(57)【要約】  本報告書は、完全にロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる一本鎖（ｓｓ−）オリゴヌクレオチドのハイブリダイズに関するものである。本文書は、完全に相補的なｓｓ−オリゴヌクレオチド対を用いたハイブリダイゼーション実験を示す。これは、所定の時間間隔内で二本鎖を形成することができない。本報告書は、そのような互換性のないオリゴヌクレオチド対を特定するための方法を提供する。別の態様において、本報告書は、迅速な二本鎖形成が可能である相補的なｓｓ−オリゴヌクレオチド対を提供する。本報告書は、互換性のあるオリゴヌクレオチド対を特定及び選択する方法も提供する。さらに別の態様において、本報告書は、イムノアッセイなどの結合アッセイにおける結合パートナーとしての互換性オリゴヌクレオチド対の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合対を提供する方法であって、前記結合対は、第１の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドと第２の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドからなり、前記２個のオリゴヌクレオチドは、２０℃〜４０℃の温度で、８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、
（ａ）８〜１５個のロック核酸（＝ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（＝ｓｓ−）オリゴヌクレオチドを提供し、各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、第１の核酸塩基配列を形成するステップ；
（ｂ）８〜１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドを提供し、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、少なくとも前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドの各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、前記第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で前記第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか、又はそれらからなること、及び理論的には、前記第１及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドが互いに二本鎖を形成する能力を示すこと、前記二本鎖は、８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対からなるステップ；
（ｃ）等モル量の第１及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドを水溶液中で２０℃〜４０℃の温度、２０分以下の時間間隔で、混合及びインキュベートし、それによりｓｓ−オリゴヌクレオチドの混合物又は二本鎖含有混合物を得るステップ；続いて、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記混合物を２０℃〜４０℃の温度で分離し、続いて、前記分離された二本鎖を検出及び定量し、存在する場合は、及び前記分離されたｓｓオリゴヌクレオチドを検出及び定量するステップ；続いて、
（ｅ）ステップ（ｄ）で二本鎖が検出できるほど存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ−オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、前記結合対を選択するステップ；
これにより、前記結合対を提供するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドが、５〜９個のモノマーからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドが、６個のモノマーからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各ＬＮＡモノマーが、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、７−デアザグアニン、及び７−デアザアデニンからなる群から選択される核酸塩基を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）において、前記温度が２０℃〜３７℃である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）の前に、前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチド及び前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドが、−８０℃〜４０℃の温度で、具体的には２０℃〜４０℃、より具体的には２０℃〜３７℃の温度で保たれる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）において、前記インキュベーションが、１分以下で行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）において、前記水溶液が、前記溶液のｐＨをｐＨ６〜ｐＨ８に、より具体的にはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５に維持する緩衝液を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）において、前記水溶液が、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、より具体的には２００ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／の溶解物質の総量を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）の前記インキュベートされた混合物を、移動相として水性溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーに供することを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）及び（ｂ）の前記ｓｓ−オリゴヌクレオチドが、ベータ−Ｄ−ＬＮＡモノマーからなる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）及び（ｂ）の前記ｓｓ−オリゴヌクレオチドが、ベータ−Ｌ−ＬＮＡモノマーからなる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
水性溶媒と、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対とを含む液体組成物であって、
各オリゴヌクレオチドは、８〜１５個のロック核酸（＝ＬＮＡ）モノマーからなり、各モノマーは核酸塩基を含み、前記モノマーの核酸塩基は前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の核酸塩基配列及び前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、
前記第１の核酸塩基配列及び前記第２の核酸塩基配列は、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、２０℃〜４０℃の温度で８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
及び、前記結合対は、項目１〜１２のいずれかに記載の方法によって得ることができる組成物。
【請求項１４】
各オリゴヌクレオチドが、８〜１５個のＬＮＡモノマーからなり、
前記第１の核酸塩基配列及び前記第２の核酸塩基配列は、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、２０℃〜４０℃の温度で５〜９個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
前記結合対は、項目２〜１２のいずれかに記載の方法によって得ることができる、
項目１３に記載の組成物。
【請求項１５】
各オリゴヌクレオチドが、９〜１５個のＬＮＡモノマーからなり、
前記第１の核酸塩基配列及び前記第２の核酸塩基配列は、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、２０℃〜４０℃の温度で９個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
前記結合対は、項目３〜１２のいずれかに記載の方法によって得ることができる、
項目１４に記載の組成物。
【請求項１６】
各ＬＮＡモノマーが、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び５−メチルシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む、項目１３〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
各ｓｓ−オリゴヌクレオチドが、２個または３個の異なる核酸塩基を含む、項目１３〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
各ｓｓ−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基の中で、Ｇ＋Ｃ含有量が、７５％未満である、項目１７に記載の組成物。
【請求項１９】
各ｓｓ−オリゴヌクレオチドの核酸塩基のうち、各シトシンが、５−メチルシトシンに置換されている、項目１７及び１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
分析物特異的受容体及び固相を含む不均一イムノアッセイにおける、結合対を有する組成物の使用であって、前記組成物は、請求項１３〜１９のいずれかに記載される組成物であり、前記結合対が、固相上に分析物特異的受容体を固定化する使用。
【請求項２１】
分析物を検出するための不均一イムノアッセイを実施するためのキットであって、前記キットは、別個の容器中に、請求項１３から１９のいずれかに記載の前記結合対の前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドが付着した固相、及び請求項１３から１９のいずれかに記載の前記結合対の前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが付着した分析物特異的受容体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本報告書は、完全にロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる一本鎖（ｓｓ−）オリゴヌクレオチドのハイブリダイズに関するものである。本文書は、予想外に所定の時間間隔内で二本鎖を形成することができない、完全に相補的なｓｓ−オリゴヌクレオチド対を用いたハイブリダイゼーション実験を示す。本報告書は、そのような互換性のないオリゴヌクレオチド対を特定するための効率的な方法を提供する。別の態様において、本報告書は、驚くべきことに、事前の変性がない場合に、迅速な二本鎖形成が可能であるロック核酸（ＬＮＡ）モノマーから全てが構成される、相補的一本鎖オリゴヌクレオチド対を提供する。本報告書はまた、そのような互換性のある全ＬＮＡｓｓオリゴヌクレオチド対を特定及び選択する方法を提供する。さらに別の態様において、本報告書は、結合アッセイ、イムノアッセイなどの生化学的アッセイにおける結合パートナーとしての互換性オリゴヌクレオチド対の使用を提供する。特定の実施形態では、互換性ＬＮＡオリゴヌクレオチド対が、サンプル中の分析物を検出または定量するためのアッセイにおいて、例えば分析物に特異的な捕捉分子などの異なる標的分子を固定化するために使用されることについて、考察する。
【背景技術】
【０００２】
特に焦点を当てるのは、結合対の２個のパートナーの特定の相互作用と、それらの最終的な相互連結が機能的な役割を果たす、一般的な生化学的用途である。非常に頻繁に、不均一イムノアッセイでは、ビオチン：（ストレプト）アビジン結合対を使用して、分析物特異的捕捉受容体を固相に固定化する。本報告書は、他の用途の中でも、イムノアッセイに適した代替の結合対を概念化し、説明し、実証する。具体的には、ハイブリダイゼーションによって、二本鎖を形成することができる２個の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドからなる代替の結合対は、ビオチン：（ストレプト）アビジン結合対の技術的な代替を提供する。
【０００３】
本開示の重要な焦点は、イムノアッセイの過程で、捕捉受容体が固相に係留される手段である。特に、本開示は、分析物を含むサンプルの存在下で捕捉受容体の固定化を容易にする、及び／又は複合体が形成された後に検出複合体を係留することができる、結合対に焦点を当てている。イムノアッセイにおける結合対は、特異的な特徴を有することが技術的に必要である。したがって、２個の結合パートナーの相互作用は特異的でなければならない。さらに、連結形成の動力学、すなわち、結合対の２個の別個のパートナーが相互作用し、最終的に会合する速度、すなわち互いに結合する速度は、高いことが望まれる。さらに、２個の結合パートナーの連結は、一度形成されると安定であることが望ましい。さらに、結合パートナーは、イムノアッセイに適用するために、分析物特異的受容体や固相表面などの他の分子との化学的抱合に適している必要がある。イムノアッセイでは、受容体及び通常は検出される分析物も、特定の受容体又は特定の検討中の分析物に応じて異なる可能性がある特定の条件下でのみ、立体構造及び機能を保持することを理解することが重要である。したがって、受容体分子又は分析物は、これらの条件からの限られた逸脱のみを許容し得る。そのような条件は、ほんの数例を挙げると、約ｐＨ６〜約ｐＨ８の範囲のｐＨを有する緩衝水溶液、１つ以上の溶解塩、１つ以上のヘルパー物質、２０℃〜４０℃の範囲の事前に選択された温度で、約２５０〜約４００ｍｏｓｍ／ｋｇの溶質の総量を含み得る（ただしこれらに限定されない）。
【０００４】
結合対の別個のパートナーは、抱合、特に捕捉分子すなわち受容体との抱合、及び固相表面との抱合に、互いに特異的に会合及び結合する能力を失うことなく、適している必要がある。イムノアッセイにおける抱合に関して、代替結合対の各別個の結合パートナーは、アッセイ条件下で機能的でなければならない。同じ理由が、分析物、担体材料、固相、及びアッセイの過程で存在する可能性のある他の物質又は化合物など、結合パートナーとの抱合に必要な他のすべての材料に当てはまるが、これらに限定されない。
【０００５】
相補的配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド、すなわち、ハイブリダイゼーションによって二本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドは、高分子を連結するための、または分子を固相に付着させるための結合対手段として以前に提案されてきた。ＥＰ０４８８１５２は、抗体と固相を連結する核酸二本鎖によって分析物特異的捕捉抗体が固定化された固相を用いた不均一イムノアッセイを開示する。一実施形態では、１個のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドが抗体に付着し、相補的なオリゴヌクレオチドが固相に付着し、それによって連結二本鎖を形成することが示されている。同様の開示は、文献ＥＰ０６９８７９２、ＷＯ１９９５／０２４６４９、ＷＯ１９９８／０２９７３６、及びＥＰ０９０５５１７で提供される。ＷＯ２０１３／１８８７５６は、フローサイトメトリーの方法と、第１のオリゴヌクレオチドに結合した抗体、第１のオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する第２のオリゴヌクレオチドに結合したオリゴスフェア、及びラベルと第１及び第２のオリゴヌクレオチドに相補的な第３の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む組成物を開示している。特定の実施形態では、オリゴスフェアは磁性を有する。この文書は、標準化手順の参照としてオリゴスフェアの特定の使用を報告している。
【０００６】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）やロック核酸（ＬＮＡ）などの修飾オリゴヌクレオチドは、生理学的用途のために探索されてきた。ＬＮＡは、リボース部分の２’−酸素と４’−炭素の間にメチレンリンカーを持っており、その結果、糖がＣ３−エンド立体構造にロックされるため、「ロック核酸」という名前が付けられている。この化学修飾は、ハイブリダイゼーションによる二本鎖形成を含む技術的用途において、ヌクレアーゼ耐性、ならびにオリゴヌクレオチド標的に対するより高い親和性及びより高い特異性を与える。ＷＯ１９９８／３９３５２は、ロック核酸（ＬＮＡ）構造を開示している。ＷＯ２０００／０５６７４６は、ＬＮＡの特定の立体異性体の中間生成物を含むＬＮＡモノマーの合成を開示している。化学合成により、ＬＮＡヌクレオシド類似体モノマーのみからなる（「全ＬＮＡ」）一本鎖を合成することができる。
【０００７】
上記のように、ロック核酸（ＬＮＡ）モノマーは、リボース環に余分の２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレンブリッジが追加された、立体構造的に制限されたヌクレオチド類似体である。ＬＮＡモノマーは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオシドモノマーとして提供される（Ｓｉｎｇｈ  Ｓ．Ｋ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４（１９９８）４５５−４５６；Ｋｏｓｋｉｎ  Ａ．Ａ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４（１９９８）３６０７−３６３０；Ｗｅｎｇｅｌ  Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３２（１９９９）３０１−３１０）。ＷＯ２０００／０６６６０４及びＷＯ２０００／０５６７４６は、ＬＮＡヌクレオシドモノマーの特定の立体異性体を開示している。ＤＮＡ及びＬＮＡモノマーを含む混合ＤＮＡ−ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性を示し、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡにハイブリダイズされる場合に、熱安定性が大幅に向上する。実際、合成された他の高親和性核酸模倣物、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、及び２’−フルオロＮ３’−ホスホルアミデートと比較して、ＬＮＡは、並外れた結合親和性を示す。「ミキシマー（ｍｉｘｍｅｒ）」としても知られるＬＮＡ−ＤＮＡ混合オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度論は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｕ．らによって報告された（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３５４（２００１）４８１−４８４）。それぞれが７個のＬＮＡモノマーからなる２個の相補的なｓｓ−オリゴヌクレオチドからの二本鎖の結晶構造がＥｉｃｈｅｒｔ  Ａ．らによって報告された。（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８（２０１０）６７２９−６７３６）。
【０００８】
ＷＯ１９９９／１４２２６は、目的の分子及び固体支持体に付着するための親和性対の構築におけるＬＮＡの使用を提案する。しかしながら、相補的な全ＬＮＡ一本鎖のハイブリダイゼーションが技術的問題を引き起こすことも当技術分野で知られている。全ＬＮＡハイブリダイゼーションの熱力学的分析は、主に実験によって立証できるものであり、事前の変性ステップ（ハイブリダイゼーション前の加熱など）なしで、ハイブリダイズするモノマーの配列予測は、これまでのところ不可能であるように思われる。
【０００９】
これまでのところ、ほとんどの場合、混合ＬＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（「ミキシマー一本鎖」または「ミキシマー」とも呼ばれる）が分析された。これまでのところ、特にＫｏｓｈｋｉｎ  Ａ．Ａ．ら（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏ  １２０（１９９８）１３２５２−１３２５３）及びＭｏｈｒｌｅ  Ｂ．Ｐら（Ａｎａｌｙｓｔ  １３０（２００５）１６３４−１６３８）によって、ＬＮＡモノマーのみから作られたハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチド（すなわち、「全ＬＮＡ」一本鎖オリゴヌクレオチド）の特性評価に関する報告はほとんどない。Ｅｚｅ  Ｎ．Ａ．ら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８（２０１７）１０８６−１０９６）は、ＤＮＡ−ＬＮＡミキシマーとＤＮＡプローブからの結合率が、１０５Ｍ−１ｓ−１未満であると報告している。これらの著者によると、溶液中のハイブリダイゼーション速度は、置換に利用可能なモノマーの３分の１を考慮すると、１つまたは複数のＤＮＡモノマーをＬＮＡモノマーで置換しても影響を受けないように思われる。
【００１０】
ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの熱力学的挙動に関する予測は、Ｔｏｌｓｔｒｕｐ  Ｎらによって参照される専用のコンピュータープログラムによって支援される。（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（２００３）３７５８−３７６２）。ただし、この報告書では、実験データが不足しているのではなく、これらＬＮＡオリゴヌクレオチドの特性がより複雑であるため、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの予測誤差がより高いことに明示的に言及する。具体的には、本報告書は、８つ以上のＬＮＡモノマーからなる相補的なｓｓ−オリゴヌクレオチドが、ワトソン・クリック塩基対を有する二本鎖分子を形成する能力に関して予測できないことを示す。
【００１１】
したがって、本報告書の一般的な目的は、ハイブリダイズすることができ、それによってワトソン・クリック塩基対を有する二本鎖分子を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対の同定及び提供である。より具体的には、非変性条件下で、より具体的には、分析物検出アッセイ（イムノアッセイなどであるが、これに限定されない）における分析物特異的受容体の機能と互換性のある条件下で、二本鎖形成が可能な結合対を探求する。重要なことには、相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション非互換性を引き起こす分子内二次構造を除去するための断続的な加熱ステップなしで、室温（これに限定されないが）などの周囲温度で、水溶液中において、保存及び相互にハイブリダイズすることが可能な一本鎖の全ＬＮＡオリゴヌクレオチドを探求する。
【発明の概要】
【００１２】
本開示は、本明細書に開示される他のすべての態様及び実施形態に関連する第１の態様において、結合対を提供するための方法であって、この結合対は、第１の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドからなり、この２個のオリゴヌクレオチドは、２０℃〜４０℃の温度で８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、
（ａ） ８〜１５個のロック核酸（＝ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（＝ｓｓ−）オリゴヌクレオチドを提供し、各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、第１の核酸塩基配列を形成するステップ；
（ｂ） ８〜１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドを提供し、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、少なくとも前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドの各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、前記第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で前記第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか、又はそれらからなること、及び理論的には、前記第１及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドが互いに二本鎖を形成する能力を予測すること、前記二本鎖は、８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対からなるステップ；
（ｃ）等モル量の第１及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドを水溶液中で２０℃〜４０℃の温度、２０分以下の時間間隔で、混合及びインキュベートし、それによりｓｓ−オリゴヌクレオチドの混合物又は二本鎖含有混合物を得るステップ；続いて、
（ｄ） ステップ（ｃ）で得られた前記混合物を２０℃〜４０℃の温度で分離し、続いて、前記分離された二本鎖を検出及び定量し、及び前記分離されたｓｓオリゴヌクレオチドを検出及び定量するステップ；続いて、
（ｅ）ステップ（ｄ）で二本鎖が検出できるほど存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ−オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、前記結合対を選択するステップ；
これにより、前記結合対を提供するステップ
を含む方法を提供する。
【００１３】
本開示は、本明細書に開示される他のすべての態様及び実施形態に関連する第２の態様において、水性溶媒と、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対とを含む液体組成物であって、
各オリゴヌクレオチドは、８〜１５個のロック核酸（＝ＬＮＡ）モノマーからなり、各モノマーは、前記第１のオリゴヌクレオチドの第１の核酸塩基配列及び前記第２のオリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成する前記モノマーの核酸塩基を含み、
前記第１の核酸塩基配列及び前記第２の核酸塩基配列は、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、２０℃〜４０℃の温度で８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
及び前記結合対は、本明細書に開示される第１の態様による方法によって得られる組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
結合対は、非変性条件下で、特定の非共有分子間結合を互いに形成することができる２個の異なる結合パートナーのセットであると理解されている。本開示の文脈において、非変性条件の最も広い理解は、加熱や一定量の変性化合物の添加など、標的物質を分子的に展開し、それによってその二次構造または高次構造を破壊するための外部から加えられる影響がないことを意味する。これに関して、加熱としては、温度を実質的に４０℃、５０℃、６０℃、またはさらに高い温度よりも所望の期間上昇させることが例示され、変性化合物としては、洗浄剤、カオトロープ、またはホルムアミドなどの核酸二本鎖の融解温度を下げることができる化合物が例示される。
【００１５】
重要なことに、各第１及び第２の結合パートナーは、同じ種のパートナーと特定の結合を形成しない。つまり、２個の第１のパートナーまたは２の第２のパートナー間の特定の分子内結合は生じない。同時に、非変性条件下では、それぞれの別個のパートナーは、他のパートナーを結合する能力を示す。具体的には、非変性条件下では、別個のパートナーは、他の種のパートナーとの結合を形成できなくなる状態にする分子内結合を全く形成しない。例えば、分子内フォールディングは、非変性条件下で、２個の異なる種の結合パートナーの所望の分子間結合を阻害または防止するのに十分に安定である、二次構造をもたらす可能性がある。
【００１６】
ただし、一方または両方の結合パートナーに影響を与える分子内フォールディングは、２つの異なる種の望ましい分子間結合を必ずしも完全に阻害するとは限らない。分子間結合の動力学は、分子内フォールディングのない無妨害の結合パートナーと比較して、遅くなると予想される。自動イムノアッセイ（ただしこれに限定されない）などの標準化されたハイスループットなアッセイの仕組みを特に考慮すると、そのような設定は、通常、以前の別個の結合パートナーからの結合対の分子間連結形態の迅速な形成を必要とする。したがって、各結合パートナーに分子内フォールディングがないか、大幅に最小化されていることが、望ましい技術的特徴である。
【００１７】
本開示の文脈において、そして特にイムノアッセイ及び受容体とその標的物質（分析物）との相互作用に関して、非変性状態は、受容体とその標的物質（分析物）との相互作用及び結合を可能にする立体構造を達成及び／又は維持することにおいて、受容体（例えば、抗体）を許容する環境の集合的特徴としてより具体的に理解される。同時に、非変性条件によって与えられる環境は、標的物質が、受容体に結合するようになる、及び／又は結合したままになることを可能にする立体構造を達成及び／又は維持することを許容する。
【００１８】
特に、全ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、当業者が利用できる本ツールでは確実に予測できない特徴を有する。実用上の理由から、本研究は最大１５個のＬＮＡモノマーからなるｓｓ−オリゴヌクレオチドに限定された。
【００１９】
したがって、本開示は、本明細書に開示される他のすべての態様及び実施形態に関連する第１の態様において、結合対を提供するための方法であって、この結合対は、第１の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドからなり、この２個のオリゴヌクレオチドは、２０℃〜４０℃の温度で８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、
（ａ）８〜１５個のロック核酸（＝ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（＝ｓｓ−）オリゴヌクレオチドを提供し、各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、第１の核酸塩基配列を形成するステップ；
（ｂ）８〜１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドを提供し、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、少なくとも前記第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドの各モノマーは、核酸塩基を含み、前記第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基は、第２の核酸塩基配列を形成し、前記第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で前記第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか、又はそれらからなること、及び相補性として、前記第１及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドが互いに二本鎖を形成する能力を予測すること、前記二本鎖は、８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対からなるステップ；
（ｃ）等モル量の第１及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドを水溶液中で２０℃〜４０℃の温度、２０分以下の時間間隔で、混合及びインキュベートし、それによりｓｓ−オリゴヌクレオチドの混合物又は二本鎖含有混合物を得るステップ；続いて、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記混合物を２０℃〜４０℃の温度で分離し、続いて、前記分離された二本鎖を検出及び定量し、存在する場合は、及び前記分離されたｓｓオリゴヌクレオチドを検出及び定量するステップ；続いて、
（ｅ）ステップ（ｄ）で二本鎖が検出できるほど存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ−オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、前記結合対を選択するステップ；
これにより、前記結合対を提供するステップ
を含む方法を提供する。
【００２０】
ここで指定されている全ＬＮＡｓｓ−オリゴヌクレオチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５からなる群から選択された数のモノマーを含むことができる。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の一実施形態では、第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、８〜１２個のモノマー（すなわち、８、９、１０、１１及び１２個のモノマーから選択される数）からなり、また本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態のより具体的な実施形態では、第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、８個のモノマーからなる。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の別の実施形態では、第１のｓｓオリゴヌクレオチドは、８〜１０個のモノマー（すなわち、８、９、及び１０個のモノマーから選択される数）からなり、また本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態のより具体的な実施形態では、第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、９個のモノマーからなる。第１及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、同じサイズである必要はない、すなわち、同じ数のモノマーからなる必要はない。しかしながら、第１及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドを構成する同数のモノマーは、本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の特定の実施形態である。
【００２１】
２個のオリゴヌクレオチドは、互いに平行に走るが反対の配列で走る場合、逆平行である。具体的な例は、核酸二本鎖の２本の相補鎖であり、これらは互いに並んで反対方向に走っている。結果として、二本鎖の各末端は、反対側の第２の鎖の３’末端に隣接する／整列する第１の鎖の５’末端を含む。ＤＮＡ及びＲＮＡと同様に、ＬＮＡはワトソン・クリック塩基対を示す（Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２０（１９９８）１３２５２〜１３２６０）。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の一実施形態において、各ＬＮＡモノマーは、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニンからなる群から選択される核酸塩基を含む。相補的な反対の鎖上のこれらの塩基を含む特定のワトソン・クリック塩基対形成は、当業者によく知られており、当技術分野で広く公開されている受け入れられた特徴である。記載された核酸塩基とは別に、全ＬＮＡｓｓ−オリゴヌクレオチドに組み込むことができる他のものも当業者に知られている。一般的に、これらには、Ｃ−５原子で誘導体化されたピリミジンが含まれる。
【００２２】
重要なことに、２個の異なる（すなわち、第１と第２の）ｓｓ−オリゴヌクレオチドが接触した後、本方法のステップ（ｃ）は、２０分以下の時間間隔でのインキュベーションを明記する。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、時間間隔は、１秒〜２０分、１秒〜１５分、１秒〜１０分、１秒〜５分、１秒〜１分、１秒〜３０秒、１秒〜２０秒、１秒〜１０秒、及び１秒〜５秒からなる群から選択される。非常に有利な時間間隔は、１秒〜１０秒及び１秒〜５秒から選択される。
【００２３】
ステップ（ｃ）では、温度はステップ（ｄ）の温度とは独立して選択され、その逆も同様である。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）及び（ｄ）の温度は５℃を超えて異ならない。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｄ）において、温度は２０℃〜２５℃である。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｄ）において、温度は２５℃〜３７℃である。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の前に、第１のｓｓ−オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、８０℃〜４０℃で、具体的には２０℃〜４０℃、より具体的には２０℃〜２５℃、さらにより具体的には２５℃〜３７℃の温度で保たれる。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の別の実施形態では、ステップ（ｃ）において、水溶液は、溶液のｐＨをｐＨ６〜ｐＨ８、より具体的にはｐＨ６．５〜ｐＨ７．５に維持する緩衝液を含む。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の別の実施形態では、ステップ（ｃ）において、水溶液は塩を含む。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の別の実施形態では、ステップ（ｃ）において、水溶液は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、より具体的には、２００ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、より具体的には、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より具体的には５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの溶解物質の総量を含む。
【００２４】
本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の別の実施形態では、ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）のインキュベートされた混合物を、移動相として水性溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーに供することを含む。したがって、カラムクロマトグラフィーは、ｓｓ−オリゴヌクレオチドから別個の二本鎖分子を分離するために使用される。ＨＰＬＣなどの適切なクロマトグラフィー方法は、この点に関して当業者によく知られている。
【００２５】
本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の別の実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、ベータ−Ｄ−ＬＮＡモノマーからなる。つまり、第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドは完全にベータ−Ｄ−ＬＮＡモノマーからなり、第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドは完全にベータ−Ｄ−ＬＮＡモノマーからなる。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態のさらに別の実施形態では、（ａ）及び（ｂ）のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、ベータ−Ｌ−ＬＮＡモノマーからなる。つまり、第１のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、完全にベータ−Ｌ−ＬＮＡモノマーからなり、第２のｓｓ−オリゴヌクレオチドは完全にベータ−Ｌ−ＬＮＡモノマーからなる。
【００２６】
そこに開示される方法によって、またその実施形態のいずれかによって、本開示は、それぞれが８〜１５個のＬＮＡモノマーを含む、相補的な一本鎖全ＬＮＡオリゴマーの非変性対から、２５℃〜４０℃の事前に選択された温度で形成される全ＬＮＡ二本鎖を提供する。
【００２７】
本開示は、本明細書に開示される他のすべての態様及び実施形態に関連する第２の態様において、水性溶媒及び第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対を含む液体組成物を提供し、各オリゴヌクレオチドは、８〜１５個のロック核酸（＝ＬＮＡ）モノマーからなり、各モノマーは、第１のオリゴヌクレオチドの第１の核酸塩基配列及び第２のオリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成するモノマーの核酸塩基を含み、第１の核酸塩基配列そして、第２の核酸塩基配列は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、２０℃〜４０℃の温度で８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、結合対が本明細書に開示される第１の態様による方法によって得られる。
【００２８】
すべての態様及び実施形態に関連する特定の態様において、水性溶媒及び第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対を含む液体組成物を提供し、各オリゴヌクレオチドは、８〜１５個のロック核酸（＝ＬＮＡ）モノマーからなり、各モノマーは、第１のオリゴヌクレオチドの第１の核酸塩基配列及び第２のオリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成するモノマーの核酸塩基を含み、第１の核酸塩基配列そして、第２の核酸塩基配列は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、２０℃〜４０℃の温度で８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、結合対が本明細書に開示される第１の態様による方法によって得られる。
【００２９】
すべての態様及び実施形態に関連する特定の態様において、水性溶媒及び第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対を含む液体組成物を提供し、各オリゴヌクレオチドは、８〜１５個のロック核酸（＝ＬＮＡ）モノマーからなり、各モノマーは、第１のオリゴヌクレオチドの第１の核酸塩基配列及び第２のオリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成するモノマーの核酸塩基を含み、第１の核酸塩基配列そして、第２の核酸塩基配列は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、２０℃〜４０℃の温度で８〜１５個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、結合対が本明細書に開示される第１の態様による方法によって得られる。
【００３０】
本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の一実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、９〜１５個のＬＮＡモノマーからなり、第１の核酸塩基配列及び第２の核酸塩基配列は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、２０℃〜４０℃の温度で、９個の連続するワトソン・クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成できるように選択され、結合対は、第１の態様の方法及びその実施形態によって得られうるか、又は得られる。
【００３１】
本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の一実施形態において、各ｓｓ−オリゴヌクレオチドは、２個又は３個の異なる核酸塩基を含む。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の実施形態において、各ｓｓ−オリゴヌクレオチドの核酸塩基のＧ＋Ｃ（Ｇ及びＣの類似体を含む）含有量は、７５％未満である。特定の実施形態では、Ｇ＋Ｃ含有量は、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％から選択される値よりも低い。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態のさらに別の実施形態において、結合対における各ＬＮＡモノマーは、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニンからなる群から選択される核酸塩基を含む。より具体的な実施形態では、各ｓｓ−オリゴヌクレオチド中の核酸塩基のうち、各シトシンは、５−メチルシトシンによって置換されている。
【００３２】
本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の一実施形態において、２個の別個の互換性結合パートナーの結合対は、以下からなる群から選択される全ＬＮＡｓｓ−オリゴヌクレオチド対である。
【００３３】
５’ｔｇｃｔｃｃｔｇ３’及び５’ｃａｇｇａｇｃａ３’、
５’ｇｃｃｔｇａｃｇ３’及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃ３’、
５’ｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ３’及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃａｇ３’、
５’ｇａｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ３’及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｃ３’、
５’ｔｇｃｔｃｃｔｇｔ３’及び５’ａｃａｇｇａｇｃａ３’、
５’ｇｔｇｃｇｔｃｔ３’及び５’ａｇａｃｇｃａｃ３’、
５’ｇｔｔｇｇｔｇｔ３’及び５’ａｃａｃｃａａｃ３’、
５’ｃａａｃａｃａｃｃａａｃ３’及び５’ｇｔｔｇｇｔｇｔｇｔｔｇ３’、
５’ａｃａｃａｃｃａａｃ３’及び５’ｇｔｔｇｇｔｇｔｇｔ３’、
５’ａｃａｃｃａａｃ３’及び５’ｇｔｔｇｇｔｇｔ３’
【００３４】
特定の実施形態において、前述の群の任意の選択された対におけるｓｓ−オリゴヌクレオチドのモノマーは、ベータ−Ｄ−ＬＮＡモノマーである。さらに別の特定の実施形態において、前述の群の任意の選択された対におけるｓｓ−オリゴヌクレオチドのモノマーは、ベータ−Ｌ−ＬＮＡモノマーである。
【００３５】
本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の実施形態において、結合対の１個のｓｓ−オリゴヌクレオチドは、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、合成有機ポリマー（ラテックス）ビーズ、多糖ビーズ、試験管、マイクロウェルプレートキャビティ、キュベット、膜、足場分子、水晶、フィルム、濾紙、ディスク、及びチップからなる群から選択される固相に付着する。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態の別の実施形態において、結合対の１個のｓｓオリゴヌクレオチドは、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖、グリカン、ハプテン、及び色素からなる群から選択される分子に連結する。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態のさらに別の実施形態では、ｓｓ−オリゴヌクレオチドは、リンカーに共有結合的に付着する。本明細書に開示されるすべての態様及び実施形態のさらに別の実施形態において、ｓｓ−オリゴヌクレオチドは、イムノアッセイなどであるがこれに限定されない受容体ベースの分析物検出アッセイにおいて、有用な分析物特異的受容体に、共有結合的に付着する。
【００３６】
その最も広い意味で、また生化学で一般的に受け入れられている理解に沿って、受容体は、特定の標的分子全体に対する親和性、又は特定の分子領域及び／又は標的分子の三次元的側面に対する親和性を有する構造である。本開示の目的のために、受容体は、標的分子と相互作用し、そして結合すると理解される。生化学的アッセイでは、受容体を使用してその標的分子を捕捉し、標的を複雑な混合物から分離し、標的分子を分析物として定量することができる。例として、イムノアッセイは通常、抗体又は抗体由来分子を受容体として使用する。捕捉受容体は、固定化された形態で（すなわち、固相に付着して）提供されるか、又は好ましくは、固定化されることができる形態で提供される受容体である。固定化は、固相と受容体を連結する、又は連結することができる結合対によって行うことができる。
【００３７】
非常に一般的に言えば、イムノアッセイは、標的分析物に特異的に結合することができる１つ又は複数の受容体を提供する。このような受容体としては、分析物特異的イムノグロブリンが例示され得る。そのために、この名前がイムノアッセイである。しかしながら、本開示の目的のために、他のタイプの分析物特異的受容体もまた考慮される。したがって、より一般的な用語である、受容体ベースの分析物検出アッセイが適切である。
【００３８】
通常、標的分析物はサンプルに含まれ、このサンプルは異なる分子の複雑な混合物である。本開示の目的のために、液体サンプルが考慮される。液体サンプルは、液相、すなわち大抵は水性溶媒である液体溶媒を含む。水性溶媒中には、複数の分子が溶解状態で存在する。したがって、特定の実施形態では、サンプルは液体の凝集状態にあり、それは単相の均一な混合物である。特定の実施形態では、分析物は、溶解形態の混合物に含まれ、さらに、１つ又は複数のさらなる分子が、溶解形態のその混合物中に存在する。
【００３９】
受容体ベースの分析物検出アッセイによる、液体サンプル中に存在する、又はその中に存在すると疑われる標的分析物の検出に関して、第１の必須のステップにおいて、分析物は特異的に結合する。特異的結合は、受容体が、存在する又は存在するようになることを意味し、この受容体は、標的分析物に対して高い結合親和性及び結合特異性を有し、またサンプル中にまた存在するさらなる分子に対して低い又は存在しない。特定の実施形態（及び例示する多数の既存のアッセイ）では、分析物に特異的に結合することができる受容体を含む化合物をサンプルに添加する。重要なことに、サンプルと受容体を含む化合物の混合物は、サンプル中の受容体と標的分析物との特定の相互作用を許容する条件を提供しなければならない。これは、混合物における条件は、受容体による分析物の実際の結合に許容的でなければならないことを含み、また、その条件は、結合された標的分析物で受容体を安定化することが望ましい。同時に、サンプルと化合物の混合物は、受容体、又は受容体全体を含む化合物へのさらなる分子の非特異的結合を支持又は安定化しないことが望ましい。
【００４０】
続いて、分析物を固定化する。固定化は、分析物を周囲の複雑な混合物、特にサンプルのさらなる分子から分離できる、検出プロセスの重要なステップである。固定化には、標的分析物が付着するようになる固相が必要である。固定化されると、相分離によって分析物を混合物から分離することができる。次に、混合物から分離されて（すなわち、精製されて）、分析物が検出される。
【００４１】
受容体ベースの分析物検出アッセイ及び固定化ステップを考慮すると、固相を提供し、固相と標的分析物との間の連結を構築する必要がある。連結は、自己組織化プロセスで構築されることが望ましい。
【００４２】
イムノアッセイは、分析物の検出又は定量化を行い、分析物と少なくとも１つの分析物特異的受容体との反応に依存し、その結果、分析物：受容体の複合体を形成する、確立された生物分析法である。非限定的な例は、それぞれ、抗原と抗体との間の反応である。「サンドイッチ」イムノアッセイの特定の実施形態は、複数の認識エピトープを有する分析物に使用することができる。したがって、サンドイッチアッセイには、分析物上の重複しないエピトープに付着する少なくとも２つの受容体が必要である。「不均一サンドイッチイムノアッセイ」では、受容体の１つが分析物特異的捕捉受容体の機能的役割を果たす。この受容体は、固相に固定化されているか、又は（アッセイの過程で）固定化される。第２の分析物特異的受容体は、液相中の溶解形態で供給される。それぞれの分析物が第１及び第２の受容体によって結合されると、サンドイッチ様複合体が形成される（受容体−１：分析物：受容体−２）。サンドイッチ状の複合体は、「検出複合体」とも呼ばれる。検出複合体内では、分析物は受容体の間に挟まれている。すなわち、そのような複合体内では、分析物は、第１の受容体と第２の受容体との間の連結要素を意味する。
【００４３】
（「均一」に対するものとして）「不均一」という用語は、アッセイ手順における２つの必須で別個のステップを示す。第１のステップでは、ラベルを含む検出複合体が形成され、固定化されるが、結合していないラベルがまだ複合体を囲んでいる。ラベル依存信号を判定する前に、非結合ラベルは固定化された検出複合体から洗い流される。そのため、第２のステップに相当する。対照的に、均一アッセイは、シングルステップインキュベーションによって分析物依存の検出可能なシグナルを生成し、洗浄ステップを必要としない。
【００４４】
不均一アッセイでは、固相は、分析物と接触する前に、その表面に機能的捕捉受容体（第１の受容体）に結合する場合があるように機能化される。又は、固相の表面は、分析物と反応した後、第１の受容体を係留できるように機能化される。後者の場合、係留プロセスは、分析物を特異的に捕捉して結合する受容体の能力を妨げてはならない。液相に存在する第２の受容体は、結合した分析物の検出に使用される。したがって、不均一イムノアッセイでは、分析物は第１（捕捉）及び第２（検出）受容体に結合することができる。それにより、分析物が、捕捉受容体と検出器受容体との間に挟まれる、「検出複合体」が形成される。典型的な実施形態では、検出器受容体は、分析物と接触する前にラベルされる。あるいは、分析物が結合した後、ラベルが検出器受容体に特異的に付着する。検出複合体が固相に固定化されている場合、固相で検出可能なラベルの量は、サンドイッチされた分析物の量に相当する。洗浄ステップで未結合のラベルを除去した後、分析物の存在と量を示す固定化されたラベルを検出できる。
【００４５】
別のよく知られている実施形態は、その最も単純な形態では、第２の検出器受容体の欠乏によって、サンドイッチ型フォーマットとは異なる、競合的不均一イムノアッセイである。対照的に、分析物を含むサンプルは、分析物特異的受容体と交差反応することができる人工的に生成されてラベルされた類似体と混合される。アッセイでは、分析物と類似体は、固定化されている、又は固定化されるようになる捕捉受容体への結合をめぐって競合する。この結合ステップに続いて、固定化されたラベルの量が多いほど、捕捉受容体をめぐって競合することができた非ラベル分析物の量が少なくなる。固定化されたラベルは、洗浄ステップの後に定量される。したがって、固相で検出可能なラベルの量は、サンプルに最初に存在した分析物の量に反対に相応する。
【００４６】
不均一イムノアッセイにおいて洗浄ステップは、十分に安定するために、第１の結合パートナーと第２の結合パートナーの非共有の連結を必要とする。ただし、連結に必要な安定性の程度は、適用する洗浄ステップの強度によって異なる。重要かつ予想外に、本明細書に示されるような結合対は、イムノアッセイにおける固定化ステップを容易にするのに並外れてよく適している。つまり、イムノアッセイでは、例えば、固相に付着した結合対の第１の結合パートナー、及び分析物特異的（捕捉）受容体に付着した結合対の第２の結合パートナーは、固相への受容体の固定化を容易にするのに。非常に適している。
【００４７】
以下の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】一本鎖ＬＮＡ１のＨＰＬＣ分析（実施例２）
【図２】一本鎖ＬＮＡ２のＨＰＬＣ分析（実施例２）
【図３】混合ＬＮＡ１とＬＮＡ２のＨＰＬＣ分析、ＨＰＬＣシステムへの即時注入（実施例２）
【図４】注入（実施例２）前の熱変性後の混合ＬＮＡ１とＬＮＡ２のＨＰＬＣ分析  陽性対照：二本鎖形成
【図５】一本鎖ＬＮＡ３のＨＰＬＣ分析（実施例２）
【図６】一本鎖ＬＮＡ４のＨＰＬＣ分析（実施例２）
【図７】混合ＬＮＡ３とＬＮＡ４のＨＰＬＣ分析、ＨＰＬＣシステムへの即時注入（実施例２）より遅い二本鎖形成（比率＜０．０５）
【図８】混合ＬＮＡ３及びＬＮＡ４のＨＰＬＣ分析、５０分後の注入（実施例２）より遅い二本鎖形成（比率＝０．０５）
【図９】注入（実施例２）前の熱変性後の混合ＬＮＡ３とＬＮＡ４のＨＰＬＣ分析  陽性対照：二本鎖形成
【００４９】
実施例１
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの合成
【００５０】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、標準の自動固相ＤＮＡ合成手順を使用し、ホスホロアミダイト化学を適用して、ＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡシンセサイザーで１μｍｏｌスケールの合成で合成された。Ｇｌｅｎ  ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ  ＰＳ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ  ｎｏ．２６−５０４０）及びＬＮＡホスホロアミダイト（Ｑｉａｇｅｎ／Ｅｘｉｑｏｎ  ｃａｔ．Ｎｏ．３３９７０（ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ），３３９７０２（ＬＮＡ−Ｔ），３３９７０５（ＬＮＡ−ｍＣ（Ｂｚ）及び３３９７０６（ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）；β−Ｌ−ＬＮＡ類似体は、Ａ．Ａ．Ｋｏｓｈｋｉｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ２００１，６６，８５０４−８５１２）に従って、Ｌ−グルコース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＧ０５２４７）から出発するＤ−β−ＬＮＡホスホロアミダイトと類似的に合成された。また、スペーサーホスホロアミダイト１８（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ．Ｎｏ．１０−１９１８）及び５’−ビオチンホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ．Ｎｏ．１０−５９５０）を構成要素として使用した。
すべてのホスホロアミダイトは、ＤＮＡグレードのアセトニトリルに０，１Ｍの濃度で適用された。ＬＮＡオリゴヌクレオチドの組み立てには、延長したカップリング時間（１８０秒）、延長した酸化（４５秒）、脱トリチル化時間（８５秒）での標準ＤＮＡサイクル、及び標準合成試薬と溶媒を使用した。５’−ビオチン化ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合成されたＤＭＴｏｆｆであったが、未修飾のＬＮＡオリゴヌクレオチドはＤＭＴｏｎとして合成された。次に、標準的な切断プログラムを適用して、濃縮アンモニアによって、支持体からＬＮＡオリゴヌクレオチドの切断を行った。残留保護基は、濃縮アンモニアでの処理によって切断された（５６℃で８時間）。粗ＬＮＡオリゴヌクレオチドを蒸発させ、ＲＰ  ＨＰＬＣ（カラム：ＰＲＰ−１、７μｍ、２５０×２１．５ｍｍ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ｐａｒｔ  ｎｏ．７９３５２）又はＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８  ＯＢＤ、５μｍ、１０ｘ２５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  ｐａｒｔ  ｎｏ．１８６００８１６７）で、０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム  ｐＨ７／アセトニトリルグラジエントを使用して、精製した。生成物画分を合わせ、水に対する透析（ＭＷＣＯ  １０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ  ６、ｐａｒｔ  ｎｏ．１３２６３８）によって３日間脱塩し、それによってＤＭＴｏｎ精製オリゴヌクレオチドのＤＭＴグループも切断した。最後に、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを凍結乾燥した。
【００５１】
収量は、８５〜３６０ｎｍｏｌの範囲だった。
【００５２】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム  ｐＨ７／アセトニトリルグラジエントを使用して、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ  ｐａｒｔ  ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で分析した。典型的な純度は、≧９０％だった。ＬＮＡオリゴヌクレオチドの同一性は、ＬＣ−ＭＳ分析によって確認された。
【００５３】
実施例２
【００５４】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を適用した事前の変性なしに二本鎖を形成できるＬＮＡオリゴヌクレオチド配列の同定
ａ）一般的な方法：
【００５５】
実施例１のＬＮＡオリゴヌクレオチドを緩衝液（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ）に溶解し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分間で８〜２４％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ  ｐａｒｔ  ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で、分析した。
【００５６】
鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを等モル濃度で室温で混合して、それから０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分で８−２４％Ｂ、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ  ｐａｒｔ  ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で直ちに分析した。
【００５７】
第１の対照実験では、鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを等モル濃度で室温で混合し、室温で１時間インキュベートした。その後、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分で８〜２５％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ  ｐａｒｔ  ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で分析した。
【００５８】
二本鎖形成（陽性対照）鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを示す第２の対照実験では、室温で等モル濃度で混合し、９５℃（１０分）で熱変性させ、それから室温に達した後、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分で８〜２４％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ  ｐａｒｔ  ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で再度分析した。
【００５９】
個々の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドと比較して異なる保持時間で新しいピークが形成される場合、二本鎖形成を検出することができる。陽性対照では、混合鎖と対向鎖が注入前に熱変性され、二本鎖が生成される。室温で、鎖と対向鎖ＬＮＡを混合した後の時間依存注入によって、事前の変性なしで、二本鎖形成の動態をモニターすることができる。
【００６０】
ＬＮＡ配列は、事前に変性させずに室温で５〜６０分間焼き戻した後（ＨＰＬＣ％は吸光係数で補正され、二本鎖の高色度は考慮されてない）、形成された二本鎖と両方の一本鎖ＬＮＡの一方のＨＰＬＣ％比（吸光係数で補正され、両方の鎖が正確に等モルではない場合は、より高い比率の値が考慮される）が、≧０．９の場合、迅速に二本鎖を形成できると判断される。
【００６１】
ｂ）二本鎖を高速で形成する配列の同定
ＬＮＡ１：５’−ｔｇｃｔｃｃｔｇ−３’
ＬＮＡ２：５’−Ｂｉ−Ｈｅｇ−ｃａｇｇａｇｃａ−３’
Ｈｅｇ＝ヘキサエチレングリコール
Ｂｉ＝ビオチンの吉草酸部分のカルボキシ機能を介して付着したビオチンラベル
結果を図に示す。
【００６２】
ｃ）ゆっくりと二本鎖を形成する配列の同定
ＬＮＡ３：５’−ｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ−３’
ＬＮＡ４：５’−Ｂｉ−Ｈｅｇ−ｃｇｔｃａｇｇｃａｇ−３’
結果を図に示す。
【００６３】
比率の計算：
【表１】
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ＨＰＬＣ％＊ε−１＊１０００（ＬＮＡ３／ＬＮＡ４二本鎖）／ＨＰＬＣ％＊ε−１＊１０００（ＬＮＡ３一本鎖）＝０．０２３／０．４５６＝０．０５
ＨＰＬＣ％＊ε−１＊１０００（ＬＮＡ３／ＬＮＡ４二本鎖）／ＨＰＬＣ％＊ε−１＊１０００（ＬＮＡ４一本鎖）＝０．０２３／０．４５７＝０．０５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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