様に、ある特定の例的実施形態において、分析物−リガンドのペアが非結合状態で費やす時間は、分析物の存在下で第１の捕獲速度から第２の捕獲速度へ戻る遷移の長さを測定することにより決定することができる。その後、結合反応についての分析物と分析物リガンド８の間の会合／解離速度は、同定された捕獲速度遷移から、特に、ナノポアが結合状態にある時間の長さ対非結合状態である時間の長さから、決定することができる。例えば、会合速度（Ｋａ）を決定するために、所定の結合反応についての個々の捕獲間の時間が記録されて、その結合反応を表現する方程式に適合され得る。方程式は、例えば、分析物と分析物リガンド８の間の結合機構（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用、アプタマー−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−化学物質など）に依存して、単一指数方程式または別の型の方程式であり得る。結合反応についての解離速度（Ｋｄ）を決定するために、結合ドウェル時間および各結合事象の持続時間が収集され、記録され、解離反応を表現する方程式に適合される。これは、結合反応に関連した解離機構に依存して、単一指数方程式または別の型の方程式であり得る。
【０１２９】
[00133]いったん特定の結合反応について会合および／または解離速度が決定されたならば、ＫａおよびＫｄは、公知の速度論的方法および原理に沿って、分析物の濃度を逆算するために用いることができる。例えば、チップのナノポア濃度、抗原−リガンド（すなわち、分析物−ポア）濃度、およびＫａ／Ｋｄがわかっている場合、分析物の濃度は、以下の速度論的方程式から容易に決定することができる：
【数１】
2021513962.tif 000003
式中、ｋａ／ｋｄ＝（［分析物］×［ポア］）／［分析物−リガンド］である。遊離分析物の濃度は、［分析物］＝（ｋａ／ｋｄ）×［分析物−ポア］／［ポア］によって決定することができる。したがって、分析物の全濃度は、［分析物−ポア］＋［分析物］である。様々なパラメータ、すなわち、ｋａ、ｋｄ、［ポア］、および［ポア−分析物］は全て、本明細書に記載されているようなチップ上で測定することができる。例えば、分析物−リガンド濃度は、分析物を結合すると同定されているポアの数に基づいて決定することができる。第１の捕獲速度から第２の捕獲速度へ、および、その後、第１の捕獲速度（またはおよそそれくらい）へ戻る遷移の例は、例えば、（下記で論じられる）図５Ｃに示されている。
【０１３０】
[00134]この開示に基づいて当業者が認識しているように、本明細書に記載されたナノポアアセンブリは、（分析物検出と濃度決定の両方についての）本明細書に記載された方法およびシステムと適合し得る他の構成をもつことができる。例えば、ある特定の例的実施形態において、本明細書に記載された捕獲タグは、分析物リガンドと直接的または間接的に付着することができる。そのような実施形態において、ナノポアアセンブリは、コンジュゲートタンパク質が、ナノポアタンパク質単量体および分析物リガンド付着部位を含むナノポアタンパク質コンジュゲートを含むように構成することができる。その後、捕獲タグを含む分析物リガンドを、分析物リガンド付着部位と付着させ、それにより、捕獲タグが、ナノポアタンパク質コンジュゲートよりむしろ、分析物リガンドと直接的または間接的に付着している分析物検出複合体を形成することができる。ある特定の例的実施形態において、捕獲タグを有する分析物リガンドを、ナノポアが脂質膜内に形成された後、コンジュゲートタンパク質の分析物リガンド付着部位と付着させることができる。他の例的実施形態において、捕獲タグを有する分析物リガンドを、その複合体が脂質膜へ組み入れられる前に、コンジュゲートタンパク質の付着部位と連結させることができる。
【０１３１】
[00135]他の例的実施形態において、ナノポアタンパク質単量体および捕獲タグを含むナノポアタンパク質コンジュゲートを、分析物リガンドを含む少なくとも１個の他のナノポア単量体と組み合わせることができる。例えば、アルファ−ヘモリシンナノポアは、その１つの成分が捕獲タグを含むナノポアコンジュゲートであり、その他の６個のアルファ−ヘモリシン単量体のうちの１個が分析物リガンドを含むように形成することができる。したがって、アルファ−ヘモリシンナノポアアセンブリは、単一の捕獲タグおよび単一の分析物リガンドを有する１：６七量体である。他の例的実施形態において、分析物リガンドを、七量体のアルファ−ヘモリシン単量体のうちの１個、２個、３個、４個、５個、または６個と付着させることができ、その残りのアルファ−ヘモリシン単量体が捕獲タグを含む。他の例的実施形態において、捕獲タグを、複数のアルファ−ヘモリシン単量体上に置くことができ、七量体の単量体の他の１個または複数が分析物リガンドを含む。そのようなナノポアは、例えば、本明細書に記載されているように、移動シフト分析を用いて、同定することができる。
【実施例】
【０１３２】
[00136]本発明は、以下の実施例にさらに詳細に記載され、その実施例は、特許請求されている本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。添付の図は、本発明の明細および記載の不可欠な部分として考慮されるよう意図される。引用された全ての参考文献は、本明細書に記載されている全てのために、参照により本明細書に具体的に組み入れられている。以下の実施例は、例証するために提供されるが、特許請求されている発明を限定するためではない。
【０１３３】
[00137]本明細書に用いられる場合、以下の略語が適用される：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（正常）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）。
【０１３４】
実施例１
タンパク質発現および回収
[00138]この実施例は、細菌宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのタンパク質の発現および回収を例証する。より具体的には、この実施例は、α−ＨＬナノポアタンパク質コンジュゲート（α−ＨＬサブユニット／ＳｐｙＴａｇ／捕獲タグ配列、配列番号４）、α−ＨＬサブユニットバリアント（配列番号５）、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列を有するＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）、およびＧＦＰ分析物（配列番号１０）の発現および回収を記述する。
【０１３５】
α−ＨＬナノポアタンパク質コンジュゲート（配列番号４）の調製
[00139]α−ＨＬサブユニット／ＳｐｙＴａｇ／捕獲タグタンパク質（配列番号４）を、ナノポアタンパク質コンジュゲートとして調製し、そのコンジュゲートの捕獲タグドメインが配列番号８として示される配列に対応し、そのコンジュゲートのα−ＨＬ単量体が配列番号１６に対応する。α−ＨＬサブユニット／ＳｐｙＴａｇ／捕獲タグタンパク質（配列番号４）を調製するために、α−ＨＬサブユニット／ＳｐｙＴａｇ／捕獲タグタンパク質配列（配列番号４）をコードする遺伝子を、商業的ＤＮＡ合成により合成し、標準ＤＮＡ制限酵素消化およびライゲーションを用いてｐＥＴ２６ｂベクターへ挿入した。プラスミドＤＮＡを、標準熱ショックプロトコールを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを追加したＬＢ寒天プレート上で増殖した。細菌コロニーを選択し、シーケンシングして、遺伝子の完全性を検証した。グリセロールストックから細菌培養を開始し、適切な抗生物質を追加したＬＢ培地の５ｍｌ培養物において一晩、増殖した。その後、これらの培養物を、抗生物質を追加した自己誘導ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増殖し、２５℃で１６〜２４時間、増殖させておいた。２，２００ｘｇで１５分間の遠心分離を用いて細胞ペレットを採取し、さらなる使用まで−８０℃で凍結させた。
【０１３６】
[00140]α−ＨＬサブユニット／ＳｐｙＴａｇ／捕獲タグ（配列番号４）の発現後、ペレットを解凍し、１グラムの細胞ペレットあたり５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＰＯ４、１０ｍＭ  イミダゾール）中に可溶化し、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビター錠剤およびＤＮａｓｅ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ商標）を追加した。細胞を、９０％最大パワーに設定されたチップソニケーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ商標）を用い、１秒間のオン、４秒間のオフで２分間、パルスして、溶解した。細胞片を、２０，０００ｘｇで４５分間の遠心分離を用いて除去した。上清を、コバルトアフィニティカラムへ適用し、２カラム体積の溶解バッファー、２カラム体積の洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）、１０カラム体積の高塩濃度洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）、２カラム体積の洗浄バッファーで洗浄し、１５０ｍＭ  イミダゾールを追加した洗浄バッファーを用いて溶出した。
【０１３７】
α−ＨＬサブユニットバリアント（配列番号５）の調製
[00141]α−ＨＬサブユニットバリアント（配列番号５）は、（実施例２に記載されているような）１：６α−ＨＬ七量体を形成するための６個の成分として用いられる。簡単に述べれば、α−ＨＬサブユニットバリアント（配列番号５）を調製するために、配列番号５に表記されたα−ＨＬバリアントタンパク質サブユニットをコードする遺伝子を、商業的ＤＮＡ合成により合成し、標準ＤＮＡ制限酵素消化およびライゲーションを用いてｐＥＴ２６ｂベクターへ挿入した。プラスミドＤＮＡを、標準熱ショックプロトコールを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを追加したＬＢ寒天プレート上で増殖した。細菌コロニーを選択し、シーケンシングして、遺伝子の完全性を検証した。グリセロールストックから細菌培養を開始し、適切な抗生物質を追加したＬＢ培地の５ｍｌ培養物において一晩、増殖した。その後、これらの培養物を、抗生物質を追加した自己誘導ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増殖し、２５℃で１６〜２４時間、増殖させておいた。２，２００ｘｇで１５分間の遠心分離を用いて細胞ペレットを採取し、さらなる使用まで−８０℃で凍結させた。
【０１３８】
[00142]α−ＨＬタンパク質（配列番号５）の発現後、ペレットを解凍し、１グラムの細胞ペレットあたり５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＰＯ４、１０ｍＭ  イミダゾール）中に可溶化し、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビター錠剤およびＤＮａｓｅ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ商標）を追加した。細胞を、９０％最大パワーに設定されたチップソニケーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ商標）を用い、１秒間のオン、４秒間のオフで２分間、パルスして、溶解した。細胞片を、２０，０００ｘｇで４５分間の遠心分離を用いて除去した。上清を、コバルトアフィニティカラムへ適用し、２カラム体積の溶解バッファー、２カラム体積の洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）、１０カラム体積の高塩濃度洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）、２カラム体積の洗浄バッファーで洗浄し、１５０ｍＭ  イミダゾールを追加した洗浄バッファーを用いて溶出した。
【０１３９】
ＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）の調製
[00143]ＧＦＰ分析物リガンドは、分析物検出複合体の分析物リガンドが抗ＧＦＰである、分析物検出複合体を形成するために用いられる。ＧＦＰ分析物リガンドを調製するために、ＧＦＰ分析物リガンド／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質（配列番号９）をコードする遺伝子を、商業的ＤＮＡ合成により合成し、標準ＤＮＡ制限酵素消化およびライゲーションを用いてｐＥＴ２６ｂベクターへ挿入した。プラスミドＤＮＡを、標準熱ショックプロトコールを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを追加したＬＢ寒天プレート上で増殖した。細菌コロニーを選択し、シーケンシングして、遺伝子の完全性を検証した。グリセロールストックから細菌培養を開始し、適切な抗生物質を追加したＬＢ培地の５ｍｌ培養物において一晩、増殖した。その後、これらの培養物を、抗生物質を追加した自己誘導ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増殖し、２５℃で１６〜２４時間、増殖させておいた。２，２００ｘｇで１５分間の遠心分離を用いて細胞ペレットを採取し、さらなる使用まで−８０℃で凍結させた。
【０１４０】
[00144]ＧＦＰ分析物リガンド／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質（配列番号９）の発現後、ペレットを解凍し、１グラムの細胞ペレットあたり５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＰＯ４、１０ｍＭ  イミダゾール）中に可溶化し、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビター錠剤およびＤＮａｓｅ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ商標）を追加した。細胞を、９０％最大パワーに設定されたチップソニケーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ商標）を用い、１秒間のオン、４秒間のオフで２分間、パルスして、溶解した。細胞片を、２０，０００ｘｇで４５分間の遠心分離を用いて除去した。上清を、コバルトアフィニティカラムへ適用し、２カラム体積の溶解バッファー、２カラム体積の洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）、１０カラム体積の高塩濃度洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）、２カラム体積の洗浄バッファーで洗浄し、１５０ｍＭ  イミダゾールを追加した洗浄バッファーを用いて溶出した。
【０１４１】
ＧＦＰ分析物（配列番号１０）
[00145]ＧＦＰ分析物（配列番号１０）は、分析物検出複合体を含むα−ＨＬナノポアの活性を実証するために分析物検出複合体と共に用いられる（実施例３参照）。ＧＦＰ分析物（配列番号１０）を調製するために、配列番号１０に表記されたＧＦＰ分析物をコードする遺伝子を、商業的ＤＮＡ合成により合成し、標準ＤＮＡ制限酵素消化およびライゲーションを用いてｐＥＴ２６ｂベクターへ挿入した。プラスミドＤＮＡを、標準熱ショックプロトコールを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを追加したＬＢ寒天プレート上で増殖した。細菌コロニーを選択し、シーケンシングして、遺伝子の完全性を検証した。グリセロールストックから細菌培養を開始し、適切な抗生物質を追加したＬＢ培地の５ｍｌ培養物において一晩、増殖した。その後、これらの培養物を、抗生物質を追加した自己誘導ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増殖し、２５℃で１６〜２４時間、増殖させておいた。２，２００ｘｇで１５分間の遠心分離を用いて細胞ペレットを採取し、さらなる使用まで−８０℃で凍結させた。
【０１４２】
[00146]ＧＦＰ分析物（配列番号１０）の発現後、ペレットを解凍し、１グラムの細胞ペレットあたり５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＰＯ４、１０ｍＭ  イミダゾール）中に可溶化し、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビター錠剤およびＤＮａｓｅ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ商標）を追加した。細胞を、９０％最大パワーに設定されたチップソニケーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ商標）を用い、１秒間のオン、４秒間のオフで２分間、パルスして、溶解した。細胞片を、２０，０００ｘｇで４５分間の遠心分離を用いて除去した。上清を、コバルトアフィニティカラムへ適用し、２カラム体積の溶解バッファー、２カラム体積の洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）、１０カラム体積の高塩濃度洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）、２カラム体積の洗浄バッファーで洗浄し、１５０ｍＭ  イミダゾールを追加した洗浄バッファーを用いて溶出した。タンパク質を分注し、使用直前まで−８０℃で保存した。
【０１４３】
実施例２
分析物検出複合体を含むナノポアのアセンブリ
[00147]この実施例は、６個のα−ＨＬバリアント単量体サブユニット（配列番号５）ならびに捕獲タグ配列およびＳｐｙＴａｇ配列を含む１個のα−ＨＬサブユニット（配列番号４）を有する七量体ナノポアのアセンブリであって、ＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）が単一のα−ＨＬサブユニット（配列番号４）とＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合を介して付着して、分析物検出複合体を形成する、七量体ナノポアのアセンブリを記載する。ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合は、例えば、Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｊａｎ  ２３；４２６（２）：３０９〜１７に記載されている。
【０１４４】
１：６  α−ＨＬ七量体ナノポアアセンブリの調製
[00148]１個のα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ（配列番号４）および６個のα−ＨＬバリアントタンパク質（配列番号５）を含むα−ＨＬ七量体ナノポアアセンブリ（すなわち、１：６七量体比）は、一般的に、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７４３３に記載されているように調製することができる。簡単に述べれば、およそ２０ｍｇの総タンパク質を用いて、望ましいα−ＨＬバリアントタンパク質（配列番号５）溶液に対してα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ（配列番号４）を１：９比で一緒に混合して、七量体の混合物を形成した。そのような混合物は、様々な比（すなわち、０：７、１：６、２：５、３：４など）のα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ（配列番号４）とα−ＨＬバリアントタンパク質（配列番号５）を含む様々な画分を生じ、α−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ（配列番号４）成分は、七量体の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個の単量体サブユニットとして存在することが予想される。
【０１４５】
[00149]ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８かまたは１５０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．５のいずれかに５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度へと可溶化し、α−ＨＬ単量体の混合物を５ｍｇ／ｍｌの最終濃度へと加えた。α−ＨＬ単量体の混合物を３７℃で少なくとも６０分間、インキュベートした。その後、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（βＯＧ）を、５％（重量／体積）の最終濃度へと加えて、生じた脂質−タンパク質混合物を可溶化した。その試料を透明なタンパク質凝集物および使い残しの脂質複合体へと遠心分離し、上清をさらなる精製のために収集した。
【０１４６】
[00150]その後、七量体の混合物を、陽イオン交換精製に供し、溶出画分を収集した。各画分について、２つの試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥ用に調製した。第１の試料は、１５ｕＬのα−ＨＬ溶出液のみを含み、第２の試料を、３ｕｇのＧＦＰ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１０）と組み合わせた。その後、試料を、室温で１〜１６時間、インキュベートした（および遮光した）。インキュベーション後、５ｕＬの４×Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ商標）を各試料に加えた。その後、試料およびＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌｕｓ（商標）Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅタンパク質ラダーを４〜２０％  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上へ負荷した。そのゲルを２００ｍＶで３０分間、流した。その後、ゲルをＳｔａｉｎ−Ｆｒｅｅフィルターを用いて画像化した。
【０１４７】
[00151]七量体ナノポアアセンブリのα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇタンパク質（配列番号４）へのＧＦＰ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１０）の付着は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ中の分子量バンドシフトによって観察することができ、したがって、１：６七量体画分の同定を容易にする。すなわち、単一のＳｐｙＴａｇを含有する七量体は、単一のＧＦＰ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１０）分子を結合し、それにしたがって、単一のＧＦＰ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１０）分子の分子量を加えた七量体ポアの分子量に対応するシフトを生じると予想され、一方、２個以上のＳｐｙＴａｇを有する七量体は、それに応じて、より大きい分子量シフトを生じるはずである。それゆえに、上記の七量体α−ＨＬ精製中に陽イオン交換カラムから溶出されたピークは、α−ＨＬバリアントに対するα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇの比について分析することができる。加えて、ＧＦＰ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１０）付着の存在は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを画像化した場合にＧＦＰ蛍光フィルターを用いて観察することができる。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７４３３参照。
【０１４８】
[00152]この理論的解釈に基づいて、分子量シフトが、ＧＦＰ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１０）の単一の付加、および、したがって、１成分のナノポアタンパク質コンジュゲート（配列番号４）対６個のα−ＨＬバリアント（配列番号５）に対応する画分を、分子量標準タンパク質ラダーを用いて決定した。Ｂｉｏ−Ｒａｄの染色なし画像化システムを用いて、分子量シフトを決定した。ＧＦＰ蛍光の存在を、青色フィルターを用いて決定した。蛍光の存在を用いて、ＳｐｙＴａｇタンパク質の存在を確認した。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７４３３参照。その後、１：６比、すなわち、１個のα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ（配列番号４）対６個のα−ＨＬバリアント（配列番号５）に対応する溶出画分をさらなる実験に用いた。
【０１４９】
ＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）の１：６七量体への付着
[00153]その後、上記からの１：６七量体画分を用いて、ＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）（すなわち、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列を含む抗ＧＦＰナノボディ）を、１：６七量体の１個のα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ／捕獲タグ（配列番号４）成分に、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを用いて付着させ（Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｊａｎ  ２３；４２６（２）：３０９〜１７参照）、それにより、ナノポアアセンブリ内に分析物検出複合体を形成した。簡単に述べれば、粘着性ＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）を１：６七量体の１個のα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ／捕獲タグ（配列番号４）成分に付着させるために、粘着性ＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）を１：６七量体複合体（上記参照）と４℃で一晩、混合した。その混合物をサイズ排除クロマトグラフィカラムに適用することにより、付着していないＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）をその複合体から分離した。その複合体を含有する生じた画分を分注し、使用前に−８０℃で保存した。その後、α−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ／捕獲タグ（配列番号４）に付着したＧＦＰ分析物リガンド（配列番号９）が、ナノポアアセンブリの分析物検出複合体を形成している、ＧＦＰ分析物リガンドを含む七量体を次の実験に用いた。
【０１５０】
実施例３
捕獲速度決定および分析
[00154]この実施例は、付着した分析物リガンドを含まない、分析物リガンドが付着している（すなわち、上記の実施例２に記載されたナノポア）、およびＧＦＰ分析物（配列番号１０）の存在下での、ナノポアアセンブリについての捕獲速度決定および分析を示す。
【０１５１】
[00155]簡単に述べれば、全体として本明細書に組み入れられている、名称が「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｉｎ  ａ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ」である、米国特許出願公開第２０１７／０３２２１９５号に記載されているように、分析物リガンドが付着していない、１：６アルファ−ヘモリシン七量体を調製し、チップ上に配置した。
【０１５２】
[00156]チップの調製に続いて、その後、捕獲速度分析方法を用いて、異なる条件下（すなわち、ＧＦＰ分析物リガンドがポアと結合していない、ＧＦＰ分析物リガンドがポアと結合している、およびＧＦＰ分析物の存在下）での捕獲タグの捕獲速度を評価した。簡単に述べれば、捕獲速度分析方法は、ＷＯ／２０１７／２２０７３２に詳細に記載されている、期間対期間の差による方法に基づいている。捕獲速度は、まず、ポアによる全てのタグ捕獲事象を検出することにより測定することができる。捕獲事象は、１つの期間によって右にシフトしたシグナルを最初のシグナルから引き算することにより、シグナルにおいて検出される。シグナル差は、ＡＤＣノイズ閾値より下の差の値をゼロに設定することによりさらに処理される。捕獲事象のそれぞれのタイムスタンプが記録される。
【０１５３】
[00157]図５Ａ〜５Ｃは、ある特定の例的実施形態による捕獲速度決定を示すグラフである。例えば、図５Ａ〜５Ｃにおける各点は、事象の測定されたタイムスタンプに対する捕獲事象数を表す。捕獲速度は、全事象のプロットの傾きの逆数である。より具体的には、図５Ａは、ＧＦＰ分析物リガンドの非存在下（すなわち、リガンドが結合していない）、単一の全体的な傾きを有するタグ捕獲についてのベースライン捕獲速度を示す。図５Ｂに示されるデータについて、ＧＦＰ分析物リガンドが、上記の実施例２に記載されているように、ナノポアに付着しており、第１の捕獲速度が決定された。図５Ｂに示されているように、第１の捕獲速度は、ＧＦＰ分析物リガンドがナノポアに付着した場合、ベースライン捕獲速度（図５Ａ）と比較して低下した。
【０１５４】
[00158]ベースライン捕獲速度（図５Ａ）および第１の捕獲速度（図５Ｂ）の決定後、ＧＦＰ分析物リガンドの結合に対応する第２の捕獲速度が、図５Ｃに示されているように、決定された。簡単に述べれば、２７μＬのＧＦＰ分析物（配列番号１０）をチップに加え、それにしたがって、ＧＦＰ分析物（配列番号１０）とナノポアのＧＦＰ分析物リガンドとの間の結合を促進した。図５Ｃに示されているように、第２の捕獲速度は、第１の捕獲速度より低い。さらに、ＧＦＰ分析物リガンドがＧＦＰ分析物に付着してから（約３００秒時点）、その後、解離するまで（８００秒時点の前）の遷移を観察することができる（図５Ｃ）。第１の捕獲速度とは異なる第２の捕獲速度の同定（図５Ｃ）に基づいて、チップ上のＧＦＰ分析物（配列番号１０）の存在を確認することができる。
【０１５５】
配列表フリーテキスト
配列番号１（野生型ａ−ＨＬ  ＤＮＡ）
【化１−１】
2021513962.tif 000004
【化１−２】
2021513962.tif 000005
【０１５６】
配列番号２（野生型ａ−ＨＬアミノ酸）［大腸菌において発現した場合］
【化２】
2021513962.tif 000006
【０１５７】
配列番号３（精製タグを有する成熟野生型ａＨＬ）
【化３】
2021513962.tif 000007
【０１５８】
配列番号４（α−ＨＬ−リンカー−ＳｐｙＴａｇ−ＨＩＳ−捕獲タグ）
下線＝可動性リンカー；太字＝ＳｐｙＴａｇ；イタリック体＝Ｈｉｓタグ；太字／下線＝ペプチドに基づいたナノタグ
【化４】
2021513962.tif 000008
【０１５９】
配列番号５（α−ＨＬ  Ｈ３５Ｇバリアント、６成分）
下線＝ＴＥＶ−Ｈｉｓタグ
【化５】
2021513962.tif 000009
【０１６０】
配列番号６（ＯｍｐＧ）
【化６】
2021513962.tif 000010
【０１６１】
配列番号７（ＯｍｐＧ−リンカー１−ＨＩＳ−リンカー２−ＳｐｙＴａｇ−捕獲タグ）
下線＝可動性リンカー；イタリック体＝Ｈｉｓタグ；ＧＳＧＧ（配列番号１４）＝第２のリンカー；太字／下線＝ＳｐｙＴａｇ；太字のみ＝ペプチドに基づいたナノタグ
【化７】
2021513962.tif 000011
【０１６２】
配列番号８（捕獲タグアミノ酸配列）
【化８】
2021513962.tif 000012
【０１６３】
配列番号９（ナノボディ、ＧＦＰ−リンカー−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＴＥＶ／Ｈｉｓ）
太字＝可動性リンカー；下線＝ＴＥＶ−Ｈｉｓタグ
【化９】
2021513962.tif 000013
【０１６４】
配列番号１０（ＧＦＰ−リンカー−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｈｉｓタグ）
下線＝Ｈｉｓタグ；太字＝可動性リンカー
【化１０】
2021513962.tif 000014
【０１６５】
配列番号１１（ＳｐｙＴａｇ配列）
ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫＫ
【０１６６】
配列番号１２（リンカー配列）
ＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧ
【０１６７】
配列番号１３（リンカー配列）
ＥＫＥＫＥＫＧＳ
【０１６８】
配列番号１４（リンカー配列）
ＧＳＧＧ
【０１６９】
配列番号１５（リンカー配列）
ＧＳＧＳＧＳ
【０１７０】
配列番号１６（成熟野生型α−ＨＬ；ＡＡＡ２６５９８）
【化１１】
2021513962.tif 000015
【０１７１】
配列番号１７（ＥＰＰＰタグ）
ＥＰＰＰ
【図１】
2021513962.tif 000016
【図２】
2021513962.tif 000017
【図３】
2021513962.tif 000018
【図４Ａ】
2021513962.tif 000019
【図４Ｂ】
2021513962.tif 000020
【図４Ｃ】
2021513962.tif 000021
【図５Ａ】
2021513962.tif 000022
【図５Ｂ】
2021513962.tif 000023
【図５Ｃ】
2021513962.tif 000024
【配列表】
2021513962000001.app
【国際調査報告】
2021513962.tif 000025
2021513962.tif 000026
2021513962.tif 000027