(57)【要約】  本発明は、とりわけ、以下の構造を有する化合物を提供する。    【化２６２】2021518856.tif 000288薬学的に許容される担体および本発明による１つまたは複数の化合物を含む組成物も提供される。さらに提供される対象における障害の影響を治療または改善するための方法、方法である小胞体の毒性を抑制する（ER）ストレス被験者において、方法の軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善の対象における、および神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法。
2021518856.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Aの式（I）に従う化合物。
【化１６９】
2021518856.tif 000195
ここで：
Ｒ１は、アルキルヘテロシクロアルキルまたはアルキルヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、任意選択で、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で置換されている。
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１７０】
2021518856.tif 000196
ではないという条件付きで。
【請求項２】
式（II）の構造を有する請求項1に記載のAの化合物：
【化１７１】
2021518856.tif 000197
ここで：
R 1 、A及びR 1 Bそれらが結合している窒素原子と一緒になって、Cを形成5-6C請求ヘテロシクロアルキル、5-6ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコールから選択される1個のまたは複数の原子または基で置換され、またはヘテロシクロアルキル;
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１７２】
2021518856.tif 000198
ではないという条件付きで。
【請求項３】
【化１７３】
2021518856.tif 000199
【化１７４】
2021518856.tif 000200
【化１７５】
2021518856.tif 000201
【化１７６】
2021518856.tif 000202
【化１７７】
2021518856.tif 000203
【化１７８】
2021518856.tif 000204
からなる群から選択される、請求項1に記載のAの化合物：およびそれらの組み合わせ、または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項４】
【化１７９】
2021518856.tif 000205
からなる群から選択される、請求項3に記載のAの化合物：およびそれらの組み合わせ、またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項５】
【化１８０】
2021518856.tif 000206
である、請求項4に記載のAの化合物またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項６】
【化１８１】
2021518856.tif 000207
である、請求項4に記載のAの化合物またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７】
請求項４に記載の化合物、すなわち 
【化１８２】
2021518856.tif 000208
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８】
【化１８３】
2021518856.tif 000209
である、請求項4に記載のAの化合物またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９】
薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を1種以上の化合物を式（I）に従います。
【化１８４】
2021518856.tif 000210
ここで：
Ｒ１は、アルキルヘテロシクロアルキルまたはアルキルヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、任意選択で、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で置換されている。
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１８５】
2021518856.tif 000211
ではないという条件付きで。
【請求項１０】
A医薬組成物請求項にccording9項、一つ以上の化合物Sを有する式（II）の構造を。
【化１８６】
2021518856.tif 000212
ここで：
R 1 、A及びR 1 Bそれらが結合している窒素原子と一緒になって、Cを形成5-6C請求ヘテロシクロアルキル、5-6ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコールから選択される1個のまたは複数の原子または基で置換され、またはヘテロシクロアルキル;
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１８７】
2021518856.tif 000213
ではないという条件付きで。
【請求項１１】
請求項に記載のA医薬組成物9、前記一つ以上の化合物Sを有するからなる群から選択される構造
【化１８８】
2021518856.tif 000214
【化１８９】
2021518856.tif 000215
【化１９０】
2021518856.tif 000216
【化１９１】
2021518856.tif 000217
【化１９２】
2021518856.tif 000218
およびそれらの組み合わせ、またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１２】
請求項に記載のA医薬組成物9、前記一つ以上の化合物Sを有するからなる群から選択される構造
【化１９３】
2021518856.tif 000219
および、およびそれらの組み合わせ、またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１３】
請求項に記載の医薬組成物9 、前記一つ以上の化合物Sを有し、以下の構造
【化１９４】
2021518856.tif 000220
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１４】
請求項に記載の医薬組成物9 、前記一つ以上の化合物Sを有し、以下の構造
【化１９５】
2021518856.tif 000221
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１５】
項に記載の医薬組成物9 、前記一つ以上の化合物Sを有し、以下の構造
【化１９６】
2021518856.tif 000222
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１６】
請求項に記載の医薬組成物9 、前記一つ以上の化合物Sを有し、以下の構造
【化１９７】
2021518856.tif 000223
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１７】
化合物ACを含むAキット請求項1■のいずれかにcording8の化合物の使用のための説明書と一緒にします。
【請求項１８】
Aはキット医薬組成物を含む請求項のいずれかに記載の9- 16が一緒に医薬組成物の使用説明書と。
【請求項１９】
被験体への有効量の投与を含む、必要とする被験体における障害の影響治療または改善するためのA法一つ以上の化合物sは、式（I）の構造を有します：
【化１９８】
2021518856.tif 000224
ここで：
Ｒ１は、アルキルヘテロシクロアルキルまたはアルキルヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、任意選択で、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で置換されている。
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１９９】
2021518856.tif 000225
ではないという条件付きで。
【請求項２０】
請求項19に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sを有する式（II）の構造
【化２００】
2021518856.tif 000226
ここで：
R 1 、A及びR 1 Bそれらが結合している窒素原子と一緒になって、Cを形成5-6C請求ヘテロシクロアルキル、5-6ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコールから選択される1個のまたは複数の原子または基で置換され、またはヘテロシクロアルキル;
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化２０１】
2021518856.tif 000227
ではないという条件付きで。
【請求項２１】
請求項19に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sはさからなる群から選択されます：
【化２０２】
2021518856.tif 000228
【化２０３】
2021518856.tif 000229
【化２０４】
2021518856.tif 000230
【化２０５】
2021518856.tif 000231
【化２０６】
2021518856.tif 000232
および、およびそれらの組み合わせ、またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２２】
請求項19に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sはさからなる群から選択されます：
【化２０７】
2021518856.tif 000233
およびそれらの組み合わせ、またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２３】
請求項19に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２０８】
2021518856.tif 000234
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２４】
請求項19に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２０９】
2021518856.tif 000235
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２５】
請求項19に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２１０】
2021518856.tif 000236
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２６】
請求項19に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２１１】
2021518856.tif 000237
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２７】
前記障害が、小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
疾患が、対象における異常なキナーゼレベルによって特徴付けられる疾患である、請求項19に記載の方法。
【請求項２９】
前記障害が、軸索変性を伴う疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
障害が、外傷性脳損傷、脳卒中、虚血、双極性障害、心臓病、アテローム性動脈硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、癌、自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。および神経変性疾患。
【請求項３１】
項に記載の方法30神経変性疾患がアルツハイマー病、からなる群から選択される、パーキンソン病、筋萎縮性側索Lateral S clerosis （ALS） 、フリードライヒ失調症、多発性硬化症、ハンチントン病、伝達性海綿状脳症、シャルコー- Marie-歯の病気、レビー小体型認知症、皮質基底変性、進行性核上麻痺、慢性外傷性脳症（CTE）、ポリグルタミン病、プリオン病、緑内障、および遺伝性痙性麻痺。
【請求項３２】
疾患である、請求項19に記載の方法、筋萎縮性側索のL ateral S clerosis （ALS）。
【請求項３３】
対象における異常なキナーゼレベルを特徴とする疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。白血病、急性巨核芽球性白血病、小児白血病、家族性慢性リンパ球性白血病、左右軸奇形、悪性黒色腫、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、精巣がん、胃がん、胃腸癌、神経膠腫、甲状腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、大細胞リンパ腫、軟組織肉腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、遺伝性出血性毛細血管拡張症2型（オスラー-レンデュ-ウェーバー症候群2）、腸の出血、動脈性高血圧、動静脈奇形、進行性線維異形成症、骨格奇形、骨格外ボー ne形成、中毒、高血圧、心筋梗塞、アクロメソメリック異形成、運動失調、毛細血管拡張症、セッケル症候群、心不全、若年性ポリポーシス症候群、A2型短指症（手の奇形）、アクロメソメリック軟骨異形成症（骨奇形）、外生殖器異常高血圧症（PPH1）、心顔面皮膚症候群、若年性正中線癌、X連鎖無ガンマグロブリン血症、心不整脈、体細胞黒色腫、家族性黒色腫、肉腫、頭頸部扁平上皮癌、上皮性腫瘍、心臓肥大、レット症候群、X連鎖乳児痙攣症候群、Li-Fraumeni症候群、サーカディアン障害、乳管癌、乳腺過形成、コーンロッドジストロフィー（CORD）タイプ5、コーンロッドジストロフィー（CORD）タイプ6、リーバー先天性黒内障1型（LCA1）、てんかん、筋緊張症、筋肉の消耗、白内障、性腺機能低下症、内分泌機能の欠陥、男性のはげ、ダウン症候群（DS）、神経膠芽細胞腫、肝細胞癌、ファイファー症候群、カルマン症候群2、細胞白血病リンパ腫症候群（SCLL）を幹、骨髄増殖性疾患、アペール症候群、ジャクソン-ワイス症候群、クルーゾン症候群、ベーレ-スティーブンソンはgyrata症候群真皮、軟骨無形成症、hypochrondroplasia、thanatophorIC異形成、頭蓋骨癒合アデレードタイプ、サンディエゴ骨格異形成、ミュンケ症候群、下垂体腺腫、骨髄異形成、幻覚性血管腫の毛細血管、特発性骨髄線維症、神経芽細胞腫、腎癌、乳頭状癌、高IgM症候群、色素性失禁、低汗性外皮異形成、関節リウマチ、軟骨無形成症多嚢胞性卵巣症候群、非定型移行、糖尿病性高脂血症、軟骨無形成症、細菌誘発性マクロファージアポトーシス、発熱性細菌感染症、子宮平滑肉腫、移植後リンパ増殖性疾患、骨髄増殖性疾患（MPD）、多発性細菌性腫瘍、脳腫瘍、胃腸間質GIST）、肥満細胞症、ピエバルdism、T細胞白血病、Williams-Beuren症候群、Peutz-Jeghers症候群、全身性紅斑性ループス、自己体細胞優性血小板減少症、色素性網膜炎、遺伝性乳頭状腎癌、ミュラー管症候群II型、家族性肥大性心筋症、重力性筋無力症、進行性難聴、多発性嚢胞腎臓病、ユーイング腫瘍、非症候性精神遅滞タイプ30（MRX30）、特発性高好酸球性症候群、ビフィダ脊髄、ウォルコット-ラリソン症候群（WRS）、肝グリコーゲン症、肝肝硬変、造血器悪性腫瘍、カーニー複合腫瘍、心臓収縮性、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病のVascular合併症、自閉症、支配的な型脊髄小脳失調14、疼痛知覚、変形性関節症の軟骨、膀胱癌、nasopharyngeアル腫、未分化大細胞白血病、家族性甲状腺髄様癌（FMTC）、複数の腫瘍タイプIIA（MEN2A）、MEN2B、phaeoc血球腫、乳頭状甲状腺癌、Hischsprung dis 容易さ、2型小口病、HPC1、血液凝固、血管腫、腎腫瘍細胞腫、肺腺腫、優性短指症B型、劣性ロビノウ症候群（RRS）、棺-ローリー症候群、CNS腫瘍、ロイス-ディーツ症候群、食道癌、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（HNPCC、リンチ症候群）、マルファン症候群II型、静脈奇形、星状細胞腫、肥大性および拡張性心筋症、脛骨筋ジストロフィー、無汗症、偽性低アルドステロン症II型、および慢性関節炎。
【請求項３４】
請求項1のいずれかに記載の方法9-26さらに、被験体に5-ヒドロキシからなる群から選択される1つのまたは複数の追加の治療薬の有効量は、同時投与を含むACTIVASE、AFQ056（ノバルティス）、Aggrastatを、アルベンダゾール、α-リポ酸/L-アセチルカルニチン、アルテプラーゼ、アマンタジン（シンメトレル）、アムロジピン、アンクロド、アポモルヒネ（アポキン）、アリモクロモール、アリクストラ、アルモダフィニル、アスコルビン酸、アクリプチン、アスピリン、アテノロール、アボネックス、バクロフェン（Li、バンゼル、ベンズトロピン（コゲンチン）、ベタセロン、BGG492（ノバルティス社）、ボツリヌス毒素、バファリン、カルバトロール(R)、カルビドパ/レボドパ即時放出（シネメット）、カルビドパ/レボドパ経口崩壊（パルコパ）、カルビドパ/レボドパ/エンタカポン（Stalevo）、CERE-110：NGF（Ceregene）、セレブロリシン、CinnoVex、シタロプラム、シチコリン、クロバザム、クロナゼパム、クロピドグレル、クロザピン（クロザリル）、コエンザイムQ、クレアチン、ダビガトラン、ダルテパリン、ダプのアデノ関連ウイルス送達Deferiprone、Depakene(R)、デパコートER(R)、Depakote(R)、デスモテプラーゼ、Diastat、ジアゼパム、ジゴキシン、Dilantin(R)、ジメボン、ジピリダモール、ジバルプロックス（デパコート）、ドネペジル（アリセプト）、EGB761、エルデプリル、ELND002（エラン医薬品）、エナラプリル、エノキサパリン、エンタカポン（Comtan）、エポエチンアルファ、エプチフィバチド、エリスロポイエチン、エスシタロプラム、酢酸エスリカルバゼピン、エスモロール、エトスクシミド、エチルEPA（MiraxionTM）、エクセナチド、Extavia、Ezogabine、フェルバメート、Felbatol(R)、フィンゴリモド（Gilenya）、フルオキセチン（プロザック）、fondaparinux、Fragmin、Frisium、Gabapentin、Gabitril(R)、Galantamine、Glatiramer（Copaxone）、haloperidol（Haldol）、Heparin 、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、Idebenone、Inovelon(R)、インスリン、Interferonbeta 1a、Interferon beta 1b、ioflup DATSCAN(R)）、IPX066（Impax Laboratories Inc。）、JNJ-26489112（Johnsonand Johnson）、Keppra(R)、クロノピン、ラコサミド、L-アルファグリセリルホスホリルコリン、Lamictal(R)、ラモトリジン、レベチラセタム、リラグルチド、リシノプリル、炭酸リチウム、ロプレス、losartan、Lovenox、LuAA24493、管腔、LY450139（イーライリリー）、リリカ、Masitinib、メコバラミン、メマンチン、メチルプレドニゾロン、メトプロロール酒石酸、Minitran、ミノサイクリン、ミルタザピン、ミトキサントロン（ノバントロン）、Mysoline(R)、ナタリズマブ（タイサブリ）、Neurontin(R)、ナイアシンアミド、ニトロ入札、ニトロ-Dur、ニトログリセリン、ニトロリンガル、ニトロミスト、ニトロスタット、ニトロタイム、ノルエピネフリン（NOR）、カルバマゼピン、オクトレオチド、Onfi(R)、オキシカルバゼピン、オキシブチニンクロリド、PF-04360365（ファイザー）、フェノバルビタール、フェニテック(R)、フェニトイン、プラビックス、Potiga、プラミペキソール（ミラペックス）、プラムリンチド、プレドニゾン、プリミドン、プリニビル、プロベネシド、プロプラノロール、PRX-00023（EPIXPharmaceuticals Inc.）に、PXT3003、キナクリン、ラメルテオン、ラサギリン（アジレクト）、レビフ、ReciGen、レマセミド、レスベラトロール、レタバーゼ、レテプラーゼ、リルゾール（Rilutek）、リバスチグミン（Exelon）、ロピニロール（Requip）、ロチゴチン（Neupro）、ルフィナミド、サブリル、サフィナミド（EMDSerono）、サラゲン、サラフェム、セレギリン（l-デプレニル、エルデプリル）、SEN0014バイオテック）、セルトラリン（ゾロフト）、シム バスタチン、ニトロプルシエートナトリウム（NPS）、フェニル酪酸ナトリウム、スタンバック頭痛パウダー、タクリン（コグネックス）、タモキシフェン、タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）、テグレトール(R)、テネクテプラーゼ、テノルミン、テトラベナジン（キセナジン）、THR-18（トロンボテック社）、チアガビン、Tideglusib、チロフィバン、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）、チザニジン（Zanaflex）、TNKase、トルカポン（タスマール）、トルテロジン、Topamax(R)、トピラメート、トリヘキシフェニジル（旧Artane）、Trileptal(R)、ウルソジオール、バルプロ酸、バルサルタン、バレニクリン（ファイザー）、Vimpat、VitaminE、Warfarin、Zarontin(R)、Zestril、Zonegran(R)、Zonisamide、Zydis selegiline HCL経口崩壊（Zelapar）、およびそれらの組み合わせ。
【請求項３５】
前記対象が哺乳動物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物が、ヒト、獣医動物、および農業動物からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項19に記載の方法、被験体がヒトである、請求、。                          
【請求項３８】
必要その被験体に、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物の有効量を投与することを含むとする対象における障害の影響を治療または改善するためのA法一つ以上の化合物Sは式の構造を有します（私）：
【化２１２】
2021518856.tif 000238
ここで：
Ｒ１は、アルキルヘテロシクロアルキルまたはアルキルヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、任意選択で、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で置換されている。
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化２１３】
2021518856.tif 000239
ではないという条件付きで。
【請求項３９】
請求項38に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sを有する式（II）の構造を
【化２１４】
2021518856.tif 000240
ここで：
R 1 、A及びR 1 Bそれらが結合している窒素原子と一緒になって、Cを形成5-6C請求ヘテロシクロアルキル、5-6ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコールから選択される1個のまたは複数の原子または基で置換され、またはヘテロシクロアルキル;
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化２１５】
2021518856.tif 000241
ではないという条件付きで。
【請求項４０】
40.請求項38に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sはさからなる群から選択されます：
【化２１６】
2021518856.tif 000242
【化２１７】
2021518856.tif 000243
【化２１８】
2021518856.tif 000244
【化２１９】
2021518856.tif 000245
【化２２０】
2021518856.tif 000246
【化２２１】
2021518856.tif 000247
およびそれらの組み合わせ、またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項４１】
請求項38に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sはさからなる群から選択されます：
【化２２２】
2021518856.tif 000248
およびそれらの組み合わせ、またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項４２】
請求項38に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２２３】
2021518856.tif 000249
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項４３】
請求項38に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２２４】
2021518856.tif 000250
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項４４】
請求項38に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２２５】
2021518856.tif 000251
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項４５】
請求項38に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２２６】
2021518856.tif 000252
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項４６】
前記障害が、小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
疾患が、対象における異常なキナーゼレベルによって特徴付けられる疾患である、請求項38に記載の方法。
【請求項４８】
障害が、軸索変性を伴う疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
請求項38に記載の方法障害が2型糖尿病、1型糖尿病、外傷性脳損傷、脳卒中、虚血、双極性障害、心臓病、アテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、肥満、癌、自己免疫疾患、および神経変性疾患。
【請求項５０】
請求項49に記載の方法、神経変性疾患は、以下からなる群から選択される、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索Lateral S clerosis （ALS） 、フリードライヒ失調症、多発性硬化症、ハンチントン病、伝達性海綿状脳症、シャルコー- Marie-歯の病気、レビー小体型認知症、皮質基底変性、進行性核上麻痺、慢性外傷性脳症（CTE）、ポリグルタミン病、プリオン病、緑内障、および遺伝性痙性麻痺。
【請求項５１】
疾患である、請求項38に記載の方法、筋萎縮性側索のL ateral S clerosis （ALS）。
【請求項５２】
対象における異常なキナーゼレベルを特徴とする疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。白血病、急性巨核芽球性白血病、小児白血病、家族性慢性リンパ球性白血病、左右軸奇形、悪性黒色腫、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、精巣がん、胃がん、胃腸癌、神経膠腫、甲状腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、大細胞リンパ腫、軟組織肉腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、遺伝性出血性毛細血管拡張症2型（オスラー-レンデュ-ウェーバー症候群2）、腸の出血、動脈性高血圧、動静脈奇形、進行性線維異形成症、骨格奇形、骨格外ボー ne形成、中毒、高血圧、心筋梗塞、アクロメソメリック異形成、運動失調、毛細血管拡張症、セッケル症候群、心不全、若年性ポリポーシス症候群、A2型短指症（手の奇形）、アクロメソメリック軟骨異形成症（骨奇形）、外生殖器異常高血圧症（PPH1）、心顔面皮膚症候群、若年性正中線癌、X連鎖無ガンマグロブリン血症、心不整脈、体細胞黒色腫、家族性黒色腫、肉腫、頭頸部扁平上皮癌、上皮性腫瘍、心臓肥大、レット症候群、X連鎖乳児痙攣症候群、Li-Fraumeni症候群、サーカディアン障害、乳管癌、乳腺過形成、コーンロッドジストロフィー（CORD）タイプ5、コーンロッドジストロフィー（CORD）タイプ6、リーバー先天性黒内障1型（LCA1）、てんかん、筋緊張症、筋肉の消耗、白内障、性腺機能低下症、内分泌機能の欠陥、男性のはげ、ダウン症候群（DS）、神経膠芽細胞腫、肝細胞癌、ファイファー症候群、カルマン症候群2、細胞白血病リンパ腫症候群（SCLL）を幹、骨髄増殖性疾患、アペール症候群、ジャクソン-ワイス症候群、クルーゾン症候群、ベーレ-スティーブンソンはgyrata症候群真皮、軟骨無形成症、hypochrondroplasia、thanatophorIC異形成、頭蓋骨癒合アデレードタイプ、サンディエゴ骨格異形成、ミュンケ症候群、下垂体腺腫、骨髄異形成、幻覚性血管腫の毛細血管、特発性骨髄線維症、神経芽細胞腫、腎癌、乳頭状癌、高IgM症候群、色素性失禁、低汗性外皮異形成、関節リウマチ、軟骨無形成症多嚢胞性卵巣症候群、非定型移行、糖尿病性高脂血症、軟骨無形成症、細菌誘発性マクロファージアポトーシス、発熱性細菌感染症、子宮平滑肉腫、移植後リンパ増殖性疾患、骨髄増殖性疾患（MPD）、多発性細菌性腫瘍、脳腫瘍、胃腸間質GIST）、肥満細胞症、ピエバルdism、T細胞白血病、Williams-Beuren症候群、Peutz-Jeghers症候群、全身性紅斑性ループス、自己体細胞優性血小板減少症、色素性網膜炎、遺伝性乳頭状腎癌、ミュラー管症候群II型、家族性肥大性心筋症、重力性筋無力症、進行性難聴、多発性嚢胞腎臓病、ユーイング腫瘍、非症候性精神遅滞タイプ30（MRX30）、特発性高好酸球性症候群、ビフィダ脊髄、ウォルコット-ラリソン症候群（WRS）、肝グリコーゲン症、肝肝硬変、造血器悪性腫瘍、カーニー複合腫瘍、心臓収縮性、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病のVascular合併症、自閉症、支配的な型脊髄小脳失調14、疼痛知覚、変形性関節症の軟骨、膀胱癌、nasopharyngeアル腫、未分化大細胞白血病、家族性甲状腺髄様癌（FMTC）、複数の腫瘍タイプIIA（MEN2A）、MEN2B、phaeoc血球腫、乳頭状甲状腺癌、Hischsprung dis 容易さ、2型小口病、HPC1、血液凝固、血管腫、腎腫瘍細胞腫、肺腺腫、優性短指症B型、劣性ロビノウ症候群（RRS）、棺-ローリー症候群、CNS腫瘍、ロイス-ディーツ症候群、食道癌、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（HNPCC、リンチ症候群）、マルファン症候群II型、静脈奇形、星状細胞腫、肥大性および拡張性心筋症、脛骨筋ジストロフィー、無汗症、偽性低アルドステロン症II型、および慢性関節炎。
【請求項５３】
項のいずれか一項に記載の方法38-45さらによりなる群から選択される1つのまたはそれ以上の治療薬の被験体に同時投与する有効量を含む：5-ヒドロキシトリプトファン、アクティ、AFQ056（ノバルティス）を、Aggrastat、アルベンダゾール、α-リポ酸/L-アセチルカルニチン、アルテプラーゼ、アマンタジン（シンメトレル）、アムロジピン、アンクロド、アポモルヒネ（アポキン）、アリモクロモール、アリクストラ、アルモダフィニル、アスコルビン酸、アクリプチン、アスピリン、アテノロール、アボネックス、バクロフェン（リオレサル）バンゼル、ベンズトロピン（コゲンチン）、ベタセロン、BGG492（ノバルティス社）、ボツリヌス毒素、バファリン、カルバトロール(R)、カルビドパ/レボドパ即時放出（シネメット）、カルビドパ/レボドパ経口崩壊（パルコパ）、カルビドパ/レボドパ/エンタカポン（スタレボ）、CERE-110：NGF（セレジーン）、セレブロリシン、CinnoVex、シタロプラム、シチコリン、クロバザム、クロナゼパム、クロピドグレル、クロザピン（クロザリル）、コエンザイムQ、クレアチン、ダビガトラン、ダルテパリン、ダップのアデノ関連ウイルス送達、Depakene(R)、DepakoteER(R)、Depakote(R)、デスモテプラーゼ、Diastat、ジアゼパム、ジゴキシン、Dilantin(R)、ジメボン、ジピリダモール、ジバルプロックス（デパコート）、ドネペジル（アリセプト）、EGB761、エルデプリル、ELND002（エラン医薬品）、エナラプリル、エノキサパリン、エンタカポン（Comtan ）、エポエチンアルファ、エプチフィバチド、エリスロポイエチン、エスシタロプラム、酢酸エスリカルバゼピン、エスモロール、エトスクシミド、エチルEPA（MiraxionTM）、エクセナチド、Extavia、Ezogabine、フェルバメート、Felbatol(R)、フィンゴリモド（Gilenya）、フルオキセチン（プロザック）、フォンダパリヌクス、フラグミン、フリジウム、ガバペンチン、ガビトリル(R)、ガランタミン、グラチラマー（コパキソン）、ハロペリドール（ハルドール）、ヘパリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、イデベノン、イノベロン(R)、インスリン、インターフェロンベータ1a、インターフェロンベータ1b、イオフルパン123I（DATSCAN(R)） 、IPX066（ImpaxLaboratories Inc。）、JNJ-26489112（Johnson and Johnson）、Keppra(R)、Klonopin、Lacosamide、L-Alphaglycerylphosphorylcholine、Lamictal(R)、Lamotrigine、Levetiracetam、liraglutide、Lisinopril、Lithiumcarbonate、Lopressor、LorazeLovenox、Lu AA24493、Luminal 、L Y450139（Eli Lilly）、Lyrica、Masitinib、Mecobalamin、Memantine、methylprednisolone、metoprololtartrate、Minitran、Minocycline、mirtazapine、Mitoxantrone （Novantrone）、Mysoline(R)、Natalizumab（Tysabri）、Neurontin(R)、Niacinamide、Nitro-Bid 、ニトログリセリン、Nitrolingual、Nitromist、Nitrostat、ニトロ時間、ノルエピネフリン（NOR）、カルバマゼピン、オクトレオチド、Onfi(R)、オキシカルバゼピン、オキシブチニン塩化物、PF-04360365（ファイザー）、フェノバルビタール、Phenytek(R)、フェニトイン、piclozotan、ピオグリタゾン、プラビックス、Potiga、プラミペキソール（ミラペックス）、プラムリンチド、プレドニゾン、プリミドン、プリニビル、プロベネシド、プロプラノロール、PRX-00023（EPIXPharmaceuticals Inc.）に、PXT3003、キナクリン、ラメルテオン、ラサギリン（アジレクト）、レビフ、ReciGen、レマセミド、レスベラトロール、Retavase、レテプラーゼ、リルゾール（Rilutek）、リバスチグミン（Exelon）、ロピニロール（Requip）、ロチゴチン（Neupro）、ルフィナミド、サブリル、サフィナミド（EMDSerono）、サラゲン、サラフェム、セレギリン（l-デプレニル、エルデプリル）、SEN0014196（Siena Biotech） 、セルトラリン（ゾロフト）、シンバスタチン、Sニトロプルシエートナトリウム（NPS）、フェニル酪酸ナトリウム、スタンバック頭痛パウダー、タクリン（コグネックス）、タモキシフェン、タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）、テグレトール(R)、テネクテプラーゼ、テノルミン、テトラベナジン（キセナジン）、THR-18（トロンボテック社）、チアガビン、チデグ、チロフィバン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、チザニジン（ザナフレックス）、TNKase、トルカポン（タスマール）、トルテロジン、トパマックス(R)、トピラメート、トリヘキシフェニジル（旧アルタン）、トリレプタール(R)、ウルソジオール、バルプロ酸、バルサルタン、バレニックVimpat、VitaminE、Warfarin、Zarontin(R)、Zestril、Zonegran(R)、Zonisamide、Zydis selegiline HCL経口崩壊（Zelapar）、およびそれらの組み合わせ。
【請求項５４】
前記対象が哺乳動物である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５５】
ACCO方法請求項54にrding哺乳動物は、ヒト、獣医動物、農業動物からなる群から選択されます、。
【請求項５６】
被験体がヒトである、請求、。
【請求項５７】
57のA法小胞体（ER）ストレスの毒性を抑制し、その被験体への有効量の投与を必要とする対象におけるキナーゼ備える阻害剤、一つ以上の化合物Sは（I）式の構造を有します：
【化２２７】
2021518856.tif 000253
ここで：
Ｒ１は、アルキルヘテロシクロアルキルまたはアルキルヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、任意選択で、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で置換されている。
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化２２８】
2021518856.tif 000254
ではないという条件付きで。
【請求項５８】
58のA法軸索変性を伴う疾患の影響の治療または改善を必要その被験体に有効量投与することを含む、被験体においてキナーゼ備える阻害剤、一つ以上の化合物sは、式（I）の構造を有します：
【化２２９】
2021518856.tif 000255
ここで：
Ｒ１は、アルキルヘテロシクロアルキルまたはアルキルヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、任意選択で、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で置換されている。
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化２３０】
2021518856.tif 000256
ではないという条件付きで。
【請求項５９】
59の効果を処置または改善するためのA法神経変性疾患を必要その被験体に有効量投与することを含む、被験体において一つ以上の化合物sは、式（I）の構造を有します：
【化２３１】
2021518856.tif 000257
ここで：
Ｒ１は、アルキルヘテロシクロアルキルまたはアルキルヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、任意選択で、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で置換されている。
R 2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミドから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化２３２】
2021518856.tif 000258
ではないという条件付きで。
【請求項６０】
60の方法に従ってのいずれか一項の57-一つ以上の請求項59、化合物Sがさからなる群から選択されます：
【化２３３】
2021518856.tif 000259
およびそれらの組み合わせ、またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項６１】
一つ以上の化合物は、以下の構造を有する、請求項60に記載の方法。
【化２３４】
2021518856.tif 000260
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項６２】
請求項60に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２３５】
2021518856.tif 000261
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項６３】
請求項60に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２３６】
2021518856.tif 000262
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項６４】
請求項60に記載の方法、前記一つ以上の化合物Sは、以下の構造を有します：
【化２３７】
2021518856.tif 000263
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項６５】
請求項59に記載の方法、神経変性疾患は、以下からなる群から選択される、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索Lateral S clerosis （ALS） 、フリードライヒ失調症、多発性硬化症、ハンチントン病、伝達性海綿状脳症、シャルコー- Marie-歯の病気、レビー小体型認知症、皮質基底変性、進行性核上麻痺、慢性外傷性脳症（CTE）、ポリグルタミン病、プリオン病、緑内障、および遺伝性痙性麻痺。
【請求項６６】
法による神経変性疾患である、請求項65に筋萎縮性側索L ateral Sのclerosis （ALS）。
【請求項６７】
ドネペジル（アリセプト）、リバスチグミン（エクセロン）、ガランタミン（ラザダイン）からなる群から選択される有効量の１つまたは複数の追加の治療薬を対象に同時投与することをさらに含む、請求項５９■６４のいずれか一項に記載の方法。）、タクリン（コグネックス）、メマンチン（ナメンダ）、ビタミンE、CERE-110：NGF（セレギリン）、LY450139（エリリリー）、エクセナチド、バレニクリン（ファイザー）、PF-04360365（ファイザー）のアデノ関連ウイルス送達レスベラトロール、カルビドパ/レボドパ、即時放出（シネメット）、カルビドパ/レボドパ口腔内崩壊（Parcopa）、カルビドパ/レボドパ/エンタカポン（Stalevo）、ロピニロール（レキップ）、プラミペキソール（ミラペックス）、ロチゴチン（Neupro）、アポモルフィン（Apokyn）セレギリン（l-デプレニル、エルデプリル）、ラサギリン（アジレクト）、ジディスセレギリンHCL経口崩壊（ゼラパー）、エンタカポン（コンタン）、トルカポン（タスマー）、アマンタジン（シンメトレル）、トリヘキシフェニジル（旧アルタン）、ベンゾトロピン（ImpaxLaboratoriesInc。）、イオフルパン123I（DATSCAN(R)）、サフィン アミド（EMD Serono社）、ピオグリタゾン、リルゾール（リルテック）、炭酸リチウム、アリモクロモル、クレアチン、タモキシフェン、メコバラミン、タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）、イデベノン、コエンザイムQ、5-ヒドロキシトリプトファン、プロプラノロール、エナラプリル、リシノプリル、ジゴキシン、エリスロポエチン、陸AA24493、デフェリプロン、IVIG、EGB761、アボネックス、ベタセロン、Extavia、レビフ、グラチラマー（コパキソン）、フィンゴリモド（Gilenya）、ナタリズマブ（タイサブリ）、ミトキサントロン（ノバントロン）、バクロフェン（リオレサール）、チザニジン（Zanaflex）、メチルプレドニゾロン、CinnoVex、ReciGen、マシチニブ、プレドニゾン、インターフェロンベータ1a、インターフェロンベータ1b、ELND002（エランファーマシューティカルズ）、テトラベナジン（キセナジン）、ハロペリドール（ハルドール）、クロザピン（クロザリル）、クロナゼパム（クロノピン）、ジアゼパム（バリウム）、esc、フルオキセチン（Prozac、Sarafem）、セルトラリン（Zoloft）、バルプロ酸（Depakene）、divalproex（Depakote）、ラモトリジン（Lamictal）、Dimebon、AFQ056（Novartis）、Ethyl-EPA（MiraxionTM）、SEN0014196（Siena Biotech）、フェニル酪酸ナトリウム、シタロプラム、ウルソジオール、ミノサイクリ ne、レマセミド、ミルタザピン、キナクリン、アスコルビン酸、PXT3003、アルモダフィニル、ラメルテオン、ダブネチド、チデグルシブ、α-リポ酸/L-アセチルカルニチン、ナイアシンアミド、オキシブチニンクロリド、トルテロジン、ボツリヌス毒素、およびそれらの組み合わせ。
【請求項６８】
請求項59に記載の方法対象が哺乳動物です、。
【請求項６９】
請求項68に記載の方法哺乳動物は、ヒト、獣医動物、農業動物からなる群から選択されます、。
【請求項７０】
請求項59に記載の方法、被験体がヒトである、請求、。
【請求項７１】
以下の構造を有する化合物：
【化２３８】
2021518856.tif 000264
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７２】
以下の構造を有する化合物：
【化２３９】
2021518856.tif 000265
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７３】
以下の構造を有する化合物：
【化２４０】
2021518856.tif 000266
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７４】
74.以下の構造を有する化合物：
【化２４１】
2021518856.tif 000267
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７５】
75.製薬上許容される担体または希釈剤、および以下の構造を有する化合物を含む医薬組成物：
【化２４２】
2021518856.tif 000268
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７６】
製薬上許容される担体または希釈剤、および以下の構造を有する化合物を含む医薬組成物：
【化２４３】
2021518856.tif 000269
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７７】
製薬上許容される担体または希釈剤と、以下の構造を有する化合物とを含む医薬組成物：
【化２４４】
2021518856.tif 000270
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７８】
薬学的に許容される担体または希釈剤、および以下の構造を有する化合物を含む医薬組成物：
【化２４５】
2021518856.tif 000271
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項７９】
それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法であって、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【化２４６】
2021518856.tif 000272
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８０】
それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法であって、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【化２４７】
2021518856.tif 000273
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８１】
それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法であって、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【化２４８】
2021518856.tif 000274
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８２】
それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法であって、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【化２４９】
2021518856.tif 000275
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８３】
それを必要とする対象における小胞体（ER）ストレスの毒性を抑制する方法であって、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む方法。
【化２５０】
2021518856.tif 000276
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８４】
それを必要とする対象における小胞体（ER）ストレスの毒性を抑制する方法であって、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む方法。
【化２５１】
2021518856.tif 000277
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８５】
それを必要とする対象における小胞体（ER）ストレスの毒性を抑制する方法であって、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む方法。
【化２５２】
2021518856.tif 000278
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８６】
それを必要とする対象における小胞体（ER）ストレスの毒性を抑制する方法であって、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む方法。
【化２５３】
2021518856.tif 000279
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８７】
以下の構造を有する化合物を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善する方法。
【化２５４】
2021518856.tif 000280
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８８】
以下の構造を有する化合物を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善する方法。
【化２５５】
2021518856.tif 000281
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項８９】
以下の構造を有する化合物を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善する方法。
【化２５６】
2021518856.tif 000282
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９０】
以下の構造を有する化合物を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善する方法。
【化２５７】
2021518856.tif 000283
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９１】
それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法であって、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【化２５８】
2021518856.tif 000284
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項９２】
以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法。                          
【化２５９】
2021518856.tif 000285
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９３】
それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法であって、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【化２６０】
2021518856.tif 000286
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【請求項９４】
神経変性疾患を必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法であって、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【化２６１】
2021518856.tif 000287
またはそのN-オキシド、結晶形態、水和物、またはその医薬的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、2018年3月1日に出願された米国仮特許出願シリアル番号62/ 637,242の利益を主張し、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、とりわけ、以下の構造を有する化合物を提供する。
【化１】
2021518856.tif 000003
本発明の化合物を含む医薬組成物、ならびにそのような化合物および組成物を使用する方法も提供される。
【０００３】
政府の資金
本発明は、助成金番号の下で政府の支援を受けてなされた。 XW81XWH-16-1-0204、DODによって授与されました。政府は本発明において一定の権利を有します。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動、呼吸、および食事のような本質的な日常機能を制御する細胞である脊髄運動ニューロンを標的とする神経変性障害である。他の多くの神経変性疾患と同様に、ALSは誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積を特徴としています。ニューロンは、折りたたまれていないタンパク質応答（UPR）に関与して、誤って折りたたまれたタンパク質を再折り畳みまたはクリアします。これらの努力が失敗した場合、UPRは細胞をアポトーシス細胞死に導く小胞体（ER）ストレス経路に道を譲ります。最近の研究では、UPRおよびERストレスが家族性および散発性ALSの病因に関係しているとされています。
【０００５】
ＥＲストレスのマーカーは、幹細胞由来の運動ニューロンおよびＡＬＳ関連突然変異を有するマウスを含む、ＡＬＳのインビトロおよびインビボモデル全体で検出された最も初期の病理学的特徴のいくつかである。トランスジェニックhSOD1G93Aマウスの胚性幹（ES）細胞に由来する脊髄運動ニューロンでERストレスマーカーの持続的なアップレギュレーションが観察されたことが以前に報告されています（Thamset al 2017（未発表、付録Bとして添付））。例12）。これらのマウスは、ALSに因果関係があるヒトSOD1の変異型を過剰発現し、その表現型は、神経筋除神経や進行性麻痺など、患者の病理の多くの側面を再現します。SOD1のALSを引き起こす変異は、通常、SOD1機能の喪失または獲得を引き起こしません。代わりに、それらは誤って折りたたまれたSOD1種の蓄積と運動ニューロンにおける不溶性タンパク質性凝集体の形成を促進し、これらの細胞における小胞体ストレスマーカーの増加の根底にある可能性があります。同様の凝集体が、TDP-43、FUS、OPTN、UBQLN2などの複数の疾患を引き起こす変異を含むALSのモデル全体で観察されています（Blokhuiset al.2013）。さらに、野生型の脊髄運動ニューロンでさえ、他の脊髄ニューロンのサブタイプと比較して、シクロピアゾン酸（CPA）（図2C）のような小胞体ストレス誘発性化合物に非常に敏感であることがわかっています。まとめると、これらの観察結果は、他のニューロンが免れている間、ALSに対する脊髄運動ニューロンの選択的な脆弱性への洞察を提供します。
【０００６】
運動ニューロンが、ＥＲへのＣａ ２＋取り込みを防止し、それにより、Ｃａ２＋依存性タンパク質フォールディングシャペロンの活性を遮断する、サルコ／ ＥＲカルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）ポンプ阻害剤であるＣＰＡに非常に感受性であるという事実に基づく。小胞体ストレスを急速に誘発する（図26）、小胞体ストレス誘発性神経変性を逆転させる可能性のある小分子化合物のライブラリーがスクリーニングされています。 （図27）。
【０００７】
この画面からのヒットの中には、100を超える生物学的に活性な小分子、Go6976、スニチニブ、K252a（図2A）、およびケンパウロン（Thams et al2017、付録を参照）を含む広域スペクトルキナーゼ阻害剤が含まれていました。 B例12）。予備分析では、マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼMLK3およびHGKがこれらのレスキュー化合物の機能的標的である可能性が高いことが指摘されました。これらの発見は、小胞体ストレス経路のIRE1a分岐が最終的にJNK経路を活性化するという以前の報告と一致しており、これは多くの神■■経変性疾患モデルに関連付けられています。以前の研究では、CPAがIRE1a活性を誘導し、JNKのすぐ下流にあるc-junのリン酸化を促進することも示されています（Thamset al 2017、付録B例12を参照）。
【０００８】
公開されているデータベース（Anastassiadis etal。2011）をマイニングすることにより、4つのキナーゼ阻害剤ヒット化合物およびケンパウロンよりも強力であることが見出されたケンパウロンの構造類似体であるアルスターパウロンについて既知の標的を比較した。0.5 μMのさまざまなキナーゼ阻害剤の存在下での300キナーゼの触媒活性と、双方向の階層的クラスタリング分析の実行（図1）。
【０００９】
５つすべての神経保護化合物によってその活性が強く阻害された（＜１５％のキナーゼ活性が１μＭ阻害剤濃度で残っている）キナーゼには、ＭＡＰキナーゼＨＧＫ（ＭＡＰ４Ｋ４）およびＭＡＰＫ関連キナーゼＮＵＡＫ１が含まれた。 NUAK1アブレーションは、タウオパチーのマウスモデルの皮質ニューロンを保護し、運動ニューロンにおけるCPAの神経毒性作用も調節する可能性があることを示唆しています（Lasagna-Reeveset al.2016）。ただし、強力で選択的なNUAK1阻害剤WZ4003（NUAK1のIC50 = 20 nM）は、6段階希釈系列（0.1■10 μM）全体でCPA毒性を救うことができないことがわかりました。1 μM以上の濃度では、WZ4003はCPA誘発性神経変性を増強し、CPAがない場合でも運動ニューロンに対して毒性がありました（図3）。同様に、SU6656（0.5μMで10.9％の活性が残っている）やHTH-01-051（IC50 = 100 nM、Banerjee etal。2014を参照）など、他の選択的NUAK1阻害剤は、CPA毒性を救うことができなかっただけでなく、さらに強化されました。高用量でそれを（図3）。これらの結果は、NUAK1活性が、小胞体ストレスとの関連で、そしておそらく基礎条件下での運動ニューロンの生存に不可欠であることを示唆している。それがヒットレスキュー化合物の共有標的であるという事実は、これらの化合物の機能的標的とのその構造的類似性または配列相同性に起因する可能性が高い。
【００１０】
その間、ヤン等。 （2013）HGKがケンパウロンの主な機能的標的であると仮定し、神経栄養因子の離脱誘発性死からES由来の脊髄運動ニューロンを救うことができる化合物のハイスループットスクリーニングでヒットとして特定した。Larhammar et al（2017）は後に、HGKが他の2つのMAP4キナーゼ、TNIKおよびMINK1と組み合わせて、マウス後根神経節ニューロンにおける神経栄養因子離脱後の神経変性を媒介するという機能的証拠を提供しました。ERストレスとの関連で運動ニューロンにおけるHGKの役割をさらに評価するために、選択的HGK阻害剤PF-6260933（Ammirati etal。2015）を6点希釈系列（0.01μM - 5 μM）でテストし、用量依存的にCPA毒性から保護しました（図3）。 HGK阻害剤GNE-495も同様に神経保護作用がありました（図3）。この発見は、小胞体ストレス誘発性神経変性におけるHGKの役割の予備的なサポートを提供しました。
【００１１】
K252a、Go6976、およびアルスターパウロンの別の共有標的は、MAPK3キナーゼMLK3であった。ケンパウロンとスニチニブはMLK3活性をわずかにしか阻害しませんでしたが（それぞれ、0.5μMのままのMLK3活性は49.3％と68.4％、Anastassiadis et al、2011を参照）、多くの神経変性状況におけるMLK3の役割について文献で強力な支持があります。CEP1347、NU6140、ボスチニブ、JAK3阻害剤IV、およびSyk阻害剤を含む、MLK3活性を強力に（<15％の活性が残っている）が非選択的に阻害する多くの追加の化合物が、CPA毒性の用量依存的な救済を提供することがわかった。ヒトES運動ニューロン（図3）。
【００１２】
これらの発見に基づいて、ＣＰＡ生存スクリーニングからのヒットキナーゼ阻害剤の保護効果は、ＨＧＫおよび／またはＭＬＫ３活性のそれらの阻害に起因する可能性が高いと仮定される。理想的な化合物は、1）HGKとMLK3の両方を強力に阻害する、2）低用量（ナノモルからマイクロモル）でCPAを介した神経毒性を完全に逆転させる、3）水性ビヒクルに可溶、4）血液脳関門透過性である必要があります。および経口的に生物学的に利用可能であり、5）インビボでのその使用を最適化するためのさらなる構造的改変に適している。ただし、画面からのヒット化合物はこれらの基準を満たしていませんでした。Go6976もスニチニブも、テストしたどの用量でもCPA毒性を完全に救うことができませんでした。一方、K-252aは、広域スペクトルのキナーゼ阻害とアナログ合成への抵抗性の両方のため、適切なリード化合物ではありません。この足場に対する熱意をさらに弱めるのは、構造的に関連する非特異的なスタウロスポリンベースのキナーゼ阻害剤であるCEP-1347（図2A）がパーキンソン病の臨床試験で神経保護剤として効果がないという観察でした。ケンパウロンは、選択性は高いものの、invitro CPAアッセイで有効であることがわかった濃度では不溶性であるため、invivoでの使用には適していません。
【００１３】
文献検索を通じて、我々は、小分子ＵＲＭＣ?０９９を有望なリード化合物（化合物１）として同定した（図２Ａ）。化合物1は経口で生物学的に利用可能で脳浸透性であり、MLK3（IC50 = 14 nM）とHGK（1 μM処理で0.54％の酵素活性が残っている）の両方に強く結合して阻害し、アナログ合成に適しています。（図28）。 6ポイントの用量反応アッセイ（0.01 μM - 3 μM）でヒトALS幹細胞由来の運動ニューロンのCPA毒性を救済する能力をテストしたところ、1μMでCPA誘発性神経変性が完全に逆転することがわかりました。 100 nMから始まる濃度は、保護効果を示しました（図2B）。
【００１４】
次に、ＣＰＡ処理後の化合物１の保護効果がＨＧＫおよびＭＬＫ３によって媒介されるかどうかを決定した。小胞体ストレス経路の活性化が長引くと、JNKキナーゼカスケードが活性化され、最終的にはアポトーシスが起こります（Sano et al。、2013を参照）。 MAPキナーゼJNK1-3は、カスパーゼ3などのアポトーシス促進因子の発現を促進する転写因子であるc-junを直接リン酸化して活性化します。これは、CPAがESMNでc-junのリン酸化を誘導することを以前に示しています。ERストレスを介した神経変性に対して特に脆弱ですが、耐性のある共培養されたES由来のインターニューロンでは脆弱ではありません（Thams et al 2017、付録B例12を参照）。化合物1はCPA処理MNでc-junリン酸化とカスパーゼ3切断の両方を強く抑制することが観察され（図4）、化合物1がアポトーシスの誘導を防ぐことを示しています。次に、c-junのすぐ上流にあるMAPKJNKとJNKのすぐ上流にあるMKK4のリン酸化状態を評価しました。MKK4およびJNKリン酸化の変化は、化合物1の推定標的であるHGK（MAP4K）および/またはMLK3（MAP3K）を含む上流キナーゼの活性を反映しています。化合物1の添加はJNKおよびMKK4のリン酸化を強く弱め（図4）、化合物1がHGKおよび/またはMLK3に作用して、下流のアポトーシス経路の活性化を防ぐという考えをさらに支持します。
【００１５】
これらの初期結果は有望であったが、化合物１は、潜在的な臨床候補と見なされる前に、さらなる最適化を必要とした。ミクロソーム安定性試験では、化合物1の半減期はマウス肝ミクロソームで短く（T1 / 2 = 7.8分）、in vivoでの半減期はマウスで約2■3時間であることが示されました。さらに、化合物１は非選択的であり、多くのキナーゼを阻害し、１００ｎＭを超える細胞効力を有し、改善されたＰＫ特性を有するより選択的かつ強力な誘導体が好ましく、入手可能である可能性を高める。
【００１６】
したがって、化合物１の様々な類似体の探索、ならびに有毒な小胞体（ＥＲ）ストレスを抑制するための組成物および方法が必要である。本発明は、これらおよび他のニーズを満たすことを目的としている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要旨
特定の理論に拘束されることなく、潜在的な類似体の設計を支援するために、本発明者らは、グライドを使用して、ＨＧＫ（ＰＤＢ ＩＤ：５ＤＩ１）の結晶構造に化合物１をドッキングさせた（図５Ａ）。ドッキングポーズと結合部位相互作用図（図5Bを参照）から、次のことがわかりました。1）7-アザインドール部分がキナーゼのヒンジ領域に結合し、活性に不可欠である。2）ピペラジン部分は溶媒にさらされた領域まで伸びており、分子の物理的特性を改善し、その安定性を高めるために変更することができます。 3）側鎖を修飾して、結合ポケット内の追加の相互作用をピックアップし、キナーゼの特異性を高めることができます。
【００１８】
したがって、本発明の一実施形態は、式（Ｉ）による化合物である。
【化２】
2021518856.tif 000004
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化３】
2021518856.tif 000005
ではないという条件付きで。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、以下の構造を有する化合物である。
【化４】
2021518856.tif 000006
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、以下の構造を有する化合物である。
【化５】
2021518856.tif 000007
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、以下の構造を有する化合物である。
【化６】
2021518856.tif 000008
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、以下の構造を有する化合物である：
【化７】
2021518856.tif 000009
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、医薬組成物である。この医薬組成物は、医薬的に許容される担体または希釈剤、および式（Ｉ）による１つまたは複数の化合物を含む：
【化８】
2021518856.tif 000010
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化９】
2021518856.tif 000011
ではないという条件付きで。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態はキットである。このキットは、本発明による化合物または医薬組成物を、それぞれ化合物または医薬組成物の使用説明書とともに含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、式（Ｉ）の構造を有する有効量の１つまたは複数の化合物を対象に投与することを含む。
【化１０】
2021518856.tif 000012
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１１】
2021518856.tif 000013
ではないという条件付きで。
【００２６】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、医薬的に許容される担体または希釈剤と、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物とを含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【化１２】
2021518856.tif 000014
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１３】
2021518856.tif 000015
ではないという条件付きで。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含み、これは、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物を含む：
【化１４】
2021518856.tif 000016
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１５】
2021518856.tif 000017
ではないという条件付きで。
【００２８】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を含む疾患の影響を治療または改善する方法である。この方法は、有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含み、これは、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物を含む：
【化１６】
2021518856.tif 000018
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１７】
2021518856.tif 000019
ではないという条件付きで。
【００２９】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、式（Ｉ）の構造を有する有効量の１つまたは複数の化合物を対象に投与することを含む。
【化１８】
2021518856.tif 000020
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化１９】
2021518856.tif 000021
ではないという条件付きで。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
アプリケーションファイルは、カラーで実行された少なくとも１枚の写真を含む。カラー写真付きのこの特許出願のコピーは、要求と必要な料金の支払いに応じて、オフィスから提供されます。
【００３１】
【図１】図１は、標的キナーゼをランク付けするための３００個のキナーゼのスポットファイア分析の結果を示す。
【００３２】
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＥＰ?１３４７、Ｋ?２５２ａおよび化合物１（ＵＲＭＣ?０９９）の構造を示す。
【００３３】
【図２Ｂ】図２Ｂは、３３μＭのＣＰＡでのヒトＡＬＳ ｉＰＳ?ＭＮの治療によって誘発されたＥＲストレスに対する化合物１のレスキュー効果を示す。
【００３４】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＰＡの構造を示している。
【００３５】
【図３】図３は、特定のキナーゼ阻害剤の予測される標的の薬理学的阻害を示す。選択的NUAK1阻害剤WZ4003もHTG-01-015もCPAに対する神経保護を提供しませんでした。一方、選択的阻害剤PF626093およびGNE-495によるHGKの阻害、および非選択的阻害剤ボスチニブによるMLK3の阻害は、すべて神経保護作用がありました。これらの結果を総合すると、MLK3とHGKは化合物1のターゲットである可能性がありますが、NUAK1のターゲットではない可能性があります。
【００３６】
【図４Ａ】図４Ａは、ＥＲストレスの状況における化合物１の異なる推定下流標的の発現を示す。マウスES由来の運動ニューロンをCPA、CPA+化合物1、またはビヒクルコントロール（DMSO）で4時間処理しました。次に、細胞を溶解してタンパク質を抽出しました。タンパク質抽出物は、リン酸化MKK4（化合物1ターゲットMLK3のすぐ下流のキナーゼ）、リン酸化JNK（MKK4のすぐ下流のキナーゼ）、リン酸化を含む、化合物1の推定下流ターゲットの活性化型の発現についてウエスタンブロットによって分析されました。c-jun（JNKのすぐ下流の転写因子）、および切断されたカスパーゼ3（アポトーシス細胞死の広く認識されているマーカー）。すべてがCPAによってアップレギュレートされ、CPAがJNK経路駆動アポトーシスを介して運動ニューロン変性を引き起こすことを示しています。一方、化合物1の添加は、これらの経路成分の活性化を弱め、化合物1がこの経路内の上流キナーゼを標的としていることを確認します。
【００３７】
【図４Ｂ】図４Ｂは、免疫染色されたマウスＥＳ由来の運動ニューロンを示す。 ES由来の運動ニューロンを図4Aに記載されているのと同じ方法でCPA+/-化合物1で処理し、化合物1の標的活性の調節が運動ニューロンまたは他の汚染細胞タイプで起こっているかどうかを判断しました。得られた画像は、CPA処理が運動ニューロンのc-junリン酸化を強力かつ選択的に誘導する一方で、化合物1がそれを完全に減衰させることを示しています。運動ニューロンはIslet1-2免疫反応性によって示されます。
【００３８】
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＧＫ（ＭＡＰ４Ｋ４）結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：５ＤＩ１）における化合物１のドッキングポーズを示している。
【００３９】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ドッキングポーズに対応するＨＧＫとの化合物１のリガンド相互作用図を示す（矢印は水素結合を示す）。
【００４０】
【図６】図６は、７ａａなどの化合物１類似体が、ＣＰＡに対する運動ニューロンの保護の増加を提供することを示す。ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンは、33 μMCPAおよび増加する濃度の化合物1またはその類似体で処理されました。生き残った運動ニューロンの数は、ビヒクルで処理された対照に対して正規化された。
【００４１】
【図７Ａ】図７Ａは、％運動ニューロン生存率と％ＭＬＫ１（Ｒ２ ＝ ０．４０）または％ＭＬＫ３（Ｒ２ ＝ ０．５２）活性との相関関係を示している。ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンは、33 μMCPAおよび1.0μMの化合物1または類似体7a■7azで処理されました。 ％MN生存率は、DMSOコントロールに対して有意な増殖を示す細胞の量に基づいていました。残りの％MLK1または％MLK3活性は、10μM ATP（Reaction Biology Corp.）の存在下で0.1 μM化合物を処理した場合の、ビヒクルコントロールと比較した％酵素活性の平均値です。
【００４２】
【図７Ｂ】図７Ｂは、％運動ニューロン生存率と％ＨＧＫ（Ｒ２ ＝ ０．８４）活性との相関関係を示している。ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンは、33 μMCPAおよび1.0μMの化合物1または類似体7a■7azで処理されました。 ％ＭＮ生存率は、ビヒクル対照に対して有意な増殖を示す細胞の量に基づいていた。残りの％HGK活性は、10μM ATP（Reaction Biology Corp.）の存在下で0.025 μMの化合物を処理したときの、DMSOコントロールと比較した％酵素活性の平均値です。
【００４３】
【図８】図８は、化合物１およびその類似体である化合物７ａｄ）による６０個のキナーゼの選択の阻害の結果を示す。運動ニューロン生存アッセイでCPAに対して同様のレベルの保護を提供するにもかかわらず、化合物7adは、化合物1よりも少ないキナーゼの活性を阻害し、それによって、細胞生存の媒介における化合物1およびその類似体の推定機能標的を強調します。
【００４４】
【図９】図９は、２つのＧＣＫ阻害剤、化合物１７およびＮＧ２５（両方ともＴａｎら、２０１５から）が、ＣＰＡ誘発性ＥＲストレスから運動ニューロンを救出することができないことを示している。
【００４５】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＣＲＩＳＰＲによるＨＧＫノックアウトの生成を示す。 2つのガイドRNAは、HGKのATP結合ドメインを取り巻くゲノム領域をターゲットにするように設計されました。この領域のCRISPRを介した切除は、非相同末端結合による二本鎖切断修復につながります。
【００４６】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＨＧＫタンパク質のウエスタンブロッティングによるＨＧＫノックアウトクローンの検証を示す。テストした3つのノックアウトクローンには、検出可能なHGKタンパク質は残っていませんでした。
【００４７】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＷＴ（青色）およびＨＧＫノックアウト（オレンジ色）におけるＣＰＡ用量反応治療後の運動ニューロン（ＭＮ）生存の結果を示す。運動ニューロンは、磁気活性化セルソーティング（MACS）によって精製され、プレーティングの24時間後にさまざまな用量のCPAで処理され、48時間後に画像化されました。
【００４８】
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＨＧＫノックアウトが、ＣＰＡ曝露後早期（＜８時間）に、適度であるが統計的に有意な（ｐ ＜０．０００１、双方向ＡＮＯＶＡ）神経保護を提供することを示している。 MACSで精製した運動ニューロンを10μM CPAで0■24時間処理し、24時間の時点で画像化しました。遺伝子型間の生存率の最大の違いは、CPA曝露の3■8時間の間に発生しましたが、その後の時点で消失しました。
【００４９】
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、ＨＧＫノックアウトがＭＡＰＫ経路の活性化をわずかに減少させることを示している（ｐ ＜０．０１、双方向ＡＮＯＶＡ）。化合物1の推定標的の下流にあるリン酸化（活性化）c-junの発現を、FRETによるCPA曝露（10 μM）の過程でモニターしました。C-junは、野生型運動ニューロンと比較して、HGKノックアウトではCPAによる活性化が中程度ですが有意に少なかった。
【００５０】
【図１１−１】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−２】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−３】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−４】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−５】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−６】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−７】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−８】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−９】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【図１１−１０】図１１は、化合物１およびその類似体（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ）のミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。、12k、12l）。それらの構造とマウス肝ミクロソームでの半減期が示されています。
【００５１】
【図１２】図１２は、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの添加が、化合物１およびその類似体の溶解度を増加させることができることを示している。化合物1またはDMSO（化合物1およびその類似体の希釈剤）を、関連するインビボ用量（2■10mg / kg）に対応する濃度で異なるビヒクル組成物と混合した。ビヒクル1（55％生理食塩水、40％PEG-400、5％DMSO）は、以前は化合物1のinvivo送達に使用されていました（Goodfellow VS et al。、2013）。次に、これらの混合物を540 nMの分光光度計で読み取って、光学密度、混合物の透明度の尺度、および沈殿物の形成の指標を評価しました。ビヒクル１および２は、ＤＭＳＯのみの存在下では沈殿物を形成しなかったが、化合物１の存在下では形成した。より高い濃度では、これらの沈殿物は目で見ることができた。ビヒクル１の成分への１１％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの添加は、化合物１（ビヒクル３）を可溶化するのに十分であった。
【００５２】
【図１３Ａ】図１３Ａは、肝臓ミクロソーム安定性アッセイにおける化合物１および１２ｋの半減期を示す。最適化された化合物12kの半減期（> 120分）は、化合物1の半減期（15分）よりもかなり長く、12kの代謝安定性がはるかに強いことを示しています。
【００５３】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、１０ｍｇ ／ ｋｇのいずれかの化合物を静脈内（ＩＶ）注射されたマウスの血漿および脳サンプル中の化合物１および１２ｋの濃度（ｎｇ／ ｍＬ）を示す。薬物濃度はLC-MSによって分析されました。注入の1時間後の化合物11のレベルは、LC-MSアッセイの検出限界を下回っていますが、12kは依然として検出可能でした。さらに、脳内の12kの量は血漿中の量を上回り、12kが血液脳関門の浸透性が高いことを示しています。
【００５４】
【図１４】図１４は、化合物１およびその類似体１２ｈおよび１２ｋでの処理後の野生型マウスの嗅球におけるリン酸化（活性化）ｃ?ジュンの発現を示す。 10 mg / kgの化合物は、腹腔内（IP）、経口、または皮下（SC）に送達されました。治療の1時間後に動物を犠牲にした。それらの嗅球を解剖し、ウエスタンブロット分析のために溶解した。ホスホ-cjunの発現は、ハウスキーピングタンパク質GAPDHに対して正規化されました。未処理の動物と比較して、ホスホ-cjunレベルはほとんどすべての処理条件で減少し、化合物1とその類似体がinvitroと同じ標的にinvivoで関与していることを示しています。
【００５５】
15A -15Kは、デュアルカラー運動ニューロン毒性スクリーンの設計に使用される新しいトランスジェニックマウスESC系統の導出と特性評価を示しています。
【００５６】
【図１５Ａ】図１５Ａは、運動ニューロン（ＭＮ）転写因子Ｈｂ９およびＩｓｌｅｔ１ ／ ２について染色されたＨｂ９ ：： ＲＦＰ ｈＳＯＤ１ＷＴおよびＨｂ９：： ＧＦＰ ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａからの胚様体の共焦点顕微鏡写真を示す。
【００５７】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、蛍光レポータータンパク質（ＦＰ）と転写因子（ＴＦ）との間の重複の測定値を示す。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。
【００５８】
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、二色培養を示す代表的な顕微鏡写真を備えた概略９６ウェルプレートを示す。
【００５９】
【図１５Ｄ−Ｅ】図１５Ｄは、トロフォスプレートランナーＨＤで取得された生細胞の代表的なウェル全体の画像を示す。
【００６０】
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、図１５Ｄの倍率およびメタモルフソフトウェアを使用した自動画像分析の結果を示す。
【００６１】
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、生細胞を蛍光破片から区別するために有意な神経突起の存在を使用する「健康な細胞基準」を示している。
【００６２】
【図１５Ｇ】図１５Ｇは、異なる蛍光レポーターを発現するトランスジェニックｈＳＯＤ１ ＷＴおよびＧ９３Ａ細胞株におけるＭＮ生存を示す。生存は、混合赤緑培養（赤WT＃1 +緑G93A＃1、N = 6）または別々の培養（緑WT＃）のいずれかで中（G + F + I）および低（F + I）神経栄養サポートで評価されました。1、緑のG93A＃2、N = 3）。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。** p <0.01 *** p <0.001。
【００６３】
【図１５Ｈ】図１５Ｈは、４８時間の曝露での小分子スクリーニングの結果を示す。濃い青色のデータポイントは、化合物に十分に曝露された場合の正規化されたG93A / WT生存率を示し、水色と黄色のデータポイントは、コントロールのG93A / WT生存率を示します。円は、図15Iに示されている二次スクリーニング後に確認された有望なリード化合物を示します。
【００６４】
【図１５Ｉ】図１５Ｉは、図１５Ｈに示される結果に基づく二次スクリーニング後の有望なリード化合物のリストを示す。
【００６５】
【図１５Ｊ】図１５Ｊは、４８時間の曝露での小分子スクリーニングの結果を示す。赤と緑のデータポイントは、化合物に曝露されたHb9 :: RFP-hSDO1WT（赤）とHb9 :: GFP-hSDO1G93A（緑）の細胞の生存を示し、水色、黄色、青、マゼンタのデータポイントはコントロールの生存を示します。円は、図15Kに示されている二次スクリーニング後に確認された有望なリード化合物を示します。
【００６６】
【図１５Ｋ】図１５Ｋは、図１５Ｊに示される結果に基づく二次スクリーニング後の有望なリード化合物のリストを示す。
【００６７】
図16A■16Jは、シクロピアゾン酸の特性と、運動ニューロンおよび介在ニューロンの生存に対するその影響、およびカルシウム恒常性に対する影響を示しています。
【００６８】
【図１６Ａ】図１６Ａは、Ｈｂ９ ：： ＲＦＰ ｈＳＯＤ１ＷＴおよびＨｂ９ ：： ＧＦＰ ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ ＭＮの生存を示すシクロピアゾン酸（ＣＰＡ）の用量反応曲線を示す。
【００６９】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、正規化されたＧ９３Ａ ／ ＷＴ生存率を示す。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。**p <0.01（N = 10）。
【００７０】
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＣＰＡに曝露された同じウェル内のＨｂ９ ：： ＲＦＰ ｈＳＯＤ１ＷＴおよびＨｂ９ ：： ＧＦＰ ｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡＭＮを示す、ウェル全体の画像化および拡大からの代表的な画像を示す。
【００７１】
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、Ｔｕｊ−１（赤）について染色されたｃｔｒｌおよびＣＰＡに曝露されたＨｂ９ ：： ＧＦＰ ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ培養物の顕微鏡写真を示す。
【００７２】
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、ｃｔｒｌおよびＣＰＡに曝露された混合Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ（緑）／ Ｐｔｆ１α ：： ｔｄＴｏｍａｔｏｒｅｄ）培養物の顕微鏡写真を示す。
【００７３】
【図１６Ｆ−Ｇ】図１６Ｆおよび図１６Ｇは、ｃｔｒｌおよびＣＰＡに曝露されたＭＮ、Ｔｕｊ?１ ＋およびＰｔｆ１α ＋ニューロンの生存が４８時間で定量化されたことを示す（両方の分析についてＮ＝ ３）。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。** p <0.01 *** p <0.001。
【００７４】
【図１６Ｈ】図１６Ｈは、ＳＥＲＣＡ２（赤）、Ｔｕｊ−１（マゼンタ）およびＤＡＰＩ（青）について染色された未精製のＨｂ９ ：： ＧＦＰＭＮ培養物の顕微鏡写真を示す。
【００７５】
【図１６Ｉ】図１６Ｉは、細胞質Ｃａ ＋＋のＣＰＡ誘導性変化が、Ｆｕｒａ?２標識精製ｈＳＯＤ１ＷＴおよびｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ ＭＮ培養物（ＷＴについてはＮ＝ ５、Ｇ９３ＡについてはＮ ＝ ４）において３４０ ／ ３８■■０ｎｍ比を計算することによって評価されたことを示す。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。
【００７６】
【図１６Ｊ】図１６Ｊは、ＣＰＡの非存在下または存在下でカイニン酸（ＫＡ）に曝露された培養物において、フラ?２比（タウ）の減少の傾きが測定されたことを示している。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。
【００７７】
図17A■17Gは、シクロピアゾン酸で処理された運動ニューロン培養における小胞体ストレスマーカーの特性を示しています。
【００７８】
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＣＰＡ曝露後のより早い時点での特に関心のある遺伝子のｑＰＣＲ結果点を示すヒストグラムを示す。 RNAは未精製のhSDO1G93AMN（N = 3）から抽出されました。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。
【００７９】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＣＰＡ曝露後の異なる時点でのｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ ９６７ ＭＮにおけるＸＢＰ１スプライシングを示すヒストグラムおよび逆ゲル画像を示す（Ｎ＝ ３）。バーは平均比s / uを示し、エラーバーはSEMを示します。
【００８０】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＣＰＡ曝露後の異なる時点でのＥＲストレス関連タンパク質の発現の免疫ブロットおよびそれらの負荷制御を示す。
【００８１】
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、ＣＰＡで処理されたｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ細胞からの溶解物におけるＳＯＤ１発現およびローディングコントロールの免疫ブロットを示す。中央のレーンはpanSOD1の発現を示しています。下のレーンは、誤って折りたたまれたhSOD1種（C4F6およびB8H10クローン）に特異的な抗体を使用して免疫沈降したライセートを示しています。
【００８２】
【図１７Ｅ−Ｆ】図１７Ｅおよび図１７Ｆは、ｃｔｒｌおよびＣＰＡ処理されたＭＮ培養物（Ｎ ＝ ５）におけるホスホ?ｃ?ｊｕｎ ＋ ＭＮのヒストグラムおよび共焦点顕微鏡写真を示す。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。** p <0.01。
【００８３】
【図１７Ｇ】図１７Ｇは、Ｐｔｆ１α ＋ ：： ｔｄトマト介在ニューロン（ＩＮ）およびＨｂ９ ：： ＧＦＰ運動ニューロン（ＭＮ）に対するＣＰＡ曝露の異なる効果のヒストグラムを示し、バーは、平均比ＭＮ／ ＩＮ（Ｎ ＝ ３技術的複製）を示す。 ）、エラーバーはSEMを示します。
【００８４】
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＥＲストレスレスキュースクリーンからの選択された結果、特に、運動ニューロンの生存および神経突起伸長の結果を示す。化合物は、それらの推定される作用機序に基づいて細分類され、色分けされています。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します（N = 3-6培養ウェル/化合物）。さらに分析するためのカットオフレベルは、灰色の線で示されています。
【００８５】
図19A■19Fは、マウス運動ニューロンのc-junリン酸化およびヒト運動ニューロンの生存に対する影響を含む、レスキュー化合物の特性を示しています。
【００８６】
【図１９Ａ】図１９Ａは、レスキュースクリーンからのリード化合物の用量反応曲線を示す（ＧＯ６９７６ Ｎ ＝ ６培養ウェル、Ｋ２５２−ａＮ ＝ ２独立培養、ケンパウロンＮ ＝ ３独立培養、ＴＵＤＣＡ Ｎ ＝ ２独立培養）。 。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。
【００８７】
【図１９Ｂ】図１９Ｂおよび図１９Ｃは、２時間の曝露でのＣＰＡ処理されたＭＮ培養物におけるホスホ−ｃ−ジュン発現に対するレスキュー化合物の効果のヒストグラムおよび共焦点顕微鏡写真を示す。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。*** p <0.001。
【図１９Ｃ】図１９Ｂおよび図１９Ｃは、２時間の曝露でのＣＰＡ処理されたＭＮ培養物におけるホスホ−ｃ−ジュン発現に対するレスキュー化合物の効果のヒストグラムおよび共焦点顕微鏡写真を示す。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。*** p <0.001。
【００８８】
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、ＳＯＤ１ ＋ ／ ＋および同質遺伝子型の遺伝子改変ＳＯＤ１ ＋ ／ Ａ４Ｖ ｈＥＳＣ系統（Ｎ）から分化したＦＡＣＳ精製Ｈｂ９：： ＧＦＰ ＋ヒトＭＮにおけるレスキュー化合物の非存在下または存在下でのＣＰＡの効果のヒストグラムを示す。両方の遺伝子型のCPA対CTRLの場合は=9、両方の遺伝子型のレスキュー化合物の場合はN = 3）。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。* p <0.05、** p <0.01、***p <0.001（CPAの効果は、線で示されているように、SOD1 + / +とSOD1 + / A4VMNの間で比較されました。レスキュー化合物の効果を、各遺伝子型のCPAと比較しました）。
【００８９】
【図１９Ｅ】図１９Ｅは、カルセイン＋細胞の代表的なトリミングされたウェル全体の画像を示す。
【００９０】
【図１９Ｆ】図１９Ｆは、ＣＰＡの推定シグナル伝達経路およびレスキュー化合物の標的の概略図である。上付き文字は、サポートする参照を示します（1Sakaki et al。2008、2Yamada et al。1998、3Roux et al。2002、4Yang et al。2013、5Ozcanetal。2006、6Uppalaet al.2017）。
【００９１】
図20A■20Fは、ALSのマウスモデルにおけるinvitroでのTUDCAの栄養効果とinvivoでの筋肉除神経への影響の特性を示しています。
【００９２】
【図２０Ａ−Ｂ】図２０Ａおよび図２０Ｂは、標準的な神経栄養因子（ＣＴ?１についてはＮ ＝ ３、他のグループについてはＮ ＝ ４）と比較して、ＭＮ生存および神経突起伸長に対するＴＵＤＣＡの効果を示す。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します。* p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001（コントロールと比較）。
【００９３】
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ ＋細胞の代表的なトリミングされたウェル全体の画像を示す。
【００９４】
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける筋肉除神経に関するＴＵＤＣＡのインビボ試験のための実験計画の概略図を示す。
【００９５】
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、ＴＡにおけるＮＭＪ神経支配の散布図を示す（ＷＴ＋ ＴＵＤＣＡについてはＮ ＝ ４、Ｇ９３Ａ ＋ ＴＵＤＣＡについてはＮ ＝ ６、Ｇ９３Ａ ＋車両についてはＮ ＝ ５）。データポイントは個々の動物を表し、水平線は平均を表し、* p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001です。
【００９６】
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、ビヒクルおよびＴＵＤＣＡで処理されたｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスのＴＡ ＮＭＪ（α−ｂｔｘ赤、ＶＡＣｈＴ緑）の共焦点顕微鏡写真を示す。円は除神経されたNMJを示します。
【００９７】
21A - 21Kは、新たに誘導されたトランスジェニックES系統の評価、分化細胞における正常および誤って折りたたまれたSOD1発現とpEif2αレベルの生化学的分析、および運動ニューロン培養における神経栄養サポートの滴定を示しています。
【００９８】
【図２１Ａ】図２１Ａは、新たに誘導されたレポーター系統からの典型的なＥＳコロニーの光学顕微鏡写真を示す。
【００９９】
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、野生型または変異型ヒトＳＯＤ１の存在を確認する配列決定結果を示す。
【０１００】
【図２１Ｃ】図２１Ｃ、図２１Ｄおよび図２１Ｅは、分化した新しいＥＳラインにおけるレポーター検証の光学顕微鏡写真およびヒストグラムを示す（各レポーターの２つのラインは２つの別々のラウンドで分化し、結果は平均値／レポーターとして提示される）。。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【図２１Ｄ】図２１Ｃ、図２１Ｄおよび図２１Ｅは、分化した新しいＥＳラインにおけるレポーター検証の光学顕微鏡写真およびヒストグラムを示す（各レポーターの２つのラインは２つの別々のラウンドで分化し、結果は平均値／レポーターとして提示される）。。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【図２１Ｅ】図２１Ｃ、図２１Ｄおよび図２１Ｅは、分化した新しいＥＳラインにおけるレポーター検証の光学顕微鏡写真およびヒストグラムを示す（各レポーターの２つのラインは２つの別々のラウンドで分化し、結果は平均値／レポーターとして提示される）。。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１０１】
【図２１Ｆ】図２１Ｆおよび図２１Ｇは、Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ ｈＳＯＤ１ＷＴまたはＨｂ９ ：： ＧＦＰ ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ細胞の個々の培養物における運動ニューロンの生存および神経突起成長の評価を示す（両方の遺伝子型についてＮ＝ ３）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【図２１Ｇ】図２１Ｆおよび図２１Ｇは、Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ ｈＳＯＤ１ＷＴまたはＨｂ９ ：： ＧＦＰ ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ細胞の個々の培養物における運動ニューロンの生存および神経突起成長の評価を示す（両方の遺伝子型についてＮ＝ ３）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１０２】
【図２１Ｈ】図２１Ｈは、未処理の運動ニューロン培養物における総および誤って折りたたまれた（Ｃ４Ｆ６）ＳＯＤ１の発現を示す免疫ブロットのトリミングされた画像を示す。 WTまたはSOD1G93AマウスのP100脊髄を対照として使用した。破線は、下の画像がトリミングされたことを示します。
【０１０３】
【図２１Ｉ】図２１Ｉは、誤って折りたたまれた変異体ＳＯＤ１に対するＣ４Ｆ６およびｆ Ｂ８Ｈ１０抗体に対する特異性を示す免疫ブロットを示す。
【０１０４】
【図２１Ｊ】図２１Ｊおよび図２１Ｋは、フォルスコリン（Ｆ、範囲：１００μＭ−０．７８１２５μＭ）、ＩＢＭＸ（Ｉ、範囲：１ｍＭ−の組み合わせで処理された培養物における運動ニューロン生存の用量反応曲線を示すヒストグラムを示す。 7.8125μM）およびGDNF（G、範囲：50ng / mL - 0.128 pg / mL）、高培地サポートをコントロール（NTF）として使用しました（N= 6培養ウェル/条件）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【図２１Ｋ】図２１Ｊおよび図２１Ｋは、フォルスコリン（Ｆ、範囲：１００μＭ−０．７８１２５μＭ）、ＩＢＭＸ（Ｉ、範囲：１ｍＭ−の組み合わせで処理された培養物における運動ニューロン生存の用量反応曲線を示すヒストグラムを示す。 7.8125μM）およびGDNF（G、範囲：50ng / mL - 0.128 pg / mL）、高培地サポートをコントロール（NTF）として使用しました（N= 6培養ウェル/条件）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１０５】
22A■22Fは、CPAで処理された濃縮運動ニューロン培養における一次毒性スクリーニングおよびカルシウムイメージング実験からの追加の結果を示しています。
【０１０６】
【図２２Ａ】図２２Ａは、４８時間の曝露での小分子スクリーニングの結果を示す。濃い青色のデータポイントは、化合物に十分に曝露された場合の正規化されたG93A / WT生存率を示し、水色と黄色のデータポイントは、コントロールのG93A / WT生存率を示します。円は、二次スクリーニング後に確認された有望なリード化合物を示し、以下の表に示されています。
【０１０７】
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、４８時間の曝露での小分子スクリーニングの結果を示す。赤と緑のデータポイントは、化合物に曝露されたHb9 :: RFP-hSDO1WT（赤）とHb9 :: GFP-hSDO1G93A（緑）の細胞の生存を示し、水色、黄色、青、マゼンタのデータポイントはコントロールの生存を示します。円は、二次スクリーニング後に確認された有望なリード化合物を示し、以下の表に示されています。
【０１０８】
【図２２Ｃ】図２２Ｃおよび図２２Ｅは、ＣＰＡ曝露の前または後にカイニン酸パルスに供された濃縮運動ニューロン培養物におけるＦｕｒａ−２信号比３４／３８０を示す（ＷＴについてはＮ＝ ５およびＧ９３ＡについてはＮ ＝ ４）。 。データポイントは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１０９】
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、カイニン酸に曝露されたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンのビデオからの代表的な静止画像を示す。画像はFura-2信号比340/380を示しており、信号はFIJI（NIH）の画像ルックアップテーブル機能を使用して表示されます。矢印はHb9:: RFP +セルを示します。
【図２２Ｅ】図２２Ｃおよび図２２Ｅは、ＣＰＡ曝露の前または後にカイニン酸パルスに供された濃縮運動ニューロン培養物におけるＦｕｒａ−２信号比３４／３８０を示す（ＷＴについてはＮ＝ ５およびＧ９３ＡについてはＮ ＝ ４）。 。データポイントは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１１０】
【図２２Ｆ】図２２Ｆは、Ｈｂ９ ：： ＲＦＰ−ｈＳＤＯ１ＷＴ（赤）およびＨｂ９ ：： ＲＦＰ−ｈＳＤＯ１ＷＴにおけるピークカイニン酸およびＣＰＡ誘発Ｆｕｒａ−２信号比３４／３８０の測定値のヒストグラムを示す。
【０１１１】
図２３Ａ■２３Ｆは、混合およびＦＡＣＳ選別された運動ニューロン培養物における、２つの独立した細胞株の対におけるＣＰＡ毒性の評価を示している。
【０１１２】
【図２３Ａ−Ｂ】図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃおよび図２３Ｄは、レポーター細胞株の２つの異なる組み合わせにおけるＣＰＡ処理培養物における生存率の用量反応曲線を示す。培養物は未精製であるか、またはＦＡＣＳを使用して精製された（図２３Ａ：Ｎ＝ ５、図２３Ｂ：Ｎ ＝ ４、図２３Ｃ：Ｎ ＝ ６培養ウェル、図２３Ｄ：Ｎ ＝ ２）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【図２３Ｃ−Ｄ】図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃおよび図２３Ｄは、レポーター細胞株の２つの異なる組み合わせにおけるＣＰＡ処理培養物における生存率の用量反応曲線を示す。培養物は未精製であるか、またはＦＡＣＳを使用して精製された（図２３Ａ：Ｎ＝ ５、図２３Ｂ：Ｎ ＝ ４、図２３Ｃ：Ｎ ＝ ６培養ウェル、図２３Ｄ：Ｎ ＝ ２）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１１３】
【図２３Ｅ】図２３Ｅおよび図２３Ｆは、レポーターラインのＦＡＣＳ精製のための代表的なゲートの散布図を示す。
【図２３Ｆ】図２３Ｅおよび図２３Ｆは、レポーターラインのＦＡＣＳ精製のための代表的なゲートの散布図を示す。
【０１１４】
24A -24Lは、invitroでALSの病因の側面を研究するためのヒト同質遺伝子細胞株の生成を示しています。
【０１１５】
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ変異対立遺伝子をＨＵＥＳ３ Ｈｂ９ ：： ＧＦＰのＳＯＤ１遺伝子座に導入するための遺伝子ターゲティング戦略の図を示す。
【０１１６】
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＳＯＤ１遺伝子座の配列決定を示す。
【０１１７】
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、固有のＰｓｈＡＩ制限部位のＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析が正しい標的化を確認したことを示している。
【０１１８】
【図２４Ｄ−Ｅ】図２４Ｄおよび図２４Ｅは、標的化された幹細胞株におけるＳＯＤ１発現のｑＲＴ?ＰＣＲおよびイムノブロットアッセイが、ＳＯＤ１転写物のレベルおよびタンパク質レベルの低下を示したことを示している。
【０１１９】
【図２４Ｆ】図２４Ｆは、ＧＦＰレポーターを発現する分化した細胞の別個の集団を示すＦＡＣＳプロットを示す。 MNパターニング分子RAおよびSAGに曝露されていない分化した神経細胞を、緑色蛍光をゲートするためのネガティブコントロールとして使用しました。
【０１２０】
【図２４Ｇ】図２４Ｇは、Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ ＋細胞が転写因子Ｉｓｌｅｔ１を発現し、脊髄ＭＮ同一性を確認することを示している。
【０１２１】
【図２４Ｈ】図２４Ｈおよび図２４Ｉは、混合培養物における細胞生存アッセイが、同質遺伝子対照と比較して、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ変異体を発現する同質遺伝子ヒトＥＳＭＮにおける生存の低下の傾向を示すことを示す。 3日目と30日目のヒト核とTuj1染色の代表的な画像（P = 0.09、n= 4）。
【図２４Ｉ】図２４Ｈおよび図２４Ｉは、混合培養物における細胞生存アッセイが、同質遺伝子対照と比較して、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ変異体を発現する同質遺伝子ヒトＥＳＭＮにおける生存の低下の傾向を示すことを示す。 3日目と30日目のヒト核とTuj1染色の代表的な画像（P = 0.09、n= 4）。
【０１２２】
【図２４Ｊ】図２４Ｊは、生培養におけるカルセイン標識によって評価された、ＦＡＣＳ精製されたヒト同質遺伝子系統におけるＭＮ生存および神経突起成長の短期評価（解離後５日）を示す。
【０１２３】
【図２４Ｋ】図２４Ｋは、精製された同質遺伝子のヒト運動ニューロン培養物における神経突起成長のヒストグラムを示す。細胞を対照条件下で増殖させ、CPAで処理するか、レスキュー化合物で前処理した後、CPAで前処理しました（CPAのN = 9対両方の遺伝子型のCTRL（両方の遺伝子型のレスキュー化合物のN= 3）。バーは平均を示し、エラーバーは示しますSEM、* p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001（線で示されているように、CPAの効果はWTとALSMNの間で比較されました。レスキュー化合物の効果はそれぞれのCPAと比較されました。遺伝子型）。
【０１２４】
【図２４Ｌ】図２４Ｌは、精製されたヒトＳＯＤ１ ＋ ／ Ａ４Ｖ ＥＳ ＭＮにおけるＣＰＡ毒性の用量反応生存曲線を示すヒストグラムを示す。バーは平均を示し、エラーバーはSEMを示します（N = 3培養ウェル/濃度）。
【０１２５】
25A -25Hは、Hb9 :: GFP +運動ニューロンとPtf1a :: dtTomato +介在ニューロンを含むCPA処理混合培養におけるc-junリン酸化とカルシウム恒常性を示しています。抱合胆汁酸のCPAレスキュー効果、および高および低栄養サポートの存在下でのTUDCAの生存およびレスキュー効果のミニスクリーン。
【０１２６】
【図２５Ａ】図２５Ａは、Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ ＋運動ニューロン（緑）およびＰｔｆ１ ：： ｔｄトマト介在ニューロン（赤）におけるｐ−ｃ−ｊｕｎ（青）発現の共焦点顕微鏡写真を示す。
【０１２７】
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、培養中の他のニューロンに対する運動ニューロンにおけるＦｕｒａ−２信号比３４／３８０を示すヒストグラムを示す（ＷＴについてはＮ＝ ５、Ｇ９３ＡについてはＮ ＝ ４）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１２８】
【図２５Ｃ−Ｄ】図２５Ｃおよび図２５Ｄは、ＣＰＡ処理されたＨｂ９ ：： ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ運動ニューロン（Ｎ ＝ ３■６培養ウェル／化合物）におけるタウリン結合胆汁酸のレスキュー効果のミニスクリーンを示す。データポイントは平均値を示しています。
【０１２９】
【図２５Ｅ−Ｆ】図２５Ｅおよび図２５Ｆは、低神経栄養サポート（Ｎ ＝ ３）で成長したＣＰＡ処理Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンにおける生存および神経突起成長に対するＴＵＤＣＡおよび標準的な神経栄養因子のレスキュー効果を示すヒストグラムを示す。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１３０】
【図２５Ｇ】図２５Ｇは、高い神経栄養サポート下で成長したＨｂ９ ：： ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンにおける生存および神経突起成長に対するＴＵＤＣＡの効果を示す（Ｎ＝ ３）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１３１】
【図２５Ｈ】図２５Ｈは、高い神経栄養サポート下で成長したＣＰＡ処理Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンにおける生存および神経突起成長に対するＴＵＤＣＡの効果を示す（Ｎ＝ ３）。バーは平均とエラーバーSEMを示します。
【０１３２】
【図２６】図２６は、ＣＰＡがＥＲへのＣａ ２＋取り込みを防止し、それにより、Ｃａ ２＋依存性タンパク質フォールディングシャペロンの活性を遮断し、ＥＲストレスを急速に誘導することを示している。
【０１３３】
【図２７】図２７は、ＡＣＳ関連ストレス化合物を同定するスクリーニングプロセスの概略図を示し、これはまた、ＣＰＡ毒性を救済する。
【０１３４】
【図２８】図２８は、化合物１類似体を合成するための潜在的な改変を示す。
【０１３５】
【図２９】図２９は、合成された類似体の代謝安定性を試験するためのインビトロアッセイの概略図を示す。
【０１３６】
【図３０】図３０は、合成された類似体のインビボ薬物動態の評価プロセスの概略図を示す。
【０１３７】
【図３１Ａ】図３１Ａは、化合物１および類似体の阻害プロファイルを示し、ＨＧＫ、ＴＮＩＫおよびＭＩＮＫ１を含む特定のＭＡＰ４Ｋキナーゼの強力な阻害を示している。 HGK、TNIKおよびMINK1のMAP4K4触媒ドメインのアミノ酸配列アラインメントが示されています。
【０１３８】
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＣＰＡ処理されたＥＳ ＭＮにおける化合物１およびその類似体の神経保護効果の可能な作用機序の概略図である。
【０１３９】
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、３つすべてのキナーゼ（ＨＧＫ、ＴＮＩＫおよびＭＩＮＫ１）の発現を弱めるための手順を示す概略図である。
【０１４０】
【図３２】図３２は、所与のキナーゼの阻害と運動ニューロンの生存との間の相関を説明する、ランク付けされたＲ二乗値（ピアソンのｒから）を示す。 10の化合物1アナログを、化合物1の60の異なる既知の標的を阻害する能力と、CPA治療後の運動ニューロンの生存を促進する能力について比較しました。MAP4K（緑色で強調表示）は、最もランクの高いキナーゼの1つです。 ** P <0.01; * P <0.05。
【０１４１】
【図３３】図３３は、ＭＡＰ４ＫのＣＲＩＳＰＲノックアウトが神経保護的であり、運動ニューロンにおいて相加効果を有することを示し、それらが化合物１およびその神経保護類似体の機能的標的であることを示している。
【０１４２】
【図３４Ａ】図３４Ａは、１０ｍｇ ／ ｋｇのＩＰまたはＯＧで１回投与され、脳および血漿中で経時的に評価された化合物１の薬物動態結果を示す。
【０１４３】
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、化合物１２ｋの薬物動態結果を示し、１０ｍｇ ／ ｋｇのＩＰまたはＯＧで１回投与され、脳および血漿中で経時的に評価された。
【０１４４】
【図３５Ａ】図３５Ａは、以下の設定におけるそれらの薬物動態結果を比較することによる化合物１と化合物１２ｋとの間の差異を示す：脳対血漿、濃度は［ｎｇ／ ｍＬまたはｎｇ ／ ｇ］で計算され、１０ｍｇ ／ ｋｇで１回投与される。 IPまたはOGであり、時間の経過とともに評価されます。
【０１４５】
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、以下の設定におけるそれらの薬物動態結果を比較することによる化合物１と化合物１２ｋとの間の差異を示す：脳対血漿、濃度を［ｎＭ］で計算し、１０ｍｇ／ ｋｇのＩＰまたはＯＧで１回投与し、そして時間。
【０１４６】
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、化合物を１０ｍｇ ／ ｋｇ ＩＰで１回投与し、経時的に評価した、インビトロでの活性と比較した、大まかな［ｎＭ］での計算を示す。
【０１４７】
【図３６】図３６は、化合物を１０ｍｇ ／ ｋｇのＩＰまたはＯＧで１回投与し、経時的に評価した、経時的な脳／血漿比を示す。
【０１４８】
【図３７Ａ】図３７Ａは、７日間にわたって飲料水中に経口で送達され、７日の時点で評価された、化合物１対化合物１２ｋの比較結果を示す。
【０１４９】
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、１５日間にわたって飲料水中に経口で送達され、１５日の時点で評価された、化合物１対化合物１２ｋの比較結果を示す。
【０１５０】
図３８Ａ■３８Ｃは、化合物１２ｋが、化合物１と比較して増強されたＭＡＰ４Ｋ阻害を示すことを示している。
【０１５１】
【図３８Ａ】図３８Ａは、キナーゼファミリーによって分離された化合物１の全体的なキナーゼ阻害プロファイルを示す。
【０１５２】
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、キナーゼファミリーによって分離された、化合物１２ｋの全体的なキナーゼ阻害プロファイルを示す。
【０１５３】
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、１と比較した化合物１２ｋによる所与のキナーゼの阻害の倍率変化を示す。ＭＡＰ４Ｋ（緑色）は、１２ｋの最も増強された標的の中にある。
【０１５４】
【図３９】図３９は、化合物１およびその類似体が、ミクログリアによる炎症性サイトカインＴＮＦα放出を抑制することを示している。
【０１５５】
【図４０】図４０は、化合物１および類似体の機能的標的が、炎症対神経変性について異なることを示している。
【０１５６】
41A -41Cは、HGK阻害剤が神経保護作用を示し、JNK経路を介して作用することを示しています。
【０１５７】
【図４１Ａ】図４１Ａは、以前の生存スクリーニングからの神経保護ヒットのキナーゼ標的の双方向階層的クラスタリングの結果を示し、ＨＧＫおよびＮＵＡＫ１がこれらの化合物の共有標的であることを示している。 MAP4キナーゼには下線が引かれています。
【０１５８】
【図４１Ｂ】図４１Ｂは、希釈系列全体にわたるより特異的なＨＧＫおよびＮＵＡＫ１阻害剤と比較した、図４１Ａ（灰色）からのヒットの最大の効力を示す。バーは、CPA（33 μm）+ビヒクル対照に対して正規化された試験化合物で処理された野生型運動ニューロンの平均±SEMを表す。 n = 96ウェルプレートからの3つの複製ウェル。破線は、CPAのみで処理された細胞の平均生存率を表しています。
【０１５９】
【図４１Ｃ】図４１Ｃは、ビヒクル、ＣＰＡ、またはＣＰＡ ＋化合物１（０．５μＭ）で処理された混合運動ニューロン培養物のウエスタンブロットの結果を示す。 4時間の処理後にサンプルを採取しました。 N =別々に処理および溶解された3つの別々の運動ニューロン分化からのサンプル。各分化からの細胞は、各処理条件に1つずつ、3つのサンプルに分割されました。すべてのサンプルは、同じブロットで同時に実行されました。すべてのバンド強度は、ローディングを制御するためにGAPDHに正規化され、次にDMSOおよびCPA+化合物1の値が各nのCPA値に正規化されました。一元配置分散分析を使用して、JNKリン酸化（P = 0.0009; F = 28.33; R2 =0.9042）およびc-Junリン酸化（P <0.0001; F = 101.9; R2 = 0.9714）に対する治療の全体的な効果を評価しました。データは、平均CPA+化合物1値、CPAのみと比較したlog2倍変化±SEMを表します。ボンフェローニの多重比較検定を使用して、ホスホ-JNKおよびホスホ-c-JunのCPAとCPA+化合物1の条件を比較しました。 ** P <0.01; *** P <0.001。
【０１６０】
42A■42Cは、化合物1類似体のinvitroおよびinvivo特性を示しています。
【０１６１】
【図４２Ａ】図４２Ａは、最初に生成された４９の化合物１類似体の間での効力（赤）および効力（青）の改善の要約を提供する。
【０１６２】
【図４２Ｂ】図４２Ｂは、希釈系列（ログμＭ）にわたる、ＣＰＡ（３３μＭ）および化合物１、１２ｆ、および１２ｋで処理されたＳＯＤ１Ａ４Ｖ変異ＡＬＳ運動ニューロンの生存曲線を示す。化合物12fは、1と比較して効力と有効性が改善されていますが、0.5 μMを超えると急激に毒性があります。化合物12kは、1と比較して効力と有効性が改善されており、高用量では12fよりも毒性が低くなっています。データは、CPA（33μm）+ビヒクル対照に対して正規化された試験化合物で処理された運動ニューロンの平均±SEMです。 n = 3は、各試験化合物の用量について、96ウェルプレートからウェルを複製します。
【０１６３】
【図４２Ｃ】図４２Ｃは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみで処理されたＳＯＤ１Ａ４Ｖ運動ニューロンのウェル全体の画像からの代表的なフィールドを示す（左上）。 CPA（33 μm）のみ（右上）; CPA +化合物1（0.5 μM）（左下）;またはCPA +化合物12k（0.1 μM）（右下）。
【０１６４】
43A -43Bは、特定のNUAK1およびHGK阻害剤の完全な用量反応曲線を示しています。データは、ビヒクル対照±SEMに正規化されたCPA +試験化合物で処理された野生型運動ニューロンの平均である。n = 96ウェルプレートから3つの複製ウェル。
【０１６５】
【図４３Ａ】図４３Ａは、ＮＵＡＫ１阻害剤ＨＴＨ−０１−０１５およびＷＺ４００３の８点希釈曲線を示す。化合物の固有の毒性を示すために、CPAを含まない手段が含まれています。
【０１６６】
【図４３Ｂ】図４３Ｂは、ＨＧＫ阻害剤ＵＲＭＣ−０９９（化合物１）、ＰＦ−６２６０９３３、およびＧＮＥ−４９５の８点希釈曲線を示す。
【０１６７】
【図４４】図４４は、化合物１２ｋがミクログリアサイトカイン放出を抑制する能力を維持することを示している。ミクログリアN9細胞は、LPS +化合物1、12k、または12eの濃度を上げながら処理しました。 TNFα放出は、細胞培養培地からの定量的ELISAによって測定されました。化合物1は、LPSのすべての濃度にわたって0.1μMでTNFα放出の有意な阻害を示しました。このアッセイでは、化合物12kは化合物1よりも約5倍効力が低かったが、それでもTNFα放出の抑制に成功した。HGKを強く阻害するが、MLK3でほとんど活性を持たない化合物12eは、LPSの最高濃度を除いて、0.5 μMでTNFα放出を阻害しませんでした。これは、TNFα放出の阻害がHGK阻害ではなく、他の阻害に関連している可能性があることを示唆しています。MLK3などのキナーゼ。データは平均±SEMです。 n = 96ウェルプレートの2つの複製ウェル。化合物1アナログとLPS濃度の全体的な効果を、双方向ANOVAで比較しました（化合物1アナログ、LPS濃度、および相互作用の有意な効果、すべてP<0.0001）。異なるLPS濃度対LPS単独（ビヒクル、灰色のバー）での個々の化合物1類似体の効果は、ボンフェローニ多重比較検定によって評価されました。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、**** P <0.0001。
【０１６８】
【図４５】図４５は、化合物１２ｋの標的関与のマーカーを示す。
【０１６９】
【図４６Ａ】図４６Ａは、化合物１２ｋを与えられたマウス対対照における体重変化を示す。
【０１７０】
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、化合物１２ｋを与えられたマウス対対照における握力の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７１】
発明の詳細な説明
本発明において、化合物１の新しい類似体が提供される。特定の類似体は、毒性の小胞体ストレスの良好な阻害効力を維持しながら、ミクロソームの安定性と溶解性を改善しています。したがって、本発明の一実施形態は、式（Ｉ）による化合物である。
【化２０】
2021518856.tif 000022
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化２１】
2021518856.tif 000023
ではないという条件付きで。
【０１７２】
この実施形態の一態様では、化合物は、式（ＩＩ）の構造を有する：
【化２２】
2021518856.tif 000024
ここで：
R1aおよびR1bは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、C5-6ヘテロシクロアルキルを形成します。C5-6ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換されます。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化２３】
2021518856.tif 000025
ではないという条件付きで。
【０１７３】
この実施形態の別の態様では、化合物は、以下からなる群から選択される：
【化２４】
2021518856.tif 000026
【化２５】
2021518856.tif 000027
【化２６】
2021518856.tif 000028
【化２７】
2021518856.tif 000029
【化２８】
2021518856.tif 000030
およびそれらの組み合わせ、
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０１７４】
好ましくは、化合物は、以下からなる群から選択される：
【化２９】
2021518856.tif 000031
およびそれらの組み合わせ、またはＮ−オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０１７５】
より好ましくは、化合物は以下の通りである。
【化３０】
2021518856.tif 000032
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０１７６】
より好ましくは、化合物は以下の通りである。
【化３１】
2021518856.tif 000033
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０１７７】
より好ましくは、化合物は以下の通りである。
【化３２】
2021518856.tif 000034
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０１７８】
より好ましくは、化合物は以下の通りである。
【化３３】
2021518856.tif 000035
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０１７９】
本発明の別の実施形態は、医薬組成物である。この医薬組成物は、医薬的に許容される担体または希釈剤、および式（Ｉ）による１つまたは複数の化合物を含む：
【化３４】
2021518856.tif 000036
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化３５】
2021518856.tif 000037
ではないという条件付きで。
【０１８０】
本発明の医薬組成物で使用される適切かつ好ましい化合物は、上記でも同定された特定の化合物を含めて、式（Ｉ）■（ＩＩ）で上記に開示されている。
【０１８１】
本発明のさらなる実施形態はキットである。このキットは、本明細書に開示される化合物または医薬組成物を、それぞれ化合物または医薬組成物の使用説明書とともに含む。
【０１８２】
キットはまた、本発明の各化合物（例えば、医薬組成物の形態であり得る）のための適切な貯蔵容器、例えば、アンプル、バイアル、チューブなど、および他の試薬、例えば、対象への活性剤の投与に使用するための緩衝液、平衡塩類溶液など。本発明の化合物および／または医薬組成物および他の試薬は、例えば、溶液または粉末形態などの任意の便利な形態でキットに存在し得る。キットは、化合物および／または医薬組成物および他の任意の試薬を収容するための１つまたは複数の仕切りを任意選択で有する包装容器をさらに含み得る。
【０１８３】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、式（Ｉ）の構造を有する有効量の１つまたは複数の化合物を対象に投与することを含む。
【化３６】
2021518856.tif 000038
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化３７】
2021518856.tif 000039
ではないという条件付きで。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療する」、「治療」およびそれらの文法的変形という用語は、生理学的応答を得ることが望まれるプロトコル、レジメン、プロセスまたは治療に個人を服従させることを意味する。その被験者、例えば患者の転帰。特に、本発明の方法および組成物は、疾患症状の発症を遅らせるか、または疾患または状態の発症を遅らせるか、または疾患発症の進行を停止させるために使用され得る。しかしながら、すべての治療対象が特定の治療プロトコル、レジメン、プロセスまたは治療に応答しない可能性があるため、治療は、すべての対象または対象集団、例えば、患者集団において所望の生理学的応答または結果が達成されることを必要としない。したがって、所与の対象または対象集団、例えば、患者集団は、治療に応答しないか、または不十分に応答する可能性がある。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「改善する」、「改善する」およびそれらの文法的変形という用語は、対象における疾患の症状の重症度を低下させることを意味する。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、経口投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病変内、鼻腔内または皮下投与、または徐放性デバイスの移植、例えば、被験者へのミニ浸透圧ポンプ。投与は、非経口的および経粘膜的（例えば、経口、経鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路による。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が含まれる。他の送達様式には、リポソーム製剤、静■■脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。ヒトに加えて、本発明の範囲内の哺乳動物のカテゴリーには、例えば、農業動物、獣医動物、実験動物などが含まれる。農業動物のいくつかの例には、牛、豚、馬、山羊などが含まれる。獣医動物には、犬、猫などが含まれます。実験動物の例には、霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなどが含まれます。
【０１８８】
この方法で使用するのに適した好ましい化合物および医薬組成物は、上記で同定された特定の化合物を含む、式（Ｉ）■（ＩＩ）で上記に開示された通りである。
【０１８９】
特定の実施形態において、障害は、小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う疾患である。
【０１９０】
特定の実施形態において、障害は、対象における異常なキナーゼレベルを特徴とする疾患である。本発明による対象における異常なキナーゼレベルを特徴とする疾患の非限定的な例には、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性白血病、急性巨核芽球性白血病、小児期が含まれる。白血病、家族性慢性リンパ性白血病、左右軸奇形、悪性黒色腫、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、肝がん、精巣がん、胃がん、胃腸がん、神経膠腫、甲状腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、大細胞リンパ腫、軟部組織肉腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、遺伝性出血性毛細血管拡張症2型（オスラー-レンデュ-ウェーバー症候群2）、腸出血、動脈性高血圧、動静脈奇形、線維性奇形ossificans progressiva、骨格奇形、骨格外骨形成、中毒、hy緊張、心筋梗塞、アクロメソメリック異形成、運動失調、毛細血管拡張症、セケル症候群、心不全、若年性ポリポーシス症候群、A2型短指症（手の奇形）、アクロメソメリック軟骨異形成（骨奇形）、外性生殖器異常、原発性肺高血圧症（原発性肺高血圧症）、若年性正中線癌、X連鎖無ガンマグロブリン血症、心不整脈、体細胞黒色腫、家族性黒色腫、肉腫、頭頸部扁平上皮癌、上皮性腫瘍、心臓肥大、レット症候群、X連鎖乳児痙攣症候群、Li-Fraumeni症候群、サーカディアン障害、乳管癌、乳腺過形成、コーンロッドジストロフィー（CORD）タイプ5、コーンロッドジストロフィー（CORD）タイプ6、リーバー先天性黒内障1型（LCA1）、てんかん、筋緊張症、筋肉消耗、白内障、性腺機能低下症、内分泌機能障害、男性のはげ、ダウン症候群（DS）、神経膠芽細胞腫、肝細胞癌、ファイファー症候群、カルマン症候群ndrome2、幹細胞白血病リンパ腫症候群（SCLL）、骨髄増殖性疾患、アペール症候群、ジャクソン-ワイス症候群、クルーゾン症候群、ベア-スティーブンソンキューティスジャイラタ症候群、軟骨無形成症、低慢性形成症、thanatophoric異形成、頭蓋骨癒合症アデレード型、サンディエゴ骨格異形成症候群、下垂体腺腫、骨髄異形成、毛細血管乳児血管腫、特発性骨髄線維症、神経芽細胞腫、腎癌、乳頭癌、高IgM症候群、色素性失禁、低汗性外胚葉異形成、関節リウマチ、関節リウマチ、軟骨無形成症、松果体過形成、多嚢胞高脂血症、leprechaunism、細菌誘発性マクロファージアポトーシス、発熱性細菌感染症、子宮平滑筋肉腫、移植後リンパ増殖性疾患、骨髄増殖性疾患（MPD）、多発性細菌性腫瘍、脳腫瘍、胃腸間質腫瘍（GIST）、肥満細胞症、piebaldism、T細胞白血病ウィリアムズ-ビュールn症候群、ポイツ・ジェガーズ症候群、全身性紅斑性ループス、常染色体優性血小板減少症、色素性網膜炎、遺伝性乳頭状腎癌、ミュラー管症候群II型、家族性肥大性心筋症、重力筋無力症、進行性難聴、多発性嚢胞腎、ユーイング腫瘍、非症候性30型（MRX30）、特発性高好酸球症候群、スピナビフィダ、ウォルコット-ラリソン症候群（WRS）、肝グリコーゲン症、肝肝硬変、造血器悪性腫瘍、カーニー複合腫瘍、心臓収縮性、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管合併症、自閉症脊髄小脳性運動失調14型、疼痛知覚、骨関節炎性軟骨、膀胱癌、鼻咽頭癌、未分化大細胞白血病、家族性髄質甲状腺癌（FMTC）、多発性内分泌腺腫症IIA型（MEN2A）、MEN2B、褐色細胞腫、乳頭状甲状腺癌、ヒシュシュプル2小口病、HPC1、血液共同凝集、アンギナ、腎腫瘍細胞腫、肺腺腫、優性短指症B型、劣性ロビノウ症候群（RRS）、コフィン・ローリー症候群、CNS腫瘍、ロイス-ディーツ症候群、食道癌、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（HNPCC、リンチ症候群）、マルファン症候群II型症候群、静脈奇形、星状細胞腫、肥大性および拡張性心筋症、脛骨筋ジストロフィー、無汗症、偽性低アルドステロン症II型、および慢性関節炎。
【０１９１】
この実施形態の一態様では、障害には、外傷性脳損傷、脳卒中、虚血、双極性障害、心臓病、アテローム性動脈硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、癌、自己免疫が含まれ得るが、これらに限定されない。病気、および神経変性疾患。
【０１９２】
この実施形態の一態様では、障害は神経変性疾患である。本発明による神経変性疾患の非限定的な例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症、ハンチントン病、伝染性海綿状脳症、シャルコットマリートゥース病、レビー小体型認知症が含まれる。変性、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症（CTE）、ポリグルタミン病、プリオン病、緑内障、および遺伝性痙性麻痺。
【０１９３】
特定の実施形態では、障害は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
【０１９４】
この実施形態の別の局面において、方法は、本発明の１つ以上の化合物または医薬組成物と共に、有効量の１つ以上の５などの追加の治療薬を対象に同時投与することをさらに含む。ヒドロキシトリプトファン、アクチバーゼ、AFQ056（Novartis Corp.、ニューヨーク、ニューヨーク）、アグラスタット、アルベンダゾール、α-リポ酸/ L-アセチルカルニチン、アルテプラーゼ、アマンタジン（シンメトレル）、アムロジピン、アンクロド、アポモルヒネ（アポキン）、アリモクロモール、アリクストラ、アルモダフィニル、アスコルビン酸、アスクリプトイン、アスピリン、アテノロール、アボネックス、バクロフェン（リオレサル）、バンゼル、ベンズトロピン（コゲンチン）、ベタセロン、BGG492（ノバルティス社、ニューヨーク、ニューヨーク）、ボツリヌス毒素、バファリン、カルバトロール（登録商標）、カルビドパ/レボドパ即時放出（シネメット）、カルビドパ/レボドパ経口崩壊（パルコパ）、カルビドパ/レボドパ/エンタカポン（スタレボ）、CERE-110：NGFのアデノ関連ウイルス送達（セレジーン、サンディエゴ、カリフォルニア州）、セレブロリシン、CinnoVex、シタロプラム、シチコリン、クロバザム、クロナゼパム、クロピドグレル、クロザピン（クロザリル）、コエンザイムQ、クレアチン、ダビガトラン、ダルテパリン、ダプソン、ダブネチド、デフェリプロン、デパケン（登録商標）、デパコートER（登録商標）、デパコート（登録商標）、デスモテプラーゼ、ダイアスタット、ジアゼパム、ジゴキシン、ジランチン（登録商標）、ディメボン）、ドネペジル（アリセプト）、EGb761、エルデプリル、ELND002（エランファーマシューティカルズ、ダブリン、アイルランド）、エナラプリル、エノキサパリン、エンタカポン（コンタン）、エポエチンアルファ、エプチフィバチド、エリスロポイエチン、エシタロプラム、エスリカルバゼピンアセテート、エスモル（MiraxionTM）、Exenatide、Extavia、Ezogabine、Felbamate、Felbatol（登録商標）、Fingolimod（Gilenya）、fluoxetine（Prozac）、fondaparinux、Fragmin、Frisium、Gabapentin、Gabitril（登録商標）、Galantamine、Glatiramer（Copaxone）、haloper、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、イデベノン、イノベロン（登録商標）、インスリン、インターフェロンベータ1a、インターフェロンベータ1b、イオフルパン123I（DATSCAN（登録商標））、IPX066（ImpaxLaboratories Inc.、ヘイワード、カリフォルニア州）、JNJ-26489112（ジョンソンおよびジョンソン、ニューブランズウィック、NJ）、Keppra（登録商標）、クロノピン、ラコサミド、LAlphaグリセリルホスホリルコリン、Lamictal（登録商標）、ラモトリジン、レベチラセタム、リラグルチド、リシノプリル、炭酸リチウム、ロプレッサー、ロラゼパム、ロサルタン、ラブノックス、LuAA24493、ルミナール、LY450139（エリリリー、インディアナポリス、インディアナ）、リリカ、マシチニブ酒石酸メトプロロール、ミニトラン、ミノサイクリン、ミルタザピン、ミトキサントロン（ノバントロン）、ミソリン（登録商標）、ナタリズマブ（タイサブリ）、ニューロンチン（登録商標）、ナイアシンアミド、ニトロビッド、ニトロデュア、ニトログリセリン、ニトロリンガル、ニトロミスト、ニトロスタット、ニトロタイム、ノレ）、カルバマゼピン、オクトレオチド、Onfi（登録商標）���オキシカルバゼピン、オキシブチニンクロリド、PF-04360365（ファイザー、ニューヨーク、ニューヨーク）、フェノバルビタール、フェニテック（登録商標）、フェニトイン、ピクロゾタン、ピオグリタゾン、プラビックス、ポチガ、プラミペキソール（ミラペックス）、プラムプリミドン、プリニビル、プロベネシド、プロプラノロール、PRX-00023（EPIXPharmaceuticals Inc。）、PXT3003、キナクリン、ラメルテオン、ラサギリン（アジレクト）、レビフ、レシゲン、レマセミド、レスベラトロール、レタバセ、レテプラーゼ、リルゾール（リシノプリル）e（Exelon）、Ropinirole（Requip）、Rotigotine（Neupro）、Rufinamide、Sabril、safinamide（EMDSerono、Rockland、MA）、Salagen、Sarafem、Selegiline（l-deprenyl、Eldepryl）、SEN0014196（SienaBiotech、Siena、Italy ）、セルトラリン（ゾロフト）、シンバスタチン、ニトロプルシエートナトリウム（NPS）、フェニル酪酸ナトリウム、スタンバック頭痛パウダー、タクリン（コグネックス）、タモキシフェン、タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）、テグレトール（登録商標）、テネクテプラーゼ、テノルミン、テトラベナジン（キセナジン）、THR（ThrombotechLtd。）、ティアガビン、チデグルシブ、チロフィバン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、チザニジン（ザナフレックス）、TNKase、トルカポン（タスマール）、トルテロジン、トパマックス（登録商標）、トピラメート、トリヘキシフェニジル（旧アルタン）、トリレプタル（登録商標）、酸、バルサルタン、バレニクリン（ファイザー）、ビンパット、ビタミンE、ワルファリン、ザロンチン（登録商標）、ゼストリル、ゾーングラン（登録商標）、ゾニサミド、ジディスセレギリンHCL経口崩壊（ゼラパー）、およびそれらの組み合わせ。
【０１９５】
例えば、アルツハイマー病の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、および例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：ドネペジル（アリセプト））、リバスチグミン（Exelon）、ガランタミン（Razadyne）、タクリン（Cognex）、メマンチン（Namenda）、ビタミンE、CERE-110：NGF（Ceregene）のアデノ関連ウイルス送達、LY450139（EliLilly）、エクセナチド、バレニクリン（ Pfizer）、PF-04360365（Pfizer）、Resveratrol、およびDonepezil（EisaiKorea）。
【０１９６】
パーキンソン病の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば、以下のうちの１つまたは複数を投与され得る：カルビドパ／レボドパ即時放出。（Sinemet）、Carbidopa / levodopa経口崩壊（Parcopa）、Carbidopa /levodopa / Entacapone（Stalevo）、Ropinirole（Requip）、Pramipexole（Mirapex）、Rotigotine（Neupro）、Apomorphine（Apokyn）、Selegiline（l-deprenyl、Eldepr）、ラサギリン（Azilect）、ZydisセレギリンHCL経口崩壊（Zelapar）、エンタカポン（Comtan）、トルカポン（Tasmar）、アマンタジン（Symmetrel）、トリヘキシフェニジル（旧Artane）、ベンゾトロピン（Cogentin）、IPX066（ImpaxLaborator （Teva Neuroscience、Inc。）、ioflupane 123I（DATSCAN(R)）、safinamide（EMDSerono）、およびPioglitazone。
【０１９７】
筋萎縮性側索硬化症の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：リルゾール（リルテック）、炭酸リチウム、アリモクロモール、クレアチン、タモキシフェン、メコバラミン、メマンチン（Ebixa）、およびタウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）。
【０１９８】
フリードライヒ運動失調症の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：イデベノン、コエンザイムＱ、５ -ヒドロキシトリプトファン、プロプラノロール、エナラプリル、リシノプリル、ジゴキシン、エリスロポイエチン、Lu AA24493、デフェリプロン、バレニクリン、IVIG、ピオグリタゾン、およびEGb761。
【０１９９】
多発性硬化症の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：アボネックス、ベータセロン、エクスタビア、 Rebif、Glatiramer（Copaxone）、Fingolimod（Gilenya）、Natalizumab（Tysabri）、Mitoxantrone（Novantrone）、baclofen（Lioresal）、tizanidine（Zanaflex）、methylprednisolone、CinnoVex、ReciGen、Masitinib、Prednisone、InterferonおよびELND002（ElanPharmaceuticals）。
【０２００】
ハンチントン病の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：テトラベナジン（キセナジン）、ハロペリドール（ハロペリドール）、クロザピン（クロザリル）、クロナゼパム（クロノピン）、ジアゼパム（バリウム）、エスシタロプラム（レクサプロ）、フルオキセチン（プロザック、サラフェム）、セルトラリン（ゾロフト）、バルプロ酸（デパケン）、ジバルプロエクス（デパコート）、）、Dimebon、AFQ056（Novartis）、Ethyl-EPA（MiraxionTM）、SEN0014196（SienaBiotech）、フェニル酪酸ナトリウム、シタロプラム、ウルソジオール、ミノサイクリン、レマセミド、およびミルタザピン。
【０２０１】
伝染性海綿状脳症の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、例えば、キナクリンを投与され得る。
【０２０２】
シャルコー・マリー・トゥース病の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、および例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：アスコルビン酸およびPXT3003。
【０２０３】
レビー小体型認知症の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、および例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：アリセプト、ガランタミン、メマンチン、アルモダフィニル、ドネペジル、ラメルテオン。
【０２０４】
大脳皮質基底核変性症の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：ダブネチドおよびコエンザイムＱ１０。
【０２０５】
進行性核上性麻痺の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば、以下の１つまたは複数を投与され得る：チデグルシブ、ラサギリン、アルファ。 -リポ酸/ L-アセチルカルニチン、リルゾール、ナイアシンアミド、およびリバスチグミン。
【０２０６】
遺伝性痙性対麻痺の影響を治療または改善するために、対象は、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば、バクロフェン、チザニジン、オキシブチニンのうちの１つまたは複数を投与され得る。塩化物、トルテロジン、およびボツリヌス毒素。
【０２０７】
本発明において、１つ以上の化合物または医薬組成物は、最も適切であると考えられるように、それを必要とする対象に、同じ組成物で、同時に別個の組成物で、または異なる時間に投与される別個の組成物として一緒に同時投与され得る。医師による。
【０２０８】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、医薬的に許容される担体または希釈剤と、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物とを含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【化３８】
2021518856.tif 000040
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化３９】
2021518856.tif 000041
ではないという条件付きで。
【０２０９】
この方法で使用するのに適した好ましい医薬組成物は、上記で特定された特定の化合物を含む医薬組成物を含む、式（Ｉ）■（ＩＩ）で上記に開示された通りである。この方法に従って治療され得る適切で好ましい対象は、上記に開示された通りである。この実施形態では、この方法は、小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う疾患および対象における異常なキナーゼレベルを特徴とする疾患を含む、上記の障害を治療するために使用され得る。
【０２１０】
この実施形態の別の態様では、この方法は、本明細書に開示される有効量の１つまたは複数の追加の治療薬を対象に同時投与することをさらに含む。
【０２１１】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含み、これは、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物を含む：
【化４０】
2021518856.tif 000042
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化４１】
2021518856.tif 000043
ではないという条件付きで。
【０２１２】
本明細書で使用される場合、「小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性」は、適切なＥＲ機能を妨害することができる多くの生理学的および病理学的状態、ならびにシクロピアゾン酸（ＣＰＡ）などの様々な薬剤を意味する。そしてそれによって小胞体ストレスを引き起こし、それはタンパク質の折り畳みをひどく損ない、したがってタンパク質毒性のリスクをもたらします。小胞体ストレスのアッセイは、本明細書、例えば、実施例のセクションに開示されている通りである。
【０２１３】
この方法で使用するのに適した好ましい化合物は、上記で同定された特定の化合物を含む、式（Ｉ）■（ＩＩ）で上記に開示された通りである。この方法に従って治療され得る適切で好ましい対象は、上記に開示された通りである。この実施形態では、この方法は、神経変性疾患を含む、上記の障害を治療するために使用することができる。
【０２１４】
この実施形態の別の態様では、この方法は、本明細書に開示される有効量の１つまたは複数の追加の治療薬を対象に同時投与することをさらに含む。
【０２１５】
本明細書で使用される場合、「抑制」、「抑制」およびそれらの文法的変化という用語は、毒性小胞体ストレスの発生を減少または減少させるなど、変化することを意味する。この実施形態では、「接触する」とは、化合物および任意選択で１つまたは複数の追加の治療薬を、そのような調節を必要とする細胞に近接させることを意味する。これは、対象への薬物送達の従来の技術を使用して、またはインビトロの状況において、例えば、細胞が位置する培養培地に化合物および任意選択で他の治療薬を提供することによって達成することができる。
【０２１６】
この実施形態の一態様では、対象は哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物は、ヒト、獣医動物、および農業動物からなる群から選択される。より好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２１７】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善する方法である。この方法は、有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含み、これは、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物を含む：
【化４２】
2021518856.tif 000044
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化４３】
2021518856.tif 000045
ではないという条件付きで。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、「軸索変性」は、神経回路の機能的接続を破壊する特徴的な事象を意味し、脳卒中、緑内障、および運動神経障害を含む多くの神経変性状態における重要な特徴である。
【０２１９】
この方法で使用するのに適した好ましい化合物は、上記で同定された特定の化合物を含む、式（Ｉ）■（ＩＩ）で上記に開示された通りである。この方法に従って治療され得る適切で好ましい対象は、上記に開示された通りである。この実施形態では、これらの方法を使用して、上記の障害を治療することができる。
【０２２０】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、式（Ｉ）の構造を有する有効量の１つまたは複数の化合物を対象に投与することを含む。
【化４４】
2021518856.tif 000046
ここで：
R1は、アルキル-ヘテロシクロアルキルまたはアルキル-ヘテロビシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の原子または基で任意選択で置換されている。
R2は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、これらのいずれも、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、から選択される1つまたは複数の原子または基で任意に置換される。シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル-ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、または尿素;
またはN-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩、
化合物が
【化４５】
2021518856.tif 000047
ではないという条件付きで。
【０２２１】
この方法で使用するのに適した好ましい化合物は、上記で同定された特定の化合物を含む、式（Ｉ）■（ＩＩ）で上記に開示された通りである。この実施形態では、この方法を使用して、上記の障害を治療することができる。
【０２２２】
適切で好ましい対象は、本明細書に開示される通りである。この実施形態では、これらの方法を使用して、上記の神経変性障害を治療することができる。
【０２２３】
この実施形態の一態様では、この方法は、本明細書に開示される有効量の１つまたは複数の治療薬を対象に同時投与することをさらに含む。
【０２２４】
本発明の追加の実施形態は、以下の構造を有する化合物である。
【化４６】
2021518856.tif 000048
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２２５】
本発明の追加の実施形態は、以下の構造を有する化合物である。
【化４７】
2021518856.tif 000049
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２２６】
本発明の追加の実施形態は、以下の構造を有する化合物である。
【化４８】
2021518856.tif 000050
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２２７】
本発明の追加の実施形態は、以下の構造を有する化合物である。
【化４９】
2021518856.tif 000051
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２２８】
本発明の追加の実施形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤と、以下の構造を有する化合物とを含む医薬組成物である。
【化５０】
2021518856.tif 000052
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２２９】
本発明の追加の実施形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤と、以下の構造を有する化合物とを含む医薬組成物である。
【化５１】
2021518856.tif 000053
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３０】
本発明の追加の実施形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤と、以下の構造を有する化合物とを含む医薬組成物である。
【化５２】
2021518856.tif 000054
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３１】
本発明の追加の実施形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤と、以下の構造を有する化合物とを含む医薬組成物である。
【化５３】
2021518856.tif 000055
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３２】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【化５４】
2021518856.tif 000056
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３３】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【化５５】
2021518856.tif 000057
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３４】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【化５６】
2021518856.tif 000058
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３５】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における障害の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【化５７】
2021518856.tif 000059
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３６】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【化５８】
2021518856.tif 000060
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３７】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【化５９】
2021518856.tif 000061
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３８】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【化６０】
2021518856.tif 000062
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２３９】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【化６１】
2021518856.tif 000063
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４０】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を含む疾患の影響を治療または改善する方法である。この方法は、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【化６２】
2021518856.tif 000064
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４１】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善する方法である。この方法は、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【化６３】
2021518856.tif 000065
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４２】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善する方法である。この方法は、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【化６４】
2021518856.tif 000066
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４３】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の影響を治療または改善する方法である。この方法は、以下の構造を有する化合物を含む有効量のキナーゼ阻害剤を対象に投与することを含む。
【化６５】
2021518856.tif 000067
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４４】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【化６６】
2021518856.tif 000068
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４５】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【化６７】
2021518856.tif 000069
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４６】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【化６８】
2021518856.tif 000070
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４７】
本発明の追加の実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の影響を治療または改善するための方法である。この方法は、以下の構造を有する有効量の化合物を対象に投与することを含む。
【化６９】
2021518856.tif 000071
または、N-オキシド、結晶形、水和物、またはそれらの薬学的に許容される塩。
【０２４８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、本明細書で定義されるように薬学的に許容され、そして所望の薬理学的活性を有する本発明の化合物の塩を意味する。このような塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成される酸付加塩が含まれる。または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸などの有機酸、安息香酸、o-（4-ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-クロロベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、4-メチルビシクロ[2.2.2]オクト-2-エン-1-カルボン酸、グルコヘプトン酸、4,4'-メチレンビス（3-ヒドロキシ-2-エン-1-カルボン酸）、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸など。薬学的に許容される塩には、存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応することができるときに形成され得る塩基付加塩も含まれる。許容される無機塩基には、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウムおよび水酸化カルシウムが含まれる。許容される有機塩基には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどが含まれる。
【０２４９】
本発明において、化合物または医薬組成物の「有効量」または「治療有効量」は、投与されたときに本明細書に記載されるような有益なまたは所望の結果に影響を与えるのに十分なそのような化合物または組成物の量である。件名。有効な剤形、投与様式、および投与量は、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは、当業者の技術の範囲内である。投与量は、投与経路、排泄速度、治療期間、投与されている他の薬物の同一性、年齢、サイズ、および種によって変化することが当業者には理解されている。主題、および例えば医学および獣医学の分野でよく知られている同様の要因。一般に、本発明による化合物または医薬組成物の適切な用量は、その量の化合物または組成物であり、これは、副作用がないかまたは最小限である所望の効果を生み出すのに有効な最低用量である。本発明による化合物または医薬組成物の有効用量は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のサブ用量として投与され得、一日を通して適切な間隔で別々に投与され得る。
【０２５０】
本発明による化合物または医薬組成物またはそのような化合物を含む組成物の投与量の適切な非限定的な例は、約１ｎｇ／ ｋｇから約１０００ｍｇ ／ ｋｇ、例えば、約１ｎｇ ／ ｋｇである。約５ｍｇ ／ ｋｇから約５０ｍｇ ／ ｋｇを含む、１ｍｇ ／ ｋｇから約１００ｍｇ ／ｋｇ。本発明の化合物または医薬組成物の他の代表的な投与量には、約１ｍｇ ／ ｋｇ、５ｍｇ ／ ｋｇ、１０ｍｇ ／ ｋｇ、１５ｍｇ ／ ｋｇ、２０ｍｇ ／ ｋｇ、２５ｍｇ／ ｋｇ、３０ｍｇ ／ ｋｇが含まれる。 、35 mg / kg、40 mg / kg、45 mg / kg、50 mg /kg、60 mg / kg、70 mg / kg、80 mg / kg、90 mg / kg、100 mg / kg、125 mg / kg 、150 mg/ kg、175 mg / kg、200 mg / kg、250 mg / kg、300 mg / kg、400 mg / kg、500 mg / kg、600mg / kg、700 mg / kg、800 mg / kg 、900 mg / kg、または1000 mg / kg。
【０２５１】
本発明の化合物または医薬組成物は、任意の所望の効果的な方法で投与することができる：経口摂取のために、または眼への局所投与のための軟膏または滴として、またはそのような任意の適切な方法での非経口または他の投与のために。腹腔内、皮下、局所、皮内、吸入、肺内、直腸、膣、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、髄腔内、またはリンパ内として。さらに、本発明の化合物または医薬組成物は、他の治療と組み合わせて投与することができる。本発明の化合物または医薬組成物は、必要に応じて、カプセル化するか、そうでなければ胃または他の分泌物から保護することができる。
【０２５２】
本発明の医薬組成物は、薬学的に受容可能であり、１つ以上の薬学的に受容可能な担体または希釈剤、および任意選択で、１つ以上の他の化合物、薬物、成分および／または材料と混合した１つ以上の活性成分を含む。選択された投与経路に関係なく、本発明の化合物／医薬組成物は、当業者に知られている従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に処方される。たとえば、Remington、The Science and Practice of Pharmacy（21st Edition、LippincottWilliams and Wilkins、Philadelphia、PA）を参照してください。より一般的には、「薬学的に許容される」とは、一般に安全で毒性がなく、生物学的にも他の方法でも望ましくない組成物を調製するのに有用であり、獣医学的使用ならびにヒトの製薬的使用に許容されるものを含むことを意味する。
【０２５３】
薬学的に許容される担体および希釈剤は、当技術分野で周知であり（例えば、レミントン、薬局の科学および実践（第２１版、リッピンコットウィリアムズおよびウィルキンス、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）および国立フォーミュラリー（アメリカ製薬協会、ワシントンDC））であり、糖（例、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール）、デンプン、セルロース製剤、リン酸カルシウム（例、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例えば、生理食塩水、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、乳酸加リンゲル注射）、アルコール（例えば、エチルアルコール、プロピルアルコール、およびベンジルアルコール）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール）、有機エステル（例、オレイン酸エチルおよびトリグリセリド）、生分解性ポリマー（例、ポリラクチド-ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（無水物））、エラストマーマトリックスes、リポソーム、ミクロスフェア、油（例えば、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ油、ゴマ、綿実、および落花生）、カカオバター、ワックス（例えば、坐剤ワックス）、パラフィン、シリコーン、タルク、シリチル酸塩など。本発明の組成物に使用される担体または希釈剤は、製剤の他の成分と適合性があり、対象に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。選択された剤形および意図される投与経路に適した担体または希釈剤は当技術分野で周知であり、選択された剤形および投与方法に許容される担体または希釈剤は、当業者を使用して決定することができる。
【０２５４】
本発明の医薬組成物は、任意選択で、そのような組成物で一般的に使用される追加の成分および／または材料を含み得る。これらの成分および材料は当技術分野で周知であり、（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤。（2）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびアカシアなどの結合剤。（3）グリセロールなどの保湿剤。 （4）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、澱粉グリコレートナトリウム、架橋炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなどの崩壊剤。（5）パラフィンなどの溶液遅延剤。 （6）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤。 （7）セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤。 （8）カオリンやベントナイト粘土などの吸収剤。（9）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤。 （10）エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタヒドロキシアルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントなどの懸濁剤。（11）緩衝剤; （12）乳糖、乳糖、ポリエチレングリコール、動植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、ココアバター、デンプン、トラガカンス、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、サリチル酸塩などの賦形剤、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末。（13）水または他の溶媒などの不活性希釈剤。 （14）防腐剤; （15）界面活性剤; （16）分散剤; （17）ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、生分解性ポリマー、リポソーム、ミクロスフェア、モノステレートアルミニウム、ゼラチン、およびワックスなどの制御放出または吸収遅延剤。（18）不透明剤; （19）アジュバント; （20）湿潤剤; （21）乳化剤および懸濁剤; （22）、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル。（23）クロロフルオロ炭化水素などの推進剤、およびブタンやプロパンなどの揮発性非置換炭化水素。 （24）酸化防止剤; （25）糖や塩化ナトリウムなど、目的のレシピエントの血液と製剤を等張にする薬剤。（26）増粘剤; （27）レシチンなどのコーティング材料。 （28）甘味料、香料、着色料、香料および防腐剤。そのような各成分または材料は、製剤の他の成分と適合性があり、対象に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。選択された剤形および意図された投与経路に適した成分および材料は当技術分野で周知であり、選択された剤形および投与方法に許容される成分および材料は、当業者を使用して決定することができる。
【０２５５】
経口投与に適した化合物または医薬組成物は、カプセル、カシェ、ピル、錠剤、粉末、顆粒、水性または非水性液体中の溶液または懸濁液、水中油または油中水型液体エマルジョン、エリキシルまたはシロップ、トローチ、ボーラス、エレクトリックまたはペースト。これらの製剤は、当技術分野で知られている方法によって、例えば、従来のパンコーティング、混合、造粒または凍結乾燥プロセスによって調製することができる。
【０２５６】
経口投与用の固体剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末、顆粒など）は、例えば、有効成分を１つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤と混合することによって調製することができる。、任意選択で、１つまたは複数の充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶液遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、潤滑剤、および／または着色剤。同様のタイプの固体組成物は、適切な賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用することができる。錠剤は、任意選択で１つまたは複数の付属成分を用いて、圧縮または成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、適切な結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤、界面活性剤または分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤、および糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒などの他の固形剤形は、任意選択で、腸溶コーティングおよび医薬製剤分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルでスコアリングまたは調製することができる。それらはまた、その中の有効成分の徐放または制御放出を提供するように処方され得る。それらは、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって滅菌することができる。これらの組成物はまた、任意選択で乳白剤を含み得、そしてそれらが有効成分のみを放出するか、または優先的に、胃腸管の特定の部分において、任意選択で遅延的に放出するような組成物であり得る。有効成分はまた、マイクロカプセル化された形態であり得る。
【０２５７】
経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳濁液、マイクロ乳濁液、溶液、懸濁液、シロップおよび秘薬が含まれる。液体剤形は、当技術分野で一般的に使用される適切な不活性希釈剤を含み得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味料、着色剤、芳香剤および防腐剤などの補助剤を含み得る。懸濁液には、懸濁剤が含まれている場合があります。
【０２５８】
直腸または膣投与用の組成物は、坐剤として提示することができ、これは、１つまたは複数の有効成分を、室温では固体であるが体温では液体である１つまたは複数の適切な非刺激性担体と混合することによって調製することができる。したがって、直腸または膣腔で溶けて、活性化合物を放出します。膣内投与に適した組成物には、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、または当技術分野で適切であることが知られているような薬学的に許容される担体を含むスプレー製剤も含まれる。
【０２５９】
局所または経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、滴および吸入剤が含まれる。活性剤／化合物は、無菌条件下で、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と混合することができる。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、賦形剤を含み得る。粉末およびスプレーには、賦形剤および噴射剤が含まれている場合があります。
【０２６０】
非経口投与に適した組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される滅菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、または滅菌粉末と組み合わせた１つまたは複数の薬剤／化合物を含む。使用直前に無菌の注射可能な溶液または分散液に再構成します。これには、適切な抗酸化剤、緩衝液、目的のレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤または増粘剤が含まれる場合があります。適切な流動性は、例えば、コーティング材料の使用、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。これらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの適切な補助剤を含み得る。等張剤を含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な剤形の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらされ得る。
【０２６１】
場合によっては、薬物（例えば、医薬製剤）の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からのその吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶性またはアモルファス材料の液体懸濁液を使用することによって達成することができる。
【０２６２】
次に、活性剤／薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは、次に、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬剤／薬物の遅延吸収は、活性剤／薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成され得る。注射可能なデポー形態は、生分解性ポリマーにおいて有効成分のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製され得る。ポリマーに対する有効成分の比率、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、有効成分の放出速度を制御することができる。デポ注射用製剤はまた、体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封入することによって調製される。注射可能な材料は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することによって滅菌することができる。
【０２６３】
製剤は、単位用量または複数用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提示することができ、滅菌液体担体または希釈剤、例えば、水を添加することのみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。使用直前の注射。即時注射溶液および懸濁液は、上記のタイプの滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【０２６４】
前述の実施形態では、以下の定義が適用される。
【０２６５】
本明細書で使用される「脂肪族」という用語は、芳香環を含まない炭素および水素から構成される基を指す。したがって、脂肪族基には、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびカルボシクリル基が含まれる。さらに、特に明記しない限り、「脂肪族」という用語は、「非置換脂肪族」および「置換脂肪族」の両方を含むことを意図し、後者は、脂肪族基の１つまたは複数の炭素上の水素を置換する置換基を有する脂肪族部分を指す。そのような置換基には、例えば、ハロゲン、重水素、ヒドロキシル、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシルなど）、チオカルボニル（チオエステル、チオ酢酸、またはチオギ酸など）が含まれ得る。）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、芳香族、またはヘテロ芳香族部分。
【０２６６】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基および分枝鎖アルキル基を含む、環構造を有さない飽和脂肪族基のラジカルを指す。特定の実施形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に６個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合はＣ１■Ｃ６、分岐鎖の場合はＣ３■Ｃ６）。このような置換基には、安定性が法外な場合を除いて、以下で説明するように、脂肪族基について考えられるすべてのものが含まれます。
【０２６７】
本明細書で使用される「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの二重結合を含む脂肪族基を指し、他に示されない限り、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含むことを意図し、後者は、アルケニル基の1つまたは複数の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルケニル部分。このような置換基には、安定性が法外な場合を除いて、以下で説明するように、脂肪族基について考えられるすべてのものが含まれます。例えば、１つ以上のアルキル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール基によるアルケニル基の置換が企図される。
【０２６８】
さらに、特に明記しない限り、本明細書、実施例、および特許請求の範囲全体で使用される「アルキル」という用語は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含むことを意図し、後者は、置換基を置換するアルキル部分を指す。炭化水素骨格の1つまたは複数の炭素上の水素。実際、特に明記しない限り、本明細書に列挙されるすべての基は、置換および非置換の両方の選択肢を含むことを意図している。
【０２６９】
「Ｃｘ−ｙ」という用語は、アルキルおよびシクロアルキルなどの化学部分と組み合わせて使用■■される場合、鎖中にｘからｙの炭素を含む基を含むことを意味する。例えば、「Ｃｘ−γアルキル」という用語は、トリフルオロメチルおよび２などのハロアルキル基を含む、鎖中にｘからｙの炭素を含む直鎖アルキルおよび分枝鎖アルキル基を含む、置換または非置換飽和炭化水素基を指す。 2,2-チフルオロエチルなど
【０２７０】
本明細書で使用される「アリール」という用語は、環の各原子が炭素である置換または非置換の単一環芳香族基を含む。好ましくは、環は３から８員環であり、より好ましくは６員環である。「アリール」という用語はまた、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通であり、環の少なくとも１つが芳香族である２つ以上の環状環を有する多環式環系を含み、例えば、他の環状環は、シクロアルキル、シクロアルケニルであり得る。シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および/またはヘテロシクリル。アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが含まれる。
【０２７１】
「アルキル−アリール」という用語は、少なくとも１つのアリール基で置換されたアルキル基を指す。
【０２７２】
「アルキル−ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１つのヘテロアリール基で置換されたアルキル基を指す。
【０２７３】
「アルケニル−アリール」という用語は、少なくとも１つのアリール基で置換されたアルケニル基を指す。
【０２７４】
「アルケニル−ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１つのヘテロアリール基で置換されたアルケニル基を指す。
【０２７５】
本明細書で単独または組み合わせて使用■■される「アミノ」という用語は、−ＮＲＲ'を指し、ＲおよびＲ'は、水素、アルキル、アシル、ヘテロアルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキルから独立して選択される。それらのいずれか自体を任意選択で置換することができる。さらに、ＲとＲ'は結合してヘテロシクロアルキルを形成することができ、そのいずれかを任意に置換することができる。
【０２７６】
本明細書で単独または組み合わせて使用■■される「アミド」という用語は、−ＲｎＥ（Ｏ）ｘＮＲ'２を指し、ここで、ＲおよびＲ 'は、水素、アルキル、アシル、ヘテロアルキル、アリール、シクロアルキルから独立して選択される。ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキル、これらのいずれか自体を任意選択で置換することができる。例としては、カルボキサミド（n= 1、E = C、x = 1）、ホスホルアミド（n = 2、E = P、x = 1）、およびスルホンアミド（n = 1、E = S、x = 2）があります。
【０２７７】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用■■される「ベンゾ」および「ベンツ」という用語は、ベンゼンに由来する二価ラジカルＣ６Ｈ４＝を指す。例としては、ベンゾチオフェンやベンズイミダゾールがあります。
【０２７８】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「カルバメート」という用語は、窒素または酸末端のいずれかから親分子部分に結合し得るカルバミン酸のエステル（−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−）を指す。、およびこれは、本明細書で定義されるように任意選択で置換され得る。本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「Ｏ−カルバミル」という用語は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ '基を指す。そして、本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「Ｎ−カルバミル」という用語は、ＲＯＣ（Ｏ）ＮＲ'−基を指す。 ＲおよびＲ'は、本明細書で定義されている通り、または指定された具体的に列挙された「Ｒ」基によって定義されている通りである。
【０２７９】
本明細書で使用される「カルボニル」という用語は、単独でホルミル［−Ｃ（Ｏ）Ｈ］を含み、組み合わせて−Ｃ（Ｏ）−基である場合。
【０２８０】
本明細書で使用される「カルボキシル」または「カルボキシ」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨまたは対応する「カルボン酸」アニオン、例えば、カルボン酸塩にあるものを指す。「Ｏ−カルボキシ」基は、ＲＣ（Ｏ）Ｏ−基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義される通りである。 「Ｃ−カルボキシ」基は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義される通りである。
【０２８１】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用■■される「シアノ」という用語は、−ＣＮを指す。
【０２８２】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用■■される「シクロアルキル」またはあるいは「炭素環」という用語は、飽和または部分的に飽和した単環式、二環式または三環式アルキル基を指し、各環式部分は３から１２個の炭素を含む。原子環員であり、任意選択で、本明細書で定義されるように任意選択で置換されるベンゾ縮合環系であり得る。特定の実施形態において、前記シクロアルキルは、５から７個の炭素原子を含むであろう。そのようなシクロプロピル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、オクタヒドロナフチル、2,3-ジヒドロ-1H-インデニル、アダマンチルなどが含まれる。本明細書で使用される「二環式」および「三環式」は、デカヒドロナフタレン、オクタヒドロナフタレンなどの縮合環系、ならびに多環式（多中心）飽和または部分的に不飽和型の両方を含むことを意図している。後者のタイプの異性体は、一般に、ビシクロ[1,1,1]ペンタン、樟脳、アダマンタン、およびビシクロ[3,2,1]オクタンによって例示されます。
【０２８３】
本明細書で使用される「炭素環」、「カルボシクリル」、および「炭素環」という用語は、環の各原子が炭素である非芳香族飽和または不飽和環を指す。好ましくは、炭素環は３から１０個の原子、より好ましくは３から８個の原子を含み、例えば５から７個の原子、例えば６個の原子を含む。「カボサイクル」という用語には、自転車、三輪車、およびアダマンチル環系を含む他の多環式環系も含まれる。
【０２８４】
本明細書で使用される「ヘテロ原子」という用語は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、および硫黄である。より好ましくは、窒素および酸素。
【０２８５】
本明細書で単独または組み合わせて使用される「ヘテロアルキル」という用語は、完全に飽和または１から３度の不飽和を含み、以下からなる、安定な直鎖または分枝鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはそれらの組み合わせを指す。記載された数の炭素原子、およびＯ、Ｎ、およびＳから選択される１から３個のヘテロ原子であり、窒素および硫黄原子は任意選択で酸化され得、窒素ヘテロ原子は任意選択で四級化され得る。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に配置することができる。たとえば、-CH2-NH-OCH3のように、最大2つのヘテロ原子が連続している場合があります。
【０２８６】
「ヘテロアリール」という用語は、置換または非置換の芳香族単環構造、好ましくは３から８員環、より好ましくは５から７員環、さらにより好ましくは５から６員環を含み、その環構造は少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは１から４つのヘテロ原子、より好ましくは１つまたは２つのヘテロ原子を含む。「ヘテロアリール」という用語はまた、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通であり、環の少なくとも１つがヘテロ芳香族である、２つ以上の環状環を有する多環式環系を含み、例えば、他の環状環は、シクロアルキル、シクロアルケニルであり得る。シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および/またはヘテロシクリル。ヘテロアリール基には、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどが含まれる。
【０２８７】
本明細書で単独または組み合わせて使用される「ヘテロシクロアルキル」および交換可能に「複素環」という用語はそれぞれ、少なくとも１つのヘテロ原子を含む飽和、部分的に不飽和、または完全に不飽和の単環式、二環式、または三環式複素環式基を指す。それぞれの前記ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、およびＳから独立して選択され得る。さらに、ヘテロシクロアルキルは、環メンバーとして１つまたは２つのＣ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳ（Ｏ）２基を含み得る。。特定の実施形態において、前記ヘテロシクロアルキルは、環メンバーとして１から４個のヘテロ原子を含むであろう。さらなる実施形態において、前記ヘテロシクロアルキルは、環メンバーとして１から２個のヘテロ原子を含むであろう。特定の実施形態では、前記ヘテロシクロアルキルは、各環に３から８個の環部材を含むであろう。さらなる実施形態において、前記ヘテロシクロアルキルは、各環に３から７個の環部材を含むであろう。さらに別の実施形態では、前記ヘテロシクロアルキルは、各環に５から６個の環部材を含むであろう。「複素環式」および「複素環」は、スルホン、スルホキシド、第三級窒素環員のＮ−オキシド、ならびに炭素環式縮合およびベンゾ縮合環系を含むことを意図している。さらに、両方の用語は、本明細書で定義されるように、複素環がアリール基または追加の複素環基に融合される系も含む。複素環基の例には、アジリジニル、アゼチジニル、1,3-ベンゾジオキソリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロイソキノリニル、ジヒドロシンノリニル、ジヒドロベンゾジオキシニル、ジヒドロ[1,3]オキサゾロ[4,5-b]ピリジニル、ベンゾチアゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキシリジニルが含まれる。-ジオキサニル、1,4-ジオキサニル、1,3-ジオキソラニル、イソインドリニル、モルホリニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロピリジニル、ピペリジニル、チオモルホリニルなど。複素環基は、特に禁止されていない限り、任意選択で置換することができる。
【０２８８】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用■■される「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨを指す。
【０２８９】
「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、およびヨードを含む。
【０２９０】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「ハロアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に結合したハロアルキル基を指す。ハロアルコキシには、ペルハロアルコキシが含まれます。「ペルハロアルコキシ」という用語は、すべての水素原子がハロゲン原子で置き換えられているアルコキシ基を指す。ペルハロアルコキシの例は、パーフルオロメトキシです。
【０２９１】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「ハロアルキル」という用語は、１つまたは複数の水素がハロゲンで置き換えられている、上記で定義された意味を有するアルキルラジカルを指す。具体的には、モノハロアルキル、ジハロアルキル、ポリハロアルキル、およびペルハロアルキルラジカルが含まれる。一例として、モノハロアルキルラジカルは、ラジカル内にヨード、ブロモ、クロロまたはフルオロ原子を有し得る。ジハロおよびポリハロアルキルラジカルは、2つ以上の同じハロー原子または異なるハローラジカルの組み合わせを有し得る。ハロアルキルラジカルの例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチルおよびジクロロプロピルが含まれる。「ハロアルキレン」は、２つ以上の位置に結合したハロアルキル基を指す。ハロアルキルラジカルの例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチルおよびジクロロプロピルが含まれる。「ハロアルキレン」は、２つ以上の位置に結合したハロアルキル基を指す。例としては、フルオロメチレン（-CFH-）、ジフルオロメチレン（-CF2-）、クロロメチレン（-CHCl-）などがあります。本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「ペルハロアルキル」という用語は、すべての水素原子がハロゲン原子で置き換えられているアルキル基を指す。例には、パーフルオロメチルが含まれます。
【０２９２】
「アルコール」という用語は、ヒドロキシル官能基（−ＯＨ）が飽和炭素原子に結合している有機化合物を意味する。
【０２９３】
「ケトン」という用語は、構造ＲＣ（＝ Ｏ）Ｒ 'を有する有機化合物を意味し、ここで、ＲおよびＲ'はどちらも水素原子であってはならない。
【０２９４】
「エステル」という用語は、構造ＲＣ（＝ Ｏ）ＯＲ ’を有する有機化合物を意味し、ＲおよびＲ’のいずれも水素原子であってはならない。
【０２９５】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「エーテル」という用語は、炭素原子で連結された２つの部分を架橋するオキシ基を指す。
【０２９６】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２を指す。
【０２９７】
「ポリイン」という用語は、交互の単結合および三重結合を有する有機化合物を意味する。つまり、一連の連続したアルキン（-C≡C-）
nが1より大きいn。
【０２９８】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「チア」および「チオ」という用語は、酸素が硫黄で置き換えられている−Ｓ−基またはエーテルを指す。チオ基の酸化誘導体、すなわちスルフィニルおよびスルホニルは、チアおよびチオの定義に含まれる。本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「スルファニル」という用語は、−Ｓ−を指す。本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「スルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）−を指す。本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「スルホニル」という用語は、-S（O）2-を指す。
【０２９９】
本明細書で単独でまたは組み合わせて使用される「尿素」または「カルバミド」という用語は、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−を指す。
【０３００】
「置換された」という用語は、主鎖の１つまたは複数の炭素上の水素を置換する置換基を有する部分を指す。「置換」または「置換」は、そのような置換が置換原子および置換基の許容される原子価に従うという暗黙の但し書きを含み、置換が安定な化合物をもたらすこと、例えば、そうではないことが理解されよう。転位、環化、除去などによる自発的な変換を受ける。本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、有機化合物のすべての許容される置換基を含むと考えられる。広い態様では、許容される置換基には、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族置換基が含まれる。許容される置換基は、適切な有機化合物について、１つまたは複数であり、同じであっても異なっていてもよい。本発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たす、水素置換基および／または本明細書に記載の有機化合物の任意の許容可能な置換基を有し得る。置換基は、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシルなど）、チオカルボニル（チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメートなど）を含むことができる。）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族またはヘテロ芳香族部分。炭化水素鎖上で置換された部分は、適切な場合、それ自体で置換され得ることが当業者によって理解されるであろう。
【０３０１】
前述のように、「非置換」として具体的に述べられていない限り、本明細書における化学部分への言及は、置換された変異体を含むと理解される。例えば、「アリール」基または部分への言及は、置換および非置換の両方の変異体を暗黙的に含む。
【０３０２】
本明細書で使用される場合、「フラニル」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７０】
2021518856.tif 000072
【０３０３】
本明細書で使用される場合、「インドリル」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７１】
2021518856.tif 000073
【０３０４】
本明細書で使用される場合、「インダゾール」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７２】
2021518856.tif 000074
【０３０５】
本明細書で使用される場合、「ピリジル」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７３】
2021518856.tif 000075
【０３０６】
本明細書で使用される場合、「ピリミジニル」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７４】
2021518856.tif 000076
【０３０７】
本明細書で使用される場合、「ピラゾール」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７５】
2021518856.tif 000077
【０３０８】
本明細書で使用される場合、「チエニル」または「チオフェン」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７６】
2021518856.tif 000078
【０３０９】
本明細書で使用される場合、「ベンゾチオフェニル」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７７】
2021518856.tif 000079
【０３１０】
本明細書で使用される場合、「ベンゾジオキサン」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７８】
2021518856.tif 000080
【０３１１】
本明細書で使用される場合、「ジベンゾフラニル」という用語は、以下の構造を含む任意の化合物または化学基を意味する。
【化７９】
2021518856.tif 000081
【０３１２】
本明細書における化合物の開示は、その化合物のすべての立体異性体を包含することが理解される。本明細書で使用される場合、「立体異性体」という用語は、同じ結合によって結合された同じ原子からなるが、互換性のない異なる三次元構造を有する化合物を指す。三次元構造は構成と呼ばれます。立体異性体には、エナンチオマーとジアステレオマーが含まれます。
【０３１３】
「ラセミ体」または「ラセミ混合物」という用語は、等量のエナンチオマーの混合物を指す。「キラル中心」という用語は、4つの異なる基が結合している炭素原子を指します。本明細書で使用される「エナンチオマー濃縮」という用語は、他方と比較した一方のエナンチオマーの量の増加を指す。
【０３１４】
本発明の化合物がキラル中心を有する範囲で、それらは、光学活性およびラセミ形態で存在し、単離され得ることが理解される。一部の化合物は多型を示す場合があります。本発明は、本明細書に記載の有用な特性を有し、本明細書に記載の有用な特性を有する、本発明の化合物の任意のラセミ、光学活性、ジアステレオマー、多形、または立体異性体、またはそれらの混合物を包含することを理解されたい。光学活性形態を調製する方法（例えば、再結晶技術によるラセミ形態の分解、光学活性出発物質からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離による）。
【０３１５】
光学活性材料を得るための方法の例は当技術分野で知られており、少なくとも以下を含む。
i）結晶の物理的分離-個々のエナンチオマーの巨視的結晶を手動で分離する技術。この手法は、別々のエナンチオマーの結晶が存在する場合、つまり、材料が集合体であり、結晶が視覚的に異なる場合に使用できます。
ii）同時結晶化-個々のエナンチオマーがラセミ体の溶液から別々に結晶化される技術。後者が固体状態の集塊である場合にのみ可能です。
iii）酵素分解-酵素とのエナンチオマーの反応速度が異なるためにラセミ体を部分的または完全に分離する技術。
iv）酵素的不斉合成-合成の少なくとも1つのステップが酵素反応を使用して、所望の鏡像異性体の鏡像異性的に純粋なまたは濃縮された合成前駆体を得る合成技術;
v）化学的不斉合成-本明細書でより詳細に開示されるキラル触媒またはキラル補助剤を使用して達成され得る、生成物に非対称性（すなわち、キラリティー）を生じる条件下でアキラル前駆体から所望のエナンチオマーを合成する合成技術。;
vi）ジアステレオマー分離-ラセミ化合物を、個々のエナンチオマーをジアステレオマーに変換する鏡像異性的に純粋な試薬（キラル補助剤）と反応させる技術。次に、得られたジアステレオマーは、それらの現在より明確な構造の違いによりクロマトグラフィーまたは結晶化によって分離され、キラル補助剤は後で除去されて、所望のエナンチオマーが得られる。
vii）一次および二次非対称変換-ラセミ体からのジアステレオマーが平衡化して、所望のエナンチオマーからのジアステレオマーの溶液中で優勢をもたらす、または所望のエナンチオマーからのジアステレオマーの優先的結晶化が平衡を乱し、最終的に原則として、すべての材料は、目的のエナンチオマーから結晶性ジアステレオマーに変換されます。次に、所望のエナンチオマーがジアステレオマーから放出される。
viii）速度論的分割-この手法は、キラルな非ラセミ試薬とのエナンチオマーの反応速度が等しくないために、ラセミ体の部分的または完全な分割（または部分的に分割された化合物のさらなる分割）の達成を指します。速度論的条件下での触媒;
ix）非ラセミ前駆体からのエナンチオ特異的合成-目的のエナンチオマーが非キラル出発物質から得られ、合成の過程で立体化学的完全性が損なわれないか、最小限に抑えられる合成技術。
x）キラル液体クロマトグラフィー-固定相との相互作用が異なるため、ラセミ体のエナンチオマーが液体移動相で分離される技術。固定相はキラル材料で作ることができ、移動相は異なる相互作用を引き起こすために追加のキラル材料を含むことができます。
xi）キラルガスクロマトグラフィー-固定された非ラセミキラル吸着剤相を含むカラムとのガス状移動相におけるそれらの異なる相互作用により、ラセミ体が揮発し、エナンチオマーが分離される技術。
xii）キラル溶媒による抽出-1つのエナンチオマーを特定のキラル溶媒に優先的に溶解することによりエナンチオマーを分離する技術。
xiii）キラル膜を通過する輸送-ラセミ体を薄い膜バリアと接触させて配置する技術。バリアは通常、2つの混和性流体を分離します。1つはラセミ体を含み、濃度や圧力差などの駆動力により、膜バリアを通過する優先的な輸送が発生します。分離は、ラセミ体の1つのエナンチオマーのみが通過できる膜の非ラセミキラル性の結果として発生します。
【０３１６】
立体異性体はまた、塩基またはそれらの塩の分別結晶化を含む当業者に知られている通常の技術、またはＬＣまたはフラッシュクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術によって分離することができる。（＋）エナンチオマーは、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓら、エナンチオマー、ラセミ体、および解像度によって記載されているものなど、当技術分野で周知の技術および手順を使用して（−）エナンチオマーから分離することができる」、ジョンワイリーおよびサンズ、Ｉｎｃ．、１９８１。例えば、エタノール／アセトニトリルおよびキラルパックＡＤパッキングなどの適切な有機溶媒を用いたキラルクロマトグラフィーもまた、エナンチオマーの分離をもたらすために利用され得る。
【０３１７】
以下の実施例は、本発明の方法をさらに説明するために提供される。これらの例は例示に過ぎず、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０３１８】
本発明は、例示の目的で提供され、いかなる方法でも本発明を限定することを意図しない以下の実施例によってさらに例示される。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修正することができる様々な重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
例1
方法と材料
化学薬品
【０３１９】
出発物質は、シグマアルドリッチ、フィッシャーサイエンティフィック、アークファーム、オークウッドケミカル、ケンブリッジアイソトープラボラトリー、またはＡＫサイエンティフィックから購入し、特に明記しない限り、受け取ったまま使用した。すべての溶媒は試薬グレードでした。
クロマトグラフィー
【０３２０】
カラムクロマトグラフィーは、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）順相シリカフラッシュカラムを使用して、テレダインＩＳＣＯＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆ ＋で実施された。薄層クロマトグラフィー（TLC）は、SilicycleSiliaPlateTMガラスTLCプレート（250μm、20 x 20 cm）で実施しました。示されている場合、化合物は、GX-271リキッドハンドラーを備えたGilson HPLCを使用して、PhenomenexGemini NX-C18カラム（250 x 21.2 mm、粒子サイズ：5 μm、細孔サイズ：110A）での分取HPLCによって精製しました。
分光法
【０３２１】
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、示されるように、４００ｍＬまたは５００ｍＬの分光計を使用して周囲温度で記録された。化学シフトは、残留溶媒ピークに対するppmで報告されます（1H NMR：DMSO-d6、δ2.50;クロロホルム-d、δ7.26;メタノール-d4、δ3.31）。次の略語は、多重度を示すために使用されます：s（シングレット）、d（ダブレット）、t（トリプレット）、q（カルテット）、hept（ヘプトプレット）、m（マルチプレット）、br（ブロード）。高分解能質量スペクトル（HRMS）は、示されているように、大気圧化学イオン化（APCI）またはエレクトロスプレーイオン化（ESI）を備えた飛行時間型質量分析計で取得され、ピークマッチングによって取得されました。すべての反応は、特に明記しない限り、アルゴン下で火炎乾燥したガラス器具内の窒素またはアルゴンの雰囲気下で実行されました。水溶液は、抵抗率が18MΩ・cmを超えるナノ純水から調製されました。特に断りのない限り、すべての試薬は市販されていました。
ソフトウェア
【０３２２】
分子ドッキング、分子モデリング、および視覚化は、グライド（バージョン２０１２■２０１６、シュレーディンガー）およびシュレーディンガーマエストロ（バージョン2017■１）を使用して実施された。すべての化学構造は、ChemDraw Professional 16.0（Perkin Elmer）を使用して描画されました。すべてのミクロソーム安定性曲線は、Prism7（GraphPad Software）を使用して作成されました。
例2
ピペラジン類似体の合成
【０３２３】
式（Ｉ）から（ＩＩ）の化合物を得るための一般的な経路は、以下に示される合成に従う。効力媒介グループは、初期段階ではなく最終ステップで追加されました。各化合物の調製も提供されます。
【化８０】
2021518856.tif 000082
スキーム1：化合物1および7a■7azの一般的な合成スキーム。
4-（1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（化合物3）の準備
【化８１】
2021518856.tif 000083
【０３２４】
５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２、３．９４ｇ、２０ミリモル、１．０当量）および４−ホルミルフェニルボロン酸（３．３０ｇ、２２ミリモル、１．１当量）を圧力に加えた。チューブとアセトニトリル（80 mL）および1,4-ジオキサン（20 mL）を加えました。反応混合物を脱気し、アルゴン下に保った。 Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（０．７０ｇ、１．０ｍｍｏｌ、５モル％）を加え、続いて水性Ｎａ２ＣＯ３（２．０Ｍ、５０ｍＬ）を加えた。反応混合物を５分間撹拌し、油浴に移し、１３０℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物を酢酸エチルとブラインに分配し、分離し、水層を酢酸エチル（3x）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライトで濾過した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中0■100％のEtOAc）で精製して、4-（1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（3、2.15g、48 ％収率）無色の固体として。 1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ11.80（s、1H）、10.06（s、1H）、8.63（d、J =2.2 Hz、1H）、8.35（d、J = 2.2 Hz、1H）、8.05 - 7.94（m、4H）、7.55（d、J = 3.5 Hz、1H）、6.54（d、J= 3.4 Hz、1H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C14H11N2O [M + H +]の場合：223.0872、実測値：223.0872。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物4）の準備
【化８２】
2021518856.tif 000084
【０３２５】
４−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（３、２．１５ｇ、９．６６ｍｍｏｌ、１．０当量）をジクロロメタン（■０．１Ｍ）、および１−メチルピペラジン（約０．１Ｍ）に懸濁させた。 1.93 g、2.14 mL、19.3 mmol、2.0 eq）、およびNa（OAc）3BH（3.07 g、14.5 mmol、1.5eq）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンとブラインとの間で分配し、層を分離し、水層をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライトで濾過し、溶媒を蒸発させて、5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2、無色の固体としての3-b]ピリジン（4、2.2グラム、74％の収率）。生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.43（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.21（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.64（d、J =8.2 Hz、2H）、7.45（d 、J = 8.2 Hz、2H）、7.42（d、J = 3.5 Hz、1H）、6.55（d、J = 3.5 Hz、1H）、3.64（s、2H）、2.71（bs、4H）、2.63（bs、4H）、2.44（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C19H23N4 [M + H +]の場合：307.1923、実測値：307.1918。
3-ヨード-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物5）の準備
【化８３】
2021518856.tif 000085
【０３２６】
５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（４、２．２ｇ、７．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）をアセトンに懸濁させた。（0.015 M、480 mL）およびN-ヨードスクシンイミド（1.78 g、7.9 mmol、1.1 eq）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（1％Et3Nを含むDCM中0■10％MeOH）で精製して、3-ヨード-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニルを得た。）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（5、2.3 g、74％収率）を黄褐色の固体として。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.46（d、J= 2.1 Hz、1H）、7.88（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.64（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.57（s 、1H）、7.47（d、J =8.2 Hz、2H）、3.71（s、2H）、3.35（s、1H）、3.21（bs、8H）、2.80（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。C19H22N4I [M + H +]の場合：433.0889、実測値：433.0883。
tert-ブチル3-ヨード-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-カルボキシレート（化合物6）の準備
【化８４】
2021518856.tif 000086
【０３２７】
３−ヨード−５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５、２．３ｇ、５．３２ｍｍｏｌ、１．０当量）をTHF（250 mL）とDMF（20 mL）の混合物に溶解しました。 Ｂｏｃ２Ｏ（３．４８ｇ、１５．９６ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＤＭＡＰ（０．９７ｇ、７．９８ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。水を加え、反応混合物を酢酸エチル（3x）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。粗物質をシリカのカラムクロマトグラフィー（1％Et3Nを含むDCM中0■10％MeOH）で精製して、tert-ブチル3-ヨード-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニルを得た。）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-カルボキシレートを黄褐色の固体として（6、2.0 g、71％収率）。 1H NMR（400 MHz、クロロホルム-d）δ8.73（d、J= 2.1 Hz、1H）、7.84（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.82（s、1H）、7.59（d、J = 8.2 Hz 、2H）、7.45（d、J =8.2 Hz、2H）、3.58（s、2H）、2.53（bs、4H）、2.47（bs、4H）、2.30（s、3H）、1.69（s、9H） ppm。 HRMS（APCI+、m / z）：計算値。 C24H30N4O2I [M + H +]の場合：533.1413、実測値：533.1423。
鈴木カップリングとその場脱保護の一般的な手順
【化８５】
2021518856.tif 000087
スキーム2：鈴木カップリングとinsitu脱保護のための一般的な合成スキーム。
【０３２８】
ｔｅｒｔ−ブチル３−ヨード−５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボキシレート（６、２６．２ｍｇ、0.05 mmol、1.0 eq）を、テフロンで裏打ちされたキャップ付きの1ドラムガラスバイアル内の1,4-ジオキサン（2.0mL）に溶解しました。ボロン酸またはボロン酸エステル（0.075ミリモル、1.5当量）を加え、続いてテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（Pd（PPh3）4、5.8mg、5mol％）を加えた。反応混合物を脱気し、Ｎａ２ ＣＯ ３水溶液（２．０Ｍ、０．５ｍＬ）を加え、１００℃で一晩撹拌した。反応混合物をセライトで濾過し、セライトを酢酸エチルで洗浄した。溶媒を蒸発させ、粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製によって精製して、純粋な材料を得た。
3-（1H-インドール-5-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物1）の準備
【化８６】
2021518856.tif 000088
【０３２９】
化合物１は、５−インドリルボロン酸（１２．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３ -b]ピリジン（1、14.8 mg、70％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.61（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.52（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.86（dd、J= 1.7、0.7 Hz、1H）、7.70 （d、J = 8.2 Hz、2H）、7.67（s、1H）、7.50（m、3H）、7.44（dd、J = 8.4、1.7Hz、1H）、7.28（d、J = 3.2 Hz、1H） 、6.51（dd、J = 3.2、0.9 Hz、1H）、3.84（s、2H）、3.00 - 2.80（bs、8H）、2.87（s、3H）ppm。分光データは、文献で報告されているものと一致しました。
3-（1H-インドール-2-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7a）の準備
【化８７】
2021518856.tif 000089
【０３３０】
化合物７ａは、インドール−２−ボロン酸ピナコールエステル（１８．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（１Ｈ−インドール−２−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３ -b]ピリジン（7a、14.1 mg、67％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.54（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.49（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.82（s、1H）、7.65（d、J= 8.2 Hz 、2H）、7.54（dt、J = 7.8、1.0 Hz、1H）、7.41（d、J = 8.1 Hz、2H）、7.42 - 7.35（m、1H）、7.07（ddd、J= 8.0、7.2、1.1 Hz、1H）、7.00（ddd、J = 8.0、7.1、1.1 Hz、1H）、6.78（d、J = 1.0 Hz、1H）、3.56（s、2H）、2.75- 2.40（bs、8H）、2.34 （s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H28N5 [M + H +]の場合：422.2339、実測値：422.2336。
3-（6-エトキシピリジン-3-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7b）の準備
【化８８】
2021518856.tif 000090
【０３３１】
化合物７ｂは、６−エトキシ−３−ピリジニルボロン酸（１２．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護のための一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（６−エトキシピリジン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３ -b]ピリジン（7b、16.2 mg、76％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.48（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.42（dd、J = 2.6、0.8 Hz、1H）、8.33（d、J= 2.1 Hz、1H）、7.99 （dd、J = 8.6、2.5 Hz、1H）、7.66（s、1H）、7.63（d、J = 8.0 Hz、2H）、7.43（d、J= 8.0 Hz、2H）、6.88（dd、J = 8.6、0.8 Hz、1H）、4.34（q、J = 7.0 Hz、2H）、2.80 - 2.45（bs、8H）、2.40（s、3H）、1.40（t、J= 7.1 Hz、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C26H30N5O [M + H +]の場合：428.2450、実測値：428.2449。
3-（ジベンゾ[b、d]フラン-4-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7c）の準備
【化８９】
2021518856.tif 000091
【０３３２】
化合物７ｃは、４−（ジベンゾフラニル）ボロン酸（１５．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（ジベンゾ［ｂ、ｄ］フラン−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロを得た。 [2,3-b]ピリジン（7c、12.6 mg、58％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.57（s、2H）、8.18（s、1H）、8.12（dt、J = 7.7、1.2 Hz、1H）、8.00（dd、J= 7.7、1.2 Hz、 1H）、7.94（dd、J = 7.6、1.2 Hz、1H）、7.72（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.70 - 7.65（m、2H）、7.57- 7.48（m、4H）、3.69（s 、2H）、3.05 - 2.75（bs、4H）、2.85 - 2.55（bs、4H）、2.59（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C31H29N4O [M + H +]の場合：473.2341、実測値：473.2345。
3-（2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-6-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3 -b]ピリジン（化合物7d）の準備
【化９０】
2021518856.tif 000092
【０３３３】
化合物７ｄは、１，４−ベンゾジオキサン−６−ボロン酸（１３．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）−５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）を得た。 ）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（7d、10.2mg、46％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.45（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.34（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.61（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.55（s 、1H）、7.43（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.17 - 7.10（m、2H）、6.91（d、J = 8.8Hz、1H）、4.27（s、4H）、3.60（s、2H） 、2.77 - 2.46（bs、8H）、2.39（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m /z）：計算値。 C27H29N4O2 [M + H +]の場合：441.2291、実測値：441.2287。
4-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）アニリン（化合物7e）の準備
【化９１】
2021518856.tif 000093
【０３３４】
化合物７ｅは、４−アミノフェニルボロン酸ピナコールエステル（１７．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。アニリン（7e、14.4mg、73％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.43（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.34（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.61（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.50（s 、1H）、7.46 -7.39（m、4H）、6.84（d、J = 8.5 Hz、2H）、3.62（s、2H）、2.79（bs、4H）、2.63（bs、4H）、2.49（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H28N5 [M + H +]の場合：398.2345、実測値：398.2344。
3-（ベンゾ[b]チオフェン-3-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7f）の準備
【化９２】
2021518856.tif 000094
【０３３５】
化合物７ｆは、ベンゾ［ｂ］チエン−３−イルボロン酸（１４．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２）を得た。 、3-b]ピリジン（7f、16.0mg、73％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.50（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.17（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.97- 7.87（m、2H）、7.71（s、1H） 、7.63（s、1H）、7.55（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.44 - 7.33（m、4H）、3.55（s、2H）、2.71- 2.45（bs、8H）、2.37（s、3H ）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H27N4S [M + H +]の場合：439.1956、実測値：439.1955。
3-（ベンゾ[b]チオフェン-2-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（コンパウンド7g）の準備
【化９３】
2021518856.tif 000095
【０３３６】
化合物７ｇは、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イルボロン酸（１４．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２）を得た。 、3-b]ピリジン（7g、15.9mg、73％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.52（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.50（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.83- 7.74（m、3H）、7.64（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.57（d、J = 0.7 Hz、1H）、7.43（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.32（ddd、J= 7.9、7.2、1.2 Hz、1H）、7.26（ddd、 J = 8.4、7.2、1.2 Hz、1H）、3.59（s、2H）、2.72 - 2.48（bs、8H）、2.38（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H27N4S [M + H +]の場合：439.1956、実測値：439.1959。
3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）アニリン（化合物7時間）の準備
【化９４】
2021518856.tif 000096
【０３３７】
化合物７ｈは、３−アミノフェニルボロン酸塩酸塩（１３．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。アニリン（7時間、14.9mg、75％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.47（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.45（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.64（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.61（s 、1H）、7.44（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.19（t、J = 7.8 Hz、1H）、7.11（t、J =2.0 Hz、1H）、7.03（ddd、J = 7.6、1.7、 1.0 Hz、1H）、6.68（ddd、J = 7.8、2.3、1.0 Hz、1H）、3.60（s、2H）、2.58（bs、8H）、2.34（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H28N5 [M + H +]の場合：398.2345、実測値：398.2337。
3-（1H-インドール-2-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7a）の準備
【化９５】
2021518856.tif 000097
【０３３８】
化合物７ｉは、３−カルボキシ−４−フルオロフェニルボロン酸（１３．８ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、２−フルオロ−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−を得た。 3-イル）安息香酸（7i、8.9mg、40％収率）。 1H NMR（500 MHz、メタノール-d4）δ8.56（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.53（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.24（dd、J= 6.8、2.5 Hz、1H）、7.95 （ddd、J = 8.6、4.5、2.5 Hz、1H）、7.81（s、1H）、7.75（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.55（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.32（dd、 J = 10.6、8.6 Hz、1H）、3.96（s、2H）、3.38（bs、4H）、3.05（bs、4H）、2.91（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C26H26FN4O2 [M + H +]の場合：445.2040、実測値：445.2035。
3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）安息香酸（化合物7j）の準備
【化９６】
2021518856.tif 000098
【０３３９】
化合物７ｊは、３−カルボキシフェニルボロン酸（１２．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。安息香酸（7j、12.0mg、56％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.62- 8.56（m、2H）、8.36（s、1H）、8.02 - 7.94（m、2H）、7.85（s、1H）、7.76（d、J= 8.0 Hz、2H）、7.60（d、J = 7.8 Hz、1H）、7.56（d、J = 8.0 Hz、2H）、3.97（s、2H）、3.39（bs、4H）、3.05（bs、4H）、2.91（s、3H）ppm HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C26H27N4O2 [M + H +]の場合：427.2134、実測値：427.2137。
5-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）ピリミジン-2-アミン（化合物7k）の準備
【化９７】
2021518856.tif 000099
【０３４０】
化合物７ｋは、２−アミノピリミジン−５−ボロン酸（１１．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。ピリミジン-2-アミン（7k、16.4mg、82％）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.87（s、2H）、8.58（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.46（d、J =2.1 Hz、1H）、7.87（s、1H）、7.76 （d、J = 8.2 Hz、2H）、7.54（d、J = 8.2 Hz、2H）、3.93（s、2H）、3.37（bs、4H）、3.01（bs、4H）、2.90（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C23H26N7 [M + H +]の場合：400.2250、実測値：400.2250。
3-メチル-5-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）ピリジン-2-アミン（化合物7l）の準備
【化９８】
2021518856.tif 000100
【０３４１】
化合物７ｌは、２−アミノ−３−メチルピリジン−５−ボロン酸ピナコールエステル（１８．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−メチル−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−を得た。 3-イル）ピリジン-2-アミン（7l、8.2mg、40％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.55（s、1H）、8.42（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.24（dd、J= 2.2、1.1 Hz、1H）、8.14 - 8.08（m、 1H）、7.83（s、1H）、7.73（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.51（d、J =8.1 Hz、2H）、3.79（s、2H）、3.04 - 2.68（bs、8H）、 2.87（s、3H）、2.37（s、3H）ppm HRMS（APCI +、m/ z）：計算値。 C25H29N6 [M + H +]の場合：413.2454、実測値：413.2457。
5-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）ピリジン-2-アミン（コンパウンド7m）の準備
【化９９】
2021518856.tif 000101
【０３４２】
化合物７ｍは、２−アミノピリジン−５−ボロン酸ピナコールエステル（１６．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。ピリジン-2-アミン（7m、15.2mg、76％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.60（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.52（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.35（dd、J= 9.3、2.2 Hz、1H）、8.22 （dd、J = 2.2、0.7 Hz、1H）、7.87（s、1H）、7.80（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.59（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.16（dd、J = 9.2、0.7 Hz、1H）、4.10（s、2H）、3.46（bs、4H）、3.20（s、4H）、2.93（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C24H27N6 [M + H +]の場合：399.2297、実測値：399.2307。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-（ピリジン-4-イル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7n）の準備
【化１００】
2021518856.tif 000102
【０３４３】
化合物７ｎは、４−ピリジニルボロン酸（１０．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ）を得た。 ]ピリジン（7n、8.7mg、45％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.74（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.68 - 8.64（m、3H）、8.57（s、1H）、8.43（d、J= 7.1 Hz、2H） 、7.83（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.60（d、J = 8.2 Hz、2H）、4.04（s、2H）、3.43（bs、4H）、3.13（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C24H26N5 [M + H +]の場合：384.2188、実測値：384.2194。
4-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）ベンゾニトリル（化合物7o）の準備
【化１０１】
2021518856.tif 000103
【０３４４】
化合物７ｏは、４−シアノフェニルボロン酸（１１．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。ベンゾニトリル（7o、14.4 mg、71％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.56（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.54（d、J= 2.1 Hz、1H）、7.97 - 7.91（m、3H）、7.83 - 7.77（m、 2H）、7.75（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.54（d、J= 8.2 Hz、2H）、3.89（s、2H）、3.35（bs、4H）、2.96（bs、4H）、2.89（ s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m /z）：計算値。 C26H26N5 [M + H +]の場合：408.2188、実測値：408.2198。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-（3-ニトロフェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7p）の準備
【化１０２】
2021518856.tif 000104
【０３４５】
化合物７ｐは、３−ニトロフェニルボロン酸（１２．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを得た。 （7p、15.4 mg、72％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.59（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.58（d、J= 2.0 Hz、1H）、8.54（t、J = 2.0 Hz、1H）、8.15（dddd 、J = 7.7、4.3、2.1、1.0 Hz、2H）、7.96（s、1H）、7.77（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.71（t、J = 8.0 Hz、1H）、7.58（d、 J = 8.2 Hz、2H）、4.08（s、2H）、3.44（bs、4H）、3.17（bs、4H）、2.93（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H26N5O2 [M + H +]の場合：428.2087、実測値：428.2081。
3-（4-イソプロポキシフェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7q）の準備
【化１０３】
2021518856.tif 000105
【０３４６】
化合物７ｑは、４−イソプロポキシフェニルボロン酸（１３．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（４−イソプロポキシフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを得た。 （7q、18.2 mg、83％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.61（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.56（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.75（d、J =8.2 Hz、2H）、7.69（s 、1H）、7.64 - 7.58（m、2H）、7.55（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.08 - 6.98（m、2H）、4.65（hept、J= 6.0 Hz、1H）、3.94（s、 2H）、3.37（bs、4H）、3.02（bs、4H）、2.90（s、3H）、1.35（d、J = 6.0 Hz、6H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C28H33N4O [M + H +]の場合：441.2654、実測値：441.2646。
3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェノール（化合物7r）の準備
【化１０４】
2021518856.tif 000106
【０３４７】
化合物７ｒは、３−ヒドロキシフェニルボロン酸（１０．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護のための一般的な手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。フェノール（7r、9.8mg、49％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.68（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.60（s、1H）、7.80 -7.73（m、3H）、7.58（d、J = 8.2 Hz、2H） 、7.30（t、J = 7.8 Hz、1H）、7.24 - 7.17（m、1H）、7.16（t、J= 2.0 Hz、1H）、6.78（ddd、J = 8.1、2.5、1.0 Hz、1H）、 4.04（s、2H）、3.42（bs、4H）、3.13（bs、4H）、2.92（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H27N4O [M + H +]の場合：399.2185、実測値：399.2180。
3-（1-メチル-1H-ピラゾール-4-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（コンパウンド7s）の準備
【化１０５】
2021518856.tif 000107
【０３４８】
化合物７ｓは、１−メチルピラゾール−４−ボロン酸ピナコールエステル（１６．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロを得た。 [2,3-b]ピリジン（7s、14.8 mg、77％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.62（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.31（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.80（s、1H）、7.76（d、J= 8.2 Hz 、2H）、7.64（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.58（d、J = 8.2 Hz、2H）、6.60（d、J = 2.1 Hz、1H）、4.14（s、2H）、3.95（s、3H）、3.48（bs、4H）、3.25（bs、4H）、2.94（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C23H27N6 [M+ H +]の場合：387.2297、実測値：387.2303。
4-（（5-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）チオフェン-2-イル）メチル）モルホリン（コンパウンド7t）の準備
【化１０６】
2021518856.tif 000108
【０３４９】
化合物７ｔは、５−（モルホリノメチル）−２−チオフェンボロン酸ピナコールエステル（２４．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、４−（（５−（５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン− 3-イル）チオフェン-2-イル）メチル）モルホリン（7t、10.0mg、41％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.57（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.52（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.84（s、1H）、7.75（d、J= 8.2 Hz 、2H）、7.57（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.42（d、J = 3.7 Hz、1H）、7.37（d、J = 3.7 Hz、1H）、4.64（s、2H）、4.06（bs、4H）、4.01（s、2H）、3.80（bs、4H）、3.41（bs、4H）、3.09（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m/ z）：計算値。 C28H34N5OS [M + H +]の場合：488.2484、実測値：488.2475。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-（6-（メチルスルホニル）ピリジン-3-イル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7u）の準備
【化１０７】
2021518856.tif 000109
【０３５０】
化合物７ｕは、６−（メチルスルホニル）ピリジン−３−ボロン酸（１５．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（６−（メチルスルホニル）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロロ［2,3-b]ピリジン（7u、11.0 mg、48％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ9.14（dd、J = 2.2、0.8 Hz、1H）、8.59（q、J= 2.1 Hz、2H）、8.46（dd、J = 8.2、2.2 Hz、1H） 、8.15（dd、J = 8.2、0.8 Hz、1H）、8.08（s、1H）、7.78（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.57（d、J = 8.2 Hz、2H）、4.02（s、 2H）、3.41（bs、4H）、3.27（s、3H）、3.11（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H28N5O2S [M + H +]の場合：462.1964、実測値：462.1968。
5-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）-1H-インダゾール（コンパウンド7v）の準備
【化１０８】
2021518856.tif 000110
【０３５１】
化合物７ｖは、１Ｈ−インダゾール−５−ボロン酸（１２．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。 -1H-インダゾール（7v、8.4mg、40％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.67（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.58（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.13- 8.09（m、2H）、7.79（s、1H） 、7.80 - 7.73（m、3H）、7.67（dt、J = 8.7、0.9 Hz、1H）、7.55（d、J= 8.3 Hz、2H）、3.95（s、2H）、3.38（bs、4H）、 3.03（bs、4H）、2.90（s、3H）ppm HRMS（APCI +、m /z）：計算値。 C26H27N6 [M + H +]の場合：423.2297、実測値：423.2298。
3-（フラン-3-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（コンパウンド7w）の準備
【化１０９】
2021518856.tif 000111
【０３５２】
化合物７ｗは、３−フラニルボロン酸（７ｗ、８．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（フラン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ）を得た。 ]ピリジン（12.9 mg、69％収率）。1H NMR（500 MHz、メタノール-d4）δ8.58（s、2H）、8.08（t、J = 1.1 Hz、1H）、7.80（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.76（s、1H）、7.62（t、J = 1.7 Hz、1H）、7.58（d、J = 8.2 Hz、2H）、6.87（dd、J = 1.8、1.1 Hz、1H）、4.00（s、2H）、3.41（bs、4H）、3.07（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C23H25N4O [M + H +]の場合：373.2028、実測値：373.2036。
1-（4-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）エタン-1-オン（コンパウンド7x）の準備
【化１１０】
2021518856.tif 000112
【０３５３】
化合物７ｘは、４−アセチルフェニルボロン酸（１２．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３）を得た。 -イル）フェニル）エタン-1-オン（7x、15.1mg、71％収率）。 1H NMR（500 MHz、メタノール-d4）δ8.63（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.58（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.11（d、J= 8.4 Hz、2H）、7.95（s 、1H）、7.90（d、J = 8.4 Hz、2H）、7.78（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.57（d、J =8.2 Hz、2H）、4.01（s、2H）、3.41（bs 、4H）、3.09（bs、4H）、2.92（s、3H）、2.65（s、3H）ppm。 HRMS（APCI+、m / z）：計算値。 C27H29N4O [M + H +]の場合：425.2341、実測値：425.2347。
3-（3-フルオロフェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7年）の準備
【化１１１】
2021518856.tif 000113
【０３５４】
化合物７ｙは、３−フルオロフェニルボロン酸（１０．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（３−フルオロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを得た。 （7年、12.8 mg、64％収率）。1H NMR（500 MHz、メタノール-d4）δ8.59（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.58（d、J = 2.2 Hz、1H）、7.85（s、1H）、7.78（d、J= 8.2 Hz 、2H）、7.61 - 7.55（m、3H）、7.52 - 7.44（m、2H）、7.11 - 7.02（m、1H）、4.02（s、2H）、3.41（bs、4H）、3.09（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H26N4F [M + H +]の場合：401.2142、実測値：401.2146。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-（4-（トリフルオロメトキシ）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（コンパウンド7z）の準備
【化１１２】
2021518856.tif 000114
【０３５５】
化合物７ｚは、４−（トリフルオロメトキシ）フェニルボロン酸（１５．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３− b]ピリジン（7z、17.4 mg、75％収率）。 1H NMR（500 MHz、メタノール-d4）δ8.62（d、J = 2.0Hz、1H）、8.59（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.85（s、1H）、7.86 - 7.80（m、2H） 、7.79（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.58（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.40（d、J = 8.0 Hz、2H）、4.05（s、2H）、3.43（bs、4H） 、3.13（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C26H26F3N4O [M + H +]の場合：467.2059、実測値：467.2062。
4-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）-1H-インダゾール（化合物7aa）の準備
【化１１３】
2021518856.tif 000115
【０３５６】
化合物７ａａは、１Ｈ−インダゾール−５−ボロン酸（１２．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護のための一般的な手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）を得た。 -1H-インダゾール（7aa、15.6mg、74％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.62（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.52（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.18（s、1H）、7.94（s、1H）、7.73（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.58 - 7.51（m、4H）、7.44（dd、J = 6.2、1.7 Hz、1H）、3.97（s、2H）、3.38（bs、4H）、3.05（3.05（bs、4H）、2.90（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C26H27N6 [M + H +]の場合：423.2297、実測値：423.2303。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-（3-（トリフルオロメチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7ab）の準備
【化１１４】
2021518856.tif 000116
【０３５７】
化合物７ａｂは、３−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（１４．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−b]ピリジン（7ab、17.0 mg、75％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.59（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.54（d、J= 2.0 Hz、1H）、8.00（d、J = 7.8 Hz、1H）、7.97（s 、1H）、7.89（s、1H）、7.76（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.68（t、J= 7.7 Hz、1H）、7.61（d、J = 8.4 Hz、1H）、7.57（d 、J = 8.2 Hz、2H）、4.03（s、2H）、3.42（bs、4H）、3.12（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C26H26F3N4 [M + H +]の場合：451.2110、実測値：451.2115。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-フェニル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7ac）の準備
【化１１５】
2021518856.tif 000117
【０３５８】
化合物７ａｃは、フェニルボロン酸（９．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｃ、１６．２）を得た。 mg、85％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.69（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.61（d、J= 1.9 Hz、1H）、7.82（s、1H）、7.78（d、J = 8.2 Hz 、2H）、7.76 - 7.69（m、2H）、7.59（d、J = 8.3Hz、2H）、7.53 - 7.44（m、2H）、7.39 - 7.29（m、1H）、4.08（s、2H）、 3.45（bs、4H）、3.17（bs、4H）、2.93（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H27N4 [M + H +]の場合：383.2236、実測値：383.2236。
3-（3-クロロフェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7ad）の準備
【化１１６】
2021518856.tif 000118
【０３５９】
化合物７ａｄは、３−クロロフェニルボロン酸（１１．７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護のための一般的な手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（３−クロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを得た。 （7ad、18.4mg、88％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.60（d、J = 1.3 Hz、2H）、7.85（s、1H）、7.79（d、J =8.2 Hz、2H）、7.71（t、J = 1.9 Hz 、1H）、7.66（dt、J = 7.8、1.3 Hz、1H）、7.61（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.46（t、J= 7.9 Hz、1H）、7.32（ddd、J = 8.1、 2.1、1.0 Hz、1H）、4.17（s、2H）、3.49（bs、4H）、3.29（bs、4H）、2.94（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H26ClN4 [M + H +]の場合：417.1846、実測値：417.1843。
3-（2,4-ジクロロフェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7ae）の準備
【化１１７】
2021518856.tif 000119
【０３６０】
化合物７ａｅは、２，４−ジクロロフェニルボロン酸（１４．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ）を得た。 ]ピリジン（7ae、14.9mg、66％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.61（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.32（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.77（s、1H）、7.75（d、J= 8.3 Hz 、2H）、7.64（d、J = 2.2 Hz、1H）、7.58（dd、J = 8.3、1.4 Hz、3H）、7.44（dd、J = 8.3、2.2Hz、1H）、4.16（s、2H） 、3.49（bs、4H）、3.27（bs、4H）、2.94（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。C25H25Cl2N4 [M + H +]の場合：451.1456、実測値：451.1447。
3-（2,5-ジメチルフェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7af）の準備
【化１１８】
2021518856.tif 000120
【０３６１】
化合物７ａｆは、２，５−ジメチルフェニルボロン酸（１１．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２，５−ジメチルフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ）を得た。 ]ピリジン（7af、14.0mg、68％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.65（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.36（d、J = 1.9 Hz、1H）、7.75（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.63（s 、1H）、7.60（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.25（d、J = 7.8 Hz、1H）、7.21（s、1H）、7.13（dd、J= 7.4、1.7 Hz、1H）、4.18 （s、2H）、3.50（bs、4H）、3.30（bs、4H）、2.94（s、3H）、2.35（s、3H）、2.26（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H31N4 [M + H +]の場合：411.2549、実測値：411.256。
1-メチル-6-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）-1H-インダゾール（化合物7ag）の準備
【化１１９】
2021518856.tif 000121
【０３６２】
化合物７ａｇは、１−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−ボロン酸（１３．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−メチル−６−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−を得た。 3-イル）-1H-インダゾール（7ag、13.2mg、60％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.67（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.58（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.01（d、J= 0.9 Hz、1H）、7.88（s 、1H）、7.84（dd、J = 8.4、0.9 Hz、1H）、7.81（d、J = 1.2 Hz、1H）、7.76（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.60 - 7.52（m、3H） 、4.11（s、3H）、3.99（s、2H）、3.40（bs、4H）、3.09（bs、4H）、2.91（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H29N6 [M + H +]の場合：437.2454、実測値：437.2449。
3-（1-ベンジル-1H-ピラゾール-4-イル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7ah）の準備
【化１２０】
2021518856.tif 000122
【０３６３】
化合物７ａｈは、１−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−４−ボロン酸（１５．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（１−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロを得た。 [2,3-b]ピリジン（7ah、14.3mg、62％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.61（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.57（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.19（d、J= 0.8 Hz、1H）、7.94（d 、J = 0.8 Hz、1H）、7.79（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.75（s、1H）、7.57（d、J =8.2 Hz、2H）、7.39 - 7.26（m、5H）、5.42 （s、2H）、4.01（s、2H）、3.41（bs、4H）、3.09（bs、4H）、2.92（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C29H31N6 [M + H +]の場合：463.2610、実測値：463.2612。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-（1,3,5-トリメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7ai）の準備
【化１２１】
2021518856.tif 000123
【０３６４】
化合物７ａｉは、１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−ボロン酸ピナコールエステル（１７．７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。 eq）。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）を得た。-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（7ai、7.6 mg、37％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.59（d、J = 2.0Hz、1H）、8.16（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.70（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.56 - 7.50 （m、3H）、3.93（s、2H）、3.88（s、3H）、3.37（bs、4H）、3.01（bs、4H）、2.90（s、3H）、2.28（s、3H）、2.22（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H31N6 [M + H +]の場合：415.2610、実測値：415.2604。
3-（3,5-ビス（トリフルオロメチル）フェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7aj）の準備
【化１２２】
2021518856.tif 000124
【０３６５】
化合物７ａｊは、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（１９．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２）を得た。 、3-b]ピリジン（7aj、11.2mg、43％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.58（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.44（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.29- 8.23（m、2H）、8.02（s、1H） 、7.86（s、1H）、7.74（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.56（d、J = 8.2 Hz、2H）、3.96（s、2H）、3.38（bs、4H）、3.04（bs、4H）、2.90（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H25F6N4 [M + H +]の場合：519.1983、実測値：519.1983。
1-メチル-3-（3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（化合物7ak）の準備
【化１２３】
2021518856.tif 000125
【０３６６】
化合物７ａｋは、（３−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ａ、１４．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−メチル−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ）を得た。 ]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（7ak、6.4mg、14％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.70（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.57（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.96（t、J= 1.8 Hz、1H）、7.81 - 7.75 （m、3H）、7.54（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.39 - 7.31（m、2H）、7.18（dt、J= 7.3、2.0 Hz、1H）、3.91（s、2H）、3.35（ bs、4H）、2.98（bs、4H）、2.89（s、3H）、2.80（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H31N6O [M + H +]の場合：455.2559、実測値：455.2559。
メチル（3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）カルバメート（化合物7al）の準備
【化１２４】
2021518856.tif 000126
【０３６７】
化合物７ａｌは、（３ −（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（１３ｂ、１４．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、メチル（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−）を得た。イル）フェニル）カルバメート（7al、8.5 mg、19％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.74（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.59（d、J= 2.0 Hz、1H）、7.98（s、1H）、7.83 - 7.78（m、3H） 、7.56（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.41 - 7.37（m、2H）、7.36- 7.27（m、1H）、3.97（s、2H）、3.77（s、3H）、3.38（bs、4H ）、3.04（bs、4H）、2.91（s、3H）ppm。 HRMS（APCI+、m / z）：計算値。 C27H30N5O2 [M + H +]の場合：456.2400、実測値：456.2400。
1-メチル-3-（4-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（化合物午前7時）の準備
【化１２５】
2021518856.tif 000127
【０３６８】
化合物７ａｍは、（４−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ｃ、１４．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−メチル−３−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ）を得た。 ]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（午前7時、5.1mg、収率22％）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.63（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.56（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.76（s、1H）、7.74（d、J= 4.6 Hz 、2H）、7.65 - 7.60（m、2H）、7.55（d、J = 8.1 Hz、2H）、7.52 - 7.45（m、2H）、3.92（s、2H）、3.36（bs、4H）、2.99（bs、4H）、2.90（s、3H）、2.80（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H31N6O [M + H +]の場合：455.2559、実測値：455.2566。
メチル（4-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）カルバメート（化合物7an）の準備
【化１２６】
2021518856.tif 000128
【０３６９】
化合物７ａｎは、（４ −（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（１３ｄ、１４．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、メチル（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−）を得た。イル）フェニル）カルバメート（7an、7.6 mg、33％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.68（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.59（d、J= 2.0 Hz、1H）、7.82 - 7.72（m、3H）、7.65（d、J = 8.7 Hz、2H）、7.61■7.51（m、4H）、4.04（s、3H）、3.76（s、2H）、3.43（bs、4H）、3.13（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H30N5O2 [M + H +]の場合：456.2400、実測値：456.2397。
3-（4-（（4-メトキシベンジル）オキシ）フェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7ao）の準備
【化１２７】
2021518856.tif 000129
【０３７０】
化合物７ａｏは、４−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニルボロン酸（１９．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（４−（（４−メトキシベンジル）オキシ）フェニル）−５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロを得た。 [2,3-b]ピリジン（7ao、20.4 mg、79％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.69（dd、J= 7.3、1.9 Hz、2H）、8.59（d、J = 1.8 Hz、1H）、7.77（dd、J = 8.3、1.6 Hz、2H） 、7.72（d、J =8.2 Hz、1H）、7.66 - 7.51（m、3H）、7.37（dd、J = 8.7、6.9 Hz、2H）、7.28 - 7.03（m、1H）、6.98 -6.77（m 、3H）、5.05（s、2H）、4.06（s、2H）、3.80（s、3H）、3.44（bs、4H）、3.16（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C33H35N4O2 [M + H +]の場合：519.2760、実測値：519.2755。
5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-（3,4,5-トリメトキシフェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（コンパウンド7ap）の準備
【化１２８】
2021518856.tif 000130
【０３７１】
化合物７ａｐは、３，４，５−トリメトキシフェニルボロン酸（１５．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−３-b]ピリジン（7ap、19.2 mg、81％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.67（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.60（d、J= 1.9 Hz、1H）、7.81（s、1H）、7.78（d、J = 8.2 Hz 、2H）、7.59（d、J = 8.2 Hz、2H）、6.96（s、2H）、4.10（s、2H）、3.92（s、6H）、3.82（s、3H）、3.46（bs、4H）、3.20（bs、4H）、2.93（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C28H33N4O3 [M + H +]の場合：473.2553、実測値：473.2554。
3-（4-メトキシ-3-メチルフェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7aq）の準備
【化１２９】
2021518856.tif 000131
【０３７２】
化合物７ａｑは、４−メトキシ−３−メチルフェニルボロン酸（１２．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（４−メトキシ−３−メチルフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３ -b]ピリジン（7aq、17.2 mg、81％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.69（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.59（d、J = 1.9 Hz、1H）、7.77（d、J =8.2 Hz、2H）、7.72（s 、1H）、7.59（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.51（dd、J = 8.4、2.3 Hz、1H）、7.48 -7.44（m、1H）、7.03（d、J = 8.4 Hz、1H） 、4.03（s、2H）、3.88（s、3H）、3.43（bs、4H）、3.12（bs、4H）、2.92（s、3H）、2.28（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H31N4O [M + H +]の場合：427.2498、実測値：427.2501。
3-（3-（ベンジルオキシ）フェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7ar）の準備
【化１３０】
2021518856.tif 000132
【０３７３】
化合物７ａｒは、３−（ベンジルオキシ）フェニルボロン酸（１７．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護のための一般的な手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（３−（ベンジルオキシ）フェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３− b]ピリジン（7ar、15.4 mg、63％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.58（s、2H）、7.79（s、1H）、7.74（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.58（d、J =8.2 Hz、2H）、7.49 - 7.43（m、2H）、7.43 - 7.22（m、6H）、7.06 - 6.96（m、1H）、5.17（s、2H）、4.06（s、2H）、3.43（bs、4H）、3.15（bs、4H）、2.92（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C32H33N4O [M + H +]の場合：489.2654、実測値：489.2657。
3-（2-クロロフェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物7as）の準備
【化１３１】
2021518856.tif 000133
【０３７４】
化合物７ａｓは、２−クロロフェニルボロン酸（１７．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護のための一般的な手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２−クロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを得た。 （7as、16.6mg、80％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.60（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.32（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.74（s、1H）、7.72（d、J= 8.2 Hz 、2H）、7.59（ddd、J = 7.7、4.0、1.7 Hz、2H）、7.55（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.43（td、J =7.5、1.7 Hz、1H）、7.38（td、 J = 7.5、2.0 Hz、1H）、4.01（s、2H）、3.41（bs、4H）、3.10（bs、4H）、2.91（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C25H26N4Cl [M + H +]の場合：417.1846、実測値：417.1849。
3-（2-メトキシフェニル）-5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（コンパウンド7at）の準備
【化１３２】
2021518856.tif 000134
【０３７５】
化合物７ａｔは、２−メトキシフェニルボロン酸（１１．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２−メトキシフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジンを得た。 （7at、17.1mg、83％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.61（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.58（d、J = 1.9 Hz、1H）、7.80（s、1H）、7.75（d、J= 8.2 Hz 、2H）、7.61 - 7.54（m、3H）、7.38（ddd、J = 8.3、7.4、1.7 Hz、1H）、7.16（dd、J = 8.3、1.1Hz、1H）、7.08（td、J = 7.4 、1.1 Hz、1H）、4.02（s、2H）、3.86（s、3H）、3.42（s、4H）、3.11（s、4H）、2.92（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C26H29N4O [M + H +]の場合：413.2341、実測値：413.2337。
1-（3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）-3-フェニル尿素（化合物7au）の準備
【化１３３】
2021518856.tif 000135
【０３７６】
化合物７ａｕは、（３−（３−フェニルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ｅ、１９．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を使用して、上記の鈴木カップリングおよびインサイチュ脱保護の一般的手順に従って調製した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３）を得た。 -イル）フェニル）-3-フェニル尿素（7au、5.4mg、21％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.61（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.51（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.08（s、1H）、7.78- 7.71（m、3H） 、7.60（d、J = 6.9 Hz、2H）、7.49（d、J = 8.0 Hz、2H）、7.46 - 7.40（m、1H）、7.41- 7.36（m、2H）、7.36 - 7.27（m、2H ）、7.24 - 7.17（m、1H）、3.76（s、2H）、3.13（bs、8H）、2.85（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C32H33N6O [M + H +]の場合：517.2716、実測値：517.2713。
2-フルオロ-N-（フラン-2-イルメチル）-5-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）ベンズアミド（化合物7av）の準備
【化１３４】
2021518856.tif 000136
スキーム3：化合物7avの合成。
【０３７７】
２−フルオロ−５−（５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）安息香酸（７ｉ、3.3 mg、7.4 μmol）、EDC■HCl（2.8 mg、14.8μmol、2.0 eq）、およびHOBT（2.0 mg、14.8 μmol、2.0 eq）をDMF（1.0 mL）に溶解しました。フルフリルアミン（1.4mg、1.3μL、14.8μmol、2.0当量）およびEt3N（1.5mg、2.0μL、14.8μmol、2.0当量）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を分取ＨＰＬＣ精製によって精製して、２−フルオロ−Ｎ−（フラン−２−イルメチル）−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）を得た。フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）ベンズアミド（7av、3.8 mg、98％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.54（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.52（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.08（dd、J= 6.9、2.4 Hz、1H）、7.88 （ddd、J = 8.6、4.8、2.4 Hz、1H）、7.78（s、1H）、7.73（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.52（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.44（dd、 J = 1.9、0.9 Hz、1H）、7.32（dd、J = 10.7、8.6 Hz、1H）、6.37（dd、J= 3.2、1.9 Hz、1H）、6.33（dd、J = 3.2、0.9 Hz、1H ）、4.61（s、2H）、3.84（s、2H）、2.97 - 2.84（m、8H）、2.88（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C31H31FN5O2 [M + H +]の場合：524.2462、実測値：524.2452。
1-シクロヘキシル-3-（4-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（化合物7aw）の準備
【化１３５】
2021518856.tif 000137
スキーム4：化合物7awの合成。
【０３７８】
４?（５?（４ ?（（４?メチルピペラジン?１?イル）メチル）フェニル）?１Ｈ?ピロロ［２，３?ｂ］ピリジン?３?イル）アニリン（７ｅ、１０ｍｇ、０．０２５）ミリモル、2.5当量）をDCM（0.5mL）に溶解し、トリエチルアミン（10mg、14μL、0.1ミリモル、10当量）を加えた。この溶液を、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のトリホスゲン（３．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に滴下して加え、室温で５分間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のシクロヘキシルアミン（１９．８ｍｇ、２３μＬ、０．２ｍｍｏｌ、２０．０当量）の溶液に加え、一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を分取ＨＰＬＣ精製によって精製して、１−シクロヘキシル−３−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［ 2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（7aw、2.8 mg、54％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.53（m、2H）、7.72（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.68（s、1H）、7.64 -7.59（m、2H）、7.52（d、 J = 8.2 Hz、2H）、7.49 - 7.44（m、2H）、3.82（s、2H）、3.65 - 3.54（m、1H）、3.00- 2.74（bs、8H）、2.88（s、3H）、2.00 - 1.90（m、2H）、1.84 - 1.71（m、2H）、1.65（d、J = 12.9 Hz、1H）、1.48- 1.34（m、2H）、1.36 - 1.16（m、3H）ppm HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C32H39N6O [M + H +]の場合：523.3185、実測値：523.3182。
（R）-1-（3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）-3-（1-フェニルエチル）尿素（コンパウンド7ax）の準備
【化１３６】
2021518856.tif 000138
スキーム5：化合物7axの合成。
【０３７９】
３−（５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７時間、１６ｍｇ、０．０４）。ミリモル、2.5当量）をDCM（1.0mL）に溶解し、トリエチルアミン（16.2mg、22μL、0.16ミリモル、10当量）を加えた。この溶液を、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中のトリホスゲン（４．７５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に滴下して加え、室温で５分間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中の（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミン（３８．８ｍｇ、４１μＬ、０．３２ｍｍｏｌ、２０．０当量）の溶液に加え、一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を分取ＨＰＬＣ精製によって精製して、（Ｒ）−１−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［ 2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）-3-（1-フェニルエチル）尿素（7ax、6.7mg、31％収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.65（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.54（d、J = 2.1 Hz、1H）、7.94（s、1H）、7.78- 7.72（m、3H） 、7.51（d、J = 8.0 Hz、2H）、7.42 - 7.28（m、6H）、7.23（t、J = 7.0 Hz、1H）、7.18- 7.11（m、1H）、4.95（q、J = 7.0 Hz、1H）、3.83（s、2H）、3.14 - 2.50（bs、8H）、2.88（s、3H）、1.50（d、J= 7.0 Hz、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C34H37N6O [M + H +]の場合：545.3029、実測値：545.3027。
1-（フラン-2-イルメチル）-3-（3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（コンパウンド7ay）の準備
【化１３７】
2021518856.tif 000139
スキーム6：化合物7ayの合成。
【０３８０】
３−（５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７時間、１６ｍｇ、０．０４）。ミリモル、2.5当量）をDCM（1.0mL）に溶解し、トリエチルアミン（16.2mg、22μL、0.16ミリモル、10当量）を加えた。この溶液を、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中のトリホスゲン（４．７５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に滴下して加え、室温で５分間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中のフルフリルアミン（３１．１ｍｇ、２８．３μＬ、０．３２ｍｍｏｌ、２０．０当量）の溶液に加え、一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を分取ＨＰＬＣ精製によって精製して、１−（フラン−２−イルメチル）−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）を得た。 ）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（7ay、8.6 mg、41％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.74（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.69 - 8.66（m、2H）、7.82 - 7.78（m、2H）、7.74（s、1H）、7.65（d、J = 7.9 Hz、2H）、7.41 - 7.34（m、4H）、6.35（dd、J = 3.2、1.9 Hz、1H）、6.28（dd、J = 3.2、0.8Hz、1H）、4.41（s 、2H）、3.89（s、2H）、3.21（bs、4H）、3.11（bs、4H）、2.89（s、3H）ppm。 HRMS（APCI+、m / z）：計算値。 C31H33N6O2 [M + H +]の場合：521.2665、実測値：521.2670。
1-（2-メトキシエチル）-3-（3-（5-（4-（（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（化合物7az）の準備
【化１３８】
2021518856.tif 000140
スキーム7：化合物7azの合成。
【０３８１】
３−（５−（４ −（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７時間、１６ｍｇ、０．０４）。ミリモル、2.5当量）をDCM（1.0mL）に溶解し、トリエチルアミン（16.2mg、22μL、0.16ミリモル、10当量）を加えた。この溶液を、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中のトリホスゲン（４．７５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に滴下して加え、室温で５分間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中の２−メトキシエタン−１−アミン（２４．０ｍｇ、２７．８μＬ、０．３２ｍｍｏｌ、２０．０当量）の溶液に加え、一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を分取ＨＰＬＣ精製によって精製して、１−（２−メトキシエチル）−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−を得た。 1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）フェニル）尿素（7az、4.0 mg、20％収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.78（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.60（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.48（d、J =2.0 Hz、1H）、7.81（s 、1H）、7.76（s、1H）、7.61 - 7.53（m、4H）、7.45 - 7.25（m、4H）、3.54（s、2H）、3.50（s、2H）、3.47（s、3H）、3.27 - 3.12（bs、8H）、2.87（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C29H35N6O2 [M + H +]の場合：499.2821、実測値：499.2827。
例3
化合物9a■9cの合成
【０３８２】
化合物９ａ■９ｃを得るための一般的な経路は、以下に示される合成に従う。各化合物の調製も提供されます。
【化１３９】
2021518856.tif 000141
スキーム8：化合物9a■9cの一般的な合成スキーム。
【０３８３】
５−ブロモ−３−ヨード−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１（８、１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ、１．０当量）を１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）に溶解した。。ボロン酸（2.3ミリモル、1.1当量）を加え、続いてPd（PPh3）2Cl2（70mg、0.1ミリモル、5モル％）を加えた。反応混合物を、アルゴン下での超音波処理によって脱気した。水性Na2CO3を加え、反応混合物を完全に完了するまで（通常8時間）45℃で撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃとブラインとの間で分配し、層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発させた。粗物質をシリカのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中0■50％のEtOAc）で精製して、所望の生成物（9a-c）を得た。
4-（5-ブロモ-1-トシル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）-1H-インダゾール（化合物9a）の準備
【化１４０】
2021518856.tif 000142
【０３８４】
上記の一般的手順に従って、４−（５−ブロモ−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（９ａ）をタン−として単離した。着色された固体（461mg、47％の収率）。 1H NMR（400 MHz、クロロホルム-d）δ10.29（bs、1H）、8.53（d、J = 2.2Hz、1H）、8.19 - 8.13（m、2H）、8.13 - 8.10（m、2H）、8.05（8.05（ s、1H）、7.55（d、J = 8.4 Hz、1H）、7.49（dd、J= 8.4、6.9 Hz、1H）、7.37 - 7.31（m、2H）、7.29（dd、J = 6.9、1.0 Hz 、1H）、2.41（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C21H16N4O2SBr [M + H +]の場合：467.0177、実測値：467.0176。
5-ブロモ-3-（3-フルオロフェニル）-1-トシル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物9b）の準備
【化１４１】
2021518856.tif 000143
【０３８５】
上記の一般的手順に従って、５−ブロモ−３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（９ｂ）を無色の固体として単離した（６１７ｍｇ、 67％の収率）。 1H NMR（400 MHz、クロロホルム-d）δ8.50（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.19（d、J =2.1 Hz、1H）、8.09（d、J = 8.4 Hz、2H）、7.90（s 、1H）、7.44（td、J = 8.0、5.9 Hz、1H）、7.36 -7.28（m、3H）、7.27 - 7.21（m、1H）、7.08（tdd、J = 8.4、2.6、1.0 Hz、1H ）、2.39（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C20H15N2O2FSBr [M + H +]の場合：445.0022、実測値：445.0020。
5-ブロモ-3-（3-クロロフェニル）-1-トシル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物9c）の準備
【化１４２】
2021518856.tif 000144
【０３８６】
上記の一般的手順に従って、５−ブロモ−３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（９ｃ）を無色の固体として単離した（８５０ｍｇ、 88％の収率）。 1H NMR（400 MHz、クロロホルム-d）δ8.50（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.18（d、J =2.1 Hz、1H）、8.09（d、J = 8.4 Hz、2H）、7.89（s 、1H）、7.56 - 7.50（m、1H）、7.46 - 7.40（m、2H）、7.40- 7.34（m、1H）、7.31（d、J = 7.8 Hz、2H）、2.39（s、3H）ppm 。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。C20H15N2O2SBrCl [M + H +]の場合：460.9726、実測値：460.9715。
例4
化合物10a■10cの合成
【０３８７】
化合物１０ａ■１０ｃを得るための一般的な経路は、以下に示される合成に従う。各化合物の調製も提供されます。
【化１４３】
2021518856.tif 000145
スキーム9：化合物10a■10cの一般的な合成スキーム。
【０３８８】
基質（９ａ■ｃ、１．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を圧力管内で１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）に溶解し、そして４−ホルミルフェニルボロン酸（２２５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。。反応混合物をアルゴン下での超音波処理により脱気し、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１１６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１０モル％）を加えた。Na2CO3水溶液（12.5 mL、2.0 M）を加えた後、反応混合物を100oCで一晩撹拌した。粗混合物をＥｔＯＡｃとブラインとの間で分配し、層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、セライトで濾過した。溶媒を蒸発させ、粗物質をシリカのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中0■100％のEtOAc）で精製して、所望の生成物（10a-c）を得た。
4-（3-（1H-インダゾール-4-イル）-1-トシル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（化合物10a）の準備
【化１４４】
2021518856.tif 000146
【０３８９】
上記の一般的手順に従って、４−（３−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ａ）は、黄褐色の固体として単離された（350mg、71％収率）。 1H NMR（400 MHz、クロロホルム-d）δ10.37（bs、1H）、10.06（s、1H）、8.78（d、J= 2.2 Hz、1H）、8.23 - 8.17（m、3H）、8.14（d、 J = 1.1 Hz、1H）、8.10（s、1H）、7.96（d、J = 8.3Hz、2H）、7.72（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.59 - 7.51（m、2H）、7.40 - 7.32（m、3H）、2.41（s、3H）ppmHRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C28H21N4O3S [M + H +]の場合：493.1334、実測値：493.1329。
4-（3-（3-フルオロフェニル）-1-トシル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（化合物10b）の準備
【化１４５】
2021518856.tif 000147
【０３９０】
上記の一般的手順に従って、４−（３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｂ）を無色として単離した。固体（466 mg、99％収率）。 1H NMR（400 MHz、クロロホルム-d）δ10.08（s、1H）、8.74（d、J = 2.1Hz、1H）、8.26（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.16（d、J = 8.4 Hz 、2H）、7.99（d、J = 8.4 Hz、2H）、7.96（s、1H）、7.74（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.47（td、J = 7.9、5.8 Hz、1H）、7.40 （dt、J = 7.7、1.3 Hz、1H）、7.36 - 7.28（m、3H）、7.10（tdd、J= 8.4、2.6、1.1 Hz、1H）、2.40（s、3H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H20N2O3FS [M + H+]の場合：471.1179、実測値：471.1185。
4-（3-（3-クロロフェニル）-1-トシル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（化合物10c）の準備
【化１４６】
2021518856.tif 000148
【０３９１】
上記の一般的手順に従って、２．０ミリモルの出発物質、４−（３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒドにスケールアップした。（10c）を無色の固体として単離した（730mg、87％収率）。 1H NMR（400 MHz、クロロフォーム-d）δ10.08（s、1H）、8.74（d、J= 2.1 Hz、1H）、8.24（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.16（d、J = 8.4 Hz 、2H）、7.99（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.95（s、1H）、7.74（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.59（t、J = 1.8 Hz、1H）、7.50（dt 、J = 7.6、1.5 Hz、1H）、7.43（t、J = 7.7Hz、1H）、7.38（ddd、J = 7.9、2.0、1.3 Hz、1H）、7.36 - 7.29（m、2H）、2.40（2.40（ s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H20N2O3ClS [M + H +]の場合：487.0883、実測値：487.0878。
例5
化合物12a■12lの合成
【０３９２】
化合物１２ａ■１２ｌを得るための一般的な経路は、以下に示される合成に従う。各化合物の調製も提供されます。
【化１４７】
2021518856.tif 000149
スキーム10：化合物12a■12lの一般的な合成スキーム。
【０３９３】
二環式ピペラジン類似体１２ｅおよび１２ｆの詳細な合成は、以下のスキームに示されている。
【化１４８】
2021518856.tif 000150
スキーム11：化合物12eおよび12fの合成。
【０３９４】
マウス肝臓ミクロソームにおける類似体１２ｇ■１２ｌの合成およびそれらの半減期は、以下のスキームに示されている。
【化１４９】
2021518856.tif 000151
スキーム12：（A）類似体12g -12lの合成。 （B）類似体12g- 12lおよびそれらの半減期の構造は、マウス肝ミクロソームに存在します。
【０３９５】
アルデヒド（１０ａ■ｃ、または１１（ＧｏｄｆｅｌｌｏｗＶＳら、２０１３））（０．５ミリモル、１．０当量）をジクロロメタンおよび対応するアミン（１．０ミリモル、２．０当量）およびＮａ（ＯＡｃ）３ＢＨに溶解した。 （159mg、0.75mmol、1.5当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、ジクロロメタンとブラインとの間で分配した。水層をジクロロメタン（2x）で抽出し、合わせた有機層をNa2 SO 4で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発させた。粗生成物をさらに精製することなく脱保護工程で使用した。
【０３９６】
中間体をアセトン（２０ｍＬ）、メタノール（３０ｍＬ）およびＮａＯＨ水溶液（２．０Ｍ、１５ｍＬ）の混合物に溶解し、６５℃で３時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルとＮａＯＨ水溶液（１．０Ｍ）との間で分配した。層を分離し、水層を酢酸エチル（2x）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Na 2 SO 4で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。粗物質を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、生成物（１２ａ■１）を得た。
3-（4-（3-（1H-インドール-5-イル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イル）ベンジル）-8-オキサ-3-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（化合物12a）の準備
【化１５０】
2021518856.tif 000152
【０３９７】
上記の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１１、出発物質として100mg、0.2mmol）および8-オキサ-3-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（45mg、0.4mmol、2.0当量）、3-（4-（3-（1H-インドール-5-イル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イル）ベンジル）-8-オキサ-3-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（12a）を薄茶色の固体（37.2mg、 2ステップで43％の収率）。 1H NMR（500 MHz、メタノール-d4）δ8.42（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.40（d、J =2.1 Hz、1H）、7.83（d、J = 1.5 Hz、1H）、7.55（s 、1H）、7.52（d、J = 8.1 Hz、2H）、7.47（d、J =8.4 Hz、1H）、7.46 - 7.39（m、1H）、7.33（d、J = 7.9 Hz、2H）、7.24 （d、J = 3.1 Hz、1H）、6.49（dd、J= 3.1、0.8 Hz、1H）、4.20（dd、J = 4.7、2.3 Hz、2H）、3.41（s、2H）、2.52（d、 J = 11.5 Hz、2H）、2.25（dd、J= 11.4、2.1 Hz、2H）、2.00 - 1.90（m、3H）、1.86 - 1.73（m、2H）ppm HRMS（APCI +、m / z）：計算値。C32H33N6O [M + H +]の場合：517.2716、実測値：517.2713。
3-（1H-インドール-5-イル）-5-（4-（（8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2、3-b]ピリジン（化合物12b）の準備
【化１５１】
2021518856.tif 000153
【０３９８】
上記の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１１、出発物質として67.1mg、0.137mmol）および8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン（16b、55.5mg、0.44mmol、3.2当量）、3-（1H-インドール-5-イル）-5-（4-（（8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（12b）は次のように単離されました。黄褐色の固体（2.6mg、2ステップで4％の収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.57（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.51（d、J = 2.0Hz、1H）、7.87（dd、J = 1.6、0.7 Hz、1H）、7.70 （d、J = 8.1 Hz、2H）、7.65（s、1H）、7.56 - 7.38（m、5H）、7.27（d、J= 3.2 Hz、1H）、3.88（s、2H）、3.70（s、 2H）、2.95（d、J = 12.6 Hz、2H）、2.80（s、3H）、2.57（d、J= 13.0 Hz、2H）、2.23（s、4H）ppm HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C29H30N5 [M + H +]の場合：448.2501、実測値：448.2505。
3-（1H-インドール-5-イル）-5-（4-（（3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-8-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2、3-b]ピリジン（化合物12c）の準備
【化１５２】
2021518856.tif 000154
【０３９９】
上記の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１１、出発物質として60.2mg、0.122mmol）および3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン（16a、36.6mg、0.29mmol、2.4当量）、3-（1H-インドール-5-イル）-5-（4-（（3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-8-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（12c）は次のように単離されました。黄褐色の固体（9.6mg、2ステップで18％の収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.74（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.60（d、J = 2.0Hz、1H）、7.88（dd、J = 1.7、0.8 Hz、1H）、7.86 - 7.79（m、2H）、7.74（s、1H）、7.68 - 7.64（m、3H）、7.54- 7.50（m、1H）、7.48 - 7.43（m、2H）、4.12（s、2H）、3.84 （bs、4H）、3.29（d、J = 2.7 Hz、2H）、3.10（bs、4H）、2.69（s、3H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C29H30N5 [M + H +]の場合：448.2501、実測値：448.2503。
4-（5-（4-（（8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）-1H-インダゾール（化合物12d）の準備
【化１５３】
2021518856.tif 000155
【０４００】
上記の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ａ、出発物質として49.2mg、0.1mmol）および8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン（16b、39.1mg、0.31mmol、3.1当量）、4-（5-（4-（（8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）-1H-インダゾール（12d）は次のように単離されました。薄茶色の固体（11.7mg、2ステップで26％の収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.61（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.55（d、J = 2.0Hz、1H）、8.18（d、J = 0.9 Hz、1H）、7.95（s 、1H）、7.67（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.55 - 7.50（m、2H）、7.47（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.43（dd、J = 6.5、1.4 Hz、1H） 、3.88（s、2H）、3.70（s、2H）、2.94（dd、J = 13.1、2.8Hz、2H）、2.80（s、3H）、2.67 - 2.62（m、2H）、2.27 - 2.19（bs 、4H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。C28H29N6 [M + H +]の場合：449.2454、実測値：449.2462。
4-（5-（4-（（3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-8-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）-1H-インダゾール（化合物12e）の準備
【化１５４】
2021518856.tif 000156
【０４０１】
上記の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ａ、出発物質として49.2mg、0.1mmol）および3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン（16a、34.0mg、0.27mmol、2.7当量）、4-（5-（4-（（3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-8-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル）-1H-インダゾール（12e）は次のように単離されました。薄茶色の固体（12.0mg、2ステップで27％の収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.60（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.45（d、J = 2.1Hz、1H）、8.18（d、J = 0.7 Hz、1H）、7.90（s 、1H）、7.77（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.62（d、J = 8.2Hz、2H）、7.54 - 7.51（m、2H）、7.43（dd、J = 5.6、2.3 Hz、1H） 、4.09（s、2H）、3.80（s、2H）、3.18（d、J= 11.9 Hz、2H）、2.94（d、J = 12.6 Hz、2H）、2.61（s、3H）、2.45 - 2.36（ m、2H）、2.14（d、J =8.6 Hz、2H）ppm。 HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C28H29N6 [M + H +]の場合：449.2454、実測値：449.2455。
3-（3-クロロフェニル）-5-（4-（（3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-8-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（化合物12f）の準備
【化１５５】
2021518856.tif 000157
【０４０２】
上記の一般的手順に従い、４−（３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｃ、４８．６ｍｇ、０．１出発物質としての3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン（16a、25.2 mg、0.2 mmol、2.0 eq）、3-（3-クロロフェニル）-5-（4-（（3-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-8-イル）メチル）フェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（12f）を淡黄色の固体（18.0mg）として単離した。 、2ステップで41％の収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.54（d、J = 2.1 Hz、1H）、8.46（d、J= 2.1 Hz、1H）、7.81 - 7.75（m、3H）、7.70（t、J = 1.9 Hz、1H）、7.68 - 7.61（m、3H）、7.45（t、J= 7.9 Hz、1H）、7.30（ddd、J = 8.0、2.1、1.0 Hz、1H）、4.11（s、2H）、 3.82（s、2H）、3.25 - 3.16（m、2H）、3.04- 2.94（m、2H）、2.62（s、3H）、2.42（dd、J = 9.6、4.7 Hz、2H）、2.17（t、 J = 7.3 Hz、2H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C27H28N4Cl [M + H +]の場合：443.2002、実測値：443.2005。
5-（4-（[1,4'-ビピペリジン]-1'-イルメチル）フェニル）-3-（3-フルオロフェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（コンパウンド12g）の準備
【化１５６】
2021518856.tif 000158
【０４０３】
上記の一般的手順に従い、４−（３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｂ、２６．０ｍｇ、０．０５５）を用いて。出発物質としての4-ピペリジノピペリジン（18.6mg、0.11mmol、2.0当量）、5-（4-（[1,4'-ビピペリジン] -1'-イルメチル）フェニル）-3-（3-フルオロフェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン（12g）をオフホワイトの固体として単離した（6.2mg、2ステップで24％の収率）。 1H NMR（400 MHz、メタノール-d4）δ8.58（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.56（d、J = 2.1Hz、1H）、7.86（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.82（s 、1H）、7.66（d、J = 8.2 Hz、2H）、7.57 - 7.53（m、1H）、7.52- 7.42（m、2H）、7.04（tdd、J = 8.2、2.6、1.0 Hz、1H）、 4.43（s、2H）、3.72（d、J = 12.9 Hz、2H）、3.63- 3.47（m、4H）、3.23 - 3.12（m、4H）、3.03（t、J = 11.3 Hz、2H）、2.41 （d、J = 13.5 Hz、2H）、2.20- 2.08（m、3H）、2.04 - 1.94（m、2H）、1.86 - 1.73（m、2H）、1.64 - 1.46（m、1H）、1.42 - 1.26 （m、2H）ppm。HRMS（APCI +、m / z）：計算値。 C30H34N4F [M + H +]の場合：469.2768、実測値：469.2771。
2-（4-（4-（3-（3-フルオロフェニル）-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-5-イル）ベンジル）ピペラジン-1-イル）エタン-1-オール（化合物12時間）の準備
【化１５７】
2021518856.tif 000159
【０４０４】
上述した一般的な方法に従って用いて、4-（3-（3-フルオロフェニル）-1-トシル1 Hピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（10B 、318 mgを、0.675 mmol）および1-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン（176ミリグラム、166μL、1.35ミリモル、2.0当量）を出発物質として2-（4-（4-（3-（3-フルオロフェニル）-1H -ピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンジル）ピペラジン-1-イル）エタン-1-オール（12Hは）をオフホワイトの固体（153.7 mgの、2つの工程にわたって53％収率）として単離しました。1H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ8.62（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.60（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.85（s、1H）、7.80（d、J= 8.2 Hz、2H）、7.62（d、J = 8. 2 Hz、2H）、7.55（dt、J = 7.8、1.3 Hz、1H）、7.51 - 7.42（m、2H）、7.05（dddd、J= 9.0 、8.2、2.6、1.1 Hz、1H）、4.22（s、2 H）、3.95 - 3.85（m、2H）、3.58（bs 、4H）、3.34（bs 、6H）ppm。HRMS（APCI + 、m / z）：計算値。C 26 H 28 N 4 OF [M + H + ]の場合：431.2247、実測値：431.2250。 
（R ）-1-（4-（3-（3-Fのフルオロフェニル）-1H -ピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンジル）ピロリジン-3-オール（化合物12i）の準備
【化１５８】
2021518856.tif 000160
【０４０５】
上述した一般的な方法に従って用いて、4-（3-（3-フルオロフェニル）-1-トシル1 Hピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（10B 、318 mgを、0.675 mmol）および（R出発材料として）-3-ピロリジノール（118ミリグラム、109μL、1.35ミリモル、2.0当量）、 （R ）-1-（4-（3-（3-フルオロフェニル）-1H -ピロロ[2,3 - b ]ピリジン-5-イル）ベンジル）ピロリジン-3-オール（12i ）をオフホワイトの固体として単離した（113mg、2段階で43％の収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ8.56（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.53（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.84 -7.77（m、3H）、7.68 - 7.61（ m、2H）、7.52（dt、J = 7.8、1.3 Hz、1H）、7.50 - 7.38（m、2H）、7.02（dddd、J= 9.0、8.2、2.6、1.1 Hz、1H）、4.66 - 4.34（ m、3H）、3.82 - 3.42（m、2H）、3.41 - 3.20（m、2H）、2.49- 1.92（m、2H）ppm 。HRMS（APCI + 、m / z）：計算値。C 24 H 23 N 3 OF [M + H + ]の場合：388.1825、実測値：388.1824。
5-（4 - （（4-（tert-ブチル-ブチル）ピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3-（3-フルオロフェニル）-1H -ピロロ[2,3- B ]ピリジン（化合物12j）の準備
【化１５９】
2021518856.tif 000161
【０４０６】
上述した一般的な方法に従って用いて、4-（3-（3-フルオロフェニル）-1-トシル1 Hピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（10B 、32.8mgを、 0.055ミリモル）および1- tert-ブチルピペラジン（15.7mg、0.11ミリモル、2.0当量）を出発物質として、5-（4-（（4-（tert-ブチル）ピペラジン-1-イル）メチル）フェニル）-3- （3-フルオロフェニル）-1 H -ピロロ[2,3- B ]ピリジン（12Jは）単離し、オフホワイトの固体（9.8 mgの、2つの工程にわたって40％収率）として得ました。1H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ8.63（d、J = 1.9 Hz、1H）、8.60（b s、1H）、7.85（s、1H）、7.83 - 7.78（m、2H）、7.65- 7.60（m、2H）、7.56（dt、J = 7.8、1.3 Hz、1H）、7.52 - 7.42（m、2H）、7.05（dddd、J = 9.0、8.2、2.6、1.0Hz、1H）、4.22 （s、2H）、3.89 - 3.04（m、8H）、1.44（s、9H）ppm 。HRMS（APCI + 、m / z）：計算値。C28 H 32 N 4 F [M + H + ]の場合：443.2611、実測値：443.2610。                                                       
2-（4-（4-（3-（3-クロロフェニル）-1H -ピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンジル）ピペラジン-1-イル）エタン-1-オール（化合物12k）の準備
【化１６０】
2021518856.tif 000162
【０４０７】
一般的な手順は、上述した後で、4-（3-（3-クロルOフェニル）-1-トシル1 Hピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（10C 、418ミリグラム出発物質として、0.86mmol）および1-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン（224ミリグラム、211μL、1.72ミリモル、2.0当量）、2-（4-（4-（3-（3-クロロフェニル）-1H -ピロロ[2,3 - b ]ピリジン-5-イル）ベンジル）ピペラジン-1-イル）エタン-1-オール（12k ）をオフホワイトの固体として単離した（139.9mg、2ステップで36％の収率） 。1 H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ8.57（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.54（d、J =2.0 Hz、1H）、7.80（s、1H）、7.76（d、J = 8.3 Hz、2H）、7.65（t、J = 1.9 Hz、1H）、7.64 - 7.57（m、3H）、7.42（t、J= 7.9 Hz、1H）、7.29（ddd、J = 8.0、2.1、1.0 Hz、1H）、4.27（s、2H）、3.93 - 3.86（m、2H）、3.62（s、4H）、3.41（s、4H）、3.35- 3.31（m、2H）ppm 。HRMS（APCI + 、m / z）：計算値。C 26 H 28 N 4 OCl [M + H + ]の場合：447.1952、実測値：447.1954。                                                      
（R ）-1-（4-（3-（3-クロロフェニル）-1H -ピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンジル）ピロリジン-3-オール（化合物12l）の準備
【化１６１】
2021518856.tif 000163
【０４０８】
一般的な手順は、上述した後で、4-（3-（3- CHLのorophenyl）-1-トシル1 Hピロロ[2,3- B ]ピリジン-5-イル）ベンズアルデヒド（10C 、177ミリグラム、0.86mmol）および（R ）-3-ピロリジノール（150ミリグラム、139μL、1.72ミリモル、2.0当量）を出発物質として、（R ）-1-（4-（3-（3-クロルOフェニル）-1-H-ピロロ[2,3 - b ]ピリジン-5-イル）ベンジル）ピロリジン-3-オール（12l ）をオフホワイトの固体として単離した（177mg 、2段階で51％の収率）。1H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ8.52（d、J = 2.0 Hz、1H）、8.42（d、J = 2.0 Hz、1H）、7.78 -7.71（m、3H）、7.64 - 7.60（ m、3H）、7.58（ddd、J = 7.7、1.7、1.1 Hz、1H）、7.39（t、J = 7.9 Hz、1H）、7.25（ddd、J= 8.0、2.2、1.0 Hz、1H）、4.58 （s、1H）、4.54 - 4.32（m、2H）、3.82 - 3.39（m、4H）、2.50 -1.96（m、2H）ppm 。HRMS（APCI + 、m / z）：計算値。C 24 H 23 N 3 OCl [M + H + ]の場合：404.1530、実測値：404.1529。                                                      
例6
合成のボロン酸13A - 13E
【０４０９】
化合物が得るための一般的経路13aは- 13Eは合成が以下に示す以下。各化合物の調製も提供されます。
【化１６２】
2021518856.tif 000164
スキーム13 ：のための一般合成スキーム化合物13A- 13E 。
【０４１０】
ボロン酸（３−アミノフェニルボロン酸または４−アミノフェニルボロン酸、８７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、２．５当量）をＤＣＭ（４ｍＬ）に懸濁し、トリエチルアミン（２０２ｍｇ、２７７μＬ、２．０ｍｍｏｌ、１０当量）を追加されました。得られた溶液を、ＤＣＭ（６ｍＬ）中の溶液トリホスゲン（５９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、１．０当量）に滴下して加え、室温で５分間撹拌した。アミン（0.6mmol、3当量）またはアルコール（過剰）を滴下し、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、トルエンを加え、そして溶媒を再び蒸発させた。粗物質をNMRで分析し、さらに精製することなく次のステップで使用しました。
（3-（3- Mエチルウレイド）フェニル）ボロン酸（化合物13a）の準備
【化１６３】
2021518856.tif 000165
【０４１１】
上記の一般的手順に従い、３−アミノフェニルボロン酸およびメチルアミンを用いて、（３−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ａ）をオフホワイトの固体として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。。1 H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ7.49（b s、1H）、7.38（b s、1H）、7.22（d、J= 5.3 Hz、2H）、2.77（s、3H）。
（3-（（Mエトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（化合物13b）の準備
【化１６４】
2021518856.tif 000166
【０４１２】
上記の一般的手順に従い、３−アミノフェニルボロン酸およびメタノールを用いて、（３−（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（１３ｂ）をオフホワイトの固体として単離し、それ以上せずに次のステップで使用した。精製。1 H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ7.59（bs、1H）、7.48（bs、1H）、7.26（d、J = 5.2Hz、2H）、3.73（s、3H）。
（4 - （3-Mエチルウレイド）フェニル）ボロン酸（化合物13c）の準備
【化１６５】
2021518856.tif 000167
【０４１３】
上記の一般的手順に従い、４−アミノフェニルボロン酸およびメチルアミンを用いて、（４−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ｃ）をオフホワイトの固体として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。。1 H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ7.62（d、J = 8.5 Hz、2H）、7.37（d、J =8.5 Hz、2H）、2.77（s、3H）。
（4 -（（Mエトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（化合物13d）の準備
【化１６６】
2021518856.tif 000168
【０４１４】
一般的な手順は、上述した後、4-アミノフェニルボロン酸とメタノール、（4 - （（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（13 、D ）として単離したオフホワイトの固体とすることなく、次の工程で使用しさらなる精製。1H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ7.65（d、J = 8.6 Hz、1H）、7.43（d、J = 8. 6 Hz、2H）、3.74（s、3H）。
（3-（3- Phenylureido）フェニル）ボロン酸（化合物13e）の準備
【化１６７】
2021518856.tif 000169
【０４１５】
上記の一般的手順に従い、３?アミノフェニルボロン酸およびアニリンを用いて、（３?（３?フェニルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ｅ）をオフホワイトの固体として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。。1 H NMR（400 MHz、メタノール-d 4 ）δ7.62（b s、1H）、7.51（d、J = 7.4 Hz、1H）、7.34- 7.23（m、2H）、7.08（dd、J = 8.5、 7.4 Hz、2H）、6.71（dt、J = 7.7、1.1 Hz、2H）、6.67（tt、J =7.4、1.1 Hz、1H）。
例7
合成の二環式ピペラジンの16aおよび16b
【０４１６】
化合物１６ａおよび１６ｂを得るための一般的な経路は、以下に示される合成に従う。各化合物の調製も提供されます。
【化１６８】
2021518856.tif 000170
スキーム14 ：化合物16aおよび16bの一般的な合成スキーム。
【０４１７】
Ｂｏｃ保護された二環式ピペラジン（１４ａ−ｂ； ２５０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＴＨＦ／ ＭｅＯＨ（１：１）の混合物に溶解した。ホルムアルデヒド（H 2 O中37％、287 μL、3.53 mmol、3.0eq）を加え、続いてNa（OAc）3 BH（274.5 mg、1.30 mmol、1.1 eq）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をシリカのカラムクロマトグラフィー（DCM中0■20％MeOH）で精製した。生成物のKMnO用いてTLCプレート上で可視化した4ステイン。
【０４１８】
Ｂｏｃ基を除去するために、生成物（１５ａ■ｂ）をＤＣＭに溶解し、過剰のＴＦＡを加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、トルエンを加え、そして溶媒を再び蒸発させた。粗生成物（16a-b ）は、さらに精製することなく次のステップで使用され、分光データは文献で報告されているものと一致しました（Paliulis Oet al 。、2007）。
例8
HGK（MAP4K4）は、化合物1およびその類似体の生物学的に関連性の高い標的です。
【０４１９】
上記で合成された類似体を用いて、個々の生存アッセイを、リアルタイムフィードバックおよびリアルタイムフィードバックを可能にするであろうＣＰＡ処理（３３μＭ）ヒト胚性幹細胞由来運動ニューロン（ＨＢ９：： ＧＦＰレポーター、およびＳＯＤ１ Ａ４Ｖ突然変異）で実施した。アッセイの最適化。次に、すべての類似体を使用して生存アッセイを一度に実行し、変動性の低いデータセットを生成しました。すべての化合物は、3つの技術的複製と2つの生物学的複製で、0.1■3.0 μM（5段階希釈）の範囲の濃度で評価されました。
【０４２０】
T O HGKリン酸化を阻害する類似体の能力を評価する、類似体は、高スループットに提出されたが、10μMATPの存在下で0.025μMまたは0.1μMの用量で反応生物学社からATPアッセイを放射標識。対照として、スタウロスポリンは、IC10用量で試験した50 20μMから始まる4倍連続希釈。このようにして、類似体がHGKに結合するかどうかだけでなく、それらがキナーゼ活性を妨げるかどうかもテストすることができました。テストされたアナログの約45％が0.025μMの用量でHGK活性の少なくとも半分を阻害し、それによって計算アナログ設計を検証することがわかりました。MLK1およびMLK3のリン酸化を阻害する類似体の能力も、10μMATPの存在下で0.1μMの用量で評価されました。全体として、MLK1およびMKL3の阻害は低かったが、それでも、試験した類似体の約40％が、0.1 μMの用量でMLK3活性の少なくとも半分を阻害した。
【０４２１】
次に、我々は、各類似体が酵素活性を抑制した程度と、それがＣＰＡ毒性を救済した程度との間の相関を評価した。全体として、CPA治療時の運動ニューロン生存率と％MLK1活性（R 2 = 0.40）または％MLK3活性（R 2 = 0.52）の間に中程度の相関が観察され（図7Aを参照）、MLK1とMLK3はERストレスおよびCPA誘導細胞死経路との関連での化合物1およびその類似体（7a- 7az ）の生物学的に関連する標的。
【０４２２】
非常に強い相関が観察された（R CPA処置および％HGKの活性に％の運動ニューロンの生存との間に2 = 0.84）（参照図7（b）、HGK、または密接に関連MAP4Kのメンバーが家族キナーゼことを示唆する）ことができCPA誘発性小胞体ストレスおよび運動ニューロン変性の状況において、化合物1およびその類似体（7a- 7az ）の生物学的に関連する標的であること。
【０４２３】
ＣＲＩＳＰＲ戦略は、ｍｏ使用ＥＳ細胞におけるＨＧＫ発現を完全に除去するために開発された（図１０Ａ）。使用されるES系統には、細胞表面マーカーCD14が運動ニューロン特異的HB9プロモーターの制御下で発現される導入遺伝子が含まれているため、運動ニューロンは、下流アッセイ用の磁気活性化セルソーティング（MACS）によって混合分化培養から精製できます。。CRISPR戦略には、キナーゼ活性を媒介するHGKのATP結合部分の上流と下流のゲノム領域を標的とする2つのガイドRNAが含まれます。二本鎖切断修復は、このシナリオでは非相同末端結合によって達成され、これは一般にフレームシフトと発現の完全な除去をもたらします。HGK除去は、ウエスタンブロッティングによって分化した運動ニューロンで確認されました（図10B）。
【０４２４】
ＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＧＫアブレーションは、ＣＰＡの用量の増加に伴う我々の典型的な４８時間の用量反応アッセイにおいて神経保護をもたらさなかった（図１０Ｃ）。このアッセイでは、運動ニューロンはMACSで精製され、イメージングの前にCPAで48時間処理されます。
【０４２５】
MACS精製WTまたはHGKノックアウト運動ニューロンが短時間（1■24時間）のみCPAで治療されるようにCPA治療パラダイムを調節することにより、HGKアブレーションが適度であるが統計的に有意な神経保護を提供することを観察できた。CPAに対して（図10D）。したがって、HGKはCPA治療後の細胞死カスケードにおいて初期の役割を果たします。しかしながら、その切除の効果が後の時点で検出できないという事実は、その不在下で最終的に引き継ぐ他の冗長なキナーゼが存在する可能性があることを示唆している。TNIKやMINK1などの他の構造的に相同なMAP4Kキナーゼは、小胞体ストレスの状況で神経変性を媒介するためにHGKと重複して作用する可能性があり、化合物1とその類似体はこれらの関連するすべてのMAP4Kを標的にしてニューロンの生存を促進する可能性があることを提案します（図31A ）。
【０４２６】
化合物１およびその類似体の生物学的に関連する標的をよりよく理解するために、第２ラウンドの無細胞キナーゼアッセイを実施した。この拡張アッセイでは、CPAアッセイで中程度から非常に強力な保護までの範囲の10の類似体を選択しました。これらの類似体は、0.1 μMおよび0.5 μMで60種類のキナーゼの選択を阻害する能力について評価されました。60個のキナーゼのこのリストは、化合物の既知の対象から得られた1（グッドフェローら、2013）レスキューを示した他のキナーゼ阻害剤の既知の標的は、であり、R文献からelevantターゲットを、K CPAにおいて保護的であった他のキナーゼ阻害剤の標的nown生存アッセイ、および文献からの関連する標的。RNAseqデータを使用して、ESMNにおける各キナーゼの発現を確認しました（実施例12を参照）。
【０４２７】
化合物１と比較して類似体間で標的選択性が増加するという包括的な傾向はなく、類似体生成のプロセス自体が選択性を改善せず、選択性も乱交もＣＰＡ生存アッセイにおいて神経保護で追跡されなかったことを示す。しかしながら、化合物7aはdが（化合物に同様に神経保護的であった1 0.5μMで、化合物60個のキナーゼが試験間で増加標的選択性を示しながら）1ながら強く、（<20％残存活性）60個のキナーゼの27を阻害する化合物7aはD強く60種類のキナーゼのうち12種類を阻害しました（図8）。
【０４２８】
比較的選択的な神経保護類似体の標的を化合物１の標的と比較することは、ＣＰＡ生存アッセイにおいて神経変性を軽減する可能性が最も高い標的を浮き彫りにする。HGKに加えて、選択的化合物7adは、TNIK、MINK1、KHS（M AP4K5）、GCK（MAP4K2）などの密接に関連するMAP4キナーゼを最も強く阻害します（図8）。これらの調査結果は、HGK、MINK、KHS、およびGCKが最もランクの高いターゲットの1つである予備スクリーニング（図3 ）からのヒット化合物の共有ターゲットの分析とも一致しています（TNIKアクティビティは既存の公的に利用可能なデータベース;Anastassiadis et al。、2011 ）。
【０４２９】
全体として、０．５μＭおよび０．１μＭでのＭＡＰ４Ｋ阻害と神経保護との間の化合物１およびその類似体について中程度の相関を観察したが（図３２）、中程度の神経保護化合物でさえＭＡＰ４Ｋを依然として強力に阻害するという事実を意味のある相関が覆い隠した可能性が高い。これらの濃度で。さらに、MAP4Kファミリーメンバーのキナーゼドメイン間の高度な構造的相同性により、個々のMAP4Kの阻害がCPAアッセイでの生存に機能的に関連しているか、単に偶発的であるかを解析することが困難になっています。
【０４３０】
したがって、他のものよりも個々のＭＡＰ４Ｋに選択的である化合物はほとんど存在しない。しかし、我々は、GCK、選択的阻害剤が見出さ（化合物17およびNG-25でタン。ら、2015 ;図9 ）の化合物の可能性の高い官能ターゲット狭くCPA生存アッセイにおいて、レスキューのMNすることができなかった1類似体HGK、MINK1、TNIK、KHS、またはそれらの組み合わせ（図33 ）。
【０４３１】
また、Larhammarら（2017）の最近の研究は、HGK、TNIK、及びMINK1を阻害する化合物は、神経栄養因子の除去に供一次後根神経節ニューロンにおいて神経保護的であることが示されている、と一緒にすべての3つのキナーゼの発現を減衰させること-個別ではありません-化合物の効果を反映しています（図31C）。彼らは、神経変性アッセイにおけるHGK、TNIK、およびMINK1の役割は冗長であり、単一のキナーゼを阻害する効果は、残りのキナーゼの活性によって克服できると主張しています。したがって、複数のMAP4キナーゼの複合阻害が、CPA処理ESMNにおける化合物1およびその類似体の神経保護効果の根底にある可能性があります（図31B）。
例9
類似体の代謝安定性
【０４３２】
T 、類似のテストO代謝安定性のinvitroミクロソーム安定性アッセイを行いました。このアッセイでは、小胞体ストレスアッセイで優れたレスキュー特性を示した類似体を、NADPH再生システムを含むバッファー中でマウス肝ミクロソームとインキュベートしました。アリコートを2時間かけて採取し、内部標準を使用してHPLC-MSで分析し、化合物の経時的な安定性を評価しました（図29）。
方法と材料
【０４３３】
ミクロソーム安定性アッセイは、９６ウェルフォーマット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＳｔｏｒＰｌｅｔ−９６Ｕ、ＰＰ、９６ウェル、丸底）で実施された。各ウェルにリン酸緩衝液（182.2 μL、pH 7.4、100 mM）を添加し、続いてNADPH再生システム溶液A（10 μL）、およびNADPH再生システム溶液B（2μL）（Corning Gentest 3PNADPH再生システム溶液A （＃451220）およびB（＃451200））。分析する化合物のストック溶液（0.8μL。5 mM）またはエトキシクマリン（ポジティブコントロール、0.8 μL、5 mM）を加え、混合物を37 ° Cで5分間温めました。マウスミクロソーム（CD-1、5μL、使用前に37 ° Cのウォーターバスで解凍、20 mg / mL、Life Technologies）を追加しました。選択した時点（0、15、30、45、60、および120分）で、アリコート（15μL）をプレートから取り出し、内部標準（5 μM）を含む冷アセトニトリル（60 μL）に添加してクエンチしました。 96ウェルプレート。サンプルを13,000rpmで10分間、4° Cで遠心分離しました。上清（40 μL）を取り出し、インサート付きのサンプルバイアルに移しました。サンプルはLC-MSで分析しました。
【０４３４】
ＬＣ−ＭＳ分析は、サーモサイエンティフィックダイオネックスアルティメット３０００と、ブルカーハイスター３．２によって制御されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたブルカーアマゾンＳＬとを含むプラットフォーム上で実施された。クロマトグラフィーによる分離は、20 ° Cに維持されたAgilent Eclipse Plus C18カラム（2.1 x 50 mm、3.5 μm）に5 μLのサンプルを注入することによって実行されました。流速は400μL / minに維持されました。初期フロー条件は、60％の溶媒A（0.1％の酢酸を含む水）と40％の溶媒B（0.1％の酢酸を含むメタノール）でした。溶媒Bは0.25分で60％に、6.75分で70％に上昇しました。溶媒Bは7.00分で95％に上昇し、8.00分で初期条件（40％）に戻り、合計実行時間は9.00分でした。
Rのesults
【０４３５】
最初に、１１個の類似体の選択が、マウス肝臓ミクロソームにおけるそれらの安定性について分析された（図１１）。ミクロソームでの半減期が30分未満の化合物は、クリアランス率が高いため、一般的に理想的な薬剤候補ではありません。以前に発表された研究によれば、化合物1のマウス肝ミクロソームでの半減期は比較的短いことがわかりました（T1/2 = 15分）。最初に評価された11個の類似体のうち、3つだけのアナログ（7Y 、7ad 、および7ATは）マウス肝ミクロソームにおける有望な半減期（>30分）を示しました。
【０４３６】
次に、半減期を改善するために化合物修飾を行った。計算機のドッキング実験は、メチル部分が露出溶媒であることを示しました。したがって、小胞体ストレスアッセイでの効力を維持（または改善）すると同時に、代謝安定性を高めることを目的として、類似体のピペラジングループを変更しました。
【０４３７】
のいずれかの二環式メチルの導入最も強力なアナログ（参照スキーム11 ）、9分（化合物の半減期を増加7AA 13分（化合物）12E ）。類似体のミクロソーム安定性をさらに高めるために、同じ二環式ピペラジンを、半減期が30分を超える最初のシリーズの類似体の1つに導入しました（スキーム11、化合物12f ）。この場合、半減期は38分（化合物7ad ）から158分（化合物12f ）に増加し、大幅に改善されました。化合物12fは、小胞体ストレスアッセイでより強力であり、0.3μMで完全なレスキューを示しましたが、0.5 μMを超える濃度でもわずかに高い毒性を示しました。効力とミクロソームの安定性を維持しながら、この毒性の増加を減らすために、7-アザインドール足場の3位にm-クロロフェニルまたはm-フルオロフェニル置換基を含む別の一連の類似体（スキーム12）を合成しました。
【０４３８】
Tこれらの化合物の彼効力を評価したERストレスアッセイで、その安定性を評価したミクロソーム安定性アッセイで。これらの化合物のうちの2つ、12gおよび12jは、必要なものよりも半減期が短いか、小胞体ストレスアッセイで効力の低下を示しました。残りの4つの化合物（12h、12i 、12k 、および12l ）は、運動ニューロンをCPA誘発性ERストレスから強力に救出し、0.3 μM未満の濃度でCPA治療の効果を完全に打ち消すことができました。これらの非常に強力な類似体のうち、12hおよび12kは、マウス肝ミクロソームでの安定性が向上しているため、さらなるinvivo研究の最も有望な候補でした（図11 ;図13A ）。
例10
薬物動態のEの評価化合物
改善のSのolubilitycが1とそのompound Aのnalogsを
【０４３９】
以前の刊行物は、５５％生理食塩水、４０％ＰＥＧ−４００、および５％ＤＭＳＯからなる化合物１のインビボ送達のための基礎製剤を記載した。驚いたことに、この製剤では、化合物1が細胞培養培地に非常に不溶性であることが観察されました。これは、製剤がinvivo実験に適していないことを示しています。ビヒクル製剤を最適化するために、化合物1とその類似体の溶解度に対するさまざまな濃度のpHと可溶化剤の影響を迅速にスクリーニングできる96ウェルフォーマットの分光光度アッセイを開発しました（図30）。
【０４４０】
異なるビヒクル製剤で希釈された化合物を、我々のインビボ投与スキームと一致する比率で透明な細胞培養培地に添加した。次に、プレートを分光光度計で540 nM、化合物が光を吸収しない波長で読み取り、光学密度を測定し、それらが光を遮る沈殿物を形成しているかどうかを判断しました。化合物1とその類似体を完全に可溶化するには、十分に特性化された安全性プロファイルを持つ環状糖オリゴマーである2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを添加するだけで十分であることがわかりました（図12）。
動物の治療
【０４４１】
すべての研究は、食物および水を自由に摂取できる１２時間の明／暗サイクルでコロンビア大学メディカルセンター施設に収容された６週齢の雄のＣ５７ＢＬ６／ Ｊマウスで実施された。すべての動物の手順は、コロンビア大学IACUCによって承認されました。化合物１およびその類似体は、２０％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（１１％の最終濃度）＋４０％のＰＥＧ−４００ ＋ ５％のＤＭＳＯを含有する５０％のｄｄＨ ２ Ｏから構成されるビヒクルに処方された。動物の体重を測定し、示された用量（10または20mg/ kg）で腹腔内（IP）に1回注射した。30分後、動物を2.5％アベルチンで深く麻酔した。全血は、抗凝固剤として0.5M EDTAを含むチューブに心臓穿刺によって収集され、血漿を分離するために845rcf、4°で10分間遠心分離されました。心臓穿刺後、動物を断頭し、脳を解剖して体重を測定した。脳サンプルは、5倍量のddH2O中のガラスダウンスホモジナイザーでホモジナイズしました。脳と血漿のサンプルを液体窒素で急速凍結し、さらに処理する前に-80℃で保存しました。
血漿中の化合物濃度
【０４４２】
血漿サンプルをエッペンドルフチューブ（サンプルあたり５０μＬ）に移し、アセトニトリル（２００μＬ）で希釈した。サンプルを1分間超音波処理した後、16,000rpmで10分間遠心分離しました。上澄みを別のエッペンドルフチューブに移し、溶媒を一晩蒸発させた。サンプルは、40μLのアセトニトリルと10 μLの水の混合液で再構成し、インサート付きのサンプルバイアルに移し、LC-MSで分析しました。
脳内の化合物濃度
【０４４３】
均質化された脳サンプル（２５０μＬ）をエッペンドルフチューブに移し、アセトニトリル（７５０μＬ）で希釈した。サンプルを1分間超音波処理した後、16,000rpmで10分間遠心分離しました。上澄み（900 μL）を別のエッペンドルフチューブに移し、溶媒を一晩蒸発させました。サンプルを80μLのアセトニトリルと20μLの水の混合液で再構成し、インサート付きのサンプルバイアルに移し、LC-MSで分析しました。
LC-MS分析
【０４４４】
ＬＣ−ＭＳ分析は、サーモサイエンティフィックダイオネックスアルティメット３０００と、ブルカーハイスター３．２によって制御されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたブルカーアマゾンＳＬとを含むプラットフォーム上で実施された。各血漿サンプル中の化合物濃度は、検量線を使用して決定されました。クロマトグラフィーによる分離は、20 ° Cに維持されたAgilent Eclipse Plus C18カラム（2.1 x 50 mm、3.5 μm）に10 μLのサンプルを注入することによって実行されました。流速は400μL / minに維持されました。初期フロー条件は、60％の溶媒A（0.1％の酢酸を含む水）と40％の溶媒B（0.1％の酢酸を含むメタノール）でした。溶媒Bは0.25分で60％に、6.75分で70％に上昇しました。溶媒Bは7.00分で95％に上昇し、8.00分で初期条件（40％）に戻り、合計実行時間は9.00分でした。
結果
【０４４５】
Pのharmacokinetic選択された化合物（複数可の結果12H、12I、12K、12リットル脳および血漿中の異なる投薬で）を以下の表に要約されています。化合物１と化合物１２ｋとの間の比較は、少なくとも図１３Ｂ、図ｓにさらに示され、議論されている。34A-34B、図35A-35C、図。36、図。37A-37Bおよび例13。
【表１】
2021518856.tif 000171
【表２】
2021518856.tif 000172
例11
バイオアベイラビリティとベストDeviveryルートの化合物
【０４４６】
発明者らが観察インビトロでホスホ酸化cJunのこと発現が強くCPA処理によってアップレギュレート強く化合物によって減衰される1 、および化合物のキナーゼ標的（単数または複数）のありそうな下流エフェクターである1（図4Aおよび図。 4B）。したがって、我々は、さらなるインビボ研究のための標的関与のマーカーとしてホスホ-cjunを選択した。C-junは、マウスの中枢神経系全体、特に嗅球で高度に発現しています。8週齢の野生型C57BL/ 6Jマウス（Jackson）は、10mg / kgの化合物で処置した1 、12H 、又は12K強制経口投与、腹腔内注射、または皮下注射によって送達される（図14）。次に、1時間後に動物を犠牲にし、それらの嗅球を細かく解剖し、さらにウエスタンブロット分析のために溶解した。サンプルは、リン酸化c-jun（セリン63;細胞シグナル伝達）に特異的な抗体でプローブされ、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化されました。ほぼすべての薬物処理した試料は、薬物が同じターゲットを係合することを示し、未処理対照と比較して酸化cJunリン酸化の減少を示し、インビボでそれらがそうであるようにinvitroで。さらに、強制経口投与によって治療された動物からのサンプルにおけるcjunリン酸化の減少は、12hと12kの両方が経口で生物学的に利用可能であることを示しています。
例12
敏感なデュアルカラー運動ニューロンスクリーンは、ALS関連のストレッサーと神経保護剤を明らかにします
【０４４７】
筋萎縮性側索硬化症は、運動皮質、脳幹および脊髄のニューロンを標的とする神経変性疾患である。ALSを引き起こす突然変異は、数十の多様な遺伝子で発見されましたが、運動ニューロンの感受性が異なる理由はよくわかっていません。ALS運動ニューロン変性に寄与する細胞自律メカニズムを研究するために、高感度の2色共培養システムを開発しました。生物活性化合物のライブラリーをスクリーニングすると、小胞体（SERCA）で発現するカルシウムポンプの阻害剤であるシクロピアゾン酸（CPA）が、G93A変異を引き起こすALSを運ぶヒトSOD1を発現する運動ニューロンが高感度であるストレッサーとして特定されました。重要なことに、運動ニューロンは、脊髄介在ニューロンよりも、CPAおよび小胞体（ER）ストレスの誘導および折りたたまれていないタンパク質応答パターンに対して有意に感受性が高い。二次スクリーニングでは、3つのキナーゼ阻害剤やFDA承認の胆汁酸誘導体であるタウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）など、CPA誘発性変性から運動ニューロンを救済する化合物を特定しました。hSOD1G93Aを発現しているマウスをTUDCAで治療すると、初期の筋肉の除神経が改善されました。neuroprote同定のctive作用化合物は、ヒトモータニューロ用いて検証した同質遺伝子から分化NS搬送胚性幹細胞株SOD1A4V 17変異。オベRALL、我々の結果は、ハイライト開発の翻訳可能性のin vitro創薬としての役割を果たすことができ、プラットフォーム、新たな薬物標的を同定するための貴重なツール神経変性の治療疾患を。
【０４４８】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動皮質および運動野のニューロンまたは脳幹および脊髄のニューロンを優先的に標的とする遅発性神経変性疾患である。家族性ALSを引き起こす40を超える変異が発見されたにもかかわらず（Peters etal。2015 ）、運動ニューロンの変性につながる病理学的プロセス、および広く発現している変異タンパク質に対するニューロンサブタイプの感受性の違いの理由はよくわかっていません。
【０４４９】
ＡＬＳの効果的なモデリングは、患者および動物モデルにおける運動ニューロンの限定されたアクセス可能性、およびＡＬＳが遅発性で比較的進行の遅い疾患であるという事実によって妨げられる。疾患を引き起こす突然変異を運ぶ脊髄運動ニューロンの大規模生産を促進する幹細胞技術の開発は、最初の課題を回避し、関連する細胞の状況での生化学的分析と薬物スクリーニングを可能にしました（Amorosoetal。2013 ; Dimos etal。 al.2008; Hoing et al.2012; Wichterleet al.2002; Yang et al.2013 ）。ただし、幹細胞由来の運動ニューロンは、転写的および電気生理学的に未成熟であり、胚性または出生後早期の運動ニューロンに最もよく似ています（Pattersonet al.2012 ; Stein et al.2014; Miles et al.2004 ）。最も重要なことは、ALSを引き起こす変異を運ぶ幹細胞由来の運動ニューロンは、変異タンパク質の凝集体など、運動ニューロン疾患の重要な特徴を示さないことです（Boscoet al.2010; Kiskinis et al.2014; Wang et al.2009 ）。
【０４５０】
それらの比較的未成熟な状態にもかかわらず、いくつかの研究は、培養されたヒトおよびマウス幹細胞由来のＡＬＳ運動ニューロンの生存、生理学、および生化学の違いを報告している（Ｋｉｓｋｉｎｉｓら、２０１４；Ａｌａｍｉら、２０１４； Ｄｅｖｌｉｎら。 al.2015; Di Giorgio et al.2008; DiGiorgio et al.2007 ; Donnelly et al.2013; Egawa et al.2012; Naujock et al.2016;Sareen et al.2013; Sivadasan et al.2016; Wainger et al。 al。2014 ）。これらの表現型は、培養細胞における病理学的プロセスの時期尚早または異常な症状を誘発するストレスの多いinvitro環境に起因する可能性がありますが、これらの培養関連ストレッサーの性質は未定義のままです。特定のストレスは、疾患増強の理解関連する運動ニューロンの病理は、ALのより忠実なモデルを開発可能にするSをして、順番に、より良いツールがする疾患の発症や進行を理解し、neuroprotec用画面へTIVE薬。
【０４５１】
ここで、本発明者らは、高感度運動ニューロン生存アッセイを開発し、それを使用して、ＡＬＳを引き起こすＧ９３Ａ突然変異（ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）を有するヒトＳＯＤ１導入遺伝子の過剰発現に対して運動ニューロンを感作するストレッサーについての生物活性化合物のライブラリーをスクリーニングした。トランスジェニックマウスにおける運動ニューロンの変性のようなもの（Gurney et al.1994 ）。画面は、ALS運動ニューロンが非常に敏感な化合物として、小胞体（SERCA）で発現するカルシウムポンプの阻害剤であるシクロピアゾン酸（CPA）（Goegeretal。1988 ）を特定しました。我々は、CPAが培養運動ニューロンにおいて小胞体（ER）ストレスと小胞体ストレス応答経路を急速に誘導することを示しています。誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、多くの神経変性疾患の特徴であり、ALSの動物および幹細胞ベースのモデルにおけるERストレスの活性化と関連して説明されています（Kiskiniset al.2014; Hetz et al.2009; Saxena etal。 2009;。Saxenaら2013 ）、などでポスト死後ALS患者からの脊髄サンプル（Hetzら2009;。。アトキンら2006;アトキンら2008。）。
【０４５２】
この加速された運動ニューロン変性パラダイムを利用して、我々は、脊髄運動ニューロンをＣＰＡ毒性から保護する化合物を同定するために第２のスクリーニングを実施した。我々は、タンパク質が最近示された阻害剤でキナーゼ、そのkenpaulloneを実証神経栄養因子の除去から保護運動ニューロン（Yangらが2013; Liuら2016。 ）、また、MOT保護又はCPAアッセイにおいてニューロン。ケンパウロンに加えて、追加のキナーゼ阻害剤や胆汁酸成分であるタウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）など、他のいくつかの保護化合物を特定しました。マウス幹細胞由来の運動ニューロンにおけるこれらの化合物のレスキュー効果は、ヒト幹細胞由来の運動ニューロンで再現された。さらに、我々はTUDCAがneurom減少ことがわかっuscularジャンクション除神経におけるトランスジェニックhSOD1G93Aの疾患の早期症候性の段階でマウスを。
【０４５３】
まとめると、これらの発見は、開発された幹細胞ベースの運動ニューロン生存アッセイの翻訳の可能性を強調している。小胞体ストレス誘発化合物CPAを運動ニューロンに対して優先的に毒性があると特定する際に、私たちの最初のストレッサースクリーニングは、ALS病理に寄与することが知られている経路を独立して再発見しました（Kiskiniset al.2014; Saxena et al.2009; Saxena et al 。2013;西戸ら.2008 ）。また、hSOD1においてTUDCAの保護効果G93Aのm個の氷が証明の原理として作用する化合物は、から現れることインビトロスクリーニングプラットフォーム缶TRAnsitionシームレスにin vivoでのALSのモデル。
生存および神経突起outgrの微妙な欠陥幹細胞由来の運動のowthhSOD1発現ニューロンG93Aを
【０４５４】
変異体ＳＯＤ１プロテインを発現する動物における運動ニューロン変性の開始に寄与する病理学的プロセスへの洞察を得るために、本発明者らは、２色の運動ニューロン生存アッセイを開発した。運動ニューロンのALSを引き起こす変異に対する感受性の増加に寄与するメカニズムの発見には、運動ニューロンの細胞自律性表現型と非細胞自律性表現型を区別できる、堅牢で感度が高く、スケーラブルなシステムが必要であると考えました。疾患のより進行した段階（DiGiorgioetal。2008 ; Di Giorgioetal。2007; Boilleeetal。2006; Kangetal。2013; Nagaietal。2007 ）。
【０４５５】
野生型（ＷＴ）および突然変異体運動ニューロンを区別し、ウェル間の変動を最小限に抑え、スケーラビリティを高めるために、ｈＳＯＤ１ＷＴ（対照）を含むマウスを交配することにより、新しい多能性胚性幹細胞（ＥＳＣ）系統を生成した。）とhSOD1 G93A （変異）の導入遺伝子（ガーニーら、1994マウスは、eGFPを（発現する）Wichterleら、2002 ）またはtagRモータの制御の下でFPをニューロン特異的HB9（Mnx1）プロモーター（図15 A。図2 （a）及び図21 B）。抗体で免疫染色HB9及び運動ニューロン転写因子ISL1に対して共同新しい細胞株がそのnfirmed匹敵する効率で運動ニューロンに分化する（図15 Aおよび図15 B、図S 。2 1 C- 21 E）。次に、新しい変異細胞株が既知のALS表現型を再現したかどうかを調べました。免疫組織化学および生化学を使用して（データは示していない）、ALS患者の死後組織で通常観察される変異運動ニューロンの大きなSOD1凝集体は観察されませんでした（Gradet al.2014 ）。しかし、immunopre抗体とcipitation特異MISF上の立体配座エピトープを認識するが、ヒトSOD1を明らかにするたoldedミスフォールドSOD1種（図の存在下で2肝炎1H）、Eが以前に関係してALSの病因（グロスルイら2010）。
【０４５６】
新生運動ニューロンは、それらの生存および神経突起伸長について神経栄養因子に高度に依存している（Hendersonetal。1994; Oppenheimetal。1992; Sendtner etal。1991 ）。最適以下の条件下で運動ニューロンを成長させると、WT運動ニューロンよりも変異体が優先的に変性するかどうかを判断するために、神経栄養因子の量を減らした培地で両方の遺伝子型を培養し、運動ニューロンの生存と神経突起伸長を評価しました。最も支持的な媒体には、運動ニューロンの生存と神経突起伸長に対する効果が文書化されている神経栄養因子が含まれていました：グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、繊毛神経栄養因子（CNTF）、およびインスリン様成長因子-1（IGF-1）。また、サイクリックAMP（cAMP）のレベルを増加させ、以前はニューロトロフィンと相乗的に作用して一次運動ニューロンの生存をサポートする2つの化合物であるIBMXとforskolinの効果を評価しました（Hanson et al.1998 ）。IBMXおよびフォルスコリン単独で最初の24時間の間に支持運動ニューロン生存FTERめっきが、その効果は次の24■48時間（Fで急速に減少し、IG。21J）。一方、単独GDNFはCu中週間までのための運動ニューロンの生存を強力にサポートを提供lture、その効果は、cAMPの上昇化合物（図によって増強することができる。21K）。これらの結果に基づいて、3つの異なる培養条件を評価しました：低神経栄養サポート（10μMフォルスコリン+100μMIBMX ）、中神経栄養サポート（10μMフォルスコリン+100μMIBMX+ 0.4 ng / ml GDNF）、および強力な神経栄養サポート（10μMforsko LIN +100μMのIBMX + 10ng /mlののBDNF、CNTF、GDNF、及びIGF-1）（図2 （f）及び図21 G）。
【０４５７】
細胞の生存および神経突起伸長をAUTOMAにより評価したテッドライブイメージング（TROPHOSプレート蛍光運動ニューロン（図1のランナー）5 Dおよび図15 E）。DISに生細胞との間tinguishGFP陽性死細胞または蛍光破片、我々は使用し日間をMetaMorphソフトウェア（モレキュラー・デバイス）と「健康な細胞の基準」を適用し、唯一のCEれる神経突起の長さのLLSは等しく5回平均のセルに本体直径は税込た分析（図1にuded5 F）。Cの上のライブ運動ニューロンの数の定量六日間のラース（図2 （f）及び図21 G）は、SUとの適度な、しかし一貫した15~20％の減少を明らかにしたrvivalの神経突起伸長対照と比較して、変異体の運動ニューロンを。このディfference高および中にあった支持体、及び赤色-緑色混合培養の両方で観察されたSまたはごとに別々の培養物の遺伝子型（図15 G）。まとめると、これらの知見は、神経栄養性の撤退することを示す要因が増強する生存赤字がESC由来hSOD1において検出されないG93Aを発現する運動ニューロンを。
変異運動ニューロンの優先的変性を誘発するストレッサーのデュアルカラースクリーン
【０４５８】
変異運動ニューロンの変性に寄与する経路を同定するために、我々は、ＲＦＰを発現する制御運動ニューロンをＧＦＰを発現する変異運動ニューロンと等しい割合で混合し、９６で培養するストレッサーアッセイを設計した。ウェルプレート（図。1つの5 C）媒体神経栄養支持の下で。両方の遺伝子型からの他の腹側脊髄ニューロンとグリア細胞も含む混合培養で運動ニューロンの生存を分析することで、運動ニューロンの生存における細胞自律的変化に研究を集中させることができると考えました。したがって、ALS星状細胞毒性（Kiskinisetal。2014;Nagai etal。2007 ）などの非細胞自律因子の影響は、両方の遺伝子型の生存に等しく影響するため、最小限に抑えられます。
【０４５９】
めっきされた運動ニューロンは、１２７５の生物学的に活性な小分子のライブラリー（ＴｏｃｒｉｓＳｃｒｅｅｎ Ｍｉｎｉおよびカスタムコレクション、Ｔｏｃｒｉｓ）で処理する前に、２４時間神経突起を回復および伸長させた。自動ロボット支援液体処理プラットフォーム（Tecan）を使用して、化合物を最終濃度10μMで添加し、48時間後および72時間後に細胞をライブイメージングで分析しました。次のパラメータを測定しました：生きている蛍光運動ニューロンの数（「運動ニューロンの生存」、図15 J）、細胞あたりの平均神経突起伸長（「全体的な神経突起成長」、図2 2B）、GFP / RFP運動ニューロンコントロールウェルの運動ニューロンのGFP /RFP比に正規化された比率（「正規化された生存率」、図1 5 H）、およびGFP / RFP平均神経突起成長率（「選択的神経突起成長」、図2 2A）。変異運動ニューロンを優先的に標的とするストレッサーを特定するために、まず、対照運動ニューロンと変異運動ニューロンの両方に対して明白に毒性のあるすべての化合物を排除しました（平均生存率<変異細胞と対照細胞の25％）。残りの化合物の中で、変異運動ニューロンの生存を優先的に減少させ、少なくとも50％の生存差に対応する比率を生み出したサブセットには、膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、イオンポンプおよびチャネル阻害剤、抗有糸分裂薬、そして一般的なプロアポトーシス剤（図15 Hと図15のI）。
【０４６０】
我々が同定した選択的ストレッサーの１つは、シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）であり、これは、関連カルシウムＡＴＰｓｅ（ＳＥＲＣＡ）として、筋小胞体を可逆的に遮断するマイコトキシンである。SERCAは、カルシウムを細胞質から小胞体（ER）に隔離する役割を果たします（Goeger et al.1988 ）。SERCA阻害は、ERのカルシウム濃度を低下させ、タンパク質の折り畳みの機能不全、折り畳まれていないタンパク質応答の活性化、ERストレス、およびアポトーシスを引き起こします（Doutheilet al.1997 ）。我々は、効果的な確立するためにCPAを滴定濃度範囲（6.25から12.5 SUR減少変異運動ニューロンが示されるμM）を制御するモータに比べvivalニューロン（図S。16 A- 16 C、図2 （a）及び図23 B）。その後のすべての実験では、特に明記しない限り、運動ニューロンを7.5μMCPAで処理しました。
【０４６１】
ＣＰＡの効果をさらに調査するために、我々は、それが運動ニューロンに直接作用するか、または培養中の他の細胞を介して間接的に作用するかを調べた。FO我々精製運動ニューロンことウント蛍光活性化セルソーティング（FACS）（図によってS 。2 （c）- 23としてCPAに感受性の通りであったF）は、CPAをd作用することを示し、混合培養における運動ニューロンirectly運動ニューロンではなく以外に次に二次毒素を産生する細胞型（DiGiorgioetal。2008; Di Giorgioetal。2007; Nagaietal。2007; Haidet-Phillips etal。2011）。これらの発見はまた、混合培養に存在する他の細胞タイプが、CPAで処理された運動ニューロンを保護しないことを示唆している。
【０４６２】
他のタイプの神経細胞よりも運動皮質における脊髄運動ニューロンおよびニューロンの優先的な変性は、ＡＬＳの特徴である。阻止する運動ニューロンがあったかどうか鉱山をニューロンの他のタイプよりCPA処置に対してより感受性、我々は、混合銅分析ltures hSOD1成るG93A脊髄運動ニューロン発現S、介在ニューロンおよび他の細胞タイプ。生存細胞の免疫染色により、GFPと汎ニューロンマーカーTuj1を発現する運動ニューロンの生存率が約71％減少したのに対し、すべてのGFP- Tuj-1 +非運動ニューロンの生存率は約23％減少したことが明らかになりました。（図16 D及び図16 F）。hSOD1 G93A ESC系統に由来する混合培養におけるさまざまなニューロンサブタイプ間のCPA感度のこのかなりの違いにより、WT系統に由来する培養にも同じことが当てはまるかどうかを尋ねました。
【０４６３】
この分析のために、本発明者らは、Ptf1α発現前駆細胞に由来するdI4およびdIL背側脊髄抑制性介在ニューロンにおいてtdTomatoを発現する新しいESC系統を生成した（Hoangetal。2017 、未発表データ）。我々は、背側介在ニューロンのアイデンティティの仕様を促進する条件下でこの線を区別しました。FACS精製tdTomat O発現介在ニューロンは、FACS精製GFP発現脊髄と共培養した運動ニューロン（図16E及び図16のG）。RFP陽性ニューロンとGFP陽性ニューロンの定量化により、CPA処理により、共培養された脊髄運動ニューロンの約70％と比較して、背側脊髄介在ニューロンの生存率が約17％減少したことが明らかになりました。一緒にこれらのデータは、他の腹側または背側脊髄ニューロンと比較して、CPAに対する脊髄運動ニューロンの感度の増加を明らかにしました。
細胞質ゾルのカルシウムレベルに対するCPAの影響
【０４６４】
ＣＰＡは、細胞質ゾルカルシウムの小胞体への隔離に重要なＳＥＲＣＡポンプの可逆的阻害剤である。培養されたESC由来することを明らかにした免疫染色運動ニューロンは、SERCA2アイソフォーム（ATPの高レベルの発現2A2）（図16 H）を。運動ニューロンのカルシウム処理に対するCPAの影響を研究するために、遊離の細胞質ゾルカルシウムを視覚化し、カルシウムインジケーターFura-2のレシオメトリック分析によって測定する一連のイメージング実験を実施しました。GFPとFura-2蛍光の間のクロストークを回避するために、実験はソートされたHb9:: tagRFPを発現する運動ニューロンを使用して実行されました。まず、コントロールおよび変異体の取り扱い全体カルシウム特徴モータ三日カルシウムトランス測定することにより、めっき後ニューロンによって変力誘発ients（グルタミン酸受容体アゴニストでカイニン酸（KA）; Carriedoら、1996。Carriedoら、2000 ）。露光100の5秒パルスに対する細胞のμMKAは、ESC-DERIにおける細胞質カルシウムの急速な上昇誘起続いVED運動ニューロンのカルシウムに戻された隔離の期間ベースラインレベル（図2（c）及び図22 D ）、初代運動ニューロン培養と同様（Carriedo et al.2000 ）。60秒のイメージングウィンドウ内でベースラインに戻らなかった運動ニューロンは、さらなる分析から除外されました。Followi5分ngの回復期間は、細胞を7.5μMCPAにさらされた私はさらに20分間maged。継続的なCPA曝露は、両方の遺伝子型で遅いカルシウムトランジェントを誘発し（図16I）、最終的にはベースラインに近いレベルに戻り、イメージングシーケンスの終わりを迎えました。細胞をさらに5分間回復させた後、CPAの存在下で2回目のKAパルスを発生させ、急速なカルシウムトランジェントを引き起こしてベースラインに戻しました（図22E）。これにより、ERでのカルシウム隔離がブロックされたときに細胞が細胞質ゾルのカルシウム増加をどのように処理したかを調べることができました。CPAは著しく遅く、しかし抹消しなかった（図KA誘導性のカルシウムの隔離を16JとF IG。2 （e））は、その運動を示すニューロンが正常に隔離さcytosにERに依存しオリッチカルシウム、他の使用できる時に隔離ルートをこのコンパートメントの喪失。CPAの非存在下で複数の連続したKAパルスを用いた並行実験ではカルシウム隔離速度の障害が明らかにならなかったため、この違いはKAによる反復刺激によるものではありませんでした（データは示していません）。対照運動ニューロンと変異運動ニューロンを比較すると、CPAの非存在下または存在下でのKA誘発カルシウム隔離の速度（タウ）の遺伝子型間の違いは観察されず（図16J）、CPAでのカルシウム処理に影響を与えることを示しています比較的。
【０４６５】
上昇したサイトゾルカルシウムは、複数の細胞内活性化することができるなど、シグナリングプロセスを細胞死経路（デステファニら、2012; Jayaramanら、1997; Pintonら2008 ）、およびカルシウムdysregulatのイオンは、多くに関与している神経変性状態、ALSを含む（Kiskinis et al.2014; Bernard-Marissal et al.2012; Jaiswal et al.2009;Jaiswal et al.2009; Kawamata et al.2010; Kim et al.2012; Rothstein et al.1990;Takuma et al。 .1999; Tradewelletal。2011; von Lewinski and Keller 2005 ）。したがって、ERへのカルシウム隔離を改善するか、カルシウムシグナル伝達が促進する変性経路を不活性化することで、CPA毒性を潜在的に打ち消すことができます。したがって、本発明者らは、細胞質ゾルのカルシウム処理および／またはシグナル伝達に対する既知の効果を有する８つの化合物のパネルを評価した。これらには、細胞透過性カルシウムキレート剤であるBAPTA-amが含まれていました。ER貯蔵から細胞質にカルシウムを放出するリアノジン受容体の阻害剤であるダントロレン。THREE阻害剤カルパインの、カルシウム依存性システインプロテアの家族のES。カルシウム活性化キナーゼCaMKK / IIの3つの阻害剤。注目すべきことに、これらの治療のいずれも、モータの改善ないニューロンの生存またはCPA曝露によって誘発神経突起退縮（図S。18A-18Bを）。一緒にこれらのデータは、CPA誘導性細胞質カルシウムリットルという観察とevelsは本質的に等しかった脆弱な運動ニューロン耐性非運動神経NS（図2（b））があることを示唆細胞質カルシウムの過負荷は、一次CAの可能性は低い使用CPA誘発運■■動ニューロン死の。
脊髄運動ニューロンは小胞体ストレス経路の活性化に敏感です
【０４６６】
細胞質ゾルカルシウムに対するその効果に加えて、ＣＰＡ処理は、ＥＲ中のカルシウムレベルを減少させ、ＥＲストレス経路の活性化をもたらすことが示されている（Ｄｏｕｔｈｅｉｌら、１９９７）。THES電子の経路は、免疫グロブリン結合のproteによって開始される内（BIP;熱ショックタンパク質70、HSP70; 78 kDaのは、グルコース調節タンパク質、GRP-78）、ER常駐シャペロン、ER-膜結合上のその結合部位からの転位をER内腔で折りたたまれていないタンパク質を検出したときのストレスセンサー。非結合BiPは、小胞体ストレスに関連する3つの別々のシグナル伝達経路の活性化に関与します：PERK、ATF-6、およびIRE1α経路。以下、小胞体ストレス応答（UPR、図19F）と呼びます（Gardner et al.2013 ; Hetz 2012; Lurlaro and Munoz-Pinedo 2016;Kozutsumi etal。1988 ）。
【０４６７】
ＣＰＡに曝露された運動ニューロンにおけるこれらの経路の活性化を評価するために、我々は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンにおけるＣＰＡ治療後の３つの時点での１５のストレス関連遺伝子の発現レベルを調べた（図。。17 A）。Bipと主要な下流エフェクターChop（Ddit3）の発現の急速な増加を観察しました。Bipは、CPA曝露の1時間後に2倍に増加し、8時間までに約5倍に増加し続けました。チョップは、CPA処理の1時間で4倍に誘導され、4時間と8時間で16倍の誘導に達しました。2倍を超える誘導を伴う他の遺伝子には以下が含まれます：p58IPK 255 （8時間で6.5倍）、ERストレス誘導プロテインキナーゼ。成長停止およびDNA損傷誘導性タンパク質45アルファ（Gadd45a;4時間で5倍）、最近、発症前のSOD1 G93Aマウスの脊髄でアップレギュレートされることが示されました（Saxena et al.2009 ）。Erdj4 、ER関連タンパク質分解（ERAD）に関与するBip補因子（4■8時間で5倍）;Atf4 、UPRのPERK軸の下流メディエーター（8時間で3倍）。カルレティキュリン、ER関連シャペロン（8時間で3倍）。これは、hSOD1 G93AマウスのNOを介した運動ニューロン変性に関連していた（Bernard-Marissal et al.2012 ）。およびＮｒｆ２、ＰＥＲＫ基質（８時間で２倍）。要するに、これらの発現の変化は、複数の軸の強力な活性化を指摘小胞体ストレス（UPR）CPA（図に露出運動ニューロンにおける19F）。
【０４６８】
ＣＰＡに１、２、４、８および２４時間曝露された対照および突然変異運動ニューロンからのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、ＰＥＲＫ経路の早期活性化を確認した（Ｅｉｆ２αのリン酸化の増加は、１時間ですでに検出可能である）。 CPのA露出）との蓄積ATF-6 8個の侯で検出の活性切断型RS（図17 C）の両方の遺伝子型です。IRE1α枝の活性化の定量PCR分析によって評価したXボックス結合タンパク質1（XBP1）既にの1時間により誘導されたスプライシング、CPA処置とピークに達し曝露4時間（図において17 B）。我々はまた、IRE1α枝の活性化を評価することにより、C-Junリン酸化の免疫細胞化学的分析（浦野ら、2000）の2時間後にピークに達し、CPA処理（図17のE及び図17 F）。
【０４６９】
ＵＰＲ ／ＥＲストレス経路のＰＥＲＫおよびＡＴＦ−６分岐の活性化は、タンパク質合成を弱め、誤って折りたたまれたタンパク質クリアランスを加速することを目的とした保護細胞応答と関連している（Ｈｅｔｚ２０１２； ＬｕｒｌａｒｏおよびＭｕｎｏｚ−Ｐｉｎｅｄｏ ２０１６）。したがって、培養運動ニューロンにおける誤って折りたたまれたSOD1タンパク質の蓄積に対するCPA処理の影響を調べるのに十分です（Boscoetal。2010; Hetzetal。2009;Saxenaetal。2009; Nishitohetal。2008 ; Gros-Louis etal。2010 ）。変異運動ニューロンをCPAまたはビヒクルで処理し、2つの異なるコンフォメーション特異的hSOD1抗体を使用して誤って折りたたまれたSOD1を免疫沈降させました。ウェスタンブロット分析は、予期しないCPA依存性の増加が明らかになったINミスフォールドの蓄積CPA処理はCLEAを損なうことを示す、SOD1のミスフォールドSOD1タンパク質のランス（図17 D）を。
【０４７０】
ＥＲストレスの活性化と運動ニューロン変性との間の関連を強化するために、我々は、ＥＲストレスを活性化する２つの追加の化合物を含むように我々の研究を拡張した：タプシガルギン、ＳＥＲＣＡポンプを阻害することによってＣＰＡと同様に作用するが不可逆的である薬物。（Lytton etal。1991 ）、およびツニカマイシン、ERのタンパク質N-グリコシル化を阻害することによってカルシウム非依存的にERストレスを誘発する薬剤（Oslowskiet al.2011 ）。我々は、露出GFP発現のD共培養運動ニューロンおよびtdTomato発現背側介在ニューロンの濃度の増加にタプシガルギンおよびツニカマイシンを、そして、CPAと同様に、我々が観察する脊髄運動ニューロンであることがDを両化合物に対して選択的に敏感。これにより、モータCPAの神経毒性効果はれる可能性ERストレス経路のその活性化に関係していないiがカルシウムレベルまたはに対する効果tsは他のオフターゲット効果（図16G）を。
運動ニューロンをCPA誘発性変性から保護する化合物
【０４７１】
運動ニューロンが他の脊髄ニューロンよりもＵＰＲ ／ＥＲストレス経路の活性化に対してより敏感であるという認識は、ＥＲストレスがそうであったように、運動ニューロンをＣＰＡ毒性から保護する化合物を同定することを目的としてスクリーニングされた候補分子を設定することを促した。病原体に関係しているのは、ALSおよび他の多くの神経変性状態です（Hetz and Saxena 2017 ）。社内ライブラリから編集された100を超える化合物のアパネルをスクリーニングし、文献検索から得られた化合物を補足しました（表3）。このパネルには、小胞体ストレスのさまざまな枝を調節する化合物、カルシウム隔離に影響を与える化合物、神経栄養因子として作用する化合物、および運動ニューロンの生存を促進することが以前に示された化合物が含まれていました。混合運動ニューロン培養物は、7.5μMCPAに曝露する前に45分間レスキュー化合物で前処理しました。生存および神経突起の成長は、24時間および48時間後に評価されました。画面は、いくつかの化合物が得られたの保護された50％を超えることは運動ニューロンは、CPA（図に対応して死んS。18A-18B c-Jun N末端キナーゼ（JNK）を：）阻害剤SP600125。チロシンキナーゼ阻害剤スニチニブ; 幅広いキナーゼ阻害剤であるRo31-8220メシル酸塩、ケンパウロン、GO6976、H-7、およびK252a（Sakakietal。2008;Kaseetal。1987 ; Roux etal。2002 ）。神経突起成長の50％以上を救済した化合物には、神経栄養因子であるカルジオトロフィン-1が含まれていました。p38阻害剤SB293063およびSB203580;SP600125; スニチニブ; 胆汁酸TCA、TGCAおよびTUDCA; およびキナーゼ阻害剤Roを31-8220メシレート、GO6976、kenpaullone、H-7とのK252a（図18B）。全体として、GO6976、ケンパウロン、K252a、およびTUDCAは、低濃度での強力な生存促進効果（GO6976、ケンパウロン、K252a）または強力な神経突起伸長促進（TUDCA）により、最も有望な候補であると思われ、さらなる特性評価。
【０４７２】
プロテインキナーゼ阻害剤であるケンパウロンは、最近、ＥＳＣ由来の運動ニューロンにおける神経栄養因子の離脱を救済する化合物のスクリーニングからのヒットとして現れた（Ｙａｎｇら、２０１３）。また、CPAに応答して運動ニューロンの変性を効果的に防止することもわかりました。我々は、2つの追加のキナーゼ阻害剤を同定し、STAurosporine類似GO6976と運動ニューロンに匹敵する救助を提供するが、で活性であったのK252a、低い（0.5~2μMは5~10と比較kenpaulloneより濃度（図kenpaullone用μM）。19A ）。我々はまた、TUDCA、両親媒性胆汁のACIと判定として機能することがD成分の化学シャペロン、救出神経突起伸長（図2 （f））、しかしはO NLY適度示した運動ニューロン変性（図に及ぼす影響19A）を。
【０４７３】
幹細胞由来の運動ニューロン生存アッセイの１つの利点は、それがヒト運動ニューロンに容易に拡張され得ることである。アッセイを適合させるためにヒト細胞、我々は新たな生成ESC株の同質遺伝子対は、ヒトESC線eから誘導制御下でGFPをxpressing HB9運動ニューロンプロモーターの（HUES3HB9 :: GFP、（ディジョルジョら、2008 ））。ALSの原因A4Vの突然変異は、単一の対立遺伝子に導入したSOD1のジンクフィンガーヌクレアーゼ用いた遺伝子ヒト患者の遺伝子型を再現する（ZFN）ベースのゲノム工学（図S。2 4 A-24L ）。細胞株のペアは、以前に公開されたプロトコル（Amorosoetal。2013 ; Maury etal。2015 ）を使用して並行して運動ニューロンに分化し、CPAの濃度を上げながら生存および神経突起の成長に関して特徴づけられました。ヒト運動ニューロンはマウス運動ニューロンよりもCPAに対する感受性が低かったが（図24J）、対照ニューロンと比較して、33μMCPAに曝露された変異型ヒトSOD1 A4V運動ニューロンの変性の有意な増加を検出した（約86％の損失）（■71％の損失）、それによって、GEの反復するCPAのNOTYPE依存効果マウスの運動ニューロン（図19Dおよび図19 E）。
【０４７４】
次に、本発明者らは、マウス運動ニューロンを保護する化合物が、３３μＭのＣＰＡに曝露されたヒト運動ニューロンを保護することができるかどうかを試験するためにアッセイを使用した。注目すべきことに、マウスの運動ニューロン画面で特定されたすべてのテスト済み保護化合物は、CPAからヒトの運動ニューロンを保護するのにも効果的でした。有するヒト運動ニューロンの前処理kenpaulloneはでWTの運動ニューロンにおけるCPA誘導細胞死の42％と31％救出SOD1A4Vの運動ニューロン（図19 D）が、神経突起成長に対する有意な効果（図なかった2 4I）を。GO6976は、WT運動ニューロンの細胞死の45％とSOD1A4V運動ニューロンの34％を救助し（図19 D）、神経突起伸長の減少も大幅に救済しました（図2 4K）。K252aは、全体の最も有望な化合物で、RであったWTにおける細胞死の56％escuingSOD1および細胞死の100％A4Vの運動ニューロン（図19 D及び図19に有意な効果を有する、E）後者のグループのための神経突起成長。最後に、TUDCAはWTおよびSOD1A4V運動ニューロンの細胞死をそれぞれ34％および9％減少させ、神経突起の成長に実質的な影響を与えませんでした（図19 D、図2 4K）。
表3 。CPA毒性の救済のためのスクリーン。
CPA誘発性のMN毒性および/または神経突起退縮を逆転させる能力について試験された化合物のリスト。化合物は、推定される経路または作用機序に基づいて細分化されます。レスキュー効果は、テストされた最良の時点（CPA後24時間または48時間）および濃度について、生存および神経突起成長に対するCPA効果の％反転として表されます。値は、複製培養ウェルの平均、または追跡実験で評価された化合物の独立した実験からのいずれかを表します。
【表３−１】
2021518856.tif 000173
【表３−２】
2021518856.tif 000174
栄養補助食品TUDCAがneuroprotectivのある電子、CPAによって誘発される神経突起反転後退を、および遅延のALS関連の筋肉の除神経、invivoで
【０４７５】
ＴＵＤＣＡは、ＦＤＡ承認の栄養補助食品であり、多様な病的状態に対するその効果は、複数の臨床試験（ＮＣＴ0087７６０４、ＮＣＴ０２２１８６１９、ＮＣＴ0077１９０１、ＮＣＴ０１８２９６９８）の焦点となっている。TUDCAは一般的に安全であり、副作用がほとんどなく、皮下または経口投与した場合に良好な血液脳関門浸透度を示します（Kaemmereret al.2001 ）。神経筋接合部（NMJ）の除神経は、ALSのマウスモデルで観察された最も初期の表現型の1つであるため（Azzouzetal。1997;Masellietal。1993; Tsujihataetal。1984; Sharma etal。2016 ）、そのTUDCA mはIGHT端子INTE軸索モータの維持を促進grityと除神経遅延処理。
【０４７６】
ＴＵＤＣＡの有効性をその類似体と比較するために、我々は、それを、ＣＰＡ処理された運動神経における１０個の抱合胆汁酸と並行してスクリーニングした。タウリン-グリシン結合コール酸（TGCA）は、運動ニューロンの生存に対するTUDC Aの中程度の効果と一致しましたが、低濃度で機能しました。しかし、smalleあった神経にTUDCAよりR効果を延長する（図2（c）及び図25 D）。タウリン結合コール酸、TCAは、運動ニューロンの生存と神経突起伸長の両方でTUDCAと同様の効果を示しましたが、薬剤開発の点では何の利点もありませんでした。したがって、我々はさらなるインビボ実験のためにTUDCAを進めることを決定した。
【０４７７】
このALSモデルにおける運動軸索を保持するTUDCAの能力を試験するために、invivoでの、我々が設計し、我々は除神経評価した小規模研究高速fatigable後肢の前脛骨（TA）筋（図20 D） 。我々は以前に決定していることTAモータB6.Cg-TG（SOD1でニューロン*G93A）1Gur / JマウスのAP受けるから始まるERストレスのeriod P50まで延長筋肉の除神経に続いてP30、（カプランら。2014 ）。この期間中、TA筋肉は、後の時点で実質的に萎縮する前に、25■40％の除神経を示します。ERストレス関連神経変性のこのウィンドウをターゲットとするために、我々はhSOD1治療G93Aの3日ごとに皮下TUDCA注射でマウスをP50へP30間。実験の最後に、TA筋肉のアセチルコリン受容体をAlexaFluor 488結合α-ブンガロトキシンで染色して総NMJをカウントし、小胞性アセチルコリントランスフェラーゼ（VAChT）に対する抗体で運動軸索を染色して神経支配を評価しました。（図20F）。マウスはわずか7 I受け取ったという事実にもかかわらず、21の過程でnjectionsの治療の日、私たちは中程度を観察したが、STATISTICANMJの中LLY著しい増加TUDCA処理hSOD1における神経支配G93Aのマウスは、未処置動物（図に比べ20 E）。
討論
【０４７８】
細胞培養システムにおける変性疾患のモデル化は、疾患を引き起こす突然変異に関連する病理学的プロセスを調査し、新規の治療薬をスクリーニングするための新しい機会を開く。ただし、原因となる変異が細胞機能の微妙な変化や軽度の生存または形態学的表現型をもたらす成人発症の変性疾患は、ハイスループット薬物スクリーニングと互換性のある種類の短期培養システムでモデル化することは困難です。我々は、その発見推論誘導し、運動ニューロンにおける表現型の変化を加速ストレスin vitroで可能性に貢献する分子経路への洞察を提供運動ニューロン変性、および新しい運動ニューロン保護化合物の発見につながる可能性が。
【０４７９】
ＡＬＳを引き起こす突然変異は、脊髄運動ニューロンに対して明白に毒性ではない：患者は、典型的には数十年続く、疾患の発症前段階の間に明らかな運動障害を示さない。変異型h■■SOD1の過剰発現によって引き起こされるALSの攻撃的なマウスモデルでも、成人になるまで運動ニューロンの死は観察されず（Chiuetal。1995 ）、ALS変異の影響は累積的であるか、年齢によって増強されることを示しています-および/または環境関連のストレッサー。変異運動ニューロンの変性に寄与するストレッサーを特定するために、高感度で本質的に制御された生存アッセイを設計しました。共培養のセットアップは、非細胞自律毒性因子の影響を低減し、疾患の原因となる変異SOD1タンパク質を発現する運動ニューロンの本質的な脆弱性の増加に焦点を当てることができます。このプラットフォームを使用して、コントロールのESC由来の運動ニューロンよりも変異体に対して毒性の高い化合物としてCPAを特定しました。おそらくさらに興味深い観察は、運動ニューロンが他のタイプの脊髄ニューロンよりもCPAおよび他の小胞体ストレス誘発化合物にかなり敏感であったということでした。
【０４８０】
ＣＰＡは、ＳＥＲＣＡポンプを阻害し、以前にＡＬＳに関連したいくつかの経路および細胞プロセスに影響を与える（Ｋｉｓｋｉｎｉｓら、２０１４；Ｈｅｔｚら、２００９； Ｓａｘｅｎａら、２００９； Ｓａｘｅｎａら、２０１３； Ｎｉｓｈｉｔｏｈら、２００８ ;Bernard-Marissal et al.2012; Jaiswal et al.2009; Jaiswal et al.2009; Takuma etal.1999; von Lewinski and Keller 2005; Kikuchi et al.2006; Parone et al.2013 ）。CPA処理（Petersetal。2015 ）がカルシウム処理を混乱させることを示します。（Amoroso etal。2013）は小胞体ストレスと折りたたまれていないタンパク質応答を引き起こします。及び（DIMOSら、2008）hSOD1において変異SOD1の蓄積をもたらすG93A ESC-導出D運動ニューロン。この最後の発見は、変異体SOD1が通常、構成的経路を介して除去されることを示唆しており、これはSERCA阻害によって損なわれます。MIは、SOD1の形態がされていsfoldedならびにヒト死後組織試料で観察されたALSのいくつかのモデルが、それらはモータNEU永続とを介して正確なメカニズムロン死は不明（あるグロルイら、2010;菊地ら。2006）。SOD1は、遊離細胞質ゾルのRに変換されていてもibosomes、以前の研究はしている変異型は、ミトコンドリアおよびERの内側に検出することができることを示した（。菊池ら、2006;ヴァンデヴェルデら、2008。）。
【０４８１】
ＣＰＡ媒介性神経変性における異常なカルシウム処理対ＥＲストレス誘導の役割を解析するために、我々は、細胞内カルシウムレベルを調節するか、またはカルシウム非依存経路を介してＥＲストレスを誘導する一連の薬理学的年齢を試験した。これらの研究に基づいて、カルシウムの誤った取り扱いが、CPAに応答して観察された急性変性プロセスを促進している可能性は低いと結論付けました。そこでpathwに焦点を当てたAYSに関連付けられている、と小胞体ストレスと小胞体ストレスの下流。
【０４８２】
候補神経活性化合物のスクリーニングは、ＣＰＡの有害な効果を逆転させることができるいくつかの強力な薬物を同定した。キナーゼ阻害剤と胆汁酸誘導体の2つのクラスの化合物が特に興味深いものでした。キナーゼ阻害剤は、運動ニューロンをCPA毒性から保護する顕著な能力を示しました。1つの化合物であるケンパウロンは、運動ニューロンを神経栄養の剥奪から保護することが以前に示されていました（Yanget al.2013 ）。また、FUS遺伝子に変異を有する患者のヒト幹細胞由来の運動ニューロンの生存率を改善し、電気生理学的欠損を逆転させることも実証されました（Liuet al.2016 ）。ケンパウロンに加えて、いくつかの体外神経変性モデルでニューロンの生存を増加させることが以前に報告されている2つのスタウロスポリン類似体、K252aおよびGO6976を特定しました（Rouxetal。2002;Jeohn etal。2000 ）。ただし、これらの阻害剤にはさらに最適化が必要です。ケンパウロンは、その最も効果的な濃度で水溶液に不溶性であり、そのビヒクル組成を再処方するための広範な努力なしに、さらなるインビボ研究を排除する。K252aおよびGO6976は、生存アッセイにおいてケンパウロンよりも強力で溶解性があります（データは示していません）。ただし、これらの化合物は広域スペクトル阻害剤であり、それぞれが100を超える異なるキナーゼを標的とし、運動ニューロン変性に関連する標的の正体は未だ明確にされていません。現在、taのこれらを識別するために取り組んでいるrgets、より具体的な開発、さらに用の類似体をinvivoでのテスト。
【０４８３】
我々のスクリーニングから出現した第２のクラスの神経保護化合物は、哺乳動物の胆汁酸の誘導体であり、これは、伝統的なチベットおよび漢方薬で広範に使用されてきた。このクラスの化合物は、死にかけている運動ニューロンの30％未満を保護しましたが、神経突起伸長を完全に回復させました。人間の使用が承認されていないキナーゼ阻害剤とは対照的に、タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）は広く利用可能な栄養補助食品であり、その類似体UDCAは掻痒および肝疾患を治療するための水溶性FDA承認薬です。TUDCAは、ハンチントン病およびアルツハイマー病のマウスモデルで有益な効果があることが以前に示されています（Keeneetal。2002;Keeneetal。2001; Nunes etal。2012 ）。TUDCAは、2型糖尿病のマウスモデルにおいて、誤って折りたたまれたタンパク質のシャッパーとして機能することにより、折りたたまれていないタンパク質応答のマーカーの発現を低下させることも示されています（Ozcanet al.2006; Uppala et al.2017 ）。TUDCAがALSのマウスモデルで神経筋接合部の完全性を維持することを実証することにより、これらの研究を拡張し、TUDCAを単独で、または他の治療法と組み合わせて、運動ニューロン疾患の発症または進行を遅らせる可能性を高めました。
【０４８４】
本発明者らの知見は、ERストレスのcontribという証拠に追加する運動神経細胞死にUTES ALSで、私たちは、スケーラブルな幹細胞ベース記述するセルの両方のプローブするDシステムをERストレスとtによる手段の自律的な効果Oをそれらを逆にします。このシステムは、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、アルツハイマー病など、小胞体ストレスが特徴的な他の神経変性状態に簡単に適応できます（Hetzand Saxena 2017 ）。最も重要なことは、我々は、運動ニューロンの生存を調節する薬物がヒトの患者に有効である可能性を最大化することにより、それらの薬物の事前評価を加速できる、ヒトの運動ニューロンで直接神経保護化合物をテストするようにアッセイを適応させた。
材料および方法
マウストランスジェニック胚性幹細胞株の派生
【０４８５】
彼terozygousのTg（Hlxb9-GFP）1Tmj又はTgが（Hlxb9-tagRFP）レポーターマウスを交配した変異を発現するマウスと（B6.Cg-TG（SOD1 * G93A）1Gur /J）を、またはWT形（B6SJL-TGヒトSOD1の（SOD1）2Gur / J）。胚盤胞は胚の3。5日目に収集されました。からのマウス胚性幹細胞（ESC）系統は、以前に記載されたように誘導されました（5）。導入遺伝子とG93A点突然変異の両方の存在を確認するために、新しい系統の遺伝子型と配列が決定されました。
【０４８６】
介在ニューロン分化のために、マウス胚性ステム細胞株は、Ｒｏｓａ−ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍｏｔ蛍光レポーターマウスと交配されたＰｔｆ１α：： ｃｒｅマウス（親切にカルトシュミット博士によって提供された）から誘導された（Ｋａｗａｇｕｃｈら、２００２； Ｍａｄｉｓｅｎら。 2010 ）。
遺伝子ターゲティングによる同質遺伝子のヒト胚性幹細胞株の生成
【０４８７】
マウスアッセイからの結果を推定するために、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞株の野生型SOD1遺伝子座にA4V突然変異を導入することにより、SOD1 + / A4VおよびSOD1 + / +同質遺伝子細胞株の独立したセットを生成した。HUES3 Hb9 :: GFP（Di Giorgio et al.2008 ）。再び用いて二段階ヌクレアーゼ媒介遺伝子ターゲティング戦略（Maederら、2008）、我々は、SOD1導入A4VのHUES3 HB9 :: GFP遺伝的バックグラウンドに（図突然変異。2 （a）参照）。確証した後、所望のSOD1遺伝子編集（図2（b）及び図24 C）に、我々は悲惨なSODの分化CTED + / A4V及びSOD1 + / +脊髄運動ニューロンを含む培養物にHUES3 HB9 ::GFP細胞。GFP +のモータの両方の遺伝子型のニューロンは、FACSを用いて単離することができた（図2 （d））、及びSOD1転写物、これらの細胞におけるタンパク質発現は、（確認された図2（f）及び図24 G）を。新しい行をし、さらに運動ニューロン転写因子Islet1（のための染色によって検証図2 （e））とショアのに生存の評価Tおよび長期培養（図。24H及び図24のI）。
マウスとヒューマン運動ニューロンの分化
【０４８８】
トランスジェニックマウスＥＳＣの運動ニューロン分化は、以前に記載されたように実施された（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら、２００２）。簡単に説明すると、細胞を分化の6日目に解離させ、ポリオルニチン（Sigma、100μg/ ml）およびラミニン（4μg/ ml）でコーティングされた表面にプレーティングしました。本文に記載されているように、細胞は、cAMP上昇化合物であるフォルスコリン（10μM）およびIBMX（100μM）の存在下で、神経栄養因子の異なるセット（GDNF、BDNF、CNTF、IGF-1）と組み合わせて培養されました（図。21G、図21 K及び図21 L）。すべての実験の大部分では、運動ニューロン、介在ニューロン、およびグリア前駆細胞を含むマウス培養が使用され（「運動ニューロン培養」と呼ばれる）、いくつかの実験では、運動ニューロンがFACSによって精製されました（以下を参照）。
【０４８９】
ｄＩ４介在ニューロンへの分化のために、Ｐｔｆ１α−ｔｄＴｏｍｏｔｏＥＳＣを解離させ、８．０×１０５細胞／ １０ｃｍ培養処理ペトリ皿の密度で胚様体（ＥＢ）として懸濁液中で培養した。分化の2日目に、EBを収集し、しゃれ、1：4で新しいペトリ皿に分割し、1μMRAを補充しました。分化の4日目と6日目に培地を交換した。dI4 IN分化のエンドポイントは、共培養研究のためにEBが収集された8日目でした。
【０４９０】
ヒト同質遺伝子ＨＵＥＳ３ ＥＳＣ ＨＢ９ ：： ＧＦＰレポーター系統の運動ニューロンへの分化は、以前に記載されたように実施された（Ｍａｕｒｙら、２０１５）。細胞は分化の16日目に解離され、FACSで選別され、上記のようにポリオルニチンおよびラミニンでコーティングされた表面にプレーティングされました。無血清ヒト運動ニューロンプレーティング培地には、有糸分裂阻害剤UFdUと、神経栄養因子GDNF、BDNF、CNTF、およびIGF1（すべて10ng / mL）が記載されているように補充されました（Johnson-Kerner et al.2015 ）。
【０４９１】
使用されたすべての細胞株は、マイコプラズマについて日常的に試験された。フローサイトメトリー支援セルソーティング（FACS）
【０４９２】
細胞は、１００μｍセラミックノズルで構成され、２０ｐｓｉで作動する５レーザーＡＲＩＡ−ＩＩｕＲＯＵセルソーター（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＧＦＰまたはＲＦＰ発現に基づいて選別された。
デュアルカラーESC運動ニューロン共培養アッセイ
【０４９３】
解離した蛍光Ｈｂ９ ：： ＲＦＰ−ｈＳＯＤ１ＷＴ細胞を血球計算盤によってカウントし、各遺伝子型の５００個の蛍光細胞がウェルごとにプレーティングされるように、同数のＨｂ９：： ＧＦＰ−ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンと混合した。細胞は、FSKとIBMX（低栄養サポート、細胞死のポジティブコントロール）を含む培地で、コーティングされた96ウェルプレートに播種されました。またはFSK、IBMXおよび250pg / mL GDNF（中程度の栄養サポート、生存のためのポジティブコントロール）。
自動画像分析
【０４９４】
生きているＧＦＰ＋細胞のウェル全体の画像は、プレートランナーＨＤシステム（トロフォス）を使用して取得された。Metamorphソフトウェア（Molecular Devices）を使用して画像を分析し、細胞体径の5倍を超える増殖を示す「健康y」蛍光細胞の数を評価し（全体の生存率の評価）、細胞あたりの平均神経突起長を評価しました（神経突起の成長）。これらのパラメータは、研究全体を通して一貫して使用されました。なぜならendogenous HB9 ::におけるGFPレポーターヒトラインは、我々の自動imagi上で検出されない十分に明るいたNGプラットフォーム、細胞は、直前に生細胞の撮像に処理した10用色素カルセイン-AM（1.33μM）、続いて分PBS中のヘモグロビンの10％溶液でクエンチすることによって。
小分子スクリーン
【０４９５】
トクリスミニスクリーンおよびカスタムコレクションからの約１３００の生物学的に活性な化合物を、シングルトンで１０μＭの最終濃度でスクリーニングプレートに加えた。DMSOの最終濃度は0.5％でした。生存率は、化合物への48時間および72時間の曝露後に生存しているGFP +細胞の数をRFP +細胞の数で割ることによって計算されました。我々は一貫して、未処理の野生型運動ニューロンに対する未処理のG93A変異体運動ニューロンの生存率が約0.83であることを観察しました。遺伝子型に対して相乗的に作用する化合物を検出するために、すべてのデータをこの比率に正規化した。生存率の50％の差に対応する<0.67倍のG93A対WT生存率をもたらす化合物を、5点2倍希釈系列で再試験しました。すべてのヒット化合物を視覚的に評価し、自家蛍光や過剰な細胞凝集などの明らかなアーチファクトのあるウェルを除去しました。一般的に毒性のある化合物、すなわち、両方の遺伝子型の栄養サポートが低いコントロールよりも生存率が低い化合物を、1：10希釈系列で再スクリーニングしました。次に、一次スクリーニングの効果を再現する化合物を、混合およびFACS精製共培養の両方で、独立した細胞株のセットでテストし、細胞の自律的効果を確認しました。
小胞体ストレスレスキュー画面
【０４９６】
解離した蛍光Ｈｂ９ ：： ＧＦＰ−ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ５５４細胞をカウントし、ＦＳＫ、ＩＢＭＸおよびＧＤＮＦを含む培地中、１０００蛍光細胞／ウェルの密度でコーティングされた９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞をレスキュー化合物または培地+コントロールとしての0.5％DMSOとともに45分間インキュベートしました。レスキュー化合物は、最初のデュアルカラースクリーンから、または他のモデルの小胞体ストレスへの影響が文書化されている化合物に焦点を当てた文献検索から選択されました。次に、細胞を7.5μmのCPA、またはコントロールとして培地+0.5％DMSOに曝露しました。前のセクションでは、細胞を画像化し、説明ベッドとしてスコアリングしました。ヒトESC由来HB9 :: GFP-SOD1 + /+およびHB9 :: GFP-SOD1 + / A4V運動ニューロンを、前のセクションの説明として、96ウェルプレートに2000細胞/ウェルで別々にプレーティングし、試験化合物を追加しました上記の10ng/ mL BDNF、GDNF、CNTF、およびIGF1を添加した無血清ヒト運動ニューロンプレーティング培地。33 μM CPA（またはDMSOコントロール）とさまざまなレスキュー化合物を同時に添加しました。
免疫細胞化学
【０４９７】
生培養物は、固定液を培地に直接２分間加えることにより、氷上で４％ＰＦＡで前固定され、次いで、ウェル内容物を４％ＰＦＡで置き換え、そして４℃でインキュベートすることによりさらに１５分間固定された。固定培養物は、0.3％Triton- Xおよび20％ロバ血清を含む0.01 MPBSで室温で1時間ブロックされました。一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、4° Cでオーバーナイトインキュベートしました。培養物を0.3％Triton -Xを含む0.01M PBSで3回洗浄した後、二次抗体（Alexaロバ488/555/647）で60分間インキュベートしました。室温で最小。以下の一次抗体を使用した：マウスHB9ハイブリドーマからDマウスislet1/ 2バンク（1：100）。NeuromicsまたはEMDMilliporeのTuj-1（1：500）; Cell Signaling（1：100）のホスホc-junとPierce（2A7A1、1：100）のSERCA2。スライドは、CoolsnapHQ2カメラ（Phot ometrics）を備えたZeiss AxioObserver、Zeiss LSM Meta 510、またはZeiss LSM 880AxioobserverZ1共焦点顕微鏡のいずれかで検査されました。我々は画像処理され、再時々 Adobe Photoshopの（クリエイティブスーツ6、Aにトリミングプレゼンテーション用DOBEシステム）の目的は、変更が画像全体に適用される、としていたすべての画像に同じ割合と同じから。
生化学
【０４９８】
６日目のＥＢを、プロテアーゼ（完全ミニ）およびホスファターゼ（ＰｈｏＳｏｐ）阻害剤を含むＴＮＧ−Ｔ溶解緩衝液（３６）で３０分間溶解し、続いて２６Ｇ注射器で機械的粉砕した。免疫沈降では、C4F6およびB8H10抗体（MediMabs）をプロテインGダイナビーズに結合し、Gros-Louis etal。によって説明されているように誤って折りたたまれたhSOD1の免疫沈降に使用しました。2010A対照IgG抗体を用いた陰性対照（図2 1I参照）。免疫ブロッティングには汎SOD1抗体（Novus Bio）を使用し、インプットの5％をローディングコントロールとして使用しました。ウエスタンブロッティングには、次の抗体を使用しました：カスパーゼ-3（1：1000）、CHOP（1：500）、ホスホ-Eif2α（1：1000）（CellSignaling Technologies）、SOD1およびATF-6（1：200、Novus生物学的）、α-チューブリン（1:50 000、AbCam）。代表的なゲルは、元のフィルムのスキャン画像から切り取られます。本研究とは関係のない個々のバンドは、図の破線で示されています。バンド強度は、ImageJ（NIH）のAnalyze-Gelsアプリケーションを使用して測定しました。
定量的PCR
【０４９９】
試料をトリゾールに溶解し、-80℃で凍結した° C UNT ILさらに処理。QiashredderおよびQiagenRNeasy Miniキット（Qiagen）を製造元のプロトコルに従って使用して、RNAを抽出しました。1-2?μ gの全RNAをそれぞれに使用した逆転写反応、および反応を用いて行われたのTaqMan RTキット（Applied Biosystems社、グランドアイランド、NY、米国）。プライマーペアは、PrimerExpress 3.0（Applied Biosystems）を使用してターゲット転写産物用に設計されました。定量的PCR反応は、Power SYBRGreen PCR Master Mix （Applied Biosystems）を使用して実施しました。反応は、絶対定量設定を使用して、ViiA 7（LifeTechnologies）qPCR装置で実行および分析されました。
XBP1スプライシング
【０５００】
PCRは、50で行ったμのL用のJumpStartTaqポリメラーゼ（Sigma-Aldrich社、製品番号（フォワードスプライシングを検出するために、XBP-1特異的プライマー10 pmolの含有D9307）反応：5' - GAATGCCCAAAAGGATATCAGACTC - 3'およびリバース：5 ′ ‐ GGCCTTGTGGTTGAGAACCAGGAG ‐ 3'）。PCR条件は次のとおりです。94°Cで1分間の1サイクル。94°Cで30秒間、60°Cで30秒間、72°Cで1分間を30サイクル。そして72°Cで1分の1サイクル。PCR産物は、臭化エチジウムを含む2.5％アガロースゲルで30分間泳動しました。SyngeneG：BoxおよびGenesisソフトウェアを使用して、バンドを観察および定量化しました。バンド強度は、Image J（NIH）のAnalyze-Gelsアプリケーションを使用して測定しました。
カルシウムイメージング
【０５０１】
Ｈｂ９ ：： ＲＦＰ運動ニューロンは、分化の６日目に解離され、ガラスカバースリップ上で培養された。解離後３日目に、カバースリップを５μＭのＦｕｒａ−２ＡＭ、レシオメトリックカルシウムインジケーター色素（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と共に室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、カバースリップは、畝をしたNikon Eclipse TE 3500にnted 40×1.30 NA OBJを備えた倒立顕微鏡ective（ニコン、USA）、pco.EDGECMOSカメラ（PCO、ドイツ）、ラムダLS光源、ラムダ340nmおよび380nm励起フィルターを備えたLS-2フィルターホイール（両方ともSutter、USA）。画像は、最初に明視野と蛍光フィルターを使用して取得し、後のステップで分析する細胞を識別しました。薬剤の塗布は、視野から約100μmの位置にある特注のフォーカルアプリケーションシステムを使用して実行されました。次に、Fura-2シグナルの5秒間のベースラインを取得し、続いて100μMカイニン酸（KA）の1秒間のパルスを取得しました。落射蛍光IMAGESが1枚の割合で捕獲されたF 340と380nmの間の切り替え、1分間の画像/秒ilters毎に500ミリ秒。細胞を2分間回復させ、細胞がベースラインに戻ったカバースリップのみをさらに分析しました。次に、カバースリップを7.5μMCPAに継続的に曝露し、1画像/30秒を20分間取得した後、2分間回復し、最後にKAの2番目のパルスを取得しました。取得後、FIJIソフトウェアv。1.4 （www.fij i.sc）を使用して、各画像ペアの340/380比をピクセルごとに計算しました。関心領域は、単一の340画像からの細胞の形態をテンプレートとして使用して手動で描画されました。定量化は、IgorProv。6（Wavemetr ics、USA）を使用して実行されました。誘発されたカルシウムトランジェントがベースラインに戻る速度は、の下降部分に適合した単一の指数曲線のタウ（時定数）から計算されました。ピークの80％から20％までのCa強度トレース。ピーク比値の10％に回復したニューロンのみが分析に含まれました。
in vivoでのTUDCAを投与
【０５０２】
Ｐ３０マウスを３つのコホートに分けた：（１）０．０１ＭＰＢＳ中の０．５ｍｇ ／ ｇ ＴＵＤＣＡを皮下投与したｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス。（2）hSOD1のWTマウスに0.01 MPBSのsubcutane中の0.5mg / gのTUDCAを受信mutation-評価するously NMJの除神経の薬物の具体的な効果を、（3）hSOD1G93Aの0.01受けたマウス皮下ビヒクル対照としてM PBSを。薬剤は、P30からP51まで3日ごとに、合計7回の注射で投与されました。P51で、マウスをケタミン/キシラジンを使用して深く麻酔し、約15mLの室温リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、続いて約30 mLの4％PFAで心臓内灌流しました。解剖後、前距腓靭帯（TA）の筋肉をPBSで一晩洗浄し、凍結保護包埋のために処理しました。NMJを視覚化するために、TA全体の30μmの縦方向の結晶切片を、AlexaFluor 488（1：500; Invitrogen）に結合したα-ブンガロトキシンおよび小胞性アセチルコリントランスポーター（VAChT;ウサギで発生、Covance1：32,000 ）に対する抗体とともにインキュベートしました。）モーター終板と神経終末にそれぞれラベルを付ける。共LOCAの不足ためlizationは筋肉脱神経を示し、％NMJ神経支配は、Dた合計割ることによってeterminedVAChTとBTXの間の重複の領域の数ignals（総数神経支配BTX信号（合計numbeを含む領域の数で終板）をエンドプレートのr）。動物ごとに1つのTAを評価し（n= 4-6）、筋肉全体の3つおきのセクションを染色し、動物ごとに最低1000のNMJが評価されるようにカウントしました。画像は、4倍または10倍の対物レンズを備えたNikonEclipseTE-2000-E蛍光顕微鏡を使用して取得しました。すべての動物実験は、コロンビア大学のIACUCプロトコルに準拠して実施されました。
統計学
【０５０３】
細胞培養については、少なくとも３つの独立した実験が一般に行われ、これは、培養条件および細胞株が一定に保たれたこのタイプのアッセイでの以前の経験に基づいて十分であると考えられた。以下のためにin vivoでの実験、パイロット研究に基づいて電力解析をするために実施した動物の数を推定する研究効果を検出するために必要。データセットは、平均値+/-SEとして表されるM紙を通して。統計分析は、Graph Pad Prism（v。7 、GraphPad Software Inc.）またはR '（）を使用して実行されました。正規分布と等分散が仮定できる場合は、有意性の分析を、ペアワイズ比較のための対応のない2尾のスチューデントのt検定、または事後ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析で実行しました。それ以外の場合は、解析が代わりにbを行ったYマン・ホイットニー順位和検定またはDunnの多重比較とクラスカル・ウォリス検定事後TEST。統計的有意性は、* P <0.05 、** P <0.01 、*** P <0.001で示されます。特に明記しない限り、各Nは独立した実験または動物を表します。生物学的複製が1つだけ分析されたいくつかのイベントでは、該当する場合は図の凡例に記載されているように、技術的複製を使用してヒストグラムが生成されました。統計分析は、これらのデータのいずれに対しても実行されませんでした。
例13
運動ニューロン保護剤としてのMAP4キナーゼ阻害剤の開発
【０５０４】
本明細書に記載の化合物１のＭＡＰ４Ｋ阻害誘導体の中で、化合物１２ｋは、その並外れた神経保護および薬物動態プロファイル、特にその増加した代謝安定性および高い脳浸透度で際立っていた。化合物12kは、いくつかのMAP4Kのナノモル濃度でもほぼ完全な阻害を示しました。さらに、我々は示し編という化合物12Kはの抗炎症特性を保持して化合物1を。したがって、化合物12kは、神経変性疾患の動物モデルでの将来の試験のために準備されています。
HGK（MAP4K4）とNUAK1は神経保護キナーゼ阻害剤の一般的な標的です
【０５０５】
我々は、元のヒット化合物の標的を比較して、新しい潜在的なリード化合物の選択を知らせることを試みた。公開されているデータベース（Anastassiadis et al。、2011）をマイニングして、最初の画面からの4つのヒット（Go6976、スニチニブ、K252a、およびケンパウロン）の存在下での300を超えるキナーゼの触媒活性を比較しました。また、アルスターパウロンはケンパウロンの構造類似体であるため、CPA生存アッセイでケンパウロンよりも強力であることがわかったため、この分析に追加しました（図41B）。次に、双方向の階層的クラスタリング分析を実行して、これらの化合物の共有ターゲットをランク付けしました。その活性が強く、5つのすべての化合物によって阻害された（<0.5μMの阻害剤濃度で残りの15％のキナーゼ活性）がMAP4K/ STE20キナーゼHGK（MAP4K4）とAMPK関連キナーゼNUAK1を含ん（図キナーゼ4 （a））。
HGK阻害剤は、NUAK1阻害剤ではなく、強力な神経保護作用を示します
【０５０６】
ＥＲストレス媒介性神経変性に対するＨＧＫおよびＮＵＡＫ１の機能的関連性を評価するために、本発明者らは、ヒト運動ニューロンＣＰＡ生存アッセイにおいて既知のＨＧＫおよびＮＵＡＫ１阻害剤を試験した。化合物は、健康な患者に由来するヒト幹細胞由来の運動ニューロンでテストされ、CPAは33 μMで72時間添加されました。これらの条件下では、運動ニューロンの生存率は、ビヒクルのみで治療された対照の約40％に低下します。
【０５０７】
ＮＵＡＫ１阻害剤ＷＺ４００３（ＮＵＡＫ１のＩＣ５０＝２０ｎＭ（Ｂａｎｅｒｊｅら、２０１４））およびＨＴＨ ０１−０１５（ＮＵＡＫ１のＩＣ５０＝ １００ｎＭ（Ｂａｎｅｒｊｅら、２０１４））が8点希釈系列を横切るレスキューCPA毒性にできない（図4 （b）及び図43 A ）。2μM以上の濃度で、WZ4003およびHTH 01から015の両方があってもCPA（図の非存在下での運動ニューロンに対して毒性であった43A ）。まとめると、これらの結果は、NUAK1阻害剤が小胞体ストレスを介した神経変性の治療に適したリードではないことを示していました。
【０５０８】
一方、我々はまた、ＨＧＫ活性を阻害することが以前に示された３つの化合物、ＰＦ−６２６０９３３（Ａｍｍｉｒａｔｉら、2015）、ＧＮＥ−４９５（Ｎｄｕｂａｋｕら、2015）、およびＵＲＭＣ−０９９（Ｇｏｄｆｅｌｌｏｗらal。、2013）。PF-6260933及びGNE-495はもともとHGK阻害するように設計した（ICの両方50; 3.7 nMでの（Ammiratiら、2015; Ndubakuら2015年））、URMC-099はもともと抑制するように最適化しながらMAP3KキナーゼMLK3。それにもかかわらず、URMC-099はHGKに結合し、1μMでの無細胞アッセイでその活性の99％以上を阻害することが示されました（Goodfellow et al。、2013）。
【０５０９】
PF-62609331.2μMでのビヒクル対照の63％までCPA処置後の救出運動ニューロン生存（図4 （b）及び図43 B ）。GNE-495は、2.4 μMで生存率を基礎レベルの最大73％に回復させました。3つの化合物のうち、URMC-099は、0.6μMでの基礎レベルの90％まで生存率を回復、CPA誘発性神経変性から運動ニューロンを救出において最も有効であった（図4（b）及び図43 B ）。したがって、さらなる分析と最適化のためにURMC-099（化合物1 ）を選択しました。
化合物1は小胞体ストレスを介したJNK経路の活性化を阻害します
【０５１０】
化合物１が、我々が以前に同定した神経保護キナーゼ阻害剤と同じ分子経路を介して作用していたかどうかを決定するために、我々は、ストレス関連転写因子ｃ−Ｊｕｎの活性化を阻害するその能力を評価した。我々は、CPA処理がアポトーシス遺伝子転写を媒介することが知られている部位であるセリン63でc-Junリン酸化を急速に増加させ（Pulvereret al。、1991）、K252A、ケンパウロン、およびGo6976がこの部位でc-Junリン酸化を減少させることを示しました（例12を参照）。HGK阻害剤GNE-495は、神経栄養因子の離脱症状にさらされたニューロンのc-Junリン酸化も阻害します（Larhammaret al。、2017）。ここで、我々は、ウェスタンブロットによって観察化合物1は、検出（図の閾値以下のレベルにCPAで処理した運動ニューロンにおけるc-Junリン酸化の減少41C）。
【０５１１】
ストレスを受けたニューロンにおいて、ｃ−Ｊｕｎは、ＪＮＫキナーゼ（ＭＡＰＫ８−１０）によってセリン６３でリン酸化される（Ｐｕｌｖｅｒｅｒら、１９９１）。化合物1は、炎症誘発性条件下でマウスミクログリアのJNKリン酸化を弱めることが示されています（Marker et al。、2013）。同様に、HGK阻害剤GNE-495は、ストレスを受けた感覚ニューロンのJNKリン酸化を弱めることが示されています（Larhammaret al。、2017）。化合物1がERストレスを受けた運動ニューロンのJNK経路にも作用しているかどうかを判断するために、ストレス応答を調節することが知られている部位でリン酸化された3つのJNKキナーゼすべてを認識する抗体を使用して、CPA処理運動ニューロン培養物のウエスタンブロットを行いました。化合物1は、CPA処理のみと比較して、JNKリン酸化を有意に減少させることがわかりました（図41C）。これらの発見は、化合物1の神経保護活性がJNK経路の減衰に関連しており、HGKとJNK活性化を関連付けた以前の研究と一致していることを示唆しています（Larhammaret al。、2017; Wu et al。、2019; Yang et al。、2013）。
構造ベースの化合物設計により、化合物1の強力で効果的な誘導体が得られます
【０５１２】
ＵＲＭＣ−０９９がもともとＭＬＫ３阻害のために最適化されたことを考慮して、我々は、ＨＧＫを阻害するそれらの能力を最適化することによって、より強力で効果的な誘導体が得られるかもしれないと推測した。潜在的なアナログの設計を助けるために、我々はURMC-099（化合物ドッキング1グライド（シュレーディンガースイート）を使用して（図：HGKの結晶構造中（5DI1 PDB ID））5Aを）。ドッキングポーズと結合部位相互作用図（図5B ）から、次のように見えました。1）7-アザインドール部分はキナーゼのヒンジ領域に結合し、活性に不可欠です。2）ピペラジン部分は溶媒にさらされた領域に広がり、分子の安定性と物理化学的特性を改善するために変更することができます。3）インドール側鎖を修飾して、結合ポケット内の相互作用を最適化し、キナーゼの特異性を高めることができます。
【０５１３】
これらの観察に基づいて、我々は一連の化合物１類似体を生成することに着手した。ただし、公開されている合成ルートは簡単に拡張できませんでした。側鎖（スキーム1、Rグループ）は最初のステップで導入され、合成全体を通して実行する必要があり、複数の側鎖類似体の生成には効率的ではありません。そのため、柔軟性を高めた改良された合成ルートを開発しました（スキーム1）。最初のステップでは、圧力管内での5-ブロモ-7-アザインドール（2）と4-ホルミルボロン酸の鈴木カップリングにより、アルデヒド3が得られました。ジクロロメタン中、室温で1-メチルピペラジンを用いた還元的アミノ化により、化合物4が得られた。次の2つのステップでは、化合物4を3位でヨウ素化し、続いてアザインドールにBoc基を導入しました。このグループを放棄する最初の試みは、その後の鈴木カップリングでの収量の大幅な減少につながりました。化合物5は、多くのボロン酸およびボロン酸ピナコールエステルとの最終的な鈴木カップリングの基質として使用されました。便利なことに、Boc基はこれらの反応条件下で脱保護され、追加の脱保護ステップが不要になりました。化合物1および目的の類似体である6a■6azは、分取HPLCによる精製後、中程度から良好な収率（40■88％）で単離されました。
【０５１４】
この合理化された合成経路が確立されたら、我々は、運動ニューロンにおけるＣＰＡ毒性を救済するそれらの能力について、それらが生成されたときに（一度に■５）新しく設計された化合物１類似体を評価し、それは我々にリアルタイムフィードバックを提供した。アナログ設計について。各生存アッセイの後、最も効果的な化合物を新しい類似体セットの足場として使用しました。この反復的な最適化プロセスを通じて、最初に化合物1の49の類似体を開発してテストしました。
【０５１５】
これらおよびその後のすべての生存実験のために、我々は、ＡＬＳを引き起こすＳＯＤ１Ａ４Ｖ突然変異を保有するヒトＥＳ運動ニューロンを使用して、類似体の翻訳能を最大化した（実施例１２を参照）。これらの細胞の生存率は、72時間のCPA処理（33 μM）後、未処理のコントロールの約10％に低下しました（以前に使用したコントロールのヒト運動ニューロン系統の約40％と比較して）。これらの条件下で、化合物による処置11μM（図で完全に救出CPA誘発性神経変性（未処理対照102％）42 B ）。49の類似体のうち、11は化合物1よりも大きな最大効果を示し（図3Aおよび表S1）、一部の類似体は、CPAとは無関係に72時間のアッセイで発生した細胞死の基礎レベルにも対抗していることを示しています。さらに、5つの類似体は、化合物よりも強力であった1（EC 50 ?0.22ミリモル）、および4つの化合物は、両方の化合物よりも有効で、より強力であった1 （図42 Aおよび表S1）。2つの類似体だけが完全に効果がありませんでした（生存?CPAのみ）。まとめると、これらの結果は、ここで行われたドラッグデザインへの反復アプローチの有効性を浮き彫りにします。
【表Ｓ１−１】
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【表Ｓ１−２】
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代謝安定性のinvitro最適化は化合物12kにつながります
【０５１６】
強力な神経保護類似体の代謝安定性を評価するために、我々は、化合物を、ＮＡＤＰＨ再生システムを含む緩衝液中でマウス肝臓ミクロソームと共にインキュベートするインビトロアッセイを確立した。アリコートを2時間かけて採取し、内部標準を使用してHPLC-MSで分析し、化合物の経時的な安定性を評価しました。以前に発表された研究によれば（グッドフェローら、2013）、我々は、その化合物が見出さ1 （Tマウス肝ミクロソームで比較的短い半減期を有する1/2 ;図= 15分1 3 A ）。ミクロソームでの半減期が30分未満の化合物は、クリアランス率が高いため、一般的に理想的な薬剤候補ではありません。最初に評価された11の類似体のうち、2つの類似体（7y、7ad ）のみが有望な半減期（> 30分;図11 ）を示しました。
【０５１７】
次に、我々は、さらなる構造的改変を通じて類似体の半減期を改善することに着手した。私たちの計算ドッキング実験は、メチルピペラジン部分が溶媒にさらされていることを示し、その修飾が小胞体ストレスアッセイでの効力を維持しながら、化合物の薬物動態特性を変える可能性があることを示唆しています。
【０５１８】
我々の最も強力な類似体の１つ（スキーム１１）への二環式メチルピペラジンの導入は、半減期を９分から１３分に増加させた（化合物１２ｅ；図１１）。類似体のミクロソーム安定性をさらに高めるために、同じ二環式ピペラジンを、半減期が30分を超える最初のシリーズの類似体の1つに導入しました（化合物7ad ;図11 ）。この場合、半減期を38分から158分に大幅に延長することができました（化合物12f;図11 ）。
【０５１９】
化合物12Fを化合物よりも強力であった1ECと、運動ニューロン生存アッセイにおいて50 0.11μM（表S1）のが、0.3μM（図以上の濃度で急激に毒性であった42 B ）。効力とミクロソームの安定性を維持しながら、この毒性の増加を軽減するために、7-アザインドール足場の3位にm-クロロフェニルまたはm-フルオロフェニル置換基を含む別の一連の類似体（スキーム12）を合成しました。小胞体ストレスアッセイでこれらの化合物の効力を評価し、ミクロソーム安定性アッセイでそれらの安定性を評価しました。これらの化合物のうちの2つ、12gおよび12jは、必要なものよりも半減期が短いか、小胞体ストレスアッセイで効力の低下を示しました。残りの4つの化合物（12H、12I 、12K 、及び12リットルから）強く救出運動ニューロンCPA-誘発されるERストレスと完全に集中<0.3μMでCPA処置の効果を打ち消すことができました。得られた化合物の一つ、12K、ミクロソームアッセイ（図中で> 120分の半減期を有し13A ）でレスキューCPA誘発性神経変性は、EC向上50 0.099μMの（図42 Bを）。
化合物12kは安定しており、経口で生物学的に利用可能であり、invivoで脳への浸透性が高い
【０５２０】
ミクロソームアッセイにおけるその強力な性能に基づいて、インビボでのさらなる薬物動態分析のために１２ｋが選択された。化合物１および１２ｋは、腹腔内（ＩＰ）注射または強制経口投与（ＯＧ）により、１０ｍｇ／ ｋｇで８週齢の野生型Ｂ６ＳＪＬＦ１ ／ Ｊマウスに投与された。脳と血漿は、LC-MS / MS分析のために24時間にわたって4つの時点で収集されました。
【０５２１】
１２ｋの薬物動態特性は、いくつかの測定にわたって１と比較して改善された。血漿中の曲線下面積（AUC）は1と比較して12k減少しましたが、脳内の12kのAUCは、IPとOGの両方の投与後に大幅に増加し、invitroミクロソームアッセイによって予測されたクリアランス率の減少と一致しました。（表4）。脳内の12kの濃度は、評価されたすべての時点および投与経路にわたって1と比較して増加し、脳と血漿の比率（図34Aおよび図34B 、および表4 ）も同様であり、脳浸透度の改善を示しています。IP注射動物の12kの脳Cmaxは1162ng/ g（= 2.60 μM;図34Aと図34B 、および表4 ）であり、CPA運動ニューロン生存アッセイでの救済に必要な閾値濃度を大幅に超えています。（図42B ）。IP対OG処理動物の血漿測定に基づく経口バイオアベイラビリティ（％F）は、化合物1で46％であり、Goodfellow etal。によって報告された値と一致しています。（％F= 41; （Goodfellow et al。、2013））。一方、12kの％Fは73％で、1と比較して著しく増加しています。脳の測定値を比較することにより、12kでも同様の結果が得られました（％F= 73％）。まとめると、これらの結果は、12kが、特に中枢神経系の研究において、invivoでの将来の使用に非常に適していることを示しています。
【表４】
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MLK3阻害ではなく、HGK阻害は、運動ニューロンの生存と強く相関します
【０５２２】
ここで生成および試験された化合物１類似体のバッテリーは、化合物１がもともとＭＬＫを阻害するように最適化されたことを考えると、ＨＧＫまたはＭＬＫ阻害が運動ニューロン生存にとってより重要であるかどうかを調査するユニークな機会を提供した。化合物の神経保護効果は、1と53の類似体（図7B - 12eが）1μM（表S2）でCPAで処理したヒトALS運動ニューロン培養物中で同時に評価しました。一方、同じ類似体を放射性標識ATPアッセイ（10μM ATP; Reaction Biology Corp.）で分析し、無細胞環境でHGK、MLK1、またはMLK3の活性を阻害できる程度を比較しました（表S3およびS4）。化合物は、MLK1およびMLK3阻害については0.1μMで、HGK阻害については0.025 μMおよび0.1 μMでテストされました。多くの化合物が0.1μMでHGKを完全に阻害し、それによって神経保護類似体間のHGK阻害の微妙な違いを隠蔽したため、0.025μMアッセイのデータをさらなる分析のために選択しました（表S4）。
【０５２３】
次に、回帰分析を使用して、ＨＧＫ、ＭＬＫ１、またはＭＬＫ３を阻害する所与の類似体の能力を、ＣＰＡ生存アッセイにおいてヒトＡＬＳ運動ニューロンをレスキューするその能力と比較した。全体として、我々は、MLK3活性を阻害すると神経保護との間のわずかだが有意な相関関係（R観察2 ; p <0.0001;図= 0.52 7 Aを）。我々はMLK1、また、JNK経路を活性化することが示されているMLK3のパラログについて同じ分析を行っ（ギャロおよびJohnson、2002）、それでも弱いことが相関を見出した（R 2 = 0。40 、p <0.0001。図7A ）。（R一方、我々は、堅牢なHGKの活性および神経保護の阻害との相関関係が観察2; p <0.0001;図= 0.84 7 Bを）。これらの発見は、HGKが化合物1およびその類似体の潜在的に重要な生物学的標的であることを示しています。
【表Ｓ２−１】
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【表Ｓ２−２】
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【表Ｓ３−１】
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【表Ｓ３−２】
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【表Ｓ４−１】
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【表Ｓ４−２】
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関連するMAP4Kの抑制は、運動ニューロンの生存と相関します
【０５２４】
化合物１およびその類似体の生物学的に関連する標的をさらに調査するために、我々は、ＣＰＡアッセイにおいて中程度から非常に強い保護までの範囲の１０個の類似体を選択し、放射性標識において０．１μＭで６０個のヒトキナーゼのパネルを阻害するそれらの能力を評価した。 ATPアッセイ（表S5）。拡大されたパネルのキナーゼは、化合物1の既知の標的（Goodfellow et al。、2013）、CPA生存アッセイで保護された他のキナーゼ阻害剤の既知の標的（実施例12を参照）、および文献からの関連標的から選択された。RNAseqデータを使用して、ES運動ニューロンにおける各キナーゼの発現を確認しました（例12を参照）。
【０５２５】
ＣＰＡアッセイにおける類似体の機能的標的を解析するために、我々は、所与のキナーゼの活性の阻害がＣＰＡアッセイにおける神経保護と相関する程度を比較する回帰分析を実施した。試験した10種類の類似体すべてによって活性がほとんど阻害されなかったキナーゼ（0.1 μMで> 20％の活性が残っている）は分析から除外されました。HGK、TNIK、MINK1（MAP4K6）、GCK（MAP4K2）、およびKHS（MAP4K5）の阻害は、神経保護と強く相関していることがわかりました（図32）。これらの調査結果は、HGK、MINK1、GCK、およびKHSがすべて最も上位にランク付けされたターゲットの1つである、予備スクリーニング（図4 1A）からのヒット化合物の共有ターゲットの分析とも一致していました。（TNIKは、既存の公開されているデータベースでその活性が評価されなかったため、共有ターゲットの最初の分析には表示されませんでした（Anastassiadiset al。、2011）。）すべてのMAP4Kキナーゼの触媒ドメインは高度に保存されているため、神経保護は、いくつかのMAP4Kファミリーメンバーを同時に阻害することによって媒介されます（Larhammaret al。、2017）。
表S5。化合物1および9の類似体に対してReactionBiologyCorpが実施した放射性リガンド結合アッセイを使用した、化合物1の60の既知の標的の阻害プロファイル。（化合物は、0.1μMの濃度で単回投与の単一モードで試験された。反応は10μMATPで実施された。）
【表Ｓ５−１】
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【表Ｓ５−２】
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化合物12kの追加のキナーゼ標的の同定
【０５２６】
効力の増加および１２ｋの好ましい薬物動態プロファイルは、それを、オフターゲット効果が懸念されるであろうインビボでの将来の研究の有力な候補にする。グローバルキナーゼ阻害プロフィールを得るために、化合物1及び12Kは、371個のヒトキナーゼ（図の拡張パネルを横切って無細胞放射性標識ATPアッセイで0.025μMで試験した38 Aおよび図38B、表S6）。MAP4KのMINK1、KHS、HGK、GLK、およびGCKは、1と比較して12kの曝露後に最も高い活性の変化を示したことがわかりました（それぞれ22.56、17.36、14.92、6.84、および6.22倍の変化;図38 C ）。ただし、以前に神経変性NUAK1 （Lasagna -Reeves et al。、2016）およびLRRK2 （Islamand Moore ）に関与していたキナーゼを含め、いくつかの非MAP4キナーゼは12k対1の曝露によってより効率的に（> 1.5倍）阻害されました。、2017）。これらの観察は、MAP4Kを超える追加のキナーゼ標的が12kの増強された効力に寄与する可能性を高めた。遺伝子ノックダウンやノックアウトなどのさらにターゲットを絞った分析は、神経変性のモデルにおけるこれらの追加のキナーゼの役割を解析するために正当化される可能性があります。
【表Ｓ６−１】
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【表Ｓ６−２】
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【表Ｓ６−３】
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【表Ｓ６−４】
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【表Ｓ６−５】
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【表Ｓ６−６】
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【表Ｓ６−７】
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【表Ｓ６−８】
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【表Ｓ６−９】
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化合物12kは、MAP4Kでの活性を介さずに、化合物1の抗炎症特性を維持します。
【０５２７】
化合物１は、ＨＩＶ関連神経炎症のインビトロおよびインビボモデルで最初に検証され、ミクログリアによる炎症性サイトカイン産生を弱めることが示された（Ｍｅｒｋｅｒら、２０１３）。本明細書に記載の化合物1類似体の開発における私たちの目的は、主に神経細胞死を防ぐことができる強力で代謝的に安定した薬物を生成することでしたが、ALSなどの神経変性疾患も攻撃的なミクログリオーシスを伴うという事実を考えると（Hallet al。、1998）、薬物を介したミクログリオーシスの抑制はALSのげっ歯類モデルで保護的であるため（Trias et al。、2016）、最適化された化合物がミクログリアのサイトカイン放出も調節できるかどうかを尋ねました。この質問は、Markeret al。によると、化合物1の抗炎症効果がミクログリアのMLK3によって調整されるという事実によっても促されました（Marker et al。、2013）。一方、ここでテストしたすべての類似体は、化合物1と比較してMLK3での活性の低下を示しました。
【０５２８】
このミクログリア活性化をモデル化するために、インビトロで、我々は濃度の増加とともにマウスN9ミクログリア細胞を刺激した大腸菌リポ多糖（LPS）由来-プロ炎症性サイトカインのTNFの放出を測定する（0.1~5μM）αを細胞培養培地への。TNFで誘導されるここで用量依存的増加選択LPS濃度の範囲α分泌（図44）が、N9細胞死を誘導しなかった（データは示さず）。我々は次に、TNF比べα LPS及び化合物と共処理した培養物中の分泌1又は最適化されたアナログ12KMAP4Ksで増加した活性を示した（図42 Bを）が、わずかに（66.99パーセントMLK3活性は0.25μMで残りMLK3で活性を減少しました12K対0.025μMで残りの56.39パーセントMLK3活性1;表S6）。我々はまた、化合物試験12E 、強く阻害HGK活性（0.025μMのに残って2.73パーセントのHGK活性12E 、表S4）を、高度に神経保護性であった（表S2）が、MLK30.1μM1で、残りの（71.81パーセントMLK3活性にほとんど活性を有し2E 1の10.5％と比較して;表S3）。
【０５２９】
我々は、その化合物が見出さ1を有意と用量が依存的減少TNF α分泌の刺激ミクログリアの以前に報告された抗炎症効果と一致LPSの全濃度を横切る（図44 ）。化合物12Kをも大幅に減少TNFα化合物よりも、このアッセイではあまり強力であったが、分泌を1 （図44 ）。一方、化合物12eは有意TNF減少しなかったα最高LPS濃度（図以外で0.5μMで加えたときのレベルを44）。まとめると、これらの知見は、MAP4K阻害がTNF軽減しないことを示唆しているα 、この文脈でのリリースを、そのようなMLK3などの非MAP4K目標の保持は配合する抗炎症活性を与えることが1つのアナログを。さらに、これらの知見はまた、ことを示している12Eは、キナーゼ阻害の抗炎症効果対神経保護を解離するための貴重なツール化合物であってもよいインビボ。
ディスカッション
【０５３０】
ＥＲストレスにさらされたヒト運動ニューロンにおける我々の以前の研究は、強力な神経保護剤として広域スペクトルキナーゼ阻害剤を指摘した。ここでは、これらの保護化合物の共有ターゲットには、HGK、MINK1、GCK、および密接に関連するMAP4KのグループであるKHSが含まれると判断しました。化合物1を足場として使用して、MAP4Kをブロックする能力で有効性を追跡した、神経保護的で薬理学的に安定した化合物のアレイを開発しました。
【０５３１】
我々の最初の焦点は、以前は運動ニューロン変性に関与していたキナーゼであるＨＧＫにあったが（Ｗｕら、2019； Ｙａｎｇら、２０１３）、複数のＭＡＰ４Ｋが協調して作用して、状況において神経変性を媒介する可能性がある。小胞体ストレスの。Larhammaretal。（2017）HGK、TNIK、およびMINK1を阻害する小分子であるGNE-495が、神経栄養因子の離脱にさらされた一次後根神経節ニューロンにおいて神経保護的であることを示しました。さらに、3つのキナーゼすべてを一緒にノックダウンすると（個別ではない）、阻害剤の効果が再現されました。彼らは、神経変性アッセイにおける関連するMAP4Kの役割は冗長であり、単一のキナーゼを阻害する効果は、残りのキナーゼの活性によって克服できると主張しています。したがって、複数のMAP4Kの複合阻害が、CPA処理運動ニューロンにおける化合物1およびその類似体の強力な神経保護効果の根底にある可能性があります。
【０５３２】
一方、ＥＲストレスの状況における活性化されたＭＡＰ４Ｋの下流の標的は、完全には理解されていない。CPA処理により、JNKおよびc-Junのリン酸化が誘導されることがわかりました。これらはすべて、化合物1によって元に戻すことができます。また、MLK3とMLK1の阻害は、どちらも化合物1によって強く標的とされるMAP3Kであり、神経保護と中程度に、しかし有意に相関することを発見しました。これは、複数のMAP3Kキナーゼの活性が下流のMAP2K標的に関与するために必要である可能性を示唆しています。この考えに沿って、ヤン等。（2013）HGK阻害剤ケンパウロンが運動ニューロンにおける神経栄養因子の離脱に続くTAK1（MAP3K7）のリン酸化を防ぐことを発見しました。他の研究では、DLK（MAP3K12）が軸索損傷に関係しており、神経変性（Yanget al。、2015）と軸索再生（Shin et al。、2012）の両方を促進しています。感覚ニューロンにおける神経栄養因子の離脱がカンペノットチャンバーの軸索コンパートメントに制限された実験では、DLKのアポトーシス促進活性はMAP4Kによって媒介されることが示されました（Larhammaret al。、2017a）。まとめると、これらの観察結果は、MAP4Kの下流エフェクターが細胞の種類や傷害によって異なる可能性があり、さらに、化合物1とその類似体が神経変性の複数のモデルにわたって保護的である可能性があることを示唆しています。
【０５３３】
と同時に、キノーム全体プロファイル1及び12K （図38 Aおよび図38。B;表S6）、それはどちらの化合物は、MAPキナーゼの完全に選択的であることが明らかにします。化合物1およびその類似体の非MAPK標的のいくつかは、それらの神経保護効果を増強する可能性があります。阻害が神経保護と強く相関する他のキナーゼには、PRKD3、ABL1、およびABL2が含まれていました（表S6）。したがって、非サブタイプ特異的な方法でPKCまたはABLキナーゼを標的とするキナーゼ阻害剤（例えば、それぞれRo-318220メシル酸塩およびボスチニブ）は、CPA処理運動ニューロンにおいて穏やかに保護的であることが観察された（データは示されていない）。さらに、ボスチニブの添加とABL1の遺伝的切除の両方が、ALSのヒト幹細胞由来の運動ニューロンモデルにおいて神経保護的であることが示されています（Imamuraet al。、2017）。PRKD3やABL1などのキナーゼがCPAのコンテキストでどのように活性化されるかは不明ですが、おそらくJNK経路の下流、またはJNK経路に直交して、化合物1とその類似体の幅広いスペクトル効果が成功の鍵となる可能性があります。invitro運動ニューロン生存アッセイ。
【０５３４】
我々の研究は神経変性に焦点を合わせているが、インビボで非ＭＡＰ４キナーゼおよび／または非神経細胞を標的化することには、さらにかなりの利益があるかもしれない。代表的な例は、化合物1がMLK3を介してミクログリアの活性化を強力に阻害し、それによってHIV関連の神経炎症との関連でシナプスの喪失を防ぐことです（Markeret al。、2013）。神経膠症は多くの神■■経変性疾患の特徴であり、ALSのマウスモデルで容易に観察されます（Hall et al。、1998）。ミクログリアがALSの文脈で有用であるか有害であるかについてはいくつかの議論があります（Chiuet al。、2013; Gowing et al。、2008; Spiller et al。、2018）-おそらく両方とも、疾患の段階に応じて-しかし、キナーゼ阻害剤であるマシチニブによる治療は、後期SOD1G93A変異ラットのミクログリオーシスを軽減し、疾患の進行を遅らせることが示されています（Trias et al。、2016）。最適化されたアナログ12kは、ミクログリアのサイトカイン放出を阻害する能力を保持していることがわかりました。これは、MLK3活性をブロックする能力に依存している可能性があります。したがって、神経変性を超え、comound12Kおよび他の化合物1つのここで生成された類似体標的神経炎症および神経変性経路の両方が、ALSのための特に強い治療候補であり得ることを。
【０５３５】
最後に、ＭＡＰ４Ｋは、肥満（Ｄａｎａｉら、2015）、インスリン抵抗性（Ａｍｍｉｒａｔｉら、2015； ＢｏｕｚａｋｒｉおよびＺｉｅｒａｔｈ、２００７； Ｃｈｕａｎｇらを含む、ＣＮＳ以外の複数の多様な障害に関係している。、2014; Flach et al。、2016; 2017; Tang et al。、2006; Tesz et al。、2007）、アテローム性動脈硬化症（Aouadiet al。、2009; Virbasius and Czech、2016）、肝細胞癌（Han etal。 、2010）、肺腺癌（Qiu et al。、2012）、結腸直腸癌（Linet al。、2018; Salem et al。、2018）、および多くの種類のヒト腫瘍における一般的な形質転換および転移過程（Wright etal。 、2003）。したがって、ここで生成された化合物は、広範囲のヒトの疾患にわたって幅広い治療の可能性を秘めている可能性があります。
材料および方法
ヒトおよびマウスの幹細胞株の生成
【０５３６】
リード化合物を同定するための予備的生存アッセイを、野生型運動ニューロンレポーターｉＰＳ細胞株に由来するヒト運動ニューロンで実施した。このラインは、CRISPRベースの遺伝子ターゲティング戦略を使用してNCRM-1コントロールiPSライン（RRID：CVCL-1E71）から生成されました。ここで、iCre-IRESは運動ニューロン固有のVAChTプロモーター領域のN末端に挿入され、CAGGS-lox-STOP-lox-TdTomatoがAAVS1セーフハーバー遺伝子座に挿入されました。両方の挿入を確認するためにクローンを配列決定し、さらなる増殖のために選択されたクローンを核型決定した。
【０５３７】
特徴づけられた化合物１類似体に対する生存アッセイは、以前に記載されたように（実施例１２を参照）、ヘテロ接合性ＳＯＤ１Ａ４Ｖ点突然変異を有するＨＢ９：ＧＦＰ運動ニューロンレポーター胚性幹細胞株に由来するヒト運動ニューロンにおいて実施された。
【０５３８】
ウエスタンブロット実験は、タムスらによって生成されたＥＳ由来のマウス運動ニューロンにおいて実施された。（実施例12を参照）ヘテロ接合性Tg（Hlxb9-GFP）1Tmj運動ニューロンレポーターマウスと野生型ヒトSOD1（B6SJL-Tg（SOD1）2Gur/ J）を発現するマウスの交配から。
【０５３９】
すべての細胞株は、マイコプラズマについて日常的に試験された。
人間の運動ニューロンの分化
【０５４０】
ヒト運動ニューロンは、以前に記載されたように（Ｍａｕｒｙら、２０１４；実施例１２）、上記のヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞から分化された。幹細胞は、照射されたCF-1マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層（Thermo Fisher）で、ノックアウト血清置換（20％、LifeTechnologies）、Glutamax（1）を添加した無血清培地（DMEM / F12、Life Technologies）で維持されました。 ％、LifeTechnologies）、非必須アミノ酸（1％、Millipore）、ベータメルカプトエタノール（0.1％、Sigma）、およびヒト組換え線維芽細胞成長因子2（FGF2、20ng / mL、Peprotech）。
【０５４１】
０日目に、幹細胞は、アキュターゼ（サーモフィッシャー）を使用して単一細胞に解離され、胚様体が懸濁液中で培養されるにつれて、１６日間にわたって運動ニューロンに分化した。分化は、Advanced DMEM / F12とNeurobasal培地（Life Technologies）、Glutamax（1％）、ベータメルカプトエタノール（0.1％）、N2（1％、Life）の1：1混合物で構成されたN2B27培地で実施されました。Technologies）、B27（2％、Life Technologies）、およびアスコルビン酸（10 μM、Sigma）。0-1日目から、分化培地にFGF2（10ng / mL）、Y-27632二塩酸塩（10 μM、Abcam）、SB 431542水和物（SB、20 μM、Sigma）、LDN193189（LDN、0.1μM、 Stemgent）およびCHIR 99021（CHIR、3 μM、Tocris）。2■7日目から、分化培地にSB（20 μM）、LDN（0.1 μM）、CHIR（3μM）、レチノイン酸（100 nM）、およびソニックヘッジホッグアゴニスト（SAG、500 nM; Millipore）を添加しました。7■9日目から、分化培地にレチノイン酸（100nM）、SAG（500 nM）、脳由来神経栄養因子（BDNF、10 ng / mL、Peprotech）を補充しました。9■14日目から、分化培地にレチノイン酸（100nM）、SAG（500 nM）、BDNF（10 ng / mL、Peprotech）、およびDAPT（10 μM、Tocris）を補充しました。14■6日目から、分化培地にレチノイン酸（100nM）、SAG（500 nM）、BDNF（10 ng / mL）、DAPT（10 μM）、およびグリア由来神経栄養因子（GDNF、10 ng / mL;Peprotech）。
【０５４２】
分化の１６日目に、胚様体を０．０５％トリプシン（ライフテクノロジーズ）および機械的粉砕を使用して解離し、運動ニューロンを、ポリオルニチン（１００）でコーティングされた９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に２０００細胞／ウェルでプレーティングした。 μg / mL、Sigma）およびマウスラミニン（3 μg / mL、ThermoFisher）。培養物は、N-2（1％）、B27（2％）、抗有糸分裂薬としてのウリジンとフルロデオキシウリジンの1：1カクテル（1μM、Sigma）を添加した無血清神経基礎培地（Life Technologies）で維持されました。次の組換えヒト神経栄養因子：GDNF、BDNF、繊毛神経栄養因子（CNTF）、およびインスリン様成長因子1（IGF-1）、すべて10ng / mL（Peprotech）。
ヒト運動ニューロン生存アッセイ
【０５４３】
解離およびプレーティング（ＤＩＶ２）の４８時間後、運動ニューロンを、ＣＰＡ（３３μＭ、トクリス）および試験化合物で同時に処理した。DMSO（Sigma）をビヒクル対照として使用した。すべての試験化合物について、ストック溶液はDMSOで調製し、作業溶液は運動ニューロン培地で調製しました。WZ4003（Tocris）およびHTH01-015（Selleckchem）は、3つの複製ウェルで0.25■32 μMの8ポイント2倍希釈系列でテストされました。PF-6260933（Selleckchem）、GNE-495（Selleckchem）、およびURMC-099（Selleckchem）は、3つの複製ウェルで0.075■9.6μMの8ポイント2倍希釈系列でテストされました。化合物1の類似体は、3つの複製ウェルで0.1、0.3、0.5、1、および3 μMで評価されました。EC 50化合物の1つの類似体は、化合物の実験からPrismソフトウェア（グラフパッド）を使用して決定した1と53の類似体を同時にアッセイしました。
【０５４４】
運動ニューロンを、ＣＰＡおよび試験化合物と共に７２時間インキュベートした。CellTrace Calcein AM（1.3 μM、Thermo Fisher）を使用して生細胞を可視化し、PBS中の10％ブリリアントブラック（Sigma）の溶液でバックグラウンド蛍光を消光しました。ウェル全体の画像は、PlateRunner HDシステム（Trophos）を使用して取得しました。Metamorphソフトウェア（MolecularDevices）を使用して細胞をカウントした。すべての細胞数は、生存ビヒクル（DMSO）で処理された細胞のパーセンテージとして表されます。
マウス運動ニューロンの分化
【０５４５】
マウス運動ニューロンはタンパク質抽出に必要な量で迅速に生成することができるので、生化学アッセイのためにヒト運動ニューロンではなくマウスを使用した。実施例１２に記載されているように分化を実施した。Wichterle et al。、2002）。ES細胞はCF-1MEFフィーダー層で維持され、レチノイン酸（1 μM）とSAG（0.5μM）を使用して6日間解離および分化しました。運動ニューロンは、2％ウシ胎児血清（Life Technologies）、GDNF（400 pg / mL）、フォルスコリン（10μM、Tocris）、およびIBMX（100 μM、Sigma）を含む培地で維持されました。
JNK経路調節の生化学的分析
【０５４６】
分化の６日目のマウス胚様体全体を、ＣＰＡ（１０μＭ）および試験化合物で４時間処理し、次いで、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎを含む氷冷緩衝液中で溶解および超音波処理した。 -X（1％）、SDS（0.1％）、DTT（1 mM）、EDTA（1 mM）、およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルタブレット（Roche）。総タンパク質含有量は、製造元の指示（Pierce）に従ってBCAキットを使用して分析しました。各サンプルについて、50μgの総タンパク質をDTT（100 mM）で70℃で10分間還元し、LDSローディングバッファー（Thermo Fisher）を含むNuPAGE Novex4-12％ビストリスゲル（Thermo Fisher）にロードしました。サンプルを100V、4°で4時間泳動した後、iBlot乾式転写システム（ThermoFisher）を使用してニトロセルロースメンブレンに転写しました。メンブレンを5％BSA（Cell Signaling Technologies）を含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）でブロックし、TBS中の5％BSAおよび0.1％Tweenを含むバッファー中の一次抗体と4°で一晩インキュベートしました。phospho-c-Junに対する一次抗体（セリン63;Cell Signaling Technologies＃9261）を1：500で追加しました。phospho-JNKに対する一次抗体（thr183 / tyr185;Cell Signaling Technologies＃4688）を1：1000で追加しました。GAPDH（Santa CruzBiotechnologies）に対する一次抗体は、ローディングコントロールとして1：1000で追加されました。0.1％Tweenを含むTBSで洗浄した後、メンブレンをヤギ抗ウサギHRP標識二次抗体溶液（1：10,000;Santa Cruz Biotechnologies）で1時間インキュベートしました。次に、メンブレンを0.1％Tweenを含むTBSで再度洗浄し、FemtoECL（Pierce）で5分間インキュベートしました。化学発光は、LiCorOdysseyを使用して視覚化されました。Phospho-c-Junおよびphopsho-JNKバンド強度はGAPDHに正規化されました。
化合物1類似体および中間体の合成に関する一般的な実験の詳細
【０５４７】
出発物質は、シグマアルドリッチ、フィッシャーサイエンティフィック、アークファーム、オークウッドケミカル、ケンブリッジアイソトープラボラトリー、またはＡＫサイエンティフィックから購入し、特に明記しない限り、受け取ったままで使用した。すべての溶媒は試薬グレードでした。カラムクロマトグラフィーは、RediSep(R)順相シリカフラッシュカラムを使用して、TeledyneISCOCombiFlash(R)Rf+で実行されました。薄層クロマトグラフィー（TLC）は、SilicycleSiliaPlateTMガラスTLCプレート（250μm、20 x 20 cm）で実施しました。示されている場合、化合物は、GX-271リキッドハンドラーを備えたGilson HPLCを使用して、PhenomenexGemini NX-C 18カラム（250 x 21.2 mm、粒子サイズ：5 μm、細孔サイズ：110A）での分取HPLCによって精製しました。1 HNMRスペクトルは、示されているように400MHzまたは500MHzの分光計を使用して周囲温度で記録されました。化学シフトは、残留溶媒ピークに対するppmで報告されます（1H NMR：DMSO- d6 、δ2.50;クロロホルム-d 、δ7.26;メタノール-d4 、δ3.31）。次の略語は、多重度を示すために使用されます：s（シングレット）、d（ダブレット）、t（トリプレット）、q（カルテット）、hept（ヘプトプレット）、m（マルチプレット）、br（ブロード）。高分解能質量スペクトル（HRMS）は、示されているように、大気圧化学イオン化（APCI）またはエレクトロスプレーイオン化（ESI）を備えた飛行時間型質量分析計で取得され、ピークマッチングによって取得されました。すべての反応は、特に明記しない限り、アルゴン下で火炎乾燥したガラス器具内の窒素またはアルゴンの雰囲気下で実行されました。水溶液は、抵抗率が18MΩ・cmを超えるナノ純水から調製されました。特に断りのない限り、すべての試薬は市販されていました。
体外ミクロソームの安定性
【０５４８】
ミクロソーム安定性アッセイは、９６ウェルフォーマット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＳｔｏｒＰｌｅｔ−９６Ｕ、ＰＰ、９６ウェル、丸底）で実施された。各ウェルにリン酸緩衝液（182.2 μL、pH 7.4、100 mM）を添加し、続いてNADPH再生システム溶液A（10 μL）、およびNADPH再生システム溶液B（2μL）（Corning Gentest 3PNADPH再生システム溶液A）を添加しました。 （＃451220）およびB（＃451200））。分析する化合物のストック溶液（0.8μL。5 mM）またはエトキシクマリン（ポジティブコントロール、0.8 μL、5 mM）を加え、混合物を37 ° Cで5分間温めました。マウスミクロソーム（CD-1、5μL、使用前に37 ° Cのウォーターバスで解凍、20 mg / mL、Life Technologies）を追加しました。選択した時点（0、15、30、45、60、および120分）で、アリコート（15μL）をプレートから取り出し、内部標準（5 μM）を含む冷アセトニトリル（60 μL）に添加してクエンチしました。 96ウェルプレート。サンプルを13,000rpmで10分間、4° Cで遠心分離しました。上清（40 μL）を取り出し、インサート付きのサンプルバイアルに移しました。サンプルはLC-MSで分析しました。
【０５４９】
ＬＣ−ＭＳ分析は、サーモサイエンティフィックダイオネックスアルティメット３０００と、ブルカーハイスター３．２によって制御されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたブルカーアマゾンＳＬとを含むプラットフォーム上で実施された。クロマトグラフィーによる分離は、20 ° Cに維持されたAgilent Eclipse Plus C18カラム（2.1 x 50 mm、3.5 μm）に5 μLのサンプルを注入することによって実行されました。流速は400μL / minに維持されました。初期フロー条件は、60％の溶媒A（0.1％の酢酸を含む水）と40％の溶媒B（0.1％の酢酸を含むメタノール）でした。溶媒Bは0.25分で60％に、6.75分で70％に上昇しました。溶媒Bは7.00分で95％に上昇し、8.00分で初期条件（40％）に戻り、合計実行時間は9.00分でした。
インビボ薬物動態
【０５５０】
化合物１および１２ｋをＤＭＳＯに溶解して４０ｍｇ ／ｍＬにした。インビボ投与のために、DMSOストックを、40％のPEG-400（Sigma）および55％の（2-ヒドロキシプロピル）-ベータ-シクロデキストリン溶液（ナノ純水中の20％）を含むビヒクルでさらに2mg/ mLに希釈した。シグマ）。化合物は、腹腔内注射または強制経口投与により、8週齢の雄の野生型C57Bl6Jマウス（Jackson）に10mg / kgで送達された。15分、3時間、8時間、または24時間後、動物をケタミン（100mg / kg）とキシラジン（10 mg / kg）の混合物で麻酔し、断頭して体幹血液を採取し、新鮮な脳組織を解剖しました。血液サンプルをEDTA溶液（最終濃度50mM）で処理して凝固を防ぎ、血漿を分離するために845 rcf、4°で10分間遠心分離しました。新鮮な脳を5倍量のddH2Oで溶解しました。
【０５５１】
血漿サンプルをエッペンドルフチューブ（サンプルあたり５０μＬ）に移し、アセトニトリル（２００μＬ）で希釈した。サンプルを1分間超音波処理した後、16,000rpmで10分間遠心分離しました。上澄みを別のエッペンドルフチューブに移し、溶媒を一晩蒸発させた。サンプルは、40μLのアセトニトリルと10 μLの水の混合液で再構成し、インサート付きのサンプルバイアルに移し、LC-MSで分析しました。
【０５５２】
均質化された脳サンプル（２５０μＬ）をエッペンドルフチューブに移し、アセトニトリル（７５０μＬ）で希釈した。サンプルを1分間超音波処理した後、16,000rpmで10分間遠心分離しました。上澄み（900 μL）を別のエッペンドルフチューブに移し、溶媒を一晩蒸発させました。サンプルを80μLのアセトニトリルと20μLの水の混合液で再構成し、インサート付きのサンプルバイアルに移し、LC-MSで分析しました。
【０５５３】
ＬＣ−ＭＳ分析は、サーモサイエンティフィックダイオネックスアルティメット３０００と、ブルカーハイスター３．２によって制御されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたブルカーアマゾンＳＬとを含むプラットフォーム上で実施された。各血漿サンプル中の化合物濃度は、検量線を使用して決定されました。クロマトグラフィーによる分離は、20 ° Cに維持されたAgilent Eclipse Plus C18カラム（2.1 x 50 mm、3.5 μm）に10 μLのサンプルを注入することによって実行されました。流速は400μL / minに維持されました。初期フロー条件は、60％の溶媒A（0.1％の酢酸を含む水）と40％の溶媒B（0.1％の酢酸を含むメタノール）でした。溶媒Bは0.25分で60％に、6.75分で70％に上昇しました。溶媒Bは7.00分で95％に上昇し、8.00分で初期条件（40％）に戻り、合計実行時間は9.00分でした。
ミクログリア文化、LPS処理、およびTNFαのELISA
【０５５４】
不死化Ｎ９マウスミクログリア細胞（Ｃｏｒｒａｄｉｎら、１９９３）を、ゼラチンコーティング（０．１％、ＥＭＤミリポア）９６ウェルプレートに８０００細胞／ウェルでプレーティングした。培養は、FBS（10％、Life Technologies）およびGlutamax（1％、Life Technologies）を含むDMEMで維持されました。プレーティングの24時間後、細胞をE.coli O111：B4（Sigma）のLPSと指定濃度の試験化合物で処理しました。LPS処置の開始後24時間、細胞培養培地の50μL（最終培養体積の25％）TNFについての定量的ELISAを実行するために使用されたα、製造業者の説明書（R＆Dシステムズ）による離。吸光度は分光光度計（TECAM）で450 nMで評価され、540nMでの読み取り値が波長補正に使用されました。培養皿に残っているN9細胞をAlamarBlue（ThermoFisher）で処理して、生存率を評価しました。5 μLのAlamarBlueを各ウェル（50 μLの培地を含む）に添加し、37°で4時間インキュベートしました。吸光度は570nMで評価され、600nMでの読み取り値が波長補正に使用されました。
ソフトウェア
【０５５５】
スポットファイア（バージョン2017、ＴＩＢＣＯ）を使用して、試験極１２に記載された元のスクリーンからのヒット化合物のキナーゼ標的を比較し、階層的クラスタリングを実行した。分子ドッキング、分子モデリング、および視覚化は、Glide（バージョン2012-2016、Schrodinger）およびSchrodingerMaestro（バージョン2017-1）を使用して実行されました。すべての化学構造は、ChemDrawProfessional 16.0（Perkin Elmer）を使用して描画されました。ImageStudioLite（LiCor）を使用して、ウエスタンブロットバンド強度を評価しました。Prism5、7、および8（GraphPad Software）を使用して、運動ニューロンの生存データとEC 50 、ウエスタンブロットバンド強度、ミクロソーム安定性データ、invivo薬物動態パラメーター、キナーゼ活性の阻害と化合物1類似体の生存との相関関係を分析しました。そしてTNF α ELISAデータ。
統計分析
【０５５６】
統計分析は、GraphPadPrismを用いて実施された。データは平均±SEMとして表されます。運動ニューロン生存アッセイからの平均のプロットは、単一のアッセイからの3つのウェルを表しています。データは正規分布について評価されました。一元配置分散分析を使用して、ウエスタンブロットアッセイにおける運動ニューロンに対する治療の効果を比較しました。双方向ANOVAを使用して、N9ミクログリアに対するLPSと化合物1アナログ処理の効果を比較しました。一元配置および双方向のANOVAは、条件間の相互作用を評価するためにボンフェローニの多重比較検定で補完されました。ピアソンのrは、キナーゼ阻害の程度と運動ニューロンの救済の程度との間の相関の尺度として使用されました。
例14
化合物12kのCNSにおける安全性と目標の関与
【０５５７】
には、化合物のためのCNSにおける目標締結expore 12Kを、Cのompounds 1及び12Kは、野生型マウスとOSごとに連続的に投与した（N = 3あたり処理）。化合物1は100mg/ kgで投与された。化合物12kを5または10mg / kgで投与した。新鮮な脳サンプルは、7日間の治療後に採取されました。還元された脳サンプルをSDS-PAGEで分離し、サイクリン依存性キナーゼおよびマイトジェン活性化キナーゼの標的に対応するモチーフでリン酸化されたリンタンパク質を認識する抗体でプローブしました。図45に示すように、Compound 12Kは、一貫して、ビヒクルまたは化合物と比較して（矢印）、高分子量バンドの強度の減少1 。
【０５５８】
評価するために、長期的な化合物の安全12K 、C、投与ompound 12Kは、野生型マウスcontinuouslを投与した時に飲料水中のOSあたりY相当ミリグラム/ kgの10への濃度。治療はP30から始まり、60日間続けられました。12kで治療されたマウス（n= 3）は、ビヒクルで治療された対照（n = 3）と比較して体重の軽度の増加を示したが、それ以外は健康であった（図46A）。治療条件間で生存率、後肢強度、または肉眼的病理の違いは観察されなかった（図46B）。
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【０５５９】
本出願で引用されるすべての文書は、本明細書で完全に引用されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０５６０】
本発明の例示的な実施形態が本明細書に記載されているが、本発明は記載されたものに限定されず、範囲から逸脱することなく当業者によって様々な他の変更または修正を行うことができることを理解されたい。または発明の精神。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ−Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１５Ｋ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ−Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ−Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
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【図２１Ｉ】
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【図２１Ｊ】
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【図２１Ｋ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ−Ｂ】
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【図２３Ｃ−Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ−Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２４Ｈ】
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【図２４Ｉ】
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【図２４Ｊ】
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【図２４Ｋ】
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【図２４Ｌ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ−Ｄ】
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【図２５Ｅ−Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２５Ｈ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【国際調査報告】
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