(57)【要約】  本発明は、神経前駆細胞の調製、それを含んでなる組成物、及び治療用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−前記サンプル中の神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数を濃縮することを可能にする条件で、前記順化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖できる細胞の組成物を生成する方法。
【請求項２】
前記毛包細胞が毛包前駆体を含む、請求項１に記載の方法
【請求項３】
毛包前駆細胞の亜集団が、神経外胚葉性バイオマーカーを発現する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
毛包細胞が皮膚のサンプル中に提供される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記毛包前駆細胞の大部分が成長期に移行できるようにする条件で、前記毛包細胞を処理する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記毛包細胞を毛包細胞の休止期から成長期への移行を促進するための抗難治性毛包因子で処理し、それによって前記皮膚中の毛包細胞の保持又は成長期への移行を可能にする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記因子がノギン又はソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記毛包細胞を毛包細胞の休止期から成長期への移行を促進するための増殖促進因子で処理し、それによって前記皮膚中の毛包細胞の保持又は成長期への移行を可能にする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記増殖促進因子がＴＧＦ−β２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記毛包細胞が、毛包細胞のための細胞培養培地中で培養される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地がウィリアムズ培地Ｅである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記皮膚がヒト皮膚であり、又は毛包がヒト毛包である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記皮膚又は毛包が頭皮のものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記皮膚又は毛包が正中線後頭皮のものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
−前記皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚である皮膚のサンプルを処理し、それによって順化皮膚のサンプルを形成するステップと；
−前記順化皮膚から前記サンプル中に細胞を剥離させるステップと；
−前記サンプルから最終分化細胞又はアポトーシス細胞又は細胞残骸を枯渇させ、それによって非最終分化細胞のサンプルを形成するステップと；任意選択的に
−前記サンプル中の非最終分化細胞数の増加を可能にする条件で、前記非最終分化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプル中への前記細胞の剥離のために、前記順化皮膚の細胞外マトリックスの分解を可能にする条件で、前記皮膚に１種又は複数種の酵素を接触させることによって、前記細胞を前記皮膚から剥離させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素が、トリプシン、ＤＮＡ分解酵素、ディスパーゼ、及びコラゲナーゼからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプル中への前記細胞の剥離のために、前記順化皮膚の細胞外マトリックスを機械的に破壊することによって、前記細胞を前記順化皮膚から剥離させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記機械的破壊が手動摩砕を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプル中への前記順化皮膚からの細胞の剥離後、前記サンプルからの最終分化細胞の枯渇に先立って、前記サンプルから非細胞構成要素を除去するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルからの最終分化細胞の選択的枯渇を可能にする条件で、前記サンプルから最終分化細胞を選択的に枯渇させるための試薬に前記サンプルを接触させることによって、前記サンプルから前記最終分化細胞を枯渇させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
薬剤が、最終分化細胞には結合するが非最終分化細胞には結合しない抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が神経前駆細胞に結合しない抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が表皮又は真皮の細胞に結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が、上皮細胞又は角化細胞、又は線維芽細胞に結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が、線維芽細胞特異的抗原１又はＣＤ４５に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記枯渇ステップの完了時に、前記サンプルが数で約５％以下の最終分化細胞を含有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−前記順化細胞のサンプルに、細胞の単一細胞への解離を可能にする条件を提供するステップと；
−前記順化細胞のサンプルの細胞から神経球サンプルを形成することを可能にする条件で、前記順化細胞のサンプルを処理するステップと、
−前記神経球のサンプルに、前記神経球の細胞数を増加させる条件を提供するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法によって生成された前記組成物が、
＜５％の細胞が、星状膠細胞ＧＦＡＰ、アジポネクチン、乏突起膠細胞０４、筋線維芽細胞ＳＭＡを発現し、
＞９０％の細胞が、ネスチン、ＣＤ１３３、及びβＩＩＩ−チューブリンに対して陽性である
の特性を有する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法によって生成された前記組成物が、生体外神経細胞分化に続いて、９０〜１００％の神経収率を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物の前記細胞が増殖可能で、ほぼ１０７個程度の均質且つ単能性神経前駆細胞を４週間以内に産生する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経前駆細胞の調製、それを含んでなる組成物、及び治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における任意の先行技術への言及は、この先行技術が任意の法域における通常の一般知識の一部を形成すること、又はこの先行技術が、当該技術に熟練した者によって理解され、関連性があると見なされ、及び／又はその他の先行技術と組み合わされることが合理的に期待され得ることを承認又は示唆するものではない。
【０００３】
多能性幹細胞は、神経細胞を新規に生産するための通例の出発点であり、原始的な複製状態にある細胞の増殖に続いて、成熟神経細胞表現型への指向性分化が起こる。多能性幹細胞は、胚性起源（すなわち、胚性幹細胞）又は成体幹細胞リザバー（すなわち、間葉系幹細胞などの成体幹細胞）から単離することができ、又はより最近発見されたように、成熟した後分化細胞（例えば、線維芽細胞）を胚性様幹細胞（すなわち、誘導多能性幹細胞）に再プログラム化することによって単離され得る。
【０００４】
これらの方法のそれぞれは、定義上、複数の細胞運命（すなわち、多能性）を有することができるという一般的な制限を有する。したがって、神経細胞の収量は低く、変動し、特定の神経細胞分化条件で処理した後でさえも、非神経細胞の表現型がもたらされる。例えば、このような処理後のグリア細胞分化は、一般的な制限である。生物学的研究、商業的応用、又は治療的使用の目的のためには、単能性神経前駆体の均質な｛ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ｝集団、すなわち、均一で、一過性に複製性があり、神経細胞系に運命付けられた細胞を生産できることが有用であろう。
【０００５】
これまでの最も近い近似解は、主要な神経誘導遺伝子の上方制御を通じて増殖性幹細胞又は前駆細胞段階をバイパスすることによる、成熟した後分化細胞（例えば、線維芽細胞）の有糸分裂後神経細胞への直接的な遺伝子再プログラム化である（Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｔｓｕｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。しかし、この方法は遺伝子操作に依存しており、増殖可能な集団を生成せず、また、全ての方法と同様に、許容できないほど高い系統間変動に悩まされている（Ｔｒｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０００６】
これを念頭に置いて、ヒトの皮膚と中枢神経系が同一の発生学的起源、外胚葉系であることは興味深い。これら２つの器官中の成体幹細胞と前駆細胞が、同一細胞マーカー（例えば、ネスチン、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２など）の多くを発現し、同一細胞周期調節因子（ノギン、ＳＨＨ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＢＤＮＦなど）の多くを利用することは、ほとんど評価されていない。
【０００７】
２００１年に、Ｔｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）は、哺乳類の毛包ニッチ中の多能性幹細胞が、分化後に、低収率（＜１５％）ではあるが実際に生体外で神経細胞を産生し得て、ほとんどの細胞が非神経系に発達することを初めて実証した（Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｔｓｕｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）、及びその他の研究者ら（Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｂｅｌｉｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。興味深いことに、最近ではその逆も示されている：Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）は、真正の神経幹細胞抽出物（ヒト胎児由来）が、脱毛マウスの生体内で毛髪の再増殖を増加させ得ることを発見した。
【０００８】
したがって、双方の器官系は構造と機能が大きく異なるものの、それらは幹細胞と前駆細胞の増殖を支配する、同一生物学的機構系の多くを維持している。さらに、一方のニッチからの幹細胞と前駆体は、環境の手がかりだけで、もう一方の役割とアイデンティティを引き受け得る。（脳内の）生理学的ニッチから成人神経幹細胞にアクセスすることの難しさを考えると、遺伝的操作に頼ることなく、神経前駆細胞が所与の個人について彼ら自身の毛包前駆体集団から提供され得ることは、概念的に訴求力がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまでのところ、この前提は実際には失敗している。天然ヒト皮膚からの細胞生存率と神経収率はあまりにも低く、系統間の変動が非常に大きかった。
【００１０】
この文脈における前駆細胞供給源である成人の毛包は、単能性前駆細胞と多能性幹細胞の双方を含有する。単能性前駆体は、１つの細胞系統のみへの運命制限があり、生体外で無期限に細胞複製できないおかげで、多能性幹細胞とは根本的に異なる。最近、毛包内の一過性に増幅する前駆細胞の間には大きな異質性が存在し、この異質性により、異なる系統運命を有する亜集団の発生が可能になることが、明らかになってきた（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。さらに、この「系統背信」は、創傷修復、腫瘍発生性形質転換、又は生体外細胞培養の条件下で最大限に現れる（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｆｕｃｈｓ，２０１８）。
【００１１】
これまで認識されていなかったのは、ヒト毛包幹細胞又は前駆細胞の亜集団が、潜在的な神経細胞運命制限を保持する能力であった。
【００１２】
成熟した皮膚からこのような単能性神経前駆体を単離し増殖させる容易さは、種間で大きく異なる。例えば、本発明者らは以前、成犬の皮膚上でのプロセスを開発したことがあるが（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）、この方法は、毛包の量及び質における個体間及び個体内の差が大きいため、一般的にはヒト皮膚には適用できない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態では、
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−神経細胞系バイオマーカーを含むサンプルにおける細胞数の濃縮を可能にする条件で、順化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞の組成物、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成する方法が提供される。
【００１４】
一実施形態では、
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−順化細胞のサンプルの細胞から神経球を形成することを可能にする条件で、順化細胞のサンプルを処理するステップと、
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞の組成物、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成する方法が提供される。
【００１５】
一実施形態では、
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−順化細胞のサンプルの細胞から神経球を形成することを可能にする条件で、順化細胞のサンプルを処理するステップと、
−神経球のサンプルに、神経球の細胞数を増加させる条件を提供するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞の組成物、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成する方法が提供される。
【００１６】
一実施形態では、
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−順化細胞のサンプルに、細胞の単一細胞への解離を可能にする条件を提供するステップと；
−順化細胞のサンプルの細胞から神経球を形成することを可能にする条件で、順化細胞のサンプルを処理するステップと、
−神経球のサンプルに、神経球の細胞数を増加させる条件を提供するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞の組成物、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成する方法が提供される。
【００１７】
一実施形態では、
−皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚である皮膚のサンプルを処理し、それによって順化皮膚のサンプルを形成するステップと；
−神経細胞系バイオマーカーを含むサンプルにおける細胞数の濃縮を可能にする条件で、順化皮膚のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞の組成物、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成する方法が提供される。
【００１８】
一実施形態では、
−皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚である皮膚のサンプルを処理し、それによって順化皮膚のサンプルを形成するステップと；
−順化皮膚のサンプルから、最終分化細胞又はアポトーシス細胞又は細胞残骸を枯渇させ、それによって非最終分化細胞のサンプルを形成するステップと；
−神経細胞系バイオマーカーを含むサンプルにおける細胞数の濃縮を可能にする条件で、非最終分化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞の組成物、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成する方法が提供される。
【００１９】
一実施形態では、
−皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚である皮膚のサンプルを処理し、それによって順化皮膚のサンプルを形成するステップと；
−順化皮膚からサンプル中に細胞を剥離させるステップと；
−順化皮膚のサンプルから、最終分化細胞又はアポトーシス細胞又は細胞残骸を枯渇させ、それによって非最終分化細胞のサンプルを形成するステップと；
−神経細胞系バイオマーカーを含むサンプルにおける細胞数の濃縮を可能にする条件で、非最終分化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞の組成物、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成する方法が提供される。
【００２０】
さらなる実施形態では、上述の方法によって生成された細胞の組成物が提供される。組成物は、治療的有効量の細胞と、薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤とを含んでなってもよい。組成物の細胞構成要素は、上述の方法によって生成された細胞からなってもよく、又は細胞構成要素は、上述の方法によって生成された細胞を含んでなってもよく、その他の細胞をさらに含んでなってもよい。組成物は、注射又は輸液を可能にするように適合されてもよい。
【００２１】
さらなる実施形態では、治療のための、例えば、神経組織の病状又は疾患の治療のための細胞組成物の使用が提供される。このように、一実施形態では、治療を必要とする個人に上記組成物を投与し、それによって前記個人における疾患又は病状を治療するステップを含んでなる、前記治療を必要とする個人における前記疾患又は病状、好ましくは神経組織の疾患又は病状を治療する方法が提供される。
【００２２】
さらなる実施形態では、疾患又は病状、好ましくは神経組織の疾患又は病状の治療で使用するための上記の細胞の組成物が提供される。
【００２３】
さらなる実施形態では、疾患又は病状、好ましくは神経組織の疾患又は病状を治療するための薬剤の製造における上記の細胞の組成物の使用が提供される。
【００２４】
さらなる実施形態では、疾患又は病状、好ましくは神経組織の疾患又は病状を治療するための上記の細胞の組成物を含んでなる、１つ又は複数の装置が提供される。
【００２５】
本明細書の用法では、文脈が他を必要とする場合を除き、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、そして「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの用語の変形は、さらなる添加剤、構成要素、整数又はステップを除外することを意図しない。
【００２６】
本発明のさらなる態様、及び先行する段落に記載された態様のさらなる実施形態は、例示のために提供される以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】６時間又は７２時間にわたるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）を用いた事前の化学的前処理あり又はなしの、神経球解離後における、毛包当たりの典型的な細胞収量。４５歳の男性からのデータ。
【図２】コラゲナーゼ／ディスパーゼ処理と摩砕による、即時毛包酵素処理に続く優れた細胞収量。
【図３】４５歳男性（上段）及び２５歳男性（下段）の毛包由来の典型的な神経球の明視野顕微鏡写真。
【図４】一連の典型的な神経前駆体バイオマーカーで染色された神経球の蛍光顕微鏡写真。Ａ）遍在性神経幹細胞マーカーであるネスチン（細胞陽性の＞９０％）。Ｂ）神経前駆体マーカーダブルコルチン（ＤＣＸ；細胞陽性の＞８０％）。Ｃ）未成熟神経マーカーβＩＩＩ−チューブリン（Ｂ３Ｔ；細胞陽性の＞５０％）。Ｄ）陰性対照（プライマリーなし）。３４歳男性の毛包由来の全神経球。
【図５】ＨＦＮの単層増殖。２５歳男性からのコンフルエントＨＦＮの典型的な形態の明視野顕微鏡写真。幹細胞マーカーＣＤ１３３及び神経幹細胞マーカーであるネスチン及び未成熟神経マーカーβＩＩＩ−チューブリン（Ｂ３Ｔ）の遍在性（＞９０％陽性）タンパク質発現を示す蛍光画像。４５歳男性からのＨＦＮ細胞の蛍光画像。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、限定的な系統間変動性を示し、且つ商業的に有用な細胞数に迅速に増加する能力を有する、遺伝的に未改変のヒト細胞を生産することを可能にする、前駆体神経細胞組成物を生成する方法を提供する。方法は、
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−サンプル中の神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数を濃縮することを可能にする条件で、順化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む。
【００２９】
方法によって生成される組成物の細胞は、神経前駆細胞、又はより一般的には神経系列バイオマーカーを発現する増殖細胞である。神経系列バイオマーカーは、（最も原始的に）神経幹細胞様マーカーであるネスチン、放射状グリア細胞マーカーであるＧＦＡＰ、神経芽細胞マーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ）及びＮＣＡＭ、及び未成熟神経細胞マーカーであるβＩＩＩ−チューブリンを含み得る、発達スペクトルをカバーする。ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２、及びＯＣＴ４などのより一般的な幹細胞様マーカーもまた、発現され得る。これらのマーカーに対して陽性の細胞は、神経球が濃縮され、最終分化神経細胞を形成する可能性を有する。一般に、これらの細胞は多能性であり、神経細胞及びグリア細胞などの神経系の最終分化細胞を生成する能力を有する。
【００３０】
一般的に、方法の最初のステップは、毛包細胞の処理を伴う。以下に説明するように、これらの細胞は、毛包を有する皮膚のサンプルの形態で得られてもよい。代案としては、これらの細胞は、毛包単離物から得られてもよい。一般に知られているように、毛包細胞は、成長の文脈において、一連の相（成長期、退行期、及び休止期）にあってもよい。休止期は休止相（すなわち、成長なし）であり、成長期は成長相であり、退行期は成長期と休止期の中間相である。処理ステップは、成長相又は成長期にある毛包細胞の濃縮をもたらす。濃縮は、休止期の細胞が成長期に移行するように毛包細胞を刺激することから生じてもよく、及び／又は成長期の細胞が退行期に移行するのを防ぐことから生じてもよい。処理ステップの結果として、成長期における神経系列バイオマーカーへの発達可能性を有する毛包細胞が、特に濃縮される。
【００３１】
さらなるステップでは、細胞は処理されて、濃縮され、又はさもなければ、神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数が増加される。これは、神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数を増加させる処理、及び／又は神経細胞系バイオマーカーを含有しない細胞数を減少させる処理によって達成され得る。特に好ましいステップでは、細胞は、神経球の形成を可能にする条件で処理される。神経球形成の方法は、一般に当該技術分野で周知であり、本明細書でさらに例示される。一実施形態では、バイオリアクター内で細胞を培養することによって、神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数を濃縮し、又はさもなければ増加させるために、又は神経球の形成を可能にするために、細胞が処理される。バイオリアクターを利用して、神経球の形成のための条件の改善が提供されてもよい。
【００３２】
ここで、毛包を含む皮膚のサンプルが利用され、神経前駆細胞の組成物が誘導される、本発明の第１の実施形態について説明し、それによれば、皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚のサンプルが処理され、それによって順化皮膚のサンプルが形成され；その後、サンプル中の神経系特有のバイオマーカーを含有する細胞数の濃縮を可能にする条件で、順化細胞のサンプルが処理され、それによって、神経前駆細胞の組成物が生成される。
【００３３】
この方法の最初のステップは、毛包細胞を含有する皮膚サンプルの採取を伴ってもよい。サンプルは、最も高く均一な毛包密度を有するヒトの頭皮皮膚、好ましくは正中線後頭皮から得られることが好ましい。この皮膚は、一般に個人毎により高密度の活性毛包を含有する。本発明者らは、より高密度の活性毛包を含有する皮膚領域が、より低密度の毛包を含有する皮膚領域と比較して、より多量で高質の細胞を生成する方法を可能にすることを見出した。
【００３４】
毛包の細胞は、一般に、毛隆起領域、毛芽領域、及び真皮乳頭をはじめとする、異なるニッチからの前駆細胞及び幹細胞を含み、これらは集合的に毛包前駆体と称される。毛包前駆体は、神経外胚葉性バイオマーカーを発現し得る。
【００３５】
次に、実質的に全ての毛包前駆体が成長期に移行することを可能にする条件で、採取された皮膚サンプルが処理される。このステップは、神経前駆細胞の収量増加に寄与するため、重要である。ステップの例示は、本明細書の実施例においてある程度詳細に記載されている。
【００３６】
このステップは、一般に、ヒト皮膚サンプルの生体外順化を伴い、その目的は、皮膚サンプルの細胞の細胞生存を支持する条件を提供し、細胞の成長期（又は毛包細胞周期の活性成長期）への移行を可能にすることである。
【００３７】
このステップに先立って、皮膚サンプルの細胞は、成長期、休止期、又は毛包周期の別の期のいずれにあってもよい。生体外培養の最終的な結果が毛包前駆体の大部分を成長期に移行させることであるため、必ずしも必須ではないが、採取時点で毛包前駆体の大部分が成長期にあることが好ましい。
【００３８】
抗難治性毛包因子及び／又は増殖促進因子は、毛包前駆体及び幹細胞の成長期への移行を促進するために利用されてもよく、それによって皮膚中の毛包細胞の成長期への移行が可能になる。抗難治性毛包因子の例としては、ノギン又はソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、又はそのＷｎｔ１シグナル伝達経路を活性化する因子、又は骨形態形成タンパク質（難治促進性）刺激を阻害する因子が挙げられる。抗難治性因子のその他の例としては、ＷＮＴ、並びにＧｒｅｍ１及びＢａｍｂｉなどのＢＭＰ拮抗剤が挙げられる。ＴＧＦ−β２は、重要な増殖促進因子であり、増殖促進因子のその他の例としては、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が挙げられる。
【００３９】
皮膚サンプルの生体外順化は、一般に、上皮細胞の生体外生存能力と毛包器官形成とを支持する細胞培養培地を利用する。ウィリアムズ培地Ｅが、その一例である。その他の例としては、異なる組み合わせでダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にＦ−１２を加えたもの、異なる組み合わせでＦ１２に哺乳類血清を加えたもの、及び異なる栄養補給リン酸緩衝食塩水の組み合わせが挙げられる。
【００４０】
一般的には、生体外順化は１２〜１００時間であるが、ただし状況によっては、より長期にわたって培養することも可能であってもよい。
【００４１】
培養期間中に生体外培養の進捗をモニターすることが可能である。例えば、単離された毛包内の毛軸の成長によって、細胞又は培養の特性が評価されてもよい。
【００４２】
生体外細胞培養の完了時には、少なくとも８０％の細胞が成長期にあることが好ましい。
【００４３】
それによって順化皮膚のサンプルが得られる培養の完了時に、細胞の多くは、皮膚組織の余分な細胞マトリックスと非細胞構成要素によって、順化皮膚内に捕捉されたままになる。これらの細胞は、皮膚組織から剥離されることになる。本方法によれば、サンプル中への細胞の剥離のために、順化皮膚の細胞外マトリックスの分解を可能にする条件で、皮膚を１種又は複数種の酵素と接触させることによって、順化皮膚から細胞が剥離される。一般に、酵素は、トリプシン、ＤＮＡ分解酵素、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、そしてアクスターゼとＴｒｙｐＬＥの組み合わせからなる群から選択される、１種又は複数種である。
【００４４】
順化皮膚の性質に応じて、代替的に、順化組織を破壊することによって組織を刻み、又はより小さな粒子に分離する機械的手段によって、順化皮膚から細胞を遊離させることが可能であってもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態では、細胞は、酵素処理と機械的処理の組み合わせによって、順化皮膚から剥離される。酵素処理と機械的処理は同時に行われてもよいが、ただし一般には機械的処理が開始される前に酵素処理が開始される。
【００４６】
順化皮膚組織サンプルから細胞を剥離させるステップの完了時に、細胞培地中に懸濁されていてもよい剥離細胞と、細胞外マトリックスの非細胞構成要素、及び皮膚組織のその他の非細胞構成要素とが提供される。これらは一般的に、後続のステップの開始前に除去される。遠心分離及び濾過が利用されてもよい。アプローチの例示は、本明細書の実施例に記載される。
【００４７】
順化皮膚から剥離された細胞の組成物は、組織が採取された場所に応じて、神経前駆細胞、その他の多能性細胞、及び皮膚組織の表皮層及び真皮層の線維芽細胞、角化細胞、及びその他の細胞をはじめとする、最終分化細胞を含む不均一なものである。次のステップでは、神経前駆細胞を主に含んでなる、細胞のサンプルを得ることが必要である。次に、順化ヒト皮膚から剥離された細胞組成物から、非神経前駆細胞である細胞を除去することが必要となる。除去される細胞は、典型的には、最終分化細胞（すなわち、角化細胞、線維芽細胞、その他の真皮及び表皮細胞、及びアポトーシス細胞）である。
【００４８】
一実施形態では、サンプルからの最終分化細胞の選択的な枯渇を可能にする条件下で、サンプルからの最終分化細胞を選択的に枯渇させる試薬にサンプルを接触させることによって、サンプルから最終分化細胞を枯渇させる。好ましくは、薬剤は、最終分化細胞に結合するが、非最終分化細胞には結合しない抗体である。このステップでは、抗体、好ましくは神経前駆細胞に結合しないモノクローナル抗体が効果的である。好ましくは、抗体は、角化細胞などの表皮又は真皮の細胞、又は線維芽細胞に結合する。抗体の例としては、線維芽細胞特異的抗原１、又はＣＤ４５に選択的に結合するものが挙げられ、これらは、神経前駆細胞の表面上に見られる抗原でない。
【００４９】
枯渇ステップの完了時には、サンプルは、数で約５％以下の最終分化細胞を含有する。
【００５０】
このように、本発明の第１の実施形態に従って、
−皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚である皮膚のサンプルを処理し、それによって順化皮膚のサンプルを形成するステップと；
−順化皮膚からサンプル中に細胞を剥離させるステップと；
−サンプルから最終分化細胞又はアポトーシス細胞又は細胞残骸を枯渇させ、それによって非最終分化細胞のサンプルを形成するステップと；任意選択的に
−サンプル中の非最終分化細胞数の増加を可能にする条件で、非最終分化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成する方法が提供される。
【００５１】
方法は、順化皮膚から細胞を剥離させる別個のステップなしに実行されてもよい。例えば、毛包細胞が成長期に移行する処理ステップの条件で、皮膚からサンプル中に細胞を剥離させてもよい。したがって、方法は、
−皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚である皮膚のサンプルを処理し、それによって順化皮膚のサンプルを形成するステップと；
−順化皮膚のサンプルから、最終分化細胞又はアポトーシス細胞又は細胞残骸を枯渇させ、それによって非最終分化細胞のサンプルを形成するステップと；
−サンプル中の神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数の濃縮を可能にする条件で、非最終分化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
によって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞が濃縮された組成物を生成することを広く含んでもよい。
【００５２】
さもなければ、
−皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚である皮膚のサンプルを処理し、それによって順化皮膚のサンプルを形成するステップと；
−順化皮膚からサンプル中に細胞を剥離させるステップと；
−順化皮膚のサンプルから、最終分化細胞又はアポトーシス細胞又は細胞残骸を枯渇させ、それによって非最終分化細胞のサンプルを形成するステップと；
−サンプル中の神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数の濃縮を可能にする条件で、非最終分化細胞のサンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む方法におけるように、状態の（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）皮膚から細胞を剥離させるための別個のプロセスステップを実行することが必要であってもよい。
【００５３】
いくつかの実施形態では、順化皮膚サンプルから最終分化細胞を枯渇させるステップは、神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数の濃縮を可能にする条件で、非最終分化細胞サンプルを処理するステップの間に、又はその一部として実施されてもよい。例えば、一実施形態では、神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数の濃縮をもたらす条件は、最終分化細胞、多能性細胞、又は神経系列の細胞の生成以外の能力を有する細胞の喪失に有利に働く条件を含んでもよい。したがって一実施形態では、方法は、
−皮膚中の毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞を含む皮膚である皮膚のサンプルを処理し、それによって順化皮膚のサンプルを形成するステップと；
−任意選択的に、順化皮膚からサンプル中に細胞を剥離させるステップと；
−サンプル中の神経細胞系バイオマーカーを含有する細胞数の濃縮を可能にする条件で、順化皮膚からの細胞サンプルを処理するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含んでもよい。
【００５４】
ここで、本発明の第２の実施形態を説明し、その中では、天然状態でそれらに付着する皮膚組織が付着しないように、それから単離され、又は別の様式で分離された毛包のサンプルが利用されて、神経前駆細胞の組成物が誘導される。単離された毛包の使用の特に有利な１つの点は、さもなければ周囲の皮膚組織から毛包細胞を剥離させるのに必要とされる酵素又は機械的手段の実質的な使用なしに、本方法が実装され得ることである。さらに、これによって、また最終分化真皮細胞及び非神経細胞系の細胞による、後続の培養物の汚染が回避される。実施形態によれば、方法は、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞が濃縮された組成物を生成し、
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−順化細胞のサンプルの細胞から神経球を形成することを可能にする条件で、順化細胞のサンプルを処理するステップと、
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む。
【００５５】
順化細胞のサンプルは、一般に、成長期にある毛包細胞が濃縮され、神経細胞系バイオマーカーを提示する細胞を含有する。
【００５６】
神経球の形成の完了時に、神経前駆細胞である、又は神経系列バイオマーカーを発現する、神経球の細胞数を増殖ステップによって増加させることが有利であってもよい。この目的のために様々な技術が知られている。したがって、別の実施形態では、
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−順化細胞のサンプルの細胞から神経球サンプルを形成することを可能にする条件で、順化細胞のサンプルを処理するステップと、
−神経球のサンプルに、神経球の細胞数を増加させる条件を提供するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞が濃縮された組成物を生成する方法が提供される。
【００５７】
毛包細胞を処理して細胞を成長期に移行させるステップの完了時に、細胞は、その他の細胞又は材料と塊状になり又はグループ化してもよく、その場合、細胞は解離されて単一細胞の懸濁液が形成されてもよい。これは、いくつかの当該技術分野で公知の技術によって達成され得る。一例では、毛包細胞を単一細胞に解離させるのに有用である、酵素を使用した酵素的解離が使用される。したがって、別の実施形態では、
−毛包細胞の成長期への移行を可能にする条件で、毛包細胞のサンプルを処理し、それによって順化細胞のサンプルを形成するステップと；
−順化細胞のサンプルに、細胞の単一細胞への解離を可能にする条件を提供するステップと；
−順化細胞のサンプルの細胞から神経球サンプルを形成することを可能にする条件で、順化細胞のサンプルを処理するステップと、
−神経球のサンプルに、神経球の細胞数を増加させる条件を提供するステップと；
それによって、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞の組成物を生成するステップと
を含む、神経前駆細胞、又は神経系列バイオマーカーを発現する増殖可能な細胞が濃縮された組成物を生成する方法が提供される。
【００５８】
本発明の第２の実施形態によれば、正中線後頭皮から得られた、約２００個の毛包のサンプルは、最大１００時間にわたり成長期促進環境下で順化されてもよい。得られた細胞は、酵素的に解離されて単細胞となり、ほぼ１０５個程度の細胞で提供されてもよい。次に、これらの細胞は、神経球形成を可能にする条件下で、１０４個の細胞／ｍｌ程度の希釈で、懸濁液中で培養されてもよい。次に懸濁培養物が濾過されて神経球のみが採取され、酵素処理されて細胞が解離され、付着性単層が増殖される。
【００５９】
本明細書に開示され、定義される本発明は、記載された個々の特徴の２つ以上の代替的な組み合わせの全てに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせの全てが、本発明の様々な代替的態様を構成する。
【実施例】
【００６０】
実施例１−ドナー組織の採取
ヒト成人皮膚は、次のように後頭部の頭皮から採取する：採取に先立って後頭部を剪毛して滅菌し、麻酔する。幅１０ｍｍ、長さ３ｃｍのサンプルを正中線の周囲の軸方向面で円周方向に、二重刃外科用メスを使用して脂肪層まで全厚で採取する。
【００６１】
実施例２−毛周期調節因子を用いたドナー組織のインキュベーション
抗難治性又は増殖促進性毛包調節因子によるドナー皮膚組織の最大１００時間の順化は、皮膚サンプル全体の成長期：休止期の比率を増加させ、並びに毛包間同期を増加させる。したがってこのような因子によるドナー皮膚組織の前処理は、最終的な細胞の生存率、収量、及び均一性を増加させる。皮膚のインキュベーションは、生体外での原位置毛包の生存率の増加を提供する、栄養補給されたウィリアムズＥ培地環境内で行う。例示的な抗難治性毛包細胞周期因子としてのノギン又はＳＨＨは、成長期：休止期の比率を増加させ、したがって、最終的な細胞の生存率、収量、及び均一性を増加させる。例示的な増殖促進性毛包細胞周期因子としてのＴＧＦ−β２は、成長期：休止期の比率を増加させ、したがって、最終的な細胞の生存率、収量、及び均一性を増加させる。栄養補給されたウィリアムズＥ培地中のノギン、ＳＨＨ、ＴＧＦ−β２の組み合わせは、高い細胞の生存率、収量、及び均一性を提供する。実際には：
１．確実に毛乳頭が暗い斑点として認識でき、皮膚サンプルの脂肪側に保持されるように、余分な皮下脂肪を切除する。
２．残りの皮膚をＰＢＳ中の１％ａｎｔｉ−ａｎｔｉでさらに３回洗浄する。
３．サンプルを外科用メスで４ｍｍ×１０ｍｍに切断する。
４．１０マイクログラム／ｍｌのインスリンプラス：１００〜５００ｎｇ／ｍｌのノギン（１２〜１００時間）、１００〜５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ（１２〜１００時間）、又は５０ｎｇ〜２００／ｍｌのＴＧＦ−β２（Ｆｏｉｔｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９ａ）（１２〜１００時間）、又はそれらの組み合わせを補充した、栄養補給されたウィリアムズＥ培地（１１．１ｍＭのグルコース及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有する）中における皮膚片のインキュベーション。
【００６２】
実施例３−皮膚の機械的処理及び消化酵素剤処理。
細胞外マトリックスからの前駆体細胞の解離のための酵素消化と組み合わせた皮膚解離のための機械装置は、細胞の生存率、収量、及び均一性を増加させ得る。例示的な組み合わせは、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ酵素分解キットと組み合わせて使用される、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置であり、これらは一緒に、細胞の生存率、収量、及び均一性を向上させる。
【００６３】
独自の使用説明書以外の細胞濾過へのカスタマイズされたアプローチは、高い細胞生存率、収量、及び均一性を提供する。
１．ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離酵素を準備する（以下の容積は４×４ｍｍの皮膚片用）。
２．緩衝液Ｌ（４３５μｌ）と酵素Ｐ（１２．５μｌ）を注意深く混合する。
３．酵素Ｄ（５０μｌ）と酵素Ａ（２．５μｌ）を注意深く混合する。
４．Ｄ／Ａ混合物をＣ管内のＬ／Ｐ混合物に加える。
５．酵素を含有するＣ管内に４個の皮膚片を入れ、蓋をねじ込む。
６．３７℃で１２時間インキュベートする。
翌日
７．開始前に、少なくとも５０ｍＬのＣＯＬＤ洗浄液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１＋１％ａｎｔｉ−ａｎｔｉ）を作成し、少なくとも５０ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１  ２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ＋４０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２＋２％Ｂ２７）を温めておく。
８．０．５ｍｌの冷洗浄液を添加して、各Ｃ管の内容物を希釈する。
９．Ｃ管の蓋を再度しっかりと閉め、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置のスリーブに逆さまに取り付ける。
１０．ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳでプログラムｈ＿ｓｋｉｎ＿０１を選択し、ｓｔａｒｔを押す。
１１．遠心分離機内で４５秒間、３００ｘＧで管の内容物を遠心分離する。
１２．６ウェルプレート上に載せた金網ストレーナー上で、Ｃ管の内容物を空にする。
１３．洗浄液を用いて、内容物をストレーナーを通してウェル内にすすぎ入れる。
１４．ストレーナーから大きな閉塞性のある組織の断片を順次除去する。
注記：ピペット操作によって冷洗浄液で徹底的に洗浄した後にのみ、組織片を除去すること。
１５．洗浄液を用いて、全てのＣ管を５０ｍＬ管内に徹底的にすすぎ入れる。
１６．これをストレーナーに通し、同じ６ウェルにピペットで入れる。
１７．５０ｍＬ管に４０μＭのストレーナーを載せ、ストレーナーのメッシュを洗浄液で湿らせる。
１８．４０μＭストレーナーを通して、細胞と洗浄液の混合物を濾過する。
１９．細胞／洗浄液の混合物を第２の４０μＭストレーナーを通して濾過することによって、先の濾過ステップを繰り返す。
２０．細胞を３００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を完全に除去する。
【００６４】
実施例４−潜在的な汚染細胞の枯渇
潜在的な汚染細胞の枯渇は、そのような枯渇がない場合と比較して、細胞の生存率、収量、及び均一性を増加させる。例示的なアプローチは、このような生細胞枯渇のためにＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ磁気細胞単離システムを使用する。この装置を使用して、最終分化細胞型を枯渇させることで、細胞の生存率、収量、及び一貫性が増加する。例えば、線維芽細胞（線維芽細胞特異的抗原１）又は上皮細胞（ＣＤ４５）などの成熟した非神経球形成細胞を枯渇させるために、１つ又は複数のマーカーを使用し得る。この装置を使用することで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ死滅細胞除去キットによるアポトーシス細胞及び残骸の枯渇は、細胞の生存率、収量、及び一貫性を増加させる。
【００６５】
アポトーシス細胞枯渇では：
１．１０７個の総細胞当たり、０．２５ｍＬの２０×結合緩衝液ストック溶液を４．７５ｍＬの無菌再蒸留水で希釈する。
２．およそ１０７個の総細胞当たり、１００μＬの死滅細胞除去マイクロビーズに細胞ペレットを再懸濁する。
３．十分に混合し、室温（２０〜２５℃）で１５分間インキュベートする。
４．細胞数に応じてカラムタイプを選択し、ＭＡＣＳ分離器の磁場中にカラムを置く。
５．１×結合緩衝液（ＭＳ：５００μＬ、ＬＳ：３ｍＬ）ですすいで、カラムを準備する。
６．１×結合緩衝液（ＭＳ：５００〜１０００μＬ、ＬＳ：１〜１０ｍＬ）を適量の細胞懸濁液をカラムに適用する。加温したＤＭＥＭを含有する１５ｍＬの管に、陰性（標識なし）細胞画分を通過させる。
７．適量の１×結合緩衝液（ＭＳ：４×５００μＬ；ＬＳ：４×３ｍＬ）でカラムをすすぎ、標識のない細胞を回収する。
８．細胞を３００×ｇで１０分間遠心分離する。
９．ＭＡＣＳ  ＢＳＡストック溶液１：２０をａｕｔｏＭＡＣＳすすぎ溶液で希釈して、緩衝液を調製する。緩衝液は低温に保つ（２〜８℃）。
１０．細胞から上清を完全に除去し、細胞ペレットを１０７個の総細胞当たり８０μＬの緩衝液に再懸濁する。１０７個の総細胞当たり２０μＬのマイクロビーズ（例えば、抗線維芽細胞ビーズ）を添加する。
１１．十分に混合し、室温（１９〜２５℃）で３０分間インキュベートする。
１２．１０７個の細胞当たり、１〜２ｍＬの緩衝液を加えて細胞を洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離する。
１３．上清を完全に吸引する。１０８個の細胞を５００μＬの緩衝液に再懸濁する。
１４．細胞数に応じてカラムタイプを選択し、ＭＡＣＳ分離器の磁場中にカラムを置く。緩衝液ですすいで、カラムを準備する。
１５．細胞懸濁液をカラムに適用する。標識のない細胞を含有する通過物を収集する。適量の緩衝液でカラムを洗浄する。通過した標識のない細胞を収集し、流出細胞懸濁液と合わせる。
【００６６】
実施例５−３Ｄ神経球形成
１．標識のない細胞画分を３５０×Ｇで１０分間遠心分離する。
２．上清を除去し、ペレットを５ｍＬのＳＫＮ増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、４０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び２％Ｂ２７）に再懸濁する。
３．１０μＬを取り出してマイクロバイアルに入れ、１０μＬのトリパンブルーと混合する。細胞数と生存率を記録する。
４．細胞懸濁液をＳＫＮ増殖培地で希釈し、非組織培養処理した６ウェルプレートに、１ウェル当たり６ｍＬの培地中の１×１０６個の細胞を播種する。播種されたウェルの数と密度を記録する。
５．３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする−これが培養０日目に相当する。
６．全ての記録と画像を転送しアーカイブする。
７．培養１日目：汚染の徴候を評価し、必要に応じて培養物を廃棄する。
８．培養５日目及び７日目：低倍率と高倍率で細胞を撮影し、神経球のサイズを測定する。培養物の成長に関する観察を記録する。神経球の大部分が直径＞５０ｕｍであれば、２Ｄ単層増殖に進む（最初の出現からおよそ１日後）。７日目に続いて、神経球サイズを毎日モニターする。解離は、神経球の大部分が＞１００ｕｍになる前か、付着性になる前に行なわなければならない。
【００６７】
実施例６−２Ｄ単層増殖
球体がプレートに付着し始めると、回収及び解離が困難になるので回避する。目標は、大部分が直径約１００μｍの球体である。最初の１〜２日間に出現する大型で不規則な細胞のクラスターは細胞の集合体であり、神経球ではない。これらは、細胞密度が高すぎるか、又は組織が十分に解離していないことの指標である。
１．開始前に、１本の（又は必要な本数の）Ｔ２５フラスコを０．５μｇ／ｃｍ２のラミニン５１１でカバーし、４℃で一晩重合させ、１％のｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、４０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び２％Ｂ２７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２  ３：１の増殖培地７〜１４ｍＬを加温し（Ｔ２５細胞が分割される度に７ｍＬが必要）、４℃で１ｍＬのＴｒｙｐＬＥを解凍する。
２．高倍率と低倍率の双方で球体の写真を撮影する。
３．球体を含有する全ての培地を培養ウェルから遠心管に移す。
４．３００×Ｇで１０分間遠心分離する。
５．上清を除去し、１ｍＬのＴｒｙｐＬＥに再懸濁する。インキュベーター内に５分間放置する
６．インキュベーターから細胞を取り出し、（２００μＬピペットを用いて）１００〜２００回ピペットで上下させ、球体を砕く。
７．２ｍＬの成長培地を添加し、十分に混合する。
８．１０μＬの懸濁液を取り出し、１０μＬのトリパンブルーと共に小型バイアル内に入れ、細胞計数する。
９．生細胞と死細胞の合計数を記録する
１０．さらなる加温増殖培地で、細胞懸濁液を必要に応じて希釈する
１１．Ｔ２５フラスコを調製するために、ラミニン５１１を除去する。
１２．１×１０４個の細胞／ｃｍ２（Ｔ２５フラスコの場合は７ｍＬ中に２．５×１０５個の細胞）で播種する。これがＰ０である。
１３．最初の２４時間は、最小限の動きで細胞をインキュベーターに戻す。
１４．２４時間後に新鮮な成長のために、培地を交換する
１５．増殖培地を３日毎に交換する。フラスコが約８０％コンフルエントになれば、ＴｒｙＰＬＥで細胞を継代し、１×１０４個の細胞／ｃｍ２で再播種する。
【００６８】
参照文献
ＢＥＬＩＣＣＨＩ，Ｍ．，ＰＩＳＡＴＩ，Ｆ．，ＬＯＰＡ，Ｒ．，ＰＯＲＲＥＴＴＩ，Ｌ．，ＦＯＲＴＵＮＡＴＯ，Ｆ．，ＳＩＲＯＮＩ，Ｍ．，ＳＣＡＬＡＭＯＧＮＡ，Ｍ．，ＰＡＲＡＴＩ，Ｅ．Ａ．，ＢＲＥＳＯＬＩＮ，Ｎ．＆  ＴＯＲＲＥＮＴＥ，Ｙ．２００４．Ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｇｒａｔｅ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ，７７，４７５−８６．
ＢＩＥＲＮＡＳＫＩＥ，Ｊ．Ａ．，ＭＣＫＥＮＺＩＥ，Ｉ．Ａ．，ＴＯＭＡ，Ｊ．Ｇ．＆  ＭＩＬＬＥＲ，Ｆ．Ｄ．２００７．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ＳＫＰｓ）ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｅｎｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１，２８０３．
ＦＯＩＴＺＩＫ，Ｋ．，ＰＡＵＳ，Ｒ．，ＤＯＥＴＳＣＨＭＡＮ，Ｔ．＆  ＤＯＴＴＯ，Ｇ．Ｐ．１９９９ａ．Ｔｈｅ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ２  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｉｓ  ｂｏｔｈ  ａ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ａｎｄ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅＨａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，２１２，２７８−８９．
ＦＵＣＨＳ，Ｅ．２０１８．Ｓｋｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｉｌｅｎｃｅ，Ａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１０，１４３２−１４３８．
ＧＥ，Ｙ．，ＧＯＭＥＺ，Ｎ．Ｃ．，ＡＤＡＭ，Ｒ．Ｃ．，ＮＩＫＯＬＯＶＡ，Ｍ．，ＹＡＮＧ，Ｈ．，ＶＥＲＭＡ，Ａ．，ＬＵ，Ｃ．Ｐ．−Ｊ．，ＰＯＬＡＫ，Ｌ．，ＹＵＡＮ，Ｓ．，ＥＬＥＭＥＮＴＯ，Ｏ．＆  ＦＵＣＨＳ，Ｅ．２０１７．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｄｒｉｖｅｓ  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ，１６９，６３６−６５０．ｅ１４．
ＨＷＡＮＧ，Ｉ．，ＣＨＯＩ，Ｋ．Ａ．，ＰＡＲＫ，Ｈ．Ｓ．，ＪＥＯＮＧ，Ｈ．，ＫＩＭ，Ｊ．Ｏ．，ＳＥＯＬ，Ｋ．Ｃ．，ＫＷＯＮ，Ｈ．Ｊ．，ＰＡＲＫ，Ｉ．Ｈ．＆ＨＯＮＧ，Ｓ．２０１６．Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ＲｅｓｔｏｒｅＨａｉｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅＨａｉｒ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｎｉｃｈｅ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２５，１４３９−５１．
ＪＯＡＮＮＩＤＥＳ，Ａ．，ＧＡＵＧＨＷＩＮ，Ｐ．，ＳＣＨＷＩＥＮＩＮＧ，Ｃ．，ＭＡＪＥＤ，Ｈ．，ＳＴＥＲＬＩＮＧ，Ｊ．，ＣＯＭＰＳＴＯＮ，Ａ．＆  ＣＨＡＮＤＲＡＮ，Ｓ．２００４．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔＨｕｍａｎ  ｓｋｉｎ：ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３６４，１７２−１７８．
ＰＡＮＧ，Ｚ．Ｐ．，ＹＡＮＧ，Ｎ．，ＶＩＥＲＢＵＣＨＥＮ，Ｔ．，ＯＳＴＥＲＭＥＩＥＲ，Ａ．，ＦＵＥＮＴＥＳ，Ｄ．Ｒ．，ＹＡＮＧ，Ｔ．Ｑ．，ＣＩＴＲＩ，Ａ．，ＳＥＢＡＳＴＩＡＮＯ，Ｖ．，ＭＡＲＲＯ，Ｓ．，ＳＵＤＨＯＦ，Ｔ．Ｃ．＆  ＷＥＲＮＩＧ，Ｍ．２０１１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆＨｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４７６，２２０−３．
ＳＯＮ，Ｅ．Ｙ．，ＩＣＨＩＤＡ，Ｊ．Ｋ．，ＷＡＩＮＧＥＲ，Ｂ．Ｊ．，ＴＯＭＡ，Ｊ．Ｓ．，ＲＡＦＵＳＥ，Ｖ．Ｆ．，ＷＯＯＬＦ，Ｃ．Ｊ．＆  ＥＧＧＡＮ，Ｋ．２０１１．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄＨｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，９，２０５−１８．
ＴＯＭＡ，Ｊ．Ｇ．，ＡＫＨＡＶＡＮ，Ｍ．，ＦＥＲＮＡＮＤＥＳ，Ｋ．Ｊ．Ｌ．，ＢＡＲＮＡＢＥ−ＨＥＩＤＥＲ，Ｆ．，ＳＡＤＩＫＯＴ，Ａ．，ＫＡＰＬＡＮ，Ｄ．Ｒ．＆  ＭＩＬＬＥＲ，Ｆ．Ｄ．２００１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｅｒｍｉｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｋｉｎ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，３，７７８−７８４．
ＴＯＭＡ，Ｊ．Ｇ．，ＭＣＫＥＮＺＩＥ，Ｉ．Ａ．，ＢＡＧＬＩ，Ｄ．＆  ＭＩＬＬＥＲ，Ｆ．Ｄ．２００５．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍＨｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２３，７２７−３７．
ＴＲＵＯＮＧ，Ａ．，ＳＩ，Ｅ．Ｓ．，ＤＵＮＣＡＮ，Ｔ．＆  ＶＡＬＥＮＺＵＥＬＡ，Ｍ．２０１６．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｄｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｌ．，１１，２３２−２４５．
ＴＳＵＮＥＭＯＴＯ，Ｒ．，ＬＥＥ，Ｓ．，ＳＺＵＣＳ，Ａ．，ＣＨＵＢＵＫＯＶ，Ｐ．，ＳＯＫＯＬＯＶＡ，Ｉ．，ＢＬＡＮＣＨＡＲＤ，Ｊ．Ｗ．，ＥＡＤＥ，Ｋ．Ｔ．，ＢＲＵＧＧＥＭＡＮＮ，Ｊ．，ＷＵ，Ｃ．，ＴＯＲＫＡＭＡＮＩ，Ａ．，ＳＡＮＮＡ，Ｐ．Ｐ．＆  ＢＡＬＤＷＩＮ，Ｋ．Ｋ．２０１８．Ｄｉｖｅｒｓｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．
ＶＡＬＥＮＺＵＥＬＡ，Ｍ．Ｊ．，ＤＥＡＮ，Ｓ．Ｋ．，ＳＡＣＨＤＥＶ，Ｐ．，ＴＵＣＨ，Ｂ．Ｅ．＆  ＳＩＤＨＵ，Ｋ．Ｓ．２００８．Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｉｎｅ  ｓｋｉｎ：ａ  ｎｅｗ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ，１７，１０８７−９４．
ＶＩＥＲＢＵＣＨＥＮ，Ｔ．，ＯＳＴＥＲＭＥＩＥＲ，Ａ．，ＰＡＮＧ，Ｚ．Ｐ．，ＫＯＫＵＢＵ，Ｙ．，ＳｕｅＤＨＯＦ，Ｔ．Ｃ．＆  ＷＥＲＮＩＧ，Ｍ．２０１０．Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４６３，１０３５−１０４１．
ＹＡＮＧ，Ｈ．，ＡＤＡＭ，Ｒ．Ｃ．，ＧＥ，Ｙ．，ＨＵＡ，Ｚ．Ｌ．＆  ＦＵＣＨＳ，Ｅ．２０１７．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｍｉｃｒｏ−ｎｉｃｈｅｓ  Ｇｏｖｅｒｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｈｏｉｃｅｓ．Ｃｅｌｌ，１６９，４８３−４９６．ｅ１３．
ＹＵ，Ｈ．，ＦＡＮＧ，Ｄ．，ＫＵＭＡＲ，Ｓ．Ｍ．，ＬＩ，Ｌ．，ＮＧＵＹＥＮ，Ｔ．Ｋ．，ＡＣＳ，Ｇ．，ＨＥＲＬＹＮ，Ｍ．＆  ＸＵ，Ｘ．２００６．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍＨｕｍａｎＨａｉｒ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６８，１８７９−１８８８．
ＹＵ，Ｈ．，ＫＵＭＡＲ，Ｓ．Ｍ．，ＫＯＳＳＥＮＫＯＶ，Ａ．Ｖ．，ＳＨＯＷＥ，Ｌ．＆  ＸＵ，Ｘ．２０１０．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｒｅｓｔ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｂｕｌｇｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＣｕｌｔｕｒｅｄＨｕｍａｎＨａｉｒ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３０，１２２７−１２３６．
ＺＨＯＵ，Ｄ．，ＺＨＡＮＧ，Ｚ．，ＨＥ，Ｌ．Ｍ．，ＤＵ，Ｊ．，ＺＨＡＮＧ，Ｆ．，ＳＵＮ，Ｃ．Ｋ．，ＺＨＯＵ，Ｙ．，ＷＡＮＧ，Ｘ．Ｗ．，ＬＩＮ，Ｇ．，ＳＯＮＧ，Ｋ．Ｍ．，ＷＵ，Ｌ．Ｇ．＆  ＹＡＮＧ，Ｑ．２０１４．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐ５３  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ，９，２０３４−４２．
【図１】
2021528102.tif 000002
【図２】
2021528102.tif 000003
【図３】
2021528102.tif 000004
【図４】
2021528102.tif 000005
【図５】
2021528102.tif 000006
【国際調査報告】
2021528102.tif 000007
2021528102.tif 000008
2021528102.tif 000009
2021528102.tif 000010