(57)【要約】  成分（ａ）：一般式（Ｉ）    （Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）（式中、  ｎは１〜１２から選択され、  ｍは０〜５０から選択され、  Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、  Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、  Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、  ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、  Ａ−は無機または有機対アニオンである）による少なくとも１種の塩、  成分（ｂ）：ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される少なくとも１種の酵素、  ならびに  任意に成分（ｃ）：成分（ａ）とは異なる酵素安定剤、保存剤および界面活性剤から選択される少なくとも１種の化合物を含有する、液体酵素調製物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分（ａ）：一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０〜５０から選択され、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルおよびフェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
による少なくとも１種の塩、
成分（ｂ）：ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素、
ならびに
任意に成分（ｃ）：成分（ａ）とは異なる酵素安定剤、保存剤ならびに好ましくは非イオン性、両性およびアニオン性界面活性剤から選択される界面活性剤から選択される少なくとも１種の化合物
を含有する、液体酵素調製物。
【請求項２】
成分（ａ）がハロゲン化物イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、乳酸イオンおよびメタンスルホン酸イオンから選択される対イオンを有する、請求項１に記載の酵素調製物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）による化合物のＲ２がすべてメチルである、請求項１または２に記載の酵素調製物。
【請求項４】
前記酵素調製物の総質量に対して０．１〜３０質量％の範囲の量で成分（ａ）を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項５】
成分（ａ）が、不純物として化合物（ａ’）：
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−ＯＨ    Ｒ１−ＣＯＯ−      （ａ’）
（式中、変数Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、ｎおよびｍは対応する成分（ａ）のものと同じである）
を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項６】
ホウ素含有化合物およびペプチドアルデヒドから選択される少なくとも１種の酵素安定剤を含む成分（ｃ）を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項７】
少なくとも
成分（ａ）：一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０〜５０から選択され、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
の化合物である少なくとも１種の塩
ならびに
成分（ｂ）：ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素
を混合する工程を含む、酵素調製物を製造するための方法。
【請求項８】
ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素を、一般式（Ｉ）、
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０〜５０から選択され、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
の少なくとも１種の塩を添加する工程によって、液体酵素調製物中で安定化する方法。
【請求項９】
前記酵素が、好ましくは非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤およびアニオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種の界面活性剤の存在下で安定化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）、
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０〜５０から選択され、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
の少なくとも１種の塩を、ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素の添加剤として使用する方法であって、前記塩および前記酵素が固体であり、前記酵素の安定化が、前記塩および前記酵素が少なくとも１種の溶媒と接触するときに生じる、方法。
【請求項１１】
洗剤配合物に配合される請求項１〜６に記載の液体酵素調製物を使用する方法であって、請求項１〜６に記載の酵素調製物が１または複数の工程で１種または複数の洗剤成分と混合される、方法。
【請求項１２】
成分（ａ）：一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０〜５０から選択され、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
による少なくとも１種の塩、
成分（ｂ）：ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素、
任意に成分（ｃ）：好ましくは上記で開示されるホウ素含有化合物から選択される、より好ましくは上記で開示されるフェニルボロン酸（ＰＢＡ）またはその誘導体から選択される、最も好ましくは４−ホルミルフェニルボロン酸（４−ＦＰＢＡ）である、成分（ａ）とは異なる少なくとも１種の酵素安定剤、ならびに
少なくとも１種の洗剤成分
を含む、洗剤配合物。
【請求項１３】
脂肪を含む染みを除去するための方法であって、染みを請求項１２に記載の洗剤配合物と接触させる工程を含み、前記洗剤配合物の成分（ｂ）に含まれる少なくとも１種の酵素が、好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）の群からの少なくとも１種のリパーゼ（ＥＣ３．１．１）を含む、方法。
【請求項１４】
染みが温度≦４０℃で布地から除去される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、
成分（ａ）：一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０〜５０から選択され、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
による少なくとも１種の塩、
成分（ｂ）：ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される少なくとも１種の酵素
ならびに
任意に成分（ｃ）：成分（ａ）とは異なる酵素安定剤および界面活性剤から選択される少なくとも１種の化合物
を含有する、酵素調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は通常、多くの場合発酵ブロス由来の液体濃縮物として商業的に生産される。酵素は水性環境中に残存すると不安定になりやすいため、従来では無水物の形態に変換される。水性濃縮物は、例えば担体物質の存在下で凍結乾燥または噴霧乾燥され、凝集物を形成し得る。通常、固形の酵素製品は使用前に「溶解」する必要がある。酵素を液体製品中で安定化するために、酵素阻害剤、好ましくは可逆的酵素阻害剤を用いて、酵素阻害剤が遊離するまで酵素活性を一時的に阻害することが公知である。
【０００３】
ホウ酸およびボロン酸は、タンパク質分解酵素を可逆的に阻害することが公知である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１、１９８３年、５〜３２頁には、ボロン酸による、セリンプロテアーゼの一種であるサブチリシンの阻害についての考察が提供されている。この阻害剤は再活性化のために適用前または適用中に除去する必要があり、これは例えば希釈によって行うことができる。
【０００４】
さらに、脂肪分解酵素の安定性は、ボロン酸誘導体などの安定化物質を添加することにより、脂肪分解酵素の活性部位と可逆的に複合体を形成することで向上することが公知である（例えば、ＥＰ０４７８０５０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＥＰ０４７８０５０
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１、１９８３年、５〜３２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
環境への配慮のために、酵素の安定化に使用されるホウ素含有化合物の量を少なくとも低減することへの要求が存在する。酵素の存在下で酵素安定剤として使用するための代替物が探求されている。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、代替的な酵素安定剤を提供することに関する。本発明のさらなる目的は、含水量が高いまたは低い、いずれの場合もその中に含有される酵素に関する貯蔵寿命が優れた配合物に、調整可能に配合することができる酵素調製物を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この課題は、以下の一般式（Ｉ）：
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０〜５０から選択され、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
による少なくとも１種の塩を酵素安定剤として使用することによって解決される。
【００１０】
本発明の酵素安定剤は、好ましくはヒドロラーゼ（ＥＣ３）の群から選択される酵素を安定化する。酵素名は、国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会の推奨に基づき、当業者に公知である。酵素名は、ＥＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ；酵素委員会）番号、推奨名、代替名（存在する場合）、触媒活性および他の要素を含む。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｃｓ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ３／の最終更新日２０１７年３月１２日バージョンを参照されたい。
【００１１】
一実施形態では、少なくとも１種のヒドロラーゼは、エステル結合に作用する酵素（ＥＣ３．１）、グリコシラーゼ（ＥＣ３．２）およびペプチダーゼ（ＥＣ３．４）の群から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、
成分（ａ）：一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０〜５０から選択され、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
による少なくとも１種の塩、
成分（ｂ）：好ましくはヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される少なくとも１種の酵素
ならびに
任意に成分（ｃ）：成分（ａ）とは異なる酵素安定剤および界面活性剤から選択される少なくとも１種の化合物
を含有する、液体酵素調製物を提供する。
【００１３】
本発明の酵素調製物は、２０℃および１０１．３ｋＰａで液体であってもよい。一実施形態では、液体は、２０日間の保存後であっても沈殿物の形成や混濁の痕跡を示さない酵素調製物を意味する。
【００１４】
成分（ａ）
塩（成分（ａ））は、コリンの有機エステルの、またはコリンの誘導体の塩である。塩（成分（ａ））のアニオン（対イオン）は、無機であっても有機であってもよいが、有機であることが好ましい。塩（成分（ａ））の無機対イオンの例は、硝酸イオン、水酸化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオンおよびハロゲン化物イオン、例えば臭化物イオンまたは塩化物イオンである。ハロゲン化物イオン、特に塩化物イオンならびに硫酸イオン、炭酸イオンおよび炭酸水素イオンが好ましい。有機対イオンの例は、乳酸イオン、酢酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオンおよびＣＨ３ＳＯ３−（メタンスルホン酸イオン）である。二価または三価の対イオンを含む実施形態では、それぞれのモル量のカチオンが存在する。
【００１５】
塩（成分（ａ））の窒素原子は、３個のメチル基およびヒドロキシエチル基を有する。本発明の文脈で使用されるコリンの誘導体という用語は、少なくとも１個のメチル基以外のアルキル基または２−ヒドロキシエチル基以外のヒドロキシアルキル基またはさらなるアルコキシ基を有する化合物を指す。
【００１６】
より詳細には、成分（ａ）は一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２、例えば１〜９、好ましくは１、２、３または４から選択され、さらにより好ましくはｎは１であり、
ｍは０〜５０、例えば２〜５０から選択され、１０〜２５であることが好ましいが、最も好ましくはｍは０であり、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよい。Ｒ１の好ましい例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ヘキシルなどの非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、好ましい非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルはメチルおよびエチルであり、さらに−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ３、（Ｅ）−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、（Ｚ）−ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、−Ｃ６Ｈ５、パラ−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４−、ｏ、ｐ−ジヒドロキシフェニルおよび３，４，５−トリヒドロキシフェニルなどの置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。好ましい実施形態では、Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１は一緒になってクエン酸を構成する。さらにより好ましくは、Ｒ１はメチルであり、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、フェニルおよびＣ１〜Ｃ１０アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ネオペンチル、１，２−ジメチルプロピル、イソアミル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、２−ｎ−プロピル−ヘプチルまたはイソデシルから選択され、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、より好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、さらにより好ましくは少なくとも２個のＲ２基がＣＨ３であり、３個目のＲ２が直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキルから選択され、最も好ましくはすべてのＲ２が同じでありメチルであり、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、好ましくはｎ−、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピルおよびｎ−ブチルであり、さらにより好ましくはＲ３とＲ４はいずれも水素である。別の実施形態では、Ｒ３はＣ１〜Ｃ４アルキルでありＲ４は水素であり、好ましくはＲ３はメチルでありＲ４は水素であり、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレン、例えば−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）３−、ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−または−（ＣＨ２）４−であり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである。塩（成分（ａ））の無機対イオンの例は、硫酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオンおよびハロゲン化物イオン、例えば臭化物イオンまたは塩化物イオンである。ハロゲン化物イオン、特に塩化物イオンならびに硫酸イオン、炭酸イオンおよび炭酸水素イオンが好ましい。有機対イオンの例は、乳酸イオン、酢酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオンおよびＣＨ３ＳＯ３−（メタンスルホン酸イオン）である。）
の化合物である。
【００１７】
成分（ａ）は界面活性剤ではない。一実施形態では、水１０００ｇ中５ｇの成分（ａ）溶液の、２０℃および１０１．３ｋＰａでの動的表面張力は＞４５ｍＮ／ｍである。水１０００ｇ中の５ｇの成分（ａ）溶液の、２０℃および１０１．３ｋＰａでの動的表面張力は≧５０ｍＮ／ｍであってもよい。
【００１８】
動的表面張力は、毛細管によって液体中に形成される気泡の最大内圧が測定される泡圧張力計で測定されてもよい。測定値は通常、気泡が形成し始めてから最大圧が生じるまでの時間である、特定の表面寿命における表面張力に相当する。一実施形態では、泡圧張力計を用いて２０℃および１０１．３ｋＰａで動的表面張力を測定したときの表面寿命は５０ｍｓである。
【００１９】
塩（成分（ａ））の最も好ましい例は、対イオンとして酒石酸イオンまたはクエン酸イオンを含むコリンエステルの塩ならびにアセチルコリン、クエン酸コリンの塩および酒石酸コリンの塩、例えば乳酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩である。
【００２０】
対アニオンＡ−が硫酸イオン、酒石酸イオン、炭酸イオンなどの二価またはリン酸イオンもしくはクエン酸イオンなどの多価である、またはそれらであってもよい実施形態では、必要な正電荷は別の塩（成分（ａ））に由来するカチオンによって、あるいはカリウムもしくは好ましくはナトリウムなどのアルカリ金属カチオンによって、あるいは非置換の、またはＣ１〜Ｃ４アルキルで、および／もしくは２−ヒドロキシエチルで置換されたアンモニウムによって供給されてもよい。
【００２１】
Ｒ１が１個または複数のカルボキシル基を有する実施形態では、それらは遊離ＣＯＯＨ基であってもよく、またはアルカリ、例えばカリウムもしくは特にナトリウムで部分的にまたは完全に中和されてもよく、または例えば（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎ−（Ｏ−Ｘ）ｍ−ＯＨでエステル化されてもよい。そのような実施形態では、妥当な場合、それぞれのジまたはトリカルボキシル酸のジまたはトリエステルが生じる。例えば、酒石酸またはクエン酸のモノおよびジエステルの混合物ならびにクエン酸のジおよびトリエステルの混合物も適用可能である。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、塩（成分（ａ））は、式（ＩＩ）
（ＣＨ３）３Ｎ＋−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５      （Ａ１）−      （ＩＩ）
（式中、（Ａ１）−はメタンスルホン酸塩、酒石酸塩およびクエン酸塩から選択され、
Ｒ５は−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）（ＣＯＯＸ２）−ＣＨ２−ＣＯＯＸ２および−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯＯＸ１から選択され、
Ｘ１は水素、アルカリ金属、特にナトリウム、および（ＣＨ３）３Ｎ＋−（ＣＨ２）２−から選択され、
Ｘ２は同じであるかまたは異なり、水素、アルカリ金属、特にナトリウム、および（ＣＨ３）３Ｎ＋−（ＣＨ２）２−から選択される）
による化合物である。好ましい実施形態では、Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５のエステル基および（Ａ１）−は互いに対応する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、液体酵素調製物は、成分（ａ）を、酵素調製物の総質量に対して０．１質量％〜３０質量％の範囲の量で含有する。酵素調製物は、成分（ａ）を、いずれも酵素調製物の総質量に対して０．１質量％〜１５質量％、０．２５質量％〜１０質量％、０．５質量％〜１０質量％、０．５質量％〜６質量％または１質量％〜３質量％の範囲の量で含有してもよい。
【００２４】
本発明の一実施形態では、塩（成分（ａ））は、不純物として以下の化合物（ａ’）を含有する：
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−ＯＨ      Ｒ１−ＣＯＯ−
（式中、変数Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、ｎおよびｍは対応する塩（成分（ａ））のものと同じである）。前記不純物の量は、塩（成分（ａ））の最大５０モル％、好ましくは０．１〜２０モル％、さらにより好ましくは１〜１０モル％であってもよい。不純物である化合物（ａ’）は、塩（成分（ａ））の合成から生じてもよく、精製法によって除去されてもよいが、除去することは好ましくない。
【００２５】
成分（ｂ）
本発明の一態様では、成分（ｂ）に含まれる少なくとも１種の酵素は液体酵素濃縮物の一部である。本明細書において、「液体酵素濃縮物」は、少なくとも１種の酵素を含む、任意の液体酵素含有生成物を意味する。酵素濃縮物の文脈における「液体」は、２０℃および１０１．３ｋＰａでの物理的外観に関する。
【００２６】
液体酵素濃縮物は、固体酵素を溶媒に溶解することによって生じてもよい。溶媒は、水および有機溶媒から選択されてもよい。固体酵素を溶媒に溶解することによって生じる液体酵素濃縮物は、最大で飽和濃度の量の酵素を含んでもよい。
【００２７】
本明細書において、溶解は、固体化合物が少なくとも１種の溶媒と接触することによって液化されることを意味する。溶解は、相分離が生じることなく特定の溶媒で飽和濃度に達するまでの、固体化合物の完全な溶解を意味する。
【００２８】
本発明の一態様では、得られる酵素濃縮物の成分（ｂ）は水を含まなくてもよく、これは有意量の水が存在しないことを意味する。本明細書において、非有意量の水は、酵素調製物が、いずれも酵素濃縮物の総質量に対して、２５質量％未満、２０質量％未満、１５質量％未満、１０質量％未満、７質量％未満、５質量％未満、４質量％未満、３質量％未満、２質量％未満の水を含むこと、または水を含まないことを意味する。
【００２９】
一実施形態では、本発明の酵素調製物は、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、ジグリコール、プロピルジグリコール、ブチルジグリコール、ヘキシレングリコール、エチレングリコールメチルエーテル、エチレングリコールエチルエーテル、エチレングリコールプロピルエーテルおよびフェノキシエタノール、好ましくはエタノール、イソプロパノールまたはプロピレングリコールから選択される少なくとも１種の有機溶媒を含む。さらに、本発明の酵素調製物は、２−ブトキシエタノール、イソプロピルアルコールおよびｄ−リモネンなどの化合物から選択される少なくとも１種の有機溶媒を含んでもよい。
【００３０】
水を含む液体酵素濃縮物は、「水性酵素濃縮物」と呼ばれてもよい。水性酵素濃縮物は、固体酵素生成物が水に溶解した酵素含有溶液であってもよい。一実施形態では、「水性酵素濃縮物」は発酵による酵素の生成から生じる酵素含有生成物を意味する。
【００３１】
発酵は、所望の酵素を発現する組換え細胞を好適な栄養培地で培養し、組換え宿主細胞を成長させ（このプロセスを発酵と呼んでもよい）、所望のタンパク質を発現させるプロセスを意味する。通常、発酵の終了時に液体画分および固体画分を含む発酵ブロスが収集されてさらに処理される。酵素が液体画分に分泌されているか否かにかかわらず、所望のタンパク質または酵素を、発酵ブロスの液体画分または細胞ライセートから回収してもよい。所望の酵素の回収では、当業者に公知の方法が使用される。タンパク質または酵素を発酵ブロスから回収するための好適な方法は、これらに限定されないが、収集、遠心分離、濾過、抽出および沈殿を含む。
【００３２】
液体酵素濃縮物は、いずれも酵素濃縮物の総質量に対して０．１質量％〜４０質量％または０．５質量％〜３０質量％または１質量％〜２５質量％または３質量％〜２５質量％または５質量％〜２５質量％の範囲の量の酵素を含んでもよい。一実施形態では、液体酵素濃縮物は発酵によって生じ、水性である。
【００３３】
発酵によって生じる水性酵素濃縮物は、水を、いずれも酵素濃縮物の総質量に対して、約５０質量％より多い、約６０質量％より多い、約７０質量％より多い、または約８０質量％より多い量で含んでもよい。発酵によって生じる水性酵素濃縮物は、発酵培地に由来する塩、生成宿主細胞に由来する細胞デブリ、発酵時に生成宿主細胞によって生成される代謝物などの残留成分を含んでもよい。一実施形態では、残留成分は、いずれも水性酵素濃縮物の総質量に対して、３０質量％未満、２０質量％未満、１０質量％未満または５質量％未満の量で液体酵素濃縮物に含まれてもよい。
【００３４】
成分（ｂ）に含まれる少なくとも１種の酵素はヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択され、以下、酵素（成分（ｂ））とも称される。好ましい酵素（成分（ｂ））は、エステル結合に作用する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１）、グリコシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２）およびペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）の群から選択される。エステル結合に作用する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１）は、以下、それぞれリパーゼ（成分（ｂ））とも称される。グリコシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２）は、以下、アミラーゼ（成分（ｂ））とセルラーゼ（成分（ｂ））のいずれかとも称される。ペプチダーゼは、以下、プロテアーゼ（成分（ｂ））とも称される。
【００３５】
本発明の文脈におけるヒドロラーゼ（成分（ｂ））は、ポリペプチド配列（本明細書ではアミノ酸配列とも呼ばれる）によって識別される。ポリペプチド配列は酵素の「活性部位」を含む三次元構造を特定し、この構造がひいては酵素の触媒活性を決定する。ポリペプチド配列は、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）による配列番号によって識別されてもよく、ここでアミノ酸は最初の文字を大文字とする３文字コード、または対応する１文字を使用して表される。
【００３６】
本発明による酵素（成分（ｂ））は、いずれも酵素活性を有する親酵素および／またはバリアント酵素に関する。酵素活性を有する酵素は、酵素的に活性であるまたは酵素変換を行う、つまり酵素は基質に作用してそれらを生成物に変換する。本明細書において、「酵素」という用語は酵素の不活性バリアントを除外する。
【００３７】
「親」配列（親タンパク質または酵素のもの、「親酵素」とも呼ばれる）は、配列に変化を導入し（例えば、１個または複数のアミノ酸置換、挿入、欠失またはそれらの組合せを導入することによって）、親配列の「バリアント」を生じるための開始配列である。親酵素（または親配列）という用語は、野生型酵素（配列）および（さらなる）変化を導入するための開始配列として使用される合成によって発生した配列（酵素）を含む。
【００３８】
「酵素バリアント」または「配列バリアント」または「バリアント酵素」という用語は、その親酵素と、そのアミノ酸配列がある程度異なる酵素を指す。別様に示されない限り、「酵素活性を有する」バリアント酵素とは、このバリアント酵素がそれぞれの親酵素と同じタイプの酵素活性を有することを意味する。
【００３９】
本発明のバリアントについて記載する上で、以下の通り記載される命名法が使用される。
【００４０】
アミノ酸置換は、親酵素の元のアミノ酸、続いてアミノ酸配列内の位置数、続いて置換されたアミノ酸を示すことによって記載される。
【００４１】
アミノ酸欠失は、親酵素の元のアミノ酸、続いてアミノ酸配列内の位置数、続いて＊を示すことによって記載される。
【００４２】
アミノ酸挿入は、親酵素の元のアミノ酸、続いてアミノ酸配列内の位置数、続いて元のアミノ酸および付加されたアミノ酸を示すことによって記載される。例えば、グリシンに隣接するリシンの１８０位における挿入は、「Ｇｌｙ１８０ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１８０ＧＫ」と表記される。
【００４３】
置換と挿入が同じ位置で起こる場合、Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ９９Ａまたは簡潔にＳ９９ＡＤと示されてもよい。既存のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法において縮重が生じることは明らかである。例えば、上記の例においてグリシンがグリシンの後に挿入される場合、Ｇ１８０ＧＧと示される。
【００４４】
１つの位置に様々な変更が導入される場合、様々な変更はカンマで分けられ、例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ」は１７０位におけるアルギニンのチロシンまたはグルタミン酸での置換を表す。あるいは、様々な変更または任意選択の置換はカッコで示されてもよい、例えばＡｒｇ１７０［Ｔｙｒ、Ｇｌｙ］もしくはＡｒｇ１７０｛Ｔｙｒ、Ｇｌｙ｝、または簡潔にＲ１７０［Ｙ、Ｇ］もしくはＲ１７０｛Ｙ、Ｇ｝、または長く表すとＲ１７０Ｙ、Ｒ１７０Ｇである。
【００４５】
酵素バリアントは、親酵素と比較した場合のそれらの配列同一性によって定義されてもよい。配列同一性は、通常「％配列同一性」または「％同一性」と示される。配列同一性の計算では、第１の工程で配列アラインメントを作成する必要がある。本発明によると、ペアワイズグローバルアラインメントを作成する必要がある、つまり２つの配列をそれらの完全長にわたってアラインメントする必要があり、これは通常、アラインメントアルゴリズムと呼ばれる数学的手法を使用して作成される。
【００４６】
本発明によると、アラインメントはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７９年）４８、４４３〜４５３頁）のアルゴリズムを使用して生成される。好ましくは、本発明の目的のために、プログラム「ＮＥＥＤＬＥ」（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ  （ＥＭＢＯＳＳ））を、プログラムのデフォルトパラメーター（ｇａｐ  ｏｐｅｎ＝１０．０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ＝０．５およびｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を使用して使用する。
【００４７】
本発明によると、以下の％同一性の計算が適用される：％同一性＝（同一残基／その完全長にわたって本発明のそれぞれの配列を示すアラインメント領域の長さ）＊１００。
【００４８】
本発明によると、酵素バリアントはそれぞれの親酵素のアミノ酸配列に対して少なくともｎ％同一であるアミノ酸配列として記載されてもよく、「ｎ」は１０〜１００の整数である。一実施形態では、バリアント酵素は、親酵素の完全長アミノ酸配列と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、酵素バリアントは酵素活性を有する。
【００４９】
酵素バリアントは、親酵素と比較した場合のそれらの配列類似性によって定義されてもよい。配列類似性は、通常「％配列類似性」または「％類似性」と示される。％配列類似性は、所定のセットのアミノ酸が、例えば、それらのサイズによって、それらの疎水性によって、それらの電荷によって、または他の特徴によって類似の特性を共有することを考慮に入れる。本明細書では、１つのアミノ酸を類似のアミノ酸と交換することを「保存的突然変異」と呼ぶ場合がある。
【００５０】
本発明による％類似性の決定では、以下を適用する：アミノ酸Ａはアミノ酸Ｓに類似する；アミノ酸Ｄはアミノ酸ＥおよびＮに類似する；アミノ酸Ｅはアミノ酸ＤおよびＫおよびＱに類似する；アミノ酸Ｆはアミノ酸ＷおよびＹに類似する；アミノ酸Ｈはアミノ酸ＮおよびＹに類似する；アミノ酸Ｉはアミノ酸ＬおよびＭおよびＶに類似する；アミノ酸Ｋはアミノ酸ＥおよびＱおよびＲに類似する；アミノ酸Ｌはアミノ酸ＩおよびＭおよびＶに類似する；アミノ酸Ｍはアミノ酸ＩおよびＬおよびＶに類似する；アミノ酸Ｎはアミノ酸ＤおよびＨおよびＳに類似する；アミノ酸Ｑはアミノ酸ＥおよびＫおよびＲに類似する；アミノ酸Ｒはアミノ酸ＫおよびＱに類似する；アミノ酸Ｓはアミノ酸ＡおよびＮおよびＴに類似する；アミノ酸Ｔはアミノ酸Ｓに類似する；アミノ酸Ｖはアミノ酸ＩおよびＬおよびＭに類似する；アミノ酸Ｗはアミノ酸ＦおよびＹに類似する；アミノ酸Ｙはアミノ酸ＦおよびＨおよびＷに類似する。
【００５１】
保存的アミノ酸置換は、酵素などの機能的タンパク質のポリペプチド配列の完全配列長にわたって生じてもよい。一実施形態では、そのような突然変異は、酵素の機能的ドメインに関与しない。一実施形態では、保存的突然変異は酵素の触媒中心に関与しない。
【００５２】
保存的突然変異を考慮に入れるために、２個のアミノ酸配列の配列類似性の値は、％同一性を計算するのに使用されるものと同じアラインメントから計算されてもよい。
【００５３】
本発明によると、以下の％類似性の計算が適用される：％類似性＝［（同一残基＋類似残基）／その完全長にわたって本発明のそれぞれの配列（複数可）を示すアラインメント領域の長さ］＊１００。
【００５４】
本発明によると、酵素バリアントはそれぞれの親配列に少なくともｍ％類似するアミノ酸配列として記載されてもよく、「ｍ」は１０〜１００の整数である。一実施形態では、バリアント酵素は、親酵素の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％類似し、バリアント酵素は酵素活性を有する。
【００５５】
「酵素活性」は酵素が発揮する触媒作用を意味し、通常は酵素１ミリグラムあたりの単位（比活性）で表され、酵素１分子あたり１分あたりに変換される基質分子（分子活性）に関する。
【００５６】
バリアント酵素は、前記酵素バリアントがそれぞれの親酵素の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の酵素活性を示す場合に、本発明による酵素活性を有し得る。
【００５７】
成分（ｂ）に含まれる少なくとも１種の酵素は、ヒドロラーゼ（ＥＣ３）の群から選択される。
【００５８】
リパーゼ
一実施形態では、本発明の酵素調製物は、少なくとも１種のリパーゼ（ＥＣ３．１．１；成分（ｂ））を含む。「リパーゼ」、「脂肪分解酵素」、「脂質エステラーゼ」はいずれも、ＥＣクラス３．１．１（「カルボン酸エステルヒドロラーゼ」）の酵素を指す。リパーゼは、リパーゼ活性（または脂肪分解活性；トリアシルグリセロールリパーゼ、ＥＣ３．１．１．３）、クチナーゼ活性（ＥＣ３．１．１．７４；クチナーゼ活性を有する酵素は本明細書においてクチナーゼと呼ぶ場合がある）、ステロールエステラーゼ活性（ＥＣ３．１．１．１３）および／またはワックス−エステルヒドロラーゼ活性（ＥＣ３．１．１．５０）を有する活性タンパク質を意味する。
【００５９】
脂肪分解活性を決定するための方法は文献において周知である（例えば、Ｇｕｐｔａら（２００３年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７、６３〜７１頁を参照されたい）。例えば、リパーゼ活性は、基質であるパラ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰ−パルミテート、Ｃ：１６）のエステル結合の加水分解によって、黄色の４０５ｎｍで検出可能なｐＮＰが遊離することによって測定されてもよい。
【００６０】
「脂肪分解活性」はリパーゼが発揮する触媒作用を意味し、脂肪分解単位（ＬＵ）で示されてもよい。例えば、１ＬＵは、以下の条件：温度３０℃；ｐＨ＝９．０；基質は３．３ｗｔ．％のオリーブ油と３．３％のアラビアゴムのエマルジョンであってもよい、において、５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ緩衝液中１３ｍｍｏｌ／ｌのＣａ２＋および２０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌの存在下で、ｐＨスタットで１分あたりに滴定可能な脂肪酸を１μｍｏｌ生成するリパーゼの量に相当してもよい。
【００６１】
リパーゼ（成分（ｂ））は、細菌または真菌由来のものを含む。本発明の一態様では、好適なリパーゼ（成分（ｂ））は以下から選択される：Ｈｕｍｉｃｏｌａ（同義語  Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）由来の、例えばＥＰ２５８０６８、ＥＰ３０５２１６、ＷＯ９２／０５２４９およびＷＯ２００９／１０９５００に記載されるＨ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来の、またはＷＯ９６／１３５８０に記載されるＨ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ由来のリパーゼ；ＷＯ９２／０５２４９に記載されるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉに由来のリパーゼ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株（これらの一部はこれまでにＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａに改名されている）由来の、例えばＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓまたはＰ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＥＰ２１８２７２、ＷＯ９４／２５５７８、ＷＯ９５／３０７４４、ＷＯ９５／３５３８１、ＷＯ９６／００２９２）、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ（ＥＰ３３１３７６）、Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ（ＧＢ１３７２０３４）、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．株ＳＤ７０５（ＷＯ９５／０６７２０およびＷＯ９６／２７００２）、Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＷＯ９６／１２０１２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ（ＷＯ９５／１４７８３）、Ｐ．ｇｌｕｍａｅ（ＷＯ９５／３５３８１、ＷＯ９６／００２９２）由来のリパーゼ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ＷＯ２０１１／１５０１５７）およびＳ．ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ（ＷＯ２０１２／１３７１４７）由来のリパーゼ、ＧＤＳＬ型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓリパーゼ（ＷＯ２０１０／０６５４５５）；ＷＯ２０１１／０８４４１２に開示されるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ由来のリパーゼ；ＷＯ２０１１／０８４４１７に開示されるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のリパーゼ；Ｂａｃｉｌｌｕｓリパーゼ、例えばＷＯ００／６００６３に開示されるリパーゼ、Ｄａｒｔｏｉｓら（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１１３１、２５３〜３６０またはＷＯ２０１１／０８４５９９に開示されるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＪＰ  Ｓ６４−０７４９９２）またはＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ（ＷＯ９１／１６４２２）由来のリパーゼ；ＷＯ９４／０１５４１に開示されるＣａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ由来のクチナーゼ（ＵＳ５３８９５３６、ＷＯ８８／０９３６７）；Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼ（ＷＯ２０１０／１０７５６０）；ＷＯ９０／０９４４６、ＷＯ００／３４４５０およびＷＯ０１／９２５０２に開示されるＦｕｓａｒｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ由来のクチナーゼ；ならびにＷＯ００／３４４５０およびＷＯ０１／９２５０２に開示されるＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来のクチナーゼ。
【００６２】
好適なリパーゼ（成分（ｂ））は、アシルトランスフェラーゼまたはペルヒドロラーゼと称されるもの、例えばＣａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＡに相同性を有するアシルトランスフェラーゼ（ＷＯ２０１０／１１１１４３）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来のアシルトランスフェラーゼ（ＷＯ２００５／０５６７８２）、ＣＥ７ファミリー由来のペルヒドロラーゼ（ＷＯ２００９／６７２７９）ならびにＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓペルヒドロラーゼのバリアント、特にＳ５４Ｖバリアント（ＷＯ２０１０／１０００２８）も含む。
【００６３】
好適なリパーゼ（成分（ｂ））は、脂肪分解活性を有する上記のリパーゼのバリアントであるものも含む。そのような好適なリパーゼバリアント（成分（ｂ））は、例えばＷＯ９５／２２６１５、ＷＯ９７／０４０７９、ＷＯ９７／０７２０２、ＷＯ００／６００６３、ＷＯ２００７／０８７５０８、ＥＰ４０７２２５およびＥＰ２６０１０５に開示される方法によって開発されるものである。
【００６４】
好適なリパーゼ（成分（ｂ））は、上記で開示された親酵素の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の脂肪分解活性を有するリパーゼバリアントを含む。
【００６５】
好適なリパーゼ（成分（ｂ））は、親酵素の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％類似する脂肪分解活性を有するリパーゼバリアントを含む。
【００６６】
一実施形態では、リパーゼ（成分（ｂ））は、真菌トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣクラス３．１．１．３）から選択される。真菌トリアシルグリセロールリパーゼ（成分（ｂ））は、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａのリパーゼから選択されてもよい。一実施形態では、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼ（成分（ｂ））は、ＵＳ５８６９４３８の配列番号２のアミノ酸１〜２６９によるトリアシルグリセロールリパーゼおよび脂肪分解活性を有するそのバリアントから選択される。ＵＳ５８６９４３８の配列番号２のアミノ酸１〜２６９によるトリアシルグリセロールリパーゼは、本明細書においてＬｉｐｏｌａｓｅと呼ぶ場合がある。
【００６７】
Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼ（成分（ｂ））は、ＵＳ５８６９４３８の配列番号２のアミノ酸１〜２６９の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の脂肪分解活性を有するバリアントから選択されてもよい。
【００６８】
Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼ（成分（ｂ））は、脂肪分解活性を有し、保存的突然変異のみを含むが、ＵＳ５８６９４３８の配列番号２のアミノ酸１〜２６９の機能的ドメインに関与しないバリアントから選択されてもよい。脂肪分解活性を有するこの実施形態のリパーゼバリアントは、ＵＳ５８６９４３８の配列番号２のアミノ酸１〜２６９の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％類似してもよい。
【００６９】
Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼ（成分（ｂ））は、アミノ酸Ｔ２３１ＲおよびＮ２３３Ｒを有することを特徴とするＵＳ５８６９４３８の配列番号２に少なくとも８０％同一であってもよい。前記Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼは、以下のアミノ酸交換：Ｑ４Ｖ、Ｖ６０Ｓ、Ａ１５０Ｇ、Ｌ２２７Ｇ、Ｐ２５６Ｋのうちの１または複数をさらに含んでもよい。
【００７０】
一実施形態では、少なくとも１種のリパーゼは、商品名Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｅｘ（商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）およびＬｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｌｕｍａｆａｓｔ（元はＧｅｎｅｎｃｏｒ製）ならびにＬｉｐｏｍａｘ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ／現在のＤＳＭ）で販売されている製品を含むがこれらに限定されない、市販のリパーゼから選択される。
【００７１】
本発明によると、成分（ｂ）は、好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）の群から選択される少なくとも２種のリパーゼの組合せを含んでもよい。
【００７２】
一実施形態では、成分（ｂ）は、上記で開示された、ＵＳ５８６９４３８の配列番号２のアミノ酸１〜２６９によるトリアシルグリセロールリパーゼおよび脂肪分解活性を有するそのバリアントから選択される少なくとも１種のリパーゼを含む。
【００７３】
一実施形態では、成分（ｂ）は、好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）の群から選択される少なくとも１種のリパーゼと、好ましくはセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）から選択される、より好ましくはサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される、少なくとも１種のプロテアーゼの組合せを含む。
【００７４】
プロテアーゼ
一実施形態では、本発明の酵素調製物は、少なくとも１種のプロテアーゼ（成分（ｂ））を含む。プロテアーゼは、クラスＥＣ３．４のメンバーである。プロテアーゼ（成分（ｂ））は、アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）、ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３）、ジペプチジル−ペプチダーゼおよびトリペプチジル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４）、ペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５）、セリン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１８）、オメガペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１９）、セリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロ−エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４）、トレオニンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２５）または未知の触媒機構を有するエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．９９）を含む。
【００７５】
一実施形態では、少なくとも１種のプロテアーゼ（成分（ｂ））は、セリンプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）から選択される。セリンプロテアーゼまたはセリンペプチダーゼは、触媒反応時に基質と共有結合付加物を形成するセリンを触媒活性部位に有することを特徴とする。本発明の文脈におけるセリンプロテアーゼ（成分（ｂ））は、キモトリプシン（例えば、ＥＣ３．４．２１．１）、エラスターゼ（例えば、ＥＣ３．４．２１．３６）、エラスターゼ（例えばＥＣ３．４．２１．３７またはＥＣ３．４．２１．７１）、グランザイム（例えば、ＥＣ３．４．２１．７８またはＥＣ３．４．２１．７９）、カリクレイン（例えば、ＥＣ３．４．２１．３４、ＥＣ３．４．２１．３５、ＥＣ３．４．２１．１１８またはＥＣ３．４．２１．１１９）、プラスミン（例えば、ＥＣ３．４．２１．７）、トリプシン（例えば、ＥＣ３．４．２１．４）、トロンビン（例えば、ＥＣ３．４．２１．５）およびサブチリシンからなる群から選択される。サブチリシンは、サブチロペプチダーゼ、例えばＥＣ３．４．２１．６２としても公知であり、サブチロペプチダーゼは以下「サブチリシン」とも称される。
【００７６】
暫定的にサブチラーゼと表記されるセリンプロテアーゼのサブグループが、Ｓｉｅｚｅｎら（１９９１年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４：７１９〜７３７およびＳｉｅｚｅｎら（１９９７年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：５０１〜５２３によって提案されている。サブチラーゼは、サブチリシンファミリー、テルミターゼファミリー、プロテイナーゼＫファミリー、ランチビオティックペプチダーゼファミリー、ケキシンファミリーおよびピロリシンファミリーを含む。
【００７７】
サブチラーゼのサブグループは、ＭＥＲＯＰＳデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）によって定義されるファミリーＳ８由来のセリンプロテアーゼであるサブチリシンである。ペプチダーゼファミリーＳ８は、セリンエンドペプチダーゼサブチリシンおよびその相同体を含有する。サブファミリーＳ８Ａでは、活性部位残基は多くの場合、モチーフＡｓｐ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＡＡクランのアスパラギン酸エンドペプチダーゼのファミリーの配列モチーフに類似する）、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＨｉｓおよびＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｐｒｏで生じる。
【００７８】
サブチリシンに関連するクラスのセリンプロテアーゼ（成分（ｂ））は、それらをキモトリプシンに関連するクラスのセリンプロテアーゼと区別する触媒三残基を定義する、共通のアミノ酸配列を共有する。サブチリシンおよびキモトリプシンに関連するセリンプロテアーゼは、いずれもアスパラギン酸、ヒスチジンおよびセリンを含む触媒三残基を有する。
【００７９】
例としては、ＷＯ８９／０６２７６およびＥＰ０２８３０７５、ＷＯ８９／０６２７９、ＷＯ８９／０９８３０、ＷＯ８９／０９８１９、ＷＯ９１／０６６３７およびＷＯ９１／０２７９２に記載されるサブチリシンが挙げられる。
【００８０】
プロテアーゼは、「プロテアーゼ活性」または「タンパク質分解活性」を発揮する活性タンパク質である。タンパク質分解活性は、タンパク質が所定の時間経過でプロテアーゼまたはタンパク質分解酵素によって分解される速度に関する。
【００８１】
タンパク質分解活性を分析するための方法は文献において周知である（例えば、Ｇｕｐｔａら（２００２年）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：３８１〜３９５を参照されたい）。タンパク質分解活性は、基質としてスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ、簡潔にはＡＡＰＦ；例えば、ＤｅｌＭａｒら（１９７９年）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ９９、３１６〜３２０を参照されたい）を使用することによって決定されてもよい。ｐＮＡは、タンパク質分解切断によって基質分子から切断され、これによりＯＤ４０５を測定することによって定量化され得る黄色の遊離ｐＮＡが遊離される。
【００８２】
タンパク質分解活性は、酵素１グラムあたりの単位で示されてもよい。例えば、１Ｕプロテアーゼは、（カゼインを基質として）ｐＨ８．０および３７℃で１分あたり１μｍｏｌのフォリン陽性アミノ酸およびペプチド（チロシンとして）を遊離するプロテアーゼの量に相当してもよい。
【００８３】
サブチリシン型（ＥＣ３．４．２１．６２）プロテアーゼ（成分（ｂ））は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロテアーゼ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、ｌｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＵｒｅａｐｌａｓｍａなどのグラム陰性菌ポリペプチドから選択される微生物に由来する細菌プロテアーゼであってもよい。
【００８４】
本発明の一態様では、少なくとも１種のプロテアーゼ（成分（ｂ））は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓプロテアーゼから選択される。
【００８５】
本発明の一実施形態では、少なくとも１種のプロテアーゼ（成分（ｂ））は、以下から選択される：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＰＮ’由来のサブチリシン（Ｖａｓａｎｔｈａら（１９８４年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９巻、８１１〜８１９頁およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１巻、７９１１〜７９２５頁のＪＡ  Ｗｅｌｌｓら（１９８３年）によって記載される）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のサブチリシン（サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ；Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２４３巻、２１８４〜２１９１頁のＥＬ  Ｓｍｉｔｈら（１９６８年）およびＮｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１３巻、８９１３〜８９２６頁のＪａｃｏｂｓら（１９８５年）によって開示される）；サブチリシンＰＢ９２（アルカリプロテアーゼＰＢ９２の元の配列はＥＰ２８３０７５  Ａ２に記載される）；ＷＯ８９／０６２７９に開示されるサブチリシン１４７および／または３０９（それぞれＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標））；ＷＯ９１／０２７９２に開示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ由来のサブチリシン、例えばＷＯ９５／２３２２１に記載されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ＤＳＭ  ５４８３またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ＤＳＭ  ５４８３のバリアント由来のもの；ＤＥ  １００６４９８３に開示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ（ＤＳＭ  １１２３３）由来のサブチリシン；ＷＯ  ２００３／０５４１８４に開示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ（ＤＳＭ  １４３９１）由来のサブチリシン；ＷＯ  ２００３／０５６０１７に開示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（ＤＳＭ  １４３９０）由来のサブチリシン；ＷＯ  ２００３／０５５９７４に開示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（ＤＳＭ  １４３９２）由来のサブチリシン；ＷＯ  ２００３／０５４１８４に開示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ  （ＤＳＭ  １４３９３）由来のサブチリシン；ＷＯ  ２００５／０６３９７４に記載される配列番号４を有するサブチリシン；ＷＯ  ２００５／１０３２４４に記載される配列番号４を有するサブチリシン；ＷＯ  ２００５／１０３２４４に記載される配列番号７を有するサブチリシン；ならびに出願ＤＥ１０２００５０２８２９５．４に記載される配列番号２を有するサブチリシン。
【００８６】
一実施形態では、成分（ｂ）は、少なくともＷＯ８９／０６２７９の表Ｉにおける配列ａ）に開示されるサブチリシン３０９（本明細書ではＳａｖｉｎａｓｅと呼ぶ場合がある）、またはそれに少なくとも８０％同一であり、タンパク質分解活性を有するバリアントを含む。
【００８７】
本発明による有用なプロテアーゼ（成分（ｂ））の例は、以下に記載されるバリアントを含む：ＷＯ９２／１９７２９、ＷＯ９５／２３２２１、ＷＯ９６／３４９４６、ＷＯ９８／２０１１５、ＷＯ９８／２０１１６、ＷＯ９９／１１７６８、ＷＯ０１／４４４５２、ＷＯ０２／０８８３４０、ＷＯ０３／００６６０２、ＷＯ２００４／０３１８６、ＷＯ２００４／０４１９７９、ＷＯ２００７／００６３０５、ＷＯ２０１１／０３６２６３、ＷＯ２０１１／０３６２６４およびＷＯ２０１１／０７２０９９。
【００８８】
好適な例は、特に、タンパク質分解活性を有する、以下の位置：３、４、９、１５、２４、２７、３３、３６、５７、６８、７６、７７、８７、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１１８、１２０、１２３、１２８、１２９、１３０、１３１、１５４、１６０、１６７、１７０、１９４、１９５、１９９、２０５、２０６、２１７、２１８、２２２、２２４、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８、２５２および２７４（ＢＰＮ’番号付けによる）のうちの１または複数にアミノ酸置換を含む、ＥＰ１９２１１４７に記載される配列番号２２（Ｂａｃｉｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ＤＳＭ５４８３由来の成熟アルカリプロテアーゼの配列）に由来するサブチリシンプロテアーゼのバリアントを含む。一実施形態では、そのようなプロテアーゼは位置Ａｓｐ３２、Ｈｉｓ６４およびＳｅｒ２２１（ＢＰＮ’番号付けによる）で突然変異していない。
【００８９】
好適なプロテアーゼ（成分（ｂ））は、上記で開示される親酵素の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のタンパク質分解活性を有するプロテアーゼバリアントを含む。
【００９０】
好適なプロテアーゼ（成分（ｂ））は、親酵素の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％類似するタンパク質分解活性を有するプロテアーゼバリアントを含む。
【００９１】
一実施形態では、少なくとも１種のプロテアーゼ（成分（ｂ））は、ＥＰ１９２１１４７に記載される配列番号２２、またはそれに少なくとも８０％同一であり、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼを有する。一実施形態では、前記プロテアーゼは、１０１位（ＢＰＮ’番号付けによる）にアミノ酸グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）またはアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）を有することを特徴とし、タンパク質分解活性を有する。一実施形態では、前記プロテアーゼは、１または複数のさらなる置換を含む：（ａ）３位のトレオニン（３Ｔ）、（ｂ）４位のイソロイシン（４Ｉ）、（ｃ）６３位のアラニン、トレオニンまたはアルギニン（６３Ａ、６３Ｔまたは６３Ｒ）、（ｄ）１５６位のアスパラギン酸またはグルタミン酸（１５６Ｄまたは１５６Ｅ）、（ｅ）１９４位のプロリン（１９４Ｐ）、（ｆ）１９９位のメチオニン（１９９Ｍ）、（ｇ）２０５位のイソロイシン（２０５Ｉ）、（ｈ）２１７位のアスパラギン酸、グルタミン酸またはグリシン（２１７Ｄ、２１７Ｅまたは２１７Ｇ）、（ｉ）（ａ）〜（ｈ）による２種以上のアミノ酸の組合せ。少なくとも１種のプロテアーゼ（成分（ｂ））は、ＥＰ１９２１１４７に記載される配列番号２２に少なくとも８０％同一であってもよく、１種のアミノ酸（（ａ）〜（ｈ）による）または（ｉ）による組合せを、アミノ酸１０１Ｅ、１０１Ｄ、１０１Ｎ、１０１Ｑ、１０１Ａ、１０１Ｇまたは１０１Ｓ（ＢＰＮ’番号付けによる）とともに含み、タンパク質分解活性を有することを特徴とする。一実施形態では、前記プロテアーゼは、突然変異（ＢＰＮ’番号付けによる）Ｒ１０１ＥまたはＳ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５ＩまたはＲ１０１ＥおよびＳ３Ｔ、Ｖ４ＩおよびＶ２０５ＩまたはＳ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを含み、タンパク質分解活性を有することを特徴とする。
【００９２】
一実施形態では、ＥＰ１９２１１４７に記載される配列番号２２によるプロテアーゼは、突然変異（ＢＰＮ’番号付けによる）Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ９Ｒ＋Ａ１５Ｔ＋Ｖ６８Ａ＋Ｄ９９Ｓ＋Ｒ１０１Ｓ＋Ａ１０３Ｓ＋Ｉ１０４Ｖ＋Ｎ２１８Ｄを含み、タンパク質分解活性を有することを特徴とする。
【００９３】
一実施形態では、少なくとも１種のプロテアーゼは、商品名Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）およびＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）で販売されている製品、商品名Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＭＡ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｏｘ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（登録商標）、Ｐｕｒａｍａｘ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、ＦＮ２（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｅｒａｓｅｒ（登録商標）、Ｕｌｔｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｚ（登録商標）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ（登録商標）およびＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ／ＤｕＰｏｎｔ）、Ａｘａｐｅｍ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｓｅｓ  Ｎ．Ｖ．）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＢＬＡＰ；ＵＳ５，３５２，６０４の図２９に示される配列）およびそのバリアントならびにＫａｏ  Ｃｏｒｐ製のＫＡＰ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ  サブチリシン）で販売されているものを含むがこれらに限定されない、市販のプロテアーゼ酵素から選択される。
【００９４】
本発明によると、成分（ｂ）は、いずれも上記で開示される、好ましくはセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から選択される、より好ましくはサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される、少なくとも２種のプロテアーゼの組合せを含んでもよい。
【００９５】
一実施形態では、成分（ｂ）は、少なくとも１種のリパーゼと少なくとも１種のプロテアーゼの組合せを含む。一実施形態では、成分（ｂ）は、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）から選択される少なくとも１種のリパーゼおよびセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）から選択される、より好ましくはサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種のプロテアーゼを含む。
【００９６】
一実施形態では、成分（ｂ）は、いずれも上記で開示される、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）から選択される少なくとも１種のリパーゼおよびＥＰ１９２１１４７に記載される配列番号２２によるプロテアーゼから選択される少なくとも１種のプロテアーゼまたはタンパク質分解活性を有するそのバリアントを含む。
【００９７】
一実施形態では、成分（ｂ）は、いずれも上記で開示される、ＵＳ５８６９４３８の配列番号２のアミノ酸１〜２６９によるトリアシルグリセロールリパーゼから選択される少なくとも１種のリパーゼおよびタンパク質分解活性を有するそのバリアント、ならびにＥＰ１９２１１４７に記載される配列番号２２によるプロテアーゼから選択される少なくとも１種のプロテアーゼまたはタンパク質分解活性を有するそのバリアントを含む。
【００９８】
一実施形態では、成分（ｂ）は、いずれも上記で開示される、ＵＳ５８６９４３８の配列番号２のアミノ酸１〜２６９によるトリアシルグリセロールリパーゼから選択される少なくとも１種のリパーゼおよび脂肪分解活性を有するそのバリアント、ならびにＷＯ８９／０６２７９の表Ｉａ）に開示されるサブチリシン３０９から選択される少なくとも１種のプロテアーゼまたはタンパク質分解活性を有するそのバリアントを含む。
【００９９】
アミラーゼ
一実施形態では、本発明の酵素調製物は、少なくとも１種のアミラーゼ（成分（ｂ））を含む。本発明による「アミラーゼ」（成分（ｂ））（アルファおよび／またはベータ）は、細菌または真菌起源のもの（それぞれＥＣ３．２．１．１および３．２．１．２）を含む。化学的に修飾された、またはタンパク質が工学的に操作された突然変異体が含まれる。
【０１００】
本発明によるアミラーゼ（成分ｂ））は、多糖のグルコシド結合の（エンド）加水分解を含む、「デンプン分解活性」または「アミラーゼ活性」を有する。α−アミラーゼ活性は、当業者に公知のα−アミラーゼ活性の測定のためのアッセイによって決定することができる。α−アミラーゼ活性を測定するアッセイの例は以下である。
【０１０１】
α−アミラーゼ活性は、基質としてＰｈａｄｅｂａｓタブレット（Ｐｈａｄｅｂａｓ  Ａｍｙｌａｓｅ  Ｔｅｓｔ、Ｍａｇｌｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅから供給）を用いる方法によって決定することができる。デンプンがα−アミラーゼによって加水分解され、可溶性の青色断片が生じる。６２０ｎｍで分光光度法によって測定される、生じた青色溶液の吸光度がα−アミラーゼ活性の関数である。測定された吸光度は、所与の条件下の対象のα−アミラーゼの比活性（活性／純粋なα−アミラーゼタンパク質のｍｇ）に正比例する。
【０１０２】
α−アミラーゼ活性は、エチリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド（ＥＰＳ）を用いる方法によって決定することもできる。Ｄ−マルトヘプタオシドは、エンド−アミラーゼによって切断され得るブロックされたオリゴ糖である。切断に続き、キットに含まれるα−グルコシダーゼが基質を消化して黄色の遊離ＰＮＰ分子を遊離させ、これにより可視分光光度法による４０５ｎｍでの測定が可能になる。ＥＰＳ基質およびα−グルコシダーゼを含有するキットは、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｓｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈによって製造されている（カタログＮｏ．１０８８００７８１０３）。時間依存吸収曲線の傾きは、所与の条件における対象のα−アミラーゼの比活性（酵素１ｍｇあたりの活性）に正比例する。
【０１０３】
デンプン分解活性は、酵素１グラムあたりの単位で示されてもよい。例えば、１単位のα−アミラーゼは、ｐＨ６．９で２０℃において、３分で１．０ｍｇのマルトースをデンプンから遊離させ得る。
【０１０４】
少なくとも１種のアミラーゼ（成分（ｂ））は、以下から選択されてもよい：ＷＯ９５／１０６０３に記載される、配列番号２を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアミラーゼ；ＷＯ０２／１０３５５に開示される、配列番号６を有するＢ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のアミラーゼ；ＷＯ９９／１９４６７に開示される、配列番号６を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．７０７由来のアミラーゼ；ＳＰ−７２２とも記載される、ＷＯ９６／２３８７２に記載される配列番号２または配列番号７を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｍａｐａｌｕｓ由来のアミラーゼ；ＷＯ００／２２１０３に開示される、配列番号４を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＤＳＭ  １２６４９由来のアミラーゼ；ＷＯ２００９／０６１３８０に開示される、配列番号２を有するＢａｃｉｌｌｕｓ株ＴＳ−２３由来のアミラーゼ；ＷＯ２０１３／１８４５７７に開示される、配列番号１を有するＣｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．由来のアミラーゼ；ＷＯ２０１０／１０４６７５に開示される、配列番号１を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＤＳＭ９０由来のアミラーゼ；ＷＯ００／６００６０に記載される、配列番号２のアミノ酸１〜４８５を含むＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来のアミラーゼ。
【０１０５】
好適なアミラーゼ（成分（ｂ））は、上記で開示された親酵素の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミラーゼ活性を有するアミラーゼバリアントを含む。
【０１０６】
好適なアミラーゼ（成分（ｂ））は、親酵素の完全長ポリペプチド配列と比較して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％類似するアミラーゼ活性を有するアミラーゼバリアントを含む。
【０１０７】
少なくとも１種のアミラーゼ（成分（ｂ））は、ＷＯ２００６／００２６４３に記載される配列番号１２を有してもよく、またはそれに少なくとも８０％同一であり、デンプン分解活性を有する。少なくとも１種のアミラーゼは、配列番号１２に少なくとも８０％同一であってもよく、位置Ｙ２９５ＦおよびＭ２０２ＬＩＴＶに置換を含む。
【０１０８】
少なくとも１種のアミラーゼ（成分（ｂ））は、ＷＯ２０１１／０９８５３１に記載される配列番号６を有してもよく、またはそれに少なくとも８０％同一であり、デンプン分解活性を有する。少なくとも１種のアミラーゼは、配列番号６に少なくとも８０％同一であってもよく、１９３［Ｇ、Ａ、Ｓ、ＴまたはＭ］、１９５［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＶ］、１９７［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＶ］、１９８［ＱまたはＮ］、２００［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＶ］、２０３［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＶ］、２０６［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、ＤまたはＥ］、２１０［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＶ］、２１２［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＶ］、２１３［Ｇ、Ａ、Ｓ、ＴまたはＭ］および２４３［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＶ］からなる群から選択される１または複数の位置に置換を含む。
【０１０９】
少なくとも１種のアミラーゼ（成分（ｂ））は、ＷＯ２０１３／００１０７８に記載される配列番号１を有してもよく、またはそれに少なくとも８５％同一であり、デンプン分解活性を有する。少なくとも１種のアミラーゼは、配列番号１に少なくとも８５％同一であってもよく、位置Ｇ３０４、Ｗ１４０、Ｗ１８９、Ｄ１３４、Ｅ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する２以上（複数）の位置に変更を含む。
【０１１０】
少なくとも１種のアミラーゼ（成分（ｂ））は、ＷＯ２０１３／００１０８７に記載される配列番号２を有してもよく、またはそれに少なくとも８５％同一であり、デンプン分解活性を有する。少なくとも１種のアミラーゼは、配列番号２に少なくとも８５％同一であってもよく、位置１８１＋１８２または１８２＋１８３または１８３＋１８４の欠失を含み、デンプン分解活性を有する。一実施形態では、前記アミラーゼは、Ｗ１４０、Ｗ１５９、Ｗ１６７、Ｑ１６９、Ｗ１８９、Ｅ１９４、Ｎ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｆ２８９、Ｇ３０４、Ｇ３０５、Ｒ３２０、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応する位置のいずれかに１または２以上のさらなる修飾を含んでもよい。
【０１１１】
一実施形態では、少なくとも１種のアミラーゼは、商品名Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ  Ｐｌｕｓ（商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ  ＸおよびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ製）ならびにＲａｐｉｄａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）、Ｐｏｗｅｒａｓｅ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｚ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ製Ｍ１００）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ（商標）（Ｓ１０００、Ｓ１１０およびＦ１０００；ＤｕＰｏｎｔ製）、ＰｒｉｍａＧｒｅｅｎ（商標）（ＡＬＬ；ＤｕＰｏｎｔ）、Ｏｐｔｉｓｉｚｅ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ）で販売されている製品を含むが、これらに限定されない市販のアミラーゼから選択される。
【０１１２】
本発明によると、少なくとも２種のアミラーゼ（成分（ｂ））の組合せが使用されてもよい。
【０１１３】
一実施形態では、成分（ｂ）は、少なくとも１種のリパーゼと少なくとも１種のアミラーゼの組合せを含む。
【０１１４】
一実施形態では、成分（ｂ）は、少なくとも１種のプロテアーゼおよび／または少なくとも１種のアミラーゼの組合せを含む。
【０１１５】
一実施形態では、成分（ｂ）は、少なくとも１種のリパーゼと少なくとも１種のプロテアーゼと少なくとも１種のアミラーゼの組合せを含む。
【０１１６】
セルラーゼ
本発明の酵素調製物は、少なくとも１種のセルラーゼ（成分（ｂ））を含んでもよい。セルラーゼの３種の主な種類が公知であり、すなわちセロビオヒドロラーゼ（１，４−Ｐ−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．９１）、エンド−ｓｓ−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−Ｐ−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．４）およびｓｓ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）である。
【０１１７】
「セルラーゼ」、「セルラーゼ酵素」または「セルロース分解酵素」（成分（ｂ））は、セルロースの加水分解に関与する酵素である。「セルラーゼ活性」または「セルロース分解活性」の測定のためのアッセイが当業者に公知である。例えば、セルロース分解活性は、セルラーゼがカルボキシメチルセルロースを加水分解して還元炭水化物を生じるという事実によって決定することができ、その還元能はＨｏｆｆｍａｎ、Ｗ．Ｓ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１２０、５１（１９３７年）に従いフェリシアニド反応を用いて比色分析によって決定される。
【０１１８】
セルロース分解活性は、酵素１グラムあたりの単位で示されてもよい。例えば、１単位は、ｐＨ５．０で３７℃において、セルロースから１時間に１．０μｍｏｌのグルコースを遊離させ得る（２時間のインキュベーション時間）。
【０１１９】
本発明によるセルラーゼは、細菌または真菌起源のものを含む。
【０１２０】
一実施形態では、少なくとも１種のセルラーゼ（成分（ｂ））は、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）、Ｅｎｄｏｌａｓｅ（商標）、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（商標）、Ｃｅｌｌｕｓｏｆｔ（商標）、Ｒｅｎｏｚｙｍｅ（商標）、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ製）、Ｅｃｏｓｔｏｎｅ（商標）、Ｂｉｏｔｏｕｃｈ（商標）、Ｅｃｏｎａｓｅ（商標）、Ｅｃｏｐｕｌｐ（商標）（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｆｉｎｌａｎｄ製）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｄａｘ  ＨＡ（商標）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｌ、ＩｎｄｉＡｇｅ（商標）Ｎｅｕｔｒａ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．／ＤｕＰｏｎｔ製）、Ｒｅｖｉｔａｌｅｎｚ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ製２０００）、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ）およびＫＡＣ−５００（商標）（Ｋａｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を含むがこれらに限定されない、市販のセルラーゼから選択される。
【０１２１】
成分（ｃ）
一実施形態では、本発明の液体酵素調製物は、成分（ａ）とは異なる酵素安定剤、保存剤および界面活性剤から選択される少なくとも１種の化合物を含む成分（ｃ）を含有する。
【０１２２】
成分（ａ）とは異なる酵素安定剤：
本発明の液体酵素調製物は、成分（ａ）とは異なる少なくとも１種の酵素安定剤を含んでもよい。前記酵素安定剤（成分（ｃ））は、ホウ素含有化合物、ポリオール、ペプチドアルデヒド、他の安定剤およびそれらの混合物から選択されてもよい。
【０１２３】
ホウ素含有化合物：
ホウ素含有化合物（成分（ｃ））は、ホウ酸またはその誘導体から、およびアリールボロン酸またはその誘導体などのボロン酸またはその誘導体から、それらの塩から、およびそれらの混合物から選択されてもよい。本明細書では、ホウ酸をオルトホウ酸と呼ぶ場合がある。
【０１２４】
一実施形態では、ホウ素含有化合物（成分（ｃ））は、アリールボロン酸およびそれらの誘導体からなる群から選択される。一実施形態では、ホウ素含有化合物は、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）とも呼ばれるベンゼンボロン酸（ＢＢＡ）、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される。一実施形態では、フェニルボロン酸誘導体は、式（ＩＩＩａ）および式（ＩＩＩｂ）：
【化１】
2021504541.tif 000002
（式中、
Ｒ１は水素、ヒドロキシ、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよび非置換または置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニルからなる群から選択される；好ましい実施形態では、Ｒはヒドロキシおよび非置換Ｃ１アルキルからなる群から選択される；
Ｒ２は水素、ヒドロキシ、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよび非置換または置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニルからなる群から選択される；好ましい実施形態では、ＲはＨ、ヒドロキシおよび置換Ｃ１アルキルからなる群から選択される）
の誘導体からなる群から選択される。
【０１２５】
一実施形態では、フェニルボロン酸誘導体（成分（ｃ））は、４−ホルミルフェニルボロン酸（４−ＦＰＢＡ）、４−カルボキシフェニルボロン酸（４−ＣＰＢＡ）、４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸（４−ＨＭＰＢＡ）およびｐ−トリルボロン酸（ｐ−ＴＢＡ）からなる群から選択される。
【０１２６】
他の好適な誘導体（成分（ｃ））は、以下を含む：２−チエニルボロン酸、３−チエニルボロン酸、（２−アセトアミドフェニル）ボロン酸、２−ベンゾフラニルボロン酸、１−ナフチルボロン酸、２−ナフチルボロン酸、２−ＦＰＢＡ、３−ＦＢＰＡ、１−チアントレニルボロン酸、４−ジベンゾフランボロン酸、５−メチル−２−チエニルボロン酸、１−ベンゾチオフェン−２ボロン酸、２−フラニルボロン酸、３−フラニルボロン酸、４，４ビフェニル−ジボロン酸、６−ヒドロキシ−２−ナフタレンボロン酸、４−（メチルチオ）フェニルボロン酸、４−（トリメチルシリル）フェニルボロン酸、３−ブロモチオフェンボロン酸、４−メチルチオフェンボロン酸、２−ナフチルボロン酸、５−ブロモチオフェンボロン酸、５−クロロチオフェンボロン酸、ジメチルチオフェンボロン酸、２−ブロモフェニルボロン酸、３−クロロフェニルボロン酸、３−メトキシ−２−チオフェンボロン酸、ｐ−メチル−フェニルエチルボロン酸、２−チアントレニルボロン酸、ジ−ベンゾチオフェンボロン酸、９−アントラセンボロン酸、３，５ジクロロフェニルボロン酸、ジフェニルボロン酸無水物、ｏ−クロロフェニルボロン酸、ｐ−クロロフェニルボロン酸、ｍ−ブロモフェニルボロン酸、ｐ−ブロモフェニルボロン酸、ｐ−フルオロフェニルボロン酸、オクチルボロン酸、１，３，５トリメチルフェニルボロン酸、３−クロロ−４−フルオロフェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、３，５−ビス−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２，４ジクロロフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸およびそれらの混合物。
【０１２７】
ポリオール：
ポリオール（成分（ｃ））は、２〜６個のヒドロキシル基を含有するポリオールから選択されてもよい。好適な例は、グリコール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、エチレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、グルコース、フルクトース、ラクトース（ｌａｃｔｏｒｅ）、およびエリスリタンを含む。
【０１２８】
ペプチドアルデヒド：
ペプチドアルデヒド（成分（ｃ））は、ジ−、トリ−またはテトラペプチドアルデヒドおよびアルデヒド類似体（形態Ｂ１−ＢＯ−Ｒ（ここでＲはＨ、ＣＨ３、ＣＸ３、ＣＨＸ２またはＣＨ２Ｘ（Ｘ＝ハロゲン）であり、ＢＯは単一のアミノ酸残基（一実施形態では、任意に置換された脂肪族または芳香族側鎖を含む）であり、Ｂ１は１個または複数のアミノ酸残基（一実施形態では、１、２または３個）からなり、任意にＮ末端保護基を含むもの、またはＷＯ０９／１１８３７５およびＷＯ９８／１３４５９に記載のもののいずれか）、あるいはＲＡＳＩ、ＢＡＳＩ、ＷＡＳＩ（イネ、オオムギおよびコムギの二官能性アルファ−アミラーゼ／サブチリシン阻害剤）またはＣｌ２もしくはＳＳＩなどの、タンパク質型プロテアーゼ阻害剤から選択されてもよい。
【０１２９】
他の安定剤：
他の安定剤（成分（ｃ））は、ＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩ならびに乳酸およびギ酸のアルカリ塩から選択されてもよい。
【０１３０】
他の安定剤（成分（ｃ））は、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）および／またはマグネシウム（ＩＩ）イオンを酵素に与える最終組成物に含まれる、そのようなイオンの水溶性供給源、ならびに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）およびオキソバナジウム（ＩＶ））から選択されてもよい。
【０１３１】
それ自体で液体酵素調製物を安定化する化合物
それ自体で液体酵素調製物を安定化する化合物は、保存安定性を確実にするのに有効な量で液体調製物の保存安定性を確立するのに必要とされる、酵素安定剤以外の任意の化合物を意味する。
【０１３２】
当業者にとって、液体調製物の文脈における保存安定性には、通常、製品の外観および用量の均一性の側面が含まれる。
【０１３３】
製品の外観は、製品のｐＨおよび保存剤、抗酸化剤、粘度調整剤、乳化剤などの化合物の存在の影響を受ける。
【０１３４】
用量の均一性は、通常、製品の均質性に関する。
【０１３５】
保存剤：
本発明の液体酵素調製物は、少なくとも１種の保存剤を含んでもよい。保存剤は、液体酵素調製物、好ましくは水性酵素調製物への微生物の混入を防止するのに有効な量で添加される。
【０１３６】
好適な保存剤の非限定的な例は、（第四級）アンモニウム化合物、イソチアゾリノン、有機酸およびホルムアルデヒド放出剤を含む。好適な（第四級）アンモニウム化合物の非限定的な例は、ベンザルコニウム塩化物、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）、塩化ジデシルジメチルアンモニウム（ＤＤＡＣ）およびＮ−（３−アミノプロピル）−Ｎ−ドデシルプロパン−１，３−ジアミン（ジアミン）を含む。好適なイソチアゾリノンの非限定的な例は、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（ＢＩＴ）、２−メチル−２Ｈ−イソチアゾール−３−オン（ＭＩＴ）、５−クロロ−２−メチル−２Ｈ−イソチアゾール−３−オン（ＣＩＴ）、２−オクチル−２Ｈ−イソチアゾール−３−オン（ＯＩＴ）および２−ブチル−ベンゾ［ｄ］イソチアゾール−３−オン（ＢＢＩＴ）を含む。好適な有機酸の非限定的な例は、安息香酸、ソルビン酸、Ｌ−（＋）−乳酸、ギ酸およびサリチル酸を含む。好適なホルムアルデヒド放出剤の非限定的な例は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスモルホリン（ＭＢＭ）、２，２’，２’’−（ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン−１，３，５−トリイル）トリエタノール（ＨＨＴ）、（エチレンジオキシ）ジメタノール、α，α’，α’’−トリメチル−１，３，５−トリアジン−１，３，５（２Ｈ，４Ｈ，６Ｈ）−トリエタノール（ＨＰＴ）、３，３’−メチレンビス［５−メチルオキサゾリジン］（ＭＢＯ）およびシス−１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド（ＣＴＡＣ）を含む。
【０１３７】
さらなる有用な保存剤は、ヨードプロピニルブチルカルバメート（ＩＰＢＣ）、ジクロロ−ジメチル−ヒダントイン（ＤＣＤＭＨ）、ブロモ−クロロ−ジメチル−ヒダントイン（ＢＣＤＭＨ）およびジブロモ−ジメチル−ヒダントイン（ＤＢＤＭＨ）などのハロゲン放出化合物、ブロノポール（２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール）、２，２−ジブロモ−２−シアノアセトアミド（ＤＢＮＰＡ）などのブロモ−ニトロ化合物、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、フェノキシエタノール、ビフェニル−２−オールおよび亜鉛またはナトリウムピリチオンを含む。
【０１３８】
界面活性剤：
本発明の液体酵素調製物は、少なくとも１種の界面活性剤（成分（ｃ））を含んでもよい。界面活性剤の例は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤を含み、以下、非イオン性界面活性剤（成分（ｃ））、両性界面活性剤（成分（ｃ））、アニオン性界面活性剤（成分（ｃ））およびカチオン性界面活性剤（成分（ｃ））とも称する。一実施形態では、本発明の液体酵素調製物は、非イオン性界面活性剤から、両性界面活性剤およびアニオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種の界面活性剤を含む。
【０１３９】
液体酵素調製物は、酵素調製物の総質量に対して０．１〜６０質量％の界面活性剤（成分（ｃ））を含有してもよい。成分（ｃ）は、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤およびアミンオキシド界面活性剤ならびに前述のうちの少なくとも２種の組合せから選択される少なくとも１種の化合物を含んでもよい。一実施形態では、本発明の酵素調製物は、いずれも酵素調製物の総質量に対して５〜３０質量％、例えば３〜２０質量％の範囲のアニオン性界面活性剤および少なくとも１種の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４０】
少なくとも１種の非イオン性界面活性剤（成分（ｃ））は、アルコキシル化アルコール、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのジ−およびマルチブロックコポリマー、ならびにソルビタンとエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドの反応生成物、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、ヒドロキシアルキル混合エーテルおよびアミンオキシドから選択されてもよい。
【０１４１】
アルコキシル化アルコールおよびアルコキシル化脂肪アルコールの好ましい例は、例えば、一般式（ＩＶ）
【化２】
2021504541.tif 000003
（式中、
Ｒ３は同一であるまたは異なり、水素および直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキルから選択され、好ましくはいずれの場合も同一であり、エチル、および特に好ましくは水素またはメチルであり、
Ｒ４は分岐状または直鎖状Ｃ８〜Ｃ２２アルキル、例えばｎ−Ｃ８Ｈ１７、ｎ−Ｃ１０Ｈ２１、ｎ−Ｃ１２Ｈ２５、ｎ−Ｃ１４Ｈ２９、ｎ−Ｃ１６Ｈ３３またはｎ−Ｃ１８Ｈ３７から選択され、
Ｒ５はＣ１〜Ｃ１０アルキル、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ネオペンチル、１，２−ジメチルプロピル、イソアミル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルまたはイソデシルから選択される）
の化合物である。
【０１４２】
変数ｍおよびｎは０〜３００の範囲であり、ここでｎとｍの合計は少なくとも１、好ましくは３〜５０の範囲である。好ましくは、ｍは１〜１００の範囲であり、ｎは０〜３０の範囲である。
【０１４３】
一実施形態では、一般式（ＩＩＩ）の化合物はブロックコポリマーであってもランダムコポリマーであってもよいが、好ましくはブロックコポリマーである。
【０１４４】
アルコキシル化アルコールの他の好ましい例は、例えば、一般式（Ｖ）：
【化３】
2021504541.tif 000004
（式中、
Ｒ６は同一であるまたは異なり、水素および直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキルから選択され、好ましくはいずれの場合も同一であり、エチル、および特に好ましくは水素またはメチルであり、
Ｒ７は分岐状または直鎖状Ｃ６〜Ｃ２０アルキル、特にｎ−Ｃ８Ｈ１７、ｎ−Ｃ１０Ｈ２１、ｎ−Ｃ１２Ｈ２５、ｎ−Ｃ１３Ｈ２７、ｎ−Ｃ１５Ｈ３１、ｎ−Ｃ１４Ｈ２９、ｎ−Ｃ１６Ｈ３３、ｎ−Ｃ１８Ｈ３７から選択され、
ａは０〜１０、好ましくは１〜６の範囲の数であり、
ｂは１〜８０、好ましくは４〜２０の範囲の数であり、
ｃは０〜５０、好ましくは４〜２５の範囲の数である）
の化合物である。
【０１４５】
ａ＋ｂ＋ｃの合計は好ましくは５〜１００の範囲、さらにより好ましくは９〜５０の範囲である。
【０１４６】
ヒドロキシアルキル混合エーテルの好ましい例は、一般式（ＶＩ）
【化４】
2021504541.tif 000005
（式中、変数は以下の通り定義される：
Ｒ８は同一であるまたは異なり、水素および直鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキルから選択され、好ましくはいずれの場合も同一であり、エチル、および特に好ましくは水素またはメチルであり、
Ｒ９は分岐状または直鎖状Ｃ８〜Ｃ２２アルキル、例えばイソ−Ｃ１１Ｈ２３、イソ−Ｃ１３Ｈ２７、ｎ−Ｃ８Ｈ１７、ｎ−Ｃ１０Ｈ２１、ｎ−Ｃ１２Ｈ２５、ｎ−Ｃ１４Ｈ２９、ｎ−Ｃ１６Ｈ３３またはｎ−Ｃ１８Ｈ３７から選択され、
Ｒ１０はＣ１〜Ｃ１８アルキル、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ネオペンチル、１，２−ジメチルプロピル、イソアミル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、イソデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシルおよびｎ−オクタデシルから選択される）
の化合物である。
【０１４７】
変数ｍおよびｘは０〜３００の範囲であり、ここでｎとｍの合計は少なくとも１、好ましくは５〜５０の範囲である。好ましくは、ｍは１〜１００の範囲であり、ｎは０〜３０の範囲である。
【０１４８】
一般式（Ｖ）および（ＶＩ）の化合物はブロックコポリマーであってもランダムコポリマーであってもよいが、好ましくはブロックコポリマーである。
【０１４９】
さらに好適な非イオン性界面活性剤は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドからなるジ−およびマルチブロックコポリマーから選択される。さらに好適な非イオン性界面活性剤は、エトキシ化またはプロポキシ化ソルビタンエステルから選択される。アミンオキシドまたはアルキルポリグリコシド、特に直鎖Ｃ４〜Ｃ１８アルキルポリグルコシドおよび一般平均式（ＶＩＩ）の化合物などの分岐状Ｃ８〜Ｃ１８アルキルポリグリコシドもまた好適である。
【０１５０】
【化５】
2021504541.tif 000006
（式中、
Ｒ１１はＣ１〜Ｃ４アルキル、特にエチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルであり、
Ｒ１２は−（ＣＨ２）２−Ｒ１１であり、
Ｇ１は４〜６個の炭素原子を含む単糖、特にグルコースおよびキシロースから選択され、
ｙは１．１〜４の範囲であり、ｙは平均数である。）
【０１５１】
非イオン性界面活性剤のさらなる例は、一般式（ＶＩＩＩａ）および（ＶＩＩＩｂ）
【化６】
2021504541.tif 000007
（式中、
ＡＯはエチレンオキシド、プロピレンオキシドおよびブチレンオキシドから選択され、
ＥＯはエチレンオキシド、ＣＨ２ＣＨ２−Ｏであり、
Ｒ１３はＣ１〜Ｃ４アルキル、特にエチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルであり、
Ｒ１４は分岐状または直鎖状Ｃ８〜Ｃ１８アルキルから選択され、
Ａ３Ｏはプロピレンオキシドおよびブチレンオキシドから選択され、
ｗは１５〜７０、好ましくは３０〜５０の範囲の数であり、
ｗ１およびｗ３は１〜５の範囲の数であり、
ｗ２は１３〜３５の範囲の数である）
の化合物である。
【０１５２】
さらなる好適な非イオン性界面活性剤の概要は、ＥＰ−Ａ０８５１０２３およびＤＥ−Ａ１９８１９１８７に見出すことができる。
【０１５３】
一実施形態では、酵素調製物は、２種以上の異なる非イオン性界面活性剤（成分（ｃ））の混合物を含有する。
【０１５４】
少なくとも１種の両性界面活性剤（成分（ｃ））は、使用条件下で同じ分子に正電荷および負電荷を有する界面活性剤から選択されてもよい。両性界面活性剤の好ましい例は、いわゆるベタイン界面活性剤である。ベタイン界面活性剤の多くの例は、分子１つにつき１つの四級化窒素原子および１つのカルボン酸基を有する。両性界面活性剤の特に好ましい例は、コカミドプロピルベタイン（ラウラミドプロピルベタイン）である。
【０１５５】
アミンオキシド界面活性剤の例は、一般式（ＩＸ）
Ｒ１３Ｒ１４Ｒ１５Ｎ→Ｏ      （ＩＸ）
（式中Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は互いに独立して脂肪族、環式脂肪族またはＣ２〜Ｃ４アルキレンＣ１０〜Ｃ２０アルキルアミド部分から選択される。好ましくは、Ｒ１２はＣ８〜Ｃ２０アルキルまたはＣ２〜Ｃ４アルキレンＣ１０〜Ｃ２０アルキルアミドから選択され、Ｒ１３およびＲ１４はいずれもメチルである）の化合物である。
【０１５６】
特に好ましい例は、ラウラミンオキシドと呼ばれることもあるラウリルジメチルアミンオキシドである。さらなる特に好ましい例は、コカミドプロピルアミンオキシドと呼ばれることもあるコカミドプロピルジメチルアミンオキシドである。
【０１５７】
少なくとも１種のアニオン性界面活性剤（成分（ｃ））は、Ｃ８〜Ｃ１８アルキル硫酸塩の、Ｃ８〜Ｃ１８脂肪アルコールポリエーテル硫酸塩の、エトキシ化Ｃ４〜Ｃ１２アルキルフェノール（エトキシ化：エチレンオキシド１〜５０ｍｏｌ／ｍｏｌ）の硫酸半エステルの、Ｃ１２〜Ｃ１８スルホ脂肪酸アルキルエステル、例えばＣ１２〜Ｃ１８スルホ脂肪酸メチルエステルの、さらにＣ１２〜Ｃ１８アルキルスルホン酸の、およびＣ１０〜Ｃ１８アルキルアリールスルホン酸のアルカリ金属塩およびアンモニウム塩から選択されてもよい。前述の化合物のアルカリ金属塩が好ましく、特に好ましくはナトリウム塩である。
【０１５８】
アニオン性界面活性剤（成分（ｃ））の具体例は、一般式（Ｘ）
ＣｓＨ２ｓ＋１−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ−ＳＯ３Ｍ      （Ｘ）
（式中、
ｓは１０〜１８、好ましくは１２〜１４の範囲の数であり、さらにより好ましくはｓ＝１２であり、
ｔは１〜５、好ましくは２〜４の範囲の数、さらにより好ましくは３であり、
Ｍはアルカリ金属、好ましくはカリウム、さらにより好ましくはナトリウムから選択される）
による化合物である。
【０１５９】
変数ｓおよびｔは平均数であってもよく、したがって整数である必要はないが、式（Ｘ）による個々の分子においてｓとｔはいずれも整数を表す。
【０１６０】
好適なアニオン性界面活性剤（成分（ｃ））のさらなる例は石鹸、例えばステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、エーテルカルボン酸塩およびアルキルエーテル硫酸塩のナトリウムまたはカリウム塩である。
【０１６１】
一実施形態では、本発明の酵素調製物は水性であり、水を、いずれも酵素調製物の総質量に対して５質量％〜９５質量％の範囲、５質量％〜３０質量％の範囲、５質量％〜２５質量％の範囲または２０質量％〜７０質量％の範囲の量で含有する。前記酵素調製物は、有機溶媒を、酵素調製物の総質量に対して０質量％〜２０質量％の範囲の量で含有してもよい。一実施形態では、酵素調製物は、水を、いずれも酵素調製物の総質量に対して５質量％〜１５質量％の範囲の量で含有し、非有意量、例えば１質量％以下の有機溶媒を含有する。
【０１６２】
本発明の酵素調製物はアルカリ性であってもよく、または中性もしくはわずかに酸性のｐＨ価、例えば６〜１４、６．５〜１３、８〜１０．５または８．５〜９．０を示してもよい。
【０１６３】
酵素配合物の調製：
本発明は、酵素調製物を製造するための方法であって、少なくとも上記で開示された成分（ａ）と上記で開示された成分（ｂ）を混合する工程を含む方法に関する。
【０１６４】
成分（ｂ）は固体であってもよい。固体成分（ｂ）は、固体成分（ａ）に、両方が少なくとも１種の溶媒と接触する前に添加されてもよい。少なくとも１種の溶媒は、上記で開示された通りである。少なくとも１種の溶媒との接触により、少なくとも１種の分子成分（ａ）および少なくとも１種の分子成分（ｂ）が可溶化され、少なくとも１種の分子成分（ｂ）が安定化してもよい。一実施形態では、固体成分（ａ）および（ｂ）は相分離することなく少なくとも１種の溶媒に完全に溶解される。
【０１６５】
固体成分（ａ）は、固体または液体成分（ｂ）と混合される前に、少なくとも１種の溶媒に溶解されてもよい。一実施形態では、成分（ａ）は、成分（ｂ）と混合される前に少なくとも１種の溶媒に完全に溶解される。少なくとも１種の溶媒は上記で開示された通りである。
【０１６６】
成分（ｂ）は液体であってもよく、ここで少なくとも１種の酵素が上記で開示された液体酵素濃縮物に含まれていてもよい。液体成分（ｂ）は固体成分（ａ）で補完されてもよく、ここで固体成分（ａ）は液体成分（ｂ）に溶解する。一実施形態では、液体成分（ｂ）は水性であり、好ましくは発酵によって生じる。
【０１６７】
一実施形態では、上記で開示された成分（ｃ）が成分（ａ）および（ｂ）と混合され、ここで混合は１または複数の工程でなされることを特徴とする。
【０１６８】
酵素の安定化
本発明は、成分（ａ）を添加する工程によって成分（ｂ）を安定化する方法に関し、成分（ａ）および（ｂ）は上記で開示されたものである。一実施形態では、成分（ｂ）は液体である。一実施形態では、本発明は、成分（ａ）を添加する工程によって、少なくとも１種の界面活性剤の存在下で成分（ｂ）を安定化する方法に関し、成分（ａ）および（ｂ）ならびに少なくとも１種の界面活性剤は上記で開示されたものである。一実施形態では、本発明は、成分（ａ）を添加する工程によって成分（ｂ）を安定化する方法に関し、成分（ｂ）は少なくとも１種のリパーゼおよび少なくとも１種のプロテアーゼを含む。
【０１６９】
本発明はさらに、上記で開示された成分（ａ）および（ｂ）と１種または複数の配合物成分を、１または複数の工程で、指定されない順序で混合することを含む、液体配合物中で少なくとも１種の酵素を安定化する方法に関する。一実施形態では、液体配合物は洗剤配合物である。
【０１７０】
本発明は、成分（ｂ）の添加剤として成分（ａ）を使用する方法に関する。一実施形態では、成分（ａ）および（ｂ）は固体であり、成分（ｂ）は、固体成分（ａ）と（ｂ）の混合物と、少なくとも１種の溶媒が接触したときに安定化する。少なくとも１種の溶媒は、上記で開示された通りである。少なくとも１種の溶媒との接触により、少なくとも１種の分子成分（ａ）および少なくとも１種の分子成分（ｂ）が可溶化され、少なくとも１種の分子成分（ｂ）が安定化してもよい。一実施形態では、固体成分（ａ）および（ｂ）は、相分離することなく少なくとも１種の溶媒に完全に溶解する。
【０１７１】
酵素の安定化は、経時的な安定性（例えば、保存安定性）、熱安定性、ｐＨ安定性および化学的安定性に関してもよい。本明細書において「酵素安定性」という用語は、好ましくは、例えば保存中または操作中の時間の関数としての酵素活性の保持に関する。本明細書において「保存」という用語は、生成物または組成物が、製造された時間から最終適用において使用される時点まで保存されることを示すことを意図する。保存中の時間の関数としての酵素活性の保持を「保存安定性」と呼ぶ。
【０１７２】
経時的な酵素活性の変化を決定するために、時間ゼロ（すなわち、保存前）において所定の条件下で酵素の「初期酵素活性」が測定されてもよく、その後の特定の時点（すなわち、保存後）において「保存後の酵素活性」が測定されてもよい。
【０１７３】
保存後の酵素活性を初期酵素活性で除し、１００を乗じることによって「適用時に利用可能な酵素活性」（ａ％）が得られる。
【０１７４】
本発明による酵素は、その「適用時に利用可能な」酵素活性が、保存前の初期酵素活性と比較して１００％に等しいとき、安定である。酵素は、本発明において、その適用時に利用可能な酵素活性が、保存前の初期酵素活性と比較して少なくとも６０％，少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％である場合、安定といってもよい。
【０１７５】
一実施形態では、３７℃で３０日間保存した後に利用可能な脂肪分解活性は、保存前の初期脂肪分解活性と比較して少なくとも６０％である。
【０１７６】
１００％からａ％を減じることにより、保存前の初期酵素活性と比較した場合の「保存中の酵素活性の損失」が得られる。一実施形態では、本発明による酵素は、保存中に酵素活性が本質的に損失しない、すなわち、酵素活性の損失が、保存前の初期酵素活性と比較して０％に等しい場合に安定である。本発明において、酵素活性が本質的に損失しないとは、酵素活性の損失が、保存前の初期酵素活性と比較して３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満であることを意味してもよい。
【０１７７】
一実施形態では、３７℃で３０日間保存した後の脂肪分解活性の損失は、保存前の初期脂肪分解活性と比較して４０％未満である。
【０１７８】
本発明の一態様では、成分（ａ）は、液体酵素濃縮物に含まれる少なくとも１種の酵素の、保存中の酵素活性の損失を低減させるために使用される。本発明において酵素活性の損失の低減とは、酵素活性の損失が、保存前の初期酵素活性と比較して少なくとも５％，少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％低減されることを意味してもよい。
【０１７９】
一実施形態では、３７℃で３０日間保存した後の脂肪分解活性の損失は、成分（ａ）によって、保存前の初期脂肪分解活性と比較して少なくとも６０％低減される。
【０１８０】
一実施形態では、３７℃で３０日間保存した後のタンパク質分解活性の損失は、成分（ａ）によって、保存前の初期タンパク質分解活性と比較して少なくとも２０％低減される。
【０１８１】
酵素阻害剤によって阻害される酵素は、通常、前記酵素の阻害されていない酵素活性と比較して低減した酵素活性を示す。酵素阻害剤を添加した後に測定され、初期酵素活性で除して１００を乗じた酵素活性は、本明細書において「残存酵素活性」（ｂ％）と呼ぶ場合がある。酵素は、本明細書において、保存前の初期酵素活性と比較して５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満の残存酵素活性（ｂ％）を示す場合、「安定化した」といってもよい。酵素は、阻害剤が遊離した後でその適用時に利用可能な酵素活性が、保存前の初期酵素活性と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％である場合、安定化したといってもよい。阻害剤は、本明細書において「酵素安定剤」と呼ぶ場合がある。
【０１８２】
配合プロセスに酵素調製物を使用する方法
一態様では、本発明は、洗剤配合物に配合される本発明の液体酵素調製物を使用する方法に関し、成分（ａ）および（ｂ）は、１または複数の工程で、指定されない順序で１種または複数の洗剤成分と混合される。
【０１８３】
本発明の一態様は、本発明の液体酵素調製物および１種または複数の洗剤成分を含有する洗剤配合物に関する。
【０１８４】
洗剤成分は、洗濯用白色布地、着色布地およびウールなどの所望の適用に応じて、タイプおよび／または洗剤配合物における量が変動する。選択される成分（複数可）はさらに、洗剤配合物の物理的形態（液体、固体、ゲル、パウチでまたは錠剤として提供される、など）によって異なる。例えば洗濯用配合物に選択される成分（複数可）はさらに、それらが関連する地域の慣習、使用される洗浄温度、洗濯機の機械的構造（縦軸型機対横軸型機）、洗浄サイクルあたりの水消費量などの態様、および水の平均硬度などの地理的特性によって異なる。
【０１８５】
個々の洗剤成分および洗剤配合物での使用法は当業者に公知である。好適な洗剤成分は、とりわけ、界面活性剤、ビルダー、ポリマー、アルカリ脱色系、蛍光漂白剤、石鹸泡抑制剤および安定剤、ヒドロトロープおよび腐食阻害剤を含む。さらなる例は、例えば、「ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  （Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｃａｋｅ，Ｄｉｓｈｗａｓｈｉｎｇ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｌｉｑｕｉｄ  ＆  Ｐａｓｔｅ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｃｌｅａｎｉｎｇ  Ｐｏｗｄｅｒ  ＆  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｉｅｄ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｐｏｗｄｅｒ）」、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  Ｉｎｄｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＩＲＩ）、第６版（２０１５年）に記載されている。当業者のための他の参考書籍は、「Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ」、Ｓｏｌｖｅｒｃｈｅｍ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１６年であってもよい。
【０１８６】
洗剤成分は、本発明の酵素調製物に含まれる成分に加えて存在することが理解される。本発明の酵素調製物に含まれる成分もまた洗剤成分である場合、成分が洗剤配合物に所望される目的に有効であるような濃度に調整が必要な場合がある。
【０１８７】
洗剤成分は、洗剤配合物の最終適用において１より多くの機能を有してもよく、したがって本明細書において特定の機能の文脈で言及される如何なる洗剤成分も、洗剤配合物の最終適用において他の機能を有してもよい。洗剤配合物の最終適用での特定の洗剤成分の機能は、通常、洗剤配合物中のその量、すなわち洗剤成分の有効量によって異なる。
【０１８８】
「有効量」という用語は、有効な染み除去および／または有効なクリーニング条件（例えば、ｐＨ、発泡量）をもたらすための個々の成分の量、光学的利点（例えば、光学的増白、色素移行阻害）を有効にもたらすための特定の成分の量および／または処理を有効に補助する（処理、保存および使用中に物理的特性を維持する、例えば、レオロジー調整剤、ヒドロトロープ、乾燥剤）ための特定の成分の量を含む。
【０１８９】
一実施形態では、洗剤配合物は２種より多くの洗剤成分の配合物であり、ここで少なくとも１種の成分は染み除去に有効であり、少なくとも１種の成分は最適クリーニング条件をもたらすのに有効であり、少なくとも１種の成分は洗剤の物理的特性を維持するのに有効である。
【０１９０】
本発明の洗剤配合物は、溶媒に溶解された成分（ａ）および成分（ｂ）を含んでもよい。溶解されたとは、洗剤配合物全体に溶解されたことを意味してもよい。溶解されたとは、成分（ａ）および成分（ｂ）が、カプセル化されていてもよい本発明の液体酵素調製物の一部であることを意味してもよい。カプセル化液体酵素調製物は、液体洗剤配合物の一部または固体洗剤配合物の一部であってもよい。
【０１９１】
本発明の一実施形態では、洗剤配合物は、いずれも液体洗剤配合物の総質量に対して、０．５〜２０質量％、特に１〜１０質量％の成分（ｂ）および０．０１％〜１０％の成分（ａ）、より詳細には０．０５〜５質量％、最も詳細には０．１質量％〜２質量％の成分（ａ）を含有する。
【０１９２】
本発明の洗剤配合物は、ビルダー、ポリマー、香料および染料から選択される少なくとも１種の化合物を含んでもよい。
【０１９３】
本発明の一実施形態では、成分（ａ）は、所望のビルダー機能をもたらすのに有効な量で、洗剤配合物中でビルダーとして使用される。成分（ａ）をビルダーとして使用することにより、含水量が高いまたは低い、調整可能な洗剤配合が可能になる。含水量が低い液体洗剤配合物では、成分（ａ）以外のさらなるビルダー物質は使用されなくてもよい。本明細書において、含水量が低いとは、いずれも洗剤配合物の総質量に対して、少なくとも≦３０質量％、少なくとも≦２０質量％、少なくとも≦１０質量％または少なくとも≦５質量％を意味し得る。
【０１９４】
一実施形態では、洗剤配合物は、成分（ａ）とは異なる１種または複数のビルダーを含有してもよい。
【０１９５】
本発明の洗剤配合物は、ゼオライト、リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ポリマービルダーまたはイミノジスクシネートのアルカリ金属塩などのアミノカルボン酸塩、例えばＩＤＳ−Ｎａ４、さらに、ニトリロ三酢酸（「ＮＴＡ」）、メチルグリシン二酢酸（「ＭＧＤＡ」）、グルタミン酸二酢酸（「ＧＬＤＡ」）、エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）またはジエチレントリアミン五酢酸（「ＤＴＰＡ」）などの、しかしこれらに限定されない、成分（ａ）とは異なる洗剤ビルダーを１〜４０質量％含有してもよい。好ましいアルカリ金属塩は、カリウム塩および特にナトリウム塩である。
【０１９６】
洗剤ビルダーのさらなる例は、例えば、２０〜９０モル％のＮ原子が少なくとも１個のＣＨ２ＣＯＯ−基を有するポリエチレンイミンなどの錯化基を含むポリマーおよび上記金属イオン封鎖剤のそれぞれのアルカリ金属塩、特にそれらのナトリウム塩である。
【０１９７】
好適なポリマーのさらなる例は、ポリアルキレンイミン、例えばポリエチレンイミンおよびポリプロピレンイミンである。ポリアルキレンイミンはそれ自体で使用されてもよく、ポリアルコキシル化、例えばエトキシ化またはプロポキシ化誘導体として使用されてもよい。ポリアルキレンイミンは、分子１つあたり少なくとも３個のアルキレンイミン単位を含有する。
【０１９８】
本発明の一実施形態では、前記アルキレンイミン単位は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキレンジアミン単位、例えば１，２−プロピレンジアミン、好ましくはα、ω−Ｃ２〜Ｃ１０アルキレンジアミン、例えば１，２−エチレンジアミン、１，３−プロピレンジアミン、１，４−ブチレンジアミン、１，５−ペンチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン（１，６−ヘキシレンジアミンとも称される）、１，８−ジアミンまたは１，１０−デカンジアミン、さらにより好ましくは１，２−エチレンジアミン、１，３−プロピレンジアミン、１，４−ブチレンジアミンおよび１，６−ヘキサンジアミンである。
【０１９９】
本発明の別の実施形態では、前記ポリアルキレンイミンは、ポリアルキレンイミン単位、好ましくはポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン単位から選択される。
【０２００】
本発明の文脈での「ポリエチレンイミン」という用語は、ポリエチレンイミンホモポリマーだけでなく、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ構造要素とともに他のアルキレンジアミン構造要素、例えばＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ構造要素、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ構造要素、ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ構造要素、ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ構造要素または（ＮＨ−（ＣＨ２）８−ＮＨ構造要素を含有するが、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ構造要素がモル割合に関して大部分であるポリアルキレンイミンも指す。好ましいポリエチレンイミンは、モル割合に関して大部分、例えばすべてのアルキレンイミン構造要素に関して６０ｍｏｌ％以上の量、より好ましくは少なくとも７０ｍｏｌ％の量であるＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ構造要素を含有する。特別な実施形態では、ポリエチレンイミンという用語は、ポリエチレンイミン単位１個あたり、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨとは異なるアルキレンイミン構造要素を１個のみまたはゼロ個有するポリアルキレンイミンを指す。
【０２０１】
本発明の文脈での「ポリプロピレンイミン」という用語は、ポリプロピレンイミンホモポリマーだけでなく、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ構造要素とともに他のアルキレンジアミン構造要素、例えばＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ構造要素、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ構造要素、ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ構造要素、ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ構造要素または（ＮＨ−（ＣＨ２）８−ＮＨ構造要素を含有するが、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ構造要素がモル割合に関して大部分であるポリアルキレンイミンも指す。好ましいポリプロピレンイミンは、モル割合に関して大部分、例えば、すべてのアルキレンイミン構造要素に関して６０ｍｏｌ％以上の量、より好ましくは少なくとも７０ｍｏｌ％の量であるＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ構造要素を含有する。特別な実施形態では、ポリプロピレンイミンという用語は、ポリプロピレンイミン単位１個あたり、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨとは異なるアルキレンイミン構造要素を１個のみまたはゼロ個有するポリアルキレンイミンを指す。
【０２０２】
分岐は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２基または（ＣＨ２）３−ＮＨ２−基などの、しかしこれらに限定されないアルキレンアミノ基であってもよい。より長い分岐は、例えば−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）２または−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）２基であってもよい。高度に分岐したポリエチレンイミンは、例えばポリエチレンイミンデンドリマーまたは分岐度が０．２５〜０．９５の範囲、好ましくは０．３０〜０．８０の範囲、特に好ましくは少なくとも０．５である関連する分子である。分岐度は、例えば１３Ｃ−ＮＭＲまたは１５Ｎ−ＮＭＲ分光法によって、好ましくはＤ２Ｏで決定することができ、以下の通り定義される：
ＤＢ＝Ｄ＋Ｔ／Ｄ＋Ｔ＋Ｌ
ここでＤ（樹状）は第三級アミノ基の分率に対応し、Ｌ（直鎖状）は第二級アミノ基の分率に対応し、Ｔ（末端）は第一級アミノ基の分率に対応する。
【０２０３】
本発明の文脈では、分岐ポリエチレンイミン単位は、ＤＢが０．２５〜０．９５の範囲、特に好ましくは０．３０〜０．９０％の範囲、非常に特に好ましくは少なくとも０．５であるポリエチレンイミン単位である。好ましいポリエチレンイミン単位は、分岐をほとんどまたは全く示さないものであり、したがって主に直鎖状の、または直鎖状ポリエチレンイミン単位である。
【０２０４】
本発明の文脈では、ＣＨ３基は分岐とみなされない。
【０２０５】
本発明の一実施形態では、ポリアルキレンイミンは、１〜１０００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇの範囲、好ましくは１０〜５００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇ、最も好ましくは５０〜３００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇの第一級アミン価を有してもよい。第一級アミン価は、ＡＳＴＭ  Ｄ２０７４−０７によって決定することができる。
【０２０６】
本発明の一実施形態では、ポリアルキレンイミンは、１０〜１０００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇの範囲、好ましくは５０〜５００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇ、最も好ましくは５０〜５００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇの第二級アミン価を有してもよい。第二級アミン価は、ＡＳＴＭ  Ｄ２０７４−０７によって決定することができる。
【０２０７】
本発明の一実施形態では、ポリアルキレンイミンは、１〜３００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇの範囲、好ましくは５〜２００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇ、最も好ましくは１０〜１００ｍｇ  ＫＯＨ／ｇの第三級アミン価を有してもよい。第三級アミン価は、ＡＳＴＭ  Ｄ２０７４−０７によって決定することができる。
【０２０８】
本発明の一実施形態では、第三級Ｎ原子のモル割合は、１５Ｎ−ＮＭＲ分光法によって決定される。第三級アミン価と１３Ｃ−ＮＭＲ分光法による結果が一致しない場合、１３Ｃ−ＮＭＲ分光法で得られた結果が優先される。
【０２０９】
本発明の一実施形態では、前記ポリアルキレンイミンの平均分子量Ｍｗは、２５０〜１００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは最大５０，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは８００〜最大２５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。ポリアルキレンイミンの平均分子量Ｍｗは、１．５質量％の水性ギ酸を溶出液として、および架橋ポリヒドロキシエチルメタクリレートを固定相として、それぞれの中間ポリアルキレンイミンのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定されてもよい。
【０２１０】
前記ポリアルキレンイミンは遊離していてもアルコキシル化されていてもよく、前記アルコキシル化はエトキシ化、プロポキシ化、ブトキシ化および前述の少なくとも２種の組合せから選択される。エチレンオキシド、１，２−プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドと１，２−プロピレンオキシドの混合物が好ましい。少なくとも２種のアルキレンオキシドの混合物が適用される場合、段階的に反応させてもよく、同時に反応させてもよい。
【０２１１】
本発明の一実施形態では、アルコキシル化ポリアルキレンイミンは、単位あたり少なくとも６個の窒素原子を有する。
【０２１２】
本発明の一実施形態では、ポリアルキレンイミンは、ＮＨ基１個あたり２〜５０モルのアルキレンオキシド、好ましくはＮＨ基１個あたり５〜３０モルのアルキレンオキシド、さらにより好ましくはＮＨ基１個あたり５〜２５モルのエチレンオキシドまたは１，２−プロピレンオキシドまたはそれらの組合せでアルコキシル化される。本発明の文脈では、ＮＨ２単位は２個のＮＨ基として計数される。好ましくは、すべてまたはほぼすべてのＮＨ基がアルコキシル化されており、検出可能な量のＮＨ基は残されない。
【０２１３】
そのようなアルコキシル化ポリアルキレンイミンの製造に応じて、分子量分布は狭くても広くてもよい。例えば、多分散度Ｑ＝Ｍｗ／Ｍｎは１〜３の範囲、好ましくは少なくとも２である、または３より大きく最大２０、例えば３．５〜１５、さらにより好ましくは４〜５．５の範囲であってもよい。
【０２１４】
本発明の一実施形態では、アルコキシル化ポリアルキレンイミンの多分散度Ｑは、２〜１０の範囲である。
【０２１５】
本発明の一実施形態では、アルコキシル化ポリアルキレンイミンは、ポリエトキシ化ポリエチレンイミン、エトキシ化ポリプロピレンイミン、エトキシ化α、ω−ヘキサンジアミン、エトキシ化およびプロポキシ化ポリエチレンイミン、エトキシ化およびプロポキシ化ポリプロピレンイミンならびにエトキシ化およびポリプロポキシ化α、ω−ヘキサンジアミンから選択される。
【０２１６】
本発明の一実施形態では、アルコキシル化ポリエチレンイミンの平均分子量Ｍｎ（数平均）は、ＧＰＣで決定して２，５００〜１，５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲、好ましくは最大５００，０００ｇ／ｍｏｌである。
【０２１７】
本発明の一実施形態では、平均アルコキシル化ポリアルキレンイミンは、それぞれ平均分子量Ｍｎ（数平均）が８００〜５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であるエトキシ化α、ω−ヘキサンジアミンならびにエトキシ化およびポリプロポキシ化α、ω−ヘキサンジアミンから選択される。
【０２１８】
緩衝液の例はモノエタノールアミンおよびＮ，Ｎ，Ｎ−トリエタノールアミンである。
【０２１９】
消泡剤の例はシリコーンである。
【０２２０】
香料の例は、サリチル酸ベンジル、Ｌｉｌｉａｌ（登録商標）として市販されている２−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）２−メチルプロピオナールおよびヘキシルシンナムアルデヒドである。
【０２２１】
染料の例は、Ａｃｉｄ  Ｂｌｕｅ  ９、Ａｃｉｄ  Ｙｅｌｌｏｗ  ３、Ａｃｉｄ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２３、Ａｃｉｄ  Ｙｅｌｌｏｗ  ７３、Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  １０１、Ａｃｉｄ  Ｇｒｅｅｎ  １、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｇｒｅｅｎ  ７およびＡｃｉｄ  Ｇｒｅｅｎ  ２５である。
【０２２２】
液体洗剤配合物は、有機溶媒、保存剤、粘度調整剤およびヒドロトロープから選択される少なくとも１種の化合物を含んでもよい。
【０２２３】
本発明の一実施形態では、液体洗剤配合物は、液体洗剤配合物の総質量に対して０．５〜２５質量％の量の有機溶媒を含有する。特に、本発明の液体洗剤配合物がパウチなどで提供される場合、液体洗剤配合物の総質量に対して８〜２５質量％の有機溶媒が含有されてもよい。有機溶媒は上記で開示されたものである。
【０２２４】
本発明の液体洗剤配合物は、上記で開示されたものから選択される１種または複数の保存剤を、液体洗剤配合物への微生物の混入を回避するのに有効な量で含有してもよい。
【０２２５】
本発明の一実施形態では、液体洗剤配合物は、１種または複数の粘度調整剤を含有する。好適な粘度調整剤の非限定的な例は、寒天、カラギーン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸塩、ペクチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ゼラチン、ローカストビーンガム、架橋ポリ（メタ）アクリレート、例えばビス−（メタ）アクリルアミドで架橋されたポリアクリル酸、さらにケイ酸、モンモリロナイト、ゼオライト、デキストリンおよびカゼインなどの、しかしこれらに限定されない粘土を含む。粘度調整剤は、所望の粘度をもたらすのに有効な量で含有されてもよい。
【０２２６】
本発明の一実施形態では、液体洗剤配合物は、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコールなどの有機溶媒、および限定することなく、通常条件下で水混和性であるさらなる有機溶媒であってもよい１種または複数のヒドロトロープを含有する。好適なヒドロトロープのさらなる例は、トルエンスルホン酸の、キシレンスルホン酸の、およびクメンスルホン酸のナトリウム塩である。ヒドロトロープは、水に対して限定された溶解度を示す化合物の溶解を容易にする、または可能にする量で含有されてもよい。
【０２２７】
本明細書において、「洗剤配合物」または「クリーニング配合物」は、汚れた材料をクリーニングするために指定された配合物を意味する。クリーニングは、洗濯および硬質表面クリーニングを含む。本発明による汚れた材料は、布地および／または硬質表面を含む。
【０２２８】
「洗濯」という用語は、家庭洗濯と工業洗濯の両方に関し、布地を、本発明の洗剤配合物を含有する溶液で処理するプロセスを意味する。洗濯プロセスは、家庭用または工業用洗浄機などの技術デバイスを使用することによって行ってもよい。代替的に、洗濯プロセスは手作業で行ってもよい。
【０２２９】
「布地」という用語は、糸（編物または機織りに使用される天然または合成繊維から作製されるより糸）、糸中間体、繊維、不織材料、天然材料、合成材料を含む任意の布地材料、ならびにこれらの材料から作製される布（繊維を織ること、編むことまたはフェルト状にすることによって作製される布地）、例えば衣類（布地から作製される任意の衣服製品）、生地および他の製品を意味する。
【０２３０】
「繊維」という用語は、天然繊維、合成繊維およびそれらの混合物を含む。天然繊維の例は、植物（亜麻、ジュートおよび綿など）またはコラーゲン、ケラチンおよびフィブロインなどのタンパク質を含む動物起源のもの（例えば、絹、羊毛ウール、アンゴラ、モヘア、カシミア）である。合成起源の繊維の例は、Ｓｐａｎｄｅｘ（登録商標）またはＬｙｃｒａ（登録商標）などのポリウレタン繊維、ポリエステル繊維、エラストフィン（ｅｌａｓｔｏｆｉｎ）などのポリオレフィンまたはナイロンなどのポリアミド繊維である。繊維は単一繊維またはニットウェア、織布または不織布などの布地の一部であってもよい。
【０２３１】
「硬質表面クリーニング」という用語は、本明細書では硬質表面のクリーニングと定義され、硬質表面は床、家具、壁、衛生陶器、ガラス、カトラリーまたは食器を含む金属表面などの家庭内の任意の硬質表面を含んでもよい。
【０２３２】
「食器洗浄」という用語は、食器を洗浄する任意の形態、例えば手作業によるまたは自動食器洗浄を指す。食器洗浄は、これらに限定されないが、プレート、カップ、グラス、ボウルなどの瀬戸物のすべての形態、スプーン、ナイフ、フォークおよび配膳用具などのカトラリーのすべての形態、ならびに陶器、メラミン、金属、陶磁器、ガラスおよびアクリル製品などのプラスチック製品のクリーニングを含む。
【０２３３】
さらなる使用
本発明は、成分（ａ）および（ｂ）ならびに１種または複数の洗剤成分を含む洗剤配合物と染みを接触させる工程を含む、染みを除去するための方法に関する。一実施形態では、洗剤配合物は、本発明の酵素調製物を含む。一実施形態では、方法は、脂肪を含む染みの除去に関する。
【０２３４】
脂肪は、融解温度に応じて脂肪、グリースまたは油として細分類することができる。油は通常、室温で液体である。グリースは室温で油より粘度が高く、ペースト状といってもよい。
【０２３５】
一実施形態では、脂肪を含む染みの除去は、温度≦４０℃で、特に温度≦３０℃で行われる。
【実施例】
【０２３６】
本発明を実施例によってさらに例示する。
【０２３７】
全般の注釈：パーセンテージは、別様に具体的に述べられない限り、質量パーセントである。
【０２３８】
アセチルコリン（Ａ．１２）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。対イオンは塩化物イオンであった。
【０２３９】
（Ａ．１４）の前駆体は、トリメチルアミンのエトキシ化でＨＣｌを使用する代わりに直接、または炭酸水素コリンをメタンスルホン酸と反応させることによって生成することができる。Ｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  Ｄａｔａ、２００７年、５２  １２８０〜１２８５のＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕらを参照されたい。
【０２４０】
Ｉ．塩（成分（ａ））の合成
留去した水の量に基づき、およびＩＲ分光法によって、エステル化反応が完了したことが示され得る。
【０２４１】
９０％のメタンスルホン酸は、１０％の水と９０％のメタンスルホン酸の混合物を指す。
【０２４２】
Ｉ．１  本発明の塩（Ａ．１）の合成：
２２５ｇ（１．５モル）の量の酒石酸を、７５質量％の塩化コリン水溶液２８０ｇ（１．５モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１５ｇの量の９０質量％の水性メタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２００ｇのジエチレングリコールで希釈した。６１７ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで７．８ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．１）が得られた。
【０２４３】
Ｉ．２  本発明の塩（Ａ．２）の合成：
１５０ｇの量の酒石酸（１．０モル）を、７５質量％の塩化コリン水溶液３７４ｇ（２．０モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１５ｇの量の９０質量％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２００ｇのジエチレングリコールで希釈した。６０７ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで８．７ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．２）が得られた。
【０２４４】
Ｉ．３  本発明の塩（Ａ．３）の合成：
２１０ｇの量のクエン酸一水和物（１．０モル）を、７５質量％の塩化コリン水溶液３７４ｇ（２．０モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１８ｇの量の９０質量％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２００ｇのジエチレングリコールで希釈した。６０７ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで１０．３ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．３）が得られた。
【０２４５】
Ｉ．４  本発明の塩（Ａ．４）の合成：
２１０ｇの量のクエン酸一水和物（１．０モル）を、７５質量％の塩化コリン水溶液５６１ｇ（３．０モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１８ｇの量の９０質量％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２７０ｇのジエチレングリコールで希釈した。８６８ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで９．６ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．４）が得られた。
【０２４６】
Ｉ．５  本発明の塩（Ａ．５）の合成：
２１０ｇの量のクエン酸一水和物（１．０モル）を、７５質量％のメタンスルホン酸コリン水溶液４８５ｇ（２．０モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１８ｇの量の９０質量％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２００ｇのジエチレングリコールで希釈した。６６３ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで１２．５ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．５）が得られた。
【０２４７】
Ｉ．６  本発明の塩（Ａ．６）の合成：
９８，１ｇの量の無水マレイン酸（１．０モル）を、乾燥物質としてのメタンスルホン酸コリン３６３ｇ（２．０モル）と混合した。混合物をロータリーエバポレーターで１３５℃に加熱した。１時間の混合後、１２ｇの量のメタンスルホン酸（純粋）を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間の混合後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２００ｇのジエチレングリコールで希釈した。６５３ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで８．９ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．６）が得られた。
【０２４８】
Ｉ．７  本発明の塩（Ａ．７）の合成：
２１０ｇの量のクエン酸一水和物（１．０モル）を、７０質量％の塩化ベータ−メチルコリン水溶液４３７ｇ（ＨＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）３Ｃｌ、２．０モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１８ｇの量の９０質量％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２００ｇのジエチレングリコールで希釈した。６７６ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで１２．３ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．７）が得られた。
【０２４９】
Ｉ．８  本発明の塩（Ａ．８）の合成：
１０５ｇの量のクエン酸一水和物（０．５モル）を、７０質量％の塩化ベータ−メチルコリン水溶液３２７ｇ（１．５モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１３ｇの量の９０質量％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを１７０ｇのジエチレングリコールで希釈した。４７１ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで２１．７ｇのトリエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．８）が得られた。
【０２５０】
Ｉ．９  本発明の塩（Ａ．９）の合成：
２１０ｇの量のクエン酸一水和物（１．０モル）を、７０質量％の塩化ベータ−ｎ−プロピルコリン水溶液５２０ｇ（２．０モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１８ｇの量の９０％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２５０ｇのプロピレングリコールで希釈した。７７４ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで１１．９ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．９）が得られた。
【０２５１】
Ｉ．１０  本発明の塩（Ａ．１０）の合成：
２１０ｇの量のクエン酸一水和物（１．０モル）を、７０％の塩化ジメチルモノブチルコリン水溶液５２０ｇ（２．０モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで４５分以内に水を除去した。１８ｇの量の９０％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２００ｇのプロピレングリコールで希釈した。７８８ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで１１．４ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．１０）が得られた。
【０２５２】
Ｉ．１１  本発明の塩（Ａ．１１）の合成：
１０５ｇの量のクエン酸一水和物（０．５モル）を、６０質量％の塩化ジメチルｎ−オクチルコリン水溶液３９７ｇ（１．０モル）に溶解した。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで９０分以内に水を除去した。９．５ｇの量の９０％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを２００ｇのプロピレングリコールで希釈した。４７０ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート２００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで８．９ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．１１）が得られた。
【０２５３】
Ｉ．１３  本発明の塩（Ａ．１３）の合成：
８５ｇの量の没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、０．５モル）を、７５質量％のメタンスルホン酸コリン水溶液１２１ｇ（０．５モル）に分散させた。ロータリーエバポレーター（２−ｌ−フラスコ）にて、オイルバス温度１００〜１２０℃、５０〜８０ｍｂａｒで９０分以内に水を除去した。８ｇの量の９０％のメタンスルホン酸を添加し、圧力８００ｍｂａｒで温度を１４５℃に上げた。１時間のロータリーエバポレーション後、１４５℃でさらに４．５時間かけて水を除去しながら、圧力を継続的に１０ｍｂａｒまで下げた。薄黄色がかった物質が得られ、これを１００ｇのジエチレングリコールで希釈した。２７１ｇの量の黄色がかった液体が得られた。そのように得られた液体のアリコート１００ｇを、ｐＨ値６〜６．５（水中１０％）まで４．６ｇのエタノールアミンで中和した。本発明の塩（Ａ．１３）が得られた。
【０２５４】
比較塩：
Ｃ−（Ａ．１５）：塩化コリン、７５質量％水溶液、ＢＡＳＦ  ＳＥから市販
【０２５５】
Ｃ−（Ａ．１６）：
７５ｇの量（０．５モル）の酒石酸を、８０質量％の重炭酸コリン水溶液２０６ｇ（１．０モル）に少量ずつ溶解した（１５ｇ単位）。ＣＯ２の放出が止まるまで溶液を撹拌した。ロータリーエバポレーション（２−ｌ−フラスコ）によって、オイルバス温度１２０℃、１０ｍｂａｒで９０分以内に水を除去した。透明な物質が得られ、これを１５０ｇのジエチレングリコールで希釈した。３９０ｇの透明な溶液、Ｃ−（Ａ．１６）が得られた。エステル形成は検出できなかった。
【０２５６】
Ｃ−（Ａ．１７）：１０５ｇの量（０．５モル）のクエン酸一水和物を、８０質量％の重炭酸コリン水溶液２０６ｇ（１．０モル）に少量ずつ溶解した（２０ｇ単位）。ＣＯ２の放出が止まるまで溶液を撹拌した。ロータリーエバポレーション（２−ｌ−フラスコ）によって、オイルバス温度１２０℃、１０ｍｂａｒで９０分以内に水を除去した。透明な物質が得られ、これを１５０ｇのジエチレングリコールで希釈した。４１２ｇの透明な溶液、Ｃ−（Ａ．１７）が得られた。エステル形成は検出できなかった。
【０２５７】
Ｃ−（Ａ．１８）：１０５ｇの量（０．５モル）のクエン酸一水和物を、８０質量％の重炭酸コリン水溶液３０９ｇ（１．５モル）に少量ずつ溶解した（２０ｇ単位）。ＣＯ２の放出が止まるまで溶液を撹拌した。ロータリーエバポレーション（２−ｌ−フラスコ）によって、オイルバス温度１２０℃、１０ｍｂａｒで９０分以内に水を除去した。透明な物質が得られ、これを１５０ｇのジエチレングリコールで希釈した。４９７ｇの透明な粘性溶液、Ｃ−（Ａ．１８）が得られた。エステル形成は検出できなかった。
【０２５８】
Ｃ−（Ａ．１９）：クエン酸一水和物
【０２５９】
Ｃ−（Ａ．２０）：クエン酸の一ナトリウム塩
【０２６０】
Ｃ−（Ａ．２１）：クエン酸の二ナトリウム塩
【０２６１】
Ｃ−（Ａ．２２）：クエン酸の三ナトリウム塩
【０２６２】
Ｃ−（Ａ．１９）、Ｃ−（Ａ．２０）、Ｃ−（Ａ．２１）およびＣ−（Ａ．２２）は、洗剤配合物に使用される公知のビルダー化合物である。
【０２６３】
ＩＩ．適用試験
ＩＩ．１  液体配合物
低水分液体洗剤配合物では水をジエチレングリコールまたはＤＰＧなどのグリコールで置換するため、溶解度は必須である。塩（Ａ．１）〜（Ａ．１１）およびＣ−（Ａ．１６）〜Ｃ−（Ａ．１８）はそれぞれ、ジエチレングリコールおよび／またはジプロピレングリコールに可溶性であるため、水なしで配合可能である。
【０２６４】
それぞれ５０ｇのＣ−（Ａ．１９）、Ｃ−（Ａ．２０）、Ｃ−（Ａ．２１）およびＣ−（Ａ．２２）をフラスコで１００ｇのジエチレングリコールと合わせ、撹拌しながら３０分間１００℃で加熱した。熱源を取り除き、得られた白色懸濁液を１０時間かけて周囲温度に冷却した。得られたスラリーを濾過し（ペーパーフィルター）、濾過ケーキを５０ｇのイソプロパノールで２回洗浄した。単離された化合物Ｃ−（Ａ．１９）、Ｃ−（Ａ．２０）、Ｃ−（Ａ．２１）およびＣ−（Ａ．２２）を重量測定によって決定したところ、水の非存在下では、Ｃ−（Ａ．１９）、Ｃ−（Ａ．２０）、Ｃ−（Ａ．２１）およびＣ−（Ａ．２２）は溶解度が不十分であるため使用不可能であることが示された。濾過ケーキとして以下の量が得られた：Ｃ−（Ａ．１９）：４４．０ｇ；Ｃ−（Ａ．２０）：４５．８ｇ；Ｃ−（Ａ．２１）：４７．２ｇ；Ｃ−（Ａ．２２）：４８．２ｇ。
【０２６５】
ＩＩ．２  酵素安定性
リパーゼおよびプロテアーゼの水中での保存安定性を、３７℃で評価した。
【０２６６】
ベース試験配合物を、表１による成分を混合してベース配合物Ｉ〜ＶＩを作製することによって製造した。
【０２６７】
それぞれの塩（成分（ａ））または妥当な場合、比較化合物を、表１に示される量でそれぞれのベース配合物に添加した。
【０２６８】
酵素（成分（ｂ））を、表１に示される量でそれぞれのベース配合物に添加した。表１に示される酵素の量は、活性タンパク質を指す。どちらの酵素活性が測定されるかに応じて、リパーゼまたはプロテアーゼのいずれかを添加した。
【０２６９】
Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ（ＣＡＳ−Ｎｏ．９００１−６２−１、ＥＣ−Ｎｏ．２３２−６１９−９）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０２７０】
Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）１６．０Ｌ（ＣＡＳ−Ｎｏ．９０１４−０１−１、ＥＣ−Ｎｏ．２３２−７５２−２）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０２７１】
水を添加して１００までの残部を満たした。
【０２７２】
【表１】
2021504541.tif 000008
【０２７３】
(B.1):n-C18-アルキル-(OCH2CH2)25-OH
(B.2):C10-C18-アルキルポリグリコシド(alkylpolygycoside)ブレンド
(B.3):C10-C12-アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
(B.4):クメンスルホン酸ナトリウム
(B.5):ラウレス硫酸ナトリウム- n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na
(B.6):n-C12H25(CH3)2N→O
**本発明の化合物を用いない比較試験では、これらを同量のジエチレングリコールで置き換えた。
【０２７４】
リパーゼの活性：
表２に示される特定の時点におけるＬｉｐｏｌａｓｅの活性を、吉草酸ｐニトロフェノール（１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００中２．４ｍＭのｐＮＰ−Ｃ５）を基質として用いて決定した。４０５ｎｍにおける吸光度を、５分間にわたって２０℃で３０秒ごとに測定した。時間依存吸光曲線の傾き（４０５ｎｍでの１分あたりの吸光度増加）は、リパーゼの活性に正比例する。
【０２７５】
表２は、３７℃で１〜３０日間保存した後に測定した、液体配合物中のリパーゼ活性を示す。表２に示される脂肪分解活性値は、時間０において参照配合物で決定された１００％値を参照して計算した。
【０２７６】
配合物の命名法は以下の通りである：ピリオド前のローマ数字はベース配合物を表し、アラビア数字は塩のタイプを表す（Ａ．＃  本発明の塩（成分（ａ））；Ｃ−（Ａ．＃）比較化合物）。ゼロ（「０」）：塩ではなくジエチレングリコール。
【０２７７】
【表２】
2021504541.tif 000009
2021504541.tif 000010
【０２７８】
プロテアーゼの活性：
表３に示される特定の時点におけるＳａｖｉｎａｓｅの活性を、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ、簡潔にはＡＡＰＦ）を基質として用いて決定した。タンパク質分解切断によってｐＮＡを基質分子から切断し、黄色の遊離ｐＮＡを遊離させ、これをＯＤ４０５を測定することによって決定した。測定は２０℃で行った。
【０２７９】
表３は、３７℃で１〜３０日間保存した後に測定した、液体配合物中のプロテアーゼ活性を示す。表３に示されるタンパク質分解活性値は、時間０において参照配合物で決定された１００％値を参照して計算した。
【０２８０】
配合物の命名法は以下の通りである：ピリオド前のローマ数字はベース配合物を表し、アラビア数字は塩のタイプを表す（Ａ．＃  本発明の塩（成分（ａ））；Ｃ−（Ａ．＃）比較化合物）。ゼロ（「０」）：塩ではなくジエチレングリコール。
【０２８１】
【表３】
2021504541.tif 000011
【０２８２】
ＩＩ．３  布地クリーニング試験
２つのタイプの試験布のクリーニングにおける配合物の洗剤性能試験を行った。試験生地試料は、ＣＦＴ処理によるタンパク質性成分および脂肪成分を含有する複合汚れを含み、さらに試験生地試料は脂肪／微粒子タイプの汚れを含んだ。
【０２８３】
試験は以下の通り実施した：それぞれサイズが２．５×２．５ｃｍの、２辺がポリエステルキャリアに縫い付けられた８枚の汚れた標準布パッチを含む複合染みモニターを、ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒで２．５ｇの綿布および５ｇ／Ｌの液体試験洗濯洗剤とともに洗浄した。表４。
【０２８４】
条件は以下の通りであった：デバイス：ＳＤＬ  Ａｔｌａｓ、Ｒｏｃｋ  Ｈｉｌｌ、米国製Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−Ｍｅｔｅｒ、洗浄用液体：２５０ｍｌ、洗浄時間：６０分、洗浄温度：３０℃。水硬度：２．５ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｃａ：Ｍｇ：ＨＣＯ３  ４：１：８
【０２８５】
布対液体比  １：１２。洗浄サイクルの後、複合染みモニターを水ですすぎ、続いて周囲温度で１４時間にわたって乾燥した。
【０２８６】
以下の予め汚れた試験布を使用した：
ＣＦＴ  Ｃ−Ｓ−１０：綿上のバター
ＣＦＴ  Ｃ−Ｓ−６２：綿上のラード、着色
ＣＦＴ  Ｃ−Ｓ−６８：綿上のチョコレートアイスクリーム
ＥＭＰＡ  １１２：綿上のココア
ＥＭＰＡ  １４１／１：綿上の口紅
ＥＭＰＡ  １２５：ｔｅｎｓｉｄ用モニター
ｗｆｋ２０Ｄ：ポリエステル／綿混合布上の顔料および皮脂タイプの脂肪
ＣＦＴ  Ｃ−Ｓ−７０：チョコレートムース
ｗｆｋ  ＝  ｗｆｋ試験用布  ＧｍｂＨ、Ｋｒｅｆｅｌｄ
ＥＭＰＡ  ＝  Ｓｗｉｓｓ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ
ＣＦＴ  ＝  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｂ．Ｖ
【０２８７】
色測定を使用してクリーニングの総レベルを評価した。球状反射率分光計（Ｄａｔａｃｏｌｏｒ、米国製ＳＦ５００型、波長範囲３６０〜７００ｎｍ、光学的形状ｄ／８°）をＵＶカットオフフィルターとともに使用して、４６０ｎｍでのモニターの染みの反射率値を測定した。この場合、ＣＩＥ−Ｌａｂ色空間分類を利用して、モニターの染み８種について、洗浄前後に明度Ｌ＊、赤−緑軸の値ａ＊および黄−青軸のｂ＊値を測定して平均した。色値の変化（ΔＥ）値は、以下の等式：
ΔＥ＝ΔＤｅｌｔａ  ａ＊２＋ΔＤｅｌｔａ  ｂ＊２＋＋ΔＤｅｌｔａ  Ｌ＊２
で色評価ツールによって自動的に定義および計算され、ΔＥは達成されたクリーニング効果の尺度である。すべての測定を６回反復し平均数を得た。ΔＥ値が高いほど良好なクリーニングを示すことに留意されたい。技術者であれば１単位の差を検出することができる。非専門家は容易に２単位を検出することができる。結果を表５に示す。
【０２８８】
Ｒｗ＝洗浄後の汚れの反射率
ＲＯ＝汚れ前の反射率
【０２８９】
ビルダーによる洗浄性の増大は次の通り計算した：本試験では各生地について合計６回の反復試験を実行した；９０〜９５％の統計的信頼水準を計算した。
【０２９０】
試験配合物を、表１４による成分を混合して配合物ＶＩＩ〜ＸＩＩＩを作製することによって製造した。
【０２９１】
それぞれの塩（成分（ａ））または妥当な場合、比較化合物を、表４に示される量でそれぞれのベース配合物に添加した。
【０２９２】
Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌを、妥当な場合、表４に示される量でそれぞれのベース配合物に添加した。
【０２９３】
Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）１６．０Ｌを、妥当な場合、表４に示される量でそれぞれのベース配合物に添加した。
【０２９４】
水を添加して１００までの残部を満たした。
【０２９５】
【表４】
2021504541.tif 000012
【０２９６】
(B.1):n-C18-アルキル-(OCH2CH2)25-OH
(B.2):C10-C18-アルキルポリグリコシドブレンド
(B.3):C10-C12-アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
(B.4):クメンスルホン酸ナトリウム
(B.5):ラウレス硫酸ナトリウム- n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na
(B.6):n-C12H25(CH3)2N→O
**本発明の化合物を用いない比較試験では、これらを同量のジエチレングリコールで置き換えた。
【０２９７】
塩（成分（ａ））による洗浄性の増大は次の通り計算した：本試験では各生地について合計６回の実施例を実行した；＞９０％の統計的信頼水準を計算した。表５は、上記で言及された複合染みモニターのΔＥの概要を示す。ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒ試験を、２カ月間３７℃の保存温度で保存した、新たに製造した配合物（ｔ０）を用いて実行した。概算として、３７℃での１週間は２０℃での３  １／２週間に等しい。
【０２９８】
【表５】
2021504541.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月27日(2019.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分（ａ）：一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０であり、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルおよびフェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
による少なくとも１種の塩、
成分（ｂ）：ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素、
ならびに
任意に成分（ｃ）：成分（ａ）とは異なる酵素安定剤、保存剤ならびに好ましくは非イオン性、両性およびアニオン性界面活性剤から選択される界面活性剤から選択される少なくとも１種の化合物
を含有する、液体酵素調製物。
【請求項２】
成分（ａ）がハロゲン化物イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、乳酸イオンおよびメタンスルホン酸イオンから選択される対イオンを有する、請求項１に記載の酵素調製物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）による化合物のＲ２がすべてメチルである、請求項１または２に記載の酵素調製物。
【請求項４】
前記酵素調製物の総質量に対して０．１〜３０質量％の範囲の量で成分（ａ）を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項５】
成分（ａ）が、不純物として化合物（ａ’）：
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−ＯＨ    Ｒ１−ＣＯＯ−      （ａ’）
（式中、変数Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、ｎおよびｍは対応する成分（ａ）のものと同じである）
を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項６】
ホウ素含有化合物およびペプチドアルデヒドから選択される少なくとも１種の酵素安定剤を含む成分（ｃ）を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素調製物。
【請求項７】
少なくとも
成分（ａ）：一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０であり、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
の化合物である少なくとも１種の塩
ならびに
成分（ｂ）：ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素
を混合する工程を含む、酵素調製物を製造するための方法。
【請求項８】
ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素を、一般式（Ｉ）、
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０であり、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
の少なくとも１種の塩を添加する工程によって、液体酵素調製物中で安定化する方法。
【請求項９】
前記酵素が、好ましくは非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤およびアニオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種の界面活性剤の存在下で安定化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）、
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０であり、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
の少なくとも１種の塩を、ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素の添加剤として使用する方法であって、前記塩および前記酵素が固体であり、前記酵素の安定化が、前記塩および前記酵素が少なくとも１種の溶媒と接触するときに生じる、方法。
【請求項１１】
洗剤配合物に配合される請求項１〜６に記載の液体酵素調製物を使用する方法であって、請求項１〜６に記載の酵素調製物が１または複数の工程で１種または複数の洗剤成分と混合される、方法。
【請求項１２】
成分（ａ）：一般式（Ｉ）
（Ｒ２）３Ｎ＋−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ３）（Ｒ４）−（Ｏ−Ｘ）ｍ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１  Ａ−      （Ｉ）
（式中、
ｎは１〜１２から選択され、
ｍは０であり、
Ｒ１は直鎖状または分岐状のＣ１〜Ｃ１０アルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールから選択され、Ｒ１は、１個もしくは複数のヒドロキシル基、または妥当な場合、部分的にまたは完全に中和されたＣ＝ＯもしくはＣＯＯＨ基を有してもよく、
Ｒ２は同じであるかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルから選択され、
Ｒ３およびＲ４は同じであるかまたは異なり、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ＸはＣ２〜Ｃ４アルキレンであり、
Ａ−は無機または有機対アニオンである）
による少なくとも１種の塩、
成分（ｂ）：ヒドロラーゼ（ＥＣ３）から選択される、好ましくはリパーゼ（ＥＣ３．１．１）およびエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）の群から、より好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）およびサブチリシン型プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）の群から選択される少なくとも１種の酵素、
任意に成分（ｃ）：好ましくは上記で開示されるホウ素含有化合物から選択される、より好ましくは上記で開示されるフェニルボロン酸（ＰＢＡ）またはその誘導体から選択される、最も好ましくは４−ホルミルフェニルボロン酸（４−ＦＰＢＡ）である、成分（ａ）とは異なる少なくとも１種の酵素安定剤、ならびに
少なくとも１種の洗剤成分
を含む、液体洗剤配合物。
【請求項１３】
脂肪を含む染みを除去するための方法であって、染みを請求項１２に記載の洗剤配合物と接触させる工程を含み、前記洗剤配合物の成分（ｂ）に含まれる少なくとも１種の酵素が、好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）の群からの少なくとも１種のリパーゼ（ＥＣ３．１．１）を含む、方法。
【請求項１４】
染みが温度≦４０℃で布地から除去される、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
2021504541.tif 000014
2021504541.tif 000015
2021504541.tif 000016