(57)【要約】  本願発明は、細胞へのウイルスベクターの形質導入の効率を改善する方法であって、細胞に抗マラリア剤およびウイルスベクターを投与することを含む、方法に関する。本願発明はまた、ウイルスベクターの形質導入の効率を増加させることにおける使用のための抗マラリア剤およびウイルスベクターを含む組成物に関する。本願発明はさらに、疾患または障害を処置するための本願発明の方法および組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞へのウイルスベクターの形質導入の効率を改善する方法であって、細胞に抗マラリア剤およびウイルスベクターを投与することを含む、方法。
【請求項２】
抗マラリア剤およびウイルスベクターが、同時に、連続してまたは別々に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗マラリア剤が、４−アミノキノリン（例えば、ヒドロキシクロロキン、クロロキンおよびアモジアキン）、８−アミノキノリン（例えば、プリマキン、パマキンおよびタフェノキン）、メフロキン、キニーネ、メパクリン、アトバコン、ドキシサイクリン、およびそれらの塩または誘導体を含む、またはからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗マラリア剤がキノリン化合物である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗マラリア剤が、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、メフロキン、アモジアキン、キニーネ、パマキン、プリマキン、メパクリン、およびそれらの塩または誘導体を含む、またはからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗マラリア剤がヒドロキシクロロキンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニア／ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスを含む、またはからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗マラリア剤がヒドロキシクロロキンであり、ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
方法がインビトロまたはインビボで実施される、前記発明のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗マラリア剤および／またはウイルスベクターが全身的にまたは局所的に投与される；および／または
抗マラリア剤およびウイルスベクターが同じ細胞、組織または臓器に投与される；および／または
抗マラリア剤およびウイルスベクターが共投与される；および／または
抗マラリア剤および／またはウイルスベクターが形質導入の意図される部位に投与される、
前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスベクターが形質導入時に発現されるカーゴ(cargo)を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
２つ以上のウイルスベクターが投与される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
カーゴが、疾患または障害を処置するために意図される導入遺伝子またはその部分を含む；または
カーゴが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を容易にするために必要とされる少なくとも１つの構成要素を含む；または
カーゴが、阻害性ＲＮＡまたはミルトロンを含む；または
カーゴが、光遺伝学療法またはシステムを細胞、組織または臓器に送達するために必要とされる１つ以上の構成要素を含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
方法がウイルスベクターの生産工程中に組換えＡＡＶ粒子の収量を増加させるために使用される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
細胞へのウイルスベクターの形質導入効率を増加させることにおける使用のための抗マラリア剤。
【請求項１７】
抗マラリア剤がヒドロキシクロロキンであり、ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１６に記載の使用のための抗マラリア剤。
【請求項１８】
ウイルスベクターおよび抗マラリア剤を含む組成物。
【請求項１９】
ウイルスベクター、抗マラリア剤、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
組成物が、ＡＡＶベクター、およびヒドロキシクロロキン、クロロキン、およびメフロキンの１つ以上を含む、請求項３４に記載の医薬組成物
【請求項２１】
組成物が眼への投与を意図される、請求項１９または２０に記載の医薬組成物
【請求項２２】
疾患または障害の処置における使用のための、請求項１８から２１のいずれかに記載の組成物または医薬組成物、請求項１６または１７に記載の使用、または請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
疾患または障害が眼の疾患または障害である；または
組成物、使用、または方法が、眼の障害または疾患の遺伝子治療処置を増強させることであり、所望により、ウイルスベクターおよび／または抗マラリア剤が、例えば網膜下、脈絡膜上(suprachoroidal)、硝子体内、眼球周囲または前房注射により、眼に直接的に投与される、請求項２２に記載の組成物または医薬組成物、または使用、または方法。
【請求項２４】
疾患または障害がＣＮＳ状態であり、所望によりＡＡＶベクターおよび／または抗マラリア剤が直接的な脊髄注射および／または脳内投与により投与される、請求項２２に記載の組成物または医薬組成物、または使用、または方法。
【請求項２５】
標的細胞集団においてウイルスベクターによって形質導入される細胞の割合が、ウイルスベクター単独の使用と比較して、抗マラリア剤の存在下で少なくとも１％増加される；または
標的細胞集団においてウイルスベクターによって形質導入される細胞の割合が、ウイルスベクター単独の使用と比較して、抗マラリア剤の存在下で少なくとも１倍増加される、
請求項２２に記載の組成物または医薬組成物、または使用、または方法。
【請求項２６】
抗マラリア剤が約１μＭから約３０μＭの濃度で使用される、請求項１８から２１のいずれかに記載の組成物または医薬組成物、請求項１６または１７に記載の使用、または請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
対象において疾患または障害を処置する方法であって、対象に請求項１９または２０に記載の医薬組成物を投与することを含み、所望により疾患または障害が眼の疾患または障害またはＣＮＳ状態である、方法。
【請求項２８】
ウイルスベクターの形質導入の効率を増加させることにおける使用のためのキットであって、形質導入されるべきウイルスベクターおよび抗マラリア剤を含む、キット。
【請求項２９】
ウイルスベクターおよび抗マラリア剤が同じ組成物において提供される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
ウイルスベクターが第１の容器において提供され、抗マラリア剤が第２の容器において提供され、所望により投与の前に第１および第２の容器の内容物を混合するための指示書をさらに含む、および／または、
いつ抗マラリア剤を投与するか、およびいつウイルスベクターを投与するかの指示書をさらに含む、
請求項４１に記載のキット。
【請求項３１】
ウイルスベクターおよび／または抗マラリア剤を注射することにおいて使用するための１つ以上のシリンジをさらに含む、請求項２８から３０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、細胞へのウイルスベクターの形質導入の有効性を改善するための方法または産物、特に遺伝子治療の有効性を改善するための本願発明の方法または産物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、疾患を処置または治癒するために、患者の細胞への核酸の治療的送達である。過去３０年間で、遺伝子治療は、劇的に進歩し、網膜、肝臓および神経系への治療的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのインビボ送達により、先天性失明、血友病Ｂおよび脊髄性筋萎縮症を有する患者において臨床的改善を引き起こす。
【０００３】
遺伝子治療技術で成功が見られている一方で、この治療方法の使用の増加を妨げる多くのハードルがまだ存在する。１つは、標的細胞によるウイルスベクターの摂取の効率である。遺伝子治療の有効性は、一般的に、遺伝子異常を修正するために、提供されたＤＮＡの十分なおよび効率的な送達に依存し、このプロセスは、通常、ウイルスベクターによって介在される。疾患の進行を減速または停止するために、標的細胞の十分な割合がウイルスベクターによって形質導入される必要があり、ウイルスに対する免疫学的または炎症性反応のリスクを回避するために十分に低いベクター用量でなし遂げられる必要がある。
【０００４】
以下の例は、遺伝子治療の有効性を改善するために、ウイルスベクター形質導入を改善する必要性を証明する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用する遺伝性網膜ジストロフィー（例えば、レーバー先天性黒内障および先天性脈絡膜欠如）を処置するための遺伝子治療を使用する臨床試験は、安全性および有望な早期有効性を証明した。しかしながら、治療効果の大きさは、ＡＡＶベクターによって成功裏に形質導入される非分裂網膜細胞の割合に依存すると予期される。網膜下注射の限られた範囲内でさえ網膜色素上皮（ＲＰＥ）および光受容細胞を形質導入するために高用量のベクター（１０１０−１０１１のゲノム粒子の桁において）を必要とするが、これは、炎症性応答を誘導することができる用量に非常に近い。ＡＡＶベクターはまた、細胞型特異的指向性を示し、それにより網膜内の双極、ミュラー、および神経節細胞の形質導入が不十分になり、これらの細胞型に影響を与える疾患への遺伝子治療の適用が妨げる。さらに、前臨床試験でマウス網膜を高効率で形質導入すると見られるＡＡＶベクターは、霊長類（ヒトを含む）の網膜で同等の効率を必ずしもなし遂げない。Ｘ連鎖性網膜ジストロフィーの女性保因者（例えば、ＲＰＧＲ変異に関連する先天性脈絡膜欠如および網膜色素変性）は、５０％のランダムなＸ染色体不活化にもかかわらず、通常は影響を受けないため、遺伝性網膜ジストロフィーのＡＡＶベクター遺伝子治療は、理想的には標的網膜細胞の＞５０％の形質導入率をなし遂げるべきである。形質導入されていない細胞の変性（隣接する細胞の二次変性を伴う）に起因する遺伝子治療にもかかわらず、＜５０％の形質導入率は、疾患の進行に関連している可能性がある。したがって、ウイルスベクターを使用する遺伝子治療アプローチの有効性を改善するために、ウイルスベクター、特にＡＡＶベクターによる細胞への形質導入の割合を改善する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本願発明は、細胞へのウイルスベクターの形質導入の効率を改善する方法であって、細胞に抗マラリア剤およびウイルスベクターを投与することを含む、方法を提供する。抗マラリア剤およびウイルスベクターは、同時に、連続してまたは別々に投与されてよい。
【０００６】
抗マラリア剤
抗マラリア剤は、４−アミノキノリン（例えば、ヒドロキシクロロキン、クロロキンおよびアモジアキン）、８−アミノキノリン（例えば、プリマキン、パマキンおよびタフェノキン）、メフロキン、キニーネ、メパクリン、アトバコン、ドキシサイクリン、またはそれらの塩または誘導体を含む群から選択されてよい。
【０００７】
好ましくは、抗マラリア剤は、キノリン化合物、例えばヒドロキシクロロキン、クロロキン、メフロキン、アモジアキン、キニーネ、パマキン、プリマキン、メパクリン、またはそれらの塩または誘導体である。好ましくは、抗マラリア剤は、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、メフロキン、またはそれらの塩または誘導体、またはそれらの組合せである。好ましくは、抗マラリア剤はヒドロキシクロロキンである。
【０００８】
ヒドロキシクロロキンまたはＨＣＱ（化学名：２−［｛４−［（７−クロロキノリン−４−イル）アミノ］ペンチル｝（エチル）アミノ］エタノール）は、１９５０年代初頭から知られている（ＵＳ  ２，５４６，６５８）。それは、最初に抗マラリア薬として開発され、Ｓａｎｏｆｉ  ＡｖｅｎｔｉｓによりＰｌａｑｕｅｎｉｌ（登録商標）の商品名で硫酸塩として販売された。経口ヒドロキシクロロキン硫酸塩は、また、リウマチ性関節炎および全身性エリテマトーデスを含む炎症性皮膚疾患の処置のために使用される。
【０００９】
ヒドロキシクロロキンの化学構造は、以下に示される。
【化１】
2021512912.tif 000002
【００１０】
化合物は、アスタリスクで識別される炭素原子にキラル中心を有し、したがって、２つの鏡像異性体形態、（Ｒ）−（−）−２−［｛４−［（７−クロロキノリン−４−イル）アミノ］ペンチル｝（エチル）アミノ］エタノール）［以下、（Ｒ）−（−）−ヒドロキシクロロキン］および（Ｓ）−（＋）−２−［｛４−［（７−クロロキノリン−４−イル）アミノ］ペンチル｝（エチル）アミノ］エタノール）［以下、（Ｓ）−（＋）−ヒドロキシクロロキン］で存在することができる。
【００１１】
したがって、ヒドロキシクロロキンは、２つの鏡像異性体、実質的に単一の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシクロロキンまたは実質的に単一の（Ｓ）−（＋）−ヒドロキシクロロキンの１：１混合物からなるラセミ化合物として存在することができる。市販されているヒドロキシクロロキンは、２つの鏡像異性体のラセミ混合物であってよい。
【００１２】
ヒドロキシクロロキンラセミ化合物または異性体の製造のための方法は、当分野で知られている。例えば、ヒドロキシクロロキンは、ＵＳ  ２，５４６，６５８およびＵＳ  ５，３１４，８９４にしたがって製造することができる。
【００１３】
クロロキンまたはＣＱ（化学名：２−［｛４−［（７−クロロキノリン−４−イル）アミノ］ペンチル｝（エチル）アミノ］エタノール）は、薬物クラス４−アミノキノリンのメンバーであり、抗マラリア薬としても使用される。それは、Ｒｅｓｏｃｈｉｎｅ（登録商標）、Ｄａｗａｑｕｉｎ（登録商標）またはＣｈｌｏｒｑｕｉｎｅ  ＦＮＡ（登録商標）の商品名で販売されている場合がある。
【００１４】
クロロキンの化学構造は、以下に示される。
【化２】
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【００１５】
ヒドロキシクロロキンと同様に、クロロキンは、アステリスクで識別される炭素原子にキラル中心を有し、したがって、２つの鏡像異性体形態で存在することができる。したがって、クロロキンは、２つの鏡像異性体、実質的に単一の（Ｒ）−（−）−クロロキンまたは実質的に単一の（Ｓ）−（＋）−クロロキンの１：１混合物からなるラセミ化合物として存在することができる。市販されているクロロキンは、２つの鏡像異性体のラセミ混合物であってよい。
【００１６】
メフロキンは、一般的にはＬａｒｉａｍ（登録商標）の商品名で販売されているキノリンメタノール誘導体であり、マラリアを処置または予防するために使用される。メフロキンの化学構造は以下に示されるとおりである。
【００１７】
【化３】
2021512912.tif 000004
【００１８】
メフロキンは、２つの不斉炭素中心を有するキラル分子であり、４つの異なる立体異性体を有することを意味する。薬物は、現在、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅによって（Ｒ，Ｓ）−および（Ｓ，Ｒ）−鏡像異性体のラセミ化合物として製造および販売されている。本質的に、それは、１の中に２つの薬物である。（−）−鏡像異性体の血漿濃度は、（＋）−鏡像異性体よりも有意に高く、２つの鏡像異性体間の薬物動態学は有意に異なる。（＋）−鏡像異性体は、（−）−鏡像異性体よりも短い半減期を有する。
【００１９】
ウイルスベクター
ウイルスベクターは、カーゴ(cargo)を細胞に送達するように設計されてよい。カーゴは、治療的トランス遺伝子産物（ＤＮＡ）であってよい。意図は、治療的導入遺伝子が細胞核（エピソームとして、または宿主ゲノムＤＮＡに組み込まれてのいずれか）において残り、所望の遺伝子産物を発現することであってよい。
【００２０】
ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニア／ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））を含む群から選択されてよい。好ましい態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。１つの態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、抗マラリア剤はヒドロキシクロロキンである。
【００２１】
１２のヒト血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２）を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の複数の血清型および非ヒト霊長類からの１００を超える血清型が、現在、同定されている。逆方向末端反復（ＩＴＲ）の血清型またはＡＡＶベクターのキャプシド配列は、任意の既知のヒトまたは非ヒトＡＡＶ血清型から選択されてよい。いくつかの態様において、シュードタイピングアプローチが使用され、１つのＩＴＲ血清型のゲノムが異なる血清型キャプシドにパッケージされる。
【００２２】
異なるＡＡＶベクター血清型は、異なる組織／細胞型特異性を有してよく、適当な血清型は、特定の組織／細胞型での使用のために選択されてよい。１つの態様において、ＡＡＶ２／２は、ＲＰＥ細胞を形質導入するために使用されてよい。別の態様において、ＡＡＶ２／５および／またはＡＡＶ２／８は、光受容体を形質導入するために使用されてよい。
【００２３】
本願発明は、目的が２つの異なるＡＡＶベクターを使用して大きな導入遺伝子を送達することであるデュアルＡＡＶベクターアプローチを使用してよい、例えばスターガルト病（ＡＢＣＡ４）の処置において、遺伝子が１つのベクターに対して大きすぎるため、デュアルＡＡＶベクターが必要とされる。かかるアプローチにおいて、細胞へのベクター形質導入の効率はさらに重要である。
【００２４】
本願発明の方法は、哺乳動物で実施されてよく、好ましくは哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、マウスまたはラットを含む群から選択される。
【００２５】
抗マラリア剤および／またはウイルスベクターは、全身的に（例えば、経口的に、静脈内に、舌下におよび経皮的に）または局所的に（例えば、腹腔内に、髄腔内に、脳室内にまたは組織または臓器への直接的な注射により）投与されてよい。好ましくは、臨床を簡単にするために、抗マラリア剤およびウイルスベクターが同じ方法で投与される。
【００２６】
抗マラリア剤および／またはウイルスベクターは、単回投与または複数回投与で投与されてよい。好ましい態様において、抗マラリア剤およびウイルスベクターはそれぞれ、互いに好ましくは約１週間以内、約５日以内、約３日以内、約２日以内、約２４時間以内、約１２時間以内、約６時間以内、約１時間以内、約３０分以内、約１０分以内に、１回のみ投与される。抗マラリア剤およびウイルスベクターの送達間の時間は、異なる組織／細胞型および異なる適用によって異なってよい。送達プロトコールは、日常的な技術を使用して最適化されてよい。
【００２７】
好ましくは、抗マラリア剤およびウイルスベクターは、好ましくは同じ細胞、組織または臓器に、同時に、別々にまたは連続して投与される。
【００２８】
本発明の意味内での、同時投与は、抗マラリア剤およびウイルスベクターが同じ経路により、および同時にまたは実質的に同時に投与されることを意味する。抗マラリア剤およびウイルスベクターは、同じ組成物中であってもよい。
【００２９】
本発明の意味内での、別々の投与は、抗マラリア剤およびウイルスベクターが異なる経路によって同時にまたは実質的に同時に投与されることを意味する。
【００３０】
本発明の意味内での、連続投与は、抗マラリア剤およびウイルスベクターが異なる時に投与され、投与経路が同一または異なることを意味する。
【００３１】
抗マラリア剤および／またはウイルスベクターは、意図される作用部位で、例えば標的細胞へのウイルスベクターの形質導入が必要とされる組織または臓器に、投与されてよい。好ましくは、抗マラリア剤およびウイルスベクターの両方が、意図される作用部位に投与される。好ましくは、抗マラリア剤およびウイルスベクターは、注射により投与され、抗マラリア剤およびウイルスベクターは、単一の注射で共投与されてよく、または別々の注射で投与されてもよい。
【００３２】
本願発明の方法は、任意の組織または臓器の細胞へのウイルスベクターの形質導入を改善するために使用されてよい。細胞は分裂細胞または非分裂細胞であってよい。細胞型は、任意の組織の細胞を含んでよく、組織は、肺、気管、皮膚、筋肉、脳、肝臓、心臓、脾臓、骨髄（インビボまたはエキソビボ）、胸腺、膀胱、リンパ系、血液、膵臓、胃、腎臓、卵巣、精巣、直腸、末梢または中枢神経系（ＣＮＳ）、眼、リンパ器官、軟骨、または内皮の組織の間質または管腔の空間であってよい。細胞型は、眼に見られる細胞型、例えば網膜色素上皮（ＲＰＥ）または光受容体の細胞であってよい。あるいは、細胞型は、ＣＮＳに見られる細胞の型であってよい。
【００３３】
本願発明の方法においてウイルスベクターによって導入されるカーゴの発現は、組織特異的転写プロモーターなどの細胞／組織／臓器特異的調節要素によって制御されてよい。あるいは、導入遺伝子の発現は、遍在する転写プロモーターによって制御されてよい。
【００３４】
本願発明の方法は、カーゴを運ぶウイルスベクターを送達するために使用されてよい。カーゴは、疾患または障害を処置するために意図される導入遺伝子またはその一部を含んでよい。あるいは、またはさらに、カーゴは、Ｃａｓ９酵素などのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を容易にするために必要とされる構成要素の少なくとも１つを含む。あるいは、またはさらに、カーゴは、阻害性ＲＮＡまたはミルトロンを生成するために必要とされる構成要素を含む。別の態様において、カーゴは、細胞、組織または臓器に光遺伝学療法（例えば、感光性オプシン）またはシステムを送達するために必要とされる１つ以上の構成要素を含んでよい。
【００３５】
別の態様において、本願発明の方法は、低効率プロモーター（例えば遍在するプロモーターとは対照的に内因性プロモーター）を有する既存のＡＡＶ構築物からの遺伝子発現のレベルを増加させるために使用してよい。
【００３６】
別の局面において、本願発明の方法は、ウイルスベクターの生産工程中に組換えＡＡＶ粒子の収量を増加させる方法を提供することができる。これは、抗マラリア剤をプロデューサー細胞系、例えばＨＥＫ−２９３細胞に、当分野で知られているプロトコール内で加えることによってなし遂げてよい。
【００３７】
本願発明の方法は、哺乳動物の任意の障害または疾患を処置するために使用されてよい。本願発明の方法は、哺乳動物の障害または疾患を処置するために遺伝子治療を使用してよい。本願発明の方法は、哺乳動物の障害または疾患を処置するために遺伝子編集およびブロック補充療法（block-and-replace therapies）を使用してよい。
【００３８】
本願発明の方法は、眼の障害または疾患を処置するために、または眼の障害または疾患の遺伝子治療処置を増強するために使用されてよい。眼の障害または疾患は、重度の早期卵黄様変性（レーバー先天性黒内障）、先天性の色または夜間視力障害（例えば色覚異常）、網膜色素変性（常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、またはミトコンドリア遺伝）、黄斑ジストロフィー（例えばスターガルト病、ベスト病）、先天性脈絡膜欠如、ドイン網膜ジストロフィー、錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖性網膜分離症、網膜繊毛症（例えばアッシャー症候群）、湿性（または血管新生）加齢黄斑変性症、乾燥性加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症（例えば糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、遺伝性網膜剥離（例えば結合組織障害、例えばスティッカーラー症候群）、ブドウ膜炎（例えばＣＡＰＮ５関連遺伝性ブドウ膜炎）、遺伝性視神経症（例えばレーバー視神経障害）、緑内障、および遺伝性角膜ジストロフィーを含む群から選択されてよい。本願発明の方法はまた、卵黄様変性のための他の遺伝子治療レスキュー戦略、例えばデュアルベクター遺伝子治療（例えば大きな導入遺伝子のフラグメントを送達するために複数のＡＡＶベクターを使用して）、光遺伝学療法（例えばメラノプシンまたは他のオプシン遺伝子を送達するためにＡＡＶを使用して）、神経栄養因子療法（例えば網膜または視神経に毛様体神経栄養因子、ＣＮＴＦ、または他の生存／抗アポトーシス性因子を送達するためにＡＡＶを使用して）、遺伝子編集（例えばＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９構造を送達するためにＡＡＶを使用して）、および「ブロック補充」療法（例えば導入遺伝子と共に阻害性ＲＮＡまたはＭｉｔｒｏｎエレメントを送達するためにＡＡＶを使用して）の有効性を増強してもよい。抗マラリア剤が、ＡＡＶ網膜遺伝子治療に対する補助剤として、眼に、例えば網膜下、脈絡膜上(suprachoroidal)、硝子体内、眼球周囲または前房注射により、直接的に投与されてもよい。ＡＡＶベクターはまた、眼に、例えば網膜下、脈絡膜上、硝子体内、眼球周囲または前房注射により、直接的に投与されてもよい。
【００３９】
別の態様において、本願発明の方法は、ＣＮＳ状態を処置するために使用されてよく、ＡＡＶベクターおよび／または抗マラリア剤は、直接的な脊髄注射および／または脳内投与により投与されてもよい。いくつかの態様において、脳内投与は、大脳、髄質、橋、小脳、頭蓋内腔、脳周囲の髄膜、硬膜、くも膜、軟膜、脳周囲のくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）、小脳の深い小脳核、大脳の心室系、くも膜下腔、線条体、皮質、中隔、視床、視床下部、および脳の実質からなる群から選択される部位である。いくつかの態様において、投与は、少なくとも１つの脳の側脳室への脳室内注射による。いくつかの態様において、投与は、頸部、胸部、および／または腰部領域における髄腔内注射による。いくつかの態様において、投与は、線条体内注射による。いくつかの態様において、投与は、視床内注射による。いくつかの態様において、投与は、実質内注射による。いくつかの態様において、投与は、直接的な脊髄注射、頭蓋内、および／または脳内投与を含む。
【００４０】
本願発明の方法は、ＣＮＳの障害または疾患を処置するために使用されてよい。障害または疾患は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、癲癇、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）または脳の癌であってよい。いくつかの態様において、障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、乳幼児型バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的後期乳幼児型バッテン病（ＣＮＬ２）、若年型バッテン病（ＣＮＬ３）、バッテン型ＣＮＬ４、バッテン型ＣＮＬ５、バッテン型ＣＮＬ６、バッテン型ＣＮＬ７、バッテン型ＣＮＬ８、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシドシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ハンター病、クラベ病、α−マンノシドーシス病、β−マンノシドーシス病、マロトー・ラミー、異染性白質ジストロフィー症、モルキオＡ、モルキオＢ、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ病、ニーマンピックＡ病、ニーマンピックＢ病、ニーマンピックＣ病、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリポ（SanfiUipo）Ａ病、サンフィリポＢ病、サンフィリポＣ病、サンフィリポＤ病、シンドラー病、シンドラー−カンザキ、シアリドーシス、スライ病、テイ−サックス病、およびウォルマン病からなる群から選択されるリソソーム蓄積症である。いくつかの態様において、ＣＮＳの障害は、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、または前頭側頭型認知症である。
【００４１】
本願発明の方法（抗マラリア薬、例えばＨＣＱまたはＣＱの補助的使用）は、標的細胞集団においてウイルスベクターによって形質導入される細胞の割合を、ウイルスベクター単独の使用と比較して、１、２、３倍、またはそれ以上増加させることができてよい。単一遺伝子劣性疾患における疾患の進行を減速または停止するために、ＡＡＶベクターおよび抗マラリア剤と接触している細胞の好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％がウイルスベクターによって形質導入される。
【００４２】
本願発明の方法は、ウイルスベクターの形質導入の効率の増加をもたらし得る。１つの態様において、形質導入の効率の増加は、対象に臨床的利益をもたらし得る。形質導入の割合は、ウイルスベクター形質導入の割合において、１倍未満、好ましくは少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、好ましくは少なくとも約１．５倍、好ましくは少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、好ましくは少なくとも約４倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約６倍、好ましくは少なくとも約７倍、好ましくは少なくとも約８倍、好ましくは少なくとも約９倍、好ましくは少なくとも約１０倍またはそれ以上の増加であってよい。好ましくは、ウイルスベクター形質導入の割合の増加倍率は、約１から約５倍である。本願発明の方法の結果として観察されるウイルスベクター形質導入の増加倍率は、インビトロで決定されてよい。
【００４３】
あるいは、ウイルスベクターの形質導入の効率の増加は、増加率に関して測定されてよく、増加は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％またはそれ以上であってよい。形質導入の効率の増加は、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約２００％以上、約３００％以上、約４００％以上、または約５００％以上であってよい。
【００４４】
形質導入のパーセンテージまたは増加倍率は、抗マラリア剤の非存在下で観察される形質導入の割合と比較することによって決定されてよい。
【００４５】
本願発明の方法において、抗マラリア剤、特にＨＣＱは、約１μＭから約３０μＭ、約３μＭから約３０μＭ、約３μＭから約２５μＭ、約５μＭから約２５μＭ、約１０μＭから約３０μＭ、約１０μＭから約２５μＭ、約５μＭから約２０μＭ、約１０μＭから約２０μＭ、および約１５μＭから約２０μＭの濃度で使用される。抗マラリア剤は、約３０μＭ未満、約２５μＭ未満、または約２０μＭ未満の濃度で使用されてよい。使用される抗マラリア剤の濃度は、ウイルスベクターの形質導入を増加させることおよび細胞への毒性のバランスである。
【００４６】
好ましい態様において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターであり、好ましくはウイルスベクター形質導入の少なくとも２倍の増加が抗マラリア剤の存在下で観察され、抗マラリア剤は好ましくはＨＣＱまたはＣＱである。ＨＣＱまたはＣＱは、約１μＭから約３０μＭ、約３μＭから約３０μＭ、約３μＭから約２５μＭ、約５μＭから約２５μＭ、約１０μＭから約３０μＭ、約１０μＭから約２５μＭ、約５μＭから約２０μＭ、約１０μＭから約２０μＭ、および約１５μＭから約２０μＭの濃度で使用されてよい。抗マラリア剤は、約３０μＭ未満、約２５μＭ未満、または約２０μＭ未満の濃度で使用されてよい。この好ましい態様において、ベクターおよび抗マラリア剤は、対象の眼に直接的に投与されてよい。
【００４７】
さらなる局面において、本願発明は、対象において疾患または障害を処置するための本願発明の方法の使用を提供する。疾患または障害は眼の疾患または障害であってよい。
【００４８】
別の局面において、本願発明は、ウイルスベクターおよび抗マラリア剤を含む組成物を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでよい医薬組成物であってよい。１つの態様において、医薬組成物は、眼内投与のためである。
【００４９】
１つの態様において、本願発明は、ＡＡＶベクター、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、およびメフロキンの１つ以上および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ＡＡＶベクターおよびヒドロキシクロロキンおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含んでよい。医薬組成物は、眼内投与のためであってよい。
【００５０】
さらなる局面において、本願発明は、疾患または障害の処置における使用のための本願発明の組成物または医薬組成物を提供する。疾患または障害は、眼の疾患または障害であってよい。
【００５１】
眼障害または疾患は、重度の早期卵黄様変性（レーバー先天性黒内障）、先天性の色または夜間視力障害（例えば色覚異常）、網膜色素変性（常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、またはミトコンドリア遺伝）、黄斑ジストロフィー（例えばスターガルト病、ベスト病）、先天性脈絡膜欠如、ドイン網膜ジストロフィー、錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖性網膜分離症、網膜繊毛症（例えばアッシャー症候群）、湿性（または血管新生）加齢黄斑変性症、乾燥性加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症（例えば糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、遺伝性網膜剥離（例えば結合組織障害、例えばスティッカーラー症候群）、ブドウ膜炎（例えばＣＡＰＮ５関連遺伝性ブドウ膜炎）、遺伝性視神経症（例えばレーバー視神経障害）、緑内障、および遺伝性角膜ジストロフィーを含む群から選択されてよい。本願発明の方法はまた、卵黄様変性のための他の遺伝子治療レスキュー戦略、例えばデュアルベクター遺伝子治療（例えば大きな導入遺伝子の複数のフラグメントを送達するためにＡＡＶベクターを使用して）、光遺伝学療法（例えばメラノプシンまたは他のオプシン遺伝子を送達するためにＡＡＶを使用して）、神経栄養因子療法（例えば網膜または視神経に毛様体神経栄養因子、ＣＮＴＦ、または他の生存／抗アポトーシス性因子を送達するためにＡＡＶを使用して）、遺伝子編集（例えばＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９構造を送達するためにＡＡＶを使用して）、および「ブロック補充」療法（例えば導入遺伝子と共に阻害性ＲＮＡまたはＭｉｔｒｏｎエレメントを送達するためにＡＡＶを使用して）の有効性を増強してもよい。
【００５２】
別の局面において、本願発明は、対象において疾患または障害の処置における使用のための、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター、および抗マラリア剤、例えばヒドロキシクロロキンを提供してよい。疾患または障害は、眼の疾患または障害であってよい。抗マラリア剤は、本願明細書に記載されている任意の薬剤であってよい。ウイルスベクターは、本願明細書に記載されている任意のベクターであってよい。ウイルスベクターおよび抗マラリア剤は、同じか、または異なっている組成物において提供されてよい。異なる組成物におけるとき、ウイルスベクターおよび抗マラリア剤は、同時に、連続してまたは別々に投与されることが意図されてよい。１つの態様において、本願発明は、対象において疾患または障害の処置における使用のためのＡＡＶベクターおよびヒドロキシクロロキンを提供する。
【００５３】
本願発明のＡＡＶベクターおよび／または抗マラリア剤、および／または医薬組成物、および／または方法は、網膜下、直接的な網膜、脈絡膜上または硝子体内注射により対象の眼に投与されてよい。
【００５４】
１つの態様において、ＡＡＶベクターは眼内注射により投与されてよく、一方、抗マラリア剤は全身投与により別々に投与される。抗マラリア剤はヒドロキシクロロキンであってよい。
【００５５】
別の態様において、ＡＡＶベクターおよび／または抗マラリア剤および／または医薬組成物は、直接的な脊髄注射および／または脳内投与により投与されてよい。あるいは、ＡＡＶベクターは直接的な脊髄注射および／または脳内投与により投与されてよく、一方、抗マラリア剤は全身投与により別々に投与される。
【００５６】
本願発明は、本願発明によるＡＡＶベクターおよび抗マラリア剤、または医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、眼の疾患または障害を処置する方法をさらに提供してよい。眼の障害または疾患は、重度の早期卵黄様変性（レーバー先天性黒内障）、先天性の色または夜間視力障害（例えば色覚異常）、網膜色素変性（常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、またはミトコンドリア遺伝）、黄斑ジストロフィー（例えばスターガルト病、ベスト病）、先天性脈絡膜欠如、ドイン網膜ジストロフィー、錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖性網膜分離症、網膜繊毛症（例えばアッシャー症候群）、湿性（または血管新生）加齢黄斑変性症、乾燥性加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症（例えば糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、遺伝性網膜剥離（例えば結合組織障害、例えばスティッカーラー症候群）、ブドウ膜炎（例えばＣＡＰＮ５関連遺伝性ブドウ膜炎）、遺伝性視神経症（例えばレーバー視神経障害）、緑内障、および遺伝性角膜ジストロフィーを含む群から選択されてよい。本願発明の方法はまた、卵黄様変性のための他の遺伝子治療レスキュー戦略、例えばデュアルベクター遺伝子治療（例えば大きな導入遺伝子の複数のフラグメントを送達するためにＡＡＶベクターを使用して）、光遺伝学療法（例えばメラノプシンまたは他のオプシン遺伝子を送達するためにＡＡＶを使用して）、神経栄養因子療法（例えば網膜または視神経に毛様体神経栄養因子、ＣＮＴＦ、または他の生存／抗アポトーシス性因子を送達するためにＡＡＶを使用して）、遺伝子編集（例えばＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９構造を送達するためにＡＡＶを使用して）、および「ブロック補充」療法（例えば導入遺伝子と共に阻害性ＲＮＡまたはＭｉｔｒｏｎエレメントを送達するためにＡＡＶを使用して）の有効性を増強してもよい。本願発明は、本願発明によるＡＡＶベクターおよび抗マラリア剤、または医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、ＣＮＡの疾患または障害を処置する方法をさらに提供してよい。ＣＮＳの疾患または障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、癲癇、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上まひ（ＰＳＰ）または脳の癌であってよい。いくつかの態様において、障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、乳幼児型バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的後期乳幼児型バッテン病（ＣＮＬ２）、若年型バッテン病（ＣＮＬ３）、バッテン型ＣＮＬ４、バッテン型ＣＮＬ５、バッテン型ＣＮＬ６、バッテン型ＣＮＬ７、バッテン型ＣＮＬ８、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシドシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ハンター病、クラベ病、α−マンノシドーシス病、β−マンノシドーシス病、マロトー・ラミー、異染性白質ジストロフィー症、モルキオＡ、モルキオＢ、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ病、ニーマンピックＡ病、ニーマンピックＢ病、ニーマンピックＣ病、ポンペ病、サンドホフ病、サ��フィリポ（SanfiUipo）Ａ病、サンフィリポＢ病、サンフィリポＣ病、サンフィリポＤ病、シンドラー病、シンドラー−カンザキ、シアリドーシス、スライ病、テイ−サックス病、およびウォルマン病からなる群から選択されるリソソーム蓄積症である。いくつかの態様において、ＣＮＳの障害は、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、または前頭側頭型認知症である。
【００５７】
本願発明はまた、対象において疾患または障害を処置または予防するための、特に眼の疾患または障害の処置のための医薬の製造のための、本願発明によるＡＡＶベクターおよび抗マラリア剤、または医薬組成物の使用を提供してよい。
【００５８】
本願発明はまた、ＣＮＳの疾患または障害を処置または予防するための医薬の製造のための、本願発明によるＡＡＶベクターおよび抗マラリア剤、または医薬組成物の使用を提供してよい。
【００５９】
さらなる局面において、本願発明は、ＡＡＶベクターと組み合わせての遺伝子治療の方法における使用のための抗マラリア剤を提供する。
【００６０】
よりさらなる局面において、本願発明は、細胞へのウイルスベクターの形質導入の効率を改善するための抗マラリア剤の使用を提供してよい。細胞は、臓器または組織の細胞であってよい。細胞は網膜細胞であってよい。抗マラリア剤は、本願明細書に記載されている任意の薬剤であってよい。ウイルスベクターは、本願明細書に記載されている任意のベクターであってよい。１つの態様において、抗マラリア剤はヒドロキシクロロキンである。１つの態様において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。好ましい態様において、抗マラリア剤はヒドロキシクロロキンであり、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。
【００６１】
別の局面によると、本願発明は、ウイルスベクターの形質導入の効率を増加させることにおける使用のためのキットであって、形質導入されるべきウイルスベクターおよび抗マラリア剤を含む、キットを提供する。ウイルスベクターおよび抗マラリア剤は、同じ組成物において提供されてよい。
【００６２】
あるいは、キットにおいて、ウイルスベクターは第１の容器において提供されてよく、抗マラリア剤が第２の容器において提供されてよい。キットは、投与の前に第１および第２の容器の内容物を混合するための指示書を含んでよい。あるいは、キットは、いつ抗マラリア剤を投与するか、およびいつウイルスベクターを投与するかの指示書を含んでよい。
【００６３】
キットは、ウイルスベクターおよび／または抗マラリア剤を注射することにおける使用のためのシリンジを含んでよい。キットは、冷蔵温度または室温のいずれかで保存されてよい。
【００６４】
当業者は、本願発明の任意の１つの態様および／または局面および／または請求項の好ましい特徴が、本願発明の他のすべての態様および／または局面および／または請求項に適用されてよいことを理解する。
【００６５】
本願発明は、以下の図を参照して、単なる一例として、さらに詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１ａおよび１ｂは、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＡＡＶ形質導入に対するヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）の効果を説明し、用量依存的である効果を証明する。
【００６７】
【図２】図２ａ、２ｂおよび２ｃは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるＡＡＶ形質導入に対するヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）の効果を説明する。ＮＨＰ  ＲＰＥは、マカクザルのためのＭＲＣセンター（Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、ＵＫ）から得られたアカゲザルマカクザル（Ｍ．  ｍｕｌｌａｔａ）眼から得た。
【００６８】
【図３】図３ａおよび３ｂは、ヒト網膜外植片におけるＡＡＶ形質導入に対するヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）の効果を説明する。
【００６９】
【図４】図４ａ、４ｂおよび４ｃは、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）が、マウスにおける網膜下腔へのＨＣＱおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶベクターの共投与後に、インビボでのＡＡＶ形質導入の有効性を改善することを説明する。
【００７０】
【図５】図５ａおよび５ｂは、ＡＡＶ形質導入に対するクロロキン（ＣＱ）の効果を説明し、用量依存的である効果を証明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１は、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）が、用量依存的にＡＡＶ形質導入の有効性を改善するということを証明する。
【００７２】
方法：
細胞培養。野生型（ＷＴ）マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を６ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、１０００のＭＯＩでｒＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡ  ベクターでの形質導入の１時間前に、３．１２５−５０ｕＭのＨＣＱ濃度を有する培養培地において細胞をインキュベートした。採取するまで、細胞をＨＣＱ含有培地で培養した。形質導入の３日後に細胞をイメージ化した（図１Ａ）。
【００７３】
フローサイトメトリー分析。細胞を、形質導入の３日後に処理し、フローサイトメトリー分析の５分前に、細胞生存色素７−ＡＡＤで染色した。７−ＡＡＤおよびＧＦＰの蛍光色素を検出するためにそれぞれ帯域フィルター６９５ｎｍ／４０ｍＷおよび５３０ｎｍ／３０ｍＷでの青色レーザーを使用してＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  フローサイトメーターにより蛍光を測定した（図１ａ）。
【００７４】
結果＆議論：
（ａ）図１ａおよび１ｂに示される結果は、ＨＣＱの濃度が増加すると、最大１８．７５ｕＭまでＧＦＰ発現細胞の数が増加するということを証明する。２５ｕＭ以上の濃度で、ＨＣＱは細胞死を誘導し、次にＧＦＰ発現細胞の生存率を減少させる。
（ｂ）結果はまた、ＨＣＱが、ＷＴ  ＭＥＦにおいて用量依存的にＧＦＰ発現細胞の数を増加させるということを証明する。
【００７５】
示された結果は、抗マラリア剤ＨＣＱがＡＡＶ形質導入の有効性を改善するということを証明する。
【００７６】
実施例２は、ＨＣＱが、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞においてＡＡＶ形質導入の有効性を改善するということを証明する。
【００７７】
方法：
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の採取。摘出後、角膜および水晶体を、外科的顕微鏡で直接的視覚化の下に除去した。放射状の切開を、眼杯(eyecup)を平らにするために後極に向かって行った。網膜を鈍的切開により除去し、残りの眼杯を培地に置き、ＲＰＥ細胞を除去するまで氷上で保存した。ＲＰＥ細胞をＴｒｙｐＬＥ細胞解離試薬を使用して分離し、３７℃で培養した。
【００７８】
細胞培養。初代ＮＨＰ  ＲＰＥ細胞を１２ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、１ウェルあたり２ｘ１０９のゲノムコピーでの形質導入の１時間前に、３．１２５ｕＭまたは１８．７５ｕＭのＨＣＱを有する培地において細胞をインキュベートした。形質導入の３日後に細胞をイメージ化した。
【００７９】
ＲＮＡ＆タンパク質抽出およびｃＤＮＡ合成。ＨＣＱと共にＡＡＶ形質導入の３日後にＲＮＡ抽出のために初代ＮＨＰ  ＲＰＥを採取した。製造業者の指示書にしたがってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。オリゴｄＴプライマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して８５０−１５００ｎｇのＲＮＡを使用してコピーＤＮＡを合成した。
【００８０】
ｑＰＣＲ分析。ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔサーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）においてＧＦＰおよびβ−アクチンに対するＴａｑＭａｎプローブを使用してｑＰＣＲを実施した。ＧＦＰ発現をβ−アクチンに対して正規化し、ＨＣＱなしでインキュベートされた形質導入細胞に対する倍率変化として表した。
【００８１】
タンパク質抽出。上記のＲＮＡ抽出からのフロースルーを４容量のアセトンと組み合わせ、氷上で３０分間インキュベートした。サンプルを１７，０００ｘｇで３０分間遠心し、上清を廃棄し、ペレットを１００μＬの氷冷エタノールで洗浄した。ペレットを１％ＳＤＳに再懸濁した。
【００８２】
ウェスタンブロット。細胞溶解物中の全タンパク質内容物を、ビシンコニン酸方法を使用して決定した。モノクローナル抗体を使用してＧＦＰおよびアクチンタンパク質をプローブし、ＥＣＬおよびＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して検出した。ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用してデータ分析を行った。ＧＦＰバンド密度をβ−アクチンに対して正規化した。
【００８３】
結果＆議論：
初代ＮＨＰ  ＲＰＥ細胞が１８．７５μＭのＨＣＱで処理されたとき、ＨＣＱなしでインキュベートされた形質導入細胞と比較して、形質導入の３日後に、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現は３倍増加し（Ｎ＝３、ｐ＝０．０２５３）、ＧＦＰタンパク質発現は１９倍増加した（図２ａおよび２ｂ）。これらの結果は、１８．７５μＭのＨＣＱが初代ＮＨＰ  ＲＰＥ細胞においてＡＡＶ形質導入を改善したということを証明する。
【００８４】
タンパク質をＲＮＡ抽出フロースルーから抽出したが、これは、Ｎ＝２でのウェスタンブロットを実行することができるのみであるように低い濃度をもたらし、これは、１８．７５μＭのＨＣＱがＮＨＰ  ＲＰＥ細胞においてＧＦＰタンパク質発現を約４倍改善したことを示した（図２ｃ）。
【００８５】
実施例３は、ＨＣＱが、ヒト網膜外植片においてＡＡＶ形質導入の有効性を改善するということを証明する。
【００８６】
方法：
組織の採取。網膜切除が必要とされる日常的な網膜手術中に、ヒト網膜フラグメントを抽出した（倫理は承認済）。網膜のフラグメントを、硝子体切除用カッターを備えた２３Ｇ強膜切開術（最小限のカットレートで）および手動吸引によって取り出した。
【００８７】
外植片の培養。組織回収から１時間以内に、網膜フラグメントを３ｍＬのパスツールピペットを使用して個々の器官型培養インサート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に移し、次に２４ウェルプレートに配置した。４００ｕＬの培地をインサートの真下に（beneath）置き、１００ｕＬの培地をインサート内に置いた。網膜外植片を培養してから２４時間後、培地を３．１２５ｕＭまたは１８．７５ｕＭのＨＣＱを含む培地と置き換えた。ｒＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡベクターの１ｘ１０９ゲノムコピーでの形質導入の前に、外植片をＨＣＱ培地に１時間インキュベートした。外植片を１１日間２日毎にイメージ化し、外植片の平均グレイ値（ＧＦＰ蛍光の典型的な）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した（図３ａ）。
【００８８】
結果＆議論：
ＡＡＶ形質導入外植片は、３．１２５ｕＭのＨＣＱで処理されたとき、ＨＣＱなしと比較して、平均グレイ値が最大２倍増加することを証明した（ｎ＝６、ｐ＝０．０２１３）（図３ｂ）。これは、３．１２５μＭのＨＣＱがＡＡＶ形質導入を改善したということを証明する。
【００８９】
実施例４は、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）が、マウスにおける網膜下腔へのＨＣＱおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶベクターの共投与後に、インビボでのＡＡＶ形質導入の有効性を改善することを説明する。
【００９０】
方法：
網膜下注射。７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、１．２μＬのベクター懸濁液（１ｘ１０８のゲノムコピー）を網膜下に注入した。ベクターを、ＨＣＱの３．１２５ｕＭまたは１８．７５ｕＭの最終濃度と、ＨＣＱなしのコントロール調製物とを調製した。動物に、一方の眼においてＡＡＶ＋ＨＣＱ調製物および対の眼においてＡＡＶのみを注入した。
【００９１】
共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）分析。ｃＳＬＯ（Spectralis HRA, Heidelberg Engineering）を使用する標準化されたマウス自己蛍光（ＡＦ）イメージ化を、以前に公開されたプロトコールにしたがってすべての動物で実行した。すべてのイメージを、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡの５５°レンズを使用して、注射後２、４および８週で記録した。イメージを、標準化されたシグナル検出器感度を使用して記録した。眼底ＡＦの定量分析のために、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して、視神経乳頭中心から半径３５０から８６０ピクセルに位置するリング状領域内で平均グレーレベルを測定した。
【００９２】
ＯＣＴ分析。動物を、注射後２、４および８週で広視野スペクトル領域光干渉断層法（OCT, Spectralis HRA, Heidelberg Engineering）に付した。５５°レンズを使用してマウスをスキャンし、２５フレームのリアルタイム平均プロセスで８つの放射状断面を撮影した。総網膜の厚さおよび外境界膜（ＯＬＭ）の厚さを、キャリパーを使用して、代替の放射状断面で手動で測定した。
【００９３】
タンパク質抽出。マウス網膜を氷上で解凍し、１ｘ  ＲＩＰＡバッファー＋プロテアーゼ阻害剤に溶解した。ハンドヘルドホモジナイザーを使用して網膜をホモジナイズし、氷上で３０分間インキュベートした。サンプルを１７，０００ｘｇで４℃で２０分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、氷上に置いた。
【００９４】
ウエスタンブロット（ＷＢ）。細胞溶解物中の全タンパク質内容物を、ビシンコニン酸方法を使用して決定した。モノクローナル抗体を使用してＧＦＰおよびアクチンタンパク質をプローブし、ＥＣＬおよびＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して検出した。ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用してデータ分析を行った。ＧＦＰバンド密度をアクチンに対して正規化した。
【００９５】
結果＆議論：
眼底ＡＦイメージの平均グレイ値の定量化により、注射後４週および８週目に、ＡＡＶのみを注入したコントロール眼と比較して、ＡＡＶおよび１８．７５ｕＭのＨＣＱの懸濁液を網膜下に注入された眼において平均グレイ値（ＧＦＰ発現の代理測定）が統計的に有意な２倍の増加を証明した（図４ａ）。
【００９６】
網膜下注射懸濁液においてＨＣＱ有りおよび無しのグループ間で、平均の網膜の厚さまたは網膜の形態に有意な差異はなかった（図４ｂ）。これは、網膜下ＨＣＱが動物の網膜に検出可能な毒性効果を有さなかったことを示唆する。
【００９７】
図４ｃは、０μＭのＨＣＱ対の眼と比較してＷＢによって検出されたＧＦＰシグナルの増加があったことを説明し、１８．７５ｕＭのＨＣＱがＧＦＰタンパク質レベルを増加させることを証明する。
【００９８】
実施例５は、実施例１のＨＣＱのようなクロロキン（ＣＱ）が、用量依存的にＡＡＶ形質導入の有効性を改善することを証明する。
【００９９】
方法：
細胞培養。野生型（ＷＴ）マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を６ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、１０００のＭＯＩでｒＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡ  ベクターでの形質導入の１時間前に、１．５から１２ｕＭのＣＱ濃度を有する培地において細胞をインキュベートした。採取するまで、細胞をＣＱ含有培地で培養した。形質導入の３日後に細胞をイメージ化した（図５ａ）。
【０１００】
フローサイトメトリー分析。細胞を、形質導入の３日後に処理し、フローサイトメトリー分析の５分前に、細胞生存色素７−ＡＡＤで染色した。７−ＡＡＤおよびＧＦＰの蛍光色素を検出するためにそれぞれ帯域フィルター６９５ｎｍ／４０ｍＷおよび５３０ｎｍ／３０ｍＷでの青色レーザーを使用してＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａにより蛍光を測定した（図５ａ）。
【０１０１】
結果＆議論：
図５ａおよび５ｂに示される結果は、ＣＱの濃度が増加すると、最大１２ｕＭまでＧＦＰ発現細胞の数が増加するということを証明する。結果はまた、ＣＱが、用量依存的にＧＦＰ発現細胞の数を増加させるということを証明する。
【０１０２】
示された結果は、抗マラリア剤ＣＱがＡＡＶ形質導入の有効性を改善するということを証明する。
【図１ａ−１】
2021512912.tif 000005
【図１ａ−２】
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【図１ａ−３】
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【図１ａ−４】
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【図１ａ−５】
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【図１ａ−６】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ−１】
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【図３ｂ−２】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ−１】
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【図４ｃ−２】
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【図５ａ−１】
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【図５ａ−２】
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【図５ｂ】
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【国際調査報告】
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