(57)【要約】  本発明は、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を検出するための方法に関し、前記方法は、波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍに自然の電磁応答を有する前記株の少なくとも１つの細菌を前記範囲で照明することと、前記照明した細菌によって反射した、または前記照明した細菌を通じて透過した光強度を前記範囲内で獲得することと、前記範囲内で獲得した光強度に応じて、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定することとを含む。【選択図】図３
2021506288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌株のグラムタイプおよび発酵特性を検出するための方法であって、
−  波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍに自然の電磁応答を有する前記株の少なくとも１つの細菌を前記範囲で照明することと、
−  前記照明した細菌から反射した、または前記照明した細菌を通じて透過した光強度を前記範囲内で獲得することと、
−  前記範囲内で獲得した光強度に応じて、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定することと
を含む方法。
【請求項２】
グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光強度が発酵性グラム陰性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類を適用することを含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光強度がグラム陽性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類を適用すること、または、獲得した光強度がグラム陰性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類を適用することを含む、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光強度が酵母の光強度であるかどうかを予測する分類または菌株を酵母と区別する微生物学的試験を適用することをさらに含む、請求項１、２、または３に記載の検出方法。
【請求項５】
−  照明および獲得が、菌株のコロニーと、血液寒天培地、具体的にはコロンビアヒツジ血液である、前記コロニーが成長した栄養培地とを含む試料に対して直接行われ、
−  獲得した光強度が発酵性グラム陰性菌株の光強度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光強度がグラム陽性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類を適用することをさらに含む、
請求項２に記載の検出方法。
【請求項６】
獲得した光強度がグラム陽性菌株の光強度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光強度が酵母の光強度であるかどうかを予測する分類を適用することをさらに含む、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
−  獲得した光度がグラム陰性かつ発酵性菌株の光度であるかどうかを予測する分類が、グラム陰性かつ発酵性菌株の光度を、グラム陰性かつ非発酵性菌株、グラム陽性菌株、および酵母からなるグループの光度と区別する分類であり、
−  獲得した光強度がグラム陽性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類が、グラム陽性菌株の光強度を、陰性かつ非発酵性菌株および酵母からなるグループの光強度と区別する分類であり、
−  獲得した光度が酵母の光度であるかどうかを予測する分類が、酵母の光度を、グラム陰性かつ非発酵性菌株からなるグループの光度と区別する分類である、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
獲得した光強度が酵母の光強度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光強度がグラム陽性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類を適用することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
獲得した光強度がグラム陽性菌株の光強度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、光強度が発酵性グラム陰性菌株の光強度であるか、非発酵性グラム陰性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類を適用することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
−  獲得した光度が酵母の光度であるかどうかを予測する分類が、酵母の光度を、グラム陽性菌株、グラム陰性かつ非発酵性菌株、およびグラム陰性かつ発酵性菌株からなるグループの光度と区別する分類であり、
−  光強度がグラム陽性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類が、グラム陽性菌株の光強度を、グラム陰性かつ非発酵性菌株とグラム陰性かつ発酵性菌株との組合せの光強度と区別する分類であり、
−  光強度が、発酵性グラム陰性菌株または非発酵性グラム陰性菌株の光強度である場合の分類が、グラム陰性非発酵性菌株の光強度を、グラム陰性かつ発酵性菌株からなるグループの光強度と区別する分類である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
−  照明および獲得が、菌株のコロニーと、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ−Ｓｏｙ寒天である、前記コロニーが成長した栄養培地とを含む試料に対して直接行われ、
−  獲得した光度がグラム陽性菌株の光度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光度が酵母の光度であるかどうかを予測する分類を適用することをさらに含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
獲得した光強度が酵母の光強度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、光強度が発酵性グラム陰性菌株の光強度であるか、非発酵性グラム陰性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類を適用することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
−  光強度がグラム陽性菌株の光強度であるかどうかを予測する分類が、グラム陽性菌株の光強度を、グラム陰性かつ非発酵性菌株、グラム陰性かつ発酵性菌株、および酵母からなるグループの光強度と区別する分類であり、
−  獲得した光強度が酵母の光強度であるかどうかを予測する分類が、酵母の光強度を、陰性かつ非発酵性菌株、および陰性かつ発酵性菌株からなるグループの強度と区別する分類であり、
−  光強度が、発酵性グラム陰性菌株または非発酵性グラム陰性菌株の光強度である場合の分類が、グラム陰性非発酵性菌株の光強度を、グラム陰性かつ発酵性菌株からなるグループの光強度と区別する分類である、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
各分類が、範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍのハイパースペクトル画像から、および、所定の精度の閾値、またはチャネルの所定の最大数に達するまで、分類に使用されるスペクトルチャネルのセットを段階的に増加させることからなる手法に従って、学習される、請求項２から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第１の分類が、波長範囲４７０ｎｍ〜５００ｎｍおよび波長範囲５７５ｎｍ〜６４５ｎｍだけで光強度を区別する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項１６】
第２の分類が、波長範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍおよび波長範囲８５０ｎｍ〜８７５ｎｍだけに応じて、光強度を区別する、請求項３に記載の検出方法。
【請求項１７】
第２の分類が、波長範囲４１５ｎｍ〜５００ｎｍおよび波長範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍだけに従って、光強度を区別する、請求項５から７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１８】
光強度が、２４個以下の複数のスペクトルチャネルにおいて獲得される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１９】
光強度が、第１および第２の分類のそれぞれに対して５以下、好ましくは４以下の複数のスペクトルチャネルにおいて獲得される、請求項５から７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項２０】
光強度の獲得が、株の細菌のコロニーのハイパースペクトル画像またはマルチスペクトル画像の獲得を含み、光強度が、コロニーに対応する前記画像の少なくとも１つのピクセルに応じて判定される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項２１】
グラムタイプおよび発酵特性の判定が、コロニーのピクセルのセットの各ピクセルの光強度に応じて行われ、グラムタイプおよび発酵特性が、前記第１の検出の結果の多数決によって判定される、請求項２０に記載の検出方法。
【請求項２２】
多数決が、７０％以上のピクセル投票または単純な多数決である、請求項２１に記載の検出方法。
【請求項２３】
抗生物質に対する菌株のアンチバイオグラムを作るための方法であって、
−  菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定することと、
−  グラムタイプおよび選択した発酵特性に応じて、菌株、培地、および抗生物質の濃度を含む少なくとも１つの試料を提供することと、
−  試料中の前記株の成長に応じて、抗生物質に対する菌株の感受性を判定することと
を含み、
菌株のグラムタイプおよび発酵特性の判定が請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って行われる、方法。
【請求項２４】
抗生物質に対する菌株を識別するための方法であって、
−  菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定することと、
−  グラムタイプおよび選択した発酵特性に従って、少なくとも１つの比色媒質を選択することと、
−  前記媒質内で菌株を培養することと
を含み、
菌株のグラムタイプおよび発酵特性の判定が請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法によって行われる、方法。
【請求項２５】
菌株のグラムタイプおよび発酵特性を検出するためのシステムであって、
−  株の少なくとも１つの細菌を、波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで照明するように構成された照明と、
−  前記照明した細菌から反射した、または前記照明した細菌を通じて透過した光強度を、３９０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲で獲得するように構成されたセンサと、
−  ３９０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲で獲得した光強度に応じて、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定するように構成されたコンピュータユニットと
を備えるシステム。
【請求項２６】
請求項２から２２のいずれか一項に記載の方法を実行するように構成された、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記株の細菌のコロニーを含む試料と、前記コロニーが成長した栄養培地、詳細にはペトリ皿とを照明し、試料と栄養培地との画像を獲得するように構成された、請求項２５または２６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物分析の分野に関し、詳細には、微生物の特徴づけ、特に、酵母と細菌の識別、ならびに、後者のフレームワークの中で、これらのグラムタイプおよびこれらの発酵または非発酵特性の識別に関する。
【０００２】
都合のよいことに、本発明は、非発色、非蛍光発生、および無着色の栄養培地の中で成長した細菌または酵母コロニーのハイパースペクトルまたはマルチスペクトル画像の分析に適用される。
【背景技術】
【０００３】
病原微生物の分野では、微生物の特徴づけは、この微生物に感染した患者に対する処置を決定するために、微生物の種、および抗菌剤に対する微生物の感受性（または「アンチバイオグラム」）を識別することからなるのが好ましい。これを行うために、複雑な微生物学的方法が実験室において通常行われ、方法は、通常、微生物の界（例えば酵母または細菌）、および、細菌の背景では、細菌のグラムタイプ、または、細菌の発酵もしくは非発酵特性を含む微生物の他の性質を事前に知っている必要がある。実際、この情報は、微生物の種または微生物のアンチバイオグラムを最終的に判定するために、培地、または微生物に適合される抗菌剤の種類を選べるようにする。例えば、出願人によって市販されているＡＰＩ（登録商標）微生物識別ギャラリーを選ぶことは、微生物の界（例えば酵母対細菌）、または、識別されることになる菌株のグラムタイプの知識に基づく。同様に、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）２システムによって菌株のアンチバイオグラムを判定することは、前記株のグラムタイプおよび発酵または非発酵特性に従ってカードを選ぶことに基づく。識別されることになる微生物が酵母であるか細菌であるかに応じて異なるマトリックスを使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による識別を挙げることもできる。できる限り早くこの情報を知ることが、特に方法を加速すること、または使用される消耗品の数を減らすことによって、微生物学的方法を最適化できるようにする。
【０００４】
また、これらの性質の知識は、菌株の間違った肯定的識別を減らすのに役立つ。例として、出願人によって市販されているＣｈｏｍＩＤ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍの背景では、試験される菌株の発酵特性の知識は、サルモネラ属の識別を強化する。具体的には、サルモネラ属、発酵細菌と、シュードモナス属、非発酵細菌は両方、発色性基質を損なう。細菌が非発酵性であるかどうか知っていることは、追加の微生物学的試験を行わなくても、サルモネラ属を単純に排除できるようにする。
【０００５】
微生物の特徴を明らかにして、実験室における微生物学的方法を導くことに加えて、この情報には、臨床的有用性もある。具体的には、菌株のグラム分類は、例えば、菌のペプチドグリカンの割合といった、菌の細胞壁の特徴を明らかにできるようにし、細菌の分類に、または抗生物質に対する菌の感受性を第１の近似値として評価するために、使用される。２種類の細菌、すなわちグラム「陽性」およびグラム「陰性」の細菌がある。同様に、非発酵細菌、すなわちグルコースを異化できない細菌は、病原性細菌の中で特殊な位置を占めるということが観察される。実際、非発酵細菌には、抗生物質に対する高レベルの自然耐性があり、多くの院内感染に関与している。例は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびアシネトバクター属を含む。したがって、細菌の発酵または非発酵特性を素早く知ることは、第１線の抗生物質治療をさらに効果的に指図できるようにし、多剤耐性株の拡散の速度を遅くする。
【０００６】
歴史的に、上述の性質（界、グラム、および発酵性）のそれぞれは、専用の技法で取得される。例えば、菌株のグラムタイプは、「グラム染色」と呼ばれる手動技法で判定されたが、この技法は、多くの手動工程（固定、染色、媒染剤の塗布、洗浄、過剰染色（ｏｖｅｒ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）〜）を含み、したがって、実行に時間がかかる。したがって、細菌のグラムタイプの検出を自動化するため、特に、多くの試料を処理するために、様々な技法が開発されてきた。しかし、これらの技法は本質的に、そのグラムタイプを簡単に観察できるようにするために、細菌の電磁応答、または、細菌の環境を変化させ続ける。具体的には、第１の種類の技法は、顕微鏡のスライド上で細菌の細胞膜の染色を自動化することにあるが、グラムタイプの最終判定は、常に、技術者が顕微鏡の下のスライドを観察することによって行われる。したがって、この種類の技法は完全に自動化されるわけではなく、その上、自動化しにくい。実際、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との間の色の差は微妙である可能性があり、このことは、実験室の技術者の介入が依然として必要である理由を説明する。第２の種類の技法は、細菌の細胞膜のペプチドグリカンによって開始された酵素反応によって劣化する基質の存在下に細菌を置くことにある。この反応は、濃縮がグラムタイプの指標である発色団または蛍光物質を生み出す。これは、通常、細菌の発色性または蛍光発生性「ラベリング」と呼ばれる。この種類の先行技術の技法は、例えば、適切なデバイス（例えば分光計／蛍光計）を使用して、発色団／蛍光物質の光強度を測定し、次に、測定された強度を所定の閾値と、コンピュータで比較することによって自動化されることが可能であるが、それでも、特殊な、しばしば高価な発色団または蛍光発生基質の設計を必要とする。さらに、使用される技法がどのようなものであっても、細菌は、その自然状態を変更され（例えば、細菌が染料を含む、発色または蛍光マーカを固定した、等）、したがって、その後の特徴づけ試験（例えば、アンチバイオグラムの判定）のために、もはや使用されることが不可能である。
【０００７】
細菌の発酵または非発酵特性の判定について、判定は、通常、試験される菌株の発酵または非発酵特性に応じて色を変化させる発色培地の使用によって実行される。例えば、「Ｋｌｉｇｌｅｒ−Ｈａｊｎａ」試験は、培地上の株を成長させることからなり、ｐＨ、ラクトース、グルコース、チオ硫酸塩、および第一鉄イオンに応じて色を変化させる比色指標を含む。この媒質は、グルコースの異化によって細菌の発酵特性を検出し、ｐＨ指標の比色の遷移を生じる。菌株のトリブチリンエステラーゼの活動を試験するための媒質もあり、グラム陰性非発酵細菌の特徴づけを可能にする。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定するための方法を提供することであり、この方法は自動的なものであり、細菌の特性を判定するために、細菌、または細菌の培地のラベリングまたは染色を必要としない。
【０００９】
このために、本発明は、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を検出するための方法に関し、
−  波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍに自然の電磁応答を有する前記株の少なくとも１つの細菌を前記範囲で照明することと、
−  前記照明した細菌から反射した、または前記照明した細菌を通じて透過した光強度を前記範囲内で獲得することと、
−  前記範囲内で獲得した光強度に応じて、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定することと
を含む。
「自然の電磁」応答は、関心のある少なくとも波長範囲での照明への細菌の電磁応答を変化させる要素（染料、色原体、フルオロゲン、等）によって細菌が変更されないことを意味する。例えば、株のコロニーは、非発色、非蛍光栄養培地の中で成長し、照明／獲得は、コロニーの栄養培地の中に依然として存在するコロニーに対して直接的に行われる。
【００１０】
言い換えれば、波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで、細菌のグラムタイプ、および細菌の発酵または非発酵特性に特徴的な電磁特性を細菌が「自然に」有するということを、発明者は発見した。したがって、本発明による方法は、この特性を測定し、次に、そこから、細菌のグラムタイプおよび発酵特性を抽出することからなる。したがって、発色性または蛍光発生性の基質または染料を使用する必要はない。さらに、本発明による方法は、照明すること、スペクトルを測定すること、および、コンピュータ処理を含むこのスペクトルの処理を実行すること、からなるという点で速い。具体的には、本発明により、菌株がグラム陽性またはグラム陰性かつ発酵性であるか、グラム陰性かつ非発酵性であるかを、３９０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲を使用して判定することができ、この情報を知っているとが、例えば、上述のような実験室の微生物学的方法を最適化できるようにする。
【００１１】
グラムタイプおよび発酵特性の判定は、菌株の種または属または科の事前の判定を必要とせず、獲得した光強度から直接行われるということに留意されたい。具体的には、本発明の方法は、菌株の種が最初に識別され、次に、グラムタイプおよび発酵特性が種の知識から推定される方法とは異なる。種のレベルで菌株を識別する必要がないことには、グラムタイプおよび発酵特性を予測するためのモデルを大いに単純化するという長所がある。実際、種のレベルでの識別は、クラス数が非常に多い予測モデルを必要とする。例えば、尿路感染症の場合、約５０個の細菌種に含まれる菌株による症例の９９％で、感染症が引き起こされるということが推定される。したがって、種のレベルでの識別は、約５０個のクラスでの予測を必要とする。本発明によれば、予測モデルは、４つのクラスに限定されることが可能である。
【００１２】
都合のよいことに、方法は、微生物のコロニーが成長した寒天栄養培地を含むペトリ皿に応用される。例えば、栄養培地は、酵母または細菌を含むか、含むと疑われる生物学的試料、例えば尿、で植え付けられ、次に、コロニーを成長させるために培養される。コロニーが栄養培地で検出されるとすぐ、本発明の方法に従って特徴づけられる。したがって、方法は、栄養培地の植え付け後の、いかなる物質移動または試薬追加も必要としない。例えば、コロニーの検出は、一定間隔でペトリ皿の画像を撮影し、コロニー検出アルゴリズムを実行することによって、自動的に行われる。
【００１３】
都合のよいことに、本発明による方法は、菌株の自己蛍光の分析ではなく、前記株の反射または吸光度の分析に基づく。具体的には、一般に照明は強すぎて、ハイパースペクトル画像またはマルチスペクトル画像で自己蛍光を観察することができない。
【００１４】
また、本発明は、抗生物質の菌株のアンチバイオグラムを作るための方法に関し、
−  菌株のグラムタイプおよび発酵特性の判定と、
−  グラムタイプおよび選択した発酵特性に応じて、菌株、培地、および抗生物質の濃度を含む少なくとも１つの試料を提供することと、
−  試料中の前記株の成長に応じて、抗生物質に対する菌株の感受性を判定することと
を含み、
菌株のグラムタイプおよび発酵特性の判定が、前述の種類の方法に従って行われる。
【００１５】
また、本発明は、抗生物質に対する菌株を識別するための方法に関し、
−  菌株のグラムタイプおよび発酵特性の判定と、
−  グラムタイプおよび選択した発酵特性に応じた少なくとも１つの比色媒質の選択と、
前記媒質内で菌株を培養することと
を含み、
菌株のグラムタイプおよび発酵特性の判定が、前述の種類の方法に従って行われる。
【００１６】
また、本発明は、たった今、説明された方法を実行するためのシステムに関する。詳細には、本発明は、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を検出するための検出システムに関し、
−  株の少なくとも１つの細菌を波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで照明するように構成された照明と、
−  前記照明した細菌から反射した、または前記照明した細菌を通じて透過した光強度を３９０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲で獲得するように構成されたセンサと、
−  範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで獲得した光強度に応じて、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定するように構成されたコンピュータユニットと
を備える。
【００１７】
１つの実施形態によれば、システムは、前記株の細菌のコロニーを含む試料、および前記コロニーが成長した栄養培地、詳細にはペトリ皿を照明し、試料および栄養培地の画像を獲得するように構成される。
【００１８】
また、本発明は、本発明による方法を実行するためのシステムを較正するための方法に関し、システムは、
−  株の少なくとも１つの細菌を波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで照明するように構成された照明と、
−  前記照明した細菌から反射した、または前記照明した細菌を通じて透過した光強度を３９０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲で獲得するように構成されたセンサと、
−  センサによって獲得された強度に関する分析命令を収めることができるコンピュータメモリ、および、コンピュータメモリに収められた分析命令を実行できるマイクロプロセッサを備えるコンピュータユニットと
を備え、
較正方法は、
−  範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで照明された菌株の前記範囲における光強度を含む訓練データベースを構築することであって、前記株が、種々のグラムタイプおよび種々の発酵特性と関連付けられる、構築することと、
−  前記データベースに基づいて、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を予測するためのモデルの機械学習をコンピュータによって実行することと、
−  学習後の予測モデルの実行のために分析命令をシステムのコンピュータメモリに格納することと
という工程を含む。
【００１９】
また、本発明は、治療方法に関し、
−  細菌感染症があると疑われる患者から試料を採取することと、
−  都合のよいことに、寒天培地に試料を植え付けること、前記植え付けた媒質を培養して細菌のコロニーを成長させること、および１つまたは複数の成長した細菌のコロニーを検出することによって、試料内にある１つまたは複数の菌株を検出することと、
−  上述の種類の方法によって検出された菌株のグラムタイプまたは発酵特性を検出することと、
−  検出したグラムタイプおよび発酵特性に基づいて、１つまたは複数の抗生物質を選択することと、
−  選択した抗生物質を患者に投与することと
を含む。
【００２０】
本発明は、単に例として示され、同一の参照記号が同一または類似の要素を指す添付の図面に関連して行われる以下の説明を読むと、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明によるハイパースペクトルシステムの概略図である。
【図２】本発明によるマルチスペクトルシステムの概略図である。
【図３】図２のシステムで使用される帯域通過フィルタの透過スペクトルの例を示す図である。
【図４】図１または図２のシステムを使用して実行される、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮについての予測方法の流れ図である。
【図５】ステップフォワード法を使用して、特異なスペクトルチャネルを選択するための方法の流れ図である。
【図６】クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮについての予測モデルを学習するための方法の流れ図である。
【図７Ａ】クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮのフラットな予測モデルを示すグラフである。
【図７Ｂ】クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮの系統樹に基づく階層式予測モデルを示すグラフである。
【図７Ｃ】クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮの最適木に基づく階層式予測モデルを示すグラフである。
【図８】クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮについての予測モデルを学習するために使用される細菌および酵母の種を記述するテーブルである。
【図９】予測モデルの較正および交差検証のために使用されるピクセル数、およびしたがってスペクトルを記述する、ＣＯＳ媒質についてのテーブルである。
【図１０】予測モデルの較正および交差検証のために使用されるピクセル数、およびしたがってスペクトルを記述する、ＴＳＡ媒質についてのテーブルである。
【図１１】重みを付けられた予測レート、またはバランスのよい分類レートの計算を示すグラフである。
【図１２】ＣＯＳ媒質の最適木のための主な判別スペクトルチャネルの空間分散を示すグラフである。
【図１３】ＣＯＳ媒質の最適木のための各モデルの５つの主な判別スペクトルチャネルの空間分散を示すグラフである。
【図１４】ＣＯＳ環境の最適木の各モデルの５つの主な判別チャネルを個別に示すグラフである。
【図１５】ＴＳＡ媒質の最適木のための主な判別スペクトルチャネルの空間分散を示すグラフである。
【図１６】ＣＯＳ媒質の最適木のための主な判別スペクトルチャネルの空間分散を示すグラフである。
【図１７】ＴＳＡ媒質の最適木の第１、第２、および第３の予測モデルそれぞれと関連付けられた１２個、８個、および１１個の主な判別チャネルを示すグラフである。
【図１８】系統樹の第１の予測モデルを示すグラフであり、図の一番上にあるグラフはＴＳＡ媒質に対応し、図の一番下にあるグラフは、ＣＯＳ媒質に対応する。
【図１９】系統樹の第２の予測モデルを示すグラフであり、図の一番上にあるグラフはＴＳＡ媒質に対応し、図の一番下にあるグラフは、ＣＯＳ媒質に対応する。
【図２０】系統樹の第３の予測モデルを示すグラフであり、図の一番上にあるグラフはＴＳＡ媒質に対応し、各図の一番下にあるグラフは、ＣＯＳ媒質に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下で、表記Ａｉ，ｊは、マトリックスＡのｉ行ｊ列の要素を指す。
【００２３】
図１を参照すると、ペトリ皿に落とされた寒天上で成長した酵母または細菌のコロニーの特徴を明らかにするためのハイパースペクトルシステム１０は、
−  ハイパースペクトル画像獲得デバイス１２と、
−  データ処理ユニット１４の制御のため、および、デバイス１２によって獲得された画像を受信して処理するために、（例えば有線またはワイヤレスリンクによって）デバイス１２に接続されたデータ処理ユニット１４と
を備える。
【００２４】
例えば、米国モンタナ州のＲｅｓｏｎｏｎからのリファレンスハイパースペクトルイメージングシステム「Ｐｉｋａ  ＩＩ」といった、デバイス１２は、以下を含む
−  波長範囲［λｍｉｎ；λｍａｘ］＝［３９０；９００］ナノメートルで感度がよい、例えば、ＣＣＤまたはＣＭＯＳデジタルセンサといった、エレメンタリセンサのアレイを備えるデジタルセンサ、および、センサによって獲得されることになる波長を選択するための光分散エレメントまたはスペクトルグラフからなる、いわゆる「ハイパースペクトル」カメラ１８。
−  ハイパースペクトル画像を獲得しようとするペトリ皿２２の光学画像の焦点を、カメラ１８のデジタルセンサ上に合わせるためのレンズ２０。
−  ［λｍｉｎ；λｍａｘ］の範囲内の光を発することができ、ペトリ皿２２の一様な前面照明を実現するための、例えば２つまたは４つのランプといった、例えば１つまたは複数のアロジェニックランプからなる前面照明２４。例えば、光は、白色光ランプである。
−  ［λｍｉｎ；λｍａｘ］の範囲でペトリ皿２２の一様な背面照明を行うための、例えば白色光ＬＥＤアレイからなる背面照明２６。
−  スキャンすることによってペトリ皿２２の全体画像を取得するために、ペトリ皿２２を置き、レンズ２０の前でペトリ皿２２をスクロールさせることを可能にする、キャリッジ２８。
【００２５】
このようにして、照明は、範囲［λｍｉｎ；λｍａｘ］全体にわたって行われる。
【００２６】
例えば、デバイス１２は、１６０マイクロメートルのサンプリングステップ（３００マイクロメートルで推定される空間分解能）で、および、範囲［λｍｉｎ；λｍａｘ］にわたる１．７ナノメートルのスペクトル分解能で、縦９０ミリメートル横９０ミリメートルの領域の画像を獲得するように構成される。
【００２７】
したがって、デバイス１２は、Ｎ行Ｍ列の、ペトリ皿によって反射された光のデジタル画像ＨＳＩを生み出し、ペトリ皿２２は開いている（すなわち、ペトリ皿２２のカバーがない）のが好ましい。
2021506288.tif 000003
ピクセルの放射輝度は、一般に「光強度」と呼ばれ、本明細書では、例えばデジタル写真撮影の分野から本質的に知られているように、露出時間中にカメラ１８のセンサの対応する基本的な高感度部位の表面に入射する光の量に相当する。
【００２８】
各ピクセルＲａｄｉ，ｊ（λ）は、異なる波長［λｍｉｎ；λｍａｘ］におけるピクセルに対応する皿２２の放射輝度のデジタルスペクトルからなり、数値スペクトルは、以下の関係に従って表現される。
2021506288.tif 000004
ここで、Δλは、スペクトル分解能であり、ｐは、
2021506288.tif 000005
に属する正の整数である。獲得波長λｍｉｎ＋ｐ×Δλは、一般に、「チャネル」と呼ばれる。
【００２９】
データ処理ユニット１４は、例えば、パーソナルコンピュータ、タブレット、スマートフォン、サーバ、スーパーコンピュータ、または、より一般には、獲得デバイス１２によって生み出された画像ＨＳＩの処理を行うように構成された、具体的にはデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）といったマイクロプロセッサに基づく、ＦＰＧＡ型回路に基づく、これらの種類の技術を組み合わせた回路に基づく、等、のいずれかのシステムである。ユニット１４は、具体的には、本実装形態に役立つパラメータと共に、本発明による方法を実行するためのコンピュータ命令と共に、デバイス１２によって生み出された画像を格納するため、ならびに、中間および最終的な計算結果を格納するための、メモリ全て（ＲＡＭ、ＲＯＭ、キャッシュ、マスメモリ、〜）を提供される。ユニット１４は、任意選択として、コロニーの特徴づけの最終的な結果、具体的には、グラムタイプおよび／もしくは発酵特性、ならびに／または、調査されるコロニーの細菌もしくは酵母の特徴の判定を見えるようにするためのディスプレイ画面を含む。ただ１つの処理ユニットが説明されるが、本発明は明らかに、いくつかの処理ユニット（例えば、画像ＨＳＩの事前処理を行うためのカメラ１８に搭載されたユニット、および、他の処理を実行するためのデバイス１２の外部のユニット）によって行われる処理に適用される。さらに、システムは、例えば、オペレータが利用できるキーボード／マウスおよびドロップダウンメニュー、ペトリ皿の上にあり媒質についての情報を含むバーコード／ＱＲコードを読み取るバーコード／ＱＲコードリーダ、等によって、予測が媒質によって決まる場合に使用される試料に関するデータ、具体的には培地の種類を、ユニット１４に入力できるようにするインターフェースによって完成させることができる。
【００３０】
図１のハイパースペクトルシステムは、種々のコロニークラス予測モデルに適合し、多くのスペクトルチャネルを使用して予測の精度を向上させることができるので、獲得波長に関して機敏であるという長所がある。しかし、高価格であることに加えて、このようなシステムは、一般に、センサに入射する光の強度の画像を獲得することだけが目的の、従来のＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラより空間分解能が小さい。
【００３１】
図２を参照すると、マルチスペクトルシステム３２は、例えば、レンズ２０とカメラ３２のセンサとの間のレンズ２０の前に配列されたスペクトルフィルタ３６のセットと連結された、高い空間分解能のＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラであることが好都合な、カメラ３２の分だけ、ハイパースペクトルシステム１０とは異なる。フィルタ３６のセットは、ＮＦ個の別個の帯域通過フィルタからなり、半値全幅（ＦＷＨＭ）が５０ｎｍ以下、および好ましくは２０ｎｍ以下の範囲［λｍｉｎ；λｍａｘ］のうちの［λ１；λ２］の範囲の光だけを透過させるようにそれぞれ構成される。例えば、４２０ｎｍに中心を置くＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓフィルタといった、このようなフィルタの透過スペクトルが、図３に示される。アセンブリ３６は、例えば、２４個までの種々のフィルタを収容することができるフィルタのホイールであり、カメラの前でフィルタをスクロールさせ、フィルタのそれぞれに対する画像キャプチャを制御するように動作させるユニット１４によって駆動される。
【００３２】
マルチスペクトル画像ＨＳＩ（λ）は、このようにして獲得され、画像の各ピクセルＲａｄｉ，ｊ（λ）は、アセンブリ３６によって取り除かれた種々のスペクトル帯域のピクセルに対応する皿２２の放射輝度のデジタルスペクトルからなり、デジタルスペクトルは、以下の関係に従って表現される。
2021506288.tif 000006
ここで、λ１、λ２、〜
2021506288.tif 000007
は、それぞれ、アセンブリ３６のスペクトルフィルタの中心波長である。
【００３３】
たった今説明されたシステムを使用して、生物学的試料（例えば、尿、血液、気管支肺胞の標本、等）に含まれる微生物の特徴を明らかにするための方法４０が、次に、図４の流れ図に関連して詳述される。具体的には、この方法は、都合のよいことに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（例えば、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）ＭＳ）によって前記試料に含まれる微生物を、および、（例えば、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）２プラットフォームによって）前記微生物のアンチバイオグラムを、識別するための、よりグローバルな方法のフレームワークの中で応用される。本質的に知られているように、これらの技法のそれぞれは、微生物の種類に応じて、特定の媒質および／または試薬および／または消耗品を選ぶ必要がある。例として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による酵母の識別は、都合のよいことに、この種類の技術において使用されるマトリックスにおけるギ酸の使用を伴う。同様に、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）２プラットフォームカードの選択（カードは、抗生物質感受性試験中に試験される成長培地および１つまたは複数の抗菌物質を含む）は、試験される微生物の細菌の特徴によって決まる。具体的には、グラム陰性発酵細菌は、これらのアンチバイオグラムを行うための特殊なカードを必要とする。
【００３４】
都合のよいことに、下記で説明される特徴づけ方法４０は、具体的には、成長したコロニーが酵母（「Ｙ」）であるか細菌であるか、また、細菌の場合、この細菌がグラム陽性（「ＧＰ」）であるかグラム陰性（「ＧＮ」）であるか、また、グラム陰性細菌の場合、この細菌が発酵性（「ＧＮＦ」）であるか非発酵性（「ＧＮＮ」）であるか、といった、微生物学的方法の継続のための微生物についての必要情報を取得することを、ペトリ皿上の最初の成長から可能にする。したがって、方法は、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮを得るために、微生物のクラスを予測できるようにする。
【００３５】
方法の第１の工程４２において、ペトリ皿は、ペトリ皿に堆積した、栄養培地または「培養物」の表面で酵母または細菌のコロニーを成長させるために、例えば患者から採取された生物学的試料を植え付けられる。栄養培地の主な目的は、前記コロニーを成長させること、および任意選択として、光の擾乱を制限することによって特徴づけの精度を向上させることである。反射した光強度によるグラムタイプ検出に関して言えば、栄養培地は不透明であることが好ましく、検出の精度を向上させる。具体的には、不透明な媒質は、反射係数ρが１０％以下であり、５％以下であることが好ましく、１％以下であることがさらにいっそう優先される。例えば、培地は、いわゆる「ＣＰＳＯ」寒天（「ＣＰＳ」寒天は、媒質を不透明にするためにＳｉＯ２を含む）、いわゆる「コロンビア」寒天（「ＣＮＡ」寒天）、５％のヒツジ血液を含むコロンビア寒天（「ＣＯＳ」寒天）、Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ（「ＭＲＳＭ」）寒天、チョコレート（「ＰＶＸ」）寒天、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ−Ｓｏｙ寒天（「ＴＳＡ」）、等である。
【００３６】
この種類のコロニーの成長は典型的なものであり、本明細書では下記でより詳細に説明されることはない。コロニーの成長は、都合のよいことに、本質的に知られた様式で、オペレータによって手動で、または、自動的な植え付け機械を使用して自動的に、行われることが可能である。都合のよいことに、調製は、コロニーに基づいて微生物の特徴づけが行われるコロニーが、互いに間隔を空けられるように、また、デバイス１２によって獲得される画像の複数のピクセルにコロニーの表面積が対応するように、行われる。これは、具体的には、獲得した画像のピクセルのその後の識別、およびしたがって、画像処理アルゴリズムによるピクセルのセグメント化、または、ユーザによる画像内のピクセルの抽出を容易にすることができる。
【００３７】
コロニーの成長が終わると、例えば、２４時間、３６時間、または４８時間後、ペトリ皿は開けられ、キャリッジ２８上に置かれるのが好ましく、照明２４および２６が点灯され、ペトリ皿の少なくとも１つのハイパースペクトル（またはマルチスペクトル）画像ＨＳＩが、４４において、獲得デバイス１２（または３２）によって獲得され、処理ユニット１４に格納され、処理ユニット１４は、コンピュータ処理を実行して、獲得した画像からコロニーを占める微生物の種類を判定する。
【００３８】
ユニット１４は、任意選択として、４６において、以下の種類の処理のうちの１つ、またはその任意の組合せからなるノイズ事前処理をスタートさせる。
ａ．  本質的に知られた様式での、カメラセンサノイズ、具体的には、そのオフセット、空間ノイズ、等の補正。
ｂ．  画像ＨＳＩに「ハイライト」を形成する付随的に発生する好ましくない反射、特に鏡面反射の処理。例えば、例えば、ピクセルがとることができる最大値の３分の２以上（すなわち、０から２５５の８ビットでエンコードされたピクセルの場合、１７０以上）といった、所定の閾値より大きい値を有するピクセルを除くように実行される閾値化。
ｃ．  細菌の種類、および、使用される寒天の種類で変化しない波長で反射された光強度ごとに画像ＨＳＩを分割することによって、照明の変化などの外部変動によって引き起こされる画像の変化を弱めるためのレシオメトリック処理。
ｄ．  複数の画像ＨＳＩが獲得された場合、獲得された画像の孤立値および／または平均を探して除くこと。
【００３９】
都合のよいことに、処理は、４８において、ペトリ皿単独で生成された信号を抽出するために、種々の波長の放射輝度値を格納する事前処理された画像ＨＳＩを、ハイパースペクトルまたはマルチスペクトル反射画像に変換することを続ける。これは、具体的には、照明光源２４、２６の発光スペクトルの変動を取り除けるようにする。例えば、反射率を取得するために、フラットフィールド補正（ＦＦＣ）が実行され、これには、センサの反応のピクセルごとのばらつき（暗電流分散、利得分散、等）を補正するという長所もある。
【００４０】
ハイパースペクトル画像の背景において、この変換は、例えば、以下の関係による補正である。
2021506288.tif 000008
ここで、Υ（λ）は反射画像であり、Ｗは、例えば、９０％より大きい一様な反射率のシート（例えば、いわゆる「白い」シート、または、１０％より小さい灰色のチャートを伴う）といった、高反射率の中性オブジェクトの、また、照明２４、２６によって照明された、ユニット１４に格納されたハイパースペクトル画像であり、Ｂは、レンズ２０をブロックする黒いキャップの画像など、低反射の中性オブジェクトの、また、ｍ（λｍｉｎ＋ｐ×Δλ）＝１であるか、マトリックスＷ（λｍｉｎ＋ｐ×Δλ）−Ｂ（λｍｉｎ＋ｐ×Δλ）の平均に等しい、ユニット１４に格納されたハイパースペクトル画像である。
【００４１】
同様に、マルチスペクトル画像の背景において、変換は、例えば、以下の関係よる補正である。
2021506288.tif 000009
ここで、Ｗは、例えば、９０％より大きい一様な反射率のシート（例えば、いわゆる「白い」シート、または、１０％より小さい灰色のスケールを伴う）といった、高反射率の中性オブジェクトの、また、照明２４、２６によって照明された、ユニット１４に格納されたマルチスペクトル画像であり、Ｂは、レンズ２０をブロックする黒いキャップの画像など、低反射の中性オブジェクトの、また、ｍ（λｎ）＝１であるか、マトリックスＷ（λｎ）−Ｂ（λｎ）の平均に等しい、ユニット１４に格納されたマルチスペクトル画像である。ユニット１４は、５０において、例えば画像ＨＳＩ（λ）またはΥ（λ）から、細菌コロニーを識別するためのアルゴリズムを、工程３８に続いて、または、以前の工程と並行に、実行する。任意の標準パターンおよびオブジェクト認識アルゴリズムが、コロニーに対応する「Ｃｏｌ（λ）」と呼ばれる画像のエリアを抽出するために使用されることが可能である。代替として、この選択はオペレータによって手動で行われ、オペレータは、ディスプレイ画面、および、例えばマウスなどのポインティングメカニズムを使用して、このフィールドを選択する。例として、フィールドＣｏｌ（λ）は、コロニーに属するピクセル座標のリストからなる。選択されたピクセルエリアは、ユニット１４によって格納される。
【００４２】
方法は、５２において、所定の判定ルールを適用することによって、ゾーンＣｏｌ（λ）の少なくとも１つのスペクトルに応じて、コロニー内の微生物のクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮを予測することによって継続するが、この変化形が下記で説明される。具体的には、この予測は、エリアＣｏｌ（λ）の各ピクセル（ｉ，ｊ）のスペクトルΥｉ，ｊ（λ）に基づいて行われる。このために、クラスの最初の予測は、エリアＣｏｌ（λ）の各ピクセル（ｉ，ｊ）に対して行われ、次に、クラスの最終的な予測のために多数決が行われる。第１の変化形では、単純な多数決が行われ、すなわち、Ｃｏｌ（λ）の最大数のピクセルに対して予測されたクラスが、最後に選択されたクラスである。第２の変化形では、クラスの予測の確実性を向上させるために、条件付きの投票が行われ、すなわち、最後に保持されるクラスは、Ｃｏｌ（λ）を占めるピクセル数のＸ％より大きいものに対して予測されたものであり、Ｘは、完全に５０％より大きく、７０％以上であることが好ましい。この条件をクラスが満たさない場合、方法は、クラス予測なしを返す。当然、コロニーのクラスは、例えば、エリアＣｏｌ（λ）のスペクトルのセット｛Υｉ，ｊ（λ）｝（ｉ，ｊ）∈Ｃｏｌ（λ）の中間スペクトルΥｃｏｌ（λ）といった、単一の値を使用して、実現されることが可能である。
【００４３】
ユニット１４による各コロニーのクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮは、所定の予測ルールを適用することによって達成されるが、この変化形が下記で説明される。予測されたクラスはユニット１４に格納され、および／または、ユーザのために画面に表示される。また、この予測は、都合のよいことに、識別のその後の工程、および／または、コロニーを形成した微生物の抗生物質感受性試験のために、別の微生物分析器具に配信される。
【００４４】
コロニーピクセルのスペクトルΥｉ，ｊ（λ）に応じたクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮの異なる予測モデルが、次に、説明されることになり、教師あり機械学習（ＳＭＬ：ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）に基づく予測モデルを含む。使用されるＳＭＬツールが、図５について最初に説明され、次に、予測モデルが、図６および図７に示されたこれらの学習方法を通じて下記で説明される。
【００４５】
Ａ．教師あり機械学習ツール
考えられる学習の種類に関わらず、学習データベースの作成で始まる。各Ｙ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮクラスについて、細菌および酵母が選択され、これらのそれぞれは、ペトリ皿に落とされた寒天上にまかれ、所定の時間、培養され、図１で説明されたシステムによって、ならびにしたがって、同じ照明条件の下、および波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで、皿のハイパースペクトル画像が獲得される。寒天上で成長したコロニーのピクセルは、例えば、方法４０の工程４６〜５０で説明されたように抽出され、これらの関連付けられたスペクトルが訓練データベースに格納される。したがって、訓練データベースは、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮとそれぞれ関連付けられたスペクトル
2021506288.tif 000010
、
2021506288.tif 000011
、
2021506288.tif 000012
、
2021506288.tif 000013
の４つのセットを含む。これらのセットのそれぞれは、先行技術から本質的に知られるように、訓練自体のために使用される「較正」と呼ばれる第１の部分、および、計算した予測モデルの性能を評価するために使用される「交差検証」と呼ばれる第２の部分、という、２つの部分に分割される。
【００４６】
第１の特殊な実施形態によれば、コンピュータ実行学習は、「ステップフォワード」として知られ、予測モデルを学習するために使用される。この種類の学習は、本質的に貧弱であり、図２のシステムによって実行されるときのマルチスペクトルアプリケーションに適しているように、最も特異なスペクトルチャネルの段階的な選択に基づく。
【００４７】
図５を参照すると、学習６０は、初期化工程６２でスタートし、最大Ｒ個の特異なチャネルが選択され、この数は、１と、スペクトル獲得のために使用されるハイパースペクトルカメラのスペクトルチャネルの数Ｐとの間にある。選択された特異なチャネルのリストＬは空にされ、候補チャネルのリストｌは、ハイプスペクトル（ｈｙｐｅｓｐｅｃｔｒａｌ）カメラチャネルのセット｛λ１，λ２，…，λＰ｝に初期化される。
【００４８】
その後の反復工程６４において、リストｌは、反復工程６６を実行することによってリストＬの最も特異なＲ個のチャネルで段階的に満たされる。具体的には、工程６４、工程６６の所与の反復ｒの間、以下を行う。
−  リストｌの各チャネルλｋを抽出すること。
−  ６８において、抽出されたチャネルλｋおよびＬリストからのチャネル｛λ１，λ２，…，λｒ−１｝について、予測モデル
2021506288.tif 000014
を判定すること。
−  ７０において、例えば、交差検証スペクトルの妥当な分類のレートといった、予測モデル
2021506288.tif 000015
の性能尺度
2021506288.tif 000016
を計算する。
【００４９】
次に、工程６４は、７２において、最善の性能尺度を示す予測モデルの識別、および必然的に、リストＬ内のチャネルと組み合わせた最も特異なリストｌのチャネルλｒの識別を続ける。７４において、リストＬは、次に、チャネルλｒで完了し、これは、工程６４の次の反復ｒ＋１の間、リストｌから削除される。最も特異なＲ個のチャネルが識別されると、学習方法は、７４において、リストＬ、および、後者、すなわち、工程７２において識別された最後のモデル、と関連付けられた予測超平面
2021506288.tif 000017
を格納することによって終わる。
【００５０】
都合のよいことに、工程６８で計算された予測モデルは、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）タイプ、「１対多（ｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｌｌ）」、線形カーネル、およびソフトマージンのものである。この種類の訓練は、較正スペクトルに従って計算することにあり、超平面
2021506288.tif 000018
は、下記で説明されるように、クラスＣｌ（Ｃｌ＝Ｙ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮ）を、他のクラスの１つ、２つ、または３つから形成されたセット
2021506288.tif 000019
と区別する。例えば、モデルは、工程６６の反復ｋ、および工程６４の反復ｒの間、
2021506288.tif 000020
という制約の下、
2021506288.tif 000021
という関係に従って最適化問題を解決することによって学習され、
ここで、
−  クラスＣｌに、または、セット
2021506288.tif 000022
に属する較正スペクトルΥｍ（λ）について、
2021506288.tif 000023
は、リストＬ＝｛λ１，λ２，…，λｒ−１｝におけるスペクトルチャネル、および、反復ｋの中でリストｌから抽出されたチャネルλｋに対応するΥｍ（λ）の成分のベクトル、好ましくは、成分がチャネルの値に従って並べられるベクトルに等しい。
−  
2021506288.tif 000024
およびβは、スペクトル
2021506288.tif 000025
の次元に等しい次元の、およびしたがって、ｒに等しい次元の、ベクトルである。
−  Ｍは、クラスＣｌに、または、１からＭまで番号を付けられたセット
2021506288.tif 000026
に属する較正スペクトルΥｍ（λ）の数である。
−  
2021506288.tif 000027
．βは、ベクトル
2021506288.tif 000028
とベクトルβとの間のスカラ積である。
−  ξｍおよび
2021506288.tif 000029
はスカラである。
−  ｑｍ∈｛−１，１｝であり、ｍ番目の学習スペクトルがクラスＣｌと関連付けられる場合、ｑｍ＝１であり、ｍ番目のスペクトルが他のクラスのセット
2021506288.tif 000030
と関連付けられる場合、ｑｍ＝−１である。
−  Ｃは、所定のスカラである。
【００５１】
１ピクセルのスペクトルΥｉ，ｊ（λ）のクラスＣｌへのメンバシップを予測するモデルは、したがって、以下の工程に従って行われる。
−  ベクトル
2021506288.tif 000031
におけるスペクトル変換Υｉ，ｊ（λ）。
−  スペクトル
2021506288.tif 000032
および超平面
2021506288.tif 000033
にわたる距離
2021506288.tif 000034
の計算。
−  距離Ｓｃｌに応じたクラスＣｌの予測ルールの適用、例えば、スペクトルは、Ｓｃｌの符号が正である場合、クラスＣｌに属し、この符号が負である場合、全体
2021506288.tif 000035
に属する。
【００５２】
第２の実施形態によれば、学習は貧弱ではなく、図１に示されたシステムを使用するハイパースペクトルアプリケーションに、結果として生じる予測モデルが特によく適しているとき、全チャネルを同時に使用することからなる。例えば、この訓練は、線形カーネルおよびフレキシブルマージンを伴うＳＶＭタイプ、「１対多」のものであり、較正スペクトルに応じて、
2021506288.tif 000036
という制約の下、
2021506288.tif 000037
という関係に従って最適化問題を解決することによって、クラスＣｌ（Ｃｌ＝Ｙ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮ）を、他のクラスの１つ、２つ、または３つから形成されたセット
2021506288.tif 000038
と区別する超平面
2021506288.tif 000039
を計算することからなり、
ここで、
−  Υｍ（λ）は、クラスＣｌに、またはセット
2021506288.tif 000040
に属する較正スペクトルΥｍ（λ）である。
−  
2021506288.tif 000041
およびβは、較正スペクトル
2021506288.tif 000042
の次元に等しい次元の、およびしたがって、Ｐに等しい次元の、ベクトルである。
−  Ｍは、クラスＣｌに、または、１からＭまで番号を付けられたセット
2021506288.tif 000043
に属する較正スペクトルΥｍ（λ）の数である。
−  Υｍ（λ）．βは、ベクトルΥｍ（λ）とベクトルβとの間のスカラ積である。
−  ξｍと
2021506288.tif 000044
は、スカラである。
−  ｑｍ∈｛−１，１｝であり、ｍ番目の学習スペクトルがクラスＣｌと関連付けられる場合、ｑｍ＝１であり、ｍ番目のスペクトルが他のクラスのセット
2021506288.tif 000045
と関連付けられる場合、ｑｍ＝−１である。
−  Ｃは、所定のスカラである。
【００５３】
１つのピクセルΥｉ，ｊ（λ）のスペクトルのクラスＣｌへのメンバシップを予測するモデルは、したがって、以下の工程に従って行われる。
−  スペクトルΥｉ，ｊ（λ）と超平面
2021506288.tif 000046
との間の距離
2021506288.tif 000047
の計算。
−  距離Ｓｃｌに応じたＣｌクラスの予測ルールの適用、例えば、スペクトルは、Ｓｃｌの符号が正である場合、クラスＣｌに属し、この符号が負である場合、セット
2021506288.tif 000048
に属する。
【００５４】
Ｂ．予測モデルを学習するための方法
図６を参照すると、予測モデルのための学習方法８０は、上述のような、８２における、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮのための学習データベースの確立でスタートする。方法８０は、８４において、予測モデル構造の決定を続ける。具体的には、図７Ａに、ならびに図６Ｂおよび図６Ｃに、それぞれ示されるような２種類のモデルが可能である。
【００５５】
予測モデルの第１の種類は、図７Ａに示され、４つの「１対多」の予測モデル９０、７２、７４、７６、すなわち、クラスＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮに対するクラスＹの予測、クラスＹ、ＧＮＦ、ＧＮＮに対するクラスＧＰの予測、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＮに対するクラスＧＮＦの予測、および、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦに対するクラスＧＮＮの予測を学習することからなる。このために、
−  各予測モデルは、関係（６）または関係（７）に関して上述された学習ツールの１つを実行することによって学習データベースから学習され、クラスＣｌは、Ｙ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮに等しく、セット
2021506288.tif 000049
は、他の３つのクラスで構成される。
−  ピクセルのグラムタイプおよび発酵特性の予測（図３の工程５２）は、超平面
2021506288.tif 000050
、
2021506288.tif 000051
、
2021506288.tif 000052
、
2021506288.tif 000053
への、または、超平面超平面（ｈｙｐｅｒｐｌａｎｅｓ  ｈｙｐｅｒｐｌａｎｅｓ）
2021506288.tif 000054
、
2021506288.tif 000055
、
2021506288.tif 000056
、
2021506288.tif 000057
への、前記ピクセルそれぞれのスペクトルΥｉ，ｊ（λ）の距離ＳＹ、ＳＧＰ、ＳＧＮＦ、ＳＧＮＮを計算し（工程９０〜工程９６）、次に、８８において、計算された距離に応じてピクセルのクラスを判定することによって取得される。具体的には、選択されたクラスは、最大距離に対応するものである。
【００５６】
「フラット」と呼ばれる、図７Ａに示された第１の種類の構造によれば、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮは、等しく重要であるものとみなされ、したがって識別は同様にエラーとなる。例えば、細菌ＧＮＮではなく酵母Ｙを識別することは、細菌ＧＮＮではなく細菌ＧＮＦを識別することと同様に深刻である。図７Ｂに示された構造によれば、予測モデルは、系統発生学的分類木に従って編成され、等しく重要な異なるクラスをもはや考慮せず、先験的情報、すなわち、スペクトルの形状に影響を及ぼす可能性のある進化情報を導入できるようにする。より具体的には、この予測モデル木は、以下を含む。
−  酵母Ｙを細菌ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＦと区別することからなる第１のモデル１００
−  細菌ＧＰを細菌ＧＮＦおよびＧＮＮと区別するための第２のモデル１０２
−  細菌ＧＮＦを細菌ＧＮＮと区別することからなる第３のモデル１０４
【００５７】
モデル１００〜１０４のそれぞれは、関係（６）または関係（７）について上述された手法で取得され、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮのうちの１つへの、ピクセルスペクトルΥｉ，ｊ（λ）のメンバシップの予測は、したがって、第１のモデル１００の超平面への距離ＳＹを計算することからなり、この距離の符号が正である場合、クラスＹが予測される。そうでなければ、第２のモデル１０２の超平面への距離ＳＧＰが計算され、この距離の符号が正である場合、クラスＧＰが予測される。そうでなければ、第３のモデル１０４の超平面への距離ＳＧＮＦが計算され、クラスＧＮＦが予測される。そうでなければ、クラスＧＮＮが予測される。
【００５８】
表現型モデルは、図７Ａに示されるようなフラットな予測構造と比較すると、予測の精度を改善するが、表現型木は、必ずしも、より良い結果を示す木ではないということに、発明者は気づいた。具体的には、木は、スペクトルの形状に影響を及ぼす、特徴づけられることになる微生物が成長してきた培地に依存するのが好ましいことがある。好ましくは、最適な予測構造は、図７Ｃに示されるように、較正スペクトルに応じて決定される。具体的には、第１の工程において、４つの予測モデルである、ａ）Ｙ対ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮ、ｂ）ＧＰ対Ｙ、ＧＮＦ、およびＧＮＮ、ｃ）ＧＮＦ対Ｙ、ＧＰ、およびＧＮＮ、ならびに、ｄ）ＧＮＮ対Ｙ、ＧＰ、およびＧＮＦは上述のように計算され、最善の予測性能のモデルが、最適木の第１のモデル１１０として保持される。第２の工程において、第１のモデルのクラスは捨てられ、残りのクラスに対応する３つの予測モデルが計算される。例えば、第１のモデルがクラスＧＮＮに対応する場合、第２の工程の３つのモデルは、上述のように、ａ）Ｙ対ＧＰおよびＧＮＦ、ｂ）ＧＰ対ＹおよびＧＮＦ、ならびに、ｃ）ＧＮＦ対ＹおよびＧＰである。３つのモデルの最善のものが、次に、最適木の第２のモデル１１２として保持される。第３の工程において、第１および第２のモデル１１０および１１２のクラスは捨てられ、２つの残りのクラスの間の予測モデルが上述のように計算され、最適木の第３のモデル１１４として維持される。クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮのうちの１つへのピクセルスペクトルΥｉ，ｊ（λ）のメンバシップの予測が、次に、図７Ｂについて説明されたものに類似の様式で木を詳しく検討することによって取得される。
【００５９】
図６に戻ると、予測モデルの構造が決定されると、学習方法８０は、任意選択として８４において、予測のために使用されるスペクトルチャネルの数の削減を続け、この削減は、チャネル選択および／またはグルーピングによって実現される。具体的には、図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃについて前述された予測モデルが、図５の「ステップフォワード」法を使用して計算されるとき、使用されるチャネルの数は、パラメータＲによって直接的に固定されることが可能である。代替としてまたは追加として、モデル性能の重大な向上を何ももたらさない追加のチャネルは、捨てられることが可能である。代替としてまたは追加として、図２および図３について上述されたように、フィルタの幅に幅が対応する間隔に、範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍを分割することによってチャネルグルーピングが実現されることが可能である。ただ１つのスペクトルチャネルが、次に、間隔ごとに保持される。λ１、λ２、〜、
2021506288.tif 000058
の場合のチャネルの最終的な数は、このようにして選択され、図２のマルチスペクトルシステムのセット３６のスペクトルフィルタの中心波長を定義する。下記で説明されることになるように、２４個のチャネル、およびしたがって、２４個のスペクトルフィルタだけを使用して、高精度のクラスの予測を取得することができる。
【００６０】
任意選択として、マルチスペクトルアプリケーションのための最終的なチャネルを選択し、マルチスペクトルシステムを適宜構築すると、新しい訓練は、図２のシステムによるスペクトルの獲得に基づいて、予測モデルを洗練するために実行され、この訓練は、図６および図７について説明されたものに似ている。
【００６１】
同様に、所定のＲ個の特異なチャネルの選択が説明されてきた。代替として、この数は、演繹的に固定されておらず、スロットサーチのための停止尺度は、チャネルの数に応じた性能利得の停滞である。例えば、少なくとも１つのチャネルの追加が、Ｘ％を超えるまで、例えば下記で詳述されるＢＣＲといった性能を向上させない場合、チャネルサーチは停止され、例えばＸは２％以下である。
【実施例】
【００６２】
Ｃ．実施例
クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮの予測のアプリケーションが、次に、説明されることになる。このために、２１種の細菌および酵母株が使用され、これらの微生物種が図８に記述される。これらの種は、ＣＯＳ寒天およびＴＳＡ寒天上で２４時間培養され、これらの媒質のそれぞれに対する学習データベースを生じた。それぞれの種のコロニーおよびピクセルの数ならびに媒質は、図９（ＣＯＳ）および図１０（ＴＳＡ）にそれぞれ示され、ブロック１が較正データに対応し、ブロック２が交差検証データに対応する。
【００６３】
クラス予測の性能は、都合のよいことに、クラス予測の感度の平均（よくランク付けされたスペクトルのレート）として計算される。この重みを付けられた尺度は、「バランス分類レート（ｂａｌａｎｃｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」すなわち「ＢＣＲ」とも呼ばれ、コロニーのサイズによるケースであり、種に応じて変化する、不安定なピクセル数を考慮できるようにする。ＢＣＲの計算は、図１１に示される。
【００６４】
Ｃ．１．ＣＯＳ結果
Ｃ．１．１．フラットなモデル
下記のテーブル１は、図７Ａに示されたフラットな予測モデルに対する、および、関係（７）を使用して取得された予測モデルに対する、ＢＣＲを示す。
2021506288.tif 000059
【００６５】
細菌の種々の株を正確に予測できるということがテーブル１からすぐにわかる。具体的には、特徴づけられることになる微生物が細菌であることを知っていると、第１の予測ＧＰ対ＧＮＮおよびＧＮＦ、ならびに第２の予測ＧＮＮ対ＧＰおよびＧＮＦを実行することによって、細菌のグラムタイプおよび細菌の発酵または非発酵特性を予測することができる。この種類の予測は、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）２プラットフォームでのアンチバイオグラムの実行のための消耗品の選択に特に有用である。
【００６６】
Ｃ．１．２．最適木
図７Ｃに示され、関係（７）を使用して取得されたモデル１１０、１１２、１１４に対するＢＣＲが、テーブル２に概説される。
2021506288.tif 000060
【００６７】
最適木は、系統樹とは著しく異なり、ＣＯＳ媒質の影響は、系統発生学上の差の影響より大きくなる可能性があるということに留意されたい。
【００６８】
図７Ｃに示され、図４のステップフォワード法、および、各モデルに対してＲ＝２４である関係（６）を使用して取得された、モデル１１０、１１２、１１４に対するＢＣＲが、テーブル３に概説される。
2021506288.tif 000061
【００６９】
性能利得は、第１のモデルのための８番目のチャネルから、および、第３のモデルのための４番目のチャネルから、限定されるということがテーブル３から気づく。市販のフィルタシステムに対応する２４個のスペクトルフィルタを使用してマルチスペクトルアプリケーションを取得するために、第１、第２、および第３のモデル１１０、１１２、１１４に対して８個のチャネル、１４個のチャネル、および４個のチャネルをそれぞれ選択することが、したがって有利である。本実施形態の性能が、テーブル４に概説される。
2021506288.tif 000062
【００７０】
当然、図２のシステムが利用できるスペクトルフィルタの数に応じて、他の数のチャネルが選択されることが可能である。
【００７１】
「ステップフォワード」法は、クラス予測に必要な情報を含むスペクトル範囲を決定できるようにするということにも留意されたい。各モデルの最初の５つのチャネルにスペクトル範囲自体を限定することによって、９０％に近い、または９０％より大きいＢＣＲがそれぞれ取得される。これらのチャネルのスペクトル分散が、図１２から図１４に示される。これは、５０ｎｍより大きく離れた異なるスペクトル帯域を明確に区別する。具体的には、
Ａ．  ４つのクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮは、第１の範囲４１５ｎｍ〜５００ｎｍ、および第２の範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍにあるスペクトル情報だけを使用して効率的に予測されることが可能である。これらの範囲だけを使用すると、ＢＣＲは、９０％以上になる。第１の範囲を５７５ｎｍ〜６７５ｎｍに限定することによって、４つのチャネルは、９０％に近い、または９０％より大きいＢＣＲについてのモデルに従ってのみ使用される。任意選択として、第２のモデルのチャネルランク５に対応する第３の範囲８５０ｎｍ〜８７５ｎｍが使用される。詳細には、第１の範囲４１５ｎｍ〜５００ｎｍでの予測は、範囲４１５ｎｍ〜４４０ｎｍおよび４７０ｎｍ〜４９５ｎｍでのみ行われることが可能である。したがって、本発明は、前記範囲のスペクトルを獲得し、前記範囲の前記スペクトルのみに応じてクラスを予測することからなるクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮについてのいずれかの予測方法を含む。本発明が、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮの間で区別できるようにすると、したがって、前述の範囲に含まれるスペクトル情報を使用して酵母と細菌を区別できるようにするということにさらに留意されたい。したがって、本発明は、特徴が明らかにされることになる微生物の酵母または細菌の特徴を予測するための方法も含む。
Ｂ．  Ｙ＋ＧＰ＋ＧＮＮに対するクラスＧＮＦの予測は、第１の範囲４７０ｎｍ〜５００ｎｍおよび第２の範囲５７５〜６４５ｎｍに対してのみ効率的に行われることが可能である。したがって、本発明は、前記範囲のスペクトルを獲得し、前記範囲の前記スペクトルのみに応じてクラスＧＮＦを予測することからなるクラスＧＮＦを予測するためのいずれかの方法を含む。特徴が明らかにされることになる微生物の細菌の特徴が既に知られているとき、予測は、ＧＰおよびＧＮＮに対するクラスＧＮＦを予測することからなるということに留意されたい。したがって、本発明は、４７０ｎｍ〜５００ｎｍおよび５７５ｎｍ〜６４５ｎｍの範囲だけに基づくこの種類の予測も含む。
Ｃ．  クラスＧＰ対Ｙ＋ＧＮＮの予測は、第１の範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍでのみ、および特に範囲５８５ｎｍ〜６７５ｎｍでのみ、ならびに第２の範囲８５０ｎｍ〜８７５ｎｍでのみ効果的に行われることが可能である。したがって、本発明は、前記範囲のスペクトルを獲得し、前記範囲の前記スペクトルのみに応じてクラスＧＰを予測することからなるクラスＧＰを予測するためのいずれかの方法を含む。特徴が明らかにされることになる微生物の細菌の特徴が既に知られているとき、予測は、クラスＧＮＦおよびＧＮＮに対するクラスＧＰを予測すること、また必然的に、グラム陰性（ＧＮ）細菌のクラスに対するクラスＧＰによって予測することからなるということに留意されたい。したがって、本発明は、５３５ｎｍ〜６７５ｎｍの範囲、およびさらに具体的には５８５ｎｍ〜６７５ｎｍの範囲、ならびに８５０ｎｍ〜８７５ｎｍの範囲だけに基づくこの種類の予測も含む。
Ｄ．  下記のポイントＢおよびＣで説明される予測を組み合わせることによって、３つの範囲と共に、また、特徴が明らかにされることになる微生物の細菌の特徴を知っていると、細菌のコロニーがＧＰであるか、ＧＮＦであるか、ＧＮＮであるかを判定できるということに留意されたい。この種類の予測は、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）２プラットフォームでアンチバイオグラムを実行するための消耗品の選択に特に有用である。
【００７２】
Ｃ．１．３．系統樹
図７Ｂに示され、関係（７）を使用して取得されたモデル１００、１０２、１０４に対するＢＣＲが、テーブル５に概説される。
2021506288.tif 000063
【００７３】
Ｃ．２．ＴＳＡの結果
Ｃ．２．１．フラットなモデル
下記のテーブル１は、図７Ａに示されたフラットな予測モデルに対する、および、関係（７）を使用して取得された予測モデルに対する、ＢＣＲを示す。
2021506288.tif 000064
【００７４】
Ｃ．２．２．最適木
図７Ｃに示され、関係（７）を使用して取得されたモデル１１０、１１２、１１４に対するＢＣＲが、テーブル７に概説される。
2021506288.tif 000065
【００７５】
最適木は、系統樹とは著しく異なり、ＣＯＳ媒質の影響は、系統発生学上の差の影響より大きくなる可能性があるということに留意されたい。
【００７６】
図７Ｃに示され、図５のステップフォワード法、および、各モデルに対してＲ＝２４である関係（６）を使用して取得されたモデル１１０、１１２、１１４に対するＢＣＲが、テーブル８に概説される。
2021506288.tif 000066
【００７７】
図１５から図１７は、第１、第２、および第３のモデル１１０、１１２、および１１４（図１６）に対する、ならびにモデル（図１７）による、１２個、８個、および１１個のチャネルによる貧弱な手法で、同じグラフ（図１５）の中に主なブランチチャネルのスペクトル分散を示す。
【００７８】
Ｃ．２．３．系統樹
図７Ｂに示され、関係（７）を使用して取得されたモデル１００、１０２、１０４に対するＢＣＲが、テーブル９に概説される。
2021506288.tif 000067
【００７９】
図７Ｂに示され、図４のステップフォワード法、および、各モデルに対してＲ＝２４である関係（６）を使用して取得されたモデル１００、１０２、１０４に対するＢＣＲが、テーブル１０に概説される。
2021506288.tif 000068
【００８０】
図１８から図２０は、これらの図のそれぞれの一番上にＴＳＡ媒質があり、図のそれぞれの一番下にあるＣＯＳ媒質と比較して、モデルごとに主なスペクトルチャネルのスペクトル分散を示す。
【図１】
2021506288.tif 000069
【図２】
2021506288.tif 000070
【図３】
2021506288.tif 000071
【図４】
2021506288.tif 000072
【図５】
2021506288.tif 000073
【図６】
2021506288.tif 000074
【図７Ａ】
2021506288.tif 000075
【図７Ｂ】
2021506288.tif 000076
【図７Ｃ】
2021506288.tif 000077
【図８】
2021506288.tif 000078
【図９】
2021506288.tif 000079
【図１０】
2021506288.tif 000080
【図１１】
2021506288.tif 000081
【図１２】
2021506288.tif 000082
【図１３】
2021506288.tif 000083
【図１４】
2021506288.tif 000084
【図１５】
2021506288.tif 000085
【図１６】
2021506288.tif 000086
【図１７】
2021506288.tif 000087
【図１８】
2021506288.tif 000088
【図１９】
2021506288.tif 000089
【図２０】
2021506288.tif 000090
【国際調査報告】
2021506288.tif 000091
2021506288.tif 000092
2021506288.tif 000093
2021506288.tif 000094
2021506288.tif 000095
2021506288.tif 000096
2021506288.tif 000097