(57)【要約】  本発明は、異なる遺伝的変異体の存在に基づく、妊娠喪失又は再発性妊娠喪失が発生する可能性に対するより適切なリスク評価の方法に関する。本発明は、被験者由来の試料におけるいくつかの遺伝子多型マーカーの有無を従来の危険因子と組み合わせることによって、妊娠喪失又はＲＰＬを被るリスクを決定する方法だけでなく、当該方法を実行するためのコンピュータ実施手段にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
流産及び／又は再発性妊娠喪失を経験する女性被験者のリスクを評価する方法であって、前記被験者から単離された試料において、第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯハプロタイプ（ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ  ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ  ｒｓ８１７６７５０を含む）、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰの存在を決定し、それによって、これらの遺伝的変異の存在（又はＡＢＯ遺伝子の場合には任意のＡ１対立遺伝子の欠如）が流産及び／又は再発性妊娠喪失（ＲＰＬ）を経験するリスクを示すステップを含む方法。
【請求項２】
女性被験者において流産及び／又は再発性妊娠喪失を経験するリスクを診断する方法であって、前記被験者から単離された試料において、第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯハプロタイプ（ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ  ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ  ｒｓ８１７６７５０を含む）、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰの存在を決定し、それによって、これらの遺伝的変異の存在（又はＡＢＯ遺伝子の場合には任意のＡ１対立遺伝子の欠如）が流産及び／又は再発性妊娠喪失（ＲＰＬ）を経験するリスクを示すステップを含む方法。
【請求項３】
少なくとも１回の流産を既に経験した被験者においてＲＰＬを経験するリスクを決定又は診断することである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験者の年齢を決定するステップをさらに含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料は、口腔組織試料、掻爬試料、又は、洗浄若しくは生物学的流体試料、好ましくは唾液、尿、又は血液である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチドの有無は、前記試料からの増幅産物を増幅すること又は増幅できないことによって同定され、前記増幅産物は、好ましくは、分析前に制限酵素で消化され、及び／又は、核酸試料を、検出可能部分であるプライマーラベルとハイブリダイズさせることによって前記ＳＮＰが同定される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドの有無は、マイクロアレイ上にスポットされた特異的なＨａｉｒｌｏｏｐ（商標）プローブへのハイブリダイゼーションによって、対立遺伝子特異的ＰＣＲによって、ＫＡＳＰジェノタイピング化学又はＴａｑＭａｎアッセイによって同定される、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
女性被験者が流産及び／又はＲＰＬを呈する確率を、１からＰの古典的危険因子、並びに、第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ  ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ  ｒｓ８１７６７５０、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰの群から選択された１からＪの遺伝子多型の存在に基づき、（再発性）妊娠喪失のリスクを推定する関数１を使用して決定する方法であって、（再発性）妊娠喪失のリスクの個々の推定は、ロジスティック回帰モデルに基づき、このモデルの目的は、人が（再発性）妊娠喪失を呈する確率を、その人の遺伝的、社会人口統計学的、及び臨床的な特徴に従って計算することであり、この確率を計算するには、以下の式
【数１０】
2021513372.tif 000023
が使用され、式中、
Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｙ＝１｜ｘ１，．．．，ｘｎ）＝多数の変数１，．．．，ｎにおいて具体的で測定可能な特徴を有する特定の個人における血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失を呈する確率であり、この確率は、０から１まで及ぶことができ、
Ｅｘｐ＝指数関数の自然対数の底であり、
β０＝変数１からｎと関連していない血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失のリスク（確率）を定義する係数であり、この係数は、−∞から＋∞までの値をとることができ、静脈血栓の発生率の自然対数として計算され、また、
集団において
【数１１】
2021513372.tif 000024
が使用され、
β１＝予測変数ｘ１の値／存在に付随した血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失を呈する（より高い又はより低い）リスクを表す回帰係数であり、この係数は、
【数１２】
2021513372.tif 000025
から
【数１３】
2021513372.tif 000026
までの値をとることができ、
ｘ１＝個人における予測変数ｘ１がとる値であり、あり得る値の範囲は変数次第であり、
βｎ＝予測変数ｘｎの値／存在に付随した血栓症を呈する（より高い又はより低い）リスクを表す回帰係数であり、この係数は、−∞から＋∞までの値をとることができ、
ｘｎ＝個人における予測変数ｘｎがとる値であり、あり得る値の範囲は変数次第である、方法。
【請求項９】
さらなる遺伝的変異が決定されない、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法を実行するための手段を有するコンピュータプログラム又はコンピュータ読取可能媒体。
【請求項１１】
第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯ（ｒｓ８１７６７１９、ｒｓ７８５３９８９、ｒｓ８１７６７４３、及びｒｓ８１７６７５０）、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰの群から選択されるヌクレオチドの同一性を検出するための試薬、及び使用説明書を含むキット。
【請求項１２】
第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯ式血液型ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ（ｒｓ７８５３９８９、ｒｓ８１７６７４３、及びｒｓ８１７６７５０）を含む領域の増幅、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰに特異的な１つ又は複数のプライマーの対を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプライマーの対、使用説明書、及びエンドポイントの蛍光−ＰＣＲ化学的性質に適した試薬を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記試薬は、デュアル加水分解プローブ、ＭｇＣｌ２、及びＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記プライマーの対が、
【表１１】
2021513372.tif 000027
である、請求項１３又は１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓塞栓性の疾患又は障害のスクリーニングによる妊娠喪失の予測の分野に関する。より具体的には、本発明は、被験者、特に女性が、妊娠困難、特に妊娠喪失又は再発性妊娠喪失さえも経験するリスクがあるかどうかを決定するためのマーカー及び方法に関し；これらの方法は、臨床医が、リスクのある女性患者に適した抗血栓療法を処方することによって、そのような妊娠喪失を潜在的に防ぐのを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
血栓塞栓性疾患は、先進国世界における罹患率及び死亡率の主因である（非特許文献１）だけでなく、被験者の妊娠喪失（以下において「ＰＬ」とも呼ばれる）にもおそらく関係づけられると考えられている。
【０００３】
血栓性素因は、血栓傾向をもたらす凝固性亢進の状態として定義されている（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。血栓性素因は、遺伝性、後天性、又は混合性（先天性及び後天性）であってもよく、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）のリスクは、結果として生じる凝固の変化に基づき異なる（Ｍａｎｎｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ，  ２０１４）。血栓性素因を有する女性は、妊娠中の静脈血栓症、胎盤を介した妊娠合併症、及び再発性妊娠喪失（ＲＰＬ）のリスクが高いと考えられている（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；  Ｚｉａｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。臨床的に認識された妊娠の１５％が流産しているけれども、総生殖能力喪失率は５０％に近い（Ｒａｉ  ａｎｄ  Ｒｅｇａｎ，  ２００６）。再発性妊娠喪失（ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２０１３によると、２回以上の臨床的流産として理解されている）は、夫婦の０．４％から２％に影響を与えている（Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【０００４】
最も一般的に検査されるタイプの遺伝性血栓性素因には、アンチトロンビン、プロテインＣ、又はプロテインＳの欠乏が含まれるが、特に機能獲得型の遺伝的変異体Ｆ５−ｒｓ６０２５及びＦ２−ｒｓ１７９９９６３（以下において、これら２つは「ＦＶＬ−ＰＴパネル」とも称される）が挙げられる。いくつかのコホート研究及び症例対照研究によって、血栓性素因と妊娠喪失との間に明らかな関連性が認められている（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；  Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ，２０１４）。ＰＬのリスクは、遺伝性血栓性素因を有する女性においてより高いが、血栓性素因のスクリーニングの価値は、現在でも不明である（Ｓｉｍｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０００５】
特に血栓性素因に関連した、あり得る妊娠喪失又はＲＰＬを予測するための既存のアプローチは、以下のように要約することができる。
【０００６】
臨床検査
現在、血栓性素因に関連した妊娠喪失又はＲＰＬを経験するリスクを「スクリーニング」する、単一試験室によるグローバルアッセイは存在しない。
【０００７】
特殊化された凝固検査
特殊な凝固検査は、遺伝性又は後天性の血栓性素因の存在を検出するための一連の複合（タンパク質及びＤＮＡベースの）血栓性素因アッセイを含む。しかし、（例えば、抗凝固薬、急性血栓症、肝疾患等の）複数の検査前条件が非ＤＮＡベースのアッセイの結果に影響を与えるため、結果の解釈は、試験を取り巻く状況に関連して行う必要がある。
【０００８】
活性化プロテインＣに対する遺伝性の抵抗性：血栓性素因全般に関連した第Ｖ因子ライデン
１９９４年まで、凝固性亢進の臨床的エビデンスを有する患者の調査は通常、非生産的であった。しかし、Ｄａｈｌｂａｃｋ及びＨｉｌｄｅｂｒａｎｄによる、活性化プロテインＣのタンパク質分解作用に対する遺伝型の抵抗性の発見、及び、その後のライデンにおけるＢｅｒｔｉｎａ及び同僚による第Ｖ因子遺伝子の共通のミスセンス変異の知見で、血栓のリスクの実験的評価において大きな進歩がもたらされた。
【０００９】
ライデン変異は、活性化プロテインＣに対する最初の切断部位である、第Ｖ因子のアミノ酸残基５０６のアルギニンをグルタミンで置き換える。この変異は、多数のＰＣＲベースのアプローチによって容易に検出される。西洋人の２％から５％は、第Ｖ因子ライデンに対してヘテロ接合性であることが実証されている。対照的に、突然変異は、アジア系及びアフリカ系の被験者では極めてまれである。
【００１０】
一部の研究室では、活性化プロテインＣに対する抵抗性の初期のスクリーニングは、指標として活性化部分トロンボプラスチン時間ベースのアッセイの延長を使用して行われ；検査陽性（第Ｖ因子欠乏血漿の存在下での延長）の患者が、その後、ＰＣＲによって評価される。
【００１１】
ＰＣＲベースの分子分析の利用が日常的である場合、研究室はますます、遺伝子検査に直接進むことをより頻繁に選んでおり、それは、結果が決定的であり、活性化プロテインＣ抵抗性の９５％以上が、この単一の突然変異の結果であるためである。
【００１２】
第Ｖ因子ライデン変異に対してヘテロ接合性の人間は、静脈血栓症の相対リスクが約５倍高くなり、静脈血栓症の初期症状を経験した患者の１５〜２０％、及び、血栓性疾患の家族歴のある血栓症患者の５０〜６０％に認められる。第Ｖ因子ライデンに関連する凝固性亢進の表現型は不完全な浸透率を示し、一部の個体では臨床的な血栓性イベントは現れないことがある。第Ｖ因子ライデンに関連する初期の静脈血栓性イベントの相対リスクの増加とは対照的に、この遺伝的変異体は、動脈血栓症又は静脈血栓症の再発に対するリスクの増加とは関連していない。他の遺伝性血栓性危険因子の共遺伝又は環境的危険因子への曝露は、第Ｖ因子ライデンのキャリアにおいて血栓性リスクを劇的に増大させる恐れがある。多くの臨床医が、後天性の血栓性危険因子に曝露されようとしている血栓症の家族歴のある患者において、この障害の検査を行う。突然変異に対してホモ接合性の個体は、静脈血栓症の相対リスクが７０倍高く、この表現型が共優性の形質として伝達されることを示している。
【００１３】
妊娠喪失又はＲＰＬを有する女性においてこの遺伝的変異体の存在を検査することの臨床的有用性を結論的に実証する研究はない。
【００１４】
血栓性素因の一般的状況におけるＤダイマー血液検査
Ｄ−ダイマーは、架橋フィブリンがプラスミンによって分解されるときに形成され、レベルは通常、例えば深部静脈血栓症によって上昇する。正常レベルは、この状態を除外するのに寄与し得るが、上昇したＤ−ダイマーのレベルは非特異性であり、低い陽性適中率を有する。Ｄ−ダイマーアッセイは、血栓症に対するその診断特性において著しく異なる。非常に感度の高いＤ−ダイマーアッセイ（すなわち、約９８％の感度）での正常な結果によって、そのままで血栓症は除外される（すなわち、高い陰性適中率（ＮＰＶ）を有する）。しかし、非常に感度の高いＤ−ダイマー検査は低い特異度（約４０％）を有し、これは、高い偽陽性率のためにその使用を制限する。血栓症を除外するためには、感度の低いＤ−ダイマーアッセイ（すなわち、約８５％）での正常な結果は、低い臨床的確率、又は高いＮＰＶを有する別の客観テストと組み合わされる必要があるが、そのままでは非診断である（例えば、近位静脈の陰性の静脈超音波検査等）。Ｄ−ダイマーアッセイの感度が低いほどより特異性である（約７０％）ため、もたらす偽陽性の結果はより少ない。
【００１５】
Ｄ−ダイマーの特異度は、また、加齢と共に、及び、癌等の合併性疾患と共に低下する。その結果、Ｄ−ダイマー検査は、血栓症の診断検査としての価値が限られている恐れがある。
【００１６】
新たな危険因子の必要性
上述の血栓症一般の早期診断のための危険因子及び診断ツールが存在するにもかかわらず、女性患者が血栓症に関連した妊娠喪失又はＲＰＬのリスクがあるかどうかを臨床医が確証するのを可能にするであろう単一の検査、アッセイ、又は方法は、現在知られていない。
【００１７】
高リスク群の間でさえも、実際に妊娠喪失を経験することになる個人を同定することは可能ではない。妊娠喪失が患者及びその家族にかける大きな負担を考慮すると、このタイプの妊娠喪失又はＲＰＬさえも経験するあり得るリスクに対するその予防又は正確な決定は、非常に望ましいであろう。
【００１８】
分子診断を使用して、血栓性及び／又は血栓塞栓性イベントにかかるリスクが高い被験者を同定する試みがいくつか行われてきた。しかし、これらのうちいずれも、特に血栓性イベントに関連した妊娠喪失及び／又はＲＰＬに対するリスク推定を提供する試みを行っていない。
【００１９】
従って、誰が妊娠喪失及び／又はＲＰＬを経験するリスクが高いかを、好ましくは予防処置を実施してそのリスクを可能な限り低いレベルで維持することができるような方法で、首尾よく且つ有利に予測するであろう新しい遺伝子マーカー及び／又は臨床マーカー、及びそれらの特定の組み合わせを含む新規のマーカーが必要である。
【００２０】
妊娠喪失及び／又はＲＰＬのリスクの診断に、好ましくは予防処置を実施してそのリスクを可能な限り低いレベルで維持することができるような方法で、首尾よく且つ有利に寄与するであろう新しい遺伝子マーカー及びそれらの特定の組み合わせを含む新規のマーカーも必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許第６，１５９，６９３号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献３】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献４】米国特許第４，８００，１５９号
【特許文献５】米国特許第４，８８３，７５０号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ａｍｅｒｉｃａ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ２０１０．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；  １２１：ｅ４６−ｅ２１５
【非特許文献２】Ｈｉｌｌ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９６８；３８：２２６−２３１
【発明の概要】
【００２３】
第１の態様において、本発明は、特定の女性被験者について妊娠喪失及び／又はＲＰＬを経験するリスクを推定するために今日使用されている方法による制限を解決するのに適した方法を提供する。
【００２４】
本発明に従って提供される方法は、先行技術による制限を解決し、（本出願においては同義的に使用される）妊娠喪失又は流産を経験する女性被験者のリスクを予測することを可能にする方法を提供するという上記の目標を達成し、当該方法は、上記の女性被験者から単離された試料において、以下の遺伝的変異体：第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯハプロタイプ（ＡＢＯ式血液型  ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ式血液型  ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ式血液型  ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ式血液型  ｒｓ８１７６７５０を含む）、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰのうち少なくとも１つの存在を決定し、それによって、これらの遺伝的変異の存在（又は任意のＡ１血液型対立遺伝子の場合にはその欠如）が流産及び／又は再発性妊娠喪失（ＲＰＬ）を経験するリスクを示すステップを含み；好ましい実施形態において、上記の決定は、被験者の年齢の決定でさらに補完され、それによって、リスクは、年齢と共に増加する。
【００２５】
年齢は、現状では実際に適中率を有する唯一の古典的危険因子であることが示されている。
【００２６】
上記の方法は、先に知られた「ＴｉＣパネル」並びにｒｓ６０２５及びｒｓ１７９９９６３のみを使用する標準的なパネルのいずれかに基づく評価よりも明らかに優れており、実際には、そのようなリスク評価のために第１の既知の方法を提供する。
【００２７】
上記の目的に対するこの解決策を見出すために、本発明者等は、特に、目的を解決するのに適しているであろう好ましいリスクマーカー、臨床マーカー及び遺伝子マーカーの決定に焦点を当てた研究を設定した。
【００２８】
研究のデザイン、サイズ、期間：少なくとも１回の合併症を伴わない満期までの妊娠をした、以前に流産のない１８０人の健康な女性、及び、１８４の突発性再発性妊娠喪失（ＲＰＬ）の症例における後ろ向きデータ分析による症例対照観察研究。
【００２９】
参加者／材料、設定、方法：Ｆ５−ｒｓ６０２５及びＦ２−ｒｓ１７９９９６３を含む標準的なＦＶＬ−ＰＴパネルと、年齢、Ｆ１２−ｒｓ１８０１０２０、Ｆ１３−ｒｓ５９８５、Ｆ２−ｒｓ１７９９９６３、Ｆ５−ｒｓ６０２５、及びＡＢ０−ｒｓ８１７６７１９、ｒｓ７８５３９８９、ｒｓ８１７６７４３、及びｒｓ８１７６７５０を含む、本研究において開発された新たな血栓性素因ベースの遺伝子パネル（ＴｉＣ−ＲＰＬ）の２つの遺伝子パネルを使用した。それらの予測能力を、識別（ＡＵＣ）、感度、特異度、陽性及び陰性適中率（ＰＰＶ、ＮＰＶ）、並びに陽性及び陰性尤度比（ＰＬＲ及びＮＬＲ）に関して評価した。
【００３０】
重要な結果の要約：包括的に、ＴｉＣ−ＲＰＬは、ＦＶＬ−ＰＴよりも良好なＡＵＣ  （９５％  ＣＩ）を有し［０．７６３（０．７１５−０．８１１）対０．５４０（０．５１４−０．５６７）；  ｐ＜０．０００１］、感度７０．６５％、特異度６７．７８％、ＰＰＶ６９．１５％、ＮＰＶ６９．３２％、ＰＬＲ２．１９、及びＮＬＲ０．４３であった。
【００３１】
別の態様では、本発明は、さらなる危険因子として年齢と組み合わせて、上述の遺伝子多型の１つ以上の存在に基づき、流産及び／又はＲＰＬを呈する個人、すなわち女性被験者の確率を確立する方法に関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、好ましくはさらなる危険因子として年齢と組み合わせて、上述の遺伝子多型の１つ以上の存在に基づき、流産及び／又はＲＰＬを呈する個人、すなわち女性被験者の診断に寄与する方法に関する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、好ましくはさらなる危険因子として年齢と組み合わせて、上述の遺伝子多型の１つ以上の存在に基づき、個人、すなわち女性被験者において、流産及び／又はＲＰＬを防ぐための予防的測定の必要性を確立する方法に関する。
【００３４】
上記の危険因子の組み合わせに基づきリスクを決定した後、臨床医は、血栓性イベントを防ぐために一般的に使用され、それによって、当技術分野においてよく知られている薬物を投与するかどうかを決定することができる。
【００３５】
本出願に関連して「血栓塞栓性イベント」は、血管（動脈又は静脈）内側の血餅（血栓）の発生につながる止血の変化として理解されるべきである。血栓は、血管を完全に閉塞させる、及び／又は、剥離されて、別の血管を閉塞させることさえあり得る。
【００３６】
「血栓塞栓性イベント」には、数ある中でも、以下の状態：動脈血栓症、致死性及び非致死性の心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、脳静脈性血栓症、末梢動脈疾患、深部静脈血栓症、及び肺塞栓症が含まれる。
【００３７】
本出願に関連して「血栓塞栓性イベント」は、「血栓塞栓症」と同義的に使用される。
【００３８】
本出願に関連して「血栓塞栓性イベント」は、「血栓症」と同義的に使用される。
【００３９】
本出願に関連して「血栓塞栓性イベント」は、「血栓塞栓性合併症」と同義的に使用される。
【００４０】
本出願に関連して「血栓性素因」は、血栓症の素因となる止血障害として理解されるべきである。これには、天然の抗凝固剤であるアンチトロンビン、プロテインＣ、及びプロテインＳの遺伝性の欠損、並びに、凝固因子及び抗リン脂質抗体等の後天性の血栓性素因をコードする遺伝子における一般的な突然変異が含まれる。
【００４１】
「疾患」及び「障害」という用語は、本出願に関連して、同義的に解釈されるはずである。
【００４２】
「流産」又は「妊娠喪失」という用語は、本明細書において同義的に使用される。本方法、アッセイ、及びキットでは、流産する又は複数の流産（「再発性妊娠喪失」又は「ＲＰＬ」と同義的に使用される）さえも経験するリスクがより低い又はより高いと予測することが可能であり；このリスク増加は、妊娠に関連した又は妊娠中の血栓性イベントに基づくと仮定される。
【００４３】
本出願に関連して「突然変異」は、遺伝子の構造の変化であり、その結果、ＤＮＡにおける単一塩基単位の変化、又は遺伝子若しくは染色体のより大きな部分の欠失、挿入、若しくは再編成によって引き起こされる、次の世代に伝えられ得る変異体が生じるとして理解されるべきである。
【００４４】
本出願に関連して「遺伝的変異体」は、集団内及び集団間の双方における遺伝的差異を指す。ヒト集団（対立遺伝子）には、任意の所与の遺伝子において複数の変異体が存在し、遺伝子多型を引き起こす可能性がある。
【００４５】
「遺伝子多型」及び「一塩基多型」（ＳＮＰ）という用語は、本明細書において同義的に使用され、ゲノム中の一塩基又は別の共有配列が、種のメンバー間又は個体における対になった染色体間で異なる場合に生じるヌクレオチド配列の変異に関する。ＳＮＰは、規定された集団において約１％を超える低い対立遺伝子頻度の突然変異として示すこともできる。本出願による一塩基多型は、遺伝子のコード配列、遺伝子の非コード領域、又は遺伝子間のイントロン領域内にあり得る。
【００４６】
「試料」という用語は、本明細書において使用される場合、生物学的供給源からの任意の試料を指し、限定されるものではないが、細胞培養物若しくはその抽出物、哺乳動物から得られた生検材料若しくはその抽出物、及び血液、唾液、尿、糞便、精液、涙、又は他の体液若しくはその抽出物を含む。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法のいずれかを実行するための手段を有するコンピュータプログラム又はコンピュータ読取可能媒体に関する。
【００４８】
別のさらなる態様では、本発明は、遺伝的変異体である第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯ式血液型ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ式血液型ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ式血液型ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ式血液型ｒｓ８１７６７５０を検出するための試薬を含むキットに関し、それによって、キットは、上記及び下記の決定方法又は診断方法に使用されることになる。
【００４９】
好ましい実施形態において、キットはさらに使用説明書を含む。さらなる好ましい実施形態において、キットは、上記及び下記の決定又は診断方法に対する危険因子として年齢をさらに含む説明書を含む。
【００５０】
本発明の著者等は、流産及び／又はＲＰＬを発症する被験者におけるリスクの計算のために今日使用されている方法における先に同定した問題を解決した。
【００５１】
本発明の著者等は、そのようなリスクを呈するリスクに関連する一連の遺伝的変異体を同定し、それによって、ここで呈される特定の組み合わせが特に予測的であり、従って本目的にとって有利であることが示された。
【００５２】
本発明は、以下の項目によって例証される：
１．流産及び／又は再発性妊娠喪失を経験する女性被験者のリスクを評価する方法であって、上記の被験者から単離された試料において、第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯハプロタイプ（ＡＢＯ式血液型  ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ式血液型  ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ式血液型  ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ式血液型  ｒｓ８１７６７５０を含む）、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰの存在を決定し、それによって、これらの遺伝的変異の存在（又は任意のＡ１血液型対立遺伝子の場合にはその欠如）が流産及び／又は再発性妊娠喪失（ＲＰＬ）を経験するリスクを示すステップを含む方法。
【００５３】
２．女性被験者において流産及び／又は再発性妊娠喪失を経験するリスクを診断する方法であって、上記の被験者から単離された試料において、第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯハプロタイプ（ｒｓ８１７６７１９、ｒｓ７８５３９８９、ｒｓ８１７６７４３、及びｒｓ８１７６７５０を含む）、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰの存在を決定し、それによって、これらの遺伝的変異の存在（又は任意のＡ１血液型対立遺伝子の場合にはその欠如）が流産及び／又は再発性妊娠喪失（ＲＰＬ）を経験するリスクを示すステップを含む方法。
【００５４】
好ましくは、ＡＢＯハプロタイプに属する変異体であって、全てが１つの遺伝子、すなわち、ＡＢＯ式血液型遺伝子、すなわち、ｒｓ８１７６７１９、ｒｓ７８５３９８９、グループｒｓ８１７６７４３、及びｒｓ８１７６７５０に関係する変異体は、それらのハプロタイプについて共に分析される。ＡＢＯハプロタイプが、被験者は任意のＡ１血液型対立遺伝子を有さない、すなわち、Ａ１血液型に属さないということを決定する場合、これは、流産及び／又は再発性妊娠喪失を経験するリスクの増加を示す。
【００５５】
言い換えると：「又は任意のＡ１血液型対立遺伝子の場合にはその欠如」という表示は、以下の組み合わせ１〜５のいずれも存在しない場合には、これは、流産及び／又は再発性妊娠喪失を経験するリスクを示すであろうということを意味する：
【００５６】
【表１】
2021513372.tif 000002
示される遺伝的変異体の危険対立遺伝子は以下の通りである：
【００５７】
【表２】
2021513372.tif 000003
３．少なくとも１回の流産を既に経験した被験者においてＲＰＬを経験するリスクを決定又は診断することである、項目１又は２に記載の方法。
【００５８】
４．被験者の年齢を決定するステップをさらに含む、項目１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【００５９】
５．試料は、口腔組織試料、掻爬試料、又は、洗浄若しくは生物学的流体試料、好ましくは唾液、尿、又は血液である、項目１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【００６０】
６．ポリヌクレオチドの有無は、試料からの増幅産物を増幅すること又は増幅できないことによって同定され、増幅産物は、好ましくは、分析前に制限酵素で消化され、及び／又は、核酸試料を、検出可能部分であるプライマーラベルとハイブリダイズさせることによってＳＮＰが同定される、項目１乃至５のいずれか一項以上に記載の方法。
【００６１】
７．ポリヌクレオチドの有無は、マイクロアレイ上にスポットされた特異的なＨａｉｒｌｏｏｐ（商標）プローブへのハイブリダイゼーションによって、対立遺伝子特異的ＰＣＲによって、ＫＡＳＰジェノタイピング化学又はＴａｑＭａｎアッセイによって同定される、項目１乃至６のいずれか一項以上に記載の方法。
【００６２】
８．女性被験者が流産及び／又はＲＰＬを呈する確率を、１からＰの古典的危険因子、並びに、第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ  ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ  ｒｓ８１７６７５０、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰの群から選択された１からＪの遺伝子多型の存在に基づき、（再発性）妊娠喪失のリスクを推定する関数１を使用して決定する方法であって、（再発性）妊娠喪失のリスクの個々の推定は、ロジスティック回帰モデルに基づき、このモデルの目的は、人が（再発性）妊娠喪失を呈する確率を、その人の遺伝的、社会人口統計学的、及び臨床的な特徴に従って計算することであり、この確率を計算するには、以下の式
【００６３】
【数１】
2021513372.tif 000004
が使用され、式中、
Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｙ＝１｜ｘ１，．．．，ｘｎ）＝多数の変数１，．．．，ｎにおいて具体的で測定可能な特徴を有する特定の個人における血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失を呈する確率であり、この確率は、０から１まで及ぶことができ、
Ｅｘｐ＝指数関数の自然対数の底（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ）であり、
β０＝変数１からｎと関連していない血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失のリスク（確率）を定義する係数であり、この係数は、−∞から＋∞までの値をとることができ、静脈血栓の発生率の自然対数として計算され、また、
集団において
【００６４】
【数２】
2021513372.tif 000005
が使用され、
β１＝予測変数ｘ１の値／存在に付随した血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失を呈する（より高い又はより低い）リスクを表す回帰係数であり、この係数は、
【００６５】
【数３】
2021513372.tif 000006
から
【００６６】
【数４】
2021513372.tif 000007
までの値をとることができ、
ｘ１＝個人における予測変数ｘ１がとる値であり、あり得る値の範囲は変数次第であり、
βｎ＝予測変数ｘｎの値／存在に付随した血栓症を呈する（より高い又はより低い）リスクを表す回帰係数であり、この係数は、−∞から＋∞までの値をとることができ、
ｘｎ＝個人における予測変数ｘｎがとる値であり、あり得る値の範囲は変数次第である、方法。 
９．さらなる遺伝的変異が決定されない、項目１乃至８のいずれか一項以上に記載の方法。 
１０．項目１乃至９のいずれか一項に記載の方法を実行するための手段を有するコンピュータプログラム又はコンピュータ読取可能媒体。
【００６７】
１１．第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ  ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ  ｒｓ８１７６７５０）、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰの群から選択されるヌクレオチドの同一性を検出するための試薬、並びに使用説明書を含むキット。
【００６８】
１２．第ＸＩＩ因子Ｃ４６Ｔ（ｒｓ１８０１０２０）、第ＸＩＩＩ因子Ｖａｌ３４Ｌｅｕ（ｒｓ５９８５）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）Ｇ２０２１０Ａ（ｒｓ１７９９９６３）、第Ｖ因子ライデン  Ａｒｇ５０６Ｇｌｎ（ｒｓ６０２５）、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７１９、ＡＢＯ  ｒｓ７８５３９８９、ＡＢＯ  ｒｓ８１７６７４３、及びＡＢＯ  ｒｓ８１７６７５０を含む領域の増幅、又はこれらの変異体と強い連鎖不平衡にあるそれぞれのＳＮＰに特異的な１つ又は複数のプライマーの対を含む、項目１１に記載のキット。
【００６９】
１３．項目１２に記載のプライマーの対、使用説明書、及びエンドポイントの蛍光−ＰＣＲ化学的性質に適した試薬を含む、項目１２に記載のキット。
【００７０】
リアルタイムＰＣＲが、増幅及び蛍光測定を行う好ましい方法である。識別は、当該キットによって調べられる各対立遺伝子の有無に比例する特異的な信号の検出に基づく。
【００７１】
１４．上記の試薬は、デュアル加水分解プローブ、ＭｇＣｌ２、及びＤＮＡポリメラーゼである、項目１３に記載のキット。
１５．プライマーの対が、
【００７２】
【表３】
2021513372.tif 000008
である、項目１３又は１４に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
本発明はまた、図を参照することによってさらに記載される：
【図１Ａ】ＨａｉｒＬｏｏｐ（登録商標）分子、閉鎖状態を示した図である。
【図１Ｂ】ＨａｉｒＬｏｏｐ（登録商標）分子、閉鎖状態を示した図である。
【図２】ＲＯＣ曲線下面積：ＦＶＬ−ＰＴ及びＴｉＣ−ＲＰＬを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
遺伝子マーカーの（上記のような）特定の組み合わせが、一連のあり得るマーカーの複雑且つ真正の分析の後に、本発明者等によって使用、選択、及び評価される。遺伝子リスクスコア（ＧＲＳ）を構築する異なる可能性のうち、本発明者等は、異なる可能性について得られた結果に基づき、上記の８つの遺伝的変異体の特定の組み合わせを選択した。
【００７５】
当業者は、ＮＣＢＩ  ＳＮＰデータベース（「ｄｂＳＮＰ」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ）上のｒｓ配列にアクセスすることができ、それによって、それらは当業者の一般知識の一部となる。
【００７６】
強い連鎖不平衡にあるＳＮＰも、上記の具体的に記載された８つの遺伝的変異体を置き換えるために使用することができる。
【００７７】
本明細書において、強い連鎖不平衡は、ｒ２値によって定義されてもよい。連鎖不平衡は、遺伝子座の対におけるハプロタイプの分布の特徴づけである。これは、集団における染色体座の対の間の関連性を述べている。ｒ２値は、連鎖不平衡を述べるのに特に適していると考えられる。
【００７８】
連鎖不平衡のｒ２の尺度は、
【００７９】
【数５】
2021513372.tif 000009
として定義され、
式中、ｐａｂは、遺伝子座１において対立遺伝子ａ及び遺伝子座２において対立遺伝子ｂを有するハプロタイプの頻度である（非特許文献２）。相関係数の二乗として、ｒ２（ｐａ，ｐｂ，ｐａｂ）は、ｐａ，ｐｂ及びｐａｂが変わるに従い、０から１に及び得る。
【００８０】
強い連鎖不平衡は、ｒ２値が、例えば１のｒ２値を含む等、０．７を超える、好ましくは０．８を超える、より好ましくは０．９を超えるものである。
【００８１】
ＬＤにおけるそのようなＳＮＰに対する例証は、以下の通りである：
【００８２】
【表４】
2021513372.tif 000010
2021513372.tif 000011
例えば、予測モデルが使用される場合、限定されることはないが、低分子量のヘパリン、アスピリン、未分画ヘパリン、フォンダパリヌクス、ビバリルジン、キシメラガトラン、ワルファリン、ジフェナジオン、キシメラガトラン、ダゾキシベン、スルフィンピラゾン、エポプロステノール、ジピリダモール、ペントキシフィリン、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ、チロフィバン、インテグレリン、エプチフィバチド等、抗血栓薬及び／又は抗凝固薬を用いた治療の可能性に関する治療の決定を行うために、予測リスクが、リスクカットオフ閾値を使用することによって分類されてもよい。
【００８３】
個人の核酸における本発明の方法に従った存在するヌクレオチドの分析は、多型部位に存在するヌクレオチドを決定する能力を有する任意の方法又は技術によって行うことができるということを当業者は容易に認識することになる。当技術分野において明らかであるように、多型マーカーに存在するヌクレオチドは、いずれかの核酸の鎖から又は両方の鎖から決定することができる。
【００８４】
被験者からの生物学的試料（例えば、尿、唾液、血漿、血清等の体液、又は頬側組織試料若しくは頬側細胞等の組織試料等）が得られると、配列変異又は対立遺伝子変異体ＳＮＰの検出が典型的に行われる。実質的に、当業者には既知の任意の方法を利用することができる。おそらく最も直接的な方法は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのいずれかの配列を実際に決定し、これらの配列を遺伝子の既知の対立遺伝子ＳＮＰと比較することである。これは、かなり高価で時間のかかるプロセスであり得る。それにもかかわらず、この技術は非常に一般的であり、よく知られている。
【００８５】
配列変異を検出するために存在する種々の方法のいずれも、本発明の方法において使用することができる。使用される特定の方法は、心血管リスクの推定又は治療法の選択において重要ではない。
【００８６】
他のあり得る市販の方法が、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＶｅｒａｃｏｄｅ技術、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ  ＩＦＣを伴う対立遺伝子特異的ＰＣＴ、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＳＮＰジェノタイピング化学、及びＫＡＳＰａｒ  ＳＮＰジェノタイピング化学等、直接配列決定技術を使用しないハイスループットＳＮＰ同定のために存在する。
【００８７】
直接配列決定法に対する変種は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社から入手可能なＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（商標）法である。或いは、ＤＮＡ配列の変異を検出する頑強でより安価な方法も市販されている。
【００８８】
例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社は、そのＴＡＱｍａｎ  Ａｓｓａｙ（商標）を、配列変異を検出するように適応させた。Ｏｒｃｈｉｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社は、標識ヌクレオチドアナログを用いたプライマー伸長法を使用して、オリゴヌクレオチドプローブの３′すぐの位置でどのヌクレオチドが生じるかを決定し、次に、直接蛍光、間接比色アッセイ、質量分析、又は蛍光偏光を使用して、伸長した塩基が同定されるＳＮＰ−ＩＴ（商標）（ＳＮＰ−同定技術）と呼ばれる方法を有する。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社は、ハイブリダイゼーションキャプチャー技術に加えてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法−飛行時間型−質量分析計）を使用して、そのＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）システムを用いてＳＮＰ遺伝子型を検出する。Ｐｒｏｍｅｇａ社は、ＲＥＡＤＩＴ（商標）ＳＮＰ／ジェノタイピングシステムを提供する（特許文献１）。この方法では、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせる。各塩基において標的配列に相補的なプローブが、独自仕様の酵素の混合物で解重合されるが、照合位置において標的と異なるプローブは、未変化のままである。この方法は、ルシフェラーゼ検出と組み合わせてピロリン酸化化学を使用して、高感度で適応性のあるＳＮＰスコアリングシステムを提供する。Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社は、インベーダープロセスの間に形成された特定の構造のみを認識及び切断する独自仕様のＣｌｅａｖａｓｅｇ酵素を使用するＩｎｖａｄｅｒ  ＯＳ（商標）法を有する。Ｉｎｖａｄｅｒ  ＯＳは、標的の指数関数的増幅ではなく、インベーダープロセスによって生成される信号の線形増幅を頼りにする。Ｉｎｖａｄｅｒ  ＯＳアッセイは、アッセイのいかなる部分においてもＰＣＲを利用しない。加えて、遺伝子特異的ＰＣＲ、それに続く制限酵素消化及びゲル電気泳動（又は他のサイズ分離技術）を使用して、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を検出する多数の法医学的ＤＮＡ試験機関及び多くの研究所がある。
【００８９】
上記の態様のいずれかの様々な実施形態において、ＳＮＰの有無は、試料から増幅産物を増幅すること又は増幅できないことによって同定される。ポリヌクレオチド増幅は、典型的には鋳型依存性である。そのような増幅は、一般的に、鋳型のさらなるコピーを作るために鋳型鎖の存在に頼っている。プライマーは、鋳型鎖にハイブリダイズする、鋳型依存性プロセスにおいて新生核酸の合成を刺激する能力を有する短い核酸である。典型的には、プライマーは、長さが１０から３０塩基対であるが、より長い配列を利用することができる。プライマーは、二本鎖及び／又は一本鎖の形で提供されてもよいが、一本鎖の形が一般的には好ましい。多くの場合、プライマーの対は、鋳型核酸の異なる領域に選択的にハイブリダイズするように設計され、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で鋳型ＤＮＡと接触される。所望の用途に応じて、プライマーに完全に相補的な配列へのハイブリダイゼーションのみを可能にすることになる高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件が選択されてもよい。他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、プライマー配列との１つ又は複数のミスマッチを有する核酸の増幅を可能にするために、減少したストリンジェンシー下で生じてもよい。ハイブリダイズされると、鋳型−プライマー複合体は、鋳型依存性核酸合成を促進する１つ又は複数の酵素と接触される。十分な量の増幅産物が作製されるまで、「サイクル」とも呼ばれる繰り返しの増幅が行われる。
【００９０】
ポリメラーゼ連鎖反応
所与の鋳型試料に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するために、多数の鋳型依存性プロセスが利用可能である。最もよく知られた増幅法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応である。ＰＣＲでは、核酸に選択的にハイブリダイズするプライマーの対が、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で使用される。「プライマー」という用語は、本明細書において使用される場合、鋳型依存性プロセスにおいて新生核酸の合成を刺激する能力を有する任意の核酸を包含する。プライマーは、二本鎖又は一本鎖の形で提供されてもよいが、一本鎖の形が好ましい。プライマーは、所与の鋳型試料に存在する標的遺伝子配列を増幅するために、多数の鋳型依存性プロセスのいずれか１つにおいて使用される。最もよく知られた増幅法の１つはＰＣＲであり、これは、参照により本明細書において援用する特許文献２乃至４において詳細に記載されている。ＰＣＲでは、１つ又は複数の標的遺伝子配列の反対側の相補鎖上の領域に相補的な２つのプライマー配列が調製される。１つ又は複数の標的遺伝子配列が試料に存在する場合、プライマーはハイブリダイズして核酸：プライマー複合体を形成することになる。過剰量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸が、鋳型依存性核酸合成を促進するＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ等と共に反応混合物に添加される。１つ又は複数の標的遺伝子配列：プライマー複合体が形成された場合、ポリメラーゼは、ヌクレオチドを付加することによって、プライマーを１つ又は複数の標的遺伝子配列に沿って伸長させる。反応混合物の温度を上げたり下げたりすることによって、伸長されるプライマーは、１つ又は複数の標的遺伝子から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーが１つ又は複数の標的遺伝子及び反応生成物に結合することになり、このプロセスは繰り返される。「サイクル」と呼ばれる、これらの繰り返しの増幅は、十分な量の増幅産物が作製されるまで行われる。
【００９１】
増幅産物は、分析前に制限酵素で消化されてもよい。上記の態様のうちいずれかのさらに他の実施形態において、ＳＮＰの有無は、検出可能部分で標識されたプライマーと核酸試料をハイブリダイズすることによって同定される。上記の態様のうちいずれかの他の実施形態では、検出可能部分は、酵素アッセイ、免疫アッセイにおいて、又は蛍光を検出することによって検出される。上記の態様のうちいずれかの他の実施形態では、プライマーは、検出可能な色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＹＯ−ＰＲＯ−Ｉ、チアゾールオレンジ、Ｈｅｘ、ｐｉｃｏ  ｇｒｅｅｎ、ｅｄａｎｓ、フルオレセイン、ＦＡＭ、又はＴＥＴ等）で標識される。上記の態様のうちいずれかの他の実施形態では、プライマーは、チップ上に位置する。上記の態様のうちいずれかの他の実施形態では、増幅のためのプライマーは、上記のＳＮＰに特異的である。
【００９２】
増幅ための別の方法は、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲは、ヌクレオチドの重合を介してアンプリコンを作製するのではなく、プローブ分子を増幅するため、ＰＣＲとは異なる。ＬＣＲでは、２つの相補的なプローブ対が調製され、標的配列の存在下で、各々の対が標的の反対の相補鎖に結合し、それらが隣接するようになる。リガーゼの存在下で、２つのプローブ対は、連結して単一のユニットを形成することになる。温度サイクリングによって、ＰＣＲのように、結合した連結されたユニットが標的から解離し、次に、過剰なプローブ対の核酸連結のための「標的配列」として働く。参照により本明細書において援用する特許文献５が、標的配列にプローブ対を結合するためのＬＣＲと類似の方法を記載している。
【００９３】
等温増幅
制限酵素及びリガーゼが使用されて、制限部位の一方の鎖にヌクレオチド５′−［［アルファ］−チオ］−三リン酸を有する標的分子の増幅が達成される等温増幅法も、本発明の核酸の増幅において有用であり得る。一実施形態において、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）法が、一塩基多型（ＳＮＰ）タイピングに使用される。
【００９４】
鎖置換増幅
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、繰り返しの鎖置換及び合成、すなわちニックトランスレーションを含む、核酸の等温増幅を実行する別の方法である。修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる類似の方法は、増幅の標的となる領域全体にわたっていくつかのプローブをアニールし、それに続いて、４つの塩基のうち２つのみが存在する修復反応を含む。他の２つの塩基は、容易な検出のためにビオチン化誘導体として加えることができる。
【００９５】
他の増幅方法が、本発明に従って使用されてもよい。一実施形態において、「修飾された」プライマーは、ＰＣＲ様の、鋳型及び酵素依存性合成において使用される。プライマーは、キャプチャ部分（例えば、ビオチン等）及び／又は検出部分（例えば、酵素等）で標識することによって修飾されてもよい。標的配列の存在下で、プローブは結合し、触媒的に切断される。切断後、標的配列は、未変化で放出されて、過剰のプローブによって結合される。標識されたプローブの切断は、標的配列の存在を合図する。別のアプローチでは、核酸増幅プロセスは、本発明に従って使用され得る一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を周期的に合成することを含む。ｓｓＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される第１のプライマーオリゴヌクレオチドに対する第１の鋳型である。次に、ＲＮＡは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡ又はＲＮＡとの二重鎖のＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって、結果として生じるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から除去される。結果としてのｓｓＤＮＡは、第２のプライマーに対する第２の鋳型であり、鋳型に対するその相同性に対して５′に（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって例証される）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列も含む。次に、このプライマーは、（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」断片により例証される）ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、プライマー間の元のＲＮＡの配列と同一の配列を有し、加えて、一端にプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子を結果として生じる。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作るために、適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。これらのコピーは、次に、サイクルに再び入り、非常に迅速な増幅をもたらすことができる。適切な酵素の選択により、この増幅は各サイクルで酵素を添加することなく等温的に行うことができる。このプロセスの周期的な性質のため、開始配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの形であるように選ぶことができる。
【００９６】
大規模シークエンシング、すなわち大規模並列シークエンシング又は超並列シークエンシングを使用することも考えられ、これは、超並列処理の概念を使用したＤＮＡ配列決定のためのいくつかのハイスループットアプローチのいずれかであり；次世代シークエンシング（ＮＧＳ）とも呼ばれる。これらの技術の一部は１９９４〜１９９８年に現れ、２００５年から市販されている。これらの技術は、１回の装置の実行あたり１００万から４３０億の短い読み取りデータ（各５０〜４００塩基）を配列決定するための小型化及び並列化されたプラットフォームを使用する。
【００９７】
さらに、分析の基礎としてエクソームを使用することが考えられ；エクソームは、エクソンによって形成されるゲノムの一部であり、その配列は、転写されるときに、イントロンがＲＮＡスプライシングによって除去された後も成熟ＲＮＡ内にとどまる。これは、特定の細胞集団においてのみ転写されたＲＮＡであるトランスクリプトームとは異なる、任意のタイプの細胞において成熟ＲＮＡに転写される全てのＤＮＡを含む。ヒトゲノムのエクソームは、全ゲノムの約１％又は約３０メガ塩基のＤＮＡを構成するおよそ１８０，０００のエクソンを含む。非常にごく一部のゲノムを含むけれども、エクソームにおける突然変異は、疾患に大きな影響を及ぼす突然変異の８５％を抱えると考えられている。エクソームの配列決定は、２４を超えるメンデル型遺伝性疾患又は単一遺伝子疾患の遺伝学的基礎を決定するための効率的な戦略であることを証明した。通常、エクソームの配列決定は、上述のように、超並列シークエンシングによって行われる。
【００９８】
核酸分離の方法
鋳型及び過剰なプライマー等、他の材料から核酸産物を分離することが望ましい場合がある。一実施形態において、増幅産物は、標準的な方法を使用して、アガロース、アガロース−アクリルアミド又はポリアクリルアミドのゲル電気泳動によって分離される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、下記参照）。分離される増幅産物は、さらなる操作のために、ゲルから切り取られ、溶出されてもよい。低い融点のアガロースゲルを使用して、分離されたバンドは、ゲルを加熱し、それに続く核酸の抽出によって除去されてもよい。核酸の分離はまた、当技術分野において知られているクロマトグラフィー技術によってもたらされてもよい。吸着、分配、イオン交換、ヒドロキシルアパタイト、分子ふるい、逆相、カラム、ペーパー、薄層、及びガスクロマトグラフィー、並びにＨＰＬＣを含む、本発明の実行において使用され得る多くの種類のクロマトグラフィーがある。特定の実施形態では、増幅産物は可視化される。典型的な可視化法は、臭化エチジウムを用いたゲルの染色、及び、紫外線下でのバンドの可視化を含む。或いは、増幅産物が放射標識されたか又は蛍光定量的に標識されたヌクレオチドで一体的に標識されている場合、分離された増幅産物を、Ｘ線フィルムに曝すか又は適切な励起スペクトルを示す光で可視化することができる。
【００９９】
本発明の方法においてハイブリダイゼーションに有用な核酸分子には、標的核酸と特異的にハイブリダイズすることができるように実質的な同一性を示す任意の核酸分子が含まれる。内在性配列に対する「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子のうち少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする能力を有する。「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列又は核酸配列と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベル又は核酸で少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、より好ましくは９０％、９５％、又は９９％同一でさえある。配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ, Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  １７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．  ５３７０５の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム等）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／又は他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同一又は類似の配列をマッチさせる。保存的置換は、代表的には、以下のグループ：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン；内の置換を含む。同一性の程度を決定するための例証的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ＜‘‘３＞とｅ＜‘‘１００＞の間の確率スコアが、密接に関連した配列を示す。
【０１００】
検出システムを使用して、同時に異なる配列の全てについて、ハイブリダイゼーションの非存在、存在、及びその量を測定することができる。好ましくは、スキャナが、蛍光のレベル及びパターンを決定するために使用される。
【０１０１】
配列変異を検出する別の方法は、特異的なヒト標的のＰＣＲによる増幅、及び、その後のマイクロアレイ上にスポットされた特異的なＨａｉｒｌｏｏｐ（商標）プローブへのハイブリダイゼーションによるそれらの遺伝子型の検出に基づく。
【０１０２】
ＨａｉｒＬｏｏｐ（商標）は、ヘアピンステムを形成する相補的な配列間に包埋されたプローブ配列を含むステムループの一本鎖ＤＮＡ分子である。ステムは、その鎖のうち１つのみによってマイクロアレイ表面に付着される。ＤＮＡ標的の非存在下で、ＨａｉｒＬｏｏｐ（商標）は、閉じた状態で保持される（図１ａ）。標的がそのＨａｉｒＬｏｏｐ（商標）に完璧に結合する（ミスマッチがない）場合、プローブ−標的二重鎖のより優れた安定性によって、ステムはほどけるよう強制され、結果としてＨａｉｒＬｏｏｐ（商標）が開く（図１ｂ）。これらの独特な構造的及び熱力学的な特性により、ＨａｉｒＬｏｏｐ（商標）は、直鎖状プローブよりもいくつかの利点を提供し、その１つは、わずか１つのヌクレオチドだけ異なる２つのＤＮＡ標的配列を区別する特異度の増加である。
【０１０３】
ＨａｉｒＬｏｏｐ（商標）は、通常は閉じている又は「オフ」であるスイッチのように作用する。蛍光ＤＮＡ標的に結合すると、構造を開くコンフォメーション変化が誘発され、その結果、洗浄後に蛍光が可視になる又は「オン」になる。
【０１０４】
１つのＨａｉｒＬｏｏｐ（商標）は、１つの所与の対立遺伝子に特異的であるように設計される。従って、２対立遺伝子マーカーに対する点突然変異の評価には、２つのＨａｉｒＬｏｏｐ（商標）が必要であり；１つは野生型対立遺伝子に対するものであり、もう１つは突然変異遺伝子に対するものである。
【０１０５】
驚くべきことに、本発明に含まれ、先に記載したＳＮＰマーカーの組み合わせは、女性被験者における流産及び／又はＲＰＬの決定及び診断方法に寄与する能力を有するということを証明した。
【０１０６】
好ましい実施形態では、年齢が、さらなるリスクマーカーとしてリスク決定に含まれる。
【０１０７】
さらなる好ましい実施形態では、リスクは：（再発性）妊娠喪失のリスクを推定する関数１を用いて決定され、（再発性）妊娠喪失のリスクの個々の推定は、ロジスティック回帰モデルに基づき、このモデルの目的は、人が（再発性）妊娠喪失を呈する確率を、その人の遺伝的、社会人口統計学的、及び臨床的な特徴に従って計算することであり、この確率を計算するには、以下の式
【０１０８】
【数６】
2021513372.tif 000012
が使用され、式中、
Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｙ＝１｜ｘ１，．．．，ｘｎ）＝多数の変数１，．．．，ｎにおいて具体的で測定可能な特徴を有する特定の個人における血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失を呈する確率であり、この確率は、０から１まで及ぶことができ、
Ｅｘｐ＝指数関数の自然対数の底であり、
【０１０９】
【数７】
2021513372.tif 000013
が使用され、
β０＝変数１からｎと関連していない血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失のリスク（確率）を定義する係数であり、この係数は、−∞から＋∞までの値をとることができ、静脈血栓の発生率の自然対数として計算され、
集団において、
β１＝予測変数ｘ１の値／存在に付随した血栓性素因に関連する妊娠喪失又は再発性妊娠喪失を呈する（より高い又はより低い）リスクを表す回帰係数であり、この係数は、
【０１１０】
【数８】
2021513372.tif 000014
から
【０１１１】
【数９】
2021513372.tif 000015
までの値をとることができ、
ｘ１＝個人における予測変数ｘ１がとる値であり、あり得る値の範囲は変数次第であり、
βｎ＝予測変数ｘｎの値／存在に付随した血栓症を呈する（より高い又はより低い）リスクを表す回帰係数であり、この係数は、−∞から＋∞までの値をとることができ、
ｘｎ＝個人における予測変数ｘｎがとる値であり、あり得る値の範囲は変数次第である。
【０１１２】
モデルに含まれる変数及びこれらの変数の各々の回帰係数が、以下の表５において示される。
【０１１３】
【表５】
2021513372.tif 000016
以下の組み合わせ（Ａ１対立遺伝子）のうちいずれもない
【０１１４】
【表６】
2021513372.tif 000017
記載される方法及び関数の使用によって、流産又はＲＰＬを経験する個別化されたリスクが得られる。
【０１１５】
本発明者等は、以下の例において示されているように、流産又はＲＰＬのリスクを推定するための改善された方法を提供するという目的を達成するために、研究を念入りに行った。
【０１１６】
実施例
材料及び方法
倫理的承認
本研究は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに登録番号ＮＣＴ０３３３６４６３で登録され、ヘルシンキ宣言に従って行い、対応する施設内倫理委員会による承認を受けた。加入前に患者全員が同意説明文書に署名した。
【０１１７】
研究デザイン及び参加者
この多施設対照観察研究を、後向きデータ分析と共に、スペイン全土にわたる３つの地理的領域から４つの施設で行った。
【０１１８】
ＲＰＬの女性は、以下の基準：年齢＞１８歳、自然妊娠又は補助妊娠からのＲＰＬの病歴（連続２回以上又は非連続３回以上）、自身の配偶子の使用、夫婦両方における正常な核型、正常又は修正された甲状腺機能、ＢＭＩ＜３０、（３Ｄ超音波検査、子宮卵管造影法、又は子宮鏡検査によって評価される）正常な子宮の解剖学的形態、非糖尿病性、慢性的な病態なし、卵管水腫なし、及び抗凝固療法又は凝集抑制療法の併用なしを満たす場合、研究への参加に対して適格とした。１８４のＰＲＬ症例のうち１１２例において夫婦の精子を分析することができ、数は２×１０６／ｍｌより多かった。
【０１１９】
対照被験者は、以下の基準：最初の妊娠時の年齢＞１８歳、少なくとも１回の満期までの妊娠、慢性的な病態なし、血栓症の個人歴又は家族歴なし、分娩合併症（流産又は胎児死亡、妊娠高血圧腎症、子癇、子宮内胎児発育遅延、胎盤早期剥離）の病歴なし、及び妊娠中の抗凝固療法又は凝集抑制療法の併用なしを満たす場合、研究への参加に対して適格とした。
【０１２０】
遺伝子解析は、（口腔粘膜スメアによる）唾液試料又は血液試料の採取、（消化及びエタノールによる選択的沈殿による）ＤＮＡ抽出、及び標準的なＦＶＬ−ＰＴパネル及びＴｈｒｏｍｂｏ  ｉｎＣｏｄｅ（登録商標）を（以下においては「ＴｉＣ」、Ｆｅｒｒｅｒ  ｉｎＣｏｄｅ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎも）使用して（遺伝子−ｒｓ）として同定された血栓形成促進性の遺伝的変異のジェノタイピングを必要とした（Ｓｏｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＦＶＬ−ＰＴパネルは、Ｆ５−ｒｓ６０２５及びＦ２−ｒｓ１７９９９６３の遺伝的変異体から構成された。ＴｉＣパネルには、１２の遺伝的変異体：Ｆ２−ｒｓ１７９９９６３、Ｆ５−ｒｓ６０２５、Ｆ１２−ｒｓ１８０１０２０、Ｆ１３−ｒｓ５９８５、ＡＢ０−ｒｓ８１７６７１９、ｒｓ７８５３９８９、ｒｓ８１７６７４３、及びｒｓ８１７６７５０（４つのＡＢ０  ｒｓ全てが、Ａ１  ＡＢ０群キャリアの同定のためのハプロタイプを形成する）が含まれた。遺伝子解析は、Ｇｅｎｄｉａｇ．ｅｘｅで行った。
【０１２１】
研究変数及びデータ分析
考慮した臨床変数は、年齢、ＶＴＥの家族歴、及び妊娠喪失が生じた週であった。全ての変数を、再発性流産を有する患者及び対照について分析した。
【０１２２】
年齢の交絡効果を考慮して、遺伝的変数と再発性流産との関連性を決定した。このために、ロジスティック回帰モデルをフィットさせ、このモデルにおいては独立変数として個々の遺伝的変数及び年齢を含めた。
【０１２３】
再発性妊娠喪失（ＴｉＣ‐ＲＰＬ）リスクスコアに対するＴｈｒｏｍｂｏ  ＩｎＣｏｄｅの展開のために、再発性流産と個々に関連した年齢及び遺伝的変数（ｐ＜０．１０）を、多変量ロジスティック回帰によって分析した。Ｈｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ検定を使用して、モデルの正しい較正を評価した。ＴｉＣ−ＲＰＬスコアを、Ｆ５−ｒｓ６０２５又はＦ２−ｒｓ１７７９９９６３危険対立遺伝子の存在下で１と定義し、それ以外は０としたＦＶＬ＋ＰＴバイナリスコアと比較した。
【０１２４】
リスクスコアの予測能力を、受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ；値が大きいほど良好な識別を示す）を使用して評価した（Ｈａｎｌｅｙ  ａｎｄ  Ｈａｊｉａｎ−Ｔｉｌａｋｉ，  １９９７）。ＤｅＬｏｎｇ検定を使用して、２つのスコア間のＡＵＣ値を比較した。感度、特異度、陽性及び陰性適中率（ＰＰＶ、ＮＰＶ）、並びに、陽性及び陰性尤度比（ＰＬＲ、ＮＬＲ）の標準尺度（Ａｔｔｉａ，２００３）を計算した。これらの尺度を、尺度の各々に対していくつかの方法を実行するＲ  ｐａｃｋａｇｅ  ＤＴＣｏｍＰａｉｒ  （ｈｔｔｐ：／／ＣＲＡＮ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ＤＴＣｏｍＰａｉｒ）を使用してスコア間で比較した。要するに、感度及び特異度を、ＭｃＮｅｍａｒ検定によって比較し、ＰＰＶ及びＮＰＶを、一般化スコア統計量を使用して比較し（Ｌｅｉｓｅｎｒｉｎｇ，  Ａｌｏｎｚｏ  ａｎｄ  Ｐｅｐｅ，  ２０００）、尤度比を、回帰モデルアプローチを使用して比較した（Ｇｕ  ａｎｄ  Ｐｅｐｅ，  ２００９）。
【０１２５】
ＦＶＬ−ＰＴスコアを使用した高リスクに対するカットオフ値は、０．５（任意の危険対立遺伝子が存在する高リスクの個人として定めるのと等価）であり、ＴｉＣ−ＲＰＬスコアに対しては、この閾値は、感度約７０％に相当するＲＯＣ曲線上の点であった。ＲＰＬの原因であり得る関連性のある血栓性素因に対するカットオフ値を、リスクがＦ５−ｒｓ６０２５に対するものと類似しているか又はそれ以上である任意の血栓性素因の存在として確立した。
【０１２６】
ＴｉＣ−ＲＰＬスコアに対する回帰モデルをフィットさせるために全ての試料を使用したため、交差検証ＡＵＣも算出し、任意の過度の楽観バイアスを補正した。この目的のために、一つ抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）アプローチを使用した。要するに、１つの試料を除き、新しい回帰モデルを残りの試料を用いてフィットさせ、その係数を推定した。次に、取り除かれた試料に対する予測されるリスクを、新しいモデルに基づき算出した。このステップを、全ての試料が一度除外されるまで繰り返した。新たに生成したリスク値を使用して、補正ＡＵＣを計算した。
【０１２７】
全ての計算を、Ｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１．３（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，  ２０１５）を使用して行った。
【０１２８】
結果
患者特性
この研究に参加した３６４人の被験者のうち、対照群における健康な女性は１８０人であり、ＲＰＬ群における被験者は１８４人であった。年齢は、健常対照群とＲＰＬ群との間で異なっていた（ｐ＜０．００１）（それぞれ中央値３１歳対３５歳）。遺伝的変数の中でも、Ｆ１２−ｒｓ１８０１０２０（ｐ＝０．０１９）、Ｆ１３−ｒｓ５９８５（ｐ＝０．０６２）、Ｆ２−ｒｓ１７９９９６３（ｐ＝０．０３７）、及びＡＢ０ハプロタイプ（ｐ＝０．０３０）は、本明細書において以下に見られるように、ＲＰＬと個々に関連していた（表７）：
【０１２９】
【表７】
2021513372.tif 000018
2021513372.tif 000019
この表から分かるように、この研究に含まれ且つＴｉＣパネルの一部である４つのさらなる遺伝的変異体は、かなり驚いたことに、流産／ＲＰＬリスクと個々に関連していない。
【０１３０】
ＴｉＣ−ＲＰＬリスクモデルの開発
表８は、ＴｉＣ−ＲＰＬのリスクスコアに含まれた遺伝的変数及び臨床変数を示している。メタアナリシス（Ｓｋｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；  Ｓｅｒｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）に基づき、Ｆ５−ｒｓ６０２５を組み込んだ。各変数に割り当てた重みを、Ｆ５−ｒｓ６０２５及びＦ２−ｒｓ１７９９９６３に対するメタアナリシス（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）から、及び、残りの変数に対する多変量ロジスティック回帰によって定めた。これらの遺伝的変数（及びさらに好ましくは年齢）は、本発明を構成するＴｉＣ−ＲＰＬの組み合わせである。
【０１３１】
【表８】
2021513372.tif 000020
リスクのある患者を同定するためのＴｉＣ−ＲＰＬスコアに対して、７０．６５％の感度及び６７．７８％の特異度をもたらすカットオフ値を選択した。比較して、そのようなリスクのある患者を同定するためのＦＶＬ−ＰＴに対して、Ｆ５−ｒｓ６０２５及びＦ２−ｒｓ１７９９９６３における任意の危険対立遺伝子の存在を、１１．４％の感度及び９６．７％の特異度をもたらすカットオフ値として選択した。
【０１３２】
リスクモデルの正確さ及び検証
ＴｉＣ−ＲＰＬスコアは、０．７６３（０．７１５−０．８１１）のＲＯＣ曲線下面積、７０．６５％の感度、及び６７．７８％の特異度を有した。ＰＰＶは６９．１５％、ＮＰＶは６９．３２％、ＰＬＲは２．１９、ＮＬＲは０．４３（表９）、交差検証ＡＵＣ値は０．７４２（０．６８２−０．７８４）であった。ＦＶＬ−ＰＴスコアは、ＲＰＬを経験した患者と経験しなかった患者も区別しなかった（０．７６３対０．５４０；  ｐ＜０．０００１、図２も参照）。ＴｉＣ‐ＲＰＬスコアの感度は、ＦＶＬ‐ＰＴの感度よりも有意に高かった（７０．６５％対１１．４％；  ｐ＜０．０００１）が、特異度は低かった（６７．７８％対９６．７％；  ｐ＜０．０００１）。ＴｉＣ‐ＲＰＬスコアのＮＰＶは、ＦＶＬ‐ＰＴスコアのＮＰＶを上回った（６９．３２％対５１．６３％；  ｐ＜０．０００１）が、そのＰＰＶスコアは類似していた（６９．１５％対７７．８％；  ｐ＝０．２７７２）。ＴｉＣ−ＲＰＬスコアのＮＬＲも、ＦＶＬ−ＰＴよりも有意に優れていたが、そのＰＬＲは類似していた（表９）。
【０１３３】
【表９】
2021513372.tif 000021
ＦＶＬ−ＰＴ又はＴｉＣ−ＲＰＬスコアに従って高リスク又は低リスクとして分類したＲＰＬ患者の割合も比較した。ＲＰＬを被った大部分の患者（８８．５９％）は、低リスクとしてＦＶＬ−ＰＴスコアによって同定された。注目すべきことに、これらの患者の中でも６８．１％が、ＴｉＣ−ＲＰＬスコアによって高リスクとして再分類された。ＴｉＣ−ＲＰＬは、ＲＰＬを被った患者の７０．６５％がＲＰＬを発症するリスクが高いと考えた。
【０１３４】
ＴｉＣ−ＲＰＬは、１８４人のＲＰＬ女性のうち１３０人（７０．６５％）がＲＰＬに対して高リスクであると同定した。ＴｉＣ−ＲＰＬに従ったＰＬ／ＲＰＬのリスクが高い全ての患者が、血栓予防が示唆され得る患者とみなすことができた。
【０１３５】
考察
この研究で開発したＴｉＣ−ＲＰＬスコアは、ＲＰＬが重大な血栓性素因と関連している女性を同定するものである。この同定は、流産又はＲＰＬイベントの発生を防ぐための個別化されたアプローチを導くことができる。
【０１３６】
多変量解析によって、８つの遺伝的変異体を用いる（好ましくは年齢も含む）モデルを開発し、ＴｉＣ−ＲＰＬに対するアルゴリズムを定め、これは、最初に、患者がＲＰＬのリスクが高い又は低いとして分類されるのを可能にした。ＴｉＣ−ＲＰＬベースの高リスク群における患者の中でも、６９．１５％が最終的にＲＰＬを被り、低リスク群の３０．６８％がＲＰＬを被った（表９）。比較して、ＦＶＬ−ＰＴスコアに従った高リスク患者の７７．７８％がＲＰＬを経験した。同様に、ＦＶＬ−ＰＴスコアに基づく、低リスク群の患者の４８．３６％がＲＰＬを経験した。それにもかかわらず、明らかにＴｉＣ−ＲＰＬは、より多くの女性（ＦＶＬ−ＰＴによって同定した女性２１人に対して１３０人）を、ＲＰＬが高リスクであるとして検出するが、ＴｉＣ−ＲＰＬは、より少ない女性（ＦＶＬ−ＰＴによって分類した女性１６３人に対して５４人）をＲＰＬが低リスクであるとして分類する。
【０１３７】
妊娠喪失及び妊娠における他の有害事象に対する血栓性素因の寄与については、議論されたままである（Ｂａｔｔｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｓｔ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓのガイドラインは、妊娠合併症の病歴がある女性における遺伝性血栓性素因のスクリーニングを勧めていない（Ｂａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。血栓性素因に関するこれらの相克的な結果は、Ｆ５−ｒｓ６０２５のみを使用した単一マーカー限界分析アプローチの使用又はＦ２−ｒｓ１７９９９６３と組み合わせた使用に起因する可能性が最も高い。この標準的なアプローチは、低出力及び乏しい再現性に悩まされる可能性がある。これらの問題を解決するための１つの有用な戦略は、マーカーセット分析であり、遺伝子マーカーの組み合わせが決定され、その予測力に関して評価される。
【０１３８】
その結果、新しいアルゴリズム（上記参照）が臨床マーカー及び遺伝子マーカーから開発された。第一に、本研究は、年齢がＲＰＬと有意に関連しており、ＲＰＬを有する女性は、合併症を伴わない妊娠を有し且つ対照として使用される女性よりも高齢である（３５歳対３１歳、ｐ＜０．００１）ことを示している。
【０１３９】
本研究は特発性のＲＰＬに焦点を当てていたため、ＲＰＬに関連づけられた、及び、臨床医が評価する際にＲＰＬを有する患者とみなす（Ｓｍｉｔｈ  ＭＬ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｓｔ  ＤＪ，  ２０１１）べき、肥満等の臨床的因子を有する患者は除外していた。
【０１４０】
本アルゴリズムにおける遺伝的変異体は、ＲＰＬに個々に関連づけられている。Ｆ２−ｒｓ１７９９９６３及びＦ５−ｒｓ６０２５とＲＰＬとの関連性は広範に研究されている（Ｓｉｍｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；  Ｓｋｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；  Ｓｅｒｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；  Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；  Ｒｏｄｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｌｉｓｓａｌｄｅ−Ｌａｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｋｏｖａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）が、臨床的感度は報告されていない（Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）；しかし、本研究において、臨床的感度は低いことが示されている。これら２つの遺伝的変異体は、現在記載されているリスクの決定のための標準的なパネルとして実際に使用されている。
【０１４１】
遺伝性血栓性素因がＲＰＬを引き起こす正確な機構は不明である。遺伝性血栓性素因は、母体−胎児の境界面にて動脈又は静脈の血栓症を引き起こすことによって胎盤機能を障害するということが示唆されている。また、血栓性素因は、母体血管の合胞体−栄養膜浸潤をもたらし、着床の部位においてミクロ血栓症を形成し、従ってＲＰＬが結果として生じると提唱されている（Ａｂｕ−Ｈｅｉｊａ，  ２０１４）。
【０１４２】
選択した患者集団に基づくいかなるバイアスも回避するために、Ｆ５−ｒｓ６０２５を文献に基づき含めて、Ｆ５−ｒｓ６０２５及びＦ２−ｒｓ１７９９９６３に対する重みを、発表済みの３７５３人の女性によるメタアナリシスから得た（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【０１４３】
この研究の主な成果の１つは、好ましくは「年齢」という変数と組み合わせた、遺伝的変数の特定の成功した組み合わせの開発だけでなく、遺伝子マーカーのセットが構築されるマーカーセット分析を介したアルゴリズムの開発である。この組み合わせは、Ｆ５−ｒｓ６０２５及びＦ２−ｒｓ１７９９９６３の遺伝的変異体よりも良好な結果をもたらす。本明細書において提供されるさらなる利点は、２つのアルゴリズム：  ＴｉＣ−ＲＰＬ及びＦＶＬ−ＰＴ  （Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ａｔｔｉａ，  ２００３）の良さを特徴付けるために行った分析及び変数の選択である。ほとんどの研究が、この分析をマーカーとＲＰＬとの関連性に限定している。Ｆ５−ｒｓ６０２５は、良好なＰＰＶ（本明細書では、Ｆ２−ｒｓ１７９９９６３と組み合わせて７７．７８％）で、ＲＰＬとの強い関連性を有している可能性がある（ＯＲ：  ２．０１）（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）が、これらの変異体は、ＲＰＬ女性では珍しく、その臨床的価値は限られている（本願では、感度は１１．４１％であった）。Ｆ５−ｒｓ６０２５及びＦ２−ｒｓ１７９９９６３等、低い感度を有する２つの変異体のみの使用が、リスクのある人の同定及び血栓予防のための患者の選択において、これらの変異体では再現性のある結果が得られなかったことを説明する可能性がある（ＦＶＬ−ＰＴに対するＡＵＣも低かった、ＡＵＣ＝０．５４０）。
【０１４４】
本研究では、臨床医には、流産を経験する又はＲＰＬにかかるリスクのある女性を同定するアルゴリズムが提供される。この組み合わせ／アルゴリズムは、妊娠喪失一般の可能性を予測するために、又は、最初の（若しくはいかなるさらなる）妊娠喪失の後に、そのような女性を同定するために使用することができる。また、ＲＰＬが確認された女性に対して適用して、血栓予防の必要が示され得るＲＰＬのリスクが高い患者を同定することもできる。血栓予防を勧めるために、ＲＰＬのリスクが高い女性が同定され、そのような女性では、（提案されている多変量モデルに従って、単一の遺伝的変異体又は組み合わせとして）血栓性素因の存在は、介入治療を必要とする血栓性素因のレベルとしてほとんどのガイドラインによって使用される閾値であるＦ５−ｒｓ６０２５（ＯＲ  ２．０１）と同程度又はそれよりも強く、ＲＰＬに関連している。この基準を適用すると、ＲＰＬ群における１３０人の高リスク女性のうち、９１人（７０％）を、血栓性素因が関連しており且つ血栓予防が示唆され得る患者とみなすことができる。進行中のパイロット研究においてこの基準を使用すると、ＲＰＬのリスクが高かった８０人の女性のうち、３７人が、Ｆ５−ｒｓ６０２５と同程度又はそれよりも強い有意な血栓性素因を（提案されている多変量モデルに従って、単一の遺伝的変異体又は組み合わせとして）有した。３７人全てを、予防的用量のＬＭＷＨで治療し、そのうち３３人（８９．２％）が満期まで妊娠を経験した。
【０１４５】
要約すると、本願は、ＲＰＬの女性を同定する際のその良好なＡＵＣ値、感度、陰性尤度比、及び感度（７０．７％）によって実証されるように、ＦＶＬ−ＰＴよりも有意に優れた臨床遺伝学的リスクスコアを提供する。血栓予防の推奨は、ＦＶＬと同等又はそれ以上の有意な血栓性素因を有する患者にとって適切であり得る。提示する臨床遺伝学的リスクスコアの使用は、ＲＰＬにおける遺伝性血栓性素因に関する矛盾する結果を解決するのに有用である。ＴｉＣ−ＲＰＬのリスクスコアによって高リスクであると同定され且つ有意な血栓性素因を有する患者は、血栓予防から利益を得る可能性が高い。ＴｉＣ−ＲＰＬスコア等の高感度の予測ツールは、低リスクのあり得る血栓予防処置を考慮し、現在では血栓性素因に関連する不妊症を改善するために利用可能である。
【０１４６】
【表１０】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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