(57)【要約】本発明は、癌の養子細胞療法のための改善されたキメラ抗原受容体、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、その組成物、ならびにそれらを作製する方法および使用する方法を提供する。
2021506305.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ａ）第一の抗原に結合する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、
ｂ）第二の抗原に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合断片、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン、および／または
ｄ）一次シグナル伝達ドメイン、を含有する前記キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記ＣＡＲが、５’から３’の方向で、
ａ）第一の抗原に結合する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、
ｂ）第二の抗原に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合断片、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン、および／または
ｄ）一次シグナル伝達ドメイン、を含有する、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記ＣＡＲが、５’から３’の方向で、
ａ）第二の抗原に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合断片、
ｂ）第一の抗原に結合する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン、および／または
ｄ）一次シグナル伝達ドメイン、を含有する、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記ｓｃＦｖが、マウスｓｃＦｖ、ヒト化ｓｃＦｖ、またはヒトｓｃＦｖである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記ｓｄＡｂが、ラクダ科ＶＨＨである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記第一の抗原は、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ６、炭酸脱水素酵素ＩＸ型（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＣＬＬ−１）、ＣＤ２  ｓｕｂｓｅｔ  １（ＣＳ−１）、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ４（ＣＳＰＧ４）、ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  １（ＣＴＡＧＥ１）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＥＧＰ２），ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、ｅｐｈｒｉｎ  ｔｙｐｅ−Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＥＰＨＡ２）、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｋｅ  ５（ＦＣＲＬ５）、ｆｅｔａｌ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２，Ｋａｐｐａ、ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２（ＬＡＧＥ−１Ａ），Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｌ１−ＣＡＭ）、ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅ（ＭＡＧＥ）−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  １（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  １（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ポリシアル酸；ｐｌａｃｅｎｔａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＰＬＡＣ１）、ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＲＯＲ１）、ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｓａｒｃｏｍａ，Ｘ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ２（ＳＳＸ２）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ７２（ＴＡＧ７２）、ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ  １（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ７−ｒｅｌａｔｅｄ（ＴＥＭ７Ｒ）、ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰＢＧ）、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、およびＷｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ  １（ＷＴ−１）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記第二の抗原は、ＦＲα、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＬＬ−１、ＣＳ−１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＡＧＥ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＣＲＬ５、ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２，Ｋａｐｐａ、ＬＡＧＥ−１Ａ，Ｌａｍｂｄａ、ＬｅＹ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＰＢＧ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記第一の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
前記第二の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８０、Ｃ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＢＣＭＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ１９である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ２０である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ２２である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ２３である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ３３である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ３７である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１７】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ３８である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１８】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ５２である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１９】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ８０である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２０】
．前記第一の抗原または第二の抗原が、ＣＤ１２３である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２１】
前記第一の抗原または第二の抗原が、ＨＬＡ−ＤＲである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２２】
前記第一および第二の抗原が、癌細胞上に発現される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２３】
前記第一および第二の抗原が、同じ癌細胞上に発現される、請求項２２に記載のＣＡＲ。
【請求項２４】
前記癌が、固形癌である、請求項２２または請求項２３に記載のＣＡＲ。
【請求項２５】
前記癌が、液状癌である、請求項２２または請求項２３に記載のＣＡＲ。
【請求項２６】
前記第一および第二の抗原が、悪性Ｂ細胞上に発現される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２７】
前記第一および第二の抗原が、悪性形質細胞上に発現される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２８】
前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２９】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３０】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αから単離される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３１】
前記１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３２】
前記１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激性分子から単離される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３３】
前記１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ２７８からなる群から選択される共刺激性分子から単離される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３４】
前記１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７から単離される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３５】
前記一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３６】
前記一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζから単離される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３７】
ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含有する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３８】
前記ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含有する、請求項３７に記載のＣＡＲ。
【請求項３９】
スペーサー領域をさらに含有する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項４０】
シグナルペプチドをさらに含有する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項４１】
前記シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含有する、請求項４０に記載のＣＡＲ。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするｃＤＮＡ。
【請求項４４】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするｍＲＮＡ。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをコードするベクター。
【請求項４６】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
前記ベクターが、エピソーム性ベクターである、請求項４５または請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４９】
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５０】
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５１】
前記レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、Ｐｓｉ（ψ）パッケージングシグナル、中心ポリプリン帯（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）／ＤＮＡ  ｆｌａｐ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸出因子（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｘｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、請求項３９に記載のポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター、および右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含有する、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５３】
前記５’ＬＴＲのプロモーターが、異種プロモーターと置換される、請求項５２に記載のベクター。
【請求項５４】
前記異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ルイス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
前記３’ＬＴＲが、自己不活化（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項５４に記載のベクター。
【請求項５６】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項４５〜５５のいずれか１項に記載のベクターを含有する細胞。
【請求項５７】
前記細胞が、造血細胞である、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５８】
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項５６または５７に記載の細胞。
【請求項５９】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６０】
前記細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋またはそれらの組み合わせを発現する、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６１】
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６２】
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６３】
前記細胞の源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織または腫瘍である、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６４】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５〜５５のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項５６〜６３のいずれか１項に記載の細胞を含有する組成物。
【請求項６５】
生理学的に許容可能な担体、ならびに請求項１〜４１のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４５〜５５のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項５６〜６３のいずれか１項に記載の細胞を含有する組成物。
【請求項６６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法であって、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４５〜５５のいずれか１項に記載のベクターを、前記細胞内に導入することを含む、前記方法。
【請求項６７】
その必要のある対象の癌を治療する方法であって、請求項６４または請求項６５に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６８】
前記癌が、固形癌である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記癌が、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様腫瘍／非定型横紋筋様腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、グリア芽腫、頭頚部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、咽頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、胚カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞癌、正中線癌、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔の癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ、ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性胸膜腫、前立腺癌、直腸癌、網膜芽腫、腎細胞癌、腎盂および尿管の癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑液腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される、請求項６７または請求項６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記癌が、肝癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、骨癌、甲状腺癌、腎癌、および皮膚癌からなる群から選択される、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記癌が、液状癌または血液癌である、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記悪性血液疾患が、Ｂ細胞の悪性疾患である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｂ細胞の悪性疾患は、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｂ細胞の悪性疾患は、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性多血症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、および髄外形質細胞腫からなる群から選択される、請求項７２または請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｂ細胞の悪性疾患は、多発性骨髄腫である、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
対象において癌と関連した１つまたは複数の症状を改善する方法であって、請求項６４または請求項６５に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７７】
前記改善される１つまたは複数の症状は、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい、および出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張または腹部疼痛、骨または関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、および排尿減少からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）の定めのもと、２０１７年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／６０９，８４７号明細書の利益を主張するものであり、当該出願は、その全体で参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表に関する声明
本出願に関する配列表は紙媒体の代わりにテキストフォーマットで提出され、本明細書に参照により援用される。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０９６＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは９９ＫＢであり、２０１８年１２月２１日に作成された。そして本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【０００３】
本発明は、細胞免疫療法用組成物、および関連方法に関する。より具体的には、本発明は、免疫系障害を治療するための多価キメラ抗原受容体、組成物、遺伝子改変細胞、ならびにそれらの作製方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌は世界中で重大な健康問題である。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＩＡＲＣ）による比率に基づけば、２０１２年には世界で１４１０万人が新たに癌を発症し、８２０万人が癌で死亡している。２０１５年には、癌は世界で２番目の死因であり、８８０万人が癌により死亡し、６人に１人が癌により死亡した。２０３０年までに世界で２１７０万人が新たに癌と診断され、１３００万人の癌患者がシンプルに癌増殖と加齢により死亡すると予測されている。例えば喫煙、貧弱な食事、運動不足および出産数の減少などの西洋のライフスタイルが発展途上国にも取り入れられることで、将来的にはさらに多くなる可能性さえある。２０１０年における、癌の年間の経済的な総損害額は、およそ１兆１６００億米国ドルと推定されている。癌の経済的な影響は甚大であり、そして増加している。
【０００５】
癌の検出、予防および治療は進歩しているが、普遍的に成功している治療戦略はまだ実現していない。様々な形式の癌治療の反応は、様々である。従来的な癌の治療方法としては化学療法や放射線療法が挙げられるが、毒性のある副作用のために利用は限定されている。治療用抗体を用いた免疫療法も成功するのは限定的であり、部分的には、貧弱な薬物動態プロファイル、血清プロテアーゼおよび糸球体ろ過による急速な抗体の排除、そして腫瘍部位への浸潤と腫瘍細胞上での標的抗原の発現レベルが限定的であることが理由である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現する遺伝子改変細胞を使用する試みも成功するのは限定的であり、貧弱なＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ拡張、注入後の細胞の急速な消失、期待外れの臨床活性、そして抗原逃避（ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｓｃａｐｅ）が原因である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は概して、Ｔ細胞療法剤を作製するための改善されたベクター、およびその使用方法を提供する。より具体的には、本発明は、免疫系障害を治療、予防または改善するための多価ＣＡＲ、ＣＡＲ  Ｔ細胞、組成物、ならびにそれらの使用方法および作製方法を提供する。
【０００７】
様々な実施形態において、以下を含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が予期される：第一の抗原に結合する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；第二の抗原に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）もしくはその抗原結合断片；膜貫通ドメイン；１つもしくは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメイン。
【０００８】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、５’から３’に向けて以下を含有する：第一の抗原に結合する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）；第二の抗原に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）もしくはその抗原結合断片；膜貫通ドメイン；１つもしくは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメイン。
【０００９】
一部の実施形態において、ＣＡＲは、５’から３’に向けて以下を含有する：第二の抗原に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）もしくはその抗原結合断片；第一の抗原に結合する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）；膜貫通ドメイン；１つもしくは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメイン。
【００１０】
一部の実施形態において、ＣＡＲは、５’から３’に向けて以下を含有する：第一の抗原に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）もしくはその抗原結合断片；第二の抗原に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）もしくはその抗原結合断片；膜貫通ドメイン；１つもしくは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメイン。
【００１１】
特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスｓｃＦｖ、ヒト化ｓｃＦｖ、またはヒトｓｃＦｖである。
【００１２】
一部の実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科ＶＨＨである。
【００１３】
ある実施形態では、第一の抗原は、以下からなる群から選択される：アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ６、炭酸脱水素酵素ＩＸ型（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＣＬＬ−１）、ＣＤ２  ｓｕｂｓｅｔ  １（ＣＳ−１）、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ４（ＣＳＰＧ４）、ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  １（ＣＴＡＧＥ１）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＥＧＰ２），ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、ｅｐｈｒｉｎ  ｔｙｐｅ−Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＥＰＨＡ２）、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｋｅ  ５（ＦＣＲＬ５）、ｆｅｔａｌ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２，Ｋａｐｐａ、ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２（ＬＡＧＥ−１Ａ），Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｌ１−ＣＡＭ）、ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅ（ＭＡＧＥ）−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  １（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  １（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ポリシアル酸；ｐｌａｃｅｎｔａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＰＬＡＣ１）、ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＲＯＲ１）、ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｓａｒｃｏｍａ，Ｘ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ２（ＳＳＸ２）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ７２（ＴＡＧ７２）、ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ  １（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ７−ｒｅｌａｔｅｄ（ＴＥＭ７Ｒ）、ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰＢＧ）、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、およびＷｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ  １（ＷＴ−１）。
【００１４】
様々な実施形態では、第二の抗原は、以下からなる群から選択される：ＦＲα、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＬＬ−１、ＣＳ−１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＡＧＥ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＣＲＬ５、ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２，Ｋａｐｐａ、ＬＡＧＥ−１Ａ，Ｌａｍｂｄａ、ＬｅＹ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＰＢＧ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１。
【００１５】
特定の実施形態では、第一の抗原は、以下からなる群から選択される：ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲ。
【００１６】
さらなる実施形態では、第二の抗原は、以下からなる群から選択される：ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８０、Ｃ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲ。
【００１７】
様々な実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＢＣＭＡである。
【００１８】
一部の実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ１９である。
【００１９】
ある実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ２０である。
【００２０】
一部の実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ２２である。
【００２１】
様々な実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ２３である。
【００２２】
追加的な実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ３３である。
【００２３】
特定の実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ３７である。
【００２４】
ある実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ３８である。
【００２５】
様々な実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ５２である。
【００２６】
さらなる実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ８０である。
【００２７】
特定の実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＣＤ１２３である。
【００２８】
一部の実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、ＨＬＡ−ＤＲである。
【００２９】
様々な実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は、癌細胞上で発現される。
【００３０】
ある実施形態では、第一の抗原または第二の抗原は、同じ癌細胞上で発現される。
【００３１】
追加的な実施形態では、癌は、固形癌である。
【００３２】
様々な実施形態では、癌は、液状癌である。
【００３３】
さらなる実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は、悪性Ｂ細胞上で発現される。
【００３４】
特定の実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は、悪性形質細胞上で発現される。
【００３５】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、以下からなる群から選択されるポリペプチドから単離される：Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ  １３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ１。
【００３６】
様々な実施形態では、膜貫通ドメインは、以下からなる群から選択されるポリペプチドから単離される：ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１およびＣＤ１５２。
【００３７】
ある実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αから単離される。
【００３８】
様々な実施形態では、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）を含有する。
【００３９】
一部の実施形態では、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインは、以下からなる群から選択される共刺激性分子から単離される：ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０。
【００４０】
特定の実施形態では、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインは、以下からなる群から選択される共刺激性分子から単離される：ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ２７８。
【００４１】
さらなる実施形態では、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７から単離される。
【００４２】
様々な実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、以下からなる群から選択されるポリペプチドから単離される：ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ。
【００４３】
特定の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζから単離される。
【００４４】
ある実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含有する。
【００４５】
様々な実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含有する。
【００４６】
追加的な実施形態では、ＣＡＲは、スペーサー領域をさらに含有する。
【００４７】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含有する。
【００４８】
ある実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルペプチド、ＣＤ８αシグナルペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルペプチドを含有する。
【００４９】
様々な実施形態では、本明細書に予期されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００５０】
特定の実施形態では、本明細書に予期されるＣＡＲをコードするｃＤＮＡが提供される。
【００５１】
特定の実施形態では、本明細書に予期されるＣＡＲをコードするｍＲＮＡが提供される。
【００５２】
様々な実施形態では、本明細書に予期されるポリヌクレオチドをコードするベクターが提供される。
【００５３】
ある実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。
【００５４】
さらなる実施形態では、ベクターは、エピソーム性ベクターである。
【００５５】
追加的な実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
【００５６】
一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００５７】
様々な実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００５８】
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される。
【００５９】
ある実施形態では、ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、Ｐｓｉ（ψ）パッケージングシグナル、中心ポリプリン帯（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）／ＤＮＡ  ｆｌａｐ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸出因子（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｘｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、予期されるポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーター、および右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含有する。
【００６０】
様々な実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは、異種プロモーターと置換される。
【００６１】
特定の実施形態では、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ルイス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【００６２】
一部の実施形態では、３’ＬＴＲは、自己不活化（ＳＩＮ：ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ＬＴＲである。
【００６３】
特定の実施形態では、本明細書に予期されるＣＡＲ、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含有する細胞が提供される。
【００６４】
特定の実施形態では、細胞は、造血細胞である。
【００６５】
ある実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。
【００６６】
さらなる実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
【００６７】
ある実施形態では、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋またはそれらの組み合わせを発現する。
【００６８】
様々な実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）またはヘルパーＴ細胞である。
【００６９】
ある実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
【００７０】
一部の実施形態では、細胞の源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織または腫瘍である。
【００７１】
様々な実施形態では、本明細書に予期されるＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞を含有する組成物が提供される。
【００７２】
特定の実施形態では、生理学的に許容可能な担体、ならびに本明細書に予期されるＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞を含有する組成物が提供される。
【００７３】
特定の実施形態では、本明細書に予期されるＣＡＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞を、細胞に導入することを含む、ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法が提供される。
【００７４】
一部の実施形態では、その必要のある対象において癌を治療する方法であって、本明細書に予期される組成物の有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００７５】
一部の実施形態では、癌は、固形癌である。
【００７６】
様々な実施形態では、癌は、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様腫瘍／非定型横紋筋様腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、グリア芽腫、頭頚部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、咽頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、胚カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞癌、正中線癌、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔の癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ、ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性胸膜腫、前立腺癌、直腸癌、網膜芽腫、腎細胞癌、腎盂および尿管の癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑液腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【００７７】
様々な実施形態では、癌は、肝癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、骨癌、甲状腺癌、腎癌、および皮膚癌からなる群から選択される。
【００７８】
ある実施形態では、癌は、液状の癌または血液の癌である。
【００７９】
さらなる実施形態では、悪性血液疾患は、Ｂ細胞の悪性疾患である。
【００８０】
特定の実施形態では、Ｂ細胞の悪性疾患は、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される。
【００８１】
ある実施形態では、Ｂ細胞の悪性疾患は、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性多血症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、および髄外形質細胞腫からなる群から選択される。
【００８２】
一部の実施形態では、Ｂ細胞の悪性疾患は、多発性骨髄腫である。
【００８３】
様々な実施形態では、対象において癌と関連する１つまたは複数の症状を改善する方法であって、本明細書に予期される組成物の有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００８４】
特定の実施形態では、改善される１つまたは複数の症状は、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい、および出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張または腹部疼痛、骨または関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、および排尿減少からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、典型的な抗体（左のパネル）およびＶＨＨ抗体（右のパネル）および関連結合ドメインの図を示す。
【図２】図２は、多価ＶＨＨ−ｓｃＦｖ  ＣＡＲの図を示す。
【図３】図３は、ＶＨＨ  ＣＡＲ、ｓｃＦｖ  ＣＡＲ、およびＶＨＨ−ｓｃＦｖ  ＣＡＲのＣＡＲ構造（ＣＡＲｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）の図を示す。
【図４】図４は、抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ  ＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ、および多価抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ−抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲを形質導入されたドナーＰＢＭＣのＣＡＲ発現を示す。
【図５】図５は、抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ  ＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ、および多価抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ−抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲを形質導入されたドナーＰＢＭＣとともに、１：１のＥ：Ｔ比で４８時間、共培養されたＡ５４９細胞（ＥＧＦＲ＋ＢＣＭＡ＋）の細胞傷害性を示す。
【図６】図６は、抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ  ＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ、および多価抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ−抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲを形質導入され、Ａ５４９細胞（ＥＧＦＲ＋ＢＣＭＡ＋）とともに１：１のＥ：Ｔ比で２４時間、共培養されたドナーＰＢＭＣからのＩＦＮγの分泌を示す。
【図７−１】図７Ａは、蛍光標識されたＣＤ１９抗原に結合する、または蛍光抗ＶＨＨ抗体で検出されたＣＡＲ陽性細胞（左軸）の割合を示す。全体的な発現は、ＭＦＩ（右軸）で定量された。  図７Ｂは、抗原陽性Ａ５４９細胞とともに共培養されたＣＡＲ  Ｔ細胞の抗原特異的細胞傷害活性を示す。
【図７−２】図７Ｃは、共培養後、２４時間でのＣＡＲ構築物を発現する形質導入ヒトＴ細胞のＩＦＮγの分泌を示す。  図７Ｄは、共培養後、２４時間でのＣＡＲ構築物を発現する形質導入ヒトＴ細胞のＩＬ−２の分泌を示す。
【図８−１】図８Ａは、蛍光標識されたＣＤ１９抗原に結合する、または蛍光標識されたＣＤ７９ａ抗原に結合する、または蛍光抗ＶＨＨ抗体で検出されたＣＡＲ陽性細胞の割合を示す。  図８Ｂは、抗原陽性Ａ５４９細胞とともに共培養されたＣＡＲ  Ｔ細胞の抗原特異的細胞傷害活性を示す。細胞傷害活性は、ＡＵＣに反比例する。ＡＵＣが低いと、腫瘍細胞殺傷が高レベルであることを示す。
【図８−２】図８Ｃは、腫瘍細胞共培養後、２４時間でのＣＡＲ構築物を発現する形質導入ヒトＴ細胞のＩＦＮ−γの分泌を示す。タンデム構築物は、ＣＡＲの特異性に沿った抗原特異的反応を呈する。Ｄａｕｄｉ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ７９ａ抗原が陽性である。  図８Ｄは、腫瘍細胞共培養後、２４時間でのＣＡＲ構築物を発現する形質導入ヒトＴ細胞のＴＮＦαの分泌を示す。タンデム構築物は、ＣＡＲの特異性に沿った抗原特異的反応を呈する。Ｄａｕｄｉ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ７９ａ抗原が陽性である。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
配列番号に関する簡単な説明
配列番号１は、抗ＥＧＦＲのＶＨＨドメインのポリヌクレオチド配列を記載する。
【００８７】
配列番号２は、抗ＥＧＦＲのＶＨＨドメインのポリペプチド配列を記載する。
【００８８】
配列番号３は、抗ＥＧＦＲのＶＨＨ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【００８９】
配列番号４は、抗ＥＧＦＲのＶＨＨ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【００９０】
配列番号５は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【００９１】
配列番号６は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【００９２】
配列番号７は、多価抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ−抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【００９３】
配列番号８は、多価抗ＥＧＦＲ  ＶＨＨ−抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【００９４】
配列番号９は、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖのポリヌクレオチド配列を記載する。
【００９５】
配列番号１０は、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖのポリペプチド配列を記載する。
【００９６】
配列番号１１は、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【００９７】
配列番号１２は、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【００９８】
配列番号１３は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖのポリヌクレオチド配列を記載する。
【００９９】
配列番号１４は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖのポリペプチド配列を記載する。
【０１００】
配列番号１５は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１０１】
配列番号１６は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【０１０２】
配列番号１７は、抗ＣＤ１９のＶＨＨドメインのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１０３】
配列番号１８は、抗ＣＤ１９のＶＨＨドメインのポリペプチド配列を記載する。
【０１０４】
配列番号１９は、抗ＣＤ２０のＶＨＨドメインのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１０５】
配列番号２０は、抗ＣＤ２０のＶＨＨドメインのポリペプチド配列を記載する。
【０１０６】
配列番号２１は、タンデムな抗ＣＤ１９  ＶＨＨ−抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１０７】
配列番号２２は、タンデムな抗ＣＤ１９  ＶＨＨ−抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【０１０８】
配列番号２３は、タンデムな抗ＣＤ２０  ＶＨＨ−抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１０９】
配列番号２４は、タンデムな抗ＣＤ２０  ＶＨＨ−抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【０１１０】
配列番号２５は、タンデムな抗ＣＤ１９  ＶＨＨ−抗ＣＤ２０  ＶＨＨ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１１１】
配列番号２６は、タンデムな抗ＣＤ１９  ＶＨＨ−抗ＣＤ２０  ＶＨＨ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【０１１２】
配列番号２７は、抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１１３】
配列番号２８は、抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖのポリペプチド配列を記載する。
【０１１４】
配列番号２９は、タンデムな抗ＣＤ２０  ＶＨＨ−抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１１５】
配列番号３０は、タンデムな抗ＣＤ２０  ＶＨＨ−抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【０１１６】
配列番号３１は、抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１１７】
配列番号３２は、抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【０１１８】
配列番号３３は、タンデムな抗ＣＤ２０  ＶＨＨ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列を記載する。
【０１１９】
配列番号３４は、タンデムな抗ＣＤ２０  ＶＨＨ  ＣＡＲのポリペプチド配列を記載する。
【０１２０】
配列番号３５〜４６は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
【０１２１】
配列番号４７〜７１は、プロテアーゼ切断部位および自己切断性ポリペプチドの切断部位のアミノ酸配列を記載する。
【０１２２】
前述の配列において、Ｘは、もしあれば任意のアミノ酸、またはアミノ酸の非存在を指す。
【０１２３】
Ａ．概要
癌は多くの場合、異なるレベルの様々な抗原を発現する不均一な細胞プールである。一般的に、免疫療法は最初に、大部分の癌細胞上に発現され、正常な細胞上では実質的に発現されない抗原を標的とするよう選択される。効果的な標的化免疫療法は、標的抗原を発現する大部分の癌細胞を殺し、部分寛解または完全寛解をもたらすであろう。しかしほとんどの癌は本来不均一であり、標的抗原を発現しない、または低レベルで発現する残留癌細胞が拡散され、最初の免疫療法では効率的に標的化されない癌細胞が生じてしまう可能性がある。
【０１２４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性を制限する主要な障害の１つは、「抗原陰性」癌の再発である。例えば抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、当初は再発性および難治性の急性ＡＬＬにおいて優れた寛解率をもたらすが、およそ１０〜２０％の症例でＣＤ１９陰性の白血病性芽球の再発が発生する。この驚くほど高率の抗原陰性再発は、ＣＡＲ  Ｔ免疫療法がいまだ対処出来ない弱点である。任意の特定の学説に拘束されることは望まないが、本発明者らは、ＣＡＲを再操作し、再発または難治性の抗原陰性癌細胞上に発現される事実上、無制限の数の追加抗原を再標的化し得ることにより、この課題を解決した。したがって、本明細書に予期される組成物および方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法における重要な進展を示すものである。
【０１２５】
様々な実施形態では、複数の標的抗原を標的とする多価キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。ＣＡＲは、２つ以上の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含有してもよい。特定の実施形態において予期されるＣＡＲは、１、２、３またはそれ以上の標的抗原に指向化された１つまたは複数の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）結合ドメインを含有する。ある実施形態において予期されるＣＡＲは、１、２、３、４またはそれ以上の標的抗原に指向化された、１つまたは複数の単一ドメイン抗体結合ドメインおよび一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）結合ドメインを含有する。
【０１２６】
様々な実施形態では、ＣＡＲは、２つ以上のｓｄＡｂ抗原結合ドメインを含有する。
【０１２７】
様々な実施形態では、ＣＡＲは、ｓｄＡｂ抗原結合ドメインおよびｓｃＦｖを含有する。
【０１２８】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖに対してＮ末端側のｓｄＡｂ抗原結合ドメインを含有し、他の特定の実施形態では、ＣＡＲは、ｓｄＡｂに対してＮ末端側のｓｃＦｖを含有する。
【０１２９】
特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、本明細書において予期される１つまたは複数の多価ＣＡＲを発現するように改変される。
【０１３０】
様々な実施形態では、１つまたは複数の多価ＣＡＲを含有する改変免疫エフェクター細胞は、限定されないが、癌、移植片対宿主病、感染性疾患、自己免疫性疾患、または免疫不全を含む免疫系障害を有する患者に投与される。
【０１３１】
組み換え（すなわち操作された）ＤＮＡ、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの合成、免疫アッセイ、組織培養、形質転換（例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法）、酵素反応、精製に関する方法、ならびに関連する技術および手順は概して、本明細書全体を通じて引用および検討されるように、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学の概論ならびに各論の様々な参照文献において記載されるように実施されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ，１９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）；Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｕｌｉｅ  Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ  Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｋ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎ��ｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  ＣＣ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびに例えばＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの雑誌の研究論文を参照のこと。
【０１３２】
Ｂ．定義
本開示を詳細に記載する前に、本明細書において使用される用語の定義を提供することで、その理解の助けとなるであろう。
【０１３３】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似した、または均等の方法および材料を、特定の実施形態の実施または検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法および材料の実施形態を開示する。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。
【０１３４】
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」といった冠詞は、本明細書において、当該冠詞の文法上の対象の１つまたは複数（すなわち少なくとも１つ、または１つもしくは複数）を指すために使用される。例示として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、１つの要素、または１つもしくは複数の要素を意味する。
【０１３５】
選択肢（例えば「または」）の使用は、いずれか１つ、両方、またはその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。
【０１３６】
「および／または」という用語は、いずれか１つ、またはその選択肢の両方を意味すると理解されたい。
【０１３７】
１つの実施形態では、例えば１〜５、約１〜５、または約１〜約５といった範囲は、当該範囲に包含される各数値を指す。例えば１つの非限定的で、単なる例示的な実施形態において、「１〜５」という範囲は、１、２、３、４、５；または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０；または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。
【０１３８】
本明細書において使用される場合、「実質的に」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。１つの実施形態において、「実質的に同一」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さとおよそ同じである、例えば生理学的効果などの効果を生じさせる数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。
【０１３９】
本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％までも変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。１つの実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに関し、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さの範囲を指す。
【０１４０】
本明細書全体を通じて、別段であることが要求されない限り、「含む」および「含むこと」という文言は、記載される工程、または要素、または工程もしくは要素の群の含有を示唆するが、任意の他の工程、または要素、または工程もしくは要素の群の除外は示唆しないことを理解されたい。「〜からなる」とは、「〜からなる」という文言に続くものを含むが、それらに限定されることを意味する。ゆえに、「〜からなる」という文言は、列記される要素が必要または義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に〜からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、および列記される要素に対し、本開示中に特定される活性もしくは作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。ゆえに、「本質的に〜からなる」という文言は、列記される要素が必須または義務であり、しかし列記される要素の活性または作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。
【０１４１】
本明細書全体を通じて「１つの実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造または特徴が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。ゆえに本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに特定の性質、構造または特徴は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされ得る。さらに、１つの実施形態でのある性質の肯定的な列挙は、特定の実施形態では当該性質の除外の根拠として機能することを理解されたい。
【０１４２】
Ｃ．多価キメラ抗原受容体
様々な実施形態では、免疫エフェクター細胞の細胞傷害活性を、標的抗原を発現する癌細胞へと再指向化させる操作された受容体が提供される。これら操作された受容体は、本明細書において、多価キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼称される。多価ＣＡＲは、標的抗原に対する抗体系の特異性と、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせて、抗原特異的な細胞性免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成する分子である。多価ＣＡＲは、２つ以上の標的抗原に指向化された２つ以上の抗原結合ドメインを含有し、それらにより、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の活性を、１つまたは複数の標的抗原を発現する標的細胞へと再指向化させ、または標的抗原を発現する標的細胞の不均一な群へと再指向化させることが可能となる。本明細書において使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源に由来する異なるタンパク質部分またはＤＮＡ部分から構成されるものを表す。
【０１４３】
様々な実施形態では、本明細書において予期される多価ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の細胞傷害活性を、２つ以上の標的抗原を発現する標的細胞へと再指向化させるように操作される。再発癌または難治性癌は、細胞性免疫療法分野において広く存在する課題である。一部の実施形態では、標的細胞は、一価ＣＡＲ  Ｔ細胞療法に対する高い再発発生率または高い治療抵抗性を特徴とする腫瘍細胞である。任意の特定の学説に拘束されることは望まないが、多価ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、免疫療法の有効性を高め、再発癌細胞または難治性癌細胞が発生する可能性を低下させることが予期される。例えば抗原Ｘを発現する癌に対し、抗Ｘ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で治療された患者は、当初は改善と癌の退縮を示すが、最終的にはＸ発現を欠く癌が再発する場合がある。この状況は重大な問題であり、患者中に存在するＣＡＲ  Ｔ細胞はＸに特異的であるが故に、再発または難治性のＸ陰性癌細胞は免疫系に認識されず、追加の治療介入を行わなければ抑制されることなく増殖する。本明細書において予期される多価ＣＡＲは、癌細胞上に発現される複数の標的抗原を同時に標的とすることで当該癌細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を高め、抗原逃避の発生率を低下させることにより、この抗原逃避の問題に対する治療的解決法を提供するものである。
【０１４４】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、複数の標的抗原に結合する多価抗原結合ドメインを含有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。従来的な一価ＣＡＲは、標的抗原に対するｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含有する。本明細書において予期される多価ＣＡＲは、限定されないが、ラクダ科（ＶＨＨ抗体）または軟骨魚類（ＩｇＮＡＲ抗体）から単離される重鎖のみの抗体、またはその抗原結合断片を含む、単一ドメイン抗体の単量体的でモジュール的な性質を利用している。好ましい実施形態では、本明細書において予期される多価ＣＡＲは、１つもしくは複数のｓｄＡｂ、またはその抗原結合断片または例えばＶＨＨドメインなどのそのドメイン、および１つもしくは複数のｓｃＦｖまたはその抗原結合断片またはそのドメインを含有する。好ましい実施形態では、本明細書において予期される多価ＣＡＲは、第一の抗原に結合するｓｄＡｂまたはその抗原結合断片、および第二の抗原に結合するｓｃＦｖまたはその抗原結合断片を含有する。好ましい実施形態では、本明細書において予期される多価ＣＡＲは、第一の抗原に結合するｓｃＦｖまたはその抗原結合断片、および第二の抗原に結合するｓｄＡｂまたはその抗原結合断片を含有する。
【０１４５】
標的細胞の表面上に発現される１つまたは複数の標的抗原と、ＣＡＲの１つまたは複数の抗原結合ドメインを会合させることで、ＣＡＲのクラスター化が生じ、活性化刺激がＣＡＲ含有細胞に送達される。ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性を再指向化させる能力であり、この能力によって、増殖、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス、または標的抗原発現細胞の細胞死を、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）非依存性の様式で介在し得る分子の産生が誘発され、モノクローナル抗体、可溶性リガンドまたは細胞特異的コレセプターの細胞特異的標的化能力が引き出される。
【０１４６】
様々な実施形態では、ＣＡＲは、ｓｄＡｂ、または例えばＶＨＨドメインなどのその抗原結合断片、およびｓｃＦｖを含有する細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、第一の抗原に結合するｓｄＡｂ、または例えばＶＨＨドメインなどのその抗原結合断片、および第二の抗原に結合するｓｃＦｖを含有する細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメインを含有する。特定の実施形態では、第一および第二の抗原は、以下からなる群から選択される：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８０、Ｃ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲ。
【０１４８】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８０、Ｃ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される第一の抗原に結合するｓｄＡｂ、または例えばＶＨＨドメインなどのその抗原結合断片、ならびに第二の抗原に結合するｓｃＦｖを含有する細胞外結合ドメイン：膜貫通ドメイン；１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０１４９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、第一の抗原に結合するｓｄＡｂ、または例えばＶＨＨドメインなどのその抗原結合断片、ならびに    ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８０、Ｃ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される第二の抗原に結合するｓｃＦｖを含有する細胞外結合ドメイン：膜貫通ドメイン；１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０１５０】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、第一の抗原に結合するｓｄＡｂ、または例えばＶＨＨドメインなどのその抗原結合断片、および抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを含有する細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０１５１】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡまたはＣＤ１９に結合するｓｄＡｂ、または例えばＶＨＨドメインなどのその抗原結合断片、および第二の抗原に結合するｓｃＦｖを含有する細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；１つまたは複数の細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン；および／または一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０１５２】
１．結合ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、標的細胞上に発現される第一の抗原に特異的に結合する１つもしくは複数のｓｄＡｂ、またはその抗原結合断片、またはそのドメイン、および標的細胞上に発現される第二の抗原に特異的に結合する１つもしくは複数のｓｃＦｖ抗体、またはその抗原結合断片、またはそのドメイン、を含有する細胞外結合ドメインを含有する。例えば標的抗原などの第一および第二の抗原は、同じ細胞上で発現されてもよく、または不均一な細胞群内の異なる細胞上で発現されてもよい。本明細書において使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は相互交換可能に使用され、標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合ドメインは、天然源、合成源、半合成源、または組み換え源のいずれかから誘導されてもよい。好ましい実施形態では、本明細書において予期される多価ＣＡＲは、２つ以上の抗原結合ドメインを連続して（タンデムで、または一列で）含有し、各結合ドメインは、異なる抗原に結合する。
【０１５３】
本明細書において使用される場合、「特異的結合アフィニティ」または「特異的に結合する」または「特異的に結合された」または「特異的結合」または「特異的に標的化」という用語は、バックグラウンド結合よりも高い結合アフィニティでの、標的抗原への抗体またはその抗原結合断片（またはそれを含有するＣＡＲ）の結合を記載する。結合ドメイン（または結合ドメインを含有するＣＡＲ、または結合ドメインを含有する融合タンパク質）は、例えば約１０５  Ｍ−１以上のアフィニティまたはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する、特定の結合相互作用の平衡結合定数）で抗原に結合する、または抗原と会合する場合、標的抗原に「特異的に結合する」。ある実施形態では、結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、標的に、約１０６  Ｍ−１、１０７  Ｍ−１、１０８  Ｍ−１、１０９  Ｍ−１、１０１０  Ｍ−１、１０１１  Ｍ−１、１０１２  Ｍ−１、または１０１３  Ｍ−１以上のＫａで結合する。「高アフィニティ」結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）とは、少なくとも１０７  Ｍ−１、少なくとも１０８  Ｍ−１、少なくとも１０９  Ｍ−１、少なくとも１０１０  Ｍ−１、少なくとも１０１１  Ｍ−１、少なくとも１０１２  Ｍ−１、少なくとも１０１３  Ｍ−１以上のＫａを有する結合ドメインを指す。
【０１５４】
あるいはアフィニティは、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として規定されてもよい（例えば１０−５  Ｍ〜１０−１３  Ｍ以下）。本開示による結合ドメインポリペプチドおよびＣＡＲタンパク質のアフィニティは、従来的な技術を使用して、例えば競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）により、または結合関連性アッセイにより、もしくは標識リガンドを使用した置換アッセイにより容易に決定され得、または例えばＢｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイスを使用して、または例えばＣｏｒｎｉｎｇ社およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社からそれぞれ入手可能なＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサー技術を使用して、容易に決定され得る（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；および米国特許第５，２８３，１７３号、第５，４６８，６１４号、ならびにその均等物を参照のこと）。
【０１５５】
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、２つ以上の抗原に結合する２つ以上の抗体断片、またはその抗原結合ドメインを含有する。「抗体」とは、抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する少なくとも軽鎖または重鎖の免疫グロブリン可変領域を含有するポリペプチドである結合物質を指し、そうした抗原としては例えば脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチドまたは核酸が挙げられ、免疫細胞により認識されるものなどの抗原性決定基を含有する。
【０１５６】
「抗原（Ａｇ）」とは、動物へ注射される、または吸収される組成物（例えば癌特異的タンパク質を含む組成物など）を含む、動物において抗体産生またはＴ細胞反応を刺激し得る化合物、組成物または物質を指す。抗原の例としては限定されないが、脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチドまたは核酸が挙げられる。
【０１５７】
「標的抗原」または「対象の標的抗原」は、本明細書に予期される結合ドメインが結合するよう設計された抗原である。特定の実施形態では、標的抗原は、以下からなる群から選択される：ＦＲα、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＬＬ−１、ＣＳ−１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＡＧＥ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＣＲＬ５、ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２，Ｋａｐｐａ、ＬＡＧＥ−１Ａ，Ｌａｍｂｄａ、ＬｅＹ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＰＢＧ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１。
【０１５８】
１つの実施形態では、抗原は、例えばクラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
【０１５９】
「エピトープ」または「抗原性決定基」とは、結合物質が結合する抗原の領域を指す。
【０１６０】
抗体は、例えばラクダＩｇ、リャマＩｇ、アルパカＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ラクダ科ＶＨＨ、ナノボディ）、またはその他の抗体断片などの抗原結合断片またはそのドメインを含む。当該用語はさらに、例えばキメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）、ヘテロ複合体化抗体（例えば二特異性抗体）、およびその抗原結合断片などの遺伝子操作型も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照のこと。
【０１６１】
軽鎖および重鎖の可変領域は、「フレームワーク」領域を含有し、この領域に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる３個の超可変領域が割り込んでいる。ＣＤＲは、従来的な方法により規定または特定されることができ、例えばＫａｂａｔら（Ｗｕ，ＴＴ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−５０，（１９７０）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０−２４４３（１９８７）；（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと。当該文献は参照により本明細書に援用される）による配列、またはＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１−９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９））による構造により規定され、または特定され得る。各鎖のＣＤＲは、典型的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼称され、Ｎ末端から連続的に番号付けされている。そして典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖により識別される。従って、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と呼称され、一方で抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と呼称される。
【０１６２】
軽鎖ＣＤＲを予測するための規則の例示としては、以下が挙げられる：ＣＤＲ−Ｌ１は、約２４番目の残基で始まり、Ｃｙｓが先行し、約１０〜１７残基である。その後にＴｒｐが続く（典型的にはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎであるが、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕもある）。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の末端から約１６残基で始まり、一般的にはＩｌｅ−Ｔｙｒが先行するが、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅが先行する場合もあり、７残基である。そしてＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の末端から約３３残基で始まり、Ｃｙｓが先行し、７〜１１残基である。その後にＰｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ（配列番号７３）（ＸＸＸは任意のアミノ酸）が続く。
【０１６３】
重鎖ＣＤＲを予測するための規則の例示としては、以下が挙げられる：ＣＤＲ−Ｈ１は、約２６番目の残基で始まり、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（配列番号７４）が先行し、１０〜１２残基である。その後にＴｒｐ（典型的にはＴｒｐ−Ｖａｌであるが、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ａｌａもある）が続く。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の末端から約１５残基で始まり、一般的にはＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号７５）が先行するが多くの変動がある。１６〜１９残基であり、その後にＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続く。そしてＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の末端から約３３残基で始まり、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（典型的にはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）が先行し、３〜２５残基である。その後にＴｒｐ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ（配列番号７６）が続く。
１つの実施形態では、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法に従い決定される。
【０１６４】
１つの実施形態では、軽鎖ＣＤＲならびに重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ法に従い決定され、重鎖ＣＤＲ１は、ＡｂＭ法に従い決定される。ＡｂＭ法はＫａｂａｔ法とＣｌｏｔｈｉａ法の中間から構成される。例えば、Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ  Ｎ  ＆  Ｒｅｅｓ  ＡＲ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２０００  Ｄｅｃ；１３（１２）：８１９−２４およびＭｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；２４８：５１−９１を参照のこと。ＣＤＲを予測するためのプログラムは公的に入手可能であり、例えば、ＡｂＹｓｉｓ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）がある。
【０１６５】
「ＶＬ」または「ＶＬ」への参照は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂまたは本明細書に開示される他の抗体断片のものを含む。
【０１６６】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への参照は、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲまたは本明細書に開示される他の抗体断片のものを含む。
【０１６７】
好ましい実施形態では、多価ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、例えばＶＨＨまたはＩｇＮＡＲなどのｓｄＡｂ、またはその抗原結合断片もしくはドメイン、およびｓｃＦｖを含有する。
【０１６８】
特定の実施形態では、多価ＣＡＲの結合ドメインは、ヒト抗体（例えばヒトモノクローナル抗体）、または標的抗原に特異的に結合するその断片に由来する。ヒト抗体は、上述のように公知のヒト定常ドメイン配列を含むヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を組み合わせることにより構築され得る。あるいはヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により作製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体作製用のヒトミエローマとマウス−ヒトのヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）に記載されている。トランスジェニック動物（例えばマウス）を使用しても、内在的な免疫グロブリンの産生を伴わずにヒトの完全レパートリーを産生させることができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。遺伝子シャッフリングを使用して、非ヒト、例えば齧歯類抗体から、ヒト抗体を誘導することもできる。この場合、ヒト抗体は、開始非ヒト抗体と類似したアフィニティと特異性を有している（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３を参照のこと）。従来的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と違い、この技術は完全なヒト抗体を提供するものであり、非ヒト起源のＦＲ残基またはＣＤＲ残基は有していない。
【０１６９】
特定の実施形態では、多価ＣＡＲの結合ドメインは、「ヒト化」される。ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えばラクダ科、サメ、マウス、またはラット）の免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と称される。１つの実施形態では、ヒト化免疫グロブリンにおいて、すべてのＣＤＲはドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要はないが、もしあれば、ヒト免疫グロブリンの定常領域と実質的に同一でなければならない。すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％以上同一でなければならない。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、追加的な保存的アミノ酸置換を有してもよく、この置換は、抗原結合または他の免疫グロブリンの機能に実質的な影響を与えない。ヒト化抗体は、遺伝子操作により構築されてもよい（例えば米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【０１７０】
特定の実施形態では、多価ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨ、好ましくはヒト化されたラクダ科ＶＨＨ、またはＩｇＮＡＲ、またはその抗原結合断片もしくはドメイン、およびｓｃＦｖを含有する。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ｓｃＦｖに由来する。すなわちｓｃＦｖから単離された１つまたは２つのＶＨドメインである。
【０１７１】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」とは、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４−４９０）。
【０１７２】
「ラクダＩｇ」または「ラクダ科ＶＨＨ」とは、本明細書において使用される場合、重鎖抗体の公知の最小抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ，ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２１：３４９０−３４９８（２００７））。「重鎖抗体」または「ラクダ科抗体」とは、２つのＶＨドメインを含有するが、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８（１９９９）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。特定の実施形態では、ラクダ科抗体は、ラクダＩｇ、アルパカＩｇ、およびリャマＩｇを含む。
【０１７３】
「免疫グロブリンの新規抗原受容体」の「ＩｇＮＡＲ」とは、１つの可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインと、５つの定常新規抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなる、サメ免疫レパートリーからの抗体クラスを指す。ＩｇＮＡＲは、公知の最小免疫グロブリン系タンパク質スキャホールドのいくつかを象徴しており、高度に安定的で、効率的な結合特性を保有している。その固有の安定性は、（ｉ）マウス抗体に存在する従来的な抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインと比較して、相当な数の荷電および親水性の表面露呈残基を呈する基盤的Ｉｇスキャホールド、および（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋およびループ内の水素結合のパターンを含む相補性決定領域（ＣＤＲ）ループにおける構造的性質の安定化、の両方に起因し得る。
【０１７４】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含有し、これらドメインは、１つのポリペプチド鎖中に、いずれかの方向で存在する（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含有しており、それによってｓｃＦｖは抗原結合に望ましい構造を形成することができる。ｓｃＦｖのレビューについては例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）、２６９−３１５ページを参照のこと。可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用され得る技術は、例えばＯｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３−３８３７に記載されている。
【０１７５】
抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成され、各々が一つの抗原結合部位を有している。残りの「Ｆｃ」断片は、容易に結晶化するという能力を反映した名称となっている。ペプシン処理ではＦ（ａｂ’）２断片が生成され、この断片は２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋させることもできる。
【０１７６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。１つの実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、緊密な非共有結合をしている１つの重鎖軽鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインは、柔軟性のあるペプチドリンカーにより共有結合されてもよく、それにより軽鎖と重鎖は、二本鎖Ｆｖ種と類似した「二量体」構造で結合し得る。この構造では、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。まとめると、６個のＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を与えることとなる。しかし１つの可変ドメイン（すなわち抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含有する、Ｆｖの半分）であっても、抗原を認識し、結合する能力を有している。ただし、結合部位全体と比べると、アフィニティは低い。
【０１７７】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含有し、そして軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片とは異なり、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む、少数の残基が付加されている。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’の本明細書における呼称であり、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を担持している。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして生成された。他の抗体の化学的連結も公知である。
【０１７８】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖中で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）につながれた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有する（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上で２つのドメイン間にペアを形成するには短すぎるリンカーを使用することで、それらドメインは、別の鎖の相補的なドメインとのペア形成を余儀なくされ、２つの抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、二価または二特異性であってもよい。ダイアボディについては、例えばＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  １９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１７９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、第一の抗原に結合するヒト化ラクダ科ＶＨＨ、および第二の抗原に結合するマウスｓｃＦｖ、ヒト化ｓｃＦｖ、またはヒトｓｃＦｖを含有する。
【０１８０】
好ましい実施形態では、ＣＡＲは、第一の抗原に結合するヒト化ラクダ科ＶＨＨ、および第二の抗原に結合するマウスｓｃＦｖを含有する。
【０１８１】
２．リンカー
ある実施形態では、多価ＣＡＲは、１つまたは複数のリンカーを含有する。「リンカー」とは、ＣＡＲ中の様々なポリペプチドドメイン間、例えば抗原結合ドメインの間、および抗原結合ドメインのＶＨ領域とＶＬ領域の間の複数のアミノ酸を指し、分子の適切な間隔および立体構造のために付加される。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域を結合させる配列である。「可変領域を結合させる配列」は、ＶＨとＶＬを繋げるアミノ酸配列であり、２つの下位結合ドメインの相互作用と適合可能なスペーサー機能を提供し、得られたポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合アフィニティを保持する。特定の実施形態では、リンカーは、ｓｄＡｂまたはその断片と、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ中の１つもしくは複数の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激性ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを分離させる。ＣＡＲは、１、２、３、４、または５個以上のリンカーを含有する。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１〜約２５アミノ酸、約５〜約２０アミノ酸、または約１０〜約２０アミノ酸、または任意のその間のアミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のアミノ酸長である。
【０１８２】
リンカーの例示としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎで式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４または５の整数であるもの；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；および当分野に公知の他の柔軟性のあるリンカーが挙げられる。グリシンポリマーおよびグリシン−セリンポリマーは比較的、非構造的であり、そのため例えば本明細書に記載されるＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中立的なテザーとしての役割を果たし得る。グリシンは、アラニンよりも遥かに多くのφ−ψ空間にアクセスし、長い側鎖を有する残基よりもずっと制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照のこと）。当業者であれば、特定の実施形態におけるＣＡＲの設計には、全て柔軟なリンカーまたは部分的に柔軟なリンカーを含み得ること、それにより当該リンカーは、柔軟なリンカー、ならびに所望のＣＡＲ構造をもたらすために柔軟性が低い構造を与える、１つまたは複数の部分を含み得ることを理解するであろう。
【０１８３】
他のリンカー例としては限定されないが、以下のアミノ酸配列が挙げられる：ＧＧＧ（配列番号３５）；ＤＧＧＧＳ（配列番号３６）；ＴＧＥＫＰ（配列番号３７）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと）；ＧＧＲＲ（配列番号３８）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ  式中、ｎ  ＝  １、２、３、４または５（配列番号３９）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号４０）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４１）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号４２）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号４３）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号４４）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２  ＥＲＰ（配列番号４５）。あるいは、ＤＮＡ結合部位とそのペプチドの両方をモデリングすることができるコンピュータープログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ＆  Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４））を使用して、またはファージディスプレイ法により、可塑性リンカーが合理的に設計されてもよい。１つの実施形態では、リンカーは、以下のアミノ酸配列を含む：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４６）（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７−１６４４（２００３））。
【０１８４】
３．スペーサードメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインの後に、１つまたは複数の「スペーサードメイン」が続く。「スペーサードメイン」とは、２つのドメインを分離させるポリペプチドを指す。１つの実施形態では、スペーサードメインは、エフェクター細胞の表面から抗原結合ドメインを離れさせ、適切な細胞／細胞の接触、抗原結合、および活性化を可能にする（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然源、合成源、半合成源、または組み換え源のいずれかから誘導されてもよい。ある実施形態では、スペーサードメインは、１つまたは複数の重鎖定常領域、例えばＣＨ２およびＣＨ３などを含む免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、天然免疫グロブリンヒンジ領域、または改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１８５】
１つの実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４またはＩｇＤのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する。
【０１８６】
４．ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合ドメインの後には概して、１つまたは複数の「ヒンジドメイン」が続く。「ヒンジドメイン」とは、エフェクター細胞の表面から抗原結合ドメインを離れて配置させ、適切に細胞／細胞を接触させる、抗原結合させる、および活性化させることに重要な役割を果たすポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ＣＡＲは、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）の間に１つまたは複数のヒンジドメインを含有する。ヒンジドメインは、天然源、合成源、半合成源、または組み換え源のいずれかから誘導されてもよい。ヒンジドメインは、天然免疫グロブリンヒンジ領域、または改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１８７】
「改変ヒンジ領域」とは、（ａ）最大で３０％のアミノ酸が変化した天然ヒンジ領域（例えば最大で２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸が置換または欠失）、（ｂ）少なくとも１０アミノ酸（例えば少なくとも１２、１３、１４、または１５アミノ酸）の長さであり、最大で３０％のアミノ酸が変化した天然ヒンジ領域部分（例えば最大で２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸が置換または欠失）、または（ｃ）コアヒンジ領域（４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５アミノ酸の長さ、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５アミノ酸の長さであり得る）を含有する天然ヒンジ領域部分を指す。ある実施形態では、天然免疫グロブリンヒンジ領域中の１つまたは複数のシステイン残基が、１つまたは複数の他のアミノ酸残基（例えば１つまたは複数のセリン残基）で置換されてもよい。あるいは、または追加的に、改変免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基が、別のアミノ酸残基（例えばセリン残基）で置換されている。
【０１８８】
本明細書に記載されるＣＡＲにおける使用に適したヒンジドメインの例示としては、例えばＣＤ８αおよびＣＤ４といった１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これら分子の野生型ヒンジ領域であってもよく、または改変されてもよい。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含有する。
【０１８９】
１つの実施形態では、ヒンジは、ＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
【０１９０】
５．膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、ＣＡＲの細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインを融合させ、ＣＡＲを、免疫エフェクター細胞の細胞膜に固定するドメインである。ＴＭドメインは、天然源、合成源、半合成源、または組み換え源のいずれかから誘導されてもよい。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１の少なくとも膜貫通領域に由来してもよい（すなわち含有してもよい）。特定の実施形態では、ＴＭドメインは、合成であり、例えばロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含有する。
【０１９１】
１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２またはＣＤ８α由来のＴＭドメインを含有する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２またはＣＤ８α由来のＴＭドメインと、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の長さの短オリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーを含有し、当該リンカーは、ＣＡＲのＴＭドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを結合させる。グリシン−セリンを基にしたリンカーが、特に適切なリンカーを提供する。１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８α由来のＴＭドメインと、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の長さの短オリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーを含有し、当該リンカーは、ＣＡＲのＴＭドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを結合させる。
【０１９２】
６．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、標的抗原への効果的なＣＡＲ結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達し、例えば活性化、サイトカイン産生、増殖および細胞傷害活性など、ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で惹起される他の細胞反応を含む、エフェクター細胞機能を惹起させることに関与するＣＡＲの部分を指す。
【０１９３】
「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の専門的な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば細胞溶解活性、またはサイトカイン分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するタンパク質部分を指し、細胞に専門的機能を実行するよう指示を出す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体が使われ得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される範囲について、エフェクター機能シグナルが伝達される限りにおいて、ドメイン全体に代わり、そうした切断部分が使用されてもよい。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に充分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことが意図される。
【０１９４】
ＴＣＲのみを通じて生じたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不充分であること、および二次的シグナルまたは共刺激性シグナルも必要であることが知られている。ゆえにＴ細胞の活性化は、２つの別種の細胞内シグナル伝達ドメインにより介在されると言うこともできる。一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ（例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を通じて抗原依存性の一次活性化を開始させる。そして共刺激性シグナル伝達ドメインは、抗原依存性の様式で作用して、二次性または共刺激性のシグナルを生じさせる。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の「共刺激性シグナル伝達ドメイン」と、「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。
【０１９５】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインを含有し、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および拡張を強化する。本明細書において使用される場合、「共刺激性シグナル伝達ドメイン」または「共刺激性ドメイン」という用語は、共刺激性分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激性分子は、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子であり、抗原に結合したときのＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要とされる二次的なシグナルを生じさせる。そうした共刺激性分子の例示としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が挙げられる。
【０１９６】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激性または阻害性のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激性に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆｓ）またはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有する場合がある。
【０１９７】
特定の実施形態での使用に適したＩＴＡＭ含有一次シグナル伝達ドメインの例示としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン、および１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメインを含有する。細胞内の一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインは、任意の順序で、多価に、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に結合されてもよい。
【０１９８】
１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つまたは複数の共刺激性シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０１９９】
１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７共刺激性シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０２００】
１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３４共刺激性シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０２０１】
１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含有する。
【０２０２】
Ｄ．ポリペプチド
様々なポリペプチドが本明細書において予期され、限定されないが、多価ＣＡＲポリペプチド、その断片、およびそのドメインが挙げられる。好ましい実施形態では、１つまたは複数のＣＡＲを含有するポリペプチドが提供される。特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含有する。
【０２０３】
「ポリペプチド」「ペプチド」、および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、反対であることが明記されない限り、従来的な意味に従う。すなわちアミノ酸配列として使用される。１つの実施形態では、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な公知の組み換え技術および／または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは特定の長さに限定されない。例えばポリペプチドは、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含有してもよい。ポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの翻訳後修飾を含んでもよく、ならびに当分野に公知の天然および非天然の他の修飾を含んでもよい。
【０２０４】
様々な実施形態では、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含有し、当該配列は、翻訳と同時、または翻訳の後のタンパク質移送を指示する。本明細書において予期されるポリペプチドにおいて有用な、適切なシグナル配列の例示としては限定されないが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドは、様々な公知の組み換え技術および／または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。本明細書において予期されるポリペプチドは特に、本明細書において予期されるＣＡＲの１つまたは複数のアミノ酸からの欠失、付加、および／または置換を有する配列を包含する。
【０２０５】
本明細書において使用される場合、「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチド分子またはポリペプチド分子のインビトロでの単離および／または精製を指す。すなわち、インビボでの物質と実質的に関連づけられていない。特定の実施形態では、単離ポリペプチドは、合成ポリペプチド、半合成ポリペプチド、または組み換え源から取得された、もしくは誘導されたポリペプチドである。
【０２０６】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入により、天然ポリペプチドとは異なっている場合がある。そうしたバリアントは、天然であってもよく、または例えば上述のポリペプチド配列の１つまたは複数を改変することにより合成的に生成されてもよい。例えば特定の実施形態では、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入をポリペプチドに導入することにより、ポリペプチドの結合アフィニティおよび／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書において予期される参照配列のいずれかに対し、少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、当該バリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持している。
【０２０７】
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示としては、抗原結合ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインなどが挙げられる。本明細書において使用される場合、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、天然ポリペプチドの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の活性を保持するポリペプチド断片を指す。
【０２０８】
ある実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００アミノ酸の長さのアミノ酸鎖を含有し得る。ある実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、またはそれ以上のアミノ酸の長さである。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＡＲの生物学的に活性な断片を含有する。
【０２０９】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、「Ｘ」と示される１つまたは複数のアミノ酸を含有してもよい。アミノ酸の配列番号中にある場合、「Ｘ」とは、任意のアミノ酸を指す。１つまたは複数の「Ｘ」残基は、本明細書において予期される特定の配列番号に記載されるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に存在してもよい。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に記載される残りのアミノ酸配列は、生物学的に活性な断片とみなされ得る。特に有用なポリペプチド断片としては、抗体の抗原結合ドメインまたは断片を含む機能性ドメインが挙げられる。
【０２１０】
ポリペプチドは、ポリペプチドの合成、精製もしくは識別をし易くするため（例えばポリ−Ｈｉｓ）、または固形支持体へのポリペプチドの結合を強化するためのリンカーまたは他の配列に、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合されてもよく、または結合されてもよい。
【０２１１】
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む、様々な方法で改変されてもよい。そうした操作のための方法は、当分野において一般的に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の突然変異により作製され得る。突然変異誘導およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当分野に公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびそれらにおいて引用される参照文献を参照のこと。対象タンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得る。
【０２１２】
ある実施形態では、ポリペプチドバリアントは、１つまたは複数の保存的置換を含有する。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似した性能を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、ペプチド化学分野の当業者であれば、そうした置換によって、当該ポリペプチドの二次構造および疎水親水的性質が実質的に変化しないと予測するであろう。特定の実施形態において予期されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に改変を行ってもよく、それでも所望の特徴を有するバリアントポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子が取得される。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更し、均等な、または改善されたバリアントポリペプチドを生成することが望ましい場合、当業者は、例えば表１に従い、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変えることができる。
表１−アミノ酸コドン
【表１】
2021506305.tif 000003
【０２１３】
どのアミノ酸残基が、生物活性を無効化することなく置換、挿入または欠失させ得るかを決定するガイダンスは、当分野に公知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ、またはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアなどを使用して見出すことができる。本明細書に開示されるタンパク質バリアント中のアミノ酸の変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち類似した荷電アミノ酸、または非荷電アミノ酸の置換であることが好ましい。保存的アミノ酸変化には、その側鎖で関連付けられているアミノ酸ファミリーの１つの置換を含む。天然アミノ酸は一般的に以下の４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、合わせて芳香族アミノ酸として分類される場合もある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般的に得られる分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域中の一アミノ酸置換は概して、生物活性を大きくは変化させないと認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照のこと）。
【０２１４】
１つの実施形態では、２つ以上のポリペプチドの発現が望ましい場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書において別段に検討されるようにＩＲＥＳ配列により分離されてもよい。別の実施形態では、２つ以上のポリペプチドが、１つまたは複数の自己切断ポリペプチド配列を含有する融合タンパク質として発現されてもよい。
【０２１５】
特定の実施形態において予期されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば多価ＣＡＲが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、典型的にはＣ末端〜Ｎ末端で結合されるが、Ｃ末端〜Ｃ末端、Ｎ末端〜Ｎ末端、またはＭ末端〜Ｃ末端で結合されることもできる。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であってもよく、または指定の順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、保存的に改変されたバリアント、多型バリアント、アレル、突然変異体、下位配列、および種間ホモログを含み得るが、ただし融合ポリペプチドの望ましい転写活性は保存されるものとする。融合ポリペプチドは、化学合成法により、または２つの部分の間の化学的結合により作製されてもよく、または他の標準的な方法を使用して一般的に調製されてもよい。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書において別段に検討されるように適切な転写制御因子または翻訳制御因子に操作可能に連結される。
【０２１６】
１つの実施形態では、融合パートナーは、タンパク質の発現を、そのままの組み換えタンパク質よりも高い収率で補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度を高めるように、またはタンパク質が所望の細胞内コンパートメントへと標的化され得るように、または融合タンパク質の細胞膜を通過する輸送が促進されるように選択されてもよい。
【０２１７】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載される各ポリペプチドドメインの間に、ポリペプチド切断シグナルをさらに含有してもよい。それに加えて、ポリペプチド切断部位を、任意のリンカーペプチド配列内に挿入することもできる。ポリペプチド切断シグナルの例としては、例えばプロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、および自己切断ウイルスオリゴペプチド（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照のこと）といったポリペプチド切断認識部位が挙げられる。
【０２１８】
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照のこと）。プロテアーゼ切断部位の例としては限定されないが、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えばタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２−コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（ワイカウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。切断ストリンジェンシーが高いために、１つの実施形態ではＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えばＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号４７）、例えばＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４８）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４９）が好ましく、式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表している（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間、またはＱとＳの間で発生する）。
【０２１９】
特定の実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピング配列である。
【０２２０】
リボソームスキッピング配列の例示としては限定されないが、２Ａもしくは２Ａ様の部位、配列またはドメインが挙げられる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０２２１】
１つの実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、以下からなる群から選択される：口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチド。
【０２２２】
２Ａ部位の例示を表２に提示する。
表２：
【表２−１】
2021506305.tif 000004
【表２−２】
2021506305.tif 000005
【０２２３】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、多価ＣＡＲポリペプチドを含有する。
【０２２４】
Ｅ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、および組み換え、合成または単離されていてもよい。ポリヌクレオチドとしては限定されないが、以下が挙げられる：プレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組み換えＤＮＡ。ポリヌクレオチドとは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチドの長さのヌクレオチドの多量体型を指し、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかタイプのヌクレオチドの改変型、ならびにすべての中間の長さのものを指す。本文脈において、「中間の長さ」とは、例えば６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などの引用されている値の間の任意の長さを意味すると容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対し、少なくとも、もしくは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【０２２５】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書において使用される場合、「コドン最適化された」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコドンを置換して、ポリペプチドの発現、安定性および／または活性を向上させることを指す。コドン最適化に影響を及ぼす因子としては限定されないが、以下のうちの１つまたは複数が挙げられる：（ｉ）２つ以上の生物体または遺伝子または合成構築されたバイアステーブルの間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物体、遺伝子または遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）コンテキストを含むコドンの体系的変動、（ｉｖ）その解読ｔＲＮＡに伴うコドンの変動、（ｖ）三つ組全体または三つ組の１つの位置のいずれかのＧＣ％に伴うコドンの変動、（ｖｉ）例えば天然配列などの参照配列に対する類似性における変動、（ｖｉｉ）コドン頻度のカットオフにおける変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的性質、（ｉｘ）コドン置換セットの設計の基礎となるＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸に対するコドンセットの合成的変動、および／または（ｘｉ）誤った翻訳開始位置の分離された除去。
【０２２６】
様々な例示的実施形態において、本明細書に予期されるポリヌクレオチドとしては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３に記載されるもの、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、ウイルスベクター、およびトランスファープラスミドが挙げられる。
【０２２７】
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と相当の配列同一性を呈するポリヌクレオチド、または本明細書において規定されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語には、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換または改変によって参照ポリヌクレオチドと識別されるポリヌクレオチドも包含される。従って、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語には、１つまたは複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失もしくは改変され、または別のヌクレオチドと置換されたポリヌクレオチドが含まれる。この点に関し当分野において、参照ポリヌクレオチドに対して変異、付加、欠失および置換を含むある変更が為され、それにより変更されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または生物活性を保持し得ると理解されている。
【０２２８】
「配列同一性」、または例えば「〜に対して５０％同一の配列」を含む、という文章は、本明細書において使用される場合、比較ウィンドウ上で配列が、ヌクレオチド毎で同一である、またはアミノ酸ごとで同一である程度を指す。ゆえに「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウ上の２つの最適アライメント配列を比較する工程、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が、両方の配列中に存在する位置の数を決定して、合致位置数を算出する工程、合致位置数を、比較ウィンドウ中の総位置数（すなわちウィンドウサイズ）で割る工程、および結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を算出する工程、により計算されてもよい。本明細書に記載される参照配列のいずれかに対し、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、当該ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持している。
【０２２９】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列相関性を記載するために使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、および「実質的同一性」が挙げられる。「参照配列」は、少なくとも１２個、しばしば１５〜１８個、通常は少なくとも２５個の単量体単位の長さであり、単位にはヌクレオチド残基およびアミノ酸残基が含まれる。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）当該２つのポリヌクレオチドの間で似ている配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部のみ）と、（２）２つのポリヌクレオチドの間で相違する配列、を含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は、多くの場合、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」上で比較し、配列類似性の局所領域を特定および比較することにより実施される。「比較ウィンドウ」とは、少なくとも６個の連続する位置、通常は約５０〜１００個、より普遍的には約１００〜１５０個の連続する位置の概念的なセグメントを指し、２つの配列が最適にアライメントされた後、そのセグメント中で配列は同じ連続位置数の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適アライメントを目的として、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較し約２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含む場合がある。比較ウィンドウの整列のための最適な配列アライメントは、アルゴリズム（米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）をコンピューター実装することで実施されてもよく、または選択される様々な方法のいずれかにより行われる検査と最適アライメント（すなわち比較ウィンドウ上で最も高い相同性百分率を生じさせるアライメント）により実施されてもよい。参照も、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９により開示されるように、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムに対して為されてもよい。配列解析の詳細な検討については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５のＵｎｉｔ  １９．３に見出すことができる。
【０２３０】
本明細書において使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」とは、自然状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチドを指し、例えば、通常では当該断片と隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態では、「単離ポリヌクレオチド」とは、自然界では存在せず、ヒトの手により作製された相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチド、半合成ポリヌクレオチド、または組み換え源から取得された、もしくは誘導されたポリヌクレオチドである。
【０２３１】
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書において予期されるＣＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含有する。
【０２３２】
ポリヌクレオチドの方向性を説明する用語としては、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチド末端）、および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチド末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５〜３’の方向で、または３’〜５’の方向でアノテーションされることができる。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関しては、５’〜３’鎖が、「センス」鎖、「プラス」鎖または「コーディング」鎖と指定される。その理由は、当該配列は、プレメッセンジャー（ｐｒｅｍＲＮＡ）の配列と［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりのＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除き］同一であるためである。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関し、相補的な３’〜５’鎖は、ＲＮＡポリメラーゼにより転写された鎖であり、「鋳型」鎖、「アンチセンス」鎖、「マイナス」鎖または「非コーディング」鎖と指定される。本明細書において使用される場合、「逆方向」という用語は、３’〜５’方向で記載された５’〜３’配列を指し、または５’〜３’の方向で記載された３’〜５’配列を指す。
【０２３３】
「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成の規則に関連するポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を指す。例えばＤＮＡ配列の５’Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  ３’の相補鎖は、３’Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ａ  Ｃ  ５’である。後者の配列はしばしば、左側に５’末端、右側に３’末端を置いて、５’Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｔ  ３’のように逆相補として記載される。自身の逆相補と同一である配列は、パリンドローム配列と呼ばれる。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基の一部のみが、塩基対形成規則に従い合致する。または核酸の間に、「完全な」または「全体の」相補性があってもよい。
【０２３４】
本明細書において使用される場合、、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後にポリペプチドを発現することができるベクター中の遺伝子配列を指す。１つの実施形態では、核酸カセットは、対象遺伝子、例えば対象ポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、１つまたは複数の発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および例えば対象ポリヌクレオチドなどの対象遺伝子を含有する。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上の核酸カセットを含有してもよい。核酸カセットは、ベクター内で位置的に、そして連続的に方向付けられる。それにより、カセット中の核酸はＲＮＡに転写され得、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され、形質転換細胞での活動に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内コンパートメントに標的化することで、生物活性に適したコンパートメントへと移行され、または細胞外コンパートメントへと分泌されることができる。一部の実施形態では、カセットは、ベクターおよび／またはゲノム内への即時の挿入に適合された３’末端および５’末端を有することが好ましく、例えば各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有している。好ましい実施形態では、核酸カセットは、本明細書に予期される多価ＣＡＲをコードする。カセットは、取り出され、そして単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクター内に挿入されることができる。
【０２３５】
ポリヌクレオチドは、対象ポリヌクレオチドを含む。本明細書において使用される場合、「対象ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において予期される、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または阻害性ポリヌクレオチドの転写用の鋳型としての役割を果たすポリヌクレオチドを指す。
【０２３６】
さらに当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に予期されるポリペプチドまたはそのバリアント断片をコードし得るヌクレオチド配列は多数存在することを認識するであろう。これらポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対し、最小の相同性を担持する。とはいえコドン使用頻度の差異によって変化するポリヌクレオチドが予期され、特定の実施形態では例えばヒトおよび／または霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが予期される。１つの実施形態では、特定のアレル配列を含有するポリヌクレオチドが提供される。アレルは、例えばヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１つまたは複数の変異の結果として変化する内因性のポリヌクレオチド配列である。
【０２３７】
特定の実施形態において予期されるポリヌクレオチドは、本明細書において別段に記載されるように、または当分野に公知のように、それ自体のコード配列の長さに関わらず、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニングサイト、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えばＬｏｘＰ、ＦＲＴおよびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終止シグナル、転写後反応エレメント（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、および自己切断ポリペプチド、エピトープタグをコードするポリヌクレオチドなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされて、その全体の長さを大幅に変化させてもよい。ゆえに特定の実施形態では、ほとんどすべての長さのポリヌクレオチド断片が採用され得ること、好ましくは全体の長さは調製の容易さ、および意図される組み換えＤＮＡプロトコールでの用途により制限されることが予期される。
【０２３８】
ポリヌクレオチドは、当分野で公知および利用可能な様々な確立された技術のいずれかを使用して調製され、操作され、発現され、および／または送達されてもよい。所望のポリペプチドを発現するために、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクターに挿入されてもよい。所望のポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞内に送達することにより発現されてもよい。
【０２３９】
ベクターの例示としては限定されないが、プラスミド、自己複製配列、および転移性因子、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃなどが挙げられる。
【０２４０】
ベクターの追加的な例示としては限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスが挙げられる。
【０２４１】
ベクターとして有用なウイルスの例示としては限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴型ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられる。
【０２４２】
発現ベクターの例示としては限定されないが、哺乳動物細胞での発現用のｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、哺乳動物細胞でのレンチウイルス介在型遺伝子移送および発現用のｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞でのポリペプチドの発現のために、そうした発現ベクター内にライゲートされてもよい。
【０２４３】
特定の実施形態では、ベクターは、エピソーム性ベクター、または染色体外で維持されるベクターである。本明細書において使用される場合、「エピソーム性」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに統合されることなく複製することができるベクターを指し、宿主細胞の分裂により徐々に減少することがないということは、当該ベクターが染色体外で、またはエピソーム性に複製することも意味している。
【０２４４】
発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御因子」、または「制御性配列」は、ベクターの非翻訳領域であり、複製起源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）、イントロン、転写後制御因子、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域が挙げられ、それらは宿主の細胞タンパク質と相互作用して、転写と翻訳を実行する。そうした因子は、その強度および特異性を変化させてもよい。利用するベクターシステムおよび宿主に応じて、ユビキタスプロモーターおよび誘導性プロモーターをはじめとする任意の数の適切な転写因子および翻訳因子を使用してもよい。
【０２４５】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが発現ベクターおよびウイルスベクターをはじめとするベクターを含有する。ベクターは、１つまたは複数の外因性、内因性、または異種の制御配列、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーを含有してもよい。「内因性制御配列」は、ゲノム中で所与の遺伝子と本来連結される配列である。「外因性制御配列」は、遺伝子操作の手段（すなわち分子生物学的技術）により、遺伝子に並置して置かれる配列であり、当該遺伝子の転写は、その連結したエンハンサー／プロモーターにより誘導される。「異種制御配列」は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。「合成」制御配列は、特定の療法に対し最適なプロモーター活性および／またはエンハンサー活性を提供する、１つもしくは複数の内因性および／または外因性の配列の因子、ならびに／またはインビトロもしくはインシリコで決定された配列を含有してもよい。
【０２４６】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を開始させる。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で動作するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ−リッチ領域、および／または転写開始部位から７０〜８０塩基上流に存在する別の配列であるＣＮＣＡＡＴ領域を含有し、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。
【０２４７】
「エンハンサー」という用語は、転写の強化を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指し、一部の場合では、別の制御配列に対する方向性に関係なく機能することができる。エンハンサーは、プロモーター因子および／または他のエンハンサー因子と共同して、または付加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指す。
【０２４８】
「操作可能に連結された」という用語は、開示される構成要素が、その意図される様式で機能することが可能な関係性にある並置を指す。１つの実施形態では、当該用語は、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、および／またはエンハンサー）と、第二のポリヌクレオチド配列、例えば対象ポリヌクレオチドの間の機能的結合を指し、この場合において当該発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
【０２４９】
本明細書において使用される場合、「構造的発現制御配列」という用語は、操作可能に連結された配列の継続的な、または連続的な転写を可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構造的発現制御配列は、様々な細胞型と組織型での発現を可能にする「ユビキタス」なプロモーター、エンハンサー、プロモーター／エンハンサーであってもよく、または限定的な細胞型および組織型での発現を可能にする、それぞれ「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞株特異的」、または「組織特異的」なプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０２５０】
特定の実施形態における使用に適したユビキタス発現制御配列の例示としては限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期または後期）、モロニ−マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５およびＰ１１プロモーター、短伸長因子１−α（ＥＦ１ａ−短）プロモーター、長伸長因子１−α（ＥＦ１ａ−長）プロモーター、ｅａｒｌｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  １（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５（ＨＳＰＡ５）、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０ｋＤａ  ｂｅｔａ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＨＳＰ９０Ｂ１）、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ  ２６座位（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７  −  １４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、ネガティブ制御領域欠失型、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーター（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００３；７７（１７）：９４３９−９４５０）が挙げられる。
【０２５１】
特定の実施形態では、細胞、細胞型、細胞株、または組織に特異的な発現制御配列を使用して、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞株特異的、または組織特異的な発現を実現することが望ましい場合もある（例えば特定のポリペプチドをコードする核酸を、細胞型、細胞株、または組織のサブセットにおいてのみ、または発生の特定のステージでのみ発現させる）。
【０２５２】
本明細書において使用される場合、「条件付き発現」とは、限定されないが、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態もしくは疾患状態にある細胞または組織での発現をはじめとする条件付き発現の任意の型を指す場合がある。この定義は、細胞型または組織に特異的な発現を除外することは意図されない。ある実施形態は、対象ポリヌクレオチドの条件付き発現を提供するものであり、例えば発現は、細胞、組織、生物体を、ポリヌクレオチドが発現される処理または条件、または対象ポリヌクレオチドにコードされるポリヌクレオチドの発現が増加もしくは減少する処理または条件に曝すことにより制御される。
【０２５３】
誘導性プロモーター／システムの例示としては限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えばグルココルチコイド受容体またはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンの処理で誘導可能）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属の処理で誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンで誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン制御性システム（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸塩（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性制御システムなどが挙げられる。
【０２５４】
条件付き発現は、部位特異的なＤＮＡリコンビナーゼを使用することでも実現することができる。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼにより介在される組み換え用の部位を少なくとも１つ（典型的には２つ）含有する。本明細書において使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、除去的または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連タンパク質を含み、それらは１つまたは複数の組み換え部位（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）を含む組み換え反応に関与しており、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと）であってもよく、またはその変異型、誘導体（例えば組み換えタンパク質配列を含む融合タンパク質またはその断片）、断片、およびバリアントであってもよい。特定の実施形態における使用に適したリコンビナーゼの例示としては限定されないが、以下が挙げられる：Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルベース、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡ。
【０２５５】
ポリヌクレオチドは、様々な部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対する組み換え部位を１つまたは複数含有してもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのベクターの統合に必要とされる任意の部位に追加されることを理解されたい。本明細書において使用される場合、「組み換え配列」、「組み換え部位」または「部位特異的組み換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
【０２５６】
例えばＣｒｅリコンビナーゼの１つの認識部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列に隣接する１３塩基対の逆位反復（リコンビナーゼ結合部位としての役割を果たす）を２つ含む３４塩基対の配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）を参照のこと）。ｌｏｘＰ部位の他の例としては限定されないが、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が挙げられる。
【０２５７】
ＦＬＰリコンビナーゼの適切な認識部位としては限定されないが、以下が挙げられる：ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【０２５８】
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列であり、これらはリコンビナーゼ酵素のλインテグラーゼ、例えばｐｈｉ−ｃ３１に認識される。φＣ３１  ＳＳＲは、異型部位のａｔｔＢ（３４ｂｐの長さ）とａｔｔＰ（３９ｂｐの長さ）の間でのみ組み換えを介在する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ａｔｔＢとａｔｔＰはそれぞれ細菌ゲノムとファージゲノム上のファージインテグラーゼの結合部位に由来しており、両方とも、φＣ３１ホモ二量体に結合されると推定される不完全な逆位反復を含有する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。産生部位のａｔｔＬおよびａｔｔＲは、次のφＣ３１介在組み換えでは事実上、不活性となるため（Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、反応は不可逆的なものとなる。挿入の触媒について、ａｔｔＢ担持ＤＮＡをゲノムａｔｔＰ部位に挿入することは、ゲノムａｔｔＢ部位にａｔｔＰを挿入するよりも簡単であることが判明している（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。そのため典型的には、ａｔｔＰ担持「ドッキング部位」を規定の座位に相同組み換えし、次いで挿入用のａｔｔＢ担持入配列と組み合わせる戦略が取られている。
【０２５９】
特定の実施形態では、本明細書に予期されるポリヌクレオチドは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の対象のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を実現するために、ポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数のＩＲＥＳ配列、または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列により分離されてもよい。
【０２６０】
本明細書において使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質コード領域）の例えばＡＴＧなどの開始コドンに内部リボソームが直接侵入することを促進し、キャップ非依存性の遺伝子翻訳を生じさせる因子を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照のこと。当業者により一般的に採用されるＩＲＥＳの例としては、米国特許第  第６，６９２，７３６号に記載されるものが挙げられる。当分野に公知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては限定されないが、ピコルナウイルスから取得可能なＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、および例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのウイルスｍＲＮＡまたは細胞ｍＲＮＡを源として取得可能なＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子のｅＩＦ４Ｇ、ならびに酵母転写因子のＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎ社から販売されている脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−９）およびＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（１１）：６１７８−９０）が挙げられる。ＩＲＥＳは、ピコルナウイルス科、ジシストロウイルス科、およびフラビウイルス科の種のウイルスゲノム、ならびにＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）においても報告されている。
【０２６１】
１つの実施形態では、本明細書において予期されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０２６２】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する。本明細書において使用される場合、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソーム小サブユニットへのｍＲＮＡの初期結合を大きく促進し、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号７２）であり、式中、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０２６３】
異種核酸転写物の効率的な終止とポリアデニル化を誘導する因子は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、一般的にポリアデニル化シグナルの下流に存在する。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にポリアデニル化配列を含有する。本明細書において使用される場合、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる初期ＲＮＡ転写物の終止とポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡ尾部をコード配列の３’末端に付加することでｍＲＮＡの安定性を促進し、それにより翻訳効率の増強に寄与することができる。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列により誘導される。哺乳動物のプレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断−ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識因子を有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、Ｕ残基またはＧＵ残基が豊富な可変因子の上流に、２０〜５０ヌクレオチド存在する。初期転写物の切断はこれら２つの因子の間で発生し、５’切断産物に最大で２５０個のアデノシンが付加される。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、最良のポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０のポリＡ配列、ウシ成長ホルモンのポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンのポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当分野に公知の別の適切な異種または内因性のポリＡ配列である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、合成である。
【０２６４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性および／または非制御増幅のリスクを減少させるための誘導性自殺遺伝子をはじめとする自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主、または細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子の例は、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量体化の特定の化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
【０２６５】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に予期される遺伝子改変細胞が、インビボでのネガティブ選択に感受性となる遺伝子セグメントを含有する。「ネガティブ選択」とは、個々のインビボ条件における変化の結果として排除され得る注入細胞を指す。ネガティブ選択的表現型は、例えば化合物などの投与剤に対する感受性に寄与する遺伝子の挿入から生じ得る。ネガティブ選択遺伝子は当分野に公知であり、限定されないが、以下が挙げられる：ガンシクロビル感受性に寄与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子、細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼ。
【０２６６】
一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は、ポジティブマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含有し、それによりインビトロでネガティブ選択的表現型の細胞の選択が可能となる。ポジティブ選択的マーカーは、宿主細胞に導入されたときに優性表現型を発現する遺伝子であってもよく、それにより当該遺伝子を担持する細胞のポジティブ選択が可能となる。このタイプの遺伝子は当分野に公知であり、限定されないが、ハイグロマイシンＢに対する抵抗性に寄与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する抵抗性をコードするＴｎ５に由来するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられる。
【０２６７】
１つの実施形態では、ポジティブ選択的マーカーとネガティブ選択的因子が結合され、ネガティブ選択的因子の消失は必然的にポジティブ選択的マーカーの消失も伴う。特定の実施形態では、ポジティブおよびネガティブの選択的マーカーは融合され、１つが消失すると義務的に他方の消失も生じる。上述の望ましいポジティブ選択およびネガティブ選択の特性の両方に寄与するポリペプチドを発現産物として生じさせる融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現によって、インビトロでのポジティブ選択用のハイグロマイシンＢ抵抗性に寄与するポリペプチドと、インビボでのネガティブ選択用のガンシクロビル感受性に寄与するポリペプチドが生じる。さらに、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の公表特許を参照のこと。これらは優性ポジティブ選択的マーカーとネガティブ選択的マーカーを融合させることで得られる、二機能性選択的融合遺伝子の使用について記載している。
【０２６８】
好ましいポジティブ選択的マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏおよびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来するものであり、好ましいネガティブ選択的マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴおよびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来するものである。特定の実施形態で予期される二機能性選択的融合遺伝子の例としては限定されないが、ポジティブ選択的マーカーが、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、ネガティブ選択的マーカーが、シトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子または選択的マーカーに由来する。
【０２６９】
特定の実施形態では、１つまたは複数の多価ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、例えばＴ細胞などの造血細胞内に、非ウイルス法およびウイルス法の両方により導入され得る。
【０２７０】
「ベクター」という用語は、本明細書において、もう１つの核酸分子を移送または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。移送される核酸は一般的にベクター核酸分子に連結され、例えば挿入される。ベクターは、細胞中での自律的複製を誘導する配列を含んでもよく、または宿主細胞ＤＮＡへの統合が充分に可能となる配列を含んでもよい。特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、本明細書に予期される１つまたは複数のポリヌクレオチドがＴ細胞に送達される。
【０２７１】
非ウイルス性ベクターの例示としては限定されないが、プラスミド（例えばＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられる。
【０２７２】
特定の実施形態で予期されるポリヌクレオチドの非ウイルス性の送達法の例示としては限定されないが、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、バイオリステック法、ウイロゾーム法、リポソーム法、免疫リポソーム法、ナノ粒子法、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ法、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン介在移送、遺伝子銃、およびヒートショックが挙げられる。
【０２７３】
特定の実施形態において予期される特定の実施形態での使用に適したポリヌクレオチド送達システムの例示としては限定されないが、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．により提供されるシステムが挙げられる。リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体−認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７；およびＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照のこと。抗体標的化送達、細菌誘導送達、非生物ナノセル系送達も特定の実施形態において予期される。
【０２７４】
特定の実施形態において予期されるポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターは、個々の患者に投与することにより、典型的には以下に記載されるように全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内点滴）または局所適用することによりインビボで送達され得る。あるいはベクターは、例えば個々の患者から外殖された細胞（例えば動員（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検等）またはユニバーサルドナーの造血幹細胞などの細胞に生体外で送達されてもよく、その後、患者に当該細胞を再移植してもよい。
【０２７５】
１つの実施形態では、多価ＣＡＲを含むウイルスベクターは生物体に直接投与され、インビボで細胞に形質導入される。あるいはネイキッドＤＮＡが投与されてもよい。投与は、分子を導入して最終的には血液または組織細胞と接触させるために通常に使用される経路のいずれかによるものであり、限定されないが、注射、点滴、局所適用およびエレクトロポレーションが挙げられる。そうした核酸の適切な投与方法は当業者に利用可能および公知であるが、複数の経路を使用して特定の組成物を投与してもよく、特定の経路はしばしば、別の経路よりも即時性で高い効果的反応を提供することができる。
【０２７６】
本明細書において予期される特定の実施形態での使用に適したウイルスベクター系の例示としては限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスのベクターが挙げられる。
【０２７７】
様々な実施形態では、多価ＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、当該１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を細胞に形質導入することで、例えばＴ細胞などの造血細胞内に導入される。
【０２７８】
ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）の複製能力を欠いた、主にエピソーム性の非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む場合がある。組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は典型的には、最小で導入遺伝子とその制御配列、ならびに５’および３’のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）から構成される。ＩＴＲ配列は約１４５ｂｐの長さである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０から単離されたＩＴＲとカプシド配列を含有する。
【０２７９】
一部の実施形態では、キメラｒＡＡＶが使用される。ＩＴＲ配列は、１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列は別のＡＡＶ血清型から単離される。例えばＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列と、ＡＡＶ６由来のカプシド配列を含むｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と呼ばれる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０のいずれか１つに由来するカプシドタンパク質を含有してもよい。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列と、ＡＡＶ６由来のカプシド配列を含有する。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列と、ＡＡＶ２由来のカプシド配列を含有する。
【０２８０】
一部の実施形態では、操作法と選択法をＡＡＶカプシドに行い、それらが対象細胞に形質導入される確率を高くしてもよい。
【０２８１】
ｒＡＡＶベクターの構築、産生、および精製は、例えば米国特許第９，１６９，４９４号、第９，１６９，４９２号、第９，０１２，２２４号、第８，８８９，６４１号、第８，８０９，０５８号、および第８，７８４，７９９号に開示されている。それら文献はその全体で参照により本明細書に援用される。
【０２８２】
様々な実施形態では、多価ＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、当該１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する例えばレンチウイルスなどのレトロウイルスを細胞に形質導入することで、造血細胞内に導入される。
【０２８３】
本明細書において使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、自身のゲノムＲＮＡを直線的二本鎖ＤＮＡコピーへと逆転写し、次いで自身のゲノムＤＮＡを宿主ゲノムへと共有結合的に統合させるＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に適したレトロウイルスの例示としては限定されないが、以下が挙げられる：モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、およびレンチウイルス。
【０２８４】
本明細書において使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合的なレトロウイルスの群（または属）を指す。レンチウイルスの例としては、以下が挙げられる：ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。１つの実施形態では、ＨＩＶをベースとしたベクター骨格（すなわちＨＩＶシス作用性配列因子）が好ましい。
【０２８５】
様々な実施形態では、本明細書に予期されるレンチウイルスベクターは、１つまたは複数のＬＴＲ、および以下のアクセサリー因子のうちの１つまたは複数またはすべてを含有する：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、輸出因子（ｅｘｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、多価ＣＡＲに操作可能に連結された免疫エフェクター細胞中で活性なプロモーター、ポリ（Ａ）配列。および任意で、本明細書において別段に検討されるように、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、インシュレーター因子、選択的マーカー、および細胞自殺遺伝子を含有してもよい。
【０２８６】
特定の実施形態では、本明細書において予期されるレンチウイルスベクターは、統合的、または非統合的、または統合能力を欠くレンチウイルスであってもよい。本明細書において使用される場合、「統合能力を欠くレンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞ゲノムに統合させる能力を欠くインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。統合能力のないウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、当該出願はその全体で参照により本明細書に援用される。
【０２８７】
インテグラーゼ活性の低下に適したＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子中の変異の例としては限定されないが、以下が挙げられる：Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１  Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１  Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３ＡおよびＫ２６４Ｈ。
【０２８８】
１つの実施形態では、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２ＧもしくはＥ１５２Ａの変異；Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６ＩおよびＥ１５２Ｇの変異；またはＤ６４Ｖ、Ｄ１１６ＡおよびＥ１５２Ａの変異を含有する。
【０２８９】
１つの実施形態では、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ変異を含有する。
【０２９０】
「長末端反復（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、本来の配列コンテキストではＬＴＲはダイレクトリピートであり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含有する。
【０２９１】
本明細書において使用される場合、「ＦＬＡＰ因子」、または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、その配列が、例えばＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２などのレトロウイルスの中心ポリプリン帯（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）と中心末端配列（ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰ因子は、米国特許第  ６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴエレメントおよび／またはＣＴＳエレメント中に１つまたは複数の変異を有するＦＬＡＰエレメントを含有する。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴエレメントまたはＣＴＳエレメントのいずれかを含有する。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴエレメントまたはＣＴＳエレメントを含有しない。
【０２９２】
本明細書において使用される場合、「パッケージシグナル」または「パッケージ配列」という用語は、レトロウイルスゲノム内に位置するｐｓｉ［Ψ］配列を指し、ウイルスカプシドまたはウイルス粒子内にウイルスＲＮＡを挿入するために必要とされる。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１〜２１０９を参照のこと。
【０２９３】
「輸出因子」という用語は、シス作用性の転写後制御因子を指し、核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を制御する。ＲＮＡ輸出因子の例としては限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｒｅｖ反応性因子（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照のこと）およびＢ型肝炎ウイルスの転写後制御因子（ＨＰＲＥ）が挙げられる。
【０２９４】
特定の実施形態では、ウイルスベクター中の異種配列の発現は、転写後制御因子、効率的ポリアデニル化部位、および任意で転写終止シグナルをベクターに組み込むことで増加する。様々な転写後制御因子が、タンパク質での異種核酸の発現を増加させることができる。例えばウッドチャック肝炎ウイルスの転写後制御因子（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルス中に存在する転写後制御因子（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）；など（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）が挙げられる。
【０２９５】
レンチウイルスベクターは、ＬＴＲ改変を行い、いくつかの安全性強化因子を含有することが好ましい。「自己不活化」（ＳＩＮ：ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ベクターとは、複製能力を欠いたベクターを指し、例えば右（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域はＵ３領域として知られているが、この領域が（例えば欠失または置換により）改変されて、ウイルス複製の最初のラウンドを超えたウイルス転写が阻害されるベクターなどである。追加的な安全性の向上は、５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を誘導する異種プロモーターと置き換えることで提供される。使用され得る異種プロモーターの例としては例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）のプロモーターが挙げられる。
【０２９６】
本明細書において使用される場合、「偽型」または「偽型の」という用語は、そのウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を有する別のウイルスのエンベロープと置き換えられたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子にコードされる）は通常、ＣＤ４＋提示細胞に対してウイルスを標的化するが、水泡性口炎ウイルスのＧ−タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でＨＩＶを偽型化することで、広範な細胞にＨＩＶが感染できるようになる。
【０２９７】
ある実施形態では、レンチウイルスベクターは、公知の方法により産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０；Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５〜５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照のこと。
【０２９８】
本明細書に予期されるある特定の実施形態によると、ほとんど、またはすべてのウイルスベクターの骨格配列は、例えばＨＩＶ−１などのレンチウイルスに由来する。ただし、レトロウイルス配列および／またはレンチウイルス配列の多くの様々な源を使用してもよく、もしくは組み合わせてもよく、そして本明細書に記載される機能を実行するトランスファーベクターの能力を損なうことなく、特定のレンチウイルス配列に多くの置換および変更を含ませてもよいことを理解されたい。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当分野に公知である。Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ，１９９６ｂ，ａｎｄ  １９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）；Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号および第５，９９４，１３６号を参照のこと。それらの多くが、本明細書に予期されるウイルスベクターまたはトランスファープラスミドの産生に適合され得る。
【０２９９】
様々な実施形態では、多価ＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、当該１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有するアデノウイルスを細胞に形質導入することで、造血細胞内に導入される。
【０３００】
アデノウイルス系のベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質導入を行うことができ、そして細胞分裂を必要としない。そうしたベクターを用いることで、高い力価と、高レベルの発現が得られる。このベクターは、比較的シンプルなシステムで大量に作製することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターが、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するよう操作されている。その結果、複製能力を欠くベクターはヒト２９３細胞中で増幅され、当該細胞が失われた遺伝子機能をトランスで供給する。Ａｄベクターは、例えば肝臓、腎臓および筋肉中に存在する細胞などの非分裂細胞、分化細胞を含む、複数のタイプの組織にインビボで形質導入することができる。従来的なＡｄベクターは、大きな運搬能力を有している。
【０３０１】
複製能力を欠く現在のアデノウイルスベクターの作製と増幅は、２９３と呼ばれるユニークなヘルパー細胞株を利用する場合がある。この細胞株は、ヒト胚腎臓細胞からＡｄ５  ＤＮＡ断片により形質転換されたものであり、Ｅ１タンパク質を構造的に発現している（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。アデノウイルスゲノムのＥ３領域は必須ではないため（Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の補助を得て、Ｅ１、Ｄ３またはその両方の領域に外来性ＤＮＡを担持している（Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子の発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ  ＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用されている。組み換えアデノウイルスを様々な組織に投与する実験としては、気管滴下（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈注射（Ｈｅｒｚ  ＆  Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳内への定位性接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）が挙げられる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用例には、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫を目的としたポリヌクレオチド療法が含まれる（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
【０３０２】
様々な実施形態では、多価ＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、当該１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する例えばＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２などの単純ヘルペスウイルスを細胞に形質導入することで、造血細胞内に導入される。
【０３０３】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの直線型二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含む、エンベロープ型正２０面体カプシドからなる。１つの実施形態では、ＨＳＶをベースとしたウイルスベクターは、１つもしくは複数の必須または非必須のＨＳＶ遺伝子が欠落している。１つの実施形態では、ＨＳＶをベースとしたウイルスベクターは、複製能力を欠く。殆どの複製能力を欠くＨＳＶベクターは、１つまたは複数の中間−初期、初期、または後期のＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含有し、複製が阻害されている。例えばＨＳＶベクターは、以下からなる群から選択される前初期遺伝子が欠落していてもよい：ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組み合わせ。ＨＳＶベクターの利点は、後期ステージに入り、長期的にＤＮＡ発現を生じさせることができる能力と、最大２５ｋｂもの外因性ＤＮＡインサートを収容できる、その巨大なウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶ系のベクターは、例えば米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号および第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７およびＷＯ９９／０６５８３に記載されており、それらはその全体で参照により本明細書に援用される。
【０３０４】
Ｆ．遺伝子改変細胞
様々な実施形態では、細胞は、免疫障害の治療における使用を目的として、本明細書に予期される多価ＣＡＲを発現するよう改変され、提供される。細胞は、本明細書において予期されるＣＡＲを発現するよう非遺伝的に改変されてもよく、または特定の好ましい実施形態では、細胞は、本明細書において予期されるＣＡＲを発現するよう遺伝的に改変されてもよい。本明細書において使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝的に改変された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の追加遺伝物質を、細胞中の総遺伝物質に加えることを指す。「遺伝的に改変された細胞」、「改変細胞」、および「再指向化細胞」という用語は、特定の実施形態において相互交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態で、追加の遺伝物質を、細胞中の総遺伝物質内に導入することを指し、それにより細胞は遺伝子の発現を回復、修正もしくは変更し、またはＣＡＲポリペプチドを発現させる。「単離された細胞」とは、インビボの組織または器官から取得され、実質的に細胞外マトリクスを含まない細胞を指す。
【０３０５】
特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞に導入および発現され、その特異性を、標的抗原を発現する細胞に再指向化させる。特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞に導入および発現され、その特異性を、第一の標的抗原および第二の標的抗原に再指向化させる。
【０３０６】
「免疫エフェクター細胞」は、１つまたは複数のエフェクター機能（例えば細胞傷害性の細胞殺傷活性、サイトカイン分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導など）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書において予期される免疫エフェクター細胞の例示は、Ｔリンパ球であり、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。１つの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。１つの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。免疫エフェクター細胞は、自己（ｓｅｌｆ）または非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ、例えば同種、同系または異種）であってもよい。
【０３０７】
本明細書において使用される場合、「自己」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。本明細書において使用される場合、「同種」とは、比較すると当該細胞と遺伝的に異なる同種の細胞を指す。本明細書において使用される場合、「同系」とは、比較すると当該細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。本明細書において使用される場合、「異種」とは、比較すると当該細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は、自己である。
【０３０８】
本明細書に予期されるＣＡＲとともに使用される免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔリンパ球が挙げられる。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当分野において認識されており、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞などのＴヘルパー（Ｔｈ）細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）のＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであってもよい。特定の実施形態における使用に適したＴ細胞群の他の例としては、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌを発現する。
【０３０９】
当業者に理解されるように、他の細胞も、本明細書において予期されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞として使用され得る。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球またはマクロファージも含む。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、この場合においてそうした前駆細胞は、インビボまたはインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導されてもよい。したがって特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、例えば臍帯血、骨髄または動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団内に含有される造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含み、それらは対象に投与されたときに成熟免疫エフェクター細胞へと分化し、またはインビトロで誘導されて成熟免疫エフェクター細胞へと分化してもよい。
本明細書において使用される場合、特定のＣＡＲを含有するよう遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、「抗原特異的再指向化免疫エフェクター細胞」と呼称される場合がある。
【０３１０】
本明細書において使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書において使用される場合、「ＣＤ３４」とは、細胞−細胞付着因子として作用することが多く、リンパ節へのＴ細胞の侵入に関与する細胞表面糖タンパク質（例えばシアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有し、ＨＳＣは患者に投与されたときに分化し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、および単球／マクロファージ系統の細胞を含むすべての造血系の元となる。
【０３１１】
本明細書において予期されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製する方法は、特定の実施形態に提示される。１つの実施形態では、方法は、個体から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクトまたは形質導入することにより、当該免疫エフェクター細胞が、本明細書において予期されるように１つまたは複数のＣＡＲを発現することを含む。１つの実施形態では、方法は、個体から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクトまたは形質導入することにより、当該免疫エフェクター細胞が、本明細書において予期される１つまたは複数のＣＡＲを発現することを含む。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞は、個体から単離され、および遺伝子改変され、インビトロでさらなる操作は受けない。次いでそうした細胞を当該個体に直接再投与してもよい。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は最初にインビトロで活性化され、そして刺激されて増殖し、その後、遺伝子改変される。これに関し、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前、および／または後に培養され得る。
【０３１２】
特定の実施形態では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、対象から細胞源が取得される。特定の実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含有する。
【０３１３】
Ｔ細胞は、限定されないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多くの源から取得されることができる。ある実施形態では、Ｔ細胞は、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの沈殿作用といった当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液ユニットから取得されることができる。
【０３１４】
他の実施形態では、単離された、または精製されたＴ細胞群が使用される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、活性化、拡張および／もしくは遺伝子改変の前または後に、ナイーブＴ細胞亜群、メモリーＴ細胞亜群およびエフェクターＴ細胞亜群へとソーティングしてもよい。
【０３１５】
以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７およびＨＬＡ−ＤＲのうちの１つまたは複数を発現するＴ細胞の特定の亜群は、ポジティブ選択法またはネガティブ選択法によりさらに単離され得る。１つの実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７；またはＣＤ３８もしくはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８からなる群から選択されるされるマーカーのうちの１つまたは複数を発現するＴ細胞の特定の亜群は、ポジティブ選択法またはネガティブ選択法によりさらに単離される。様々な実施形態では、製造されたＴ細胞組成物は、以下のマーカーのうちの１つまたは複数を発現しない、または実質的に発現しない：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３。
１つの実施形態では、単離された、または精製されたＴ細胞群は、限定されないが、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋またはそれらの組み合わせを含むマーカーのうちの１つまたは複数を発現する。
【０３１６】
ある実施形態では、Ｔ細胞が個体から単離され、インビトロで最初に活性化および刺激されて増殖した後に改変されて、多価ＣＡＲを発現する。
【０３１７】
Ｔ細胞組成物の充分な治療投与量を獲得するために、しばしばＴ細胞に、１ラウンドまたは複数ラウンドの刺激、活性化および／または拡張が行われる。Ｔ細胞は一般的に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、および第６，８６７，０４１号に記載される方法を使用して活性化および拡張され得る。それら特許はその全体で参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、約６時間、約１２時間、約１８時間、または約２４時間、活性化および拡張され、その後に本明細書に予期される多価ＣＡＲをコードするベクターまたはｍＲＮＡが導入される。
【０３１８】
１つの実施形態では、Ｔ細胞は、改変されるときに同時に活性化される。
【０３１９】
様々な実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の作製方法は、Ｔ細胞を含む細胞群を活性化させること、および当該Ｔ細胞群を拡張させることを含む。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して一次刺激シグナルを提供し、そして例えばＣＤ２８などのアクセサリー分子を介して二次共刺激シグナルを提供することにより達成され得る。
【０３２０】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞と、適切なＣＤ３結合剤、例えばＣＤ３リガンドや抗ＣＤ３モノクローナル抗体を接触させることにより刺激されてもよい。ＣＤ３抗体の例示としては限定されないが、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３および６４．１が挙げられる。
【０３２１】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して提供される一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞反応の誘導には二次的な共刺激性シグナルを必要とする。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合剤を使用して、共刺激性シグナルを提供してもよい。ＣＤ２８結合剤の例示としては限定されないが、天然ＣＤ２８リガンド、例えばＣＤ２８に対する天然リガンド（例えばタンパク質のＢ７ファミリーのメンバー、例えばＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）；および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、またはＣＤ２８分子と交差結合することができるその断片、例えばモノクローナル抗体の９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、およびＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられる。
【０３２２】
１つの実施形態では、一次刺激シグナルを提供する分子、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して刺激を提供する分子、および共刺激性分子は、同じ表面に連結される。
【０３２３】
ある実施形態では、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤は、細胞表面上に局在する。これは、細胞に、結合剤をコードする核酸を、細胞表面上での発現に適した形態でトランスフェクトすることにより、もしくは形質導入することにより、または結合剤と細胞表面を連結させることにより、実現され得る。
【０３２４】
別の実施形態では、一次刺激シグナルを提供する分子、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して刺激を提供する分子、および共刺激性分子は、抗原提示細胞上に提示される。
【０３２５】
１つの実施形態では、一次刺激シグナルを提供する分子、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して刺激を提供する分子、および共刺激性分子は、別の表面上に提示される。
【０３２６】
ある実施形態では、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤のうちの１つは、可溶性であり（溶液で提供される）、他方の剤は、１つまたは複数の表面上に提供される。
【０３２７】
特定の実施形態では、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤は両方とも可溶型で提供される（溶液で提供される）。
【０３２８】
様々な実施形態では、本明細書に予期されるＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法は、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化させることを含む。
【０３２９】
１つの実施形態では、本明細書において予期される方法により活性化されたＴ細胞の拡張は、Ｔ細胞を含む細胞群を、数時間（約３時間）〜約７日〜約２８日、またはその間の任意の整数の時間数の間、培養することをさらに含む。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、１４日間培養されてもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、約２１日間培養される。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、約２〜３日間培養される。数サイクルの刺激／活性化／拡張が望ましい場合もあり、それによりＴ細胞の培養時間は６０日間以上になる可能性もある。
【０３３０】
特定の実施形態では、Ｔ細胞培養に適した条件は、適切な培地（例えばＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＭｅｄｉａまたはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ社））、および増殖と活性に必要な１つまたは複数の因子が含まれ、限定されないが血清（例えばウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に公知の細胞増殖に適した任意の他の添加物が挙げられる。
【０３３１】
細胞培養培地のさらなる例示としては限定されないが、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ、それらにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミン類が添加され、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは所定のホルモンの組み合わせ、および／またはＴ細胞の増殖と拡張に充分な量のサイトカインが補充される。
【０３３２】
例えばペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養でのみ含有され、対象への注入用の細胞培養には含有されない。標的細胞は、例えば適切な温度（例えば３７℃）および大気（例えば空気に５％ＣＯ２を加える）など、増殖をサポートするために必要な条件下で維持される。
【０３３３】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣ、または単離Ｔ細胞は、通常はビーズまたは他の表面上に結合された例えば抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などの刺激剤および共刺激剤と、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地中で、接触する。
【０３３４】
他の実施形態では、Ｋ５６２細胞、Ｕ９３７細胞、７２１．２２１細胞、Ｔ２細胞およびＣ１Ｒ細胞を操作して、様々な共刺激性分子およびサイトカインの安定的な発現と分泌を誘導することにより、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）が作製される。特定の実施形態では、Ｋ３２  ａＡＰＣまたはＵ３２  ａＡＰＣを使用して、ＡＡＰＣ細胞表面上の１つまたは複数の抗体系刺激分子の提示が誘導される。Ｔ細胞群は、限定されないがＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）および／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含む様々な共刺激性分子を発現するａＡＰＣにより拡張されてもよい。最終的に、ａＡＰＣは、遺伝子改変されたＴ細胞の拡張と、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２８発現の維持に効率的なプラットフォームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１およびＵＳ２００３／０１４７８６９に提示されるａＡＰＣは、その全体で参照により本明細書に援用される。
【０３３５】
特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞群に導入される。ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在移送などによりＴ細胞に導入されてもよい。
【０３３６】
様々な実施形態では、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞が作製される。
【０３３７】
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０３３８】
免疫エフェクター細胞またはＣＤ３４＋細胞へのポリヌクレオチドの導入に適したウイルスベクターシステムの例示としては限定されないが、遺伝子移送用のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスのベクターが挙げられる。
【０３３９】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０３４０】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、レトロウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０３４１】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、レンチウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０３４２】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、アデノウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０３４３】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０３４４】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ワクシニアウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０３４５】
特定の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞を作製する方法は、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカイン、および／またはＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つもしくは複数の剤を含む培養培地中で、細胞と、刺激剤および共刺激剤、例えば可溶性の、またはビーズもしくは他の表面に付着された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を接触させることを含む。
【０３４６】
本明細書において使用される場合、「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋに結合し、ＰＩ３Ｋの少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物または有機低分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、およびクラス３のＰＩ３Ｋの３つのクラスに分けられる。クラス１のＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブユニット（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γ）のうちの１つ、および２つの制御性サブユニットファミリーのうちの１つからなるヘテロ二量体として存在する。特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤を標的とする。１つの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤の１つまたは複数のアイソフォームに対し選択性を呈する（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γ、またはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γのうちの１つもしくは複数に対する選択性を呈する）。別の態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、アイソフォーム選択性を呈さず、「汎−ＰＩ３Ｋ阻害剤」とみなされる。１つの実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＡＴＰと、ＰＩ３Ｋ触媒ドメインへの結合に関して競合する。
【０３４７】
特定の実施形態での用途に適したＰＩ３Ｋ阻害剤の例示としては限定されないが、ＢＫＭ１２０（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）、ＸＬ１４７（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ社）、（汎−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、およびＰＸ−８６６（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤；ｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０γアイソフォーム、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ社）が挙げられる。
【０３４８】
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の例としては限定されないが、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４、およびＩＰＩ−１４５が挙げられる。
【０３４９】
汎−ＰＩ３Ｋ阻害剤のさらなる例示としては限定されないが、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、およびＧＤＣ−０９４１が挙げられる。
【０３５０】
好ましい実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
【０３５１】
Ｇ．組成物および製剤
本明細書において予期される組成物は、１つまたは複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞などを含んでもよい。組成物としては限定されないが、医薬組成物が挙げられる。「医薬組成物」とは、細胞または動物への投与に対し、薬学的に許容可能な溶液または生理学的に許容可能な溶液中で、単独で、または１つもしくは複数の他の治療モダリティと併用されて製剤化される組成物を指す。所望の場合には、組成物は、例えばサイトカイン、増殖因子、ホルモン、低分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、または他の様々な薬学的に活性な剤などの他の剤も同様に併用されて投与され得ることも理解されたい。事実上、組成物に含有され得る他の構成要素に制限はないが、追加される剤は、意図される療法を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。
【０３５２】
本明細書において、「薬学的に許容可能」という文言は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合った、それら化合物、物質、組成物および／または剤型を指すために採用される。
【０３５３】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」としては限定されないが、ヒトまたは家畜における使用に許容可能であるとして、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に承認された任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、調味料、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤または乳化剤が挙げられる。薬学的に許容可能な担体の例としては限定されないが、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびに例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロース誘導体；トラガカント；モルト；ゼラチン；滑石；ココアバター、ワックス、動物性脂肪および植物性脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブオイル、トウモロコシ油および大豆油などの油類；例えばプロピレングリコールなどのグリコール類；例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類；例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；アガー；例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質が含まれていない水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；、ならびに医薬製剤中に採用される任意の他の適合性物質が挙げられる。
【０３５４】
特定の実施形態では、組成物は、本明細書において予期される多価ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の量を含有する。
【０３５５】
本明細書において使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益な、もしくは所望の予防的結果または治療結果を実現するための治療用細胞、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞などの「有効な量」または「有効量」を指す。
【０３５６】
「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を実現するのに有効な治療用細胞、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞などの量を指す。必ずではないが典型的には、予防的投与量は、疾患の早期ステージの前、または早期ステージにある対象において使用されるため、予防的有効量は、治療的有効量よりも少ない。
【０３５７】
治療用細胞、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞などの「治療的有効量」は、例えば個体の疾患状態、年齢、性別および体重などの因子、および個体において所望の反応を惹起させる組成物の能力に従い変化し得る。治療有効量はまた、治療用細胞、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞などの任意の毒性または有害な作用を、治療上の有益な作用が上回る量でもある。「治療的有効量」という用語は、対象（例えば患者）を治療するのに有効である量を含む。治療的な量が示されている場合、投与される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および状態における個々の差を考慮し、医師により決定され得る。一般的に、本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０２〜１０１０細胞／体重ｋｇ、好ましくは１０５〜１０６細胞／体重ｋｇの用量で、当該範囲内のすべての整数値を含み、投与され得ると言える。細胞数は、組成物の意図される最終用途に依存し、組成物中に含有される細胞のタイプも同様である。本明細書において提示される用途に関し、細胞は一般的に、リットル以下の量であり、５００ｍＬ以下、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。ゆえに所望される細胞の密度は、多くの場合、１０６細胞／ｍｌ超であり、一般的には、１０７細胞／ｍｌ超、一般的には１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、複数回の点滴に分けられてもよく、累積的には１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１または１０１２細胞以上となる。一部の実施形態では、具体的には注入される全細胞は特定の標的抗原へと再指向化されるため、より少ない、１０６／キログラム（患者当たり１０６−１０１１）の範囲にある細胞が投与されてもよい。多価ＣＡＲを発現するＴ細胞を含有するＴ細胞組成物は、これら範囲内の用量で、複数回投与されてもよい。細胞は、治療を受ける患者に対し、同種、同系、異種、または自己であってもよい。望ましい場合、治療は、本明細書に記載されるようにマイトージェン（例えばＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカインおよび／もしくはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、およびＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与を含み、免疫反応の誘導を強化してもよい。
【０３５８】
一般的に、本明細書に記載されるように活性化および拡張された細胞を含む組成物は、免疫不全状態の個体で生じる疾患の治療および予防に活用されてもよい。特に本明細書において予期される組成物は、癌の治療に使用される。特定の実施形態では、多価ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独で投与されてもよく、または担体、希釈剤、賦形剤を併用した医薬組成物として、および／または例えばＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは他の細胞群などの他の構成要素を併用した医薬組成物として投与されてもよい。
【０３５９】
特定の実施形態では、医薬組成物は、遺伝子改変されたＴ細胞の量を、１つもしくは複数の薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と併用して含有する。
【０３６０】
例えばＴ細胞などの多価ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞群を含有する医薬組成物は、例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤；例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの糖類；タンパク質；ポリペプチド、または例えばグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；例えばＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；および保存剤を含有してもよい。特定の実施形態では、組成物は、鼻内投与、経口投与、腸内投与、または例えば血管内（静脈内または動脈内）投与、腹腔内投与もしくは筋肉内投与などの非経口投与を目的として製剤化されることが好ましい。
【０３６１】
溶液、懸濁液または他の類似した形状であるかに関わらず、液状の医薬組成物は、以下のうちの１つまたは複数を含んでもよい：例えば注射用水、生理食塩水、好ましくは生理学的食塩水、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液、例えば溶媒または懸濁化媒体としての機能を果たし得る合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒などの滅菌希釈液；例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；例えばエチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性の調整用の剤。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作製されたアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数回投与用バイアル中に封入されてもよい。注射用医薬組成物は滅菌されていることが好ましい。
【０３６２】
１つの実施形態では、本明細書に予期されるＴ細胞組成物は、薬学的に許容可能な細胞培養培地中で製剤化される。そうした組成物は、ヒト対象への投与に適している。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な細胞培養培地は、無血清培地である。
【０３６３】
無血清培地は、血清含有培地を超える利点をいくつか有しており、シンプルでより明白な組成、汚染物質量の低下、感染性実体の源となる可能性の排除、コスト低下が挙げられる。様々な実施形態では、無血清培地は、動物質を含まず、任意で無タンパク質であってもよい。任意で培地はバイオ医薬品的に受容可能な組み換えタンパク質を含有してもよい。「動物質を含まない」培地とは、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組み換えタンパク質は、動物質を含まない培地中で動物性タンパク質を置き換え、その栄養素は合成、植物または微生物の源から取得される。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、実質的にタンパク質を含まないと規定される。
【０３６４】
特定の組成物において使用される無血清培地の例示としては限定されないが、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＸ−ＶＩＶＯ  １０が挙げられる。
【０３６５】
１つの好ましい実施形態では、本明細書に予期されるＴ細胞を含有する組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する溶液中で製剤化される。
【０３６６】
別の好ましい実施形態では、本明細書に予期されるＴ細胞を含有する組成物は、凍結保存媒体を含有する溶液中で製剤化される。例えば凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、融解後の高い細胞活性成績を維持してもよい。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示としては限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が挙げられる。
【０３６７】
より好ましい実施形態では、本明細書に予期されるＴ細胞を含有する組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  ＡとＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０を５０：５０で含有する溶液中で製剤化される。
【０３６８】
特定の実施形態では、組成物は、多価ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の有効量を単独で、または１つもしくは複数の治療剤と併用して含有する。したがって多価ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で投与されてもよく、または例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的治療などの他の公知の癌治療と併用されて投与されてもよい。組成物は、抗生物質と併用して投与されてもよい。そうした治療剤は、例えば特定の癌などの本明細書に記載の特定の疾患状態に対する標準治療として当分野において承認されている場合がある。予期される治療剤の例としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤｓ、ＤＭＡＲＤｓ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法、治療用抗体、または他の活性で補助的な剤が挙げられる。
【０３６９】
ある実施形態では、本明細書に開示される多価ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含有する組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与されてもよい。化学療法剤の例示としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミンレジューム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ  ｒｅｓｕｍｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補液（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉ���）；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社、ニュージャージー州プリンストン）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ社、フランス、アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸誘導体、例えばＴａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキン・ディフティトックス）；エスペラミシン；カペシタビン；および上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、癌に対するホルモンの作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）をはじめとする抗エストロゲン；例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；および上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体がある。
【０３７０】
様々な他の治療剤が、本明細書に記載の組成物と併せて使用されてもよい。１つの実施形態では、多価ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含有する組成物は、抗炎症剤とともに投与される。抗炎症剤または抗炎症薬としては限定されないが、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ医薬、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸塩を含む非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）が挙げられる。
【０３７１】
他のＮＳＡＩＤｓの例としては、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ−２阻害剤、例えばＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、ならびにシアリレート（ｓｉａｌｙｌａｔｅ）からなる群から選択される。鎮痛剤の例は、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン（ｐｒｏｐｏｒｘｙｐｈｅｎｅ）塩酸塩のトラマドールからなる群から選択される。グルココルチコイドの例は、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンまたはプレドニゾンからなる群から選択される。生体反応調節物質の例としては、細胞表面マーカー（例えばＣＤ４、ＣＤ５など）に対して指向化された分子、サイトカイン阻害剤、例えばＴＮＦアンタゴニスト（例えばエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ケモカイン阻害剤、ならびに付着分子阻害剤が挙げられる。生物反応調節物質には、モノクローナル抗体ならびに組み換え型分子が含まれる。ＤＭＡＲＤｓの例としては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、Ｇｏｌｄ（経口（オーラノフィン）および筋肉内）およびミノサイクリンが挙げられる。
【０３７２】
本明細書に予期される多価ＣＡＲ改変Ｔ細胞との併用に適した治療用抗体の例示としては限定されないが、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モキセツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、およびウブリツキシマブが挙げられる。
【０３７３】
ある実施形態では、本明細書に記載の組成物は、サイトカインと併せて投与される。本明細書において使用される場合、「サイトカイン」とは、１つの細胞群により放出され、別の細胞に対して細胞間メディエーターとして作用するタンパク質の総称を意味する。そうしたサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカインおよび従来的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中でも、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよびβ；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えばＮＧＦβ：血小板由来成長因子；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦαおよびＴＧＦβ；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロンα、βおよびγ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書において使用される場合、サイトカインという用語は、天然源由来のタンパク質、または組み換え細胞培養に由来するタンパク質、および天然配列サイトカインと均等な生物活性のタンパク質を含む。
【０３７４】
Ｈ．治療方法
本明細書に予期される多価ＣＡＲ免疫エフェクター細胞は、免疫障害の予防、治療および改善における使用のための改善された養子免疫療法、または免疫障害と関連した少なくとも１つの症状を予防する、治療する、もしくは改善するための改善された養子免疫療法を提供する。好ましい実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ免疫エフェクター細胞は、癌と関連した少なくとも１つの症状の予防、治療、および改善における使用のための改善された養子免疫療法を提供する。
【０３７５】
「免疫障害」とは、免疫系からの反応を引き起こす疾患を指す。特定の実施形態では、「免疫障害」という用語は、癌、移植片対宿主病、自己免疫性疾患、または免疫不全を指す。１つの実施形態では、免疫障害は、感染性疾患を包含する。
【０３７６】
本明細書において使用される場合、「癌」という用語は概して、異常な細胞が制御されずに分裂し、近傍組織へと浸潤し得る、ある種の疾患または状態に関連する。
【０３７７】
本明細書において使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞群が、制御不能な増殖（すなわち正常限界を超える分裂）、浸潤（すなわち隣接組織への侵入と破壊）、および転移（すなわちリンパまたは血液を介して身体の他の場所へ拡散）のうちの１つまたは複数を呈する癌を指す。
【０３７８】
本明細書において使用される場合、「転移する」という用語は、身体の一部分から、別の部分へと癌が拡散することを指す。拡散した細胞により形成された腫瘍は、「転移腫瘍」または「転移癌」と呼ばれる。転移腫瘍は、元の腫瘍（原発腫瘍）の細胞と似た細胞を含有する。
【０３７９】
本明細書において使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、大きく成長するが、身体の他の部分に拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は自己限定的であり、多くの場合、浸潤せず、または転移しない。
【０３８０】
「癌細胞」または「腫瘍細胞」とは、癌性増殖または癌性組織の個々の細胞を指す。「腫瘍」とは概して、細胞の異常な増殖による膨張、または細胞の異常な増殖により形成された病変を指し、良性、前癌性、または悪性であり得る。殆どの癌は腫瘍を形成するが、例えば白血病などの一部の癌は必ずしも腫瘍を形成するわけではない。腫瘍を形成する癌に関し、癌（細胞）という用語、および腫瘍（細胞）という用語は相互交換可能に使用される。個体中の腫瘍の量は、「腫瘍組織量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）」であり、腫瘍の数、体積または重量で測定され得る。
【０３８１】
「移植片対宿主病」または「ＧＶＨＤ」とは、細胞移植、組織移植、または固形臓器移植の後に発生する可能性がある合併症を指す。ＧＶＨＤは、幹細胞移植または骨髄移植の後に発生する可能性があり、この場合、移植されたドナー細胞が、移植レシピエントの身体を攻撃する。ヒトの急性ＧＶＨＤは、移植後約６０日以内に発生し、細胞溶解性リンパ球の作用によって皮膚、肝臓および消化管に損傷が生じる。慢性ＧＶＨＤはもっと遅く発生し、主に皮膚に影響を及ぼす全身性の自己免疫性疾患であり、Ｂ細胞のポリクローナル性の活性化、およびＩｇと自己抗体の過剰産生を生じさせる。固形臓器の移植片対宿主病（ＳＯＴ−ＧＶＨＤ）は、２つの型で発生する。より普遍的なタイプは抗体が介在するもので、この場合、Ｏ型の血液型を有するドナー由来の抗体が、Ａ型、Ｂ型またはＡＢ型の血液型を有するレシピエントの赤血球を攻撃し、軽度で一過性の溶解性貧血を生じさせる。ＳＯＴ−ＧＶＨＤの２番目の型は高い死亡率と関連した細胞型であり、この場合、ドナー由来のＴ細胞は免疫学的に異種である宿主組織、最も多くは皮膚、肝臓、消化管および骨髄に対して免疫攻撃を行い、これらの臓器に合併症を引き起こす。
【０３８２】
「移植片対白血病」または「ＧＶＬ」とは、例えば骨髄または末梢血などのドナーの移植組織中に存在する免疫細胞による、個体の白血病細胞への免疫反応を指す。
【０３８３】
「自己免疫性疾患」とは、身体が、自身の組織の構成物質の一部に対し、免疫原性（すなわち免疫系）反応を生じさせる疾患を指す。言い換えると、免疫系が、身体内の組織またはシステムの一部を「自己」として認識する能力を失い、外来性であるとして攻撃してしまう。自己免疫疾患の例示としては限定されないが、関節炎、炎症性大腸炎、橋本甲状腺炎、グレーブス病、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが挙げられる。
【０３８４】
「免疫不全」とは、疾患または化学物質投与によって免疫系が機能障害を受けた患者の状態を意味する。これにより、外来性物質に対する防御に必要とされる血液細胞の数とタイプにおいて免疫系が不完全な状態となる。免疫不全状態または免疫不全疾患は当分野に公知であり、例えばＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫症、抗ＩｇＭ症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）および糖尿病が挙げられる。
【０３８５】
「感染性疾患」とは、ヒトからヒトへと伝達され得る、または生物から生物へと伝達され得る疾患を指し、微生物またはウイルスにより発生する（例えば、風邪）。感染性疾患は当分野に公知であり、例えば肝炎、性感染症（例えば、クラミジア、淋病）、結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、およびインフルエンザが挙げられる。
【０３８６】
本明細書において使用される場合、「個体」および「対象」という用語はしばしば相互交換可能に使用され、免疫障害の症状を呈する任意の動物を指し、多価ＣＡＲ、多価ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞、および本明細書に別段に予期される方法を用いて治療され得る。適切な対象（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ、ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、およびペット（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト対象も含まれる。典型的な対象としては、免疫障害を有する、免疫障害と診断された、または免疫障害を有するリスクのあるヒト患者が挙げられる。
【０３８７】
本明細書において使用される場合、「患者」という用語は、多価ＣＡＲ、多価ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞、および本明細書において別段に予期される方法を用いて治療され得る免疫障害と診断された対象を指す。
【０３８８】
本明細書において使用される場合、「治療」または「治療すること」には、疾患の症状もしくは病理、または病的状態に対する何らかの有益な効果または望ましい効果が含まれ、例えば癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患および免疫不全などの治療される疾患もしくは状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーの最小の減少であっても含まれ得る。治療は任意で、疾患または状態の進行の遅延も含み得る。「治療」は必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な排除または治癒を示すものではない。
【０３８９】
本明細書において使用される場合、「予防する」、および例えば「予防」、「予防された」、「予防すること」といった類似の文言は、例えば癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患および免疫不全などの疾患または状態を予防する、阻害する、または発生もしくは再発の可能性を低下させるためのアプローチを示唆する。さらに、疾患もしくは状態の発生または再発の遅延、または疾患もしくは状態の症状の発生または再発の遅延も指す。本明細書において使用される場合、「予防」およびその類似文言も、疾患もしくは症状の発生または再発の前の、疾患もしくは状態の強度、作用、症状、および／または負荷量の低下を含む。
【０３９０】
本明細書において使用される場合、「〜の少なくとも１つの症状の改善」とは、例えば癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患および免疫不全などの対象が治療される疾患もしくは状態の１つまたは複数の症状の減少を指す。特定の実施形態では、治療される疾患または状態は、癌であり、この場合において改善される１つまたは複数の症状としては限定されないが、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい、および出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張または腹部疼痛（膨張した腹部臓器が原因）、骨または関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、および排尿減少（腎機能の障害が原因）が挙げられる。
【０３９１】
様々な実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、癌細胞に対する細胞傷害性の増加における使用のための、または再発癌細胞もしくは難治性癌細胞の数の減少における使用のための、改善された養子免疫療法を提供する。
【０３９２】
特定の実施形態では、初代Ｔ細胞の特異性は、癌細胞上に発現される第一および／または第二の抗原に指向化された多価ＣＡＲを用いて当該初代Ｔ細胞を遺伝子改変することにより、腫瘍細胞または癌細胞に再指向化される。１つの実施形態では、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、その必要のあるレシピエントに注入される。注入される細胞は、レシピエント中の腫瘍細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞はインビボで複製することができため、長期的に残留し、より長く持続的な癌治療がもたらされ得る。
【０３９３】
１つの実施形態では、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、癌と診断された対象に投与される。
【０３９４】
特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、固形腫瘍または癌の治療に使用される。
【０３９５】
特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、限定されないが、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様腫瘍／非定型横紋筋様腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、グリア芽腫、頭頚部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、咽頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、胚カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞癌、正中線癌、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔の癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ、ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性胸膜腫、前立腺癌、直腸癌、網膜芽腫、腎細胞癌、腎盂および尿管の癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑液腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍を含む固形腫瘍または癌の治療に使用される。
【０３９６】
特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、限定されないが、肝癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、骨癌、甲状腺癌、腎癌または皮膚癌を含む固形腫瘍または癌の治療に使用される。
【０３９７】
特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、限定されないが、膵臓癌、膀胱癌および肺癌を含む様々な癌の治療に使用される。
【０３９８】
特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、液状癌または血液癌の治療に使用される。
【０３９９】
特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、限定されないが、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を含むＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用される。
【０４００】
特定の実施形態では、本明細書に予期される多価ＣＡＲ  Ｔ細胞は、限定されないが、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性多血症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、および髄外形質細胞腫を含む液状の癌の治療に使用される。
【０４０１】
特定の実施形態では、方法は、その必要のある患者に、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療有効量を投与することを含む。
【０４０２】
ある実施形態では、細胞は、癌を発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって特定の実施形態は、その必要のある患者に、多価ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療有効量を投与することを含む、癌の少なくとも１つの症状の治療または予防または改善を含む。
【０４０３】
投与の量および頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重大度といった因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定されてもよい。
【０４０４】
１つの実施形態では、対象に投与される組成物中の例えばＴ細胞などの免疫エフェクター細胞の量は、少なくとも０．１ｘ１０５個の細胞、少なくとも０．５ｘ１０５個の細胞、少なくとも１ｘ１０５個の細胞、少なくとも５ｘ１０５個の細胞、少なくとも１ｘ１０６個の細胞、少なくとも０．５ｘ１０７個の細胞、少なくとも１ｘ１０７個の細胞、少なくとも０．５ｘ１０８個の細胞、少なくとも１ｘ１０８個の細胞、少なくとも０．５ｘ１０９個の細胞、少なくとも１ｘ１０９個の細胞、少なくとも２ｘ１０９個の細胞、少なくとも３ｘ１０９個の細胞、少なくとも４ｘ１０９個の細胞、少なくとも５ｘ１０９個の細胞、または少なくとも１ｘ１０１０個の細胞である。
【０４０５】
特定の実施形態では、約１ｘ１０７個のＴ細胞〜約１ｘ１０９個のＴ細胞、約２ｘ１０７個のＴ細胞〜約０．９ｘ１０９個のＴ細胞、約３ｘ１０７個のＴ細胞〜約０．８ｘ１０９個のＴ細胞、約４ｘ１０７個のＴ細胞〜約０．７ｘ１０９個のＴ細胞、約５ｘ１０７個のＴ細胞〜約０．６ｘ１０９個のＴ細胞、または約５ｘ１０７個のＴ細胞〜約０．５ｘ１０９のＴ細胞が、対象に投与される。
【０４０６】
１つの実施形態では、対象に投与される組成物中の例えばＴ細胞などの免疫エフェクター細胞の量は、少なくとも０．１ｘ１０４細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０４細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０４細胞／体重ｋｇ、少なくとも５ｘ１０４細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０５細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０７細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０７細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０８細胞／体重ｋｇ、少なくとも１ｘ１０８細胞／体重ｋｇ、少なくとも２ｘ１０８細胞／体重ｋｇ、少なくとも３ｘ１０８細胞／体重ｋｇ、少なくとも４ｘ１０８細胞／体重ｋｇ、少なくとも５ｘ１０８細胞／体重ｋｇ、または少なくとも１ｘ１０９細胞／体重ｋｇである。
【０４０７】
特定の実施形態では、約１ｘ１０６  Ｔ細胞／体重ｋｇ〜約１ｘ１０８  Ｔ細胞／体重ｋｇ、約２ｘ１０６  Ｔ細胞／体重ｋｇ〜約０．９ｘ１０８  Ｔ細胞／体重ｋｇ、約３ｘ１０６  Ｔ細胞／体重ｋｇ〜約０．８ｘ１０８  Ｔ細胞／体重ｋｇ、約４ｘ１０６  Ｔ細胞／体重ｋｇ〜約０．７ｘ１０８  Ｔ細胞／体重ｋｇ、約５ｘ１０６  Ｔ細胞／体重ｋｇ〜約０．６ｘ１０８  Ｔ細胞／体重ｋｇ、または約５ｘ１０６  Ｔ細胞／体重ｋｇ〜約０．５ｘ１０８  Ｔ細胞／体重ｋｇが対象に投与される。
【０４０８】
当業者であれば、所望の治療効果を発揮させるために、特定の実施形態において予期される組成物の複数回の投与が必要とされる場合があることを認識するであろう。例えば組成物は、１週、２週、３週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年、２年、５年、１０年またはそれ以上の期間にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上投与される場合がある。
【０４０９】
ある実施形態では、対象に活性化Ｔ細胞が投与され、次いで対象から採血して（またはアフェレーシス療法を実施し）、Ｔ細胞を活性化し、そしてこれら活性化および拡張されたＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週ごとに複数回実施されてもよい。ある実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化されてもよい。ある実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃ以上の採血から活性化される。学説には拘束されないが、複数回の採血／複数回の再注入のプロトコールを使用することで、Ｔ細胞のある群の選択に役立つ場合がある。
【０４１０】
特定の実施形態において予期される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎおよびｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含む、任意の簡便な方法で実施されてもよい。好ましい実施形態では、組成物は、経鼻、経口、腸内または非経口で投与される。本明細書において使用される場合、「非経口投与」、「非経口で投与される」という文言は、腸内投与および局所投与以外の投与様式を指し、通常、注射により行われ、限定されないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、関節包内、眼窩内、腫瘍内、心腔内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および胸骨下の注射ならびに点滴が挙げられる。１つの実施形態では、本明細書に予期される組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位への直接的な注入により対象に投与される。
【０４１１】
１つの実施形態では、その必要のある対象は、当該対象中の癌に対する細胞性免疫反応を増加させるのに有効な量の組成物を投与される。免疫反応は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞の反応により介在される細胞性免疫反応を含み得る。Ｂ細胞を活性化し、それにより抗体産生を誘導することができるヘルパーＴ細胞により主に介在される液性免疫反応も誘導され得る。組成物により誘導された免疫反応のタイプを分析するために様々な技術が使用されてもよく、そうした技術は当分野に公知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ。
【０４１２】
１つの実施形態では、癌と診断された対象を治療する方法は、当該対象から免疫エフェクター細胞を採取すること、本明細書に予期される多価ＣＡＲを発現するように免疫エフェクター細胞を改変すること、および改変免疫エフェクター細胞群を生成すること、ならびに当該対象に、当該改変免疫エフェクター細胞群を投与することを含む。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含有する。
【０４１３】
特定の実施形態において予期される細胞組成物を投与する方法は、生体外で改変された免疫エフェクター細胞の再導入を生じさせるために有効である任意の方法、または対象への導入時に成熟免疫エフェクター細胞へと分化する免疫エフェクター細胞の前駆体の再導入に有効である任意の方法を含む。１つの方法は、生体外で末梢血Ｔ細胞を改変すること、および当該改変細胞を対象に戻すことを含む。
【０４１４】
本明細書に引用されるすべての公表文献、特許出願および登録特許が、個々の公表文献、特許出願または登録特許のそれぞれが具体的に、および個々に参照により援用されることが示されているように、参照により本明細書に援用される。
【０４１５】
前述の実施形態は、明確性および理解を目的として、図および実施例により詳細に記載されているが、本明細書に予期される教示に照らし、特定の変化および改変が、添付の請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、解説のみを目的として提供されるものであり、限定ではない。当業者であれば、本質的に類似した結果を得るために変えられ得る、または改変され得る重要ではない様々なパラメーターが容易に認識されるであろう。
【実施例】
【０４１６】
実施例１
多価形式でのＣＡＲのマルチプレックス化
従来的なＣＡＲは、２つの鎖から構成されるｓｃＦｖドメインを使用して抗原標的化を行っており、その１つの鎖は、抗体の可変重鎖に由来し、他方の鎖は、抗体の可変軽鎖に由来している。ラクダ科、および一部の軟骨魚類は、ＶＨＨ（ラクダ科）またはＩｇＮＡＲ（軟骨魚類）と呼ばれる重鎖のみの抗体を生来的に発現する。これら抗体の抗原結合領域は一般的に、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）と呼称されており、単一単量体可変抗体ドメインから構成される（図１）。単一ドメイン抗体断片は、高度にモジュール式であり、安定的で、ｓｃＦｖのおよそ半分の大きさである。そして特定の抗原に高いアフィニティで選択的に結合することができる。
【０４１７】
ｓｄＡｂのコンパクトなモジュール様式は、一列多価形式でのＣＡＲのマルチプレックス化に理想的な候補である（図２および図３）。
【０４１８】
多価ＣＡＲ構築物は、ＥＧＦＲを標的とするｓｄＡｂクローン７Ｄ１２（例えば、配列番号１〜５を参照のこと）を、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（例えば、配列番号６、７を参照）のＮ末端に、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー（例えば、配列番号８〜１０を参照のこと）を使用して融合させることにより設計された。図３。
【０４１９】
一価ＣＡＲおよび多価ＣＡＲを、レンチウイルス粒子内にパッケージングし、これを使用してインビトロで初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を形質導入した。形質導入されたヒトＰＢＭＣは、蛍光抗原で標識し、フローサイトメトリーで分析することにより、ＣＡＲ発現が評価された。図４Ａ。多価ＣＡＲ構築物のみが、およそ等しい量で両方の抗原で標識された。このことから、両方の抗原結合ドメインが適切にフォールディングされ、多価形式でも抗原結合活性が保持されたことが示唆される。
【０４２０】
形質導入された細胞はその後、抗原陽性Ａ５４９（ＢＣＭＡ＋およびＥＧＦＲ＋）腫瘍細胞とともに１：１のＥ：Ｔ比で共培養され、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３を使用して経時的に細胞傷害性がモニタリングされた。４８時間の共培養後、Ａ５４９腫瘍細胞の細胞傷害性を、腫瘍単独と比較した共培養細胞の曲線下面積から算出した。多価ＣＡＲ構築物は、ｓｄＡｂ  ＣＡＲまたはｓｃＦｖ  ＣＡＲの単独と比較して安定的な細胞傷害性を示した。図４Ｂ。
【０４２１】
Ａ５４９腫瘍細胞と１：１のＥ：Ｔ比で共培養された形質導入細胞からのサイトカイン分泌は、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＭｕｌｔｉＣｙｔ  Ｑｂｅａｄｓ  Ｐｌｅｘｓｃｒｅｅｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用して２４時間で評価された。両抗原に対する反応におけるＩＦＮγは、多価構築物に対して検出された（図４Ｃ）。
【０４２２】
実施例２
ＣＤ１９−ＣＤ２０タンデムＣＡＲ
タンデムＣＡＲは、単一ドメインＶＨＨ抗体を、ＣＡＲ含有ｓｃＦｖのＮ末端に融合させることにより構築された。抗ＣＤ１９  ＶＨＨ（配列番号１８）を、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（配列番号１２）のＮ末端に融合して、抗ＣＤ１９  ＶＨＨ−抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖタンデムＣＡＲ（配列番号２２）を作製した。抗ＣＤ２０  ＶＨＨ（配列番号２０）を、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（配列番号１６）のＮ末端に融合して、抗ＣＤ２０  ＶＨＨ−抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖタンデムＣＡＲ（配列番号２４）を作製した。さらに抗ＣＤ１９  ＶＨＨと抗ＣＤ２０  ＶＨＨを、タンデムＣＡＲとして作製した（配列番号２６）。
【０４２３】
一価ＣＡＲ構築物およびタンデムＣＡＲ構築物をレンチウイルス粒子内にパッケージングして、これを使用してインビトロでヒトＰＢＭＣに形質導入した。形質導入されたヒトＴ細胞を、蛍光抗原で標識することにより一価ＣＡＲ発現またはタンデムＣＡＲ発現を評価した。ＣＤ２０の場合、可溶性蛍光抗原は利用できないため、ＶＨＨ発現は抗ＶＨＨ抗体を用いて評価された。図７Ａ。タンデム構築物のみが、ＣＤ１９試薬および抗ＶＨＨ試薬の両方で標識された。Ｉｄ．
【０４２４】
形質導入されたＴ細胞はその後、抗原陽性Ａ５４９腫瘍細胞とともに１：１のエフェクター：腫瘍比（Ｅ：Ｔ比）で共培養され、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３を使用して経時的に細胞傷害性がモニタリングされた。４８時間の腫瘍共培養後、細胞傷害性を、腫瘍単独と比較した共培養細胞の曲線下面積から算出した。タンデム構築物は、両方の抗原を発現する腫瘍に対し、細胞溶解活性を有していることが観察された。一方で、一価構築物は、それらの各抗原が陽性である腫瘍細胞に対してのみ殺傷を呈した。図７Ｂ。
【０４２５】
形質導入Ｔ細胞からのサイトカイン分泌は、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＭｕｌｔｉＣｙｔ  ＱＢｅａｄｓ  Ｐｌｅｘｓｃｒｅｅｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用して２４時間で評価された。細胞傷害性アッセイで観察されたように、サイトカイン放出アッセイの結果から、タンデムＣＡＲは両方の抗原を担持する腫瘍に対し反応することができた一方で、一価ＣＡＲは、それらの各抗原を担持する腫瘍に対してのみ反応した。図７Ｃおよび７Ｄ。
【０４２６】
実施例３
ＣＤ２０−ＣＤ７９ａタンデムＣＡＲ
タンデムＣＡＲは、単一ドメインＶＨＨ抗体を、ＣＡＲ含有ｓｃＦｖのＮ末端に融合させることにより構築された。抗ＣＤ２０  ＶＨＨ（配列番号２０）を、抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（配列番号２８）のＮ末端に融合して、抗ＣＤ２０  ＶＨＨ−抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖタンデムＣＡＲ（配列番号３０）を作製した。抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（配列番号３２）および抗ＣＤ２０  ＶＨＨ  ＣＡＲ（配列番号３４）も構築された。一価ＣＡＲ構築物およびタンデムＣＡＲ構築物をレンチウイルス粒子内にパッケージングして、これを使用してインビトロでヒトＰＢＭＣに形質導入した。
【０４２７】
形質導入されたヒトＴ細胞を、蛍光抗原で標識することにより一価ＣＡＲ発現またはタンデムＣＡＲ発現を評価した。ＣＤ２０の場合、可溶性蛍光抗原は利用できないため、ＶＨＨ発現は抗ＶＨＨ抗体を用いて評価された。タンデム構築物は、抗ＶＨＨ抗体で認識されたことから、単一ドメイン部分の陽性発現が示唆される。タンデム構築物の抗ＣＤ７９ａ  ｓｃＦｖドメインは、組み換えＣＤ７９ａ抗原で標識された。表面染色により概算した場合の発現の程度は、一価の単一抗原標的化構築物と同等であった。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲは、対照として含められた。図８Ａ。
【０４２８】
形質導入されたＴ細胞はその後、抗原陽性Ａ５４９腫瘍細胞（ＣＤ１９＋またはＣＤ２０＋）とともに１：１のエフェクター：腫瘍比（Ｅ：Ｔ比）で共培養され、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３を使用して経時的に細胞傷害性がモニタリングされた。４８時間の腫瘍共培養後、細胞傷害性を、腫瘍単独と比較した共培養細胞の曲線下面積から算出した。並行して形質導入Ｔ細胞も、Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞とインキュベートされた。Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞は、３つすべての標的抗原を発現している（ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ７９ａ）。タンデムＣＡＲは、ＣＤ２０＋  Ａ５４９細胞に対して細胞溶解能力を示したが、タンデムＣＡＲ中に抗ＣＤ１９構成要素が存在しないため、ＣＤ１９＋  Ａ５４９細胞に対しては示さなかった。タンデムＣＡＲはさらに、ＣＤ２０＋  Ａ５４９細胞に対する細胞傷害性を示し、一価抗ＣＤ２０  ＶＨＨ  ＣＡＲと同等であった。図８Ｂ。
【０４２９】
ＣＡＲ構築物で改変され、抗原陽性腫瘍細胞と共培養された細胞からのサイトカイン分泌は、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＭｕｌｔｉＣｙｔ  ＱＢｅａｄｓ  Ｐｌｅｘｓｃｒｅｅｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用して２４時間で評価された。タンデムＣＡＲで形質導入されたＴ細胞からのサイトカイン分泌は、一価ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞と同等であり、抗原特異的であり、抗原依存性であることが示された。図８Ｃおよび８Ｄ。
【０４３０】
一般的に以下の請求の範囲において、使用される用語は、請求の範囲を本明細書に開示される特定の実施形態に限定するとは解釈されず、請求の範囲は、当該請求の範囲が権利付与される均等の全範囲に沿って、すべての可能性のある実施形態を含むと解釈されるものとする。したがって、請求の範囲は、本開示により限定されない。
【図１】
2021506305.tif 000006
【図２】
2021506305.tif 000007
【図３】
2021506305.tif 000008
【図４】
2021506305.tif 000009
【図５】
2021506305.tif 000010
【図６】
2021506305.tif 000011
【図７−１】
2021506305.tif 000012
【図７−２】
2021506305.tif 000013
【図８−１】
2021506305.tif 000014
【図８−２】
2021506305.tif 000015
【配列表】
2021506305000001.app
【国際調査報告】
2021506305.tif 000016
2021506305.tif 000017
2021506305.tif 000018