(57)【要約】  本発明は、微小管結合タンパク質タウに特異的に結合する結合分子及び抗原結合断片に関する。本発明はまた、結合分子又は抗原結合断片を使用する診断方法、予防方法、及び治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウに特異的に結合することができる結合分子であって：
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；並びに、
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子
からなる群から選択される、前記結合分子。
【請求項２】
前記結合分子が、配列番号１５、１６、１８、１９、及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１４及び１７からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記結合分子が：
配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；並びに、
配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の結合分子。
【請求項４】
タウとの結合に関して、請求項１、２、又は３に記載の結合分子と免疫特異的に競合する結合分子。
【請求項５】
前記結合分子が、ヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合性フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項６】
タウタンパク質凝集体の拡散を阻害する、並びに／又はミクログリアによるタウ凝集体の取り込み及び分解を媒介する際に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項７】
医薬として使用するための、好ましくは、タウの病的凝集が関わる神経変性疾患の診断、予防、及び／又は治療において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項８】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項６又は７に記載の使用のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかの一項に記載の少なくとも１つの結合分子を含み、少なくとも１つのタグをさらに含む、免疫コンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合分子、及び／又は請求項９に記載の免疫コンジュゲート、並びに薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬に関する。本発明は特に、タウに特異的に結合し、タウ種の拡散を阻害することができる結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片に関する。本発明はまた、抗タウ結合分子を使用する診断方法、予防方法及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は、記憶、思考、行動、及び日常活動を行う能力に支障を来たす多くの進行性障害によって引き起こされ得る症候群である。現在、全世界で約３６００万人が認知症に罹患している。認知症者数は２０３０年までに倍増し、２０５０年までには３倍を超えて１億１５４０万人に上ることが予想されている。アルツハイマー病（ＡＤ）は最も一般的なタイプの認知症である。現在、６５歳以上の９人に１人（１１パーセント）及び８５歳を超える人のほぼ半数がアルツハイマー病を患っている。国際アルツハイマー病協会（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によれば、これらの患者にかかる医療コストは、現在では世界全体で年間６０００億ドルを超える。これらのコストは、特に発展途上国世界において、さらなる公的な社会医療制度の出現、及び所得の向上による機会費用の高まりに伴い、疾患の罹患率を上回ってさらに急速に上昇する可能性が高い。
【０００３】
ＡＤ患者の脳には、２つの異常構造、アミロイド斑及び細胞内の神経原線維変化（ＮＦＴ）が豊富にある。これは、特に脳のうちの記憶に重要な特定の領域について当てはまる。また、大脳皮質及び特定の皮質下領域におけるニューロン及びシナプスの実質的な消失もある。神経原線維変化及びニューロンの消失の両方は、病気の継続期間及び重症度と平行に増大し、神経原線維負荷は、認知低下と相関することが示されてきた。
【０００４】
神経原線維変化は、微小管結合タンパク質タウの過剰リン酸化した不溶性の蓄積物で構成される神経細胞内病変である。これらの蓄積は、ＡＤだけでなく多くの他の神経変性疾患の病理組織学的特徴であり、一括してタウオパチーとして知られる。タウオパチーには、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）が含まれる。ヒトタウオパチーでは、病変が疾患に特異的なパターンで、１つの脳領域から別の脳領域に進行し、この基礎的なメカニズムは、まだ明らかではない。
【０００５】
したがって、タウ病変は多くのタウオパチーに関与し、それらの原因であり得る。その標準形では、タウは、微小管に結合し、その集合及び安定性を促進する、ニューロンの軸索中で主要素をなすように発現した高溶解性の微小管結合タンパク質である。タウタンパク質は、多くの潜在的なリン酸化部位を含み、これらの部位のうちのいくつかの調節されたリン酸化及び脱リン酸化が、チューブリン及び細胞骨格機能とのその相互作用に影響を及ぼすことが示されてきた。タウの過剰リン酸化は、微小管の解離、並びに通常は無秩序な高溶解性タンパク質の、βシートリッチな原線維、又はＮＦＴを作り上げ変性神経突起及び細胞体の内部で視覚化できる対らせんフィラメント（ＰＨＦ）とも呼ばれるタウ凝集体への集合を導くと考えられる。タウ線維化の初期段階がエネルギー的に好ましくない一方で、一旦核が形成されると、それらは急速にタウモノマーをリクルートし、熱力学的に安定した凝集体へと変換する。その後、これらの凝集体は、タウモノマーをリクルートし、且つそれらをデノボ原線維に変換可能であるより多くの原線維末端を生成する断片化を受けることもある。このプロセスは、最も一般的な用語で「シーディング」と呼ばれる。タウ病変の量は、ヒト及びトランスジェニックマウスモデルにおける進行性ニューロン機能不全、シナプス消失、及び機能低下と相関する。能動免疫化のための種々のホスホタウペプチド及び受動免疫化のための種々の抗タウ抗体を含む、タウに対する受動免疫化及び能動免疫化が、いくつかの異なるマウスモデルを用いてマウスにおいて分析されている。タウ上の初期病的立体エピトープにおける過剰リン酸化タウタンパク質のリン酸化Ｓｅｒ３９６及びＳｅｒ４０４と反応する十分に特徴付けられた抗タウ抗体による受動免疫化により、能動免疫化研究で見られた結果が確認された。これらの抗体で処置されたマウスは、タウ病変の顕著な減少（これは生化学的方法及び組織学によって測定された）、同様に運動機能低下の損失の有意な遅延（これは行動試験において評価された）を示した（Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ  Ａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１１；１１８（４）：６５８−６６７、Ｃｈａｉ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（３９）：３４４５７−３４４６７）。
【０００６】
現在、ＡＤに対する最も一般的な医学的アプローチは対症療法の提供であり、これは、数年の治療後でさえ有効ではない。ＡＤのための新しい治療的アプローチ及び戦略は、症状の治療を超えて、認知低下を予防し、疾患の基本的な病的プロセスを妨げる必要がある。特に、単独で、又は他のＡＤ標的薬物と組み合わせて、疾患の最も初期の段階の少なくともいくつかを妨害する分子を開発する必要がある。このような分子は、ＡＤ及び他のタウオパチーの早期診断（それ自体が治療結果を改善し得る）、予防、及び治療において、新規の有利な選択肢を提供するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、タウ対らせんフィラメント（ＰＨＦ）に特異的に結合することができ、並びにタウ凝集体の拡散を阻害し、及び／若しくはミクログリアによるタウ凝集体の取り込み及び分解を媒介することができる、新規な結合分子、特にヒト結合分子、例えばヒト抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
好ましい実施形態において、本発明の結合分子は：
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；並びに、
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子、からなる群から選択される。
【０００９】
特定の実施形態において、結合分子は、インビトロ及び／又はエクスビボで、タウ対らせんフィラメント（ＰＨＦ）に結合することができる。
【００１０】
特定の実施形態において、結合分子は、インビトロでタウ凝集体の拡散を阻害することができる。
【００１１】
特定の実施形態において、結合分子は、タウ対らせんフィラメント（ＰＨＦ）に結合することができ、インビトロでミクログリアによるその取り込みを媒介する。
【００１２】
特定の実施形態において、結合分子は、配列番号１５、１６、１８、１９、及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１４及び１７からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明の結合分子は：
配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；並びに
配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子、からなる群から選択される。
【００１４】
好ましくは、本発明による結合分子は、ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。
【００１５】
特定の実施形態において、結合分子は、ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である。
【００１６】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの結合分子を含み、少なくとも１つのタグをさらに含む免疫コンジュゲートに関する。
【００１７】
本発明の他の態様は、本発明による結合分子をコードする核酸分子に関する。
【００１８】
本発明の結合分子、免疫コンジュゲート及び／又は核酸分子は、医薬としての使用、好ましくはアルツハイマー病（ＡＤ）を含むがこれに限定されないタウオパチーの診断、予防及び／又は治療における使用に適している。
【００１９】
本発明はまた、本発明による結合分子の機能的変異体に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明による結合分子及び／又は免疫コンジュゲート、並びに薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｂｉｏｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（Ｏｃｔｅｔ）による親和性の評価。
【図２】ＡＤ脳ホモジネートから種を枯渇させるための、本発明の結合分子の能力。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書で使用される用語「結合分子」は、当該技術分野で公知の全ての免疫グロブリンのクラス及びサブクラスを含む。それらの重鎖結合分子の定常ドメインのアミノ酸配列によって、５つの主要なクラスの完全な抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分けられ、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に分けられ得る。
【００２３】
本発明を通して使用される場合、用語「抗原結合断片」は、抗体などの完全な結合分子の一部を意味する。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ＣＤＲ、抗原結合部位、重鎖若しくは軽鎖可変領域、ダイアボディ、トリアボディ、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、及び少なくとも２つの完全な抗体若しくはその断片から形成される多重特異性抗体、又は（ポリ）ペプチドに結合する抗原を付与するのに十分な免疫グロブリンの断片を少なくとも含む（ポリ）ペプチドなどが含まれる。抗原結合断片は、抗体のアミノ酸配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又は２５０の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを含み得る。抗原結合断片は、合成的に、又は完全な免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的開裂によって作製されてもよく、或いは組換えＤＮＡ手法によって遺伝子操作されてもよい。生産の方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ，Ｌａｎｅ（１９８８），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。抗体又はその抗原結合断片は１つ以上の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位がある場合、それらの結合部位は互いに同一であってもよく、又はそれらは異なってもよい。
【００２４】
免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、「抗原結合部位」によって分断された「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下のように、種々の用語を用いて定義される：（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づく（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１−５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は各可変領域に３つのＣＤＲを有する（重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９６：９０１−１７，１９８７）により定義されるように、抗体可変ドメインの中で構造が超可変的な領域を指す。一般に、抗原結合部位は各ＶＨ（Ｈｌ、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ（Ｌｌ、Ｌ２、Ｌ３）に３つの超可変領域を有する。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保存されたＨＶを「カノニカルな構造」と呼んでいる。ＣＤＲ及びＨＶの付番方式及びアノテーションは、近年、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ４５：３８３２−９，２００８）によって改訂されている。（ｉｉｉ）抗原結合部位を形成する領域の別の定義は、免疫グロブリンとＴ細胞受容体のＶドメインの比較に基づき、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ  Ｃａｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２７：５５−７７，２００３）によって提唱されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ  ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）が、これらの領域の標準化された付番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴ記述の間の対応は、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。抗原結合部位はまた、特異性決定残基使用法（ＳＤＲＵ）に基づき記述することもでき（Ａｌｍａｇｒｏ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １７：１３２−４３，２００４）、ここで、特異性決定残基（ＳＤＲ）は、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。
【００２５】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の付番方式を定義した。当業者は、配列それ自体を超えるいかなる実験データにも頼ることなく、この「Ｋａｂａｔ付番」方式を任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用されるとき、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって規定される付番方式を指す。特記されない限り、本発明の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体における具体的なアミノ酸残基位置の付番に対する言及はＫａｂａｔ付番方式に従うが、しかしながら、この方式は理論上のものであり、本発明のあらゆる抗体に等しく適用されないこともある。例えば、最初のＣＤＲの位置によって、続くＣＤＲがいずれかの方向にシフトし得る。
【００２６】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位配列と定義されるものを除いた抗体の可変領域内の残りの配列である。抗原結合部位の正確な定義は上記に記載したとおり様々な記述によって決定し得るため、正確なフレームワーク配列は抗原結合部位の定義に依存する。
【００２７】
用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、本明細書で使用されるとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体断片）を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一般的には単一の抗原決定基を対象とする。
【００２８】
用語「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」は、抗体とその結合パートナー、例えば抗原との相互作用に関連して本明細書で使用されるとき、その相互作用が結合パートナー上の特定のアミノ酸配列又は構造、例えば抗原決定基又はエピトープの存在に依存することを意味する。換言すれば、結合パートナーが他の分子又は生物の混合物中に存在する場合であっても、抗体はその結合パートナーに優先的に結合し、又は認識する。結合は共有結合性又は非共有結合性相互作用又はその両方の組み合わせによって媒介され得る。さらに言い換えれば、用語「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」は、抗体が、ある抗原決定基又はエピトープとの特異的な免疫反応性を有し、他の抗原決定基又はエピトープとの免疫反応性を有しないことを意味する。抗原に（免疫）特異的に結合する抗体は、他のペプチド又はポリペプチドに対し、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ、又は当該技術分野において公知の他のアッセイによって決定するときもより低い親和性で結合し得る。抗原に特異的に結合する抗体又はその断片は、同じエピトープを有する関連抗原との交差反応性を有し得る。好ましくは、抗原に特異的に結合する抗体又はその断片は、他の抗原との交差反応性を有しない。
【００２９】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、抗体のＣＤＲループが接触する抗原の一部分を意味する。「構造的エピトープ」は抗原表面上の約１５〜２２個の接触残基を含み、抗体のパラトープと一括して称されるＣＤＲ上の残基の大きい群と接触する多くのアミノ酸残基が関わる。エピトープとパラトープとの残基間の直接接触は、疎水性表面の静電力、例えば、水素結合、塩橋、ファンデルワールス力及び形状の相補性によって確立される。界面はまた、抗原−抗体相互作用の特異性及び親和性に寄与する結合した水分子又は他の補因子も有する。抗原−抗体複合体の結合エネルギーは主にエピトープ−パラトープ界面におけるごく一部の接触残基によって媒介される。これらの「エネルギー残基」は、多くの場合、エピトープ−パラトープ界面の中心に位置して機能的エピトープを作り上げる。界面の周辺の接触残基は、概して結合エネルギーへの寄与は小さく、それらを置き換えても、往々にして抗原との結合にはほとんど影響がない。したがって、エピトープの結合又は機能活性には、構造的エピトープの中心に位置し、且つ特異性決定ＣＤＲが接触するごく一部のエネルギー残基が関わる。抗原タンパク質上の機能的エピトープの割り当ては、アラニンスキャン変異誘発を含むいくつかの方法を用いるか、又は抗体で抗原の結晶構造を解くことによって行い得る。エピトープは本質的に線状であってもよく、又は不連続エピトープ、例えば立体エピトープ（これは線状の一続きのアミノ酸よりむしろ、抗原の非連続アミノ酸の間の空間的関係によって形成される）であってもよい。立体エピトープは、抗原の折り畳みによって生じるエピトープ（ここでは抗原の線状配列の異なる部分のアミノ酸が三次元空間で近接するようになる）を含む。不連続エピトープについては、１つ以上の線状ペプチドが、例えばタンパク質配列の異なる領域に分散したいわゆる部分エピトープと低い親和性で結合を達成することが可能であり得る（Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１８（２）：２１９−２０）。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は結合分子（例えば、免疫グロブリン分子）のＣＤＲとの個々のエピトープ又は部分エピトープの結合の強度の尺度を指し、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）のＰ２７−２８を参照されたい。本明細書で使用されるとき、用語「アビディティ」は、免疫グロブリンの集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能上の組み合わせ強度を指し、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  のＰ２９−３４を参照されたい。アビディティは、特異的エピトープに対する集団中の個々の免疫グロブリン分子の親和性と、また免疫グロブリン及び抗原の結合価との両方に関係する。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーなどの繰り返しの非常に多いエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高アビディティの１つであろう。抗原に対する抗体の親和性又はアビディティは任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができ、例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、及び本明細書中に記載の方法を参照されたい。抗原に対する抗体の親和性を測定する一般的な方法には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴が含まれる。特定の抗体抗原相互作用の親和性測定値は、例えば、塩濃度、ｐＨなどの条件が異なる中で測定した場合には変わり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０の測定は、好ましくは抗体及び抗原の標準溶液、並びに標準緩衝液で行われる。
【００３１】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸及び複数の核酸を包含するものとし、単離された核酸分子又は核酸コンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合又は非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクター中に含まれる抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的上、単離されていると見なされる。
【００３２】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域に作動可能に会合したプロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、その遺伝子産物の発現を調節配列の影響下又は制御下に置くようにして１つ以上の調節配列と会合している場合である。したがって、プロモーター領域は、プロモーターにその核酸の転写を生じさせる能力があれば、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合しているとし得る。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指図する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルがポリヌクレオチドと作動可能に会合して細胞特異的転写を指図し得る。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示される。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」又は「治療」は、療法的治療及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置（その目的は、パーキンソニズム又はアルツハイマー病の発症などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防又は減速（減少）させることである）の両方を指す。有益な又は所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、検出が可能であるか不可能であるかに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患が安定している（すなわち、悪化していない）状態、疾患の進行の遅延又は減速、病状の改善又は緩和、及び寛解（部分的であるか全体的であるかに関わらず）が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けなかった場合の予想と比較して生存が延びることも意味し得る。治療を必要とする者には、既に病態若しくは障害を有する者、及び病態若しくは障害に罹り易い者又は病態若しくは障害の発現を予防すべき者が含まれる。「医薬」は、本明細書で使用されるとき、望ましくない生理学的変化又は障害の治療に用いられる薬剤である。
【００３４】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」は、診断、予後判定、予防、又は治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象、例えばヒト患者を意味する。
【００３５】
本発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、タウ対らせんフィラメント（ＰＨＦ）に特異的に結合することができ、並びにタウ凝集体の拡散を阻害し及び／又はミクログリアによるタウ凝集体の取り込みを媒介することができる、結合分子、例えば抗体及び／又はその抗原結合断片を提供し、ここで、結合分子は、
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；並びに、
配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子、からなる群から選択される。
【００３６】
特定の実施形態において、結合分子は、インビトロ及び／又はエクスビボで、タウＰＨＦに結合することができる。
【００３７】
特定の実施形態において、結合分子は、インビトロでタウ凝集体の拡散を阻害することができる。
【００３８】
特定の実施形態において、結合分子は、タウ対らせんフィラメント（ＰＨＦ）に結合することができ、インビトロでミクログリアによるその取り込みを媒介する。
【００３９】
特定の実施形態において、結合分子は、配列番号１５、１６、１８、１９、及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１４及び１７からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明の結合分子は：
配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；並びに、
配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子、からなる群から選択される。
【００４１】
特定の実施形態において、結合分子は、ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である。
【００４２】
本発明によれば、非常に高い親和性でタウＰＨＦに特異的に結合し、ＰＨＦ様凝集体の伝播を阻害することができる新規な結合分子が提供される。特定の実施形態において、結合分子は、タウＰＨＦに結合することができ、Ｆｃ媒介機構を介してミクログリアによるその取り込みを促進する。
【００４３】
特定の実施形態において、結合分子は、２５０ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは２５ｎＭ以下、より一層好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下の親和性で、タウに特異的に結合する。
【００４４】
タウは、複数のよく知られたアイソフォームを有する、豊富にある中枢及び末梢神経系タンパク質である。ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）においては、３５２〜４４１のサイズ範囲の６つの主要なタウアイソフォームが、選択的スプライシングのために存在する（Ｈａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １５：１１２−９，２００９）。これらのアイソフォームは、０、１、又は２のＮ末端酸性インサート（０Ｎ、１Ｎ、又は２Ｎ）、及び３又は４の直列に配列した微小管結合リピート（３Ｒ又は４Ｒ）の調節的包含によって互いに異なり、ＯＮ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ、２Ｎ３Ｒ、ＯＮ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ、及び２Ｎ４Ｒと呼ばれる。本明細書で使用されるとき、組換えタウは、配列番号９のタウアイソフォームを指す。タウタンパク質は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バキュロウイルス、哺乳類、又は無細胞系において多量に組換え発現させることができる。組換えタウは、標準的な方法（例えば、Ｂａｒｇｈｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ  ２００５，Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５−５１）を用いて、組換え発現及び精製し得る。
【００４５】
一実施形態において、抗体又はその抗原結合断片などの本発明の結合分子は、配列番号９のアミノ酸配列を含むリン酸化タウペプチドに特異的に結合する。
【００４６】
タウは微小管に結合して細胞を通じたカーゴの輸送を調節し、これは、７９個の潜在的なセリン（Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）リン酸化部位の多くで起こるタウリン酸化によって調節され得るプロセスである。タウは、脳の発達中に高度にリン酸化される。リン酸化の程度は成人期に減少する。リン酸化部位の一部はタウの微小管結合ドメイン内に位置し、タウリン酸化の増加が微小管の結合を負に調節することが示されている。例えば、微小管結合モチーフ内又はそれに隣接して位置するＳｅｒ２６２及びＳｅｒ３９６が、ＡＤ患者の脳における神経原線維変化（ＮＦＴ）の主要な成分である異常な対らせんフィラメント（ＰＨＦ）のタウタンパク質において過リン酸化される。
【００４７】
用語「対らせんフィラメントタウ」又は「ＰＨＦタウ」は、本明細書で使用されるとき、最初に認知症患者の脳においてアルツハイマーにより説明された、神経原線維変化（ＮＦＴ）と呼ばれる病理学的構造を作り上げる、よく知られたタウ凝集体を指す。その存在はまた、タウオパチーとして知られる数々の他の疾患にも見られる。したがって、タウの凝集体は、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症、核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性疾患（ＡＧＤ）、皮質基底核変性症、ＦＴＤＰ−１７、パーキンソン病、拳闘家認知症において、神経原線維変化（ＮＦＴ）の主要な成分として観察することができる（Ｇｅｎｄｒｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．４：１３（２００９）に概説されている）。
【００４８】
用語「神経原線維変化」（ＮＦＴ）は、最初に認知症患者の脳においてアルツハイマーにより説明された病理学的構造を指す。ＮＦＴは、アルツハイマー病の主要なマーカーとして最も一般的に知られている過リン酸化タウタンパク質の順序正しく並んだ対らせんフィラメントで構成される。
【００４９】
生理学上のタウタンパク質はニューロンの微小管を安定化させる。病的リン酸化が異常なタウ局在化及び凝集をもたらし、それによって微小管の不安定化及び細胞輸送障害が起こる。凝集タウはインビトロで神経毒性がある（Ｋｈｌｉｓｔｕｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６），１２０５−１２１４）。しかしながら、正確な神経毒種は未だ明らかになっておらず、それらがニューロン死をもたらす機構も不明である。
【００５０】
本発明によって、タウＰＨＦに特異的に結合し、並びにタウ凝集体の拡散を阻害し、及び／又はミクログリアによるその取り込み及び可能な分解を媒介することができる、新規な結合分子が提供される。したがって、本発明の結合分子は、タウ病変の形成を妨げる可能な治療試薬として、ＡＤを発症するリスクを評価するバイオマーカーとして、及び／又はＡＤを発症するリスクを評価するバイオマーカーを捕捉するために使用される試薬として役立ち得る。
【００５１】
本発明の結合分子は、モノクローナル抗体などの完全な免疫グロブリン分子であってもよいし、その抗原結合断片であってもよく、このような抗原結合断片としては、以下に限定されないが、タウに対する特異的な抗原結合性を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも断片を含む重鎖及び軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、及び（ポリ）ペプチドが挙げられる。
【００５２】
好ましい一実施形態において、本発明の結合分子は、ヒトモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片である。結合分子はまた、ナノボディ、アルファボディ、アフィボディ、ＦＮ３ドメイン足場、及びＡｄｎｅｃｔｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ｄａｒｐｉｎ、Ｃｅｎｔｙｒｉｎなどのような（ヒト）リピートタンパク質におけるドメインに基づく他の足場、又はエピトープ結合配列を含む他の足場であってもよい。
【００５３】
特定の実施形態において、抗体はキメラ抗体である。
【００５４】
特定の実施形態において、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びにヒトＩｇＧ１の組換え定常領域を含むキメラ抗体である。
【００５５】
特定の実施形態において、本抗体は、タウに特異的に結合するヒト抗体由来の抗原結合可変領域、及びヒトＩｇＧ１の組換え定常領域を含むキメラ抗体であり、ここで、キメラ抗体の定常領域は、ヒト抗体の定常領域とは異なる。
【００５６】
特定の実施形態において、抗体は、ヒト抗体由来の重鎖及び軽鎖可変領域、並びに組換えヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖定常領域を含むキメラ抗体である。
【００５７】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００５８】
なおさらなる態様では、本発明は免疫コンジュゲート、すなわち、本明細書中に定義されるような少なくとも１つの結合分子を含み、そしてさらに少なくとも１つのタグを含む分子を提供する。タグは、共有結合によってヒト結合分子に直接連結／コンジュゲートすることができる。或いは、タグは、１つ以上の連結化合物によって結合分子に連結／コンジュゲートすることができる。タグを結合分子にコンジュゲートする手法は当業者によく知られている。本発明の免疫コンジュゲートのタグは、治療薬とすることができるが、検出可能な部分／作用物質とすることもできる。治療及び／又は予防に適したタグは、毒素若しくはその機能的部分、抗生物質、酵素、食作用を強める他の結合分子、又は免疫刺激物とすることができる。検出可能な作用物質を含む免疫コンジュゲートは、例えば、対象がＡＤを発症するプロセスにあるかどうかを評価するために診断的に使用され得る。検出可能な成分／作用物質としては、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられるが、これらに限定されない。検出及び／又は分析及び／又は診断目的のために結合分子を標識するのに使用されるタグは、とりわけ（組織）試料の免疫組織化学的染色、フローサイトメトリー検出、走査型レーザーサイトメトリー検出、蛍光イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ（例えば、食作用アッセイ）、ウェスタンブロッティングアプリケーションなどの、使用する具体的な検出／分析／診断の手法及び／又は方法に依存する。当該技術分野で知られている検出／分析／診断の手法及び／又は方法のための好適な標識は、当業者の理解の範囲内である。
【００５９】
本発明の別の態様では、本発明による少なくとも１つの結合分子、機能的変異体、又は免疫コンジュゲートをコードする核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、例えば、クローニングの目的のために中間体として使用できる。好ましい実施形態において、核酸分子は単離又は精製される。当業者は、これらの核酸分子の機能的変異体もまた本発明の一部であると意図されることを理解するであろう。機能的変異体は、標準的な遺伝子コードを用いて直接翻訳されて、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供し得る核酸配列である。
【００６０】
本発明による１つ以上の核酸分子を含むポリヌクレオチド、例えば、ベクターを提供することは、本発明の他の態様である。ベクターは、とりわけＦ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴＯＬ、Ｔｉなどのプラスミド；コスミド；ラムダ、ラムドイド、Ｍ１３、Ｍｕ、Ｐ１、Ｐ２２、Ｑβ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ−ｏｄｄ、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスに由来することができる。ベクターは、本発明の結合分子のクローニング及び／又は発現に使用することができ、且つ遺伝子治療目的にさえも使用することができる。１つ以上の発現調節核酸分子に作動可能に連結された本発明による１つ以上の核酸分子を含むベクターもまた本発明に包含される。ベクターの選択は、以下の組換え手順及び使用する宿主に依存する。宿主細胞におけるベクターの導入は、とりわけリン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって達成することができる。ベクターは、自己複製性であってもよく、又はそれらが統合される染色体と一緒に複製してもよい。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選択マーカーを含む。マーカーの選択は、当業者によく知られているように、本発明にとって重大ではないが、選択した宿主細胞に依存し得る。それらには、カナマイシン、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、マウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）が含まれるが、これらに限定されない。ヒト結合分子の単離に使用することができるタンパク質又はペプチドをコードする１つ以上の核酸分子に作動可能に連結された上記のヒト結合分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターもまた本発明に包含される。このようなタンパク質又はペプチドとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、金属結合ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
上述のベクターの１つ以上のコピーを含む宿主は、本発明のさらなる態様である。好ましくは、宿主は、宿主細胞である。宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、真菌、又は細菌を起源とする細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のいくつかの種などのグラム陽性菌又はグラム陰性菌由来の細胞を含むが、これらに限定されない。真菌細胞の群では、好ましくは、酵母細胞が使用される。酵母における発現は、とりわけピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの酵母株を使用することにより実現することができる。さらに、ショウジョウバエ及びＳｆ９由来の細胞などの昆虫細胞を、宿主細胞として使用することができる。それに加えて、宿主細胞は、とりわけ、森林植物などの作物植物由来の細胞、又は穀物植物若しくは薬用植物などの食物及び原材料を提供する植物由来の細胞、又は鑑賞植物由来の細胞、又は球根作物由来の細胞などの植物細胞とすることができる。形質転換（トランスジェニック）植物又は植物細胞は、知られた方法、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介遺伝子導入、葉片の形質転換、ポリエチレングリコール誘導ＤＮＡ導入によるプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、又はパーティクルガン遺伝子導入法によって作製することができる。加えて、好適な発現系は、バキュロウイルス系であってもよい。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、又はＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの哺乳類細胞を使用する発現系は、本発明において好ましい。哺乳動物細胞は、哺乳動物起源の天然分子に極めて類似した翻訳後修飾を有する発現タンパク質を提供する。本発明はヒトに投与しなければならないことがあり得る分子を扱うため、完全にヒトの発現系が特に好ましいであろう。したがって、より一層好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。ヒト細胞の例は、とりわけＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。好ましい実施形態において、ヒトプロデューサー細胞は、発現可能な構成をしたアデノウイルスＥ１領域をコードする核酸配列の少なくとも機能的部分を含む。より一層好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト網膜に由来し、９１１細胞、又は番号９６０２２９４０で１９９６年２月２９日にＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、ＣＡＭＲ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ＯＪＧ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎに委託され、商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ＰＥＲ．Ｃ６はＣｒｕｃｅｌｌ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．Ｖ．の登録商標である）で販売されている細胞株などのように、アデノウイルスＥ１配列を含む核酸により不死化される。本出願の目的のために、「ＰＥＲ．Ｃ６細胞」は、番号９６０２２９４０で委託された細胞又は祖先、上流又は下流の継代、及び委託された細胞の祖先由来の子孫、並びに前述のもののいずれかの誘導体を指す。宿主細胞における組換えタンパク質の産生は、当該技術分野においてよく知られている方法によって実行することができる。目的タンパク質のための産生プラットフォームとしてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）という商標で販売されている細胞の使用は、国際公開第００／６３４０３号パンフレットに記載されており、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本発明による結合分子を生産する方法は、本発明のさらなる態様である。特定の実施形態において、この方法は、ａ）本発明による宿主を、結合分子が発現しやすい条件下で培養する工程と、ｂ）任意選択で、発現した結合分子を回収する工程とを含む。発現した結合分子は、無細胞抽出物から回収することができるが、好ましくは、培地から回収される。上記の生産方法はまた、本発明の結合分子及び／又は免疫コンジュゲートの機能的変異体を生産するために使用することができる。結合分子などのタンパク質を無細胞抽出物又は培地から回収する方法は当業者にはよく知られている。上記の方法によって得られる結合分子、機能的変異体、及び／又は免疫コンジュゲートもまた本発明の一部である。
【００６３】
或いは、宿主細胞などの宿主での発現の次に、本発明の結合分子及び免疫コンジュゲートを、従来のペプチドシンセサイザーによる合成によって、又は本発明によるＤＮＡ分子に由来するＲＮＡ核酸を用いる無細胞翻訳系で生産することができる。上記の合成による生産方法又は無細胞翻訳系によって得られる結合分子及び免疫コンジュゲートも本発明の一部である。
【００６４】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つの結合分子、好ましくはヒトモノクローナル抗体、少なくとも１つのその機能的変異体、本発明による少なくとも１つの免疫コンジュゲート、及び／又はこれらの組み合わせを含む組成物を提供する。それに加えて、組成物は、とりわけ、アルブミン若しくはポリエチレングリコールなどの安定化分子又は塩を含んでもよい。使用される塩は、好ましくは、結合分子の望ましい生物学的活性を保持し、且つ望ましくない毒性効果を一切付与しない塩である。必要に応じて、本発明のヒト結合分子を、物質の内若しくは外にコーティングして、酸の作用、又は結合分子を不活化し得る他の天然若しくは非天然の条件から結合分子を保護することができる。
【００６５】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明で定義される少なくとも１つの核酸分子を含む組成物を提供する。組成物は、水溶液、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ又は上記の塩）を含む水溶液、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、及び／又は他の適切な成分を含み得る。
【００６６】
さらに、本発明は、本発明の少なくとも１つの結合分子、例えば、ヒトモノクローナル抗体（又はその機能的断片若しくは変異体）、本発明による少なくとも１つの免疫コンジュゲート、本発明による少なくとも１つの組成物、又はこれらの組み合わせを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体をさらに含む。薬学的に許容される賦形剤又は担体は当業者によく知られている。
【００６７】
特定の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの他の予防薬及び／又は治療薬を含む。このような薬剤は、結合分子、小分子、有機又は無機化合物、酵素、ポリヌクレオチド配列などであり得る。これらは、本発明の結合分子と組み合わせて使用することができる。本明細書における「組み合わせて」は、別個の製剤として、若しくは１つの単一の組み合わされた製剤として、同時に、又は別個の製剤として、逐次的な投与レジメンに従い、任意の順序で、であることを意味する。
【００６８】
特定の実施形態において、結合分子は、タウタンパク質の凝集を阻害及び／又は防止するために使用されるものである。
【００６９】
特定の実施形態において、結合分子は、医薬として使用するためのものであり、好ましくはＡＤなどの神経変性疾患の診断、治療、及び／又は予防処置に使用するためのものである。したがって、本発明の結合分子又はその断片は、脳内の病的タウの蓄積、又はタウ凝集を含む神経変性疾患を有する患者、例えば、ＡＤ、並びにタウが過剰発現し得る任意の他のタウオパチー又は他のタウ関連病変を患う患者の症状を治療、減少又は予防するために使用され得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明の結合分子は、病的タウ又はタウ凝集、したがって脳内のＰＨＦタウの量を低減又は消失させることにより、その有益な効果を発揮し得る。本発明の結合分子を使用して、任意の分類に属する動物患者を治療し得る。かかる動物の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ及び家畜が挙げられる。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、タウタンパク質凝集体の拡散を阻害及び／又は防止する方法である。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、患者におけるタウの凝集が関わる神経変性疾患の症状を治療又は低減する方法であり、この方法は、神経変性疾患の症状を治療又は低減するのに十分な時間にわたって本発明の結合分子の治療有効量を患者に投与することを含む。上記の実施形態のいずれにおいても、タウの凝集が関わる神経変性疾患はタウオパチーである。本明細書で使用されるとき、「タウオパチー」は、脳内におけるタウの病的凝集が関わる任意の神経変性疾患を包含する。家族性及び孤発性ＡＤに加えて、他の例示的なタウオパチーは、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維変化型老年期認知症（ｔａｎｇｌｅ  ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソニズム認知症複合、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルトヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソニズム、及び慢性外傷性脳症、例えば、拳闘家認知症（ボクサー病）である。（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ  ７０：４１０−２６，２０１１）。
【００７２】
タウオパチー関連行動表現型としては、認知障害、初期人格変化及び脱抑制、無関心、無為症、無言症、失行症、保続症、常同運動／行動、口愛過度、無秩序、逐次的な課題を計画したり又は取りまとめたりできないこと、利己的／冷淡、反社会的特性、共感の欠如、もたつき、高頻度の錯語的誤りを伴うが理解力は比較的保たれている失文法発話、理解力低下及び喚語困難、緩徐進行性歩行不安定性、後方突進、すくみ、頻繁な転倒、レボドパ不応性軸性硬直、核上性注視麻痺、矩形波眼球運動、緩徐な垂直性サッケード、仮性球麻痺、四肢の失行、ジストニー、皮質性感覚消失、及び振戦が挙げられる。
【００７３】
治療に適した患者には、ＡＤ又は他のタウオパチーのリスクがある無症候者、並びに現在症状を示している患者が含まれる。治療に適した患者には、ＡＤの家族歴又はゲノムにおける遺伝的リスク要因の存在など、ＡＤの既知の遺伝的リスクを有する者が含まれる。例示的リスク要因は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の、特に７１７位、並びに６７０位及び６７１位における変異（それぞれ、ハーディ型変異及びスウェーデン型変異）である。他のリスク要因は、プレセニリン遺伝子ＰＳ１及びＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４の変異、高コレステロール血症又はアテローム性動脈硬化症の家族歴である。現在ＡＤに罹患している者は、上記のリスク要因の存在による特徴的な認知症から認めることができる。加えて、ＡＤを有する者を特定するための幾つもの診断検査が利用可能である。それらには、脳脊髄液タウ及びＡβ４２レベルの測定が含まれる。タウレベルの上昇及びＡΒ４２レベルの低下はＡＤの存在を意味する。ＡＤ罹患者はまた、アルツハイマー病・関連障害協会（ＡＤ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の基準によって診断することができる。
【００７４】
本発明の抗タウ結合分子は、タウの病的凝集の蓄積が関わる神経変性疾患、例えばＡＤ又は他のタウオパチー若しくはタウ関連の病気を治療又は予防するための治療用薬剤及び予防用薬剤のいずれとしても好適である。無症候患者では、治療は任意の年齢（例えば、約１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳）で開始し得る。しかしながら、通常は、患者が約４０歳、５０歳、６０歳、又は７０歳に達するまで治療を開始する必要はない。治療は、一般的には、ある期間にわたって複数回の投薬を伴う。治療は、時間の経過に伴う治療用薬剤に対する抗体又は活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞応答をアッセイすることによってモニタし得る。応答が低下する場合、ブースター投薬が適応となる。
【００７５】
予防的適用においては、医薬組成物又は医薬は、ＡＤ又はタウが関わる他の病気に罹り易い、又はさもなければそのリスクがある患者に対し、疾患の生化学的、組織学的な及び／又は行動上の症状、その合併症、及び疾患の発症中に現れる中間的な病的表現型を含めた疾患のリスクを解消又は低減し、その重症度を軽減し、又はその発生を遅延させるのに十分な量で投与される。療法的適用においては、組成物又は医薬は、そうした疾患の疑いがあるか、又は既にそれに罹患している患者に対し、疾患の症状（生化学的、組織学的な及び／又は行動上の）のいずれかを低減し、抑え、又は遅延させるのに十分な量で投与される。療法薬の投与により、特徴的なアルツハイマーの病変を未だ発症していない患者における軽度認知障害が低減され、又は消失し得る。療法的又は予防的治療を達成するのに十分な量は、療法上又は予防上有効な用量として定義される。予防的レジーム及び療法的レジームの両方において、組成物又は医薬は、通常、十分な免疫応答が得られるまで数回の投薬で投与される。
【００７６】
本発明の抗タウ結合分子又はその断片は、関連する神経変性疾患の治療に有効な他の薬剤と併用して投与され得る。ＡＤの場合、本発明の抗体は、アミロイドβ（Ａβ）の沈着を低減又は予防する薬剤と併用して投与され得る。ＰＨＦタウ病変及びＡβ病変は相乗的である可能性がある。したがって、ＰＨＦタウ病変及びＡβ関連病変の両方の除去を同時に目的とする併用療法は、各々を個別に標的化するより有効であり得る。
【００７７】
パーキンソン病及び関連する神経変性疾患の場合、凝集形態のａ−シヌクレインタンパク質を除去するための免疫調節もまた、新たな療法である。タウ及びα−シヌクレインの両タンパク質の除去を同時に標的化する併用療法は、いずれかのタンパク質を個別に標的化するより有効であり得る。本発明の方法において、タウオパチーの治療又は症状の改善における結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片の「治療有効量」は、標準的な研究手法によって決定し得る。例えば、抗体の投薬量は、当該技術分野においてよく知られている関連性のある動物モデルにその薬剤を投与することによって決定し得る。
【００７８】
加えて、任意選択でインビトロアッセイを用いて最適な投薬量範囲の特定を補助し得る。特定の有効用量の選択は、当業者が（例えば臨床試験によって）幾つかの要因を考慮して決定し得る。かかる要因としては、治療又は予防しようとする疾患、関わる症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者に知られている他の要因が挙げられる。製剤中に用いられる正確な用量はまた、投与経路、及び疾患の重症度にも依存することになり、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から推定することができる。本発明の結合分子の療法的使用に対する投与方法は、その薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。これらの結合分子の医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、又は頭蓋内投与に有用であり、或いは脳又は脊椎の脳脊髄液に投与することもできる。
【００７９】
治療は、単回投与スケジュールで与えられても、又は複数回投与スケジュールとして与えられてもよく、複数回投与スケジュールでは、主要な治療コースは１〜１０回の別個の投与と、続いて応答の維持及び／又は強化に必要な時間間隔後に、例えば２回目の用量について１〜４ヵ月の時点で与えられる他の投与、及び必要であれば数ヵ月後のその後の投与を含むものであり得る。好適な治療スケジュールの例としては、以下が挙げられる：（ｉ）０、１ヵ月、及び６ヵ月、（ｉｉ）０、７日、及び１ヵ月、（ｉｉｉ）０及び１ヵ月、（ｉｖ）０及び６ヵ月、又は疾患症状を低減し、若しくは疾患の重症度を低減すると予想される所望の応答を誘発するのに十分な他のスケジュール。したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍｌの滅菌緩衝用水と、約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体とを含有するように調製し得る。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル溶液と、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体とを含有するように構成し得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法はよく知られており、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにさらに詳細に記載されている。
【００８０】
本発明の結合分子は、保存のため凍結乾燥し、使用前に好適な担体中に再構成することができる。この手法は、抗体及び他のタンパク質製剤で有効であることが示されており、当該技術分野において知られている凍結乾燥及び再構成手法を用いることができる。
【００８１】
特定の実施形態において、結合分子は、対象におけるＡＤ又は他のタウオパチーを診断する方法で使用され得る。この方法には、本発明の抗体又はその断片などの診断用試薬を使用してタウの存在を対象において検出することが関わる。タウは、対象からの生体試料（例えば、血液、尿、脳脊髄液）において、その生体試料を診断用抗体試薬と接触させて、対象からの試料中のＰＨＦタウに対する診断用抗体試薬の結合を検出することにより検出し得る。検出を実施するためのアッセイには、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又は生体内イメージングなどのよく知られた方法が含まれる。
【００８２】
診断は、対象からの試料又は対象における標識されたタウの数、サイズ、及び／若しくは強度、タウの蓄積、タウの凝集、並びに／又は神経原線維変化を対応するベースライン値と比較することによって行われ得る。ベースライン値は、無疾患者の集団の平均レベルに相当し得る。ベースライン値はまた、同じ対象で測定された以前のレベルに相当してもよい。
【００８３】
上記の診断方法はまた、対象における治療前、治療中又は治療後のタウの存在を検出することにより、療法に対する対象の反応のモニタリングにも用いることができる。ベースラインと比較した値の変化が治療反応性を示す。値はまた、病的タウが脳から除去されていくにつれ、生体液中で一時的に変化することもある。
【００８４】
本発明は、さらに、上述の診断及びモニタリング方法を実施するためのキットを対象とする。通常、かかるキットは、本発明の結合分子などの診断用試薬と、任意選択で検出可能標識とを含む。診断用結合分子、例えば抗体、それ自体が、直接検出可能な、又は二次的反応（例えば、ストレプトアビジンとの反応）を介して検出可能な検出可能標識（例えば、蛍光分子、ビオチンなど）を含んでもよい。或いは、検出可能標識を含有する第２の試薬を利用してもよく、ここで、この第２の試薬は一次抗体に対して結合特異性を有する。生体試料中のタウの測定に好適な診断キットにおいて、キットの抗体は、マイクロタイターディッシュのウェルなどの固相に予め結合して供給されてもよい。
【００８５】
実施例において本発明をさらに説明するが、それらは決して本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１
発明の新規な抗体の調製
ヒトＩｇＧ１抗体を、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域をクローニングすることにより、ＩｇＧ定常領域を含む単一の発現ベクターへと構成した。ヒト抗タウｍＡｂｓに対応する配列をコードするプラスミドを、一時的に、ヒト胎児腎臓２９３由来のＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）にトランスフェクトし、トランスフェクションの７日後、発現した抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーにより培養培地から精製した。ＩｇＧを、ｐＨ３．５の１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液でカラムから溶離し、これを、セルフパックＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳへと直ちに緩衝液交換した。各抗体を、多角度光散乱法（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）に加えて、ＳＤＳページ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより品質管理し、さらに、同族タウペプチドに対する反応性を、Ｏｃｔｅｔ  ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙにより確認した。
【００８７】
実施例２
同族タウペプチドＶ１０８９−２４に対する、抗体のＯｃｔｅｔ  Ｂｉｏｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙベースの会合及び解離プロファイル
アミノ酸配列
【化１】
2021512602.tif 000002
を含むタウペプチドＶ１０８９−２４を、Ｎ末端ビオチンを介してストレプトアビジンバイオセンサに結合させた。本発明の抗体（１００ｎＭ）を含有する溶液にセンサーを浸漬した後に会合（０〜６００秒）が起こった一方で、タンパク質複合体を含むセンサーをキネティクス緩衝液へと移動させた後に解離（６００〜１２００秒）が起こった。これらの実験のために使用する緩衝液を、ＰＢＳで１０Ｘ「Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ’ｓ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ」を１０倍希釈することにより得た。親和性の改善は、波長（ｎｍ）の大きな変化及び／又はより低速な解離反応速度により確認する。
【００８８】
結果を、図１に示す。示されているとおり、本発明の新規な結合分子が、以前に説明された抗体ＣＢＴＡＵ  ２２．１（国際公開第２０１５／１９７８２３号パンフレット）と比較して、タウペプチド（配列番号９）に対する結合プロファイルが改善されていることを示した。このことは、より高い分率の抗体分子が、定常状態条件、及び新規な結合分子がかなり長い時間タウに結び付いたままであることを示すより低速の解離反応速度下でタウに結合されることを示す、会合時の著しく大きい波長シフトにより明示された。
【００８９】
実施例３
抗体がＡＤ脳ホモジネートの種を枯渇させる能力
ホモジネート含有タウ種を、凍結保存されたヒトＡＤ脳組織から生成した。
免疫枯渇アッセイにおいて、種を、試験抗体を用いてインキュベートし、Ｇタンパク質Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いて溶液から除去した。枯渇させた上澄み（「免疫枯渇させた画分」と命名）を、発色団−Ｋ１８含有ＨＥＫ２９３細胞中での残留シーディング能力に関して試験し、フローサイトメトリーにより分析した。
【００９０】
ＦＲＥＴバイオセンサ細胞は、Ｋ１８／Ｐ３０１Ｓ−ＣＦＰ及びＫ１８／Ｐ３０１Ｓ−ＹＦＰを安定して発現するＨＥＫ細胞であり、９６ウェルプレート形式で平板培養される。免疫枯渇させた画分を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と共に画分を予備混合することにより細胞中でトランスフェクトしてアッセイウィンドウを増大させ、レシピエントＦＲＥＴバイオセンサセル上で２日間インキュベートし、この後に、細胞をトリプシン処理し、ＦＲＥＴ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリーにより定量化した。ＦＲＥＴ信号は、Ｋ１８レポータータンパク質が凝集体を形成する場合、したがってＣＦＰ及びＹＦＰが近接している場合にのみ測定できる。ＣＦＰを励起させたときに、エネルギーは、ＹＦＰ蛍光発光を生じさせるＹＦＰに伝達する（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，ＰＮＡＳ，１１１，Ｅ４３７６−Ｅ４３８５）。
【００９１】
種：
凍結保存された脳組織を、バイオバンク（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）から取得した。凍結した脳組織を、ダウンス型ホモジナイザーを用いて、均質化緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５５６７−０２７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２４７４０−０１１）、ｐＨ７．４、フィルター：０．２２μｍ＋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１  ８３６  １７０  ００１））で、１０００ｒｐｍにて１０回ストロークすることにより均質化して、１０％ｗ／ｖのホモジネートを得た。ホモジネートを、２７．０００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離し、上澄みを、免疫枯渇アッセイにおいて種として使用するまで、−８０℃で、一定分量保存した。
【００９２】
アッセイ手順：
６６０ｎＭの抗体稀釈液を、以下に記載される抗体−種−ビーズミックス中で３００ｎＭの最終濃度を得るように、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８５３７）中に調製した。種を、ＰＢＳ中で１．３倍に希釈して、３００ｎＭの抗体濃度で完全な枯渇を達成し、適正なシーディングウィンドウを維持した。抗体及び種の稀釈液を、１：１の比率で、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＢ−０６００）中で混合し、ビーズを洗浄するまでインキュベートした。
【００９３】
ウェル当たり、１２１．５μｌのＧタンパク質ＤｙｎａＢｅａｄｓ懸濁液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１０００４Ｄ）を、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＢ−０６００）に添加し、ビーズから緩衝液を除去し、ビーズをＰＢＳ中で０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ１３７９）と共に再懸濁することができるように、磁石（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１２３．３１Ｄ）を用いてビーズを引き下げることにより２回洗浄した。洗浄緩衝液を完全に除去し、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０μｌのＰＢＳを、各ウェルのビーズに添加し、ウェル当たり９０μｌの１：１抗体−種混合物を添加した。抗体−種−ビーズミックスは、ビーズがＰＣＲプレートのプラスチックに付くことを防止するように、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含むべきである。
【００９４】
抗体−種−ビーズミックスを、５ｒｐｍで回転しながら、終夜４℃でインキュベートした。次の日、凝縮体を、３０００ｒｐｍで、おおよそ２０秒間遠心分離することにより、蓋から除去した。免疫枯渇させた画分を、磁石を用いてビーズをプルダウンすることによりビーズから分離し、新しい９６ウェルＰＣＲプレートに移動させて、シーディング能力を残すために、ＦＲＥＴバイオセンサセル上で試験するまで−８０℃で保存した。ビーズを、上記したように２回洗浄し、−２０℃で、ＰＣＲプレートに乾式保存した。各条件を２通り試験した。
【００９５】
免疫枯渇させた画分を、ＦＲＥＴバイオセンサセルへと逆にトランスフェクトし：ウェル当たり１０μｌの免疫枯渇させた画分を、９６ウェルプレート（ポリＤリジンで予めコーティングされているμｃｌｅａｒプレート；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５９４６）に添加した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０５８−０２１）で４０倍に希釈した１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８−０２７）を添加し、この混合液をプレート中で１０分間インキュベートした。１ウェル当たり、５５，０００個のＦＲＥＴバイオセンサセルを、１３０μｌのＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１０％（ｖ／ｖ）の加熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ、カタログ番号Ｓ１８１０−５００）が補われたピルベート（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９６６−０２１）、及び１％のＰｅｎｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４３３３）に添加した。３７℃で２日間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８５３７）で２回洗浄し、その後に、それらを５０μｌ／ウェルの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５３００−０５４）で、３７℃で５分間かけて剥離した。細胞を、繰り返し上下にピペッティングすることにより再懸濁し、顕微鏡で単一細胞を視覚的に確認した。３０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ８２６４）、１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５７５−０３８）、１％のＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、カタログ番号Ｓ１８１０−５００））を、５０μｌの細胞懸濁液を添加したポリプロピレン丸底プレート（ＭＷ３８４；Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６５７）に添加した。細胞を、フローサイトメトリーによりＦＲＥＴ陽性に関して分析した。
【００９６】
図２に示されるように、前記した抗体ＣＢＴＡＵ−２２．１は、シーディング効率を、この実験で使用した抗体の最も高い濃度に対する初期値の３０％まで低下させることにより表されるような用量依存的様式で、ＡＤ脳からＰＨＦを枯渇させることが可能である。驚くべきことに、本発明の新規な抗体は、著しく高いＰＨＦ枯渇効力を示す。これは、用量依存的効果が急峻であり、実験で使用した最も高い抗体濃度でシーディングが事実上無効化されるという事実により表される。これらの観察により、親分子よりもＡＤ脳からのＰＨＦ種を無効化するこれらの抗体の能力が、非常に向上したことが示される。
【００９７】
配列：
【００９８】
【表１】
2021512602.tif 000003
【００９９】
重鎖可変領域ＣＢＴＡＵ−２２．１（配列番号１３）
【化２】
2021512602.tif 000004
【０１００】
軽鎖可変領域ＣＢＴＡＵ−２２．１（配列番号１４）
【化３】
2021512602.tif 000005
【０１０１】
重鎖可変領域［Ｓ５２Ｒ］（配列番号１５）
【化４】
2021512602.tif 000006
【０１０２】
軽鎖可変領域［Ｓ５２Ｒ］（配列番号１４）
【化５】
2021512602.tif 000007
【０１０３】
重鎖可変領域Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ５２Ｒ［ＶＨ］（配列番号１６）
【化６】
2021512602.tif 000008
【０１０４】
軽鎖可変領域Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ５２Ｒ［ＶＨ］（配列番号１４）
【化７】
2021512602.tif 000009
【０１０５】
重鎖可変領域Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ５２Ｒ［ＶＨ］；Ｑ２７Ｒ［ＶＬ］（配列番号１６）
【化８】
2021512602.tif 000010
【０１０６】
軽鎖可変領域Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ５２Ｒ［ＶＨ］；Ｑ２７Ｒ［ＶＬ］（配列番号１７）
【化９】
2021512602.tif 000011
【０１０７】
重鎖可変領域Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｐ５３Ｒ［ＶＨ］；Ｑ２７Ｒ［ＶＬ］（配列番号１８）
【化１０】
2021512602.tif 000012
【０１０８】
軽鎖可変領域Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｐ５３Ｒ［ＶＨ］；Ｑ２７Ｒ［ＶＬ］（配列番号１７）
【化１１】
2021512602.tif 000013
【０１０９】
重鎖可変領域Ｓ３０Ｒ［ＶＨ］；Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ５２Ｒ［ＶＨ］（配列番号１９）
【化１２】
2021512602.tif 000014
【０１１０】
軽鎖可変領域Ｓ３０Ｒ［ＶＨ］；Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ５２Ｒ［ＶＨ］（配列番号１４）
【化１３】
2021512602.tif 000015
【０１１１】
重鎖可変領域Ｓ３０Ｒ［ＶＨ］；Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｐ５３Ｒ［ＶＨ］（配列番号２０）
【化１４】
2021512602.tif 000016
【０１１２】
軽鎖可変領域Ｓ３０Ｒ［ＶＨ］；Ｎ３３Ｆ［ＶＨ］；Ｐ５３Ｒ［ＶＨ］（配列番号１４）
【化１５】
2021512602.tif 000017
【０１１３】
タウタンパク質２Ｎ４Ｒ（配列番号２１）：
【化１６】
2021512602.tif 000018
【０１１４】
タウペプチドＶ１０８９−２４（配列番号９）：
【化１７】
2021512602.tif 000019
【図１】
2021512602.tif 000020
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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