(57)【要約】  本発明は、医薬品の分野、具体的には、トレプロスチニルのグリコシド誘導体に関する。グリコシドトレプロスチニル誘導体は、肺動脈性肺高血圧症などの肺高血圧症を含め、トレプロスチニルによる処置に応答する任意の病態を処置するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化８】
2021506959.tif 000012
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、Ｈまたは炭水化物であり、そして、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、Ｈではない］で示されるトレプロスチニルのグリコシド誘導体。
【請求項２】
炭水化物が、単糖、二糖、オリゴ糖、アミノ糖またはアルジトールである、請求項１に記載のトレプロスチニル誘導体。
【請求項３】
単糖が、ピラノシドまたはフラノシドである、請求項２に記載のトレプロスチニル誘導体。
【請求項４】
炭水化物が、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースのようなヘキソアルドース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースのようなヘキソケトース、リボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースのようなアルドペントース、リブロースおよびキシルロースのようなケトペントース、またはガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、ノイラミン酸（neuramine acid）、ムラミン酸（muramine acid）およびＮ−アセチルグルコサミンのようなヘキソサミンから選択される、請求項２に記載のトレプロスチニル誘導体。
【請求項５】
ピラノシドが、グルコースまたはガラクトースである、請求項４に記載のトレプロスチニル誘導体。
【請求項６】
少なくとも６０分、具体的には７０分、８０分、９０分、具体的には１００分±２０分の血漿中半減期を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトレプロスチニル誘導体。
【請求項７】
血漿中、２０時間±５時間で、少なくとも５０％、具体的には少なくとも６０％、７０％、８０％、より具体的には少なくとも９０％開裂される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトレプロスチニル誘導体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のトレプロスチニルのグリコシド誘導体を含む、組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のトレプロスチニルのグリコシド誘導体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
トレプロスチニル誘導体が、
【化９】
2021506959.tif 000013
2021506959.tif 000014
から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１つがＨである式Ｉで示される化合物の製造方法であって、以下の反応工程：
【化１０】
2021506959.tif 000015
［式中、ＰＧは、保護基であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、請求項１に定義される通りである］を含む製造方法。
【請求項１２】
保護基が、ベンジル、ベンジル、置換メチルエーテル、置換エチルエーテル、置換ベンジルエーテル、様々なシリルエーテルからなる群より選択されるエーテル、酢酸エステル、置換酢酸エステル、安息香酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステルからなる群より選択されるエステル、環状アセタール、ケトンに由来するアセタール、エステル、アミド、ヒドラシド（hydracide）、ベンジルエステルである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
グリコシドが、ピラノシド、具体的にはグルコースまたはガラクトースである、請求項１１または１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
式ＩＩ：
【化１１】
2021506959.tif 000016
［式中、Ｂｎは、ベンジル部分である］で示される中間化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬品の分野、具体的には、グリコシドトレプロスチニルおよびその製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
トレプロスチニルは、肺動脈性肺高血圧症の処置に使用される血管拡張薬である。トレプロスチニルは、プロスタサイクリン（ＰＧｌ２）類似体のグループに属しており、リモジュリン（Remodulin）（注入）、オレニトラム（Orenitram）（経口）およびタイヴァソ（Tyvasoｍ）（吸入）という名で販売されている。
【０００３】
リモジュリンは、持続皮下注入または持続静脈内注入によって投与される。製造業者によれば、初期注入速度は、１．２５ng/kg/分とすべきである。この投与量が患者に忍容されない場合、注入速度を０．６２５ng/kg/分まで減量することができる。
【０００４】
そのバイオアベイラビリティは１００％に近く、人体における生物学的半減期は４．４〜４．６時間であると示されている［１］。トレプロスチニルは、肝臓によって代謝され、尿排泄は７９％（その４％が未代謝トレプロスチニル、６４％が代謝物として同定される）であり、糞便排泄は１３％である。
【０００５】
ＵＳ  ２０１５／１６６５０３Ａ１は、トレプロスチニル誘導体を記載している。
【０００６】
ＷＯ  ２０１６／２０５２０２Ａ１およびＵＳ  ９，３９４，２２７Ｂ１は、全身アベイラビリティが増加したトレプロスチニル誘導体に言及している。
【０００７】
ＷＯ  ２００５／００７０８１Ａ２は、経口アベイラビリティが増加したトレプロスチニル誘導体を記載している。
【０００８】
現在まで、トレプロスチニルは、患者が常時装着しなければならない注入ポンプを介した持続皮下注入または持続静脈内注入として投与されることが依然求められている。トレプロスチニルの皮下注入は、患者が痛みに耐えることのできないほどの苦痛を伴うことが多く、そのような事情から、投与様式は、静脈内注入に切り替えられる。しかしながら、静脈内リモジュリンによる敗血症リスクの増加が報告されている。皮下注入は痛みを伴うので、皮下投与によって投与できるが痛みの程度が低減されたプロスタサイクリン作動薬または類似体を開発する必要性がある。吸入用トレプロスチニルは、より簡便であり、皮下注入用トレプロスチニルに伴うことの多い強い痛みはないが、吸入は、有効性が低いと考えられており、それゆえ、処方される頻度は少ない。
【０００９】
それゆえ、患者にとってより効果的かつ／またはより快適なトレプロスチニル処置を提供する必要性が依然として存在する。
【００１０】
発明の概要
それゆえ、本発明の目的は、トレプロスチニルの改善されたプロドラッグを提供することである。この目的は、本発明の主題によって解決される。
【００１１】
本発明によれば、一般式Ｉ：
【化１】
2021506959.tif 000002
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、Ｈまたは炭水化物であり、そして、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、Ｈではない］で示されるトレプロスチニルのグリコシド誘導体が提供される。
【００１２】
ある実施態様において、グリコシド誘導体は、Ｒ１およびＲ２がＨであり、そして、Ｒ３が炭水化物である、上記の通りの一般式で示される。
【００１３】
本発明のさらなる実施態様は、炭水化物が環状の単糖、二糖、オリゴ糖、アミノ糖またはアルジトールである、本明細書に記載の通りのトレプロスチニル誘導体に関する。
【００１４】
本発明の一実施態様において、単糖は、ピラノシドまたはフラノシドである。
【００１５】
本発明の一実施態様において、炭水化物は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースのようなヘキソアルドース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースのようなヘキソケトース、リボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースのようなアルドペントース、リブロースおよびキシルロースのようなケトペントース、またはガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、ノイラミン酸（neuramine acid）、ムラミン酸（muramine acid）およびＮ−アセチルグルコサミンのようなヘキソサミンから選択される。
【００１６】
本発明の一実施態様において、ピラノシドは、グルコースまたはガラクトースである。
【００１７】
本発明のさらなる実施態様は、少なくとも６０分、具体的には７０分、８０分、９０分、具体的には１００分±２０分の血漿中半減期を有する、本明細書に記載の通りのトレプロスチニル誘導体に関する。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様は、血漿中、２０時間±５時間で、少なくとも５０％、具体的には少なくとも６０％、７０％、８０％、より具体的には少なくとも９０％開裂される、本明細書に記載の通りのトレプロスチニル誘導体に関する。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様は、ＩＰ、ＥＰ２および／またはＥＰレセプターに対するレセプター結合親和性が未修飾トレプロスチニルと比べて低減された、本明細書に記載の通りのトレプロスチニル誘導体に関する。具体的には、レセプター結合は、未修飾トレプロスチニルのレセプター結合親和性に対して少なくとも２倍、具体的には５倍、１０倍、１５倍、より具体的には約２０倍低減されている。
【００２０】
本発明の一実施態様は、本明細書に記載の通りのトレプロスチニルのグリコシド誘導体を含む組成物に関する。
【００２１】
本発明の一実施態様は、本明細書に記載の通りのトレプロスチニルのグリコシド誘導体を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様は、トレプロスチニル誘導体が以下から選択される、本明細書に記載の通りの医薬組成物に関する。
【化２】
2021506959.tif 000003
2021506959.tif 000004
【００２３】
本発明の一実施態様は、式Ｉで示される化合物の製造方法であって、以下の反応工程：
【化３】
2021506959.tif 000005
［式中、ＰＧは、保護基であり、
そして、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書に定義される通りである］を含む製造方法に関する。
【００２４】
本発明の一実施態様において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つは、Ｈを表し、それゆえ、保護基のために利用可能である。以降の反応工程において、保護されていない残基がグリコシル化される。その後、グリコシドの保護基が除去される。したがって、最終生成物において、Ｒ１、Ｒ２および／またはＲ３がグリコシル化される。
【００２５】
本発明のさらなる実施態様は、保護基が、ベンジル、エーテル（置換メチルエーテル、置換エチルエーテル、置換ベンジルエーテル、様々なシリルエーテル）、エステル（酢酸エステル、置換酢酸エステル、安息香酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル）、環状アセタール、ケトンおよびアルデヒドに由来するアセタール）の基であるがそれらに限定されない、本明細書に記載の通りの製造方法に関する。
【００２６】
分子に対して室温で最大限の保護をもたらし、副生成物の妨げになることなく、かつ、大幅なｐＨ変化なしに、再び切り離される保護基が好ましい可能性がある。ベンジルエーテルの使用が、本明細書における特別な実施態様であり、ベンジルエーテルは、合成が容易であり、かつ、不均一接触水和（heterogenic catalytic hydration）によって開裂が容易である。
【００２７】
トレプロスチニルの酸性官能基（acid function）のための保護基は、エステル、例えば、ベンジルエステル、アミドおよびヒドラジド（hydrazides）であり得る。
【００２８】
本発明の一実施態様は、式ＩＩ：
【化４】
2021506959.tif 000006
［式中、Ｂｎは、ベンジル部分である］で示される中間化合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】トレプロスチニルの較正曲線を描写する。
【図２】トレプロスチニルのヒト血漿中および水中加水分解を示す。
【図３】遊離トレプロスチニルの溶出プロファイルを表す。
【図４】ヒト血漿中のトレプロスチニルガラクトシドのインキュベーション後の遊離トレプロスチニルの濃度を示す。
【図５】血漿中トレプロスチニルグルコシド。
【図６】トレプロスチニルグルコシドの血漿中加水分解。
【図７】ＩＰレセプターを一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるトレプロスチニルおよびトレプロスチニル−グルコシドの濃度反応曲線（ｎ＝３の独立した実験）。
【図８】ＥＰ２レセプターを一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるトレプロスチニルおよびトレプロスチニル−グルコシドの濃度反応曲線（ｎ＝４の独立した実験）。
【図９】ＥＰ４レセプターを一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるトレプロスチニルおよびトレプロスチニル−グルコシドの濃度反応曲線（ｎ＝３の独立した実験）。
【００３０】
実施態様の説明
トレプロスチニルは、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）の処置に適応される、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）の合成類似体である。トレプロスチニルの主な薬理学的作用機序は、肺および全身の動脈血管床の直接的な血管拡張と血小板凝集の抑制である。
【００３１】
プロドラッグは、活性化すると薬物を形成する、薬物の修飾形態である。したがって、プロドラッグ設計は、創薬の重要な一部である。プロドラッグは、増加した溶解度、増強された安定性、改善されたバイオアベイラビリティ、低減された副作用および／またはより良好な選択性などの、親薬物を上回る多くの利点を提供し得る。プロドラッグ設計の重要な工程は、所与の医学的応用の要求を満たす、効率的かつ／または制御された様式でプロドラッグを活性種に変換することができる活性化機序の組み込みである。プロドラッグ活性化は、酵素媒介性の加水分解プロセスを通じて達成され得る。
【００３２】
グリコシドは、プロドラッグとして作用することができ、また直接的な治療効果も有することを示す証拠が増えている。グリコシドプロドラッグは、より部位特異的または組織特異的な薬物送達、より均一な血漿中薬物レベルおよび薬物の持続または遅延放出を含め、改善された薬物バイオアベイラビリティまたは改善された薬物体内動態を可能にし得る。
【００３３】
グリコシドは、糖部分がグリコシド結合を介して別の官能基に結合している分子である。グリコシドは、生体において多数の重要な役割を果たしている。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「プロドラッグ」は、投与後に代謝プロセスによる化学変換を受け、その後に活性な薬理学的物質になる必要のある、化合物を指す。
【００３５】
トレプロスチニルグリコシド生成物は、２つの構造的特徴：糖（グリコン）およびトレプロスチニル部分（アグリコン）から構成される。用語「トレプロスチニルグリコシドプロドラッグ」または「トレプロスチニルグリコシド」は、互換的に使用され、一般にはトレプロスチニルのグリコシドを指す。トレプロスチニルグリコシドプロドラッグは、典型的にはグリコシダーゼの作用による、グリコシド結合の加水分解を受けて、活性なトレプロスチニルを放出する。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「グリコン」は、グリコシドの糖部分を指す。保護されたグリコンは、ヒドロキシ基が、保護基によって、例えばベンジル部分などによって保護されている、糖部分である。
【００３７】
また、本発明に従うと、トレプロスチニルグリコシドプロドラッグは、グリコシド結合の加水分解によって変換されて、活性なトレプロスチニル薬物を提供する。したがって、本発明は、疎水性アグリコン部分を有するグリコシドが血漿中でグルコース加水分解を受けて、疎水性トレプロスチニル化合物をもたらすことを実証した。
【００３８】
「炭水化物」は、本明細書において使用される場合、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンおよびそれらの誘導体を指す。最も単純な炭水化物は、多くのヒドロキシル基が付加された（通常は、官能基を除き、各炭素上に１つ）小さな直鎖のアルデヒドおよびケトンである、単糖である。単糖の例は、エリトロース、アラビノース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、トレオース、キシロース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、アルドヘキソース、フルクトース、ケトヘキソース、リボースおよびアルドペントースを含む。他の炭水化物は、単糖単位から構成され、単糖単位の数に応じて、二糖、オリゴ糖または多糖が含まれる。二糖は、共有結合性グリコシド結合によって接続されている２つの単糖単位から構成される。二糖の例は、スクロース、ラクトースおよびマルトースである。オリゴ糖および多糖は、グリコシド結合によって一緒に結合されているより長い単糖単位の鎖から構成される。オリゴ糖は、一般には、３〜９個の単糖単位を含有し、多糖は、１０を超える単糖単位を含有する。
【００３９】
本発明の一態様において、炭水化物は、糖、特にヘキソースまたはペントースであり、アルドースであっても、ケトースであってもよい。糖は、Ｄ系列のメンバーであっても、Ｌ系列のメンバーであってもよく、アミノ糖、デオキシ糖およびそれらのウロン酸誘導体を含むことができる。
【００４０】
アミノ糖は、ヒドロキシル基がアミン基に置き換わっている糖分子である。好適なアミノ糖は、例えば、ヘキソサミン、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、特にＤ−グルコサミン（２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース）またはＤ−ガラクトサミン（２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース）、アルジトールである。
【００４１】
炭水化物がヘキソースである本発明の実施態様において、ヘキソースは、グルコース、ガラクトースおよびマンノースからなる群より選択される。好適なペントース糖は、アラビノース、フコースおよびリボースを含む。
【００４２】
トレプロスチニルの化学構造は、グリコシドコンジュゲーションを通じてグリコシドを作るために利用され得る、２つのヒドロキシル基を保有する。本発明のいくつかの実施態様において、１つのヒドロキシル基が糖部分にコンジュゲートされている。本発明のいくつかの実施態様において、両方のヒドロキシル基が糖部分にコンジュゲートされている。本発明のいくつかの実施態様において、糖部分は、同じ部分であるかまたは異なる構造である。
【００４３】
Ｏ−グリコシドとしてのトレプロスチニルグリコシド誘導体は、例えば、化学的合成を介して得ても、酵素的合成を介して得てもよい。
【００４４】
Ｏ−グリコシドの化学的合成では、グリコシル供与体が、グリコシル受容体中の遊離ヒドロキシル基と、一般には、ある促進剤の存在下で反応して、所望のグリコシドを与える。本発明の一実施態様において、トレプロスチニルグリコシドの製造方法であって、トレプロスチニルと１つまたは複数のグリコシル供与体とを、任意である促進剤の存在下で反応させて、所望のトレプロスチニルグリコシド誘導体を与えることを含む製造方法が提供される。
【００４５】
本発明に従うと、トレプロスチニルグリコシドの製造方法であって、１つまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼの存在下でトレプロスチニルを１つまたは複数の糖供与体とインキュベートすることを含む製造方法が提供される。
【００４６】
追加の実施態様は、本明細書に記載の１つまたは複数のトレプロスチニル誘導体またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物もしくは多形と、１つまたは複数の薬学的に許容し得る賦形剤または担体とを含む、医薬組成物に関する。組成物は、任意で、追加の治療用物質を含有することができる。
【００４７】
適切な製剤は、選択される投与経路などの様々な要因に依存し得る。グリコシドトレプロスチニル誘導体を含む医薬組成物の可能性のある投与経路は、非限定的に、経口、非経口（皮内、皮下、筋肉内、血管内、静脈内、動脈内、髄内および髄腔内を含む）、腔内、腹腔内、および局所（皮膚／皮膚上、経皮、粘膜、経粘膜、鼻腔内［例えば、鼻噴霧または点鼻による］、眼内［例えば、点眼による］、肺［例えば、吸入による］、口腔、舌下、直腸および腟を含む）を含む。局所製剤は、局部または全身に治療効果をもたらすように設計することができる。トレプロスチニルのグルコシド誘導体に起因して、皮下投与が、苦痛がより少ないと期待される。
【００４８】
一例として、経口投与に適したグリコシドトレプロスチニル誘導体の製剤は、例えば、カプセル剤（押し込み式カプセル剤および軟質カプセル剤を含む）、カシェ剤もしくは錠剤として；散剤または顆粒剤として；またはボーラス剤、舐剤もしくはペースト剤として提示され得る。例えば、押し込み式カプセル剤は、グリコシドトレプロスチニル誘導体を、例えば、充填剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）および滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）、および任意で安定剤との混合物で含有し得る。軟質カプセル剤のために、グリコシドトレプロスチニル誘導体を、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁させることができ、安定剤を加えてもよい。
【００４９】
本明細書に記載のグリコシドトレプロスチニル誘導体は、インビボでトレプロスチニルに変換することができ、したがって、トレプロスチニルのプロドラッグとして作用することができる。いくつかの実施態様において、グリコシドトレプロスチニル誘導体は、肝臓内で、急速にかつ実質的に完全にトレプロスチニルに変換される（例えば、少なくとも約７０％、８０％、９０％または９５％変換）。
【００５０】
グリコシドトレプロスチニル誘導体は、プロスタサイクリンまたはトレプロスチニルによる処置に応答する任意の病態を処置するために追加の治療用物質と共に使用することができる。
【００５１】
グリコシドトレプロスチニル誘導体の、例えば、肺高血圧症を処置するための治療上有効な量およびその投与頻度は、肺高血圧症の種類、病態の重症度、投与様式、対象の年齢、体重、総体的な健康状態、性別および食事、ならびに処置に対する対象の応答を含めた様々な要因に依存し得、担当医によって決定され得る。特定の態様において、１日当たりのグリコシドトレプロスチニル誘導体の有効用量は、約０．１〜１００mg、０．１〜５０mg、０．５〜５０mg、０．５〜２５mg、０．５〜１０mg、１〜１０mgもしくは１〜５mgであるか、または担当医によって適宜判断される通りであり、単回用量でまたは分割用量で投与することができる。さらなる実施態様において、１日当たりのグリコシドトレプロスチニル誘導体の有効用量は、約０．００１〜２mg/kg、０．００５〜１mg/kg、０．０１〜０．５mg/kgもしくは０．０１〜０．１mg/kg（体重）であるか、または担当医によって適宜判断される通りである。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために示されるもので、本発明の範囲を限定するとの意図はなく、いかようにもそのように解釈されるべきではない。実施例は、従来の方法の詳細な説明を含まず；そのような方法は、当業者に周知である。
【００５３】
実施例１−血漿試料中のトレプロスチニルの判定
通常、トレプロスチニルは、血液試料からＨＰＬＣ−ＭＳによって判定される［２，３］。血漿試料中のトレプロスチニルを判定するために、試料調製がわずか一工程で、血漿中の遊離トレプロスチニルの判定を可能にする、アイソクラティックのロバストなＨＰＬＣ法を開発した。
【００５４】
ＨＰＬＣ法および装置：
ポンプ：ESTA HD-2 400
カラムオーブン：−
検出器：UV-VIS Beckmann 163可変波長検出器
バルブ：Rheodyne 7125
カラム：RP, Nucleosil 120 3C18、直径４mm、プレカラム４cm、カラム８cm
試料ループ：２０μL
波長検出：２７７nm
フィート速度：０．６mL/分
移動相：６８．５mL  アセトニトリル、１２０mL  水、１０mL  ギ酸アンモニウム、０．２mL  ＨＣＯＯＨ
勾配：なし、アイソクラティック条件；溶出プロファイルを図３に描写する。
【００５５】
較正
トレプロスチニルの絶対濃度についての較正曲線を、ＨＰＬＣによって、上に定義した通りの設定で作成した。トレプロスチニルの較正曲線を図１に描写する。直線の方程式は、ｙ＝４１７８．３ｘ−１．７１７である。
【００５６】
実施例２−トレプロスチニルグリコシドの加水分解
トレプロスチニルのグリコシド誘導体のグリコシド結合が血漿試料中で酵素によって開裂されるかどうかを判定する。
【００５７】
健常な成人（男性、ＭＷ  ５８歳、ｎ＝２）の静脈血を採取し、遠心分離する（ｒ＝１２cm、３０００rpm、１０分）。その後、このようにして得られた血漿を−２０℃で保存する。
【００５８】
トレプロスチニルグリコシド４mgを１０cmの試験官中に準備する。その後、融解した血漿４mLを加えて、濃度を１mg/mLにする。次いで、試験管を簡単に振盪させ、すぐさま試料（０．５mL）を抽出する。血漿試料を無水エタノール３mLで希釈すると、血漿タンパク質が沈殿する。したがって、触媒反応は、直ちに停止する。希釈した試料を遠心分離し（ｒ＝１２cm、３０００rpm、１０分）、上清をＨＰＬＣに直接注入することができる。遊離トレプロスチニルが約２３分に出現し、曲線下面積を積分する。
【００５９】
並行かつ同時に、血漿の代わりに水を用いて同じプロセスを実施して、血漿のマトリックス（matrix）に対する比較を得る。ガラクトシドは、合成工程に起因してわずかに酸性である（ｐＨ６前後）という理由から、反応媒体中での酸性加水分解を排除するために、トレプロスチニルガラクトシドを緩衝溶液（Sorensen  ｐＨ７）中でインキュベートする。
【００６０】
血漿中、水中および緩衝液中のトレプロスチニルグリコシドのすべての調製物を、ここで、乾燥オーブン中、３７℃でインキュベートする。試料を、それぞれ、０、３０、９０、１８０、２７０および１，２００分後に採取し、上記の通りの方法によって遊離トレプロスチニルを判定する。
【００６１】
実施例３−トレプロスチニルグルコシド
結果を表１に示す。トレプロスチニルグルコシドは、約１００分の血漿中半減期を有する。このことは、１００分後にトレプロスチニルグルコシドの約５０％が加水分解されることを意味している。２０時間後、グルコシドは、定量的に開裂される。トレプロスチニルグルコシドの質量分率の６４％がトレプロスチニルであり、したがって、使用されたトレプロスチニルの約９０％が検出される。このことは、トレプロスチニルグルコシドを含む試料中、約９０％のトレプロスチニルグルコシドが開裂可能であることを暗示する。
【００６２】
【表１】
2021506959.tif 000007
【００６３】
トレプロスチニルは、３９０．５g/molのモル質量を有し、トレプロスチニルグルコシドは、約５５２．７g/molのモル質量を有する。したがって、グリコシドの約３３％（w/w）がグルコースである。反応混合物中のトレプロスチニルグルコシドの重量は、１mg/mL（血漿）であり、この結果、グルコースが０．３３mgとなり、トレプロスチニルが０．６７mgとなる（理論上でしかない、不純物も水も考慮しない）。２０時間のインキュベーション後、遊離トレプロスチニルの濃度は、約０．５４mg/mL（血漿）である。このことは、グリコシドが定量的に加水分解されていると仮定して、出発物質がおよそ９０％の開裂可能なトレプロスチニルグルコシドからなることを意味している。
【００６４】
遊離トレプロスチニルの血漿中および水中濃度プロファイルを図２に示す。反応は、本質的に、ミカエリス・メンテンモデルに従い、このことは、明らかに酵素反応であることを示している。トレプロスチニルグルコシドについて、プレ定常状態相は、約３０分以内と推定される。遊離トレプロスチニルの平衡は、約１０時間で達する。
【００６５】
遊離トレプロスチニルの溶出プロファイルを図３に描写する。トレプロスチニルは、２３分の保持時間を示す。ライン１は０分インキュベーション時間後、ライン２は３０分インキュベーション時間後、ライン３は９０分インキュベーション時間後、ライン４は１８０分インキュベーション時間後、そして、ライン５は１，２００分インキュベーション時間後の測定を反映している。トレプロスチニルグルコースのピークは、８分（ライン１）に出現し、時間と共に消失し、１，２００分後にはもはや検出不可能である。
【００６６】
実施例４−トレプロスチニルガラクトシド
トレプロスチニルガラクトシドの合成プロセスに起因して、マトリックスは、水中でわずかに酸性である（ｐＨ６）。それゆえ、血漿および水のインキュベーション混合物に加えて、緩衝溶液中でも追加でインキュベーションを行い、例えば、ｐＨ７のSorensen緩衝液を使用してよい。
【００６７】
結果を表２に示す。ガラクトシドの水中半減期は２４時間でも到達しないが、血漿中トレプロスチニルガラクトシドは約９０分の半減期を示す。このことは、上記の通りの条件下でガラクトシドの５０％が９０分後に開裂されることを意味している。２０時間後、ガラクトシドは、トレプロスチニルおよびガラクトースへと定量的に開裂される。
【００６８】
製造プロセスに起因して、本方法において使用されるトレプロスチニルガラクトシドは、約５〜６％の未結合トレプロスチニルを含有する。遊離トレプロスチニル物質のこの量は、ＨＰＬＣによっても検出することができ、測定値から減算される。表２に示される値は、出発物質に含有される遊離トレプロスチニルを減量した測定値である。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
トレプロスチニルは、３９０．５g/molのモル質量を有し、トレプロスチニルガラクトシドは、約５５２．７g/molのモル質量を有する。したがって、グリコシドの約３３％（w/w）がガラクトースである。反応混合物中のトレプロスチニルガラクトシドの重量は、１mg/mL（血漿）であり、この結果、ガラクトースが０．３３mgとなり、トレプロスチニルが０．６７mgとなる。２０時間のインキュベーション後、遊離トレプロスチニルの濃度は、約０．３０４mg/mL（血漿）である。このことは、出発物質がおよそ５０％の開裂可能なトレプロスチニルガラクトシドからなることを意味している。このことは、残り５０％が、ガラクトース（４０％）、遊離トレプロスチニル（５〜６％）および未特定の残渣（４〜５％）を含むという供給業者の仕様書と一致する。
【００７１】
トレプロスチニルガラクトシドの加水分解による遊離トレプロスチニルの血漿中、緩衝液中および水中濃度プロファイルを図４に示す。トレプロスチニルガラクトシドは、血漿中、約６〜８時間後に定量的に加水分解される。
【００７２】
実施例５−血漿中トレプロスチニルグルコシド
トレプロスチニルのカルボキシル−ＯＨ基にグルコシドを有するトレプロスチニル−グルコシドを、ヒト血漿および変性血漿（タンパク質は９６％エタノールによる）中でインキュベートした。ヒト血漿中で２０時間のインキュベーション時間後、トレプロスチニル−グルコシドの５３％が加水分解される。対照的に、２０時間後の変性血漿中では、加水分解されたトレプロスチニル−グルコシドがわずか４％検出される。結果を図５および図６に示す。
【００７３】
実施例５−酸性基のベンジルエステル保護
【化５】
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トレプロスチニルナトリウム塩１．１ｇをアセトニトリル５０mlに懸濁した。Ｃｓ２ＣＯ３１．３ｇおよび臭化ベンジル１．４ｇを懸濁液に加え、出発物質がＴＬＣで検出不可となるまで還流下で撹拌した。次いで、懸濁液を濾過し、ジクロロメタンで洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタン５０mLに再溶解し、２％ＮａＨＣＯ３溶液５０mLで３回、ブライン５０mLで１回洗浄した。次いで、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させると、帯黄色のシロップが生じた。シロップをジクロロメタンに再溶解し、シリカゲルカラムに注ぎ、ＴＨＦで溶出させる。生成物を含有する画分を蒸発させて、トレプロスチニルベンジルエステル１．３ｇを無色のシロップとして得た。
【００７４】
実施例６−エステル基のグリコシル化
【化６】
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トレプロスチニルベンジルエステル１．０ｇを無水ＴＨＦ２０mlに懸濁し、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート（ＴＭＳＯＴｆ）０．１mLをトレプロスチニルベンジルエステル溶液に加えた。次いで、無水ＴＨＦ２０ｇ中のＴＣＡ−グルコース３ｇを室温でゆっくり加えた。トリメチルアミン０．５mLで反応をクエンチし、蒸発させると、帯黄色のシロップが生じた。シリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィーにシロップをかけた。生成物を含有する画分を濃縮した。ほぼ純粋な生成物を蒸発させると、グリコシドトレプロスチニル１．５ｇが無色のシロップとして生じた。
【００７５】
実施例７−保護基の除去
【化７】
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メタノール／ＴＨＦ（１：１）５０mL中の保護されたトレプロスチニルグルコシド１．５ｇの溶液を調製し、１０％Ｐｄ／Ｃ（乾物）０．５ｇを溶液に加えた。得られた混合物を蒸発させ、水素でパージした。次いで、反応混合物を、すべてのベンジル基が開裂するまで、１barの水素下で撹拌した。次いで、反応混合物をセライト上で濾過し、水ですすぐ。溶媒を蒸発させると、所望のトレプロスチニルジグリコシドが生じる。
【００７６】
実施例８−プロスタグランジンＩ２レセプター（ＩＰ）またはプロスタグランジンＥ２レセプター２（ＥＰ２）またはプロスタグランジンＥ２レセプター４（ＥＰ４）のいずれかを一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞における、トレプロスチニルまたはトレプロスチニル−グルコシドによって誘導されるｃＡＭＰ蓄積
方法：
０日目：９００万個のＨＥＫ２９３細胞を実験毎に２個の１５cmディッシュに播種した（ディッシュ毎に：２０mlのＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＣＳ）。
【００７７】
１日目：細胞に、空のベクターまたはＩＰもしくはＥＰ２もしくはＥＰ４レセプターのいずれかをコードするプラスミドをトランスフェクトした。
【００７８】
トランスフェクションプロトコル：１５cmディッシュ毎に、１０μgのＤＮＡおよび２０μlのＪｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬をＪｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション緩衝液１ml（最終容量）に加え、室温で１０分間インキュベートした。その後、混合物を細胞に滴下した（トランスフェクションの４時間後に培地を新鮮培地に交換して、毒性を低下させた）。
【００７９】
２日目：細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、６ウェルプレートに播種し（１ウェル当たり７０万個の細胞）、［３Ｈ］−アデニン（１μCi/ml）と１２〜１６時間プレインキュベーションした。
【００８０】
３日目：アッセイ緩衝液（ＨＥＰＥＳ  １０mM、ＮａＣｌ  １２０mM、ＫＣｌ  ３mM、ＣａＣｌ２  ２mM、ＭｇＣｌ２  ２mM、グルコース  ２０mM、ＲＯ−２０−１７２４  １００μM  ｐＨ７．３）中、室温で３０分間、トレプロスチニルまたはトレプロスチニル−グルコシド（Ｒ３位にグルコシドを有する）のいずれかで細胞を刺激し（非刺激対照を常に含めた）、次いで、氷上で３０分間、２．５％過塩素酸（ＰＣＡ）で溶解した。ＰＣＡ抽出物を中和し（ＫＯＨで）、ＤＯＷＥＸおよび酸化アルミニウムカラムを使用した連続クロマトグラフィーによって［３Ｈ］−ｃＡＭＰを他のヌクレオチドから分離し、最終的に、シンチレーション計数器を使用してＣＰＭ（カウント毎分）として放射能を測定した。
【００８１】
ＩＰレセプターを一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるトレプロスチニルおよびトレプロスチニル−グルコシドの濃度反応曲線（ｎ＝３の独立した実験）を図７に示す。トレプロスチニルのＥＣ５０値は０．８０６５であり、Ｒ３にグルコシドを有するトレプロスチニル−グルコシドのＥＣ５０は９．２７７である。
【００８２】
ＥＰ２レセプターを一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるトレプロスチニルおよびトレプロスチニル−グルコシド（Ｒ３位にグルコシドを有する）の濃度反応曲線（ｎ＝４の独立した実験）を図８に示す。トレプロスチニルのＥＣ５０値は３．１０３であり、トレプロスチニル−グルコシドのＥＣ５０は５６．５７である。
【００８３】
ＥＰ４レセプターを一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるトレプロスチニルおよびトレプロスチニル−グルコシドの濃度反応曲線（ｎ＝３の独立した実験）を図９に示す。トレプロスチニルのＥＣ５０値は０．２８０１であり、トレプロスチニル−グルコシドのＥＣ５０は５．０１６である。
【００８４】
結果：有利なことに、本発明のトレプロスチニル−グルコシドは、ＩＰ、ＥＰ２およびＥＰ４レセプターに対して低下した親和性を有するが、類似のｃＡＭＰ増加をもたらす。したがって、トレプロスチニル−グルコシドの皮下投与は、このように、苦痛がより少ないと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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