(57)【要約】  配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む修飾溶解素ポリペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸置換がＣＨＡＰドメイン及び／又はＳＨ３ｂドメイン中にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチドが本明細書に開示される。修飾溶解素ポリペプチドを含む組成物、及び修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターが本明細書に更に開示される。グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法、細菌感染を治療する方法、及び抗生物質の有効性を高めるか、又は抗生物質耐性の発現を低減する方法も本明細書に開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメイン及び細胞壁結合（ＳＨ３ｂ）ドメインを有する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む修飾溶解素ポリペプチドであって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が前記ＣＨＡＰドメイン及び／又は前記ＳＨ３ｂドメイン中にあり、該修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項２】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が前記ＣＨＡＰドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置、及び／又は前記ＳＨ３ｂドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置にある、請求項１に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＣＨＡＰドメイン中の前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＲ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓの少なくとも１つである、請求項２に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＳＨ３ｂドメイン中の前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＹ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇの少なくとも１つである、請求項２に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項５】
Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓからなる群から選択される前記ＣＨＡＰドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸置換と、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇからなる群から選択される前記ＳＨ３ｂドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸置換とを有する、請求項２に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＨＡＰドメイン中に少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項７】
前記ＳＨ３ｂドメイン中に少なくとも２つのアミノ酸置換又は少なくとも３つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項８】
前記修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１と比較して３つ〜９つのアミノ酸置換を含み、該３つ〜９つのアミノ酸置換がＲ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ｅ、Ｖ２１２Ａ及びＶ２１４Ｇから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＬ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｑを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＣＨＡＰドメイン中の前記少なくとも１つのアミノ酸置換がＬ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、
（ｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ、
（ｉｉ）Ｙ１６４Ｎ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ、
（ｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｈ及びＩ２０６Ｅ、
（ｉｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ａ及びＶ２１２Ａ、
（ｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｑ、
（ｖｉ）Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ及びＹ１６４Ｋ、
（ｖｉｉ）Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ、
（ｖｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ、
（ｉｘ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ、
（ｘ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ及びＮ１８４Ｄ、
（ｘｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ及びＲ１９５Ｅ、
（ｘｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、Ｖ２０４Ａ及びＶ２１２Ａ、
（ｘｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ及びＹ１６４Ｋ、
（ｘｉｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｉ２０６Ｅ及びＶ２１４Ｇ、並びに、
（ｘｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｈ、
からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１２】
スタフィロコッカス・アウレウス；リステリア・モノサイトゲネス；スタフィロコッカス・アウレウス；スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌；ストレプトコッカス・スイス；ストレプトコッカス・ピオゲネス；ストレプトコッカス・アガラクティアエ；ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ；ストレプトコッカス・ニューモニアエ；ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種；エンテロコッカス・フェカーリス；並びにエンテロコッカス・フェシウムの１つ以上に対して野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の約２倍、約３倍又は約５倍以下の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＭＩＣがスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、リステリア・モノサイトゲネス及びストレプトコッカス・アガラクティアエの１つ以上に対して野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の約５倍以下である、請求項１２に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＭＩＣが野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の約４倍以下である、請求項１２又は１３に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＭＩＣが野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の約２倍以下である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１６】
野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と比較して免疫原性を低下させ、及び／又は炎症応答関連毒性を低下させる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１７】
グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅がＭＩＣ及び／又は最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド。
【請求項１８】
許容可能な担体と、抗菌量の請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチドとを含む組成物。
【請求項１９】
前記組成物が医薬組成物であり、前記担体が薬学的に許容可能な担体である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗菌量の修飾溶解素ポリペプチドが、スタフィロコッカス・アウレウス；リステリア・モノサイトゲネス；スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌；ストレプトコッカス・スイス；ストレプトコッカス・ピオゲネス；ストレプトコッカス・アガラクティアエ；ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ；ストレプトコッカス・ニューモニアエ；ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種；エンテロコッカス・フェカーリス；並びにエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択される１つ以上のグラム陽性細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるのに効果的である、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記グラム陽性細菌がメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス又はバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウスである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
溶液、懸濁液、エマルション、吸入用粉末、エアロゾル又はスプレーである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
グラム陽性細菌感染の治療に適した１つ以上の抗生物質を更に含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２６】
前記ベクターがプラスミドであり、前記核酸が異種プロモーターに操作可能に連結する、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、前記細菌と請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の組成物とを接触させることを含む、方法。
【請求項２８】
グラム陽性細菌の少なくとも１つの種によって引き起こされる細菌感染を予防又は治療する方法であって、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、（１）第１の量の請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチド、及び（２）第２の量のグラム陽性細菌感染の治療に適した抗生物質を同時投与することを含む、方法。
【請求項２９】
前記グラム陽性細菌感染の治療に適した抗生物質がメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細菌感染の治療に適した抗生物質の有効性を高める方法であって、該抗生物質を請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチドと組み合わせて同時投与することを含み、同時投与が、細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる上で、前記抗生物質又は前記修飾溶解素ポリペプチド若しくはそのフラグメントのいずれか個別の投与よりも効果的である、方法。
【請求項３１】
前記抗生物質がメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ブドウ球菌又はレンサ球菌細菌に感染した被験体においてブドウ球菌又はレンサ球菌細菌の抗生物質耐性の発現を低減する方法であって、前記被験体に、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾溶解素ポリペプチドとメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンから選択される抗生物質との組合せを投与することを含む、方法。
【請求項３３】
前記修飾溶解素ポリペプチドを、該修飾溶解素ポリペプチドの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を下回る濃度に相当する量で投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾溶解素ポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換がＬ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ａ及びＶ２１２Ａを含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１８年２月２６日付で出願された米国仮特許出願第６２／６３５，５１５号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０１９年２月２２日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は０３４１＿０００４−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、３６１５３バイトのサイズである。
【０００３】
本開示は、概して抗菌剤、より具体的には修飾された非自然発生溶解素ポリペプチド、特に修飾ＰｌｙＳｓ２溶菌酵素、並びにグラム陽性細菌を死滅させ、細菌感染及び汚染に対抗する上でのこれらのペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗生物質耐性は、世界的に増加しており、特に、（ａ）様々な病気及び他の病態を治療するために投与される抗生物質の使用の増加及び長期化、（ｂ）低い患者コンプライアンス、並びに（ｃ）既存の抗生物質に対する耐性を発現した病原体に対して採用することができる新たな抗微生物剤の不足の影響を受ける。
【０００５】
バクテリオファージエンドリシン（溶解素）は、細菌感染に対抗し、細菌耐性を克服する有望な代替的又は相補的なアプローチである。溶解素は、バクテリオファージによって自然に産生され得るペプチドグリカンヒドロラーゼである。外部から細菌と接触することで、組換えにより作製された溶解素ポリペプチドは、細菌を直接溶解し、死滅させる（１）、（２）。溶解素は、病原体への抗生物質剤のアクセスを促進することによっても抗生物質耐性を克服することができる。近年、幾つかの研究から、器官限局性（organ-confined）感染及び全身感染において粘膜表面上の病原体を制御する、これらの酵素の人間医学及び獣医学における大きな可能性が示されている。
【０００６】
グラム陽性細菌は、ポリペプチド及び多糖を含有する細胞壁に囲まれている。グラム陽性細胞壁は、約２０ｎｍ〜８０ｎｍの厚さであり得る幅広い緻密な壁のように見え、ペプチドグリカンの多数の相互接続層を含有する。グラム陽性細胞壁の６０％〜９０％が細胞形状、剛構造、及び浸透圧衝撃に対する耐性をもたらすペプチドグリカンである。細胞壁は、グラム染色クリスタルバイオレットを排除せず、細胞が紫色に染色され、したがって「グラム陽性」に分類される。
【０００７】
バクテリオファージ溶菌酵素は、様々な投与経路を介した被験体における様々なタイプの感染の特異的治療に有用であるとして確立されている。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５及び特許文献６を参照されたい。Fischetti et al.に対する米国特許第９，０３４，３２２号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）は、溶解素ＰｌｙＳｓ２を含む、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）細菌に由来するバクテリオファージ溶解素に関する。これらの溶解素ポリペプチドは、ブドウ球菌、Ｂ群レンサ球菌、腸球菌及びリステリア細菌株等のグラム陽性細菌を含む複数の細菌に対して広範な死滅活性を示す。
【０００８】
ＰｌｙＳｓ２溶解素は、動物モデルにおいてスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）細菌を死滅させ、抗生物質と相乗作用を示し、抗生物質耐性を克服（又は予防）することが可能である。ＰｌｙＳｓ２は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＶＲＳＡ）等の抗生物質耐性スタフィロコッカス・アウレウスに対して効果的であることが示されている。
【０００９】
治療用タンパク質による炎症性免疫応答の誘発は、望ましくない（６）、（８）。タンパク質の免疫原性が、合成起源に由来するか又は生物学的（例えば、組み換え）起源に由来するかに関わらず、外因性タンパク質及びペプチドについて懸念される可能性がある。場合によっては、治療用タンパク質は、重度の有害事象（例えば、貧血、血小板減少症、アナフィラキシー及び先天性免疫応答）を引き起こし、これが更に致死的となる場合もある。よく知られている例としては、トロンボポエチンで治療した患者における血小板減少症、及び機能的に冗長でない内因性ＥＰＯと交差反応する中和抗体の誘導による、認可済みのエリトロポエチン（ＥＰＯ）製剤であるＥＰＲＥＸ（商標）で治療した慢性腎疾患患者における赤芽球癆が挙げられる。モノクローナル抗体、トロンボキナーゼ及びＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（商標）（ドルナーゼアルファ）を含む様々な製品で免疫原性が報告されているため、免疫原性は規制機関、業界及び臨床医による大きな注目を集め続けている。かかる免疫応答は、潜在的な細菌感染のために既に炎症応答を起こしている患者において悪化する可能性がある。
【００１０】
ＰｌｙＳｓ２等の溶解素は、タンパク質であるため、宿主に投与した場合に免疫応答を引き起こす可能性がある。上で論考される重大な副作用を引き起こすことに加えて、かかる免疫応答は、溶解素の溶菌活性を低下させる可能性もある。実際に、Ｃｐｌ−１等の他のタイプの溶解素による幾つかの免疫応答が動物において観察されており、これは溶菌活性の遅延を引き起こしたが、実質的には阻害しなかった。しかしながら、他の研究者により、Ｃｐｌ−１の投与が炎症性サイトカイン分泌の大幅な増加を伴うことが観察された（９）。
【００１１】
コンピューターによる計算ガイドツールがタンパク質のエピトープ領域の特定を容易にし、免疫原性である傾向がより低い変異体を設計するために開発されている（１１）〜（１８）。かかる手法は有用であり得るが、幾つかの制約を有する。これらの制約には、例えば幾つかの推定Ｔ細胞エピトープを除外する可能性がある抗原プロセシング、Ｔ細胞受容体の多形性及び三次元複雑性のためにコンピューターによる方法を用いてＴ細胞受容体親和性を予測することができないこと、Ｔ細胞エピトープ表現型を予測することができないこと、個々の患者及び翻訳後因子の影響を考慮して患者集団を用いて考案される統計的手法の適用性の限界、並びにコンピューターによる手法及びその根底にある前提の固有の限界が含まれ得る（８）。したがって、ペプチドの免疫原性を低下させるには試行錯誤及び不確実性が残る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，９８５，２７１号
【特許文献２】米国特許第６，０１７，５２８号
【特許文献３】米国特許第６，０５６，９５５号
【特許文献４】米国特許第６，２４８，３２４号
【特許文献５】米国特許第６，２５４，８６６号
【特許文献６】米国特許第６，２６４，９４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このため、所望の抗菌活性を保持するが、低下した免疫原性を有する修飾ＰｌｙＳｓ２溶解素等の修飾溶解素の発見が有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願は、対応する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する一方で抗菌活性及び有効性を保つ修飾溶解素ポリペプチドを開示する。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、対応する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と比較して低下した免疫原性も有する。野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素は、ＰｌｙＳｓ２ポリペプチドの酵素活性ドメイン（ＥＡＤ）であるシステイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）エンドペプチダーゼドメインと、Ｃ末端ＳＨ３ｂ＿５（ＳＨ３ｂ）細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）とを有する。或る特定の態様では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰ中の少なくとも１つのアミノ酸置換及び／又はＳＨ３ｂ中の１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００１５】
１つの態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメイン及び細胞壁結合（ＳＨ３ｂ）ドメインを有する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む修飾溶解素ポリペプチドであって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が前記ＣＨＡＰドメイン及び／又は前記ＳＨ３ｂドメイン中にあり、該修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチドに関する。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＣＨＡＰドメイン中にある。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＳＨ３ｂドメイン中にある。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＣＨＡＰドメイン及びＳＨ３ｂドメイン中にある。
【００１６】
或る特定の実施の形態では、少なくとも１つの置換は、ＣＨＡＰドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置にある。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つの置換は、ＳＨ３ｂドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置にある。或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン中の配列番号１のアミノ酸３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも１つの置換を有し、ＳＨ３ｂドメイン中の配列番号１のアミノ酸１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも１つの置換を有する。
【００１７】
幾つかの実施の形態では、ＣＨＡＰドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓからなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、ＳＨ３ｂドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇからなる群から選択される。
【００１８】
或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓからなる群から選択される前記ＣＨＡＰドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸置換と、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇからなる群から選択される前記ＳＨ３ｂドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸置換とを有する。
【００１９】
また他の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン中に少なくとも２つのアミノ酸置換を有する。更に他の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＳＨ３ｂドメイン中に少なくとも２つのアミノ酸置換を有する。他の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＳＨ３ｂドメイン中に少なくとも３つのアミノ酸置換を有する。また他の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメインとＳＨ３ｂドメインとの間に分散した５つ、６つ、７つ又は８つのアミノ酸置換を有し、或る特定の実施の形態では、配列番号１のアミノ酸配列は、Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ｅ、Ｖ２１２Ａ及びＶ２１４Ｇからなる群から選択される３つ〜９つのアミノ酸置換によって修飾される。
【００２０】
或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を有する：（ｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ（ｐｐ５５）、（ｉｉ）Ｙ１６４Ｎ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ（ｐｐ３８８）、（ｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｈ及びＩ２０６Ｅ（ｐｐ６１）、（ｉｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ａ及びＶ２１２Ａ（ｐｐ６５）、（ｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｑ（ｐｐ２９６）、（ｖｉ）Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ及びＹ１６４Ｋ（ｐｐ６１６）、（ｖｉｉ）Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ（ｐｐ４００）、（ｖｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ（ｐｐ６２８）、（ｉｘ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ（ｐｐ６３２）、（ｘ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ及びＮ１８４Ｄ（ｐｐ３２４）、（ｘｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ及びＲ１９５Ｅ（ｐｐ３２５）、（ｘｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、Ｖ２０４Ａ及びＶ２１２Ａ（ｐｐ３４１）、（ｘｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ及びＹ１６４Ｋ（ｐｐ６１９）、（ｘｉｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｉ２０６Ｅ及びＶ２１４Ｇ（ｐｐ６４２）、並びに（ｘｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｈ（ｐｐ３３８）。或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３〜１７の１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を有する：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ。或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を有する：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｑ（ｐｐ２９６）。
【００２２】
本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントであって、ＣＨＡＰドメイン及び／又はＳＨ３ｂドメイン中に１つ以上のアミノ酸置換を含む、活性フラグメントも開示される。
【００２３】
本明細書に開示される修飾ＰｌｙＳｓ２  ＣＨＡＰドメインと、別の溶解素の結合ドメイン又は別の溶解素の触媒ドメインと、本明細書に開示される修飾ＰｌｙＳｓ２  ＳＨ３ｂドメインとを含むキメラ溶解素も開示される。
【００２４】
幾つかの実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、スタフィロコッカス・アウレウス、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（限定されるものではないが、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Staphylococcus saprophyticus）群、スタフィロコッカス・シミュランス（Staphylococcus simulans）群、スタフィロコッカス・インターメディウス（Staphylococcus intermedius）群、スタフィロコッカス・シウリ（Staphylococcus sciuri）群、スタフィロコッカス・ヒイカス（Staphylococcus hyicus）群からの少なくとも４０の認定種、並びに「不特定種群」と称される任意の分離株を含む）、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）、緑色レンサ球菌群に含まれる任意の付加的な種（ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）群、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）群、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）（現ガロリティカス（gallolyticus））群、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）群及びストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）群に含まれる全ての種及び株を含むが、これらに限定されない）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）及びエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）の１つ以上に対して野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素（配列番号１）の約２倍以下の最小阻止濃度（ＭＩＣ）、又は約３倍〜約５倍、例えば約３倍以下、約４倍以下又は約５倍以下のＭＩＣを有する。或る特定の実施の形態では、ＭＩＣは、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、リステリア・モノサイトゲネス及びストレプトコッカス・アガラクティアエの１つ以上に対して野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素（配列番号１）の約２倍以下、約３倍以下、約４倍以下又は約５倍以下である。
【００２５】
幾つかの実施の形態では、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素（配列番号１）と比較して免疫原性を低下させ、及び／又は炎症応答関連毒性を低下させる。本開示の或る特定の実施の形態では、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅は、ＭＩＣ及び／又は最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評定される。
【００２６】
別の態様は、許容可能な担体と本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドとを含む組成物に関する。或る特定の実施の形態では、組成物は医薬組成物であり、担体は薬学的に許容可能な担体である。
【００２７】
本明細書に開示の組成物の特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドの量は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス又はバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌の１つ以上の種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるのに効果的である。或る特定の実施の形態では、組成物は溶液、懸濁液、エマルション、吸入用粉末、エアロゾル又はスプレーである。或る特定の実施の形態では、組成物は、グラム陽性細菌感染の治療に適した１つ以上の抗生物質を更に含む。
【００２８】
また別の態様では、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
【００２９】
別の態様は、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターに関する。幾つかの実施の形態では、ベクターは、プラスミドである。幾つかの実施の形態では、核酸分子は、異種プロモーターに操作可能に連結する。
【００３０】
別の態様では、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種と、抗菌有効量の本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させることを含む、方法が提供される。
【００３１】
更に別の態様では、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種によって引き起こされる細菌感染を予防又は治療する方法であって、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、（１）第１の量の本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチド、及び（２）第２の量のグラム陽性細菌感染の治療に適した抗生物質を同時投与することを含む、方法が提供される。
【００３２】
幾つかの方法の実施の形態では、抗生物質はメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンの１つ以上である。或る特定の実施の形態では、抗生物質はメチシリン、バンコマイシン及びダプトマイシンの１つ以上である。
【００３３】
幾つかの実施の形態では、上述の方法に使用される修飾溶解素ポリペプチドの量は、抗生物質の非存在下で使用される場合の修飾溶解素ポリペプチドのＭＩＣに等しい濃度をもたらす量を下回り得る（すなわち、「ＭＩＣ以下の溶解素量」）。代替的又は付加的には、上述の方法に使用される抗生物質の量は、修飾溶解素ポリペプチドの非存在下で使用される場合の抗生物質のＭＩＣに等しい濃度に相当する、すなわち、それをもたらす量を下回り得る（すなわち、「ＭＩＣ以下の抗生物質量」）。
【００３４】
更に別の態様では、グラム陽性細菌感染の治療に適した抗生物質の有効性を高める方法であって、抗生物質を本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドと組み合わせて同時投与することを含み、同時投与が、グラム陽性細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる上で、抗生物質又は修飾溶解素ポリペプチドのいずれか個別の投与よりも効果的である、方法が提供される。或る特定の実施の形態では、抗生物質はメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンからなる群から選択される。
【００３５】
別の態様では、修飾溶解素ポリペプチドと抗生物質とを含む組合せが提供される。或る特定の実施の形態では、組合せで効果的な修飾溶解素ポリペプチド、抗生物質又はその両方の最少量は、修飾溶解素ポリペプチド及び／又は抗生物質のそれぞれのＭＩＣ量を下回る。幾つかの実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチド及び抗生物質は、同じ組成物中で提供され、或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチド及び抗生物質は、異なる組成物中で提供される。
【００３６】
幾つかの実施の形態では、表面上のブドウ球菌又はレンサ球菌細菌を含有するバイオフィルムを予防、破壊、消散又は処理する方法であって、表面に有効量の本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドを単独で又は抗生物質と組み合わせて送達することを含み、バイオフィルムが効果的に予防、破壊、消散又は処理される、方法が提供される。或る特定の実施の形態では、表面は、医療器具の表面である。更に他の実施の形態では、医療器具は、限定されるものではないが、血液又は他の体液を含むヒトの身体内で又はヒトの身体と接触して使用される。かかる器具の非限定的な例としては、吸入器、挿管具、弁、カテーテル、人工肛門装置又は他の人工装具が挙げられる。
【００３７】
或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドの活性、例えばグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるペプチドの能力は、例えばＭＩＣ及び／又は最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評定することができる。或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドの活性は、例えばマウス好中球減少性大腿感染（ＭＮＴＩ）モデルによってｉｎ  ｖｉｖｏで評定することができる。更なる実施の形態では、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドとグラム陽性感染の治療に適した抗生物質、例えばメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィンの１つ以上との相乗活性は、チェッカーボードアッセイを用いて評定することができる。
【００３８】
幾つかの或る特定の実施の形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と同等の抗生物質耐性プロファイルを示し得る。したがって、抗生物質と、抗生物質に対する耐性の発現を回避する、低減する又は遅らせるのに効果的な量の本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドとを同時投与することを含む、ブドウ球菌又はレンサ球菌感染の治療に適した抗生物質に対する耐性の発現を阻害する方法が提供される。
【００３９】
更なる実施の形態では、抗生物質耐性プロファイルは、連続継代耐性単独、又は例えばメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン及びリソスタフィン等の抗生物質と組み合わせた連続継代によって評定される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】実施例３に記載される修飾溶解素ポリペプチドｐｐ５３、ｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５及びｐｐ２９６、並びに対照である野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素タンパク質ｐｐ１１４９（ＧＭＰグレードまで精製した）の精製プロセスの最終工程においてサイズ排除カラムから溶出した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。描かれた円に含まれる画分を、この最終精製工程でプールした。
【図２】実施例７に記載されるマウス好中球減少性大腿感染ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素（ＣＦ−３０１と表す）及び対照の野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチドｐｐ１１４９、並びに修飾溶解素ポリペプチドｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５及びｐｐ２９６の殺菌有効性の用量応答プロットである。細菌負荷（処理した大腿１ｇ当たりのコロニー形成単位）を、投与した溶解素の用量（ｍｇ／ｋｇ）に対してプロットする。
【図３Ａ−３Ｃ】実施例６に記載されるような２１日間又は２６日間の継代にわたる各々の指定の作用物質についての経時的なＭＩＣの倍率変化を示す一連の連続継代耐性アッセイの結果を示す図である。図３Ａでは、ＭＩＣの倍率変化（ＭＩＣの増加として測定される）を、ｐｐ２９６で処理した３つの独立した系統（「ｐｐ２９６−１」、「ｐｐ２９６−２」及び「ｐｐ２９６−３」と表す）、及び野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素（ＣＦ−３０１と表す）又はリソスタフィン（ＬＳＰ）のいずれかで処理した単一系統について示す。図３Ｂでは、ダプトマイシン（ＤＡＰ）のＭＩＣの倍率増加を、一定のＭＩＣ以下の量（１／１６×ＭＩＣ）のｐｐ２９６と組み合わせたＤＡＰ（「ＤＡＰ＋ｐｐ２９６−１」、「ＤＡＰ＋ｐｐ２９６−２」及び「ＤＡＰ＋ｐｐ２９６−３」と表す）及びＤＡＰ単独で処理した３つの独立した系統について示す。図３Ｃでは、バンコマイシン（ＶＡＮ）のＭＩＣの倍率増加を、一定のＭＩＣ以下の量（１／８×ＭＩＣ）のｐｐ２９６と組み合わせたＶＡＮ（「ＶＡＮ＋ｐｐ２９６−１」、「ＶＡＮ＋ｐｐ２９６−２」及び「ＶＡＮ＋ｐｐ２９６−３」と表す）及びＶＡＮ単独で処理した３つの独立した系統について示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語及びその同語源語は、文脈上そうでないことが明示されない限り、下記の意味を有するものとする。
【００４２】
「担体」は、活性化合物と共に投与される溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤（absorption delaying agent）、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。かかる担体は、滅菌液、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であり得る。
【００４３】
「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。担体（複数の場合もある）は、薬剤中で通常使用される量で治療対象の被験体に有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容可能な担体は、組成物をその意図される目的に不適なものにすることなく組成物の他の成分に適合する。さらに、薬学的に許容可能な担体は、過度の有害な副作用（毒性、刺激及びアレルギー応答等）なしに本明細書に提示される被験体への使用に適している。副作用は、それらのリスクが組成物によってもたらされる利益を上回る場合に「過度」である。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、並びに油／水エマルション及びマイクロエマルション等のエマルションが挙げられる。好適な医薬担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, 18th Editionに記載されている。
【００４４】
「殺菌」は、細菌の初期集団において１８時間〜２４時間にわたって少なくとも３ｌｏｇ１０（９９．９％）以上の減少の程度まで細菌の死滅を引き起こす特性を有するか、又は細菌を死滅させることが可能であることを指す。
【００４５】
「静菌」は従来、細菌細胞の増殖を阻害し、それにより細菌の初期集団において１８時間〜２４時間にわたって２ｌｏｇ１０（９９％）以上かつ最大３ｌｏｇ弱の減少を引き起こすことを含む、細菌増殖を阻害する特性を有することを指す。
【００４６】
「抗菌剤」は、静菌剤及び殺菌剤の両方を指す。
【００４７】
「抗生物質」は、細菌に致死性又は増殖の低減等の負の影響を与える特性を有する化合物を指す。抗生物質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌又はその両方に負の影響を与えることができる。例としては、抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカンの生合成、細胞膜の完全性、又は細菌におけるＤＮＡ若しくはタンパク質の合成に影響を及ぼし得る。グラム陽性細菌に対して活性の抗生物質の非限定的な例としては、メチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン、リソスタフィン、ペニシリン、クロキサシリン、エリスロマイシン、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、及びフィダキソマイシンが挙げられる。
【００４８】
「薬物耐性」は、概して薬物の抗菌活性に耐性を示す細菌を指す。或る特定の方法で使用される場合、薬物耐性は、特に抗生物質耐性を指し得る。場合によっては、一般に特定の抗生物質の影響を受けやすい細菌は、抗生物質に対する耐性を発現し、それにより薬物耐性微生物又は株となる可能性がある。「多剤耐性」（「ＭＤＲ」）病原体は、各々が単剤療法として使用される少なくとも２つのクラスの抗微生物薬に対する耐性を発現した病原体である。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）の或る特定の株は、メチシリン及び／又はバンコマイシンを含む幾つかの抗生物質に耐性を示すことが見出されている（Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention）。当業者は、薬物又は抗生物質に対する細菌の感受性又は耐性を決定する日常的な実験技術を用いて、細菌が薬物耐性であるかを容易に決定することができる。
【００４９】
「有効量」は、適切な頻度又は投与計画で適用又は投与した場合に、細菌増殖若しくは細菌負荷を予防、低減、阻害若しくは解消するか、又は治療される障害（例えば細菌病原体の増殖又は感染）の発症、重症度、期間若しくは進行を予防、低減若しくは改善するか、治療される障害の進展を予防するか、治療される障害の退行を引き起こすか、又は抗生物質若しくは静菌療法等の別の療法の予防効果若しくは治療効果（複数の場合もある）を高める若しくは改善するのに十分な量を指す。
【００５０】
「同時投与する」は、順次的な２種類の薬剤、例えば溶解素ペプチド及び抗生物質又は任意の他の抗菌剤の別々の投与、並びに実質的に同時の、例えば単一の混合物／組成物中での、又は別個に与えられるが、それでも実質的に同時に、例えば同日又は２４時間中に異なる時点で被験体に投与される用量でのこれらの作用物質の投与を包含することを意図する。このような溶解素ペプチドと１つ以上の付加的な抗菌剤との同時投与は、最大数日、数週間又は数ヶ月続く継続的な治療として行うことができる。さらに、用途に応じて、同時投与は、継続的又は同延的（coextensive）である必要はない。例えば、用途が局所抗菌剤として、例えば細菌性潰瘍又は感染した糖尿病性潰瘍を治療することがであった場合、溶解素ポリペプチドを初めのみ、最初の抗生物質の使用の２４時間以内に投与することができ、その後、抗生物質の使用を溶解素ポリペプチドの更なる投与なしに継続してもよい。
【００５１】
「被験体」は、哺乳動物、植物、下等動物、単細胞生物又は細胞培養物を指す。例えば、「被験体」という用語は、細菌感染、例えばグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌感染の影響を受けやすい又はそれを患う生物、例えば原核生物及び真核生物を含むことを意図する。被験体の例としては、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。或る特定の実施形態では、被験体はヒト、例えばかかる感染が全身性であるか、局所性であるか、又は別の形で特定の器官若しくは組織に集中若しくは限局しているかに関わらず、グラム陽性細菌による感染を患う、それを患うリスクがある又はその影響を受けやすいヒトである。
【００５２】
「ポリペプチド」は、「タンパク質」、「ペプチド」という用語と区別なく使用され、アミノ酸残基からなるポリマーを指す。或る特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも約３０個のアミノ酸残基を有する。この用語は、単離形態のポリペプチドだけでなく、その活性フラグメント及び誘導体も含み得る。「ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載の修飾溶解素ポリペプチドを含み、溶解素機能を維持する融合タンパク質又は融合ポリペプチドも包含する。文脈に応じて、ポリペプチドは、自然発生ポリペプチド、又は組換え、改変若しくは合成的に作製されたポリペプチドであり得る。特定の溶解素ポリペプチドは、例えば、酵素的若しくは化学的切断によって天然タンパク質から得るか若しくは取り出しても、又は従来のペプチド合成法（例えば、固相合成）若しくは分子生物学的手法（例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に開示されるもの）を用いて調製しても、又は戦略的に切断若しくはセグメント化して、同じ若しくは少なくとも１つの一般的な標的細菌に対する溶菌活性を維持する活性フラグメントを得てもよい。
【００５３】
「融合ポリペプチド」は、通例、異なる特性又は機能性を有する２つ以上のドメイン又はセグメントを有する融合発現産物を生じる、２つ以上の核酸セグメントの融合から得られる発現産物を指す。或る特定の実施形態では、「融合ポリペプチド」という用語は、直接、又はアミノ酸若しくはペプチドリンカーを介して共有結合的に連結した２つ以上の異種ポリペプチド又はペプチドを含むポリペプチド又はペプチドも指す。融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは通例、Ｃ末端からＮ末端に連結されるが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端又はＮ末端からＣ末端に連結されてもよい。「融合ポリペプチド」という用語は、「融合タンパク質」という用語と区別なく使用される場合もある。このため、或る特定の構造「を含むポリペプチド」というオープンエンドの表現は、融合ポリペプチド又は構築物等の列挙される構造よりも大きい分子を含む。本明細書で言及される構築物は、融合ポリペプチド又はコンジュゲート（２つ以上の部分を連結することによる）として作製され得る。
【００５４】
「異種」は、天然では隣接しないヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドの配列を指す。例えば、本開示との関連で、「異種」という用語は、融合ペプチド又はポリペプチドが通常は天然に見られない２つ以上のペプチド及び／又はポリペプチドの組合せ又は融合、例えば増強した溶菌活性を有し得る、修飾溶解素ポリペプチド、並びにカチオン性及び／又はポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、ｓｕｓｈｉペプチド（Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)）、ディフェンシンペプチド（Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)）、疎水性ペプチド及び／又は抗微生物ペプチドを記載するために使用することができる。２つ以上の溶解素ポリペプチド又はその活性フラグメントがこの定義に含まれる。これらを用いて溶菌活性を有する融合ポリペプチドを作製することができる。
【００５５】
「活性フラグメント」は、フラグメントが得られた単離ポリペプチドの１つ以上の機能又は生物活性を保持するポリペプチドの部分を指す。本明細書で使用される場合、修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントは、スタフィロコッカス・アウレウス等の少なくとも１つのグラム陽性細菌種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
【００５６】
「両親媒性ペプチド」は、親水性官能基及び疎水性官能基の両方を有するペプチドを指す。或る特定の実施形態では、二次構造により疎水性及び親水性アミノ酸残基が両親媒性ペプチドの反対側（例えば、ペプチドが水等の溶媒中にある場合、内側対外側）に置かれる。これらのペプチドは、或る特定の実施形態では、αヘリックス二次構造等のヘリックス二次構造を取ることができる。
【００５７】
「カチオン性ペプチド」は、正に帯電したアミノ酸残基を高い割合で有するペプチドを指す。或る特定の実施形態では、カチオン性ペプチドは、８．０以上のｐＫａ値を有するのが好ましい。本開示との関連での「カチオン性ペプチド」という用語は、主に正に帯電したアミノ酸残基、例えばリシン及び／又はアルギニン残基で構成される、合成的に作製されたペプチドであるポリカチオン性ペプチドも包含する。正に帯電していないアミノ酸残基は、中性に帯電したアミノ酸残基、負に帯電したアミノ酸残基、及び／又は疎水性アミノ酸残基であり得る。
【００５８】
「疎水性基」は、水分子に対する親和性が低いか又は親和性を有しないが、油分子に対してより高い親和性を有するアミノ酸側鎖等の化学基を指す。疎水性物質は、水又は水相への溶解性が低いか又は溶解性を有しない傾向があり、通例非極性であるが、油相への溶解性がより高い傾向がある。疎水性アミノ酸の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
【００５９】
「高める（Augmenting）」は、本明細書で使用される場合、そうでない場合よりも高い抗微生物活性等の作用物質の活性の程度を指す。「高める」は、相加的効果及び相乗（超相加的（superadditive））効果を包含する。
【００６０】
「相乗的」又は「超相加的」は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を超える、組合せでの２つの物質によってもたらされる有益な効果を指す。或る特定の実施形態では、相乗又は超相加的効果は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を有意に、すなわち統計的に有意に超える。一方又は両方の活性成分を閾値下レベル、すなわち活性物質が個別に用いられる場合に効果を生じないか、又は非常に限られた効果しか生じないレベルで用いることができる。効果は、本明細書に記載されるチェッカーボードアッセイ等のアッセイによって測定することができる。
【００６１】
「治療」は、ヒトを含む被験体が、直接的又は間接的に、障害を治癒するか、又は病原体を根絶するか、又は被験体の状態を改善する目的で医療を受ける任意のプロセス、行為、適用、療法等を指す。治療は、発生率の低減、若しくは症状の軽減、再発の解消、再発の予防、発生の予防、若しくは発生リスクの低減、症状の改善、予後の改善、又はそれらの組合せも指す。「治療」は、被験体における細菌の集団、増殖速度又は病原性を低減することで、被験体における細菌感染、又は器官、組織若しくは環境の細菌汚染を制御又は低減することを更に包含し得る。このため、発生率を低減する「治療」は、被験体であるか又は環境であるかを問わず、特定のミリュー（milieu）での少なくとも１つのグラム陽性細菌の増殖を阻害するのに効果的である。一方、既に確立された感染の「治療」は、感染又は汚染の原因となるグラム陽性細菌の菌数を減少させるか、それを死滅させるか、その増殖を阻害するか、及び／又はそれを根絶することを指す。
【００６２】
「予防する」という用語は、細菌感染等の障害の発生、再発、拡大、発症又は確立の予防を含む。本開示が感染の完全な予防又は感染の確立の予防に限定されることは意図されない。幾つかの実施形態では、発症を遅らせるか、又は続いて発症した（contracted）疾患の重症度若しくはその発症の可能性を低減することが予防例を構成する。特にバイオフィルムの予防に関して、この用語は、例えば対象の表面、例えば医療器具（例えば、吸入器、カテーテル、挿管具、弁又は他の人工器官）の表面への細菌の付着を妨げることによるバイオフィルムの形成の予防を含む。
【００６３】
「発症した疾患」は、発熱、敗血症又は菌血症の検出等の臨床症状又は不顕性（subclinical）症状が現れた疾患、並びにかかる病理と関連する症状が未だ現れていない場合の細菌病原体の増殖（例えば、培養物中での）によって検出され得る疾患を指す。特に、医療器具に関して、発症した疾患は、ブドウ球菌又はレンサ球菌細菌等の細菌を含有し、かかる器具の使用時に形成されるバイオフィルムを含むものとする。
【００６４】
ペプチド又はポリペプチド（本明細書で述べられるように活性フラグメントを含む）との関連での「誘導体」という用語は、例えば溶菌活性等のポリペプチドの活性に実質的に悪影響を与えない若しくは溶菌活性等のポリペプチドの活性を損なわない、アミノ酸以外の１つ以上の化学的部分を含有するように修飾されたポリペプチドを包含することを意図する。化学的部分は、例えばアミノ末端のアミノ酸残基、カルボキシ末端のアミノ酸残基又は内部アミノ酸残基を介してペプチドに共有結合的に連結することができる。かかる修飾は、天然であっても又は非天然であってもよい。或る特定の実施形態では、非天然修飾は、反応性部分への保護基若しくはキャップ基（capping group）の付加、抗体及び／又は蛍光標識等の検出可能な標識の付加、グリコシル化の付加若しくは修飾、又はＰＥＧ（ペグ化）等の嵩高基（bulking group）の付加、並びに当業者に既知の他の変化を含み得る。或る特定の実施形態では、非天然修飾は、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化等のキャップ修飾であり得る。溶解素ポリペプチドに付加することができる、例示的な保護基としては、ｔ−Ｂｏｃ及びＦｍｏｃが挙げられるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙ等の一般に使用される蛍光標識タンパク質は、細胞タンパク質の正常機能に干渉することなく、溶解素ポリペプチドに共有結合的若しくは非共有結合的に結合するか、又は溶解素ポリペプチドに融合させることができる小型のタンパク質である。或る特定の実施形態では、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが溶解素ポリヌクレオチド配列の上流又は下流に挿入される。これにより、細胞機能又はそれが結合した溶解素ポリペプチドの機能を妨げない融合タンパク質（例えば、溶解素ポリペプチド：：ＧＦＰ）が生じる。タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーションが、多くの医薬タンパク質の循環半減期を延長する方法として使用されている。このため、溶解素ポリペプチド誘導体との関連で、「誘導体」という用語は、１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合によって化学修飾された溶解素ポリペプチドを包含する。ペグ化溶解素ポリペプチドは、生物活性及び治療活性を保持した上で非ペグ化溶解素ポリペプチドと比較して延長された循環半減期を示すことが予想される。別の例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を改善するために短いポリカチオン性及び両親媒性αヘリックスを溶解素ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加する、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗レンサ球菌活性を改善するために短いポリカチオン性及び両親媒性αヘリックスをレンサ球菌溶解素のＮ末端又はＣ末端に付加する「ａｒｔｉｌｙｓｉｎ」の使用である。
【００６５】
「パーセントアミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、任意の保存的置換を配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列、例えば溶解素ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の能力の範囲内の様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ等の公開されているソフトウェア、又は例えばDNASTARにより市販されているソフトウェアを用いて達成することができる。２つ以上のポリペプチド配列は、０％〜１００％の間のいずれか、又はその間の任意の整数値で同一であり得る。本開示との関連で、２つのポリペプチドは、アミノ酸残基の少なくとも８０％（好ましくは少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも９９％）が同一である場合に「実質的に同一」である。本明細書に記載される「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、ペプチドにも当てはまる。このため、「実質的に同一」という用語は、本明細書に記載されるもの等の単離ポリペプチド及びペプチドの突然変異型、切断型、融合型、又は別の形で配列が修飾された変異体、及びその活性フラグメント、並びに参照（野生型又は他の無傷）ポリペプチドと比較して相当の配列同一性（例えば１つ以上の上記の方法によって測定される、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性）を有するポリペプチドを包含する。２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性）が同一であるか、又は保存的置換を示す場合に「実質的に相同」である。本開示のポリペプチドの配列は、ポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び／又は融合ポリペプチドのアミノ酸の１つ以上、又は幾つか、又は最大１０％、又は最大１５％、又は最大２０％が同様の又は保存的アミノ酸置換で置換され、得られるポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び／又は融合ポリペプチドが、参照ポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び／又は融合ポリペプチドの少なくとも１つの活性、抗菌効果及び／又は細菌特異性を有する場合に実質的に相同である。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【００６７】
「吸入用組成物」は、日常呼吸又は補助呼吸（例えば、気管気管支内（intratracheobronchial）投与、経肺投与及び／又は経鼻投与による）時の、又はそれと同時の気道への直接送達のために配合されている本開示の医薬組成物を指し、霧化、噴霧化、乾燥粉末及び／又はエアロゾル化配合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
「バイオフィルム」は、表面に付着し、細菌及び／又は宿主に由来する成分で構成され得る水和したポリマーマトリックス中に凝集した細菌を指す。バイオフィルムは、生物表面又は非生物表面上で細胞が互いに接着した微生物の凝集物である。これらの接着細胞は、限定されるものではないが、細胞外高分子物質（ＥＰＳ）で構成されるマトリックス中に埋め込まれることが多い。バイオフィルムのＥＰＳは、スライム（スライムと記載されたもの全てがバイオフィルムという訳ではない）又はプラークとも称され、一般に細胞外ＤＮＡ、タンパク質及び多糖で構成されるポリマー集塊である。或る特定の実施形態では、バイオフィルムは、ブドウ球菌及び／又はレンサ球菌細菌を含有し得る。
【００６９】
或る特定の細菌に対する使用に適した抗生物質との関連での「適した、好適な（Suitable）」は、耐性が後に発現する場合であっても、これらの細菌に対して効果的であることが見出された抗生物質を指す。
【００７０】
「野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素」及び「ＰｌｙＳｓ２溶解素」は、アミノ酸配列：ＭＴＴＶＮＥＡＬＮＮＶＲＡＱＶＧＳＧＶＳＶＧＮＧＥＣＹＡＬＡＳＷＹＥＲＭＩＳＰＤＡＴＶＧＬＧＡＧＶＧＷＶＳＧＡＩＧＤＴＩＳＡＫＮＩＧＳＳＹＮＷＱＡＮＧＷＴＶＳＴＳＧＰＦＫＡＧＱＩＶＴＬＧＡＴＰＧＮＰＹＧＨＶＶＩＶＥＡＶＤＧＤＲＬＴＩＬＥＱＮＹＧＧＫＲＹＰＶＲＮＹＹＳＡＡＳＹＲＱＱＶＶＨＹＩＴＰＰＧＴＶＡＱＳＡＰＮＬＡＧＳＲＳＹＲＥＴＧＴＭＴＶＴＶＤＡＬＮＶＲＲＡＰＮＴＳＧＥＩＶＡＶＹＫＲＧＥＳＦＤＹＤＴＶＩＩＤＶＮＧＹＶＷＶＳＹＩＧＧＳＧＫＲＮＹＶＡＴＧＡＴＫＤＧＫＲＦＧＮＡＷＧＴＦＫ（配列番号１；翻訳後プロセシング時に除去され、２４４アミノ酸ペプチドを残す最初のメチオニン残基を含む２４５個のアミノ酸残基）を有するポリペプチドを指す。
【００７１】
「修飾溶解素ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の非自然発生の変異体（又はその活性フラグメント）を指す。修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン及び／又はＳＨ３ｂドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、スタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
【００７２】
「免疫原性の」又は「免疫原性」は、（例えば、コンピューターによる計算ガイド方法により）１つ以上のＴ細胞エピトープの存在を確立することによって免疫原性であるか又は免疫原性を有すると予測されることを意味する。本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドの免疫原性は、ＴＣＥスコアを得るための任意の利用可能なコンピューターによる計算ガイド方法を用いてＴＣＥスコアによって測定し、同様に得られた、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素のＴＣＥスコアと比較することができる。代替的には、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドの免疫原性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞応答によって測定することができる。更に言うと、「より免疫原性が低い」、「低下した免疫原性」等は、１つ以上のＴ細胞エピトープの枯渇（アミノ酸の置換えによる除去又は減衰を含む）によって、より免疫原性が低いか若しくは低下した免疫原性を有する（すなわち、参照ポリペプチドと比較してより低いＴＣＥスコアを有する）と予測されるか、又は本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドが、低下したＴ細胞応答を引き起こすことを意味する。したがって、本明細書で使用される場合、修飾溶解素ポリペプチドが、１）配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素よりも低いＴＣＥスコア、又は２）低下したＴ細胞応答のいずれかを有する場合、修飾溶解素ポリペプチドは、「より免疫原性が低い」又は「低下した免疫原性」を有する等である。
【００７３】
「低下したＴ細胞応答」は、ヒト末梢血単核細胞をフルオレセインイソチオシアネート標識抗サイトカイン抗体に曝露し、応答を測定する、ＣＤ８＋枯渇ヒト末梢血単核細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞増殖（３｛Ｈ｝−チミジン取込み）アッセイによって測定されるように、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素よりも低いＴ細胞活性化を誘導することを意味する。
【００７４】
本開示の修飾溶解素ポリペプチドの溶菌活性（抗微生物活性）との関連で使用される「実質的に」は、少なくとも野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の抗菌活性の相当部分を意味し、かかる活性に基づいて、修飾溶解素ポリペプチドは、単独で又は１つ以上の抗生物質及び／又はリソスタフィン等の他の抗微生物剤と共に、細菌を死滅させることによってブドウ球菌又はレンサ球菌感染を阻害する、それに対抗する又はそれを解消するのに有用である。野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と比較して実質的なかかる活性の非限定的な例は、野生型溶解素の約５倍以下、例えば約４倍以下、約３倍以下又は約２倍以下のＭＩＣを含む。他の活性の尺度は、例えば最小バイオフィルム除去濃度（ＭＢＥＣ）、又は例えばマウス好中球減少性大腿感染モデル（ＭＮＴＩ）等の動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性であり得る。更に他の尺度は、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と同様のバンコマイシン若しくはダプトマイシン等の抗生物質と相乗作用を示す能力、又はバンコマイシン若しくはダプトマイシン等の抗生物質の細菌耐性の発現を改善する、予防する若しくは遅らせる能力であり得る。低下した免疫原性との関連で使用される同じ「実質的に」という用語は、例えばＴＣＥスコアによって測定されるように、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の免疫原性の多くとも６５％、例えば多くとも５０％、多くとも４０％、多くとも３０％又は多くとも２５％を有することを意味する（１９）。
【００７５】
修飾溶解素ポリペプチド
一態様では、本開示は、溶菌活性を有し、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と比較して低下した免疫原性を有する修飾溶解素ポリペプチドに関する。本明細書で使用される場合、「溶菌活性」は、細菌を死滅させるか、細菌の菌数を減少させるか、又は細菌増殖を阻害する溶解素の能力を包含する。溶菌活性は、バイオフィルムを除去又は低減する能力、及び／又は抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる能力も包含する。
【００７６】
通例、本修飾溶解素ポリペプチドは、細菌細胞壁の主要な構造成分であるペプチドグリカンを分解し、細胞溶解をもたらすことが可能である。修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と比較して免疫原性を低下させ、及び／又は炎症応答関連毒性を低下させることが更に可能である。
【００７７】
本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドの活性を評定するのに適した方法は、当該技術分野で既知であり、実施例に記載されている。簡潔に述べると、ＭＩＣ値（すなわち、対照と比較して少なくとも８０％の細菌増殖を抑制するのに十分なペプチドの最小濃度）を修飾溶解素ポリペプチドについて決定し、例えば野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素又は不活性化合物と比較することができる。例えば、修飾溶解素ポリペプチドのＭＩＣ値を、例えばミューラーヒントンブロス、又はウマ血清等の血清を添加したミューラーヒントンブロス中で、例えば実験室スタフィロコッカス・アウレウス株に対して決定することができる。
【００７８】
幾つかの実施形態では、本修飾溶解素ポリペプチドは、バイオフィルムを低減することが可能である。修飾溶解素ポリペプチドの最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）を評定する方法では、修正した微量液体希釈ＭＩＣ法の変法を用いて決定することができる（Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）及びSchuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, pages 1-18（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。この方法では、細菌、例えばメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）及びメチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ）等のスタフィロコッカス・アウレウスのコロニーを媒体、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁し、例えばＴＳＢｇ（０．２％グルコースを添加したトリプシンソイブロス）で１００倍希釈し、例えば０．１５ｍｌアリコートとしてＣａｌｇａｒｙ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｄｅｖｉｃｅ（９６個のポリカーボネートペグを備える蓋を有する９６ウェルプレート；lnnovotech Inc.）に添加し、例えば３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、バイオフィルムを洗浄し、例えばＴＳＢｇ中の２倍希釈系列の溶解素によって、例えば３７℃で２４時間処理する。処理後に、ウェルを洗浄し、例えば３７℃で風乾し、例えば０．０５％クリスタルバイオレットで１０分間染色する。染色後に、バイオフィルムを、例えば３３％酢酸で脱染し、例えば抽出されたクリスタルバイオレットのＯＤ６００を決定する。各サンプルのＭＢＥＣが、クリスタルバイオレット定量化によって評定される、バイオフィルムのバイオマスの９５％超を除去するのに必要とされる最小溶解素濃度である。
【００７９】
幾つかの実施形態では、本修飾溶解素ポリペプチドは、抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる。ＭＩＣを評定する任意の既知の方法を用いることができる。幾つかの実施形態では、チェッカーボードアッセイを用いて、抗生物質濃度に対する溶解素の影響を決定する。チェッカーボードアッセイは、微量液体希釈によるＭＩＣ決定のためのＣＬＳＩの方法の修正に基づく（Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）及びCeri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776（同様にその全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。
【００８０】
チェッカーボードを、初めに横軸に沿って、例えば各ウェルが同量の２倍希釈した抗生物質を含む９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの列を作成することによって構築する。別のプレートに、縦軸に沿って各ウェルが同量の、例えば２倍希釈した溶解素を有する比較用の行を作成する。次いで、各列が一定量の抗生物質及び溶解素の２倍希釈物を含み、各行が一定量の溶解素及び抗生物質の２倍希釈物を含むように、溶解素及び抗生物質の希釈物を組み合わせる。これにより、各ウェルは、溶解素と抗生物質との独自の組合せを有する。細菌を所与の濃度で薬物の組合せに添加する。次いで、単独及び組合せでの各薬物のＭＩＣを、例えば周囲空気中にて３７℃で１６時間の後に記録する。部分阻止濃度の総和（ΣＦＩＣ）を各薬物について算出し、最小のΣＦＩＣ値（ΣＦＩＣｍｉｎ）を用いて溶解素／抗生物質の組合せの効果を決定する。
【００８１】
本明細書に開示の溶解素ポリペプチドを野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素から修飾した。ＰｌｙＳｓ２は、ストレプトコッカス・スイス細菌に由来し得るバクテリオファージ溶解素である。ＰｌｙＳｓ２は、ＭＲＳＡ及びバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＶＲＳＡ）等の抗生物質耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むブドウ球菌、レンサ球菌、エンテロコッカス及びリステリア細菌株を含むグラム陽性細菌を含む複数の細菌に対して広範な死滅活性を示す。野生型ＰｌｙＳｓ２は、以下のアミノ酸配列を有する：
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配列番号１は、翻訳後プロセシング時に除去され、２４４アミノ酸ポリペプチドを残す最初のメチオニン残基を含む２４５個のアミノ酸残基を有する。イタリック体のアミノ酸は、ＣＨＡＰドメイン（アミノ酸１〜１４６）を示し、点線下線は、ＳＨ３ｂドメイン（アミノ酸１５７〜２４５）を示す。２つのドメイン間の自然発生リンカーは、ＰＰＧＴＶＡＱＳＡＰ（配列番号２）である。
【００８２】
本明細書に開示されるように、野生型ＰｌｙＳｓ２は、ＣＨＡＰドメイン及びＳＨ３ｂドメインの両方を含み、その各々が複数のＴ細胞エピトープ（ＴＣＥ）を含む。ＴＣＥ１、ＴＣＥ２、ＴＣＥ３及びＴＣＥ４は、ＣＨＡＰドメイン中に位置し、ＴＣＥ５、ＴＣＥ６、ＴＣＥ７及びＴＣＥ８は、ＳＨ３ｂドメイン中に位置する。ＴＣＥ１は、配列番号１のアミノ酸残基３２〜４５に対応する。ＴＣＥ２は、配列番号１のアミノ酸残基８４〜９８に対応する。ＴＣＥ３は、配列番号１のアミノ酸残基１００〜１１２に対応する。ＴＣＥ４は、配列番号１のアミノ酸残基１２８〜１４５に対応する。ＴＣＥ５は、配列番号１のアミノ酸残基１６４〜１７０に対応する。ＴＣＥ６は、配列番号１のアミノ酸残基１７２〜１８７に対応する。ＴＣＥ７は、配列番号１のアミノ酸残基１８９〜２０１に対応し、ＴＣＥ８は、配列番号１のアミノ酸残基２０４〜２２１に対応する。
【００８３】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも１つの置換を含み、少なくとも１つの置換がＴＣＥ１、ＴＣＥ２、ＴＣＥ３又はＴＣＥ４の１つ以上にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも１つの置換を含み、少なくとも１つの置換がＴＣＥ５、ＴＣＥ６、ＴＣＥ７又はＴＣＥ８の１つ以上にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも第１の置換及び少なくとも第２の置換を含み、少なくとも第１の置換がＴＣＥ１、ＴＣＥ２、ＴＣＥ３又はＴＣＥ４の１つ以上にあり、少なくとも第２の置換がＴＣＥ５、ＴＣＥ６、ＴＣＥ７又はＴＣＥ８の１つ以上にあり、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰｌｙＳｓ２と比較して低下した免疫原性を有する。
【００８４】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも２つの置換を含み、少なくとも２つの置換がＴＣＥ４にある。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも４つの置換を含み、少なくとも１つの置換がＴＣＥ２にあり、少なくとも１つの置換がＴＣＥ３にあり、少なくとも２つの置換がＴＣＥ４にある。
【００８５】
或る特定の実施形態では、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列をＣＨＡＰドメイン中のアミノ酸残基３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置でのアミノ酸置換、及び／又はＳＨ３ｂドメイン中のアミノ酸残基１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置でのアミノ酸置換によって修飾することで得ることができる。したがって、或る特定の実施形態では、野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する修飾溶解素ポリペプチドであって、ＣＨＡＰドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置での少なくとも１つのアミノ酸置換、及び／又はＳＨ３ｂドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、修飾溶解素ポリペプチドが本明細書に開示される。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基９２、１０４、１２８及び１３７にアミノ酸置換を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基９２、１０４、１２８、１３７、１６４、１８４及び１９８にアミノ酸置換を含む。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰｌｙＳｓ２と比較して低下した免疫原性を有する。
【００８６】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸置換、例えば少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ又は少なくとも９つのアミノ酸置換を含有し得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１に対して３つ〜９つのアミノ酸置換、例えば４つ〜９つ、５つ〜９つ、６つ〜９つ、７つ〜９つ、８つ〜９つ又は９つのアミノ酸置換を含有し得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１に対してＣＨＡＰドメイン中に少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ又は少なくとも４つのアミノ酸置換を含み得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１に対してＳＨ３ｂドメイン中に少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ又は少なくとも４つのアミノ酸置換を含み得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１に対してＣＨＡＰドメイン中の２つ、３つ又は４つのアミノ酸置換からなり得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１に対してＳＨ３ｂドメイン中の２つ、３つ又は４つのアミノ酸置換からなり得る。
【００８７】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１に対して以下のアミノ酸置換の１つ以上を含む：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ｅ、Ｖ２１２Ａ及びＶ２１４Ｇ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の１つ以上：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ、及び／又はＳＨ３ｂドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の１つ以上：Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇを含み、修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰｌｙＳｓ２と比較して低下した免疫原性を有する。
【００８８】
本明細書中の置換は、置き換えられる配列番号１中の元のアミノ酸の一文字アミノ酸コード、続いて配列番号１中のアミノ酸位置、続いて配列中に置換され、修飾溶解素ポリペプチドをもたらすアミノ酸を用いて表される。したがって、例として、Ｒ３５Ｅは、配列番号１のアミノ酸番号３５のアルギニンがグルタミン酸で置き換えられる置換を示す。
【００８９】
例示的な修飾溶解素ポリペプチドは、ｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５、ｐｐ２９６、ｐｐ３２４、ｐｐ３２５、ｐｐ３４１、ｐｐ３３８、ｐｐ３８８、ｐｐ４００、ｐｐ６１６、ｐｐ６１９、ｐｐ６２８、ｐｐ６３２及びｐｐ６４２として本明細書に開示される。
【００９０】
例示的な修飾溶解素ポリペプチドは、下記表１に示されるような配列番号１のアミノ酸配列に対するアミノ酸置換を含む。
【００９１】
【表１】
2021513865.tif 000004
【００９２】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ５５であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９３】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ６１であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｈ及びＩ２０６Ｅ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９４】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ６５であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ａ、及びＶ２１２Ａ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９５】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ２９６であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、及びＳ１９８Ｑ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９６】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ３２４であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、及びＮ１８４Ｄ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９７】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ３２５であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、及びＲ１９５Ｅ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９８】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ３８１であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、及びＳ１９８Ｈ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９９】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ３４１であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、Ｖ２０４Ａ、及びＶ２１２Ａ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１００】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ３８８であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｙ１６４Ｎ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０１】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ４００であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０２】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ６１６であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、及びＹ１６４Ｋ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０３】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ６１９であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、及びＹ１６４Ｋ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０４】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ６２８であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０５】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ６３２であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０６】
本明細書に開示の或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドはｐｐ６４２であり、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｉ２０６Ｅ、及びＶ２１４Ｇ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０７】
ＣＨＡＰ及び／又はＣｈ３ｂドメイン中の少なくとも１つの置換に加えて、修飾溶解素ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸挿入及び／又は欠失を、これらの修飾が修飾溶解素ポリペプチドの溶菌活性及び／又は免疫原性の低下を妨げない限りにおいて含んでいてもよい。
【０１０８】
キメラ溶解素ポリペプチドも開示される。キメラ溶解素ポリペプチドは、当該技術分野で既知である。例えば、ＣｌｙＦは、Ｐｌｙ１８７溶解素の触媒ドメイン（Ｎ末端の１５７アミノ酸残基）とＰｌｙＳｓ２の結合ドメイン（Ｃ末端の９９残基）とを組み合わせたキメラ溶解素である（１０）。或る特定の実施形態では、キメラ溶解素ポリペプチドは、本明細書に開示される修飾ＰｌｙＳｓ２  ＣＨＡＰドメインと別の溶解素の結合ドメインとを含む。或る特定の実施形態では、キメラ溶解素ポリペプチドは、別の溶解素の触媒ドメインと本明細書に開示される修飾ＰｌｙＳｓ２  ＳＨ３ｂドメインとを含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントが得られる。「活性フラグメント」という用語は、参照溶解素の１つ以上の生物活性を保持する完全長溶解素の一部分を指す。このため、本明細書で使用される場合、修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントは、少なくとも１つのグラム陽性細菌種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
【０１１０】
ポリヌクレオチド
一態様では、本開示は、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチドであって、修飾溶解素ポリペプチドが溶菌活性及び野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する、単離ポリヌクレオチドに関する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントは、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
【０１１１】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがＴＣＥ１、ＴＣＥ２、ＴＣＥ３又はＴＣＥ４の１つ以上に少なくとも１つの置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがＴＣＥ５、ＴＣＥ６、ＴＣＥ７又はＴＣＥ８の１つ以上に少なくとも１つの置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも第１の置換及び少なくとも第２の置換を含み、少なくとも第１の置換がＴＣＥ１、ＴＣＥ２、ＴＣＥ３又はＴＣＥ４の１つ以上にあり、少なくとも第２の置換がＴＣＥ５、ＴＣＥ６、ＴＣＥ７又はＴＣＥ８の１つ以上にある。或る特定の実施形態では、核酸分子は、野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも２つの置換を含む修飾溶解素ポリペプチドをコードし、少なくとも２つの置換がＴＣＥ４にある。或る特定の実施形態では、核酸分子は、野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも４つの置換を含む修飾溶解素ポリペプチドをコードし、少なくとも１つの置換がＴＣＥ２にあり、少なくとも１つの置換がＴＣＥ３にあり、少なくとも２つの置換がＴＣＥ４にある。
【０１１２】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、修飾溶解素ポリペプチドがＣＨＡＰドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置での少なくとも１つのアミノ酸置換、及び／又はＳＨ３ｂドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸残基９２、１０４、１２８及び１３７にアミノ酸置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸残基９２、１０４、１２８、１３７、１６４、１８４及び１９８にアミノ酸置換を含む。
【０１１３】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換の１つ以上を含む：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ｅ、Ｖ２１２Ａ及びＶ２１４Ｇ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがＣＨＡＰドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の１つ以上：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ、及び／又はＳＨ３ｂドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の１つ以上：Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇを含む。
【０１１４】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１１５】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｈ、及びＩ２０６Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１１６】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ａ、及びＶ２１２Ａ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１１７】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、及びＳ１９８Ｑ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１１８】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、及びＮ１８４Ｄ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１１９】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、及びＲ１９５Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２０】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、及びＳ１９８Ｈ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２１】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、Ｖ２０４Ａ、及びＶ２１２Ａ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２２】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｙ１６４Ｎ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２３】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１２のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２４】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、及びＹ１６４Ｋ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２５】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、及びＹ１６４Ｋ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１４のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２６】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１５のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２７】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２８】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｉ２０６Ｅ、及びＶ２１４Ｇ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１７のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも９０％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも９５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも９８％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２９】
ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチド又は本単離ポリヌクレオチドの相補配列を含むベクターに関する。幾つかの実施形態では、ベクターはプラスミド又はコスミドである。他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、それが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることで、宿主ゲノムと共に複製され得る。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、本明細書で「組み換え発現ベクター」又は「発現ベクター」と称される特定のベクターは、それらが操作可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。ポリヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的関係に置かれる場合、「操作可能に連結する」。例えば、プロモーター又は調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ及び／又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列に、２つの配列が操作可能に連結する、すなわちプロモーター又は調節ＤＮＡ配列がコード又は構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を及ぼすように位置する場合に「操作可能に連結した」と言われる。操作可能に連結したＤＮＡ配列は、必ずしもというわけではないが、通例、連続する。
【０１３１】
概して、ポリペプチドを宿主内で維持、増加又は発現するのに適した任意の系又はベクターを本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントの発現に使用することができる。適切なＤＮＡ／ポリヌクレオチド配列を様々な既知の日常的な手法、例えばSambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に記載される手法のいずれかによって発現系に挿入することができる。さらに、簡便な単離方法を得るためにタグ、例えばｃ−ｍｙｃ、ビオチン、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ等を本開示の修飾溶解素ポリペプチドに付加することもできる。かかる発現系のキットが市販されている。
【０１３２】
広範な宿主／発現ベクターの組合せを、本修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の発現に用いることができる。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。適切なベクターの例は例えば、Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に提示されている。かかるベクターとしては、特に染色体ベクター、エピソームベクター及びウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０等のパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルスに由来するベクター、並びにそれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドとコスミド及びファージミド等のバクテリオファージ遺伝要素とに由来するベクターが挙げられる。
【０１３３】
さらに、上記ベクターは、本開示の修飾溶解素ポリペプチドの構成的又は誘導性発現をもたらすことができる。好適なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体、並びに既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌＥｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４、ｐＢＡＤ２４及びｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ等のプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージＡの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、並びに他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２Ｄプラスミド等の酵母プラスミド又はその誘導体；昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクター等の真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミド等のプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。上述のベクターの多くがNew England Biolabs Inc.、Addgene、Takara Bio Inc.、ThermoFisher Scientific Inc.等の供給業者から市販されている。
【０１３４】
さらに、ベクターは、様々な調節要素（プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する様々なシスエレメントを含む）を含んでいてもよく、ベクターは、宿主細胞に応じて構築される。広範な発現制御配列（それに操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を制御する配列）のいずれかを、本開示の修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するために、これらのベクターに用いることができる。有用な制御配列としては、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ又はアデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージＡの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母接合因子のプロモーター、細菌における発現のための大腸菌プロモーター、並びに原核若しくは真核細胞、又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーター配列、並びにそれらの様々な組合せが挙げられるが、これらに限定されない。通例、修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、異種プロモーター又は調節要素に操作可能に連結する。
【０１３５】
別の態様では、本開示は、本開示の修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む本明細書に開示のベクターのいずれかを含む単離宿主細胞に関する。広範な宿主細胞が本ポリペプチドの発現に有用である。本ポリペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例としては、大腸菌、シュードモナス属、バシラス属、ストレプトミセス属の株、酵母等の真菌、並びに組織培養物中のＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ及びＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０）等の動物細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、並びにヒト細胞及び植物細胞等の既知の真核生物及び原核生物宿主が挙げられる。
【０１３６】
発現宿主は、任意の既知の発現宿主細胞であってもよいが、典型的な実施形態では、発現宿主は大腸菌株の１つである。これらとしては、Ｔｏｐ１０（ThermoFisher Scientific, Inc.）、ＤＨ５ａ（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Agilent Technologies, Inc.）、ＳＣＳ１１０（Agilent Technologies, Inc.）、ＪＭ１０９（Promega, Inc.）、ＬＭＧ１９４（ATCC）及びＢＬ２１（Thermo Fisher Scientific, Inc.）等の市販の大腸菌株が挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌を宿主系として使用することの利点は幾つかあり、最適な環境条件下で、その倍加時間が約２０分間である急速な増殖動態（Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)）、容易に達成される高密度の培養物、外来性ＤＮＡによる容易かつ急速な形質転換等が挙げられる。プラスミド選択及び株選択を含む、大腸菌におけるタンパク質発現に関する詳細は、Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014)に詳細に論考されている。
【０１３７】
本修飾溶解素ポリペプチドの効率的な発現は、最適発現シグナル（転写及び翻訳の両方のレベルで）、正確なタンパク質フォールディング及び細胞増殖特性等の様々な要因によって決まる。ベクターを構築する方法及び構築した組換えベクターを宿主細胞に形質導入する方法に関して、当該技術分野で既知の従来の方法を利用することができる。全てのベクター、発現制御配列及び宿主が本開示の修飾溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するよう同様に良好に機能するわけではないことが理解されるが、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成するために過度な実験なしに適当なベクター、発現制御配列及び宿主を選択することが可能である。
【０１３８】
本開示の修飾溶解素ポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィーを溶解素ポリペプチド精製に用いることもできる。
【０１３９】
代替的には、本開示の修飾溶解素ポリペプチドの作製に用いられるベクター系は、無細胞発現系であってもよい。様々な無細胞発現系が市販されており、限定されるものではないが、Promega、LifeTechnologies、Clonetech等から入手可能なものが挙げられる。
【０１４０】
修飾溶解素ポリペプチドを含む組成物
本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、単独で又は１つ以上の従来の抗生物質及び他の殺菌剤と共に抗微生物及び殺菌組成物、並びにその単位剤形に組み込まれ得る。
【０１４１】
通例、組成物は、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドをスタフィロコッカス・アウレウス；リステリア・モノサイトゲネス；スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌；ストレプトコッカス・スイス；ストレプトコッカス・ピオゲネス；ストレプトコッカス・アガラクティアエ；ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ；ストレプトコッカス・ニューモニアエ；ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種；エンテロコッカス・フェカーリス；並びにエンテロコッカス・フェシウムからなる群から選択されるグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量で含有する。
【０１４２】
本明細書に開示の組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体を含むカプセル、散剤、徐放製剤、坐剤、タンポン塗布、エアロゾル、スプレー、ロゼンジ剤、トローチ剤、キャンディ、注射剤、チューインガム、軟膏、擦り込み剤、時間放出貼付剤、液体を吸収したワイプ、及びそれらの組合せの形態を取り得る。したがって、組成物は、固体、例えば錠剤、再構成のための凍結乾燥散剤、リポソーム若しくはミセルとして利用され得るか、又は組成物は、液体、例えば液剤、懸濁剤、含嗽剤（gargles）、乳剤、若しくは固体若しくは液体を充填した、例えば経口使用のためのカプセルとして利用され得る。或る特定の実施形態では、組成物は、直腸投与のための坐剤若しくはカプセルの形態、又は非経口（例えば、静脈内又は皮下を含む）若しくは局所、例えば皮膚、鼻、咽頭若しくは肺への使用のための滅菌注射用若しくは吸入用溶液若しくは懸濁液の形態であり得る。かかる組成物には医薬組成物が含まれ、その単位剤形は、付加的な活性化合物又は成分を伴う又は伴わない、従来の又は特別な割合での従来の又は新たな成分を含み得る。かかる単位剤形は、用いるべき意図される１日投与量範囲に応じた任意の好適な有効量の活性成分を含有し得る。
【０１４３】
担体及び賦形剤は、ヒト又は動物への使用に許容可能な多種多様の物質から選択することができる。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、標準的な薬学的担体、例えばリン酸緩衝食塩水、水、ポリオール、二糖又は多糖、並びにエマルション、例えば油／水エマルション及びマイクロエマルションが挙げられる。他の安定化賦形剤としては、安定化剤及び保護溶液（ＳＰＳ）の保護されたブレンド、シクロデキストリン、並びに組換えヒトアルブミン（ｒＨＳＡ）が挙げられる。他の賦形剤としては、充填剤、緩衝剤、浸透圧調整剤（例えば塩及びアミノ酸）、界面活性剤、保存料、抗酸化剤、及び共溶媒を挙げることができる。本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドを含む固形経口組成物について、好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等が挙げられる。液体経口組成物について、好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、水、グリコール、油、アルコール、矯味剤、保存料等を挙げることができる。局所固形組成物、例えばクリーム剤、ゲル剤、フォーム、軟膏、又はスプレーについて、好適な賦形剤としては、限定されないが、セルロース性又は油性のクリーム剤、乳化剤、硬化剤、レオロジー調整剤又は増粘剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、保存料、保湿剤、アルカリ化剤又は緩衝剤、及び溶媒を挙げることができる。
【０１４４】
例えば、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、液体懸濁液、溶液又はエマルションのｐＨを修飾溶解素ポリペプチドの活性に実質的に影響を及ぼさない範囲内に維持する緩衝液と組み合わせることができる。例えば、組成物又は投与時に活性成分が見られる環境の望ましいｐＨ範囲は約４．０〜約９．０、例えば約４．５〜約８．５であり得る。
【０１４５】
修飾溶解素ポリペプチドが最適化された形で活性を発揮するように安定化緩衝液が任意に含まれていてもよい。緩衝液は、ジチオスレイトール等の還元試薬を含有し得る。安定化緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム塩等の金属キレート試薬であっても若しくはそれを含んでいてもよく、又はリン酸緩衝液若しくはクエン酸リン酸緩衝液、若しくはＴｒｉｓ若しくはコハク酸エステル等の任意の他の緩衝剤を含有していてもよい。
【０１４６】
温和な界面活性剤が、組成物に使用される修飾溶解素ポリペプチドの治療効果を高めるのに効果的な量で医薬組成物中に含まれていてもよい。好適な温和な界面活性剤としては、特にポリオキシエチレンソルビタン及び脂肪酸のエステル（Ｔｗｅｅｎシリーズ等）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘシリーズ等）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ポロキサマー、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール、並びに生物学的に生じる界面活性剤、例えば脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、デオキシコール酸及びデオキシコール酸のエステルを挙げることができる。
【０１４７】
保存料を本明細書に開示の組成物に使用してもよく、例えば全組成物の約０．０５重量％〜約０．５重量％を占めることができる。保存料の使用は、製品が微生物で汚染される場合、配合物が微生物の増殖を予防又は軽減する（又は配合物の効力を弱める）ことを確実にし得る。例示的な保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロキシレノール、安息香酸ナトリウム、ＤＭＤＭヒダントイン、３−ヨード−２−プロピルブチルカルバメート、ソルビン酸カリウム、クロルヘキシジンジグルコン酸塩、又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１４８】
経口投与のため、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、固形又は液体の製剤、例えば錠剤、カプセル、散剤、液剤、懸濁剤、及び分散剤に配合される。錠剤又はカプセルの形態での経口投与のため、活性成分は１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、例えば結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えばラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、他の還元及び非還元糖、微結晶性セルロース、硫酸カルシウム、又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、ステアリン酸、フマル酸ステアリルナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸カルシウム等）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）、着色及び矯味剤、ゼラチン、甘味料、天然及び合成ガム（例えばアカシア、トラガント又はアルギン酸塩）、緩衝塩、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等と組み合わせられ得る。液体形態での経口投与のため、薬物成分は、非毒性の、薬学的に許容可能な不活性の担体（例えばエタノール、グリセロール、水）、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体又は水素化食用油脂）、乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）、非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分画された植物油）、保存料（例えばメチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）等と組み合わせられ得る。安定化剤、例えば抗酸化剤（例えばＢＨＡ、ＢＨＴ、プロピルガレート、アスコルビン酸ナトリウム又はクエン酸）を加えて、剤形を安定化させることもできる。
【０１４９】
或る特定の実施形態では、錠剤を当該技術分野で既知の方法によってコーティングしてもよい。本明細書に開示の組成物を、例えばポリグリコール酸／乳酸（ＰＧＬＡ）から製造されたマイクロスフェア又はマイクロカプセル内に導入することもできる。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロップ、エマルション若しくは懸濁液の形態を取ることができ、又は使用前に水若しくは他の好適なビヒクルで再構成される乾燥製品として与えることができる。経口投与用の製剤は、活性化合物の制御又は遅延（postponed）放出をもたらすように適切に配合することができる。
【０１５０】
活性剤を小型単層ベシクル、大型単層ベシクル及び多層ベシクル等のリポソーム送達系の形態で投与してもよい。リポソームは、既知のコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリン等の様々なリン脂質から形成することができる。
【０１５１】
錠剤及び丸剤等の固体組成物を調製するために、本明細書に開示される修飾溶解素ポリペプチドを医薬賦形剤と混合し、固体製剤化前（preformulation）組成物を形成することができる。必要に応じて、錠剤を標準的な手法により糖コーティング又は腸溶コーティングしてもよい。錠剤又は丸剤をコーティングするか又は他の形で調合して、持続性又は遅延作用の利点をもたらす剤形を得ることができる。例えば、錠剤又は丸剤が内部投薬成分（dosage component）及び外部投薬成分を含み、後者が前者の外層の形態であってもよい。２つの成分が、胃内での崩壊に対抗し、内部成分が無傷で十二指腸に運ばれるか又は更に放出を遅らせるように働く腸溶層で隔てられてもよい。様々な材料をかかる腸溶層又はコーティングに使用することができ、かかる材料としては、多数のポリマー酸、並びにポリマー酸とセラック、セチルアルコール及び酢酸セルロース等の材料との混合物が挙げられる。同様に、経口投与される薬剤を拡散制御系、浸透圧デバイス（osmotic devices）、溶解制御マトリックス及び浸食性／分解性マトリックスを含む時間制御放出ビヒクルの形態で投与することができる。
【０１５２】
本明細書に開示される局所用組成物は、皮膚科学的に又は耳に（otically）許容可能な担体等の薬学的又は生理学的に許容可能な担体を更に含み得る。かかる担体は、皮膚科学的に許容可能な担体の場合、皮膚、爪、粘膜、組織及び／又は毛髪に適合することができ、これらの要件を満たす任意の通常使用される皮膚用担体を含み得る。耳に許容可能な担体の場合、担体は耳の全ての部位に適合することができる。かかる担体は、当業者が容易に選択することができる。本明細書に開示の化合物の局所投与用の担体としては、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン及び／又はポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が挙げられるが、これらに限定されない。皮膚用軟膏の配合では、本開示の活性成分を油脂性炭化水素基剤、無水吸水性基剤、油中水型吸水性基剤、水中油型水除去性（water-removable）基剤及び／又は水溶性基剤中に配合することができる。耳用組成物の配合では、本開示の活性成分を担体、例えばデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、多糖ゲル、Ｇｅｌｒｉｔｅ（商標）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロースポリマー、及びアクリル酸のポリマー又はコポリマー等のカルボキシ含有ポリマー、並びに他のポリマー粘滑剤を含む水性ポリマー懸濁液中に配合することができる。本明細書に開示される局所用組成物は、水性、水性アルコール性若しくは油性溶液、ローション若しくは血清分散液、水性、無水若しくは油性ゲル、水相への脂肪相（fatty phase）の分散（Ｏ／Ｗ又は水中油型）、若しくは逆に脂肪相への水相の分散（Ｗ／Ｏ又は油中水型）によって得られるエマルション、マイクロエマルション、若しくは代替的にはマイクロカプセル、マイクロ粒子、又はイオン性及び／又は非イオン性の脂質ベシクル分散液、クリーム、ローション、ゲル、フォーム（加圧キャニスター、好適なアプリケーター、乳化剤及び不活性噴射剤が用いられ得る）、エッセンス、乳液、懸濁液、又はパッチを含む局所適用に適した任意の形態であり得る。本明細書に開示の局所用組成物は、親水性又は親油性ゲル化剤、親水性又は親油性活性剤、保存剤、酸化防止剤、溶媒、香料、増量剤、日焼け止め剤、消臭剤（odor-absorbers）及び染料等の補助剤を含有していてもよい。更なる態様では、本明細書に開示の局所用組成物は、被験体の皮膚、又は他の組織若しくは器官と付着するか又は他の形で結合することが可能であり、治療有効量の本明細書に開示される１つ以上の修飾溶解素ポリペプチドを送達することが可能である経皮パッチ、包帯剤、パッド、ラップ、マトリックス及び包帯等の道具と共に投与することができる。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の局所用組成物は、局所熱傷の治療に使用される１つ以上の成分を付加的に含む。かかる成分としては、プロピレングリコールヒドロゲル；グリコール、セルロース誘導体及び水溶性アルミニウム塩の組合せ；防腐剤；抗生物質；並びにコルチコステロイドを挙げることができるが、これらに限定されない。保湿剤（固体又は液体ワックスエステル等）、吸収促進剤（親水性クレイ又はデンプン等）、粘度上昇剤（viscosity building agents）及び皮膚保護剤を添加することもできる。局所用配合物は、洗口液等の洗浄剤の形態であってもよい。例えば、国際公開第２００４／００４６５０号を参照されたい。
【０１５４】
本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、適切な量の修飾溶解素ポリペプチドと担体とを含む治療剤の注射によって投与することもできる。例えば、修飾溶解素ポリペプチドは、グラム陽性細菌等の細菌による感染を治療するために筋肉内に、脳室内に、髄腔内に、真皮下に（subdermally）、皮下に、腹腔内に、静脈内に、又は直接注射若しくは持続注入によって投与することができる。担体は、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清又はそれらの任意の組合せで構成され得る。さらに、非経口注射の医薬組成物は、修飾溶解素ポリペプチドの薬学的に許容可能な水溶液又は非水溶液を以下の１つ以上に加えて含み得る：ｐＨ緩衝液、補助剤（例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤、安定化剤及び分散剤）、リポソーム配合物、ナノ粒子、分散液、懸濁液及びエマルション、並びに使用直前に滅菌注射用溶液又は分散液に再構成される滅菌粉末。
【０１５５】
或る特定の実施形態では、注射用の配合物は単位剤形で、例えばアンプル又は複数回投与用容器内で与えることができ、或る特定の実施形態では、保存料が添加され得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の賦形剤、懸濁液、溶液又はエマルション等の形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤、充填剤及び／又は分散剤等の調合剤（formulatory agent）を含有し得る。活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で再構成される粉末形態であってもよい。緩衝剤の例としては、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ、リン酸、コハク酸クエン酸、メチオニン、シスチン、グリシン、温和な界面活性剤、カルシウム及びマグネシウムを挙げることができる。ジチオスレイトール等の還元剤が含まれていてもよい。
【０１５６】
非経口注射が選ばれる投与方法である場合、等張配合物が使用され得る。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液を使用してもよい。安定化剤としては、ヒスチジン、メチオニン、グリシン、アルギニン、ゼラチン、及びヒト又はウシ血清アルブミン等のアルブミンを挙げることができる。上述の賦形剤の多くが注射用の組成物にも使用され得ることが当業者には容易に理解される。
【０１５７】
血管収縮剤を本明細書に開示の組成物に添加することができる。或る特定の実施形態では、組成物は、滅菌かつパイロジェンフリーで提供され得る。
【０１５８】
別の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、乾燥吸入用粉末、又はエアロゾル若しくはスプレー等の他の吸入用組成物であり得る。本明細書に開示の吸入用組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。吸入による投与については、修飾溶解素ポリペプチドは、好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスを用いた吸入器、加圧エアロゾルディスペンサー又はネブライザー等の器具からのエアロゾルスプレーの提供の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するための弁を設けることによって決定することができる。吸入器又は注入器に使用される、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを、活性成分とラクトース又はデンプン等の好適な粉末基剤との粉末混合物を含有させて配合することができる。
【０１５９】
一実施形態では、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、乾燥吸入用粉末、又はエアロゾル若しくはスプレーとして配合することができる。具体的な実施形態では、修飾溶解素ポリペプチド吸入溶液には、エアロゾル送達のための噴射剤を更に配合することができる。或る特定の実施形態では、溶液を噴霧することができる。多くの分注器具が、吸入によるポリペプチドを含む医薬組成物の送達のために当該技術分野で利用可能である。これらにはネブライザー、加圧エアロゾルディスペンサー及び吸入器が含まれる。
【０１６０】
薬剤と噴射剤との間の表面張力及び界面張力を低下させるために、界面活性剤を本明細書に開示される吸入用医薬組成物に添加することができる。薬剤、噴射剤及び賦形剤で懸濁液を形成する場合、界面活性剤が必要とされる場合も又は必要とされない場合もある。薬剤、噴射剤及び賦形剤で溶液を形成する場合、特定の薬剤及び賦形剤の溶解性に部分的に依存して、界面活性剤が必要とされる場合も又は必要とされない場合もある。界面活性剤は、薬剤と反応せず、薬剤、賦形剤及び噴射剤間の表面張力を低下させ、及び／又は弁潤滑剤として作用する任意の好適な非毒性の化合物であり得る。
【０１６１】
好適な界面活性剤の例としては、限定されないが、オレイン酸；ソルビタントリオレエート；塩化セチルピリジニウム；大豆レシチン；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート；ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル；ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエチレンジアミンブロックコポリマー；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー；ひまし油エトキシレート及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１６２】
好適な噴射剤の例としては、限定されないが、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン及び二酸化炭素が挙げられる。
【０１６３】
吸入用組成物における使用に適した賦形剤の例としては、限定されないが、ラクトース、デンプン、中鎖脂肪酸のプロピレングリコールジエステル；中鎖、短鎖若しくは長鎖、又はそれらの組合せの脂肪酸のトリグリセリドエステル；パーフルオロジメチルシクロブタン；パーフルオロシクロブタン；ポリエチレングリコール；メタノール；ラウログリコール；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；中鎖脂肪酸のポリグリコール化グリセリド；アルコール；ユーカリ油；短鎖脂肪酸；及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１６４】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、鼻腔適用を含む。鼻腔適用としては、例えば、鼻腔用スプレー、鼻腔用ドロップ、鼻腔用軟膏、鼻腔用洗浄液、鼻腔用注射剤、鼻腔用パッキング、気管支スプレー、及び吸入剤、又は咽喉ロゼンジ剤、洗口液若しくは含嗽剤の間接的な使用によるもの、又は鼻孔若しくは顔へ適用される軟膏の適用の使用によるもの、又はこれらの及び類似の適用方法の任意の組合せが挙げられる。
【０１６５】
本明細書に開示の組成物は、直腸投与のために、例えば坐剤又は停留浣腸（例えば、ココアバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含有する）として配合することもできる。
【０１６６】
或る特定の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるのに効果的な少なくとも１つの抗生物質等の少なくとも１つの抗生物質を更に含み得る。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの抗生物質は、スタフィロコッカス・アウレウス；リステリア・モノサイトゲネス；スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌；ストレプトコッカス・スイス；ストレプトコッカス・ピオゲネス；ストレプトコッカス・アガラクティアエ；ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ；ストレプトコッカス・ニューモニアエ；ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種；エンテロコッカス・フェカーリス；並びにエンテロコッカス・フェシウムの１つ以上に対して効果的である。
【０１６７】
本明細書に開示の組成物の或る特定の実施形態では、少なくとも１つの抗生物質と組み合わせた修飾溶解素ポリペプチドは、相乗作用、例えばグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる修飾溶解素ポリペプチド又は抗生物質の能力における相乗作用を示すことができる。相乗作用は、２つの活性剤の組合せの阻害活性を指す場合があり、組合せの部分阻止濃度（ＦＩＣ）指数は１未満、強い相乗作用については、０．５以下である。作用物質のＦＩＣは、別の作用物質と組み合わせて使用した場合に細菌を死滅させるその作用物質の最小濃度を、第１の作用物質を単独で使用した場合に同じ効果を有する第１の作用物質の濃度で除算したものである。Ａ及びＢの組合せのＦＩＣ指数は、それらの個々のＦＩＣ値の総和である。
【０１６８】
相乗作用は、チェッカーボードアッセイにおいて評価することができる（時間−死滅曲線によって検証することができる）。各チェッカーボードアッセイにより多くの異なる組合せが生成し、慣例により、最も効果的な組合せのＦＩＣ値がＦＩＣ指数の算出に用いられる。ＦＩＣ指数により相互作用の性質が規定される。相加的相互作用を有する抗微生物剤は、ＦＩＣ指数が１であり、１未満のＦＩＣ指数は、相乗的相互作用を規定し、ＦＩＣ指数が１を超える組合せは、拮抗する。ＦＩＣ指数が低いほど、組合せがより相乗的となる。例えば、Singh, P.K. et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279: L799-L805, 2000を参照されたい。相乗作用は、修飾溶解素ポリペプチドと抗生物質との同時投与に基づく効果的な新たな一般的抗感染戦略に影響がある。特に、修飾溶解素ポリペプチド及び抗生物質の両方の各々を、殺菌及び静菌活性を高め、耐性発現のリスクを低下させて、より少ない用量及び量で投与することができる。言い換えると、相乗作用の利点は、一方又は両方の作用物質をＭＩＣ以下の濃度で使用する場合に実現されるだけでなく、相乗作用の存在を、ＭＩＣ以下の濃度の各作用物質を用いて試験することで明らかにすることができる。
【０１６９】
方法
その高度の活性及び低い毒性と共に、有利な治療指数を示すことから、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドは、その影響を受けやすい適応症又は病態の治療、軽減若しくは改善、緩和、又は解消のために、それを必要とする被験体、例えば生きている動物（ヒトを含む）に投与することができる。
【０１７０】
したがって、本開示の修飾溶解素ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば被験体においてスタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌による細菌感染を治療するために、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば表面、例えば医療器具の表面での、例えば細菌汚染のレベルを低下させるために使用することができる。
【０１７１】
例えば、幾つかの実施形態では、本修飾溶解素ポリペプチドは、グラム陽性細菌によって形成される細菌バイオフィルムの予防、制御、破壊及び処理のために使用することができる。バイオフィルム形成は、微生物細胞が互いに接着し、表面上の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）のマトリックス中に埋め込まれる場合に生じる。生体高分子（例えば、多糖、核酸及びタンパク質）及び栄養素が豊富な、かかる保護環境での微生物の増殖は、微生物クロストークを増強し、病原性を増大させる。バイオフィルムは、生物表面及び非生物表面、例えばＣＦ肺の粘液栓、汚染カテーテル、インプラント、コンタクトレンズ等を含む任意の支持環境で発生し得る（Sharma et al. Biologicals, 42(1):1-7 (2014)（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす））。バイオフィルムが細菌を保護するため、細菌が従来の抗微生物治療により高い耐性を示すことが多く、深刻な健康リスクとなる。これは、多くがバイオフィルム関連細菌に起因し得る、毎年１００万件を超えるカテーテル関連尿路感染（ＣＡＵＴＩ）の報告から明らかである（Donlan, RM (2001) Emerg Infect Dis7(2):277-281、Maki D and Tambyah P (2001) Emerg Infect Dis 7(2):342-347）。
【０１７２】
このため、一実施形態では、本開示の修飾溶解素ポリペプチドは、グラム陽性細菌が細菌バイオフィルムによって保護される場合のグラム陽性細菌による細菌感染の予防、制御、阻害及び治療に使用することができる。
【０１７３】
一態様では、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、本明細書に記載されるグラム陽性細菌の１つ以上の種によって引き起こされる細菌感染を治療する方法に関する。
【０１７４】
「感染」及び「細菌感染」という用語は、気道感染（ＲＴＩ）、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する患者における気道感染、下気道感染、例えば慢性気管支炎の急性増悪（ＡＣＥＢ）、急性副鼻腔炎、市中肺炎（ＣＡＰ）、院内肺炎（ＨＡＰ）及び院内気道感染；淋菌性子宮頸管炎及び淋菌性尿道炎等の性感染症；尿路感染；急性中耳炎；新生児敗血症及びカテーテル関連敗血症を含む敗血症；並びに骨髄炎を含むことが意図される。薬物耐性細菌及び多剤耐性細菌によって引き起こされる感染も企図される。
【０１７５】
グラム陽性細菌によって引き起こされる感染の非限定的な例としては、Ａ）院内感染：１．気道感染、特に嚢胞性線維症患者及び人工呼吸器を装着している患者における気道感染、２．菌血症及び敗血症、３．創傷感染、特に火傷被害者の創傷感染、４．尿路感染、５．侵襲的器具上での術後感染、６．汚染された薬液の静脈内投与による心内膜炎、７．後天性免疫不全症候群、癌化学療法、ステロイド療法、血液悪性疾患、臓器移植、腎代替療法、及び重度の好中球減少症を伴う他の病態の患者における感染、Ｂ）市中感染：１．市中気道感染、２．髄膜炎、３．汚染水に起因する毛包炎及び外耳道感染、４．高齢者及び糖尿病患者における悪性外耳炎、５．小児における踵骨の骨髄炎、６．一般に汚染されたコンタクトレンズと関連した眼感染、７．手が頻繁に水に曝される人々における爪感染等の皮膚感染、８．消化管感染、並びに９．筋骨格系感染を挙げることができる。
【０１７６】
本方法のグラム陽性細菌の１つ以上の種には、本明細書に記載されるか又は当該技術分野で既知のグラム陽性細菌の任意の種が含まれ得る。通例、グラム陽性細菌の種としては、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（限定されるものではないが、スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群、スタフィロコッカス・ヒイカス群からの少なくとも４０の認定種、及び「不特定種群」と称される任意の分離株を含む）、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティアエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、緑色レンサ球菌群に含まれる任意の付加的な種（ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス（現ガロリティカス）群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群に含まれる全ての種及び株を含むが、これらに限定されない）、エンテロコッカス・フェカーリス及びエンテロコッカス・フェシウムを挙げることができる。グラム陽性細菌の他の例としては、アクチノマイセス属、バシラス属、ラクトコッカス属、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びクロストリジウム属が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
別の態様では、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、有効量の本明細書に記載される修飾溶解素ポリペプチドを含有する第１の有効量の組成物と、グラム陽性細菌感染の治療に適した第２の有効量の抗生物質との組合せを同時投与することを含む、細菌感染を予防又は治療する方法に関する。
【０１７８】
本開示の修飾溶解素ポリペプチドは、個別に又は当業者の技能の範囲内の様々な組合せで標準療法の抗生物質又は最終手段の抗生物質と同時投与することができる。グラム陽性細菌に対して使用される従来の抗生物質は本明細書に開示され、例えばメチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン、リソスタフィン、ペニシリン、クロキサシリン、エリスロマイシン、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、及びフィダキソマイシンを挙げることができる。
【０１７９】
本開示の修飾溶解素ポリペプチドと抗生物質とを組み合わせることで、効果的な抗菌療法がもたらされる。幾つかの実施形態では、本開示の修飾溶解素ポリペプチドと１つ以上の抗生物質との同時投与は、より少ない修飾溶解素ポリペプチド又は抗生物質のいずれか又は両方の用量及び量、及び／又はより少ない治療頻度及び／又は期間で、殺菌及び静菌活性を増大させ、抗生物質耐性のリスクを低下させ、有害な神経学的又は腎臓副作用（コリスチン又はポリミキシンＢの使用と関連する副作用等）のリスクを低下させて行うことができる。本明細書で使用される場合、「より少ない用量」という用語は、同じ活性成分による単剤療法と比較した組合せでの或る活性成分の用量を指す。幾つかの実施形態では、組合せでの修飾溶解素ポリペプチド又は抗生物質の用量は、それぞれの単剤療法と比較して最適値以下又は更には閾値以下であり得る。
【０１８０】
幾つかの実施形態では、本開示は、被験体に本明細書に開示の１つ以上の修飾溶解素ポリペプチドを対象の抗生物質と共に投与することによって、グラム陽性細菌に対する１つ以上の抗生物質の抗生物質活性を単独で使用される該抗生物質の活性と比較して高める方法を提供する。組合せは、細菌に対して効果的であり、抗生物質に対する耐性を克服し、及び／又は抗生物質をより低い用量で用いることを可能し、望ましくない副作用を減少させる。
【０１８１】
また別の態様では、本開示は、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、細菌と有効量の本明細書に記載される修飾溶解素ポリペプチドを含有する組成物とを接触させることを含み、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる、方法に関する。
【０１８２】
幾つかの実施形態では、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させることは、細菌と本明細書に記載される修飾溶解素ポリペプチドとを接触させることを含み、細菌は、例えば病院及び他の健康関連又は公共の建物における医療器具、床、階段、壁及び調理台の表面、並びに手術室、緊急治療室、病室、診療所及び浴室等における機器の表面上に存在する。
【０１８３】
本明細書に記載の修飾溶解素ポリペプチドを用いて保護することができる医療器具の例としては、管類及び他の表面医療器具、例えば尿道カテーテル、粘液吸引カテーテル、吸引カテーテル、臍帯カニューレ（umbilical cannulae）、コンタクトレンズ、子宮内器具、膣内及び腸内器具、気管内チューブ、気管支鏡、歯科補綴物及び歯列矯正器具、外科用器械、歯科用器械、管類、歯科用送水管、布、紙、指示薬ストリップ（例えば、紙の指示薬ストリップ又はプラスチックの指示薬ストリップ）、接着剤（例えば、ヒドロゲル接着剤、ホットメルト接着剤又は溶剤系接着剤）、包帯、組織包帯剤（tissue dressings）又は治療器具、及び密封パッチ（occlusive patches）、並びに医療分野で使用される任意の他の表面器具が挙げられるが、これらに限定されない。器具には、電極、外部人工装具、固定テープ、圧迫包帯、及び様々なタイプのモニターが含まれ得る。医療器具には、挿入又は移植部位近くの皮膚等の挿入又は移植部位に設置することができ、グラム陽性細菌によるコロニー形成の影響を受けやすい少なくとも１つの表面を含み得る任意の器具も含まれ得る。
【０１８４】
投与量及び投与
投与される投与量は、治療される感染の活性、治療対象の被験体の年齢、健康及び全身的な身体状態、特定の修飾溶解素ポリペプチドの活性、もしあれば、本開示による修飾溶解素ポリペプチドと組み合わされる抗生物質の性質及び活性、並びにかかる組合せの複合効果等の多数の要因によって決まる。或る特定の実施形態では、投与される修飾溶解素ポリペプチドの有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（又は１ｍｃｇ／ｍｌ〜１００ｍｃｇ／ｍｌ）、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、１日〜１４日間の範囲の期間にわたって１日１回〜４回投与することができる。抗生物質も使用される場合、抗生物質は、標準的な投与計画で又は任意の相乗作用を考慮してより少ない量で投与することができる。しかしながら、かかる全ての投与量及び計画は（修飾溶解素ポリペプチド、又はそれと同時に投与される任意の抗生物質のいずれに関わらず）、最適化に供される。最適投与量は、当業者の技能の範囲内であるが、本開示を考慮に入れてｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ予備有効性実験を行うことで決定することができる。
【０１８５】
本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドが急速な殺菌をもたらすことができ、ＭＩＣ以下の量で使用した場合に静菌効果をもたらすことができることが企図される。本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドが様々な抗生物質耐性細菌に対して活性であり得ることが更に企図される。本開示に基づき、臨床状況では、本修飾溶解素ポリペプチドは、単独で又は抗生物質（耐性が発現された抗生物質を含む）と共に、薬物耐性及び多剤耐性細菌から生じる感染の治療の有力な代替（又は付加的）手段となり得る。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドへの曝露時間は、１ｍｌ当たりの活性ポリペプチド単位の所望の濃度に影響を及ぼし得る。「長時間」又は「持続」放出担体に分類される担体（例えば、或る特定の鼻腔用スプレー又はロゼンジ剤等）は、より低濃度であるが、より長時間にわたってポリペプチド単位／ｍｌを含む又は提供することができ、「短時間」又は「急速」放出担体（例えば、含嗽剤等）は、高濃度であるが、より短時間でポリペプチド単位（ｍｃｇ）／ｍｌを含む又は提供することができる。より高い単位／ｍｌの投与量又はより低い単位／ｍｌの投与量を有することが望ましい場合もある。
【０１８７】
本開示の修飾溶解素ポリペプチドについて、治療有効用量は、初めに細胞培養アッセイ、又は動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ若しくはブタのいずれかにおいて推定することができる。動物モデルは、望ましい濃度範囲及び投与経路を達成するために使用することもできる。次いで、得られた情報を用いて、ヒトにおける有効用量及び投与経路を決定することができる。投与量及び投与は、十分な活性成分のレベルをもたらすか又は所望の効果を維持するために更に調整することができる。考慮され得る付加的な要因としては、疾患状態の重症度、患者の年齢、体重及び性別、食生活、所望の治療期間、投与方法、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ、反応感度、療法に対する耐容性／応答、並びに治療を行う医師の判断が挙げられる。
【０１８８】
治療計画は、連日投与（例えば、１日１回、２回、３回等）、隔日（例えば、隔日で１回、２回、３回等）、週２回、週１回、２週間に１回、月に１回等を必要とし得る。一実施形態では、治療は持続注入として行うことができる。単位用量を何度も投与することができる。間隔は、臨床症状のモニタリングによって指定されるように不規則であってもよい。代替的には、単位用量を持続放出配合物として投与してもよく、この場合、より低頻度の投与を用いることができる。投与量及び頻度は、患者に応じて異なり得る。かかる指針が限局的投与、例えば鼻腔内、吸入、直腸等、又は全身投与、例えば経口、直腸（例えば、浣腸による）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、経尿道等のために調整されることが当業者には理解される。
【実施例】
【０１８９】
本明細書に記載の修飾溶解素ポリペプチド、並びにそれらの調製、特性評価及び使用は、本開示の範囲の限定ではなく、説明として意図される以下の実施例との関連でより良く理解される。
【０１９０】
【表２】
2021513865.tif 000005
【０１９１】
実施例１−修飾溶解素ポリペプチドの選択
本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドを、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の推定Ｔ細胞エピトープ（ＴＣＥ）のコア配列のコンピューターによる計算ガイド特定及び野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素への任意ＴＣＥスコアの割当てを含む大規模スクリーニングプログラムによって得た。コンピューターによるスクリーニング方法及びアルゴリズムを商業（個別支払い）方式で用いて、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素配列の潜在的免疫関連セグメント（推定Ｔ細胞エピトープ）を特定し、これらのセグメントを突然変異の標的とした。予測ＴＣＥを破壊するように設計される突然変異を特定した。商業サービスを各修飾溶解素ポリペプチドの免疫原性の評定に用いることができる。修飾溶解素ポリペプチドに破壊されたＴＣＥに基づいて免疫原性スコアを割り当てることができる。
【０１９２】
次いで、推定ＴＣＥを減衰又は除去するように設計された突然変異部位を計算的に設計し、代わりのアミノ酸をＴＣＥセグメントのＴＣＥスコアが減少するように計算的に選択した。７個のアミノ酸位置を特定されたＴＣＥ１、ＴＣＥ２及びＴＣＥ３の各々における突然変異のために選択し、４７個のアミノ酸位置を特定されたＴＣＥ４について選択した。ＣＨＡＰドメインにのみ突然変異を有する合計１６１２１個の変異体を生成した。同様に、５個、８個、１９個及び２１個のアミノ酸残基を特定されたＳＨ３ｂ  ＴＣＥ５、６、７及び８のそれぞれにおける潜在的置換えに選択し、ＳＨ３ｂドメインに突然変異を有する合計１５９６０個の変異体を生成した。次いで、突然変異体の各セットのライブラリー（ＣＨＡＰドメイン及びＳＨ３ｂドメインライブラリー）を、細菌細胞壁のペプチドグリカンを切断する能力について、オーバーレイ試験を用いてスクリーニングした。
【０１９３】
下記表２に示されるように、配列番号１の配列を有するＰｌｙＳｓ２の野生型アミノ酸配列の以下のセグメント（それぞれ、触媒ドメイン及び細胞壁結合ドメインに位置する）が、推定Ｔ細胞エピトープ（「ＴＣＥ」）のコアセグメントを構成するか又は１つ以上のＴ細胞エピトープの一部を潜在的に形成すると特定された。
【０１９４】
【表３】
2021513865.tif 000006
【０１９５】
次いで、１つ以上の推定ＴＣＥを「枯渇させる」（除去する又は弱める）ことによって得られるポリペプチドのＴＣＥスコアを減少させることが予測される突然変異を特定した。最大１６１２１個のＣＨＡＰドメイン変異体及び１５９６０個のＳＨ３ｂドメイン変異体を包含するライブラリーをｐＢＡＤ２４発現ベクターにクローニングし、大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、溶菌活性を有する修飾溶解素を特定するために一次スクリーニングにおいて特性評価した。溶菌活性の一次スクリーニングは、溶解素の死滅活性を、最初に精製する必要なしに溶解素発現クローンを用いて検出するために以前に開発されたプレートベースの溶原性ブロス（lysogeny broth）（ＬＢ）軟寒天オーバーレイ法を用いて行った。しかしながら、溶菌活性を確認する任意の他の方法を用いることができる。
【０１９６】
簡潔に述べると、全てのライブラリー成員（すなわち、クローン）及びベクター対照株を、アンピシリンを添加したＬＢガラスプレートに貼り付けた後、得られたコロニーを１時間にわたる０．２％アラビノース蒸気の噴霧によって誘導した。誘導後にプレートを一晩インキュベートし、組換えタンパク質の発現を可能にした。発現後に、大腸菌細胞壁を透過化するためにライブラリーをクロロホルム蒸気に３０分間曝露し、風乾した後、ＬＢ中のスタフィロコッカス・アウレウス株ＭＷ２の７５μｌの一晩培養物を含有する溶融軟ＬＢ寒天を重層した。重層プレートを室温で１５分間固化させた後、３７℃で１６時間〜２４時間インキュベートした。活性溶解素を発現するクローンのオーバーレイにおけるスタフィロコッカス・アウレウスに対する制限増殖条件により、溶解素の特定を容易にする明らかな透明帯（clearing zones）の出現が可能になる。ベクター対照は、透明帯を有しない。
【０１９７】
スクリーニングの或る特定の実施形態では、タンパク質を過剰発現させてもよく、或る特定の実施形態では、タンパク質を過剰発現させなくてもよい。同様に、或る特定の実施形態では、タンパク質を精製してもよく、或る特定の実施形態では、タンパク質を精製しなくてもよい。例示的な一実施形態では、タンパク質を過剰発現させるが、精製しなくてもよい。
【０１９８】
陽性クローン（すなわち、明らかな透明帯と関連するクローン）を、クローン純度を確実にするために継代培養した後、シークエンシングして独自の配列を確認し、活性変異体の脱免疫化（deimmunization；ＤＩ）スコアを決定した。様々なＤＩスコアを有する、１０００個を超える活性変異体がこのようにして特定された。最も低いＤＩスコアを有する活性クローンを、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞においてｐＢＡＤ２４発現ベクターを用いて高レベルで発現させ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ミューラーヒントンブロス及び１００％ヒト血清の両方におけるＭＩＣ値、寒天プレート上での大きな透明帯、熱安定性、並びに精製の容易さを含む情報の組合せに基づいて更に選択した。
【０１９９】
これらの基準に基づいて、３６個のＣＨＡＰ変異体及び６６個のＳＨ３ｂドメイン変異体を特定した。次いで、３６個のＣＨＡＰドメインの各々及び６６個のＳＨ３ｂドメインの各々の配列修飾を、単一大腸菌ライブラリーにおいて組み合わせ、各ドメインの修飾を組み合わせた合計で最大２３７６個のクローンを得た。次いで、組み合わせライブラリーを、軟寒天オーバーレイ法を用いて上記のようにスクリーニングし、溶菌活性を発現する５３０個の「組み合わせ」突然変異体／変異体を特定した。この突然変異体は、或る変異体に由来する触媒ドメインと別の変異体の結合ドメインを組み合わせていることから、キメラ又はシャッフルと称することができる。各クローンの配列を特定し、各々の推定タンパク質配列を免疫原性についてスコアリングした。様々なＴ細胞エピトープ突然変異の脱免疫化能を予測するコンピューターによる計算法が幾つか知られており、例えばStealth Biologics, LLC等の企業から商業的に利用可能である（１８）。次いで、最も低いＤＩスコアを有する活性クローンを過剰発現、精製、更なる特性評価、及びＭＩＣアッセイを用いた溶菌活性の試験のために選んだ。そのサブセットをマウス好中球減少性大腿感染モデル（ＭＮＴＩ）においてｉｎ  ｖｉｖｏ有効性について更に試験した。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性（低いＭＩＣ値）、野生型タンパク質と同様のＭＮＴＩを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性、高い熱安定性、高い精製収率及び低いＴＣＥスコア（例えば、４２という野生型（ＷＴ）ＴＣＥスコアよりも少なくとも２５％低い、例えば少なくとも４０％低い）に基づいて、最も活性の高い修飾溶解素ポリペプチドを選択した。最終的に選択された修飾溶解素ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１との差及びそのアミノ酸残基の位置に言及する）を、以下のように下記表３にまとめる（一文字アミノ酸コードを用いる）。
【０２００】
【表４】
2021513865.tif 000007
2021513865.tif 000008
【０２０１】
上記表では、各変異体の８つの推定ＴＣＥの各々についての総ＤＩスコアを提示する。ＭＩＣ値を試験した変異体について表に報告する。値は、０．１２５μｇ／ｍＬ〜６４μｇ／ｍＬの範囲であった。小規模で精製した野生型溶解素は、変異体と同様、１μｇ／ｍＬのＭＩＣを有し、ＧＭＰグレードの野生型溶解素は、０．５μｇ／ｍＬのＭＩＣを有していた。理論に束縛されることを望むものではないが、野生型活性の差が純度の差に起因し得る可能性がある。
【０２０２】
グラム陽性細菌の治療に適した抗生物質、例えばダプトマイシン（ＤＡＰ）及びバンコマイシン（ＶＡＮ）との相乗作用研究を、チェッカーボードアッセイを用いて行った。部分阻止濃度（ＦＩＣ）指数値を、５つのメチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ）分離株及び５つのメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）分離株に対して修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６及び抗生物質の組合せについて決定した。０．５以下のＦＩＣ指数値は、２つの作用物質間の強い相乗作用と解釈することができ、０．５〜１の値は、依然として相乗作用とみなすことができる。ｐｐ２９６が触媒ドメインに４つのアミノ酸置換えを有するとすると、抗生物質と相乗作用を示すｐｐ２９６の能力は予期せぬものであった。このため、本開示により、感受性細菌に対する修飾溶解素ポリペプチドとグラム陽性細菌の治療に適した抗生物質との組合せの注目すべき有効性及び相乗作用が実証される。定性的に同様の結果がｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５、ｐｐ４００及びｐｐ６１９等の他の脱免疫化活性変異体を用いた同様のアッセイを本開示に従って行うことで予想され得る。
【０２０３】
修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６のＦＩＣ指数値は、ダプトマイシン及びバンコマイシンの両方を用いた場合に主に０．５であり、野生型とほぼ同一であり、ダプトマイシン及びバンコマイシンの両方とのｐｐ２９６の相乗活性が野生型溶解素とほぼ同一であることが示された。下記実施例５を参照されたい。定性的に同様の結果がｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５、ｐｐ４００及びｐｐ６１９等の他の脱免疫化活性変異体を用いた同様のアッセイを本開示に従って行うことで予想され得る。
【０２０４】
更なる研究により、変異体ｐｐ２９６の抗バイオフィルム活性（ＭＢＥＣとして測定される）を野生型ＰｌｙＳｓ２と比較した。各々を１７個のＭＳＳＡ分離株及び２０個のＭＲＳＡ分離株によって形成される１日経過したバイオフィルムに対して９６ウェル微量液体希釈フォーマットで試験した。修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６のＭＢＥＣ値から、修飾溶解素ポリペプチドが、全てではないが殆どの試験したＭＳＳＡ及びＭＲＳＡ分離株に対して野生型ＰｌｙＳｓ２と比較してより高い活性を有することが示される。結論として、修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性プロファイルは、野生型ＰｌｙＳｓ２と同等及び／又はより良好であり得る。下記実施例６を参照されたい。これらの結果から、本修飾溶解素ポリペプチドがバイオフィルム及びそれらの形成を破壊する、消散させる、阻害する及び処理する野生型ＰｌｙＳｓ２の能力を保持又は改善することが示される。したがって、この活性が抗生物質との組合せで持続することが予想される。本開示は、医療器具（人工装具、心臓機械弁等の弁、カテーテル、人工肛門装置、乳房インプラント、人工関節、脳室シャント、ペースメーカー、除細動器、補助人工心臓（ventricular-assisted devices）、コンタクトレンズ及びコンタクトレンズケース等）を本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドで処理し、かかる器具の使用時にバイオフィルムの形成を生じ得る、かかる器具の表面への細菌の付着を回避することも企図する。
【０２０５】
表３の選択された修飾溶解素ポリペプチドを、後続の実施例により詳細に記載される更なる試験に供した。用量応答を、より低いＭＩＣ値（より高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性）を示したこれらの修飾溶解素ポリペプチドの幾つかについて、下記のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＮＴＩモデルを用いて確認した。ＭＮＴＩにおいて試験した全てのペプチドは、より高用量（１５ｍｇ／ｋｇ以上）で十分に機能したが、ｐｐ２９６のみがより低用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）で野生型と同等に機能した。野生型対照（ＣＦ−３０１及びｐｐ１１４９）に加え、表３中の１５個の修飾溶解素ポリペプチドの幾つかをマウス毒性スクリーニングにおいて試験し、それらが野生型タンパク質と同様の毒性プロファイルを有するかを確かめた。選択した器官の完全な肉眼的剖検及び組織病理学的評価により、修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６が３０ｍｇ／ｋｇと高用量で外膜所見を引き起こさないことが明らかとなった。同じ３０ｍｇ／ｋｇ用量のＰｌｙＳｓ２は、潜在的毒性の指標となる外膜所見の１００％の発生率を生じた。
【０２０６】
２つの更なる毒性研究の結果は一致した。第１の研究は、スプラーグドーリーラットに２時間の単回静脈内注入として投与した場合のｐｐ２９６の潜在的毒性及び毒物動態学プロファイルの評価を含むものであった。最低３日間の回復期間後の任意の効果の持続又は進行のように回復が観察された。本研究では、臨床兆候、体重、体重増加、摂餌量、臨床病理パラメーター（血液学、凝固、血清化学及び尿検査）、肉眼的剖検所見及び組織病理学的所見を評価した。研究により、５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのラットへのｐｐ２９６の単回静脈内注入が、全用量で異常な所見がなく、耐容性良好であることが見出された。
【０２０７】
第２の研究は、ｐｐ２９６への動物の長期の反復曝露及びこの曝露による毒性の評価を含むものであった。具体的には、０．５ｍｇ／ｋｇ／日、２．５ｍｇ／ｋｇ／日又は１０ｍｇ／ｋｇ／日を７日連続で尾静脈を介した２時間の注入によって毎日投与した。実施例１０に詳述されるように毒性は見られなかった。
【０２０８】
加えて、修飾溶解素ポリペプチド単独に曝露した場合に修飾溶解素ポリペプチドに対して耐性を発現する細菌の能力、及びＭＩＣ以下の量の修飾溶解素ポリペプチドの存在下で抗生物質に曝露した場合にＤＡＰ又はＶＡＮのいずれかに対して耐性を発現する細菌の能力を評定した。結果を図３Ａに示すが、３つの異なる複製系統（ｐｐ２９６−１、ｐｐ２９６−２及びｐｐ２９６−３と称される）を用いた修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６のＭＩＣの増大は、全く又は殆ど観察されない。結果を図３Ｂ及び図３Ｃにも示すが、ＭＩＣ以下の量の修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６の存在下でのＤＡＰ又はＶＡＮのいずれかのＭＩＣの増大は、全く又は殆ど観察されなかった。ＤＡＰ耐性の抑制に必要とされるｐｐ２９６の量は、ｐｐ２９６単独のＭＩＣの１６分の１である０．１２５μｇ／ｍＬであった。ＤＡＰ耐性の抑制が３つの異なる複製系統（ｐｐ２９６−１、ｐｐ２９６−２及びｐｐ２９６−３と称される）において観察された。ＶＡＮ耐性の発現の抑制に必要とされるｐｐ２９６の量は、ｐｐ２９６単独のＭＩＣの８分の１である０．２５μｇ／ｍＬであった。ＶＡＮ耐性の抑制が３つの異なる複製系統（ｐｐ２９６−１、ｐｐ２９６−２及びｐｐ２９６−３と称される）で観察された。このため、修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６は、野生型溶解素ＰｌｙＳｓ２と同様、抗生物質耐性の発現を阻害し、ＭＩＣ以下の量であってもそれに効果的である。かかる発現を阻害する目的で、溶解素のＭＩＣ以下の濃度をもたらす量よりも多量の溶解素を使用する必要はない。しかしながら、より多量の溶解素の使用が企図される。上記の結果に基づくと、細菌が耐性を発現した抗生物質と組み合わせて投与した場合にｐｐ２９６が抗生物質耐性を克服し得ることが予想される。
【０２０９】
本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドの特性
本明細書に記載の修飾溶解素ポリペプチドは、触媒ドメイン中で置き換えられるアミノ酸残基の大部分がＴＣＥ２、ＴＣＥ３及びＴＣＥ４に集中し、最終候補の１つのみがＴＣＥ１にも置換を有するという点で或る特定の類似点を有する。さらに、置き換えられる残基は更に限定され、２つを除く全最終候補がＴＣＥ２中のＬ９２Ｗ及びＴＣＥ３中のＶ１０４Ｓの修飾を有し、１つを除く全最終候補が置換Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓの各々も有する。さらに、ＴＣＥ２、３及び４中のこれら４つの置換は、活性に実質的に影響を及ぼすことなく（実際に増大させる場合もある）、（結合ドメイン中の置換を有さずに又は最小限にして）免疫原性を実質的に減少させるのに十分であるようである。例えば、ｐｐ５５、ｐｐ４００、ｐｐ６１９及びｐｐ３８８を参照されたい。このため、両方のドメイン中に野生型との差異を有する必要はない。触媒ドメイン中の付加的な置換であるＲ３５Ｅは、良好な活性及び実質的に（５０％超）低下した免疫原性の両方を有するポリペプチド（ｐｐ４００）をもたらした。修飾溶解素ポリペプチドｐｐ４００が結合ドメイン中に置換を有しなかったことが更に注目に値する。しかしながら、概して、触媒ドメイン単独における突然変異は、溶解素を適切に脱免疫化するのに十分でない可能性がある。
【０２１０】
ＴＣＥスコアに関して、野生型溶解素の推定Ｔ細胞エピトープは、ＣＨＡＰドメインをＳＨ３ｂドメインよりも重要な免疫原性の全般的寄与因子とする、以下のＴＣＥスコアを有する：ＴＣＥ１＝４、ＴＣＥ２＝４、ＴＣＥ３＝７、ＴＣＥ４＝１０、ＴＣＥ５＝４、ＴＣＥ６＝３、ＴＣＥ７＝４及びＴＣＥ８＝６。
【０２１１】
概して、触媒ドメインは、より制限された置換の多様性を許容した。
【０２１２】
次に結合ドメインを検討すると、両ドメインにおける置換が必要でないことがこの場合も観察された。例えば、修飾溶解素ポリペプチドｐｐ３８８を参照されたい。触媒ドメインが免疫原性のより重要な寄与因子であり得るという観察結果と一致して、ＣＨＡＰドメインの置換を有しない修飾溶解素ポリペプチドｐｐ３８８が、ＣＨＡＰドメインに置換を含む活性修飾溶解素ポリペプチドよりも低い免疫原性の低下を示した。
【０２１３】
ＳＨ３ｂドメインのＴＣＥ５、６、７及び８中の置換は、以下のように限定される：ＴＣＥ５中のＹ１６４Ｎ又はＹ１６４Ｋ（まとめて、Ｙ１６４Ｎ／Ｋ）、ＴＣＥ６中のＮ１８４Ｄ、ＴＣＥ７中のＲ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ又はＳ１９８Ｑ（Ｓ１９８Ｈ／Ｑ）、並びにＴＣＥ８中の組合せＶ２０４Ａ／Ｋ及びＶ２１２Ａ／Ｅ、又は単独若しくはＶ２１４Ｇと組み合わせたＩ２０６Ｅ。
【０２１４】
要約すると、ＣＨＡＰドメインの３５位、９２位、１０４位、１２８位又は１３７位の１つ以上における１つ以上のアミノ酸残基、及び／又はＳＨ３ｂドメインの１６４位、１８４位、１９５位、１９８位、２０４位、２０６位、２１２位又は２１４位における１つ以上のアミノ酸残基（位置は配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型溶解素の配列に従って番号付けされる）を、１つ以上の標的微生物に対する野生型溶解素の実質的な溶菌活性を維持しながら野生型溶解素と比較して修飾溶解素ポリペプチドの免疫原性及び／又は毒性を低下させるように置き換えることによって溶解素ＰｌｙＳｓ２の変異体を作製することが可能であることが実証された。免疫原性は、ＴＣＥスコアにより、かかるスコアを得るための任意の利用可能なコンピューターによる計算ガイド方法（例えば、個別支払い方式の商業的に利用可能な方法）を用いて測定し、同様に得られる親溶解素のＴＣＥスコアと比較することができる。例えば、Stealth Biologics、ProImmune、Creative Biolabs、Epivax及び他の企業がかかる研究に取り組むことができ、その幾つかがｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験で追跡調査することができる。代替的には、免疫原性は、混合リンパ球反応又はＰＢＭＣ増殖アッセイ（並びに例えば試験されるポリペプチドによる刺激に応答して分泌された１つ以上の炎症性サイトカインの検出及び定量化による増殖の評定）等の多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏイムノアッセイのいずれかによって評定することができる。最終的に、ヒト免疫系に対する免疫原性を評定することができる。公開され、規制当局により認定された多数の戦略がこのために存在する（６）。
【０２１５】
表３から分かるように、免疫原性は、数に或る程度しか関係し得ない。概して、付加的なＴ細胞エピトープが枯渇又は減衰するにつれ、溶菌活性を実質的に損なうまでには至らない限りにおいて免疫原性が減少し得る（上記のＭＩＣアッセイ等の任意の利用可能な試験を用いて脱免疫化変異体を活性について試験することによる）。しかしながら、例えばｐｐ５５、ｐｐ６１６及びｐｐ３８８に示されるように、より少数のアミノ酸置換で望ましい効果をもたらすことができるように、与えられたパラメーター及び指針の範囲内で戦略化することが可能である。上記のデータに基づくと、ＣＨＡＰドメイン中の最適な置換の数が、例えばＴＣＥ２、ＴＣＥ３及びＴＣＥ４の位置で３であり得ると理論化される。しかしながら、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン中の３つを超える置換にも適合することができる。
【０２１６】
実施例２：修飾溶解素ポリペプチドの発現
野生型ＰｌｙＳｓ２は、例えばFischetti et alに対する米国特許第９，０３４，３２２号に記載されるように得ることができる。同様の手順（アラビノースで誘導可能なプラスミドｐＢＡＤ２４）に従い、突然変異体ポリヌクレオチドのライブラリーから本開示の修飾溶解素ポリペプチドを発現させた。野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素サンプルも修飾溶解素ポリペプチドの精製に用いられる方法によって精製し、精製した野生型ＰｌｙＳｓ２を付加的な陽性対照として使用した。ThermoFisher（InvitroGen）により、考え得る全てのＣＨＡＰドメイン及びＳＨ３ｂ変異体のライブラリーが生成された。表３に特定される修飾を有する配列番号１に基づく配列を有する修飾溶解素ポリペプチドは、例えば部位特異的突然変異誘発によって野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素から生成することができる。
【０２１７】
修飾溶解素ポリペプチドをｐＢＡＤ２４ベクターにクローニングし、大腸菌（Escherichia coli）Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。ｐＢＡＤ２４は、β−ラクタマーゼ（アンピシリン耐性をコードする）をコードし、アラビノース誘導転写の厳重な制御を可能にする。組み換え大腸菌株をＬＢプレート上で増殖させ、アラビノース蒸気で誘導し、スタフィロコッカス・アウレウス株ＭＷ２を含有する軟寒天オーバーレイを重層した（Schuch, R. et al., 2009, Methods Mol Biol. 2009; 502:. doi:10.1007/978-1-60327-565-1_18）。修飾溶解素ポリペプチドが活性である場合、透明帯が大腸菌コロニーの周囲に生じた（プレートベースのＬＢ軟寒天オーバーレイ法）。
【０２１８】
作製を以下のようにスケールアップした。ｐＢＡＤ２４＿変異体プラスミドを含有する形質転換大腸菌を−８０℃ストックから新たに画線し、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン及び０．２％グルコースを含有するＬＢ培地に接種し、一晩増殖させた。翌日、遠沈し、ＰＢＳに再懸濁した一晩培養物の５０倍希釈物を、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含む２ＬのＬＢ培地に接種した。培養物を３７℃で３時間増殖させた後、アラビノースを０．２％の最終濃度まで添加し、２５℃で１６±３時間にわたって一晩誘導した。培養物を４０００ｒｐｍで２０分間、無菌で遠心分離した。ペレットをＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）に３０ｍＬ容量まで懸濁し（細胞懸濁液）、５μｌの２５０Ｕ／μｌ  ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（合計１２５０Ｕ）及び１錠のプロテアーゼ阻害剤の完全ＥＤＴＡフリー錠（Roche）を添加した。次いで、混合物を超音波処理し、１８０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって清澄化した。次いで、得られた上清を、精製プロセスを始める前に１部のｄＨ２Ｏ及び１部の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）で３倍希釈し（総容量９０ｍＬ〜１００ｍＬ）、０．２２ミクロンの膜に通した。
【０２１９】
実施例３：修飾溶解素ポリペプチドの精製
野生型ＰｌｙＳｓ２及び修飾溶解素ポリペプチドの精製を、イオン交換クロマトグラフィーに続く最終サイズ排除クロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、再懸濁した細胞溶解物を初めに５ｍＬ容Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ＤＥＡＥカラム（弱アニオン交換）に通し、次いで５ｍＬ容Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣカラム（付加的な疎水性相互作用及びＨ結合相互作用を有する弱カチオン交換カラム）から塩勾配で溶出した。画分をＯＤ２８０によって定量化し、それらの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって評定した。タンパク質を含有する画分をプールし、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析した。透析後に、タンパク質画分を５ｍＬ容Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｑ  ＦＦカラム（強アニオン交換カラム）にロードし、溶出液を回収し、第２のＣａｐｔｏ  ＭＭＣカラムにロードし、塩勾配によって溶出した。タンパク質を含有する溶離液をプールし、リン酸緩衝生理食塩水に対して透析し、ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラムを用いたゲル濾過（サイズ排除）によって更に精製した。全ての精製サンプルをＤｅｍｏ  Ｂｕｆｆｅｒ（７．６７ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、７．３３ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム一水和物、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で保管した。サイズ排除クロマトグラフィー（精製プロセスの最終工程）の溶出ピーク下の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをｐｐ１１４９、ｐｐ５３、ｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５及びｐｐ２９６を含む精製した幾つかの修飾溶解素ポリペプチドについて図１に示す（既に精製されている委託製造業者から入手した野生型ＰｌｙＳｓ２については示さない）。
【０２２０】
図１に示される円に区分された修飾溶解素ポリペプチドの画分をプールした。
【０２２１】
精製収率は、培養物の２Ｌバッチにつき４ｇ〜９４ｇのタンパク質の範囲であった。精製された修飾溶解素ポリペプチド及び野生型対照は、下記表４に示されるように以下の特性を有していた。
【０２２２】
【表５】
2021513865.tif 000009
2021513865.tif 000010
【０２２３】
実施例４：修飾溶解素ポリペプチドの熱安定性
熱安定性は、活性を評定する前に溶解素ポリペプチドをＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中で１２８μｇ／ｍＬの一定濃度にて様々な高温（約３０℃〜６０℃の範囲内）で３０分間インキュベートすることによって評定した。次いで、サンプルを氷上で２分間冷却した後、Ｔｒｉｓ緩衝液中の細菌接種材料（ＯＤ６００  約０．５〜１．２）を各サンプルの２倍希釈系列（９６ウェルマイクロタイタープレートのｘ軸に沿って１２８μｇ／ｍＬ〜０．２５μｇ／ｍＬに希釈した）に曝露することによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解アッセイによって活性を評定した。光学密度の低下を室温で１５分間追跡し、１５分間で５０％の光学密度の低下を可能にする酵素濃度に基づいて比活性を決定した。各変異体の酵素活性を野生型ＣＦ−３０１酵素（ＧＭＴグレードのＰｌｙＳｓ２タンパク質）と比較し、様々な温度にわたる野生型活性の％を算出した。
【０２２４】
野生型ＣＦ−３０１の熱安定性を任意に１００に設定した。３７℃の単一温度での例示的な修飾溶解素ポリペプチドについての結果を下記表５に記載する。
【０２２５】
【表６】
2021513865.tif 000011
【０２２６】
別の実験では、修飾溶解素ポリペプチドの熱安定性を種々の温度で評定し、野生型ＣＦ−３０１（１００に設定した）と比較した。ｐｐ２９６を含む幾つかの修飾溶解素ポリペプチドについて、安定性は、下記表６に示されるように、野生型溶解素よりも４２℃以下の温度で実質的に高く、４５℃以上の温度で実質的に低かった。
【０２２７】
【表７】
2021513865.tif 000012
【０２２８】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの修飾溶解素ポリペプチドの溶菌活性、抗生物質との相乗作用、及び耐性の非発現
全ＰｌｙＳｓ２変異体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性をスタフィロコッカス・アウレウス分離株ＣＦＳ−８６０（ＣＡＩＲＤ−４２６）に対して１００％ヒト血清（ＨｕＳ）中で評定し、野生型ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）及び実験室で精製されたＰｌｙＳｓ２（ｐｐ１１４９と称される）と比較した。全ての変異体を、ＭＩＣを評定するＣＬＳＩ（米国臨床検査標準協議会（Clinical and Laboratory Standards Institute））の微量液体希釈法に従って以下のように試験した。
【０２２９】
メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ株ＭＷ２）を、５％ヒツジ血液を含むＢＢＬ（商標）トリプチケース（商標）ソイ寒天ＩＩのプレートに分離株を画線プレーティングすることによって８０℃細菌ストックから３７℃で１８時間〜２４時間培養し、単一コロニーを得た。一様な外観で選択されたコロニーを２．５ｍＬのミューラーヒントンブロス（ＭＨＢ）に接種した。濁度を室温で０．５マクファーランド標準単位（５×１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ）に調整した。標準化培養物を１００％ヒト血清で１５０倍希釈した後、９６ウェル丸底ポリスチレンマイクロタイタープレート（BD）において野生型ＰｌｙＳｓ２又は修飾溶解素ポリペプチドの２倍段階希釈物に曝露した。プレートを３７℃で１６時間インキュベートした後、増殖を阻害するために必要とされる最小溶解素濃度を決定した。
【０２３０】
修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を、２５％ウマ血清及び０．５ｍＭ  ＤＴＴを添加したカチオン調整ミューラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ−ＨＳＤ）において様々な５１個のＭＳＳＡ分離株及び５１個のＭＲＳＡ分離株に対して評定し、ＷＴ  ＧＭＰグレードＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と比較した。ＣＦ−３０１及びｐｐ２９６を各々ＣＡＭＨＢ−ＨＳＤで希釈した。各溶解素について、希釈系列は、プレートの各ウェルの２倍希釈後に最終濃度が６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ及び０．１２５μｇ／ｍＬを含むよう設定する。各溶解素を各株に対して二連で試験した。調製物を一晩インキュベートした。増殖を直径およそ２ｍｍの増殖ボタンとして可視化した。８０％以上の増殖阻害をもたらす最高の希釈率を最小阻止濃度（ＭＩＣ）と称した。下記表７に示されるように、ｐｐ２９６の活性は、或る２倍希釈範囲でＣＦ−３０１と非常によく似ていた。
【０２３１】
【表８】
2021513865.tif 000013
【０２３２】
別の実験では、ダプトマイシン及びバンコマイシンと相乗作用を示す修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６の能力を、チェッカーボード分析を用いて評定した。ＦＩＣ（部分阻止濃度）指数値を、５個のＭＳＳＡ分離株及び５個のＭＲＳＡ分離株に対してｐｐ２９６及び抗生物質の組合せについて決定した。合計５０μｌのミューラーヒントンブロス（ＢＢＬ）を微量希釈プレートの各ウェルに分配した。組合せの第１の抗生物質を縦座標に沿って段階希釈し、第２の薬物を横座標に沿って希釈した。０．５マクファーランド濁度標準に等しい接種材料を、ＭＨＢ中で各スタフィロコッカス・アウレウス分離株から調製した。各マイクロタイターウェルに５×１０５ＣＦＵ／ｍｌの１００μｌの細菌接種材料を接種し、プレートを好気条件下にて３７℃で１８時間インキュベートした。得られたチェッカーボードは、２つの抗生物質の各々の組合せを含み、最高濃度の各抗生物質を含むウェルを対角に置いた。微量液体希釈についてのＣＬＳＩの指針に従い、ＭＩＣを肉眼で検出される生物の増殖を完全に阻害する抗生物質の最低濃度として規定した。試験される抗生物質間の相互作用を定量化するために、ＦＩＣ指数（個々の抗生物質のＭＩＣの最も大きな変化をもたらした抗生物質の組合せ）値を各々の株及び抗生物質の組合せについて以下のように算出した：
（Ａ／ＭＩＣＡ）+（Ｂ／ＭＩＣＢ）＝ＦＩＣＡ＋ＦＩＣＢ＝ＦＩＣ指数
（式中、Ａ及びＢは、単一ウェルにおける組合せでの各作用物質のＭＩＣであり、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢは、個別に使用した場合の各薬物のＭＩＣである）。組合せは、ＦＩＣ指数が０．５以下である場合に強く相乗的とみなし、ＦＩＣ指数が０．５超〜１未満である場合に相乗的とみなす。
【０２３３】
チェッカーボードを、ｐｐ２９６とダプトマイシン又はバンコマイシンのいずれかとの組合せを用いて５つのＭＲＳＡ株（ＭＷ２、ＪＭＩ−５６７５、ＪＭＩ−４４０８、ＪＭＩ−６１８１及びＪＭＩ−６１８２）及び５つのＭＳＳＡ株（ＡＴＣＣ  ２９２１３、ＪＭＩ−４０９７９、ＪＭＩ−４３２５７、ＪＭＩ−４１２９３及びＪＭＩ−４９３１５）に対して生成した。相乗作用は、２つの成分を共に添加することで予測されるよりも大きな阻害活性として規定した。バンコマイシンを用いた場合、修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６及びＣＦ−３０１は、試験した１０個の株のうち６個に対して０．５と同一のＦＩＣ指数値を示し、強い相乗作用が明らかに示された。ｐｐ２９６は、１つのＭＲＳＡ株（ＪＭＩ−６１８２）及び１つのＭＳＳＡ株（ＪＭＩ−４０９７９）に対してＣＦ−３０１（ＦＩＣ指数値０．５）と比較して０．３７５と僅かに優れたＦＩＣ指数値を示した。ｐｐ２９６はまた、１つのＭＳＳＡ株（ＡＴＣＣ  ２９２１３）及び１つのＭＲＳＡ株（ＪＭＩ−４１２９３）に対して、両方の株に対するＣＦ−３０１の値である０．５と比較して０．６２５及び０．７５と僅かに高いＦＩＣ指数値を示した。これらの研究結果から、ｐｐ２９６がＣＦ−３０１と非常によく似たダプトマイシン及びバンコマイシンとの相乗作用のレベルを示すことが示される。
【０２３４】
別の実験では、細菌（ＭＲＳＡ株ＭＷ２）が、ｐｐ２９６を用いない抗生物質の存在下で連続継代した細菌と同様に、ＭＩＣ以下の量のｐｐ２９６と組み合わせたＭＩＣ以下の量の抗生物質の存在下で２１日間〜２６日間の連続継代後に抗生物質ダプトマイシン及びバンコマイシンに対する耐性を発現しないことが決定された。
【０２３５】
細菌耐性の分析をｐｐ２９６希釈系列及び抗生物質希釈系列の存在下、ＭＩＣ以下の量のｐｐ２９６の存在下及び非存在下で１８日間の連続継代にわたってＭＲＳＡ株ＭＷ２を用いて行った。簡潔に述べると、微量液体希釈ＭＩＣフォーマットを用い、２倍希釈範囲のｐｐ２９６単独、又はＭＩＣ以下の一定量のｐｐ２９６の存在下及び非存在下の抗生物質を細菌（５×１０５ＣＦＵ／ｍｌの出発濃度）と共にＭＨＢ中にて３７℃で２０時間培養した。次いで、細菌増殖が見られた最高濃度の修飾溶解素ポリペプチドを含むウェルを翌日の継代の接種材料として使用し、２１日間〜２６日間にわたってプロセスを繰り返した。毎日各時点でのＭＩＣを記録し、耐性をＭＩＣの段階的増大として測定した。このアッセイでは、ｐｐ２９６に対する耐性は観察されなかった。さらに、ＭＩＣ以下の量のｐｐ２９６は、ダプトマイシン及びバンコマイシン耐性の出現を抑制した。結果を図３Ａ〜図３Ｃにグラフで示す。
【０２３６】
実施例６：修飾溶解素ポリペプチドの抗バイオフィルム活性
ｐｐ２９６の抗バイオフィルム活性を、１７個のＭＳＳＡ分離株及び２０個のＭＲＳＡ分離株によって形成される、１日経過したバイオフィルムに対して９６ウェル微量液体希釈フォーマットで決定した。野生型ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と比較したｐｐ２９６の最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）値を以下の標準的な方法論によって決定した。細菌をＰＢＳに懸濁し（０．５マクファーランド単位）、ＴＳＢｇ（６６％トリプシンソイブロス、０．２％グルコース）で１００倍希釈し、０．１５ｍｌアリコートとして９６ウェルポリスチレンマイクロプレートに添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、バイオフィルムを洗浄し、ＴＳＢｇ中の２倍希釈系列のＣＦ−３０１又はｐｐ２９６によって３７℃で２４時間処理した。全サンプルを三連で試験した。処理後に、ウェルを洗浄し、３７℃で風乾し、０．０５％クリスタルバイオレットで１０分間染色した。バイオフィルムのバイオマスの減少を目視で評定し、クリスタルバイオレットを３３％（体積／体積）酢酸への可溶化によって定量化した。６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅマイクロプレートリーダーを用いて決定した。各サンプルのＭＢＥＣが、クリスタルバイオレット定量化によって評定される、バイオフィルムのバイオマスの９５％超を除去するのに必要とされる最小溶解素濃度であった。ＭＢＥＣアッセイを用いることで、全てではないが、殆どの試験したＭＳＳＡ分離株及びＭＲＳＡ分離株に対してｐｐ２９６が野生型ＰｌｙＳｓ２と比較してより高い活性を有することが決定された。したがって、下記表８に示されるように、ｐｐ２９６抗バイオフィルム活性は、全体として野生型溶解素よりも僅かに良好である。
【０２３７】
【表９】
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【０２３８】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｖｏでの修飾溶解素ポリペプチドの有効性
４つの修飾溶解素ポリペプチドの有効性を、マウス好中球減少性大腿感染（ＭＮＴＩ）モデルを用いる用量応答（０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ）アッセイにおいて野生型ＰｌｙＳｓ２と比較した。
【０２３９】
細菌接種材料は、細菌細胞を６００ｎｍで約０．５の光学密度（ＯＤ）に達するまでＭＨＢ中で対数期へと増殖させることによって生成した。細菌細胞を十分に洗浄し、０．９％塩化ナトリウムＵＳＰに再懸濁し、３．９×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの相当量まで希釈した。細胞を下記のように０．９％塩化ナトリウムＵＳＰで更に希釈し、湿氷上で維持した。
【０２４０】
好中球減少症を、雌性ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス（５週〜７週、Jackson Laboratories）において１５０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのシクロフォスファミドの腹腔内（ｉｐ）投与によって、それぞれ細菌の接種の４日前及び１日前に誘導した。細菌接種材料（スタフィロコッカス・アウレウス分離株ＣＦＳ−８６０、１００μｌの１０７ＣＦＵ／ｍｌ溶液）を各マウスの両大腿後部に筋肉内（ＩＭ）注射した。マウスに野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素、並びに修飾溶解素ポリペプチドｐｐ１１４９、ｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５及びｐｐ２９６（１回の投与につき２匹のマウス）をｉｐ感染の２時間後から静脈内投与した（０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ）。接種の２時間後（初期対照）及び処理開始の２４時間後に、動物を安楽死させ（ＣＯ２窒息）、大腿を無菌で切除した。各大腿を秤量し、４ｍｌの滅菌生理食塩水に入れ、７ｍｌ容の溶解チューブ内でＰｒｅｃｅｌｌｙｓ２４ハイスループット組織ホモジナイザー（Bertin Corp，Rockville，MD）を用いてホモジナイズした。ホモジネートの希釈物をトリプシンソイ血液寒天プレート（Becton Dickinson）にプレーティングし、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で一晩インキュベートした。細菌負荷を計数し、ｌｏｇ１０  ＣＦＵ／ｇ（大腿重量）として表し、感染の２時間後に採取された対照動物（初期対照）及びビヒクルで処理した動物（後期対照）と比較した。
【０２４１】
マウス大腿細菌負荷を表すデータを図２に示す。ｙ軸上の上の点はビヒクル単独であり、ｙ軸上の下の点は初期対照である。実際に、ｐｐ１１４９は、同様に実験室において他の修飾溶解素ポリペプチドと共に過剰発現され、精製される野生型溶解素であり、付加的な陽性対照として使用される。
【０２４２】
４つの変異体（ｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５及びｐｐ２９６）が野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と同等の活性を有し、使用した最低用量（５ｍｇ／ｋｇ）であっても野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と活性が同等であることから、ｐｐ２９６が優れていることが図２から明らかである。
【０２４３】
実施例８：マウスにおける毒性スクリーニング
マウス毒物学的スクリーニングから、３０ｍｇ／ｋｇの野生型ＰｌｙＳｓ２を投与したマウスが腹部及び胸部の大動脈並びに心基部の大動脈基部に外膜病変（又は外膜所見）を伴う混合炎症細胞集団の血管周囲性浸潤を生じることが示された。外膜所見が、３０ｍｇ／ｋｇの野生型ＰｌｙＳｓ２及び野生型ＰｌｙＳｓ２（ｐｐ１１４９）を投与した全てのマウスにおいて観察された。外膜病変が、ＰｌｙＳｓ２野生型溶解素とはＣ末端２４６位の余分なリシンアミノ酸残基のみが異なるｐｐ５３の３０ｍｇ／ｋｇ用量で処理した４匹のマウスのうち３匹で観察された。残りの修飾溶解素ポリペプチドの３０ｍｇ／ｋｇ以上の用量を投与したマウスは、いかなる外膜所見も有しなかった。
【０２４４】
本実験で外膜病変を生じなかった４つの修飾溶解素ポリペプチド（ｐｐ５５、ｐｐ６１、ｐｐ６５及びｐｐ２９６）は、触媒ドメインに同じ突然変異（Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ）を有しており、野生型溶解素中の対応する位置が観察される有害作用に寄与し得ることが示唆された。ｐｐ５３を投与したマウスにおける外膜病変の存在から、ＰｌｙＳｓ２溶解素のＣ末端の余分なリシン残基が毒性を妨げるのに十分でないことが示された。
【０２４５】
他の軽度の病理所見が時折種々の群のマウスに見られたが、溶解素の投与に起因すると考えることはできなかった。腎臓の微少変化が種々の用量群のマウスにおいて観察され、理論に束縛されることを望むものではないが、野生型ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）が腎臓所見を生じず、腎臓の変化が野生型ＰｌｙＳｓ２（ｐｐ１１４９）を投与した４匹のマウスのうち１匹で認められたことから、この差は試験ポリペプチドの純度に関連する可能性がある。いずれにしても、病理の発生率は低く、一貫せず、懸念すべきものではなかった。
【０２４６】
これらの実験に基づくと、ｐｐ２９６が、外膜所見の発生率によって測定される野生型溶解素と比較して低下した免疫原性及び低下した毒性と共に、野生型溶解素と同等のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を含む最も望ましい特徴の組合せを有するようである。
【０２４７】
予想実施例９：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性評定
種々のドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨＬＡタイピングし、評価して、包括的なヒト集団にわたる広範な説明を確認する。ＰＢＭＣをタンパク質若しくは対照と共に、又は変異体に曝露せずに培養する。ＰＢＭＣサンプルを１４日間培養し、４日目、７日目及び１１日目に培地交換及びサイトカイン補助を行った。１４日目に、各培養物のＰＢＭＣサンプルを採取し、対象のサイトカインに対する抗ヒト抗体でプレコートしたＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ（商標）プレートに分取する。各サンプルをプレートのインキュベーション前に変異体、又は陽性対照として野生型溶解素（チャレンジ又は初回曝露のいずれかとして）、又は陰性対照として無タンパク質で刺激する。
【０２４８】
２４時間後に、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ（商標）プレートをＦＩＴＣ標識抗サイトカイン抗体（例えば、抗ＩＦＮ−γ抗体）の添加によって展開する。抗ＦＩＴＣ−４９０抗体の添加により膜上にスポットが現れ、これをＺｅｉｓｓ自動化ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ（商標）リーダーシステムで計数する。
【０２４９】
陽性応答（スチューデントＴ検定）を各変異体又は対照の曝露サンプルと非曝露サンプルとの間のスポット数の差に基づいて決定する。異なる変異体にわたる応答を統計的有意性（ｐ＜０．０５）について評価する。
【０２５０】
実施例１０：ラットにおける毒性研究
本研究の目的は、２時間の単回静脈内注入としてスプラーグドーリーラットに投与した場合のｐｐ２９６の潜在的毒性及び毒物動態学プロファイルを評価すると共に、最低３日間の回復期間後に任意の効果の回復、持続又は進行を評価することであった。
【０２５１】
以下の表９及び表１０に研究群の設定を示す。フェーズＡでは１群当たり５匹の雄性ラット及び５匹の雌性ラットとした。
【０２５２】
【表１０】
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【０２５３】
【表１１】
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【０２５４】
主フェーズ（フェーズＡ）及び毒物動態学フェーズ（フェーズＢ）については、動物に２時間の単回静脈内注入を行った。フェーズＡの動物には、最大耐量（ＭＴＤ）が１００ｍｇ／ｋｇの高用量まで決定されるまで漸増用量で２時間の単回静脈内注入を行った。最低３日間の観察を各ｐｐ２９６投与の間に設けた。群２〜５に割り当てられた動物を用量投与の終了のおよそ７２時間後に剖検した。
【０２５５】
以下のパラメーター及びエンドポイントを本研究で評価した：臨床兆候、体重、体重増加、摂餌量、臨床病理パラメーター（血液学、凝固、血清化学及び尿検査）、肉眼的剖検所見及び組織病理学検査。
【０２５６】
本研究の結果に基づくと、５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラットへのｐｐ２９６の単回静脈内注入は、全用量で異常な所見がなく、耐容性良好であった。したがって、無毒性量（no-observed-adverse-effect level；ＮＯＡＥＬ）は、毒性が最高の試験用量（１００ｍｇ／ｋｇ）で観察されなかったことから１００ｍｇ／ｋｇ超であると考えられた。
【０２５７】
実施例１１：ラットにおける付加的な毒性研究
本研究の目的は、スプラーグドーリーラットに７日連続で２時間の注入によって毎日投与した場合の修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６の潜在的毒性及び毒物動態学プロファイルを評価することであった。
【０２５８】
実験手順、動物及び処理を下記表１１にまとめる。
【０２５９】
【表１２】
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【０２６０】
全ての生存動物が８日目に剖検を受けた（終末期安楽死）。試験施設職員によって剖検が行われ、臓器重量が収集された。臓器重量データの統計分析は、個別支払いの商業ベースで従事する試験施設によって行われた。顕微鏡評価に必要とされる組織は、Charles River Laboratories Ashland, LLCによってトリミングされ、通常通りに処理され、パラフィン包埋され、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。顕微鏡評価は、正式な獣医病理学者によって、群１〜４の全動物の選択プロトコルで指定される組織及び全動物の全ての肉眼的病変に対して行われた。組織を光学顕微鏡法によって評価した。
【０２６１】
スプラーグドーリーラットは、７日連続で尾静脈を介した２時間の注入によって毎日投与した場合の０．５ｍｇ／ｋｇ／日、２．５ｍｇ／ｋｇ／日又は１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量の修飾溶解素ポリペプチドｐｐ２９６に耐容性を示した。研究全体を通して予定外の死亡は見られず、ｐｐ２９６に関連する肉眼的所見、顕微鏡的所見又は臓器重量所見は見られなかった。
【０２６２】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態に、その範囲を限定するものではない。実際、当業者にとっては、上述の記載を読めば、本明細書に記載の形態に加えて、本発明の様々な変更形態が明らかである。
【０２６３】
本明細書に引用される全ての特許、出願、公報、試験方法、文献及び他の題材は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【０２６４】
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【図１】
2021513865.tif 000018
【図２】
2021513865.tif 000019
【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021513865.tif 000022
2021513865.tif 000023
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