(57)【要約】  本発明は、Ｏ−グリカン（タグ）に共有結合された、操作されたＯ−結合アミノ酸（ＡＡ）グリコシル化配列（モチーフ）を有する、組換えポリペプチド治療薬に関する。組換えＯ−グリコシル化ポリペプチドは、哺乳類細胞内で生産され、代謝標識を通じて天然又は非天然のＯ−グリカン構造を提示してもよい。
2021506831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．細胞培養培地の存在下において、操作された治療用タンパク質を宿主細胞内で発現させるステップと；
ｂ．任意選択的に、組換え治療用タンパク質を精製するステップと
を含んでなる、Ｏ−グリコシル化組換え治療用タンパク質を生産する方法であって、少なくとも１つのＯ−結合グリコシル化配列が、前記組換え治療用タンパク質のＯ−グリカンに共有結合するように、
ｉ．前記操作された治療用タンパク質が、少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含んでなり、
ｉｉ．前記細胞培養培地が、Ｏ−グリコシル化用試薬を含んでなる、方法。
【請求項２】
ａ．前記少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含んでなる前記操作された治療用タンパク質をコードする、ＤＮＡを含んでなる、発現ベクターを得るステップと；
ｂ．宿主細胞に前記発現ベクターを形質移入するステップと
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養培地が、Ｏ−グリカンがアジ化物で標識されるようにアジ化物含有化合物を含んでなる、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記アジ化物含有化合物がＧａｌＮＡｚである、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって生産された、Ｏ−グリコシル化組換え治療用タンパク質。
【請求項６】
少なくとも１つのＯ−グリカンに共有結合した少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含んでなり、天然グリコシル化パターンをさらに含んでなる、Ｏ−グリコシル化組換え治療用タンパク質。
【請求項７】
前記Ｏ−グリカンがアジ化物官能基で標識されている、請求項６に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質。
【請求項８】
Ｏ−結合グリコシル化配列を含んでなり、前記Ｏ−結合グリコシル化配列が表１に記載されるものから選択された配列を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項９】
Ｏ−結合グリコシル化配列を含んでなり、前記Ｏ−結合グリコシル化配列が表１に記載されるものから選択された配列を含んでなり、前記Ｏ−結合グリコシル化配列がＯ−グリカンに共有結合する、Ｏ−グリコシル化ポリペプチド。
【請求項１０】
操作された治療用タンパク質を発現する宿主細胞からＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質を生産するための、Ｏ−グリコシル化用試薬を含んでなる細胞培養培地の使用であって、
ａ．前記操作された治療用タンパク質が、少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含んでなり、
ｂ．前記組換え治療用タンパク質が、少なくとも１つのＯ−グリカンに共有結合する、前記少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含んでなる、使用。
【請求項１１】
請求項５〜７のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質又は請求項８若しくは請求項９に記載のポリペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１２】
薬剤として使用するための、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質又は請求項８若しくは請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項５〜７のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質又は請求項８若しくは請求項９に記載のポリペプチドを患者に投与するステップを含んでなる、前記患者において疾患を治療又は予防する方法。
【請求項１４】
ａ．請求項５〜７のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質又は請求項８若しくは９に記載のポリペプチドを提供するステップと；
ｂ．前記Ｏ−グリカンに分子を共有結合させるように、前記Ｏ−グリカンを前記組換え治療用タンパク質に結合することが望ましい前記分子の反応基と反応させるステップと
を含んでなる、Ｏ−グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲートを生産する方法。
【請求項１５】
前記反応が、アジ化物−アルキンカップリング反応を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の方法によって生産された、Ｏ−グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲート。
【請求項１７】
請求項５〜７のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質又は請求項８若しくは９に記載のポリペプチドを含んでなり、前記組換え治療用タンパク質に結合することが望ましい分子が前記Ｏ−グリカンに共有結合する、Ｏ−グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲート。
【請求項１８】
請求項１６又は１７のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１９】
薬剤として使用するための、請求項１６又は１７のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１６又は１７のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質コンジュゲートを患者に投与するステップを含んでなる、前記患者において疾患を治療又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書にその全体が参照により援用されるのは、本明細書と同時に提出され、次のように特定される、コンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列リストである：２０１７年１２月２１日に作成された「ＯＧＬＹＣ−１００−ＵＳ−ＰＳＰ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ」と命名される、１件の１１，８９１バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【０００２】
本発明は、Ｏ−グリカン（タグ）に共有結合された、操作されたＯ−結合アミノ酸（ＡＡ）グリコシル化配列（モチーフ）を有する、組換えポリペプチド治療薬に関する。組換えＯ−グリコシル化ポリペプチドは、哺乳類細胞内で生産され、代謝標識を通じて天然又は非天然のＯ−グリカン構造を提示してもよい。この方法によって生産されたポリペプチドは、追加的な機能を提供する操作されたＯ−グリカン構造から恩恵を受けてもよく；最も注目すべきは、化学的コンジュゲーションによる、操作されたＯ−グリカンへの機能的部分の付加の可能性である。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質のグリコシル化は、一般的且つ非常に多様な翻訳後修飾（ＰＴＭ）である。真核細胞では、このような修飾は、Ｎ−結合グリコシル化及びＯ−結合グリコシル化の２つの広義のカテゴリーに分類され得る。典型的には、細胞外において；Ｎ−結合グリコシル化では、オリゴ糖はアスパラギンに共有結合するが、Ｏ−結合グリコシル化では、結合は、通常、セリン又はチロシンのどちらかのヒドロキシル基上に発生する。
【０００４】
グリコシル化反応によって生じる構造には大きな多様性があり、分泌及び細胞表面関連糖タンパク質上に見られるＯ−結合ムチン型グリカンの場合、この多様性は、分泌経路（特にゴルジ体）に内在する特定のトランスフェラーゼ酵素の活性によって生じる。それらは、ポリペプチドＮ−アセトガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ）イソ酵素の作用によってそれ自体が配置された、前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｏ−ＧａｌＮＡｃ、Ｔｎ抗原）への／それを越える、連続的な単糖縮合を通じて、Ｏ−グリカンの成熟を触媒する。多様性は、グリカン構造自体のレベルと、タンパク質骨格へのＯ−グリカンの結合位置とに存在し、それは、栄養素利用性及び細胞活動に加えて、Ｏ−グリコシル化配列モチーフとオリゴ糖トランスフェラーゼ発現とのユニークな相互作用によって、絶妙に制御される。現在、このプロセスの詳細はあいまいにしか理解されていない。
【０００５】
自然界では、Ｏ−グリカンは、水和／電荷、タンパク質間相互作用、骨格露出／アクセス性、表面エピトープ／認識などの特性によってもたらされる、多くの望ましい効果を付与する。例えば、ポリペプチド中のＯ−グリカンの存在は、障壁／潤滑（一括）、半減期の増加（プロテアーゼ／分解耐性）、活性減衰（タンパク質輸送、受容体シグナル伝達）、及びタンパク質折り畳み／凝集状態などの特性を付与してもよい。非天然Ｏ−グリカンは、さらに望ましい特性を提供してもよい。例えば、ポリペプチド中のＯ−グリカンの存在は、製剤化、半減期延長又は免疫原性の変化などの改善された製薬的挙動を付与してもよい。さらなる進歩において、ポリペプチド中の非天然Ｏ−グリカン組成（又は位置）の操作もまた活用されてもよい。例えば、クリックケミストリーコンジュゲーションなどの引き続く化学反応に対して受容性がある。これらの多くの特性は、操作された治療用ポリペプチドで活用されてもよい。
【０００６】
Ｏ−結合グリコシル化がポリペプチドに導入され、Ｏ−グリカンの１つ又は複数の特性が活用され得る。しかし、全てのポリペプチドが、それらのアミノ酸配列の一部としてＯ−結合グリコシル化配列を有するとは限らない。さらに、既存のＯ−結合グリコシル化配列のＯ−グリコシル化は効率的に進行しないこともあり、及び／又は既存のＯ−結合グリコシル化配列のグリコシル化を通じて存在するＯ−グリカンは、利用に最適でないこともある。したがって、Ｏ−グリコシル化部位をポリペプチドに組み入れる必要が存在する。
【０００７】
特許文献１は、ＢＭＰ−７、ＮＴ−３、及びＦＧＦ−２１などのタンパク質への外因性グリコシル化部位の組み込みに関する。特許文献１の方法論によれば、外因性Ｏ−結合グリコシル化配列を有する変異体タンパク質が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内で発現され、精製された。次に、精製タンパク質にＧａｌＮＡｃを生体外で添加することによって、グリコシル化が引き続いて試みられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第９，１８７，５３２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記及びその他の方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｌｉｃｋ−ＩＴテクノロジーを参照されたい）で説明されているように、Ｏ−グリカンをタンパク質に導入する方法は存在するが、それらは、（ｉ）Ｏ−グリコシル化モチーフが特異的且つ再現性良くＯ−グリコシル化されるような、それらの位置に対する制御、（ｉｉ）Ｏ−グリカンタグを持つポリペプチドの商業的に実現可能な収率での高効率生産、（ｉｉｉ）Ｏ−グリカンタグを修飾して追加的な機能を提供する可能性に対する必要性に満足に対処していない。本発明は、Ｏ−グリカンタグを組換えポリペプチドに組み込む、信頼性が高く効果的な手段の必要性に独自に対処する発現「システム」を提供することによって、これらの問題に対する解決策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチド及びそのコンジュゲートを生産する方法に関する。それに関連して、本発明は、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチド、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲート、それらを含んでなる医薬組成物、及び治療方法をはじめとするそれらの使用を提供する。本発明はまた、宿主治療ポリペプチドからＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを生産するためのＯ−グリコシル化用試薬を含んでなる細胞培養培地の使用と、このプロセスをさらに促進してもよい細胞株の修飾にも関する。
【００１１】
本発明の態様及び実施形態は、添付の特許請求の範囲に記載される。これらの及びその他の本発明の態様及び実施形態もまた、本明細書に記載される。
【００１２】
本開示の実施形態を添付の図面を参照して、ここで単なる例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｏ−グリコシル化の部位における、ＴＢ４ペプチドの注釈付きリボン構造及びアミノ酸配列を示す。
【図２】質量分析法による、異なるグリコフォームの特性評価を示す。
【図３】ＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用した、保持時間に対するＯ−グリコシル化の効果を示す。
【図４】ｈＧＬＰ−１Ｒ細胞内のＨＴＦＲ  ｃＡＭＰアッセイによって測定された、齧歯類ＰＫモデルにおける半減期試験の結果を示す。
【図５】ｈＧＬＰ−１Ｒに対するペプチド活性を示す。
【図６】飢餓状態のＧａｌＮＡｚ濃度の増加を示し、一過性の発現は標識の取り込みと相関する。
【図７】クリックケミストリーを使用して、組み込まれたＯグリカンタグを介して官能基をコンジュゲートした結果を示す。
【図８】Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びその誘導体の存在下又は非存在下において、ＣＨＯ  Ｋ１（ａ）又はＣＨＯ  Ｋ１  ＧＡＬＥ  ＫＯ（ｂ）のどちらかで発現された、Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧのＯ−グリコシル化プロファイル。Ｏ−グリカン非含有種とＯ−グリコシル化種との相対量は、ＭＳピーク強度に基づいて計算された。
【図９】５０μＭのＡｃ４ＧａｌＮＡｚの非存在下又は存在下において、ＨＥＫ２９３Ｆ  ＧＡＬＥ  ＫＯで発現されたＩｇＧ１−Ａ−ＰＴＡＥＰＧ（パネルａ）及びＦｃ−ＰＴＡＥＰＧ（パネルｂ）のＯ−グリコシル化プロファイルと、それに続くＧａｌＮＡｚ標識ＦｃへのＡＦ４８８−ＤＢＣＯ試薬の銅非含有「クリック」ケミストリー付加（パネルｂ）。
【図１０】クリックケミストリーを用いてＧａｌＮａｚの存在下でＨＥＫ２９３Ｆ  ＫＯ細胞株を使用して生産され、ＡＦ４８８で標識された、受容体Ａに特異的なＩｇＧ１（ＩｇＧ−Ａ−ＰＴＡＥＰＧ）がある受容体Ａに対する陽性（＋Ａ）及び陰性（−Ａ）細胞のＦＡＣＳ分析。同様の方法で標識されたＦｃ−ＰＴＡＥＰＧが、陰性対照として使用された。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、
ａ．細胞培養培地の存在下において、操作された治療用ポリペプチドを宿主細胞内で発現させるステップと；
ｂ．任意選択的に、組換え治療用ポリペプチドを精製するステップと
を含んでなる、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを生産する方法を提供し、少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列が、組換え治療用ポリペプチドのＯ−グリカンに共有結合するように、
ｉ．操作された治療用ポリペプチド質は、少なくとも１つのＯ−結合グリコシル化配列を含んでなり、
ｉｉ．細胞培養培地は、Ｏ−グリコシル化用試薬を含んでなる。
【００１５】
Ｏ−グリコシル化のための特定の試薬を細胞培養培地に添加することによって、本発明者らは、発現された操作された治療用ポリペプチドが、操作されたＯ−結合グリコシル化配列の部位において、Ｏ−グリカンで効率的に且つ一貫してグリコシル化され得ることを発見した。Ｏ−グリコシル化の効率の向上によって、商業生産実現性のある収率でＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを生産する可能性が、初めて提供される。したがって本発明は、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを生産する改善された方法を提供する。
【００１６】
一実施形態では、本発明の方法は、
ａ．少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含んでなる操作された治療用ポリペプチドをコードする、ＤＮＡを含んでなる、発現ベクターを得るステップと；
ｂ．宿主細胞に発現ベクターを形質移入するステップと
をさらに含んでなる。
【００１７】
本発明は、操作された治療用ポリペプチドを発現する宿主細胞からＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを生産するための、Ｏ−グリコシル化用試薬を含んでなる細胞培養培地の使用を提供し、
ａ．操作された治療用ポリペプチドは、少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含んでなり、
ｂ．組換え治療用ポリペプチドは、少なくとも１つのＯ−グリカンに共有結合する、少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含んでなる。
【００１８】
Ｏ−結合グリコシル化配列は、治療用ポリペプチドにとって内因性であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、治療用ポリペプチドにとって外因性であってもよい。天然及び非天然の双方のＯ−結合グリコシル化配列は、当業者に周知の方法によって、治療用ポリペプチドに組み入れられてもよい。
【００１９】
したがって操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、（ｉ）宿主細胞内で発現された操作された治療ポリペプチド、及び（ｉｉ）本明細書に記載される発明の方法によって生産された本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドの双方に存在する。
【００２０】
本発明は、上で定義された方法によって生産されたＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドをさらに提供する。本発明は、上で定義された方法によって生産されることができる、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドをさらに提供する。上で定義された方法によって生産されたＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドの特徴を有するＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。
【００２１】
本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、タンパク質に組み入れられているＯ−結合グリコシル化配列と、操作されたＯ−結合グリコシル化配列に共有結合するＯ−グリカンの存在とのために、天然に存在するグリコシル化タンパク質と比較して修飾されていると理解される。本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、Ｏ−結合グリコシル化配列に共有結合するＯ−グリカンの代謝性付加のためにグリコシル化配列を含んでなることがある操作された治療用ポリペプチドと比較して、修飾されていると理解される。
【００２２】
さらに、操作されたＯ−結合グリコシル化配列を除いて、細胞内で発現した操作された治療用ポリペプチドのグリコシル化の結果生じるグリコシル化パターンをタンパク質が有するであろうという事実によって、本発明の方法によって生産されたＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドが同定可能であることが理解されるであろう。特定の培養条件（細胞型、グルコース可用性、ストレス、酵素ＫＯ）は、存在するグリカンのタイプに影響を及ぼす。
【００２３】
したがって、本発明は、少なくとも１つのＯ−グリカンに共有結合した少なくとも１つのＯ−結合グリコシル化配列を含むＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを提供し、組換え治療用ポリペプチドは、天然又は非天然のグリコシル化パターン／構成を含んでなる。
【００２４】
本明細書に記載される操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドに有利な特性を付与してもよい。例えば、構造及び機能（可撓性、アクセス性、生物活性）、物理化学的及び生物物理学的特性（ｐＩ、溶解度、流体力学半径）、タンパク質間相互作用の調整（自己会合の低減、凝集、及びプロテアーゼ耐性をはじめとする）、免疫原性（遮蔽エピトープ）、製品差別化、及びバイオプロセシング。特定の例では、操作されたＯ−結合グリコシル化配列の存在は、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドのタンパク質分解を低減してもよい。次に、操作されたＯ−結合グリコシル化配列の存在は、操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含まない治療用ポリペプチドと比較して、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドの半減期を延長してもよい。本明細書に記載される操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドのＯ−グリカン修飾を正確に標的化する能力を提供する。
【００２５】
なおも別の態様では、さらなる分子がＯ−グリカンに付着されて、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートが形成され得る。したがって、本発明は、上記で定義されたとおりのＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを含んでなる、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを提供し、さらなる分子ＭはＯ−グリカンに共有結合される。
【００２６】
なおも別の態様では、さらなる分子がＯ−グリカンに付着されて、式：
Ｐ−（Ｏ−グリカン）−Ｍ
を含んでなるＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートが形成され得て、
式中、Ｐは操作された組換え治療用ポリペプチドを表し、ＭはＰに結合することが望ましい分子を表す。したがってＯ−グリカンは、ＰとＭとの間の連結基の役割を果たす。
【００２７】
なおも別の態様では、本発明は、式：
Ｐ−（Ｏ−グリカン）−Ｍ
を含んでなるＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを生産する方法を提供し、
式中、Ｐは発明の操作された組換え治療用ポリペプチドを表し、ＭはＰに結合することが望ましい分子を表す。方法は、
（ｉ）本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを提供するステップと；
（ｉｉ）ＭをＯ−グリカンに連結させるように、Ｏ−グリカンをＭと反応させるステップと
を含んでなる。
【００２８】
Ｏ−グリカンは、ＭとＯ−グリカンを連結させるために、Ｍの反応基と反応できる反応基を有しなくてはならないことが理解されるであろう。一実施形態では、連結は共有結合であってもよい。
【００２９】
一実施形態では、反応はアジ化物−アルキンカップリング反応を含んでなる。
【００３０】
本発明は、上で定義された方法によって生産されたＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを提供する。本発明は、上で定義された方法によって生産されることができる、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートをさらに提供する。上で定義された方法によって生産されたＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートの特徴を有するＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートもまた、本発明の範囲内である。
【００３１】
本発明は、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。本発明は、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物もまた提供する。
【００３２】
本発明は、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを患者に投与するステップを含んでなる、患者において疾患を治療又は予防する方法を提供する。本発明は、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを患者に投与するステップを含んでなる、患者において疾患を治療又は予防する方法もまた提供する。本発明は、受容性Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドと、同時投与される基質Ｍとを患者に投与して、本発明のコンジュゲートを生成するステップを含んでなる、患者において疾患を治療又は予防する方法もまた提供する。
【００３３】
本発明は、薬剤として使用するための、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを提供する。本発明は、薬剤として使用するための、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートもまた提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、上記製品の第２の医学的使用を提供する。
【００３５】
Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチド
一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、３０ｋＤａ未満の分子量を有する。一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、約３０ｋＤａ以上の分子量を有する。一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、約６５ｋＤａ以上の分子量を有する。一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、約１００ｋＤａ以上の分子量を有する。一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、約１５０ｋＤａ以上の分子量を有する。
【００３６】
本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、任意の治療用ポリペプチドであってもよく、その中にＯ−結合グリコシル化配列が存在することが望ましい。
【００３７】
一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合断片である。
【００３８】
一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、Ｆｃタンパク質である。
【００３９】
一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、Ｔｎ３スキャフォールド、Ｄａｒｐｉｎ、ｓｃＦｖ、アフィボディ又はドメイン抗体である。
【００４０】
操作されたＯ−結合グリコシル化配列の位置
操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、たとえ生物学的活性が、操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含まない対応する組換え治療用ポリペプチドの生物学的活性から変化したとしても、タンパク質がなおも生物学的に活性であるという条件で、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチド上の任意の箇所に存在し得る。タンパク質の構造／機能に対する操作されたＯ−グリコシル化配列の効果を判定するための適切な実験は、使用されている特定の治療用ポリペプチドの当業者に公知であろう。
【００４１】
操作された治療用ポリペプチドにＯ−グリカンを結合させるためには、操作されたＯ−リンクされたグリコシル化配列の標的アミノ酸（Ｓ／Ｔ／Ｙ）が、主要なグリコシル化酵素（例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔなど）に立体構造的にアクセス可能でなくてはならない。一実施形態では、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、ゴルジ装置内の翻訳後修飾中に、治療用ポリペプチドの溶媒露出面でアクセス可能でなくてはならない。当業者は、翻訳後修飾のための適切な細胞株及び条件の選択が、Ｏ−グリコシル化の効率に影響を及ぼしてもよいことを理解するであろうが、効率を最適化するためのこのような細胞株及び条件の選択は、日常的な最適化の問題である。
【００４２】
操作されたＯ−結合グリコシル化配列のアクセス性は、一般に三次元構造がわずか又は皆無であるがＯ−結合グリコシル化配列のアクセシビリティを改善するリンカー（Ｌ１／２）の使用によって、補助され得る。一実施形態では、リンカーは、例えば、Ｃｙｓ架橋又はプロリンに富む配列の存在を通じて、構造モチーフが「ねじれた」構造を形成することの促進を援助しても良い。リンカーは、操作されたＯ−結合グリコシル化配列：
−（Ｌ１）ｍ−（操作されたＯ−連結グリコシル化配列）−（Ｌ２）ｎ−
の片側又は両側上に存在してもよく、
式中、ｍ及びｎは独立して０又は１である。また、Ｌ１はＬ２と同一であっても、２つが異なってもよい。Ｌ１及び／又はＬ２は、好ましくは天然タンパク質を最小限に乱すように短いが、アクセス性について妥協するために長さが変動する。リンカーは、１〜３０、好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜５アミノ酸残基であってもよい。
【００４３】
適切なペプチドリンカーは、当業者に知られているであろう。例えば、Ｇｌｙ４Ｓリンカー、Ａ／Ｐリンカー、荷電リンカー、ＰｏｌｙＰ、及びポリＡリンカー。リンカーはさらなる構造又は機能を付加してもよく、一実施形態では、これはプロテアーゼ開裂部位又はタグを含み得る。
【００４４】
一般に、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、Ｏグリコシル化され得る天然に存在する残基に、隣接又は近接していないことが好ましい。（例えば、操作されたＯ−結合グリコシル化配列に近接してＳｅｒ、Ｔｈｒ又はＴｙｒがある場合、これは二次的なＯ−グリコシル化部位を提供することがある）。このようにして、このような部位はタンパク質から操作して除去されなくてはならず、又は操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、天然に存在する残基に対して異なる位置に配置されなくてはならない。これは、Ｏ−結合グリコシル化部位の完全な再配置によって、又は適切なリンカーの挿入によってのどちらかで達成されてもよい。グリコシル化を伝播する能力を有しないレクチン−ドメイン短縮型ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ、又はそれによってレクチンドメインの認識／伸長を妨げる確かに修飾された糖の組み込みの使用をはじめとする、この現象を制御するための代替え方法がある。
【００４５】
上記にもかかわらず、隣接残基の追加的なＯ−グリコシル化（Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｌａｔｉｏｎ）が望まれる場合があってもよい。その場合は、リンカーはＳ／Ｔに富み、又は煽動部位から適切な間隔を提供して、最適な二次Ｏグリコシル化事象を提供する。
【００４６】
下流又は上流のＳｅｒ又はＴｈｒは、例えば、およそ１０アミノ酸の距離など、操作されたグリコシル化部位から離れていなくてはならないが、アミノ酸の正確な数はペプチドにより異なり、例えば、５〜１５アミノ酸など、この値よりも大きくても又は小さくてもよい。
【００４７】
操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、操作された治療用ポリペプチドの任意の適切な位置に存在してもよい。したがって、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、操作された治療用ポリペプチドのＣ末端にあってもよいことが理解されるであろう。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、操作された治療用ポリペプチドのＮ末端にあってもよい。この意味では、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は治療用ポリペプチド配列内になくてもよく、むしろその配列のＣ末端又はＮ末端のどちらかの延長（任意選択的にリンカーを使用する）であってもよいことが理解されるであろう。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、操作された治療用ポリペプチドのＣ末端とＮ末端との間（すなわち、操作された治療用ポリペプチド内）にあり得る。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、操作された治療用ポリペプチドのＣ末端の近く（例えば、１０アミノ酸以内）にあってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、操作された治療用ポリペプチドのＮ末端の近く（例えば、１０アミノ酸以内）にあってもよい。操作された配列は、例えば、Ｆｃ−ペプチド融合のスキャフォールドとペプチド領域との間など、治療薬の２つの異なる構成要素の間にあってもよい。
【００４８】
一実施形態では、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、操作された治療用ポリペプチドのループドメインに配置される。このような位置は、ポリペプチドの非構造化領域内で通常は発生する天然グリコシル化の部位と一致する。当技術分野の操作方法は、例えば、球状ドメインからＯ−グリコシル化配列を押出すためのリンカードメインの使用など、最初は不適切な位置を採用できるようにしてもよい。
【００４９】
既存の技術は、タンパク質の研究（例えば、アミノ酸配列、質量分析法、及び既知の結晶構造を使用する）が、既存のＯ−グリコシル化部位を特性評価し、及び／又は操作されたＯ−結合グリコシル化配列の導入に最適なドメインを特徴付けられるようにする。
【００５０】
そのため、上記の全てを考慮に入れることによって、操作されたＯ−結合グリコシル化配列の有望な位置に到達してもよい。
【００５１】
Ｏ−結合グリコシル化配列を治療用ポリペプチドに組み込むことは当技術分野で公知であり、したがって、操作されたＯ−結合グリコシル化配列の位置に関する追加的な情報が、当技術分野で利用できることがさらに理解されよう。
【００５２】
一実施形態では、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは抗体又はその断片であり、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は抗体のヒンジ領域に存在する。細胞毒などの機能的部分がこのような部位を介して抗体にコンジュゲートされて、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）複合体が生成されてもよい。
【００５３】
Ｏ−グリカンの数
本発明の組換え治療用ポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化された少なくとも１つの残基を有するように操作されている。
【００５４】
一実施形態では、少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、配列内の単一の位置でグリコシル化される。別の実施形態では、少なくとも１つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、配列内の複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又は５つの）位置でグリコシル化される。
【００５５】
２つ以上の操作されたＯ−結合グリコシル化配列を有することが望ましいことがある。一実施形態では、組換え治療用ポリペプチドは、例えば、２つ、３つ、４つ又は５つの操作されたＯ−結合グリコシル化配列を有する。２つ以上の操作されたＯ−結合グリコシル化配列がある場合、各操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、同一であっても又は異なっていてもよい。
【００５６】
別の実施形態では、２つ以上のグリカンが存在してもよいが、これらのＯ−グリカンの１つ又は複数は、操作されたＯ−グリコシル化配列の外側にあってもよい。ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔの伝播特性を活用して、このようなグリコシル化パターンが達成されてもよい。
【００５７】
本発明の組換え治療用ポリペプチドは、より大型の発現産物の構成成分として発現され、引き続いて翻訳後に切断されてもよい。このような翻訳後修飾は、伝播性グリコシル化が開始される場合の使用に適してもよいが、操作された配列に限定されるものではない。例えば、Ｆｃ−ペプチド−Ｓ／Ｔ−ペプチド−切断部位−グリカンモチーフ→Ｆｃ−ペプチド−Ｓ／Ｔ−ペプチド。
【００５８】
操作されたＯ−結合グリコシル化配列
操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、定義された長さであってもよい。操作されたＯ−結合型グリコシル化配列は、Ｏ−結合グリコシル化の標的となるのに十分な長さであるが、タンパク質の構造／機能の妨害が皆無又は最小限であるように十分に短い長さでなければならない。
【００５９】
操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、約５アミノ酸長〜２５アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、少なくとも５アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、少なくとも６アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約７アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約８アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約９アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１０アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１１アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１２アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１３アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１４アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１５アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１６アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１７アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１８アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約１９アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約２０アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約２１アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約２２アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約２３アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約２４アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、最大約２５アミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態では、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、約５アミノ酸長又は約６アミノ酸長である。
【００６０】
特定の実施形態では、Ｏ−結合グリコシル化配列は、天然に存在するポリペプチド配列に挿入された外因性アミノ酸からなってもよい。その他の実施形態では、Ｏ−結合グリコシル化配列は、天然に存在するポリペプチド及び外因性残基の配列内の残基を含んでなってもよく、外因性残基は、本明細書で開示されるＯ−結合グリコシル化配列を形成するような位置に挿入される。より詳細には、このようなＯ−結合グリコシル化配列は、内因性残基と外因性残基の双方で構成されてもよく、これらの残基は連続していても／していなくてもよい（例えば、．．．ＸＸＸＰＡＡＥＫＸＸＸ．．．（配列番号４２）の宿主配列は、ＡをＴで、ＫをＰで置換することで修飾されてもよい．．．ＸＸＸＰＴＡＥＰＸＸＸ．．．（配列番号４３））。
【００６１】
操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、約５アミノ酸長〜１５アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、約５アミノ酸長〜１０アミノ酸長であってもよい。操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、約５アミノ酸長〜６アミノ酸長であってもよい。
【００６２】
操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、定義された配列を有してもよい。この点において、Ｏ−結合グリコシル化配列は当技術分野で公知である。しかし、Ｏ−グリコシル化の天然制御は複雑であり、全ての場合／状況において、所与のＯＬＧＳとＯ−グリコシル化の存在との間に直接的な相関関係はない。理論によって制限されることは望まないが、宿主環境（例えば、特定のｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ発現、栄養素利用性など）と、単なるＯＬＧＳの遊離ＯＨ提示基の要件を超える複雑なタンパク質機能との精微な相互作用があるように見える。それにもかかわらず、１つ又は複数のＰｒｏ残基に近接するＳｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒの存在を特徴とする、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、ＯＨ基へのアクセス性が向上したねじれた構造の形成の結果として、Ｏ−グリコシル化の増加をもたらすように見える。理論によって制限されることは望まないが、−１及び＋３の位置（Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対して）はアミノ酸の選択（特定の残基を好む）に特に敏感であるように見え、当業者は、その他の位置を最適化することもまた重要であり、置換がその他の配列位置に依存性及び非依存性の双方であり得ることを理解するであろう。
【００６３】
本発明は、特に効率的なＯ−グリコシル化を提供する新規のＯ−結合グリコシル化配列を提供する。
【００６４】
このように、本発明はＯ−結合グリコシル化配列を含んでなる新規のポリペプチドを提供し、Ｏ−結合グリコシル化配列は、表１に記載されるものから選択された配列を含んでなる。
【００６５】
一実施形態では、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、表１に記載される配列を含んでなる。一実施形態では、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、表１に記載される配列から本質的になる。一実施形態では、操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、表１に記載される配列番号２〜１４に示される配列のいずれか１つからなる。
【００６６】
【表１】
2021506831.tif 000003
【００６７】
表１に記載されるＯ−結合グリコシル化配列は、Ｏ−グリカンタグの標識／修飾によってもたらされる特性を通じて、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドに有利な特性を付与してもよい。
【００６８】
本発明者らは、操作されたＯ−結合グリコシル化配列の存在が、タンパク質分解性切断を阻害するＯ−グリカンの存在を通じて、操作されたＯ−結合グリコシル化配列を含まない治療用タンパク質と比較して、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用タンパク質の半減期を延長する可能性を有することを示した（実施例２を参照されたい）。
【００６９】
代案としては、又はこれに加えて、操作されたＯ−結合グリコシル化配列の存在は、Ｏ−グリカンタグの存在を通じて、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドの流体力学的直径の変化をもたらしてもよい。
【００７０】
本明細書に記載される操作されたＯ−結合グリコシル化配列は、宿主の治療用ポリペプチド活性に実質的な有害効果を与えることなく、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドのＯ−グリカン修飾を正確に標的化する能力を提供する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、Ｏ−結合グリコシル化配列を含んでなるＯ−グリコシル化ポリペプチドを提供し、Ｏ−結合グリコシル化配列は表１に記載されるものから選択／誘導される配列を含んでなり、引き続くＯ−結合グリコシル化配列はＯ−グリカンに共有結合する。一実施形態では、Ｏ−グリコシル化ポリペプチドは、本明細書中の任意の箇所で定義される本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドの特徴を有する。本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドのコンジュゲート形態に関する以下の考察は、本Ｏ−グリコシル化ポリペプチドに等しく当てはまる。
【００７２】
Ｏ−グリコシル化用試薬
Ｏ−グリコシル化用試薬は、典型的に（ｉ）グリカン及び（ｉｉ）触媒的トランスフェラーゼ酵素を含む。異なるタイプの（ｉ）及び（ｉｉ）が典型的に組み合わされて異なるグリカン構造を生産し、多くのグリカンは成熟を達成するために、複数のタイプの（ｉ）及び（ｉｉ）を必要とする。細胞型によってもたらされるグリカンの特性は、（ｉ）及び（ｉｉ）の可用性／発現によって制御される。この環境は、当業者によって変更され得る。例えば、ＣＨＯ細胞は通常、Ｃｏｒｅ  １グリカン構造をもたらすが、これはグリカン飢餓若しくは触媒的トランスフェラーゼの過剰発現又はノックアウトによって変更されてもよい。
【００７３】
触媒的トランスフェラーゼ酵素は、その中で治療用ポリペプチドに含まれる操作されたＯ−結合型グリコシル化配列へのグリカンの転移が起こる、Ｏ−グリコシル化反応を触媒することが理解されるであろう。状況によっては、グリカンが脱保護、エピマー化、及び／又は活性化（例えばリン酸化／ヌクレオチド結合）酵素を必要とする場合があることが理解されるであろう。
【００７４】
一実施形態では、グリカンは、Ａｃ４ＧａｌＮＡｃなどの）細胞内取り込みを促進するＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮａｃ誘導体である。ＧａｌＮＡｃは、Ｏ−グリカンプロセシングで非常に優先的に使用されるために、有利である。
【００７５】
一実施形態では、グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ、フコース、キシロース、ガラクトース、シアル酸又はマンノースである。特定のグリカンの適切さは、トランスフェラーゼを決定する、細胞株及びそれが由来する種に依存する。特定のトランスフェラーゼを欠く細胞株では、これらは、例えば組換え技術を使用して外因的に導入されてもよい。
【００７６】
一実施形態では、Ｏ−グリカンは、官能基の付加又は置換によって修飾される。この官能基は、例えばクリックケミストリー反応などの引き続く反応に使用され得る反応基を提供してもよい。一実施形態では、Ｏ−グリカンはアジ化物官能基で標識される。別の実施形態では、官能基は直接的な利益を提供してもよく、このような官能基はこの効果を与える。一実施形態では、Ｏ−グリカンは、さらなる鎖延長を妨げるために保護される。天然再利用経路及びｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔに対してなおも受容性である、いくつかの成功裏のＯ−ＧａｌＮＡｃ誘導体の詳細は、（ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｃｂ２００５１１ｔ）にある。
【００７７】
１つ又は複数のＯ−グリカンの標識化は、任意の適切な方法を使用して実行されてもよい。例えば、マンノースをＮＡＮＡに変換するためのシアル酸経路などの細胞のグリカン生合成経路を使用することによって、修飾ポリペプチドの１つ又は複数のＯ−グリカンに、アジ化物が組み込まれてもよい（例えば、ＭａｎＮＡｚを供給すると、アジ化物標識されたシアル酸残基が生成する）。同様のアプローチが、ＧａｌＮＡｃ（又はＧｌｃＮＡｃ）経路の仲介のために用いられ得る。いくつかの実施形態では、Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ）などのＧａｌＮＡｃのアジド類似体、又はＮ−アジドアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｚ）などのＧｌｃＮＡｃのアジド類似体が、細胞培養培地（テトラアセチル化形態）に添加されてもよい。このような実施形態では、細胞は、治療用ポリペプチドに組み入れられた１つ又は複数のＯ−グリカンタグに、アジド含有残基を組み込む。
【００７８】
一実施形態では、アジ化物標識は、アジ化物含有化合物を細胞培養培地に添加することによって実行されてもよい。
【００７９】
別の実施形態では、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＡｃ４ＧｌｃＮＡｚなどのアジ化物含有前駆体が、細胞培地に添加されてもよい。このような基質は細胞の再利用経路を通じてプロセシングされるが、これは、Ｏ−グリカンプロセシングに対するより大きな特異性を有し、ひいてはより良い細胞成長及びタンパク質の品質／収率をもたらすことから、望ましい。
【００８０】
一実施形態では、誘導体化されたグリカンはＡｃ４ＧａｌＮＡｚである。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１５０μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも３００μＭ、少なくとも３５０μＭ、少なくとも４００μＭ、少なくとも４５０μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも５５０μＭ、少なくとも６００μＭ、少なくとも６５０μＭ、少なくとも７００μＭ、少なくとも７５０μＭ、少なくとも８００μＭ、少なくとも８５０μＭ、少なくとも９００μＭ、少なくとも９５０μＭ、少なくとも１０００μＭ、少なくとも２０００μＭ、少なくとも３０００μＭ、少なくとも４０００μＭ、又は少なくとも５０００μＭのＡｃ４ＧａｌＮＡｚが、細胞培養培地に添加される。
【００８１】
一実施形態では、触媒的トランスフェラーゼ酵素はポリペプチドＮ−アセトガラクトサミニルトランスフェラーゼである。
【００８２】
一実施形態では、触媒的トランスフェラーゼ酵素は、例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ２などのｐｐＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼファミリーのメンバーである。その他のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ酵素としては、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ７、及びＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０が挙げられる。これらの触媒的トランスフェラーゼ酵素は、例えば、レクチンドメインの欠失、又はレクチンドメインの修飾などで修飾されてもよい。これらの触媒的トランスフェラーゼ酵素は、外因性又は内因性であってもよい。所望の活性に応じて、それらは過剰発現され又はノックアウトされてもよい。
【００８３】
細胞株操作及び細胞培養条件は、どちらも方法の最適化に関連すると考えられる。ここで最適化は、タンパク質に組み込まれた修飾糖の高い相同的な収率で、組換えタンパク質の発現を改善することである。
【００８４】
一実施形態では、古典的なレロアール／新生経路ではなく再利用経路を通じて進行するように、Ｏ−グリコシル化を促進／強制するために、培養条件及び供給を操作し得る。再利用経路の使用は、生産されたＯ−グリコシル化治療用ペプチドに、より高レベルの均質性を提供する。いくつかの手段によって、再利用経路を通じた反応を強制することが可能である。細胞のグルコースを枯渇させると、基質の古典的な経路が奪われ、再利用経路が活性化され得る。別の実施形態では、再利用経路を促進することは、古典的経路を再利用経路に連結することに関与する酵素（例えば、ＧＡＬＥなどのイソメラーゼ酵素）のノックアウト又は阻害によって達成されてもよい。別の実施形態では、再利用経路の促進は、宿主タンパク質（例えば、トランスポーター、ホスホリラーゼ、及びウリジルトランスフェラーゼ酵素）をはじめとするが、これに限定されるものではない、再利用経路のＲＤＳを過剰発現することによって達成されてもよい。
【００８５】
糖構造の伸長
一実施形態では、導入されたＯ−グリカンは、グリカン構造の伸長を可能にする。グリカン構造の伸長は、完全に／部分的にシアル化されていてもされていなくてもよい、一般的なムチン型グリカン構造（Ｃｏｒｅ  １などの）を生じてもよい。代案としては、導入されたＯ−グリカンが修飾されて、ブロッキング基が組み込まれて伸長が妨げられ、又は特定のグリカン構造の形成が促進されて、例えば、Ｔｎ抗原からＣｏｒｅ  １構造への成熟が妨げられ、又はＣｏｒｅ  １エピトープのシアル化（修飾ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌ供給からの）が妨げられてもよい。
【００８６】
別の実施形態では、グリカンの伸長の防止が望ましい場合、伸長が防止されるように細胞酵素が操作されてもよい。例えば、シアル酸トランスフェラーゼ（及び他の特定のトランスフェラーゼ）のノックアウトによって。代案としては、細胞による糖の使用をグリカンの成熟ではなく維持及び成長に転用するために、例えばグルコースの供給を低減することによって、糖構造の伸長を促進しないように細胞培養培地が制御されてもよい。このような方法は、当業者に周知である。
【００８７】
発現条件（例えば資源／ストレスなどの細胞環境、及び例えば細胞型／種などの細胞遺伝形質遺産）は、異なる成熟Ｏ−グリカン構造をもたらすことが知られており、例えば、グルコース培地を供給されたＣＨＯ細胞は、好ましくはジシアル酸化されたＣｏｒｅ  １ムチン型Ｏ−グリカンを組み込む。当業者は、異なる細胞培養環境が適合化され、及び／又は細胞株が操作されて、Ｏ−グリコシル化配列に組み込まれ得る異なるＯ−グリカン構造が生成され得ることを知っている。異なる一次トランスフェラーゼ（例えば、異なる株又は生物種からのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ）が、異なる配列認識及びその他の初期の事象（増殖など）を惹起してもよいこともまた、理解されるであろう。タンパク質機能を強化する（例えば、アミド化を改善し又はＮ−グリコシル化を制限する）ために、細胞株／条件をその他の目的のために操作してもよいこともまた予期される。
【００８８】
Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲート
なおも別の態様では、さらなる分子がＯ−グリカンに付着されて、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートが形成され得る。したがって、本発明は、上記で定義されたとおりのＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを含んでなる、Ｏ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを提供し、さらなる分子ＭはＯ−グリカンに共有結合される。
【００８９】
なおも別の態様では、さらなる分子がＯ−グリカンに付着されて、式：
Ｐ−（Ｏ−グリカン）−Ｍ
を含んでなるＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートが形成され得て、
式中、Ｐは操作された組換え治療用ポリペプチドを表し、ＭはＰに結合することが望ましい分子を表す。したがってＯ−グリカンは、ＰとＭとの間の連結基の役割を果たす。
【００９０】
なおも別の態様では、本発明は、式：
Ｐ−（Ｏ−グリカン）−Ｍ
を含んでなるＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドコンジュゲートを生産する方法を提供し、
式中、Ｐは発明の操作された組換え治療用ポリペプチドを表し、ＭはＰに結合することが望ましい分子を表す。方法は、
（ｉ）本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドを提供するステップと；
（ｉｉ）ＭをＯ−グリカンに共有結合させるように、Ｏ−グリカンをＭと反応させるステップと
を含んでなる。
【００９１】
Ｏ−グリカンは、ＭとＯ−グリカンを連結させるために、Ｍの反応基と反応できる反応基を有しなくてはならないことが理解されるであろう。このような結合は、クリックケミストリー反応を通じて形成されてもよい。クリックケミストリーは、優れた選択性、効率、及び生体直交（ｂｉｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）適合性を提供する（いくつかの一般的なクリックケミストリーについては１０．１０３９／Ｂ６１３０１４Ｎを参照されたい）。一実施形態では、反応は、アジ化物−アルキンカップリング反応を含んでなる（生体直交反応としてのＣｕフリークリックの例については１０．１０２１／ａｒ２００１４８ｚを参照されたい）。
【００９２】
反応工程のためのその他の適切なカップリング反応としては、求核置換（例えば、アミン及びアルコールと、ハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、炭素−炭素及び炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス・アルダー付加）などのバイオコンジュゲーションの当技術分野で公知のものが挙げられる。カップリング反応への参加には、以下に列挙されるような反応基が存在することが望ましい：
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｔｒｉａｚｏｌｅ）エステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、及び芳香族エステルをはじめとするが、これに限定されるものではない、カルボキシル基及びそれらの種々の誘導体；
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換され得る、ヒドロキシル基；
（ｃ）ハロゲン化物が後に、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルバニオン、又はアルコキシドイオンなどの求核基で置換され、その結果、ハロゲン原子の官能基における新しい基の共有結合がもたらされ得る、ハロアルキル基；
（ｄ）例えば、マレイミド基などのディールス・アルダー反応に参加できる、求ジエン体基；
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン又はオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を通じて、又はグリニャール付加又はアルキルリチウム付加などの機序を通じて、引き続く誘導体化を可能にするような、アルデヒド又はケトン基；
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するための引き続くアミンとの反応のための、ハロゲン化スルホニル基；
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換され、又はハロゲン化アシルと反応し得る、チオール基；
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化又は酸化型であり得る、アミン又はスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば、付加環化、アシル化、マイケル付加などを被り得る、アルケン；及び
（ｊ）例えば、アミン及びヒドロキシル化合物と反応し得る、エポキシド。
【００９３】
Ｍは、例えば、別の治療用ポリペプチド、Ｆｃドメイン、細胞毒、例えばフルオロフォアなどの標識、脂質、例えばＰＥＧ又はナノ粒子などの小分子のような、任意の共役可能な分子を含んでなってもよい。
【００９４】
Ｍは、Ｏ−グリカンとのカップリング反応への参加に適した反応基（例えば、アルキン基）を有する必要があることが理解されるであろう。分子Ｍへのアルキンなどの反応基の付加は、当業者の能力の範囲内であると考えられる。
【００９５】
コンジュゲーションには、架橋剤の使用を伴ってもよい。好ましい架橋試薬は、種々のゼロ長及び非ゼロ長（例えば、ＰＥＧｘスペーサー）、ホモ二官能性、及びヘテロ二官能性の架橋試薬に由来する。好ましいホモ及びヘテロ二官能性試薬は、それぞれ、アジ化物、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、又は非特異的基などに対して反応性であってもよい、２つの同一又は２つの異なる部位を含み、一般に、Ｏ−グリカンの部位におけるより広範な潜在的な化学物質の使用を可能にする。
【００９６】
場合によっては、ＭをＯ−グリカンにカップリングさせるのに必要な反応基を提供するために、例えば、
ステップ１：Ｍ’＋マレイミド−リンカー−アルキン→Ｍ’−リンカー−アルキン
ステップ２：Ｍ’−リンカー−アルキン＋Ｐ−（Ｏ−グリカン）→Ｐ−（Ｏ−グリカン）−リンカー−Ｍ
など、最初にＭをリンカー基と反応させる必要があることがある。
【００９７】
その他の場合には、リンカーを介してＰ−（Ｏ−グリカン）をＭにカップリングさせるのに必要な反応基を提供するために、例えば、
ステップ１：Ｐ−（Ｏ−グリカン）’＋アルキン−リンカー−マレイミド→Ｐ−（Ｏ−グリカン）’−リンカー−マレイミド
ステップ２：Ｐ−（Ｏ−グリカン）’−リンカー−マレイミド＋Ｍ）→Ｐ−（Ｏ−グリカン）−リンカー−Ｍ
など、最初にＰ−（Ｏ−グリカン）をリンカー基と反応させる必要があることがある。
【００９８】
異なるＧａｌＮＸ供給物の使用を通じてリンカーの使用を回避することが望ましいと想定される一方で、細胞が供給物の非天然グリカンを処理する必要がないことから、リンカーの使用は収率及び効率を高める可能性がある。リンカーの使用は、バイオ精製中又は同時精製中のどちらででもコンジュゲートできるという利点もまた提供してもよい。
【００９９】
一実施形態では、Ｐ−（Ｏ−グリカン）−Ｍが抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を表すように、Ｐは抗体を含んでなり、Ｍは細胞毒を含んでなる。一実施形態では、ＡＤＣが式、Ｐ−［（Ｏ−グリカン）−Ｍ］ｚ（式中、ｚ＞１であり、ｚは約２、約４、約６又は約８であってもよい）を有するように、２つ以上の操作されたグリコシル化配列がＯ−グリコシル化治療用ポリペプチド中に存在する。
【０１００】
上記のように、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、化学合成反応などのさらなる反応の基質として使用されてもよい。例えば、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、クリックケミストリー反応で使用されてもよい。
【０１０１】
本明細書の用法では、「クリックケミストリー」という用語は、熱力学的駆動力が高く、副産物／廃棄物も可逆性もほとんどない基質を結合する反応のクラスを指すために使用される。クリックケミストリー反応は、迅速且つ高い反応特異性で起こり得る、「ワンポット」、「銅フリー」反応において、高収率の反応生成物を提供し得る。クリックケミストリーの生体適合性は産業界では特に重要であり、穏和な反応条件及び低い受容者毒性をはじめとするさらなる利点を提供する。操作された部位で発生するように設計されたクリック反応の特異性及び選択性は、オフサイトの宿主反応性を予防する。
【０１０２】
クリックケミストリーを用いて、アジ化物官能基をアルキン官能基とコンジュゲートしてもよい。これは、古典的に、Ｃｕ（Ｉ）−ＣｕＡＡＣ（Ｃｕ触媒されるアジ化物アルキン付加環化）によって触媒される、ヒュスゲン１，３−双極子付加環化を伴う。より最近では、これはＣｕ非含有反応を伴うように成熟し、これは細胞毒性が低下するために生体適合性がより高い。例としては、ＣｕＡＡＣとほぼ等しい反応性及び安定性がある協調［３＋２］付加環化である、ひずみ促進アジ化物−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）が挙げられる。さらに反応性の高いクリックケミストリーが利用可能であり、新しく発見されたクリックケミストリーもまた本発明の範囲に包含される（異なるコンジュゲーション効率についての優れた実証は、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｃｒ４００３５５ｗを参照されたい）。
【０１０３】
例えば、可能な薬物送達機序としての生体内クリック反応は、テトラジン−ＴＣＯカップリングなどの、より反応性の高い化学に依存してもよい（ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｃｒ４００３５５ｗを参照されたい）。別の実施形態では、本発明の範囲には、天然宿主酵素であれ、又は例えば、非クリックケミストリー若しくは既に機能的である基などの変更された特性を予測して導入され若しくは操作された非天然酵素であれ、酵素代謝プロセスを通じてＯ−グリコシル化配列に組み込まれ得る任意の基が含まれる。このような実装された設計は、新規の酵素を必要とする。
【０１０４】
アジ化物部分で標識された本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、クリックケミストリー反応に適してもよいことが理解されるであろう。例えば、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、１つ又は複数のＯ−グリカンへのアジ化物官能基の結合によって修飾されてもよい。このようなタンパク質は、アルキン官能基を含む基質とのクリックケミストリー反応を受けてもよい。このようなコンジュゲーションは、非常に特異的且つ不可逆的である。
【０１０５】
したがって、アジ化物官能基で標識された本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドは、アルキン官能基を含む基質と反応させてもよい。アルキン官能基を含む基質は、本発明のＯ−グリコシル化組換え治療用ポリペプチドにコンジュゲートさせるのに望ましい任意の基質であってもよい。代案としては、この配置は逆転され得て、Ｏ−グリカンが遊離アルキンを提示し、基質が遊離アジ化物を提示してもよい。
【０１０６】
宿主細胞株
操作された治療用ポリペプチドの発現には、任意の適切な宿主細胞を使用してもよいことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、操作された治療用ポリペプチドは、哺乳類細胞株で発現される。例えば、操作された治療用ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞株が使用される。その他の実施形態では、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３ＴなどのＨＥＫ細胞株が使用される。
【０１０７】
特に適切な細胞株は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの新規合成に関与するエピメラーゼのノックアウトを含み、したがって再利用経路に有利に働く、ＣＨＯ  ｌｄｌＤ細胞であろう。
【０１０８】
別の特に適切な細胞株は、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ（ＧＡＬＥ）遺伝子のノックアウトを含むＨＥＫ細胞であろう。例えば、Ｔｅｒｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ１２（６）：ｅ０１７９９４９に記載されるようなＨＥＫ２９３ＴＧＡＬＥ  ＫＯ細胞。
【０１０９】
細胞株が哺乳類細胞株でないいくつかの実施形態では、その他の生産系（例えば、昆虫細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が使用されてもよい。これらは、このような細胞型を適切なＯ−グリカン供給系に変換するために、外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）酵素の同時発現を必要としてもよいことが理解されるであろう。このような方法は、当技術分野で周知である。
【０１１０】
宿主細胞株は、組換えベクターで一過性に又は安定して形質移入されてもよいことが理解されるであろう。
【０１１１】
疾患の治療又は予防
本発明は、本発明の上記製品のいずれかを患者に投与するステップを含んでなる、患者において疾患を治療又は予防する方法を提供する。
【０１１２】
本発明は、薬剤として使用するための本発明の上記製品のいずれかを提供する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、本発明の上記製品の第２の医学的使用を提供する。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、本発明の上記製品のいずれかを含んでなる医薬組成物を提供する。
【０１１５】
上記の実施形態は、例示的な例として理解されるべきである。さらなる実施形態が想定される。任意の一実施形態に関して記載される任意の特徴は、単独で又は記載されるその他の特徴と組み合わせて使用されてもよく、任意のその他の実施形態又は任意のその他の実施形態の任意の組み合わせの１つ又は複数の特性と組み合わせて使用されてもよいものと理解される。さらに、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を逸脱することなく、上に記載されない等価物及び修正物もまた使用されてもよい。
【０１１６】
本開示の文脈において、本明細書に記載される装置及び方法のその他の例及びバリエーションは、当業者には明らかであろう。その他の実施例及びバリエーションは、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の範囲内である。
【実施例】
【０１１７】
実施例１：Ｏ−結合グリコシル化配列の開発
サイモシン−β４タンパク質からの短いアミノ酸配列は、サイモシン−β４：リンカー：Ｆｃ融合タンパク質としてＮ末端に存在する場合、Ｏ−グリコシル化をもたらすことが分かった。融合タンパク質中サイモシン−β４アミノ酸配列は、次のようである：
【化１】
2021506831.tif 000004
次にサイモシン−β４配列の最後の１９アミノ酸（下線で示される）をＧＬＰ−１：Ｆｃ−融合タンパク質に組み込んで、存在するＯ−グリカンの量を測定した。次に、分子を最適化した。最適化には、アミノ酸残基の数の低減、及びアミノ酸残基の交換が含まれた。最適化された配列及びその結果を表２に示し、野生型ＴＢ４、配列ＰＬＰＴＡＥを含む融合タンパク質（配列番号９）、及び配列ＡＴＡＥＰを含む融合タンパク質（配列番号１３）のグリコシル化プロファイルを図１に示す。
【０１１８】
表２及び図１から見て分かるように、いくつかの配列が高いＯ−グリコシル化をもたらし、融合タンパク質は、単一グリカン（例えば、ＰＬＰＴＡＥ（配列番号９））又は複数のグリカン（例えば、ＡＴＡＥＰ（配列番号１３））を主に含むが、Ｏ−結合グリコシル化部位の変化の効果は、完全には予測可能でない。
【０１１９】
【表２】
2021506831.tif 000005
【０１２０】
実施例２：Ｏ−グリカン特性評価
次に、実施例１からの配列の選択をさらに特性評価した。
【０１２１】
グリコフォーム及びシアル化レベル
質量分析法を用いて、ＣＨＯ又はＨＥＫ細胞のどちらかで発現された際の融合タンパク質における、存在するグリコフォームとシアル化レベルとを決定した。結果を図２に示す。
【０１２２】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ
ＳＥＣ−ＭＡＬＳを用いて、融合タンパク質の物理化学的特性を測定した。結果を図３に示す。
【０１２３】
齧歯類ＰＫ研究
ｈＧＬＰ−１Ｒ細胞を用いたＨＴＦＲｃＡＭＰアッセイを使用して、融合タンパク質の薬物動態特性をラットにおいて測定し、コンストラクト半減期を判定した。図４から見て分かるように、配列ＰＬＰＴＡＥ（配列番号９）を含む融合タンパク質は、野生型よりも若干短い半減期を有し、配列ＡＴＡＥＰ（配列番号１３）を含む融合タンパク質は、野生型より長い半減期を有した。
【０１２４】
ペプチド活性
最後に、いくつかの融合タンパク質上でペプチド活性を測定した。結果を図５に示す。図から分かるように、変更された配列の存在は、機能への影響が少ない。
【０１２５】
実施例３：Ｏ−グリカンタグ付きペプチドのアジ化物標識
Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ（及び継代に存在するグルコースのみ、補足なし）を含有する培養培地中で、ＰＴＡＥＰＧ（配列番号４１）Ｏ−グリコシル化配列がある組換えＦｃタンパク質を一過性に発現するＣＨＯ細胞を３７℃で７２時間培養した。増加する濃度のＡｃ４ＧａｌＮＡｚ中で培養された細胞のグリカンＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｚの百分率占有率を測定し、結果を図６に示す。図６から見て分かるように、融合タンパク質を一過性に発現するＣＨＯ細胞のＡｃ４ＧａｌＮＡｚ供給は、高レベルのＧａｌＮＡｚ取り込みをもたらす。
【０１２６】
さらなる実験では、細胞を異なる環境条件（収穫までの時間及び温度）でインキュベートし、Ｏ−グリカンプロファイルを測定した。ここで観察したのは、標識された糖が有利に組み込まれるように、培養プロセスをさらに最適化する手段である。これは、グルコース飢餓成長状態において、再利用経路の使用を好む細胞に起因する可能性が高い。グルコース及び標識剤について飢餓状態の細胞は、Ｏ−グリカンをほとんど発現せず、グリカンプロセシングに対する栄養素利用性の重要な役割が示される（予期される必須プロセスへのグルコースの転用）。さらに、これらの結果は、温度などの細胞培養条件を変更することによって、ＧａｌＮＡｚ標識を調節することが可能であることを実証する。我々は、再利用経路の使用に対するＣＨＯ細胞の優先度もまた観察する（例えば、グルコース飢餓などの特定条件下における）。またＣＨＯ細胞の特徴的な発現パターン（例えば、Ｃｏｒｅ  １の発現のみに対する優先度、これは細胞がグルコース除去によってストレス下にある場合の非シアル化形態に限定される）。
【０１２７】
実施例４：クリックケミストリー：アルキン基の付加
Ｆｃタンパク質へのＧａｌＮＡｚ標識の成功裏の組み込みに続いて、次にＧａｌＮＡｚ標識されたタンパク質上にアルキン基（例えば、ＤＢＣＯ又はＤＩＢＯ）を含む部分を「クリック」する実験を実施した。
【０１２８】
図７の第１のパネルには、グリカンが組み込まれていないＦｃ、Ｏ−グリカンがあるＦｃ（「標識なし」）、及びＧａｌＮＡｚがあるＦｃ（「標識あり」）に対応する、３つのピークがある。
【０１２９】
図７の第２のパネルはリンカーの付加に続くピークを示し、第３のパネルはアルキン基を含む部分の付加に続くピークを示す。ＧａｌＮＡｚを含まないＦｃ及びＧａｌＮＡｚ標識されたＦｃに対応するピークに加えて、アルキン基を含む部分のアルキン基と「クリック」されたＧａｌＮＡｚ標識されたＦｃに対応するピークもまたある。
【０１３０】
実施例５：クリックケミストリー：二官能性架橋剤とのコンジュゲーション
ヘテロ二官能性架橋剤；Ｆｃ−スキャフォールド＋ペプチドコンジュゲーション
コンジュゲーションには、ヘテロ二官能性架橋剤（ＤＢＣＯ−マレイミド及びＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）の使用が含まれる。精製することなくワンポット様式で、ＳＰＡＡＣと一緒にマレイミド補完ペプチド（遊離チオールを提示する）を使用した（１：４：１６のアジ化物／アルキン−マレイミド／フリー−チオール）。これは、良好なレベルのコンジュゲーション効率を提供した。
【０１３１】
ホモ二官能性架橋剤；Ｆｃ−スキャフォールド二量体
コンジュゲーションには、ホモ二官能性架橋剤（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）を介したＯ−ＧａｌＮＡｚを提示するＦｃ−スキャフォールドの二量体化が関与した。ＳＰＡＡＣは、リンカーが過剰で固定化されていない場合でさえも、コンジュゲートされた化学種を成功裏に生成した。
【０１３２】
実施例６：ＣＨＯ  Ｋ１  ＧＡＬＥ  ＫＯ中のＯ−グリカンタグ付きペプチドのアジ化物標識
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を用いて、ＣＨＯ  Ｋ１  ＧＡＬＥノックアウト細胞を生成した。ＣＨＯ  ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ＧＡＬＥ；ＮＷ＿００３６２２９３８．１）を標的化して、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を構築した。簡潔に述べると、ＨＡＭのＦ１２培地中で培養されたＣＨＯ  Ｋ１  細胞に、５’−ｃｃａｃａｃｇｇｔａｃｔｇｇａｇｃｔｇｃ−３’（エクソン２）、５’−ｇｔａｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｇｇａｇｇｃ−３’（エクソン２）、及び５’−ｃｇｇｃｇｇｇｔｃｃａｇｇａａｃｔｇａｃ−３’（エクソン３）の３つのｇＲＮＡを同時形質移入し、このプラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ形質移入細胞の同定のためのＲＦＰレポーター遺伝子もまた発現する。ＦＡＣＳベースの選別によって、ＲＦＰ陽性細胞を単一細胞クローンに選別した。次にウエスタンブロット分析によって、クローンをＧＡＬＥ  ＫＯについてスクリーニングした。
【０１３３】
ＣＨＯ  Ｋ１  ＧＡＬＥＫＯＦｃ−ＰＴＡＥＰＧ発現細胞を、Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧを含むレンチウイルス粒子を用いたＣＨＯ  Ｋ１  ＧＡＬＥ  ＫＯ細胞の形質導入によって作製した。市販の第三世代統合レンチウイルスベクターを使用して、Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧレンチウイルス粒子を作製した。哺乳類選択剤ピューロマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を同時発現するレンチウイルスベクターの発現カセットに、Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧタンパク質をクローニングした。どちらの遺伝子も、高発現サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあった。Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧ発現細胞のプールは、２週間にわたる１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン中の細胞選択後に単離した。Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧタンパク質の標識化のために、補給剤を含有しない、若しくは７５μＭのＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｚのいずれかを含有する、無血清培地中で、ＣＨＯ  Ｋ１  Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧ細胞を４日間インキュベートした。上記のように作製されたＣＨＯ  Ｋ１ｗｔ  Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧ細胞プールが、対照として機能した。タンパク質を細胞培地から精製した。ＰＮＧａｓｅＦを使用してタンパク質を脱Ｎ−グリコシル化し、ジスルフィド還元がそれに続き、ＵＰＬＣ及びＱＴｏＦ質量分析法を使用してＬＣ−ＭＳで分析した（図８）。
【０１３４】
実施例７：ＨＥＫ２９３Ｆ  ＧＡＬＥ  ＫＯ中のＦｃとＩｇＧの融合の文脈におけるＯ−グリカンタグ付きペプチドのアジ化物標識
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株は、懸濁培養中で増殖するＨＥＫ２９３細胞のクローン変異型であり、一過性形質移入後に、高い細胞密度及び高い組換えタンパク質収率を達成し得る。効率的なＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９仲介遺伝子ノックアウトを達成することは、懸濁培養中では困難である。したがって、高レベルの遺伝子ノックアウトを保証する以下の手順が考案された。ポリ−Ｄ−リジン処理細胞培養プレート内において、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で細胞を培養することによって、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を接着性にした。次に接着性ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、ヒトＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ遺伝子（ＧＡＬＥ；ＮＣ＿０００００１．１１）を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを形質移入した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、５’−ｇｔａｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｇｇａｇｇｃ−３’（エクソン３）及び５’−ｃｇｇｃｇｇｇｔｃｃａｇｇａａｃｔｇａｃ−３’（エクソン４）の２つのｇＲＮＡを同時形質移入し、このプラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ形質移入細胞の同定のためのＲＦＰレポーター遺伝子もまた発現する。ＦＡＣＳベースの選別によって、ＲＦＰ陽性細胞を単一細胞クローンに選別した。ウエスタンブロット分析によって、クローンをＧＡＬＥ  ＫＯについてスクリーニングした。ＨＥＫ２９３Ｆ  ＧＡＬＥ  ＫＯクローンを同定した後、細胞を懸濁培養に再適応させて、最終的な懸濁ＨＥＫ２９３Ｆ  ＧＡＬＥ  ＫＯ細胞株を作製した。懸濁培養への迅速な再適応は、１週間にわたり培養培地のＦＢＳ濃度を１０％、５％から２％に順次低下させ、その後、通常の培養のためのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中の１ｘ１０６細胞／ｍｌで、振盪フラスコに細胞を直接接種することによって達成した。
【０１３５】
ＨＥＫ２９３Ｆ  ＧＡＬＥ  ＫＯ細胞に、Ｆｃ又はＰＴＡＥＰＧ（配列番号４１）Ｏ−グリコシル化配列を有するＩｇＧタンパク質のどちらかを発現するプラスミドを一過性に形質移入した。細胞は、５０μＭのＡｃ４ＧａｌＮａｚを条件付きで補足したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培養培地中で、３７℃で５日間培養した。タンパク質を細胞培地から精製し、ＧａｌＮＡｚ含有タンパク質を室温においてＰＢＳ中で、ＡＦ４８８−ＤＢＣＯの２倍のモル濃度アクセスを使用したクリックケミストリー反応（クリックケミストリーツール＃１２７８）に供した。実施例６に記載されるように、ＬＣ−ＭＳを使用してタンパク質を分析した（図９ａ及び図９ｂ）。
【０１３６】
ＦＡＣＳ分析のために、細胞受容体Ａを標的化するヒトＩｇＧ１抗体（ＩｇＧ−Ａ−ＰＴＡＥＰＧ）を使用した。ＦＡＣＳ分析のための細胞の免疫蛍光染色は、次のように実施した：Ｆｃ受容体をブロックするｍＡｂと１０％ＦＢＳとの溶液中で細胞をインキュベートすることによって、受容体Ａを発現する細胞への非特異的結合をブロックした。次に、「クリック」ケミストリーによって作製された受容体Ａ特異的ＩｇＧ１−Ａ−ＰＴＡＥＰＧ−ＡＦ４８８又はクリックケミストリーによって作製された対照Ｆｃ−ＰＴＡＥＰＧ−ＡＦ４８８と共に、ブロックされた細胞を１０μｇ／ｍｌの濃度で２０分間インキュベートした。過剰な染色を洗い落とし、標準プロトコルを用いて、細胞上の受容体発現のＦＡＣＳ分析を実施した（図１０）。
【図１】
2021506831.tif 000006
【図２】
2021506831.tif 000007
【図３】
2021506831.tif 000008
【図４】
2021506831.tif 000009
【図５】
2021506831.tif 000010
【図６】
2021506831.tif 000011
【図７】
2021506831.tif 000012
【図８ａ】
2021506831.tif 000013
【図８ｂ】
2021506831.tif 000014
【図９ａ】
2021506831.tif 000015
【図９ｂ】
2021506831.tif 000016
【図１０】
2021506831.tif 000017
【配列表】
2021506831000001.app
【国際調査報告】
2021506831.tif 000018
2021506831.tif 000019
2021506831.tif 000020
2021506831.tif 000021
2021506831.tif 000022