(57)【要約】  薬剤耐性を低減する方法及び組成物が記載される。ｍ６Ａ  ＲＮＡのメチル化を減少させる剤が記載される。また、剤を含む組成物、当該剤の作製方法、及びそれを必要としている対象において薬物耐性を低減するため、又は免疫応答を刺激するために、当該剤を使用する方法も記載される。
2021518372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要としている対象において薬物耐性を低減する方法であって、前記対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させ、それにより、前記対象において薬物耐性を低減する有効量の剤、好ましくはオリゴヌクレオチドを前記対象に投与すること、を含む、方法。
【請求項２】
前記剤、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ１４、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）のうちの少なくとも１つの阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記剤が、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、任意選択で前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなり、任意選択で前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対象に、抗インフルエンザ薬と組み合わせて有効量の前記剤を投与する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗インフルエンザ薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビル及びオセルタミビルからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
必要としている対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させ、それにより、前記対象における免疫応答を刺激する有効量の剤、好ましくはオリゴヌクレオチドを前記対象に投与すること、を含む、方法。
【請求項１０】
前記剤、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ１４、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）のうちの少なくとも１つの阻害剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記剤が、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、任意選択で前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなり、任意選択で前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなる、ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
抗ウイルス活性剤、好ましくは、抗インフルエンザ薬を更に含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
必要としている対象における疾患を治療する方法であって、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物を前記対象に投与すること、を含み、前記疾患が、免疫応答の刺激が有益である疾患である、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載のオリゴヌクレオチドと、抗ウイルス活性剤と、を含むキットであって、前記オリゴヌクレオチドと前記抗ウイルス活性剤とが、同じ組成物又は異なる組成物中に存在する、キット。
【請求項１９】
前記抗ウイルス活性剤が、ノイラミニダーゼ阻害剤である抗インフルエンザ薬である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビル及びオセルタミビルからなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
薬物を投与された対象において薬物耐性を予防又は治療する方法であって、前記対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる有効量の剤、好ましくはオリゴヌクレオチドを前記対象に投与すること、を含む、方法。
【請求項２２】
前記剤、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質１４（ＭＥＴＴＬ１４）、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）のうちの少なくとも１つの阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記剤が、オリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドが、立体ブロッカーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドにおける少なくとも１つのヌクレオシドが修飾されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾されたヌクレオチドが、２’フルオロ修飾を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾されたヌクレオチドが、アデノシンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬物が、抗ウイルス剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗ウイルス剤が、抗インフルエンザ剤である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記インフルエンザ剤が、ノイラミニダーゼ阻害剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビル及びオセルタミビルからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
必要としている対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる有効量の剤、好ましくはオリゴヌクレオチドを前記対象に投与すること、を含む、方法。
【請求項３７】
前記剤、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ１４、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）のうちの少なくとも１つの阻害剤である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記剤が、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、２’−フルオロ−アデノシン修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを含む剤、及び薬物で治療された対象において薬物耐性を低減する方法に関する。本発明は、更に、抗ウイルス活性剤で治療された対象において薬物耐性を低減する方法、及び免疫応答を刺激することによってＩ型免疫応答を伴う病態を治療する方法に関する。オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲート又は組成物、オリゴヌクレオチドの作製方法、及び対象において薬物耐性を低減するため、又はＩ型免疫応答を伴う病態を治療するために、オリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は組成物を使用する方法も記載される。
【０００２】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、２０１９年３月２１日付で作成された「ＡＬＰ００５７ＷＯＰＣＴ１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ」というファイル名のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された、４．０ＫＢのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
薬物耐性、特にウイルス感染を治療するために使用される薬物に対する耐性は、深刻な問題であり得る。ウイルス感染の治療における主要な問題は、感染後に薬剤耐性変異体が短時間で出現することである。インフルエンザは、重度の呼吸器疾患、臓器不全につながる炎症、及び最終的には死を引き起こし得るＲＮＡウイルスである。インフルエンザ及び他のＲＮＡウイルスは、ＲＮＡのエラーを修復する機構が存在しないことから高い変異速度を有し、季節性インフルエンザウイルスは、ウイルスポリメラーゼによって導入された変異を伴う抗原シフトと、ヒトにおける既存の抗体媒介免疫応答を回避するウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質内で生成された抗原変異体を伴う抗原ドリフトとの組み合わせの結果として発生する（Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４）。
【０００４】
インフルエンザウイルスの治療標的としては、ポリメラーゼ複合体、すなわちＰＡ、ＰＢ２及びＰＢ１の構成要素；Ｍ２チャネル；及びノイラミニダーゼＮＡが挙げられる。ノイラミニダーゼ阻害剤は、抗インフルエンザ医薬の主要な分類である。ＮＡを標的指向する薬物の例としては、オセルタミビル及びザナミビルが挙げられる。ザナミビルは、ＮＡタンパク質の活性部位に結合することによって機能し、インフルエンザウイルスがその宿主細胞から逃げられないようにするものであり、オセルタミビルは、ＮＡの競合的阻害剤である。オセルタミビル及びザナミビルは、インフルエンザの治療において有効な治療薬であるが、いずれの薬物で治療されている患者においても薬物耐性が生じ得る（Ｃｏｌｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｃｈｅｍ，２００９）。ノイラミニダーゼ阻害剤耐性インフルエンザウイルスによって引き起こされるパンデミックは、パンデミックに対する準備における防御の第一線が解除されるので、深刻な脅威である（Ｊａｅｒｈｕｌｔ，Ａｃｔａ  Ｖｅｔ  Ｓｃａｎｄ．２０１８  ６０（１）：６）。
【０００５】
Ｎ６−アデノシンメチル化（ｍ６Ａ）は、薬物耐性に影響を及ぼすと考えられるＲＮＡ構造及び機能に影響を及ぼす修飾である（Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９７４）。ＲＮＡのｍ６Ａ修飾は、動的かつ可逆的である。哺乳類細胞では、ｍ６Ａ修飾は、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ１４、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）からなる複合体によって触媒され、ｍ６Ａ修飾は、デメチラーゼ脂肪量及び肥満関連タンパク質（ＦＴＯ）、並びにＡｌｋＢホモログ５（ＡＬＫＢＨ５）によって元に戻る（Ｂｒｏｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１７）。したがって、ｍ６Ａのレベルは、宿主のメチルトランスフェラーゼＭＥＴＴＬ３及び宿主のデメチラーゼＦＴＯによって制御される。
【０００６】
ｍ６Ａメチル化ＲＮＡなどのメチル化ＲＮＡは、メチル化されていないＲＮＡよりも免疫原性が有意に低い（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ  ａｎｄ  ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１４）。具体的には、ｍ６Ａメチル化ＲＮＡなどのＲＮＡのメチル化は、自然免疫応答において重要な役割を果たすトール様受容体（ＴＬＲ）の活性化を防ぐ。細菌、真菌、寄生虫、及びウイルスＲＮＡなどのメチル化されていない病原体によるＴＬＲの活性化は、一連のシグナル伝達事象を引き起こし、その結果、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、炎症性サイトカイン、及びケモカインが産生され、免疫応答が誘導される（Ｌｉｃｈｉｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ，２０１６；Ｎａｒａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７；Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１７）。最終的に、この炎症は適応免疫系も活性化させ、その結果、次いで、侵入した病原体及び感染した細胞がクリアランスされる。しかしながら、病原性ＲＮＡがメチル化される場合もあり、メチル化ウイルスＲＮＡは、例えば、宿主ＴＬＲによる検出を逃れる。実際に、ウイルスＲＮＡにおけるｍ６Ａのレベルの増加は、ザナミビルなどの薬物によるＡ型インフルエンザ（ＩＶＡ）ウイルスの治療に対する獲得耐性と相関する。更に、ｍ６Ａの化学阻害剤である３−デアザアデノシン（３ＤＺＡ）でＩＶＡを処理すると、薬物耐性が減少するが（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ  ａｎｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９１）、メクロフェナム酸（ＭＡ）によるｍ６Ａの促進は薬物耐性を増加させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、薬物で治療された対象において薬物耐性を効果的に低減することができる治療薬が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、抗ウイルス活性剤などの薬物で治療された対象において薬物耐性の発生を効果的に低減することができる治療薬の必要性を満たす。そのため、本開示は、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させるＲＮＡオリゴヌクレオチド分子などの剤を提供する。好ましくは、本開示のオリゴヌクレオチドは、安定性の向上のために修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【０００９】
驚くべきことに、ＭＥＴＴＬ３に結合し、その立体阻害剤として機能する本開示の実施形態によるオリゴヌクレオチド阻害剤は、宿主及びウイルスのＲＮＡの両方においてｍ６Ａメチル化を低減できることが見出された。更に、ＩＶＡなどのウイルス感染を阻害性オリゴヌクレオチドとザナミビルなどの抗ウイルス薬とで同時治療すると、ウイルスＲＮＡにおけるｍ６Ａレベルを阻害し、薬剤耐性ウイルスを低減できることが更に見出された。
【００１０】
一般的な態様では、本開示は、抗ウイルス活性剤による治療を必要としている対象などの、それを必要としている対象において薬物耐性を低減する方法であって、当該対象におけるｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させ、それにより、当該対象において薬剤耐性を低減する、有効量の剤、例えば、開示されたオリゴヌクレオチドを当該対象に投与すること、を含む、方法に関する。
【００１１】
本出願の実施形態では、方法は、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、及びＷＴＡＰのうちの少なくとも１つの阻害剤を対象に投与すること、を含む。
【００１２】
本出願の実施形態では、方法は、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを対象に投与すること、を含む。
【００１３】
特定の態様によれば、開示されたオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている。
【００１４】
特定の態様によれば、開示されたオリゴヌクレオチドは、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなり、任意選択でオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている。
【００１５】
特定の態様によれば、開示されたオリゴヌクレオチドは、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる。
【００１６】
特定の態様によれば、対象に、抗インフルエンザ薬、好ましくは、ザナミビル又はオセルタミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤と組み合わせて、ｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化レベルを減少させる有効量の開示されたオリゴヌクレオチドを投与する。
【００１７】
別の一般的な態様では、本開示は、必要としている対象における免疫応答を刺激する方法であって、当該対象におけるｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させ、それにより、当該対象における免疫応答を刺激する、有効量の開示されたオリゴヌクレオチドを当該対象に投与すること、を含む、方法に関する。
【００１８】
一般的な態様では、本開示は、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなる、ＲＮＡオリゴヌクレオチドに関する。
【００１９】
一般的な態様では、本開示は、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物に関する。
【００２０】
特定の態様によれば、医薬組成物は、抗ウイルス活性剤、好ましくは、抗インフルエンザ薬、より好ましくは、ザナミビル又はオセルタミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤を更に含む。
【００２１】
一般的な態様では、本開示は、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドと、抗ウイルス活性剤と、を含む、キットであって、当該オリゴヌクレオチドと当該抗ウイルス活性剤とが、同じ組成物又は異なる組成物中に存在し、当該抗ウイルス活性剤が、抗インフルエンザ薬、好ましくは、ザナミビル又はオセルタミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤である、キットに関する。
【００２２】
開示された実施形態の他の態様、特徴、及び利点は、「発明を実施するための形態」及びその好ましい実施形態を含む以下の開示、並びに添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
上述の要約、並びに以下の「発明を実施するための形態」は、添付図面と併せて読むとより深く理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解されるべきである。
【００２４】
図面は、以下のとおりである。
【図１Ａ】耐性継代中に使用したザナマビル（Zanamavir）の用量を示す。
【図１Ｂ】ザナミビル継代されたインフルエンザＡ／ＰＣのＥＣ５０値を示す。
【図２】ザナマビル（ＺａｎＲ）による耐性継代の前及び後のインフルエンザＡ／ＰＣ及びインフルエンザＢ／ＶｉｃのウイルスＲＮＡにおけるｍ６Ａレベルの倍率変化を示す。
【図３】対照サンプル及び３ＤＺＡ又はＭＡで処理されたサンプルにおけるｍ６Ａレベルを示す。
【図４】３ＤＺＡ又はＭＡで処理されたインフルエンザＡ／ＰＣ又はインフルエンザＡ／ＰＣ／ＺａｎＲ株におけるｍ６Ａレベルを示す。
【図５】３ＤＺＡ又はＭＡで処理されたインフルエンザＡ／ＰＣ又はインフルエンザＡ／ＰＣ／ＺａｎＲ株のＥＣ５０値を示す。
【図６】ビオチン標識オリゴヌクレオチドの免疫沈降アッセイの概略（左）及び結果（右）を示す。
【図７Ａ】開示されたＲＮＡオリゴヌクレオチドによる処理後のＭＤＣＫ細胞におけるｍ６Ａレベルを示す。
【図７Ｂ】本開示の開示されたＲＮＡオリゴヌクレオチドによる処理後のＨＥＫ２９３細胞におけるｍ６Ａレベルを示す。
【図８】本開示の開示されたＲＮＡオリゴヌクレオチドによる処理後のインフルエンザＡ／ＰＣ又はインフルエンザＡ／ＰＣ／ＺａｎＲ株に感染したＭＤＣＫ細胞におけるｍ６Ａレベルを示す。
【図９】本開示の開示されたＲＮＡオリゴヌクレオチドによる処理後のインフルエンザＡ／ＰＣ又はインフルエンザＡ／ＰＣ／ＺａｎＲ株のＥＣ５０値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【００２６】
定義
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解される意味と同一の意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によって恰もその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「減少する」、「低減する」、又は「阻害する」は全て、統計的に有意な量の減少を指す。本開示の特定の実施形態によれば、「減少する」、「低減する」、又は「阻害する」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は最大１００％の減少、又は１０〜１００％のいずれかの減少を意味する。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「統計的に有意な」又は「有意に」は、統計的有意性を指し、概して、測定値の値における標準偏差の２倍又はより大きな差を意味する。この用語は、差があるという統計的根拠を指し、帰無仮説が実際に真であるときに帰無仮説を棄却するという判断をする確率と定義される。統計的有意性は、例えば、ｔ検定によって又はｐ値を使用して判定することができる。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用語「薬物で治療された対象」又は「活性剤で治療された対象」は、本開示の実施形態によるｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる剤、例えば、開示されたオリゴヌクレオチドの投与前、投与中、又は投与後に薬物又は活性剤で治療された対象を指す。本開示の特定の実施形態によれば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどのｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる剤を、現在薬物又は活性剤で治療されている対象に投与する。本開示の他の特定の実施形態によれば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどのｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる開示された剤を、将来薬物又は活性剤による治療を受ける対象に予防的に投与する。本開示の他の特定の実施形態によれば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどのｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる剤を、薬物又は活性剤による治療を以前に受けたことがある対象に投与する。
【００３０】
本明細書で使用するとき、用語「抗ウイルス活性剤」は、対象におけるウイルス感染を治療又は予防するために使用される任意の化合物を指す。本開示の特定の実施形態によれば、抗ウイルス活性剤は、その薬物耐性がｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化によって制御される任意のウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、又はジカウイルスなどの二本鎖（ｄｓ）／一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスによる感染を治療又は予防するために使用される化合物である。
【００３１】
本明細書で使用するとき、用語「有効量」は、対象において所望の生物学的又は医薬的応答を惹起する活性成分又は構成成分の量を指す。有効量は、記載される目的に対して経験的及び／又は日常的な方法で決定することができる。例えば、インビトロアッセイを任意選択で用いて、最適な用量範囲を特定するのに役立てることができる。具体的な有効量の選択は、治療又は予防される疾病、伴う症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者に既知の他の因子を含むいくつかの因子の考慮に基づいて、当業者によって（例えば、臨床試験により）決定することができる。また、製剤に用いられる正確な用量は、投与経路及び疾患の重症度に依存し、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれる用量応答曲線から推定することができる。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語「Ｎ６−メチルアデノシン」、「ｍ６Ａ」、又は「ｍ６Ａ」は、細胞内のＲＮＡの窒素−６位におけるアデノシン塩基のメチル化を指す。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「被験体／対象」は、動物を指す。具体的な実施形態によれば、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモット又はマウス）、又は霊長類（例えば、サル、チンパンジー、又はヒト）を含む哺乳動物である。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「阻害剤」は、タンパク質の量又は活性を阻止又は減少させる化合物又は分子を指す。例えば、用語「阻害剤」は、タンパク質ｍＲＮＡの転写、タンパク質ｍＲＮＡの安定性、タンパク質ｍＲＮＡの翻訳、タンパク質ポリペプチドの安定性、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質の活性、タンパク質のシグナル伝達経路、又はこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現、安定性、又は活性を負に制御する化合物又は分子を指すことができる。ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、又はＷＴＡＰの阻害剤としては、タンパク質の１つ以上に結合し、それを阻害する核酸阻害剤、又はタンパク質の１つ以上の発現を低減又は阻止するアンチセンス核酸などの核酸；タンパク質の１つ以上の活性を阻害する低分子阻害剤；タンパク質の１つ以上に選択的に結合し、その活性を阻害する抗体などの、タンパク質の１つ以上に結合し、活性を阻害するペプチド又はタンパク質；タンパク質の１つ以上のレベル又は活性を低減する炭水化物、脂質、又は任意の他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様によれば、阻害剤としては、例えば、タンパク質の１つ以上を（立体的に又はその他の方法で）阻害するオリゴヌクレオチド、タンパク質の１つ以上の転写物を標的指向するｓｉＲＮＡ分子、又はタンパク質の１つ以上の活性を阻害する抗体若しくは低分子が挙げられる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、Ｎ６−アデノシン−メチルトランスフェラーゼ７０ｋＤａサブユニット又はＭＴ−Ａ７０としても知られている、用語「メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３」又は「ＭＥＴＴＬ３」は、いくつかのＲＮＡのＮ６位でアデノシン残基をメチル化し、概日時計、胚性幹細胞及び造血幹細胞の分化、皮質神経新生、ＤＮＡ損傷に対する応答、Ｔ細胞の分化、並びに初代ｍｉＲＮＡプロセシングなどの様々なプロセスを制御するＮ６−メチルトランスフェラーゼ複合体を形成する、ＭＥＴＴＬ３−ＭＥＴＴＬ１４ヘテロ二量体の構成要素を指す。ＭＥＴＴＬ３の例としては、２０３８ヌクレオチド長のｍＲＮＡ転写物によってコードされている５８０アミノ酸長のタンパク質であるヒトＭＥＴＴＬ３（ＮＭ＿０１９８５２．４）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒトＭＥＴＴＬ３のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６２８２６．２で表される。本明細書で使用するとき、用語「ＭＥＴＴＬ３」は、カニクイザル（Macaca Fascicularis）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの、ヒト以外の種由来のＭＥＴＴＬ３のホモログを含む。本明細書で使用するとき、用語「ＭＥＴＴＬ３」は、完全長野生型ＭＥＴＴＬ３の変異、例えば、点変異、断片、挿入、欠失、及びスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。用語「ＭＥＴＴＬ３」は、ＭＥＴＴＬ３アミノ酸配列の翻訳後修飾も包含する。
【００３６】
本明細書で使用するとき、ＫＩＡＡ１６２７としても知られている、用語「メチルトランスフェラーゼ様タンパク質１４」又は「ＭＥＴＴＬ１４」は、上記のＭＥＴＴＬ３−ＭＥＴＴＬ１４ヘテロ二量体の構成要素を指す。ＭＥＴＴＬ１４の例としては、３５２０ヌクレオチド長のｍＲＮＡ転写物によってコードされている４５６アミノ酸長のタンパク質であるヒトＭＥＴＴＬ１４（ＮＭ＿０２０９６１．３）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒトＭＥＴＴＬ１４のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６６０１２．１で表される。本明細書で使用するとき、用語「ＭＥＴＴＬ１４」は、カニクイザル（Macaca Fascicularis）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの、ヒト以外の種由来のＭＥＴＴＬ１４のホモログを含む。本明細書で使用するとき、用語「ＭＥＴＴＬ１４」は、完全長野生型ＭＥＴＴＬ１４の変異、例えば、点変異、断片、挿入、欠失、及びスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。用語「ＭＥＴＴＬ１４」は、ＭＥＴＴＬ１４アミノ酸配列の翻訳後修飾も包含する。
【００３７】
本明細書で使用するとき、ＫＩＡＡ１６２７としても知られている用語「ウィルムス腫瘍１関連タンパク質」又は「ＷＴＡＰ」は、上記のＭＥＴＴＬ３−ＭＥＴＴＬ１４  Ｎ６−メチルトランスフェラーゼ複合体の制御性サブユニットを指す。ＷＴＡＰの例としては、２２６５ヌクレオチド長のｍＲＮＡ転写物によってコードされている３９６アミノ酸長のタンパク質であるヒトＷＴＡＰ（ＮＭ＿００４９０６．４）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒトＷＴＡＰのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４８９７．２で表される。本明細書で使用するとき、用語「ＷＴＡＰ」は、カニクイザル（Macaca Fascicularis）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの、ヒト以外のＷＴＡＰ種のホモログを含む。本明細書で使用するとき、用語「ＷＴＡＰ」は、完全長野生型ＷＴＡＰの変異、例えば、点変異、断片、挿入、欠失、及びスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。用語「ＷＴＡＰ」は、ＷＴＡＰアミノ酸配列の翻訳後修飾も包含する。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合ヌクレオチド単位（すなわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は両方）から形成されるポリヌクレオチドを指す。このようなオリゴヌクレオチドは、既存の核酸源から得ることもでき、又は合成方法によって生成することもできる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々、約１０〜約３０個のヌクレオチド残基、好ましくは約１０〜約２５個のヌクレオチド残基、より好ましくは約１０〜約２０個のヌクレオチド残基を有する。特定の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合としては、ホスホジエステル結合、ホスホチオエート結合、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「併用される」は、対象への２つ以上の治療薬の投与との関連において、複数の治療薬の使用を指す。用語「併用される」の使用は、治療薬を対象に投与する順序について限定しない。例えば、第１の治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。あるいは、例えば、第１の治療薬及び第２の治療薬を、同じ組成物又は別個の組成物のいずれかで同時に投与してもよい。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための技術分野では公知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するとき、用語「医薬的に上許容される担体」は、本発明による組成物の効果又は本発明による組成物の生物活性を妨げない非毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、ＲＮＡオリゴヌクレオチドベースの医薬組成物で使用するのに好適な任意の医薬的に許容される担体を、本発明において使用してよい。
【００４１】
本明細書で使用するとき、用語「誘導する」及び「刺激する」並びにこれらの変形は、細胞活性の任意の測定可能な増加を指す。免疫応答の誘導は、Ｂ細胞の増殖の増加、抗原特異的抗体の産生、抗原特異的Ｔ細胞の増殖の増加、樹状細胞の抗原提示の改善、並びに／又は特定のサイトカイン、ケモカイン、及び共刺激マーカーの発現の増加を含み得る。
【００４２】
本明細書で使用するとき、用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は全て、免疫性の疾患、障害、又は病態などの免疫応答の刺激が有益である疾患に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は回復を指すことを意図するものであり、これは対象において必ずしも認識可能ではないが、対象において認識可能である場合もある。用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」はまた、疾患、障害、又は病態の退縮を生じる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。具体的な実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、ウイルス感染又は癌を含む、免疫性の疾患、障害、又は病態などの免疫応答の刺激が有益である疾患に関連する１つ以上の症状の緩和、発症若しくは発病の阻止、又は期間の短縮を指す。具体的な実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。具体的な実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。具体的な実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「免疫応答の刺激が有益である疾患」は、免疫応答の刺激が対象に利益をもたらす任意の疾患を含む。例えば、免疫応答の刺激が有益である疾患は、免疫性の疾患、障害、又は病態を含み得る。具体的な実施形態によれば、治療される疾患、障害、又は病態は、炎症性の疾患、障害、若しくは病態、自己免疫性の疾患、障害、若しくは病態、又はウイルス感染などの病原体によって引き起こされる疾患、障害、若しくは病態である。具体的な実施形態によれば、免疫応答の刺激が有益である疾患は、ＲＮＡ又はＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；ＨＢＶ、慢性ＨＢＶを含むヘパドナウイルス；黄熱病ウイルスを含むフラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含むヘパシウイルス、１及び２型単純ヘルペス、帯状疱疹、ヒトヘルペスウイルス６、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ジカウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、麻疹、パラインフルエンザウイルス、ペスチウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ライノウイルス、コロノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）；アレナウイルス、ブンヤウイルス、及びフィロウイルスを含む出血熱を引き起こす複数の科のウイルス、並びにＲＮＡ及びＤＮＡウイルスによって引き起こされる様々なウイルス性脳炎であるウイルス感染である。
【００４４】
薬剤耐性を低減する又は免疫応答を刺激する方法
一般的な態様では、本開示は、抗ウイルス剤などの薬物で治療された対象において薬物耐性を低減する方法であって、有効量の剤、例えば、開示されたオリゴヌクレオチドを当該対象に投与すること、を含む、方法に関する。ある実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドなどの剤は、対象におけるｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させ、それにより、当該対象において薬剤耐性を低減する。
【００４５】
本開示はまた、薬物で治療された対象において薬物耐性を低減する方法であって、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、及びＷＴＡＰのうちの少なくとも１つを阻害し、それにより、当該対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる有効量の剤、例えば、核酸阻害剤を当該対象に投与すること、を含む、方法を目的とする。
【００４６】
本開示は、更に、薬物で治療された対象において薬物耐性を低減する方法であって、有効量の（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを当該対象に投与すること、を含み、任意選択で当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、方法を目的とする。
【００４７】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド配列は（ＧＧＡＣＵ）ｎ（式中、ｎは２〜６である）である。
【００４８】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド配列は、（ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ）ｎ（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表し、ｎは２〜６である）である。
【００４９】
その薬物を対象に投与することによって引き起こされる当該対象において薬物耐性の存在又はレベル、及び薬剤耐性の存在又はレベルに対する剤、例えば、開示された核酸阻害剤の効果は、本開示を考慮して当該技術分野において既知の方法を使用して決定することができる。例示的な方法は、本明細書に、例えば、以下の実施例に記載される。
【００５０】
本開示の特定の実施形態によれば、抗ウイルス活性剤は、抗インフルエンザ薬（例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤、例えば、ザナミビル、オセルタミビル、タミホスホル（Tamiphosphor）、ペラミビル）、抗ＨＩＶ薬（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＣ、ＴｉＢＯ誘導体、アシクロビル、アルファ−インターフェロン）、抗ジカ薬、又は免疫刺激物質若しくは免疫調節物質（例えば、インターロイキン、サイトカイン）である。本開示の特定の実施形態によれば、抗ウイルス活性剤は、ザナミビル及びオセルタミビルから選択される抗インフルエンザ薬である。
【００５１】
別の一般的な態様では、本発明は、必要としている対象における免疫応答を刺激する方法であって、有効量の剤、例えば、開示された核酸阻害剤を当該対象に投与すること、を含む、方法に関する。ある実施形態では、開示された核酸阻害剤は、対象におけるｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させ、それにより、当該対象における免疫応答を刺激する。
【００５２】
免疫応答の刺激は、本開示を考慮して、当該技術分野において既知の方法を用いて判定することができる。例示的な方法としては、例えば、サイトカイン及びケモカインに特異的なＥＬＩＳＡ若しくは抗体を使用して免疫応答を測定すること、開示された核酸阻害剤などの剤と接触させた免疫細胞（例えば、リンパ球及び単球からなる末梢血単核球（ＰＢＭＣ））若しくはレポーター細胞の応答を測定すること、又は開示された核酸阻害剤を注射した後の動物におけるサイトカイン誘導を測定することが挙げられる。
【００５３】
対象におけるｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベル、及び対象におけるｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルに対する剤、例えば、開示された核酸阻害剤の効果は、本開示を考慮して、当該技術分野において既知の方法を用いて決定することができる。例えば、ｍ６Ａ修飾ｍＲＮＡに結合し、単離することができるＥＬＩＳＡ又は抗体を使用してｍ６Ａを測定して、その定量を可能にすることができる。例示的な方法は、本明細書に、例えば、以下の実施例に記載される。
【００５４】
ｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる剤、例えば、開示された核酸阻害剤に関して本明細書で使用するとき、有効量は、それを必要としている対象におけるｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを低減し、それにより、当該対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルスの抗ウイルス薬物耐性を低減するか、又はそれを必要としている対象における免疫応答を誘導する剤、例えば、開示された核酸阻害剤の量を意味する。また、ｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる剤、例えば、開示された核酸阻害剤に関して本明細書で使用するとき、有効量は、対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染を治療する、当該対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染の進行を阻止又は遅延させる、当該対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染に関連する症状を低減又は十分に軽減する剤、例えば、開示された核酸阻害剤の量を意味する。また、ｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる剤、例えば、開示された核酸阻害剤に関して本明細書で使用するとき、有効量は、免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、又は病態を治療する、免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、又は病態の進行を阻止又は遅延させる、免疫応答の刺激が有益である疾患、障害又は病態に関連する症状を低減又は十分に軽減する剤、例えば、開示された核酸阻害剤の量を意味する。
【００５５】
具体的な実施形態によれば、有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療薬の量を指す：（ｉ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状の重症度を低下若しくは改善する、（ｉｉ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状の期間を短縮する、（ｉｉｉ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状の進行を阻止する、（ｉｖ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状の退縮を引き起こす、（ｖ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状の発症若しくは発病を予防する、（ｖｉ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状の再発を予防する、（ｖｉｉ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状を有する対象の入院を低減する、（ｖｉｉｉ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮する、（ｉｘ）対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状を有する対象の生存率を増大させる、（ｘｉ）対象における、対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染若しくはそれに関連する症状を阻害若しくは軽減する、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療薬の予防若しくは治療効果を強化若しくは改善する。
【００５６】
他の具体的な実施形態によれば、有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療薬の量を指す：（ｉ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状の重症度を低下又は改善する、（ｉｉ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状の期間を短縮する、（ｉｉｉ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状の進行を阻止する、（ｉｖ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状の退縮を引き起こす、（ｖ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状の発症又は発病を予防する、（ｖｉ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状の再発を予防する、（ｖｉｉ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状を有する対象の入院を低減する、（ｖｉｉｉ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮する、（ｉｘ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を増大させる、（ｘｉ）免疫応答の刺激が有益である疾患、障害、若しくは病態又はそれに関連する症状を阻害又は低減する、及び／あるいは（ｘｉｉ）別の治療薬の予防又は治療効果を強化又は改善する。
【００５７】
治療有効量又は投与量は、投与手段、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、及び投与される他の医薬などの様々な要因によって変化し得る。治療用量は、安全性及び効能を最適化するために最適に漸増される。
【００５８】
本開示の核酸阻害剤などの剤の治療的使用のための投与様式は、開示された核酸阻害剤などの剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。例えば、本明細書に記載する組成物は、非経口的投与、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻孔内、若しくは頭蓋内投与に好適であるように製剤化することができ、又は、脳若しくは脊椎の脳脊髄液内に投与することができる。
【００５９】
特定の実施形態によれば、対象が抗ウイルス活性剤で治療されるウイルス感染は、ｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化によって薬剤耐性が制御される任意のウイルスによる感染である。例えば、ウイルス感染は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、エボラ、ＨＣＶ又はジカウイルスを含み得る。特定の実施形態によれば、ウイルス感染は、Ａ型インフルエンザウイルス感染、Ｂ型インフルエンザウイルス感染、又はＣ型インフルエンザウイルス感染などのインフルエンザウイルス感染である。特定の実施形態によれば、ウイルス感染は、Ａ型インフルエンザウイルス感染である。
【００６０】
特定の実施形態によれば、剤は、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、及びＷＴＡＰのうちの少なくとも１つの阻害剤である。特定の実施形態によれば、阻害剤は、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、若しくはＷＴＡＰ遺伝子のうちの１つ以上に結合するオリゴヌクレオチド、又はＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、若しくはＷＴＡＰの発現を低減若しくは阻止するアンチセンス核酸などの核酸である。特定の実施形態によれば、阻害剤は、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、又はＷＴＡＰに結合し、その活性を阻害する低分子、ペプチド、抗体、炭水化物、又は脂質である。特定の実施形態によれば、阻害剤は、タンパク質の１つ以上とＮ６−メチルトランスフェラーゼ複合体のコンセンサス配列、ＲＲｍ６ＡＣＨ（式中、Ｒは、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンである）との間の結合を遮断又は減少させる核酸阻害剤である。
【００６１】
特定の態様によれば、核酸阻害剤は、ＭＥＴＴＬ３に結合し、立体的に阻害するＲＮＡオリゴヌクレオチドである。特定の態様によれば、核酸阻害剤は、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている。特定の実施形態によれば、（ＲＲＡＣＨ）部分は、互いに隣接し、それらの間に他のヌクレオチドを有さない。特定の実施形態によれば、開示された核酸阻害剤は、ＧＧＡＣＡ、ＧＧＡＣＣ、ＧＧＡＣＵ、ＧＡＡＣＡ、ＧＡＡＣＣ、ＧＡＡＣＵ、ＡＧＡＣＡ、ＡＧＡＣＣ、ＡＧＡＣＵ、ＧＧｍ６ＡＣＡ、ＧＧｍ６ＡＣＣ、ＧＧｍ６ＡＣＵ、ＧＡｍ６ＡＣＡ、ＧＡｍ６ＡＣＣ、ＧＡｍ６ＡＣＵ、ＡＧｍ６ＡＣＡ、ＡＧｍ６ＡＣＣ、及びＡＧｍ６ＡＣＵ、又はこれらの組み合わせのうちの１つ以上、例えば、ＧＧＡＣＡＧＧＡＣＣＧＧＡＣＵ  ＧＡＡＣＡ、ＧＡＡＣＣＧＡＡＣＵ  ＡＧＡＣＡＡＧＡＣＣ、（ＧＧＡＣＡ）２（ＡＧＡＣＵ）２、ＧＡＡＣＵ（ＡＧＡＣＡ）３ＡＧＡＣＣなどを含むＲＮＡオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態によれば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ’３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなり、任意選択で当該ＲＮＡオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている。
【００６２】
好ましくは、オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの安定性を増加させるように修飾されている。特定の態様によれば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において既知の化学を使用して、１つ以上の修飾によって安定化される。例示的なヌクレオチド修飾としては、糖及び／又はリン酸骨格修飾リボヌクレオチドが挙げられる。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むように修飾され得る。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに連結するホスホジエステル基のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート基、ホスホラミエート又はチオホスホラミデートなどの修飾基によって置換される。例示的な糖修飾リボヌクレオチドでは、糖の２’ＯＨ基は、Ｈ、Ｒ、ＯＲ、ＯＲＯＲ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、又はＯＮから選択される基によって置換され、各Ｒは、独立して、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、ハロアルキル、アルケニル又はアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。特定の実施形態では、糖の２’ＯＨ基は、フルオロによって置換される。特定の実施形態では、糖の２’ＯＨ基は、フルオロによって置換される（２’フルオロ修飾）。特定の実施形態では、糖の２’ＯＨ基は、アデニン塩基を有するヌクレオシドにおけるフルオロによって置換される（２’−フルオロ−アデノシン修飾）。
【００６３】
ある実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のアデノシンは、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシ、２’−Ｏ−エチル、又は２’−Ｏ−メトキシエチルで修飾されている。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位又はリボ（下）位にあってよい。
【００６４】
他の修飾としては、２’−アミノ及び／又は２’−チオ修飾を挙げることができるが、これらに限定されない。特定の修飾としては、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２’−フルオロ−グアノシン、２’−アミノ−シチジン、２’−アミノ−ウリジン、２’−アミノ−アデノシン、２’−アミノ−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン、及び／又は５−アミノ−アリル−ウリジンが挙げられる。
【００６５】
糖変性リボヌクレオチドは、糖の他の位置、例えば５’位でも修飾され得る。更なる例示的な修飾としては、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−メチル−シチジン、リボ−チミジン、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリル−ピレン−ウリジン、５−フルオロ−シチジン、及び５−フルオロ−ウリジンが挙げられる。更なる修飾残基としては、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシド、及びリバビリンが挙げられる。複数の化学修飾を同じ分子内で組み合わせることができることを理解すべきである。ＲＮＡオリゴヌクレオチドにおける任意の１つ以上のヌクレオシドが修飾され得ることも理解すべきである。
【００６６】
特定の態様によれば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドは、２’−フルオロ−アデノシン修飾によって修飾されている。ある実施形態では、ポリヌクレオチド配列は（ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ）ｎ（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表し、ｎは２〜６である）である。特定の態様によれば、オリゴヌクレオチドは、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる。
【００６７】
特定の実施形態によれば、本開示のオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して標的指向化部分にコンジュゲートされ得る。特定の実施形態によれば、標的指向化部分は、安定性を増加させる及び／又はコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの送達を誘導する。
【００６８】
本明細書で使用するとき、用語「リンカー」は、ヌクレオチドを標的指向化部分に結合させる化学部分を指し、用語「切断可能なリンカー」は、ヌクレオチド又はそれが結合している核酸分子を本質的に変化させることなく、必要に応じてヌクレオチドから増強部分を除去するために切断され得るリンカーを指す。切断は、結合の性質に応じて、例えば、酸又は塩基処理によって、結合の酸化又は還元によって、光処理（光退色）によって達成することができる。リンカーは、例えば、単一の共有結合、置換又は非置換アルキル、置換若しくは非置換のヘテロアルキル部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、又は１つ、２つ、若しくは３つの脱塩基及び／若しくはリビトール基であってよい。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「標的指向化部分」は、そのコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの標的細胞への送達を安定化及び／又は誘導するのに好適な任意の部分を指す。特定の実施形態によれば、標的指向化部分は、脂質部分である。本明細書で使用するとき、「脂質部分」は、親油性構造を含有する部分を指す。コレステロール、トコフェロール、又は他の脂肪酸などの脂質部分は、核酸などの高度に親水性の分子に結合したとき、血漿タンパク質結合を実質的に強化し、結果として、親水性分子の循環半減期を延長することができる。
【００７０】
具体的な実施形態によれば、標的指向化部分は、対象とする特定の標的細胞型に存在する受容体に結合する。標的指向化部分は、オリゴヌクレオチドが必要な標的部位を標的指向化するのに役立つ。標的指向化部分が送達を改善することができる１つの方法は、受容体によって媒介されるエンドサイトーシス活性によるものである。この取り込み機構は、膜構造の陥入を介した、又は送達系と細胞膜との融合による、膜受容体に結合したオリゴヌクレオチドの、膜に包囲された領域の内部への移動を伴い、これは、受容体への特異的リガンドの結合後に細胞表面又は膜受容体の活性化を介して開始される。ガラクトース、マンノース、マンノース−６−リン酸などの糖、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク糖、ビタミンＢ１２、インスリン、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）などのペプチド及びタンパク質を認識するものを含む、多くの受容体によって媒介されるエンドサイトーシス系が公知であり、研究されている。
【００７１】
特定の態様によれば、対象に、抗インフルエンザ薬、抗ＨＩＶ薬、又は抗ジカウイルス薬などの抗ウイルス活性剤と組み合わせて、有効量の開示された核酸阻害剤を投与する。特定の態様によれば、対象に、ザナミビル又はオセルタミビルなどの抗インフルエンザ薬と組み合わせて、有効量の開示された核酸阻害剤を投与する。他の特定の態様によれば、対象に、免疫調節物質又は抗炎症薬と組み合わせて、有効量の開示された核酸阻害剤を投与する。特定の態様によれば、対象に、ＴＬＲ７又はＴＬＲ９のアゴニストなどの免疫調節物質と組み合わせて、有効量の開示された核酸阻害剤を投与する。
【００７２】
開示された核酸阻害剤を、単回投与スケジュールで投与してもよく、又は１〜１０回の別個の投与を含む治療の一次過程に続いて、後続の時間間隔で、例えば、２回目の投与については１〜４日、週、又は月間隔で与えられる他の投与、そして、必要に応じて、数日、数週間、又は数ヶ月後に次の投与を行う、複数回投与スケジュールとして投与してもよい。オリゴヌクレオチド、医薬組成物、及びキット
【００７３】
ある実施形態では、（ＲＲＡＣＨ）ｎのポリヌクレオチド配列は（ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ）ｎ（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表し、ｎは２〜６である）である。実施形態では、核酸阻害剤は、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなるオリゴヌクレオチドである。
【００７４】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどの開示された核酸阻害剤は、本開示を考慮して、当該技術分野において既知の方法を用いて作製することができる。例えば、開示されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、固相合成により作製することができ、例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４年；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１年（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ｍｏｄｅｒｎ  ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ）を参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、ブロッキング基、及び反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１  ａｎｄ  Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６１９４、又はその中に参照されている参照文献に記載されている。特定の開示されたオリゴヌクレオチド及びそのモノマーは、商業的に入手することもできる。
【００７５】
一般的な態様では、本開示は、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなる核酸阻害剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物に関する。
【００７６】
具体的な実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、対象への想定される投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与、皮下投与、又は筋肉内投与に好適であるように製剤化することができる。好ましい実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、静脈内又は皮下への投与に好適であるように製剤化される。
【００７７】
別の一般的な態様によれば、本出願は、本開示の核酸阻害剤などの剤と、抗ウイルス活性剤などの別の活性成分と、を含む、医薬組成物に関する。本出願の一実施形態では、医薬組成物は、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドと組み合わせて、抗インフルエンザ薬、抗ＨＩＶ薬、抗ジカウイルス薬、免疫刺激物質、又は免疫調節物質を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている。特定の態様によれば、医薬組成物中の抗インフルエンザ薬は、ザナミビル又はオセルタミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤を含む。ある実施形態では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、任意選択で１つ以上の修飾されたヌクレオシドを有する５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有し、好ましくは、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなる。
【００７８】
別の一般的な態様では、本開示は、剤又は核酸阻害剤を医薬的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ること、を含む、開示された核酸阻害剤などの剤を含む医薬組成物を作製する方法に関する。
【００７９】
別の一般的な態様では、本開示は、本開示の医薬組成物を対象に投与すること、を含む、それを必要としている対象における疾患を治療する方法であって、当該疾患が、免疫応答の刺激が有益である疾患である、方法に関する。特定の態様によれば、疾患は、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、ＨＩＶ、ライノウイルス、ＨＣＶ、及びＨＢＶによる感染などの、ウイルス感染又は疾患、障害又は病態である。
【００８０】
一般的な態様では、本開示は、開示された核酸阻害剤などの剤と、抗ウイルス活性剤などの別の活性成分と、を含むキットであって、当該開示された核酸阻害剤及び当該他の活性成分が、同じ組成物又は異なる組成物中に存在する、キットに関する。ある実施形態では、剤又は核酸阻害剤は、ｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化のレベルを減少させるのに有効である。本出願の一実施形態では、キットは、抗インフルエンザ薬、抗ＨＩＶ薬、抗ジカウイルス薬、免疫刺激物質、又は免疫調節物質と、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドと、を含み、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている。特定の態様によれば、キットは、好ましくはザナミビル及びオセルタミビルから選択されるノイラミニダーゼ阻害剤である抗インフルエンザ薬と、任意選択で１つ以上の修飾されたヌクレオシドを有する５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなり、好ましくは、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドと、を含む。
【００８１】
本出願全体で引用した全ての引用参考文献（論文参考文献、交付済み特許、公開された特許出願、及び同時係属の特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
【００８２】
実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
【００８３】
実施形態１は、薬物で治療された対象において薬物耐性を低減する方法であって、当該対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させ、それにより、当該対象において薬物耐性を低減する有効量の剤を当該対象に投与すること、を含む、方法である。
【００８４】
実施形態２は、当該剤が、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ１４、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）のうちの少なくとも１つの阻害剤である、実施形態１に記載の方法である。
【００８５】
実施形態３は、当該剤が、核酸、低分子、又は抗体若しくはその抗原結合断片などのポリペプチドである、実施形態１又は２に記載の方法である。
【００８６】
実施形態４は、当該剤が、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、任意選択で当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法である。
【００８７】
実施形態５は、ポリヌクレオチド配列が、（ＧＧＡＣＵ）ｎ（式中、ｎは、２〜６の整数である）である、実施形態４に記載の方法である。
【００８８】
実施形態６は、当該オリゴヌクレオチドが、任意選択で１つ以上のヌクレオシド修飾を含有している、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態４又は５に記載の方法である。
【００８９】
実施形態７は、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、実施形態４〜６のいずれか１つに記載の方法である。
【００９０】
実施形態８は、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが、２’−フルオロ修飾を有し、好ましくは、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のアデノシン残基が、２’−フルオロ修飾を有する、実施形態７に記載の方法である。
【００９１】
実施形態９は、当該オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態６〜８のいずれかに記載の方法である。
【００９２】
実施形態１０は、当該オリゴヌクレオチドが、リンカーを介して標的指向化部分にコンジュゲートしている、実施形態４〜９のいずれかに記載の方法である。
【００９３】
実施形態１１は、当該オリゴヌクレオチドを、静脈内又は皮下投与する、実施形態４〜１０のいずれかに記載の方法である。
【００９４】
実施形態１２は、当該対象に、当該薬物と組み合わせて有効量の当該剤を投与する、実施形態１〜１１のいずれかに記載の方法である。
【００９５】
実施形態１３は、当該薬物が、抗ウイルス薬である、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法である。
【００９６】
実施形態１４は、当該抗ウイルス薬が、抗インフルエンザ薬である、実施形態１３に記載の方法である。
【００９７】
実施形態１５は、当該抗インフルエンザ薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤である、実施形態１４に記載の方法である。
【００９８】
実施形態１６は、当該ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビル又はオセルタミビルである、実施形態１５の方法である。
【００９９】
実施形態１７は、必要としている対象における免疫応答を刺激する方法であって、当該対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させ、それにより、当該対象における免疫応答を刺激する有効量の剤を当該対象に投与すること、を含む、方法である。
【０１００】
実施形態１８は、当該剤が、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、ＭＥＴＴＬ１４、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）のうちの少なくとも１つの阻害剤である、実施形態１７に記載の方法である。
【０１０１】
実施形態１９は、当該剤が、核酸、低分子、又は抗体若しくはその抗原結合断片などのポリペプチドである、実施形態１７又は１８に記載の方法である。
【０１０２】
実施形態２０は、当該剤が、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドである、実施形態１７〜１９のいずれかに記載の方法である。
【０１０３】
実施形態２１は、ポリヌクレオチド配列が、（ＧＧＡＣＵ）ｎ（式中、ｎは、２〜６の整数である）である、実施形態２０に記載の方法である。
【０１０４】
実施形態２２は、当該オリゴヌクレオチドが、任意選択で１つ以上のヌクレオシド修飾を含有する、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態２１に記載の方法である。
【０１０５】
実施形態２３は、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、実施形態２０〜２２のいずれか１つに記載の方法である。
【０１０６】
実施形態２４は、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが、２’−フルオロ修飾を有し、好ましくは、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のアデノシン残基が、２’−フルオロ修飾を有する、実施形態２３に記載の方法である。
【０１０７】
実施形態２５は、当該オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態２２〜２４のいずれかに記載の方法である。
【０１０８】
実施形態２６は、当該オリゴヌクレオチドが、リンカーを介して標的指向化部分にコンジュゲートしている、実施形態２０〜２５のいずれかに記載の方法である。
【０１０９】
実施形態２７は、当該オリゴヌクレオチドを、静脈内又は皮下投与する、実施形態２０〜２６のいずれかに記載の方法である。
【０１１０】
実施形態２８は、当該対象に、薬物、好ましくは、抗ウイルス薬、抗炎症薬、又は免疫調節物質と組み合わせて、有効量の当該剤を投与する、実施形態１８〜２７のいずれかに記載の方法である。
【０１１１】
実施形態２９は、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなる、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【０１１２】
実施形態３０は、当該オリゴヌクレオチドが、リンカーを介して標的指向化部分にコンジュゲートしている、実施形態２９に記載のオリゴヌクレオチドである。
【０１１３】
実施形態３１は、実施形態２９又は３０に記載のオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物である。
【０１１４】
実施形態３２は、抗ウイルス活性剤、好ましくは、抗インフルエンザ薬、より好ましくは、ノイラミニダーゼ阻害剤、例えば、ザナミビル又はオセルタミビルなどの薬物と、対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる剤と、を含む医薬組成物であって、好ましくは、当該剤が、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、当該剤が、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、これは、任意選択で１つ以上のヌクレオチド修飾を含有しており、最も好ましくは、当該剤が、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドである、医薬組成物である。
【０１１５】
実施形態３３は、必要としている対象における疾患を治療する方法であって、実施形態３１又は３２に記載の医薬組成物を当該対象に投与すること、を含み、当該疾患が、免疫応答の刺激が有益である疾患である、方法である。
【０１１６】
実施形態３４は、抗ウイルス活性剤、好ましくは、抗インフルエンザ薬などの薬物と、対象におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ＲＮＡメチル化のレベルを減少させる剤と、を含むキットであって、好ましくは、当該剤が、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、当該剤が、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、これは、任意選択で１つ以上のヌクレオチド修飾を含有し、最も好ましくは、当該剤が、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドである、キットである。
【０１１７】
実施形態３５は、当該オリゴヌクレオチドと当該抗ウイルス活性剤とが、同じ組成物中に存在する、実施形態３４に記載のキットである。
【０１１８】
実施形態３６は、当該オリゴヌクレオチド及び当該抗ウイルス活性剤が、異なる組成物中に存在する、実施形態３４に記載のキットである。
【０１１９】
実施形態３７は、当該抗ウイルス活性剤が、ノイラミニダーゼ阻害剤である、実施形態３４〜３６のいずれかに記載のキットである。
【０１２０】
実施形態３８は、当該ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビル又はオセルタミビルである、実施形態３７に記載のキットである。
【０１２１】
実施形態３９は、薬物を投与された対象において薬物耐性を予防又は治療する方法であって、有効量の核酸阻害剤を当該対象に投与すること、を含む、方法である。
【０１２２】
実施形態４０は、当該核酸阻害剤が、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質１４（ＭＥＴＴＬ１４）、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）のうちの少なくとも１つの阻害剤である、実施形態３９に記載の方法である。
【０１２３】
実施形態４１は、当該核酸阻害剤が、オリゴヌクレオチドである、実施形態３９又は４０に記載の方法である。
【０１２４】
実施形態４２は、当該オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、実施形態４１に記載の方法である。
【０１２５】
実施形態４３は、当該オリゴヌクレオチドが、立体ブロッカーである、実施形態４１又は４２に記載の方法である。
【０１２６】
実施形態４４は、当該オリゴヌクレオチドが、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態４１〜４３のいずれかに記載の方法である。
【０１２７】
実施形態４５は、当該オリゴヌクレオチドが、任意選択で１つ以上のヌクレオシド修飾を含有する、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態４４に記載の方法である。
【０１２８】
実施形態４６は、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、実施形態４４又は４５に記載の方法である。
【０１２９】
実施形態４７は、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが、２’−フルオロ修飾を有し、好ましくは、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のアデノシン残基が、２’−フルオロ修飾を有する、実施形態４５又は４６に記載の方法である。
【０１３０】
実施形態４８は、当該オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態４５〜４７のいずれかに記載の方法である。
【０１３１】
実施形態４９は、当該薬物が、抗ウイルス薬である、実施形態３９〜４８のいずれかに記載の方法である。
【０１３２】
実施形態５０は、当該抗ウイルス薬が、抗インフルエンザ薬である、実施形態４９に記載の方法である。
【０１３３】
実施形態５１は、当該抗インフルエンザ薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤である、実施形態５０に記載の方法である。
【０１３４】
実施形態５２は、当該ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビル又はオセルタミビルである、実施形態５１の方法である。
【０１３５】
実施形態５３は、必要としている対象における免疫応答を刺激する方法であって、有効量の核酸阻害剤を当該対象に投与すること、を含む、方法である。
【０１３６】
実施形態５４は、当該核酸阻害剤が、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質３（ＭＥＴＴＬ３）、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質１４（ＭＥＴＴＬ１４）、及びウィルムス腫瘍１関連タンパク質（ＷＴＡＰ）のうちの少なくとも１つの阻害剤である、実施形態５３に記載の方法である。
【０１３７】
実施形態５５は、当該核酸阻害剤が、オリゴヌクレオチドである、実施形態５３又は５４に記載の方法である。
【０１３８】
実施形態５６は、当該オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、実施形態５５に記載の方法である。
【０１３９】
実施形態５７は、当該オリゴヌクレオチドが、立体ブロッカーである、実施形態５５又は５６に記載の方法である。
【０１４０】
実施形態５８は、当該オリゴヌクレオチドが、（ＲＲＡＣＨ）ｎ（式中、少なくとも１つのＲは、独立して、グアノシンであり、その他は、独立して、グアノシン又はアデノシンであり、Ａは、メチル化されているか又はメチル化されていないアデノシンであり、Ｃは、シチジンであり、Ｈは、独立して、アデノシン、シチジン、又はウリジンであり、ｎは、２〜６の整数である）のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態５５〜５７のいずれかに記載の方法である。
【０１４１】
実施形態５９は、当該オリゴヌクレオチドが、任意選択で１つ以上のヌクレオシド修飾を含有する、５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態５８に記載の方法である。
【０１４２】
実施形態６０は、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが修飾されている、実施形態５８又は５９に記載の方法である。
【０１４３】
実施形態６１は、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオシドが、２’−フルオロ修飾を有し、好ましくは、当該オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のアデノシン残基が、２’−フルオロ修飾を有する、実施形態５９又は６０に記載の方法である。
【０１４４】
実施形態６２は、当該オリゴヌクレオチドが、５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２）（式中、ｉ２ＦＡは、２’−フルオロ−アデノシンを表す）のポリヌクレオチド配列からなる、実施形態５９〜６１のいずれかに記載の方法である。
【実施例】
【０１４５】
以下の本開示の実施例は、本開示の性質について更に説明するためのものである。以下の実施例は本開示を限定するものではなく、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって定められることを理解すべきである。
【０１４６】
以下の実施例で使用される実験方法は、別途記載のない限り、全て常法である。以下の実施形態で使用される試薬は、別途記載のない限り、全て通常の試薬供給元から購入される。
【０１４７】
（実施例１）
材料及び方法
細胞ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡの抽出、及びｍ６Ａの定量
感染７日後にＭＤＣＫ上清からウイルスを回収し、２５００ｒｐｍで１０分間回転させ、ＱｉａｇｅｎウイルスＲＮＡ抽出キット（カタログ＃５２９０４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＲＮＡ濃度を測定した。２０００ｎｇの総ＲＮＡ  ｍ６Ａ定量キット（カタログ番号ＡＢ１８５９１２、Ａｂｃａｍ）を使用して、総ｍ６Ａレベルを測定した。細胞ＲＮＡを抽出するために、上清を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ抽出キット（カタログ番号７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。
【０１４８】
ＥＣ５０の決定
９６ウェルフォーマットを用いてＥＣ５０を決定した。最高濃度（各薬物のＥＣ５０に依存）を、ディープウェルブロックにおいて逐次１／３希釈した。薬物の添加後、細胞を２４時間インキュベートし、続いて、ウイルスを添加した。７２時間又は１２０時間のいずれかにわたってウイルスを細胞と共にインキュベートし、製造業者のプロトコルに従って、ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ（カタログ番号Ｇ７５７０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存率を求め、又はｍｕｎａｎａアッセイ（カタログ＃４４５７０９１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてウイルスレベルを求めた。
【０１４９】
トランスフェクション
リポフェクタミン２０００を用いて、ＭＤＣＫ細胞をトランスフェクトした。簡潔には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（カタログ番号１１６６８０１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、１ウェル当たり１００ｎＭのオリゴヌクレオチドをトランスフェクトし（対照ＲＮＡ：５’ＧＧＧＣＵＧＧＧＣＵＧＧＧＣＵＧＧＧＣＵ３’（配列番号３）；標的ＲＮＡ：５’ＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵ３’（配列番号１）；安定なＲＮＡ：５’ＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵＧＧ／ｉ２ＦＡ／ＣＵ３’（配列番号２））、２４時間インキュベートした後、培地を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに置き換えた。ＩＤＴによってオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１５０】
免疫沈降アッセイ及びウェスタンブロッティング
５’ビオチン標識オリゴを使用して、免疫沈降を行った。簡潔には、プロテアーゼ阻害剤（カタログ番号７８４３８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を補給したＮＰ４０溶解緩衝液（カタログ番号ＦＮＮ００２１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、２０×１０６個の２９３Ｔ細胞を溶解させ、溶解物を４℃で１０分間回転させ、上清を単離した。製造業者のプロトコルに従ってＢＣＡアッセイ（カタログ番号２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、総タンパク質濃度を測定した。１００μｇの総溶解物を、プロテアーゼ及びＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｃａｔ＃Ｎ８０８０１１９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を補給した１００ｎＭビオチン化オリゴと共に、ロッカー上にて４℃で１時間インキュベートし、次いで、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（カタログ番号１１２０６Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）３０μＬを加え、更に２時間インキュベートした。ビーズを氷冷ＮＰ４０溶解緩衝液で３回洗浄し、ビーズをＳＤＳサンプル緩衝液と共に１００℃で１０分間煮沸した。
【０１５１】
（実施例２）
ウイルスＲＮＡのメチル化は、ザナミビル耐性Ａ型インフルエンザウイルスと共に増加する。
【０１５２】
薬剤耐性Ａ型インフルエンザウイルスを生成するために、ＩＶＡをＭＤＣＫ細胞において逐次継代した。５×１０６個のＭＤＣＫ（カタログ番号ＣＣｌ３４、ＡＴＣＣ）細胞を６ウェルプレートに播種した。２ｎＭのＩＣ５０で出発して、ＭＯＩ及びザナミビル（カタログ番号ＳＭＬ０４９２、Ｓｉｇｍａ）で細胞にＩＶＡ／ＰＣウイルスを感染させた。細胞を目視検査し、有意な細胞変性効果が観察された後、ザナミビルの用量を増加させて次の継代を行った。約４１５ｎＭまで、継代毎に用量を２倍増加させた（図１）。野生型及び薬剤耐性ＩＶＡ及びＩＶＢウイルスにおけるｍ６Ａメチル化の可能な変化を評価するために、ウイルスＲＮＡを抽出し、上記のようにｍ６Ａ特異的ＥＬＩＳＡでｍ６Ａを測定した。各ウイルスにおいて、総ｍ６Ａの有意な増加が検出され（図２）、これは、獲得された薬剤耐性におけるｍ６Ａの役割を示唆している。
【０１５３】
（実施例３）
ＲＮＡメチル化の調節物質は薬物耐性を変化させる
３−デアザアデノシン（３ＤＺＡ）を使用してＲＮＡメチル化を変化させると、薬剤耐性ＩＶＡ（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ  ａｎｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９１）の生成が阻害されることが実証されている。この情報に基づいて、薬剤耐性の制御におけるＲＮＡ調節物質の役割を試験した。３ＤＺＡ（２５ｕＭ）を使用して、総細胞ｍ６Ａを阻害し、ＭＡ（５０μＭ）を使用して、総細胞ｍ６Ａを増加させた（Ｆｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４）。図５に示すように、ＭＡによる処理によってｍ６Ａ  ＲＮＡメチル化レベルを増加させると、ザナミビルに対するウイルス耐性が増強される。
【０１５４】
次に、３ＤＺＡ又はＭＡのいずれかの存在下で、ザナミビルによる耐性継代を行った。５×１０６個のＭＤＣＫ（カタログ番号ＣＣｌ３４、ＡＴＣＣ）細胞を６ウェルプレートに播種した。５０μＭの３ＤＺＡ（カタログ番号Ｄ８２９６、Ｓｉｇｍａ）又は１００μＭ  ＭＡ（カタログ番号Ｍ４５３１、Ｓｉｇｍａ）で細胞を処理した。２４時間後、培地を、０．３％ＦＢＳ  １０％ＰＳ及び１：５０００  ＴＰＣＫトリプシン（カタログ番号Ｔ１４２６、Ｓｉｇｍａ）を含むＭＥＭに置き換え、各ウェルを様々なＭＯＩ及びザナミビル濃度（カタログ番号ＳＭＬ０４９２、Ｓｉｇｍａ）でＩＶＡ／ＰＣウイルスに感染させた。細胞を目視検査し、有意な細胞変性効果が観察された後、ザナミビルの用量を増加させて次の継代を行った。ｍ６Ａ  ＥＬＩＳＡを使用して、ｍ６Ａのレベルを測定した。図５に示すように、ＭＡではＩＣ５０の増加（１．６８ｕＭ）が、３ＤＺＡでは、ＩＣ５０の減少（０．０６１８ｕＭ）が観察された。
【０１５５】
ＭＤＣＫ細胞を３ＤＺＡ及びＭＡで処理した後、ウイルスＲＮＡ中の総ｍ６Ａレベルを測定した。図３に示すように、ＭＡ処理細胞におけるｍ６Ａの増加及び３ＤＺＡ処理細胞におけるｍ６Ａの減少が観察され、これは、宿主のメチルトランスフェラーゼを標的指向化することも、ウイルスＲＮＡ中のｍ６Ａレベルを変化させることを示唆している。ザナミビル耐性Ａ型インフルエンザウイルスは、耐性を直接的に引き起こす変異を有することが示された。
【０１５６】
（実施例４）
オリゴヌクレオチド立体ブロッカーによるＭＥＴＴＬ３の標的指向化
ＲＮＡメチル化調節物質ＭＡ及び３ＤＺＡを使用して薬剤耐性の変化が観察されたため、ＭＥＴＴＬ３活性を競合的に阻害することができるＧＧＡＣＵの４回反復配列で構成されたオリゴヌクレオチド阻害剤を設計した（図６）。
【０１５７】
ｍ６Ａの阻害を判定するために、ＭＤＣＫ及び２９３細胞を、１００ｎＭの対照、標的又は安定なオリゴのいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後にｍ６Ａのレベルを測定した。安定なオリゴでトランスフェクトされたＭＤＣＫ及び２９３細胞においてそれぞれ、ｍ６Ａレベルの８０％又は５０％阻害が観察された（図７）。
【０１５８】
２９３総細胞溶解物中でインキュベートされた３’−ビオチン標識オリゴによるＲＮＡプルダウンアッセイを使用して、標的配列がＭＥＴＴＬ３に結合したかどうかを試験した。図６に示すように、本開示の実施形態によるＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてＭＥＴＴＬ３に結合することができるが、ＭＥＴＴＬ１４に結合することはできない。
【０１５９】
（実施例５）
オリゴヌクレオチド立体ブロッカーによる宿主ＭＥＴＴＬ３の標的指向化は、ザナミビル耐性を阻害する
効率的なＭＥＴＴＬ３の結合及び宿主ｍ６Ａの阻害は、本開示の実施形態によるＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＭＥＴＴＬ３の立体ブロッカーとして機能することができ、薬物耐性を阻害するためにザナミビルなどの抗ウイルス活性剤と共に補助剤として使用できることを示唆した。これを試験するために、ＭＤＣＫ細胞を、単独で又はザナミビルと組み合わせて標的又は安定なオリゴ（図９）で処理し、１０ラウンドの選択後にＥＣ５０レベルを求めた。図９に示すように、対照と比較して、標的又は安定なオリゴのいずれかで前処理された細胞による薬物耐性の低減（スクランブル：３３７ｎＭ対標的：８ｎＭ及び安定：７０ｎＭ）が観察された。更に、対応するウイルスＲＮＡにおけるｍ６Ａメチル化の付随的な減少が観察され（図８）、これは、この変化がウイルスＲＮＡ  ｍ６Ａレベルの変化によるものであることを示唆している。
【０１６０】
以上、本発明を詳細に、その具体的な実施形態を参照して説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本開示において様々な変更及び改変を行い得ることが当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】
2021518372.tif 000003
【図１Ｂ】
2021518372.tif 000004
【図２】
2021518372.tif 000005
【図３】
2021518372.tif 000006
【図４】
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【図５】
2021518372.tif 000008
【図６】
2021518372.tif 000009
【図７Ａ】
2021518372.tif 000010
【図７Ｂ】
2021518372.tif 000011
【図８】
2021518372.tif 000012
【図９】
2021518372.tif 000013
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021518372.tif 000015
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