(57)【要約】ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態の処理および／または予防に使用するためのロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）および／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤に関する。好ましくは、ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態が乾癬または皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎である。本発明はさらに、ケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定する方法に関し、前記方法は（ａ）ケラチノサイトを試験化合物と接触させ、前記ケラチノサイトにおけるＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量を決定する工程と、（ｂ）工程（ａ）において決定されたＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量を、前記試験化合物と接触させていない対照中のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量と比較する工程とを含み、ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量の変化が、前記試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す。さらに、本発明はケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定する方法に関し、この方法は（ａ）ケラチノサイトを試験化合物と接触させる工程と、前記ケラチノサイト中に（１つまたは複数の）ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性を決定する工程と、（ｂ）工程（ａ）で決定された活性を、前記試験化合物と接触させていない対照中の活性と比較する工程とを含み、ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後の、（ａ）ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性の変化は、試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す。本発明はさらに、皮膚損傷および創傷治癒障害から選択される皮膚状態の処理および／または予防に使用するためのロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）の阻害剤、ならびに罹患個体の皮膚の外見に対する皮膚状態の影響を軽減するための美容方法に関し、この方法は、（ｉ）ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）；（ｉｉ）ＬＲＲＣ８Ａの活性化剤；（ｉｉｉ）ＬＲＲＣ８ＡおよびＬＲＲＣ８Ａの活性化剤；または（ｉｖ）ＬＲＲＣ８Ａの阻害剤の有効量を局所投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態の処理および／または予防に使用するための、ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）、および／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤。
【請求項２】
ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態が、表皮増殖の増強を特徴とする状態である、請求項１に記載の使用のためのＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤。
【請求項３】
ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態が乾癬または皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の使用のためのＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤。
【請求項４】
活性化剤が、
（ｉ）発現可能な形態でＬＲＲＣ８Ａをコードするベクター；または
（ｉｉ）内因的に存在するＬＲＲＣ８Ａの発現をアップレギュレートする遺伝子発現のレギュレーターである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのＬＲＲＣ８Ａの活性化剤。
【請求項５】
内因的に存在するＬＲＲＣ８Ａの発現をアップレギュレートする遺伝子発現のレギュレーターが、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースのレギュレーター；（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ベースのレギュレーター；（ｉｉｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されるプログラム可能な配列特異的ゲノム編集ヌクレアーゼ；（ｉｖ）メガヌクレアーゼ；（ｖ）小分子；（ｖｉ）抗体または抗体模倣物；（ｖｉｉ）アプタマー；および（ｖｉｉ）ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸分子から選択される阻害性核酸分子から選択される、請求項４（ｉｉ）に記載の使用のためのＬＲＲＣ８Ａの活性化剤。
【請求項６】
ケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定する方法であって、
（ａ）ケラチノサイトを試験化合物と接触させ、前記ケラチノサイト中のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写産物の量を決定する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で決定されたＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写産物の量を、前記試験化合物と接触させていない対照中のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写産物の量と比較する工程
とを含み、
ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写産物の量の変化が、前記試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す方法。
【請求項７】
ケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定する方法であって、
（ａ）ケラチノサイトを試験化合物と接触させ、前記ケラチノサイト中にＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性を決定する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で決定された活性を前記試験化合物と接触させていない対照中の活性と比較する工程
とを含み、ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性の変化が、前記試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す方法。
【請求項８】
ケラチン１（ＫＲＴ１）、ケラチン１０（ＫＲＴ１０）、インボルクリン（ＩＶＬ）、フィラグリン（ＦＬＧ）、ロリクリン（ＬＯＲ）、ケラチン４（ＫＲＴ４）、ケラチン１５（ＫＲＴ１５）、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７（Ｓ１００Ａ７）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（Ｓ１００Ａ９）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、小プロリンリッチタンパク質２Ｃ（ＳＰＲＲ２Ｃ）、小プロリンリッチタンパク質２Ｄ（ＳＰＲＲ２Ｄ）、セルピンファミリーＢメンバー３（ＳＥＲＰＩＮＢ３）、セルピンファミリーＢメンバー４（ＳＥＲＰＩＮＢ４）、ペプチダーゼ阻害剤３（ＰＩ３）、リポカリン２（ＬＣＮ２）、ケラチン６Ａ（ＫＲＴ６Ａ）、ケラチン１６（ＫＲＴ１６）、β−デフェンシン１（ＤＥＦＢ１）および増殖マーカーＫｉ−６７（ＭＫＩ６７）から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルを決定することをさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量の増加および／またはケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性の増加が、試験化合物がケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態の処理および／または予防に使用するのに適した化合物であることを示す、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態が乾癬または皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）の阻害剤であって、皮膚損傷および創傷治癒障害から選択される皮膚状態の処理および／または予防に使用するための阻害剤。
【請求項１２】
（ｉ）阻害剤がＬＲＲＣ８Ａの発現を減少させる；および／または
（ｉｉ）阻害剤がＬＲＲＣ８Ａを含む容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）の活性を減少させる、
請求項１１に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１３】
ＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤、または阻害剤が医薬組成物中に含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤、または請求項１１または１２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１４】
ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写産物の量の減少および／またはケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性の減少が、試験化合物が皮膚損傷および創傷治癒障害から選択される皮膚状態の処理および／または予防における使用に適した化合物であることを示す、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
個体の皮膚を処理するための化粧方法であって、
（ｉ）ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）；
（ｉｉ）ＬＲＲＣ８Ａの活性化剤；
（ｉｉｉ）ＬＲＲＣ８ＡおよびＬＲＲＣ８Ａの活性化剤；または
（ｉｖ）ＬＲＲＣ８Ａの阻害剤
の有効量を局所的に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態の処理および／または予防に使用するためのロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）および／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤に関する。好ましくは、ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態が乾癬または皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎である。本発明はさらに、ケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定する方法であって、（ａ）ケラチノサイトを試験化合物と接触させ、前記ケラチノサイト中のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量を決定する工程；および（ｂ）工程（ａ）において決定されたＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量を、前記試験化合物と接触させていない対照中のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量と比較する工程を含み、ここで、ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量の変化は、前記試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す、方法に関する。さらに、本発明は、ケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定する方法に関し、方法は、（ａ）ケラチノサイトを試験化合物と接触させ、前記ケラチノサイト中のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性を決定する工程、および（ｂ）前記試験化合物と接触させていない対照中の活性と工程（ａ）で決定された活性を比較する工程を含み、ここで、ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性の変化は、試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す。本発明はさらに、皮膚損傷および創傷治癒障害から選択される皮膚状態の治療および／または予防に使用するためのロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）の阻害剤、ならびに罹患個体の皮膚の外観に対する皮膚状態の影響を緩和するための美容方法に関し、この方法は、有効量の（ｉ）ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）；（ｉｉ）ＬＲＲＣ８Ａの活性化剤；（ｉｉｉ）ＬＲＲＣ８ＡおよびＬＲＲＣ８Ａの活性化剤；または（ｉｖ）阻害剤のＬＲＲＣ８Ａを局所投与することを含む。
【０００２】
本明細書では、特許出願及び製造業者のマニュアルを含む多くの文献が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられないが、その全体は本明細書に参照により援用される。より具体的には、全ての参照文書は、各個々の文書が参照により援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により援用される。
【０００３】
ヒトの皮膚の主な防御機能は、分化している数層のケラチノサイトからなる表皮によって達成される。健常表皮のホメオスタシスを維持するために、ケラチノサイトは増殖している基底細胞から徐々に有棘層、顆粒層、角質層に発達する。この分化過程には、ケラチノサイトの劇的な形態学的および機能的変化につながる秩序立った遺伝子発現変化が関与している。このケラチノサイトの増殖と分化の均衡は健常皮膚では厳密に調節されているが、乾癬やアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患では乱されている。
【０００４】
ヒトの表皮は、有害な環境の影響に対して重大なバリアを形成するだけでなく、皮膚の水分ホメオスタシスにおいても基本的な働きをしている。すなわち、経表皮的水分喪失を防止することにより体の水和状態の維持に寄与し、環境浸透圧変動から保護する（文献１）。しかし、乾癬、アトピー性皮膚炎または湿疹のようなある種の疾患では表皮バリア機能が損なわれ、その下にある表皮ケラチノサイトが浸透圧ストレスの直接の標的となる（文献２）。
【０００５】
乾癬は、赤色鱗屑を呈する慢性炎症性皮膚疾患であり、大部分は頭部、体幹、腕や脚の伸展部位に発症し、身体的、精神的負担を伴う。症状には、痛み、かゆみ、出血などがある。疾患の重症度は、メタボリックシンドロームまたは心血管疾患のような併存疾患によってしばしば増加する（文献３）。Psoriasis Area and Severity Index （ＰＡＳＩ）スコアは、紅斑、浸潤または厚みの程度、鱗屑および病変の範囲を推定することにより、疾患の重症度を定量化するために用いられる。最大７２に達することができ、１０を超えるＰＡＳＩは中等度から重度と考えられる。
【０００６】
種々のin vitro乾癬モデルが知られており、乾癬における分子および細胞レベルでのシグナル伝達経路、転写調節、炎症、分化および増殖を研究するために一般的に使用される（文献４−６）。さらに、これらのモデルは、乾癬の治療のための新しい化合物または治療法の効果を判断するためにも使用することができる。典型的には、このようなモデルは、正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）を、例えばＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７を含む乾癬サイトカインのカクテルで処理し、それによって乾癬に特徴的なケラチノサイトの異常な分化を誘導することによって生成される。前記異常分化の正常化は、例えば関連化合物による治療後に、既知の分化マーカーの発現レベルの変化に基づいて典型的に分析される。したがって、前記化合物で処理されなかったin vitro乾癬モデルケラチノサイトにおけるそれらの発現レベルと比較したマーカーであるケラチン１（ＫＲＴ１）、ケラチン１０（ＫＲＴ１０）、フィラグリン（ＦＬＧ）またはロリクリン（ＬＯＲ）の発現増加は、典型的には、異常な分化の正常化を示すと考えられる。
【０００７】
乾癬は、皮膚のＴ細胞、好中球、マクロファージおよびケラチノサイトなどの複数の細胞型に影響を及ぼす。疾患の重症度の違いや患者間のばらつきのため、さらなる複雑性が生じる。これらの複雑さにもかかわらず、乾癬ケラチノサイトおよび乾癬のin vitroケラチノサイトモデルにおいて一般的に影響を受ける一連の遺伝子を、公表されているトランスクリプトーム研究からマーカー遺伝子として抽出することができる（文献５，７）。この一連の遺伝子には、Ｓ１００Ａグループ（例：Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９）、ＣＸＣＬ遺伝子（例：ケモカインＣＸＣＬ１またはＣＸＣＬ８／ＩＬ−８）、小プロリンリッチタンパク質２グループ（例：ＳＰＲ２ＣまたはＳＰＲ２Ｄ）、セルピンペプチダーゼ阻害剤クレードＢ（例：ＳＥＲＰＩＮＢ３またはＳＥＲＰＩＮＢ４）、皮膚由来ペプチダーゼ阻害剤３（ＰＩ３）、リポカリン２（ＬＣＮ２）およびトランスグルタミナーゼタイプＩ（ＴＧＭ１）の遺伝子が含まれ、これらはすべて乾癬でアップレギュレートされている。加えて、ケラチンＫＲＴ１とＫＲＴ１０の発現は減少することが見出されている一方で、過剰増殖のマーカーＫＲＴ６とＫＲＴ１６は乾癬表皮でアップレギュレートされている（文献８）。
【０００８】
これまでに５種類の乾癬が報告されている：尋常性乾癬（plaque psoriasis）（尋常性乾癬（psoriasis vulgaris）としても知られている）；鱗屑を伴う涙滴状の斑点を特徴とする滴状乾癬；通常皮膚のヒダにみられる逆乾癬；掌蹠膿疱症（手掌や足底の膿疱性乾癬）、または汎発性膿疱性乾癬（乾癬のまれで重篤な型）のいずれかの形をとる膿疱性乾癬；稀ではあるが非常に重篤な乾癬の合併症である乾癬性紅皮症（文献３）。
軽症の乾癬患者は、典型的には、コルチコステロイド、ビタミンＤアナログ、局所レチノイドおよびカルシニュリン阻害剤のような薬剤を用いる局所療法で治療される。中等度から重度の乾癬、例えば広い表面積を侵す乾癬では、よく確立された治療計画は、外用剤と光線療法または全身薬の組合せからなる（文献９，１０）。全身薬には、メトトレキサート、シクロスポリン、アシトレチンなどがあり、一部の国ではフマル酸エステルを経口投与する。さらに、この１０年間にいくつかの生物学的製剤が開発されており、これは主にＴＮＦ−α、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１２／ＩＬ−２３を標的とする抗体からなる（文献３）。しかしながら、これらの薬物を使用する主な欠点は、静脈内注入または皮下注射のいずれかを必要とすることである。
【０００９】
また、湿疹、特にアトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、ケラチノサイトの増殖が亢進しているのに対し、分化が障害されている皮膚疾患であり、ＡＤの病変部皮膚におけるＫＲＴ６の増加やＫＲＴ１０発現の低下などで観察できる（文献１１）。
【００１０】
湿疹およびＡＤに罹患している患者は、典型的には、罹患した皮膚を水分補給するために、入浴中に皮膚軟化剤を日常的に使用するよう勧められる。さらに、ヒドロコルチゾンなどのステロイド、またはＴ細胞におけるサイトカイン発現の下流抑制を導き、それによって皮膚炎症を減少させるカルシニュリン阻害剤による局所治療を受ける。中等度から重度のＡＤには、インターロイキンシグナル伝達を標的とする抗体を用いることができる。現在治験で検証されている新しい方策は、経口および局所の両方に適用される低分子ＪＡＫ−１／２阻害剤を用いてＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を標的とすることに焦点を当てている（文献１２）。しかしながら、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路は免疫の保存されたマスターレギュレーターであり、したがって、そのような中心的役割を標的とする方策の適合性は、例えば、これらの方策が市場に到達するまでに実施されなければならないであろう大規模な安全性および有効性試験において、厳密に見直されなければならないであろう（文献１３）。
【００１１】
現在、これらの疾患の特徴付けに多くの努力が費やされているにもかかわらず、ここ数年、乾癬の局所治療のための新規物質が開発されていないことは注目に値する。加えて、新たに導入された全ての薬剤は、主に既知の薬剤の類似体、誘導体または新剤型であった（文献１４）。 
【発明の概要】
【００１２】
従って、これらの皮膚障害の治療のための、および罹患者の皮膚の外観に対するこれらの皮膚状態の影響を軽減するための新規アプローチを提供する必要が依然として存在する。さらに、新規薬剤の同定のための方法が緊急に必要である。このような方法は貴重な研究ツールとなり、この分野に多大な価値をもたらすであろう。
この必要性は、請求項において特徴付けられた実施形態の規定によって対処される。
【００１３】
従って、本発明は、ケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚状態の治療および／または予防に使用するためのロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）および／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤に関する。
本明細書中で使用される「ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ」という用語は、タンパク質のロイシンリッチ反復ファミリーに属するタンパク質を指し、これは、多様な生物学的過程、例えば、リンパ球発生および細胞容積調節に関与する（文献１５）。ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａは、本明細書ではＬＲＲＣ８Ａと略記する。このタンパク質のロイシンリッチ反復ファミリーは、ＬＲＲＣ８ＡからＬＲＲＣ８Ｆを含むイオンチャネルタンパク質のファミリーであり、そのすべては４つの膜貫通ドメインと１７のロイシンリッチ反復を含むＣ末端ドメインを包含する保存的ドメイン構造を共有している（文献１６）。このタンパク質ファミリーの６つのサブユニットが機能性容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）を形成するために必要であり、ＬＲＲＣ８Ａが少なくとも１つの追加のＬＲＲＣ８サブユニットとヘテロメア複合体に集合することが記載されている（文献１７，１８）。従って、ＬＲＲＣ８Ａは、ＬＲＲＣ８Ａ、ＬＲＲＣ８Ｂ、ＬＲＲＣ８Ｃ、ＬＲＲＣ８Ｄ、ＬＲＲＣ８ＥおよびＬＲＲＣ８Ｆから選択される少なくとも１つのさらなるＬＲＲＣ８サブユニットと組合せて、本発明の用途に提供されることもまた、本発明に従って想定される。さらに包含されるのは、ＬＲＲＣ８Ａが、ＬＲＲＣ８Ａである少なくとも１つのサブユニットを含む６つのサブユニットのＬＲＲＣ８複合体として提供されることである。 
【００１４】
ヒトＬＲＲＣ８Ａは、例えば、２０１７年１１月２３日に更新されたＲｅｆＳｅｑ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ５６２６２、および２０１７年１１月２２日に更新されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ８ＩＷＴ６によって表される。ヒトＬＲＲＣ８Ａは、配列番号１および２にも示されている。
【００１５】
本明細書で使用される用語「活性化剤」は、標的分子、すなわちＬＲＲＣ８Ａの発現および／または活性を誘導または増強する化合物として定義される。好ましくは、活性化剤は、下記の１つ以上の効果を媒介する：（ｉ）ＬＲＲＣ８Ａをコードする遺伝子の発現、すなわち、転写および／または翻訳が誘導または増加される、（ｉｉ）ＬＲＲＣ８Ａが、活性化剤の存在下で、その機能、例えば、その生化学的および／または細胞機能などを増大した効率で行う。
【００１６】
クラス（ｉ）に入る化合物は、転写機構および／またはＬＲＲＣ８Ａ遺伝子のプロモーターと相互作用する化合物および／またはエンハンサーなどのプロモーターから離れた発現制御要素と相互作用する化合物を含む。また、当該技術分野でよく知られている（例えば、Zamore (2001) Nat.Struct.Biol.8(9), 746; Tuschl (2001) Chembiochem.2(4), 239)を参照）、例えばＬＲＲＣ８Ａ発現を阻害する分子を標的としたＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を実施するためのアンチセンス構築物および構築物も含まれる。クラス（ｉ）に該当する化合物には、ＬＲＲＣ８Ａ発現に対して直接活性化作用を有する化合物が含まれるが、間接的に活性化している分子も含まれる。例えば、ＬＲＲＣ８Ａ発現を調節する分子と相互作用する。ＬＲＲＣ８Ａ発現に対して間接的な効果を有する分子は、ＬＲＲＣ８Ａに対する全体的な効果がＬＲＲＣ８Ａの活性化のものである限り、それ自体、その標的分子の正の（すなわち、活性化する）または負の（すなわち、阻害する）レギュレーターであり得ることが理解されるであろう。
【００１７】
クラス（ｉｉ）の化合物は、活性化されるタンパク質の生物学的活性を増大させる。生物学的活性とは、特に本発明に従って解明された機能を含むＬＲＲＣ８Ａの既知のあらゆる機能を意味する。前記機能の非限定的な例としては、例えば以下の実施例５に記載されているようなそのＶＲＡＣ活性ならびに例えば以下の実施例６に記載されているようなケラチノサイトの分化レギュレーターとしてのその活性が挙げられる。さらに、ＬＲＲＣ８ＡはＧＲＢ２‐ＧＡＢ２複合体およびリンパ球特異的受容体チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）を介してリンパ球においてＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路と相互作用することが示されている。ＬＲＲＣ８ＡとＧＲＢ２−ＧＡＢ２−ＬＣＫ複合体との構成的な会合は、ＬＣＫ−ＺＡＰ−７０−ＧＡＢ２−ＰＩ３Ｋを介してＡＫＴを活性化するが、ＬＲＲＣ８Ａの非存在下では、ＡＫＴの活性化は低下する（文献１９）。ＬＲＲＣ８Ａは脂肪細胞においても役割を果たしており、脂肪細胞サイズの増加は、ＬＲＲＣ８Ａを介したインスリン−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ２−ＧＬＵＴ４シグナル伝達経路の活性を調節することにより、インスリンシグナル伝達の増加と関連している。詳細には、ＧＲＢ２とインスリン受容体基質（ＩＲＳ）に連結したインスリン受容体（ＩＲ）の複合体は、負のレギュレーターとして作用する。免疫共沈降試験は、ＬＲＲＣ８Ａがこのインスリンシグナル伝達複合体にも存在し、ＬＲＲＣ８ＡとＧＲＢ２とのこの相互作用がＬＲＲＣ８ＡのＣ末端ロイシンリッチ反復ドメイン（ＬＲＲ）によって媒介されることを示した（文献２０）。ＬＲＲＣ８ＡがそのＬＲＲドメインを介してＧＲＢ２に結合すると、インスリン受容体シグナル伝達の負の阻害が破壊される。このように、ＬＲＲＣ８Ａは、そのＬＲＲドメインとＧＲＢ２との相互作用を介して、異なる細胞型における様々なＰＩ３Ｋ経路の重要な構成要素としても機能することが示されている。ＬＲＲＣ８Ａのこれらすべての機能は、通常の一般知識に基づいて、または本明細書の教示に基づいて、場合によってはここに引用される文書の教示と併せて、当業者によってテストされ得る。 
【００１８】
また、クラス（ｉｉ）の化合物は、ＬＲＲＣ８Ａに対して直接的な活性化作用を有する化合物も含むが、例えば、ＬＲＲＣ８Ａ活性を調節する分子と相互作用することによって間接的に活性化している分子も含む。ここでも、ＬＲＲＣ８Ａに対する間接的な効果を有する分子は、ＬＲＲＣ８Ａに対する全体的な効果が活性化である限り、正の（すなわち、活性化する）または負の（すなわち、阻害する）レギュレーターであり得ることが理解されるであろう。非限定的な例として、２つの最近の研究は、アンギオテンシンＩＩ  ＡＴ１受容体ＡＴ１Ｒによって感知される細胞内ｐＨ変化ならびに機械的膜ストレッチが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）酵素複合体の活性化を導き、それが次にＬＲＲＣ８Ａの活性化を導くことを示唆した（文献２１、２２）。このように、これら２つの試験の結果は、ＬＲＲＣ８Ａ媒介ＶＲＡＣ活性がＮＯＸ複合体を活性化する化合物によって活性化され得る一方で、ＮＯＸ阻害剤はＬＲＲＣ８Ａ媒介ＶＲＡＣ活性の低下をもたらすことを示唆する。 
【００１９】
本発明によれば、活性化剤は、ＬＲＲＣ８Ａに直接的に作用し、より好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａの転写および／または翻訳を直接的に増大させることが好ましい。
【００２０】
ＬＲＲＣ８Ａ遺伝子およびＬＲＲＣ８Ａゲノム遺伝子座の天然ならびに人工転写レギュレーターの両方を、本発明によるＬＲＲＣ８Ａの活性化剤、ならびにＬＲＲＣ８Ａタンパク質活性の天然または人工レギュレーターとして使用することができる。ＬＲＲＣ８Ａ遺伝子、ＬＲＲＣ８Ａゲノム遺伝子座、またはＬＲＲＣ８Ａタンパク質活性の前記レギュレーターの刺激または過剰発現は、ＬＲＲＣ８Ａの発現および／または活性を活性化するための適当な手段を表す。好適には、活性化剤は、核酸分子として、小分子として、またはタンパク質性化合物として、例えば抗体または抗体模倣物またはペプチドアプタマーとして提供される。
【００２１】
核酸分子として提供される活性化剤は、例えば、核酸分子によってコードされる活性化剤であってよく、例えば、ケラチノサイト特異的プロモーターなどの調節エレメントを含む発現ベクターに組み込むことができる。活性化剤は、例えば、Ｗａｎｇら（文献２３）に記載されているように、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ベースの方法のようなプログラム可能な配列特異的ゲノム編集ツールの形態の活性化核酸分子として提供することもできる。 
【００２２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１と同様に、ほぼすべてのモデル生物に適用技術であり、ノックアウト突然変異、染色体欠失、ＤＮＡ配列の編集および遺伝子発現の調節に使用できる。遺伝子発現の調節は、転写抑制因子と結合して転写を抑制する触媒的に死んだＣａｓ９酵素（ｄＣａｓ９）の使用、または特異的遺伝子の転写の活性化のための転写活性化因子の使用によって操作することができる。同様に、触媒的に不活性な「死んだ（ｄｅａｄ）」Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  および  Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ−１からのＣＲＩＳＰＲ）を、合成転写リプレッサーまたは活性化剤に融合させて、内因性プロモーターをダウンレギュレートまたはアップレギュレートすることができる（文献２４）。したがって、以下に記載する例示的なアプローチは、ｄＣａｓ９の代わりにＣｐｆ１を用いて実施することもできる。 
【００２３】
例えばＬＲＲＣ８Ａ遺伝子発現のような遺伝子転写の活性化のために、ｄＣａｓ９はＣ末端ＶＰ６４トランス活性化ドメインと遺伝的に融合される。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４媒介遺伝子活性化の効力をさらに改善するために、高度なシステムが開発されている。このシステムのために、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎら（文献２５）は、ゲノムの特定の領域にＣａｓ９を誘導する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を操作した。二量体化したＭＳ２バクテリオファージ被覆タンパク質に選択的に結合する２つのヘアピンアプタマーを付加した。さらに、ＭＳ２タンパク質をｐ６５およびＨＳＦ１トランス活性化ドメインに融合させ、それらは共にＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１複合体を形成する。まとめると、ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１融合タンパク質はｓｇＲＮＡのヘアピンアプタマーに結合し、次にｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質に取り込まれ、最終的なｄＣａｓ９−ＳＡＭ複合体を形成する。ｄＣｓＳＡＭ複合体は設計されたｓｇＲＮＡを介して標的遺伝子プロモーターに動員され、プロモーター周囲の多数の転写因子の動員を増強し、最終的に標的遺伝子の発現増加につながる（文献２５） 
【００２４】
ＬＲＲＣ８Ａの転写開始部位の上流の調節ＤＮＡ領域、例えばＬＲＲＣ８Ａプロモーターを特異的に標的とするｓｇＲＮＡを設計することにより、このようにして、乾癬ケラチノサイトの特異的な調節ＤＮＡ領域にｄＣａｓ９−ＳＡＭ複合体を動員し、それによってＬＲＲＣ８Ａ遺伝子発現の活性化を導くことが可能である。ＬＲＲＣ８Ａの２つの転写開始部位が現在アノテートされており、３つの異なったＬＲＲＣ８Ａ  ｍＲＮＡ変異体（ＮＭ＿０１９５９４（配列番号３）、ＮＭ＿００１１２７２４４（配列番号４）、ＮＭ＿００１１２７２４５；配列番号５）の形成につながるが、いずれも同じＬＲＲＣ８Ａタンパク質の形成につながる。１つだけでなく２つの転写開始部位がマッピングされるので、転写開始部位の３５００ｂｐ上流にある２つの調節ＤＮＡ配列も定義でき、ｄＣａｓ９−ＳＡＭ複合体を動員するｓｇＲＮＡの設計に依存する。本明細書では、配列番号６および配列番号７として提供されるこれらの調節配列は、転写開始部位の３５００ｂｐ上流、ならびにｍＲＮＡ転写物をコードする最初のヌクレオチドを含む。
【００２５】
あるいは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のＤＮＡ結合ドメインを、ＬＲＲＣ８Ａプロモーター領域またはその５’−ＵＴＲを特異的に認識するように設計することができる。このようなＤＮＡ結合ドメインと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ＿Ｃｐｆ１に関して上述したような転写活性化因子ドメインとの融合構築物も、従って、乾癬ケラチノサイトにおけるＬＲＲＣ８Ａ遺伝子発現を増強するために使用することができる。
【００２６】
ＬＲＲＣ８Ａ発現に関与する調節分子を標的とする阻害核酸分子として提供される活性化剤も本明細書では想定される。調節分子の発現を減少または消失させるそのような分子には、限定されるものではないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼが含まれる。このような方法は、例えば、Silva, G et al., 2011, Miller, JC et al. 2011 または Klug, A. 2010（文献２６−２８）に記載されている。 
【００２７】
本発明による「小分子」は、例えば、有機分子であってもよい。有機分子は、炭素基を有する化学化合物の分類に関連するか、または属し、炭素原子は炭素−炭素結合によって連結される。有機の本来の定義は化合物の源に関連し、有機化合物は、植物、動物または微生物源から得られた炭素含有化合物であるが、無機化合物は鉱物源から得られたものである。有機化合物は、天然または合成のものであり得る。または、本発明による「小分子」は、無機化合物であってもよい。無機化合物は鉱物源に由来し、炭素原子を持たないすべての化合物（二酸化炭素、一酸化炭素および炭酸塩を除く）を含む。好適には、小分子は約２０００ａｍｕ未満、または約５００ａｍｕ未満のような約１０００ａｍｕ未満、さらにより好適には約２５０ａｍｕ未満の分子量を有する。小分子の大きさは、当技術分野でよく知られている方法、例えば質量分析によって決定することができる。小分子は、例えば、標的分子のクリスタル構造に基づいて設計することができ、ここでは、生物学的活性の原因と考えられる部位を同定し、in vivoハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイのようなin vivoアッセイで検証することができる。
【００２８】
本発明に従って使用される用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに結合特異性を保持する誘導体または断片を含む。抗体断片または誘導体は、特に、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ’）2、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片と同様に、ＦａｂまたはＦａｂ’断片を含む；例えば、Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 および Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999を参照のこと。用語「抗体」は、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖およびヒト化（非ヒトＣＤＲを除くヒト抗体）抗体などの実施形態も含む。
【００２９】
抗体の産生のための様々な技術は、当該技術においてよく知られており、例えば、Harlow and Lane (1988)および(1999)（上掲）において記載されている。さらに、抗体をペプチド模倣物として産生することができる。さらに、一本鎖抗体の産生について記載された技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）は、本発明の標的に特異的な一本鎖抗体を産生するように適合され得る。また、トランスジェニック動物または植物（例えば、米国特許６，０８０，５６０参照）を用いて、本発明の標的に特異的な（ヒト化）抗体を発現させることができる。最も好ましくは、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体のようなモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技術を使用することができる。このような技術の例は、例えば、Harlow and Lane (1988)および(1999)（上掲）に記載されており、Kohler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497により開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72)およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)を含む。ＢＩＡｃｏｒｅ系で使用されるような表面プラズモン共鳴は、標的タンパク質のエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めるために使用することができる(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol.Methods 183 (1995), 7-13)。また、本発明の文脈において、「抗体」という用語は、細胞内で発現され得る抗体構築物、例えば、ウイルスまたはプラスミドベクターを介してトランスフェクトおよび／または形質導入され得る抗体構築物を含むことが想定される。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「抗体模倣物」は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合することができるが、抗体に構造的に関連しない化合物を指す。抗体模倣物は通常、約３〜２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。例えば、抗体模倣物は、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチドおよびＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）からなる群から選択され得る。これらのポリペプチドは当該技術分野でよく知られており、以下に簡単に記載する。
【００３１】
本明細書中で使用される「アフィボディ」という用語は、ブドウ球菌タンパク質ＡのＺ−ドメインに由来する抗体模倣物のファミリーを指し、構造的には、アフィボディ分子は、融合タンパク質にも取り込むことができる３−ヘリックスバンドルドメインに基づく。標的特異性は、親タンパク質領域の結合活性に関与する２つのαヘリックスに位置する１３のアミノ酸をランダム化することにより得られる(Feldwisch J, Tolmachev V.; (2012) Methods:Mol Biol.899:103-26)。
【００３２】
用語「アドネクチン」（「モノボディ」とも呼ばれる）は、本明細書中で使用される場合、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ（１０Ｆｎ３）の１０番目の細胞外ドメインに基づく分子に関し、２〜３の露出したループを有する９４残基のＩｇ様βサンドイッチフォールドを採用するが、中央のジスルフィド架橋を欠く(Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。所望の標的特異性をもつアドネクチンは、タンパク質の特異的なループに修飾を導入することにより、遺伝的に改変することができる。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「アンチカリン」は、リポカリンに由来する改変タンパク質を指す(Beste G, Schmidt FS, Stibora T, Skerra A. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A. 96(5):1898-903; Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。アンチカリンは８本鎖βバレルを有し、リポカリンの中で高度に保存されたコアユニットを形成し、開いた末端に４つの構造的に可変なループを介してリガンドに対する結合部位を天然に形成する。アンチカリンは、ＩｇＧスーパーファミリーとは相同ではないが、これまで抗体の結合部位に典型的と考えられてきた特徴を示す：（ｉ）配列変異の結果としての高い構造可塑性、（ｉｉ）立体配座柔軟性の上昇で、形状の異なる標的への誘導適合を可能にする。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「ＤＡＲＰｉｎ」は、設計されたアンキリンリピートドメイン（１６６残基）を指し、これは、典型的には３回の反復β−ターンから生じる硬い界面を提供する。ＤＡＲＰｉｎは通常、人工的なコンセンサス配列に対応する３つの反復配列をもっており、反復ごとに６つの位置がランダム化されている。そのため、ＤＡＲＰｉｎは構造的柔軟性を欠いている(Gebauer and Skerra, 2009)。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「アビマー」は、種々の膜受容体のＡ−ドメインに由来し、リンカーペプチドによって連結される、各々３０〜３５アミノ酸の２つ以上のペプチド配列からなる抗体模倣物のクラスを指す。標的分子の結合はＡ−ドメインを介して起こり、所望の結合特異性を有するドメインを、例えばファージディスプレイ技術により選択することができる。アビマーに含まれる異なるＡ−ドメインの結合特異性は同一である可能性があるが、同一である必要はない(Weidle UH, et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics;10(4):155-68)。
【００３６】
「ナノフィチン」（別名アフィチン）は、スルホロブス・アシドカルダリウスのＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄに由来する抗体模倣タンパク質である。ナノフィチンは通常、約７ｋＤａの分子量を有し、結合表面のアミノ酸をランダム化することによって標的分子と特異的に結合するように設計されている(Mouratou B, Behar G, Paillard-Laurance L, Colinet S, Pecorari F., (2012) Methods:Mol Biol.; 805:315-31)。
【００３７】
本明細書で使用される「アフィリン」という語は、ガンマ−Ｂクリスタリン性またはユビキチンのいずれかを足場として使用し、ランダム突然変異誘発によってこれらのタンパク質の表面上のアミノ酸を修飾することによって開発される抗体模倣物を指す。所望の標的特異性を有するアフィリンの選択は、例えばファージディスプレイまたはリボソームディスプレイ技術によって行われる。足場にもよるが、アフィリンの分子量はおよそ１０または２０ｋＤａである。本明細書で使用される場合、用語「アフィリン」はまた、アフィリンの二量体型または多量体型を指す(Weidle UH, et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics;10(4):155-68)。
【００３８】
「クニッツドメインペプチド」は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）または組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）のようなクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに由来する。Ｋｕｎｉｔｚドメインは分子量が約６ｋＤＡであり、ファージディスプレイ(Weidle et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics;10(4):155-68)などのディスプレイ技術により、必要な標的特異性を有するドメインを選択することができる。
【００３９】
本明細書中で使用される「Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）」という用語は、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチドを指す。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドは当技術分野で周知であり、例えば、Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204, WO 2008/022759, Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57-68, Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255, or Schlatter et al. (2012), MAbs 4:4, 1-12)に記載されている。
【００４０】
タンパク質性化合物の別の例は、ペプチドアプタマーである。アプタマー自体は、特定の標的分子に結合する核酸分子またはペプチド分子である。アプタマーは通常、大きなランダムな配列プールからこれらを選択することにより作製されるが、天然のアプタマーも、リボスイッチに存在する。アプタマーはリボザイムと結合して、その標的分子の存在下で自己切断することができる(Osborne et. al. (1997), Current Opinion in Chemical Biology, 1:5-9; Stull & Szoka (1995), Pharmaceutical Research, 12, 4:465-483)。
【００４１】
アプタマーは、一般的に使用される生体分子、特に抗体のそれらに匹敵する分子認識特性を提供するので、バイオテクノロジーおよび治療用途のための有用性を提供する。アプタマーは、その識別認識に加えて、試験管内で完全に改変することができ、化学合成により容易に生産され、望ましい貯蔵特性を有し、治療用途においてほとんどまたは全く免疫原性を誘発しないので、抗体よりも有利である。非修飾アプタマーは血流から速やかに除去され、半減期は数分から数時間である。これは主に、アプタマーが本来低分子量である結果、ヌクレアーゼの分解と腎臓による身体からのクリアランスのためである。非修飾アプタマーの応用は、現在、血液凝固のような一過性の状態の治療、または局所送達が可能な眼のような器官の治療に焦点を当てている。この迅速なクリアランスは、in vivo画像診断などの応用において利点となりうる。２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合、アルブミンへの融合または他の半減期延長タンパク質などのいくつかの修飾が科学者に利用可能であり、アプタマーの半減期を数日間または数週間にわたって増加させることができる。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」は、３０個までのアミノ酸からなる分子群を記載するが、本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」（「タンパク質」とも呼ばれる）は、３０個以上のアミノ酸からなる分子群を記載し、ペプチドおよびポリペプチドの群は、「（ポリ）ペプチド」という用語を使用することによってまとめて呼ばれる。
核酸分子として提供される活性化剤はさらに、核酸アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンス核酸分子を含む。
【００４３】
アプタマーは、本明細書中で上記に記載されている。核酸アプタマーは、通常オリゴヌクレオチドの（通常は短い）鎖からなる核酸種である。典型的には、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織および生物などの種々の分子標的に結合するために、in vitro選択の反復ラウンドまたは同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）を介して改変されている。
【００４４】
本発明によれば、短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られる「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という用語は、生物学において様々な役割を果たす１８〜３０、好ましくは１９〜２５、最も好ましい２１〜２３またはさらに好ましい２１ヌクレオチド長二本鎖ＲＮＡ分子を指す。最も顕著なことは、ｓｉＲＮＡが特定の遺伝子の発現を妨害するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与することである。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路における役割に加えて、ＲＮＡｉ関連経路においても、例えば、抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造を形成する際に、作用する。
【００４５】
天然に存在するｓｉＲＮＡは、明確な構造をもっている。すなわち、両端に２ｎｔの３’突出部をもつ短い二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。各鎖は５’ホスフェート基と３’ヒドロキシル（−ＯＨ）基をもつ。この構造は、長いｄｓＲＮＡか小さなヘアピンＲＮＡのどちらかをｓｉＲＮＡに変換する酵素であるダイサーによるプロセシングの結果である。ｓｉＲＮＡを細胞内に外因的に（人工的に）導入して、目的の遺伝子の特異的なノックダウンをもたらすこともできる。このようにして、配列が既知である本質的に任意の遺伝子を、適切に調整されたｓｉＲＮＡとの配列相補性に基づいて標的化することができる。二本鎖ＲＮＡ分子またはその代謝プロセシング産物は、標的特異的核酸修飾、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を媒介することができる。外因的に導入されたｓｉＲＮＡは、その３’末端および５’末端に突出部を欠くことがあるが、しかしながら、少なくとも１つのＲＮＡ鎖が５’および／または３’−突出部を有することが好ましい。好適には、二本鎖の一方の末端は、１〜５ヌクレオチド、より好適には１〜３ヌクレオチド、最も好適には２ヌクレオチドの３’−突出部を有する。もう一方の末端は平滑末端であってもよいし、最大６ヌクレオチドの３’−突出部を有していてもよい。一般に、ｓｉＲＮＡとして作用するのに適した任意のＲＮＡ分子が、本発明において想定される。これまで最も効率的なサイレンシングは、２−ｎｔ  ３’突出部を有するように対になった２１−ｎｔセンスおよび２１−ｎｔアンチセンス鎖から構成されるｓｉＲＮＡ二重鎖で得られた。２−ｎｔの３’突出部の配列は、第１の塩基対に隣接する対になっていないヌクレオチドに限定された標的認識の特異性に少し寄与する(Elbashir et al. 2001)。３’突出部の２’−デオキシヌクレオチドはリボヌクレオチドと同程度に効率的であるが、合成がより安価で、おそらくヌクレアーゼ抵抗性がより高い。ｓｉＲＮＡの送達は、当技術分野で公知の方法のいずれかを用いて、例えば、ｓｉＲＮＡを生理食塩水と組み合わせ、組合せたものを静脈内または鼻腔内に投与することによって、またはグルコース中のｓｉＲＮＡ（例えば、５％グルコース）を処方することによって、またはカチオン性脂質およびポリマーを、静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）のいずれかの全身経路を介するｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡ送達のために使用することができる (Fougerolles et al. (2008), Current Opinion in Pharmacology, 8:280-285; Lu et al. (2008), Methods in Molecular Biology, vol. 437: Drug Delivery Systems Chapter 3: Delivering Small Interfering RNA for Novel Therapeutics)。
【００４６】
短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用できる、緊密なヘアピンターンを作るＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは、細胞に導入されたベクターを使用し、Ｕ６プロモーターを利用して、常にｓｈＲＮＡが発現されるようにする。このベクターは通常娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングを受け継ぐことができる。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は細胞機構によってｓｉＲＮＡに切断され、次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は結合しているｓｉＲＮＡに一致するｍＲＮＡに結合して切断する。本発明で使用されるｓｉ／ｓｈＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学的に合成されることが望ましい。ＲＮＡ合成試薬の供給業者は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，  ＣＯ，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）である。最も好都合なことに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、異なる品質およびコストのＲＮＡ合成生成物を販売する、市販のＲＮＡオリゴ合成供給業者から得られる。一般に、本発明で適用可能なＲＮＡは、従来技術で合成され、ＲＮＡｉに適した品質で容易に提供される。
【００４７】
ＲＮＡｉに影響を及ぼすさらなる分子には、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。前記ＲＮＡ種は一本鎖ＲＮＡ分子である。内因的に存在するｍｉＲＮＡ分子は、相補的なｍＲＮＡ転写産物に結合し、ＲＮＡ干渉と同様のプロセスを通して、前記ｍＲＮＡ転写産物の分解の引き金を引くことによって、遺伝子発現を調節する。したがって、外因的ｍｉＲＮＡは、それぞれの細胞への導入後に、それぞれの標的の阻害剤として使用され得る。
【００４８】
リボザイム（リボ核酸酵素由来、ＲＮＡ酵素または触媒ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、自身の切断または他のＲＮＡの切断のいずれかを触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することもわかっている。よく特徴づけられた小さな自己切断ＲＮＡの非限定的な例は、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、およびin vitroで選択された鉛依存性リボザイムであるが、グループＩイントロンはより大きなリボザイムの例である。触媒による自己切断の原理は近年よく確立されるようになった。ハンマーヘッド型リボザイムは、リボザイム活性をもつＲＮＡ分子の中で最もよく特徴づけられている。ハンマーヘッド型構造が異種ＲＮＡ配列に組み込まれ、リボザイム活性がそれによってこれらの分子に移入され得ることが示されたので、標的配列が潜在的に一致する切断部位を含むならば、ほぼあらゆる標的配列に対する触媒的アンチセンス配列を作製することができるようである。ハンマーヘッド型リボザイムを構築する基本原理は以下の通りである：ＧＵＣ（またはＣＵＣ）トリプレットを含むＲＮＡの関心領域が選択される。通常６〜８ヌクレオチドの２本のオリゴヌクレオチド鎖が取られ、触媒ハンマーヘッド配列がそれらの間に挿入される。最良の結果は通常、短いリボザイムと標的配列で得られる。
【００４９】
また、最近の発展は、ハンマーヘッドリボザイムを有する小さな化合物を認識するアプタマーの組合せである。標的分子と結合したときにアプタマーに誘導される立体配座変化はリボザイムの触媒機能を調節することができる。
【００５０】
用語「アンチセンス核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、標的核酸に相補的である核酸を指す。本発明によるアンチセンス分子は、標的核酸と相互作用することができ、より具体的には、標的核酸とハイブリダイズすることができる。ハイブリッドの形成により、標的遺伝子の転写および／または標的ｍＲＮＡの翻訳が減少または遮断される。アンチセンス技術に関する標準的な方法が記載されている（例えば、Melaniら Cancer Res.(1991)51:2897-2901を参照）。
【００５１】
本発明で言及される活性化剤のいずれかの機能は、ハイスループットスクリーニングアッセイ（ＨＴＳ）を使用することによって同定および／または検証され得る。好ましくは、活性のレベルは、活性化剤の非存在下での活性よりも少なくとも１０％高い；より好ましくは、活性のレベルは、活性化剤の非存在下での活性よりも少なくとも２０％高く、例えば少なくとも３０％高い、より好ましくは少なくとも４０％高い。しかし、より好ましいのは、活性化剤の非存在下で活性よりも少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも５００％高い活性レベルまで活性レベルを高める活性化剤である。
【００５２】
活性化剤の有効性は、活性化剤存在下の活性のレベルを、活性化剤非存在下の活性のレベルと比較することによって定量化することができる。例えば、活性測定値としては、形成されたｍＲＮＡの量の変化、形成されたタンパク質の量の変化、ＬＲＲＣ８Ａを含む容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）の活性の変化、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達の活性の変化および／または細胞表現型の変化、または例えば、以下に詳述するような特異的マーカー遺伝子の発現に基づく生物の表現型の変化が使用され得る。
【００５３】
試料におけるＬＲＲＣ８Ａ発現の量を決定するための手段および方法は、核酸レベルまたはアミノ酸レベルで実施することができる。核酸レベルでのタンパク質の発現を決定する方法としては、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ解析およびＲＮＡ配列決定が挙げられるが、これらはすべて当技術分野で周知である。例えば、Bruce Alberts et alによるMolecular Biology of the cell, 5th edition, 2007, Chapter 8, Garland Science。アミノ酸レベルでのタンパク質の発現の決定方法も、当技術分野で周知であり（例えば、Alberts et al.Molecular Biology of the cell, 5th edition, 2007, Chapter 8, Garland Science）には、クーマシーブリリアントブルー、銀染色、および抗体染色などのタンパク質染色技術と併せたウエスタンブロットまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
ＬＲＲＣ８Ａを含む容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）の活性の変化を決定するための手段および方法には、制限することなく、ヨウ化物流入を測定すること、イオン電流を測定すること、ＶＲＡＣ基質の放出を測定すること、細胞容積変化を測定すること、細胞剛性を測定すること、インピーダンス測定、細胞の大きさ決定、または電気感知ゾーン法が含まれる。これらの方法は、当技術分野において、例えば文献１８、２９−３１において記載されており、以下でより詳細に考察する。 
【００５５】
本発明によれば、ＬＲＲＣ８Ａおよび／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤は、ケラチノサイトの変化された分化に関連する皮膚状態の治療および／または予防に使用するためのものである。好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａおよび／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤は、ヒトにおける皮膚状態の治療および／または予防に使用するためのものである。
【００５６】
前述したように、ヒトの皮膚は分化している数層のケラチノサイトから構成されている。健常表皮のホメオスタシスは、ケラチノサイトの増殖と分化の間の厳密に調節された均衡によって維持されている。この均衡の乱れは、例えば、ケラチノサイトの分化の変化の形成で、乾癬およびアトピー性皮膚炎のような皮膚障害を引き起こす。本発明によれば、「ケラチノサイトの分化の変化」という用語は、分化パターンの乱れ、すなわち、健常皮膚では観察されないパターンに関する。ケラチノサイトの分化が変化するかどうかは、難しい話は抜きにして、当業者によって、例えば、健常皮膚の標本由来であることが知られているケラチノサイトの分化と比較することによって、または、分化パターンを、健常皮膚における分化に関する公表されたデータ、または本明細書に添付された実施例において以下に提供される健常皮膚に関するデータと比較することによって、決定することができる。
【００５７】
代替の実施形態では、本発明は、ケラチノサイトの変化された分化に関連する皮膚状態の治療および／または予防方法に関し、方法は、ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ  （ＬＲＲＣ８Ａ）、および／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。本発明に従って使用するためのＬＲＲＣ８Ａ、および／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤に関して本明細書に提供される全ての定義および好ましい実施形態は、本治療法に準用する。
【００５８】
本発明によれば、ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）がケラチノサイトの分化において重要な役割を果たすことが驚くべきことに見出された。
ＬＲＲＣ８Ａは同定された容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）の最初の構成要素であり、天然ＶＲＡＣの生物物理学的および薬理学的特性を有するＶＲＡＣの必須構成要素である（文献１８，３１）。ＶＲＡＣは、浸透圧ストレスに応答して細胞が最初の細胞容積を回復する過程である「調節性容積減少（ＲＶＤ）」と呼ばれる過程において重要な役割を果たす。細胞外浸透圧が増加すると浸透圧勾配が形成され、水を細胞外に戻す駆動力となり、それによって細胞容積が減少する（文献３２−３４）。  
【００５９】
細胞容積調節は、アポトーシス、経上皮イオン輸送、移動および増殖（文献３２，３５，３６）のような多くの生理学的過程の不可欠な一部である。しかし、ケラチノサイトの分化の間の調節された容積変化の役割は、まだあまり詳細には解明されていない。ケラチノサイトは基底レベルから顆粒レベルに移動すると明らかな形態学的および細胞サイズ変化を受けるにもかかわらず（文献３７）、これがＲＶＤおよびＶＲＡＣの活性化のような能動的に制御された調節機構を含むかどうかは知られていない。全てではないが、いくつかの研究は、低張性および高張性ストレスがＨａＣａＴ細胞の増殖に差次的に影響し得ることを示唆し（文献３８−４０）、これはインボルクリン、フィラグリンおよびトランスグルタミナーゼのような分化マーカーの遺伝子発現変化も伴う（文献３８，３９）。 
【００６０】
また、ケラチノサイトにおけるＶＲＡＣ成分ＬＲＲＣ８Ａの機能は、当技術分野では研究されていない。これまでのところ、ＬＲＲＣ８ＡがＶＲＡＣの主成分であるかどうかは知られておらず、ＲＶＤやケラチノサイト分化などの生理学的過程におけるＬＲＲＣ８Ａの役割に関しては何も知られていなかった。本発明に従い、ＬＲＲＣ８ＡがＶＲＡＣの主成分であり、それがケラチノサイトにおけるＲＶＤの一部を媒介することが初めて示される。さらに、ＬＲＲＣ８Ａが正常ならびに異常な病的ケラチノサイト分化において重要な役割をすることが予想外に示されている。特に、乾癬患者の表皮ではＬＲＲＣ８Ａ発現がダウンレギュレートされていることが示された。
【００６１】
健常皮膚の終末分化の間に、基底ケラチノサイトは角質ケラチノサイトに発達する。この過程は、増殖と分化の間の厳密に制御された変化に基づいている。基底ケラチノサイトでは、増殖は高いが、分化は低い。ケラチノサイトがさらに異なるケラチノサイト層に発達すると、増殖は減少するが、分化はさらに進行する。この過程で、ＬＲＲＣ８Ａは一定ではなく、そのタンパク質レベルは変化する：ＬＲＲＣ８Ａは基底層に優先的に局在し、ヒト皮膚において外側のより分化したケラチノサイト層に向かって低下することが見出される。さらに、ＬＲＲＣ８Ａ発現は、動的に調節され、分化段階に依存することが示される：ＬＲＲＣ８Ａは、それが最大に達するまで最初に増加し、その後、分化の最新段階で減少する。このＬＲＲＣ８Ａ発現の動的変化は、健常ケラチノサイト発生に特徴的である。
【００６２】
乾癬などの病変部皮膚では、増殖と分化の平衡が乱される。分化は異常でより遅いが、増殖はより速く、最終的には異常に形成されたケラチノサイト層および病的な皮膚状態に至る。本明細書では、乾癬におけるケラチノサイトの最終分化の間に、ＬＲＲＣ８Ａ発現も異常に変化することが見出されている。第一に、基底段階では、ＬＲＲＣ８Ａ発現が低下し、健常皮膚ほど速くは増加しない。後期段階では、ＬＲＲＣ８Ａレベルは健常皮膚と比較して高く維持され、低下しない。さらに、本明細書では、乾癬患者の病変部皮膚において、図３Ｃに示すように、ＬＲＲＣ８Ａ発現が減少することが見出されている。従って、ＬＲＲＣ８Ａ発現パターンは乾癬ケラチノサイトで乱され、それによりＬＲＲＣ８Ａが秩序だったケラチノサイト分化に重要であることを示唆する。
【００６３】
重要なことに、実施例６に示すように、ＬＲＲＣ８Ａ遺伝子量を減少させることを介したＬＲＲＣ８Ａ活性の調節は、この分化過程の操作を可能にする。ＬＲＲＣ８Ａレベルが低下すると、ケラチノサイトは異常に発育し始めた。これらの遺伝子発現様式は驚くほど乾癬と類似しており、ＬＲＲＣ８Ａが正常分化に必要であると結論した。より具体的には、分化の初期段階では、ＬＲＲＣ８Ａレベルが低すぎる場合、例えば乾癬の場合、またはＬＲＲＣ８Ａが完全に欠如している場合、例えばＬＲＲＣ８Ａノックアウトの場合、細胞はその正常分化プログラムを受けることができなかったことが見出される。
【００６４】
これらの知見は、乾癬のような皮膚状態の治療のために、ＬＲＲＣ８Ａ活性／発現レベルを、正常レベルに、すなわちＬＲＲＣ８Ａ活性／発現を増加させることによって、回復されなければならないことを示唆する。この知見は、驚くべきことである。トランスクリプトームワイド研究（文献５，７，４１−４３）では、乾癬皮膚におけるＬＲＲＣ８Ａレベルは、健常皮膚と比較して高いと記載されていた。これらの観察に基づけば、当業者は乾癬の適切な治療にはＬＲＲＣ８Ａレベル／活性の減少（増加ではなく）が必要であると結論していたであろう。本発明によれば、このような結論は妥当ではなかったであろうことが判明した。これらのトランスクリプトームワイド研究における乾癬皮膚における全体的に高い総ＬＲＲＣ８Ａレベルの所見は、全皮膚における総遺伝子発現レベルが測定されたという事実によって説明できる。しかし、重要なことに、このアプローチは、分化中に起こり、本明細書で初めて発見されたＬＲＲＣ８Ａレベルの動的変化を見落とした。言い換えれば、これらのトランスクリプトームワイド研究の知見は、ＬＲＲＣ８Ａレベルが、健常ケラチノサイトと比較して乾癬において、分化の最初の段階、すなわち基底状態で、初期には低いこと、および乾癬においても、健常ケラチノサイトと比較して、乾癬において、あまりにもゆっくりと増加することを無視している。ＬＲＲＣ８Ａのレベルは、健常ケラチノサイトと比較して乾癬ケラチノサイトで高いというのは、最も遅い段階、すなわち角質層でのみである。
【００６５】
さらに、これらのトランスクリプトームワイド研究の知見は、ＬＲＲＣ８Ａ  ｍＲＮＡ量のみを測定し、形成されるＬＲＲＣ８Ａタンパク質の実際の量を測定していないため、さらに誤解を招くものである。一方、後記する実施例では、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質はＬＲＲＣ８Ａ抗体を用いた免疫組織学的解析により直接的に検出され、乾癬患者の病巣皮膚においてＬＲＲＣ８Ａタンパク質レベルが低下することが明確に示された。
【００６６】
このように、本発明によれば、驚くべきことに乾癬の治療は、ＬＲＲＣ８Ａレベル／活性の減少させる必要がなく、基底および進行中のケラチノサイトでＬＲＲＣ８Ａの正常レベルに回復させるために増加させることが見出された。ＬＲＲＣ８Ａレベルがほぼ正常な基底およびさらに成熟したケラチノサイトは、通常の最終分化プログラムの発生を開始し、乾癬性ケラチノサイト層を減らすことができる。
【００６７】
本発明によれば、ＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤は、ＬＲＲＣ８Ｂおよび／またはＬＲＲＣ８Ｂの活性化剤；ＬＲＲＣ８Ｃおよび／またはＬＲＲＣ８Ｃの活性化剤；ＬＲＲＣ８Ｄおよび／またはＬＲＲＣ８Ｄの活性化剤；ＬＲＲＣ８Ｅおよび／またはＬＲＲＣ８Ｅの活性化剤；および／またはＬＲＲＣ８Ｆおよび／またはＬＲＲＣ８Ｆの活性化剤から選択される１つ以上の追加の化合物と組合せて使用することができる。
【００６８】
標的とする特定のＬＲＲＣ８Ａ含有ＶＲＡＣの構築に依存して、当業者は、難しい話は抜きにして、さらなる化合物をＬＲＲＣ８の異なるサブタイプであるか、またはＬＲＲＣ８の異なるサブタイプに標的とされるさらなる化合物であるかの適切な選択をすることができる。したがって、例えば、ＶＲＡＣがＬＲＲＣ８ＡおよびＬＲＲＣ８Ｂからなることが知られている場合、ＬＲＲＣ８ＢまたはＬＲＲＣ８Ｂの活性化剤のいずれか（または両方）を、この好ましい実施形態による追加の化合物として選択することができる。
【００６９】
より好ましくは、本発明によるＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤は、ＬＲＲＣ８を標的とする唯一の活性化合物である。換言すれば、この好ましい実施形態において、ＬＲＲＣ８Ａおよび／またはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤は、ＬＲＲＣ８Ｂおよび／またはＬＲＲＣ８Ｂの活性化剤；ＬＲＲＣ８Ｃおよび／またはＬＲＲＣ８Ｃの活性化剤；ＬＲＲＣ８Ｄおよび／またはＬＲＲＣ８Ｄの活性化剤；ＬＲＲＣ８Ｅおよび／またはＬＲＲＣ８Ｅの活性化剤；および／またはＬＲＲＣ８Ｆおよび／またはＬＲＲＣ８Ｆの活性化剤から選択される化合物の追加の使用なしに使用される。
【００７０】
本発明による使用のためのＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤の好ましい実施形態では、ケラチノサイトの変化された分化に関連する皮膚状態は、表皮増殖の増強を特徴とする状態である。
【００７１】
上に詳細に述べたように、健常表皮のホメオスタシスは、ケラチノサイトの増殖と分化の間の厳密に調節された均衡に依存している。好ましい実施に従って、皮膚状態は、ケラチノサイトの分化の変化によって特徴づけられるだけでなく、表皮増殖の増強によっても特徴づけられる。より好ましくは、皮膚状態は、ケラチノサイトの増殖の増強を特徴とする状態である。
【００７２】
本明細書中で使用される「増強された増殖」という用語は、健常細胞において観察される細胞の増殖および分裂の速度と比較した、細胞の増殖および分裂の速度の増加に関する。増殖が増強されるかどうかは、難しい話は抜きにして当業者が判断できる。例えば、罹患皮膚標本と非罹患皮膚標本を比較すること、または増殖速度を、健常標本について公表または事前に決定されたデータと比較することによる。
【００７３】
本発明による使用のためのＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤の好ましい実施形態では、ケラチノサイトの変化された分化に関連する皮膚状態は乾癬または皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎である。
【００７４】
本明細書に記載される皮膚状態の全ては、当業者によく知られており、先行技術および当業者の一般知識に従って定義される。
本明細書中で使用される用語「乾癬」は、乾癬の５つの主なタイプ、すなわち、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、および乾癬性紅皮症の全てを含む。組織学的に乾癬は、錯角化を伴う肥厚した不規則な角質層、表皮肥厚症を伴う表皮肥厚、および顆粒層の欠如を特徴とする。これは、表皮分化プログラムを適切に開始できない過剰増殖ケラチノサイトによって引き起こされ、分化マーカーインボルクリン（ＩＶＬ）の有棘層および顆粒層への非局在化、ならびに分化マーカーケラチン（ＫＲＴ）およびフィラグリン（ＦＬＧ）の発現低下をもたらす。さらに、基底層にはより多くのＫｉ−６７陽性核が検出でき、増殖を示している（文献４４）。 
【００７５】
「皮膚炎」という用語は、あらゆる種類の皮膚炎を表現するために用いられる医学用語である。乾燥した炎症を起こした皮膚を特徴とする皮膚炎には様々なサブタイプがある。「湿疹」という用語は、追加の症状としてかゆみのある皮膚を特徴とする皮膚炎のサブタイプに関連する。一般的に、罹患した皮膚では、バリア機能が損なわれ、皮膚がアレルゲンや環境ストレスを受けやすくなる。その結果、皮膚感作や炎症につながる可能性がある（文献４５）。ここで用いられる「皮膚炎」という用語は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、うっ滞性皮膚炎を含み、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は通常小児期に始まる最も一般的な形態である。 
【００７６】
ＡＤは湿疹の一種で、かゆみ、赤み、腫れ、ひび割れなどの特徴がある。急性アトピー性皮膚炎の部位から採取した皮膚生検は、細胞間浮腫、主にリンパ球の血管周囲浸潤、ケラチノサイトが角質層に上行する際の角化細胞の核の貯留、いわゆる錯角化を特徴とする。慢性部位は肥厚した角質層、いわゆる過角化症、肥厚した有棘層（表皮肥厚）が優勢であるが、まばらなリンパ球浸潤がみられる（文献４６）。 
【００７７】
本発明による使用のためのＬＲＲＣ８Ａの活性化剤のさらに好ましい実施形態では、活性化剤はＬＲＲＣ８Ａの発現および／またはＬＲＲＣ８Ａを含む容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）の活性を増大させる。
【００７８】
この好ましい態様によれば、活性化剤は、ＬＲＲＣ８Ａの発現および／またはＬＲＲＣ８Ａを含む容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）の活性を増大させる。活性化剤の存在下でＬＲＲＣ８Ａの量が活性化剤の非存在下よりも高ければ、活性化剤はＬＲＲＣ８Ａの発現を増大させると考えられる。好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａの量は、活性化剤の存在下では、活性化剤の非存在下よりも少なくとも１０％高く；より好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａの量は、活性化剤の存在下では、活性化剤の非存在下よりも少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％高い。さらに好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａの量は、活性化剤の非存在下よりも、活性化剤の存在下で少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも５００％高い。「ＬＲＲＣ８Ａの量」では、本実施形態に関して使用されるように、ＬＲＲＣ８Ａ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の量を指し、好ましくはＬＲＲＣ８Ａタンパク質の量を指す。
ＬＲＲＣ８Ａの発現量を決定するための手段および方法が、上に提供されている。
【００７９】
活性化剤は、ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性をさらに増大させることができる。この活性化剤は「ＬＲＲＣ８Ａの活性化剤」に限定されること、すなわち、ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性の増加に対するその作用は、必然的にＬＲＲＣ８Ａの活性化を介してであることが理解されるであろう。
【００８０】
活性化剤は、ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性が、活性化剤の非存在下よりも活性化剤の存在下で高い場合、ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性を増大させると考えられる。好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性は、活性化剤の非存在下よりも活性化剤の存在下で少なくとも１０％高い；より好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性は、活性化剤の非存在下よりも少なくとも３０％高い、より好ましくは少なくとも４０％高いなど、少なくとも２０％高い。さらに好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣの活性は、活性化剤の存在下で、活性化剤の非存在下よりも少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも５００％高い。
【００８１】
この好ましい実施形態によれば、活性化剤は、ＬＲＲＣ８Ａの発現に作用するか、またはＶＲＡＣの構成要素としてのその役割に関してＬＲＲＣ８Ａの活性に作用するか、またはその両方に作用することができる。
【００８２】
したがって、ＬＲＲＣ８Ａの発現を増加させることは、本発明の活性化剤が作用することができる１つの手段である。ＬＲＲＣ８Ａノックダウンに関して本明細書に提供されるデータ（実施例６を参照）に基づいて、増加した量のＬＲＲＣ８Ａの存在が、列挙された皮膚障害で観察される異常な分化パターンの修正につながると規定されている。
代替的に、または加えて、活性化剤は、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質の活性を増大させることができる。前述のように、ＬＲＲＣ８Ａは、天然ＶＲＡＣの生物物理学的および薬理学的特性を有する、容積調節性アニオンチャネル、すなわちＶＲＡＣの必須成分として近年同定されている（文献１８，３１）。細胞容積調節は、アポトーシス、経上皮イオン輸送、移動および増殖のような多くの生理学的過程の不可欠な一部である（文献３２，３５，３６）。しかし、ケラチノサイトの分化の間の調節された容積変化の役割は、まだあまり詳細には解明されていない。ケラチノサイトは基底レベルから顆粒レベルに移動すると明らかな形態学的および細胞サイズ変化を受けるにもかかわらず（文献３７）、これがＲＶＤおよびＶＲＡＣの活性化のような能動的に制御された調節機構を含むかどうかは知られていない。全てではないが、いくつかの研究は、低張性および高張性ストレスがＨａＣａＴ細胞の増殖に差次的に影響し得ることを示唆し（文献３８−４０）、これはインボルクリン、フィラグリンおよびトランスグルタミナーゼのような分化マーカーの遺伝子発現変化も伴う（文献３８，３９）。  
【００８３】
本明細書に提供されるデータ（実施例５参照）に示されるように、ＨａＣａＴ細胞におけるＬＲＲＣ８Ａノックダウンは、ＶＲＡＣ活性の減少をもたらし、特に、調節容積減少（ＲＶＤ）は、ＨａＣａＴ野生型細胞と比較してＬＲＲＣ８Ａノックアウト細胞において劇的に減少した。これらの観察に基づいて、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質活性の増加は、ＬＲＲＣ８Ａを含むＶＲＡＣのより高い活性を導くことが規定される。
【００８４】
本発明による使用のためのＬＲＲＣ８Ａの活性化剤の別の好ましい実施形態では、活性化剤は、（ｉ）発現可能な形態でＬＲＲＣ８Ａをコードするベクター；または（ｉｉ）内因的に存在するＬＲＲＣ８Ａの発現をアップレギュレートする遺伝子発現のレギュレーターである。
【００８５】
選択肢（ｉ）によれば、活性化剤は、発現可能な形態、すなわち、対応する核酸分子によってコードされるＬＲＲＣ８Ａタンパク質の発現を可能にする形態で、ＬＲＲＣ８Ａをコードするベクターである。核酸分子の発現は、例えば、調節エレメントを用いることによって確実にすることができる。調節エレメント／配列は当業者によく知られており、限定されるものではないが、転写の開始を確実にする調節配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ） (Owens, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001), 1471-1476)および任意に転写の終結および転写物の安定化を確実にする調節エレメントを含む。
【００８６】
転写の開始を確実にする調節エレメントの非限定的な例は、翻訳開始コドン、エンハンサー、例えばＳＶ４０−エンハンサー、インシュレーター、および／またはプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０−プロモーター、ＲＳＶ（トリ肉腫ウイルス）−プロモーター、ｌａｃＺプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ＣＡＧ−プロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルス即初期エンハンサーの組合せ）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１α−プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターＣａＭ−キナーゼプロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、オートグラファカリフォルニカ多核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多角体プロモーターまたはグロビンイントロンを含む。
【００８７】
転写終結を確実にする調節エレメントの非限定的な例としては、発現される核酸配列の下流に含まれるべき、Ｖ４０−ポリ−Ａ部位、ｔｋ−ポリ−Ａ部位またはＳＶ４０、ｌａｃＺまたはＡｃＭＮＰＶ多面体ポリアデニル化シグナルが挙げられる。
【００８８】
さらなる調節エレメントは、翻訳エンハンサー、コザック配列およびＲＮＡスプライシングのためのドナー部位および受容部位に挟まれた介在配列、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列、または使用される発現系に応じて、発現されたポリペプチドを細胞内区画に導くことができるシグナル配列を含み得る。さらに、複製起点、薬剤耐性遺伝子、レギュレーター（誘導性プロモーターの一部として）などのエレメントも含まれ得る。
【００８９】
さらに、例えば選択マーカーのような追加の配列を、ＬＲＲＣ８Ａをコードする核酸分子と共に導入することができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、Ｇ４１８、ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択マーカーとの同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺伝子を数百あるいは数千コピー保有する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である。これらのマーカーを用いて、細胞を選択培地で増殖させ、最も高い耐性を有する細胞を選択する。
【００９０】
この好ましい実施形態によれば、ＬＲＲＣ８Ａをコードする核酸分子ならびに潜在的調節配列およびさらなる配列は、発現ベクターに含まれる。好適には、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または従来から、例えば遺伝子工学で用いられている別のベクターである。非限定的な例としては、ｐＥＴ系列の発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＵＣ系列、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１、ｐＪＯＥ、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳ系列、ｐＪＢ８６１、ｐＢＳＭＵＬ、ｐＢＣ２、ｐＵＣＰＫＳ、ｐＴＡＣＴ１、およびＥ−０２７  ｐＣＡＧ  Ｋｏｓａｋ−Ｃｈｅｒｒｙ  （Ｌ４５ａ）ベクター系、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５，Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ  発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ  Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ−１０（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの哺乳動物細胞における発現に適合するベクターが挙げられる。
【００９１】
ベクターに挿入されたコード配列は、標準的な方法により合成することができる。コード配列の転写調節エレメントへのライゲーションは、確立された方法を用いて行うことができる。ベクター修飾技術については、Sambrook and Russel, 2001を参照のこと。非限定的な例として、配列番号１として本明細書に提供される核酸配列は、ＬＲＲＣ８Ａのベクターへの挿入および発現のために使用することができる。さらなる実施例として、配列番号３〜５として本明細書で提供される核酸配列のいずれかを使用することもできる。
【００９２】
あるいは、活性化剤は、内因的に存在するＬＲＲＣ８Ａの発現をアップレギュレートする遺伝子発現のレギュレーターでもあり得る。このようなレギュレーターは、細胞内にすでに存在し、通常ＬＲＲＣ８Ａの発現を調節する、天然に存在するレギュレーターであり得る。さらに、または代替的に、ケラチノサイトに通常存在しない、および／またはケラチノサイトにおいて通常ＬＲＲＣ８Ａレギュレーターとして作用しないレギュレーターを用いることができる。内因的に存在するＬＲＲＣ８Ａの発現をアップレギュレートする遺伝子発現のこのようなレギュレーターには、制限されることなく、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースのレギュレーター；（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ベースのレギュレーター；（ｉｉｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されるプログラム可能な配列特異的ゲノム編集ヌクレアーゼ；（ｉｖ）メガヌクレアーゼ；（ｖ）小分子；（ｖｉ）抗体または抗体模倣物；（ｖｉｉ）アプタマー；および（ｖｉｉ）ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸分子から選択される阻害性核酸分子が含まれる。好ましくは、レギュレーターは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ベースのレギュレーター、ならびにプログラム可能な配列特異的ゲノム編集ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される。これらのレギュレーターに関する詳細は、上記に記載されている。
【００９３】
本発明はさらに、ケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定する方法であって、（ａ）ケラチノサイトを試験化合物と接触させ、前記ケラチノサイト中のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量を決定する工程；および（ｂ）工程（ａ）において決定されたＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量を、前記試験化合物と接触させていない対照中のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量と比較する工程を含み、ここで、ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量の変化は、前記試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す、方法に関する。
【００９４】
第１の工程（ａ）に従って、ケラチノサイトを試験化合物と接触させる。
同定される化合物のタイプに依存して、ケラチノサイトは、健常細胞、すなわち、例えば乾癬または湿疹のようなケラチノサイトの分化の変化に関連する皮膚障害を有する患者の罹患組織から得られなかった細胞であり得る。あるいは、細胞は、そのような皮膚障害を有する患者の罹患組織から、またはそのような皮膚障害を反映する細胞モデルから得ることができる。例えば、様々なin vitro乾癬モデルが知られており、例えば文献４−６に記載されている。典型的には、このような細胞培養モデルは、正常（すなわち、健常である）ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）を、例えばＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７を含む乾癬サイトカインのカクテルで処理し、それによって乾癬に特徴的なケラチノサイトの異常な分化を誘導することによって作製される。これらの公知のモデルは、例えば、本発明の方法において使用することができる。 
【００９５】
健常細胞は、特定の化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができるかどうかに関する基礎情報を得るために特に適切であるが、疾患細胞またはケラチノサイトの分化変化に関連する障害のモデルとして機能する細胞は、前記障害をより詳細に調査し、潜在的な治療的または美容的に有用な化合物を同定するために使用することができる。
【００９６】
ケラチノサイトは、目的の生物から得られた初代培養細胞であってもよく、確立されたケラチノサイト細胞株であってもよい。さらに、ケラチノサイトは、例えば細胞培養中のような個別化形態の細胞、または組織生検または３Ｄ皮膚モデルのような三次元（３Ｄ）構造内に含まれる細胞であってもよい。このような乾癬のための３Ｄ皮膚モデルは最近開発されており、例えばＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）から市販されている。これらのモデルは、患者の乾癬病変から単離された健常ケラチノサイトと疾患線維芽細胞から構成される。好適には、このようなモデルは、このような乾癬表皮ケラチノサイトの使用が乾癬状態により近似するであろうと最近記載されたので、乾癬表皮ケラチノサイトを含むように修正される（文献４７）。乾癬は様々な細胞型とサイトカインとの複雑なクロストークが関与しているため、免疫細胞を追加的に含む３Ｄ皮膚モデルは非常に有用である。異なったＴ細胞集団を含むことができた最初の３Ｄ皮膚等価物は、免疫細胞の移動と炎症誘発性サイトカインの分泌を研究することを可能にした（文献４８）。このような３Ｄモデルはまた、乾癬のような分化障害の治療のためのＬＲＲＣ８Ａの調節を介して作用する化合物の潜在的な有益な効果を分析するために使用することができる。  
ＬＲＲＣ８Ａタンパク質レベルならびにＬＲＲＣ８Ａ転写物レベルの測定は、前述のように、いくつかの方法で達成することができる。
【００９７】
第二の工程（工程（ｂ））では、こうして決定されたＬＲＲＣ８Ａタンパク質または転写物の量を、試験化合物と接触させなかった対照に存在する量と比較する。対照におけるＬＲＲＣ８Ａタンパク質または転写物の量は、本発明の方法を実施する前に（例えば、工程（ａ）の前に工程（ａ−０）として）、またはそれと並行して（例えば、工程（ａ）または工程（ａ）の後および工程（ｂ）の前に）決定することができることが理解されるであろう。さらに、この工程は、将来の使用のための基準値を提供するために一度実施することができるか、または、その方法が実施されるたびに実施することができる。次に、工程（ｂ）で決定した量をこの基準値と比較して、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質または転写物の量が、ケラチノサイトと試験化合物とを接触させたときに変化したかどうかを決定する。
【００９８】
本発明によれば、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質または転写物の量の変化の所見は、試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す。ケラチノサイトの分化に関して本明細書中で使用される「変化させる」という用語は、（ｉ）分化の全体的程度、ならびに（ｉｉ）分化の経時変化に関して、両方とも、前記細胞の分化速度の変化に関する。
【００９９】
「分化の全体的程度」という言葉は、完全な分化に達するケラチノサイトの量に関係している。これは、例えば、特定時間後に完全に分化したケラチノサイトに分化した未分化ケラチノサイトの数に基づいて決定することができる。分化の全体的な程度が増加または減少するかのいずれかであれば、分化は変化すると考えられることが認識されるであろう。
【０１００】
一方、「分化の経時変化」という言葉は、ある量の細胞が部分的または完全な分化に到達する速さに関する。例えば、定義された数の未分化ケラチノサイトを、０時点で試験化合物で処理することができ、次いで、分化を、１時間後、２時間後、５時間後、１２時間後などに評価する。ケラチノサイトが分化するスピードを速めることができ、減少させることができ、両者の組合せ、すなわち、最初に一方向に変化し（増減のいずれか）、その後に他方向に変化することができることが理解されるであろう。３つの態様はすべて、分化の変化を表していると考えられる。さらに、健常表皮皮膚細胞では、分化は増殖と相互に結びついている。したがって、分化の増加は典型的には増殖の減少を伴い、一方、分化の減少は増殖の増加を伴う。したがって、分化速度のいかなる変化も、少なくとも健常ケラチノサイトにおいて、細胞の増殖速度の決定を介して間接的に決定することもできる。
【０１０１】
本発明の前記方法は、例えば、ハイスループットな方法で達成することができる。その目的のためのロボット装置は当該技術分野で知られており、多くの供給業者から入手可能である。細胞は通常、９６、３８４、１５３６以上のウェルのアレイを含むプレートのウェル内で増殖する。インキュベーターからウェルプレートを移し、試験化合物を加え、任意の洗浄工程を加え、読み取り値を決定することは、数日から数週間で数十万から数百万の化合物を使用してユーザ干渉を必要とせずに、自動化された方法で実行される。
目的の化合物が同定されると、さらに、その毒性を低下させること、有効期間を延長させること等により、医薬品又は化粧品に開発をすすめることができる。
【０１０２】
本発明はさらに、ケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定する方法に関し、方法は、（ａ）ケラチノサイトを試験化合物と接触させ、前記ケラチノサイト中のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性を決定する工程、および（ｂ）試験化合物と接触させていない対照中の活性と工程（ａ）で決定された活性を比較する、というものであり、ここで、ケラチノサイトを試験化合物と接触させた後のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性の変化は、試験化合物がケラチノサイトの分化を変化させることができることを示す。
【０１０３】
ＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量の測定に基づく本発明の方法に関して上述した定義および好ましい実施形態は、ＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性の測定に基づく本発明の本方法に準用する。
ＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性を決定する手段および方法は、当該技術分野で周知である（文献１８，２９−３１）。好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性は、ヨウ化物流入の測定、イオン電流の測定、ＶＲＡＣ基質の放出の測定、細胞容積変化の測定、細胞剛性の測定、インピーダンス測定、細胞サイズ決定、または電気感知ゾーン法から選択される１以上の方法によって決定される。より好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性は、蛍光ハロゲン化物感受性タンパク質（ｈｓＹＦＰ）またはイオン感受性低分子色素を用いてヨウ化物流入を測定すること、パッチクランプ技術などの電気生理学的方法を用いてイオン電流を測定すること、放出されたＶＲＡＣ基質、例えば神経伝達物質（例えば、ＧＡＢＡ）、アミノ酸（例えば、［3Ｈ］−Ｄ−セリン）および放射性標識浸透圧溶解液（例えば、［3Ｈ］−タウリン、［14Ｃ］−Ｄ−アスパラギン酸、ミオイノシトール）を測定すること、カルセインなどの容積感受性蛍光色素による細胞容積変化を測定すること、従来法、共焦点または原子間力顕微鏡を用いた３Ｄ容積測定、光磁気ねじれサイトメトリー（ＯＭＴＣ）による細胞剛性の測定、インピーダンス測定、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による細胞サイズ決定、または電気感知ゾーン法（コールター原理）により決定される。 
【０１０４】
本発明の方法の好適な実施形態では、方法は、ケラチン１（ＫＲＴ１）、ケラチン１０（ＫＲＴ１０）、インボルクリン（ＩＶＬ）、フィラグリン（ＦＬＧ）、ロリクリン（ＬＯＲ）、ケラチン４（ＫＲＴ４）、ケラチン１５（ＫＲＴ１５）、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７（Ｓ１００Ａ７）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（Ｓ１００Ａ９）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、小プロリンリッチタンパク質２Ｃ（ＳＰＲＲ２Ｃ）、小プロリンリッチタンパク質２Ｄ（ＳＰＲＲ２Ｄ）、セルピンファミリーＢメンバー３（ＳＥＲＰＩＮＢ３）、セルピンファミリーＢメンバー４（ＳＥＲＰＩＮＢ４）、ペプチダーゼ阻害剤３（ＰＩ３）、リポカリン２（ＬＣＮ２）、ケラチン６Ａ（ＫＲＴ６Ａ）、ケラチン１６（ＫＲＴ１６）、β−デフェンシン１（ＤＥＦＢ１）および増殖マーカーＫｉ−６７（ＭＫＩ６７）から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルを決定することをさらに含む
【０１０５】
本明細書で言及されるマーカーの全ては、関連する先行技術に従って定義される。以下の記述は、以下から入手可能な情報に基づいている：ヒト遺伝子データベース「ＧｅｎｅＣａｒｄｓ」、Weizmann Institute of Science, Version v4.6.1 Build 19, Genecards.org/のWorld Wide Webを参照のこと。
【０１０６】
上記のマーカーのいくつか、すなわち、ケラチン１（ＫＲＴ１）、ケラチン１０（ＫＲＴ１０）、ケラチン４（ＫＲＴ４）、ケラチン１５（ＫＲＴ１５）、ケラチン６Ａ  （ＫＲＴ６Ａ）およびケラチン１６（ＫＲＴ１６）は、ケラチン遺伝子ファミリーに属する。ケラチンは、中間径フィラメントを形成するヘテロ高分子構造タンパク質である。これらのフィラメントは、アクチンミクロフィラメントや微小管とともに上皮細胞の細胞骨格を構成し、上皮細胞の構造的完全性を担っている。ケラチンはサイトケラチンと毛髪ケラチンに細分される。Ｉ型サイトケラチンの大部分は酸性タンパク質からなり、異型ケラチン鎖の対をなして配列している。ＩＩ型サイトケラチンは塩基性または中性タンパク質からなり、単層および重層上皮組織の分化時に共発現するヘテロタイプケラチン鎖の対に配列される。
【０１０７】
ケラチン１（ＫＲＴ１）は、ＫＲＴ１遺伝子によってヒトでコードされるＩＩ型サイトケラチンである。ＫＲＴ１は、ファミリーメンバーＫＲＴ１０を有する表皮の有棘層および顆粒層に特異的に発現する。ＫＲＴ１およびＫＲＴ１０遺伝子の突然変異は水疱性先天性魚鱗癬様紅皮症と関連している。
【０１０８】
ケラチン１０（ＫＲＴ１０）は、ＫＲＴ１０遺伝子によってヒトでコードされるＩ型（酸性）サイトケラチンである。ＫＲＴ１０遺伝子の変異は表皮溶解性角質増殖症と関連している。
【０１０９】
ケラチン４（ＫＲＴ４）は、ＫＲＴ４遺伝子によってヒトでコードされるＩＩ型サイトケラチンである。ＫＲＴ４は、ファミリーメンバーＫＲＴ１３を有する粘膜および食道上皮の分化層において特異的に発現される。ＫＲＴ４およびＫＲＴ１３遺伝子の突然変異は、経口、食道、および肛門白板症を特徴とする白色海綿状母斑と関連している。
【０１１０】
ケラチン１５（ＫＲＴ１５）はＩ型サイトケラチンであり、ＫＲＴ１５遺伝子によってヒトでコードされている。ＫＲＴ１５に関連する疾患には、中枢性遠心性瘢痕性脱毛症およびエクリン汗腺新生物がある。
【０１１１】
ケラチン６Ａ（ＫＲＴ６Ａ）は、ＫＲＴ６Ａ遺伝子によってヒトでコードされるＩＩ型サイトケラチンである。これまでに、ヒトＩＩ型ケラチン‐６（Ｋ６）の６つのアイソフォームが同定されている；遺伝子の多重性は連続した遺伝子重複事象に起因する。ＫＲＴ６Ａはこれらのアイソフォームのうち最も豊富なものをコードしており、上皮にみられるすべての型の約７７％に相当する。これらの遺伝子は、舌の糸状乳頭、口腔粘膜および食道の重層上皮層、毛包の外毛根鞘、および腺上皮において、ファミリーメンバーＫＲＴ１６および／またはＫＲＴ１７とともに発現される。ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１６およびＫＲＴ１７遺伝子の突然変異は、先天性爪肥厚と関連している。加えて、ＫＲＴ６ＡのＣ末端領域由来のペプチドは、細菌病原体に対して抗微生物活性を有する。
【０１１２】
ケラチン１６（ＫＲＴ１６）はＩ型サイトケラチンであり、ＫＲＴ１６遺伝子によってヒトでコードされている。ＫＲＴ１６は、食道、舌、および毛包を含む多くの上皮組織においてケラチン１４と共発現されている。ＫＲＴ１６遺伝子の突然変異は、１型先天性爪肥厚、非表皮剥離性掌蹠角化症および片側掌蹠疣贅母斑と関連している。
【０１１３】
インボルクリン（ＩＶＬ）はＩＶＬ遺伝子によりヒトでコードされるタンパク質である。ケラチノサイト架橋エンベロープの構成要素であるインボルクリンは細胞質にみられ、トランスグルタミナーゼによって膜タンパク質と架橋される。ＩＶＬに関連する疾患には汗孔角化症がある。
【０１１４】
フィラグリン（ＦＬＧ）はＦＬＧ遺伝子によりヒトでコードされるタンパク質である。ＦＬＧは、哺乳動物の表皮においてケラチン中間径フィラメントを凝集させる中間径フィラメント関連タンパク質である。最初はケラトヒアリン顆粒に局在するポリタンパク質前駆体プロフィラグリンとして合成され、その後タンパク質分解により個々の官能性フィラグリン分子にプロセシングされる。ＦＬＧ遺伝子の変異は尋常性魚鱗癬およびアトピー性皮膚炎と関連している。
【０１１５】
ロリクリン（ＬＯＲ）は、ＬＯＲ遺伝子によってヒトでコードされるタンパク質である。ロリクリンは、最終分化した表皮細胞にみられる角化細胞膜の主要なタンパク質成分である。ＬＯＲ遺伝子の突然変異はＶｏｈｗｉｎｋｅｌ症候群および進行性対称性紅斑角化症と関連しており、いずれも遺伝性皮膚疾患である。
【０１１６】
マーカーＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（Ｓ１００Ａ９）およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７（Ｓ１００Ａ７）は、２つのＥＦ−ハンドカルシウム結合モチーフを含むタンパク質のＳ１００ファミリーのメンバーである。Ｓ１００タンパク質は広範囲の細胞の細胞質および／または核に局在し、細胞周期の進行および分化のような多くの細胞過程の調節に関与する。Ｓ１００遺伝子は少なくとも１３メンバーを含む。
【０１１７】
Ｓ１００Ａ８はＳ１００Ａ８遺伝子によってヒトにコード化されたタンパク質である。Ｓ１００Ａ８は、カセインキナーゼの阻害、およびサイトカインとして機能すると考えられている。このタンパク質の発現の変化はのう胞性線維症と関連している。この遺伝子については、異なるアイソフォームをコードする複数の転写物変異体が見つかっている。
【０１１８】
Ｓ１００Ａ９はＳ１００Ａ９遺伝子によってヒトにコード化されたタンパク質である。Ｓ１００Ａ９はカセインキナーゼを阻害する働きをすると考えられ、このタンパク質の発現を変えたものは、システイン繊維症と関連している。この抗菌タンパク質は抗真菌活性と抗菌活性を示す。
【０１１９】
Ｓ１００Ａ７はＳ１００Ａ７遺伝子によってヒトにコード化されたタンパク質である。Ｓ１００Ａ７は、Ｎ末端にある一つのＥＦハンドにカルシウム結合能力がないという点で、他の既知構造のＳ１００タンパク質とは異なっている。タンパク質は過剰増殖性皮膚疾患で過剰発現し、細菌に対して抗菌活性を示し、免疫調節活性を誘導する。
【０１２０】
Ｃ‐Ｘ‐Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）は、ＣＸＣＬ１遺伝子によりヒトでコードされるタンパク質である。ＣＸＣＬ１はケモカインのＣＸＣサブファミリーのメンバーである。コードされたタンパク質は、Ｇ−タンパク質共役受容体、ＣＸＣ受容体２を介してシグナルを伝達する分泌性増殖因子である。このタンパク質は炎症に関与し、好中球の化学誘引物質として働く。ＣＸＣＬ１の異常な発現は、ある種の腫瘍の増殖および進行と関連している。ＣＸＣＬ１の天然に存在するプロセシング型は、走化性活性を増加させた。交互スプライシングは、この遺伝子のコード変異体および非コード変異体を生じる。
【０１２１】
Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）は、ＣＸＣＬ８遺伝子によってヒトでコードされるタンパク質である。ＣＸＣＬ８はＣＸＣケモカインファミリーのメンバーであり、炎症反応の主要なメディエーターである。コードされたタンパク質は主に好中球によって分泌され、好中球を感染部位に誘導することによって走化性因子として働く。このケモカインも強力な血管新生因子である。ＣＸＣＬ８遺伝子は、ウイルス感染によって引き起こされる一般的な気道疾患である毛細気管支炎の病因において役割を果たすと考えられている。
小プロリンリッチタンパク質２Ｃ（ＳＰＲＲ２Ｃ）は偽遺伝子である。
【０１２２】
小プロリンリッチタンパク質２Ｄ（ＳＰＲＲ２Ｄ）は、ＳＰＲＲ２Ｄ遺伝子によってヒトでコードされるタンパク質である。ＳＰＲＲ２Ｄはケラチノサイトの架橋エンベロープタンパク質である。細胞質に最初に現れるのはケラチノサイトのタンパク質であるが、最終的にはトランスグルタミナーゼによって膜タンパク質と架橋され、その結果、細胞膜の下に不溶性の外皮ができる。
【０１２３】
セルピンファミリーＢメンバー３（ＳＥＲＰＩＮＢ３）は、ＳＥＲＰＩＮＢ３遺伝子によってヒトでコードされるタンパク質である。ＳＥＲＰＩＮＢ３はパパイン様システインプロテアーゼ阻害剤として作用し、腫瘍細胞に対する宿主免疫反応を調節すると考えられている。また、ｃ‐Ｊｕｎ  ＮＨ（２）‐末端キナーゼ（ＪＮＫ１）の活性の抑制を介してＵＶ誘導アポトーシスの阻害剤として機能する。ＳＥＲＰＩＮＢ３に関連する疾患には、扁平上皮癌および肛門癌がある。この遺伝子の重要なパラログはＳＥＲＰＩＮＢ４である。
【０１２４】
セルピンファミリーＢメンバー４（ＳＥＲＰＩＮＢ４）は、ＳＥＲＰＩＮＢ４遺伝子によってヒトでコードされるタンパク質である。ＳＥＲＰＩＮＢ４はセリンプロテアーゼ阻害剤のセルピンファミリーの一員であり、多くの腫瘍細胞で高度に発現している。ＳＥＲＰＩＮＢ４は、ＳＥＲＰＩＮＢ３とともに、より小さな断片にプロセシングされ、おそらく慢性炎症を引き起こすことによって、凝集して乾癬における自己抗原を形成することができる。
【０１２５】
ペプチダーゼ阻害剤３（ＰＩ３）は、ＰＩ３遺伝子によってヒトでコードされるタンパク質である。ＰＩ３は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌、ならびに真菌病原体に対する抗菌ペプチドとして機能するエラスターゼ特異的阻害剤である。タンパク質はＷＡＰ型４‐ジスルフィドコア（ＷＦＤＣ）ドメインを含み、従ってＷＦＤＣドメインファミリーの一員である。ほとんどのＷＦＤＣ遺伝子メンバーは、動原体とテロメアの２つの染色体クラスターに局在している。ＰＩ３遺伝子は動原体クラスターに属する。ＰＩ３の発現は細菌のリポ多糖とサイトカインによってアップレギュレートされる。
【０１２６】
リポカリン２（ＬＣＮ２）はＬＣＮ２遺伝子によりヒトでコードされるタンパク質である。ＬＣＮ２はリポカリンファミリーに属するタンパク質である。このファミリーのメンバーは、脂質、ステロイドホルモンおよびレチノイドのような小さな疎水性分子を輸送する。ＬＣＮ２は好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンであり、鉄含有シデロホアを隔離する結果として細菌の増殖を制限することにより自然免疫に役割を果たす。血中および尿中のＬＣＮ２の存在は、急性腎障害の初期のバイオマーカーである。ＬＣＮ２は、皮膚の恒常性の維持、侵襲性や転移の抑制など、複数の細胞プロセスに関与していると考えられている。ＬＣＮ２遺伝子を欠損したマウスは、野生型マウスよりも細菌感染に対する感受性が高い。
【０１２７】
「トランスグルタマーゼ１（ＴＧＭ１）」は、ＴＧＭ１遺伝子によってヒトでコードされるタンパク質である。ＴＧＭ１はアルキルアミンからタンパク質のグルタミン残基へのアルキル基の付加を触媒し、タンパク質中でアルキルグルタミンを生成する。このタンパク質アルキル化はタンパク質の架橋とポリアミンのタンパク質へのカテーテル化を導く。ＴＧＭ１遺伝子の変異は、常染色体劣性層状魚鱗癬（ＬＩ）および非水疱性先天性魚鱗癬様紅皮症と関連している。
【０１２８】
デフェンシンβ１（ＤＥＦＢ１）はＤＥＦＢ１遺伝子によりヒトでコードされるタンパク質である。デフェンシンは、好中球によって作られる殺菌性および細胞毒性ペプチドのファミリーを形成する。デフェンシンファミリーのメンバーはタンパク質配列がよく似ている。ＤＥＦＢ１は、上皮表面の微生物コロニー形成に対する耐性に関与する抗菌ペプチドである。ＤＥＦＢ１遺伝子はデフェンシンファミリーメンバーデフェンシンα１に近接してマップされ、のう胞性線維症の病因に関係している。
【０１２９】
増殖Ｋｉ‐６７（ＭＫＩ６７）のマーカーは、ＭＫＩ６７遺伝子によりヒトでコードされるタンパク質である。ＭＫＩ６７は核タンパク質であり、細胞増殖に関連しており、それに必須である可能性がある。
データベース受入番号、関連する出版物、プライマーおよび／または抗体情報などの付加的な情報を、下記の表１および２に要約する。
表１：マーカー遺伝子のリスト。対応するｍＲＮＡのＮＣＢＩリファレンスＩＤ、参考文献のｄｏｉ番号および市販の抗体を示す。
【表１】
2021513980.tif 000002
【０１３０】
表２：マーカー遺伝子のリスト。Harvard primer data bank (see the World Wide Web at pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ )に由来するＲＴ−ＰＣＲ解析用のリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ解析用の市販のＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびオリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号８〜４１）を示す。
【表２】
2021513980.tif 000003
【０１３１】
本明細書で使用される用語「少なくとも１つ」は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０の異なるアミノ酸またはそれ以上、例えば、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または１９のマーカーすべてをも包含する。この用語がさらに、正確に１つ、正確に２つ、正確に３つ、正確に４つ、正確に４つ、正確に４つ、正確に６つ、正確に８つ、正確に９つ、正確に１０、正確に１１、正確に１２、正確に１３、正確に１４、正確に１５、正確に１６、正確に１７、正確に１８、または正確に１９のマーカーすべてを包含することは、当業者によって理解されるであろう。特に好ましいマーカーは、ケラチノサイトの分化のマーカーとしてＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＩＶＬ、ＦＬＧ、ＬＯＲ、およびＴＧＭ１から、および／またはケラチノサイトの増殖のマーカーとしてＫＲＴ６、ＫＲＴ１６、およびＭＫＩ６７から選択される。
【０１３２】
当業者は、上記のマーカーの少なくとも１つが細胞によって発現されるかどうかを決定する適切な方法を知っている。このような方法は、限定するものではないが、本明細書において上記で定義されるように、アミノ酸レベルならびに核酸レベルでのマーカーの発現を決定することを含む。例えば、このような方法には、ウエスタンブロット分析、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析、免疫組織または細胞化学分析、ならびにマイクロアレイまたはＲＮＡ配列分析が含まれる。前記少なくとも１つのマーカーの発現は、ウエスタンブロット分析またはｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定されることが特に好ましい。
【０１３３】
上記の遺伝子のいくつかは、ケラチノサイトの分化マーカーとして知られている。一般に、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧおよびＬＯＲの発現は、ケラチノサイト分化時に増大することが知られているが、ＫＲＴ４およびＫＲＴ１５は、典型的には、分化時にダウンレギュレートされる。本発明によれば、以下の発現プロファイルは特に関連性がある：
【０１３４】
（ｉ）２Ｄ細胞培養でin vitro培養された正常な、健常ケラチノサイトにおけるＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧ、ＬＯＲ、ＩＶＬ、ＴＧＭ１から選択された少なくとも１つのマーカー、および／またはＫＲＴ４およびＫＲＴ１５から選択された少なくとも１つのマーカーの発現の分析。未処理の正常、健常ケラチノサイトと比較して、試験化合物による刺激後のＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧ、ＬＯＲ、ＩＶＬおよび／またはＴＧＭ１の発現の増加および／またはＫＲＴ４および／またはＫＲＴ１５の発現の減少は、分化速度の増加を示す。このモデルは、例えば、乾癬または皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎のようなケラチノサイトの変化された分化に関連する皮膚状態の治療のためのリード化合物として適した試験化合物を同定するために役立ちうる。
【０１３５】
（ｉｉ）２Ｄ細胞培養でin vitro培養された乾癬ケラチノサイトモデル（例えば、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７による刺激によって生成されるモデル）におけるＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧから選択された少なくとも１つのマーカー、およびＬＯＲおよび／またはＩＶＬ、Ｓ１００Ａ８、ＤＥＦＢ１、ＫＲＴ６、ＫＲＴ１６およびＭＫＩ６７から選択された少なくとも１つのマーカーの発現の分析。同じモデルの未処理の乾癬ケラチノサイトと比較して、試験化合物により刺激を与えた後の、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧおよび／またはＬＯＲの発現の増加またはＩＶＬ、Ｓ１００Ａ８、ＤＥＦＢ１、ＫＲＴ６、ＫＲＴ１６および／またはＭＫＩ６７の発現の増加は、分化速度の増加を示し、したがって、増殖の減少による分化の向上および疾患状態の改善を示す。このモデルは、特に、乾癬の治療のためのリード化合物として適した試験化合物を同定するために役立つことができる。
【０１３６】
（ｉｉｉ）乾癬患者の皮膚（例：皮膚生検）におけるＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧおよびＴＧＭ１から選択される少なくとも１つのマーカーおよび／またはＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＳＰＲＲ２Ｃ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＰＩ３、ＬＣＮ２、ＩＶＬ、ＫＲＴ６、ＫＲＴ１６およびＭＫＩ６７から選択される少なくとも１つのマーカーの発現の分析。乾癬患者の未処理の皮膚と比較して、試験化合物による刺激後のＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧおよび／またはＴＧＭ１の発現の増加、および／または、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＳＰＲＲ２Ｃ、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＰＩ３、ＬＣＮ２、ＩＶＬ、ＫＲＴ６、ＫＲＴ１６および／またはＭＫＩ６７の発現の低下は分化速度の増加を示し、したがって、増殖の減少による分化の向上および乾癬表現型の改善を示す。このモデルは、特に、乾癬の治療のためのリード化合物として適した試験化合物を同定するために役立つことができる。
【０１３７】
（ｉｖ）２Ｄ細胞培養でin vitro培養された正常、健常ケラチノサイトにおける、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧおよびＬＯＲから選択された少なくとも１つのマーカーおよび／またはＫＲＴ４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ６およびＫＲＴ１６から選択された少なくとも１つのマーカーの発現の分析。未処理の正常、健常ケラチノサイトと比較して、試験化合物による刺激後のＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧおよび／またはＬＯＲの発現の減少および／またはＫＲＴ４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ６および／またはＫＲＴ１６の発現の増加は、増殖の増強を伴う分化速度の低下を示す。このモデルは、例えば、皮膚損傷後、または創傷治癒障害の場合に、創傷治癒を促進するためのリード化合物として適当な試験化合物を同定するために役立つことができる。
【０１３８】
（ｖ）患者の創傷から得られたケラチノサイトにおけるＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧおよびＬＯＲから選択された少なくとも１つのマーカーおよび／またはＫＲＴ４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ６およびＫＲＴ１６から選択された少なくとも１つのマーカーの発現の分析。患者の創傷から得られた未処理ケラチノサイトと比較して、試験化合物による刺激後のＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＦＬＧおよび／またはＬＯＲの発現の低下および／またはＫＲＴ４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ６および／またはＫＲＴ１６の発現の上昇は、増殖の亢進を伴う分化速度の低下を示す。また、このモデルは、皮膚損傷後、または創傷治癒障害の場合に、創傷治癒を促進するためのリード化合物として適当な試験化合物を同定するために役立つことができる。
【０１３９】
好適には、上記（ｉ）から（ｖ）に引用されるマーカー組合せのマーカーの全ての発現レベルを決定する。未処理対照における発現レベルは、試験化合物による試料刺激における発現レベルの決定と並行して、続いて、またその前に決定することができることが理解されるであろう。さらに、未処理対照における前記の決定は、将来の使用のための基準値を提供するために一度実施することができるか、またはその方法が実施されるたびに実施することができる。以前に公開されたデータが対象の参照値として信頼されることも想定される。
【０１４０】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、本方法は、同定された化合物の薬理学的特性を最適化することをさらに含む。したがって、本方法によって同定された化合物は、「リード化合物」とみなすことができ、そこからさらに修飾され、潜在的に改善された化合物を開発することができる。
【０１４１】
同定されたリード化合物は、たとえば、化合物を修飾して最適化することができる：（ｉ）活性のスペクトルの修飾、（ｉｉ）効力の向上、（ｉｉｉ）毒性の減少（治療指数の向上）、（ｉｖ）副作用の減少、（ｖ）作用の開始、効果の持続時間の変更、（ｖｉ）物理化学的パラメーターの修飾（溶解度、吸湿性、色、味、臭い、安定性、状態）、および／または（ｖｉｉ）最適化されたアプリケーションフォームと経路。そのような修飾を達成するための手段および方法は、（ａ）カルボキシル基のエステル化、（ｂ）ヒドロキシル基のカルボン酸とのエステル化、（ｃ）例えばリン酸、ピロリン酸または硫酸もしくはヘミコハク酸へのヒドロキシル基のエステル化、（ｄ）薬学的に許容される塩類の形成、（ｅ）薬学的に許容される錯体の形成、（ｆ）薬理活性ポリマーの合成、（ｇ）親水性部分の導入、（ｈ）芳香族または側鎖への置換基の導入／交換、置換基パターンの変更、（ｉ）アイソスターまたはバイオアイソスター部分の導入による修飾、（ｊ）相同化合物の合成、（ｋ）分岐側鎖の導入、（ｌ）環状類似体へのアルキル置換基の変換、（ｍ）ケタール、アセタールへのヒドロキシル基の誘導体化、（ｎ）アミド、フェニルカルバメートへのＮ−アセチル化、（ｏ）マンニッヒ塩基、イミンの合成、および／または（ｐ）ケトンまたはアルデヒドのシッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジンまたは  それらの組合せへの変換を含むが、これらに限定されない。
上記に挙げた種々の工程は、当該技術分野において一般的に知られている。
【０１４２】
本発明の両方の方法（本明細書では「本発明のスクリーニング方法」とも呼ばれる）は、ケラチノサイトの分化を変化させることができる化合物を同定するのに適している。
【０１４３】
両方の方法の好ましい実施形態では、試験化合物とケラチノサイトを接触させた後のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量の増大および／または試験化合物とケラチノサイトを接触させた後のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性の増大は、試験化合物がケラチノサイトの変化された分化に関連する皮膚状態の治療および／または予防に使用するのに適した化合物であることを示す。本発明の方法の特に好ましい実施では、ケラチノサイトの変化された分化に関連する皮膚状態は、乾癬または皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎である。これらの条件の定義および好ましい実施形態は、上記で本明細書に提供されている。
【０１４４】
両方の方法の代替の好ましい実施形態では、試験化合物とケラチノサイトを接触させた後のＬＲＲＣ８Ａタンパク質またはＬＲＲＣ８Ａ転写物の量の減少、および／または試験化合物とケラチノサイトを接触させた後のＬＲＲＣ８Ａを含む（１つまたは複数の）ＶＲＡＣの活性の減少は、試験化合物が皮膚損傷および創傷治癒障害から選択される皮膚状態の治療および／または予防に使用するのに適した化合物であることを示す。
【０１４５】
創傷治癒は、一方ではケラチノサイトの分化の低下、他方ではケラチノサイトの速い増殖を特徴とする。乾癬および同様の皮膚状態では、分化の増加および増殖の減少が望ましいが、創傷治癒の促進においては逆が望ましい。ここでは、このタイプの表皮変化をさらに促進することが有益であり、その結果、分化はさらに遅くなるが、増殖はさらに増強される。添付の実施例に示され、図６および７に示されるように、ＬＲＲＣ８Ａの抑制は、ケラチノサイトの分化を低下させることが見出された。このように、ＬＲＲＣ８Ａ阻害剤による創傷治癒を促進することは有益であり、それは分化が少なく、ケラチノサイトがより増殖する結果となる。
【０１４６】
従って、本発明はさらに、皮膚損傷および創傷治癒障害から選択される皮膚状態の治療および／または予防に使用するロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）の阻害剤に関する。
【０１４７】
本実施形態で使用される用語「阻害剤」は、標的分子、すなわちＬＲＲＣ８Ａの発現および／または活性を抑制または低下させる化合物として定義される。好ましくは、阻害剤は以下の１つまたは複数の効果を媒介する：（ｉ）ＬＲＲＣ８Ａをコードする遺伝子の発現、すなわち、転写および／または翻訳が抑制または減少される、および（ｉｉ）  ＬＲＲＣ８Ａが、活性化剤の存在下で、その機能、例えば、その生化学的および／または細胞機能などを、低下した効率で行う。
【０１４８】
クラス（ｉ）に入る化合物は、転写機構および／またはＬＲＲＣ８Ａ遺伝子のプロモーターと相互作用する化合物および／またはエンハンサーなどのプロモーターから離れた発現制御要素と相互作用する化合物を含む。また、当該技術分野でよく知られている（例えば、Zamore (2001) Nat.Struct.Biol.8(9), 746; Tuschl (2001) Chembiochem.2(4), 239)を参照）、例えばＬＲＲＣ８Ａ発現を阻害する分子を標的としたＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を実施するためのアンチセンス構築物および構築物も含まれる。クラス（ｉｉ）の化合物は、阻害されるタンパク質の機能を低下させ、ＬＲＲＣ８Ａの本例では、それらは、例えば、以下の実施例５に記載されるように、そのＶＲＡＣ活性を低下させ、ならびに例えば、以下の実施例６に記載されるように、ケラチノサイトの分化調節因子としてのその活性を低下させる。
【０１４９】
本発明によれば、用語「阻害剤」は、ＬＲＲＣ８Ａに対して直接的に阻害作用を有する分子を包含するが、例えば、ＬＲＲＣ８Ａの発現または機能を調節する分子と相互作用することによって間接的に阻害する分子も両方包含する。したがって、ＬＲＲＣ８Ａに対する直接作用を有する分子は、必然的に阻害剤であろうが、一方、ＬＲＲＣ８Ａに対する間接作用を有する分子は、ＬＲＲＣ８Ａに対する総合作用が阻害である限り、正の（すなわち、活性化する）または負の（すなわち、阻害する）調節因子であり得る。好ましくは、阻害剤は、ＬＲＲＣ８Ａに直接的に作用し、より好ましくは、ＬＲＲＣ８Ａの転写および／または翻訳を直接的に低下させる。
【０１５０】
本発明による阻害剤は、ＬＲＲＣ８Ａの活性化剤のために、上記で定義した分子のタイプのいずれかとして提供することができ、すなわち、小分子、タンパク質化合物または核酸分子として提供することができる。ＬＲＲＣ８Ａの阻害剤として機能する化合物の標的は、ＬＲＲＣ８Ａの活性化剤として機能する化合物の標的とは異なるように選択されなければならないであろうことは認識されるであろうが、これらの化合物、すなわち、小分子、タンパク質化合物および核酸分子について上述した全般的な定義および一般的な実施形態の全てが、準用される。好ましくは、阻害剤は、ＬＲＲＣ８Ａを特異的に認識する抗体、またはＬＲＲＣ８Ａ核酸配列、例えばｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−およびＣＲＩＳＰＲ−ＣＰｆ１−ベースの構築物、ならびにメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼを特異的に除去またはサイレンシングする核酸分子であるか、または阻害剤は、ＬＲＲＣ８Ａを特異的に認識する小分子である。また、例えば、ＬＲＲＣ８Ａ発現の上流調節因子に作用することにより、ＬＲＲＣ８Ａを間接的に阻害する抗体、干渉核酸配列または小分子化合物などの阻害剤が本発明に従って想定される。
【０１５１】
「ＬＲＲＣ８Ａの阻害剤」という語は、本明細書中で使用される場合、ＬＲＲＣ８Ａの生物学的機能を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、またはさらに少なくとも９９％に減少させる化合物を指す。生物学的機能とは、特に、本発明に従って解明された機能を含むＬＲＲＣ８Ａの既知の生物学的機能またはその任意の組合せを意味する。前記生物学的機能の実施例は、ＬＲＲＣ８Ａの活性化剤に関して上述したものである。これらの全ての機能は、技術常識に基づいて、又は本明細書の教示に基づいて、場合によってはそれに引用される文書の教示と併せて、当業者によってテストされ得る。
【０１５２】
本発明による阻害剤は、皮膚損傷および創傷治癒障害から選択される皮膚状態の治療および／または予防に使用するためのものである。皮膚損傷には、皮膚を貫通する傷、例えば、切傷（ｃｕｔｓ）、断傷（ｌａｃｅｒａｔｉｏｎｓ）、深傷（深傷）および裂傷（ｔｅａｒｓ）、ならびに皮膚の表面にある傷、例えば、擦り傷（ｓｃｒａｐｅｓ）、擦過傷（ａｂｒａｓｉｏｎｓ）、引っかき傷（ｓｃｒａｔｃｈｅｓ）および擦り傷（ｆｌｏｏｒ  ｂｕｒｎｓ）が含まれる。本明細書中で使用される用語「創傷治癒障害」は、すでに存在する損傷が治癒せず、慢性創傷をもたらし、またはゆっくりと治癒する状態に関する。
【０１５３】
ＬＲＲＣ８ＡまたはＬＲＲＣ８Ａの活性化剤に関して上記で提供された全ての他の定義および好ましい実施形態、ならびに上記の方法は、ＬＲＲＣ８Ａの本阻害剤にも準用する。
【０１５４】
本発明による使用のための本阻害剤の好ましい実施形態では、本阻害剤は、ＬＲＲＣ８Ｂの阻害剤、ＬＲＲＣ８Ｃの阻害剤、ＬＲＲＣ８Ｄの阻害剤、ＬＲＲＣ８Ｅの阻害剤、およびＬＲＲＣ８Ｆの阻害剤から選択される１以上の追加化合物と組合せて使用される。
【０１５５】
本発明の阻害剤の好ましい実施形態では、（ｉ）阻害剤はＬＲＲＣ８Ａの発現を低下させる；および／または（ｉｉ）阻害剤はＬＲＲＣ８Ａを含む容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）の活性を低下させる。
【０１５６】
ＬＲＲＣ８Ａの発現および／またはＬＲＲＣ８Ａを含む容積調節性アニオンチャネル（ＶＲＡＣ）の活性が低下しているかどうかを決定するための手段および方法が、上記に詳細に提供されている。
【０１５７】
代替の実施形態では、本発明はさらに、皮膚損傷および創傷治癒障害から選択される皮膚状態の治療および／または予防方法に関し、この方法は、ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）の阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。本発明に従って使用するためのＬＲＲＣ８Ａの阻害剤に関して本明細書に提供される全ての定義および好ましい実施形態は、本治療法に準用する。
【０１５８】
本発明による使用のためのＬＲＲＣ８Ａおよび／または活性化剤、または本発明による使用のための阻害剤が、医薬組成物中に含まれることがさらに好ましい。
【０１５９】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、上記の化合物を含む。本発明の医薬組成物は、任意におよび追加的に、薬学的に許容される担体を含むことができ、「薬学的に許容される担体」は、非毒性の固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、封入材料または任意の種類の製剤助剤を意味する。適切な薬学的に許容される担体の例は、当技術分野において周知であり、リン酸緩衝塩化ナトリウム溶液のような塩化ナトリウム溶液、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液、有機溶媒などが挙げられる。このような薬学的に許容される担体は、等張性および化学的安定性を増強する物質のような少量の添加剤を含むことが多い。そのような材料は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ペプチド；例えばポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、またはさらなる免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖、二糖、および他の炭水化物；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどのカウンターイオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。また、キトサンは、例えば、投与時に活性成分の放出を遅延させるための使用のために、医薬組成物中に含むことができる。
【０１６０】
医薬組成物は、医薬組成物の意図される用途に応じて、さらなる薬剤を含んでもよく、またはさらなる薬剤と併用して（必ずしも同時にではなく）投与してもよい。例えば、（ａ）目的のＶＲＡＣの残りのＬＲＲＣ８サブタイプを標的とする上記の追加の化合物；ならびに（ｂ）乾癬の治療のために確立された治療薬、例えば（ｉ）コルチコステロイド、ビタミンＤアナログ、局所レチノイド、カルシニュリン阻害剤などの局所薬剤、（ｉｉ）メトトレキサート、シクロスポリン、アシトレチンおよび許可されている場合はフマル酸エステルなどの全身薬、または（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１２／ＩＬ−２３を標的とする抗体などの生物製剤  、または（ｃ）皮膚炎の治療のための確立された治療法、例えば、（ｉ）ヒドロコルチゾンまたはカルシニュリン阻害剤などの局所薬剤、（ｉｉ）インターロイキンシグナル伝達を標的とする抗体、または（ｉｉｉ）経口および局所適用される小分子ＪＡＫ−１／２阻害剤の両方を使用してＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を標的とする薬剤を含んでいてもよい。
【０１６１】
本発明の薬学的組成物の投与は、異なる方法、例えば局所投与（例えば、クリーム、ローション、スプレー、粉末、軟膏、点滴または経皮パッチ）、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、鼻腔内投与または気管支内投与によって、ならびに頬側投与によって、または経口スプレーとして行うことができる。したがって、薬学的に許容される担体は、これらの投与様式に適した担体であることが好ましい。
【０１６２】
最も好ましくは、担体は局所投与に適している。局所投与に適しているためには、担体は浸透増強剤であるか、またはそれを含むべきである。浸透促進剤は、典型的には、皮膚または粘膜表面のバリア特性を克服し、医薬製剤に添加された活性剤の経皮吸収を容易にするのに役立つ。浸透増強剤の別の名称には、例えば、透過増強剤、収着増強剤および促進剤が含まれる。浸透増強剤は、角質層中の分子と相互作用してその透過性を改変し、治療的に効果的な速度での送達を達成することによって作用する。このような透過増強剤は、前処理により、または薬物と同時に、または併用して、皮膚に適用することができる。製剤に使用する物質としての浸透増強剤は、一連の品質的な基準を満たさなければならない。例えば、感作を誘発したり、アレルギー反応を引き起こしたりするなど、皮膚を刺激してはならない。また、十分な浸透作用を発揮するのに必要な濃度で薬理学的に不活性でなければならない。その作用は予測的かつ可逆的であり、できれば即効性でなければならない。また、製剤に容易に取り込まれるべきである。
【０１６３】
一般に、浸透促進剤は、複数の化学的クラスに分けられる：アルコール（例えば、エタノール、プロピレングリコールまたはラウリルアルコール）、アミド（例えば、Ｉ−ドデシルアゼパン−２−オン（Ａｚｏｎｅ））、エステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル、ドデシル−２−ジメチルアミノプロパノエート（ＤＤＡＩＰ））、エーテルアルコール（例えば、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、脂肪酸（例えば、リノール酸、オレイン酸）、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、ピロリドン（例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン）、スルホキシド（例えば、ジメチルスルホキシド）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキルトリメチルアンモニウムハライド、ｔｗｅｅｎ８０、２−ノニル−１，３−ジオキソラン（ＳＥＰＡ  ００９））、テルペン（例えば、ユージノール、ファルネソール）（文献４９）。 
【０１６４】
このような担体を含む組成物は、よく知られた従来の方法によって処方することができる。一般に、製剤は、医薬組成物の成分を、液体担体または微細な固体担体またはその両方と均一かつ密接に接触させることによって調製される。その後、必要であれば、生成物を所望の製剤に形作る。本発明の医薬組成物の好ましい投与様式は、局所投与用によるものである。
【０１６５】
医薬組成物は、適当な投与量で対象に投与することができる。用量の投与方法は、主治医および臨床的要因により決定する。医学分野でよく知られているように、任意の１人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康、ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。当業者は、個々に投与される医薬組成物の有効量が、特に、化合物の性質に依存することを知っている。例えば、前記化合物がポリペプチドまたはタンパク質である場合、用量当たり非経口的に投与される医薬組成物の総医学的有効量は、患者体重あたり約１μｇタンパク質／ｋｇ／日〜１０ｍｇタンパク質／ｋｇ／日の範囲であろうが、上述のように、これは治療上の裁量の対象であろう。より好ましくは、この投与量は少なくとも０．０１ｍｇタンパク質／ｋｇ／日であり、最も好ましくは、ヒトに対して約０．０１〜１ｍｇタンパク質／ｋｇ／日である。連続的に投与される場合、薬学的組成物は、典型的には、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投与速度で、１日当たり１〜４回の注射によって、または例えばミニポンプを用いる持続皮下注入によって投与される。静脈注射バッグ溶液もまた用いられ得る。さらに、例えば前記化合物がｓｉＲＮＡのようなｉＲＮＡ剤である場合、投与される医薬組成物の総医学的有効量は、典型的には体重ｋｇ当たり約７５ｍｇ未満であり、例えば体重ｋｇ当たり約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００５ｍｇである。より好ましくは、量は体重ｋｇ当たり２０００ｎｍｏｌ未満のｉＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０１６コピー）、例えば体重ｋｇ当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５または０．０００１５ｎｍｏｌ未満のｉＲＮＡ剤である。
【０１６６】
変化を観察するために必要な治療の長さ、および反応が起こるための治療後の間隔は、望ましい効果に応じて変化するようである。所定の状況に対する特定の治療的有効量は、日常的な実験によって容易に決定され、通常の臨床医または医師の技術および判断の範囲内である。
【０１６７】
治療的投与のために使用される医薬組成物の成分は、滅菌されなければならない。滅菌は、例えば、滅菌ろ過膜（例えば、０．２μｍ膜）を通したろ過によって容易に達成される。
【０１６８】
本発明はさらに、（ｉ）ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）の有効量、（ｉｉ）ＬＲＲＣ８Ａの活性化剤、（ｉｉｉ）ＬＲＲＣ８ＡおよびＬＲＲＣ８Ａの活性化剤、または（ｉｖ）ＬＲＲＣ８Ａの阻害剤を局所投与することを含む、個体の皮膚を治療するための美容方法に関する。
【０１６９】
本明細書で使用される用語「美容方法」は、皮膚状態に影響を受ける個人の皮膚の光学的外観および／または皮膚感覚を改善するための方法に関する。前記光学的外観は、限定されるものではないが、例えば皮膚に対する創傷の結果として、発赤、加齢、つやなし（ｄｕｌｌｎｅｓｓ）、斑点状皮膚、しわ、凹凸、テカテカ光る皮膚、べとつきおよび鱗屑を含む。治療できる皮膚感覚の例としては、限定されるものではないが、硬い皮膚や緊張状態の皮膚、かゆみや灼熱感、および痛みを感じるなどがある。
【０１７０】
非限定的な例を提供するために、乾癬および皮膚炎のような皮膚障害は、罹患者の皮膚または爪の外観の悪化および／または罹患者が経験する皮膚感覚の悪化を伴うことが多く、これには、限定されることなく、発赤、鱗屑、剥離、乾固、かゆみ、灼熱感、痛み、爪の変色または爪のつぶれが含まれる。これらの美容上の問題は、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載の化合物の有効量を局所的に投与することを含む本発明の美容方法によって軽減することができる。一方、皮膚損傷や創傷治癒には、皮膚の望ましくない、見えない変化、ならびに制限されることなく、瘢痕、こわばり、かゆみ、乾固、浸軟、腫脹、緊張、色素沈着などの望ましくない皮膚感覚を伴うことが多い。また、これらの美容上の問題は、本発明の美容方法によって軽減することができ、ここで、該方法は、（ｉｖ）に列挙される化合物の有効量を局所投与することを含む。
【０１７１】
本発明の美容方法に従って、列挙された化合物は、局所的に投与される。局所投与は、当該技術分野でよく知られており、皮膚または粘膜、好ましくは皮膚などの体表面への化合物の適用に関する。化合物は、限定されるものではないが、クリーム、ローション、フォーム、ゲル、スプレー、粉末、軟膏、点滴、ペースト、チンキ、および経皮パッチの形態を含む、局所投与用のための種々の形態で提供することができる。
【０１７２】
本明細書で上述し、図６および７に要約したように、ロイシンリッチ反復含有タンパク質８Ａ（ＬＲＲＣ８Ａ）の発現のノックアウトが、ケラチノサイトの分化の変化をもたらすことが驚くべきことに見出された。したがって、ＬＲＲＣ８Ａの発現および／または活性の量に影響を与える化合物は、ケラチノサイトの分化を望ましい方向に誘導することによって皮膚の外観を改善するための有望なツールである：分化を増強することにより、乾癬および皮膚炎などの疾患の皮膚の外観への悪影響を軽減することができ、分化を減少させ、増殖を促進することにより、瘢痕化した皮膚の外観を改善することができる。
【０１７３】
特に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含む特許明細書が優先する。
【０１７４】
本明細書で引用されたデータベースアクセッション番号を介してアクセス可能なすべての配列は、本発明の範囲内であり、また、科学の継続的な進歩により発生する可能性のある、それぞれのデータベースのエントリの将来の修正および変更を考慮するために、データベース内の潜在的な将来の更新も含まれる。
【０１７５】
本明細書で提供されるすべてのアミノ酸配列は、当技術分野で慣習的に行われているように、最もＮ末端の残基で始まり、最もＣ末端の残基（Ｎ−＞Ｃ）で終わるように提示され、１文字または３文字のコード略語は、本発明を通じてアミノ酸を同定するとき、アミノ酸に一般的に使用されるものに対応する。
【０１７６】
本明細書で特徴付けられる実施形態に関して、特に請求項では、従属請求項で言及される各実施形態が、各請求項の各実施形態（独立または従属）と組み合わせられることが意図されている。例えば、独立請求項１が３つの代替案Ａ、Ｂ及びＣを記載し、従属請求項２が３つの選択肢Ｄ、Ｅ及びＦを記載し、請求項３が請求項１および２に従属し、且つ３つ代替案Ｇ、Ｈ及びＩを記載する場合には、本明細書が、特に言及しない限り、組み合わせA, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, Iに対応する実施形態を明確に開示していることを理解されたい。
【０１７７】
同様に、また、独立請求項及び／又は従属請求項が選択肢を記載していない場合においても、従属請求項が複数の先行する請求項に遡って参照している場合、それによってカバーされる対象事項の組合せは、明示的に開示されているとみなされることが理解される。例えば、独立請求項１、請求項１をさかのぼって参照する従属請求項２、および請求項２および１の両方をさかのぼって参照する従属請求項３の場合、請求項３及び１の対象事項の組合せは、請求項３、２及び１の対象事項の組合せと同様に明確かつ明白に開示されることになる。請求項１〜３のいずれか１項を参照するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４及び１、請求項４、２及び１、請求項４、３及び１並びに請求項４、３、２及び１の対象事項の組合せは、明確かつ明白に開示されることになる。
【０１７８】
上述の考察は、全ての添付された請求項に準用される。非限定的な例を挙げると、請求項１０、９および６に記載の組合せは、請求項構造を考慮して明確かつ明白に想定される。同様のことが、例えば請求項１０、９及び５に記載の組合せ、又は請求項１３、１２及び１１に記載の組合せ等に適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】培養ケラチノサイト及びヒト皮膚におけるＬＲＲＣ８Ａ発現。（Ａ）ＨａＣａＴケラチノサイトおよび正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＫ）から単離した全ＲＮＡを用いたＲＴ‐ＰＣＲ解析は、全てのＬＲＲＣ８遺伝子ファミリーメンバー（ＬＲＲＣ８Ａ‐Ｅ）に対する特異的ＰＣＲ産物を明らかにした。β‐アクチン特異的ＰＣＲ産物を得、ローディング対照とした。逆転写酵素（−ＲＴ）を省略した場合、ＰＣＲ産物は得られなかった。Ｍ，分子量標準。（Ｂ）正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＫ）とＨａＣａＴケラチノサイトの全細胞抽出物を用いたウエスタンブロット分析は、１００ｋＤａ付近で強力なＬＲＲＣ８Ａ抗体シグナルを示し、これは計算された９４ｋＤａの分子量に近かった。β‐アクチン特異的抗体シグナルを得、ローディング対照とした。Ｍ，  分子量標準。（Ｃ）ＬＲＲＣ８Ａ抗体を用いた免疫組織化学的分析により、ヒト皮膚生検におけるＬＲＲＣ８Ａタンパク質の存在が明らかになった。一次抗ＬＲＲＣ８Ａ抗体およびＦＩＴＣ標識二次抗体を用いて、ＬＲＲＣＡ８の局在を可視化した。緑色蛍光ＦＩＴＣシグナルは、基底表皮ケラチノサイトで優先的に検出され、外側ケラチノサイト層に向かって減少した。アイソタイプ抗体対照は、ＬＲＲＣ８Ａ抗体の特異性を確認する緑色蛍光シグナルを示さなかった。ＤＮＡをＤＡＰＩで対比染色し、細胞核を同定した。注：緑色の蛍光ＦＩＴＣシグナルは白色／明るい灰色で、ＤＡＰＩはこの写真で暗い灰色で示されている。
【図２】ケラチノサイト分化時のＬＲＲＣ８Ａの動的調節。分化段階の違いによるＨａＣａＴ細胞のウエスタンブロット（Ａ）と免疫蛍光解析（Ｂ）は、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質レベル（Ａ）ならびにＬＲＲＣ８Ａ  （Ｂ）の膜局在が最初にそれが最高に達する以前に増加し、その後最終分化が達成されると再度減少することを示した。ＨａＣａＴ細胞を異なる細胞密度（融合後増殖）で播種し、分化を誘導した。（Ａ）全細胞抽出物中の分化マーカーインボルクリン（ＩＶＬ）に対する抗体を用いて、進行性分化をモニターした。β‐アクチンをローディング対照とした。（Ｂ）一次抗ＬＲＲＣ８Ａ抗体およびＦＩＴＣ標識二次抗体を用いて、ＬＲＲＣＡ８の膜局在を可視化した。ＤＮＡをＤＡＰＩで対比染色し、細胞核を同定した。注：この写真では緑色の蛍光ＦＩＴＣシグナルが白色／淡灰色で示されている。
【図３】：ＬＲＲＣ８Ａは乾癬ケラチノサイトおよび乾癬の皮膚病変で発現する。異常に分化しているＨａＣａＴ細胞のウエスタンブロット分析。ＨａＣａＴ細胞を様々な細胞密度で播種し、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−α）の存在下（Ｂ）または非存在下（Ａ）で培養して乾癬状態を模倣した。ＨａＣａＴ細胞の全細胞抽出物中の分化マーカーインボルクリン（Ｉ）に対する抗体を用いて、進行性正常（Ａ）と異常（Ｂ）分化をモニターした。抗ＬＲＲＣ８Ａ抗体を用いることにより、ＬＲＲＣ８Ａのベル型発現様式は正常分化（Ａ）中に観察されたが、乾癬様ＨａＣａＴ細胞では、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質ははるかに遅れて検出され、異常分化（Ｂ）の後期段階では低下しなかった。（Ｃ）２人の異なった尋常性乾癬患者（患者１：ａ、ｂ；患者２：ｄ、ｅ）または健康なドナー（ｃ、ｆ）の病変皮膚（ａ、ｄ）および非病変皮膚（ｄ、ｅ）からのパンチ生検（６ｍｍ）を４％ＰＦＡで固定し、パラフィン包埋した。４μｍ切片は通常のように処理した。免疫組織化学のため、ＥＤＴＡ溶液による抗原賦活  後、一晩一次抗ＬＲＲＣ８Ａ抗体を適用した。検出には、製造業者の指示に従い、Histofine Simple Stain AP Multi (Medac Diagnostika社、ドイツ、Wedel社）を使用した。核はヘマトキシリンで染色した。画像はＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅスライド走査顕微鏡を用いて取得した。黒色は抗体結合を示す。バーは１００μｍを表す。健常ヒト皮膚は表皮、特に基底層（ｃ，ｆ）に強力なＬＲＲＣ８Ａ染色を示す。対照的に、乾癬患者の非病変皮膚はＬＲＲＣ８Ａ（ｂ，ｅ）の染色が低下しているが、病変乾癬皮膚ではほとんど検出できないか（ｄ）または非常に弱い（ａ）染色である。このように、ＬＲＲＣ８Ａ発現は乾癬炎症中にダウンレギュレートされるようである。
【図４】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９により作製したＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞におけるＶＲＡＣ活性とＲＶＤの修飾。（Ａ）ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＬＲＲＣ８Ａ特異的プライマー対を用いたＰＣＲにより、ＨａＣａＴ野生型細胞（ＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ+/+）では７００ｂｐのＰＣＲ産物が、ＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞クローンでは４００ｂｐのＰＣＲ産物が得られ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が誘導するＬＲＲＣ８Ａの３００ｂｐ遺伝子欠失が確認された。Ｍ，分子量標準。（Ｂ）全細胞抽出物およびＬＲＲＣ８Ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析は、ＨａＣａＴ野生型細胞（ＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ+/+）において１００ｋＤａ付近で強力なＬＲＲＣ８Ａ抗体シグナルを示し、これはＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/細胞において欠損しており、ＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/細胞において検出可能なＬＲＲＣ８Ａタンパク質の欠如を確認した。注意：１００ｋＤａ以上の非特異的な抗体シグナルが、野生型とノックアウト細胞の両方に存在する。β‐アクチン特異的抗体シグナルを得、ローディング対照とした。Ｍ，分子量標準。（Ｃ）ＨａＣａＴ細胞におけるｈｓＹＦＰを用いたＶＲＡＣ活性の測定。ＨａＣａＴ野生型（ＷＴ）およびＨａＣａＴ  ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞をｈｓＹＦＰ遺伝子発現カセットを含むアデノウイルスで形質導入し、等張性緩衝液で前もってインキュベートし、次いでヨウ化物含有等張性または低張性緩衝液で処理した。ｈｓＹＦＰ蛍光を測定し、時間に対してプロットした。等張性緩衝液の添加はｈｓＹＦＰ蛍光の実質的な消光をもたらさなかったが、低張性ヨウ化物含有緩衝液は速いＩ-流入と強力なＩ-依存性ｈｓＹＦＰ消光をもたらした。低張性刺激後のＩ-流入のスピード（ΔＦ／Δ時間）を定量化し、ＶＲＡＣ活性の尺度として用いた。例示的な生データ（左グラフ）および決定されたＶＲＡＣ活性（平均値および標準偏差として描写、棒グラフ）が示されている。明らかに、ＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/細胞において、低張性刺激後のＶＲＡＣ活性はほぼ完全に減少した。＊＊＊統計的にきわめて有意であったスチューデントのｔ検定、ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＨａＣａＴ細胞における容積感受性色素カルセインを用いた細胞容積変化の測定。ＨａＣａＴ野生型（ＷＴ）およびＨａＣａＴ  ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞をカルセインで負荷し、等張性緩衝液で前もってインキュベートし、等張性または低張性緩衝液で刺激した。カルセイン蛍光を測定し、時間に対してプロットした。ＨａＣａＴ細胞の低張性刺激は速い増加とその後のカルセイン蛍光の減少を導き、細胞膨張とそれに続く代償性ＲＶＤを示した。カルセイン蛍光の変化（ΔＦ＝Ｆmax−Ｆ0）をベースライン蛍光（ΔＦ／Ｆ0）に正規化し、相対容積増加（細胞膨張）の尺度として用いた。カルセイン蛍光減少の速度（ΔＦ／Δ時間）を相対容積減少（ＲＶＤ）の尺度として用いた。例示的な生データ（左グラフ）および計算された相対容積増加（右上）および減少（右下）は、平均値および標準偏差として示される。細胞腫脹はＨａＣａＴ野生型細胞と比較してＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/細胞では軽度に影響されただけであったが、調節性容積減少（ＲＶＤ）は劇的に減少した。＊＊＊統計的にきわめて有意であったスチューデン��ｔ検定、ｐ＜０．００１。
【図５】ケラチノサイトにおけるＬＲＲＣ８Ａ依存性の分化と遺伝子発現の変化。（Ａ）分化中のＨａＣａＴ野生型細胞（ＨａＣａＴ  ＷＴ）およびＬＲＲＣ８Ａを欠損したＨａＣａＴ細胞（ＨａＣａＴ  ＬＲＲＣ８Ａ-/-）のウエスタンブロット分析。ＨａＣａＴ細胞を異なる細胞密度（融合後増殖）で播種し、分化を誘導した。分化の進行は、全細胞抽出物中の分化マーカーインボルクリン（ＩＶＬ）およびケラチン１０（ＫＲＴ１０）に対する抗体を用いることによってモニターした。ＬＲＲＣ８Ａ活性を欠く細胞（ＨａＣａＴ  ＬＲＲＣ８Ａ-/-）では、ＩＶＬは分化過程の初期段階で生じ、ＫＲＴ１０タンパク質レベルは連続的には上昇しなかったが、全分化を通して低レベルにとどまった。（Ｂ，Ｃ）ＨａＣａＴ  ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞のＲＮＡ配列データの差次的に調節される遺伝子を、乾癬に関連する公表されているトランスクリプトーム研究と比較するパイチャート。Chiricozzi et al.（文献５）がＩＬ−１７で処理したケラチノサイトで差次的に発現すると報告された２３遺伝子のうち、６遺伝子はＨａＣａＴ細胞で全く発現しないことが見出され、６遺伝子は影響を受けず、遺伝子のほぼ５０％（すなわち、２３遺伝子のうち１１遺伝子（すなわち、ＩＬ１Ｆ９、ＰＩ３、ＬＣＮ２、ＩＬ８、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＳＰＲＲ２Ｄ、ＩＬ−１Ｂ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＸＣＬ１、ＳＡＴ１）がＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ-/細胞（Ｂ）でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることがわかった。Swindell et al.（文献７）が報告した患者の乾癬病巣で最も強く上昇していた３５遺伝子のうち、ＨａＣａＴ細胞では１４遺伝子が全く発現していないこと、１０遺伝子は影響を受けなかったが、ＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞（Ｃ）では約３０％の遺伝子（すなわち：ＴＣＮ１、Ｓ１００Ａ７Ａ、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＰＩ３、Ｓ１００Ａ９、ＩＬ３６Ｇ、ＬＣＮ２、ＯＡＳＬ、ＩＧＦＬ１、ＫＲＴ１６、ＣＸＣＬ１）もアップレギュレートまたはダウンレギュレートされていたことがＲＮＡ配列決定で判明した。
【図６】健常状態及び罹患状態におけるケラチノサイトの分化及び増殖中のＬＲＲＣ８Ａ発現の動態モデル案。（Ａ）健常皮膚では、ケラチノサイトは増殖する基底細胞から次第に表皮の有棘層、顆粒層、角質層に発達する。このプロセスは最終分化と呼ばれ、増殖と分化の厳密な均衡を必要とする。最初の増殖は基底細胞で高いが、分化は低い（灰色の三角形）。最終分化が進むと（黒矢印）、増殖は減少する（破線の三角形）が、分化は増加する（灰色の三角形）。正常分化にはＬＲＲＣ８Ａ発現の動的変化も必要である。ＬＲＲＣ８Ａ（黒い三角形）のレべルはまず増加し、その後最高値に達し、正常分化の後期段階に再び低下する。三角形は、ケラチノサイト（黒矢印）の最終分化過程におけるＬＲＲＣ８Ａタンパク質レベル（黒）、分化（灰色）および増殖（破線）のダイ（ｄｉｅ）増加／減少を示す。（Ｂ）皮膚障害乾癬では、分化と増殖の均衡が乱される。分化はより遅い（灰色の三角形）が、増殖は速い（過剰増殖、破線の三角形）。この異常増殖過程では、ＬＲＲＣ８Ａ発現も障害される。ＬＲＲＣ８Ａレベル（黒の三角形）は初期段階では低く、増加ははるかに遅く、再び低下することはないが、代わりに、健常な皮膚と比較して後期段階では高く維持される。（Ｃ）ＬＲＲＣ８Ａが完全に欠損している場合、例えば、ＬＲＲＣ８Ａノックアウト細胞の場合、またはＬＲＲＣ８Ａレベルが初期段階で低すぎる場合（黒線）、例えば、乾癬の場合、ケラチノサイトは正常分化プログラム（灰色の三角形）を受けることができない。以上をまとめると、ＬＲＲＣ８Ａは正常表皮分化に必要である。対照的に、乾癬では、ＬＲＲＣ８Ａレベルが低すぎて異常な分化につながる。結果として、ＬＲＲＣ８Ａ発現の増加またはＬＲＲＣ８Ａ活性の増強は、分化障害、例えば乾癬に関連する皮膚状態の治療のための新規アプローチを表す。
【図７】ＬＲＲＣ８Ａ活性化剤または阻害剤をそれぞれ乾癬または創傷治癒の治療に使用。ＬＲＲＣ８Ａレベル／イオンチャンネル活性（黒の三角形）の違いが分化（灰色の三角形）と増殖（破線の三角形）に及ぼす影響と、乾癬と創傷治癒に及ぼすその作用を図示した。乾癬の変化の程度と傷の治癒は黒／灰色の勾配で示され、灰色は向上を、黒色は悪化を示す。（Ａ）ＬＲＲＣ８Ａ活性／レベルが低ければ（あるいはノックアウト細胞の場合のように完全に欠如していても）、乾癬と創傷治癒（Ｃ）の両方の特徴である異常な分化と過剰増殖（Ｂ）を引き起こす。創傷治癒を改善するためには、このタイプの表皮変化をさらに促進することが有益であり、このことは、増殖をさらに増加させ、分化をさらに減少させるべきであることを意味する（Ｃ＋Ｄ）。乾癬の治療には、増殖を減少させ、分化を亢進させる（Ｃ＋Ｄ）という逆の作用が有益である。これは、ＬＲＲＣ８Ａ活性を調節することによって達成することができる：ＬＲＲＣ８Ａ（Ｅ）の阻害は、分化は少ないが、より増殖（Ｂ）につながり、それによって創傷治癒を改善するであろう。対照的に、ＬＲＲＣ８Ａ（Ｅ）の活性化は、より多くの分化およびより少ない増殖（Ｂ）につながり、それにより乾癬および同様の障害を改善するであろう。
【実施例】
【０１８０】
以下の実施例は、本発明を例示する：
実施例１：材料および方法
細胞培養条件と細胞培養
８％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）と３．５ｍＭ  Ｌ‐グルタミン（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地高グルコース４．５ｇ／Ｌ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、３７℃および５％  ＣＯ2でＨａＣａＴ細胞を培養した。
正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＫ）は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌから購入したか、またはヒト幼若包皮から単離した初代ケラチノサイトである（文献５０による）。細胞は、０．００４ｍｌ／ｍｌウシ下垂抽出物、０．１２５ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子、５μｇ／ｍｌインシュリン、０．３３μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、０．３９μｇ／ｍｌエピネフライン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリンおよび０．０６ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むkeratinocyte growth medium 2 supplement Mix を添加した keratinocyte growth medium 2 (PromoCell)中で８０％コンフルエンスまでの培養した。 
【０１８１】
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた遺伝子発現解析
ケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴおよび正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＫ）においてＬＲＲＣ８ファミリーメンバー（ＬＲＲＣ８Ａ‐Ｅ）が発現するかどうか、およびどのＬＲＲＣ８ファミリーメンバー（ＬＲＲＣ８Ａ‐Ｅ）であるかを決定するために、ＲＴ‐ＰＣＲを行った。この目的のため、NucleoSpin RNA II Kit (Macherey-Nagel)を用いて、ＨａＣａＴおよびＮＨＫ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは総ＲＮＡ１μｇとＰｏｌｙ−ｄＴプライマー(ProtoScript M-MuLV First Strand Synthesis Kit, New England Biolabs)を用いた逆転写により合成した。ＬＲＲＣ８Ａ−ＥのＰＣＲ増幅は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびPhire Hot Start II PCR Master Mix (Thermo Scientific)を使用して行い、９８℃で３０秒間の最初の変性、続いて９８℃で５秒間の変性、５５℃で５秒間のプライマーアニーリング、および７２℃で１２秒間の伸長を含む２７増幅サイクル、続いて７２℃で１分間の最終伸長工程を含む。ＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲル上で分離し、Ｍｉｄｏｒｉ  Ｇｒｅｅｎ  （Ｂｉｏｚｙｍ）染色により可視化した。以下のセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた：
b-Actin fw 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'  (配列番号42);
b-Actin rv 5'- CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (配列番号43);
LRRC8A fw 5'- CCTGCCTTGTAAGTGGGTCAC-3'  (配列番号44);
LRRC8A rv 5'- CACAGCGTCCACGTAGTTGTA-3'  (配列番号45);
LRRC8B fw 5'- CTGGCATAGAAAGCCCAACTT-3'  (配列番号46);
LRRC8B rv 5'- CGATTTCAAGAGTGATGTGGGT-3' (配列番号47);
LRRC8C fw 5'- CTGGGGAAGTGTTTTGACTCTC-3'  (配列番号48);
LRRC8C rv 5'- GGACCAGATTGGATGGTGTTG-3'  (配列番号49);
LRRC8D fw 5'- GTGGTCTGTTTGCCAGTATTGC-3'  (配列番号50);
LRRC8D rv 5'- CCCAAAGGAAATGTCGTTTGTTG-3'  (配列番号51);
LRRC8E fw 5'- CAAGCAGTTCACGGAACAGC-3'  (配列番号52);
LRRC8E rv 5'- GGGCCTCTGATAAGTTCTCCTG-3' (配列番号53).
【０１８２】
ウエスタンブロット法によるタンパク質検出
細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ノニデトＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）と４℃で３０分間インキュベートすることにより、全タンパク質を抽出した。上清を１分間遠心分離し、タンパク質抽出物を９５℃で１０分間、ラエムリ試料緩衝液（０．５ＭトリスｐＨ  ６．８、４％  ＳＤＳ、４０％グリセロール、１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．０８％ブロモフェノールブルー）とインキュベートすることにより変性させた。タンパク質濃度はＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）により測定した。１０−１５μｇ総タンパク質を７．５％または１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＡゲル上で分離し、ウエスタンブロットにより、ＬＲＲＣ８Ａ（Ｎｏｖｕｓ  ＮＢＰ２−３２１５８１：５００）、サイトケラチン１０（ａｂｃａｍ  ａｂ７６３１８，１：１００００）、インボルクリン（ａｂｃａｍ  ａｂ２０２０２，１：１００００）、β−Ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ１９７８，１：１００００）およびα−チューブリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ９０２６，１：５０００）に対する種特異的抗体および種特異的二次抗体（ａ−マウスＩｇＧ，ａ−ウサギＩｇＧ，ＶＷＲ，１：５０００）を使用して分析した。タンパク質はＥＣＬ試薬（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって視覚化され、タンパク質のサイズはタンパク質マーカーＩＶ（１０−１７０ｋＤａ）（ＰｅｑＬａｂ）との比較によって推定されました。
【０１８３】
皮膚標本の免疫組織学および免疫蛍光染色
健常者を募集し、書面によるインフォームドコンセントを行った。本試験はｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｏｅｔｈｅ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの倫理委員会の承認を得た（１１６／１１）；ヘルシンキ宣言のプロトコールに従った。パンチ生検（６ｍｍ）を採取した。免疫組織化学のために、それらを４％  ＰＦＡで固定し、パラフィンを包埋して４μｍ切片に切断した。パラフィン切片は常法で処理した（文献５１）。一次抗体（ａｎｔｉ−Ｓｗｅｌｌ  Ｎｏｖｕｓ  １：１００；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社の「ａｎｔｉ−ＬＲＲＣ８Ａ  ＮＢＰ２−３２１５８」という名称でも入手可能）又はウサギアイソタイプ対照抗体（＃３９００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  １：２，５）をクエン酸溶液ｐＨ６による抗原賦活後一晩適用した。検出には、製造業者の指示に従い、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｉｎ  ＡＰ  Ｍｕｌｔｉ（Ｍｅｄａｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ社）を使用した。画像はＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅスライド走査顕微鏡を用いて取得した。免疫蛍光染色生検のために、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ）で採取し、８μｍの凍結切片に切断し、メタノールで固定した。検体を５％ヤギ血清／ＴＢＳ−Ｔでブロッキングし、一次抗Ｓｗｅｌｌ１  Ｎｏｖｕｓ  １：１００またはアイソタイプ抗体（＃３９００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  １：２，５）と４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳで洗浄後、試料をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識二次抗体（１：１０００  ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とインキュベートし、核をＤＡＰＩで染色した。共焦点画像は、ＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０顕微鏡を用いて生成した（文献４）。  
【０１８４】
細胞の免疫蛍光染色
ＨａＣａＴ細胞をガラススライド上に播種し、メタノール中に固定し、ＴＢＳ−Ｔで透過処理した。検体を５％ヤギ血清／ＴＢＳ−Ｔでブロッキングし、一次抗体またはアイソタイプ抗体と４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、試料をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識二次抗体とインキュベートし、核をＤＡＰＩで染色した。共焦点画像は、ＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０顕微鏡を用いて生成した（文献５２）。 
【０１８５】
ケラチノサイトのin vitro分化
ＨａＣａＴ細胞の分化はコンフルエンス後の成長により開始された。したがって、ＨａＣａＴ細胞は、Buerger C. et al.（文献４）に記載されているように、細胞数を増加させて（０．１〜１．０×１０6細胞／６ウェル）、４８時間培養され、サブコンフルエントからポストコンフルエントな細胞密度となった。次に、細胞を回収し、ＲＮＡ抽出、タンパク質抽出のために使用するか、または免疫蛍光解析のために固定した。指定した場合には、細胞を、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦ−ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ由来；各２０ｎｇ／ｍｌ）からなる炎症性サイトカインの混合物で、指定した期間処理した。次に細胞を回収し、ＲＮＡ抽出、タンパク質抽出に用いた。 
【０１８６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＬＲＲＣ８Ａノックアウト細胞株の作製
ＬＲＲＣ８Ａ遺伝子を欠くモノクローナルＨａＣａＴ細胞を作製するために、ＨａＣａＴ細胞を、ＣＭＶプロモーターの制御下でＣａｓ９ヌクレアーゼおよび橙色蛍光タンパク質をコードする遺伝子発現カセットを送達するアデノウイルスＡｄ５−ＣＭＶ−Ｃａｓ９−ｗｔ−２Ａ−ＯＦＰ（Ｓｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）およびＵ６プロモーターの制御下でＬＲＲＣ８Ａの異なった位置を標的とする２つの単一ガイドＲＮＡコードする遺伝子発現カセットを送達するアデノウイルスＡｄ５−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−Ｇ−ＳＷＥＬＬ１−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−Ｇ−ＳＷＥＬＬ４（Ｓｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で形質導入した。使用したｓｇＲＮＡの配列は以下の通りである：
sgRNA-G-LRRC8A#1: 5'-GCTGCGTGTCCGCAAAGTAG （配列番号５４）；およびsgRNA-G-LRRC8A#4: 5'-CCGGCACCAGTACAACTACG （配列番号５５）。
【０１８７】
アデノウイルス形質導入後、モノクローナルＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞を限界希釈により異種細胞プールから単離した。次に、ＬＲＲＣ８ＡのＣａｓ９媒介ゲノム欠失を、標的部位特異的ＰＣＲおよびその後のサンガー配列決定により確認した。ゲノム領域のＰＣＲ増幅を、特異的オリゴヌクレオチド（Seq#LRRC8A#24839 fw 5'-TGGTTTCCCAGCCAAGTG （配列番号：５６）；およびSeq#LRRC8A#965 rv 5'-GCGGGAATTTGAACCAGAAG  （配列番号：５７））、ｄＮＴＰｓ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および鋳型としてゲノムＤＮＡを用いて行った。ゲノムＤＮＡは最初９８℃で３０秒変性し、続いて９８℃で１０秒変性、６５℃で１０秒アニーリング、７２℃で３０秒伸長を含む３０増幅サイクル、７２℃で１０分の最終伸長を行った。ＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲル上で分離し、Ｍｉｄｏｒｉ  Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｚｙｍ）染色により可視化した。ＰＣＲ増幅産物をＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃｔａｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて精製し、オリゴヌクレオチドSeq#LRRC8A#24839 fw （配列番号５６）を用いてサンガー配列決定により配列決定した。
【０１８８】
ｈｓＹＦＰを用いた膨張誘発ＶＲＡＣ活性の測定
組織培養細胞におけるＶＲＡＣ活性を測定するために、ｈｓＹＦＰ遺伝子発現カセットをアデノウイルス形質導入を介して送達する。したがって、０．２５ｘ１０6セル／ウェル  ＨａＣａＴセルを６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％  ＣＯ2で１日間インキュベートした。次に、細胞を３００ＭＯＩ(multiplicities of infection)でアデノウイルスＡｄ−ＣＭＶ−ｈｓＹＦＰ（Ｓｉｒｉｏｎ）で形質導入し、３７℃および５％ＣＯ2でさらに１日間インキュベートした。３０，０００の形質導入した細胞を９６ウェルの黒壁、透明な底部のマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、１日間培養した。細胞を７０μlの等張性インキュベーション緩衝液（１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＣａＣｌ2、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、３２９  ｍＯｓｍ）で３回洗浄し、５０μｌの等張性インキュベーション緩衝液と３７℃で１５分間インキュベートした。細胞のｈｓＹＦＰ蛍光（４８５ｎｍでの励起、５３５ｎｍでの発光）を、自動蛍光プレートリーダーで３．５秒毎に連続的に記録した。２０秒間のベースライン記録後、細胞外Ｉ-濃度５０ｍＭ  Ｉ-を確立するために、細胞を等張Ｉ-溶液（７０ｍＭ  ＮａＩ、５ｍＭ  ＮａＣｌ、１４０ｍＭマンニトール、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、３２９  ｍＯｓｍ）または低張性Ｉ-溶液（７０ｍＭ  ＮａＩ、５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、１８９  ｍＯｓｍ）の添加により刺激した。低張性緩衝液を加えると、浸透圧は３０％減少した（最終浸透圧は２２９ｍＯｓｍ）。細胞外カルシウムを用いない実験では、２ｍＭのＣａＣｌ2を２ｍＭのＭｇＣｌ2に置き換えた。
【０１８９】
ＨｓＹＦＰ蛍光（任意単位）を時間についてプロットし、Ｉ-流入速度を膨潤誘導イオンチャンネル活性の尺度として最初の傾き（ΔＦ蛍光／Δ時間）から導いた。ＶＲＡＣ活性は、重複して実施した少なくとも４つの独立した実験から決定し、平均±標準偏差（ＳＤ）として提示した。統計解析のために両側独立スチューデントのｔ検定を行い、有意性を＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１および＊＊＊  ｐ＜０．００１と示した。
【０１９０】
カルセイン−ＡＭを用いた細胞容積変化の測定
３０，０００細胞を９６ウェルの黒壁、透明な底部のマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、１日間培養した。測定に先立ち、細胞を１０μＭのカルセイン‐ＡＭ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に正常培養培地に３７℃で７５分間負荷した。細胞内カルシウムの影響を調べる実験のために、細胞に２０μＭのＢＡＰＴＡ‐ＡＭを追加負荷した。細胞を７０μｌの等張性インキュベーション緩衝液（１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＣａＣｌ2、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、３２９ｍＯｓｍ）で３回洗浄し、５０μｌの等張性インキュベーション緩衝液中で３７℃でインキュベートした。細胞カルセイン蛍光（４８５ｎｍでの励起、５３８ｎｍでの発光）を、自動蛍光プレートリーダーで１．６秒毎に連続的に記録した。２０秒間のベースライン記録後、細胞を等張液（２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭマンニトール、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、３２９  ｍＯｓｍ）または低張液（２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、７９  ｍＯｓｍ）の添加により刺激した。低張性緩衝液を加えると、浸透圧は５５％減少した（最終浸透圧は１５０ｍＯｓｍ）。カルセイン蛍光（任意単位）を時間についてプロットした。刺激前後の蛍光（ΔＦ＝Ｆmax−Ｆ0）（刺激前（Ｆ0）、刺激後（Ｆmax））をベースライン蛍光（ΔＦ／Ｆ0）に正規化し、細胞容積増大の相対測定値として用いた。蛍光消光は最大蛍光増加（Ｆmax）後の傾き（ΔＦ蛍光／Δ時間）から導き、細胞容積減少の尺度として用いた。細胞容積変化は、３回に分けて実施した２つの独立した実験で測定し、平均±ＳＤとして提示した。統計解析のために両側独立スチューデントのｔ検定を行い、有意性を＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１および＊＊＊  ｐ＜０．００１と示した。
【０１９１】
ＨａＣａＴ野生型およびＬＲＲＣ８Ａノックアウト細胞のトランスクリプトームデータ解析
細胞溶解およびＲＮＡ単離は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ由来のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ＩＩを用いて行った。ライブラリー調製には、全ＲＮＡ５００ｎｇの投入量から開始して、イルミナ社のＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡライブラリープレップキットｖ２を使用した。調製したライブラリーを、ＨｉＳｅｑ  ３０００／４０００  ＳＢＳキットおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ  ４０００シークエンサーを用いて、２×１５０ｂｐの読み取り長で配列決定した。Ｈｉｓａｔ２（２．０．４）を用いて、アダプタートリム化、脱多重化およびクオリティフィルタ化リードをｈｇ１９リファレンスゲノムおよびトランスクリプトームに整列させた（文献５３）。Ｈｉｓａｔ２出力ファイル（ＳＡＭ）をＢＡＭフォーマットに変換し、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（１．３．１）を用いてソートし、インデックス付けした（文献５４）。ＢＡＭファイルは、前述のように、Ｃｕｆｆｄｉｆｆ２（２．１．１）によって評価された（文献５５）。差次的転写量はＣｕｆｆｄｉｆｆ２を用いて計算した。すべてのサンプルが１つの計算サイクルで比較および評価されたため、アルゴリズムはトランスクリプトレベルの解像度でＦＰＫＭ値を推定し、レプリケートライブラリ全体の変動を制御できた（文献５５）。Ｃｕｆｆｄｉｆｆ２が使われたのは、読み込みカウントの正規化がＤＥＳｅｑのものと等しいからである（文献５５）。これは、ＲＮＡシークエンシングのための最も信頼性の高い正規化法の１つであることが示されている（文献５６）。ここでは、任意の試料における各遺伝子のスケーリング係数を、全試料におけるその遺伝子の幾何平均に対するその遺伝子の読み取り数の比率の中央値として計算した（文献５７）。
【０１９２】
実施例２：  ＬＲＲＣ８Ａは、培養ヒトケラチノサイトおよびヒト皮膚において発現される
まず、ＬＲＲＣ８Ａとその他のＬＲＲＣファミリーメンバー（ＬＲＲＣ８Ｂ‐Ｅ）がヒト皮膚細胞で発現するかどうかを検討した。ＲＴ−ＰＣＲ解析が行われ、すべてのＬＲＲＣ８サブユニットのｍＲＮＡ転写物が、ケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴの細胞ならびに初代正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＫ）において容易に検出可能であることが示された（図１Ａ）。また、ＬＲＲＣ８Ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析により、ｍＲＮＡ転写物がＬＲＲＣ８Ａタンパク質に翻訳されることを確認した。ＬＲＲＣ８Ａタンパク質は、ＮＨＫと同様にＨａＣａＴ細胞の全細胞抽出物で検出できた（図１Ｂ）。
【０１９３】
次に、ＬＲＲＣ８Ａが正常ヒト皮膚との関連においても見出されるかどうかを解析した。ＬＲＲＣ８Ａ−抗体染色は実際にヒト皮膚生検の組織切片で観察された（図１Ｃ）。驚いたことに、ＬＲＲＣ８Ａはすべての表皮ケラチノサイト層で一様に発現しているわけではないことが観察された。ＬＲＲＣ８Ａは皮膚の基底層に優先的に認められ、外層に向かって減少した（図１Ｃ）。この知見は、分化依存性ＬＲＲＣ８Ａ発現を示唆し、ＬＲＲＣ８Ａが最終分化においてまだ記載されていない役割を有する可能性があるという仮説を導いた。
【０１９４】
実施例３：ＬＲＲＣ８Ａはケラチノサイト分化の間に動的に調節される
表皮ケラチノサイト層に沿ったＬＲＲＣ８Ａタンパク質の漸進的分布（図１Ｃ）から、ＬＲＲＣ８Ａも最終分化に関与している可能性が示されたことから、ケラチノサイトの分化過程においてＬＲＲＣ８Ａ発現がどのように変化するかをさらに検討した。この目的のために、有糸分裂後細胞密度でＨａＣａＴ細胞を培養することにより分化を誘導した。全細胞抽出物のウエスタンブロット分析により、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質レベルはまず増加し、最高値に達し、その後最終分化が達成されると再度減少することが観察された（図２Ａ）。このベル型発現様式は、分化状態の増加した細胞の免疫蛍光解析によっても確認された。明らかに、ＬＲＲＣ８Ａの膜局在は、その最大まで増加し、その後、ケラチノサイト成熟の進行に伴って再度減少した（図２Ｂ）。これらの知見は、ＬＲＲＣ８Ａがケラチノサイト分化の間に動的に調節されることを示す。
【０１９５】
実施例４：ＬＲＲＣ８Ａ発現は、炎症性、乾癬様ケラチノサイトおよび乾癬の皮膚病変において変化する
ＬＲＲＣ８Ａが正常分化の間に動的に調節されることを見いだした後（図２Ａ、Ｂ）、次に、ＬＲＲＣ８Ａが炎症性皮膚病乾癬で起こるような異常な分化過程に関連して見いだされるかどうかを分析した。ＨａＣａＴ細胞では、分化がコンフルエント後の成長、および乾癬状態を模倣する炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−α）の存在下で、誘導された。ＬＲＲＣ８Ａの発現ならびに分化マーカーインボルクリン（ＩＶＬ）の発現を、ウエスタンブロット分析によりモニターした（図３Ａ、Ｂ）。予想通り、乾癬様ＨａＣａＴ細胞は、未処理ＨａＣａＴ細胞と比較した場合、ＩＶＬの発現が劇的に遅延した。また、ＬＲＲＣ８Ａの発現も乾癬様ＨａＣａＴ細胞で変化していた（図３Ａ、Ｂ）。正常分化中に観察された典型的なベル型発現様式（図３Ａ）とは対照的に、乾癬様ＨａＣａＴ細胞における異常分化の後期段階では、ＬＲＲＣ８Ａタンパク質ははるかに遅れて検出され、低下しなかった（図３Ｂ）。
【０１９６】
次に、初代乾癬ケラチノサイトや乾癬の皮膚病変においてもＬＲＲＣ８Ａが変化するかどうかを検証した。乾癬の皮膚生検試料を入手し分析することは困難であるため、最初に乾癬の皮膚病変から公的に入手可能な全体トランスクリプトームデータを検索した。乾癬、炎症性皮膚細胞を模倣するＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７で処理された一次ケラチノサイトからトランスクリプトームデータを集めたいくつかの研究、および乾癬患者からの研究が同定された（文献５、７、４１−４３）。その結果、これらの研究は乾癬における最も強く影響された遺伝子の重要性に焦点を当てていることがわかった。これらは約３５遺伝子であり、乾癬の鍵となる脱調節遺伝子と考えることができるが（文献７）、２００遺伝子以上（文献５、４１）、最大２２００遺伝子（文献７）が追加変更されると記載されていた。これらの遺伝子の多くの機能は知られておらず、したがって現状の科学的研究では、主に既知の遺伝子の機能を扱っている。その結果、乾癬における新たな潜在的な重要な担い手や標的は、しばしば見逃されたり、看過されたりする。 
【０１９７】
それにもかかわらず、入手可能なトランスクリプトームデータを検索し、ＬＲＲＣ８Ａが乾癬においてこれまで監視されてきた調節不全遺伝子の１つであるかどうかを調べた。実際、補足データの分析により、ＬＲＲＣ８Ａは、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７  で処理された初代ケラチノサイトにおいて、差次的に調節される遺伝子の一覧に属することが明らかになった（文献５）（表３）。これは、本明細書に提供される乾癬様ＨａＣａＴ細胞モデルからの結果と完全に一致する（図３Ｂ）。また、別のＬＲＲＣ８ファミリーメンバーであるＬＲＲＣＢは、トランスクリプトームデータから判断して、乾癬患者の皮膚病変で脱調節される遺伝子のリストの一つであることがわかった（文献４２）（表３）。以上を総合すると、ＬＲＲＣ８Ａおよび他のＬＲＲＣサブユニットは炎症性、乾癬様ケラチノサイトだけでなく乾癬皮膚病変においても脱調節されており、ＬＲＲＣ８Ａは乾癬においてこれまでのところ看過されているプレーヤーである可能性があることが強く示唆される。   
【０１９８】
表３：調査した乾癬モデル、トランスクリプトームデータに基づく遺伝子発現のｌｏｇ２変化と倍変化を列挙した。ＬＲＲＣ８遺伝子ファミリーの２つの遺伝子、ＬＲＲＣ８ＡおよびＬＲＲＣＢは、乾癬炎症性皮膚細胞を模倣するＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１７で処理されたケラチノサイトにおいて、または乾癬患者の病原性ケラチノサイトにおいて、約１．５〜２によってアップレギュレートされる。
【表３】
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【０１９９】
次に、ＬＲＲＣ８Ａ発現が乾癬患者のヒト皮膚で変化するかどうかを検討した（図３Ｃ）。そのために、２名の異なった尋常性乾癬患者（患者１：ａ，ｂ；患者２：ｄ，ｅ）の病変部皮膚（ａ，ｄ）および非病変部皮膚（ｂ，ｅ）からのパンチ生検を健康なドナー（ｃ，ｆ）と比較した。健常ヒト皮膚は表皮、特に基底層（ｃ，ｆ）に強力なＬＲＲＣ８Ａ染色（黒色で示す）を示した。対照的に、乾癬患者の非病変皮膚はＬＲＲＣ８Ａ（ｂ，ｅ）の染色が低下しているが、病変乾癬皮膚ではほとんど検出できないか（ｄ）または非常に弱い（ａ）染色である。したがって、ＬＲＲＣＡタンパク質レベルは乾癬表皮で低下する。
【０２００】
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によるＬＲＲＣ８Ａ活性の低下はＨａＣａＴケラチノサイトにおけるＶＲＡＣ活性とＲＶＤに影響する
乾癬におけるＬＲＲＣ８Ａの脱調節発現は、疾患皮膚細胞における分化欠損を減弱させる目的で、乾癬またはアトピー性皮膚炎のような他の皮膚疾患における分化を調節する潜在的に魅力的な新しい標的となる。ＬＲＲＣ８Ａ活性の調節が分化過程を操作するために使用できることを証明するために、ＬＲＲＣ８Ａ活性の非存在下での分化過程をモニターした。
【０２０１】
この目的のために、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓゲノム編集技術を用いて、機能性ＬＲＲＣ８Ａを欠損したＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/-ノックアウト細胞株を作製した。２つの単一ガイドＲＮＡ（sgRNA-G-LRRC8A#1: 5'-GCTGCGTGTCCGCAAAGTAG(配列番号54); sgRNA-G-LRRC8A#4:5'-CCGGCACCAGTACAACTACG  (配列番号55））を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをゲノムＬＲＲＣ８Ａ遺伝子座中の規定された領域に結合させ、次いでＬＲＲＣ８Ａコード配列の約３００ｂｐの規定された欠失をもたらすように設計した。予測されたＬＲＲＣ８Ａ遺伝子欠失は、特異的オリゴヌクレオチドプライマー対（Seq#LRRC8A#24839 fw）を用いたＰＣＲにより確認した。
【０２０２】
5'-TGGTTTCCCAGCCAAGTG (配列番号56); Seq#LRRC8A#965 rv 5'-GCGGGAATTTGAACCAGAAG (配列番号57））および、単離されたゲノムＤＮＡ（図４Ａ）。
【０２０３】
構成的ＬＲＲＣ８Ａ遺伝子破壊は、ゲノムＬＲＲＣ８Ａ遺伝子座のＤＮＡ配列決定（データは示していない）によって、および全細胞溶解物および抗ＬＲＲＣ８Ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析において、ＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞における検出可能なＬＲＲＣ８Ａタンパク質の非存在によって確認された（図４Ｂ）。
【０２０４】
次に、ＬＲＲＣ８Ａを欠損したこれらのＨａＣａＴ細胞がＶＲＡＣ活性が低下しているかどうか、また、これが細胞容積調節に影響するかどうかを解析した。細胞容積変化は、蛍光容積感受性色素カルセインをＨａＣａＴ細胞に負荷することによって決定したが（文献１８、５８、５９）、ＶＲＡＣ活性は、蛍光ハロゲン化物感受性ＹＦＰ  （ｈｓＹＦＰ）を発現することによって決定し、これは、ＶＲＡＣを含む塩素チャネルの特徴的Ｉ-流入を監視することを可能にする（文献１８、３１、６０−６２）。 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA  ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA 
【０２０５】
特に、ＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞は、低張性刺激時のＶＲＡＣ活性を完全に欠いていた（図４Ｃ）。興味深いことに、ＨａＣａＴ野生型細胞と比較してＬＲＲＣ８Ａノックアウト細胞では、細胞の膨張は軽度にしか影響されなかったが、調節性容積減少（ＲＶＤ）は劇的に減少した（図４Ｄ）。これらの知見は、ＬＲＲＣ８Ａが明らかにＨａＣａＴケラチノサイトにおいてもＶＲＡＣの必須要素であり、主にＨａＣａＴにおいてＲＶＤを媒介することを初めて示すだけでなく、ＬＲＲＣ８Ａ遺伝子をノックアウトすることによりＬＲＲＣ８Ａ遺伝子量を減少させることによりＬＲＲＣ８Ａ活性を特異的に低下させるアプローチが妥当であることを証明する。
【０２０６】
実施例６：ＬＲＲＣ８Ａ活性の調節はケラチノサイトの分化に影響する
ＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ−／細胞においてＬＲＲＣ８Ａ効果がほぼ完全に減少することを立証した後、この細胞株を用いて、ＬＲＲＣ８Ａ効果の非存在下でケラチノサイト分化に対する作用をモニタリングした（図５Ａ）。分化過程は、有糸分裂後の細胞密度でＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ−／細胞を培養することによって開始され、重要な分化マーカーインボルクリン（ＩＶＬ）の発現およびケラチン１０（ＫＲＴ１０）がウエスタンブロット分析によって決定された（図５Ａ）。明らかに、ＬＲＲＣ８Ａ活性を欠くＨａＣａＴ細胞では、ＩＶＬは分化過程のずっと初期段階で生じた。さらに、ＫＲＴ１０タンパク質レベルは継続的に上昇することはなかったが、全分化期間を通して低レベルで推移した（図５Ａ）。ＩＶＬおよびＫＲＴ１０が変化している様式は、ＬＲＲＣ８Ａ活性の低下が異常な分化を導くことを示すケラチノサイトの異常な分化の特徴であり、このことはＬＲＲＣ８Ａが適切な分化に必要であることを示唆する。
【０２０７】
他の潜在的に脱調節された遺伝子のより包括的な概観を得るために、ＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞のＲＮＡ‐Ｓｅｑ分析を行った。ＩＶＬおよびＫＲＴ１０に加えて、このトランスクリプトミクスアプローチは、ＴＧＭ１、ＫＲＴ４およびＫＲＴ１５などのさらなる重要なケラチノサイト分化マーカーおよび異常な過剰増殖ＫＲＴ６およびＫＲＴ１６のマーカーの差次的遺伝子発現を明らかにした。また、乾癬で脱調節されていると記載されているいくつかの重要な遺伝子は（文献５，７）、ＬＲＲＣ８Ａ（ＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞）をもたないＨａＣａＴ細胞でも脱調節されていることがわかった（図５Ｂ、Ｃ）。 
【０２０８】
特に、Ｃｈｉｒｉｃｏｚｚｉらは、ＩＬ−１７で処理されたケラチノサイトにおいて差次的に発現される一般的な２３の遺伝子群に焦点を当ててきた（文献５）。これら２３遺伝子のうち、６遺伝子はＨａＣａＴ細胞では全く発現せず、６遺伝子は影響を受けず、ＨａＣａＴ‐ＬＲＲＣ８Ａ-/細胞でもほぼ５０％の遺伝子（すなわち、２３遺伝子のうち１１遺伝子）が脱調節されていることが本試験でＲＮＡ塩基配列決定により見出された（図５Ｂ）。 
【０２０９】
２番目の研究では、Ｓｗｉｎｄｅｌｌらが乾癬病巣で最も強く上昇する３５の遺伝子群を報告した（文献７）。ＲＮＡ配列決定により、これら３５個の遺伝子のうち、ＨａＣａＴ細胞では１４遺伝子が全く発現せず、１０個の遺伝子は影響を受けず、約３０％の遺伝子（すなわち、３５個の遺伝子のうち１１個）がＨａＣａＴ−ＬＲＲＣ８Ａ-/-細胞で脱調節されていることが分かった（図５Ｃ）。このことは、単一の分化マーカーが脱調節されるだけでなく、ＬＲＲＣ８Ａ活性の欠損が、代わりに乾癬患者の乾癬ケラチノサイトおよび病的皮膚における異常分化に関連するよく知られた遺伝子を含む劇的な遺伝子発現変化に関連することを示す。 
【０２１０】
以上をまとめると、ＬＲＲＣ８Ａの発現／活性の低下は、変化した分化を導く、すなわち、それが異常な分化を引き起こすことが示された。結果的に、ＬＲＲＣ８Ａ活性の増加は、乾癬で見出されるような異常な分化過程に有益な影響を及ぼすであろう。したがって、分化は、ＬＲＲＣ８Ａ効果を調節することによって影響され得、例えば乾癬における分化欠損の治療処置のために、または罹患者の皮膚の外観における、乾癬のような皮膚状態の作用を美容的に軽減するために使用され得る。
【０２１１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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