(57)【要約】  本発明は、エクスビボの流体に一酸化炭素（ＣＯ）を投与し、該一酸化炭素の投与をモニターする方法であって、（ｉ）ＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）と放出トリガー分子を反応させて、ＣＯを発生させる工程、（ii）工程（ｉ）で発生させたＣＯを、ガス透過膜を通してエクスビボの流体と接触させることによって、該エクスビボの流体にＣＯを投与する工程、（iii）工程（ii）において前記エクスビボの流体にＣＯを投与した後、相互補完的モニタリング技術によって、一酸化炭素および／または一酸化炭素マーカーを分析する工程、ならびに（iv）必要に応じて、工程（iii）で実施した一酸化炭素または一酸化炭素マーカーの分析に基づいて、ＣＯの投与を調節する工程を含む方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法において使用するための体外循環回路システムに関する。
2021513406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクスビボの流体に一酸化炭素（ＣＯ）を投与し、該一酸化炭素の投与をモニターする方法であって、
（ｉ）ＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）と放出トリガー分子を反応させて、ＣＯを発生させる工程、
（ii）工程（ｉ）で発生させたＣＯを、ガス透過膜を通してエクスビボの流体と接触させることによって、該エクスビボの流体にＣＯを投与する工程、
（iii）工程（ii）において前記エクスビボの流体にＣＯを投与した後、相互補完的モニタリング技術によって、一酸化炭素および／または一酸化炭素マーカーを分析する工程、ならびに
（iv）必要に応じて、工程（iii）で実施した一酸化炭素または一酸化炭素マーカーの分析に基づいて、ＣＯの投与を調節する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記エクスビボの流体が、対象の血液または灌流液であり、好ましくは対象の血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一酸化炭素マーカーが、カルボキシヘモグロビン（ＣＯＨｂ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記相互補完的モニタリング技術が、対象の血液試料中におけるＣＯＨｂの測定、対象の呼気中におけるＣＯ濃度の測定、対象の血液循環に接続されるように構成された心肺補助システムに組み込まれた酸素供給器の排気中のＣＯ濃度の測定のうちの少なくとも２つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（iii）の前記相互補完的モニタリング技術が、機械学習に基づくＣＯ濃度予測により補助され、好ましくはランダムフォレスト回帰を使用して補助される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法において使用するための体外循環回路システムであって、
外側のコンパートメントと内側のコンパートメントを備える膜モジュールを含む体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）を備え、
前記外側のコンパートメントが、対象からの血液を収容する一次回路に接続されており、前記内側のコンパートメントが、ＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）と放出トリガー分子との反応によりＣＯが発生される二次回路に接続されていること、
前記膜モジュールのこれら２つのコンパートメントが、二次回路で発生したＣＯを内側のコンパートメントから外側のコンパートメントへと透過してエクスビボの流体にＣＯを投与することができるガス透過膜を介して互いに分離されていること、および
一次回路が対象の血液循環に接続されるように構成されていること
を特徴とする、体外循環回路システム。
【請求項７】
前記膜モジュールの内側のコンパートメントと外側のコンパートメントが、管状膜で分離されている、請求項６に記載の体外循環回路システム。
【請求項８】
前記一次回路が、酸素供給器とポンプをさらに備える、請求項６または７に記載の体外循環回路システム。
【請求項９】
前記ガス透過膜が、シリコーン膜またはＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）膜である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法および請求項６〜８のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
【請求項１０】
前記ＣＯＲＭが金属カルボニル化合物である、請求項１〜５および９のいずれか１項に記載の方法ならびに請求項６〜９のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
【請求項１１】
前記ＣＯＲＭが、Ｍｏ（ＣＯ）３（ＣＮＣＨ２ＣＯＯＨ）３（「Ｂｅｃｋ１」）、Ｍｏ（ＣＯ）３（ＣＮＣＨ２ＣＯＮａＯ）３（「Ｂｅｃｋ１−Ｎａ」）、ＣＯＲＭ−ＡＬＦ７９４、ＣＯＲＭ−１、ＣＯＲＭ−２、ＣＯＲＭ−３およびＣＯＲＭ−４０１からなる群から選択される金属カルボニル化合物である、請求項１〜５、９および１０のいずれか１項に記載の方法ならびに請求項６〜１０のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
【請求項１２】
前記放出トリガー分子が、硫黄含有化合物、窒素含有化合物および酸化化合物からなる群から選択される、請求項１〜５および９〜１１のいずれか１項に記載の方法ならびに請求項６〜１１のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
【請求項１３】
前記放出トリガー分子が、塩化鉄（III）（ＦｅＣｌ３）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、硫酸セリウム（IV）（Ｃｅ（ＳＯ４）２）、重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）、塩化金（III）（ＡｕＣｌ３）および硝酸銀（ＡｇＮＯ３）からなる群から選択される酸化化合物である、請求項１〜５および９〜１２のいずれか１項に記載の方法ならびに請求項６〜１２のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
【請求項１４】
前記放出トリガー分子の水溶液に前記ＣＯＲＭが添加されるか、前記ＣＯＲＭの水溶液に前記放出トリガー分子が添加される、請求項１〜５および９〜１３のいずれか１項に記載の方法ならびに請求項６〜１３のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
【請求項１５】
前記体外循環回路システムが、心肺補助システムまたは透析システムの一部である、請求項５〜１４のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクスビボの流体への一酸化炭素（ＣＯ）の投与をモニターする方法、および該方法において使用するためのシステムに関する。エクスビボの流体としては、動物対象もしくはヒト対象の血液または灌流液が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
ＣＯには有害な作用（すなわち中毒）があるが、その一方で、低濃度で使用した場合には、たとえば虚血再灌流障害や炎症などにおいて治療特性を有することが実証されている（Motterlini R., Otterbein L.E. (2010), “The therapeutic potential of carbon monoxide”, Nat. Rev. Drug Discov., doi: 10.1038/nrd322）。
【０００３】
体外治療は、急性疾患患者または慢性疾患患者の治療、および周術期処置に使用される。心臓・胸部外科手術では、心停止手術中に心循環機能および肺機能の代わりとして、酸素供給器、ポンプ、チューブ類およびカニューレからなる人工心肺装置（CPB）が使用される。急性期または慢性期の心不全、呼吸器不全、腎不全または肝不全を伴う疾患は、体外治療により処置することが多い。さらに、体外循環回路を使用して臓器を灌流させて、移植用に臓器を保存することもできる。しかしながら、これらの疾患や処置はいずれも、重篤な炎症反応や虚血再灌流障害に伴うものであったり、これらの障害を引き起こしたりすることが多い。特に、心肺補助法（たとえば、心筋梗塞、心停止、急性呼吸促迫症候群などが発症した後に行われる心肺補助法）では、体外式膜型人工肺（ECMO）または体外生命維持装置（ECLS）が使用される。これを実施するため、大血管（静脈および／または動脈）にカニューレを挿入し、酸素供給器、ポンプおよびチューブ類を使用して体外循環回路を構築する。このようにすることで、救命救急治療において、短期間にわたって、時には長期間にわたって、臓器を補助し、代替することが可能になる。
【０００４】
米国特許公開第2007/0202083（A1）号明細書は、臓器の移植方法であって、臓器のレシピエントに移植される臓器の生着の向上に十分な量の一酸化炭素を含む医薬組成物を、該レシピエントに投与することを含む方法に関する。この一酸化炭素組成物は、液体中の一酸化炭素が所望の濃度に達するまで、該液体中に一酸化炭素ガスを直接吹き込むことによって製造される。別の方法では、たとえば体外式膜型酸素化装置を使用して、一酸化炭素を含む雰囲気中を通過するガス拡散性チューブ類に適切な液体が流される。一酸化炭素は液体中に拡散し、一酸化炭素を含む液体組成物が得られる。この液体は、通常、患者に経口投与または注射投与することが可能な水溶液である。しかし、米国特許公開第2007/0202083（A1）号明細書に記載されているこの方法は、液体中のＣＯ濃度の調節が難しいという欠点がある。
【０００５】
別のＣＯ投与方法として、「一酸化炭素放出分子（CORM）」として、吸入投与、経口投与または全身投与する方法がある。しかし、この方法にもいくつかリスクがあり、ＣＯを吸入するためには、危険な無臭気体を含むリザーバー（たとえばガスカートリッジ）を使用場所に提供する必要がある。この方法では、過剰致死量を患者に投与してしまうリスクがあるだけでなく（わずかな用量ミスでも相当な危険性が発生する）、関係する医療従事者にも危害が及ぶ可能性がある。したがって、非制御下でＣＯを投与すると、常に中毒の危険性が伴い、これは致命的となる場合がある。しかし、ＣＯ放出分子（CORM）を使用して、特定量のＣＯのみを制御下で放出させれば、このような問題を防ぐことができることは注目に値する。CORMは、通常、金属カルボニル錯体（たとえば、モリブデンやルテニウムなど）であり、生理学的トリガー（たとえば亜硫酸類や水など）に反応してＣＯを放出する。したがって、医薬品化学の原理を利用して、このようなCORMからのＣＯ放出を、合理的な量で時間依存的に制御できるように調節することができる。
【０００６】
CORMには、前述のような好ましい特性があるにもかかわらず、欠点が数多く存在する。CORMは、通常、有害でありうる不特定の分解産物（様々な酸化状態、リガンド状態、類似物など）に分解されることから、臨床への移行が非常に困難である。この問題は、近年になって、膜型治療用ガス放出システム（TGRS）の導入による解決策が提示され、有毒でありうる分解産物への患者の暴露を防止しながら、臨床的に有意な一酸化炭素の放出が可能になっている（欧州特許公開第15150532.8号明細書および独国特許公開第10 2014 008 685.2号明細書；Steiger C. et al. (2015) “Controlled therapeutic gas delivery systems for quality-improved transplants”, Eur. J. Biopharm, doi: 10.106/j.ejpb.2015.10.009）。TGRSの内部では、疎水性膜（シリコーン）によって患者または治療対象の組織を反応室から隔離しており、この反応室内では、様々なトリガー（たとえば水や光など）によってCORMからのＣＯの放出が誘導される。ＣＯの放出が開始されたら、ガスのみが膜を透過して反応室を出て行き、患者／組織に対して治療効果が誘導される。有害でありうるCORMの分解産物は、放出システム内に安全に保持される。
【０００７】
このような状況下にもかかわらず、臨床においてＣＯの使用を可能とするため、高度に制御可能な安全な方法で、遷移金属の毒性とＣＯの投与という課題に対処可能な、エクスビボの流体にＣＯを投与可能な方法およびシステムが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題は以下によって解決される。
（１）エクスビボの流体に一酸化炭素（ＣＯ）を投与し、該一酸化炭素の投与をモニターする方法であって、
（ｉ）ＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）と放出トリガー分子を反応させて、ＣＯを発生させる工程、
（ii）工程（ｉ）で発生させたＣＯを、ガス透過膜を通してエクスビボの流体と接触させることによって、該エクスビボの流体にＣＯを投与する工程、
（iii）工程（ii）において前記エクスビボの流体にＣＯを投与した後、相互補完的モニタリング技術によって、一酸化炭素および／または一酸化炭素マーカーを分析する工程、ならびに
（iv）必要に応じて、工程（iii）で実施した一酸化炭素または一酸化炭素マーカーの分析に基づいて、ＣＯの投与を調節する工程
を含む方法。
【０００９】
本発明の方法の好ましい実施形態は、以下に関する。
（２）前記エクスビボの流体が、対象の血液または灌流液であり、好ましくは対象の血液である、項（１）に記載の方法。
（３）前記一酸化炭素マーカーが、カルボキシヘモグロビン（ＣＯＨｂ）である、項（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記相互補完的モニタリング技術が、対象の血液試料中におけるＣＯＨｂの測定、対象の呼気中におけるＣＯ濃度の測定、対象の血液循環に接続された心肺補助システムに組み込まれた酸素供給器の排気中のＣＯ濃度の測定のうちの少なくとも２つを含む、項（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）工程（iii）の前記相互補完的モニタリング技術が、機械学習に基づくＣＯ濃度予測により補助され、好ましくはランダムフォレスト回帰を使用して補助される、項（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
【００１０】
本発明の目的は、以下によってさらに解決される。
（６）本発明の方法において使用するための体外循環回路システムであって、
外側のコンパートメントと内側のコンパートメントを備える膜モジュールを含む体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）を備え、
前記外側のコンパートメントが、対象からの一次回路血液に接続されており、前記内側のコンパートメントが、ＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）と放出トリガー分子との反応によりＣＯが発生される二次回路に接続されていること、
前記膜モジュールのこれら２つのコンパートメントが、二次回路で発生したＣＯを内側のコンパートメントから外側のコンパートメントへと透過してエクスビボの流体にＣＯを投与することができるガス透過膜を介して互いに分離されていること、および
一次回路が対象の血液循環に接続されていること
を特徴とする、体外循環回路システム。
【００１１】
本発明のシステムの好ましい実施形態は、以下に関する。
（７）前記膜モジュールの内側のコンパートメントと外側のコンパートメントが、管状膜で分離されている、項（６）に記載の体外循環回路システム。
（８）前記一次回路が、酸素供給器とポンプをさらに備える、項（６）または（７）に記載の体外循環回路システム。
【００１２】
本発明の方法およびシステムの好ましい実施形態は、以下に関する。
（９）前記ガス透過膜が、シリコーン膜またはＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）膜である、項（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法および項（６）〜（８）のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
（１０）前記ＣＯＲＭが金属カルボニル化合物である、項（１）〜（５）および（９）のいずれか１項に記載の方法ならびに項（６）〜（９）のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
（１１）前記ＣＯＲＭが、Ｍｏ（ＣＯ）３（ＣＮＣＨ２ＣＯＯＨ）３（「Ｂｅｃｋ１」）、Ｍｏ（ＣＯ）３（ＣＮＣＨ２ＣＯＯＮａ）３（「Ｂｅｃｋ１−Ｎａ」）、ＣＯＲＭ−ＡＬＦ７９４、ＣＯＲＭ−１、ＣＯＲＭ−２、ＣＯＲＭ−３およびＣＯＲＭ−４０１からなる群から選択される金属カルボニル化合物である、項（１）〜（５）、（９）および（１０）のいずれか１項に記載の方法ならびに項（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
（１２）前記放出トリガー分子が、硫黄含有化合物、窒素含有化合物および酸化化合物からなる群から選択される、項（１）〜（５）および（９）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法ならびに項（６）〜（１１）のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
（１３）前記放出トリガー分子が、塩化鉄（III）（ＦｅＣｌ３）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、硫酸セリウム（IV）（Ｃｅ（ＳＯ４）２）、重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）、塩化金（III）（ＡｕＣｌ３）および硝酸銀（ＡｇＮＯ３）からなる群から選択される酸化化合物である、項（１）〜（５）および（９）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法ならびに項（６）〜（１２）のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
（１４）前記放出トリガー分子の水溶液に前記ＣＯＲＭが添加されるか、前記ＣＯＲＭの水溶液に前記放出トリガー分子が添加される、項（１）〜（５）および（９）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法ならびに項（６）〜（１３）のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
（１５）前記体外循環回路システムが、心肺補助システムまたは透析システムの一部である、項（５）〜（１４）のいずれか１項に記載の体外循環回路システム。
【００１３】
以下の詳細な説明において本発明を詳細に説明し、実施例１および実施例２においてさらに具体的に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において「エクスビボの流体」は、対象の体外において一酸化炭素が投与される流体を意味する。
【００１５】
エクスビボの流体は、たとえば、対象からの血液であってもよく、本発明の方法を使用して対象の生体の外で（すなわち体外で）一酸化炭素を投与した後、本発明のシステムにより循環させ、該対象の血液循環に戻される。本明細書において「対象」は、動物を意味し、より具体的にはサル、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマなどの哺乳動物、またはヒト患者を意味する。
【００１６】
さらに、エクスビボの流体は、たとえば手術中などに対象に投与される灌流液であってもよい。このような目的に適した灌流液は、当業者に公知である。本発明での使用に適した灌流液は、たとえば等張生理食塩水である。
【００１７】
本発明の方法およびシステムにおいて、対象からの血液はエクスビボの流体として好ましい。
【００１８】
本発明において「一酸化炭素放出分子（ＣＯＲＭ）」は、ＣＯ放出トリガー化合物と反応して一酸化炭素（ＣＯ）を放出する化合物を意味する。本発明の方法およびシステムに有用な一酸化炭素放出化合物は、後で詳しく説明する。
【００１９】
本発明において「放出トリガー分子」（「トリガー分子」または「トリガー化合物」とも呼ぶ）は、一酸化炭素放出分子と反応して、この一酸化炭素放出分子から一酸化炭素を放出させる化合物を意味する。本発明の方法およびシステムにおいて有用なトリガー分子については、後で詳しく説明する。
【００２０】
本明細書において「ＣＯ含有溶液」は、一酸化炭素ガスを含有する溶液、通常、一酸化炭素ガスを含有する水溶液である。このような一酸化炭素ガスは、一酸化炭素放出分子（ＣＯＲＭ）を放出トリガー分子と反応させることによって発生させる。したがって、ＣＯ含有溶液は、少なくとも、ＣＯＲＭと放出トリガー化合物の間のＣＯ放出反応が完了する前は、ＣＯＲＭと放出トリガー化合物を含む。
【００２１】
本明細書において「体外」は、生体の外を意味する。当然のことながら、この用語は、本発明の体外循環回路システムが、カニューレを介して対象の血流に接続されていることを除外するものではない。
【００２２】
本発明において「体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）」は、本発明の方法およびシステムにおいて、ガスを透過するが液体や固体は透過性しない膜を通して、ＣＯ含有溶液からエクスビボの流体、好ましくは対象の血液中へとＣＯを投与することができるシステムを指す。
【００２３】
前記目的を達成するため、体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）は、このシステムの主要な機能部品として、膜モジュールを備え、この膜モジュールは、シリコーン膜モジュールであることが好ましい。管状膜（好ましくはシリコーン製の管状膜）によって、外側のコンパートメントと内側のコンパートメントとが分離される。外側のコンパートメントは、通常、エクスビボの流体、すなわち対象の血液または灌流液、好ましくは対象の血液を収容する。内側のコンパートメントは、通常、ＣＯＲＭを放出トリガー化合物と反応させてＣＯを発生させる場となる溶液を収容する。膜モジュールの外側のコンパートメントと内側のコンパートメントを分離するため、複数本の管状膜（10000本以下、好ましくは5000本以下、より好ましくは2000本以下の管状膜）を使用することが好ましい。したがって、膜モジュールにおいて使用する管状膜は、中空繊維であることが好ましい。
【００２４】
ECCORSは、本発明の体外循環回路システムに組み込まれており、膜モジュールの外側のコンパートメントは、対象の血液循環に接続された一次回路に接続されており、膜モジュールの内側のコンパートメントは、ＣＯ放出トリガー分子の溶液またはＣＯＲＭの溶液が循環する二次回路に接続されている。二次回路内でＣＯを発生させるため、放出トリガー分子の溶液にＣＯＲＭを添加するか、ＣＯＲＭの溶液に放出トリガー分子を添加する。したがって、二次回路は、体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）の一部であり、かつ本発明の体外循環回路システムの一部である。
【００２５】
本明細書で述べる「体外循環回路システム」は、本発明の方法を使用することによって、対象の体外において該対象の血液中にＣＯを投与することができ、該対象の生体へと血液を再循環させることができ、エクスビボの流体へのＣＯ投与をモニターすることができる。
【００２６】
体外循環回路システムの一次回路において、血液はチューブ内を循環する。循環は、本発明の体外循環回路システムの一次回路の一部であるポンプを用いて行われる。
【００２７】
本発明のシステムにおいて、対象の血液は、本発明の方法およびシステムを使用して体外でＣＯを投与した後、該対象の体内に再循環させることができる。ＣＯが添加された対象の血液の再循環は、本発明の体外循環回路システムの一次回路を対象の血管（静脈および／または動脈）に接続したカニューレを使用して行うことができる。また、本発明の方法に含まれるモニタリング工程（分析工程）によって、ＣＯの投与を制御し、過剰投与を防ぐことができる。
【００２８】
本発明の体外循環回路システムの一次回路は、体外において対象からの血液の酸素濃度を上昇させ、かつＣＯ２を血液中から取り除くための酸素供給器をさらに備えることが好ましい。酸素供給器は、外部生命維持が必要な場合（たとえば心臓手術中）に、対象の肺機能の代替または補助として必要とされる。
【００２９】
本発明のシステムの二次回路において、ＣＯは、通常、水溶液中で発生される。水溶液中におけるＣＯの発生は、ＣＯ放出トリガー化合物の水溶液にＣＯＲＭを添加することによって、あるいはＣＯＲＭの水溶液にＣＯ放出トリガー化合物を添加することによって達成することができる。一方の化合物の水溶液に添加される他方の化合物も水溶液の状態であってもよいことは言うまでもない。
【００３０】
ポンプ（好ましくはチューブポンプ）を使用して、生成したＣＯ含有溶液を二次回路内に循環させる。二次回路は、本発明のシステム内の超過圧力を防ぐため、少なくとも１つの気密バッグを備えることが好ましく、少なくとも２つの気密バッグを備えることが好ましい。たとえば、放出トリガー化合物の水溶液にＣＯＲＭを少量ずつ添加することによって、ＣＯの放出を制御することができる。これを達成するため、放出トリガー化合物の水溶液を収容する二次回路は、通常、ＣＯＲＭの注入口を備える。このＣＯＲＭの注入口を備えていることから、ＣＯＲＭを少量ずつ添加することが可能になり、本発明のシステムへの一酸化炭素の放出を制御することが可能になる。
【００３１】
本発明の体外循環回路システムでは、前述の２つの回路が分離していることから、対象の血流から独立して制御下でＣＯを発生させることができる。体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）に設けられた膜モジュール内において、ガスを透過するがそれ以外の成分は透過しない膜を介して、本発明の体外循環回路システムを２つの回路に分離することによって、体外でＣＯを添加した対象の血液を該対象の血流に再循環させる際に、臓器を虚血再灌流障害から保護することができる。
【００３２】
本発明の方法およびシステムにおいてＣＯを発生させるには、ＣＯＲＭと放出トリガー化合物の間で反応を起こすことが必要である。
【００３３】
本発明の方法およびシステムにおいて使用されるＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）は、金属カルボニル化合物であることが好ましい。金属カルボニル化合物は、たとえば、Ｒｈ、Ｔｉ、Ｏｓ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｗ、ＲｅおよびＩｒからなる群から選択される元素の錯体を含む。金属カルボニル化合物は、Ｒｈ、Ｍｏ、Ｍｎ、ＦｅおよびＲｕからなる群から選択される元素の錯体を含むことがより好ましく、Ｒｈ、Ｆｅ、ＭｎおよびＭｏからなる群から選択される元素の錯体を含むことがさらにより好ましい。金属カルボニル化合物は、金属中心に配位したＣＯ基を含むことから、錯体と見なしてもよい。しかし、これらの金属は、配位結合以外のイオン結合や共有結合などによって別の基に結合していてもよい。したがって、金属カルボニル化合物の一部を形成するＣＯ以外の基は、孤立電子対を介して金属中心に配位するという意味において、厳密に「リガンド」である必要はないが、参照の便宜上、本明細書では「リガンド」と呼ぶ。
【００３４】
したがって、金属に配位したリガンドは、すべてカルボニルリガンドであってもよい。あるいは、カルボニル化合物は、ＣＯではないリガンドを少なくとも１つ含んでいてもよい。ＣＯではないリガンドは、通常、中性リガンドまたはアニオン性リガンドであり、たとえばハライドであるか、ルイス塩基由来のＮ、Ｐ、ＯまたはＳを有するか、配位原子として共役した炭素基である。配位原子としては、Ｎ、ＯおよびＳが好ましい。カルボニルリガンドの例としては、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド；グリシン、システイン、プロリンなどの天然アミノ酸、合成アミノ酸およびこれらの塩；ＮＥｔ３およびＨ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２などのアミン；ビス−２，２’−ピリジル、インドリン、ピリミジン、シチジンなどの芳香族塩基およびその類似体；ビリベルジンやビリルビンなどのピロール；ＹＣ−１（２−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインダゾール）などの薬物分子；ＥｔＳＨやＰｈＳＨなどのチオールおよびチオレート；塩化物、臭化物およびヨウ化物；ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩などのカルボン酸塩；Ｅｔ２Ｏやテトラヒドロフランなどのエーテル；ＥｔＯＨなどのアルコール；ならびにＭｅＣＮなどのニトリルが挙げられるが、これらに限定されない。その他の使用可能なリガンドとして、ジエンなどの共役炭素基、たとえばシクロペンタジエン（Ｃ５Ｈ５）または置換シクロペンタジエンが挙げられる。置換シクロペンタジエンの置換基は、たとえば、アルカノール、エーテルまたはエステルであってもよく、たとえば−（ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、ｎは１〜４である）であってもよく、特に−ＣＨ２ＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＯＲ（式中、ｎは１〜４であり、Ｒは炭化水素、好ましくは炭素数１〜４のアルキルである）および−（ＣＨ２）ｎＯＯＣＲ（式中、ｎは１〜４であり、Ｒは炭化水素、好ましくは炭素数１〜４のアルキルである）であってもよい。このようなシクロペンタジエンカルボニル錯体または置換シクロペンタジエンカルボニル錯体中の金属としてＦｅが好ましい。
【００３５】
本発明の方法およびシステムにおいて、一酸化炭素放出分子として、Ｍｏ（ＣＯ）３（ＣＮＣＨ２ＣＯＯＨ）３（「Ｂｅｃｋ１」）、Ｍｏ（ＣＯ）３（ＣＮＣＨ２ＣＯＮａＯ）３（「Ｂｅｃｋ１−Ｎａ」）、Ｍｏ（ＣＯ）３（ＣＮＣ（ＣＨ３）２ＣＯＯＨ）３、ＣＯＲＭ−ＡＬＦ７９４、ＣＯＲＭ−１、ＣＯＲＭ−２、ＣＯＲＭ−３、またはＣＯＲＭ−４０１を使用することが好ましい。本発明における使用に特に好ましいものは、Ｍｏ（ＣＯ）３（ＣＮＣＨ２ＣＯＯＨ）３（「Ｂｅｃｋ１」）である。「Ｂｅｃｋ１」化合物は、D. Achatz et al., “Carbonyl-Komplexe von Chrom, Molybdaen und Wolfram in Isocyanacetat. Reaktionen am koordinierten Isocyanacetat. Stabilisierung von Isocyanessigsaeure und Isocyanacetylchlorid am Metall. Isocyanopeptide [1]”, Zeitschrift fuer anorganische und allgemeine Chemie, 631 (2005), 2339-2346に開示されている。その他の化合物はWO2016/110517(A1)に開示されている。
【００３６】
また、本明細書において、WO2008/130261(A1)および米国特許公開第2007/0219120(A1)号明細書を明示的に援用する。これらの文献には、本発明の方法およびシステムに使用可能なＣＯ放出分子が記載されているが、これらのＣＯ放出分子は本発明において好ましいものではない。これらの文献には、式Ｉ
【化１】
2021513406.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、アルキルヘテロシクリル、置換アルキルヘテロシクリル、アルケニル、置換アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルキルアリール、置換アルキルアリール（炭素原子の数はそれぞれ１〜１２または１〜６である）、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、メルカプト、アルキルメルカプト、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、アルコキシカルボニル、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２およびシアノからそれぞれ独立して選択されるか、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの２つ以上が一緒になって、置換炭素環構造、無置換炭素環構造、置換複素環構造、無置換複素環構造、またはこれらの誘導体を形成し、前記置換基において炭素原子の数は１〜１２または１〜６である）で示されるアルデヒドが開示されており、このアルデヒドは、本発明の方法およびシステムにおいてガス放出分子として使用することができる。
【００３７】
本発明において、式Ｉの化合物の誘導体もガス放出分子として使用することができ、式Ｉの化合物の誘導体としては、アセタール、ヘミアセタール、アミノカルビノール、アミナール、イミン、エナミノン、イミダート、アミジン、イミニウム塩、亜硫酸水素ナトリウム付加物、ヘミメルカプタール、ジチオアセタール、１，３−ジオキセパン、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、１，３−ジオキセタン、α−ヒドロキシ−１，３−ジオキセパン、α−ヒドロキシ−１，３−ジオキサン、α−ヒドロキシ−１，３−ジオキソラン、α−ケト−１，３−ジオキセパン、α−ケト−１，３−ジオキサン、α−ケト−１，３−ジオキソラン、α−ケト−１，３−ジオキセタン、大環状エステル／イミン、大環状エステル／ヘミアセタール、オキサゾリジン、テトラヒドロ−１，３−オキサジン、オキサゾリジノン、テトラヒドロ−オキサジノン、１，３，４−オキサジアジン、チアゾリジン、テトラヒドロ−１，３−チアジン、チアゾリジノン、テトラヒドロ−１，３−チアジノン、イミダゾリジン、ヘキサヒドロ−１，３−ピリミジン、イミダゾリジノン、テトラヒドロ−１，３−ピリミジノン、オキシム、ヒドラジン、カルバゾン、チオカルバゾン、セミカルバゾン、セミチオカルバゾン、アシルオキシアルキルエステル誘導体、Ｏ−アシルオキシアルキル誘導体、Ｎ−アシルオキシアルキル誘導体、Ｎ−マンニッヒ塩基誘導体またはＮ−ヒドロキシメチル誘導体が挙げられる。
【００３８】
また、本発明におけるガス放出分子は、たとえば、トリメチルアセトアルデヒド、２，２−ジメチル−４−ペンテナール、４−エチル−４−ホルミル−ヘキサンニトリル、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロパナール、２−ホルミル−２−メチル−プロピルメタノエート、２−エチル−２−メチルプロピオンアルデヒド、２，２−ジメチル−３−（ｐ−メチルフェニル）プロパナールまたは２−メチル−２−フェニルプロピオンアルデヒドであってもよい。
【００３９】
本発明の方法およびシステムにおいて、シュウ酸塩、シュウ酸エステルまたはシュウ酸アミドも一酸化炭素放出分子として使用することができるが、これらは好ましいものではない。
【００４０】
さらに、本発明において、好ましくはないものの、カルボキシボラン、カルボキシボランエステルまたはカルボキシボランアミドも一酸化炭素放出分子として使用することができる。このようなガス放出分子は、WO2005/013691(A1)に具体的に記載されている。したがって、本発明の一実施形態では、ＢＨｘ（ＣＯＱ）ｙＺｚ（式中、ｘは１、２または３であり、ｙは１、２または３であり、ｚは０、１または２であり、ｘ＋ｙ＋ｚ＝４であり、ＱはそれぞれＯ−（カルボン酸のアニオンを表す）であるか、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＳＲまたはハロゲンであり（Ｒはそれぞれ（好ましくは炭素数１〜４の）アルキルである）、Ｚはそれぞれハロゲン、ＮＨ２、ＮＨＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’またはＯＲ’である（Ｒ’はそれぞれ（好ましくは炭素数１〜４の）アルキルである））で示される化合物が、ガス放出分子として用いられる。より好ましくは、式中、ｚは１であり、ｙは１であり、かつ／またはｘは３である。一実施形態では、式中、少なくとも１つのＱはＯ−またはＯＲであり、化合物の組成中に少なくとも１つの金属カチオンを含み、この金属カチオンはアルカリ金属カチオンまたは土類金属カチオンであることが好ましい。
【００４１】
ガス放出分子としてボロンカルボキシレートを使用する場合、Ｎａ２（Ｈ３ＢＣＯ２）が最も好ましく、これはＣＯＲＭ−Ａ１としても知られている。
【００４２】
ＣＯ放出分子は、放出トリガー化合物と接触すると、ＣＯを放出する。したがって、「接触」は、ガス放出分子とトリガー化合物の間で反応が起こり、一酸化炭素放出分子から一酸化炭素を放出させることができることを意味する。
【００４３】
放出トリガー化合物は、たとえば、硫黄含有化合物、窒素含有化合物、酸化化合物、酸、塩基または水であってもよい。
【００４４】
一酸化炭素放出分子が、本発明において一酸化炭素放出分子として好ましい金属カルボニル化合物である場合、トリガー化合物は、カルボニルを置換するリガンド、たとえば硫黄含有化合物または窒素含有化合物であることが好ましい。硫黄含有化合物は、たとえば、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩から選択することができ、亜硫酸、亜ジチオン酸もしくはメタ重亜硫酸のナトリウム塩、またはシステインやグルタチオンなどの少なくとも１つのチオール部分を有する化合物であることが好ましい。
【００４５】
本発明の方法およびシステムにおいてトリガー化合物として有用な酸化化合物、特に、前述の好ましい金属カルボニル化合物からのＣＯの放出を誘発するための酸化化合物としては、過酸化物、過ホウ酸塩、過炭酸塩、および硝酸塩が挙げられ、その中でも、過酸化カルシウム、過酸化ジベンゾイル、過酸化水素尿素、過ホウ酸ナトリウムおよび過炭酸ナトリウムが好ましい。さらに、一酸化炭素放出分子から、特に前述の好ましい金属カルボニル化合物からＣＯの放出を誘発するために使用可能なものとして、塩化鉄（III）（ＦｅＣｌ３）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、硫酸セリウム（IV）（Ｃｅ（ＳＯ４）２）、重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）、塩化金（III）（ＡｕＣｌ３）、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）などの酸化金属塩が挙げられる。酸化金属塩としては、塩化鉄（III）、過マンガン酸カリウム、および硫酸セリウム（IV）が好ましい。
【００４６】
酸としては、たとえば、クエン酸を使用することができる。一実施形態において、トリガー化合物は非酵素系化合物である。また、トリガー化合物は、水または溶媒であってもよい。水と接触して一酸化炭素を放出するガス放出分子としては、ＡＬＦ１８６が好ましい。
【００４７】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、一酸化炭素放出分子としての金属カルボニル化合物およびトリガー化合物としての硫黄含有化合物または別の電子求引性化合物に関して、たとえば、このトリガー化合物が金属カルボニル化合物に接触すると、リガンドの置換が起こり、ガスの放出が誘発されると考えられる。また、金属カルボニル化合物が酸化性のトリガー化合物に接触すると、金属カルボニル化合物中の金属が酸化されて、金属カルボニル化合物が分解し、ＣＯを放出すると考えられる。
【００４８】
本発明の方法およびこの方法において使用されるシステムにおいて、トリガー化合物は通常、水溶液の状態で提供される。たとえば、酸化金属塩をトリガー化合物として使用する場合、水相中の金属塩の濃度は、通常、０．０１〜２０ｍｏｌ／ｌの範囲、好ましくは０．０２〜１５ｍｏｌ／ｌの範囲、特に好ましくは０．０５〜１０ｍｏｌ／ｌの範囲である。水溶液中の酸化塩の濃度が高いほど、一酸化炭素放出分子に対する酸化効果は強くなり、ＣＯの放出速度が上昇する。このように、トリガー化合物の水溶液にＣＯＲＭを添加して、一酸化炭素を発生させる。トリガー化合物の水溶液に添加されるＣＯＲＭも水溶液の形態であることが好ましく、ＣＯＲＭの濃度は、その水溶解度にもよるが、通常、０．０１〜２ｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは０．０５〜１．５ｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００４９】
本発明の方法およびシステムの好ましい実施形態では、ＦｅＣｌ３をトリガー化合物として提供し、Ｂｅｃｋ１を一酸化炭素放出分子として提供する。ＦｅＣｌ３は、１〜１０ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１．５〜７．５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２〜５ｍｏｌ／Ｌの濃度の水溶液として提供する。また、Ｂｅｃｋ１も、０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度の水溶液として提供し、トリガー化合物の水溶液に添加する。別の一実施形態では、ＦｅＣｌ３の代わりに、Ｃｅ（ＳＯ４）２を（ＦｅＣｌ３と同じ濃度の水溶液の形態で）トリガー化合物として使用することができる。
【００５０】
しかしながら、本発明の方法およびシステムでは、前述したとおり、ＣＯＲＭの水溶液にトリガー化合物を添加して一酸化炭素を発生させることもできる。通常、前述したような水溶液の形態のトリガー化合物を、ＣＯＲＭの水溶液に添加する。この場合、ＣＯＲＭ水溶液およびＣＯ放出トリガー化合物水溶液の濃度は、前記と同様とすることができる。
【００５１】
本発明の方法の工程（ii）では、本発明の方法の工程（ｉ）で発生させたＣＯを、ガス透過膜を通してエクスビボの流体に接触させることによって、ＣＯをエクスビボの流体に投与する。前述のとおり、通常、水溶液中でＣＯＲＭとＣＯ放出トリガー化合物を反応させることによってＣＯを発生させる。
【００５２】
本発明の方法およびシステムで使用される「ガス透過膜」は、ガスを透過するが、液体や固体は透過しない。このようなガス透過膜は、通常、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、テフロン）、シリコーン、ブチルゴム、酢酸セルロース、セラミック、ジメチルシリコーンゴム６０、エチルセルロース、フルオロシリコーン、Kel F、ラテックス、メチルセルロース、金属有機構造体膜（たとえばChem. Soc. Rev., 2014, 43, 6116-6140参照）、マイラー、天然ゴム、ニトリルシリコーン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、塩化ビニリデン−塩化ビニルおよびゼオリスからなる群から選択される１種以上の材料を含む。このような膜はWO2016/110517(A1)にも記載されている。シリコーンおよびポリテトラフルオロエチレンが膜材料として好ましく、シリコーンが特に好ましい。
【００５３】
本発明において、ＣＯは、通常、水溶液中においてトリガー分子と反応した一酸化炭素放出分子から発生するが、ガスを透過するが液体や固体は透過しない膜を本発明において使用することによって、ＣＯＲＭまたはトリガー分子の固体や溶解残渣がエクスビボの流体に接触することなく、血液や灌流液などのエクスビボの流体にＣＯを投与することができる。したがって、ＣＯＲＭとトリガー分子の反応から生じた毒性を発揮しうる固体残渣は、ＣＯが発生した溶液中に留まり、エクスビボの流体を汚染することはない。これによって、最終的に、たとえば、対象の体内の血液循環へと血液を再循環させたり、灌流液中に保存されたエクスビボの臓器を対象の体内へと移植したりすることが可能になる。
【００５４】
ＣＯＲＭをトリガー化合物に添加する操作またはトリガー化合物をＣＯＲＭに添加する操作のいずれにおいても、ＣＯＲＭおよびトリガー化合物の目的に応じた注入動態によって、ＣＯの発生を制御することが可能であり、その結果、ガス透過膜を通した血液または灌流液へのＣＯの投与を制御することが可能になる。治療用のＣＯＨｂの血中濃度は、血中総ヘモグロビンに対して１０±４％の範囲である。移植前に臓器または組織を保存するための灌流液中における適切なＣＯ濃度は、２０〜２００μＭの範囲である。
【００５５】
本発明の方法は、工程（ii）においてエクスビボの流体にＣＯを投与した後、工程（iii）において、相互補完的モニタリング技術により、一酸化炭素および／または一酸化炭素マーカーを分析する必要がある。本発明の方法におけるこの工程により、対象の全身ＣＯ濃度を常時測定することが可能になり、したがって、制御下において、エクスビボの流体、特に対象の血液中へのＣＯの投与が可能になり、ＣＯが投与された血液は次いで対象の血液中に（再）循環させることができる。一酸化炭素マーカーは、たとえばＣＯＨｂ（カルボキシヘモグロビン）である。
【００５６】
本発明の方法の工程（iii）においてＣＯの投与を分析するための相互補完的モニタリング方法には、以下のものが含まれる。
（ａ）血液ガス分析によるＣＯＨｂの測定：本発明の方法および／またはシステムを使用して、対象の体外でＣＯを投与した血液または灌流液を対象に投与した後、本発明の方法によってＣＯを投与した体外血液から得た対象の血液試料中（通常、患者または本発明の体外循環回路システムの一次回路から採取された血液試料０．１〜０．５ｍＬ中）のＣＯＨｂをＣＯマーカーとして測定することができる。通常、血中総ヘモグロビンに対して、ＣＯＨｂの濃度は１０±３％以下とする。血液ガス分析によるＣＯＨｂ測定は、本明細書の実施例で説明している（Roth, D., et al., Ann. Emerg. Med. 2011, 58(1), 74-79も参照されたい）。
（ｂ）対象の呼気中ＣＯ濃度：本発明の方法および／またはシステムを使用して、対象の体外でＣＯを投与した血液または灌流液を対象に投与した後、対象から吐き出された呼気から対象のＣＯ濃度を求めることができる。通常、対象の呼気中のＣＯの閾値濃度は２５０ｐｐｍ以下とする。呼気中のＣＯ濃度の測定は、本明細書の実施例で説明している。
（ｃ）酸素供給器の排気中ＣＯ濃度：本発明の方法および／またはシステムを使用して、対象の体外でＣＯを投与した血液または灌流液を対象に投与した後、本発明のシステムの一部である酸素供給器の排気から対象のＣＯ濃度を定量することができる。通常、酸素供給器の排気中のＣＯの閾値濃度は１００ｐｐｍ以下とする。対象の呼気中のＣＯ濃度の測定は、本明細書の実施例で説明している。
（ｄ）パルスオキシメトリーによるＣＯＨｂの分析：本発明の方法および／またはシステムを使用して、対象の体外でＣＯを投与した血液または灌流液を対象に投与した後、パルスオキシメトリーによるＣＯＨｂの分析により、対象のＣＯ濃度を定量することができる。しかしながら、パルスオキシメトリーによるＣＯＨｂの定量は、４８％と感度が低いことから［M. Touger et al. (2010) Performance of the RAD-57 pulse CO-oximeter compared with standard laboratory COHb measurement. Ann. Emerg. Med. 56:382-388. Doi: 10.106/j.annemergmed.2010.03.041］、対象の血液にＣＯを投与後に、信頼性を持ってＣＯ濃度をモニターするにはあまり適切な方法とは言えない。本明細書の実施例では、パルスオキシメトリーによるＣＯＨｂの測定と血液ガス分析によるＣＯＨｂの測定の間の相関が低いことが実証されている。したがって、パルスオキシメトリーによるＣＯＨｂの分析は、本発明において対象の血液中にＣＯを投与した後にＣＯ濃度をモニターするための方法として単独で使用することは好ましくなく、（ａ）〜（ｃ）の方法の少なくとも１つと組み合わせて使用することが好ましい。
【００５７】
本発明のシステムは、前述の（ａ）〜（ｄ）の分析方法を実施するための各分析手段を備えている。
【００５８】
本発明の方法において、体外一酸化炭素放出システムによるＣＯの送達量を、確実にモニターし制御するために、前述の（ａ）〜（ｄ）の分析操作を組み合わせることが望ましい。相互補完的な分析方法とは、エクスビボの流体、特に対象の血液中にＣＯを投与した後に、（（ａ）および／または（ｄ）による）対象の血液試料中におけるＣＯＨｂの測定、（（ｂ）による）対象の呼気中におけるＣＯ濃度の測定、および（（ｃ）による）酸素供給器の排気中におけるＣＯ濃度の測定のうちの少なくとも２種を使用して、ＣＯおよび／または一酸化炭素マーカーを分析することを意味する。このようにして、対象の血液中のＣＯ濃度の測定ができ、過剰投与時の安全対策を開始することができる。
【００５９】
エクスビボの流体、特に対象の血液中のＣＯ含量を求めるにあたり、前記方法のうちの３種以上を用いることが好ましい。本発明の方法およびシステムにおいて、（ａ）〜（ｄ）の４種すべての相互補完的モニタリング技術を用いて、全身のＣＯ濃度を常時評価することが特に好ましい。次に、前記分析により得られたデータを、目標値と実測値の比較により処理し、ＣＯ放出速度を制御することによって、対象の全身のＣＯ濃度、具体的には本発明のシステムに血液循環が接続されたヒト患者の全身のＣＯ濃度を制御する。予期しない過剰投与が起こった場合、本発明のシステムを緊急バイバスへ迂回させることができる。
【００６０】
ECCORSを使用したＣＯ送達の安全性と効果は、全身のＣＯ濃度を予測するためのモニタリングパラメーターとして評価される前記パラメーターの分析精度、正確度および精度に大きく依存する。本発明の方法の工程（iii）によるＣＯモニタリングの分析力をさらに向上させるため、機械学習によるアプローチを構築した。このアプローチをリアルタイムのＣＯモニタリングパラメーターの処理に適用することによって、ＣＯの予測濃度値を求め、次いでフィードバックループを修正することができる。実施例２において詳述するような、ランダムフォレスト回帰を使用して求めたこのアプローチの変数により、本発明の送達方法における分析力を向上させることができるため、本発明の概念を臨床へ移行させる意義を顕著に向上させることができる。
【００６１】
一酸化炭素および／または一酸化炭素マーカーの分析結果に基づき、本発明の方法の工程（iv）において、必要に応じ、エクスビボの流体への一酸化炭素の投与量が調節される。
【００６２】
つまり、必要とされるＣＯ濃度にまだ達していなければ、より多くの量のＣＯＲＭをＣＯ放出トリガー化合物に添加するか、より多くの量のＣＯ放出トリガー化合物をＣＯＲＭに添加することによって、ＣＯの放出を増加させる。特に、意図しない過剰投与が起こった場合、本発明の方法において使用される本発明のシステムは、体外補助を継続しつつも、血液中のＣＯ濃度の上昇を止めるため、体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）を自動的にバイバスに迂回させる安全機構を備える。過剰なＣＯは、酸素供給器へのスイープガスの流量を増やすことによって、生体から除去することができる。ＣＯの治療濃度域は狭いことから、治療効果があるとされる量（すなわちＣＯＨｂ濃度１０±４％）でＣＯが全身投与される救急医療用途において、このような対策は極めて重要である。したがって、所定の閾値（たとえば、ＣＯＨｂ濃度１３％、呼気中ＣＯ濃度２５０ｐｐｍ、酸素供給器の排気中ＣＯ濃度１００ｐｐｍ）を超えた場合、ＣＯ送達システムはバイパスに迂回されて、直ちにＣＯの供給が停止され、全身のＣＯ濃度は無毒な濃度のまま制限される。
【００６３】
本発明の方法およびシステムの一実施形態において、ＣＯ放出トリガー物質の注入を制御することによって、体外一酸化炭素放出システムから全身へのＣＯの送達を調節する。フィードバックアルゴリズムを含むフィードバックループにより注入が制御され、このフィードバックアルゴリズムには、入力パラメーターとしての（ａ）血液ガス分析によるＣＯＨｂの測定、（ｂ）呼気中のＣＯの測定および（ｃ）酸素供給器の排気中のＣＯの測定と、（ｄ）パルスオキシメトリーによるＣＯＨｂの分析とを利用したPID制御（比例・積分・微分制御）が含まれるが、これに限定されない。したがって、所望のＣＯＨｂ濃度を所望の範囲内になるように自動で維持することができる。モニタリングパラメーターのすべてまたはその一部が所定の閾値を超えた場合、体外一酸化炭素放出システムを自動または手動でバイパスに迂回させることができる。図４は、本発明の体外循環回路システムに接続された体外一酸化炭素放出システムの、アルゴリズムによる制御の一例を示す。
【００６４】
結論として、本発明は、対象の体外において、制御下でＣＯを放出し、エクスビボの流体、特に対象の血液にＣＯを投与することが可能な方法およびシステムであって、相互補完的モニタリング技術を使用してＣＯまたはＣＯマーカーを分析することにより、毒性を発揮するような高濃度のＣＯになることを防止することができる方法およびシステムを提供する。ガスを透過するが液体や固体は透過しない膜を通してエクスビボの流体にＣＯを投与することによって、一酸化炭素放出分子とトリガー分子の反応から生じる固体および溶解残渣によるエクスビボの流体の汚染を防ぐことができる。
【００６５】
したがって、対象の体外において、制御下で該対象の血液にＣＯを投与することができ、次いで、ＣＯを添加した血液を該対象の血流へと再循環させることができる本発明のシステムは、たとえば体外生命維持装置（ECLS）、体外式膜型人工肺（ECMO）、または人工心肺装置などの心肺補助装置、または透析において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）の一部である膜モジュールの概略図を示す。
【図１Ｂ】体外生命維持システムの動静脈回路の一例における体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）の適用の概略図を示す。
【図２】血液ガス分析（BGA）によって測定したＣＯＨｂ（％）、パルスオキシメトリー（SpCO）で測定したＣＯＨｂ（％）、肺から吐き出された一酸化炭素の濃度（ppm）、および酸素供給器から排出された一酸化炭素の濃度（ppm）の時間経過を示す。仮死状態の開始時（t=0）からのECCORSによる処置の平均開始時間は、t＝24.2±4.7分である。Ｎ＝７；平均±ＳＤで示す。
【図３】（Ａ）は、肺から吐き出されたＣＯの濃度に対してプロットした血液ガス分析（BGA）で測定したＣＯＨｂの濃度の散布図と両者の相関を示し、相関係数は、Ｒ２＝０．４３である。（Ｂ）は、酸素供給器から排出されたＣＯの濃度に対してプロットした血液ガス分析（BGA）で測定したＣＯＨｂの濃度の散布図と両者の相関を示し、相関係数はＲ２＝０．５９である。（Ｃ）は、パルスオキシメトリーにより非侵襲的に測定したSpCO濃度に対してプロットした血液ガス分析で測定したＣＯＨｂの測定値の散布図と両者の相関を示し、相関係数はＲ２＝０．３７である。
【図４】本発明の体外循環回路システムに接続された体外一酸化炭素放出システムの、アルゴリズムによる制御の一例を示す。４種の相互補完的モニタリング技術、すなわち、血液中のＣＯＨｂ分析（オフライン）、パルスオキシメトリーによるＣＯＨｂ分析、呼気中のＣＯの定量、および酸素供給器の排気中のＣＯの定量を使用して、全身のＣＯ濃度を継続的に評価する。これらのパラメーターの目標値と実測値を比較することによって、（ｉ）ＣＯ放出速度を制御し、それにより患者の全身ＣＯ濃度を制御し（体外一酸化炭素放出システムにおける放出トリガーとＣＯ放出分子の間の動態のPID制御（比例・積分・微分制御）による調節を含むが、これに限定されない）、（ii）予期しない過剰投与が起こった場合には体外一酸化炭素放出システムを緊急バイバスに迂回させる。
【図５】呼吸器パラメーター、酸塩基パラメーターおよび血行動態パラメーター（パルスオキシメトリーで測定したＣＯＨｂ（SpCO）；吸入酸素濃度（FiO2）；体外生命維持装置（ECLS）；肺毛細血管楔入圧（PCWP）；全身血管抵抗（SVR））を含む、ＣＯＨｂの予測に影響を及ぼすパラメーター間のピアソンの相関係数（ｒ）（絶対値）のヒートマップを示す。
【図６】全身のＣＯ濃度のリアルタイム分析を行う際の分析精度を向上させるため、図３に示した連続モニタリングパラメーターをランダムフォレスト回帰で処理し、ランダム５分割交差検証法で解析した。ＣＯＨｂの実測値に対してＣＯＨｂの予測値をプロットしている。Ａ）３種の連続リアルタイムパラメーターを示し、Ｂ）酸素供給器の排気中ＣＯ量［ppm］のみのプロットを示す。実線は完全予測を示し、破線は９０％予測区間を示す。
【実施例】
【００６７】
実施例１
本明細書で開示した方法およびシステムを、臨床ルーチンで容易に実施できるように設計した。本発明のシステムを開発後、ブタでの前臨床試験に汎用可能な体外循環回路システムとしてこのシステムを実際に使用することによって、臨床への移行の意義を実証する。体外生命維持装置用の体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）を備えた動静脈体外循環回路システムの適用の概略図を図１Ｂに示す。
【００６８】
フライブルク当局の承認を得た後、７匹のランドレース種のハイブリッドブタ（体重52±2kg）に麻酔をかけ（プロポフォール、フェンタニルおよびシサトラクリウムの持続点滴）、人工呼吸器に接続し、頸動脈と肺動脈へのカニューレ挿入による侵襲的血圧測定、心電図およびパルスオキシメトリーでモニターした。動静脈ECMO（体外式膜型人工肺）による処置を、以下のようにして無菌操作により行った。超音波ガイド下で大腿静脈にカニューレ（21フレンチのHLSカニューレ、Maquet社、ドイツ、ラシュタット）を挿入することにより静脈にアクセスし、Maquet社製（ドイツ、ラシュタット）の17フレンチのHLSカニューレを使用して大腿動脈への動脈流入を確立した。次に、従来の遠心ポンプヘッド（Revolution 5、Sorin社、イタリア、ローマ）、酸素供給器（EOS ECMO、Sorin社、イタリア、ローマ）、および相互接続用の3/8インチのチューブを使用して、ECMO回路（一次回路）を構成した。改良型コンソール（主要な部品：遠心ポンプシステム（SCP）コンソール、Sorin社、イタリア、ローマ）を使用して、このECMO回路を制御した。
【００６９】
次に、ECCORSを酸素供給器と直列に接続し、一次ECMO回路に組み込んだ。ECCORSの主要な機能部品として、市販品であるPermSelect社製（イリノイ州アナーバー）のPDMSXA-1.0シリコーン膜モジュールを使用した。PDMSXAモジュール内のシリコーン製の管状膜（内径190μm、外径300μm）では、外側の血液収容コンパートメント（一次ECMO回路）と内側のCORM収容コンパートメント（二次回路）が分離されている。外側のコンパートメントは、一次ECMO回路の3/8インチのチューブに接続した（上記参照）。内側のコンパートメントは、15gのFeCl3を0.04Lの水に溶解した溶液を含む二次回路に接続した。二次回路のチューブは、CORMの注入口と、システム内の超過圧力を防ぐための２つの気密バッグ（リザーバーバッグ1L、Sorin社、イタリア、ローマ）とを備えていた。二次回路は、Cole-Parmer社製（イリノイ州バーノンヒルズ）のMasterflex Console Driveにより1/4インチのチューブ内を常時循環させた。
【００７０】
図１Ａに、体外一酸化炭素放出システム（ECCORS）の一部である膜モジュールの概略図を示す。ＣＯカートリッジに圧力がかかることに関する安全上の問題に対処するため、トリガー物質であるFeCl3を含む鉄−CORM回路内にＣＯ放出分子（CORM）であるBeck1を注入することによって、ＣＯをECCORS内で必要に応じて発生させる。ＣＯの発生後、ＣＯのみがECCORS内のガス透過性シリコーン中空繊維を透過して（その他の成分は透過しない）、体循環に送達される。モジュール内部のシリコーン中空繊維の表面によって、ＣＯＨｂ濃度が一定となる。
【００７１】
Beck1（Mo(CO)3(CNCH2COOH)3）1gを水0.02Lに溶解した溶液を二次回路に注入することによって、ＣＯの放出を開始させる。さらに、Beck1のさらなる注入は、所望の目標に対するフィードバック測定、すなわち、図２および図３に詳細に示したモニタリングパラメーターに基づいて制御した（下記参照）。
【００７２】
遊離のＣＯガスが、チューブ内を循環し、過剰なガスは、回路に接続された２つの不透過性ガスバッグリザーバーに収容されることから、チューブからなる閉ループ系においてＣＯを拡散させることが可能であった。このような構成であることから、ＣＯは、CORMから血液コンパートメントへと透過することができるが、非ガス成分の透過は膜により阻止された。
【００７３】
２台のMX6 iBridTM（Industrial Scientific社、米国）測定装置を使用して、酸素供給器の排気中のＣＯと呼気中のＣＯを定量した。また、血液ガス分析（cobas b 123、エフ・ホフマン・ラ・ロシュ社、スイス）と多波長パルスオキシメトリー（Rad-97、Massimo社、米国）によりＣＯＨｂを定量した。
【００７４】
治療的ＣＯ濃度に到達後、呼気中のＣＯ濃度と酸素供給器の排気中のＣＯ濃度を含むオンラインモニタリングパラメーターを使用した厳密なフィードバック制御下において、ECCORSへのBeck1の注入を制御することにより、定常状態を維持した（図２）。血液試料中のＣＯＨｂの分析はオフラインで行った（図２参照）。この手法は、現在最も標準的な全身ＣＯ濃度の評価方法であり、自動オンライン測定（つまり、自動フィードバックループの実施（下記参照））を行うことはできない。
【００７５】
パルスオキシメーター（連続式）でもＣＯＨｂの生成を測定したが、この手法は、主に、医療現場でファーストレスポンダーがＣＯＨｂ濃度のおおよその値を知るために使用されていることから、このデータは、血液で分析されたＣＯＨｂと低い相関しか認められなかった（Ｒ２＝０．３７、図３Ｃ）。
【００７６】
呼気中のＣＯ濃度および酸素供給器の排気中のＣＯ濃度を評価した。これらも血液試料中で分析したＣＯＨｂとの相関は低かった（それぞれＲ２＝０．４３およびＲ２＝０．５９であった；図３Ａおよび図３Ｂ）。したがって、これら３種の連続的なＣＯモニタリング方法では、治療的濃度の確実な識別（ＣＯ−Ｈｂ濃度１０％と毒性の閾値（たとえばＣＯ−Ｈｂ１６％）との区別）を行うのには適していない。これは、本発明により解決すべき課題の１つである。
【００７７】
CORMの有毒成分、特に遷移金属が、組織または血液中において確認されないことがデータから明らかになった。採取した組織および血液中のモリブデンをICP-MSにより分析して、ＣＯの効果および残留CORM成分を分析した。血流から独立して制御下でＣＯを発生させることが可能となるように２つの回路を分離した。ＣＯのみを透過し、その他の成分は透過しない膜を使用して、２つの回路を分離することによって、有毒なCORM成分に臓器を暴露することなく、ＣＯを体外循環に投与することが可能となり、その結果、虚血再灌流障害から臓器を保護することができる。
【００７８】
実施例２
全身のＣＯモニタリングプロトコルの分析力を向上させるため、機械学習を使用したアプローチを構築し、これを検証した。このアプローチでは、リアルタイムでＣＯのモニタリングパラメーターを処理し、次いでフィードバックループを修正するためのＣＯ濃度の予測値を提供する。このプロトコルによって、本発明の送達方法における分析力を向上させることができるため、本発明の概念を臨床へ移行させる意義を顕著に向上させることができる。
【００７９】
方法：Pythonのscikit-learnライブラリ（Pedregosa F, Ga, #235, Varoquaux l, Gramfort A, Michel V, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. J Mach Learn Res. 2011;12:2825-30）で実行させるランダムフォレスト回帰（Breiman L. Random Forests. Machine Learning. 2001;45(1):5-32）を使用して、機械学習モデルを構築した。決定木の数は1000とした。このモデルの予測力を、ランダム５分割交差検証法と１標本抜き取り交差検証法で評価した。
【００８０】
結果：インビボ研究において、複数のパラメーター（図５参照）をプロットして分析した。相関性の評価では、肺のＣＯ濃度、酸素供給器のＣＯ濃度、およびSpCO（パルスオキシメトリーによるカルボキシヘモグロビンの測定値）が、ＣＯＨｂ濃度の予測値に最も影響を及ぼす因子であることが確認された。Ｒ２値は、肺のＣＯ濃度に対するＣＯＨｂ濃度ではＲ２＝０．４３、酸素供給器のＣＯ濃度に対するＣＯＨｂ濃度ではＲ２＝０．５９、およびSpCOに対するＣＯＨｂ濃度ではＲ２＝０．３７であった（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ参照）。
【００８１】
分析方法の設定の正確度と精度を向上させるため、前述のパラメーターを使用して多元的ＣＯＨｂ予測モデルを構築した。ランダム５分割交差検証法と１標本抜き取り交差検証法において、重回帰分析（MLR）の予測力をベースラインとして評価した。３つのパラメーターを使用した重回帰分析（MLR）モデルによるＣＯＨｂ濃度の予測では、ＣＯＨｂ濃度での平均絶対誤差（MAE）＝２．３６％およびＱ２値（交差検証法による予測結果のＲ２）＝０．４５となり、予測性能はそれほど良くないことが示唆された（表１参照）。また、１標本抜き取り交差検証法では、平均絶対誤差＝２．８２％およびＱ２値＝０．１０となり、重回帰分析（MLR）モデルの性能が低いことが示された。ＣＯＨｂ濃度の予測性能を向上させるため、ランダムフォレスト（RF）回帰を使用して非線形機械学習モデルを構築した。ランダムフォレスト回帰を使用した場合、ランダム５分割交差検証法では平均絶対誤差＝１．３５％およびＱ２値＝０．７９となり、１標本抜き取り交差検証法では平均絶対誤差＝１．４１％およびＱ２値＝０．７２となったことから、ＣＯＨｂ濃度の予測力が向上したことが示された。ランダム５分割交差検証法では、９０％予測区間がＣＯＨｂ濃度で２．８０％であることが示された（図６Ａ）。酸素供給器のＣＯ濃度を唯一の入力パラメーターとしてランダムフォレスト回帰を繰り返したところ、ランダム５分割交差検証法では平均絶対誤差＝２．１６％およびＱ２値＝０．５２となり（図６Ｂ）、１標本抜き取り交差検証法では平均絶対誤差＝１．９９％およびＱ２値＝０．４６となる予測モデルであることが示された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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