(57)【要約】本発明は「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」を含有する抗体組成物Ａと、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」を含有する抗体組成物Ｂと、を含む肺癌診断用免疫学的組成物；これを用いてヒトの生物学的試料で肺癌を診断する方法、並びにこれを用いた肺癌診断用キットを提供する。本発明による肺癌診断用組成物及び肺癌診断方法は、非侵襲的生物学的試料において肺癌０〜IV期が発病したか否かを９０％以上の特異度と７５％以上の感度で診断することができ、特に肺癌初期に濃度が急激に増加する自己抗体を利用するため、初期肺癌０〜I期が発病したか否かを７６％以上の感度で診断することができる。
2021517250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子及び抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカーを含有する抗体組成物Ａと、
抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子及び抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカーを含有する抗体組成物Ｂと、
を含む肺癌診断用免疫学的組成物。
【請求項２】
前記測定マーカーは発色酵素、蛍光物質、蛍光ビーズ、放射性アイソトープ、及びコロイドからなる群から 選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１記載の肺癌診断用免疫学的組成物。
【請求項３】
前記測定マーカーは、蛍光物質から選択されることを特徴とする、請求項２記載の肺癌診断用免疫学的組成物。
【請求項４】
ヒトの生物学的試料において、請求項１記載の肺癌診断用免疫学的組成物を使用する肺癌診断方法であって、
（ａ）「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」と「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」とを含む抗体組成物Ａを利用して、前記生物学的試料中の「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」の有無または濃度を測定する段階；
（ｂ）「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」と「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」とを含む抗体組成物Ｂを利用して、前記生物学的試料中の「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」の有無または濃度を測定する段階；及び
（ｃ）前記（ａ）で得られた濃度及び前記（ｂ）で得られた濃度との比率から、前記生物学的試料で正常と肺癌を判定する段階
を含む、肺癌診断方法。
【請求項５】
前記（ａ）において、抗体組成物Ａに含有された「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」が生物学的試料中の「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」と結合して「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」複合体を形成させて、「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」の有無または濃度を測定することを特徴とする、請求項４記載の肺癌診断方法。
【請求項６】
前記（ｂ）において、抗体組成物Ｂに含有された「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」が生物学的試料中の「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」と結合して「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原」：「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」複合体を形成させて、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」の有無または濃度を測定することを特徴とする、請求項４記載の肺癌診断方法。
【請求項７】
前記（ｃ）において、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」複合体と、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原」：「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」複合体との比率を利用して前記生物学的試料で正常と肺癌を判定することを特徴とする、請求項４記載の肺癌診断方法。
【請求項８】
前記生物学的試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、脳脊髄液、及び細胞液からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項４記載の肺癌診断方法。
【請求項９】
前記（ａ）及び（ｂ）で形成された抗原−抗体の複合体は、固形支持体に固定されることを特徴とする、請求項４記載の肺癌診断方法。
【請求項１０】
前記固形支持体は、９Ｇメンブレンまたは９ＧＤＮＡメンブレンを含むことを特徴とする、請求項９記載の肺癌診断方法。
【請求項１１】
前記抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体に特異的な抗原は、ＣＹＦＲＡ２１−１タンパク質であることを特徴とする、請求項４記載の肺癌診断方法。
【請求項１２】
前記測定マーカーは、発色酵素、蛍光物質、蛍光ビーズ、放射性アイソトープ、及びコロイドからなる群から選択されたいずれか一つであるを特徴とする、請求項４記載の肺癌診断方法。
【請求項１３】
前記測定マーカーは、蛍光物質から選択されることを特徴とする、請求項１２記載の肺癌診断方法。
【請求項１４】
請求項１記載の肺癌診断用免疫学的組成物及びバイオチップを含む肺癌診断用キット。
【請求項１５】
前記バイオチップは、９Ｇメンブレンまたは９ＧＤＮＡメンブレンを含むことを特徴とする、請求項１４記載の肺癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明は自己抗体−抗原結合体を利用した肺癌診断用免疫学的組成物、これを用いた肺癌診断方法及びこれを含む肺癌診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は国際的に年間１００万名が死亡することと知られている。去る数十年間診断及び治療技術が開発されてきたが、特別な自覚症状がなく、かつ大部分進行性の癌または他の部位に転移された状態で発見されており、肺癌患者の完治率は３０％以下で予後が非常に良くない。
【０００３】
このような肺癌であるものの、早期診断ができれば生存率を８０％以上に画期的に増加させることができるが、現在肺癌診断のためにはイメージング法（Ｘ−ｒａｙ、ＣＴ、ＭＲＩなど）への依存度が高い方であり、生化学的指標として使用可能な物質は発見された例が少ない。
【０００４】
現在肺癌診断のためにバイオマーカーという名前で提示された物質が存在するが、依然として十分な特異度（specificity）と感度（sensitivity）を示していない。
【０００５】
したがって、国内外的に急速に増加している肺癌の有病率に係わって先進国を中心に肺癌バイオマーカー及び診断キットの開発の源泉技術の確保は必ず必要であり、肺癌を早期（０期〜I期）に発見しうる新しい肺癌診断方法の開発が急がれる実情である。
【０００６】
肺癌の診断方法には次の三つがある：
１）イメージング法（Ｘ−ｒａｙ、ＣＴ、ＭＲＩ）：現在肺癌診断のためにはイメージング法への依存度が高い方であるが、肺癌を早期診断するには感度及び特異度が良くない。
２）組職検査：組職検査方法として、 喀痰細胞診検査 、気管支内視鏡検査、細針吸引生検 、縱隔鏡検査などがあり、生検組職を要する病理学的・細胞学的検出方法であって、侵襲的であり、かつ繰り返し測定しにくいという短所がある。
３）腫瘍マーカー検査：悪性腫瘍を診断する非侵襲的な診断方法であって、予後予測および治療効果の判定において良好な因子として広く用いられている。とりわけ、ＣＹＦＲＡ２１−１は、サイトケラチン１９フラグメントであり、１９９３年に肺癌マーカーとして提示されて以後、ずっとその有用性に関する研究が続けられており、多くの研究において非小細胞性肺癌のマーカーとしての価値を認められている。しかし、ほとんどの腫瘍マーカーは、濃度が一定以上になると癌と判断し、そうでなければ正常と判断する基準（ｃｕｔ  ｏｆｆ）値を利用するため、正常人と癌患者とを区分する正確性においては限界がある。
【０００７】
正常基準値を超えたとしても、癌であると確信できず、正常基準値以下であるとしても癌ではないともいえない。それがゆえ癌を確定診断するためには組職検査などの精密検査が必要である。
【０００８】
腫瘍マーカー検査は、抗原検出方法を基本としており、腫瘍マーカーに対する研究が持続的に行われてきたが、腫瘍マーカー検査のみでは血液中における腫瘍マーカーの量的変化が癌病期０期〜III期までは非常に小さく現われ、IV期の段階で量的な差が現われるので、量的変化が微々たる腫瘍マーカーである抗原のみを利用した検査だけでは８９％の特異度及び４３％の感度で低く現われるから正常と癌を区分しにくく、特に癌０期〜I期の段階では正常と癌の区分が極めて難しい。
【０００９】
したがって正常と癌を区分するためには、正常と、癌が発生した場合とにおいて、血液中における量的変化が非常に大きく現われる新しい腫瘍マーカー（ｍａｒｋｅｒ）及びこれを用いた新しい検出及び診断方法が必要となった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
抗原に特異的に反応する自己抗体は、癌が発生すると量的増加が現われるが、癌の病期初期（０〜I期）では免疫系が活発になるため自己抗体の量的増加が最も大きく現われ、正常である場合に比べ５〜１０倍以上の増加幅を示す。
【００１１】
本発明は正常に比して癌である場合に血液中の量的増加が非常に大きく現われる自己抗体を測定して正常と癌とを区分する方法を開発しようとした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために、本発明は、抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子及び、抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカーを含有する抗体組成物Ａと、抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子及び抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカーを含有する抗体組成物Ｂと、を含む肺癌診断用免疫学的組成物を提供する。
また、前記課題を解決するために、本発明は、前述した肺癌診断用免疫学的組成物を利用してヒトの生物学的試料で肺癌を診断する方法を提供し、下記段階を含む：
（ａ）抗体組成物Ａを利用して、 ＣＹＦＲＡ２１−１抗原の濃度を測定する段階；
（ｂ）抗体組成物Ｂを利用して、 抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体の 濃度を測定する段階；及び
（ｃ）前記（ａ）で得られた濃度及び前記（ｂ）で得られた濃度との比率から、前記生物学的試料で正常と肺癌を判定する段階。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による肺癌診断用免疫学的組成物及び肺癌診断方法は、非侵襲的生物学的試料において、肺癌０〜IV期が発病したか否かを９０％以上の特異度と７５％以上の感度で診断することができ、特に肺癌初期に濃度が急激に増加する自己抗体を利用するため、初期肺癌０〜I期が発病したか否かを７６％以上の感度で診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】正常人と癌患者を対象として、本発明の自己抗体−抗原結合体及び抗原測定法を用いて得られた「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」と「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」との比率を示したグラフである。
【図２】「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」が生物学的試料中の「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」に結合して、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−Ｃｙ５」複合体を形成することを示す概念図である。
【図３】「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ヒトＩｇＧ抗体−Ｃｙ５」が生物学的試料中の「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原」に結合して、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」：「抗ヒトＩｇＧ抗体−Ｃｙ５」複合体を形成することを示す概念図である。
【図４】９ＧＤＮＡメンブレン上でＣＹＦＲＡ２１−１抗原の検出形態を示す。
【図５】９ＧＤＮＡメンブレン上で抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体の検出形態を示す図である。
【図６】正常及び肺癌病期別（０〜III期別）による癌抗原（Ａｇ）及び自己抗体（オート抗体、ＡＡｂ）の血液中の量的変化を示すグラフである。
【図７】抗原検査（ＥＬＩＳＡ方式）による抗原濃度グラフであって、正常人と癌患者とを区分しにくいことをを示す図である。
【図８】本発明による「自己抗体−抗原結合体」及び「抗原」の濃度グラフであって、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」及び「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」が別の領域で現われるので、正常人と癌患者とを容易に区分することができることを示す図である。
【図９】「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」と「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−Ｃｙ５」を含む抗体組成物Ａの概念図；及び「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ヒトＩｇＧ抗体−Ｃｙ５」を含む抗体組成物Ｂの概念図をそれぞれ示す。
【図１０】本発明による肺癌診断方法を９ＧＤＮＡメンブレン上で遂行した時、「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」が検出される過程を示す概念図である。
【図１１】本発明による肺癌診断方法を９ＧＤＮＡメンブレン上で遂行した時、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」が検出される過程を示す概念図である。
【図１２】本発明による肺癌診断用キットを９ＧＤＮＡメンブレンに適用した形態を示す図である。
【図１３】９ＧＤＮＡメンブレンに適用された肺癌診断用キットを検出し、読み取る過程を示す写真である。
【図１４】本発明による肺癌診断組成物を正常２００検体及び肺癌I〜IV期の５０検体に適用して肺癌感度を測定した病院の臨床結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子及び抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカーを含有する抗体組成物Ａと、抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子及び抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカーを含有する抗体組成物Ｂと、を含む肺癌診断用免疫学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明の一実施形態によれば、前記測定マーカーは、発色酵素、蛍光物質、蛍光ビーズ、放射性アイソトープ、及びコロイドからなる群から選択されたいずれか一つであることができ、望ましくは蛍光物質から選択されることができる。
【００１７】
また、本発明は、前述した肺癌診断用免疫学的組成物を用いてヒトの生物学的試料で肺癌を診断する方法を提供し、下記の段階を含む：
（ａ）「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」を含有する抗体組成物Ａを利用して、前記生物学的試料中の「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」の有無または濃度を測定する段階；
（ｂ）「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」を含油する抗体組成物Ｂを利用して、前記生物学的試料中の「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」の有無または濃度を測定する段階；及び
（ｃ）前記（ａ）で得られた濃度と、前記（ｂ）で得られた濃度との比率から、前記生物学的試料で正常と肺癌を判定する段階。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、前記（ａ）で形成された「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」複合体と、前記（ｂ）で形成された「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原」：「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」複合体との比率を利用して前記生物学的試料で正常と肺癌を判定することができる。
【００１９】
本発明は前述した肺癌診断用免疫学的組成物及びバイオチップを含む肺癌診断用キットを提供する。
【発明を実施のための形態】
【００２０】
本発明は、生物学的試料において、抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体及びＣＹＦＲＡ２１−１抗原の検出方法に関するものであり、また抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体とＣＹＦＲＡ２１−１抗原との比率を利用して０〜I期を含む肺癌を診断する診断用キットと診断方法に関する。
本発明の目的は、生体試料中のＣＹＦＲＡ２１−１抗原及びそれと結合された形態の抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体を測定し、それを利用する方法を提供するためのものである。
【００２１】
したがって、本発明の第１の目的は、抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子及び抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカーを含有する抗体組成物Ａと、抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子及び抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカーを含有する抗体組成物Ｂと、を含む肺癌診断用免疫学的組成物を提供することである。
本発明において、前記測定マーカー（detection marker）は発色、発光、蛍光などの形で検出されることができる。
本発明の一実施形態によれば、前記測定マーカーは蛍光物質、蛍光ビーズ、放射性アイソトープ、及びコロイドからなる群から選択されたいずれか一つであることができる。前述したコロイドは、一般的に肉眼測定のためのマーカーであることができ、例えばナノ金コロイドのようなナノ金属コロイドを使用してもよい。
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、前記測定マーカーは、蛍光物質から選択されることができ、例えば、シアニンＣｙ３（５７０ｎｍ放出）、Ｃｙ５（６７０ｎｍ放出）、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＲＥＤ６１０、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ、ＲＥＤ６７０、ＴＹＥ５６３、及びＮＥＤが用いられることができる 。
本発明の第２の目的は、前述した肺癌診断用免疫学的組成物を用いてヒトの生物学的試料で肺癌を診断する方法を提供することであり、下記の段階を含む：
（ａ）「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」を含油する抗体組成物Ａを利用して、前記生物学的試料中の「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」の濃度を測定する段階；
（ｂ）「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」を含有する抗体組成物Ｂを利用して、前記生物学的試料中の「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」の濃度を測定する段階；及び
（ｃ）前記（ａ）で得られた濃度と、前記（ｂ）で得られた濃度との比率から、前記生物学的試料で正常と肺癌を判定する段階。
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、前記（ａ）において、抗体組成物Ａに含有された「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」が生物学的試料中の「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」と結合して「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」複合体を形成させて、「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」の有無または濃度を測定することができる。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、前記（ｂ）において、抗体組成物Ｂに含有された「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」及び「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」が生物学的試料中の「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」と結合して「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原」：「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」複合体を形成させて、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」の有無または濃度を測定することができる。
本発明の一実施形態によれば、前記（ｃ）において、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−測定マーカー」複合体と、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」：「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原」：「抗ヒトＩｇＧ抗体−測定マーカー」複合体との比率を利用して、前記生物学的試料が正常状態であるか、それとも肺癌発病状態であるかを判定することができ、場合によって肺癌進行状態を判定することができる。
本発明の一実施形態によれば、前記（ｃ）において、「抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体」/「ＣＹＦＲＡ２１−１抗原」の比率が一定数値（ｃｕｔ  ｏｆｆ）、例えば１以上、望ましくは１．５以上、より望ましくは２以上、具体的に１〜４、もっと具体的には１．５〜３から選択され得る数値よりも高い場合、肺癌であると選別するか、又は肺癌の発病又は進行状態であると判定することができる。
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、前記生物学的試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、脳脊髄液、及び細胞液からなる群から選択されたいずれか一つであることができる。
【００２６】
本発明の一実施形態によれば、前記（ａ）及び（ｂ）で形成された抗原−抗体複合体は固形支持体に固定されることができる。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、前記固形支持体は９Ｇメンブレンまたは９ＧＤＮＡメンブレンを含むことができる。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、前記抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体に特異的な抗原は、ＣＹＦＲＡ２１−１タンパク質であることができる。
【００２９】
また、免疫複合体が「抗ＣＦＹＲＡ２１−１自己抗体−抗原」結合体にさらに 結合されることができる。前記「抗ＣＦＹＲＡ２１−１自己抗体−抗原」結合体は、ヒト自己抗体と抗原と結合体であり、抗ＣＦＹＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体に結合する分子は、抗ヒトＩｇＧ抗体である。
本発明は９ＧＤＮＡ技術（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２０１１，  ４７，  ７１０４）に基づくＤＡＧＯＮ技術（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１１， ４７， ７６１６）が適用されたプラットホームを利用して非侵襲的な方法である血液を用いた測定によって肺癌を０〜I期で発見することがにより、生存率を高けるとともに、生活の質を向上させることにその目的がある。
【００３０】
したがって、本発明の第３の目的は、前述した肺癌診断用免疫学的組成物及びバイオチップを含む肺癌診断用キットを提供することである。
【００３１】
本発明の一実施形態によれば、前記バイオチップは９Ｇメンブレンまたは９ＧＤＮＡメンブレンを含むことができる。
【００３２】
本発明において、用語「９Ｇメンブレン」とは、連続した９つのグアニンを有するオリゴ遺伝子が固定化された表面がカリックスアレーン誘導体に変性されたガラス繊維メンブレンを意味し、用語「９ＧＤＮＡメンブレン」とは、連続した９つのグアニンを有するオリゴ遺伝子が固定化されたガラス繊維メンブレンを意味する。「９Ｇメンブレン」及び「９ＧＤＮＡメンブレン」は、前述した９ＧＤＮＡ技術（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１１， ４７， ７１０４）に基盤を置いている。
【００３３】
以下、本発明を実施例及び図面を参照してより詳しく説明する。ただし本発明はこれらに限定されない。
【００３４】
本発明は正常に比して癌である場合に血液中の量的増加が非常に大きく現われる自己抗体を測定することで、抗原との量的比率を利用して正常と癌とを区分する方法を提供する。
【００３５】
肺癌が発生されれば血液中でを示す癌関連タンパク質であるＣＹＦＲＡ２１−１抗原と、該ＣＹＦＲＡ２１−１抗原に特異的に反応する抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体の量的増加が現われ、ここで抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体は、抗原と結合した形態である抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体として存在する。
【００３６】
本発明は癌０〜I期で量的増加がほとんどないＣＹＦＲＡ２１−１抗原と、量的増加の幅が非常に大きい抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体と結合した抗原結合体の量を正確に検出することで、これらの量的比率を利用して正常と癌を早期に発見することができる方法を提供する（図１参照）。
【００３７】
正常と癌を癌０〜I期の段階で区分するためには、生物学的試料中の抗原及び自己抗体の量的変化を正確に測定しなければならなく、試料中における如何なる干渉現象及び非特異的な反応があってはならない。
本発明において、公知の方法（韓国登録特許第１０−０８８３７６３号、第１０−１６８２３４７号）により製造された遺伝子が固定化されたガラス繊維を利用して干渉現象及び非特異的な反応のない肺癌診断用キットを製造し、それを使用する方法を提供する。
【００３８】
本発明の目的は、生体試料中のＣＹＦＲＡ２１−１抗原及びこれと結合された形態の抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体を測定し、それを利用する方法を提供することである。
本発明は、抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体及びＣＹＦＲＡ２１−１抗原を測定するための、蛍光免疫測定法に関する。詳しくは、本発明はヒトの生物学的試料において抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体及びＣＦＹＲＡ２１−１の抗原の有無及び比率を検定する、下記の段階を含む免疫測定法を提供する：
（ａ）抗体組成物Ａを利用してＣＹＦＲＡ２１−１抗原の有無または濃度を検定する段階：前記の段階では（抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子）及び（抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−Ｃｙ５）が生物学的試料中の（ＣＹＦＲＡ２１−１抗原）と結合して（抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子）：（ＣＹＦＲＡ２１−１抗原）：（抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−Ｃｙ５）複合体が形成される。（図２）
（ｂ）抗体組成物Ｂを利用して抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体の有無または濃度を検定する段階：前記の段階では（抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子）及び（抗ヒトＩｇＧ抗体−Ｃｙ５）が生物学的試料中の（抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体）と結合して（抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子）：（抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原）：（抗ヒトＩｇＧ抗体−Ｃｙ５）複合体が形成される。（図３）
（ｃ）前記で形成された（抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子）：（抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原）：（抗ヒトＩｇＧ抗体−Ｃｙ５）複合体と、（抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子）：（ＣＹＦＲＡ２１−１抗原）：（抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−Ｃｙ５）複合体との比率を利用して生物学的試料で正常と肺癌を判定する段階。
本発明は正常人と肺癌患者の血液、血漿のような非侵襲的生物学的試料を用いて 抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体と、ＣＹＦＲＡ２１−１抗原との比率を利用して９１．７％の特異度とI期７６％、II期８０％、III期７７％、IV期５０％の感度でI〜IV期肺癌が発病したか否かを診断することができる診断キット及びその使用方法を提供する。
【００３９】
特に、自己抗体が急激に増加する時期である癌病期０〜I期で７６％感度のレベルで肺癌の診断効果が高く現われるので、肺癌初期段階である０〜I期で肺癌診断に非常に有効である。
【００４０】
図６は正常及び肺癌病期別（０〜III期別）による肺癌腫瘍マーカーである癌抗原（Ａｇ）及び自己抗体（オート抗体、ＡＡｂ）の血液中における量的変化を示すグラフである。
【００４１】
図６を参照すれば、癌抗原（Ａｇ）は正常状態で肺癌０〜III期まで変化量が多くなく、肺癌がよほど進行された肺癌III〜IV期になってからこそ高い変化量を示すので、少なくとも肺癌０〜I期の初期段階では抗原検査だけでは正常状態と肺癌発病状態とを区分して診断することが容易でないことが分かる。これに対し、自己抗体（ＡＡｂ）は初期段階である肺癌０〜I期に正常状態に比べて５〜１０倍以上増加して明確な変化量を示すので、肺癌を初期（０〜I期）に診断することができることを示している。
【００４２】
本発明によれば、生物学的試料中の抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体とＣＹＦＲＡ２１−１抗原マーカーの増減を正確に検出できるように、抗体に遺伝子が結合された形態の「抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子」を用いており、溶液上で抗原−抗体−遺伝子複合体が形成された後、遺伝子が固定された固体基質及び抗原−抗体−遺伝子複合体が固定されるので、生物学的試料中における如何なる干渉現象や非特異的な反応なしに固定されることができ、これにより血液中のマーカーの量的変化を正確に測定することができる。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するために提供されるものであって、本発明を限定することを意図しない。
【実施例１】
【００４４】
ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子結合体の製造及び精製
ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子結合体に用いた物質は下記表１に示し 、使用したターゲット遺伝子（ＴＤ）の塩基配列は下記表２に示す
【００４５】
【表１】
2021517250.tif 000003
【００４６】
【表２】
2021517250.tif 000004
ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子結合体は、表１の物質を使用して公知の方法によって製造及び精製して。ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子結合体を濃度２ｍｇ／ｍｌで８０μl得た。（韓国登録特許第１０−１６８２３４７号、実施例１、図１参照）
【実施例２】
【００４７】
蛍光標識物質が付着した抗体−測定マーカー結合体の製造及び精製
測定マーカーとして蛍光物質を使用して「抗体−測定マーカー」結合体を製造したし、その製造に使用された物質を下記表３に示す。
【００４８】
【表３】
2021517250.tif 000005
【００４９】
【表４】
2021517250.tif 000006
表４には実施例１及び２で得られた生成物の濃度及び体積がそれぞれ記載されている。
【実施例３】
【００５０】
肺癌診断用抗体組成物Ａ及びＢの製造
表５に記載された物質を使用して、抗体組成物Ａ及びＢを製造した。抗体の濃度はいずれも３００μl／ｍｌに希釈して使用した。
【００５１】
【表５】
2021517250.tif 000007
５ｍｌのチューブ（ｔｕｂｅ）にそれぞれの構成物質を使用量によって添加して混合した。
【実施例４】
【００５２】
肺癌診断用オリゴ遺伝子の固定化及び９ＧＤＮＡメンブレンの製造
下記表６に探針遺伝子の塩基配列を示す。
【００５３】
【表６】
2021517250.tif 000008
肺癌診断用オリゴ遺伝子の固定化及び９ＧＤＮＡメンブレンの製造に使用した物質は、表６に示しており、公知の方法によって図９のように９ＧＤＮＡメンブレンを製造した。（韓国登録特許第１０−０８８３７６３号、実施例２及び３参照）
【実施例５】
【００５４】
ＣＹＦＲＡ２１−１抗原タンパク質及び抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体の検出
ＣＹＦＲＡ２１−１抗原タンパク質及び抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体の検出方法に関する概念は、図４及び図５に、その実験過程は図１０及び図１１に図式的に説明されている。
１）血液サンプル及び使用物質の準備
正常人と癌患者の血液サンプルは、正常２００検体、肺癌I〜IV期５０検体を用い、原子力病院（KOREA CANCER CENTER HOSPITAL）から入手した（IRB#KIRAMS2018-10-006、2018-06-016）サンプルを利用した。癌患者のサンプルは、組職検査において肺癌を確定診断された患者の血漿サンプルを利用した。正常人のサンプルは、健康検診に参加した正常人のサンプルを利用した。実験に使用した物質は下記表７に示している 。
【００５５】
【表７】
2021517250.tif 000009
【００５６】
２）サンプル混合及びインキュベーション
イ．ＣＹＦＲＡ２１−１抗原検出用抗原検出用０．２ｍｌサイズのマイクロチューブに標準物質２０μlを入れ、表７に示すように、準備した１００μlの抗体組成物Ａを混合して１１分間常温でインキュベーションした。
ロ．抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原検出用
自己抗体−抗原検出用０．２ｍｌサイズのマイクロチューブに標準物質２０ml を入れ、表７に示すように、準備した１００μlの抗体組成物Ｂを混合して１１分間常温でインキュベーションした。
３）試料負荷及び交雑反応
イ．ＣＹＦＲＡ２１−１抗原検出用
反応物１２０μlが入っている抗原検出用の０．２ｍｌサイズのマイクロチューブにＲ  ｂｕｆｆｅｒを６０μl添加した後、試料をすべて採取して、１8０μlを図１２に示す抗原検出用の９ＧＤＮＡメンブレンのサンプルポートにローディングした後、１１分間常温で交雑反応した。
ロ．抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原検出用
反応物１２０μlが入っている自己抗体−抗原検出用の０．２ｍｌサイズのマイクロチューブにＲ  ｂｕｆｆｅｒを６０μl添加後、試料をすべて採取して図１２に示す自己抗体−抗原検出用の９ＧＤＮＡメンブレンのサンプルポートに１８０μlをローディング後１１分間常温で交雑反応した。
４）洗浄及びスキャン
イ．ＣＹＦＲＡ２１−１抗原検出用
１８０μlのＷ  ｂｕｆｆｅｒを抗原検出用の９ＧＤＮＡメンブレンの洗浄ポートにローディング後、１１分間常温で洗浄してから、図１３に示したように１Ｄスキャナーを用いて読み出した 。
ロ．抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原検出用
１８０μlのＷ  ｂｕｆｆｅｒを自己抗体−抗原検出用の９ＧＤＮＡメンブレンの洗浄ポートにをローディング後、１１分間常温で洗浄してから、図１３に示したように１Ｄスキャナーを用いて読み出した。
５）結果の分析
５．１）ＣＹＦＲＡ２１−１抗原検出に対する蛍光感度の結果
抗体組成物Ａを用いて正常人と肺癌患者の血液サンプルに対するＣＹＦＲＡ２１−１抗原検出に対する蛍光感度を確認して下記表８に示している。
【００５７】
【表８】
2021517250.tif 000010
ＣＹＦＲＡ２１−１抗原に対する蛍光感度の平均値は、正常人の血液サンプルで２６７４５で現われ、肺癌患者の血液サンプルで１９９３５で現われることを確認した。
５．２）抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原検出に対する蛍光感度
抗体組成物Ｂを利用して正常人と肺癌患者の血液サンプルに対する抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原検出に対する蛍光感度を確認して下記表９に示す。
【００５８】
【表９】
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ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原に対する蛍光感度の平均値は正常人の血液サンプルで２６８６２で現われ、肺癌患者の血液サンプルで４７１６７で現われることを確認した。
５．３）血液サンプルで抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原／ＣＹＦＲＡ２１−１抗原の比率の確認
図７に示している ように、腫瘍マーカーＣＹＦＲＡ２１−１抗原検査だけでは正常と癌を区分することができない。大部分の癌関連抗原（腫瘍マーカー）は癌が発生すると血液中の量的増加が現われる。癌病期０〜III期までの量的変化が非常に小さく、IV期段階になってからこそ量的変化の差が現われるため、一般的に正常と癌との区分が難しく、特に癌０〜I期である場合には一層区分しにくい。
【００５９】
抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体は肺癌に対するＣＹＦＲＡ２１−１抗原が存在する時に特異的に反応する自己抗体であって、癌０〜I期でその量的増加が正常時に比べて５〜１０倍以上増加するようになる。
【００６０】
このため、正常と癌の区分において、抗ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原とＣＹＦＲＡ２１−１抗原との比率を利用して正常に比して一定数値（ｃｕｔ  ｏｆｆ）以上なら癌と判定することができる。
【００６１】
【表１０】
2021517250.tif 000012
蛍光感度の結果は表１０に示しており、癌病期による分析結果は図１４に示している 。ＣＹＦＲＡ２１−１自己抗体−抗原結合体／抗原の比率（Ｂ／Ａ）が、それぞれ正常人が１．０３、肺癌患者が２．１５で確認された。Ｂ／Ａの比率値のカットオフ １．５を基準に１．５以下は正常と判定し、１．５以上は肺癌と判定した。２００人の正常人に対して９１．７％の特異度を得ており、５０人の癌患者を対象としてI期７６％、II期８０％、III期７７％、IV期５０％の感度を得た。
自己抗体が急激に増加する時期である癌病期０〜I期では、７６％感度のレベルで効果が非常に大きく現われて、これによって肺癌早期診断用キット開発に有効であることを証明した。
【００６２】
本明細書でよく使われる用語に対する簡単な説明を次のように付記するが、これらは本発明の理解を助けるために提供されるもので、本発明の範囲を限定するか制限する意図で使われてはならない。
１．９Ｇメンブレン：連続した９個のグアニンが含まれたオリゴ遺伝子が固定化される表面がケルリックスアレン誘導体に変性されたガラス繊維メンブレン。
２．９ＧＤＮＡメンブレン：連続した９個のグアニンが含まれたオリゴ遺伝子が固定化されたガラス繊維メンブレン。
３．抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ、Ａｇ）：免疫反応を起こして抗体を生産させる物質、一般的に体内で異物として見なされる物質の総体。
４．ＣＹＦＲＡ２１−１抗原：肺癌関連腫瘍マーカー。
５．抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体−遺伝子：抗ＣＹＦＲＡ２１−１一次抗体に遺伝子が結合された抗体−遺伝子結合体。
６．抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体−Ｃｙ５：抗ＣＹＦＲＡ２１−１二次抗体にＣｙ５−ｄｙｅ（蛍光マーカー）が付着した抗体−蛍光マーカー結合体。
７．自己抗体（Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ、ＡＡｂ）：自分の体成分と特異的に反応する抗体を意味し、自己抗体またはオート抗体とも言う。
８．抗ＣＹＦＲＡ−２１−１自己抗体（ａｎｔｉ−ＣＹＦＲＡ２１−１Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ）：肺癌関連タンパク質であるＣＹＦＲＡ２１−１抗原に特異的に反応する抗体。
９．抗ＣＹＦＲＡ−２１−１自己抗体−抗原結合体：抗ＣＹＦＲＡ−２１−１自己抗体とＣＹＦＲＡ２１−１抗原とが結合された形態。
１０．抗ヒトＩｇＧ抗体（ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ）：ヒト抗体に特異的に反応する抗体。
１１．抗ヒトＩｇＧ抗体−Ｃｙ５：抗ヒトＩｇＧ抗体にＣｙ５−ｄｙｅ（蛍光マーカー）が付着した抗体−蛍光マーカー結合体。
【図１】
2021517250.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021517250.tif 000021
【図１０】
2021517250.tif 000022
【図１１】
2021517250.tif 000023
【図１２】
2021517250.tif 000024
【図１３】
2021517250.tif 000025
【図１４】
2021517250.tif 000026
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021517250.tif 000028
2021517250.tif 000029
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