(57)【要約】本開示は、センス鎖がヌクレオチド配列１を含み、アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、ヌクレオチド配列１と２の長さがいずれも１９ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチド及びヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがいずれもフルオロ修飾ヌクレオチドであり、他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つである、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。本開示は、当該オリゴヌクレオチドを含む薬物組成物、複合体及びその薬物の調製における使用をさらに提供する。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドがいずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖がヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２の長さがいずれも１９ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２が、第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で逆相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列断片が、標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列断片であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列２の５’末端の１番目のヌクレオチドがアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つである、二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ヌクレオチド配列２は、第１のヌクレオチド配列断片と基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の少なくとも第２〜１９位のヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列断片と相補的である、請求項２に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の第１位のヌクレオチドは、Ａ又はＵである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、ヌクレオチド配列３とヌクレオチド配列４の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４の長さがそれぞれ１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列４と同じヌクレオチド配列を指し、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列５の長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、又は第３のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、前記第３の配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて第１のヌクレオチド配列断片又は第２のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列５に等しいヌクレオチド配列を指す、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドから選択される１種であり、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたヌクレオチドを指す、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも１個は、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項１２に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１２１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項１２又は１３に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド：
【化１】
2021504415.tif 000126
【請求項１５】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、チオリン酸エステルは、
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項１３又は１４に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドは、５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（１２２）〜式（１２６）の１つに示されるヌクレオチドである、請求項１６に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド：
【化２】
2021504415.tif 000127
ただし、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ及びメトキシ基からなる群から選択される基を表し、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す。
【請求項１８】
ｓａＲＮＡである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
ｓｉＲＮＡである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記標的ｍＲＮＡは、遺伝子のＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶが対応するｍＲＮＡから選択される１つである、請求項１９に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記標的ｍＲＮＡは、Ｂ型肝炎ウイルスのｍＲＮＡ、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子により発現されたｍＲＮＡ、又はアポリポタンパクＣ３遺伝子により発現されたｍＲＮＡから選択される、請求項１９に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号２に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号３に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号４に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号５に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号６に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号７に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号８に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号９に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１０に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１１に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１２に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１３に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１４に示される配列である、請求項２１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド：
５’−ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ−３’（配列番号１）
５’−ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍ−３’（配列番号２）
５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号３）
５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍ−３’（配列番号４）
５’−ＵｍＣｍＵｍＧｍＵｍＧｍＣｆＣｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＧｍＡｍ−３’（配列番号５）
５’−ＵｍＣｆＡｍＧｍＡｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＧｍＣｆＡｍＣｆＡｍＧｍＡｍ−３’（配列番号６）
５’−ＣｍＧｍＵｍＧｍＵｍＧｍＣｆＡｆＣｆＵｍＵｍＣｍＧｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍ−３’（配列番号７）
５’−ＵｍＵｆＧｍＡｍＡｍＧｆＣｍＧｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｆＡｍＣｆＡｍＣｍＧｍ−３’（配列番号８）
５’−ＧｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＡｆＵｆＧｆＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
５’−ＵｍＡｆＵｍＵｍＣｍＧｆＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＵｍＵｍＣｍ−３’（配列番号１０）
５’−ＣｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＧｆＣｆＡｆＣｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１１）
５’−ＵｍＡｆＧｍＵｍＵｍＣｆＵｍＵｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｆＣｍＵｆＵｍＧｍＧｍ−３’（配列番号１２）
５’−ＣｍＡｍＡｍＵｍＡｍＡｍＡｆＧｆＣｆＵｍＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍ−３’（配列番号１３）
５’−ＵｍＵｆＣｍＵｍＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＵｆＵｍＡｆＵｍＵｍＧｍ−３’（配列番号１４）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項２４】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドと前記薬学的に許容可能な担体との重量比が１：（１〜５００）である、請求項２３に記載の薬物組成物。
【請求項２５】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドと前記薬学的に許容可能な担体との重量比が１：（１〜５０）である、請求項２３又は２４に記載の薬物組成物。
【請求項２６】
前記薬学的に許容可能な担体が、有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を含み、前記有機アミンが、式（２０１）に示される化合物及び／又はその薬学的に許容できる塩である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の薬物組成物：
【化３】
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式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎは１〜３の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、ｐは０又は１であり、ｍ及びｐがいずれも０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成し、
【化４】
2021504415.tif 000129
式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）に示される窒素原子を表す。
【請求項２７】
前記有機アミンが、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンであり、
【化５】
2021504415.tif 000130
前記補助脂質がコレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質が１，２−ジパルミトアミド−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］−２０００である、請求項２６に記載の薬物組成物。
【請求項２８】
前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比が（１９．７〜８０）：（１９．７〜８０）：（０．３〜５０）である、請求項２６又は２７に記載の薬物組成物。
【請求項２９】
前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比が（５０〜７０）：（２０〜４０）：（３〜２０）である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の薬物組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本鎖オリゴヌクレオチドに複合して結合される複合基を含むオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３１】
前記複合基が薬学的に許容できる標的基とリンカーを含み、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合又は非共有結合的に結合される、請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３２】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合的に結合される、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３３】
前記リンカーが式（３０１）に示される構造を有し、
【化６】
2021504415.tif 000131
式中、ｋは１〜３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合され、
【化７】
2021504415.tif 000132
ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ−アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素原子を有し、前記二本鎖オリゴヌクレオチドにリン酸エステル結合により結合され、
【化８】
2021504415.tif 000133
ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記ＬＢ部に結合される、請求項３１又は３２に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３４】
前記リンカーが前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の５’又は３’末端に結合される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３５】
式（３０５）に示される構造を有し、
【化９】
2021504415.tif 000134
式中、二重螺旋構造は前記二本鎖オリゴヌクレオチドを表し、
前記リンカーが前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の５’又は３’末端に結合される、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３６】
前記リンカーが式（３０６）に示される構造を有し、
【化１０】
2021504415.tif 000135
式中、ｌは０〜５の整数であり、好ましくは１〜３の整数であり、
＊は、前記リンカーにおける、エーテル結合により前記標的基に結合される部位を表し、
＃は、前記リンカーにおける、リン酸エステル結合により前記二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される部位を表す、請求項３１又は３２に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３７】
前記リンカーは前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３８】
式（３０７）に示される構造を有し、
【化１１】
2021504415.tif 000136
式中、二重螺旋構造は前記二本鎖オリゴヌクレオチドを表し、
前記リンカーは、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項３１〜３２及び３６〜３７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３９】
式（３０８）に示される構造を有し、
【化１２】
2021504415.tif 000137
式中、ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであるか、又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３が式Ａ５９に示される構造の基であり、
【化１３】
2021504415.tif 000138
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
2021504415.tif 000139
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、Ｍ１は標的基を表す、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４０】
各Ｌ１が、式Ａ１〜Ａ２６の基から独立して選択される１又は複数の結合の組合せである、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【化１４】
2021504415.tif 000140
式中、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７〜Ａ４５の基又はその任意の組合せからなる群から選択され、
【化１５】
2021504415.tif 000141
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【請求項４１】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４２】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４３】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４４】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子である、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４５】
Ｌ１の長さが４〜１５個の原子である、請求項４４に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４６】
ｊ１は２〜１０の整数であり、ｊ２は２〜１０の整数であり、Ｒ’はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、ＲｂがＣ１−Ｃ５のアルキル基である、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４７】
ｊ１は３〜５の整数であり、ｊ２は３〜５の整数であり、Ｒ’はメチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つであり、ＲａはＡ２７又はＡ２８であり、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである、請求項４６に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４８】
ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立して１又は２である、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４９】
ｎ１＋ｎ３＝２〜３である、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項５０】
各ｍ１、各ｍ２及び各ｍ３がそれぞれ独立して２〜５の整数から選択される、請求項３９〜５１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項５１】
ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項４５〜５５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項５２】
各前記標的基は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される、請求項３１〜３４、３６〜３７及び３９〜５１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５３】
各前記標的基は、哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体と親和性のあるリガンドから選択される、請求項５２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５４】
各前記標的基が独立してアシアロ糖タンパク質又は糖である、請求項５３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５５】
各前記標的基が、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースから独立して選択される１つである、請求項５８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５６】
前記標的基の少なくとも１つ又は各々がガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンＧａｌＮＡｃである、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項５７】
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が独立してＨ、メチル基又はエチル基である、請求項３９〜５６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項５８】
Ｒ２が前記窒素含有骨格上のＮとアミド結合を形成する、請求項３９〜５７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項５９】
Ｒ２がＢ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’から選択され、
【化１６】
2021504415.tif 000142
式中、
2021504415.tif 000143
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、ｑ２は１〜１０の整数である、請求項５８に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項６０】
式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項３９〜５９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体：
【化１７】
2021504415.tif 000144
2021504415.tif 000145
2021504415.tif 000146
2021504415.tif 000147
2021504415.tif 000148
2021504415.tif 000149
【請求項６１】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３０〜６０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体の、遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用。
【請求項６２】
前記遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子或いはアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
前記疾患は、慢性疾患、炎症、線維性疾患、過形成性疾患又は脂質異常から選択される、請求項６１又は６２に記載の使用。
【請求項６４】
前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項６３に記載の使用。
【請求項６５】
遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療方法であって、それを必要とする被験体に請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３０〜６０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項６６】
前記遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子或いはアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患は、慢性疾患、炎症、線維性疾患、過形成性疾患又は脂質異常から選択される、請求項６５又は６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
遺伝子発現の抑制方法であって、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３０〜６０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体の有効量を、前記当該遺伝子を発現する細胞と接触させることを含む、方法。
【請求項７０】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３０〜６０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖オリゴヌクレオチドは、薬物の活性成分として周知である。低分子核酸薬物の開発では、送達系は、キー技術の一つである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そのうち、肝細胞に対する標的複合送達技術である低分子核酸送達系がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
いくつかの実施形態において、本開示は、二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドがいずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖がヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２の長さがいずれも１９ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２が、第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で逆相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列断片が標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列断片であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列２の５’末端の１番目のヌクレオチドがアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つである。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む薬物組成物をさらに提供する。当該薬物組成物は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む複合体をさらに提供する。当該複合体は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本鎖オリゴヌクレオチドに複合して結合されるリガンドを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物又は複合体の、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本開示は、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療方法であって、当該疾患に罹患している被験体に本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物又は複合体を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物又は複合体を肝細胞と接触させることを含む、前記肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物又は複合体を含むキットを提供する。
【００１１】
本発明の他の特徴と利点については、後述する発明を実施するための形態部分において詳しく説明する。
【００１２】
［引用による組み込み］
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−２】ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性試験の半定量的結果を示す。
【図３−４】ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのヒト血漿における安定性試験の半定量的結果を示す。
【図５−６】ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのサル血漿における安定性試験の半定量的結果を示す。
【図７−１０】１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラット血漿における複合体Ａ１（図７）、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体Ａ１（図８）、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラット血漿における複合体Ａ１（図９）、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体Ａ１（図１０）のＰＫ／ＴＫ血漿濃度又は組織濃度の経時的代謝曲線を示す。
【図１１−１４】それぞれ４４ＢｒｉＨＢＶモデルにおいて本開示の複合体によるＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図１５−１６】それぞれＡＡＶ−ＨＢＶモデルにおいて本開示の複合体による血清ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する経時的な抑制作用を示す。
【図１７】Ｍ−Ｔｇモデルにおいて本開示の複合体による血清ＨＢｓＡｇに対する経時的な抑制作用を示す。
【図１８−１９】それぞれ１．２８ｃｏｐｙのＨＢＶ−Ｔｇモデルにおいて本開示の複合体による血清ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する経時的な抑制作用を示す。
【図２０Ａ−２０Ｄ】それぞれ異なる濃度の複合体Ａ１によるＧＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＣＭ及びＰＳＳＭの発現に対する抑制効果を示す。
【図２１−２２】それぞれ本開示の複合体による体外での標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図２３−２５】それぞれ本開示の複合体の体外での安定性試験結果を示す。
【図２６−２８】本開示の複合体による体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図２９−３１】本開示の複合体による異なるＨＢＶトランスジェニックマウス血清におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡの発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図３２−３４】本開示の複合体の体外での安定性試験結果を示す。
【図３５−３６】本開示の複合体による体外での標的ｍＲＮＡ及びオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制効果を示す。
【図３７】４４ＢｒｉＨＢＶモデルにおいて本開示の複合体による体内でのｍＲＮＡに対する抑制効果を示す。
【図３８】本開示の複合体によるマウスにおけるＨＢｓＡｇの発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図３９】本開示の複合体による体内でのＭ−ＴｇモデルマウスにおけるｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図４０−４２】本開示の複合体の体外での安定性試験結果を示す。
【図４３−４４】本開示の複合体による体外での標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図４５】本開示の複合体による体内でＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図４６】本開示の複合体によるＨＢＶトランスジェニックマウス血清におけるＨＢｓＡｇの発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図４７】Ｍ−Ｔｇモデルマウスにおける本開示の複合体によるＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図４８Ａ−４８Ｄ】比較ｓｉＲＮＡ３による体外での標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図４９Ａ−４９Ｄ】本開示のｓｉＲＮＡ  Ｅ１による体外での標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図５０Ａ−５０Ｂ】それぞれ本開示のｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ複合体による体外でのＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図５１Ａ−５１Ｄ】それぞれ本開示の複合体の体外での安定性実験結果を示す。
【図５２Ａ−５２Ｄ】本開示の複合体による脂質（血中脂質）に対する抑制率を示し、血清における総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図５３Ａ−５３Ｄ】本開示の複合体による体内でＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現に対する抑制率を示す。
【図５４Ａ−５４Ｄ】それぞれ本開示の複合体による脂質に対する抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図５５Ａ−５５Ｂ】本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図５５Ｃ】本開示の複合体によるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現に対する抑制率を示す。
【図５６Ａ−５６Ｂ】本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図５７Ａ−５７Ｄ】本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図５８Ａ−５８Ｂ】本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図５８Ｃ】本開示の複合体によるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現に対する抑制率を示す。
【図５９】本開示の複合体による体外でＡＰＯＣ３発現に対する抑制率を示す。
【図６０】１４日目に、本開示の複合体による肝組織におけるＡＰＯＣ３の発現の抑制率を示す。
【図６１Ａ−６１Ｂ】本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図６２Ａ−６２Ｂ】本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図６３Ａ−６３Ｄ】異なる用量の本開示の複合体による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図６４−６５】本開示の複合体の体外での安定性試験結果を示す。
【図６６−６８】異なる用量の本開示の複合体による血清表面抗原、血清ｅ抗原及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する経時的な抑制率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示を制限するためのものではないと理解すべきである。
【００１５】
（定義）
文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、特に、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＶＰで表される）、５’−リン酸ヌクレオチド（以下の実施例においてＰで表される）又は５’−チオリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＰｓで表される）を指す。
【００１６】
本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という用語は、互換的に使用されてもよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基と他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｇ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｃ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的であり、またその相補鎖の配列から鎖の配列を推知できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。
【００１７】
文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的である」とは、関連する２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「実質的に逆相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「完全に相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。
【００１８】
文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化したことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであるとき、前者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。
【００１９】
文脈において、特に本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製する二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体におけるヌクレオチドの種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、２つのアルファベット文字間又は記号間のものでないダッシュ（「−」）は、置換基の結合点の位置を示すために用いられている。例えば、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基により結合する。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに前記記載が事象又は状況が発生した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換されたアルキル」は、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及び／又は本質的に不安定な、いかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されないと、当業者に理解される。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１〜２０個の炭素原子、例えば、１〜１０個の炭素原子、１〜８個又は１〜６個の炭素原子である。例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキルは、１〜６個の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を命名する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチル」は、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ−プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素−炭素二重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン−１−イル（アリル）、プロパ−２−エン−２−イル等のプロペニルと、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチルプロパ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル等のブテニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルケニルは２〜２０個の炭素原子を有し、他の実施形態においては、２〜１０個、２〜８個又は２〜６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素−炭素三重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から２つの水素分子を除去することにより得られる。典型的なアルキニルとしては、エチニルと、プロパ−１−イン−１−イル、プロパ−２−イン−１−イル等のプロピニルと、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イル等のブチニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルキニルは２〜２０個の炭素原子を有し、他の実施形態においては、２〜１０、２〜８又は２〜６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセットであり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、２−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２−ヘキシルオキシ、３−ヘキシルオキシ、３−メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１〜１０個、１〜８個、１〜６個又は１〜４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される、環炭素原子から水素原子を除去して形成された基を指す。前記芳香族単環式又は多環式炭化水素環系は、水素及び６〜１８個の炭素原子の炭素のみを含有し、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状、非局在化（４ｎ＋２）π−電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「シクロアルキル」とは、通常３〜７個の環状炭素原子を有する非芳香族炭素環を指す。環は、飽和であってもよいし、１又は複数の炭素−炭素二重結合を有してもよい。シクロアルキルの実例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニル、並びにノルボルナン（ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ）等の架橋及びカゴ状環状基を含む。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２−フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
「複素環基」とは、２〜１２個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜６個のヘテロ原子とを含む、安定した３〜１８員非芳香族環状基を指す。明細書において特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽和又は完全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル［１，３］ジスルホニル、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、２−オキサピペラジニル、２−オキサピペリジル、２−オキサピリミジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスルホニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１−オキソチオモルホリニル及び１，１−ジオキソチオモルホリニルを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
「ヘテロアリール」とは、２個〜１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜６個のヘテロ原子とを含む、３〜１８員芳香環状基から誘導される基を指す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であってもよく、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π−電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の原子により分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３−ベンゾジオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキサゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサゾリル、１，４−ベンゾジオキサゾリル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾジアゾリル、ベンゾジオキサフェニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｅｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル（ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎｏｎｙｌ）、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２−ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［３，２−ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロヘプタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリル、インダゾリル、イミダゾリル、インドール、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、５，８−メタノ−５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジノニル、１，６−ナフチリジノニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタロイル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリジル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、６，７，８，���テトラヒドロ−５Ｈ−シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８−テトラヒドロピリド［４，５−ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３−ｃ］プリジニル及びチオフェニルを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能性を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能性に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８，２２２３〜２３１１、及びＧｒｅｅｎｅａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，２ｄ  ｅｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１に開示されており、引用により、上記文献は、全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去されることができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）「９−ｐｈｅｎｙｌｘａｎｔｈｅｎ−９−ｙｌ（Ｐｉｘｙｌ）」及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）「９−（ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｘａｎｔｈｅｎ−９−ｙｌ（Ｍｏｘ）」を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４−メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’−ジメトキシトリチル）及びＴＭＴｒ（４，４’，４’’−トリメトキシトリチル）を含む。
【００３３】
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本開示の主題としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「治療方法」、「治療」、「軽減」又は「改善」は、ここで互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、患者が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理的症状を根絶又は改善することにより、患者に改善が観察されて得られる。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「防止」と「予防」は互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されない。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行っていないかもしれないが、複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある患者に投与し、又は疾患の１又は複数の病理学的症状が報告された患者に投与することができる。
【００３６】
＜修飾二本鎖オリゴヌクレオチド＞
１つの側面において、本開示は、遺伝子発現を調節できる二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
【００３７】
本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここでは説明を省略する。
【００３８】
ＣＮ１０２１４０４５８Ｂには、ＨＢＶ遺伝子を特異的に抑制するｓｉＲＮＡが開示されており、当該ｓｉＲＮＡの複数種の化学修飾策略を研究している。当該研究によると、異なる修飾策略により、ｓｉＲＮＡの安定性、生物活性及び細胞毒性等の指標に全く異なる影響を与えることを見出した。当該研究では、７種類の有効な修飾方法を実証し、未修飾ｓｉＲＮＡに比べて、そのうちの１つの修飾方法で得られたｓｉＲＮＡは、血液安定性を向上させるとともに、未修飾ｓｉＲＮＡと基本的に同等の抑制活性を維持する。
【００３９】
本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、いずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２の長さは、いずれも１９ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２は、第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で逆相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列断片は、標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列断片であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列２の５’末端の１番目のヌクレオチドがアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つである。本開示の文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。
【００４０】
「ヌクレオチドアナログ」とは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドがある。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列２は、第１のヌクレオチド配列断片と基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の少なくとも第２〜１９位のヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列断片と相補的である。いくつかの具体的な実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の第１位のヌクレオチドは、Ａ又はＵである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、ヌクレオチド配列３とヌクレオチド配列４の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４の長さは、それぞれ１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおける第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列４と同じヌクレオチド配列を指す。
【００４５】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に相補的であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、或いは、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に相補的であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、或いは、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に相補的であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、或いは、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に相補的であり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的である。
【００４６】
前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、完全に逆相補的であり、ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、標的ｍＲＮＡに関連するヌクレオチド配列が決定されると、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４も決定される。
【００４７】
したがって、前記センス鎖又はアンチセンス鎖の長さは、独立して１９〜２３ヌクレオチドであってもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成する。
【００４９】
このように、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、１９／１９、１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２０、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２３、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列５の長さは、２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、又は第３のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、前記第３の配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおける第１のヌクレオチド配列断片又は第２のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列５に等しいヌクレオチド配列を指す。
【００５１】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドは、より良好な標的ｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。
【００５２】
文脈において、フルオロ修飾ヌクレオチドとは、式（１０１）に示されるように、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、そのうちのＢａｓｅは、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵから選択される塩基を表す。
【００５３】
非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである。
【００５４】
これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、例えば、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態において、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（１０２）に示される、メトキシ修飾ヌクレオチド（２’−ＯＭｅ）であってもよい。いくつかの実施形態において、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（１０３）に示される、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド（２’−ＭＯＥ）であってもよい。いくつかの実施形態において、２’−アミノ修飾ヌクレオチド（２’−ＮＨ２）は、式（１０４）に示される。いくつかの実施形態において、２’−デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は、式（１０５）に示される。
【００５６】
【化１】
2021504415.tif 000003
【００５７】
ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドであってもよい。
【００５８】
ＢＮＡとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’−エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’−、４’−位に導入して２’，４’−ＢＮＡヌクレオチド、例えば、式（１０６）に示されるＬＮＡ、式（１０７）に示されるＥＮＡ、式（１０８）に示されるｃＥＴ  ＢＮＡ等を提供する。
【００５９】
【化２】
2021504415.tif 000004
【００６０】
非環式ヌクレオチドとは、ヌクレオチドの糖環が開環された「開環」ヌクレオチド、例えば、式（１０９）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は式（１１０）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）を指す。
【００６１】
【化３】
2021504415.tif 000005
【００６２】
上記式（１０９）及び式（１１０）中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ−アルキル）から選択される。
【００６３】
イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化した化合物を指し、例えば、式（１１１）又は（１１２）に示される、塩基がリボース環の１’−位から２’−位又は３’−位に移行した化合物であってもよい。
【００６４】
【化４】
2021504415.tif 000006
【００６５】
上記式（１１１）〜式（１１２）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴ等の塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素化基から選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたヌクレオチドを指す。
【００６７】
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’−フルオロ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’−フルオロリボース基」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式（１０１）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「２’−メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたヌクレオチド」及び「２’−メトキシリボース基」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドリボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されて式（１０２）に示される構造を形成するものを指す。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、血中のリボヌクレアーゼによる切断に抵抗することにより、核酸の血液安定性を向上させ、核酸により強いヌクレアーゼ加水分解耐性を持たせるとともに、高い標的遺伝子調節活性を維持することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドは、動物実験において血漿中安定性と遺伝子発現調節効率の高度なバランスが取られており、かつ、いくつかは、より簡単で、コストがより低い利点をさらに有する。いくつかの例を以下に示す。
【００７０】
５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、他の修飾ヌクレオチド基をさらに含み、前記修飾ヌクレオチド基により、前記二本鎖オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を調節する機能を明らかに弱める又は喪失させることがない。
【００７２】
現在、本分野では、二本鎖オリゴヌクレオチドの修飾に使用できる複数種の方法があり、以上の文章で言及されたリボース基修飾のほか、骨格修飾（例えば、リン酸基修飾）及び塩基修飾等をさらに含む（例えば、Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｋ．，Ｇ．Ｆ．Ｄｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ：ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ，２００８．１３（１９−２０）：ｐ．８４２〜５５を参照し、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
いくつかの実施形態において、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも１つは、修飾基を有するリン酸エステル基である。前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基であり、１つの硫黄原子でリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子を置換することで、チオリン酸ジエステル結合でリン酸ジエステル結合を置換し、即ち、２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されている、式（１２１）に示されるチオリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）構造であってもよい。当該修飾により、二本鎖オリゴヌクレオチドの構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持することができる。
【００７４】
【化５】
2021504415.tif 000007
【００７５】
いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、チオリン酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間。
【００７６】
いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチド分子のアンチセンス鎖配列の５’末端ヌクレオチドは、５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、５’−リン酸ヌクレオチドは、式（１２２）に示される構造を有する。
【００７８】
【化６】
2021504415.tif 000008
【００７９】
同時に、慣用の前記５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドの種類は、当業者に公知であり、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ  Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ａｎｄ  Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｋ．  Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）：２３８〜４８には、式（１２３）から式（１２６）に示されるヌクレオチドが開示されている。
【００８０】
【化７】
2021504415.tif 000009
ただし、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ及びメトキシ基からなる群から選択される基を表し、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す。
【００８１】
いくつかの実施形態において、５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（１２３）に示される、ビニルリン酸エステル（Ｅ−ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ−ＶＰ）を含むヌクレオチド、又は式（１２５）に示される、チオリン酸エステルを含むヌクレオチドである。
【００８２】
本明細書に開示された修飾手段は、遺伝子発現を調節する各種の二本鎖オリゴヌクレオチドに適用することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子発現を抑制又は下方制御する二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡであってもよく、いくつかの実施形態において、遺伝子発現を活性化又は上方制御する二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、ｓａＲＮＡであってもよい。
【００８３】
本開示の修飾手段を採用した二本鎖オリゴヌクレオチドは、意外に、血液における安定性を向上させ、リソソームにおける安定性を向上させ、オフターゲット効果を低減し、及び／又は、二本鎖オリゴヌクレオチドの活性を向上させることができる。同時に、標的遺伝子発現調節活性は、顕著に低下しておらず、優れた体内抑制効果を示す。
【００８４】
本開示により提供される修飾二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び複合体は、各種の遺伝子の異常発現を調節し、遺伝子の異常発現による各種の病理学的状態又は疾患を治療するために用いることができる。これらの遺伝子は、人体又は動物体内での各種の内因性遺伝子であってもよく、人体又は動物体内で繁殖する病原体遺伝子であってもよい。目的とする標的点ｍＲＮＡにより特定のヌクレオチド配列及び前記修飾手段を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを設計し調製することができる。
【００８５】
本開示のいくつかの実施形態により、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、以下のｓｉＲＮＡであってもよい。
【００８６】
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号２に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号３に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号４に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号５に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号６に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号７に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号８に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号９に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１０に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１１に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１２に示される配列であり、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１３に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１４に示される配列である。
【００８７】
５’−ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ−３’（配列番号１）
５’−ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍ−３’（配列番号２）
５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号３）
５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍ−３’（配列番号４）
５’−ＵｍＣｍＵｍＧｍＵｍＧｍＣｆＣｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＧｍＡｍ−３’（配列番号５）
５’−ＵｍＣｆＡｍＧｍＡｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＧｍＣｆＡｍＣｆＡｍＧｍＡｍ−３’（配列番号６）
５’−ＣｍＧｍＵｍＧｍＵｍＧｍＣｆＡｆＣｆＵｍＵｍＣｍＧｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍ−３’（配列番号７）
５’−ＵｍＵｆＧｍＡｍＡｍＧｆＣｍＧｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｆＡｍＣｆＡｍＣｍＧｍ−３’（配列番号８）
５’−ＧｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＡｆＵｆＧｆＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
５’−ＵｍＡｆＵｍＵｍＣｍＧｆＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＵｍＵｍＣｍ−３’（配列番号１０）
５’−ＣｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＧｆＣｆＡｆＣｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１１）
５’−ＵｍＡｆＧｍＵｍＵｍＣｆＵｍＵｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｆＣｍＵｆＵｍＧｍＧｍ−３’（配列番号１２）
５’−ＣｍＡｍＡｍＵｍＡｍＡｍＡｆＧｆＣｆＵｍＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍ−３’（配列番号１３）
５’−ＵｍＵｆＣｍＵｍＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＵｆＵｍＡｆＵｍＵｍＧｍ−３’（配列番号１４）
【００８８】
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【００８９】
本開示のいくつかの実施形態により、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、表１Ａ〜１Ｆに示すｓｉＲＮＡであってもよい。
【００９０】
［表１］
いくつかの実施形態におけるｓｉＲＮＡ配列
【表１Ａ】
2021504415.tif 000010
【００９１】
【表１Ｂ】
2021504415.tif 000011
【００９２】
【表１Ｃ】
2021504415.tif 000012
【００９３】
【表１Ｄ】
2021504415.tif 000013
【００９４】
【表１Ｅ】
2021504415.tif 000014
【００９５】
【表１Ｆ】
2021504415.tif 000015
【００９６】
【表１Ｇ】
2021504415.tif 000016
2021504415.tif 000017
＊Ｓ：センス鎖、ＡＳ：アンチセンス鎖
【００９７】
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、いくつかの実施形態において、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＶＰで表される）、５’−リン酸修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＰで表される）又はチオリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＰｓで表される）である。
【００９８】
当業者であれば明らかに知っているように、本分野における通常の二本鎖オリゴヌクレオチド調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）により本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドを得ることができる。ここで、固相合成は、既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオチドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドに導入することができ、対応する修飾を有するヌクレオチドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基を二本鎖オリゴヌクレオチドに導入する方法も、当業者によく知られている。
【００９９】
本開示により提供される修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、単独で用いられてもよいし、薬学的に許容可能な担体と薬物組成物を形成してもよいし、複合分子と結合して複合体を形成してもよいし、他の形式であってもよい。前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記薬物組成物又は複合体の有効量を細胞と接触し、目的遺伝子の発現を調節し、或いは、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記薬物組成物又は複合体を被験体に投与し、目的遺伝子の発現を調節し、目的遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療を達成する。
【０１００】
適切な担体と薬物組成物を形成したり、適切な複合分子と複合体を形成することにより、さらに本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドの血液安定性を改善し、その標的性を向上させ、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドの体内送達問題等を解決することができる。二本鎖オリゴヌクレオチドに対しては、標的性を付与又は向上できる担体又は複合分子は、二本鎖オリゴヌクレオチドの目的遺伝子発現を調節する効率を大幅に向上させるとともに、潜在的副作用を低下させるため、十分に有利である。さらに、標的性担体又は複合分子を導入した後、二本鎖オリゴヌクレオチドは、さらに、標的部位で作用できることが必要であり、即ち、担体又は複合分子の包み込み／複合は、二本鎖オリゴヌクレオチド自体の活性に影響してはならない（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである場合に、ｓｉＲＮＡを細胞内に取り込むＲＮＡｉ機構、即ち、ＲＩＳＣコンプレックスに影響してはならない）。また、これらの標的担体又は複合分子には、さらに、良好な生体適合性及びできるだけ低い毒性を有することが求められる。
【０１０１】
前記薬物組成物は、体の各部位に系統的に分布してもよいし、又は体の特定の部位に特異的に富化してもよい。前記複合体は、一般的に標的性を有し、標的遺伝子の人体、動物体内での発現分布により複合分子の種類を相応に変更し、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを関連部位に送達する目的を達成することができ、例えば、複合分子は、肝臓、肺、腎臓又は癌細胞を標的する複合分子であってもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本開示は、上記修飾二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物をさらに提供する。薬学的に許容可能な担体は、いかなる使用可能な担体であってもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本開示は、上記修飾二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本鎖オリゴヌクレオチドに複合して結合されるリガンドを含むオリゴヌクレオチド複合体をさらに提供する。標的遺伝子の発現分布により、異なる複合分子を用い、二本鎖オリゴヌクレオチドを異なる臓器又は細胞に送達することができる。例えば、後述する複合分子は、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを肝臓に送達し、目的肝臓に発現する内因性遺伝子又は肝臓で繁殖する病原体遺伝子の発現を調節し、肝臓に発現する内因性遺伝子又は肝臓で繁殖する病原体遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患を治療する目的の達成に適する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本開示は、当該二本鎖オリゴヌクレオチド、上述した二本鎖オリゴヌクレオチドを含む薬物組成物、又は上記オリゴヌクレオチド複合体の、遺伝子の過剰発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本開示は、被験体に上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組成物又は上記オリゴヌクレオチド複合体の有効量を投与することを含む、遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療方法を提供する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本開示は、上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組成物又は上記オリゴヌクレオチド複合体の有効量を、上述した当該遺伝子を発現する細胞と接触させることを含む、遺伝子発現の調節方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記異常発現は、過剰発現であり、これに応じて、前記調節は、前記過剰発現に対する抑制である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組成物又は上記オリゴヌクレオチド複合体は、肝臓に発現する遺伝子の調節、又は肝細胞における遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療において、予期しない安定性と活性を示す。肝臓に発現する遺伝子としては、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の遺伝子を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子又はアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組成物又は上記オリゴヌクレオチド複合体は、不要な細胞増殖を特徴とする疾患、血液疾患、代謝性疾患、及び炎症を特徴とする疾患を含む他の肝臓疾患の治療に用いることもできる。肝臓の増殖性疾患は、良性又は悪性疾患、例えば、癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝転移又は肝芽腫であってもよい。肝臓血液学的又は炎症性疾患は、血液凝固因子、補体媒介炎症又は線維化に関する疾患であってもよい。肝臓の代謝性疾患は、脂質異常及びグルコースの調節の不規則性を含む。
【０１０９】
本開示は、上記二本鎖オリゴヌクレオチド、上記薬物組成物又は上記オリゴヌクレオチド複合体を含むキットをさらに提供する。
【０１１０】
以下に薬物組成物及びオリゴヌクレオチド複合体に関する記載は、前述した、遺伝子の発現を調節できることに適する二本鎖オリゴヌクレオチドに基づく。しかし、当該記載において薬学的に許容可能な担体及び薬物複合体におけるリガンドに関する記載は、同様に、前記修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを全身に投与する場合と、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを標的臓器又は組織、特に肝臓に送達し、目的とする標的臓器若しくは組織に発現する内因性遺伝子又は標的臓器若しくは組織で繁殖する病原体遺伝子の発現を調節する場合に適する。
【０１１１】
＜薬物組成物＞
１つの側面において、本開示は、活性成分として上述した二本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
【０１１２】
前記薬学的に許容可能な担体は、二本鎖オリゴヌクレオチド投与分野で通常用いられる担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば、Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ  （ＰＡＭＡＭ）  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ−又はＬ−乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ−ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複数があるが、これらに限定されない。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物における二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、いくつかの実施形態においては、二本鎖オリゴヌクレオチドと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１〜５００）であってもよい。いくつかの具体的な実施形態においては、上記重量比が１：（１〜５０）である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。
【０１１５】
前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５〜８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５〜８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、例えば、ｐＨ５．５〜８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。
【０１１６】
前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１〜３０重量％であってもよい。
【０１１７】
前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００〜７００ミリオスモル／キログラムとなるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決定することができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定されず、噴霧により肺に投与し、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの具体的な実施形態において、前記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂質及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化脂質を含む。ここで、前記有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、ＣＮ１０３３１１３Ａ（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１種又は複数種であってもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３１１３Ａに記載された式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。
【０１２１】
【化８】
2021504415.tif 000018
式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
Ｘが１〜１０の整数であり、
ｎが１〜３の整数であり、ｍが０〜２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、ｍ及びｐがいずれも０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
【０１２２】
【化９】
2021504415.tif 000019
式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）に示す窒素原子を表す。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、Ｒ１０３はポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ１０１及びＲ１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アルキル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３〜約２０個の炭素原子、例えば、８〜約１８個の炭素原子、及び０〜４個の二重結合、例えば、０〜２個の二重結合を有する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ｎ及びｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合、Ｒ１０３は、下記式（２０４）〜式（２１３）のいずれか１つであってもよい。
【０１２５】
【化１０】
2021504415.tif 000020
式（２０４）〜式（２１３）中、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊はＲ１０３と式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子との結合を実現するために置換されてもよい。
【０１２６】
ここで、式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３１１３Ａの記載により調製されてもよい。
【０１２７】
いくつかの具体的な実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。
【０１２８】
【化１１】
2021504415.tif 000021
【０１２９】
前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２−ジパルミトアミド−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］−２０００である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７〜８０）：（１９．７〜８０）：（０．３〜５０）であり、例えば、（５０〜７０）：（２０〜４０）：（３〜２０）であってもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均径を有し、一般に約４０ｎｍ〜約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均径は、約５０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ〜約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物において、二本鎖オリゴヌクレオチドと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１〜約１：５０、約１：１〜約１：３０、約１：３〜約１：２０、約１：４〜約１：１８、約１：５〜約１：１７、約１：５〜約１：１５、約１：５〜約１：１２、約１：６〜約１：１２又は約１：６〜約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドと全脂質の重量比は約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１，１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在してもよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドと上記薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来の二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドを用いればよい。いくつかの具体的な実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。
【０１３４】
有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２〜２５ｍｇ／ｍＬ、例えば、８〜１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択される１種又は複数種であり、例えばエタノールであってもよい。
【０１３５】
本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドを緩衝塩溶液に溶解し、二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度が０．０５〜０．５Ｍであり、例えば、０．１〜０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨを４．０〜５．５に調節し、例えば、５．０〜５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、二本鎖オリゴヌクレオチドの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１種又は複数種であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってもよい。
【０１３６】
脂質溶液と二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液を混合した後、得られた生成物を４０〜６０℃で少なくとも２分間、例えば、５〜３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る。脂質溶液と二本鎖オリゴヌクレオチド水溶液の体積比は１：（２〜５）、例えば、１：４であってよい。
【０１３７】
培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが６．５〜８であり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０〜２００ｎｍであり、多分散指数が０．３０以下であり、浸透圧が２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、例えば、物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが７．２〜７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０〜１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。
【０１３８】
ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われてもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過して除菌してもよい。
【０１３９】
＜オリゴヌクレオチド複合体＞
１つの側面において、本開示は、上記二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される複合基を含むオリゴヌクレオチド複合体を提供する。
【０１４０】
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらには、「オリゴヌクレオチド複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化学部分が二本鎖オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以下に、本開示のオリゴヌクレオチド複合体を単に「複合体」ということもある。より具体的には、本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることにより二本鎖オリゴヌクレオチドに複合され、最終的に本開示のオリゴヌクレオチド複合体を形成することができる特定の化合物であると理解すべきである。前記リガンドの種類と結合方法は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合される二本鎖オリゴヌクレオチドの標的細胞への送達を媒介する。
【０１４１】
一般的には、前記複合基は、薬学的に許容できる少なくとも１つの標的基及び任意のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、前記リンカー及び前記標的基は順に結合されている。１つの実施形態において、前記標的基が１〜６個である。１つの実施形態において、前記標的基が２〜４個である。前記二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複合されてもよい。二本鎖オリゴヌクレオチドと複合基との複合部位は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、二本鎖オリゴヌクレオチドの内部配列にあってもよい。いくつかの具体的な実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと複合基との複合部位は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端にある。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’−位のヒドロキシ基又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、３’−位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、二本鎖オリゴヌクレオチド鎖の末端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、二本鎖オリゴヌクレオチドの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。各種の結合方法については、Ｍｕｔｈｉａｈ  Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ．ａｌ．  ｓｉＲＮＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｔｒｉｖａｌｅｎｔ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｒｏｂｕｓｔ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０  （５）：１１８１〜７．を参照することができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチドと複合基との間が酸不安定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合が分解され、二本鎖オリゴヌクレオチドが遊離状態になることができる。分解できない複合方法については、複合基は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖に結合され、複合による二本鎖オリゴヌクレオチド活性への影響をできるだけ低下させることができる。
【０１４４】
標的基は、適切なリンカーを介して二本鎖オリゴヌクレオチド分子に結合されてもよく、当業者は、標的基の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。これらのリンカー、標的基の種類及び二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合方法については、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ−アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。
【０１４６】
【化１２】
2021504415.tif 000022
式中、ｋは１〜３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合される。
【０１４７】
【化１３】
2021504415.tif 000023
ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ−アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素基を有し、前記二本鎖オリゴヌクレオチドにリン酸エステル結合により結合される。
【０１４８】
【化１４】
2021504415.tif 000024
ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記ＬＢ部に結合される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−によりＮ−アセチルガラクトサミン分子と二本鎖オリゴヌクレオチド分子を結合して形成されたオリゴヌクレオチド複合体は、その構造が以下の式（３０４）に示される。
【０１５０】
【化１５】
2021504415.tif 000025
式中、二重螺旋構造は二本鎖オリゴヌクレオチドを表す。
【０１５１】
同様に、二本鎖オリゴヌクレオチドと複合基との複合部位は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、二本鎖オリゴヌクレオチドの内部配列にあってもよい。
【０１５２】
いくつかの具体的な実施形態において、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端は、リンカー−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−により３個のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合的に複合され、二本鎖オリゴヌクレオチド分子とＧａｌＮＡｃ分子のモル比が１：３である、構造が以下の式（３０５）に示されるオリゴヌクレオチド複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）３−Ｎｕともいう）を得る。
【０１５３】
【化１６】
2021504415.tif 000026
式中、二重螺旋構造は前記二本鎖オリゴヌクレオチドを表し、
前記リンカーは前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端に結合される。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ−アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。
【０１５５】
【化１７】
2021504415.tif 000027
式中、ｌは０〜３の整数であり、
＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合により二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される部位を表す。
【０１５６】
いくつかの具体的な実施形態において、ｌ＝２である場合、前記オリゴヌクレオチド複合体は、式（３０７）に示される構造を有する。
【０１５７】
【化１８】
2021504415.tif 000028
式中、二重螺旋構造は前記二本鎖オリゴヌクレオチドを表し、
前記リンカーは前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端に結合される。
【０１５８】
上記複合体は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成されてもよい。例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種の複合体の調製が詳しく記載されている。また、ＷＯ２０１４０２５５Ａ１には、式（３０５）に示される構造の調製方法が記載されている。さらに、Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３−９０８に式（３０７）に示される構造の調製方法を記載した。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、前記複合体は、式（３０８）に示される構造を有する。
【０１６０】
【化１９】
2021504415.tif 000029
式中、ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
【０１６１】
【化２０】
2021504415.tif 000030
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは二本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１６２】
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよい。
【０１６３】
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよい。Ｍ１は標的基を表す。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１〜Ａ２６の基又はその任意の組合せからなる群から選択されてもよく、Ａ１〜Ａ２６の構造と定義は以下のとおりである。
【０１６５】
【化２１】
2021504415.tif 000031
ただし、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７〜Ａ４５の基から選択される１つである。
【０１６６】
【化２２】
2021504415.tif 000032
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
2021504415.tif 000033
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【０１６７】
便宜上、Ｌ１は、線形アルキル基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、二本鎖オリゴヌクレオチド投与分野で通常用いられるリガンド、例えば、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２に記載された各種のリガンドであってもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、哺乳動物の肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合される二本鎖オリゴヌクレオチドの標的細胞への送達を媒介する。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合するいずれか１種のリガンドであってもよい。１つの実施形態において、各リガンドは、独立してアシアロ糖タンパク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯＲ）又はアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ、ＡＳＦ）である。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、コレステロール、胆汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子と、ポリエチレングリコール等のポリマーと、膜透過性ペプチド等のポリペプチドと、アプタマーと、抗体と、量子ドットと、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類と、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）と、アシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高比重リポタンパク、低比重リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその誘導体により形成されたリガンドから選択される１種又は複数種てあってよい。
【０１７２】
１つの実施形態において、前記リガンドは、糖又は糖の誘導体である。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドはいずれも糖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、単糖、多糖、修飾単糖、修飾多糖又は糖誘導体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの前記リガンドは、単糖、二糖又は三糖であってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも独立して多糖、修飾多糖、単糖、修飾単糖、多糖誘導体又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、リガンドのそれぞれ又は少なくとも１つは、グルコース及びその誘導体、マンナン及びその誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択される。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、各前記リガンドは、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース又はＬ−４−チオリボースから独立して選択されてもよい。前記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド複合体における、薬学的に許容できる標的基は、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれ二本鎖オリゴヌクレオチド分子と、標的基としてのガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成されたオリゴヌクレオチド複合体における二本鎖オリゴヌクレオチド分子とガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３又は１：４であることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基はＮ−アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドがＮ−アセチルガラクトサミを含む複合基と複合する場合、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの実施形態において、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドがＮ−アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子は３価である。
【０１７６】
Ｍ１は、標的基を表し、その定義と選択可能な範囲は上記と同じである。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから独立して選択される１つである。
【０１７７】
Ｍ１が哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドである場合、いくつかの実施形態において、ｎ１は、１〜３の整数であってもよく、ｎ３は、０〜４の整数であってもよく、前記複合体におけるＭ１リガンドの個数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２であり、これにより、Ｍ１リガンドの個数が少なくとも３であり、Ｍ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記複合体が細胞内取込み（エンドサイトーシス）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分かるように、Ｍ１リガンドの個数が３個以上である場合、Ｍ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形態において、ｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、独立して２〜１０の整数から選択される場合、複数のＭ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供される複合体をより簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２〜５の整数であり、いくつかの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
【０１７９】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシから選択される１つである場合、いずれも本明細書で開示された複合体の性質を変化させることなく、本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立してＨ、メチル基及びエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、いずれもＨである。
【０１８０】
本開示により提供されるオリゴヌクレオチド複合体によれば、Ｒ３は、式Ａ５９に示される構造の基であり、そのうち、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、調製原料の入手しやすさを考慮し、いくつかの実施形態において、Ｅ１はＯＨ又はＳＨである。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現するために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が結合された炭素原子とＮが互いに結合している鎖状構造を指す。したがって、Ｒ２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮに結合することができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合成プロセスにより本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製する場合に、Ｒ２基には、窒素含有骨格上のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれる必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格中のＮに結合される部位は、Ｎとアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰに結合される部位は、Ｐとリン酸エステル結合を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’である。
【０１８２】
【化２３】
2021504415.tif 000034
ただし、
2021504415.tif 000035
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
【０１８３】
ｑ２の値の範囲は、１〜１０の整数であってもよく、いくつかの実施形態において、ｑ２は１〜５の整数である。
【０１８４】
Ｌ１は、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮを結合し、本開示のオリゴヌクレオチド複合体に標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３〜２５個の原子、３〜２０個の原子、４〜１５個の原子又は５〜１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個の原子である。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、ｊ１は２〜１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ１は３〜５の整数である。いくつかの実施形態において、ｊ２は２〜１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ２は３〜５の整数である。Ｒ’はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１−Ｃ５のアルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。いくつかの実施形態において、式Ａ１〜Ａ２６においてそれぞれｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、Ｍ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に更に適合させる。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。
【０１８８】
【化２４】
2021504415.tif 000036
2021504415.tif 000037
2021504415.tif 000038
2021504415.tif 000039
2021504415.tif 000040
2021504415.tif 000041
【０１８９】
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチド配列における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合されてもよく、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の端部に結合される。前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４ヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端に結合される。二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、本開示により提供される複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独の二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を放出し、標的遺伝子発現を調節することができる。
【０１９０】
式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド上の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖における１つのヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合される。
【０１９１】
本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド複合体において、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基として存在してもよく、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムイオンＮＨ４＋、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮して、１つの実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１種又は複数種である。アルカリ金属イオンは、Ｋ＋及び／又はＮａ＋であってもよく、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。１つの形態において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド複合体は、ナトリウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。
【０１９２】
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基を二本鎖オリゴヌクレオチドに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製してもよい。
【０１９３】
＜式（３０８）のオリゴヌクレオチド複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製してもよい。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、式（３０８）のオリゴヌクレオチド複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれ二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含む。前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、上記本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１９５】
また、当該方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分子とも呼ばれる。
【０１９６】
【化２５】
2021504415.tif 000042
式中、
Ｒ４は、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドに結合できる部分である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、共有結合により本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドに結合できる部分である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、反応させてリン酸ジエステル結合により二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の官能基に複合されることができる部分であり、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ−基で置換された基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つである。
【０１９７】
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０１９８】
Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、式（３０８）のオリゴヌクレオチド複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４には、Ｒ２リンカー基又は保護されたＲ２リンカー基、及び反応させることにより二本鎖オリゴヌクレオチドとＡ５９に示される構造を形成することができる官能基が含まれる。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、二本鎖オリゴヌクレオチド又はヌクレオシドモノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる第１の官能基、及びヒドロキシ基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる第２の官能基を含み、或いは、前記共有結合により結合された固相担体を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボン酸又はカルボン酸塩である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体であり、前記共有結合は、ヒドロキシ基又はアミノ基により形成されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。
【０２００】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、−ＯＲｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。
【０２０１】
【化２６】
2021504415.tif 000043
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
2021504415.tif 000044
は、基が分子の残りの部分に共有結合的に結合される部位を表す。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、式（Ｃ３）に示されるように、ホスホルアミダイト基を含み、当該ホスホルアミダイト基は、ヌクレオチド上の任意位置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリング反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子を二本鎖オリゴヌクレオチドに複合させることができる。この場合、前記第２の官能基が存在しなくても、式（３２１）の化合物は、ヌクレオチドに複合することもでき、式（３０８）に示されるオリゴヌクレオチド複合体の取得に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合成等の方法により二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式（３２１）の化合物と、ヌクレオチド配列において末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基を反応させ、後の酸化又は硫化過程においてリン酸ジエステル結合結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、式（３２１）の化合物を二本鎖オリゴヌクレオチドに複合させる。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応できる基を含み、前記反応により固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。前記第２の官能基がカルボキシ基又はカルボン酸塩を含む場合、式（３２１）の化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により結合された、又はアミド結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。前記第２の官能基がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）の化合物と汎用の固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン酸ジエステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。その後、上記固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合された二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記第１の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホスホルアミダイト基とカップリングさせる。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として固相担体の代わりに式（３２１）の化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合された二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、−ＣＯＯ−Ｍ＋で表されてもよく、ここで、Ｍ＋は、カチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４＋、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。１つの実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、例えば、Ｋ＋又はＮａ＋である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮して、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む。
【０２０７】
【化２７】
2021504415.tif 000045
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ｑ２は１〜１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
2021504415.tif 000046
は、基が分子の残りの部分に共有結合的に結合される部位を表す。いくつかの実施形態において、ｑ１は１又は２である。いくつかの実施形態において、ｑ２は１〜５の整数である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構造を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４−メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’−ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’−トリメトキシフェニルメチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’−ビスメトキシトリチル（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
【０２０９】
Ｌ１とは、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基を指し、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよい。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｍ１リガンドを窒素含有骨格上のＮ原子に結合し、オリゴヌクレオチド複合体に肝標的機能を提供するために用いられる。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１〜Ａ２６のいずれか１つ又はその組合せを含む。
【０２１１】
上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルアミダイト固相合成方法と比較して、上記第１の官能基及び任意の第２の官能基により、複合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌクレオチド配列の末端に結合された、オリゴヌクレオチド複合体を得ることができる。これに応じて、特に説明がない限り、以下に複合体の調製に関する記載において、「脱保護」、「カップリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、本分野で公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた、同様にこれらの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に詳細に説明する。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１に存在する活性ヒドロキシ基が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、当業者に既知のあらゆるヒドロキシ保護基を、Ｍ１における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護されたヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ−で表されてもよく、各Ｙは、独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基及びＣ６−Ｃ１０アリール基からなる群から選択され、前記Ｃ１−Ｃ１０アルキル基及びＣ６−Ｃ１０アリール基は、１又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は、ハロゲン及びＣ１−Ｃ６アルキル基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、各Ｙは、独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１−Ｃ６アルキルフェニル基からなる群から選択される。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６〜Ａ５４からなる群から選択される。
【０２１４】
【化２８】
2021504415.tif 000047
【０２１５】
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
【０２１７】
前述したように、本開示のオリゴヌクレオチド複合体の調製方法は、二本鎖オリゴヌクレオチドの他方の鎖を合成し（例えば、上記工程で、複合基が結合された二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖を合成した場合、固相合成方法に従い二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆も同様である）、センス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさらに含む。具体的には、単離工程において、ヌクレオチド配列及び／又は複合基に結合される固相担体が切断されるとともに、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１）の化合物における各Ｓ１基が、対応するＭ１リガンドに変換される）、複合基が結合された二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又はセンス鎖）が得られ、センス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、式（３０８）に示されるオリゴヌクレオチド複合体を得る。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド複合体の調製方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基を含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる、式（３２１）に示される化合物であり、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）の化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、複合基が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；ホスホルアミダイト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のアンチセンス鎖又はセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製して核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド複合体の調製方法は、当該二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程と、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイト基である第１の官能基が含まれる式（３２１）の化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させる工程と、保護基を除去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。前記二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖に複合基が結合されている。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるセンス鎖の３’末端に結合され、本開示のオリゴヌクレオチド複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）の化合物（式（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基ＯＲｋを含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒｋを除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合基により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’−５’の方向に従い、ホスホルアミダイト固相合成方法により二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を合成すること、
（４）二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のオリゴヌクレオチド複合体を得ることを含む。
【０２２１】
工程（１）において、式（３２１）の化合物における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱保護条件で、式（３２１）の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒であり、いくつかの実施形態において、５０〜１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と式（３２１）の化合物とのモル比が１０：１〜１０００：１であり、いくつかの実施形態において、５０：１〜５００：１である。
【０２２２】
前記カップリング反応条件とカップリング試薬としては、上記カップリング反応に適した任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件としては、反応温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であってもよい。式（３２１）の化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１〜１：５０であり、いくつかの実施形態において、１：２〜１：５であり、式（３２１）の化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：３〜１：１０であり、反応時間が２００〜３０００秒であり、いくつかの実施形態において、５００〜１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ１Ｈ−テトラゾールから選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態においては、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態においては、無水アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２２４】
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製された複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’−５’の方向に従い、オリゴヌクレオチド複合体のセンス鎖Ｓを合成する。この場合、複合基は、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。
【０２２５】
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件としては、ヌクレオシドモノマーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬及び用量を含み、本分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
【０２２６】
例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成では、以下の条件を用いてもよい。
【０２２７】
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒であり、いくつかの実施形態において、５０〜１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態においては、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’−ジメトキシトリチル保護基とのモル比は、２：１〜１００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、３：１〜５０：１である。
【０２２８】
カップリング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：５〜１：１５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：１００であってもよく、いくつかの実施形態において、１：５０〜１：８０であり、反応時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
【０２２９】
キャッピング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が５〜５００秒であり、いくつかの実施形態において、１０〜１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１：１００〜１００：１であり、いくつかの実施形態において、１：１０〜１０：１である。キャッピング試薬として等モル量の酢酸無水物とＮ−メチルイミダゾールを用いる場合に、酢酸無水物、Ｎ−メチルイミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比が１：１：１０〜１０：１０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１：２〜２：２：１である。
【０２３０】
酸化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が１〜１００秒であり、いくつかの実施形態において、５〜５０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態において、ヨウ素である（いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、１：１〜１００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５：１〜５０：１である。いくつかの実施形態において、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１〜１：１：３の混合溶剤で行われる。硫化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が５０〜２０００秒であり、いくつかの実施形態において、１００〜１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態において、キサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１０：１〜１０００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１０：１〜５００：１である。いくつかの実施形態において、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリジン＝１：３〜３：１の混合溶剤で行われる。
【０２３１】
全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前、当該方法は、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
【０２３２】
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去するには、二本鎖オリゴヌクレオチド合成において通常の切断と脱保護方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６〜Ａ５４基の保護基ＹＣＯＯ−をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（３０８）に示される複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、２５〜３０重量％のアンモニア水であってもよく、濃アンモニア水の用量は、目的とする二本鎖オリゴヌクレオチド配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ〜０．８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。
【０２３３】
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’−ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩と接触させることにより、当該２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この場合、得られた目的とする二本鎖オリゴヌクレオチド配列には、遊離の２’−ヒドロキシ基の対応するヌクレオシドを有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とする二本鎖オリゴヌクレオチド配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ〜１．０ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。このように式（３０８）のオリゴヌクレオチド複合体を得ることができる。
【０２３４】
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマトグラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製を完成し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩することができる。
【０２３５】
このように得られたオリゴヌクレオチド複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本的にナトリウムイオンに結合されており、オリゴヌクレオチド複合体は、基本的にナトリウム塩として存在する。熟知のイオン交換方法により、水素イオン及び／又は他のカチオンで前記ナトリウムイオンを置換し、他の形式のオリゴヌクレオチド複合体を得ることができる。前記カチオンは、前述したとおりである。
【０２３６】
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御することができる。このような検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析により分子量を測定することができる。
【０２３７】
アニール方法も、当業者によく知られている。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０〜９５℃に加熱し、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このように本開示のオリゴヌクレオチド複合体を得ることができる。
【０２３８】
本開示の複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成されたオリゴヌクレオチド複合体の特徴を明らかにし、合成されたオリゴヌクレオチド複合体が、目的設計のオリゴヌクレオチド複合体であるとともに、合成された二本鎖オリゴヌクレオチドの配列が、所望の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列、例えば表１に示される配列の１つであると確認することもできる。
【０２３９】
式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
【０２４０】
【化２９】
2021504415.tif 000048
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ６は、式（３２１）におけるＲ４を提供する基である。いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
【０２４１】
【化３０】
2021504415.tif 000049
式中、Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現できる、ＲｋＯと結合して１つの遊離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この場合、Ｒ４にヒドロキシ保護基としての第１の官能基と第２の官能基が含まれ、前記第２の官能基が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２４２】
前記エステル化反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が８〜４８時間であり、いくつかの実施形態において、前記エステル化反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が２０〜３０時間である。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１〜５：１である。
【０２４５】
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例えば、当該触媒は、４−ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１〜５：１である。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第３級アミン類有機塩基であってもよい。いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜１０：１である。
【０２４７】
前記イオン交換作用は、式（３２１）の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオン交換溶液と交換条件を用い、前述したカチオンがＭ＋である複合分子を得ることができ、ここで詳しい説明を省略する。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が０．２〜０．８Ｍであり、いくつかの実施形態において、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が０．４〜０．６Ｍであり、式（３１３）の化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量が３〜６Ｌ／ｍｏｌであり、さらなる実施形態において４〜５Ｌ／ｍｏｌである。
【０２４８】
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３２１）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出する、又は、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、縮合反応条件下で、有機溶剤において、縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、上記イオン交換反応により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２５０】
前記固相担体は、二本鎖オリゴヌクレオチドの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態において、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径１００〜４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は１０〜４００μｍｏｌ化合物／グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ）である。いくつかの実施形態において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は５０〜２００μｍｏｌ／ｇである。
【０２５１】
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は２０〜２００Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５０〜１００Ｌ／ｍｏｌである。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン及び／又はＯ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであってもよく、いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートである。前記縮合剤と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１〜２０：１であり、さらなる実施形態において１：１〜５：１である。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン及び／又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１〜５：１である。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、得られた縮合生成物をキャッピング反応条件下で、有機溶剤において、キャッピング試薬及びアシル化触媒と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前記キャッピング反応の条件としては、反応温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が１〜１０ｈであり、いくつかの実施形態において、３〜６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、核酸固相合成に用いられるキャッピング試薬を用いてもよい。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬Ａ（ｃａｐＡ）及びキャッピング試薬Ｂ（ｃａｐＢ）からなり、キャッピング試薬Ａは、Ｎ−メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：１０〜１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３〜１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ−メチルイミダゾールとの体積は１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜７：１である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬Ｂは、酢酸無水物である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬Ｂは、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積が１：１〜１：１０であり、さらなる実施形態において１：２〜１：６である。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、前記Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比が５ｍｌ／ｇ〜５０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態において、１５ｍｌ／ｇ〜３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比は０．５ｍｌ／ｇ〜１０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態において、１ｍｌ／ｇ〜５ｍｌ／ｇである。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ−メチルイミダゾールを用いる。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１０〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜３０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、４−ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３２１）に示される化合物との質量比が０．００１：１〜１：１であり、いくつかの実施形態において、０．０１：１〜０．１：１である。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）の化合物を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノールから選択され、いくつかの実施形態において、アセトニトリルである。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３１３）に示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、式（３１３）の化合物とホスホルジアミダイトとのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、例えば１：５〜１：１５であり、式（３１３）の化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：１００であってもよく、例えば１：５０〜１：８０であり、反応時間が２００〜３０００秒であってもよく、例えば５００〜１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品として購入されてもよく、又は本分野で公知の方法により合成されてもよい。カップリング試薬は、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ１Ｈ−テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、例えば、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水アセトニトリルである。いくつかの実施形態において、式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５〜２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）の化合物におけるヒドロキシ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、カップリング反応条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）の化合物を得る。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ３’）に示される構造を有する式（３２１）の化合物が得られる。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用できる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ３００  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。
【０２６４】
【化３１】
2021504415.tif 000050
【０２６５】
脱保護反応は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒、例えば５０〜１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における−ＤＭＴｒ（４，４’−ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１〜１００：１であり、例えば３：１〜５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、次のカップリング反応を行いやすくする。
【０２６６】
カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、以上のとおりである。当該カップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルアミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、反応時間が５〜５００秒であり、例えば１０〜１００秒であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の選択と用量は、以上のとおりである。
【０２６８】
酸化反応条件としては、温度が０〜５０℃であってもよく、例えば、１５〜３５℃であってもよく、反応時間が１〜１００秒、例えば、５〜５０秒であってもよく、酸化試薬は、例えば、ヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する）。いくつかの実施形態において、酸化試薬と亜リン酸エステル基とのモル比が１：１〜１００：１であり、例えば、５：１〜５０：１であってもよい。いくつかの実施形態において、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１〜１：１：３の混合溶剤で行われる。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。
【０２７０】
【化３２】
2021504415.tif 000051
式中、ｑ２の定義は、前述したとおりである。
【０２７１】
この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下及びアミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、式（３１４）に示される化合物を式（Ａ−１）に示される化合物又は式（Ａ−２）の化合物と接触させ、その後単離する、という調製方法により得ることができる。
【０２７２】
【化３３】
2021504415.tif 000052
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２７３】
前記アミド化反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が１〜４８時間であってもよく、いくつかの実施形態において、前記アミド化反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が２〜１６時間である。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記アルコール類溶剤は、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノールの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、エタノールである。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１４）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、さらなる実施形態において３〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（４−（４，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、さらなる実施形態において、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１４）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、さらなる実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１４）に示される化合物とのモル比が３：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１〜１０：１である。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、式（Ａ−１）及び式（Ａ−２）の化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ−１）の化合物を調製することができる。同様に、３−アミノ−１，２−プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ−２）の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４〜１３、いくつかの実施形態においては４〜８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ−２）の化合物におけるｑ２の異なる値に対応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２＝２であり、以下類推してもよい。
【０２７８】
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３−アミノ−１，２−プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（３１３）の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、これらの変形は、式（３１３）の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当業者が上記方法により容易に実現されるものである。
【０２７９】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１３）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１３）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、脱保護反応条件下で、式（３１５）に示される化合物をハロ酢酸と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０２８１】
【化３４】
2021504415.tif 000053
式中、Ｒ７は、式（３３０）、（３３１）、（３３２）又は（３３３）に示される基から選択され、いくつかの実施形態において、Ｒ７の構造が式（３３０）に示される。
【０２８２】
【化３５】
2021504415.tif 000054
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２８３】
前記ハロ酢酸は、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、クロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸である。
【０２８４】
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が０．１〜２４時間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が０．５〜１６時間である。
【０２８５】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１５）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、さらなる実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２８６】
前記ハロ酢酸と前記式（３１５）に示される化合物とのモル比が５：１〜１００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１０：１〜５０：１である。
【０２８７】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１４）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１４）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２８８】
式（３１５）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下及び縮合反応条件下で、式（３１７）に示される化合物を式（３１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０２８９】
【化３６】
2021504415.tif 000055
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２９０】
式（３１６）の化合物としては、例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，１６９５８−１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式（３１６）の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、米国特許ＵＳ８，１０６，０２２Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が０．１〜２４時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が０．５〜１６時間である。
【０２９２】
前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３１７）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３１７）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２９４】
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又は４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩であり、さらなる実施形態において、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩であってもよい。前記アミド化反応縮合剤と式（３１７）に示される化合物とのモル比は２：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０２９５】
前記第３級アミン類有機塩基は、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｎ−メチルモルホリンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３１７）に示される化合物とのモル比が３：１〜２０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５：１〜１０：１である。
【０２９６】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１５）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１５）の化合物を単離し、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１５）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２９７】
いくつかの実施形態において、式（３１７）の化合物と十分な量の式（３１６）の化合物を一度反応させるだけで所望の式（３１５）の化合物を生成する。この場合、各Ｓ１−Ｌ１部分同士が同じである。いくつかの実施形態において、必要に応じて、式（３１７）の化合物を、異なる式（３１６）の化合物、即ち、Ｌ１及び／又はＳ１が異なる式（３１６）の化合物とバッチ反応させることにより、生成された式（３１５）の化合物に２種類以上のＳ１及び／又はＬ１を含ませることができる。例えば、１ｅｑの式（３１７）の化合物に対して、それを２ｅｑの第１の式（３１６）の化合物と接触させ、式（３１７）の化合物における２つの末端第一級アミン基に第１のＳ１−Ｌ１部分を結合した後、続いて（ｎ３＋ｎ１−１）ｅｑの第２の式（３１６）の化合物と接触させ（ｎ３及びｎ１の定義と値の範囲は、前述したとおりである）、式（３１７）の化合物における（ｎ３＋ｎ１−１）個の第二級アミン基に第２のＳ１−Ｌ１部分を結合することができる。
【０２９８】
いくつかの実施形態において、式（３１７）に示される化合物は、有機溶剤の存在下及び脱保護反応条件下で、式（３１８）に示される化合物をメチルアミン水溶液と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０２９９】
【化３７】
2021504415.tif 000056
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３００】
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０〜１５０℃であり、反応時間が５〜７２時間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が２０〜８０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０３０１】
前記有機溶剤は、アルコールから選択されてもよく、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール及びイソプロパノールの１つであり、いくつかの実施形態において、メタノールであり、式（３１８）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１〜２０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、１．５〜１０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３０２】
前記メチルアミン水溶液の濃度が３０〜４０質量％であってもよく、メチルアミンと式（３１８）に示される化合物とのモル比が１０：１〜５００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５０：１〜２００：１である。
【０３０３】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１７）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１７）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１７）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、式（３１８）に示される化合物は、有機溶剤の存在下及び置換反応条件下で、式（３１９）に示される化合物を、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタン、いくつかの実施形態においてトリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０３０５】
【化３８】
2021504415.tif 000057
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３０６】
前記置換反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が５〜７２時間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０３０７】
トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンは、市販品を購入することができ、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンと式（３１９）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１：１〜３：１である。
【０３０８】
前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であってもよい。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであってもよく、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであってもよく、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１９）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３０９】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１８）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１８）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメタン＝０．０１：１〜０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石油エーテル＝０．１：１：１：１〜１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１８）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３１０】
いくつかの実施形態において、式（３１９）に示される化合物は、有機溶剤において、置換反応条件下で、式（３２０）に示される化合物をトリフルオロ酢酸エチルと接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０３１１】
【化３９】
2021504415.tif 000058
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０３１２】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、いくつかの実施形態において、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、いくつかの実施形態において、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２０）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１〜５０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、いくつかの実施形態において、１〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０３１３】
前記置換反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が５〜７２時間であってもよく、いくつかの実施形態において、前記置換反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０３１４】
式（３２０）の化合物は、市販品を購入して、又は、当業者により既知の方法を用いて得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれもＨである場合、式（３２０）の化合物は、アルファ・エイサー社から市販品として購入することができる。
【０３１５】
前記トリフルオロ酢酸エチルと式（３２０）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜５：１である。
【０３１６】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１９）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１９）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメタン＝０．０１：１〜０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石油エーテル＝０．１：１：１：１〜１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１９）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３１７】
本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併用してもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと。
【０３１８】
＜本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及びオリゴヌクレオチド複合体の使用＞
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体の、細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝細胞に異常に発現する遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝臓に発現する内因性遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝臓で繁殖する病原体遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の遺伝子から選択される。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子又はアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。
【０３１９】
いくつかの実施形態において、本開示は、それを必要とする被験体に本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体の有効量を投与することを含む、特定の遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の遺伝子から選択される。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子又はアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。いくつかの実施形態において、本開示により提供される複合体は、不要な細胞増殖を特徴とする疾患、血液疾患、代謝性疾患及び炎症を特徴とする疾患を含む他の肝臓疾患の治療に用いることもできる。肝臓の増殖性疾患は、良性又は悪性疾患、例えば、癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝転移又は肝芽腫であってもよい。肝臓血液学的又は炎症性疾患は、血液凝固因子、補体媒介炎症又は線維化に関する疾患であってもよい。肝臓の代謝性疾患は、脂質異常及びグルコースの調節の不規則性を含む。１つの実施形態において、疾患に関与する遺伝子配列と高度に同じ配列を有する１又は複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いることにより前記疾患を治療する。
【０３２０】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体の有効量を細胞と接触させることを含む、前記細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
【０３２１】
本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を、それを必要とする被験体に投与することにより、遺伝子発現調節機構により細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患を予防及び／又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体は、前記病理学的状態又は疾患の予防及び／又は治療に用いられ、又は本明細書に記載された病理学的状態又は疾患の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。
【０３２２】
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化することにより所望の効果を生じさせる方法又は経路により、二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体全身よりも多くの二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体が被験体のほぼ全身に送達される。本開示が肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の予防及び／又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、いくつかの実施形態において、薬物を肝臓に送達することができる投与方法である。
【０３２３】
本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、経口投与又は胃腸外経路（非経口経路）、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月又は１年に１回若しくは複数回であってもよい。
【０３２４】
本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定されてもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０（５０％の群体を死亡させる用量）及びＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％実験対象に陽性反応が発生する場合の用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいてヒト用量の範囲を得ることができる。
【０３２５】
本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６〜１２週齢、体重１８〜２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又はＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌＶｒマウスに対して、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体における二本鎖オリゴヌクレオチドの量として、二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容できる複合分子により形成されたオリゴヌクレオチド複合体について、その二本鎖オリゴヌクレオチド用量が０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態において、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、さらなる実施形態において、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より更なる実施形態において、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重であり、また更なる実施形態において、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本開示に記載された二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を投与する場合、上記用量が好ましい。
【０３２６】
また、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体を、特定の遺伝子が異常に発現する肝細胞に導入することにより、遺伝子発現調節機構により肝細胞における当該特定の遺伝子の発現を抑制する目的を達成することもできる。いくつかの実施形態において、前記肝細胞は肝炎細胞であり、いくつかの実施形態において、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞である。いくつかの実施形態において、前記肝細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７等の肝癌細胞系又は単離した初代肝細胞から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、Ｈｕｈ７肝癌細胞である。
【０３２７】
本開示により提供される方法により肝細胞における特定の遺伝子の発現を抑制する。提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体における二本鎖オリゴヌクレオチドの用量は、当業者が所望の効果により容易に決定するものである。例えば、いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチド、薬物組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体は、ｓｉＲＮＡ複合体であり、提供されるｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ用量は、以下のような量である：標的遺伝子の発現を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ〜１μＭ、０．０１ｎＭ〜１００ｎＭ、０．０５ｎＭ〜５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ〜約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達するのが局所か全身か等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
【０３２８】
＜キット＞
本開示は、上述した二本鎖オリゴヌクレオチド、上述した薬物組成物及び／又は上述したオリゴヌクレオチド複合体を含むキットを提供する。
【０３２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器で二本鎖オリゴヌクレオチドを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、薬学的に許容できる賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等が含まれてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載された二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、二本鎖オリゴヌクレオチドと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含んでもよい。
【０３３０】
本開示のキットにおいて、前記二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記二本鎖オリゴヌクレオチド組成物及び／又は複合体、及び／又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記二本鎖オリゴヌクレオチド組成物及び／又は複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供することができる。
【０３３１】
以下に実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何ら制限されない。
【０３３２】
限定されることを望まないが、以下の実施形態、及び本開示の組成物及び／又はオリゴヌクレオチド複合体における二本鎖オリゴヌクレオチドが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である例示的な実施形態に関する実施例において、本発明をさらに詳しく説明する。このような場合に、本開示の二本鎖オリゴヌクレオチド、組成物及びオリゴヌクレオチド複合体は、それぞれｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む組成物及びｓｉＲＮＡ複合体である。本開示の文脈において、説明の便宜上、これらの実施形態におけるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、本開示のｓｉＲＮＡ、本開示のｓｉＲＮＡ組成物及び本開示のｓｉＲＮＡ複合体とも称する。本開示の二本鎖オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡのみであることを意味するものではなく、逆に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示された又は当業者に既知の他の変異体、例えば、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）等であってもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む組成物及びｓｉＲＮＡ複合体に対する詳しい説明に基づき、他の機能性二本鎖オリゴヌクレオチドは、単独で用い、又は本開示に記載された組成物及び／又は複合体を形成する際に同様に作用することを想定することができる。
（発明の効果）
【０３３３】
いくつかの実施形態において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、組成物又はオリゴヌクレオチド複合体は、体内でより高い安定性、より低い毒性及び／又はより高い活性を有することができる。いくつかの実施形態において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドは、ｓａＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓａＲＮＡ、ｓａＲＮＡ組成物又はｓａＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的遺伝子発現向上率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のヒト被験体における肝内ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のヒト被験体における肝内ＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供される二本鎖オリゴヌクレオチド、組成物又はオリゴヌクレオチド複合体は、明らかなオフターゲット効果を示していない。オフターゲット効果は、例えば、標的遺伝子でない遺伝子の正常発現の抑制であってもよい。オフターゲット遺伝子発現の結合／抑制がオンターゲット遺伝子効果に比べて５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％を下回る場合、当該オフターゲット効果が顕著ではないと考えられている。
【０３３４】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本開示のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、優れた抑制効果を示す。例えば、本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における６６．９％〜９０．９％のＨＢＶ遺伝子発現を抑制することができるという優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制特性を示す。同時に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原発現及びＨＢＶ  ＤＮＡを効果的に低下させることもできる。特に、従来技術で提供されるものに比べて、本開示により提供される特定の修飾ｓｉＲＮＡと特定の複合分子により形成された特定のｓｉＲＮＡ複合体は、低用量で、１４０日間の実験時間と長期間にわたって優れたＨＢＶ発現抑制作用を示し続けることができる。
【０３３５】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における８１．７〜８９．２％のＨＢＶ遺伝子発現を抑制することができるという優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制特性を示す。同時に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原発現及びＨＢＶ  ＤＮＡを効果的に低下させることもできる。特に、従来技術で提供される複合分子により形成された複合体に比べて、本開示により提供される特定の修飾ｓｉＲＮＡと特定の複合分子により形成された特定のｓｉＲＮＡ複合体は、低用量で、８４日間の実験時間と長期間にわたって優れたＨＢＶ発現抑制作用を示し続けることができる。
【０３３６】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における９３．８％と高いＨＢＶ遺伝子発現を抑制することができるという優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制特性を示す。同時に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原発現を効果的に低下させることもでき、ひいては３ｍｇ／ｋｇの用量で９０％以上のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を達成し、ＨＢＶ  ＤＮＡを効果的に抑制することができる。特に、参照複合体に比べて、本開示により提供される特定の修飾ｓｉＲＮＡと特定の複合分子により形成された特定のｓｉＲＮＡ複合体は、低用量で、２１日間の実験時間と長期間にわたって高いＨＢＶ発現抑制作用を示し続けることができる。
【０３３７】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における９３．６３％と高いＨＢＶ  Ｘ遺伝子領域の遺伝子発現を抑制することができるという優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制特性を示す。同時に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原発現を効果的に低下させることもでき、ひいては３ｍｇ／ｋｇの用量で９５％以上のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を達成することができ、ＨＢＶ  ＤＮＡを効果的に抑制することができる。特に、従来技術で提供される複合分子により形成された複合体に比べて、本開示により提供される特定の修飾ｓｉＲＮＡと特定の複合分子により形成された特定のｓｉＲＮＡ複合体は、低用量で、５６日間の実験時間と長期間にわたって優れたＨＢＶ発現抑制効果を示し続け、ＨＢＶ  Ｘ  ｍＲＮＡ抑制率を９０％以上とすることができる。
【０３３８】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、優れたＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ抑制効率を示し、脂質レベルを顕著に低下させる。例えば、いくつかの実施形態において、単回皮下投与後の１４日目に、マウスのＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ抑制率が９５％以上と高く、いくつかの実施形態において、単回皮下投与し、トリグリセリド（ＴＧ）に対する最大抑制率が９３％であり、総コレステロール（ＣＨＯ）に対する最大抑制率が８３％であり、薬剤投与後の１５４日目に、ＴＧに対する抑制率が５５％以上に維持でき、ＣＨＯに対する抑制率が４０％以上に維持される。特に、従来技術で提供される複合分子により形成された複合体に比べて、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、より優れた遺伝子抑制率、より強い脂質低下能力を示す。また、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低用量、低投与頻度の場合に、１８９日間の実験時間と長期間にわたって優れた脂質抑制作用を示し続けることができる。
【０３３９】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、１ｍｇ／ｋｇの用量で高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも８８％のＡＰＯＣ３遺伝子発現を抑制するという優れたＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制特性を示す。特に、従来技術で提供される複合分子により形成された複合体に比べて、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ複合体は、優れた遺伝子抑制率及び低いオフターゲット効果を示す。また、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、低用量、低投与頻度の場合に、１８９日間の実験時間と長期間にわたって優れた脂質抑制作用を示し続けることができる。
【０３４０】
ある実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ複合体は、動物レベルの毒性の低さ及び良好な安全性をさらに示す。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の複合体については、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに有効濃度の１００倍（有効濃度を３ｍｇ／ｋｇとする）を投与しても、明らかな毒性反応が認められていない。
【０３４１】
以上のことから、本明細書により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、標的細胞における遺伝子の発現を効率的に低下させ、優れた送達潜力を示すことが分る。
【実施例】
【０３４２】
以下に実施例により本開示を詳しく説明する。特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬＢｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。
【０３４３】
ＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０３４４】
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、ＡＴＣＣから購入され、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び３８０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０３４５】
Ｈｕｈ７細胞は、ＡＴＣＣから購入され、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び３８０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０３４６】
特に説明がない限り、以下に合成される各種のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体で細胞をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、具体的な操作については、メーカーにより提供される説明書を参照のこと。
【０３４７】
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。
【０３４８】
用いられる動物モデルは以下のとおりである。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス：６〜８週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入、以下単にＣ５７マウスという。
ＳＤラット：北京維通利華実験動物技術有限公司により提供される。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６−ＨＢＶ：品種名：Ｂ６−Ｔｇ  ＨＢＶ／Ｖｓｔ（１．２８ｃｏｐｙ、ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ａ）、北京維通達生物技術有限公司から購入する。実験前にＣＯＩ＞１０４のマウス（以下単に１．２８ｃｏｐｙマウスともいう）を選択した。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊ：北京大学医学部実験動物科学部から購入する。
ＨＢＶトランスジェニックマウス：Ｍ−ＴｇＨＢＶと命名され、上海市公衆衛生センター動物部から購入し、トランスジェニックマウスの作製方法は、Ｒｅｎ  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ２００６，７８：５５１〜５６０に記載されている。
ＡＡＶ−ＨＢＶトランスジェニックマウス：文献の方法（董小岩ら、Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０１０，Ｍａｙ  ２５，２６（５）：６７９〜６８６）によりＡＡＶ−ＨＢＶモデルを作製し、ｒＡＡＶ８−１．３ＨＢＶ、Ｄ型（ａｙｗ）、北京五加和分子医学研究所有限公司から購入し、１×１０１２ウイルスゲノム（ｖ．ｇ．）／ｍＬ、ロット番号２０１６１２３０１１。実験前を無菌ＰＢＳで５×１０１１ｖ．ｇ．／ｍＬに希釈した。マウス１匹あたり２００μＬ注射し、即ち、マウス１匹あたり１×１０１１ｖ．ｇ．注射した。ウイルスを注射した後の２８日目に、全てのマウスに対して眼窩採血（約１００μＬ）を行い、血清を回収してＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡを検出するために用いられる。
低濃度ＡＡＶ−ＨＢＶトランスジェニックマウス：実験前にウイルスを無菌ＰＢＳで１×１０１１ｖ．ｇ．／ｍＬに希釈し、マウス１匹あたり１００μＬのウイルスを注射し、即ち、マウス１匹あたり１×１０１０ｖ．ｇ．注射したこと以外、上記と基本的に同じモデリング方法を採用した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス：６〜８週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
ｏｂ／ｏｂマウス：６〜８週齢、常州キャヴェンス実験動物有限公司から購入する。
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス：Ｂ６、ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ、米国Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入する。
メタボリックシンドロームサル：北京大学分子医学研究所非ヒト霊長類研究センターにより提供される。
【０３４９】
特に説明がない限り、以下の体内／体外効果実験データは、いずれも
2021504415.tif 000059
で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェアを採用した。まずデータに対して正規分布と等分散性検定を行った。正規分布を満たす（ｐ＞０．２０）とともに分散が等しい（ｐ＞０．１０）場合、複数の群間の比較では、一元配置分散分析によるＬＳＤ法により多重比較し、ｐ＜０．０５である場合、統計学的に有意であるとみなした。正規分布を満たしておらず、又は分散が等しくない場合、複数の群間の比較では、ノンパラメトリック検定であるＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ方法を採用し、Ｋｒｕｓｋａｌ−ｗａｌｌｉｓ  Ｈ検定結果が有意（ｐ＜０．０５）である場合、データをランク変換した後、複数の群間の一対比較を行い、ｐ＜０．０５である場合、統計学的に有意であるとみなした。
【０３５０】
（調製例１）本開示のｓｉＲＮＡの調製
本調製例では、以下の方法に従い、表２のｓｉＲＮＡを合成した。
【０３５１】
【表２】
2021504415.tif 000060
＊Ｓ：センス鎖、ＡＳ：アンチセンス鎖
注釈：大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、ｄＴは、デオキシチミンヌクレオチドを表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、ＶＰは、当該文字ＶＰの右側の１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Ｐは、当該文字Ｐの右側の１つのヌクレオチドがリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Ｐｓは、当該文字Ｐｓの右側の１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表す。
【０３５２】
（１−１）ｓｉＲＮＡのセンス鎖の合成
汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、上記配列並び順に従い３’−５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を含む。合成条件は、以下のように規定された。
【０３５３】
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の条件が同じであり、即ち、温度が２５℃であり、反応時間が７０秒であり、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体における４，４’−ジメトキシトリチル保護基とのモル比が５：１であった。
【０３５４】
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５であり、反応時間が６００秒であり、カップリング試薬は、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールの０．５Ｍアセトニトリル溶液であった。
【０３５５】
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐ１とＣａｐ２の混合溶液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物：Ｎ−メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１であった。
【０３５６】
各酸化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であり、酸化試薬が濃度０．０５Ｍのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が３０：１であった。反応をテトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
【０３５７】
目的配列における２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、当該２つのヌクレオチドのうち後のヌクレオチドの結合における酸化反応工程の代わりに、以下の硫化反応工程を用いた。各工程の硫化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が３００秒であり、硫化試薬がキサンタンヒドリドであることを含む。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１２０：１であった。反応をアセトニトリル：ピリジン＝１：１の混合溶剤で行った。
【０３５８】
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体を除去し、乾燥させるまで真空濃縮した。アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ−メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去した。目的配列における全てのヌクレオチドの２’−位がいずれも修飾ヒドロキシ基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去する工程を含まなかった。
【０３５９】
精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完成した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０〜５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５であり、脱イオン水で溶出した。
【０３６０】
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析し、理論値と比較した。
【０３６１】
これにより、当該工程においてｓｉＲＮＡのセンス鎖Ｓを合成した。
【０３６２】
（１−２）アンチセンス鎖の合成
本工程において、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖ＡＳを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化及び／又は硫化反応条件、脱保護と切断、単離条件は、センス鎖の合成と同じであった。
【０３６３】
ここで、ビニルリン酸エステルで修飾された２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（ＶＰ−Ｕｍ）は、以下の方法に従い合成された。
【０３６４】
【化４０】
2021504415.tif 000061
【０３６５】
（１−２−１）ＶＰ−Ｕ−２の合成
以下の方法に従い、ＶＰ−Ｕ−２分子を合成した。
【０３６６】
【化４１】
2021504415.tif 000062
２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオチド（２’−ＯＭｅ−Ｕ、５１．３０ｇ、９１．６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ、５０．３５ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１２．４７ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）を混合して４５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。ＤＭＦを留去し、６００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり３００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、５％シュウ酸で水相をｐＨ＜５になるまで洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発した後ＶＰ−Ｕ−１粗製品を得、そのまま後のＶＰ−Ｕ−２の合成に用いた。
【０３６７】
ＶＰ−Ｕ−１粗製品を１００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、氷浴を施して１０分間攪拌し、さらに、予め４℃の冷蔵庫で冷蔵された４５０ｍｌの２％ｐ−トルエンスルホン酸溶液（溶剤が、体積比３：７のメタノール−ジクロロメタン混合溶剤である）を加え、１０分間反応させた。さらに２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエンチングし、有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝８になるまで洗浄した。水相をあわせ、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、さらに２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５〜１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計４０．００ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−２を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝７．８  Ｈｚ，１Ｈ），７．６４  （ｄｔｄ，Ｊ  ＝５．１，４．０，２．２  Ｈｚ，４Ｈ），７．４１−７．３０  （ｍ，６Ｈ），６．７９  （ｄ，Ｊ  ＝４．７  Ｈｚ，１Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝７．６  Ｈｚ，１Ｈ），４．９４  （ｔ，Ｊ  ＝７．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  （ｔｄ，Ｊ  ＝４．６，３．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．０５  （ｄｄ，Ｊ  ＝４．８、４．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．９６  （ｔ，Ｊ  ＝４．７  Ｈｚ，１Ｈ），３．６８  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝１１．８，７．０，４．６  Ｈｚ，１Ｈ），３．５７  −  ３．４６  （ｍ，１Ｈ），３．３９  （ｓ，３Ｈ），１．０５  （ｓ，８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｓｉ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４９７．２１、実測値：４９７．４５。
【０３６８】
（１−２−２）ＶＰ−Ｕ−４の合成：
【０３６９】
【化４２】
2021504415.tif 000063
ＶＰ−Ｕ−２（１９．８４ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１６．４８ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（４．２０ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（６．６１ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。別に、メチレンジホスホン酸テトラエチル（２１．４４ｇ、７４．４ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのＴＨＦに溶解させ、氷浴で降温し、氷浴温度でｔ−ＢｕＯＫ（１１．３６ｇ、１０１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴温度で１０ｍｉｎ反応させた後、室温まで昇温して０．５ｈ反応させた後、約１ｈかけて前述した反応液に加え、氷浴温度で１ｈ反応させた後、室温まで昇温して１８ｈ反応させた。水を加えて反応をクエンチングし、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出した。有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄した後に乾燥させるまで溶剤を蒸発した。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル＝１：１〜１：４で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計１４．００ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−４を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝７．８  Ｈｚ，１Ｈ），７．６４  （ｄｔｄ，Ｊ  ＝５．１，４．０，２．２  Ｈｚ，４Ｈ），７．４１  −  ７．３０  （ｍ，６Ｈ），６．８２  −  ６．７１  （ｍ，２Ｈ），５．９０  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝２５．９、１５．０，１．０  Ｈｚ，１Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝７．６  Ｈｚ，１Ｈ），４．３６  −  ４．２１  （ｍ，３Ｈ），４．１８  （ｔ，Ｊ  ＝４．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．０５  （ｄｄｑ，Ｊ  ＝９．７，８．５，６．９  Ｈｚ，２Ｈ），３．８７  （ｔ，Ｊ  ＝４．８  Ｈｚ，１Ｈ），３．３９  （ｓ，３Ｈ），１．３２  （ｔｄ，Ｊ  ＝６．９，０．７  Ｈｚ，６Ｈ），１．０５  （ｓ，８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２Ｏ８ＰＳｉ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：６２９．２４、実測値：６２９．５１。
【０３７０】
（１−２−３）ＶＰ−Ｕ−５の合成：
【０３７１】
【化４３】
2021504415.tif 000064
ＶＰ−Ｕ−４（１４．００ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸（１７．９６ｇ、１１１．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌して完全に反応させた。そのまま乾燥させるまで溶剤を蒸発し、５０ｍｌのジクロロメタンで溶解してから蒸発乾固する操作を２回繰り返し、粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５〜１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計６．７０ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−５を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝７．８  Ｈｚ，１Ｈ），６．７７  （ｄｄ，Ｊ  ＝１５．０，６．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．９９  −  ５．８２  （ｍ，２Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝７．６  Ｈｚ，１Ｈ），５．２７  （ｄ，Ｊ  ＝５．１  Ｈｚ，１Ｈ），５．１０  （ｄｄ，Ｊ  ＝５．３，４．７  Ｈｚ，１Ｈ），４．２９  （ｄｄｑ，Ｊ  ＝９．８，８．６，７．０  Ｈｚ，２Ｈ），４．１７  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝６．２，５．２，１．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  −  ３．９８  （ｍ，３Ｈ），３．３９  （ｓ，２Ｈ），１．３２  （ｔｄ，Ｊ  ＝６．９，０．６  Ｈｚ，６Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ８Ｐ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：３９１．１３、実測値：３９１．３８。
【０３７２】
（１−２−４）ＶＰ−Ｕ−６の合成：
【０３７３】
【化４４】
2021504415.tif 000065
アルゴン保護条件で１０ｍｌの無水ジクロロメタンにＶＰ−Ｕ−５（３９１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロアセテート（０．２３２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．０９９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン（０．４５２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を留去し、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン：アセトニトリル（０．５ｗｔ％トリエチルアミンを含む）＝３：１〜１：３で勾配溶出した）、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計５０８ｍｇの目的生成物ＶＰ−Ｕ−６を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６１  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １５０．３４，１５０．２９，１７．０７，１５．５０．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ４１Ｎ４Ｏ９Ｐ２、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：５９１．２３、実測値：５９１．５５。ＶＰ−Ｕ−６が目的生成物ＶＰ−Ｕｍであり、ヌクレオシドモノマーとしてＲＮＡ鎖の合成に関与することを示した。
【０３７４】
以下の方法を用いて５’−リン酸エステル修飾をアンチセンス鎖の５’端に結合した。
【０３７５】
原料は、以下の式ＣＰＲ−Ｉの構造を有するリン酸化構造モノマーであり、蘇州吉瑪により提供され、番号がＣａｔ＃１３〜２６０１−ＸＸである。
【０３７６】
【化４５】
2021504415.tif 000066
アンチセンス鎖の全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行ってＣＰＲ−Ｉモノマーをアンチセンス鎖の５’末端に結合した。その後、以下の条件により切断と脱保護を行い、アンチセンス鎖を得た。
【０３７７】
合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体を除去し、乾燥させるまで真空濃縮した。アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ−メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去した。精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完成した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０〜５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５であり、脱イオン水で溶出した。
【０３７８】
目的生成物が５’−チオリン酸エステル修飾を有する場合に、結合する際に、上記酸化反応条件の代わりに硫化反応条件を用い、硫化反応を行ったこと以外、上記と同じ工程を用いた。
【０３７９】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を同様に分析検出し、用いられた計器と方法は、センス鎖と同じであり、最終的に、対応するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を得たことを確認した。
【０３８０】
（１−３）ｓｉＲＮＡの合成
Ｓ鎖とＡＳ鎖を等モル比で混合し、注射用水に溶解させ９５℃に加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。
【０３８１】
上記合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析し、合成された核酸配列が表２における各ｓｉＲＮＡに対応することを確認した。
【０３８２】
（調製例２）複合体１の調製
本調製例では、以下の方法に従い、表４Ａにおいて番号が複合体Ａ１であるｓｉＲＮＡ複合体を合成した。
【０３８３】
（２−１）Ｌ−１０化合物の調製
以下の方法に従い、Ｌ−１０化合物を合成した。
【０３８４】
【化４６】
2021504415.tif 000067
【０３８５】
（２−１−１）複合末端セグメントＧＡＬ−５の合成
【０３８６】
【化４７】
2021504415.tif 000068
【０３８７】
（２−１−１ａ）ＧＡＬ−２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ−１（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１７７２−０３−８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ−２を得た。
【０３８８】
（２−１−１ｂ）ＧＡＬ−３の合成
工程（１−１ａ）で得られたＧＡＬ−２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１３ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、２４．０ｇのＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７−７７−８、マックリン社から購入、１０８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
【０３８９】
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、洗浄し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品ＧＡＬ−３を得た。
【０３９０】
（２−１−１ｃ）ＧＡＬ−４の合成
工程（１−１ｂ）で得られたＧＡＬ−３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．０ｇの５−ヘキセン−１−オール（ＣＡＳ番号：８２１−４１−０、Ａｄａｍａｓ−ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ−４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
【０３９１】
（２−１−１ｄ）ＧＡＬ−５の合成
工程（１−１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ−４（１４．９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：７７９０−２８−５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８−６７−０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、システム温度を３０℃以下に制御し、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ−５を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １２．０１  （ｂｒ，１Ｈ），７．８３  （ｄ，Ｊ  ＝９．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝３．２  Ｈｚ，１Ｈ），４．９６  （ｄｄ，Ｊ  ＝１１．２，３．２  Ｈｚ，１Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝８．４  Ｈｚ，１Ｈ），４．０７  −  ３．９５  （ｍ，３Ｈ），３．９２  −  ３．８５  （ｍ，１Ｈ），３．７４  −  ３．６７  （ｍ，１Ｈ），３．４８  −  ３．３９  （ｍ，１Ｈ），２．２０  （ｔ，Ｊ  ＝６．８  Ｈｚ，２Ｈ），２．１１  （ｓ，３Ｈ），２．００  （ｓ，３Ｈ），１．９０  （ｓ，３Ｈ），１．７７  （ｓ，３Ｈ），１．５５  −  １．４５  （ｍ，４Ｈ）．
【０３９２】
（２−１−２）Ｍ−１１−Ｔ３の合成：
【０３９３】
【化４８】
2021504415.tif 000069
Ｊ−０（１．８８３ｇ、１０ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、トリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加えて氷水浴で０℃まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ、５．３４２ｇの固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３を得、さらに精製することなく、そのまま後の反応に用いた。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２２Ｆ９Ｎ４Ｏ３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４７７．３５、実測値：４７７．６５。
【０３９４】
（２−１−３）Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒの合成：
【０３９５】
【化４９】
2021504415.tif 000070
Ｍ−１１−Ｔ３粗製品（５．３４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させ、飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を１回あたり２０ｍｌで２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、７．７６３ｇの固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３４Ｈ３６Ｆ９Ｎ４Ｏ３、［Ｍ＋Ｎａ］＋、理論値：７４１．２５、実測値：７４１．５３。固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒは、精製することなく、引き続き次のＭ−１８−Ｔｒの合成に使用した。
【０３９６】
（２−１−４）Ｍ−１８−Ｔｒの合成：
【０３９７】
【化５０】
2021504415.tif 000071
工程（２−１−３）で得られたＭ−１１−Ｔ３−Ｔｒ粗製品（７．７６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０質量％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させ、不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００ｍｌの体積比１：１のＤＣＭ：メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて２．８８７ｇの純粋なＭ−１８−Ｔｒを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．４７  −  ７．３９  （ｍ，６Ｈ），７．３２  −７．２４  （ｍ，６Ｈ），７．１９  −  ７．１２  （ｍ，３Ｈ），２．６０  −  ２．４７  （ｍ，４Ｈ），２．４６  −  ２．１９  （ｍ，１３Ｈ），１．７０  −  １．５５  （ｍ，４Ｈ），１．４０  （ｐ，Ｊ  ＝６．８  Ｈｚ，２Ｈ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２８Ｈ３９Ｎ４、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４３１．６５、実測値：４３２．６１。
【０３９８】
（２−１−５）Ｌ−５−Ｔｒの合成：
【０３９９】
【化５１】
2021504415.tif 000072
工程（２−１−４）で得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工程（２−１−１）で得られたＧＡＬ−５（６．９３ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、Ｎ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）及び４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．４９ｇの純粋なＬ−５−Ｔｒを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．８３  −  ７．１０  （ｍ，４Ｈ），７．６７  −  ７．６０  （ｍ，１Ｈ），７．４４  −  ７．３４  （ｍ，６Ｈ），７．３３  −  ７．２４  （ｍ，６Ｈ），７．２０  −  ７．１５  （ｍ，３Ｈ），５．２２  （ｓ，３Ｈ），４．９７  （ｄ，Ｊ  ＝１１．３  Ｈｚ，３Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝８．４  Ｈｚ，３Ｈ），４．０６  −  ３．０７  （ｍ，９Ｈ），３．９５  −  ３．８３  （ｍ，３Ｈ），３．７７  −  ３．６４  （ｍ，３Ｈ），３．４５  −  ３．３５  （ｍ，３Ｈ），３．１２  −  ２．８７  （ｍ，８Ｈ），２．３０  −  ２．１５  （ｍ，３Ｈ），２．１１  −  １．９８  （ｍ，２２Ｈ），１．９５  −  １．８４  （ｍ，１１Ｈ），１．８１  −  １．６１  （ｍ，１４Ｈ），１．５４  −  １．３６  （ｍ，１４Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１８．８１、実測値：１７１８．０３。
【０４００】
（２−１−６）Ｌ−８の合成：
【０４０１】
【化５２】
2021504415.tif 000073
工程（２−１−５）で得られたＬ−５−Ｔｒ（５．９４ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させ、１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６ｇの純粋なＬ−８を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ７．８４  （ｄ，Ｊ  ＝９．０  Ｈｚ，３Ｈ），７．２７  −  ７．２３  （ｍ，１Ｈ），７．１３  −  ７．１８  （ｍ，１Ｈ），５．２２  （ｄ，Ｊ  ＝３．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．９７  （ｄｄ，Ｊ  ＝１１．３，３．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．４８  （ｄ，Ｊ  ＝８．４  Ｈｚ，３Ｈ），４．０９  −  ３．９８  （ｍ，９Ｈ），３．８８  （ｄｄ，Ｊ  ＝１９．３，９．３  Ｈｚ，３Ｈ），３．７５  −  ３．６６  （ｍ，３Ｈ），３．４４  −  ３．３８  （ｍ，３Ｈ），３．１７  −  ３．３０  （ｍ，４Ｈ），３．１０  −  ２．９７  （ｍ，４Ｈ），２．３５  −  ２．２０  （ｍ，６Ｈ），２．１５  −  ２．０８  （ｍ，９Ｈ），２．０７  −  １．９８  （ｍ，１３Ｈ），１．９４  −  １．８７  （ｍ，９Ｈ），１．８１  −  １．７４  （ｍ，９Ｈ），１．６５  −  １．４２  （ｍ，１８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
【０４０２】
（２−１−７ａ）Ａ−１の合成
【０４０３】
【化５３】
2021504415.tif 000074
ＤＭＴｒＣｌ（４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド、３８．１２ｇ、１１２．５ｍｍｏｌ）を４５０ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ−グリセリン酸カルシウム水和物（１２．８８ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２２ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥させるまで減圧濃縮し、残りを５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐＨ＝７〜８）で１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５〜１：１：１：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩減圧し、２０．７ｇの白色固形製品Ａ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．４６  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝６．５，２．３，１．１  Ｈｚ，１Ｈ），７．４０  −  ７．２８  （ｍ，７Ｈ），６．８９  −  ６．８１  （ｍ，４Ｈ），４．８４  （ｄ，Ｊ  ＝５．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．３６  −  ４．２４  （ｍ，１Ｈ），４．２９  （ｓ，６Ｈ），３．９２  （ｄｄ，Ｊ  ＝１２．４，７．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．６７  （ｄｄ，Ｊ  ＝１２．３，７．０  Ｈｚ，１Ｈ），２．５２  （ｑ，Ｊ  ＝６．３  Ｈｚ，６Ｈ），１．０３  （ｔ，Ｊ  ＝６．３  Ｈｚ，９Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６、［Ｍ−Ｈ］−、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。
【０４０４】
（２−１−７ｂ）Ｌ−７の合成：
【０４０５】
【化５４】
2021504415.tif 000075
工程（２−１−６）で得られたＬ−８（２．２６２ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）及び工程（２−１−７ａ）で得られたＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合し、１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させ、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、４．９００ｇの粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．３３６ｇの純粋なＬ−７を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．９０  −  ７．７８  （ｍ，４Ｈ），７．７５  −  ７．６４  （ｍ，１Ｈ），７．３８  −  ７．１８  （ｍ，９Ｈ），６．９１  −  ６．８３  （ｍ，４Ｈ），５．２５  −  ５．１０  （ｍ，４Ｈ），４．９７  （ｄｄ，Ｊ  ＝１１．２，３．２  Ｈｚ，３Ｈ），４．４８  −  ４．３０  （ｍ，４Ｈ），４．０２  （ｓ，９Ｈ），３．９３  −  ３．８４  （ｍ，３Ｈ），３．７６  −  ３．６６  （ｍ，９Ｈ），３．４５  −  ３．３５  （ｍ，３Ｈ），３．２４  −  ２．９８  （ｍ，１０Ｈ），２．３０  −  ２．２０  （ｍ，２Ｈ），２．１１  −  １．８８  （ｍ，３１Ｈ），１．８０  −  １．４０  （ｍ，２８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５、［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
【０４０６】
（２−１−８）Ｌ−９の合成：
【０４０７】
【化５５】
2021504415.tif 000076
工程（２−１−７ｂ）で得られたＬ−７（２．３００ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．３７８ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．４６２ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を混合して１３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＰＥＡ（０．８１４ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌し、５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して２．７７４ｇの粗製品を得た。カラム精製には、６０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．８７４ｇの純粋なＬ−９複合分子（複合分子１化合物）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ８．５８  （ｄ，Ｊ  ＝４．２  Ｈｚ，１Ｈ），７．９４  −  ７．８２  （ｍ，３Ｈ），７．４１  −  ７．２９  （ｍ，５Ｈ），７．２２  （ｄ，Ｊ  ＝８．１  Ｈｚ，５Ｈ），６．８９  （ｄ，Ｊ  ＝８．３  Ｈｚ，４Ｈ），５．４９  −  ５．３７  （ｍ，１Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝３．０  Ｈｚ，３Ｈ），４．９７  （ｄ，Ｊ  ＝１１．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝８．２  Ｈｚ，３Ｈ），４．０２  （ｓ，９Ｈ），３．８８  （ｄｄ，Ｊ  ＝１９．４、９．４  Ｈｚ，３Ｈ），３．７７  −  ３．６５  （ｍ，９Ｈ），３．５０  −  ３．３９  （ｍ，６Ｈ），３．１１  −  ２．９０  （ｍ，５Ｈ），２．６１  −  ２．５４  （ｍ，４Ｈ），２．４７  −  ２．４１  （ｍ，２Ｈ），２．２６  −  ２．１７  （ｍ，２Ｈ），２．１５  −  １．９５  （ｍ，２２Ｈ），１．９２  −  １．８４  （ｍ，９Ｈ），１．８０  −  １．７０  （ｍ，１０Ｈ），１．６５  −  １．３５  （ｍ，１７Ｈ）、１．３１  −  １．１９  （ｍ，４Ｈ），０．９６  （ｔ，Ｊ  ＝７．１  Ｈｚ，９Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８、［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１６６４．７２、実測値：１６６５．０３。
【０４０８】
（２−１−９）Ｌ−１０化合物の合成：
【０４０９】
【化５６】
2021504415.tif 000077
この工程において、Ｌ−９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ−１０化合物を調製した。
【０４１０】
工程（１−１−８）で得られたＬ−９複合分子（０．２３３ｇ、０．１１２６ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、０．０６４ｇ、０．１６８９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．０２９ｇ、０．２２５２ｍｍｏｌ）を混合し、１９ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（Ｈ２ＮＲｅｓｉｎ、０．９０１ｇ、１００〜２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を加え、２５℃でシェーカーで反応を行い、回転数２２０回転／分間、１５ｈ反応させた後に濾過し、ケーキをＤＣＭで１回あたり３０ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、３０ｍｌのエチルエーテルで１回リンスし、真空油ポンプで２ｈ乾燥させ、その後、表３に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング反応を行った。２５℃でシェーカーに放置し、回転数２００回転／分間で５ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキをアセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、乾燥させるまで吸引濾過し、真空油ポンプで一晩減圧乾燥させ、１．１００ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇのＬ−１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ−９複合分子）を得た。
【０４１１】
【表３】
2021504415.tif 000078
ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積％のＮ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニトリル溶液であった。
【０４１２】
以下の合成では、センス鎖及びアンチセンス鎖の配列は、それぞれ表４における複合体１のＳ配列とＡＳ配列に対応した。
【０４１３】
（２−２）センス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ−１０化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’−５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含む。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を含む。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。上記反応の条件は、前述した調製例１でセンス鎖を合成する際に用いられる条件が同じであった。
【０４１４】
（２−３）アンチセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、複合体１のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、前述した調製例１でアンチセンス鎖を合成する際に用いられる条件と同じであった。
【０４１５】
合成を完成した後、上記センス鎖及びアンチセンス鎖に対して、それぞれイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析し、測定された分子量と理論値を比較し、合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖を確認した。
【０４１６】
（２−４）複合体Ａ１の合成
Ｓ鎖とＡＳ鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を得、等モル比で混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純水装置で自作、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いて複合体を濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０６１．５７、実測値Ｓ：７５１６．６、ＡＳ：７０６０．４９であり、分子量の実測値が理論値と一致しており、式（４０３）に示される構造の目的複合体Ａ１を得たことを示した。
【０４１７】
（調製例３）本開示の複合体及び比較複合体の調製
前記複合体のｓｉＲＮＡ配列が、それぞれ表４Ａ〜４Ｇに示される対応する配列であったこと以外、調製例２と同じ方法により、表４Ａ〜４Ｇにおける複合体Ａ２〜Ａ７、Ｂ１〜Ｂ２、Ｃ２、Ｃ１２〜Ｃ１３、Ｄ２、Ｄ１２〜Ｄ１３、Ｅ１〜Ｅ４、Ｆ１〜Ｆ３、Ｇ１〜Ｇ３及び比較複合体Ａ２、Ｃ１、Ｄ１、Ｅ１、Ｆ１、Ｇ１を合成し、表４Ａ〜４Ｇに示される複合体Ａ８〜Ａ１１、Ｂ３〜Ｂ７、Ｃ１、Ｃ３、Ｄ１、Ｄ３、Ｅ５〜Ｅ９、Ｆ４〜Ｆ１１、Ｇ４〜Ｇ９を製造できると予期した。合成を完成した後、調製例２と同じ検出方法により得られた複合体を確認した。そのうち、
複合体Ａ２の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０６５．５８、実測値Ｓ：７５１６．６、ＡＳ：７０６４．５、
複合体Ａ３の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７１３９．６８、実測値Ｓ：７５１５．６、ＡＳ：７１３８．９、
複合体Ａ４の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０８１．６４、実測値Ｓ：７５１５．６、ＡＳ：７０８０．９、
複合体Ａ５の理論値Ｓ：８２１８．８３、ＡＳ：７７０３．０５、実測値Ｓ：８２１８、ＡＳ：７７０２．５、
複合体Ａ６の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：６９８５．５８、実測値Ｓ：７５１６．５、ＡＳ：６９８４．９、
複合体Ｂ１の理論値Ｓ：７４０７．２２、ＡＳ：７２０８．７７、実測値Ｓ：７４０６．４、ＡＳ：７２０８．１、
複合体Ｂ２の理論値Ｓ：７４０７．２２、ＡＳ：７１７０．７２、実測値Ｓ：７４０６．５、ＡＳ：７１７０．１、
複合体Ｃ２の理論値Ｓ：７４８５．３、ＡＳ：７１６１．７、実測値Ｓ：７４８４．４、ＡＳ：７１６０．９、
複合体Ｄ２の理論値Ｓ：７４２３．２２、ＡＳ：７２０７．７８、実測値Ｓ：７４２２．６、ＡＳ：７２０７．２、
複合体Ｆ２の理論値Ｓ：７６４９．５５、ＡＳ：６９９５．４７、実測値Ｓ：７６４８．８、ＡＳ：６９９４．８、
複合体Ｆ３の理論値Ｓ：７６４９．５５、ＡＳ：７０１１．５３、実測値Ｓ：７６４８．８、ＡＳ：７０１０．９、
複合体Ｅ１の理論値Ｓ：７５８４．５、ＡＳ：７００７．４６、実測値Ｓ：７５８４、ＡＳ：７００６．２、
複合体Ｅ２の理論値Ｓ：７５８４．５、ＡＳ：７０１１．４７、実測値Ｓ：７５８４、ＡＳ：７０１１．３、
複合体Ｅ４の理論値Ｓ：７５７２．４７、ＡＳ：６９０７．４１、実測値Ｓ：７５７１．８、ＡＳ：６９０６．９。
【０４１８】
分子量の実測値が理論値と一致しており、目的複合体を得たことを示した。これらの複合体は、いずれも式（４０３）に示される構造を有する。
【０４１９】
［表４］
ｓｉＲＮＡ複合体
【表４Ａ】
2021504415.tif 000079
2021504415.tif 000080
2021504415.tif 000081
【０４２０】
【表４Ｂ】
2021504415.tif 000082
2021504415.tif 000083
【０４２１】
【表４Ｃ】
2021504415.tif 000084
2021504415.tif 000085
【０４２２】
【表４Ｄ】
2021504415.tif 000086
2021504415.tif 000087
【０４２３】
【表４Ｅ】
2021504415.tif 000088
2021504415.tif 000089
【０４２４】
【表４Ｆ】
2021504415.tif 000090
2021504415.tif 000091
【０４２５】
【表４Ｇ】
2021504415.tif 000092
2021504415.tif 000093
＊Ｓ：センス鎖、ＡＳ：アンチセンス鎖
注釈：大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、ＶＰは、当該文字ＶＰの右側の１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Ｐは、当該文字Ｐの右側の１つのヌクレオチドがリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Ｐｓは、当該文字Ｐｓの右側の１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表す。
【０４２６】
以下の調製例４〜１２では、各種の複合分子を合成し、調製例２におけるＬ−１０化合物の代わりに、これらの複合分子をそれぞれ用い、表４Ａ〜４Ｇに示される対応する配列により、表４Ａ〜４Ｇにおける複合体Ａ１２〜Ａ１９、Ｂ８〜Ｂ１５、Ｃ４〜Ｃ１１、Ｄ４〜Ｄ１１、Ｅ１０〜Ｅ１７、Ｆ１２〜Ｆ１９及びＧ１０〜Ｇ１７を得ることができると予期した。
【０４２７】
（調製例４）Ｐ１０複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１２、Ｂ８、Ｃ４、Ｄ４、Ｅ１０、Ｆ１２及びＧ１０（以下、ともいうＰ−１０複合体）を合成できると予期した。
【０４２８】
（４−１）Ｐ−１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｐ−１０化合物を合成した。
【０４２９】
【化５７】
2021504415.tif 000094
【０４３０】
（４−１−１）ＧＡＬ５−Ｃ４−１の合成
４０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに上記工程（２−１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（１３．４３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、４−アミノ酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩（５．８７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１３．６５ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１１．６３ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を加え、均一に溶解させた後に室温で５時間攪拌反応させた。反応液に３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して３０．３ｇの油状物粗製品ＧＡＬ５−Ｃ４−１を得、そのまま次の反応を行った。
【０４３１】
（４−１−２）ＧＡＬ５−Ｃ４−２の合成
工程（４−１−１）で得られたＧＡＬ５−Ｃ４−１粗製品（３０．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）を１８０ｍｌギ酸に溶解させ、室温で１６時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出した）、反応溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計１４．８４ｇの目的生成物ＧＡＬ５−Ｃ４−２を得た。
【０４３２】
（４−１−３）Ｐ−６の合成：
工程（２−１−４）に記載された方法により得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工程（４−１−２）で得られたＧＡＬ５−Ｃ４−２（８．２４ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計８．２７ｇの純粋なＰ−６を得た。
【０４３３】
（４−１−４）Ｐ−７の合成：
上記（４−１−３）で得られたＰ−６（６．８２ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルで精製し、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計４．８２ｇのＰ−７を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ７８Ｈ１２７Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７３２．９１、実測値：１７３５．７３。
【０４３４】
（４−１−５）Ｐ−８の合成：
【０４３５】
【化５８】
2021504415.tif 000095
（Ａ−１）
Ｐ−７（２．６５３ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２．７９３ｇの純粋なＰ−８を得た。
【０４３６】
（４−１−６）Ｐ−９の合成：
Ｐ−８（４９０ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（６９ｍｇ、０．６９３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６８ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）を混合して２．３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１４９ｍｇ、１．１５５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２１ｈ攪拌反応させた。５０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、さらに１００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩を加えて反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、８０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２００ｍｇの純粋なＰ−９複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０６Ｈ１５３Ｎ１０Ｏ４１、［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１９２１．０５、実測値：１９２０．９７。
【０４３７】
（４−１−７）Ｐ−１０の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＰ−９複合分子を用い、固相担体に結合されたＰ−９複合分子を得たこと以外、調製例２における工程（２−１−９）と同じ方法により、Ｐ−１０を調製した。
【０４３８】
（４−２）Ｐ１０複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＰ−１０化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、複合体を調製した。構造が式（４０４）に示される複合体Ａ１２、Ｂ８、Ｃ４、Ｄ４、Ｅ１０、Ｆ１２及びＧ１０を得ることができると予期した。
【０４３９】
（調製例５）Ｒ５複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１３、Ｂ９、Ｃ５、Ｄ５、Ｅ１１、Ｆ１３及びＧ１１（以下、Ｒ５複合体ともいう）を合成できると予期した。
【０４４０】
（５−１）Ｒ−５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｒ−５化合物を合成した。
【０４４１】
【化５９】
2021504415.tif 000096
【０４４２】
（５−１−１）ＧＡＬ−Ｃ７−１の合成
工程（２−１−１ｂ）に記載された方法により得られたＧＡＬ−３（２６．４ｇ、８０．２ｍｍｏｌ）を１３４ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、６０ｇの４Å分子篩粉を加え、さらに７−オクテン−１−オール（１１．３ｇ、８８．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（８．９ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、水相を１００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相をあわせ、２５０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して３３．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ−Ｃ７−１を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
【０４４３】
（５−１−２）ＧＡＬ−Ｃ７−２の合成
工程（５−１−１）で得られたＧＡＬ−Ｃ７−１（３３．３ｇ、７２．８ｍｍｏｌ）を１６０ｍｌのジクロロメタンと１６０ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ２１６ｍｌの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム（６２．３ｇ、２９１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（４９８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加えて自然に室温まで昇温し２３時間攪拌反応させた。反応液に２００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを７．５に調節し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで３回抽出し、有機相を捨て、水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でカラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出した）により精製して２２．４ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ−Ｃ７−２を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ３２ＮＯ１１、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４７６．５０、実測値：４７５．９４。
【０４４４】
（５−１−３）Ｒ−１の合成：
工程（２−１−４）に記載された方法により得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）とＧＡＬ−Ｃ７−２（７．３６ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．８２ｇの純粋なＲ−１を得た。
【０４４５】
（５−１−４）Ｒ−２の合成：
Ｒ−１（６．２３ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．４９ｇの純粋なＲ−２を得た。
【０４４６】
（５−１−５）Ｒ−３の合成：
Ｒ−２（２．３９１ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．６４２ｇの純粋なＲ−３を得た。
【０４４７】
（５−１−６）Ｒ−４の合成：
Ｒ−３（７９５ｍｇ、０．４０７４ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８２ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、３０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して５０５ｍｇの純粋なＲ−４複合分子を得た。
【０４４８】
（５−１−７）Ｒ−５複合分子の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＲ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＲ−４複合分子を得たこと以外、調製例２における工程（２−１−９）と同じ方法により、Ｒ−５を調製した。
【０４４９】
（５−２）Ｒ５複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＲ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、Ｒ５複合体を調製した。構造が式（４０７）に示される複合体Ａ１３、Ｂ９、Ｃ５、Ｄ５、Ｅ１１、Ｆ１３及びＧ１１を得ることができると予期した。
【０４５０】
（調製例６）ＬＡ５複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１４、Ｂ１０、Ｃ６、Ｄ６、Ｅ１２、Ｆ１４及びＧ１２（以下、ＬＡ５複合体ともいう）を合成できると予期した。
【０４５１】
以下のプロセス経路により、ＬＡ−５化合物を合成できると予期した。
【０４５２】
【化６０】
2021504415.tif 000097
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＬＡ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、ＬＡ複合体を調製した。構造が式（４１２）に示される複合体Ａ１４、Ｂ１０、Ｃ６、Ｄ６、Ｅ１２、Ｆ１４及びＧ１２を得ることができると予期した。
【０４５３】
（調製例７）ＬＢ５複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１５、Ｂ１１、Ｃ７、Ｄ７、Ｅ１３、Ｆ１５及びＧ１３（以下、ＬＢ５複合体ともいう）を合成できると予期した。
【０４５４】
（７−１）ＬＢ−５化合物の合成
以下の方法に従い、ＬＢ−５化合物を合成した。
【０４５５】
【化６１】
2021504415.tif 000098
【０４５６】
（７−１−１）ＬＢ−１の合成：
工程（２−１−６）に記載された方法により得られたＬ−８（５．０ｇ、３．３８６ｍｍｏｌ）、アジピン酸無水物（８７０ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、８２７ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）を混合して１３０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２．２ｇ、１６．９３１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で４ｈ攪拌反応させた。７０ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで４回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．２〜１：１：１：１で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６７ｇの純粋なＬＢ−１を得た。
【０４５７】
（７−１−２）ＬＢ−２の合成：
工程（７−１−１）に記載された方法により得られたＬＢ−１（４．６９７ｇ、２．７５３ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）、３−アミノ−１，２−プロパンジオール（３１３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、９５３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（７００ｍｇ、６．８８４ｍｍｏｌ）を順に３０ｍｌのアセトニトリルと３ｍｌのメタノールの混合液に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、カラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０７〜１：０．５で勾配溶出した）により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、３．２７ｇの目的生成物ＬＢ−２を得た。
【０４５８】
（７−１−３）ＬＢ−３の合成：
ＬＢ−２（２．２７ｇ、１．３５３ｍｍｏｌ）を１４ｍｌの無水ピリジンで溶解させた。さらに４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド（６８８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩攪拌反応させた。１５０ｍｌのメタノールを加えてクエンチングし、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。カラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０５〜１：０．２で勾配溶出した）により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、１．６４７ｇの目的生成物ＬＢ−３を得た。
【０４５９】
（７−１−４）ＬＢ−４の合成：
ＬＢ−３（８２２ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８３ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１０２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＥＡ（２７０ｍｇ、２．０７５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で一晩攪拌反応させた。０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を３回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、５ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：２０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して７８７ｍｇの純粋なＬＢ−４複合分子を得た。
【０４６０】
（７−１−５）ＬＢ−５の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＬＢ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＬＢ−４複合分子を得たこと以外、調製例２における工程（２−１−９）と同じ方法により、ＬＢ−５を調製した。
【０４６１】
（７−２）ＬＢ５複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＬＢ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、ＬＢ５複合体を調製した。構造が式（４１３）に示される複合体Ａ１５、Ｂ１１、Ｃ７、Ｄ７、Ｅ１３、Ｆ１５及びＧ１３を得ることができると予期した。
【０４６２】
（調製例８）Ｖ８複合体の合成
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１６、Ｂ１２、Ｃ８、Ｄ８、Ｅ１４、Ｆ１６及びＧ１４（以下、Ｖ８複合体ともいう）を合成できると予期した。
【０４６３】
以下のプロセス経路により、Ｖ−８化合物を合成できると予期した。
【０４６４】
【化６２】
2021504415.tif 000099
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＶ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、Ｖ８複合体を調製した。構造が式（４１４）に示される複合体Ａ１５、Ｂ１２、Ｃ８、Ｄ８、Ｅ１４、Ｆ１６及びＧ１４（以下、Ｖ８複合体ともいう）を得ることができると予期した。
【０４６５】
（調製例９）Ｗ８複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１７、Ｂ１３、Ｃ９、Ｄ９、Ｅ１５、Ｆ１７及びＧ１５（以下、Ｗ８複合体ともいう）を合成できると予期した。
【０４６６】
（９−１）Ｗ−８化合物の合成
以下の方法に従い、Ｗ−８化合物を合成した。
【０４６７】
【化６３】
2021504415.tif 000100
【０４６８】
（９−１−１）Ｗ−１の合成：
Ｗ−０（２．０２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにトリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴で０℃程度まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ、５．８３５ｇの固形粗製品Ｗ−１を得た。
【０４６９】
（９−１−２）Ｗ−２の合成：
Ｗ−１粗製品（５．８３５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させた。２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、８．０１２ｇの固形粗製品Ｗ−２を得た。処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
【０４７０】
（９−１−３）Ｗ−３の合成：
Ｗ−２粗製品（８．０１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、さらに１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０ｗｔ％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００ｍｌの体積比１：１のＤＣＭ−メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて３．０６２ｇの純粋なＷ−３を得た。
【０４７１】
（９−１−４）Ｗ−４の合成：
Ｗ−３（０．６７５ｇ、１．５１７ｍｍｏｌ）とＧＡＬ−Ｃ７−２（２．６０ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．５７ｇ、１２．１４ｍｍｏｌ）を加え、最後に３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．８１６ｇ、６．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して１．６１０ｇの純粋なＷ−４を得た。
【０４７２】
（９−１−５）Ｗ−５の合成：
Ｗ−４（１．６１ｇ、０．８８６ｍｍｏｌ）を１２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸（３．５ｍｌ、４２．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させた。１５０ｍｌのピリジンを加えて反応液を中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．２６ｇの純粋なＷ−５を得た。
【０４７３】
（９−１−６）Ｗ−６の合成：
Ｗ−５（１．２５ｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）及び工程（２−１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（１．２１ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を混合して１２ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、０．７１２ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（０．６１５ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１８５ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．１〜１：１：０．７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．５７ｇの純粋なＷ−６を得た。
【０４７４】
（９−１−７）Ｗ−７の合成：
Ｗ−６（１．２３８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１８９ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．２３１ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を混合して７ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＥＡ（０．４０７ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、３０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．０３３ｇの純粋なＷ−７複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０１Ｈ１４６Ｎ７Ｏ３８、［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１７６３．９２、実測値：１７６３．２１。
【０４７５】
（９−１−８）Ｗ−８の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＷ−７複合分子を用い、固相担体に結合されたＷ−７複合分子を得たこと以外、調製例２における工程（２−１−９）と同じ方法により、Ｗ−８を調製した。
【０４７６】
（９−２）Ｗ８複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＷ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、Ｗ８複合体を調製した。構造が式（４１５）に示される複合体Ａ１７、Ｂ１３、Ｃ９、Ｄ９、Ｅ１５、Ｆ１７及びＧ１５を得ることができると予期した。
【０４７７】
（調製例１０）Ｘ８複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１８、Ｂ１４、Ｃ１０、Ｄ１０、Ｅ１６、Ｆ１８及びＧ１６（以下、Ｘ８複合体ともいう）を合成できると予期した。
【０４７８】
以下のプロセス経路により、Ｘ−８化合物を合成できると予期した。
【０４７９】
【化６４】
2021504415.tif 000101
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＸ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、Ｘ８複合体を調製した。本調製例では、以下の方法に従い、構造が式（４２１）に示される複合体Ａ１８、Ｂ１４、Ｃ１０、Ｄ１０、Ｅ１６、Ｆ１８及びＧ１６を合成できると予期した。
【０４８０】
（調製例１１）Ｚ５複合体の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合体Ａ１９、Ｂ１５、Ｃ１１、Ｄ１１、Ｅ１２、Ｆ１４及びＧ１２（以下、Ｚ５複合体ともいう）を合成できると予期した。
【０４８１】
（１１−１）Ｚ−５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｚ−５化合物を合成した。
【０４８２】
【化６５】
2021504415.tif 000102
【０４８３】
（１１−１−１）Ｚ−１の合成：
工程（９−１−３）に記載された方法により得られたＷ−３（１．５０ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）と工程（４−１−２）に記載された方法により得られたＧＡＬ５−Ｃ４−２（７．１８ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を混合して３４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（３．４８ｇ、２６．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、４．０４ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１〜１５：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して３．９７ｇの純粋なＺ−１を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９８Ｈ１４３Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９８７．９８、実測値：１９８７．９０。
【０４８４】
（１１−１−２）Ｚ−２の合成：
Ｚ−１（３．９７ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸（１０．９４１ｇ、８４．８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させた。ピリジンを加えて反応液を中性に中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、１０％ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、１‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１０：１〜２：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３．４９ｇの純粋なＺ−２を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ７９Ｈ１２９Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７４６．９４、実測値：１７４６．９０。
【０４８５】
（１１−１−３）Ｚ−３の合成：
Ｚ−２（３．４９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）と工程（２−１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（３．０６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を混合して３０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．８０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．５５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を１回あたり３０ｍｌで２回洗浄し、水相を１０ジクロロメタンで抽出し、有機相をあわせ、５０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、２００ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝２５：１〜１５：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．２ｇの純粋なＺ−３を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０３Ｈ１５１Ｎ１０Ｏ３８、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：２１３６．０２、実測値：２１３６．２０。
【０４８６】
（１１−１−４）Ｚ−４の合成：
Ｚ−３（２．１０ｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）をＤＩＥＡ（０．６３５ｇ、４．９１５ｍｍｏｌ）を含む１４．８ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２４０ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸無水物（１９７ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５０ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、８０ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１８８ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１０：１〜３：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．９５ｇの純粋なＺ−４複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０７Ｈ１５５Ｎ１０Ｏ４１、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９３５．０７、実測値：１９３５．２９。
【０４８７】
（１１−１−５）Ｚ−５の合成
Ｌ−９複合分子の代わりにＺ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＺ−４複合分子を得たこと以外、調製例２における工程（２−１−９）と同じ方法により、Ｚ−５を調製した。
【０４８８】
（１１−２）Ｚ５複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＺ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、Ｚ５複合体を調製した。構造が式（４２２）に示される複合体Ａ１９、Ｂ１５、Ｃ１１、Ｄ１１、Ｅ１７、Ｆ１９及びＧ１７を得ることができると予期した。
【０４８９】
（調製例１２）ＦＩＮ複合体の調製
本調製例では、表４Ａ〜４Ｇに示される複合体Ａ２０〜Ａ２３、Ｂ１６〜Ｂ１７、Ｃ１４、Ｄ１４、Ｅ１８〜Ｅ２０、Ｆ２０及び比較複合体Ａ１、Ｂ１（以下、ＦＩＮ複合体ともいう）を合成した。これらの複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表４Ａ〜４Ｇにおける対応する配列に示される。
【０４９０】
（１２−１）ＦＩＮ−２複合分子の合成
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３−９０８に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、ＦＩＮ−２複合分子を合成した。
【０４９１】
（１２−１−１）ＰＲＯ−１０の合成
【０４９２】
【化６６】
2021504415.tif 000103
【０４９３】
（１２−１−１ａ）ＰＲＯ−７の合成
２．９３ｇのＰＲＯ−６（Ｌ−ヒドロキシプロリン、ＣＡＳ番号：５１−３５−４、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２２．４ｍｍｏｌ）を２２．５ｍｌの１，４−ｄｉｏｘａｎｅ（１，４−ジオキサン、ＣＡＳ番号：１２３−９１−１）に溶解させ、３４ｍｌの１０％（ｗ／ｗ）Ｎａ２ＣＯ３の水溶液を加え、懸濁液状態にし、６．９５ｇのＦｍｏｃ−Ｃｌ（クロロギ酸−９−フルオレニルメチル、ＣＡＳ番号：２８９２０−４３−６、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２６．８ｍｍｏｌ）を３４ｍｌの１，４−ｄｉｏｘａｎｅに溶解させ、氷浴下で上記懸濁液中に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を１５０ｍｌの氷水に注入し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで１回あたり１００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨て、水相を濃ＨＣｌでｐＨ≦５になるように調節し、１００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して７．８３ｇの白色泡状固形製品ＰＲＯ−７を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９１  （ｔ，Ｊ  ＝７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．６７  （ｄ，Ｊ  ＝７．５  Ｈｚ，２Ｈ），７．４８  −  ７．３９  （ｍ，２Ｈ），７．３８  −  ７．２７  （ｍ，２Ｈ），５．１７  （ｓ，１Ｈ），４．２７  （ｓ，２Ｈ），４．２３  −  ４．１１  （ｍ，２Ｈ），３．５５  −  ３．４１  （ｍ，３Ｈ），２．３１  −  ２．１０  （ｍ，１Ｈ），２．０８  −  １．８８  （ｍ，１Ｈ）．  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ）  Ｃ２０Ｈ１９ＮＯ５  ［Ｍ−Ｈ］−３５２．１１９０、実測値：３５２．１０３３．
【０４９４】
（１２−１−１ｂ）ＰＲＯ−８の合成
７．８３ｇのＰＲＯ−７（２２．２ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのＴＨＦ（ＣＡＳ番号：１０９−９９−９）に溶解させ、油浴で６５℃に加熱し、還流状態で３６．６ｍｌの２ｍｏｌ／ＬのＢＨ３−Ｍｅ２ＳのＴＨＦ溶液（ＣＡＳ番号１３２９２−８７−０、Ｊ＆Ｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入、７３．２ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えてから３０分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後石油エーテルで３回精製して７．１ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−８を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９１  （ｔ，Ｊ  ＝６．７  Ｈｚ，２Ｈ），７．６７  （ｄ，Ｊ  ＝７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．４９  −  ７．３９  （ｍ，２Ｈ），７．３８  −  ７．２６  （ｍ，２Ｈ），５．１８  （ｄｄ，Ｊ  ＝６．１，３．８  Ｈｚ，１Ｈ），４．２８  （ｓ，２Ｈ），４．２３  −  ４．１３  （ｍ，２Ｈ），３．５５  −  ３．３８  （ｍ，２Ｈ），２．３２  −  ２．１１  （ｍ，１Ｈ），２．０８  −  １．８９  （ｍ，１Ｈ）．  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値  Ｃ２０Ｈ２１ＮＯ４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋３６２．１３６８、実測値：３６２．１０１２．
【０４９５】
（１２−１−１ｃ）ＰＲＯ−９の合成
７．１ｇのＰＲＯ−８（２１ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのピリジンに溶解させ、１４．２ｇのＤＭＴｒ−Ｃｌ（４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド、４２ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＤＭＴｒ−Ｃｌを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、８．２ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−９を得た。ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値  Ｃ４１Ｈ３９ＮＯ６  ［Ｍ＋Ｎａ］＋６６４．２６７５、実測６６４．２３４８，Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＪＪＳ１６０３２４−１）純度９４．２０％。
【０４９６】
（１２−１−１ｄ）ＰＲＯ−１０の合成
８．２ｇのＰＲＯ−９（１２．８ｍｍｏｌ）を６４ｍｌのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に溶解させ、４０ｍｌのピペリジン（３８４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌反応させた。反応液を３００ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり１５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で洗浄した後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＦｍｏｃを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、４．６５ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−１０を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．４０  （ｄ，Ｊ  ＝７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．３５  −  ７．１８  （ｍ，７Ｈ），６．９３  −  ６．８４  （ｍ，４Ｈ），４．５６  （ｄ，Ｊ  ＝３．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  （ｓ，１Ｈ），３．７４  （ｓ，６Ｈ），３．４６  −  ３．３７  （ｍ，１Ｈ），２．８８  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝１８．５，１０．０，５．５  Ｈｚ，２Ｈ），２．７５  （ｄｄ，Ｊ  ＝８．７，５．８  Ｈｚ，１Ｈ），２．６２  （ｄｄ，Ｊ  ＝１１．０，２．７  Ｈｚ，１Ｈ），１．７４  −  １．６５  （ｍ，１Ｈ），１．４０  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝１２．９，８．５，５．９  Ｈｚ，１Ｈ），ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値  Ｃ２６Ｈ２９ＮＯ４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋４４２．１９９４、実測４４２．１９９９，Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＪＪＳ１６０３２９−１）純度９７．０７％。
【０４９７】
（１２−１−２）ＦＩＮ−１の合成
【０４９８】
【化６７】
2021504415.tif 000104
（２−１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（４．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、順に３．９ｇのＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＡＳ番号：７０８７−６８−５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、３０ｍｍｏｌ）及び３．８ｇのＨＢＴＵ（ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳ番号：９４７９０−３７−２、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌し、工程（１１−１−１ｄ）で得られたＰＲＯ−１０（４．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、上記反応液に加え、反応液に無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、室温で２時間攪拌した。反応液を１２０ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり６０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ２０ｍｌの水、２０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去し、シリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからそれに試料を負荷し、１体積％トリエチルアミン及び１体積％メタノールを含むジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液で溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．５ｇの淡黄色泡状固形製品ＦＩＮ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８３  （ｄ，Ｊ  ＝９．２  Ｈｚ，１Ｈ），７．３２  （ｔ，Ｊ  ＝６．６  Ｈｚ，４Ｈ），７．２０  （ｔｄ，Ｊ  ＝８．９，３．５  Ｈｚ，５Ｈ），６．９３  −  ６．８４  （ｍ，４Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝３．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．０４  −  ４．９０  （ｍ，２Ｈ），４．４９  （ｓ，１Ｈ），４．４０  （ｄ，Ｊ  ＝４．４  Ｈｚ，０．８Ｈ），４．３１  （ｄ，Ｊ  ＝５．０  Ｈｚ，０．２Ｈ），４．１５  （ｓ，１Ｈ），４．０３  （ｓ，３Ｈ），３．９３  （ｓ，１Ｈ），３．７４  （ｓ、７Ｈ）、３．５９  （ｄｔ，Ｊ  ＝１２．０，６．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．５０  −  ３．４０  （ｍ，１Ｈ），３．３９  −  ３．２５  （ｍ，３Ｈ），３．１３  （ｄｄ，Ｊ  ＝８．９，５．２  Ｈｚ，１Ｈ），３．００  （ｄｑ，Ｊ  ＝９．３，５．３，４．３  Ｈｚ，１Ｈ），２．２２  （ｓ，２Ｈ），２．０７  （ｓ，３Ｈ），１．９９  （ｓ，３Ｈ），１．９０  （ｓ，４Ｈ），１．７４  （ｓ，３Ｈ），１．５０  （ｓ，３Ｈ），１．３６  （ｓ，１Ｈ）。Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＬＪ１６０４２２）純度９５．４５％。
【０４９９】
（１２−１−３）ＦＩＮ−２の合成
【０５００】
【化６８】
2021504415.tif 000105
工程（１２−１−２）で得られたＦＩＮ−１（３．０ｇ、３．５３ｍｍｏｌ）をアセトニトリルと共沸させて水を除去し、減圧吸引乾燥させ、１０ｍｌのＤＭＦに溶解させ（分子篩に浸して水を除去した）、窒素保護下で２．１３ｇのＰＡ（ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン、Ａｄａｍａｓ社から購入、商品番号１１３５６Ｂ、７．０６ｍｍｏｌ）、３４６ｍｇのテトラゾール（ＣＡＳ番号：２８８−９４−８、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、４．９４ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌反応させ、１０ｍｌのＤＭＦを追加し、１時間攪拌反応を続けた。溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、酢酸エチルで溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧留去し、４．５ｇの無色シロップ状粗製品を得た。粗製品を５０体積％アセトニトリル水溶液で完全に溶解するまで溶解させ、Ｃ−１８、３３０ｇ、３００Å中圧精製カラムでサンプルを精製し、カラムをまず１体積％ピリジンのアセトニトリル溶液でアルカリ化し、勾配溶出させて製品のピークを回収し、溶剤を減圧留去して２．２ｇの白色粉末製品ＦＩＮ−２複合分子を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １４８．０４，１４７．９４，１４７．６２，１４７．１９、リンスペクトル純度９２％、Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ純度９０．５４％。
【０５０１】
（１２−２）ＦＩＮ−２複合分子の固相担体への結合
核酸固相合成方法により、工程（１２−１−３）で得られたＦＩＮ−２複合分子を３回循環させることにより、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ）に結合し、複合基（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）のＲＮＡセンス鎖の３’末端への結合を実現した。
【０５０２】
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３−９０８に記載された調製方法を参照して上記結合を行い、具体的には、まず、上記汎用の固相担体から始まり、固相担体におけるヒドロキシ保護基を除去し、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下でＦＩＮ−２複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を行った後、固相担体に結合されたＦＩＮ複合分子を得た。当該固相担体に結合されたＦＩＮ複合分子におけるヒドロキシ保護基ＤＭＴｒを除去し、ＦＩＮ−２複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を行い、再び上記脱保護−カップリング−キャッピング−酸化工程を１回繰り返し、３番目のＦＩＮ−２複合分子を結合させ、固相担体に結合された複合基（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）を得た。
【０５０３】
上記反応において、上述した脱保護、カップリング、キャッピング、酸化は、反応条件、溶剤及び試薬用量が前述した調製例１に記載された核酸固相合成方法と同じであった。
【０５０４】
（１２−３）複合体Ｆ１〜Ｆ５の合成
１）工程（１２−２）で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、２）複合ｓｉＲＮＡが、表４Ａ〜４Ｇに示される複合体Ａ２０〜Ａ２３、Ｂ１６〜Ｂ１７、Ｃ１４、Ｄ１４、Ｅ１８〜Ｅ２０、Ｆ２０及び比較複合体Ａ１、Ｂ１に対応する配列を有すること以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、表題複合体を調製した。
【０５０５】
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値に一致しており、合成された複合体は、構造が式（３０７）に示される目的設計の化合物であることが確認された。
【０５０６】
（調製例１３）比較複合体Ａ３、Ｅ２、Ｆ２の調製
本調製例で比較複合体Ａ３、Ｅ２、Ｆ２を合成し、これらの複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表４Ａ、４Ｅ及び４Ｆに示される。
【０５０７】
（１３−１）（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の合成
ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１に記載された調製方法により化合物３０、即ち、以上のようなリンカー−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−及び標的基であるＮ−アセチルガラクトサミン分子（ここで、各ＬＡに１つのＮ−アセチルガラクトサミン分子が結合されてもよいので、１つのリンカーに３個のＮ−アセチルガラクトサミン分子が結合できる）を含む複合分子（（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子ともいう）を合成し、前記化合物３０の構造は、下式に示される。
【０５０８】
【化６９】
2021504415.tif 000106
【０５０９】
（１３−２）（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子の固相担体への結合
調製例２における工程（２−１−９）と同じ方法により、（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子を固相担体に結合し、固相担体に結合された（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子を得た。
【０５１０】
（１３−３）比較複合体Ａ３、Ｅ２、Ｆ２の合成
１）工程（１３−２）で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、２）複合ｓｉＲＮＡが表４Ａ、４Ｅ、４Ｆにおいて番号Ａ３、Ｅ２、Ｆ２に示される配列を有すること以外、調製例２における工程（２−２）、（２−３Ａ）、（２−４）と同じ方法により、比較複合体Ａ３、Ｅ２、Ｆ２を調製した。
【０５１１】
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値に一致しており、合成された複合体は、構造が式（３０５）に示される目的設計の化合物であることが確認された。
【０５１２】
上記本開示の複合体の調製が完了した後、使用のために、標準的な手段により固体粉末として凍結乾燥させて保存した。使用時、例えば注射用水を用いて改めて溶解させ所望の濃度の溶液として用いてもよい。
【０５１３】
以下、実験例を通じて以上の通り調製された本開示のｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ複合体の特性を研究した。
【０５１４】
以下、表４ＡのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
【０５１５】
（実験例Ａ１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の毒性について証明している。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、各マウス１匹あたり１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡとして計算）の複合体Ａ１をそれぞれ単回皮下投与し（０．９％塩化ナトリウム水溶液、濃度がそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬであり、投与体積が１０ｍＬ／ｋｇであり、濃度ごとに雌雄マウス各３匹に投与した）、その間に臨床観察を行ったところ、動物の死亡はなく、薬物の副作用に関連する臨床症状も認められておらず、投与した２４ｈ後、血液サンプルを採取して臨床病理学的検査を行い、動物を解剖した。その結果、臨床病理学的検査及び肉眼解剖のいずれにおいても異常が認められなかった。上記結果から明らかなように、本開示の複合体は、動物レベルの毒性が低い。
【０５１６】
（実験例Ａ２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を証明している
（実験例２−１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：比較複合体Ａ１及び複合体Ａ２１（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり６μｌ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのトリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社から購入、番号Ｒ０６１０ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈに５μｌの試料を取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
【０５１７】
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の上記複合体（２０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各複合体の参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記している。
【０５１８】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サンプルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図１に示した。
【０５１９】
図１は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果を示すものである。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間分解されずに維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
【０５２０】
（実験例Ａ２−２）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
被験サンプルが複合体Ａ１、Ａ６及び比較ｓｉＲＮＡ１であり、トリトソームとの培養時間がそれぞれ０ｈ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈであったこと以外、実験例２−１と同じ方法を採用した。
【０５２１】
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図２に示した。
【０５２２】
図２は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果を示すものである。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間分解されずに維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
【０５２３】
以上の図１及び図２の結果から、本開示の特定の修飾を有するｓｉＲＮＡは、リソソーム溶解液において満足できる安定性を示すことが示された。
【０５２４】
（実験例Ａ２−３）ヒト血漿における安定性
複合体Ａ１、Ａ６及び比較ｓｉＲＮＡ２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬのサンプルを取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとって使用に備えた。同時に、等モル量の被験サンプル（２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製し、Ｃｏｎと記した。２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルを４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）と混合した後、前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後イメージングを行った。結果を図３に示した。
【０５２５】
図３は、被験複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果を示すものである。
【０５２６】
図３の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿中で７２ｈまでも分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
【０５２７】
（実験例Ａ２−４）複合体のサル血漿における安定性
複合体Ａ１、Ａ６及び比較ｓｉＲＮＡ２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）を、１０８μＬの９０％カニクイザル血漿（Ｍｏｎｋｅｙ  ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳで希釈）とそれぞれ均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとって使用に備えた。同時に、等モル量の被験サンプル（２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、１０μＬサル血漿処理されていないサンプルとして調製し、Ｃｏｎと記した。２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルを４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）と混合した後、前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後イメージングを行った。結果を図４に示した。
【０５２８】
図４は、被験ｓｉＲＮＡの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示すものである。
【０５２９】
図４の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿中で７２ｈまでも分解されず、サル血漿における優れた安定性を示した。
【０５３０】
（Ａ２−５）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性を証明している
１）マウス由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：各６μｌの複合体Ａ２及び比較ｓｉＲＮＡ２（２０μＭ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｒ０６１０．ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が０．２ｍＵ／μＬであった。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、１、２、４、６、２４時間でそれぞれ混合液を５μｌ取り出し、１５μＬの９Ｍ尿素溶液に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
【０５３１】
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体Ａ２及び比較ｓｉＲＮＡ２（２０μＭ）を各１．５μｌとり、７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水とそれぞれ均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各サンプルの参照サンプルは、Ｍと記し、当該サンプルの電気泳動結果と比較するために用いる。
【０５３２】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サンプルのそれぞれ２０μｌをゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図５に示した。
【０５３３】
２）ヒト由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
マウス由来のリソソーム溶解液をヒト由来のリソソーム溶解液（Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｈ０６１０．Ｌ、ロット番号１６１０３１６）に変更したこと以外、１）と同じ方法により比較ｓｉＲＮＡ２及び複合体Ａ２のヒト由来のリソソーム溶解液における安定性を検出した。結果を図６に示した。
【０５３４】
結果から明らかなように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト由来のリソソーム溶解液及びマウス由来のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定性を示し、少なくとも２４時間分解されずに維持することが可能である。
【０５３５】
（実験例Ａ３）本実験では、複合体Ａ１のラット体内での薬物動力学的研究結果を示している
本実験例では、それぞれ各実験群のラット（１群あたり１０匹のラットであり、雌雄がそれぞれ半分であった）に皮下注射により複合体Ａ１を単回投与し、１０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの用量で実施した。その後、各時点でのラット血漿の薬物濃度及び肝臓、腎臓組織の薬物濃度を検出した。
【０５３６】
本実験例で用いたＳＤラットは、北京維通利華実験動物技術有限公司により提供された。
【０５３７】
まず、ＰＲＩＳＴＩＭＡ  ７．２．０版データシステムにより、ＳＤラットをラットの体重に応じて性別でランダムに分け、その後、設計された用量でそれぞれ各群の複合体に投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し、用量は１０及び５０ｍｇ／ｋｇであり、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を投与し、体積が１０ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前及び薬剤投与後の５分間（±３０秒）、３０分間（±１分間）、１時間（±２分間）、２時間（±２分間）、６時間（±５分間）、２４時間（±１０分間）、４８時間（±２０分間）、７２時間（±２０分間）、１２０時間（±３０分間）、１６８時間（±３０分間）でそれぞれ頸静脈からラット全血を採取した後、２〜８℃で遠心力１８００×ｇで１０分間遠心して血漿を単離し、血漿サンプルをチューブに約７０μＬ放置し、残りのサンプルを別のチューブに放置し、検出するまで、−７０〜−８６℃で冷凍保存した。それぞれ薬剤投与後の約２４、４８、７２、１２０、１６８時間で、対応するラットを、体重に応じてペントバルビタールナトリウムで麻酔させ（６０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射した）、腹大動脈から採血して安楽死させ、肉眼解剖を行うように、ラットの肝臓、腎臓組織を採取した。各ラットの肝臓、腎臓をサンプリングし、１ｍＬの冷凍保存チューブに保存し、検出・分析するまで、−６８℃以下で保存した。
【０５３８】
ＨＰＬＣ−ＦＬＤ（蛍光検出高速液体クロマトグラフィー）によりラット血漿及び肝臓、腎臓組織における複合体Ａ１の濃度を定量的に検出した。具体的には、以下の工程による。
【０５３９】
（１）組織塊が８０ｍｇ以下となるまで組織を粉砕した後、組織と細胞溶解液（Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、供給者：ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、番号：ＭＴＣ０９６Ｈ）を加えて６６．７ｍｇ／ｍＬの組織ホモジネートとして調製した。
（２）細胞を破砕するために組織ホモジネートを超音波（１５０Ｗ、３０ｓ）処理した。
（３）組織サンプルについては、組織サンプル７５μＬを９６ウェルのＰＣＲプレートに加え、５μＬのプロテアーゼＫ（供給者：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号：２５５３０−０１５）、１０μＬの１０ｗｔ％アセトニトリル及び０．０１ｗｔ％ツウィーン２０の混合水溶液を加え、血漿サンプルについては、血漿２０μＬを９６ウェルのＰＣＲプレートに加え、４５μＬの組織と細胞溶解液、５μＬのプロテアーゼＫ、２０μＬの１０ｗｔ％アセトニトリル及び０．０１ｗｔ％ツウィーン２０の混合水溶液を加えた。
（４）プレートをシールし、ＰＣＲ器（供給者：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、型番：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００）に放置し、６５℃で４５分間培養した。
（５）培養終了後、１０μＬの３Ｍ  ＫＣｌの水溶液（供給者：Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、番号：６０１３５−２５０ＭＬ）を加え、振とうして均一にし、４℃、３２００ｒｃｆで１５分間遠心した。
（６）組織サンプルに対して、上清液８０μＬを１２０μＬのハイブリッド混合液に加え（ハイブリッド混合液の調製：０．５ｍＬの６μＭ  ＰＮＡプローブ（供給者：杭州泰禾生物科技有限公司）、１ｍＬの２００ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ／ｐＨ＝８、５ｍＬの８Ｍ尿素水溶液、３．５ｍＬのＨ２Ｏ、２ｍＬのアセトニトリル）、
血漿サンプルに対して、上清液４０μＬを１６０μＬのハイブリッド混合液に加えた（ハイブリッド混合液の調製：０．５ｍＬの６μＭ  ＰＮＡプローブ、１ｍＬの２００ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ／ｐＨ＝８、５ｍＬの８Ｍ尿素水溶液、７．５ｍＬのＨ２Ｏ、２ｍＬのアセトニトリル）。
（７）プレートをシールし、ＰＣＲ器に放置し、９５℃で１５分間培養し、直ちに氷の上に５分間放置した。
（８）別の円錐底９６ウェルプレートに移し、振とうして均一にした。３２００ｒｃｆで１分間遠心した。
（９）サンプルを負荷して検出し、ＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析して定量した（液相系供給者：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、クロマトグラフ型番：ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００）。
【０５４０】
分析結果は、図７〜図１０に示した。図７〜図１０は、それぞれ投与量が１０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示している。具体的には、
図７は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
【０５４１】
図８は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
【０５４２】
図９は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
【０５４３】
図１０は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体Ａ１のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示したものである。
【０５４４】
図７〜図１０の結果から分かるように、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）であっても比較的高用量（５０ｍｇ／ｋｇ）であっても、複合体Ａ１のラット血漿における濃度は、いずれも急速に数時間で検出限界以下まで低下したが、肝臓組織においては、いずれも少なくとも１６８ｈ以内は、高い安定したレベルの組織濃度が維持された。このことから、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、特異的に肝臓において顕著に富化して安定化でき、高度な標的性を有することが示された。
【０５４５】
（実験例Ａ４）本実験では、本開示のＲＮＡ複合体の体内での（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を証明している
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて複合体Ａ５及びＡ７によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０５４６】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原診断キット（酵素結合免疫吸着測定法）（上海科華生物）を用いてマウス血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出し、Ｓ／ＣＯＶ＞１０のマウスを選択し、マウスを４匹／群でランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ複合体Ａ５及び複合体Ａ７で番号を付けるとともに、ＮＳ対照群を追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ／ｋｇの異なる用量で投与し、薬物を０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の１４日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０５４７】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現量を検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びβ−アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ−アクチンを検出した。
【０５４８】
検出プライマーの配列を表５Ａに示した。
【０５４９】
【表５Ａ】
2021504415.tif 000107
【０５５０】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現量は、ＨＢＶ  Ｘ遺伝子発現残量で表され、以下の等式により算出された。
【０５５１】
ＨＢＶ  Ｘ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ  Ｘ遺伝子のコピー数／試験群β−アクチンのコピー数）／（対照群ＨＢＶ  Ｘ遺伝子のコピー数／対照群β−アクチンのコピー数）×１００％。図においてＨＢＶ  Ｘ／β−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量と記した。
【０５５２】
その後、下式により複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率を算出した。
【０５５３】
複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率＝（１−ＨＢＶ  Ｘ遺伝子発現残量）×１００％
【０５５４】
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図１１に示した。
【０５５５】
他の実験において、以下の条件でそれぞれいくつかのの実験を行った。
【０５５６】
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ａ１及び複合体Ａ６に変更して試験を行い、１４日目に検出データを回収したこと以外、上記と同じ方法を採用した。結果を図１２に示した。
【０５５７】
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４に変更して試験を行い、１群あたりの動物は５匹であり、２８日目に検出データを回収し、各複合体に対して、１ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与した（投与体積を変えることなく複合体溶液の濃度を相応的に調整した）こと以外、上記と同じ方法を採用した。結果をそれぞれ図１３に示した。
【０５５８】
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ａ１と比較複合体Ａ３に変更して試験を行い、１４日目に検出データを回収し、各複合体に対して、１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与した（投与体積を変えずに複合体溶液の濃度を相応的に調整した）こと以外、上記と同じ方法を採用した。結果をそれぞれ図１４に示した。
【０５５９】
上記結果から分かるように、試験時点が異なる複数回の試験において、上記本開示の複合体は、いずれも高いマウス体内ＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制活性を示した。
【０５６０】
（実験例Ａ５）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶトランスジェニックマウスにおけるｓｉＲＮＡの血清ＨＢｓＡｇ発現量及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する抑制効率の時間関連性試験を説明している
ＡＡＶ−ＨＢＶマウスを用い、動物のモデリングに成功した後、血清におけるＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（５匹／群）、それぞれ複合体Ａ１、比較複合体Ａ２、比較複合体Ａ３投与及びＮＳブランク対照とした。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、濃度がそれぞれ０．３ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を使用し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前（Ｄ０と記した）及び薬剤投与後の７、１４、２１、２８、５６、８４、１１２、１４０、１５４、１６８、１８２日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。その間、検出結果から、血清におけるＨＢｓＡｇの含有量が初期値に近くなった、又はそれを超えた場合、当該対象の検出を停止させた。
【０５６１】
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの発現含有量を検出し、ＱＩＡａｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ説明書を参照して血清におけるＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行い、ＨＢＶ  ＤＮＡの発現レベルを検出した。
【０５６２】
標準化されたＨＢｓＡｇの発現レベル＝（薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
【０５６３】
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
【０５６４】
ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
【０５６５】
標準化されたＨＢＶ  ＤＮＡの発現レベル＝（薬剤投与後のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
【０５６６】
ＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
【０５６７】
ここで、ＨＢＶ  ＤＮＡ含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数で表される。
【０５６８】
結果を図１５及び図１６に示した。
【０５６９】
図１５の結果から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＮＳ陰性対照群は、いかなる抑制作用も示さなかったのに対して、各複合体は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢｓＡｇに対して、いずれも優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示した。特に、複合体Ａ１は、１４０日間という長期間にわたって高い血清ＨＢｓＡｇ抑制率を示し続け、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制できることを示した。
【０５７０】
図１６の結果から分かるように、複合体Ａ１は、同様に効率的なＨＢＶ  ＤＮＡ発現抑制を示し、８４日間と長期間にわたって高い抑制率を維持した。
【０５７１】
それに対して、比較複合体Ａ２及び比較複合体Ａ３は、体内実験において各複合体と近いｍＲＮＡ抑制効果を得たが、図１５〜１６に示される抑制効果の持続時間が同じ投与レベルの複合体１及び６より明らかに弱くなった。
【０５７２】
以下の点を除いて上記と同じ方法により、さらに２回実験を行い、血清ＨＢｓＡｇを検出した。
【０５７３】
Ｍ−Ｔｇモデルを採用し、複合体Ａ６を用い、用量はそれぞれ５、１、０．２ｍｇ／ｋｇであり、また、５ｍｇ／ｋｇの比較複合体Ａ３を用い、７８日目まで試験を行った。結果を図１７に示した。
【０５７４】
１．２８ｃｏｐｙモデルを採用し、複合体Ａ１を用い、用量は３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、２１０日目まで試験を行った。結果を図１８及び図１９に示した。
【０５７５】
上記異なる用量について、いずれも投与体積が同じとして、溶液の濃度を相応的に調整して対応する用量で投与した。
【０５７６】
図１５〜１９から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、複数種の動物モデルにおいて、いずれも持続的で効率的な血清ＨＢｓＡｇ抑制効率を示し、規律的な用量依存性を示した。
【０５７７】
（実験例Ａ６）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
【０５７８】
（Ａ６−１）本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０５７９】
本実験例では、複合体Ａ１の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びオフターゲット効果を調べ、即ち、複合体Ａ１が、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が複合体Ａ１のアンチセンス鎖／センス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）又はシード領域がマッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が複合体Ａ１のアンチセンス鎖／センス鎖の１〜８位のヌクレオチド配列と相補的である）を標的する活性を測定した。
【０５８０】
Ｋｕｍｉｃｏ  Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ  ｓｅｅｄ  ａｒｍ  ｉｓ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６−２１５１に記載された方法により、検出プラスミドを構築し、被評価ｓｉＲＮＡ複合体と共にＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェクションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮＡ複合体のオンターゲット活性及びオフターゲット効果を反映した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０５８１】
［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより４つの組換えプラスミドを構築した。そのうち、ＧＳＣＭは、オンターゲットプラスミドを表し、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭは、オフターゲットプラスミドを表す。
（１）ＧＳＣＭは、被験複合体（本例では複合体Ａ１）におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
（２）ＰＳＣＭは、複合体Ａ１におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全てと完全に一致している目的配列を含む。
（３）ＧＳＳＭは、複合体Ａ１においてアンチセンス鎖の５’端から１〜８位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残りの部分が複合体１においてアンチセンス鎖の５’端から９〜２１位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、複合体１においてアンチセンス鎖の５’端から９〜２１位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ又はＵである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ又はＧである目的配列を含む。
（４）ＰＳＳＭは、複合体Ａ１においてセンス鎖の５’端から１〜８位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残りの部分が複合体Ａ１においてセンス鎖の５’端から９〜１９位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的でない、即ち、複合体Ａ１においてセンス鎖の５’端から９〜１９位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ又はＵである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ又はＧである目的配列を含む。ＧＳＳＭ標的配列の長さに等しくするために、目的配列の３’末端に２つのＣＣを加えた。
【０５８２】
目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２プラスミドのＸｈｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ部位にクローニングした。
【０５８３】
［２］トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書に従って、ｓｉＲＮＡと上記各プラスミドをそれぞれコトランスフェクションし、プラスミドごとにいくつかのグループの特定の濃度の複合体１が対応している。プラスミドをウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用いた。ＧＳＣＭオンターゲットプラスミドに対して、複合体Ａ１の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）が１００ｎＭから、０．０００１ｎＭまで１１個の濃度に４倍希釈した。１群あたり３個の複製ウェルがあった。
【０５８４】
［３］検出
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用説明書に従ってＨＥＫ２９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。各特定の濃度の試験群では、複合体処理なしを対照（ｃｏｎ）とした。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベル（Ｆｉｒ）に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベル（Ｒｅｎ）で標準化した。
【０５８５】
ｓｉＲＮＡの異なる濃度で測定された活性結果から、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ５．０ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  ｖｓ．  ｒｅｓｐｏｎｓｅ―Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ機能により用量−効果曲線をフィッティングし、用量−効果曲線から以下の算出方法により被験ｓｉＲＮＡのＧＳＣＭを標的したＩＣ５０値を算出した。
【０５８６】
【数１】
2021504415.tif 000108
式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
【０５８７】
用量−効果曲線から、複合体Ａ１のＧＳＣＭを標的したＩＣ５０値を算出した。結果を図２０Ａ〜２０Ｄに示した。その結果から、ＧＳＣＭに対応して、複合体Ａ１のＩＣ５０が０．０５１３ｎＭであり、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭに対応して、複合体Ａ１は、ｓｉＲＮＡの各濃度でいずれも明らかな抑制効果が認められなかったことが示され、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することが証明された。
【０５８８】
上記結果から分かるように、複合体Ａ１は、オンターゲットプラスミドにおける標的ｍＲＮＡの発現に対して優れた抑制効果を示し、低いＩＣ５０値を有するが、３本のオフターゲットプラスミドの発現に対して、いずれも抑制作用がなかった。複合体Ａ１は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効率を有することを示すとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することが分かった。
【０５８９】
以下、表４ＢのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
【０５９０】
（実験例Ｂ１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での抑制活性を証明している
（実験例Ｂ１−１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０５９１】
本実験例では、複合体Ｂ１６及び複合体Ｂ１７の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット効果を調べ、即ち、複合体Ｂ１６及び複合体Ｂ１７が、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が前記複合体のアンチセンス鎖／センス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）又はシード領域がマッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が前記複合体のアンチセンス鎖／センス鎖の１〜８位のヌクレオチド配列と相補的である）を標的する活性を測定した。
【０５９２】
Ｋｕｍｉｃｏ  Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ  ｓｅｅｄ  ａｒｍ  ｉｓ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６−２１５１に記載された方法により、検出プラスミドを構築し、被評価ｓｉＲＮＡ複合体と共にＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェクションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮＡ複合体のオンターゲット活性を反映した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０５９３】
［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより、被験複合体（複合体Ｂ１６又は複合体Ｂ１７）におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含むオンターゲットプラスミドを構築した。目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２プラスミドのＸｈｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ部位にクローニングした。
［２］トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書に従って、ｓｉＲＮＡ複合体及び上記プラスミドをそれぞれコトランスフェクションし、プラスミドはウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用い、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出）は順に０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ及び０．０１ｎＭであった。各群では、複合体処理なしを対照とした。１群あたり３個の複製ウェルがあった。
ＮＣは、ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ社からの、目的遺伝子配列と相同性のない汎用の陰性対照Ｂ０１００１であった。
［３］検出
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用説明書に従ってＨＥＫ２９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベルに対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベルで標準化した。結果を図２１に示した。
【０５９４】
結果から明らかなように、複合体Ｂ１６及び複合体Ｂ１７はいずれも良好な体外抑制活性を有する。
【０５９５】
（実験例Ｂ１−２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット効果
本実験例では、複合体Ｂ２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット効果を調べた。
【０５９６】
複合体Ｂ２に対応する配列を用いて４本の目的配列を構築し、希釈濃度は０．１ｎＭから０．０００１ｎＭに倍加希釈し、各群のプラスミドが１１群のｓｉＲＮＡ濃度に対応していること以外、実験例Ａ６の方法により複合体Ｂ２に対して試験を行った。試験結果を図２２に示した。
【０５９７】
図２２から分かるように、複合体Ｂ２は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効果を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を示した。
【０５９８】
（実験例Ｂ２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を証明している
（実験例Ｂ２−１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：複合体Ｂ１及び複合体Ｂ２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり６μｌ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのトリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社から購入、番号Ｒ０６１０ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０ｈ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈに５μｌの試料（サンプル）を取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
【０５９９】
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の対応する複合体（２０μＭ）を１．５μｌとり、７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記されている。
【０６００】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サンプルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図２３に示した。
【０６０１】
図２３は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果を示すものである。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間分解されずに維持し、優れた安定性を示すことが示された。
【０６０２】
（実験例Ｂ２−２）ｓｉＲＮＡ複合体のヒト血漿における安定性
複合体Ｂ１、複合体Ｂ２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後各サンプルを１０μＬずつとって使用に備えた。同時に、等モル量のｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ濃度は２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製し、Ｃｏｎと記した。
【０６０３】
２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルと４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）を混合した後、前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後イメージングを行った。結果を図２４に示した。
【０６０４】
図２４は、被験複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果を示すものである。
【０６０５】
図２４の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿中で７２ｈまでも分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
【０６０６】
（実験例Ｂ２−３）ｓｉＲＮＡ複合体のサル血漿における安定性
他の実験において、実験例２−２と同じ方法により複合体Ｂ１、Ｂ２のサル血漿（Ｍｏｎｋｅｙ  ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳで希釈）における安定性を検出した。結果を図２５に示した。
【０６０７】
図２５は、被験ｓｉＲＮＡの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示すものである。
【０６０８】
図２５の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿中で７２ｈまでも分解されず、サル血漿における優れた安定性を示した。
【０６０９】
（実験例Ｂ３）本実験例では、本開示の複合体によるマウスにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制を証明している
本実験例では、複合体Ｂ１によるＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０６１０】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスを血清におけるＨＢｓＡｇの含有量別マウスを４匹／群でランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ番号を付けるとともに、ＮＳ対照群を追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ／ｋｇの異なる用量で複合体Ｂ１を投与し、濃度がそれぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を使用し、投与体積が５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の７日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０６１１】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びＧＡＰＤＨを検出した。
【０６１２】
検出プライマーの配列を表５Ｂに示した。
【表５Ｂ】
2021504415.tif 000109
【０６１３】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ｓｉＲＮＡ抑制活性は、ＨＢＶ遺伝子発現残量で表され、以下の等式により算出された。
【０６１４】
ＨＢＶ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／試験群ＧＡＰＤＨのコピー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群ＧＡＰＤＨのコピー数）×１００％
【０６１５】
その後、下式によりｍＲＮＡ抑制率を算出した。
【０６１６】
ｍＲＮＡ抑制率＝（１−ＨＢＶ遺伝子発現残量）×１００％
【０６１７】
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図２６に示した。
【０６１８】
他の実験において、以下の条件でそれぞれ実験を２回を行った。
【０６１９】
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ｂ２に変更して試験を行い、７日目に検出データを回収し、結果を図２７に示し、
投与するｓｉＲＮＡ複合体を複合体Ｂ１、複合体Ｂ２に変更して試験を行い、複合体Ｂ１について、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与し、複合体Ｂ２を１ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、検出配列を表５Ｃに示される配列に変更し、結果を図２８に示したこと以外、上記と同じ方法を採用した。
【０６２０】
【表５Ｃ】
2021504415.tif 000110
【０６２１】
図２７及び図２８の結果から分かるように、上記本開示の複合体は、標的ｍＲＮＡに対していずれも良好な抑制効果を示し、異なるＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制効果がほぼ一致した。
【０６２２】
（実験例Ｂ４）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶトランスジェニックマウスにおけるｓｉＲＮＡの血清ＨＢｓＡｇ発現量及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する抑制効率の時間関連性試験について説明している
ＡＡＶ−ＨＢＶ低濃度モデルマウスに対して、血清におけるＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（５匹／群）、それぞれ複合体Ｂ２及びＮＳブランク対照を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの２群であり、濃度がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を使用し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８、５６、８４、９８、１１２、１２６、１４０日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。
【０６２３】
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出した。ＱＩＡａｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ説明書を参照して血清におけるＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行い、ＨＢＶ  ＤＮＡの発現レベルを検出した。
【０６２４】
ＨＢｓＡｇ抑制率は、以下の等式により算出された。
【０６２５】
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
【０６２６】
ＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率は、以下の等式により算出された。
【０６２７】
ＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
【０６２８】
ここで、ＨＢＶ  ＤＮＡ含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数で表される。
【０６２９】
結果を図２９に示した。
【０６３０】
図２９の結果から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＮＳ陰性対照群は、いかなる抑制作用も示さなかったのに対して、複合体Ｂ２は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢｓＡｇに対して、いずれも優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示し、１００日間程度の長期間にわたって高い血清ＨＢｓＡｇ抑制率を示し続け、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制できることを示した。
【０６３１】
さらなる実験では、上記方法により、１．２８ｃｏｐｙモデルマウスにおいて、複合体Ｂ２を用い、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの２つの用量群で投与し、濃度がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液を使用し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであり、投与時間を８５日間まで維持し、上記の方法によりＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡの抑制効果を検出した。結果を図３０と３１に示した。
【０６３２】
図３０と３１の結果から分かるように、１．２８ｃｏｐｙマウスにおいて、本開示の複合体Ｂ２は、８５日間にわたってＨＢＶ遺伝子発現及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する効率的な抑制を示し続けた。
【０６３３】
以下、表４ＣのｓｉＲＮＡ複合体の性質実験を説明する。
【０６３４】
（実験例Ｃ１）本実験では、表のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を証明している
（実験例Ｃ１−１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：複合体Ｃ２（ｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり６μｌ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのトリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社から購入、番号Ｒ０６１０ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０ｈ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈに５μｌの試料を取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
【０６３５】
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体Ｃ２（２０μＭ）１．５μｌを７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記した。
【０６３６】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サンプルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図３２に示した。
【０６３７】
図３２は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのリソソームにおける安定性の半定量的検出結果を示すものである。結果から、本開示の複合体は、リソソームにおいて長期間分解されずに維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
【０６３８】
（実験例Ｃ１−２）ｓｉＲＮＡ複合体のヒト血漿における安定性
複合体Ｃ２（ｓｉＲＮＡ濃度２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとって使用に備えた。同時に、等モル量のｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ濃度は２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製し、Ｃｏｎと記した。
【０６３９】
２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルと４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）を混合した後、前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後イメージングを行った。結果を図３３に示した。
【０６４０】
図３３の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿中で７２ｈまでも分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
【０６４１】
（実験例Ｃ１−３）ｓｉＲＮＡ複合体のサル血漿における安定性
他の実験において、実験例Ｃ１−２と同じ方法により複合体Ｃ２のサル血漿（Ｍｏｎｋｅｙ  ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳで希釈）における安定性を検出した。結果を図３４に示した。
【０６４２】
図３４は、被験ｓｉＲＮＡの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示すものである。
【０６４３】
図３４の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿中で７２ｈまでも分解されず、サル血漿における優れた安定性を示した。
【０６４４】
（実験例Ｃ２）本実験例では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での抑制活性を証明している
（実験例Ｃ２−１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
複合体Ｃ１４の配列により目的配列を構築したこと以外、実験例Ｂ１−２の方法により複合体Ｃ１４を検出した。結果を図３５に示した。結果から明らかなように、複合体Ｃ１４は、良好な体外抑制活性を有している。
【０６４５】
（実験例Ｃ２−２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０の測定
複合体Ｃ２の配列により目的配列を構築し、試験濃度が０．１ｎＭから０．０００１ｎＭに倍加希釈し、各群の配列を１１個の濃度で測定したこと以外、実験例Ａ６の方法により複合体Ｃ２を検出した。結果を図３６に示した。
【０６４６】
図３６から分かるように、複合体Ｃ２は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効果を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を示した。
【０６４７】
（実験例Ｃ３）本実験例では、マウスにおいて本開示の複合体によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制を証明している
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて複合体Ｃ２によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０６４８】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスマウスを４匹／群でランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ番号を付け、生理食塩水ＮＳ対照群を追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回投与（皮下投与）し、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ／ｋｇの異なる用量で複合体Ｃ２を投与し（それぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供）、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の７日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０６４９】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びβ−アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ−アクチンを検出した。
【０６５０】
検出プライマーの配列を表５Ａに示した。
【０６５１】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ｓｉＲＮＡ抑制活性は、ＨＢＶ遺伝子発現残量で表され、以下の等式により算出された。
【０６５２】
ＨＢＶ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／試験群β−アクチンのコピー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群β−アクチンのコピー数）×１００％。図においてＨＢＶ  Ｘ／β−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量と記した。
【０６５３】
その後、下式によりｍＲＮＡ抑制率を算出した。
【０６５４】
ｍＲＮＡ抑制率＝（１−ＨＢＶ  Ｘ遺伝子発現残量）×１００％
【０６５５】
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図３７に示した。
【０６５６】
図３７の結果から分かるように、本開示の複合体による標的ｍＲＮＡに対する抑制率は９３．８％に達し、良好な抑制効果を示した。
【０６５７】
（実験例Ｃ４）本実験では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のＭ−Ｔｇモデルへの単回投与によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  Ｘ  ｍＲＮＡに対する抑制作用を証明している
ＨＢＶトランスジェニック（Ｍ−ＴｇＨＢＶ）マウス（上海市公衆衛生センター動物部から購入）を血清におけるＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（６匹／群、いずれも雄性）、それぞれ生理食塩水（ＮＳ）対照群、複合体Ｃ２  １ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ群であった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、投与体積が１０ｍｌ／ｋｇであり、単回皮下投与した。薬剤投与前（Ｄ０と記した）及び薬剤投与後の第７、１４、２１、２８、４２、５６、７０、８５日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。
【０６５８】
１回あたり約０．５ｍｌ眼窩採血し、遠心後の血清が２００μｌ以上であった。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出した。
【０６５９】
標準化された血清ＨＢｓＡｇレベル＝（薬剤投与後の試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前の試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
【０６６０】
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
【０６６１】
以下の図３８及び図３９は、上記試験ｓｉＲＮＡ複合体のＭ−Ｔｇモデルへの単回投与によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  Ｘ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制作用の検出結果を示している。
【０６６２】
図３８及び図３９の結果から分かるように、３ｍｇ／ｋｇ単回投与した複合体Ｃ２は、２１日間でＨＢｓＡｇに対する９０％以上と高い抑制率を維持した。また、３ｍｇ／ｋｇの複合体Ｃ２は、８５日目にＨＢＶ  Ｘ  ｍＲＮＡ  に対して依然として高い抑制率を有している。
【０６６３】
以下、表４ＤのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
【０６６４】
（実験例Ｄ１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を示している
（実験例Ｄ１−１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
実験例Ｃ１−１の方法に基づいて、複合体Ｄ２の体外リソソーム溶解液における安定性に対して試験を行った。結果を図４０に示した。
【０６６５】
図４０は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのリソソームにおける安定性の半定量的検出結果を示すものである。結果から、本開示の複合体は、リソソームにおいて長期間分解されずに維持し、非常に良好な安定性を示すことが示された。
【０６６６】
（実験例Ｄ１−２）ｓｉＲＮＡ複合体のヒト血漿／サル血漿における安定性
実験例Ｃ１−２、Ｃ１−３の方法に基づいて、複合体Ｄ２の体外でのヒト血漿、体外でのカニクイザル血漿における安定性に対してそれぞれ試験を行った。結果を図４１、図４２に示した。
【０６６７】
図４１及び図４２の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿／サル血漿中で７２ｈまでも分解されず、優れた安定性を示した。
【０６６８】
（実験例Ｄ２）本実験例では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での抑制活性を証明している
（実験例Ｄ２−１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
本実験例に用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０６６９】
複合体Ｄ１４の配列に基づいて目的配列を構築し、各配列について、０．１ｎＭから０．０００１ｎＭに倍加希釈し、１１個の濃度点で各配列を測定したこと以外、実験例Ａ６の方法により複合体Ｄ１４を検出した。結果を図４３に示した。結果から明らかなように、複合体Ｄ１４は、良好な体外抑制活性を有する。
【０６７０】
（実験例Ｄ２−２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０の測定
本実験例では、複合体Ｄ２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０を調べた。
【０６７１】
複合体Ｄ２の配列に基づいて４本の目的配列を構築し、各配列について、０．１ｎＭから０．０００１ｎＭに倍加希釈し、１１個の濃度点で各配列を測定したこと以外、実験例Ｂ１−２の方法により複合体Ｄ２を測定した。結果を図４４に示した。図４４から分かるように、複合体Ｄ２は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効果を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を示した。
【０６７２】
（実験例Ｄ３）本実験例では、マウスにおいて本開示の複合体によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制を証明している
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて複合体Ｄ２によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０６７３】
実験例Ｃ３に記載された方法に基づいて、複合体Ｄ２を検出した。結果を図４５に示した。
【０６７４】
図４５の結果から分かるように、本開示の複合体による標的ｍＲＮＡに対する抑制率は、良好な抑制効果を示し、１ｍｇ／ｋｇの投与量で、標的ｍＲＮＡに対する抑制率が９３．６３％に達し、より低い濃度（０．１ｍｇ／ｋｇ）の投与量で、依然として７７．０５％の抑制率を有し、良好な抑制効果を示した。
【０６７５】
（実験例Ｄ４）本実験では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のＭ−Ｔｇモデルへの単回投与によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  Ｘ  ｍＲＮＡに対する抑制作用を証明している
ＨＢＶトランスジェニック（Ｍ−ＴｇＨＢＶ）マウス（上海市公衆衛生センター動物部から購入）を血清におけるＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（６匹／群、いずれも雄性）、それぞれ生理食塩水（ＮＳ）対照群、複合体Ｄ２  １ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ群であった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、投与体積が１０ｍｌ／ｋｇであり、単回皮下投与した。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８、４２、５６、７０、８５日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。
【０６７６】
１回あたり約０．５ｍｌ眼窩採血し、遠心後の血清が２００μｌ以上であった。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出した。ＨＢｓＡｇ発現残量は、以下の等式により算出された。
【０６７７】
ＨＢｓＡｇ発現残量＝（試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量／ＮＳ対照群におけるＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
【０６７８】
以下の図４６及び図４７には、上記試験ｓｉＲＮＡ複合体のＭ−Ｔｇモデルへの単回投与によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  Ｘ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制作用の検出結果が示された。
【０６７９】
図４６及び図４７の結果から分かるように、３ｍｇ／ｋｇ単回投与した複合体Ｄ２は、５０日間でＨＢｓＡｇに対する高い抑制を維持し、抑制率が９０％以上であり、最大抑制率が９５％以上であった。また、３ｍｇ／ｋｇの複合体Ｄ２は、８５日目にＨＢＶ  Ｘ  ｍＲＮＡに対して依然として６２％の抑制率を有している。
【０６８０】
以下、表４ＥのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
【０６８１】
（実験例Ｅ１）ｓｉＲＮＡの体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系における活性抑制及びオフターゲット効果の検出
本実験例では、ｓｉＲＮＡ  Ｅ１、Ｅ４及び比較ｓｉＲＮＡ３の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット効果を調べ、即ち、それぞれ３本のｓｉＲＮＡが、完全マッチングした目的配列又はシード領域がマッチングした目的配列を標的する活性を測定した。
【０６８２】
検出された配列により４本の目的配列を構築し、検出濃度が５ｎＭから、０．００００８ｎＭに３倍希釈し、計１１個の濃度としたこと以外、実験例Ｂ１−２の方法により試験を行った。比較ｓｉＲＮＡ  ３による４つの組換えプラスミドの発現に対する抑制については、図４８Ａ〜４８Ｄを参照する。ｓｉＲＮＡ  Ｅ１による４つの組換えプラスミドの発現に対する抑制については、図４９Ａ〜４９Ｄを参照する。図面から分かるように、未修飾比較ｓｉＲＮＡ  ３は、５ｎＭで、ＧＳＳＭとＰＳＣＭの発現に対して約２０％の抑制率があり、アンチセンス鎖のシード領域のオフターゲット効果及びセンス鎖のオフターゲット効果をわずかに示した。しかし、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡ  Ｅ１は、いかなるオフターゲット効果も認められなかった。ｓｉＲＮＡＥ４とｓｉＲＮＡ  Ｅ１は、発現が一致しており、いかなるオフターゲット効果も認められなかった。
【０６８３】
ｓｉＲＮＡの異なる濃度で測定された活性結果に基づき、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ５．０ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  ｖｓ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ−Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ機能によって用量−効果曲線をフィッティングし、用量−効果曲線から、以下の算出方法により被験ｓｉＲＮＡのＧＳＣＭを標的するＩＣ５０値を算出した。結果を表５に示した。
【０６８４】
【数２】
2021504415.tif 000111
式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
【０６８５】
【表６Ｅ】
2021504415.tif 000112
【０６８６】
表６Ｅから、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡは、体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系において非常に高い抑制活性を有し、ＩＣ５０が３〜３０ｐＭにあり、同時に、５ｎＭでも、各被験修飾ｓｉＲＮＡにいかなるオフターゲット効果も検出されなかった。
【０６８７】
（実験例Ｅ２）ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ複合体の体外細胞系における抑制活性の検出
（実験例Ｅ２−１）ｓｉＲＮＡのＨｕｈ７細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率の検出。
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用いて被験ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡＥ１、Ｅ２、Ｅ４）をヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７にトランスフェクションし、ｓｉＲＮＡの最終濃度はそれぞれ５ｎＭ、０．２５ｎＭ及び０．０５ｎＭであった。各濃度につき２つの複製ウェルがあった。いかなるｓｉＲＮＡ処理も施していない細胞をブランク対照（Ｂｌａｎｋ）とした。
【０６８８】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）によりそれぞれ各濃度のｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨｕｈ７細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量を検出した。具体的な工程としては、トランスフェクションした細胞を２４時間培養した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により細胞における全ＲＮＡを抽出し、それぞれ１μｇの全ＲＮＡをとり、逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ａ３５００）を用いてその説明書の操作方法により逆転写してｃＤＮＡを得た。２×Ｕｌｔｒａ  ＳＹＢＲ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｗｉｔｈ  ＲＯＸ）（北京康為世紀生物科技有限公司、番号ＣＷ０９５６）キットを用い、ｃＤＮＡをテンプレートとして説明書の手順によりＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量を検出した。ＡＮＧＰＴＬ３及び内因性参照遺伝子であるＧＡＰＤＨの増幅のためのＰＣＲプライマーは、表５Ｅに示すとおりである。
【０６８９】
【表５Ｅ】
2021504415.tif 000113
【０６９０】
ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現レベルは、ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量＝（試験群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量）×１００％という等式により算出された。ｓｉＲＮＡによるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率は、（１−ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量）×１００％であった。ここで、各試験群は、それぞれ各濃度のｓｉＲＮＡで処理されたＨｕｈ７細胞であり、対照群は、ｓｉＲＮＡで処理されていないＨｕｈ７細胞であった（図５０Ａにおいて「ブランク」と記される）。結果を図５０Ａに示した。
【０６９１】
図５０Ａから分かるように、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡは、Ｈｕｈ７細胞系において高い抑制活性を有する。
【０６９２】
（実験例Ｅ２−２）Ｈｕｈ７細胞におけるｓｉＲＮＡ複合体によるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率の検出。
被験サンプルが複合体Ｅ１８、Ｅ１９であり、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量として）がそれぞれ５０ｎＭ及び５ｎＭであったこと以外、実験例２−１と同じ方法により検出した。各複合体による体外での抑制活性は、図５０Ｂに示すとおりである。
【０６９３】
図５０Ｂから分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、Ｈｕｈ７細胞系において高い抑制活性を有し、５ｎＭの複合体のＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率が６０〜８０％に達した。
【０６９４】
（実験例Ｅ２−３）Ｈｕｈ７細胞におけるｓｉＲＮＡ複合体のＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対するＩＣ５０の測定。
被験サンプルが複合体Ｅ１８、Ｅ１９であり、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量として）が５０ｎＭから、０．０１６ｎＭに５倍希釈し、最低濃度を０．００００１ｎＭとし、計７個の濃度であり、１群あたり３個の複製ウェルがあったこと以外、実験例Ｅ２−１と同じ方法により検出した。
【０６９５】
他の実験において、被験サンプルが複合体Ｅ２であり、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量として）が２ｎＭから、０．００７８ｎＭに倍加希釈し、計９個の濃度であり、１群あたり２個の複製ウェルがあった。
【０６９６】
他の実験において、被験サンプルが複合体Ｅ１、Ｅ４であり、複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量として）が０．５ｎＭから、０．０３１２５ｎＭに倍加希釈し、最高濃度を５ｎＭとし、計６個の濃度であり、１群あたり２個の複製ウェルがあった。
【０６９７】
ｓｉＲＮＡ複合体の異なる濃度で測定されたＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率から、実験例１と同じ方法によりＩＣ５０を算出し、被験複合体の体外Ｈｕｈ７細胞におけるＩＣ５０値が得られた。結果を表７に示した。
【０６９８】
【表７Ｅ】
2021504415.tif 000114
【０６９９】
表７Ｅから分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、体外細胞系において非常に高い抑制活性を有し、ＩＣ５０が０．０８５〜０．３８３ｎＭであった。
【０７００】
（実験例Ｅ３）ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ複合体の血漿及びリソソームにおける安定性の検出
（実験例Ｅ３−１）ｓｉＲＮＡのリソソームにおける安定性の検出。
本実験例では、ｓｉＲＮＡ  Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４のマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を調べた。
【０７０１】
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：６μｌの各ｓｉＲＮＡ（２０μＭ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｒ０６１０．ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が０．２ｍＵ／μＬであった。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、１、２、４、６、２４時間でそれぞれ混合液を５μｌ取り出し、１５μＬの９Ｍ尿素溶液に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
【０７０２】
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量のｓｉＲＮＡ（２０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各ｓｉＲＮＡの参照サンプルは、電気泳動図においてＭと記される。
【０７０３】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サンプルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図５１Ａに示した。
【０７０４】
図５１Ａから分かるように、本開示により提供される修飾ｓｉＲＮＡは、マウス由来のリソソームにおいて少なくとも２４時間安定して存在することができる。
【０７０５】
（実験例Ｅ３−２）ｓｉＲＮＡ複合体のリソソームにおける安定性の検出。
本実験例では、複合体Ｅ１とＥ４のマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を調べた。
【０７０６】
被験サンプルが複合体Ｅ１及び複合体Ｅ４であり、複合体の濃度をｓｉＲＮＡの量とし、検出時点が０時間、５分間、１５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、６時間であったこと以外、実験例３−１と同じ方法により検出した。ゲルイメージングは、図５１Ｂに示すとおりである。
【０７０７】
図５１Ｂから分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、マウス由来のリソソームにおいて少なくとも１時間分解されず、その後電気泳動における主バンドは、下へわずかにシフトしたに過ぎず、対応するｓｉＲＮＡのリソソーム溶解液における高度な安定性に鑑みて、バンドシフトは、複合基において単糖の開裂である可能性があり、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、満足できる安定性を示したことが示唆された。
【０７０８】
（実験例Ｅ３−３）ｓｉＲＮＡ複合体の血漿における安定性の検出。
本実験例では、複合体Ｅ１とＥ４のヒト血漿における安定性を調べた。
【０７０９】
複合体Ｅ１とＥ４及び比較ｓｉＲＮＡ  ３（ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体の濃度がいずれも２０μＭ、１２μｌであり、複合体をｓｉＲＮＡの量とした）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬの試料（サンプル）を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとり、同時に、等モル量のｓｉＲＮＡ（２μＭ、２μｌ）又はｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ濃度は２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製し、Ｍと記した。
【０７１０】
２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記サンプルと４μｌの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルー）を均一に混合した後、試料をゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間程度電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図５１Ｃに示した。
【０７１１】
図５１Ｃから分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト血漿中で７２ｈまでも分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
【０７１２】
他の実験において、上記と同じ方法により複合体Ｅ１とＥ４のサル血漿における安定性を検出した。結果を図５１Ｄに示した。
【０７１３】
結果から明らかなように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト血漿及びサル血漿においていずれも少なくとも７２時間安定して存在し、優れた安定性を示すことができる。
【０７１４】
（実験例Ｅ４）マウス体内でのｓｉＲＮＡ複合体のＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率の検出、及び脂質に対する抑制効果の検出。
（実験例Ｅ４−１）正常マウスＣ５７体内でのｓｉＲＮＡ複合体のＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対するＥＤ５０の測定。
本実験例では、複合体Ｅ１８とＥ１９の正常マウスＣ５７体内での抑制活性を調べた。
【０７１５】
６〜８週齢の正常マウスＣ５７を５匹／群でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体Ｅ１８、Ｅ１９及びＰＢＳを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、各ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲＮＡの量として）がそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇであり、複合体Ｅ１８とＥ１９の最低用量が０．００３ｍｇ／ｋｇであり、各試験群の投与体積が１０ｍＬ／ｋｇであった。各ｓｉＲＮＡ複合体は、それぞれＰＢＳ水溶液として提供され、用量と投与体積により、複合体について設定すべき薬物濃度を換算した。薬剤投与後３日にマウスを死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、その後、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して肝組織の全ＲＮＡを得た。
【０７１６】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現レベルを検出し、具体的には、逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ａ３５００）を用いてその説明書の操作方法により逆転写してｃＤＮＡを得た。２×Ｕｌｔｒａ  ＳＹＢＲ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｗｉｔｈ  ＲＯＸ）（北京康為世紀生物科技有限公司、番号ＣＷ０９５６）キットを用い、ｃＤＮＡをテンプレートとして説明書の手順によりＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量を検出した。ＡＮＧＰＴＬ３及び内因性参照遺伝子であるＧＡＰＤＨの増幅のためのＰＣＲプライマーは、表８Ｅに示すとおりである。
【０７１７】
【表８Ｅ】
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【０７１８】
ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量は、ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量＝［（試験群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量）］×１００％という等式により算出された。
【０７１９】
複合体によるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率は、抑制率＝［１−（試験群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群β−Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群β−Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量）］×１００％という等式により算出された。対照群は、本実験においてＰＢＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。
【０７２０】
ｓｉＲＮＡ複合体の異なる濃度で測定されたＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率から、実験例Ｅ１と同じ方法によりＥＤ５０を算出し、被験複合体による正常マウス体内でのＥＤ５０値を得た。結果を表９Ｅに示した。
【０７２１】
【表９Ｅ】
2021504415.tif 000116
【０７２２】
表９Ｅから分かるように、試験された複合体による正常マウス体内での抑制活性は、実験例２−３における対応する複合体の体外細胞系における抑制活性と高度に一致しており、ＥＤ５０が０．１４０３〜０．１５９５ｎＭであり、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、正常マウス体内において非常に高い抑制活性を有することが示された。
【０７２３】
（実験例Ｅ４−２）ｓｉＲＮＡ複合体による正常マウスＢＡＬＢ／ｃ体内でのＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率及び脂質に対する影響
本実験例では、複合体Ｅ１８、Ｅ２０による正常マウスＢＡＬＢ／ｃ体内での肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
【０７２４】
６〜８週齢の正常マウスＢＡＬＢ／ｃを１０匹／群でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体Ｅ１８、Ｅ２０、比較複合体Ｅ２及びＰＢＳを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲＮＡの量として）が３ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの２つの用量群であり、投与体積が１０ｍＬ／ｋｇであった。各ｓｉＲＮＡ複合体は、それぞれＰＢＳ水溶液として提供され、用量と投与体積により、複合体について設定すべき薬物濃度を換算した。薬剤投与前と薬剤投与後の７日目と１４日目に動物に対して眼窩静脈採血を行い、各時点で血清脂質レベルを検出した。薬剤投与後の７日目と１４日目にそれぞれ５匹のマウスを死亡させ、肝臓を回収し、肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。
【０７２５】
１回あたり約１００μＬで眼窩静脈採血を行い、遠心して血清を得、さらにＰＭ１Ｐ０００／３全自動血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ、イタリア）を用いて血清における総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を検出した。
【０７２６】
標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。
【０７２７】
脂質レベルの抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。
【０７２８】
薬剤投与後の７日目のマウスの脂質の含有量を図５２Ａ〜５２Ｂに示し、薬剤投与後の１４日目のマウスの脂質の含有量を図５２Ｃ〜５２Ｄに示した。
【０７２９】
図５２Ａ〜５２Ｄから分かるように、試験されたｓｉＲＮＡ複合体により正常マウスの脂質レベルを顕著に低下させることができ、薬剤投与後の１４日に、３ｍｇ／ｋｇの本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、脂質低下能力が陽性対照（比較複合体Ｅ２）よりも強くなった。
【０７３０】
実験例Ｅ４−１と同じ方法により、蛍光定量的リアルタイムＰＣＲによりｓｉＲＮＡ複合体による肝ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を検出した。結果を表１０Ｅに示した。
【０７３１】
【表１０Ｅ】
2021504415.tif 000117
【０７３２】
他の実験において、投与された複合体が複合体Ｅ１、Ｅ４及び比較複合体Ｅ２であり、検出時間が薬剤投与後の１４日目と２８日目であったこと以外、上記と同じ方法によりマウスの脂質及びＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量を検出した。各複合体によるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制効果については、図５３Ａ〜５３Ｄを参照し、脂質に対する抑制効果を５４Ａ〜５４Ｄに示した。
【０７３３】
図５３Ａ〜５３Ｄから分かるように、薬剤投与後の１４日目に、高用量での本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体によるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制率が９５％以上と高く、その抑制強度は明らかに比較複合体Ｅ２よりも優れていた。低用量の本開示のｓｉＲＮＡ複合体について、観察時間を薬剤投与後の２８日目まで延長したところ、試験されたｓｉＲＮＡ複合体は、いずれも正常マウスの肝組織ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する強い抑制作用を示し、かつ、その抑制強度が明らかに比較複合体よりも高くなった。
【０７３４】
図５４Ａ〜５４Ｄから分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体で治療されたマウス血清におけるＣＨＯとＴＧの含有量は明らかに低下し、かつ、少なくとも２８日目にも依然として一定の脂質低下効果を示した。３ｍｇ／ｋｇの本開示のｓｉＲＮＡ複合体による脂質を低下させる能力については、陽性対照（比較複合体Ｅ２）よりも強くなった。
【０７３５】
（実験例Ｅ４−３）ｓｉＲＮＡ複合体による肥満マウス体内でのＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率及び脂質に対する影響
本実験例では、複合体Ｅ１８によるｏｂ／ｏｂマウス体内での肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
【０７３６】
６〜８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを６匹／群とし、投与された複合体が複合体Ｅ１８であり、用量が３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇであり、採血時間が薬剤投与前２日（−２日と記した）及び薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３４日目であり、３４日目にマウスを死亡させたこと以外、実験例Ｅ４−２と同じ方法によりｏｂ／ｏｂマウスの脂質及びＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量を検出した。複合体Ｅ１８による脂質に対する抑制効果については、図５５Ａ〜５５Ｂを参照し、ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制効果を５５Ｃに示した。
【０７３７】
図から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体で治療されたマウス血清におけるＣＨＯとＴＧの含有量は明らかに低下し、かつ、少なくとも３４日目にも依然として一定の脂質低下効果を示した。同時に、薬剤投与後の３４日目に、各ｓｉＲＮＡ複合体は、依然としてＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現を効率的に抑制することができる。
【０７３８】
（実験例Ｅ４−４）高脂血症モデルマウス体内でのｓｉＲＮＡ複合体による脂質に対する影響
本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内での複合体Ｅ１による肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
【０７３９】
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスＴｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅを血清ＴＧの含有量＞２ｍｍｏｌ／Ｌで６匹／群でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体Ｅ１、比較複合体Ｅ１及びＰＢＳブランク対照を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲＮＡの量として）が３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、体積が５ｍｌ／ｋｇであった。各ｓｉＲＮＡ複合体は、それぞれＰＢＳ水溶液として提供され、用量と投与体積により、複合体について設定すべき濃度を換算した。薬剤投与前（−１日と記した）と薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３５、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４、１６８日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、実験例４−２と同じ方法により各時点での脂質レベルを検出した。結果を図５６Ａと５６Ｂに示した。
【０７４０】
図５６Ａと５６Ｂから分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＰＢＳブランク対照群及び比較複合体Ｅ１陰性対照群は、脂質に対していかなる抑制作用も示さなかったのに対して、複合体Ｅ１によりＴＧ及びＣＨＯを明らかに低下させることができる。ＴＧについては、高用量群の最大抑制率が薬剤投与後の７日目に現れ、９２．９％であり、低用量群の最大抑制率が薬剤投与後の２１日目に現れ、７９．１％であった。高用量群については、単回薬剤投与後の１５４日間と長期間にわたって、ＴＧに対する抑制率が常に５５％以上に維持され、低用量群については、単回薬剤投与後の９８日間と長期間にわたって、ＴＧに対する抑制率が常に５５％以上に維持された。ＣＨＯについては、高用量群の最大抑制率が薬剤投与後の１４日目に現れ、８２．９％であり、低用量群の最大抑制率が薬剤投与後の１４日目に現れ、６５．９％であった。高用量群については、単回薬剤投与後の１５４日間と長期間にわたって、ＣＨＯに対する抑制率が常に４０％以上に維持され、低用量群については、単回薬剤投与後の５６日間と長期間にわたって、ＣＨＯに対する抑制率が常に４０％以上に維持された。図５６Ａと５６Ｂから、複合体Ｅ１を単回投与後の１６８日間に脂質レベルを持続的、安定的且つ効率よく低下させることができることを示した。
【０７４１】
他の実験において、投与された複合体が複合体Ｅ２及び比較複合体Ｅ２であり、薬剤投与後の７０日目まで脂質を検出したこと以外、上記と同じ実験方法を採用した。その結果を図５７Ａ〜５７Ｄに示した。
【０７４２】
図５７Ａと５７Ｂには、薬剤投与後の異なる時点で、２つの用量での複合体Ｅ２によるＣＨＯに対する抑制効果が示されている。高用量群については、単回薬剤投与後の２１日でＣＨＯの最大抑制率が７４．３％に達し、薬剤投与後の７０日間と長期間にわたって、ＣＨＯの抑制率が常に５０％以上に維持された。低用量群については、ＣＨＯの最大抑制率が薬剤投与後の１４日で現れ、５９．５％であった。
【０７４３】
図５７Ｃ及び５７Ｄには、薬剤投与後の異なる時点で、２つの用量での複合体２によるＴＧに対する抑制効果が示されている。高用量群については、単回薬剤投与後の１４日でＴＧの最大抑制率が９６．３％に達し、薬剤投与後の７０日間と長期間にわたって、ＴＧの抑制率が常に７０％以上に維持された。低用量群については、ＴＧの最大抑制率が薬剤投与後の１４日で現れ、７５．３％であった。
【０７４４】
図５７Ａ〜５７Ｄから分かるように、複合体Ｅ２は、単回投与した７０日間で脂質レベルを持続的に低下させることができ、明らかに同じ用量での比較複合体Ｅ２よりも優れていた。
【０７４５】
（実験例Ｅ５）非ヒト霊長類体内でのｓｉＲＮＡ複合体によるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率の検出、及び脂質に対する抑制効果の検出。
メタボリックシンドロームのサル１２匹（全て雄性）をランダムに分け、８匹に複合体Ｅ２を投与し、４匹に比較複合体Ｅ１を投与した。各ｓｉＲＮＡ複合体をそれぞれ注射用生理食塩水で溶解させ、薬物濃度（ｓｉＲＮＡの量として）が１００ｍｇ／ｍｌであった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、用量はいずれも９ｍｇ／ｋｇであり、注射量は０．０９ｍｌ／ｋｇであり、各注射点は２ｍｌ以下であった。
【０７４６】
薬剤投与前３週間に、週に１回静脈採血し、脂質、肝機能、定期血液検査等の指標を検出した。薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３５日目にそれぞれ再び上記各項の指標を検出した。
【０７４７】
標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。
脂質レベルの抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。
【０７４８】
薬剤投与前の脂質の含有量は、薬剤投与前３週間の脂質の含有量の平均値であり、０日目（Ｄ０）の基準データとして記した。脂質抑制効果については、図５８Ａ〜５８Ｂを参照する。
【０７４９】
図５８Ａ〜５８Ｂから、単回薬剤投与後の２８日目に、薬剤投与前に対して、複合体Ｅ２によるＴＧに対する最大抑制率が６８％に達し、ＣＨＯに対する最大抑制率が３０％に達したことが示された。
【０７５０】
肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現レベルを検出するために、投与当日（投与前と記した）及び薬剤投与後の２８日目に肝穿刺生検を行った。蛍光定量的リアルタイムＰＣＲの検出方法は、検出プライマーが異なること以外、実験例４−１と同じであった。用いられたプライマー配列を表１１Ｅに示した。ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ抑制率については、図５８Ｃを参照する。
【０７５１】
【表１１Ｅ】
2021504415.tif 000118
【０７５２】
図５８Ｃから、単回投与２８日目以後、薬剤投与前に対して、複合体Ｅ２のＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制率が８３％に達したことが示されている。
【０７５３】
薬剤投与後の各時点で他の指標を検出したところ、血小板、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ−ｐｙｒｕｖｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）の異常変化が認められておらず、複合体Ｅ２が比較的安全であり、明らかな毒性副作用が認められなかったことが示された。
【０７５４】
図５８Ａ〜５８Ｃから分かるように、複合体Ｅ２は、非ヒト霊長類において明らかな脂質低下及びＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制効果を示すとともに、比較的安全性を示した。
【０７５５】
上記結果から明らかなように、本発明により提供されるｓｉＲＮＡ及び複合体は、肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現を効率的に低下させ、血中総コレステロール、トリグリセリド含有量を低下させることができ、脂質異常を予防及び／又は治療することができ、臨床への応用の将来性がある。
【０７５６】
以下、表４ＦのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
【０７５７】
（実験例Ｆ１）本実験では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での抑制活性を調べた
（実験例Ｆ１−１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
本実験例では、複合体Ｆ２０の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性を調べ、即ち、複合体Ｆ２０が、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が前記複合体のアンチセンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）を標的する活性を測定した。
【０７５８】
実験例Ａ１−６に示される方法により複合体Ｆ２０に対して試験を行い、結果を図５９に示した。結果から明らかなように、複合体Ｆ２０は、良好な体外抑制活性を有する。
【０７５９】
（実験例Ｆ１−２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０の測定
本実験例では、複合体Ｆ１の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０を調べた。
【０７６０】
実験例Ｆ１−１と同じ方法により複合体Ｆ１のオンターゲットプラスミドを構築し、複合体Ｆ１の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）が１ｎＭから、０．００１ｎＭまで１１個の濃度に倍加希釈した。異なる複合体の濃度で測定された活性結果から、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ５．０ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  ｖｓ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ−Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ機能により用量−効果曲線をフィッティングし、用量−効果曲線から、複合体Ｆ１のＩＣ５０値を算出した。
【０７６１】
【数３】
2021504415.tif 000119
式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
【０７６２】
検出したところ、複合体Ｆ１の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０が０．０１７４ｎＭであり、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有することが示された。
【０７６３】
（実験例Ｆ１−３）体外細胞系におけるＩＣ５０の測定
本実験例では、複合体Ｆ２による体外Ｈｕｈ７細胞におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０７６４】
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用いて複合体Ｆ２をヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７にトランスフェクションし、ｓｉＲＮＡ複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量として）が３ｎＭから、０．００４ｎＭまで７個の濃度に３倍希釈した。各濃度につき２つの複製ウェルがあった。
【０７６５】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）によりそれぞれ各濃度の複合体Ｆ２がトランスフェクションされたＨｕｈ７細胞におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量を検出した。具体的な工程としては、トランスフェクションした細胞を２４時間培養した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により細胞における全ＲＮＡを抽出し、それぞれ１μｇの全ＲＮＡをとり、逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ａ３５００）を用いてその説明書の操作方法により逆転写してｃＤＮＡを得た。２×Ｕｌｔｒａ  ＳＹＢＲ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｗｉｔｈ  ＲＯＸ）（北京康為世紀生物科技有限公司、番号ＣＷ０９５６）キットを用い、ｃＤＮＡをテンプレートとして説明書の手順によりＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現量を検出した。ここで、ＡＰＯＣ３及び内因性参照遺伝子であるβ−ａｃｔｉｎの増幅のためのＰＣＲプライマーは、表５Ｆに示すとおりである。
【０７６６】
【表５Ｆ】
2021504415.tif 000120
【０７６７】
ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現量は、ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現量＝［（試験群ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群β−Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群β−Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量）］×１００％という等式により算出された。
【０７６８】
複合体によるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率は、抑制率＝［１−（試験群ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群β−Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群β−Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量）］×１００％という等式により算出された。ここで、各試験群は、それぞれ各濃度の複合体２で処理されたＨｕｈ７細胞であり、対照群は、複合体Ｆ２で処理されていないＨｕｈ７細胞であった。
【０７６９】
複合体Ｆ２の異なる濃度で測定されたＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率から、実験例Ｆ１−２と同じ方法によりＩＣ５０を算出し、複合体Ｆ２の体外Ｈｕｈ７細胞におけるＩＣ５０が０．００８５ｎＭであり、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有することが示された。
【０７７０】
（実験例Ｆ２）本実験では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体による体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた
（実験例Ｆ２−１）本実験例では、ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内での複合体Ｆ１による肝臓組織におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率を調べた。
【０７７１】
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６、ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ）をトリグリセリド含有量が２ｍｍｏｌ／Ｌより大きくなるように、５匹／群でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体Ｆ１、比較複合体Ｆ１及び生理食塩水ＮＳを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲＮＡの量として）は１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの２つの用量群であり、複合体はそれぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。薬剤投与後の１４日目にマウスを死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、その後組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して肝組織の全ＲＮＡを得た。
【０７７２】
実験例Ｆ１−３と同じ蛍光定量的リアルタイムＰＣＲ方法により肝組織におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＡＰＯＣ３に対するプライマー及びβ−アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＡＰＯＣ３及びβ−アクチンの発現量を検出した。
【０７７３】
検出プライマーの配列を表６Ｆに示した。
【０７７４】
【表６Ｆ】
2021504415.tif 000121
【０７７５】
複合体によるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率は、抑制率＝［１−（試験群ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群β−Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群β−Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現量）］×１００％という等式により算出された。対照群は、本実験において生理食塩水が施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図６０に示した。
【０７７６】
結果から、複合体Ｆ１は、トランスジェニックマウスにおけるヒトＡＰＯＣ３遺伝子に対して顕著な抑制作用を有することが示された。
【０７７７】
（実験例Ｆ２−２）本実験例では、複合体Ｆ１によるカニクイザル体内での肝臓組織におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現レベルに対する抑制率、及び脂質レベルに対する影響を調べた。
【０７７８】
当該実験例は、蘇州華測生物技術有限公司に委託して行われた。２〜４ｋｇの年齢３〜５歳のカニクイザルを１雄１雌／群で２群にランダムに分け、それぞれ複合体Ｆ１及び比較複合体Ｆ２を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量（ｓｉＲＮＡの量として）は３ｍｇ／ｋｇであり、複合体はそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ濃度の塩化ナトリウム注射液（山東科倫薬業有限公司）として提供され、投与体積は１ｍＬ／ｋｇであった。最初の投与当日を試験の１日目（Ｄ１）として定義し、薬剤投与前日を０日目（Ｄ０）とした。
【０７７９】
薬剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８日目に動物に対して静脈採血を行い、各時点で血清における、脂質（総コレステロールＣＨＯ、トリグリセリドＴＧ）及びトランスアミナーゼ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ）である被験物の含有量を検出した。被験物を標準化処理し、各被験物の抑制率は、抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群における被験物の含有量／薬剤投与前の試験群における被験物の含有量）×１００％という等式により算出された。トリグリセリドに対する抑制率を表７Ｆに示した。
【０７８０】
【表７Ｆ】
2021504415.tif 000122
【０７８１】
薬剤投与後に各検出点でのトランスアミナーゼの含有量を検出したところ、肝機能異常は認められなかった。
【０７８２】
薬剤投与後の２８日目に動物を死亡させ、肝臓を摘出した。一通り観察したところ、顕著な異常は認められなかった。実験例Ｆ２−１と同じ方法により肝組織ＲＮＡを抽出し、肝臓におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。検出プライマーの配列を表８Ｆに示した。
【０７８３】
【表８Ｆ】
2021504415.tif 000123
【０７８４】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲで検出したところ、比較複合体Ｆ２に対して、複合体Ｆ１は、雌性動物のＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡに対する抑制率が５５．３％であり、雄性動物のＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡに対する抑制率が７８．５％であった。
【０７８５】
当該実験から、複合体Ｆ１は、非ヒト霊長類におけるＡＰＯＣ３遺伝子に対して同様に顕著な抑制作用を有し、血清ＴＧに対しても顕著な抑制作用を有し、同時に肝機能異常が検出されなかったことが示された。
【０７８６】
（実験例Ｆ３）本実験で本発明のｓｉＲＮＡ複合体による体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での脂質の含有量に対する影響を調べた
（実験例Ｆ３−１）本実験例では、複合体Ｆ１によるヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内での血清中総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量に対する影響を調べた。
【０７８７】
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６、ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ）を、ＴＧ含有量＞２ｍｍｏｌ／Ｌとして７匹／群でランダムに分け、（１）生理食塩水対照群、（２）３ｍｇ／ｋｇの複合体Ｆ１群、（３）１ｍｇ／ｋｇの複合体Ｆ１群とした。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。
【０７８８】
薬剤投与前（０日目と記録する）、及び薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、６３、７７、９１、１１２、１３３、１４７、１５４、１６１、１７５、１８９日目に、それぞれマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＣＨＯ及びＴＧレベルを検出した。
【０７８９】
１回あたり約１００μＬ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μＬ以上とし、さらにＰＭ１Ｐ０００／３全自動血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ、イタリア）を用いて血清における総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を検出した。
【０７９０】
標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。
【０７９１】
脂質レベルの抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。
【０７９２】
検出結果を図６１Ａと６１Ｂに示した。
【０７９３】
図６１Ａと６１Ｂから分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、複合体Ｆ１は、１８９日間と長期間にわたって、明らかなマウス血清中ＴＧ及びＣＨＯの低下効果を示し、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制できることが示された。
【０７９４】
（実験例Ｆ３−２）本実験例では、複合体Ｆ２によるヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内での血清中総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）含有量に対する影響を調べた。
【０７９５】
８匹／群でマウスを分け、投与した複合体が複合体Ｆ２であり、０．１、０．３、１、３、９ｍｇ／ｋｇの５つの用量群でそれぞれ投与し、投与体積を変えることなく複合体溶液の濃度を相応的に調整し、薬剤投与後の１１２日目まで試験を続けたこと以外、実験例Ｆ３−１と同じ方法により検出した。結果を図６２Ａと６２Ｂに示した。
【０７９６】
図６２Ａと６２Ｂの結果から分かるように、複合体Ｆ２は、１１２日間と長期間にわたってトランスジェニックマウスにおけるＴＧ及びＣＨＯレベルを顕著に低下させることができ、当該低下効果は、明らかな用量依存効果があった。
【０７９７】
（実験例Ｆ３−３）本実験例で、複合体１〜３によるヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス体内での血清中総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量に対する影響を比較した。
【０７９８】
６匹／群でマウスを分け、それぞれ複合体Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及び比較複合体Ｆ２を投与し、各複合体を１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの２つの用量群で投与し、投与体積を変えることなく複合体溶液の濃度を相応的に調整し、薬剤投与後の１１２日目まで試験時間としたこと以外、実験例３−１と同じ方法によりマウス血清総コレステロール（ＣＨＯ）及び総脂質（ＴＧ）を測定した。結果を図６３Ａ〜図６３Ｄに示した。
【０７９９】
図６３Ａ〜図６３Ｄの結果から分かるように、１１２日間と長期間にわたって、本開示の複合体Ｆ１〜Ｆ３は、異なる用量でいずれもトランスジェニックマウスにおける脂質に対して持続的な低下作用を示し、当該持続的な低下効果は、全体として比較複合体Ｆ２よりも優れていた。
【０８００】
上記結果から明らかなように、本発明により提供される複合体は、肝臓におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現を効率的に低下させ、血中総コレステロール、トリグリセリドの含有量を低下させることができ、脂質異常を予防及び／又は治療することができ、臨床への応用の将来性がある。
【０８０１】
以下、表４ＧのｓｉＲＮＡ複合体の効果実験について説明する。
【０８０２】
（実験例Ｇ１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
【０８０３】
本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０８０４】
本実験例では、複合体Ｇ２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性及びオフターゲット効果を調べ、即ち、複合体Ｇ２が、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が複合体Ｇ２のアンチセンス鎖／センス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）又はシード領域がマッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が複合体Ｇ２のアンチセンス鎖／センス鎖の１〜８位のヌクレオチド配列と相補的である）を標的する活性を測定した。
【０８０５】
実験例Ａ１−６の方法を参照して複合体Ｇ２を検出したこと以外、複合体Ｇ２の配列により４グループの目的配列を構築し、ＧＳＣＭオンターゲットプラスミドについて、複合体Ｇ２の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）が１ｎＭから、０．０００９７７ｎＭまで１１個の濃度に倍加希釈し、他の３個オフターゲットプラスミドについて、複合体Ｇ２の最終濃度が１０ｎＭから、０．００００３８ｎＭまで１０個の濃度に４倍希釈した。
【０８０６】
ＧＳＣＭに対して、複合体Ｇ２のＩＣ５０が０．０５１３ｎＭであり（Ｒ２＝０．９９１１）、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭに対して、複合体Ｇ２は、ｓｉＲＮＡの各濃度でいずれも明らかな抑制効果が認められず、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することが示された。
【０８０７】
（実験例Ｇ２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性を証明している
１）マウス由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：各６μｌの複合体Ｇ２及び比較ｓｉＲＮＡ１（２０μＭ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｒ０６１０．ＬＴ、ロット番号１６１００６９）と均一に混合し、酸性ホスファターゼの最終濃度が０．２ｍＵ／μＬであった。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、１、２、４、６、２４時間でそれぞれ混合液を５μｌ取り出し、１５μＬの９Ｍ尿素溶液に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
【０８０８】
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体Ｇ２及び比較ｓｉＲＮＡ１（２０μＭ）を各１．５μｌとり、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各サンプルに対して、参照サンプルをＭと記し、当該サンプルの電気泳動結果と比較するために用いた。
【０８０９】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サンプルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷し、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動を続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図６４に示した。
【０８１０】
２）ヒト由来のリソソーム溶解液における安定性の検出
マウス由来のリソソーム溶解液をヒト由来のリソソーム溶解液（Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社、番号Ｈ０６１０．Ｌ、ロット番号１６１０３１６）に変更したこと以外、１）と同じ方法により比較ｓｉＲＮＡ１及び複合体Ｇ２のヒト由来のリソソーム溶解液における安定性を検出した。結果を図６５に示した。
【０８１１】
図６４と６５の結果から明らかなように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト由来のリソソーム溶解液及びマウス由来のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定性を示し、少なくとも２４時間分解されずに維持することが可能である。
【０８１２】
（実験例Ｇ３）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢＶモデルマウスにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を証明している
１）本実験例では、複合体Ｇ１及び複合体Ｇ２によるＨＢＶモデルマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０８１３】
本実験例に用いられるＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスは、北京大学医学部実験動物科学部から購入された。０．９％塩化ナトリウム水溶液で複合体Ｇ２を濃度０．２ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）の溶液として調製した。０．９％塩化ナトリウム水溶液で複合体１を濃度０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０６ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）の溶液として調製した。
【０８１４】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原診断キット（酵素結合免疫吸着測定法）（上海科華生物）を用いてマウス血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出し、Ｓ／ＣＯＶ＞１０のマウスを選択し、６匹／群で２群にランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ対照群及び試験群と記した。各群の動物について、１日目に各種の薬物を皮下注射し、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。体重に応じて投与体積を算出した。対照群に生理食塩水を注射し、試験群の動物に複合体Ｇ２を注射し、用量は１ｍｇ／ｋｇであった。薬剤投与後の２８日目に全ての動物を死亡させ、動物に対して肉眼解剖を行い、体内臓器に病変があるか否かを観察し、肉眼で病変が観察された組織を１０％ホルマリンで保存してさらに病理観察を行い、肝臓を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０８１５】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びβ−アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ−アクチンを検出した。
【０８１６】
検出プライマーの配列を表５Ａに示した。
【０８１７】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ｓｉＲＮＡ抑制活性は、ＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制率で表され、以下の等式により算出された。
【０８１８】
ＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制率＝（１−ＨＢＶ遺伝子発現残量）×１００％。
ＨＢＶ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／試験群β−アクチンのコピー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群β−アクチンのコピー数）×１００％。
【０８１９】
結果を以下の表６Ｇに示した。
【０８２０】
同じ方法により、異なる用量の複合体１による体内（ｎ＝５）でのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を検出した。結果を以下の表６Ｇに示した。
【０８２１】
【表６Ｇ】
2021504415.tif 000124
【０８２２】
上記結果から分かるように、本開示の各実施例の複合体は、いずれも高いマウス体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制活性を示した。本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、良好な体内送達効率を有することも示された。
【０８２３】
２）１）と同じ方法により、複合体Ｇ３〜複合体Ｇ２０による体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制効率を検出し、複合体Ｇ３〜複合体２０も、高いｍＲＮＡ抑制活性を有することを予期できる。
【０８２４】
（実験例Ｇ４）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢＶモデルマウスにおける血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ発現量に対する抑制効率の時間関連性試験を説明している
本実験例に用いられるＨＢＶモデルマウスＣ５７Ｂ／６Ｎ−Ｔｇ（１．２８ＨＢＶ）／Ｖｓｔ（遺伝子型Ａ型）は、北京維通達生物技術有限公司から購入された。０．９％塩化ナトリウム水溶液で複合体１を濃度０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）の溶液として調製した。
【０８２５】
血清におけるＨＢｓＡｇの含有量が１０４ＣＯＩ以上のマウス（雌雄がそれぞれ半分であった）を選択し、６匹／群で３群にランダムに分け、それぞれ対照群、高用量群及び低用量群と記した。各群の動物について、１日目に各種の薬物を皮下注射し、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。体重に応じて投与体積を算出した。全ての動物について、いずれも午前に投与し、採血する必要がある場合、採血後に投与した。対照群に対しては、生理食塩水を注射し、試験群の動物に対しては、高用量群３ｍｇ／ｋｇ、低用量群１ｍｇ／ｋｇで異なる用量の複合体Ｇ１を注射した。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１３、２１、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡレベルを検出した。
【０８２６】
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清が２０μｌ以上であり、ＰＢＳで５００μｌに再懸濁させ、北京迪安医学検定センターに送って血清におけるＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡの含有量を検出し、それぞれＣＯＩ、ＣＯＩ、ＩＵ／ｍｌで表される。
【０８２７】
被験指標（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ）の標準化レベルは、以下の等式により算出された。
【０８２８】
被験指標の標準化レベル＝（薬剤投与後の被験指標の残存含有量／薬剤投与前の被験指標の含有量）×１００％
被験指標の抑制率＝（１−被験指標の標準化レベル）×１００％。
【０８２９】
実験データは、いずれも
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で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェアを採用した。まずデータに対して正規分布と等分散性検定を行った。正規分布を満たす（ｐ＞０．２０）とともに分散が等しい（ｐ＞０．１０）場合、複数の群間の比較では、一元配置分散分析によるＬＳＤ法により多重比較し、ｐ＜０．０５である場合、統計学的に有意であるとみなした。正規分布を満たしておらず、又は分散が等しくない場合、複数の群間の比較では、ノンパラメトリック検定であるＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ方法を採用し、Ｋｒｕｓｋａｌ−ｗａｌｌｉｓ  Ｈ検定結果が有意（ｐ＜０．０５）である場合、データをランク変換した後、複数の群間の一対比較を行い、ｐ＜０．０５である場合、統計学的に有意であるとみなした。
【０８３０】
結果を図６６〜６８に示した。
【０８３１】
図６６から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、生理食塩水が施された陰性対照群は、血清表面抗原に対していかなる抑制作用も示さなかったのに対して、２つの用量での複合体１は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢｓＡｇに対していずれも優れた抑制効果を示した。高用量群については、単回薬剤投与後の１３日目に、ＨＢｓＡｇの最大抑制率が９９．８％に達し、薬剤投与後の８４日間の長期間にわたって、ＨＢｓＡｇの抑制率は依然として９０％以上に維持され、観察が完了するまで、ＨＢｓＡｇの抑制効率は依然として８０．１％と高かった。低用量群については、薬剤投与後の１３日目に、ＨＢｓＡｇ最大抑制率が９９．０％に達し、１５４日間の観察が完了するまで、ＨＢｓＡｇの抑制効率は依然として６０．８％のレベルに達していた。
【０８３２】
図６７から分かるように、複合体Ｇ１は、同様にＨＢｅＡｇの発現を抑制することができた。高用量群については、薬剤投与後の７０日間で、血清ＨＢｅＡｇの発現に対する抑制は５０％程度であり、１５４日間の観察が完了するまで、ＨＢｅＡｇの抑制効率は薬剤投与前のレベルに戻っていなかった。
【０８３３】
図６８から分かるように、複合体Ｇ１は、さらにＨＢＶ  ＤＮＡの発現も効率よく抑制することができ、１５４日間という長期間にわたって高い抑制率を維持した。高用量群については、単回薬剤投与後の１３日目に、ＨＢＶ  ＤＮＡの最大抑制率が９９．２％に達し、薬剤投与後の８４日間の長期間にわたって、ＨＢＶ  ＤＮＡの抑制率は依然として９０％以上に維持され、観察が完了するまで、ＨＢＶ  ＤＮＡの抑制効率は依然として７７．０％と高かった。低用量群については、薬剤投与後の１３日目に、ＨＢＶ  ＤＮＡの最大抑制率は９５．４％に達し、１５４日間の観察が完了するまで、ＨＢｓＡｇの抑制効率は依然として７９．４％のレベルに達していた。
【０８３４】
上記結果から、本開示の複合体は、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制することができ、特に、表面抗原に対する長期間の持続的な抑制に対して、優れた効果を示すことが明らかになった。
【０８３５】
以上に本開示の発明を実施するための形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段に対して種々の簡単な変形が可能であり、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護範囲に属する。
【０８３６】
このほかに説明すべきこととして、上記発明を実施するための形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
【０８３７】
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本開示の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４８Ｄ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５１Ｄ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５２Ｄ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５３Ｄ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５４Ｄ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５７Ｄ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６３Ｃ】
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【図６３Ｄ】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月3日(2020.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
前記センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドがいずれも修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖がヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２の長さがいずれも１９ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２とが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２が、第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で逆相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列断片が、標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列断片であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列１の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列２の５’末端の１番目のヌクレオチドがアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２の他の位置の各ヌクレオチドが独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つである、二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の少なくとも第２〜１９位のヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列断片と相補的である、又は、
５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の第１位のヌクレオチドは、Ａ又はＵである、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、ヌクレオチド配列３とヌクレオチド配列４の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４の長さがそれぞれ１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列４と同じヌクレオチド配列を指し、前記基本的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１又は２に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５の各ヌクレオチドは、独立して非フルオロ修飾ヌクレオチドの１つであり、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成する、請求項３のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列５の長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド、連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、又は第３のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的であり、前記第３の配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて第１のヌクレオチド配列断片又は第２のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列５に等しいヌクレオチド配列を指す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシ基で置換されたヌクレオチドを指す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、少なくとも１つのリン酸エステル基は、チオリン酸エステルであり、前記チオリン酸エステルは、
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドは、５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ｓａＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記標的ｍＲＮＡは、遺伝子のＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶが対応するｍＲＮＡから選択される１つである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号２に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号３に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号４に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号５に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号６に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号７に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号８に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号９に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１０に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１１に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１２に示される配列である、或いは
前記ヌクレオチド配列１は、配列番号１３に示される配列であり、前記ヌクレオチド配列２は、配列番号１４に示される配列である、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド：
５’−ＣｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｆＧｆＣｆＡｍＵｍＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍ−３’（配列番号１）
５’−ＵｍＵｆＵｍＧｍＡｍＡｆＧｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＵｆＣｍＡｆＡｍＧｍＧｍ−３’（配列番号２）
５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号３）
５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍ−３’（配列番号４）
５’−ＵｍＣｍＵｍＧｍＵｍＧｍＣｆＣｆＵｆＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＧｍＡｍ−３’（配列番号５）
５’−ＵｍＣｆＡｍＧｍＡｍＵｆＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＧｍＣｆＡｍＣｆＡｍＧｍＡｍ−３’（配列番号６）
５’−ＣｍＧｍＵｍＧｍＵｍＧｍＣｆＡｆＣｆＵｍＵｍＣｍＧｍＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡｍ−３’（配列番号７）
５’−ＵｍＵｆＧｍＡｍＡｍＧｆＣｍＧｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＣｆＡｍＣｆＡｍＣｍＧｍ−３’（配列番号８）
５’−ＧｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＡｆＵｆＧｆＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
５’−ＵｍＡｆＵｍＵｍＣｍＧｆＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＡｍＵｍＡｆＣｍＵｆＵｍＵｍＣｍ−３’（配列番号１０）
５’−ＣｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＧｆＣｆＡｆＣｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１１）
５’−ＵｍＡｆＧｍＵｍＵｍＣｆＵｍＵｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｆＣｍＵｆＵｍＧｍＧｍ−３’（配列番号１２）
５’−ＣｍＡｍＡｍＵｍＡｍＡｍＡｆＧｆＣｆＵｍＧｍＧｍＡｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍ−３’（配列番号１３）
５’−ＵｍＵｆＣｍＵｍＵｍＧｆＵｍＣｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＵｆＵｍＡｆＵｍＵｍＧｍ−３’（配列番号１４）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド及び当該二本鎖オリゴヌクレオチドに複合して結合される複合基を含むオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１４】
式（３０８）に示される構造を有し、
【化１２】
2021504415.tif 000253
式中、ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであるか、又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３が式Ａ５９に示される構造の基であり、
【化１３】
2021504415.tif 000254
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
2021504415.tif 000255
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、Ｍ１は標的基を表す、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１５】
各Ｌ１が、式Ａ１〜Ａ２６の基から独立して選択される１又は複数の結合の組合せである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【化１４】
2021504415.tif 000256
式中、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７〜Ａ４５の基又はその任意の組合せからなる群から選択され、
【化１５】
2021504415.tif 000257
2021504415.tif 000258
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【請求項１６】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである、又は
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、又は
Ｌ１が、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１７】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子である、又は
Ｌ１の長さが４〜１５個の原子である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１８】
ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立して１又は２である、又は、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１９】
各ｍ１、各ｍ２及び各ｍ３がそれぞれ独立して２〜５の整数から選択される、又は、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２０】
各前記標的基は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される、又は
各前記標的基は、哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体と親和性のあるリガンドから選択される、又は
前記標的基の少なくとも１つ又は各々がガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンＧａｌＮＡｃである、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２１】
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が独立してＨ、メチル基又はエチル基である、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２２】
Ｒ２が前記窒素含有骨格上のＮとアミド結合を形成する、又は
Ｒ２がＢ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’から選択され、
【化１６】
2021504415.tif 000259
式中、
2021504415.tif 000260
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、ｑ２は１〜１０の整数である、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２３】
式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体：
【化１７】
2021504415.tif 000261
2021504415.tif 000262
2021504415.tif 000263
2021504415.tif 000264
2021504415.tif 000265
2021504415.tif 000266
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項１２に記載の薬物組成物及び／又は請求項１３〜２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体の、遺伝子の異常発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用。
【請求項２５】
前記遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子或いはアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記疾患は、慢性疾患、炎症、線維性疾患、過形成性疾患又は脂質異常から選択される、請求項２４又は２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
遺伝子発現の抑制方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項１２に記載の薬物組成物及び／又は請求項１３〜２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド複合体の有効量を、前記当該遺伝子を発現する細胞と接触させることを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
便宜上、Ｌ１は、線形アルキレン基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４−メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’−ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’−トリメトキシトリチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’−ビスメトキシトリチル（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５５】
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬Ａ（ｃａｐＡ）及びキャッピング試薬Ｂ（ｃａｐＢ）からなり、キャッピング試薬Ａは、Ｎ−メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：１０〜１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３〜１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ−メチルイミダゾールの体積との比は１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜７：１である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬Ｂは、酢酸無水物である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬Ｂは、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積比が１：１〜１：１０であり、さらなる実施形態において１：２〜１：６である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１３】
（２−２）センス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ−１０化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’−５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含む。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を含む。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。上記反応の条件は、前述した調製例１でセンス鎖を合成する際に用いられる条件が同じであった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５８７】
用量−効果曲線から、複合体Ａ１のＧＳＣＭを標的したＩＣ５０値を算出した。結果を図２０Ａ〜２０Ｄに示した。その結果から、ＧＳＣＭに対応して、複合体Ａ１のＩＣ５０が０．００１９ｎＭであり、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭに対応して、複合体Ａ１は、ｓｉＲＮＡの各濃度でいずれも明らかな抑制効果が認められなかったことが示され、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することが証明された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６８７】
（実験例Ｅ２）ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ複合体の体外細胞系における抑制活性の検出
（実験例Ｅ２−１）ｓｉＲＮＡのＨｕｈ７細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率の検出。
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用いて被験ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡＥ１、Ｅ２、Ｅ４および比較ｓｉＲＮＡ４）をヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７にトランスフェクションし、ｓｉＲＮＡの最終濃度はそれぞれ５ｎＭ、０．２５ｎＭ及び０．０５ｎＭであった。各濃度につき２つの複製ウェルがあった。いかなるｓｉＲＮＡ処理も施していない細胞をブランク対照（Ｂｌａｎｋ）とした。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８２４】
（実験例Ｇ４）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢＶモデルマウスにおける血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ発現量に対する抑制効率の時間関連性試験を説明している
本実験例に用いられるＨＢＶモデルマウスＣ５７Ｂ／６Ｎ−Ｔｇ（１．２８ＨＢＶ）／Ｖｓｔ（遺伝子型Ａ型）は、北京維通達生物技術有限公司から購入された。０．９％塩化ナトリウム水溶液で複合体Ｇ１を濃度０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）の溶液として調製した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８３１】
図６６から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、生理食塩水が施された陰性対照群は、血清表面抗原に対していかなる抑制作用も示さなかったのに対して、２つの用量での複合体Ｇ１は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢｓＡｇに対していずれも優れた抑制効果を示した。高用量群については、単回薬剤投与後の１３日目に、ＨＢｓＡｇの最大抑制率が９９．８％に達し、薬剤投与後の８４日間の長期間にわたって、ＨＢｓＡｇの抑制率は依然として９０％以上に維持され、観察が完了するまで、ＨＢｓＡｇの抑制効率は依然として８０．１％と高かった。低用量群については、薬剤投与後の１３日目に、ＨＢｓＡｇ最大抑制率が９９．０％に達し、１５４日間の観察が完了するまで、ＨＢｓＡｇの抑制効率は依然として６０．８％のレベルに達していた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2021504415.tif 000267
【国際調査報告】
2021504415.tif 000268
2021504415.tif 000269
2021504415.tif 000270
2021504415.tif 000271
2021504415.tif 000272
2021504415.tif 000273