(57)【要約】  無細胞系で標的分析物に応答してレポーター分子を生じさせる方法が記載される。合成生物学的回路を用いて、標的分析物の存在に応答してレポーター分子のレベルを修飾する。レポーター分子は、グルコースモニターまたはその他の携帯型センサーなどの装置を用いて容易に検出されるグルコースまたは別の分子であり得る。また、標的分析物に応答してレポーター分子を生成または消費する合成生物学的回路を有する無細胞系を含む、キットが提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的分析物に応答してグルコースを生成する方法であって、
前記試料と無細胞系の合成生物学的回路とを接触させることを含み、
前記標的分析物が、前記合成生物学的回路を活性化して、無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを修飾する、
方法。
【請求項２】
前記標的分析物が、前記合成生物学的回路を活性化して、前記無細胞系反応体積中の前記グルコースのレベルを上昇させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的分析物が、前記合成生物学的回路を活性化して、前記無細胞系反応体積中の前記グルコースのレベルを低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的分析物が、無機分子または有機分子、任意選択で生体分子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的分析物が、核酸分子、任意選択で標的ＤＮＡ分子または標的ＲＮＡ分子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料と前記合成生物学的回路との接触前または接触時に、前記試料中の前記標的分析物の濃度を増大させることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料中の前記標的分析物の濃度を増大させることが、前記標的ＤＮＡ分子または前記標的ＲＮＡ分子の等温増幅を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的分析物の濃度を増幅することが、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、またはリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記合成生物学的回路が、前記無細胞系の前記グルコースのレベルを修飾する酵素の発現を、任意選択で前記酵素の転写または翻訳を調節することによって調節する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記合成生物学的回路が、前記無細胞系の前記グルコースのレベルを修飾する酵素のレベルまたは活性を、任意選択で前記酵素の翻訳後調節によって調節する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成生物学的回路が遺伝子回路である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子回路が、発現が前記無細胞系の前記グルコースのレベルを修飾する１つまたは複数の酵素をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子回路が、前記１つもしくは複数の酵素をコードする前記ＤＮＡ分子の転写、または前記１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のｍＲＮＡ分子の翻訳を調節する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２つの合成生物学的回路が、前記グルコースのレベルを修飾する少なくとも２つの酵素の発現を調節し、任意選択で、前記２つの酵素が、異なる速度で前記グルコースのレベルを修飾する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子回路が、１つまたは複数の転写活性化因子または転写抑制因子を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子回路が、前記酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳を制御するリボレギュレーターを含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リボレギュレーターが足がかり配列スイッチであり、前記標的核酸分子が前記足がかり配列スイッチのトリガーであるため、前記標的核酸分子と前記足がかり配列スイッチが結合すると、前記遺伝子回路内の前記酵素をコードする前記ｍＲＮＡが翻訳される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記無細胞系が、グルコース、または前記酵素が作用してグルコースを生成する基質を含み、任意選択で、前記基質が、１つまたは複数のグルコースモノマーを含むオリゴ糖または多糖を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ｉ）前記基質がトレハロースであり、前記酵素がトレハラーゼである；
ｉｉ）前記基質がマルトースであり、前記酵素がマルターゼである；
ｉｉｉ）前記基質がセロビオースであり、前記酵素がセロビアーゼである；
ｉｖ）前記基質がデンプンであり、前記酵素がアミラーゼである；
ｖ）前記基質がラクトースであり、前記酵素がラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）である；
ｖｉ）前記基質がスクロースであり、前記酵素がインベルターゼもしくはスクラーゼである；
ｖｉｉ）前記基質がグルコースであり、前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである；または
ｖｉｉｉ）前記基質がグルコース−６−リン酸であり、前記酵素がグルコース６−ホスファターゼである、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的分析物が、微生物病原体、任意選択でウイルスまたは細菌に関連する核酸分子である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的分析物が、表現型に関連するバイオマーカーであり、任意選択で、前記試料が対象由来のものであり、前記試料中の前記バイオマーカーの存在が、前記対象の前記表現型を示す、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的分析物が、微生物の薬物耐性に関連する核酸分子である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的分析物が、金属、爆発物、汚染物質、タンパク質、および／または毒素である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、体液、任意選択で、血液、尿、または唾液である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、環境試料、任意選択で水試料である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料と前記無細胞系の前記合成生物学的回路とを接触させる前に前記試料を処理することをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料を処理することが、前記試料を希釈することを含み、任意選択で、前記試料を希釈することが、グルコースの濃度を正常化または低下させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料を処理することが、前記試料を精製し、かつ／または前記試料を濃縮して、前記標的分析物の相対濃度を増大させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料を処理することが、熱処理、任意選択で、前記試料を加熱して細胞を溶解させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料を処理して、前記試料中の内因性グルコースおよび／または血糖を除去および／または隔離することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料とグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびＮＡＤとを接触させて、グルコースおよび／または血糖を除去すること、任意選択で所定量のＧＤＨおよび／またはＮＡＤを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
レクチンを用いて前記試料中のグルコースおよび／または血糖を隔離することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料と無細胞系の前記合成生物学的回路とを接触させる前に、前記試料を希釈液または緩衝液に加えることを含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記希釈液または緩衝液が、無ヌクレアーゼ水および／または界面活性剤、任意選択でＴｗｅｅｎ−２０を、任意選択で０．０２％未満、約０．０１２５％、または０．０１０％〜０．０１５％の濃度で含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記無細胞系が、前記合成生物学的回路と、転写および翻訳のための酵素と、リボソームと、ｄＮＴＰと、ｔＲＮＡと、アミノ酸とを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記無細胞系が、ＲＮアーゼ阻害剤、緩衝剤、１つもしくは複数の補因子、凍結保護物質、および／または界面活性剤、任意選択でＴｗｅｅｎ−２０をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記無細胞系が、発現および／または活性が前記合成生物学的回路によって調節される酵素に対する基質を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記無細胞系を凍結乾燥させ、前記試料および／または反応緩衝液との接触によって再水和する、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記無細胞系反応体積中のグルコースを検出し、それにより、前記試料中の前記標的分析物を検出することをさらに含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを検出し、それにより、前記試料中の前記標的分析物のレベルを定量化することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料を少なくとも５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、または４５分間にわたって、前記合成生物学的回路と接触させた後、前記無細胞系反応体積中のグルコースを検出することを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
グルコースを検出する前に前記無細胞系反応体積に緩衝液を添加することをさらに含み、任意選択で、前記緩衝液が、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含み、ｐＨが約７．３である、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
グルコースメーターを用いて、任意選択でグルコース試験紙を用いて、前記無細胞系反応体積中のグルコースを検出することを含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記グルコース試験紙が、任意選択でグルコースデヒドロゲナーゼおよびフェリシアン化物を用いて、前記グルコースメーターの電極上で電気シグナルを発生させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料と無細胞系の複数の合成生物学的回路とを接触させることを含み、異なる標的分析物が各合成生物学的回路を活性化してグルコースを生じさせる、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数の合成生物学的回路のそれぞれが、異なる基質と酵素を用いてグルコースを生成する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記無細胞系の前記複数の合成生物学的回路によって生成されるグルコースの速度および／またはレベルを検出することによって、複数の異なる標的分析物の多重検出が可能になる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記無細胞系反応体積中に検出された前記グルコースのレベルを、対照試料中の前記標的分析物のレベルを示す１つまたは複数の対照レベルと比較することを含む、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記無細胞系反応体積中に検出された前記グルコースのレベルを１つまたは複数の対照レベルと比較することを含み、各対照レベルが、前記試料中の１つまたは複数の前記標的分析物の有無を示すものである、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料中の１つまたは複数の標的分析物の有無を示すデータを使用者に提示することをさらに含み、任意選択で、前記データが、前記試料中の前記１つまたは複数の標的分析物のレベルを示すものである、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
試料中の標的分析物に応答してグルコースを生成または消費する合成生物学的回路を含む無細胞系を含む、キット。
【請求項５２】
前記試料を入れ、前記試料と前記無細胞系とを接触させる容器を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記標的分析物が、無機分子または有機分子、任意選択で生体分子である、請求項５１または５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記標的分析物が、核酸分子、任意選択で標的ＤＮＡ分子または標的ＲＮＡ分子である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記試料中の前記標的分析物の濃度を増大させる試薬を含む、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５６】
前記標的分析物が核酸分子であり、前記試薬が、前記核酸分子を等温増幅する試薬を含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記合成生物学的回路が遺伝子回路である、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５８】
前記遺伝子回路が、発現が前記無細胞系のグルコースを生成または消費する１つまたは複数の酵素をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ分子を含む、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記遺伝子回路が、前記酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳を制御するリボレギュレーターを含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記リボレギュレーターが足がかり配列スイッチであり、前記標的核酸分子が、前記足がかり配列スイッチのトリガーであるため、前記標的核酸分子と前記足がかり配列スイッチが結合すると、前記遺伝子回路内の前記酵素をコードする前記ｍＲＮＡが翻訳される、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記無細胞系が、グルコース、または前記酵素が作用してグルコースを生成する基質を含み、任意選択で、前記基質が、１つまたは複数のグルコースモノマーを含むオリゴ糖または多糖を含む、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６２】
ｉ）前記基質がトレハロースであり、前記酵素がトレハラーゼである；
ｉｉ）前記基質がマルトースであり、前記酵素がマルターゼである；
ｉｉｉ）前記基質がセロビオースであり、前記酵素がセロビアーゼである；
ｉｖ）前記基質がデンプンであり、前記酵素がアミラーゼである；
ｖ）前記基質がラクトースであり、前記酵素がラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）である；
ｖｉ）前記基質がスクロースであり、前記酵素がインベルターゼである；
ｖｉｉ）前記基質がグルコースであり、前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである；または
ｖｉｉｉ）前記基質がグルコース−６−リン酸であり、前記酵素がグルコース６−ホスファターゼである、
請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記標的分析物が、微生物病原体、任意選択でウイルスまたは細菌に関連する核酸分子であり、前記キットが、前記微生物病原体を検出するためのものである、請求項５１〜６２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６４】
前記標的分析物が、表現型に関連するバイオマーカーであり、任意選択で、前記試料が対象由来のものであり、前記試料中の前記バイオマーカーの存在が、前記対象の前記表現型を示す、請求項５１〜６２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６５】
前記標的分析物が、微生物の薬物耐性に関連する核酸分子である、請求項５１〜６２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６６】
前記標的分析物が、金属、爆発物、汚染物質、タンパク質、および／または毒素である、請求項５１〜６２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６７】
前記試料を処理して前記試料中の内因性グルコースおよび／または血糖を除去および／または隔離する試薬をさらに含む、請求項５１〜６６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６８】
前記試薬が、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）とＮＡＤとを含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記試薬が、前記試料中のグルコースおよび／または血糖を隔離するレクチンを含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
前記試料と混合する希釈液または緩衝液を含む、請求項５１〜６９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７１】
前記希釈液または緩衝液が、無ヌクレアーゼ水および／または界面活性剤、任意選択でＴｗｅｅｎ−２０を含む、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
前記無細胞系が、合成生物学的回路と、転写および翻訳のための酵素と、リボソームと、ｄＮＴＰと、ｔＲＮＡと、アミノ酸とを含む、請求項５１〜７１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７３】
前記無細胞系が、ＲＮアーゼ阻害剤、緩衝剤、１つもしくは複数の補因子、凍結保護物質、および／または界面活性剤、任意選択でＴｗｅｅｎ−２０をさらに含む、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
前記無細胞系が、発現および／または活性が前記合成生物学的回路によって調節される酵素に対する基質を含む、請求項５１〜７３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７５】
前記無細胞系が凍結乾燥されている、請求項５１〜７４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７６】
前記無細胞系が、前記容器の蓋の中に含まれている、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
前記容器が、グルコース試験紙を入れるのに適合している、請求項５１〜７６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７８】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法を実施するための、請求項５１〜７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記無細胞系の前記合成生物学的回路によって生成されたグルコースを検出するグルコースメーターをさらに含む、請求項５１〜７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８０】
前記試料中の複数の異なる標的分析物に応答してグルコースを生成または消費する複数の合成生物学的回路を含む、請求項５１〜７９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８１】
前記複数の合成生物学的回路のそれぞれが、異なる基質と酵素を用いてグルコースを生成する、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
前記標的分析物が核酸分子であり、前記方法が、前記試料と前記合成生物学的回路とを接触させる前に前記核酸分子を抽出することをさらに含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記核酸分子を抽出することが、前記試料と、前記標的分析物を捕捉する基質、任意選択で、紙基質、膜基質、または磁気ビーズとを接触させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記標的分析物を捕捉する基質を含む、請求項５１〜８１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８５】
前記基質が、紙基質または膜基質であり、任意選択で、前記基質がセルロースを含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
試料を入れる容器を含み、前記容器が取外し可能な蓋を含み、前記基質が前記取外し可能な蓋に接着している、請求項８４または８５に記載のキット。
【請求項８７】
複数の容器を含み、前記取外し可能な蓋が、前記複数の容器に適合するよう構成されている、請求項８６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１７年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／６０９，５２５号の優先権の利益を主張するものであり、上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、標的分析物を検出する製品および方法、より具体的には、グルコースを産生または消費する合成生物学的回路を用いて標的分析物を検出する製品および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
血糖モニターは、議論の余地はあるものの、最も広く用いられている診断装置であり、血糖の携帯機器による定量化、したがって個人の管理を可能にすることによって、何百万人もの糖尿病患者の生活に「革命」をもたらしてきた。世界全体の販売額が年間１１０億ドル（ＵＳＤ）であるグルコースメーターは、分散型の診断法としては比類なき成功を収めたものである。このように広く採用されることによって、装置の製造、流通、および消耗品の世界規模のネットワークがもたらされただけでなく、患者および臨床医によって広く受け入れられるようにもなった。しかし、これほどの成功を収めたものの、それは携帯機器による他の疾患バイオマーカー（例えば、核酸、タンパク質、および他の小分子）の診断にマッチするものではなかった。その理由は複雑なものであるが、重要な要因の１つとして、他の種類の分析物に適した携帯型センサー技術が存在しないということがある。
【０００４】
これまでに、個人用のグルコースメーターをグルコース以外の分析物の検出に転用する研究が記載されている（Ｘｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｕ，２０１１；Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。しかし、これらの報告に用いられた分子機序は、複数のエレメント間のアプタマーまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを用い、予め生成した酵素を使用するものであり、このことがその実用性を制限するものと思われる。
【０００５】
標的分析物を検出し、携帯型センサー技術における使用への適合が容易な新規な製品および方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、無細胞系の合成生物学的回路を活性化することによって標的分析物を検出するのに有用な方法および製品に関する。一実施形態では、合成生物学的回路の活性化が、グルコースなどのレポーター分子のレベルを修飾する。次いで、グルコースメーターなどの使用によるレポーター分子の検出を用いて、試料中の標的分析物の存在を検出し得る。
【０００７】
図１に示すように、遺伝子回路などの合成生物学的回路を用いて、標的分析物の存在に応答するレポーター酵素の活性または発現を活性化し得る。反応内のレポーター分子のレベルを上昇または低下させる基質と酵素の様々な組合せを選択し得る。好ましい実施形態では、レポーター分子はグルコースであり、合成生物学的回路は、反応体積中のグルコースのレベルを修飾するレポーター酵素を生成および／または活性化するものである。グルコースは、無細胞反応体積中で、グルコースメーターに対して不活性な基質、例えば多糖などから生成する。一実施形態では、グルコースは、グルコースメーターに対して不活性な産物（Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンなど）に変換される。反応体積中のグルコースのレベルの変化は、グルコースメーターおよび／またはグルコース試験紙を用いて容易に求めることができる。グルコースモニターを用いて患者由来血液試料中の標的分析物を検出する例示的アッセイを図２に示す。
【０００８】
さらに、本明細書に記載される実施形態は、試料中の複数の標的分析物を単一の反応で検出することを可能にする。図４に示すように、無細胞系の複数の合成生物学的回路を用いて、異なる標的分析物に応答し、グルコースモニターを用いて容易に識別される異なるグルコースのレベルを生じさせ得る。
【０００９】
本明細書に記載される実施形態には多数の利点があり、様々な目的で様々なタイプの試料中の標的分析物を検出するのに用いることができる。例えば、本明細書に記載される実施形態は、患者試料中の臨床的に重要な量の疾患関連ＤＮＡ／ＲＮＡを検出するのに適した携帯機器を実現し得る。同様に、この技術を用いて、ポイントオブケアで個人の遺伝子型を同定して表現型に関する情報を推測する、食品中の遺伝子マーカーの存在を試験する（例えば、食品安全性）、または環境試料を分析する（例えば、環境モニタリング）ことができる。さらに、単に上流遺伝子に基づく回路を変化させることによって、目的とする試料中の汚染物質（例えば、重金属または殺虫剤）、爆発物（例えば、国家の保安）、または違法物質（例えば、法執行）などの小分子分析物を検出し得る。本明細書に記載される方法および製品を分子バーコード、例えばサプライチェーンの商品の追跡、情報の暗号化、および／または高価商品に透かしを入れることに使用する分子バーコードなどの検出に使用してもよい。本明細書に記載される実施形態は、多種多様な標的分析物の検出にグルコースモニターなどの安価で携帯可能なセンサーを用いることを可能にする。
【００１０】
したがって、一態様では、試料中の標的分析物に応答してグルコースを生じさせる方法が提供される。一実施形態では、この方法は、試料と無細胞系の合成生物学的回路とを接触させることを含む。次いで、標的分析物が合成生物学的回路を活性化して、無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを修飾する。
【００１１】
標的分析物は任意選択で、合成生物学的回路を活性化して、無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを上昇させるか、無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを低下させる。
【００１２】
一実施形態では、標的分析物は無機分子または有機分子である。一実施形態では、標的分析物は、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質などの生体分子である。
【００１３】
一実施形態では、この方法は、標的分析物（１つまたは複数）を精製し、かつ／または利用可能な状態にするため、試料と生物学的回路との接触前または接触時に試料を処理することを含む。例えば、一実施形態では、この方法は、試料から核酸分子を抽出することを含む。当該技術分野で公知の様々な核酸抽出方法を本明細書に記載される実施形態と組み合わせて用い得る。一実施形態では、この方法は、核酸分子などの標的分析物を捕捉する紙または膜などの基質を用いて標的分析物を抽出することを含む。別の実施形態では、この方法は、標的分析物の抽出に磁気ビーズを使用することを含む。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、試料と合成生物学的回路とを接触させる前に、試料からの紙による核酸分子抽出、任意選択で、本明細書に記載されるＲｅＣａｐ  ＲＮＡ抽出と、それに続く核酸配列ベースの等温増幅（例えば、ＮＡＳＢＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰなど）を含む。
【００１４】
一実施形態では、この方法は、試料と合成生物学的回路との接触前または接触時に、試料中の標的分析物の濃度を増大および／または増幅することを含む。例えば、一実施形態では、この方法は、任意選択で等温増幅技術などの当該技術分野で公知の核酸増幅技術を用いて標的ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を増幅することを含む。
【００１５】
一実施形態では、合成生物学的回路は、任意選択で酵素の転写または翻訳を調節することによって、標的分析物に応答して無細胞反応体積中のグルコースのレベルを修飾する酵素の発現を調節する。一実施形態では、合成生物学的回路は遺伝子回路である。例えば、一実施形態では、遺伝子回路は、リボレギュレーター、例えば酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳を標的分析物に応答して制御する足がかり配列スイッチなどを含む。あるいは、合成生物学的回路は、任意選択で酵素の翻訳後調節により、無細胞系のグルコースのレベルを修飾する酵素のレベルまたは活性を調節し得る。
【００１６】
本明細書に記載される実施形態では、無細胞系反応体積中のレポーター分子のレベルを上昇または低下させる基質と酵素の様々な組合せを用い得る。一実施形態では、基質は、グルコース、または酵素が作用してグルコースを生成する基質である。例えば、一実施形態では、基質はトレハロースであり、酵素はトレハラーゼである。特に限定されないが図１Ｂに挙げるものを含めたこの記載の教示を考慮すれば、当業者には基質と酵素の他の組合せが明らかになるであろう。一実施形態では、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼを用いてＨＭＧ−ＣｏＡからケトンのアセトアセタートを生じさせる。別の実施形態では、酵素３−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼを用いてＤ−３−ヒドロキシブチラートをアセトアセタートに酸化する。一実施形態では、β−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼを用いてβ−ヒドロキシ酪酸塩をアセトアセタートに変換する。
【００１７】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、試料またはその一部と無細胞系の合成生物学的回路とを接触させる前に試料を処理することを含む。例えば、一実施形態では、試料を処理して、試料中のグルコース濃度を正常化もしくは低下させ、かつ／または試料中の標的分析物の相対濃度を増大させる。一実施形態では、試料を処理して、試料中の内因性グルコースおよび／または血糖を除去および／または隔離する。この方法は任意選択で、試料とグルコースデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤとを接触させて、内因性グルコースをＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換することを含む。
【００１８】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、無細胞系反応体積中のレポーター分子を検出し、それにより試料中の標的分析物を検出することを含む。一実施形態では、レポーター分子はグルコースであり、グルコースメーターおよび／またはグルコース試験紙を用いて無細胞系反応体積中のグルコースを検出する。一実施形態では、レポーター分子はケトンであり、ケトンメーターおよび／またはケトン試験紙を用いて無細胞系反応体積中のケトンを検出する。
【００１９】
本明細書に記載される実施形態を用いて、複数の検出反応で複数の異なる標的分析物を検出してもよい。例えば、一実施形態では、この方法は、試料と無細胞系の複数の合成生物学的回路とを接触させることを含み、異なる標的分析物が各合成生物学的回路を活性化して、無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを修飾する。一実施形態では、無細胞系反応体積中のグルコースのレベルと１つまたは複数の対照レベルとの比較を用いて、試料中の複数の標的分析物の存在、不在、および／またはレベルを求め得る。
【００２０】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたは複数の標的分析物の有無を示すデータを使用者に提示することを含む。任意選択で、データをスマートフォンなどの携帯用電子機器で使用者に提示する。
【００２１】
別の態様では、試料中の標的分析物に応答してレポーター分子を生成または消費する合成生物学的回路を含む無細胞系を含む、キットが提供される。一実施形態では、レポーター分子はグルコースである。一実施形態では、キットは、容器、任意選択で、試料を入れ、かつ／または試料と無細胞系とを接触させる容器を含む。一実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法を実施する試薬を含む。一実施形態では、キットは、合成生物学的回路を有する無細胞系を形成するよう働く試薬を含む。一実施形態では、無細胞系は凍結乾燥されている。一実施形態では、キットは、本明細書に記載される、レポーター分子を生じさせ、かつ／または標的分析物を検出する方法を実施するための指示書を含む。
【００２２】
一実施形態では、キットは、試料を処理する、例えば試料から核酸分子を抽出する製品および／または試薬を含む。一実施形態では、キットは、標的分析物を捕捉する基質、例えば紙または膜基質など、任意選択でセルロースを含む。一実施形態では、基質は容器、任意選択で、試料を入れるのに適した容器の内側に固定されている。一実施形態では、容器の取外し可能なキャップまたは蓋の内側に付着性基質が固定されている。一実施形態では、キットは、核酸の抽出に適した磁気ビーズを含む。一実施形態では、キットは、試料中の標的分析物の濃度を増大させる試薬を含む。一実施形態では、キットは、標的核酸分子を増幅する、任意選択で、核酸分子を等温増幅する試薬を含む。一実施形態では、キットは、試料の熱処理を実施する、任意選択で、試料を蒸発させる、または試料中の細胞を溶解させる加熱器を含む。一実施形態では、試料と無細胞系とを接触させる前の熱処理によって、グルコース修飾酵素を含めた内因性タンパク質が変性する。
【００２３】
一実施形態では、キットは、試料を入れる容器を含み、容器は取外し可能な蓋を含み、基質は取外し可能な蓋に接着している。一実施形態では、キットは複数の容器を含み、取外し可能な蓋は複数の容器に適合するよう構成されている。例えば、一実施形態では、キットは、試料と合成生物学的回路とを接触させる前に標的分析物を抽出し、洗浄し、かつ／または増幅するための別個の容器を含む。一実施形態では、キットは、標的分析物の抽出、洗浄、および／または増幅に適した緩衝液などの試薬を含む。
【００２４】
一実施形態では、キットは、遺伝子回路を含む合成生物学的回路を含む。一実施形態では、遺伝子回路は、リボレギュレーター、例えば、発現が無細胞系のグルコースを生成または消費する酵素をコードする、ｍＲＮＡの翻訳を制御する足がかり配列スイッチなどを含む。一実施形態では、キットは、試料中の複数の異なる標的分析物に応答してグルコースを生成または消費する複数の合成生物学的回路を含む。任意選択で、各合成生物学的回路は、異なる基質および酵素を用いてグルコースを生成する。
【００２５】
一実施形態では、キットは、試料を処理および／または希釈する試薬をさらに含む。一実施形態では、キットは、試料中の内因性グルコースおよび／または血糖を除去および／または隔離する試薬を含む。例えば、一実施形態では、キットは、試料中のグルコースをＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換する所定量のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）とＮＡＤとを含む。
【００２６】
一実施形態では、キットは、グルコースメーターおよび／またはグルコース試験紙をさらに含む。別の実施形態では、キットは、ケトンメーターおよび／またはケトン試験紙をさらに含む。
【００２７】
本発明の他の特徴と利点については、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明より本発明の趣旨および範囲に含まれる様々な変更および修正が当業者に明らかになることから、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであると同時に、単に説明を目的として記載されるものであることを理解するべきである。
【００２８】
これより、本発明の実施形態を図面と関連させて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａは、蛍光タンパク質または比色タンパク質出力を生じ、解釈に特別な装置を必要とする、標的分析物を検出するための従来の遺伝子回路ベースのセンサーを示す。このような従来の検出方法は、グルコースメーターなどの広く利用可能な診断基盤には適合しない。図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、および１Ｅは、標準的なグルコースメーターおよび試験紙を、グルコース生成酵素を用いて本明細書に記載されるように標的分析物を検出する一般的装置に変換する、様々な実施形態を示す。図１Ｂには、レポーター酵素、各酵素の基質、および１分子当たりのグルコース産生量のリストが記載されている。図１Ｃは、遺伝子回路ベースのセンサーの例示的実施形態が転写を調節することによって機能し得ることを示し、ここでは、ＴｅｔＯベースの遺伝子回路がＴｅｔＲの存在によって抑制される。この抑制は、ＴｅｔＲがＴｅｔＯプロモーターと結合するのを妨げる小分子ａＴｃの添加によって解除され、グルコース生成酵素の転写および翻訳が可能になる。図１Ｄは、翻訳を調節する役割を果たす例示的な足がかり配列スイッチベースの遺伝子回路の模式図を示す。適切なトリガーＲＮＡの存在下では、足がかり配列スイッチの５’ＲＮＡヘアピンが直線化し、それにより、リボソームがリボソーム結合部位（ＲＢＳ）と結合し、グルコース生成レポーター酵素の翻訳を誘導することが可能になる。図１Ｅは、無細胞反応でのオリゴマーグルコース基質の変換を示す。これらの基質がオリゴマー状態であることは、それらが、活性化された遺伝子回路からのレポーター酵素出力によってモノマーグルコースに変換されるまでグルコース試験紙に対して無反応性であることを意味する。
【図２】遺伝子回路ベースのＲＮＡセンサーの出力をグルコースメーターで解釈する際の流れ図の一実施形態を示す図である。ランセットを用いて指を刺すことなどによって、対象から試料を採取し得る。次いで、試料を標的特異的プライマーと等温増幅反応混合物とを含む試料調製緩衝液のバイアルに入れて希釈し、バイアルを反転させてかき混ぜる。増幅後、シールを取り外し、密閉したバイアルを反転させることにより、増幅された標的配列を蓋中のマイクロチャンバに移す。ＲＮＡセンサーでの無細胞反応を（任意選択で２０〜４０分間）進行させ、患者試料が標的分析物について陽性であればグルコースが産生されるのはこの時間の間である。次いで、グルコース試験紙をマイクロチャンバに挿入し、グルコースモニターで読み取る。
【図３】グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）のＮＡＤ共基質を漸増させることによってグルコースの減少が制御されたことを示す図である。無細胞反応でＧＤＨを発現させると、様々な量のＮＡＤを添加することによって、酵素により異化されるグルコースの量を高い精度で制御できる。ＮＡＤは、ＧＤＨによってＮＡＤＨに還元され、グルコースの異化作用には１：１の比で必要とされる。ＧＤＨは、診断レポーター酵素として、またはアッセイ実施前に試料中に存在する内因性グルコースを減少させるのに使用し得る。
【図４】診断用無細胞反応からの多重出力へのシグナル強度の使用を示す図である。異なる酵素に対するＤＮＡ鋳型を共通の反応混合物に添加することによって、異なる標的分析物に応答して異なるレベルのグルコースを生成する反応が可能となる。このことを用いて、単一の反応で複数の診断センサーを作動させることができる。反応はいずれも、無細胞発現系を用いて実施したものであり、実施例１に記載する通りに添加したＤＮＡ以外は同一のものである。この系でプラスミドＤＮＡから酵素を発現させた。ラクターゼ発現を足がかり配列スイッチの制御下に置き、トリガーを添加した。他の２つの酵素は標準的なＴ７プロモーターから発現させた。値はいずれも、ＤＮＡを添加していない対照反応を測定することによって求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。無細胞反応を３７℃で１時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
【図５】酵素のＤＮＡ鋳型の量を漸増させることによって、反応により生成するグルコースの量を制御できることを示す図である。鋳型ＤＮＡの量を減少させることにより、グルコース産生速度が低下する。このことを診断システムに利用し、異なる酵素からの出力を調整してシグナル強度間に明確な差を生じさせ、多重化し得る。値は、ＤＮＡが存在しない陰性対照反応を用いて求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。試料を３７℃で１時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
【図６】グルコース産生に対する基質濃度の影響を示す図である。トレハラーゼの存在下、トレハロース基質のレベルが異なると、異なる濃度のグルコースが生じる。値は、ＤＮＡが存在しない陰性対照反応を用いて求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。無細胞反応を３７℃で１時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
【図７】足がかり配列スイッチベースのＲＮＡセンサーの制御下でのトレハラーゼ発現を示す図である。これは、トリガーＲＮＡの存在がトレハラーゼの翻訳およびこれと同時に起こるグルコース産生を誘導する、模擬診断反応を表している。トレハラーゼは各トレハロース分子を２つのグルコース分子に変換する。値は、ＤＮＡが存在しない陰性対照反応を用いて求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。無細胞反応を３７℃で１時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
【図８】足がかり配列スイッチベースのＲＮＡセンサーの制御下でのラクターゼ発現を示す図である。ここでは、適切なＲＮＡトリガー配列の存在下ではレポーター酵素ラクターゼの翻訳が誘導され、グルコースの産生が生じる。ラクターゼは各糖ラクトース分子を１つのグルコース分子（および１つのガラクトース）に変換する。ここでは、可能性としてこの酵素の反応速度が低下することから、漏出は検出されない。値は、ＤＮＡが存在しない陰性対照反応を用いて求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。無細胞反応を３７℃で１時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
【図９】患者試料中の標的分析物を検出する方法の一実施形態を示す図である。任意選択で、グルコースメーターを用いてグルコースを検出する前、反応体積にグルコースメーター緩衝液（５×０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．３）を加える。
【図１０】単一反応体積中の異なる標的分析物に２つの異なる足がかり配列スイッチを用いた多重化を示す図である。図１０Ｂは、２つの異なるグルコース生成酵素を用いて２つの異なる標的ＲＮＡ配列を多重検出する同様の実験の結果を示す。図１０Ｃは、同じ酵素を用い、異なる足がかり配列スイッチ（足がかり配列スイッチは様々な活性レベルを有し得る）およびそれぞれの足がかり配列スイッチをコードする異なる量（すなわち、存在するセンサーの量）のＤＮＡを用いてレポーター活性を調整した多重検出を示す。
【図１１】グルコースを産生する合成生物学的回路のチフス標的およびパラチフス標的検出への使用を示す図である。
【図１２】診断応用のためのグルコースメーターが介在する例示的ワークフローを示す図である。
【図１３】ＲｅＣａｐ紙抽出ＰＣＲおよび対照ＰＣＲ反応の結果を示す図である。
【図１４】ＲｅＣａｐ紙抽出ＰＣＲを用いたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉアッセイの結果を示す図である。
【図１５】磁気ビーズ抽出ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１６】ＲｅＣａｐ  ＲＮＡ抽出とそれに続くＮＡＳＢＡ増幅の結果を示す図である。
【図１７】合成生物学的回路を用いた水銀検出のためのグルコースメーターが介在する例示的ワークフローを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
この説明は、無細胞系の標的分析物を検出する合成生物学的回路を提供する。実施例で示すように、記載される合成生物学的回路の使用により、グルコースモニターおよび試験紙などの容易に入手可能なセンサーおよび試薬を用いて標的分析物を検出することが可能になる。本明細書に記載される実施形態を用いて、容易に様々な合成生物学的回路を生じさせ、様々な標的分析物の検出を可能にできる。例えば、リボレギュレーター、例えば標的核酸配列に応答してレポーター酵素の発現を制御する足がかり配列スイッチなどを用いて、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を検出できる。レポーター酵素の発現が基質のレベルを修飾し、次いで、これを無細胞反応体積中に検出する。好ましい実施形態では、レポーター酵素が無細胞反応体積中のグルコースのレベルを修飾し、グルコースモニターおよび／またはグルコース試験紙を用いて標的分析物を検出することが可能になる。
【００３１】
同じ反応に異なるレポーター酵素を用いて、複数の標的分析物の同時検出を可能にし得る。レポーター分子（グルコースなど）のレベルを修飾する速度が異なるレポーター酵素を選択し、各酵素に対して異なる量の基質を予め加えることによって、複数の標的分析物の有無が、異なるレベルのレポーター分子を生じさせる。
【００３２】
本明細書で使用される「無細胞系」は、細胞の不在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生合成反応（例えば、転写反応、翻訳反応、またはその両方）を生じさせる、または補助することが可能な一連の試薬を指す。例えば、転写反応を生じさせるには、無細胞系は、プロモーターを含むＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド、および緩衝液系を含む。組換え細胞を含めた真核細胞または原核細胞から単離もしくは精製した、またはそのような細胞の抽出物または一部として調製した酵素、補酵素、およびその他の細胞内成分を用いて、無細胞系を調製できる。様々な供給源、特に限定されないが、真核細胞および原核細胞、例えば、特に限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好熱細菌または好冷細菌などを含めた細菌、コムギ胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、および出芽酵母などを含めた供給源から無細胞系を得ることができる。一実施形態では、無細胞系を得るため、細胞抽出物を精製および／または処理して内因性グルコースおよび／またはグルコース変換酵素を除去する。無細胞系の例としてまた、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手可能なＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システムが挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用される「生合成反応」という用語は、１つまたは複数の生体化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、単糖、多糖など）の合成をもたらす任意の反応を指す。例えば、転写反応は、ＲＮＡが産生されることから、生合成反応である。生合成反応のその他の例としては、特に限定されないが、翻訳反応、共役転写／翻訳反応、ＤＮＡ合成、等温増幅反応、およびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される「合成生物学的回路」という用語は、生体成分が論理機能を実行するよう設計されている、任意の操作された生物学的回路を指す。一般に、合成生物学的回路を活性化するには入力が必要であり、次いで、その入力に応じて出力が生じる。いくつかの実施形態では、合成生物学的回路は、少なくとも１つの核酸物質または構築物を含む。他の実施形態では、合成生物学的回路は、実質的に核酸を含まない。合成遺伝子ネットワークは合成生物学的回路の一種である。合成生物学的回路のその他の例としては、特に限定されないが、操作されたシグナル伝達経路、例えば、キナーゼ活性を介して入力を増幅する経路などが挙げられる。一実施形態では、合成生物学的回路は、標的分析物に応答して無細胞反応体積中のレポーター分子のレベルを修飾する。一実施形態では、合成生物学的回路は、無細胞反応体積中のレポーター分子を生成または消費する酵素の発現および／または活性を調節する。
【００３５】
本明細書では、「合成遺伝子ネットワーク」または「合成遺伝子回路」または「遺伝子回路」は、少なくとも１つの核酸物質または構築物を含み、特に限定されないが、検知、論理機能、および／または調節機能を含めた機能を実行できる、操作された組成物を指すのに互換的に使用される。核酸物質または構築物は、天然のものまたは合成のものであり得る。核酸物質または構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその人工核酸類似体を含み得る。少なくとも２つの核酸物質または構築物を含む合成遺伝子ネットワークのいくつかの実施形態では、核酸物質または構築物が互いに直接的または間接的に相互作用し得る。間接的な相互作用は、その相互作用に他の分子が必要とされるか、介在することを意味する。合成遺伝子ネットワークのいくつかの例は、プロモーターと作動可能に連結された核酸を含む。一実施形態では、遺伝子回路または遺伝子ネットワークは、足がかり配列スイッチなどのリボレギュレーターを含む。
【００３６】
一態様では、試料中の標的分析物に応答してレポーター分子を生じさせる方法が提供される。好ましくは、レポーター分子は、グルコースモニターなどの容易に入手可能なセンサーを用いて検出できる、グルコースなどの分子である。一実施形態では、この方法は、試料と無細胞系の合成生物学的回路とを接触させることを含み、標的分析物が合成生物学的回路を活性化して、無細胞系反応体積中のレポーター分子のレベルを修飾する。
【００３７】
一実施形態では、標的分析物が合成生物学的回路を活性化して、無細胞系反応体積中のレポーター分子のレベルを上昇させる。別の実施形態では、標的分析物が合成生物学的回路を活性化して、無細胞系反応体積中のレポーター分子のレベルを低下させる。例えば、標的分析物が合成生物学的回路を活性化して、ポリマー糖を分解することによってグルコースのレベルを上昇させる酵素を生じさせ得る。
【００３８】
本明細書に記載される方法を用いて、様々な異なる標的分析物を検出できる。一実施形態では、標的分析物は金属などの無機分子である。別の実施形態では、標的分析物は有機分子、任意選択で生体分子である。様々な無機または有機標的によって活性化される合成生物学的回路は当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される方法およびキットに使用するのに容易に適合させ得る。例えば、Ｒｏｅｌｏｆ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  ＭｅｅｒおよびＢｅｌｋｉｎ（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１０，Ｊｕｌｌ  ８（７）５１１−５２２）、Ｚｈｏｕら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２０１７，１１７（１２），ｐｐ  ８２７２−８３２５）、ならびにＷｅｄｅｋｉｎｄら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９２，９４４１−９４５０  Ｊｕｎｅ  ９，２０１７）にこのような回路が記載されており、上記文献はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
一実施形態では、標的分析物は生体分子、例えば核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、タンパク質、脂質、代謝産物、または糖分子である。核酸は、特定の生物体および／または表現型に関連する核酸またはバリアントであり得る。一実施形態では、標的分析物は、微生物病原体、任意選択でウイルスまたは細菌に関連する核酸分子である。したがって、本明細書に記載される方法およびキットを特定の微生物の検出に、任意選択で診断目的に使用し得る。例えば、一実施形態では、標的分析物は、微生物の薬物耐性に関連する核酸分子である。一実施形態では、本明細書に記載される方法およびキットをチフスまたはパラチフスなどの腸炎熱の検出に使用し得る。例えば、実施例４および図１１に示すように、グルコース生成のためのトレハラーゼ酵素の産生を活性化するよう構成された足がかり配列スイッチにより、チフス、パラチフスＡ、またはパラチフスＢ由来のＲＮＡ標的を検出することができた。
【００４０】
一実施形態では、試料は対象由来のものであり、標的分析物は既知の表現型に関連するバイオマーカーである。例えば、バイオマーカーは、疾患、または特定の治療法もしくは化学療法剤に対する応答性に関連するものであり得る。本明細書に記載される方法および製品を用い、任意選択でグルコースメーターなどの安価な携帯機器を用いて、ポイントオブケアで患者のバイオマーカーデータを作成し得る。
【００４１】
上記のものに代えて、またはこれに加えて、本明細書に記載される合成生物学的回路を用い、金属（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｈｇ）、爆発物、除草剤（例えば、アトラジン）、汚染物質、および／または毒素に応答してレポーター分子を生じさせ得る。次いで、グルコースメーターなどの安価な携帯機器を用いて、レポーター分子を検出し得る。図１７に、Ｔｎ２１プロモーターを有し、水銀の不在下ではＭｅｒＲ抑制因子がＴｎ２１プロモーターと結合してこれを隔離する遺伝子回路を用いて水銀を検出するための例示的ワークフローを示す。Ｔｎ２１−ＭｅｒＲ遺伝子調節系がグルコース産生のためのトレハラーゼ酵素と作動可能に連結されており、次いで、グルコースメーターを用いてグルコースを検出できる。
【００４２】
合成生物学的回路との接触前または接触時に試料に様々な処理を実施し得る。一実施形態では、処理により試料中の標的分析物の濃度が増大する。上記のものに代えて、またはこれに加えて、標的分析物の検出を容易にするため、試料を処理して１つまたは複数の汚染物質を除去する、または試料を希釈することができる。一実施形態では、標的分析物は核酸分子であり、この方法は試料中の核酸分子を増幅することを含む。例えば、一実施形態では、この方法は、合成生物学的回路との接触前または接触時に標的ＤＮＡ分子または標的ＲＮＡ分子の等温増幅を含む。
【００４３】
一実施形態では、本明細書に記載される方法およびキットは、合成生物学的回路を用いて１つまたは複数の標的分析物を検出する前に、試料を処理する段階および／または試薬を含む。一実施形態では、試料から核酸分子を抽出する。様々な核酸抽出方法を本明細書に記載される実施形態と組み合わせて用い得る。実施例に示すように、セルロース系の紙などの付着性基質を用いて、溶解細胞の試料などの試料から核酸を捕捉できる。任意選択で、次いで、洗浄段階の間、核酸分子を基質上に保持すると同時に、試料中に存在する汚染物質を除去する。
【００４４】
当該技術分野で公知の様々な技術を用いて、試料中の核酸分子を増幅し得る。このような技術としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、インベーダーアッセイ、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、シグナル媒介ＲＮＡ増幅技術（ＳＭＡＲＴ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ニッキングエンドヌクレアーゼシグナル増幅（ＮＥＳＡ）およびニッキングエンドヌクレアーゼ支援ナノ粒子活性化（ＮＥＮＮＡ）、エキソヌクレアーゼ支援標的リサイクリング、ジャンクションまたはＹ−プローブ、分割ＤＮＡザイムおよびデオキシリボザイム増幅戦略、増幅シグナルを生じさせる鋳型指向性化学反応、非共有結合ＤＮＡ触媒反応、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）、ならびに超分子構造を生じるＤＮＡプローブの自己集合を介する検出が挙げられる。
【００４５】
本開示の一態様では、標的分析物の存在に応答してグルコースなどのレポーター分子のレベルを修飾するよう合成生物学的回路を構築する。一実施形態では、合成生物学的回路は、無細胞系のレポーター分子のレベルを修飾する酵素の発現、レベル、または活性を調節する。合成生物学的回路は任意選択で、酵素の転写もしくは翻訳を調節することによって、または酵素の翻訳後調節によって、例えば小分子制御インテインを用いることなどによって作動し得る。
【００４６】
一実施形態では、合成生物学的回路は遺伝子回路である。一実施形態では、遺伝子回路は、発現が無細胞系のグルコースなどのレポーター分子のレベルを修飾する１つまたは複数の酵素をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含む、ＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、遺伝子回路は、１つもしくは複数の酵素をコードするＤＮＡ分子の転写、または１つもしくは複数の酵素をコードする１つもしくは複数のｍＲＮＡ分子の翻訳を調節する。任意選択で、２つ以上の合成生物学的回路が、グルコースのレベルを修飾する２つ以上の酵素の発現を調節する。一実施形態では、２つ以上の酵素は、例えば異なる基質に作用することによって、異なる速度でグルコースのレベルを修飾する。
【００４７】
一実施形態では、遺伝子回路は、１つまたは複数の転写活性化因子または転写抑制因子を含む。一実施形態では、遺伝子回路は、酵素をコードするｍＲＮＡ分子の翻訳を制御するリボレギュレーターを含む。一実施形態では、リボレギュレーターは足がかり配列スイッチである。例えば、一実施形態では、標的分析物は、足がかり配列スイッチのトリガーであるため、標的分析物と足がかり配列スイッチが結合すると、遺伝子回路内の酵素をコードするｍＲＮＡが翻訳される。当業者であれば、様々な標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の足がかり配列スイッチを容易に設計できるであろう。
【００４８】
一実施形態では、無細胞系は、生物学的回路の活性に応答してレポーター分子のレベルを修飾する、１つまたは複数の基質を含む。例えば、一実施形態では、無細胞系は、グルコース、または合成生物学的回路の制御下で酵素が作用してグルコースを生成する基質を含む。
【００４９】
一実施形態では、基質は、１つまたは複数のグルコースモノマーを含む、オリゴ糖または多糖を含む。本明細書に記載される合成生物学的回路に使用するのに適した酵素と基質の例示的組合せを図１Ｂに示す。
【００５０】
本明細書に記載される方法および製品を用いて、標的分析物の有無に関する情報が望まれる任意の試料を分析し得る。一実施形態では、試料は体液、任意選択で、血液、尿、脳脊髄液、または唾液である。一実施形態では、試料は、組織試料などの患者試料である。別の実施形態では、試料は環境試料、任意選択で水試料である。一実施形態では、試料は食品試料である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、試料と無細胞系の合成生物学的回路とを接触させる前に試料を処理する。一実施形態では、試料を処理することは、試料を緩衝液／希釈液、および／または無ヌクレアーゼ水で希釈することを含む。一実施形態では、試料を処理して、試料中のグルコースの濃度を正常化または低下させる。試料を処理して、無細胞系および／またはレポーター分子の検出に干渉する汚染物質を除去するか、そのレベルを低下させてもよい。一実施形態では、試料を処理して、標的分析物の相対濃度を増大させる。上記のものに代えて、またはこれに加えて、試料を加熱、冷却、および／または凍結することなどによって、試料に熱処理を実施してもよい。一実施形態では、試料を加熱して、試料中に含まれる細胞を溶解させ、かつ／あるいは無細胞系および／または合成生物学的回路の作動に干渉する可能性のある天然の酵素などの内因性タンパク質を変性させる。
【００５２】
一実施形態では、試料と合成生物学的回路とを接触させる前に、試料を処理して、試料中のグルコースなどのレポーター分子のレベルを正常化および／または低下させ得る。一実施形態では、試料の処理が、標的分析物の検出に歪みを生じさせ得るレポーター分子（グルコースまたは天然の血糖など）または酵素を含んでいる可能性のある試料供給源の影響を制御するのに役立つ。
【００５３】
一実施形態では、試料を希釈液または緩衝液で希釈して、試料中のレポーター分子のレベルを低下させる。一実施形態では、希釈液または緩衝液は界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤はＴｗｅｅｎ−２０である。一実施形態では、試料を希釈することにより、高い糖尿病レベルのグルコースでも本明細書に記載される方法の閾値未満になり得る。例えば、正常なグルコースレベルは７．８〜１６．７ｍＭであるが、極度の高血糖で一時的に２８ｍＭを超えることがある。試料を例えば１０倍希釈すれば、グルコースレベルが０．８ｍＭ〜２．８ｍＭになり、いくつかの実施形態では、このことが本明細書に記載される方法の使用に支障を来すことはないものと予想される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、試料に追加の処理段階を実施して、グルコースを減少させ、除去し、隔離し、かつ／またはそのレベルを正常化させ得る。例えば、グルコース結合レクチンを用いて、試料からグルコースおよび／または血糖を隔離し得る。一実施形態では、グルコースを不活性物質に変換し得る酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ）を添加することによって、試料からグルコースを除去し得る。この工程は、入ってくるグルコースを失活させるよう添加し調整する補因子（例えば、ＮＡＤ）の量によって制限され得る。
【００５５】
一実施形態では、この方法は、試料を所定量のＧＤＨおよび／またはＮＡＤで処理して、試料から所定量のグルコース、例えば特定の試料のタイプにみられる平均量のグルコースを除去することを含む。
【００５６】
一実施形態では、無細胞系は、本明細書に記載される合成生物学的回路と、転写および翻訳のための酵素と、リボソームと、ｄＮＴＰと、ｔＲＮＡと、アミノ酸とを含む。無細胞系は任意選択で、ＲＮアーゼ阻害剤、緩衝剤、１つもしくは複数の補因子、凍結保護物質、および界面活性剤、任意選択でＴｗｅｅｎ−２０のうちの１つまたは複数のものをさらに含む。一実施形態では、無細胞系はまた、発現および／または活性が合成生物学的回路によって調節される酵素に対する基質を含む。例えば、一実施形態では、無細胞系は、所定量の図１Ｂに示すグルコースまたは基質を含む。一実施形態では、基質は、酵素が作用してグルコースを生成する基質、例えば、１つまたは複数のグルコースモノマーを含むオリゴ糖または多糖などである。
【００５７】
本明細書に記載される方法の前に、またはその一環として、無細胞系の成分を凍結乾燥させ、再水和し得る。例えば、一実施形態では、無細胞系を凍結乾燥させ、試料、緩衝液、および／または希釈液との接触によって再水和する。
【００５８】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、合成生物学的回路によってレベルが修飾されるグルコースなどのレポーター分子を検出することを含む。一実施形態では、レポーター分子の有無の検出が試料中の標的分析物の有無の指標となる。一実施形態では、この方法は、無細胞反応体積中のグルコースのレベルを検出することを含む。
【００５９】
一実施形態では、無細胞反応体積中のグルコースのレベルが試料中の標的分析物のレベルの指標となる。一実施形態では、無細胞反応体積中のグルコースのレベルが、複数の反応で検出される複数の標的分子の有無の指標となる。一実施形態では、複数の時点で無細胞反応体積中のグルコースのレベルを求める。
【００６０】
グルコースメーターは、広範囲にわたるグルコースレベルを測定できるものであるが、従来、単に単一の読取り値（ｍｇ／ｄＬで表したグルコース）を得るのに用いられてきた。本明細書に記載される方法およびキットは、グルコースメーターのこの広いダイナミックレンジを利用して、多重出力に対する帯域を生じさせるものである。このことは、動力学の異なる酵素を選択し、基質濃度を制御することによって実施できる。各合成生物学的回路に対して重複しないグルコース産生量を設定することにより、単一の読取り数値で多重診断が可能となる。一実施形態では、多重システムの各センサーが、オリゴマーグルコース基質をグルコースメーターによって検出できるモノマーグルコースに変換する固有のレポーター酵素を産生する。動力学の異なる酵素を選択し、基質の濃度、鋳型ＤＮＡ、およびその他の分子的／生化学的パラメータを調整することによって、得られるグルコース産生量を制御できる。一実施形態では、付加的なグルコース産生を用いてどのセンサーが活性化されたかを容易に判定できるように、センサー出力を重複しないよう設計する。
【００６１】
一実施形態では、無細胞反応体積中のグルコースを検出する前に、試料を所定の長さの時間にわたって無細胞系の合成生物学的回路と接触させるか、インキュベートする。一実施形態では、試料を少なくとも５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、または４５分間にわたって、無細胞系の合成生物学的回路と接触させるか、インキュベートする。一実施形態では、試料を３０〜１８０分間、任意選択で３０〜９０分間または６０〜９０分間にわたって、無細胞系の合成生物学的回路と接触させるか、インキュベートする。
【００６２】
一実施形態では、この方法は、グルコースを検出する前に無細胞系反応体積に緩衝液を添加することを含む。一実施形態では、緩衝液は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含み、ｐＨが約７．３である、組成物である。一実施形態では、緩衝液は、Ｔｗｅｅｎ−２０、任意選択で約０．０１２５％のＴｗｅｅｎ−２０または０．０１％〜０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含むか、これよりなるものである。
【００６３】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、グルコースメーターを用いて、任意選択でグルコース試験紙を用いて、グルコースのレベルを検出することを含む。一実施形態では、この方法は、無細胞反応体積またはその一部をグルコース試験紙と接触させることを含む。
【００６４】
実施例３で示すように、本明細書に記載される合成生物学的回路を２つ以上用いて、単一反応体積中の複数の標的分析物を検出できる。一実施形態では、この方法は、試料と無細胞系の複数の合成生物学的回路とを接触させることを含み、異なる標的分析物が各合成生物学的回路を活性化して、無細胞反応体積中のレポーター分子のレベルを修飾する。一実施形態では、複数の合成生物学的回路のそれぞれが、異なる基質と酵素を用いてグルコースを生成する。一実施形態では、無細胞系の複数の合成生物学的回路によって生成されるレポーター分子の速度および／またはレベルの差によって、複数の異なる標的分析物を単一の反応で多重検出することが可能になる。
【００６５】
図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、本明細書に記載される方法およびキットは、例えば異なる速度でグルコースを産生する２つの別個の酵素を用いて、または図１０Ｃに示すように、各標的が異なる速度で産生を活性化する単一の酵素を用いて多重化するのに有用である。
【００６６】
本明細書に記載される方法は任意選択で、無細胞系反応体積中に検出されたグルコースのレベルを１つまたは複数の対照レベルと比較することを含む。一実施形態では、対照レベルは、同様の条件下で試験した対照試料中の標的分析物の所定レベルを示すものである。一実施形態では、この方法は、無細胞系反応体積中に検出されたグルコースのレベルを１つまたは複数の対照レベルと比較することを含み、各対照レベルは、試料中の１つまたは複数の標的分析物の有無を示すものである。
【００６７】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、試料中の１つまたは複数の標的分析物の有無を示すデータを使用者に提示することを含む。例えば、データは、試料中の１つまたは複数の標的分析物のレベルを示すものであり得る。一実施形態では、データは、試料中の標的分析物の存在に関連する表現型またはその他の状態を示すものであり得る。
【００６８】
この説明の別の態様では、試料中の標的分析物に応答してレポーター分子を生成または消費する合成生物学的回路を含む無細胞系を含む、キットが提供される。一実施形態では、レポーター分子はグルコースである。別の実施形態では、レポーター分子はケトンである。一実施形態では、キットは、特に限定されないが、無細胞系の試薬または標的分析物の濃度を増大させる試薬などの試薬を含む。一実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法を実施する試薬を含む。
【００６９】
一実施形態では、キットは、試料を入れ、試料と無細胞系とを接触させる容器を含む。一実施形態では、容器は蓋と受口とを含む。容器は任意選択で、容器内の無細胞反応体積がグルコース試験紙と接触するようにグルコース試験紙を入れるのに適合している。一実施形態では、容器は、無細胞系の入ったチャンバを含む。例えば、一実施形態では、チャンバは蓋の中に位置している。無細胞系は任意選択で、凍結乾燥され、容器内に位置していてよい。一実施形態では、無細胞系に紙またはその他の不活性材料などの基質が付随する。
【００７０】
一実施形態では、キットは、本明細書に記載されるワークフローに有用な複数の容器を含む。例えば、一実施形態では、キットは、試料を入れ、付着性基質上に核酸を抽出するのに適した第一の容器を含む。一実施形態では、キットは、付着性基質を洗浄して不純物を除去するのに適した第二の容器を含む。一実施形態では、キットは、試料と合成生物学的回路とを接触させる前に、基質上に捕捉された核酸分子を溶離させ、任意選択で試料中の核酸分子を増幅するのに適した第三の容器を含む。一実施形態では、付着性基質は、３つの容器のうちの１つまたは複数のものに適合するよう構成された蓋またはキャップに固定されている。これにより、試料を合成生物学的回路と接触させる前に処理および／または増幅するため、標的分析物を含有する試料を異なる容器間で移動させることが容易になる。
【００７１】
一実施形態では、キットは、試料から標的分析物を抽出および／または洗浄する試薬を含む。一実施形態では、キットは、細胞を溶解させて核酸を抽出するのに適した抽出緩衝液を含む。一実施形態では、キットは、核酸分子の試料から不純物を除去するのに適した洗浄緩衝液を含む。
【００７２】
一実施形態では、標的分析物は核酸分子であり、キットは、核酸分子の濃度を増大させる試薬を含む。一実施形態では、キットは、核酸分子を等温増幅する試薬を含む。任意選択で、標的分析物の濃度を増大させる試薬を容器内の無細胞系と組み合わせるか、または容器の内部もしくは外部に別個に提供する。
【００７３】
一実施形態では、合成生物学的回路は遺伝子回路である。例えば、一実施形態では、遺伝子回路は、発現が無細胞系のレポーター分子を生成または消費する１つまたは複数の酵素をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含む、ＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、遺伝子回路は、発現が無細胞系のレポーター分子を生成または消費する酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳を制御する、リボレギュレーターを含む。一実施形態では、リボレギュレーターは足がかり配列スイッチである。一実施形態では、レポーター分子はグルコースである。
【００７４】
一実施形態では、キットの無細胞系は、グルコース、または酵素が作用してグルコースを生成する基質を含む。例えば、一実施形態では、無細胞系は、所定量の図１Ｂに示すグルコースまたは基質を含む。一実施形態では、基質に酵素が作用してグルコースを生成するもの、例えば、１つまたは複数のグルコースモノマーを含むオリゴ糖または多糖などである。
【００７５】
一実施形態では、キットは、試料と無細胞系とを接触させる前に試料を処理する試薬を含む。一実施形態では、キットは、試料を処理して試料から内因性グルコースおよび／または血糖を除去および／または隔離する試薬を含む。例えば、一実施形態では、キットは、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびＮＡＤ、任意選択で、所定量のＧＤＨおよび／またはＮＡＤを含む。一実施形態では、キットは、試料中のグルコースおよび／または血糖を隔離するレクチンを含む。一実施形態では、試料を処理して試料から内因性グルコースおよび／または血糖を除去および／または隔離する試薬は、無細胞系から分離してキットに提供される。
【００７６】
一実施形態では、キットは希釈液または緩衝液を含む。一実施形態では、希釈液または緩衝液を用いて、試料を希釈し、かつ／または無細胞系を再水和し得る。一実施形態では、希釈液または緩衝液は、無ヌクレアーゼ水および／または界面活性剤、任意選択でＴｗｅｅｎ−２０を含む。一実施形態では、希釈液または緩衝液は、無細胞系と分離した容器内に提供される。使用時、試料および希釈液または緩衝液を無細胞系と接触させて、標的分子に応答して合成生物学的回路を活性化し得る。
【００７７】
一実施形態では、無細胞系は、本明細書に記載される合成生物学的回路、転写および翻訳のための酵素、リボソーム、ｄＮＴＰ、ｔＲＮＡ、およびアミノ酸を含む。無細胞系は任意選択で、ＲＮアーゼ阻害剤、緩衝剤、１つもしくは複数の補因子、凍結保護物質、および／または界面活性剤、任意選択でＴｗｅｅｎ−２０をさらに含む。一実施形態では、無細胞系は、発現および／または活性が合成生物学的回路によって調節される酵素に対する基質、例えば図１Ｂに示す基質などを含む。
【００７８】
一実施形態では、キットは、異なる標的分析物によって活性化される複数の異なる合成生物学的回路を含む。例えば、異なる標的分析物または標的分析物の組合せを検出するための異なるキットを単独で、または組み合わせて提供し得る。
【００７９】
一実施形態では、キットは、無細胞反応体積中のレポーター分子を検出するのに適した装置および／または試薬を含む。例えば、一実施形態では、キットは、グルコースメーターと、任意選択で１つまたは複数のグルコース試験紙とを含む。
【００８０】
実施例１：無細胞系での標的分析物に応答したグルコース産生への合成生物学的回路の使用。
合成生物学的回路を用いて、無細胞反応で標的分析物に応答してグルコースが生成することを示すため、一連の実験を実施した。いずれの実験でも、市販の血糖メーターおよび付属の試験紙（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてグルコースを検出した。
【００８１】
特に生体試料の分析では、試料中の内因性のグルコースのレベルがレポーター分子であるグルコースの使用に干渉する可能性があると思われた。図３に示すように、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を用い、補因子ＮＡＤを漸増させて、試料中のグルコースの減少を制御することが可能である。したがって、無細胞系を用いて分析する前に、ＧＤＨおよびＮＡＤを用いて試料を処理して、グルコースのレベルを低下または正常化させ得る。
【００８２】
次に、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社が販売し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの転写／翻訳に必要な成分が精製され再構築されて含まれているＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）無細胞系を用いて、実験を実施した。トレハラーゼ酵素をコードするＤＮＡと作動可能に連結されたＴ７プロモーター（イタリック体）および足がかり配列スイッチＧ（下線部）を有する組換え構築物「足がかり配列スイッチＧ」を作製した（配列番号１）：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＣＴＴＡＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＴＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＡＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＧＧＡＴＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＡＧＣＧＧＧＴＴＡＡＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＡＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＴＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＧＣＣＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＴＴＧＴＣＡＧＣＧＡＴＡＣＣＴＣＧＣＧＣＣＣＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＣＣＣＣＴＡＴＧＴＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＣＧＧＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＴＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴＡＴＧＧＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＧＣＴＴＴＡＴＴＣＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＡＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＧＣＡＴＴＴＧＣＣＧＣＡＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧＧＣＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡＡＴＣＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＴＡＴＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＴＣＣＴＴＣＣＧＣＧＡＡＧＡＣＴＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＣＣＡＴＡＴＴＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＡＡＴＣＣＧＧＣＴＧＧＧＡＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＧＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＣＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＴＡＴＴＴＡＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＡＣＧＣＡＴＴＡＣＴＡＣＣＡＡＴＴＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＧＡＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴＴＴＣＣＡＣＧＡＴＴＡＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＧＣＣＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＴＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＴＡＣＣＣＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＣＧＣＡＴＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＣＴＧＧＣＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＡＣＧＣＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＴＴＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＧＡＣＣＡＡＣＧＧＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＣＴＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＧＴＡＣＡＣＣＣＴＡＡ（配列番号１）。
【００８３】
足がかり配列スイッチＧは、下のＲＮＡトリガー配列Ｇ（配列番号２）：
ＧＧＧＵＧＡＵＧＧＧＡＣＡＵＵＣＣＧＡＵＧＵＣＣＣＡＵＣＡＡＵＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＡＡＵＧＧＵＡＡＧＵＡＧＵＡＡＵＡＧＡＵＡＡＧ（配列番号２）
によって活性化される。
【００８４】
図４〜６に示すように、異なるレポーター酵素を合成生物学的回路からの出力として使用することによって、異なる濃度のグルコースを生じさせることができる。この特徴を用いて、単一の反応体積およびグルコース測定で異なる合成生物学的回路の活性を識別する（異なる分析物を検知する）ことができる（図４）。同様に、ＤＮＡ鋳型および酵素基質の濃度を制御して、レポーター酵素からのグルコース産生量を調整できる（図５および６）。さらに、図７に示すように、無細胞系および足がかり配列スイッチＧを用いた模擬診断では、標的分析物（ＲＮＡトリガー配列Ｇ）に応答してグルコースが産生され、携帯型血糖メーターを用いて容易に検出された。
【００８５】
実施例２：足がかり配列スイッチを用いた無細胞系でのラクターゼ発現の調節
表１に示すように、ラクターゼ発現を制御する足がかり配列スイッチを用いた反応テンプレートに従い、一連の無細胞反応を組み立てた。
【００８６】
【表１】
2021506315.tif 000003
2021506315.tif 000004
足がかり配列スイッチの制御下にあるラクターゼ（β−ガラクトシダーゼまたはＬａｃＺとしても知られる）を用いた無細胞系のｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘおよび個々の反応の組立て。体積はマイクロリットル。
【００８７】
ラクターゼレポーター酵素をコードするＤＮＡと作動可能に連結されたＴ７プロモーター（イタリック体）および足がかり配列スイッチＥ（下線部）を有する組換え構築物「足がかり配列スイッチＥ」を作製した（配列番号３）：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＴＡＡＡＣＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＴＡＣＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＴＴＡＣＧＧＴＣＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣＡＣＧＧＡＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＴＴＡＣＴＣＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＧＣＧＴＴＡＡＣＴＣＧＧＣＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＧＣＡＡＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＴＴＧＣＣＧＴＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＴＴＴＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＣＧＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＧＧＡＴＡＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＣＧＴＧＡＣＧＴＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＧＣＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＡＣＣＴＡＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＧＣＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＧＡＴＣＧＣＧＴＣＡＣＡＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＧＣＧＣＣＧＡＡＡＴＣＣＣＧＡＡＴＣＴＣＴＡＴＣＧＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＧＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＣＧＡＴＧＴＣＧＧＴＴＴＣＣＧＣＧＡＧＧＴＧＣＧＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＣＧＡＧＧＣＧＴＴＡＡＣＣＧＴＣＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＡＣＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＴＡＡＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＴＧＴＴＣＧＣＡＴＴＡＴＣＣＧＡＡＣＣＡＴＣＣＧＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡＣＧＣＴＧＴＧＣＧＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＡＡＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＡＧＣＧＡＡＣＧＣＧＴＡＡＣＧＣＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＴＣＧＴＡＡＴＣＡＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＴＡＡＴＣＡＣＧＡＣＧＣＧＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＴＣＧＡＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＧＣＣＣＧＡＴＧＴＡＣＧＣＧＣＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＴＧＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＧＣＧＣＣＣＧＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＧＡＡＴＡＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＴＧＧＣＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＡＡＴＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＴＡＣＡＧＧＧＣＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＴＣＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＣＣＣＧＴＧＧＴＣＧＧＣＴＴＡＣＧＧＣＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＡＣＧＧＴＣＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＣＣＡＴＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＡＧＣＧＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＣＡＧＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＣＧＣＧＴＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＡＡＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＣＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＧＣＧＴＴＧＧＣＡＡＴＴＴＡＡＣＣＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＧＡＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＧＴＧＣＡＣＣＧＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＣＡＴＴＧＧＣＧＴＡＡＧＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＡＡＣＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＡＧＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧＴＧＣＡＣＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＡＣＧＡＣＣＧＣＴＣＡＣＧＣＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＣＧＧＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＧＡＴＴＡＣＣＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＧＣＧＡＴＡＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＧＡＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣＧＧＡＴＴＡＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＧＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＡＣＣＣＣＧＴＡＣＧＴＣＴＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＧＧＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＴＡＴＣＧＡＣＧＧＴＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＣＧＣＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡ（配列番号３）。
【００８８】
足がかり配列スイッチＥは、下のＲＮＡトリガー配列Ｅ（配列番号４）：
ＧＧＧＡＣＡＧＡＵＣＣＡＣＵＧＡＧＧＣＧＵＧＧＡＵＣＵＧＵＧＡＡＣＡＣＵＡＡＡＣＵＡＡＡＣＧＡＣＡＡＵＧＵＡＡＵＣＡＡＡＣＵＡＡＣ（配列番号４）
によって活性化される。
【００８９】
図８に示すように、無細胞系および足がかり配列スイッチＥを用いた模擬診断反応では、標的分析物（ＲＮＡトリガー配列Ｅ）に応答してグルコースが産生され、携帯型血糖メーターを用いて容易に検出された。
【００９０】
実施例３：単一反応体積中の標的分析物の多重検出
２つの異なる足がかり配列スイッチを含有する共通の反応混合物を組み立て、レプリケートに等分した。次いで、最初の組の三重反復反応をトリガーを加えずにインキュベートし、データをバックグラウンドシグナルに対して正規化するのに用いた。図１０Ａに示されるように、次の組の三重反復反応にトリガーＥ  ＲＮＡを加えたところ、グルコースがわずかであるが、有意に増大した。三組目の三重反復反応にトリガーＧ  ＲＮＡを加えたところ、さらに大きく明確な量のグルコースが産生された。
【００９１】
したがって、２つの異なる遺伝子回路を有する単一の反応を用いて２つ以上の標的分析物を識別できる。これは、存在するＲＮＡ入力に応じたグルコース出力のある単一の反応を用いて２つ以上の病原体／分析物を識別する模擬診断応用を示している。
【００９２】
図１０Ｂに、２つの異なるグルコース生成酵素を用いた２つの異なる標的ＲＮＡ配列の多重検出を特徴付けるために実施した同様の実験の結果を示す。各標的が異なる酵素の産生を活性化し、各酵素が異なる量のグルコースを生成する。標的Ａはラクターゼの産生を誘発し、標的Ｂはトレハラーゼの産生を誘発する。いずれの反応にも全足がかり配列スイッチが存在し、唯一の差は添加する標的であった。図１０Ｂの値は、標的が存在しない対照反応を測定することによって求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。試料を３７℃で１時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
【００９３】
図１０Ｃに、多重反応で２つの異なる標的の検出に各標的に対して異なる酵素ではなく単一の酵素（トレハラーゼ）を用いて得られた結果を示す。各標的は同じ酵素の産生を活性化するが、足がかり配列スイッチの動力学の差によりその速度が異なる。これにより、存在する標的（１つまたは複数）に応じてグルコースの産生速度が異なり、両方が存在する場合はシグナルがさらに強くなる。いずれの反応にも全足がかり配列スイッチが存在し、唯一の差は添加する標的（１つまたは複数）であった。値は、標的が存在しない対照反応を測定することによって求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。試料を３７℃で１時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。図１０Ｃに示されるように、標的Ａ、標的Ｂ、または標的Ａ＋Ｂを含有する試料が容易に識別された。
【００９４】
実施例４：チフスおよびパラチフス標的の検出への合成生物学的回路の使用
チフス、パラチフスＡ、およびパラチフスＢ由来のＲＮＡ配列を検出する足がかり配列スイッチをそれぞれ設計した。いずれの足がかり配列スイッチも、グルコースを生成するトレハラーゼ酵素の産生を活性化するよう構成した。図１１に、スイッチＤＮＡ濃度および基質を最適化して、発生シグナルを増強し差を分かりやすくする前の予備データを示すが、３つのいずれの場合にも明白な増大がみられる。図１１に示されるデータは、各反応に足がかり配列スイッチが１つだけ存在するものであったため、多重化実験ではない。値は、標的が存在しない対照反応を測定することによって求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。試料を３７℃で１時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
【００９５】
実施例５：グルコースメーターが介在する診断ワークフロー
図１２に、グルコースメーターが介在する例示的診断ワークフロー（これに限定されない）を示す。提案するワークフローの全般的過程は、段階１−試料採取、段階２−ＲＮＡ抽出、段階３−等温増幅、段階４−標的ＲＮＡの存在下でグルコースを産生する標的特異的センサーと組み合わせた無細胞反応、段階５−グルコースメーターでの試料分析、および段階６−特注ソフトウェアでの結果の解釈の６段階に従う。本明細書に記載される方法の好ましい実施形態は、図１２に示す段階のうち１つまたは複数のものを含み得るものであり、諸段階の任意選択の詳細については以下に示す。
【００９６】
段階１：試料採取
試料は患者血液試料またはその他の生体試料であり得る。
【００９７】
段階２：ＲＮＡ抽出
ａ）紙による抽出またはｂ）磁気ビーズ抽出などの様々なＲＮＡ抽出方法を用いることができる。
【００９８】
紙による抽出では、紙または膜をチューブのキャップの内側に接着剤またはロウを用いて接着させる。試料に溶解緩衝液を加えて最終濃度を１×とする。チューブを反転させ、キャップを抽出物とともに１分間インキュベートした後、キャップを洗浄緩衝液の入った別のチューブに移し、１分間、連続的に反転させる。最後に、キャップを等温反応混合物の入った別のチューブに移す。チューブを反転させ、混合物とさらに１分間インキュベートして、ＲＮＡを溶出させる。
【００９９】
磁気ビーズ抽出では、紙による抽出方法と同様に、試料に溶解緩衝液を加えて最終濃度を１×とする。次いで、磁気ビーズを含有する溶液を試料に加え、均一になるまでかき混ぜる。磁石を用いて磁気ビーズおよびそれに結合した核酸をチューブの側面に集め、溶解廃棄物を除去する。これに続く洗浄段階を同様にして進め、チューブに洗浄緩衝液を加え、チューブを振盪して混合物をホモジナイズし、磁石を用いて再び磁気ビーズをチューブの側面に集める。最後の段階として、ＲＮＡをビーズから水中に、または等温増幅反応混合物中に直接、溶出させる。
【０１００】
段階３）等温増幅反応
検出しようとする標的が最初の試料中に低濃度で存在する場合、標的ＲＮＡをセンサーに適合するレベルまで増幅することが必要となり得る。これは、ＮＡＳＢＡなどの等温増幅法またはほぼ等温の増幅方法を用いて実施する。スマートフォンで制御する恒温器内で反応インキュベーションを実施し得る。
【０１０１】
段階４）無細胞反応
次いで、増幅したＲＮＡを直接、標的ＲＮＡが認識されたときだけ有意水準のトレハラーゼを発現するよう設計したセンサーを含有する無細胞反応に加え得る。次いで、トレハラーゼが（反応に添加した）トレハロースからグルコースモノマーへの分解を触媒する。スマートフォンで制御する恒温器内で反応インキュベーションを実施し得る。
【０１０２】
段階５）グルコースメーター
次いで、無細胞反応をグルコース試験紙で試験してよく、陽性試料であれば、グルコースメーターによる読取りが可能なグルコースレベルの有意な上昇がみられることが予想される。
【０１０３】
段階６）分析結果
スマートフォンアプリを用いてグルコースメーターのデータを解釈し（任意選択で、家庭医または公衆衛生監視プログラムに＋／−匿名で転送し）得る。これは任意選択で、段階３）および４）で使用する恒温器を制御するものと同じアプリである。
【０１０４】
実施例７：Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  Ｃａｐ  Ｐａｐｅｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＲｅＣａｐ）または磁気ビーズを用いた核酸抽出。
紙または膜を用いて試料から核酸を捕捉することを検討する実験を実施した。Ｚｏｕら（２０１７）（参照により本明細書に組み込まれる）は既に、核酸精製へのセルロース紙の使用について記載している。
【０１０５】
チューブのキャップに紙を接着し、最初の溶解段階で核酸を捕捉する。次いで、捕捉された核酸を有するキャップを、血液試料由来の残留グルコースを含めた下流の反応を阻害する可能性のある物質を除去する洗浄チューブに移す。最終段階では核酸を増幅反応物中に溶出させる。
【０１０６】
また、磁気抽出を用いて試料から核酸を捕捉することを検討する実験を実施した。
【０１０７】
材料および試薬
溶解段階では、緩衝液を最終濃度１×で使用した。４×緩衝液では、溶解段階でさらに多くの試料を加えることが可能になる。
【０１０８】
【表２】
2021506315.tif 000005
2021506315.tif 000006
ＲｅＣａｐおよび磁気ビーズ抽出用の緩衝液：Ａ）およびＢ）に、溶解に使用する抽出緩衝液＃３の異なる組成を挙げる。Ｃ）に洗浄緩衝液の組成を挙げる。これらの緩衝液はＲｅＣａｐ抽出および磁気ビーズによる抽出の両方に使用されることに留意されたい。ＲＮＡ抽出には、０．５％ｖ／ｖのマウスＲＮアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）を含有するよう緩衝液を改変した。
【０１０９】
ＲｅＣａｐの製作
ばらけた紙ディスクまたは試験紙の形で紙を用いる代わりに、キャップの内側に紙を接着させたチューブを用いた。Ｗｈａｔｍａｎフィルター紙およびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜の両方を用いてこの方法を試験し、紙／膜を接着させるのにともに熱接着剤およびパラフィンロウを用いた。この方法は理論的には、キャップを有する任意のタイプおよび容積のチューブ（５０ｍＬ、１５ｍＬ、２ｍＬ、１．５ｍＬ、ストリップＰＣＲチューブなど）に取り入れることができる。
【０１１０】
以下のプロトコル段階を用いた：
１．溶解、洗浄、および溶出チューブを準備する。緩衝液がＲＮアーゼＩ阻害剤を含有する場合、チューブを氷上に保持する。
ａ．ＲｅＣａｐチューブ内に溶解チューブを設置し、試料添加後に抽出緩衝液の最終濃度が１×になるよう抽出緩衝液を適切な濃度で加える。
ｂ．洗浄チューブに洗浄緩衝液２００μＬを加える
ｃ．溶出チューブに増幅反応混合物（例えば、ＰＣＲ反応またはＮＡＳＢＡ増幅反応）を設置する。このチューブは氷上に保持するべきである。
２．溶解：
ａ．ＲｅＣａｐチューブ内で、抽出する試料と抽出緩衝液とを混合して最終濃度を１×にする。
ｂ．１分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる。
ｃ．台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
３．洗浄
ａ．ＲｅＣａｐの蓋を洗浄チューブに移す
ｂ．１分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる
ｃ．台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
４．溶出
ａ．ＲｅＣａｐの蓋を溶出チューブに移す
ｂ．１分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる。
ｃ．台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
ｄ．ＲｅＣａｐの蓋を取り外して通常の蓋にする。相当量の熱を必要とする反応によりＲｅＣａｐで使用する接着剤が溶ける可能性があることから、このことは重要である。
５．増幅
ａ．ＰＣＲ：標準的ＰＣＲプロトコルで反応を実施する。例えば、表３に挙げるＮＥＢ  Ｑ５ポリメラーゼプロトコルを用いてＲｅＣａｐをアッセイした。
ｂ．等温反応：表４に挙げるＮＡＳＢＡ反応を用いてＲｅＣａｐをアッセイした。
【０１１１】
【表３】
2021506315.tif 000007
ＰＣＲ増幅プロトコル。
【０１１２】
【表４】
2021506315.tif 000008
等温ＮＡＳＢＡプロトコル
【０１１３】
ＮＡＳＢＡ反応を６２℃で２分間実施し、この時点で酵素混合物を加え、反応を４１℃で１時間実施した。
【０１１４】
ＲｅＣａｐ抽出および増幅
１００〜１０１０コピーのｍＲＦＰ１プラスミドＤＮＡ鋳型を抽出緩衝液に添加し、紙に結合させ、洗浄し、５０μＬのＰＣＲ反応中に溶出させた。ＰＣＲ＋対照では、１００〜１０１０コピーのＤＮＡ鋳型をＱ５ポリメラーゼＰＣＲ反応に直接加えた。ＰＣＲ産物５μＬを１％アガロースゲル上で泳動した。図１３に示すように、ＲｅＣａｐ法では、ＰＣＲの感度限界（ＤＮＡ  １０７コピー）まで核酸を捕捉することができる。
【０１１５】
図１３に示すものと同じ反応にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素を加え、標準的なプレートリーダーを用い、０〜１０１０コピーのｍＲＦＰ１でエンドポイントの蛍光を測定した。結果を図１４に示す。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩはｄｓＤＮＡに対する蛍光挿入色素であるため、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を用いて異なる増幅反応のｄｓＤＮＡ産生量を比較できる。
【０１１６】
磁気ビーズ抽出および増幅
ＲｅＣａｐ抽出に代わる方法として、磁気ビーズによる抽出方法を用い、ＲｅＣａｐ紙抽出法の緩衝液（表２に挙げたもの）とともにＧｅｎｅｓｉｇ  Ｅａｓｙ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットの磁気ビーズ（Ｔｕｂｅ  ３）で実験を実施した。以下のプロトコル段階を用いた：
１．溶解
ａ．試料および抽出緩衝液を最終濃度１×まで加える。キットに提供されているＴｕｂｅ  ３（磁気ビーズを含む溶液）を等体積だけ加える。
ｂ．チューブを振盪し、１５分間待つ
ｃ．磁化し、液体を全部除去する
２．洗浄
ａ．洗浄緩衝液２００μＬを加える。
ｂ．チューブを振盪し、３０秒間待つ
ｃ．磁化し、液体を全部除去する。
３．溶出
ａ．適切な体積の水または増幅混合物中で溶出させる。
【０１１７】
ＲｅＣａｐで実施した実験と同様に、１００〜１０１０コピーのｍＲＦＰ１プラスミドを抽出緩衝液５０μＬに加え、磁気ビーズに結合させ、洗浄し、Ｑ５ポリメラーゼＰＣＲ緩衝液中に溶出させた。反応産物を１％アガロースゲル上で泳動した。図１５に示すように、磁気ビーズを用いて良好な抽出がＰＣＲ検出範囲（１０７〜１０１０）内でみられた。
【０１１８】
等温増幅および無細胞反応
合成回路を用いて検出する前に核酸を増幅するのに用いる増幅方法は、等温性またはほぼ等温性のもの（すなわち、ＮＡＳＢＡ）であるのが好ましい。ＲｅＣａｐ紙抽出をＮＡＳＢＡとともに用いることを検討するため、Ｚｉｋａセンサー（参照により本明細書に組み込まれるＰａｒｄｅｅら、２０１６を参照されたい）を用いて実験を実施した。
【０１１９】
１０１０コピーのＺｉｋａウイルストリガー３ＲＮＡを抽出緩衝液５０μＬ中に添加し、紙に結合させ、洗浄し、ＮＡＳＢＡ反応２５μＬ中に溶出させた。次いで、Ｚｉｋａ  ＲＮＡトリガーが認識したときだけＬａｃＺ酵素を産生するＺｉｋａ足がかり配列センサーを含有する無細胞反応１．８μＬにＮＡＳＢＡ反応を１：７の比で加えた。次いで、産生されたＬａｃＺ酵素が基質（ＣＰＲＧ）を切断してクロロフェノール赤が生じ、これを５７０ｎＭで検出できる。
【０１２０】
図１６に示すように、ＲｅＣａｐ抽出はＮＡＳＢＡ増幅および無細胞足がかり配列検知と適合性がある。
【０１２１】
実施例８：合成生物学的回路を用いた水銀の環境検知
グルコースメーターが介在し、合成生物学的回路を用いる検知を金属などの環境分析物の検出に用いてもよい。具体的には、このセンサーおよび方法を環境の監視および改善のほかにも、貴元素または希土類元素などの有価金属の検出／探査に用い得る。
【０１２２】
環境中の水銀の検知に現在の用いられている方法は、水、組織、および土壌試料中に存在する水銀汚染物質のレベルを求めるために原子吸収（ＡＡ）分光測定法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および質量分光測定法ＭＳなどの高価な設備に依存するものである。
【０１２３】
水銀を検出するという目的には、試料は、水、組織、および土壌試料を含み得る。抽出方法は試料のタイプによって決まる。例えば、土壌ベースの抽出には、遠心分離法とろ過法とを組み合わせるのが通常である（例えば、Ｒｅｉｓら、２０１４を参照されたい）。組織試料から水銀を抽出するには、試料を凍結乾燥させ、マイクロ波処理を実施し得る（例えば、Ｈｉｎｏｊｏｓａ  Ｒｅｙｅｓら、２００９を参照されたい）。
【０１２４】
水から水銀を抽出するには、試料に凝集／ろ過法を実施するのが最も一般的である。
【０１２５】
図１７に示すように、抽出した試料は、水銀の存在に応答して緑色蛍光またはトレハラーゼ酵素を生じる遺伝子回路ベースのセンサーで試験し得る。
【０１２６】
水銀の不在下でＭｅｒＲ抑制因子が結合して隔離するＴｎ２１プロモーターを用いて、水銀センサーを設計する。水銀が存在すると、抑制因子がＴｎ２１プロモーターを開放して露出させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）による下流遺伝子の転写を可能にする。Ｔｎ２１−ＭｅｒＲ遺伝子調節系とトレハラーゼ酵素を組み合わせてグルコースメーターとともに使用する前に、ｄｅＧＦＰ蛍光レポーターを用いてセンサーの設計を試験する。トレハラーゼ酵素は、水銀の存在下でトレハロースからグルコースモノマーへの分解を触媒する。産生されたグルコースのレベルは、グルコースメーターを用いグルコース試験紙で測定する。任意選択で、スマートフォンアプリによりグルコースメーターの結果の解釈およびデータの分析を支援する。
【０１２７】
刊行物、生物学的配列または配列識別番号、特許、および特許出願いずれも、個々の刊行物、生物学的配列、特許、または特許出願が具体的かつ個別に、その全体が参照により組み込まれると明記された場合と同様に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月14日(2020.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021506315000001.app
【国際調査報告】
2021506315.tif 000027
2021506315.tif 000028
2021506315.tif 000029
2021506315.tif 000030
2021506315.tif 000031