(57)【要約】  本発明は、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法に関し、当該方法は、被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定すること、当該遺伝子発現プロファイルに基づいて当該被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、当該被験体の発現に基づくリスクスコア及び術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定することを含む。これにより、術前の状況において、被験体の層別化が改善され、一次治療をより良好に決定しうる。例えば、手術前の予後リスクスコアは、前立腺がん患者の特定の亜集団に対して積極的監視対積極的治療介入（例えば、根治的前立腺摘除術）を選択するか否かに関して、より優れた提案を行いうる。
2021506326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法であって、以下の：
被験体から得られた生物学的試料におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定すること、
前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、かつ
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
術前臨床変数は、（ｉ）被験体の年齢、（ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル、（ｉｉｉ）一次及び二次の生検グリソンスコア、（ｉｖ）臨床病期、及び（ｖ）腫瘍陽性生検の割合、のうちの１又はそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、
被験体の術前前立腺リスク評価（ＣＡＰＲＡ）スコアの決定すること、を含み、
ここで、術前予後リスクスコアは、発現に基づくリスクスコアと前記術前ＣＡＰＲＡスコアとを組み合わせることにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
発現に基づくリスクスコア及び術前ＣＡＰＲＡスコアが、前立腺がん被験体の集団から得られた回帰関数と組み合わされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
術前の予後リスクスコアが、被験体に対する改変術前前立腺リスク評価（ＣＡＰＲＡ）スコアとして決定され、ここで、一次及び二次の生検グリソンスコアは、発現に基づくリスクスコアに置換される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
発現に基づくリスクスコアは、所定の範囲の値であり、前記値に応じて、改変術前ＣＡＰＲＡスコアに０〜３の範囲のポイントが加算される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、以下の：
術前の予後リスクスコアに基づいて、被験体に一次治療を提案すること、を含み、
ここで、前記一次治療は、（ｉ）少なくとも前立腺部分切除術；（ｉｉ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びそれらの併用から選択される積極的治療；及び（ｉｉｉ）積極的監視からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
さらに、以下の：
遺伝子発現プロファイルを、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリンα１ｂ（Ｔｕｂｕｌｉｎ−Ａｌｐｈａ−１ｂ；ＴＵＢＡ１Ｂ）、ホモサピエンスｐｕｍｉｌｉｏＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ｐｕｍｉｌｉｏ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ；ＰＵＭ１）、及びホモサピエンスＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択される、１又はそれ以上の対照遺伝子に関して、正規化すること、を含み、
ここで、発現に基づくリスクスコアは、前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
１又はそれ以上の対照遺伝子が、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰの少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又はすべてを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
発現に基づくリスクスコアが、スコアリング機能を用いて、遺伝子発現プロファイルに基づいて決定され、ここで、前記スコアリング機能は、前立腺がん被験体の生物学的試料の遺伝子発現プロファイルから得られた、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子発現プロファイルの決定は、生物学的試料から抽出されたＲＮＡに対してＲＴ−ｑＰＣＲを実施することを含み、ここで、Ｃｑ値は、ＰＤＥ４Ｄ７及び前記１又はそれ以上の対照遺伝子各々について決定され、かつ、前記発現に基づくリスクスコアの決定は、前記１又はそれ以上の対照遺伝子各々について前記Ｃｑ値を用いてＰＤＥ４Ｄ７の前記Ｃｑ値を正規化すること、及び前記正規化されたＣｑ値の線形関数として前記発現に基づくリスクスコアを計算すること、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子発現プロファイルが、さらに、ホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体５（ＰＤＥ４Ｄ５）及び／又はホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体９（ＰＤＥ４Ｄ９）由来の発現情報を含み、発現に基づくリスクスコアは、前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、前記ホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体各々について被験体について決定され、かつ、前記被験体の術前予後リスクスコアは、前記被験体の前記発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の前記術前臨床変数に基づいて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
診断キットであって、以下の：
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定する、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；及び
場合によっては、ホモサピエンスヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリンα１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ホモサピエンスｐｕｍｉｌｉｏＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びホモサピエンスＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択される１又はそれ以上の対照遺伝子の遺伝子発現プロファイルを決定する、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；かつ、
場合によっては、前記被験体から得られた生物学的試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルを測定する、少なくとも１つの薬剤；かつ、
場合によっては、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて術前予後リスクスコアを算出する命令を含み、
ここで、前記命令は、場合によっては、コンピュータにより実行される場合に、以下の工程：
前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルに基づいて、前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、及び
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む方法を実行するコンピュータプログラムに記憶されていてもよく、
場合によっては、前記方法は、以下の：
１又はそれ以上の前記対照遺伝子に関して前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルを正規化することを含み、
ここで、前記発現に基づくリスクスコアは、前記ＰＤＥ４Ｄ７の正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定され、
場合によっては、前記術前の臨床変数が、前記前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルを含む、
診断キット。
【請求項１４】
前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法における、請求項１３に記載のキットの使用。
【請求項１５】
前立腺がん被験体の術前リスク層別化におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルの使用であって、以下の：
被験体から得られた生物学的試料における遺伝子発現プロファイルを決定すること、
遺伝子発現プロファイルに基づいて被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、かつ、
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む、使用。
【請求項１６】
コンピュータによりプログラムが実行される場合に、前記コンピュータに以下の：
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定すること、
前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、かつ、
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む方法を実行させる命令を含む、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法に関する。さらに、本発明は、診断キット、前立腺がん被験体の術前リスク層別化方法における当該キットの使用、前立腺がん被験体の術前リスク層別化におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルの使用、及び対応するコンピュータプログラム製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、一群の細胞が制御不能な増殖、浸潤、及び場合により転移を示す疾患の一種である。これら３つのがんの悪性度は、自己限定性で浸潤も転移もしない良性腫瘍から区別される。前立腺がん（ＰＣａ）は、男性に最も頻発する皮膚以外の悪性腫瘍である。当該疾患は、致死病型へと進行する可能性が様々で、不均一な疾患とみられる。ヨーロッパにおける推定年間４１７，０００例の新規症例のうち、約９２，０００例が当該疾患により死亡すると考えられる（非特許文献１）。
【０００３】
臨床的には、術前リスク分類の様々なスキームが、長期的な生物学的転帰に基づいて開発されている（非特許文献２）。積極的監視（ＡＳ）は、極めて低リスク及び低リスクの前立腺がん男性に対する様々な国内及び国際的なガイドライン（非特許文献３）により推奨されているが、この患者集団には、一次治療後にがんの再発リスクが１０〜２５％である有意なサブグループが存在する（例えば、非特許文献４）。当該患者は、通常、生化学的再発により誘発されるフォローアップ治療の負担を負う。同様に、中等度リスク群では、生化学的進行のリスクが低い部分集団が存在する（例えば、非特許文献５）。それにもかかわらず、当該グループは不均一であり、侵襲性の病理学的特徴を有する患者を含む、様々な転帰を有する患者を含む  (非特許文献６を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ferlay  J.  et  al.,  GLOBOCAN  2012  v1.0,  Cancer  Incidence  and  Mortality  Worldwide:  IARC  CancerBase  No.  11  [Internet],  Lyon,  France,  International  Agency  for  Research  on  Cancer,  2013
【非特許文献２】Rodrigues  G.  et  al.,  “Pre-treatment  risk  stratification  of  prostate  cancer  patients:  A  critical  review”,  Canadian  Urological  Association  Journal,  Vol.  6,  No.  2,  pages  121-127,  2012
【非特許文献３】Mohler  J.  et  al.,  “NCCN  clinical  practice  guidelines  in  oncology:  Prostate  cancer,  Version  1.2016”,  Journal  of  the  National  Comprehensive  Cancer  Network,  Vol.  14,  No.  1,  pages  19-30,  2016
【非特許文献４】Hernandez  D.J.  et  al.,  “Contemporary  evaluation  of  the  D’amico  risk  classification  of  prostate  cancer”,  Journal  of  Urology,  Vol.  70,  No.  5,  pages  931-935,  2007
【非特許文献５】Jung  J.W.  et  al.,  “Stratification  of  patients  with  intermediate-risk  prostate  cancer”,  BJU  International,  Vol.  115,  No.  6,  pages  907-912,  2015
【非特許文献６】Abern  M.R.  et  al.,  “Delayed  radical  prostatectomy  for  intermediate-risk  prostate  cancer  is  associated  with  biochemical  recurrence:  Possible  implications  for  active  surveillance  from  the  SEARCH  database”,  The  Prostate,  Vol.  73,  No.  4,  pages  409-417,  2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臨床リスクの記述子は、すべての患者について、疾患の程度又はその侵攻性を効果的に描出するものではない。したがって、一次治療の決定を最適化するためには、患者の層別化がより良好であることが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、一次治療の決定をより良好にしうる、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、診断キット、前立腺がん被験体の術前リスク層別化方法における当該キットの使用、前立腺がん被験体の術前リスク層別化におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルの使用、及び対応するコンピュータプログラム製品を提供することである。
【０００７】
本発明の第１局面では、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法が提示され、以下の：
被験体から得られた生物学的試料におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定すること、
前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び被験体の術前臨床変数に基づいて、被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、を含む方法が提供される。
【０００８】
ｃＡＭＰシグナル伝達経路は、前立腺がんの発生と進行に重要な役割を果たすことが公知である(Merkle  D.  and  Hoffmann  R.,  “Roles  of  cAMP  and  cAMP-dependent  protein  kinase  in  the  progression  of  prostate  cancer:  Cross-talk  with  the  androgen  receptor”,  Cellular  Signalling,  Vol.  23,  No.  3,  pages  507-515,  2011を参照。ｃＡＭＰの合成にはアデニル酸シクラーゼファミリーが関与するが、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）はその分解の唯一の細胞機構であるようだ。ＰＤＥは、シグナル終結と、重要なことに、細胞の３Ｄマトリクス内でのｃＡＭＰシグナル伝達の区画化をともにもたらす。これは、局在化したアンカータンパク質／シグナロソームにより隔離された他のＰＤＥアイソフォームの亜集団を介した空間的に不連続なｃＡＭＰの破壊により達成される(例えば、Conti  M.  and  Beavo  J.,  “Biochemistry  and  physiology  of  cyclic  nucleotide  phosphodiesterases:  essential  components  in  cyclic  nucleotide  signaling”,  Annual  Review  of  Biochemistry,  Vol.  76,  pages  481-511,  2007を参照)。このように、異なるＰＤＥアイソフォームの発現及び／又は活性の変化により、疾患の発症及び進行中に下流のシグナル伝達経路が変化する可能性があり、新たなバイオマーカー及び標的治療の治療介入の標的となる可能性がある。実際、ｃＡＭＰ分解ＰＤＥ４ファミリーメンバーの発現の変化は、脳卒中、肢端骨症、統合失調症、及びＣＯＰＤを含む多くの様々な疾患と関連するようだ。最近、特定のＰＤＥ４アイソフォーム（ＰＤＥ４Ｄ７）のダウンレギュレーションは、前立腺がんに影響を及ぼす可能性があることが示された（例えば、Boettcher  R.  et  al.,“Human  phosphodiesterase  4D7  (ＰＤＥ４Ｄ７)  expression  is  increased  in  TMPRSS2-ERG  positive  primary  prostate  cancer  and  independently  adds  to  a  reduced  risk  of  post-surgical  disease  progression”,  Britisch  Journal  of  Cancer,  Vol.  113,  No.  10,  pages  1502-1511,  2015を参照)。ＰＤＥ４Ｄ７アイソフォームは、ＵＣＲ１及びＵＣＲ２調節ドメインをともに含む、いわゆる長アイソフォームである。ＵＣＲ１は長いＰＤＥ４アイソフォームに存在するが、短い同アイソフォームには見られず、ＰＫＡやＭＫ２を含む様々なプロテインキナーゼによる調節が可能となり、またＥＲＫによる触媒ユニットのリン酸化の機能的結果を決定する。機能的には、ｃＡＭＰに対する細胞脱感作システムの部分を提供し、例えば、ＥＲＫ及びＡＭＰＫの活性化につながるシグナル伝達経路間のクロストークが可能となる。
【０００９】
ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルに基づいて前立腺がん被験体の発現に基づくリスクスコアを決定することにより、疾患の生物学を表す追加の分子情報が得られる。ＰＤＥ４Ｄ７の予後的検出力は、被験体の術前臨床変数のみならず、発現に基づくリスクスコアに基づいた術前予後リスクスコアを決定することにより、術前患者リスク評価に利用される。これにより、術前の状況において、被験体の層別化が改善され、一次治療をより良好に決定しうる。例えば、手術前の予後リスクスコアは、前立腺がん患者の特定の亜集団に対して積極的なサーベイランス対積極的治療介入（例えば、根治的前立腺摘除術）を選択するか否かに関して、より優れた提案を行いうる。
【００１０】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ７」又は「ＰＤＥ４Ｄ７」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体７、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ７遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１６５８９９．１で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ７転写物の上記に示されたＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１９で表されるヌクレオチド配列、及びまたＰＤＥ４Ｄ７ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００１１５９３７１．１で特定されるタンパク質配列に対応する、配列番号２０で表される、対応するアミノ酸配列に関する。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ７」又は「ＰＤＥ４Ｄ７」はまた、プライマー対ＰＤＥ４Ｄ７＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２１）及びＰＤＥ４Ｄ７＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号２２）により生成されうる、かつプローブ配列番号２３により検出しうるするアンプリコンに関する。
【００１１】
ＰＤＥ４Ｄ７ポリペプチドはまた、プライマー対ＰＤＥ４Ｄ７−２＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２４）及びＰＤＥ４Ｄ７＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号２５）で検出することができ、またプローブ配列番号２６により検出することができる。
【００１２】
用語「ＰＤＥ４Ｄ７」はまた、ＰＤＥ４Ｄ７に対して高度の相同性を示すヌクレオチド配列を含み、例えば、核酸配列が配列番号１９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、又はアミノ酸配列が配列番号２０に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、又はアミノ酸配列をコードする核酸配列が配列番号２０に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である。又は核酸配列によりコードされるアミノ酸配列が、配列番号１９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【００１３】
用語「生物学的試料」又は「被験体から得られた試料」は、被験体、例えば前立腺がん患者から当業者に公知の適当な方法を介して得られたいかなる生物学的物質をも意味する。用いられる生物学的試料は、例えば、核酸（特にＲＮＡ）又はタンパク質が保存される方法で、臨床的に許容される方法で収集されてよい。
【００１４】
生物学的試料は、体組織及び/又は血液、汗、及び尿等の流体を含んでもよいが、これらに限定されない。さらに、生物学的試料は、がん性上皮細胞又はがん性であることが疑われる組織に由来する上皮細胞等の上皮細胞に由来する細胞抽出物、又はそれらを含む細胞集団を含んでよい。生物学的試料は、腺組織に由来する細胞集団を含んでよく、例えば、試料は、男性被験体の前立腺に由来してよい。さらに、必要に応じて、得られた体組織及び体液から細胞を精製し、次いで、生物学的試料として用いてよい。いくつかの態様では、試料は、組織試料、尿試料、尿沈渣試料、血液試料、唾液試料、精液試料、循環腫瘍細胞を含む試料、細胞外小胞、前立腺分泌エキソソームを含む試料、又は細胞株もしくはがん細胞株でありうる。
【００１５】
一つの特定の態様では、生検又は切除試料が得られ、及び／又は用いられてよい。当該試料は、細胞又は細胞溶解物を含んでよい。
【００１６】
また、生物学的試料の内容物が濃縮工程に供されることも考えられる。例えば、試料は、特定の細胞型、例えば、前立腺細胞の細胞膜又は細胞小器官に特異的なリガンド、例えば、磁性粒子で機能化されたリガンドと接触してよい。その後、磁性粒子により濃縮された材料を、上記又は以下に記載されるように、検出及び分析工程に用いてよい。
【００１７】
さらに、細胞、例えば、腫瘍細胞は、流体又は液体試料、例えば、血液、尿等の濾過プロセスを介して濃縮されてよい。当該濾過プロセスはまた、上記のように、リガンド特異的相互作用に基づく濃縮工程と組み合わせることができる。
【００１８】
用語「前立腺がん」は、前立腺の細胞が突然変異し、制御できない状態で増殖し始めたときに生じる、男性生殖器系の前立腺のがんをいい、通常、前立腺がんは、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の上昇レベルに関連する。本発明の一実施形態では、用語「前立腺がん」は、ＰＳＡレベルが４．０を超えるがんに関する。他の実施形態では、用語「ＰＳＡレベル」は、ＰＳＡレベルが２．０を超えるがんに関する。用語「ＰＳＡレベル」は、血中のＰＳＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）をいう。
【００１９】
用語「非進行性前立腺がん状態」は、個体の試料が「生化学的再発」及び／又は「臨床的再発」を示すパラメータ値を示さないことをいう。
【００２０】
用語「進行性前立腺がん状態」は、個体の試料が「生化学的再発」及び／又は「臨床的再発」を示すパラメータ値を示すことをいう。
【００２１】
用語「生化学的再発」は、一般に、試料中の前立腺がん細胞の存在を示す、ＰＳＡが上昇した、再発した生物学的値を指す。しかしながら、当該存在の検出に用いうる、又は当該存在が疑われる他のマーカーを用いることもまた可能である。
【００２２】
用語「臨床的再発」とは、例えば、インビボイメージングを用いて測定される腫瘍細胞の存在を示す臨床的徴候の存在をいう。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語「前立腺がんを予知する」は、例えば、特定期間中、治療中又は治療後の、診断された又は検出された前立腺がんの経過又は転帰の予測をいう。当該用語はまた、生存又は疾患の治癒の可能性の決定、並びに被験体の予期生存時間の予測をいう。予後は、具体的には、６ヵ月、１年、２年、３年、５年、１０年、又はその他の期間等、将来にわたって被験体が生存する可能性を確立することを含んでよい。
【００２４】
術前臨床変数は、（ｉ）被験体の年齢、（ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル、（ｉｉｉ）一次及び二次の生検グリソンスコア、（ｉｖ）臨床病期、及び（ｖ）腫瘍陽性生検の割合、のうちの１又はそれ以上を含むことが好ましい。
【００２５】
原発性限局性前立腺がんの治療法の決定は、主に将来の疾患進行リスクと平均余命の組み合わせに依存する。ガイドライン策定組織（ＮＣＣＮ）は、術前の臨床変数に基づいて５つのリスクカテゴリーを定義する(非特許文献３を参照)。非常に低い、低い、中間の(中間のうち良好側と不良側に二分される)、高い、非常に高いリスクの各リスク群について、治療介入に関するいくつかの選択肢が現行の実践前立腺がんガイドラインで提示されている。臨床的リスク予測のより高度なツールは、以前臨床変数の価値を単一のスコアに統合する数学的モデルの形で提示されている(Lughezani  G.  et  al.,  “Predictive  and  prognostic  models  in  radical  prostatectomy  candidates:  A  critical  analysis  of  the  literature”.  European  Urology,  Vol.  58,  No.  5,  pages  687-700,  2010を参照)。術前の意思決定支援の最も広範に検証された臨床的リスクアルゴリズムの一つは、術前ＣＡＰＲＡスコア(Cooperberg  M.R.,  “The  UCSF  Cancer  of  the  Prostate  Risk  Assessment  (ＣＡＰＲＡ)  Score:  A  straightforward  and  reliable  pre-operative  predictor  of  disease  recurrence  after  radical  prostatectomy”,  Journal  of  Urology,  Vol.  173,  No.  6,  pages  1938-1942,  2005を参照)である。当該スコアは、臨床的に利用可能な情報、すなわち、患者の年齢、術前ＰＳＡ、グリソン生検、腫瘍生検陽性率、及び臨床病期の組み合わせである。２００５年にこのスコアが初めて発表されて以来、いくつかの研究で検証されている（Brajtbord  J.S.  et  al.,  “The  ＣＡＰＲＡ  score  at  10  years:  Contemporary  perspectives  and  analysis  of  supporting  studies”,  European  Urology,  Vol.  71,  No.  5,  pages  705-709,  2017を参照）。発現に基づくリスクスコアにより提供される分子情報を、このような広範に検証された術前の臨床変数由来の情報と組み合わせることにより、術前の予後リスクスコアが得られ、予後的検出力が改善される。
【００２６】
本方法はまた、好ましくは、さらに以下の：
被験体の術前前立腺リスク評価（ＣＡＰＲＡ）スコアの決定、を含み、ここで、術前の予後リスクスコアは、発現に基づくリスクスコアと術前のＣＡＰＲＡスコアとを組み合わせることにより決定される。
【００２７】
上記のように、術前ＣＡＰＲＡスコアは、前立腺がんの術前の意思決定支援の最も広範に検証された臨床リスクアルゴリズムのひとつである。カテゴリースコアは１〜１０で、低リスク（術前ＣＡＰＲＡスコア０〜２）、中リスク（術前ＣＡＰＲＡスコア３〜５）、高リスク（術前ＣＡＰＲＡスコア６〜１０）の３群に分類される。現在、前立腺がんの予後予測アルゴリズムとしての妥当性が確認されており、また、その解釈が容易な単一スコアの出力を考慮すると、術前ＣＡＰＲＡスコアは、有利には、発現に基づくリスクスコアと組み合わせて、臨床現場で容易に判定され、術前ＣＡＰＲＡアルゴリズムの単独使用と比較して術前予後がさら改善されうる術前予後リスクスコアである。
【００２８】
発現に基づくリスクスコア及び術前ＣＡＰＲＡスコアは、前立腺がん被験体の集団に由来する回帰関数と組み合わせることがさらに好ましい。
【００２９】
回帰分析は、独立変数のいずれかが変化し、他の独立変数が固定されている場合、従属変数（又は「基準変数」）の典型的な値がどのように変化するかを理解するのに役立つ。従属変数と独立変数の間のこの関係は回帰関数で捉えられ、独立変数の値が与えられた場合、従属変数を予測するのに用いることができる。従属変数は、例えば、手術後５年以内の生化学的再発等の二値変数でありうる。この場合、回帰は独立変数のロジット関数に基づくロジスティック回帰であり、式に基づくリスクスコア及び術前ＣＡＰＲＡスコアを含むか、又はからなる。回帰関数により、例えば、手術後５年の生化学的再発リスクの改善予測が可能であろう。
【００３０】
他の方法では、術前の予後リスクスコアは、好ましくは、被験体の改変術前前立腺リスク評価（ＣＡＰＲＡ）スコアとして決定され、この場合、一次及び二次の生検グリソンスコアは、発現に基づくリスクスコアにより置換される。
【００３１】
生検グリソンスコアは、一方で術前ＣＡＰＲＡスコアに有意な影響を及ぼす。しかしながら、同時に、本発明者は、グリソンスコアリングが病理学者間で実質的に変動しやすいことを見出した。術前ＣＡＰＲＡスコア内の生検グリソンスコアの情報を、発現に基づくリスクスコアにより提供される分子情報に置換することにより、改変術前ＣＡＰＲＡスコアが得られるが、これは信頼性がより高く、異なる病理学者により提供される評価のばらつきに影響されにくい。
【００３２】
さらに、発現に基づくリスクスコアは、所定の範囲の値であることが好ましく、ここで、値に応じて、改変術前ＣＡＰＲＡスコアに０〜３の範囲のポイント数が加算される。
【００３３】
一次及び二次の生検グリソンスコアは、術前ＣＡＰＲＡスコアでは以下のように考慮される：一次及び二次の生検グリソンスコアがともに１〜３の範囲にある場合、改変術前ＣＡＰＲＡスコアにポイントは加算されない。あるいは、一次生検グリソンスコアが１〜３の範囲で、二次生検グリソンスコアが４〜５の範囲である場合では、改変後の術前ＣＡＰＲＡスコアには１ポイントが加算される。最後に、一次生検グリソンスコアが４〜５の範囲で、二次生検グリソンスコアが１〜５の範囲の場合、改変術前ＣＡＰＲＡスコアに３ポイントが加算される。発現に基づくリスクスコアの値に応じて、改変術前ＣＡＰＲＡスコアの０〜３の範囲の多数のポイントを加えることにより、得られた改変術前ＣＡＰＲＡスコアの全体構造は、最小合計スコア０及び最大合計スコア１０と同様に保持されうる。
【００３４】
好ましい一例では、発現に基づくリスクスコアは、１〜５の範囲の値であり、値が１〜２未満の範囲の場合には改変術前ＣＡＰＲＡスコアに３ポイントが加算され、値が２〜＜３の範囲の場合には２ポイントが加算され、値が３〜＜４の範囲の場合には１ポイントが加算され、値が４〜＜５の範囲の場合にはポイントは加算されない。
【００３５】
本方法は、好ましくは、さらに、以下の：
術前の予後リスクスコアに基づいて、被験体に一次治療を提案すること、を含み、
ここで、前記一次治療は、（ｉ）少なくとも前立腺部分切除術；（ｉｉ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びそれらの併用から選択される積極的治療；及び（ｉｉｉ）積極的監視からなる群から選択される。
【００３６】
上記のように、様々な国内及び国際的なガイドラインは、将来の疾患進行リスク及び平均余命に応じて、一人の前立腺がん被験体に対して様々な治療を提案する。例えば、非常に低リスク及び低リスクの前立腺がんでは、一般に積極的監視（ＡＳ）が提案されるが、高リスクのがんでは根治的前立腺摘除術が提示される。しかしながら、上記のように、既公知の臨床的リスク記述子は、すべての患者について、疾患の範囲又は侵攻性を効果的に描出するとは限らない。例えば、ＮＣＣＮの極低リスク群及び低リスク群では、明らかに一次治療後にがんが１０〜２５％再発するリスクのある患者集団が有意に多い。同様に、中間リスク群では、生化学的進行のリスクが低い亜集団が存在することが知られている。手術前の予後リスクスコアに基づいて被験体に対する一次治療を提案することにより、例えば、積極的監視対積極的治療介入（例えば、根治的前立腺全摘除術）を選択するか否かに関して、前立腺がん患者の特定の亜集団により優れた提案を行いうる。
【００３７】
さらに好ましくは、本方法は以下の：
ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）１（ＨＰＲＴ１）、チューブリンα１ｂ（Ｔｕｂｕｌｉｎ−Ａｌｐｈａ−１ｂ；ＴＵＢＡ１Ｂ）、ホモサピエンスｐｕｍｉｌｉｏＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びホモサピエンスＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択される１又はそれ以上の対照遺伝子の遺伝子発現プロファイルを正規化することを含み、ここで、発現に基づくリスクスコアは正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定される。
【００３８】
１又はそれ以上の対照遺伝子の遺伝子発現プロファイルを正規化することにより、及び発現に基づくリスクスコアを、正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定することにより、発現に基づくリスクスコアの決定における変動性を低減することができる。これにより、遺伝子発現プロファイルの実際の変動と測定プロセスによる変動とを区別することができる。この点で、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰは、ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子発現プロファイルを正規化する対照遺伝子として、特に適することが見出されている。
【００３９】
遺伝子発現プロファイルは、１又はそれ以上のプライマー及び／又はプローブ及び／又はそれらの１又はそれ以上のセットを用いて、ｍＲＮＡ発現を検出することにより決定することができる。さらに、当該遺伝子発現プロファイルは、増幅ベースの方法及び／又はマイクロアレイ分析及び／又はＲＮＡ配列決定により決定することができる。当該遺伝子発現プロファイルの決定としては、生物試料から抽出したＲＮＡに対してリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ｑＰＣＲ）があげられる。他の態様では、遺伝子発現プロファイルは、ＲＮＡ配列決定、従来型ＰＣＲ（例えば、ゲル電気泳動によるエンドポイント分析を使用）、又はマルチプレックスＰＣＲにより決定される。ＲＴ−ｑＰＣＲの場合、遺伝子発現プロファイルの決定は、ＰＤＥ４Ｄ７及び１又はそれ以上の対照遺伝子各々の閾値サイクル値を決定することを含んでよい。ＰＣＲは、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰから選択される対照遺伝子測定用の少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブを用いて行うことができる。
【００４０】
１又はそれ以上の対照遺伝子は、好ましくは、少なくとも２つ、又は少なくとも３つのＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰを含む。特に好ましい態様では、１又はそれ以上の対照遺伝子は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰの全てを含む。
【００４１】
ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子発現プロファイルを正規化するために追加的又は代替的に用いられてよい他の対照遺伝子としては、ホモサピエンスアクチンベータｍＲＮＡ（ＡＣＴＢ）；ホモサピエンス６０Ｓ酸性リボソームリン酸化タンパク質Ｐ０ｍＲＮＡ（ＲＰＬＰ０）；ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ指向性）ポリペプチドＡ、２２０ｋＤａ（ＰＯＬＲ２Ａ）；ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；及びアミノレブリン酸−デルタ−シンターゼ（ＡＬＡＳ−１）があげられる。
【００４２】
発現に基づくリスクスコアは、さらに好ましくは、前立腺がん被験体の生物学的試料についての遺伝子発現プロファイルから導かれた遺伝子発現プロファイルに基づいて、スコアリング機能を用いて決定される。
【００４３】
本明細書では、スコアリング機能は、特に好ましくは、正規化された遺伝子発現プロファイル、例えば、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰの全てに関して正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、かつ当該スコアリング機能は、前立腺がん被験体の生物学的試料に対応する正規化された遺伝子発現プロファイルから導かれる。一つの好ましい態様例では、スコアリング機能は、正規化された遺伝子発現プロファイルを、上記の１〜５の範囲等の所定の範囲の値に変換する線形変換である。当該変換は、前立腺がん被験体の集団の生物学的試料のＰＤＥ４Ｄ７に関する正規化された遺伝子発現プロファイル値の頻度分布を考慮することにより、かつ、頻度分布を所望の範囲に変換する変換を決定することにより、決定することができる。当該スコアリング関数を用いることにより、発現に基づくリスクスコアは、正の低値の範囲である場合のように、ユーザが直感しうる方法で表現することができる。これは、例えば組織病理学的悪性度分類（グレソン；Ｇｌｅａｓｏｎ）又はマルチパラメトリックＭＲＩ放射線スコアリング（ＰＩＲＡＤＳ）等、臨床ルーチンで用いられる他のカテゴリーと類似する。
【００４４】
ある特定の態様では、発現に基づくリスクスコアは以下：
【００４５】
【数１】
2021506326.tif 000003
のように決定される。
【００４６】
ここで、「ＥＢＲＳ」は発現に基づくリスクスコア、「ＰＤＥ４Ｄ７＿ｎｏｒｍ」は正規化されたＰＤＥ４Ｄ７遺伝子発現プロファイル値、Ａ及びＢは変数である。
【００４７】
一例では、Ａは、約６〜８、例えば、6.71674999999999、Ｂは、０．４〜０．４５、例えば、0.42002023174713であり得、発現に基づくリスクスコアは、１〜５の範囲の値でありうる（上記のように）。当該発現に基づくリスクスコアは、発現に基づくリスクスコアの価値に基づいて、少なくとも２つのリスクグループの１つに分類又はカテゴライズすることもできる。例えば、２つのリスク群、３つのリスク群、４つのリスク群、又は４つ以上の所定のリスク群がある。各リスク群は、発現に基づくリスクスコアの各範囲（重複しない）をカバーする。例えば、リスク群は、１〜（から）＜２（まで）の発現に基づくすべてのリスクスコア、２〜＜３の他のリスク群、３〜＜４の他のリスク群、及び４〜＜５の他のリスク群を含んでよい。
【００４８】
遺伝子発現プロファイルの決定には、特に好ましくは、生物学的試料から抽出されたＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲの実施があげられ、ここで、Ｃｑ値は、ＰＤＥ４Ｄ７について、及び１又はそれ以上の対照遺伝子各々について決定され、当該発現に基づくリスクスコアの決定は、ＰＤＥ４Ｄ７のＣｑ値を、１又はそれ以上の対照遺伝子各々のＣｑ値を用いて正規化すること、及び正規化されたＣｑ値の線形関数として発現に基づくリスクスコアを計算することがあげられる。
【００４９】
例えば、ＰＤＥ４Ｄ７の正規化Ｃｑ値は、以下：
【００５０】
【数２】
2021506326.tif 000004
を適用して、作成されてよい。
【００５１】
ここで、Ｎ（ＣｑＰＤＥ４Ｄ７）はＰＤＥ４Ｄ７の正規化された遺伝子発現プロファイル値（定量サイクル、Ｃｑ）であり、Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）は、１又はそれ以上の対照遺伝子のＰＣＲ  Ｃｑ値の算出平均であり、ＣｑＰＤＥ４Ｄ７は、ＰＤＥ４Ｄ７のＰＣＲ  Ｃｑ値である。
【００５２】
遺伝子発現プロファイルは、好ましくは、さらに、ホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体５（ＰＤＥ４Ｄ５）及び／又はホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体９（ＰＤＥ４Ｄ９）由来の発現情報を含み、ここで、発現に基づくリスクスコアは、遺伝子発現プロファイルに基づいて、被験体の各ホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体について決定され、被験体の術前予後リスクスコアは、被験体の発現に基づくリスクスコア及び術前臨床変数に基づいて決定される。
【００５３】
本発明のさらなる態様では、以下の：
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定する、少なくとも１つのプライマー及び/又はプローブ；及び
場合によっては、ホモサピエンスヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリンα１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ホモサピエンスｐｕｍｉｌｉｏＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びホモサピエンスＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択される１又はそれ以上の対照遺伝子の遺伝子発現プロファイルを決定する、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；及び
場合によっては、被験体から得られた生物学的試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルを測定する少なくとも１つの薬剤；及び
場合によっては、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて術前予後リスクスコアを算出する命令であって、前記命令は、コンピュータにより実行される場合、以下の工程：
前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルに基づいて前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、
前記発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む方法を実行するコンピュータプログラム製品に記憶されていてよい、命令であり、
場合によっては、前記方法は、以下の：
前記１又はそれ以上の対照遺伝子のＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルを正規化すること、を含み、
ここで、前記発現に基づくリスクスコアは、前記ＰＤＥ４Ｄ７の正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定され、かつ、
場合によっては、前記術前臨床変数は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルを含む、
を含む診断キットが提供される。
【００５４】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルを測定するための少なくとも１つの薬剤は、例えば、ＰＳＡ特異的抗体などでありうる。
【００５５】
本発明のさらなる側面では、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法の請求項１３に記載のキットの使用があげられる。
【００５６】
本発明のさらなる側面では、前立腺がん被験体の術前リスク層別化におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルの使用があげられ、以下の：
被験体から得られた生物学的試料における遺伝子発現プロファイルを決定すること、
前記遺伝子発現プロファイルに基づいて被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、
被験体の発現に基づくリスクスコア及び被験体の術前臨床変数に基づいて、被験体の術前予後リスクスコアを決定する、ことを含む。
【００５７】
本発明の他の態様では、プログラムがコンピュータにより実行されると、コンピュータに以下の方法：
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定すること；
前記遺伝子発現プロファイルに基づいて前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること；
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定することを、含む。
【００５８】
請求項１に記載の方法、請求項１３に記載の診断キット、請求項１４に記載の診断キットの使用、請求項１５に記載の遺伝子発現プロファイルの使用、及び請求項１６に記載のコンピュータプログラムには、特に、従属請求項で特定されるように、類似及び／又は同一の好ましい実施形態があることが理解されるであろう。
【００５９】
また、本発明の好ましい実施形態は、従属請求項のいかなる組み合わせであってよく、又は、上記の実施形態と、各独立請求項との組み合わせであってよいことが理解されるであろう。
【００６０】
本発明の上記及び他の態様は、以下に記載する実施形態から明らかであり、説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】前立腺がん被験体の手術前リスク層別化の方法の実施形態のフローチャートを概略的かつ例示的に示す図である。
【図２】ＤＢ患者コホート（＃１５１）の、根治的前立腺全摘除術後からＰＳＡ再発又はサルベージ療法開始までの期間に関する、カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存分析の結果を示すグラフである。
【図３】ＤＢ患者コホート（＃１５１）の、根治的前立腺全摘除術後からＰＳＡ再発又はサルベージ療法開始までの期間に関する、カプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図４】ＤＢ患者コホート（＃１５１）の、根治的前立腺全摘除術後からＰＳＡ再発又はサルベージ療法開始までの期間に関する、カプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図５】ＤＢ患者コホート（＃１５１）の、根治的前立腺全摘除術後からＰＳＡ再発又はサルベージ療法開始までの期間に関する、カプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図６】ＤＢ患者コホート（＃１５１）の、根治的前立腺全摘除術後からＰＳＡ再発又はサルベージ療法開始までの期間に関する、カプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図７】ＤＢ患者コホート（＃１５１）の、根治的前立腺全摘除術後からＰＳＡ再発又はサルベージ療法開始までの期間に関する、カプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図８】ＤＢ患者コホートの、術後５年目の生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ曲線分析の結果を示すグラフである。
【図９】、ＤＢ患者コホートの、術後５年目の生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ曲線分析の結果を示すグラフである。
【図１０】、ＤＢ患者コホートの、術後５年目の生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ曲線分析の結果を示すグラフである。
【図１１】術後５年以内に再発した男性（被験体１５１例中計４５例がＰＳＡ再発による一次治療を受けなかった（２９．８％））に対する５つの異なる治療戦略の正味の有益性の判定曲線分析の結果を示すグラフである。
【図１２】ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９スコアに関する、ＲＰ患者コホート（ｎ＝５３６）の、ＰＳＡ再発までの時間（エンドポイント：ＢＣＲ）のカプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図１３】ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９スコアに関する、ＲＰ患者コホート（ｎ＝５３６）の、ＰＳＡ再発までの時間（エンドポイント：ＢＣＲ）のカプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図１４】ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９スコアに関する、ＲＰ患者コホート（ｎ＝５３６）の、ＰＳＡ再発までの時間（エンドポイント：ＢＣＲ）のカプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図１５】ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９スコアに関する、ＲＰ患者コホート（ｎ＝５３６）の、ＰＳＡ再発までの時間（エンドポイント：ＢＣＲ）のカプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図１６】ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９スコアに関する、ＲＰ患者コホート（ｎ＝５３６）の、ＰＳＡ再発までの時間（エンドポイント：ＢＣＲ）のカプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図１７】ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９スコアに関する、ＲＰ患者コホート（ｎ＝５３６）の、ＰＳＡ再発までの時間（エンドポイント：ＢＣＲ）のカプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図１８】ＲＰ患者コホート（ｎ＝２５６）のＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ陰性腫瘍試料のヒートマップを示す図である。
【図１９】カテゴリー化されたＣＡＰＲＡ及びＰＤＥ４Ｄ５／７／９の併用スコアに関する、ＤＢ患者コホートの、無生化学的再発（ＢＣＲ）生存期間及び無二次治療（サルベージ放射線及び又はアンドロゲン遮断）生存期間（secondary  treatment  free  survival；ＳＴＦＳ）のカプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図２０】カテゴリー化されたＣＡＰＲＡ及びＰＤＥ４Ｄ５／７／９の併用スコアに関する、ＤＢ患者コホートの、無生化学的再発（ＢＣＲ）生存期間及び無二次治療（サルベージ放射線及び又はアンドロゲン遮断）生存期間（ＳＴＦＳ）のカプラン−マイヤー生存分析の結果を示すグラフである。
【図２１】ＣＡＰＲＡモデル対ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７モデル対ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９併用モデルのＤＢ患者コホートの、術後５年の生化学的再発（ＢＣＲ）及び術後５年の無二次治療生存（ＳＴＦＳ）のＲＯＣ曲線分析の結果を示すグラフである。
【図２２】ＣＡＰＲＡモデル対ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７モデル対ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９併用モデルのＤＢ患者コホートの、術後５年の生化学的再発（ＢＣＲ）及び術後５年の無二次治療生存（ＳＴＦＳ）のＲＯＣ曲線分析の結果を示すグラフである。
【図２３】ＤＢ患者コホートの、術後５年以内に再発するリスクのある男性に対する４つの様々な治療戦略の正味の有益性の判定曲線分析の結果を示すグラフである。
【図２４】ＤＢ患者コホートの、術後５年以内に再発するリスクのある男性に対する２つの異なる治療決定戦略の正味減少の決定曲線分析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
〔術前のリスク層別化の概要〕
図１は、前立腺がん被験体の手術前リスク層別化の方法の実施形態のフローチャートを概略的及び例示的に示す。
【００６３】
この方法は工程Ｓ１００で開始される。
工程Ｓ１０２では、前立腺がんと診断された第１群の患者（被験体）各々から生物学的試料を得る。好ましくは、前立腺がんのモニタリングは、当該前立腺がん患者について、生物学的試料獲得後、少なくとも１年、少なくとも２年、又は約５年等の期間にわたって行われる。
【００６４】
工程Ｓ１０４では、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルが、例えば、各生物学的試料から抽出されたＲＮＡに対してＲＴ−ｑＰＣＲ（リアルタイム定量ＰＣＲ）を実施することにより、第１群の患者から生物学的試料の各々について得られる。例示的な遺伝子発現プロファイルは、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及び／又はＴＢＰ等の対照遺伝子セットの各セットの値を用いて正規化することができるＰＤＥ４Ｄ７の発現レベル（例えば、値）を含む。一つの態様では、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル値は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰ、例えば、当該対照遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は好ましくは全てからなる群から選択される１又はそれ以上の対照遺伝子に関して正規化される。
【００６５】
工程Ｓ１０６では、第１群の患者について得られた生物学的試料の少なくとも部分について得られたＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及びモニタリングから得られた各結果に基づいて、発現に基づくリスクスコアを割り当てるスコアリング機能が決定される。一つの好ましい態様例では、スコアリング機能は、正規化された遺伝子発現プロファイルを、上記の１〜５の範囲等の所定の範囲の値に変換する線形変換である。上記のように、当該変換は、前立腺がん被験体の集団（ここでは、第１群の患者）の生物学的試料のＰＤＥ４Ｄ７に関する正規化された遺伝子発現プロファイル値の頻度分布を考慮することにより、及び頻度分布を所望の範囲に変換する変換を決定することにより、決定することができる。一つの特定の態様では、数式に基づくリスクスコアを上記式（１）で特定されることにより、決定される。
【００６６】
工程Ｓ１０８では、生物学的試料が患者（被験体又は個人）から得られる。患者は、新規患者であってよく、第１群の１つであってよい。
【００６７】
工程Ｓ１１０では、例えば、生物学的試料でＰＣＲを実施することにより、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルが得られる。一つの態様では、当該ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル値は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰ、例えば、これらの対照遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は好ましくは全てからなる群から選択される、１又はそれ以上の対照遺伝子に関して正規化される。これは、工程Ｓ１０４と実質的に同様である。
【００６８】
工程Ｓ１０４及びＳ１１０では、追加的又は代替的に用いられてよい他の対照遺伝子として、ホモサピエンスアクチン、ベータ、ｍＲＮＡ（ＡＣＴＢ）；ホモサピエンス６０Ｓ酸性リボソームホスホプロテインＰ０ｍＲＮＡ（ＲＰＬＰ０）；ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ指向）ポリペプチドＡ、２２０ｋＤａ（ＰＯＬＲ２Ａ）；ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；及びアミノレブリン酸デルタ−シンターゼ（ＡＬＡＳ−１）があげられる。
【００６９】
工程Ｓ１１２では、得られたスコアリング関数を用いて、遺伝子発現プロファイルに基づき、患者の発現に基づくリスクスコアが決定される。
【００７０】
工程Ｓ１１４で、患者の発現に基づくリスクスコア及び患者の術前臨床変数に基づいて、患者の術前予後リスクスコアが決定される。これについては、後述する。
【００７１】
Ｓ１１６では、手術前の予後リスクスコアに基づいて、例えば、患者又は患者の保護者、医師、又は他の医療従事者に対して治療が提案されてよい。この目的のために、術前予後リスクスコアは、術前予後リスクスコアの価値に基づいて、所定のリスクグループのセットの１つに分類されてよい。治療に関する提案事項を提供することには、ａ）割り当てられたリスク群に基づいて、少なくとも２つのリスク群の異なる治療法に関連する患者に対する治療法を提案すること、ｂ）前立腺手術前後の患者の疾患進行リスクの予測値を算出すること、ｃ）前立腺手術前後の患者の治療反応予測値を算出すること、のうち１又はそれ以上が含まれる。例示的な治療法としては、少なくとも前立腺部分切除術、放射線治療、化学療法、及びそれらの組み合わせから選択される能動的治療、並びに観察のみ、すなわち、前立腺摘除術又は能動的治療の非実施（すなわち、能動的監視）が挙げられる。
【００７２】
この方法は、Ｓ１１８で終了する。
各リスク群は、各治療案に関連する可能性があり、その侵襲性も異なる。提案された各治療法は、そのリスク群に割り付けられた第１群の患者の結果に基づく可能性があり、前立腺がん発生の臨床リスク閾値を超えない最も非積極的治療法を提供すると予測される治療法である。場合によっては、グリソンスコア、ＮＣＣＮリスクカテゴリー、術前ＣＡＰＲＡスコア等の他のリスクプロファイリング法よりも積極的でない治療法が提案されたリスク群に新たな患者を割り付けることができる。
【００７３】
一つの実施形態では、工程Ｓ１０４及びＳ１１０における遺伝子発現プロファイルは、１又はそれ以上のプライマー及び／又はプローブ及び／又はそれらの１又はそれ以上のセットを用いてｍＲＮＡ発現を検出することにより、決定される。
【００７４】
ＰＤＥ４Ｄ７、及びそれらの転写産物ＩＤ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ）及びプライマー対及びプローブに対する対応するアミノ酸配列を含む１又はそれ以上の対照遺伝子の詳細な説明を表３に示す。この表はまた、各遺伝子に関する、センスプライマー及びアンチセンスプライマー、並びにアンプリコンに特異的に結合するプローブ配列を示す。
【００７５】
表１：例示的プライマー及びプローブ核酸配列
【表１】
2021506326.tif 000005
【００７６】
術前の患者のリスク評価におけるＰＤＥ４Ｄ７の予後的検出力を探索するため、術前のリスク変数及び術前のＣＡＰＲＡスコア等のアルゴリズムとの関連における疾患再発との相関を検討した。手術コホートでは、発現に基づくリスクスコアと術前変数の組み合わせモデルを開発し、当該モデルを診断的生検組織上の独立した患者で検証した。その結果、ＰＤＥ４Ｄ７は、術前の変数又は術前のＣＡＰＲＡスコア等の変数に基づく予後スコアに追加情報を加える可能性があり、これにより、一次治療の決定を最適化するより良好な患者の層別化をもたらしうることが示された。
【実施例１】
【００７７】
〔患者コホート及び試料〕
２つの患者コホート、すなわち根治的前立腺全摘除術（ＲＰ）患者コホート及び診断的生検（ＤＢ）患者コホートを採用し、人口統計学的データを表２に示した。ＲＰ患者コホートとしては、ドイツの単一大規模臨床センターで２０００年から２００４年の間に連続的に手術を受けた患者５５０人から、切除された前立腺の代表的な腫瘍領域から生検小パンチ（約１ｍｍ×２ｍｍ）で組織を採取した。所定の基準に基づく試験データの品質管理後、補助ホルモン療法を受けた患者５０３例の検体が統計分析に適することが判明した。ＤＢ患者コホートとしては、腫瘍陽性診断の生検から１回の生検パンチ（約１ｍｍ×２ｍｍ）が採取され、患者当たりのグリソンスコアが最も高かった。本症例の患者１６８人は前立腺がんと診断され、１９９５年から２０１１年の間にドイツのミュンスター大学病院で手術を受けた。計１５１例の患者の診断的針生検組織が統計分析に適することが判明した。
【００７８】
表２：根治的前立腺全摘除術（ＲＰ）患者コホート及び診断的生検（ＤＢ）患者コホートの人口統計学的特性
【表２】
2021506326.tif 000006
【００７９】
患者の年齢、術前ＰＳＡ値、生検における腫瘍の割合、前立腺容積、ＰＳＡ濃度については、各コホートの最小値と最大値を示し、中央値とＩＱＲ値はカッコ内に示される。ＣＡＰＲＡリスクカテゴリーについては、患者数及びリスク群ごとの割合を示す。術前病理検査では、生検グリソンスコア及びグリソングレード群スコア、臨床病期が示される（患者数及びその割合）。術後の病理は、病理学的グリソンスコア及びグリソングレード群、病理学的病期、前立腺摘除術後の外科的切除断端の状態、精嚢及び骨盤リンパ節への腫瘍浸潤の状態（患者数及びその割合）で示される。この点に関し、被膜外への進展は、主要パラメータとして提供されたものではなく、病理学的病期ｐＴ３ａ由来であることに留意されたい。追跡調査では、全患者について、術後数カ月の平均及び中央値の追跡調査期間が実証された。転帰カテゴリーは、累積５年及び１０年生化学的再発（ＢＣＲ）及び転移（ＣＲ）に対する臨床的再発を示す。治療カテゴリーには、手術後にサルベージ放射線療法（ＳＲＴ）又はサルベージアンドロゲン遮断療法（ＳＡＤＴ）を開始してから５年及び１０年の累積値が記載される。死亡率は、前立腺がん特異的生存率（ＰＣＳＳ）及び全生存率（ＯＳ）として示される。すべての転帰は、５年後又は１０年後に各々転帰を経験した男性の数を、男性の総数に対する割合で示す。ここでは、事象の割合を括弧内に示す。（Ｂ）は診断的生検患者コホートの人口統計学的特性を示す（「該当なし」はＮ／Ａである）。
【００８０】
〔検査方法〕
オリゴヌクレオチドプライマー及びＲＴ−ｑＰＣＲ（リアルタイム定量ＰＣＲ）用プローブ、ＲＮＡ抽出、並びに統計分析からの試料を含める品質管理及び手順を含む、用いたすべての実験方法は、Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  Ｒらの記載に従った。所望の被験体の遺伝子及び対照遺伝子を測定するのにＲＴ−ｑＰＣＲで用いられるプライマー及びプローブも、表１に示される。
【００８１】
〔結果〕
［発現に基づくリスクスコアと長期臨床転帰との相関］
連続発現に基づくリスクスコア（すなわち、正規化された対照遺伝子及びＰＤＥ４Ｄ７転写産物の形質転換された発現）は、２つの患者コホート（ＲＰ患者コホート及びＤＢ患者コホート）では術前臨床変数と相関していた。
【００８２】
表３〜８は、連続発現に基づくリスクスコアの無生化学的再発（ＢＣＲ）生存及び全生存（ＯＳ）の単変量及び多変量Ｃｏｘ回帰分析を示す。多変量分析では、術前の臨床変数、すなわち、手術時の年齢、術前のＰＳＡ値、ＰＳＡ濃度、生検グリソン悪性度グループ、腫瘍陽性の生検コアの割合、生検における腫瘍の割合、臨床病期（表３、５、及び７参照）又は前立腺リスク評価（ＣＡＰＲＡ）術前のがんスコア（表４、６、及び８参照）により、発現に基づくリスクスコアを調整した。グリソン生検の悪性度グループ及び臨床病期は、参考として用いたカテゴリーが最も低いカテゴリーとしてモデル化された。その他のすべての人口統計学的変数及び臨床変数、並びに発現に基づくリスクスコアを連続変数としてモデル化した。すべての変数を多変量モデルに入力し、各々の統計指標を表に示した。
【００８３】
単変量Ｃｏｘ回帰分析では、検討した２つの患者コホートでは、ＢＣＲまでの時間に対する連続発現に基づくリスクスコアの有意な相関が示され、各々、ＨＲ＝０．５３；９５％ＣＩ＝０．４１〜０．６７；ｐ＜０．０００１、及びＨＲ＝０．４３；９５％ＣＩ＝０．３３〜０．６５、ｐ＜０．０００１であった（表３及び７参照）。術前変数又は術前ＣＡＰＲＡスコアに関する多変量Ｃｏｘ回帰分析を調整することにより、連続発現に基づくリスクスコアに関する術後ＢＣＲの予測に有意な独立した寄与がもたらされた（表３、４、７、及び８参照）。さらに、ＲＰ患者コホートにおけるエンドポイントの全生存期間（ＯＳ）を検討したところ、術前の適当な臨床変数又は術前のＣＡＰＲＡスコアに調整した場合、連続発現に基づくリスクスコアの独立した予測力が同様に認められた（表５及び６参照）。しかし、興味深いことに、年齢（ＨＲ＝１．１；９５％ＣＩ＝１．０３〜１．２；ｐ＝０．００７）と臨床病期ｃＴ２とｃＴ３は、発現に基づくリスクスコア（ＨＲ＝０．４３；９５％ＣＩ＝０．２９〜０．６２；ｐ＜０．０００１）とは別に、多変量モデルでは有意な予測因子であった。術前ＣＡＰＲＡスコアは、単変量分析では全生存の有意な予測因子であったが（ＨＲ＝１．２；９５％ＣＩ＝１．３〜１．６；ｐ＝０．０１）、多変量分析では統計的有意性を下回った（ＨＲ＝１．２；９５％ＣＩ０．９９〜１．４；ｐ＝０．０６）。連続発現に基づくリスクスコアは、多変量モデルでも非常に有意であった（ＨＲ＝０．４；９５％ＣＩ＝０．２８〜０．５８；ｐ＜０．０００１；表５及び６）。
【００８４】
表３：ＲＰ患者コホート（＃５０３）における発現に基づくリスクスコアの生化学的再発（ＢＣＲ）の単変量及び多変量Ｃｏｘ回帰分析
多変量分析では、発現に基づくリスクスコアを術前変数について調整した。
【表３】
2021506326.tif 000007
【００８５】
表４：ＲＰ患者コホート（＃５０３）における発現に基づくリスクスコアの無生化学的再発（ＢＣＲ）生存率の単変量及び多変量Ｃｏｘ回帰分析
多変量分析では、発現に基づくリスクスコアを術前ＣＡＰＲＡスコアについて調整した。
【表４】
2021506326.tif 000008
【００８６】
表５：ＲＰ患者コホート（＃５０３）における発現に基づくリスクスコアの全生存期間（ＯＳ）の単変量及び多変量Ｃｏｘ回帰分析
多変量分析では、発現に基づくリスクスコアを術前変数について調整した。
【表５】
2021506326.tif 000009
【００８７】
表６：ＲＰ患者コホート（＃５０３）における発現に基づくリスクスコアの全生存期間（ＯＳ）の単変量及び多変量Ｃｏｘ回帰分析
ここで、多変量分析では、発現に基づくリスクスコアを術前のＣＡＰＲＡスコアについて調整した。
【表６】
2021506326.tif 000010
【００８８】
表７：ＤＢ患者コホート（＃１５１）における発現に基づくリスクスコアの無生化学的再発（ＢＣＲ）生存率の単変量及び多変量Ｃｏｘ回帰分析
多変量分析では、発現に基づくリスクスコアを術前変数について調整した。
【表７】
2021506326.tif 000011
【００８９】
表８：ＤＢ患者コホート（＃１５１）における発現に基づくリスクスコアの無生化学的再発（ＢＣＲ）生存率の単変量及び多変量Ｃｏｘ回帰分析
多変量分析では、発現に基づくリスクスコアを術前ＣＡＰＲＡスコアについて調整した。
【表８】
2021506326.tif 000012
【００９０】
［発現に基づくリスクスコア及び術前臨床変数に基づく術前予後リスクスコア］
ＰＤＥ４Ｄ７の予後的検出力をさらに調査するために、様々な治療レジメンに対する前立腺がん患者の予後の予測に用いられる術前の臨床変数と、発現に基づくリスクスコアの組み合わせの利益が検証された。多変量Ｃｏｘ回帰データに基づき、術前ＣＡＰＲＡスコアと発現に基づくリスクスコアを組み合わせることにより、術前臨床変数単独の場合よりも予後的検出力が有意に改善されると仮定した。この仮説を評価するため、ＲＰ患者コホートのサブコホート４４９例（９２件；２０．５％）を選択し、完全な５年間の転帰歴を有する患者を選択し、発現に基づくリスクスコアと術前のＣＡＰＲＡスコアを組み合わせるロジスティック回帰モデルを作成して、術後の生化学的再発の５年間のリスクを予測した。ｌｏｇｉｔ（ｐ）回帰関数をｐ＝１／（１＋ｅ＾（−ｌｏｇｉｔ（ｐ）））に変換し、個々の患者が術後５年以内に生化学的再発を経験する確率ｐを算出した。
【００９１】
モデル化により、発現に基づくリスクスコアの術前ＣＡＰＲＡ指標に対する独立した予測値が証明された（オッズ比０．４６；９５％ＣＩ０．３−０．６９；ｐ＝０．０００２；データは示さず）。次に、この術前ＣＡＰＲＡスコア及び発現に基づくリスクスコアロジスティック回帰モデルを、統計データ分析に適格な患者１５１例について独立して検証した。すべての患者は、術後最低６０か月の追跡調査を受けた。（ｉ）カプラン−マイヤー生存分析、（ｉ）ＲＯＣ曲線分析、（ｉｉｉ）再分類及び決定曲線分析を用いて、術前ＣＡＰＲＡスコア及び発現に基づくリスクスコアロジスティック回帰モデルの検出力の検討を行った。
【００９２】
図２〜図７は、ＤＢ患者コホート（＃１５１）における根治的前立腺全摘除術後のＰＳＡ再発又はサルベージ療法開始までの期間についてのカプラン−マイヤー生存分析の結果を示したグラフである。図２〜４：ＤＢ患者コホートにおける無生化学的再発（ＢＣＲ）生存率の分類式によるリスクスコア（図２では「ＰＤＥ４Ｄ７スコア」と表示）、術前ＣＡＰＲＡスコアカテゴリー（図３では「ＣＡＰＲＡスコア」と表示）、術前ＣＡＰＲＡスコアと発現によるリスクスコアの組み合わせモデル（図４では「ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコア」と表示）のカプラン−マイヤー分析、図５〜７：分類式によるリスクスコアのＤＰ患者コホートにおけるサルベージ療法後の無再発生存期間開始までの時間の分析（図５では「ＰＤＥ４Ｄ７スコア」と表示）、術前ＣＡＰＲＡスコアカテゴリー（図６では「ＣＡＰＲＡスコア」と表示）、術前ＣＡＰＲＡスコアによるリスクスコアの組み合わせモデル（「ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコア」と表示）（図７）である。全ての図中、打ち切りとなった患者は縦棒で示す。危険比率（Ｈａｚａｒｄ  Ｒａｔｉｏ；ＨＲ）を対照群と比較し、ログランクｐ値（Ｌｏｇｒａｎｋ  ｐ−ｖａｌｕｅ）を示した。リスクがある男性の数をカプラン−マイヤー生存率グラフの下の表に示した。発現に基づくリスクスコアのカテゴリーを、「ＰＤＥ４Ｄ７スコア（１−２）」：１〜＜２の範囲の発現に基づくリスクスコア、「ＰＤＥ４Ｄ７スコア（２−３）」：２〜＜３の範囲の発現に基づくリスクスコア、「ＰＤＥ４Ｄ７スコア（３−４）」：３〜＜４の範囲の発現に基づくリスクスコア、「ＰＤＥ４Ｄ７スコア（４−５）」：「ＰＤＥ４Ｄ７スコア（４−５）」：４〜≦５の範囲の発現に基づくリスクスコア、最も高い発現に基づくリスクスコアのカテゴリー「ＰＤＥ４Ｄ７スコア（４−５）」を対照カテゴリーとした。術前のＣＡＰＲＡのカテゴリーは、「ＣＡＰＲＡスコア（０−２）」が、術前のＣＡＰＲＡスコアが０〜２の範囲；「ＣＡＰＲＡスコア（３−５）」：術前ＣＡＰＲＡスコアが３〜５の範囲、「ＣＡＰＲＡスコア（＞５）」：術前ＣＡＰＲＡスコアが６〜１０である。術前ＣＡＰＲＡスコアが最も低いカテゴリー「ＣＡＰＲＡスコア（０−２）」を対照カテゴリーとした。術前のＣＡＰＲＡスコアと発現に基づくリスクスコアの組み合わせモデルのカテゴリーを、ロジスティック回帰モデルのｌｏｇｉｔ（ｐ）関数に基づく術後ＰＳＡ失敗の発生確率により、「可能性（＜０．１５）」、「可能性（０．１５〜＜０．２５）」、「可能性（０．２５〜＜０．５）」、「可能性（０．５〜１．０）」とした。
【００９３】
ＤＢ患者コホートを被験体としたカプラン−マイヤー生存率の研究では、診断的生検の組織穿孔における発現に基づくリスクスコアの術前測定に基づくと、患者が、根治的前立腺摘除術後のＰＳＡの術後再発経験又はサルベージ療法の開始に対する、様々なリスクに有意に分離されることが示された（図２参照）。回帰関数において術前ＣＡＰＲＡスコアと発現に基づくリスクスコアを組み合わせたロジスティック回帰モデルに関して、エンドポイント経験のモデルで計算した確率を４群にカテゴライズ又は分類し（上記のように）、最も低い再発リスク群と最も高い再発リスク群の危険比率を、術前ＣＡＰＲＡスコア単独で層別化した患者群と比較した。術前のＣＡＰＲＡカテゴリーに発現に基づくリスクスコアを追加すると、危険比率は最低リスク群から最高リスク群にかけて有意に増加したが（各々９．０対３９．６）、これらのリスクカテゴリーの患者数はほぼ同数であった（図３及び４参照）。
【００９４】
ＰＳＡ失敗後の何らかのサルベージ療法（放射線療法、ホルモンアブレーション）の開始という臨床的に重要なエンドポイントを検証したところ、以前と同様、術前ＣＡＰＲＡスコアと発現に基づくリスクスコアを組み合わせると、術後二次治療を受けるリスクが最も低い患者と最も高い患者との間でリスク分離が改善された（図５〜７参照）。
【００９５】
さらに、術前ＣＡＰＲＡスコアと発現に基づくリスクスコアを回帰関数として組み合わせたロジスティック回帰モデルであり、ＲＰコホートを用いて以前に開発された術前ＣＡＰＲＡスコアの一次治療後の５年ＰＳＡ再発予測（＃４４９）を、完全な５年追跡（＃４４９）で検証した。ＲＯＣ分析を用いて、５年ＡＵＣ（曲線下面積）は、術前ＣＡＰＲＡスコア単独では０．７７、ロジスティック回帰モデルでは０．８２と算出された（図８参照）。２つのモデルのＡＵＣは有意に異なっていた（ｐ＝０．００４）。
【００９６】
他の試験では、発現に基づくリスクスコアを術前のＣＡＰＲＡスコアに追加する利点を調べた。術前ＣＡＰＲＡ測定値は、個々の成分を分類し、これらのカテゴリーに重み付けしたポイント付与する。術前のＣＡＰＲＡスコアは、これらの加重点の合計である（Cooperberg  Ｍ．Ｒ．参照）。上記のように、生検グリソンスコアは一方でＣＡＰＲＡスコアに有意な影響を及ぼす。しかしながら、同時に、本発明者は、グリソンスコアリングが病理学者間で実質的に変動しやすいことを発見した。したがって、術前ＣＡＰＲＡスコア内の生検グリソンスコアの情報を、発現に基づくリスクスコアにより提供される分子情報に置換した。特に、改変術前ＣＡＰＲＡスコアには、発現に基づくリスクスコアの値に依存した０〜３の範囲の多数のポイントがあった。これにより、得られた改変術前ＣＡＰＲＡスコアの全体構造は、最小合計スコア０及び最大合計スコア１０で同様に保持された（表９参照）。
【００９７】
表９：術前ＣＡＰＲＡモデルにおける生検グリソンスコアの発現に基づくリスクスコアによる置換
【表９】
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【００９８】
このモデルをＲＯＣ分析で５年ＢＣＲ転帰予測のために検証したところ、「ＣＡＰＲＡ（−ＢｘＧｌ／＋ＰＤＥ４Ｄ７）スコア」のＡＵＣは、生検グリソンスコアの情報を含む術前ＣＡＰＲＡスコア（ＡＵＣ＝０．７７、図９参照）と同等であったが、生検グリソンスコアを発現ベースのリスクスコアに置換してもモデルの性能に影響はないが、生検グリソン情報が臨床モデルから除外された場合、術前ＣＡＰＲＡモデルのＰＳＡ失敗の５年予測は有意に低下する（ＡＵＣ＝０．７７対ＡＵＣ＝０．６９、生検グリソンスコアの有無を問わずＡＵＣ＝０．００８、生検グリソン情報を含まない術前ＣＡＰＲＡスコアが「ＣＡＰＲＡスコア（−ＢｘＧｌ）」として示されている図９参照）。
【００９９】
グリソン生検が６以下の患者コホートでは、術後にＰＳＡ再発を経験するのはごく限られた数の男性（ＲＰコホートで２１．２％、ＤＢコホートで２１．２％）のみであり、さらに関連性の高い転移への進行（ＲＰコホートで１．９％）又は疾患特異的死亡（ＲＰコホートで１．３％）を経験する。したがって、生検グリソンスコアが７以上の患者のみを被験体としたＤＰ患者コホートを被験体に、術前ＣＡＰＲＡスコアと術前ＣＡＰＲＡスコア及び発現に基づくリスクスコアの組み合わせモデルのサブコホート分析（＃７４）を実施した。併用モデルは、完全コホートの検査と同等の性能を示したが（各々ＡＵＣ＝０．８ｖｓ．０．８２）、サブコホート分析では術前ＣＡＰＲＡモデル単独の方が、性能低下が大きかった（各々ＡＵＣ＝０．７３ｖｓ．０．７７、図１０参照）。これは、高リスク特性を有する患者では併用モデルの識別能力が改善することが示されている可能性がある。
【０１００】
最近、決定曲線分析（ＤＣＡ）の概念が、臨床現場におけるバイオマーカー又は予測モデルの価値を検査する分野に導入された（Vickers  A.J.  and  Elkin  E.B.,  “Decision  curve  analysis:  A  novel  method  for  evaluating  prediction  models”,  Medical  Decision  Making,  Vol.  26,  No.  6,  pages  565  to  574,  2006を参照）。ＤＣＡは純便益分析であり、様々なリスク閾値にわたって真陽性と加重偽陽性の割合を比較し、将来のＰＳＡ失敗リスクに対して術後の二次治療の開始を決定する。本明細書では、３つのモデル（すなわち、術前ＣＡＰＲＡスコア、術前ＣＡＰＲＡスコア、術前ＣＡＰＲＡスコア、及び術前リスクスコア回帰モデル）について、意思決定曲線分析（ＤＣＡ）において、術後のＰＳＡ再発により誘発される二次治療の正味の有益性を試験した。以下の５つの異なる治療戦略を比較した：（１，２）全患者治療又は全患者治療せず；（３〜５）発現ベースのリスクスコア、術前ＣＡＰＲＡスコア、又は術前ＣＡＰＲＡスコアと発現ベースのリスクスコアを組み合わせた回帰モデルにより治療である。これに対して、５％の工程中０％〜５０％の範囲の様々な決定閾値の間のすべての戦略について、真の（ＴＰＲ）及び偽陽性率（ＦＰＲ）を決定した（図１１参照）。分析の結果、用いたモデルは全て「全治療」戦略と比較して正味の有益性が良好であることが実証されたが、術前ＣＡＰＲＡスコア及び発現に基づくリスクスコア回帰モデルでは、モデル化したすべての意思決定閾値にわたって正味の有益性が最善であることが明らかになった。
【０１０１】
提供された結果は、前立腺がん被験体の生物学的試料における前立腺がんバイオマーカーＰＤＥ４Ｄ７の定量的測定による術前臨床リスクアルゴリズムＣＡＰＲＡの予測モデルが、リスク層別化を改善しうることを示す。このリスク予測モデルは、現在採用されている様々な国の前立腺がんガイドラインにより推奨されているように、術前の臨床パラメータのみに基づくリスクスキーマを用いる場合と比較して、治療に関連するリスクカテゴリーに前立腺がん患者を層別化するのに優れていることが、多重分析で実証された。
【０１０２】
［考察］
原発性限局性前立腺がんの治療法の決定は、主に将来の疾患進行リスクと平均余命の組み合わせに左右される。提供されたデータは、発現に基づくリスクスコアが疾患の再発を予測するために術前ＣＡＰＲＡ測定値に独立した情報を追加することを示すが、全生存（事象の約８０％は疾患に特異的でない死亡による）の予測においては、発現に基づくリスクスコアが依然として生存予測に有意に寄与する唯一の変数である。このように、ＰＤＥ４Ｄ７は、術前ＣＡＰＲＡスコア等の術前変数に基づく臨床予測モデルに、治療法の意思決定を支援する生存率の予測と同様、疾患特異的転帰の予測に予後的価値を付加しうる。
【０１０３】
最近、ヨーテボリのランダム化前立腺がんスクリーニング試験内の積極的監視コホートの長期結果が発表された。これは、臨床的に低リスクの疾患を有する男性は、治療延期レジメン下で進行性疾患を経験するかなりのリスクを有する可能性があることを示す（Godtman  R.A.  et  al.,  “Long-term  Results  of  Active  Surveillance  in  the  Goeteborg  Randomized,  Population-based  Prostate  Cancer  Screening  Trial”,  European  Urology,  Vol.  70,  No.  5,  pages  760-766,  2016を参照）。従って、本発明者は、非常に低リスクの疾患を有する男性以外の男性が待機的管理戦略に適するか疑問であった。ＰｒｏｔｅｃＴ試験の１０年間の転帰に関する最近の発表は、この試験の実薬モニタリング群でも同様の結論を示す（Hamdy  F.C.  et  al.,  “10-Year  Outcomes  after  Monitoring,  Surgery,  or  Radiotherapy  for  Localized  Prostate  Cancer”,  New  England  Journal  of  Medicine  Vol.  375,  pages  1415-1424,  2016を参照）。これらの結果の現代診療への妥当性については議論があるが（Bergh  R.C.N.  van  den,  Murphy  D.G.,  Poel  H.G.  van  der,  “Expectant  Management  for  Prostate  Cancer:  Lessions  from  the  past,  Challenges  for  the  Future”,  European  Urology,  Vol.  70,  pages  767-770,  2016を参照）は、延期された治療管理の間に進行しても安全なのは、非常にリスクの低い患者だけであることを示唆しているのかもしれない。術前ＣＡＰＲＡモデル等の臨床規準を用いて、当該低リスク患者コホートの選択が可能となるが（ＲＰコホートの４５％で術後５年ＢＣＲのリスクが９．３％、ＤＰコホートの２７．７％で術後５年ＢＣＲのリスクが４．８％）、分子マーカーの追加により、この極めて低リスク患者群を拡張しうる。実際、開発された術前ＣＡＰＲＡスコア及び発現に基づくリスクスコア回帰モデルは、ＤＢ患者コホートの１５１例中３８例（２５．２％）の超低リスクコホートを定義し、ＮＰＶ（陰性適中率）は治療後のＰＳＡ再発の５年リスクに対して１００％であった。
【０１０４】
積極的監視（ＡＳ）は、低リスク前立腺がんの男性に対する過去数年間の適切で安全な治療選択肢として確立されている（Garisto  J.D.  and  Klotz  L.,  “Active  surveillance  for  prostate  cancer:  How  to  do  it  right”,  Oncology  (Williston  Park),  Vol.  31,  No.  5,  pages  333  to  340  2017を参照）。ＡＳと関連する、大きな課題は、ＰＳＡ値の上昇又は典型的にＡＳ治療から積極的治療への切り替えの引き金となるプロトコールであるグリソン生検におけるグレードアップ等の進行性疾患の徴候を見逃さないために、男性に課される厳格なモニタリングスケジュールである。ＡＳの縦断的研究では、特に追加の生検手技に関しては、ＡＳのモニタリングプロトコルに対する患者のコンプライアンスが経時的に低下することが公表される（Bokhorst  L.P.  et  al.,  “Compliance  Rates  with  the  Prostate  Cancer  Research  International  Active  Surveillance  (PRIAS)  Protocol  and  Disease  Reclassification  in  Noncompliers”,  European  Urology,  Vol.  68,  No.  5,  2015を参照）この問題は、本明細書で提案する選択アルゴリズム、すなわち、術前ＣＡＰＲＡスコア等の臨床モデルと予後のゲノムバイオマーカーＰＤＥ４Ｄ７を組み合わせて、実質的に５年間にわたって進行するリスクのない患者コホートを画定することで解決し得る。これは、ＡＳ開始後の一定期間の非常に限定された（又は全くない）追跡調査に基づいて、男性を積極的監視に組み込む方法を提供する。
【０１０５】
開示された態様例に対する他の変形例は、図面、開示、及び添付の請求の範囲の研究から、請求の範囲に記載された発明を実施する際に当業者により理解され、実施されてよい。
【０１０６】
請求項において、用語「含む」は、他の要素又は工程を除外せず、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」（原文）は、複数を除外しない。
【０１０７】
図１に示す方法の１又はそれ以上の工程は、コンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラム製品内に実装することができる。コンピュータプログラム製品は、ディスク、ハード・ドライブ等の、制御プログラムが記録される（記憶される）非一時的コンピュータ読取可能記録媒体を含むことができる。非一時的コンピュータ読取可能媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、又は他のいかなる磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、又は他のいかなる光学媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、又は他のメモリチップ又はカートリッジ、又はコンピュータがそれから読み出して使用できる他のいかなるの非一時的媒体があげられる。
【０１０８】
あるいは、本方法の１又はそれ以上の工程は、伝送可能な搬送波のような一時的媒体に実装することができ、この伝送可能な搬送波において、制御プログラムは、例えば無線波及び赤外線データ通信の間に生成されるような、音波又は光波等の伝送媒体を用いるデータ信号として具現化される。
【０１０９】
例示的な方法は、１又はそれ以上の汎用コンピュータ、専用コンピュータ、プログラムされたマイクロプロセッサ又はマイクロコントローラ及び周辺集積回路素子、ＡＳＩＣ又は他の集積回路、デジタル信号プロセッサ、個別素子回路等のハードワイヤード電子又は論理回路、ＰＬＤ、ＰＬＡ、ＦＰＧＡ、グラフィカルカードＣＰＵ、又はＰＡＬ等のプログラマブル論理デバイスに実装することができる。一般に、図１に示されたフローチャートを実行することができる有限状態マシンを実行することができるいかなる装置を用いて、前立腺がん患者における治療選択のためのリスク層別化方法の１又はそれ以上の工程を実行することができる。理解されるように、本方法の工程はすべてコンピュータで実施することができるが、いくつかの実施形態では、工程のうちの１又はそれ以上を少なくとも部分的に手動で実施することができる。
【０１１０】
コンピュータプログラム命令はまた、コンピュータ、他のプログラマブルデータ処理装置、又は他の装置にロードされて、コンピュータ、他のプログラマブル装置、又は他の装置で一連の操作工程を実行させて、コンピュータ又は他のプログラマブル装置上で実行される命令が、本明細書に特定される機能／動作を実行するためのプロセスを提供するように、コンピュータ実施プロセスを生成することができる。
【０１１１】
本発明は、これまでＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルに基づいて記載されてきたが、これは、対照遺伝子セット各々の値を用いて正規化することができるＰＤＥ４Ｄ７の発現レベル（例えば、値）を含むことができ、遺伝子発現プロファイルは、他のＰＤＥ４Ｄ変異体からの発現情報をさらに含むことができる。例えば、他のＰＤＥ４Ｄ変異体は、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ８及びＰＤＥ４Ｄ９の１又はそれ以上を含んでもよい。次いで、診断キットは、前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中の他のＰＤＥ４Ｄ変異体の各々について遺伝子発現プロファイルを決定する、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブをさらに含んでよい。しかしながら、好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル単独、特に、対照遺伝子セット各々の値を用いて正規化することができるＰＤＥ４Ｄ７の発現レベル（例えば、値）が単独で用いられる。
【０１１２】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ１」又は「ＰＤＥ４Ｄ１」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体１、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ１遺伝子であり、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９７２２２．１で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ１転写物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１で表されるヌクレオチド配列に関し、また、ＰＤＥ４Ｄ１ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００１１８４１５１．１で特定されるタンパク質配列に対応する、配列番号２で表される対応するアミノ酸配列に関する。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ１」又は「ＰＤＥ４Ｄ１」はまた、プライマー対ＰＤＥ１Ｄ１Ｄ２＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３）及びＰＤＥ１Ｄ１Ｄ２＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号４）により生成することができ、プローブ配列番号５により検出することができるアンプリコンに関する。
【０１１３】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ２」又は「ＰＤＥ４Ｄ２」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体２、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ２遺伝子であり、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９７２２１．１で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ２転写物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号６で表されるヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ２ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００１１８４１５０．１で特定されるタンパク質配列に対応する配列番号７で表される対応するアミノ酸配列でもある。
【０１１４】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ３」又は「ＰＤＥ４Ｄ３」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体３、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ３遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６２０３．４で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ３転写物の上記に示されたＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号８で表されるヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ３ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００６１９４．２で特定されるタンパク質配列に対応する配列番号９で表される対応するアミノ酸配列をいう。
【０１１５】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ４」又は「ＰＤＥ４Ｄ４」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体４、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ４遺伝子を指し、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１０４６３１．１で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ４転写物の上記に示されたＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１０で表されるヌクレオチド配列であり、また、ＰＤＥ４Ｄ４ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００１０９８１０１．１で特定されるタンパク質配列に対応する配列番号１１で表される対応するアミノ酸配列にも関する。
【０１１６】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ５」又は「ＰＤＥ４Ｄ５」とは、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体５、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ５遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９７２１８．１で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ５転写物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１２で表されるヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ５ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００１１８４１４７．１で特定されるタンパク質配列に対応する配列番号１３で表される対応するアミノ酸配列をいう。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ５」又は「ＰＤＥ４Ｄ５」はまた、プライマー対ＰＤＥ４Ｄ５＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号１４）及びＰＤＥ４Ｄ５＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号１５）により生成することができ、プローブ配列番号１６により検出することができるアンプリコンに関する。
【０１１７】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ６」又は「ＰＤＥ４Ｄ６」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体６、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ６遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９７２２３．１で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ６転写物の上記に示されたＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１７で表されるヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ６ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００１１８４１５２．１で特定されるタンパク質配列に対応する配列番号１８で表される対応するアミノ酸配列にも関する。
【０１１８】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ８」又は「ＰＤＥ４Ｄ８」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体８、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ８遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９７２１９．１で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ８転写物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号２７に記載されるヌクレオチド配列、に関し、また、ＰＤＥ４Ｄ８ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００１１８４１４８．１で特定されるタンパク質配列に対応する、配列番号２８に記載される対応するアミノ酸配列にも関する。
【０１１９】
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ９」又は「ＰＤＥ４Ｄ９」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体９、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ９遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９７２２０．１で特定される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ９転写物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号２９に記載されるヌクレオチド配列、に関し、また、ＰＤＥ４Ｄ９ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質アクセッション参照配列ＮＰ＿００１１８４１４９．１で特定されるタンパク質配列に対応する配列番号３０に記載される対応するアミノ酸配列にも関する。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ９」又は「ＰＤＥ４Ｄ９」はまた、プライマー対ＰＤＥ４Ｄ９＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３１）及びＰＤＥ４Ｄ９＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３２）により生成することができ、プローブ配列番号３３により検出することができるアンプリコンに関する。
【０１２０】
用語「ＰＤＥ４Ｄ１」、「ＰＤＥ４Ｄ２」、「ＰＤＥ４Ｄ３」、「ＰＤＥ４Ｄ４」、「ＰＤＥ４Ｄ５」、「ＰＤＥ４Ｄ６」、「ＰＤＥ４Ｄ８」及び「ＰＤＥ４Ｄ９」はまた各々、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ８及びＰＤＥ４Ｄ９に対して高度の相同性を示すヌクレオチド配列を含み、例えば、核酸配列が、配列番号１、６、８、１０、１２、１７、２７又は２９で表される配列と各々、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％同一であるか、又は配列番号２、７、９、１１、１３、１８、２８又は３０で表される配列とアミノ酸配列が各々、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９２％、９１％、９２％、９３％、９３％、９４％、９４％、９７％又は９８％同一であるか、又は、核酸配列が、配列番号２、７、９、１１、１３、１８、２８もしくは３０で表される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列をコードするか、又はアミノ酸配列が、配列番号１、６、８、１０、１２、１７、２７もしくは２９で表される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列である。
【０１２１】
［術前予後リスクスコアへのＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９の情報の追加］
ＰＤＥ４Ｄ７アイソフォームと同様に、ＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ７アイソフォームは各々、ＵＣＲ１及びＵＣＲ２調節ドメインを含む長いアイソフォームである。本明細書では、ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコア組み合わせモデルにおけるＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９の遺伝子発現プロファイルからの情報を含めることの付加価値を検討し、縦断的臨床転帰を予測した。
【実施例２】
【０１２２】
［患者コホート及び試料］
２つの患者コホート、すなわち根治的前立腺全摘除術（ＲＰ）患者コホート及び診断的生検（ＤＢ）患者コホートを採用し、人口統計学的データを表１０に示した。ＲＰ患者コホートについては、ドイツの単一の大規模臨床センターで２０００〜２００４年に連続手術を受けた患者６０６人から、切除された前立腺の代表的な腫瘍領域（腫瘍の指標病変）から２つの小さな生検パンチ（約１ｍｍ×２ｍｍ）を採取した。ＤＢ患者コホートについては、腫瘍陽性診断のための生検から１回の生検パンチ（約１ｍｍ×２ｍｍ）が採取され、患者当たりのグリソンスコアが最も高かった。本症例の患者１６８人は前立腺がんと診断され、１９９５年から２０１１年の間にドイツのミュンスター大学病院で手術を受けた。ＲＮＡｓｅｑ及びＲＴ−ｑＰＣＲデータの品質管理の後、ＲＰコホート及びＤＢコホートにおいて、各々患者試料５３６及び１５１が統計分析に適することが判明した。
【０１２３】
表１０：根治的前立腺全摘除術（ＲＰ）患者コホート及び診断的生検（ＤＢ）患者コホートの人口統計学的特性
【表１０】
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【０１２４】
患者の年齢、術前ＰＳＡ値、生検における腫瘍の割合、前立腺容積、ＰＳＡ濃度については、各コホートの最小値と最大値を示し、中央値とＩＱＲ値はカッコ内に示される。ＣＡＰＲＡリスクカテゴリーについては、患者数及びリスク群ごとの割合を示す。術前病理検査では、生検グリソンスコア及びグリソングレード群スコア、臨床病期が示される（患者数及びその割合）。術後の病理は、病理学的グリソンスコア及びグリソングレード群、病理学的病期、前立腺摘除術後の外科的切除断端の状態、精嚢及び骨盤リンパ節への腫瘍浸潤の状態（患者数及びその割合）で示される。この点に関し、被膜外への進展は、主要パラメータとして提供されたものではなく、病理学的病期ｐＴ３ａ由来であることに留意されたい。追跡調査では、全患者について、術後数カ月の平均及び中央値の追跡調査期間が実証された。転帰カテゴリーは、累積５年及び１０年生化学的再発（ＢＣＲ）及び転移（ＣＲ）に対する臨床的再発を示す。治療カテゴリーには、手術後にサルベージ放射線療法（ＳＲＴ）又はサルベージアンドロゲン遮断療法（ＳＡＤＴ）を開始してから５年及び１０年の累積値が記載される。死亡率は、前立腺がん特異的生存率（ＰＣＳＳ）及び全生存率（ＯＳ）として示される。すべての転帰について、５年後又は１０年後に各々の転帰を経験した男性の数を、男性の総数に対する割合で示す。ここでは、イベントの割合を括弧内に示す。（Ｂ）診断的生検患者コホートの人口統計学的特性を示す（「該当なし」はＮ／Ａである）。
【０１２５】
〔検査方法〕
潜在的な腫瘍の不均一性を考慮するために、ＲＰコホートの２つの組織パンチを核酸抽出前に組み合わせた。ＰＤＥ４Ｄ転写産物の４つの対照遺伝子ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰに対するＲＴ−ｑＰＣＲの結果を正規化することにより、組織穿孔の腫瘍細胞密度の潜在的な差異に対処した。ＲＴ−ｑＰＣＲリアルタイム定量ＰＣＲ）用オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ、ＲＮＡ抽出、並びに統計分析からの試料を含めるための品質管理及び手順を含む用いたすべての実験方法は上記のとおりであった（Alves  de  Inda  M.  et  al.,  “Validation  of  Cyclic  Adenosine  Monophosphate  Phosphodiesterase-4D7  for  its  Independent  Contribution  to  Risk  Stratification  in  a  Prostate  Cancer  Patient  Cohort  with  Longitudinal  Biological  Outcomes”,  European  Urology  Focus,  2017を参照）。
【０１２６】
［ＲＮＡ配列決定］
［ＲＮＡ試料処理］全ＲＮＡ１００ｎｇを入力として用いて、リボゾームＲＮＡをRibo-Zero  Gold（ヒト／マウス／ラット）ｒＲＮＡ除去キット(Illumina  Inc.)を用いて製造業者の指示に従って除去した。ライブラリー構築には、除去されたＲＮＡの合計をＳｃｒｉｐｔｓｅｑ  Ｖ２  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製キット（Epicentre/Illumina  Inc.）に入力として用いて、調製されたＲＮＡｓｅｑライブラリーは、ＮｅｘｔＳｅｑ５００配列決定システム（ペアエンド；２×７５ｂｐの読み取り長；１試料あたりの総読み取り数約８０００万）を用いて配列決定した。
【０１２７】
［ＲＮＡｓｅｑデータ処理］ＲＮＡｓｅｑ生データをＩｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑソフトウェアを用いて前処理し、ｐｈｒｅｄスコアによるフィルタリングを組み込むことにより、低品質の読み取りを低減させた。ＦＦＰＥは塩基を変性させることがあるため、配列決定結果は、高品質画分を表す読み取りを選択するために、スコアリングアルゴリズムを用いてフィルタリングされた。スコアは、以下のように、試料中の一連の読み取りについて計算した：一連の読み取りは、対照ゲノムに対して整列された。各読み取りについてのアラインメント結果（すなわち、対照ゲノムに正確にマッピングされた塩基の数）を、読み取りごとにカウントした。マッピングに成功した塩基の総数を、集合のすべてのリードにわたって合計した。この合計を集合の全塩基数で除算した。得られた相対数をスコアという。
【０１２８】
【数３】
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【０１２９】
スコアフィルターを用いて、良好なアラインメント結果（塩基のすべて又は大部分がゲノムに正しくマップされている）によりＥＱスコアに寄与する読み取りのサブセットを選択した。得られた高品質の読み取りのサブセットは、さらなる処理のために選択された。リードが（ＲＮＡのアラインメント時に必要となるかもしれない）フラグメント化によりマッピングされた場合、フラグメントのアラインメント品質に基づいて測定値を計算し、それに応じてフラグメントを選択した。
【０１３０】
[読み取り品質フィルタリング]  高品質の読み取りのみを保持するため、以下のフィルタリング工程が適用された。すなわち、塩基の＞５０％がｐｈｒｅｄ  ｓｃｏｒｅ＜１１である場合、ｐｈｒｅｄ  ｓｃｏｒｅ  ＜１１である場合の読取端の塩基は読み取られない；読取端の塩基は読み取られない；読取＜６３塩基は除去された；未知の（Ｎ）塩基のコールを伴う読取は削除された；各読取が品質フィルターを通過したペアである場合の読取のみが保持された。
【０１３１】
[遺伝子発現計算]  試料間の発現値の比較可能性を保証するために、ＲＳＥＭアルゴリズムに実装されているように、すべての読み取りカウントを転写物／百万個の方法（ＴＰＭ）により正規化した（Li  B.  et  al.,  “RNA-Seq  gene  expression  estimation  with  read  mapping  uncertainty”,  Bioinformatics,  Vol.  26,  No.  4,  pages  493-500,  2010を参照）。
【０１３２】
［データ分析と統計］
標準化ＰＤＥ４Ｄ転写物発現の生成は、対照遺伝子の平均ＲＴ−ｑＰＣＲ  Ｃｑから各ＰＤＥ４Ｄ転写物のＲＴ−ｑＰＣＲ  Ｃｑを差し引くことにより行った。正規化されたＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９発現プロファイルを、上記のＰＤＥ４Ｄ７について詳細に概説したように、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９スコアに変換した。生物学的及び治療に関連した様々な転帰についての相関分析（表１０参照）において、ＰＤＥ４Ｄ転写産物スコアを連続又はカテゴリー変数として用い、ａ）ＰＤＥ４Ｄ５／７／９スコア（１≦２）、ｂ）ＰＤＥ４Ｄ５／７／９スコア（＞２及び≦３）、ｃ）ＰＤＥ４Ｄ５／７／９スコア（＞３及び≦４）、ｄ）ＰＤＥ４Ｄ５／７／９スコア（＞４及び≦５）と定義した。ＣＡＰＲＡリスクスコア及び対応する低（１）、中間（２）、高リスク（３）カテゴリーをCooperberg  M．R．Uni−に記載されているように計算し、かつ多変量Ｃｏｘ回帰及びカプラン−マイヤー分析を、無生化学的再発（ＢＣＲ）生存期間に適用し、又は二次治療（サルベージ放射線及びアンドロゲン遮断）無治療生存期間（ＳＴＦＳ）を、ＲＰコホート（ｎ＝５３６）及びＤＢコホート（ｎ＝１５１）のＰＤＥ４Ｄ７スコアと相関させるために、Taylor  B.S.  et  al.,  “Integrative  genomic  profiling  of  human  prostate  cancer”,  Cancer  Cell,  Vol.  18,  No.  1,  pages  11-22,  2010（患者１７８例、うち１３０例を本試験に組み入れた）から適用した。Ｅｘｏｎ  Ａｒｒａｙコホートにおける患者試料のＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ状態を判定するために、相対的ＥＲＧ発現値を用い、発現に基づいて患者試料をＥＲＧ陽性群又は陰性群に割り当てるためにPartitioning  Around  Medoids（ＰＡＭ、Ｒパッケージ「ｃｌｕｓｔｅｒ」、ｋ＝２）を適用した。決定曲線分析は、Vickers  A.J.  et  al.,  “Extension  to  decision  curve  analysis,  a  novel  method  for  evaluating  diagnostic  tests,  prediction  models  and  molecular  markers”,  BMC  Medical  Informatics  and  Decision  Making,  Vol.  8,  pages  1-17,  2008に記載のように実施した。統計分析には、ソフトウェアパッケージＭｅｄＣａｌｃ（MedCalc  Software  BVBA,  Ostend,  Belgium）を用いた。
【０１３３】
〔結果〕
［ＰＤＥ４Ｄ転写物スコアと縦断的臨床転帰との関連性は、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合状態に依存する］
まず、ＴＭＰＲＳＳ２‐ＥＲＧ再構成陽性対遺伝子融合陰性患者試料におけるＰＤＥ４Ｄ７スコアカテゴリーのカプラン−マイヤー生存分析を開始した。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧの状態に関するデータを有する計５３６例の患者試料を被験体とし、そのうち２８０例（５２．２％）が融合陽性であると定義され、２５６例（４７．８％）がこの前立腺特異的融合事象がないと定義された。生化学的再発（ＢＣＲ）は、研究被験体となった患者コホートにおいてこの転帰に有意なイベントが認められたことから、術後疾患進行の代理エンドポイントとして選択された（表１０参照）。
【０１３４】
再構成されたＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合の存在下では、ＰＤＥ４Ｄ７カテゴリーのきわめて有意なログランクｐ値（＜０．０００１）が認められた融合陽性腫瘍と陰性腫瘍との間で、無ＢＣＲ生存分析に明らかな差が認められた（図１２参照）。ＰＤＥ４Ｄ７発現レベルが最も高い患者群（すなわち、ＰＤＥ４Ｄ７スコア４〜５）は、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合陽性がんにおいて、手術後の疾患進行のリスクが最も低かった。対照的に、ＥＲＧ遺伝子融合事象のない前立腺腫瘍では、所定の４つの異なるＰＤＥ４Ｄ７カテゴリー間のカプラン−マイヤー生存率の識別は有意ではなかった（ログランクｐ値＝０．０８；図１３参照）。興味深いことに、ＰＤＥ４Ｄ５スコアの無ＢＣＲ生存期間分析を見ると、ＰＤＥ４Ｄ７スコアで観察されたものとは逆の状況が見出された。遺伝子融合のない腫瘍においてのみ、ＰＤＥ４Ｄ５スコアのカテゴリーは生化学的再発を有意に予測した（ログランクｐ値＜０．０００１）（図１４、１５参照）。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ陰性腫瘍の生存分析では、ＰＤＥ４Ｄ９スコアカテゴリーについてもＰＤＥ４Ｄ５スコアと同様の結果が得られ、ログランクｐ値は０．０００１未満であった。しかしながら、ＰＤＥ４Ｄ５スコアの分析とは対照的に、遺伝子融合陽性がんにおけるＰＤＥ４Ｄ９スコアのカテゴリーの生存分析でも、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ陰性腫瘍と比較してｐ値がやや弱いものの（各々ログランクｐ値＝０．００５対ログランクｐ値＜０．０００１；図１６及び１７参照）、生化学的再発との有意な関連が認められた。
【０１３５】
次に、ＰＤＥ４Ｄを発現する３つの異なる前立腺がんのスコアカテゴリーが、個々の患者試料において相互に排他的であると決定された程度、又は同じスコアカテゴリー（例えば、［１−２］又は［４−５］）が、検討された３つのＰＤＥ４Ｄスプライス変異体について同一の試料に見られたかどうかについて試験した。このため、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合陽性試料と融合陰性試料の間の初期スプリットを有する５３６人の患者試料すべてを含むヒートマップ（図には示さず）をプロットした。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ陰性試料内の試料は、それらのＰＤＥ４Ｄ５又はＰＤＥ４Ｄ９スコアカテゴリーに従って順序付けられたが、遺伝子融合陽性試料は、それらのＰＤＥ４Ｄ７スコアカテゴリーに従って低から高まで順序付けられた。ヒートマップはカプラン−マイヤー生存分析の結果を再現し、ＰＤＥ４Ｄアイソフォームスコアカテゴリーが低いほど、事象（イベント）がより多く示された。しかし、ＰＤＥ４Ｄ転写物スコアのカテゴリーの一定の程度は、患者試料内で重複しなかった。最低のスコアカテゴリー（すなわち、［１−２］の間のＰＤＥ４Ｄ５／ＰＤＥ４Ｄ７／ＰＤＥ４Ｄ９のすべてのスコア）に注目すると、スコアカテゴリー［１−２］を有する３つのＰＤＥ４Ｄ転写産物のうちの少なくとも１つを有する３１の試料が同定された（図１８参照）。３つの試料（太字）では、３つのＰＤＥ４Ｄ転写物すべてについて最低スコアのカテゴリーが測定されたが、２つの試料（太字の斜体）では、少なくとも２つのＰＤＥ４Ｄ転写物が最低スコアのカテゴリーに属していた。他の２６試料については、ＰＤＥ４Ｄスプライス変異体のうち１つのみが非常に低い発現として測定されたが、他の２つのアイソフォームは各々これらの試料でより高い発現レベルを示した。転移を発症するリスク又は前立腺がんにより死亡するリスク（患者３１人中各々６人及び５人）は、ＰＤＥ４Ｄを発現する多重長前立腺アイソフォームの発現レベルの低下に伴って大きく増加する（図１８参照）。また、ＰＤＥ４Ｄ転写スコアが２つ以上［１−２］及び／又は［２−３］の患者では、一般に術後のＢＣＲの時間指標が短かった（２年未満）。逆に、３つのＰＤＥ４Ｄスプライス変異体のうち１又はそれ以上の発現量が高かった患者では、術後のＢＣＲの発現率が低かった。あるいは、この事象が起こった場合には、より長い時間指標（一部の症例では、一次治療から５年以上経過した後、２−５年）であった。まとめると、これらのデータは、ＰＤＥ４Ｄ７の次に、ＰＤＥ４Ｄの他の長い転写物、すなわちＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９もまた、前立腺がんにおいて有意な予後的価値を有する可能性があることを示す。したがって、ＰＤＥ４Ｄ７のスコアにＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９スコアを追加することにより、臨床変数又は上記のＰＤＥ４Ｄ７系モデルのいずれかで術後の疾患進行リスクを予測する精度が高まる可能性があるという仮説を立てた（Alves  de  Inda  M.  et  al.  and  van  Strijp  D.  et  al.,  “The  Prognostic  PDE4D7  Score  in  a  Diagnostic  Biopsy  Prostate  Cancer  Patient  Cohort  with  Longitudinal  Biological  Outcomes”,  Prostate  Cancer,  2018も参照）。
【０１３６】
［臨床変数及び前立腺がんのロジスティック回帰モデルはＰＤＥ４Ｄ転写産物の発現が長い］
この仮説を検証するため、臨床的ＣＡＰＲＡスコア（Cooperberg  M．R．参照）とＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７及びＰＤＥ４Ｄ９の遺伝子発現プロファイルスコアを含む予後モデルを開発した。モデル開発には、ＲＰ（ｎ＝５３６）及びＲＰ＊コホート（ｎ＝１３０）を用いた。ロジスティック回帰分析を行い、ＲＰコホート及びＲＰ＊コホートにおける術後の生化学的再発を予測し、ＰＤＥ４Ｄ転写産物と同様にＣＡＰＲＡスコアの重みを推定した。係数はロジスティック回帰により算出した。次に、ＲＰ＊コホートとＲＰ＊コホートの係数の平均値を計算することにより、ＲＰ＊コホートの４つのモデル入力のロジスティック回帰分析後の初期係数を調整し、従って、異なる患者群の不均一性を考慮した。最終的なＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９モデル（ｃｏ１・ＰＤＥ４Ｄ５スコア＋ｃｏ２・ＰＤＥ４Ｄ７スコア＋ｃｏ３・ＰＤＥ４Ｄ９スコア＋ｃｏ４・ＣＡＰＲＡスコア（ｃｏ１、ｃｏ２、ｃｏ３、ｃｏ４は回帰係数））について、独立したＤＢ患者コホートを被験体に、ＢＣＲを予測する予後的検出力と、手術後の二次治療（放射線療法又はホルモン遮断）の開始を検討した。転移又は死亡のようなその他の転帰については、ＲＰコホート及びＲＰ＊コホートを用いた（注：これらの臨床エンドポイントはモデル開発時には用いなかった）。ロジスティック回帰モデルの概要を以下の表１１に示す。
【０１３７】
表１１：ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９スコア組み合わせモデルは、ＲＰ患者コホート（ｎ＝４８０、術後５年間の追跡を完了）及びＲＰ＊コホート（ｎ＝１３０；Taylorら、2010）におけるＣＡＰＲＡスコア及び標準化ＰＤ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９発現値のロジスティック回帰により開発した。２つのコホートのロジスティック回帰係数を平均し、ＰＤ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、及びＰＤＥ４Ｄ９の平均係数、並びに異なる患者群の変動を考慮に入れるために２つの独立した患者コホートのデータに基づくＣＡＰＲＡスコアを作成した。これらの係数を最終的なＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９回帰モデルの重みとして用いた。注：ＣＡＰＲＡスコアはCooperberg  M．R．に基づいて算出したが、ＲＰ＊コホートでは生検陽性コア数に関する情報が欠如したため、このコホートのＣＡＰＲＡスコアは患者の年齢、術前ＰＳＡ、生検グリソンスコア、及び臨床病期のみを用いて算出した。生検コアに対する欠落情報の影響は、ＲＰコホート及びＤＢコホートでの検査と同様に非常に限定された（データは示さず）。
【表１１】
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【０１３８】
ａＣＡＰＲＡ分析用のａ４５９試料
特に好ましい実施例では、
ＰＤＥ４Ｄ５の係数ｃｏ１は、−１．２６から−０．２６の範囲、好ましくは−１．１６から−０．３６の範囲、より好ましくは−１．０６から−０．４６の範囲、より好ましくは−０．９６から−０．５６の範囲、より好ましくは−０．８６から−０．６６の範囲、最も好ましくは−０．７６及び／又はそのいずれかの範囲であり；
ＰＤＥ４Ｄ７の係数ｃｏ２は、−１．２１から−０．２１の範囲、好ましくは−１．１１から−０．３１の範囲、より好ましくは−１．０１から−０．４１の範囲、より好ましくは−０．９１から−０．５１の範囲、より好ましくは−０．８１から−０．６１の範囲、最も好ましくは−０．７１の範囲、及び／又はそのいずれかであり；
ＰＤＥ４Ｄ９の係数ｃｏ３は、−１．２３から−０．２３の範囲、好ましくは−１．１３から−０．３３の範囲、より好ましくは−１．０３から−０．４３の範囲、より好ましくは−０．９３から−０．５３の範囲、より好ましくは−０．８３から−０．６３の範囲、最も好ましくは−０．７３及び／又はそのいずれかの範囲であり；
術前ＣＡＰＲＡスコアの係数ｃｏ４は、０．１５〜１．１５の範囲、好ましくは０．２５〜１．０５の範囲、より好ましくは０．３５〜０．９５の範囲、より好ましくは０．４５〜０．８５の範囲、より好ましくは０．５５〜０．７５の範囲、最も好ましくは０．６５の範囲である。
【０１３９】
［ＣＡＰＲＡ及びＰＤＥ４Ｄ５／７／９モデルのカプラン−マイヤー生存分析］
カプラン−マイヤー法による生存期間分析では、ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９モデルを用いて、最低スコアクラス［１−２］の全ＤＢコホート（ｎ＝１５１）の男性２９人（１９．２％）を、６０〜２００ヵ月のＰＳＡ再発の追跡期間を通してリスクがなく、二次治療を開始するリスクのない患者群に層別化した（図１９，２０参照）。このモデルのスコアカテゴリーのカットオフ値を［１−２］から［１−２．１］に若干増加させることにより、この群の術後疾患進行のリスクがない男性の数は２９例から３６例に増加する（２３．８％；データは示さず）。対照的に、ＣＡＰＲＡ及びＰＤＥ４Ｄ５／７／９スコアが最も高いカテゴリーの患者は［３−４］及び［４−５］の場合、術後５年以内に生化学的進行のリスクが各々６３．９％及び８３．３％であった。同様に、術後５年以内の生存分析から推定された二次治療を受けるリスクは、これらの患者群で各々４４．１％及び７５％であった（図１９及び２０参照）。
【０１４０】
［ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９モデルのＲＯＣ曲線分析］
ＤＢコホート（上記の通り）については、ＢＣＲ及び二次治療の開始を転帰として試験した。ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９モデルを上記のＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７モデルと比較した（van  Strijp  Dらも参照）。いずれの臨床評価項目についても、ＣＡＰＲＡスコア単独群と比較してＡＵＣ（曲線下面積）が各々１０％及び６％増加し、ＣＡＰＲＡモデルとＰＤＥ４Ｄ７モデルを比較したところ、各々５％及び４％増加した（図２１及び２２参照）。
【０１４１】
この効果をさらに探索するために、発明者らは生化学的再発以外の転帰を検討した。２つの根治的前立腺全摘除術コホート（ＲＰ及びＲＰ＊）におけるエンドポイントとしてＢＣＲを用いたＣＡＰＲＡ及びＰＤＥ４Ｄ転写産物スコアの併用モデルを開発したが、これらのコホートではこのモデルを検証しなかった。その代わり、発明者らは、手術後の転移への進行、又は一次治療後の前立腺がん（すなわち、ＲＰ）又は二次治療（すなわち、ＳＲＴ−サルベージ放射線療法；ＳＡＤＴ−サルベージアンドロゲン遮断療法）後の前立腺がんによる死亡等の検査に他の転帰を用いて、先に報告されたＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７モデルに対するＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９の潜在的な付加価値を調査した。ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアモデルに加えてＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９の追加予後値を用いた場合、ＣＡＰＲＡスコア又はＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアモデルと比較して、各々最大５％及び最大１２％のＡＵＣ（曲線下面積）増加したが、その概要を表１２に示す。このデータは、前立腺関連ＰＤＥ４Ｄ転写産物をさらに用いると、発明者らが以前に発表したＣＡＰＲＡ及びＰＤＥ４Ｄ７スコアの併用モデルの予後的検出力をさらに高める可能性があることを示す。
【０１４２】
表１２：ＣＡＰＲＡスコア、ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７、ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９回帰モデルのＡＵＣの概要
【表１２】
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【０１４３】
各々のエンドポイントに用いた患者コホートには、各々追跡調査期間の患者数を含める。試験された臨床エンドポイントは、各々試験された事象数と比率を含む。注：ＣＡＰＲＡスコアはCooperberg  M．R．に基づいて算出したが、ＲＰ＊コホートでは生検陽性コア数に関する情報が欠如したため、このコホートのＣＡＰＲＡスコアは、患者の年齢、術前ＰＳＡ、生検グリソンスコア、及び臨床病期のみを用いて算出した。生検コアに対する欠失した情報の影響は、ＲＰコホート及びＤＢコホートでの試験と同様に非常に限定された。
【０１４４】
［ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９モデルの判定曲線分析］
決定曲線分析は、臨床医／患者が受諾したいと考える様々なリスク閾値にわたる真陽性率と加重偽陽性率を比較する正味の有益性の分析である（Vickers  A.J.  et  al.,  “Net  benefit  approaches  to  the  evaluation  of  prediction  models,  molecular  markers,  and  diagnostic  tests”,  BMJ,  Vol.  25,  2016を参照）。ＣＡＰＲＡスコア及びＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコア対本明細書で示すＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９併用モデルについて、術後のＰＳＡ再発の予測リスクに基づいて、一次治療回避の正味の有益性を検討した。分析の結果、ＣＡＰＲＡと３つのＰＤＥ４Ｄ転写産物との併用モデルでは、モデル化したすべての意思決定閾値にわたって正味の有益性が最も良好であったが（図２３参照）、分析の結果、すべてのモデルが「全治療」戦略よりも正味の有益性が良好であったことが示された。同様に、一次治療における正味の減少分析では、ＣＡＲＰＡスコアとＣＡＲＰＡ＆ＰＤＥ４Ｄ５／７／９併用モデルとの間に、すべての決定閾値（図２４参照）にわたって、治療減少に大きな差が認められた。さらに、ＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７モデルにＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９を追加すると、ＰＤＥ４Ｄ７単独のＣＡＰＲＡ併用モデルと比較して、患者１００人あたりの治療介入数がより効果的に減少するとともに、決定曲線分析の正味の有益性が明らかに改善される。
【０１４５】
本発明者らは、以前に提示されたＣＡＰＲＡ及びＰＤＥ４Ｄ７リスクモデルは、モデルに他の長いＰＤＥ４Ｄ転写物を加えるとさらに改善されることを示した。ＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９のこの付加的な予後的有益性の理論的根拠は、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ陽性患者腫瘍と遺伝子融合陰性患者腫瘍との間の予測力の差により支持される。ＰＤＥ４Ｄ７を他の２つの前立腺がん関連ＰＤＥ４Ｄ転写物ＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９で補完することにより、一次治療介入前の疾患進行リスクを評価するより包括的な予後モデルが構築された。
【０１４６】
［考察］
前立腺がんバイオマーカーＰＤＥ４Ｄ７と組み合わせた臨床リスクアルゴリズムＣＡＰＲＡの予測モデルは、前立腺がんリスクの層別化に有用であることが示される（Alves  de  Inda  M.ら及びvan  Strijp  D.らも参照）。提供された実験結果は、ＰＤＥ４Ｄ７が臨床ＣＡＰＲＡモデルに独立した価値を付加し、術後の疾患進行を予測する予後的検出力を有意に改善することを実証する。前立腺がん特異的ＴＭＲＰＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子再構成に関して異なる原発腫瘍物質における様々な長いＰＤＥ４Ｄアイソフォームの発現差を同定し、このＣＡＰＲＡ＆ＰＤＥ４Ｄ７併用モードの価値をさらに高めた（Boettcher  R.  et  al.,  “Human  PDE4D  isoform  composition  is  deregulated  in  primary  prostate  cancer  and  indicative  for  disease  progression  and  development  of  distant  metastases”,  Oncotarget,  Vol.  7,  No.  43,  pages  70669-70684,  2016を参照）。
【０１４７】
ここに示した研究データにより、患者の腫瘍のゲノム背景に依存する術後疾患進行のリスクに対する３つの異なるＰＤＥ４Ｄ転写物ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７及びＰＤＥ４Ｄ９の影響が分析することができた。興味深いことに、ＰＤＥ４Ｄ７はＴＭＲＰＳＳ２−ＥＲＧ融合陽性バックグラウンドでは治療後の疾患再発と有意に関連したが、この特定の遺伝子融合事象を伴わない患者では予後不良であった。対照的に、ＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９は、非融合ゲノムバックグラウンドでは予後が極めて良好であったが、ＰＤＥ４Ｄ５は異なり、ＰＤＥ４Ｄ９は、ゲノム融合が存在する場合には疾患進行と有意に関連しなかった。
【０１４８】
積極的監視（ＡＳ）は、低リスク及び超低リスク前立腺がんの男性に対する治療選択肢として認められており、米国のガイドラインで推奨される（Briganti  A.  et  al.,  “Active  Surveillance  for  Low-risk  Prostate  Cancer:  The  European  Association  of  Urology  Position  in  2018”,  European  Urology,  Vol.  74,  No.  3,  pages  357-368,  2018を参照）ｐＡＳの指導原則は、一次治療の回避でなく、その遅延である。ＡＳから積極的治療介入への切り替えは、治療目的が依然として治癒的である間に行うべきである。したがって、ＡＳ患者は、ＰＳＡ値の上昇、生検グリソンスコア又は臨床病期の移行など、疾患進行の徴候が最も早い時点で中止及び積極的治療への切り替えが行われるため、厳格な監視計画に従わなければならない。しかし、ＰｒｏｔｅｃＴ試験の実薬モニタリング群の男性の死亡リスクが低いことを考慮すると、観察された疾患のこのような臨床像の変化が、真の生物学的疾患の進行とどの程度相関するかは疑わしい（Hamdy  C.F.  et  al.,  “10-Year  Outcomes  after  Monitoring,  Surgery,  or  Radiotherapy  for  Localized  Prostate  Cancer”,  The  New  England  Journal  of  Medicine,  Vol.  375,  pages  1415-1424,  2016を参照）。
【０１４９】
現在、マルチパラメトリックＭＲＩ又はゲノミクスのような新技術を、男性の積極的監視への層別化又はＡＳの男性のモニタリングに考慮している（Eineluoto  J.T.,  “Repeat  multiparametric  MRI  in  prostate  cancer  patients  on  active  surveillance”,  PLoS  ONE,  Vol.  12,  No.  12,  2017,  and    Canfield  S.  et  al.,  “Active  Surveillance  Use  Among  a  Low-risk  Prostate  Cancer  Population  in  a  Large  US  Payer  System:  17-Gene  Genomic  Prostate  Score  Versus  Other  Risk  Stratification  Methods”,  Reviews  in  Urology,  Vol.  19,  No.  4,  pages  203-212,  2017を参照）。ＳｔＡＳの縦断的費用は、特に生検の反復費用に起因する一次治療介入と同程度に達すると推定されているが（Keegan  K.A.  et  al.,  “Active  surveillance  for  prostate  cancer  compared  with  immediate  treatment:  an  economic  analysis”,  Cancer,  Vol.  118,  No.  14,  pages  3512-3518,  2012を参照）、新たに実施された技術的ツールを用いることで、根治的治療への切り替えによりＡＳを中止する男性が少なくなる場合、及び／又は監視計画が最小限に抑制される（又は一部の患者では回避される）場合にのみ、費用対効果が高くなる可能性がある。
【０１５０】
発明者らは、ＣＡＰＲＡスコア等の臨床的指標と、本明細書で紹介したようなゲノムバイオマーカーの組み合わせ、すなわち、疾患進行を経験する患者の将来のリスクを予測する長いＰＤＥ４Ｄ（５／７／９）転写産物の評価は、監視開始後の所定の期間に極めて限定される（ほとんど、又は全くない）追跡調査を要する、積極的監視に組み込まれる患者を選択する将来的支援を提供する可能性があると考える。
【０１５１】
請求項中の引用符号は、その範囲を限定するものと解釈してはならない。
【０１５２】
本発明は、被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定する工程と、遺伝子発現プロファイルに基づいて被験体の発現に基づくリスクスコアを決定する工程と、被験体の発現に基づくリスクスコア及び術前臨床変数に基づいて被験体の術前予後リスクスコアを決定する工程とを含む、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法に関する。これにより、術前の状況において、被験体の層別化が改善され、一次治療をより良好に決定しうる。例えば、手術前の予後リスクスコアは、前立腺がん患者の特定の亜集団に対して積極的監視対積極的治療介入（例えば、根治的前立腺摘除術）を選択するか否かに関して、より優れた提案を行いうる。
【０１５３】
添付の配列リスト(2017PF02734_Sequence  Listing_ST25)は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
2021506326.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月24日(2020.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法であって、以下の：
被験体から得られた生物学的試料におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定すること、
前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、かつ
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
術前臨床変数は、（ｉ）被験体の年齢、（ｉｉ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル、（ｉｉｉ）一次及び二次の生検グリソンスコア、（ｉｖ）臨床病期、及び（ｖ）腫瘍陽性生検の割合、のうちの１又はそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、
被験体の術前前立腺リスク評価（ＣＡＰＲＡ）スコアの決定すること、を含み、
ここで、術前予後リスクスコアは、発現に基づくリスクスコアと前記術前ＣＡＰＲＡスコアとを組み合わせることにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
発現に基づくリスクスコア及び術前ＣＡＰＲＡスコアが、前立腺がん被験体の集団から得られた回帰関数と組み合わされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
術前の予後リスクスコアが、被験体に対する改変術前前立腺リスク評価（ＣＡＰＲＡ）スコアとして決定され、ここで、一次及び二次の生検グリソンスコアは、発現に基づくリスクスコアに置換される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
発現に基づくリスクスコアは、所定の範囲の値であり、前記値に応じて、改変術前ＣＡＰＲＡスコアに０〜３の範囲のポイントが加算される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、以下の：
術前の予後リスクスコアに基づいて、被験体に一次治療を提案すること、を含み、
ここで、前記一次治療は、（ｉ）少なくとも前立腺部分切除術；（ｉｉ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びそれらの併用から選択される積極的治療；及び（ｉｉｉ）積極的監視からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
さらに、以下の：
遺伝子発現プロファイルを、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリンα１ｂ（Ｔｕｂｕｌｉｎ−Ａｌｐｈａ−１ｂ；ＴＵＢＡ１Ｂ）、ホモサピエンスｐｕｍｉｌｉｏＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ｐｕｍｉｌｉｏ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ；ＰＵＭ１）、及びホモサピエンスＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択される、１又はそれ以上の対照遺伝子に関して、正規化すること、を含み、
ここで、発現に基づくリスクスコアは、前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
１又はそれ以上の対照遺伝子が、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰの少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又はすべてを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
発現に基づくリスクスコアが、スコアリング機能を用いて、遺伝子発現プロファイルに基づいて決定され、ここで、前記スコアリング機能は、前立腺がん被験体の生物学的試料の遺伝子発現プロファイルから得られた、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子発現プロファイルの決定は、生物学的試料から抽出されたＲＮＡに対してＲＴ−ｑＰＣＲを実施することを含み、ここで、Ｃｑ値は、ＰＤＥ４Ｄ７及び前記１又はそれ以上の対照遺伝子各々について決定され、かつ、前記発現に基づくリスクスコアの決定は、前記１又はそれ以上の対照遺伝子各々について前記Ｃｑ値を用いてＰＤＥ４Ｄ７の前記Ｃｑ値を正規化すること、及び前記正規化されたＣｑ値の線形関数として前記発現に基づくリスクスコアを計算すること、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
診断キットであって、以下の：
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定する、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；及び、
前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて術前予後リスクスコアを算出する命令を含み、
ここで、前記命令は、コンピュータにより実行される場合に、以下の工程：
前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルに基づいて、前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、及び
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む方法を実行するコンピュータプログラムに記憶される、
診断キット。
【請求項１３】
前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法における、請求項１２に記載のキットの使用。
【請求項１４】
前立腺がん被験体の術前リスク層別化におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルの使用であって、以下の：
被験体から得られた生物学的試料における遺伝子発現プロファイルを決定すること、
遺伝子発現プロファイルに基づいて被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、かつ、
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む、使用。
【請求項１５】
コンピュータによりプログラムが実行される場合に、前記コンピュータに以下の：
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルを決定すること、
前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、前記被験体の発現に基づくリスクスコアを決定すること、かつ、
前記被験体の発現に基づくリスクスコア及び前記被験体の術前臨床変数に基づいて、前記被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、
を含む方法を実行させる命令を含む、コンピュータプログラム。
【国際調査報告】
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