(57)【要約】  本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を低減するためのＲＮＡｉコンストラクトに関する。そのようなＲＮＡｉコンストラクトを使用して肝臓疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を治療又は予防する方法もまた記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖が、表１又は２に列記されるアンチセンス配列から３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含み、且つ前記ＲＮＡｉコンストラクトが、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害する、ＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２】
前記アンチセンス鎖が、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列と相補的である領域を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３】
前記センス鎖が、表１又は２に列記されるアンチセンス配列から３ヌクレオチド以下異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む、請求項１又は２のいずれかに記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項４】
前記コンストラクトが、優先的にＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９マイナーアレルを阻害する、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項５】
前記コンストラクトが、メジャーアレルと比較して少なくとも１０％高くＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９マイナーアレルを阻害する、請求項４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項６】
前記コンストラクトが、優先的にＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０８マイナーアレルを阻害する、請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項７】
前記コンストラクトが、メジャーアレルと比較して少なくとも１０％高くＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８二重マイナーアレルを阻害する、請求項６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項８】
前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含み、約１５〜約３０塩基対長の二重鎖領域を形成する、請求項１〜７のいずれかに記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項９】
前記二重鎖領域が、約１７〜約２４塩基対長である、請求項８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１０】
前記二重鎖領域が、約１９〜約２１塩基対長である、請求項８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１１】
前記二重鎖領域が、１９塩基対長である、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１２】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約１５〜約３０ヌクレオチド長である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１３】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約１９〜約２７ヌクレオチド長である、請求項１２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１４】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約２１〜約２５ヌクレオチド長である、請求項１２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１５】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約２１〜約２３ヌクレオチド長である、請求項１２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１６】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、少なくとも１つの平滑末端を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１７】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、１〜４個の不対ヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１８】
前記ヌクレオチドオーバーハングが、２個の不対ヌクレオチドを有する、請求項１７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項１９】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の３’末端、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１７又は１８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドオーバーハングが、５’−ＵＵ−３’ジヌクレオチド又は５’−ｄＴｄＴ−３’ジヌクレオチドを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２１】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２２】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−修飾ヌクレオチドである、請求項２１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２３】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、二環性核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸、反転塩基又はこれらの組み合わせである、請求項２１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２４】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項２３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２５】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖中の前記ヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドである、請求項２１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２６】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項２５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２７】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２８】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、前記アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項２９】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、前記アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つ前記センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３０】
前記アンチセンス鎖が、表１又は表２に列記される前記アンチセンス配列から選択される配列を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３１】
前記センス鎖が、表１又は表２に列記される前記センス配列から選択される配列を含む、請求項３０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３２】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、表１〜２のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３３】
対照ＲＮＡｉコンストラクトとインキュベートされた肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトが、前記ＲＮＡｉコンストラクトとのインキュベーション後の肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現レベルを低減する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３４】
前記肝臓細胞が、Ｈｅｐ３Ｂ細胞又はＨｅｐＧ２細胞である、請求項２７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３５】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、インビトロのＨｅｐ３Ｂ細胞において、５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも１０％を阻害する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３６】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、インビトロのＨｅｐＧ２細胞において、５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも１０％を阻害する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３７】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３８】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＨｅｐＧ２細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項４０】
ＰＮＰＬＡ３の発現の低減を必要とする患者において、ＰＮＰＬＡ３の発現の低減を行う方法であって、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４１】
肝細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現レベルが、前記ＲＮＡｉコンストラクトを投与されていない患者のＰＮＰＬＡ３発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトの投与後に前記患者において低減される、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は２０１７年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５９７，８４１号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年１２月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩの複製は、Ａ−２２１９−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは７０８，９６１バイトである。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の肝臓発現を調節するための組成物及び方法に関し、特に、本発明は、ＲＮＡ干渉によりＰＮＰＬＡ３発現を低減するための核酸に基づく治療薬及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などの肝疾患を治療又は予防するためのそのような核酸に基づく治療薬を使用する方法に関する。
【０００４】
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年１２月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩの複製は、Ａ−２２１９−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは７０８，９６１バイトである。
【背景技術】
【０００５】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、様々な肝臓病理を含む世界で最も一般的な慢性肝疾患であり、その有病率は過去２０年間で倍増し、現在では世界人口の約２０％が罹患していると推定される（Ｓａｔｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＢＭＪ  ３４９：ｇ４５９６；Ｌｏｏｍｂａ  ａｎｄ  Ｓａｎｙａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １０（１１）：６８６−６９０；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（２０１７）Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １５（４）：４７４−４８５；Ｐｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｄｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ４８（３）：３３３−３４２）。ＮＡＦＬＤは、肝臓中におけるトリグリセリドの蓄積から始まり、１）著しい飲酒歴がなく、且つ２）他の種類の肝疾患の診断が除外されている個体において、５％を超える肝細胞中において細胞質脂質小滴が存在することによって定義される（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２２（３６）：８２２６−３３；Ｒｉｎｅｌｌａ（２０１５）ＪＡＭＡ  ３１３（２２）：２２６３−７３；Ｙｋｉ−Ｊａｒｖｉｎｅｎ（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５９（６）：１１０４−１１）。一部の個体において、脂肪症と呼ばれる肝臓への異所性脂肪の蓄積が、炎症及び肝細胞損傷を誘発し、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれるより進行した段階の疾患を引き起こす（Ｒｉｎｅｌｌａ、前掲）。２０１５年の時点で、７５００万〜１億人のアメリカ人がＮＡＦＬＤを有すると予測され；ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤ診断のおよそ１０〜３０％を占める（Ｒｉｎｅｌｌａ、前掲；Ｙｏｕｎｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ６４（５）：１５７７−１５８６）。
【０００６】
以前にアディポニュートリン（ＡＤＰＮ）及びカルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２−イプシロン（ｉＰＬＡ（２）ε）として知られるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）は、ＩＩ型膜貫通タンパク質である（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４７（９）：１９４０−９；Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（４７）：４８９６８−７５）。マウスにおいて脂肪生成中に誘導される膜結合型の脂肪に富むタンパク質として脂肪細胞で最初に同定されたが、現在では肝臓を含む他の組織において発現していることが明らかになっている（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、前掲；Ｂａｕｌａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（３６）：３３３３６−４４；Ｍｏｌｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５５（３）：４６１−８；Ｆａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９１（２）：４２７−３５；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８９（６）：２６８４−９；Ｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４６（１１）：２４７７−８７）。無細胞生化学系において、組換え体ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、トリアシルグリセロールリパーゼ又はアシル交換反応活性のいずれかを示すことができる（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；Ｋｕｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １５（５）：６９１−７０２；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５（９）：６７０６−１５）。肝細胞において、ＰＮＰＬＡ３は、小胞体及び脂質膜上に発現され、主にトリアシルグリセロールヒドロラーゼ活性を示す（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７（１７）：７８９２−７；Ｒｕｈａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ５５（４）：７３９−４６；Ｐｉｎｇｉｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８４１（４）：５７４−８０）。分泌性シグナルを欠いているが、データは、ＰＮＰＬＡ３が分泌され、且つジスルフィド結合依存性多量体としてヒト血漿において見出され得ることを示す（Ｗｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４４６（４）：１１１４−９）。したがって、ＰＮＰＬＡ３機能を標的とする新規の治療薬は、ＰＮＰＬＡ３レベルを低減し、且つ非アルコール性脂肪性肝疾患などの肝臓学的疾患を治療する新規の手法となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｔｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＢＭＪ  ３４９：ｇ４５９６
【非特許文献２】Ｌｏｏｍｂａ  ａｎｄ  Ｓａｎｙａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １０（１１）：６８６−６９０
【非特許文献３】Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（２０１７）Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １５（４）：４７４−４８５
【非特許文献４】Ｐｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｄｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ４８（３）：３３３−３４２
【非特許文献５】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２２（３６）：８２２６−３３
【非特許文献６】Ｒｉｎｅｌｌａ（２０１５）ＪＡＭＡ  ３１３（２２）：２２６３−７３
【非特許文献７】Ｙｋｉ−Ｊａｒｖｉｎｅｎ（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５９（６）：１１０４−１１
【非特許文献８】Ｙｏｕｎｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ６４（５）：１５７７−１５８６
【非特許文献９】Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４７（９）：１９４０−９
【非特許文献１０】Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（４７）：４８９６８−７５
【非特許文献１１】Ｂａｕｌａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（３６）：３３３３６−４４
【非特許文献１２】Ｍｏｌｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５５（３）：４６１−８
【非特許文献１３】Ｆａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９１（２）：４２７−３５
【非特許文献１４】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８９（６）：２６８４−９
【非特許文献１５】Ｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４６（１１）：２４７７−８７
【非特許文献１６】Ｋｕｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １５（５）：６９１−７０２
【非特許文献１７】Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５（９）：６７０６−１５
【非特許文献１８】Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７（１７）：７８９２−７
【非特許文献１９】Ｒｕｈａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ５５（４）：７３９−４６
【非特許文献２０】Ｐｉｎｇｉｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８４１（４）：５７４−８０
【非特許文献２１】Ｗｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４４６（４）：１１１４−９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化し、且つ肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現を低減するＲＮＡｉコンストラクトの設計及び生成に部分的に基づく。ＰＮＰＬＡ３発現の配列特異的阻害は、例えば、単純性脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な進行した瘢痕）、又はＰＮＰＬＡ３関連肥満などの肝臓関連疾患などのＰＮＰＬＡ３発現に関連する状態を治療又は予防するのに有用である。したがって、一実施形態では、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、アンチセンス鎖がＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列と相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。ある種の実施形態では、アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列から少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉは、ＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９、ＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０８、及び／又はＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８マイナーアレルを、これらの変化を含有しない参照アレルよりも選択的に阻害する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、約１５〜約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。これら及び他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々は、約１５〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。このようなヌクレオチドオーバーハングは、少なくとも１〜６個の不対ヌクレオチドを含み得、且つセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置し得る。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含み、且つセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。
【００１０】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リボース環、核酸塩基、又はホスホジエステル骨格への修飾を有するヌクレオチドを含む１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’−修飾ヌクレオチドを含む。このような２’−修飾ヌクレオチドは、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、反転塩基（例えば、反転アデノシン）又はその組み合わせを含み得る。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、ヌクレオチド間又はヌクレオシド間の修飾された結合などの少なくとも１つの骨格修飾を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’又は５’末端に配置され得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖は、表１又は２に列記されるアンチセンス配列及びセンス配列からの配列を含むか又はそれからなり得る。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１〜２のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】インビボでの用量依存的ｍＲＮＡノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関する５つのｓｉＲＮＡ分子のスクリーニングを示す。
【図１Ｂ】インビボでの用量依存的ｍＲＮＡノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関する５つのｓｉＲＮＡ分子のスクリーニングを示す。
【図１Ｃ】インビボでの用量依存的ｍＲＮＡノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関する５つのｓｉＲＮＡ分子のスクリーニングを示す。
【図１Ｄ】インビボでの用量依存的ｍＲＮＡノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関する５つのｓｉＲＮＡ分子のスクリーニングを示す。
【図２Ａ】マウスにおけるインビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図２Ｂ】マウスにおけるインビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図２Ｃ】マウスにおけるインビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図２Ｄ】マウスにおけるインビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図２Ｅ】マウスにおけるインビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図２Ｆ】マウスにおけるインビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図２Ｇ】マウスにおけるインビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図３Ａ】インビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図３Ｂ】インビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図３Ｃ】インビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図３Ｄ】インビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図３Ｅ】インビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図３Ｆ】インビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図３Ｇ】インビボでのＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の効果、肝臓重量、ヒトＰＮＰＬＡ３発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図４Ａ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の過剰発現によるＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の疾患関連表現型をレスキューする能力、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図４Ｂ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の過剰発現によるＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の疾患関連表現型をレスキューする能力、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図４Ｃ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の過剰発現によるＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の疾患関連表現型をレスキューする能力、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図４Ｄ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の過剰発現によるＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の疾患関連表現型をレスキューする能力、肝臓のトリグリセリド含量、血清ＴＩＭＰ１レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。
【図５Ａ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｂ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｃ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｄ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｅ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｆ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｇ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｈ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｉ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｊ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｋ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【図５Ｌ】ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、その遺伝子は、細胞又は哺乳動物（例えば、ヒト）などの対象内にあり得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡを標的化し、且つ細胞又は哺乳動物におけるＰＮＰＬＡ３発現を低減するＲＮＡｉコンストラクトを含む。そのようなＲＮＡｉコンストラクトは、例えば、単純性脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な進行した瘢痕）、又はＰＮＰＬＡ３関連肥満などの肝臓関連疾患の様々な形態を治療又は予防するのに有用である。
【００１５】
２００８年に、ＮＡＦＬＤと関連する非同義の配列変異、又は一塩基多型（ＳＮＰ）を探索するゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、ＰＮＰＬＡ３のバリアント（ｒｓ７３８４０９［Ｇ］、Ｉ１４８Ｍをコードする；ＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９、ＰＮＰＬＡ３−ｍａ又はＰＮＰＬＡ３−マイナーアレルとして参照され得る）が肝臓の脂肪含量と有意に関連していることが明らかになった。この最初の報告以来、その後のＧＷＡＳでは、ＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９が、１）肝損傷の血清バイオマーカーであるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルの上昇、２）ＮＡＦＬＤの発病率、進行度及び重症度、３）肥満個体と痩せ型の個体の両方、並びに４）ＮＡＦＬＤ：脂肪症、ＮＡＳＨ、肝硬変及び肝細胞癌の全ての段階と有意に関連していることが示されている唯一の既知のＳＮＰと有意に関連するＮＡＦＬＤの主要な遺伝的決定因子であることが確認されている。多数のＧＷＡＳのコンセンサスは、ＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９とＮＡＦＬＤの関連は、年齢、性別、民族、メタボリックシンドローム、肥満度指数、インスリン抵抗性、及び血清脂質に依存しないことを示している。さらに、複数の情報源からの統計解析では、ＮＡＦＬＤ患者の約５０％がＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９変異を保有すると推定されている。患者は、ＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９変異のホモ接合体又はヘテロ接合体であり得る。さらに、ＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９変異を有する患者は、多くの場合３塩基対離れたｒｓ７３８４０８変異も保有していることが発見されている（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２：２１−２３）。したがって、患者は、ＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９マイナーアレル、ＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０８マイナーアレル又はＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８二重マイナーアレル変異（ＰＮＰＬＡ３−ｄｍａ）を有し得る。
【００１６】
発明者らは、インビボでのＰＮＰＬＡ３機能を探索するためのマウスモデルを開発した。現在まで、Ｐｎｐｌａ３欠損又はＰｎｐｌａ３過剰発現の結果としての検出可能な代謝表現型は同定されていない。対照的に、トランスジェニックマウス及びノックインマウスの両方におけるＰｎｐｌａ３Ｉ１４８Ｍの発現により、ＮＡＦＬＤに類似した肝臓トリグリセリドレベルの上昇がもたらされた。したがって、合わせると、インビボマウスモデルのデータは、野生型タンパク質の過剰発現ではなく、変異体Ｐｎｐｌａ３Ｉ１４８Ｍタンパク質の発現が疾患表現型のドライバーであることを示唆している。これらの知見は、ＮＡＦＬＤに罹患した個体におけるマイナーアレルの頻度の高さ及び疾患との有力な関連に加えて、ＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９がＮＡＦＬＤの主要な治療標的であることを強調している。
【００１７】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞内に外来のＲＮＡを導入して、標的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの特異的な分解をもたらし、その結果としてタンパク質の発現を低減させるプロセスである。ＲＮＡｉ技術及び肝臓への送達の両方の進歩並びに他のＲＮＡｉに基づく療法による好結果の増加は、ＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍを直接的に標的化することによってＮＡＦＬＤを治療するための説得力のある手段としてのＲＮＡｉを示唆している。多数のＧＷＡＳは、ＮＡＦＬＤの発病率、進行度及び重症度に対するＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９の用量依存的効果を示している（ＧＷＡＳ）；オッズ比は、ホモ接合体キャリアとヘテロ接合体キャリアに関しては少なくとも２倍、ヘテロ接合体と野生型個体に関してはさらに少なくとも２倍を超える傾向がある。したがって、アレルの識別特異性を利用してＰＮＰＬＡ３をサイレンシングすることは、ＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍキャリアの肝臓トリグリセリドを減少させるための潜在的な手段であると同時に、さらに野生型アレルをサイレンシングすることなくヘテロ接合体が利益を得る場合があるシナリオを提示し得る。これらに沿って、本発明者らは、ＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍに対するＳＮＰ特異的な短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を同定し、インビトロでの概念証明を示す。Ｈｅｐ３Ｂ（参照アレルＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｉのホモ接合体）及びＨＥＰＧ２（マイナーアレルＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍのホモ接合体）の両方の肝細胞癌細胞株を用いて、本発明者らは、特異的にＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍ遺伝子の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ配列を同定した。これらの配列の阻害効果は、ＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｉ又はＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍのいずれかを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に対するスクリーニングによって確認された。次に、インビボでヒトＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍを過剰発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、本発明者らは、マウスにおいてヒトＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍの発現を特異的に低減するだけでなく、ヒトＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍの過剰発現により誘導される肝臓のトリグリセリド蓄積を著しく逆転させるマイナーアレルに特異的なＳＮＰによる治療を実証した。
【００１８】
本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡｉコンストラクト」は、細胞に導入された際にＲＮＡ干渉機構を介して標的遺伝子（例えば、ＰＮＰＬＡ３）の発現を下方制御することができるＲＮＡ分子を含む薬剤を指す。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的な様式で標的のＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子）の切断及び分解を誘導するプロセスである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、互いに十分に相補的であり、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成する連続したヌクレオチドの２本の逆平行鎖を含む二重鎖ＲＮＡ分子を含む。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、２つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合（例えば、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した相補的なポリヌクレオチドの対合を指す。標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と称される。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３に向けられるＲＮＡｉである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９部位で結合するＲＮＡｉである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０８部位で結合するＲＮＡｉである。いくつかの実施形態では、本発明は、両方のＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９  ｒｓ７３８４０８部位で結合するＲＮＡｉである。いくつかの実施形態では、本発明は、天然ＰＮＰＬＡ３配列（ＰＮＰＬＡ３−ｒｅｆ）より優先的にＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９に結合するＲＮＡｉである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３−ｒｅｆ配列より優先的にＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０８に結合するＲＮＡｉである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３−ｍａより優先的にＰＮＰＬＡ３−ｄｍａに結合するＲＮＡｉである。いくつかの実施形態では、本発明は、表１又は２において見出される配列のいずれかを含有するＲＮＡｉ分子である。
【００２０】
二重鎖ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のもの又は当技術分野で知られるものなど、リボース糖、塩基、又はリボヌクレオチドの骨格構成要素に対する修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含み得る。二重鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）で使用されるような任意のそのような修飾は、本開示の目的のための用語「二重鎖ＲＮＡ」によって包含される。
【００２１】
本明細書で使用する場合、生理的条件などのある種の条件下において、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができる場合、第１の配列は、第２の配列に「相補的」である。他のそのような条件は、当業者に知られる中程度の又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むことができる。第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドとミスマッチすることなく１つ又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％標的配列と相補的である場合、配列は、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第２の配列又は標的配列の対応する位置の塩基と相補的な第１の配列の塩基の数を第１の配列の全体長で割ることによって計算することができる。２つの配列がハイブリダイズするとき、３０塩基対の二重鎖領域にわたって５、４、３、２又は１個以下のミスマッチが存在する場合、配列は他方の配列に対して実質的に相補的であると言われ得る。一般に、本明細書に定義される任意のヌクレオチドオーバーハングが存在する場合、このようなオーバーハングの配列は、２つの配列間の相補性の程度の決定において考慮されない。例として、ハイブリダイズして、各鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対二重鎖領域を形成する、２１ヌクレオチド長のセンス鎖及び２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、この用語が本明細書に使用される場合、完全に相補的であるとみなされることになる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、標的ＲＮＡ配列（例えば、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ）の領域と完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のこのような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域に１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する配列を含み得る。ある種の実施形態では、任意のミスマッチが末端領域内（例えば、鎖の５’及び／又は３’末端の６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域における任意のミスマッチは、アンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチド以内に生じる。
【００２３】
ある種の実施形態では、二重鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、この領域を除いて繋がっていない２つの別々の分子であり得る。２本の別々の鎖から形成されるこのような二重鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「短い干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｉＲＮＡを含む。
【００２４】
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が別個のＲＮＡ分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合される必要はないが、共有結合することができる。２本の鎖が、一方の鎖の３’末端と二重鎖構造を形成する各々の他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されていない鎖以外の方法で共有結合されている場合、その結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じ又は異なる数のヌクレオチドを有してもよい。二重鎖における塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短の鎖のヌクレオチドの数から二重鎖に存在する任意のオーバーハングを引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。
【００２５】
他の実施形態では、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の一部であってもよく、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の自己相補的領域の一部である。そのような場合、単一ＲＮＡ分子は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）及びループ領域を含む。センス鎖の３’末端は、ループ領域を形成することになる不対ヌクレオチドの隣接配列によってアンチセンス鎖の５’末端に結合される。アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対形成して二重鎖又はステム領域を形成することができるように、ループ領域は、通常、ＲＮＡ分子がそれ自体で折り返すことを可能にする十分な長さのものである。ループ領域は、約３〜約２５、約５〜約１５又は約８〜約１２個の不対ヌクレオチドを含むことができる。少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するこのようなＲＮＡ分子は、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。いくつかの実施形態では、ループ領域は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、又は２５個の不対ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ループ領域は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下の不対ヌクレオチドを含み得る。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡを含む。単一の少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の長さは、約３５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約８５ヌクレオチド又は約５０〜約６０ヌクレオチドであり得、本明細書に列挙される長さをそれぞれ有する二重鎖領域及びループ領域を含むことができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＰＮＰＬＡ３のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含む。本明細書で使用する場合、「ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列」は、任意の種（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）に由来するＰＮＰＬＡ３タンパク質のバリアント又はアイソフォームを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードするスプライスバリアントを含む任意のメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、アディポニュートリン（ＡＤＰＮ）及びカルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２−イプシロン（ｉＰＬＡ（２）ε））としても知られる。
【００２７】
ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列は、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として発現される転写物配列も含む。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン）ではなく、ＤＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、チミン及びシトシン）として表されるｍＲＮＡ転写物の配列を指す。したがって、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、標的のＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列又はＰＮＰＬＡ３のｃＤＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含み得る。ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２５２２５．２に由来し得るような任意のＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。
【００２８】
アンチセンス鎖の領域は、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと実質的に相補的又は完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖が相補性の領域を含むＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列の標的領域は、約１５〜約３０個の連続したヌクレオチド、約１６〜約２８個の連続したヌクレオチド、約１８〜約２６個の連続したヌクレオチド、約１７〜約２４個の連続したヌクレオチド、約１９〜約２５個の連続したヌクレオチド、約１９〜約２３個の連続したヌクレオチド又は約１９〜約２１個の連続したヌクレオチドの範囲であり得る。ある種の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、いくつかの実施形態では、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、アンチセンス配列は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、又は少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス及び／又はアンチセンス配列は、１、２、又は３個以下のヌクレオチドミスマッチを伴って、表１又は表２に列記される配列からの少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。
【００２９】
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、通常、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するようにアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン−クリック塩基対合又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対形成して、２つのポリヌクレオチド間で二重鎖を生成する２つの相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチドの領域を指す。ＲＮＡｉコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素及び／又はＲＩＳＣ複合体が結合することにより、ＲＮＡｉコンストラクトがＲＮＡ干渉経路に入ることを可能にする十分な長さのものであるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、約１５〜約３０塩基対長である。この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５〜約２８塩基対、約１５〜約２６塩基対、約１５〜約２４塩基対、約１５〜約２２塩基対、約１７〜約２８塩基対、約１７〜約２６塩基対、約１７〜約２４塩基対、約１７〜約２３塩基対、約１７〜約２１塩基対、約１９〜約２５塩基対、約１９〜約２３塩基対、又は約１９〜約２１塩基対も好適である。一実施形態では、二重鎖領域は、約１７〜約２４塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約１９〜約２１塩基対長である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉ薬剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＰＮＰＬＡ３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する約２４〜約３０個のヌクレオチドの二重鎖領域を含有する。理論に束縛されるものではないが、細胞に導入される長い二重鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって分解されてｓｉＲＮＡになることができる（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサー、リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素、１５は、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれるが、ここで、１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を巻き戻して、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ１０７：３０９）。適切な標的の２０のｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８）。
【００３１】
センス鎖及びアンチセンス鎖が２種の別々の分子である（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む）実施形態について、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方又は両方の鎖は、二重鎖領域より長くてもよく、二重鎖領域に隣接している１個以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端における不対ヌクレオチド又は二重鎖領域を越えて延在するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、通常、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在する場合又は一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１〜６ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、１〜４ヌクレオチド、１〜３ヌクレオチド、２〜６ヌクレオチド、２〜５ヌクレオチド、又は２〜４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドを含む。特定の一実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１〜４ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、２ヌクレオチドを含む。オーバーハングにおけるヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりのリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、５’−ウリジンウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチドを含む。このような実施形態では、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば２’−修飾ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、オーバーハングは、５’−デオキシチミジン−デオキシチミジン−３’（５’−ｄＴｄＴ−３’）ジヌクレオチドを含む。
【００３２】
ヌクレオチドオーバーハングは、一方又は両方の鎖の５’末端又は３’末端に存在してもよい。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。
【００３３】
ＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖ＲＮＡ分子の一方の末端に単一ヌクレオチドオーバーハングを含み、且つ他の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、分子の末端においてセンス鎖及びアンチセンス鎖が完全に塩基対形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドが存在しないことを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖ＲＮＡ分子の両端に平滑末端を含む。このような実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、二重鎖領域は、センス鎖及びアンチセンス鎖と同じ長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二重鎖である）。
【００３４】
センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１５〜約３０ヌクレオチド長、約１８〜約２８ヌクレオチド長、約１９〜約２７ヌクレオチド長、約１９〜約２５ヌクレオチド長、約１９〜約２３ヌクレオチド長、約２１〜約２５ヌクレオチド長、又は約２１〜約２３ヌクレオチド長であり得る。ある種の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有するが、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’端及びアンチセンス鎖の３’端の両方における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’端及びアンチセンス鎖の３’端の両方における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、二重鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、その長さ全体にわたって二重鎖領域を形成する。このような一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域を含む。別のこのような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２３塩基対長である二重鎖領域を含む。
【００３５】
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、センス鎖又はアンチセンス鎖は、他方の鎖よりも長く、この２つの鎖は、短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）１９ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’端における２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２１ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’端における２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。
【００３６】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、表１若しくは表２に列記されるアンチセンス配列又はこれらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド１〜１９の配列のいずれか１つの配列を含み得る。表１及び６に列記されるアンチセンス配列の各々は、２ヌクレオチドのオーバーハング配列に加えて、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ配列と相補的な１９個の連続したヌクレオチド（５’末端から数えて最初の１９個のヌクレオチド）の配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１〜１６６又は１６７〜３３２のいずれか１つのヌクレオチド１〜１９の配列を含む。
【００３７】
修飾ヌクレオチド
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環、又はホスフェート基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。二重鎖ＲＮＡ分子の一方又は両方の鎖への修飾ヌクレオチドの組み込みは、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低下させることにより、ＲＮＡ分子のインビボ安定性を向上させることができる。標的遺伝子の発現を低減するためのＲＮＡｉコンストラクトの効力を修飾ヌクレオチドの組み込みによって増強することもできる。
【００３８】
ある種の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖修飾は、ペントース環の２’及び／又は５’位における修飾並びに二環性糖修飾を含むことができる。２’−修飾ヌクレオチドは、Ｈ又はＯＨ以外の置換基を２’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような２’修飾としては、２’−Ｏ−アルキル（例えば、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０又はＯ−Ｃ１〜Ｃ１０置換アルキル）、２’−Ｏ−アリル（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、２’−Ｏ−メトキシエチル（Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’−ＯＣＦ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−アミノ（例えば、ＮＨ２）、２’−Ｏ−エチルアミン、及び２’−アジドが挙げられるが、これらに限定されない。ペントース環の５’位置における修飾としては、５’−メチル（Ｒ又はＳ）、５’−ビニル、及び５’−メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「二環性糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の２つの原子を接続して、二環性糖構造をもたらす第２の環を形成する。いくつかの実施形態では、二環性糖修飾は、ペントース環の４’及び２’炭素間の架橋を含む。二環性糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書では二環性核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環性糖修飾としては、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）二環性核酸（ＢＮＡ）；β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ（ロックド核酸又はＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ）又はｃＥｔとも称される）；メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ；メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ＭＯＥ）又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７−９５４，２０１２に記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、二環性核酸（ＢＮＡ）、又はこれらの組み合わせを含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含む。
【００４１】
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、センス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。ある種の他の実施形態では、センス鎖中の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせであり得る。
【００４２】
いくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖におけるアデノシンヌクレオチドの前にある全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、いずれかの鎖で配列５’−ＣＡ−３’又は５’−ＵＡ−３’が現れる場合、シチジン及びウリジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。ある種の実施形態では、センス鎖中の全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド）であり、アンチセンス鎖において存在する全ての配列５’−ＣＡ−３’又は５’−ＵＡ−３’の５’ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド）である。他の実施形態では、二重鎖領域における全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。このような実施形態では、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである。
【００４３】
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、いくつかの実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである。
【００４４】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド間結合も含み得る。本明細書で使用する場合、用語「修飾されたヌクレオチド間結合」は、元から存在する３’−５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間の結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート（例えば、メチルホスホナート、３’−アルキレンホスホナート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば、３’−アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、２’−５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であり、したがって、修飾されたヌクレオシド間結合と称される場合もある。このようなリン非含有結合は、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；スルフィド、スルホキシド及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホナート及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書に記載されているものなど、ペプチド核酸又はＰＮＡを生成するためのペプチドに基づく結合（例えば、アミノエチルグリシン）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおいて使用され得る他の好適な修飾されたヌクレオチド間及びヌクレオシド間結合は、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、同第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７−９５４，２０１２に記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４５】
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖において存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに他の実施形態では、両方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端又は３’末端及び５’末端の両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に約１個〜約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に約１個〜約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つアンチセンス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む（すなわちアンチセンス鎖の３’末端の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む（すなわちアンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、並びにセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。一方又は両方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかにおいて、鎖内の残りのヌクレオチド間結合は、元から存在する３’−５’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。
【００４６】
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング中の不対ヌクレオチドの２つ以上は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合され得る。ある種の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。他の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。さらに他の実施形態では、任意のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。
【００４７】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方又は両方の鎖に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書では「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成的な修飾又は天然に存在する修飾であってもよく、且つユニバーサル塩基、５ーメチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２−アミノアデニン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル並びに他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオ、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含むことができるが、これらに限定されない。
【００４８】
いくつかの実施形態では、修飾塩基は、ユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡ及びＤＮＡの天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は、当業者に知られており、イノシン、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド、並びに３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる他の好適な修飾塩基は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１０：２９７−３１０，２０００及びＰｅａｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｒｎ．，Ｖｏｌ．７６：７２９５−７３００，２０１１に記載されているものを含み、これらの文献の両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルは、上述の修飾核酸塩基などの他の核酸塩基により、そのような置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変えることなく置換され得ることを当業者は十分に認識している。
【００５０】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の５’末端は、ホスフェート部分を含む。本明細書で使用する場合、用語「ホスフェート部分」は、非修飾ホスフェート（−Ｏ−Ｐ＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨ）及び修飾ホスフェートを含む末端ホスフェート基を指す。修飾ホスフェートは、Ｏ及びＯＨ基の１つ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）又はアルキルで置換されており、ＲがＨ、アミノ保護基又は非置換若しくは置換アルキルであるホスフェートを含む。例示的なホスフェート部分は、５’−モノホスフェート；５’ジホスフェート；５’−トリホスフェート；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化若しくは非メチル化）；５’−アデノシンキャップ又は任意の他の修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造；５’−モノチオホスフェート（ホスホロチオエート）；５’−モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート）；５’−α−チオトリホスフェート；５’−γ−チオトリホスフェート；５’−ホスホロアミダート；５’−ビニルホスフェート；５’−アルキルホスホナート（例えば、アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）；及び５’−アルキルエーテルホスホナート（例えば、アルキルエーテル＝メトキシメチル、エトキシメチルなど）を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載の２つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖への修飾及び核酸塩基への修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’−フルオロ又は２’−メチル）を含んでもよく、修飾塩基（例えば、５−メチルシトシン又はプソイドウラシル）を含んでもよい。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれたとき、修飾されたヌクレオチド間又はヌクレオシド間結合を生成するであろう、５’ホスフェートへの修飾と組み合わされた糖修飾を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−フルオロ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾又は二環性糖修飾及び５’ホスホロチオエート基などの糖修飾を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方又は両方の鎖は、２’修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の鎖は、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド間結合を含む例示的なＲＮＡｉコンストラクトを表２に示す。
【００５２】
ＲＮＡｉコンストラクトの機能
好ましくは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、細胞内、特に肝臓細胞内でのＰＮＰＬＡ３の発現を低減又は阻害する。したがって、一実施形態では、本発明は、細胞を本明細書に記載の任意のＲＮＡｉコンストラクトと接触させることにより、細胞内でのＰＮＰＬＡ３発現を低減する方法を提供する。細胞は、インビトロ又はインビボにあり得る。ＰＮＰＬＡ３発現は、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ、ＰＮＰＬＡ３のタンパク質、又はＰＮＰＬＡ３発現と関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞又は動物におけるＰＮＰＬＡ３発現の低減は、ＲＮＡｉコンストラクトで処理されていないか又は対照ＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞又は動物におけるＰＮＰＬＡ３発現と比較して決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝臓細胞において発現しないＲＮＡ分子又はナンセンス若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを対象とするＲＮＡｉ薬剤）又はコンストラクトなしで処理された肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）において処理された細胞から測定されたＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡレベルと、（ｂ）における対照細胞から測定されたＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡレベルとを比較することによって評価される。比較前に、処理された細胞及び対照細胞におけるＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡレベルは、対照遺伝子（例えば、１８Ｓ  リボソームＲＮＡ）に対するＲＮＡレベルに正規化され得る。ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲなどを含む様々な方法によって測定することができる。
【００５３】
他の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３のタンパク質の量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝臓細胞において発現しないＲＮＡ分子又はナンセンス若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを対象とするＲＮＡｉ薬剤）又はコンストラクトなしで処理された肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３のタンパク質の量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）において処理された細胞から測定されたＰＮＰＬＡ３のタンパク質レベルと、（ｂ）における対照細胞から測定されたＰＮＰＬＡ３のタンパク質レベルとを比較することによって評価される。ＰＮＰＬＡ３のタンパク質レベルを測定する方法は、当業者に知られており、ウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、及びフローサイトメトリーを含む。ＰＮＰＬＡ３のタンパク質発現を評価するための例示的なイムノアッセイに基づく方法を実施例２に記載する。実施例３は、ＲＮＡ  ＦＩＳＨを使用してＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡを測定するための例示的な方法を記載する。ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ又はタンパク質を測定することができる任意の方法を使用して、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効性を評価することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現レベルを評価するための方法は、自然にＰＮＰＬＡ３を発現する細胞（例えば、肝臓細胞）又はＰＮＰＬＡ３を発現するように操作された細胞においてインビトロで実施される。ある種の実施形態では、これらの方法は、肝臓細胞においてインビトロで実施される。好適な肝臓細胞は、初代肝細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、又は齧歯類の肝細胞）、ＨｅｐＡＤ３８細胞、ＨｕＨ−６細胞、ＨｕＨ−７細胞、ＨｕＨ−５−２細胞、ＢＮＬＣＬ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、又はＨｅｐＧ２細胞を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、肝臓細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞である。別の実施形態では、肝臓細胞は、ＨｅｐＧ２細胞である。
【００５５】
他の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現レベルを評価するための方法は、インビボで実施される。ＲＮＡｉコンストラクト及び任意の対照ＲＮＡｉコンストラクトを動物（例えば、齧歯類又は非ヒト霊長類）に投与することができ、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ又はタンパク質レベルを、処理後の動物から採取した肝臓組織において評価することができる。代わりに又は加えて、ＰＮＰＬＡ３発現と関連するバイオマーカー又は機能的表現型を、処理された動物において評価することができる。
【００５６】
ある種の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％低減する。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％低減する。他の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上低減する。ＰＮＰＬＡ３発現の低減パーセントは、本明細書に記載の方法のいずれか及び当技術分野で知られる他の方法によって測定することができる。例えば、ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐ３Ｂ細胞（野生型ＰＮＰＬＡ３を含有する）において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも４５％を阻害する。関連する実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐ３Ｂ細胞において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％を阻害する。他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐ３Ｂ細胞において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、又は少なくとも９８％を阻害する。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐＧ２細胞（ＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８二重マイナーアレルを含有する）において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも４５％を阻害する。関連する実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐＧ２細胞において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％を阻害する。他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのＨｅｐＧ２細胞において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、又は少なくとも９８％を阻害する。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのヒトＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８Ｉ又はＩ１４８Ｍを発現するＣＨＯトランスフェクト細胞において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも４５％を阻害する。関連する実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのヒトＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８Ｉ又はＩ１４８Ｍを発現するＣＨＯトランスフェクト細胞において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％を阻害する。他の実施形態で��、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロのヒトＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８Ｉ又はＩ１４８Ｍを発現するＣＨＯトランスフェクト細胞において５ｎＭでＰＮＰＬＡ３発現の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、又は少なくとも９８％を阻害する。ＰＮＰＬＡ３の低減は、実施例２及び３において記載されるとおり、ＲＮＡ  ＦＩＳＨ又はドロップレットデジタルＰＣＲを含む様々な手法を使用して測定され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＩＣ５０値を計算して、肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現の阻害に対する本発明のＲＮＡｉコンストラクトの効力を評価する。「ＩＣ５０値」は、生物学的又は生化学的機能の５０％阻害を達成するのに要求される用量／濃度である。任意の特定の物質又はアンタゴニストのＩＣ５０値を、用量反応曲線を作成すること、及び任意のアッセイにおける発現レベル又は機能活性に対する異なる濃度の物質又はアンタゴニストの効果を試験することによって決定することができる。最大の生物学的応答又は本来の発現レベルの半分を阻害するのに必要とされる濃度を決定することにより、ＩＣ５０値を所与のアンタゴニスト又は物質について計算することができる。したがって、実施例に記載のイムノアッセイ又はＲＮＡ  ＦＩＳＨアッセイ又はドロップレットデジタルＰＣＲアッセイなどの任意のアッセイにおいて、肝臓細胞における本来のＰＮＰＬＡ３の発現レベル（例えば、対照肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現レベル）の半分を阻害するのに必要とされるＲＮＡｉコンストラクトの濃度を決定することにより、任意のＲＮＡｉコンストラクトについてＩＣ５０値を計算することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約２０ｎＭ未満のＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞）におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害し得る。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．００１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約５ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約５ｎＭ、又は約０．１ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害する。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、約１ｎＭ〜約１０ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞）におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害する。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約２０ｎＭ未満のＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害し得る。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．００１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約５ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約５ｎＭ、又は約０．１ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害する。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、約１ｎＭ〜約１０ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害する。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約２０ｎＭ未満のＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、ヒトＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８Ｉ又はＩ１４８Ｍを発現するＣＨＯトランスフェクト細胞）におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害し得る。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．００１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約５ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約５ｎＭ、又は約０．１ｎＭ〜約１ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害する。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、約１ｎＭ〜約１０ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、ヒトＰＮＰＬＡ��  Ｉ１４８Ｉ又はＩ１４８Ｍを発現するＣＨＯトランスフェクト細胞）におけるＰＮＰＬＡ３発現を阻害する。
【００５８】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、当技術分野で知られる手法、例えば従来の核酸固相合成を使用して容易に作製することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準のヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えば、ホスホラミダイト）を利用する好適な核酸合成装置上で構築することができる。自動核酸合成装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅ合成装置、及びＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置を含む、いくつかのベンダーによって市販されている。
【００５９】
リボヌクレオシドの５’位で酸解離性ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）とともに２’シリル保護基を使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、大規模、中規模又は小規模で任意の自動又は手動合成装置において行うことができる。合成は、複数のウェルプレート、カラム、又はスライドガラスにおいて実行され得る。
【００６０】
２’−Ｏ−シリル基は、フッ化物イオンへの曝露を介して除去することができ、フッ化物イオンは、フッ化物イオンの任意の供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム又は有機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを含むことができる。クラウンエーテル触媒は、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用することができる。好ましいフッ化物イオン供給源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミンヒドロフルオライド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミドにおいてトリエチルアミンと水性ＨＦとを組み合わせる）である。
【００６１】
亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに対して使用するための保護基の選択により、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルのメチル保護は、フッ化物イオンに対する結合を安定化し、プロセス収率を向上させることができる。
【００６２】
リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有するため、ＲＮＡにおける反応性の２’位を、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基、例えば酸処理に対して安定であるもので保護することが望ましい場合がある。シリル保護基は、この条件を満たし、最小のＲＮＡ分解をもたらし得る最終のフッ化物脱保護ステップにおいて容易に除去することができる。
【００６３】
テトラゾール触媒は、標準的なホスホラミダイトカップリング反応において使用することができる。好ましい触媒は、例えば、テトラゾール、Ｓ−エチル−テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、ｐ−ニトロフェニルテトラゾール（ｐｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｅ）を含む。
【００６４】
当業者によって理解され得るように、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを合成するさらなる方法は、当業者に明らかである。加えて、様々な合成ステップを代替の順番又は順序で実施して、所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの合成において有用な他の合成化学転換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための）及び保護基の手法（保護及び脱保護）は、当技術分野で知られており、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；並びにＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにそれらの後続版に記載のものなどを含む。ＲＮＡｉ薬剤のカスタム合成もまた、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ  ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むいくつかの民間のベンダーから入手可能である。
【００６５】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物又は分子と直接的又は間接的に相互作用することができる任意の化合物又は分子を指す。別の化合物又は分子とリガンドとの相互作用は、生物学的応答を誘発し得るか（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体媒介性のエンドサイトーシスを誘導する）、又はまさに物理的会合であり得る。リガンドは、結合する二重鎖ＲＮＡ分子の１つ以上の特性、例えばＲＮＡ分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞内取り込み、電荷及び／又はクリアランス特性を改変することができる。
【００６６】
リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えば、コール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質、又は抗体若しくはその結合断片（例えば、肝臓などの特定の細胞型に対するＲＮＡｉコンストラクトを標的化する抗体若しくは結合断片）を含み得る。リガンドの他の例は、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばアダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビスＯ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、０３−（オレオイル）リトコール酸、０３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ポリアミノ酸及びポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）を含む。
【００６７】
ある種の実施形態では、リガンドは、エンドソーム不安定化特性を有する。エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム不安定化リガンドは、ｐＨ依存性膜活性及び膜融合性を示すポリカチオンペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態では、エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型コンフォメーションをとる。「活性型」コンフォメーションは、エンドソーム不安定化リガンドが、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。例示的なエンドソーム不安定化リガンドは、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６：２９６４−２９７２，１９８７）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｒｎ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８：１５８１−１５８６，１９９６）、及びそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１５５９：５６−６８，２００２）を含む。一実施形態では、エンドソーム不安定化構成要素は、ｐＨの変化に応答して電荷又はプロトン化に変化を起こすことになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム不安定化構成要素は、直鎖状又は分枝状であり得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、それらの非コンジュゲート型の対応物よりも活性であると報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３−２２８，２００２）。核酸分子へのコンジュゲーションのためのコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；同第７，７４５，６０８号明細書；及び同第７，８３３，９９２号明細書にも記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リガンドは、葉酸部分を含む。葉酸部分とコンジュゲートしたポリヌクレオチドは、受容体媒介性のエンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ得る。このような葉酸−ポリヌクレオチドコンジュゲートは、米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
ＰＮＰＬＡ３が肝臓細胞（例えば、肝細胞）において発現されることを考慮すると、ある種の実施形態では、それらの肝臓細胞にＲＮＡｉコンストラクトを特異的に送達することが望ましい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓細胞の表面に発現されるタンパク質と結合又は相互作用するリガンドを採用することにより、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、ある種の実施形態では、リガンドは、肝細胞で発現される受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））含み得る。
【００７０】
ある種の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、各炭素原子に結合される酸素、窒素又は硫黄原子を伴う少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分岐状又は環状であり得る）を有する１つ以上の単糖単位で構成される化合物を指す。炭水化物は、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及び約４、５、６、７、８又は９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）、並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖類ガムなどの多糖を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース、又はヘプトースから選択される単糖並びにこのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、及びＮ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、又はフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン、又はマンノサミンから選択され得る。ある種の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン、又はグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミン、又はＮ−アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ−アセチル−ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース、及びＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、肝臓細胞において化合物を標的化するのに特に有効である。例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ａｎｄ  Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６−１３９，２０１５を参照されたい。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるＧａｌＮＡｃ又はガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；同第８，１０６，０２２号明細書；及び同第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号明細書；並びに国際公開第２０１３１６６１５５号パンフレットに記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７２】
ある種の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書で使用する場合、「多価炭水化物部分」は、独立して他の分子と結合又は相互作用することができる２つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２つ以上の異なる分子又は同じ分子の２つ以上の異なる部位に結合することができる炭水化物で構成される２つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を意味する。例えば、炭水化物部分に関する用語「一価」、「二価」、「三価」、及び「四価」は、それぞれ１、２、３、及び４個の結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ−アセチル−ガラクトサミン部分、多価Ｎ−アセチル−グルコサミン部分、多価マンノース部分、又は多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価Ｎ−アセチル−ガラクトサミン部分を含む。これら及び他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価、又は四価である。このような実施形態では、多価炭水化物部分は、二分岐又は三分岐であり得る。特定の一実施形態では、多価Ｎ−アセチル−ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態では、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトへの組み込みのための例示的な三価又は四価のＧａｌＮＡｃ含有リガンドは、以下に詳述される。
【００７３】
リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのＲＮＡ分子に直接的又は間接的に結合又はコンジュゲートされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に直接結合される。他の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合的に結合される。リガンドは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド（例えば、センス鎖若しくはアンチセンス鎖）の核酸塩基、糖部分又はヌクレオチド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、環内及び環外の原子を含む任意の位置で起こり得る。ある種の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、又は８位がリガンドに結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合も任意の位置で起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、及び６位がリガンドに結合され得る。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合は、任意の炭素原子で起こり得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子は、２’、３’、及び５’の炭素原子を含む。１’位も塩基性残基などにおいてリガンドに結合され得る。ヌクレオチド間結合もリガンドの結合を促進し得る。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど）について、リガンドは、リン原子又はリン原子に結合したＯ、Ｎ若しくはＳ原子に直接結合され得る。アミン又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）について、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合され得る。
【００７４】
ある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’又は５’末端に結合され得る。ある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合的に結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合的に結合される。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。このようなある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位で結合される。代替的な実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端近傍であるが、１つ以上の末端ヌクレオチドの前（すなわち１、２、３、又は４個の末端ヌクレオチドの前）に結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。
【００７５】
ある種の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合的に結合する原子又は原子の基である。リンカーは、約１〜約３０の原子長、約２〜約２８の原子長、約３〜約２６の原子長、約４〜約２４の原子長、約６〜約２０の原子長、約７〜約２０の原子長、約８〜約２０の原子長、約８〜約１８の原子長、約１０〜約１８の原子長、及び約１２〜約１８の原子長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、通常、２個の官能基を有するアルキル部分を含む二官能性の結合部分を含み得る。官能基の一方が選択されて目的の化合物（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖）に結合し、さらに他方が選択されて、本明細書に記載のようなリガンドなどの任意の選択された基に基本的に結合する。ある種の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール又はアミノ酸単位などの繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分において通常採用される官能基の例は、求核性基と反応するための求電子剤及び求電子性基と反応するための求核剤を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二官能性結合部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重結合又は三重結合）などを含む。
【００７６】
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するために使用され得るリンカーは、ピロリジン、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、６−アミノヘキサン酸、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル又は置換若しくは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルを含むが、これらに限定されない。このようなリンカーのための好ましい置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含むが、これらに限定されない。
【００７７】
ある種の実施形態では、リンカーは、切断可能である。切断可能なリンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞内への進入後に切断されて、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出するものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、標的細胞中又は第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下において、対象の血液中又は第２の参照条件（例えば、血液若しくは血清に見出される条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下よりも少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍以上又は少なくとも１００倍速く切断される。
【００７８】
切断可能なリンカーは、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部において優勢であるか又は高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解性薬剤の例は、例えば、細胞内に存在して還元によって酸化還元切断可能なリンカーを分解することができる、メルカプタンなどの酸化酵素若しくは還元酵素又は還元性薬剤を含む、特定の基質のために選択されるか又は基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を作ることができる薬剤、例えば５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸として作用することにより酸切断可能なリンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）及びホスファターゼを含む。
【００７９】
切断可能なリンカーは、ｐＨに対して感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、平均的な細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０のさらにより酸性であるｐＨを有する。一部のリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な基を有し、それにより細胞内部又は細胞の所望の区画内にリガンドからＲＮＡ分子を放出することになる。
【００８０】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存する場合がある。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してＲＮＡ分子に結合され得る。肝臓細胞は、エステラーゼに富んでおり、したがって、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型においてよりも肝臓細胞において効率的に切断されることになる。エステラーゼに富む他の種類の細胞としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。ペプチド結合を含有するリンカーは、肝臓細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合に使用され得る。
【００８１】
一般に、切断可能なリンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤（又は条件）の能力を試験することによって評価することができる。血液中又は他の非標的組織と接触する場合の切断に抵抗する能力に関しても切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。したがって、標的細胞における切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織又は生体液、例えば血液又は血清における切断を示すように選択される第２の条件との間で切断に対する相対的感受性を決定することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器若しくは組織培養又は動物全体において実行することができる。無細胞又は培養条件において初期評価を行い、動物全体におけるさらなる評価によって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）において少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍、又は１００倍速く切断される。
【００８２】
他の実施形態では、酸化還元切断可能なリンカーが利用される。酸化還元切断可能なリンカーは、還元又は酸化に際して切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能なリンカー候補が、好適な「還元的に切断可能なリンカー」であるかどうか、又は例えば特定のＲＮＡｉコンストラクト及び特定のリガンドとともに使用するのに好適であるかどうかを判定するために、本明細書に記載の１つ以上の方法を使用することができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は例えば標的細胞などの細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野で知られる他の還元剤とともにインキュベーションすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液又は血清条件を模倣するように選択される条件下でも評価することができる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中において最大で１０％切断される。他の実施形態では、有用なリンカー候補は、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）において少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍、又は１００倍速く分解される。
【００８３】
さらに他の実施形態では、ホスフェート系の切断可能なリンカーは、ホスフェート基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でホスフェート基を加水分解する薬剤の一例は、細胞内におけるホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の切断可能な基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。特定の実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−ＳＰ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−を含む。別の特定の実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
【００８４】
他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境中において、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内において、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラは、酸切断可能な基のための切断環境をもたらし得る。酸切断可能な連結基の例は、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルを含むが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素（アルコキシ基）に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基、又はジメチル、ペンチル若しくはｔ−ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
【００８５】
他の実施形態では、リンカーは、細胞中のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断されるエステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例は、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルを含むが、これらに限定されない。エステル切断可能な基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
【００８６】
さらなる実施形態では、リンカーは、細胞中のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断されるペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
【００８７】
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するのに好適な他の種類のリンカーが当技術分野で知られており、米国特許第７，７２３，５０９号明細書；同第８，０１７，７６２号明細書；同第８，８２８，９５６号明細書；同第８，８７７，９１７号明細書；及び同第９，１８１，５５１号明細書に記載されるリンカーを含むことができ、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８８】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば多価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡｉコンストラクトの細胞内発現をコードし、且つ制御するベクターを投与することにより、目的の細胞又は組織に送達され得る。「ベクター」（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。多数のベクターが当技術分野で知られており、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、これらに限定されない。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。ベクターは、生細胞内で複製され得るか又は合成的に作製され得る。
【００９０】
一般に、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを発現するためのベクターは、ＲＮＡｉコンストラクトをコードする配列に作動可能に連結された１つ以上のプロモーターを含むことになる。本明細書で使用する場合、語句「作動可能に連結」又は「転写制御下」は、プロモーターが適切な位置及びポリヌクレオチド配列に対して適切な向きにあり、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチド配列の発現を制御することを意味する。「プロモーター」は、細胞の合成装置によって認識されるか又は合成装置に導入され、特定の遺伝子配列の転写を開始するのに必要とされる配列を指す。好適なプロモーターは、ＲＮＡ  ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ＨＩ又はＵ６  ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ、及びウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びラウス肉腫ウイルス長い末端反復配列）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＨＩ又はＵ６ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩプロモーターが好ましい。そのプロモーターは、組織特異的又は誘導性プロモーターであり得る。特に興味深いのは、ヒトα１−アンチトリプシン遺伝子、アルブミン遺伝子、ヘモペキシン遺伝子、及び肝性リパーゼ遺伝子由来のプロモーター配列などの肝臓特異的なプロモーターである。誘導性プロモーターは、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、及びイソプロピル−ＰＤ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって調節されるプロモーターを含む。
【００９１】
ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含むいくつかの実施形態では、２つの別々の鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）は、単一のベクター又は２つの別々のベクターから発現され得る。例えば、一実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第１のベクターのプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第２のベクターのプロモーターに作動可能に連結される。このような実施形態では、第１及び第２のベクターは、例えば、感染又はトランスフェクションによって標的細胞に同時に導入され、その結果、センス鎖及びアンチセンス鎖が転写されると、細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ分子を形成することになる。別の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のベクター中に配置される２つの別々のプロモーターから転写される。いくつかのこのような実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結され、第１及び第２のプロモーターは、単一のベクター中に配置される。一実施形態では、ベクターは、ｓｉＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結される第１のプロモーター及び逆方向の同じ配列に作動可能に連結される第２のプロモーターを含み、その結果、第１のプロモーターからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の合成をもたらし、第２のプロモーターからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の合成をもたらす。
【００９２】
ＲＮＡｉコンストラクトがｓｈＲＮＡを含む他の実施形態では、単一の少なくとも部分的に自己相補的ＲＮＡ分子をコードする配列は、単一の転写物を生成するプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、リンカーポリヌクレオチド配列によって結合される逆方向反復を含み、転写後にｓｈＲＮＡのステム及びループ構造を生成する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトをコードするベクターは、ウイルスベクターである。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを発現するのに好適な様々なウイルスベクター系は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス）、アデノ随伴ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ４０ベクター；ポリオーマウイルスベクター；パピローマウイルスベクター；ピコルナウイルスベクター；及びポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス）を含むが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。
【００９４】
本発明における使用に好適な様々なベクター、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子をコードする核酸配列をベクターに挿入する方法及びベクターを目的の細胞に送達する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．２：３０１−３１０，１９９５；Ｅｇｌｉｔｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．６：６０８−６１４，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ，ＨｕｍＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．１：５−１４，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９２：２５−３０，１９９８；Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  Ｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．３３：４０１−４０６，２００３；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９６：５５０−５５３，２００２；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２：２４３−２４７，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５００−５０５，２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：４９７−５００，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ，Ｖｏｌ．１６：９４８−９５８，２００２；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５０５−５０８，２００２；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：５５１５−５５２０，２００２；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：６０４７−６０５２，２００２を参照されたい（これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９５】
本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物及び製剤も含む。このような組成物及び製剤は、必要とする対象においてＰＮＰＬＡ３の発現を低減するのに有用である。臨床上の用途を考える場合、医薬組成物及び製剤は、目的の用途に適切な形態で作製されることになる。一般に、これは、パイロジェン、及びヒト又は動物に有害になる可能性のある他の不純物を本質的に含まない組成物を作製することを必然的に伴うことになる。
【００９６】
「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という語句は、動物又はヒトに投与される場合に、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤」は、ヒトへの投与に好適な薬剤などの薬剤の製剤化における使用に許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体又は薬剤が本発明のＲＮＡｉコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分は、それらが組成物のベクター又はＲＮＡｉコンストラクトを不活性化しないという条件で組成物に組み込むこともできる。
【００９７】
医薬組成物の製剤の組成及び方法は、投与経路、治療される疾患若しくは障害の種類及び程度又は投与される用量を含むがこれらに限定されない、いくつかの条件に依存する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、目的の送達経路に基づいて製剤化される。例えば、ある種の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達のために製剤化される。非経口の送達形態は、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入を含む。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内送達のために製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含み得る。別の実施形態では、医薬組成物は、皮下送達のために製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、標的化リガンド（例えば、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃ含有リガンド）を含み得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを有効量含む。「有効量」は、有利な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象の肝細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現を低減するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、ＰＮＰＬＡ３発現を、例えばヒトヘテロ接合体における野生型ＰＮＰＬＡ３アレルの発現に相当するレベルまで部分的にのみ低減するのに十分な量であり得る。機能欠損型のＰＮＰＬＡ３バリアントアレルのヘテロ接合性ヒト保因者は、非保因者と比べて非ＨＤＬコレステロールの血清レベルが低く、且つ冠動脈疾患及び心筋梗塞のリスクが低いと報告された（Ｎｉｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３７４（２２）：２１３１−２１４１，２０１６）。したがって、理論に束縛されることなく、ＰＮＰＬＡ３発現の部分的な低減は、有利な血清非ＨＤＬコレステロールの低減並びに冠動脈疾患及び心筋梗塞のリスクの低減を実現するのに十分であり得ると考えられる。
【００９９】
本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの１回の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。有効量のＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物は、毎週、隔週、毎月、３ヶ月毎、又は半年毎に投与され得る。有効な投与量及び投与頻度であろうと考えられるものの正確な決定は、患者の大きさ、年齢及び全身状態、治療される障害の種類（例えば、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患、高コレステロール血症）、採用される特定のＲＮＡｉコンストラクト、並びに投与経路を含むいくつかの要因に基づき得る。本発明の任意の特定のＲＮＡｉコンストラクトについての有効用量及びインビボ半減期の推定値は、適切な動物モデルにおける従来の方法及び／又は試験を用いて確認することができる。
【０１００】
本発明の医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の一般的な経路を介するものであり得る。このような経路は、非経口（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内）、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮、及び舌下経路、又は肝臓組織への直接注射若しくは肝門脈を介する送達を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口で投与される。例えば、ある種の実施形態では、医薬組成物は、静脈内に投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下に投与される。
【０１０１】
水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースの系などのコロイド分散系は、本発明のＲＮＡｉコンストラクト又はそのようなコンストラクトをコードするベクターのための送達ビヒクルとして使用され得る。本発明の核酸を送達するのに好適な市販の脂肪乳剤としては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、及び他の同様の脂肪乳剤が挙げられる。インビボにおける送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リポソーム内に封入され得るか、又はそれと、特に、カチオン性リポソームと複合体を形成し得る。代わりに、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））並びにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））を含む。このようなコロイド分散系の調製及び使用は、当技術分野でよく知られている。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号明細書；米国特許第６，２１７，９００号明細書；米国特許第６，３８３，５１２号明細書；米国特許第５，７８３，５６５号明細書；米国特許第７，２０２，２２７号明細書；米国特許第６，３７９，９６５号明細書；米国特許第６，１２７，１７０号明細書；米国特許第５，８３７，５３３号明細書；米国特許第６，７４７，０１４号明細書；及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにおいても開示される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質製剤に完全に封入されて、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸−脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、用語「ＳＮＡＬＰ」は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸−脂質粒子を指す。本明細書で使用する場合、用語「ＳＰＬＰ」は、脂質小胞に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、且つ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身投与のために極めて有用である。ＳＰＬＰは、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載の封入された縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含む。核酸−脂質粒子は、通常、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、又は約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸−脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸−脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書；同第５，９８１，５０１号明細書；同第６，５３４，４８４号明細書；同第６，５８６，４１０号明細書；同第６，８１５，４３２号明細書；及び国際公開第９６／４０９６４号パンフレットにおいて開示される。
【０１０３】
注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液又は分散体及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されているべきである。適切な溶媒又は分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、好適なその混合物、及び植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤、抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によってもたらすことができる。
【０１０４】
注射用滅菌溶液は、活性化合物を適切な量で所望の任意の他の成分（例えば、上で列挙されるとおり）とともに溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散体は、塩基性分散媒体及び所望の他の成分、例えば上で列挙された成分を含有する滅菌ビヒクルに滅菌された様々な活性成分を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる真空乾燥及びフリーズドライの手法を含む。
【０１０５】
本発明の組成物は、一般に、中性又は塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する酸付加塩（遊離アミノ基によって形成される）を含む。遊離カルボキシル基によって形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄）又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。
【０１０６】
水溶液における非経口投与のために、例えば、溶液は、通常、適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば、十分な生理食塩水又はグルコースにより最初に等張にされる。このような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に使用され得る。好ましくは、特に本開示を考慮すれば、当業者に知られるような滅菌水性媒体が採用される。実例として、単回用量が等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解され、皮下注入液１０００ｍｌに添加されるか、又は提案された注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８及び１５７０−１５８０を参照されたい）。ヒトへの投与に関して、調製物は、ＦＤＡ標準が要件とする無菌性、発熱性、全般的安全性及び純度標準を満たすべきである。ある種の実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水及び本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含むか又はそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むか又はそれらからなる。さらに他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか又はそれらからなる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスでパッケージ化されるか又はその中に保存される。注射用製剤のためのデバイスは、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動注入装置、注射ポンプ、装着型注射器、及び注射ペンを含むが、これらに限定されない。エアロゾル化又は粉末製剤のためのデバイスは、インヘラー、吸入器、吸引器などを含むが、これらに限定されない。したがって、本発明は、本明細書に記載の障害の１つ以上を治療又は予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
【０１０８】
ＰＮＰＬＡ３発現を阻害するための方法
本発明はまた、細胞におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。方法は、細胞をＲＮＡｉ薬剤、例えば、二重鎖ＲＮＡｉ薬剤と、細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するのに有効な量で接触させることによって、細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害することを含む。ＲＮＡｉ薬剤、例えば、二重鎖ＲＮＡｉ薬剤と細胞の接触は、インビトロ又はインビボで行われ得る。細胞をインビボでＲＮＡｉ薬剤と接触させることは、対象、例えばヒト対象内の細胞又は細胞群をＲＮＡｉ薬剤と接触させることを含む。細胞を接触させるインビトロ及びインビボでの方法の組み合わせもまた、可能である。
【０１０９】
本発明は、ＰＮＰＬＡ３の発現の低減又は阻害を、それを必要とする対象において行う方法、及びＰＮＰＬＡ３発現若しくは活性と関連する状態、疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。「ＰＮＰＬＡ３発現と関連する状態、疾患又は障害」は、ＰＮＰＬＡ３の発現レベルが変化するか、又はＰＮＰＬＡ３の上昇した発現レベルがその状態、疾患又は障害の増大した発症リスクと関連する状態、疾患又は障害を指す。
【０１１０】
細胞の接触は、上記のとおり直接的又は間接的であり得る。さらに、細胞の接触は、本明細書で記載されるか又は当技術分野で知られるいずれかのリガンドを含む標的化リガンドを介して達成され得る。好ましい実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、又は目的の部位にＲＮＡｉ薬剤を誘導する任意の他のリガンドである。
【０１１１】
一実施形態では、細胞とＲＮＡｉの接触は、細胞への取り込み又は細胞への吸収を促進するか又は引き起こすことによって、「導入すること」又は「細胞にＲＮＡｉを送達すること」を含む。ＲＮＡｉの吸収又は取り込みは、補助なしの拡散性若しくは活性細胞性プロセスによって、又は補助剤若しくはデバイスによって起こすことができる。ＲＮＡｉの細胞への導入は、インビトロ及び／又はインビボであり得る。例えば、インビボでの導入のために、ＲＮＡｉを組織部位に注射してもよいし、全身投与してもよい。細胞へのインビトロでの導入としては、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの当技術分野で知られる方法が挙げられる。さらなる手法は、本明細書の下記に記載され、且つ／又は当技術分野で知られる。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、用語「阻害する」は、「低減する」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、及び他の類似用語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。
【０１１３】
語句「ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害する」は、任意のＰＮＰＬＡ３遺伝子（例えば、マウスＰＮＰＬＡ３遺伝子、ラットＰＮＰＬＡ３遺伝子、サルＰＮＰＬＡ３遺伝子、又はヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子など）及びＰＮＰＬＡ３遺伝子のバリアント又は変異体の発現の阻害を指すものとする。したがって、ＰＮＰＬＡ３遺伝子は、野生型ＰＮＰＬＡ３遺伝子、変異体ＰＮＰＬＡ３遺伝子（アミロイド沈着を引き起こす変異体ＰＮＰＬＡ３遺伝子など）、又は遺伝子操作細胞、細胞群、若しくは生物の文脈におけるトランスジェニックＰＮＰＬＡ３遺伝子であってもよい。
【０１１４】
「ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する」は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のあらゆるレベルの阻害、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を含む。ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、例えば、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡレベル、ＰＮＰＬＡ３タンパク質レベル、又はアミロイド沈着物の数若しくは程度などのＰＮＰＬＡ３遺伝子発現と関連する任意の変数のレベル、又はレベルの変化に基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象に由来する試料を含む、個々の細胞又は細胞群において評価され得る。
【０１１５】
阻害は、対照レベルと比較して、ＰＮＰＬＡ３発現に関連する１つ以上の変数の絶対又は相対レベルの減少によって評価され得る。対照レベルは、例えば、投与前のベースラインレベル、又は治療されていないか若しくは対照（例えば、緩衝剤のみの対照又は不活性薬剤対照）で治療された類似対象、細胞、若しくは試料から決定されるレベルなどの当技術分野で利用される任意のタイプの対照レベルであり得る。本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％阻害される。
【０１１６】
ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害は、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるが、同様に処理されていない第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した場合の、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が阻害されるように、ＰＮＰＬＡ３遺伝子が転写され、且つ処理された（例えば、細胞を本発明のＲＮＡｉ薬剤と接触させることにより、又は当該細胞が存在する、若しくは存在した対象に本発明のＲＮＡｉ薬剤を投与することにより）第１の細胞又は細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）により発現されるｍＲＮＡの量の減少によって明らかにされ得る。好ましい実施形態では、阻害は、以下の式：
【数１】
2021506238.tif 000002
を使用して、対照細胞中のｍＲＮＡのレベルのパーセンテージとして処理された細胞中のｍＲＮＡのレベルを表すことにより評価される。
【０１１７】
或いは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現、例えば、ＰＮＰＬＡ３タンパク質発現又はヘッジホッグ経路タンパク質活性に機能的に関連するパラメーターの低下に関して評価されてもよい。ＰＮＰＬＡ３遺伝子サイレンシングは、構成的に又はゲノム操作によりＰＮＰＬＡ３を発現する任意の細胞において、当技術分野で知られる任意のアッセイにより決定され得る。
【０１１８】
ＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現の阻害は、細胞又は細胞群により発現されるＰＮＰＬＡ３タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中で発現されるタンパク質のレベル）の低減によって明らかにされ得る。上に説明されるとおり、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処理された細胞又は細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞又は細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表され得る。
【０１１９】
ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害を評価するために使用され得る対照細胞又は細胞群としては、本発明のＲＮＡｉ薬剤とまだ接触していない細胞又は細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞又は細胞群は、ＲＮＡｉ薬剤による対象の治療の前に、個別の対象（例えば、ヒト又は動物対象）から得てもよい。
【０１２０】
細胞又は細胞群により発現されるＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡのレベル、又は循環しているＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で知られる任意の方法を用いて決定され得る。一実施形態では、試料中のＰＮＰＬＡ３の発現レベルは、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡなどの転写ポリヌクレオチド、又はその部分を検出することにより決定される。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用を含むＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ分析が挙げられる。循環しているＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４３５８４号明細書に記載される方法を用いて検出され得る。
【０１２１】
一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。用語「プローブ」は、本明細書で使用する場合、特定のＰＮＰＬＡ３に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成することができるか、又は適切な生物学的調製物から誘導することができる。プローブは、標識されるように特異的に設計されてもよい。プローブとして利用され得る分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
単離されたｍＲＮＡは、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用することができる。ｍＲＮＡレベルの１つの決定方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、例えば、アガロースゲル上で単離ｍＲＮＡを泳動させ、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、プローブは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、固体表面上に固定化し、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者は、既知のｍＲＮＡ検出法を、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡのレベルの決定に使用するために容易に適合させることができる。
【０１２３】
試料中のＰＮＰＬＡ３の発現のレベルを決定するための代替的な方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載の実験的な実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）又は任意の他の核酸増幅法による、例えば、試料中のｍＲＮＡの核酸増幅及び／又は逆転写酵素（ｃＤＮＡを調製するための）の工程の後、当業者によく知られる手法を使用する増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合、核酸分子の検出に有用である。本発明の具体的な態様では、ＰＮＰＬＡ３の発現のレベルは、定量蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）により決定される。ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されているものなど）、又はマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ若しくはファイバー（又は結合核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニターされ得る。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書及び同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＰＮＰＬＡ３の発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブの使用も含み得る。
【０１２４】
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡの発現のレベルは、分岐状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価される。これらの方法の使用は、本明細書に提示される実施例に記載及び例示される。
【０１２５】
ＰＮＰＬＡ３タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で知られる任意の方法を使用して決定され得る。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、液体又はゲル沈降素反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一元又は二元）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法の有効性は、四肢、顔、喉頭、上気道、腹部、躯幹、及び性器の浮腫状腫脹、前駆症；喉頭部浮腫；非掻痒性発疹；吐き気；嘔吐；又は腹痛の低減などのＰＮＰＬＡ３疾患の症状の低減を検出又はモニターすることにより、モニターすることができる。これらの症状は、当技術分野で知られる任意の方法を使用してインビトロ又はインビボで評価され得る。
【０１２７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤が対象内の特定の部位に送達されるように、ＲＮＡｉ薬剤は対象に投与される。ＰＮＰＬＡ３の発現の阻害は、対象内の特定の部位からの体液又は組織に由来する試料中のＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ又はＰＮＰＬＡ３タンパク質のレベル又はレベルの変化の測定を使用して評価され得る。好ましい実施形態では、その部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、及び膵臓からなる群から選択される。その部位は、前述の部位のいずれか１つからの細胞の小単位又は部分群であってもよい。その部位はまた、特定の型の受容体を発現する細胞を含んでもよい。
【０１２８】
ＰＮＰＬＡ３関連疾患を治療又は予防する方法
本発明は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患、障害、及び／若しくは状態を有する、又はＰＮＰＬＡ３関連疾患、障害、及び／若しくは障害を発症しやすい対象に、ＲＮＡｉ薬剤を含む組成物、又はＲＮＡｉ薬剤を含む医薬組成物、又は本発明のＲＮＡｉを含むベクターを投与することを含む、治療及び予防方法を提供する。ＰＮＰＬＡ３関連疾患の非限定的な例として、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内での脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、ＮＡＦＬＤである。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、ＮＡＳＨである。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。
【０１２９】
ある種の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む、ＰＮＰＬＡ３の発現の低減を、それを必要とする患者において行う方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「患者」は、ヒトを含む哺乳動物を指し、用語「対象」と互換的に使用することができる。好ましくは、患者の肝細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクトを受容していない患者のＰＮＰＬＡ３の発現レベルと比較してＲＮＡｉコンストラクトの投与後に低減される。
【０１３０】
本発明の方法は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現及び／又はＰＮＰＬＡ３タンパク質産生の低減から利益を受けることになる対象を治療するのに有用である。一態様では、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象におけるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子発現のレベルを低減する方法を提供する。別の態様では、本発明は、ＮＡＦＬＤを有する対象においてＰＮＰＬＡ３タンパク質のレベルを低減する方法を提供する。本発明はまた、ＮＡＦＬＤを有する対象におけるヘッジホッグ経路の活性のレベルを低減する方法も提供する。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、ＮＡＦＬＤを有する対象を治療する方法を提供する。一態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内での脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象を治療する方法を提供する。本発明の治療方法（及び使用）は、対象、例えば、ヒトに、治療有効量のＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化する本発明のＲＮＡｉ薬剤又はＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化する本発明のＲＮＡｉ薬剤若しくはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤を含む本発明のベクターを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０１３２】
一態様では、本発明は、例えば、高められたヘッジホッグシグナル伝達経路の存在、疲労、衰弱、減量、食欲不振、吐き気、腹痛、クモ状血管、皮膚及び眼の黄色化（黄疸）、かゆみ、水分蓄積及び脚の腫脹（浮腫）、腹部膨満（腹水）、及び精神錯乱など、ＮＡＦＬＤを有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。この方法は、治療有効量のＲＮＡｉ薬剤、例えば、本発明のｄｓＲＮＡ、医薬組成物、又はベクターを対象に投与することにより、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低減から利益を受けることになる障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防することを含む。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低減及び／又は阻害から利益を受けることになる対象を治療するための、治療有効量の本発明のＲＮＡｉ薬剤の使用を提供する。さらなる態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低減から利益を受けることになる障害、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象などの対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現及び／又はＰＮＰＬＡ３タンパク質産生の低減及び／又は阻害から利益を受けることになる対象を治療するための医薬の製造における、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化する本発明のＲＮＡｉ薬剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現及び／又はＰＮＰＬＡ３タンパク質産生の低減及び／又は阻害から利益を受けることになる障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための本発明のＲＮＡｉ、例えば、ｄｓＲＮＡの使用を提供する。
【０１３５】
さらなる態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患などのＰＮＰＬＡ３遺伝子発現及び／又はＰＮＰＬＡ３タンパク質産生の低減及び／又は阻害から利益を受けることになる障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための医薬の製造における本発明のＲＮＡｉ薬剤の使用を提供する。
【０１３６】
一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３を標的化するＲＮＡｉ薬剤は、ｄｓＲＮＡ薬剤が対象に投与されるとき、例えば、対象の細胞、組織、血液又は他の組織若しくは体液においてＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上低減されるように、ＰＮＰＬＡ３関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象に投与される。
【０１３７】
本発明の方法及び使用は、標的ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、又は約８０時間減少されるように、本明細書に記載の組成物を投与することを含む。一実施形態では、標的ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、長期間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、又は約４週間以上低減される。
【０１３８】
本発明の方法及び使用に従うｄｓＲＮＡの投与は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する患者におけるそのような疾患又は障害の重症度、徴候、症状、及び／又はマーカーの低減をもたらし得る。この文脈における「低減」は、このようなレベルの統計的に有意な低減を意味する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％であり得る。疾患の治療又は予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、疼痛の減少、生活の質、治療効果を維持するのに必要な医薬の用量、疾病マーカーのレベル又は治療されているか若しくは予防の標的となる所与の疾患に適した任意の他の測定可能パラメーターレベルを測定することによって評価することができる。このようなパラメーターのいずれか１つ、又はパラメーターの任意の組み合わせを測定することによって、治療又は予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＮＡＦＬＤの治療の有効性は、例えば、ＮＡＦＬＤ症状、肝臓脂肪レベル、又は下流遺伝子の発現の定期的なモニタリングによって評価され得る。最初の読み取りと後の読み取りの比較は、治療が有効かどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメーターのいずれか１つ、又はパラメーターの任意の組み合わせを測定することによって、治療又は予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＰＮＰＬＡ３を標的化するＲＮＡｉ又はその医薬組成物の投与と関連して、ＰＮＰＬＡ３関連疾患「に対して有効」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計学的に有意な割合の患者に、症状の改善、治癒、疾患の低減、延命、生活の質の改善、又はＮＡＦＬＤ及び／若しくはＰＮＰＬＡ３関連疾患並びに関連原因の治療に精通している医者によって、好ましいと一般に認められている他の効果などの有益な効果をもたらすことを示す。
【０１３９】
病状の１つ以上のパラメーターにおいて統計的に有意な改善がある場合、又はそうでない場合に予期されるであろう症状悪化又は発症の欠如によって、治療又は予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、有効な治療を意味し得る。所与のＲＮＡｉ薬物又はその薬物の製剤の有効性はまた、当技術分野で知られる所与の疾患のための実験動物モデルを使用して判定され得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカー又は症状の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。
【０１４０】
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ��ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡ、又は約５０ｍｇ／ｋｇ  ｄｓＲＮＡなどの、治療量のＲＮＡｉが投与され得る。一実施形態では、対象には、０．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０１４１】
ＲＮＡｉの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は他のコンパートメント中において、ＰＮＰＬＡ３タンパク質レベルの存在を少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上低減し得る。
【０１４２】
ＲＮＡｉの総用量の投与前に、５％の注入液などのより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応などの有害作用についてモニターしてもよい。別の実施例では、患者は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−アルファ又はＩＮＦ−アルファ）レベルの上昇などの望まれない免疫賦活性効果についてモニターされ得る。
【０１４３】
ＰＮＰＬＡ３発現に対する阻害効果によって、本発明による組成物又はそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高めることができる。
【０１４４】
本発明のＲＮＡｉは、「裸の」形態で投与されてもよく、この場合、修飾又は未修飾ＲＮＡｉ薬剤は、「遊離ＲＮＡｉ」として、水性又は好適な緩衝溶媒中に直接的に懸濁される。遊離ＲＮＡｉは、医薬組成物の非存在下で投与される。遊離ＲＮＡｉは、好適な緩衝溶液中にあってもよい。緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、若しくはリン酸塩、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉを含有する緩衝溶液のｐＨ及び重量オスモル濃度は、対象への投与に好適であるように調節され得る。
【０１４５】
或いは、本発明のＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。
【０１４６】
ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低減及び／又は阻害から利益を受けるとこになる対象は、本明細書に記載されるとおりの非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又はＰＮＰＬＡ３関連疾患若しくは障害を有するものである。
【０１４７】
ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低減及び／又は阻害から利益を受けることになる対象の治療は、治療的及び予防的治療を含む。
【０１４８】
本発明はさらに、例えば、これらの障害を治療するために現在利用されているものなどの、例えば既知の医薬品及び／又は既知の治療法などと他の医薬品及び／又は他の治療法を組み合わせて、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低減及び／又は阻害から利益を受けることになる対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象を治療するための方法、並びにＲＮＡｉ薬剤又はその医薬組成物の使用を提供する。
【０１４９】
例えば、ある種の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するＲＮＡｉは、本明細書の他の箇所で記載されるとおりの、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を治療するのに有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を受けることになる対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象を治療するのに好適な追加の治療薬及び治療法としては、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の異なる部分を標的化するＲＮＡｉ薬剤、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を治療するための治療剤、及び／若しくは処置、又は前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。
【０１５０】
ある種の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉ薬剤は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の異なる部分を標的化する第２のＲＮＡｉ薬剤と組み合わせて投与される。例えば、第１のＲＮＡｉ薬剤は、二重鎖領域を形成する第１のセンス鎖及び第１のアンチセンス鎖を含み、ここで、前記第１のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び第１のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドであり、前記第１のセンス鎖は、３’末端で結合したリガンドにコンジュゲートされ、このリガンドは、二価又は三価の分岐状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体であり；且つ第２のＲＮＡｉ薬剤は、二重鎖領域を形成する第２のセンス鎖及び第２のアンチセンス鎖を含み、ここで、第２のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾ヌクレオチドであり、第２のセンス鎖は、３’末端で結合したリガンドにコンジュゲートされ、このリガンドは、二価又は三価の分岐状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
【０１５１】
一実施形態では、第１及び第２のセンス鎖のヌクレオチドの全て並びに／又は第１及び第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含む。
【０１５２】
一実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、３’−末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体配座が制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシ修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホンスホン酸基を含むヌクレオチド、５’−リン酸塩を含むヌクレオチド、及び５’−リン酸塩模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
【０１５３】
ある種の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉ薬剤は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子とは異なる遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉ薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤は、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤と組み合わせて投与され得る。ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉ薬剤及びＰＮＰＬＡ３遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉ薬剤は、同じ医薬組成物の一部として投与され得る。或いは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉ薬剤及びＰＮＰＬＡ３遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉ薬剤は、異なる医薬組成物の一部として投与され得る。
【０１５４】
ＲＮＡｉ薬剤及び追加の治療剤並びに／又は治療は、同時に且つ／又は同じ配合において、例えば、非経口的に投与されてもよいし、或いは追加の治療剤が、別々の組成物の一部として若しくは別々に、且つ／又は当技術分野で知られるか若しくは本明細書に記載される別の方法により投与されてもよい。
【０１５５】
本発明はまた、細胞内のＰＮＰＬＡ３発現を低減及び／又は阻害するために、本発明のＲＮＡｉ薬剤及び／又は本発明のＲＮＡｉ薬剤を含有する組成物を使用する方法も提供する。他の態様では、本発明は、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子発現を低減及び／又は阻害するのに使用するための、本発明のＲＮＡｉ及び／又は本発明のＲＮＡｉを含む組成物を提供する。さらに他の態様では、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子発現を低減及び／又は阻害する医薬の製造のための、本発明のＲＮＡｉ及び／又は本発明のＲＮＡｉを含む組成物の使用が提供される。さらに他の態様では、本発明は、細胞内のＰＮＰＬＡ３タンパク質産生を低減及び／又は阻害するのに使用するための、本発明のＲＮＡｉ及び／又は本発明のＲＮＡｉを含む組成物を提供する。さらに他の態様では、細胞内のＰＮＰＬＡ３タンパク質産生を低減及び／又は阻害する医薬の製造のための、本発明のＲＮＡｉ及び／又は本発明のＲＮＡｉを含む組成物の使用が提供される。本方法及び使用は、細胞を本発明のＲＮＡｉ、例えば、ｄｓＲＮＡと接触させ、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり細胞を維持し、それにより細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するか又はＰＮＰＬＡ３タンパク質産生を阻害することを含む。
【０１５６】
遺伝子発現の低減は、当技術分野で知られる任意の方法によって評価され得る。例えば、ＰＮＰＬＡ３の発現の低減は、当業者にとって通例の方法、例えば、ノーザンブロッティング、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ発現レベルを決定することにより、ウエスタンブロッティング、免疫学的手法、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡなどの当業者にとって通例の方法を使用して、ＰＮＰＬＡ３のタンパク質レベルを決定することにより、及び／又はＰＮＰＬＡ３の生物活性を決定することにより決定され得る。
【０１５７】
本発明の方法及び使用において、細胞は、インビトロ又はインビボで接触されてもよく、すなわち、細胞は対象内にあってもよい。
【０１５８】
本発明の方法を使用する治療に好適な細胞は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、ＮＡＦＬＤを有する対象からの細胞、又はＰＮＰＬＡ３遺伝子若しくはＰＮＰＬＡ３遺伝子の部分を含む発現ベクターを含む細胞であり得る。本発明の方法及び使用で使用するのに好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞又はチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、又はバッファロー細胞など）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞）、又はクジラ細胞であってもよい。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
【０１５９】
ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現は、細胞中において、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％阻害され得る。
【０１６０】
ＰＮＰＬＡ３タンパク質産生は、細胞中において、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％阻害され得る。
【０１６１】
本発明のインビボでの方法及び使用は、ＲＮＡｉを含有する組成物を対象に投与することを含んでもよく、ＲＮＡｉは、治療されることになる哺乳動物のＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療されることになる生物がヒトである場合、組成物は、皮下、静脈内、経口、腹腔内、又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及び髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸を含む非経口経路、並びに局所（頬側及び舌下を含む）投与を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られる任意の手段によって投与され得る。ある種の実施形態では、組成物は、皮下又は静脈内注入若しくは注射によって投与される。一実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、投与は、デポ注射を介する。デポ注射は、長期間にわたり一貫してＲＮＡｉを放出し得る。したがって、デポ注射は、所望の効果、例えば、所望のＰＮＰＬＡ３の阻害、又は治療効果若しくは予防効果を得るのに必要な投与頻度を減少させ得る。デポ注射はまた、より一貫した血清濃度を提供し得る。デポ注射は、皮下注射又は筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態では、デポ注射は皮下注射である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、投与は、ポンプを介する。ポンプは、外部ポンプ又は外科的に植え込まれたポンプであってもよい。ある種の実施形態では、ポンプは、皮下に植え込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈、又は硬膜外注入のために使用してもよい。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ＲＮＡｉを対象に送達する外科的に植え込まれたポンプである。
【０１６４】
投与様式は、局所性又は全身性の治療が所望されるかどうかに基づいて、及び治療されることになる領域に基づいて選択され得る。投与経路及び部位は、標的化を向上させるように選択され得る。
【０１６５】
一態様では、本発明はまた、例えば、ヒトなどの哺乳動物中においてＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本発明はまた、哺乳動物中でＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するのに使用するためのＲＮＡｉ、例えば、哺乳動物の細胞内でＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡを含む組成物を提供する。別の態様では、本発明は、哺乳動物中でＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する医薬の製造における、ＲＮＡｉ、例えば、哺乳動物の細胞内でＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡの使用を提供する。
【０１６６】
方法及び使用は、ＲＮＡｉ、例えば、哺乳動物の細胞内でＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡを含む組成物を、哺乳動物、例えば、ヒトに投与すること、及びＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり哺乳動物を維持し、それにより哺乳動物内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害することを含む。
【０１６７】
遺伝子発現の低減は、当技術分野で知られる任意の方法、例えば、本明細書で記載されるｑＲＴ−ＰＣＲによって、ＲＮＡｉ投与対象の末梢血試料中で評価され得る。タンパク質産生の低減は、当技術分野で知られる任意の方法及び方法、例えば、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングによって評価され得る。一実施形態では、組織試料は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子及び／又はタンパク質発現の低減をモニターするための組織材料としての役割を果たす。別の実施形態では、血液試料は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子及び／又はタンパク質発現の低減をモニターするための組織材料としての役割を果たす。
【０１６８】
一実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤の投与後のインビボでの標的のＲＩＳＣ媒介性切断の検証は、５’−ＲＡＣＥ又は当技術分野で知られるプロトコルの改変（Ｌａｓｈａｍ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３８（３）ｐ−ｅ１９）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１１１−４）を実施することによって行われる。
【０１６９】
本明細書に開示される全てのリボ核酸配列は、配列中のウラシル塩基をチミン塩基で置換することにより、デオキシリボ核酸配列に変換することができることが理解される。同様に、本明細書に開示される全てのデオキシリボ核酸配列は、配列中のチミン塩基をウラシル塩基で置換することにより、リボ核酸配列に変換することができる。デオキシリボ核酸配列、リボ核酸配列、並びに本明細書に開示される全ての配列のデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの混合物を含有する配列が本発明に含まれる。
【０１７０】
加えて、本明細書に開示される任意の核酸配列は、化学修飾の任意の組み合わせによって修飾され得る。当業者は、特定の場合、修飾ポリヌクレオチドを記載するための「ＲＮＡ」又は「ＤＮＡ」のこのような指定が任意であることを容易に理解するであろう。例えば、リボース糖の２’−ＯＨ置換基及びチミン塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ分子（ＤＮＡの天然の２’−Ｈについて２’−ＯＨ）又は修飾塩基を有するＲＮＡ分子（ＲＮＡの天然のウラシルについてチミン（メチル化ウラシル））と記載され得る。
【０１７１】
したがって、配列表のものを含むがこれらに限定されない本明細書に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有するそのような核酸を含むが、これらに限定されない天然若しくは修飾ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの任意の組み合わせを含有する核酸を包含するように意図される。さらなる例として、限定するものではなく、配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するポリヌクレオチドは、修飾又は非修飾にかかわらず、ＲＮＡ塩基、例えば配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するもの、並びに「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」などのいくつかのＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基を有するもの、並びに「ＡＴｍｅＣＧＡＵＣＧ」などの他の修飾塩基を有するポリヌクレオチドを含むそのような化合物を含むが、これらに限定されないそのような配列を有する任意のポリヌクレオチドを包含し、配列中、ｍｅＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す。
【０１７２】
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１７３】
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる参考文献において提供される定義又は用語が、本明細書において提供される用語及び考察と異なる限り、本用語及び定義が優先される。
【０１７４】
均等物
前述の本明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳細に説明し、本発明者らによって考えられた最良の形態を記載するものである。しかし、前述の内容がいかに詳細に記載されていたとしても、本発明は、多くの方法で実施されてもよく、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って本発明が解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【０１７５】
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７６】
実施例１：修飾ＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の選択、設計及び合成
パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）を標的化する治療用ｓｉＲＮＡ分子のための最適な配列の同定及び選択は、ヒトＰＮＰＬＡ３転写物（ＮＭ＿０２５２２５．２）のバイオインフォマティクス分析を使用して確認された。表１は、治療特性を有すると同定された配列を示す。様々な配列全体にわたって、｛ＩＮＶＡＢ｝は反転脱塩基であり、｛ＩＮＶＤＡ｝は反転デオキシチミジンであり、ＧＮＡはグリコール核酸であり、ｄＴはデオキシチミジンであり、ｄＣはデオキシシトシンである。
【０１７７】
【表１】
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【０１７８】
【表２】
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【０１７９】
【表３】
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【０１８０】
【表４】
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【０１８１】
【表５】
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【０１８２】
【表６】
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【０１８３】
【表７】
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【０１８４】
【表８】
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【０１８５】
【表９】
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【０１８６】
【表１０】
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【０１８７】
【表１１】
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【０１８８】
【表１２】
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【０１８９】
【表１３】
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【０１９０】
【表１４】
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【０１９１】
【表１５】
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【０１９２】
【表１６】
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【０１９３】
【表１７】
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【０１９４】
【表１８】
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【０１９５】
【表１９】
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【０１９６】
【表２０】
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【０１９７】
【表２１】
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【０１９８】
【表２２】
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【０１９９】
【表２３】
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【０２００】
【表２４】
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【０２０１】
【表２５】
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【０２０２】
ＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ配列の効力及びインビボ安定性を向上させるために、化学修飾をＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子に組み込んだ。具体的には、リボース糖の２’−Ｏ−メチル及び２’−フルオロ修飾をＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ内の特定の位置に組み込んだ。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合もアンチセンス配列及び／又はセンス配列の末端に組み込んだ。下の表２は、修飾ＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡの各々のセンス配列及びアンチセンス配列における修飾を示す。表Ｘのヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列記される。Ａ、Ｕ、Ｇ、及びＣ＝対応するリボヌクレオチド；ｄＴ＝デオキシチミジン；ａ、ｕ、ｇ、及びｃ＝対応する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ、及びＣｆ＝対応する２’−デオキシ−２’−フルオロ（「２’−フルオロ」）リボヌクレオチドである。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって結合されることを示す。特に指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、３’−５’ホスホジエステル基によって結合される。表２のｓｉＲＮＡ化合物の各々は、両方の鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング又は一方若しくは両方の末端に平滑末端を有する１９塩基対の二重鎖領域を含む。ＧａｌＮＡｃ３Ｋ２ＡｈｘＣ６は、
【化１】
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である。
【０２０３】
【表２６】
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【０２０４】
【表２７】
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【０２０５】
【表２８】
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【０２０６】
【表２９】
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【０２０７】
【表３０】
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【０２０８】
【表３１】
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【０２０９】
【表３２】
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【０２１０】
【表３３】
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【０２１１】
【表３４】
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【０２１２】
【表３５】
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【０２１３】
【表３６】
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【０２１４】
【表３７】
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【０２１５】
【表３８】
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【０２１６】
【表３９】
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【０２１７】
【表４０】
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【０２１８】
【表４１】
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【０２１９】
【表４２】
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【０２２０】
【表４３】
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【０２２１】
【表４４】
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【０２２２】
【表４５】
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【０２２３】
実施例２：ＲＮＡ  ＦＩＳＨアッセイにおける選択したＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の有効性
ＰＮＰＬＡ３におけるｒｓ７３８４０９及び／又はｒｓ７３８４０８  ＳＮＰに及ぶｓｉＲＮＡを含む一連の十分に化学修飾されたｓｉＲＮＡが調製され、インビトロでｍＲＮＡノックダウンの効力及び選択性に関して試験された。各ｓｉＲＮＡ二重鎖は、２つの鎖であるセンス鎖又は「パッセンジャー」鎖及びアンチセンス鎖又は「ガイド」鎖からなった。鎖は２１又は２３ヌクレオチド長であり、１９の相補的塩基対を有する。いくつかの場合において、２塩基対の３’オーバーハングがある。ｓｉＲＮＡは、各ヌクレオチドのリボースにおける天然の２’−ＯＨの２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆ基のいずれかによる置換により調製された。任意選択により、一方又は両方の鎖でのホスホジエステルヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートで置き換えられて、エキソヌクレアーゼによる分解が低減された。
【０２２４】
ＰＮＰＬＡ３発現を低減する際のｓｉＲＮＡ分子の各々の有効性を、３８４ウェル形式のインビトロｓｉＲＮＡトランスフェクションアッセイ、それに続くリボ核酸分子を標的化する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＦＩＳＨ）アッセイを使用して評価して、ＩＣ５０及び最大活性値を決定した。このアッセイは、ヒトＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８Ｉを発現するヒト肝細胞癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６４）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上で実施された。ヒト肝細胞癌ＨｅｐＢ３は、１０％ウシ胎仔血清及び１％抗生物質／抗真菌剤を補充したＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ  ３０−２００３）中において３７℃及び５％ＣＯ２で維持された。ヒトＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８Ｉを発現するＣＨＯ細胞は、５０％ＣＤ−ＣＨＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０％Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯ５培地（Ｓｉｇｍａ）、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘＨＴ、１％抗生物質／抗真菌剤、及び１０μｇ／ｍＬピューロマイシンを含有する培地中において３７℃及び５％ＣＯ２で維持された。
【０２２５】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞アッセイのために、ＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ  ３０−２００３）中のｓｉＲＮＡ分子及びリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のトランスフェクション複合体を、製造業者の推奨に従って３８４ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）においてウェル当たり１０μｇで調製した。ＣＨＯヒト細胞アッセイのために、Ｆ１２Ｋ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中のｓｉＲＮＡ分子及びリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬のトランスフェクション複合体を、製造業者の推奨に従って３８４ウェルプレートにおいてウェル当たり１０μｇで調製した。細胞を抗生物質／抗真菌剤を含まない培地において６７，０００細胞／ｍｌに希釈し、３０μｌを各ウェルに加え、４０μｌ培地中の２０００細胞／ウェルの最終密度にした。室温での２０分間のインキュベーションの後、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーターに移した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞トランスフェクションアッセイを７２時間インキュベートし、ＣＨＯヒトＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８Ｉトランスフェクションアッセイを４８時間インキュベートした。
【０２２６】
収集時、細胞を８％ホルムアルデヒド固定液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中において室温で１５分間固定した。次に、プレートを、連続的な５０％、７０％、及び１００％のエタノール洗浄による脱水に付した。次に、プレートを密閉し、−２０℃で保存した。
【０２２７】
ＲＮＡ  ＦＩＳＨアッセイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）Ｖｉｅｗ  ＲＮＡ  ＨＣスクリーニングアッセイキット（ＱＶＰ００１１）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｖｉｅｗ  ＨＣシグナル増幅キット３−プレックス（ＱＶＰ０２１３）、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子特異的プローブ：ＰＮＰＬＡ３  Ｈｕｍａｎ  ０．３３ｍＬ  Ｖｉｅｗ  ＲＮＡ  Ｔｙｐｅ  ６（６５０ラベル）ＶＡ６−２０２７９−０１及びＰＰＩＢ  Ｈｕｍａｎ  ０．４４ｍＬ  Ｖｉｅｗ  ＲＮＡ  Ｔｙｐｅ  １（４８８ラベル）ＶＡ１−１０１４８−０１を使用して実施された。
【０２２８】
最初に、プレートを連続的な１００％、７０％、及び５０％エタノール洗浄により再水和した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、続いてキットの指示書に従って透過処理し、プロテアーゼ消化した。目的のＷｏｒｋｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔを、製造業者のプロトコルに従って調製し、ウェルに加え、４０℃で３時間インキュベートした。製造業者のプロトコルは、Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ、Ｗｏｒｋｉｎｇ  ＰｒｅＡｍｐ、Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ａｍｐ、及びＷｏｒｋｉｎｇ  ＬＰによる連続的なハイブリダイゼーションのために採用された。最後に、核対比染色が適用された（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＣｅｌｌ  Ｍａｓｋ  Ｂｌｕｅ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。プレートを室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、８０μｌのＰＢＳで重層し、続いてプレートをイメージングのために密閉した。
【０２２９】
全てのプレートが、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＣｅｌｌ  Ｍａｓｋ  Ｂｌｕｅに関してはＵＶチャネル、Ｔｙｐｅ１プローブに関しては４８８チャネル、並びにＴｙｐｅ６プローブに関しては６４７チャネルを使用して、Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントスクリーニングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で画像化された。
【０２３０】
ＲＮＡ  ＦＩＳＨデータはＣｏｌｕｍｂｕｓソフトウェアを使用して分析され、画像はＧｅｎｅｄａｔａ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒを使用して生成された。ＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８ＩでトランスフェクトされたＣＨＯに関するアッセイの結果は、表３において示される。ＰＮＰＬＡ３  Ｉ１４８ＭでトランスフェクトされたＣＨＯに関するアッセイの結果は、表４において示される。ＰＮＰＬＡ３ノックダウンは、対照と比較したノックダウンのパーセンテージを提供する。負の値は、ＰＮＰＬＡ３レベルの低減を示す。
【０２３１】
【表４６】
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【０２３２】
【表４７】
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【０２３３】
【表４８】
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【０２３４】
ＲＮＡ  ＦＩＳＨもまた、二重変異体ＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０８−ｒｓ７３８４０９を含有する肝細胞株、及び対照野生型細胞株、Ｈｅｐ３Ｂに対して行われた。Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣから購入された）は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ−Ｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補充した最小必須培地（Ｈｅｐ３Ｂに関してはＣｏｒｎｉｎｇからのＭＥＭ及びＨｅｐＧ２に関してはＡＴＣＣからのＥＭＥＭ）中で培養された。ｓｉＲＮＡトランスフェクションは次のとおりに実施された：１μＬの試験ｓｉＲＮＡ及び細胞株に応じて４μＬの単純ＭＥＭ又はＥＭＥＭを、ＢｉｏＭｅｋ  ＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって、ＰＤＬでコーティングされたＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ−３８４  Ｕｌｔｒａアッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に加えた。次に、単純ＭＥＭ又はＥＭＥＭ（具体的には、Ｈｅｐ３Ｂに関しては５μＬ中０．０３５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ及びＨｅｐＧ２に関しては５μＬのＥＭＥＭ中の０．０６μＬのＲＮＡｉＭＡＸ）中で予め希釈された５μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ試薬ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってアッセイプレートに分注した。室温（ＲＴ）でのｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉＭＡＸ混合物の２０分のインキュベーションの後、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ−Ｓを補充したＭＥＭ又はＥＭＥＭ中の３０μＬのＨｅｐ３Ｂ又はＨｅｐＧ２細胞（ウェル当たり２０００細胞）のいずれかを、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ試薬ディスペンサーを使用してトランスフェクション複合体に加えた。アッセイプレートを、インキュベーターに置く前にＲＴで２０分間インキュベートした。次に、細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＶｉｅｗＲＮＡ  ＩＳＨ細胞アッセイを、リキッドハンドリングのための内製の自動ＦＩＳＨアッセイプラットフォームを使用して製造業者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って実施した。手短に言えば、細胞を４％ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中においてＲＴで１５分間固定し、界面活性剤によりＲＴで３分間透過処理し、続いてプロテアーゼ溶液によりＲＴで１０分間処理した。標的特異的プローブペア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のインキュベーションが３時間行われたが、Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒ、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ及びＬａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に関してはそれぞれ１時間であった。全てのハイブリダイゼーション工程は、Ｃｙｔｏｍａｔ  ２  Ｃ−ＬＩＮ自動インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において４０℃で行われた。ハイブリダイゼーション反応の後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ及びＣｅｌｌＭａｓｋ  Ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間染色し、続いてＯｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で画像化した。画像を、Ｃｏｌｕｍｂｕｓイメージデータ保存・解析システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して分析して、細胞当たりの平均スポットカウントを得た。スポットカウントは、高用量（リン酸緩衝生理食塩水を含有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ）及び低用量（目的のプローブペアを含まない）の対照ウェルを使用して正規化された。総ｓｉＲＮＡ濃度に対して正規化された値をプロットし、データをＧｅｎｅｄａｔａ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）において４パラメーターのシグモイドモデルに当てはめて、ＩＣ５０及び最大活性を得た。ＨｅｐＧ２細胞に関するアッセイの結果は表５に示され、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に関するアッセイの結果は表６に示される。ＰＮＰＬＡ３ノックダウンは、対照と比較したノックダウンのパーセンテージを提供する。負の値は、ＰＮＰＬＡ３レベルの低減を示す。二重鎖が２回以上行われた場合において、平均ＩＣ５０が標準偏差とともに示される。
【０２３５】
【表４９】
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【０２３６】
【表５０】
2021506238.tif 000053
【０２３７】
【表５１】
2021506238.tif 000054
【０２３８】
【表５２】
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【０２３９】
実施例３：ＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９及びＰＮＰＬＡ３−ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８に関するｓｉＲＮＡのドロップレットデジタルＰＣＲアッセイ
製造業者のプロトコルに従って、ヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ／Ｓｅｋｉｓｕｉ  ドナーロット＃ＨＣ３−３８）をＯｐｔｉＴｈａｗ培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ  ｃａｔ＃Ｋ８０００）中に解凍し、細胞を遠心分離し、培地吸引後、ＯｐｔｉＰｌａｔｅ肝細胞培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ  ｃａｔ＃Ｋ８２００）に再懸濁し、９６ウェルのコラーゲンコーティングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｃａｔ＃６５５９５０）に蒔いた。２〜４時間のインキュベーション期間の後、培地を除去し、ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ肝細胞培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ  ｃａｔ＃Ｋ８３００）で置き換えた。ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ培地の添加の２〜４時間後、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡを自由取り込み（トランスフェクション試薬なし）によって細胞に送達した。細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で２４〜７２時間インキュベートした。続いて、１％２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ−３１４８）を加えたＱｉａｇｅｎのＲＬＴ緩衝液（７９２１６）で細胞を溶解し、溶解物を−２０℃で保存した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡＣｕｂｅ  ＨＴ機器（９００１７９３）及びＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ  ９６  ＱＩＡＣｕｂｅ  ＨＴキット（７４１７１）を使用して、製造業者の指示書に従ってＲＮＡを精製した。試料は、ＱＩＡｘｐｅｒｔシステム（９００２３４０）を使用して分析された。Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（４３６８８１３）を使用してＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、反応を製造業者の指示書に従って組み立て、投入するＲＮＡ濃度は、試料によって変動した。逆転写は、ＢｉｏＲａｄの４つ組のサーマルサイクラー（モデル番号ＰＴＣ−０２４０Ｇ）上において以下の条件で実行した：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５分、その後（任意選択）４℃で保持し続ける。
【０２４０】
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、製造業者の指示書に従ってＢｉｏＲａｄのＱＸ２００  ＡｕｔｏＤＧドロップレットデジタルＰＣＲシステムを使用して実施した。ＢｉｏＲａｄのプローブ用ｄｄＰＣＲスーパーミックス（１８６３０１０）、並びにＰＮＰＬＡ３のための蛍光標識されたｑＰＣＲアッセイ（ＩＤＴ  Ｈｓ．ＰＴ．５８．２１４６４６３７、プライマー対プローブ比３．６：１及びＴＢＰ（ＩＤＴ  Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２０１０５４８６、プライマー対プローブ比３．６：１）、並びにＲＮａｓｅフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９９３７）を使用して、反応をＥｐｐｅｎｄｏｒｆのクリア９６ウェルＰＣＲプレート（９５１０２０３０３）に組み立てた。プライマー／プローブの最終濃度は、それぞれ９００ｎＭ／２５０ｎＭであり、投入するｃＤＮＡ濃度は、ウェル間で変動した。ドロップレットは、製造業者によって推奨される消耗品（ＢｉｏＲａｄのＤＧ３２カートリッジ１８６４１０８、ＢｉｏＲａｄのチップ８６４１２１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの青色９６ウェルＰＣＲプレート９５１０２０３６２、ＢｉｏＲａｄのプローブ用ドロップレット生成オイル１８６４１１０及びＢｉｏＲａｄのドロップレットプレート組立品）とともに設置されたＢｉｏＲａｄ  Ａｕｔｏ  ＤＧドロップレット生成器（１８６４１０１）を使用して形成された。ドロップレットは、ＢｉｏＲａｄのＣ１０００  ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー（１８５１１９７）上で次の条件を用いて増幅した：酵素活性化９５℃で１０分、変性９４℃で３０秒、その後６０℃で１分間のアニーリング／エクステンション、２℃／秒のランプ速度を用いる４０サイクル、酵素活性解除９８℃で１０分、その後（任意選択）４℃で保持し続ける。続いて、ＰＮＰＬＡ３又はＴＢＰ濃度に相関するＦＡＭ／ＨＥＸシグナルを測定するＢｉｏＲａｄのＱＸ２００ドロップレットリーダー上で試料を読み取った。データを、ＢｉｏＲａｄのＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアパッケージを使用して分析した。試料をチャネル（蛍光標識）によってゲート制御して、１試料当たりの濃度を決定する。続いて、各試料を、異なる試料負荷量に関して、対照に対する目的の遺伝子（ＰＮＰＬＡ３）の濃度／ハウスキーピング遺伝子（ＴＢＰ）の濃度の比として表す。続いて、データをＧｅｎｅｄａｔａ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒにインポートし、ここで、各試験ｓｉＲＮＡを中立対照ウェル（緩衝液のみ）の中央値に正規化する。ＩＣ５０値は表７において報告される。
【０２４１】
【表５３】
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【０２４２】
【表５４】
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【０２４３】
【表５５】
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【０２４４】
【表５６】
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【０２４５】
【表５７】
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【０２４６】
実施例４：ヒト化マウスモデルにおける選択したＰＮＰＬＡ３  ｓｉＲＮＡ分子の有効性スクリーニング
リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４１９０−１３６）中で動物当たり４ｅ１１から１ｅ１２個のウイルス粒子まで希釈されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ；血清型ＡＡＶ８又はＡＡＶ７；エンドトキシンフリー、Ａｍｇｅｎによる内製）を、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の尾静脈に静脈内注射して、肝臓におけるヒトＰＮＰＬＡ３ＷＴ（ＰＮＰＬＡ３−ＷＴ）、ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９（ＰＮＰＬＡ３−Ｉ１４８Ｍ）、又はＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８（ＰＮＰＬＡ３−Ｉ１４８Ｍ  ＤＭ）のいずれかの発現をドライブした。マウスは一般に１０〜１２週齢であり、一群当たりｎ＝４〜６の動物が含まれた。スクリーニングのどのラウンドも、少なくとも２つの溶媒処理対照群：溶媒で処理されたＡＡＶ−空ベクター及びＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ＷＴ又はＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８を含んだ。全てのｓｉＲＮＡが、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ＷＴ、ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９、及び／又はＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８に対して試験された。ＡＡＶ注射の２週間後、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４１９０−１３６）中で希釈された単一用量のｓｉＲＮＡ  Ｄ−２３２４（０．５ｍＭ）により動物の１キログラム当たり０．５、１．０、３．０又は５．０ミリグラムで皮下注射を介して処理した。ｓｉＲＮＡ注射後の８、１５、２２、２８又は４２日目に肝臓を動物から収集し、液体窒素中で急速凍結させ、ＱＩＡＣｕｂｅ  ＨＴ機器（Ｑｉａｇｅｎ、９００１７９３）及びＲＮｅａｓｙ  ９６  ＱＩＡＣｕｂｅ  ＨＴキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１７１）を使用して製造業者の指示書に従って精製ＲＮＡに関して処理した。試料は、ＱＩＡｘｐｅｒｔシステム（Ｑｉａｇｅｎ、９００２３４０）を使用して分析された。ＲＮＡは、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−フリーＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ６１０１）で処理され、ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ（商標）１−ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３９２６５３）を使用してリアルタイムｑＰＣＲのために調製された。リアルタイムｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲ装置上で実施された。結果は、マウスＧａｐｄｈ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ、それぞれｈｓ００２２８７４７＿ｍ１及び４３５２９３２Ｅ）に正規化されたヒトＰＮＰＬＡ３の遺伝子発現を基準とし、溶媒処理対照動物と比較したヒトＰＮＰＬＡ３  ｍＲＮＡ発現の相対的ノックダウンとして示される。内在性マウスＰｎｐｌａ３発現が、比較のために決定された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｍ００５０４４２０＿ｍ１）。
【０２４７】
肝臓のトリグリセリド含量分析のために、動物に由来するおよそ０．０５〜０．１ミリグラムの凍結肝臓を、１ミリリットルのイソプロパノール中でホモジナイズした。氷上での１時間のインキュベーションの後、試料を微量遠心管中において１０，０００ｒｐｍで回転させ、上清を透明のディープウェル９６ウェルプレートに移した。トリグリセリド含量は、比色分析Ｉｎｆｉｎｉｔｙトリグリセリド試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＲ２２４２１）及びトリグリセリド標準（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ７５３１−ＳＴＤ）を使用して、製造業者の指示書に従って決定された。結果は、組織１ミリグラム当たりトリグリセリドのミリグラムとして示される。
【０２４８】
本明細書に記載される全ての動物実験は、Ａｍｇｅｎの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認され、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｕ．Ｓ．）Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ．の更新のための委員会、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｕ．Ｓ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ（Ｕ．Ｓ．）（２０１１）Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ．８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に従って管理された。マウスは、空調された空間において２２±２℃で１２時間の光；１２時間の暗やみの周期（０６００〜１８００時間）により単独飼育された。動物は、別段の指示がない限り、適宜通常の固形飼料食餌（Ｅｎｖｉｇｏ、２９２０Ｘ）及び自動給水システムによる水（逆浸透精製）の利用を有した。終了時に、血液が深麻酔下で心臓穿刺により回収され、その後Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）ガイドラインに従って、二次的な物理的方法によって安楽死させられた。図１Ａ〜Ｄ。インビボでの用量依存的ｍＲＮＡノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関してスクリーニングされた５つのｓｉＲＮＡ分子の一例。ヒトＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０を発現するマウスは、静脈内ＡＡＶ注射の２週間後にｓｉＲＮＡで処理された。一群当たりＮ＝６のマウス；平均及び平均値の標準誤差として表されるデータ。（Ａ）ｓｉＲＮＡは、１キログラムの体重当たり０．５、１．０、３．０、又は５．０ミリグラムでマウスの腹部に皮下注射された。ｓｉＲＮＡ処理の４週間後、マウスを屠殺し、肝臓を回収し、遺伝子発現分析に関して処理した。データは、溶媒処理対照群に対して設定された各群におけるヒトＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の平均の相対的ノックダウンを表す。（Ｂ）同じ４週間の処理群に由来する肝臓もまた、機能上の有効性を入手するためにトリグリセリド含量に関して処理された。データは、処理された組織の１グラム当たりのトリグリセリドの平均のミリグラムを表す。（Ｃ）ｓｉＲＮＡは、体重１キログラム当たり１．０及び３．０ミリグラムで並行コホートの動物の腹部に皮下注射された。マウスをｓｉＲＮＡ処理の６週間後に収集して、インビボでのｓｉＲＮＡ分子の耐久性を比較した。肝臓を回収し、遺伝子発現分析のために処理した。データは、溶媒処理対照群に対して設定された各群におけるヒトＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の平均の相対的ノックダウンを表す。（Ｄ）同じ６週間の処理群に由来する肝臓もまた、経時的な機能上の有効性を入手するためにトリグリセリド含量に関して処理された。データは、処理された組織の１グラム当たりのトリグリセリドの平均のミリグラムを表す。
【０２４９】
相対的ノックダウンに関するデータは表８〜１２に示され、これはそれぞれ８、１５、２２、２８、及び４２日目及び様々な用量での相対的ノックダウンを示している。ＰＮＰＬＡ３ノックダウンは、ＰＮＰＬＡ３レベルの低減を示す負の値を伴うパーセンテージである。
【０２５０】
【表５８】
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【０２５１】
【表５９】
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【０２５２】
【表６０】
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【０２５３】
【表６１】
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【０２５４】
【表６２】
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【０２５５】
【表６３】
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【０２５６】
【表６４】
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【０２５７】
【表６５】
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【０２５８】
【表６６】
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【０２５９】
【表６７】
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【０２６０】
【表６８】
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【０２６１】
【表６９】
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【０２６２】
実施例５：ヒト化ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８マウスモデルにおけるｓｉＲＮＡ分子によるＮＡＦＬＤの予防及びレスキュー
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨのための「アメリカ人のライフスタイルに誘導される肥満症」、又はＡＬＩＯＳマウスモデルは、トランス脂肪（脂肪の総量の４５％）及び糖の高い食餌をマウスに供給することによって発症される（Ｔｅｔｒｉ  ２００８）。これらの試験のために、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）は、前述のとおりのＡＡＶ空ベクター又はＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８を注射された。ＡＡＶ注射時に、マウスは、収集されるまで通常の固形飼料食餌で維持されたか又は５５％フルクトース及び４５％グルコース（それぞれＳｉｇｍａ、Ｆ０１２７及びＧ７０２１）で構成される飲料水を完全に含むＡＬＩＯＳ食餌（Ｅｎｖｉｇｏ、ＴＤ．０６３０３）に対して置かれた。前述の実験において、ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の過剰発現がこの文脈においてＮＡＦＬＤ表現型を促進し且つ悪化させることを確立した（データは示さず）。
【０２６３】
ＡＡＶ注射及び食餌の開始の２週間後、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４１９０−１３６）中で希釈された単一用量のｓｉＲＮＡ  Ｄ−２３２４（０．５ｍＭ）により動物の１キログラム当たり５．０ミリグラムで又は溶媒対照で皮下注射を介して処理した。投与は収集まで２週間に１回繰り返された。収集時に、体重を回収し、その後イソフルラン麻酔下で心臓穿刺を介して血清を回収し、続いて肝臓重量を回収した。中葉を１０％の中性緩衝ホルマリンにより固定し、続いてパラフィン処理し、包埋した。肝臓の残部は、前述のとおりの含量及び遺伝子発現分析のために急速凍結された。
【０２６４】
急速凍結された肝臓組織を、前述のとおりのＲＮＡ及び遺伝子発現分析のために処理した。結果は、未加工のＣｔ値及びマウスＧａｐｄｈに正規化された指定の遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現の両方として示される。（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ：ヒトＰＮＰＬＡ３、ｈｓ００２２８７４７＿ｍ１；マウスＰｎｐｌａ３、Ｍｍ００５０４４２０＿ｍ１；マウスＧａｐｄｈ、４３５２９３２Ｅ）。
【０２６５】
ホルマリン固定組織は、製造業者の指示書に従ってヘモトキシリン及びエオシン染色（それぞれＤａｋｏ、ＣＳ７００３０−２、ＣＳ７０１３０−２）のために処理された。脂肪症及び炎症に関するスコア化は、委員会認定の病理学者によって実施された。
【０２６６】
血清分析は、ＴＩＭＰ１、ＮＡＳＨ及びＮＡＳＨ関連線維症と関連するバイオマーカーを含んだ（Ｙｏｕｓｓａｎｉ  ２０１１）。ＴＩＭＰ１  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＴＭ１００）は、製造業者の指示書に従って実施された。
【０２６７】
図２Ａ−Ｇ。ＮＡＦＬＤ及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の過剰発現と関連する表現型の発症を予防するＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子Ｄ−２３２４の能力を評価するために、マウスは、ＡＡＶ８空ベクター（ＥＶ）、又はＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８、又は溶媒を受容し、通常の固形飼料食餌で維持されたか、又はＡＬＩＯＳ食餌に移行された。ＡＡＶ注射の２週間後、マウスを、隔週で６週間（合計で３回の注射ラウンド）ｓｉＲＮＡ又は溶媒で処理した。マウスは８週目の時点で収集された。結果は、群平均及び標準誤差、一群当たりＮ＝８として示される。アスタリスクは、ダネット多重比較検定を利用する一方向ＡＮＯＶＡにより生成された、ＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８コホートに対する統計的有意性を表す。（Ａ）収集時の肝臓重量（グラム）と体重（グラム）の比率。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＝０．００１８、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。（Ｂ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるヒトＰＮＰＬＡ３  ｍＲＮＡ発現及びサイレンシングの確認。（左）未加工のＣｔ値及び（右）マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現；ＡＬＩＯＳ摂取ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ群を比較する。（Ｃ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるマウスＰｎｐｌａ３  ｍＲＮＡ発現の分析は、内在性のＰｎｐｌａ３がＡＡＶ媒介性の過剰発現又はｓｉＲＮＡサイレンシングによって有意に変化しないことを示す。（左）未加工のＣｔ値及び（右）マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現；固形飼料摂取ＡＡＶなしの群とＡＬＩＯＳ摂取ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ群を比較する。（Ｄ）肝臓組織１グラム当たりのトリグリセリドのミリグラムとして示される肝臓トリグリセリド含量。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＝０．０３９３、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＝０．００６３。（Ｅ）血清１ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清ＴＩＭＰ１。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。（Ｆ）Ｈ＆Ｅ染色に基づく脂肪症の組織学的徴候、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、有意性なし、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＝０．００１２。（Ｇ）Ｈ＆Ｅ染色に基づく炎症の組織学的徴候、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２��、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。
【０２６８】
図３Ａ−Ｇ。疾患発症後のＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８媒介性疾患のさらなる進行を予防するＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の能力を評価するために、マウスは、ＡＡＶ８空ベクター（ＥＶ）、又はＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８、又は溶媒を受容し、通常の固形飼料食餌で維持されたか、又はＡＬＩＯＳ食餌に移行された。ＡＡＶ注射及び食餌変化の８週間後、マウスを、隔週で８週間（合計で４回の注射ラウンド）ｓｉＲＮＡ又は溶媒で処理した。マウスは１６週目の時点で収集された。脂肪症において変化は観察されなかったが、ｓｉＲＮＡ処理が疾患誘導後に開始された場合、いくつかの他の疾患関連の評価項目は有意に低減した。結果は、平均及び標準誤差、一群当たりＮ＝８として示される。アスタリスクは、ダネット多重比較検定を利用する一方向ＡＮＯＶＡにより生成された、ＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８コホートに対する統計的有意性を表す。（Ａ）収集時の肝臓重量（グラム）と体重（グラム）の比率。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、有意性なし、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＝０．０００６。（Ｂ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるヒトＰＮＰＬＡ３  ｍＲＮＡ発現及びサイレンシングの確認。（左）未加工のＣｔ値及び（右）マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現；ＡＬＩＯＳ摂取ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ群を比較する。（Ｃ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるマウスＰｎｐｌａ３  ｍＲＮＡ発現の分析は、内在性のＰｎｐｌａ３がＡＡＶ媒介性の過剰発現又はｓｉＲＮＡサイレンシングによって有意に変化しないことを示す。（左）未加工のＣｔ値及び（右）マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現；固形飼料摂取ＡＡＶなしの群とＡＬＩＯＳ摂取ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ群を比較する。（Ｄ）肝臓組織１グラム当たりのトリグリセリドのミリグラムとして示される肝臓トリグリセリド含量。調整されたＰ値：ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、有意性なし、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＝０．０４０３。（Ｅ）血清１ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清ＴＩＭＰ１。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＝０．００２７、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＝０．００２。（Ｆ）Ｈ＆Ｅ染色に基づく脂肪症の組織学的徴候、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、有意性なし、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、有意性なし。（Ｇ）Ｈ＆Ｅ染色に基づく炎症の組織学的徴候��正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、有意性なし、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＝０．００６８。
【０２６９】
図４Ａ−Ｄ。ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８の過剰発現に起因する疾患関連表現型をレスキューするＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の能力を評価するために、ＡＬＩＯＳ摂取８週ＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８−溶媒処理マウス由来の肝臓及び血清を、ＡＬＩＯＳ摂取１６週溶媒−又はｓｉＲＮＡ処理ＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８マウス由来の肝臓及び血清と比較した。ｓｉＲＮＡ処理によりこの時点での脂肪症における変化は観察されなかったが、肝臓グリセリド、血清ＴＩＭＰ１、及び炎症は全て、８週目の溶媒対照と比較して１６週目で統計的に低かった。結果は、平均及び標準誤差、一群当たりＮ＝８として示される。アスタリスクは、ダネット多重比較検定を利用する一方向ＡＮＯＶＡにより生成された、８週ＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８溶媒処理コホートに対する統計的有意性を表す。（Ａ）肝臓組織１グラム当たりのトリグリセリドのミリグラムとして示される肝臓トリグリセリド含量。調整されたＰ値：１６週ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒、有意性なし；１６週ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＝０．００１１。（Ｂ）血清１ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清Ｔｉｍｐ１。調整されたＰ値：１６週ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒、有意性なし；１６週ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＝０．０１３４。（Ｃ）Ｈ＆Ｅ染色に基づく脂肪症の組織学的徴候、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：１６週ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒、有意性なし；１６週ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、有意性なし。（Ｄ）Ｈ＆Ｅ染色に基づく炎症の組織学的徴候、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：１６週ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒、有意性なし；１６週ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＝０．０１１２。
【０２７０】
実施例６：ヒト化ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８マウスモデルにおけるｓｉＲＮＡ分子による肝線維症の予防
Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃｌａｐｐｅｒ  ２０１３）により開発された「ＡＭＬＮ」食餌は、ＡＬＩＯＳ食餌の改変バージョンである。飼料は、コレステロール（２％）の１０倍増加及び追加のスクロースを含む。「ＡＭＬＮ」食餌に置かれたマウスは、２０〜３０週後に軽症〜中等症の線維症を発症する（Ｃｌａｐｐｅｒ、Ｍｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｐａｐｅｒｓ）。この試験のために、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）は、上記のとおりのＡＡＶ空ベクター又はＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８を注射されて、疾患発症が加速された。ＡＡＶ注射時に、マウスは、収集されるまで通常の固形飼料食餌で継続されたか又は５５％フルクトース及び４５％グルコース（それぞれＳｉｇｍａ、Ｆ０１２７及びＧ７０２１）で構成される飲料水を完全に含むＥｎｖｉｇｏ食餌、ＴＤ．１７０７４８に対して置かれた。
【０２７１】
ＡＡＶ注射及び食餌の開始の２週間後、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４１９０−１３６）中で希釈された単一用量のｓｉＲＮＡ  Ｄ−２３２４（０．５ｍＭ）により動物の１キログラム当たり５．０ミリグラムで又は溶媒対照で皮下注射を介して処理した。投与は収集まで２週間に１回繰り返された。収集時に、体重を回収し、その後イソフルラン麻酔下で心臓穿刺を介して血清を回収し、続いて肝臓重量を回収した。中葉を１０％の中性緩衝ホルマリンにより固定し、続いてパラフィン処理し、包埋した。肝臓の残部は、遺伝子発現分析のために急速凍結された。
【０２７２】
急速凍結された肝臓組織を、前述のとおりのＲＮＡ及び遺伝子発現分析のために処理した。結果は、未加工のＣｔ値及びマウスＧａｐｄｈに正規化された指定の遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現の両方として示される。（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ：ヒトＰＮＰＬＡ３、ｈｓ００２２８７４７＿ｍ１；マウスＰｎｐｌａ３、Ｍｍ００５０４４２０＿ｍ１；マウスＣｏｌ１ａ１、Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１；マウスＣｏｌ３ａ１、Ｍｍ０１２５４４７１＿ｇ１；Ｃｏｌ４ａ１、Ｍｍ０１２１０１２５＿ｍ１；マウスＧａｐｄｈ、４３５２９３２Ｅ）。Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１及びＣｏｌ４ａ１は、肝星細胞活性化及び肝線維症と関連する細胞外マトリックスマーカーである（Ｂａｉｏｃｃｈｉｎｉ  ２０１６）。
【０２７３】
ホルマリン固定組織は、製造業者の指示書に従ってヘモトキシリン、エオシン、及びマッソン・トリクローム染色（それぞれＤａｋｏ、ＣＳ７００３０−２、ＣＳ７０１３０−２、ＡＲ１７３１１−２）のために処理された。抗平滑筋アクチン染色は、抗原賦活化を伴わず且つＤＡＫＯ自動染色装置を使用して実施された。スライドは、Ｐｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ  １及びＳｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ、それぞれＰＸ９６８及びＢＳ９６６）を使用して処理し、モノクローナル抗アクチン、α−平滑筋抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｆ３７７７）、続いてウサギ抗ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、７１１９００）、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ−ウサギＨＲＰポリマー（Ｄａｋｏ、Ｋ４００３）、ＤＡＢ＋（Ｄａｋｏ、Ｋ３４６８）、及びヘモトキシリンで染色した。脂肪症、炎症、卵形細胞／胆管過形成、及びａＳＭＡ陽性細胞の量に関するスコア化は、委員会認定の病理学者によって実施された。
【０２７４】
血清は、製造業者の指示書に従ってマウスＴＩＭＰ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＴＭ１００）及びマウスサイトケラチン１８−Ｍ３０（Ｃｕｓａｂｉｏ、ＣＳＢ−Ｅ１４２６５ｍ）について分析された。ＴＩＭＰ１に加えて、サイトカイン１８−Ｍ３０は、初期線維症を含むＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨに関する潜在的なバイオマーカーとして同定された（Ｎｅｕｍａｎ  ２０１４及びＹａｎｇ  ２０１５）。図５Ａ−Ｌ。初期線維症の発症を予防するＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８特異的ｓｉＲＮＡ分子の能力を評価するために、マウスは、ＡＡＶ８空ベクター（ＥＶ）、又はＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８、又は溶媒を受容し、通常の固形飼料食餌で維持されたか、又はＡＭＬＮ食餌に移行された。ＡＡＶ注射の２週間後、マウスを、隔週でさらに１０週間（合計で６回の注射ラウンド）ｓｉＲＮＡ  Ｄ−２３２４又は溶媒で処理した。マウスは１０週目の時点で収集された。結果は、平均及び標準誤差として表される、固形飼料摂取ＡＡＶなし＋溶媒及びＡＭＬＮ摂取ＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒、一群当たりＮ＝８；ＡＭＬＮ摂取ＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒及びＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、一群当たりＮ＝１２。アスタリスクは、ダネット多重比較検定を利用する一方向ＡＮＯＶＡにより生成された、ＡＡＶ８−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８溶媒処理コホートに対する統計的有意性を表す。（Ａ）収集時の肝臓重量（グラム）と体重（グラム）の比率。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、有意性なし、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。（Ｂ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるヒトＰＮＰＬＡ３  ｍＲＮＡ発現及びサイレンシングの確認。（左）未加工のＣｔ値及び（右）マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現；ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ群を比較する。（Ｃ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるマウスＰｎｐｌａ３  ｍＲＮＡ発現の分析は、内在性のＰｎｐｌａ３がＡＡＶ媒介性の過剰発現又はｓｉＲＮＡサイレンシングによって有意に変化しないことを示す。（左）未加工のＣｔ値及び（右）マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現；固形飼料摂取ＡＡＶなしの群とＡＭＬＮ摂取ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋溶媒及びＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ群を比較する。（Ｄ）血清１ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清Ｔｉｍｐ１。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。（Ｅ）血清１ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清ＣＫ１８ｍ３０。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。（Ｆ）Ｈ＆Ｅ染色に基づく炎症の組織学的徴候、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＝０．０１０８、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。（Ｇ）Ｈ＆Ｅ染色に基づく卵形細胞／胆管過形成の組織学的徴候、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、有意性なし、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＝０．００８１。（Ｈ）抗平滑筋アクチンに関する免疫組織化学的染色、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＝０．０１０１、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＝０．０００２。（Ｉ）線維症に関するマッソン・トリクローム染色、正常な規制値内（０）、最小（１）、軽症（２）、中等症（３）、及び重症（４）としてスコア化される。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、有意性なし、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、有意性なし。（Ｊ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるマウスＣｏｌ１ａ１  ｍＲＮＡ発現。マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。（Ｋ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるマウスＣｏｌ３ａ１  ｍＲＮＡ発現。マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＊＊＜０．０００１。（Ｌ）ｑＰＣＲによる肝臓におけるマウスＣｏｌ４ａ１  ｍＲＮＡ発現。マウスＧａｐｄｈに正規化された相対的な倍率のｍＲＮＡ発現。調整されたＰ値：ＡＡＶなし＋溶媒群、＊＊＊＊＜０．０００１、ＡＡＶ−ＥＶ＋溶媒、＊＊＊＜０．０００５、ＡＡＶ−ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９−ｒｓ７３８４０８＋ｓｉＲＮＡ、＊＊＜０．００４１。
【図１Ａ】
2021506238.tif 000073
【図１Ｂ】
2021506238.tif 000074
【図１Ｃ】
2021506238.tif 000075
【図１Ｄ】
2021506238.tif 000076
【図２Ａ】
2021506238.tif 000077
【図２Ｂ】
2021506238.tif 000078
【図２Ｃ】
2021506238.tif 000079
【図２Ｄ】
2021506238.tif 000080
【図２Ｅ】
2021506238.tif 000081
【図２Ｆ】
2021506238.tif 000082
【図２Ｇ】
2021506238.tif 000083
【図３Ａ】
2021506238.tif 000084
【図３Ｂ】
2021506238.tif 000085
【図３Ｃ】
2021506238.tif 000086
【図３Ｄ】
2021506238.tif 000087
【図３Ｅ】
2021506238.tif 000088
【図３Ｆ】
2021506238.tif 000089
【図３Ｇ】
2021506238.tif 000090
【図４Ａ】
2021506238.tif 000091
【図４Ｂ】
2021506238.tif 000092
【図４Ｃ】
2021506238.tif 000093
【図４Ｄ】
2021506238.tif 000094
【図５Ａ】
2021506238.tif 000095
【図５Ｂ】
2021506238.tif 000096
【図５Ｃ】
2021506238.tif 000097
【図５Ｄ】
2021506238.tif 000098
【図５Ｅ】
2021506238.tif 000099
【図５Ｆ】
2021506238.tif 000100
【図５Ｇ】
2021506238.tif 000101
【図５Ｈ】
2021506238.tif 000102
【図５Ｉ】
2021506238.tif 000103
【図５Ｊ】
2021506238.tif 000104
【図５Ｋ】
2021506238.tif 000105
【図５Ｌ】
2021506238.tif 000106
【配列表】
2021506238000001.app
【国際調査報告】
2021506238.tif 000107
2021506238.tif 000108
2021506238.tif 000109
2021506238.tif 000110