(57)【要約】本出願は、少なくとも細胞質内のグリコーゲン集積を減少させる（例えば、グリコーゲン集積を除去するか、またはグリコーゲン蓄積を減少させるなどの）方法及び組成物を開示する。例えば、本出願は、糖原病／グリコーゲン代謝疾患を有する対象を処置するための方法であって、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド及び内在化モイエティを含む治療有効量のキメラポリペプチドを対象に投与することを含む方法を開示する。本出願はさらに、糖原病／グリコーゲン代謝疾患を有する対象を処置するための方法であって、アルファ−アミラーゼポリペプチド及び内在化モイエティを含む治療有効量のキメラポリペプチドを対象に投与することを含む方法を開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリグルコサン蓄積症を有する対象を処置するための方法であって、
（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド及び
（ｉｉ）内在化モイエティ
を含む治療有効量のキメラポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
ポリグルコサン蓄積症を有する対象由来の細胞またはポリグルコサン蓄積症を有する対象の細胞にアルファ−グルコシダーゼ活性を送達するための方法であって、
（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び
（ｉｉ）内在化モイエティ
を含むキメラポリペプチドに前記細胞を接触させることを含む、前記方法。
【請求項３】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が筋細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が横隔膜筋細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が脳細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が神経細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記キメラポリペプチドが酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７０キロダルトンの分子量を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７６キロダルトンの分子量を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が非ヒト動物である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象がヒトである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法がグリコーゲンの除去をもたらす、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリグルコサン蓄積症が糖原病ＩＶ型（ＧＳＤ  ＩＶ）である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリグルコサン蓄積症が糖原病ＶＩＩ型（ＧＳＤ  ＶＩＩ）である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリグルコサン蓄積症が糖原病ＸＶ型（ＧＳＤ  ＸＶ）である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリグルコサン蓄積症がＲＢＣＫ１欠損症である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリグルコサン蓄積症がＰＲＫＡＧ２関連心筋症（ＰＡＣ）である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリグルコサン蓄積症が糖原病Ｖ型（ＧＳＤ  Ｖ）である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、
前記抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、
前記重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ラフォラ病を有する対象を処置するための方法であって、
（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド及び
（ｉｉ）内在化モイエティ
を含む治療有効量のキメラポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
ラフォラ病を有する対象由来の細胞またはラフォラ病を有する対象の細胞にアルファ−グルコシダーゼ活性を送達するための方法であって、
（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び
（ｉｉ）内在化モイエティ
を含むキメラポリペプチドに前記細胞を接触させることを含む、前記方法。
【請求項２８】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が筋細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が横隔膜筋細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が脳細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が神経細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記キメラポリペプチドが酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を有する、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、
前記抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、
前記重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、請求項２６〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７０キロダルトンの分子量を有する、請求項２６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７６キロダルトンの分子量を有する、請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が非ヒト動物である、請求項２６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象がヒトである、請求項２６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法がグリコーゲンの除去をもたらす、請求項２６〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法がラフォラ小体の分解をもたらす、請求項２６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
ダノン病を有する対象を処置するための方法であって、
（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド及び
（ｉｉ）内在化モイエティ
を含む治療有効量のキメラポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
ダノン病を有する対象由来の細胞またはラフォラ病を有する対象の細胞に酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を送達するための方法であって、
（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び
（ｉｉ）内在化モイエティ
を含むキメラポリペプチドに前記細胞を接触させることを含む、前記方法。
【請求項４８】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が筋細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が横隔膜筋細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が脳細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が神経細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記キメラポリペプチドが酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を有する、請求項４６〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、
前記抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、
前記重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドが配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項４６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、請求項４６〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７０キロダルトンの分子量を有する、請求項４６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドがおよそ７６キロダルトンの分子量を有する、請求項４６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が非ヒト動物である、請求項４６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象がヒトである、請求項４６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法がグリコーゲンの除去をもたらす、請求項４６〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
ダノン病を有する対象を処置するための方法であって、
（ｉ）アルファ−アミラーゼポリペプチド、及び
（ｉｉ）内在化モイエティ
を含む治療有効量のキメラポリペプチドを前記対象に投与することを含み、ここで、
前記アルファ−アミラーゼポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含み、
前記内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、
前記抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、
前記重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項６６】
アルツハイマー病を有する対象を処置するための方法であって、
（ｉ）アルファ−アミラーゼポリペプチド、及び
（ｉｉ）内在化モイエティ
を含む治療有効量のキメラポリペプチドを前記対象に投与することを含み、ここで、
前記アルファ−アミラーゼポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含み、
前記内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、
前記抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、
前記重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項６７】
前記アルファ−アミラーゼポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列から構成される、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記重鎖が配列番号４のリーダー配列を含む、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記軽鎖が配列番号５のリーダー配列を含む、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記キメラポリペプチドがアルファ−１，４−グルコシド結合加水分解活性を有する、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記キメラポリペプチドが、無細胞系においてアルファ−１，４−グルコシド結合を加水分解することができる、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記キメラポリペプチドが、前記疾患を有する対象由来の細胞においてアルファ−１，４−グルコシド結合を加水分解することができる、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象が非ヒト動物である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記対象がヒトである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞が筋細胞である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞が横隔膜筋細胞である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞が脳細胞である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞が神経細胞である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記アルファ−アミラーゼポリペプチドが、前記内在化モイエティに化学的にコンジュゲートされている、請求項６５〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記キメラポリペプチドが、前記アルファ−アミラーゼポリペプチド及びすべてまたは一部の前記内在化モイエティを含む融合タンパク質を含む、請求項６５〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記キメラポリペプチドが、前記アルファ−アミラーゼポリペプチドを前記内在化モイエティと相互連結させるリンカーを含まない、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記融合タンパク質がリンカーを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記リンカーが、前記アルファ−アミラーゼポリペプチドを前記内在化モイエティにコンジュゲートまたは連結させる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記リンカーが切断可能リンカーである、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記リンカーが配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項８４〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記内在化モイエティのすべてまたは一部が、前記アルファ−アミラーゼポリペプチドのＮ末端アミノ酸に直接またはリンカーを介してコンジュゲートまたは連結されている、請求項６５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記内在化モイエティのすべてまたは一部が、前記アルファ−アミラーゼポリペプチドのＣ末端アミノ酸に直接またはリンカーを介してコンジュゲートまたは連結されている、請求項６５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記内在化モイエティのすべてまたは一部が、前記アルファ−アミラーゼポリペプチドの内部アミノ酸に直接または間接的にコンジュゲートまたは連結されている、請求項６５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）輸送体を介して前記キメラポリペプチドの細胞への送達を促進する、請求項６５〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記内在化モイエティが、ＥＮＴ２を介して前記キメラポリペプチドの細胞への送達を促進する、請求項６５〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記内在化モイエティが、前記キメラポリペプチドの筋細胞への送達を促進する、請求項６５〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記筋細胞が心筋細胞である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記内在化モイエティが、前記キメラポリペプチドの神経細胞への送達を促進する、請求項６５〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記神経細胞が脳細胞である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記内在化モイエティが抗体を含む、請求項６５〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記内在化モイエティが抗原結合断片を含む、請求項６５〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記抗原結合断片がＦａｂである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗原結合断片がＦａｂ’である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記抗原結合断片がｓｃＦｖである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記キメラポリペプチドが組換えにより産生される、請求項６５〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記キメラポリペプチドが、原核細胞または真核細胞中で産生される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記真核細胞が、酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
１つ以上のグリコシル化基が前記キメラポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項６５〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記キメラポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記キメラポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記キメラポリペプチドが配列番号７及び配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記キメラポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記キメラポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記キメラポリペプチドが配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記キメラポリペプチドが配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記キメラポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記キメラポリペプチドが配列番号８及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項６５〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６４３，５９２号及び２０１８年６月９日に出願された米国特許仮出願第６２／６８２，９２８号の利益を主張する。上記出願の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
糖原病及びグリコーゲン代謝異常症は、基礎代謝酵素の欠損に起因する一連の疾患であり、これによって、筋肉、肝臓、神経細胞、及び他の細胞型内のグリコーゲンの合成または分解に異常が生じる。糖原病は、遺伝性（通常、常染色体劣性障害として）または後天性（例えば、アルカロイドによる中毒によって）のいずれかであり得る（Ｍｏｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，）。糖原病には、しばしばグリコーゲン代謝異常症と呼ばれるラフォラ病に加えて、ＧＳＤ  Ｉ型〜ＸＩ型、ＧＳＤ  ０型を含む多数の異なる型が存在する。これらの疾患は、変異した酵素及び／または主要な罹患組織に関して異なっている（Ｍｏｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ５，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４５、及びＧｅｎｔｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＦＥＢＳ  Ｊ，２８０（２）：５２５−３７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍｏｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ５，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４５
【非特許文献２】Ｇｅｎｔｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＦＥＢＳ  Ｊ，２８０（２）：５２５−３７
【発明の概要】
【０００４】
当該技術分野において、糖原病及びグリコーゲン代謝異常症（例えば、フォーブス・コリ病及び／またはアンダーセン病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはポンペ病及び／またはラフォラ病及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病）を有する患者におけるグリコーゲン集積、特に細胞質のグリコーゲン集積を除去するための、またはグリコーゲン集積に伴う細胞毒性作用を処置するための方法及び組成物が必要とされており、さらに、これらの疾患または障害を処置するための代替療法も必要とされている。本開示は、そのような方法及び組成物を提供する。例を挙げると、例えば、筋細胞（例えば、心臓及び／または横隔膜の筋細胞）及び／または肝細胞及び／または神経細胞（例えば、脳細胞）などの細胞の細胞質におけるグリコーゲン蓄積を減少させる必要性が存在する。さらなる例として、そのような方法及び組成物は、細胞質のグリコーゲン蓄積を減少させ得る。
したがって、本出願全体を通じて、グリコーゲン集積の除去またはグリコーゲン蓄積の減少（または同様の用語）への言及は、別途明記しない限り、過剰な（例えば、通常の生理学的レベルを超える）グリコーゲンの除去または減少を包含し、これには、異常な形態（例えば、ポリグルコサン）で存在する過剰なグリコーゲンの除去または減少が含まれる。特定の実施形態では、本開示は、細胞質内などの、例えば、筋細胞（骨格筋細胞及び／または心筋細胞）、横隔膜、または神経細胞内の１つ以上における過剰なポリグルコサンを除去するか、または減少させる（例えば、ポリグルコサン蓄積を除去するか、または減少させる）方法を提供する。特定の実施形態では、グリコーゲン集積を除去することまたはグリコーゲン蓄積を減少させること（または同様の用語）は、少なくとも１つ以上の罹患細胞の細胞質においてそれがなされることを指す。特定の実施形態では、少なくとも細胞質内などのグリコーゲン集積を除去することもしくはグリコーゲン蓄積を減少させることは、少なくとも細胞質内などのポリグルコサン集積を除去することもしくはポリグルコサン蓄積を減少させることであるか、または少なくとも細胞質内などのポリグルコサン集積を除去することもしくはグリコーゲン蓄積を減少させることを含む。そのような方法及び組成物は、特に、顕著で異常な細胞質のグリコーゲン蓄積（例えば、正常な及び／または異常なグリコーゲンの蓄積）を有するほどに疾患が重度及び／または進行している患者において、疾患または障害の処置を向上させる。本開示は、そのような方法及び組成物を提供する。
【０００５】
特定の実施形態では、本明細書にて提供される方法及び組成物は、（例えば、グリコーゲン集積を除去するか、またはグリコーゲン蓄積を減少させるなど）少なくとも細胞質内のグリコーゲン集積を減少させる。特定の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、ポリグルコサン集積（例えば、筋細胞（複数可）及び／または肝細胞（複数可）及び／または横隔膜細胞（複数可）、及び／または神経細胞（複数可）などの、少なくとも細胞（複数可）の細胞質内の集積）を減少させる。特定の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、グリコーゲン、例えば、少なくとも筋細胞及び／または神経細胞の少なくとも細胞質内のポリグルコサンの集積を減少させる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるいずれかの治療有効量のキメラポリペプチドを対象に投与することを含む、ダノン病を有する対象を処置するための方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるいずれかの治療有効量のキメラポリペプチドを対象に投与することを含む、アルツハイマー病を有する対象を処置するための方法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）アルファ−アミラーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティ（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を含むキメラポリペプチドであって、アルファ−アミラーゼポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含み、内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドを提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から構成される。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号４のリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号５のリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、アルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解活性を有する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、無細胞系においてアルファ−１，４−グルコシド結合を加水分解することができる。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、疾患を有する対象由来の細胞においてアルファ−１，４−グルコシド結合を加水分解することができる。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、心筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、脳細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、内在化モイエティに化学的にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼポリペプチド及びすべてまたは一部の内在化モイエティを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼポリペプチドを内在化モイエティと相互連結させるリンカーを含まない。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アルファ−アミラーゼポリペプチドを内在化モイエティにコンジュゲートまたは連結させる。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、内在化モイエティのすべてまたは一部は、アルファ−アミラーゼポリペプチドのＮ末端アミノ酸に直接またはリンカーを介してコンジュゲートまたは連結されている。いくつかの実施形態では、内在化モイエティのすべてまたは一部は、アルファ−アミラーゼポリペプチドのＣ末端アミノ酸に直接またはリンカーを介してコンジュゲートまたは連結されている。いくつかの実施形態では、内在化モイエティのすべてまたは一部は、アルファ−アミラーゼポリペプチドの内部アミノ酸に直接または間接的にコンジュゲートまたは連結されている。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）輸送体を介して、キメラポリペプチドの細胞への送達を促進する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、ＥＮＴ２を介してキメラポリペプチドの細胞への送達を促進する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、キメラポリペプチドの筋細胞への送達を促進する。いくつかの実施形態では、筋細胞は、横隔膜筋細胞である。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、ＥＮＴ２を介してキメラポリペプチドの神経細胞への送達を促進する。いくつかの実施形態では、神経細胞は、脳神経細胞で���る。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ’である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、組換えにより産生される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、原核細胞または真核細胞中で産生される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のグリコシル化基がキメラポリペプチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号７及び配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号８及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含む治療有効量のキメラポリペプチドを対象に投与することを含む、ラフォラ病を有する対象を処置するための方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ラフォラ病を有する対象由来の細胞またはラフォラ病を有する対象の細胞にアルファ−グルコシダーゼ活性を送達するための方法であって、（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含むキメラポリペプチドを細胞に接触させることを含む方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、抗体または抗原結合断片であって、抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、およそ７０〜７６キロダルトン、７０キロダルトン、または７６キロダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト動物（例えば、マウス）である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、横隔膜筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、脳細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、グリコーゲンの除去をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、ラフォラ小体の分解をもたらす。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含む治療有効量のキメラポリペプチドを対象に投与することを含む、ダノン病を有する対象を処置するための方法を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ダノン病を有する対象由来の細胞またはダノン病を有する対象の細胞に酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を送達するための方法であって、（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含むキメラポリペプチドを細胞に接触させることを含む方法を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、抗体または抗原結合断片であって、抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、およそ７０〜７６キロダルトン、７０キロダルトン、または７６キロダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト動物（例えば、マウス）である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、横隔膜筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、脳細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、グリコーゲンの除去をもたらす。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含む治療有効量のキメラポリペプチドを対象に投与することを含む、ポリグルコサン蓄積症を有する対象を処置するための方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ポリグルコサン病を有する対象由来の細胞またはポリグルコサン病を有する対象の細胞に酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を送達するための方法であって、（ｉ）成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含むキメラポリペプチドを細胞に接触させることを含む方法を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは抗体または抗原結合断片であって、抗体または抗原結合断片が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドまたは成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、およそ７０〜７６キロダルトン、７０キロダルトン、または７６キロダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト動物（例えば、マウス）である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、横隔膜筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、脳細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、グリコーゲンの除去をもたらす。いくつかの実施形態では、ポリグルコサン蓄積症は、糖原病ＩＶ型（ＧＳＤ  ＩＶ）、糖原病ＶＩＩ型（ＧＳＤ  ＶＩＩ）、糖原病ＸＶ型（ＧＳＤ  ＸＶ）、ＲＢＣＫ１欠損症及び／またはＰＲＫＡＧ２関連心筋症（ＰＡＣ）である。
【００１９】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請かつ必要な料金の支払により特許庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＥＮＴ２＋  Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＦａｂ−アミラーゼの用量依存的な取り込みを示す。０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌでの−Ｆａｂ−アミラーゼと＋Ｆａｂ−アミラーゼとの比較を示す。（注：抗Ｈ３Ｌ２、ウサギｐＡｂ、１：１００；ロバ抗ウサギ−ＨＲＰ、１：２００００）。
【図２】ＥＮＴ２＋  Ｃ２Ｃ１２筋管におけるグリコーゲンの減少を示すグラフである。
【図３】ダノン病の治療選択肢としてのＦａｂ−ＧＡＡの使用を示す。ダノン病患者の心臓組織を処理し、ＰＢＳで処置した試料と比較して、Ｆａｂ−ＧＡＡがグルコースの相対濃度の低下をもたらすことが示された。
【図４】精製したラフォラ小体をＦａｂ−アミラーゼによって分解することができるが、Ｆａｂ−グルコシダーゼでは分解することができないことを示す。Ａは、Ｆａｂ−アミラーゼ、Ｆａｂ−グルコシダーゼまたは対照で処置した場合の、脳、心臓、及び骨格筋からのラフォラ小体の分解の百分率を示すグラフである。Ｂは、−Ｆａｂ−アミラーゼ及び＋Ｆａｂ−アミラーゼで処置したＷＴマウス及びＫＯマウスのラフォラ小体含有量（抽出物１ｍＬあたりのμｇ）を示すグラフである。
【図５】注射されたＦａｂ−アミラーゼが筋肉及び脳において活性であることを示す。Ａは、注射１時間後、注射２時間後、注射４時間後、及び注射２４時間後の筋肉におけるアミラーゼ活性を示すグラフである。Ｂは、脳の試料（上部パネル）の注射直後及び注射１時間後に確認したアミラーゼ活性（下部パネル）を示す。
【図６】左脚に溶媒（ＰＢＳ）を注射し（左パネル）右脚にＦａｂ−アミラーゼを注射した（右パネル）、８．５ヶ月齢の雌マウスの前脛骨筋（ＴＡ）の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を示す。
【図７】左脚に溶媒（ＰＢＳ）を注射し（左パネル）右脚にＦａｂ−アミラーゼを注射した（右パネル）、８．５ヶ月齢の雌マウスの前脛骨筋（ＴＡ）の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を示す。
【図８】左脚に溶媒（ＰＢＳ）を注射し（左パネル）右脚に溶媒（ＰＢＳ）を注射した（右パネル）、８．５ヶ月齢の雌マウスの前脛骨筋（ＴＡ）の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を示す。
【図９】左脚に溶媒（ＰＢＳ）を注射し（左パネル）右脚にＦａｂ−アミラーゼを注射した（右パネル）、４ヶ月齢の雌マウスの前脛骨筋（ＴＡ）の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を示す。
【図１０Ａ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスの脳におけるグルコースレベルを示すグラフである。
【図１０Ｂ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。Ｆａｂ−アミラーゼで処置したマウスの脳におけるグルコースレベルを示すグラフである。
【図１０Ｃ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスとＦａｂ−アミラーゼ（Ｆａｂ−Ａｍｙ）で処置したマウスの脳におけるグルコースレベルの比較を示すグラフである。
【図１０Ｄ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスとＦａｂ−アミラーゼ（Ｆａｂ−Ａｍｙ）で処置したマウスの脳におけるグルコースレベルの比較を示すグラフである。
【図１０Ｅ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲンの除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスとＦａｂ−アミラーゼ（Ｆａｂ−Ａｍｙ）で処置したマウスの脳におけるグルコースレベルの比較を示すグラフである。
【図１０Ｆ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲンの除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスとＦａｂ−アミラーゼ（Ｆａｂ−Ａｍｙ）で処置したマウスの脳におけるグルコースレベルの比較を示すグラフである。
【図１０Ｇ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。Ｆａｂ−ＧＡＡで処置したマウスの脳におけるグルコースレベルを示すグラフである。
【図１０Ｈ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスとＦａｂ−ＧＡＡで処置したマウスの脳におけるグルコースレベルの比較を示すグラフである。
【図１０Ｉ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスとＦａｂ−ＧＡＡで処置したマウスの脳におけるグルコースレベルの比較を示すグラフである。
【図１０Ｊ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスとＦａｂ−ＧＡＡで処置したマウスの脳におけるグルコースレベルの比較を示すグラフである。
【図１０Ｋ】Ｆａｂ−アミラーゼまたはＦａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与で２８日間処置したマウスの脳からのグリコーゲン除去を示す。ＰＢＳで処置したマウスとＦａｂ−ＧＡＡで処置したマウスの脳におけるグルコースレベルの比較を示すグラフである。
【図１１Ａ】抗アミラーゼ免疫組織化学法（ＩＨＣ）を使用して可視化したＦａｂ−アミラーゼの脳にわたる分布及び神経細胞への取り込みを示す。Ａｂ２１１５６は１：５０００で使用した。陽性対照としての膵臓及び唾液腺を示す。陽性対照の組織染色は極めて濃いか（左及び中央の組織）、または判別するのに十分な程度に濃い（右）。島細胞及び間質細胞は陰性である。
【図１１Ｂ】抗アミラーゼ免疫組織化学法（ＩＨＣ）を使用して可視化したＦａｂ−アミラーゼの脳にわたる分布及び神経細胞への取り込みを示す。Ａｂ２１１５６は１：５０００で使用した。陰性対照としてのＬ４脳を示す。脈絡叢（下部）及び神経細胞（上部パネル）（いずれも２０倍）は陰性である。
【図１１Ｃ】抗アミラーゼ免疫組織化学法（ＩＨＣ）を使用して可視化したＦａｂ−アミラーゼの脳にわたる分布及び神経細胞への取り込みを示す。Ａｂ２１１５６は１：５０００で使用した。Ｆａｂ−アミラーゼを３日間ＩＣＶで処置したマウスの抗アミラーゼ染色を示す。脈絡叢（下部）及び神経細胞（上部パネル）（いずれも２０倍）は陽性である。
【図１２Ａ】腓腹筋のグリコーゲン含有量を示す。無処置ＷＴマウス、無処置ラフォリン（ｌａｆｏｒｉｎ）ノックアウトマウス、及びＦａｂ−アミラーゼ処置ラフォリンノックアウトマウスにおける腓腹筋のグリコーゲン含有量を測定した。Ｆａｂ−アミラーゼ（Ｆａｂ−Ａｍｙ）３０ｍｇ／ｍｌを７日間にわたって３回右腓腹筋に注射した。最終注射の２４時間後、マウスを屠殺して右腓腹筋及び左腓腹筋のグリコーゲンを測定した。ＷＴ：Ｎ＝マウス４匹、無処置ＫＯマウス：Ｎ＝マウス４匹、Ｆａｂ−アミラーゼ処置ＫＯマウス：Ｎ＝マウス４匹。無処置ＷＴマウス、無処置ラフォリンＫＯマウス、及びＦａｂ−アミラーゼ処置ラフォリンＫＯマウスにおける腓腹筋のグリコーゲン含有量レベルを示すグラフである。
【図１２Ｂ】腓腹筋のグリコーゲン含有量を示す。無処置ＷＴマウス、無処置ラフォリンノックアウトマウス、及びＦａｂ−アミラーゼ処置ラフォリンノックアウトマウスにおける腓腹筋のグリコーゲン含有量を測定した。Ｆａｂ−アミラーゼ３０ｍｇ／ｍｌを７日間にわたって３回右腓腹筋に注射した。最終注射の２４時間後、マウスを屠殺して右腓腹筋及び左腓腹筋のグリコーゲンを測定した。ＷＴ：Ｎ＝マウス４匹、無処置ＫＯマウス：Ｎ＝マウス４匹、Ｆａｂ−アミラーゼ処置ＫＯマウス：Ｎ＝マウス４匹。Ｆａｂ−アミラーゼ処置ラフォリンノックアウトマウスの無注射の腓腹筋及び注射した腓腹筋のグリコーゲン含有量を示すグラフである。
【図１３】種々のＧＡＡコンストラクトの設計の概略図を示す。融合体には、１）重鎖のＦａｂセグメントのＣ末端に融合したＧＡＡ  ７０−９５２を有する３Ｅ１０  Ｆａｂ、２）重鎖のＦａｂセグメントのＣ末端に融合したＧＡＡ  ６１−９５２を有する３Ｅ１０  Ｆａｂ、３）５アミノ酸のリンカー及び重鎖のＦａｂセグメントのＣ末端に融合したＧＡＡ  ５７−９５２を有する３Ｅ１０  Ｆａｂ、４）１３アミノ酸のリンカー及び重鎖のＦａｂセグメントのＣ末端に融合したＧＡＡ  ６７−９５２を有する３Ｅ１０  Ｆａｂ、５）Ｃ末端の融合を強化するように設計された点突然変異、１３アミノ酸のリンカー、及び軽鎖のＮ末端で融合した３Ｅ１０  Ｆａｂを有するＧＡＡ、６）上記のコンストラクト４と類似の接合部を有する、重鎖のＣ末端でＧＡＡに融合した３Ｅ１０全抗体、ならびに７）成熟ＧＡＡ配列の上流にウシＧＡＡプロ配列を有する、重鎖のＣ末端でＧＡＡに融合した３Ｅ１０全抗体が含まれる。
【図１４】クエン酸−Ｐ０４緩衝液を用いた、グリコーゲン基質を使用したｐＨ依存的比活性を示すグラフを示す。比活性は、ｐＨに対するμｍｏｌ／分／ｍｇで測定され、活性のピークはｐＨ約５．０である。
【図１５−１】ｐＨ３．５〜ｐＨ７．０の範囲のｐＨ値にわたるＦａｂ−ＧＡＡの比活性を要約する。
【図１５−２】ｐＨ３．５〜ｐＨ７．０の範囲のｐＨ値にわたるＦａｂ−ＧＡＡの比活性を要約する。
【図１６】グルコース標準曲線（Ｂ）及び対応するデータ（Ａ）を示す。
【図１７】表７に見られるデータに対応する、Ｆａｂ−ＧＡＡグリコーゲン標準曲線を示す。
【図１８】ＰＢＳで処置した野生型マウスの骨格筋のＰＡＳ染色を示す画像を提供する。注：８９ＬＧ；ＰＡＳ陽性線維なし。
【図１９】Ｆａｂ−ＧＡＡで処置した野生型マウスの骨格筋のＰＡＳ染色を示す画像を提供する。注：９８ＬＧ；ＰＡＳ陽性線維なし。
【図２０】ＰＢＳで処置したラフォラノックアウトマウスの骨格筋のＰＡＳ染色を示す画像を提供する。注：８５ＬＧ；３８／４４及び４２／２６  ＰＡＳ陽性線維。
【図２１】Ｆａｂ−ＧＡＡで処置したラフォラノックアウトマウスの骨格筋のＰＡＳ染色を示す画像を提供する。注：９３ＬＧ；２／３３及び１／３５  ＰＡＳ陽性線維。
【図２２】マイオザイムで処置したラフォラノックアウトマウスの骨格筋のＰＡＳ染色を示す画像を提供する。注：１０２ＬＧ；２／５９及び３／５６  ＰＡＳ陽性線維。
【図２３】ＰＢＳ、Ｆａｂ−ＧＡＡ、及びマイオザイムで処置したラフォラノックアウトマウスにおける、心臓のグリコーゲン量の定量的な生化学的比較のグラフ表示を提供する。
【図２４】ＰＢＳで処置したラフォラノックアウトマウスの心筋のＲＤＲ１３  ＰＡＳ染色を示す画像を提供する。注：８５ＬＧ；＞７０％のＰＡＳ陽性線維。
【図２５】Ｆａｂ−ＧＡＡで処置したラフォラノックアウトマウスの心筋のＲＤＲ１３  ＰＡＳ染色を示す画像を提供する。注：９３ＬＧ；約１０％のＰＡＳ陽性線維。
【図２６】マイオザイムで処置したラフォラノックアウトマウスの心筋のＲＤＲ１３  ＰＡＳ染色を示す画像を提供する。注：１０２ＬＧ；＞５０％のＰＡＳ陽性線維。
【図２７−１】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−２】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−３】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−４】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−５】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−６】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−７】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−８】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−９】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−１０】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２７−１１】使用するキー配列の例を示す。各種融合体に関して、分泌のためのシグナル配列は、単にアミノ酸配列として示されているが、この配列内のイントロンを使用することが望ましいことに留意されたい。
【図２８】ラット細胞及びＨＥＫ２９３細胞におけるＦａｂ−アミラーゼの濃度を示すグラフを示す。
【図２９】Ｆａｂ−アミラーゼの図を示す。
【図３０】Ｆａｂ−ＡＭＹの免疫ブロット、銀染色、及びＥＬＩＳＡを示す。Ａは、Ｆａｂ−ＡＭＹの免疫ブロット（レーン１は５ｎｇ、レーン２は５０ｎｇ）及び銀染色（レーン３は５００ｎｇ、レーン４は２５０ｎｇ）を示し、１００ｋＤａのＦａｂ−ＡＭＹを検出する。Ｂは、抗Ｆａｂキャプチャー抗体、次いで抗アミラーゼ検出抗体（ａｂ２１１５６）を使用するＥＬＩＳＡを示す。
【図３１】Ｆａｂ−ＡＭＹがｉｎ  ｖｉｔｒｏでラフォラ小体を分解することを示す。脳、心臓、及び骨格筋の無処置ラフォラ小体及びＦａｂ−ＡＭＹ処置ラフォラ小体を示す。
【図３２】Ｆａｂ−ＡＭＹがｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を透過することを示す。細胞透過アッセイを実施した。Ｆａｂ−ＡＭＹ（１．３ｕＭ）またはヒトアミラーゼ（１．３ｕＭ）をＴ４７Ｄ細胞に一晩アプライし、洗浄してエタノールで固定した。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２−アルカリホスファターゼコンジュゲート（抗ヒトＦ（ａｂ’）２−ＡＰ）、またはウサギ抗ヒトＡＭＹ２Ａ−アルカリホスファターゼコンジュゲート（抗ＡＭＹ２Ａ−ＡＰ）によって、細胞透過を検出した。
【図３３】ＩＣＶ送達されたＦａｂ−ＡＭＹが脳の全領域を透過することを示す。Ｆａｂ−ＡＭＹで処置した脳及び無処置対照の脳を示している染色を示す。
【図３４】ラフォラ小体が、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）によって可視化される大型のグリコーゲン凝集体であることを示す。ラフォラ小体は、脳（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）、骨格筋（パネルＤ）、及び心臓（パネルＥ、弱拡大；パネルＦ、強拡大）に存在する。
【図３５】Ｆａｂ−ＡＭＹの連続ＩＣＶ注入を示す。Ｆａｂ−ＡＭＹをＡｌｚｅｔポンプを使用して連続ＩＣＶによって野生型の脳に送達した（Ａ）。注射の３日後、脳の薄片６つを採取した（Ｂ）。免疫ブロット（Ｃ）、ＥＬＩＳＡ（Ｄ）、及びアミラーゼ活性（Ｅ）によって、Ｆａｂ−ＡＭＹはすべての薄片で強く検出された。免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ、及びアミラーゼ活性によって測定されたＦａｂ−ＡＭＹのレベルは一致していた。注：＊＝Ａｌｚｅｔカテーテルの配置
【図３６】ＩＣＶによってラフォラノックアウトマウスの脳に送達されたＦａｂ−ＡＭＹが、グリコーゲン量を減少させることを示す。ＩＣＶ投与によるラフォラノックアウトマウスへのＦａｂ−ＡＭＹ投与によって、すべての脳切片にわたってグリコーゲン量が減少する。グリコーゲンレベルを、個々の薄片ごとに脳ホモジネートのタンパク質含有量に対して正規化した。各マウスの平均値を使用して、各処置群の平均値及びＳＤを算出した。動物の数（ｎ値）を示す。注：ＰＢＳ：ｎ＝４、Ｆａｂ−ＡＭＹ：ｎ＝５。＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図３７】成人ポリグルコサン小体病（ＡＰＢＤ）のＧＢＥ１  ｎｅｏ／ｎｅｏマウスモデルの骨格筋及び心臓の、ポリグルコサン総含有量に対するＦａｂ−ＧＡＡ処置の作用を示す。心臓及び骨格筋をＧＢＥ１  ｎｅｏ／ｎｅｏマウスから摘出してホモジナイズし、次にＦａｂ−ＧＡＡで処置した。ポリグルコサンを分解するＦａｂ−ＧＡＡの能力を、ホモジネート中の残留グルコースを測定することにより判定した。Ｆａｂ−ＧＡＡに応答して、心臓（Ｂ）及び筋肉（Ａ）の両方からのグルコースが５０％減少し、Ｆａｂ−ＧＡＡによるポリグルコサンの効果的な分解が示された。
【図３８】異なる遺伝子突然変異を有するＡＰＢＤ患者からの組織標本中のポリグルコサン封入体に対するＦａｂ−ＧＡＡの作用を示す。様々なポリグルコサン蓄積症の患者のヒト組織標本をＦａｂ−ＧＡＡで処置した。凍結切片を１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂ−ＧＡＡまたは溶媒のいずれかで、３７℃で１２時間インキュベートした。次に、標本をＰＡＳ染色して２つの標本群のグリコーゲン含有量を比較した。Ａは、心臓移植を必要とする拡張型心筋症が生じる重度のグリコゲニン−１欠損を有する、ＧＹＧ１ミスセンス突然変異（ｃ．３０４Ｇ＞Ｃ，ｐ．（Ａｓｐ１０２Ｈｉｓ））を有する患者の心臓の標本を示す。Ｂは、重度のＲＢＣＫ１欠損症が生じる、複数のＲＢＣＫ１突然変異（ｃ．８１７ｄｕｐＣ，ｐ（Ｌｅｕ２７３Ｐｒｏｆｓ＊２７）及びｃ．１４６５ｄｅｌＡ，ｐ．（Ｔｈｒ４８９Ｐｒｏｆｓ＊９））を有する患者の骨格筋の標本を示す。Ｆａｂ−ＧＡＡは、２つの組織型のグリコーゲン貯蔵異常の病因の違いにもかかわらず、両方の組織型でポリグルコサンを減少させた。
【図３９】Ｅｐｍ２ａ−／−マウスにおける、腓腹筋及び心臓への筋肉内注射後のポリグルコサンラフォラ小体の量に対する、Ｆａｂ−ＧＡＡの作用を示す。１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂ−ＧＡＡ（Ｎ＝３）またはＰＢＳ（Ｎ＝４）２０μＬの３回の連続注入を、１０ヶ月齢のＥｐｍ２ａ−／−マウスの右腓腹筋に１週間にわたり（１日目、４日目、及び７日目に）投与した。年齢を一致させた野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、同じレジメンを使用してＰＢＳで処置した（Ｎ＝３）。８日目にマウスを安楽死させ、ポリグルコサンの測定のために心臓を含む筋肉を採取した。Ａは、ＰＢＳで処置した筋肉と比較して、Ｆａｂ−ＧＡＡ処置がポリグルコサンレベルを４２％減少させたことを示す。Ｂは、Ｆａｂ−ＧＡＡ処置が、心臓におけるポリグルコサンレベルも減少させたことを示す。
【図４０】Ｆａｂ−ＧＡＡ  １２０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射後の、Ｅｐｍ２ａ−／−マウスの心臓（Ａ）及び四頭筋（Ｂ）におけるポリグルコサン含有量を示す。０．９０ｍｇのＦａｂ−ＧＡＡまたはＰＢＳの４回の連続尾静脈注射を、６ヶ月齢のＥｐｍ２ａ−／−マウス（処置ごとにＮ＝５）に投与した。年齢を一致させた野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝４）に、対照コホートとしてＰＢＳを注射した。心臓及び四頭筋を採取し、ポリグルコサン含有量について定量化した。Ｆａｂ−ＧＡＡ処置は、Ｅｐｍ２ａ−／−（ＫＯ）マウスのポリグルコサンＬＢの量を、野生型（ＷＴ）レベルまで減少させた。
【図４１】Ｅｐｍ２ａ−／−（ＫＯ）マウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスの心臓及び四頭筋における、グリコーゲン豊富な領域の過ヨウ素酸シッフ染色を示す。Ｆａｂ−ＧＡＡで処置後の両方の組織において、ポリグルコサン小体数の減少が見られる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
グリコーゲンは、すぐに使用可能なグルコースの貯蔵を人体の細胞へ供給する複合多糖である。グリコーゲンは主に肝臓に見られ、そこで加水分解されて血流中に放出されグルコースを他の細胞に供給する。筋肉では、グリコーゲンの加水分解から生じるグルコースが筋細胞にエネルギーを供給する。タンパク質であるラフォリン、マリン（ｍａｌｉｎ）及びアルファ−アミラーゼが、グリコーゲンクリアランスにおいて役割を果たしていると考えられている。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２３】
Ｉ．ポリペプチド
アルファ−アミラーゼポリペプチド
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチド（または本開示の方法で使用するためのキメラポリペプチド）の非内在化モイエティポリペプチド部分は、アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、唾液アルファ−アミラーゼまたは膵アルファ−アミラーゼ）である。換言すれば、特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼ含有キメラポリペプチドが提供される。本開示の方法及び組成物において使用するための例示的なアルファ−アミラーゼ（例えば、成熟アルファ−アミラーゼ）ポリペプチドが、本明細書にて提供される。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼ（例えば、成熟アルファ−アミラーゼ）ポリペプチドは、罹患細胞において、過剰グリコーゲンの除去に有用である。いくつかの実施形態では、罹患細胞は、ポリグルコサン蓄積症（例えば、非中枢神経系（ＣＮＳ）ポリグルコサン蓄積症）を有する対象の細胞である。いくつかの実施形態では、罹患細胞は、糖原病またはグリコーゲン代謝異常症を有する対象の細胞である。いくつかの実施形態では、罹患細胞は、ポンペ病、アンダーセン病、フォン・ギールケ病、ラフォラ病、フォーブス・コリ病、ダノン病、及び／またはアルツハイマー病を有する対象に由来する細胞である。いくつかの実施形態では、罹患細胞は、ダノン病を有する対象に由来する細胞である。他の実施形態では、罹患細胞は、アルツハイマー病または認知症を有する対象に由来する細胞である。
【００２４】
特定の実施形態では、本明細書で言及されるアルファ−アミラーゼポリペプチドのいずれかは、ガンマ−アミラーゼで置換されていてもよい。特定の実施形態では、ガンマ−アミラーゼは、ベータ−グルコースの遊離により、多糖鎖の非還元末端から連続的に、末端の１，４結合型アルファ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒することができる。いくつかの実施形態では、ガンマ−アミラーゼは、グリコーゲン分子内の配列中の次の結合が１，４である場合、１，６−アルファ−グルコシド結合を加水分解することもできる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼ（例えば、成熟アルファ−アミラーゼ）は、モノマーである。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼは、二量体または三量体である。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼは、多量体化できないように変異されている（例えば、アルファ−アミラーゼは、二量体化または三量体化できないように変異されている）。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼは、アルファ−アミラーゼの多量体化（例えば、二量体化または三量体化）を阻害する薬剤で処理されている。いくつかの実施形態では、薬剤は、小分子である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、野生型アルファ−アミラーゼポリペプチドの種々の機能的断片及び変異体、融合タンパク質、ならびに改変形態を含む。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼは、成熟アルファ−アミラーゼである。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼまたはその断片もしくは変異体は、唾液アルファ−アミラーゼまたはその断片もしくは変異体である。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼまたはその断片もしくは変異体は、膵アルファ−アミラーゼまたはその断片もしくは変異体である。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼまたはその断片もしくは変異体は、哺乳動物のアルファ−アミラーゼまたはその断片もしくは変異体である。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼまたはその断片もしくは変異体は、ヒトアルファ−アミラーゼまたはその断片もしくは変異体である。そのようなアルファ−アミラーゼポリペプチドの機能的断片または変異体、融合タンパク質、及び改変形態は、天然のアルファ−アミラーゼポリペプチドに対して実質的に配列同一性であるアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、天然のアルファ−アミラーゼポリペプチドの機能（例えば、アルファ−１，４−グルコシド結合を加水分解する能力）を保持する。「機能を保持する」とは、特定の断片の活性が天然タンパク質の活性と同一または実質的に同一でなければならないことを意味しないことに留意すべきである（ただし、いくつかの実施形態では同一または実質的に同一である場合がある）。しかしながら、天然の活性を保持するためには、その天然の活性は、同じまたは類似の条件下で比較して、そのような活性が比較されている天然タンパク質の活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるべきである。いくつかの実施形態では、天然の活性を保持することは、断片または変異体が、そのような活性が比較されている天然タンパク質に対して、同じまたは類似の条件下で比較して、例えば、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、または少なくとも１２５％、活性が向上しているというシナリオを含み得る。
【００２７】
特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドの機能的断片、変異体、または融合タンパク質は、成熟アルファ−アミラーゼなどのアルファ−アミラーゼポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である（例えば、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である）アミノ酸配列またはその断片を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチド及び方法において使用するためのアルファ−アミラーゼポリペプチドは、完全長もしくは実質的に完全長のアルファ−アミラーゼポリペプチド、または完全長アルファ−アミラーゼの成熟形態である。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチド及び方法において使用するためのアルファ−アミラーゼポリペプチドは、アルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解活性を有する機能的断片である。
【００２９】
前述のいずれかの特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドのアルファ−アミラーゼ部分は、アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、成熟形態）を含み、これは、特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドの機能的断片である場合もあれば、または実質的に完全長のアルファ−アミラーゼポリペプチドである場合もある。
【００３０】
いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼは、アルファ−アミラーゼの成熟形態である。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼの成熟形態は、配列番号３６のアミノ酸１６〜５１１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００６９０）に対応する。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼの成熟形態は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片に対応する。
【００３１】
本開示のキメラポリペプチド及び方法において使用するための好適なアルファ−アミラーゼポリペプチドまたはその機能的断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価されたアルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解活性を有する。例示的な機能的断片は、完全長アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、配列番号３６）の連続したアミノ酸残基を、少なくとも１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個、または５１１個含む。いくつかの実施形態では、機能的断片は、成熟アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、配列番号１）の連続したアミノ酸を、１００〜１５０個、１００〜２００個、１００〜２５０個、１００〜３００個、１００〜４００個、１００〜４５０個、１００〜４９５個、２００〜４９５個、３００〜４９５個、４００〜４９５個、４５０〜４９５個、４７５〜４９５個含む。同様に、特定の実施形態では、本開示は、アルファ−アミラーゼ部分が前述のいずれかのアルファ−アミラーゼポリペプチドまたは生理活性断片の変異体であるキメラタンパク質を企図する。例示的な変異体は、天然の（例えば、成熟した）アルファ−アミラーゼポリペプチドまたはその機能的断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、そのような変異体は、アルファ−アミラーゼ変異体のアルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解活性を保持する。本開示は、アルファ−アミラーゼ部分が、本明細書に記載の任意の内在化モイエティと組み合わされた本明細書に記載のアルファ−アミラーゼポリペプチド、断片または変異体のいずれかを含む、キメラポリペプチド及びそのようなポリペプチドの使用を企図する。さらに、特定の実施形態では、前述のキメラポリペプチドのいずれかのアルファ−アミラーゼ部分は、特定の実施形態では、融合タンパク質であり得る。アルファ−アミラーゼ部分と内在化モイエティ部分（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ  ｐｏｒｔｉｏｎ）との任意の組み合わせを含み、所望により１つ以上のリンカー、１つ以上のタグなどを含むそのようなキメラポリペプチドのいずれも、本開示の方法のいずれかで使用することができる。
【００３２】
特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドの断片または変異体は、アルファ−アミラーゼポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えにより産生されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、断片または変異体は、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学作用などの、当該技術分野で既知の技術を使用して化学的に合成することができる。断片もしくは変異体を、（組換えによりもしくは化学合成により）生成することができ、天然のアルファ−アミラーゼポリペプチドとして機能できるこれらの断片もしくは変異体を、例えばダノン病及び／またはアルツハイマー病を処置するこれらの能力をｉｎ  ｖｉｖｏで試験することによって、及び／または断片もしくは変異体がアルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解活性を有していることを（例えば、無細胞もしくは細胞ベースのアッセイにおいて）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認することによって同定するために試験することができる。本明細書に開示されるアルファ−アミラーゼポリペプチドの活性を試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの例は、アルファ−アミラーゼ含有キメラポリペプチドで、またはアルファ−アミラーゼ含有キメラポリペプチドなしで罹患細胞を処置し、次に一定時間インキュベートした後にポリグルコサンレベルを検査するものである。
【００３３】
特定の実施形態では、本開示は、治療有効性もしくは予防有効性、または安定性（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの有効期間及びｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解に対する耐性）を高めるなどの目的で、アルファ−アミラーゼポリペプチドの構造を改変することを企図する。改変ポリペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加によって生成することができる。例を挙げると、例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンとの単独の置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単独の置換、トレオニンのセリンとの単独の置換、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸との同様の置換（例えば、保存的突然変異）が、得られた分子のアルファ−アミラーゼ生物活性に対して重大な影響を及ぼさないと予想することは妥当である。保存的置換は、アミノ酸のファミリー内で起こる、それらの側鎖に関連する置換である。
【００３４】
本開示はさらに、アルファ−アミラーゼポリペプチドのコンビナトリアル突然変異体のセット、及びトランケーション突然変異体を作製することを企図しており、本開示は、機能的変異体の配列を同定するのに特に有用である。天然起源のアルファ−アミラーゼポリペプチドと比較して選択的な効力を有する、コンビナトリアル的に得られた変異体を作製することができる。同様に、変異導入により、対応する野生型アルファ−アミラーゼポリペプチドとは著しく異なる細胞内半減期を有する変異体を生じさせることができる。例えば、改変したタンパク質は、タンパク質分解または他の細胞プロセスに対してより安定またはより不安定になり、その結果、アルファ−アミラーゼの分解、またはさもなければ不活性化が生じる可能性がある。そのような変異体は、その半減期を調節することによって、アルファ−アミラーゼポリペプチドレベルを変化させるために利用することができる。可能性のあるアルファ−アミラーゼ変異体配列のライブラリーを生成することのできる多くの方法が存在しており、例を挙げれば、縮重オリゴヌクレオチド配列から生成する方法である。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で実施することができ、次に、合成遺伝子を、適切な遺伝子にライゲーションして発現させることができる。遺伝子の縮重セットの目的は、１つの混合物中に、可能性のあるポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列のすべてを提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６、Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。そのような技術は、他のタンパク質の指向性進化法に採用されてきた（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３、Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２、ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、及び同第５，０９６，８１５号を参照されたい）。
【００３５】
あるいは、変異導入の他の方式をコンビナトリアルライブラリーを作製するために利用することができる。例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチド変異体は、例えば、アラニンスキャニング変異導入などを使用してスクリーニングすることによって（Ｒｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９、Ｂａｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８、Ｇｒｏｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１、Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８、及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）、リンカースキャニング変異導入によって（Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２、ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）、飽和変異導入によって（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）、ＰＣＲ変異導入によって（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）、または化学的変異導入を含むランダム変異導入などによって（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、及びＧｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）、ライブラリーから作製及び単離することができる。リンカースキャニング変異導入、特にコンビナトリアルな場合のリンカースキャニング変異導入は、アルファ−アミラーゼポリペプチドのトランケートされた（生理活性の）形態を同定するための魅力的な方法である。
【００３６】
点突然変異及びトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための広範な技術、より詳細に述べると、特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が、当該技術分野で知られている。そのような技術は、一般に、アルファ−アミラーゼポリペプチドのコンビナトリアル変異導入によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技術は、通常、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、及び所望の活性の検出によって、検出された産物の遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離が促進される条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。下記の例示的なアッセイのそれぞれは、コンビナトリアル変異導入技術によって生成された多数の縮重配列をスクリーニングするために、必要に応じてハイスループット分析に適用できる。
【００３７】
特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、ペプチドミメティックを含み得る。本明細書で使用する場合、「ペプチドミメティック」という用語は、非天然起源のアミノ酸、ペプトイドなどを含有する化学的に改変されたペプチド及びペプチド様分子を含む。ペプチドミメティックは、対象に投与されたとき、ペプチドと比べて安定性の向上を含む様々な利点を提供する。ペプチドミメティックを同定するための方法は当該分野で周知であり、可能性のあるペプチドミメティックのライブラリーを含有するデータベースをスクリーニングすることが含まれる。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造を有する３００，０００種を超える化合物のコレクションを含有する（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ，３５：２３３１（１９７９））。標的分子の結晶構造が利用できない場合は、構造は、例えば、ＣＯＮＣＯＲＤプログラム（Ｒｕｓｉｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用して作製することができる。別のデータベースであるＡｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  Ｃａｌｉｆ．）には、市販されている約１００，０００種の化合物が含まれており、このデータベースもまた、検索してアルファ−アミラーゼポリペプチドの可能性のあるペプチドミメティックを同定することができる。
【００３８】
特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含み得る。例示的な翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾されたアルファ−アミラーゼポリペプチドは、脂質、多糖または単糖、及びリン酸塩などの非アミノ酸要素を含み得る。アルファ−アミラーゼポリペプチドの機能性に対するそのような非アミノ酸要素の作用は、その生物活性、例えば、アルファ−１，４−グルコシド結合加水分解活性及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病を処置する能力について試験され得る。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、及び／または精製のうちの１つ以上を高める１つ以上のポリペプチド部分をさらに含み得る。他の実施形態では、内在化モイエティは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されていないか、または野生型アルファ−アミラーゼポリペプチドに存在するＮ−グリコシル化基のうちの１つ以上が欠如している。例えば、本開示で使用するためのアルファ−アミラーゼポリペプチドは、天然のアルファ−アミラーゼと比較してすべてのＮ−グリコシル化部位が欠如している場合があるか、または本開示で使用するためのアルファ−アミラーゼポリペプチドは、天然のアルファ−アミラーゼと比較してグリコシル化が不十分である場合がある。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、１つ以上のＮ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化することが不可能な改変アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチド中の少なくとも１つの予測されるＮ−グリコシル化部位（すなわち、Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒのアミノ酸配列で表されるコンセンサス配列）のアスパラギン（Ａｓｎ）は、別のアミノ酸によって置換されている。いくつかの実施形態では、配列番号１の残基４１２及び／または４６１に対応するアミノ酸位置のアスパラギンは、別のアミノ酸によって置換されている。本開示は、本開示のアルファ−アミラーゼポリペプチドが１つ以上のＮ−グリコシル化部位を欠き、それゆえ、グリコシル化されていないか、または天然のアルファ−アミラーゼと比較してグリコシル化が不十分であるかのいずれかであるように、前述の例のうちのいずれか１つ以上を組み合わせることができることを企図する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化されていないか、または野生型アルファ−アミラーゼポリペプチドに存在するＯ−グリコシル化基のうちの１つ以上が欠如している。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、１つ以上のＯ−グリコシル化部位でＯ−グリコシル化することが不可能な改変アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチド配列における任意の１つ以上の予測されるＯ−グリコシル化部位のセリンまたはトレオニンは、置換されているかまたは欠失している。本開示は、本開示のアルファ−アミラーゼポリペプチドが１つ以上のＮ−グリコシル化部位及び／またはＯ−グリコシル化部位を欠き、それゆえ、グリコシル化されていないか、または天然のアルファ−アミラーゼと比較してグリコシル化が不十分であるかのいずれかであるように、前述の例のうちのいずれか１つ以上を組み合わせることができることを企図する。
【００４１】
本開示の特定の一実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、非タンパク質性ポリマーで修飾され得る。特定の一実施形態では、ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載されているような様式のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは、市販されているか、または当技術分野で周知の方法（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，１３８〜１６１ページ）に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる、周知の水溶性ポリマーである。
【００４２】
「生物活性」、「生理活性」または「機能的な」という用語は、野生型成熟アルファ−アミラーゼポリペプチドに伴う機能を果たすアルファ−アミラーゼポリペプチドの能力、例えば、アルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解活性またはポリグルコサンを加水分解する能力を意味する。「生物活性」、「生理活性」及び「機能的な」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用する場合、「断片」は本明細書に記載の「生理活性」を示す生理活性断片（機能的断片とも称される）または生理活性変異体を含むと理解される。すなわち、アルファ−アミラーゼの生理活性断片または生理活性変異体は、測定及び試験することが可能な生理活性を示す。例えば、生理活性断片／機能的断片または変異体は、天然（すなわち、野生型もしくは正常）のアルファ−アミラーゼポリペプチドと同じか、または実質的に同じ生理活性を示し、そのような生理活性を、断片または変異体の能力、例えば、炭水化物中のアルファ−１，４−グルコシド結合を加水分解する能力によって評価することができる。本明細書で使用する場合、「実質的に同じ」とは、パラメータが測定される対照の少なくとも７０％である任意のパラメータ（例えば、活性）を指す。特定の実施形態では、「実質的に同じ」とは、パラメータが測定される対照の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０２％、１０５％、または１１０％である任意のパラメータ（例えば、活性）も指す。特定の実施形態では、成熟アルファ−アミラーゼポリペプチドの断片または変異体は、同じか、または実質的に同じ条件下で評価したときに、天然の成熟アルファ−アミラーゼポリペプチドに伴うアルファ−アミラーゼ生物活性を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％保持することが好ましい。
【００４３】
特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドの断片または変異体は、天然タンパク質の半減期（ｔ１／２）と比較して半減期が向上している。アルファ−アミラーゼ断片または変異体の半減期は、天然のアルファ−アミラーゼポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはさらには１０００％向上するのが好ましい。いくつかの実施形態では、タンパク質の半減期は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば緩衝生理食塩水中でまたは血清中で測定される。他の実施形態では、タンパク質の半減期はｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、例えば、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期である。さらに、断片または変異体は、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学作用などの、当該技術分野で既知の技術を使用して化学的に合成することができる。断片または変異体を、（組換えによりまたは化学合成により）生成することができ、天然のアルファ−アミラーゼポリペプチドと同程度にまたは実質的に同様に機能できるこれらの断片または変異体を同定するために試験することができる。
【００４４】
細胞におけるアルファ−アミラーゼの生理活性を増加させる方法に関して、本開示は、前述の任意の態様及び実施形態のすべての組み合わせ、ならびに発明を実施するための形態及び実施例に記載される任意の実施形態の組み合わせを企図する。キメラポリペプチドを投与することまたはキメラポリペプチドを細胞に接触させることに基づく記載されている方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞もしくは培養液において）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、患者もしくは動物モデルにおいて）で実施することができる。特定の実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。特定の実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ法である。
【００４５】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されている前述のキメラポリペプチドのいずれかを生成する方法も提供する。さらに、本開示は、前述の方法及び組成物の任意の数の組み合わせを企図する。
【００４６】
特定の態様では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、１つ以上の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であり得る。そのような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、及び免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティー精製を目的として、グルタチオンコンジュゲートレジン、アミラーゼコンジュゲートレジン、及びニッケルコンジュゲートレジンまたはコバルトコンジュゲートレジンなどのアフィニティークロマトグラフィーに関連するマトリックスが使用される。融合ドメインはまた、「エピトープタグ」を含み、これは、一般に特定の抗体で利用可能な短いペプチド配列である。特定のモノクローナル抗体で容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、Ｈｉｓタグ及びｃ−ｍｙｃタグが含まれる。例示的なＨｉｓタグは、配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）を有し、例示的なｃ−Ｍｙｃタグは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号１６）を有する。場合によっては、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有し、これにより、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって組換えタンパク質をそこから遊離させることができる。次に、遊離したタンパク質を、後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、ポリペプチドを安定化させることのできる１つ以上の改変を含み得る。例えば、そのような改変は、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を向上させ、ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、またはポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。
【００４７】
前述のいずれかの特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドのアルファ−アミラーゼ部分は、アルファ−アミラーゼポリペプチドを含み、これは、特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドの機能的断片であるか、または実質的に完全長のアルファ−アミラーゼポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、最Ｎ末端のアミノ酸位置においてメチオニンを欠いている（例えば、配列番号３６または配列番号４４のいずれかの最初のアミノ酸においてメチオニンを欠いている）。本開示のキメラポリペプチド及び方法において使用するための好適なアルファ−アミラーゼポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価されたアルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解活性を有する。例示的な機能的断片は、完全長アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、配列番号３６または配列番号４４）の連続したアミノ酸残基を、少なくとも１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個、または５１１個含む。いくつかの実施形態では、機能的断片は、完全長アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、配列番号３６または配列番号４４）の連続したアミノ酸を、１００〜１５０個、１００〜２００個、１００〜２５０個、１００〜３００個、１００〜４００個、１００〜５００個、１００〜５１１個、２００〜５００個、３００〜５００個、４００〜５００個、４５０〜５００個、４７５〜５００または５００〜５１１個含む。同様に、特定の実施形態では、本開示は、アルファ−アミラーゼ部分が前述のいずれかのアルファ−アミラーゼポリペプチドまたは生理活性断片の変異体であるキメラタンパク質を企図する。例示的な変異体は、天然のアルファ−アミラーゼポリペプチドまたはその機能的断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、そのような変異体は、アルファ−アミラーゼ変異体のアルファ−１，４−グルコシド結合の加水分解活性を保持する。本開示は、アルファ−アミラーゼ部分が、本明細書に記載の任意の内在化モイエティと組み合わされた本明細書に記載のアルファ−アミラーゼポリペプチド、断片または変異体のいずれかを含む、キメラポリペプチド及びそのようなポリペプチドの使用を企図する。さらに、特定の実施形態では、前述のキメラポリペプチドのいずれかのアルファ−アミラーゼ部分は、特定の実施形態では、融合タンパクによる。アルファ−アミラーゼ部分と内在化モイエティ部分との任意の組み合わせを含み、所望により１つ以上のリンカー、１つ以上のタグなどを含むそのようなキメラポリペプチドのいずれも、本開示の方法のいずれかで使用することができる。
【００４８】
酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチド（または本開示の方法において使用するためのキメラポリペプチド）の非内在化モイエティポリペプチド部分は、酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドである。換言すれば、特定の実施形態では、酸性アルファ−グルコシダーゼ含有キメラポリペプチドが提供される。本開示の方法及び組成物において使用するための例示的な酸性アルファ−グルコシダーゼ（例えば、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ）ポリペプチドが、本明細書にて提供される。いくつかの実施形態では、酸性アルファ−グルコシダーゼ（例えば、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ）ポリペプチドは、罹患細胞において、過剰グリコーゲンの除去に有用である。いくつかの実施形態では、罹患細胞は、ポリグルコサン蓄積症（例えば、非中枢神経系（ＣＮＳ）ポリグルコサン蓄積症）を有する対象の細胞である。いくつかの実施形態では、罹患細胞は、糖原病またはグリコーゲン代謝異常症を有する対象の細胞である。いくつかの実施形態では、罹患細胞は、ポンペ病、アンダーセン病、フォン・ギールケ病、ラフォラ病、フォーブス・コリ病、ダノン病、アルツハイマー病、ＰＲＫＡＧ２関連心筋症（ＰＡＣ）、ＧＳＤ  ＶＩＩ、ＧＳＤ  ＸＶ、またはＲＢＣＫ１欠損症を有する対象に由来する細胞である。いくつかの実施形態では、罹患細胞は、ダノン病を有する対象に由来する細胞である。他の実施形態では、罹患細胞は、ＰＡＣを有する対象に由来する細胞である。さらに他の実施形態では、罹患細胞は、ラフォラ病を有する対象に由来する細胞である。
【００４９】
成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドは、低ｐＨ（すなわち、リソソームもしくはオートファジー液胞のｐＨ）の条件下であろうと、または中性ｐＨ（すなわち、細胞質のｐＨ）の条件下であろうと、完全長の前駆体ＧＡＡと比較してグリコーゲンクリアランスが向上していることが示されている（Ｂｉｊｖｏｅｔ，ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，７（１１）：１８１５−２４）。さらに、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼは、低ｐＨで至適活性を有するリソソームタンパク質であるが、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼは、中性ｐＨ（すなわち、細胞質のｐＨ）でおよそ４０％の活性を保持する（Ｍａｒｔｉｎ−Ｔｏｕａｕｘ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１１（１４）：１６３７−４５）。したがって、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼを含む酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドは細胞質送達に適しており、ゆえに、細胞質のグリコーゲン蓄積に対処するのに適している。
【００５０】
本明細書で使用する場合、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドは、変異体、特に、タンパク質の成熟した活性形態（活性のある約７６ｋＤａもしくは約７０ｋＤａの形態または代替の開始残基及び／または終了残基を有する類似の形態であり、「成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ」または「成熟ＧＡＡ」と総称される）を含む。「成熟ＧＡＡ」という用語は、内因的にプロセシングされたときに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が約７０ｋＤａ〜約７６ｋＤａである、未成熟ＧＡＡタンパク質のその部分に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに代替の開始残基及び／または終了残基を有する類似のポリペプチドを指す。本開示のコンジュゲートは、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含み、特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、シグナル配列（配列番号４５もしくは配列番号４６のアミノ酸１〜２７、または配列番号４５もしくは配列番号４６のアミノ酸１〜５６によって示される配列）を欠いている。例示的な成熟ＧＡＡポリペプチドには、配列番号４５もしくは配列番号４６の残基１２２〜７８２、配列番号４５もしくは配列番号４６の残基１２３〜７８２、または配列番号４５もしくは配列番号４６の残基２０４〜７８２を有するポリペプチドが含まれる。「成熟ＧＡＡ」という用語は、内在性の成熟タンパク質と同じかまたは実質的に同じ方法でグリコシル化され、したがって、予測される分子量と同じかまたは類似の分子量を有するポリペプチドを含む。この用語はまた、ポリペプチドであって、同じ一次アミノ酸配列を含むにもかかわらず、それらポリペプチドの見かけの分子量が異なるように、グリコシル化されていないかまたは高グリコシル化されているポリペプチドを含む。そのような成熟ＧＡＡポリペプチドの変異体またはアイソフォーム、機能的断片または変異体、融合タンパク質、及び改変形態のいずれも、天然の成熟ＧＡＡタンパク質に対して実質的に配列同一性であるアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、酵素活性を保持する。
【００５１】
特定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドの機能的断片、変異体、または融合タンパク質は、配列番号４７または配列番号４８の一方または両方に記載されている成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号４５もしくは配列番号４６の残基１２２〜７８２、配列番号４５もしくは配列番号４６の残基１２３〜７８２、または配列番号４５もしくは配列番号４６の残基２０４〜７８２のうちの１つ以上に対応する成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である。特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドの機能的断片、変異体、または融合タンパク質は、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１のいずれか１つに記載されている成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、非ヒト種、例えばマウス、ラット、イヌ、ゼブラフィッシュ、ブタ、ヤギ、雄ウシ、ウマ、サルまたは類人猿に由来するＧＡＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＧＡＡタンパク質は、成熟形態であるが完全長形態ではない、配列番号５２のアミノ酸配列を有するウシＧＡＡタンパク質を含む。
【００５２】
ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含む（例えば、異種薬剤は成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドである）。成熟ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡの７６ｋＤａもしくは７０ｋＤａの形態、または代替の開始残基及び／または終了残基を使用する類似の形態であり得る。Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ａｃｉｄ  ａ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８０（８）：６７８０−６７９１，２００５）に記載されているように、ＧＡＡのプロセシングされた形態に使用される名称は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した見かけの分子量に基づく。いくつかの実施形態では、成熟ＧＡＡは、通常、小胞体でグリコシル化されるＮ末端部位を欠いている場合がある。例示的な成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４７または配列番号４８を含む。さらなる例示的な成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４５もしくは配列番号４６の残基１２２〜７８２、配列番号４７に見られるような配列番号４５もしくは配列番号４６の残基１２３〜７８２、配列番号４５もしくは配列番号４６の残基２０４〜７８２、配列番号４５もしくは配列番号４６の残基２０６〜７８２、配列番号４８に見られるような配列番号４５もしくは配列番号４６の残基２８８〜７８２について対応するアミノ酸配列を含み得るか、またはこれらから構成され得る。成熟ＧＡＡポリペプチドはまた、上述のＮ末端残基及びまたはＣ末端残基を有し得る。
【００５３】
特定の実施形態では、コンジュゲートは、完全長ＧＡＡポリペプチドを含まないが、成熟ＧＡＡポリペプチド及び少なくとも完全長ＧＡＡポリペプチドの一部を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートは、ＧＡＡポリペプチドを含むが、配列番号４５または配列番号４６の残基１〜５６を含まない。特定の実施形態では、コンジュゲートは、ＧＡＡポリペプチドを含むが、配列番号４５または配列番号４６の残基１〜５６を含まない。特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体を含まない。これらはすべて、本開示の異種薬剤の例、具体的には、異種薬剤が成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドである実施形態の例である。
【００５４】
特定の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートのＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号４５に記載のＧＡＡ翻訳産物を含まないＧＡＡの成熟形態を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチド及びコンジュゲートのいずれも、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜２７または１〜５６に対応する隣接アミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ完全リンカー領域（配列番号５３）の少なくとも一部を欠き、この完全リンカー領域は、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸５７〜７８に対応する。特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６０に対応する隣接アミノ酸配列を含まない（例えば、ＧＡＡポリペプチドは配列番号４９のアミノ酸配列を含む）。他の実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６６に対応する隣接アミノ酸配列を含まない（例えば、ＧＡＡポリペプチドは配列番号５０のアミノ酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６９に対応する隣接アミノ酸配列を含まない（例えば、ＧＡＡポリペプチドは配列番号５１のアミノ酸配列を含む）。他の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、グリコシル化されている場合もあれば、グリコシル化されていない場合もある。グリコシル化されているＧＡＡポリペプチドについては、グリコシル化パターンは、天然起源のヒトＧＡＡのものと同じである場合もあれば、異なっている場合もある。前駆体ＧＡＡタンパク質上の１つ以上のグリコシル化部位は、最終的な成熟ＧＡＡコンストラクトでは除去され得る。さらなる例示的なＧＡＡポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１のいずれか１つに対応するアミノ酸配列を含み得るか、またはこれらから構成され得る。
【００５５】
特定の実施形態では、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドは、ヒトである。
【００５６】
「生物活性」、「生理活性」または「機能的な」という用語は、野生型ＧＡＡタンパク質に伴う機能を果たすＧＡＡポリペプチドを含むコンジュゲートの能力、例えば、グリコーゲン（例えば、リソソームのグリコーゲン）のａ−１，４−グリコシド結合及びａ−ｌ，６−グリコシド結合を加水分解する能力を意味する。「生物活性」、「生理活性」及び「機能的な」という用語は、本明細書では互換的に使用される。特定の実施形態では、生物活性は、グリコーゲンを加水分解する能力を含む。他の実施形態では、生物活性は、リソソーム及び／または細胞質のグリコーゲンの濃度を低下させる能力である。さらに他の実施形態では、コンジュゲートは、ダノン病、ラフォラ病及び／または他のポリグルコサン蓄積症（例えば、ＰＡＣ）に伴う症状を処置する能力を有する。本明細書で使用する場合、「断片」は本明細書に記載の「生理活性」を示す生理活性断片（機能的断片とも称される）または生理活性変異体を含むと理解される。すなわち、成熟ＧＡＡの生理活性断片または生理活性変異体は、測定及び試験することが可能な生理活性を示す。例えば、生理活性断片／機能的断片または変異体は、天然（すなわち、野生型もしくは正常）のＧＡＡタンパク質と同じか、または実質的に同じ生理活性を示し、そのような生理活性を、断片または変異体の能力、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでグリコーゲンを加水分解する能力によって評価することができる。本明細書で使用する場合、「実質的に同じ」とは、パラメータが測定される対照の少なくとも７０％である任意のパラメータ（例えば、活性）を指す。特定の実施形態では、「実質的に同じ」とは、同じか、または実質的に同じ条件下で評価したときに、パラメータが測定される対照の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０２％、１０５％、または１１０％である任意のパラメータ（例えば、活性）も指す。特定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドの断片または変異体は、同じか、または実質的に同じ条件下で評価したときに、天然のＧＡＡポリペプチドに伴うＧＡＡ生物活性を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％保持することが好ましい。
【００５７】
特定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドの断片または変異体は、天然タンパク質の半減期（ｔ１／２）と比較して半減期が向上している。成熟ＧＡＡ断片または変異体の半減期は、同じか、または実質的に同じ条件下で評価したときに、天然のＧＡＡタンパク質の半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはさらには１０００％向上するのが好ましい。いくつかの実施形態では、タンパク質の半減期は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば緩衝生理食塩水中でまたは血清中で測定される。他の実施形態では、タンパク質の半減期はｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、例えば、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期である。さらに、断片または変異体は、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学作用などの、当該技術分野で既知の技術を使用して化学的に合成することができる。断片または変異体を、（組換えによりまたは化学合成により）生成することができ、天然のＧＡＡタンパク質と同程度にまたは実質的に同様に機能できるこれらの断片または変異体を同定するために試験することができる。
【００５８】
特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティとを含むコンジュゲートは、マンノース−６−リン酸受容体（ＭＰＲ）を阻害する薬剤の存在下で、細胞質内などの細胞内に進入することができる。
【００５９】
細胞におけるＧＡＡの生理活性を増加させる方法に関して、本開示は、前述の任意の態様及び実施形態のすべての組み合わせ、ならびに発明を実施するための形態及び実施例に記載される任意の実施形態の組み合わせを企図する。コンジュゲートを投与することまたはコンジュゲートを細胞に接触させることに基づく記載されている方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞もしくは培養液において）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、患者もしくは動物モデルにおいて）で実施することができる。特定の実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。特定の実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ法である。
【００６０】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されている前述のいずれかのコンジュゲートを生成する方法も提供する。さらに、本開示は、前述の方法及び組成物の任意の数の組み合わせを企図する。
【００６１】
特定の態様では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、１つ以上の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であり得る。そのような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、及び免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティー精製を目的として、グルタチオンコンジュゲートレジン、アミラーゼコンジュゲートレジン、及びニッケルコンジュゲートレジンまたはコバルトコンジュゲートレジンなどのアフィニティークロマトグラフィーに関連するマトリックスが使用される。融合ドメインはまた、「エピトープタグ」を含み、これは、一般に特定の抗体が利用可能な短いペプチド配列である。特定のモノクローナル抗体で容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、Ｈｉｓタグ及びｃ−ｍｙｃタグが含まれる。例示的なＨｉｓタグは、配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）を有し、例示的なｃ−Ｍｙｃタグは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号１６）を有する。そのようなタグまたは融合体のいずれも、コンジュゲートの成熟ＧＡＡ部分に付加することができるか、またはコンジュゲートの内在化モイエティ部分に付加することができるか、またはその両方であることが認識されている。特定の実施形態では、コンジュゲートは、コンジュゲートのＮ末端（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内）に「ＡＧＩＨ」部分（配列番号２５）を含み、そのようなコンジュゲートは、１つ以上のエピトープタグの存在下または非存在下で提供され得る。さらなる実施形態では、コンジュゲートは、ポリペプチドの最Ｎ末端位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ポリペプチドのＮ末端（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内）に「ＳＡＧＩＨ」（配列番号２６）部分を含み、そのようなコンジュゲートは、１つ以上のエピトープタグの存在下または非存在下で提供され得る。
【００６２】
場合によっては、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有し、これにより、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって組換えタンパク質をそこから遊離させることができる。次に、遊離したタンパク質を、後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。特定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、ポリペプチドを安定化させることのできる１つ以上の改変を含み得る。例えば、そのような改変は、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を向上させ、ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、またはポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であり得る。
【００６４】
前述のいずれかの特定の実施形態では、コンジュゲートのＧＡＡ部分は、ＧＡＡの成熟形態のうちの１つ、例えば、７６ｋＤａの断片、７０ｋＤａの断片、代替の開始部位及び／または終了部位を使用する類似の形態、またはその機能的断片を含む。特定の実施形態では、そのような成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能的断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価されたグリコーゲンを加水分解する能力を保持する。さらに、特定の実施形態では、そのような成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能的断片を含むコンジュゲートは、グリコーゲンを加水分解することができる。例示的な生理活性断片は、完全長成熟ＧＡＡポリペプチドの、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個、少なくとも２２５個、少なくとも２３０個、少なくとも２５０個、少なくとも２６０個、少なくとも２７５個、または少なくとも３００個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートのＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号４５に記載のＧＡＡポリペプチドを含まないＧＡＡの成熟形態を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ完全リンカー領域（配列番号５３）の少なくとも一部を欠き、この完全リンカー領域は、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸５７〜７８に対応する。特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６０に対応する隣接アミノ酸配列を含まない。他の実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６６に対応する隣接アミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６９に対応する隣接アミノ酸配列を含まない。
【００６６】
特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６０に対応する隣接アミノ酸配列を含まない（例えば、コンジュゲートは配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６０を含まない）。他の実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６６に対応する隣接アミノ酸配列を含まない（例えば、コンジュゲートは、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６０または１〜６６に対応する隣接アミノ酸配列を含まない）。いくつかの実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６９に対応する隣接アミノ酸配列を含まない（例えば、コンジュゲートは、配列番号４５または配列番号４６のアミノ酸１〜６０または１〜６６または１〜６９に対応する隣接アミノ酸配列を含まない）。本明細書にて記載される好適な組み合わせが、具体的に企図される。
【００６７】
特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸６１〜９５２に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号４５のアミノ酸６１〜９５２を含み、配列番号４５のアミノ酸１〜６０に対応する隣接アミノ酸配列を含まない。特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸６７〜９５２に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号４５のアミノ酸６７〜９５２を含み、配列番号４５のアミノ酸１〜６０に対応する隣接アミノ酸配列を含まず、特定の実施形態では、配列番号４５のアミノ酸１〜６６に対応する隣接アミノ酸配列を含まない。特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸７０〜９５２に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号４５のアミノ酸７０〜９５２を含み、配列番号４５のアミノ酸１〜６０に対応する隣接アミノ酸配列を含まず、特定の実施形態では、配列番号４５のアミノ酸１〜６６に対応する隣接アミノ酸配列を含まず、または特定の実施形態では、配列番号４５のアミノ酸１〜７０に対応する隣接アミノ酸配列を含まない。成熟ＧＡＡを含むあらゆるそのようなＧＡＡポリペプチドを含むコンジュゲートを使用して、ＧＡＡ活性を細胞に送達することができる。
【００６８】
特定の実施形態では、本開示は、成熟ＧＡＡ部分が前述の成熟ＧＡＡポリペプチドまたは機能的断片のいずれかの変異体であるコンジュゲートを企図する。例示的な変異体は、天然のＧＡＡポリペプチドまたはその生理活性断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、そのような変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価されたグリコーゲンを加水分解する天然のＧＡＡの能力を保持する。本開示は、ＧＡＡ部分が、本明細書に記載の任意の内在化モイエティと組み合わされた本明細書に記載の成熟ＧＡＡポリペプチド、形態、または変異体のいずれかを含む、コンジュゲート及びそのようなタンパク質の使用を企図する。さらに、特定の実施形態では、前述のコンジュゲートの成熟ＧＡＡ部分のいずれかは、特定の実施形態では、融合タンパク質であり得る。ＧＡＡ部分と内在化モイエティ部分との任意の組み合わせを含み、所望により１つ以上のリンカー、１つ以上のタグなどを含むそのようなコンジュゲートのいずれも、本開示の方法のいずれかで使用することができる。
【００６９】
ＩＩ．内在化モイエティ
本明細書で使用する場合、「内在化モイエティ」という用語は、モイエティが標的組織型または標的細胞型中に内在化されるように、標的組織型または標的細胞型と相互作用することができるポリペプチド／タンパク質を指す。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「本開示の抗体または抗原結合断片」は、本明細書にて提供される抗体及び抗原結合断片のうちのいずれか１つ以上を指す。本開示の抗体及び抗原結合断片は、重鎖可変ドメインを含む重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含む。ＶＨドメインは、本明細書にて提供されるＣＤＲのいずれかのような、ならびにＫａｂａｔ及び／またはＩＭＧＴシステムによって定義または同定されるような３つのＣＤＲを含む。これらのＣＤＲは通常、フレームワーク領域（ＦＲ）に散在しており、ともにＶＨドメインを構成する。同様に、ＶＬは、本明細書にて提供されるＣＤＲのいずれかのような、ならびにＫａｂａｔ及び／またはＩＭＧＴシステムによって定義されるような３つのＣＤＲを含む。これらのＣＤＲは通常、フレームワーク領域（ＦＲ）に散在しており、ともにＶＬドメインを構成する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４などのＦＲ領域は、ＫａｂａｔまたはＩＭＧＴシステムによって同様に定義または同定することができる。本出願全体を通じて、ＣＤＲがＫａｂａｔまたはＩＭＧＴシステムによって同定または定義されていると示されている場合、そのＣＤＲがそのシステムに準拠していることを意味する（例えば、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲまたはＩＭＧＴ  ＣＤＲ）。これらの用語のいずれも、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲまたはＩＭＧＴ  ＣＤＲのどちらが参照されているかを示すために使用することができる。
【００７１】
本開示は、抗体または抗原結合断片が、本明細書にて提供されるＶＨドメインと本明細書にて提供されるＶＬドメインとのあらゆる組み合わせを含み得ることを企図する。特定の実施形態では、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインのうちの少なくとも１つがヒト化されている（合わせて、本開示の抗体または抗原結合断片）。キメラ抗体も含まれる。本開示の抗体または抗原結合断片はいずれも、単独で提供され得る。他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片はいずれも、異種薬剤に会合したコンジュゲートとして提供され得る。ポリペプチド、ペプチド、小分子（例えば、化学療法薬小分子）、またはポリヌクレオチドを含み得る異種薬剤の非限定的な例が、本明細書にて提供される。コンジュゲートとは、異種薬剤に会合した抗体または抗原結合断片を指し得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、単離及び／または精製されている。単離または精製された形態で提供されるものを含む、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合断片のいずれも、１つ以上の薬学的及び／または生理学的に許容可能な担体及び／または賦形剤とともに製剤化された抗体もしくは抗原結合断片を含む組成物などの組成物として提供され得る。組成物（例えば、医薬組成物）を含む、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片のいずれも、本明細書に記載の方法のいずれかで使用することができ、所望により、異種薬剤にコンジュゲートさせて（例えば、相互連結させて、会合させて）提供することができる。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、標的組織型または標的細胞型と相互作用して、異種薬剤の細胞への送達をもたらす（すなわち、所望の細胞を透過する；細胞膜を通過して輸送する；細胞膜を通過して少なくとも細胞質に送達する）ことができる。そのようなコンジュゲートは、同様に組成物として提供することができ、本明細書に記載の方法のいずれかで使用することができる。
【００７３】
一般に、限定的な交差反応性を有する内在化モイエティが好ましい。特定の実施形態では、本開示は、必ずしも排他的ではないが、選択的に、筋細胞、肝細胞及び／または神経細胞を標的としこれらを透過する内在化モイエティに関する。特定の実施形態では、内在化モイエティは限定的な交差反応性を有し、したがって特定の細胞型または組織型を優先的に標的とする。しかしながら、本開示の内在化モイエティは、特定の細胞型のみを標的とするわけではないことを理解されたい。どちらかと言えば、内在化モイエティは、１つ以上の特定の細胞型への送達を他の細胞型よりも優先的に促進し、これにより、遍在的ではない送達をもたらす。特定の実施形態では、好適な内在化モイエティには、例えば、抗体、モノクローナル抗体、もしくは誘導体またはそれらの類似体が含まれる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＥＮＴ２輸送体を介して細胞膜を横切る通過を媒介する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、キメラポリペプチドが効果的かつ効率的に細胞膜を通過するのを補助する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシド（ＥＮＴ）輸送体を介して細胞膜を通過する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４輸送体を介して細胞膜を通過する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシド輸送体２（ＥＮＴ２）及び／またはＥＮＴ３輸送体を介して細胞膜を通過する。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、筋細胞（例えば、心筋細胞もしくは横隔膜筋細胞）、肝細胞、皮膚細胞または神経細胞（例えば、脳細胞）への送達を促進する。前述のいずれかに関して、特定の実施形態では、内在化モイエティは細胞質に内在化される。特定の実施形態では、内在化モイエティは核またはリソソームに内在化される。
【００７４】
特定の実施形態では、内在化モイエティはＤＮＡに結合する抗体または抗体断片である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、本明細書に記載の抗体または抗体断片のいずれかである。換言すれば、特定の実施形態では、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合断片を含む抗体断片）は、ＤＮＡに結合する。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合能力は、二本鎖ＤＮＡ基質に対して測定される。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＤＮＡに結合し、ＥＮＴ２を介して細胞膜を通過することができる抗体または抗体断片である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＤＮＡバブルに結合する。
【００７５】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、キメラポリペプチドの細胞質への送達を促進する。特定の実施形態では、内在化モイエティは、アルファ−アミラーゼ活性を細胞へ送達する。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼ含有キメラポリペプチド（例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチドを含むかまたはアルファ−アミラーゼポリペプチドから構成される非内在化モイエティ部分）を含む。本明細書に記載の内在化モイエティのいずれかを、本明細書に記載されているように非内在化モイエティポリペプチド部分のいずれかと組み合わせて、本開示のキメラポリペプチドを作製することができる。
【００７６】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、ポリヌクレオチドに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＤＮＡに結合することができる抗体である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、またはさらには３０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。ＫＤは、現行の標準的な方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を使用して測定することができる。例として、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体または抗体断片を含む３Ｅ１０抗体または抗体断片は、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することが知られている。したがって、特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドに使用するための内在化モイエティは、細胞膜を通過して細胞質に入りＤＮＡに結合することができる抗体または抗体断片（例えば、抗原結合断片）である。
【００７７】
これは、抗ＤＮＡ抗体の例でもある。特定の実施形態では、本明細書で使用するための内在化モイエティは、抗ＤＮＡ抗体またはその抗原結合断片である。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗体断片などの本開示の内在化モイエティは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体のＶＨ及びＶＬを有する抗体またはｓｃＦｖまたはＦｖと比較して、より高い親和性で所与のＤＮＡ基質に結合する。特定の実施形態では、本開示の方法で使用するための内在化モイエティは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体のＶＨ及びＶＬを有する抗体または抗体断片ではない。いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための内在化モイエティは、マウス抗体または抗体断片ではない。
【００７８】
特定の態様では、内在化モイエティは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びヒト化抗体を含む抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、抗原結合断片を含む抗体断片（例えば、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体及びラクダ化抗体断片、ヒト化抗体及びヒト化抗体断片、ヒト抗体及びヒト抗体断片、ならびに前述の多価バージョンを含むがこれらに限定されない、抗体断片、誘導体またはそれらの類似体；Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体及びラクダ化抗体断片、ヒト化抗体及びヒト化抗体断片、ヒト抗体及びヒト抗体断片、ならびに前述の多価バージョンを含むがこれらに限定されない、多価内在化モイエティ；単一特異性または二重特異性抗体、例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）２断片）、ダイアボディ、トリボディもしくはテトラボディ（これらは通常、共有結合されているか、または他の方法で安定化されている（すなわち、ロイシンジッパーもしくはヘリックスで安定化された）ｓｃＦｖ断片である）を含むがこれらに限定されない、多価内在化モイエティ；所望の標的分子と天然に相互作用する受容体分子を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体またはその変異体はキメラであり得、例えば、それらはマウス３Ｅ１０抗体由来の可変重鎖領域または可変軽鎖領域を含み得るが、別の種（例えば、ヒト）の抗体由来の定常領域を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体またはその変異体は、いくつかの異なる抗体サブクラス定常ドメインのハイブリッドである定常領域（例えば、任意の種または種の組み合わせに由来するＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の任意の組み合わせ）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体またはその変異体（例えば、内在化モイエティ）は、次の定常ドメインスキーム：ＩｇＧ２ａ  ＣＨ１−ＩｇＧ１  ｈｉｎｇｅ−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３を含み、例えば、前述のいずれかは、ヒトＩｇＧまたはマウスＩｇＧであり得る。他の好適な組み合わせも企図される。他の実施形態では、抗体は完全長抗体を含み、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３は同じ定常ドメインサブクラス（例えば、ＩｇＧ１）に由来する。いくつかの実施形態では、抗体またはその変異体は、免疫グロブリンの定常ドメインの一部、例えば、次の定常ドメインスキーム：ＩｇＧ２ａ  ＣＨ１−ＩｇＧ１  上部ヒンジ、を含む抗体断片である（例えば、内在化モイエティは、抗原結合断片を含む抗体断片である；例えば、内在化モイエティは、抗原結合断片である）。いくつかの実施形態では、抗体またはその変異体は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む抗体断片である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、抗体またはその変異体は、カッパ定常ドメイン（例えば、Ｋｍ３アロタイプ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその変異体は、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列番号１２である配列を含む抗体断片である。天然のＩｇＧドメインと比較してエフェクター機能を低下させる及び／または生成を促進させるためのアミノ酸置換を含む重鎖定常ドメインは、（完全長抗体用または抗体断片用（例えば、抗原結合断片）のいずれであっても）抗体及び抗原結合断片の範囲内に含まれる。例えば、重鎖定常領域のヒンジまたはＣＨ２ドメイン内などの天然マウスまたは天然ヒト免疫グロブリン定常領域と比較した、重鎖における１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換。
【００８０】
特定の実施形態では、内在化モイエティは抗体を含み、重鎖はＶＨ領域、ならびにＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含む。特定の実施形態では、重鎖は、ＶＨ領域、ならびにＣＨ１ドメイン、及び所望により上部ヒンジを含む定常ドメインを含む。上部ヒンジは、例えば、ヒンジ領域の１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸残基を含み得る。特定の実施形態では、上部ヒンジはシステイン残基を含まない。特定の実施形態では、上部ヒンジは、Ｎ末端から天然のヒンジ配列に存在するシステインへと連続する残基を１つ以上含む。特定の実施形態では、重鎖は、ＣＨ領域、ならびにＣＨ１ドメイン及びヒンジを含む定常ドメインを含む。特定の実施形態では、ヒンジ（完全長抗体と抗体断片のどちらの一部として存在しているかを問わない）は、Ｋａｂａｔ位置２２２に対応する位置でのＣからＳへの置換（例えば、変異がＫａｂａｔ位置２２２に対応する位置である、ヒンジ内のＣ２２２Ｓ）を含む。換言すれば、特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｋａｂａｔ２２２に対応する位置のヒンジドメインに、システイン残基ではなくセリン残基を含む。特定の実施形態では、重鎖は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及び所望により、ＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置２９７に対応する位置でのＮからＱへの置換（例えば、変異がＫａｂａｔ位置２９７に対応する位置である、ＣＨ２ドメイン内のＮ２９７Ｑ）を含む。換言すれば、特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｋａｂａｔ位置２９７に対応する位置にアスパラギンではなくグルタミンを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、免疫グロブリンのＦｃ領域の全体または一部を含む。換言すれば、抗原結合部分に加えて、特定の実施形態では、内在化モイエティは、免疫グロブリンの重鎖定常領域の全体または一部（例えば、重鎖定常領域の１つまたは２つのポリペプチド鎖）を含む。知られているように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４つまたは５つのドメインで構成される。ドメインは、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）のように順番に命名されている。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンのクラス間で交差相同性を有し、例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡ及びＩｇＤのＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＭ及びＩｇＥのＣＨ３ドメインに相同である。本明細書で使用する場合、「免疫グロブリンＦｃ領域」という用語は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域またはヒンジャー（ｈｉｎｇｅｒ）の一部（例えば、上部ヒンジ）との組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、内在化モイエティは、軽鎖定常領域（ＣＬ）をさらに含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の内在化モイエティのいずれかのＦｃ部分は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発しないように改変されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、補体に結合しないように改変されている。特定の実施形態では、Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置２９７に対応する位置でのＮからＱへの置換（例えば、変異がＫａｂａｔ位置２９７に対応する位置である、ＣＨ２ドメイン内のＮ２９７Ｑ）を含む。換言すれば、特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｋａｂａｔ位置２９７に対応する位置にアスパラギンではなくグルタミンを含む。
【００８３】
一実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、γサブクラス２、γサブクラス３、またはγサブクラス４）である。免疫グロブリンの他のクラスである、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）及びＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用することができる。特定の結果を得るために、特定の免疫グロブリンクラス及びサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を選択することは、当業者のレベルの範囲内であるとみなされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡコンストラクトの一部は、好ましくは少なくともヒンジドメインの一部、好ましくは、ＦｃγのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのいずれかの相同ドメインの少なくとも一部を含む。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は、本開示の実施において有用であり得ると考えられる。一例は、上部ＣＨ２領域にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下したＦｃ変異体を生成することであろう（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学的技術を使用してそのようなコンストラクトを調製することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される内在化モイエティのいずれかは、重鎖アミノ酸配列及び／または軽鎖アミノ酸配列にコンジュゲートされたシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、Ｎ末端メチオニンを欠いている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかは、Ｎ末端メチオニンを欠いている。
【００８５】
いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、３Ｅ１０抗体配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）または３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの同じ標的）に結合する抗体の相補性決定領域を有する任意のペプチドまたは抗体様タンパク質である。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を使用して、ヒト化抗体またはヒト抗体を発現させることができる。そのようなヒト化は、部分的である場合もあれば、または完全である場合もある。
【００８６】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、モノクローナル抗体３Ｅ１０またはその抗原結合断片を含む。他の実施形態では、内在化モイエティは、抗体またはその抗原結合断片、例えば、本明細書に記載の抗原結合断片のいずれかを含む。例えば、抗体もしくはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体３Ｅ１０もしくは細胞透過性活性を保持したその変異体、または３Ｅ１０の抗原結合断片もしくは当該３Ｅ１０の変異体の抗原結合断片であり得る。さらに、抗体またはその抗原結合断片は、３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの同じ標的）に結合する抗体であるか、もしくは３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過性活性を有する抗体、またはそれらの抗原結合断片であり得る。これらは、ＥＮＴ２を介して細胞を通過することができる薬剤の例である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ポリヌクレオチドに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、二本鎖平滑ＤＮＡなどのＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、またはさらには３０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。ＫＤは、製造業者の指示及び現行の慣習に従って、ＳＰＲまたはＱＣＭまたはＥＬＩＳＡを使用して求められる。いくつかの実施形態では、ＫＤは蛍光偏光アッセイを使用して求められる。
【００８７】
特定の実施形態では、抗原結合断片は、ＦｖまたはそのｓｃＦｖ断片である。モノクローナル抗体３Ｅ１０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下で永続的に寄託されたハイブリドーマ３Ｅ１０より産生することができ、この抗体は、米国特許第７，１８９，３９６号に開示されている。この抗体は、ＤＮＡに結合することが示されている。それに加えて、またはその代わりに、３Ｅ１０抗体は、３Ｅ１０抗体の重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内で発現させることにより産生することができる。「３Ｅ１０抗体」または「モノクローナル抗体３Ｅ１０」という用語は、抗体を産生するために使用する方法にかかわらず、抗体を指すために使用される。同様に、３Ｅ１０の変異体または抗原結合断片を指す場合、そのような用語は、抗体が産生された方法に関係なく使用される。現時点で、３Ｅ１０は一般にハイブリドーマによっては産生されず、組換えにより産生される。したがって、本出願の文脈において、別途明記しない限り、３Ｅ１０抗体はハイブリドーマの配列を有するか、または配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン（これは、本明細書に記載のようにＡＴＣＣに寄託された３Ｅ１０抗体のものと比較して、アミノ酸置換を１つ有している）及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む抗体ならびにその抗体断片を指す。
【００８８】
内在化モイエティは、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の変異体、例えばｍＡｂ  ３Ｅ１０と同じ細胞透過特性を保持した３Ｅ１０の変異体、及びその有用性を向上させるために（例えば、特定の細胞型を標的とする能力の向上、細胞膜を透過する能力の向上、細胞ＤＮＡへ局在化する能力の向上、コンジュゲーションに好都合な部位など）、突然変異によって改変された変異体をさらに含み得る。そのような変異体には、１つ以上の保存的置換または非保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖及び／または定常領域（複数可）に導入されている変異体が含まれる。そのような変異体には、３Ｅ１０のヒト化型または３Ｅ１０変異体のヒト化型、特に本明細書にて提供されるように活性または有用性が向上したものが含まれる。いくつかの実施形態では、軽鎖または重鎖は、Ｎ末端またはＣ末端で改変され得る。同様に、前述の変異体の説明は、抗原結合断片に適用される。これらの抗体、変異体、または断片のいずれも、宿主細胞内のヌクレオチド配列（複数可）の発現によって組換えにより作製され得る。
【００８９】
モノクローナル抗体３Ｅ１０は、細胞を透過してタンパク質及び核酸を標的組織の細胞質空間または核空間に送達することが示されている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９９８  Ｏｃｔ；１１（５）：５３９−４６、Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｍａｒ；３９（１３）：７８３−９、Ｚａｃｋ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  Ｓｅｐ  １；１５７（５）：２０８２−８．）。さらに、３Ｅ１０のＶＨ及びＶｋ配列は、ヒト性のｚスコアがそれぞれ０．９４３及び−０．８８０であり、ヒト抗体に対して相同性が高い。したがって、Ｆｖ３Ｅ１０は、他の多くの既承認のヒト化抗体よりも少ない抗抗体反応を誘発することが予期される（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００７  ３６９，８５２−８６２）。３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ断片は、元のモノクローナル抗体のすべての細胞透過能力を備えており、カタラーゼ、ジストロフィン、ＨＳＰ７０、及びｐ５３などのタンパク質は、Ｆｖ３Ｅ１０へのコンジュゲーション後にそれらの活性を保持する（Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００６  Ｍａｙ  ９；１０８８（１）：１８７−９６、Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ｊｕｎ  １０；１９５（２）：２１１−９、Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．２００５  Ｆｅｂ；１３（２）：８１−７、Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｊｕｎ  １；１６４（１１）：６０２０−６、Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  Ｊｕｌ  ２０；２８２（２９）：２０７９０−３）。３Ｅ１０は、すべての哺乳動物に存在する抗体足場上に構築されている；マウス可変重鎖及び可変カッパ軽鎖。３Ｅ１０は、骨格筋及びがん細胞に特に豊富であるＥＮＴ２ヌクレオチド輸送体を介して細胞に進入することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、３Ｅ１０は無毒であることが示されている。（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｍａｒ；３９（１３）：７８３−９、Ｐｅｎｎｙｃｏｏｋｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１  Ｊａｎ  ２６；２８０（３）：９５１−９）。３Ｅ１０は、ＥＮＴ３を介して膜を通過することができる場合もある。
【００９０】
内在化モイエティは、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の突然変異体、例えばｍＡｂ  ３Ｅ１０と同じか、または実質的に同じ細胞透過特性を保持した３Ｅ１０の変異体、及びそれらの有用性を向上させるために（例えば、特定の細胞型を標的とする能力の向上、細胞膜を透過する能力の向上、細胞ＤＮＡへ局在化する能力の向上、結合親和性の向上など）、突然変異によって改変された変異体をさらに含み得る。そのような突然変異体には、１つ以上の保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖及び／または定常領域（複数可）に導入されている変異体が含まれる。多くのｍＡｂ  ３Ｅ１０の変異体が、例えば、米国特許第７，１８９，３９６号及びＷＯ２００８／０９１９１１で特性決定されており、それらの教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９１】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び／または配列番号１８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体もしくは抗原結合断片、またはそれらのヒト化変異体を含む。抗体または抗体断片の発現のためにシグナル配列が含まれる場合、そのシグナル配列は一般に切断され、完成したキメラポリペプチド中に存在しないことが理解される（例えば、シグナル配列は一般に切断され、タンパク質の産生中に一時的にのみ存在する）。そのような内在化モイエティは、特定の実施形態では、ＥＮＴ２を介して細胞を通過し、及び／またはＤＮＡに結合する。特定の実施形態では、本開示の方法で使用するための内在化モイエティ（またはそのような使用のための抗体もしくは抗原結合断片）は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体のＶＨ及びＶＬを有する抗体または抗体断片ではない。いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための内在化モイエティ（またはそのような使用のための抗体もしくは抗原結合断片）は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する抗体または抗体断片ではない。
【００９２】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、ポリヌクレオチドに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＤＮＡに結合（特異的に結合）することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、５０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、二本鎖平滑ＤＮＡに結合する抗体または抗原結合断片などの抗ＤＮＡ抗体である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、抗ＤＮＡ抗体または（その）抗原結合断片であり、ＫＤは、本明細書にて提供されるような二本鎖ＤＮＡ基質に対して評価される。
【００９３】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、配列番号１７及び配列番号１８を含む３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの抗原結合断片である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ（または他の抗原結合断片）を含み、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１８と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。３Ｅ１０変異体またはその断片は、内在化モイエティの機能を保持する。内在化モイエティがｓｃＦｖである場合、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、通常、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカーなどのリンカーを介して連結されている。ＶＨドメインは、ＶＬドメインに対してＮ末端である場合もあれば、その逆である場合もある。
【００９４】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＶＨ及びＶＬを含むＦａｂなどの抗原結合断片である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｆａｂ（またはＦａｂ’などの別の抗原結合断片）であり、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｆａｂ（またはＦａｂ’などの別の抗原結合断片）であり、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１８と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。本明細書に記載の我々のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、またはそれらの組み合わせは、同様に企図される。特定の実施形態では、内在化モイエティがＦａｂである場合、重鎖は、免疫グロブリン定常領域のＣＨ１ドメイン及び上部ヒンジを含む。特定の実施形態では、上部ヒンジは、天然免疫グロブリン定常領域と比較して、例えば、エフェクター機能を低下させるために、及び／またはシステインを除去する（例えば、ＣからＳ）ために置換を含む。特定の実施形態では、上部ヒンジはシステインを含まない。
【００９５】
特定の実施形態では、本開示の方法で使用するための内在化モイエティ（またはそのような使用のための抗体もしくは抗原結合断片）は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体のＶＨ及びＶＬを有する抗体または抗体断片ではない。いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための内在化モイエティ（またはそのような使用のための抗体もしくは抗原結合断片）は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを有する抗体または抗体断片ではない。
【００９６】
特定の実施形態では、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合断片）の定常ドメインは、ヒトＦｃドメインの全体または一部を含む。特定の実施形態では、内在化モイエティは完全長抗体であり、抗体の定常ドメインは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、定常ドメインは、天然免疫グロブリンと比較してエフェクター機能を低下させる１つ以上の置換を含む。場合により、特定の実施形態では、そのような定常ドメインは、例えばエフェクター機能を低下させるために、ヒンジ／またはＣＨ２ドメインなどの重鎖定常ドメインに１つ以上の置換（例えば、１つの置換、２つの置換、３つの置換）の置換を含み得る。そのような置換は当該技術分野で知られている。
【００９７】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、抗原結合断片、すなわち、抗原結合断片を含む抗体の断片である。好適なそのような抗体の断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’などは、本明細書に記載されている。特定の実施形態では、内在化モイエティは、抗原結合断片または完全長抗体である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、定常領域を含む軽鎖（ＣＬ）を含む。特定の実施形態では、内在化モイエティは、定常領域を含む重鎖を含み、この定常領域は、ＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態では、内在化モイエティは、定常領域を含む重鎖及び定常領域を含む軽鎖を含み、この重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインを含む。場合により、内在化モイエティは、ヒンジの全体または一部（例えば、上部ヒンジまたは上部ヒンジより大きい部分）を含む重鎖定常領域をさらに含み得る。場合により、内在化モイエティは、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインを含む重鎖をさらに含み得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、３Ｅ１０抗体のＣＤＲのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、内在化モイエティは、配列番号１７と同一であるＶＨドメインのアミノ酸配列、及び配列番号１８と同一であるＶＬドメインのアミノ酸配列を含む、３Ｅ１０抗体のＣＤＲのうちの１つ以上を含む。３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、当該技術分野で利用可能なＣＤＲ同定スキームのいずれかを使用して決定され得る。例えば、いくつかの実施形態では、３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＫａｂａｔ定義に従って定義される。他の実施形態では、３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ．３４２：８７７−８８３に従って定義される。他の実施形態では、３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、ＬｅＦｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：５５−７７に記載の国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）に従って定義される。他の実施形態では、３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，２００１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７−６７０に従って定義される。いくつかの実施形態では、３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｋｕｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．８（２）：ｅ１００２３８８で論じられているＣＤＲ同定スキームのいずれかに従って定義される。当該技術分野で既知のＣＤＲ同定スキームのいずれかに従ってＣＤＲを同定する目的で３Ｅ１０抗体の残基を付番するために、抗体配列の相同性領域で、選択したＣＤＲ同定スキームに対する当該技術分野で既知の「標準」付番された配列に３Ｅ１０抗体をアラインさせることができる。フレームワーク残基の最大アラインメントは、Ｆｖ領域に使用するために付番システムに「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。さらに、任意の所与の部位番号における特定の個々の残基の同一性は、種間または対立遺伝子の分岐により、抗体鎖ごとに異なる場合がある。
【００９９】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ同定スキームを使用して決定された３Ｅ１０のＣＤＲを少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ含む（例えば、配列番号１９〜２４に記載のＣＤＲ；内在化モイエティは、配列番号１９〜２１にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖ならびに配列番号２２〜２４にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片である；例えば、及び内在化モイエティにおけるこれらのＣＤＲはＫａｂａｔスキームを使用して決定されたものである）。他の実施形態では、内在化モイエティは、ＩＭＧＴ同定スキームを使用して決定された３Ｅ１０のＣＤＲを少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ含む（例えば、配列番号２７〜３２に記載のＣＤＲ；内在化モイエティは、配列番号２７〜２９にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖ならびに配列番号３０〜３２にそれぞれ記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片である；例えば、及び内在化モイエティにおけるこれらのＣＤＲはＩＭＧＴ同定スキームを使用して決定されたものである）。特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ同定スキームを使用して決定された３Ｅ１０の６つすべてのＣＤＲを含む（例えば、配列番号１９〜２４を含む）。他の実施形態では、内在化モイエティは、ＩＭＧＴ同定スキームを使用して決定された３Ｅ１０の６つすべてのＣＤＲ（例えば、配列番号２７〜３２として示されているＣＤＲ）を含む。前述のいずれかに関して、特定の実施形態では、内在化モイエティは、３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの同じ標的）に結合する抗体であり、及び／または内在化モイエティは、抗原への結合について３Ｅ１０と競合する。例示的な内在化モイエティは、ＥＮＴ２を介して細胞を標的化し、細胞を通過する。例示的な内在化モイエティは、二本鎖平滑ＤＮＡなどのＤＮＡに結合する抗体または抗原結合断片を含む。
【０１００】
特定の実施形態では、抗体断片を含む内在化モイエティ及び抗体断片は、ＦａｂまたはＦａｂ’などの抗原結合断片を含む。換言すれば、特定の実施形態では、内在化モイエティはＦａｂまたはＦａｂ’を含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、二本鎖平滑ＤＮＡなどのＤＮＡ基質への結合について、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下で永続的に寄託されたハイブリドーマ３Ｅ１０より産生された抗体の抗体（または抗原結合断片）と競合する。
【０１０２】
抗体またはその断片（例えば、ＶＨ−リンカー−ＶＬもしくはＶＬ−リンカー−ＶＨによってコードされる一本鎖Ｆｖ断片またはＦａｂ）は当該技術分野で周知である。特にｍＡｂ  ３Ｅ１０抗体断片の組換え産生の方法は、ＷＯ２００８／０９１９１１に記載されている。さらに、抗体またはＦａｂのｓｃＦｖ断片を作製する方法は、当該技術分野で周知である。抗体または抗体断片を組換えにより産生する場合、リンカーを使用することができる。例えば、柔軟性のあるタンパク質領域の典型的な表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒが含まれる。１つの例示的なリンカーは、配列番号６、配列番号１３、または配列番号１４に提供されている。Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むアミノ酸配列の順列は、リンカー配列のための基準（例えば、最小限の疎水性または荷電特性を備え柔軟性がある）を満たすことが予期される。別の例示的なリンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｎのものであり、式中、ｎは１〜１０の整数、例えば２、３、または４である。他の中性に近いアミノ酸、例えば、Ｔｈｒ及びＡｌａもリンカー配列に使用することができる。
【０１０３】
例えば、ｓｃＦｖの部分を相互連結するリンカーに加えて、本開示は、例えば、キメラポリペプチドの抗体部分にアルファ−アミラーゼ部分を相互連結させるための追加のリンカーの使用を企図する。
【０１０４】
抗体の調製は、モノクローナル抗体を作製するための任意の数の周知の方法によって実施することができる。これらの方法は、通常、動物、通常はマウスを所望の免疫原（例えば、所望の標的分子またはその断片）で免疫する工程を含む。マウスが免疫されると、好ましくは所望の免疫原（複数可）で１回以上追加免疫されると、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、周知の方法に従って調製及びスクリーニングすることができる（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１３１−１３９，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．（１９９７）を参照されたい。モノクローナル抗体産生の全般的な概要については、その部分は参照により本明細書に組み込まれる）。過去数十年にわたり、抗体の産生は極めて頑強になっている。抗体認識とファージディスプレイ技術を組み合わせたｉｎ  ｖｉｔｒｏ法により、極めて特異的な結合能力を有する抗体を増幅及び選択することができる。例えば、参考として本明細書に組み込まれている、Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，１１：４４５−４４９を参照されたい。これらの方法は通常、従来のモノクローナル抗体調製法によるハイブリドーマの調製よりもはるかに煩雑ではない。一実施形態では、ファージディスプレイ技術を使用して、所望の標的分子に特異的な内在化モイエティを作製することができる。選択した免疫原に対する免疫応答を動物（マウス、ウサギ、ヤギ、または他の動物など）において誘発し、この応答を追加刺激して、免疫原特異的Ｂ細胞集団を増殖させる。メッセンジャーＲＮＡは、これらのＢ細胞、または場合によりモノクローナルまたはポリクローナルハイブリドーマ集団から単離される。ｍＲＮＡは、ポリＡプライマーまたはマウス免疫グロブリン特異的プライマー（複数可）のいずれかを使用する既知の方法によって逆転写され、通常、所望のＶＨ鎖及びＶＬ鎖に隣接する配列に特異的であり、ｃＤＮＡをもたらす。所望のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を、通常、ＶＨ及びＶＬに特異的なプライマーセットを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、ともにライゲーションして、リンカーで分離する。ＶＨ及びＶＬ特異的プライマーセットは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。アセンブルしたＶＨ−リンカー−ＶＬ産物（ｓｃＦｖ断片をコードしている）を、ＰＣＲ用に選択して、ＰＣＲによって増幅する。制限部位は、制限部位を含むプライマーを用いたＰＣＲによりＶＨ−リンカー−ＶＬ産物の末端に導入され、ｓｃＦｖ断片は、ファージディスプレイに適した発現ベクター（通常はプラスミド）に挿入される。Ｆａｂ’断片などの他の断片は、ファージ粒子上での表面発現のためにファージディスプレイベクターにクローニングすることができる。ファージは、ラムダなどの任意のファージであってよいが、通常はｆｄ及びＭ１３、典型的にはＭ１３などの繊維状ファージである。
【０１０５】
特定の実施形態では、抗体または抗体断片は、宿主細胞内で組換えにより作製される。換言すれば、抗体の配列が（例えば、上述の方法を使用して）判明すると、抗体を標準的な技術を使用して組換えにより作製することができる。
【０１０６】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、プロテアーゼによる切断に対してより耐性となるように改変され得る。例えば、ポリペプチドを含む内在化モイエティの安定性は、（Ｌ）配置の天然起源のアミノ酸の１つ以上をＤ−アミノ酸で置換することによって向上させることができる。種々の実施形態では、内在化モイエティのアミノ酸残基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％、９０％または１００％は、Ｄ配置のものであり得る。Ｌアミノ酸からＤアミノ酸への転換は、消化管で見られるユビキタスペプチダーゼの多くの消化能力を中和する。あるいは、ペプチド結合を含む内在化モイエティの安定性の向上は、従来のペプチド結合の改変の導入によって実現することができる。例えば、ポリペプチド骨格内への環状環の導入によって、胃または他の消化器官及び血清中でポリペプチドを消化することが知られている多くのタンパク質分解酵素の作用を回避するための、安定性の向上をもたらすことができる。さらに他の実施形態では、内在化モイエティのアミノ酸の間に１つ以上の右旋性アミノ酸（右旋性フェニルアラニンまたは右旋性トリプトファンなど）を挿入することにより、内在化モイエティの安定性の向上を実現することができる。例示的な実施形態では、そのような改変は、所望の標的分子との相互作用の活性または特異性に影響を及ぼすことなく、内在化モイエティのプロテアーゼ耐性を増加させる。
【０１０７】
本開示は、前述または以下の構造的及び／または機能的特性のいずれかの任意の組み合わせに基づいて記載された内在化モイエティ（本開示の抗体または抗原結合断片を含む）の使用を企図する。抗体または抗原結合断片などのそのような内在化モイエティのいずれも、本開示の抗体及び抗原結合断片とみなされ、ラフォラ病の処置のためなど、本明細書に記載の使用または方法のいずれにも使用することができる。
【０１０８】
ヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片などの抗体または抗原結合断片のさらなる例
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片のいずれかを提供し、この抗体または抗原結合断片は、ヒト化されている。換言すれば、抗体または抗原結合断片などの内在化モイエティの１つの部類は、ヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片である。そのような内在化モイエティは、全体的にまたは部分的にヒト化され得る。そのようなヒト化内在化モイエティの多数の例が本明細書にて提供され、ＷＯ２０１５／１０６２９０にも記載されており、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
一実施形態では、本開示は、ヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片を含む抗体または抗原結合断片を提供し、このヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＨドメインはヒト化されており、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含み、
このＶＬはヒト化されており、
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに準拠しており、このヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むマウス３Ｅ１０抗体のものと比較して、ＤＮＡ結合性及び／または細胞透過性が向上している。特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片をマウス抗体または別のヒト化抗体と比較する場合、適切な比較は、同じ構造の２つのタンパク質間（例えば、完全長抗体と別の完全長抗体との比較、またはＦａｂと別のＦａｂとの比較）である。しかしながら、他の実施形態では、比較は、比較のための一定の基準としてのマウス抗体のｓｃＦｖまたはＦｖに対するものである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体またはヒト化抗体断片のＮ−結合型グリコシル化を減少させるために、アスパラギンをＶＨドメインまたはＶＬドメイン内の別のアミノ酸残基に変異させる。このヒト化抗体またはヒト化抗体断片は、マウス親抗体、具体的には、重鎖及び軽鎖を含むマウス３Ｅ１０抗体であって、軽鎖が、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含み、重鎖が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨを含むマウス３Ｅ１０抗体に基づく。好ましい実施形態では、内在化モイエティ及び断片は、少なくとも細胞透過特性のマウス３Ｅ１０抗体に伴う細胞透過特性を伴う（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％超保持する）。特定の実施形態では、ヒト化抗体またはヒト化抗体断片は、透過効率の向上などの１つ以上の好ましい細胞透過特性を有する。他の実施形態では、ヒト化抗体またはヒト化抗体断片は、ＤＮＡ結合活性が向上しており、及び／または異なる範囲のＤＮＡ基質親和性もしくは特異性を有している。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、ヒト化抗体部分の「断片」もしくは「抗原結合断片」または「抗原結合断片」という用語は、マウス３Ｅ１０抗体に伴う細胞透過性及び／またはＤＮＡ結合特性を少なくとも保持する、ヒト化内在化モイエティの任意の断片を含む。本出願では、「断片」及び「抗原結合断片」という用語は、互換的に使用される。例示的な抗体断片には、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片（例えば、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２）などが含まれる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティ（例えば、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片）は、いずれの異種薬剤にも直接融合していないか、または治療用もしくは毒性異種薬剤に融合していないか、もしくは他の方法で連結していない。しかしながら、そのような実施形態では、また以下にさらに詳細に述べるように、内在化モイエティは依然として翻訳後修飾（例えば、グリコシル化または）され得、及び／または組成物の一部として提供され得る。
【０１１３】
他の実施形態では、ヒト化内在化モイエティ（例えば、ヒト化抗体またはヒト化抗体結合断片などの本開示の抗体または抗原結合断片）は、異種薬剤または治療用もしくは毒性異種薬剤に融合している。いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、異種薬剤の細胞への送達をもたらす（すなわち、所望の細胞を透過する；細胞膜を通過して輸送する；細胞膜を通過して少なくとも細胞質に送達する）。特定の実施形態では、本開示は、筋細胞、肝細胞及び／または神経細胞ならびに他の特定の細胞型への異種薬剤の送達を促進する内在化モイエティに関する。この部分は、コンジュゲートの細胞への進入を促進する。マウスの親抗体のように、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、ＥＮＴ２輸送体及び／またはＥＮＴ３輸送体などのＥＮＴ輸送体を介して細胞への進入を促進する。理論に束縛されるものではないが、ＥＮＴ２は筋細胞（骨格筋細胞及び／または心筋細胞）、神経細胞及び／または肝細胞を含む特定の細胞型で優先的に発現する。したがって、コンジュゲート（例えば、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片が異種薬剤にコンジュゲートされたコンジュゲート）は、細胞内に送達されるが、一般に遍在的ではない。むしろ、コンジュゲートは、骨格筋、心筋、横隔膜、肝臓及び神経細胞を含む特定の組織に対して、ある程度豊富に送達され得る。
【０１１４】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、ポリヌクレオチドに結合することができる（例えば、本開示の抗体の標的／抗原はＤＮＡである）。このことは、ＤＮＡに結合する（例えば、ＤＮＡに特異的に結合する）ことが知られている３Ｅ１０抗体の特性と一致する。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、内在化モイエティは、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、またはさらには３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、またはさらには１ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡ（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは平滑二本鎖ＤＮＡ）に結合することができる。ＫＤは、現行の標準的な方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）もしくは水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を使用して、またはＥＬＩＳＡによって測定することができる。例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体または抗体断片は、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに特異的に結合し、これは、抗ＤＮＡ抗体の一例である。特定の実施形態では、内在化モイエティは二本鎖平滑ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ結合活性は、ＥＬＩＳＡ、ＱＣＭ、またはＢｉａｃｏｒｅなどによって、平滑ＤＮＡを使用して結合アッセイで実証されているか、または実証することができる（例えば、Ｘｕ  ｅｔ．Ａｌ．（２００９）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２８：５６８−５７７、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｄ  ４：ＤＯＩ  １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００４３８５を参照されたい）。特定の実施形態では、内在化モイエティは、抗ＤＮＡ抗体である。したがって、特定の実施形態では、単独でまたは異種薬剤に伴って使用するための内在化モイエティ（例えば、抗体または抗原結合断片）は、細胞膜を通過して細胞質及び／または核に入ることができる抗体または抗体断片を含み、この内在化モイエティは、ＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、ヒト化抗体及びヒト化抗原結合断片などの本開示の抗体及び抗原結合断片は、上記のようなＶＨドメイン及びＶＬドメインを有するマウスの親３Ｅ１０抗体に基づく。
【０１１５】
ヒト化抗体は、存在する場合にマウス定常ドメインを含むマウスの親抗体を含む、マウスの親抗体と比較して同じであるか、実質的に同じであるか、またはさらには向上した細胞透過性及び／またはＤＮＡ結合性特性を有することが好ましい。
【０１１６】
特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、ＩＭＧＴシステムを使用して定義されたマウスの親抗体（例えば、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを含む重鎖及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む軽鎖を含む抗体）と同じＣＤＲを有する。特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、マウスの親抗体のものと異なる（例えば、Ｋａｂａｔに従って、ＶＨ  ＣＤＲ２及び／またはＶＬ  ＣＤＲ２及び／またはＶＬ  ＣＤＲ１で異なる）少なくとも１つの重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに準拠する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３（これらのＣＤＲはＫａｂａｔに準拠する）、ならびに
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３（これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに準拠する）を含むＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３（これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに準拠する）、ならびに
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３（これらのＣＤＲはＫａｂａｔに準拠する）を含むＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。
【０１１９】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３（これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムに準拠する）を含むＶＨドメイン、ならびに
配列番号２２または配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３（これらのＣＤＲはＫａｂａｔに準拠する）を含むＶＬドメインを含む。
【０１２０】
本出願全体を通じて詳述されるように、ヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片などの本開示の抗体または抗原結合断片は、マウスの親抗体と、または元の３Ｅ１０抗体もしくはその抗原結合断片と比較することができる。それに加えて、またはその代わりに、本開示の抗体（またはその抗原結合断片）は、代替抗体及び代替断片（例えば、同じマウス親に基づく他のヒト化抗体）と比較することができる。そのようなシナリオでは、比較は、前述の６つのＩＭＧＴ  ＣＤＲまたはＫａｂａｔ  ＣＤＲを有するが、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片と比較してフレームワーク領域において１つ以上の変化を有する、代替抗体または代替抗原結合断片に対するものであり得る。本明細書に開示されるＣＤＲを有するが、１つ以上のＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換（例えば、１つのＣＤＲに１つの置換、２つのＣＤＲに各１つの２つの置換、または３つのＣＤＲに各１つの３つの置換）を有する抗体または抗原結合断片も同様に企図される。活性を比較する場合、ＥＮＴ２及び／またはＥＮＴ３を介して筋細胞、肝細胞及び／または神経細胞などの細胞を透過する能力及び効率が評価され得る。マウスの親抗体の活性のおよそ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約９５％超である場合、活性は同等または実質的に同じとみなされる。マウスの親抗体と比較して特性が少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％良好（例えば、マウスの親抗体または代替ヒト化抗体の活性のおよそ１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１５０％、もしくは１５０％超）である場合、活性は向上したとみなされる。特定の実施形態では、特性が少なくとも２倍良好である場合、活性は別の抗体と比較して向上したとみなされる。他の実施形態では、特性が少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、または１０倍良好である場合、活性は向上したとみなされる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、抗体またはヒト化抗体は、抗原結合断片を含む抗体断片（例えば、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一ドメイン抗体ならびに前述の多価バージョンを含むがこれらに限定されない、抗体断片、誘導体またはそれらの類似体；Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体及びラクダ化抗体断片、ヒト化抗体及びヒト化抗体断片、ヒト抗体及びヒト抗体断片、ならびに前述の多価バージョンを含むがこれらに限定されない、多価内在化モイエティ；単一特異性または二重特異性抗体、例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）２断片）、ダイアボディ、トリボディもしくはテトラボディ（これらは通常、共有結合されているか、または他の方法で安定化されている（すなわち、ロイシンジッパーもしくはヘリックスで安定化された）ｓｃＦｖ断片である）を含むがこれらに限定されない、多価内在化モイエティ；所望の標的分子と天然に相互作用する受容体分子を含み得る。特定の実施形態では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖであり、ペプチドリンカーがＶＨドメインとＶＬドメインとを相互連結する。いくつかの実施形態では、抗体またはその変異体は、いくつかの異なる抗体サブクラス定常ドメインのハイブリッドである定常領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の任意の組み合わせ）を含み得る。
【０１２２】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、抗原結合断片を含む抗体断片である。換言すれば、特定の実施形態では、内在化モイエティは、完全長抗体ではなく、抗原結合断片を含む完全長抗体の断片である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’またはＦａｂ２’である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む完全長抗体であり、場合によっては、本明細書に記載されているように、エフェクター機能を低下させるためにヒンジ及び／またはＣＨ２ドメインなどにおいて置換されている。特定の実施形態では、重鎖は、ＶＨドメイン、ならびにＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含む。特定の実施形態では、重鎖は、ＶＨドメイン、ならびにＣＨ１ドメイン、及び所望により上部ヒンジを含む定常ドメインを含む。上部ヒンジは、例えば、ヒンジ領域の１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸残基を含み得る。特定の実施形態では、上部ヒンジはシステイン残基を含まない。特定の実施形態では、上部ヒンジは、Ｎ末端から天然のヒンジ配列に存在するシステインへと連続する残基を１つ以上含む。特定の実施形態では、重鎖は、ＣＨ領域、ならびにＣＨ１ドメイン及びヒンジを含む定常ドメインを含む。特定の実施形態では、ヒンジ（完全長抗体と抗体断片のどちらの一部として存在しているかを問わない）は、Ｋａｂａｔ位置２２２に対応する位置でのＣからＳへの置換（例えば、変異がＫａｂａｔ位置２２２に対応する位置である、ヒンジ内のＣ２２２Ｓ）を含む。換言すれば、特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｋａｂａｔ２２２に対応する位置のヒンジドメインに、システイン残基ではなくセリン残基を含む。特定の実施形態では、重鎖は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及び所望により、ＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置２９７に対応する位置でのＮからＱへの置換（例えば、変異がＫａｂａｔ位置２９７に対応する位置である、ＣＨ２ドメイン内のＮ２９７Ｑ）を含む。換言すれば、特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｋａｂａｔ位置２９７に対応する位置にアスパラギンではなくグルタミンを含む。
【０１２３】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、重鎖定常ドメインのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ならびに軽鎖定常ドメインを含む完全長抗体である。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのうちの１つ以上を含み、所望によりヒンジを有する。
【０１２４】
モノクローナル抗体３Ｅ１０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下で永続的に寄託されたハイブリドーマ３Ｅ１０より産生することができ、この抗体は、米国特許第７，１８９，３９６号に開示されている。この抗体は、ＤＮＡに結合することが示されている。それに加えて、またはその代わりに、３Ｅ１０抗体は、３Ｅ１０抗体の重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内で発現させることにより産生することができる。本明細書において、「３Ｅ１０抗体」または「モノクローナル抗体３Ｅ１０」という用語は、抗体を産生するために使用する方法にかかわらず、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含むマウス抗体（または抗原結合断片）を指すためにも使用される。したがって、本出願の文脈において、３Ｅ１０抗体は、別途明記しない限り、ハイブリドーマの配列を有するか、または配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン（これは、本明細書に記載のように、ＡＴＣＣに寄託された３Ｅ１０抗体のものと比較してアミノ酸置換を１つ有しており、細胞透過性及びＤＮＡ結合活性を保持していることが既に実証されている）ならびに配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む抗体を指す。しかしながら、本開示の文脈において、ヒト化の基盤として使用した親マウス抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む抗体であった。本開示は、特定の実施形態において、マウス３Ｅ１０に基づくヒト化抗体を提供する。
【０１２５】
同様に、３Ｅ１０の変異体または抗原結合断片を指す場合、そのような用語は、抗体が産生された方法に関係なく使用される。現時点で、３Ｅ１０は一般に、組換えにより産生される。
【０１２６】
ヒト化内在化モイエティは、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の変異体、例えばｍＡｂ  ３Ｅ１０と同じ細胞透過特性を保持した３Ｅ１０の変異体、及びその有用性を向上させるために（例えば、特定の細胞型を標的とする能力の向上、細胞膜を透過する能力の向上、細胞ＤＮＡへ局在化する能力の向上、コンジュゲーションに好都合な部位など）、突然変異によって改変された変異体にも由来し得る。そのような変異体には、１つ以上の保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖及び／または定常領域（複数可）に導入されている変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、軽鎖または重鎖は、Ｎ末端またはＣ末端で改変され得る。さらに、抗体または抗体断片は、異種薬剤へのコンジュゲーションを促進するように改変され得る。同様に、前述の変異体の説明は、抗原結合断片に適用される。これらの抗体、変異体、または断片のいずれも、宿主細胞内のヌクレオチド配列（複数可）の発現によって組換えにより作製され得る。そのような内在化モイエティは、ＥＮＴ２及び／またはＥＮＴ３などのＥＮＴ輸送体を介して細胞を通過でき、及び／または３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの標的）に結合できる。
【０１２７】
ヒト化内在化モイエティは、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の突然変異体、例えばｍＡｂ  ３Ｅ１０と同じか、または実質的に同じ細胞透過特性を保持した３Ｅ１０の変異体、及びその有用性を向上させるために（例えば、特定の細胞型を標的とする能力の向上、細胞膜を透過する能力の向上、細胞ＤＮＡへ局在化する能力の向上、結合親和性の向上など）、突然変異によって改変された変異体にも由来し得る。そのような突然変異体には、１つ以上の保存的置換が重鎖または軽鎖に導入されている変異体が含まれる。多くのｍＡｂ  ３Ｅ１０の変異体が、例えば、米国特許第７，１８９，３９６号及びＷＯ２００８／０９１９１１で特性決定されており、それらの教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書にて提供される実施例において、親マウス３Ｅ１０は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１２８】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、ヒト化一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの抗原結合断片である。他の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｆａｂ’断片である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、内在化モイエティは、免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片を含む抗体または抗体断片である。知られているように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４つまたは５つのドメインで構成される。ドメインは、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）のように順番に命名されている。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンのクラス間で交差相同性を有し、例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡ及びＩｇＤのＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＭ及びＩｇＥのＣＨ３ドメインに相同である。本明細書で使用する場合、「免疫グロブリンＦｃ領域」という用語は、免疫グロブリン鎖重鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせを含み得る。一実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠いている。一実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、γサブクラス２、γサブクラス３、またはγサブクラス４）である。免疫グロブリンの他のクラスである、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）及びＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用することができる。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号及び同第５，７２６，０４４号に詳細に説明されている。特定の結果を得るために、特定の免疫グロブリンクラス及びサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を選択することは、当業者のレベルの範囲内であるとみなされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡコンストラクトの一部は、少なくともヒンジドメインの一部、好ましくは、ＦｃγのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのいずれかの相同ドメインの少なくとも一部を含み得る。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は、本開示の実施において有用であり得ると考えられる。特定の実施形態では、定常領域ドメインは、ヒトである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の内在化モイエティのいずれかのＦｃ部分は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発しないように改変されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、補体に結合しないように改変されている。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置２９７に対応する位置でのＮからＱへの置換（例えば、変異がＫａｂａｔ位置２９７に対応する位置である、ＣＨ２ドメイン内のＮ２９７Ｑ）を含む。換言すれば、特定の実施形態では、内在化モイエティは、Ｋａｂａｔ位置２９７に対応する位置にアスパラギンではなくグルタミンを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ハイブリッド重鎖定常領域を含む。すなわち、この抗体または抗原結合断片は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインから選択される複数の重鎖定常領域ドメインを含み、この抗体または抗原結合断片内の定常領域ドメインのうちの少なくとも１つは、この抗体または抗原結合断片内の別のドメインの免疫グロブリンクラスまたはサブクラスのものと異なるクラスまたはサブクラスのものである。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片内の定常領域ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩｇＧ定常領域ドメインであり、抗体または抗原結合断片内の定常領域ドメインのうちの少なくとも１つは、異なる免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ定常領域ドメインのものである。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片内の定常領域ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩｇＧ１定常領域ドメインであり、抗体または抗原結合断片内の定常領域ドメインのうちの少なくとも１つは、異なるＩｇＧサブクラス、すなわち、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものである。好適な定常領域は、ヒトであるか、または別の種（例えば、マウス）由来であり得る。本開示のヒト化抗体及びヒト化抗原結合断片は、存在する場合、定常領域配列（重鎖または軽鎖）がヒト免疫グロブリンのものと対応するかまたは別の種のものと対応するかどうかにかかわらず、ヒト化されたとみなされる。
【０１３１】
ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片またはヒト化変異体の細胞透過能力を利用して、異種薬剤の送達を促進することができる。３Ｅ１０に由来するヒト化モイエティは、筋細胞、肝細胞、及び神経細胞への送達を効果的に促進できることが実証されているため、これに特に適している。したがって、ヒト化内在化モイエティは、ヒト患者またはモデル生物などの対象の細胞への効果的な送達を促進するのに特に有用である。特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、異種タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子などの異種薬剤へのさらなるコンジュゲーションのための中間体として有用である。しかしながら、他の実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片またはヒト化変異体は、いかなる異種薬剤の送達にも利用されない。
【０１３２】
抗体またはその断片（例えば、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨによってコードされる一本鎖Ｆｖ断片）の調製は当該技術分野で周知である。特にｍＡｂ  ３Ｅ１０抗体断片の組換え産生の方法は、ＷＯ２００８／０９１９１１に記載されている。さらに、抗体のｓｃＦｖ断片を作製する方法は、当該技術分野で周知である。抗体または抗体断片を組換えにより産生する場合、リンカーを使用することができる。例えば、柔軟性のあるタンパク質領域の典型的な表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒが含まれる。１つの例示的なリンカーは、配列番号６、配列番号１３、または配列番号１４に提供されている。Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むアミノ酸配列の順列は、リンカー配列のための基準（例えば、最小限の疎水性または荷電特性を備え柔軟性がある）を満たすことが予期される。別の例示的なリンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｎのものであり、式中、ｎは１〜１０の整数、例えば２、３、または４である。他の中性に近いアミノ酸、例えば、Ｔｈｒ及びＡｌａもリンカー配列に使用することができる。
【０１３３】
例えば、ｓｃＦｖの部分を相互連結するリンカーに加えて、本開示は、例えば、異種薬剤をコンジュゲートの抗体部分に相互連結させるか、または異種薬剤部分をコンジュゲートの抗体部分に相互連結させるための追加のリンカーの使用を企図する。
【０１３４】
抗体の調製は、モノクローナル抗体を作製するための任意の数の周知の方法によって実施することができる。これらの方法は、通常、動物、通常はマウスを所望の免疫原（例えば、所望の標的分子またはその断片）で免疫する工程を含む。マウスが免疫されると、好ましくは所望の免疫原（複数可）で１回以上追加免疫されると、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、周知の方法に従って調製及びスクリーニングすることができる（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１３１−１３９，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．（１９９７）を参照されたい。モノクローナル抗体産生の全般的な概要については、その部分は参照により本明細書に組み込まれる）。過去数十年にわたり、抗体の産生は極めて頑強になっている。抗体認識とファージディスプレイ技術を組み合わせたｉｎ  ｖｉｔｒｏ法により、極めて特異的な結合能力を有する抗体を増幅及び選択することができる。例えば、参考として本明細書に組み込まれている、Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，１１：４４５−４４９を参照されたい。これらの方法は通常、従来のモノクローナル抗体調製法によるハイブリドーマの調製よりもはるかに煩雑ではない。一実施形態では、ファージディスプレイ技術を使用して、所望の標的分子に特異的な内在化モイエティを作製することができる。選択した免疫原に対する免疫応答を動物（マウス、ウサギ、ヤギ、または他の動物など）において誘発し、この応答を追加刺激して、免疫原特異的Ｂ細胞集団を増殖させる。メッセンジャーＲＮＡは、これらのＢ細胞、または場合によりモノクローナルまたはポリクローナルハイブリドーマ集団から単離される。ｍＲＮＡは、ポリＡプライマーまたはマウス免疫グロブリン特異的プライマー（複数可）のいずれかを使用する既知の方法によって逆転写され、通常、所望のＶＨ鎖及びＶＬ鎖に隣接する配列に特異的であり、ｃＤＮＡをもたらす。所望のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を、通常、ＶＨ及びＶＬに特異的なプライマーセットを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、ともにライゲーションして、リンカーで分離する。ＶＨ及びＶＬ特異的プライマーセットは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。アセンブルしたＶＨ−リンカー−ＶＬ産物（ｓｃＦｖ断片をコードしている）を、ＰＣＲ用に選択して、ＰＣＲによって増幅する。制限部位は、制限部位を含むプライマーを用いたＰＣＲによりＶＨ−リンカー−ＶＬ産物の末端に導入され、ｓｃＦｖ断片は、ファージディスプレイに適した発現ベクター（通常はプラスミド）に挿入される。Ｆａｂ’断片などの他の断片は、ファージ粒子上での表面発現のためにファージディスプレイベクターにクローニングすることができる。ファージは、ラムダなどの任意のファージであってよいが、通常はｆｄ及びＭ１３、典型的にはＭ１３などの繊維状ファージである。
【０１３５】
特定の実施形態では、抗体または抗体断片は、宿主細胞内で組換えにより作製される。換言すれば、抗体の配列が（例えば、上述の方法を使用して）判明すると、抗体を標準的な技術を使用して組換えにより作製することができる。
【０１３６】
特定の実施形態では、ヒト化内在化モイエティは、プロテアーゼによる切断に対してより耐性となるように改変され得る。例えば、ポリペプチドを含む内在化モイエティの安定性は、（Ｌ）配置の天然起源のアミノ酸の１つ以上をＤ−アミノ酸で置換することによって向上させることができる。種々の実施形態では、内在化モイエティのアミノ酸残基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％、９０％または１００％は、Ｄ配置のものであり得る。Ｌアミノ酸からＤアミノ酸への転換は、消化管で見られるユビキタスペプチダーゼの多くの消化能力を中和する。あるいは、ペプチド結合を含む内在化モイエティの安定性の向上は、従来のペプチド結合の改変の導入によって実現することができる。例えば、ポリペプチド骨格内への環状環の導入によって、胃または他の消化器官及び血清中でポリペプチドを消化することが知られている多くのタンパク質分解酵素の作用を回避するための、安定性の向上をもたらすことができる。さらに他の実施形態では、内在化モイエティのアミノ酸の間に１つ以上の右旋性アミノ酸（右旋性フェニルアラニンまたは右旋性トリプトファンなど）を挿入することにより、内在化モイエティの安定性の向上を実現することができる。例示的な実施形態では、そのような改変は、所望の標的分子との相互作用の活性または特異性に影響を及ぼすことなく、内在化モイエティのプロテアーゼ耐性を増加させる。
【０１３７】
「Ｆａｂ断片」は１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域から構成される。一般的に、Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆａｂは、所望により上部ヒンジなどのヒンジの一部を含み得る。
【０１３８】
「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間に、より多くの定常領域を含有する１つの軽鎖及び１つの重鎖を含有しており、これにより鎖間ジスルフィド結合を２つの重鎖の間に形成しＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
【０１３９】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する２つの軽鎖及び２つの重鎖を含有しており、これにより鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間に形成される。
【０１４０】
天然抗体とは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプが異なる重鎖の間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔をおいた鎖間ジスルフィドブリッジも有する。各重鎖は可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有し、これに複数の定常ドメイン（ＣＨ）が続く。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ラムダ鎖またはカッパ鎖のいずれかに分類される。カッパ軽鎖の可変ドメインは、本明細書においてＶＫとも示される。
【０１４１】
本開示の抗体は、完全長抗体またはインタクト抗体、抗体断片、天然配列抗体またはアミノ酸変異体、ヒト抗体、ヒト化抗体（キメラ抗体の形態）、翻訳後修飾抗体、キメラ抗体、イムノコンジュゲート、及びそれらの機能的断片を含む。抗体は、所望のエフェクター機能または血清半減期をもたらすように、Ｆｃ領域において改変することができる。
【０１４２】
抗体の調製
天然起源の抗体構造単位は、通常、四量体で構成される。そのような四量体はそれぞれ、通常、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの完全長「軽」鎖（通常約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの完全長「重」鎖（通常約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。通常、各鎖のアミノ末端部分には、典型的には抗原認識を担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、通常、エフェクター機能を担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、通常、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖は通常、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスがある。ＩｇＭには、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスがある。ＩｇＡも同様に、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに細分される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７，２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．），１９８９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域の組み合わせは、通常、抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、次の定常ドメインスキーム：ＩｇＧ２ａ  ＣＨ１−ＩｇＧ１  ヒンジ−ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３、を含む。他の好適な組み合わせも企図される。他の実施形態では、抗体は完全長抗体を含み、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３は同じ定常ドメインサブクラス（例えば、ＩｇＧ１）に由来する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、免疫グロブリンの定常ドメインの一部、例えば、次の定常ドメインスキーム：ＩｇＧ２ａ  ＣＨ１−ＩｇＧ１  上部ヒンジ、を含む抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、カッパ定常ドメイン（例えば、配列番号１２）を含む。
【０１４３】
各重鎖及び軽鎖の可変領域は、通常、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域によって連結された、４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によってアラインされ、そのアラインメントによって、特定の標的（例えば、本開示の文脈における抗原、ＤＮＡ）への結合が可能となり得る。Ｎ末端からＣ末端にかけて、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方は、通常、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメイン（ＦＲまたはＣＤＲ）へのアミノ酸の割り当ては、通常、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）の定義に準拠する。特定の実施形態では、本明細書にて提供される抗体などの特定の抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＣＤＲである（例えば、抗体または抗原結合断片に関して言及されるＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して同定される）。同様に、特定の実施形態では、特にＣＤＲがＫａｂａｔシステムによって定義または同定される場合、ＦＲ領域もまた、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義及び／または同定される。しかしながら、（本明細書に記載されている）ＩＭＧＴシステムを含む、ＣＤＲ及びＦＲ領域を同定するための代替のシステムも利用可能である。特定の実施形態では、本明細書にて提供される抗体などの特定の抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムによって定義されるＣＤＲである（例えば、抗体または抗原結合断片のＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムを使用して同定される）。
【０１４４】
抗体は、モノクローナル抗体の開発に伴い、医薬品として有用となり、かつ関心の対象となった。モノクローナル抗体は、培地中の連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するための好適な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）のハイブリドーマ法ならびにヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１、及びＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．５１−６３）が挙げられる。多くの場合、ハイブリドーマは、マウスまたはげっ歯類起源の初期抗体を作製するために使用される。次に、組換え技術を使用してげっ歯類変異体、キメラ抗体、ヒト化抗体などを生成するなどして、初期抗体を改変することができる。初期抗体を生成するための他の方法が存在しており、そのような方法は当該技術分野で知られている。しかしながら、初期抗体またはさらにその初期抗体の変異体を作製するために使用される方法にかかわらず、非ヒト起源の任意の所与の抗体は、その後、そのヒト性を増加させるように改変することができる。
【０１４５】
非ヒト抗体のヒト性を増加させて、ヒト対象及び細胞での使用により適するようにすることは、診断、治療、または研究のいずれの目的であろうと、有益であり得る。抗体は、治療薬として使用するために改変することができる。そのような抗体（抗体断片を含む）の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒト抗体が挙げられる。キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を作製するための多数の方法が当該技術分野に存在する。本開示の文脈では、抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのうちの少なくとも１つがヒト化された場合、ヒト化されているとみなされる。さらに、ＶＨドメインまたはＶＬドメインは、少なくとも１つのＦＲ領域の少なくとも一部のアミノ酸配列が親マウス抗体に対して改変され、それにより、その部分のアミノ酸配列がヒト抗体またはヒトコンセンサス配列のアミノ酸配列に対応する場合、ヒト化されている。特定の実施形態では、ＶＨドメインの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのＦＲ領域及び／またはＶＬドメインの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのＦＲ領域が、それらの配列がヒト配列により密接に関連するように、（全体的にまたは部分的に）改変されている。前述のいずれかに関して、特定の実施形態では、ヒト化抗体断片は、（例えば、ＣＬならびにＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３ドメインのうちの１つ以上を含む）ヒトまたは非ヒト軽鎖及び／または重鎖定常領域との関連において提供され得る。特定の実施形態では、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、存在する場合、ヒト軽鎖及び／または重鎖定常ドメインとの関連において提供される。３Ｅ１０親抗体に基づくヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域の多数の例が、本明細書にて提供される。本明細書に記載のヒト化軽鎖可変ドメイン及び／またはヒト化重鎖可変ドメインのいずれかを組み合わせた抗体及び抗体結合断片は、本開示の抗体及び抗原結合断片の例示である。
【０１４６】
そのような抗体をコードするヌクレオチド配列が決定されると、キメラ抗体またはヒト化抗体を組換え法により産生することができる。抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、当該技術分野で一般に知られている材料及び手順を使用して発現させる。
【０１４７】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。本開示の特定の実施形態では、抗体は、ヒトカッパ軽鎖及びヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖またはヒトＩｇＧ４重鎖を含む。特定の実施形態では、本開示の抗体は、哺乳動物細胞での発現のためにクローニングされている。
【０１４８】
本開示の抗体が完全長抗体であるか、または抗原結合断片であるかにかかわらず、本開示の抗体及び抗原結合断片は、細胞株において組換えにより発現させることができる。これらの実施形態では、特定の抗体をコードする配列を、哺乳動物宿主細胞または酵母宿主細胞などの好適な宿主細胞の形質転換に使用することができる。これらの実施形態によれば、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスに（もしくはウイルスベクターに）パッケージングし、宿主細胞をウイルス（もしくはベクター）で形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法を使用して、または当該技術分野において既知のトランスフェクション方法により、実現することができる。一般に、使用される形質転換方法は、形質転換される宿主に依存し得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へ導入する方法は、当該技術分野で周知であり、限定されないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソームへの封入、及びＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【０１４９】
本開示の特定の実施形態によれば、重鎖定常領域（全部もしくは一部）、本開示の重鎖可変領域、軽鎖定常領域、または本開示の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的なライゲーション技術を使用して、適切な発現ベクターに挿入される。好ましい実施形態では、重鎖定常領域または軽鎖定常領域は、適切な可変領域のＣ末端に付加され、発現ベクターにライゲーションされる。ベクターは、通常、使用される特定の宿主細胞内で機能するように選択する（すなわち、ベクターを、遺伝子の増幅及び／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構に適合させる）。発現ベクターの概説については、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．），１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎ．Ｙ．を参照されたい。抗体発現に関連して、重鎖及び軽鎖の両方は、同じベクターから（例えば、同じベクター上に存在する同じまたは異なるプロモーターから）発現させてもよく、または重鎖及び軽鎖は、異なるベクターから発現させてもよい。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖を、同じ宿主細胞にトランスフェクトして共発現させた異なるベクターから発現させる。重鎖及び軽鎖が同じ宿主細胞内で同じベクターから発現するかまたは異なるベクターから発現するかどうかにかかわらず、次に、重鎖及び軽鎖は会合して抗体（または発現する重鎖及び軽鎖の部分に応じて、抗体断片）を形成することができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、異種薬剤にコンジュゲートされていない。他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、異種薬剤にコンジュゲートされている。特定の実施形態では、異種薬剤は、タンパク質またはペプチドである。このタンパク質またはペプチドは、例えば重鎖とのインフレームの同時翻訳融合タンパク質として発現させ、本明細書に記載されているように発現させることができる。化学的コンジュゲーションも可能である。本明細書に詳細に記載されているコンジュゲートされたとは、別途明記しない限り、本開示の抗体または抗原結合部分のいずれかが、相互連結に関係なく、異種薬剤に会合または相互連結する（例えば、相互連結／会合が、化学的コンジュゲーション、共有結合、ジスルフィド結合など、またはそれらの組み合わせを含み得る）シナリオを指す。特定の実施形態では、本開示の抗体の重鎖と異種薬剤との間の融合タンパク質（これは、本開示の抗体の軽鎖とさらに会合し得る）の形成などの相互連結の少なくとも一部は、共有結合による。したがって、本開示は、そのようなコンジュゲート及びそのようなコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。コンジュゲートとは、異種薬剤に会合した本開示の抗体または抗原結合部分を含む分子である。同様に、本開示の抗体または抗原結合断片は、異種薬剤をさらに含み得る。２つの部分が会合しているか、または相互連結している、分子に沿ったコンジュゲート（例えば、相互連結は、化学的コンジュゲーション、共有結合、ジスルフィド結合など、またはそれらの組み合わせを含み得る）。特定の実施形態では、本開示の抗体の重鎖と異種薬剤との間の融合タンパク質（これは、本開示の抗体または抗体断片の軽鎖とさらに会合し得る）の形成などの相互連結の少なくとも一部は、共有結合による。
【０１５１】
通常、宿主細胞のいずれかで使用される発現ベクターは、プラスミドの維持のための配列及び外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有する。そのような配列は、「隣接配列」と総称され、特定の実施形態では、通常、以下のヌクレオチド配列、すなわち、プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止配列、ドナースプライス部位及びアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカー要素のうちの１つ以上を含む。ベクターのこれらの部分は周知であり、タンパク質の発現のために選択及び使用することができる一般に入手可能なベクターが多数存在する。所望の宿主細胞及び用途に基づいてベクターを容易に選択することができる。
【０１５２】
複製起点は、通常、商業的に購入されたそれらの原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製起点部位を含有しない場合、既知の配列に基づいて化学合成し、ベクター内にライゲーションすることができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）由来の複製起点は、大半のグラム陰性細菌に好適であり、様々なウイルスの起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点構成成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない（例えば、ＳＶ４０の起点は、それがウイルス初期プロモーターも含有するという理由のみで使用されることが多い）。
【０１５３】
本開示の発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、かつ重鎖及び／または軽鎖をコードする分子に作動可能に連結されるプロモーターを含有する。プロモーターは、構造遺伝子の転写を調節する構造遺伝子の開始コドンの（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内の）上流（すなわち、５’）に位置する非転写配列である。プロモーターは、慣習的に、誘導性プロモーターと構成的プロモーターの２つのクラスのうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件のある変化、例えば、栄養素の有無、または温度の変化に応答して、誘導性プロモーターの制御下でＤＮＡから高レベルの転写を開始させる。一方、構成的プロモーターは、継続的な遺伝子産物の産生を開始させる。すなわち、遺伝子発現は、ほとんどまたは全く制御されない。様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、本開示の抗体または抗原結合断片を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。特定の実施形態では、同じプロモーターが、重鎖及び軽鎖の両方に使用される。他の実施形態では、（同じまたは異なるベクター上に存在する）異なるプロモーターがそれぞれに使用される。
【０１５４】
酵母宿主とともに使用するための好適なプロモーターもまた、当該技術分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに好都合に使用される。哺乳動物宿主細胞とともに使用するのに好適なプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものを含むが、これらに限定されない。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
【０１５５】
対象となり得るさらなるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；ベータラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に対象となるものは、組織特異性を示し、かつトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写調節領域、すなわち、膵腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６、Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９  （１９８６）、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ系細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８、Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパ系細胞及びマスト細胞で活性であるマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓で活性であるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓で活性であるアルファ・フェト・プロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓で活性であるアルファ１−抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄系細胞で活性であるベータ−グロブリン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０、Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳内の希突起膠細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａ��  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；ならびに視床下部で活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）である。
【０１５６】
ベクターは、軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させるためのエンハンサー配列を含み得る。
【０１５７】
本開示の発現ベクターは、市販のベクターなどの開始ベクターから構築することができる。そのようなベクターは、所望の隣接配列のすべてを含有しても、または含有しなくてもよい。本明細書に記載の隣接配列のうちの１つ以上が既にベクターに存在していない場合、それらを個々に得て、ベクターにライゲーションすることができる。隣接配列の各々を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１５８】
ベクターが構築され、本開示の抗体または抗原結合断片を含む軽鎖もしくは重鎖、または軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成したベクターを、増幅及び／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入することができる。発現ベクターの選択した宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、または他の既知の技術を含む周知の方法によって実現され得る。選択される方法は、ある程度、使用される宿主細胞の型に依存する。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者に周知であり、例えば、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。
【０１５９】
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、後に培地から採取するか（宿主細胞が抗体または抗原結合断片を培地内に分泌する場合）、または産生した宿主細胞から直接採取する（抗体または抗原結合断片が分泌されない場合）ことができる、本開示の抗体または抗原結合断片を合成する。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド改変（グリコシル化またはリン酸化など）、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの様々な要因に依存する。
【０１６０】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で周知であり、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、及び多数の他の細胞株を含む、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、それ自体の抗体を作製しないが、異種抗体を作製及び分泌する能力を有するＢ細胞系（例えば、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０及びＳＰ２／０）から細胞株を選択することができる。他の実施形態では、酵母細胞株（例えば、Ｐｉｃｈｉａ）などの、哺乳動物細胞以外の細胞が使用される。
【０１６１】
特定の実施形態では、細胞株は、本開示の抗体または抗原結合断片を安定して発現する。他の実施形態では、細胞株は、本開示の抗体または抗原結合断片を一過性に発現する。
【０１６２】
特定の実施形態では、実質的に精製／単離された本開示の抗体（抗原結合断片を含む）が提供される。組換え細胞培養で増殖させた抗体を実質的に精製するための多くの方法、フィルター、及び装置が利用可能である。
【０１６３】
抗体断片は、完全長抗体の酵素消化によっても作製することができる。
【０１６４】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、単独で提供されるか、または異種薬剤とのコンジュゲートとして提供されるかにかかわらず、検出可能に標識される。特定の実施形態では、検出可能な標識は、それ自体が異種薬剤の例である。検出可能な標識などの物質へのコンジュゲーションのための方法は、当該技術分野で周知である。一実施形態では、結合した物質は、検出可能な標識（本明細書においてレポーター分子とも称される）である。結合に好適な物質としては、フルオロフォア、発色団、色素、放射性同位体、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。別の物質を抗体にコンジュゲーションまたは共有結合させるための方法は、当該技術分野で周知である。
【０１６５】
「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射性標識化されたアミノ酸の組み込みによるか、あるいは標識されたアビジン（例えば、好ましくは、蛍光マーカー、化学発光マーカーまたは光学法もしくは比色法によって検出することができる酵素活性などの検出可能なマーカーを含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチンモイエティのポリペプチドへの結合による、検出可能なマーカーの組み込みを指す。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示される方法で有益に使用され得る。ポリペプチドのための標識の例としては、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、標識は、放射性同位体である。好適な放射性物質の例としては、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３５Ｘｅ），フッ素（１８Ｆ）、１５３ＳＭ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ及び９７Ｒｕが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
標識のさらなる例としては、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、またはランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチン化基などのハプテン標識、及び二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられる。特定の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減させるための、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
【０１６７】
存在する場合、個々の標識に関係なく、当業者は、精製、診断、または研究での使用を容易にするための適切な標識を選択することができる。他の実施形態では、異種薬剤は治療用分子であり、検出可能な標識及び／またはエピトープタグを含まないか、または検出可能な標識及び／またはエピトープタグに加えて、治療用分子を含むかのいずれかである。
【０１６８】
「ヒト化」は、抗体などの免疫グロブリンを指し、ここで、抗原結合に直接関与するアミノ酸、いわゆる重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は必ずしもヒト由来とは限らないが、その一方で、いわゆる可変重鎖及び／または軽鎖のフレームワーク領域である免疫グロブリン分子の一方または両方の鎖の残りの可変ドメイン（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４のうちの１つ以上）の少なくとも一部と、ならびに存在する場合、所望により重鎖または軽鎖の定常領域は、それらのアミノ酸配列がヒト配列により密接に対応するように改変される。
【０１６９】
２つ以上の鎖の抗体の場合に本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、少なくとも１つの鎖がヒト化されている抗体である。ヒト化抗体鎖は、フレームワーク領域の１つ以上がマウスの親と比較してヒトに近いかまたは改変を含んでいる可変領域を有し、それにより、１つ以上のフレームワーク領域がマウス親よりもヒトに近い。一本鎖であるヒト化抗体は、その鎖がフレームワーク領域の１つ以上がマウスの親と比較してヒトに近いかまたは改変を含んでいる可変領域を有しており、それにより、１つ以上のフレームワーク領域がよりヒトに近いものである。ヒト化抗体鎖またはヒト化抗原結合断片の可変領域の非ヒト部分は、非ヒト供給源、特に非ヒト抗体、典型的にはげっ歯類起源の非ヒト抗体に由来する。ヒト化抗体への非ヒトの寄与は、通常、１つ（または複数）のヒト免疫グロブリン（複数可）に由来するフレームワーク領域の間に散在する少なくとも１つのＣＤＲ領域の形態でもたらされる。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保持するために改変することができる。したがって、当該技術分野で理解されているように、フレームワーク領域全体または特定の鎖上のフレームワーク領域のすべては、抗体がヒト化されているとみなされるためにヒト抗体に対応する残基を含有する必要はない。
【０１７０】
「ヒト化抗体」は定常領域（例えば、軽鎖の場合、少なくとも１つの定常領域またはそれらの一部、及びいくつかの実施形態では、重鎖の場合、３つの定常領域）をさらに含むことができる。ヒト化抗体の定常領域は、存在する場合、通常はヒト起源である。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、最初に、配列類似性において最も近いヒト免疫グロブリンカッパ鎖または重鎖のホモログ（例えば、上位１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個の最も近い免疫グロブリンカッパ鎖または重鎖のホモログ）を同定するために、マウス３Ｅ１０軽鎖または重鎖抗体配列（例えば、それぞれ、配列番号１８のマウス３Ｅ１０抗体軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１７のマウス３Ｅ１０抗体重鎖アミノ酸配列）を、配列データベース検索（例えば、ＢＬＡＳＴ）に供することによって作製される。最も近いヒト免疫グロブリンカッパ鎖または重鎖のホモログは、カッパ鎖または重鎖ＣＤＲグラフティングの候補とみなされる。いくつかの実施形態では、次に、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉ配列アラインメントツールなどの配列アラインメントツールを使用して、３Ｅ１０カッパ鎖または重鎖由来のＣＤＲ及び上位のヒト免疫グロブリンカッパ鎖または重鎖のホモログのいずれか１つのフレームワーク領域で構成されるキメラアミノ酸配列を分析する。
【０１７２】
一般に、本明細書で使用する場合、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは一部が非ヒト親配列に由来する部分に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは一部がヒト免疫グロブリン配列に由来する、１つまたは２つの可変ドメインを含む。さらに、ヒト化抗体は、所望により免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、特に、選択した参照ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含むことができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片（例えば、ヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片などの抗体または抗原結合断片）は、３Ｅ１０抗体のＣＤＲのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む３Ｅ１０抗体のＣＤＲのうちの１つ以上を含む。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲまたはＩＭＧＴ  ＣＤＲのいずれかまたは両方を使用して、抗体を参照または記述することができる。３Ｅ１０抗体のＣＤＲまたは本開示の抗体は、当該技術分野で利用可能なＣＤＲ同定スキームのいずれかを使用して決定することができ、そのようなスキームを使用して、抗体を記述することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＫａｂａｔ定義に従って定義される。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ．３４２：８７７−８８３に従って定義される。他の実施形態では、ＣＤＲは、ＬｅＦｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：５５−７７に記載の国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）に従って定義される。他の実施形態では、３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，２００１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７−６７０に従って定義される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋｕｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．８（２）：ｅ１００２３８８で論じられているＣＤＲ同定スキームのいずれかに従って定義される。特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、マウスの親抗体と比較した場合に、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲに１つ以上の差異を含む。例えば、特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、マウスの親抗体と比較して、ＶＨ  ＣＤＲ２及び／またはＶＬ  ＣＤＲ２、ならびに場合により、ＶＬ  ＣＤＲ１で異なる。しかしながら、特定の実施形態では、そのような抗体は、マウスの親抗体のＩＭＧＴ  ＣＤＲを共有する。
【０１７４】
本明細書では、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン中の残基のアミノ酸位置は、例えば、配列番号１７または配列番号１８と比較した線状配列によって示される。したがって、本開示の抗体または抗原結合断片のＶＨ及び／またはＶＬの配列は、配列番号１７または配列番号１８の対応するアミノ酸位置（複数可）と比較して記述することができる。例えば、ＶＨドメインまたはＶＬドメインは、特定のアミノ酸位置で改変を含む場合があり、この位置は、配列番号１７または配列番号１８の特定の位置に対応し得る。
【０１７５】
しかしながら、ＣＤＲ同定スキームは、抗体間の比較を容易にするために使用できる付番システムも提供する。本明細書では特に使用していないが、当業者は、利用可能な付番スキームを容易に使用して、線状配列を参照することによってではなく均一な付番システムを使用して、本明細書に記載のＣＤＲを示すことができる。特定の実施形態では、当該技術分野で既知のＣＤＲ同定スキームのいずれかに従って、ＣＤＲを同定する目的で抗体の残基を付番するために、抗体配列の相同性領域で、選択したＣＤＲ同定スキームに対する当該技術分野で既知の「標準」付番された配列に抗体をアラインさせることができる。フレームワーク残基の最大アラインメントは、Ｆｖ領域に使用するために付番システムに「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。さらに、任意の所与の部位番号における特定の個々の残基の同一性は、種間または対立遺伝子の分岐により、抗体鎖ごとに異なる場合がある。残基の付番のためのこれらの均一な付番システムは、本明細書では明示的に使用していないが、開示された配列及び同定されたＣＤＲに基づいて、容易に使用することができる。
【０１７６】
特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片）はＫａｂａｔ  ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸残基３１〜３５に対応するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸残基５０〜６６に対応するＶＨ  ＣＤＲ２、及び／または配列番号１７のアミノ酸残基９９〜１０５に対応するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。このアミノ酸残基の付番は、配列番号１７の線状アミノ酸配列を参照していることに言及しておく。当業者は、Ｋａｂａｔシステムを容易に使用して、Ｋａｂａｔ付番を使用してそれらの残基を同定することができる。特定の実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、配列番号１８のアミノ酸残基２４〜３８に対応するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸残基５４〜６０に対応するＶＬ  ＣＤＲ２、及び／または配列番号１８のアミノ酸残基９３〜１０１に対応するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。このアミノ酸残基の付番は、配列番号１８の線状アミノ酸配列を参照していることに言及しておく。当業者は、Ｋａｂａｔシステムを容易に使用して、Ｋａｂａｔ付番を使用してそれらの残基を同定することができる。
【０１７７】
特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、ＩＭＧＴシステムを使用して定義されたＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸残基２６〜３３に対応するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸残基５１〜５８に対応するＶＨ  ＣＤＲ２、及び／または配列番号１７のアミノ酸残基９７〜１０５に対応するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。このアミノ酸残基の付番は、配列番号１７の線状アミノ酸配列を参照していることに言及しておく。特定の実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、配列番号１８のアミノ酸残基２７〜３６に対応するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸残基５４〜５６に対応するＶＬ  ＣＤＲ２、及び／または配列番号１８のアミノ酸残基９３〜１０１に対応するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。このアミノ酸残基の付番は、配列番号１８の線状アミノ酸配列を参照していることに言及しておく。特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、前述のＣＤＲの６つすべてを含む。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、前述のＣＤＲのうちの４つ、ならびに配列番号３７に記載のＶＨ  ＣＤＲ２及び配列番号３９に記載のＶＬ  ＣＤＲ２を含む。
【０１７８】
特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ同定スキームを使用して決定された３Ｅ１０のＣＤＲ（例えば、配列番号１９〜２４に記載のＣＤＲ）のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを含む。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３７に記載のＶＨ  ＣＤＲ２及び／または配列番号３８に記載のＶＬ  ＣＤＲ２及び／または配列番号３９に記載のＶＬ  ＣＤＲ１をさらに含む。特定の実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、ＩＭＧＴ同定スキームを使用して決定された３Ｅ１０のＣＤＲ（例えば、配列番号２７〜３２に記載のＣＤＲ）のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを含む。特定の実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ同定スキームを使用して決定された３Ｅ１０の６つすべてのＣＤＲを含む（例えば、配列番号１９〜２４を含む）。他の実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、ＩＭＧＴ同定スキームを使用して決定された３Ｅ１０の６つすべてのＣＤＲ（例えば、配列番号２７〜３２として示されているＣＤＲ）を含む。前述のいずれかに関して、特定の実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの同じ標的）に結合する抗体であり、及び／または内在化モイエティは、抗原（例えば、ＤＮＡ）への結合について３Ｅ１０と競合する。例示的な抗体及び抗原結合断片は、ＥＮＴ２及び／またはＥＮＴ３を介して細胞を通過することができる。特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、前述のＣＤＲのうちの６つを含むが、１つ以上のＣＤＲに１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を含む。例えば、抗体または抗原結合断片は、３つのＣＤＲ置換、すなわち、３つのＣＤＲのそれぞれに１つの置換を含む。
【０１７９】
特定の実施形態では、本開示の抗体もしくは抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体もしくはヒト化抗原結合断片）は、ＩＭＧＴ付番を使用して１つ以上のＣＤＲに（例えば、１〜２つ、１〜３つ、１〜４つ、もしくは１〜５つの改変を有するような配列番号２７〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲに）、またはＫａｂａｔ付番を使用して１つ以上のＣＤＲに（例えば、１〜２つ、１〜３つ、１〜４つ、もしくは１〜５つの改変を有するような、配列番号１９〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲに）少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片）は、Ｋａｂａｔ付番を使用して１つ以上のＣＤＲに（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの改変を有するような配列番号１９〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲに）少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号１８の線状アミノ酸配列と比較し、それに対して付番した場合に、次のアミノ酸改変、すなわちＭ３７Ｌ、Ｈ３８ＡまたはＥ５９Ｑのうちの１つ以上を含むＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片のいずれかは、配列番号１７の線状アミノ酸配列と比較し、それに対して付番した場合にＴ６３Ｓ改変を含むＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号１８の線状アミノ酸配列と比較し、それに対して付番した場合にＥ５９Ｑ改変を含むＶＬドメイン、及び配列番号１７の線状アミノ酸配列と比較し、それに対して付番した場合にＴ６３Ｓ改変を含むＶＨドメインを含む。
【０１８０】
理論に束縛されることを望まないが、本開示の驚くべき知見の１つは、マウス３Ｅ１０と比べてＤＮＡ結合活性が向上し、かつ特定のＫａｂａｔ  ＣＤＲにおけるアミノ酸改変（ここでは置換）をさらに含む抗体及びそれらの抗原結合断片を作り出す能力である。さらに、特定の実施形態では、ＣＤＲ置換を有するこれらの向上した抗体は、特定の実施形態ではまた、ヒト化されている。
【０１８１】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗体断片などの本開示の内在化モイエティは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体のＶＨ及びＶＬを有する抗体またはｓｃＦｖまたはＦｖと比較して、より高い親和性で所与のＤＮＡ基質に結合する。特定の実施形態では、本開示の方法で使用するための内在化モイエティは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９の下でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体のＶＨ及びＶＬを有する抗体または抗体断片ではない。いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための内在化モイエティは、マウス抗体または抗体断片ではない。
【０１８２】
特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ同定スキームを使用して決定された、配列番号１７に記載の対応するＣＤＲと異なるＣＤＲを少なくとも１つ含む可変重鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なるＣＤＲは、配列番号３７に記載のＶＨ  ＣＤＲ２である。
【０１８３】
特定の実施形態では、本開示の抗体及び抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ同定スキームを使用して決定された、配列番号１８に記載の対応するＣＤＲと異なるＣＤＲを少なくとも１つ含む可変軽鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なるＣＤＲは、配列番号３８に記載のＶＬ  ＣＤＲ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なるＣＤＲは、配列番号３９に記載のＶＬ  ＣＤＲ２である。
【０１８４】
アクセプターがヒト免疫グロブリンに由来する場合、ドナーフレームワーク配列との相同性に基づいて選択されるヒトフレームワーク配列を、ヒトフレームワーク配列のコレクション内の様々なヒトフレームワーク配列にドナーフレームワーク配列をアラインさせることにより任意で選択して、最も相同なフレームワーク配列をアクセプターとして選択することができる。アクセプターヒトフレームワークは、公共データベースで入手可能なヒト抗体生殖系列配列に由来するか、またはその配列から派生するものでもよい。ヒト化抗体またはヒト化抗体断片を作製するために使用される特定の方法にかかわらず、抗体を評価して、（ｉ）親のマウス抗体の所望の機能を保持している（または所望により、機能が向上している）、（ｉｉ）作製または使用を困難にする有害な特性がない、及び好ましくは（ｉｉｉ）マウスの親抗体と比較して、１つ以上の有利な特性を有することを確認しなければならない。特定のヒト化抗体についてこれらのいずれかまたはすべてが生じるかどうか、及びその程度は予測不能で不確実である。これは、置換がＣＤＲにも導入される場合に特に当てはまる。さらに、ヒト化抗体またはヒト化抗体断片のパネルの中には、必要な活性を持たないものもあり、必要な活性を有する１つ以上の抗体は、他のヒト化抗体と比較して有利な特性を有する場合がある。このことも、予測不能で不確実である。
【０１８５】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、ＶＬドメインはヒト化されており、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含み（これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに準拠する）、
ＶＨドメインはヒト化されており、
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み、これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに準拠しており、抗体または抗原結合断片は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むマウス３Ｅ１０抗体のものと比較して、ＤＮＡ結合性及び／または細胞透過性が向上している。
【０１８６】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、ＶＨドメインは、
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムに準拠しており、
ＶＬは、
配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムに準拠しており、
抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合する。
【０１８７】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、ＶＨドメインは、
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔに準拠しており、
ＶＬは、
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔに準拠しており、
抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合する。
【０１８８】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、細胞を透過する（例えば、形質膜を通過してＥＮＴ２を発現している細胞などの細胞に進入することができる）。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＶＨドメインはヒト化されている。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインはヒト化されている。
【０１９０】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または配列番号３５と比較して、ＩＭＧＴシステムによって定義されたフレームワーク領域内に合計１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸置換、挿入及び／または欠失が存在することにより配列番号３５と異なるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号３と比較して、ＩＭＧＴシステムによって定義されたフレームワーク領域内に合計１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸置換、挿入及び／または欠失が存在することにより配列番号３と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１９１】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、または配列番号３３と比較して、ＩＭＧＴシステムによって定義されたフレームワーク領域内に合計１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸置換、挿入及び／または欠失が存在することにより配列番号３３と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列、または配列番号３４と比較して、ＩＭＧＴシステムによって定義されたフレームワーク領域内に合計１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸置換、挿入及び／または欠失が存在することにより配列番号３４と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号２と比較して、ＩＭＧＴシステムによって定義されたフレームワーク領域内に合計１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸置換、挿入及び／または欠失が存在することにより配列番号２と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１９２】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＬドメインはヒト化されており、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＨドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。
【０１９３】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＬドメインはヒト化されており、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＨドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。
【０１９４】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＨドメインはヒト化されており、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＬドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。
【０１９５】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＨドメインはヒト化されており、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＬドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。
【０１９６】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＨドメインは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＬドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。
【０１９７】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＨドメインはヒト化されており、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＬドメインは、配列番号３に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。
【０１９８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片のＶＨドメインは、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【０１９９】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片のＶＬドメインは、
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＬドメインは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＨドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＬドメインは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＨドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＨドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＬドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＨドメインは、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＬドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、このＶＨドメインは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含み、このＶＬドメインは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、この抗体または抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、細胞を透過する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＨドメイン及びｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及びｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及びｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むヒト化ＶＬドメインを含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、本明細書に開示されているＶＬ配列（例えば、配列番号３）のいずれかのＮ末端部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、軽鎖にコンジュゲートされるシグナル配列は、配列番号５である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、本明細書に開示されているＶＨ配列（例えば、配列番号２）のいずれかのＮ末端部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、重鎖にコンジュゲートされるシグナル配列は、配列番号４である。抗体または抗体断片の発現のためにシグナル配列が含まれる場合、そのシグナル配列は一般に切断され、完成したポリペプチド中に存在しないことが理解される（例えば、シグナル配列は一般に切断され、タンパク質の産生中に一時的にのみ存在する）。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示の抗体または抗原結合断片のいずれかのＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番した以下のアミノ酸改変、すなわち、Ｖ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｖ１２Ｉ、Ｋ１３Ｑ、Ｒ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｖ３７Ｉ、Ｅ４２Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｔ６３Ｓ、Ａ７５Ｓ、Ｆ８０Ｙ、Ｔ８４Ｎ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｔ１１１Ｌ、またはＬ１１２Ｖのうちの１つ以上を含む。換言すれば、特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、１つ以上のアミノ酸改変を前述と対応する位置に含み、この対応する位置を配列番号１７と比較する。特定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番した以下のアミノ酸改変、すなわち、Ｖ５Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｋ１３Ｑ、Ｒ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｖ３７Ｉ、Ｅ４２Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｔ６３Ｓ、Ａ７５Ｓ、Ｆ８０Ｙ、Ｔ８４Ｎ、Ｍ９３Ｖ、Ｔ１１１Ｌ、またはＬ１１２Ｖのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番した当該改変を、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、または少なくとも１７個含む。特定の実施形態では、ＶＨドメイン内の改変の少なくとも１つは、配列番号１７のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番したＶ５Ｑ改変である。特定の実施形態では、ＶＨドメイン内の改変の少なくとも１つは、配列番号１７のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番したＥ６Ｑ改変である。特定の実施形態では、ＶＨドメイン内の改変の少なくとも１つは、配列番号１７のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番したＬ１１Ｖ改変である。特定の実施形態では、ＶＨドメイン内の改変の少なくとも１つは、配列番号１７のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番したＶ３７Ｉ改変である。特定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸位置８８に対応するアミノ酸位置にセリンを保持する。特定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸位置１２に対応するアミノ酸位置にバリンを保持する。特定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸位置４７に対応するアミノ酸位置にトリプトファンを保持する。ＶＬについて本明細書にて提供される任意の態様及び実施形態の組み合わせと同様に、前述のすべての使用可能な組み合わせが企図される。前述のアミノ酸残基の付番は、所与のＶＨの線状アミノ酸配列を参照しており、本開示は、マウスの親ＶＨまたはＶＬにおける列挙された位置に対応する位置に、列挙された置換の１つ以上を有するヒト化抗体及びヒト化抗原結合断片を企図する。
【０２０４】
前述のいずれか、または本明細書に開示される態様及び実施形態のいずれかの特定の実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片のいずれかのＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番した以下のアミノ酸改変、すなわち、Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ａ９Ｓ、Ａ１２Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｌ１５Ｖ、Ｑ１７Ｄ、Ａ１９Ｖ、Ｓ２２Ｔ、Ｍ３７Ｌ、Ｈ３８Ａ、Ｇ４５Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｐ４７Ａ、Ｅ５９Ｑ、Ａ６４Ｓ、Ｈ７６Ｔ、Ｎ７８Ｔ、Ｈ８０Ｓ、Ｐ８１Ｓ、Ｖ８２Ｌ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８４Ｐ、Ａ８７Ｖ、Ａ８７Ｆ、またはＧ１０４Ａのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番した以下のアミノ酸改変、すなわち、Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ａ９Ｓ、Ａ１２Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｌ１５Ｖ、Ｑ１７Ｄ、Ａ１９Ｖ、Ｇ４５Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｐ４７Ａ、Ｅ５９Ｑ、Ａ６４Ｓ、Ｈ７６Ｔ、Ｎ７８Ｔ、Ｈ８０Ｓ、Ｐ８１Ｓ、Ｖ８２Ｌ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８４Ｐ、Ａ８７Ｖ、またはＧ１０４Ａのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と比較しこのアミノ酸配列を参照して付番した当該改変を、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、または少なくとも２２個含む。
【０２０５】
特定の位置での前述のいずれかの変異は、配列番号１７または配列番号１８に記載のアミノ酸配列と比較して示されることを理解されたい。本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号１８または配列番号１７のアミノ酸配列と比較して対応する位置に、そのようなアミノ酸改変のうちの１つ以上を含み得る。例として、特定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７の位置１１に対応する位置でのＬからＶへの改変（例えば、Ｌ１１Ｖ改変）を含む。これは、前述の改変のすべてをさらに説明することができる方法の例示であり、そのような説明は明示的に企図されている。別の例として、特定の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１８の位置３に対応する位置でのＶからＱへの改変（例えば、Ｖ３Ｑ改変）を含む。
【０２０６】
特定の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸位置８０及び８１に対応する各アミノ酸位置にセリンを含む。特定の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸位置５３に対応するアミノ酸位置にリシンを保持する。特定の実施形態では、ＶＬドメインは、以下のアミノ酸の組み合わせ、すなわち、
ａ）配列番号１８のアミノ酸位置８０及び８１のそれぞれに対応するアミノ酸位置のアスパラギン及びセリン、または
ｂ）配列番号１８のアミノ酸位置８０及び８１のそれぞれに対応するアミノ酸位置のアスパラギン及びグリシン、または
ｃ）配列番号１８のアミノ酸位置８０及び８１のそれぞれに対応するアミノ酸位置のアスパラギン及びプロリン、のうちの１つ以上を有さない。ＶＨについて本明細書にて提供される任意の態様及び実施形態の組み合わせと同様に、前述のすべての使用可能な組み合わせが企図される。前述のアミノ酸残基の付番は、所与のＶＨの線状アミノ酸配列を参照しており、本開示は、マウスの親ＶＨまたはＶＬにおける列挙された位置に対応する位置に、列挙された置換の１つ以上を有するヒト化抗体及びヒト化抗原結合断片を企図する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティ（例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片）は、参照非ヒト化内在化モイエティ（例えば、マウスの親３Ｅ１０抗体）と比較して、少なくとも１つの優れた生理学的または生物学的特性を伴う。他の実施形態では、ヒト化内在化モイエティは、参照非ヒト化内在化モイエティと比較して、少なくとも２つの優れた生理学的または生物学的特性を伴う。他の実施形態では、ヒト化内在化モイエティは、参照非ヒト化内在化モイエティ（例えば、マウスの親３Ｅ１０抗体）と比較して、少なくとも３つの優れた生理学的または生物学的特性を伴う。いくつかの実施形態では、参照非ヒト化内在化モイエティは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含むマウス親抗体を含む。いくつかの実施形態では、参照ヒト化内在化モイエティは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、参照ヒト化内在化モイエティは、配列番号４１のＶＨアミノ酸配列及び配列番号４０のＶＬアミノ酸配列を含むヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片である。
【０２０８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合断片は、ヒト化しており、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含むマウス抗体と比較して、及び／または代替抗体もしくはその抗原結合断片と比較して少なくとも１つの優れた生物学的もしくは生理学的特性を伴い、ここで、当該代替抗体もしくは抗原結合断片は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列のＣＤＲを含むＶＬドメイン及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ならびに当該代替抗体もしくは断片は、配列番号３もしくは配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含まず、及び／または当該代替抗体もしくは断片は、配列番号２、配列番号３３もしくは配列番号３４のいずれかのアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含まず、あるいは、いくつかの実施形態では、当該代替抗体もしくは断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含まず、及び／または当該代替抗体もしくは断片は、配列番号２のいずれかのアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含まない。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本開示のヒト化内在化モイエティ（例えば、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む）は、代替内在化モイエティまたはその断片（例えば、同じ親のマウス抗体に基づき、場合により同じＣＤＲを有する異なるヒト化抗体）と比較して、少なくとも１つの優れた生理学的または生物学的特性を伴う。他の実施形態では、本開示のヒト化内在化モイエティは、代替ヒト化内在化モイエティ（例えば、同じ親のマウス抗体に基づき、場合により同じＣＤＲを有する異なるヒト化抗体）と比較して、少なくとも２つの優れた生理学的または生物学的特性を伴う。他の実施形態では、本開示のヒト化内在化モイエティは、代替ヒト化内在化モイエティ（例えば、同じ親のマウス抗体に基づき、場合により同じＣＤＲを有する異なるヒト化抗体）と比較して、少なくとも３つの優れた生理学的または生物学的特性を伴う。いくつかの実施形態では、代替抗体は、ヒト化抗体が由来する親抗体（例えば、親のマウス抗体）である。いくつかの実施形態では、代替抗体は、３Ｅ１０抗体に由来するが本開示のヒト化内在化モイエティまたはその抗原結合断片とは異なるアミノ酸配列を有する、別のヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、マウス親抗体及び／または代替ヒト化抗体と比較して、１つ以上の特性が向上している。いくつかの実施形態では、代替ヒト化抗体は、本開示の抗体と比較して、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲに、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、代替内在化モイエティまたはその断片は、
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み、これらのＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されているが、本開示のヒト化内在化モイエティまたはその断片（例えば、配列番号２、配列番号３、または配列番号３８〜４０のいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化内在化モイエティまたはその断片）に存在するものと同じ足場アミノ酸配列を含まない。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ヒト患者における非ヒト化のものの免疫原性と比較して、または代替抗体もしくは抗原結合断片の免疫原性と比較して、ヒト患者における免疫原性の低減を伴うことである。当業者は、抗体の免疫原性を測定するための多数のアッセイに精通している。好ましい実施形態では、本開示のヒト化抗体は、ヒト患者における免疫原性の低減を伴うが、マウス３Ｅ１０抗体に伴う細胞透過特性を保持する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化のものの溶解性と比較して、または代替抗体もしくは抗原結合断片の溶解性と比較して、溶解性の向上を伴うことである。本明細書で使用する場合、生理学的に許容可能な担体には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％高い溶解性を伴う。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の溶解性を試験するために利用することができる日常的実験を承知している。溶解度アッセイの例には、標準的な濁度アッセイもしくは光散乱アッセイ、ＯｐｔｉＳｏｌ（商標）溶解度アッセイキット（ＤｉＬｙｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）などの市販の溶解度アッセイが含まれるが、またはＢｏｎｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１６：２２３−２３１に記載されているタンパク質溶解度アッセイスクリーニングを利用してもよい。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型において、同じ細胞型における非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片の発現レベルと比較して、高い発現レベルを伴うことである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、ある細胞において、同じ細胞型における非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片の発現レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％高い発現レベルを伴う。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の発現レベルを試験するために利用することができる日常的実験を承知している。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型において、同じ細胞型における非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片に伴う毒性と比較して、低い毒性（例えば、細胞毒性及び／または遺伝子毒性）を伴うことである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、同じ細胞型における非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片の毒性と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％低い毒性を伴う。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物などの生物に存在する。いくつかの実施形態では、細胞は、人体中のヒト細胞である。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の毒性を試験するために利用することができる日常的実験を承知している。例えば、本開示のヒト化内在化モイエティもしくはヒト化断片及び非ヒト化内在化モイエティもしくは代替内在化モイエティまたはそれらの断片の毒性は、ヒト細胞由来の細胞もしくは細胞培養物中などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞もしくは細胞培養物で試験することができ、またはマウスもしくはラットなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ動物モデルで試験することもできる。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片の凝集と比較して、凝集の減少を伴うことである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％低い凝集を伴う。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体中のヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、少なくとも１時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、２日後、５日後、１週間後、２週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後または１年後の凝集の減少を伴う。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の凝集を試験するために利用することができる日常的実験を承知している。凝集アッセイの例には、標準的な濁度アッセイもしくは光散乱アッセイ（例えば、Ａ６００ｎｍアッセイ）、目視検査、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＯｐｔｉＳｏｌ（商標）凝集アッセイキット（ＤｉＬｙｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）などの市販の凝集アッセイ、ＨＰ−ＳＥＣ分析が含まれるが、または、Ｂｏｎｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１６：２２３−２３１に記載されているタンパク質凝集アッセイスクリーニングを利用してもよい。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片の安定性と比較して、安定性の向上を伴うことである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、ある生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％高い安定性を伴う。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体におけるヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも１時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、２日後、５日後、１週間後、２週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後または１年後の安定性の向上を伴う。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の安定性を試験するために利用することができる日常的実験を承知している。例えば、当業者は、ヒト化内在化モイエティ及び非ヒト化内在化モイエティもしくは代替内在化モイエティまたはそれらの断片の安定性を、生理学的に許容可能な担体中に様々な間隔で保存された後に、試験することができる。ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（商標）サーマルシフト安定性アッセイ（Ｅｎｚｏ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）などの市販のアッセイを利用して、モイエティまたはその断片の安定性を評価することができる。あるいは、モイエティまたはその断片の安定性は、ＨＰ−ＳＥＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定することができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片の細胞透過性と比較して、細胞透過性の向上を伴うことである。いくつかの実施形態では、透過性の向上は、ＥＮＴ輸送体（例えば、ＥＮＴ２及び／またはＥＮＴ３輸送体）によって内在化されるヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片の効率の向上によるものである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％高い細胞透過性を伴う。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の細胞透過性を試験するために利用することができる日常的実験を承知している。例えば、ヒト化内在化モイエティまたはその断片を標識（例えば、蛍光標識または放射標識）してヒト化内在化モイエティまたはその断片の細胞透過性を測定するために、細胞または細胞培養物に投与することができる。あるいは、ヒト化内在化モイエティまたはその断片を細胞または細胞培養物に投与して、次に、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の細胞透過性を測定するために、二次作用物質（例えば、蛍光標識または放射標識した二次抗体）で検出することができる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型において、同じ細胞型における非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片のグリコシル化と比較して、グリコシル化の減少を伴うことである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体またはヒト化抗体断片のＮ−結合型グリコシル化を減少させるために、アスパラギンをＶＨドメインまたはＶＬドメイン内の別のアミノ酸残基に変異させる。他の実施形態では、本明細書に記載のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型において、同じ細胞型における非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片のグリコシル化と比較して、グリコシル化の増加を伴うことである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型において、同じ細胞型における非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片のグリコシル化パターンと異なる特定のグリコシル化パターンを伴うことである。例えば、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片は、ある細胞型においてヘミグリコシル化され得るが、一方で、非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片は、同じ細胞型においてヘミグリコシル化されていない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型において、同じ細胞型における非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片の翻訳後修飾とは異なる、特定のグリコシル化基で翻訳後修飾されることである。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片のグリコシル化パターンを試験するために利用することができる日常的実験を承知している。内在化モイエティ及びその断片のグリコシル化レベル及びグリコシル化パターンを試験するための実験の例には、Ｍｏｈａｍｍａｄ，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，７９５〜８０２ページに記載されているプロトコール、質量分析及び／またはＨＰＬＣを含む標準的方法、ＧＬＹＣＯ−ＰＲＯＴＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびにＱｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＫｉｔＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）が含まれる。タンパク質配列中のグリコシル化の正確な部位を特定するために、Ｚａｕｎｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ  Ｓｅｐ  Ｓｃｉ．，３３：９０３−１０に記載されているプロトコールと同様に、標準的なエンドプロテアーゼ切断（例えば、トリプシン消化）を実施し���次いでＬＣ／ＭＳまたはＨＩＬＩＣ−ＭＳ／ＭＳで分析することができる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片の脱アミド化と比較して、脱アミド化の減少を伴うことである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％低い脱アミド化を伴う。いくつかの実施形態では、ある薬学的に許容可能な担体におけるヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも１時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、２日後、５日後、１週間後、２週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後または１年後の脱アミド化の減少を伴う。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の脱アミド化を試験するために利用することができる日常的実験を承知している。タンパク質の脱アミド化を試験するためのアッセイの例には、ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）イソアスパラギン酸検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）またはＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００チタンシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）などの市販の脱アミド化アッセイが含まれる。他のアッセイとしては、ペプチドマッピングを挙げることができる。概して、Ｋａｌｇａｈｔｇｉ，Ｋ．，＆  Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｃ．“Ｒａｐｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４４３，３４３−３５４（１９８８）を参照されたい。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片の酸化と比較して、酸化の減少を伴うことである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、ある生理学的に許容可能な担体中で、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％低い酸化を伴う。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体におけるヒト化抗体またはヒト化抗原結合断片は、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも１時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、２日後、５日後、１週間後、２週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後または１年後の酸化の減少を伴う。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の酸化を試験するために利用することができる日常的実験を承知している。例えば、酸化レベルは、メチオニンスルホキシド免疫ブロッティングキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）などのいくつかの市販の酸化アッセイのいずれかを使用して評価することができる。他のアッセイとしては、ペプチドマッピングを挙げることができる。概して、Ｋａｌｇａｈｔｇｉ，Ｋ．，＆  Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｃ．“Ｒａｐｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４４３，３４３−３５４  （１９８８）を参照されたい。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型において産生される場合、同じ細胞型で産生される場合の非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片の脂質化と比較して、脂質化の減少を伴うことである。他の実施形態では、本明細書に記載のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型中で産生される場合、同じ細胞型中で産生される場合の非ヒト化抗体もしくは非ヒト化抗原結合断片または代替抗体もしくは代替抗原結合断片の脂質化と比較して、脂質化の増加を伴うことである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型中で産生される場合、同じ細胞型中で産生される場合の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片の脂質化パターンと異なる特定の脂質化パターンを伴うことである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、ある細胞型中で産生される場合、同じ細胞型中で産生される場合の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片の翻訳後修飾とは異なる、特定の脂質化基で翻訳後修飾されることである。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の脂質化パターンを試験するために利用することができる日常的実験を承知している。例えば、内在化モイエティまたはその断片は、Ｇｅｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１〜２５６ページに記載されているプロトコールによって評価することができる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本開示のヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片に伴う優れた生物学的または生理学的特性は、このヒト化内在化モイエティまたはヒト化抗原結合断片が、非ヒト化の親抗体もしくは断片または代替抗体もしくは断片、例えば異なるヒト化抗体の結合親和性と比較して、高い親和性（低いＫＤ）でポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に結合することができることである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化モイエティまたはヒト化断片は、同種の生理学的に許容可能な担体中の非ヒト化内在化モイエティもしくは非ヒト化抗原結合断片または代替内在化モイエティもしくは代替抗原結合断片と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％または３００％高いポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ；二本鎖平滑ＤＮＡ）に対する結合親和性を伴う。当業者は、ヒト化内在化モイエティまたはその断片の結合親和性（ＫＤ）を試験するために利用することができる日常的実験を承知している。結合親和性は、現行の標準的な方法及び製造業者のプロトコールに従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を使用して測定することができる。
【０２２２】
ホーミングペプチド
特定の態様では、内在化モイエティは、対象のキメラアルファ−アミラーゼポリペプチドを標的組織（例えば、筋肉）に選択的に導くホーミングペプチドを含み得る。例えば、キメラポリペプチドの筋肉への送達は、ＡＳＳＬＮＩＡのアミノ酸配列を含むホーミングペプチドによって媒介され得る。さらなる例示的なホーミングペプチドは、ＷＯ９８／５３８０４に開示されている。標的組織（または器官）に対するホーミングペプチドは、当該技術分野で周知の様々な方法を使用して同定することができる。ホーミングペプチドのさらなる例としては、核局在化配列Ｔａｔ４８−６０を含むＨＩＶ転写トランスアクチベーター（ＴＡＴ）、ショウジョウバエアンテナペディア転写因子ホメオドメイン（例えば、Ａｎｔｐ４３−５８ホメオドメイン第３ヘリックスを含むペネトラチン）、ホモアルギニンペプチド（例えば、虚血ラット心臓のＡｒｇ７ペプチド−ＰＫＣ−εアゴニスト保護）、アルファ−ヘリックスペプチド、カチオン性ペプチド（「超正」電荷を持つタンパク質）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ホーミングペプチドは、受動拡散型ヌクレオシド（ＥＮＴ）輸送体を介して細胞膜を通過する。いくつかの実施形態では、ホーミングペプチドは、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４輸送体を介して細胞膜を通過する。いくつかの実施形態では、ホーミングペプチドは、ＥＮＴ２を標的とする。他の実施形態では、ホーミングペプチドは、筋細胞を標的とする。ホーミングペプチドによって標的化される筋細胞には、骨格筋細胞、心筋細胞または平滑筋細胞が含まれ得る。他の実施形態では、ホーミングペプチドは、神経細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞またはライディッヒ細胞を標的とする。
【０２２３】
特定の実施形態では、ホーミングペプチドは、ポリヌクレオチドに結合することができる。特定の実施形態では、ホーミングペプチドは、ＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、ホーミングペプチドは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。特定の実施形態では、ホーミングペプチドは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡに結合することができる。
【０２２４】
加えて、標的組織（または器官）に対するホーミングペプチドは、当該技術分野において周知の様々な方法を使用して同定することができる。同定されると、特定の実施形態において、特定の標的組織に対して選択的であるホーミングペプチドを使用することができる。
【０２２５】
例示的な方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏファージディスプレイ法である。具体的には、ランダムペプチド配列をファージの表面タンパク質との融合ペプチドとして発現させ、このランダムペプチドのライブラリーを体循環に注入する。宿主マウスへの注入後、標的組織または器官を摘出し、次いでファージを単離して、増殖させ、この注射手順をさらに２回繰り返す。注射されたウイルスが組織にランダムに結合する可能性、または非標的組織に特異的に結合する可能性のいずれかがあることから、各注射ラウンドは、デフォルトで陰性選択構成成分を含む。非標的組織に特異的に結合するウイルス配列は、選択プロセスによって迅速に除去されることになり、その一方で非特異的結合ファージの数は、各選択ラウンドに伴って減少する。多くの研究室が脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、腸、子宮、副腎、網膜、筋肉、前立腺または腫瘍の脈管構造に対して選択的であるホーミングペプチドを同定した。例えば、Ｓａｍｏｙｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，２２：４６０、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：３６４、Ｋｏｉｖｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：２６５、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３０：１１８９、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌｅ．Ｐｓｙｃｈ．，１：４２１，４２３、Ｒａｊｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：４３０、Ｒａｊｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１１５９３を参照されたい。さらに、米国特許第５，６２２，６９９号、同第６，０６８，８２９号、同第６，１７４，６８７号、同第６，１８０，０８４号、同第６，２３２，２８７号、同第６，２９６，８３２号、同第６，３０３，５７３号、同第６，３０６，３６５号も参照されたい。上記のいずれかの組織を標的化するホーミングペプチドを、アルファ−アミラーゼタンパク質をその組織に対して標的化するために使用してよい。
【０２２６】
リソソーム及びオートファジー小胞へのさらなる標的化
リソソームへのタンパク質の従来の標的化方法は、Ｍ６Ｐ残基によるタンパク質の改変であり、この方法は、Ｍ６Ｐ残基とゴルジ体または後期エンドソームなどの構造の内表面上のＭ６ＰＲ分子との相互作用によって、リソソームへのタンパク質の輸送を導く。リソソームへの内在性アルファ−アミラーゼの輸送は、Ｍ６ＰとＭ６ＰＲとの相互作用に依存する。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチド（例えば、アルファ−アミラーゼ；及び内在化モイエティを含むポリペプチド）は、Ｍ６ＰＲを介した、またはＭ６ＰＲ非依存性経路内の、リソソームへのさらなる標的化を促進するような改変をさらに含み得る。そのような標的化モイエティを、例えば、キメラポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、３Ｅ１０またはアルファ−アミラーゼへのコンジュゲーションを介して、付加させることができる。他の実施形態では、キメラポリペプチドのアルファ−アミラーゼ部分は、Ｍ６Ｐ輸送を促進するための内在性配列のすべてまたは一部を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、オートファジーの細胞プロセスを介してリソソームへ輸送される。オートファジーは、リソソーム機構による不必要なまたは機能不全の細胞成分の細胞分解に関与する異化メカニズムである。このプロセス中に、標的細胞質成分は、細胞の他の部分からオートファゴソームと称される小胞内へと分離され、このオートファゴソームは、その後、リソソームと融合され、分解または再循環される。オートファジー小胞へのタンパク質の取り込みは、細胞の標的領域周囲の膜の形成、及びそれに続くリソソームとの小胞の融合によって媒介される。細胞小器官及びタンパク質がオートファジー液胞と称される小胞の中の細胞内に捕捉されるマクロオートファジーを含む、いくつかのオートファジーに関するメカニズムが知られている。リソソームと融合すると、オートファジー液胞の内容物は、酸性リソソーム加水分解酵素によって分解される。ミクロオートファジーでは、リソソームが細胞質を直接貪食し、シャペロン介在性オートファジーでは、コンセンサスペプチド配列を有するタンパク質にｈｓｃ７０含有シャペロン−シャペロン補助因子複合体が結合し、その複合体がリソソームタンパク質によって認識され、リソソーム膜を越えて移動される。オートファジー液胞は、酵素の活性の助けとなるリソソーム環境（低ｐＨ）を有する。
【０２２８】
オートファジーは哺乳動物の筋細胞において天然に発生する（Ｍａｓｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１０（６）：５０７−１５）。オートファジー液胞は細胞質からタンパク質を取り込むことから、本開示のキメラポリペプチドは、グリコーゲン含有オートファジー小胞によって取り込まれると予想され、そこで、このキメラポリペプチドはそれらの空胞内に存在するあらゆるグリコーゲンを自由に分解することになる。したがって、いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、いずれのオートファジー液胞特異的標的化モチーフも付加せずにオートファジー液胞によって取り込まれることが可能である。
【０２２９】
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、オートファジー小胞へのさらなる標的化を容易にするための改変をさらに含み得る。１つの既知のシャペロン標的化モチーフは、ＫＦＥＲＱ様モチーフである。したがって、このモチーフを本明細書に記載のキメラポリペプチドに付加させて、ポリペプチドをオートファジーの標的にすることができる。そのような標的化モイエティを、例えば、キメラポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、３Ｅ１０またはアルファ−アミラーゼへのコンジュゲーションを介して、付加させることができる。
【０２３０】
Ｍ６Ｐ残基またはシャペロン標的化モチーフを、アルファ−アミラーゼポリペプチドに付加させることができる。
【０２３１】
ＩＩＩ．キメラポリペプチド
本開示は、内在化モイエティ部分と非内在化モイエティ部分とを含むキメラポリペプチドを提供する。上述のように、非内在化モイエティポリペプチド部分は、アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、成熟アルファ−アミラーゼ）を含むか、またはアルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、成熟アルファ−アミラーゼ）から構成される。あるいは、非内在化モイエティポリペプチド部分は、酸性アルファ−グルコシダーゼ（例えば、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ）を含むか、または酸性アルファ−グルコシダーゼ（例えば、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ）から構成される。内在化モイエティの多数の例、及び可能性のある非内在化モイエティポリペプチド部分のそれぞれが上述されており、キメラポリペプチドを生成するための内在化モイエティ部分及び非内在化モイエティポリペプチド部分のすべての適切な組み合わせが企図される。
【０２３２】
理論に束縛されるものではないが、アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、成熟アルファ−アミラーゼポリペプチド）または酸性アルファ−グルコシダーゼ（例えば、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ）の内在化モイエティ部分との会合は、キメラポリペプチドの細胞質への送達、したがって、非内在化モイエティ部分の細胞質への送達、及び場合により、リソソーム及び／またはオートファジー小胞への送達を促進する。特定の実施形態では、内在化モイエティは、アルファ−アミラーゼ活性を細胞へ送達する。特定の実施形態では、内在化モイエティは、酸性アルファ−グルコシダーゼ活性を細胞へ送達する。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼ含有キメラポリペプチド（例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチドを含むかまたはアルファ−アミラーゼポリペプチドから構成される非内在化モイエティ部分）を含む。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、酸性アルファ−グルコシダーゼ含有キメラポリペプチド（例えば、酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドを含むかまたは酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドから構成される非内在化モイエティ部分）を含む。本明細書に記載の内在化モイエティのいずれかを、本明細書に記載されているように非内在化モイエティポリペプチド部分のいずれかと組み合わせて、本開示のキメラポリペプチドを作製することができる。
【０２３３】
本開示は、キメラポリペプチド（例えば、本開示のキメラポリペプチド）を提供する。本明細書に開示される方法で使用するためのキメラポリペプチドは、様々な方法で作製することができる。キメラポリペプチドは、本明細書に開示される内在化モイエティ部分及びアルファ−アミラーゼポリペプチド部分のいずれかを含み得る。他の態様では、キメラポリペプチドは、本明細書に開示される内在化モイエティ部分及び酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド部分のいずれかを含み得る。本開示のキメラポリペプチドは、（ｉ）アルファ−アミラーゼポリペプチド部分及び（ｉｉ）内在化モイエティ部分を含み得る。あるいは、本開示のキメラポリペプチドは、（ｉ）酸性アルファ−グルコシダーゼ部分及び（ｉｉ）内在化モイエティ部分を含み得る。さらに、本明細書に開示されるキメラポリペプチドのいずれも、本明細書に開示される方法または組成物のいずれかにおいて使用することができる。いくつかの実施形態では、内在化モイエティ（例えば、抗体または抗原結合断片）は、本明細書に開示されるポリペプチド及び／または断片及び／または変異体のいずれかに直接または間接的に連結される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、成熟アルファ−アミラーゼであり、内在化モイエティのＣ末端に融合した配列番号１のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、Ｆａｂ内在化モイエティの重鎖セグメントのＣ末端に融合した配列番号１のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、完全長抗体内在化モイエティの重鎖セグメントのＣ末端に融合した配列番号１のアミノ酸配列、またはその変異体もしくは断片を含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドは、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼであり、内在化モイエティのＣ末端に融合した配列番号４９、配列番号５０、もしくは配列番号５１のアミノ酸配列、またはそれらの変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドは、Ｆａｂ内在化モイエティの重鎖セグメントのＣ末端に融合した配列番号４９、配列番号５０、もしくは配列番号５１のアミノ酸配列、またはそれらの変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドは、完全長抗体内在化モイエティの重鎖セグメントのＣ末端に融合した配列番号４９、配列番号５０、もしくは配列番号５１のアミノ酸配列、またはそれらの変異体もしくは断片を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、（ｉ）酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含み、この酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、この抗体または抗原結合断片が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、この重鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この軽鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、（ｉ）酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含み、この酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドが、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、この抗体または抗原結合断片が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、この重鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この軽鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、（ｉ）酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含み、この酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドが、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、この抗体または抗原結合断片が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、この重鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この軽鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、（ｉ）アルファ−アミラーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含み、このアルファ−アミラーゼポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、この抗体または抗原結合断片が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、この重鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この軽鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、（ｉ）アルファ−アミラーゼポリペプチド、及び（ｉｉ）内在化モイエティを含み、このアルファ−アミラーゼポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、この内在化モイエティが抗体または抗原結合断片であり、この抗体または抗原結合断片が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、この重鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、この軽鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号４のリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号５のリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、リーダー配列、例えば、プロセシングされたリーダー配列を含まないキメラポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼポリペプチドを内在化モイエティと相互連結させるリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、リーダー配列を欠いている（例えば、配列番号４のリーダー配列を欠いている）重鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、リーダー配列を欠いている（例えば、配列番号５のリーダー配列を欠いている）軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号７及び配列番号８の両方のアミノ酸配列を含む。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号９及び配列番号１０の両方のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号８及び配列番号４３の両方のアミノ酸配列を含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される成熟アルファ−アミラーゼポリペプチドまたはその断片もしくは変異体のいずれか、ならびに本明細書に開示される抗体または抗原結合断片のいずれかを含むキメラポリペプチド（例えば、配列番号８及び配列番号４３のアミノ酸配列を含むタンパク質）は、弱酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）で、参照野生型成熟アルファアミラーゼ（例えば、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるアルファ−アミラーゼ）と比較して高い生物活性（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、または２００％高い生物活性）を有する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、弱酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）で、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．０）における同じキメラポリペプチドの生物活性と比較して高い生物活性（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、または２００％高い生物活性）を有する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、弱酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）で、より酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ４．３）における同じキメラポリペプチドの生物活性と比較して高い生物活性（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、または２００％高い生物活性）を有する。いくつかの実施形態では、「弱酸性ｐＨ」とは、４．５〜６．５、４．８〜６．３、５．２〜６．２、５．３〜６．３、５．０〜６．０、５．２〜５．８、５．３〜５．７、５．４〜５．６の範囲または５．５からなる群から選択される範囲である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、４．５〜６．５、４．８〜６．３、５．２〜６．２、５．３〜６．３、５．０〜６．０、５．２〜５．８、５．３〜５．７、５．４〜５．６の範囲のｐＨまたはｐＨ５．５で、最も高い生物活性を有する。いくつかの実施形態では、生物活性は、キメラポリペプチドのアルファ−アミラーゼ部分がグリコーゲンを加水分解する能力である。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、本明細書にて提供される例示のセクションに記載されるアッセイと同様のグリコーゲン消化アッセイを使用して測定することができる。
【０２４０】
特定の実施形態では、可能性のある構成は、結合したアルファ−アミラーゼの機能的完全性を維持するために必要に応じて、抗体の重鎖及び軽鎖配列（例えば、ｍＡＢ  ３Ｅ１０）のトランケートされた部分の使用を含む。さらになお、内在化モイエティは、アルファ−アミラーゼまたはその断片及び／または変異体の露出した内部（非末端）残基に連結させることができる。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼ−内在化モイエティの構成の任意の組み合わせを用いることができ、それによって、１：１より大きいアルファ−アミラーゼ：内在化モイエティ比（例えば、２アルファ−アミラーゼ分子対１内在化モイエティ）が得られる。
【０２４１】
ポリペプチド（例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチドまたは酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド）及び内在化モイエティは、互いに直接連結させてもよい。あるいはそれらを、各ドメインが確実にその二次構造及び三次構造に適切にフォールディングするのに十分な距離だけアルファ−アミラーゼポリペプチドと内在化モイエティとを離隔するリンカー配列を介して、互いに連結させてもよい。好ましいリンカー配列は、（１）柔軟性のある伸長した立体構造をとるべきであり、（２）アルファ−アミラーゼポリペプチドまたは内在化モイエティの機能的ドメインと相互作用し得る、規則的二次構造を生じさせる傾向を示してはならず、かつ（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用を促進させることができる最小限の疎水性または荷電特性を有するべきである。柔軟性のあるタンパク質領域の典型的な表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒが含まれる。Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むアミノ酸配列の順列は、リンカー配列の上記基準を満たすことが予期される。他の中性に近いアミノ酸、例えば、Ｔｈｒ及びＡｌａも、リンカー配列に使用することができる。ある特定の実施形態では、約２０アミノ酸長のリンカー配列を使用して、機能性タンパク質ドメインの適切な離隔をもたらすことができるが、より長いまたはより短いリンカー配列を使用してもよい。アルファ−アミラーゼポリペプチドを内在化モイエティから離隔するリンカー配列の長さは、５〜５００アミノ酸長、またはさらに好ましくは５〜１００アミノ酸長であってよい。リンカー配列は、約５〜３０アミノ酸長であるのが好ましい。好ましい実施形態では、リンカー配列は、約５〜約２０アミノ酸であり、約１０〜約２０アミノ酸が好都合である。他の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドを内在化モイエティに連結させるリンカーは、抗体の定常ドメイン（例えば、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の定常ドメインまたは別の抗体のＦｃ領域の全体もしくは一部）である場合がある。特定の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。特定の実施形態では、リンカー配列は、配列番号６のリンカー配列を含む。特定の実施形態では、内在化モイエティは、抗体または抗体断片であり、コンジュゲーションは、抗体または抗体断片の重鎖の定常ドメインなどの定常ドメインへの化学的コンジュゲーションまたは組換えによるコンジュゲーションを含む。このような実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチド及び内在化モイエティは、抗体または抗体断片の重鎖と軽鎖の間の会合を介してさらに会合され得ることが理解される。このこともまた、コンジュゲーションの範囲内に含まれる。
【０２４２】
他の実施形態では、ポリペプチド（例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチドもしくは酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド）またはその機能的断片は、内在化モイエティに直接コンジュゲートまたは連結され得る。例えば、組換えによりコンジュゲートされたキメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼ部分と内在化モイエティ部分とのインフレーム融合体として生成することができる。特定の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーであり得る。前述のいずれかの実施形態では、内在化モイエティは、アルファ−アミラーゼポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸に（直接またはリンカーを介して）コンジュゲートされ得る。他の実施形態では、内在化モイエティは、アルファ−アミラーゼポリペプチドの内部アミノ酸に（直接または間接的に）コンジュゲートされ得る。このコンストラクトの２つの部分が互いにコンジュゲート／連結されることに留意されたい。別途明記しない限り、アルファ−アミラーゼ部分の内在化モイエティへのコンジュゲーションとしてのキメラポリペプチドの記述は、内在化モイエティのアルファ−アミラーゼ部分へのコンジュゲーションと同義で使用されている。さらに、別途明記しない限り、コンジュゲーション及び／または連結は、化学的コンジュゲーションまたは遺伝学的コンジュゲーションのいずれかを指す。
【０２４３】
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、周知の架橋剤及びプロトコールを使用して作製することができる。例えば、当業者に既知であり、アルファ−アミラーゼポリペプチドを内在化モイエティ（例えば、抗体）と架橋させるのに有用である、多数の化学的架橋剤がある。例えば、架橋剤は、段階的に分子を連結させるために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤によって、タンパク質をコンジュゲートさせるためのより特異的なカップリング方法が設計できるようになり、これにより、ホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低減させる。多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が当該技術分野において既知であり、それらとしては、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドモイエティを有するこれらの架橋剤を、一般により高い水溶性を有するＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。さらに、連結鎖内にジスルフィドブリッジを有するこれらの架橋剤を、代わりにアルキル誘導体として合成して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリンカー切断量を低減させることができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性架橋剤及び光反応性架橋剤を含む多数の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）及びジメチルピメルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ならびにビス−［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）及びＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、本開示における使用のために有用な光反応性架橋剤の例である。タンパク質カップリング技術の最近の概説については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１：２−１２を参照されたい。
【０２４４】
上記に含まれるヘテロ二官能性架橋剤の１つの特に有用な部類には、第一級アミン反応性基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、またはその水溶性類似体Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）が含まれる。アルカリｐＨでの第一級アミン（リシンイプシロン基）はプロトン化されておらず、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに対する求核攻撃によって反応する。この反応は、アミド結合の形成及びＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの副生成物としての遊離をもたらす。ヘテロ二官能性架橋剤の一部として有用なもう１つの反応性基は、チオール反応性基である。一般的なチオール反応性基としては、マレイミド、ハロゲン、及びピリジルジスルフィドが挙げられる。マレイミドは、弱酸性から中性（ｐＨ６．５〜７．５）条件下で数分で遊離スルフヒドリル（システイン残基）と特異的に反応する。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は、生理ｐＨで−−ＳＨ基と反応する。これらの反応性基はいずれも、安定したチオエーテル結合の形成をもたらす。ヘテロ二官能性架橋剤の第３の構成成分は、スペーサーアームまたはブリッジである。ブリッジは、２つの反応性末端を接続する構造である。ブリッジの最も明らかな特質は、立体障害に対するその効果である。場合によっては、長いブリッジは、２つの複雑な生体分子を連結させるために必要な距離により容易にまたがることができる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、複数のリンカーを含む。例えば、キメラポリペプチドがｓｃＦｖ内在化モイエティを含む場合、キメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼを内在化モイエティにコンジュゲートさせる第１のリンカー及びＶＨドメイン（例えば、配列番号２）をＶＬドメイン（例えば、配列番号３）にコンジュゲートさせるｓｃＦｖ内の第２のリンカーを含み得る。
【０２４６】
ヘテロ二官能性試薬を使用するタンパク質−コンジュゲートの調製は、アミン反応及びスルフヒドリル反応を含む２工程プロセスである。第一の工程であるアミン反応用に選択されるタンパク質は、第一級アミンを含有すべきである。これは、大部分のタンパク質のＮ末端に見られるリシンイプシロンアミンまたは第一級アルファアミンであってよい。このタンパク質は、遊離スルフヒドリル基を含有してはならない。コンジュゲートされる両方のタンパク質が遊離スルフヒドリル基を含有する場合、例えばＮ−エチルマレイミドを使用してすべてのスルフヒドリルをブロックするように一方のタンパク質を改変することができる（参照により本明細書に組み込まれている、Ｐａｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｐｒｏ．Ｃｈｅｍ．２：２６３を参照されたい）。エルマン試薬を使用して、特定のタンパク質中のスルフヒドリルの量を算出することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９５８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４：４４３及びＲｉｄｄｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：７５を参照されたい）。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、ユニバーサル担体系を使用して生成することができる。例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチドを一般的な担体、例えば、プロテインＡ、ポリ−Ｌ−リシン、ｈｅｘ−ヒスチジンなどにコンジュゲートさせることができる。コンジュゲートされた担体は、次に、内在化モイエティとして作用する抗体と複合体を形成することになる。免疫グロブリンとの結合を担う担体分子の小部分を、担体として使用することができる。
【０２４８】
特定の実施形態では、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）及びＧｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．（ｅｄ．），Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用することにより、本開示のキメラポリペプチドを生成することができる。さらに、自動ペプチド合成装置が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。アルファ−アミラーゼの内在化モイエティへの化学的コンジュゲーションのための上述のいずれの架橋方法においても、切断可能ドメインまたは切断可能リンカーを使用することができる。切断により、内在化モイエティとアルファ−アミラーゼポリペプチドを分離することが可能となる。例えば、キメラポリペプチドが細胞を透過した後に、切断可能リンカーの切断によってアルファ−アミラーゼを内在化モイエティから分離することが可能となる。
【０２４９】
特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドと内在化モイエティ部分とを含むキメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼポリペプチドと内在化モイエティとを含有する融合タンパク質として作製することができる。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼポリペプチドと内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）とを含有する融合タンパク質として作製して、１本の連続ポリペプチド鎖として発現させることができる。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼポリペプチド部分と内在化モイエティ部分とを含む融合タンパク質として作製される。そのような融合タンパク質の調製においては、アルファ−アミラーゼポリペプチド及び内在化モイエティをコードし、かつ、所望により、アルファ−アミラーゼポリペプチド及び内在化モイエティにまたがるペプチドリンカー配列をコードする核酸を含む融合遺伝子を構築する。翻訳産物が所望の融合タンパク質である融合遺伝子を生成するための組換えＤＮＡ技術の使用は、当該技術分野において周知である。遺伝子のコード配列とその制御領域の両方を再設計して、タンパク質産物の機能的特性、作製されるタンパク質の量、またはそのタンパク質が産生される細胞型を変更することができる。遺伝子のコード配列は大幅に変更することができる（例えば、融合タンパク質をコードする新規ハイブリッド遺伝子を生成するために、遺伝子のコード配列の一部を異なる遺伝子のコード配列に融合させることによって大幅に変更することができる）。融合タンパク質の生成方法の例は、本明細書に参照によって組み込まれている、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２９６８、ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５８７及びＰＣＴ／ＵＳ９０／０７３３５、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８に記載されている。基本的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端または付着末端である末端、適切な末端を生じさせるための制限酵素消化、適宜の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションを用いる、従来技術に従って実施される。あるいは、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術によって合成することができる。別の方法では、後にアニーリングしてキメラ遺伝子配列を作製することができる相補的オーバーハングを、連続した２つの遺伝子断片間に生じさせるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。融合遺伝子によってコードされたキメラポリペプチドを、当該技術分野において周知のような様々な発現系を使用して組換えにより産生してもよい（下記も参照されたい）。
【０２５０】
組換えによりコンジュゲートされたキメラポリペプチドには、アルファ−アミラーゼポリペプチドが内在化モイエティのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされている実施形態が含まれる。アルファ−アミラーゼがＦｖ３Ｅ１０の変異体軽鎖及び重鎖にコンジュゲートされている例示的なキメラポリペプチドは、配列番号３及び配列番号２にそれぞれ示されている。
【０２５１】
組換えによりコンジュゲートされたキメラポリペプチドには、内在化モイエティがアルファ−アミラーゼポリペプチドに対してＮ末端にある実施形態、及び内在化モイエティがアルファ−アミラーゼポリペプチド部分に対してＣ末端にある実施形態が含まれる。融合タンパク質を組換えにより作製する方法は当該技術分野において周知であることに言及しておく。本明細書に記載のいずれのキメラタンパク質も、容易に組換えにより作製することができる。これには、１つ以上のタグ及び／または１つ以上のリンカーを有するタンパク質が含まれる。例えば、キメラポリペプチドがｓｃＦｖ内在化モイエティを含む場合、キメラポリペプチドは、内在化モイエティをアルファ−アミラーゼポリペプチド部分に相互連結する第１のリンカー及びＶＨドメインをコンジュゲートさせるｓｃＦｖ内の第２のリンカーを含み得る。さらに、特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドのＮ末端（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内）に「ＡＧＩＨ」部分（配列番号２５）を含み、そのようなキメラポリペプチドは、１つ以上のエピトープタグの存在下または非存在下で提供され得る。さらなる実施形態では、キメラポリペプチドは、ポリペプチドの最Ｎ末端位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内）に「ＳＡＧＩＨ」（配列番号２６）部分を含み、そのようなキメラポリペプチドは、１つ以上のエピトープタグの存在下または非存在下で提供され得る。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、シグナル配列（例えば、配列番号４または配列番号５）を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列（例えば、配列番号５）は、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片のいずれかの軽鎖配列のＮ末端にある。いくつかの実施形態では、シグナル配列（例えば、配列番号５）は、配列番号３のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体のＮ末端にある。いくつかの実施形態では、シグナル配列（例えば、配列番号４）は、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片のいずれかの重鎖配列のＮ末端にある。いくつかの実施形態では、シグナル配列（例えば、配列番号４）は、配列番号２のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体のＮ末端にある。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、細胞中で組換えにより産生される。いくつかの実施形態では、細胞は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ−２９３細胞）である。本開示のキメラポリペプチドは、特定の実施形態では、細胞または細胞上清からタンパク質を作製及び精製するための当該技術分野で認められている方法を使用して、前述のいずれかの培養細胞で作製される。
【０２５４】
免疫グロブリンまたはエピトープタグ、例えばＨＡタグもしくはｍｙｃタグの全体または一部がキメラポリペプチド中に存在することで、キメラポリペプチドの精製のための領域がもたらされる。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの免疫原性は、米国特許公報第２００３／０１６６８７７号に記載されているように、キメラポリペプチドにまたがる連結領域内の候補Ｔ細胞エピトープを同定し、その連結領域内のアミノ酸を変更することによって低減され得る。
【０２５６】
本開示によるキメラポリペプチドは、非常に多くの目的に使用することができる。本明細書に記載の任意のキメラポリペプチドを本明細書に記載の任意の方法で使用することができ、そのような好適な組み合わせが具体的に企図されることに言及しておく。
【０２５７】
本明細書に記載のキメラポリペプチドを使用して、アルファ−アミラーゼポリペプチドを細胞に送達することができる。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼを神経細胞に送達する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼを心臓細胞に送達する。したがって、キメラポリペプチドを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのアルファ−アミラーゼの細胞への輸送を促進することができる。細胞への輸送を促進することにより、キメラポリペプチドは送達効率を向上させ、これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのアルファ−アミラーゼポリペプチドに伴う機能を促進させる。さらに、輸送効率を上昇させることにより、キメラポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ実験に必要なアルファ−アミラーゼの量を減少させるのに役立ち得る。さらに、細胞質への送達を促進することによって、本開示のキメラポリペプチド及び方法は、例えば、フォーブス・コリ病及び／またはアンダーセン病及び／またはポンペ病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはラフォラ病及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病における、グリコーゲンの細胞質蓄積に伴う問題に対処することができる。
【０２５８】
キメラポリペプチドを使用して、培養細胞におけるアルファ−アミラーゼの機能を試験することができ、また、アルファ−アミラーゼの輸送を試験することもできる。キメラポリペプチドを使用して、例えば細胞質とリソソーム間の輸送などの細胞中のアルファ−アミラーゼに対する結合パートナーを同定することができる。キメラポリペプチドをスクリーニングに使用して、細胞中のアルファ−アミラーゼ活性の修飾因子（例えば、小有機分子またはポリペプチド修飾因子）を同定することができる。キメラポリペプチドを使用して、ヒトにおける、または動物モデルにおけるフォーブス・コリ病及び／またはアンダーセン病及び／またはポンペ病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはラフォラ病及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病の症状の処置または緩和を補助することができる。前述は、主題のキメラポリペプチドについての使用の例示にすぎない。
【０２５９】
アルファ−アミラーゼポリペプチド、内在化モイエティ及びリンカーの任意の特徴を兼備するキメラポリペプチドを含む、本明細書に記載の任意のキメラポリペプチドを、本開示の方法のいずれかで使用することができる。
【０２６０】
ＩＶ．核酸及び発現
特定の実施形態では、本開示は、アルファ−アミラーゼポリペプチド（成熟アルファ−アミラーゼポリペプチド及び機能的断片、変異体、ならびにそれらの融合体を含む）を生成するために核酸を使用する。特定の実施形態では、本開示は、酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド（成熟酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド及び機能的断片、変異体、ならびにそれらの融合体を含む）を生成するために核酸を使用する。ある特定の実施形態では、核酸は、本開示の組換えキメラタンパク質を作製するための内在化モイエティをコードするＤＮＡをさらに含み得る。
【０２６１】
特定の実施形態では、本開示は、アルファ−アミラーゼヌクレオチド配列の領域（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＨ００２６７２．１またはＡＨ００２６７１．１）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離核酸配列または組換え核酸配列に関する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、成熟アルファ−アミラーゼポリペプチド配列をコードする。特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸１〜１５に対応するアミノ酸を欠いているアルファ−アミラーゼポリペプチドをコードする。さらなる実施形態では、アルファ−アミラーゼ核酸配列は、単離されている場合があり、組換え型である場合があり、及び／または異種ヌクレオチド配列に融合している場合があり、またはＤＮＡライブラリーに存在する場合がある。
【０２６２】
特定の実施形態では、アルファ−アミラーゼ核酸は、上述のヌクレオチド配列またはそれらの相補配列のいずれかに、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進するための適切なストリンジェンシー条件を変更することができることは、当業者は容易に理解するであろう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことができるであろう。例えば、洗浄工程での塩濃度を５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄工程の温度を室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に上昇させることができる。温度と塩の両方を変えてもよく、または他の変数を変化させつつ温度もしくは塩濃度を一定に保ってもよい。一実施形態では、本開示は、室温で６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、続いて室温で２×ＳＳＣで洗浄する核酸を提供する。
【０２６３】
遺伝コードの縮重のために天然のアルファ−アミラーゼ核酸とは異なっている単離された核酸も、本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が複数のトリプレットによって表される。同じアミノ酸を指定するコドン、すなわちシノニム（例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらすことがある。しかしながら、主題のタンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間に存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（最大でヌクレオチドの約３〜５％）のこれらの変異が、天然の対立遺伝子変異のため所与の種の個体間に存在し得ることは、当業者には理解されるであろう。任意の及びすべてのそのようなヌクレオチド変異及び結果として生じるアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸のいずれかは、特定の細胞発現系、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞または昆虫細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、核酸は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ−２９３細胞などの哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている。
【０２６５】
特定の実施形態では、組換えアルファ−アミラーゼ核酸は、発現コンストラクト内の１つ以上の制御ヌクレオチド配列と作動可能に連結され得る。制御ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞にとって適切である。様々な宿主細胞のための非常に多くのタイプの適切な発現ベクター及び好適な制御配列が、当該技術分野で知られている。通常、当該１つ以上の制御ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列及び転写終止配列、翻訳開始配列及び翻訳終止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知の構成的プロモーター及び誘導性プロモーターが、本開示により企図される。プロモーターは、天然起源のプロモーターまたは複数のプロモーターの要素を兼備するハイブリッドプロモーターのいずれかであってもよい。発現コンストラクトは、細胞中のエピソーム上、例えばプラスミドに存在してもよく、または発現コンストラクトを染色体に挿入してもよい。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は当該技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なることがある。特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の任意のアルファ−アミラーゼポリペプチドなどのアルファ−アミラーゼポリペプチドをコードし、かつ少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。制御配列は、当該技術分野で認められており、コードされたポリペプチドの発現を指示するために選択される。したがって、制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節要素を含む。例示的な制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの設計が、形質転換させる宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）の選択、及び／または発現させることを所望するタンパク質のタイプなどの因子に依存し得ることを理解されたい。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、及びそのベクターによってコードされる抗生物質マーカーなどの任意の他のタンパク質の発現も考慮すべきである。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼポリペプチドまたはその生理活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトは、内在化モイエティをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、この核酸コンストラクトは、アルファ−アミラーゼ生物活性を有するキメラポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、核酸コンストラクトは、リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【０２６７】
本開示はまた、本開示のアルファ−アミラーゼポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチドまたはキメラポリペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母、または哺乳動物細胞で発現させることができる。他の好適な宿主細胞は、当業者に知られている。
【０２６８】
本開示はさらに、本開示のアルファ−アミラーゼポリペプチドまたはキメラポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、ポリペプチドの発現を生じさせることができるような適切な条件下で培養することができる。ポリペプチドは、ポリペプチドを含有する細胞と培地の混合物から分泌させ、単離することができる。あるいは、ポリペプチドを細胞質中にまたは膜画分中に保持して、細胞を回収し、溶解してタンパク質を単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地及び他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は、当該技術分野で周知である。ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、及びポリペプチド（例えば、アルファ−アミラーゼポリペプチド）の特定のエピトープに対して特異的な抗体によるイムノアフィニティー精製を含む当該技術分野で既知のタンパク質を精製するための技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、その精製を促進するドメインを含有する融合タンパク質である。
【０２６９】
組換えアルファ−アミラーゼ核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核細胞及び真核細胞（酵母、鳥類、昆虫もしくは哺乳動物）のいずれかまたは両方における発現に適するベクターにライゲーションすることにより生成することができる。組換えポリペプチド生成のための発現媒体には、プラスミド及び他のベクターが含まれる。例えば、好適なベクターとしては、次のタイプのプラスミド、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド及びｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌中のベクターの増殖を促進するための原核生物配列と、真核細胞中で発現される１つ以上の真核生物転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適している哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部をｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で改変して、原核細胞及び真核細胞の両方における複製及び薬剤耐性選択を容易にする。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バールウイルスなどのウイルスの誘導体（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用することができる。プラスミドの調製及び宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法が当該技術分野で周知である。原核細胞及び真核細胞両方のための他の好適な発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １６  ａｎｄ  １７を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ）が挙げられる。
【０２７０】
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。基本的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端または付着末端である末端、適切な末端を生じさせるための制限酵素消化、適宜の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションを用いる、従来技術に従って実施される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術によって合成することができる。あるいは、後にアニーリングしてキメラ遺伝子配列を作製することができる相補的オーバーハングを、連続した２つの遺伝子断片間に生じさせるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。
【０２７１】
本開示は、組換えによりキメラタンパク質を生成する方法、例えば上記の方法を企図する。タンパク質の例えば酵母または哺乳動物細胞における発現のための好適なベクター及び宿主細胞を、容易に選択することができる。宿主細胞は、キメラポリペプチドをコードするベクターを安定して発現する場合もあれば、一過性に発現する場合もある。そのような宿主細胞は、細胞培養培地から容易に単離することができるキメラポリペプチドを発現させるための好適な条件下で、培養することができる。
【０２７２】
本開示のキメラポリペプチド（例えば、成熟アルファ−アミラーゼ部分と内在化モイエティ部分とを含むポリペプチド）は、単一ポリペプチド鎖として発現させてもよく、または複数のポリペプチド鎖として発現させてもよい。単一ポリペプチド鎖の例は、アルファ−アミラーゼ部分が内在化モイエティにインフレームで融合しており、その内在化モイエティがｓｃＦｖである場合である。特定の実施形態では、この単一ポリペプチド鎖は、単一のベクターから融合タンパク質として発現される。
【０２７３】
複数のポリペプチド鎖の例は、内在化モイエティが抗体またはＦａｂである場合である。特定の実施形態では、抗体またはＦａｂの重鎖及び軽鎖は、単一のベクターまたは２つのベクターを発現する（一方は重鎖を発現し、他方は軽鎖を発現する）宿主細胞内で発現され得る。いずれの場合も、アルファ−アミラーゼポリペプチドは、例えば、重鎖のＣ末端へのインフレーム融合体として発現させることができ、これにより、アルファ−アミラーゼポリペプチドが内在化モイエティに付加されるが、内在化モイエティの抗原結合領域とは離れて付加される。
【０２７４】
上述の通り、キメラポリペプチドを含むポリペプチドを組換えにより発現させる方法は、当該技術分野で周知である。特定のアミノ酸配列を有する、ヒト成熟アルファ−アミラーゼポリペプチドなどの成熟アルファ−アミラーゼポリペプチドを発現するヌクレオチド配列は、入手可能であり使用することができる。さらに、内在化モイエティ部分を発現するヌクレオチド配列、例えば配列番号２及び配列番号３に記載のＶＨ及びＶＬを含む３Ｅ１０抗体、ｓｃＦｖ、またはＦａｂを発現するヌクレオチド配列は、公的に入手でき、好適な重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列と組み合わせることができる。本開示は、本開示の任意のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、そのようなヌクレオチド配列を含むベクター（単一のベクターまたはベクターのセット）、そのようなベクターを含む宿主細胞、及びそのような宿主細胞を培養して本開示のキメラポリペプチドを発現させる方法を企図する。
【０２７５】
Ｖ．処置方法及び他の使用方法
本明細書に記載のいずれの方法についても、本開示は、本出願全体を通じて記載される任意のキメラポリペプチド及び／または組成物の使用を企図する。さらに、本明細書に記載のいずれの方法についても、本開示は、ある方法の任意の工程（複数可）と別の方法からの任意の工程（複数可）との組み合わせを企図する。
【０２７６】
例えば、成熟アルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、成熟アルファ−アミラーゼポリペプチド）部分と内在化モイエティ部分とを含む本開示のキメラポリペプチドを、本開示の方法のいずれかで使用することができる。他の例では、成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）部分と内在化モイエティ部分とを含む本開示のキメラポリペプチドを、本開示の方法のいずれかで使用することができる。
【０２７７】
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチド（例えば、成熟アルファ−アミラーゼポリペプチド部分と内在化モイエティ部分とを含むポリペプチドまたは成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ部分と内在化モイエティ部分とを含むポリペプチド）は、細胞質のグリコーゲン蓄積（例えば、ポリグルコサンなどの異常グリコーゲンの正常な有害な蓄積）を減少させるために、細胞の細胞質、例えば、筋肉（例えば、横隔膜筋、骨格筋、及び／または心筋）、神経細胞（例えば、脳の神経細胞）及び／または肝細胞に送達される。そのような細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで存在する場合もあれば、対象（例えば、ヒトなどの患者）内に存在する場合もある。いくつかの実施形態では、対象は、ポリグルコサン蓄積症（例えば、非中枢神経系ポリグルコサン蓄積症）を有するか、または有することが疑われる対象である。特定の実施形態では、対象は、糖原病、特に、ダノン病、ポンペ病、成人ポリグルコサン小体病（ＡＰＢＤ）、ＧＳＤ  ＩＩＩ、ＧＳＤ  ＩＶ、ＧＳＤ  Ｖ、もしくはＧＳＤ  ＸＶ、及び／またはグリコーゲン代謝異常症、例えばＧＳＤ  ＶＩＩ、ラフォラ病、ＰＲＫＡＧ２関連心筋症（ＰＡＣ）もしくはＲＢＣＫ１欠損症を有するか、または有することが疑われる対象である。いくつかの実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼまたは酸性アルファ−グルコシダーゼを、それらを必要としている対象、例えば、ダノン病、ポンペ病、ＡＰＢＤ、ＧＳＤ  ＩＩＩ、ＧＳＤ  ＩＶ、ＧＳＤ  Ｖ、ＧＳＤ  ＸＶ、ＧＳＤ  ＶＩＩ、ラフォラ病、ＰＲＫＡＧ２関連心筋症（ＰＡＣ）またはＲＢＣＫ１欠損症対象の細胞への送達に使用するのに適している。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼを、それを必要としている対象、例えば、ポンペ病、ＧＳＤ  ＩＩＩもしくはＧＳＤ  ＩＶ、及び／またはラフォラ病などのグリコーゲン代謝異常症を有する対象の細胞質への送達に使用するのに適している。
【０２７８】
特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、ＧＳＤ  ＩＩＩを有しているかまたは有していることが疑われる。特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、ＧＳＤ  ＩＶを有しているかまたは有していることが疑われる。特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、ＧＳＤ  Ｖを有しているかまたは有していることが疑われる。特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、ＧＳＤ  ＶＩＩを有しているかまたは有していることが疑われる。特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、ＧＳＤ  ＸＶを有しているかまたは有していることが疑われる。特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、ＰＡＣを有しているかまたは有していることが疑われる。特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、アルツハイマー病及び／または認知症を有しているかまたは有していることが疑われる。特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、ラフォラ病を有しているかまたは有していることが疑われる。特定の実施形態では、それらを必要としている対象は、ダノン病を有しているかまたは有していることが疑われる。
【０２７９】
特定の実施形態では、本開示は、ＧＳＤ  ＩＩＩの処置方法（例えば、ＧＳＤ  ＩＩＩの１つ以上の症状を改善させる；細胞質のグリコーゲン蓄積などのグリコーゲン蓄積を減少させる）を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＧＳＤ  ＩＶの処置方法（例えば、ＧＳＤ  ＩＶの１つ以上の症状を改善させる；細胞質のグリコーゲン蓄積などのグリコーゲン蓄積を減少させる）を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ラフォラ病の処置方法（例えば、ラフォラ病の１つ以上の症状を改善させる；グリコーゲン蓄積を減少させる）を提供する。特定の実施形態では、本開示は、低酸素誘発性グリコーゲン蓄積に伴う疾患または障害の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、低酸素誘発性グリコーゲン蓄積に伴う疾患または障害は、がんである。さらなる方法が本明細書に記載されている。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキメラポリペプチドのいずれかは、酸性細胞区画（例えば、リソソームまたはオートファゴソーム）内のグリコーゲン蓄積を減少させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、酸性細胞区画（例えば、リソソームまたはオートファゴソーム）内のグリコーゲン蓄積に伴う疾患を有する患者の１つ以上の細胞内のグリコーゲン蓄積を減少させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ポンペ病（ＧＳＤ  ＩＩ）細胞内のグリコーゲン蓄積を減少させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ダノン病（ＧＳＤ  ＩＩｂ）細胞内のグリコーゲン蓄積を減少させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ポンペ病（ＧＳＤ  ＩＩ）を有する患者を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ダノン病（ＧＳＤ  ＩＩｂ）を有する患者を処置するために使用され得る。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキメラポリペプチドのいずれかは、神経細胞内のグリコーゲン蓄積を減少させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、神経細胞内のグリコーゲン蓄積に伴う疾患を有する患者の１つ以上の細胞内のグリコーゲン蓄積を減少させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、アルツハイマー病細胞または認知症細胞内のグリコーゲン蓄積を減少させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、アルツハイマー病または認知症を有する患者を処置するために使用され得る。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、細胞内のグリコーゲンクリアランスを向上させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞（例えば、心筋細胞もしくは横隔膜筋細胞）、肝細胞、または神経細胞（例えば、脳の神経細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ダノン病及び／またはアルツハイマー病を有する対象内に存在する。
【０２８３】
特定の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−アミラーゼポリペプチドまたは酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドのいずれかを含むキメラポリペプチドは、ダノン病を処置するために使用することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−アミラーゼポリペプチドのいずれかを含むキメラポリペプチドは、アルツハイマー病及び／または認知症を処置するために使用することができる。特定の実施形態では、本開示は、キメラポリペプチドを培養細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ）及び対象内の細胞を含む細胞に送達する方法を提供する。培養細胞、例えば健常細胞または疾患モデル由来の細胞への送達は、非常に多くの用途がある。これらの用途としては、アルファ−アミラーゼ基質または結合パートナーを同定するため、（例えば、細胞質、リソソーム、及び／またはオートファジー小胞への）局在化及び／または輸送を評価するため、様々な条件下（例えば、ｐＨ）における酵素活性を評価するため、グリコーゲン蓄積を評価するためなどが挙げられる。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、健常状態または疾患状態でのアルファ−アミラーゼ活性、局在化、及び輸送を理解するための試薬として使用することができる。
【０２８４】
対象への送達、例えば対象内の細胞への送達は、非常に多くの用途がある。例示的な治療的使用を以下に記載する。さらに、キメラポリペプチドは、診断目的または研究目的で使用することができる。例えば、本開示のキメラポリペプチドを検出可能に標識し、疾患の動物モデルまたは患者などの対象に投与して、対象の組織内のキメラポリペプチド（例えば、筋肉、脳、及び／または肝臓への局在化）を画像化するために使用することができる。さらに、例示的な用途には、対象内の細胞への送達、例えば疾患（例えば、フォーブス・コリ病及び／またはアンダーセン病及び／またはポンペ病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはラフォラ病及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病）の動物モデルへの送達が含まれる。例として、本開示のキメラポリペプチドは、健常動物または罹患動物における、アルファ−アミラーゼ生理活性、局在化及び輸送、タンパク質−タンパク質相互作用、酵素活性、ならびに動物生理に対する影響を理解するための試薬として使用して、動物へ送達することができる。
【０２８５】
特定の実施形態では、本開示は、ラフォリン、アルファ−アミラーゼ及び／またはマリンの機能不全に伴う状態、異常グリコーゲン蓄積に伴う状態、及び／またはフォーブス・コリ、ポンペ病、フォン・ギールケ病、ラフォラ病、アンダーセン病、ダノン病、及び／またはアルツハイマー病に伴う状態の処置方法を提供する。特定の実施形態では、グリコーゲン蓄積は細胞質に存在しており、アルファ−アミラーゼの送達によって、心筋細胞または神経細胞内などの細胞質のグリコーゲン蓄積が減少する。特定の実施形態では、対象は内在性ラフォリン、アルファ−アミラーゼ及び／またはマリンの機能不全を有さない（例えば、方法は変異したタンパク質または機能不全であるタンパク質の置換を含まない）。
【０２８６】
特定の実施形態では、これらの方法は、治療有効量の上述のキメラポリペプチド（例えば、（ｉ）アルファ−アミラーゼポリペプチド及び（ｉｉ）内在化モイエティ部分を含むキメラポリペプチド）を個体に投与することを含む。これらの方法は、動物の、より詳細にはヒトの治療的及び予防的処置を特に目的とする。フォーブス・コリ病及び／またはアンダーセン病及び／またはポンペ病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはラフォラ病及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病を処置するための方法に関して、本開示は、前述の任意の態様及び実施形態のすべての組み合わせ、ならびに発明を実施するための形態及び実施例に記載される任意の実施形態の組み合わせを企図する。したがって、本開示のキメラポリペプチドは、特定の実施形態では、フォーブス・コリ病及び／またはアンダーセン病及び／またはポンペ病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはラフォラ病及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病などの疾患を処置するのに適している。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、細胞内、例えば、筋細胞（例えば、横隔膜筋細胞もしくは心筋細胞）、肝細胞、及び／または神経細胞のグリコーゲン蓄積を減少させ、処置を必要とする患者において、フォーブス・コリ病及び／またはアンダーセン病及び／またはポンペ病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはラフォラ病及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病を処置する。
【０２８７】
本開示は、キメラポリペプチドまたは核酸コンストラクトを、受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ２）経路を介して細胞へ送達する方法であって、細胞をキメラポリペプチドまたは核酸コンストラクトと接触させることを含む方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、細胞をキメラポリペプチドと接触させることを含み、このキメラポリペプチドは、アルファ−アミラーゼポリペプチドもしくはその生理活性断片または酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチドもしくはその生理活性断片、ならびにＥＮＴ２経路を介した（及び場合により、ＥＮＴ３などの別のＥＮＴ輸送体を介した）細胞膜を通過する輸送を媒介し、それによりキメラポリペプチドを細胞に送達することができる内在化モイエティを含む。特定の実施形態では、細胞は、筋細胞である。本明細書に開示される任意の方法を使用して標的化される筋細胞には、骨格筋細胞（例えば、横隔膜細胞）、心筋細胞または平滑筋細胞が含まれ得る。他の実施形態では、キメラポリペプチドは、肝細胞または神経細胞（例えば、脳細胞）に送達される。
【０２８８】
本開示は、キメラポリペプチドまたは核酸コンストラクトを、筋細胞以外の細胞への出入りを可能とする経路を介して細胞に送達する方法も提供する。本明細書に開示される任意の方法を使用して標的化され得る他の細胞型としては、例えば、肝細胞、神経細胞（例えば、脳の神経細胞）上皮細胞、子宮細胞、及び腎細胞が挙げられる。
【０２８９】
特定の実施形態では、内在化モイエティは、ＤＮＡに結合する抗体または抗原結合断片などの抗体または抗原結合断片である。特定の実施形態では、内在化モイエティは、完全長抗体またはＦａｂなどの抗体である。特定の実施形態では、完全長抗体またはＦａｂは、天然免疫グロブリン定常領域と比較して、エフェクター機能を低下させるためなどの１つ以上の置換を含む。
【０２９０】
糖原病ＩＩＩ型、ＧＳＤ  ＩＩＩ、または限界デキストリン症としても知られるフォーブス・コリ病は、推定発生率が８３，０００〜１００，０００件の出生に対して１件の常染色体劣性神経筋／肝疾患である。フォーブス・コリ病は、全糖原病のおよそ２４％を占める。フォーブス・コリ病の臨床像は、十分に確立されているが変動しやすい。フォーブス・コリ病患者は、骨格筋ミオパチー、心筋症、肝硬変、肝腫大、低血糖、低身長、脂質異常症、わずかな精神遅滞、顔面異常、及び／または骨粗しょう症のリスクの増加を患うおそれがある（Ｏｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，１３（１８）：２５４５−４６）。筋肉に影響するフォーブス・コリ病の型は、筋力低下、疲労及び筋萎縮を示すことがある。進行性筋力低下及び遠位筋消耗は、患者が３０歳代または４０歳代に入るにつれしばしば身体障害性となるが、この状態は多くの日本人患者で小児期に発生すると報告されている。
【０２９１】
糖原病ＩＶ型またはＧＳＤ  ＩＶとしても知られるアンダーセン病もまた、常染色体劣性神経筋／肝疾患であり、全世界の推定発生率は６００，０００〜８００，０００人に対して１人である。発症年齢は胎児から成人期に及び、４つのグループ、すなわち、（ｉ）胎児無動変形シークエンス及び周産期死亡として現れる周産期、（ｉｉ）胎児水腫、神経併発及び乳児期初期の死亡を伴う先天性、（ｉｉｉ）ミオパチーまたは心筋症を伴う小児期、ならびに（ｉｖ）孤立性ミオパチーまたは成人ポリグルコサン小体病を伴う成人に分けられる（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。酵素活性の欠如は、通常、子宮内または乳児期において致死的であり、主に筋肉及び肝臓に影響を及ぼす。しかしながら、残存酵素活性（５〜２０％）は、主に筋肉ならびに中枢神経系及び末梢神経系の両方に影響を及ぼす若年発症障害または成人発症障害を招く。アンダーセン病患者に観察される症状としては、肝機能不全、関節拘縮症、神経機能不全、発育不良、肝硬変、門脈圧亢進症（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、食道静脈瘤、腹水症、肝脾腫、門脈圧亢進症（ｐｏｒｔａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、筋緊張低下、ミオパチー、拡張型心筋症、及び平均余命の短縮が挙げられる。これらの症状は、対象が罹患するアンダーセン病の型に応じて重症度が異なる場合がある。
【０２９２】
糖原病Ｉ型（ＧＳＤ  Ｉ）またはフォン・ギールケ病は、最も多く見られる糖原病であり、発生率は、およそ５０，０００件〜１００，０００件の出生に対して１件である。この欠損症は、グリコーゲン及び糖新生から遊離グルコースを生成する肝臓の能力を障害して重度の低血糖を引き起こし、結果として肝臓及び腎臓内のグリコーゲンの貯蔵を増加させる。このことは、両臓器の腫大を招き得る。
【０２９３】
ＧＳＤ  Ｉの最も多く見られる型は、ＧＳＤ  Ｉａ及びＧＳＤ  Ｉｂと称され、前者は診断症例のうちの８０％超を占め、後者は２０％未満を占める。より稀ないくつかの型が説明されてきた。ＧＳＤ  Ｉａは、グルコース−６−ホスファターゼの遺伝子であるＧ６ＰＣの突然変異に起因する。ＧＳＤ  Ｉｂは、グルコース−６−ホスファターゼ輸送体であるＳＬＣ３７Ａ４の突然変異に起因する。特定の実施形態では、主題の方法による処置を必要とする患者は、ＧＳＤ  Ｉａを有する患者である。他の実施形態では、処置を必要とする患者は、ＧＳＤ  Ｉｂを有する患者である。
【０２９４】
フォン・ギールケ病の臨床徴候は、毎日の吸収後の時間中に適切な血糖値の維持が不可能であること、グリコーゲン蓄積による臓器変化、過剰な乳酸生成、及び高尿酸血症による組織への損傷に直接または間接的に起因する。グリコーゲン蓄積は、肝臓内、ならびに腎臓及び小腸内の蓄積を含む。肝腫大（通常は脾腫を伴わない）は胎児期に発生し始め、通常、生後数ヶ月で顕著になる。子供が立って歩く頃までには、肝腫大は腹部突出を引き起こすほど重度になる場合がある。
【０２９５】
フォン・ギールケ病患者の腎臓は、通常、貯蔵グリコーゲンにより１０〜２０％腫大する。このことは通常、重炭酸塩及びリン酸塩の消耗を伴う近位尿細管性アシドーシスを含む、尿細管再吸収の複数の障害を伴うファンコーニ症候群を偶発的な例外として、小児期に臨床的問題を引き起こさない。しかしながら、長期にわたる高尿酸血症は、尿酸性腎症を引き起こす可能性がある。ＧＳＤ  Ｉを有する成人では、糖尿病性腎症に類似した慢性糸球体損傷が、腎不全を招くおそれがある。
【０２９６】
一部のフォン・ギールケ病患者では、肝合併症が重篤である。肝腺腫は、２０歳代またはそれ以降に発生する可能性があり、わずかな確率で、後にヘパトーマまたは肝癌へ悪性転換する。ＧＳＤ  Ｉを有する青年及び成人で報告されているさらなる障害としては、高尿酸血症性痛風、膵炎、慢性腎不全が挙げられる。
【０２９７】
糖原病ＶＩＩ型（ＧＳＤ  ＶＩＩ）は、ＰＦＫＭ（ホスホフルクトキナーゼの筋肉アイソフォーム）の突然変異に起因する。ＧＳＤ  ＶＩＩは、ミオパチー及び心筋症を伴う重度で致命的な乳児型から、筋肉痛及びけいれん及び横紋筋融解症を伴う典型的な小児型、低運動能及び筋肉への影響のない溶血性貧血を伴う遅発性ミオパチーに及ぶ、広範な年齢関連性の表現型のばらつきを伴う常染色体劣性障害である。
【０２９８】
糖原病ＸＶ型（ＧＳＤ  ＸＶ）は、ＧＹＧ１（グリコゲニンの遺伝子）の突然変異に起因する。ＧＳＤ  ＸＶは、純粋型の骨格筋ミオパチーから心不全を伴う純粋型の心筋症に及ぶ表現型のスペクトルを含む、常染色体優性障害である。発症は、通常５０歳代またはそれ以降であるが、それよりも早く起こり得る。
【０２９９】
ＲＢＣＫ１欠損症は、表現型の中程度のばらつきを伴う常染色体劣性障害である。タンパク質のＮ末端部分の突然変異は主に免疫学的異常を引き起こすが、タンパク質の中央部とＣ末端部分の突然変異は、通常小児期または青年期初期に始まり、後に心筋症を発症するミオパチーを引き起こす。ミスセンス突然変異は一般にミオパチーに限定されるが、一方で、切断型突然変異はミオパチーと進行性拡張型心筋症の両方に関連し、多くの場合移植を必要とする。
【０３００】
ＰＲＫＡＧ２関連心筋症（ＰＡＣ）は、最も多く見られるポリグルコサン蓄積症のうちの１つであり、肥大型心筋症の患者のおよそ１％に発生し、表現型のばらつきが最も少ないものの１つである。ＰＡＣは常染色体優性の、主として心臓特異的な非リソソーム性糖原病であり、一般に、青年期またはそれ以降に現れるが、乳児期に現れることもある。ＰＡＣは、心肥大、房室副伝導路、及び伝導系異常を伴う心臓内のポリグルコサン小体の蓄積を特徴とする。これらの特徴は、しばしば不整脈及び突然死の発生率の高い心不全及び心室早期興奮を引き起こし、ペースメーカーまたは除細動器の留置を必要とする。骨格筋への影響は稀である。ＰＲＫＡＧ２は、グルコース代謝経路及び脂肪酸代謝経路を制御するアデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のγ２制御サブユニットをコードする。ＰＡＣのトランスジェニックマウスモデルでの研究により、蓄積したポリグルコサンの枯渇が、正常な電気生理学的機能を回復させ、心肥大を減少させる可能性のあることが示唆されている。
【０３０１】
ラフォラ進行性ミオクローヌスてんかんまたはＭＥＬＦとも称されるラフォラ病は、脳、心臓、肝臓、筋肉及び皮膚を含む罹患個体の大部分の組織の細胞内における細胞質ポリグルコサン封入体（ラフォラ小体として知られている）の蓄積を特徴とする稀な致死性の神経変性障害である。ラフォラ病患者は、通常、まず青年期に症状が発生する。症状としては、一時的な失明、うつ病、発作、倒れ発作、ミオクローヌス、幻視、欠神、運動失調、及び進展が急速で重度の認知症が挙げられる。通常、発症後２〜１０年（平均値は５年）に死亡する。
【０３０２】
ラフォラ病の有病率は不明である。この疾患は全世界的に発生するが、地中海諸国、中央アジアの一部、インド、パキスタン、北アフリカ、及び中東で最も多い。西洋諸国では、有病率は１／１，０００，０００未満であると推定されている。
【０３０３】
現在、ラフォラ病を有する患者に対する治療法または有効な処置は存在しない。しかしながら、発作及びミオクローヌスは、少なくとも疾患の初期段階では抗てんかん薬により管理することができる。
【０３０４】
ダノン病または糖原病ＩＩｂは、肥大型心筋症、骨格筋の筋力低下、及び知的障害を伴う稀な代謝異常症である。心筋症は重度であり、最終的には心不全を招くおそれがある。さらに、心筋症は、心房細動及び塞栓性脳卒中を伴う場合がある。ダノン病は、正常なタンパク質構造に変化をもたらすＬＡＭＰ２の遺伝的欠陥に関係する。ダノン病の症状は、一般に、女性よりも男性でより重度である。
【０３０５】
アルツハイマー病及び／または認知症を含む神経障害または神経疾患は、罹患個体の脳組織からの細胞（例えば、神経細胞）内のグリコーゲンの蓄積によって特徴付けることができる。アルツハイマー病は、通常、緩徐に発生し経時的に悪化する慢性の神経変性疾患である。アルツハイマー病は、認知症症例の６０％〜７０％の原因であり、最も一般的な初期症状は短期記憶喪失である。アルツハイマー病患者は、言語障害、見当識障害、気分変動、意欲喪失、自己管理の欠如、及び行動的問題を患うおそれがある。アルツハイマー病の原因は不明であり、とりわけ、遺伝的仮説、コリン作動性仮説、アミロイド仮説、タウ仮説をはじめとする、原因を説明する複数の仮説が存在する。アルツハイマー病は、神経細胞変性を引き起こすベータ−アミロイドペプチドの集積によって特徴付けることができる。細胞内のミトコンドリアに集積するベータ−アミロイドは、特定の酵素機能、及び神経細胞によるグルコースの利用を阻害するおそれがある。
【０３０６】
認知症は、アルツハイマー病、ならびにとりわけ、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉型認知症、パーキンソン病、梅毒、クロイツフェルト・ヤコブ病、及び正常圧水頭症を伴うおそれのある幅広いカテゴリーの脳疾患を指し得る。認知症患者は、明確に思考し日々の詳細を記憶する能力について、長期かつ一般には緩徐な低下を経験する場合がある。約４６００万人が認知症を発症しており、約１０％の人が生涯のある時点でこの障害を発症する。この疾患は、個体の加齢とともにより一般的となり、６５〜７４歳の人の約３％が認知症であるが、これに対して、７５〜８４歳の人では約１９％が認知症である。
【０３０７】
本明細書で使用する場合、「処置」、「処置する」などの用語は、一般に、所望の薬理学的作用及び／または生理学的作用を得ることを意味する。状態または疾患を「処置する」とは、その状態または疾患の少なくとも１つの症状を治癒及び改善することを指し、かつ、その組成物を投与されていない対象と比較して、それを必要とする対象の病態の症状の頻度を低減させるか、またはその病態の発症を遅延させる組成物の投与を含む。本明細書で使用する場合、「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患または状態のあらゆる処置を包含し、（ａ）疾患もしくは状態の素因を有し得るが、まだ症状を示し始めていない対象においてその疾患もしくは状態の症状の発症を予防すること、（ｂ）疾患もしくは状態を抑制すること（例えば、その発生を阻止すること）、または（ｃ）疾患もしくは状態を軽減すること（例えば、疾患もしくは状態の退行を生じさせること、１つ以上の症状の改善をもたらすこと）を含む。例えば、フォーブス・コリ、ポンペ病、アンダーセン病、ダノン病、及び／またはアルツハイマー病の「処置」が企図され、これは、疾患の完全回復もしくは治癒、または疾患に起因する症状及び／または有害な影響のあらゆる範囲の改善を包含する。
【０３０８】
例示のためのみであるが、フォーブス・コリ病の「処置」には、フォーブス・コリ病に伴う以下の影響、すなわち、骨格筋ミオパチー、心筋症、肝硬変、肝腫大、低血糖、低身長、脂質異常症、発育不良、精神遅滞、顔面異常、骨粗しょう症、筋力低下、疲労及び筋萎縮のいずれかまたはそれらの組み合わせの改善が含まれる。処置には、細胞質グリコーゲンの異常レベルの１つ以上の低下、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、またはクレアチンホスホキナーゼのうちの１つ以上の高値の減少、例えば、血清中のそのようなレベルの減少も含まれ得る。これらの状態のいずれかの改善は、当該技術分野で既知の標準的な方法及び技術に従って容易に評価することができる。フォーブス・コリ病の処置の有効性を判断するために、上に列記していない他の症状もモニタリングすることができる。本開示の方法により処置される対象の集団には、望ましくない状態または疾患に罹患している対象、及びこの状態または疾患の発症のリスクがある対象が含まれる。
【０３０９】
例示のためのみであるが、アンダーセン病の「処置」には、アンダーセン病に伴う以下の影響、すなわち、肝機能不全、関節拘縮症、神経機能不全、発育不良、肝硬変、門脈圧亢進症（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、食道静脈瘤、腹水症、肝脾腫、門脈圧亢進症（ｐｏｒｔａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、筋緊張低下、ミオパチー、拡張型心筋症、及び平均余命の短縮のいずれかまたはそれらの組み合わせの改善が含まれる。処置には、細胞質グリコーゲンの異常レベルの１つ以上の低下が含まれ得る。アンダーセン病の処置の有効性を判断するために、上に列記していない他の症状もモニタリングすることができる。本開示の方法により処置される対象の集団には、望ましくない状態または疾患に罹患している対象、及びこの状態または疾患の発症のリスクがある対象が含まれる。
【０３１０】
特定の実施形態では、処置を必要とする対象は、アンダーセン病の周産期型（例えば、ＧＳＤ  ＩＶの周産期型）を有する対象である。他の実施形態では、処置を必要とする対象は、アンダーセン病の先天性（乳児）型を有する対象である。他の実施形態では、処置を必要とする対象は、アンダーセン病の小児（若年）型を有する対象である。いくつかの実施形態では、処置を必要とする対象は、アンダーセン病の成年型を有する対象である。したがって、特定の実施形態では、本開示は、本開示のキメラポリペプチドを投与することによって前述のいずれかの患者を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、前述のいずれかの必要とする対象における骨格筋、心筋、及び／または肝臓内などの細胞質のグリコーゲン蓄積を、本開示のキメラポリペプチドを投与することによって減少させる方法を提供する。
【０３１１】
例示のためのみであるが、ポンペ病の「処置」には、アルファ−アミラーゼの機能不全に伴う以下の影響、すなわち、アルファアミラーゼ活性の減少（例えば、処置はアミラーゼ活性を増加させる）、細胞内のグリコーゲン蓄積（例えば、処置はグリコーゲン蓄積を減少させる）、クレアチンキナーゼレベルの上昇、尿中グルコース四糖類の上昇、心臓サイズ、肥大型心筋症、呼吸器系合併症、人工呼吸器への依存、筋機能不全及び／または筋肉衰弱、運動機能の喪失、車椅子もしくは他の形態の移動介助への依存、直立座位のための頸部もしくは腹部支持具への依存、筋線維の超微細構造の損傷、筋緊張及び筋機能の喪失のいずれか（またはそれらの組み合わせ）の改善が含まれる。これらの症状のいずれかの改善は、当該技術分野で既知の標準的な方法及び技術に従って容易に評価することができる。ポンペ病の処置の有効性を判断するために、上に列記していない他の症状もモニタリングすることができる。
【０３１２】
特定の実施形態では、処置を必要とする対象は、ポンペ病の乳児型を有する対象である。他の実施形態では、処置を必要とする対象は、若年発症または成人発症のポンペ病を有する対象である。したがって、特定の実施形態では、本開示は、本開示のキメラポリペプチドを投与することによって前述のいずれかの患者を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、前述のいずれかの必要とする対象における骨格筋、心筋、及び／または肝臓内などの細胞質のグリコーゲン蓄積を、本開示のキメラポリペプチドを投与することによって減少させる方法を提供する。
【０３１３】
例示のためのみであるが、フォン・ギールケ病の「処置」には、フォン・ギールケ病に伴う次の影響、すなわち、常時空腹、易内出血及び易鼻出血、疲労、易怒性、頬の腫脹、胸部及び四肢の痩せ、腹部腫大、思春期の遅れ、肝肥大、痛風、炎症性腸疾患、腎疾患、腎不全、骨粗しょう症、発作、嗜眠、低身長、口腔潰瘍、腸潰瘍、肝腫瘍、低血糖、関節炎、発育阻害、肺高血圧症及び／または成長不全のいずれかまたはそれらの組み合わせの改善が含まれる。フォン・ギールケ病の処置の有効性を判断するために、上に列記していない他の症状もモニタリングすることができる。本開示の方法により処置される対象の集団には、望ましくない状態または疾患に罹患している対象、及びこの状態または疾患の発症のリスクがある対象が含まれる。特定の実施形態では、処置される対象は青年であり、思春期開始前に処置される。
【０３１４】
例示のためのみであるが、ラフォラ病の「処置」には、ラフォラ病に伴う次の影響、すなわち、失明、うつ病、発作、倒れ発作、肝疾患、筋萎縮、ミオクローヌス、幻視、欠神、運動失調、認知症、及び／または寿命の短縮のいずれかまたはそれらの組み合わせの改善が含まれる。処置はまた、例えば、筋肉（例えば、心筋もしくは横隔膜筋）、肝臓及び／または脳内のラフォラ小体及びまたはポリグルコサンの異常な蓄積の減少を含み得る。ラフォラ病の処置の有効性を判断するために、上に列記していない他の症状もモニタリングすることができる。本開示の方法により処置される対象の集団には、望ましくない状態または疾患に罹患している対象、及びこの状態または疾患の発症のリスクがある対象が含まれる。特定の実施形態では、処置される対象は、認知症発症前に、または測定可能で明らかな認知症の発症前に処置される。
【０３１５】
例示のためのみであるが、ダノン病の「処置」には、アルファ−アミラーゼの機能不全に伴う以下の影響、すなわち、アルファアミラーゼ活性の減少（例えば、処置はアミラーゼ活性を増加させる）、細胞内のグリコーゲン蓄積（例えば、処置はグリコーゲン蓄積を減少させる）、クレアチンキナーゼレベルの上昇、心臓サイズ、肥大型心筋症、呼吸器系合併症、人工呼吸器への依存、筋機能不全及び／または筋肉衰弱、運動機能の喪失、車椅子もしくは他の形態の移動介助への依存、直立座位のための頸部もしくは腹部支持具への依存、筋線維の超微細構造の損傷、筋緊張及び筋機能の喪失のいずれか（またはそれらの組み合わせ）の改善が含まれる。これらの症状のいずれかの改善は、当該技術分野で既知の標準的な方法及び技術に従って容易に評価することができる。ダノン病の処置の有効性を判断するために、上に列記していない他の症状もモニタリングすることができる。
【０３１６】
例示のためのみであるが、神経疾患（例えば、アルツハイマー病または認知症）の「処置」には、アルファ−アミラーゼの機能不全に伴う以下の影響、すなわち、アルファアミラーゼ活性の減少（例えば、処置はアミラーゼ活性を増加させる）、細胞内のグリコーゲン蓄積の減少（例えば、処置はグリコーゲン蓄積を減少させる）、神経細胞によるグリコーゲン取り込みの減少のいずれか（またはそれらの組み合わせ）の改善が含まれる。これらの症状のいずれかの改善は、当該技術分野で既知の標準的な方法及び技術に従って容易に評価することができる。アルツハイマー病及び／または認知症の処置の有効性を判断するために、上に列記していない他の症状もモニタリングすることができる。
【０３１７】
特定の実施形態では、本開示は、アルファ−アミラーゼ活性を細胞、例えば、フォーブス・コリ病、アンダーセン病、ポンペ病、フォン・ギールケ病、ラフォラ病、ダノン病、またはアルツハイマー病を有する対象の筋細胞及び／または肝細胞及び／または腎細胞及び／または神経細胞に送達する方法であって、本開示のキメラポリペプチドまたは１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び／または賦形剤とともに製剤化した本開示のキメラポリペプチドを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０３１８】
「治療有効用量」という用語は、投与する所望の効果をもたらす用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認される（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
【０３１９】
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドの投与は、本明細書に記載の投与経路のいずれか１つ、例えば、皮下、静脈内、または肝門脈経由による。換言すれば、本開示は、そのような投与経路のいずれかを介した投与による送達方法を企図する。
【０３２０】
特定の実施形態では、方法は、内在化モイエティにコンジュゲートしていないアルファ−アミラーゼポリペプチドの送達後と比較して、及び／または異なる内在化モイエティにコンジュゲートしたアルファ−アミラーゼポリペプチドのものと比較して、細胞質により高いアルファ−アミラーゼ活性の送達をもたらす。
【０３２１】
特定の実施形態では、１つ以上の本開示のキメラポリペプチドを一緒に（同時に）、または異なる時点で（逐次的に）投与することができる。さらに、本開示のキメラポリペプチドは、単独で、またはポンペ病及び／またはフォーブス・コリ病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはラフォラ病及び／またはアンダーセン病及び／またはダノン病及び／またはアルツハイマー病を処置するための１つ以上の追加の化合物または療法と組み合わせて投与することができる。例えば、１つ以上のキメラポリペプチドを１つ以上の他の治療用化合物とともに併用投与することができる。併用投与が必要である場合、その併用療法は、同時投与または交互投与を包含し得る。さらに、併用は、急性投与または長期投与を包含し得る。場合により、本開示のキメラポリペプチド及び追加の化合物は、ラフォラ病の処置に関して相加的または相乗的な様式で作用する。併用療法で使用される追加の化合物としては、小分子、ポリペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡ分子が挙げられるがこれらに限定されない。併用療法の性質に応じて、本開示のキメラポリペプチドの投与を、他の療法が投与されている間、及び／またはその後、続けてよい。キメラポリペプチドの投与は、単回投与でまたは複数回投与で行うことができる。場合によっては、キメラポリペプチドの投与は、他の療法の少なくとも数日前に開始するが、別の例では、投与を他の療法の直前、または他の療法の投与時のいずれかに開始する。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意のキメラポリペプチドを、抗てんかん薬と併用して対象に投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意のキメラポリペプチドを、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１５／１９２０９２に開示されている任意のキメラポリペプチドと併用して対象に投与する。特定の実施形態では、本明細書に記載の任意のキメラポリペプチドを、ＷＯ２０１５／１９２０９２に開示されている任意のマリンキメラポリペプチド及び／またはラフォリンキメラポリペプチドと併用して対象に投与する。
【０３２３】
併用療法の１つのタイプは、筋肉合成及び／または脂肪減少を促進する分子を使用する。筋組織を構築し、脂肪浸潤を減少させるために、ＩＧＦ−１、成長ホルモン、ステロイド、β−２アゴニスト（例えばクレンブテロール）、及びミオスタチン阻害剤などの分子を患者に投与することができる。これらの分子も、ＥＮＴ２レベルを上昇させ得る。したがって、これらの分子を、本開示のキメラポリペプチドによる処置の開始前に、処置の間に、または本開示のキメラポリペプチドによる処置後に投与することができる。
【０３２４】
併用療法の別の例では、１つ以上の本開示のキメラポリペプチドを、１つ以上の追加の処置様式と組み合わせた治療レジメンの一部として使用することができる。例として、そのような他の処置様式としては、食事療法、作業療法、物理療法、人工呼吸器による支持療法、マッサージ、鍼療法、指圧、移動補助、介助動物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２５】
特定の実施形態では、１つ以上の本開示のキメラポリペプチドを、肝移植の前に、または肝移植の後に投与することができる。
【０３２６】
本明細書に記載のキメラポリペプチドは、他の療法との併用で使用することができるが、特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、療法の単独の形態として提供されることに留意されたい。単独で投与するか、または他の薬物もしくは治療レジメンと併用投与するかにかかわらず、キメラポリペプチドの投与量、頻度、投与経路、及び投与のタイミングは、患者の状態及び必要に基づいて医師により決定される。本開示は、方法が、ある用量及びある投与スケジュールで投与すること、例えば、ある期間にわたって特定の間隔で投与することを含み得ることを企図する。そのような場合、症状の改善は複数回投与後にのみ観察される可能性があるが、各用量が有効性に寄与しており、したがって効果を生じる。
【０３２７】
本開示のキメラポリペプチドには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を含む、非常に多くの用途がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用は、治療的使用のみならず、例えば、前述のいずれかの動物モデルにおける診断的または研究的使用も含む。例として、本開示のキメラポリペプチドは、健常動物または罹患動物における、アルファ−アミラーゼ生理活性、局在化及び輸送、タンパク質−タンパク質相互作用、酵素活性、ならびに動物生理に対する影響を理解するための研究試薬として使用して、動物へ送達することができる。
【０３２８】
キメラポリペプチドを、例えば、培地中の健常細胞及びアルファ−アミラーゼ欠損細胞を含む培養細胞におけるアルファ−アミラーゼ生理活性、局在化及び輸送、タンパク質−タンパク質相互作用、ならびに酵素活性を評価するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することもできる。本開示は、本開示のキメラポリペプチドを使用して、培養細胞を含む細胞の細胞質、リソソーム、及び／またはオートファジー小胞へアルファ−アミラーゼを送達することを企図する。
【０３２９】
本開示は、本明細書に記載のいずれの方法も、本開示のキメラポリペプチド及び／または本開示の組成物（例えば、１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び／または賦形剤とともに製剤化した本開示のキメラポリペプチドを含む組成物）を細胞に投与することまたは接触させることによって実施することができることを企図する。
【０３３０】
ＶＩ．遺伝子療法
従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用して、アルファ−アミラーゼもしくは酸性アルファ−グルコシダーゼ（例えば、成熟アルファ−アミラーゼもしくは成熟酸性アルファ−グルコシダーゼ）のポリペプチド、及びまたはアルファ−アミラーゼもしくは酸性アルファ−グルコシダーゼを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を、哺乳動物細胞または標的組織に導入することができる。そのような方法を使用して、本開示のポリペプチド（例えば、アルファ−アミラーゼ（その変異体を含む）、及びキメラポリペプチドを含む本開示のポリペプチド）をコードする核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に投与することができる。本開示は、遺伝子導入法を使用して、キメラポリペプチド（本開示のもの）またはアルファ−アミラーゼポリペプチドのいずれかをコードする核酸を送達することができることを企図する。いくつかの実施形態では、アルファ−アミラーゼをコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法用途のために投与される。他の実施形態では、遺伝子送達技術は、キメラポリペプチドもしくはアルファ−アミラーゼポリペプチドの活性を試験するために、または細胞ベースでもしくは動物モデルでラフォラ病を研究するために、例えば、健常もしくは罹患細胞及び組織への送達後に細胞輸送、酵素活性、及びタンパク質−タンパク質相互作用を評価するために使用される。非ウイルスベクターの送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸及びリポソームなどの送達媒体と複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられる。そのような方法は当該技術分野で周知である。
【０３３１】
本開示の改変ポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス送達方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤増強取り込みが挙げられる。リポフェクション法及びリポフェクション試薬は当該技術分野において周知である（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞への送達（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織への送達（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）であり得る。免疫脂質（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である。アルファ−アミラーゼまたはその変異体をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞へ標的化するため、及びウイルスペイロードを核に輸送するために高度に進化したプロセスを利用する。
【０３３２】
ウイルスベクターは直接患者に投与（ｉｎ  ｖｉｖｏ）することができ、またはウイルスベクターを使用して細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置することができ、改変した細胞を患者に投与（ｅｘ  ｖｉｖｏ）する。本開示のポリペプチドの送達のための従来のウイルスベースの系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び単純ヘルペスウイルスのベクターを挙げることができる。ウイルスベクターは、現在、標的細胞及び組織における遺伝子導入の最も効率的かつ汎用的な方法である。宿主ゲノムにおける組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法によって可能となり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型及び標的組織において観察されている。レトロウイルスの指向性を、外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させることができ、これにより、標的細胞の潜在的標的集団を拡大することができる。
【０３３３】
レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するかまたは感染させることができ、かつ通常、高いウイルス力価を産生するレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存するであろう。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用性の長い末端反復から構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、次にこれらを、標的細胞に治療用遺伝子を組み込んで持続性の導入遺伝子発現をもたらすために使用する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＷ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースにしたもの、及びそれらの組み合わせが挙げられ、これらのすべてが当該技術分野において周知である。本開示のポリペプチドの一過性発現が好ましい応用例では、アデノウイルスベースの系が通常使用される。
【０３３４】
アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率の形質導入が可能であり、かつ細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを使用して、高い力価及び発現レベルが得られる。このベクターは比較的単純な系において大量生産することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、標的核酸を細胞に形質導入するために、例えば、核酸及びペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法手順のために使用される。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む多数の刊行物に記載されている。組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型かつ非病原性のパルボウイルスであるアデノ随伴ウイルス２型をベースとする、有望な代替遺伝子送達系である。
【０３３５】
すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子導入及び安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である。複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ及びＥ３遺伝子を置換するように改変することができ、その後、その複製ディフェクター（ｄｅｆｅｃｔｏｒ）ベクターを、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖させる。Ａｄベクターは、非分裂性の分化細胞、例えば、肝臓、腎臓及び筋肉系組織で見られるものを含む、複数の組織型をｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い運搬能力を有する。パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能であるウイルス粒子を形成するために使用される。
【０３３６】
そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングする４２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生細胞株によって作製される。ベクターは通常、パッケージング及びその後の宿主への組み込みに必要な最小のウイルス配列、タンパク質を発現させるための発現カセットによって置換される他のウイルス配列を含む。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで提供される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、通常、パッケージング及び宿主ゲノムへの組み込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは細胞株内にパッケージングされ、この細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠損しているヘルパープラスミドを含有する。この細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列が欠損しているため有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入を、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスの方が感受性の高い熱処理によって減少させることができる。
【０３３７】
多くの遺伝子療法用途において、遺伝子療法ベクターを高度の特異性で特定の組織型に送達することが望ましい。ウイルスベクターは、通常、ウイルスの外面にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対して特異性を有するように改変される。リガンドは、目的とする細胞型に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。この原理を、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスの他の対、及び受容体を発現する標的細胞にまで拡大することができる。例えば、繊維状ファージを、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように改変することができる。上述の説明は、主に、ウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターにも適用することができる。そのようなベクターを、筋細胞などの特定の標的細胞によって好ましく取り込まれると考えられる特定の取り込み配列を含むように改変することができる。
【０３３８】
遺伝子療法ベクターを、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって個々の患者へ投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターをｅｘ  ｖｉｖｏで細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）または万能ドナー造血幹細胞に送達し、その後、通常はベクターが組み込まれた細胞を選択した後に、それらの細胞を患者に再び内植することができる。
【０３３９】
診断、研究、または遺伝子療法のためのｅｘ  ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介する）が当業者に周知である。例えば、細胞を対象生物から単離し、例えば、アルファ−アミラーゼまたはその変異体をコードする核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトして、対象生物（例えば、患者）に再注入して戻す。ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションに適した様々な細胞型が、当業者に周知である。
【０３４０】
特定の実施形態では、幹細胞は、細胞トランスフェクション及び遺伝子療法のために、ｅｘ  ｖｉｖｏ手順で使用される。幹細胞を使用する利点は、それらを他の細胞型にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることができること、または幹細胞が骨髄に移植されることになる哺乳動物（例えば、細胞のドナー）に幹細胞を導入することができることである。幹細胞は、既知の方法を用いて、形質導入及び分化のために単離される。
【０３４１】
治療用核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）をｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、分子を血液または組織細胞との最終的な接触へと導くために通常使用される任意の経路によるものである。そのような核酸の投与に好適な方法を利用することができ、方法は当業者に周知である。また、複数の経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、しばしば特定の経路が別の経路よりも即時的で効果的な反応をもたらす場合がある。
【０３４２】
薬学的に許容可能な担体は、部分的には、投与される特定の組成物によって、及びその組成物の投与に使用される特定の方法によって決定される。したがって、本明細書に記載されているように、本開示の医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。
【０３４３】
ＶＩＩ．投与方法
様々な送達系が知られており、それらを本開示のキメラポリペプチドを投与するために使用することができる。任意のそのような方法を使用して、本明細書に記載のキメラポリペプチドのいずれかを投与することができる。本開示は、本明細書に開示される投与方法のいずれかを使用して、本明細書に記載のいずれかの方法（例えば、処置方法、細胞質のグリコーゲン蓄積を減少させる方法）との関連において、本開示のキメラポリペプチドのいずれかを送達できることを企図する。
【０３４４】
導入方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、心筋内、静脈内、皮下、経肺、鼻腔内、眼球内、硬膜外、髄腔内、頭蓋内、脳室内（例えば、側脳室内）を含むがこれらに限定されない、経腸的または非経口的方法及び経口経路であってよい。キメラポリペプチドを、任意の好都合な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮内層または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸粘膜など）による吸収によって投与してよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身性であっても、または局所性であってもよい。
【０３４５】
特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、静脈内投与される。
【０３４６】
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、処置を必要とする領域（例えば、筋肉）に局所的に投与することが望ましいこともある。投与は、例えば、限定するものではないが、外科手術中の局所注入によって、カテーテルによって、またはインプラントによって実現することができ、このインプラントは、膜、例えばシアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、繊維もしくは市販の代用皮膚を含む、多孔質、無孔質、もしくはゼラチン状材料のものである。
【０３４７】
別の実施形態では、そのような局所投与は、心臓の全体または一部へのものであり得る。例えば、投与は、心膜内または心筋内投与であり得る。同様に、心臓の様々な領域への薬剤の送達を意図したカテーテル、ワイヤーなどを使用して、心臓組織への投与を実現することができる。
【０３４８】
別の実施形態では、局所投与は、肝臓に対するものである。肝臓内のグリコーゲン貯蔵及びグリコーゲン分解は、体内の多くの他の組織のグリコーゲン利用能に影響を及ぼす。例えば、静脈カテーテルを肝門脈に留置して、キメラポリペプチドを肝臓に直接送達することができる。さらに、キメラポリペプチドの内在化モイエティが他の細胞型よりも肝臓細胞に対してより低い親和性を示すいくつかの実施形態では、肝門脈を介した送達によって適切な濃度のアルファ−アミラーゼが確実に肝臓細胞に到達する。
【０３４９】
本開示がキメラポリペプチドを同時にまたは異なる時点で、複数の投与経路によって投与する方法を企図していることに留意されたい。例えば、本開示は、キメラポリペプチドを、例えば静脈内注入によって全身に、肝門脈経由の局所投与との併用で投与するレジメンを企図する。
【０３５０】
他の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドをベシクルで、特にリポソームで送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照されたい）。さらに別の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドは、制御放出系で送達することができる。別の実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０、上掲を参照されたい）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを静脈内送達することができる。
【０３５１】
特定の実施形態では、キメラポリペプチドを静脈内注入によって投与する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドを、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、または少なくとも３０分間にわたって注入する。他の実施形態では、キメラポリペプチドを、少なくとも６０分間、少なくとも９０分間、または少なくとも１２０分間にわたって注入する。注入期間にかかわらず、本開示は、各注入が、キメラポリペプチドを規則的なスケジュール（例えば、週１回、月１回など）に従って投与する処置計画全体の一部であることを企図する。
【０３５２】
上述は、本明細書に記載のキメラポリペプチド、組成物及び方法のいずれにも適用される。本開示は、そのようなキメラポリペプチド、組成物及び方法の（単独でのまたは組み合わせでの）特徴と、このセクションに記載する様々な医薬組成物及び投与経路について記載する特徴との任意の組み合わせを具体的に企図している。
【０３５３】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
特定の実施形態では、本明細書に開示されるいずれかの方法で使用するための主題のキメラポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体とともに製剤化される（例えば、１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び／または賦形剤とともに製剤化される）。１つ以上のキメラポリペプチドを、単独で、または医薬製剤（組成物）の構成成分として投与することができる。本明細書に記載のキメラポリペプチドのいずれも、本明細書に記載されているように製剤化することができ、そのような組成物（例えば、医薬組成物、または調製物または製剤）のいずれも、本明細書に記載のいずれかの方法で使用することができる。他の実施形態では、組成物は、アルファ−アミラーゼポリペプチドを含むキメラポリペプチドを含む。キメラポリペプチドは、ヒトまたは獣医学における使用のための、任意の好都合な方法で投与するために製剤化され得る。湿潤剤、乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの潤沢剤、ならびに、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤、及び抗酸化剤も、組成物中に存在する場合がある。
【０３５４】
主題のキメラポリペプチドの製剤には、例えば、経口、経鼻、局所、非経口、直腸、及び／または膣内投与に適するものが含まれる。この製剤は、単位剤形で便利に提供することができ、薬学の分野において周知である任意の方法によって調製することができる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主及び特定の投与方法に応じて異なることがある。単一剤形を生成するための担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となる。
【０３５５】
特定の実施形態では、これらの製剤または組成物を調製する方法は、別のタイプの治療剤及び担体、ならびに場合により１つ以上の補助成分を組み合わせることを含む。一般に、液体担体、もしくは微粉固体担体、または両方を用いて製剤を調製することができ、その後、必要に応じて生成物を成形することができる。
【０３５６】
特定の実施形態では、本明細書に記載のいずれかの医薬組成物は、本明細書に記載のいずれかのキメラポリペプチドの濃縮した量を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、キメラポリペプチドを産生する細胞から最初に精製されたキメラポリペプチドのレベルと比較して、５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％または４００％高い濃縮レベルのキメラポリペプチドを有する。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、または２０ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも９０ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、少なくとも１１０ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの濃度は、１０〜５０ｍｇ／ｍｌ、１０〜４０ｍｇ／ｍｌ、１０〜３０ｍｇ／ｍｌ、１０〜２５ｍｇ／ｍｌ、１０〜２０ｍｇ／ｍｌ、２０〜５０ｍｇ／ｍｌ、５０〜７０ｍｇ／ｍｌ、７０〜９０ｍｇ／ｍｌまたは９０〜１１０ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のいずれかは、薬学的に許容可能な製剤中で４℃で保存した場合、少なくとも２４時間、２日間、４日間、１週間、２週間、または１ヶ月間、少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の（本明細書に定義された通りの）生物活性を維持する。前述のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載されているように、組成物のキメラポリペプチド部分は実質的に純粋である（例えば、存在するアルファ−アミラーゼの８５％以上が内在化モイエティと会合または相互連結している）。
【０３５７】
経口投与のための製剤は、所定の量の主題のキメラポリペプチド治療剤を活性成分として各々含有する、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味付けされた基剤、通常はスクロース及びアラビアゴムもしくはトラガカントを使用する）、散剤、顆粒剤の形態、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルションとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはパステルとして（ゼラチン及びグリセリン、もしくはスクロース及びアラビアゴムなどの不活性基剤を使用する）及び／または洗口液などとしてであってよい。活性化合物に加えて、懸濁液は、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント、ならびにそれらの混合物を含有してもよい。
【０３５８】
経口投与用の固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣丸、散剤、顆粒剤など）において、本開示の１つ以上のキメラポリペプチド治療剤を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、及び／または以下のもの、すなわち、（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び／またはケイ酸、（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／またはアラビアゴムなど、（３）保湿剤、例えばグリセロール、（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなど、（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト粘土、（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びこれらの混合物、ならびに（１０）着色剤のいずれかと混合してもよい。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合、この医薬組成物はまた、緩衝剤も含み得る。類似のタイプの固体組成物も、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量のポリエチレングリコール、及び同等物などの賦形剤を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブオイル、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤、及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、及び保存剤などの補助剤を含むこともできる。
【０３５９】
特定の実施形態では、本開示の方法は、皮膚または子宮頸部及び膣の粘膜などの粘膜のいずれかへの局所投与を含む。局所製剤は、皮膚または角質層浸透促進剤として有効であることが知られている多種多様な薬剤の１つ以上をさらに含んでもよい。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコールまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド及びアゾンである。製剤を化粧品として許容可能にするために追加の薬剤をさらに含んでもよい。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、着香剤、保存剤、安定剤及び界面活性剤である。当該技術分野において既知のものなどの角質溶解剤も含んでよい。例は、サリチル酸及び硫黄である。局所投与または経皮投与用の剤形としては、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、液剤、パッチ及び吸入剤が挙げられる。主題のポリペプチド治療剤を薬学的に許容可能な担体と、及び必要とされ得る任意の保存剤、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液）または噴霧剤と無菌条件下で混合してもよい。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、主題のキメラポリペプチド剤に加えて、賦形剤、例えば、動物脂肪及び植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有してもよい。粉剤及びスプレーは、主題のキメラポリペプチドに加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉剤、またはこれらの物質の混合物を含有することができる。スプレーは、通常の噴霧剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素ならびに揮発性非置換炭化水素、例えばブタン及びプロパンをさらに含有することができる。
【０３６０】
非経口投与に適した医薬組成物は、１つ以上のキメラポリペプチドを、１つ以上の薬学的に許容可能な無菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、または抗酸化剤、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液）、静菌薬、製剤を予定レシピエントの血液と等張にする溶質、もしくは懸濁剤、もしくは増粘剤を含み得る無菌注射可能溶液もしくは分散液中に使用直前に再調製することのできる無菌粉末との組み合わせで含んでもよい。本開示の医薬組成物に用いることのできる好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合には要求される粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０３６１】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの補助剤を含有してもよい。微生物の作用の防止を、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール（ｐｈｅｎｏｌ  ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）などを含めることによって確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射用剤形の持続的吸収をもたらすことができる。
【０３６２】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中の１つ以上のポリペプチド治療剤のマイクロカプセル封入マトリックスを形成することによって作製される。薬物のポリマーに対する比、及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションの中に薬物を封入することによっても調製される。
【０３６３】
好ましい実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、日常的手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適応した医薬組成物として製剤化する。必要な場合には、組成物は、可溶化剤、及び注射部位の痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬も含んでよい。組成物を注入によって投与する場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する輸液ボトルで組成物を投与することができる。組成物を注射によって投与する場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０３６４】
別の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、ヒトへの皮下投与用に製剤化する。
【０３６５】
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、髄腔内、頭蓋内及び／または脳室内送達用に製剤化する。特定の実施形態では、アルツハイマー病及び／または認知症を処置するために使用するための、またはアルツハイマー病及び／または認知症を有する対象などにおける神経細胞内のグリコーゲン蓄積を減少させるために使用するための本開示のキメラポリペプチドを、髄腔内、頭蓋内及び／または脳室内送達用に製剤化する。特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、髄腔内、頭蓋内及び／または脳室内（例えば、側脳室内）に送達することを含む、本開示の方法、例えば、アルツハイマー病及び／または認知症を処置する方法、または神経細胞内のグリコーゲン蓄積を減少させるための方法。
【０３６６】
特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、心臓への送達、例えば、心筋内または心膜内送達用に製剤化する。
【０３６７】
特定の実施形態では、組成物は、肝門脈経由での肝臓への局所投与を意図したものであり、それに応じてキメラポリペプチドを製剤化する。
【０３６８】
特定の実施形態では、特定の製剤が複数の経路を介した送達に関連した使用に適していることに留意されたい。したがって、例えば、静脈内注入に適する製剤は、肝門脈経由での送達にも適している場合がある。しかしながら、他の実施形態では、製剤は、ある送達経路に関連した使用に適しているが、別の送達経路に関連した使用には適していない。
【０３６９】
組織に関連する状態または疾患（例えば、ポンペ病及び／またはフォーブス・コリ病及び／またはアンダーセン病及び／またはフォン・ギールケ病及び／またはラフォラ病及び／またはダノン病）の処置に有効となる本開示のキメラポリペプチドの量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な投与量範囲の特定に役立つように、場合により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いてもよい。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路及び状態の重症度にも依存し、医師の判断及び各対象の状況に従って決定すべきである。しかしながら、静脈内投与に適した投与量範囲は、一般に、体重１キログラムあたり約２０〜５０００マイクログラムの活性キメラポリペプチドである。鼻腔内投与に適した投与量範囲は、一般に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から導出される用量−反応曲線から外挿することができる。
【０３７０】
特定の実施形態では、医薬調製物を含む本開示の組成物は、非発熱性である。換言すれば、特定の実施形態では、組成物は、実質的に発熱物質を含まない。一実施形態では、本開示の製剤は、エンドトキシン及び／または関連発熱物質を実質的に含まない発熱物質不含製剤である。エンドトキシンは、微生物内部に閉じ込められており微生物が破壊されるかまたは死滅したときにのみ放出される毒素を含む。発熱物質には、細菌及び他の微生物の外膜に由来する発熱誘導性の熱安定性物質（糖タンパク質）も含まれる。これらの物質はいずれも、ヒトに投与した場合、発熱、低血圧及びショックを引き起こす可能性がある。潜在的な有害影響のため、少ないエンドトキシン量であっても静脈内投与される医薬品溶液から除去しなければならない。Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（「ＦＤＡ」）は、静注薬物適用について１用量あたり、１回１時間で体重１キログラムにつき５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００）。治療用タンパク質を比較的多い投与量で、及び／または長期間にわたって（例えば、患者の全生涯の間など）投与する場合、有害で危険な内毒素のわずかな量でさえ、危険であり得る。ある特定の実施形態では、組成物中のエンドトキシン及び発熱物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０３７１】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び／または賦形剤とともに製剤化した本開示のキメラポリペプチドを含む医薬組成物などの組成物を提供する。そのような組成物は、本明細書に記載の内在化モイエティ部分のいずれか、及び本明細書に記載されているように構成されるアルファ−アミラーゼ部分を含む組成物を含む。例えば、本開示は、アルファ−アミラーゼ含有キメラポリペプチドを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物のいずれかは、本明細書に記載のアルファ−アミラーゼ部分及び／または内在化モイエティ部分のいずれかに基づき得る。さらに、そのような組成物はいずれも、本明細書に記載の構造的及び／または機能的特徴のいずれかに基づいて説明され得る。そのような組成物はいずれも、本明細書に記載のいずれかの方法、例えば、細胞への投与及び／または細胞への投与などの処置を必要とする対象への投与及び／またはポンペ病、フォン・ギールケ病、フォーブス・コリ病、ラフォラ病、アンダーセン病、ダノン病、もしくはアルツハイマー病を有する対象への投与に使用することができる。あらゆるそのような組成物を使用して、アルファ−アミラーゼ活性を、それを必要とする患者（例えば、ポンペ病、フォン・ギールケ病、フォーブス・コリ病、ラフォラ病、アンダーセン病、ダノン病、またはアルツハイマー病を有する患者）の筋細胞、肝細胞及び／または神経細胞内などの細胞内に送達することができる。
【０３７２】
本明細書に記載の組成物のいずれかを含むそのような組成物を、例えば、ビンまたはシリンジで提供して投与前に保存することができる。
【０３７３】
上述は、本明細書に記載のキメラポリペプチド、組成物及び方法のいずれにも適用される。本開示は、そのようなキメラポリペプチド、組成物及び方法の（単独でのまたは組み合わせでの）特徴と、このセクションに記載する様々な医薬組成物及び投与経路について記載する特徴との任意の組み合わせを具体的に企図している。
【０３７４】
ＩＸ．動物モデル
マリンを欠損するように操作されたマウスは、ラフォラ病のヒトの症例で観察されるものと類似した表現型を示す。具体的には、マリン−／−マウスは、年齢依存性の神経変性、シナプス興奮性の亢進、及びミオクロニー発作の罹患傾向を示した（Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，３（１１）：６６７−６８１）。さらに、これらのマウスはグリコーゲンで満たされた封入体を蓄積しており、封入体は、海馬及び小脳に最も大量に存在していたが、骨格筋細胞及び心筋細胞にも見られた（Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．）。グリコーゲンはまた、マリン−／−マウスの細胞内では、健常対照マウスの細胞内で見られるグリコーゲンと比較して、分岐が少ないことも判明した（Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．）。グリコーゲンの過剰リン酸化レベルの上昇もまた、このマウスモデルにおいて記載されている（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ，６８（６）：９２５−３３）。
【０３７５】
ラフォリンを欠損するように操作されたマウスも、ラフォラ病のヒトの症例といくらかの表現型類似性を示す。具体的には、ラフォリン−／−マウスは、発生的に正常で出生するが、年齢依存性の運動失調及びミオクローヌスてんかんを発症する（Ｇａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１１（１１）：１２５１−６２）。さらに、ラフォリン−／−マウスは、２ヶ月齢までに広範な神経細胞の変性を示し、４〜１２ヶ月齢までに封入体の発生を示す（Ｇａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ラフォリンを欠損するマウスはまた、脳内の過剰リン酸化及びタウタンパク質の凝集も示す（Ｐｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８４（３４）：２２６５７−６３）。
【０３７６】
したがって、特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の本開示のアルファ−アミラーゼ（例えば、成熟アルファ−アミラーゼ）コンストラクトのいずれかを使用して、１つ以上の任意の動物モデル、例えば、本明細書に記載のマウスモデルにおいて、疾患表現型における改善を調査する方法を企図する。例として、主題のキメラポリペプチドで処置した実験動物において、様々なパラメータを検査することができ、そのような動物は、対照と比較することができる。潜在的な有効性評価のために評価することができる例示的パラメータとしては、寿命の増加；グリコーゲンクリアランスの向上、グリコーゲン蓄積の減少、ならびに例えばオープンフィールド及びオープンワイヤーハングパラダイムにおける筋力向上、心機能の改善、肝機能の改善または肝臓サイズの減少が挙げられるが、これらに限定されない。グリコーゲンクリアランスの向上及びグリコーゲン蓄積の減少を、例えば、処置または未処置動物モデルからの生検材料（例えば、筋肉（例えば、心筋もしくは横隔膜筋）、肝臓または神経細胞）における過ヨウ素酸シッフ染色によって評価することができる。観察することができるさらなるパラメータには、神経変性、発作の回数／持続時間／強度、封入体の数もしくはサイズ、グリコーゲン過剰リン酸化の量、運動失調、タウ過剰リン酸化及び／またはタウ凝集の減少が含まれる。特定の実施形態では、本開示は、前述の状態のいずれかを有する対象内の細胞質のグリコーゲン蓄積を減少させる方法を提供する。特定の実施形態では、本明細書に開示されるパラメータのいずれかを、ラフォラ病動物モデルからの骨格筋（例えば、横隔膜）、肝臓、心筋、及びまたは脳神経細胞においてモニタリングすることができる。
【０３７７】
さらに、本明細書に記載のキメラポリペプチドのいずれかの有効用量、クリアランス速度、分布容積及び半減期を決定するための完全な薬物動態試験が決定される。最終生成物のＰＫ／ＰＤ／ＴＫをより大きい動物、例えばラット、イヌ及び霊長類で検査することができる。
【０３７８】
上記モデルは、主題のキメラポリペプチド及び／または製剤の活性及び有効性の評価に適切な動物モデル系の例である。これらのモデルはラフォラ病の症状と相関があり、したがってラフォラ病の研究のための適切なモデルを提供する。主題のキメラポリペプチド及び／または製剤の活性をこれらのモデルのいずれか１つ以上において評価し、その結果を、野生型対照動物及びこのキメラポリペプチドで処置していない（または、アルファ−アミラーゼ単独で処置した）動物において観察された結果と比較する。同様に、培養細胞、例えば、上述の突然変異体マウスまたは他の動物のいずれかから調製した細胞、及び野生型細胞、例えば線維芽細胞、筋芽細胞、または肝細胞を使用して、主題のキメラポリペプチドを評価することができる。疾患を有する対象に由来する細胞も使用できる。本明細書に開示されるキメラポリペプチドの活性を試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの例は、キメラポリペプチドで、またはキメラポリペプチドなしでラフォラ病細胞を処置し、その後、ある一定期間のインキュベーション後に、例えば過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を使用することによって、グリコーゲンの存在に関してそれらの細胞を染色するものである。封入体及びグリコーゲン過剰リン酸化の量も、モニタリングすることができる。細胞増殖、形態及び細胞死もまた、処置細胞または無処置細胞においてモニタリングすることができる。
【０３７９】
本開示のキメラポリペプチドには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を含む、非常に多くの用途がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用は、治療的使用のみならず、例えば、前述のいずれかの動物モデルにおける診断的または研究的使用も含む。例として、本開示のキメラポリペプチドは、健常動物または罹患動物における、アルファ−アミラーゼ生理活性、局在化及び輸送、タンパク質−タンパク質相互作用、酵素活性、ならびに動物生理に対する影響を理解するための研究試薬として使用して、動物へ送達することができる。
【０３８０】
キメラポリペプチドを、例えば、培地中の健常細胞、罹患細胞（ただしアルファ−アミラーゼ欠損ではない）ならびにラフォリン、アルファ−アミラーゼ及び／またはマリン欠損細胞を含む培養細胞における、アルファ−アミラーゼ生理活性、局在化及び輸送、タンパク質−タンパク質相互作用、ならびに酵素活性を評価するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することもできる。本開示は、本開示のキメラポリペプチドを使用して、培養細胞を含む細胞の細胞質、リソソーム、及び／またはオートファジー小胞へアルファ−アミラーゼを送達することを企図する。いくつかの実施形態では、培養細胞は、ラフォラ病の対象から、例えば、ラフォラ病ヒト患者から、またはラフォラ病動物モデルから得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２（１８）：１−９に記載されているものと同様に、低酸素細胞モデルで使用され得る。
【０３８１】
さらに、無細胞系を使用して、例えば、主題のキメラポリペプチドの酵素活性を評価することができる。例えば、グリコーゲンを健常対象及び／または罹患対象から（例えば、ラフォラ病の対象から）の試料から得ることができ、本明細書に開示されるキメラポリペプチドのいずれかのグリコーゲンを加水分解する能力を、例えば、本明細書にて提供される実施例セクションに記載されているものと類似の方法で評価することができる。いくつかの実施形態では、そのような無細胞系で使用されるグリコーゲンは、対象の（例えば、ラフォラ病の対象の）筋細胞（例えば、横隔膜細胞もしくは心筋細胞）、肝細胞または神経細胞（例えば、脳細胞）から得ることができる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトラフォラ病患者またはラフォラ病の動物モデルである。
【０３８２】
アルファ−アミラーゼキメラポリペプチドなどのキメラポリペプチドはさらに、アルファ−アミラーゼなどのタンパク質に欠損のない系における、例えばフォーブス・コリ病におけるタンパク質−タンパク質相互作用を明らかにするために使用することができる。キメラポリペプチドは、さらに、ある特定の細胞型におけるグリコーゲン蓄積の減少の相対的利益を理解するために使用することができるが、その細胞型は、症状が存在するすべての細胞型ではない可能性がある。キメラポリペプチドは、特に、内在性アルファ−アミラーゼが変異していない状況で、アルファ−アミラーゼの基質を同定するために使用することができる。キメラポリペプチドは、健常細胞及びグリコーゲン蓄積が異なる根本原因に起因する罹患細胞におけるアルファ−アミラーゼ及びキメラポリペプチドの輸送を評価するために有用である。
【０３８３】
Ｘ．キット
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの本開示のキメラポリペプチドを充填した１つ以上の容器を含む医薬パッケージまたはキットも提供する。場合により、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって定められた形式での注意書きがそのような容器（複数可）に付随することがあり、この注意書きは、（ａ）ヒトへの投与のための製造、使用もしくは販売についての政府機関による承認、（ｂ）使用方法、または両方を示す。
【０３８４】
特定の実施形態では、キットは、主題のキメラポリペプチドの送達を促進するための追加の材料を含む。例えば、キットは、カテーテル、チューブ、輸液バッグ、シリンジなどのうちの１つ以上を含む場合がある。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは凍結乾燥形態でパッケージングされ、そのキットには、少なくとも２つの容器、すなわち、凍結乾燥されたキメラポリペプチドを含む容器、及び適量の水、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液）、または凍結乾燥材料の再調製に適した他の液体を含む容器が含まれる。
【０３８５】
上述は、本明細書に記載のキメラポリペプチド、組成物及び方法のいずれにも適用される。本開示は、そのようなキメラポリペプチド、組成物及び方法の（単独でのまたは組み合わせでの）特徴と、このセクションに記載する様々なキットについて記載する特徴との任意の組み合わせを具体的に企図している。
【０３８６】
例示
ここでは本開示を一般的に説明しているが、単に本開示のある一定の態様及び実施形態の説明のために含めるものであり、本開示を限定することを意図したものではない以下の実施例を参照することによって、本開示は、より容易に理解されるであろう。例えば、本明細書に開示される個々のコンストラクト及び実験設計は、適切な機能を検証するための例示的ツール及び方法を代表している。したがって、開示する特定のコンストラクト及び実験計画のいずれも、本開示の範囲内で置換できることは容易に明らかであろう。
【実施例】
【０３８７】
実施例１：Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼタンパク質の作製及び特性決定
Ａ．Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼタンパク質の合成
成熟アルファ−アミラーゼポリペプチド部分及び内在化モイエティ部分を含むキメラポリペプチドを、２つの異なる哺乳動物細胞株（ＣＨＯ−３Ｅ７細胞及びＨＥＫ−２９３  ６Ｅ細胞）内で組換えによって作製した。成熟アルファ−アミラーゼポリペプチドを含むアルファ−アミラーゼポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を、配列番号７に記載の重鎖可変ドメインを含むヒト化３Ｅ１０抗体のＦａｂに融合させた。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を有するアルファ−アミラーゼポリペプチドを、配列番号６のアミノ酸配列を有するリンカーによってヒト化３Ｅ１０  Ｆａｂ断片（配列番号４のシグナル配列を含んでいる）の重鎖定常領域のＣ末端に融合させて、配列番号９のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドを作製した。軽鎖には、配列番号１０の配列を提供するように、配列番号８のアミノ酸配列及び配列番号５のシグナル配列を含める。得られた重鎖及び軽鎖の両方を含む「Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼ」を、下記の実験設計に示す。
【０３８８】
このＦａｂを、２つの細胞株のいずれかにおいて、軽鎖をコードするベクター及び重鎖−アミラーゼ融合体をコードするベクターを発現させることによって作製した。２つの別個のベクターを使用したが、重鎖及び軽鎖の両方をコードする単一のベクターを用いることもできる。
【０３８９】
組換え重鎖（配列番号９）をコードするヌクレオチド配列及び軽鎖（配列番号１０）をコードするヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化して、標準的方法を使用してｐＴＴ５ベクターにクローニングした。配列番号９の配列をコードする発現プラスミド及び配列番号１０の配列をコードする発現プラスミドを、低エンドトキシンのギガプレップスケールで生成して、それぞれ７．０ｍｇのプラスミドＤＮＡ（１ベクターあたり）を得た。次に、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞及びＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞に、以下に要約する方法でこれら２つのプラスミドをそれぞれトランスフェクトした。
【０３９０】
ｉ．ＣＨＯ−３Ｅ７
２Ｌの振盪フラスコ中のＣＨＯ−３Ｅ７細胞の培養液１Ｌ（初期濃度１．９×１０６細胞／ｍＬ）４つに、ＰｏｌｙＰｌｕｓ直鎖状Ｑ−ＰＥＩをＤＮＡ：ＰＥＩ比１：４（ｗ／ｖ）で使用して、合計１ｍｇ（ＨＣ：ＬＣ＝１：１）のプラスミドＤＮＡ／Ｌ培養物をトランスフェクトした。ＣｅｄｅｘＸＳ（０〜１日目）またはＶｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ（２〜８日目）を使用して、濃度及び生存率について、培養パラメータをモニタリングした。培地は、０．１％プルロニック（登録商標）Ｆ−６８、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸを補充したＦ１７であった。振盪フラスコ中で、細胞を０．５〜５×１０６細胞／ｍＬの濃度の間で維持した。３７℃、５％の加湿ＣＯ２の環境下で、フラスコを１３５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。トランスフェクションの８日後、１０００×ｇで５分遠心分離して培養物を回収した。調整した培養上清を、９３００×ｇで３０分遠心分離することによって清澄化した。
【０３９１】
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティーマトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１９４３２０００１）を使用して、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼをＣＨＯ−３Ｅ７細胞から精製した。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティーレジン（ベッドボリューム５ｍＬ）を、緩衝液Ａ（１×ＰＢＳ（２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）、ｐＨ７．２（２３℃））で平衡化した。４Ｌの枯渇上清からのＦａｂ−アルファ−アミラーゼを、４℃で一晩攪拌しながらＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティーレジンとバッチ結合させた。レジンを直径２．５ｃｍのエコノカラムに採取し、およそ１５カラムボリューム（ＣＶ）の緩衝液Ａ、１５ＣＶの緩衝液Ｂ（１×ＰＢＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２（２３℃））及び１５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。レジンに結合したＦａｂ−アルファ−アミラーゼを、約４ＣＶの緩衝液Ｃ（３０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ３．５〜３．６（２３℃））、続いて約４ＣＶの緩衝液Ｄ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７（２３℃））で溶出させて、タンパク質を２ｍＬの画分中に採取し、１／１０の量の緩衝液Ｅ（３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ約９．０（２３℃））で希釈して中和させた。溶出量を最小にするため、それぞれの画分を採取する間で、溶出を数分間停止させた。緩衝液Ｃ溶出液及び緩衝液Ｄ溶出液のそれぞれからの画分６〜１２及び画分１〜１１をプールする前に、画分をＡ２８０によって分析した。一緒にしたＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティープール（５０ｍＬ）を４℃で、透析緩衝液１Ｌ（２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５（２３℃））に対して３回透析した。透析したプールを、最終分析及び−８０℃での保管の前に、ＶｉｖａＳｐｉｎ  ２０（１０Ｋ  ＭＷＣＯ、ＰＥＳ膜）遠心装置を使用して約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮させた。選択した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって分析したところ、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼが生成され、問題なく精製されたことが確認された（データは示されていない）。
【０３９２】
ｉｉ．ＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞
２Ｌの振盪フラスコ中の２９３−６Ｅ細胞の培養液１Ｌ（初期濃度２．６×１０６細胞／ｍＬ）２０個に、ＰｏｌｙＰｌｕｓ直鎖状Ｑ−ＰＥＩをＤＮＡ：ＰＥＩ比１：１．５（ｗ／ｖ）で使用して、合計１ｍｇ（ＨＣ：ＬＣ＝１：１）のプラスミドＤＮＡ／Ｌ培養物をトランスフェクトした。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲを使用して、濃度及び生存率について、培養パラメータをモニタリングした。培地は、０．１％プルロニック（登録商標）Ｆ−６８、４ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充したＦ１７であった。振盪フラスコ中で、細胞を０．５〜５×１０６細胞／ｍＬの濃度の間で維持した。３７℃、５％の加湿ＣＯ２の環境下で、フラスコを１３５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。トランスフェクションの６日後、１０００×ｇで５分遠心分離して培養物を回収した。調整した培養上清を、９３００×ｇで３０分遠心分離することによって清澄化した。
【０３９３】
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティーマトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１９４３２０００１）を使用して、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼをＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞から精製した。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティーレジンを、緩衝液Ａ（１×ＰＢＳ（２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）、ｐＨ７．２（２３℃））で平衡化した。２０Ｌの枯渇上清からのＦａｂ−アルファ−アミラーゼを、４℃で一晩攪拌しながらＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティーレジン（ベッドボリューム４０ｍＬ）とバッチ結合させた。レジンを直径５ｃｍのエコノカラムに採取し、およそ１５カラムボリューム（ＣＶ）の緩衝液Ａ、１５ＣＶの緩衝液Ｂ（１×ＰＢＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２（２３℃））及び１５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。レジンに結合した融合タンパク質を、約４ＣＶの緩衝液Ｃ（３０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ３．５〜３．６（２３℃））、続いて約４ＣＶの緩衝液Ｄ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７（２３℃））で溶出させて、タンパク質を１０ｍＬの画分中に採取し、１／１０の量の緩衝液Ｅ（３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ約９．０（２３℃））で希釈して中和させた。溶出量を最小にするため、それぞれの画分を採取する間で、溶出を数分間停止させた。画分７〜２５をプールする前に、画分をＡ２８０によって分析した。選択した画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した。Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼは、アフィニティークロマトグラフィーの最初の通過の未結合プールに残留した。上記手順を繰り返して、残留Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼをキャプチャーした。透析の前に、各アフィニティープールを一緒にした。
【０３９４】
一緒にしたＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティーのプール（２５０ｍＬ）を４℃で、透析緩衝液４Ｌ（２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５（２３℃））に対して３回透析した。透析したプールを、最終分析及び−８０℃での保管の前に、ＶｉｖａＣｅｌｌ  １００（１０Ｋ  ＭＷＣＯ、ＰＥＳ膜）遠心装置を使用して約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮させた。選択した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって分析したところ、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼが生成され、問題なく精製されたことが確認された（データは示されていない）。
【０３９５】
代替的な実施形態では、完全長のヒト化３Ｅ１０抗体及びアルファ−アミラーゼタンパク質を含むタンパク質も作製することができる。本開示の他のキメラタンパク質は、例えば同様に作製してよく、そのようなタンパク質はいずれも、本明細書に記載の方法のいずれかで使用してよい。
【０３９６】
Ｂ．無細胞活性アッセイにおけるＦａｂ−アルファ−アミラーゼ
Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼのグリコーゲンを消化する能力を、無細胞アッセイで評価した。グルコース標準液を、Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｏｘｉｄａｓｅキット（Ｓｉｇｍａ  ＧＡＧＯ２０−１ＫＴ）のグルコース１ｍｇ／ｍＬを水で希釈（０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ＝５５５．１μＭ））することによって調製した。ｐＨ３．５〜７．０のクエン酸／リン酸緩衝液２０ｍＬを、０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍ二塩基性リン酸ナトリウムを表１に示す量で添加することによって調製した。最終０．０２％となるまで緩衝液を１０％Ｔｗｅｅｎ−８０に添加して、ｐＨをｐＨメーターで確認した。ｐＨ４．３の０．１Ｍ酢酸ナトリウム＋０．０２％  ｔｗｅｅｎ−８０も調製した。
【表１】
2021518840.tif 000003
次に、グリコーゲン１０ｍｇ／ｍＬを、試験する各緩衝液中で調製した。Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼを反応緩衝液で１ｍｇ／ｍＬまで希釈して、次に、１ｍｇ／ｍＬのＦａｂ−アルファ−アミラーゼ１．８μＬを、５００μＬバイアル中のグリコーゲン溶液１７８．２μＬに添加した（１０μｇ／ｍＬのＦａｂ−アルファ−アミラーゼ最終濃度）。試料を十分に混合し、周囲温度で１時間、インキュベートした。グリコーゲン溶液も、陰性対照として保持した。試料を９５℃で１０分間加熱することにより、消化を終了させた。Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼ陰性のグリコーゲン試料を、陰性対照／ブランク試料として加熱した。次に、グルコース標準液及び消化されたグリコーゲン試験試料（４０μＬ／ウェル）を三連で９６ウェルプレートにピペットで入れ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  ＯｘｉｄａｓｅキットＲｅａｇｅｎｔ  Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ  ＧＡＧＯ２０−１ＫＴ、キットに記載の通りに調製）８０μＬを、室温にてマルチチャンネルピペットを用いて各ウェルに添加し、十分に混合して３７℃で３０分間インキュベートした。１２Ｎ硫酸８０μＬをマルチチャンネルピペットを用いて添加し、十分に混合することにより反応を終了させた。次に、プレートを５４０ｎｍで読み取った。陰性対照では、有意義なグリコーゲン消化は観察されなかった。これに対して、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼタンパク質を有する試料中ではグリコーゲン消化が観察され、最も強い活性は、弱酸性のｐＨにおいて観察された。試験試料からの代表的な結果を以下の表２に示す。
【表２】
2021518840.tif 000004
【０３９７】
Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼタンパク質は、ｐＨ４．３で不活性であることも判明した（データは示されていない）。
【０３９８】
追加または代替の実験では、ポリグルコサン小体を、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＦＥＢＳ  Ｊ，２７９（１４）：２４６７−７８に記載されているものと類似の方法で、ラフォラ病の動物モデル（例えば、Ｇａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１１：１２５１−１２６２のマウスモデル）から単離する。簡潔に述べると、前脳皮質の神経細胞を、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，４８（１）：４９−６１に記載されているものと類似の方法で、出生後２日のＥｐｍ２ａ野生型マウスまたはＥｐｍ２ａノックアウトマウスの脳からＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に顕微解剖する。次に、ポリグルコサンをＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているものと類似の方法で単離する。精製したＦａｂ−アルファ−アミラーゼ融合タンパク質を、種々の用量及び種々の時点で、単離したポリグルコサンとともにインキュベートして、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼのポリグルコサンを消化する能力をモニタリングする。
【０３９９】
Ｃ．細胞培養物におけるＦａｂ−アルファ−アミラーゼ
Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼタンパク質の、初代神経細胞培養物中のポリグルコサンレベルの低下に対する有効性を、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているものと類似の方法で試験する（上述の細胞単離プロトコールも参照されたい）。あるいは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているものと類似の方法でＮ２Ａ細胞をＥＲストレッサーであるタプシガルギンで処置することにより、ラフォラ病の表現型を模倣したＮ２Ａ細胞を使用してもよい。次に、初代神経細胞またはＥＲストレス下のＮ２Ａ細胞（もしくは対照の非ストレス下のＮ２Ａ細胞）にＦａｂ−アルファ−アミラーゼタンパク質を投与して（または投与せず）、ポリグルコサンレベルに対するタンパク質の作用をＰＡＳ染色によってモニタリングする。タンパク質で処置した細胞におけるＰＡＳ染色の減少は、キメラポリペプチドによって、ポリグルコサンが細胞から除去されたことに一致する。いくつかの実施形態では、グリコーゲンレベルに対するＦａｂ−アルファ−アミラーゼの作用を、ＧＳＤ  ＩＩＩ及び／またはＧＳＤ  ＩＶのヒト患者もしくは動物モデルの初代細胞に対して、または動物モデルにおいて試験する。
【０４００】
いくつかの実施形態では、グリコーゲンレベルに対するＦａｂ−アルファ−アミラーゼの作用を、低酸素細胞モデルにおいて試験する。特定の実施形態では、低酸素腫瘍細胞モデルは、低酸素がある特定の細胞型においてグリコーゲン蓄積を誘発することを示したＰｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２（１８）：１−９に記載されているモデルと同じであるか、または類似のものである。簡潔に述べると、非がん性細胞（例えばチャイニーズハムスター肺線維芽細胞（ＣＣＬ３９）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ））及び／またはがん細胞（例えば、ＬＳ１７４またはＢＥ結腸癌細胞）を、正常酸素圧条件下または低酸素（１％Ｏ２）条件下において、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼの存在下または非存在下で９６時間培養する。グリコーゲンレベルを、電子顕微鏡及び／または過ヨウ素酸シッフ染色で評価する。無処置の低酸素細胞と比較した、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼで処置した低酸素細胞におけるグリコーゲンレベルの低下を評価する。
【０４０１】
ＥＮＴ２＋  Ｃ２Ｃ１２筋管におけるポリグルコサンレベルの低下に対する、Ｆａｂ−アミラーゼの有効性について試験する。ＥＮＴ２＋  Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＦａｂ−アミラーゼの用量依存的な取り込みを図１に示す。０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌでの−Ｆａｂ−アミラーゼと＋Ｆａｂ−アミラーゼとの比較を示す。未トランスフェクトＣ２Ｃ１２筋管のグリコーゲン（ｍｇ）／タンパク質（ｍｇ）レベルを、処置したＣ２Ｃ１２筋管と比較することによって、Ｆａｂ−アミラーゼによるＥＮＴ２＋  Ｃ２Ｃ１２筋管におけるグリコーゲンの減少を示す（図２）。処置したＣ２Ｃ１２筋管は、Ｃ２Ｃ１２筋管をＰＴＧでトランスフェクトして、次いで２４時間後に、トランスフェクトした筋管を培地中で０．０１ｍｇ／ｍｌのＦａｂ−アミラーゼで処置することにより調製する。
【０４０２】
Ｄ．ラフォラ小体に対するＦａｂ−アミラーゼの作用
ラフォラ病は、脳、心臓、肝臓、筋肉及び皮膚における細胞の細胞質内のグリコーゲンで満たされた封入体の蓄積によって特徴付けることができる（本明細書において、ラフォラ小体またはポリグルコサン小体とも称される）。
【０４０３】
ｉ． 精製封入体の評価
Ｆａｂ−融合体の有効性は、精製封入体を使用して評価することができる。Ｆａｂ−アミラーゼ及びＦａｂ−グルコシダーゼを、ラフォラノックアウトマウスの脳、心臓、及び骨格筋の組織から単離された精製封入体にアプライすることによって分解アッセイを実施する。結果から、Ｆａｂ−アミラーゼが精製封入体を分解することが示される（図４Ａ）。封入体に対するＦａｂ−アミラーゼの作用を、ｅｘ  ｖｉｖｏで−Ｆａｂ−アミラーゼ及び＋Ｆａｂ−アミラーゼで処置した野生型マウス及びノックアウトマウスから得た試料の封入体含有量（抽出物１ｍＬあたりのμｇ）を測定することによりさらに評価する（図４Ｂ）。
【０４０４】
Ｅ．Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼ活性
Ｆａｂ−アミラーゼの活性を、アミラーゼ活性比色アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用して測定することができる。アッセイキットを使用するための方法を、ＯＤ４０５ｎｍで試料を測定するための時点の選択を明確にし、最適な時点を選択することにより最適化する。筋肉におけるＦａｂ−アミラーゼ活性（組織１ｍｇあたりのｎｍｏｌ  Ｐ）を、注射１時間後、注射２時間後、注射４時間後、及び注射２４時間後を含む注射後の様々な時点で測定する（図５Ａ）。アミラーゼ活性（ｎｍｏｌ  Ｐ／分／ｇ組織）もまた、（図５Ｂの上部パネルで明らかにされているような）脳の様々な区域について、注射直後及び注射１時間後に測定する（図５Ｂ、下部パネル）。
【０４０５】
Ｆ．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦａｂ−アルファ−アミラーゼ
マリンを欠損するように操作されたマウスは、ラフォラ病のヒトの症例で観察されるものと類似した表現型を示す。具体的には、マリン−／−マウスは、年齢依存性の神経変性、シナプス興奮性の亢進、及びミオクロニー発作の罹患傾向を示した（Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，３（１１）：６６７−６８１）。さらに、これらのマウスはグリコーゲンで満たされた封入体を蓄積しており、封入体は、海馬及び小脳に最も大量に存在していたが、骨格筋細胞及び心筋細胞にも見られた（Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．）。グリコーゲンはまた、マリン−／−マウスの細胞内では、健常対照マウスの細胞内で見られるグリコーゲンと比較して、分岐が少ないことも判明した（Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．）。グリコーゲンの過剰リン酸化レベルの上昇もまた、このマウスモデルにおいて記載されている（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ，６８（６）：９２５−３３）。本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用することができる代替のマウスモデルとしては、Ｇａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１１（１１）：１２５１−６２に記載されているラフォリン−／−マウスモデルが挙げられる。
【０４０６】
ｉ．Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼの用量選択
ラフォラ病マウスに送達するＦａｂ−アルファ−アミラーゼの評価用量は、経験的に決定される。Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼに対する免疫応答を中和する交絡影響を最小化させ、かつ治療効果を示す能力を最大化させるため、５ｍｇ／ｋｇの高用量のＦａｂ−アルファ−アミラーゼ２用量を１週間で送達し、その後疾患エンドポイントの変化を評価する。抗Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼ抗体の発生もモニタリングする。Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼの静脈内投与によってマウスの脳、心臓、横隔膜または肝臓における異常グリコーゲンの貯蔵の改善がもたらされることが確立された後に、他のモデル（例えば、霊長類）での後続のｉｎ  ｖｉｖｏ評価を開始し、その後、免疫組織化学法（例えば、ＰＡＳ染色）により判定されるグリコーゲンクリアランスの変化を評価する。
【０４０７】
ｉｉ．材料及び方法
ａ）化学的及び遺伝学的にコンジュゲートされたＦａｂ−アルファ−アミラーゼの注射
Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼを配合し、静脈内注射に適合する緩衝液（例えば、無菌生理食塩水またはｐＨ  ７．４の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌの緩衝液）で希釈した。各マウスへ与えるＦａｂ−アルファ−アミラーゼの量を以下の通り算出した。用量（ｍｇ／ｋｇ）×マウス体重（ｋｇ）×ストック濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝マウス１匹あたりのストック容量（ｍｌ）、溶媒を適量加え１００ｕｌとする。
【０４０８】
ｂ）採血
動物を組織解剖のために屠殺した際に、心臓穿刺によって血液を採取する。血清を除去して−８０℃で凍結させる。解凍及び取扱いの影響を最小にするために、血中を循環するＦａｂ−アルファ−アミラーゼのすべての分析を同一の日に実施する。
【０４０９】
ｃ）組織の採取及び調製
試料組織を免疫ブロット、グリコーゲン分析、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロック及びＯＣＴ中の凍結切片のために分割する。心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、四頭筋、ＥＤＬ、ヒラメ筋、横隔膜、脳、及び二頭筋組織（５０〜１００ｍｇ）を細分し、免疫ブロット及びグリコーゲン分析のためのさらなる処理のためにプラスチックチューブで凍結する。心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、四頭筋、ＥＤＬ、ヒラメ筋、横隔膜、脳、及び二頭筋の追加の試料を細分し、ＯＣＴ組織切片封入剤中に凍結するか、または３％グルタルアルデヒド・ホルムアルデヒド固定中で２４〜４８時間、４℃で固定してＥｐｏｎ樹脂で包埋するか、または１０％ＮＢＦに固定してパラフィンブロックに加工する。試料のいくつかを３０％ＫＯＨ中で１５分間ホモジナイズし、Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌに記載されているアミログルコシダーゼベースのアッセイを使用してグリコーゲンレベルを測定する。さらに、ホモジナイズした試料中で、Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌに記載されている方法を使用してグリコーゲンの分岐を評価する。無処置の対照マウスと比較した場合の、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼで処置したマウスからの試料中のグリコーゲン蓄積の減少及びグリコーゲンの分岐の増加は、キメラポリペプチドがマウスの細胞中でグリコーゲンを除去し、グリコーゲンの分岐を改善することができることを意味している。
【０４１０】
ｄ）組織学的評価
Ｅｐｏｎ樹脂包埋試料を１μｍに切断し、グリコーゲン染色のために、ＰＡＳ−リチャードソン染色で染色した。Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼで処置したラフォラ病マウスの組織（例えば、筋肉または肝臓）中の、対照処置したラフォラ病マウスと比較した場合のグリコーゲン蓄積レベルの低下は、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼがｉｎ  ｖｉｖｏでグリコーゲンレベルを低下させることができることを意味している。
【０４１１】
ｅ）免疫蛍光法
体外から送達されたＦａｂ−アルファ−アミラーゼを、ポリクローナル抗アルファ−アミラーゼ抗体またはモノクローナル抗アルファ−アミラーゼ抗体を使用して検出する。１０μｍの凍結切片を切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ顕微鏡スライドガラス上に載せる。
【０４１２】
ｆ）免疫ブロット
免疫ブロッティングを使用して、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼで処置した筋肉（例えば、横隔膜）、心臓及び脳内の３Ｅ１０及びアルファ−アミラーゼ免疫反応物質を検出する。３Ｅ１０及びアルファ−アミラーゼのタンパク質単離及び免疫ブロット検出を、通常の免疫ブロット法に従って実施する。アルファ−アミラーゼを、このタンパク質に特異的な抗体によって検出する。ブロッティングしたタンパク質の抗体検出は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを基質として使用する。対照には、溶媒及び処置したラフォラ病マウスならびに溶媒及び処置したホモ接合性野生型マウスを含める。
【０４１３】
ｇ）循環Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼの分析
ヒトＦａｂ−アルファ−アミラーゼに特異的なＥＬＩＳＡを展開し、利用可能な抗ヒトアミラーゼ抗体（またはＦａｂ−アルファ−アミラーゼのＦａｂ部分の定常重鎖を検出するための抗ＣＨ１抗体）及び抗マウス二次抗体にコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して検証する。組換えＦａｂ−アルファ−アミラーゼを希釈して、標準曲線を作成するために使用する。Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼのレベルを、血清の希釈度（血清のｎｇ／ｍｌに正規化）または組織抽出物（組織のｎｇ／ｍｇに正規化）の希釈度により決定する。対照には、溶媒マウスならびに処置した野生型マウス及び処置したラフォラ病マウスを含める。
【０４１４】
ｈ）抗Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼ抗体反応のモニタリング
ラフォラ病マウスへの注射に使用する精製したＦａｂ−アルファ−アミラーゼを、高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのコーティング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に１ｕｇ／ｍｌで蒔き、一晩コートして、ＴＢＳ中の１％脱脂粉乳（Ｂｉｏｒａｄ）で３０分間ブロックし、ＴＢＳで３回リンスする。溶媒またはＦａｂ−アルファ−アミラーゼを注射した動物の血清の２倍希釈物をウェルに充填して３７℃で３０分間インキュベートし、３回洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭとインキュベートして３７℃で３０分間インキュベートし、３回洗浄する。マウス抗Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼ抗体をＴＭＢ液体基質で検出して、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４０５ｎｍで読み取る。ポリクローナル抗アルファ−アミラーゼ抗体、次いでＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギが、陽性対照の抗体反応として機能する。４０５ｎｍにおいて、溶媒処置したラフォラマウスの吸光度より大きい任意の吸光度は、陽性の抗Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼの抗体反応を構成する。対照には、溶媒マウスならびに処置した野生型マウス及び処置したラフォラマウスを含める。
【０４１５】
ｉ）組織グリコーゲン分析
組織のグリコーゲン含有量を、Ａｋｍａｎ（２０１１）に記載されているプロトコールを使用してアッセイする。筋肉（例えば、横隔膜または心筋）、脳及び肝臓組織の凍結試料（約３０〜６０ｍｇ）を、３０％（重量／容量）のＫＯＨ  ２００μｌ中で３０分間、時々振盪しながら煮沸する。冷却後、０．２５ｍ  Ｎａ２ＳＯ４  ６７μｌ及びエタノール５３５μｌを添加する。次に、試料を４℃で２０分間、１４５００ｇで遠心分離してグリコーゲンを採取する。グリコーゲンペレットを水（１００μｌ）に懸濁させ、エタノール２００μｌを添加して、上記の通りに遠心分離を使用してグリコーゲンを回収する。このエタノール沈殿工程を繰り返し、グリコーゲンペレットをＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ内で乾燥させる。乾燥したグリコーゲンペレットをアミログルコシダーゼ１００μｌ（０．２ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．８）中に０．３ｍｇ／ｍｌ）に懸濁させ、３７℃で３時間インキュベートしてグリコーゲンを消化させる。試料中のグルコース濃度を測定するため、消化したグリコーゲンのアリコート（５μｌ）を、０．３ｍトリエタノールアミン（ｐＨ７．６）、０．４ｍｍ  ＭｇＣｌ２、０．９ｍｍ  ＮＡＤＰ、１ｍｍ  ＡＴＰ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ／ｍｌ  ０．１μｇを含有する溶液９５μｌに添加する。３４０ｎｍでの吸光度を、ヘキソキナーゼ０．１μｇの添加前後に読み取る。
【０４１６】
ｊ）発作の評価
Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されたマリン−／−マウスを、通常は発作に対して耐性であるマウスＣ５７ＢＬ６系統において作製する。野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスにおいてはカイニン酸の投与はいかなる発作も誘発しなかったが、しかし、カイニン酸で処置したマリン−／−マウスは、間代性の海馬発作を示した。（Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．）。マリン−／−マウスを、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼとともに、またはＦａｂ−アルファ−アミラーゼなしでカイニン酸で処置する。カイニン酸とＦａｂ−アルファ−アミラーゼで処置したマウスの場合、カイニン酸で処置したがキメラポリペプチドでは一切処置していないマリン−／−マウスと比較して発作の減少が示されており、これは、キメラポリペプチドが、マリン−／−マウスで観察されるある種の神経学的異常の処置に有効であることを意味している。
【０４１７】
ｋ）神経変性解析
パルブアルブミン陽性介在神経細胞の総数を、Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼで処置した、または処置していないマリン−／−マウスの海馬において評価する（Ｖａｌｌｅｓ−Ｏｒｔｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．）。Ｆａｂ−アルファ−アミラーゼで処置したマウスからの海馬が、無処置マウスからの海馬におけるパルブアルブミン陽性の神経変性よりも少ない神経変性を示す場合、キメラポリペプチドは、マリン−／−マウスにおいて神経変性を減少させるのに有効であることを意味している。
【０４１８】
ｌ）統計分析
対比較は、スチューデントｔ検定を用いる。複数群間の比較はＡＮＯＶＡを用いる。いずれの場合も、ｐ値＜０．０５が統計学的に有意とみなされる。
【０４１９】
ｉｉｉ．筋肉内注射時のＦａｂ−アルファ−アミラーゼの評価
Ｆａｂ−アミラーゼの筋肉内注射の作用を、Ｆａｂ−アミラーゼ処置マウスを対照マウスと比較することによって評価する。Ｆａｂ−アミラーゼ処置マウスでは、２週間にわたって右脚の前脛骨筋（ＴＡ）に２０ｕｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）の筋肉内注射を４回投与し、一方で左脚にＰＢＳを注射する。対照マウスでは、マウスの右脚及び左脚の両方にＰＢＳを注射する。２週間終了時に、マウスを屠殺して前脛骨筋をＯＣＴ封入剤で包埋し、液体窒素冷却イソブタンで急速冷凍して、次いで、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色のために後に薄片にした。
【０４２０】
Ｆａｂ−アミラーゼで処置したマウスでは、ＰＡＳ染色で濃いピンク色のグリコーゲンが検出される極めて強力な事例の減少、及び筋構造の改善（例えば、速筋線維と遅筋線維との明確な区別）が示された。例えば、図６に見られるように、処置した８．５ヶ月齢の雌マウス（標本＃８）は左脚（ＰＢＳ処置）（左パネル）に非常に濃いピンク色の染色を示しており、これは、過剰蓄積したグリコーゲンを表している。これに対して、Ｆａｂ−アミラーゼで処置した筋肉には、同様の染色が示されていない（右パネル）。処置した２匹目の８．５ヶ月齢の雌マウス（標本＃７）は、図７に見られるように同様の結果を示す。Ｆａｂ−アミラーゼで処置した筋肉（右パネル）は、ＰＢＳで処置した筋肉（左パネル）と比較して、速線維（小さい、薄紫）と遅線維（大きい、より明確）の間の正常な線維の違いも示している。図９は、４ヶ月齢の雌マウス（標本＃６）のＰＢＳで処置した筋肉（左パネル）とＦａｂ−アミラーゼで処置した筋肉（右パネル）との比較を示しており、これは、これらの知見をさらに裏付けるものである。８．５ヶ月齢の雌マウス（標本＃１０）は、左脚と右脚の両方（それぞれ左パネルと右パネル）をＰＢＳで処置した筋肉を有する対照としての役割を果たす（図８）。
【０４２１】
ｉｉｉ．ＩＣＶ投与時の脳におけるＦａｂ−アミラーゼの評価
Ｆａｂ−アミラーゼのＩＣＶポンプ投与の作用を、Ｆａｂ−アミラーゼ処置マウスをＰＢＳ処置マウスと比較することによって評価する。ＰＢＳ処置マウスでは、４匹のマウスにＩＣＶポンプを介してＰＢＳを２８日間投与し、Ｆａｂ−アミラーゼマウスでは、５匹のマウスにＩＣＶポンプを介して２８日間にわたってＦａｂ−アミラーゼを投与した。２８日目の終了時に、マウスを屠殺して、脳を６つの薄片に切り分けた。（ＰＢＳ処置またはＦａｂ−アミラーゼ処置した）各マウスのそれぞれの脳の切片において、グルコースレベルを測定した（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。Ｆａｂ−アミラーゼで処置したマウスは、脳内のグリコーゲン除去を示した。これは、ＩＨＣ（抗アミラーゼ染色）によってさらに実証され、Ｆａｂ−アミラーゼの脳にわたる幅広い分布及び神経細胞への取り込みが示された。（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。
【０４２２】
ｉｖ．腓腹筋上のＦａｂ−アミラーゼの評価
Ｆａｂ−アミラーゼの腓腹筋への筋肉内注射の作用を野生型マウス及びラフォリンノックアウトマウスを使用して評価した。１０ヶ月齢のラフォリンノックアウトマウス４匹に、Ｆａｂ−アミラーゼ３０ｍｇ／ｍｌを７日間にわたって３回右腓腹筋に注射した。最終注射の２４時間後、マウスを屠殺して右腓腹筋及び左腓腹筋のグリコーゲンを測定した。グリコーゲン含有量の試料を、年齢を一致させた野生型動物（Ｎ＝４）、及びラフォリンノックアウトマウス（Ｎ＝４）の無処置筋肉からさらに採取した（図１２Ａ〜図１２Ｂ）。
【０４２３】
実施例２：Ｆａｂ−酸性アルファ−グルコシダーゼの作製及び特性決定
Ａ．酸性アルファ−グルコシダーゼコンストラクトの設計
ＧＡＡコンストラクトの例は、ＧＡＡ酵素への３Ｅ１０  Ｆａｂの融合及び全抗体の融合を含むように設計される。ＧＡＡコンストラクトには、１）重鎖のＦａｂセグメントのＣ末端に融合したＧＡＡ  ７０−９５２を有する３Ｅ１０  Ｆａｂ、２）重鎖のＦａｂセグメントのＣ末端に融合したＧＡＡ  ６１−９５２を有する３Ｅ１０  Ｆａｂ、３）５アミノ酸のリンカー及び重鎖のＦａｂセグメントのＣ末端に融合したＧＡＡ  ５７−９５２を有する３Ｅ１０  Ｆａｂ、４）１３アミノ酸のリンカー及び重鎖のＦａｂセグメントのＣ末端に融合したＧＡＡ  ６７−９５２を有する３Ｅ１０  Ｆａｂ、ならびに５）Ｃ末端の融合を強化するように設計された点突然変異、１３アミノ酸のリンカー、及び軽鎖のＮ末端で融合した３Ｅ１０  Ｆａｂを有するＧＡＡが含まれた。モノクローナル抗体のコンストラクトには、６）上記のコンストラクト４と類似の接合部を有する、重鎖のＣ末端でＧＡＡに融合した３Ｅ１０全抗体、及び７）成熟ＧＡＡ配列の上流にウシＧＡＡプロ配列を有する、重鎖のＣ末端でＧＡＡに融合した３Ｅ１０全抗体が含まれた。種々のコンストラクトの設計の概略図を図１３に示す。融合体４を目的の融合体として決定し、さらなる実験のために選択した。ＧＡＡプロセシングに関与する５７〜７７の「プロ」セグメント全体を含めるのではなく、融合体４のＧＡＡ残基６７から開始した１つの理論的根拠は、Ａｒｇ６６の後でのＡｒｇ−Ｃのプロテアーゼ切断のあらゆる可能性を回避するためであった。
【０４２４】
Ｂ．無細胞活性アッセイにおけるＦａｂ−酸性アルファ−グルコシダーゼ
ｍＡＢ−ＧＡＡ試料及びＦａｂ−ＧＡＡ試料の活性を比較するために、無細胞活性アッセイを実施する。試料を氷上で解凍し、水で１０倍の段階希釈（１０倍、１００倍、及び１０００倍、及び１００００倍）を行う。酸性及び中性のＧＡＡ活性を、蛍光基質として４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−グルコシドを使用して、異なる希釈度の各試料についてそれぞれｐＨ４．３及びｐＨ６．７で測定する。（Ｊ．Ｌ．Ｖａｎ  Ｈｏｖｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｗｈｉｃｈ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｏ  ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”ＰＮＡＳ  ９３（１９９６）６５−７０、Ｊ．Ｙ．Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ−ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．３９（１９９６）７５５−７６４）。アッセイによって、マウスのＦａｂ−ＧＡＡ試料は、ｍＡＢ−融合体よりも活性が高いことが示される（表３）。さらに、ＧＡＡ活性は、高ｐＨ（ｐＨ６．７）においては、低ｐＨ（ｐＨ４．３）に対してはるかに低い（すなわち、３％）ことが示された。
【表３】
2021518840.tif 000005
【０４２５】
Ｃ．Ｆａｂ−酸性アルファ−グルコシダーゼのｐＨ依存的比活性
Ｆａｂ−ＧＡＡのｐＨ依存的比活性を評価するために、Ｆａｂ−ＧＡＡグリコーゲンアッセイを実施する。アッセイを実施するための材料には、Ｆａｂ−ＧＡＡ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｏｘｉｄａｓｅキット（Ｓｉｇｍａ  ＧＡＧＯ２０−１ＫＴ）、及びウサギ肝臓由来のグリコーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ８８７６−１Ｇ）が含まれる。グルコース標準液を、Ｇ．Ｏ．キットのグルコース１ｍｇ／ｍＬから水で段階希釈（０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０１２５ｍｇ／ｍＬ、０．００６２５ｍｇ／ｍＬ、０．００３１２５ｍｇ／ｍＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ＝５５５．１μＭ））することによって調製する。クエン酸／リン酸緩衝液２０ｍＬを、０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍ二塩基性リン酸ナトリウムを以下の表に列挙した量で添加することによってｐＨ３．５〜７．０に調製する。最終０．０２％となるまで１０％Ｔｗｅｅｎ−８０に添加して、ｐＨをｐＨメーターで確認する。さらに、ｐＨ４．３の０．１Ｍ酢酸ナトリウム＋０．０２％ｔｗｅｅｎ−８０も調製した。
【表４】
2021518840.tif 000006
【０４２６】
グリコーゲン１０ｍｇ／ｍＬを、試験する各緩衝液中で調製する。例えば、グリコーゲン溶液１０ｍｇ／ｍＬを０．１Ｍ酢酸、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ４．３中で調製する。Ｆａｂ−ＧＡＡを反応緩衝液で１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、次に、１ｍｇ／ｍＬのＦａｂ−ＧＡＡ  １．８μＬを５００μＬバイアル中のグリコーゲン溶液１７８．２μＬに添加して、最終のＦａｂ−ＧＡＡの濃度１０μｇ／ｍＬを得る。溶液を十分に混合し、周囲温度で１時間、インキュベートする。グリコーゲン溶液の一部を、陰性対照として保持する。試料を９５℃で１０分間加熱することにより、消化を終了させることができる。Ｆａｂ−ＧＡＡ陰性のグリコーゲン試料も、陰性対照／ブランク試料として加熱する。標準液及び消化されたグリコーゲン（４０μＬ／ウェル）を三連で９６ウェルプレートにピペットで入れる。室温のＧ．Ｏ．Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｍｉｘ（キットに記載の通りに調製）８０μＬを、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルに添加し、十分に混合して３７℃で３０分間インキュベートする。薄茶色が形成され始めるであろう。次に、１２Ｎ硫酸８０μＬをマルチチャンネルピペットを用いて添加し、十分に混合することにより反応を終了させ、プレートを展開する。色はピンクに変化するであろう。次に、プレートを５４０ｎｍで読み取る。
【０４２７】
本アッセイでは、次の５つの試料、すなわち、Ｆａｂ−ＧＡＡによるグリコーゲンの標準的消化１つ、消化前に０．０５ｍｇ／ｍＬ（２７８μＭ）のグルコースを添加した試料１つ、消化前に０．０２５ｍｇ／ｍＬ（１３９μＭ）のグルコースを添加した試料１つ、消化後に０．０５ｍｇ／ｍＬ（２７８μＭ）のグルコースを添加した試料１つ、及び消化後に０．０２５ｍｇ／ｍＬ（１３９μＭ）のグルコースを添加した試料１つを含む試料を調製しアッセイした。グルコース阻害がないと仮定すると、消化前と消化後の試料は類似すると予想される。さらに、ウェルの読み取り値は添加なしの試料よりも５５．５μＭ及び２７．８μＭ高くなると予想される（試料は、消化と５４０ｎｍでのアッセイの間に５倍に希釈される）。
【０４２８】
Ｆａｂ−ＧＡＡグリコーゲンアッセイの結果を、表５及び表６（以下に示す）ならびに図１４〜図１６に示す。グリコーゲン消化の前後でグルコースを添加した試料の間にはごくわずかな違いしかなく、これは、これらの濃度でのグルコース阻害が低いことを示唆している。さらに、すべての添加は、期待値の１０％以内である。最後に、Ｆａｂ−ＧＡＡのグリコーゲン比活性を、１１４０．１７ｕＭ／分／ｍｇで測定した。Ｆａｂ−ＧＡＡのグリコーゲン標準曲線及び関連データを図１６、ならびに表７及び対応する図１７に示す。図１７に示す標準曲線は、最大範囲で示された標準曲線の若干の非直線性（シグナルが横ばいになり始める）を伴う、ターゲットをわずかに下回るＲ２値を有する。７５〜１００μＭを評価するには（現在は１１１μＭを評価している）、上限をわずかに下方調整する必要がある。
【表５】
2021518840.tif 000007
【表６】
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【表７】
2021518840.tif 000009
【０４２９】
Ｆａｂ−ＧＡＡグリコーゲンアッセイから得られたデータより、ヒト化Ｆａｂ−ＧＡＡコンストラクトは、高ｐＨ（ｐＨ６．５）において、低ｐＨ（ｐＨ４．５）よりも良好な（すなわち、４３％）活性を保持することが示される。これは、ヒト化Ｆａｂ−ＧＡＡ断片の安定性及び純度がより良好であるためであると仮定される。
【０４３０】
Ｄ．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦａｂ−ＧＡＡ
ｉ．ＩＣＶ投与時の脳におけるＦａｂ−ＧＡＡの評価
Ｆａｂ−ＧＡＡのＩＣＶポンプ投与の作用を、Ｆａｂ−ＧＡＡ処置マウスをＰＢＳ処置マウスと比較することによって評価する。ＰＢＳ処置マウスでは、４匹のマウスにＩＣＶポンプを介してＰＢＳを２８日間投与し、Ｆａｂ−ＧＡＡマウスでは、５匹のマウスにＩＣＶポンプを介して２８日間にわたってＦａｂ−ＧＡＡを投与した。２８日目の終了時に、マウスを屠殺して、脳を６つの薄片に切り分けた。（ＰＢＳ処置またはＦａｂ−ＧＡＡ処置した）各マウスのそれぞれの脳の切片において、グルコースレベルを測定した（図１０Ａ及び図１０Ｇ〜図１０Ｋ）。Ｆａｂ−ＧＡＡで処置したマウスは、脳内のグリコーゲン除去を示した。Ｆａｂ−ＧＡＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは単離されたラフォラ小体を効率的に分解できなかったことから、これは予想外であった。
【０４３１】
ｉｉ．骨格筋におけるＦａｂ−ＧＡＡの評価
骨格筋中のグリコーゲンクリアランスに対するＦａｂ−ＧＡＡの作用を、野生型マウス及びラフォラノックアウトマウスを使用して評価する。アナフィラキシー反応を予防するため、野生型マウス及びラフォラノックアウトマウスを、各酵素の投与１０〜１５分前にジフェンヒドラミン（１５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射により前処置する。Ｆａｂ−ＧＡＡ（１０ｍｇ／ｍＬで９０ｕＬ）、マイオザイム（５ｍｇ／ｍＬで１２０ｕＬ）、またはＰＢＳの尾静脈注射を、毎週２回、２週間、計４回の注射でマウスに投与する。Ｆａｂ−ＧＡＡの総用量３６００ｕｇ（２０ｇのマウスに対して１８０ｍｇ／ｋｇ）またはマイオザイムの総用量２４００ｕｇ（２０ｇのマウスに対して１２０ｍｇ／ｋｇ）の注射を、１日目、５日目、９日目、及び１３日目に与える。次に、マウスを屠殺して、処置マウスの筋肉の切片をＰＡＳ染色した（図１８〜図２２）。
【０４３２】
ｉｉｉ．心筋におけるＦａｂ−ＧＡＡの評価
マイオザイム処置ラフォラノックアウトマウス及びＦａｂ−ＧＡＡ処置ラフォラノックアウトマウスの、心臓のグリコーゲン量の定量的な生化学的比較を実施する。アナフィラキシー反応を予防するため、ラフォラノックアウトマウスを、各酵素の投与１０〜１５分前にジフェンヒドラミン（１５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射により前処置する。Ｆａｂ−ＧＡＡ（１０ｍｇ／ｍＬで９０ｕＬ）、マイオザイム（５ｍｇ／ｍＬで１２０ｕＬ）、またはＰＢＳの尾静脈注射を、毎週２回、２週間、計４回の注射でマウスに投与する。Ｆａｂ−ＧＡＡの総用量３６００ｕｇ（２０ｇのマウスに対して１８０ｍｇ／ｋｇ）またはマイオザイムの総用量２４００ｕｇ（２０ｇのマウスに対して１２０ｍｇ／ｋｇ）（すなわち、Ｆａｂ−ＧＡＡと等モル用量）の注射を、１日目、５日目、９日目、及び１３日目に与える。次に、マウスを屠殺して、マウスの心臓組織をＨＥＰＥＳ緩衝液中でホモジナイズした。次に、組織溶解物をタンパク質濃度のＢＣＡ分析及びグルコース濃度の分析に使用した。グルコースの分析のために、可溶性及び不溶性グリコーゲンを採取しアミログルコシダーゼで消化して、グルコースアッセイキットにより分析し、アミログルコシダーゼによる消化から放出されたグルコース同等物を測定した（図２３）。有意性をｔ検定によって判定した。処置マウスの心臓におけるグリコーゲン量の第１の生化学的分析で、Ｆａｂ−ＧＡＡのマイオザイムとの明らかな差異が示される。貯蔵グリコーゲン（すなわち、心臓を摘出しｅｘ  ｖｉｖｏで破壊した後に放出されたグルコース）は、Ｆａｂ−ＧＡＡ処置マウスにおいて著しく少ない。
【０４３３】
心筋中のグリコーゲンクリアランスに対するＦａｂ−ＧＡＡの作用を、ラフォラノックアウトマウスを使用して評価する。アナフィラキシー反応を予防するため、ラフォラノックアウトマウスを、各酵素の投与１０〜１５分前にジフェンヒドラミン（１５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射により前処置する。Ｆａｂ−ＧＡＡ（１０ｍｇ／ｍＬで９０ｕＬ）、マイオザイム（５ｍｇ／ｍＬで１２０ｕＬ）、またはＰＢＳの尾静脈注射を、毎週２回、２週間、計４回の注射でマウスに投与する。Ｆａｂ−ＧＡＡの総用量３６００ｕｇ（２０ｇのマウスに対して１８０ｍｇ／ｋｇ）またはマイオザイムの総用量２４００ｕｇ（２０ｇのマウスに対して１２０ｍｇ／ｋｇ）（すなわち、Ｆａｂ−ＧＡＡと等モル用量）の注射を、１日目、５日目、９日目、及び１３日目に与える。次に、マウスを屠殺して、処置マウスの筋肉の切片をＰＡＳ染色した（図２４〜図２６）。ラフォラグリコーゲンがリソソームのグリコーゲンであり、おそらく細胞質のグリコーゲンであるという心筋のＰＡＳ染色の結果。加えて、ＰＢＳで処置したノックアウトマウスにおいて、心筋線維の９０％がＰＡＳ＋である。さらに、Ｆａｂ−ＧＡＡはマイオザイムよりもグリコーゲンを良好に除去することが示されており、マイオザイムはラフォラグリコーゲンの約５０％を除去したが、一方、Ｆａｂ−ＧＡＡはラフォラグリコーゲンの約９０％を除去した。
【０４３４】
Ｅ．ラフォラ病及び他のポリグルコサン（ｐｏｌｙｇｌｕｓａｎ）病のＦａｂ−ＧＡＡ処置
Ｆａｂ−ＧＡＡは、現在、主に骨格筋及び心臓に影響を及ぼす糖原病であるポンペ病のための療法として臨床試験で試験中である。ポンペ病の現行の療法は、ｒｈＧＡＡ（マイオザイム）であり、この療法では、マンノース−６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）を利用してリソソームへ進入し、グリコーゲンを分解する。Ｆａｂ−ＧＡＡのマイオザイムに対する利点は、Ｍ６ＰＲによって媒介されるリソソームへの輸送に加えて、ＥＮＴ２受容体を介して細胞質に進入し、破裂したリソソーム及びオートファジー液胞から蓄積したグリコーゲンを除去できることである。
【０４３５】
近年、脳室内（ＩＣＶ）注入によって送達されたＦａｂ−ＧＡＡが、ラフォリンＫＯマウスの脳のラフォラ小体／グリコーゲン量を５０％減少させることができることが示されている。実際、Ｆａｂ−ＧＡＡで処置した脳のグリコーゲンレベルは、野生型マウスのグリコーゲンレベルに近づいた。これらの結果により、Ｆａｂ−ＧＡＡがラフォラ病ならびに骨格筋及び心臓などの他の臓器に影響を及ぼす他のポリグルコサン（ｐｏｌｙｇｌｕｓａｎ）病の効果的な療法となり得るかどうかについての疑問が生じた。
【０４３６】
これらの試験からの予想外の知見は、Ｆａｂ−ＧＡＡがラフォラ病を処置するために開発された別の薬剤であるＦａｂ−アミラーゼよりもわずかに効果的であるように思われたことであった。しかしながら、動物数は少なく（Ｎ＝各グループ５）、試験は、ラフォラ病のラフォリンノックアウトマウスモデルでのみ実施された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、Ｆａｂ−アミラーゼの活性がラフォリンの存在下で増強されることを示している。この試験をラフォラ病のマリンノックアウトマウスモデルで繰り返すと、反対の結果をもたらす可能性がある。全世界の患者の５８％がＥＰＭ２Ｂ（マリン遺伝子）ノックアウト突然変異を保有していると推定されており、このため、疾患の両方のモデルで潜在的治療法を試験することが非常に重要である（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ２０１６）。
【０４３７】
以下に概説する試験は、他の疾患で見られるポリグルコサン（ｐｏｌｙｇｌｕｓａｎ）のモデルとしてラフォラ小体を使用して、脳、心臓、及び骨格筋のポリグルコサン（ｐｏｌｙｇｌｕｓａｎ）を除去するためのＦａｂ−ＧＡＡの使用に対する有効性及び投与要件に関する重要な論点に回答するように設計されている。可能な場合、追加の臓器を採取して末梢臓器における全身播種、酵素活性、及びグリコーゲン分解について試験する。マリンＫＯモデルでＦａｂ−アミラーゼを試験するさらなる実験も提案されている。
【０４３８】
ｉ．ラフォラ小体の除去に関するＦａｂ−ＧＡＡとマイオザイムの比較
Ｆａｂ−ＧＡＡがラフォラ小体及びグリコーゲン量を野生型レベルまで減少させる能力を評価する。さらに、野生型マウスにおける正常なグリコーゲンに対するＦａｂ−ＧＡＡの活性を評価する。最後に、静脈内投与した場合に脳内に進入するＦａｂ−ＧＡＡの能力を評価し、加えて、脳に到達した際に、脳内のラフォラ小体及びグリコーゲンを分解するＦａｂ−ＧＡＡの能力を評価する。
【０４３９】
アナフィラキシー反応を予防するため、動物を、各酵素の投与１０〜１５分前にジフェンヒドラミン（１５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射により前処置する。溶媒、Ｆａｂ−ＧＡＡ（１０ｍｇ／ｍＬで９０ｕＬ）、マイオザイム（５ｍｇ／ｍｌで１２０ｕＬ）、またはＰＢＳのＩＶ注射を毎週２回、２週間、計４回の注射でマウスに投与する。注射は、１日目、５日目、９日目、及び１３日目に行われる。Ｆａｂ−ＧＡＡの総用量は３６００ｕｇ（２０ｇのマウスに対して１８０ｍｇ／ｋｇ）であり、マイオザイムの総用量は２４００ｕｇ（２０ｇのマウスに対して１２０ｍｇ／ｋｇ  ｕｇ）（すなわち、Ｆａｂ−ＧＡＡと等モル用量）である。最終注射の２４時間後に動物を屠殺し、心臓、筋肉、脳、脚の肉趾、脾臓、腎臓、及び肝臓を摘出して、グリコーゲン含有量及びＧＡＡ活性についてアッセイする。可能であれば、心臓及び筋肉を、ＰＡＳ染色用に４％パラホルムアルデヒドで固定する。
【０４４０】
Ｆａｂ−ＧＡＡ  ６００ｕｇを１０ヶ月のマウス（１７ｍｇ／ｋｇの全身等価用量に等しい約３５ｇ）の腓腹筋内に注射したＩＭ実験の結果を使用すると、心臓のグルコースレベルは、年齢を一致させた無処置の心臓の５０ｕｍｏｌ／ｇ組織と比較して、１３±１０ｕｍｏｌ／ｇ組織となった。効果量が非常に大きかったことから、各群についてサンプルサイズ３で１００％の検出力を示した（グリコーゲンは処置とともに減少し得ないため、片側検定）。試験で使用するマウスの数は、実験中に失われる動物を考慮して、各群につきＮ＝５のラフォリンノックアウトマウス、ならびにＰＢＳ群及びＦａｂ−ＧＡＡ群のみＮ＝４の年齢を一致させたＷＴマウスであり、合計で１５匹のラフォリンノックアウトマウス及び８匹の野生型マウスである。
【０４４１】
ｉｉ．ラフォラ病のラフォリンノックアウトモデルにおけるＦａｂ−アミラーゼ及びアミラーゼの有効性
ラフォリンノックアウトマウスの脳からのラフォラ小体及びグリコーゲンの除去について、Ｆａｂ−アミラーゼとアミラーゼのみとを比較する。ラフォリンノックアウトマウスに、ＰＢＳ（Ｎ＝３）、Ｆａｂ−アミラーゼ（Ｎ＝３）、またはＦａｂ−アミラーゼ製剤中のアミラーゼ（Ｎ＝５）を、ＩＣＶ注入により２８日間投与した。２８日目の終了時に、マウスを屠殺して、脳を切片に切り分ける。各マウスのそれぞれの脳の切片において、グルコースレベルを測定する。
【０４４２】
ｉｉｉ．ラフォラ病のマリンノックアウトモデルにおけるＦａｂ−ＧＡＡ及びＦａｂ−アミラーゼの有効性
マリンノックアウトマウスにＡｌｚｅｔポンプ１００３Ｄを植え込み、溶媒（Ｎ＝３）、Ｆａｂ−アミラーゼ（Ｎ＝４）、またはＦａｂ−ＧＡＡ（Ｎ＝４）を０．１１ｕＬ／時で２８日間注入する。２８日後、マウスを屠殺し（すなわち、１日目に埋め込み２９日目に屠殺し）、グリコーゲン含有量の生化学的評価のために、脳を摘出して６つの厚切切片に切り分けて急速冷凍する。剖検時の血液を入手してＧＡＡ活性及びアミラーゼ活性について検査する。さらに、心臓、脚の肉趾、四頭筋、横隔膜、三頭筋、腓腹筋、肝臓、腎臓、及び脾臓からの試料を採取し、グリコーゲン含有量、ＧＡＡ活性、及びアミラーゼ活性についてアッセイする。
【０４４３】
ｉｖ．大型動物モデルにおけるＦａｂ−ＧＡＡの評価
カニクイザルにＦａｂ−ＧＡＡ  １ｍＬ（タンパク質１０ｍｇ）を１０分間にわたって注入し、有害な影響の臨床徴候をモニタリングする。１週間後に影響が観察されなければ、その動物に週１回、４週間投与して、追加の３匹のサルを試験に含める。投与後最初の週に、最初の動物に有害な影響が観察された場合、２週目に用量を減量する。２番目の動物にＦａｂ−ＧＡＡ製剤溶媒（酵素なし）１用量を投与し、酵素または製剤のどちらが有害な影響の原因であるかを確認する。両方の動物に、耐量に到達するまで、それぞれの注入液を低用量で投与する。ＰＫ（ＧＡＡ活性）分析のため、血清試料及びＣＳＦ試料を採取する。
【０４４４】
ｖ．複数時点での用量反応試験
一定速度でのＦａｂ−ＧＡＡの連続ＩＣＶ注入のために、注入時間とグリコーゲン分解の程度との関係を評価する。１日目に、ラフォリンノックアウトマウス及び野生型マウスに、溶媒またはＦａｂ−ＧＡＡを０．１１ｕＬ／時で連続ＩＣＶ注入するために植え込む。動物を表８に従って屠殺して、脳を摘出して急速冷凍し、次にグリコーゲン含有量及びＧＡＡ活性についてアッセイする。心臓、脚の肉趾、四頭筋、横隔膜、三頭筋、腓腹筋、肝臓、腎臓、及び脾臓からも試料を採取し、次に、グリコーゲン含有量及びＧＡＡ活性についてアッセイする。Ｆａｂ−ＧＡＡ  ７００ｕｇを６．５ヶ月のマウスに２８日間にわたり注入した、ラフォリンノックアウトマウスにおけるＩＣＶ実験の結果を使用すると、脳のグルコースレベルは、年齢を一致させたＰＢＳで処置したマウスの７ｕｍｏｌグルコース／ｇ組織と比較して、およそ３．８±０．２ｕｍｏｌグルコース／ｇ組織となった。効果量が非常に大きいことから、各群についてサンプルサイズ３で１００％の検出力を示す（グリコーゲンは処置とともに減少し得ないため、片側検定）。サンプルサイズには、合計５３匹のラフォリンノックアウトマウス（試験用４６匹＋補充用７匹）及び１２匹のＷＴマウス（試験用１０匹＋補充用２匹）が含まれる。２８日より短く注入した動物に対するより小さな効果量を考慮して、各群につきＮ＝５である。
【表８】
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【０４４５】
実施例３：Ｆａｂ−アミラーゼはラフォラ病のマウスモデルにおいて、細胞を透過し、細胞質のグリコーゲンを分解する
Ａ．細胞透過プラットフォーム
ユニークに細胞を透過し、治療用カーゴを細胞質に送達できる独自の抗体ベースのプラットフォーム（Ｆａｂ）を展開する。Ｆａｂは、骨格筋及び心筋、ならびに脳において高度に発現されるヌクレオシド輸送体であるＥＮＴ２受容体を介して細胞を透過する。Ｆａｂ−ＧＡＡ融合体は、現在、ポンペ病の潜在的治療法として臨床で試験されている。
【０４４６】
Ｆａｂ−アミラーゼ（Ｆａｂ−ＡＭＹ）は、ヒト膵アミラーゼ（ＡＭＹ２Ａ）に遺伝的に融合した細胞透過性Ｆａｂ断片で構成される新規タンパク質である。Ｆａｂ−ＡＭＹは、細胞の細胞質を透過し、中性ｐＨでグリコーゲンを分解するように最適化されている。ここで、Ｆａｂ−ＡＭＹは、稀であり、致死を免れることのできないてんかん性疾患であるラフォラ病に見られる病原性グリコーゲンを分解することが示されている。
【０４４７】
Ｂ．ラフォラ病
ラフォラ病（ＬＤ）は稀な神経変性障害であり、通常は発症から１０年以内で死に至る。ＬＤは、グリコーゲンがラフォラ小体（ＬＢ）と呼ばれる形成異常の凝集した封入体に変化することを特徴とする。不溶性のラフォラ小体は、神経細胞の細胞質を襲い、重度で致死的な形のてんかんを誘発する（Ｒａｔｈｔｈａｇａｌａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｌａｆｏｒｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｆｏｒａ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｊａｎ  ２２；５７（２）：２６１−７２、Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．“Ｌａｆｏｒａ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄ．２０１６  Ｓｅｐ  １；１８（Ｓ２）：３８−６２．Ｒｅｖｉｅｗ）。
【０４４８】
Ｃ．結果
Ｆａｂ−ＡＭＹ融合体がラフォラ病に効果的であるかどうかを判定する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｆａｂ−ＡＭＹは様々なラフォラ組織から単離されたラフォラ小体を分解し、細胞の透過にはＦａｂ断片を必要とする。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、連続脳室内（ＩＣＶ）でのＦａｂ−ＡＭＹ投与が脳の全領域に分布し、神経細胞の細胞質に進入して、ラフォラグリコーゲンを約５０％分解した。
【０４４９】
Ｄ．結論
これらの結果は、ラフォラ病に対する抗体−酵素処置を推進するための明確な将来性を示している。通常難治性であるＬＢに対するアミラーゼ活性は、これらの融合体がグリコーゲンに起因する他の疾患において活性であることを強く示している。さらに、このプラットフォームによって媒介される効率的な分布、取り込み、及び活性は、他の神経筋疾患、特に、毒性のオリゴマーまたは凝集した細胞内沈着物の酵素的除去を必要とする疾患に広く適用可能である。
【０４５０】
Ｅ．Ｆａｂ−ＡＭＹの概要
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：細胞を透過し、活性アミラーゼを細胞質に送達し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでラフォラ小体を分解する。
【０４５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＣＶ投与：脳全体への取り込み、神経組織における細胞質透過及びアミラーゼ活性、ならびに脳内のラフォラ小体の分解。
【０４５２】
実施例４：非ＣＮＳポリグルコサン蓄積症を処置するためのＦａｂ−ＧＡＡの使用
Ａ．ポリグルコサン蓄積症
ポリグルコサン蓄積症は、極めて稀な遺伝性疾患である。各疾患の有病率は、一般集団５０，０００人に対して１人以下である。これらの疾患は、長く、分岐のない難溶性のグリコーゲンのポリマーの蓄積を特徴とし、このポリマーは、凝集しやすく、最終的にはアミラーゼによる消化に対して部分的に耐性である独特な細胞封入体を細胞内に形成する。これらの封入体は、ラフォラ病では「ラフォラ小体」と称されるが、一般には「ポリグルコサン小体」と称される。ポリグルコサン蓄積症の表現型は、部分的には、どの組織がグリコーゲンを蓄積するかに依存しており、最も一般的には心筋であるが、骨格筋、肝臓、神経細胞、及び星状膠細胞にも蓄積する。支持療法及び機能不全組織の移植以外に、ポリグルコサン蓄積症の患者に対する根治的な処置は存在しない。
【０４５３】
ポリグルコサンの蓄積は、グリコーゲンの合成速度と分枝酵素活性との間の不均衡に起因するようである。したがって、蓄積は、分枝酵素（ＧＢＥ１）欠損症（ＧＳＤ  ＩＶもしくは成人ポリグルコサン病）、またはグリコゲニン−１欠損症（ＧＳＤ  ＸＶ）におけるような不完全なグリコーゲン合成、あるいはホスホフルクトキナーゼ欠損症（ＧＳＤ  ＶＩＩ）、Ｅｐｍ２ａ／ラフォリン欠損症もしくはＥｐｍ２ｂ／マリン欠損症（ラフォラ病）またはＲＢＣＫ１欠損症（ユビキチンリガーゼ）におけるような不完全なグリコーゲン分解により生じ得る。ＰＲＫＡＧ２における突然変異も、グリコーゲン合成酵素の構成的活性化に関連している可能性があるグルコース代謝の異常によって、ポリグルコサン蓄積を引き起こし得る。
【０４５４】
同じ遺伝子内の突然変異に起因するポリグルコサン蓄積症内と、異なる遺伝子に起因するポリグルコサン蓄積症の間の両方で、表現型に非常に大きなばらつきがある。例えば、ＧＳＤ  ＩＶには５つの異なる表現型があり、症状の発症年齢と影響を受ける組織（発生組織、進行性肝組織、非進行性肝組織、骨格筋組織、心筋組織、及び神経組織）が異なるが、一方で、ラフォラ及びＰＲＫＡＧ２関連心筋症（ＰＡＣ）はそれぞれ神経組織及び心臓に比較的特異的である。
【０４５５】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験
Ｆａｂ−ＧＡＡをポリグルコサン病モデルを含む、過剰グリコーゲン貯蔵のいくつかの動物モデルにおいて試験した。
【０４５６】
ポリグルコサン小体（ＰＢ）が出生後６週間以内にマウスの体全体に発生するＧＳＤ  ＩＶの変種である、成人ポリグルコサン小体病（ＡＰＢＤ）のグリコーゲン分枝酵素欠損（ＧＢＥ１  ｎｅｏ／ｎｅｏ）マウスモデルにおいて、組織のグリコーゲンクリアランスに対するＦａｂ−ＧＡＡの作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。
【０４５７】
心臓及び骨格筋をＧＢＥ１  ｎｅｏ／ｎｅｏマウスから摘出してホモジナイズし、次にＦａｂ−ＧＡＡで処置した。ポリグルコサンを分解するＦａｂ−ＧＡＡの能力を、ホモジネート中の残留グルコースを測定することにより判定した。Ｆａｂ−ＧＡＡに応答して、心臓（図３７Ｂ）及び筋肉（図３７Ａ）の両方に由来するグルコースが５０％減少し、Ｆａｂ−ＧＡＡによるポリグルコサンの効果的な分解が示された。
【０４５８】
マウスモデルにおけるこの概念実証試験に基づいて、様々なポリグルコサン蓄積症の患者からのヒト組織標本をＦａｂ−ＧＡＡで処置する実験を実施した。凍結切片を１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂ−ＧＡＡまたは溶媒のいずれかで、３７℃で１２時間インキュベートした。次に、標本をＰＡＳ染色して２つの標本群中のグリコーゲン含有量を比較した。図３８は、これらの試験からの近い将来に有望である結果を示している。図３８Ａは、心臓移植を必要とする拡張型心筋症が生じる重度のグリコゲニン−１欠損症を有する、ＧＹＧ１ミスセンス突然変異（ｃ．３０４Ｇ＞Ｃ，ｐ．（Ａｓｐ１０２Ｈｉｓ））を有する患者の心臓の標本を示す。図３８Ｂは、重度のＲＢＣＫ１欠損症が生じる、複数のＲＢＣＫ１突然変異（ｃ．８１７ｄｕｐＣ，ｐ（Ｌｅｕ２７３Ｐｒｏｆｓ＊２７）及びｃ．１４６５ｄｅｌＡ，ｐ．（Ｔｈｒ４８９Ｐｒｏｆｓ＊９））を有する患者の骨格筋の標本を示す。患者は車椅子を利用しており、心臓移植を必要とする拡張型心筋症を示していた。Ｆａｂ−ＧＡＡは、２つの組織型のグリコーゲン貯蔵異常の病因の違いにもかかわらず、両方の組織型でポリグルコサンを明らかに減少させた。
【０４５９】
ラフォラ病の患者のように、Ｅｐｍ２ａ−／−マウスは、病状は主に神経学的であるが、脳、筋肉、心臓及び皮膚を含む複数の組織にラフォラ小体（ＬＢ）を呈する。１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂ−ＧＡＡ（Ｎ＝３）またはＰＢＳ（Ｎ＝４）２０μＬの３回の連続注入を、１０ヶ月齢のＥｐｍ２ａ−／−マウスの右腓腹筋に１週間にわたり（１日目、４日目、及び７日目に）投与して、ポリグルコサン蓄積に対する作用を測定した。年齢を一致させた野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、同じレジメンを使用してＰＢＳで処置した（Ｎ＝３）。８日目にマウスを安楽死させ、ポリグルコサンの測定のために筋肉を採取した。以前の試験において、筋肉内投与されたＦａｂ−ＧＡＡがマウスの他の臓器に移行し得ることが示されていることから、心臓もマウスから採取してポリグルコサン含有量を測定した。図３９Ａは、ＰＢＳで処置した筋肉と比較して、Ｆａｂ−ＧＡＡ処置がポリグルコサンレベルを４２％減少させたことを示す。ポリグルコサンは細胞内部にのみ見出されることから、これらのデータは、筋肉内注射されたＦａｂ−ＧＡＡが、実際にｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を透過し、活性を維持してポリグルコサンを分解することを示している。図３９Ｂに示される、Ｆａｂ−ＧＡＡで処置したＥｐｍ２ａ−／−動物の心臓におけるポリグルコサン含有量の低下傾向は、体循環に入り心臓に移行した限られた量のＦａｂ−ＧＡＡであっても効果的であったことを示唆している。実際、Ｆａｂ−ＧＡＡで処置した３匹の動物のうち２匹では、心臓のポリグルコサンレベルがＷＴレベル近くまで低下したが（組織１ｇあたり９．９μｍｏｌ及び５．２μｍｏｌのグルコース）、一方で、３匹目の動物のレベルはＰＢＳで処置した動物と同様（組織１ｇあたり２３．７μｍｏｌのグルコース）であった。したがって、後者の動物における効果の欠如は、Ｆａｂ−ＧＡＡの限定的な活性というよりもむしろ、その動物における薬物の全身移行が限定的であったか、または全身移行しなかったことによる可能性がより高かった。
【０４６０】
Ｆａｂ−ＧＡＡの治療有効性のより直接的な基準として、ＶＡＬ−１２２１またはＰＢＳ  ０．９０ｍｇの４回の連続尾静脈注射を、６ヶ月齢のＥｐｍ２ａ−／−マウス（処置ごとにＮ＝５）に投与した。マウスの平均体重は３０ｇであり、１２０ｍｇ／ｋｇの用量のＦａｂ−ＧＡＡを処置群に投与することとなった。年齢を一致させた野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝４）に、対照コホートとしてＰＢＳを注射した。心臓及び四頭筋を採取し、ポリグルコサン総含有量について定量化した。
【０４６１】
Ｆａｂ−ＧＡＡ処置は、Ｅｐｍ２ａ−／−（ＫＯ）マウスのポリグルコサンＬＢの量を、野生型（ＷＴ）レベルまで減少させた（図４０）。過ヨウ素酸シッフ染色（図４１）は、Ｆａｂ−ＧＡＡで処置後の両方の組織におけるポリグルコサン小体数の減少を示した。
【０４６２】
これに対して、等モル用量のマイオザイムで静脈内処置したＥｐｍ２ａ−／−マウスでは、心臓のポリグルコサン封入体が、Ｆａｂ−ＧＡＡ処置動物で観察された８０％の減少と比較して、ごくわずかに減少したことを示した（図２３〜図２６）。
【０４６３】
したがって、Ｆａｂ−ＧＡＡは、ポリグルコサン病のマウスモデルにおいて、細胞質に進入し、蓄積したポリグルコサンを除去することが可能である。
【０４６４】
グリコーゲンの形成を予防すること、ゆえにポリグルコサンの沈殿を予防することは、ラフォラ病のモデルにおける疾患を予防する。したがって、凝集を除去することにより、他のポリグルコサン障害において症状を改善または反転させることが期待される。
【０４６５】
Ｃ．毒性学の概要
未成熟ラット及び成熟ラット、ならびに若齢サル及び成熟サルを使用して毒性試験を実施した。
【０４６６】
反復投与（週に１回を４週間、合計５回の注射）の非ＧＬＰ毒性試験を、未成熟ラット及び成熟ラットにおいて実施し（５０ｍｇ／ｋｇ）、ＧＬＰ試験を、未成熟ラットにおいて、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び３０ｍｇ／ｋｇで週に１回を４週間で行った。単回投与試験及び反復投与試験を、成熟及び若齢の非ヒト霊長類において、５０ｍｇ／ｋｇ（単回投与及び反復投与、非ＧＬＰ）で実施し、また、ＧＬＰ試験を、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び３０ｍｇ／ｋｇ（毎週、最大で６ヶ月間）で実施した。ラット及びサルにおけるこれらの毒性試験の条件下で、ＧＬＰ試験では、５回以上のＦａｂ−ＧＡＡの静脈内注射に対する無影響量（ＮＯＥＬ）及び無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、３０ｍｇ／ｋｇ超であった。毒性試験により、ラット及び非ヒト霊長類において、Ｆａｂ−ＧＡＡが３０ｍｇ／ｋｇまでの反復投与で安全であることが示唆されている。
【０４６７】
Ｄ．ＰＡＣの処置
非臨床及び臨床データに基づくと、Ｆａｂ−ＧＡＡはその現行製剤において、非ＣＮＳポリグルコサン蓄積症の処置によく適しているように思われる。ＰＲＫＡＧ２関連心筋症（ＰＡＣ）は、他のポリグルコサン蓄積症よりも比較的より一般的であり、表現型のばらつきがやや少ないことから、ＰＡＣ患者の処置における安全性及び有効性についてＦａｂ−ＧＡＡを評価する。この障害の処置におけるＦａｂ−ＧＡＡの安全性、ＰＫ、ＰＤ、及び有効性を評価するために、ＰＡＣを有するおよそ３６人の患者において、２パート、二重盲検、生理食塩水対照試験を実施する。パート１は１２人の患者で、パート２のより多くの患者群に提示すべき用量、患者数、及び主要な有効性評価を確認するために適応的に用いる。
【０４６８】
要約すると、Ｆａｂ−ＧＡＡは、組織標的化が向上した、非ＣＮＳポリグルコサン病のための新規抗体−酵素融合体の代替候補を代表し、罹患組織からポリグルコサン小体を除去する可能性をもたらす。
【０４６９】
参照配列
配列番号１−アルファアミラーゼポリペプチドのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００６９０）
ＱＹＳＰＮＴＱＱＧＲＴＳＩＶＨＬＦＥＷＲＷＶＤＩＡＬＥＣＥＲＹＬＡＰＫＧＦＧＧＶＱＶＳＰＰＮＥＮＶＡＩＹＮＰＦＲＰＷＷＥＲＹＱＰＶＳＹＫＬＣＴＲＳＧＮＥＤＥＦＲＮＭＶＴＲＣＮＮＶＧＶＲＩＹＶＤＡＶＩＮＨＭＣＧＮＡＶＳＡＧＴＳＳＴＣＧＳＹＦＮＰＧＳＲＤＦＰＡＶＰＹＳＧＷＤＦＮＤＧＫＣＫＴＧＳＧＤＩＥＮＹＮＤＡＴＱＶＲＤＣＲＬＴＧＬＬＤＬＡＬＥＫＤＹＶＲＳＫＩＡＥＹＭＮＨＬＩＤＩＧＶＡＧＦＲＬＤＡＳＫＨＭＷＰＧＤＩＫＡＩＬＤＫＬＨＮＬＮＳＮＷＦＰＡＧＳＫＰＦＩＹＱＥＶＩＤＬＧＧＥＰＩＫＳＳＤＹＦＧＮＧＲＶＴＥＦＫＹＧＡＫＬＧＴＶＩＲＫＷＮＧＥＫＭＳＹＬＫＮＷＧＥＧＷＧＦＶＰＳＤＲＡＬＶＦＶＤＮＨＤＮＱＲＧＨＧＡＧＧＡＳＩＬＴＦＷＤＡＲＬＹＫＭＡＶＧＦＭＬＡＨＰＹＧＦＴＲＶＭＳＳＹＲＷＰＲＱＦＱＮＧＮＤＶＮＤＷＶＧＰＰＮＮＮＧＶＩＫＥＶＴＩＮＰＤＴＴＣＧＮＤＷＶＣＥＨＲＷＲＱＩＲＮＭＶＩＦＲＮＶＶＤＧＱＰＦＴＮＷＹＤＮＧＳＮＱＶＡＦＧＲＧＮＲＧＦＩＶＦＮＮＤＤＷＳＦＳＬＴＬＱＴＧＬＰＡＧＴＹＣＤＶＩＳＧＤＫＩＮＧＮＣＴＧＩＫＩＹＶＳＤＤＧＫＡＨＦＳＩＳＮＳＡＥＤＰＦＩＡＩＨＡＥＳＫＬ
配列番号２−ヒト化可変重鎖のアミノ酸配列（ＶＨ３）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３−ヒト化可変軽鎖のアミノ酸配列（ＶＬ２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＹＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号４−重鎖のリーダーアミノ酸配列
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ
配列番号５−軽鎖のリーダーアミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ
配列番号６−グリシン−セリンリンカーのアミノ酸配列
ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ
配列番号７−ヒト化重鎖のアミノ酸配列（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１及びトランケートされたヒンジ定常領域を含む）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ
配列番号８−ヒト化軽鎖のアミノ酸配列（ヒトカッパ軽鎖領域を含む）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＹＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号９−重鎖＋アルファ−アミラーゼ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列及びリンカー配列を含む）
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＱＹＳＰＮＴＱＱＧＲＴＳＩＶＨＬＦＥＷＲＷＶＤＩＡＬＥＣＥＲＹＬＡＰＫＧＦＧＧＶＱＶＳＰＰＮＥＮＶＡＩＹＮＰＦＲＰＷＷＥＲＹＱＰＶＳＹＫＬＣＴＲＳＧＮＥＤＥＦＲＮＭＶＴＲＣＮＮＶＧＶＲＩＹＶＤＡＶＩＮＨＭＣＧＮＡＶＳＡＧＴＳＳＴＣＧＳＹＦＮＰＧＳＲＤＦＰＡＶＰＹＳＧＷＤＦＮＤＧＫＣＫＴＧＳＧＤＩＥＮＹＮＤＡＴＱＶＲＤＣＲＬＴＧＬＬＤＬＡＬＥＫＤＹＶＲＳＫＩＡＥＹＭＮＨＬＩＤＩＧＶＡＧＦＲＬＤＡＳＫＨＭＷＰＧＤＩＫＡＩＬＤＫＬＨＮＬＮＳＮＷＦＰＡＧＳＫＰＦＩＹＱＥＶＩＤＬＧＧＥＰＩＫＳＳＤＹＦＧＮＧＲＶＴＥＦＫＹＧＡＫＬＧＴＶＩＲＫＷＮＧＥＫＭＳＹＬＫＮＷＧＥＧＷＧＦＶＰＳＤＲＡＬＶＦＶＤＮＨＤＮＱＲＧＨＧＡＧＧＡＳＩＬＴＦＷＤＡＲＬＹＫＭＡＶＧＦＭＬＡＨＰＹＧＦＴＲＶＭＳＳＹＲＷＰＲＱＦＱＮＧＮＤＶＮＤＷＶＧＰＰＮＮＮＧＶＩＫＥＶＴＩＮＰＤＴＴＣＧＮＤＷＶＣＥＨＲＷＲＱＩＲＮＭＶＩＦＲＮＶＶＤＧＱＰＦＴＮＷＹＤＮＧＳＮＱＶＡＦＧＲＧＮＲＧＦＩＶＦＮＮＤＤＷＳＦＳＬＴＬＱＴＧＬＰＡＧＴＹＣＤＶＩＳＧＤＫＩＮＧＮＣＴＧＩＫＩＹＶＳＤＤＧＫＡＨＦＳＩＳＮＳＡＥＤＰＦＩＡＩＨＡＥＳＫＬ
配列番号１０−軽鎖＋リーダーアミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＹＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１１−重鎖ＩｇＧ１  ＣＨ１及びトランケートされたヒンジ定常ドメイン
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ
配列番号１２−Ｋｍ３アロタイプのヒトカッパ定常ドメイン
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１３−ＧＳ３リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１４−リンカー
ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ
配列番号１５−Ｈｉｓタグ
ＨＨＨＨＨＨＨ
配列番号１６−ｃ−Ｍｙｃタグ
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
配列番号１７−例示的な３Ｅ１０可変重鎖（Ｄ３１Ｎ置換を有するＶＨ、実施例を参照されたい）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号１８−３Ｅ１０可変軽鎖（ＶＬ）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＫＹＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＨＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＡＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号１９−Ｋａｂａｔシステムに準拠する、３Ｅ１０  ＶＨの重鎖可変ドメインＣＤＲ１（このＶＨは配列番号１７を参照して定義されるＶＨである）
ＮＹＧＭＨ
配列番号２０−Ｋａｂａｔシステムに準拠する、３Ｅ１０  ＶＨの重鎖可変ドメインＣＤＲ２（このＶＨは配列番号１７を参照して定義されるＶＨである）
ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧ
配列番号２１−Ｋａｂａｔシステムに準拠する、３Ｅ１０  ＶＨの重鎖可変ドメインＣＤＲ３（このＶＨは配列番号１７を参照して定義されるＶＨである）
ＲＧＬＬＬＤＹ
配列番号２２−Ｋａｂａｔシステムに準拠する、３Ｅ１０  ＶＬの軽鎖可変ドメインＣＤＲ１（このＶＬは配列番号１８を参照して定義されるＶＬである）
ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ
配列番号２３−Ｋａｂａｔシステムに準拠する、３Ｅ１０  ＶＬの軽鎖可変ドメインＣＤＲ２（このＶＬは配列番号１８を参照して定義されるＶＬである）
ＹＡＳＹＬＥＳ
配列番号２４−Ｋａｂａｔシステムに準拠する、３Ｅ１０  ＶＬの軽鎖可変ドメインＣＤＲ３（このＶＬは配列番号１８を参照して定義されるＶＬである）
ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ
配列番号２５−「ＡＧＩＨ」
ＡＧＩＨ
配列番号２６−「ＳＡＧＩＨ」
ＳＡＧＩＨ
配列番号２７−ＩＭＧＴシステムによって定義されるＣＤＲに準拠する、例示的な３Ｅ１０分子の重鎖可変（ＶＨ）ドメインＣＤＲ１
ＧＦＴＦＳＮＹＧ
配列番号２８−ＩＭＧＴシステムによって定義されるＣＤＲに準拠する、例示的な３Ｅ１０分子の重鎖可変（ＶＨ）ドメインＣＤＲ２
ＩＳＳＧＳＳＴＩ
配列番号２９−ＩＭＧＴシステムによって定義されるＣＤＲに準拠する、例示的な３Ｅ１０分子の重鎖可変（ＶＨ）ドメインＣＤＲ３
ＡＲＲＧＬＬＬＤＹ
配列番号３０−ＩＭＧＴシステムによって定義されるＣＤＲに準拠する、例示的な３Ｅ１０分子の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインＣＤＲ１
ＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹ
配列番号３１−ＩＭＧＴシステムによって定義されるＣＤＲに準拠する、例示的な３Ｅ１０分子の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインＣＤＲ２
ＹＡＳ
配列番号３２−ＩＭＧＴシステムによって定義されるＣＤＲに準拠する、例示的な３Ｅ１０分子の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインＣＤＲ３
ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ
配列番号３３−ヒト化３Ｅ１０重鎖（ｈＶＨ１）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧ  ＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３４−ヒト化３Ｅ１０重鎖（ｈＶＨ２）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＴＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧ  ＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号３５−ヒト化３Ｅ１０軽鎖（ｈＶＬ１）のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＹＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号３６−ヒト膵アルファアミラーゼのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００６９０．１）
ＭＫＦＦＬＬＬＦＴＩＧＦＣＷＡＱＹＳＰＮＴＱＱＧＲＴＳＩＶＨＬＦＥＷＲＷＶＤＩＡＬＥＣＥＲＹＬＡＰＫＧＦＧＧＶＱＶＳＰＰＮＥＮＶＡＩＹＮＰＦＲＰＷＷＥＲＹＱＰＶＳＹＫＬＣＴＲＳＧＮＥＤＥＦＲＮＭＶＴＲＣＮＮＶＧＶＲＩＹＶＤＡＶＩＮＨＭＣＧＮＡＶＳＡＧＴＳＳＴＣＧＳＹＦＮＰＧＳＲＤＦＰＡＶＰＹＳＧＷＤＦＮＤＧＫＣＫＴＧＳＧＤＩＥＮＹＮＤＡＴＱＶＲＤＣＲＬＴＧＬＬＤＬＡＬＥＫＤＹＶＲＳＫＩＡＥＹＭＮＨＬＩＤＩＧＶＡＧＦＲＬＤＡＳＫＨＭＷＰＧＤＩＫＡＩＬＤＫＬＨＮＬＮＳＮＷＦＰＡＧＳＫＰＦＩＹＱＥＶＩＤＬＧＧＥＰＩＫＳＳＤＹＦＧＮＧＲＶＴＥＦＫＹＧＡＫＬＧＴＶＩＲＫＷＮＧＥＫＭＳＹＬＫＮＷＧＥＧＷＧＦＶＰＳＤＲＡＬＶＦＶＤＮＨＤＮＱＲＧＨＧＡＧＧＡＳＩＬＴＦＷＤＡＲＬＹＫＭＡＶＧＦＭＬＡＨＰＹＧＦＴＲＶＭＳＳＹＲＷＰＲＱＦＱＮＧＮＤＶＮＤＷＶＧＰＰＮＮＮＧＶＩＫＥＶＴＩＮＰＤＴＴＣＧＮＤＷＶＣＥＨＲＷＲＱＩＲＮＭＶＩＦＲＮＶＶＤＧＱＰＦＴＮＷＹＤＮＧＳＮＱＶＡＦＧＲＧＮＲＧＦＩＶＦＮＮＤＤＷＳＦＳＬＴＬＱＴＧＬＰＡＧＴＹＣＤＶＩＳＧＤＫＩＮＧＮＣＴＧＩＫＩＹＶＳＤＤＧＫＡＨＦＳＩＳＮＳＡＥＤＰＦＩＡＩＨＡＥＳＫＬ
配列番号３７−Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲに準拠する、本開示の特定の抗体の重鎖可変ドメインＣＤＲ２
ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号３８−Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲに準拠する、本開示の特定の抗体の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１
ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＬＡ
配列番号３９−Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲに準拠する、本開示の特定の抗体の軽鎖可変ドメインＣＤＲ２
ＹＡＳＹＬＱＳ
配列番号４０−参照ヒト化３Ｅ１０軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＮＤＴＡＮＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号４１−参照ヒト化３Ｅ１０重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４２−参照ヒト化Ｆｖ３Ｅ１０
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＮＤＴＡＮＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４３−重鎖＋アルファ−アミラーゼ融合タンパク質のアミノ酸配列（リンカー配列を除く）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＱＹＳＰＮＴＱＱＧＲＴＳＩＶＨＬＦＥＷＲＷＶＤＩＡＬＥＣＥＲＹＬＡＰＫＧＦＧＧＶＱＶＳＰＰＮＥＮＶＡＩＹＮＰＦＲＰＷＷＥＲＹＱＰＶＳＹＫＬＣＴＲＳＧＮＥＤＥＦＲＮＭＶＴＲＣＮＮＶＧＶＲＩＹＶＤＡＶＩＮＨＭＣＧＮＡＶＳＡＧＴＳＳＴＣＧＳＹＦＮＰＧＳＲＤＦＰＡＶＰＹＳＧＷＤＦＮＤＧＫＣＫＴＧＳＧＤＩＥＮＹＮＤＡＴＱＶＲＤＣＲＬＴＧＬＬＤＬＡＬＥＫＤＹＶＲＳＫＩＡＥＹＭＮＨＬＩＤＩＧＶＡＧＦＲＬＤＡＳＫＨＭＷＰＧＤＩＫＡＩＬＤＫＬＨＮＬＮＳＮＷＦＰＡＧＳＫＰＦＩＹＱＥＶＩＤＬＧＧＥＰＩＫＳＳＤＹＦＧＮＧＲＶＴＥＦＫＹＧＡＫＬＧＴＶＩＲＫＷＮＧＥＫＭＳＹＬＫＮＷＧＥＧＷＧＦＶＰＳＤＲＡＬＶＦＶＤＮＨＤＮＱＲＧＨＧＡＧＧＡＳＩＬＴＦＷＤＡＲＬＹＫＭＡＶＧＦＭＬＡＨＰＹＧＦＴＲＶＭＳＳＹＲＷＰＲＱＦＱＮＧＮＤＶＮＤＷＶＧＰＰＮＮＮＧＶＩＫＥＶＴＩＮＰＤＴＴＣＧＮＤＷＶＣＥＨＲＷＲＱＩＲＮＭＶＩＦＲＮＶＶＤＧＱＰＦＴＮＷＹＤＮＧＳＮＱＶＡＦＧＲＧＮＲＧＦＩＶＦＮＮＤＤＷＳＦＳＬＴＬＱＴＧＬＰＡＧＴＹＣＤＶＩＳＧＤＫＩＮＧＮＣＴＧＩＫＩＹＶＳＤＤＧＫＡＨＦＳＩＳＮＳＡＥＤＰＦＩＡＩＨＡＥＳＫＬ
配列番号４４−ヒト唾液アルファアミラーゼのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ４４４５３．１）
ＭＫＬＦＷＬＬＦＴＩＧＦＣＷＡＱＹＳＳＮＴＱＱＧＲＴＳＩＶＨＬＦＥＷＲＷＶＤＩＡＬＥＣＥＲＹＬＡＰＫＧＦＧＧＶＱＶＳＰＰＮＥＮＶＡＩＨＮＰＦＲＰＷＷＥＲＹＱＰＶＳＹＫＬＣＴＲＳＧＮＥＤＥＦＲＮＭＶＴＲＣＮＮＶＧＶＲＩＹＶＤＡＶＩＮＨＭＣＧＮＡＶＳＡＧＴＳＳＴＣＧＳＹＦＮＰＧＳＲＤＦＰＡＶＰＹＳＧＷＤＦＮＤＧＫＣＫＴＧＳＧＤＩＥＮＹＮＤＡＴＱＶＲＤＣＲＬＳＧＬＬＤＬＡＬＧＫＤＹＶＲＳＫＩＡＥＹＭＮＨＬＩＤＩＧＶＡＧＦＲＩＤＡＳＫＨＭＷＰＧＤＩＫＡＩＬＤＫＬＨＮＬＮＳＮＷＦＰＥＧＳＫＰＦＩＹＱＥＶＩＤＬＧＧＥＰＩＫＳＳＤＹＦＧＮＧＲＶＴＥＦＫＹＧＡＫＬＧＴＶＩＲＫＷＮＧＥＫＭＳＹＬＫＮＷＧＥＧＷＧＦＭＰＳＤＲＡＬＶＦＶＤＮＨＤＮＱＲＧＨＧＡＧＧＡＳＩＬＴＦＷＤＡＲＬＹＫＭＡＶＧＦＭＬＡＨＰＹＧＦＴＲＶＭＳＳＹＲＷＰＲＹＦＥＮＧＫＤＶＮＤＷＶＧＰＰＮＤＮＧＶＴＫＥＶＴＩＮＰＤＴＴＣＧＮＤＷＶＣＥＨＲＷＲＱＩＲＮＭＶＮＦＲＮＶＶＤＧＱＰＦＴＮＷＹＤＮＧＳＮＱＶＡＦＧＲＧＮＲＧＦＩＶＦＮＮＤＤＷＴＦＳＬＴＬＱＴＧＬＰＡＧＴＹＣＤＶＩＳＧＤＫＩＮＧＮＣＴＧＩＫＩＹＶＳＤＤＧＫＡＨＦＳＩＳＮＳＡＥＤＰＦＩＡＩＨＡＥＳＫＬ
配列番号４５−完全長の未成熟ＧＡＡのアミノ酸配列（９５２アミノ酸、シグナル配列を下線／太字で示す）
ＭＧＶＲＨＰＰＣＳＨＲＬＬＡＶＣＡＬＶＳＬＡＴＡＡＬＬＧＨＩＬＬＨＤＦＬＬＶＰＲＥＬＳＧＳＳＰＶＬＥＥＴＨＰＡＨ  ＱＱＧＡＳＲＰＧＰＲＤＡＱＡＨＰＧＲＰＲＡＶＰＴＱＣＤＶＰＰＮＳＲＦＤＣＡＰＤＫＡＩＴＱＥＱＣＥＡＲＧＣＣＹＩＰＡＫＱＧＬＱＧＡＱＭＧＱＰＷＣＦＦＰＰＳＹＰＳＹＫＬＥＮＬＳＳＳＥＭＧＹＴＡＴＬＴＲＴＴＰＴＦＦＰＫＤＩＬＴＬＲＬＤＶＭＭＥＴＥＮＲＬＨＦＴＩＫＤＰＡＮＲＲＹＥＶＰＬＥＴＰＨＶＨＳＲＡＰＳＰＬＹＳＶＥＦＳＥＥＰＦＧＶＩＶＲＲＱＬＤＧＲＶＬＬＮＴＴＶＡＰＬＦＦＡＤＱＦＬＱＬＳＴＳＬＰＳＱＹＩＴＧＬＡＥＨＬＳＰＬＭＬＳＴＳＷＴＲＩＴＬＷＮＲＤＬＡＰＴＰＧＡＮＬＹＧＳＨＰＦＹＬＡＬＥＤＧＧＳＡＨＧＶＦＬＬＮＳＮＡＭＤＶＶＬＱＰＳＰＡＬＳＷＲＳＴＧＧＩＬＤＶＹＩＦＬＧＰＥＰＫＳＶＶＱＱＹＬＤＶＶＧＹＰＦＭＰＰＹＷＧＬＧＦＨＬＣＲＷＧＹＳＳＴＡＩＴＲＱＶＶＥＮＭＴＲＡＨＦＰＬＤＶＱＷＮＤＬＤＹＭＤＳＲＲＤＦＴＦＮＫＤＧＦＲＤＦＰＡＭＶＱＥＬＨＱＧＧＲＲＹＭＭＩＶＤＰＡＩＳＳＳＧＰＡＧＳＹＲＰＹＤＥＧＬＲＲＧＶＦＩＴＮＥＴＧＱＰＬＩＧＫＶＷＰＧＳＴＡＦＰＤＦＴＮＰＴＡＬＡＷＷＥＤＭＶＡＥＦＨＤＱＶＰＦＤＧＭＷＩＤＭＮＥＰＳＮＦＩＲＧＳＥＤＧＣＰＮＮＥＬＥＮＰＰＹＶＰＧＶＶＧＧＴＬＱＡＡＴＩＣＡＳＳＨＱＦＬＳＴＨＹＮＬＨＮＬＹＧＬＴＥＡＩＡＳＨＲＡＬＶＫＡＲＧＴＲＰＦＶＩＳＲＳＴＦＡＧＨＧＲＹＡＧＨＷＴＧＤＶＷＳＳＷＥＱＬＡＳＳＶＰＥＩＬＱＦＮＬＬＧＶＰＬＶＧＡＤＶＣＧＦＬＧＮＴＳＥＥＬＣＶＲＷＴＱＬＧＡＦＹＰＦＭＲＮＨＮＳＬＬＳＬＰＱＥＰＹＳＦＳＥＰＡＱＱＡＭＲＫＡＬＴＬＲＹＡＬＬＰＨＬＹＴＬＦＨＱＡＨＶＡＧＥＴＶＡＲＰＬＦＬＥＦＰＫＤＳＳＴＷＴＶＤＨＱＬＬＷＧＥＡＬＬＩＴＰＶＬＱＡＧＫＡＥＶＴＧＹＦＰＬＧＴＷＹＤＬＱＴＶＰＶＥＡＬＧＳＬＰＰＰＰＡＡＰＲＥＰＡＩＨＳＥＧＱＷＶＴＬＰＡＰＬＤＴＩＮＶＨＬＲＡＧＹＩＩＰＬＱＧＰＧＬＴＴＴＥＳＲＱＱＰＭＡＬＡＶＡＬＴＫＧＧＥＡＲＧＥＬＦＷＤＤＧＥＳＬＥＶＬＥＲＧＡＹＴＱＶＩＦＬＡＲＮＮＴＩＶＮＥＬＶＲＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫＶＴＶＬＧＶＡＴＡＰＱＱＶＬＳＮＧＶＰＶＳＮＦＴＹＳＰＤＴＫＶＬＤＩＣＶＳＬＬＭＧＥＱＦＬＶＳＷＣ
配列番号４６−完全長の未成熟ＧＡＡのアミノ酸配列（９５７アミノ酸、シグナル配列を下線／太字で示す）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＡＷ８９５８３．１）
ＭＧＶＲＨＰＰＣＳＨＲＬＬＡＶＣＡＬＶＳＬＡＴＡＡＬＬＧＨＩＬＬＨＤＦＬＬＶＰＲＥＬＳＧＳＳＰＶＬＥＥＴＨＰＡＨ  ＱＱＧＡＳＲＰＧＰＲＤＡＱＡＨＰＧＲＰＲＡＶＰＴＱＣＤＶＰＰＮＳＲＦＤＣＡＰＤＫＡＩＴＱＥＱＣＥＡＲＧＣＣＹＩＰＡＫＱＧＬＱＧＡＱＭＧＱＰＷＣＦＦＰＰＳＹＰＳＹＫＬＥＮＬＳＳＳＥＭＧＹＴＡＴＬＴＲＴＴＰＴＦＦＰＫＤＩＬＴＬＲＬＤＶＭＭＥＴＥＮＲＬＨＦＴＩＫＤＰＡＮＲＲＹＥＶＰＬＥＴＰＨＶＨＳＲＡＰＳＰＬＹＳＶＥＦＳＥＥＰＦＧＶＩＶＲＲＱＬＤＧＲＶＬＬＮＴＴＶＡＰＬＦＦＡＤＱＦＬＱＬＳＴＳＬＰＳＱＹＩＴＧＬＡＥＨＬＳＰＬＭＬＳＴＳＷＴＲＩＴＬＷＮＲＤＬＡＰＴＰＧＡＮＬＹＧＳＨＰＦＹＬＡＬＥＤＧＧＳＡＨＧＶＦＬＬＮＳＮＡＭＤＶＶＬＱＰＳＰＡＬＳＷＲＳＴＧＧＩＬＤＶＹＩＦＬＧＰＥＰＫＳＶＶＱＱＹＬＤＶＶＧＹＰＦＭＰＰＹＷＧＬＧＦＨＬＣＲＷＧＹＳＳＴＡＩＴＲＱＶＶＥＮＭＴＲＡＨＦＰＬＤＶＱＷＮＤＬＤＹＭＤＳＲＲＤＦＴＦＮＫＤＧＦＲＤＦＰＡＭＶＱＥＬＨＱＧＧＲＲＹＭＭＩＶＤＰＡＩＳＳＳＧＰＡＧＳＹＲＰＹＤＥＧＬＲＲＧＶＦＩＴＮＥＴＧＱＰＬＩＧＫＶＷＰＧＳＴＡＦＰＤＦＴＮＰＴＡＬＡＷＷＥＤＭＶＡＥＦＨＤＱＶＰＦＤＧＭＷＩＤＭＮＥＰＳＮＦＩＲＧＳＥＤＧＣＰＮＮＥＬＥＮＰＰＹＶＰＧＶＶＧＧＴＬＱＡＡＴＩＣＡＳＳＨＱＦＬＳＴＨＹＮＬＨＮＬＹＧＬＴＥＡＩＡＳＨＲＡＬＶＫＡＲＧＴＲＰＦＶＩＳＲＳＴＦＡＧＨＧＲＹＡＧＨＷＴＧＤＶＷＳＳＷＥＱＬＡＳＳＶＰＥＩＬＱＦＮＬＬＧＶＰＬＶＧＡＤＶＣＧＦＬＧＮＴＳＥＥＬＣＶＲＷＴＱＬＧＡＦＹＰＦＭＲＮＨＮＳＬＬＳＬＰＱＥＰＹＳＦＳＥＰＡＱＱＡＭＲＫＡＬＴＬＲＹＡＬＬＰＨＬＹＴＬＦＨＱＡＨＶＡＧＥＴＶＡＲＰＬＦＬＥＦＰＫＤＳＳＴＷＴＶＤＨＱＬＬＷＧＥＡＬＬＩＴＰＶＬＱＡＧＫＡＥＶＴＧＹＦＰＬＧＴＷＹＤＬＱＴＶＰＩＥＡＬＧＳＬＰＰＰＰＡＡＰＲＥＰＡＩＨＳＥＧＱＷＶＴＬＰＡＰＬＤＴＩＮＶＨＬＲＡＧＹＩＩＰＬＱＧＰＧＬＴＴＴＥＳＲＱＱＰＭＡＬＡＶＡＬＴＫＧＧＥＡＲＧＥＬＦＷＤＤＧＥＳＬＥＶＬＥＲＧＡＹＴＱＶＩＦＬＡＲＮＮＴＩＶＮＥＬＶＲＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫＶＴＶＬＧＶＡＴＡＰＱＱＶＬＳＮＧＶＰＶＳＮＦＴＹＳＰＤＴＫＡＲＧＰＲＶＬＤＩＣＶＳＬＬＭＧＥＱＦＬＶＳＷＣ
配列番号４７−例示的な成熟ＧＡＡのアミノ酸配列（配列番号４５の残基１２３〜７８２に対応、成熟ＧＡＡポリペプチドの一実施形態）
ＧＱＰＷＣＦＦＰＰＳＹＰＳＹＫＬＥＮＬＳＳＳＥＭＧＹＴＡＴＬＴＲＴＴＰＴＦＦＰＫＤＩＬＴＬＲＬＤＶＭＭＥＴＥＮＲＬＨＦＴＩＫＤＰＡＮＲＲＹＥＶＰＬＥＴＰＨＶＨＳＲＡＰＳＰＬＹＳＶＥＦＳＥＥＰＦＧＶＩＶＲＲＱＬＤＧＲＶＬＬＮＴＴＶＡＰＬＦＦＡＤＱＦＬＱＬＳＴＳＬＰＳＱＹＩＴＧＬＡＥＨＬＳＰＬＭＬＳＴＳＷＴＲＩＴＬＷＮＲＤＬＡＰＴＰＧＡＮＬＹＧＳＨＰＦＹＬＡＬＥＤＧＧＳＡＨＧＶＦＬＬＮＳＮＡＭＤＶＶＬＱＰＳＰＡＬＳＷＲＳＴＧＧＩＬＤＶＹＩＦＬＧＰＥＰＫＳＶＶＱＱＹＬＤＶＶＧＹＰＦＭＰＰＹＷＧＬＧＦＨＬＣＲＷＧＹＳＳＴＡＩＴＲＱＶＶＥＮＭＴＲＡＨＦＰＬＤＶＱＷＮＤＬＤＹＭＤＳＲＲＤＦＴＦＮＫＤＧＦＲＤＦＰＡＭＶＱＥＬＨＱＧＧＲＲＹＭＭＩＶＤＰＡＩＳＳＳＧＰＡＧＳＹＲＰＹＤＥＧＬＲＲＧＶＦＩＴＮＥＴＧＱＰＬＩＧＫＶＷＰＧＳＴＡＦＰＤＦＴＮＰＴＡＬＡＷＷＥＤＭＶＡＥＦＨＤＱＶＰＦＤＧＭＷＩＤＭＮＥＰＳＮＦＩＲＧＳＥＤＧＣＰＮＮＥＬＥＮＰＰＹＶＰＧＶＶＧＧＴＬＱＡＡＴＩＣＡＳＳＨＱＦＬＳＴＨＹＮＬＨＮＬＹＧＬＴＥＡＩＡＳＨＲＡＬＶＫＡＲＧＴＲＰＦＶＩＳＲＳＴＦＡＧＨＧＲＹＡＧＨＷＴＧＤＶＷＳＳＷＥＱＬＡＳＳＶＰＥＩＬＱＦＮＬＬＧＶＰＬＶＧＡＤＶＣＧＦＬＧＮＴＳＥＥＬＣＶＲＷＴＱＬＧＡＦＹＰＦＭＲＮＨＮＳＬＬＳＬＰＱＥＰＹＳＦＳＥＰＡＱＱＡＭＲＫＡＬＴＬＲＹＡＬＬＰＨＬＹＴＬＦＨＱＡＨＶＡＧＥＴＶＡＲＰＬＦＬＥＦＰＫＤＳＳＴＷＴＶＤＨＱＬＬＷＧＥＡＬＬＩＴＰＶＬＱＡＧＫＡＥＶＴＧＹＦＰＬＧＴＷＹＤＬＱＴＶＰＶＥＡ
配列番号４８−例示的な成熟ＧＡＡのアミノ酸配列（配列番号４５の残基２８８〜７８２に対応、成熟ＧＡＡポリペプチドの一実施形態）
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配列番号４９−成熟ＧＡＡを含む例示的なＧＡＡポリペプチド（残基６１〜９５２、ＧＡＡポリペプチドの一実施形態）
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配列番号５０−成熟ＧＡＡを含む例示的なＧＡＡポリペプチド（残基６７〜９５２、ＧＡＡポリペプチドの一実施形態）
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配列番号５１−成熟ＧＡＡを含む例示的なＧＡＡポリペプチド（残基７０〜９５２、ＧＡＡポリペプチドの一実施形態）
ＡＨＰＧＲＰＲＡＶＰＴＱＣＤＶＰＰＮＳＲＦＤＣＡＰＤＫＡＩＴＱＥＱＣＥＡＲＧＣＣＹＩＰＡＫＱＧＬＱＧＡＱＭＧＱＰＷＣＦＦＰＰＳＹＰＳＹＫＬＥＮＬＳＳＳＥＭＧＹＴＡＴＬＴＲＴＴＰＴＦＦＰＫＤＩＬＴＬＲＬＤＶＭＭＥＴＥＮＲＬＨＦＴＩＫＤＰＡＮＲＲＹＥＶＰＬＥＴＰＨＶＨＳＲＡＰＳＰＬＹＳＶＥＦＳＥＥＰＦＧＶＩＶＲＲＱＬＤＧＲＶＬＬＮＴＴＶＡＰＬＦＦＡＤＱＦＬＱＬＳＴＳＬＰＳＱＹＩＴＧＬＡＥＨＬＳＰＬＭＬＳＴＳＷＴＲＩＴＬＷＮＲＤＬＡＰＴＰＧＡＮＬＹＧＳＨＰＦＹＬＡＬＥＤＧＧＳＡＨＧＶＦＬＬＮＳＮＡＭＤＶＶＬＱＰＳＰＡＬＳＷＲＳＴＧＧＩＬＤＶＹＩＦＬＧＰＥＰＫＳＶＶＱＱＹＬＤＶＶＧＹＰＦＭＰＰＹＷＧＬＧＦＨＬＣＲＷＧＹＳＳＴＡＩＴＲＱＶＶＥＮＭＴＲＡＨＦＰＬＤＶＱＷＮＤＬＤＹＭＤＳＲＲＤＦＴＦＮＫＤＧＦＲＤＦＰＡＭＶＱＥＬＨＱＧＧＲＲＹＭＭＩＶＤＰＡＩＳＳＳＧＰＡＧＳＹＲＰＹＤＥＧＬＲＲＧＶＦＩＴＮＥＴＧＱＰＬＩＧＫＶＷＰＧＳＴＡＦＰＤＦＴＮＰＴＡＬＡＷＷＥＤＭＶＡＥＦＨＤＱＶＰＦＤＧＭＷＩＤＭＮＥＰＳＮＦＩＲＧＳＥＤＧＣＰＮＮＥＬＥＮＰＰＹＶＰＧＶＶＧＧＴＬＱＡＡＴＩＣＡＳＳＨＱＦＬＳＴＨＹＮＬＨＮＬＹＧＬＴＥＡＩＡＳＨＲＡＬＶＫＡＲＧＴＲＰＦＶＩＳＲＳＴＦＡＧＨＧＲＹＡＧＨＷＴＧＤＶＷＳＳＷＥＱＬＡＳＳＶＰＥＩＬＱＦＮＬＬＧＶＰＬＶＧＡＤＶＣＧＦＬＧＮＴＳＥＥＬＣＶＲＷＴＱＬＧＡＦＹＰＦＭＲＮＨＮＳＬＬＳＬＰＱＥＰＹＳＦＳＥＰＡＱＱＡＭＲＫＡＬＴＬＲＹＡＬＬＰＨＬＹＴＬＦＨＱＡＨＶＡＧＥＴＶＡＲＰＬＦＬＥＦＰＫＤＳＳＴＷＴＶＤＨＱＬＬＷＧＥＡＬＬＩＴＰＶＬＱＡＧＫＡＥＶＴＧＹＦＰＬＧＴＷＹＤＬＱＴＶＰＶＥＡＬＧＳＬＰＰＰＰＡＡＰＲＥＰＡＩＨＳＥＧＱＷＶＴＬＰＡＰＬＤＴＩＮＶＨＬＲＡＧＹＩＩＰＬＱＧＰＧＬＴＴＴＥＳＲＱＱＰＭＡＬＡＶＡＬＴＫＧＧＥＡＲＧＥＬＦＷＤＤＧＥＳＬＥＶＬＥＲＧＡＹＴＱＶＩＦＬＡＲＮＮＴＩＶＮＥＬＶＲＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫＶＴＶＬＧＶＡＴＡＰＱＱＶＬＳＮＧＶＰＶＳＮＦＴＹＳＰＤＴＫＶＬＤＩＣＶＳＬＬＭＧＥＱＦＬＶＳＷＣ
配列番号５２−ウシＧＡＡ前駆体タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７７６３３８．１）
ＭＭＲＷＰＰＣＳＲＰＬＬＧＶＣＴＬＬＳＬＡＬＬＧＨＩＬＬＨＤＬＥＶＶＰＲＥＬＲＧＦＳＱＤＥＩＨＱＡＣＱＰＧＡＳＳＰＥＣＲＧＳＰＲＡＡＰＴＱＣＤＬＰＰＮＳＲＦＤＣＡＰＤＫＧＩＴＰＱＱＣＥＡＲＧＣＣＹＭＰＡＥＷＰＰＤＡＱＭＧＱＰＷＣＦＦＰＰＳＹＰＳＹＲＬＥＮＬＴＴＴＥＴＧＹＴＡＴＬＴＲＡＶＰＴＦＦＰＫＤＩＭＴＬＲＬＤＭＬＭＥＴＥＳＲＬＨＦＴＩＫＤＰＡＮＲＲＹＥＶＰＬＥＴＰＲＶＹＳＱＡＰＦＴＬＹＳＶＥＦＳＥＥＰＦＧＶＶＶＲＲＫＬＤＧＲＶＬＬＮＴＴＶＡＰＬＦＦＡＤＱＦＬＱＬＳＴＳＬＰＳＱＨＩＴＧＬＡＥＨＬＧＳＬＭＬＳＴＮＷＴＫＩＴＬＷＮＲＤＩＡＰＥＰＮＶＮＬＹＧＳＨＰＦＹＬＶＬＥＤＧＧＬＡＨＧＶＦＬＬＮＳＮＡＭＤＶＶＬＱＰＳＰＡＬＳＷＲＳＴＧＧＩＬＤＶＹＩＦＬＧＰＥＰＫＳＶＶＱＱＹＬＤＶＶＧＹＰＦＭＰＰＹＷＧＬＧＦＨＬＣＲＷＧＹＳＴＳＡＩＴＲＱＶＶＥＮＭＴＲＡＹＦＰＬＤＶＱＷＮＤＬＤＹＭＤＡＲＲＤＦＴＦＮＫＤＨＦＧＤＦＰＡＭＶＱＥＬＨＱＧＧＲＲＹＩＭＩＶＤＰＡＩＳＳＳＧＰＡＧＴＹＲＰＹＤＥＧＬＲＲＧＶＦＩＴＮＥＴＧＱＰＬＩＧＱＶＷＰＧＬＴＡＦＰＤＦＴＮＰＥＴＬＤＷＷＱＤＭＶＴＥＦＨＡＱＶＰＦＤＧＭＷＩＤＭＮＥＰＳＮＦＶＲＧＳＶＤＧＣＰＤＮＳＬＥＮＰＰＹＬＰＧＶＶＧＧＴＬＲＡＡＴＩＣＡＳＳＨＱＦＬＳＴＨＹＤＬＨＮＬＹＧＬＴＥＡＬＡＳＨＲＡＬＶＫＡＲＧＭＲＰＦＶＩＳＲＳＴＦＡＧＨＧＲＹＳＧＨＷＴＧＤＶＷＳＮＷＥＱＬＳＹＳＶＰＥＩＬＬＦＮＬＬＧＶＰＬＶＧＡＤＩＣＧＦＬＧＮＴＳＥＥＬＣＶＲＷＴＱＬＧＡＦＹＰＦＭＲＮＨＮＡＬＮＳＱＰＱＥＰＹＲＦＳＥＴＡＱＱＡＭＲＫＡＦＴＬＲＹＶＬＬＰＹＬＹＴＬＦＨＲＡＨＶＲＧＥＴＶＡＲＰＬＦＬＥＦＰＥＤＰＳＴＷＴＶＤＲＱＬＬＷＧＥＡＬＬＩＴＰＶＬＥＡＥＫＶＥＶＴＧＹＦＰＱＧＴＷＹＤＬＱＴＶＰＭＥＡＦＧＳＬＰＰＰＡＰＬＴＳＶＩＨＳＫＧＱＷＶＴＬＳＡＰＬＤＴＩＮＶＨＬＲＡＧＨＩＩＰＭＱＧＰＡＬＴＴＴＥＳＲＫＱＨＭＡＬＡＶＡＬＴＡＳＧＥＡＱＧＥＬＦＷＤＤＧＥＳＬＧＶＬＤＧＧＤＹＴＱＬＩＦＬＡＫＮＮＴＦＶＮＫＬＶＨＶＳＳＥＧＡＳＬＱＬＲＮＶＴＶＬＧＶＡＴＡＰＱＱＶＬＣＮＳＶＰＶＳＮＦＴＦＳＰＤＴＥＴＬＡＩＰＶＳＬＴＭＧＥＱＦＶＩＳＷＳ
配列番号５３−完全リンカー領域（ＧＡＡの残基５７〜７８）
ＨＩＬＬＨＤＦＬＬＶＰＲＥＬＳＧＳＳＰＶＬＥＥＴＨＰＡＨ
【０４７０】
参照による組み込み
ＷＯ２０１８／０４９２３７及びＷＯ２０１５／０１９２０９２を含む、本明細書で述べられるすべての刊行物及び特許は、それぞれ個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されるかのように、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０４７１】
対象の開示の特定の実施形態が論じられたが、上記明細書は例証的であって制限的ではない。本開示の多くの変型は、本明細書及び下記特許請求の範囲を考慮すれば当業者に明らかとなるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲を、それらの同等物の全範囲とともに、及び明細書をそのような変型とともに参照することによって決定されるべきである。
【図１】
2021518840.tif 000011
【図２】
2021518840.tif 000012
【図３】
2021518840.tif 000013
【図４】
2021518840.tif 000014
【図５】
2021518840.tif 000015
【図６】
2021518840.tif 000016
【図７】
2021518840.tif 000017
【図８】
2021518840.tif 000018
【図９】
2021518840.tif 000019
【図１０Ａ】
2021518840.tif 000020
【図１０Ｂ】
2021518840.tif 000021
【図１０Ｃ】
2021518840.tif 000022
【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
2021518840.tif 000026
【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２７−５】
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【図２７−６】
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【図２７−７】
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【図２７−８】
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【図２７−９】
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【図２７−１０】
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【図２７−１１】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021518840.tif 000077
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