(57)【要約】  本開示は、単離されたネペタラクトンオキシドレダクターゼポリペプチド(NOR)、ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、並びに関連したポリヌクレオチド、操作された宿主細胞、及び培養物、加えて、NOR及びNEPSを産生するための方法、並びにネペタラクトール、ネペタラクトン、及びジヒドロネペタラクトンを産生するためにそれらを用いるための方法を提供する。本開示は又、グルコース等の発酵基質からネペタラクトンを産生するように細胞(例えば、微生物細胞)を操作するための方法、加えて、この能力を有する操作された細胞、並びにネペタラクトンを産生するための関連培養物及び方法も提供する。
2021506316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネペタラクトンを産生する能力がある、操作された微生物細胞。
【請求項２】
ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);チトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される活性を有する非天然ポリペプチドを発現する、請求項1に記載の操作された微生物細胞。
【請求項３】
ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を含む活性を有する非天然ポリペプチドを発現する、請求項1又は2に記載の操作された微生物細胞。
【請求項４】
ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);チトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の非天然酵素を発現する、請求項1から3のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
【請求項５】
8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)、及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を含む活性を有する非天然ポリペプチドを発現する、請求項1から4のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
【請求項６】
ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ(GES));ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);及びネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NEPS)からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の非天然酵素を発現するための手段を含む、請求項1に記載の操作された微生物細胞。
【請求項７】
真菌細胞を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
【請求項８】
真菌細胞が、サッカロミセス(Saccharomyces)属及びセレビシエ(cerevisiae)種の酵母細胞である、請求項7に記載の操作された微生物細胞。
【請求項９】
培養された時、ネペタラクトンを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルで産生する、請求項1から8のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
【請求項１０】
活性酵素をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、活性酵素が、配列番号789〜927からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS)であり;活性酵素が、配列番号928〜1037からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES)であり;活性酵素が、配列番号1038〜1072、1088〜1110からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H)であり;活性酵素が、配列番号1073〜1087からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR)であり;活性酵素が、配列番号1111〜1117からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5)であり;活性酵素が、配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO)であり;活性酵素が、配列番号1157〜1307からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、イリドイドシンターゼ(ISY)であり;活性酵素が、配列番号1308〜1395、1563〜1570からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)であり;活性酵素が、配列番号1571〜1576からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がチトクロムB5レダクターゼ(CYB5R)であり;活性酵素が、配列番号1506〜1562からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がネペタラクトールシンターゼ(NEPS)であり;活性酵素が、配列番号1396〜1397からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がGPPS-GES融合体であり;活性酵素が、配列番号1398〜1462からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がG8H-CPR融合体であり;活性酵素が、配列番号1463〜1481からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がG8H-CPR-CYB5融合体であり;活性酵素が、配列番号1482〜1493からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が8HGO-ISY融合体であり;又は活性酵素が、配列番号1494〜1505からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がISY-NEPS融合体であり;酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1577〜1633からなる群から選択されるプロモーター配列又は配列番号1634〜1641からなる群から選択されるターミネーター配列と作動可能に連結されている、発現構築物。
【請求項１１】
活性酵素をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、ヌクレオチド配列が、配列番号789〜927からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号928〜1037からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1038〜1072、1088〜1110からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1073〜1087からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1111〜1117からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1157〜1307からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が、イリドイドシンターゼ(ISY)であり;又はヌクレオチド配列が、配列番号1308〜1395、1563〜1570からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1571〜1576からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がチトクロムB5レダクターゼ(CYB5R)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1506〜1562からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がネペタラクトールシンターゼ(NEPS)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1396〜1397からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がGPPS-GES融合体であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1398〜1462からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がG8H-CPR融合体であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1463〜1481からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がG8H-CPR-CYB5融合体であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1482〜1493からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が8HGO-ISY融合体であり;又はヌクレオチド配列が、配列番号1494〜1505からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がISY-NEPS融合体であり;酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1577〜1633からなる群から選択されるプロモーター配列又は配列番号1634〜1641からなる群から選択されるターミネーター配列と作動可能に連結されている、発現構築物。
【請求項１２】
酵素コードヌクレオチド配列が、プロモーター配列及びターミネーター配列と作動可能に連結されている、請求項10又は11に記載の発現構築物。
【請求項１３】
請求項10から12のいずれか一項に記載の発現構築物を含む操作された微生物細胞。
【請求項１４】
ネペタラクトンを産生する能力がある、請求項13に記載の操作された微生物細胞。
【請求項１５】
酵母細胞を含む、請求項14に記載の操作された微生物細胞。
【請求項１６】
酵母細胞がサッカロミセス属及びセレビシエ種である、請求項15に記載の操作された微生物細胞。
【請求項１７】
培養された時、ネペタラクトンを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルで産生する、請求項14から16のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
【請求項１８】
請求項1から9又は13から17のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞の培養物。
【請求項１９】
基質が、炭素源、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、請求項18に記載の培養物。
【請求項２０】
基質が、ゲラニオール及び8-ヒドロキシゲラニオール並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される炭素源を含む、請求項18に記載の培養物。
【請求項２１】
ネペタラクトンを含む、請求項18から20のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項２２】
ネペタラクトンを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルで含む、請求項18から20のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項２３】
請求項1から9又は13から19のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞を培養する方法であって、操作された微生物細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、操作された微生物細胞がネペタラクトンを産生する、方法。
【請求項２４】
1〜100g/Lの範囲での最初のグルコースレベルを有し、その後、糖のフィードが制御される流加培養を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
0.1〜100g/Lの範囲での最初のゲラニオールレベルを有する流加培養を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
0.1〜100g/Lの範囲での最初の8-ヒドロキシゲラニオールレベルを有する流加培養を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
操作された微生物細胞が、ネペタラクトンを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルで産生する、請求項23から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
培養物からネペタラクトンを回収する工程を追加として含む、請求項23から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前駆体代謝産物からネペタラクトンを産生するための生合成経路に関与する非天然酵素を発現する、操作された細胞。
【請求項３０】
非天然酵素が、ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);チトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項29に記載の操作された細胞。
【請求項３１】
非植物細胞である、請求項29又は30に記載の操作された細胞。
【請求項３２】
非天然ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を発現する、請求項31に規定の操作された非植物細胞。
【請求項３３】
ネペタラクトールを産生する能力がある、請求項32に記載の操作された非植物細胞。
【請求項３４】
非天然のゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ(GES));ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ;8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ;及びイリドイドシンターゼ(ISY)を更に発現する、請求項31から33のいずれか一項に記載の操作された非植物細胞。
【請求項３５】
微生物細胞を含む、請求項31から34のいずれか一項に記載の操作された非植物細胞。
【請求項３６】
微生物細胞が細菌細胞又は酵母細胞を含む、請求項35に記載の操作された非植物細胞。
【請求項３７】
細菌細胞がエシェリキア・コリであり、酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエである、請求項36に記載の操作された非植物細胞。
【請求項３８】
培養された時、ネペタラクトールを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルでのネペタラクトンへ変換するのに十分なネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を産生する、請求項32から37のいずれか一項に記載の操作された非植物細胞。
【請求項３９】
請求項32から38のいずれか一項に記載の操作された非植物細胞の培養物。
【請求項４０】
ネペタラクトンを含む、請求項39に記載の培養物。
【請求項４１】
請求項31から38のいずれか一項に記載の操作された非植物細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された非植物細胞がネペタラクトンを産生する、方法。
【請求項４２】
1〜100g/Lの範囲での最初のグルコースレベルを有し、その後、糖のフィードが制御される流加培養を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
0.1〜100g/Lの範囲での最初のゲラニオールレベルを有する流加培養を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
0.1〜100g/Lの範囲での最初の8-ヒドロキシゲラニオールレベルを有する流加培養を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
発酵基質が、グルコース、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
操作された非植物細胞が、ネペタラクトールを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルでのネペタラクトンへ変換するのに十分なネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を産生する、請求項41から45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ネペタラクトンを培養物から回収する工程を追加として含む、請求項41から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
配列番号520〜607、775〜782のいずれか1つと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号1308〜1395、1563〜1570から選択されるヌクレオチド配列に対して1つ又は複数のヌクレオチド置換を含むヌクレオチド配列を含む、請求項48に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
配列番号1308〜1395、1563〜1570の1つと少なくとも60%配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項48又は49に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項48から50のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５２】
請求項51に記載の発現ベクターを含む操作された非植物細胞。
【請求項５３】
請求項31から38のいずれか一項に記載の操作された非植物細胞を、ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を発現するのに適切な条件下で培養する工程、又は無細胞タンパク質合成系において請求項48から50のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを発現する工程を含む、ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を産生する方法。
【請求項５４】
配列番号520〜607、775〜782のいずれか1つと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチド。
【請求項５５】
ネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する方法であって、ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が請求項31から38のいずれか一項に記載の操作された非植物細胞により発現し、又は請求項54に記載のネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチドが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)若しくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)の存在下でネペタラクトールと接触する、方法。
【請求項５６】
ネペタラクトールと接触するネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が、請求項32から38のいずれか一項に記載の操作された非植物細胞によって発現する、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が細胞内でネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する、請求項55又は56に記載の方法。
【請求項５８】
ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が細胞培養培地中でネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する、請求項55又は56に記載の方法。
【請求項５９】
操作された細胞が非天然ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を発現する、請求項29又は30に記載の操作された細胞。
【請求項６０】
ネペタラクトールを産生する能力がある、請求項59に記載の操作された細胞。
【請求項６１】
8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ)(8HGO)及び/又はイリドイドシンターゼ(ISY)を更に発現する、請求項59又は60に記載の操作された細胞。
【請求項６２】
ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)(GES)及びゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H)を更に発現する、請求項59から61のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項６３】
微生物細胞を含む、請求項59から62のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項６４】
微生物細胞が酵母細胞を含む、請求項63に記載の操作された細胞。
【請求項６５】
酵母細胞がサッカロミセス属及びセレビシエ種の細胞を含む、請求項64に記載の操作された細胞。
【請求項６６】
請求項59から65のいずれか一項に記載の操作された細胞の培養物。
【請求項６７】
ネペタラクトールを含む、請求項66に記載の培養物。
【請求項６８】
ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、培養物が、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、請求項67に記載の培養物。
【請求項６９】
請求項59から65のいずれか一項に記載の操作された細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された細胞がネペタラクトールを産生する、方法。
【請求項７０】
1〜100g/Lの範囲での最初の糖レベルを有し、その後、糖のフィードが制御される流加培養を含む、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
配列番号718〜774から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項７２】
請求項71に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７３】
請求項72に記載の発現ベクターを含む操作された細胞。
【請求項７４】
ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を産生する方法であって、請求項73に記載の操作された細胞を、ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を発現するのに適切な条件下で培養する工程、又は請求項71に記載のポリヌクレオチドを無細胞タンパク質合成系において発現する工程を含む、方法。
【請求項７５】
配列番号718〜774から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチド。
【請求項７６】
非天然8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO)及び/又は非天然イリドイドシンターゼ(ISY)を発現し、非天然8HGOが、配列番号330〜368から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、非天然ISYが、配列番号369〜519からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、操作された細胞。
【請求項７７】
ネペタラクトールを産生する能力がある、請求項76に記載の操作された細胞。
【請求項７８】
ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を更に発現する、請求項76又は77に記載の操作された細胞。
【請求項７９】
ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)及びゲラニオール8-ヒドロキシラーゼを更に発現する、請求項76から78のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項８０】
微生物細胞を含む、請求項76から79のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項８１】
微生物細胞が酵母細胞を含む、請求項80に記載の操作された細胞。
【請求項８２】
酵母細胞がサッカロミセス属及びセレビシエ種の細胞を含む、請求項81に記載の操作された細胞。
【請求項８３】
請求項76から82のいずれか一項に記載の操作された細胞の培養物。
【請求項８４】
ネペタラクトールを含む、請求項83に記載の培養物。
【請求項８５】
ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、培養物が、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、請求項84に記載の培養物。
【請求項８６】
請求項83から85のいずれか一項に記載の操作された細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された細胞がネペタラクトールを産生する、方法。
【請求項８７】
配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO)、又は配列番号369〜519からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性イリドイドシンターゼ(ISY)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８８】
請求項87に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８９】
請求項88に記載の発現ベクターを含む操作された細胞。
【請求項９０】
操作された微生物細胞である、請求項89に記載の操作された細胞。
【請求項９１】
酵素を産生する方法であって、請求項89に記載の操作された細胞を、酵素を発現するのに適切な条件下で培養する工程、又は請求項87に記載のポリヌクレオチドを細胞培養において、若しくは無細胞タンパク質合成系において発現させる工程を含む、方法。
【請求項９２】
配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性8HGOポリペプチド、又は配列番号369〜519からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ISYポリペプチドを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項９３】
請求項76から82のいずれか一項に記載の操作された細胞により発現された8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO)又はイリドイドシンターゼ;及び請求項92に記載の単離されたポリペプチド;請求項59から65のいずれか一項に記載の操作された細胞により発現されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS);請求項71に規定の単離されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチドからなる群から選択される酵素を酵素についての基質と接触させる工程を含む、方法。
【請求項９４】
請求項76から82のいずれか一項に記載の操作された細胞により発現された8HGO若しくはイリドイドシンターゼ、又は請求項92に記載の単離されたポリペプチドが基質を接触し、基質が、8HGOについての8-オキソゲラニアル又はイリドイドシンターゼについての8-オキソゲラニアルを含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
請求項59から65のいずれか一項に記載の操作された細胞により発現されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、請求項71に規定のネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチドが、8-オキソゲラニアルの還元から生成されたエノールと接触する、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
請求項87に規定の活性酵素のセットを含む、操作された細胞又は反応混合物。
【請求項９７】
活性ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を更に含み、活性NEPSが、配列番号718〜774からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項96に記載の操作された細胞又は反応混合物。
【請求項９８】
操作された微生物細胞である、請求項96又は97に記載の操作された細胞。
【請求項９９】
ネペタラクトールを産生する能力がある、請求項98に規定の操作された微生物細胞。
【請求項１００】
請求項96から99のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞の培養物。
【請求項１０１】
ネペタラクトールを含む、請求項100に記載の培養物。
【請求項１０２】
ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、培養物が、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、請求項101に記載の培養物。
【請求項１０３】
請求項96から99のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された微生物細胞がネペタラクトールを産生する、方法。
【請求項１０４】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)を追加として含む反応混合物である、請求項96から99のいずれか一項に記載の操作された細胞又は反応混合物。
【請求項１０５】
ネペタラクトールを産生する、請求項104に記載の反応混合物。
【請求項１０６】
請求項100から102のいずれか一項に記載の培養物若しくは請求項104又は105に記載の反応混合物を用いて、ネペタラクトールを産生する方法。
【請求項１０７】
ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換する工程を追加として含む、請求項106に記載の方法。
【請求項１０８】
ネペタラクトールが、ネペタラクトールをネペタラクトンオキシドレダクターゼ及びNAD+又はNADP+と接触させることによりネペタラクトンへ変換される、請求項107に記載の方法。
【請求項１０９】
ネペタラクトールを含む細胞培養培地であって、ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、細胞培養培地。
【請求項１１０】
請求項109に記載の細胞培養培地から精製されたネペタラクトール。
【請求項１１１】
インビトロ反応混合物から産生されたネペタラクトールであって、(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、ネペタラクトール。
【請求項１１２】
請求項110又は111に記載のネペタラクトールのネペタラクトンへの変換により産生されたネペタラクトン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年12月21日に出願された米国仮出願第62/609,272号、2017年12月21日に出願された米国仮出願第62/609,279号、及び2018年5月10日に出願された米国仮出願第62/669,919号の恩恵を主張し、それらの米国仮出願は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による組入れ
本出願は、ASCII形式で電子的に提出されており、全体として参照により本明細書により組み入れられる配列表を含有する。2018年12月21日に作成された前記ASCIIコピーは、ZMGNP012WO_SL.txtという名前であり、サイズが5,630,568バイトである。
【０００３】
本開示は、一般的に、ネペタラクトンの産生の領域に関する。特に、本開示は、ネペタラクトールのネペタラクトンへの酸化を触媒するネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)、及び8-オキソシトロネリルエノラートのネペタラクトールへの環化を触媒するネペタラクトールシンターゼ(NEPS)をコードする、新しく発見された遺伝子に関し、エノラートが、イリドイドシンターゼ(ISY)により触媒される、8-オキソゲラニアルの還元から生じた生成物である。本開示は又、ネペタラクトンを合成する能力がある微生物を作製するための、植物中に見出される生合成経路の異種性発現、加えて、関連した組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ネペタラクトンは、昆虫忌避剤についての有効活性成分である。N,N-ジエチル-メタ-トルアミド(DEET)等の昆虫忌避剤に用いられる現在の成分は、健康への懸念をもたらし、一方、他の天然代替物は短期保護を与えるのみである。ネペタラクトンは、主に、植物イヌハッカ(Nepeta cataria)から得られるが、低レベルで生産される。収量は、気候及び害虫等の環境因子に左右され、ネコ誘引物質としての働きを超える幅広い使用には供給がおぼつかない。化学合成は実行可能であるが、経済的ではない。
【０００５】
ネペタラクトンのより頼りになる供給を生じることへのアプローチは、この化学物質のグルコースからの生成のために微生物宿主を遺伝子操作すること、又はネペタラクトンを産生するための化学酵素的過程に用いることができる、細胞培養において、又は無細胞タンパク質発現系においてのいずれかで、必要な酵素のうちの1つ又は複数を発現することである。微生物宿主において中間体としてのネペタラクトン前駆体ネペタラクトールの異なる天然産物ストリクトシジンへの生成を間接的に示す、いくつかの生化学的工程及び対応する遺伝的要素はすでに特徴付けられている。しかしながら、本研究以前には、いずれの微生物においても完全な経路は再現されておらず、前駆体からのネペタラクトン産生のための効率的な化学酵素的過程は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第2011/0045563号
【特許文献２】米国特許第7,659,097号
【特許文献３】米国特許出願公開第2010/0297749号
【特許文献４】米国特許出願公開第2009/0282545号
【特許文献５】国際特許公開第2011/034863号
【特許文献６】米国特許出願公開第2009/0203102号
【特許文献７】米国特許出願公開第2010/0048964号
【特許文献８】米国特許出願公開第2010/0003716号
【特許文献９】国際特許公開第2009/076676号
【特許文献１０】国際特許公開第2010/003007号
【特許文献１１】国際特許公開第2009/132220号
【特許文献１２】国際特許公開第2004/033646号
【特許文献１３】国際特許公開第2009/076676号
【特許文献１４】欧州特許第1484967号(PCT公開第2003079786号としても公開されている)
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Berka & Barnett、Biotechnology Advances、(1989)、7(2):127〜154頁
【非特許文献２】Romanosら、Yeast、(1992)、8(6):423〜488頁
【非特許文献３】Saunders & Warmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast」、(1993)、National Agricultural Library、Beltsville、Md.
【非特許文献４】「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第4版(Sambrookら、2012)
【非特許文献５】「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、1984)
【非特許文献６】「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R. I. Freshney編、第6版、2010)
【非特許文献７】「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)
【非特許文献８】「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987及び定期的更新)
【非特許文献９】「PCR: The Polymerase Chain Reaction」、(Mullisら編、1994)
【非特許文献１０】Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology  第2版、J. Wiley & Sons(New York、N.Y. 1994)
【非特許文献１１】Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtら編、American Society for Microbiology、Washington、D.C. (1994)
【非特許文献１２】Brock、Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.、Sunderland、Mass.
【非特許文献１３】Carlson, E.D.ら(2012)、「Cell-free protein synthesis: applications come of age」、Biotechnol. Adv. 30 (5): 1185〜94頁
【非特許文献１４】Regnier, F.E.ら、Phytochemistry 6:1281〜1289頁(1967)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ネペタラクトンのより頼りなる供給を生じることへの一つのアプローチは、この化学物質の産生のために微生物宿主を遺伝子操作することである。微生物宿主において中間体としてのネペタラクトン前駆体ネペタラクトールの異なる天然産物ストリクトシジンへの生成を間接的に示す、いくつかの生化学的工程及び対応する遺伝的要素はすでに特徴付けられている。しかしながら、本研究以前では、酵素、ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)は、依然として特徴付けされていないままであり、いかなる異種性生物体においてもネペタラクトンの完全な生合成を阻んでいる。
【０００９】
本明細書に企図された様々な実施形態には、以下のうちの1つ又は複数が挙げられ得るが、それらに限定される必要はない:
実施形態1:非天然ポリペプチドを発現する操作された細胞であって、非天然ポリペプチドが、ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);チトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される活性を有する、操作された細胞。
実施形態2:ネペタラクトンを産生する能力がある、操作された微生物細胞。
実施形態3:ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);チトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される活性を有する非天然ポリペプチドを発現する、実施形態1〜2に記載の操作された微生物細胞。
実施形態4:8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)、及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を含む活性を有する非天然ポリペプチドを発現する、実施形態1〜3に記載の操作された微生物細胞。
実施形態5:ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);チトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の非天然酵素を発現する、実施形態1〜4に記載の操作された微生物細胞。
実施形態6:実施形態1に規定の酵素のそれぞれの少なくとも1つの非天然型を発現する、実施形態1に記載の操作された微生物細胞。
実施形態7:ネペタラクトンを産生するための手段を含む、操作された微生物細胞。
実施形態8:ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);及びネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NEPS)からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の非天然酵素を発現するための手段を含む、実施形態1に記載の操作された微生物細胞。
実施形態9:実施形態8に規定の酵素のそれぞれの少なくとも1つの非天然型を発現するための手段を含む、実施形態8に記載の操作された微生物細胞。
実施形態10:真菌細胞を含む、実施形態1〜9のいずれか一実施形態に記載の操作された微生物細胞。
実施形態11:酵母細胞を含む、実施形態10に記載の操作された微生物細胞。
実施形態12:酵母細胞がヤロウイア(Yarrowia)属の細胞である、実施形態11に記載の操作された微生物細胞。
実施形態13:酵母細胞がリポリティカ(lipolytica)種の細胞である、実施形態12に記載の操作された微生物細胞。
実施形態14:酵母細胞がサッカロミセス(Saccharomyces)属の細胞である、実施形態11に記載の操作された微生物細胞。
実施形態15:酵母細胞がセレビシエ(cerevisiae)種の細胞である、実施形態14に記載の操作された微生物細胞。
実施形態16:培養された時、ネペタラクトンを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルで産生する、実施形態1〜15のいずれか一実施形態に記載の操作された微生物細胞。
実施形態17:培養された時、ネペタラクトンを細胞可溶化物又は培養培地の50μMより高いレベルで産生する、実施形態16に記載の操作された微生物細胞。
実施形態18:活性酵素をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、活性酵素が、配列番号789〜927からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS)であり;活性酵素が、配列番号928〜1037からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES)であり;活性酵素が、配列番号1038〜1072、1088〜1110からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H)であり;活性酵素が、配列番号1073〜1087からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR)であり;活性酵素が、配列番号1111〜1117からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5)であり;活性酵素が、配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO)であり;活性酵素が、配列番号1157〜1307、1778〜1807からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、イリドイドシンターゼ(ISY)であり;又は活性酵素が、配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)であり;活性酵素が、配列番号1571〜1576からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がチトクロムB5レダクターゼ(CYB5R)であり;活性酵素が、配列番号1506〜1562からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がネペタラクトールシンターゼ(NEPS)であり;活性酵素が、配列番号1396〜1397、1728〜1777からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がGPPS-GES融合体であり;活性酵素が、配列番号1398〜1462からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がG8H-CPR融合体であり;活性酵素が、配列番号1463〜1481からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有���、活性酵素がG8H-CPR-CYB5融合体であり;活性酵素が、配列番号1482〜1493からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が8HGO-ISY融合体であり;又は活性酵素が、配列番号1494〜1505からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がISY-NEPS融合体であり;酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1577〜1633からなる群から選択されるプロモーター配列又は配列番号1634〜1641からなる群から選択されるターミネーター配列と作動可能に連結されている、発現構築物。
実施形態19:活性酵素をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、ヌクレオチド配列が、配列番号789〜927からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号928〜1037からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1038〜1072、1088〜1110からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1073〜1087からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1111〜1117からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1157〜1307、1778〜1807からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が、イリドイドシンターゼ(ISY)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1571〜1576からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がチトクロムB5レダクターゼ(CYB5R)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1506〜1562からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がネペタラクトールシンターゼ(NEPS)であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1396〜1397、1728〜1777からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がGPPS-GES融合体であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1398〜1462からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がG8H-CPR融合体であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1463〜1481からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がG8H-CPR-CYB5融合体であり;ヌクレオチド配列が、配列番号1482〜1493からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が8HGO-ISY融合体であり;又はヌクレオチド配列が、配列番号1494〜1505からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がISY-NEPS融合体であり;酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1577〜1633からなる群から選択されるプロモーター配列又は配列番号1634〜1641からなる群から選択されるターミネーター配列と作動可能に連結されている、発現構築物。
実施形態20:酵素コードヌクレオチド配列が、プロモーター配列及びターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18又は19に記載の発現構築物。
実施形態21:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号789〜927からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS)である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態22:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号789〜927からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、実施形態21に記載の発現構築物。
実施形態23:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号928〜1037からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES)である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態24:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号928〜1037からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、実施形態23に記載の発現構築物。
実施形態25:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1038〜1072、1088〜1110からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H)である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態26:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1038〜1072、1088〜1110からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、実施形態25に記載の発現構築物。
実施形態27:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1073〜1087からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR)である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態28:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1073〜1087からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、実施形態27に記載の発現構築物。
実施形態29:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1111〜1117からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5)である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態30:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1111〜1117からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、実施形態29に記載の発現構築物。
実施形態31:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素が8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO)である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態32:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、実施形態31に記載の発現構築物。
実施形態33:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1157〜1307、1778〜1807からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がイリドイドシンターゼ(ISY)である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態34:イリドイドシンターゼ(ISY)が、基質特異性を向上させるように修飾されている、実施形態33に記載の発現構築物。
実施形態35:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1157〜1307、1778〜1807からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、実施形態34に記載の発現構築物。
実施形態36:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有し、活性酵素がネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態37:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727からなる群から選択されるヌクレオチド配列である、実施形態36に記載の発現構築物。
実施形態38:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1120である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態39:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1121である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態40:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1122である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態41:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1123である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態42:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1124である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態43:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1125である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態44:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1126である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態45:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1127である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態46:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1128である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態47:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1129である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態48:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1130である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態49:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1131である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態50:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1075である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態51:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1077である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態52:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1041である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態53:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1054である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態54:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1056である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態55:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1063である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態56:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1067である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態57:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1417である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態58:選択されたヌクレオチド配列が配列番号930である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態59:選択されたヌクレオチド配列が配列番号931である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態60:選択されたヌクレオチド配列が配列番号932である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態61:選択されたヌクレオチド配列が配列番号934である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態62:選択されたヌクレオチド配列が配列番号937である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態63:選択されたヌクレオチド配列が配列番号938である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態64:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1396である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態65:選択されたヌクレオチド配列が配列番号791である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態66:選択されたヌクレオチド配列が配列番号793である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態67:選択されたヌクレオチド配列が配列番号897である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態68:選択されたヌクレオチド配列が配列番号898である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態69:選択されたヌクレオチド配列が配列番号900である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態70:選択されたヌクレオチド配列が配列番号901である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態71:選択されたヌクレオチド配列が配列番号914である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態72:選択されたヌクレオチド配列が配列番号915である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態73:選択されたヌクレオチド配列が配列番号916である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態74:選択されたヌクレオチド配列が配列番号917である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態75:選択されたヌクレオチド配列が配列番号918である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態76:選択されたヌクレオチド配列が配列番号919である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態77:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1163である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態78:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1169である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態79:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1170である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態80:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1171である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態81:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1172である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態82:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1173である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態83:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1174である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態84:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1175である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態85:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1176である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態86:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1177である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態87:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1506である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態88:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1507である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態89:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1508である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態90:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1509である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態91:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1510である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態92:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1511である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態93:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1512である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態94:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1513である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態95:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1514である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態96:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1515である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態97:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1516である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態98:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1517である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態99:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1518である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態100:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1519である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態101:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1520である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態102:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1521である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態103:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1114である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態104:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1115である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態105:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1086である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態106:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1308である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態107:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1309である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態108:選択されたヌクレオチド配列が配列番号1393である、実施形態18又は実施形態19に記載の発現構築物。
実施形態109:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1577を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態110:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1578を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態111:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1579を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態112:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1580を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態113:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1581を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態114:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1582を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態115:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1583を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態116:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1584を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態117:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1585を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態118:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1586を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態119:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1587を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態120:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1588を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態121:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1589を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態122:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1590を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態123:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1591を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態124:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1592を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態125:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1593を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態126:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1594を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態127:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1595を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態128:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1596を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態129:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1597を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態130:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1598を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態131:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1599を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態132:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1600を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態133:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1601を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態134:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1602を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態135:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1603を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態136:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1604を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態137:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1605を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態138:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1606を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態139:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1607を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態140:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1608を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態141:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1609を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態142:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1610を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態143:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1611を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態144:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1612を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態145:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1613を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態146:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1614を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態147:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1615を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態148:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1616を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態149:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1617を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態150:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1618を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態151:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1619を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態152:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1620を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態153:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1621を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態154:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1622を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態155:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1623を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態156:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1624を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態157:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1625を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態158:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1626を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態159:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1627を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態160:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1628を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態161:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1629を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態162:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1630を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態163:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1631を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態164:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1632を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態165:選択されたヌクレオチド配列が、配列番号1633を含むプロモーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜108のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態166:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1634を含むターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜165のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態167:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1635を含むターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜165のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態168:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1636を含むターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜165のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態169:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1637を含むターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜165のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態170:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1638を含むターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜165のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態171:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1639を含むターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜165のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態172:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1640を含むターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜165のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態173:酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1641を含むターミネーター配列と作動可能に連結されている、実施形態18〜165のいずれか一実施形態に記載の発現構築物。
実施形態174:実施形態18〜173のいずれか一実施形態に記載の発現構築物を含むセントロメア型又はエピソーム型プラスミド。
実施形態175:実施形態18〜173のいずれか一実施形態に記載の発現構築物を含む操作された微生物細胞。
実施形態176:ネペタラクトンを産生する能力がある、実施形態175に記載の操作された微生物細胞。
実施形態177:酵母細胞を含む、実施形態176に記載の操作された微生物細胞。
実施形態178:酵母細胞がヤロウイア属の細胞である、実施形態177に記載の操作された微生物細胞。
実施形態179:酵母細胞がリポリティカ種の細胞である、実施形態178に記載の操作された微生物細胞。
実施形態180:酵母細胞がサッカロミセス属の細胞である、実施形態177に記載の操作された微生物細胞。
実施形態181:酵母細胞がセレビシエ種の細胞である、実施形態180に記載の操作された微生物細胞。
実施形態182:培養された時、ネペタラクトンを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルで産生する、実施形態176〜181のいずれか一実施形態に記載の操作された微生物細胞。
実施形態183:培養された時、ネペタラクトンを細胞可溶化物又は培養培地の50μMより高いレベルで産生する、実施形態176〜181に記載の操作された微生物細胞。
実施形態184:実施形態1〜17又は175〜183のいずれか一実施形態に記載の操作された微生物細胞の培養物。
実施形態185:基質が、炭素源、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態184に記載の培養物。
実施形態186:基質が、ゲラニオール及び8-ヒドロキシゲラニオール並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される炭素源を含む、実施形態184に記載の培養物。
実施形態187:操作された微生物細胞が、その培養物が1〜500の600nmにおける光学密度を有するような濃度で存在し、任意選択的に、光学密度が、細胞を濃縮することなく測定される、実施形態184〜186のいずれか一実施形態に記載の培養物。
実施形態188:ネペタラクトンを含む、実施形態184〜187のいずれか一実施形態に記載の培養物。
実施形態189:細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルでネペタラクトンを含む、実施形態184〜188のいずれか一実施形態に記載の培養物。
実施形態190:細胞可溶化物又は培養培地の50μMより高いレベルでネペタラクトンを含む、実施形態184〜188のいずれか一実施形態に記載の培養物。
実施形態191:実施形態1〜17又は175〜183のいずれか一実施形態に記載の操作された微生物細胞を培養する方法であって、操作された微生物細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、操作された微生物細胞がネペタラクトンを産生する、方法。
実施形態192:非タンパク質性炭素及び非タンパク質性窒素源を含む発酵基質の存在下で細胞を培養する工程を含む、実施形態191に記載の方法。
実施形態193:ゲラニオール及び/又は8-ヒドロキシゲラニオールを含む発酵基質の存在下で細胞を培養する工程を含む、実施形態191に記載の方法。
実施形態194:1〜100g/Lの範囲での最初のグルコースレベルを有し、その後、糖のフィードが制御される流加培養を含む、実施形態191に記載の方法。
実施形態195:0.1〜100g/Lの範囲での最初のゲラニオールレベルを有する流加培養を含む、実施形態191に記載の方法。
実施形態196:0.1〜100g/Lの範囲での最初の8-ヒドロキシゲラニオールレベルを有する流加培養を含む、実施形態191に記載の方法。
実施形態197:発酵基質が、グルコース、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態191又は実施形態194に記載の方法。
実施形態198:培養物が培養中、pH制御される、実施形態191〜197のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態199:培養物が培養中、通気される、実施形態191〜198のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態200:操作された微生物細胞が、細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルでネペタラクトンを産生する、実施形態191〜199のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態201:操作された微生物細胞が、細胞可溶化物又は培養培地の50μMより高いレベルでネペタラクトンを産生する、実施形態200に記載の方法。
実施形態202:培養物からネペタラクトンを回収する工程を追加として含む、実施形態191〜201のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態203:ネペタラクトンをジヒドロネペタラクトンへ変換する工程を追加として含む、実施形態202に記載の方法。
実施形態204:ネペタラクトンを水素及び水素付加触媒と接触させることにより、ネペタラクトンがジヒドロネペタラクトンへ変換される、実施形態203に記載の方法。
実施形態205:ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);チトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される1つ又は複数の非天然酵素を発現する、操作された非植物細胞。
実施形態206:非天然ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を発現する、操作された非植物細胞。
実施形態207:ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES);ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR);G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5);8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO);イリドイドシンターゼ(ISY);ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);チトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);及びネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される非天然酵素を発現するための手段を含む、操作された非植物細胞。
実施形態208:非天然ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を発現するための手段を含む、操作された非植物細胞。
実施形態209:ネペタラクトールを産生する能力がある、実施形態205〜208に記載の操作された非植物細胞。
実施形態210:ネペタラクトールを産生するように操作されている、実施形態205〜209に記載の操作された非植物細胞。
実施形態211:非天然のゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ(GES));ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ;8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ、及びイリドイドシンターゼ(ISY)を更に発現する、実施形態208に記載の操作された非植物細胞。
実施形態212:微生物細胞を含む、実施形態205〜211のいずれか一実施形態に記載の操作された非植物細胞。
実施形態213:微生物細胞が細菌細胞を含む、実施形態212に記載の操作された非植物細胞。
実施形態214:細菌細胞がエシェリキア(Escherichia)属又はコリネバクテリウム(Corynebacterium)属の細胞である、実施形態213に記載の操作された非植物細胞。
実施形態215:細菌細胞が、大腸菌(E. coli)種又はC.グルタミクム(C. glutamicum)種の細胞である、実施形態214に記載の操作された非植物細胞。
実施形態216:微生物細胞が真菌細胞を含む、実施形態212に記載の操作された非植物細胞。
実施形態217:微生物細胞が酵母細胞を含む、実施形態216に記載の操作された非植物細胞。
実施形態218:酵母細胞がサッカロミセス属又はヤロウイア属の細胞である、実施形態217に記載の操作された非植物細胞。
実施形態219:酵母細胞がS.セレビシエ種又はY.リポリティカ種の細胞である、実施形態218に記載の操作された非植物細胞。
実施形態220:培養された時、ネペタラクトールを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルでのネペタラクトンへ変換するのに十分なネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を産生する、実施形態205〜219のいずれか一実施形態に記載の操作された非植物細胞。
実施形態221:培養された時、ネペタラクトールを細胞可溶化物又は培養培地の50μMより高いレベルでのネペタラクトンへ変換するのに十分なネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を産生する、実施形態220に記載の操作された非植物細胞。
実施形態222:実施形態205〜221のいずれか一実施形態に記載の操作された非植物細胞の培養物。
実施形態223:操作された非植物細胞が、その培養物が1〜500の600nmにおける光学密度を有するような濃度で存在し、任意選択的に、光学密度が、細胞を濃縮することなく測定される、実施形態222に記載の培養物。
実施形態224:ネペタラクトンを含む、実施形態222又は223に記載の培養物。
実施形態225:培養培地の10μMより高いレベルでネペタラクトンを含む、実施形態222〜224のいずれか一実施形態に記載の培養物。
実施形態226:培養培地の50μMより高いレベルでネペタラクトンを含む、実施形態225に記載の培養物。
実施形態227:実施形態205〜221のいずれか一実施形態に記載の操作された非植物細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された非植物細胞が非天然ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を発現する、方法。
実施形態228:実施形態205〜221のいずれか一実施形態に記載の操作された非植物細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された非植物細胞がネペタラクトンを産生する、方法。
実施形態229:1〜100g/Lの範囲での最初のグルコースレベルを有し、その後、糖のフィードが制御される流加培養を含む、実施形態227〜228に記載の方法。
実施形態230:0.1〜100g/Lの範囲での最初のゲラニオールレベルを有する流加培養を含む、実施形態229に記載の方法。
実施形態231:0.1〜100g/Lの範囲での最初の8-ヒドロキシゲラニオールレベルを有する流加培養を含む、実施形態229に記載の方法。
実施形態232:発酵基質が、グルコース、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態227〜228に記載の方法。
実施形態233:培養物が培養中、pH制御される、実施形態227〜232のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態234:培養物が培養中、通気される、実施形態227〜233のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態235:操作された非植物細胞が、ネペタラクトールを細胞可溶化物又は培養培地の10μMより高いレベルでのネペタラクトンへ変換するのに十分なネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を産生する、実施形態227〜234のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態236:操作された非植物細胞が、ネペタラクトールを細胞可溶化物又は培養培地の50μMより高いレベルでのネペタラクトンへ変換するのに十分なネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を産生する、実施形態235に記載の方法。
実施形態237:培養物からネペタラクトンを回収する工程を追加として含む、実施形態227〜236のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態238:配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644のいずれか1つと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
実施形態239:配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644のいずれか1つと90%より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
実施形態240:コード化ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644の1つと少なくとも95%配列同一性を有する、実施形態238又は239に記載のポリヌクレオチド。
実施形態241:配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727から選択されるヌクレオチド配列に対して1つ又は複数のヌクレオチド置換を含むヌクレオチド配列を含む、実施形態238又は239に記載のポリヌクレオチド。
実施形態242:キメラポリヌクレオチドを含む、実施形態238又は239に記載のポリヌクレオチド。
実施形態243:配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727の1つと少なくとも60%配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、実施形態238〜242のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチド。
実施形態244:実施形態238〜243のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
実施形態245:実施形態244に記載の発現ベクターを含む操作された非植物細胞。
実施形態246:操作された微生物細胞である、実施形態245に記載の操作された非植物細胞。
実施形態247:実施形態205、212、245、若しくは246のいずれか一実施形態に記載の操作された非植物細胞を、ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を発現するのに適切な条件下で培養する工程、又は実施形態238〜243のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチドを無細胞タンパク質合成系において発現する工程を含む、ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を産生する方法。
実施形態248:配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644のいずれか1つと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチド。
実施形態249:配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644のいずれか1つと90%より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチド。
実施形態250:配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644から選択されるアミノ酸配列に対して1つ又は複数のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、実施形態249に記載の単離されたネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチド。
実施形態251:配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態248〜250のいずれか一実施形態に記載の単離されたネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチド。
実施形態252:実施形態205、212、245、若しくは246のいずれか一実施形態に記載の操作された非植物細胞により発現されたネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)又は実施形態248〜251のいずれか一実施形態に記載のネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチドが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)の存在下でネペタラクトールと接触する、ネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する方法。
実施形態253:ネペタラクトールと接触するネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が、実施形態205、212、245、又は246のいずれか一実施形態に記載の操作された非植物細胞により発現する、実施形態252に記載の方法。
実施形態254:ネペタラクトールと接触するネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が、実施形態205又は実施形態245に記載の操作された非植物細胞により発現する、実施形態253に記載の方法。
実施形態255:ネペタラクトールと接触するネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が、実施形態212又は実施形態246に記載の操作された非植物細胞により発現する、実施形態252に記載の方法。
実施形態256:ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が細胞内でネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する、実施形態253〜255のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態257:ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が細胞培養培地においてネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する、実施形態253〜255のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態258:ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を精製して、酵素調製物を作製する工程、及びNAD+又はNADP+及びネペタラクトールを酵素調製物に加える工程を含み、ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチドがインビトロでネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する、実施形態253〜255のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態259:ネペタラクトールと接触するネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)が、実施形態248〜251のいずれか一実施形態に記載のネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチドであり、ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチドがインビトロでネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する、実施形態252に記載の方法。
実施形態260:ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチドが無細胞タンパク質合成系において産生される、実施形態259に記載の方法。
実施形態261:ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)ポリペプチドを精製して、酵素調製物を作製する工程、並びにNAD+又はNADP+及びネペタラクトールを酵素調製物に加える工程を含む、実施形態260に記載の方法。
実施形態262:ネペタラクトンをジヒドロネペタラクトンへ変換する工程を追加として含む、実施形態252〜261のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態263:ネペタラクトンを水素及び水素付加触媒と接触させることにより、ネペタラクトンがジヒドロネペタラクトンへ変換される、実施形態262に記載の方法。
実施形態264:(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを産生する能力があり、非天然ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)を発現する、操作された非植物細胞。
実施形態265:非天然ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を発現する、操作された細胞。
実施形態266:非天然ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を発現するための手段を含む、操作された細胞。
実施形態267:ネペタラクトールを産生する能力がある、実施形態265又は実施形態266に記載の操作された細胞。
実施形態268:ネペタラクトールを産生するように操作されている、実施形態267に記載の操作された細胞。
実施形態269:8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ)及び/又はイリドイドシンターゼを更に発現する、実施形態265〜268のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞。
実施形態270:ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)及びゲラニオール8-ヒドロキシラーゼを更に発現する、実施形態265〜269のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞。
実施形態271:微生物細胞を含む、実施形態265〜270のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞。
実施形態272:微生物細胞が細菌細胞を含む、実施形態271に記載の操作された細胞。
実施形態273:細菌細胞がエシェリキア属又はコリネバクテリウム属の細胞である、実施形態272に記載の操作された細胞。
実施形態274:細菌細胞が、大腸菌又はC.グルタミクムの属及び種の細胞である、実施形態273に記載の操作された細胞。
実施形態275:真菌細胞を含む、実施形態271に記載の操作された細胞。
実施形態276:真菌細胞が酵母細胞を含む、実施形態275に記載の操作された細胞。
実施形態277:酵母細胞がサッカロミセス属又はヤロウイア属の細胞である、実施形態276に記載の操作された細胞。
実施形態278:酵母細胞がS.セレビシエ又はY.リポリティカの属及び種の細胞である、実施形態277に記載の操作された細胞。
実施形態279:実施形態265〜278のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞の培養物。
実施形態280:操作された細胞が、その培養物が1〜500の600nmにおける光学密度を有するような濃度で存在し、任意選択的に、光学密度が、細胞を濃縮することなく測定される、実施形態279に記載の培養物。
実施形態281:ネペタラクトールを含む、実施形態279又は実施形態280に記載の培養物。
実施形態282:ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、培養物が、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、実施形態281に記載の培養物。
実施形態283:実施形態265〜278のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された細胞がネペタラクトールを産生する、方法。
実施形態284:1〜100g/Lの範囲での最初の糖レベルを有し、その後、糖のフィードが制御される流加培養を含む、実施形態283に記載の方法。
実施形態285:発酵基質が、糖、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態283又は実施形態284に記載の方法。
実施形態286:培養物が培養中、pH制御される、実施形態283〜285のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態287:培養物が培養中、通気される、実施形態283〜286のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態288:配列番号718〜774から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
実施形態289:コード化ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)が、配列番号718〜774から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%配列同一性を有する、実施形態288に記載のポリヌクレオチド。
実施形態290:配列番号1506〜1562から選択されるヌクレオチドに対して1つ又は複数のヌクレオチド置換を含むヌクレオチド配列を含む、実施形態288又は実施形態289に記載のポリヌクレオチド。
実施形態291:キメラポリヌクレオチドを含む、実施形態288〜290のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチド。
実施形態292:配列番号1506〜1562のうちの1つと少なくとも60%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態289〜291のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチド。
実施形態293:実施形態288〜292のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
実施形態294:実施形態293に記載の発現ベクターを含む操作された細胞。
実施形態295:操作された微生物細胞である、実施形態294に記載の操作された細胞。
実施形態296:実施形態294若しくは実施形態295に記載の操作された細胞を、ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を発現するのに適切な条件下で培養する工程、又は実施形態288〜292のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチドを無細胞タンパク質合成系において発現する工程を含む、ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を産生する方法。
実施形態297:配列番号718〜774から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチド。
実施形態298:配列番号718〜774から選択されるアミノ酸配列に対して1つ又は複数のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、実施形態297に記載の単離されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチド。
実施形態299:配列番号718〜774から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態297に記載の単離されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチド。
実施形態300:非天然8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO)及び/又は非天然イリドイドシンターゼ(ISY)を発現し、非天然8HGOが、配列番号330〜368から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、非天然ISYが、配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、操作された細胞。
実施形態301:操作された細胞が非天然8HGOを発現し、非天然8HGOが、配列番号330〜368から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態300に記載の操作された細胞。
実施形態302:非天然ISYを発現し、非天然ISYが、配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態300に記載の操作された細胞。
実施形態303:ネペタラクトールを産生する能力がある、実施形態300〜302のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞。
実施形態304:ネペタラクトールを産生するように操作されている、実施形態303に記載の操作された細胞。
実施形態305:ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を更に発現する、実施形態300〜304のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞。
実施形態306:ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ)及びゲラニオール8-ヒドロキシラーゼを更に発現する、実施形態300〜304のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞。
実施形態307:微生物細胞を含む、実施形態300〜306のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞。
実施形態308:微生物細胞が細菌細胞を含む、実施形態307に記載の操作された細胞。
実施形態309:細菌細胞がエシェリキア属又はコリネバクテリウム属の細胞である、実施形態308に記載の操作された細胞。
実施形態310:細菌細胞が、大腸菌又はC.グルタミクムの属及び種の細胞である、実施形態309に記載の操作された細胞。
実施形態311:真菌細胞を含む、実施形態307に記載の操作された細胞。
実施形態312:真菌細胞が酵母細胞を含む、実施形態311に記載の操作された細胞。
実施形態313:酵母細胞がサッカロミセス属又はヤロウイア属の細胞である、実施形態312に記載の操作された細胞。
実施形態314:酵母細胞がS.セレビシエ又はY.リポリティカの属及び種の細胞である、実施形態313に記載の操作された細胞。
実施形態315:実施形態300〜314のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞の培養物。
実施形態316:操作された細胞が、その培養物が1〜500の600nmにおける光学密度を有するような濃度で存在し、任意選択的に、光学密度が、細胞を濃縮することなく測定される、実施形態91に記載の培養物。
実施形態317:ネペタラクトールを含む、実施形態315又は実施形態316に記載の培養物。
実施形態318:ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、培養物が、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、実施形態317に記載の培養物。
実施形態319:実施形態300〜314のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された細胞がネペタラクトールを産生する、方法。
実施形態320:1〜100g/Lの範囲での最初の糖レベルを有し、その後、糖のフィードが制御される流加培養を含む、実施形態319に記載の方法。
実施形態321:発酵基質が、糖、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態319又は実施形態320に記載の方法。
実施形態322:培養物が培養中、pH制御される、実施形態319〜321のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態323:培養物が培養中、通気される、実施形態319〜322のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態324:配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO)、又は配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性イリドイドシンターゼ(ISY)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
実施形態325:ヌクレオチド配列が、配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性8HGOをコードする、実施形態324に記載のポリヌクレオチド。
実施形態326:ヌクレオチド配列が、配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ISYをコードする、実施形態324に記載のポリヌクレオチド。
実施形態327:配列同一性が少なくとも95%である、実施形態324〜326のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチド。
実施形態328:配列番号1157〜1307、1778〜1807からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して1つ又は複数のヌクレオチド置換を含むヌクレオチド配列を含む、実施形態324〜327のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチド。
実施形態329:キメラポリヌクレオチドを含む、実施形態324〜328のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチド。
実施形態330:活性8HGOをコードし、配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態327〜329のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチド。
実施形態331:活性ISYをコードし、配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態327〜330のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチド。
実施形態332:実施形態324〜334のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
実施形態333:実施形態332に記載の発現ベクターを含む操作された細胞。
実施形態334:操作された微生物細胞である、実施形態333に記載の操作された細胞。
実施形態335:酵素を産生する方法であって、実施形態333又は実施形態334に記載の操作された細胞を、酵素を発現するのに適切な条件下で培養する工程、又は実施形態324〜331のいずれか一実施形態に記載のポリヌクレオチドを細胞培養において、若しくは無細胞タンパク質合成系において発現させる工程を含む、方法。
実施形態336:配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性8HGOポリペプチド、又は配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ISYポリペプチドを含む、単離されたポリペプチド。
実施形態337:配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性8HGOポリペプチドを含む、実施形態336に記載の単離されたポリペプチド。
実施形態338:配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性ISYポリペプチドを含む、実施形態336に記載の単離されたポリペプチド。
実施形態339:配列同一性が少なくとも95%である、実施形態336〜338のいずれか一実施形態に記載の単離されたポリペプチド。
実施形態340:配列番号330〜368(8HGO)、369〜519、1695〜1724(ISY)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して1つ又は複数のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、実施形態336〜339のいずれか一実施形態に記載の単離されたポリペプチド。
実施形態341:キメラポリペプチドを含む、実施形態336〜340のいずれか一実施形態に記載の単離されたポリペプチド。
実施形態342:実施形態300〜314のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞により発現された8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO)又はイリドイドシンターゼ;及び実施形態336〜340のいずれか一実施形態に記載の単離されたポリペプチド;実施形態265〜278のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞により発現されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS);実施形態297〜299のいずれか一実施形態に記載の単離されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチドからなる群から選択される酵素を酵素についての基質と接触させる工程を含む、方法。
実施形態343:実施形態300〜314のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞により発現された8HGO若しくはイリドイドシンターゼ、又は実施形態336〜340のいずれか一実施形態に記載の単離されたポリペプチドが基質と接触し、基質が、8HGOについての8-オキソゲラニアル又はイリドイドシンターゼについての8-オキソゲラニアルを含む、実施形態342に記載の方法。
実施形態344:前記接触がインビトロ反応混合物中で行われる、実施形態342又は実施形態343に記載の方法。
実施形態345:酵素が、基質との接触前に、細胞培養培地から精製される、実施形態344に記載の方法。
実施形態346:酵素が、実施形態336〜340のいずれか一実施形態に記載の単離されたポリペプチドを含み、前記単離されたポリペプチドが無細胞タンパク質合成系において発現する、実施形態344に記載の方法。
実施形態347:酵素が基質との接触前に精製される、実施形態346に記載の方法。
実施形態348:実施形態265〜278のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞により発現されたネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、又は実施形態297〜299のいずれか一実施形態に記載のネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチドが、8-オキソゲラニアルの還元から生成されたエノールと接触する、実施形態342に記載の方法。
実施形態349:ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)が、実施形態265〜278又は294〜295のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞により発現する、実施形態348に記載の方法。
実施形態350:ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)が、実施形態265又は実施形態294に記載の操作された細胞により発現する、実施形態349に記載の方法。
実施形態351:ネペタラクトールと接触するネペタラクトールシンターゼ(NEPS)が、実施形態265〜278又は294〜295のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞により発現する、実施形態349に記載の方法。
実施形態352:ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)が、インビトロ反応混合物において、8-オキソゲラニアルの還元から生成されたエノールと接触する、実施形態348〜351のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態353:インビトロ反応混合物が、イリドイドシンターゼ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)を追加として含む、実施形態352に記載の方法。
実施形態354:インビトロ反応混合物が、8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ)を追加として含む、実施形態353に記載の方法。
実施形態355:ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)及び/又は、存在するならば、イリドイドシンターゼ若しくは8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼを細胞培養培地から精製して、酵素調製物を作製する工程、並びに酵素調製物を8-ヒドロキシゲラニオール及びNAD+又はNADP+と組み合わせて、インビトロ反応混合物を作製する工程を含む、実施形態352〜354のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態356:ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)及び/又は、存在するならば、イリドイドシンターゼ若しくは8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼを無細胞タンパク質合成系において産生する工程を含む、実施形態352〜354のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態357:ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)及び/又は、存在するならば、イリドイドシンターゼ若しくは8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼを精製して、酵素調製物を作製する工程、並びに酵素調製物をヒドロキシゲラニオール及びNAD+又はNADP+と組み合わせて、インビトロ反応混合物を作製する工程を含む、実施形態356に記載の方法。
実施形態358:ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)が、実施形態297〜299のいずれか一実施形態に記載のネペタラクトールシンターゼ(NEPS)ポリペプチドである、実施形態342〜357のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態359:ネペタラクトールを産生する、実施形態342〜358のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態360:ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、実施形態359に記載の方法。
実施形態361:ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換する工程を追加として含む、実施形態359に記載の方法。
実施形態362:ネペタラクトールをネペタラクトンオキシドレダクターゼ及びNAD+又はNADP+と接触させることにより、ネペタラクトールがネペタラクトンへ変換される、実施形態361に記載の方法。
実施形態363:ネペタラクトンをジヒドロネペタラクトンへ変換する工程を追加として含む、実施形態361又は実施形態362に記載の方法。
実施形態364:ネペタラクトンを水素及び水素付加触媒と接触させることにより、ネペタラクトンがジヒドロネペタラクトンへ変換される、実施形態363に記載の方法。
実施形態365:配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、活性8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO;8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ);配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、活性イリドイドシンターゼ(ISY);及び配列番号718〜774からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、活性ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を含む活性酵素のセットを含む、操作された細胞又は反応混合物。
実施形態366:配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、活性8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO;8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ);配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる活性イリドイドシンターゼ(ISY);及び配列番号1506〜1562からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも60%配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、活性ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を含む活性酵素のセットを含む、操作された細胞又は反応混合物。
実施形態367:活性8HGOが、配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態365又は実施形態366に記載の操作された細胞又は反応混合物。
実施形態368:活性8HGOが、配列番号330〜368からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態365又は実施形態366に記載の操作された細胞又は反応混合物。
実施形態369:活性ISYが、配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態365〜368のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞又は反応混合物。
実施形態370:活性ISYが、配列番号369〜519、1695〜1724からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態365〜368のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞又は反応混合物。
実施形態371:活性NEPSが、配列番号718〜774からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態365〜370のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞又は反応混合物。
実施形態372:活性NEPSが、配列番号718〜774のいずれか1つを含む、実施形態365〜370のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞又は反応混合物。
実施形態373:操作された微生物細胞である、実施形態365〜372のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞又は反応混合物。
実施形態374:ネペタラクトールを産生する能力がある、実施形態373に記載の操作された微生物細胞。
実施形態375:細菌細胞を含む、実施形態374に記載の操作された微生物細胞。
実施形態376:細菌細胞がエシェリキア属又はコリネバクテリウム属の細胞である、実施形態375に記載の操作された微生物細胞。
実施形態377:細菌細胞が、大腸菌又はC.グルタミクムの属及び種の細胞である、実施形態376に記載の操作された微生物細胞。
実施形態378:真菌細胞を含む、実施形態374に記載の操作された微生物細胞。
実施形態379:真菌細胞が酵母細胞を含む、実施形態378に記載の操作された微生物細胞。
実施形態380:酵母細胞がサッカロミセス属又はヤロウイア属の細胞である、実施形態379に記載の操作された微生物細胞。
実施形態381:酵母細胞がS.セレビシエ又はY.リポリティカの属及び種の細胞である、実施形態380に記載の操作された微生物細胞。
実施形態382:実施形態373〜381のいずれか一実施形態に記載の操作された微生物細胞の培養物。
実施形態383:基質が、炭素源、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態382に記載の培養物。
実施形態384:操作された微生物細胞が、その培養物が1〜500の600nmにおける光学密度を有するような濃度で存在し、任意選択的に、光学密度が、細胞を濃縮することなく測定される、実施形態382又は実施形態383に記載の培養物。
実施形態385:ネペタラクトールを含む、実施形態382〜384のいずれか一実施形態に記載の培養物。
実施形態386:ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、培養物が、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、実施形態385に記載の培養物。
実施形態387:実施形態373〜381のいずれか一実施形態に記載の操作された微生物細胞を培養する方法であって、細胞を適切な条件下で培養する工程を含み、それにより、操作された微生物細胞がネペタラクトールを産生する、方法。
実施形態388:1〜100g/Lの範囲での最初の糖レベルを有し、その後、糖のフィードが制御される流加培養を含む、実施形態287に記載の方法。
実施形態389:発酵基質が、糖、並びに尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態287又は実施形態288に記載の方法。
実施形態390:培養物が培養中、pH制御される、実施形態287〜289のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態391:培養物が培養中、通気される、実施形態287〜290のいずれか一実施形態に記載の方法。
実施形態392:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)を追加として含む反応混合物である、実施形態365〜373のいずれか一実施形態に記載の操作された細胞又は反応混合物。
実施形態393:ネペタラクトールを産生する、実施形態392に記載の反応混合物。
実施形態394:実施形態382〜391に記載の培養物又は実施形態392若しくは実施形態393に記載の反応混合物を用いて、ネペタラクトールを産生する方法。
実施形態395:ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換する工程を追加として含む、実施形態394に記載の方法。
実施形態396:ネペタラクトールをネペタラクトンオキシドレダクターゼ及びNAD+又はNADP+と接触させることにより、ネペタラクトールがネペタラクトンへ変換される、実施形態395に記載の方法。
実施形態397:ネペタラクトンをジヒドロネペタラクトンへ変換する工程を追加として含む、実施形態396に記載の方法。
実施形態398:ネペタラクトンを水素及び水素付加触媒と接触させることにより、ネペタラクトンがジヒドロネペタラクトンへ変換される、実施形態397に記載の方法。
実施形態399:ネペタラクトールを含む細胞培養培地であって、ネペタラクトールが(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、細胞培養培地。
実施形態400:実施形態399に記載の細胞培養培地から精製されたネペタラクトール。
実施形態401:インビトロ反応混合物から産生されたネペタラクトールであって、(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールを含み、液体クロマトグラフィー質量分析により検出可能なネペタラクトールのいかなる他の立体異性体も含まない、ネペタラクトール。
実施形態402:実施形態400又は実施形態401に記載のネペタラクトールのネペタラクトンへの変換により産生されたネペタラクトン。
実施形態403:活性酵素をコードする単離されたポリペプチド配列であって、活性酵素が、配列番号789〜927からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS)であり;活性酵素が、配列番号928〜1037からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES)であり;活性酵素が、配列番号1038〜1072、1088〜1110からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H)であり;活性酵素が、配列番号1073〜1087からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR)であり;活性酵素が、配列番号1111〜1117からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5)であり;活性酵素が、配列番号1118〜1156からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO)であり;活性酵素が、配列番号1157〜1307、1778〜1807からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が、イリドイドシンターゼ(ISY)であり;活性酵素が、配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)であり;活性酵素が、配列番号1571〜1576からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がチトクロムB5レダクターゼ(CYB5R)であり;活性酵素が、配列番号1506〜1562からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がネペタラクトールシンターゼ(NEPS)であり;活性酵素が、配列番号1396〜1397、1728〜1777からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がGPPS-GES融合体であり;活性酵素が、配列番号1398〜1462からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がG8H-CPR融合体であり;活性酵素が、配列番号1463〜1481からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がG8H-CPR-CYB5融合体であり;活性酵素が、配列番号1482〜1493からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素が8HGO-ISY融合体であり;又は活性酵素が、配列番号1494〜1505からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、活性酵素がISY-NEPS融合体であり、酵素コードヌクレオチド配列が、配列番号1577〜1633からなる群から選択されるプロモーター配列又は配列番号1634〜1641からなる群から選択されるターミネーター配列と作動可能に連結されている、ポリペプチド配列。
実施形態404:ポリペプチドが微生物宿主細胞において異種性に発現する、実施形態403に記載のポリペプチド配列。
実施形態405:宿主細胞が細菌細胞又は酵母細胞である、実施形態404に記載のポリペプチド配列。
実施形態406:宿主細胞が、ネペタラクトール及び/又はネペタラクトンを産生する能力がある、実施形態404又は実施形態405に記載のポリペプチド配列。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】ネペタラクトン生合成経路における、天然前駆体代謝産物、ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)及びイソペンテニルピロリン酸(IPP)の8-ヒドロキシゲラニオールへの変換を示す図である。
【図１Ｂ】ネペタラクトン生合成経路における、8-ヒドロキシゲラニオールのネペタラクトンへの変換を示す図である。本明細書に記載された研究以前では、エノール中間体のネペタラクトールへの環化が、ISYにより触媒され、又は植物体において自発的に起こると考えられていた。本明細書に記載された研究は、新規な酵素、ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)が、シクラーゼとして作用し、インビトロ及びインビボでこの反応を有意に増強することを示している。加えて、NEPSは、環化の立体化学を制御し、異なるNEPSが、4つの描写されたネペタラクトール立体異性体のいずれか1つを特異的に生成することができる。ネペタラクトールは、以前には特徴付けられていなかったオキシドレダクターゼ(ネペタラクトールオキシドレダクターゼ、NOR)によってネペタラクトンへ変換される。
【図２】図２Ａ。候補ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)によるネペタラクトールのネペタラクトンへの変換を示す図である。実施例1参照。様々な候補NORを発現する細胞由来の清澄化細胞可溶化物において、NAD+(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、NAD)及び/又はNADP+(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、NADP)の存在下で産生されたネペタラクトン。結果は、3つの候補NOR(NcatNOR15、NcatNOR21、及びNcatNOR34)が、ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換し得ることを示している。(実施例2Aにおいて、「uM」は「μM」を指すように用いられている。)図２Ｂ。候補ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)によるネペタラクトールのネペタラクトンへの変換を示す図である。実施例1参照。反応後の残存ネペタラクトールの濃度。結果は、3つの候補NOR(NcatNOR15、NcatNOR21、及びNcatNOR34)が、ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換し得ることを示している。(実施例2Bにおいて、「uM」は「μM」を指すように用いられている。)
【図３】イリドイドシンターゼ(ISY)、NADH、及びNADPHの存在下での8-オキソゲラニオールのネペタラクトールへのインビトロ変換を示す図である。「IS反応  補助因子なし」及び「IS反応  基質なし」についての記号が、N.ムッシーニ(N. mussinii)について重なっている。実施例3参照。
【図４】イリドイドシンターゼ(ISY、IS)、ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)、及びNADPHの存在下での8-オキソゲラニオールのインビトロ変換を示す図である。ニチニチソウ(Catharanthus roseus) ISY del22は、N末端において22個のアミノ酸だけ切り詰められている。(実施例4において、「ug」は「μg」を指すように用いられている。)実施例4参照。
【図５】NAD+及びNADPHの存在下でのネペタ・ムッシーニ(Nepeta mussinii)イリドイドシンターゼ(ISY)及びニチニチソウ(C. roseus)ネペタラクトールシンターゼ(NEPS_1)と連関した8HGOにより8-ヒドロキシゲラニオールのネペタラクトールへのインビトロ変換を示す図である。生成されたネペタラクトールは、液体クロマトグラフィー質量分析によって決定された場合、(4αS,7S,7αR)-ネペタラクトールである(この方法によっては、他の立体異性体は検出されなかった)。(実施例5において、「ug」は「μg」を指すように用いられている。)実施例5参照。
【図６Ａ】操作されたサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株におけるネペタラクトール及びネペタラクトンの産生を示す図である。野生型及び接種されていない対照と比較した、操作された株におけるネペタラクトール及びネペタラクトンの力価。ゲラニオール又は8-ヒドロキシゲラニオールは、基質フィード(feed)(すなわち、炭素源)として500mg/Lの最終濃度で供給された。シス,トランス-ネペタラクトン異性体のみが産生された。
【図６Ｂ】操作された株の株遺伝子型を示す図である。遺伝子欠失は、Δによって示されている。「ihol1」は、そのカセットが中立の遺伝子座、具体的には、HOL1と近位遺伝子の間の遺伝子間領域に組み込まれていることを示す。
【図６Ｃ】操作された株へ導入された遺伝子名及びそれらの対応する源の生物体を示す図である。実施例2参照。
【図７】2μプラスミド(pESC-URA)からNOR候補を発現する操作されたサッカロミセス・セレビシエにおけるネペタラクトールからネペタラクトンの産生を示す図である。実施例6参照。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、微生物宿主においてネペタラクトンの生合成を可能にする。この生合成経路は、グルコース又は他のフィードされた中間体を最終産物、ネペタラクトンへ変換することができる。
【００１２】
ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)のヌクレオチド及びアミノ酸配列もまた、本明細書に記載され、それらは、インビトロで、NAD+又はNADP+の存在下、ネペタラクトールのネペタラクトンへの変換を触媒することが見出された。これらの酵素の同定は、ネペタラクトールからネペタラクトンへの生合成経路を提供する。NORは、ネペタラクトンの産生のためのネペタラクトール経路を有する微生物宿主において異種性に発現し得、又は無細胞系若しくは微生物系において発現して、NAD+若しくはNADP+の存在下でのネペタラクトールのネペタラクトンへの化学酵素的変換のために精製され得る。この生物変換は、工業規模の製造に必要な過程工程の総数を減少させる、化学的変換に代わる、より環境に優しくより安価な代替法を提供する。
【００１３】
定義
特許請求の範囲及び明細書に用いられる用語は、他に規定がない限り、下記に示されたように定義される。
【００１４】
用語「発酵」は、微生物細胞が、いかなる化学的変換工程も必要とすることなく、1つ又は複数の生物学的変換工程を用いて、1つ又は複数の基質を所望の産物へ変換する過程を指すように本明細書で用いられる。
【００１５】
用語「操作された」は、細胞に関して、その細胞が、操作された細胞を天然に存在する細胞から区別する、人によって導入された少なくとも1つの標的化遺伝子変化を含有することを示すように、本明細書で用いられる。
【００１６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を指す。その用語は、天然に存在するアミノ酸重合体に加えて、1個又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸重合体にも適用される。典型的なペプチド/ポリペプチド/タンパク質は、α炭素がペプチド結合を通して連結されているアミノ酸の鎖である。しかしながら、その用語は又、ポリペプチドを構成するアミノ酸を繋ぐ、伝統的なペプチド連結の変型も含む。したがって、鎖の一端(アミノ末端側)における末端のアミノ酸は、遊離のアミノ基を有し、一方、鎖の他端(カルボキシ末端側)における末端のアミノ酸は、遊離カルボキシル基を有する。タンパク質は又、本質的にいかなるポリアミノ酸も含み、そのポリアミノ酸には、アミド結合とは対照的に、エーテルによって繋がれたアミノ酸等のペプチド模倣体が挙げられるが、それらに限定されない。典型的には、本明細書に提供されたタンパク質配列のいずれも、全て、「L」アミノ酸を含む。しかしながら、ある特定の実施形態において、本明細書に提供されたタンパク質配列のいずれかは、「L」及び「D」アミノ酸の組合せを含み得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されたタンパク質配列のいずれかは、全て、「D」アミノ酸を含み、それにより、そのタンパク質のD-鏡像異性体又はインベルソ型を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されたタンパク質配列のいずれかは、逆順序で、アミノ酸が全て「L」アミノ酸であるが、逆順序であるレトロタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されたタンパク質配列のいずれかは、逆順序で、全て「D」アミノ酸で構成されたレトロ-インベルソタンパク質を含む。
【００１７】
本明細書で用いられる場合、用語「アミノ末端」(略語N末端)は、タンパク質のアミノ末端側におけるアミノ酸上の遊離α-アミノ基、又はタンパク質内の任意の他の位置におけるアミノ酸のα-アミノ基(ペプチド結合に関与している場合はイミノ基)を指す。
【００１８】
用語「カルボキシ末端」は、タンパク質のカルボキシ末端上の遊離カルボキシル基、又はタンパク質内の任意の他の位置におけるアミノ酸のカルボキシル基を指す。
【００１９】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」は、例えばゲノムDNA;通常、メッセンジャーRNA(mRNA)の逆転写により、又は増幅により得られる、mRNAのDNA表現である相補DNA(cDNA);合成で、又は増幅により生じたDNA分子;及びmRNAを含む、任意の型のDNA又はRNAを含む。ポリヌクレオチド/オリゴヌクレオチド/核酸は、一本鎖分子に加えて、二本鎖又は三本鎖核酸を包含する。二本鎖又は三本鎖核酸において、核酸鎖は、同一の広がりをもつ必要はない(すなわち、二本鎖核酸は、両方の鎖の全長に沿って二本鎖である必要はない)。ポリヌクレオチド/オリゴヌクレオチド/核酸は又、例えばメチル化及び/又はキャッピングによる、それらの任意の化学修飾を包含する。事例的な修飾には、個々のヌクレオチド塩基への、又は全体としてのポリヌクレオチドへの、追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、及び/又は機能性を組み入れる化学基の付加を挙げることができる。そのような修飾には、2'位の糖修飾、5位のピリミジン修飾、8位のプリン修飾、シトシン環外アミンにおける修飾、5-ブロモ-ウラシルの置換、バックボーン修飾、イソ塩基であるイソシチジン及びイソグアニジン等の普通でない塩基対形成組合せ等が挙げられ得る。ポリヌクレオチド/オリゴヌクレオチド/核酸は、固相媒介性化学合成等の完全化学合成過程から、核酸を産生する任意の種からの単離を通して等の生物学的供給源から、若しくはDNA複製、増幅(例えば、PCR)、逆転写等の分子生物学ツールによる核酸の操作を含む過程から、又はこれらの過程のいずれかの組合せから得ることができる。
【００２０】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して用いられる場合、用語「キメラの」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、天然では単一分子中で一緒には見出されない少なくとも2つの部分配列を含むことを示す。キメラポリペプチドは又、「融合タンパク質」とも呼ばれる。
【００２１】
用語「天然の」は、特定の細胞において天然で存在する、ポリヌクレオチド又はポリペプチド等の細胞成分を指すように本明細書で用いられる。天然ポリヌクレオチド又はポリペプチドはその細胞にとって内因性である。
【００２２】
用語「単離された」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド等の細胞成分又は産物に関して、その細胞成分が、それの天然状態で見出される場合に通常、それに伴う少なくとも1つの他の成分から分離されていることを示すように本明細書で用いられる。この用語は、例えば、天然でそのポリヌクレオチドに通常、隣接する配列から分離されているポリヌクレオチド、及びそれを天然では含有しない細胞へ導入されたポリヌクレオチドを包含する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、細胞成分又は産物は、「精製された」、その「精製された」とは、その細胞成分又は産物が、それの天然状態で見出される場合に通常、それに伴う全ての他の成分/産物を実質的に含まないことを示す。いくつかの実施形態において、細胞成分は、それに通常伴う他の成分が銀染色ゲル上で検出することができないような、均一性へ精製されているタンパク質である。
【００２４】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して用いられる場合、用語「非天然の」は、特定の細胞において天然では存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。
【００２５】
遺伝子が発現される文脈に関して用いられる場合、用語「非天然の」は、遺伝子が天然で発現されるゲノム及び細胞の状況以外の任意の状況で発現された遺伝子を指す。非天然様式で発現された遺伝子は、宿主細胞における対応する遺伝子と同じヌクレオチド配列を有する場合があるが、その天然遺伝子の遺伝子座とは異なる、ベクターから又はゲノムにおける組込み点から発現し得る。
【００２６】
用語「異種性の」は、宿主細胞へ導入されたポリヌクレオチド又はポリペプチドを記載するために本明細書に用いられる。この用語は、宿主細胞のとは異なる生物体、種、又は株に由来した、それぞれ、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを包含する。この場合、異種性ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その同じ宿主細胞に見出されるいかなる配列とも異なる配列を有する。しかしながら、その用語は又、宿主細胞に見出される配列と同じである配列を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドであって、そのポリヌクレオチド又はポリペプチドが、天然配列とは異なる状況で存在する、ポリヌクレオチド又はポリペプチドも包含する(例えば、異種性ポリヌクレオチドは、異なるプロモーターと連結され、天然配列のとは異なるゲノム位置へ挿入され得る)。したがって、「異種性発現」は、宿主細胞にとって非天然である配列の発現、及び宿主細胞にとって天然である配列の非天然状況における発現を包含する。
【００２７】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して用いられる場合、用語「野生型」は、その分子の源に関わらず、天然に存在する生物体由来のポリヌクレオチド又はポリペプチドに存在する配列を有する任意のポリヌクレオチド、又はアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを指し、すなわち、用語「野生型」は、その分子が、天然源から精製されていようが、組換えで発現して、その後精製されていようが、合成されていようが関係なく、配列特性を指す。用語「野生型」は又、天然に存在する細胞を示すために用いられる。
【００２８】
酵素は、本明細書では、それらが触媒する反応により同定され、他に指示がない限り、同定された反応を触媒する能力がある任意のポリペプチドを指す。他に指示がない限り、酵素は、任意の生物体に由来し得、天然型又は変異型アミノ酸配列を有し得る。よく知られているように、酵素は、時々それらが由来する源の生物体に依存して、複数の機能及び/又は複数の名前を有し得る。本明細書で用いられる酵素名は、1つ若しくは複数の追加の機能又は異なる名前を有し得る酵素を含む、オルソログを包含する。
【００２９】
用語「フィードバック脱調節された」は、特定の細胞において、酵素経路の下流産物によって通常、負の調節を受ける(すなわち、フィードバック阻害)酵素に関して、本明細書で用いられる。この文脈において、「フィードバック脱調節された」酵素は、その細胞にとって天然の天然酵素よりフィードバック阻害への感受性がより低い酵素の型である。フィードバック脱調節された酵素は、天然酵素へ1つ又は複数の変異を導入することにより作製され得る。或いは、フィードバック脱調節された酵素は単に、特定の微生物細胞へ導入された場合、その細胞生来の天然酵素ほどフィードバック阻害に感受性ではない、異種性の天然酵素であり得る。いくつかの実施形態において、フィードバック脱調節された酵素は、微生物細胞においてフィードバック阻害を示さない。
【００３０】
用語「ネペタラクトール」は、ネペタラクトールの全ての立体異性体を指し、例えば、(4aS,7S,7aR)-4,7-ジメチル-1,4a,5,6,7,7a-ヘキサヒドロシクロペンタ[c]ピラン-1-オールである。
【００３１】
用語「ネペタラクトン」は、ネペタラクトンの全ての立体異性体を指し、例えば、4,7-ジメチル-5,6,7,7a-テトラヒドロシクロペンタ[c]ピラン-1(4aH)-オン(CAS No. 490-10-8)である。
【００３２】
用語「ジヒドロネペタラクトン」は、ジヒドロネペタラクトンの全ての立体異性体を指し、例えば、(4S,4aR,7S,7aR)-4,7-ジメチル-4,4a,5,6,7,7a-ヘキサヒドロ-3H-シクロペンタ[c]ピラン-1-オンである。
【００３３】
2つ以上のアミノ酸又はヌクレオチド配列の文脈における用語「配列同一性」は、配列比較アルゴリズムを用いて若しくは目視検査により測定される場合、最大の対応のために比較してアラインメントされた時、同じであり、又は同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、2つ以上の配列を指す。
【００３４】
パーセントヌクレオチド又はアミノ酸配列同一性を決定するための配列比較について、典型的には、1つの配列が、「試験」配列が比較される「参照配列」としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列が、コンピュータへ入力され、必要ならば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。その後、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列のアラインメントは、デフォルトパラメータに設定されたBLASTを用いて行うことができる。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「力価」は、反応が行われた体積で割った、反応において生じた生成物の質量を指す。例えば、微生物細胞の培養により生じた生成物の力価を計算するために、生成物の質量を培養体積で割ることができる。細胞可溶化物又は精製酵素を用いるインビトロ反応で生じた生成物について、生成物の質量を反応混合物の体積で割ることにより、力価を計算することができる。
【００３６】
ネペタラクトンを細胞培養物から回収することに関して本明細書で用いられる場合、「回収すること」とは、ネペタラクトンを、細胞培養培地の少なくとも1つの他の成分から分離することを指す。
【００３７】
NORに関して用いられる場合、用語「活性がある」は、ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換する能力があることを意味する。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、ネペタラクトンの「過剰発現」は、参照生物体においてより高いレベルでのネペタラクトンの産生を指す。参照生物体は、例えば、天然ではネペタラクトンを産生する能力がなく、この能力を有するように操作されている生物体であり得る。この産生を増強する更なる操作は、最初の操作された生物体に比べてネペタラクトンを過剰産生する操作された生物体を生じる。
【００３９】
ネペタラクトンの微生物生産のための新規経路
前駆体代謝産物、ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)及びイソペンテニルピロリン酸(IPP)から中間体ゲラニオール二リン酸(ゲラニオール-PP又はGPP)を経て、ネペタラクトンを産生するための経路は、図1に示されている。この経路に関連した酵素に対応する事例的なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、配列表(配列番号1〜1576、1642〜1807)に見出される。配列表は又、いくつかの実施形態において、これらの酵素のいずれかを(例えば、サッカロミセス・セレビシエにおいて)発現するために用いることができる、サッカロミセス・セレビシエ由来の、又は更に操作された、事例的なプロモーター(配列番号1577〜1633)及びターミネーター配列(配列番号1634〜1641)も提供する。宿主細胞(例えば、微生物宿主細胞)においてネペタラクトン経路を再構成するために導入され得る酵素は、その宿主細胞にとって天然である酵素に依存する。いくつかの実施形態において、ネペタラクトンの産生に関与する1つ又は複数の酵素の活性を有する融合ポリペプチドが導入され得る。これらは、以下の酵素のうちの1つ又は複数を含む:
セット1:IPP及びDMAPPをゲラニル二リン酸(GPP)へ縮合する能力がある1つ又は複数のゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS);例えば、配列番号789〜927(ヌクレオチド配列)及び配列番号1〜139(アミノ酸配列)。
セット2:ゲラニル二リン酸(GPP)からゲラニオールを合成する能力がある1つ又は複数のゲラニオールシンターゼ(GES);例えば、配列番号928〜1037(ヌクレオチド配列)及び配列番号140〜249(アミノ酸配列)。
セット3:ゲラニオールをヒドロキシル化して、8-ヒドロキシゲラニオールを形成する能力がある1つ又は複数のゲラニオールヒドロキシラーゼ(G8H又はG10H);例えば、配列番号1038〜1072、1088〜1110(ヌクレオチド配列)及び配列番号250〜284、300〜322(アミノ酸配列)。
セット4:G8Hの酸化還元状態の再生を援助する能力がある1つ又は複数のチトクロムP450レダクターゼ(CPR);例えば、配列番号1073〜1087(ヌクレオチド配列)及び配列番号285〜299(アミノ酸配列)。
セット5:G8Hの酸化還元状態の再生を援助する能力がある1つ又は複数のチトクロム  B5(CYB5又はCytB5);例えば、配列番号1111〜1117(ヌクレオチド配列)及び配列番号323〜329(アミノ酸配列)。
セット6:8-ヒドロキシゲラニオールを8-オキソゲラニオールへ酸化し、続いて、8-オキソゲラニオールを8-オキソゲラニアルへ更に酸化する能力がある1つ又は複数のヒドロキシゲラニオールオキシダーゼ(8HGO;ヒドロキシゲラニオールオキシダーゼ[10HGO]、及びヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼとも呼ばれる)。これらの酵素は、8-ヒドロキシゲラニオールの8-ヒドロキシゲラニアルか又は8-オキソゲラニオールかのいずれかへの酸化、続いて、いずれかの中間体の8-オキソゲラニアルへのその後の酸化を、各当量酸化について補助因子、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)の存在下で、触媒する。例えば、配列番号1118〜1156(ヌクレオチド配列)及び配列番号330〜368(アミノ酸配列)参照。
セット7:8-オキソゲラニアルをネペタラクトールへ環化させる能力がある1つ若しくは複数のイリドイドシンターゼ(IS又はISY)及び/又はこの環化を還元型副生成物形成と共に行う能力がある1つ若しくは複数のIS。イリドイドシンターゼは、補助因子、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)の存在下で、8-オキソゲラニアルの1,4-還元を触媒してエノール中間体を形成する。例えば、配列番号1157〜1307、1778〜1807(ヌクレオチド配列)及び配列番号369〜519、1695〜1724(アミノ酸配列)を参照。エノール中間体は、イリドイドシンターゼにより、又は新しく発見された酵素、ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)により、自発的にネペタラクトールへ環化し得、そのネペタラクトールシンターゼは、下記でより詳細に記載され、例えば、配列番号1506〜1562(ヌクレオチド配列)及び配列番号718〜774(アミノ酸配列)である。いくつかの実施形態において、セット7は、1つ又は複数のNEPS(いくつかの実施形態において、ISに加えて、用いられる)を含み得る。他の実施形態において、複数のNEPSのうちの1つは、別個の酵素のセットに含まれる。
セット8:ネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する能力がある1つ又は複数のネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR);例えば、配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727(ヌクレオチド配列)及び配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644(アミノ酸配列)。
セット9:1つ又は複数のチトクロムB5レダクターゼ(CYB5R);例えば、配列番号1571〜1576(ヌクレオチド配列)及び配列番号783〜788(アミノ酸配列)。
セット10:1つ又は複数のGPPS-GES融合体;例えば、配列番号1396〜1397、1728〜1777(ヌクレオチド配列)、及び配列番号608〜609、1645〜1694(アミノ酸配列)。
セット11:1つ又は複数のG8H-CPR融合体;例えば、配列番号1398〜1462(ヌクレオチド配列)及び配列番号610〜674(アミノ酸配列)。
セット12:1つ又は複数のG8H-CPR-CYB5融合体;例えば、配列番号1463〜1481(ヌクレオチド配列)及び配列番号675〜693(アミノ酸配列)。
セット13:1つ又は複数の8HGO-ISY融合体;例えば、配列番号1482〜1493(ヌクレオチド配列)及び配列番号694〜705(アミノ酸配列)。
セット14:1つ又は複数のISY-NEPS融合体;例えば、配列番号1494〜1505(ヌクレオチド配列)及び配列番号706〜717(アミノ酸配列)。
【００４０】
様々な実施形態において、微生物宿主細胞は、(例えば、実施例2においてサッカロミセス・セレビシエにおいて行われたように)(a)上記のセット8(NOR)からの1つ若しくは複数の酵素;(b)セット7及び8からの1つ若しくは複数の酵素;(c)セット6〜8からの1つ若しくは複数の酵素;(d)セット5〜8からの1つ若しくは複数の酵素;(e)セット4〜8からの1つ若しくは複数の酵素;(f)セット3〜8からの1つ若しくは複数の酵素;(g)セット2〜8からの1つ若しくは複数の酵素;及び/又は(h)セット1〜8からの1つ若しくは複数の酵素を発現するように操作される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、微生物宿主細胞は、前駆体代謝産物からネペタラクトンを生成するための生合成経路からの、又はそれに関与する1つ又は複数の非天然酵素を発現するように操作される。いくつかの実施形態において、前駆体代謝産物からネペタラクトンを生成するための生合成経路は、図1に示された経路を含む。好ましい実施形態において、微生物宿主細胞は、非植物細胞である。いくつかの実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット1〜14のいずれか1つからの1つ又は複数の酵素を発現するように操作される。いくつかの実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット1〜14のいずれか1つ又は複数からの1つ又は複数の酵素を発現するように操作される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット8(NOR)からの1つ又は複数の酵素を発現するように操作される。他の実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット8(NOR)からの1つ又は複数の酵素、及び上記のセット7からのネペタラクトールシンターゼ(NEPS)を発現するように操作される。様々な実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット8(NOR)からの1つ又は複数の酵素、及びNEPS酵素を除く、上記のセット7(ISY)からの1つ又は複数の酵素を含む異種性ポリペプチドを発現するように操作される。他の実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット8(NOR)からの1つ又は複数の酵素、及び1つ又は複数のNEPS酵素を含む、上記のセット7(ISY)からの1つ又は複数の酵素を含む異種性ポリペプチドを発現するように操作される。他の実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット8(NOR)からの1つ又は複数の酵素、1つ又は複数のNEPS酵素を含む、上記のセット7(ISY)からの1つ又は複数の酵素、及び上記のセット6(8HGO)からの1つ又は複数の酵素を含む異種性ポリペプチドを発現するように操作される。他の実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット8(NOR)からの1つ又は複数の酵素、1つ又は複数のNEPS酵素を含む、上記のセット7(ISY)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット6(8HGO)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット3(G8H)からの1つ又は複数の酵素を含む異種性ポリペプチドを発現するように操作される。他の実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット8(NOR)からの1つ又は複数の酵素、1つ又は複数のNEPS酵素を含む、上記のセット7(ISY)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット6(8HGO)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット3(G8H)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット5(CYB5)からの1つ又は複数の酵素を含む異種性ポリペプチドを発現するように操作される。他の実施形態において、微生物宿主細胞は、上記のセット8(NOR)からの1つ又は複数の酵素、1つ又は複数のNEPS酵素を含む、上記のセット7(ISY)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット6(8HGO)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット3(G8H)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット5(CYB5)からの1つ又は複数の酵素、上記のセット4(CPR)からの1つ又は複数の酵素を含む異種性ポリペプチドを発現するように操作される。いくつかの実施形態において、微生物宿主細胞は、前述の実施形態のいずれか一実施形態において発現された酵素に加えて、上記セット1(GPPS)及び/又は上記のセット2(GES)からの1つ又は複数の酵素を更に含む異種性ポリペプチドを発現するように操作される。更に他の実施形態において、微生物宿主細胞は、操作されたポリペプチド(例えば、ISY-NEPS)を含む異種性ポリペプチドを発現するように操作される。そのような操作された(すなわち、融合型)ポリペプチドは、共通の活性を有する異種性非融合型酵素の代わりに、又はそれに加えて、導入され得る。例えば、微生物宿主細胞は、細胞においてISY及び/又はNEPS活性を導入又は補充するために、ISY-NEPSを含む異種性ポリペプチドを発現するように操作され得る。
【００４３】
これらの酵素をコードする事例的なヌクレオチド配列セットは、実施例2、及び本明細書と共に提出された配列表に提供されている。これらの配列を含むこれらのポリヌクレオチド又はそれらのバリアントは、微生物においてネペタラクトン経路を再構成するために有用である。遺伝暗号の縮重のため、コード化タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、1個又は複数のヌクレオチド塩基を置換することは可能である。これらのポリヌクレオチドのバリアントには、例えば、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている配列を有するものが挙げられる。様々な実施形態において、これらのポリヌクレオチドのバリアントには、実施例及び本明細書と共に提出された配列表で言及されたヌクレオチド配列のうちの1つ又は複数と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、又は99パーセント配列同一性を有する配列が挙げられる。
【００４４】
ネペタラクトンオキシドレダクターゼをコードする新規ポリヌクレオチド
実施例1及び6は、活性ネペタラクトールオキシドレダクターゼ(NOR)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの同定及び単離を記載する。試験された及び/又は推定NORをコードするヌクレオチド配列は、添付の配列表に示されており、例えば、配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727である。
【００４５】
これらのポリヌクレオチド又はそれらのバリアントは、NORを産生するために有用である。遺伝暗号の縮重のため、コード化タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、1個又は複数のヌクレオチド塩基を置換することは可能である。NORポリヌクレオチド配列のバリアントには、例えば、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている配列を有するものが挙げられる。様々な実施形態において、NORポリヌクレオチドのバリアントは、配列番号1308〜1395、1563〜1570、1725〜1727のうちの1つ又は複数と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、又は99パーセント配列同一性を有する。
【００４６】
新規のネペタラクトールオキシドレダクターゼポリペプチド
これらのNORポリヌクレオチドについての推定アミノ酸配列は、配列表に提供されており、例えば、520〜607、775〜782、1642〜1644である。実施例1及び6は、NAD+又はNADP+の存在下でネペタラクトールをネペタラクトンへ変換する新規のNORの機能を実証している。
【００４７】
ある特定の実施形態において、アミノ酸の保存的置換等のNORポリペプチド配列の修飾が企図される。様々な実施形態において、1個、2個、3個、4個、5個、又はそれ以上の異なる残基が置換されている。用語「保存的置換」は、その分子の活性を実質的に減少させることがないアミノ酸置換を反映するように用いられる。典型的には、保存的アミノ酸置換は、1個のアミノ酸を、類似した化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する別のアミノ酸の代わりに用いることを含む。以下の6つの、事例ではあるが、非限定的な群はそれぞれ、お互いに対して典型的な保存的置換であるアミノ酸を含有する:1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【００４８】
様々な実施形態において、活性NORは、配列番号520〜607、775〜782、1642〜1644と75パーセントより高い、80パーセントより高い、85パーセントより高い、90パーセントより高い、91パーセントより高い、92パーセントより高い、93パーセントより高い、94パーセントより高い、95パーセントより高い、96パーセントより高い、97パーセントより高い、98パーセントより高い、又は99パーセントより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００４９】
ネペタラクトールシンターゼをコードする新規ポリヌクレオチド
実施例4は、活性ネペタラクトールシンターゼ(NEPS)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの同定及び単離を記載する。試験された及び/又は推定NEPSをコードするヌクレオチド配列は、添付の配列表に示されており、例えば、配列番号1506〜1562である。
【００５０】
これらのポリヌクレオチド又はそれらのバリアントは、NEPSを産生するために有用である。遺伝暗号の縮重のため、コード化タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、1個又は複数のヌクレオチド塩基を置換することは可能である。NEPSポリヌクレオチド配列のバリアントには、例えば、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている配列を有するものが挙げられる。様々な実施形態において、NEPSポリヌクレオチドのバリアントは、配列表に示されたヌクレオチド配列、例えば、配列番号1506〜1562のうちの1つ又は複数と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、又は99パーセント配列同一性を有する。
【００５１】
新規のネペタラクトールシンターゼポリペプチド
これらのNEPSについての推定アミノ酸配列もまた、配列表(配列番号718〜774)に提供されている。実施例4は、イリドイドシンターゼ(ISY)及びNADPHの存在下で、8-オキソゲラニアルをネペタラクトールへ変換する新規NEPSの機能を実証する(図5参照)。様々な実施形態において、NEPSの存在は、ネペタラクトール産生を少なくとも5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、若しくは50倍、又はそれ以上、増加させる。いくつかの実施形態において、ネペタラクトール産生の増加は、100倍未満、75倍未満、又は50倍未満である。特定の実施形態において、ネペタラクトール産生の増加は、これらの値のいずれかを境界とする範囲内、例えば、5倍〜50倍又は10倍〜40倍等に入る。
【００５２】
ある特定の実施形態において、アミノ酸の保存的置換等のNEPSポリペプチド配列の修飾が企図される。様々な実施形態において、1個、2個、3個、4個、5個、又はそれ以上の異なる残基が置換されている。用語「保存的置換」は、その分子の活性を実質的に減少させることがないアミノ酸置換を反映するように用いられる。典型的には、保存的アミノ酸置換は、1個のアミノ酸を、類似した化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する別のアミノ酸の代わりに用いることを含む。以下の6つの、事例ではあるが、非限定的な群はそれぞれ、お互いに対して典型的な保存的置換であるアミノ酸を含有する:1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【００５３】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列表、例えば、配列番号718〜774に示された配列と75パーセントより高い、80パーセントより高い、85パーセントより高い、90パーセントより高い、91パーセントより高い、92パーセントより高い、93パーセントより高い、94パーセントより高い、95パーセントより高い、96パーセントより高い、97パーセントより高い、98パーセントより高い、又は99パーセントより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性NEPSをコードする。
【００５４】
8-ヒドロキシゲラニアルのネペタラクトールへの生合成変換のための新規経路
いくつかの実施形態において、天然前駆体代謝産物、ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)及びイソペンテニルピロリン酸(IPP)のネペタラクトール、及び任意選択的にネペタラクトンへの生合成変換のための酵素は、ネペタラクトール/ネペタラクトン産生に用いられる。天然前駆体代謝産物、ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)及びイソペンテニルピロリン酸(IPP)からネペタラクトールを産生するための経路は、図1に示されている。宿主細胞(例えば、微生物宿主細胞)においてネペタラクトン経路を再構成するために導入され得る酵素は、その宿主細胞にとって天然である酵素に依存する。これらは、以下の酵素のうちの1つ又は複数を含むことができる:
本明細書に記載された任意の8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO;ヒドロキシゲラニオールオキシダーゼ[10HGO]、及びヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼとも呼ばれる)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のイリドイドシンターゼ(IS又はISY)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のネペタラクトールシンターゼ(NEPS)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のネペタラクトンオキシドレダクターゼ(NOR)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のゲラニオールシンターゼ(GES)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のゲラニオールヒドロキシラーゼ(G8H又はG10H)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のチトクロムP450レダクターゼ(CPR)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のチトクロムB5(CYB5又はCytB5)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のチトクロムB5レダクターゼ(CYB5R又はCYBR)若しくはそれの融合体;
本明細書に記載された任意のGPPS-GES融合体若しくはそれの更なる融合体;
本明細書に記載された任意のG8H-CPR融合体若しくはそれの更なる融合体;
本明細書に記載された任意のG8H-CPR-CYB5融合体若しくはそれの更なる融合体;
本明細書に記載された任意の8HGO-ISY融合体若しくはそれの更なる融合体;及び/又は
本明細書に記載された任意のISY-NEPS融合体若しくはそれの更なる融合体。
【００５５】
これらの酵素は、上記の酵素(例えば、8HGO、ISY、NEP、NOR)の1つ又は複数が、それぞれ、ネペタラクトール又はネペタラクトン形成に必要とされる残りの既知の酵素と同時発現する場合、宿主細胞(例えば、微生物宿主細胞)においてネペタラクトール又はネペタラクトンの生合成を可能にする。上記酵素のうちの1つ又は複数を発現する宿主細胞は、その細胞においてネペタラクトール又はネペタラクトンを生成するためにグルコース及び/又は経路における中間体(例えば、8-ヒドロキシゲラニオール及び/又はゲラニオール)と共に供給され得る。これらの酵素は又、8-ヒドロキシゲラニオール及び/又はゲラニオール及び前述の補助因子が、その酵素のそれぞれの1つ又は複数を含有する酵素調製物へ加えられる場合、化学酵素的過程に用いることもできる。これらの酵素は、例えば、宿主細胞における異種性発現、その後、細胞溶解及び任意選択のタンパク質精製の工程により、又は無細胞発現、その後の任意選択のタンパク質精製の工程により、取得することができる。ネペタラクトンを産生するための完全経路に関して、上記で論じられた配列に加えて、これらの酵素についての事例的なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、配列表に見出される(配列番号1〜788、1642〜1724)。
【００５６】
ネペタラクトン経路酵素を発現するための宿主細胞の操作
本明細書に記載されたポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドと天然では連結していないヌクレオチド配列を付加して、キメラポリヌクレオチドを形成することにより、修飾することができる。例えば、実施例に例証されているように、ネペタラクトン経路酵素(NPE)をコードするポリヌクレオチドを、プロモーター、リボソーム結合配列(RBS)、及び下流ターミネーター配列と連結して、ベクターへ導入することができる発現構築物を作製することができる。多くの場合、ベクターは、宿主細胞において発現を促進する配列を提供する。
【００５７】
ベクター
ベクターは、遺伝物質を細胞へ導入するために用いられるポリヌクレオチドの乗り物である。本明細書に記載された方法に有用なベクターは、直鎖状又は環状であり得る。ベクターは、宿主細胞の標的ゲノムへ統合され得、又は宿主細胞において独立して複製され得る。多くの適用について、安定な形質転換体を生じる組込みベクターが好ましい。ベクターは、例えば、複製起点、マルチプルクローニング部位(MCS)、及び/又は選択マーカーを含み得る。発現ベクターは、典型的には、特定の宿主細胞においてポリヌクレオチド配列(多くの場合、コード配列)の発現を促進する調節エレメントを含有する発現カセットを含む。ベクターには、組込みベクター、原核生物プラスミド、エピソーム、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５８】
発現カセットに用いられ得る事例的な調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位(IRES)、及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリU配列等の転写終結シグナル)が挙げられる。そのような調節エレメントは、例えば、Goeddel、Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif. (1990)に記載されている。
【００５９】
宿主細胞
操作された遺伝子を発現するために用いることができる任意の宿主細胞を、本明細書に記載されたNPEのいずれかを発現するように操作することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は非植物細胞である。適切な宿主細胞には、微生物細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、微生物は、天然ではネペタラクトンを発酵生産する能力がない微生物である。特定の実施形態において、微生物は、天然でネペタラクトールを産生する能力がある微生物、又は本明細書に記載されているように、ネペタラクトールを産生するように操作されている微生物である。いくつかの実施形態において、微生物は、例えば、目的の化合物の発酵生産における宿主細胞として有用であることが知られた微生物等の、容易に培養される微生物である。グラム陽性又はグラム陰性細菌を含む細菌細胞は、本明細書に記載されているように、操作することができる。例には、C.グルタミクム細胞に加えて、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilus)、B.リケニフォルミス(B. licheniformis)、B.レンタス(B. lentus)、B.ブレービス(B. brevis)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B.アルカロフィルス(B. alkalophilus)、B.アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B.クラウシイ(B. clausii)、B.ハロデュランス(B. halodurans)、B.メガテリウム(B. megaterium)、B.コアグランス(B. coagulans)、B.サークランス(B. circulans)、B.ロータス(B. lautus)、B.チューリンギエンシス(B. thuringiensis)、S.アルブス(S. albus)、S.リビダンス(S. lividans)、S.コエリカラー(S. coelicolor)、S.グリセウス(S. griseus)、シュードモナス種(Pseudomonas sp.)、P.アルカリゲネス(P. alcaligenes)、P.シトレア(P. citrea)、ラクトバチルス種(Lactobacilis spp.)(L.ラクチス(L. lactis)、L.プランタルム(L. plantarum)等)、L.グレイー(L. grayi)、大腸菌(E. coli)、E.フェシウム(E. faecium)、E.ガリナルム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)、及び/又はE.フェカーリス(E. faecalis)細胞が挙げられる。
【００６０】
本明細書に記載された方法において微生物宿主細胞として用いることができる多数の型の嫌気性細胞がある。いくつかの実施形態において、微生物細胞は、偏性嫌気性細胞である。偏性嫌気性菌は、典型的には、酸素が存在する条件下では、たとえ増殖したとしても、十分には増殖しない。少量の酸素が存在してもよいこと、すなわち、偏性嫌気性菌が低レベルの酸素に対して有するいくらかのレベルの許容度があることは理解されるべきである。本明細書に記載されているように操作される偏性嫌気性菌は、存在する酸素の量がその嫌気性菌の増殖、維持、及び/又は発酵に有害ではない、実質的に酸素を含まない条件下で増殖することができる。
【００６１】
或いは、本明細書に記載された方法に用いられる微生物宿主細胞は、通性嫌気性菌細胞であり得る。通性嫌気性菌は、酸素が存在する場合には、好気性呼吸(例えば、TCAサイクルの利用)によって細胞ATPを生成することができる。しかしながら、通性嫌気性菌は又、酸素の非存在下でも増殖することができる。本明細書に記載されているように操作される通性嫌気性菌は、存在する酸素の量がその嫌気性菌の増殖、維持、及び/若しくは発酵に有害ではない実質的に酸素を含まない条件下で増殖することができ、又は代替として、より高い酸素量の存在下で増殖することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法に用いられる微生物宿主細胞は糸状真菌細胞である。(例えば、Berka & Barnett、Biotechnology Advances、(1989)、7(2):127〜154頁参照)。例には、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、T.ビリデ(T. viride)、T.コニンギー(T. koningii)、T.ハルチアナム(T. harzianum)、ペニシリウム種(Penicillium sp.)、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)、H.ラヌギノセ(H. lanuginose)、H.グリセア(H. grisea)、クリソスポリウム種(Chrysosporium sp.)、C.ルクノウェンス(C. lucknowense)、グリオクラディウム種(Gliocladium sp.)、アスペルギルス種(Aspergillus sp.)(A.オリゼ(A. oryzae)、A.ニガー(A. niger)、A.ソーヤ(A. sojae)、A.ジャポニクス(A. japonicus)、A.ニデュランス(A. nidulans)、又はA.アワモリ(A. awamori)等)、フザリウム種(Fusarium sp.)(F.ロゼウム(F. roseum)、F.グラミナム(F. graminum)、F.セレアリス(F. cerealis)、F.オキシスポルム(F. oxysporum)、又はF.ベネナタム(F. venenatum)等)、ニューロスポラ種(Neurospora sp.)(N.クラッサ(N. crassa)又はヒポクレア種(Hypocrea sp.)等)、ムコール種(Mucor sp.)(M.ミーヘイ(M. miehei)等)、リゾプス種(Rhizopus sp.)、及びエメリセラ種(Emericella sp.)細胞が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書に記載されているように操作される真菌細胞は、A.ニデュランス、A.アワモリ、A.オリゼ、A.アクレアトウス(A. aculeatus)、A.ニガー、A.ジャポニクス、T.リーセイ(T. reesei)、T.ビリデ、F.オキシスポルム、又はF.ソラニ(F. solani)である。そのような宿主と共に用いられる事例的なプラスミド又はプラスミド成分には、米国特許出願公開第2011/0045563号に記載されたものが挙げられる。
【００６３】
酵母も又、本明細書に記載された方法において微生物宿主細胞として用いることができる。例には、サッカロミセス種、シゾサッカロミセス種(Schizosaccharomyces sp.)、ピキア種(Pichia sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・スティピティス(Pichia stipites)、クリュイベロミセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クリュイベロミセス種(Kluyveromyces spp.)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、及びカンジダ種(Candida sp.)が挙げられる。いくつかの実施形態において、サッカロミセス種はS.セレビシエである(例えば、Romanosら、Yeast、(1992)、8(6):423〜488頁参照)。そのような宿主と共に用いられる事例的なプラスミド又はプラスミド成分は、米国特許第7,659,097号及び米国特許出願公開第2011/0045563号に記載されたものが挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、例えば、緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ藻、クロミスタ、又は渦鞭毛藻に由来した藻類細胞であり得る(例えば、Saunders & Warmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast」、(1993)、National Agricultural Library、Beltsville、Md.参照)。藻類細胞において用いられる事例的なプラスミド又はプラスミド成分は、米国特許出願公開第2011/0045563号に記載されたものが挙げられる。
【００６５】
他の実施形態において、宿主細胞は、形態に基づいて以下の群のいずれかに分類されるシアノバクテリア等のシアノバクテリアである:クロロコックム目(Chlorococcales)、プレウロカプサ目(Pleurocapsales)、ユレモ目(Oscillatoriales)、ネンジュモ目(Nostocales)、シネコシスティス属(Synechosystis)、又はスチゴネマ目(Stigonematales)(例えば、Lindbergら、Metab.Eng、(2010)12(1):70〜79頁参照)。シアノバクテリア細胞において用いられる事例的なプラスミド又はプラスミド成分は、米国特許出願公開第2010/0297749号及び第2009/0282545号、並びに国際特許公開第2011/034863号に記載されたものが挙げられる。
【００６６】
遺伝子操作方法
微生物細胞は、本明細書に記載されたNPEのいずれかを発現するように、及び任意選択的に、発酵ネペタラクトン産生のために、当業者の能力の範囲内である(組換え技術を含む)分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び生化学の通常の技術を用いて、操作することができる。そのような技術は、文献に十分、説明されており、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第4版(Sambrookら、2012);「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、1984);「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R. I. Freshney編、第6版、2010);「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.);「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987及び定期的更新);「PCR: The Polymerase Chain Reaction」、(Mullisら編、1994);Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology  第2版、J. Wiley & Sons(New York、N.Y. 1994)を参照されたい。
【００６７】
ベクター又は他のポリヌクレオチドが、形質転換、コンジュケーション、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション(例えば、リポフェクション媒介性若しくはDEAE-デキストラン(Dextrin)媒介性トランスフェクション、又は組換えファージウイルスを用いるトランスフェクション)、リン酸カルシウムDNA沈殿物とのインキュベーション、DNAコーティング化微粒子での高速砲撃、及びプロトプラスト融合等の様々な標準方法のいずれかによって微生物細胞へ導入することができる。形質転換体は、当技術分野において知られた任意の方法によって選択することができる。形質転換体を選択するための適切な方法は、米国特許出願公開第2009/0203102号、第2010/0048964号、及び第2010/0003716号、並びに国際特許公開第2009/076676号、第2010/003007号、及び第2009/132220号に記載されている。
【００６８】
実施例1〜3、6は、大腸菌及びサッカロミセス・セレビシエ細胞においてNOR及びNEPSを同定及び発現するための事例的なアプローチを記載する。
【００６９】
ネペタラクトン経路酵素を発現するように操作された細胞
上記の方法は、本明細書に記載されたもの等の1つ又は複数の異種性NPEを発現する操作された宿主細胞を作製するために用いることができる。好ましい実施形態において、操作された宿主細胞は、非植物細胞である。いくつかの実施形態において、NORが発現し、その後、ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換するために用いられる。この場合、操作された宿主細胞は、ネペタラクトールを産生する必要はなく、ネペタラクトールは、NAD+及び/又はNADP+と共に、(例えば、培養培地中の、細胞可溶化物中の、又は精製された)発現されたNORへ別途、供給され得る。
【００７０】
他の実施形態において、操作された宿主細胞は、ネペタラクトンを産生し、ある特定の実施形態においては過剰産生する。いくつかの実施形態において、非植物細胞は、ネペタラクトンを産生又は過剰産生するように操作される。特定の実施形態において、非植物細胞は、微生物細胞であり、議論の簡便さのために、以下の説明は、微生物細胞に焦点を当てる(とは言え、以下の考察が、同様に非微生物細胞に当てはまることを、当業者は容易に理解している)。いくつかの実施形態において、微生物細胞は、イソペンチル二リン酸(IPP)及びジメチルアリル二リン酸(DMAPP)を産生する微生物細胞である。そのような細胞は、その微生物細胞にとって天然ではない以下の酵素のいずれかを発現することによりネペタラクトンを産生するように操作することができる:例えば、上記で「ネペタラクトンの微生物生産のための新規経路」と題したセクションにおいて記載されているように、ゲラニオール二リン酸シンターゼ(GPPS)、ゲラニル二リン酸ジホスファターゼ(ゲラニオールシンターゼ、GES)、ゲラニオール8-ヒドロキシラーゼ(G8H)、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムP450レダクターゼ(CPR)、G8Hの酸化還元状態の再生を促進する能力があるチトクロムB5(CYB5)、8-ヒドロキシゲラニオールデヒドロゲナーゼ(8HGO)、イリドイドシンターゼ(ISY)、及び/又はNOR(「発酵による(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールの生産のための操作された生合成経路」という発明の名称である共同所有の国際特許出願第PCT/US18/64351号もまた参照。その特許出願は、(6E)-8-ヒドロキシゲラニオールを産生するイリドイド合成経路の遺伝子操作のそれの記載のために、全体として、具体的に、参照により組み入れられる)。
【００７１】
操作された微生物細胞は、本明細書に記載された微生物宿主細胞のいずれか等の天然微生物細胞と比較して、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、又はそれ以上の遺伝子変化を有し得る。当業者は、本明細書に示されたガイダンスに従って、追加の変化を有する微生物細胞を設計することができる。追加の遺伝子変化は、例えば、ネペタラクトンをもたらす生合成経路において上流酵素の活性を増加させること、(例えば、ネペタラクトン以外の産物をもたらす「副次的経路」による)前駆体化合物の消費を低下させること、又はフィードバック阻害を低下させることにより、ネペタラクトン産生を増加させるように導入することができる。いくつかの実施形態において、操作された微生物細胞は、天然微生物細胞と比較して、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、又は4個以下の遺伝子変化を有する。様々な実施形態において、ネペタラクトン産生のために操作された微生物細胞は、以下の事例的な範囲のいずれかの内に入る数の遺伝子変化を有し得る:1〜20個、2〜19個、3〜18個、4〜17個、5〜16個、6〜15個、7〜14個、7〜13個、7〜12個、又は7〜11個等。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法及び/又は操作された微生物は、細胞可溶化物又は培養培地の少なくとも約0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.10g/L、0.20g/L、0.30g/L、0.40g/L、0.50g/L、0.60g/L、0.70g/L、0.80g/L、0.90g/L、1.00g/L、2.00g/L、3.00g/L、4.00g/L、5.00g/L、6.00g/L、7.00g/L、8.00g/L、9.00g/L、10.00g/L、20.00g/L、30.00g/L、40.00g/L、又は50.00g/Lのレベルでネペタラクトン及び/又はネペタラクトールを産生する能力がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法及び/又は操作された微生物は、細胞可溶化物又は培養培地の多くとも約0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.10g/L、0.20g/L、0.30g/L、0.40g/L、0.50g/L、0.60g/L、0.70g/L、0.80g/L、0.90g/L、1.00g/L、2.00g/L、3.00g/L、4.00g/L、5.00g/L、6.00g/L、7.00g/L、8.00g/L、9.00g/L、10.00g/L、20.00g/L、30.00g/L、40.00g/L、又は50.00g/Lのレベルでネペタラクトン及び/又はネペタラクトールを産生する能力がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法及び/又は操作された微生物は、細胞可溶化物又は培養培地の約0.01-50.00g/L、0.05〜40.00g/L、0.10〜30.00g/L、0.15〜20.00g/L、0.20〜10.00g/L、0.30〜10.00g/L、0.40〜10.00g/L、0.50〜10.00g/L、0.60〜10.00g/L、0.70〜10.00g/L、0.80〜10.00g/L、0.90〜10.00g/L、1.00〜10.00g/L、2.00〜10.00g/L、3.00〜10.00g/L、4.00〜10.00g/L、5.00〜10.00g/L、0.20〜5.00g/L、0.30〜5.00g/L、0.40〜5.00g/L、0.50〜5.00g/L、0.60〜5.00g/L、0.70〜5.00g/L、0.80〜5.00g/L、0.90〜5.00g/L、1.00〜5.00g/L、2.00〜5.00g/L、3.00〜5.00g/L、0.20〜3.00g/L、0.30〜3.00g/L、0.40〜3.00g/L、0.50〜3.00g/L、0.60〜3.00g/L、0.70〜3.00g/L、0.80〜3.00g/L、0.90〜3.00g/L、1.00〜3.00g/L、2.00〜3.00g/L、0.20〜2.00g/L、0.30〜2.00g/L、0.40〜2.00g/L、0.50〜2.00g/L、0.60〜2.00g/L、0.70〜2.00g/L、0.80〜2.00g/L、0.90〜2.00g/L、又は1.00〜2.00g/Lの間のレベルでネペタラクトン及び/又はネペタラクトールを産生する能力がある。
【００７３】
様々な実施形態において、操作された微生物細胞におけるNORの発現は、細胞可溶化物若しくは(例えば、NORが分泌される場合には)培養培地の少なくとも10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、若しくは900μM、又は細胞可溶化物若しくは培養培地の少なくとも1mM、10mM、50mM、75mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、若しくは900mM、又は細胞可溶化物若しくは培養培地の少なくとも1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M、5M、若しくは10Mのレベルでのネペタラクトンの産生を(ネペタラクトール並びにNAD+及び/又はNADP+の存在下で)可能にする(50μMネペタラクトンは8.31mg/Lと同等である)。様々な実施形態において、レベルは、10μM〜10M、25μM〜5M、50μM〜4M、75μM〜3M、100μM〜2Mの範囲、又は上記で列挙された値のいずれかを境界とする任意の範囲である。
【００７４】
操作された微生物細胞の培養
本明細書に記載された微生物細胞のいずれかを、例えば、維持、増殖、及び/又はネペタラクトン産生のために、培養することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、培養物は、50〜150の光学密度等の10〜500の600nmにおける光学密度へ増殖される。好ましい実施形態において、光学密度は、細胞を濃縮することなく測定される。
【００７６】
様々な実施形態において、培養物は、ネペタラクトンを、(NORが分泌される場合で、培養物がネペタラクトール及びNAD+又はNADP+を含む場合には)培養培地の少なくとも10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、若しくは900μM、又は培養培地の少なくとも1mM、10mM、50mM、75mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、若しくは900mM、又は培養培地の少なくとも1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M、5M、若しくは10Mのレベルで含む。様々な実施形態において、レベルは、10μM〜10M、25μM〜5M、50μM〜4M、75μM〜3M、100μM〜2Mの範囲、又は上記で列挙された値のいずれかを境界とする任意の範囲である。
【００７７】
培養培地
微生物(及び他の)細胞は、非限定的に、最少培地、すなわち、細胞増殖が可能である最少栄養分を含有するものを含む、任意の適切な培地中で培養することができる。最少培地は、典型的には、(1)微生物増殖のための炭素源、(2)特定の微生物細胞及び増殖条件に依存し得る塩、並びに(3)水を含有する。適切な培地は又、以下の任意の組合せを含み得る:増殖及び産物形成のための窒素源、増殖のためのイオウ源、増殖のためのリン酸源、増殖のための金属塩、増殖のためのビタミン、並びに増殖のための他の補助因子。
【００７８】
宿主細胞を培養するために任意の適切な炭素源を用いることができる。用語「炭素源」は、微生物細胞によって代謝され得る1つ又は複数の炭素含有化合物を指す。様々な実施形態において、炭素源は、炭水化物(例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖)又は転化糖(例えば、酵素処理されたスクロースシロップ)である。事例的な単糖には、グルコース(デキストロース)、フルクトース(左旋糖)、及びガラクトースが挙げられ、事例的なオリゴ糖には、デキストラン又はグルカンが挙げられ、事例的な多糖には、デンプン及びセルロースが挙げられる。適切な糖には、C6糖(例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース)及びC5糖(例えば、キシロース又はアラビノース)が挙げられる。他のより安価な炭素源には、サトウキビジュース、ビートジュース、ソルガムジュース等が挙げられ、それらのいずれも、必要なわけではないが、完全に又は部分的に脱イオン化され得る。
【００７９】
培養培地中の塩は、一般的に、細胞がタンパク質及び核酸を合成するのを可能にするために、マグネシウム、窒素、リン、及びイオウ等の必須元素を提供する。
【００８０】
最少培地は、抗生物質等の1つ又は複数の選択剤を追加され得る。
【００８１】
ネペタラクトンを産生するために、培養培地は、グルコース、及び/又は尿素、アンモニウム塩、アンモニア、若しくはそれらの組合せ等の窒素源を含み得、及び/又は培養中、それらを追加される。いくつかの実施形態において、培養培地は、例えば、図1に示されているように、ネペタラクトン生合成経路の任意の炭素源を含み、及び/又は含むように追加される。いくつかの実施形態において、培養培地は、ゲラニオール及び/又は8-ヒドロキシゲラニオールを含み、及び/又は含むように追加される。いくつかの実施形態において、培養培地は、ネペタラクトン生合成経路の任意の炭素源を約0.1〜100g/Lの範囲で含み、及び/又は含むように追加される。
【００８２】
培養条件
微生物(及び他の)細胞の維持及び増殖に適した材料及び方法は当技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許出願公開第2009/0203102号、第2010/0003716号、及び第2010/0048964号、並びに国際特許公開第2004/033646号、第2009/076676号、第2009/132220号、及び第2010/003007号、Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtら編)、American Society for Microbiology、Washington、D.C. (1994)、又はBrock、Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.、Sunderland、Mass.を参照。
【００８３】
一般的に、細胞は、適切な温度、気体混合物、及びpH(例えば、約20℃〜約37℃、約6%〜約84% CO2、及び約5〜約9の間のpH)で増殖及び維持される。いくつかの態様において、細胞は35℃で増殖される。好熱性細菌が宿主細胞として用いられる場合等のある特定の実施形態において、より高い温度(例えば、50℃〜75℃)が用いられ得る。いくつかの態様において、発酵のためのpH範囲は、pH約5.0〜約9.0(例えば、pH約6.0〜約8.0、又は約6.5〜約7.0)の間である。細胞は、特定の細胞の必要条件に基づいて、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で増殖することができる。
【００８４】
用いることができる標準培養条件、及び回分発酵、流加発酵、又は連続発酵等の発酵の様式は、米国特許出願公開第2009/0203102号、第2010/0003716号、及び第2010/0048964号、並びに国際特許公開第2009/076676号、第2009/132220号、及び第2010/003007号に記載されている。回分発酵及び流加発酵は、一般的であり、当技術分野においてよく知られており、例は、Brock、Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.に見出すことができる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、細胞は、限定された糖(例えば、グルコース)条件下で培養される。様々な実施形態において、加えられる糖の量は、細胞によって消費され得る糖の量の約105%以下(例えば、約100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、又は10%)である。特定の実施形態において、培養培地へ加えられる糖の量は、特定の期間中に細胞によって消費される糖の量とおよそ同じである。いくつかの実施形態において、細胞増殖速度は、細胞が細胞培地における糖の量によって支えられ得る速度で増殖するように、加えられる糖の量を限定することにより制御される。いくつかの実施形態において、糖は、細胞が培養される時間中、蓄積されない。様々な実施形態において、細胞は、約1時間以上、約2時間以上、約3時間以上、約5時間以上、約10時間以上、約15時間以上、約20時間以上、約25時間以上、約30時間以上、約35時間以上、約40時間以上、約50時間以上、約60時間以上、若しくは約70時間以上、又は更に約5〜10日間の間、限定された糖条件下で培養される。様々な実施形態において、細胞は、細胞が培養される合計時間の約5%以上、約10%以上、約15%以上、約20%以上、約25%以上、約30%以上、約35%以上、約40%以上、約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上、約95%以上、又は約100%以上の間、限定された糖条件下で培養される。いかなる特定の理論によっても縛られるつもりはないが、限定された糖条件が、細胞のより都合良い調節を可能にし得ると考えられる。
【００８６】
いくつかの態様において、細胞は回分培養で増殖される。細胞は又、流加培養又は連続培養で増殖させることができる。追加として、細胞は、最少培地で培養することができ、その最少培地には、上記の最少培地のいずれかが挙げられるが、それらに限定されない。最少培地は、1.0%(w/v)以下のグルコース(又は任意の他の6炭糖)を更に追加することができる。具体的には、最少培地は、1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、又は0.1%(w/v)のグルコースを追加することができる。いくつかの培養において、有意により高いレベル、例えば、少なくとも10%(w/v)、20%(w/v)、30%(w/v)、40%(w/v)、50%(w/v)、60%(w/v)、70%(w/v)、又は培地中の糖についての溶解限度までの糖(例えば、グルコース)が用いられる。いくつかの実施形態において、糖レベルは、上記の値のいずれか2つの範囲、例えば、0.1〜10%(w/v)、1.0〜20%(w/v)、10〜70%(w/v)、20〜60%(w/v)、又は30〜50%(w/v)内に入る。更に、異なる糖レベルが、培養の異なる相に用いられ得る。(例えば、大腸菌、S.セレビシエ、又はC.グルタミクムの)流加培養について、糖レベルは、バッチ相において約100〜200g/L(10〜20%(w/v))、その後、約500〜700g/L(フィードにおいて50〜70%)までであり得る。
【００８７】
追加として、最少培地に、0.1%(w/v)以下の酵母抽出物を追加することができる。具体的には、最少培地に、0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、又は0.01%(w/v)の酵母抽出物を追加することができる。或いは、最少培地に、1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、又は0.1%(w/v)のグルコース、及び0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、又は0.02%(w/v)の酵母抽出物を追加することができる。いくつかの培養において、有意により高いレベル、例えば、少なくとも1.5%(w/v)、2.0%(w/v)、2.5%(w/v)、又は3%(w/v)の酵母抽出物を用いることができる。いくつかの(例えば、大腸菌、S.セレビシエ、又はC.グルタミクムの)培養において、酵母抽出物レベルは、上記の値のいずれか2つの範囲、例えば、0.5〜3.0%(w/v)、1.0〜2.5%(w/v)、又は1.5〜2.0%(w/v)内に入る。
【００８８】
本明細書に記載された操作された微生物細胞の維持及び増殖に適した事例的な材料及び方法は、下記の実施例1及び2に見出すことができる。
【００８９】
ネペタラクトール又はネペタラクトン及びネペタラクトン生合成経路の酵素の、細胞に基づいた産生及び回収
本明細書に記載された方法のいずれも、本明細書に記載されているようなネペタラクトン生合成経路の酵素(例えば、NOR)を回収する工程、又はそれを生じる培養物において、ネペタラクトンを回収する工程を更に含み得る。いくつかの実施形態において、ネペタラクトン生合成経路の上流産物、例えば、ネペタラクトールが回収される。ネペタラクトン生合成経路の酵素(例えば、NOR)又はネペタラクトンが細胞内に産生されて、分泌されない、いくつかの実施形態において、細胞が回収され、ネペタラクトン生合成経路の酵素(例えば、NOR)又はネペタラクトンを含有する細胞可溶化物が作製される。ネペタラクトン生合成経路の酵素(例えば、NOR)が分泌され、ネペタラクトンが細胞の外側で生成される、いくつかの実施形態において、ネペタラクトン生合成経路の酵素(例えば、NOR)及び/又はネペタラクトンが回収される。ネペタラクトン生合成経路の酵素(例えば、NOR)及びネペタラクトンが細胞内に産生され、ネペタラクトンが分泌される、いくつかの実施形態において、ネペタラクトンが回収される。いずれの場合でも、いわゆる収穫流(harvest stream)を製造容器から回収/収穫することができる。収穫流は、例として、製造容器から来た細胞含有水溶液又は無細胞水溶液を含み得る。いくつかの実施形態において、その後者は、分泌されたネペタラクトンオキシドレダクターゼ、及び培養培地におけるネペタラクトールのネペタラクトンへの変換の結果としてのネペタラクトンを含有する。収穫流にまだ存在するいかなる残留細胞も、当技術分野において知られた任意の操作、例えば、濾過、遠心分離、デカンテーション、クロスフロー膜限外濾過若しくは精密濾過、接線流限外濾過若しくは精密濾過、又はデッドエンド濾過等によりネペタラクトールオキシドレダクターゼ及びネペタラクトンから分離され得る。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ネペタラクトール及び/又はネペタラクトンの立体異性体の混合物が産生又は回収される。いくつかの実施形態において、ネペタラクトール及び/又はネペタラクトンの単一の立体異性体が産生又は回収される。いくつかの実施形態において、シス,トランス-ネペタラクトール、トランス,シス-ネペタラクトール、トランス,トランス-ネペタラクトール、及び/又はシス,シス-ネペタラクトールが産生及び/又は回収される。いくつかの実施形態において、シス,トランス-ネペタラクトン、トランス,シス-ネペタラクトン、トランス,トランス-ネペタラクトン、及び/又はシス,シス-ネペタラクトンが産生及び/又回収される。
【００９１】
本明細書に記載されているようなネペタラクトン生合成経路の酵素(例えば、NOR)又はそれを産生する培養物中のネペタラクトンの、収穫流に含有された他の成分からの分離及び/又は精製の更なる工程、すなわち、いわゆる下流処理工程が、任意選択的に、行われ得る。これらの工程は、例として、濃縮、抽出、結晶化、沈殿、吸着、イオン交換、クロマトグラフィー、及び/又は蒸留等の、当業者に知られた任意の手段を含み得る。これらの手順のいずれかが、ネペタラクトンを精製するために単独で又は組み合わせて用いることができる。更なる精製工程は、例えば、濃縮、結晶化、沈殿、洗浄及び乾燥、活性炭での処理、イオン交換、並びに/又は再結晶化のうちの1つ又は複数を含み得る。適切な精製プロトコールの設計は、細胞、培養培地、培養のサイズ、製造容器等に依存し得、当分野の技術レベルの範囲内である。
【００９２】
ネペタラクトール又はネペタラクトン及びネペタラクトン生合成経路の酵素の無細胞産生及び回収
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているようなネペタラクトン生合成経路の酵素(例えば、NOR)又はそれを産生する培養物中のネペタラクトンを産生/回収するために無細胞タンパク質合成(CFPS)が行われる。いくつかの実施形態において、ネペタラクトン生合成経路の上流産物、例えば、ネペタラクトールが産生/回収される。いくつかの実施形態において、ネペタラクトール及び/又はネペタラクトンの立体異性体の混合物が産生又は回収される。いくつかの実施形態において、ネペタラクトール及び/又はネペタラクトンの単一の立体異性体が産生又は回収される。いくつかの実施形態において、シス,トランス-ネペタラクトールが産生及び/又は回収される。いくつかの実施形態において、シス,トランス-ネペタラクトンが産生及び/又は回収される。
【００９３】
CFPS技術はよく知られている(CFPSの記載のために本明細書に参照により組み入れられる、Carlson, E.D.ら(2012)、「Cell-free protein synthesis: applications come of age」、Biotechnol. Adv. 30 (5): 1185〜94頁を参照)。CFPS反応の一般的な成分は、細胞抽出物、エネルギー源、アミノ酸、マグネシウム等の補助因子の供給、及び所望の遺伝子に関するDNAを含む。細胞抽出物は、目的の細胞を溶解し、遠心分離して、細胞壁、ゲノムDNA、及び他の細胞デブリを除去することにより取得することができる。生じた細胞抽出物は、リボソーム、アミノアシル-tRNAシンテターゼ、翻訳開始因子及び伸長因子、ヌクレアーゼ等を含む、タンパク質合成に必要な細胞機構を含有する。
【００９４】
今日、用いられる細胞抽出物は、典型的には、大腸菌(ECE)、ウサギ網状赤血球(RRL)、コムギ胚芽(WGE)、及び昆虫細胞(ICE)から作製される。これらの抽出物の全部が市販されている。一般的に、エネルギー源及びアミノ酸が抽出物に加えられる。一般的なエネルギー源は、ホスホエノールピルビン酸、アセチルリン酸、及びクレアチンリン酸である。
【００９５】
少なくとも2つの型のDNA:プラスミド及び直鎖状発現テンプレート(LET)をCFPSに用いることができる。プラスミドは、細胞内部で増殖されなければならない。LETの複数コピーは、インキュベータ内で生じた細胞よりはるかに速くDNAを複製する、核酸増幅(例えば、PCR)によって、はるかに効果的に作製することができる。LETは作製するのにより容易で速いが、CFPSにおいて、プラスミドからの収量が、通常、ずっと高い。
【００９６】
ネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化する方法
上記のNORは、ネペタラクトールを酸化してネペタラクトンを生成するのに有用である。この反応は、NORが、NAD+又はNADP+の存在下でネペタラクトールと接触した時に起こる。NORが細胞内で発現して、分泌されない場合、その細胞がネペタラクトール並びにNAD+及び/又はNADP+を含有するならば(その細胞がネペタラクトールを産生するという理由か、又はその細胞が培養培地からネペタラクトールを取り込んでいるという理由のいずれかにより、その細胞はネペタラクトールを含有し得る)、その反応は細胞内で(インビボで)起こり得る。NORが細胞から分泌される場合、その培養培地がネペタラクトール並びにNAD+及び/又はNADP+を含有するならば、その反応は培養培地中で起こり得る。いくつかの実施形態において、ネペタラクトール並びにNAD+及び/又はNADP+は単に、実施例1で行われたように、インビトロでのネペタラクトン産生のために細胞可溶化物へ加えられる。他の実施形態において、NORは、本明細書に記載された、又は当技術分野において知られたタンパク質精製方法を用いて、(細胞内にあるならば)細胞可溶化物から、又は(分泌されるならば)細胞培養培地から精製される。NORは、均一性へと精製することができるが、必ずしも必要なわけではない。その後、生じた酵素調製物を、ネペタラクトール及びNAD+又はNADP+と接触させて、インビトロでネペタラクトンを生成することができる。
【００９７】
他のインビトロ産生の実施形態において、NORはCFPSにより産生され、ネペタラクトールとNAD+及び/又はNADP+が反応混合物中に含まれ、又はそれに加えられ、その反応混合物において、酸化が行われる。これらの実施形態のバリエーションにおいて、NORはCFPSによって産生され、部分的又は完全に精製されて、酵素調製物を生じ、その後、その酵素調製物を、ネペタラクトール並びにNAD+又はNADP+と接触させて、ネペタラクトンを生じ得る。
【００９８】
これらの方法は、例えば、昆虫忌避剤として、又は昆虫忌避剤中に用いることができる、ネペタラクトンの工業規模の製造を可能にする。昆虫忌避剤は、例えば、ネペタラクトンを約1%〜30%、2%〜28%、3%〜25%、4%〜23%、5%〜20%、6%〜18%、7%〜15%、8%〜13%、9%〜10%の範囲、又はこれらの値のいずれかを境界とする任意の範囲の濃度で含有することができる。特に、ネペタラクトンは、ゴキブリ及び蚊を効果的に追い払う。ネペタラクトンは、イヌハッカにおける活性成分であり、したがって、例えばネコ用おもちゃにおける、ネコ誘引物質としても有用である。
【００９９】
ネペタラクトンをジヒドロネペタラクトンへ変換する方法
ジヒドロネペタラクトンは、ネペタラクトンより更により強力な昆虫忌避剤である。したがって、いくつかの実施形態において、ネペタラクトンをジヒドロネペタラクトンへ変換することは有利であり、それは、ネペタラクトンの水素付加により便利に達成される。炭酸ストロンチウム上に担持された酸化白金及びパラジウム等の触媒は、ジヒドロネペタラクトンを24〜90%収率で与える(Regnier, F.E.ら、Phytochemistry 6:1281〜1289頁(1967))。ジヒドロネペタラクトン及びこの化合物に基づいた昆虫忌避剤の製造は、この記載のために本明細書に参照により組み入れられる、欧州特許第1484967号(PCT公開第2003079786号としても公開されている)に記載されている。
【０１００】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例証することを目的として示されており、いかなる形であれ、本開示を限定することを意図するものではない。特許請求の範囲の範囲によって定義されているような本開示の精神の範囲内に包含されるそれらの変化及び他の使用は、当業者に同定可能であろう。
【実施例１】
【０１０１】
ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換する能力があるエシェリキア・コリ(Escherichia coli)におけるネペタラクトンオキシドレダクターゼのクローニング及び発現
NOR候補の同定
イヌハッカ(Nepeta cataria)由来の公表されている次世代RNAシーケンシングデータを、NCBIから入手した(SRR5150709)。その読み取りを引き出し、トランスクリプトームへ構築した。ネペタラクトールのネペタラクトンへの変換を触媒する可能性があるイヌハッカ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ候補を同定するために、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ(HLADH)についてのタンパク質配列をBLASTクエリとして用いた。
【０１０２】
39個の候補を同定し、そのコード配列を大腸菌における発現のためにコドン最適化した。コドン最適化ヌクレオチド配列を、上流T7プロモーター及びリボソーム結合部位(RBS)及び下流T7ターミネーター配列と共に、組込みDNAテクノロジー(IDT)によって合成した。合成されたDNAを、IDTにより提供されたカナマイシン抵抗性マーカーを含有するバックボーン内に発現カセットを含有するプラスミドとして回収した。
【０１０３】
NOR候補の異種性発現
プラスミドを個々に、化学的コンピテントBL21(DE3)細胞へ形質転換した。pUC19もまたBL21(DE3)へ形質転換して、陰性対照としての役割を果たし得る株を作製した。形質転換体を、カナマイシンを含有するLB培地中で振盪させながら、一晩、選択及び増殖した。一晩の培養物を50%グリセロールと1:1比で混合することによりグリセロールストックを調製した。グリセロールストックを、-80℃で凍結した。
【０１０４】
グリセロールストックからのBL21(DE3)株を、カナマイシンを含有するLBプレート上に画線し、37℃で一晩、増殖した。15mL使い捨て培養チューブにおけるカナマイシン含有LB培地の4mLへ単一コロニーを接種し、250rpmで振盪させながら30℃で一晩、インキュベートした。一晩培養物の500μLを、250mLのバッフル付きフラスコにおけるカナマイシン含有LB培地の50mLへ継代培養した。その培養物を37℃で増殖し、600nmにおける光学密度(OD600)をモニターした。OD600が0.6〜1に達した時、その培養物を氷上で15分間、冷却した。その後、培養物を、100μMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドで誘導し、250rpmで振盪させながら15℃でおよそ20時間、インキュベートした。培養物を、50mL遠心管において遠心分離によりペレット化した。上清をデカントし、ペレットを、後の処理のために-20℃で凍結した。
【０１０５】
NOR候補のインビトロでの特徴付け
ペレットを、氷上で解凍し、3mLの冷たい溶解バッファー:50mMリン酸ナトリウム、pH=7.4、100mM塩化ナトリウムで再懸濁した。全ての残りの工程を、氷上か4℃かのいずれかで実施した。細胞混合物を15mL遠心管へ移し、ダブルレベル型マイクロチップを有するBranson Sonifier 450を70%振幅で用いて、3ラウンドの超音波処理で破壊した。1ラウンドの超音波処理は、超音波処理器での10秒間のオンと10秒間のオフの6サイクルからなった。ラウンドとラウンドの間に、細胞混合物を氷上に置いて、1分間、冷却した。溶解した細胞混合物を1.7mL遠心管へ移し、微量遠心機において最高速度で20分間、遠心分離した。上清(清澄化細胞可溶化物)を、別個のチューブに収集し、インビトロでの特徴付けに用いた。
【０１０６】
インビトロ反応を以下の通りに設定した:2μLの100mM NAD+又はNADP+及び10μLの100μMネペタラクトールを、188μLの清澄化細胞可溶化物に加えた。その反応物を、200rpmで振盪させながら30℃で2時間、インキュベートした。陽性対照として、2μLの100mM NAD+、2μLの100mM NADP+、及び10μLの100μMネペタラクトンを、pUC19を有する株由来の清澄化可溶化物の186μLに加え、1時間、インキュベートした。その反応物を、1体積の酢酸エチルで抽出した。有機層を引き出し、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)で分析した。分析物の正体を確認するために真正標準を流した。
【０１０７】
結果は図2に示されている。3個の候補遺伝子、NcatNOR15(タンパク質配列番号561)、NcatNOR21(タンパク質配列番566)、及びNcatNOR34(タンパク質配列番号578)[(DNA配列番号1725〜1727)]が、ネペタラクトールをネペタラクトンへ酸化することができるNORをコードすることが見出され、そのような実証は初めてであった。
【実施例２】
【０１０８】
ネペタラクトンについての生合成経路の酵母プラスミドへの導入/DNA設計
全てのプラスミドを、プロプライエタリソフトウェアを用いて設計した。遺伝子は第三者によって合成され、プラスミドを、社内か第三者によるかのいずれかで標準DNAアセンブリ方法によって構築した。その後、プラスミドDNAを用いて、その代謝経路挿入断片をサッカロミセス・セレビシエへ染色体性に組み込んだ。
【０１０９】
プラスミドを、「2プラスミド、分裂マーカー」組込みとして設計した。簡単に述べれば、2個のプラスミドを、各標的化ゲノム組込みのために構築した。第1のプラスミドは、5'から3'へ、列挙された以下のDNA部分で構成された挿入断片を含有する:1)ゲノム組込みを方向付けるための5'相同アーム;2)異種性遺伝子発現のためのカセットからなるペイロード;3)URA3選択マーカーカセットの5'側半分。第2のプラスミドは、5'から3'へ、列挙された以下のDNA部分で構成された挿入断片を含有する:1)第1のプラスミドに用いられたURA選択マーカーカセットの5'側半分の3'末端と100bp以上のDNA重複を有するURA3選択マーカーカセットの3'側半分;2)異種性遺伝子発現のためのカセットからなる任意選択のペイロード;3)ゲノム組込みを方向付けるための3'相同アーム。両方のプラスミドの挿入断片は、メガヌクレアーゼ部位に隣接している。適切なメガヌクレアーゼを用いるプラスミドの消化によって、挿入断片が放出され、直鎖状断片として細胞へ形質転換される。3重クロスオーバー事象は、所望の異種性遺伝子の組込み、及びウラシル原栄養性についての選択を可能にする完全URA3マーカーの再構築を可能にする。URA3マーカーの再利用のために、URA3カセットは、100〜200bpの直列反復配列に隣接しており、それにより、ループアウト及び5-フルオロオロチン酸(5-FOA)での対比染色が可能になる。
【０１１０】
異種性発現のためのカセットは、プロモーター及びターミネーターの転写制御下に遺伝子コード配列を含有する。プロモーター及びターミネーターは、S.セレビシエにとって天然の任意のエレメントから選択され得る。プロモーターは、構成的又は誘導性であり得る。誘導性プロモーターには、双方向性pGAL1/pGAL10(pGAL1-10)プロモーター及びpGAL7プロモーターが挙げられ、それらはガラクトースによって誘導される。
【０１１１】
株構築
細胞を、酵母抽出物ペプトンデキストロース(YPD)中、250rpmで振盪させながら、30℃で一晩、増殖した。その細胞を、50mLのYPD中、600nmにおける光学密度(OD600)=0.2に希釈し、OD600=0.6〜0.8に増殖した。細胞を、遠心分離によって収集し、水で洗浄し、100mM酢酸リチウムで洗浄し、100mM酢酸リチウム中に最終OD600=100に再懸濁した。細胞再懸濁液の15μLをDNAへ直接加えた。100μLの50%w/v PEG3350、4μLの10mg/mLサケ精子DNA、15μLの1M  酢酸リチウムを含有するPEG混合物を、DNA及び細胞混合物に加え、よく混合した。その形質転換混合物を、30℃で30分間、及び42℃で45分間、インキュベートした。
【０１１２】
熱ショック後、形質転換混合物を、ウラシルを欠損する合成の既知組成最少酵母培地(SD-URA)を含有する寒天プレート上にプレーティングした。プレートを、30℃で2〜3日間、インキュベートした。各標的化株について最高8個の形質転換体を、96ウェルプレートの1mLのSD-URA液体培地へと採取し、1000rpmで振盪させながら90%相対湿度(RH)、30℃で増殖した。培養物を、Zymolyaseを用いて溶解し、生じた可溶化物を用いて、5'組込み接合部を標的にするプライマーを用いるPCRを実施して、組込みの成功を検証した。グリセロールストックを、その培養物から16.6%グリセロールの最終濃度で調製し、後の使用のために-80℃で保存した。
【０１１３】
URA3選択マーカーを再利用するために、選択された株を、SD-URAへ接種し、30℃、1000rpm、及び90%RHで一晩、増殖した。その後、株を、0.1% 5-FOAプレート(Teknova社)上へプレーティングし、30℃で2〜3日間、インキュベートした。単一コロニーを、0.1% 5-FOAプレート上へ再び画線した。その再画線から単一コロニーを選択し、URA3マーカーのループアウトを検証するためにコロニーPCRを実施した。コロニーを又、液体SD-URA培地中で増殖の欠如について試験した。さらなる組込みを上記のように実施した。
【０１１４】
株培養及び標的化合物産生
凍結したグリセロールストックから、成功した組込み体を、300μLのSD-URAを含有する種プレートへ接種した。96ウェルプレートを、30℃、1000rpm、90%RHで48時間、インキュベートした。構築に成功した各株について、3つの生物学的レプリケートを試験した。各標的化株遺伝子型について得られた成功の形質転換体が3つより少ない場合には、存在する生物学的レプリケートを複製した。株を、96ウェルプレートに渡ってランダム化した。48時間の増殖後、種プレートからの培養物の8μLを用いて、2%グルコースを含む250μLの最少培地を含有する本培養プレートに接種し、30℃、1000rpm、90%RHで16時間、増殖した。12%ガラクトースを含む50μLの最少培地をその培養物へ加えて、ガラクトースプロモーターの制御下での異種性遺伝子の発現を誘導し、続いて、30μLのオレイン酸メチルを加えた。9時間の更なる増殖後、DMSO中に調製された50mg/mL基質フィード(ゲラニオール又は8-ヒドロキシゲラニオール)の3μLを培養物へ分注した。細胞を更に15時間、増殖し、その後、細胞増殖及び力価を評価するためにアッセイを実施した。
【０１１５】
細胞密度を、分光光度計を用いて、各ウェルの600nmにおける吸光度を測定することにより決定した。20μLの培養物を、透明底プレートにおける180μLの175mMリン酸ナトリウム緩衝剤、pH7.0へ希釈した。そのプレートを、Tecan M1000分光光度計で測定する直前に750rpmで25秒間、振盪した。接種されていない対照ウェルをブランクとして含めた。
【０１１６】
300μLの酢酸エチルをその培養物へ加えた。プレートを、PlateLoc Thermal Microplate Sealerで密封し、プレートを750rpmで1分間、振盪した。プレートを遠心分離し、酢酸エチル層を収集し、液体クロマトグラフィーを組み合わせた質量分析(LC-MS)によって分析した。標的分析物を、真正の標準に対して定量化した。
【０１１７】
図6-Aは、接種されていない対照ウェル及び野生型株CEN.PK113-7Dと比較した、いくつかの操作された株のネペタラクトン及びネペタラクトール力価を示す。図6-Bは、株の遺伝子型を示す。図6-Cは、経路遺伝子の源の生物体を示す。図6-Aにおける全ての操作された株は、8-ヒドロキシゲラニオールのフィードでネペタラクトン及びネペタラクトールを、66.7mg/Lのネペタラクトン及び44.4mg/Lのネペタラクトールの最大力価で産生した。同一の条件下で、接種されていない対照ウェル及び野生型株において、ネペタラクトンもネペタラクトールも観察されなかった。操作された株の一部だけが、ゲラニオール基質フィードでその同じ産物を産生した;全般的に、力価は、ゲラニオール基質フィードに関して、より低く、6.1mg/Lのネペタラクトン及び10.6mg/Lのネペタラクトールの最大力価であった。ゲラニオール基質フィードに関して、接種されていないウェル又は野生型株を含有したウェルにおいて、ネペタラクトンもネペタラクトールも観察されなかった。シス,トランス-ネペタラクトン異性体のみが産生された。
【実施例３】
【０１１８】
様々なイリドイドシンターゼの発現及び活性
様々なイリドイドシンターゼ(ISY、配列番号1181、1256、1257、1306、1191、1255、1269、1203、1791、1801、1215、1281、1190、1217、1800、1234、1277、1233、1300、1249、1805)を、大腸菌においてT7発現系を用いるプラスミドから異種性に発現させた。大腸菌培養物を約0.6のOD600まで増殖し、1mM IPTGで誘導し、28℃で7.5時間又は15℃で20時間、増殖した。細胞を収集し、Bugbuster HT(EMD Millipore社)により製造会社の使用説明書に従って化学的に溶解させた。細胞可溶化物を、遠心分離により清澄化し、NADH及びNADPHの存在下で8-オキソゲラニアルのネペタラクトールへのインビトロでの変換について試験した(図3参照)。2μLの細胞可溶化物を、200mM HEPES、pH=7.3、100μMの8-オキソゲラニアル、100μM NADH、及び100μMのNADPHを含有する反応混合物へ加えた。その反応混合物を、300μLの酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を、LC-MSによりネペタラクトールの定量化について分析した。
【実施例４】
【０１１９】
ネペタラクトールを産生する能力があるネペタラクトールシンターゼのクローニング及び発現
モノテルペンインドールアルカロイドを産生することが知られている4つの植物種(ニチニチソウ(Catharanthus roseus)、カンレンボク(Camptotheca acuminate)、ヒメツルニチニチソウ(Vinca minor)、及びインドジャボク(Rauvolfia serpentina))からの公表されているトランスクリプトームデータ(medicinalplantgenomics.msu.edu)を調べることにより、4つの推定ネペタラクトールシンターゼ(NEPS_1〜NEPS_4;配列番号1518〜1521)を同定した。これらのNEPSをコードする転写産物を、ゲラニオールからロガニン酸の形成(その中間体、ネペタラクトールを通って、進行する)を触媒する生合成遺伝子相同体と高度に同時発現させた。この分析は、これらのNEPS候補の、ゲラニオールからロガニン酸の生合成における、おそらくネペタラクトール形成における関与を示唆した。全ての4つのNEPSを、大腸菌においてT7発現系を用いるプラスミドから異種性に発現させた。大腸菌培養物を約0.6のOD600まで増殖し、100μM IPTGで誘導し、16℃で16時間、増殖した。細胞を収集し、Bugbuster HT(EMD Millipore社)により製造会社の使用説明書に従って化学的に溶解させた。細胞可溶化物を、遠心分離により清澄化した。10μLの細胞可溶化物を、50mM HEPES、pH=7.3、500μMの8-オキソゲラニアル、1mM NADPH、及び3つのイリドイドシンターゼ(ISY)のうちの1つを含有する10μLの細胞可溶化物を含有する反応混合物に200μLの最終体積において加えることにより、NEPS活性を個々に試験した。ISYは、ニチニチソウ  イリドイドシンターゼ(ISY;配列番号1162)、N末端において22個のアミノ酸だけ切り詰められているニチニチソウISY「del22」(配列番号1166)、及びネペタ・ムッシーニ(Nepeta mussinii) ISY(配列番号1159)を含む(図4参照)。反応混合物を、300μLの酢酸エチルで抽出し、有機層を、ネペタラクトールの定量化についてLC-MSにより分析した。どの場合においても、NEPSの存在は、NEPSを発現しない大腸菌由来の細胞可溶化物を含有するインビトロ反応物と比較して、ネペタラクトールの産生を増強した(11倍〜40倍の増加)。
【実施例５】
【０１２０】
様々な8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼの発現及び活性
様々な8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ(8HGO;配列番号1132、1134、1136、1138〜1146)を、大腸菌においてT7発現系を用いるプラスミドから異種性に発現させた。大腸菌培養物を約0.6のOD600まで増殖し、100μM IPTGで誘導し、16℃で16時間、増殖した。細胞を収集し、Bugbuster HT(EMD Millipore社)により製造会社の使用説明書に従って化学的に溶解させた。細胞可溶化物を、遠心分離により清澄化した。1μLの細胞可溶化物を、50mMのビス-トリスプロパン、pH=9.0、1mM NADPH、1mM NAD+、500μMの8-ヒドロキシゲラニオール、ネペタ・ムッシーニISY(配列番号1159)を含有する1μLの細胞可溶化物、及びNEPS_1(配列番号1518)を含有する1μLの細胞可溶化物を含有する反応混合物に100μLの最終反応体積において加えることにより、8HGO活性を試験した。反応混合物を、300μLの酢酸エチルで抽出し、有機層を、ネペタラクトールの定量化についてLC-MSにより分析した(図5参照)。
【実施例６】
【０１２１】
ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換する能力があるサッカロミセス・セレビシエにおけるネペタラクトンオキシドレダクターゼのクローニング及び発現
NOR候補の同定
上記の実施例1において作製された新規トランスクリプトームアセンブリーから17個の候補の追加のリストを同定した。簡単に述べれば、ソフトウェアHMMERからのhmmscanを用いて、アセンブリーからの全ての推定のペプチドを、E値によるそれらの最高マッチングPfam隠れマルコフモデル(HMM)に基づいて機能的に注釈を付けた。オキシドレダクターゼ活性に関連した全てのHMMを、BLASTにより更に調べ、候補のリストを更に狭めるために、非重複データベースからの任意の配列と高い配列同一性を有する配列を除去するようにフィルターにかけた。これらの候補及び実施例1に記載された最初の39個の候補の配列は、S.セレビシエにおける発現のためにコドン最適化され(配列番号1340〜1395)、第三者によって合成され、2μプラスミドバックボーン、pESC-URAへクローニングされた。
【０１２２】
NOR候補の異種性発現及び試験
実施例2に記載されているように、プラスミドを、化学的コンピテントなサッカロミセス・セレビシエ細胞へ個々に形質転換した。形質転換体をSD-URA寒天プレート上で選択した。3〜4つのレプリケートを、SD-URA液体培地へと採取し、1000rpmで振盪させながら30℃で1〜2日間、培養した。培養物を、16.6%グリセロールの最終濃度でのグリセロールストックに調製し、後の使用のために-80℃で保存した。
【０１２３】
10μLのグリセロールストック調製株を、96ウェルプレートにおけるウラシルを欠損し、4%グルコースを含有する最少培地の300μL中へ接種して、種培養物を作製した。そのプレートを、30℃、1000rpmで1〜2日間、インキュベートした。その後、10μLの種培養物を、ウラシルを欠損し、2%ガラクトース及び100mg/Lのネペタラクトールを含有する最少培地の300μLへ接種した。次に、30μLのオレイン酸メチルをウェルに加えた。本培養プレートを、細胞増殖及び力価を評価するためのアッセイを実施する前に、更に30℃、1000rpmで24時間、更にインキュベートした。細胞増殖及び力価アッセイを、上記の実施例2に記載されているように実施した。
【０１２４】
NOR候補の発現のためのプラスミドを含有しない対照株を含む、全ての試験された株は、少なくともおよそ基底レベルのネペタラクトン(約600μg/L;図7参照)を産生した。接種されていない対照ウェルにおいてネペタラクトンは観察されなかった。要するに、これらの結果は、サッカロミセス・セレビシエが低いバックグラウンドレベルのNOR活性を有することを示唆している。GAR_NOR15(配列番号1393)を発現する試験された株の1つは、基底レベルをはるかに超える、有意により多いネペタラクトン(93mg/L)を産生し、この異種性タンパク質候補が、ネペタラクトールをネペタラクトンへ変換することの活性を有することを実証した。
【０１２５】
（参考文献）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021506316.tif 000010
【図６Ａ】
2021506316.tif 000011
【図６Ｂ】
2021506316.tif 000012
【図６Ｃ】
2021506316.tif 000013
【図７】
2021506316.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
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