(57)【要約】  リピート伸長疾患と関連する伸長されたリピート配列などの核酸の二本の鎖と結合する、二価核酸塩基を含む遺伝子認識試薬が提供される。一例ではリピート伸長疾患は、ｐｏｌｙＱ疾患、例えばハンチントン病である。リピート伸長疾患と関連する伸長されたリピート配列などの核酸を結合する方法、伸長されたリピートを含む核酸の存在を特定する方法、および、リピート伸長疾患を治療する方法を含む、試薬の使用方法が提供される。
2021506313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸若しくは核酸アナログ骨格を含み、３以上のリボース、デオキシリボース、または核酸アナログ骨格残基、前記骨格残基に結合した二価核酸塩基の配列を含む遺伝子認識試薬であって、前記二価核酸塩基の配列が、二本の核酸鎖上のリピート伸長疾患の伸長されたリピートの単位標的配列、または、単位標的配列の１以上の逐次反復と結合する、遺伝子認識試薬。
【請求項２】
前記核酸若しくは核酸アナログ骨格が第一末端と第二末端とを含み、前記骨格の前記第一末端に結合した第一連結基、前記第一連結基と非共有結合するかまたはセルフライゲーションする、前記第二末端に結合した第二連結基をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項３】
二価核酸塩基の前記配列が、前記二本の鎖を逆平行配向でアライントさせた場合、前記二本の鎖の各々の上のリピート伸長疾患の伸長されたリピートの、単位標的配列または前記単位標的配列の２以上の逐次反復と結合する、請求項２に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項４】
前記単位標的配列が、前記二本の鎖の両方の上で、（ＧＡＡ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＣＣＧ）ｎ、（ＣＡＧ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＣＣＴＧ）ｎ、（ＡＴＴＣＴ）ｎ、若しくは（ＧＧＧＧＣＣ）ｎの逐次反復、または、前記のいずれかに対して相補性である配列により形成される、請求項３に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項５】
前記単位標的配列がＣ／Ｇ−Ａ／Ａ−Ｇ／Ｃである、請求項３に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項６】
前記核酸塩基配列を、
ＪＢ３核酸塩基、ＪＢ６核酸塩基、およびＪＢ４核酸塩基、
ＪＢ６核酸塩基、ＪＢ４核酸塩基、およびＪＢ３核酸塩基、
ＪＢ４核酸塩基、ＪＢ３核酸塩基、およびＪＢ６核酸塩基、
ＪＢ３またはＪＢ３ｂ、ＪＢ６またはＪＢ６ｂ、およびＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、またはＪＢ４ｅ、
ＪＢ６若しくはＪＢ６ｂ、ＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、若しくはＪＢ４ｅ、およびＪＢ３若しくはＪＢ３ｂ、
ＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、若しくはＪＢ４ｅ、ＪＢ３若しくはＪＢ３ｂ、およびＪＢ６若しくはＪＢ６ｂ、ＪＢ３、ＪＢ６、およびＪＢ４、
ＪＢ６、ＪＢ４、およびＪＢ３、または
ＪＢ４、ＪＢ３、およびＪＢ６、または、前記の２以上の逐次反復、
の順序で有する請求項５に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項７】
表Ｃに列挙された単位認識試薬配列の核酸塩基配列を有する、請求項１に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項８】
前記二本の鎖がどちらも同一の核酸分子のものである、請求項１に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項９】
前記二本の鎖がどちらもＲＮＡである、請求項１に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１０】
３、４、５、６、７、または８個の核酸塩基などの３〜８個の核酸塩基の配列からなる、請求項１に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１１】
前記骨格残基が核酸アナログ骨格残基である、請求項１に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１２】
前記骨格残基が立体構造的に予め組織化されている、請求項１１に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１３】
前記骨格残基がロックド核酸残基である、請求項１４に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１４】
前記骨格残基がペプチド核酸（ＰＮＡ）残基である、請求項１４に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１５】
前記骨格残基がγＰＮＡ残基である、請求項１４に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１６】
構造：
【化１】
2021506313.tif 000072
を有し、
ここで、ＸはＳまたはＯであり、ｎは１から６の整数であり、ｍは０から４の整数であり、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、グアニジン含有基、例えば、
【化２】
2021506313.tif 000073
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、例えば、
【化３】
2021506313.tif 000074
直鎖若しくは分枝（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、１〜５０個のエチレングリコール部分を含むエチレングリコール単位で任意に置換されていてもよい、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１はＨ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン若しくは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、ｑは０から５０の整数であり、そして、ｒおよびｓは、各々独立して、１〜５０の整数であり、
Ｒ３は、Ｈ、または脱離基、例えば、直鎖若しくは分枝（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、置換若しくは非置換（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、（Ｃ１〜Ｃ８）カルボキシ、アミノ酸側鎖で任意に置換されていてもよい、または、グアニジン含有基、または、
【化４】
2021506313.tif 000075
ここで、ｏは１〜２０であり、Ｒ６は、各々独立して、アミノ酸側鎖であり、Ｒ７は−ＯＨまたは−ＮＨ２であり、
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ１０）二価炭化水素または１以上のＮ若しくはＯ部分、例えば−Ｏ−、−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換された（Ｃ１〜Ｃ１０）二価炭化水素であり、
Ｒ５は、−ＯＨ、−ＳＨまたはジスルフィド保護基であり、そして、
Ｒの各々は、独立して、１以上の標的核酸中の核酸塩基の単位標的配列に対して相補的な核酸塩基の配列を生成し、したがって、複数の認識モジュールの各々が、鋳型核酸上の核酸塩基の標的配列に結合し、互いにライゲーションする核酸塩基である、または、
その薬剤的に許容される塩である、請求項１に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１７】
前記Ｒ１または前記Ｒ２が、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０〜５０の整数であり、ｒは１〜５０の整数であり、ｓは１〜５０の整数である、請求項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１８】
前記Ｒ５が、−ＳＨ、ＯＨ、またはＳ−Ｓ−Ｒ８であり、ここで、前記Ｒ８は、１以上のアミノ酸残基、アミノ酸側鎖、グアニジン含有基、非置換若しくは置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、または（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンである、請求項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項１９】
前記Ｒ１がＨであり、前記Ｒ２はＨではないか、または、前記Ｒ２がＨであり、前記Ｒ１はＨではない、請求項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２０】
前記Ｒ１がＨであり、前記Ｒ２がポリオキシエチレン部分を含む、請求項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２１】
前記Ｒ５が−ＳＨであり、前記ＸがＳである、請求項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２２】
前記Ｒ５が、リジン残基、アルギニン残基、またはグアニジン含有基を含む、請求項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２３】
前記Ｒ４がメチレンであり、前記Ｒ５が−ＳＨであり、前記ＸがＳであり、そして、前記Ｒ５が、ヒドロキシル置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、例えば−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨである、請求項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２４】
認識試薬が標的核酸の隣接配列とハイブリダイズする場合、前記第一連結基および前記第二連結基が、独立して、隣接する認識試薬のアリール部分とスタッキングする２〜５環縮合多環式芳香族部分である、請求項２に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２５】
前記２〜５環縮合多環式芳香族部分が、非置換若しくは置換ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン／テトラセン、プレイアデン、ピセン、またはペリレンであって、Ｏ、Ｎ、および／またはＳなどの１以上のヘテロ原子で任意に置換されていてもよく、例えば、キサンテン、リボフラビン（ビタミンＢ２）、マンゴスチン、またはマンギフェリンである、請求項２４に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２６】
前記２〜５環縮合多環式芳香族部分が同一である、請求項２４に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２７】
前記認識試薬が構造：
【化５】
2021506313.tif 000076
を有し、
ここで、
Ｒの各々が、独立して、核酸塩基であり、Ｒの各々が、同じかまたは異なる核酸塩基であり得、
ｎが１〜６の範囲の整数、例えば、１、２、３、４、５、または６であり、
Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、Ｈ、グアニジン含有基、例えば、
【化６】
2021506313.tif 000077
ここで、
ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、例えば、
【化７】
2021506313.tif 000078
非置換若しくは置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、若しくは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０から５０の整数であり、ｒおよびｓはそれぞれ独立して、１から５０の整数であり、
Ｒ１０またはＲ１１の一方、およびＲ１２、Ｒ１３、若しくはＲ１４のうちの一つは−Ｌ−Ｒ３であり、ここで、Ｒ３の各々は、独立して、２〜５環縮合多環式芳香族部分、例えば、非置換若しくは置換ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン／テトラセン、プレイアデン、ピセン、またはペリレン、Ｏ、Ｎ、および／またはＳなどの１以上のヘテロ原子で任意に置換されていてもよい、例えば、キサンテン、リボフラビン（ビタミンＢ２）、マンゴスチン、またはマンギフェリンであり、各々は、認識試薬が標的核酸の隣接配列とハイブリダイズする場合、隣接認識試薬のＲ３基とスタッキングすることができ、
Ｌはリンカーであり、そして
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４の前記残りが、各々独立して、Ｈ、１以上の連続したアミノ酸残基、例えば１以上のＡｒｇ残基、グアニジン含有基、例えば、
【化８】
2021506313.tif 000079
ここで、
ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、例えば、
【化９】
2021506313.tif 000080
非置換若しくは置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、若しくは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１はＨ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０から５０の整数であり、ｒおよびｓは各々独立して、１〜５０の整数である、または、
その薬剤的に許容される塩である、請求項２に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２８】
１以上のＲ１、Ｒ２、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４が、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ここで、Ｐ１が、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑが０〜５０の整数であり、ｒが１〜５０の整数であり、ｓが１〜５０の整数である、請求項２７に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項２９】
前記Ｒ４および前記Ｒ７がーＬ−Ｒ３である、請求項２７に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項３０】
前記リンカーが、約５〜２５個の原子、例えば、５〜２０個、５〜１０個、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の原子、または合計１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のＣおよびヘテロ原子、例えばＯ、Ｐ、Ｎ、若しくはＳ原子を含む、請求項２７に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項３１】
前記Ｒ３のいずれの場合も、同一の２〜５環縮合多環式芳香族部分を含む、請求項２７に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項３２】
グアニジン含有基、例えば、
【化１０】
2021506313.tif 000081
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５である、を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【請求項３３】
リピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含有する核酸を結合する方法であって、前記伸長されたリピートを含む核酸を、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬と接触させることを含む、方法。
【請求項３４】
前記核酸が、前記二本の鎖の両方の上の（ＧＡＡ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＣＣＧ）ｎ、（ＣＡＧ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＣＣＴＧ）ｎ、（ＡＴＴＣＴ）ｎ、もしくは（ＧＧＧＧＣＣ）ｎの逐次反復によって形成される単位標的配列、または前記のいずれかに対して相補的である配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸が、前記二本の鎖の両方の上の（ＣＡＧ）ｎの逐次反復によって形成された単位標的配列、またはそれに対して相補的な配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸が、リピート伸長障害を有する患者から得られる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
患者から得られるサンプルにおけるリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含む核酸の存在を特定する方法であって、前記患者から得た核酸サンプルを、請求項２〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬と接触させ、前記サンプルがリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含む核酸を含むことを示す、前記遺伝子認識試薬の結合および連結が起こるか否かを判定し、そして任意に前記患者を前記リピート伸長疾患について治療することを含む、方法。
【請求項３８】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬と薬剤的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３９】
細胞においてリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含有する遺伝子の発現をノックダウンする方法であって、前記伸長されたリピートを含む、ＲＮＡなどの核酸を、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬と接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府補助金に関する申立
本発明は、国立衛生研究所から授与された認可番号Ｒ２１ＮＳ０９８１０２、および全米科学財団から授与された認可番号ＣＨＥ１０３９８７０のもとで政府支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、それぞれその全体が参照により本明細書中に組み込まれる同時係属中の、２０１７年１２月２１日に提出された米国仮特許出願第６２／７０８，７８３号および２０１８年２月１４日に提出された米国仮特許出願第６２／７１０，２６２号の恩恵を請求する。
【０００３】
本願に関連する配列表はＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子フォーマットで提出され、その全体は参照により明細書中に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は６５２６＿１８０７５９７＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。当該テキストファイルのサイズは４４４バイトであり、当該テキストファイルは２０１８年１２月２１日に作成された。
【０００４】
１．発明の分野
本明細書には、核酸および核酸オリゴマー組成物を使用して核酸を結合するための組成物が記載される。また、リピート伸長疾患（expanded repeat disease）、例えば、ハンチントン病などのＰｏｌｙＱ疾患を治療する方法も提供される。
【背景技術】
【０００５】
２．関連技術の記載
ＲＮＡ−リピート伸長（RNA-repeated expansion）は神経筋障害（または疾患）でよく見られる。その一例は、筋肉協調運動に影響を及ぼし、行動変化、認知低下、および認知症に至る常染色体優性障害である、ハンチントン病（ＨＤ）である。ＨＤは、典型的には中年期に発症し、結果として発病後１０〜２０年で死に至る。これは、ハンチントン（ｈｔｔ）遺伝子の第一エクソンにおけるＣＡＧリピートが、６〜２９の正常範囲から４０〜１８０の病原性範囲まで伸長することに起因する。ＣＡＧリピート伸長（ＣＡＧｅｘｐ）の長さは、発病の年齢に反比例する。Ｈｔｔは、偏在的であるが主にＣＮＳのニューロンにおいて発現し、胚発生および神経保護作用を含む多様な生理学的役割を有する３４８ｋＤａのタンパク質をコードする。ＣＡＧリピートは、ＨｔｔのＮ末端領域におけるポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）配列に翻訳される。分子機能障害および臨床症状の膨大な情報にもかかわらず、ＣＡＧｅｘｐがＨＤを引き起こす精密なメカニズムはまだ充分に理解されていない、しかしながら、新たに出現した証拠は、ＨＤが多変量障害であることを示唆している。
【０００６】
タンパク質機能の喪失は、ＨＤの病因に寄与し得るが、ＣＡＧｅｘｐを有するヘテロ接合型およびホモ接合型患者は類似した臨床的特徴を有するので、主な原因である可能性は低い。さらに、ｈｔｔ対立遺伝子のうちの１の欠失に起因して正常なＨｔｔタンパク質レベルが５０％減少しているにもかかわらず、異常な表現型を示さない個体が確認されている。同様に、ｈｔｔヌル変異についてヘテロ接合型のマウスは、ＨＤの臨床的特徴を示さず、ホモ接合体は初期胚発生で死亡する。これらの知見は、Ｈｔｔの胚発生における重要性を強調するが、ＨＤの発病機序においては重要でない。新たに出現した証拠は、疾患のより妥当な原因として有害な機能獲得を指摘している。この示唆は、無関係な遺伝子において類似した閾値（３０〜４０単位）を超えるＣＡＧリピートは、ＨＤに加えて、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調３型またはマチャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、およびＳＣＡ１７（脊髄小脳失調症１７型）をはじめとする、いくつかの神経筋障害の原因であるという観察結果によって立証される。ｐｏｌｙＱ疾患と称するこれらの障害は、皮質下および皮質委縮、並びに核凝集物をはじめとするＨＤと共通した多くの特質を有する。
【０００７】
ＨＤおよび他のｐｏｌｙＱ疾患について三つの主な細胞毒性メカニズムが提案されている。第一のものはｐｏｌｙＱ毒性である。ｐｏｌｙＱは、凝集し、他のｐｏｌｙＱ含有タンパク質と相互作用して、大きなアミロイド様構造を形成する傾向がある。これらの主要（key）タンパク質の結合および隔離はそれらの生理的機能の喪失に至り、その結果、分子および細胞事象のカスケードの異常調節をもたらす。第二のものは、ＲＮＡ機能の毒性獲得（toxic-gain）である。転写時に、ｒＣＡＧｅｘｐは、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＭＢＮＬｌ）、選択的ＲＮＡスプライシングレギュレータ、および他の主要タンパク質を隔離する不完全なヘアピン構造をとる。正常なｒＣＡＧリピートはヘアピンモチーフも選択し得るが、前記伸長バージョンとは異なる配列構成で選択される。ｒＣＡＧｅｘｐをＭＢＮＬ１と会合させると、核内フォーカスとして核中にトラップされた複合体が得られ、Ｈｔｔタンパク質の産生のために細胞質へ輸送ができなくなる。ＭＢＮＬｌの喪失の結果としてミススプライシングされる遺伝子転写産物は多様である。第三の発症メカニズムはタンパク質毒性である。ある一定の長さを超える（＞４２単位）ｒＣＡＧリピートを、ＡＴＧ開始コドンの非存在下で、リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳を介して翻訳され、ポリセリン（ｐｏｌｙＳ）と共に、有毒なｐｏｌｙＱおよびポリアラニン（ｐｏｌｙＡ）タンパク質の産生に至ることが示された。後者の二つのメカニズムは、長い未翻訳のｒＣＡＧリピートの発現が、動物モデルにおいて有害であり、異常な行動的表現型はＨＤと同様であるという知見によってさらに裏付けられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
概して、これらの知見は、ＨＤがＲＮＡおよびタンパク質機能の毒性獲得に起因する多変量障害であることを示している。したがって、ＨＤを治療するための一つの有望なストラテジーは、伸長された転写産物を選択的に標的とすることであり、その理由は、これが三つの疾患経路すべてを干渉するからである。本明細書中で記載するのは、ｒＣＡＧリピートおよび他のＲＮＡ−リピート配列の認識のための二価核酸リガンドである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
一態様では、遺伝子認識試薬が提供される。前記試薬は、３以上のリボース、デオキシリボース、または、核酸アナログ骨格残基を含む核酸若しくは核酸アナログ骨格、前記骨格残基に結合した二価核酸塩基配列、を含み、ここで、前記二価核酸塩基配列は、二本の核酸鎖上のリピート伸長疾患（repeat expansion disease）の伸長されたリピートの単位標的配列、若しくは単位標的配列の１以上の逐次反復に結合する。別の態様では、遺伝子認識試薬と薬剤的に許容される担体とを含む組成物が提供される。
【００１０】
別の態様では、リピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含有する核酸を結合する方法も提供される。前記方法は、前記伸長されたリピートを含む核酸を、３以上のリボース、デオキシリボース、または、核酸アナログ骨格残基を含む核酸若しくは核酸アナログ骨格、前記骨格残基に結合した二価核酸塩基配列、を含み、ここで、前記二価核酸塩基配列は、二本の核酸鎖上のリピート伸長疾患の伸長されたリピートの単位標的配列、若しくは単位標的配列の１以上の逐次反復に結合する、遺伝子認識試薬と接触させることを含む。
【００１１】
さらに別の態様では、患者から得たサンプルにおけるリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含む核酸の存在を特定する方法が提供される。前記方法は、前記患者から得た核酸サンプルを、３以上のリボース、デオキシリボース、または、核酸アナログ骨格残基を含む核酸若しくは核酸アナログ骨格、前記骨格残基に結合した二価核酸塩基配列、を含み、ここで、前記二価核酸塩基配列は、二本の核酸鎖上のリピート伸長疾患の伸長されたリピートの単位標的配列、若しくは単位標的配列の１以上の逐次反復に結合する、遺伝子認識試薬と接触させることと、前記サンプルがリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含む核酸を含むことを示すものとして、前記遺伝子認識試薬の結合および連結が起こるか否かを判定することと、任意に、前記リピート伸長疾患について前記患者を治療することとを含む。前記核酸若しくは核酸アナログ骨格が第一末端と第二末端とを含み、前記骨格の前記第一末端に結合した第一連結基と、前記第一連結基と非共有的に結合するかまたはセルフライゲーションする、前記第二末端に結合した第二連結基とをさらに含む。
【００１２】
さらに別の実施形態では、細胞においてリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含有する遺伝子の発現をノックダウンする方法が提供される。前記方法は、前記伸長されたリピートを含むＲＮＡなどの核酸を、３以上のリボース、デオキシリボース、または、核酸アナログ骨格残基を含む核酸若しくは核酸アナログ骨格、前記骨格残基に結合した二価核酸塩基配列、を含み、ここで、前記二価核酸塩基配列は、二本の核酸鎖上のリピート伸長疾患の伸長されたリピートの単位標的配列、若しくは単位標的配列の１以上の逐次反復に結合する、遺伝子認識試薬と接触させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１（Ａ）（図１、パネル（Ａ））ｒＣＡＧｅｘｐ−ヘアピン構造を標的とするためのＪＢ−ＭＰγＰＮＡリガンドＬＧ１、ＬＧ２、およびＬＧ３のデザイン、Ｋ：Ｌ−リジン、矢印：Ｎ末端、（Ｂ）好ましい逆平行方向でのＬＧ２の代表的な結合モード（Ｎ末端がワトソン鎖の３’末端に向き合っている）、（Ｃ）Ｅ、Ｉ、およびＦと、ＲＮＡの各Ｃ−Ｇ、Ａ−Ａ、およびＧ−Ｃ塩基対とのＨ結合相互作用、（Ｄ）Ｊ塩基が共有結合したＭＰγＰＮＡ骨格の化学構造、（Ｅ）ＮＭＲおよびＸ線によって確認された、γＰＮＡ、およびγＰＮＡ−ＤＮＡデュプレックスとして、およびＰＮＡ［ＰＮＡ−ＤＮＡデュプレックスとして］の仮定、である。
【図２】図２、パネルＡ〜Ｆは、核酸アナログの例示的な構造を示す。
【図３】図３は、アミノ酸側鎖の様々な例を示す。
【図４】図４は、例示的な核酸塩基の構造を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、例示的な二価核酸塩基の構造を示し、Ｒはヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ骨格モノマー若しくは残基を指す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、例示的な二価核酸塩基の構造を示し、Ｒはヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ骨格モノマー若しくは残基を指す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、例示的な二価核酸塩基の構造を示し、Ｒはヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ骨格モノマー若しくは残基を指す。
【図６】配列ｒ（ＣＡＧ）４／ｒ（ＣＡＧ）４を含むＲＮＡデュプレックスに対するＬＧ１結合のＭＤシミュレーションの結果。ＬＧ１：ＮＨ２−ＥＩＦ−Ｈ、γ側鎖はメチル基である。（Ａ）シミュレーション前（ｔ＝０）および後（ｔ＝ｌ００ｎｓ）の四つの別個のＬＧ１リガンドと四つのＣＡＧリピートを含むＲＮＡデュプレックスとの結合複合体の表面図。（Ｂ）シミュレーション後のＣＥＧ、ＡＪＡ、およびＧＦＣトライアドのＨ結合相互作用。（Ｃ）ＬＧ１のＲＮＡ塩基およびＪ塩基間のトライアドあたりのＨ結合の数、（Ｄ）ＬＧ  Ｉ−ＲＮＡ複合体の旋回半径、および（Ｅ）初期構造に関するＬＧｌ−ＲＮＡ複合体の平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）。
【図７】図７は、Ｅ、Ｉ、およびＦ  ＪＢ−ＭＰγＰＮＡモノマーの構造を示す。
【図８】図８および９は、それぞれ、Ｅ（１５）およびＦ（２６）の合成スキームを示す。
【図９】図８および９は、それぞれ、Ｅ（１５）およびＦ（２６）の合成スキームを示す。
【図１０】図１０は、Ｅ（１５）、Ｆ（２６）、およびＩ（２７）のＭＰγＰＮＡ骨格へのカップリングのためのスキームを示す。
【図１１】図１１は、実施例において記載した研究を結合するために選択されたモデルＲＮＡ標的を示す（配列番号１）。
【図１２】図１２は、Ｒ１１ＡでのＬＧ２のＣＤ滴定である。Ｒ１１Ａの濃度は０．５μＭであり、ＬＧ２の濃度は、Ｘ：０、１．５、２．５、３．５、４．５、５．５、６．５、８．５、および１１．５μＭであった。ＬＧ２のＲ１１Ａへの添加後、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、２５℃でデータを取得した。
【図１３】図１３は、ＬＧ２と、（Ａ）ミスマッチＲ１１Ｕ、（Ｂ）一本鎖ＷＳおよびＣＳ、並びに（Ｃ）単結合部位を含む二本鎖ＨＰのＣＤスペクトル、並びに（Ｄ）ＬＧ２ＰとＲ１１ＡのＣＤスペクトル。ＲＮＡのＣＤスペクトル（実線）および［ＲＮＡ＋リガンド］混合物のＣＤスペクトル（破線）、である。
【図１４】図１４は、リガンド配向（ＬＧ２Ｐ）、ミスマッチＲ１１Ｕおよび一本鎖標的（ＷＳ＋ＣＳ）の効果である。挿入図は、２．５μＭのペンタミジンの添加後の対応するサンプルの蛍光スペクトルである。
【図１５】図１５は、Ｒ１１ＡでのＬＧ２のＮＭＲ滴定である。Ｒ１１Ａの濃度は０．１ｍＭであった。表示されたモル比でのＬＧ２のアリコートをＲ１１Ａに添加し、１５分間３７℃でインキュベートした後、データ収集した。溶媒交換可能なプロトンを破線で表示し、交換不可能なプロトンを垂直の実線で示す。
【図１６】図１６は、実施例で記載するような、ネイティブ・ケミカル・ライゲーションを概略的に示す。
【図１７】図１７は、３７℃での４ＭＰの前記添加後の前記親化合物Ｍの反応進行である。（Ａ）前記反応配列の概略図である。Ｍ＃およびＭ＃＃中間体をまず形成し、次いで前記反応性ＬＧ２Ｎ＊中間体に変換し、最終的に環状生成物ｃＬＧ２Ｎに変換した。（Ｂ）４ＭＰの前記添加および３７℃で０分、１５分、および６０分のインキュベーション後のＭのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルである。前記サンプルは０．１×ＰＢＳ緩衝液中で調製した。
【図１８】図１８は、３７℃で１６時間２ＭＥと共にインキュベーションした後の、（Ａ）［ＬＧ２Ｎ＋Ｒ１１Ａ］、（Ｂ）［ＬＧ２Ｎ＋Ｒ１１Ｕ］、および（Ｃ）ＬＧ２Ｎ単独のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。ＭＳ分析の前に、前記サンプルを４ｍＭ  塩化グアニジニウムで復元し、９５℃にて５分間熱変性させた。ＬＧ２Ｎ、Ｒ１１Ａ、Ｒ１１Ｕ、および２ＭＥの前記濃度は、それぞれ、２２、１、１、および５００μＭであった。前記ポジティブモードで、ＲＮＡ分子は前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルにおいて観察されなかった。（Ｂ）および（Ｃ）におけるＹ軸は、（Ａ）のものと同じであり、スペースの節約のために省略した。
【図１９】図１９は、競合的結合アッセイである。Ｒ２４Ａ、Ｒ１２７Ａ、およびＲ９６Ｕの前記濃度は、それぞれ、１００、１８、および２２ｎＭであり、各々は１．１μＭの結合部位を含み、レーン２〜６、および８中のＬＧ２Ｎの濃度は、それぞれの順で、１１、２２、４４、８８、８８、および８８μＭであり、４ＭＰおよびＴＣＥＰの濃度は、それぞれの順で、５００および１００μＭであった。結合部位のリガンドに対する比は表示した通りであった。前記サンプルを０．１×ＰＢＳ緩衝液中で調製し、３７℃で２４時間インキュベートした後、２％アガロースゲルによって分離し、ＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色した。
【図２０】図２０は、生理的にシミュレーションされたイオン強度でのゲルシフトアッセイである。緩衝液がＰＳ（１０ｍＭ  ＮａＰｉ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ７．４）である以外は図９中に示したのと同一の方法でサンプルを調製した。Ｒ２４Ａ、Ｒ１２７Ａ、およびＲ９６Ｕの前記濃度は、それぞれの順で、１００、１８、および２２ｎＭであり、各々は１．１μＭの結合部位を含み、レーン２〜６、および８中のＬＧ２Ｎの濃度は、それぞれの順で、１１、２２、４４、８８、８８、および８８μＭであり、４ＭＰおよびＴＣＥＰの濃度は、それぞれの順で、５００および１００μＭであった。結合部位のリガンドに対する前記比は表示された通りであった。前記サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした後、２％アガロースゲルによって分離し、ＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色した。
【図２１】図２１は、本明細書中で記載するリガンドを合成するための一般的方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本出願で特定される様々な範囲での数値の使用は、特に明示しない限り、規定された範囲内の最小値と最大値のどちらの前にも「約」が付けられるかのように近似として示される。このように、規定された範囲の上下のわずかな変動を使用しても、前記範囲内の値と実質的に同一の結果を達成することができる。また、別段の指示がない限り、範囲の開示は、最小値と最大値との間のすべての値を含む連続的な範囲としても意図される。本明細書で使用される場合に、単数形（"a" および "an"）は一以上を指す。
【００１５】
本明細書で使用される場合に、「含む（comprising）」という用語はオープンエンドであり、「含む（including）」、「含有する（containing）」または「〜を特徴とする（characterized by）」と同義であり得る。「〜から実質的になる（consisting essentially of）」という用語は、特許請求の範囲を、指定された材料または工程ならびに特許請求の範囲に記載された発明の一つ以上の基礎的で新規な特徴に実質的に影響しない材料または工程に限定する。「〜からなる（consisting of）」という用語は、特許請求の範囲で特定されていないあらゆる要素、工程または成分を除外する。本明細書で使用される場合に、一つ以上の要素または工程を「含む（comprising）」実施形態はまた、限定されるものではないが、これらの指定された要素または工程「から実質的になる（consisting essentially of）」および「からなる（consisting of）」実施形態も含む。
【００１６】
本明細書中で提供されるのは、核酸における標的配列を結合するため、例えば、核酸配列のリピート伸長に伴う疾患に関連したリピート伸長を結合するための組成物および方法である。図１は、ＨＤおよび他のＰｏｌｙＱ疾患でみられるようなＲＮＡヘアピン構造におけるＣＡＧリピートを標的とする、本明細書中で記載する認識試薬（遺伝子認識試薬、リガンド）の非限定例の結合を表す概略図である。モジュールの隣接モジュールに対する協同的結合は、末端セルフライゲーティング基またはπスタッキング芳香族基、例えば、以下の実施例で記載し、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００８３４３３号でさらに広範に開示されている例示的セルフライゲーティング基によって促進される。要約すると、セルフライゲーティング基、πスタッキング基、および、核酸の鎖上、または、二価核酸塩基を含む認識試薬における二本の核酸鎖間の隣接認識試薬を共有結合若しくは非共有的に結合する同様の基は、本明細書では「連結基」と総称する。複数の認識試薬は、ワトソン・クリックまたはワトソン・クリック様協同的塩基対合によって鋳型核酸に対して結合（ハイブリダイズ）する。細胞において、鋳型核酸はＲＮＡまたはＤＮＡ分子であるが、インビトロで、鋳型核酸は任意のＲＮＡまたはＤＮＡであり得、同様に修飾核酸または核酸アナログであり得る。充分近接した、例えば、鋳型核酸上の隣接配列と結合する認識試薬は、セルフライゲーションまたはπ−πスタッキングし、したがって、連結して、より長いオリゴマーまたはポリマーを本質的に形成する。さらなる詳細は以下に提示する。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、「患者」は、霊長類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、およびチンパンジー）、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラ）をはじめとする哺乳動物、または鳥類（例えば、アヒル若しくはガチョウ）などの動物である。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、「治療する」、または「治療」という用語は、疾患の１以上の症状を改善するなど、有益または所望の結果を指す。「治療する」または「治療」という用語には、限定されるものではないが、ＰｏｌｙＱリピート伸長疾患、例えば、ハンチントン病などのリピート伸長疾患の１以上の症状の軽減または改善も含まれる。「治療」は、治療の非存在下で予想される生存と比較して延長された生存も意味し得る。
【００１９】
疾患マーカーまたは症状の関連における「より低い」とは、そのようなレベルでの臨床的に関連する減少および／または統計的に有意な減少を意味する。前記減少は、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上であり、そのような障害を有しない個体にとっての正常な範囲内として許容されるレベルまで、またはアッセイの検出レベルを下回るまでの減少であり得る。特定の態様では、前記減少は、レベルの正常化とも称することができ、そのような障害を有しない個体にとっての正常な範囲内として許容されるレベルまでの減少である。特定の態様では、前記減少は、疾患の徴候または症状のレベルの正常化、前記疾患の徴候の対象レベルと前記疾患についての徴候の正常なレベルとの間の差の減少である（例えば、正常値に到達するためには前記対象に関する前記レベルを減少させねばならない場合には正常の上限レベルまで、および正常レベルに到達するためには対象に関する値を増大させねばならない場合には正常の下限レベルまで）。ある態様で、方法は、例えば、本明細書中で記載するような認識試薬での対象の治療後の臨床的に意義のある結果によって示されるような、ｐｏｌｙＱリピート伸長疾患、例えば、ハンチントン病のｍＲＮＡの発現の臨床的に意義のある阻害を含む。
【００２０】
本明細書で使用される「治療的有効量」は、疾患を有する対象体に投与される場合に（例えば、既存の疾患または疾患の一つ以上の症状の軽減、改善または維持により）、前記疾患の治療をもたらすのに十分である本明細書に記載される認識試薬の量を含むことが意図される。前記「治療的有効量」は、認識試薬（薬剤）、薬剤の投与方法、疾患および疾患の重症度ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、もしあれば先行治療または併用治療の種類、および治療されるべき対象体の他の個体特性に応じて変動し得る。本明細書中で記載する遺伝子認識試薬との関連で、用量当たりの例示的投薬量範囲は、０．１ｐｇ〜１ｍｇの範囲である。
【００２１】
「治療的有効量」はまた、任意の治療に適用可能な合理的な便益／リスク比で、幾つかの所望の局所的効果または全身効果を生ずる薬剤の量も含む。本明細書に記載される方法で使用される認識試薬薬剤は、そのような治療に適用可能な妥当な便益／リスク比をもたらすのに十分な量で投与され得る。
【００２２】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」という文言は、対象化合物をある臓器または身体の一部分から別の臓器または身体の別の部分に運搬または輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）または溶媒封入材料等の、薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、治療されるべき対象体に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として作用し得る材料の幾つかの例には、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース、（２）デンプン類、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン、（３）セルロースおよびセルロースの誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース、（４）粉末状トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム（magnesium state）、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク、（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス、（９）油類、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油、（１０）グリコール類、例えば、プロピレングリコール、（１１）ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール、（１２）エステル類、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル類、ポリカーボネート類および／またはポリ無水物類、（２２）増量剤、例えば、ポリペプチド類およびアミノ酸類、（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ、ならびに（２２）医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性物質が含まれる。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「細胞（cellおよびcells）」という用語は、限定されるものではないが、ラット、マウス、サル、およびヒトなどの任意の動物からの任意のタイプの細胞を指す。例えば、限定されるものではないが、細胞は、幹細胞などの前駆細胞、または内皮細胞、平滑筋細胞などの分化細胞であり得る。
【００２４】
「発現」または「遺伝子発現」とは、遺伝子産物（典型的には、タンパク質、任意に翻訳後修飾されたまたは機能的／構造的ＲＮＡ）の産生のための遺伝子からの全体的な情報の流れを意味する（限定されるものではないが、細胞内でＲＮＡもしくはタンパク質等の遺伝子産物を産生するための機能的遺伝単位、または核酸上にコードされ、転写プロモーターおよび他のシス作用エレメント、例えば応答エレメントおよび／またはエンハンサー、典型的にはタンパク質（オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ）または機能的／構造的ＲＮＡをコードする発現される配列ならびにポリアデニル化配列を含む他の発現系）。指定された配列の「転写制御下での遺伝子の発現」、あるいは指定された配列による「制御を受ける」とは、前記遺伝子に作動可能に連結された（典型的にはシスに機能的に結合された）前記指定された配列を含む遺伝子からの遺伝子発現を意味する。前記指定された配列は、転写要素（限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサーおよび応答エレメント）の全部または一部であってよく、遺伝子の転写を全体的または部分的に調節し、および／または遺伝子の転写に影響し得る。示された遺伝子産物の「発現のための遺伝子」は、適切な環境に置かれたとき、すなわち、例えば、細胞に形質転換、トランスフェクション、形質導入等がされて、発現に適した条件に供されたときに、前記示された遺伝子の産物を発現することができる遺伝子である。構成的プロモーターの場合に、「適切な条件」とは、遺伝子が典型的には宿主細胞に導入されることだけを必要とすることを意味する。誘導性プロモーターの場合に、「適切な条件」とは、遺伝子の発現を引き起こすのに有効な量のそれぞれのインデューサーが、発現系（例えば細胞）に投与される場合を意味する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ノックダウン」または「ノックダウンする」という用語は、生物体において１以上の遺伝子の発現が、治療上有効な程度までなど、機能性遺伝子に関して、典型的には有意に減少することを意味する。遺伝子ノックダウンはまた、完全な遺伝子サイレンシングも含む。本明細書中で使用される場合、「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子の発現が本質的に完全に防止されることを意味する。ノックダウンおよび遺伝子サイレンシングは、転写段階または翻訳段階のいずれかで起こり得る。ｍＲＮＡなどの細胞におけるＲＮＡを標的とするための記載した認識試薬の使用は、転写後または翻訳段階で１若しくは複数の遺伝子をノックダウンまたはサイレンシングすることによって遺伝子発現を改変することができる。
【００２６】
本明細書で使用される場合に、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。核酸アナログには、例えば、限定されるものではないが、２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ、ロックド核酸、アンロックド核酸、トリアゾール結合ＤＮＡ、ペプチド核酸、モルホリノオリゴマー、ジデオキシヌクレオチドオリゴマー、グリコール核酸、トレオース核酸および任意に一つ以上のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド残基を含むそれらの組合せが含まれる。本明細書では、核酸および核酸アナログに関して「核酸」およびヌクレオチドで構成される短い一本鎖構造である「オリゴヌクレオチド」は区別なく使用される。オリゴヌクレオチドは、命名法「〜マー」によって、鎖の長さ（すなわち、ヌクレオチドの数）によって言及され得る。例えば、２２個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、２２マーと言及されることとなる。
【００２７】
「核酸アナログ」は、ポリマー骨格等の基質上に配置された核酸塩基の配列を含む組成物であり、ワトソン−クリック水素結合塩基対合またはワトソン−クリック様水素結合塩基対合によるハイブリダイゼーションによってＤＮＡおよび／またはＲＮＡを結合することができる。一般的な核酸アナログの非限定的な例には、ペプチド核酸、例えば、γＰＮＡ、モルホリノ核酸、ホスホロチオエート、ロックド核酸（オキシ型、チオ型またはアミノ型を含む２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋）、アンロックド核酸（Ｃ２’−Ｃ３’結合が切断されている）、２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ、トレオース核酸、グリコール核酸等が含まれる。
【００２８】
立体構造的に事前組織化された核酸アナログは、前記核酸骨格の構造に応じて、右巻きヘリックスまたは左巻きヘリックスのいずれかのみを形成する骨格（予備組織化された骨格）を有する核酸アナログである。本明細書に示されるように、立体構造的に事前組織化された核酸アナログの一例は、γ炭素にキラル中心を有し、γ炭素にある基のキラリティーに応じて、そして前記キラリティーのため、右巻きヘリックスまたは左巻きヘリックスのみを形成するγＰＮＡである。同様に、リボースを３’−エンド（ノース）コンフォメーションへと「ロック」する２’酸素と４’炭素との間の架橋を有するリボースを含むロックド核酸である。
【００２９】
本開示の文脈において、「ヌクレオチド」は、少なくとも一つの核酸塩基と、ＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸においてリボースまたはデオキシリボースである骨格要素（骨格部）とを含むモノマーを指す。「ヌクレオチド」はまた、典型的には、特定の条件下での重合を可能にする反応性基を含む。天然のＤＮＡおよびＲＮＡでは、これらの反応性基は５’リン酸基および３’ヒドロキシル基である。核酸および核酸アナログの化学合成のために、塩基および骨格モノマーは、当該技術分野で知られているように、ブロックされたアミン等の修飾基を含み得る。「ヌクレオチド残基」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに組み込まれている単一のヌクレオチドを指す。同様に、「核酸塩基残基」は、ヌクレオチドもしくは核酸または核酸アナログに組み込まれた核酸塩基を指す。「遺伝子認識試薬」は、包括的には、協同的塩基対合、例えばワトソン−クリック塩基対合またはワトソン−クリック様塩基対合によって核酸上の相補的核酸または核酸アナログ配列にハイブリダイズ（結合）することができる核酸塩基の配列を含む核酸または核酸アナログを指す。
【００３０】
さらに詳細には、ヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは核酸アナログのいずれかについては、構造Ａ−Ｂを有し、ここで、Ａは骨格モノマー部であり、Ｂは本明細書に記載される核酸塩基である。骨格モノマーは、リボース三リン酸もしくはデオキシリボース三リン酸等の任意の適切な核酸骨格モノマー、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えばガンマＰＮＡ（γＰＮＡ）等の核酸アナログのモノマーであり得る。一例では、骨格モノマーは、リボース一リン酸、二リン酸、若しくは、三リン酸またはデオキシリボース一リン酸、二リン酸、若しくは三リン酸、例えば、リボースまたはデオキシリボースの５’一リン酸、二リン酸、若しくは、三リン酸である。骨格モノマーは、ＲＮＡ中のリボース等の構造的な「残基」成分と、モノマーを共に結合する際に改変される任意の活性基、例えばＲＮＡへと重合する場合に改変されてホスホジエステル結合を残すリボヌクレオチドの５’三リン酸基および３’ヒドロキシル基の両方を含む。ＰＮＡの場合と同様に、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン骨格モノマーのＣ末端カルボキシル基およびＮ末端アミン活性基は、重合の間に縮合してペプチド（アミド）結合を残す。別の態様では、前記活性基は、当該技術分野で広く知られているように、ホスホロアミダイトオリゴマー合成に有用なホスホロアミダイト基である。前記ヌクレオチドはまた、任意に４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）等の当該技術分野で知られる本明細書に記載される一つ以上の保護基を含む。合成遺伝子認識試薬を調製する多くの追加の方法が知られており、前記方法は骨格構造および塩基付加過程の特定の化学的特性に依存する。ヌクレオチドモノマーの結合にどの活性基を利用するか、前記塩基においてどの基を保護するかの決定と、オリゴマーの調製において必要とされる工程は、十分に化学技術、並びに、核酸および核酸アナログオリゴマー合成の分野の当業者の能力の範囲内である。
【００３１】
一般的な核酸アナログの非限定的な例には、ペプチド核酸、例えば、γＰＮＡ、ホスホロチオエート（例えば、図２（Ａ））、ロックド核酸（オキシ型、チオ型またはアミノ型を含む２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋、例えば図２（Ｂ））、アンロックド核酸（Ｃ２’−Ｃ３’結合が切断されている、例えば図２（Ｃ））、２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ、モルホリノ核酸（例えば図２（Ｄ））、トレオース核酸（例えば図２（Ｅ））、グリコール核酸（例えば図２（Ｆ）、Ｒ形およびＳ形を示す）等が含まれる。図２（Ａ〜Ｆ）は、核酸アナログの様々な例についてのモノマー構造を示している。図２（Ａ〜Ｆ）はそれぞれ、波線で示されているより長い鎖に組み込まれた二つのモノマー残基を示している。組み込まれたモノマーは、本明細書では「残基」と称され、前記核酸塩基を除く前記核酸または核酸アナログの部分は、前記核酸または核酸アナログの「骨格」と呼ばれる。一例としては、ＲＮＡの場合に、例示的な核酸塩基はアデニンであり、対応するモノマーはアデノシン三リン酸であり、組み込まれた残基はアデノシン一リン酸残基である。ＲＮＡの場合に、前記「骨格」はリン酸によって結合されたリボースサブユニットからなり、したがって、前記骨格モノマーは、組み込み前はリボース三リン酸であり、組み込み後はリボース一リン酸残基である。γＰＮＡと同様に、ロックド核酸（図２（Ｂ））は立体構造的に予備組織化されている。
【００３２】
「部分」は分子の一部分であり、一つのクラスとして、より大きな分子に化合物またはモノマーを組み込んだ後にポリマー鎖等のより大きな分子中に残る化合物またはモノマーの部分である「残基」、例えば核酸中に組み込まれた状態のヌクレオチドまたはポリペプチドもしくはタンパク質中に組み込まれた状態のアミノ酸を含む。
【００３３】
「ポリマー組成物」という用語は、一つ以上のポリマーを含む組成物である。一つのクラスとして、「ポリマー」には、限定されるものではないが、ホモポリマー、ヘテロポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、ブロックコポリマーが含まれ、天然および合成のどちらであってもよい。ホモポリマーは、一種類の構成要素またはモノマーを含む一方で、コポリマーは二種以上のモノマーを含む。「オリゴマー」は、例えば、３個〜１００個のモノマー残基等の少数のモノマーを含むポリマーである。したがって、「ポリマー」という用語にはオリゴマーが含まれる。「核酸」および「核酸アナログ」という用語には、核酸ならびに核酸ポリマーおよびオリゴマーが含まれる。
【００３４】
ポリマーは、モノマーがポリマー中に組み込まれている場合に、指定されたモノマーを「含む」かまたは指定されたモノマー「から誘導される」。したがって、ポリマーに含まれる、組み込まれるモノマーは、ポリマーに組み込まれる前のモノマーとは、重合プロセスにおいて、少なくとも、特定の連結基がポリマー骨格中に組み込まれているか、または、特定の基が除去されている点で、同一ではない。ポリマーは、特定の種類の結合がポリマー中に存在するならば、当該結合を含むといわれる。組み込まれたモノマーは「残基」である。核酸または核酸アナログの典型的なモノマーはヌクレオチドと称される。
【００３５】
「非反応性」により、化学部分、例えば、分子、化合物、組成物、基、部分、イオンなどの関連で、部分は、その使用目的において他の化学部分と実質的に反応しないことを意味する。非反応性部分は、認識試薬としての部分、部分、または基の使用目的を干渉しないか、またはほとんど干渉しないように選択される。本明細書中で記載するリンカー部分の関連で、それらは、認識試薬の標的鋳型に対する結合を干渉せず、かつ、標的鋳型上の認識試薬の連結を干渉しない点で、非反応性である。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「アルキル」とは、例えば、１〜約２０個の炭素原子を含む直鎖状、分枝鎖状、または環状の炭化水素基、例えば限定されるものではないが、Ｃ１〜３、Ｃ１〜６、Ｃ１〜１０基、例えば限定されるものではないが、直鎖状、分枝鎖状のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルなどを指す。「置換アルキル」とは、１以上、例えば、１、２、３、４、５、またはさらには６の位置で置換されたアルキルを指し、当該置換基は、任意の利用可能な原子で結合して、本明細書中で記載するような置換を有する、安定な化合物が生成される。「任意に置換されていてもよいアルキル」とは、アルキルまたは置換アルキルを指す。「ハロゲン」、「ハロゲン化合物」、および「ハロ」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および／または−Ｉを指す。「アルキレン」および「置換アルキレン」は、それぞれ、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン（hepamethylene）、オクタメチレン、ノナメチレン、またはデカメチレンを含むそれぞれ二価アルキルおよび二価置換アルキルを指す。「任意に置換されていてもよいアルキレン」は、アルキレンまたは置換アルキレンを指す。
【００３７】
「アルケンまたはアルケニル」とは、例えば、２〜約２０個の炭素原子を含む直鎖状、分枝鎖状、または環状のヒドロカルビル基、例えば、限定されるものではないが、１個以上、例えば、１、２、３、４、または５個の炭素・炭素二重結合を有するＣ１〜３、Ｃ１〜６、Ｃ１〜１０基を指す。「置換アルケン」は、１以上、例えば、１、２、３、４、または５の位置で置換されたアルケンを指し、当該置換基は、任意の利用可能な原子で結合して、本明細書中で記載するような置換を有する、安定な化合物が生成される。「任意に置換されていてもよいアルケン」とは、アルケンまたは置換アルケンを指す。同様に、「アルケニレン」とは、二価アルケンを指す。アルケニレンの例としては、限定されるものではないが、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）並びにそのすべての立体異性体および配座異性体（conformational isomeric）形態を指す。「置換アルケニレン」とは二価置換アルケンを指す。「任意に置換されていてもよいアルケニレン」とはアルケニレンまたは置換アルケニレンを指す。
【００３８】
「アルキン」または「アルキニル」とは、示された数の炭素原子と少なくとも１の三重結合とを有する直鎖状または分枝鎖状の不飽和炭化水素を指す。（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル基の例としては、限定されるものではないが、アセチレン、プロピン、１−ブチン、２−ブチン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ヘキシン、２−ヘキシン、３−ヘキシン、１−へプチン、２−へプチン、３−へプチン、１−オクチン、２−オクチン、３−オクチンおよび４−オクチンを含む。アルキニル基は、非置換であり得るか、または本明細書中で以下に記載するような１以上の置換基で任意に置換されていてもよい。「アルキニレン」という用語は、二価アルキンを指す。アルキニレンの例としては、限定されるものではないが、エチニレン、プロピニレンが挙げられる。「置換アルキニレン」とは、二価置換アルキンを指す。
【００３９】
「アルコキシ」という用語は、示された数の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基を指す。例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基は、−Ｏ−メチル（メトキシ）、−Ｏ−エチル（エトキシ）、−Ｏ−プロピル（プロポキシ）、−Ｏ−イソプロピル（イソプロポキシ）、−Ｏ−ブチル（ブトキシ）、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル（ｓｅｃ−ブトキシ）、−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−ブトキシ）、−Ｏ−ペンチル（ペントキシ）、−Ｏ−イソペンチル（イソペントキシ）、−Ｏ−ネオペンチル（ネオペントキシ）、−Ｏ−ヘキシル（ヘキシルオキシ）、−Ｏ−イソヘキシル（イソヘキシルオキシ）、および−Ｏ−ネオヘキシル（ネオヘキシルオキシ）を含む。「ヒドロキシアルキル」とは、１以上のアルキル基の水素原子が−ＯＨ基で置換されている（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル基を指す。ヒドロキシアルキル基の例としては、限定されるものではないが、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、およびその分枝型が含まれる。「エーテル」または「酸素エーテル」という用語は、１以上のアルキル基の炭素原子が−Ｏ−基で置換されているアルキル基を指す。エーテルという用語には、Ｐ１が、保護基、−Ｈ、または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１化合物が含まれる。例示的エーテルには、ポリエチレングリコール、ジエチルエーテル、メチルヘキシルエーテルなどが含まれる。
【００４０】
「ヘテロ原子」とは、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳを指す。ＮまたはＳ原子を含む化合物は、任意に、対応するＮオキシド、スルホキシド化合物またはスルホン化合物に酸化され得る。「ヘテロ置換」とは、１以上の炭素原子がＮ、Ｏ、ＰまたはＳで置換されている、本明細書中で記載する任意の実施形態における有機化合物を指す。
【００４１】
「アリール」とは、単独または組み合わせで、フェニルまたはナフチルなどの芳香環系を指す。「アリール」にはまた、任意にシクロアルキル環と縮合されていてもよい芳香環系も含まれる。「置換アリール」は、安定な化合物を生成するために任意の利用可能な原子で結合した１以上の置換基で独立して置換されたアリールであり、置換基は本明細書中で記載する通りである。「任意に置換されていてもよいアリール」とは、アリールまたは置換アリールを指す。「アリーレン」は二価アリールを意味し、「置換アリーレン」は二価置換アリールを指す。「任意に置換されていてもよいアリーレン」とは、アリーレンまたは置換アリーレンを指す。本明細書中で使用される場合、「多環式アリール基」という用語および「多環式芳香族基」などの関連する用語は、少なくとも２の縮合芳香環から構成される基を意味する。「ヘテロアリール」または「ヘテロ−置換アリール」とは、Ｎ、Ｏ、Ｐ、および／またはＳなどの１以上のヘテロ原子で置換されたアリール基を指す。
【００４２】
「シクロアルキル」は、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかである、単環式、二環式、三環式、または多環式、３〜１４員環系を指す。シクロアルキル基は、任意の原子を介して結合していてもよい。シクロアルキルはまた、シクロアルキルがアリールまたはヘテロアリール（hetroaryl）環と縮合している縮合環も想定する。シクロアルキルの代表例としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが含まれる。シクロアルキル基は、非置換であり得るか、または本明細書中で以下に記載するような１以上の置換基で任意に置換されていてもよい。「シクロアルキレン」とは、二価シクロアルキルを指す。「任意に置換されていてもよいシクロアルキレン」という用語は、安定な化合物を生成するために利用可能な任意の原子で結合した、１、２、または３個の置換基で置換されたシクロアルキレンを指し、置換基は本明細書中で記載されているとおりである。
【００４３】
「カルボキシル」または「カルボキシルの（carboxylic）」とは、示された場合に、示された炭素原子数を有し、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基を末端とし、したがって構造−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＯＨを有する基を指し、ここで、Ｒは直線状、分岐状または環状の炭化水素を含む二価の有機基である。これらの非限定的な例には、Ｃ１〜８カルボキシル基、例えば、エタノイック、プロパノイック、２−メチルプロパノイック、ブタノイック、２，２−ジメチルプロパノイック、ペンタノイック等が含まれる。「アミン」または「アミノ」とは、示された場合に示された炭素原子数を有し、−ＮＨ２基を末端とし、したがって構造−Ｒ−ＮＨ２を有する基を指し、ここで、Ｒは、直線状、分岐状または環状の炭化水素を含み、任意に１以上のヘテロ原子を含む非置換または置換された二価の有機基である。
【００４４】
上記を組み合わせた用語は、上記の好適な組み合わせ、例えば、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロ（herero）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（alkynylhereroaryl）を指す。一例として、「アリールアルキレン」とは、アルキレン基中の１以上の水素原子がアリール基、例えば（Ｃ３〜Ｃ８）アリール基で置換されている二価アルキレンを指す。（Ｃ３〜Ｃ８）アリール−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基の例としては、限定されるものではないが、１−フェニルブチレン、フェニル−２−ブチレン、ｌ−フェニル−２−メチルプロピレン、フェニルメチレン、フェニルプロピレン、およびナフチルエチレンが含まれる。「（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン」という用語は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン基中の１以上の水素原子が（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル基で置換されている二価アルキレンを指す。（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基の例としては、限定されるものではないが、１−シクロプロイル（ｐｒｏｙｌ）ブチレン、シクロプロピル（cycloproyl）−２−ブチレン、シクロペンチル−１−フェニル−２−メチルプロピレン、シクロブチルメチレンおよびシクロヘキシルプロピレンが含まれる。
【００４５】
「アミノ酸」は、構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、ここで、Ｒは側鎖、例えばアミノ酸側鎖である。「アミノ酸残基」とは、アミノ酸の鎖中に組み込まれた場合、例えば本明細書中で開示する認識試薬中に組み込まれた場合、例えば、構造−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−、Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（ポリペプチドのＮ末端である場合）、または−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（ポリペプチドのＣ末端である場合）を有するアミノ酸の残部を指す。「アミノ酸側鎖」は、タンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸を含むアミノ酸の側鎖である。アミノ酸は構造：
【化１】
2021506313.tif 000003
を有し、
ここで、Ｒはアミノ酸側鎖である。アミノ酸側鎖の非限定例を図３に示す。グリシン（Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）は側鎖を有さない。
【００４６】
「ペプチド核酸」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡの糖ホスホジエステル骨格がＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位で置換されている、核酸アナログ、またはＤＮＡ若しくはＲＮＡ模倣物を指す。ガンマＰＮＡ（γＰＮＡ）は、以下の構造：
【化２】
2021506313.tif 000004
のγ−修飾Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンモノマーのオリゴマーまたはポリマーであり、ここで、γ炭素に結合したＲ１またはＲ２の少なくとも一方は水素でないので、γ炭素はキラル中心である。Ｒ１およびＲ２が水素（Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン骨格）、または同一である場合、γ炭素についてそのようなキラリティーはない。組み込まれたＰＮＡまたはγＰＮＡモノマー、
【化３】
2021506313.tif 000005
は、本明細書中ではオリゴマー中にインテグレーションされた後の残存する構造に関してＰＮＡまたはγＰＮＡ「残基」と称され、各残基は、その塩基（核酸塩基）、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシル塩基、または他の塩基、例えば、本明細書中に記載する一価および二価塩基と同一であるかまたは異なるＲ基を有するので、ＤＮＡまたはＲＮＡと同様に、ＰＮＡ上の塩基の順序がその「配列」である。核酸または核酸アナログオリゴマー若しくはポリマー、例えばＰＮＡまたはγＰＮＡオリゴマー若しくはポリマー中の核酸塩基の配列は、核酸または核酸アナログ鎖中のアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよび／またはウラシル残基の相補的配列と、核酸塩基対合により、ワトソン・クリックまたはワトソン・クリック様方式で、本質的には二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと同様に結合する。
【００４７】
「グアニジン」または「グアニジニウム」基を認識試薬に添加して、溶解度および／またはバイオアベイラビリティを増大させることができる。ＰＮＡは合成ペプチドと同様の方法で生成されるので、グアニジン基を付加するための簡単な方法は、１以上の末端アルギニン（Ａｒｇ）残基をＰＮＡ、例えばγＰＮＡ認識試薬のＮ末端および／またはＣ末端に付加することである。同様に、アルギニン側基、
【化４】
2021506313.tif 000006
、または、グアニジン含有部分、例えば、
【化５】
2021506313.tif 000007
ここで、ｎは、例えば、限定されるものではないが、１〜５の範囲である、
または、その塩を本明細書中で記載する認識試薬骨格に結合させることができる。グアニジン含有基は、グアニジン部分を含む基であり、１００個未満の原子、５０個未満の原子、例えば、３０個未満の原子を有し得る。一態様において、グアニジン含有基は構造：
【化６】
2021506313.tif 000008
を有し、
ここで、Ｌは、本明細書中で記載する任意の態様にかかるリンカー、例えば、非反応性脂肪族ヒドロカルビルリンカー、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、またはペンタメチレンリンカーである。いくつかの態様では、グアニジン含有基は、構造：
【化７】
2021506313.tif 000009
を有し、
ここで、ｎは１〜５であり、例えば、グアニジン基はアルギニンであってよい。
【００４８】
「核酸塩基」には、主要な核酸塩基、すなわち、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルだけでなく、改変されたプリン塩基およびピリミジン塩基、例えば、限定されるものではないが、ヒポキサンチン、キサンテン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシンおよび５−ヒドロキシメチルシトシンが含まれる。図４および５Ａ〜５Ｃはまた、一価核酸塩基（例えば、核酸または核酸アナログの１つの鎖と結合する、アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシル）、および、核酸の２つの鎖上の相補的な核酸塩基と同時に結合する二価核酸塩基（例えば、本明細書中で記載するＪＢ１〜ＪＢ１６）、および、相補的な核酸塩基と増大した強度で結合する「Ｇクランプ」などの「クランプ」核酸塩基を含む、核酸塩基の非限定例を表す。さらなるプリン、プリン様、ピリミジンおよびピリミジン様核酸塩基は、例えば、米国特許第８，０５３，２１２号、同第８，３８９，７０３号、および同第８，６５３，２５４号で開示されているように、当該技術分野で公知である。図５Ａで示される二価核酸塩基ＪＢ１〜ＪＢ１６について、表Ａは種々の核酸塩基の特異性を示す。特に、ＪＢ１〜ＪＢ４シリーズは、相補的塩基（Ｃ−Ｇ、Ｇ−Ｃ、Ａ−ＴおよびＴ−Ａ）を結合し、一方で、ＪＢ５〜ＪＢ１６はミスマッチを結合し、したがって、マッチおよび／またはミスマッチ塩基の２つの鎖を結合するために使用できる。二価核酸塩基は、米国特許公開第２０１６００８３４３４Ａ１号および国際公開第ＷＯ／２０１８／０５８０９１号でさらに詳細に記載され、どちらも参照により本明細書中に組み込まれる。
【００４９】
【表Ａ】
2021506313.tif 000010
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「ＪＢ＃核酸塩基」、例えば「ＪＢ４核酸塩基」とは、ＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、およびＪＢ４ｅをはじめとする、Ｃ／Ｇ（結合Ｇ／Ｃ）を表す、ＪＢ４名称を有するすべての核酸塩基を指す。本明細書で記載する方式でアリール基により末端修飾されていないが、本明細書中で記載するように、末端修飾される可能性のある例示的γＰＮＡ構造は、国際公開第２０１２／１３８９５５号で開示されており、これは参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書中で示すように、ｍｉｎｉＰＥＧ  γＰＮＡには、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、ポリオキシエチレン）部分を含む１以上の基が含まれる。
【００５１】
相補的とは、ポリヌクレオチド（核酸）が互いにハイブリダイズ（結合）して、鎖間塩基対を形成する能力を指す。塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック方式で（例えば、Ａ対Ｔ、Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇ）、または、デュプレックスの形成を可能にする任意の他の方式で塩基対合（ハイブリダイズまたは結合）することができる。ＤＮＡではなく、ＲＮＡを使用する場合は、チミンではなくウラシルがアデノシンに対して相補的な塩基である。相補的配列を含む二つの配列は、それらが、水、食塩水（（例えば、生理食塩水、若しくは０．９％ｗ／ｖ食塩水）またはリン酸塩緩衝食塩水）中などの特定の条件下、あるいは例えば、限定されるものではないが、０．１×ＳＳＣ（食塩水クエン酸ナトリウム）〜１０×  ＳＳＣなどの他のストリンジェンシー条件下でデュプレックスを形成する場合、ハイブリダイズすることができ、ここで、１×ＳＳＣは、水中０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである。相補的配列のハイブリダイゼーションは、例えば塩濃度および温度により影響を受け、ミスマッチの増加およびストリンジェンシーの増加に伴って溶融温度（Ｔｍ）は低下する。完全にマッチした配列は「完全に相補性」であるとされるが、リピート伸長を含むｍＲＮＡなどの、それらが連結するはるかに長い標的配列に関して本明細書中で記載する小さな認識試薬の場合のように、一方の配列（例えば、ｍＲＮＡ中の標的配列）が他方よりも長い可能性がある。核酸の二本の相補的鎖は、一方の鎖が５’から３’への配向、他方が３’から５’への配向の逆平行の方向で結合する。ＰＮＡにより平行および逆平行の両方向が可能になるが、γＰＮＡについては逆平行結合が好ましい。
【００５２】
発明の一態様によると、遺伝子認識試薬が提供される。いくつかの態様において、認識試薬は自己連結（self-concatenating）し、このことは、標的核酸上の隣接する配列にハイブリダイズする場合、共有結合するか、または非共有結合の場合は、例えばπスタッキングによるかのいずれかの連結基、すなわち末端基を含むことを意味する。認識試薬は、例えばセルフライゲーションするかまたはπスタッキングし、二本鎖ＲＮＡヘアピン配列を標的とするために、リピート伸長疾患に関連するリピート伸長配列にハイブリダイズ（結合）するための核酸塩基の配列を含む末端基を有する、３以上、例えば、３〜１０個または３〜８個の近接した核酸または核酸アナログモノマー残基を含む。ｐｏｌｙＱ疾患の場合、ｒＣＡＧｅｘｐ配列から形成されるヘアピンの二本鎖配列は標的配列であり、試薬は、以下のものから選択される二価核酸塩基の配列を有する、ＥＩＦ若しくは（ＥＩＦ）ｎ（ここで、ｎは２以上の整数、例えば、２、３、４、または５である）、例えば、ＥＩＦＥＩＦ、ＩＦＥ若しくは（ＩＦＥ）ｎ（ここで、ｎは２以上の整数、例えば、２、３、４、または５である）、例えば、ＩＦＥＩＦＥ、またはＦＥＩ、若しくは（ＦＥＩ）ｎ（ここで、ｎは２以上の整数、例えば、２、３、４、または５である）、例えば、ＦＥＩＦＥＩ、ここで、Ｅは二価核酸塩基、例えば、ＪＢ３またはＪＢ３ｂ、結合Ｃ／Ｇ（ワトソン鎖／クリック鎖）であり、Ｆは、二価核酸塩基、例えば、ＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、またはＪＢ４ｅ、結合Ｇ／Ｃであり、Ｉは、二価核酸塩基、例えば、ＪＢ６またはＪＢ６ｂ、結合Ａ／Ａである、したがって、図１に示すように、ＣＡＧリピートから形成されたヘアピンの両方のハイブリダイズされた鎖と結合することができる。
【００５３】
本明細書中で記載する認識試薬は、小分子の特徴、例えば、低分子量、大規模生産の容易さ、低い生産コスト、細胞膜透過性、および所望の薬物速度論的と、ワトソン・クリック塩基対合によるオリゴヌクレオチドの配列特異的認識とを兼ね備える。オリゴマー認識試薬の連結は、セルフライゲーティング法およびπスタッキング連結法の両方について実証されており、すべての態様において限定ではなく例示的であることが意図される実施例にしたがって記載されている。したがって、本発明は、詳細な実施において、当業者が本明細書に含まれる記載から誘導することができる多くの変更が可能である。
【００５４】
本明細書中で記載する認識試薬の応用例は、表Ｂに列挙するものなどの、小配列のリピート伸長を伴う遺伝的疾患の治療においてである。
【００５５】
【表Ｂ】
2021506313.tif 000011
【００５６】
表Ｂに基づいて、記載した遺伝子産物を標的とする認識試薬の二価核酸塩基の例示的配列は、センス鎖に対して５’から３’方向の配列を含み、表Ｃに提示する。なお、それらの配列に応じて、すべてのリピート配列が通常の条件下でヘアピン構造を形成するわけではないが、列挙した認識試薬によってトリプレックス「ヘアピン」構造に誘導することができる。また、表Ｃに列挙した配列は単に例示的であって、天然のヘアピン構造または認識試薬によって誘導されたヘアピン構造中の折り畳み配列のアラインメントに応じて、他の配列がトリプレックス構造を形成することが予想される。また、配列のリピート特性のために、三塩基リピートの場合、三つの異なるフレームシフトが各配列にとって有用であり（表Ｃ、（ＧＡＡ）ｎの第三列を参照）、四塩基リピートの場合、四つの異なるフレームシフトが有用である。したがって、三塩基配列の場合、デュプレックス結合アラインメントの並べ替え、および各アラインメント内の認識試薬のフレームをシフトさせる能力（例えば、図１の図示したｒＣＡＧｅｘｐ配列内のアラインメントのＥＩＦ、ＩＦＥ、およびＦＥＩ）は、単位認識試薬の９通りの並べ替えをもたらし、これは認識試薬において反復され得る。例えば、配列（ＧＡＡ）ｎの場合、通常の条件下でヘアピンデュプレックスを形成すると予想される折り畳みアラインメントはないが、三つの異なる配列はトリプレックス構造を形成できると予想される。表Ｃにおいて、すべての並べ替えを示す唯一のリピート配列は、（ＧＡＡ）ｎの配列であり、他のリピートについては、例示的配列のみを提示する。特に、リピート構造のために、表Ｃに提示する配列のいずれも、例えば、２〜５×リピートしてもよく、例えば、Ｇ／Ａ−Ａ／Ａ−Ａ／Ｇであり、Ｇ／Ａ−Ａ／Ａ−Ａ／Ｇ−Ｇ／Ａ−Ａ／Ａ−Ａ／Ｇとも称し、そして１３−６−１４（ＪＢ１３シリーズ−ＪＢ６シリーズ−ＪＢ１４シリーズ）はまた１３−６−１４−１３−６−１４も含む。表Ｃ中、核酸塩基配列はまず、それらが結合している標的核酸塩基（例えば、ＪＢ４はＧ／Ｃと結合する）によって特定され、また、「ＪＢ」参照番号、例えば「４」によって特定され、これは「ＪＢ４」を指し、ＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、およびＪＢ４ｅが含まれる。
【００５７】
【表Ｃ−１】
2021506313.tif 000012
【表Ｃ−２】
2021506313.tif 000013
【００５８】
表Ｃ中、単位認識試薬標的配列（結合した塩基）は、「Ｂ１／Ｂ２」として認識試薬の単一の二価核酸塩基によって結合した二本の鎖の各塩基対を掲載し、認識試薬の二価核酸塩基によって結合した場合、Ｂ１は第一鎖からの塩基であり、Ｂ２は第二鎖からの塩基である。したがって、配列（ＣＡＧ）ｎの場合、単位標的配列の配列はＣ／Ｇ−Ａ／Ａ−Ｇ／Ｃであり、配列５’−ＣＡＧ−３’の逆平行配列を指し、配列、（ＣＣＧ）ｎの場合、標的配列の第二アラインメントの配列はＣ／Ｇ−Ｇ／Ｃ−Ｃ／Ｃであり、５’−ＣＣＧ−３’と逆平行の５’−ＣＧＣ−３’のアラインメントを指し、その一方で、配列Ｃ／Ｇ−Ｃ／Ｃ−Ｇ／Ｃは配列５’−ＣＣＧ−３’の逆平行配列を指す。
【００５９】
認識試薬の結合の関連での「単位標的配列」は、標的ヌクレオチド配列中のリピート核酸塩基配列で見られる最短のリピート配列、または、リピート二本鎖核酸塩基配列、ミスマッチを含み、二本鎖配列中に、同一若しくは異なる核酸分子の二本鎖、例えば本明細書中で記載するように二価認識試薬によってトリプレックス構造中で結合させた場合にアラインメントされた、である。
【００６０】
一態様において、第一末端と第二末端とを有し、３以上、例えば３〜１０、または３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、または３〜８個のＰＮＡ若しくはγＰＮＡ骨格残基から調製された、ペプチド核酸またはγペプチド核酸骨格、複数の核酸若しくは核酸アナログ骨格残基に連続して結合若しくは連結した核酸塩基の配列、骨格の第一末端における−ＳＨ、−ＯＨ、または−Ｓ−Ｓ−Ｌｇ部分、および骨格の第二末端における−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−Ｌｇ若しくは−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｌｇ部分（脱離基Ｌｇは、エステルまたはチオエステル結合により骨格に連結）であって、核酸塩基の配列は、単位標的配列、若しくは、核酸中の標的配列内の単位標的配列の２以上の逐次反復（ギャップのない、特定の配列の２以上の直接リピート）に対して相補的であるので、複数の認識モジュールが標的配列の隣接配列と結合する場合、互いにライゲーションするものを含む、認識試薬を提供する。一態様におけるＬｇは生体適合性および／または無毒である。Ｌｇの非限定例としては、置換若しくは非置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、置換若しくは非置換（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、（Ｃ１〜Ｃ８）カルボキシ、アミノ酸側鎖で任意に置換されていてもよい、または、グアニジン含有基、若しくは、
【化８】
2021506313.tif 000014
が含まれ、
ここで、ｏは１〜２０であり、Ｒ６の各々は、独立して、アミノ酸側鎖であり、Ｒ７は−ＯＨまたは−ＮＨ２である。
【００６１】
別の態様では、第一末端と第二末端とを有し、３以上、例えば３〜１０、または３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、または３〜８個の核酸若しくは核酸アナログ骨格残基から調製され、任意に立体構造的に予め組織化された、核酸または核酸アナログ骨格、複数の核酸または核酸アナログ骨格残基に連続して結合または連結した核酸塩基の配列、核酸または核酸骨格の第一末端に連結された第一アリール部分、および任意に第一アリール部分と同一であってもよく、核酸または核酸骨格の第二末端に結合した、第二アリール部分を含む、認識試薬を提供する。アリール部分は、独立して、２〜５環縮合多環式芳香族部分、例えば、２〜５縮合環を有する、置換若しくは非置換アリールまたはヘテロアリール部分、例えば、限定されるものではないが、非置換若しくは置換ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン／テトラセン、プレイアデン、ピセン、またはペリレンであって、Ｏ、Ｎ、および／またはＳなどの１以上のヘテロ原子で任意に置換されていてもよく、例えば、キサンテン、リボフラビン（ビタミンＢ２）、マンゴスチン、またはマンギフェリンであり、同一または異なっていてもよく、いくつかの態様では、同一である。ただし、認識試薬が標的核酸の隣接配列とハイブリダイズする場合、各々は隣接認識試薬のアリール部分とスタッキングできるものとする。認識試薬は、例えば、表Ｂに掲載したような、ｐｏｌｙＱ疾患などのリピート伸長疾患と関連する伸長されたリピートから形成されるヘアピンの両鎖と結合することができる。一態様において、前述のように、配列ＥＩＦ若しくは（ＥＩＦ）ｎ（ここで、ｎは２以上の整数、例えば、２、３、４、または５である）、例えばＥＩＦＥＩＦ、ＩＦＥ若しくは（ＩＦＥ）ｎ（ここで、ｎは２以上の整数、例えば、２、３、４、または５である）、例えばＩＦＥＩＦＥ、またはＦＥＩ、若しくは（ＦＥＩ）ｎ（ここで、ｎは２以上の整数、例えば、２、３、４、または５である）、例えばＦＥＩＦＥＩを有するＣＡＧリピートを結合する際に使用するため、である。
【００６２】
一態様において、認識試薬はセルフライゲーションし、構造：
【化９】
2021506313.tif 000015
を有し、
ここで、ＸはＳまたはＯであり、ｎは１以上から６以下の整数であり、ｍは０以上から４以下の整数であり、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、グアニジン含有基、例えば、
【化１０】
2021506313.tif 000016
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５、アミノ酸側鎖、例えば、
【化１１】
2021506313.tif 000017
直鎖若しくは分枝（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであって、１〜５０個のエチレングリコール部分を含むエチレングリコール単位で任意に置換されていてもよい、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０から５０の整数であり、ｒおよびｓはそれぞれ独立して、１から５０の整数であり、
Ｒ３は、Ｈまたは脱離基であり、一態様では、生体適合性および／または無毒であり、例えば、置換若しくは非置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、置換若しくは非置換（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン（Ｃ１〜Ｃ８）カルボキシ、アミノ酸側鎖で任意に置換されていてもよい、グアニジン含有基、または、
【化１２】
2021506313.tif 000018
であり、ここで、ｏは１〜２０であり、Ｒ６の各々は独立して、アミノ酸側鎖であり、Ｒ７は−ＯＨまたは−ＮＨ２であり、Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ１０）二価炭化水素または１以上のＮ若しくはＯ部分、例えば−Ｏ−、−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換された（Ｃ１〜Ｃ１０）二価炭化水素であり、Ｒ５は、−ＯＨ、−ＳＨまたはジスルフィド保護基であり、そしてＲの各々は独立して、核酸塩基であって、複数の認識モジュールの各々が鋳型核酸上の核酸塩基の標的配列と結合し、そして互いにライゲーションするように、標的核酸中の核酸塩基の標的配列と相補的な核酸塩基の配列を産生する。一態様において、Ｒ５は、構造−ＳＨ、−ＯＨ、または−Ｓ−Ｓ−Ｒ８を有し、ここで、Ｒ８は、１以上のアミノ酸残基、アミノ酸側鎖、線状、分枝状若しくはヘテロ置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンである。一態様において、Ｒ１またはＲ２は、アミノ酸側鎖またはグアニジン含有基、例えば、
【化１３】
2021506313.tif 000019
であり、ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５である。一態様において、Ｒ１およびＲ２は、異なり、Ｒ１がＨであり、Ｒ２はＨではないか、またはＲ２がＨであり、Ｒ１はＨではない。天然の核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡに対する結合について、Ｒ１はＨであってもよく、Ｒ２はＨではなく、それにより、「右巻き」Ｌ−γＰＮＡを形成する。例えば、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＨではない「左巻き」Ｄ−γＰＮＡは、天然の核酸と結合しない。一態様において、認識試薬は、１以上のグアニジン含有基、例えば、
【化１４】
2021506313.tif 000020
で置換され、ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５である。
【００６３】
一態様において、Ｒ１またはＲ２は、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０〜５０の整数であり、ｒは１〜５０の整数であり、そしてｓは１〜５０の整数である。
【００６４】
末端がアリール基である認識試薬は、すぐ隣のハイブリダイズする認識試薬のアリール基の非共有結合、例えば、πスタッキングの結果として連結する能力を有する。したがって、別の態様では、構造：
【化１５】
2021506313.tif 000021
を有する認識試薬（認識モジュール）が提供され、
ここで、Ｒは、独立して、核酸塩基であり、Ｒの各々は、同一であるか、または異なる核酸塩基であり得、
ｎは、１〜６の範囲の整数、例えば、１、２、３、４、５、または６であり、
各Ｂは、独立して、リボース−５−ホスフェート残基、デオキシリボース−５−ホスフェート残基、または核酸アナログ骨格残基であり、一態様において、立体構造的に予め組織化された核酸アナログ、例えばγＰＮＡまたはＬＮＡの骨格残基であり、
Ｌは、独立して、リンカー、例えば、非反応性リンカーまたは非反応性、非巨大リンカーであり、Ｌの各々は、同一であるまたは異なり得、そして
Ａｒの各々は、独立して、２〜５環縮合多環式芳香族部分、例えば、２〜５縮合環を有する置換若しくは非置換アリールまたはヘテロアリール部分、例えば、限定されるものではないが、非置換若しくは置換ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン／テトラセン、プレイアデン、ピセン、またはペリレンであって、Ｏ、Ｎ、および／またはＳなどの１以上のヘテロ原子で任意に置換されていてもよく、例えば、キサンテン、リボフラビン（ビタミンＢ２）、マンゴスチン、またはマンギフェリンであり、同一であるかまたは異なっていてもよく、いくつかの態様では同一である。いくつかの態様では、認識試薬が標的核酸の隣接配列とハイブリダイズする場合、各Ａｒは、隣接認識試薬のＡｒ基とスタッキングする。
【００６５】
化合物の部分、例えば、アリール部分または核酸塩基は認識試薬骨格と共有結合し、したがって、骨格に「連結」されるといわれる。化合物を調製するために使用される化学的性質に応じて、結合は直接的であってもよいし、または二つの他の部分または基と共有結合する部分である「リンカー」を介してであってよい。一態様において、末端芳香族（アリール）基はリンカーを介して認識試薬に結合される。リンカーは、芳香族基を認識試薬の骨格に連結させる非反応性部分であり、そして、いくつかの態様では、ヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｓ、若しくはＯで任意に置換されていてもよい、１〜１０個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１０）、または、非反応性結合、例えば、アミンをカルボキシル基と反応させることによって形成されるアミド結合（ペプチド結合）である。Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンの例は、任意に環状部分を含んでもよい、線状若しくは分枝状アルキレン（二価）部分、例えば、任意にアミド結合を含んでもよい、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン（hepamethylene）、オクタメチレン、ノナメチレン、またはデカメチレン部分（すなわち、−ＣＨ２−［ＣＨ２］ｎ−であり、ここで、ｎ＝１〜９）である。リンカーは、認識試薬の標的核酸に対する結合を、実質的に、立体的に遮蔽または他の方法で干渉せず、標的核酸上の認識試薬の連結を干渉しない点で、嵩高くない。リンカーは、認識試薬の芳香族基および骨格の連結に起因する残存部分、例えば、
【化１６】
2021506313.tif 000022
、または、非限定的な一例では、ピレン−１−酢酸等の酢酸置換アリール化合物（Ａ）のＤａｂ（ｎ＝１）、Ｏｒｎ（ｎ＝２）、またはＬｙｓ（ｎ＝３）残基に対する結合に起因する、
【化１７】
2021506313.tif 000023
である。
【００６６】
さらなる態様において、リンカーまたは連結基は、化合物の二つの部分と接続する、例えば、化合物の二つの部分と共有結合する有機部分、例えば本発明の関連で限定されるものではないが、認識試薬の骨格に対する芳香族基の接続、核酸若しくは核酸アナログ骨格に対する核酸塩基の接続、および／または認識試薬に対するグアニジウム基の接続である。リンカーは、典型的には、直接結合または酸素もしくは硫黄等の原子、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨもしくは原子鎖等の単位、例えば、限定されるものではないが、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロ（herero）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロ（herero）アリールを含み、ここで、１以上の炭素、例えば、メチレンまたはメチリジン（−ＣＨ＝）は、任意に、ヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、若しくはＮ、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換ヘテロ環が中間または末端にあってもよい。一態様において、リンカーは、約５〜２５個の原子、例えば、５〜２０、５〜１０、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の原子、または合計１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のＣおよびヘテロ原子、例えばＯ、Ｐ、Ｎ、若しくはＳ原子を含む。
【００６７】
ＰＮＡ、例えばγＰＮＡとの結合に関して、適切かつ利用可能なリンカーは、例えば、アミノ酸を認識試薬に付加するために周知のペプチド合成化学を使用して、アミンをカルボキシル基と反応させてアミド結合を形成するものであり、アミノ酸は、化学部分、例えば、下記の実施例で示すように、アリール修飾アミノ酸を添加してピレンアリール部分を認識試薬に連結し、アルギニンを使用してグアニジン基を提供して、アリール部分、またはグアニジン基などの化学的部分で前もって修飾してもよい。非ペプチド核酸アナログへの連結は、広く知られているような任意の好適な連結化学を使用して、例えば、カルボジイミド化学、例えば、ＥＤＣ（ＥＤＡＣ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）を使用して、アミン修飾芳香族部分を認識試薬に、例えば、末端ホスフェートを介して連結することによって達成することができる。
【００６８】
芳香族基を認識試薬の骨格に連結する際に、リンカーは、本明細書中で記載するような標的核酸配列上の認識試薬の連結の間にπ−πスタッキングのための位置に芳香族基を配置するために適切なサイズまたは長さのものである。
【００６９】
さらなる態様において、認識試薬は、構造：
【化１８】
2021506313.tif 000024
を有し、ここで、
Ｒの各々は独立して、核酸塩基であり、Ｒの各々は同一であるかまたは異なる核酸塩基であり得、
ｎは１〜６の範囲の整数、例えば、１、２、３、４、５、または６であり、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、グアニジン含有基、例えば、
【化１９】
2021506313.tif 000025
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、例えば、
【化２０】
2021506313.tif 000026
、非置換若しくは置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、または（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０〜５０の整数であり、ｒは１〜５０の整数であり、ｓは１から５０の整数であり、そして一態様では、Ｒ１およびＲ２は異なり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＨではないか、またはＲ２はＨであり、Ｒ１はＨではない、
Ｒ１０またはＲ１１の一方、およびＲ１２、Ｒ１３、またはＲ１４のうちの一つは、−Ｌ−Ｒ３であり、ここで、Ｒ３の各々は、独立して、２〜５環縮合多環式芳香族部分、例えば、２〜５縮合環を有する、置換若しくは非置換アリールまたはヘテロアリール部分、例えば、限定されるものではないが、非置換若しくは置換ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン／テトラセン、プレイアデン、ピセン、またはペリレンであって、Ｏ、Ｎ、および／またはＳなどの１以上のヘテロ原子で任意に置換されていてもよく、例えば、キサンテン、リボフラビン（ビタミンＢ２）、マンゴスチン、またはマンギフェリンであり、同一であるかまたは異なっていてもよく、いくつかの態様では同一であり、ある場合には、認識試薬が標的核酸の隣接配列とハイブリダイズする場合、隣接認識試薬のＲ３基とスタッキングし、
ここで、Ｌはリンカー、例えば、非反応性リンカーまたは非反応性、非巨大リンカーであり、Ｌの各々は、同一であるかまたは異なり得、アミノ酸残基、または置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニル、置換若しくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロ（herero）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロ（herero）アリールを含んでもよく、１以上の炭素、例えば、メチレンまたはメチリジン（−ＣＨ＝）は、任意に、ヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、若しくはＮ、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換ヘテロ環が中断若しくは末端にあってもよく、
そして、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４の残りは、各々独立して、Ｈ、１以上の近接アミノ酸残基、グアニジン含有基、アミノ酸側鎖、直鎖若しくは分枝（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであって、１〜５０個のエチレングリコール部分を含むエチレングリコール単位で任意に置換されていてもよい、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０〜５０の整数であり、ｒは１〜５０の整数であり、ｓは１〜５０の整数である。
【００７０】
一態様において、Ｒ４およびＲ７は−Ｌ−Ｒ３であり、別の態様では、Ｒ４およびＲ７は−Ｌ−Ｒ３であり、Ｒ１１およびＲ１４はＡｒｇである。一態様において、リンカーは、約５〜２５個の原子、例えば５〜２０、５〜１０、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の原子、または合計１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のＣおよびヘテロ原子、例えばＯ、Ｐ、Ｎ、若しくはＳ原子を含む。別の態様では、１以上のＲ１、Ｒ２、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４は、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０〜５０の整数であり、ｒは１〜５０の整数であり、ｓは１〜５０の整数である。
【００７１】
さらに別の態様では、認識試薬はＰＮＡ骨格を含み、したがって構造：
【化２１】
2021506313.tif 000027
を有し、ここで、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８を含む１〜８の範囲の整数であり、
ｍは、１，２、３、４、または５を含む１〜５、例えば１〜３の範囲の整数であり、
Ｒ２は、グアニジン含有基、例えば
【化２２】
2021506313.tif 000028
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、例えば、
【化２３】
2021506313.tif 000029
、非置換若しくは置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、または（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１はＨ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０から５０の整数であり、ｒおよびｓは、それぞれ独立して、１から５０の整数であり、
Ｒ３は、非置換縮合環多環式芳香族部分、例えば、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン／テトラセン、プレイアデン、ピセン、またはペリレンであり、
Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４の各々は独立して、Ｈ、グアニジン含有基、例えば、
【化２４】
2021506313.tif 000030
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、または１以上の近接アミノ酸残基、例えば１以上のＡｒｇ残基である。一態様において、Ｒ３はピレンである。
【００７２】
別の態様では、Ｒ２は−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨであり、ここで、ｒは、１〜５０、例えば１〜１０の範囲の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、実施例２では１である。別の態様では、１以上のＲ２、Ｒ１１、Ｒ１３、またはＲ１４は、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ）ｑ−ＮＨＰ１、−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、若しくは−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン若しくは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０〜５０の整数であり、ｒは１〜５０の整数であり、ｓは１〜５０の整数である。
【００７３】
ＰＮＡ系認識試薬のいくつかはキラリティーなしで示され、一例では、γ炭素（Ｒ１およびＲ２が結合しているもの）は、Ｒ２がＨであり、Ｒ１がＨではない（Ｒ）配向であるか、またはγ炭素は、例えば、Ｒ１がＨであり、Ｒ２はＨではない（Ｓ）配向である。さらに、一例では、存在する場合、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、および／またはＲ１４位置において、キラルアミノ酸残基の１以上、またはすべては、Ｌ−アミノ酸であってよい。別の例では、存在する場合、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、および／またはＲ１４位置において、キラルアミノ酸残基の１以上または全部はＤ−アミノ酸であり得る。
【００７４】
前記のいずれかの薬剤的に許容される塩も提供する。
【００７５】
本明細書中で記載する化合物のいずれかの薬剤的に許容される塩も、本明細書中で記載する方法において使用することができる。本明細書中で記載する化合物の薬剤的に許容される塩形態は、調剤分野で公知の従来法によって調製することができ、獣医学的に許容される塩として含んでもよい。例えば、制限されるわけではないが、化合物がカルボキシ基を含む場合、その好適な塩は、化合物を適切な塩基と反応させて、対応する塩基付加塩を提供することにより、形成することができる。非限定例としては、アルカリ金属水酸化物、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化リチウム、水酸化バリウムおよび水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属水酸化物、エタノール酸カリウムおよびプロパノール酸ナトリウムなどのアルカリ金属アルコキシド、並びにピペリジン、ジエタノールアミン、およびＮ−メチルグルタミンなどの様々な有機塩基が挙げられる。
【００７６】
薬剤的に許容される塩基性塩の非限定例としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン（manganic）、亜マンガン（manganous）、カリウム、ナトリウム、および亜鉛塩が挙げられる。薬剤的に許容される無毒な有機塩基から誘導される塩としては、限定されるものではないが、一級、二級、および三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クロロプロカイン、コリン、Ｎ，Ｎ´−ジベンジルエチレンジアミン（ベンザチン）、ジシクロヘキシルアミン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソ−プロピルアミン、リドカイン、リジン、メグルミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、およびトリス−（ヒドロキシメチル）−メチルアミン（トロメタミン）の塩が挙げられる。
【００７７】
薬剤的に許容される酸塩の非限定例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アルギニン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシレート（ベンゼンスルホン酸塩）、重硫酸塩、重亜硫酸塩、臭化物、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、カプリル酸塩、塩化物、クロロ安息香酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、リン酸二水素塩、ジニトロ安息香酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、ガラクタル酸塩（galacterate）、ガラクツロン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミコハク酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、馬尿酸塩，塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、イソ酪酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタリン酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル安息香酸塩、リン酸一水素塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、オレイン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニル酢酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、およびフタル酸塩が挙げられる。
【００７８】
複合塩形態もまた、薬剤的に許容される塩であると考えられる。複合塩形態の一般的な非限定例としては、酒石酸水素塩、二酢酸塩、二フマル酸塩、ジメグルミン、二リン酸塩、二ナトリウム、および三塩酸塩が挙げられる。
【００７９】
したがって、本明細書中で用いられる「薬剤的に許容される塩」は、本明細書で記載する任意の化合物の塩形態を含む活性部分（薬物）を意味することが意図される。塩形態は、好ましくは、本明細書中で記載する化合物の改善されたおよび／または所望の薬物速度論的／薬力学的（pharmodynamic）特性を付与する。
【００８０】
本明細書中で記載する組成物は任意の有効な経路によって投与することができる。送達経路の例としては、限定されるものではないが、局所、例えば皮膚上、吸入、浣腸、眼、耳および鼻腔内送達、経腸、例えば、経口的に、経胃チューブによる、および経直腸的、並びに非経口、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、皮下、骨内、皮内、髄腔内、腹腔内、経皮、イオン注入、経粘膜、硬膜外および硝子体内が挙げられ、経口、静脈内、筋肉内および経皮アプローチが多くの場合好ましい。好適な投薬形態には、本明細書中で記載するように、リピート伸長疾患の治療に有用な活性部分を含む組成物を含む、単回投与、または複数回投与バイアル若しくは他の容器、例えば、医療用シリンジが含まれ得る。
【００８１】
投薬計画は、所望の至適応答（例えば、治療または予防応答）を提供するために調節することができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、長時間にわたって複数の分割量を投与してもよいし、または組成物を連続的若しくはパルス化方式で投与してもよく、用量もしくは部分用量を一定間隔で、例えば、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、若しくは１２０分ごと、毎日２〜１２時間ごと、または一日おきなどで、治療状況の要件によって示されるとおりに比例的に低減若しくは増加させる。場合によっては、組成物、例えば非経口若しくは吸入組成物を、投与の容易さおよび投薬量の一様性のために単位投与形態で処方するのが特に有利であり得る。単位投与形態についての明細は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および達成される特定の治療または予防効果、および（ｂ）個体の過敏症の治療のためのそのような活性化合物の配合の技術に内在する限界によって決定され、直接的に依存する。
【００８２】
有用な投薬形態としては、静脈内、筋肉内、または腹腔内溶液、経口錠剤または液体、局所軟膏またはクリームおよび経皮デバイス（例えば、パッチ）が挙げられる。一態様において、化合物は、活性部分（薬物、若しくは化合物）、および溶媒、例えば水、食塩水、乳酸加リンゲル液、またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む滅菌溶液である。さらなる賦形剤、例えば、ポリエチレングリコール、乳化剤、塩および緩衝液を溶液に含めることができる。
【００８３】
治療／医薬組成物を、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｐａｕｌ  Ｂｅｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ  Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（２００５）で記載されている許容される調剤手順にしたがって調製する（例えば、粉末、液体、非経口、静脈内および経口固体処方ならびにかかる処方を作製する方法の例については、第３７章、第３９章、第４１章、第４２章および第４５章を参照のこと）。
【００８４】
投薬計画を調節して、所望の至適応答（例えば、治療または予防応答）を提供することができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、複数の分割量を投与してもよいし、または組成物を連続的もしくはパルス化方式で、用量若しくは部分用量を一定間隔で、例えば、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、もしくは１２０分毎、毎日２〜１２時間毎、または一日おき等で、治療状況の危急性によって望ましい場合は比例して減少若しくは増加させて投与してもよい。ある場合には、非経口または吸入組成物などの組成物を、投与の容易さおよび投薬量の一様性のために単位投与形態で処方するのが特に有利であり得る。単位投与形態の詳細は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および達成されるべき特定の治療または予防効果、並びに（ｂ）個体における過敏症の治療用にそのような活性化合物を配合する技術に内在する制限により決定され、直接依存する。
【００８５】
有用な投薬形態としては静脈内、筋肉内、または腹腔内溶液、経口錠剤または液体、局所軟膏またはクリームおよび経皮デバイス（例えば、パッチ）が挙げられる。一態様において、化合物は、活性部分（薬物、若しくは化合物）と、水、食塩水、乳酸加リンゲル液、またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの溶媒とを含む滅菌溶液である。ポリエチレングリコール、乳化剤、塩および緩衝液などの追加の賦形剤を溶液に含めてもよい。
【００８６】
遺伝子認識試薬に加えて、リピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含む核酸を結合する方法であって、伸長されたリピートを含む核酸を、本明細書中で記載する遺伝子認識試薬の任意の態様と接触させることを含む方法も、発明の態様で提供される。一態様では、方法をインビトロまたはエクスビボで実施する。別の態様では、方法は、遺伝子認識試薬を含む好適な製剤処方を患者に対して、伸長されたリピートを有する遺伝子の発現をノックダウンするために、若しくは患者を治療するために有効な量で投与することにより、インビボで実施する。
【００８７】
別の態様において、患者から得られたサンプル中の、（ＣＡＧ）ｎなどの、リピート伸長疾患と関連する伸長されたリピートを含有する核酸の存在を特定する方法が提供される。方法は、患者から得られた核酸サンプルを本明細書中で記載するような任意の態様にかかる遺伝子認識試薬と接触させることを含む。次に、遺伝子認識試薬の結合および連結は、サンプル中の核酸における標的配列の存在下で起こるので、結合および連結は、サンプル中の核酸における標的配列の存在を示すものである。遺伝子認識試薬の結合および連結は、任意の有効な方法を用いて検出および／または定量化することができる。標的配列における伸長されたリピートを含む核酸の存在は、リピート伸長疾患と関連し、その点で、患者を、例えば、本明細書中で記載する遺伝子認識試薬を含む医薬投与形態の患者への投与により、リピート伸長疾患について治療することができる。
【００８８】
このように、ヌクレオチド配列の伸長されたリピートと関連する疾患を有する患者を治療する方法が提供される。疾患の例は、表Ｂに掲載するものであるか、またはｐｏｌｙＱ疾患、例えば、ハンチントン病、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調３型またはマチャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調７型）、およびＳＣＡ１７（脊髄小脳失調１７型）である。疾患は、ｐｏｌｙＱ疾患、例えばハンチントン病について、（ＣＡＧ）ｎなどの特定の疾患の特徴的反復配列を結合するように選択される、本明細書中で記載するような遺伝子認識試薬を含む組成物または医薬投与形態を患者に投与することによって治療する。医薬投与形態の組成物を患者に対して、疾患を治療するために有効な量および投与計画で投与する。したがって、本明細書中で記載するような遺伝子認識試薬を含む組成物の使用として、ヌクレオチド配列の伸長されたリピートに関連する疾患、例えば、ＰｏｌｙＱ疾患、例えばハンチントン病、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調３型またはマチャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調７型）、およびＳＣＡ１７（脊髄小脳失調１７型）の治療のための使用も提供される。
【００８９】
いくつかの実施形態において、開示は、ａ）一連のペプチド核酸（ＰＮＡ）単位であって、ｉ）第一の単位、ｉｉ）最終単位、およびｉｉｉ）第一の単位と最終単位との間の少なくとも１の中間の単位を含み、一連の単位における各単位が、Ａ）骨格部分であって、１）第一の単位の骨格部分は他の１の単位の骨格部分に共有結合し、２）最終単位の骨格部分は他の１の単位の骨格部分と共有結合し、そして３）各々の中間の単位の骨格部分は他の二つの単位の骨格部分と共有結合している、骨格部分、並びにＢ）骨格部分に共有結合した二価核酸塩基を含む、一連のペプチド核酸単位、ｂ）第一の単位に共有結合した第一アリール部分、およびｃ）最終単位に共有結合した最終アリール部分を含む化合物を提供する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、開示は、ａ）一連のＰＮＡ単位であって、ｉ）第一の単位、ｉｉ）最終単位、およびｉｉｉ）第一の単位と最終単位との間の少なくとも１の中間の単位を含み、一連の単位中の各単位が、Ａ）骨格部分であって、１）第一の単位の骨格部分は他の１の単位の骨格部分と共有結合し、２）最終単位の骨格部分は他の１の単位の骨格部分と共有結合し、そして３）各中間の単位の骨格部分は他の２の単位の骨格部分と共有結合している、骨格部分、並びにＢ）骨格部分と共有結合した二価核酸塩基を含む、一連の単位、ｂ）二つのアリール部分であって、一方は第一の単位に共有結合し、もう一方は最終単位と共有結合している、アリール部分を含む化合物を提供する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、開示は、第一アリール部分が第一の単位と第一リンカー部分によって共有結合し、最終アリール部分が最終単位と最終リンカー部分によって共有結合している化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、第一リンカー部分および最終リンカー部分が、各々独立して、グアニジン基を含む化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、第一リンカー部分および最終リンカー部分が、各々独立して、アミノ酸残基を含む化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、第一リンカー部分および最終リンカー部分が、各々独立して、三つのグアニジン含有アミノ酸残基を含む化合物を提供する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、開示は、第一リンカー部分および最終リンカー部分が、各々独立して、三つの近接するアルギニン残基を含む化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、一連の単位が３〜８単位である化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、一連の単位がγ−ＰＮＡである化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、第一アリール部分および最終アリール部分が各々独立して、２〜５環縮合多環式芳香族部分、例えば、ポリ芳香族炭化水素、例えばピレンである化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、第一アリール部分および最終アリール部分が同一である化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、エチレングリコール単位、例えば、ジエチレングリコール単位をさらに含む化合物を提供する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、開示は、標的核酸配列に対して相補的な順で二価核酸塩基を提示する化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、標的核酸配列がリピート伸長疾患に関連する化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、リピート伸長疾患が１型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）または２型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ２）である化合物を提供する。いくつかの実施形態において、開示は、化合物であって、二つの化合物が核酸とハイブリダイズする場合、一方の化合物の第一アリール部分と他方の化合物の最終アリール部分とがスタッキングする化合物を提供する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、開示は、式：Ｈ−ＬＡｒｇ−ＣＡＧＣＡＧ−ＬＡｒｇ−ＮＨ２（Ｐ１）、Ｈ−ＬＡｒｇ−ＬＤａｂ（Ｐｙｒ）−ＣＡＧＣＡＧ−ＬＯｒｎ（Ｐｙｒ）−ＬＡｒｇ−ＮＨ２（Ｐ２）、Ｈ−ＬＡｒｇ−ＬＯｒｎ（Ｐｙｒ）−ＣＡＧＣＡＧ−ＬＯｒｎ（Ｐｙｒ）−ＬＡｒｇ−ＮＨ２（Ｐ３）、Ｈ−ＬＡｒｇ−ＬＬｙｓ（Ｐｙｒ）−ＣＡＧＣＡＧ−ＬＬｙｓ（Ｐｙｒ）−ＬＡｒｇ−ＮＨ２（Ｐ４）、Ｈ−ＬＡｒｇ−ＬＬｙｓ（Ｐｙｒ）−ＣＡＴＣＡＧ−ＬＬｙｓ（Ｐｙｒ）−ＬＡｒｇ−ＮＨ２（Ｐ５）、またはＨ−ＬＡｒｇ−ＬＬｙｓ（Ｐｙｒ）−ＣＴＧＣＴＧ−ＬＬｙｓ（Ｐｙｒ）−ＬＡｒｇ−ＮＨ２（Ｐ６）の化合物を提供し、ここで、Ｏｒｎはオルニチンであり、Ｄａｂはジアミノ酪酸であり、Ｐｙｒはカルボキシル官能化芳香族化合物、例えば、ピレン−１−カルボン酸、ピレン−２−カルボン酸、ピレン−４−カルボン酸、ピレン−１−酢酸、ピレン−２−酢酸、またはピレン−４−酢酸などのピレンである。
【００９５】
いくつかの実施形態において、開示は、核酸を結合する方法を提供し、方法は、核酸を開示の化合物と接触させることを含み、化合物は、接触すると核酸に結合する。いくつかの実施形態において、開示は、細胞においてｍＲＮＡの発現をノックダウンする方法を提供し、方法は、細胞を開示の化合物と接触させることを含み、化合物は、ｍＲＮＡに対応する細胞中のＤＮＡ配列を結合すると、細胞中のｍＲＮＡの発現をノックダウンする。
【００９６】
いくつかの実施形態において、開示は、第一末端と第二末端とを有し、そして３〜８個のリボース−５−ホスフェート、デオキシリボース−５−ホスフェート、または核酸アナログ骨格残基を有する、核酸若しくは核酸アナログ骨格、同一であるか若しくは異なっていてもよく、複数のリボース−５−ホスフェート、デオキシリボース−５−ホスフェート、または核酸アナログ骨格残基と連結された、二価核酸塩基、リンカーにより核酸若しくは核酸アナログ骨格の第一末端に連結された、第一アリール部分、任意に第一アリール部分と同一であってもよく、リンカーにより核酸若しくは核酸アナログ骨格の第二末端に連結された、第二アリール部分を含む遺伝子認識試薬を提供する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本開示は、ａ）１以上の二価核酸塩基と、第一エミッター部分と接続した第一末端と、第二エミッター部分と接続した第二末端とを含む第一プローブ核酸を、標的核酸の第一リピート部分とハイブリダイズさせ、そしてｂ）１以上の二価核酸塩基と、第三エミッター部分に接続した第一末端と、第四エミッター部分と接続した第二末端とを含む第二プローブ核酸を、標的核酸の第二リピート部分とハイブリダイズさせることを含む検出方法であって、ｉ）標的核酸の第一および第二リピート部分は、リピート伸長障害と関連し、ｉｉ）第一プローブ核酸および第二プローブ核酸を標的と結合させると、第三または第四エミッター部分とごく接近した第一または第二エミッター部分が得られ、ｉｉｉ）第三または第四エミッター部分とごく接近した第一または第二エミッター部分の存在は、ごく接近したエミッター部分の発光波長において変化を引き起こす、方法を提供する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、検出方法は、ごく接近したエミッター部分の発光波長における変化を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第一プローブ核酸を第一リピート部分にハイブリダイズすることで、第二プローブ核酸の第二リピート部分に対する親和性が増大する。いくつかの実施形態において、第三または第四エミッター部分に近接した第一または第二エミッター部分の存在は、第一または第二エミッター部分と第三または第四エミッター部分との間のπ−πスタッキング相互作用を引き起こす。いくつかの実施形態において、標的核酸は生体サンプルから直接得られる。
【実施例】
【００９９】
実施例１
ＮＭＲ、Ｘ線、および生化学的研究によって、ｒＣＡＧ−ヘアピン構造がカノニカルＲＮＡデュプレックスと比較して比較的動的であり、Ａ−Ａ内部隆起が大振幅運動を示すことが明らかになった。道路の「深い穴」と類似した、すべての二つのカノニカルＧ−Ｃ／Ｃ−Ｇ塩基対での内部Ａ−Ａミスマッチ（図１（Ａ））を含むそのような分子スカフォールドは、外因的リガンドの異なる生存可能な受容体様結合部位を提供する。ｒＣＡＧ−ヘアピン構造を標的とする比較的短い核酸リガンドが開発された（図１（Ｂ））。ヤヌス塩基（Ｊ塩基、すなわちＪＢ）、Ｅ、Ｉ、およびＦ（図１（Ｃ））を使用し、これらは、立体構造的に予め組織化されたＭＰｙＰＮＡ骨格を有する、ＲＮＡ二重らせんの両鎖において核酸塩基と二価Ｈ結合相互作用を形成できる（図１（ＤおよびＥ））。本明細書中で記載するＪ塩基は、合計で１６であり、１６すべての可能なＲＮＡ塩基対組み合わせと結合するように設計された、両面核酸認識要素のより大きなセットの一部である（図５Ａ〜５Ｃ）。それらは、形状、サイズ、および化学官能性が均一である点で「ヤヌス−ウェッジ」を含む他のＪ塩基とは、異なり、したがって、モジュラーフォーマットと組み合わせて、ＲＮＡ塩基対の任意の組み合わせを認識することができる。
【０１００】
分子力学（ＭＤ）シミュレーション
二価認識デザイン概念の実行可能性を評価するために、四つのｒＣＡＧリピートを含むＲＮＡデュプレックスと結合したリガンドＬＧ１のＭＤシミュレーションを実施した。Ｃ末端リジン残基を除外し、ＭＰ側鎖をメチル基と置換して（ＭｅγＰＮＡ）、コンピュータによるモデル化を単純化した。ＣＥＯ、ＡＩＡ、およびＧＦＣトライアドを構築し、６−３１基底系によって最適化し、各ＲＮＡおよびＭｅγＰＮＡ骨格上にグラフトした。結合したＲＮＡ−ＬＧｌ−ＲＮＡ複合体の構造を、ＡｍｂｅｒｔｏｏｌのＮＡＢモジュールを使用して創出した。最終構造を水分子およびイオンで溶媒和させ、エネルギーを最小化し、１００ｎｓについてシミュレーションした。結果として得られた複合体はシミュレーション全体にわたってかなり安定なままであり、四つの別個のＬＧ１リガンドが二つのＲＮＡ鎖間にぴったりと、はまっている（図６（Ａ））。Ｈ結合の数は、ＣＥＯおよびＧＦＣトライアドの各々については５であり、ＡＩＡについては４であるが（図６（Ｂ））、シミュレーションの間変わらないままであった（図６（Ｃ））。しかしながら、４より少ないＬＧ１リガンドとの結合をシミュレートする試みは失敗に終わった。複合体が解かれ、末端塩基対が不安定であるために一部はねじ曲がった構造を形成した（図６（ＤおよびＥ））。
【０１０１】
化学的構成要素およびリガンドの合成
Ｊ塩基ＥおよびＦを、対応するＪＢ−ＭＰγＰＮＡモノマー１〜３と共に合成した（図７）。Ｊ塩基Ｉは市販されているので調製しなかった。ＥおよびＦを、それぞれ、スキーム１（図８）およびスキーム２（図９）にしたがって合成した。化合物５〜９におけるＢｏｃ保護／脱保護配列は、ＮＢＳ反応の化学収率の向上およびその後の縮合および環化ステップにおける副反応の抑制に好ましいことが判明した。Ｓｔｉｌｌｅカップリングが円滑に進行するためには、１２のさらなる保護が好ましいことが見いだされた。これは、Ｂｏｃ無水物を用い、高温で実施して達成された。みかけの嵩高さにもかかわらず、ＥのＭＰγＰＮＡ骨格へのカップリングまたはＭＢＨＡ樹脂上の対応するモノマーのアセンブリにおいて何ら問題はなかった。Ｆ、４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリジン−５−カルボニトリル（１７）のコア構造を、公開されたプロトコルにしたがって調製した。その後にシアノ基からアミジンへ変換し、続いてＢｏｃ保護することで２１を得た。様々な条件下で環外アミンを大過剰のＢｏｃ無水物で完全に保護することを試みたが失敗に終わった。これにより、カラムクロマトグラフィーによって分離するのが困難な異なる数のＢｏｃ基を有するＴＬＣ上の複数のスポットの形成に至ったからである。この課題に取り組むために、二ステップでＢｏｃ保護を実施した。２２を酸化および加水分解に供し、続いてアルキル化および水素化分解を行ってＦを得た。一旦調製されたら、Ｅ（１５）、Ｆ（２６）、およびＩ（２７）をＭＰγＰＮＡ骨格にカップリングさせた（図１０，スキーム３）。Ａｌｌｏｃ保護基の除去により、所望のモノマー１〜３を得た。リガンドＬＧ１、ＬＧ２、およびＬＧ３を、ＬＧ２と逆（平行）配向であるＬＧ２Ｐと共に、ＰＡＬリンカーおよびＨＢＴＵをカップリング試薬として使用してＭＢＨＡ樹脂上で調製した。ＬＧ２Ｐは、親ＬＧ２リガンドがｒＣＡＧリピートを結合するのに最も高い見込みを示したので、負の対照として含めた。リジン残基をＣ末端で組み入れて、水溶解度を改善した。最後のモノマーカップリングが完了したら、リガンドを樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認した（表Ｄ）。
【０１０２】
【表Ｄ】
2021506313.tif 000031
【化２５】
2021506313.tif 000032
【０１０３】
標的選択およびサンプル調製
一連のモデルＲＮＡ標的を結合研究のために選択した（図１１）。Ｒ１１Ｘシリーズは２４のｒＣＸＧリピートを含み（図１１（Ａ））、これは、二次ヘアピン構造をとると、リガンドに対して１１個の結合部位を提供した（図１１（Ｂ））。Ｒ１１Ａは完全マッチ（Ａ−Ａ）を含み、その一方で、Ｒ１１ＵおよびＲ１１Ｃはリガンド結合のＵ−ＵおよびＣ−Ｃ各々のミスマッチを含んでいた。Ｒ１１Ｇ（Ｘ＝Ｇ）は確認されなかった。なぜなら、それはＧ−四本鎖並びにヘアピン構造を形成することが示されており、これは実験結果の解釈を混乱させ得るからである。ＬＧ２結合部位に下線を施した、一本鎖ＲＮＡ標的であるＷＳ（ワトソン鎖）およびＣＳ（クリック鎖）（図１１（Ｃ））、並びに単一リガンド結合部位を含む二本鎖ヘアピンＨＰ（図１１（Ｄ））も調べた。サンプルは、プレアニーリングされたＲＮＡを０．１×ＰＢＳ緩衝液（１ｍＭ  ＮａＰｉ、１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中３７℃で各リガンドと共にインキュベートすることによって調製した。この特定の緩衝液を我々の初期スクリーンに基づいて選択し、ここで、我々は、Ｒ１１Ａが安定なヘアピン構造をとることと、リガンドが結合できることを見出した。
【０１０４】
リガンド結合の分光学的同定
ＵＶ−Ｖｉｓおよび円偏光二色性（ＣＤ）の組み合わせを用いて、リガンドの結合特性を決定した。ＵＶ−Ｖｉｓ測定によって、三つのリガンドすべてがＲ１１Ａと結合できることが明らかになった。それらの相互作用の証拠は、２５２および３３０ｎｍでの［Ｒ１１Ａ＋リガンド］の吸収における淡色効果および深色移動から集めることができる。２７５〜３７５ｎｍレジームにおけるＵＶ吸収は、Ｅ塩基のπ−π＊遷移に相当する。この発見は、約２７０ｎｍのシグナルにおける顕著な増加および赤方偏移を明らかにするＣＤデータによって裏付けられた。このシリーズのうち、ＬＧ２はＣＤ振幅において最大の相違を示した。ＬＧ２のＲ１１ＡでのＣＤ滴定は、Ｒ１１Ａのリガンド結合部位の予測される数と一致する１１：１比で飽和点に達した（図１２）。Ｒ１１Ａはリガンドの添加前に熱によりアニーリングされるので、均一なヘアピン構造をとるという仮説を立てた、しかしながら、分子内および分子間折り畳みの他の組み合わせも可能である。これに対して、ＬＧ２のミスマッチＲ１１Ｕ（図１３（Ａ））およびＲ１１Ｃ（データは不掲載）、一本鎖ＷＳおよびＣＳ（図１３（Ｂ））、単結合部位を含む二本鎖ＨＰ（図１３（Ｃ））、またはミスマッチオリエンテーションＬＧ２ＰとＲ１１Ａ（図１３（Ｄ））とのインキュベーション後にＣＤシグナルにおいて有意差は観察されなかった。Ｒ１１ＵおよびＲ１１Ｃミスマッチの結果は、あらゆる点でほぼ同一であったので、これ以降は塩基ミスマッチに関する考察のすべてはＲ１１Ｕに集中する。まとめると、これらの結果から、リガンドとＲＮＡとの間の相互作用は、配列特異的および配向特異的方式で起こり、一本鎖ＲＮＡ標的よりも二本鎖が優先され、孤立したものよりも複数の連続した結合部位を有するものが有利であることがわかる。
【０１０５】
蛍光測定によるリガンド結合の確認
ＵＶ−ＶｉｓおよびＣＤの知見をさらに実証するために、３３０ｎｍ（Ｅ塩基のλｍａｘ）での励起後にＲＮＡ標的の有無でリガンドの蛍光シグナルを測定した。ＬＧ１およびＬＧ２と比較してＬＧ３の著しい蛍光クエンチングが観察された。蛍光シグナルのそのような劇的な減少は、光誘起電子移動クエンチングのためであり得、これは、フルオロフォア（Ｅ）が二つの他のＪ塩基間にスタッキングされるのでＬＧ３にとって最も効率的であると予想される。この解釈は、ＬＧ３の蛍光シグナルが加熱することにより完全に回復されるという観察結果（データは不掲載）と一致する。三つのリガンドすべてで、発光シグナルは、Ｒ１１Ａの添加によりさらに減少したが、ＬＧ２で最も劇的であり、ＬＧ１およびＬＧ３でそれぞれ３５および３３％であるのに対してＬＧ２では６０％の減少であった。ＬＧ２とＲ１１Ｕ、［ＷＳ＋ＣＳ］、ＨＰ、およびＬＧ２ＰとＲ１１Ａのインキュベーションにより類似した蛍光クエンチングパターンが観察された（図１４）が、ＬＧ２とＲ１１Ａの蛍光クエンチングパターンほど劇的ではなかった。関連するクラスの二環式ピリミジンアナログで同様の観察を行い、これらの縮合環フルオロフォアの蛍光収率が局所環境に対して感受性が高いことが示された。リガンドのＲＮＡに対する非特異的結合が蛍光クエンチングに至り得るという仮説を検証するために、各ＲＮＡ標的をペンタミジンとインキュベートした後、ＬＧ２を添加し、また逆も行った。データから、ＬＧ２とＲ１１Ｕおよび［ＷＳ＋ＣＳ］の蛍光シグナル、並びにＬＧ２ＰとＲ１１Ａの蛍光シグナルが、抑制されたままであったＬＧ２とＲ１１Ａの場合（図１４、挿入画）を除いて、完全に回復されたことがわかった。この結果は、ペンタミジンとは異なるモードによる、おそらくは規定の二価Ｈ結合相互作用を介してＲ１１Ａと結合するＬＧ２と一致する（図１ＢおよびＣ）。
【０１０６】
ＮＭＲ滴定
ＬＧ２の結合モードの洞察を得るために、ＬＧ２、Ｒ１１Ａ、および組み合わせで用いて一連の多核および多次元ＮＭＲ実験を実施した。サンプルは、９：１体積比のＨ２Ｏ：Ｄ２Ｏを含有する以前と同一である０．１×ＰＢＳ緩衝液中で調製した。ＮＯＥＳＹデータを３００、２００、および１００ｍｓの混合時間で集めて、プロトン間距離を得、一方、ＣＯＳＹ実験を実施して、各残基のプロトンスピンシステムをマッピングした。ＬＧ２とＲ１１Ａとの間のＨ結合相互作用は、塩基対開放に起因するカノニカルＧ−Ｃ／Ｃ−Ｇ対のイミノプロトンシグナルの線幅拡大およびダウンフィールド化学シフト、並びにリガンドとＲＮＡとの間のＨ結合の形成に起因してイミノプロトンシグナルの新規セットの出現をもたらすことが予想された。ＣＤデータと一致して、１Ｈ−ＮＭＲ実験によって、Ｒ１１Ａは１２．３５ｐｐｍでのシャープなイミノプロトンシグナルにから明らかなように、０．１×ＰＢＳ緩衝液中で安定なヘアピン構造をとることが明らかになった。可変温度測定によって、この化学シフト帰属がさらに裏付けられ、温度の上昇と共にピーク強度が徐々に減衰し、その一方で、交換不可能なプロトンのピーク強度はほぼ一定のままであったことが示された。核酸塩基プロトンの部分帰属をＮＯＥＳＹ実験によって行った。予想されるように、ＬＧ２の添加により、Ｒ１１Ａのイミノプロトンシグナルが徐々に拡大され、ダウンフィールドシフトした（図１５）。さらに、Ｃ４−ＮＨおよびＧ２−ＮＨの化学シフトは著しく影響を受け、このことは、それらのリガンドとの相互作用を示すものである。努力したにもかかわらず、反復配列における縮重のために、Ｒ１１Ａに対してＬＧ２を滴定する際にＡ６−ＮＨの化学シフトの帰属、ひいてはモニタリングはできなかった。それにもかかわらず、結果は、Ｇ−Ｃ／Ｃ−Ｇ塩基対開放がリガンドによって媒介されることを示す。しかしながら、リガンドとＲＮＡとの間のＨ結合形成について予想されるように、１０〜２０ｐｐｍレジームにおいて任意の新規イミノプロトンシグナルは観察されなかった。
【０１０７】
鋳型介在性ネイティブ・ケミカル・ライゲーション（ＮＣＬ）
ＬＧ２およびＲ１１Ａで観察されるような、リガンドのＲＮＡとの弱く一時的な相互作用は重要な生物学的応答をもたらす可能性が低い。ＬＧ２の結合親和性をさらに改善するために、第二のＬＧ２誘導体、ＬＧ２Ｎ（図１６（Ａ））を合成し、これはＣ末端チオエステルおよびＮ末端シスチンを含んでいた。このリガンドは、第二世代Ｎ−アシル尿素リンカーを使用して調製した。二重機能プローブデザインは、二つの官能基がジスルフィド結合の還元に際して自発的に互いに反応するのを防止する際にＭＰγＰＮＡの立体構造的にプレオーガナイゼーションを利用する。シスチン基を用いて、プローブ取り扱いをよりよく制御した。以前の研究で、全ての天然の核酸塩基を含む同じ長さのリガンドは、生理的温度（３７℃）で約１時間の減少した（非環式）半減期を有することが明らかになった。ＬＧ２Ｎ＊について同様の半減期が予想された。図１６（Ｂ）は、ジスルフィド結合の還元後のＬＧ２Ｎの反応経路、還元性細胞内環境におけるＬＧ２Ｎの予想された化学状態を示す。ＲＮＡ標的の存在下で、リガンドは、分子間塩基スタッキング（ステップ２）の結果として、隣り合うＲＮＡ標的の核酸塩基と一時的二価Ｈ結合相互作用を形成することが予想された。ジスルフィド結合が切断されると、リガンドは鋳型介在性ＮＣＬを受けて、ＲＮＡ鋳型をよりしっかりと結合する連結された生成物を形成する（ステップ３）。ＲＮＡ標的の非存在下で、リガンドは分子内ＮＣＬ反応を受けて環状生成物を形成することによって自己失活する（ステップ４）。
【０１０８】
ＬＧ２Ｎが環化反応を受ける前にジスルフィド結合の還元後に、一定の期間安定なままであるという予想を確かめるために、ＬＧ２Ｎ＊がインサイチュで誘導される親化合物Ｍの反応進行をモニタリングした（図１７（Ａ））。反応生成物の定量化では、分子内ＮＣＬはタイムスケールが比較的短く、前者を用いて５分未満で達成できるので、ＨＰＬＣや他の分析的技術よりもＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを選択した。ＨＰＬＣ分析の前に求電子試薬で反応をクエンチすることを試みた、しかしながら、そのような努力は、リガンドの迅速な分子内反応のために成功しなかった。４−メルカプトフェノール（４ＭＰ）および２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）を可能な還元剤として調べた。どちらでも親化合物Ｍについて類似した動的プロファイルが得られた、しかしながら、前者は、加水分解親化合物と重複する質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有する中間体をもたらし、互いに差別化するのが困難になった。このために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる反応モニタリングおよびゲルシフトアッセイでは４ＭＰを選択し、その一方で、その後の溶融実験では、核酸塩基吸収領域におけるその透明性のために、２ＭＥを用いた。我々のデータから、４ＭＰを親化合物Ｍに添加すると、エステル交換（Ｍ＃）およびＣ末端チオエステル（Ｍ＃＃）に対応する二つの反応種がまず形成されたことが明らかになった（図１７（Ａ））。それらは＜１５分間持続した後、反応性ＬＧ２Ｎ＊中間体に変換され、最後に環状生成物（ｃＬＧ２Ｎ）に変換された（図１７（Ｂ））。ＬＧ２Ｎ＊は生理的温度で安定であった。これは、１時間の還元時点で主生成物として存在し、混合物中の全生成物の約７５％を構成し、残りの２５％は主にｃＬＧ２Ｎであった。ＬＧ２Ｎ＊は約３時間の半減期を有し、天然のカウンターパートよりもほぼ３倍長い。ＬＧ２Ｎ＊の化学安定性はＥ塩基の拡大された芳香環サイズに起因し、このためにより良好な塩基スタッキング相互作用が得られ、したがってリガンドの立体構造的に柔軟性が低くなると考えた。
【０１０９】
次に、ＵＶ溶融実験を実施して、ＲＮＡの熱安定性に対する鋳型介在性ＮＣＬの効果を決定した。サンプルを０．１×ＰＢＳ緩衝液中、ＬＧ２ＮのＲ１１Ａの結合部位数に対する比２：１で調製し、３７℃で１６時間インキュベートした後、ＵＶ溶融分析を実施した。予想通り、還元剤がないと、ＬＧ２ＮはＲ１１Ａの溶融遷移（Ｔｍ）に対する効果が最小であり、最大でも約＋１℃のΔＴｍであった。同様のことが、Ｃ末端チオエステルもＮ末端システインも含まないＬＧ２でも見られた。しかしながら、２ＭＥの存在下で、［ＬＧ２Ｎ＋Ｒ１１Ａ］のインキュベーションを周囲温度または３７℃で行うかによらず、結果は類似していた。Ｒ１１ＡのＴｍの有意な増加は、どちらの場合にも５９〜６８℃の範囲で見られた。溶融曲線の導関数は、ブロードなＳ字状の分布を示し、このことは、形成され、ＲＮＡ鋳型に結合された様々な連結生成物の存在を示唆する。この知見が、鋳型介在性合成について予想された。Ｔｍの類似性にもかかわらず、二つの溶融曲線はパターンが異なり、高温でインキュベートしたものが２５〜５０℃範囲で逆の光吸収を示す。この溶融挙動は、疎水性／芳香族相互作用に特徴的であり、好熱性フォルダマーおよび他の芳香族系、例えばペリレンおよびピレンで以前に観察された現象である。我々は、逆の強度分布が、おそらくは周囲温度よりも３７℃でより多い量で形成された、連結された生成物のＪ塩基の相互作用に起因すると考えた。加熱すると、疎水性相互作用は、ある点（約５０℃）まではより顕著になり、それを超えると反発が起こった。Ｒ１１Ａの熱安定性の増強は、ＮＣＬ生成物の形成およびＲＮＡ鋳型に対するそれらの結合と一致する。
【０１１０】
Ｒ１１ＡのＴｍにおける増強が鋳型介在性連結および結果として得られた生成物のＲＮＡ鋳型に対する結合に起因することを確認するために、ＵＶ溶融サンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を実施した後加熱した。連結された生成物の形成は、リガンドの質量にしたがって、約１３１９ダルトンのステップサイズでｍ／ｚ値が徐々に大きくなる新しいピークの出現から明らかである（図１８（Ａ））。しかしながら、これらの連結された生成物は、ミスマッチＲ１１Ｕ（図１８（Ｂ））または標的なしでＬＧ２Ｎ単独（図１８（Ｃ））では観察されなかった。同様に、連結された生成物が一本鎖［ＷＳ＋ＣＳ］または二本鎖ＨＰで形成される証拠はなかった（データは不掲載）。この結果は、Ｒ１１Ａヘアピン構造によって媒介される、鋳型介在性合成の発生と一致する。
【０１１１】
連結されたリガンドの選択的結合
ＬＧ２ＮがｒＣＡＧｅｘｐを正常なリピートから区別できるか否かを判定するために、競合的結合アッセイを実施した。正常（Ｒ２４Ａ、ｎ＝２４、Ｒ１１Ａと同じ）および病原性（Ｒ１２７Ａ、ｎ＝１２７）範囲内のｒ（ＣＡＧ）ｎリピートをミスマッチｒ（ＣＵＧ）９６対照（Ｒ９６Ｕ）と共に含む二つのＲＮＡ標的を用いた。各ヘアピンモチーフを採用すると、これらのＲＮＡ転写産物はＬＧ２Ｎについて１１、６２、および４７の結合部位を提供する。二セットのサンプルを、一方は０．１×ＰＢＳ中で、もう一方は生理学的に関連する緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＰｉ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中で調製した。両セットにおいて、Ｒ２４Ａ（１００ｎＭ鎖濃度、１．１μＭ結合部位）およびＲ１２７Ａ（１８ｎＭ鎖濃度、１．１μＭ結合部位）の等モル混合物を様々な濃度のＬＧ２Ｎと、４ＭＰおよびＴＣＥＰと共に３７℃で２４時間インキュベートした。ＴＣＥＰを含めて、ジスルフィド結合が完全に還元されることを確実にした。反応混合物をアガロースゲルにより分析し、可視化のためにＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色した。図１９の調査によって、レーン２〜５において一番下のバンドと比べて、上の二つのバンドの消失速度が速いことによって明らかなように、ＬＧ２Ｎは、Ｒ２４ＡよりもＲ１２７Ａに対して優先的に結合することが明らかになった。そのような結合事象は、還元剤の存在下、および完全にマッチしたＲＮＡ標的でのみ起こった。なぜなら結合の証拠は４ＭＰおよびＴＣＥＰの非存在下（レーン６とレーン１を比較）およびミスマッチＲ９６Ｕ（レーン８とレーン７を比較）で観察されなかったからである。リガンドとＲＮＡの複合体化について予想されるように、シフトしたバンドが形成されることは観察されなかった。このことは、ＳＹＢＲＧｏｌｄがＲＮＡ−リガンド複合体をインターカレートできなかったことを示唆する。リガンド結合はＲＮＡの立体構造において劇的な変化を引き起こすことが知られていることを考慮すると、この観察は以外ではなかった（図６）。これに対して、生理学的に関連するイオン強度で起こるリガンド結合の証拠は観察されず（図２０）、そのような条件下で、ＲＮＡヘアピンは鋳型介在性リガンドオリゴマー化を媒介できなかったことを意味する。
【０１１２】
ＨＤ、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）および２型（ＤＭ２）、脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）、脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）、フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、またはルー・ゲーリック病）の亜集団、不安定なリピート伸長の結果としての兆候をはじめとする、２０を超える多くの神経筋障害。遺伝子のコーディング領域の伸長は、タンパク質機能の変更に至る可能性がある一方で、非コーディング領域で起こる伸長は、ＲＮＡ機能の毒性獲得によるタンパク質配列および／またはＲＡＮ翻訳による有害なポリペプチドの不測の産生を干渉しない疾患を引き起こす可能性がある。これらの遺伝性障害の多くは常染色体優性であり、疾患を引き起こすのに一つだけの対立遺伝子での伸長（または変異）を必要とする。したがって、そのような疾患経路を干渉するための１の方法は、冒された対立遺伝子または対応する遺伝子転写産物を標的とすることである。二者間で、後者は、不完全なヘアピン構造をとる傾向のために、外因的分子に対してより大きなアクセス可能性と、二価リガンド、例えばＪＢ−ＭＰｙＰＮＡに対してより大きな認識特異性とを提供する。
【０１１３】
ＨＤ、並びに、限定されるものではないが、ＭＪＤ、ＳＢＭＡ、ＤＲＰＬＡ、およびＳＣＡをはじめとする他の神経変性障害におけるｒＣＡＧリピートの伸長性遺伝的浸透度のために、我々はｒＣＡＧリピートに全力を注いだ。変異体ｈｔｔ転写産物と選択的に結合し、疾患経路を干渉する分子を使用して、ＨＤだけでなく、他の関連する遺伝性障害を治療することができる。本明細書中で記載する核酸リガンドは、通常のアンチセンス薬剤とはいくつかの点で異なる。第一に、それらはＣＡＧ−ＲＮＡヘアピンモチーフと二価Ｈ結合相互作用により結合する。第二に、それらはサイズが比較的小さく、単一トリプレット反復単位の長さである。したがって、それらは、固相化学ではなく溶液相化学により、化学的合成、構造的修飾、およびスケールアップがより容易である。第三に、小分子の外縁上の分子量について、そのような「ミラモレキュール」システムは、概して、典型的なアンチセンス薬剤よりも好ましい薬物速度論的特性を有する。第四に、Ｊ塩基認識は、より配列特異的かつ選択的である。通常、天然の核酸塩基の一面で起こる単一塩基ミスマッチは、Ｊ塩基の両面で起こるので、より特異的であり、より選択的であって、二つの結果として得られた生成物の結合自由エネルギーにおける大きな差異のために、一本鎖ＲＮＡ標的よりも二本鎖が好ましい。しかしながら、小分子、またはリボスイッチとは異なり、Ｊ塩基の認識は、より多様な引力の組み合わせではなく、二価ワトソン・クリックＨ結合相互作用により、一連の所定の規則に従う。さらに、ＪＢ−リガンドデザインはモジュール式である。したがって、リガンドを、調製し、ＲＮＡリピートの任意の配列を結合するように修飾することができる。これにより、リガンドの結合親和性を調整することによって、また緩衝液のイオン強度を調節することによって、認識選択性のさらなる改善が可能になるので、低い塩濃度でのＪＢ−リガンドと通常の長さのｒＣＡＧリピートとの弱くかつ一時的な相互作用は、初期デザイン段階で望ましい。
【０１１４】
材料および方法
ＵＶ溶融分析
すべてのＵＶ溶融サンプルは、リガンドをＲＮＡ標的と０．１×ＰＢＳ緩衝液中、表示された濃度にて混合することによって調製し、９０℃で５分間インキュベーションすることによってアニーリングし、続いて室温まで徐々に冷却した。熱電気的に制御されたマルチセルホルダーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃａｒｙ  ＵＶ−Ｖｉｓ３００分光計を用いてＵＶ溶融曲線を集めた。２６０ｎｍにて、加熱実験では２５℃から９５℃まで、そして冷却実験では９５℃から２５℃まで、どちらも１分あたり１℃の割合でＵＶ吸収をモニタリングすることによって、ＵＶ溶融スペクトルを集めた。冷却および加熱曲線はほぼ同じであり、ハイブリダイゼーションプロセスは可逆性であることを意味する。記録されたスペクトルを、２０点隣接平均化アルゴリズム（20-point adjacent averaging algorithm）を使用して平滑化した。溶融曲線の一次導関数を利用して、複合体の溶融温度を決定した。
【０１１５】
ＣＤ分析
サンプルを０．１×ＰＢＳ緩衝液中で調製した。すべてのスペクトルは、１ｃｍパス長のキュベット中、２５℃で、２００〜３７５ｎｍの間で１００ｎｍ／ｍｉｎの割合で集めた、少なくとも１５回のスキャンの平均を表す。緩衝溶液からのＣＤスペクトルを、サンプルスペクトルから差し引き、これを次に、５点隣接平均アルゴリズムによって平滑化した。定常状態蛍光測定。リガンドをＲＮＡと０．１ｌ×ＰＢＳ緩衝液中、表示された濃度での混合によってすべての定常状態蛍光サンプルを調製し、９０℃で５分間インキュベーションすることによってアニーリングし、続いて３７℃まで徐々に冷却した。サンプルを３７℃で１時間インキュベーションした後、測定をした。定常状態蛍光データを、Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ分光計によって２５℃で集めた。（εｅｘ＝３３０ｎｍ、εｅｍ＝３４０〜６００ｎｍ）。
【０１１６】
競合的結合アッセイ
Ｒ２４ＡをＩＤＴから購入した。Ｒ１２７Ａ［ｒ（ＣＡＧ）１２７］およびＲ９６Ｕ［ｒ（ＣＵＧ）９６］を先に記載したようにして調製した。Ｒ２４Ａ、Ｒ１２６Ａ、およびＲ９６Ｕを０．１×ＰＢＳ緩衝液中で調製し、９０℃で５分間加熱することによってアニーリングし、続いて室温まで徐々に冷却した。リガンドおよびＲＮＡを表示された濃度で混合し、３７℃で２４時間インキュベートした。サンプルを次いで１×トリス−ホウ酸塩緩衝液を用いて２％アガロースゲル上にロードし、１００Ｖにて２５分間、電気泳動法で分離した。ゲルをＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色し、ＵＶ−Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒで可視化した。
【０１１７】
ＭＤシミュレーション、リガンド合成、およびモノマー合成
手順は、添付した、本明細書中に組み込まれる補足情報に提示されている。
【０１１８】
一般的技術
すべての出発物質および化学物質は、特に記載しない限り、商業的供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。すべての反応は、特に記載しない限り、無水条件下で乾燥溶媒を用い、窒素雰囲気下で実施した。真空中での溶媒の除去とは、高真空ポンプに取り付けたロータリーエバポレーターを用いた蒸留を指す。固体、シロップ、または液体として得られた生成物を高真空下で乾燥させた。分析的薄層クロマトグラフィーをあらかじめコーティングしたシリカプレート（６０Ｆ−２５４、厚さ０．２５ｍｍ）上で実施し、化合物を、ＵＶ光によるかまたはニンヒドリン若しくはヨウ素での染色、または現像手段としての熱によって可視化した。ＮＭＲスペクトルを、３００または５００ＭＨｚのいずれかで、溶媒としてのＣＤＣｌ３、ＤＭＳＯ、およびＤ２Ｏ並びに内部標準としてのＴＭＳを用いて記録した。多重度を説明するために以下の略号を使用した、ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項、ｄｄｔ＝三重項の二重項の二重項、ｄｔ＝三重項の二重項、ｔｄ＝二重項の三重項、ＡＢｑ＝ＡＢ四重項、ｄｄ＝二重項の二重項、ｔｔ＝三重項の三重項、ｂｒ＝ブロードｗｔｃ。ＥＳＩ−ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析器およびＤＡＲＴ分析器を使用して高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）を実施した。ＥＳＩ−Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ−ＭＳ質量分析器を用いて低分解能質量分析（ＬＲＭＳ）を実施した。特に明記しない限り、ＲＰ−ＨＰＬＣでのオリゴマー精製については１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量にて、４０分で９５％Ｈ２Ｏ（０．０１％ＴＦＡ）から９５％ＭｅＣＮ（０．０１％ＴＦＡ）への線形溶出勾配（方法Ａ）でＣ１８（１５ｃｍ×２．１ｍｍ、５μｍ粒子）カラムを使用した。ＭＡＬＤＩスペクトルは、ＴＯＦ／ＴＯＦ分光計を使用して測定した。吸収プロファイルをＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で記録した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルをＳｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒで記録した。蛍光（発光）を蛍光Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで記録した。
【０１１９】
ＭＤシミュレーション
Ｃ末端リジン残基をγＰＮＡから除外し、ＭＰ側鎖をメチル基と置換した（ＭｅγＰＮＡ、公開されたＸ線結晶構造、ＰＤＢ−ＩＤ３ＰＡ０）。ＣＥＧ、ＡＩＡ、およびＧＦＣトライアドを、キメラ１を用いて構築し、ガウス分布で設定されたＨＦ／６−３１Ｇ＊基準により最適化した。結合したＲＮＡ−ＨＤ１−ＲＮＡ複合体のらせん構造は、ＡｍｂｅｒｔｏｏｌのＮＡＢモジュールを使用してトライアドから創出され、結晶構造からの修飾ＭｅγＰＮＡ骨格をらせん構造上にグラフトした（図２Ａに示すとおり、初期構造）。ＲＮＡが四つのｒＣＡＧリピートを含むデュプレックスであり、ＲＮＡに結合したＨＤ１リガンドの数が１から４まで変動する四つのそのようなＲＮＡ−ＨＤ１−ＲＮＡ複合体が得られた。各ＲＮＡ−（ＨＤｌ）ｎ−ＲＮＡ複合体をＴＩＰ３Ｐ４水分子で溶媒和させ、イオンを付加して、電荷を中和した。システムをエネルギー最小化し、次いでＲＮＡおよびＨＤ１リガンドの原子に関して２５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Åの高調波抑制下で３００Ｋまで加熱した。抑制を一連の六回の短いシミュレーションにおいて徐々に解除し、最終的に抑制されていないＮＰＴシミュレーションを、３００Ｋおよび１バールの圧力で１００ｎｓ、それぞれＮｏｓｅ−ＨｏｏｖｅｒサーモスタットおよびＰａｒｉｎｅｌｌｏ−Ｒａｈｍａｎバロスタットを使用して実施した。静電相互作用は、粒子メッシュＥｗａｌｄ法を使用して処理し、すべてのシミュレーションは、χＯＬ３修正付ＧＲＯＭＡＣＳ  Ａｍｂｅｒ９９−ｐａｒｍｂｓｃ０力場をＲＮＡに使用して実施し、一般的ａｍｂｅｒ力場を使用して、ＨＤ１リガンドの力場パラメータを創出した。
【０１２０】
樹脂ローディング［（ＭＰ）（ＰＡＬ）］
【０１２１】
（１）ＭＰローディング。
１ｇのＭＢＨＡ樹脂（１ｍｍｏｌ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＲＭＢ−２１００−ＰＩ）を反応容器中のＤＣＭに１時間浸し、次いでＤＣＭ（３×）およびＤＣＭ中５％ＤＩＥＡ（３×）で洗浄した。図２１を参照。Ｋａｉｓｅｒ試験によってアミン基が中和されたことを確認したら（青色）、１５ｍＬカノニカル管中に以下の溶液を順次添加した、３．５ｍＬのＮＭＰ、４５０μＬの溶液Ａ、４６０μＬの溶液Ｂ、および５５０μＬの溶液Ｃ。混合物を１０秒間ボルテックスし、３分間放置した後、反応容器中の樹脂に添加した。穏やかに振盪しながら、反応を１時間進行させた。反応混合物を陽空気圧（possitive air pressure）で廃棄し、樹脂をＤＭＦ（３×）、ＤＣＭ（３×）、ＤＣＭ中５％ＤＩＥＡ（１×）、およびＤＣＭ（３Ｘ）で洗浄した。キャッピング溶液を反応容器に添加することによって樹脂をキャッピングし、容器を４５分間穏やかに撹拌した（２Ｘ）。最後のキャッピング溶液を廃棄した後、樹脂をＤＣＭ（３×）で洗浄し、キャッピングの完了をＫａｉｓｅｒ試験によって確認した（淡黄色）。
【０１２２】
溶液Ａ：５００μＬのＮＭＰ中４３ｍｇのＦｍｏｃ−ＭＰ（０．２００Ｍ）
溶液Ｂ：９１３μＬのピリジン中８７μＬのＤＩＥＡ（０．５００Ｍ）
溶液Ｃ：７５０μＬのＮＭＰ中５５ｍｇのＨＡＴＵ（０．２０１Ｍ）
キャッピング溶液（Ａｃ２Ｏ／ＮＭＰ／ピリジン：１１２／２）：２ｍＬ  Ａｃ２Ｏ、４ｍＬ  ＮＭＰ、および４ｍＬピリジン
【０１２３】
（２）ＰＡＬおよびＬｙｓのローディング（前項からの樹脂１ｇ）。
樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液（２×）でそれぞれ７分間処理し、続いてＤＭＦ（３×）およびＤＣＭ（３×）で洗浄することによって、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。Ｋａｉｓｅｒ試験によってＦｍｏｃが首尾よく除去されたことを確認（青色）したら、以下の材料を混合することによってカップリング溶液を調製した、３ｍＬの０．２Ｍモノマー溶液、１．５ｍＬの０．５２Ｍ  ＤＩＥＡ溶液、および１．５ｍＬの０．３９Ｍ  ＨＢＴＵ溶液。混合物を３分間活性化した後、樹脂に添加した。反応容器を穏やかに撹拌しながら、反応を３０分間進行させた。反応の完了をＫａｉｓｅｒ試験によって確認した（淡黄色）。樹脂をＤＭＦ（３×）、５％ＤＩＥＡ溶液（１×）、およびＤＣＭ（１×）で洗浄し、キャッピング溶液を樹脂に添加することによって未反応アミンをキャッピングし、反応容器を３０分間穏やかに撹拌した。キャッピング溶液を除去したら、樹脂を２０％ピペリジン（２×）、ＤＭＦ（２×）、およびＤＣＭ（２×）で洗浄した。
【０１２４】
モノマー溶液：３ｍＬのＮＭＰ中３０３ｍｇのＦｍｏｃ−ＰＡＬ（０．２００Ｍ）３ｍＬのＮＭＰ中２８１ｍｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．２００Ｍ）
ＤＩＥＡ溶液：３．６３８ｍＬのＤＭＦ中３６４μＬのＤＩＥＡ（０．５２Ｍ）
ＨＢＴＵ溶液：５ｍＬのＤＭＦ中７４０ｍｇのＨＢＴＵ（０．３９Ｍ）
キャッピング溶液：（Ａｃ２Ｏ／ＮＭＰ／ピリジン：１／２５／２５ｖｏｌ）
【０１２５】
Ｆｍｏｃ脱保護
Ｆｍｏｃ保護基は、樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（５０ｍｇ樹脂に対して０．５ｍＬ）溶液（２×）で各々７分間処理し、続いてＤＭＦ（３×）およびＤＣＭ（３×）で洗浄することによって除去した。Ｆｍｏｃ脱保護はＫａｉｓｅｒ試験によって確認した（青色）。
【０１２６】
モノマーカップリング
ＦｍｏｃがＫａｉｓｅｒ試験によって首尾よく除去されたことを確認したら（青色）、樹脂をＤＭＦ（４×）およびＤＣＭ（５×）で洗浄した。カップリング溶液は、以下の材料を混合することによって調製した、１５０μＬの０．２Ｍモノマー溶液、７５μＬの０．５２Ｍ  ＤＩＥＡ溶液、および７５μＬの０．３９Ｍ  ＨＢＴＵ溶液。混合物を１０分間活性化した。樹脂をピリジン（１×）で洗浄した後、モノマー溶液を樹脂に添加した。反応容器を穏やかに撹拌しながら、反応を２〜４時間進行させた。反応の完了は、Ｋａｉｓｅｒ試験によって確認した（淡黄色）。樹脂をＤＭＦ（３×）およびＤＣＭ（３×）で洗浄した。
【０１２７】
キャッピング。
未反応アミンを新たに調製したキャッピング溶液でキャッピングした。キャッピング溶液（１：２５：２５、無水酢酸：ＮＭＰ：Ｐｙ）を樹脂に添加し、反応容器を４分間撹拌した。樹脂をＤＭＦ（４×）およびＤＣＭ（５×）で洗浄した。
【０１２８】
切断
最終Ｆｍｏｃ脱保護ステップ後、樹脂をＤＭＦ（５×）およびＤＣＭ（８×）で洗浄した。樹脂を真空下で１５分間乾燥させた。乾燥樹脂に、新たに調製した９５％ＴＦＡ：５％ｍ−クレゾール（５０ｍｇ樹脂に対して０．６ｍＬ）を添加し、反応容器をスタンドバイモードで保持した。室温で１時間後、ＴＦＡ溶液をカノニカル遠心分離管中に集めた。再度、切断溶液（５０ｍｇ樹脂に対して０．５ｍＬ）を樹脂に添加し、反応容器を３０分間放置した。ＴＦＡ溶液を先に集めた溶液と組み合わせた。
【０１２９】
沈殿
集めたＴＦＡ溶液に、冷乾燥ジエチルエーテル（−６０℃、１４ｍＬ）を添加し、振盪した。３０分以内に沈殿が生じた。沈殿したオリゴマーを遠心分離により集め、冷ジエチルエーテル（２×）で洗浄した。
【０１３０】
精製
粗オリゴマーを０．５ｍＬの９５％水、５％アセトニトリル、および０．１％のＴＦＡ中に溶解させた。結果として得られた溶液を逆相分析カラムによって精製した。
【０１３１】
実施例２−モノマー合成
【０１３２】
【化２６】
2021506313.tif 000033
【０１３３】
モノマーＥ（１）
パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（２８．２２ｍｇ、２４．４２μｍｏｌ）をフェニルシラン（０．１２ｍＬ、０．９８ミリモル）およびアリルモノマー２９ａ（０．６０ｇ、０．４９ミリモル）の無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中混合物に室温で添加した。出発物質の対応する酸への完全な変換が１５時間にわたるＴＬＣ（溶離液：ＥＡ：Ｈｅｘ（ＳＯ：ＳＯ）、２９ａのＲｆ０．６、生成物のＲｆ＝０．０（ドラッギング））により観察された。反応混合物にシリカゲルを室温で添加し、そして溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。シリカゲル吸収粗生成物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物を得た。収量：０．４４ｇ、７Ｓ％。１Ｈ ＮＭＲ（Ｓ００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ １．０８／１．０９（ｓ／ｓ，９Ｈ），１．２５−１．２８（ｍ，１８Ｈ），１．３７−１．３８（ｍ，１８Ｈ），１．４１／１．６Ｓ（ｓ／ｓ，９Ｈ），３．１２−３．６４（ｍ，１３Ｈ），３．７７−３．９０（ｍ，２Ｈ），  ３．９０−４．００（ｍ，２Ｈ），３．９９−４．４．３４（ｍ，４Ｈ），７．２１−７．４９（ｍ，５Ｈ），７．５４−７．７９（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，２Ｈ），８．５５／８．６４（ｓ／ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ ２７．２−２７．６（１８Ｃ，ｔＢｕ），３５．８，４６．７，５４．９，５９．７，６０．６／６０．６（２Ｃ），６５．６／６５．６，６９．６／６９．６，６９．８／６９．９，７０．４／７０．４，７２．２／７２．２，８２．１（３Ｃ），８２．２，８３．２，８３．４，８６．２，１０８．１，１２０．１（２Ｃ），１２５．２，１２７．０（４Ｃ），１２７．６（４Ｃ），１４０．７（２Ｃ），１４３．８／１４３．８，１４７．９，１４９．２／１４９．３，１４９．３，１４９．５，１４９．７，１５５．０／１５５．９，１５６．３／１５６．５，１６２．３，１６６．６／１６６．６、ＨＲＭＳ：［Ｃ６１Ｈ８５Ｎ７Ｏ１７＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：１１８８．６０８０、実測値：１１８８．６０７１。
【０１３４】
【化２７】
2021506313.tif 000034
【０１３５】
モノマーＩ（２）
化合物１についての上記の手順を用い、出発物質としての化合物２９ｂ（３．１０ｇ、４．３９ミリモル）から出発して、この化合物を調製した。ＴＬＣ（溶離液：ＭｅＯＨ：ＤＣＭ（５．９５）、２９ｂのＲｒ＝０．２、２のＲｆ＝０．０）。収量：２．２２ｇ、７６％。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １．０９（ｂｓ，９Ｈ），３．１１−３．５２（ｍ，１５Ｈ），３．８７−３．９６（ｍ，２Ｈ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝１３．４，５．４ Ｈｚ，４Ｈ），７．１９−７．４４（ｍ，ＳＨ），７．６９（ｄ，Ｊ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ，２Ｈ），１０．７１−１０．７５（ｍ，１Ｈ），１１．０６（ｂｓ，１Ｈ），１２．４６（ｂｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ ２７．８（３Ｃ），４７．２／４７．２，６１．１（３Ｃ），６５．６／６６．０，７０．１（２Ｃ），７０．３／７０．４，７０．９（３Ｃ），７２．７，１０７．８，１２０．６−１２８．１（１０Ｃ），１３９．７／１４０．１，１４１．２（２Ｃ），１４４．３，１５１．８，１５６．３，１６４．６，１７０．９、ＨＲＭＳ：［Ｃ３４Ｈ４２Ｎ４Ｏ１０＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：６６７．２９７９、実測値：６６７．２９８８。
【０１３６】
【化２８】
2021506313.tif 000035
【０１３７】
モノマーＦ（３）
化合物１についての上記の手順を用い、出発物質としての化合物２９ｃ（２．５０ｇ、２．００ミリモル）から出発して、この化合物を調製した。ＴＬＣ（溶離液：ＥＡ：Ｈｅｘ（５０：５０）、２９ｃのＲｆ＝０．６、３のＲｆ＝０．０（ドラッギング））。収量：１．９４ｇ、８０％。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ １．０８（ｓ，９Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ），１．３６（ｓ，９Ｈ），１．４１／１．４２（ｓ／ｓ，１８Ｈ），３．２０−３．６２（ｍ，２０Ｈ），３．７７−４．１５（ｍ，４Ｈ），４．１８−４．３４（ｍ，４Ｈ），４．８２−５．３５（ｍ，２Ｈ），７．１７−７．４６（ｍ，５Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝７．０ Ｈｚ，２Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），８．９３／８．９５（ｓ／ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ ２７．３−２７．５（１８Ｃ，ｔＢｕ），４６．７／４６．７，６０．６（２Ｃ），６０．７（２Ｃ），６９．６（２Ｃ），６９．７，６９．９，７０．４（３Ｃ），７２．２，８２．１，８２．１，８２．９，８２．９，８３．３，８３．４，１０８．０，１１０．８，１１８．４，１２０．１（２Ｃ），１２３．１，１２５．２／１２５．３，１２７．０（４Ｃ），１２７．６（４Ｃ），１４０．７（２Ｃ），１４３．８，１４６．９，１４９．５，１５６．６，１５７．１，１６２．４／１６２．４．ＨＲＭＳ：［Ｃ６０Ｈ８５Ｎ７Ｏ１９＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：１２０８．５９８０、実測値：１２０８．５９５９。
【０１３８】
【化２９】
2021506313.tif 000036
【０１３９】
（４−クロロ−ピリジン−２−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５）
氷浴中、２−アミノ−４−クロロピリジン（１）（５０．００ｇ、０．３９ｍｏｌ）の５５６ｍＬの無水ＴＨＦ中撹拌溶液に、Ｅｔ３Ｎ（８１．３７ｍＬ、０．５８ｍｏｌ）を１０分にわたって不活性雰囲気中で滴下した。同じ温度でさらに１０分間撹拌した後、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中Ｂｏｃ２Ｏ（８４．８８ｇ、０．３９ｍｏｌ）を３０分にわたって滴下し、続いて触媒量のＤＭＡＰ（４．７５ｇ、０．０４ｍｏｌ）を添加した。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈した。組み合わせた有機層を焼結漏斗でろ過し、ろ液をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレーターで除去して、純粋な生成物を得た。収量：６７．５９ｇ、７６％。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．５４（ｓ，９Ｈ），６．９５（ｄｄ，Ｊ＝５．５，１．８ Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝１．９ Ｈｚ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝５．５ Ｈｚ，１Ｈ），９．９６（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ２８．５（３Ｃ），８１．５，１１２．９，１１８．７，１４６．２，１４８．３，１５２．６，１５３．８、ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｃ１０Ｈ１３ＣｌＮ２Ｏ２＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：２２９．１、実測値：２２９．２。
【０１４０】
【化３０】
2021506313.tif 000037
【０１４１】
２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−クロロニコチン酸エチル（６）
ドライアイス−アセトン浴（−７８℃）中、（４−クロロ−ピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３０．５０ｇ、０．１３ｍｏｌ）の５３４ｍＬ
の無水ＴＨＦ中撹拌溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（２４．８６ｍＬ、０．２７ｍｏｌ、１１Ｍ）を不活性雰囲気中、１時間にわたって滴下した。さらに３０分間−７８℃で撹拌した後、ＣｌＣＯ２Ｅｔ（１３．９３ｍＬ、０．１５ｍｏｌ）を１０分間にわたって滴下した。反応進行をＴＬＣでチェックし、出発物質が完全に消費された後、反応混合物を１％ＨＣｌ（２００ｍＬ）でゆっくりとクエンチした。結果として得られた反応混合物を、１０％ＨＣｌ（５０ｍＬ）およびＥＡ（２００ｍＬ）を入れた分液漏斗に移した。粗生成物をＥＡで水層から抽出し、組み合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。結果として得られた溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、得られた粗物質をカラムクロマトグラフィーによって精製して、２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−クロロニコチン酸エチルを淡黄色固体として得た。収量：２９．６８ｇ、７４％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４０（ｔ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），４．４１（ｑ，Ｊ７．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝５．２ Ｈｚ，１Ｈ），８．３１（ｄ，Ｊ＝５．２ Ｈｚ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４．１，２８．３（３Ｃ），６２．３，８１．８，１２０．８，１４４．７，１４９．９，１５０．０，１５１．３，１５１．８，１６４．９、ＨＲＭＳ：［Ｃ１３Ｈ１７ＣｌＮ２Ｏ４＋Ｎａ］のｍ／ｚの計算値：３２３．０７７４、実測値：３２３．０７７７。
【０１４２】
【化３１】
2021506313.tif 000038
【０１４３】
２−アミノ−４−クロロニコチン酸エチル（７）
２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−クロロニコチン酸エチル（２９．００ｇ、０．１０ｍｏｌ）を濃ＨＣｌ（５２．６０ｍＬ、０．５８ｍｏｌ）とジクロロメタン（６４ｍＬ）との混合物に室温で添加した（ゆっくり添加）。室温で２時間後、出発物質の完了をＴＬＣによってモニタリングし、次いで反応混合物を０℃に冷却し、２Ｎ  ＮａＯＨ溶液で中和した。反応混合物を、１００ｍＬのジクロロメタンを入れた分液漏斗に移し、化合物を水層から有機層中に抽出した。組み合わせたジクロロメタン層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な２−アミノ−４−クロロニコチン酸エチルを白色固体として得た。収量：１８．３８ｇ、９５％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），４．４２（ｑ，Ｊ＝７．１ Ｈｚ，２Ｈ），６．１３（ｂｓ，２Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝５．３ Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝５．４ Ｈｚ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣＣｌ３）：δ １４．２，６１．８，１０８．３，１１５．９，１４５．６，１５１．２，１５９．９，１６６．４、ＨＲＭＳ：［Ｃ８Ｈ９ＣｌＮ２Ｏ２＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：２０１．０４３１、実測値：２０１．０４２２。
【０１４４】
【化３２】
2021506313.tif 000039
【０１４５】
２−アミノ−４−クロロ−５−ブロモニコチン酸エチル（８）
７（１８．００ｇ、０．０９ｍｏｌ）の無水ＤＭＦ中溶液に、ＮＢＳ（１８．３６ｇ、０．１０ｍｏｌ）を室温で数回に分けて添加した。結果として得られた溶液のＴＬＣによる分析から、８が４時間後に完全に消費されたことが分かった。結果として得られた混合物を水（１００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（ＥＡ、２×１００ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。結果として得られた残留物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（１００〜２００メッシュ）によって精製して、２−アミノ−４−クロロ−５−ブロモニコチン酸エチル（８）のみを淡黄色固体として得た。収量：２２．０７ｇ、８８％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４１（ｔ，Ｊ＝７．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．４３（ｑ，Ｊ＝７．１ Ｈｚ，２Ｈ），５．８６（ｓ，２Ｈ），８．２４（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４．２，６２．３，１０９．７，１１０．４，１４４．４，１５２．８，１５８．０，１６５．９．ＨＲＭＳ：［Ｃ８Ｈ８ＢｒＣｌＮ２Ｏ２＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：２７８．９５３６、実測値：２７８．９５４１。
【０１４６】
【化３３】
2021506313.tif 000040
【０１４７】
２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−クロロ−５−ブロモニコチン酸エチル（９）
８（２０．００ｇ、７１．５５ミリモル）の無水ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）中氷冷溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２７．４２ｍＬ、１５７．４１ミリモル）を添加し、続いてトリホスゲン（７．６４ｇ、２５．７６ミリモル）を添加した。０℃で１時間後、ｔｅｒｔ−ブタノール（３３．９６ｍＬ、３５７．７６ミリモル）を５分間にわたって添加し、そして氷浴を取り外した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングし、室温で２４時間後、出発物質は完全に消費された。結果として得られた混合物を水でクエンチし、そしてジクロロメタンで抽出した（ＣＨ２Ｃｌ２、２×１００ｍＬ）。集めた有機層を塩水、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）の飽和溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。得られた粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００〜２００メッシュ）により精製して、２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−クロロ−５−ブロモニコチン酸エチル（５）を白色固体として得た。収量：１３．５８ｇ、５０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４１（ｔ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，３Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），４．４２（ｑ，Ｊ７．２ Ｈｚ，２Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ），８．５７（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４．１，２８．３（３Ｃ），６２．６，８２．２，１１３．９，１１６．３，１１９．９，１４４．０，１４９．５，１５１．７，１６４．２、ＨＲＭＳ：［Ｃ１３Ｈ１６ＢｒＣｌＮ２Ｏ４＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：３７９．００６０、実測値：３７９．００６３。
【０１４８】
【化３４】
2021506313.tif 000041
【０１４９】
５−ブロモ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−クロロニコチン酸（１０）
４１．４１ｍＬの１Ｍ水酸化ナトリウム（１１８．５３ミリモル）を９（１０．００ｇ、２６．３４ミリモル）のエタノール：ＴＨＦ（３：１、７６ｍＬ）中混合物に０℃で１５分にわたって添加した。ＴＬＣでモニタリングして出発物質が完全に消費された後、反応混合物を濃縮した。得られた粗物質を、水（２００ｍＬ）を入れた分液漏斗に移し、ＥＡ（１×１００ｍＬ）で抽出し、有機層を廃棄した。水層に、１０％ＨＣｌ（２００ｍＬ）およびＥＡ（１００ｍＬ）を慎重に添加した（ＰＨ約３〜５）。化合物をＥＡ層中に抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、純粋な５−ブロモ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−クロロニコチン酸（１０）を淡黄色固体として得た。収量：６．０２ｇ、６５％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １．４３（ｓ，９Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），９．８８（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２７．９（３Ｃ），８０．１，１１６．３，１２４．５，１４１．２，１４８．８，１５０．８，１５２．６，１６４．１、ＨＲＭＳ：［Ｃ１１Ｈ１２ＢｒＣｌＮ２Ｏ４＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：３５０．９７４７、実測値：３５０．９７１２。
【０１５０】
【化３５】
2021506313.tif 000042
【０１５１】
（１１）この化合物にとってカラムクロマトグラフィーによる精製は困難であった。したがって我々は精製または分析をすることなく次のステップに進んだ。ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ［Ｃ１７Ｈ２３ＢｒＣｌＮ５Ｏ５＋Ｈ］についての計算値：４９２．０６４９、実測値：４９２．０６５５。
【０１５２】
【化３６】
2021506313.tif 000043
【０１５３】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（８−ブロモ−４−オキソ−３，４−ジヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−２，５−ジイル）ジカーバメート（１２）
１０（５．００ｇ、１１．０７ミリモル）の無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２８ｍＬ）中氷冷溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、１．６４ｍＬ、１４．９４ミリモル）を添加し、続いてギ酸クロロエチル（chloroethylformate）（１．６３ｍＬ、１３．８４ミリモル）を添加した。０℃で１時間後、Ｂｏｃ−グアニジン（２．３８ｇ、１４．９４ミリモル）を一度に添加し、そして氷浴を取り外した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングし、室温で２４時間後、出発物質は完全に消費された。結果として得られた混合物を濃縮乾固させて、Ｂｏｃ−グアニジン付加物を粗混合物として得、これに対して水を添加し、１０分間室温で撹拌した。得られた固体をろ紙でろ過し、そして真空下で一晩乾燥させた。結果として得られた固体の無水ＤＭＦ中前記氷冷溶液に、ＮａＨ（６０％、１．７７ｇ、４４．２８ミリモル）を慎重に添加した。２４時間後、ＤＭＦを真空下で除去し、そして水を慎重に添加した。結果として得られた固体をろ過によって集め、真空中で乾燥させた。得られた粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００〜２００メッシュ）により精製して、１２を黄色固体として得た。収量：３．６４ｇ、７２％（二ステップにわたって）。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １．４８（ｓ，９Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），１０．８５（ｓ，１Ｈ），１１．５８（ｓ，１Ｈ），１１．７８（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２７．７（３Ｃ），２７．８（３Ｃ），８０．３，８３．２，１０３．２，１０９．２，１４９．０，１５０．４，１５２．０，１５２．６，１５３．７，１５４．２，１６１．７、ＨＲＭＳ：［Ｃ１７Ｈ２２ＢｒＮ５Ｏ５＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：４５６．０８８３、実測値：４５６．０８９０。
【０１５４】
【化３７】
2021506313.tif 000044
【０１５５】
（８−ブロモ−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−２，５−ジイル）ビス（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−カルバミン酸）ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１３）
１２（３．１０ｇ、６．７９ミリモル）の無水ＴＨＦ中溶液に、ＤＩＥＡ（３．５０ｍＬ、２０．３８ミリモル）およびＤＭＡＰ（０．１７ｇ、１．３６ミリモル）を添加し、続いてＢｏｃ２Ｏ（５．９３ｇ、２７．１８ミリモル）を室温で添加した。室温で４時間後、Ｂｏｃ２Ｏ（２．９７ｇ、１３．５９ミリモル）を添加し、反応混合物を５０℃まで温めた。出発物質の消費をＴＬＣによってモニタリングし、２４時間後、反応混合物を次いでＮａＨＣＯ３の飽和溶液およびＥＡで希釈した。有機層を水層から分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、得られた粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な１３を白色固体として得た。収量：３．１５ｇ、６５％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １．２７（ｓ，１８Ｈ），１．４５（ｓ，１８Ｈ），１．６５（ｓ，９Ｈ），９．０６（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２７．２（６Ｃ），２７．４（６Ｃ），２７．５（３Ｃ），８２．７（２Ｃ），８３．８（２Ｃ），８７．６，１０９．７，１１８．２，１４８．７，１４８．８（２Ｃ），１４９．６（２Ｃ），１５０．８，１５５．０，１５６．４，１６６．５、ＨＲＭＳ：［Ｃ３１Ｈ４６ＢｒＮ５Ｏ９＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：７１２．２５５７、実測値：７１２．２５４０。
【０１５６】
【化３８】
2021506313.tif 000045
【０１５７】
（８−アリル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピリドール−４，３−ジピリミジン−２，５−ジイル）ビス（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カルバミン酸）ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１４）
１３（３．００ｇ、４．２１ミリモル）の無水トルエン（２１ｍＬ）中撹拌・脱気溶液に、アリルトリブチルスズ（２．７９ｇ、８．４２ミリモル）、続いてテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．４９ｇ、０．４２ミリモル）を室温で添加した。結果として得られた溶液をアルゴンでフラッシュして、不活性雰囲気を創出し、溶液を１５時間１２５℃で灌流させた。結果として得られた混合物を室温まで冷却し、シリカゲルを添加し、溶媒を真空下で除去し、スラリーをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにロードして、１４を淡黄色固体として得た。収量：１．７０ｇ、６０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．３２（ｓ，１８Ｈ），１．４７（ｓ，１８Ｈ），１．７１（ｓ，９Ｈ），３．７８（ｄｑ，Ｊ＝６．６，１．３ Ｈｚ，２Ｈ），４．９４−５．１５（ｍ，２Ｈ），６．０９（ｄｄｔ，Ｊ＝１６．７，１０．１，６．４ Ｈｚ，１Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ２７．８（６Ｃ），２７．９（６Ｃ），２８．２（３Ｃ），３２．４，８２．４（２Ｃ），８３．３（２Ｃ），８６．３，１０８．８，１１６．５，１３１．４，１３６．０，１４８．１（２Ｃ），１４９．８（２Ｃ），１５０．３（２Ｃ），１５５．６，１５６．８，１６７．１、ＨＲＭＳ：［Ｃ３４Ｈ５１Ｎ５Ｏ９＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：６７４．３７６５、実測値：６７４．３７４６。
【０１５８】
【化３９】
2021506313.tif 000046
【０１５９】
２−（２，５−ビス（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−８−イル）酢酸（１５、Ｅ）
１４（１．００ｇ、１．４８ミリモル）のＣＨ３ＣＮ：ＣＣｌ４：Ｈ２Ｏ（２３：２３：３４ｍＬ）中氷冷撹拌溶液に、ＮａｌＯ４（２．５４ｇ、１１．８７ミリモル）を添加し、続いて塩化ルテニウム（ＩＩＩ）水和物（０．０７ｇ、０．３０ミリモル）を添加した。０℃で２時間後、反応混合物をセライト床でろ過し、真空下、３５℃で３／４の体積まで濃縮した。この混合物に、水（２０ｍＬ）およびＥＡ（２０ｍＬ）を２５℃で添加した。有機層を水層から分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。結果として得られた溶媒を真空下で除去し、得られた粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１５（Ｅ）を明褐色固体として得た。収量：０．５１ｇ ５０％。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．３４（ｓ，１８Ｈ），１．５６（ｓ，１８Ｈ），１．７１（ｓ，９Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ２８．０（６Ｃ），２８．１（６Ｃ），２８．３（３Ｃ），３７．１，８３．２（２Ｃ），８５．１（２Ｃ），８７．７，１０９．０，１２４．５，１４９．６，１４９．９（２Ｃ），１５０．１，１５５．９（２Ｃ），１５６．５（２Ｃ），１６７．４，１７０．４、ＨＲＭＳ：［Ｃ３３Ｈ４９Ｎ５Ｏ１１＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：６９２．３５０７、実測値：６９２．３４９１。
【０１６０】
【化４０】
2021506313.tif 000047
【０１６１】
４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボニトリル（１７）
２−（エトキシメチレン）マロノニトリル（１００．００ｇ、０．８２ｍｏｌ）、Ｓ−メチルイソチオ尿素ヘミ硫酸塩（７３．８１ｇ、０．８２ｍｏｌ）、トリエチルアミン（３７０．９２ｍＬ、２．６６ｍｏｌ）の無水エタノール（８１９ｍＬ）中混合物を室温で撹拌した。二日後、溶媒を真空下で除去し、結果として得られた残留物を水で洗浄して、所望の化合物を白色固体として得た。収量：１２２．４８ｇ、９０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２．４５（ｓ，３Ｈ），７．８７（ｓ，２Ｈ），８．４３（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．４，８５．３，１１５．６，１６０．５，１６１．４，１７４．６、ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｃ６Ｈ６Ｎ４Ｓ＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：１６７．０、実測値：１６７．１。
【０１６２】
【化４１】
2021506313.tif 000048
【０１６３】
４−アミノ−Ｎ´−ヒドロキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボキシイミドアミド（１８）
１７（５０．００ｇ、０．３０ｍｏｌ）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（２４．０４ｇ、０．３５ｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（８３．９２ｍＬ、０．６０ｍｏｌ）のメタノール（６０２ｍＬ）中前記混合物を７５℃で還流させた。二日後、反応混合物を室温まで冷却し、沈殿した固体をろ過により集め、メタノールおよびヘキサンで洗浄して、１８を淡黄色固体として得た。収量：４６．１５ｇ、７７％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２．４３（ｓ，３Ｈ），５．９６（ｓ，２Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），８．３５（ｓ，１Ｈ），９．８７（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．２，１０３．６，１４９．９，１５２．８，１５９．６，１６９．３、ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｃ６Ｈ９Ｎ５ＯＳ＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値２００．１、実測値：２００．０。
【０１６４】
【化４２】
2021506313.tif 000049
【０１６５】
（Ｅ）−Ｎ´−アセトキシ−４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボキシイミドアミド（１９）
１８（３１．００ｇ、０．１６ｍｏｌ）の氷酢酸中溶液に、無水酢酸（５１．４８ｍＬ、０．５５ｍｏｌ）を室温で添加した。結果として得られた溶液のＴＬＣによる分析から、１８が１５時間後に完全に消費されたことが分かった。酢酸を真空下で除去し、この粗物質に、飽和重炭酸ナトリウム溶液およびＥＡ（それぞれ２００ｍＬ）を添加した（ＰＨ−８〜９）。水層をＥＡで二回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。ＥＡを真空下で除去して、純粋な１９を白色固体として得た。収量：２８．０２ｇ、９０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２．１５（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），６．８９（ｓ，２Ｈ），７．７８（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．３，１９．５，１０２．４，１５４．５，１５４．６，１５９．８，１６７．９，１７１．３、ＨＲＭＳ：［Ｃ８Ｈ１１Ｎ５Ｏ２Ｓ＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値２４２．０７１２、実測値：２４２．０７１８。
【０１６６】
【化４３】
2021506313.tif 000050
【０１６７】
４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボキシイミドアミド（２０）
１９（２５．００ｇ、０．１０ｍｏｌ）、ギ酸（９７．７３ｍＬ、２．５９ｍｏｌ）、および木炭上のパラジウム（１０％、５．５１ｇ、５．１８ミリモル）のメタノール（１３０ｍＬ）中混合物を８０℃で還流させた。１５時間後、反応混合物を室温まで冷却し、溶媒を真空下で除去して、所望の生成物をギ酸塩として得た。生成物のギ酸塩としての収量：２９．９６ｇ、８０％。（ＮＭＲ分析の場合：結果として得られた粗物質（１ｇ）に、メタノール（１０ｍＬ）およびＴＥＡ（５ｍＬ、ｐＨ−９〜１０）を添加し、１５分間撹拌した。結果として得られた固体をろ過により集め、ヘキサンで洗浄した。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２．４３（ｓ，３Ｈ），５．９６（ｓ，２Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），９．８７（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．３，１０３．６，１４９．９，１５２．９，１５９．６，１６９．４、ＨＲＭＳ：［Ｃ６Ｈ９Ｎ５Ｓ＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値１８４．０６５７、実測値：１８４．０６６４。
【０１６８】
【化４４】
2021506313.tif 000051
【０１６９】
（（４−アミノ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−イル）（イミノ）メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２１）
ギ酸塩としての２０（２２．００ｇ、６８．４７ミリモル）のＴＨＦ：水（１００：１２５ｍＬ）中氷冷撹拌溶液に、重炭酸ナトリウムを数回に分けて添加した（３４．５１ｍＬ、０．４１ｍｏｌ）。結果として得られた溶液のｐＨが８〜９に達したら、２５ｍｌのＴＨＦ中Ｂｏｃ−無水物（１７．１９ｇ、７８．７４ミリモル）をゆっくりと添加した。結果として得られた溶液のＴＬＣによる分析から、２０は２４時間後に完全に消費されたことが分かった。反応混合物を、１００ｍＬの水と２００ｍＬのＥＡとを含む分液漏斗に移した。ＥＡ（２×）を使用して水層を抽出し、組み合わせたＥＡ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ＥＡを真空下で除去し、混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な２１を白色固体として得た。収量：１５．７１ｇ、８１％。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．５１（ｓ，９Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），７．６１（ｓ，２Ｈ），８．４２（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １３．９，２８．１（３Ｃ），７９．６，１０４．６，１５５．２（２Ｃ），１６１．１（２Ｃ），１７３．９、ＨＲＭＳ：［Ｃ１１Ｈ１７Ｎ５Ｏ２Ｓ＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値２８４．１１８１、実測値：２８４．１１８９。
【０１７０】
【化４５】
2021506313.tif 000052
【０１７１】
（Ｚ）−（（４−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）イミノ）メチル）（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２２）
２１（１５．００ｇ、５２．９４ミリモル）のＴＨＦ（１０６ｍＬ）中氷冷撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡを一度に添加し（４６．１１ｍＬ、２６４．６９ミリモル）、ＤＭＡＰ（１．２９ｇ、１０．５９ミリモル）、続いて２５ｍｌのＴＨＦ中Ｂｏｃ−無水物（５７．７７ｇ、２６４．６９ミリモル）を添加した（ゆっくりと添加）。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングし、２１が２４時間後に完全に消費されたことが分かった。反応混合物を、２００ｍＬの水と１００ｍＬのＥＡとを含む分液漏斗に移した。混合物をＥＡで抽出し（２×）、組み合わせたＥＡ層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。ＥＡを真空下で除去し、粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な２２を白色固体として得た。収量：２８．９６ｇ、８０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４４（ｓ，ｌ８Ｈ），１．４５（ｓ，１８Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４．６，２８．０（６Ｃ），２８．１（６Ｃ），２８．１（３Ｃ），８３．２，８３．７（２Ｃ），８４．９（２Ｃ），１１９．２，１４８．３，１５０．１，１５７．３（２Ｃ），１５８．８，１５９．５（２Ｃ），１６０．４，１７６．１、ＨＲＭＳ：［Ｃ３１Ｈ５０Ｎ５Ｏ１０Ｓ＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値６８４．３２７８、実測値：６８４．３２７５．
【０１７２】
【化４６】
2021506313.tif 000053
【０１７３】
化合物（２３）
２２（１５．００ｇ、２１．９４ミリモル）のＤＣＭ（５５ｍＬ）中氷冷撹拌溶液に、ｍＣＰＢＡを数回に分けて添加した（１０．６０ｇ、６１．４２ミリモル）。反応の進行をＴＬＣによって分析し、２２が３時間後に完全に消費されたことが分かった。反応混合物を、２００ｍＬの重炭酸ナトリウムの飽和溶液と１００ｍＬのＤＣＭとを含む分液漏斗に移した。混合物をＤＣＭ（２×）で抽出し、組み合わせたＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ＤＣＭを真空下で除去し、粗混合物をさらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１７４】
【化４７】
2021506313.tif 000054
【０１７５】
（Ｚ）−（（４−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリミジン−５−イル）（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）イミノ）メチル）（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２４）
粗２３（１５．００ｇ）のＴＨＦ（５５ｍＬ）中氷冷撹拌溶液に、２Ｎ  ＮａＯＨ（５４．８４ｍＬ、１０９．６８ミリモル）をゆっくりと添加した。出発物質の消費をＴＬＣによってモニタリングした。３０分後、反応混合物を、２００ｍＬの１％ＨＣｌと１００ｍＬのＥＡとを含む分液漏斗に移した。水層をＥＡ（２×）で抽出し、組み合わせたＥＡ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ＥＡを真空下で除去し、粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：１０．７５ｇ、二ステップにわたって７５％。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １．３７（ｓ，１８Ｈ），１．３９（ｓ，１８Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），１２．８０（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２７．４（１５Ｃ），８２．０，８２．９（２Ｃ），８３．５（２Ｃ），１０８．０，１４５．２，１４７．５（２Ｃ），１４９．１（２Ｃ），１５２．８，１５５．０，１５７．０，１６２．９、ＨＲＭＳ：［Ｃ３０Ｈ４７Ｎ５Ｏ１１＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値６５４．３３５０、実測値：６５４．３３５９。
【０１７６】
【化４８】
2021506313.tif 000055
【０１７７】
（Ｚ）−２−（４−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−オキソ−５−（Ｎ，Ｎ，Ｎ´−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カルバミミドイル）ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）酢酸ベンジル（２５）
化合物２４（１０．００ｇ、１５．３０ミリモル）およびＫ２ＣＯ３（４．２３ｇ、３０．５９ミリモル）の無水ＤＭＦ（７５ｍＬ）中混合物に、２−ブロモ酢酸ベンジル（２．４２ｍＬ、１５．３０ミリモル）を１０分間にわたって滴下した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングし、反応は４時間後に完了することが判明した。焼結漏斗を通して反応混合物をろ過し、ＤＭＦを真空下で蒸発させた。結果として得られた粗物質に、水を添加し、５分間撹拌した。得られた沈殿（precipitated）をろ過によって集め、水およびヘキサンで洗浄して、純粋な化合物２５を白色固体として得た。（注：化合物が充分沈殿しないならば、抽出が化合物を得るための代替法となり、必要ならば、短床カラム（ｓｈｏｒｔ  ｂｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ）を行って純粋な化合物を得る）。収量：１０．９２ｇ、８９％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．４６（ｓ，１８Ｈ），１．４８（ｓ，１８Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），４．７５（ｓ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），７．２７−７．４７（ｍ，５Ｈ），７．９５（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ２７．８（６Ｃ），２７．９（６Ｃ），２８．０（３Ｃ），５１．０，６８．２，８３．０，８３．７（２Ｃ），８５．２（２Ｃ），１１０．６，１２８．６（３Ｃ），１２８．７（２Ｃ），１２８．８，１３４．５，１４８．２，１４９．５（２Ｃ），１５２．０（２Ｃ），１５４．４，１５７．１，１６３．９，１６６．１、ＨＲＭＳ：［Ｃ３９Ｈ５５Ｎ５Ｏ１３＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値８０２．３８７５、実測値：８０２．３８８２。
【０１７８】
【化４９】
2021506313.tif 000056
【０１７９】
（Ｚ）−２−（４−（ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−オキソ−５−（Ｎ，Ｎ，Ｎ´−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カルバミミドイル）ピリミジ−１（２Ｈ）−イル）酢酸（２６、Ｆ）
木炭上のパラジウム（１０％ローディング、０．６６ｇ、０．６２ミリモル）を、２５（５．００ｇ、６．２４ミリモル）のＥＡ（５０ｍＬ）中溶液に、アルゴンバルーン下で慎重に添加した。５分後、アルゴンバルーンを水素バルーンと置換し、反応混合物を同じ雰囲気下でさらに１時間撹拌した。出発物質の完全消耗をＴＬＣによって判断した。結果として得られた反応混合物は、セライト床を通して慎重にろ過し、ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発させて、純粋な化合物２６を白色固体として得た。収量：３．９９ｇ、９０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．３６（ｓ，１８Ｈ）、１．４１（ｓ，１８Ｈ）、１．４２（ｓ，９Ｈ）、４．８５（ｓ，２Ｈ）、９．１０（ｓ，１Ｈ）、１３．４５（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：０ ２７．４（６Ｃ）、２７．４（６Ｃ）、２７．５（３Ｃ）、５０．９、８２．２、８３．０（２Ｃ）、８３．３（２Ｃ）、１０８．３、１４５．１、１４６．９（２Ｃ）、１４９．４（２Ｃ）、１５４．１、１５６．１、１５７．０、１６２．５、１６８．４、ＨＲＭＳ：［Ｃ３２Ｈ４９Ｎ５Ｏ１３＋Ｈ］のｍ／ｚ計算値：７１２．３４０５、実測値：７１２．３３８６。
【０１８０】
【化５０】
2021506313.tif 000057
【０１８１】
２−（２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−イル）酢酸（２７）
この化合物を商業的に利用可能な供給源から購入した。
【０１８２】
【化５１】
2021506313.tif 000058
【０１８３】
（Ｒ）−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（２−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）グリシン酸アリル（２８）
Ｎ−Ｆｍｏｃ（Ｏ−ＭＰ（ｔブチル）−Ｌ−セリノール（５．００ｇ、１０．９３ミリモル）の飽和ＤＣＭ：水（２８ｍＬ）中冷却溶液に、デス・マーチン・ペルヨージナン（９．９６ｇ、２３．４９ミリモル）を数回に分けて添加した。反応混合物を同じ温度でさらに３０分間、室温で１時間撹拌して、アルコールをアルデヒドに完全に変換させた。反応混合物をエーテル、重炭酸ナトリウムの飽和溶液、１０％チオ硫酸ナトリウムで希釈し、そして５分間撹拌した。全反応混合物を分液漏斗に移し、有機化合物をエーテル（２ｘ）中に抽出した。エーテル層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで除去して、粗アルデヒドを得た。アルデヒドをさらに精製することなく次のステップで使用した。無水ＤＣＭ（４４ｍＬ）中のアルデヒドに、グリシン酸アリルＰＴＳＡ塩（６．２８ｇ、２１．８６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５．９０ｍＬ、３３．８９ミリモル）を添加し、１時間反応させた。ＮａＢ（ＯＡｃ）３Ｈ（５．７９ｇ、２７．３３ミリモル）を反応混合物に一度に添加した。室温で一晩撹拌した後、反応混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）および重炭酸ナトリウムの飽和溶液で希釈した。反応混合物を分液漏斗に移し、層を水層から分離した。組み合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで除去し、そして粗混合物をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：４．８５ｇ、８５％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．１９（ｓ，９Ｈ），２．７７−２．９２（ｍ，２Ｈ），３．４９−３．６９（ｍ，１３Ｈ），３．８８（ｂｓ，１Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ，１Ｈ），４．３９（ｄ，Ｊ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），４．６４（ｄｔ，Ｊ＝５．９，１．４ Ｈｚ，２Ｈ），５．２３−５．３６（ｍ，２Ｈ），５．７３（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｄｄｔ，Ｊ＝１７．３，１０．４，５．８ Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｔｄ，Ｊ＝７．５，１．２ Ｈｚ，２Ｈ），７．３６−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．６０−７．６８（ｍ，２Ｈ），７．７４−７．７９（ｍ，２Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ２７．５（３Ｃ），４７．３，５０．３，５０．５，５０．６，５０．７，６１．２，６５．５，６６．７，７０．５，７０．８，７１．２，７１．４，７３．１，１１８．７，１１９．９，１２０．０，１２０．０，１２５．２，１２７．０，１２７．６，１２７．７，１３１．８，１４１．３，１４４．０，１４４．０，１５６．４，１７１．８，１７４．３、ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２Ｏ７１＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値５５５．３、実測値：５５５．３。
【０１８４】
【化５２】
2021506313.tif 000059
【０１８５】
アリルモノマー（２９ａ）
１５（Ｅ）（０．５０ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１６３．６７μＬ、０．９４ミリモル）の無水ＤＭＦ（６ｍＬ）中混合物に、ＨＢＴＵ（０．３２ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を一度に室温で添加した。室温で１０分後、ＤＭＦ（４ｍＬ）中の骨格２８（０．６０ｇ、１．０８ミリモル）を上記反応混合物に添加した。ＴＬＣによってモニタリングした反応の進行（溶離液：ＥＡ：Ｈｅｘ（５０：５０）、骨格のＲｆ＝０．２、生成物のＲｆ＝０．６、ＥのＲｆ＝０．１）。出発物質が完全に消費された後、ＤＭＦを真空下、４５℃で除去した。結果として得られた粗物質に、１％ＨＣｌ（２０ｍＬ）およびＥＡ（２０ｍＬ）を添加し、有機層（２ｘ）を、分液漏斗を用いて水層から分離した。組み合わせた有機層を乾燥し、除去し、獲得した粗物質をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：０．６２ｇ、７０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ １．０８／１．０９（ｓ，９Ｈ），１．２１１．３３（ｍ，１８Ｈ），１．３６／１．３８（ｓ，１８Ｈ），１．４１／１．６５（ｓ，９Ｈ），３．３６−３．７０（ｍ，１０Ｈ），３．８２−４．２７（ｍ，８Ｈ），４．３２（ｂｓ，２Ｈ），４．４１−４．７１（ｍ，２Ｈ），５．１３−５．４１（ｍ，２Ｈ），５．８１−６．０１（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．５７（ｍ，５Ｈ），７．７１／７．７３（ｄ，Ｊ＝９．７ Ｈｚ，２Ｈ），７．８９／７．９９（ｄ，Ｊ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），８．５６／８．６０（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ ２７．２−２７．６（１８Ｃ），４６．７，５９．７，６０．６／６０．６，６４．７，６５．３，６５．５，６９．６，６９．６，６９．８，７０．０，７０．４，７０．４，７２．２，８１．８−８６．３（６Ｃ），１０８．１，１１７．７，１１８．２，１２０．ｌ（２Ｃ），１２５．１，１２７．０（２Ｃ），１２７．３，１２７．６（２Ｃ），１２７．８／１２７．９，１３２．１，１３２．３，１４０．７，１４３．８，１４７．９，１４９．３，１４９．５，１４９．６，１５５．０／１５５．１，１５５．９，１５６．５，１６６．６，１６８．８，１６９．２，１７０．２、ＨＲＭＳ：［Ｃ６４Ｈ８９Ｎ７Ｏ１７＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：１２２８．６３９３、実測値：１２２８．６３９８。
【０１８６】
【化５３】
2021506313.tif 000060
【０１８７】
アリルモノマー（２９ｂ）
この化合物は、化合物２７（１．００ｇ、５．８８ミリモル）および骨格２８（４．０８ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）を出発物質として使用して化合物２９ａについての上記の手順を使用して調製した。ＴＬＣ（溶離液：５％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ（５：９５）、骨格のＲｆ＝０．６、生成物のＲｆ＝０．２、２７のＲｆ＝０．０）．収量：３．５ｇ、８４％。１Ｈ ＮＭＲ（５００．１３ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ １．１０／１．１０（ｓ，９Ｈ），３．３０−３．５９（ｍ，１４Ｈ），３．７４４．１３（ｍ，２Ｈ），４．１７４．４２（ｍ，４Ｈ），４．６０（ｄｄ，Ｊ＝３３．４，４．８ Ｈｚ，２Ｈ），５．００−５．４４（ｍ，２Ｈ），５．８２−６．０１（ｍ，１Ｈ），７．１０−７．５５（ｍ，６Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ，２Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），１０．７５（ｂｓ，１Ｈ），１１．０８（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）δ ２７．２（３Ｃ），４６．７，６０．６（２Ｃ），６４．７，６５．２，６５．５，６９．６，６９．８，６９．９，７０．４（２Ｃ），７２．２，１０７．２，１１７．７，１１８．１，１２０．１（２Ｃ），１２５．２，１２７．０（２Ｃ），１２７．３，１２７．６（２Ｃ），１３２．２／１３２．３，１３９．２，１３９．７，１４０．７，１４３．８／１４３．８，１５１．２／１５１．３，１５５．８，１６４．１／１６４．１，１６８．９，１６９．４，１７０．６、ＨＲＭＳ：［Ｃ３７Ｈ４６Ｎ４Ｏ１０＋Ｈ］のｍ／ｚの計算値：７０７．３２９２、実測値：７０７．３２９０。
【０１８８】
【化５４】
2021506313.tif 000061
【０１８９】
アリルモノマー（２９ｃ）
この化合物は、化合物２６（３．５０ｇ、４．９２ｍｍｏｌ）および骨格２８（３．４１ｇ、６．１５ミリモル）を出発物質として使用して化合物２９ａについての上記の手順を使用して調製した。ＴＬＣ（溶離液：ＥＡ：Ｈｅｘ（４０：６０）、骨格のＲｆ＝０．１、生成物のＲｆ＝０．７、２６のＲｆ＝０．１）。収量：４．８０ｇ、７８％。１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １．０９（ｂｓ，９Ｈ），１．３４／１３．６（ｓ，１８Ｈ），１．４１／１．４２（ｓ，２７Ｈ），３．３５−３．５９（ｍ，１４Ｈ），４．０７−４．４９（ｍ，４Ｈ），４．６１（ｄｄ，Ｊ＝３７．６，５．４ Ｈｚ，３Ｈ），４．９７−５．４２（ｍ，３Ｈ），５．７７−６．０４（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），７．５０−７．５７（ｍ，３Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ，２Ｈ），８．９４／８．９６（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５．７７ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，回転異性体）：δ ２７．２−２７．５（１８Ｃ），４６．７，６０．２／６０．７（２Ｃ），６４．７，６５．５，６９．５，６９．６，６９．８，６９．９，７０．４／７０．４（２Ｃ），７２．２，８２．２−８３．４（６Ｃ），１０８．１，１１７．７，１２０．１（２Ｃ），１２４．４，１２５．１，１２７．０（２Ｃ），１２７．４，１２７．６（２Ｃ），１２７．８，１３２．２（２Ｃ），１４０．７（２Ｃ），１４３．８（２Ｃ），１４５．１，１４６．９（２Ｃ），１４９．５（２Ｃ），１５７．０，１６２．５，１６６．５，１６８．４、ＨＲＭＳ：［Ｃ６３Ｈ８９Ｎ７Ｏ１９＋Ｈ］の計算値ｄｍ／ｚ１２４８．６２９１，実測値：１２４８．６２５６．
【０１９０】
以下の附番された条項で本発明の非限定的態様を記載した。
【０１９１】
条項１：核酸若しくは核酸アナログ骨格を含み、３以上のリボース、デオキシリボース、または核酸アナログ骨格残基、前記骨格残基に結合した二価核酸塩基の配列を含む遺伝子認識試薬であって、前記二価核酸塩基の配列が、二本の核酸鎖上のリピート伸長疾患の伸長されたリピートの、単位標的配列、または、単位標的配列の１以上の逐次反復と結合する、遺伝子認識試薬。
【０１９２】
条項２：前記核酸若しくは核酸アナログ骨格が第一末端と第二末端とを含み、前記骨格の前記第一末端に結合した第一連結基、前記第一連結基と非共有結合するかまたはセルフライゲーションする、前記第二末端に結合した第二連結基をさらに含む、条項１に記載の遺伝子認識試薬。
【０１９３】
条項３：前記二価核酸塩基の配列が、前記二本の鎖を逆平行配向でアライントさせた場合、前記二本の鎖の各々の上のリピート伸長疾患の伸長されたリピートの、単位標的配列または前記単位標的配列の２以上の逐次反復と結合する、条項１または２に記載の遺伝子認識試薬。
【０１９４】
条項４：前記単位標的配列が、前記二本の鎖の両方の上で、（ＧＡＡ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＣＣＧ）ｎ、（ＣＡＧ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＣＣＴＧ）ｎ、（ＡＴＴＣＴ）ｎ、若しくは（ＧＧＧＧＣＣ）ｎの逐次反復、または、前記のいずれかに対して相補性である配列により形成される、条項１〜３いずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０１９５】
条項５：前記単位標的配列がＣ／Ｇ−Ａ／Ａ−Ｇ／Ｃである、条項１〜４いずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０１９６】
条項６：前記核酸塩基配列を、
ＪＢ３核酸塩基、ＪＢ６核酸塩基、およびＪＢ４核酸塩基、
ＪＢ６核酸塩基、ＪＢ４核酸塩基、およびＪＢ３核酸塩基、
または、ＪＢ４核酸塩基、ＪＢ３核酸塩基、およびＪＢ６核酸塩基、
または、前記の２以上の逐次反復、
の順序で有する、条項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０１９７】
条項７：前記核酸塩基配列を、
ＪＢ３若しくはＪＢ３ｂ、ＪＢ６若しくはＪＢ６ｂ、およびＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、若しくはＪＢ４ｅ、
ＪＢ６若しくはＪＢ６ｂ、ＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、若しくはＪＢ４ｅ、およびＪＢ３若しくはＪＢ３ｂ、または
ＪＢ４、ＪＢ４ｂ、ＪＢ４ｃ、ＪＢ４ｄ、若しくはＪＢ４ｅ、ＪＢ３若しくはＪＢ３ｂ、および、ＪＢ６またはＪＢ６ｂ、
または、前記の２以上の逐次反復、
の順序で有する、条項６に記載の遺伝子認識試薬。
【０１９８】
条項８：前記核酸塩基配列を、
ＪＢ３、ＪＢ６、およびＪＢ４、
ＪＢ６、ＪＢ４、およびＪＢ３、または
ＪＢ４、ＪＢ３、およびＪＢ６、
または、前記の２以上の逐次反復、
の順序で有する、条項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０１９９】
条項９：表Ｃに列挙された単位認識試薬配列の核酸塩基配列を有する、条項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０２００】
条項１０：前記二本の鎖がどちらも同一の核酸分子のものである、条項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０２０１】
条項１１：前記二本の鎖がどちらもＲＮＡである、条項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０２０２】
条項１２：３、４、５、６、７、または８個の核酸塩基などの３〜８個の核酸塩基の配列からなる、条項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０２０３】
条項１３：前記骨格残基が核酸アナログ骨格残基である、条項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０２０４】
条項１４：前記骨格残基が立体構造的に予め組織化されている、条項１３に記載の遺伝子認識試薬。
【０２０５】
条項１５：前記骨格残基がロックド核酸残基である、条項１４に記載の遺伝子認識試薬。
【０２０６】
条項１６：前記骨格残基がペプチド核酸（ＰＮＡ）残基である、条項１４に記載の遺伝子認識試薬。
【０２０７】
条項１７：前記骨格残基がγＰＮＡ残基である、条項１４に記載の遺伝子認識試薬。
【０２０８】
条項１８：構造：
【化５５】
2021506313.tif 000062
【０２０９】
ここで、ＸはＳまたはＯであり、ｎは１から６の整数であり、ｍは０から４の整数であり、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、グアニジン含有基、例えば、
【化５６】
2021506313.tif 000063
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、例えば、
【化５７】
2021506313.tif 000064
直鎖若しくは分枝（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、１〜５０個のエチレングリコール部分を含むエチレングリコール単位で任意に置換されていてもよい、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ここで、Ｐ１はＨ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン若しくは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０から５０の整数であり、そして、ｒおよびｓは、各々独立して、１〜５０の整数であり、
Ｒ３は、Ｈ、または脱離基、例えば、直鎖若しくは分枝（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、置換若しくは非置換（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、（Ｃ１〜Ｃ８）カルボキシ、アミノ酸側鎖で任意に置換されていてもよい、または、グアニジン含有基、または、
【化５８】
2021506313.tif 000065
ここで、ｏは１〜２０であり、Ｒ６は、各々独立して、アミノ酸側鎖であり、Ｒ７は−ＯＨまたは−ＮＨ２であり、
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ１０）二価炭化水素または１以上のＮ若しくはＯ部分、例えば−Ｏ−、−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−で置換された（Ｃ１〜Ｃ１０）二価炭化水素であり、
Ｒ５は、−ＯＨ、−ＳＨまたはジスルフィド保護基であり、そして、
Ｒの各々は、独立して、１以上の標的核酸中の核酸塩基の単位標的配列に対して相補的な核酸塩基の配列を生成し、したがって、複数の認識モジュールの各々が、鋳型核酸上の核酸塩基の標的配列に結合し、互いにライゲーションする核酸塩基である、を有するか、またはその薬剤的に許容される塩である、条項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１０】
条項１９：Ｒ１またはＲ２が、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０〜５０の整数であり、ｒは１〜５０の整数であり、ｓは１〜５０の整数である、条項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１１】
条項２０：Ｒ５が、−ＳＨ、ＯＨ、またはＳ−Ｓ−Ｒ８であり、ここで、Ｒ８は、１以上のアミノ酸残基、アミノ酸側鎖、グアニジン含有基、非置換若しくは置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、または（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンである、条項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１２】
条項２１：Ｒ１がＨでありＲ２はＨではない、または、Ｒ２がＨでありＲ１はＨではない、条項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１３】
条項２２：Ｒ１がＨであり、Ｒ２がポリオキシエチレン部分を含む、条項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１４】
条項２３：Ｒ５が−ＳＨであり、ＸがＳである、条項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１５】
条項２４：Ｒ５が、リジン残基、アルギニン残基、またはグアニジン含有基を含む、条項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１６】
条項２５：Ｒ４がメチレンであり、Ｒ５が−ＳＨであり、ＸがＳであり、そしてＲ５が、ヒドロキシル置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、例えば−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨである、条項１８に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１７】
条項２６：認識試薬が標的核酸の隣接配列とハイブリダイズする場合、前記第一連結基および前記第二連結基が、独立して、隣接する認識試薬のアリール部分とスタッキングする２〜５環縮合多環式芳香族部分である、条項２〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１８】
条項２７：前記２〜５環縮合多環式芳香族部分が、非置換若しくは置換ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン／テトラセン、プレイアデン、ピセン、またはペリレンであって、Ｏ、Ｎ、および／またはＳなどの１以上のヘテロ原子で任意に置換されていてもよく、例えば、キサンテン、リボフラビン（ビタミンＢ２）、マンゴスチン、またはマンギフェリンである、条項２６に記載の遺伝子認識試薬。
【０２１９】
条項２８：前記２〜５環縮合多環式芳香族部分が同一である、条項２６または２７に記載の遺伝子認識試薬。
【０２２０】
条項２９：前記認識試薬が、構造：
【化５９】
2021506313.tif 000066
を有し、
ここで、Ｒの各々が、独立して、核酸塩基であり、Ｒの各々が、同一であるか、または異なる核酸塩基であり得、
ｎが１〜６の範囲の整数、例えば、１、２、３、４、５、または６であり、
Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、Ｈ、グアニジン含有基、例えば、
【化６０】
2021506313.tif 000067
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、例えば、
【化６１】
2021506313.tif 000068
、非置換若しくは置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、若しくは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０から５０の整数であり、ｒおよびｓはそれぞれ独立して、１から５０の整数であり、
Ｒ１０またはＲ１１の一方、およびＲ１２、Ｒ１３、若しくはＲ１４のうちの一つは−Ｌ−Ｒ３であり、ここで、Ｒ３の各々は、独立して、２〜５環縮合多環式芳香族部分、例えば、非置換若しくは置換ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン／テトラセン、プレイアデン、ピセン、またはペリレン、Ｏ、Ｎ、および／またはＳなどの１以上のヘテロ原子で任意に置換されていてもよく、例えば、キサンテン、リボフラビン（ビタミンＢ２）、マンゴスチン、またはマンギフェリンであり、各々は、認識試薬が標的核酸の隣接配列とハイブリダイズする場合、隣接認識試薬のＲ３基とスタッキングすることができ、
Ｌはリンカーであり、そして
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４の残りが、各々独立して、Ｈ、１以上の連続したアミノ酸残基、例えば１以上のＡｒｇ残基、グアニジン含有基、例えば、
【化６２】
2021506313.tif 000069
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５であり、
アミノ酸側鎖、例えば、
【化６３】
2021506313.tif 000070
、非置換若しくは置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、若しくは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−ＣＨ２−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、ここで、Ｐ１はＨ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑは０から５０の整数であり、ｒおよびｓは各々独立して、１〜５０の整数である、または、
その薬剤的に許容される塩である、条項２に記載の遺伝子認識試薬、
【０２２１】
条項３０：１以上のＲ１、Ｒ２、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４が、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑＯＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＮＨＰ１、−（ＳＣＨ２−ＣＨ２）ｑ−ＳＰ１、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、または−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｒ−Ｓ−Ｓ［ＣＨ２ＣＨ２］ｓＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、ここで、Ｐ１が、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンであり、ｑが０〜５０の整数であり、ｒが１〜５０の整数であり、ｓが１〜５０の整数である、条項２９に記載の遺伝子認識試薬。
【０２２２】
条項３１：Ｒ４およびＲ７がーＬ−Ｒ３である、条項２９に記載の遺伝子認識試薬。
【０２２３】
条項３２：前記リンカーが、約５〜２５個の原子、例えば、５〜２０個、５〜１０個、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個の原子、または合計１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のＣおよびヘテロ原子、例えばＯ、Ｐ、Ｎ、若しくはＳ原子を含む、条項２９に記載の遺伝子認識試薬。
【０２２４】
条項３３：Ｒ３のいずれの場合も、同一の２〜５環縮合多環式芳香族部分を含む、条項２９に記載の遺伝子認識試薬。
【０２２５】
条項３４：
グアニジン含有基、例えば、
【化６４】
2021506313.tif 000071
ここで、ｎ＝１、２、３、４、または５である、を含む、条項１〜３３のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬。
【０２２６】
条項３５：リピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含有する核酸を結合する方法であって、前記伸長されたリピートを含む核酸を、条項１〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬と接触させることを含む、方法。
【０２２７】
条項３６：前記核酸が、前記二本の鎖の両方の上の（ＧＡＡ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＣＣＧ）ｎ、（ＣＡＧ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＣＣＴＧ）ｎ、（ＡＴＴＣＴ）ｎ、もしくは（ＧＧＧＧＣＣ）ｎの逐次反復によって形成された単位標的配列、または前記のいずれかに対して相補的である配列を含む、条項３５に記載の方法。
【０２２８】
条項３７：前記核酸が、前記二本の鎖の両方の上の（ＣＡＧ）ｎの逐次反復によって形成された単位標的配列、またはそれに対して相補的な配列を含む、条項３５に記載の方法。
【０２２９】
条項３８：前記核酸が、リピート伸長障害を有する患者から得られる、条項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【０２３０】
条項３９：患者から得られるサンプルにおけるリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含む核酸の存在を特定する方法であって、前記患者から得た核酸サンプルを、条項２〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬と接触させ、前記サンプルがリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含む核酸を含むことを示すものとして前記遺伝子認識試薬の結合および連結が起こるか否かを判定し、そして任意に前記患者を前記リピート伸長疾患について治療することを含む、方法。
【０２３１】
条項４０：条項１〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬と薬剤的に許容される担体とを含む組成物。
【０２３２】
条項４１：細胞においてリピート伸長疾患に関連する伸長されたリピートを含有する遺伝子の発現をノックダウンする方法であって、前記伸長されたリピートを含む、ＲＮＡなどの核酸を、条項１〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子認識試薬と接触させることを含む、方法。
【０２３３】
本発明を、ある特定の例示的実施形態、分散性の組成物およびその使用を参照して記載してきた。しかしながら、発明の主旨および範囲から逸脱することなく例示的実施形態のいずれかの様々な置換、変更または組み合わせをなし得ることができることは当業者には認められるであろう。したがって、発明は、例示的実施形態の記載によって限定されるのではなく、最初に提出された添付の特許請求の範囲によって限定されるものである。
【図１】
2021506313.tif 000082
【図２】
2021506313.tif 000083
【図３】
2021506313.tif 000084
【図４】
2021506313.tif 000085
【図５Ａ】
2021506313.tif 000086
【図５Ｂ】
2021506313.tif 000087
【図５Ｃ】
2021506313.tif 000088
【図６】
2021506313.tif 000089
【図７】
2021506313.tif 000090
【図８】
2021506313.tif 000091
【図９】
2021506313.tif 000092
【図１０】
2021506313.tif 000093
【図１１】
2021506313.tif 000094
【図１２】
2021506313.tif 000095
【図１３】
2021506313.tif 000096
【図１４】
2021506313.tif 000097
【図１５】
2021506313.tif 000098
【図１６】
2021506313.tif 000099
【図１７】
2021506313.tif 000100
【図１８】
2021506313.tif 000101
【図１９】
2021506313.tif 000102
【図２０】
2021506313.tif 000103
【図２１】
2021506313.tif 000104
【配列表】
2021506313000001.app
【国際調査報告】
2021506313.tif 000105
2021506313.tif 000106