(57)【要約】  本発明の主題はＮｅｑＳＳＢタンパク質とリンクされた融合一本鎖ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔであって、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐを有する６つのアミノ酸からなるリンカーを用いて前記ポリメラーゼのＮ末端でリンクされ、該ポリメラーゼは３つの異なる変種として存在するもの、およびその調製方法である。本発明の主題はまた、前記融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ全長、長断片、短断片をコードする核酸分子およびその利用である。【選択図】図１
2021528968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮｅｑＳＳＢタンパク質または５０％以下の割合でＮｅｑＳＳＢに類似する配列を有するタンパク質と結合する一本鎖ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔまたはこのクラスのＤＮＡポリメラーゼとは別のポリメラーゼの融合ポリメラーゼであって、
前記ポリメラーゼのＮ末端に、代表的なアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐのリンカーを用いて結合するか、またはリンカーを介さずに直接融合され、
前記ポリメラーゼは３つの異なる変種として存在する、融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
【請求項２】
前記３つのＢｓｔポリメラーゼの変種：
全長−点変異に起因して停止された５’−３’活性を有するＤＮＡポリメラーゼＢｓｔの全アミノ酸配列；
長断片−５’−３’ドメインなしのＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ；
短断片−両方のエキソ核酸分解ドメインが欠失した短いバージョン；
のうちの１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
【請求項３】
すべてのタイプのＤＮＡおよびＲＮＡと結合することを特徴とする請求項１又は２に記載の融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
【請求項４】
ＳＥＱ１で表される配列を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
【請求項５】
ＳＥＱ２で表される配列を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
【請求項６】
ＳＥＱ３で表される配列を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
【請求項７】
ＳＥＱ４で表される融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ全長をコードする核酸分子。
【請求項８】
ＳＥＱ５で表される融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ長断片をコードする核酸分子。
【請求項９】
ＳＥＱ６で表される融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ短断片をコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項７ないし９のいずれかに記載の融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔをコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１に記載の融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔの調製方法であって、
第１の工程が、成長温度２８〜３７℃、誘導後の媒体のインキュベーション時間が３〜２０時間、インダクター濃度が０．１〜１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドである微生物振とう機内で最適化された条件にて酵素をコードする遺伝子を発現することを含み、
得られた細胞溶解物は、超音波を用いた分解および二本鎖ＤＮＡ分解酵素を用いたＤＮＡ遺伝子汚染の除去を施され、
第２の精製工程は、ヒスチジン捕捉ビーズを用いた金属アフィニティークロマトグラフィーを利用し、
次の工程は３回の透析（１０ｍＭトリス塩酸  ｐＨ７．１，５０ｍＭ塩化カリウム，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０％グリセリン、０．１％トリトンＸ−１００）、ゲルろ過、および調製物の濃縮をカバーし、
すべてのプロセスは４℃で行われ、
得られたタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いて試験され、かつ、得られた調製物のユニットの数はＥｖａＥＺ蛍光定量ポリメラーゼ活性アッセイキットを用いて調製されたことを特徴とする融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔの調製方法。
【請求項１２】
等温増幅反応において段落１〜６で定義される融合一本鎖ＤＮＡポリメラーゼのインビトロでの利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合一本鎖ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔおよびその調製方法に関する。本発明はまた、Ｂｓｔポリメラーゼの３つの変種：全長（Full Length）、長断片（Large Fragment）、および短断片（Short Fragment）のうちの１つに係る融合ポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔをコードする核酸分子、および等温増幅反応に関する融合ＤＮＡポリメラーゼの利用に関する。
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの複製および修復のプロセスにおいて重要な役割を果たす酵素である。これらは科学の様々な分野で幅広く利用され、配列解析または様々なＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）変種に首尾よく活用されており、これらはインビトロでのＤＮＡ合成プロセスを触媒し、この反応は厳密に規定された熱ステージを有するサイクルで行われる。
【０００３】
人気が高まっている別のアプローチは熱サイクルをベースとしないＤＮＡ増幅の等温技法におけるＤＮＡポリメラーゼの利用であり、その反応は一定の伸び（elongation）温度で行われる。これまでにＤＮＡ増幅およびＲＮＡ増幅の両方についてこのような多くの技法が開発されてきた。
【０００４】
所定の技法に対する適切なポリメラーゼの選択は主にその特性に依存する。基本的な重合能力のほかに、ポリメラーゼはまた、エキソ核酸分解ドメインの存在または逆転写酵素活性の存在に起因してＤＮＡ分子を加水分解する能力を示すことができる。これらの特徴はそれぞれのドメインの存在により決定される。これらの酵素に存在する基本的なドメインは重合ドメイン、ならびに３’−５’および５’−３’エキソ核酸分解ドメインである。
【０００５】
エキソ核酸分解ドメインの欠失が天然酵素と比べて部分的に変化した特徴を有する目的機能タンパク質へと誘導するポリメラーゼが存在する。このタイプで最も人気が高いポリメラーゼはサーマス  アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）細菌から単離されるＴａｑポリメラーゼであり、この発見は分子生物学を根本から変換させた。
【０００６】
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性なしでＴａｑ  ２８９ポリメラーゼは高い熱安定性を発揮し、その一方で、より多くのＭｇ2+イオンを必要とし、新たに形成されたＤＮＡ鎖はエラーがより少ない。Ｂｓｔポリメラーゼは等温増幅技法に用いられている。その天然型は不活性３’−５’エキソ核酸分解ドメインおよび活性５’−３’エキソ核酸分解ドメインを含み、７３位（Ｔｙｒ73−＞Ｐｈｅ73およびＴｙｒ73−＞Ａｌａ73）での点変異によって活性を停止させることができる。
【０００７】
このポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼと同様にファミリーＡの一員であり、バチルス  ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌から単離される。その最適な活性は約６０℃で、エキソヌクレアーゼ活性なしでそのポリメラーゼはＬＡＭＰ反応にて非常に有用な鎖置換活性を示す。そのポリメラーゼはこのファミリーの他のポリメラーゼと比べて医療阻害剤または環境阻害剤に対して高い耐性を有するが、このポリメラーゼの用途を考慮すると、依然として、処理能力および阻害剤に対する抵抗性の改善へと主に導き得る解決策を探すことが重要である。
【０００８】
ＮｅｑＳＳＢタンパク質は一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質ファミリーの一員である。ＳＳＢタンパク質は様々なアミノ酸配列および構造を有する。しかしながら、これらは依然として、約１００個のアミノ酸からなる特徴的で高度に保存されたオリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）折り畳みドメインを１つ含む。
【０００９】
このドメインは一本鎖ＤＮＡに結合する能力を示すタンパク質に広く存在し、それゆえに、すべてのＳＳＢタンパク質に基本的な共通点−一本鎖ＤＮＡの非特異的な結合と、ずっとのちに発見されたＲＮＡ結合能力を決定する。ＳＳＢタンパク質は一本鎖ＤＮＡと密に関連するプロセスで重要な役割を果たす。これらは複製、遺伝子組み換えおよびＤＮＡ修復においてきわめて重要である。これらのタンパク質は一本鎖ＤＮＡとの相互作用を担っており、副次的構造が生成するのを抑制し、核酸分解酵素による変質から保護する。
【００１０】
ＳＳＢタンパク質の発見は１９６０年の前半に行われた。最初に発見されたＳＳＢタンパク質はＴ４ファージおよび大腸菌のＳＳＢタンパク質である。この発見の間に、一本鎖ＤＮＡと相互作用するこれらの高い相互作用能力と、高い塩濃度（２Ｍ  塩化ナトリウム）で一本鎖ＤＮＡ−セルロースビーズを用いた高いタンパク質溶出能力とが判明した。
【００１１】
加えて、このタンパク質は一本鎖ＤＮＡに対して非常に高い選択性があることも発見された。一本鎖ＤＮＡに関連するプロセスにおけるＳＳＢタンパク質の基本的な役割として、これらのタンパク質はウイルスと同様にすべての生存生物に存在するという事実が確認された。
【００１２】
ＳＳＢタンパク質と一本鎖ＤＮＡとの結合はオリゴヌクレオチド鎖の残基間の芳香族アミノ酸残基のパッキング（packing）に基づく。加えて、正に帯電したアミノ酸残基は一本鎖ＤＮＡ分子のリン酸エステル骨格と相互作用する。
【００１３】
ＮｅｑＳＳＢタンパク質はＳＳＢタンパク質のファミリーに属するという事実に関わらず、古典的なＳＳＢタンパク質の特徴から外れるがゆえに、ＮｅｑＳＳＢ様タンパク質とよばれる。このタンパク質は超好熱性の古細菌ナノアーカエウム  エクィタンス（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｕｍ  ｅｑｕｉｔａｎｓ）、クラエナーチェオン  イグニコッカス  ホスピタリス（ｃｒａｅｎａｒｃｈａｅｏｎ  Ｉｇｎｉｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ）の寄生生物に由来する。この微生物に対する最適な成長条件は９０℃の温度での厳密な嫌気的条件を必要とする。
【００１４】
興味深いことに、ナノアーカエウム  エクィタンスは４９０，８８５個の塩基対からなる最も小さな既知のゲノムを含む。少ないゲノムを有する大部分の既知の生物と対照的に、この微生物は複製、修復、ＤＮＡ組み換えに参加する酵素をフルセット含み、かつＳＳＢタンパク質を含有する。
【００１５】
このファミリーの他のタンパク質と同様に、ＮｅｑＳＳＢタンパク質はＤＮＡと結合する天然の活性を有する。ＮｅｑＳＳＢタンパク質は２４３アミノ酸残基からなり、その構造中にＯＢドメインを１つ含み、いくつかのウイルス性ＳＳＢタンパク質の場合と類似して、モノマーとして生物学的に活性である。
【００１６】
ＮｅｑＳＳＢタンパク質は、他のＳＳＢタンパク質と同様に、構造的な選択なしですべてのＤＮＡ型（一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ）およびｍＲＮＡの結合に関して並外れた能力を発揮するとの報告が示されている。加えて、このタンパク質は高い熱安定性を示す。生物学的活性を維持する半減期は１００℃で５分であり、融点は１００．２℃である。
【００１７】
最新の診断技術、分子生物学、または遺伝子エンジニアリングによって課される要求に応えるために、これらの分野の科学において有用な特性を備えるＤＮＡポリメラーゼを改良する必要がある。改良された緩衝液の導入、増幅反応のエンハンサー、またはＤＮＡポリメラーゼの変異に主に焦点を当ててこれまでに修飾が導入された。変異は熱安定性および医療的サンプルまたは環境的サンプルに存在する阻害剤に対する抵抗性が高められた酵素の獲得へと導く。
【００１８】
ＤＮＡポリメラーゼの活動メカニズムはいくつかの重要な工程を含む。第１の工程はＤＮＡマトリックスへの酵素の接触からなる。３’位の水酸基（ＯＨ）末端がヌクレオチドのリン原子に求核攻撃する結果として、得られるＤＮＡ−ＤＮＡ複合体はそれぞれのｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）に関連する。最後の工程はホスホジエステル結合の生成およびピロリン酸の遊離へと導く。
【００１９】
これらの酵素の重合活動の重要なステージのひとつは、これらの最終的な効率に寄与するものであり、マトリックスＤＮＡとの結合に関連する初期プロセスである。その理由に起因して、既知のポリメラーゼの修飾は重合を受けるＤＮＡ鎖への結合を促進するように調整される。そのような修飾の例が、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡと結合する天然の能力を示すタンパク質との融合ＤＮＡポリメラーゼの生成であろう。主にポリメラーゼ連鎖反応法に使用される熱安定性酵素とその大半が融合するような融合ＤＮＡポリメラーゼのいくつかの例のみを文献は表している。
【００２０】
その研究はＴａｑ,Ｐｆｕ,ＴｐａまたはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼと超好熱性古細菌であるスルフォロバス  ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ））由来のＤＮＡ結合タンパク質Ｓｓｏ７ｄとの融合がポリメラーゼの処理能力を５〜１７倍の増加へと導くことを示唆する。同様に、ＲＢ６９バクテリオファージのＤＮＡポリメラーゼの信頼度と処理能力の増加が、一本鎖ＤＮＡに結合する生来のＳＳＢタンパク質（ＲＢ６９ＳＳＢ)と融合した後で観察された。
【００２１】
欧州特許ＥＰ１９３４３７２Ｂ１は、古細菌スルフォロバス  ソルファタリカスのＳｓｏＳＳＢタンパク質と融合したサーモコッカス  ジリギ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉ）のＤＮＡポリメラーゼが、修飾された酵素の効率および処理能力の増加を示すことを開示する。
【００２２】
加えて、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓリガーゼのＤＢＤドメインを用いた、すべての種類のＤＮＡと結合が可能である、ＮｅｑＳＳＢタンパク質とＴａｑＳｔｏｆｆｅｌポリメラーゼの融合が最近報告された。双方の融合は酵素の機能的特性の改善へと導き、特に天然酵素の処理能力および熱安定性を改善し、医療阻害剤（ラクトフェリン、ヘパリン、全血）への耐性を大きく向上させた。
【００２３】
等温反応で用いられるＢｓｔおよび００２９などの少数の融合ポリメラーゼも導入された。これらはメタノピラス  カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）のトポイソメラーゼＶのＨｈＨ（らせん−ヘパリン−らせん）ドメインを経由して繋がり、鎖置換活性に負の影響を与えることなくＤＮＡに対するポリメラーゼの親和性を増加させた（融合ポリメラーゼＢｓｔおよび０２９に記載）。加えて、プラスミドおよびゲノムＤＮＡを用いて、より高い信頼度と増幅効率が観察された（文献０２９の場合）。
【００２４】
その文献はまた、ゲオバシルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕ）ｓｐ．７７７から単離されたＢｓｔ様ポリメラーゼの融合を表す。リガーゼであるピロコッカス  アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）のＤＢＤドメインを有するポリメラーゼとＳｔｏ７ｄタンパク質とのキメラが生成され、天然のポリメラーゼと比較して処理能力および阻害剤（尿素、全血、ヘパリン、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウムおよびエタノール）への抵抗性の増加を示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】欧州特許ＥＰ１９３４３７２Ｂ１
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Patel P.H., Motoshi S., Adman E., Shinkai A, Prokaryotic DNA Polymerase I: Evolution, Structure and Base Flipping Mechanism for Nucleotide Selection, J Mol Biol., 2001, 308: 823-837.
【非特許文献２】Steitz T.A., The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274: 17395 -17398
【非特許文献３】Riggs M. G., Tudor S., Sivaram M., McDonough S. H. Construction of single amino acid substitution mutants of cloned Bacillus stearothermophilusDNA polymerase I which lack 5'- 3' exonuclease activity. Biochim Biophys Acta, 1996; 1307(2): 178-86.
【非特許文献４】Oscorbin I.P., Belousova E.A., Boyarskikh U.A., Zakabunin A.I., Khrapov E.A., Filipenko M.L., Derivatives of Bst-like Gss-polymerase with improved processivity and inhibitor tolerance, Nucleic Acids Research, 2017, 45 (16): 9595-9610
【非特許文献５】Phang S.M., Teo C.Y., Lo E., Wong V.W. Cloning and complete sequence of the DNA polymerase-encoding gene (Bstpoll) and characterisation of the Klenow-like fragment from Bacillus stearothermophilus. Gene. 1995;163(l):65-8.
【非特許文献６】Nowak M, Olszewski M, Spibida M, Kur J. Characterization of single-stranded DNA-binding proteins from the psychrophilic bacteria Desulfotalea psychrophila, Flavobacterium psychrophilum, Psychrobacter arcticus, Psychrobacter cryohalolentis, Psychromonasingrahamii, Psychroflexus torquis, and Photobacterium profundum. BMC Microbiol. 2014;14:91.
【非特許文献７】Kur J, Olszewski M, Dtugotgcka A, Filipkowski P. Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs)- sources and applications in molecular biology. Acta Biochim Pol. 2005;52(3):569-74.
【非特許文献８】Sigal N, Delius H, Kornberg T, Gefter ML, Alberts B. A DNA-unwinding protein isolated from Escherichia coli: its interaction with DNA and with DNA polymerases. Proc Natl Acad Sci U S A. 1972;69(12):3537-41.
【非特許文献９】Olszewski M, Balsewicz J, Nowak M, Maciejewska N, Cyranka-Czaja A, Zalewska-Pigtek B, Pigtek R, Kur J. Characterization of a Single-Stranded DNA-Binding-Like Protein from Nanoarchaeum equitans-A Nucleic Acid Binding Protein with Broad Substrate Specificity. PLoS One. 2015;10(5):e0126563
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【非特許文献１１】Kermekchiev M.B., Kirilova L.I., Vail E.E., Barnes W.M., Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples, Nucleic Acids Res, 2009, 37(5): e40
【非特許文献１２】Patel PH, Suzuki M, Adman E, Shinkai A, Loeb LA. Prokaryotic DNA polymerase I: evolution, structure, and "base flipping" mechanism for nucleotide selection. J Mol Biol. 2001;308(5):823-37
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【非特許文献１７】SSB - POLYMERASE FUSION PROTEINS, European Patent Office, EP 1934372 Bl, date of filing: 08.09.2006, date of publication: 20.02.2013
【非特許文献１８】Spibida M, Krawczyk B, Zalewska-Piqtek B, Piqtek R, Wysocka M, Olszewski M. Fusion of DNA-binding domain of Pyrococcus furiosus ligase with TaqStoffel DNA polymerase as a useful tool in PCR with difficult targets. Appl Microbiol Biotechnol. 2018;102(2):713-721.
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【非特許文献２０】de Vega M., Lazaro J.M., Mencia M., Blanco L, Salas M., Improvement of E29 DNA polymerase amplification performance by fusion of DNA binding motifs, PANS, 2010; 107 (38):16506-16511
【非特許文献２１】Pavlov A.R., Pavlova N.V., Kozyavkin S.A., Slesarev A.I., Cooperation between Catalytic and DNA-binding Domains Enhances Thermostability and Supports DNA Synthesis at Higher Temperatures by Thermostable DNA Polymerases, Biochemistry. 2012;51(10): 2032-2043.
【非特許文献２２】Tveit H., Kristensen 1., Fluorescence-Based DNA Polymerase Assay. Anal Biochem. 2001;289:96-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明の目的は、あらゆる種類のＤＮＡおよびＲＮＡに結合するＮｅｑＳＳＢタンパク質との融合ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔを提供することである。驚くべきことに、この問題は本発明にて高い程度まで解決された。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明はあらゆる種類のＤＮＡおよびＲＮＡに結合するＮｅｑＳＳＢタンパク質との融合ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔに関する。３つのＢｓｔポリメラーゼ変種が修飾を施された：全長−点変異に起因して停止された５’−３’活性を有するＤＮＡ  I  Ｂｓｔポリメラーゼの全アミノ酸配列；長断片−５’−３’ドメインがないＤＮＡ  I  Ｂｓｔポリメラーゼ；短断片−両方のエキソ核酸分解ドメインを欠失する短いバージョン。Ｂｓｔポリメラーゼのすべての変種は６つのアミノ酸からなるリンカーを用いて前記ポリメラーゼのＮ末端にてＮｅｑＳＳＢタンパク質と融合する。
【００２９】
本発明の本質は、ＮｅｑＳＳＢタンパク質または５０％以下の割合でＮｅｑＳＳＢに類似する配列を有するタンパク質と結合する一本鎖ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔまたはこのクラスのＤＮＡポリメラーゼとは別のポリメラーゼの融合ポリメラーゼであって、前記ポリメラーゼのＮ末端にて、代表的なアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐのリンカーを用いて結合するか、またはリンカーを介さずに直接融合され、前記ポリメラーゼは３つの異なる変種として存在する。
【００３０】
融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔは３つのＢｓｔポリメラーゼの変種：
全長−点変異に起因して停止された５’−３’活性を有するＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｂｓｔの全アミノ酸配列；
長断片−５’−３’ドメインなしのＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｂｓｔ；
短断片−両方のエキソ核酸分解ドメインが欠失した短いバージョン；
のうちの１つを含む。
【００３１】
あらゆる種類のＤＮＡおよびＲＮＡに結合する融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
ＳＥＱ．１で表される配列を有する融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
ＳＥＱ．２で表される配列を有する融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
ＳＥＱ．３で表される配列を有する融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ。
ＳＥＱ．４で表される融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔの全長をコードする核酸分子。
ＳＥＱ．５で表される融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔの長断片をコードする核酸分子。
ＳＥＱ．６で表される融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔの短断片をコードする核酸分子。
【００３２】
上記融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔをコードする核酸分子。
【００３３】
上記融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔの調製方法は、第１の工程が、成長温度が２８〜３７℃、誘導後の媒体のインキュベーション時間が３〜２０時間、インダクター濃度が０．１〜１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドである微生物振とう機内で最適化された条件にて酵素をコードする遺伝子を発現することを含み、
得られた細胞溶解物は、超音波を用いた分解および二本鎖ＤＮＡ分解酵素を用いたＤＮＡ遺伝子汚染の除去を施される。
【００３４】
第２の精製工程はヒスチジン捕捉ビーズを用いた金属アフィニティークロマトグラフィーを利用し、
次の工程は３回の透析（１０ｍＭトリス塩酸  ｐＨ７．１，５０ｍＭ塩化カリウム，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０％グリセリン、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）、ゲルろ過および調製物の濃縮をカバーする。
【００３５】
すべてのプロセスは４℃で行われ、
得られたタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いて試験され、かつ、得られた調製物のユニットの数はＥｖａＥＺ蛍光定量ポリメラーゼ活性アッセイキットを用いて決定された。
【００３６】
等温増幅反応に関する上記融合一本鎖ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔのインビトロでの利用。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
［配列および図面の説明］
Ｓｅｑ.１は融合ポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ全長のアミノ酸配列を表す。
Ｓｅｑ.２は融合ポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ長断片のアミノ酸配列を表す。
Ｓｅｑ.３は融合ポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ短断片のアミノ酸配列を表す。
Ｓｅｑ.４は融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ全長をコードする遺伝子の配列を表す。
Ｓｅｑ.５は融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ長断片をコードする遺伝子の配列を表す。
Ｓｅｑ.６は融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ短断片をコードする遺伝子の配列を表す。
【００３８】
【図１】図１は融合ＤＮＡポリメラーゼの精製の個々のステージ由来のタンパク質の電気泳動による１０％ポリアクリルアミドゲル分離を表す。Ｍ−標準的なタンパク質の質量を有するタンパク質質量マーカー（サーモ−フィッシャー  サイエンティフィック）：１１６；６６，２；４５；３５；２５；１８．４；１４．４ｋＤａ；１−遺伝子組み換え大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’−ｐＥＴＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ株の無細胞抽出物全体；２−予備的な熱変性を施した無細胞抽出物全体３−ヒスチジン捕捉カラムと結合しないフラクション４−４０ｍＭのイミダゾールを含むヒスチジン捕捉ビーズの洗浄フラクション５−１００ｍＭのイミダゾールを含むヒスチジン捕捉ビーズの洗浄フラクション６−５００ｍＭのイミダゾールを用いた溶出後の融合ＤＮＡポリメラーゼを含有する回収されたフラクション
【図２】図２はＤＮＡポリメラーゼユニット数の計算を可能にする融合ＤＮＡポリメラーゼに対するＤＮＡ増幅から開始する時間ごとのエヴァグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）染料蛍光に関するチャートを表す。例は、カーブに対して反応に使用されたＤＮＡポリメラーゼの量（マイクロリットル）を示す。
【図３】図３は様々な発現条件に対する溶解物の電気泳動による１０％ポリアクリルアミドゲル分離を表す。Ｍ−標準的なタンパク質の質量を有するタンパク質質量マーカー（サーモ−フィッシャー  サイエンティフィック）：１１６；６６，２；４５；３５；２５；１８．４；１４．４ｋＤａ；１−誘導前の遺伝子組み換え大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’−ｐＥＴＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ株の無細胞抽出物全体；２−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから３時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。３−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから４時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。４−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから５時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。５−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから６時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。６−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから２０時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。７−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから３時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。８−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから４時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。９−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから５時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。１０−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから６時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。１１−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから２０時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は２８℃で誘導された。１２−誘導前の遺伝子組み換え大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’−ｐＥＴＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ株の無細胞抽出物全体；１３−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから３時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。１４−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから４時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。１５−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから５時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。１６−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから６時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。１７−１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから２０時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。１８−誘導前の遺伝子組み換え大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’−ｐＥＴＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ株の無細胞抽出物全体；１９−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから３時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。２０−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから４時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。２１−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから５時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。２２−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから６時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。２３−０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導してから２０時間後の無細胞抽出物全体であり、発現は３７℃で誘導された。
【図４】図４は対照例であるＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｂｓｔと比較した、温度の増加に伴う融合ＤＮＡポリメラーゼ活性の変化を表すグラフである。青線はＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｂｓｔの結果を表し、赤線は融合ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ全長を表し、紫線は融合ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ長断片を表し、緑線は融合ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ短断片を表す。活性はアガロースゲルにおいて得られたＰＣＲ生成物の強度に基づくゲルアナライザー（ＧｅｌＡｎａｌｙｚｅｒ）プログラムを用いて評価される。
【図５】図５は等温ＰＣＲの間の増幅率として定義されたＤＮＡポリメラーゼの処理能力の比較を表す臭化エチジウムを用いた１．５％アガロースゲル中での電気泳動分離を示す。反応は下線で示す様々な周期で行われた。
【図６】図６は阻害剤：血中ラクトフェリン（Ａ）、土壌ポリフェノール（Ｂ）に対するＤＮＡポリメラーゼ抵抗性の比較を表す１．５％アガロースゲル中での電気泳動分離を示す。Ａ：１−６μｇのラクトフェリンを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物２−０．６μｇのラクトフェリンを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物３−０．０６μｇのラクトフェリンを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物４−６ｎｇのラクトフェリンを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物Ｋ＋−阻害剤の添加なしでのＤＮＡ増幅中に生じた反応生成物 Ｂ：１−１００μｇのポリフェノールを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物２−１０μｇのポリフェノールを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物３−１μｇのポリフェノールを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物４−０．１μｇのポリフェノールを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物５−０．０１μｇのポリフェノールを追加したＤＮＡ増幅の結果として生じた反応生成物Ｋ＋−阻害剤の添加なしでのＤＮＡ増幅中に生じた反応生成物
【図７】図７は、融合ＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡ電気泳動の移動度シフトアッセイの結果を表す臭化エチジウムを用いた２％アガロースゲルでの電気泳動分離を示す。反応混合物は１０ｐｍｏｌ（ｄＴ７６）のフルオロセイン標識化物（緑）および１００塩基対の２．５ｐｍｏｌのＰＣＲ産物（橙）を含んでいた。１−ｄ（Ｔ）７６２−１００塩基対３−ｄ（Ｔ）７６＋１００塩基対＋３．３ｐｍｏｌの融合ＤＮＡポリメラーゼ４−ｄ（Ｔ）７６＋１００塩基対＋６．６ｐｍｏｌの融合ＤＮＡポリメラーゼ５−ｄ（Ｔ）７６＋１００塩基対＋１３．２ｐｍｏｌの融合ＤＮＡポリメラーゼ６−ｄ（Ｔ）７６＋１００塩基対＋２６．４ｐｍｏｌの融合ＤＮＡポリメラーゼ７−ｄ（Ｔ）７６＋１００塩基対＋５２．８ｐｍｏｌの融合ＤＮＡポリメラーゼ８−ｄ（Ｔ）７６＋１００塩基対＋１０５．６ｐｍｏｌの融合ＤＮＡポリメラーゼ９−ｄ（Ｔ）７６＋１００塩基対＋２１１．２ｐｍｏｌの融合ＤＮＡポリメラーゼ
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明を実施形態によって説明する。本発明は実施形態を含むが、本発明は実施形態に限定されない。
【実施例】
【００４０】
＜融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔ＞
融合ＤＮＡポリメラーゼＮｅｑＳＳＢ−Ｂｓｔは以下の配列：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐの６つのアミノ酸からなるリンカーを用いてポリメラーゼのＮ末端でＮｅｑＳＳＢタンパク質と３つの多様なＢｓｔポリメラーゼとを融合することにより得られた。融合ＤＮＡポリメラーゼの３つの変種の配列は図面、ＳＥＱ.１−３（アミノ酸配列）およびＳＥＱ.４−６（ヌクレオチド配列）に表されている。ＤＮＡポリメラーゼは大腸菌をベースとする原核生物系で実験室規模にて得られた。
【００４１】
［調製−実施例１］
ＤＮＡポリメラーゼの調製の第１工程は、成長温度が３０℃、誘導後の媒体のインキュベーション時間が３〜２０時間、インダクター濃度が０．１〜１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオグリコシドである微生物振とう機内で最適化された条件にて酵素をコードする遺伝子を発現することを含む。
【００４２】
タンパク質精製プロセスにおいて、得られた細胞溶解物は超音波を用いた分解および二本鎖ＤＮＡ分解酵素を用いたＤＮＡ遺伝子汚染の除去を施される。オリゴヒスチジンドメインが存在するおかげで、第２の精製工程はヒスチジン捕捉ビーズを用いた金属アフィニティークロマトグラフィーを利用する（図１）。
【００４３】
次の工程は、ＤＮＡポリメラーゼに対する安定性を備える条件が得られるまで３回の透析（１０ｍＭトリス塩酸  ｐＨ７．１，５０ｍＭ塩化カリウム，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０％グリセリン、０．１％トリトンＸ−１００）、ゲルろ過および調製物の高密度化をカバーする。すべてのプロセスは４℃で行われた。
【００４４】
得られたタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いて試験され、かつ、得られた調製物のユニットの数はＢｉｏｔｉｕｍ社（アメリカ合衆国）のＥｖａＥＺ蛍光定量ポリメラーゼ活性アッセイキットを用いて、ユニットの定義（１活性ユニット［１Ｕ］は最適な操作温度６５℃にて３０分間、１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを取り込むことができるＤＮＡポリメラーゼの量（図２））にしたがって決定された。１Ｌの実験室規模の培地は増幅反応の各々の数を可能にする、約１０，０００Ｕの活性を有する約５ｍｇの精製調製物を備える。
【００４５】
［調製−実施例２］
融合ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の発現は、２８℃の温度で液状培地の適切な酸素添加を備える条件で行われた。１ｍＭ〜０．１ｍＭの範囲のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、３〜２０時間のインキュベーションでタンパク質発現を提供する量のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを用いて対数増殖期の培地を誘導した（図３）。
【００４６】
その後、細胞溶解物を機械的に分解し、金属アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。得られた融合ＤＮＡポリメラーゼは保存条件（１０ｍＭトリス塩酸  ｐＨ７．１，５０ｍＭ塩化カリウム，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０％グリセリン、０．１％トリトンＸ−１００）のために透析を施され、ユニットの定義にしたがって、市販のＢｉｏｔｉｕｍ社（アメリカ合衆国）のＥｖａＥＺ蛍光定量ポリメラーゼ活性アッセイキットに基づいて１Ｕ／μＬの濃度で供された。
【００４７】
［調製−実施例３］
ＮｅｑＳＳＢタンパク質と融合させたポリメラーゼＢｓｔをコードする遺伝子の効率的な発現は３７℃の培地で３〜２０時間、１ｍＭ〜０．１ｍＭの範囲のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドの誘導により得られた（図３）。
【００４８】
遠心分離処理され、機械的に粉砕された細胞溶解物はクロマトグラフィー技法（金属アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー）を用いて精製され、製剤緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸  ｐＨ７．１，５０ｍＭ塩化カリウム，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０％グリセリン、０．１％トリトンＸ−１００）中に懸濁させて、１Ｕ／μＬの濃度で供された。ＤＮＡユニットの量はＢｉｏｔｉｕｍ社（アメリカ合衆国）のＥｖａＥＺ蛍光定量ポリメラーゼ活性アッセイキットを用いてユニットの定義に基づいて同定された。
【００４９】
対照例であるＤＮＡポリメラーゼＢｓｔとの比較における本発明の主題に係る酵素特性の分析によれば、追加されたＤＮＡ結合ＮｅｑＳＳＢタンパク質の存在は、ＤＮＡポリメラーゼ特性にプラスの効果をもたらすことを示している。対照例であるＤＮＡポリメラーゼＢｓｔと比較して、得られたすべてのＤＮＡポリメラーゼの融合変種の熱安定性は約２０％増加した（図４）。
【００５０】
加えて、ＮｅｑＳＳＢタンパク質と融合させたＤＮＡポリメラーゼは３倍の処理能力を示した（図５）。融合ＤＮＡポリメラーゼは反応混合物中で医療阻害剤（ラクトフェリン、ヘパリン）および環境阻害剤（フミン酸、土壌、ポリフェノール）の濃度に耐性を有し、対照例のポリメラーゼと比べて数十倍も耐性が増加した（図６）。融合ＤＮＡポリメラーゼは対照例のＤＮＡポリメラーゼＢｓｔと比較して数倍の感度増加を示したことから、ＤＮＡマトリックスに対する親和性が増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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