(57)【要約】  本発明は、２つ以上のペプチドループがスキャフォールドへの結合点の間に張られるように非芳香族分子スキャフォールドに共有結合的に結合したポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼＡ２（ＥｐｈＡ２）の高親和性バインダーであるペプチドを記載する。本発明はまた、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物ならびに疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療における前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのループ配列により分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および少なくとも２つのポリペプチドループが非芳香族分子スキャフォールド上に形成されるように前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する前記分子スキャフォールドを含む、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンド。
【請求項２】
前記ループ配列が、２、３、５、６または７つのアミノ酸酸を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３】
前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の一方が２つのアミノ酸からなりかつ他方が７つのアミノ酸からなる（例えば、表４に列記されるもの）、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項４】
前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の両方が５つのアミノ酸からなる（例えば、表３および表４に列記されるもの）、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項５】
前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の両方が６つのアミノ酸からなる（例えば、表３〜５および表１０に列記されるもの）、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項６】
前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の一方が７つのアミノ酸からなりかつ他方が３つのアミノ酸からなる（例えば、表４に列記されるもの）、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項７】
前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の一方が６つのアミノ酸からなりかつ他方が７つのアミノ酸からなる（例えば、表５に列記されるもの）、請求項１または請求項２に記載のペプチドリガンド。
【請求項８】
前記ペプチドリガンドが、
Ｃｉ−Ｘ１−Ｃｉｉ−Ｘ２−Ｃｉｉｉ
から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１およびＸ２が、表３〜５および表１０において列記されるシステイン残基の間のアミノ酸残基を表し、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉが、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基、または薬学的に許容されるその塩を表す、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項９】
前記ペプチドリガンドが、１つまたは複数の表３〜５および表１０において列記されるペプチドリガンドのうちの１つまたは複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０】
前記ループ配列が、その両方が６つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、かつ、前記ペプチドリガンドが、以下のアミノ酸配列：
Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号１）；および
ＣｉＰＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰＧＷＴＣｉｉｉ（配列番号９７）；
例えば、
Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号１）
（ＨｙＰはヒドロキシプロリンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基、または薬学的に許容されるその塩を表す）
を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１１】
前記ループ配列が、その両方が６つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、かつ、前記ペプチドリガンドが、以下のアミノ酸配列：
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９；化合物６６）；および
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−ＣｉＰＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰＧＷＴＣｉｉｉ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号１１））（ＢＣＹ６０１４；化合物６７）；
例えば、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９；化合物６６）
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）
を有する、請求項１０に記載のペプチドリガンド。
【請求項１２】
前記分子スキャフォールドが、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択され、かつ、前記ペプチドリガンドが、表３、４、５および１０において列記されるペプチドリガンドのいずれか１つから選択される、請求項１から１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１３】
前記分子スキャフォールドが、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択され、かつ、前記ペプチドリガンドが、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９；化合物６６）；および
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−ＣｉＰＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰＧＷＴＣｉｉｉ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号１１））（ＢＣＹ６０１４；化合物６７）；
例えば、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９；化合物６６）；
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）
である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１４】
化合物１〜１１３のいずれか１つまたは薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１５】
化合物６６（ＢＣＹ６０９９）または化合物６７（ＢＣＹ６０１４）またはその薬学的に許容される塩、例えば、化合物６６（ＢＣＹ６０９９）または薬学的に許容されるその塩である、請求項１から１３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１６】
前記薬学的に許容される塩が、遊離酸またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム塩から選択される、請求項１から１５のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１７】
前記ＥｐｈＡ２がヒトＥｐｈＡ２である、請求項１から１６のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１８】
１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、請求項１から１７のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
前記細胞傷害剤がＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される、請求項１８に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
前記ペプチドリガンドと前記細胞傷害剤との間のリンカーを追加的に含む、請求項１８または請求項１９に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
前記細胞傷害剤がＭＭＡＥであり、かつ、前記リンカーが、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−、Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ−Ｇｌｙ−ｈＰｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−（配列番号９８）から選択される、請求項２０に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
前記細胞傷害剤がＭＭＡＥであり、かつ、前記リンカーが−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−である、請求項２１に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２３】
前記細胞傷害剤がＤＭ１であり、かつ、前記リンカーが、−Ｓ−Ｓ−、−ＳＳ（ＳＯ３Ｈ）−、−ＳＳ−（Ｍｅ）−、−（Ｍｅ）−ＳＳ−（Ｍｅ）−、−ＳＳ−（Ｍｅ２）−または−ＳＳ−（Ｍｅ）−ＳＯ３Ｈ−から選択される、請求項２０に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
ＢＣＹ６０２７、ＢＣＹ６０２８、ＢＣＹ６０３１およびＢＣＹ６０３２；表１１もしくは表１３に列記されるＢＤＣ；またはＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７３のいずれか１つから選択される、請求項１８から２３のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２５】
ＢＣＹ６０３１、ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６１３５、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１７４およびＢＣＹ６１７５のいずれか１つから選択される、請求項２４に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２６】
ＢＣＹ６１３６である、請求項２４または請求項２５に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて請求項１から１７のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項１８から２６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項２８】
疾患組織におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための、請求項１８から２６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
がんの予防、抑制または治療において使用するための、請求項１８から２６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項３０】
前記がんが、前立腺がん、肺がん（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、胃がん、卵巣がん、食道がん、多発性骨髄腫および線維肉腫から選択される、請求項２９に記載の使用のための薬物コンジュゲート。
【請求項３１】
がんを予防、抑制または治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項１８から２６のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲートを投与することを含み、前記患者が、ＥｐｈＡ２の増加したコピー数多型（ＣＮＶ）を有するとして同定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つ以上のペプチドループがスキャフォールドへの結合点の間に張られるように非芳香族分子スキャフォールドに共有結合的に結合したポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼＡ２（ＥｐｈＡ２）の高親和性バインダーであるペプチドを記載する。本発明はまた、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物ならびに疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療における前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
環状ペプチドは、高い親和性および標的特異性でタンパク質標的に結合することができ、それゆえ、治療剤の開発のための魅力的な分子クラスである。実際、例えば、抗菌性ペプチドバンコマイシン、免疫抑制薬シクロスポリンまたは抗がん薬物オクトレオチドのようないくつかの環状ペプチドは、診療所において既に成功裡に使用されている（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７  （７），  ６０８−２４）。良好な結合特性は、ペプチドと標的との間に形成される比較的大きい相互作用表面の他に、環状構造の低減したコンホメーション柔軟性の結果としてもたらされる。典型的には、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，  １０６６−７１）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å２）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６  （５５５６５），  １５１−５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ｕｐａｉｎ−１（６０３Å２；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １６０  （１），  １−１０）のように、大環状分子は数百平方オングストロームの表面に結合する。
【０００３】
環状の構成に起因して、ペプチド大環状分子は直鎖状ペプチドより柔軟性が低く、標的への結合時にエントロピーのより小さい損失に繋がり、結果としてより高い結合親和性をもたらす。低減した柔軟性はまた、標的特異的なコンホメーションのロッキングに繋がり、直鎖状ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。この効果は、その環が開いた時に他のＭＭＰに対するその選択性を喪失するマトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力かつ選択的な阻害剤により例示されている（Ｃｈｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４１  （１１），  １７４９−５１）。大環状化を通じて達成される好都合な結合特性は、例えば、バンコマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシンにおけるように１つより多くのペプチド環を有する多環ペプチドにおいてよりいっそう顕著になる。
【０００４】
異なる研究チームはこれまでに、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造にテザー連結してきた（Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  ＭｃＮａｍａｒａ  （１９８５），  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造的模倣のために合成スキャフォールド上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。候補薬物化合物がシステイン含有ポリペプチドを、例えばＴＡＴＡ（１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン、Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ，  Ｉｎｔ  Ｅｄ．  ２０１４；  ５３：１６０２−１６０６）のような分子スキャフォールドに連結することにより生成される、前記化合物の生成のための方法。
【０００５】
目的の標的に対する二環ペプチドの大きいライブラリーを生成およびスクリーニングするためのファージディスプレイに基づいたコンビナトリアルアプローチが開発されている（Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５  （７），  ５０２−７およびＷＯ２００９／０９８４５０）。簡潔に述べれば、３つのシステイン残基および６つのランダムなアミノ酸（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ）の２つの領域を含有する直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリーがファージ上に提示され、システイン側鎖を小分子スキャフォールドに共有結合的に連結することにより環化される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、少なくとも２つのループ配列により分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチド、および少なくとも２つのポリペプチドループが非芳香族分子スキャフォールド上に形成されるように前記ポリペプチドの前記システイン残基と共有結合を形成する前記分子スキャフォールドを含む、ＥｐｈＡ２に特異的なペプチドリガンドが提供される。
【０００７】
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている本明細書において定義されるようなペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＬＵ−０１−００４６腫瘍を有する雌Ｂａｌｂ／ＣヌードマウスへのＢＣＹ６０３１の投与後の体重変化である。データ点は群平均体重を表す。
【図２】ＬＵ−０１−００４６腫瘍を有する雌Ｂａｌｂ／ＣヌードマウスへのＢＣＹ６０３１の投与後の腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均を表す。処置を２８日目から中止した。
【図３】二環薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）の調製の概念を実証する一般的な概略図である。
【図４】ＨＴ１０８０異種移植マウスにおけるＢＣＹ６１３６についての平均腫瘍体積対時間のプロットである。用量（２、３および５ｍｇ／ｋｇ）を０および７日目に投与した。腫瘍負荷の指標となる処置の間の体重変化、薬物関連毒物学および全般的な動物の健康を右上の挿入図に示す。
【図５】ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植マウスにおけるＢＣＹ６１３６についての平均腫瘍体積対時間のプロットである。用量（１、２および３ｍｇ／ｋｇ）を０、７、１４、２１、２８および３５日目に投与した。腫瘍負荷の指標となる処置の間の体重変化、薬物関連毒物学および全般的な動物の健康を右上の挿入図に示す。
【図６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植マウスにおけるＢＣＹ６１３６についての平均腫瘍体積対時間のプロットである。用量（１、２および３ｍｇ／ｋｇ）を０、７、１４、２１、２８、３５および４５日目に投与した。腫瘍負荷の指標となる処置の間の体重変化、薬物関連毒物学および全般的な動物の健康を右上の挿入図に示す。
【図７】ＰＣ−３異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図８】ＰＣ−３異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＡＤＣの投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図９】ＰＣ−３異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０３３の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図１０】ＰＣ−３異種移植片を有する雄Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６、ＥｐｈＡ２−ＡＤＣまたはドセタキセルの投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図１１】ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０３３の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積および体重を表す。
【図１２】ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積および体重を表す。
【図１３】ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０８２の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積および体重を表す。
【図１４】ＬＵ−０１−０２５１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６およびＡＤＣの投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図１５】ＬＵ−０１−０２５１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６およびＡＤＣの投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図１６】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６０８２およびＢＣＹ６０３１の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図１７】ＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルを有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６またはＡＤＣの投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図１８】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０３３の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図１９】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図２０】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０８２の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図２１】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７３の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図２２】ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７５および６０３１の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図２３】ＬＵ−０１−０４１２異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６（図２３においてＢＴ５５２８と称される）、ＢＣＹ８２４５またはＢＣＹ８７８１の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積（左パネル）および体重（右パネル）を表す。
【図２４】ＬＵ−０１−０４８６異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図２５】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０３３の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積および体重を表す。
【図２６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積および体重を表す。
【図２７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのおよびＢＣＹ６０８２の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均腫瘍体積および体重を表す。
【図２８】ＥＭＴ−６同系移植片（ＥＭＴ−６  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）を有する雌ＢＡＬＢ／ｃマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。群３および群４の投与量を１４日目から５ｍｐｋおよび３ｍｐｋに変化させた。
【図２９】ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３０】ＳＫ−ＯＶ−３異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３１】ＯＥ２１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３２】ＭＯＬＰ−８異種移植片を有する雌ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３３】ＭＯＬＰ−８異種移植片を有する雌ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスへのＢＣＹ６０８２の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３４】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０８２の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３５】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０３１の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３６】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７３の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３７】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３５の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３８】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６０３３の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図３９】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１３６の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図４０】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７４の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図４１】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＢＣＹ６１７５の投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。
【図４２】ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへのＡＤＣの投与後の体重変化および腫瘍体積の追跡である。データ点は群平均体重を表す。エラーバーが上記の図中に存在する場合、これらは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一実施形態では、前記ループ配列は、２、３、５、６または７つのアミノ酸酸を含む。
【００１２】
さらなる実施形態では、前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の一方が２つのアミノ酸からなりかつ他方が７つのアミノ酸からなる（例えば、表４に列記されるもの）。
【００１３】
さらなる実施形態では、前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の両方が５つのアミノ酸からなる（例えば、表３および表４に列記されるもの）。
【００１４】
さらなる実施形態では、前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の両方が６つのアミノ酸からなる（例えば、表３〜５に列記されるもの）。
【００１５】
さらなる実施形態では、前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の両方が６つのアミノ酸からなる（例えば、表１０に列記されるもの）。
【００１６】
さらなる実施形態では、前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の一方が７つのアミノ酸からなりかつ他方が３つのアミノ酸からなる（例えば、表４に列記されるもの）。
【００１７】
さらなる実施形態では、前記ループ配列が、２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、当該２つのループ配列の一方が６つのアミノ酸からなりかつ他方が７つのアミノ酸からなる（例えば、表５に列記されるもの）。
【００１８】
一実施形態では、ペプチドリガンドは、
Ｃｉ−Ｘ１−Ｃｉｉ−Ｘ２−Ｃｉｉｉ
（Ｘ１およびＸ２は、表３〜５において列記されるシステイン残基の間のアミノ酸残基を表し、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基、または薬学的に許容されるその塩を表す）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、ペプチドリガンドは、１つまたは複数の表３〜５において列記されるペプチドリガンドのうちの１つまたは複数から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
さらなる実施形態では、ペプチドリガンドは、
Ｃｉ−Ｘ１−Ｃｉｉ−Ｘ２−Ｃｉｉｉ
（Ｘ１およびＸ２は、表１０において列記されるシステイン残基の間のアミノ酸残基を表し、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基、または薬学的に許容されるその塩を表す）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、ペプチドリガンドは、表１０において列記されるペプチドリガンドのうちの１つまたは複数から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
一実施形態では、前記ループ配列は、その両方が６つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、かつ、ペプチドリガンドは、
Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号１）；および
ＣｉＰＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰＧＷＴＣｉｉｉ（配列番号９７）
（ＨｙＰはヒドロキシプロリンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基、または薬学的に許容されるその塩を表す）から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２３】
さらなる実施形態では、前記ループ配列は、その両方が６つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、かつ、ペプチドリガンドは、以下のアミノ酸配列：
Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号１）
（ＨｙＰはヒドロキシプロリンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ第１、第２および第３のシステイン残基、または薬学的に許容されるその塩を表す）を有する。
【００２４】
一実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、アミノ酸配列：
Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号１）
以外のペプチドリガンドである。
【００２５】
一実施形態では、前記ループ配列は、その両方が６つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、かつ、ペプチドリガンドは、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９；化合物６６）；および
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−ＣｉＰＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰＧＷＴＣｉｉｉ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号１１））（ＢＣＹ６０１４；化合物６７）
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
さらなる実施形態では、前記ループ配列は、その両方が６つのアミノ酸からなる２つのループ配列により分離された３つのシステイン残基を含み、かつ、ペプチドリガンドは、以下のアミノ酸配列：
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９；化合物６６）
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）を有する。
【００２７】
一実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、アミノ酸配列：
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９；化合物６６）
以外のペプチドリガンドである。
【００２８】
一実施形態では、分子スキャフォールドは、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択され、かつ、ペプチドリガンドは、表３〜５において列記されるペプチドリガンドのいずれか１つから選択される。
【００２９】
代替的な実施形態では、分子スキャフォールドは、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択され、かつ、ペプチドリガンドは、表１０において列記されるペプチドリガンドのいずれか１つから選択される。
【００３０】
一実施形態では、分子スキャフォールドは、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択され、かつ、ペプチドリガンドは、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）（ＢＣＹ６０９９；化合物６６）；および
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−ＣｉＰＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰＧＷＴＣｉｉｉ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号１１））（ＢＣＹ６０１４；化合物６７）
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）から選択される。
【００３１】
さらなる実施形態では、分子スキャフォールドは、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択され、かつ、ペプチドリガンドは、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）Ｄ−Ｃｉ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃｉｉｉ（配列番号２）
（Ｓａｒはサルコシンであり、ＨＡｒｇはホモアルギニンであり、かつ、ＨｙＰはヒドロキシプロリンである）である。
【００３２】
一実施形態では、ペプチドリガンドは、化合物１〜１１３のいずれか１つまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００３３】
さらなる実施形態では、ペプチドリガンドは、化合物６６（ＢＣＹ６０９９）または化合物６７（ＢＣＹ６０１４）または薬学的に許容されるその塩である。
【００３４】
いっそうさらなる実施形態では、ペプチドリガンドは、化合物６６（ＢＣＹ６０９９）または薬学的に許容されるその塩である。
【００３５】
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学などの技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。標準技術が、分子生物学、遺伝学および生化学的方法のために使用され、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ２００１，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照）参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
命名法
ナンバリング
本発明のペプチド内のアミノ酸残基位置を指す場合、システイン残基（Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ）は不変であるのでナンバリングから省略し、したがって、本発明のペプチド内のアミノ酸残基のナンバリングは、以下：
−Ｃｉ−ＨｙＰ１−Ｌ２−Ｖ３−Ｎ４−Ｐ５−Ｌ６−Ｃｉｉ−Ｌ７−Ｈ８−Ｐ９−（Ｄ−Ａｓｐ）１０−Ｗ１１−（ＨＡｒｇ）１２−Ｃｉｉｉ−（配列番号１）
のように称される。
【００３７】
この記載の目的のために、全ての二環ペプチドは、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）と共に環化されて三置換１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパン−１−オン構造をもたらすものと仮定される。ＴＡＴＡとの環化は、Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉにおいて起こる。
【００３８】
分子フォーマット
二環コア配列へのＮまたはＣ末端伸長は、ハイフンにより分離されて、配列の左または右側に付加される。例えば、Ｎ末端（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａｌａテイルは、
（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ−（配列番号Ｘ）
として表される。
【００３９】
反転ペプチド配列
Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０（３），  １３６２−１３７３の開示に照らして、本明細書に開示されるペプチド配列はまた、レトロインベルソ形態において有用性を有することが想定される。例えば、配列が逆転され（すなわち、Ｎ末端はＣ末端となり、逆もまた成り立つ）、立体化学もまた同様に逆転する（すなわち、Ｄ−アミノ酸はＬ−アミノ酸となり、逆もまた成り立つ）。
【００４０】
ペプチドリガンド
ペプチドリガンドは、本明細書において称されるように、分子スキャフォールドに共有結合的に結合したペプチド、ペプチド性化合物（ｐｅｐｔｉｄｉｃ）またはペプチド模倣物を指す。典型的には、そのようなペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物は、天然または非天然アミノ酸、スキャフォールドへの共有結合を形成できる２つ以上の反応性基（すなわち、システイン残基）、および前記反応性基の間に張られる配列を有するペプチドを含み、前記反応性基の間に張られる配列は、ペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物がスキャフォールドに結合した場合にループを形成するので、ループ配列と称される。本発明の場合において、ペプチド、ペプチド性化合物またはペプチド模倣物は、少なくとも３つのシステイン残基（本明細書においてＣｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉのように称される）を含み、かつスキャフォールド上に少なくとも２つのループを形成する。
【００４１】
ペプチドリガンドの利点
本発明のある特定の二環ペプチドは、注射、吸入、経鼻、眼、経口または局所投与のために好適な薬物様分子として該二環ペプチドを考えることを可能とする多数の有利な特性を有する。そのような有利な特性としては以下が挙げられる。
−  種交差反応性。これは、前臨床の薬力学および薬物動態評価のための典型的な要件である；
−  プロテアーゼ安定性。二環ペプチドリガンドは、ほとんどの状況において、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー」）プロテアーゼ、胃および腸プロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、ならびに細胞内プロテアーゼなどに対して安定性を実証するべきである。二環ペプチドリード候補を動物モデルにおいて開発できることの他に、ヒトに対して信頼性と共に投与できるように、プロテアーゼ安定性は異なる種間で維持されるべきである；
−  望ましい溶解性プロファイル。これは、疎水性残基に対する荷電性および親水性残基の割合ならびに分子内／分子間Ｈ結合の関数であり、配合および吸収目的のために重要である；
−  循環中での最適な血漿中半減期。臨床的適応および治療レジメンに依存して、慢性または急性のいずれかの病態の管理のために短いまたは長いｉｎ  ｖｉｖｏ曝露時間を有する二環ペプチドの開発が必要とされることがある。最適な曝露時間は、薬剤への持続的な曝露から生じる毒物学的効果を最小化するための短い曝露時間の要件に対する持続的な曝露（最大の治療効率のため）の要件により支配される；
−  選択性。本発明のある特定のペプチドリガンドは、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＢ１などの他のＥｐｈ受容体チロシンキナーゼならびにＸＩＩＡ因子、炭酸脱水酵素９およびＣＤ３８に対して良好な選択性を実証する（本発明の選択されるペプチドリガンドについての選択性データを表７および表１４に見出すことができる）。本発明の選択されるペプチドリガンドは他の種（例えば、マウスおよびラット）との交差反応性を呈して、動物モデルにおける試験を可能とすることもまた留意されるべきである（表３〜６および表１５）；ならびに
−  安全性。出血事象が、ＥｐｈＡ２抗体薬物コンジュゲートを用いた前臨床ｉｎ  ｖｉｖｏモデルおよび臨床試験において報告されている。例えば、ＭＥＤＩ−５４７を用いた第１相オープンラベル研究は、６人の患者のうち５人において起こった出血および凝固事象に起因して中止された（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  （２０１３）  ３１：７７−８４）。患者において観察された出血事象は、ラットおよびサルの前臨床研究において観察された凝固システムへの効果、すなわち、活性化部分トロンボプラスチン時間の増加およびフィブリノーゲン／フィブリン分解生成物の増加に合致した（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ、同書）。明白な出血事象がサルにおける毒物学研究において見られたことが報告されている（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ、同書）。これらの結果を合わせると、ＭＥＤＩ−５４７は前臨床種および患者の両方において播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を引き起こすことが暗示される。本明細書において報告するＢＤＣは、短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期（＜３０分）を有し、したがって、患者においてＤＩＣを生じさせる可能性が本来的により低い。本明細書において示す結果（生物学的データのセクション５および６ならびに表２０を参照）は、本発明の選択される二環薬物コンジュゲートは、凝固パラメーターに対して効果を有さず、かつ前臨床研究において出血事象を生じさせなかったことを実証する。
【００４２】
薬学的に許容される塩
塩形態は本発明の範囲内にあり、ペプチドリガンドへの言及は前記リガンドの塩形態を含むことが理解されるであろう。
【００４３】
本発明の塩は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ，  Ｐ．  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  ＩＳＢＮ：  ３−９０６３９−０２６−８，  Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，  ３８８  ｐａｇｅｓ，  Ａｕｇｕｓｔ  ２００２に記載される方法などの従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中または有機溶媒中、または２つの混合物中で適切な塩基または酸と反応させることにより調製され得る。
【００４４】
酸付加塩（一塩または二塩）は、無機および有機の両方の、多様な酸と共に形成されてもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）樟脳酸、カンファースルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸および吉草酸の他に、アシル化されたアミノ酸およびカチオン交換樹脂からなる群から選択される酸と共に形成される一塩または二塩が挙げられる。
【００４５】
塩の１つの特定の群は、酢酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラクトビオン酸から形成される塩からなる。１つの特定の塩は塩酸塩である。別の特定の塩は酢酸塩である。
【００４６】
化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性であり得る（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−であり得る）官能基を有する場合、塩は、有機または無機塩基と共に形成されて、好適な陽イオンを生成してもよい。好適な無機カチオンの例としては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋などのアルカリ土類金属カチオン、ならびにＡｌ３＋またはＺｎ＋などの他のカチオンが挙げられるがそれに限定されない。好適な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられるがそれに限定されない。一部の好適な置換アンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミンの他に、リジンおよびアルギニンなどのアミノ酸に由来するものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
【００４７】
本発明のペプチドがアミン官能基を含有する場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法によるアルキル化剤との反応により、第四級アンモニウム塩を形成してもよい。そのような第四級アンモニウム化合物は本発明のペプチドの範囲内である。
【００４８】
修飾誘導体
本明細書において定義されるようなペプチドリガンドの修飾誘導体は本発明の範囲内であることが理解されるであろう。そのような好適な修飾誘導体の例としては、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾；１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置換（例えば、１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等配電子または等電子アミノ酸による置換；１つまたは複数の非極性アミノ酸残基の他の非天然の等配電子または等電子アミノ酸による置換）；スペーサー基の付加；１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化抵抗性アミノ酸残基による置換；１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の置換アミノ酸、例えば、アラニンによる置換、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置換；二環ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮ−アルキル化；１つまたは複数のペプチド結合のサロゲート結合による置換；ペプチド骨格長さの修飾；１つまたは複数のアミノ酸残基のアルファ炭素上の水素の別の化学基による置換、システイン、リジン、グルタミン酸／アスパラギン酸およびチロシンなどのアミノ酸を官能基化するような、前記アミノ酸の好適なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬を用いた修飾、ならびに、例えば、アルキンまたはアジド含有部分を用いた官能基化を可能とするそれぞれアジドまたはアルキン基含有アミノ酸といった、官能基化のために好適な直交反応性を導入するアミノ酸の導入または置換から選択される１つまたは複数の修飾が挙げられる。
【００４９】
一実施形態では、修飾誘導体はＮ末端および／またはＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、好適なアミノ反応化学を使用するＮ末端修飾、および／または好適なカルボキシ反応化学を使用するＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、前記Ｎ末端またはＣ末端修飾は、細胞傷害剤、ラジオキレーター（ｒａｄｉｏｃｈｅｌａｔｏｒ）または発色団が挙げられるがそれに限定されないエフェクター基の付加を含む。
【００５０】
さらなる実施形態では、修飾誘導体はＮ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｎ末端修飾はＮ末端アセチル基を含む。この実施形態では、Ｎ末端残基は、ペプチド合成の間に無水酢酸または他の適切な試薬を用いてキャップ付加されて、Ｎ末端がアセチル化された分子をもたらす。この実施形態は、アミノペプチダーゼの潜在的な認識点を除去する利点を提供し、二環ペプチドの分解の可能性を回避する。
【００５１】
代替的な実施形態では、Ｎ末端修飾は分子スペーサー基の付加を含み、分子スペーサー基は、エフェクター基のコンジュゲーションおよびその標的への二環ペプチドの効力の保持を促進する。
【００５２】
さらなる実施形態では、修飾誘導体はＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端修飾はアミド基を含む。この実施形態では、Ｃ末端残基は、ペプチド合成の間にアミドとして合成されて、Ｃ末端がアミド化された分子をもたらす。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識点を除去する利点を提供し、二環ペプチドのタンパク質分解の可能性を低減する。
【００５３】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置換を含む。この実施形態では、分解性プロテアーゼにより認識されず、かつ標的効力に対する何らの有害効果も有しない等配電子／等電子の側鎖を有する非天然アミノ酸が選択されてもよい。
【００５４】
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質加水分解が配座によりおよび立体的に妨害されるように、束縛されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸が使用されてもよい。特に、これらは、プロリンアナログ、バルキーな側鎖、Ｃ□二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）、およびシクロアミノ酸に関し、単純な誘導体はアミノ−シクロプロピルカルボン酸である。
【００５５】
一実施形態では、修飾誘導体はスペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端システイン（Ｃｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃｉｉｉ）へのスペーサー基の付加を含む。
【００５６】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化抵抗性アミノ酸残基による置換を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、トリプトファン残基のナフチルアラニンまたはアラニン残基による置換を含む。この実施形態は、結果として生じる二環ペプチドリガンドの薬学的安定性プロファイルを向上させる利点を提供する。
【００５７】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の荷電性アミノ酸残基の１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基による置換を含む。代替的な実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の１つまたは複数の荷電性アミノ酸残基による置換を含む。疎水性アミノ酸残基に対する荷電性アミノ酸残基の正しい均衡は、二環ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質の結合の程度およびしたがって血漿中の遊離の利用可能な画分の濃度に影響を及ぼし、荷電性アミノ酸残基（特に、アルギニン）は、細胞表面上のリン脂質膜とのペプチドの相互作用に影響を及ぼすことがある。２つの組合せは、ペプチド薬物の半減期、分布の体積および曝露に影響を及ぼすことがあり、臨床的なエンドポイントにしたがって調整することができる。加えて、疎水性アミノ酸残基に対する荷電性アミノ酸残基の正しい組合せおよび数は、注射部位（ペプチド薬物が皮下に投与された場合）において刺激を低減し得る。
【００５８】
一実施形態では、修飾誘導体は、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置換を含む。この実施形態は、立体障害によりおよび□−ターンコンホメーションを安定化させるＤ−アミノ酸の傾向によりタンパク質分解の安定性を増加させると考えられる（Ｔｕｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  ＰＮＡＳ，  １０２（２），  ４１３−４１８）。
【００５９】
一実施形態では、修飾誘導体は、任意のアミノ酸残基の除去およびＤ−アラニンなどのアラニンによる置換を含む。この実施形態は、鍵となる結合性残基を同定し、かつ潜在的なタンパク質分解攻撃部位を除去する利点を提供する。
【００６０】
上記の各修飾は、ペプチドの効力または安定性を意図的に向上させるように働くことが留意されるべきである。修飾に基づくさらなる効力向上は、以下の機序を通じて達成されてもよい。
−  より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活用し、より低い解離速度に繋がる疎水性部分を組み込むこと；
−  ロングレンジのイオン相互作用を活用して、より速い会合速度およびより高い親和性をもたらす荷電性基を組み込むこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｒａｐｉｄ，  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９９６），  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３，  ４２７−３１を参照）；ならびに
−  例えば、エントロピーの損失が標的結合時に最小となるように正しくアミノ酸の側鎖を束縛すること、エントロピーの損失が標的結合時に最小となるように骨格のねじり角度を束縛することおよび同一の理由から分子中に追加の環化を導入することにより、ペプチドに追加の束縛を組み込むこと。
（総説について、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，  （２０１０），  １６，  ３１８５−２０３、およびＮｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  （２００９），  １６，  ４３９９−４１８を参照）。
【００６１】
同位体バリエーション
本発明は、１つまたは複数の原子が、同じ原子数を有するが天然に通常見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子により置き換えられた、本発明の全ての薬学的に許容される（放射性）同位体標識されたペプチドリガンド、および、関連する（放射性）同位体を保持することができる金属キレーティング基（「エフェクター」と称される）が取り付けられた本発明のペプチドリガンド、および、ある特定の官能基が、関連する（放射性）同位体または同位体標識された官能基により共有結合的に置き換えられた本発明のペプチドリガンドを含む。
【００６２】
本発明のペプチドリガンドに含めるために好適な同位体の例は、２Ｈ（Ｄ）および３Ｈ（Ｔ）などの水素、１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃなどの炭素、３６Ｃｌなどの塩素、１８Ｆなどのフッ素、１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉなどのヨウ素、１３Ｎおよび１５Ｎなどの窒素、１５Ｏ、１７Ｏおよび１８Ｏなどの酸素、３２Ｐなどのリン、３５Ｓなどの硫黄、６４Ｃｕなどの銅、６７Ｇａまたは６８Ｇａなどのガリウム、９０Ｙなどのイットリウム、１７７Ｌｕなどのルテチウム、ならびに２１３Ｂｉなどのビスマスの同位体を含む。
【００６３】
本発明のある特定の同位体標識されたペプチドリガンド、例えば、放射活性同位体を組み込んだものは、薬物および／または基質の組織分布研究において、ならびに疾患組織におけるＥｐｈＡ２標的の存在および／または非存在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチドリガンドは、標識された化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体との間の複合体の形成を検出または同定するために使用され得るという点で価値のある診断特性をさらに有し得る。検出または同定方法は、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）などの標識化剤を用いて標識された化合物を使用し得る。放射活性同位体トリチウム、すなわち、３Ｈ（Ｔ）、および炭素−１４、すなわち、１４Ｃは、組込みの容易さおよび検出の手段が用意されていることを考慮してこの目的のために特に有用である。
【００６４】
重水素、すなわち、２Ｈ（Ｄ）などのより重い同位体による置換は、より大きい代謝安定性、例えば、増加したｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期または低減した投与量の必要性の結果としてもたらされるある特定の治療的な利点が得られることがあり、それゆえ、一部の状況において好ましいことがある。
【００６５】
１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎなどのポジトロン放出同位体による置換は、標的占有を調べるためのポジトロン断層法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）研究において有用であり得る。
【００６６】
本発明のペプチドリガンドの同位体標識された化合物は、一般的に、当業者に公知の従来技術によりまたは以前に用いられた非標識化試薬の代わりに適切な同位体標識された試薬を使用する本明細書中の実施例において記載されるものに類似の方法により調製され得る。
【００６７】
非芳香族分子スキャフォールド
「非芳香族分子スキャフォールド」という用語への本明細書における言及は、芳香族（すなわち、不飽和）炭素環式または複素環式環系を含有しない本明細書において定義されるような任意の分子スキャフォールドを指す。
【００６８】
非芳香族分子スキャフォールドの好適な例は、Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０１４）  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ５３（６）  １６０２−１６０６に記載されている。
【００６９】
以上の文献において記載されているように、分子スキャフォールドは、小有機分子などの小分子であってもよい。
【００７０】
一実施形態では、分子スキャフォールドは高分子であってもよい。一実施形態では、分子スキャフォールドは、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される高分子である。
【００７１】
一実施形態では、分子スキャフォールドは、ポリペプチドの官能基と反応して共有結合を形成できる反応性基を含む。
【００７２】
分子スキャフォールドは、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの、ペプチドと連結を形成する化学基を含んでもよい。
【００７３】
α不飽和カルボニル含有化合物の例は、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）である（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１４），  ５３（６），  １６０２−１６０６）。
【００７４】
エフェクターおよび官能基
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされている本明細書において定義されるようなペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【００７５】
エフェクターおよび／または官能基は、例えば、ポリペプチドのＮおよび／もしくはＣ末端、ポリペプチド内のアミノ酸、または分子スキャフォールドに取り付けられ得る。
【００７６】
適切なエフェクター基としては、抗体およびその部分または断片が挙げられる。例えば、エフェクター基は、１つまたは複数の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメイン、または任意のその組合せを含み得る。エフェクター基はまた、抗体のヒンジ領域を含んでもよい（そのような領域は通常、ＩｇＧ分子のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に見出される）。
【００７７】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基はＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上または７日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合物を含むまたはからなる。より有利には、本発明によるペプチドリガンドは、１日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合物を含むまたはからなる。
【００７８】
官能基としては、一般に、結合性基、薬物、他の実体の取付けのための反応性基、および細胞への大環状ペプチドの取込みを補助する官能基などが挙げられる。
【００７９】
細胞中に透過するペプチドの能力は、細胞内標的に対してペプチドが効果的となることを可能とする。細胞中に透過する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的としては、転写因子、チロシンキナーゼおよびアポトーシス経路に関与する分子などの細胞内シグナル伝達分子が挙げられる。細胞の透過を可能とする官能基としては、ペプチドまたは分子スキャフォールドのいずれかに付加されたペプチドまたは化学基が挙げられる。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００７）  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５，  ｐａｒｔ  ４，  ｐ８２１；  Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００４）  Ｖｏｌｕｍｅ  ５７  ９６３７に記載されるような、ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）などに由来するものなどのペプチド。細胞膜を通る移行において効率的であることが示されている短いペプチドの例としては、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質からの１６アミノ酸ペネトラチンペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９  ｐ１０４４４）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １４１４  ｐ１２７）およびＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチとしては、生体分子に容易に取り付けることができる小分子模倣体またはＳＭＯＣの使用が挙げられる（Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  ｐ１５３）。分子にグアニジニウム基を付加する他の化学的戦略はまた、細胞透過を増進する（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８２  ｐ１３５８５）。ステロイドなどの低分子量分子は、細胞への取込みを増進するために分子スキャフォールドに付加されてもよい。
【００８０】
ペプチドリガンドに取り付けられ得る官能基の１つのクラスとしては、抗体およびＦａｂ、Ｆｖまたは単一ドメイン断片などのその結合断片が挙げられる。特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体が使用されてもよい。
【００８１】
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上または２０日以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基または組成物は、１２〜６０時間のｔβ範囲を有する。さらなる実施形態では、それは１日以上のｔβ半減期を有する。いっそうさらなる実施形態では、それは１２〜２６時間の範囲内である。
【００８２】
本発明の１つの特定の実施形態では、官能基は、医薬的関連性のある金属放射性同位体を錯化させるために好適な金属キレーターから選択される。
【００８３】
可能なエフェクター基としては酵素もまた挙げられ、酵素は、例えば、ペプチドリガンドがＡＤＥＰＴにおいて抗体を置き換える酵素／プロドラッグ療法において使用するためのカルボキシペプチダーゼＧ２などである。
【００８４】
本発明の１つの特定の実施形態では、官能基は、がん療法用の細胞傷害剤などの薬物から選択される。好適な例としては、シスプラチンおよびカルボプラチンの他に、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドなどのアルキル化剤；プリンアナログであるアザチオプリンおよびメルカプトプリンまたはピリミジンアナログを含む抗代謝物；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンなどのビンカアルカロイドを含む植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド；元々はタキソールとして公知のパクリタキセルを含むタキサン；イリノテカンおよびトポテカンといったカンプトテシン類を含むトポイソメラーゼ阻害剤；ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、およびテニポシドを含むＩＩ型阻害剤が挙げられる。さらなる薬剤としては、免疫抑制剤ダクチノマイシン（腎臓移植において使用される）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎｓ）、およびその他を含む抗腫瘍性抗生物質を挙げることができる。
【００８５】
本発明の１つのさらなる特定の実施形態では、細胞傷害剤は、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）またはモノメチルアウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ）から選択される。
【００８６】
ＤＭ１は、メイタンシンのチオール含有誘導体である細胞傷害剤であり、以下の構造を有する。
【００８７】
【化１】
2021506910.tif 000002
【００８８】
モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は合成の抗新生物剤であり、以下の構造を有する。
【００８９】
【化２】
2021506910.tif 000003
【００９０】
本発明の１つのまたさらなる特定の実施形態では、細胞傷害剤はメイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）から選択される。ＤＭ１を含有する毒素にコンジュゲートされているペプチドリガンドの効果を実証するデータが本明細書の表６に提示される。
【００９１】
一実施形態では、細胞傷害剤は、ジスルフィド結合またはプロテアーゼ感受性結合などの切断可能な結合により二環ペプチドに連結される。さらなる実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する基は、ジスルフィド結合の障害、ならびにこれにより切断および細胞傷害剤の付随的な放出の速度を制御するように修飾される。
【００９２】
公開された研究は、ジスルフィド結合のいずれかの側に立体障害を導入することにより還元に対するジスルフィド結合の感受性を修飾する可能性を確立した（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２２，  ７１７）。より大きい程度の立体障害は、細胞内グルタチオン、そしてまた細胞外（全身性）の還元剤による還元の速度を低減し、結果的に、細胞の内部および外部の両方において、毒素が放出される容易さを低減する。したがって、細胞内環境における効率的な放出（これは治療効果を最大化する）と対比した循環中のジスルフィド安定性（これは毒素の望ましくない副作用を最小化する）における最適条件の選択は、ジスルフィド結合のいずれかの側における障害の程度の注意深い選択により達成され得る。
【００９３】
ジスルフィド結合のいずれかの側における障害は、標的化実体（ここでは、二環ペプチド）または分子構築物の毒素側のいずれか上に１つまたは複数のメチル基を導入することを通じてモジュレートされる。
【００９４】
一実施形態では、薬物コンジュゲートは、前記ペプチドリガンドと前記細胞傷害剤との間のリンカーを追加的に含む。
【００９５】
一実施形態では、細胞傷害剤およびリンカーは、ＷＯ２０１６／０６７０３５（その細胞傷害剤およびリンカーは参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものの任意の組合せから選択される。
【００９６】
一実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される。
【００９７】
一実施形態では、前記細胞傷害剤と前記二環ペプチドとの間のリンカーは１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。したがって、一実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥであり、かつ、リンカーは、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−、Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ−Ｇｌｙ−ｈＰｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−（配列番号９８）から選択される。さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥであり、かつ、リンカーは、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−または−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択される。いっそうさらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥであり、かつ、リンカーは−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−または−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−である。よりいっそうさらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥであり、かつ、リンカーは−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−である。
【００９８】
代替的な実施形態では、前記細胞傷害剤（ｃｙｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）の間のリンカーは、切断性ジスルフィド結合などのジスルフィド結合を含む。したがって、さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、リンカーは、−Ｓ−Ｓ−、−ＳＳ（ＳＯ３Ｈ）−、−ＳＳ−（Ｍｅ）−、−（Ｍｅ）−ＳＳ−（Ｍｅ）−、−ＳＳ−（Ｍｅ２）−または−ＳＳ−（Ｍｅ）−ＳＯ３Ｈ−から選択される。さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、リンカーは、（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＢ）などの−Ｓ−Ｓ−部分、またはＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢなどの−ＳＳ（ＳＯ３Ｈ）−部分を含む。
【００９９】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤は切断可能でない細胞傷害剤を含む。したがって、一実施形態では、細胞傷害剤は、切断可能でないＭＭＡＥ（例えば、ＢＣＹ６０６３内の細胞傷害剤）または切断可能でないＤＭ１（例えば、ＢＣＹ６０６４内の細胞傷害剤）である。
【０１００】
一実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、式（Ａ）：
【化３】
2021506910.tif 000004
の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０９９およびＢＣＹ６０１４のいずれか１つから選択される。
【０１０１】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、式（Ｂ）：
【化４】
2021506910.tif 000005
の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０９９およびＢＣＹ６０１４のいずれか１つから選択される。
【０１０２】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ａ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０９９から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＣＹ６０２７として知られる。表６に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＣＹ６０２７について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【０１０３】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ｂ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０９９から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＣＹ６０２８として知られる。表６に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＣＹ６０２８について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【０１０４】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ａ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０１４から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＣＹ６０３１として知られる。表６に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＣＹ６０３１について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。ＢＣＹ６０３１処理は３２日目から非小細胞肺癌を完全に根絶し、２８日目における懸濁液の投与後に腫瘍再成長は起こらなかったことを実証するデータもまた本明細書の表１１ならびに図１および図２において提示される。
【０１０５】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは式（Ｂ）の化合物を含み、前記二環は、本明細書において定義されるようなＢＣＹ６０１４から選択される。このＢＤＣは本明細書においてＢＣＹ６０３２として知られる。表６に示すように、ＥｐｈＡ２競合結合アッセイにおいてＢＣＹ６０３２について優れた競合結合を実証するデータが本明細書において提示される。
【０１０６】
代替的な実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥまたはＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、表１１に列記される任意のＢＤＣから選択される。表１１に示すように、これらのＢＤＣは、ヒト、マウスおよび齧歯動物ＥｐｈＡ２の間で優れた交差反応性を呈したことを示すデータが本明細書において提示される。
【０１０７】
さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥまたはＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、表１３に列記される任意のＢＤＣから選択される。
【０１０８】
さらなる実施形態では、細胞傷害剤はＭＭＡＥまたはＤＭ１であり、かつ、薬物コンジュゲートは、ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７３から選択される。表１４および表１５に示すように、これらの４つの二環薬物コンジュゲートは、密接に関連するヒトホモログＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＢ４；マウスＥｐｈＡ３およびＥｐｈＡ４；ならびにラットＥｐｈＡ３およびＥｐｈＢ１への有意な結合を呈しなかったことを示すデータが本明細書において提示される。
【０１０９】
いっそうさらなる実施形態では、薬物コンジュゲートは、ＢＣＹ６０３１、ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６１３５、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１７４およびＢＣＹ６１７５のいずれか１つから選択される。
【０１１０】
【化５】
2021506910.tif 000006
【０１１１】
【化６】
2021506910.tif 000007
【０１１２】
【化７】
2021506910.tif 000008
【０１１３】
【化８】
2021506910.tif 000009
【０１１４】
【化９】
2021506910.tif 000010
【０１１５】
【化１０】
2021506910.tif 000011
【０１１６】
【化１１】
2021506910.tif 000012
【０１１７】
【化１２】
2021506910.tif 000013
【０１１８】
一実施形態では、薬物コンジュゲートは、ＢＣＹ６０２７、ＢＣＹ６０２８、ＢＣＹ６１３５、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１７４およびＢＣＹ６１７５以外のものである。
【０１１９】
よりいっそうさらなる実施形態では、薬物コンジュゲートはＢＣＹ６１３６である。ＢＣＹ６１３６はＰＣ−３異種移植前立腺がんモデルにおいて有意かつ強力な抗腫瘍活性を示したことを示すデータが本明細書の研究７および８において提示される（図７〜１０および表２１〜２４を参照）。ＢＣＹ６１３６はＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書において提供される（図１１〜１３および表２５〜３０を参照）。ＢＣＹ６１３６は大腫瘍サイズおよび小腫瘍サイズの両方のＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を実証し（図１４および図１５および表３１〜３４を参照）、完全な腫瘍退縮が観察されたことを示すデータもまた本明細書の研究１０および１１において提示される。ＢＣＹ６１３６はＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて有意な抗腫瘍効果を実証し（図１６ならびに表３５および表３６を参照）、完全な腫瘍退縮がＢＣＹ６１３６について観察されたことを示すデータもまた本明細書の研究１２において提示される。ＢＣＹ６１３６はＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書の研究１３において提示される（図１７ならびに表３７および表３８を参照）。ＢＣＹ６１３６はＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて腫瘍を根絶したことを示すデータもまた本明細書の研究１４において提示される（図１８〜２２および表３９〜４２を参照）。低い／ごくわずかなＥｐｈＡ２発現を有する細胞株（すなわち、Ｌｕ−０１−０４１２およびＬｕ−０１−０４８６）を利用する２つのモデルにおいてＢＣＹ６１３６の効果を実証するデータもまた本明細書の研究１５および１６において提示される。このデータは図２３および図２４ならびに表４３〜４６において示され、ＢＣＹ６１３６はいずれの細胞株においても腫瘍退縮に対して効果を有しなかったが、Ｌｕ−０１−０４１２細胞株において高発現される標的に結合するＢＣＹであるＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１は、腫瘍を完全に根絶したことを実証する。ＢＣＹ６１３６はＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植乳がんモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが本明細書の研究１７において提示される（図２５〜２７および表４７〜５０を参照）。低い／ごくわずかなＥｐｈＡ２発現を有する細胞株（すなわち、ＥＭＴ６）を利用する乳がんモデルにおいてＢＣＹ６１３６の効果を実証するデータもまた本明細書の研究１８において提示される。このデータは図２８ならびに表５１および表５２において示され、ＢＣＹ６１３６はこの細胞株において腫瘍退縮に対して効果を有しなかったことを実証する。ＢＣＹ６１３６はＮＣＩ−Ｎ８７異種移植胃がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書の研究１９において提示される（図２９ならびに表５３および表５４を参照）。ＢＣＹ６１３６は、中等度の抗腫瘍活性を実証したＡＤＣ  ＭＥＤＩ−５４７と比較して、ＳＫ−ＯＶ−３異種移植卵巣がんモデルにおい��有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書の研究２０において提示される（図３０ならびに表５５および表５６を参照）。ＢＣＹ６１３６はＯＥ−２１異種移植食道がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書の研究２１において提示される（図３１ならびに表５７および表５８を参照）。ＢＣＹ６１３６はＭＯＬＰ−８異種移植多発性骨髄腫モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６０８２は有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書の研究２２において提示される（図３２および図３３ならびに表５９および表６０を参照）。ＢＣＹ６１３６はＨＴ−１０８０異種移植線維肉腫モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書の研究２３において提示される（図３４〜４１ならびに表６１および表６２を参照）。
【０１２０】
合成
本発明のペプチドは、標準技術による合成の後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分子スキャフォールドとの反応により製造されてもよい。これが行われる場合、標準的な化学が使用されてもよい。これは、さらなる下流の実験または検証のために可溶性の材料の迅速な大規模の調製を可能とする。そのような方法は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（上掲）に開示されるものなどの従来の化学を使用して達成され得る。
【０１２１】
したがって、本発明はまた、本明細書において示されるような選択されるポリペプチドまたはコンジュゲートの製造であって、以下において説明するような任意選択のさらなるステップを含む製造に関する。一実施形態では、これらのステップは、化学合成により作製された最終生成物のポリペプチド／コンジュゲートに対して実行される。
【０１２２】
任意選択で、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を製造する時に置換されてもよい。
【０１２３】
ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、したがって複数の特異性を導入するために伸長され得る。
【０１２４】
ペプチドを伸長するために、それは単純に、標準的な固相または溶液相化学を使用して直交的に保護されたリジン（およびアナログ）を使用してそのＮ末端もしくはＣ末端においてまたはループ内において化学的に伸長されてもよい。標準的な（生物）コンジュゲーション技術を使用して、活性化されたまたは活性化可能なＮまたはＣ末端を導入してもよい。あるいは、付加は、例えば（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）に記載されるような断片凝縮もしくは天然の化学的ライゲーションにより、または、例えば（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９４  Ｄｅｃ  ２０；  ９１（２６）：１２５４４−８もしくはＨｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８，  Ｉｓｓｕｅ  ２２，  １５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８，  Ｐａｇｅｓ  ６０００−６００３）に記載されるようなサブチリガーゼを使用して、酵素により為されてもよい。
【０１２５】
あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を通じたさらなるコンジュゲーションにより伸長または修飾されてもよい。これは、第１および第２のペプチドが、細胞の還元性環境内に入ると互いに解離することを可能とするという追加の利点を有する。この場合、分子スキャフォールドは、３つのシステイン基と反応するように第１のペプチドの化学合成の間に付加されてもよく、さらなるシステインまたはチオールは次に、第１のペプチドのＮまたはＣ末端に付加されてもよく、それにより、このシステインまたはチオールは第２のペプチドの遊離のシステインまたはチオールとのみ反応して、ジスルフィド連結した二環ペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成する。
【０１２６】
類似の技術は、２つの二環および二重特異性大環状分子の合成／連結に等しく適用され、四重特異性分子を潜在的に作製する。
【０１２７】
さらには、他の官能基またはエフェクター基の付加は、適切な化学を使用して、ＮもしくはＣ末端においてまたは側鎖を介して連結させて、同様に達成されてもよい。一実施形態では、連結は、いずれの実体の活性も遮断しないような方式において実行される。
【０１２８】
医薬組成物
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０１２９】
一般的に、本発明のペプチドリガンドは、薬理学的に適切な賦形剤または担体と共に精製された形態において利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体は、生理食塩水および／または緩衝化媒体を含む、水性またはアルコール／水性溶液、エマルションまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸リンゲル液が挙げられる。好適な生理的に許容される佐剤は、ポリペプチド複合体を懸濁状態に保つために必要な場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどの増粘剤から選択されてもよい。
【０１３０】
静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液および電解質補充液、例えば、リンゲルのデキストロースに基づくものが挙げられる。防腐剤ならびに他の添加物、例えば、抗菌物質、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスもまた存在してもよい（Ｍａｃｋ  （１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１３１】
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物としてまたは他の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。これらとしては、抗体、抗体断片および様々な免疫療法薬物、例えば、シクロスポリン（ｃｙｌｃｏｓｐｏｒｉｎｅ）、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチナムおよび免疫毒素を挙げることができる。医薬組成物は、本発明のタンパク質リガンドと組み合わせて様々な細胞傷害剤もしくは他の薬剤の「カクテル」、または、投与前にプールされるか否かによらず、異なる標的リガンドを使用して選択されるポリペプチドなどの、異なる特異性を有する本発明による選択されるポリペプチドの組合せさえも含み得る。
【０１３２】
本発明による医薬組成物の投与の経路は、当業者に一般的に公知の任意のものであってもよい。療法のために、本発明のペプチドリガンドは、標準技術にしたがって任意の患者に投与され得る。投与は、任意の適切な様式によるものであり得、該様式としては、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺経路を介して、または適宜、カテーテルを用いる直接注入によるものが挙げられる。好ましくは、本発明による医薬組成物は吸入により投与される。投与の量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時的な投与、禁忌および臨床医により考慮される他のパラメーターに依存する。
【０１３３】
本発明のペプチドリガンドは、貯蔵および使用前に好適な担体中に復元するために凍結乾燥され得る。この技術は効果的であることが示されており、当該技術分野において公知の凍結乾燥および復元技術が用いられ得る。凍結乾燥および復元は様々な程度の活性損失に繋がることがあり、補償のためにレベルを上方に調整する必要があり得ることが当業者により理解されるであろう。
【０１３４】
本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防および／または治療処置のために投与され得る。ある特定の治療応用では、選択される細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、モジュレーション、殺傷、または何らかの他の測定可能なパラメーターを達成するために充分な量は、「治療有効量」として定義される。この投与量を達成するために必要とされる量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の全般的状態に依存するが、概ね体重１キログラム当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択されるペプチドリガンドの範囲内であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。予防応用のために、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、類似のまたはわずかにより低い投与量において投与されてもよい。
【０１３５】
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択標的細胞集団の変化、不活性化、殺傷または除去を補助するために予防的および治療的な設定において利用されてもよい。加えて、本明細書に記載のペプチドリガンドは、細胞の異成分集合物から標的細胞集団を選択的に殺傷し、枯渇させまたは他に効果的に除去するために生体外またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて使用されてもよい。哺乳動物からの血液を選択されるペプチドリガンドと生体外において合わせることにより、望まない細胞を殺傷し、またはそれ以外に標準技術にしたがって哺乳動物に戻すために血液から除去してもよい。
【０１３６】
治療的使用
本発明の二環ペプチドは、ＥｐｈＡ２結合剤として特定の有用性を有する。
【０１３７】
Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼ（Ｅｐｈ）は、チロシン残基においてタンパク質をリン酸化するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の大きい群に属する。Ｅｐｈおよびその膜結合型エフリンリガンド（エフリン）は、細胞の位置決めおよび組織編成を制御する（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ７，  ４６５−８０）。機能的および生化学的なＥｐｈ応答は、より高いリガンドオリゴマー化状態において起こる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２，  ６６７−６７８）。
【０１３８】
他のパターニング機能の中で、様々なＥｐｈおよびエフリンは血管発生において役割を果たすことが示されている。ＥｐｈＢ４およびエフリン−Ｂ２のノックアウトは、毛細血管床を血管に再モデル化する能力の欠如（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）および胚致死性を結果としてもたらす。一部のＥｐｈ受容体およびエフリンの持続性の発現もまた、新たに形成された成体微小血管において観察されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １０，  ３４３１−４２；  Ａｄａｍｓ  （２００３）  Ｊ  Ａｎａｔ  ２０２，  １０５−１２）。
【０１３９】
成体における一部のエフリンおよびその受容体の脱調節された再出現はまた、腫瘍浸潤、転移および血管新生に寄与することが観察されている（Ｎａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ５９，  ５８−６７；Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）。さらには、一部のＥｐｈファミリーメンバーは、様々なヒト腫瘍からの腫瘍細胞上に過剰発現されることが見出されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）；Ｍａｒｍｅ  （２００２）  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８１  Ｓｕｐｐｌ  ２，  Ｓ６６；  Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，  １３６０−１）。
【０１４０】
ＥＰＨ受容体Ａ２（エフリンＡ型受容体２）は、ヒトにおいてＥＰＨＡ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。
【０１４１】
ＥｐｈＡ２は、ヒトにおける複数のがんにおいて上方調節されており、多くの場合に、疾患進行、転移および予後不良と相関する。例えば、乳房（Ｚｅｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ２３０１−２３０６；  Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７０，  ２９９−３０８；  Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ２４４２６）、肺（Ｂｒａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）  ２，  １０３９−１０４９；  Ｋｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９，  ６１３−６１８；  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ．  ８，  ３０１−３０８）、胃（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ９６，  ４２−４７；  Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  ５４，  ２４１０−２４１７）、膵臓（Ｍｕｄａｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２３，  ３５７−３６５）、前立腺（Ｗａｌｋｅｒ−Ｄａｎｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４１，  ２７５−２８０）、肝臓（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｒｅｓ．  ３９，  １１６９−１１７７）および膠芽腫（Ｗｙｋｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３，  ５４１−５５１；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ３１，  ４７７−４８８）。
【０１４２】
がんの進行におけるＥｐｈＡ２の全体的役割は依然として定義されていないが、腫瘍細胞の増殖、生存、浸潤および血管新生を含むがんの進行の多数のステージにおける相互作用について証拠が存在する。ＥｐｈＡ２発現の下方調節は腫瘍のがん細胞繁殖を抑制し（Ｂｉｎｄａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２，  ７６５−７８０）、ＥｐｈＡ２の遮断は、ＶＥＧＦ誘導性の細胞遊走（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１，  ３２５０−３２５５）、出芽および血管新生（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １，  ２−１１；  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  １０９，  ３３２−４０）ならびに転移の進行（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９，  １８８４−１８８６）を阻害する。
【０１４３】
ＥｐｈＡ２への抗体薬物コンジュゲートは、ラットおよびマウス異種移植モデルにおいて腫瘍成長を有意に減少させることが示されており（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８，  ９３６７−９３７４）、類似のアプローチが男性において試みられたが、治療関連有害事象のために治療は中止されなければならなかった（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ３１，  ７７−８４）。
【０１４４】
本発明の方法により選択されるポリペプチドリガンドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療および予防応用、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの診断応用、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイならびに試薬応用などにおいて用いられてもよい。選択されるレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望まれる非ヒト動物における試験を伴う応用、または、ホモログもしくはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断応用において有用である。ワクチン応用などの一部の応用では、予め決定された範囲の抗原に対し免疫応答を誘発する能力を活用して、特定の疾患および病原体に対するワクチンを調整することができる。
【０１４５】
少なくとも９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なペプチドリガンドは哺乳動物への投与のために好ましく、９８〜９９％またはより高い均質性は、特に哺乳動物がヒトである場合に、医薬的使用のために最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均質になるまで精製されると、選択されるポリペプチドは、診断的もしくは治療的（生体外を含む）にまたはアッセイ手順および免疫蛍光染色などの開発および実行において使用され得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，  （１９７９  ａｎｄ  １９８１）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）。
【０１４６】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害の予防、抑制または治療において使用するための、本明細書において定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートが提供される。
【０１４７】
本発明のさらなる態様によれば、疾患組織（例えば、腫瘍）におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害を予防、抑制または治療する方法であって、それを必要とする患者に本明細書において定義されるようなペプチドリガンドのエフェクター基および薬物コンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。
【０１４８】
一実施形態では、ＥｐｈＡ２は哺乳動物ＥｐｈＡ２である。さらなる実施形態では、哺乳動物ＥｐｈＡ２はヒトＥｐｈＡ２である。
【０１４９】
一実施形態では、疾患組織におけるＥｐｈＡ２の過剰発現により特徴付けられる疾患または障害はがんから選択される。
【０１５０】
治療（または阻害）され得るがん（およびその良性の対応物）の例としては、上皮起源の腫瘍（腺癌、扁平癌、移行細胞癌および他の癌腫を含む様々な種類の腺腫および癌腫）、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管（食道、胃、小腸、結腸、直腸および肛門を含む）、肝臓（肝細胞癌）、胆嚢および胆汁系、外分泌膵臓、腎臓、肺（例えば、腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞上皮癌および中皮腫）、頭頸部（例えば、舌、頬腔、喉頭、咽頭、鼻咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および副鼻腔のがん）、卵巣、卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内膜、甲状腺（例えば、甲状腺濾胞癌）、副腎、前立腺、皮膚および付属器（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、ケラトアカントーマ、形成異常母斑）の癌腫；血液学的悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）および前悪性血液学的障害およびリンパ系列の血液学的悪性腫瘍および関連する状態を含む境界型悪性腫瘍の障害（例えば、急性リンパ性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明のモノクローナルガンマグロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、および移植後リンパ増殖性障害）、および骨髄系列の血液学的悪性腫瘍および関連する状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増多症候群、骨髄増殖性障害、例えば、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、および前骨髄球性白血病）；間葉起源の腫瘍、例えば軟組織肉腫、骨または軟骨の腫瘍、例えば、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、消化管間質腫瘍、良性および悪性組織球腫、および隆起性皮膚線維肉腫；中枢または末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫および膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍および神経鞘腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、膵島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺の髄様癌）；目および付属器の腫瘍（例えば、網膜芽腫）；生殖細胞および栄養膜腫瘍（例えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛癌）；ならびに小児性および胎児性腫瘍（例えば、髄芽腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、および未分化神経外胚葉性腫瘍）；または患者を悪性腫瘍にかかりやすくする症候群、先天性もしくはその他（例えば、色素性乾皮症）が挙げられるがそれに限定されない。
【０１５１】
さらなる実施形態では、がんは、乳がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、肝臓がん、膠芽腫および血管新生から選択される。
【０１５２】
さらなる実施形態では、がんは、前立腺がん、肺がん（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、胃がん、卵巣がん、食道がん、多発性骨髄腫および線維肉腫から選択される。
【０１５３】
いっそうさらなる実施形態では、がんは前立腺がんである。ＢＣＹ６０３３およびＢＣＹ６１３６はＰＣ−３異種移植前立腺がんモデルにおいて有意かつ強力な抗腫瘍活性を示したことを示すデータが本明細書の研究７および８において提示される（図７〜１０および表２１〜２４を参照）。
【０１５４】
いっそうさらなる実施形態では、薬物コンジュゲートは、線維肉腫および乳房、および非小細胞肺癌などの固形腫瘍を予防、抑制または治療するために有用なものである。
【０１５５】
いっそうさらなる実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺がんから選択される。本発明のＢＤＣ（ＢＣＹ６０３１）は、３２日目から非小細胞肺癌を完全に根絶し、２８日目における懸濁液の投与後に腫瘍再成長は起こらなかったことを実証するデータが本明細書において提示される。このデータは、肺がん、特に非小細胞肺癌などのがんにおける本発明のＢＤＣの臨床的有用性を明確に実証する。ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいてＢＣＹ６０３３は用量依存的な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６０８２は有意な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書の研究９において提示される（図１１〜１３および表２５〜３０を参照）。ＢＣＹ６１３６は大腫瘍サイズおよび小腫瘍サイズの両方のＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を実証し（図１４および図１５ならびに表３１〜３４を参照）、完全な腫瘍退縮が観察されたことを示すデータもまた本明細書の研究１０および１１において提示される。ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６０８２およびＢＣＹ６０３１はＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて有意な抗腫瘍効果を実証し（図１６ならびに表３５および表３６を参照）、ＢＣＹ６０３３およびＢＣＹ６１３６について完全な腫瘍退縮が観察されたことを示すデータもまた本明細書の研究１２において提示される。ＢＣＹ６１３６はＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータもまた本明細書の研究１３において提示される（図１７ならびに表３７および表３８を参照）。ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸ肺がん（ＮＳＣＬＣ）モデルにおいてＢＣＹ６０８２は用量依存的な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６０３１およびＢＣＹ６１７３は抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７５は腫瘍を根絶したことを示すデータもまた本明細書の研究１４において提示される（図１８〜２２および表３９〜４２を参照）。低い／ごくわずかなＥｐｈＡ２発現を有する細胞株（すなわち、Ｌｕ−０１−０４１２およびＬｕ−０１−０４８６）を利用する２つのモデルにおいてＢＣＹ６１３６の効果を実証するデータもまた本明細書の研究１５および１６において提示される。このデータは図２３および図２４ならびに表４３〜４６において示され、ＢＣＹ６１３６はいずれの細胞株においても腫瘍退縮に対して効果を有しなかったが、Ｌｕ−０１−０４１２細胞株において高発現される標的に結合するＢＣＹであるＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１は、腫瘍を完全に根絶したことを実証する。さらなる実施形態では、がんは乳がんである。いっそうさらなる実施形態では、乳がんはトリプルネガティブ乳がんである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植乳がんモデルにおいてＢＣＹ６０８２は抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６０３３は用量依存的な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが本明細書の研究１７において提示される（図２５〜２７および表４７〜５０を参照）。低い／ごく���ずかなＥｐｈＡ２発現を有する細胞株（すなわち、ＥＭＴ６）を利用する乳がんモデルにおいてＢＣＹ６１３６の効果を実証するデータもまた本明細書の研究１８において提示される。このデータは図２８ならびに表５１および表５２において示され、ＢＣＹ６１３６はこの細胞株において腫瘍退縮に対して効果を有しなかったことを実証する。代替的な実施形態では、乳がんはハーセプチン抵抗性乳がんである。理論により縛られるものではないが、ＥｐｈＡ２は、ハーセプチンへの抵抗性に関係があると考えられ、したがって、ＥｐｈＡ２標的化実体は、ハーセプチンに応答しなかった患者において潜在的な有用性を有する。
【０１５６】
さらなる実施形態では、がんは胃がんである。ＢＣＹ６１３６はＮＣＩ−Ｎ８７異種移植胃がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが本明細書の研究１９において提示される（図２９ならびに表５３および表５４を参照）。
【０１５７】
さらなる実施形態では、がんは卵巣がんである。ＢＣＹ６１３６は、中等度の抗腫瘍活性を実証したＡＤＣ  ＭＥＤＩ−５４７と比較して、ＳＫ−ＯＶ−３異種移植卵巣がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが本明細書の研究２０において提示される（図３０ならびに表５５および表５６を参照）。
【０１５８】
さらなる実施形態では、がんは食道がんである。ＢＣＹ６１３６はＯＥ−２１異種移植食道がんモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが本明細書の研究２１において提示される（図３１ならびに表５７および表５８を参照）。
【０１５９】
さらなる実施形態では、がんは多発性骨髄腫である。ＢＣＹ６１３６はＭＯＬＰ−８異種移植多発性骨髄腫モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６０８２は有意な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが本明細書の研究２２において提示される（図３２および図３３ならびに表５９および表６０を参照）。
【０１６０】
さらなる実施形態では、がんは線維肉腫である。ＨＴ−１０８０異種移植線維肉腫モデルにおいてＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１３５、ＢＣＹ６１７４およびＢＣＹ６１７５は用量依存的な抗腫瘍活性を実証し、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６０３１、ＢＣＹ６０３３およびＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を実証したことを示すデータが本明細書の研究２３において提示される（図３４〜４１ならびに表６１および表６２を参照）。
【０１６１】
「予防」という用語への本明細書における言及は、疾患の誘導前の保護的な組成物の投与を伴う。「抑制」は、誘導性の事象の後であるが疾患の臨床的出現の前の組成物の投与を指す。「治療」は、疾患症状が現れた後の保護的な組成物の投与を伴う。
【０１６２】
疾患からの保護または疾患の治療におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用され得る動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は本発明により促進され、本発明は、ヒトおよび動物標的と交差反応して、動物モデルの使用を可能とし得るポリペプチドリガンドの開発を可能とする。
【０１６３】
さらには、複数の腫瘍種からのＥｐｈＡ２についてのコピー数多型（ＣＮＶ）と遺伝子発現との関連性を実証するデータが本明細書において提示される。したがって、本発明のさらなる態様によれば、がんを予防、抑制または治療する方法であって、それを必要とする患者に本明細書において定義されるようなペプチドリガンドのエフェクター基および薬物コンジュゲートを投与することを含み、前記患者が、ＥｐｈＡ２の増加したコピー数多型（ＣＮＶ）を有するとして同定される、方法が提供される。
【０１６４】
一実施形態では、がんは、ＥｐｈＡ２の増加したＣＮＶを有するとして本明細書において同定されるものから選択される。さらなる実施形態では、がんは乳がんである。
【０１６５】
以下の実施例を参照して本発明を以下においてさらに記載する。
【実施例】
【０１６６】
【表１−１】
2021506910.tif 000014
【表１−２】
2021506910.tif 000015
【表１−３】
2021506910.tif 000016
【０１６７】
材料および方法
ペプチド合成
ペプチドを固相合成により合成した。Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  Ｒｅｓｉｎを使用した。Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ（０．４〜０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（３．０当量）を含有する混合物にＤＭＦを加えた後、ＤＩＣ（３当量）およびＨＯＡｔ（３当量）を加え、１時間混合した。ＤＭＦ中の２０％のピペリジンをデブロッキングのために使用した。その後の各アミノ酸をＤＭＦ中の活性化試薬、ＤＩＣ（３．０当量）およびＨＯＡＴ（３．０当量）を使用して３当量を用いて連結させた。反応をニンヒドリン呈色反応またはテトラクロル呈色反応によりモニターした。合成完了後に、ＤＭＦ×３、ＭｅＯＨ×３を用いてペプチド樹脂を洗浄した後、Ｎ２バブリング下で終夜乾燥した。次に、９２．５％のＴＦＡ／２．５％のＴＩＳ／２．５％のＥＤＴ／２．５％のＨ２Ｏを用いてペプチド樹脂を３時間処理した。冷イソプロピルエーテルを用いてペプチドを沈殿させ、遠心分離した（３０００ｒｐｍで３分）。イソプロピルエーテルを用いてペレットを２回洗浄し、粗ペプチドを真空下で２時間乾燥した後に凍結乾燥した。凍結乾燥粉末をＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０：５０）中に溶解し、ＡＣＮ中の１００ｍＭのＴＡＴＡの溶液の後にＨ２Ｏ中の重炭酸アンモニウム（１Ｍ）を加え、溶液を１時間混合した。環化が完了したら、１Ｍの水性塩酸システイン（ＴＡＴＡに対して１０当量）を用いて反応を停止させた後に混合し、１時間静置した。溶液を凍結乾燥して粗生成物を得た。粗ペプチドを分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して生成物を得た。
【０１６８】
他に記載しなければ、全てのアミノ酸はＬコンフィギュレーションにて使用した。
【０１６９】
ＢＣＹ６０９９（化合物６６）
【化１３】
2021506910.tif 000017
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号２）−ＣＯＮＨ２
【０１７０】
８．０ｇの樹脂を使用して２．１ｇのＢＣＹ６０９９（９９．２％の純度；１６．３％の収率）を白色固体として生成した。
【０１７１】
【表２】
2021506910.tif 000018
【０１７２】
ＢＣＹ６０１４（化合物６７）
【化１４】
2021506910.tif 000019
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号１１）−ＣＯＮＨ２
【０１７３】
４．７９ｇの樹脂を使用して１．０７ｇのＢＣＹ６０１４（Ｑ１：１３１．９ｍｇ、９７．９９％の純度；Ｑ２：１４１．７ｍｇ、９９．０４％の純度；Ｑ３：８００．７ｍｇ、９２．３５％の純度；１６．９％の収率）を白色固体として生成した。
【０１７４】
【表３】
2021506910.tif 000020
【０１７５】
ＢＣＹ６１０４（化合物９９）
【化１５】
2021506910.tif 000021
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）ＤＣ（ＨｙＰ）（Ｈｓｅ（Ｍｅ））ＶＮＰＬＣＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号８５））
【０１７６】
４．４４ｇの樹脂を使用して７００ｍｇのＢＣＹ６１０４（９５．８７％の純度、１０．５％の収率）を白色固体として生成した。
【０１７７】
【表４】
2021506910.tif 000022
【０１７８】
ＢＣＹ６１０３（化合物１００）
【化１６】
2021506910.tif 000023
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）ＤＣ（ＨｙＰ）（Ｈｓｅ（Ｍｅ））ＶＮＰＬＣＬＨＰ（Ｄ−Ａｓｐ）ＷＴＣ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号８６））
【０１７９】
４．４４ｇの樹脂を使用して７００ｍｇのＢＣＹ６１０３（９８．９％の純度、１１．１％の収率）を白色固体として生成した。
【０１８０】
【表５】
2021506910.tif 000024
【０１８１】
ＢＣＹ６１０１（化合物１０１）
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）ＤＣ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣＬＨＰ（Ｄ−Ａｌａ）ＷＴＣ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号８７））
【化１７】
2021506910.tif 000025
【０１８２】
４．４４ｇの樹脂を使用して７００ｍｇのＢＣＹ６１０１（９５．９％の純度、１０．９％の収率）を白色固体として生成した。
【０１８３】
【表６】
2021506910.tif 000026
【０１８４】
ＢＣＹ６１０２（化合物１０２）
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（ＨＡｒｇ）ＤＣＰＬＶＮＰＬＣＬＨＰ（Ｄ−Ａｌａ）ＷＴＣ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号８８））
【化１８】
2021506910.tif 000027
【０１８５】
４．４４ｇの樹脂を使用して９００ｍｇのＢＣＹ６１０２（９５．９％の純度、１４．１％の収率）を白色固体として生成した。
【０１８６】
【表７】
2021506910.tif 000028
【０１８７】
ＢＣＹ６１３９（化合物１０３）
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＲＤＣ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣＬＨＰＧＷＴＣ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号８９））
【化１９】
2021506910.tif 000029
【０１８８】
４．４４ｇの樹脂を使用して９００ｍｇのＢＣＹ６１３９（９７．４％の純度、１１．２％の収率）を白色固体として生成した。
【０１８９】
【表８】
2021506910.tif 000030
【０１９０】
ＢＣＹ６１３８（化合物１０４）
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＲＤＣＰＬＶＮＰＬＣＬ（Ｄ−３，３−ＤＰＡ）ＰＧＷＴＣ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号９０））
【化２０】
2021506910.tif 000031
【０１９１】
１．１１ｇの樹脂を使用して２００ｍｇのＢＣＹ６１３８（９５．２％の純度、１２．２％の収率）を白色固体として生成した。
【０１９２】
【表９】
2021506910.tif 000032
【０１９３】
ＢＣＹ６１３７（化合物１０５）
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＲＤＣＰＬＶＮＰＬＣＬＨＰＧＷＴＣＬＨ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号９１））
【化２１】
2021506910.tif 000033
【０１９４】
４．４４ｇの樹脂を使用して６００ｍｇのＢＣＹ６１３７（９８．９％の純度、９．０６％の収率）を白色固体として生成した。
【０１９５】
【表１０】
2021506910.tif 000034
【０１９６】
ＢＣＹ６０４２（化合物９１）
【化２２】
2021506910.tif 000035
配列：Ａｃ−（配列番号１４）−Ｓａｒ６−（Ｄ−Ｋ）
【０１９７】
１．１１ｇの樹脂を使用して９９．２ｍｇのＢＣＹ６０４２（９９．２％の純度、７．０％の収率）を白色固体として生成した。
【０１９８】
【表１１】
2021506910.tif 000036
【０１９９】
ＢＣＹ６０１９（化合物７７）
【化２３】
2021506910.tif 000037
配列：Ａｃ−（配列番号１２）−Ｓａｒ６−（Ｄ−Ｋ）
【０２００】
４．７９ｇの樹脂を使用して７３２．０ｍｇのＢＣＹ６０１９（９２．８２％の純度、１２．２％の収率）を白色固体として生成した。
【０２０１】
【表１２】
2021506910.tif 000038
【０２０２】
ＢＣＹ６０５９（化合物１０６）
【化２４】
2021506910.tif 000039
配列：Ａｃ−（配列番号１２）−Ｓａｒ６−（Ｄ−Ｋ［Ａｃ］）
【０２０３】
Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）中のＢＣＹ６０１９（０．０５ｇ、１７．８２μｍｏｌ、１．００当量）の溶液をＮａ２ＣＯ３（水性）によりＰＨ＝１１に調整し、アセチルアセテート（５．４６ｍｇ、５３．４６μｍｏｌ、５．０１μＬ、３．００当量）を加えた。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ６０１９は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応液を１ＮのＨＣｌによりＰＨ＝７に調整し、分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６０５９（１８．１ｍｇ、６．３６μｍｏｌ、３５．６７％の収率）を白色固体として得た。
【０２０４】
【表１３】
2021506910.tif 000040
【０２０５】
ＢＣＹ６１６０（化合物１０７）
【化２５】
2021506910.tif 000041
配列：（β−ＡｌａＳＯ３Ｈ）−Ｓａｒ４−（Ｃｙａ）−Ｓａｒ４−（Ｃｙａ）−Ａ（ＨＡｒｇ）ＤＣＰＬＶＮＰＬＣＬＨＰ（Ｄ−Ｃｙａ）ＷＴＣ（（β−ＡｌａＳＯ３Ｈ）−Ｓａｒ４−（Ｃｙａ）−Ｓａｒ４−（Ｃｙａ）−（配列番号９２））
【０２０６】
１．１１ｇの樹脂を使用して４５．２ｍｇのＢＣＹ６１６０（９５．５％の純度、２．５％の収率）を白色固体として生成した。
【０２０７】
【表１４】
2021506910.tif 000042
【０２０８】
ＢＣＹ６００９（化合物１０８）
【化２６】
2021506910.tif 000043
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＲＤＣＰＬＶＮＰＬＣＬＨＰＧＷＴＣ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号１０））
【０２０９】
４．７９ｇの樹脂を使用して２．４２ｇのＢＣＹ６００９（＞８８．９２％の純度、３６．０％の収率）を白色固体として生成した。
【０２１０】
【表１５】
2021506910.tif 000044
【０２１１】
ＢＣＹ６０１７（化合物１０９）
【化２７】
2021506910.tif 000045
配列：Ａ（ＨＡｒｇ）ＤＣＰＬＶＮＰＬＣＬＨＰＧＷＴＣ（配列番号１１）
【０２１２】
１．１９ｇの樹脂を使用して１８９．９ｍｇのＢＣＹ６０１７（９５．０５％の純度、１６．８％の収率）を白色固体として生成した。
【０２１３】
【表１６】
2021506910.tif 000046
【０２１４】
ＢＣＹ６０１８（化合物１１０）
【化２８】
2021506910.tif 000047
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ５−（配列番号１１）
【０２１５】
１．１９ｇの樹脂を使用して２８９．１ｍｇのＢＣＹ６０１８（９７．９２％の純度、２１．０％の収率）を白色固体として生成した。
【０２１６】
【表１７】
2021506910.tif 000048
【０２１７】
ＢＣＹ６１５２（化合物１１１）
【化２９】
2021506910.tif 000049
配列：（β−ＡｌａＳＯ３Ｈ）−Ｓａｒ１０−（配列番号１１）
【０２１８】
１．１１ｇの樹脂を使用して１５０．０ｍｇのＢＣＹ６１５２（９８．７５％の純度；９．５％の収率）を白色固体として生成した。
【０２１９】
【表１８】
2021506910.tif 000050
【０２２０】
ＢＣＹ６１４１（化合物１１２）
【化３０】
2021506910.tif 000051
配列：（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（Ｄ−Ａｒｇ）ＤＣ（ＨｙＰ）ＬＶＮＰＬＣＬ（Ｄ−３，３−ＤＰＡ）Ｐ（Ｄ−Ａｓｐ）Ｗ（ＨＡｒｇ）Ｃ（（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−（配列番号９３））
【０２２１】
１．１１ｇの樹脂を使用して１２０．０ｍｇのＢＣＹ６１４１（９７．９１％の純度；７．３％の収率）を白色固体として生成した。
【０２２２】
【表１９】
2021506910.tif 000052
【０２２３】
ＢＣＹ６０２６（化合物８７）
【化３１】
2021506910.tif 000053
配列：ＡＣＰＬＶＮＰＬＣＬＨＰＧＷＳＣＲＧＱ（配列番号７７）
【０２２４】
１．１１ｇの樹脂を使用して２８５．０ｍｇのＢＣＹ６０２６（９７．７％の純度；２４．２％の収率）を白色固体として生成した。
【０２２５】
【表２０】
2021506910.tif 000054
【０２２６】
ＢＣＹ６１５３（化合物１１３）
【化３２】
2021506910.tif 000055
配列：（β−ＡｌａＳＯ３Ｈ）−Ｓａｒ５−（配列番号１１）
【０２２７】
１．１１ｇの樹脂を使用して１４０．０ｍｇのＢＣＹ６１５３（９８．５９％の純度；９．９％の収率）を白色固体として生成した。
【０２２８】
【表２１】
2021506910.tif 000056
【０２２９】
二環ペプチド薬物コンジュゲートの調製
二環薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）を調製するための概略図を図３に示し、表Ａは、各ＢＤＣ内の成分標的化二環およびリンカー／毒素を記載する。
【０２３０】
【表２２】
2021506910.tif 000057
【０２３１】
表６に列記する二環ペプチド薬物コンジュゲートＢＣＹ６０２７、ＢＣＹ６０２８、ＢＣＹ６０３１およびＢＣＹ６０３２の合成をＷＯ２０１６／０６７０３５に開示されるプロトコールを使用して行った。
【０２３２】
式（Ｃ）および（Ｄ）：
【化３３】
2021506910.tif 000058
を有する活性化二環ペプチドを、二環前駆体の遊離アミノ基をＤＭＳＯ中のそれぞれＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート、Ａｎｎｏｖａ  Ｃｈｅｍ）およびＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ａｎｎｏｖａ  Ｃｈｅｍ）と反応させることにより合成した。二環前駆体の濃度は１０ｍＭ以上、室温において１．３倍過剰のＳＰＰまたはＳＰＤＢ、および２０倍過剰のジイソプロピルエチルアミンであった。ＬＣＭＳによる判断により、１時間後に反応は完了したと判断した。上記のように逆相により精製を行った。適切な画分を凍結乾燥した。
【０２３３】
式（Ｃ）および（Ｄ）を有する活性化二環ペプチドを、窒素ガスブランケット下の室温で２１時間、半水性条件（２ｍＭのＥＤＴＡを添加したｐＨ５．０の５０％のジメチルアセトアミドおよび５０％の１００ｍＭの酢酸ナトリウム）中で１．１５当量のＤＭ１（遊離チオールとして）を用いてジスルフィド交換した。反応液中の構造ＣおよびＤを有する活性化二環ペプチドの濃度は１０ｍＭ以上であった。
【０２３４】
この後に、Ｃ１８カラムを使用する標準的な逆相精製を行った。９５％より高い純度の画分を単離し、凍結乾燥した。材料は、測定可能な量の遊離の毒素を含有しなかった。
【０２３５】
ＭＭＡＥ系列
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ系列
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥリンカー
【０２３６】
【化３４】
2021506910.tif 000059
【０２３７】
化合物２
【化３５】
2021506910.tif 000060
【０２３８】
ペプチドを固相合成により合成した。５０ｇのＣＴＣ樹脂（サブ：１．０ｍｍｏｌ／ｇ）を使用した。ＣＴＣ樹脂（５０ｍｍｏｌ、５０ｇ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ）およびＦｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨ（１９．８ｇ、５０ｍｍｏｌ、１．０当量）を含有する混合物にＤＣＭ（４００ｍＬ）を加えた後、ＤＩＥＡ（６．００当量）を加え、３時間混合した。次にＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、キャップ付加のために３０分間混合した。ＤＭＦ中の２０％のピペリジンをデブロッキングのために使用した。Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（３２．５ｇ、１５０ｍｍｏｌ、３当量）を、ＤＭＦ（４００ｍＬ）中のＨＢＴＵ（２．８５当量）およびＤＩＰＥＡ（６．０当量）を使用して３当量を用いて連結させた。ニンヒドリン呈色反応試験により反応をモニターした。合成完了後に、ペプチド樹脂をＤＭＦ×３、ＭｅＯＨ×３を用いて洗浄した後、Ｎ２バブリング下で終夜乾燥した。その後、２０％のＨＦＩＰ／ＤＣＭを用いて３０分間、ペプチド樹脂を２回処理した。溶液をロータリーエバポレーターで除去して粗生成物を得た。粗ペプチドをＡＣＮ／Ｈ２Ｏ中に溶解した後、２回凍結乾燥（ｌｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）してペプチド生成物（１７．３ｇの粗生成物）を得た。
【０２３９】
【表２３】
2021506910.tif 000061
【０２４０】
化合物３
【化３６】
2021506910.tif 000062
【０２４１】
ＤＣＭ（４０．００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２０．００ｍＬ）中の化合物２（４．００ｇ、１０．６８ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を室温で撹拌した後、（４−アミノフェニル）メタノール（１．５８ｇ、１２．８２ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびＥＥＤＱ（５．２８ｇ、２１．３７ｍｍｏｌ、２．００当量）を加え、混合物を暗所で９時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン／メタノール＝５／１、Ｒｆ＝０．５６）は、１つの新たなスポットが形成されたことを指し示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。結果として得られた残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｓｉｌｉｃａ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭの溶出液、８０ｍＬ／分）により精製した。化合物３（３．００ｇ、６．２６ｍｍｏｌ、５８．５７％の収率）を白色固体として得た。
【０２４２】
【表２４】
2021506910.tif 000063
【０２４３】
化合物４
【化３７】
2021506910.tif 000064
【０２４４】
無水ＴＨＦ（３５．００ｍＬ）および無水ＤＣＭ（１５．００ｍＬ）中の化合物３（３．００ｇ、６．２６ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に（４−ニトロフェニル）クロロホルメート（６．３１ｇ、３１．３０ｍｍｏｌ、５．００当量）およびピリジン（２．４８ｇ、３１．３０ｍｍｏｌ、２．５３ｍＬ、５．００当量）を加え、混合物を２５℃で５時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン／メタノール＝１０／１、Ｒｆ＝０．５５）は、新たなスポットが形成されたことを指し示した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残留物を得た。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｓｉｌｉｃａ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜１０％のＤＣＭ／ＭｅＯＨの溶出液、８０ｍＬ／分）により精製した。化合物４（２．００ｇ、３．１０ｍｍｏｌ、４９．５６％の収率）を白色固体として得た。
【０２４５】
【表２５】
2021506910.tif 000065
【０２４６】
化合物５
【化３８】
2021506910.tif 000066
【０２４７】
ＤＭＦ（５．００ｍＬ）中の化合物４（２７８．４３ｍｇ、３８７．８０μｍｏｌ、１．００当量）およびＤＩＥＡ（５０１．１９ｍｇ、３．８８ｍｍｏｌ、６７７．２９μＬ、１０．００当量）の混合物を窒素下で１０分間撹拌した。ＭＭＡＥ（２５０．００ｍｇ、３８７．８０μｍｏｌ、１．００当量）およびＨＯＢｔ（５２．４０ｍｇ、３８７．８０μｍｏｌ、１．００当量）を加え、混合物を窒素下０℃で２０分間撹拌し、３０℃でさらに１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。結果として得られた混合物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１３０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜５０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、７５ｍＬ／分）により精製した。化合物５（１９０．００ｍｇ、１５５．２９μｍｏｌ、４０．０４％の収率）を白色固体として得た。
【０２４８】
【表２６】
2021506910.tif 000067
【０２４９】
化合物６
【化３９】
2021506910.tif 000068
【０２５０】
ＤＣＭ（２．７０ｍＬ）中の化合物５（１７０．００ｍｇ、１３８．９４μｍｏｌ、１．００当量）の溶液に２，２，２−トリフルオロ酢酸（４１３．３２ｍｇ、３．６２ｍｍｏｌ、２６８．３９μＬ、２６．０９当量）を加え、混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５は完全に消費されたことを示した。混合物を減圧下で濃縮して残留物を得た。残留物をＴＨＦ（１０．００ｍＬ）中に溶解し、Ｋ２ＣＯ３（１９２．０３ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ、１０．００当量）を加え、混合物を室温でさらに３時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。結果として得られた反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１３０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜５０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、７５ｍＬ／分）により精製した。化合物６（１１０．００ｍｇ、９７．９２μｍｏｌ、７０．４８％の収率）を白色固体として得た。
【０２５１】
【表２７】
2021506910.tif 000069
【０２５２】
化合物７
【化４０】
2021506910.tif 000070
【０２５３】
ＤＭＡ（５ｍＬ）中の化合物６（１１０．００ｍｇ、９７．９２μｍｏｌ、１．００当量）の溶液にＤＩＥＡ（２５．３１ｍｇ、１９５．８３μｍｏｌ、３４．２０μＬ、２．００当量）およびテトラヒドロピラン−２，６−ジオン（２２．３４ｍｇ、１９５．８３μｍｏｌ、２．００当量）。混合物を室温で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物６は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１３０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜５０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、７５ｍＬ／分）により精製した。化合物７（１００．００ｍｇ、８０．８１μｍｏｌ、８２．５３％の収率）を白色固体として得た。
【０２５４】
【表２８】
2021506910.tif 000071
【０２５５】
化合物８（ＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−グルタレート−ＮＨＳ）
【化４１】
2021506910.tif 000072
【０２５６】
ＤＭＡ（４．５ｍＬ）およびＤＣＭ（１．５ｍＬ）中の化合物７（１００．００ｍｇ、８０．８１μｍｏｌ、１．００当量）の溶液にＮ２下で１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（２７．９０ｍｇ、２４２．４２μｍｏｌ、３．００当量）を加え、混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＥＤＣＩ（４６．４７ｍｇ、２４２．４３μｍｏｌ、３．００当量）を混合物に加え、混合物を２５℃でさらに１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１３０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜５０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、７５ｍＬ／分）により精製した。化合物８（９０．００ｍｇ、６０．６９μｍｏｌ、７５．１１％の収率）を白色固体として得た。
【０２５７】
【表２９】
2021506910.tif 000073
【０２５８】
標的化二環とＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−グルタレート−ＮＨＳを連結するための一般的手順
ＤＭＡ中の二環（１．０〜１．３当量）の溶液にＤＩＥＡ（３当量）およびＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−グルタレート−ＮＨＳ（１当量）を加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応をＬＣ−ＭＳによりモニターし、完了したら分取ＨＰＬＣにより直接的に精製した。
【０２５９】
ＢＣＹ６１３６
【化４２】
2021506910.tif 000074
【０２６０】
ＢＣＹ６０９９（７１．５ｍｇ、２２．４８μｍｏｌ）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６１３６（４０．９ｍｇ、９．０５μｍｏｌ、４０．２７％の収率、９７．４２％の純度）を白色固体として得た。
【０２６１】
【表３０】
2021506910.tif 000075
【０２６２】
ＢＣＹ６０３３
【化４３】
2021506910.tif 000076
【０２６３】
ＢＣＹ６０１４（７０．００ｍｇ、２２．４７μｍｏｌ、１．００当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０３３（３３．９０ｍｇ、７．９６μｍｏｌ、３４．５７％の収率）を白色固体として得た。
【０２６４】
【表３１】
2021506910.tif 000077
【０２６５】
ＢＣＹ６０２９
【化４４】
2021506910.tif 000078
【０２６６】
ＢＣＹ６００９（７０．０ｍｇ、２２．４７μｍｏｌ、１当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０２９（３２．９ｍｇ、７．７５μｍｏｌ、３３．４９％の収率）を白色固体として得た。
【０２６７】
【表３２】
2021506910.tif 000079
【０２６８】
ＢＣＹ６１２２
【化４５】
2021506910.tif 000080
【０２６９】
ＢＣＹ６１０４（７１．５９ｍｇ、２２．４８μｍｏｌ、１．００当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６１２２（３８．３０ｍｇ、８．５７μｍｏｌ、３８．１４％の収率、９８．５８％の純度）を白色固体として得た。
【０２７０】
【表３３】
2021506910.tif 000081
【０２７１】
ＢＣＹ６０５３
【化４６】
2021506910.tif 000082
【０２７２】
ＢＣＹ６０１８（７２．４０ｍｇ、２６．９７μｍｏｌ、１．２当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０５３（３８．３ｍｇ、９．８１μｍｏｌ、４３．６５％の収率）を白色固体として得た。
【０２７３】
【表３４】
2021506910.tif 000083
【０２７４】
ＢＣＹ６０４９
【化４７】
2021506910.tif 000084
【０２７５】
ＢＣＹ６０１７（５０．７５ｍｇ、２２．４８μｍｏｌ、１．２当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０４９（２２．５ｍｇ、６．４７μｍｏｌ、３４．５４％の収率）を白色固体として得た。
【０２７６】
【表３５】
2021506910.tif 000085
【０２７７】
ＢＣＹ６０３７
【化４８】
2021506910.tif 000086
【０２７８】
ＢＣＹ６０１９（６５．００ｍｇ、２２．４７μｍｏｌ、１．００当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０３７（２６．８０ｍｇ、６．６６μｍｏｌ、２８．７４％の収率）を白色固体として得た。
【０２７９】
【表３６】
2021506910.tif 000087
【０２８０】
Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ系列
Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥリンカー
【０２８１】
【化４９】
2021506910.tif 000088
【０２８２】
３の調製のための一般的手順
【化５０】
2021506910.tif 000089
【０２８３】
ＤＭＦ（３０．００ｍＬ）中の化合物２（４．００ｇ、８．６７ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＩＣ（１．６１ｇ、１２．７８ｍｍｏｌ、１．９７ｍＬ、９．００当量）およびＨＯＢｔ（１０．５４ｇ、７８．００ｍｍｏｌ、９．００当量）の溶液に（４−アミノフェニル）メタノール（９．６１ｇ、７８．００ｍｍｏｌ、９．００当量）を加えた。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣにより精製した。化合物３（４．２０ｇ、７．４１ｍｍｏｌ、８５．４９％の収率）を白色固体として得た。
【０２８４】
【表３７】
2021506910.tif 000090
【０２８５】
４の調製のための一般的手順
【化５１】
2021506910.tif 000091
【０２８６】
ＤＭＦ（３０．００ｍＬ）中の化合物３（４．２０ｇ、６．３０ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＩＰＥＡ（１．０９ｇ、８．４０ｍｍｏｌ、１．４７ｍＬ、７．００当量）の溶液にビス（４−ニトロフェニル）炭酸塩（１１．５０ｇ、３７．７９ｍｍｏｌ、６．００当量）を一度に加えた。混合物を０〜１５℃で１．５時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物４（２．００ｇ、２．４０ｍｍｏｌ、３８．１６％の収率）を白色固体として得た。
【０２８７】
【表３８】
2021506910.tif 000092
【０２８８】
５の調製のための一般的手順
【化５２】
2021506910.tif 000093
【０２８９】
ＤＭＦ（１０．００ｍＬ）中の化合物４（３００．００ｍｇ、３６０．６３μｍｏｌ、１．００当量）、ＤＩＥＡ（９３．２２ｍｇ、７２１．２７μｍｏｌ、１２５．９７μＬ、３．００当量）の溶液にＭＭＡＥ（２３３．０３ｍｇ、３２４．５７μｍｏｌ、０．９０当量）およびＨＯＢｔ（４８．７３ｍｇ、３６０．６３μｍｏｌ、１．００当量）を０℃で加えた。混合物を３０℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物５（２５０．００ｍｇ、１９０．７５μｍｏｌ、５２．８９％の収率）を黄色固体として得た。
【０２９０】
【表３９】
2021506910.tif 000094
【０２９１】
６の調製のための一般的手順
【化５３】
2021506910.tif 000095
【０２９２】
ＤＣＭ（１０．００ｍＬ）中の化合物５（２４０．００ｍｇ、１８３．１２μｍｏｌ、１．００当量）の溶液にＴＦＡ（１．５４ｇ、１３．５１ｍｍｏｌ、１．００ｍＬ、７３．７６当量）を加えた。混合物を１５℃で２時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去することにより残留物を得、残留物をＴＨＦ中に溶解し、Ｋ２ＣＯ３を加え、１５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。粗生成物６（１２５．００ｍｇ、９４．３７μｍｏｌ、５１．５３％の収率、ＴＦＡ）をさらなる精製なしで次の工程において使用した。
【０２９３】
【表４０】
2021506910.tif 000096
【０２９４】
７の調製のための一般的手順
【化５４】
2021506910.tif 000097
【０２９５】
ＤＭＡ（５．００ｍＬ）中の化合物６（１２５．００ｍｇ、９４．３７μｍｏｌ、１．００当量、ＴＦＡ）の溶液にＤＩＥＡ（２４．３９ｍｇ、１８８．７５μｍｏｌ、３２．９６μＬ、２．００当量）、テトラヒドロピラン−２，６−ジオン（２１．５４ｍｇ、１８８．７５μｍｏｌ、２．００当量）を加えた。混合物を１５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物６は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物７（１００．００ｍｇ、７５．４９μｍｏｌ、８０．００％の収率）を白色固体として得た。
【０２９６】
【表４１】
2021506910.tif 000098
【０２９７】
８（ＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｃｉｔ−Ｔｒｐ−グルタレート−ＮＨＳ）の調製のための一般的手順
【化５５】
2021506910.tif 000099
【０２９８】
ＤＭＡ（３．００ｍＬ）およびＤＣＭ（１．００ｍＬ）中の化合物７（１００．００ｍｇ、７５．４９μｍｏｌ、１．００当量）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（２６．０７ｍｇ、２２６．４８μｍｏｌ、３．００当量）の溶液にＥＤＣＩ（４３．４２ｍｇ、２２６．４８μｍｏｌ、３．００当量）を加えた。混合物を１５℃で４時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。ＤＣＭを除去した。分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物８（６０．００ｍｇ、４２．２０μｍｏｌ、５５．９１％の収率）を白色固体として得た。
【０２９９】
【表４２】
2021506910.tif 000100
【０３００】
標的化二環とＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｃｉｔ−Ｔｒｐ−グルタレート−ＮＨＳを連結するための一般的手順
ＤＭＡ中の二環（１．０〜１．３当量）の溶液にＤＩＥＡ（３当量）およびＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｃｉｔ−Ｔｒｐ−グルタレート−ＮＨＳ（１当量）を加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応をＬＣ−ＭＳによりモニターし、完了したら分取ＨＰＬＣにより直接的に精製した。
【０３０１】
ＢＣＹ６０３０
【化５６】
2021506910.tif 000101
【０３０２】
ＢＣＹ６００９（４７．２９ｍｇ、１４．０７μｍｏｌ、１．００当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０３０（０．０１５６ｇ、３．５１μｍｏｌ、２４．９３％の収率、９７．４１％の純度）を白色固体として得た。
【０３０３】
【表４３】
2021506910.tif 000102
【０３０４】
ＢＣＹ６０３４
【化５７】
2021506910.tif 000103
【０３０５】
ＢＣＹ６０１４（８８．２１ｍｇ、２３．２１μｍｏｌ、１．１０当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０３４（２７．７０ｍｇ、６．０５μｍｏｌ、２８．７０％の収率、９５．０２％の純度）を白色固体として得た。
【０３０６】
【表４４】
2021506910.tif 000104
【０３０７】
ＢＣＹ６０５０
【化５８】
2021506910.tif 000105
【０３０８】
ＢＣＹ６０１７（５７．１７ｍｇ、２５．３２μｍｏｌ、１．２当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０５０（０．０５１９ｇ、１４．５６μｍｏｌ、６９．０１％の収率）を白色固体として得た。
【０３０９】
【表４５】
2021506910.tif 000106
【０３１０】
ＢＣＹ６０５４
【化５９】
2021506910.tif 000107
【０３１１】
ＢＣＹ６０１８（６７．９７ｍｇ、２５．３２μｍｏｌ、１．２当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０５４（４０．１０ｍｇ、１０．０５μｍｏｌ、４７．６２％の収率）を白色固体として得た。
【０３１２】
【表４６】
2021506910.tif 000108
【０３１３】
ＢＣＹ６０３８
【化６０】
2021506910.tif 000109
【０３１４】
ＢＣＹ６０１９（８１．３９ｍｇ、２３．２１μｍｏｌ、１．１０当量）を二環試薬として使用した。化合物ＢＣＹ６０３８（３４．１０ｍｇ、８．０２μｍｏｌ、３８．００％の収率、９６．６８％の純度）を白色固体として得た。
【０３１５】
【表４７】
2021506910.tif 000110
【０３１６】
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＭＭＡＥ系列
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＭＭＡＥリンカー
【０３１７】
【化６１】
2021506910.tif 000111
【０３１８】
化合物２の調製のための一般的手順
【化６２】
2021506910.tif 000112
【０３１９】
ＤＣＭ（３５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１８ｍＬ）中の化合物１（３．００ｇ、５．８９ｍｍｏｌ、１当量）および（４−アミノフェニル）メタノール（８６９．９３ｍｇ、７．０６ｍｍｏｌ、１．２当量）の混合物に窒素下において暗所でＥＥＤＱ（２．９１ｇ、１１．７７ｍｍｏｌ、２当量）を加え、混合物を２５℃で５時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。結果として得られた反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得た。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｓｉｌｉｃａ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭの溶出液、８０ｍＬ／分）により精製した。化合物２（２．２ｇ、３．５８ｍｍｏｌ、６０．７９％の収率）を白色固体として得た。
【０３２０】
【表４８】
2021506910.tif 000113
【０３２１】
化合物３の調製のための一般的手順
【化６３】
2021506910.tif 000114
【０３２２】
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の化合物２（５００ｍｇ、８１３．３１μｍｏｌ、１当量）の溶液に０℃において窒素下でＤＩＥＡ（６３０．６９ｍｇ、４．８８ｍｍｏｌ、８４９．９８μＬ、６当量）を加え、３０分間攪拌した。次にビス（４−ニトロフェニル）炭酸塩（１．４８ｇ、４．８８ｍｍｏｌ、６当量）をそこに加え、混合物を窒素下２５℃でさらに２１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。結果として得られた反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得た。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｓｉｌｉｃａ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭの溶出液、４０ｍＬ／分）により精製した。化合物３（５００ｍｇ、６４１．１３μｍｏｌ、７８．８３％の収率）を黄色固体として得た。
【０３２３】
【表４９】
2021506910.tif 000115
【０３２４】
化合物４の調製のための一般的手順
【化６４】
2021506910.tif 000116
【０３２５】
ＤＭＦ（８ｍＬ）中の化合物３（５００ｍｇ、５１２．９０μｍｏｌ、１．２３当量）の混合物に０℃でＤＩＥＡ（１３５．０１ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、１８１．９５μＬ、２．５当量）を加え、３０分間撹拌した。次にＭＭＡＥ（３００ｍｇ、４１７．８４μｍｏｌ、１当量）およびＨＯＢｔ（８４．６９ｍｇ、６２６．７６μｍｏｌ、１．５当量）をそこに加え、混合物を４０℃で１５時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。残留物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１３０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜６０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、７５ｍＬ／分）により精製した。化合物４（３３０ｍｇ、２４２．８７μｍｏｌ、５８．１３％の収率）を白色固体として得た。
【０３２６】
【表５０】
2021506910.tif 000117
【０３２７】
化合物５の調製のための一般的手順
【化６５】
2021506910.tif 000118
【０３２８】
ＤＣＭ（１８ｍＬ）中の化合物４（３２５ｍｇ、２３９．１９μｍｏｌ、１当量）の溶液にＴＦＡ（３．０３ｇ、２６．６０ｍｍｏｌ、１．９７ｍＬ、１１１．２２当量）を０℃で加え、混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４は完全に消費されたことを示した。次に反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得、残留物をＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、Ｋ２ＣＯ３（６６１．１６ｍｇ、４．７８ｍｍｏｌ、２０当量）をそこに加えた。混合物を２５℃で１５時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。結果として得られた反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残留物（ｒｅｓｉｕｄｅ）を得た。残留物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１３０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜６０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、７５ｍＬ／分）により精製した。化合物５（１７０ｍｇ、１３５．０７μｍｏｌ、５６．４７％の収率）を白色固体として得た。
【０３２９】
【表５１】
2021506910.tif 000119
【０３３０】
化合物６の調製のための一般的手順
【化６６】
2021506910.tif 000120
【０３３１】
ＤＭＡ（５ｍＬ）中の化合物５（１４０ｍｇ、１１１．２３μｍｏｌ、１当量）の溶液を含有するラウンドボトルを窒素バルーンを使用してパージし、０℃でＤＩＥＡ（２８．７５ｍｇ、２２２．４６μｍｏｌ、３８．７５μＬ、２当量）を加えて１０分間撹拌し、テトラヒドロピラン−２，６−ジオン（２５．３８ｍｇ、２２２．４６μｍｏｌ、２当量）をＤＭＡ中の溶液として加えた（ａｄｄｄｅｄ）。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。結果として得られた反応混合物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４３ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜６０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、４０ｍＬ／分）により精製した。化合物６（１２０ｍｇ、８７．４２μｍｏｌ、７８．５９％の収率）を白色固体として得た。
【０３３２】
【表５２】
2021506910.tif 000121
【０３３３】
化合物７（ＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｖａｌ−グルタレート−ＮＨＳ）の調製のための一般的手順
【化６７】
2021506910.tif 000122
【０３３４】
ＤＭＡ（９ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｍＬ）中の化合物６（１２０ｍｇ、８７．４２μｍｏｌ、１当量）の溶液に１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（３０．１８ｍｇ、２６２．２５μｍｏｌ、３当量）を加えて撹拌し、ＥＤＣＩ（５０．２７ｍｇ、２６２．２５μｍｏｌ、３当量）をそこに加え、混合物を０℃で３０分間、および２５℃でさらに１９時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物６は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。結果として得られた反応混合物を減圧下で濃縮してＤＣＭを除去した。混合物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４３ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜６０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、４０ｍＬ／分）により精製した。化合物７（６０ｍｇ、４０．８２μｍｏｌ、４６．７０％の収率）を白色固体として得た。
【０３３５】
【表５３】
2021506910.tif 000123
【０３３６】
標的化二環とＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｖａｌ−グルタレート−ＮＨＳを連結するための一般的手順
【化６８】
2021506910.tif 000124
【０３３７】
ＤＭＡ中の二環（１．０〜１．３当量）の溶液にＤＩＥＡ（３当量）およびＭＭＡＥ−ＰＡＢＣ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｖａｌ−グルタレート−ＮＨＳ（１当量）を加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応をＬＣ−ＭＳによりモニターし、完了したら分取ＨＰＬＣにより直接的に精製した。
【０３３８】
Ｄｄｅの脱保護のための一般的手順
【化６９】
2021506910.tif 000125
【０３３９】
ＤＭＦ中のＤｄｅ保護ペプチド（１当量）の溶液にヒドラジン水和物（６５００当量）を加え、混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳを使用して反応をモニターし、完了したら、混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、清浄な画分を凍結乾燥した。
【０３４０】
ＢＣＹ６０６１
【化７０】
2021506910.tif 000126
【０３４１】
ＢＣＹ６０１４（１２４．１２ｍｇ、４０．８２μｍｏｌ、１．２当量）を二環試薬として使用した。Ｄｄｅ−ＢＣＹ６０３８（８０ｍｇ、１８．２０μｍｏｌ、５３．５１％の収率）を白色固体として得た。
【０３４２】
【表５４】
2021506910.tif 000127
【０３４３】
一般的手順にしたがってヒドラジンを使用してＤｄｅ−ＢＣＹ６０６１（７８ｍｇ、１７．７５μｍｏｌ）を脱保護してＢＣＹ６０６１（４７．１ｍｇ、１１．１３μｍｏｌ、６２．７３％の収率）を白色固体として得た。
【０３４４】
【表５５】
2021506910.tif 000128
【０３４５】
ＢＣＹ６１７４
【化７１】
2021506910.tif 000129
【０３４６】
ＢＣＹ６０９９（３８９．７７ｍｇ、１２２．４７μｍｏｌ、１．２当量）を二環試薬として使用した。Ｄｄｅ−ＢＣＹ６１７４（０．２５０ｇ、５５．１０μｍｏｌ、５３．９９％の収率）を白色固体として得た。
【０３４７】
【表５６】
2021506910.tif 000130
【０３４８】
一般的手順にしたがってヒドラジンを使用してＤｄｅ−ＢＣＹ６１７４（０．２５０ｇ、５５．１０μｍｏｌ、１．０当量）を脱保護してＢＣＹ６１７４（０．１２０６ｇ、２７．４５μｍｏｌ、４９．８２％の収率）を白色固体として得た。
【０３４９】
【表５７】
2021506910.tif 000131
【０３５０】
Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ系列
Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥリンカー
【０３５１】
【化７２】
2021506910.tif 000132
【０３５２】
化合物３の調製のための一般的手順
【化７３】
2021506910.tif 000133
【０３５３】
ＤＭＦ（３０．００ｍＬ）中の化合物１（２ｇ、４．３３ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＩＣ（４．９２ｇ、３９．００ｍｍｏｌ、６．００ｍＬ、９．００当量）、ＨＯＢｔ（５．２７ｇ、３９．００ｍｍｏｌ、９．００当量）の溶液に（４−アミノフェニル）メタノール（４．８０ｇ、３９．００ｍｍｏｌ、９．００当量）を加えた。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物２（２ｇ、３．５３ｍｍｏｌ、８１．４５％の収率）を白色固体として得た。
【０３５４】
【表５８】
2021506910.tif 000134
【０３５５】
化合物４の調製のための一般的手順
【化７４】
2021506910.tif 000135
【０３５６】
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物２（２ｇ、３．００ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＩＥＡ（２．７１ｇ、２１．００ｍｍｏｌ、３．６６ｍＬ、７当量）の溶液にビス（４−ニトロフェニル）炭酸塩（５．４８ｇ、１８．００ｍｍｏｌ、６当量）を一度に０℃で加えた。混合物を０〜１５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物３（０．９ｇ、１．０８ｍｍｏｌ、３６．０７％の収率）を黄色固体として得た。
【０３５７】
【表５９】
2021506910.tif 000136
【０３５８】
化合物５の調製のための一般的手順
【化７５】
2021506910.tif 000137
【０３５９】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物３（３５０ｍｇ、４２０．７４μｍｏｌ、１．００当量）、ＨＯＢｔ（５６．８５ｍｇ、４２０．７４μｍｏｌ、１当量）およびＤＩＥＡ（１６３．１３ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、２１９．８６μＬ、３当量）の溶液にＭＭＡＥ（３０２．０８ｍｇ、４２０．７４μｍｏｌ、１当量）を０℃で加えた。混合物を４０℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物４（０．２２ｇ、１５５．９５μｍｏｌ、３７．０６％の収率）を黄色固体として得た。
【０３６０】
【表６０】
2021506910.tif 000138
【０３６１】
化合物６の調製のための一般的手順
【０３６２】
【化７６】
2021506910.tif 000139
【０３６３】
ＤＣＭ（９ｍＬ）中の化合物４（０．２１ｇ、１４８．８６μｍｏｌ、１当量）の溶液にＴＦＡ（１．５４ｇ、１３．５１ｍｍｏｌ、１ｍＬ、９０．７３当量）を加えた。混合物を１５℃で４ｈ撹拌し、減圧下で濃縮して残留物を得、ＴＨＦ中に溶解した（ｄｉｓｓｌｏｖｅｄ）後、Ｋ２ＣＯ３を加え（ａｄｄｄｅｄ）、１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物５（０．１３ｇ、１０２．０２μｍｏｌ、６８．５４％の収率、９５％の純度）を白色固体として得た。
【０３６４】
【表６１】
2021506910.tif 000140
【０３６５】
化合物７の調製のための一般的手順
【０３６６】
【化７７】
2021506910.tif 000141
【０３６７】
ＤＭＡ（５ｍＬ）中の化合物５（０．１２ｇ、９９．１３μｍｏｌ、１当量）の溶液にＤＩＥＡ（３８．４４ｍｇ、２９７．４０μｍｏｌ、５１．８０μＬ、３当量）およびテトラヒドロピラン−２，６−ジオン（２２．６２ｍｇ、１９８．２６μｍｏｌ、２当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物６（０．０９ｇ、６７．９４μｍｏｌ、６８．５４％の収率）を白色固体として得た。
【０３６８】
【表６２】
2021506910.tif 000142
【０３６９】
化合物８の調製のための一般的手順
【０３７０】
【化７８】
2021506910.tif 000143
【０３７１】
ＤＭＡ（６ｍＬ）およびＤＣＭ（２ｍＬ）中の化合物６（０．０９ｇ、６７．９５μｍｏｌ、１当量）、ＨＯＳｕ（２３．４６ｍｇ、２０３．８４μｍｏｌ、３当量）の溶液にＥＤＣＩ（３９．０８ｍｇ、２０３．８４μｍｏｌ、３当量）を加えた。混合物を１５℃で１６ｈ撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物６は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。ＤＣＭを除去し、分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物７（０．０６ｇ、４０．０９μｍｏｌ、５９．０１％の収率、９５％の純度）を白色固体として得た。
【０３７２】
【表６３】
2021506910.tif 000144
【０３７３】
ＢＣＹ６０６２
ＤＭＡ（５ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（７６．９９ｍｇ、２５．３２μｍｏｌ、１．２当量）の溶液にＤＩＥＡ（８．１８ｍｇ、６３．３１μｍｏｌ、１１．０３μＬ、３当量）、化合物７（０．０３ｇ、２１．１０μｍｏｌ、１当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。反応をＬＣ−ＭＳによりモニターし、完了したら、混合物を分取ＨＰＬＣにより精製した。ＢＣＹ６０６２（０．０２５５ｇ、５．７０μｍｏｌ、２７．０１％の収率、９７．１５％の純度）を白色固体として得た。
【０３７４】
【表６４】
2021506910.tif 000145
【０３７５】
ＤＭ１系列
ＤＭ１−ＳＳ系列
ＤＭ１−ＳＰＤＰ−ＴＦＰリンカー
【０３７６】
【化７９】
2021506910.tif 000146
【０３７７】
ＳＰＤＢ
【化８０】
2021506910.tif 000147
【０３７８】
ＥｔＯＨ（１００．００ｍＬ）中の２−（２−ピリジルジスルファニル）ピリジン（１２．３７ｇ、５６．１８ｍｍｏｌ、１．５０当量）の溶液に４−スルファニルブタン酸（４．５０ｇ、３７．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。混合物を１５℃でＮ２下で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８  ３６０ｇ、中性条件）により精製した。化合物ＳＰＤＢ（１．９ｇ、８．２９ｍｍｏｌ、２２．１２％の収率）を黄色固体として得た。
1H NMR: ES6446-8-P1A 400 MHz CDCl3
δ ppm 1.98 (q, J=7.09 Hz, 2 H), 2.45 (t, J=7.15 Hz, 2 H), 2.79 (t, J=7.03 Hz, 2 H), 7.03 (dd, J=7.15, 4.89 Hz, 1 H), 7.19 (s, 1 H), 7.56 - 7.65 (m, 2 H), 8.41 (d, J=4.52 Hz, 1 H).
【０３７９】
【表６５】
2021506910.tif 000148
【０３８０】
ＤＭ１−ＳＰＤＢ
【化８１】
2021506910.tif 000149
【０３８１】
ＤＭ１（２５０．００ｍｇ、３３８．６２μｍｏｌ、１．００当量）および４−（２−ピリジルジスルファニル）ブタン酸（１００．９５ｍｇ、４４０．２１μｍｏｌ、１．３０当量）の混合物を窒素下でＮ２を用いて３０分間パージしたＤＭＦ（１０．００ｍＬ）を含む５０ｍＬのフラスコ中に加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。残留物をフラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜６０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶出液、８５ｍＬ／分）により精製した。ＤＭ１−ＳＰＤＢ（１２０．００ｍｇ、１４０．１１μｍｏｌ、４１．３８％の収率）を白色固体として得た。
【０３８２】
【表６６】
2021506910.tif 000150
【０３８３】
ＤＭ１−ＳＰＤＢ−ＴＦＰ
【化８２】
2021506910.tif 000151
【０３８４】
ＤＣＭ（１．００ｍＬ）およびＤＭＡ（３．００ｍＬ）中のＤＭ１−ＳＰＤＢ（１２０．００ｍｇ、１４０．１１μｍｏｌ、１．００当量）および２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（６９．８１ｍｇ、４２０．３４μｍｏｌ、３．００当量）の溶液にＥＤＣＩ（８０．５８ｍｇ、４２０．３４μｍｏｌ、３．００当量）を加えた。混合物を１５℃で４時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１−ＳＰＤＢは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。ＤＣＭを除去し、残留混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物ＤＭ１−ＳＰＤＢ−ＴＦＰ（６０．００ｍｇ、５９．７３μｍｏｌ、４２．６３％の収率）を白色固体として得た。
【０３８５】
【表６７】
2021506910.tif 000152
【０３８６】
標的化二環とＤＭ１−ＳＰＤＢ−ＴＦＰを連結するための一般的手順
ＤＭＡ中の標的化二環（１．１〜１．３当量）の溶液にＤＩＥＡ（３当量）およびＤＭ１−ＳＰＤＢ−ＴＦＰ（１当量）を加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応をＬＣ−ＭＳによりモニターし、完了したら、混合物を分取ＨＰＬＣにより直接的に精製した。
【０３８７】
ＢＣＹ６１３５
【化８３】
2021506910.tif 000153
【０３８８】
ＢＣＹ６０９９（１１４．１ｍｇ、３５．８４μｍｏｌ）を二環試薬として使用した。２２．４ｍｇの化合物ＢＣＹ６１３５（５．３０μｍｏｌ、１７．７４％の収率、９５．１４％の純度）を白色固体として得た。
【０３８９】
【表６８】
2021506910.tif 000154
【０３９０】
ＢＣＹ６０３１
【化８４】
2021506910.tif 000155
【０３９１】
ＢＣＹ６０１４（１２１．０７ｍｇ、３９．８２μｍｏｌ）を二環試薬として使用した。５９．９０ｍｇの化合物ＢＣＹ６０３１（１４．６７μｍｏｌ、３６．８５％の収率、９５．０２％の純度）を白色固体として得た。
【０３９２】
【表６９】
2021506910.tif 000156
【０３９３】
ＢＣＹ６１３４
【化８５】
2021506910.tif 000157
【０３９４】
ＢＣＹ６１０４（９５．１１ｍｇ、２９．８７μｍｏｌ、１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６１３４（０．０２３２ｇ、５．６４μｍｏｌ、１８．８９％の収率、９７．８２％の純度）を白色固体として得た。
【０３９５】
【表７０】
2021506910.tif 000158
【０３９６】
ＢＣＹ６０２７
【化８６】
2021506910.tif 000159
【０３９７】
ＢＣＹ６００９（６０．２４ｍｇ、１９．９１μｍｏｌ、１．００当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６０２７（２０．４０ｍｇ、５．１１μｍｏｌ、２５．６９％の収率、９６．８８％の純度）を白色固体として得た。
【０３９８】
【表７１】
2021506910.tif 000160
【０３９９】
ＢＣＹ６０４７
【化８７】
2021506910.tif 000161
【０４００】
ＢＣＹ６０１７（６１．８１ｍｇ、２７．３８μｍｏｌ、１．１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６０４７（０．０３２ｇ、１０．３４μｍｏｌ、４１．５３％の収率）を白色固体として得た。
【０４０１】
【表７２】
2021506910.tif 000162
【０４０２】
ＢＣＹ６０３５
【化８８】
2021506910.tif 000163
【０４０３】
ＢＣＹ６０１９（１１５．２２ｍｇ、３２．８６μｍｏｌ、１．１０当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６０３５（３７．８０ｍｇ、１０．３７μｍｏｌ、３４．７３％の収率）を白色固体として得た。
【０４０４】
【表７３】
2021506910.tif 000164
【０４０５】
ＢＣＹ６０５１
【化８９】
2021506910.tif 000165
【０４０６】
ＢＣＹ６０１８（７３．４８ｍｇ、２７．３８μｍｏｌ、１．１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６０５１（０．０５８２ｇ、１６．５２μｍｏｌ、６６．３９％の収率）を白色固体として得た。
【０４０７】
【表７４】
2021506910.tif 000166
【０４０８】
ＢＣＹ６１５４
【化９０】
2021506910.tif 000167
【０４０９】
ＢＣＹ６１５２（９３．１７ｍｇ、２９．８７μｍｏｌ、１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６１５４（４０．１０ｍｇ、９．９３μｍｏｌ、３３．２７％の収率、９８．０６％の純度）を白色固体として得た。
【０４１０】
【表７５】
2021506910.tif 000168
【０４１１】
ＢＣＹ６１５５
【化９１】
2021506910.tif 000169
【０４１２】
ＢＣＹ６１５３（８２．５５ｍｇ、２９．８７μｍｏｌ、１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６１５５（０．０３１２ｇ、８．５５μｍｏｌ、２８．６２％の収率、９８．６９％の純度）を白色固体として得た。
【０４１３】
【表７６】
2021506910.tif 000170
【０４１４】
ＤＭ１−ＳＳ（ＳＯ３Ｈ）系列
ＤＭ１−ＳＰＤＰ（ＳＯ３Ｈ）−ＮＨＳリンカー
【０４１５】
【化９２】
2021506910.tif 000171
【０４１６】
化合物２
【化９３】
2021506910.tif 000172
【０４１７】
ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）中の４−スルファニルブタン酸（２．０ｇ、１６．６４ｍｍｏｌ、１当量）および２−（２−ピリジルジスルファニル）ピリジン（１１．０ｇ、４９．９３ｍｍｏｌ、３当量）の溶液にＡｃＯＨ（１．０５ｇ、１７．４８ｍｍｏｌ、１ｍＬ、１．０５当量）を加えた。混合物を４０℃でＮ２下で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示し、ＴＬＣは、４−スルファニルブタン酸は完全に消費されたことを指し示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物２（２．０ｇ、８．７２ｍｍｏｌ、５２．４％の収率）を黄色固体として得た。
1H NMR: 400 MHz CDCl3
δ ppm 2.03-2.11 (m, 2 H), 2.54 (t, J=7.20 Hz, 2 H), 2.88 (t, J=7.20 Hz, 2 H), 7.11-7.14 (m, 1 H), 7.67-7.74 (m, 2 H), 8.50 (d, J=4.80 Hz, 1 H).
【０４１８】
【表７７】
2021506910.tif 000173
【０４１９】
化合物３
【化９４】
2021506910.tif 000174
【０４２０】
ＤＣＥ（５ｍＬ）中の化合物２（０．５ｇ、２．１８ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に３度に分けてクロロスルホン酸（１．５ｇ、１３．０８ｍｍｏｌ、０．８９ｍＬ、６当量）および２度に分けてＤＩＥＡ（１．１３ｇ、８．７２ｍｍｏｌ、１．５２ｍＬ、４当量）を加えた。混合物を７５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を３ｍＬのＨ２Ｏの添加によりクエンチし、ＤＣＥを除去した。残留混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物３（０．６８ｇ、１．７６ｍｍｏｌ、８０．６％の収率、８０％の純度）を淡黄色油として得た。
1H NMR: 400 MHz CDCl3
δ ppm 2.49-2.54 (m, 2 H), 3.63-3.67 (m, 2 H), 3.90 (t, J=6.60 Hz, 2 H), 7.09-7.12 (m, 1 H), 7.66-7.76 (m, 2 H), 8.47 (dd, J=4.80 Hz, 0.80 Hz, 1 H), 8.56 (s, 1 H).
【０４２１】
【表７８】
2021506910.tif 000175
【０４２２】
ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢ
【化９５】
2021506910.tif 000176
【０４２３】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＤＭ１（１．０ｇ、１．３５ｍｍｏｌ、１当量）および化合物３（５０２．９ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液にｐＨが８に達するまでＮａＨＣＯ３（水性）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。残基混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢ（０．２８ｇ、２９９．０μｍｏｌ、２２．１％の収率）を白色固体として得た。
【０４２４】
【表７９】
2021506910.tif 000177
【０４２５】
ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢ−ＮＨＳ
【化９６】
2021506910.tif 000178
【０４２６】
ＤＭＡ（６ｍＬ）およびＤＣＭ（２ｍＬ）中のＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢ（１０３．２ｍｇ、８９６．９５μｍｏｌ、３当量）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（１０３．２ｍｇ、８９６．９５μｍｏｌ、３当量）の溶液にＥＤＣＩ（１７１．９ｍｇ、８９６．９５μｍｏｌ、３当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。ＤＣＭを除去した。残留混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢ−ＮＨＳ（０．２２ｇ、２１２．８５μｍｏｌ、７１．２％の収率）を白色固体として得た。
【０４２７】
【表８０】
2021506910.tif 000179
【０４２８】
標的化二環とＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢ−ＮＨＳを連結するための一般的手順
ＤＭＡ中の標的化二環（１．１〜１．３当量）の溶液にＤＩＥＡ（３当量）およびＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＤＢ−ＮＨＳ（１当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。反応をＬＣ−ＭＳによりモニターし、完了したら、混合物を分取ＨＰＬＣにより直接的に精製した。
【０４２９】
ＢＣＹ６１７３
【化９７】
2021506910.tif 000180
【０４３０】
ＢＣＹ６０９９（２００．１５ｍｇ、６２．８９μｍｏｌ）を二環試薬として使用した。５７．１ｍｇの化合物ＢＣＹ６１７３（３．４０μｍｏｌ、２２．７９％の収率、９５．８０％の純度）を白色固体として得た。
【０４３１】
【表８１】
2021506910.tif 000181
【０４３２】
ＢＣＹ６０８２
【化９８】
2021506910.tif 000182
【０４３３】
ＢＣＹ６０１４（７１１．９ｍｇ、２３４．１４μｍｏｌ）を二環試薬として使用した。３０８ｍｇの化合物ＢＣＹ６０８２（７４．９７μｍｏｌ、３５．２％の収率、９６．３６％の純度）を白色固体として得た。
【０４３４】
【表８２】
2021506910.tif 000183
【０４３５】
ＢＣＹ６１５０
【化９９】
2021506910.tif 000184
【０４３６】
ＢＣＹ６０１８（７７．９１ｍｇ、２９．０３μｍｏｌ、１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６１５０（０．０２４９ｇ、６．６１μｍｏｌ、２２．７８％の収率）を白色固体として得た。
【０４３７】
【表８３】
2021506910.tif 000185
【０４３８】
ＢＣＹ６１５１
【化１００】
2021506910.tif 000186
【０４３９】
ＢＣＹ６１０４（１２０．１７ｍｇ、３７．７３μｍｏｌ、１．３当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６１５１（０．０２５６ｇ、６．１６μｍｏｌ、２１．２２％の収率）を白色固体として得た。
【０４４０】
【表８４】
2021506910.tif 000187
【０４４１】
ＢＣＹ６１６２
【化１０１】
2021506910.tif 000188
【０４４２】
ＢＣＹ６１３８（８２．８０ｍｇ、２６．６１μｍｏｌ、１．１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６１６２（０．０３６２ｇ、８．９８μｍｏｌ、３７．１３％の収率）を白色固体として得た。
【０４４３】
【表８５】
2021506910.tif 000189
【０４４４】
ＢＣＹ６１６１
【化１０２】
2021506910.tif 000190
【０４４５】
ＢＣＹ６１３７（７９．６７ｍｇ、２４．４８μｍｏｌ、１．１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６１６１（０．０２３２ｇ、５．２６μｍｏｌ、２１．７６％の収率）を白色固体として得た。
【０４４６】
【表８６】
2021506910.tif 000191
【０４４７】
ＤＭ１−ＳＳ−Ｍｅ系列
ＤＭ１−ＳＳ−Ｍｅリンカー
【０４４８】
【化１０３】
2021506910.tif 000192
【０４４９】
ＳＰＰ
【化１０４】
2021506910.tif 000193
【０４５０】
ＥｔＯＨ（５０．００ｍＬ）中の２−（２−ピリジルジスルファニル）ピリジン（２．４６ｇ、１１．１８ｍｍｏｌ、１．５０当量）およびＡｃＯＨ（１．０５ｇ、１７．４９ｍｍｏｌ、１．００ｍＬ、２．３５当量）の溶液に４−スルファニルペンタン酸（１．００ｇ、７．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。混合物を４０℃でＮ２下で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物ＳＰＰ（１．６１ｇ、６．６２ｍｍｏｌ、８８．８１％の収率）を黄色固体として得た。
1H NMR: 400 MHz DMSO-d6
δ ppm 1.36 (d, J=6.78 Hz, 3 H), 1.88 - 2.07 (m, 2 H), 2.56 (td, J=7.53, 1.76 Hz, 2 H), 3.00 - 3.09 (m, 1 H), 7.11 (ddd, J=7.34, 4.96, 1.00 Hz, 1 H), 7.66 (td, J=7.78, 1.76 Hz, 1 H), 7.73 - 7.77 (m, 1 H), 8.48 (dt, J=4.02, 0.88 Hz, 1 H).
【０４５１】
【表８７】
2021506910.tif 000194
【０４５２】
ＤＭ１−ＳＰＰ
【化１０５】
2021506910.tif 000195
【０４５３】
Ｈ２Ｏ（５．００ｍＬ）中のＤＭ１（２００ｍｇ、２７０．９０μｍｏｌ、１．００当量）、４−（２−ピリジルジスルファニル）ペンタン酸（９８．８９ｍｇ、４０６．３５μｍｏｌ、１．５０当量）の溶液をＮａＨＣＯ３（水性）を使用してＰＨ＝８に調整した。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した（主なＭＳはＭ＋１〜１８）。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物ＤＭ１−ＳＰＰ（１２０ｍｇ、１３７．８６μｍｏｌ、５０．８９％の収率）を白色固体として得た。
【０４５４】
【表８８】
2021506910.tif 000196
【０４５５】
ＤＭ１−ＳＰＰ−ＴＦＰ
【化１０６】
2021506910.tif 000197
【０４５６】
ＤＣＭ（１．０ｍＬ）およびＤＭＡ（３．０ｍＬ）中のＤＭ１−ＳＰＰ（０．１７５ｇ、２０１．０４μｍｏｌ、１．０当量）、２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（１００．１６ｍｇ、６０３．１３μｍｏｌ、３．０当量）の溶液にＥＤＣＩ（１１５．６２ｍｇ、６０３．１３μｍｏｌ、３．０当量）を加えた。混合物を１５℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１−ＳＰＰは完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。ＤＣＭを除去し、残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物ＤＭ１−ＳＰＰ−ＴＦＰ（０．１２３ｇ、１２０．７６μｍｏｌ、６０．０７％の収率）を白色固体として得た。
【０４５７】
【表８９】
2021506910.tif 000198
【０４５８】
標的化二環とＤＭ１−ＳＰＰ−ＴＦＰを連結するための一般的手順
ＤＭＡ中の標的化二環（１．１〜１．３当量）の溶液にＤＩＥＡ（３当量）およびＤＭ１−ＳＰＰ−ＴＦＰ（１当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。反応をＬＣ−ＭＳによりモニターし、完了したら、混合物を分取ＨＰＬＣにより直接的に精製した。
【０４５９】
ＢＣＹ６０３２
【化１０７】
2021506910.tif 000199
【０４６０】
ＤＭＦ（５．００ｍＬ）中のＤＭ１−ＳＰＰ（３０．００ｍｇ、３４．４６μｍｏｌ、１．００当量）の溶液にＤＩＥＡ（１３．３６ｍｇ、１０３．３８μｍｏｌ、１８．０５μＬ、３．００当量）およびＨＡＴＵ（１３．１０ｍｇ、３４．４６μｍｏｌ、１．００当量）を加えた。１時間後、ＢＣＹ６０１４（１０４．７９ｍｇ、３４．４６μｍｏｌ、１．００当量）を加え、混合物を１５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、４０％のＤＭ１−ＳＰＰが残留していたことを示した。いくつかの新たなピークがＬＣ−ＭＳにおいて観察され、２０％の所望の化合物が検出された。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６０３２（１０．００ｍｇ、２．５７μｍｏｌ、７．４５％の収率）を白色固体として得た。
【０４６１】
【表９０】
2021506910.tif 000200
【０４６２】
ＢＣＹ６０５２
【化１０８】
2021506910.tif 000201
【０４６３】
ＢＣＹ６０１８（８６．９６ｍｇ、３２．４０μｍｏｌ、１．１当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６０５２（３２．３０ｍｇ、９．１３μｍｏｌ、３１．０１％の収率）を白色固体として得た。
【０４６４】
【表９１】
2021506910.tif 000202
【０４６５】
ＢＣＹ６０４８
【化１０９】
2021506910.tif 000203
【０４６６】
ＢＣＹ６０１７（６６．５０ｍｇ、２９．４５μｍｏｌ、１．２当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６０４８（４０．８０ｍｇ、１３．１２μｍｏｌ、５３．４５％の収率）を白色固体として得た。
【０４６７】
【表９２】
2021506910.tif 000204
【０４６８】
ＢＣＹ６０３６
【化１１０】
2021506910.tif 000205
【０４６９】
ＢＣＹ６０１９（１１３．６０ｍｇ、３２．４０μｍｏｌ、１．１０当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６０３６（５３．２０ｍｇ、１４．００μｍｏｌ、４７．５４％の収率、９６．２６％の純度）を白色固体として得た。
【０４７０】
【表９３】
2021506910.tif 000206
【０４７１】
ＢＣＹ６０２８
【化１１１】
2021506910.tif 000207
【０４７２】
ＢＣＹ６００９（９９．００ｍｇ、２９．４５μｍｏｌ、１．００当量）を二環試薬として使用した。ＢＣＹ６０２８（２４．３０ｍｇ、６．０５μｍｏｌ、２０．５６％の収率、９６．６１％の純度）を白色固体として得た。
【０４７３】
【表９４】
2021506910.tif 000208
【０４７４】
ジスルフィドリンカー（様々な障害）
ＢＣＹ６０３９（ＤＭ１−Ｍｅ−ＳＳ−Ｍｅ−二環）
【化１１２】
2021506910.tif 000209
【０４７５】
化合物２Ａ
【化１１３】
2021506910.tif 000210
【０４７６】
ＥｔＯＨ（５０．００ｍＬ）中の２−（２−ピリジルジスルファニル）ピリジン（２．４６ｇ、１１．１８ｍｍｏｌ、１．５０当量）およびＡｃＯＨ（１．０５ｇ、１７．４９ｍｍｏｌ、１．００ｍＬ、２．３５当量）の溶液に４−スルファニルペンタン酸（１Ａ）（１．００ｇ、７．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。混合物を４０℃でＮ２下で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、１Ａは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得、これを分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物２Ａ（１．６１ｇ、６．６２ｍｍｏｌ、８８．８１％の収率）を淡黄色固体として得た。
【０４７７】
【表９５】
2021506910.tif 000211
【０４７８】
化合物３Ａ
【化１１４】
2021506910.tif 000212
【０４７９】
ＤＭＡ（１ｍＬ）中の２Ａ（０．０１ｇ、４１．０９μｍｏｌ、１．００当量）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（１４．１９ｍｇ、１２３．２８μｍｏｌ、３．００当量）の溶液にＥＤＣＩ（２３．６３ｍｇ、１２３．２８μｍｏｌ、３．００当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、２Ａは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物３Ａ（０．０１１ｇ、３２．３１μｍｏｌ、７８．６３％の収率）を白色固体として得た。
【０４８０】
【表９６】
2021506910.tif 000213
【０４８１】
化合物４Ａ
【化１１５】
2021506910.tif 000214
【０４８２】
ＤＭＡ（３ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（９８．２５ｍｇ、３２．３１μｍｏｌ、１．００当量）の溶液にＤＩＥＡ（８．２６ｍｇ、６４．６２μｍｏｌ、１１．２６μＬ、２．００当量）および３Ａ（０．０１１ｇ、３２．３１μｍｏｌ、１．００当量）を加えた。混合物を１５℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、３Ａは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物４Ａ（０．０４ｇ、１２．２５μｍｏｌ、３７．９０％の収率）を白色固体として得た。
【０４８３】
【表９７】
2021506910.tif 000215
【０４８４】
化合物５Ａ
【化１１６】
2021506910.tif 000216
【０４８５】
ＭｅＣＮ（４ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２ｍＬ）中の４Ａ（０．０４ｇ、１２．２５μｍｏｌ、１．００当量）の溶液にＴＣＥＰ（４．２１ｍｇ、１４．７０μｍｏｌ、４．０５μＬ、１．２０当量）を加えた。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、４Ａは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物５Ａ（０．０３５ｇ、１１．０９μｍｏｌ、９０．５３％の収率）を白色固体として得た。
【０４８６】
【表９８】
2021506910.tif 000217
【０４８７】
ＤＭ３−ＳＰｙ
【化１１７】
2021506910.tif 000218
【０４８８】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−（２−ピリジルジスルファニル）ペンタン酸（２Ａ）（２２．４６ｍｇ、９２．２９μｍｏｌ、１．２０当量）、ＨＡＴＵ（３５．０９ｍｇ、９２．２９μｍｏｌ、１．２０当量）、ＤＩＥＡ（２９．８２ｍｇ、２３０．７１μｍｏｌ、４０．１９μＬ、３．００当量）の溶液に１Ｂ（０．０５ｇ、７６．９０μｍｏｌ、１．００当量）を加えた。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、１Ｂは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物ＤＭ３−ＳＰｙ（０．０２５ｇ、２８．５６μｍｏｌ、３７．１３％の収率）を白色固体として得た。
【０４８９】
【表９９】
2021506910.tif 000219
【０４９０】
ＢＣＹ６０３９
【化１１８】
2021506910.tif 000220
【０４９１】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＤＭ３−ＳＰｙ（０．０１５ｇ、１７．１３μｍｏｌ、１．００当量）および５Ａ（５４．０８ｍｇ、１７．１３μｍｏｌ、１．００当量）の溶液をＮａＨＣＯ３（水性）を使用してｐＨ＝８に調整した。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ３−ＳＰｙは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６０３９（０．０２６３ｇ、６．５８μｍｏｌ、３８．３９％の収率）を白色固体として得た。
【０４９２】
【表１００】
2021506910.tif 000221
【０４９３】
ＢＣＹ６０５５（ＤＭ１−ＳＳ−Ｍｅ２−二環）
【化１１９】
2021506910.tif 000222
【０４９４】
化合物２
【化１２０】
2021506910.tif 000223
【０４９５】
Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中の化合物１（０．０４５ｇ、１２６．９６μｍｏｌ、１当量）の溶液を１ＮのＮａＯＨ溶液を使用してｐＨ＝１３に調整した。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物２（０．０３ｇ、１１６．５６μｍｏｌ、９１．８１％の収率）を黄色固体として得た。
【０４９６】
【表１０１】
2021506910.tif 000224
【０４９７】
化合物３
【化１２１】
2021506910.tif 000225
【０４９８】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物２（０．０３、１１６．５６μｍｏｌ、１．０当量）およびＤＭ１（１１１．８７ｍｇ、１５１．５３μｍｏｌ、１．３当量）の溶液を１５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＮＨ４ＨＣＯ３条件）により直接的に精製した。化合物３（０．０５ｇ、５６．５３μｍｏｌ、４８．５０％の収率）を白色固体として得た。
【０４９９】
【表１０２】
2021506910.tif 000226
【０５００】
化合物４
【化１２２】
2021506910.tif 000227
【０５０１】
ＤＭＡ（３ｍＬ）およびＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物３（０．０５ｇ、５６．５３μｍｏｌ、１．０当量）および２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（２８．１６ｍｇ、１６９．５９μｍｏｌ、３．０当量）の溶液にＥＤＣＩ（３２．５１ｍｇ、１６９．５９μｍｏｌ、３当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。ＤＣＭを除去し、混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物４（０．０３ｇ、２９．０５μｍｏｌ、５１．４０％の収率）を白色固体として得た。
【０５０２】
【表１０３】
2021506910.tif 000228
【０５０３】
ＢＣＹ６０５５
【化１２３】
2021506910.tif 000229
【０５０４】
ＤＭＡ（３ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（１０６．０１ｍｇ、３４．８７μｍｏｌ、１．２当量）の溶液にＤＩＥＡ（１１．２７ｍｇ、８７．１６μｍｏｌ、１５．１８μＬ、３．０当量）および化合物４（０．０３ｇ、２９．０５μｍｏｌ、１．０当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６０５５（０．０３５２ｇ、９．０１μｍｏｌ、３１．０１％の収率）を白色固体として得た。
【０５０５】
【表１０４】
2021506910.tif 000230
【０５０６】
ＢＣＹ６０７７（ＤＭ１−ＳＳ−Ｍｅ−（ＳＯ３Ｈ）−二環）
【化１２４】
2021506910.tif 000231
【０５０７】
化合物２の調製のための一般的手順
【化１２５】
2021506910.tif 000232
【０５０８】
１，２−ジクロロエタン（３ｍＬ）中の化合物１（０．１ｇ、４１０．９４μｍｏｌ、１当量）の溶液に３度に分けてクロロスルホン酸（０．８６ｇ、７．３８ｍｍｏｌ、４９１．４３μＬ、１７．９６当量）を加え、２度に分けてＤＩＥＡ（３１８．６７ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ、４２９．４７μＬ、６当量）を加えた。混合物を７５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークはＭＳ３２４と検出され、副生成物ＭＳ２２１の１つの主なピークはＰｙＳＳＰｙであったことを示した。溶媒を除去し、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＝１５／１中に溶解した。分取ＨＰＬＣ（中性条件：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）により直接的に精製した。化合物２（０．０５５ｇ、１７０．０６μｍｏｌ、４１．３８％の収率）を黄色油として得た。
【０５０９】
【表１０５】
2021506910.tif 000233
【０５１０】
ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＰの調製のための一般的手順
【化１２６】
2021506910.tif 000234
【０５１１】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＤＭ１（１１３．００ｍｇ、１５３．０６μｍｏｌ、１．１当量）、化合物２（０．０４５ｇ、１３９．１４μｍｏｌ、１当量）の溶液をＮａＨＣＯ３（水性）のために使用されるＰＨ＝８に調整した。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＰ（０．０７５ｇ、７８．９０μｍｏｌ、５６．７１％の収率）を白色固体として得た。
【０５１２】
【表１０６】
2021506910.tif 000235
【０５１３】
ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＰ−ＮＨＳの調製のための一般的手順
【化１２７】
2021506910.tif 000236
【０５１４】
ＤＭＡ（１．５ｍＬ）およびＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＰ（０．０６ｇ、６３．１２μｍｏｌ、１当量）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（７．９９ｍｇ、６９．４３μｍｏｌ、１．１当量）の溶液にＥＤＣＩ（１３．３１ｍｇ、６９．４３μｍｏｌ、１．１当量）を加えた。混合物を１５℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＰは完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（中性条件：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）により直接的に精製した。化合物ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＰ−ＮＨＳ（０．０４５ｇ、４２．９６μｍｏｌ、６８．０５％の収率）を白色固体として得た。
【０５１５】
【表１０７】
2021506910.tif 000237
【０５１６】
ＢＣＹ６０７７の調製のための一般的手順
ＤＭＡ（１ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（１０１．５８ｍｇ、３３．４１μｍｏｌ、１当量）の溶液にＤＩＥＡ（１２．９５ｍｇ、１００．２３μｍｏｌ、１７．４６μＬ、３当量）およびＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＰ−ＴＦＰ（０．０３５ｇ、３３．４１μｍｏｌ、１当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１−ＳＯ３Ｈ−ＳＰＰ−ＴＦＰは完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６０７７（４１．３０ｍｇ、１０．０３μｍｏｌ、３０．０１％の収率、９６．４４％の純度）を白色固体として得た。
【０５１７】
【表１０８】
2021506910.tif 000238
【０５１８】
切断可能でない系列
ＢＣＹ６０６３（ＭＭＡＥ）
【化１２８】
2021506910.tif 000239
【０５１９】
グルタレート−ＭＭＡＥ
【化１２９】
2021506910.tif 000240
【０５２０】
ＤＭＡ（３ｍＬ）中のＭＭＡＥ（０．２ｇ、２７８．５６μｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＤＩＥＡ（１０８．０１ｍｇ、８３５．６８μｍｏｌ、１４５．５６μＬ、３．０当量）およびテトラヒドロピラン−２，６−ジオン（６３．５７ｍｇ、５５７．１２μｍｏｌ、２．０当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＭＭＡＥは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物グルタレート−ＭＭＡＥ（０．１２ｇ、１４４．２２μｍｏｌ、５１．７７％の収率）を白色固体として得た。
【０５２１】
【表１０９】
2021506910.tif 000241
【０５２２】
グルタレート−ＭＭＡＥ−ＮＨＳ
【化１３０】
2021506910.tif 000242
【０５２３】
ＤＭＡ（３ｍＬ）およびＤＣＭ（１ｍＬ）中のグルタレート−ＭＭＡＥ（０．１２ｇ、１４４．２２μｍｏｌ、１．０当量）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（４９．７９ｍｇ、４３２．６５μｍｏｌ、３．０当量）の溶液にＥＤＣＩ（８２．９４ｍｇ、４３２．６５μｍｏｌ、３．０当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、グルタレート−ＭＭＡＥは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物グルタレート−ＭＭＡＥ−ＮＨＳ（０．０５５ｇ、５９．１９μｍｏｌ、４１．０４％の収率）を白色固体として得た。
【０５２４】
【表１１０】
2021506910.tif 000243
【０５２５】
ＢＣＹ６０６３
【化１３１】
2021506910.tif 000244
【０５２６】
ＤＭＡ（２ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（９８．１７ｍｇ、３２．２９μｍｏｌ、１．２当量）の溶液にＤＩＥＡ（１０．４３ｍｇ、８０．７２μｍｏｌ、１４．０６μＬ、３当量）およびグルタレート−ＭＭＡＥ−ＮＨＳ（０．０２５ｇ、２６．９１μｍｏｌ、１当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、グルタレート−ＭＭＡＥ−ＮＨＳは完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６０６３（３２．１０ｍｇ、８．３３μｍｏｌ、３０．９５％の収率）を白色固体として得た。
【０５２７】
【表１１１】
2021506910.tif 000245
【０５２８】
ＢＣＹ６０６４（ＤＭ１）
【化１３２】
2021506910.tif 000246
【０５２９】
化合物１
【化１３３】
2021506910.tif 000247
【０５３０】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＤＭ１（０．１ｇ、１３５．４５μｍｏｌ、１当量）、３−［（２−ブロモアセチル）アミノ］プロパン酸（３４．１４ｍｇ、１６２．５４μｍｏｌ、１．２当量）の溶液にＴＥＡ（４１．１２ｍｇ、４０６．３５μｍｏｌ、５６．５６μＬ、３当量）を加えた。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＤＭ１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物１（０．０８ｇ、９２．２３μｍｏｌ、６８．０９％の収率）を白色固体として得た。
【０５３１】
【表１１２】
2021506910.tif 000248
【０５３２】
化合物２
【化１３４】
2021506910.tif 000249
【０５３３】
ＤＭＡ（３ｍＬ）およびＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物１（０．０８ｇ、９２．２３μｍｏｌ、１当量）、２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（４５．９５ｍｇ、２７６．６９μｍｏｌ、３当量）の溶液にＥＤＣＩ（５３．０４ｍｇ、２７６．６９μｍｏｌ、３当量）を加えた。混合物を１５℃で４時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物２（０．０６ｇ、５９．０９μｍｏｌ、６４．０６％の収率）を白色固体として得た。
【０５３４】
【表１１３】
2021506910.tif 000250
【０５３５】
ＢＣＹ６０６４
【化１３５】
2021506910.tif 000251
【０５３６】
ＤＭＡ（３ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（１０７．７９ｍｇ、３５．４５μｍｏｌ、１．２当量）の溶液にＤＩＥＡ（１１．４５ｍｇ、８８．６３μｍｏｌ、１５．４４μＬ、３．０当量）および化合物２（０．０３０ｇ、２９．５４μｍｏｌ、１当量）を加えた。混合物を１５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２は完全に消費され、所望の質量を有する１つの主なピークが検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６０６４（２８．４０ｍｇ、７．３０μｍｏｌ、２４．７１％の収率）を白色固体として得た。
【０５３７】
【表１１４】
2021506910.tif 000252
【０５３８】
ＢＣＹ６１０５
【化１３６】
2021506910.tif 000253
【０５３９】
化合物２の調製のための一般的手順
ＤＣＭ（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の化合物１（３．５ｇ、５．６８ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に（４−アミノフェニル）メタノール（９７８．５ｍｇ、７．９５ｍｍｏｌ、１．４当量）およびＥＥＤＱ（２．８１ｇ、１１．３５ｍｍｏｌ、２．０当量）を暗所で加え、混合物を２５℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋Ｈ＋］＝７２２．０）。結果として得られた反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得た。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｓｉｌｉｃａ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜１０％のメタノール／ジクロロメタンの溶出液、８０ｍＬ／分）により精製した。化合物２（３．０ｇ、４．１６ｍｍｏｌ、７３．２％の収率）を黄色固体として得た。
【０５４０】
化合物３の調製のための一般的手順
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の化合物２（２．５ｇ、３．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＤＩＥＡ（２．６９ｇ、２０．７８ｍｍｏｌ、３．６２ｍＬ、６．０当量）およびビス（４−ニトロフェニル）炭酸塩（６．３２ｇ、２０．７８ｍｍｏｌ、６．０当量）を加え、混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＴＬＣは、化合物２は完全に消費され、１つの新たなスポットが形成されたことを指し示した。反応液はＴＬＣによれば清浄であった。反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得た。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｓｉｌｉｃａ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜５％のメタノール／ジクロロメタンの溶出液、１００ｍＬ／分）により精製した。化合物３（２．２ｇ、２．４８ｍｍｏｌ、７１．６％の収率）を黄色固体として得た。
【０５４１】
化合物４の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３（０．３ｇ、３３８．２４ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＨＯＢｔ（５０．３ｍｇ、３７２．０６ｕｍｏｌ、１．１当量）、ＤＩＥＡ（１３１．１ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ、１７６．７μＬ、３．０当量）、およびＭＭＡＥ（２１８．６ｍｇ、３０４．４２ｕｍｏｌ、０．９当量）を加えた。混合物を４０℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のＭＳを有する１つのピークを示した（［Ｍ＋Ｈ＋］＝１４６６．４、［Ｍ＋２Ｈ＋］／２＝７３３．２）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製し、化合物４（０．２ｇ、１３６．４４ｕｍｏｌ、４０．３％の収率）を白色固体として得た。
【０５４２】
化合物５の調製のための一般的手順
化合物４（０．１７５ｇ、１１９．３９ｕｍｏｌ、１．０当量）を最初にＴＦＡ（１．８ｍＬ）中に溶解し、次にトリイソプロピルシラン（１３．５ｇ、８５．２０ｍｍｏｌ、１７．５ｍＬ、７１３．７当量）を加えた。混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のＭＳを有する１つのピークを示した（［Ｍ＋Ｈ＋］＝１１２３．４、［Ｍ＋２Ｈ＋］／２＝５６２．２）。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物５（０．１ｇ、８９．０２ｕｍｏｌ、７４．６％の収率）を黄色固体として得た。
【０５４３】
化合物６の調製のための一般的手順
ＤＭＡ（１．０ｍＬ）中の化合物５（０．０７ｇ、６２．３１ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＤＩＥＡ（２４．２ｍｇ、１８６．９４ｕｍｏｌ、３２．６μＬ、３．０当量）およびテトラヒドロピラン−２，６−ジオン（１４．２ｍｇ、１２４．６２ｕｍｏｌ、２．０当量）を加えた。混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋Ｈ＋］＝１２３７．４、［Ｍ＋２Ｈ＋］／２＝６１９．３）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製し、化合物６（０．０４ｇ、３２．３２ｕｍｏｌ、５１．８％の収率）を淡黄色固体として得た。
【０５４４】
化合物７の調製のための一般的手順
ＤＭＡ（３．０ｍＬ）およびＤＣＭ（１．０ｍＬ）中の化合物６（０．０４ｇ、３２．３２ｕｍｏｌ、１．０当量）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（１１．２ｍｇ、９６．９７ｕｍｏｌ、３．０当量）の溶液にＥＤＣＩ（１８．６ｍｇ、９６．９７ｕｍｏｌ、３．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物６は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋Ｈ＋］＝１３３４．５、［Ｍ＋２Ｈ＋］／２＝６６７．７）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製し、化合物７（０．０２５ｇ、１８．７３ｕｍｏｌ、５７．９％の収率）を白色固体として得た。
【０５４５】
ＢＣＹ６１０５の調製のための一般的手順
ＤＭＡ（４ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（８２．０ｍｇ、２６．９８ｕｍｏｌ、１．２当量）の溶液にＤＩＥＡ（８．７ｍｇ、６７．４４ｕｍｏｌ、１１．７μＬ、３．０当量）および化合物７（０．０３ｇ、２２．４８ｕｍｏｌ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋４Ｈ＋］／４＝１０６５．２）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６１０５（０．０２４ｇ、５．４１ｕｍｏｌ、２４．１％の収率、９６．０６％の純度）を白色固体として得た。
【０５４６】
ＢＣＹ６１０６
【化１３７】
2021506910.tif 000254
【０５４７】
化合物２の調製のための一般的手順
ＤＣＭ（３０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の化合物１（５．０ｇ、１０．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＥＥＤＱ（５．２８ｇ、２１．３４ｍｍｏｌ、２．０当量）および（４−アミノフェニル）メタノール（２．６３ｇ、２１．３４ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。混合物を２０℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（所望のｍ／ｚ＝５７４；脱落および部分的に脱落したＢｏｃ基はそれぞれｍ／ｚ＝４７４および５１８に対応した）。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物２（３．７ｇ、６．４５ｍｍｏｌ、６０．４％の収率）を黄色固体として得た。
【０５４８】
化合物３の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物２（３．４ｇ、５．９３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＤＩＥＡ（５．３６ｇ、４１．４９ｍｍｏｌ、７．２３ｍＬ、７．０当量）およびビス（４−ニトロフェニル）炭酸塩（１０．８２ｇ、３５．５６ｍｍｏｌ、６．０当量）を一度に加えた。混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のＭＳを有する１つのピークを示した（ｍ／ｚ＝６３９は、ＥＳＩの間にＢｏｃ基が脱落する質量に対応した）。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物３（３．０ｇ、４．０６ｍｍｏｌ、６８．５％の収率）を黄色固体として得た。
【０５４９】
化合物４の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の化合物３（７０７．４ｍｇ、９５７．５５ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＨＯＢｔ（１５５．３ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＤＩＥＡ（３７１．３ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、５００．４μＬ、３．０当量）、およびＭＭＡＥ（０．５５ｇ、７６６．０４ｕｍｏｌ、０．８当量）を加えた。混合物を３０℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のＭＳを有する１つのピークを示した（所望のｍ／ｚ＝１３１７、およびｍ／ｚ＝６０９は、ＥＳＩの間に２つのプロトンおよびＢｏｃ基が脱落する質量に対応した）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物４（０．５３ｇ、４０２．２３ｕｍｏｌ、４２．０％の収率）を黄色固体として得た。
【０５５０】
化合物５の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物４（０．５２６ｇ、３９９．２０ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液にピペリジン（８６２．２ｍｇ、１０．１３ｍｍｏｌ、１．０ｍＬ、２５．４当量）を加えた。混合物を２５℃で３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（所望のｍ／ｚ＝１０９５、およびｍ／ｚ＝２６５はＦｍｏｃ−ピペリジン付加体に対応した）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物５（０．２３０ｇ、２０９．９７ｕｍｏｌ、５２．６％の収率）を白色固体として得た。
【０５５１】
化合物６の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｐｈｅ−ＯＨ（１２５．６ｍｇ、２７３．８７ｕｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、ＥＤＣＩ（５２．５ｍｇ、２７３．８７ｕｍｏｌ、１．２当量）、ＨＯＢｔ（３７．０ｍｇ、２７３．８７ｕｍｏｌ、１．２当量）、および化合物５（０．２５ｇ、２２８．２３ｕｍｏｌ、１当量）を加えた。混合物を２５℃で３時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つのピークが検出されたことを示した（ｍ／ｚ＝７１８は、ＥＳＩの間に２つのプロトンおよびＢｏｃ基が脱落する質量に対応した）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物６（０．１８ｇ、１１７．２０ｕｍｏｌ、５１．３％の収率）を白色固体として得た。
【０５５２】
化合物７の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（８ｍＬ）中の化合物６（０．１８ｇ、１１７．２０ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液にピペリジン（１．７２ｇ、２０．２５ｍｍｏｌ、２．０ｍＬ、１７２．８当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（ｍ／ｚ＝１３１４および６５７は所望の質量に対応し、ｍ／ｚ＝２６５はＦｍｏｃ−ピペリジン付加体に対応した）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物７（０．１３ｇ、９８．９６ｕｍｏｌ、８４．４％の収率）を白色固体として得た。
【０５５３】
化合物８の調製のための一般的手順
ＤＭＡ（４ｍＬ）中の化合物７（０．１０５ｇ、７９．９３ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＤＩＥＡ（３１．０ｍｇ、２３９．７９ｕｍｏｌ、４１．８μＬ、３．０当量）およびテトラヒドロピラン−２，６−ジオン（２７．４ｍｇ、２３９．７９ｕｍｏｌ、３．０当量）を加えた。混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（ｍ／ｚ  ６６４．５は、ＥＳＩの間に２つのプロトンおよびＢｏｃ基が脱落する質量に対応した）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製し、化合物８（０．０９ｇ、６３．０４ｕｍｏｌ、７８．８％の収率）を白色固体として得た。
【０５５４】
化合物９の調製のための一般的手順
ＤＭＡ（３ｍＬ）およびＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物８（０．０９ｇ、６３．０４ｕｍｏｌ、１．０当量）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（２１．７ｍｇ、１８９．１１ｕｍｏｌ、３．０当量）の溶液に、１ｍＬのＤＣＭ中に溶解したＥＤＣＩ（３６．２ｍｇ、１８９．１１ｕｍｏｌ、３．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物８は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（所望のｍ／ｚ＝１５２４（１つのプロトン）および７６３（２つのプロトン）であり、ｍ／ｚ＝７１３はＥＳＩの間にＢｏｃ基が脱落する質量に対応した）。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物９（０．０７ｇ、４５．９１ｕｍｏｌ、７２．８％の収率）を白色固体として得た。
【０５５５】
化合物１０の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（１６７．５ｍｇ、５５．０９ｕｍｏｌ、１．２当量）の溶液にＤＩＥＡ（１１．８ｍｇ、９１．８１ｕｍｏｌ、１６．０μＬ、２．０当量）および化合物９（０．０７ｇ、４５．９１ｕｍｏｌ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物９は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋４Ｈ＋］／４＝１１１２．９、［Ｍ＋５Ｈ＋］／５＝８９０．５）。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。粗生成物１０（０．２２０ｇ、粗）をさらなる精製なしで次の工程において使用した。
【０５５６】
ＢＣＹ６１０６の調製のための一般的手順
ＤＣＭ（４ｍＬ）中の化合物１０（０．２００ｇ、４４．９５ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液に１ｍＬのＴＦＡを加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のＭＳを有する１つの主なピークを示した（［Ｍ＋４Ｈ＋］／４＝１０８８．０、［Ｍ＋５Ｈ＋］／５＝８７０．８）。反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を得、それを次に分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６１０６（０．０２９７ｇ、２０．０６ｕｍｏｌ、１４．５％の収率、９５．４６％の純度）を白色固体として得た。
【０５５７】
ＢＣＹ６１７５
【化１３８】
2021506910.tif 000255
【０５５８】
化合物９の調製のための一般的手順
化合物９の合成は、ＢＣＹ６１０６において記載したものと類似の様式で行った。
【０５５９】
化合物１０Ａの調製のための一般的手順
ＤＭＡ（３ｍＬ）中のＢＣＹ６０９９（１９５．１５ｍｇ、６１．３２μｍｏｌ、１．１当量）の溶液にＤＩＥＡ（２１．６１ｍｇ、１６７．２３μｍｏｌ、２９．１３μＬ、３当量）および化合物９（０．０８５ｇ、５５．７４μｍｏｌ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物９は完全に消費され、所望のｍ／ｚを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去することにより残留物（淡黄色油）を得た。反応液を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物１０Ａ（０．１６０ｇ、３４．８４μｍｏｌ、６２．５０％の収率）を白色固体として得た。
【０５６０】
ＢＣＹ６１７５の調製のための一般的手順
ＤＣＭ（４．５ｍＬ）中の化合物１０Ａの溶液にＴＦＡ（４．５ｍＬ）を加えた。混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１０Ａは完全に消費され、所望のｍ／ｚを有する１つの主なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去することにより残留物を得、それを分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物ＢＣＹ６１７５（６１．４０ｍｇ、１３．５６μｍｏｌ、３１．１３％の収率）を白色固体として得た。
【０５６１】
ＢＣＹ６１０７
【化１３９】
2021506910.tif 000256
【０５６２】
化合物２の調製のための一般的手順
ＤＣＭ（３０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の化合物１（３．０ｇ、８．４９ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＥＥＤＱ（２．５２ｇ、１０．１９ｍｍｏｌ、１．２当量）および（４−アミノフェニル）メタノール（１．２５ｇ、１０．１９ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋Ｈ］＋  ４５９．５）。加えて、ＴＬＣは、化合物１は完全に消費され、新たなスポットが形成されたことを指し示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｓｉｌｉｃａ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜６０％のエチルアセテート／石油エーテル勾配の溶出液、８０ｍＬ／分）により精製した。化合物２（３．５ｇ、７．６３ｍｍｏｌ、８９．９％の収率）を黄色固体として得た。
【０５６３】
化合物３の調製のための一般的手順
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の化合物２（３．３ｇ、７．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＤＩＥＡ（４．６５ｇ、３５．９８ｍｍｏｌ、６．２７ｍＬ、５．０当量）およびビス（４−ニトロフェニル）炭酸塩（８．７６ｇ、２８．７９ｍｍｏｌ、４．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋Ｈ］＋  ６２４．０）。加えて、ＴＬＣは、化合物２は完全に消費され、新たなスポットが形成されたことを指し示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得た。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｓｉｌｉｃａ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｏｌｕｍｎ、０〜１５％のエチルアセテート／石油エーテル勾配の溶出液、８０ｍＬ／分）により精製した。化合物３（３．０ｇ、４．８１ｍｍｏｌ、６６．８％の収率）を黄色固体として得た。
【０５６４】
化合物４の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３（１２４．０９ｍｇ、１９８．９７ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＨＯＢｔ（３２．３ｍｇ、２３８．７７ｕｍｏｌ、１．２当量）、ＤＩＥＡ（７７．１ｍｇ、５９６．９２μｍｏｌ、１０３．９μＬ、３．０当量）、およびＭＭＡＥ（０．１ｇ、１３９．２８ｕｍｏｌ、０．７当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋Ｈ］＋  １２０２．５、［Ｍ＋Ｎａ］＋  １２２４．５）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。凍結乾燥後、化合物４（０．０８ｇ、６６．５３ｕｍｏｌ、３３．４％の収率）を白色固体として得た。
【０５６５】
化合物５の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物４（０．０８ｇ、６６．５３ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液にピペリジン（８６２．２ｍｇ、１０．１３ｍｍｏｌ、１ｍＬ、１５２．２当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋Ｈ］＋  ９８１．５、［Ｍ＋Ｎａ］＋  １００３．５、ｍ／ｚ＝２６４．０はＦｍｏｃ−ピペリジン付加体に対応した）。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物５（０．０５５ｇ、５６．１１ｕｍｏｌ、８４．３％の収率）を白色固体として得た。
【０５６６】
化合物６の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（４ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ−Ｇｌｙ−ＨＰｈｅ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ（７４．１ｍｇ、６６．３１ｕｍｏｌ、１．３当量）の溶液に、ＥＤＣＩ（１２．７ｍｇ、６６．３１ｕｍｏｌ、１．３当量）、ＨＯＢｔ（８．９ｍｇ、６６．３１ｕｍｏｌ、１．３当量）、および化合物５（０．０５ｇ、５１．０１ｕｍｏｌ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で３０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、２０％の化合物５が残留し、いくつかの新たなピークが形成され、６０％の反応混合物が所望の生成物（［Ｍ＋２Ｈ＋］／２＝１０４０．４）であったことを指し示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物６（０．０７ｇ、３３．６６ｕｍｏｌ、６６．０％の収率）を白色固体として得た。
【０５６７】
化合物７の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物６（０．０７ｇ、３３．６６ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液にピペリジン（２．９ｍｇ、３３．６６ｕｍｏｌ、３．３μＬ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１５分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物６は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋２Ｈ＋］／２＝９２９．１、ｍ／ｚ＝２６４．２はＦｍｏｃ−ピペリジン付加体に対応した）。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物７（０．０４５ｇ、２４．２３ｕｍｏｌ、７２．０％の収率）を白色固体として得た。
【０５６８】
化合物８の調製のための一般的手順
ＤＭＡ（１ｍＬ）中の化合物７（０．０４ｇ、２１．５４ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＤＩＥＡ（８．３ｍｇ、６４．６１ｕｍｏｌ、１１．２μＬ、３．０当量）およびテトラヒドロピラン−２，６−ジオン（７．４ｍｇ、６４．６１ｕｍｏｌ、３．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋２Ｈ＋］／２＝９８６．４）。反応混合物を次に分取ＨＰＬＣ（中性条件）により直接的に精製した。化合物８（０．０３５ｇ、１７．７５ｕｍｏｌ、８２．４％の収率）を白色固体として得た。
【０５６９】
化合物９の調製のための一般的手順
ＤＭＡ（３ｍＬ）およびＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物８（０．０３５ｇ、１７．７５ｕｍｏｌ、１．０当量）、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（６．１ｍｇ、５３．２６ｕｍｏｌ、３．０当量）の溶液にＥＤＣＩ（１０．２ｍｇ、５３．２６ｕｍｏｌ、３．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物８が部分的に残留し、所望のＭＳ（［Ｍ＋２Ｈ＋］／２＝１０３４．７）を有する１つのピークが検出されたことを示した。ＤＣＭを次に除去した後、混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物９（０．０３ｇ、１４．５０ｕｍｏｌ、８１．７％の収率）を白色固体として得た。
【０５７０】
化合物１０の調製のための一般的手順
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＢＣＹ６０１４（５２．９ｍｇ、１７．４０ｕｍｏｌ、１．５９μＬ、１．２当量）の溶液にＤＩＥＡ（５．６ｍｇ、４３．５１ｕｍｏｌ、７．６μＬ、３．０当量）および化合物９（０．０３ｇ、１４．５０ｕｍｏｌ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のＭＳを有する１つの主なピークを示した（［Ｍ＋４Ｈ＋］／４＝１２４９．２、［Ｍ＋５Ｈ＋］／５＝９９９．３）。溶媒を次に除去し、結果として得られた粗生成物１０（０．０６ｇ、粗）をさらなる精製なしで次の工程において使用した。
【０５７１】
ＢＣＹ６１０７の調製のための一般的手順
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物１０（０．０５５ｇ、１１．０１ｕｍｏｌ、１．０当量）の溶液に１ｍＬのＴＦＡを加えた。混合物を０℃で１５分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１０は完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主なピークが検出されたことを示した（［Ｍ＋４Ｈ＋］／４＝１２２１．０、［Ｍ＋５Ｈ＋］／５＝９７７．０）。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去して残留物を得、それを次に分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接的に精製した。化合物ＢＣＹ６１０７（２０．４ｍｇ、４．０３ｕｍｏｌ、３６．６％の収率、９６．３６％の純度）を白色固体として得た。
【０５７２】
生物学的データ
研究１：蛍光偏光測定
（ａ）直接結合アッセイ
蛍光タグ（フルオレセイン、ＳＩＧＭＡまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのいずれか）を有するペプチドを、０．０１％のｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳまたは１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０１％のｔｗｅｅｎを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（共にアッセイ緩衝液と称する）を用いて２．５ｎＭに希釈した。これをペプチドと同じアッセイ緩衝液中のタンパク質の滴定と合わせて、黒壁および黒底の低結合低体積３８４ウェルプレート中の２５μＬの総体積の１ｎＭのペプチド、典型的には、５μＬのアッセイ緩衝液、１０μＬのタンパク質（表１）、そして１０μＬの蛍光ペプチドを得た。２倍の段階希釈を使用して、既知の高親和性結合剤のための５００ｎＭから低親和性結合剤および選択性アッセイのための１０μＭまでの範囲内の最高濃度を有する１２の異なる濃度を得た。測定は、４８５ｎｍにおいて励起されて５２０ｎｍにおいて平行および垂直な放射を検出する「ＦＰ  ４８５  ５２０  ５２０」の光学モジュールを備えたＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳにより実行した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳを２５℃においてウェル当たり２００のフラッシュおよび０．１秒の配置遅延で設定し、各ウェルを５〜１０分間隔で６０分間測定した。ウェル中にタンパク質が存在しない６０分の終わりに各トレーサーについて解析のために使用される増加を決定した。Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０を使用してデータを解析した。ｍＰ値をユーザー定義の二次式にフィッティングしてＫｄ値を生成した：ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（ｘ＋Ｌｉｇ＋Ｋｄ）／２−ｓｑｒｔ（（（（ｘ＋Ｌｉｇ＋Ｋｄ）／２）＾２）−（Ｌｉｇ＊ｘ）））。「Ｌｉｇ」は、使用したトレーサーの濃度の定義された値であった。
【０５７３】
（ｂ）競合結合アッセイ
蛍光タグを有しないペプチドを蛍光タグおよび既知のＫｄを有するペプチドとの競合において試験した（表２）。参照化合物Ａは配列Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−ＡＣＰＷＧＰＡＷＣＰＶＮＲＰＧＣＡ（Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−（配列番号９４））を有する。参照化合物Ｂは配列Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−ＡＣＰＷＧＰＦＷＣＰＶＮＲＰＧＣＡ（Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−（配列番号９５））を有する。参照化合物Ｃは配列Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−ＡＤＶＴＣＰＷＧＰＦＷＣＰＶＮＲＰＧＣＡ（Ｆｌ−Ｇ−Ｓａｒ５−（配列番号９６）を有する。参照化合物Ａ、ＢおよびＣのそれぞれはＴＢＭＢ分子スキャフォールドを含有する。最大５％のＤＭＳＯを用いて直接結合アッセイにおいて記載したようなアッセイ緩衝液中に適切な濃度までペプチドを希釈した後、２倍に段階希釈した。５μＬの希釈したペプチドをプレートに加えた後に使用する蛍光ペプチドに依存する固定濃度（表２）の１０μＬのヒトまたはマウスＥｐｈＡ２（表１）、次に１０μＬの蛍光ペプチドを加えた。直接結合アッセイと同様に測定を実行したが、最初の測定の前に増加を決定した。データ解析をＳｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０において行い、ｍＰ値をユーザー定義の三次式にフィッティングしてＫｉ値を生成した：
ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（Ｌｉｇ＊（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）））／（（３＊Ｋｌｉｇ）＋（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ））））。
「Ｌｉｇ」、「ＫＬｉｇ」および「Ｐｒｏｔ」はいずれも、それぞれ蛍光ペプチド濃度、蛍光ペプチドのＫｄおよびＥｐｈＡ２濃度に関する定義された値であった。
【０５７４】
【表１１５】
2021506910.tif 000257
【０５７５】
【表１１６】
2021506910.tif 000258
【０５７６】
本発明のある特定のペプチドリガンドを上記のアッセイにおいて試験し、結果を表３〜７に示す。
【０５７７】
【表１１７】
2021506910.tif 000259
【０５７８】
【表１１８−１】
2021506910.tif 000260
【表１１８−２】
2021506910.tif 000261
【表１１８−３】
2021506910.tif 000262
【表１１８−４】
2021506910.tif 000263
【表１１８−５】
2021506910.tif 000264
【表１１８−６】
2021506910.tif 000265
【表１１８−７】
2021506910.tif 000266
【表１１８−８】
2021506910.tif 000267
【表１１８−９】
2021506910.tif 000268
【０５７９】
【表１１９】
2021506910.tif 000269
【０５８０】
【表１２０】
2021506910.tif 000270
【０５８１】
【表１２１】
2021506910.tif 000271
【０５８２】
研究２：蛍光偏光測定（代替的なプロトコール）
（ａ）競合結合
蛍光タグを有しないペプチドを蛍光タグおよび既知のＫｄを有するペプチドとの競合において試験した（表９）。５μＬの増加（２倍）濃度の試験化合物をプレートに加えた後に使用する蛍光ペプチドに依存する固定濃度（表９）の１０μＬのＥｐｈＡ２タンパク質（表８）、次に１０μＬの蛍光ペプチドを加えた。緩衝液は、ＤＭＳＯ＜１％の上記のようなアッセイ緩衝液であった。測定は、４８５ｎｍにおいて励起されて５２０ｎｍにおいて平行および垂直な放射を検出する「ＦＰ  ４８５  ５２０  ５２０」の光学モジュールを備えたＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳにより実行した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳを２５℃においてウェル当たり２００回のフラッシュおよび０．１秒の配置遅延で設定し、各ウェルを５〜１０分間隔で６０分間測定した。代替的に、測定は、３０回のフラッシュおよび１．２のＧ係数を有するＦＩＴＣ  ＦＰ  Ｄｕａｌ  Ｍｉｒｒｏｒ、ＦＩＴＣ  ＦＰ  ４８０励起フィルターならびにＦＩＴＣ  ＦＰ  Ｐ−ｐｏｌ  ５３５およびＦＩＴＣ  ＦＰ  Ｓ−ｐｏｌ発光フィルターを備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎにおいて類似の時間間隔で行った。データ解析をＳｙｓｔａｔ  Ｓｉｇｍａｐｌｏｔバージョン１２．０または１３．０において行い、６０分におけるｍＰ値をユーザー定義の三次式にフィッティングしてＫｉ値を生成した：
ｆ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／Ｌｉｇ＊（（Ｌｉｇ＊（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）））／（（３＊Ｋｌｉｇ）＋（（２＊（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾０．５＊ＣＯＳ（ＡＲＣＣＯＳ（（−２＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾３＋９＊（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ）−２７＊（−１＊Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ＊Ｐｒｏｔ＊ｃ））／（２＊（（（（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＾２−３＊（Ｋｃｏｍｐ＊（Ｌｉｇ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊（Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ）＋Ｋｌｉｇ＊Ｋｃｏｍｐ））＾３）＾０．５）））／３））−（Ｋｌｉｇ＋Ｋｃｏｍｐ＋Ｌｉｇ＋Ｃｏｍｐ−Ｐｒｏｔ＊ｃ））））。
「Ｌｉｇ」、「ＫＬｉｇ」および「Ｐｒｏｔ」はいずれも、それぞれ蛍光ペプチド濃度、蛍光ペプチドのＫｄおよびＥｐｈＡ２濃度に関する定義された値であった。
【０５８３】
【表１２２】
2021506910.tif 000272
【０５８４】
【表１２３】
2021506910.tif 000273
【０５８５】
本発明のある特定のペプチドリガンドおよび二環薬物コンジュゲートを上記の競合結合アッセイにおいて試験し、結果を表１０〜１１に示す。
【０５８６】
【表１２４−１】
2021506910.tif 000274
【表１２４−２】
2021506910.tif 000275
【０５８７】
表１０における競合結合アッセイの結果は、ヒトＥｐｈＡ２標的化二環ペプチド（ＢＣＹ６０１４およびＢＣＹ６０９９）は、マウスおよびラットＥｐｈＡ２に高い親和性で結合することを示す。同様に、ＢＣＹ６０１９はヒトＥｐｈＡ２およびマウスＥｐｈＡ２の両方に結合する。これらの結果は、本発明のある特定のペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスおよびラット有効性および毒物学モデルにおいて使用できることを示す。
【０５８８】
【表１２５−１】
2021506910.tif 000276
【表１２５−２】
2021506910.tif 000277
【０５８９】
表１１は、本発明のある特定の二環薬物コンジュゲートは、ヒト、マウスおよび齧歯動物ＥｐｈＡ２の間で優れた交差反応性を呈することを示す。本発明のペプチドは、したがって、マウスおよびラット有効性および毒物学ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて使用することができる。
【０５９０】
（ｂ）ＳＰＲ測定
タンパク質に対して３ｘモル過剰のビオチンを用いてｐＨ５．４の４ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ中で１時間、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを用いて非Ｆｃ融合タンパク質をビオチン化した。反応混合物のＰＢＳへの透析後にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して標識化の程度を決定した。ペプチド結合の解析のために、ＸａｎＴｅｃ  ＣＭＤ５００Ｄチップを利用してＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて２５℃において標準的なアミン連結化学を使用してストレプトアビジンをチップ上に固定化した。簡潔に述べれば、１０μｌ／分の流速において１：１の比の０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の７分の注入を用いてカルボキシメチルデキストラン表面を活性化させた。ストレプトアビジンの捕捉のために、タンパク質を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、活性化させたチップ表面上に１２０μｌを注入することにより捕捉した。残留の活性化した基を１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）：ＨＢＳ−Ｎ（１：１）の７分の注入を用いて遮断した。緩衝液をＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０に変更し、緩衝液中への０．２μＭまでのタンパク質の希釈を使用してビオチン化ＥｐｈＡ２を５００〜１５００ＲＵのレベルまで捕捉した。０．５％の最終のＤＭＳＯ濃度を用い、５０または１００ｎＭの最高ペプチド濃度および６つのさらなる２倍希釈を用いてこの緩衝液中のペプチドの希釈系列を調製した。６０秒の会合および９００〜１２００秒の解離を用いて９０μｌ／分の流速において２５℃でＳＰＲ分析を実行した。データをＤＭＳＯ除外体積効果について補正した。標準的な処理手順およびデータ処理を使用して全てのデータをブランク注入および参照表面について二重参照化し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア、バージョン２．０ｃ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して速度論的フィッティングを行った。単純な１：１の結合モデルを使用してデータをフィッティングして、適切な場合に物質輸送効果を可能とした。
【０５９１】
二環薬物コンジュゲートの結合についてＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を使用した。ビオチン化タンパク質について固定化レベルは１５００ＲＵであり、最高濃度は１００ｎＭであった。それ以外に、方法は、ＣＭＤ５００ＤまたはＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかを使用する上記したものと同じであった。Ｆｃタグ化タンパク質について、ＣＭ５チップを上記のように活性化させた後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｈ１０５００）をｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中に２０μｇ／ｍｌまで希釈し、約３０００ＲＵまで捕捉した。表面を次に上記のように遮断した。その後にＦｃタグ化タンパク質の捕捉を実行して約２００〜４００ＲＵの標的タンパク質を得た。使用したタンパク質を以下に記載する。製造者の示唆する緩衝液および濃度にしたがって全てのタンパク質を復元し、ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０中の５〜１０μｇ／ｍｌのタンパク質を使用して捕捉した。
【０５９２】
【表１２６】
2021506910.tif 000278
【０５９３】
本発明のある特定のペプチドリガンドおよび二環薬物コンジュゲートを上記の競合結合アッセイにおいて試験し、結果を表１３〜１５に示す。
【０５９４】
【表１２７】
2021506910.tif 000279
【０５９５】
表１３は、ＳＰＲアッセイを使用して決定したヒトＥｐｈＡ２への選択された二環薬物コンジュゲートの結合についての結合親和性および速度論的パラメーター（ＫｏｆｆおよびＫｏｎ）を詳述する。
【０５９６】
【表１２８】
2021506910.tif 000280
【０５９７】
表１４は、密接に関連するヒトエフリンホモログを用いたＳＰＲアッセイにおいて４つの二環薬物コンジュゲート（ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７３）を用いた結合性の結果を示す。結果は、本発明の化合物は、密接に関連するヒトホモログであるＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＢ４への有意な結合を呈しないことを示す。
【０５９８】
【表１２９】
2021506910.tif 000281
【０５９９】
表１５の結果は、本発明のある特定の二環薬物コンジュゲート（ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６１７３）はまたマウスおよびラットＥｐｈＡ２に選択的であり、密接に関連するホモログであるマウスＥｐｈＡ３およびＥｐｈＡ４、ならびにラットＥｐｈＡ３およびＥｐｈＢ１への有意な結合を呈しないことを示す。
【０６００】
研究３および７〜２３
研究３および７〜２３のそれぞれにおいて、以下の方法論を各研究のために採用した：
（ａ）材料
（ｉ）動物および飼育条件
動物
種：ハツカネズミ（Ｍｕｓ  Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
株：Ｂａｌｂ／ｃヌードまたはＣＢ１７−ＳＣＩＤ
齢：６〜８週
体重：１８〜２２ｇ
動物の数：９〜９０匹のマウス
動物供給業者：Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．Ｌｉｍｉｔｅｄ
飼育条件
マウスを各ケージ中に３〜５匹の動物で一定の温度および湿度において個々の換気ケージ中に留めた。
・温度：２０〜２６℃
・湿度  ４０〜７０％
ケージ：ポリカーボネート製。サイズは３００ｍｍ×１８０ｍｍ×１５０ｍｍである。ベッド材料はトウモロコシの穂軸であり、週に２回交換する。
食餌：動物は、全研究期間の間に照射滅菌した乾燥顆粒食品に自由にアクセスできた。
水：動物は、無菌の飲料水に自由にアクセスできた。
ケージの同定：各ケージの同定ラベルは以下の情報：動物の番号、性別、系統、受入日、処置、研究番号、群番号および処置の開始日を含有した。
動物の同定：動物は耳の符号化により印をした。
【０６０１】
（ｉｉ）試験および陽性（Ｐｏｓｔｉｔｉｖｅ）対照物品
【０６０２】
【表１３０】
2021506910.tif 000282
【０６０３】
（ｂ）実験の方法および手順
（ｉ）観察
本研究における動物の取扱い、世話および処置に関する全ての手順は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスにしたがって、ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたガイドラインにしたがって行った。ルーチンのモニタリングの時点において、可動性などの正常な挙動、食料および水の消費（視認によってのみ）、体重の増加／減少、目／毛のマッティングおよびプロトコールにおいて述べられるような任意の他の異常な効果に関する腫瘍成長および処置の任意の効果について動物を連日チェックした。死亡および観察された臨床徴候を各サブセット内の動物の番号に基づいて記録した。
【０６０４】
（ｉｉ）腫瘍の測定およびエンドポイント
主要なエンドポイントは、腫瘍成長が遅延され得るかまたはマウスが治癒され得るかを見ることであった。キャリパーを使用して２つの次元において腫瘍体積を週に３回測定し、式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径および短径である）を使用してｍｍ３において表した。腫瘍サイズを次にＴ／Ｃ値の算出のために使用した。Ｔ／Ｃ値（パーセント）は、抗腫瘍有効性の指標であり、ＴおよびＣは、所与の日における、それぞれ治療群および対照群の平均体積である。ＴＧＩを式：ＴＧＩ（％）＝［１−（Ｔｉ−Ｔ０）／（Ｖｉ−Ｖ０）］×１００（Ｔｉは所与の日における治療群の平均腫瘍体積であり、Ｔ０は処置開始日における治療群の平均腫瘍体積であり、ＶｉはＴｉと同日におけるビヒクル対照群の平均腫瘍体積であり、Ｖ０は処置開始日におけるビヒクル群の平均腫瘍体積である）を使用して各群について算出した。
【０６０５】
（ｉｉｉ）試料収集
研究の終了時に全ての群の腫瘍をＦＦＰＥのために収集した。
【０６０６】
（ｉｖ）統計解析
平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を含む要約統計量を各時点における各群の腫瘍体積について提供する。
群間の腫瘍体積の差異の統計解析を最終投与後の最良の治療的時点において得られたデータに対して実行した。
一元配置分散分析を行って群間で腫瘍体積を比較し、有意なＦ統計量（誤差分散に対する治療分散の比）が得られた場合、Ｇａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ検定を用いて群間の比較を実行した。全てのデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を使用して解析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意と考えた。
【０６０７】
研究３：ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
がん細胞株（ＣＣＬ）は元々は患者腫瘍に由来したが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物内で増殖する能力を獲得する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏマニピュレーションの結果として、がん研究において伝統的に使用されてきたＣＣＬは、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生育される場合に回復されない遺伝的形質転換を起こす。細胞培養プロセスのため、培養において生存するようにより良好に適合する細胞を選択し、がん細胞と相互作用する腫瘍内在性の細胞およびタンパク質を除去し、培養物は表現型が均質となる。研究者らは、５％の抗がん剤のみが前臨床試験後に食品医薬品局により承認される理由を腫瘍不均質性の欠如およびヒト間質性微環境の非存在に帰せ始めている。詳細には、ＣＣＬ異種移植片は、多くの場合に、原発性腫瘍における薬物応答を予測せず、その理由は、ＣＣＬは、薬物抵抗性の経路およびヒト原発性腫瘍において見出される薬物応答に対する微環境の効果に従わないからである。これらの問題を克服するために、本発明者らは、ＰＤＸモデルを使用して、前臨床モデルの予測能力を向上させた。
【０６０８】
患者の原発性腫瘍からのがん性組織が免疫不全マウスに直接的に移植される場合にＰＤＸは生じる。ＰＤＸは、非腫瘍細胞（例えば、間質細胞）の存在を含む患者組織構造を維持することができ、したがって腫瘍微環境をより良好に模倣することができる。一般に、ＰＤＸは、したがって、ＣＣＬ異種移植片よりも原発性腫瘍の不均質性および組織構造をより反映する。
【０６０９】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者に由来する原発性腺癌ＰＤＸ異種移植片（ＬＵ−０１−００４６）においてＢＣＹ６０３１をスクリーニングした。ＬＵ−０１−００４６は、ＲＮＡシークエンシングを使用して高レベルのＥｐｈＡ２を発現することが示されている。ＢＣＹ６０３１は、ＬＵ−０１−００４６モデルにおいて優れた有効性を呈し、したがって、非小細胞肺がんの治療のための有望な新規の療法である。
【０６１０】
（ａ）処置アーム
ビヒクル処置動物および５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗにおいて４週間ＢＣＹ６０３１を用いて処置された動物において腫瘍成長を比較するための実験を設計した。
【０６１１】
【表１３１】
2021506910.tif 000283
【０６１２】
（ｂ）実験方法
（ｉ）ＰＤＸの情報
【０６１３】
【表１３２】
2021506910.tif 000284
【０６１４】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に約３０ｍｍ３のＬＵ−０１−００４６腫瘍断片を接種した。平均腫瘍体積が９４３ｍｍ３に達した時に薬物処置を開始した。試験品、投与の経路、投与頻度および各群中の動物数を上記している。
【０６１５】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０６１６】
【表１３３】
2021506910.tif 000285
【０６１７】
（ｃ）結果
（ｉ）死亡率、罹病率、および体重の増加または減少
動物の体重を毒性の間接的な尺度として定期的にモニターした。ＢＣＹ６０３１を投与したＬＵ−０１−００４６腫瘍を有する雌Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにおける体重変化を図１に示す。
【０６１８】
（ｉｉ）腫瘍成長曲線
腫瘍成長曲線を図２に示す。
【０６１９】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＰＤＸモデルＬＵ−０１−００４６におけるＢＣＹ６０３１についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後７日目の腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０６２０】
【表１３４】
2021506910.tif 000286
【０６２１】
（ｅ）考察
本研究では、ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６０３１の治療効果を評価した。測定された体重を図１に示す。様々な時点における処置群の腫瘍体積を表１９および図２に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは７日目に２１９１ｍｍ３に達した。５ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ６０３１は強力な抗腫瘍活性を生じさせ、腫瘍は７日目までに４６３ｍｍ３（ＴＧＩ＝１３８．６％、ｐ＜０．０５）と測定された。さらには、ＢＣＹ６０３１処置は３２日目から腫瘍を完全に根絶し、２８日目における懸濁液の投与後に腫瘍再成長は起こらなかった。ＢＣＹ６０３１は有意な体重損失を生じさせず（図１）、研究の全体を通じて薬物処置マウスにおいて有害な臨床的所見はなかった。
【０６２２】
研究４：ＣＤＸ異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
本研究では、ＨＴ１０８０線維肉腫株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳がん株およびＮＣＩ−Ｈ１９７５非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）株の３つのがん細胞株由来（ＣＤＸ）モデルにおいてＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。
【０６２３】
（ａ）実験方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹の皮下に腫瘍細胞を接種し、平均平均腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ３に達した時に薬物処置を開始した。腫瘍測定および統計解析は上記のように行った。腫瘍を有する動物をＢＣＹ６１３６またはビヒクルを用いて週に１回処置した。
【０６２４】
（ｂ）考察
図４〜６は、ＢＣＹ６１３６は週に１回の投与後に乳房、肺および線維肉腫異種移植モデルにおいて効果的であることを示す。
【０６２５】
ＨＴ１０８０線維肉腫モデル：
ＨＴ１０８０モデルにおいて、０および７日目における３および５ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６の週に１回の投与後１４日目までに腫瘍成長の完全な退縮が達成された（図４）。０および７日目における２ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６の週に１回の投与は腫瘍静止（部分的な退縮）を生じさせた（図４）。ＢＣＹ６１３６処置は有意な体重損失を生じさせず（図４の挿入図）、研究の全体を通じて薬物処置マウスにおいて有害な臨床的所見はなかった。
【０６２６】
ＮＣＩ−Ｈ１９７５  ＮＳＣＬＣモデル：
２および３ｍｇ／ｋｇの週に１回のＢＣＹ６１３６の投与後約２８日目までにＮＣＩ−Ｈ１９７５モデルにおいて腫瘍成長の完全な退縮が観察された（図５）。３５日目における投与中止後、３５日目から３ｍｇ／ｋｇアームの測定が終了した７２日目までに３ｍｇ／ｋｇ処置動物において腫瘍再成長は観察されなかった（図５）。２ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６の投与は、このモデルにおいて約２８日目からの完全な退縮を生じさせた。３５日目における投与中止後に２ｍｇ／ｋｇの用量での約５１日目まで腫瘍再成長はなかった。この用量レベルにおいて中等度の腫瘍再成長が約５１日目から７７日目の研究終了まで観察された。１ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ６１３６での処置は腫瘍静止（部分的な退縮）を生じさせた（図５）。ＢＣＹ６１３６処置は有意な体重損失を生じさせず（図５の挿入図）、研究の全体を通じて薬物処置マウスにおいて有害な臨床的所見はなかった。
【０６２７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房モデル：
０〜４５日目の２および３ｍｇ／ｋｇでの週に１回の投与後にＭＤＡ−ＭＢ２３１モデルにおいて腫瘍静止（部分的な退縮）が観察された（図６）。２ｍｇ／ｋｇ処置動物においてある程度の体重損失（腫瘍負荷に帰せられる）が観察された（図６の挿入図）。
【０６２８】
これらの結果は、ＢＣＹ６１３６は、線維肉腫、乳房および肺ＣＤＸ異種移植片を移植されたマウスにおいて１日１回の投与後に甚大な腫瘍成長阻害を生じさせることを実証する。
【０６２９】
研究５：ラットにおける安全性研究
６匹の雌ラットを２ラット／群の３群に無作為に割り当てて、１および８日目における５、７．５および１０ｍｇ／ｋｇでのＩＶボーラス注射による投与後にＢＣＹ６１３６の毒性を決定した。研究を１５日目に終了した。
【０６３０】
凝固パラメーター（プロトロンビン時間（秒）、活性化部分トロンボプラスチン時間（秒）またはフィブロギノゲン（ｆｉｂｒｏｇｉｎｏｇｅｎ）レベル（ｇ／Ｌ）に対する有意な効果は２、１２および１５日目に観察されなかった（データ示さず）。生存中の出血事象は報告されず、病理学的検査後に内出血の証拠は検出されなかった。
【０６３１】
研究６：カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）における安全性研究
ＢＣＹ６１３６を用いた２８日の毒物学研究をカニクイザルにおいて実行した。ＢＣＹ６１３６を１、８、１５および２２日目に１．０および２．０ｍｇ／ｋｇで投与した。２９日目（最終用量の７日後）に動物を安楽死させ、検死した。
【０６３２】
ベースラインと比べて凝固パラメーターに対する有意な効果は１８、２２および２５（データ示さず）および２９日目（表２０）に観察されなかった。生存中の出血事象は報告されず、病理学的検査後に内出血の証拠は検出されなかった。
【０６３３】
【表１３５】
2021506910.tif 000287
【０６３４】
研究７：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６０３３およびＢＣＹ６１３６およびＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＰＣ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６０３３およびＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０６３５】
（ｂ）実験の設計
【０６３６】
【表１３６】
2021506910.tif 000288
【０６３７】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＦ１２Ｋ培地中でＰＣ−３腫瘍細胞を維持する。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養する。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数する。
【０６３８】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにＰＣ−３（１０＊１０６）腫瘍細胞を接種する。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達した時に処置を開始する。試験品投与および各群中の動物数を以下の実験設計の表に示す。
【０６３９】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０６４０】
【表１３７】
2021506910.tif 000289
【０６４１】
（ｄ）結果
【０６４２】
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図７〜９に示す。
【０６４３】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＰＣ−３異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表２１に示す。
【０６４４】
【表１３８−１】
2021506910.tif 000290
【表１３８−２】
2021506910.tif 000291
【０６４５】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＰＣ−３異種移植モデルにおける試験品の腫瘍成長阻害率を処置の開始後１６日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０６４６】
【表１３９】
2021506910.tif 000292
【０６４７】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＰＣ−３異種移植モデルにおける試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図７〜９ならびに表２１および表２２に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは１６日目に２０７０ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１０７ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０２．２％、ｐ＜０．００１）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝７９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０３．６％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝７０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０４．１％、ｐ＜０．００１）は強力な抗腫瘍効果を示した。
３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６０３３（ＴＶ＝１１６ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０１．８％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝１２４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０１．４％、ｐ＜０．００１）は同等の抗腫瘍効果を示した。
この研究では、動物の体重を定期的にモニターした。全てのマウスは体重を良好に維持した。
【０６４８】
研究８．Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０６４９】
（ｂ）実験の設計
【０６５０】
【表１４０】
2021506910.tif 000293
【０６５１】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＦ−１２Ｋ培地中で腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０６５２】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のために０．２ｍｌのＰＢＳ中のＰＣ−３腫瘍細胞（１０×１０６）を接種した。５２匹の動物を平均腫瘍体積が４５４ｍｍ３に達した時に無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０６５３】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０６５４】
【表１４１】
2021506910.tif 000294
【０６５５】
（ｃ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図１０に示す。
【０６５６】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＰＣ−３異種移植片を有する雄Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表２３に示す。
【０６５７】
【表１４２−１】
2021506910.tif 000295
【表１４２−２】
2021506910.tif 000296
【０６５８】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＰＣ−３異種移植モデルにおける試験品の腫瘍成長阻害率を処置の開始後２０日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０６５９】
【表１４３】
2021506910.tif 000297
【０６６０】
（ｄ）結果の要約および考察
この研究では、ＰＣ−３異種移植モデルにおける試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図１０ならびに表２３および表２４に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２０日目に２３６４ｍｍ３に達した。０．１６７ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１１８８ｍｍ３、ＴＧＩ＝６１．４％、ｐ＜０．００１）、０．５ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｗ（ＴＶ＝５３０ｍｍ３、ＴＧＩ＝９６．０％、ｐ＜０．００１）、０．５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２３４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．４％、ｐ＜０．００１）および１．５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１３１ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１７．２％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は、２０日目に用量または投与頻度依存的な方式で有意な抗腫瘍活性を生じた。１．５ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１２８ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１７．０％、ｐ＜０．００１）は、１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６と同等の抗腫瘍活性を生じた。それらの中で、０．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６、または０．５ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗのＢＣＹ６１３６を用いて処置したマウスは処置の中止後に明らかな腫瘍再発を示し、５２日目からの１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６を用いたさらなる処置は腫瘍退縮に良好に働いた。１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗのＢＣＹ６１３６を用いて処置したマウスもまた処置の中止後に腫瘍再発を示したが、さらなる投与は完全な腫瘍退縮に働かなかった。１．５ｍｐｋ  ｑｗのＢＣＹ６１３６を用いて処置したマウスは４８日目までいかなる腫瘍再発も示さなかった。
０．３３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１６３７ｍｍ３、ＴＧＩ＝３８．１％、ｐ＜０．００１）、１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝９８１ｍｍ３、ＴＧＩ＝７２．２％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１８４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１４．０％、ｐ＜０．００１）でのＥｐｈＡ２−ＡＤＣは、２０日目に用量依存的な方式で有意な抗腫瘍活性を生じた。３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＥｐｈＡ２−ＡＤＣを用いて処置したマウスは５９日目までいかなる腫瘍再発も示さなかった。
１５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのドセタキセル（ＴＶ＝４１９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０１．８％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍活性を生じたが、重篤な動物の体重損失を引き起こした。処置の中止後に、マウスは明らかな腫瘍再発を示した。４２日目からの１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６を用いた処置はこれらのマウスの腫瘍退縮に良好に働いた。
【０６６１】
研究９．Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片の処置におけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植モデルの処置におけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することであった。
【０６６２】
（ｂ）実験の設計
【０６６３】
【表１４４】
2021506910.tif 000298
【０６６４】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０６６５】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のために０．２ｍｌのＰＢＳ中のＮＣＩ−Ｈ１９７５腫瘍細胞（１０×１０＾６）を接種した。３６匹の動物を平均腫瘍体積が１４９ｍｍ３に達した時に無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０６６６】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０６６７】
【表１４５】
2021506910.tif 000299
【０６６８】
（ｉｖ）試料収集
ＰＧ−Ｄ２３において、ＦＦＰＥのために群１の腫瘍を固定した。
ＰＧ−Ｄ４４において、ＦＦＰＥのために群２および群５の腫瘍を固定した。
研究の終了時に、ＦＦＰＥのために群６の腫瘍をした。
【０６６９】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長を図１１〜１３に示す。
【０６７０】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表２５〜２９に示す。
【０６７１】
【表１４６】
2021506910.tif 000300
【０６７２】
【表１４７】
2021506910.tif 000301
【０６７３】
【表１４８】
2021506910.tif 000302
【０６７４】
【表１４９】
2021506910.tif 000303
【０６７５】
【表１５０】
2021506910.tif 000304
【０６７６】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植モデルにおけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２１日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０６７７】
【表１５１】
2021506910.tif 000305
【０６７８】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植モデルにおけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図１１〜１３および表２５〜３０に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２１日目に２３７１ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝３０６ｍｍ３、ＴＧＩ＝９２．９％、ｐ＜０．００１）、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝９５ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０２．５％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０５．４％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６０３３は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。２ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０３３は腫瘍を根絶し、または小さいサイズまで腫瘍を退縮させ、処置を３５日目から中止したところ、腫瘍はその後の５〜６週のモニタリング中に明らかな再成長を示さなかった。
１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２０５ｍｍ３、ＴＧＩ＝９７．５％、ｐ＜０．００１）、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝９９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０２．３％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝９４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０２．４％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を生じた。２ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６は腫瘍を根絶し、または小さいサイズまで腫瘍を退縮させた。処置を３５日目から中止したところ、３ｍｇ／ｋｇ群における腫瘍はその後の５〜６週のモニタリング中に明らかな再成長を示さなかったが、２ｍｇ／ｋｇ群における腫瘍は明らかな再成長を示し、投与を再開した時に有意な腫瘍阻害を示さなかった。
２ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０８２（ＴＶ＝１５２８ｍｍ３、ＴＧＩ＝３７．９％、ｐ＞０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を示さず、５ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０８２（ＴＶ＝３９０ｍｍ３、ＴＧＩ＝８９．１％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍活性を生じた。
この研究では、３ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ６０３３を用いて処置した１匹のマウスはモニタリングの間に１５％より多く体重を損失し、他のマウスは体重を良好に維持した。
【０６７９】
研究１０．Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０６８０】
（ｂ）実験の設計
【０６８１】
【表１５２】
2021506910.tif 000306
【０６８２】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにＬＵ−０１−０２５１の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。有効性試験のために平均腫瘍体積が１７４ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０６８３】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０６８４】
【表１５３】
2021506910.tif 000307
【０６８５】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図１４に示す。
【０６８６】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−０２５１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける処置の開始後２８日目の平均腫瘍体積を表３１に示す。
【０６８７】
【表１５４】
2021506910.tif 000308
【０６８８】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣについての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２８日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０６８９】
【表１５５】
2021506910.tif 000309
【０６９０】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣの治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図１４ならびに表３１および表３２に示す。
この研究では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍体積は処置の開始後２８日目に２２０８ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４９９ｍｍ３、ＴＧＩ＝８４．０％、ｐ＜０．００１）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝３２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０７．０％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．６％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝３９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０６．６％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍活性を示した。
【０６９１】
研究１１：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０６９２】
（ｂ）実験の設計
【０６９３】
【表１５６】
2021506910.tif 000310
【０６９４】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにＬＵ−０１−０２５１の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。有効性試験のために平均腫瘍体積が９６０ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０６９５】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０６９６】
【表１５７】
2021506910.tif 000311
【０６９７】
（ｉｉｉ）試料収集
マウス＃３−２の腫瘍をＦＦＰＥのために９４日目に収集した。マウス＃５−２および５−３の腫瘍を収集し、１４０日目に１つのＦＦＰＥブロックに埋め込んだ。
【０６９８】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図１５に示す。
【０６９９】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−０２５１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける処置の開始後０日目から２８日目の平均腫瘍体積を表３３に示す。
【０７００】
【表１５８】
2021506910.tif 000312
【０７０１】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣについての腫瘍成長阻害率を処置の開始後１７日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０７０２】
【表１５９】
2021506910.tif 000313
【０７０３】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−０２５１  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＡＤＣの治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図１５ならびに表３３および表３４に示す。
この研究では、平均腫瘍体積が９６０ｍｍ３に達した時に処置を開始した。処置の開始後１７日目に、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍体積は２３０１ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１６７２ｍｍ３、ＴＧＩ＝４７．０％、ｐ＞０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を示さず、２ｍｇ／ｋｇ  ｑｗ（ＴＶ＝３９８ｍｍ３、ＴＧＩ＝１４２．１％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗ（ＴＶ＝２１６ｍｍ３、ＴＧＩ＝１５５．６％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は１７日目に用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
２ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＢＣＹ６１３６を用いた７０日の処置後に、これらの５匹のマウスのうちの３匹は完全な腫瘍退縮を示し、他の２匹のマウスは４２日目から７７日目まで明らかな腫瘍再発を示した。次に３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗのＢＣＹ６１３６を用いたさらなる処置を２つの再発腫瘍に７日目から行ったところ、腫瘍の１つは明らかな腫瘍退縮を示し、別の１つは処置への抵抗性を示した。
３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＢＣＹ６１３６を用いた５６日の処置後に、この群の全てのマウスは完全な腫瘍退縮を示した。
３ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝１１４３ｍｍ３、ＴＧＩ＝８６．３％、ｐ＜０．０１）は１７日目に明らかな抗腫瘍活性を示し、さらなる５３日の処置後に、これらのマウスは完全ではないがさらなる腫瘍退縮を示した。
この研究では、一部のマウスは突然の体重損失を示し、これは免疫不全マウスの長期飼養と関係性を有し得る。
【０７０４】
研究１２：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６０８２およびＢＣＹ６０３１のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける大きいＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸ腫瘍においてＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６０８２およびＢＣＹ６０３１のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０７０５】
（ｂ）実験の設計
【０７０６】
【表１６０】
2021506910.tif 000314
【０７０７】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにＬＵ−０１−００４６の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。平均腫瘍体積がＢＴ１７ＢＤＣ研究について９５５ｍｍ３、ＢＣＹ研究について１０３９ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０７０８】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０７０９】
【表１６１】
2021506910.tif 000315
【０７１０】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図１６に示す。
【０７１１】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表３５に示す。
【０７１２】
【表１６２】
2021506910.tif 000316
【０７１３】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおける試験品の腫瘍成長阻害率を２セクション研究のそれぞれについて処置の開始後それぞれ２２日目および２８日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０７１４】
【表１６３】
2021506910.tif 000317
【０７１５】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、大きいＬＵ−０１−００４６腫瘍における試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図１６ならびに表３５および表３６に示す。
ＢＣＹ研究において、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２２日目に６１８６ｍｍ３と算出された。１ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６および３ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣは、１０００ｍｍ３の腫瘍サイズから処置を開始した場合に明らかな抗腫瘍活性を示さなかった。
３ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０８２（ＴＶ＝１９９９ｍｍ３、ＴＧＩ＝８１．２％、ｐ＜０．０１）、ＢＣＹ６０３３（ＴＶ＝８８ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１８．６％、ｐ＜０．００１）、ＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝２３３ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１５．６％、ｐ＜０．００１）およびＢＣＹ６０３１（ＴＶ＝１１５ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１０．２％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍抗腫瘍活性を生じた。それらの中で、ＢＣＹ６０３３およびＢＣＹ６１３６は２／５および４／５の腫瘍を完全に根絶した。
【０７１６】
研究１３：ＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルを有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルを有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいてＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果を評価することであった。
【０７１７】
（ｂ）実験の設計
【０７１８】
【表１６４】
2021506910.tif 000318
【０７１９】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにある特定の種類の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。平均腫瘍体積が約１９８ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０７２０】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０７２１】
【表１６５】
2021506910.tif 000319
【０７２２】
（ｉｉｉ）試料収集
群は、平均腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えた時に終了させ、群１はＰＧ−Ｄ１４、群５はＰＧ−Ｄ１８、群２＆６はＰＧ−Ｄ２１、群３＆４はＰＧ−Ｄ３１において最後の測定の後に腫瘍をＦＦＰＥのために回収した。
【０７２３】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図１７に示す。
【０７２４】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルを有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表３７に示す。
【０７２５】
【表１６６】
2021506910.tif 000320
【０７２６】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルを有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける試験品の腫瘍成長阻害率をＰＧ−Ｄ１４において測定された腫瘍体積に基づいて算出した。
【０７２７】
【表１６７】
2021506910.tif 000321
【０７２８】
（ｅ）結果の要約および考察
本研究では、ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおける試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図１７ならびに表３７および表３８に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズはＰＧ−Ｄ１４において２３０７ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１０５８ｍｍ３、ＴＧＩ＝５９．１％、ｐ＜０．０５）、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２６４ｍｍ３、ＴＧＩ＝９７．０％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２６ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．３％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。３ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣは明らかな抗腫瘍活性を示さなかった（ｐ＞０．０５）。
この研究では、全ての群の動物は体重を良好に維持した。
【０７２９】
研究１４：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ６０８２、ＢＣＹ６１７３、ＢＣＹ６１７５およびＢＣＹ６０３１のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−００４６  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおいて試験品のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０７３０】
（ｂ）実験の設計
【０７３１】
【表１６８】
2021506910.tif 000322
【０７３２】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにＬＵ−０１−００４６の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。平均腫瘍体積がパート１の研究について２００ｍｍ３、パート２の研究について１９２ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０７３３】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０７３４】
【表１６９】
2021506910.tif 000323
【０７３５】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図１８〜２２に示す。
【０７３６】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−００４６を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける処置の開始後２１日目の平均腫瘍体積を表３９および表４０に示す。
【０７３７】
【表１７０】
2021506910.tif 000324
【０７３８】
【表１７１】
2021506910.tif 000325
【０７３９】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおける試験品の腫瘍成長阻害率を処置の開始後２１日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０７４０】
【表１７２】
2021506910.tif 000326
【０７４１】
【表１７３】
2021506910.tif 000327
【０７４２】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−００４６  ＰＤＸモデルにおける試験品の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図１８〜２２および表３９〜４２に示す。
パート１の研究では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは処置の開始後２１日目に２５５１ｍｍ３に達した。
１／２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６０３３（ＴＶ＝１２８５ｍｍ３、ＴＧＩ＝５３．９％、ｐ＜０．００１）および１／２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１２８５ｍｍ３、ＴＧＩ＝５３．９％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍活性を生じたが、いかなる腫瘍退縮も呈しなかった。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６０３３（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．６％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．５％、ｐ＜０．００１）は腫瘍を完全に根絶し、ＢＣＹ６０３３およびＢＣＹ６１３６  ３ｍｇ／ｋｇ群におけるそれぞれ５個の腫瘍のうちの１つは投与停止後に再成長を示し、投与を再開した時に腫瘍はＢＣＹ６０３３またはＢＩＣＹ６１３６処置に抵抗性であった。ＢＣＹ６０３３およびＢＣＹ６１３６群における残存腫瘍（各群について４／５）は、投与停止の８０日後に再成長を示さなかった。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１８２６ｍｍ３、ＴＧＩ＝３０．８％、ｐ＜０．０５）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１０４２ｍｍ３、ＴＧＩ＝６４．２％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６０８２は用量依存的な抗腫瘍活性を生じたが、腫瘍退縮を示さなかった。
パート２の研究では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは処置の開始後２１日目に２３４２ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１７３（ＴＶ＝２１５１ｍｍ３、ＴＧＩ＝８．９％，ｐ＞０．０５）は抗腫瘍抗腫瘍活性を示さなかった。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１７３（ＴＶ＝８９０ｍｍ３、ＴＧＩ＝６７．５％、ｐ＜０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を生じた。
３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１７５（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．９％、ｐ＜０．００１）は１４日目に４／５の腫瘍を完全に根絶した。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６０３１（ＴＶ＝８７４ｍｍ３、ＴＧＩ＝６８．２％、ｐ＜０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を生じたが、いかなる腫瘍退縮も示さなかった。
【０７４３】
研究１５：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０４１２  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
プロジェクトの目的は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０４１２  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果を評価することである。
【０７４４】
（ｂ）実験の設計
【０７４５】
【表１７４】
2021506910.tif 000328
【０７４６】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにＬＵ−０１−０４１２腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。平均腫瘍体積が１５９ｍｍ３に達した時に動物を無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０７４７】
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０７４８】
【表１７５】
2021506910.tif 000329
【０７４９】
（ｉｉｉ）試料収集
ビヒクルならびにＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１を用いて処置した３匹の追加のマウスからの血漿を投与後３０分および２４時間に収集した。ビヒクルならびにＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１を用いて処置した３匹の追加のマウスからの腫瘍を投与後２４時間に収集した。
【０７５０】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図２３に示す。
【０７５１】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−０４１２異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表４３に示す。
【０７５２】
【表１７６】
2021506910.tif 000330
【０７５３】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−０４１２異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後３２日目の腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０７５４】
【表１７７】
2021506910.tif 000331
【０７５５】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−０４１２異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６、ＢＣＹ８２４５およびＢＣＹ８７８１の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図２３ならびに表４３および表４４に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍体積は処置の開始後３２日目に１１０４ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×４（ＴＶ＝７５８ｍｍ３、ＴＧＩ＝３６．７％、ｐ＜０．０５）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×４（ＴＶ＝４１６ｍｍ３、ＴＧＩ＝７２．９％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な抗腫瘍活性を生じたが、いかなる腫瘍退縮も示さなかった。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×４でのＢＣＹ８２４５（ＴＶ＝１ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１６．８％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×４でのＢＣＹ８７８１（ＴＶ＝１２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１５．６％、ｐ＜０．００１）は腫瘍を明らかに退縮させた。それらの中で、３ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ８２４５を用いて処置された６つの腫瘍の内の５つおよび３ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ８７８１を用いて処置された６つの腫瘍の内の２つは３２日目に完全に根絶された。
この研究では、全ての群の動物は体重を良好に維持した。
【０７５６】
研究１６：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０４８６  ＰＤＸモデルの処置におけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＬＵ−０１−０４８６  ＰＤＸモデルにおいてＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０７５７】
（ｂ）実験の設計
【０７５８】
【表１７８】
2021506910.tif 000332
【０７５９】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにＬＵ−０１−０４８６の腫瘍断片（約３０ｍｍ３）を接種した。有効性試験のために平均腫瘍体積が１８０ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
（ｉｉ）試験品配合物の調製
【０７６０】
【表１７９】
2021506910.tif 000333
【０７６１】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図２４に示す。
【０７６２】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＬＵ−０１−０４８６異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける処置の開始後１４日目の平均腫瘍体積を表４５に示す。
【０７６３】
【表１８０】
2021506910.tif 000334
【０７６４】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＬＵ−０１−０４８６  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後１４日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０７６５】
【表１８１】
2021506910.tif 000335
【０７６６】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＬＵ−０１−０４８６  ＰＤＸモデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図２４ならびに表４５および表４６に示す。
この研究では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍体積は処置の開始後１４日目に６５１ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝６３８ｍｍ３、ＴＧＩ＝３．０％、ｐ＞０．０５）および２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝６４５ｍｍ３、ＴＧＩ＝１．２％、ｐ＞０．０５）でのＢＣＹ６１３６はいかなる抗腫瘍活性も示さなかった。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝４４９ｍｍ３、ＴＧＩ＝４３．１％、ｐ＞０．０５）は統計的有意性を伴わずにわずかな抗腫瘍活性を生じた。
【０７６７】
研究１７：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植片の処置におけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
【０７６８】
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植モデルの処置においてＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することであった。
【０７６９】
（ｂ）実験の設計
【０７７０】
【表１８２】
2021506910.tif 000336
【０７７１】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０７７２】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のために０．１ｍｌのマトリゲルと共に０．１ｍｌのＰＢＳ中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍細胞（１０×１０＾６）を接種した。３６匹の動物を平均腫瘍体積が１５９ｍｍ３に達した時に無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０７７３】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０７７４】
【表１８３】
2021506910.tif 000337
【０７７５】
（ｉｖ）試料収集
ＰＧ−Ｄ２４において、群１、８および９の腫瘍を収集し、それをＦＦＰＥのために固定した。
ＰＧ−Ｄ３３において、群２および５の腫瘍を収集し、それをＦＦＰＥのために固定した。
研究の終了時に、群３、４、６および７の腫瘍を収集し、それをＦＦＰＥのために固定した。
【０７７６】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長を図２５〜２７に示す。
【０７７７】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表４７〜４９に示す。
【０７７８】
【表１８４】
2021506910.tif 000338
【０７７９】
【表１８５】
2021506910.tif 000339
【０７８０】
【表１８６】
2021506910.tif 000340
【０７８１】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植モデルにおけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２１日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０７８２】
【表１８７】
2021506910.tif 000341
【０７８３】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ異種移植モデルにおけるＢＣＹ６０３３、ＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図２５〜２７および表４７〜５０に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２１日目に１６６１ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝８８０ｍｍ３、ＴＧＩ＝５２．０％、ｐ＜０．００１）、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝６７ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０６．１％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０９．１％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６０３３は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。２ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０３３は腫瘍を強力に退縮させたが、腫瘍は２１日目から明らかな再成長を示した。
１ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝９９４ｍｍ３、ＴＧＩ＝４４．４％、ｐ＜０．０１）は中等度の抗腫瘍活性を示し、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝３３ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．４％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１３２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０１．１％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を生じたが、腫瘍は２８日目から明らかな再成長を示した。
２ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０８２（ＴＶ＝１２８７ｍｍ３、ＴＧＩ＝２４．９％、ｐ＞０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を示さず、５ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０８２（ＴＶ＝２１８ｍｍ３、ＴＧＩ＝９６．１％、ｐ＜０．００１）は有意な抗腫瘍活性を生じた。
この研究では、２ｍｇ／ｋｇのＢＣＹ６１３６を用いて処置した１匹のマウスは処置スケジュールの間に１５％を超える体重を損失したが、他のマウスは体重を良好に維持した。
【０７８４】
研究１８：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＭＴ−６同系モデルの処置におけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＭＴ−６同系モデルの処置においてＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することであった。
【０７８５】
（ｂ）実験の設計
【０７８６】
【表１８８】
2021506910.tif 000342
【０７８７】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＥＭＥＭ培地中の単層培養物としてＥＭＴ−６腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持した。腫瘍細胞を週に２回トリプシン−ＥＤＴＡ処理により通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０７８８】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のために０．１ｍｌのＰＢＳ中のＥＭＴ−６腫瘍細胞（５×１０６）を接種した。４４匹の動物を平均腫瘍体積が７５ｍｍ３に達した時に無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０７８９】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０７９０】
【表１８９】
2021506910.tif 000343
【０７９１】
（ｉｖ）試料収集
１１日目に予備のマウスから３つの腫瘍をＦＡＣＳのために収集した。データは生物学チームにより供給された。
【０７９２】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図２８に示す。
【０７９３】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＥＭＴ−６同系移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５１に示す。
【０７９４】
【表１９０】
2021506910.tif 000344
【０７９５】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＥＭＴ−６同系モデルにおけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２１日目の腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０７９６】
【表１９１】
2021506910.tif 000345
【０７９７】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＥＭＴ−６同系モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図２８ならびに表５１および表５２に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２１日目に１４９９ｍｍ３に達した。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝５６１ｍｍ３、ＴＧＩ＝６６．２％、ｐ＜０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を示した。１／５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１２７２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１６．１％、ｐ＞０．０５）および０．３／３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１３９４ｍｍ３、ＴＧＩ＝７．４％、ｐ＞０．０５）はいかなる抗腫瘍活性も示さなかった。
群３および群４の投与量を１４日目から５ｍｐｋおよび３ｍｐｋに変更した。腫瘍性潰瘍形成が１４日目にマウス３〜５において見出され、抗生物質クリームを用いてマウスを処置した。この研究では、全てのマウスは体重を良好に維持した。
【０７９８】
研究１９：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０７９９】
（ｂ）実験の設計
【０８００】
【表１９２】
2021506910.tif 000346
【０８０１】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中でＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０８０２】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のために０．２ｍｌのＰＢＳ中でマトリゲル（１：１）と共にＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍細胞（１０×１０６）を接種した。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１７６ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０８０３】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０８０４】
【表１９３】
2021506910.tif 000347
【０８０５】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図２９に示す。
【０８０６】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５３に示す。
【０８０７】
【表１９４】
2021506910.tif 000348
【０８０８】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片におけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後３０日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０８０９】
【表１９５】
2021506910.tif 000349
【０８１０】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＮＣＩ−Ｎ８７モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図２９ならびに表５３および表５４に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは３０日目に１４６５ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４２５ｍｍ３、ＴＧＩ＝８０．７％、ｐ＜０．００１）および２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２１０ｍｍ３、ＴＧＩ＝９７．４％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な方式で有意な抗腫瘍活性を生じ、３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝２０１ｍｍ３、ＴＧＩ＝９８．１％、ｐ＜０．００１）は２ｍｐｋでのＢＣＹ６１３６と同等の抗腫瘍活性を示した。
この研究では、処置スケジュールの間に全ての群において明らかな体重損失は見出されなかった。
【０８１１】
研究２０：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＳＫ−ＯＶ−３異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
【０８１２】
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＳＫ−ＯＶ−３異種移植片の処置においてＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０８１３】
（ｂ）実験の設計
【０８１４】
【表１９６】
2021506910.tif 000350
【０８１５】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＭｃＣｏｙ  ５ａ培地中にＳＫ−ＯＶ−３腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０８１６】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のために０．２ｍｌのＰＢＳ中でマトリゲル（１：１）と共にＳＫ−ＯＶ−３腫瘍細胞（１０×１０６）を接種した。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１８６ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０８１７】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０８１８】
【表１９７】
2021506910.tif 000351
【０８１９】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図３０に示す。
【０８２０】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＳＫ−ＯＶ−３異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５５に示す。
【０８２１】
【表１９８】
2021506910.tif 000352
【０８２２】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＳＫ−ＯＶ−３異種移植片におけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２８日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０８２３】
【表１９９】
2021506910.tif 000353
【０８２４】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＳＫ−ＯＶ−３モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図３０ならびに表５５および表５６に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２８日目に１５６０ｍｍ３に達した。３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝６８４ｍｍ３、ＴＧＩ＝６３．８％、ｐ＜０．０１）は中等度の抗腫瘍有効性を示した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１０３５ｍｍ３、ＴＧＩ＝３８．１％、ｐ＞０．０５）は明らかな抗腫瘍活性を示さなかった。２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２７７ｍｍ３、ＴＧＩ＝９３．３％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２５４ｍｍ３、ＴＧＩ＝９５．０％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は有意な抗腫瘍活性を生じた。
この研究では、処置スケジュールの間に全ての群において明らかな体重損失は見出されなかった。
【０８２５】
研究２１：Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＯＥ２１異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＯＥ２１異種移植片の処置においてＢＣＹ６１３６のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０８２６】
（ｂ）実験の設計
【０８２７】
【表２００】
2021506910.tif 000354
【０８２８】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中にＯＥ２１腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０８２９】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のために０．２ｍｌのＰＢＳ中でマトリゲル（１：１）と共にＯＥ２１腫瘍細胞（５×１０６）を接種した。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１５７ｍｍ３に達した時に処置を開始した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示す。
【０８３０】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０８３１】
【表２０１】
2021506910.tif 000355
【０８３２】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図３１に示す。
【０８３３】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＯＥ２１異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５７に示す。
【０８３４】
【表２０２】
2021506910.tif 000356
【０８３５】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＯＥ２１異種移植片におけるＢＣＹ６１３６についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後２３日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０８３６】
【表２０３】
2021506910.tif 000357
【０８３７】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＯＥ２１モデルにおけるＢＣＹ６１３６の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図３１ならびに表５７および表５８に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは２３日目に１５８６ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６１３６（ＴＶ＝１１５５ｍｍ３、ＴＧＩ＝３０．４％  ｐ＜０．０５）はわずかな抗腫瘍活性を示した。２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝５３７ｍｍ３、ＴＧＩ＝７３．４％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４８９ｍｍ３、ＴＧＩ＝７６．７％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は有意な抗腫瘍活性を生じた。
この研究では、処置スケジュールの間に全ての群において明らかな体重損失は見出されなかった。
【０８３８】
研究２２：ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＬＰ−８異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＬＰ−８異種移植片の処置におけるＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することである。
【０８３９】
（ｂ）実験の設計
【０８４０】
【表２０４】
2021506910.tif 000358
【０８４１】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において２０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＲＭＰＩ−１６４０中の単層培養物としてＭＯＬＰ−８腫瘍細胞を維持した。腫瘍細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により通常通りに継代培養した。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数した。
【０８４２】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のために５０％のマトリゲルと共に０．２ｍｌのＰＢＳ中のＭＯＬＰ−８腫瘍細胞（１０×１０６）を接種した。３６匹の動物を平均腫瘍体積が１４１ｍｍ３に達した時に無作為化した。試験品投与および各群中の動物数を実験設計の表に示した。
【０８４３】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０８４４】
【表２０５】
2021506910.tif 000359
【０８４５】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図３２および図３３に示す。
【０８４６】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＭＯＬＰ−８異種移植片を有する雌ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表５９に示す。
【０８４７】
【表２０６】
2021506910.tif 000360
【０８４８】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＭＯＬＰ−８異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２についての腫瘍成長阻害率を処置の開始後１４日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０８４９】
【表２０７】
2021506910.tif 000361
【０８５０】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＭＯＬＰ−８異種移植モデルにおけるＢＣＹ６１３６およびＢＣＹ６０８２の治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図３２および図３３ならびに表５９および表６０に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは１４日目に２５２８ｍｍ３に達した。１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１１４６ｍｍ３、ＴＧＩ＝４５．５％、ｐ＞０．０５）、２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１２１８ｍｍ３、ＴＧＩ＝５４．９％、ｐ＜０．０５）および３ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝９３８ｍｍ３、ＴＧＩ＝６６．７％、ｐ＜０．０１）でのＢＣＹ６１３６は用量依存的な抗腫瘍活性を生じたが、全ての投与量はＭＯＬＰ−８異種移植片において腫瘍を退縮させなかった。
１ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝２２９６ｍｍ３、ＴＧＩ＝９．８％、ｐ＞０．０５）および２ｍｇ／ｋｇ（ＴＶ＝１５５４ｍｍ３、ＴＧＩ＝４０．８％、ｐ＞０．０５）でのＢＣＹ６０８２は明らかな抗腫瘍活性を示さなかった。３ｍｇ／ｋｇでのＢＣＹ６０８２は腫瘍成長を有意に阻害したが（ＴＶ＝１３２１ｍｍ３、ＴＧＩ＝５０．６％、ｐ＜０．０５）、ＭＯＬＰ−８異種移植片において腫瘍を退縮させなかった。
この研究では、全てのマウスは体重を良好に維持した。
【０８５１】
研究２３：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＨＴ１０８０異種移植片の処置におけるＢＣＹのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
（ａ）研究目的
研究の目的は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＨＴ１０８０異種移植モデルの処置においてＢＣＹのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を評価することであった。
【０８５２】
（ｂ）実験の設計
【０８５３】
【表２０８】
2021506910.tif 000362
【０８５４】
（ｃ）実験の方法および手順
（ｉ）細胞培養
３７℃の空気中の５％のＣＯ２の雰囲気において１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を添加した培地中でＨＴ１０８０腫瘍細胞を維持する。腫瘍細胞を週に２回通常通りに継代培養する。指数増殖期の増殖する細胞を回収し、腫瘍接種のために計数する。
【０８５５】
（ｉｉ）腫瘍接種
各マウスの右脇腹の皮下に腫瘍発生のためにＨＴ１０８０腫瘍細胞（５×１０６）を接種する。動物を無作為化し、平均腫瘍体積が約１５０〜２００ｍｍ３に達した時に処置を開始する。試験品投与および各群中の動物数を以下の実験設計の表に示す。
【０８５６】
（ｉｉｉ）試験品配合物の調製
【０８５７】
【表２０９−１】
2021506910.tif 000363
【表２０９−２】
2021506910.tif 000364
【０８５８】
（ｄ）結果
（ｉ）体重変化および腫瘍成長曲線
体重および腫瘍成長曲線を図３４〜４２に示す。
【０８５９】
（ｉｉ）腫瘍体積の追跡
ＨＴ１０８０異種移植片を有する雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおける経時的な平均腫瘍体積を表６１に示す。
【０８６０】
【表２１０−１】
2021506910.tif 000365
【表２１０−２】
2021506910.tif 000366
【０８６１】
（ｉｉｉ）腫瘍成長阻害解析
ＨＴ１０８０異種移植モデルにおけるＢＣＹについての腫瘍成長阻害率を処置の開始後１４日目における腫瘍体積測定値に基づいて算出した。
【０８６２】
【表２１１】
2021506910.tif 000367
【０８６３】
（ｅ）結果の要約および考察
この研究では、ＨＴ１０８０異種移植モデルにおけるＢＣＹの治療効果を評価した。様々な時点における全ての処置群の測定された体重および腫瘍体積を図３４〜４２ならびに表６１および表６２に示す。
ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは１４日目に１７３７ｍｍ３に達した。
２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＢＣＹ６０８２（ＴＶ＝５ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．１％、ｐ＜０．０１）および２ｍｇ／ｋｇ  ｑｗでのＢＣＹ６０３１（ＴＶ＝７ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０６．８％、ｐ＜０．０１）は強力な抗腫瘍活性を示した。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１０７４ｍｍ３、ＴＧＩ＝４２．５％、ｐ＞０．０５）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４８０ｍｍ３、ＴＧＩ＝８０．６％、ｐ＜０．０５）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝７ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．４％、ｐ＜０．０１）でのＢＣＹ６１７３は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝８７１ｍｍ３、ＴＧＩ＝５５．５％、ｐ＜０．０１）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝６２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０７．５％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝４４ｍｍ３、ＴＧＩ＝１０８．６％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３５は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝９ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１０．８％、ｐ＜０．００１）および５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．４％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６０３３は強力な抗腫瘍活性を示し、５ｍｇ／ｋｇにおいて１４日目までに腫瘍を完全に根絶した。
２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝３４５ｍｍ３、ＴＧＩ＝９５．７％、ｐ＜０．００１）、３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝３ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．２％、ｐ＜０．００１）および５ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．３％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１３６は強力な抗腫瘍活性を示した。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１０６６ｍｍ３、ＴＧＩ＝４３．１％、ｐ＜０．０５）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝５３２ｍｍ３、ＴＧＩ＝７７．３％、ｐ＜０．０１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１１ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１０．７％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１７４は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝７６９ｍｍ３、ＴＧＩ＝６２．１％、ｐ＜０．０１）、２ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝２９５ｍｍ３、ＴＧＩ＝９２．５％、ｐ＜０．００１）および３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ（ＴＶ＝１１ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１０．８％、ｐ＜０．００１）でのＢＣＹ６１７５は用量依存的な抗腫瘍活性を生じた。
３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗでのＡＤＣ（ＴＶ＝０ｍｍ３、ＴＧＩ＝１１１．５％）は１４日目までに腫瘍を完全に根絶した。
【０８６４】
研究２４：複数の腫瘍の種類からのＥｐｈＡ２についてのコピー数多型（ＣＮＶ）と遺伝子発現との関連性の研究
１．ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／）において全ての研究を選択し、ＥＰＨＡ２について検索する。
（ａ）暫定的な研究を除去する。
（ｂ）重なり合う試料を用いた研究を選択しないようにして試料バイアスを防止する（ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌにおける警告に基づく）。このオプションの場合、ＰａｎＣａｎｃｅｒの研究を常に残す。
（ｃ）解析のために選択した研究（表６３）。
【０８６５】
【表２１２−１】
2021506910.tif 000368
【表２１２−２】
2021506910.tif 000369
【表２１２−３】
2021506910.tif 000370
【０８６６】
２．ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌからのＣＮＶおよびＲＮＡ発現データをエクスポートする。
３．ＣＮＶがＥｐｈＡ２についてのｍＲＮＡ発現の変化と統計的に有意に関連付けられるかどうかを試験する（ｌｏｇ２は適用しない）。
（ａ）ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（７．０４）およびＲ／Ｒ  ｓｔｕｄｉｏにおいてノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定を実行する（有意性の閾値：ｐ＜０．０１）。
（ｉ）ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ：カラムテーブルを設定し、マッチングおよびペアリングのいずれもなしでノンパラメトリック検定を実行し、ガウス分布は仮定しない。
（ｉｉ）Ｒにおいて使用されるパッケージ：
１．ＸＬＣｏｎｎｅｃｔ
２．ｄｐｌｙｒ
３．Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｔｅｓｔ：  Ｋｒｕｓｋａｌ．ｔｅｓｔ。
４．Ｄｕｎｎ検定を使用してＲ／Ｒｓｔｕｄｉｏにおいて多重比較（群内でｎ＝１であったとしても全ての可能な比較を含む）のために調整する（有意性のための閾値：ｐ＜０．０２５）。
（ａ）多重比較方法＝「ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ」を用いるｄｕｎｎ．ｔｅｓｔ。
【０８６７】
結果
結果を以下の表６４に示す。ＥｐｈＡ２についてコピー数多型（ＣＮＶ）およびｍＲＮＡ遺伝子発現の両方を報告するｃＢｉｏＰｏｒｔａｌにおいて編纂された４１の公開されているデータセットにわたり、ＥｐｈＡ２浅欠失（ｓｈａｌｌｏｗ−ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（＜２コピー）を有する症例が報告されている多数のがん種がある。より頻度が低いが、これらの同じがん種において腫瘍のサブセットはＥｐｈＡ２深欠失（ｄｅｅｐ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（＞１コピーの喪失もしくは両アレルの喪失）、ＥｐｈＡ２増加（２〜３コピー）またはＥｐｈＡ２増幅（＞３コピー）を宿した。＞３３％の腫瘍がＥｐｈＡ２において浅欠失または深欠失のいずれかを有した適応症は、色素嫌性腎臓、胆管癌、褐色細胞腫および傍神経節腫、肺扁平がん、乳房、直腸、脳の低グレード神経膠腫、肝臓、副腎皮質癌、中皮腫、食道腺癌および結腸がんを含んだ。対照的に、＞３３％の試料がＥｐｈＡ２において増加または増幅のいずれかを有した研究はなかった。合わせると、これらの結果は、ＥｐｈＡ２  ＤＮＡにおける欠失は様々な適応症にわたり見出されることを実証する。
【０８６８】
４１の研究において解析した全ての試料の約３分の１はＥｐｈＡ２  ＣＮＶを宿した。研究にわたるこの高いパーセンテージのＣＮＶ、および特定の腫瘍種内の浅欠失の高いパーセンテージに基づいて、統計的検定を行って、コピー数変化とＲＮＡ発現とのあり得る関連性を同定した。適応症当たりの腫瘍を５つのクラスのうちの１つに割り当てた：
ａ）深欠失、
ｂ）浅欠失、
ｃ）二倍体、
ｄ）増加、
ｅ）増幅。
【０８６９】
クラスカル−ウォリス検定を次に行って、クラス当たりのｍＲＮＡ発現値の分布がクラス間で異なるかどうかを検出した（Ｐ＜０．０１）。Ｐ＜０．０１のＴＣＧＡデータセットのためおよびいずれのクラスが互いに異なるかを同定するために、算出された調整Ｐ値（ボンフェローニ）を用いてＺ統計量を算出することにより事後検定を行った。解釈の簡便性のために、適応症当たりの二倍体に対するペアワイズ比較を検討した（但し、全てのペアワイズＰ値を算出した）。これらの４１の研究のうちの１９は、＜０．０１のクラスカル−ウォリスのｐ値を有し、コピー数はＲＮＡ発現と統計的に有意に関連付けられることを実証した。これらの１９の研究のうちの１７は、二倍体対浅欠失について＜０．０２５のボンフェローニ調整Ｐを有し、ＥｐｈＡ２コピー数の減少とのＥｐｈＡ２  ｍＲＮＡ発現の減少の関連性を指し示した。これらの１９の研究のうちの２つのみが、二倍体対増加について＜０．０２５のボンフェローニ調整Ｐを有し、これらは共に乳がん研究であった。さらには、これらの乳がん研究のうちの１つ（Ｂｒｅａｓｔ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＴＣＧＡ、ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ａｔｌａｓ））は、二倍体対浅欠失および二倍体対増加の両方について＜０．０２５のボンフェローニ調整Ｐを有し、コピー数変化は乳がんにおけるＥｐｈＡ２  ＲＮＡ発現に強い影響力を有し得ることを示唆した。
【０８７０】
遺伝学のセントラルドグマは、ＥｐｈＡ２のコピー数の低減はＲＮＡおよびタンパク質発現の低減に繋がることを示唆する。したがって、様々な腫瘍種におけるＥｐｈＡ２のコピー数喪失とｍＲＮＡ発現の低減との観察された関連性は、ＥｐｈＡ２タンパク質発現もまた低減し得ることを示唆する。同様に、ｍＲＮＡ発現の増加と関連付けられた乳がんにおけるＥｐｈＡ２のコピー数増加はまた、ＥｐｈＡ２タンパク質発現の増加を示唆し得る。さらに、より高いＥｐｈＡ２タンパク質発現（ＦＡＣＳにより測定される）は、前臨床ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける本発明のある特定のＥｐｈＡ２二環薬物コンジュゲートの有効性（腫瘍体積により測定される）の増加と関連付けられる。合わせると、ｍＲＮＡ発現変化と関連付けられるコピー数変化がタンパク質発現レベルを予測する場合、ＥｐｈＡ２のコピー数欠失を含有する腫瘍を有する患者は本発明のＥｐｈＡ２二環薬物コンジュゲートに応答する可能性がより低い可能性がある。同様に、ＥｐｈＡ２において腫瘍コピー数増加を有する（例えば、乳がん）患者は、本発明のＥｐｈＡ２二環薬物コンジュゲートに応答する可能性がより高い可能性がある。したがって、患者をＥｐｈＡ２コピー数状態により層化した場合、この情報は、有効性を増加させるために、本発明のＥｐｈＡ２二環薬物コンジュゲートを用いる治療のための患者の除外および選択の両方のために使用され得る。
【０８７１】
【表２１３−１】
2021506910.tif 000371
【表２１３−２】
2021506910.tif 000372
【表２１３−３】
2021506910.tif 000373
【表２１３−４】
2021506910.tif 000374
【表２１３−５】
2021506910.tif 000375
【表２１３−６】
2021506910.tif 000376
【表２１３−７】
2021506910.tif 000377
【表２１３−８】
2021506910.tif 000378
【表２１３−９】
2021506910.tif 000379
【表２１３−１０】
2021506910.tif 000380
【表２１３−１１】
2021506910.tif 000381
【表２１３−１２】
2021506910.tif 000382
【表２１３−１３】
2021506910.tif 000383
【表２１３−１４】
2021506910.tif 000384
【表２１３−１５】
2021506910.tif 000385
【図１】
2021506910.tif 000386
【図２】
2021506910.tif 000387
【図３】
2021506910.tif 000388
【図４】
2021506910.tif 000389
【図５】
2021506910.tif 000390
【図６】
2021506910.tif 000391
【図７】
2021506910.tif 000392
【図８】
2021506910.tif 000393
【図９】
2021506910.tif 000394
【図１０】
2021506910.tif 000395
【図１１】
2021506910.tif 000396
【図１２】
2021506910.tif 000397
【図１３】
2021506910.tif 000398
【図１４】
2021506910.tif 000399
【図１５】
2021506910.tif 000400
【図１６】
2021506910.tif 000401
【図１７】
2021506910.tif 000402
【図１８】
2021506910.tif 000403
【図１９】
2021506910.tif 000404
【図２０】
2021506910.tif 000405
【図２１】
2021506910.tif 000406
【図２２】
2021506910.tif 000407
【図２３】
2021506910.tif 000408
【図２４】
2021506910.tif 000409
【図２５】
2021506910.tif 000410
【図２６】
2021506910.tif 000411
【図２７】
2021506910.tif 000412
【図２８】
2021506910.tif 000413
【図２９】
2021506910.tif 000414
【図３０】
2021506910.tif 000415
【図３１】
2021506910.tif 000416
【図３２】
2021506910.tif 000417
【図３３】
2021506910.tif 000418
【図３４】
2021506910.tif 000419
【図３５】
2021506910.tif 000420
【図３６】
2021506910.tif 000421
【図３７】
2021506910.tif 000422
【図３８】
2021506910.tif 000423
【図３９】
2021506910.tif 000424
【図４０】
2021506910.tif 000425
【図４１】
2021506910.tif 000426
【図４２】
2021506910.tif 000427
【配列表】
2021506910000001.app
【国際調査報告】
2021506910.tif 000428
2021506910.tif 000429
2021506910.tif 000430