(57)【要約】  本明細書では、プロテインＡクロマトグラフィーによるＦｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）の精製に関する方法；プロテインＡクロマトグラフィー中に安息香酸塩および／またはベンジルアルコールを含む洗浄溶液の使用に関する方法；ならびにプロテインＡクロマトグラフィー前に安息香酸ナトリウムを使用して回収物を調整する方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）該Ｆｃ領域を含む該ポリペプチドがプロテインＡに結合する条件下で、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスを、（ｉ）該Ｆｃ領域を含む該ポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料と接触させる工程；ならびに
（ｂ）洗浄溶液で該マトリックスを洗浄する工程であって、該洗浄溶液は、（ｉ）約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度の安息香酸塩、および（ｉｉ）約０．５％〜約４％体積／体積（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールのうちの一方または両方を含み、該洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程
を含む前記方法。
【請求項２】
洗浄溶液は、１）安息香酸塩；２）ベンジルアルコール；または３）安息香酸塩およびベンジルアルコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
安息香酸塩は約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
安息香酸塩は安息香酸アルカリ塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
安息香酸塩は安息香酸ナトリウムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
安息香酸ナトリウムは約０．１Ｍ〜約０．３Ｍの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
安息香酸ナトリウムは約０．３Ｍの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
安息香酸ナトリウムは約０．５Ｍの濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ベンジルアルコールは約１％〜約４％（ｖ／ｖ）の濃度である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ベンジルアルコールは約１％〜約２％（ｖ／ｖ）の濃度である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ベンジルアルコールは約２％（ｖ／ｖ）〜約４％（ｖ／ｖ）の濃度である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
洗浄溶液は緩衝剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
緩衝剤は、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、およびクエン酸塩からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
緩衝剤は約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である、請求項１１または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
緩衝剤は約５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である、請求項１１または請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
洗浄溶液は約５．０〜約１０．０のｐＨを有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
洗浄溶液は約５．０〜約９．０のｐＨを有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
洗浄溶液は、約５．０、約６．０、約７．０、約９．０、または約１０．０のｐＨを有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
洗浄溶液はベンゼンスルホン酸ナトリウムをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ベンゼンスルホン酸ナトリウムは約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
洗浄溶液はカプリル酸をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
カプリル酸は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
洗浄溶液はヘキシレングリコールをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ヘキシレングリコールは約１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
洗浄溶液はクレアチンをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
クレアチンは、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
洗浄溶液はアルギニンをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
アルギニンは約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アルギニンは約０．５Ｍの濃度である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
アルギニンはアルギニン−ＨＣｌである、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
アルギニンを含む洗浄溶液は約４．０〜約６．０のｐＨを有する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
アルギニンを含む洗浄溶液は約８．０〜約１０．０のｐＨを有する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
洗浄溶液は、１つまたはそれ以上の非緩衝塩をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
１つまたはそれ以上の非緩衝塩は、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
１つまたはそれ以上の非緩衝塩は、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
１つまたはそれ以上の非緩衝塩は約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
洗浄溶液は、
（ｉ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約５０ｍＭの濃度の重炭酸ナトリウムを含み、約１０．０のｐＨを有する溶液；
（ｉｉ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％の濃度のベンジルアルコール、約０．５Ｍの濃度のアルギニン、および約５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含み、約９．０のｐＨを有する溶液；
（ｉｉｉ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウムおよび約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；
（ｉｖ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；
（ｖ）約１０％（ｖ／ｖ）の濃度のヘキシレングリコール、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；
（ｖｉ）約０．５Ｍの濃度のベンゼンスルホン酸塩、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；
（ｖｉｉ）約５０ｍＭの濃度のカプリル酸、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約０．５Ｍの濃度のアルギニン、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；
（ｖｉｉｉ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約６．０のｐＨを有する溶液；
（ｉｘ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約５．０のｐＨを有する溶液；ならびに
（ｘ）約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールおよび約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約５．０のｐＨを有する溶液
からなる群から選択される溶液である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
マトリックスを請求項１における工程（ｂ）の洗浄溶液で洗浄する前に、該マトリックスを第１の溶液で洗浄する工程をさらに含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
第１の溶液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される緩衝液を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１の溶液は約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度の緩衝液を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第１の溶液はリン酸緩衝液である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
マトリックスを請求項１における工程（ｂ）の洗浄溶液で洗浄した後に、該マトリックスを第２の溶液で洗浄する工程をさらに含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
第２の溶液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される緩衝液を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第２の溶液は約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度の緩衝液を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
第２の溶液は約５．０〜約７．０のｐＨを有する、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
第２の溶液は、実質的に低い塩を含むかまたは塩を含まない、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
１回またはそれ以上の洗浄工程の後に、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスを溶出溶液と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む溶出液を回収する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
深層濾過により溶出液を濾過する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
溶出液は、約５００パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）未満の１つまたはそれ以上の不純物を含む、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
マトリックスを洗浄溶液で洗浄する工程を欠く対応する方法よりも高い程度に、１つまたはそれ以上の不純物から精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドをもたらす、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
１つまたはそれ以上の不純物は宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
１つまたはそれ以上のＨＣＰは、ホスホリパーゼ、クラステリン、セリンプロテアーゼ、伸長因子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＨＣＰは推定上のホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）である、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
Ｆｃ領域はマウスＦｃ領域である、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
マウスＦｃ領域は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３  Ｆｃ領域を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドは抗体である、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
抗体はモノクローナル抗体である、請求項６１または請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
抗体は二重特異性抗体または三重特異性抗体である、請求項６１または請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
工程（ａ）の前に、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの安息香酸塩の最終濃度、および約７．０〜約９．０のｐＨを達成するように調整して、（ｉ）該Ｆｃ領域を含む該ポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料を生成することをさらに含む、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法であって、
（Ａ）該Ｆｃ領域を含む該ポリペプチドを含む回収物を、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの安息香酸塩の最終濃度、および約７．０〜約９．０のｐＨを達成するように調整して、（ｉ）該Ｆｃ領域を含む該ポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料を生成する工程；ならびに
（Ｂ）該試料を少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程
を含む前記方法。
【請求項６７】
安息香酸塩は安息香酸アルカリ塩である、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
安息香酸塩は安息香酸ナトリウムである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
回収物中の安息香酸塩の最終濃度は約０．４Ｍ〜約０．５Ｍである、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
回収物のｐＨは約７．０〜約８．０である、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
回収物のｐＨは約８．０〜約９．０である、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
回収物は、ポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞を含む培養物から生じる、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
宿主細胞は真核生物宿主細胞である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
真核宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
回収物は、調整前に清澄化される、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
回収物は、調整後に清澄化される、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスは、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを含む、請求項６６〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスまたはプロテインＧクロマトグラフィーマトリックスである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスを少なくとも１つの洗浄溶液と接触させる工程をさらに含む、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスを溶出溶液と接触させる工程をさらに含む、請求項６５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む溶出液を回収する工程をさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
深層濾過により溶出液を濾過する工程をさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
溶出液は約５００パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）未満の１つまたはそれ以上の不純物を含む、請求項８１または請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を調整して試料を生成する工程を欠く対応する方法よりも高い程度に、１つまたはそれ以上の不純物から精製された該Ｆｃ領域を含む該ポリペプチドをもたらす、請求項６６〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
１つまたはそれ以上の不純物は宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である、請求項６６〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
１つまたはそれ以上のＨＣＰは、ホスホリパーゼ、クラステリン、セリンプロテアーゼ、伸長因子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ＨＣＰは推定上のホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）である、請求項８５または請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である、請求項６６〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
Ｆｃ領域はマウスＦｃ領域である、請求項６６〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
マウスＦｃ領域は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３  Ｆｃ領域を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドは抗体である、請求項６６〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
抗体はモノクローナル抗体である、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
抗体は二重特異性抗体または三重特異性抗体である、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／６０９，２１４号、および２０１８年７月５日に出願された米国仮特許出願第６２／６９４，３８７の優先権の利益を主張し、それらの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示は、プロテインＡクロマトグラフィーを介してＦｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体、および他のＦｃ領域含有タンパク質（イムノアドヘシンなど）は、医薬／治療用途において幅広い使用が見出されている。これらの分子の使用（例えば、ヒト患者において）は、タンパク質生成中に生じ得る任意の汚染物質／不純物から注意深く精製する必要がある。治療用タンパク質の精製は、多くの場合、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー精製工程を利用して達成され；免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、抗体）を含有するタンパク質のクロマトグラフィー精製の特に有用なタイプは、プロテインＡクロマトグラフィーである。しかしながら、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、従来の捕捉モードタンパク質クロマトグラフィー（タンパク質Ａクロマトグラフィーを含む）中に抗体と共溶出することが示されており、これらの抗体の下流での適用にとって問題となる場合がある。典型的には、溶出前に、生成物（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域を含有するタンパク質）をクロマトグラフィーレジンに結合させた後、１つまたはそれ以上の洗浄工程を採用する。残念ながら、塩および緩衝剤種からなる現在の洗浄製剤は、ＨＣＰおよび他の不純物と種々のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）生成物との相互作用を破壊するのに十分ではない場合がある。したがって、（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー中に）抗体と共精製する不純物の濃度／数を減少させる改善された精製方法（例えば、新しい洗浄製剤の実施）が必要である。
【０００４】
特許出願、特許公開、非特許文献、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書中で引用されるすべての参考文献は、各個々の参考文献が参照によって組み入れられていると具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記および他の必要性を満たすために、本明細書には、１つまたはそれ以上の不純物からＦｃ領域含有ポリペプチドを精製する改善された方法が開示される。これらの方法は、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスを、（ｉ）Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料（例えば、細胞溶解物）と接触させること、ならびに約４．０〜１０．０のｐＨを有し、安息香酸塩および／またはベンジルアルコールを含む洗浄溶液でマトリックスを洗浄することを含む。本開示は、少なくとも部分的には、プロテインＡクロマトグラフィー中に約４．０〜１０．０のｐＨでの洗浄溶液中の安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／またはベンジルアルコールの使用が、現在利用されている洗浄製剤よりも不純物（例えば、宿主細胞不純物）の優れたクリアランスを提供するという驚くべき発見に基づいている（図１、実施例１を参照されたい）。本開示はまた、少なくとも部分的には、ベンゼンスルホン酸塩（例えば、ベンゼンスルホン酸ナトリウム）、カプリル酸、ヘキシレングリコール、および／またはアルギニンから選択される１つもしくはそれ以上の追加成分の包含が、洗浄溶液に含まれる場合、不純物のクリアランスをさらに改善し得るという発見に基づいている（図２および３、実施例１を参照されたい）。
【０００６】
したがって、１つの態様において、本明細書では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）Ｆｃ領域を含むポリペプチドがプロテインＡに結合する条件下で、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスを、（ｉ）Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料と接触させる工程、ならびに（ｂ）マトリックスを洗浄溶液で洗浄する工程であって、洗浄溶液は、（ｉ）約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度の安息香酸塩、および（ｉｉ）約０．５％〜約４％体積／体積（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールのうちの１方または両方を含み、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、洗浄溶液は、（１）安息香酸塩；（２）ベンジルアルコール；または（３）安息香酸塩およびベンジルアルコールを含む。一部の実施形態では、安息香酸塩は、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度である。前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸アルカリ塩である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸ナトリウムである。一部の実施形態では、安息香酸ナトリウムは、約０．１Ｍ〜約０．３Ｍの濃度である。一部の実施形態では、安息香酸ナトリウムは、約０．３Ｍの濃度である。一部の実施形態では、安息香酸ナトリウムは、約０．５Ｍの濃度である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約１％〜約４％（ｖ／ｖ）の濃度である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約１％〜約２％（ｖ／ｖ）の濃度である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約２％（ｖ／ｖ）の濃度である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約４％（ｖ／ｖ）の濃度である。
【０００７】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、洗浄溶液は、緩衝剤をさらに含む。一部の実施形態では、緩衝剤は、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、およびクエン酸塩から選択される。一部の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、緩衝剤は、約５０ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、緩衝剤は、約５００ｍＭの濃度である。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約５．０〜約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約５．０〜約９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、または約１０．０のｐＨを有する。
【０００８】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、洗浄溶液は、ベンゼンスルホン酸ナトリウムをさらに含む。一部の実施形態では、ベンゼンスルホン酸ナトリウムは、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、洗浄溶液は、カプリル酸をさらに含む。一部の実施形態では、カプリル酸は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、洗浄溶液は、ヘキシレングリコールをさらに含む。一部の実施形態では、ヘキシレングリコールは、約１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、洗浄溶液は、クレアチンをさらに含む。一部の実施形態では、クレアチンは、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンをさらに含む。一部の実施形態では、アルギニンは、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度である。一部の実施形態では、アルギニンは、約０．５Ｍの濃度である。一部の実施形態では、アルギニンは、アルギニン−ＨＣｌである。一部の実施形態では、アルギニンを含む洗浄溶液は、約４．０〜約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、アルギニンを含む洗浄溶液は、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、洗浄溶液は、１つまたはそれ以上の非緩衝塩をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非緩衝塩は、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、およびそれらの任意の組合せから選択される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非緩衝塩は、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の非緩衝塩は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度である。
【０００９】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、洗浄溶液は、（ｉ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約５０ｍＭの濃度の重炭酸ナトリウムを含み、約１０．０のｐＨを有する溶液；（ｉｉ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％の濃度のベンジルアルコール、約０．５Ｍの濃度のアルギニン、および約５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含み、約９．０のｐＨを有する溶液；（ｉｉｉ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；（ｉｖ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；（ｖ）約１０％（ｖ／ｖ）の濃度のヘキシレングリコール、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；（ｖｉ）約０．５Ｍの濃度のベンゼンスルホン酸塩、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；（ｖｉｉ）約５０ｍＭの濃度のカプリル酸、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約０．５Ｍの濃度のアルギニン、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する溶液；（ｖｉｉｉ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約６．０のｐＨを有する溶液；（ｉｘ）約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約５．０のｐＨを有する溶液；（ｘ）約４．０（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約５．０〜約１０のｐＨを有する溶液；（ｘｉ）約４％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約９．０のｐＨを有する溶液；ならびに（ｘｉｉ）約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約５．０のｐＨを有する溶液から選択される溶液である。
【００１０】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、本方法は、上記されるようにマトリックスを洗浄溶液で洗浄する前に、マトリックスを第１の溶液で洗浄する工程をさらに含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびそれらの任意の組合せから選択される緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、リン酸緩衝液である。
【００１１】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、本方法は、上記されるようにマトリックスを洗浄溶液で洗浄した後に、マトリックスを第２の溶液で洗浄する工程をさらに含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびそれらの任意の組合せから選択される緩衝液を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の緩衝液を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、約５．０〜約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、第２の溶液は、実質的に低い塩を含むかまたは塩を含まない。
【００１２】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、本方法は、１回またはそれ以上の洗浄工程の後に、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスを溶出溶液と接触させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む溶出液を回収する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、深層濾過により溶出液を濾過する工程をさらに含む。一部の実施形態では、溶出液は、約５００パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）未満の１つまたはそれ以上の不純物を含む。
【００１３】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、本明細書に記載される方法の適用は、マトリックスを洗浄溶液で洗浄する工程を欠く対応する方法よりも高い程度に、１つまたはそれ以上の不純物から精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドをもたらす。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の不純物は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＨＣＰは、ホスホリパーゼ（例えば、推定上のホスホリパーゼＢ様２）、クラステリン、セリンプロテアーゼ、伸長因子、およびそれらの任意の組合せから選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００１４】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。一部の実施形態では、ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、マウスＦｃ領域である。一部の実施形態では、マウスＦｃ領域は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３  Ｆｃ領域を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドは抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。
【００１５】
一部の実施形態では、上記方法のいずれか１つは、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスを（ｉ）Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料と接触させる前に、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの安息香酸塩の最終濃度、および約７．０〜約９．０のｐＨを達成するように調整して、例えば、（ｉ）Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料を生成することを含む。一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸アルカリ塩である。一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸ナトリウムである。一部の実施形態では、回収物中の安息香酸塩の最終濃度は、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍである。一部の実施形態では、調整後の回収物のｐＨは、約７．０〜約８．０である。一部の実施形態では、調整後の回収物のｐＨは、約８．０〜約９．０である。一部の実施形態では、回収物は、ポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞を含む培養物から生じる。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。一部の実施形態では、真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一部の実施形態では、回収物は、調整前に清澄化される。一部の実施形態では、回収物は、調整後に清澄化される。
【００１６】
関連する態様では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法であって、（Ａ）Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの安息香酸塩の最終濃度、および約７．０〜約９．０のｐＨを達成するように調整して、例えば、（ｉ）Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料を生成する工程；ならびに（Ｂ）試料を少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスは、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを含む。一部の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスまたはプロテインＧクロマトグラフィーマトリックスである。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスを少なくとも１つの洗浄溶液と接触させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスを溶出溶液と接触させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む溶出液を回収する工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、深層濾過により溶出液を濾過する工程をさらに含む。一部の実施形態では、溶出液は、約５００パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）未満の１つまたはそれ以上の不純物を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸アルカリ塩である。一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸ナトリウムである。一部の実施形態では、回収物中の安息香酸塩の最終濃度は、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍである。一部の実施形態では、調整後の回収物のｐＨは、約７．０〜約８．０である。一部の実施形態では、調整後の回収物のｐＨは、約８．０〜約９．０である。一部の実施形態では、回収物は、ポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞を含む培養物から生じる。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。一部の実施形態では、真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一部の実施形態では、回収物は、調整前に清澄化される。一部の実施形態では、回収物は、調整後に清澄化される。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を調節して試料を生成する工程を欠く対応する方法よりも高い程度に、１つまたはそれ以上の不純物から精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の不純物は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＨＣＰは、ホスホリパーゼ、クラステリン、セリンプロテアーゼ、伸長因子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＨＣＰは、推定上のホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。一部の実施形態では、ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、マウスＦｃ領域である。一部の実施形態では、マウスＦｃ領域は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３  Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。
【００１８】
上記され、本明細書に記載される種々の実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、またはすべてを組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。本開示のこれら態様および他の態様は、当業者に明らかになる。本開示のこれら実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】示された対照または試験洗浄溶液を用いて洗浄した後の、プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物の濃度を示す図である。
【図２Ａ】プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中の特定のＨＣＰ（ＨＣＰ−Ａ）の濃度を示す図である。図２Ａは、ＥＬＩＳＡで評価した場合、対照洗浄と比較した、２％ベンジルアルコール±０．５Ｍ安息香酸ナトリウムおよび／または０．５Ｍアルギニンで洗浄した後の、プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中のＨＣＰ−Ａ濃度を示す。
【図２Ｂ】プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中の特定のＨＣＰ（ＨＣＰ−Ａ）の濃度を示す図である。図２Ｂは、ＥＬＩＳＡで評価した場合、対照洗浄と比較した、ｐＨ９．０または１０．０の種々の洗浄溶液で洗浄した後の、プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中のＨＣＰ−Ａ濃度を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡで評価した場合、追加の試験化合物を含有する示された洗浄溶液で洗浄した後の、プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中のＨＣＰ−Ａの濃度を示す図である。
【図４】プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中の汎用ＨＣＰおよびＰＬＢＬ２濃度を示す図である。図４Ａは、ＥＬＩＳＡで評価した場合、プロセス対照洗浄と比較して、０．５Ｍアルギニン、０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、または４％ベンジルアルコールで洗浄した後の、プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中の汎用ＨＣＰ濃度を示す。図４Ｂは、ＥＬＩＳＡで評価した場合、プロセス対照洗浄と比較して、０．５Ｍアルギニン、０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、または４％ベンジルアルコールで洗浄した後の、プロテインＡカラムから溶出された抗体試料中の汎用ＰＬＢＬ２濃度を示す。
【図５】２％ベンジルアルコールおよび０．５Ｍ安息香酸ナトリウムを含む中間洗浄液で洗浄されたプロテインＡカラムから溶出された抗体試料の視覚的な清澄さの改善を示す図である。
【図６】４０ｇ／Ｌを超えてプロテインＡカラムにロードした場合の、オフカラム収率およびＰＬＢＬ２除去の減少を示す図である。図６Ａは、プロテインＡカラムのローディング密度が４０ｇ／Ｌから６０ｇ／Ｌに増加するにつれて、オフカラム収率のパーセンテージが９３．１％から７８．１％に直線的に減少することを示す。図６Ｂは、プロテインＡカラムのローディング密度が４０ｇ／Ｌから６０ｇ／Ｌに増加するにつれて、プロテインＡカラムから洗い出されたＰＬＢＬ２のレベルが３２．１ｐｐｍから１７ｐｐｍに減少することを示す。
【図７】０．５Ｍ安息香酸ナトリウムおよびｐＨ７．２への回収物調整、またはプロテインＡ精製前の０．５Ｍ安息香酸ナトリウムおよびｐＨ９への回収物調整により、ＰＬＢＬ２およびＨＣＰ不純物の除去が改善されたことを示す図である。ｐＨ９．０での０．５Ｍ安息香酸ナトリウムへの回収物調整は、ＰＬＢＬ２およびＨＣＰ不純物の最低レベルを示し、ｐＨ調整単独と比較して、ＰＬＢＬ２クリアランスの対数が大きいことを示した。
【図８】ＰＬＢＬ２含量と安息香酸ナトリウム濃度との関係がほぼＳ字状であることを示す図である。０．４Ｍ安息香酸ナトリウムを超える濃度については、ＰＬＢＬ２のクリアランスの低下が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書には、Ｆｃ領域含有タンパク質のプロテインＡベースの単離中に共精製された不純物（例えば、宿主細胞タンパク質不純物）の数を減少させる方法が記載される。本開示の方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー中に回収された溶出液中の宿主細胞タンパク質不純物のレベルを有意に減少させることが示された、安息香酸塩および／またはベンジルアルコールを含有する新規な洗浄溶液を使用する中間洗浄工程を適用する（実施例１および２を参照されたい）。この新規な洗浄溶液への１つまたはそれ以上の添加剤（例えば、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、クレアチン、および／またはアルギニン）の包含、プロテインＡマトリックスからの捕捉および溶出後に、Ｆｃ領域含有タンパク質を含有するタンパク質溶出液からの不純物のクリアランスがさらに改善する。
【００２１】
Ｉ．定義
本開示を詳細に説明する前に、本開示は、当然ながら、変化し得る特定の組成物または生物学的システムに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容がそうでないことを明確に指示していない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、場合により２つまたはそれ以上のこのような分子の組合せなどを含む。
【００２３】
本明細書で使用される用語「約」は、この技術分野における当業者に容易に知られている各値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。
【００２４】
本明細書に記載される本開示の態様および実施形態は、「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。
【００２５】
本明細書で使用される用語「および／または」、「Ａおよび／またはＢ」などの語句は、ＡとＢの両方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；およびＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、本明細書で使用される用語「および／または」、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
【００２６】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書では互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分枝鎖状であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断されていることがある。用語はまた、天然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分もしくは毒素とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作または修飾が挙げられる。また、定義内には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つまたはそれ以上の類似体を含有するポリペプチド、ならびに当技術分野において公知である他の修飾も含まれる。
【００２７】
用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体など）、抗体断片、またはポリペプチドが所望の活性を示す限り、１つまたはそれ以上のＣＤＲもしくはＣＤＲ由来配列を有する合成ポリペプチドを含む。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。一般的に、抗体は、定義されたまたは認識された特異性を有するＩｇであると考えられる。したがって、抗体は、特異的標的に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、標的特異性を欠く他の抗体様分子との両方を含む。本開示の抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡなど）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）であり得る。「タイプ」および「クラス」ならびに「サブタイプ」および「サブクラス」は、本明細書において互換可能に使用される。天然または野生型（集団の非人工的に操作されたメンバーから得られる）抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダなど）抗体、またはキメラ抗体であり得る。
【００２８】
抗体の可変ドメインとの関連で「可変」という用語は、抗体間および抗体中での配列が広範に異なり、特異的認識および結合、またはその特定の標的に対する特定の抗体において使用される、関連分子のある種の部分を指すことができる。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを介して均一には分布されない。可変性は、軽鎖と重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域としても公知である相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域または配列と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲ領域を含み、主にβ−シート構造をとり、３つのＣＤＲによって連結され、これらは、ループ連結を形成し、場合によっては、β−シート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、多くの場合、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲ２とともに、抗体の標的（エピトープまたは決定基）結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７年）を参照されたい）。本明細書で使用される場合、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、そうでないことを指示していない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けシステムに従って行われる。１つのＣＤＲは、同族エピトープに特異的に結合する能力を有し得る。
【００２９】
本明細書で使用される用語「ヒンジ」または「ヒンジ領域」とは、抗体の第１と第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドを指すことができる。
【００３０】
用語「二重特異性抗体」とは、単一分子内の２つの抗体の抗原結合部位を結合する分子を指すことができる。したがって、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に同時に結合することができる。
【００３１】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指すことができ、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、可能性のある天然に存在する突然変異を除いて、同一である。本明細書におけるモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖（単数または複数）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに、それらが所望の活性を保持する限り、このような抗体の断片を含む。
【００３２】
本明細書で使用される用語「多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）抗体」または「多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）抗体」は、２つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すことができ、したがって、同一または異なる構造を有することができる２つまたはそれ以上の抗原に同時に結合することができる。用語「二価」とは、抗体が２つの抗原結合部位を含むことを意味する。用語「四価」とは、抗体が４つの抗原結合部位を含むことを意味する。
【００３３】
本明細書で使用される「抗原結合部位」という用語は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、それに相補的である領域を含む抗体の部分を指すことができる。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１つまたはそれ以上の抗体可変ドメインによって提供され、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の会合によって作製される。
【００３４】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト抗体と比較して、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片である。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン鋳型配列のものである、１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた、典型的には、選択されたヒト免疫グロブリン鋳型のものである、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含み得る。一般的に、目標は、ヒトにおいて免疫原性が最小である抗体分子を有することである。したがって、１つまたはそれ以上のＣＤＲにおける１つまたはそれ以上のアミノ酸はまた、標的に対する１つまたはそれ以上のＣＤＲの特異的結合機能を実質的に最小化することなく、ヒト宿主に対して免疫原性が低いものに変化させることができる。あるいは、ＦＲは、非ヒトであり得るが、最も免疫原性の高いそれらのアミノ酸は、より免疫原性の低いアミノ酸に置換される。それにもかかわらず、（上記されるように）ＣＤＲグラフティングは、ヒト化抗体を得る唯一の方法ではない。例えば、ＣＤＲ領域を修飾することは、フレームワーク残基がＣＤＲループの三次元構造およびそのリガンドに対する抗体の全体的な親和性を決定する役割を有することが稀でないため、不十分である場合がある。したがって、非ヒト親抗体分子が、ヒトに対してより免疫原性の低いものであるように修飾されるように、任意の手段を実施することができ、ヒト抗体との広範囲の配列同一性は必ずしも必要ではない。
【００３５】
用語「不純物」は、溶液（Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む試料など）中に存在する任意の外来または望ましくない分子を指すことができる。不純物は、目的とするタンパク質を含有する試料中にも存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質などの生物学的（分子）（例えば、高分子）であり得る。不純物には、望ましくないタンパク質変異体（例えば、凝集タンパク質、誤った折り畳たまれたタンパク質、ジスルフィド結合下のタンパク質、断片など）、宿主細胞由来の他のタンパク質、細胞培養培地由来の成分、アフィニティークロマトグラフィーに使用される吸収剤の一部である分子（例えば、プロテインＡ）、エンドトキシン、核酸、ウイルスなどが含まれる。
【００３６】
ＩＩ．ＦＣ領域含有ポリペプチドを単離および／または精製する方法
概説
本開示のある種の態様は、プロテインＡクロマトグラフィーを介してＦｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）を精製する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）がプロテインＡに結合する条件下で、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスまたはレジンを、（１）Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）、および（２）１つまたはそれ以上の不純物（例えば、宿主細胞不純物）を含む試料と接触させる工程；ならびにマトリックスを安息香酸塩および／またはベンジルアルコールを含む洗浄溶液で洗浄する工程を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度の安息香酸塩を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５％〜約４％体積／体積（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、１つまたはそれ以上の添加剤（例えば、１つもしくはそれ以上のベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩（塩化ナトリウムなど）、クレアチン、および／またはアルギニン）を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、緩衝剤をさらに含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を、約０．１Ｍ〜０．５Ｍの安息香酸塩の最終濃度、および約７〜約９のｐＨを達成するように調整して、（１）Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）、および（２）１つまたはそれ以上の不純物（例えば、宿主細胞不純物）を含む試料を生成する。
【００３７】
試料とプロテインＡマトリックスまたはレジンとの接触
本開示のある種の態様は、プロテインＡクロマトグラフィーを介してＦｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）を精製する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）がプロテインＡに結合する条件下で、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスまたはレジンを、（１）Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）、および（２）１つまたはそれ以上の不純物（例えば、宿主細胞不純物）を含む試料と接触させる工程を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示は、試料（例えば、細胞溶解物試料、細胞培養上清試料など）からＦｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体、イムノアドヘシン、融合タンパク質など）を精製する方法に関する。一部の実施形態では、試料は、細胞培養上清（例えば、ポリペプチドを生成および分泌するように操作された、ＣＨＯ細胞などの細胞からの上清）であるか、または細胞培養上清（例えば、部分的に精製された細胞培養上清試料）に由来する。一部の実施形態では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、分泌型ポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域であり、天然配列Ｆｃ領域および変異型Ｆｃ領域を含み得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は多様であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで（Ｆｃ領域の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである）伸長すると定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、２つの定常ドメインであるＣＨ２およびＣＨ３を含み、場合によりＣＨ４ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の適切な免疫グロブリンから得られるＦｃ領域である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列、非ヒト動物Ｆｃ領域（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有するＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、マウスＦｃ領域である。一部の実施形態では、マウスＦｃ領域は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３  Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。一部の実施形態では、ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、および／またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。
【００３９】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、抗体である。一部の実施形態では、「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体（例えば、二価、三価、四価など）、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性、三重特異性など）を包含する。抗体は、任意の起源に由来し得、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、ラクダ、サメ、および／または組換え的に生成されたものが含まれる。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、および／またはキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体および／または多価抗体である。一部の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む試料（例えば、細胞溶解物試料、細胞培養上清試料など）は、１つまたはそれ以上の不純物をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の不純物は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを生成するために用いられるプロセス（例えば、分泌型抗体を製造するプロセス）のために、試料中に存在する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の不純物は、宿主細胞由来の１つまたはそれ以上の不純物（例えば、１つまたはそれ以上の宿主細胞タンパク質、１つまたはそれ以上の宿主細胞核酸、１つまたはそれ以上の宿主細胞脂質など）である。宿主細胞は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの生成に適した当技術分野において公知である任意の宿主細胞であり得、例えば、原核細胞（大腸菌細胞、Ａ．ニガー細胞など）、真核細胞（酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓ１細胞）、および／または哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類など）細胞（例えば、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞など）が挙げられる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の不純物は、１つまたはそれ以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である。一部の実施形態では、ＨＣＰは、細胞培養または発酵中の宿主細胞によって生成される非精製タンパク質を指す。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の不純物は、ホスホリパーゼ、クラステリン、セリンプロテアーゼ、伸長因子、および／またはそれらの任意の組合せから選択される１つもしくはそれ以上（例えば、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上など）の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の不純物は、１つまたはそれ以上のＣＨＯ細胞ＨＣＰである。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＣＨＯ細胞ＨＣＰは、ホスホリパーゼ、クラステリン、セリンプロテアーゼ、伸長因子、および／またはそれらの任意の組合せの１つもしくはそれ以上である。
【００４１】
一部の実施形態では、本開示は、プロテインＡクロマトグラフィーを介して、試料中の１つまたはそれ以上の不純物からＦｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法に関する。一部の実施形態では、試料をプロテインＡマトリックスまたはレジンと接触させる。一部の実施形態では、試料を、試料中のＦｃ領域を含むポリペプチドがプロテインＡに結合するのに適した条件下で、プロテインＡマトリックスまたはレジンと接触させる。Ｆｃ領域含有ポリペプチドをプロテインＡマトリックスまたはレジンに接触させ、結合するための方法およびそれに適した条件は、当業者により容易に理解される（例えば、市販のプロテインＡマトリックスまたはレジンの製造業者のプロトコールに記載される方法）。当技術分野において公知である任意の適切なプロテインＡマトリックスまたはレジンが、本開示の方法に使用され、例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ＬＸ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＰｒｉｓｍＡ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、およびｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＥｓｈｍｕｎｏＡ、ＰｒｏＳｅｐ  Ａ、ＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ  Ｕｌｔｒａ、およびＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ  ＵｌｔｒａＰｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；Ｐｏｒｏｓ  ＡおよびＭａｂｃａｐｔｕｒｅ  Ａ（Ｐｏｒｏｓ）；ＩＰＡ−３００、ＩＰＡ−４００、およびＩＰＡ−５００（ＲｅｐｌｉＧｅｎ  Ｃｏｒｐ．）；Ａｆｆｉｇｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡおよびＡｆｆｉｐｒｅｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；ＭＡＢｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１ＰＰおよびＭＡＢｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ２Ｐ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｌｔｄ．）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ  Ｆ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）；Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡおよびＡｇａｒｏｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＰＩＥＲＣＥ）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｌｌｔｈｒｕ  ３００およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）；Ａｍｓｐｈｅｒｅ  Ａ３（ＪＳＲ）；ならびに／またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＣ−６５０Ｆ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。一部の実施形態では、プロテインＡマトリックスまたはレジンは、カラムクロマトグラフィーフォーマットで使用される。一部の実施形態では、プロテインＡマトリックスまたはレジンの１つまたはそれ以上のパラメータ（ｐＨ、イオン強度、温度、他の物質の添加など）は、プロテインＡマトリックスまたはレジンを試料と接触させる前に調整される。一部の実施形態では、プロテインＡマトリックスまたはレジンは、プロテインＡマトリックスまたはレジンを試料と接触させる前および／または後に、洗い流され、洗浄され、平衡化され、ストリップされ、および／または消毒される。一部の実施形態では、プロテインＡマトリックスまたはレジンは、プロテインＡマトリックスまたはレジンを試料と接触させる��に平衡化および／または洗浄される。当技術分野において公知である任意の適切な平衡化および／または洗浄緩衝液を使用することができる。一部の実施形態では、プロテインＡマトリックスまたはレジンは、使用の間に消毒され、ストリップされ、および／または再生される。
【００４２】
洗浄溶液によるプロテインＡマトリックスまたはレジンの洗浄
本開示のある種の態様は、安息香酸塩および／またはベンジルアルコールを含む洗浄溶液を用いて、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）に結合したプロテインＡマトリックスまたはレジンを洗浄することによって、プロテインＡクロマトグラフィーを介してＦｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）がプロテインＡに結合する条件下で、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスまたはレジンを、（１）Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）、および（２）１つまたはそれ以上の不純物（例えば、宿主細胞不純物）を含む試料と接触させる工程；ならびに約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度の安息香酸塩および／または約０．５％〜約４％体積／体積（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含む洗浄溶液を用いてマトリックスまたはレジンを洗浄する工程であって、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、ベンジルアルコールを含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩およびベンジルアルコールを含む。
【００４３】
一部の実施形態では、本開示は、安息香酸塩および／または安息香酸を含む洗浄溶液（例えば、調整されたｐＨ）に関する。当技術分野において公知である安息香酸塩（例えば、アルカリ塩）および／または安息香酸の任意の適切な供給源または形態は、本開示の洗浄溶液中で使用することができ、例えば、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸リチウム、安息香酸カルシウム、安息香酸マグネシウム、安息香酸ベリリウム、安息香酸バリウム、安息香酸ストロンチウム、安息香酸ルビジウム、安息香酸セシウム、および／またはそれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸アルカリ塩である。一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸ナトリウムまたは安息香酸カリウムである。一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸ナトリウムである。
【００４４】
一部の実施形態では、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／または安息香酸は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／または安息香酸は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．３Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．２Ｍ、約０．２Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．３Ｍ、約０．３Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．４Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．５Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．６Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．６Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．６Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．６Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．７Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．７Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．７Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．８Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．８Ｍ〜約０．９Ｍ、または約０．９Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／または安息香酸は、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／または安息香酸は、約０．１Ｍ〜約０．３Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００４５】
一部の実施形態では、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／または安息香酸は、約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、または１．０Ｍのいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／または安息香酸は、約０．５Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／または安息香酸は、約０．１Ｍもしくは約０．１Ｍ未満、約０．３Ｍ未満もしくは約０．３Ｍ未満、約０．５Ｍもしくは約０．５Ｍ未満、約０．７５Ｍもしくは約０．７５Ｍ未満、または約１．０Ｍもしくは約１．０Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）および／または安息香酸は、約０．５Ｍまたは約０．５Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００４６】
一部の実施形態では、本開示は、ベンジルアルコールを含む洗浄溶液に関する。当技術分野において公知であるベンジルアルコールの任意の適切な供給源または形態を、本開示の洗浄溶液中で使用することができる。
【００４７】
一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約０．５％〜約４．０％体積／体積（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、ベンジルアルコールは、約０．５％〜約４％、約１％〜約４％、約１．５％〜約４％、約２％〜約４％、約２％〜約４％、２．５％〜約４％、約３％〜約４％、約３．５％〜約４％、約０．５％〜約３．５％、約１％〜約３．５％、約１．５％〜約３．５％、約２％約３．５％、約２．５％〜約３．５％、約３％〜約３．５％、約０．５％〜約３％、約１％〜約３％、約１．５％〜約３％、約２％〜約３％、約２．５％〜約３％、約０．５％〜約２．５％、約１％〜約２．５％、約１．５％〜約２．５％、約２％〜約２．５％、約０．５％〜約２％、約１％〜約２％、約１．５％〜約２％、約０．５％〜約１．５％、約１％〜約１．５％、または約０．５％〜約１％（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約１％〜約４％体積／体積（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約１％〜約２％の体積／体積（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００４８】
一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約０．５％、０．７５％、１％、１．２５％、１．５％、１．７５％、２％、２．２５％、２．５％、２．７５％、３％、３．２５％、３．５％、３．７５％、または約４％（ｖ／ｖ）のいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約２％（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約１％もしくは約１％未満、約２％もしくは約２％未満、約３％もしくは約３％未満、または約４％もしくは約４％未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約４％または約４％（ｖ／ｖ）未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ベンジルアルコールは、約４％または約２％（ｖ／ｖ）未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００４９】
添加剤
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、本明細書に記載される濃度のいずれかで、以下の添加剤：ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンの１つまたはそれ以上（例えば、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つすべて）をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の添加剤を含む洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液中への１つまたはそれ以上の添加剤の包含は、本明細書に記載される方法により、１つまたはそれ以上の不純物（例えば、宿主細胞不純物）からのＦｃ領域を含むポリペプチドの精製をさらに改善する。
【００５０】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨで、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンのうちの１つを含む。例えば、洗浄溶液は、安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ならびにベンゼンスルホン酸塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ならびにカプリル酸；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ならびにヘキシレングリコール；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ならびに非緩衝塩；または安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ならびにクレアチンを含むことができる。
【００５１】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨで、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンのうちの２つを含む。例えば、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨで、安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ならびにカプリル酸；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ならびにヘキシレングリコール；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、カプリル酸、ならびにヘキシレングリコール；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、カプリル酸、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、カプリル酸、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ヘキシレングリコール、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ヘキシレングリコール、ならびにクレアチン；または安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、非緩衝塩、ならびにクレアチンを含み得る。
【００５２】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨで、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンのうちの３つを含む。例えば、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨで、安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ならびにヘキシレングリコール；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ヘキシレングリコール、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ヘキシレングリコール、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、非緩衝塩、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、カプリル酸、ヘキシレングリコール、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、カプリル酸、ヘキシレングリコール、ならびにクレアチン；または安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、カプリル酸、非緩衝塩、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、ならびにクレアチンを含み得る。
【００５３】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨで、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンのうちの４つを含む。例えば、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨで、安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、非緩衝塩、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、ならびにクレアチン；または安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、ならびにクレアチンを含み得る。
【００５４】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨで、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、およびクレアチンの５つすべてを含む。
【００５５】
一部の実施形態では、本開示は、ベンゼンスルホン酸塩を含む洗浄溶液に関する。当技術分野において公知であるベンゼンスルホン酸塩の任意の適切な形態または供給源は、本開示の洗浄溶液中で使用することができ、例えば、ベンゼンスルホン酸ナトリウムもしくはベンゼンスルホン酸カリウムなどのベンゼンスルホン酸塩（例えば、アルカリ塩）、ベンゼンスルホン酸、および／またはそれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、ベンゼンスルホン酸塩は、ベンゼンスルホン酸ナトリウムである。
【００５６】
一部の実施形態では、ベンゼンスルホン酸塩（例えば、ベンゼンスルホン酸ナトリウム）は、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、ベンゼンスルホン酸ナトリウムは、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．３Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．２Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．２Ｍ、０．２Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．３Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．４Ｍ、または約０．４Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、ベンゼンスルホン酸ナトリウムは、約０．１Ｍ〜約０．３Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００５７】
一部の実施形態では、ベンゼンスルホン酸ナトリウムは、約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、または０．５Ｍのいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ベンゼンスルホン酸ナトリウムは、約０．５Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ベンゼンスルホン酸ナトリウムは、約０．１Ｍもしくは約０．１Ｍ未満、約０．３Ｍもしくは約０．３Ｍ未満、または約０．５Ｍもしくは約０．５Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ベンゼンスルホン酸ナトリウムは、約０．５Ｍまたは約０．５Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００５８】
一部の実施形態では、本開示は、カプリル酸を含む洗浄溶液に関する。当技術分野において公知であるカプリル酸の任意の適切な形態または供給源を、本開示の洗浄溶液中で使用することができる。
【００５９】
一部の実施形態では、カプリル酸は、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、カプリル酸は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ、４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、カプリル酸は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００６０】
一部の実施形態では、カプリル酸は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭのいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、カプリル酸は、約５０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、カプリル酸は、約１０ｍＭもしくは約１０ｍＭ未満、約３０ｍＭもしくは約３０ｍＭ未満、または約５０ｍＭもしくは約５０ｍＭ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、カプリル酸は、約５０ｍＭまたは約５０ｍＭ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００６１】
一部の実施形態では、本開示は、ヘキシレングリコールを含む洗浄溶液に関する。当技術分野において公知であるヘキシレングリコールの任意の適切な形態または供給源を、本開示の洗浄溶液中で使用することができる。
【００６２】
一部の実施形態では、ヘキシレングリコールは、約０．５％〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、ヘキシレンは、約０．５％〜約１０％、約１％〜約１０％、約２％〜約１０％、約４％〜約１０％、約６％〜約１０％、約８％〜約１０％、約９％〜約１０％、０．５％〜約９％、約１％〜約９％、約２％〜約９％、約４％〜約９％、約６％〜約９％、約８％〜約９％、約０．５％〜約８％、約１％〜約８％、約２％〜約８％、約４％〜約８％、約６％〜約８％、約０．５％〜約６％、約１％〜約６％、約２％〜約６％、約４％〜約６％、約０．５％〜約４％、約１％〜約４％、約２％〜約４％、約０．５％〜約２％、約１％〜約２％、または約０．５％〜約１％（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、ヘキシレングリコールは、約１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００６３】
一部の実施形態では、ヘキシレングリコールは、約０．５％、１％、１．５％、２．５％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％（ｖ／ｖ）のいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ヘキシレングリコールは、約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ヘキシレングリコールは、約１％もしくは約１％未満、約２％もしくは約２％未満、約４％もしくは約４％未満、約６％もしくは約６％未満、約８％もしくは約８％未満、または約１０％もしくは約１０％（ｖ／ｖ）未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ヘキシレングリコールは、約１０％または約１０％（ｖ／ｖ）未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００６４】
一部の実施形態では、本開示は、１つまたはそれ以上（例えば、１つまたはそれ以上、２つまたはそれ以上、３つまたはそれ以上など）の非緩衝塩を含む洗浄溶液に関する。当技術分野において公知である非緩衝塩の任意の適切な形態または供給源を、本開示の洗浄溶液中で使用することができる。非緩衝塩は、ハロゲン塩（例えば、ＣｌまたはＢｒを含む塩）、特にアルカリ金属（例えば、ＮａもしくはＫ）またはアルカリ土類金属（例えば、ＣａもしくはＭｇ）を含むハロゲン塩を含み得る。一部の実施形態では、非緩衝塩は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。一部の実施形態では、非緩衝塩は、塩化ナトリウムである。
【００６５】
一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．６Ｍ、０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．２Ｍ、約０．２Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．２Ｍ約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．４Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．５Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．６Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．６Ｍ〜約０．８Ｍ、または約０．８Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００６６】
一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、または１．０Ｍのいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．５Ｍの濃度で洗浄液中に存在する。一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．１Ｍもしくは約０．１Ｍ未満、約０．２Ｍもしくは約０．２Ｍ未満、約０．４Ｍもしくは約０．４Ｍ未満、約０．５Ｍもしくは約０．５Ｍ未満、約０．６Ｍもしくは約０．６Ｍ未満、約０．８Ｍもしくは約０．８Ｍ未満、または約１．０Ｍもしくは約１．０Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．５Ｍまたは約０．５Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、非緩衝塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約１．０Ｍまたは約１．０Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示は、クレアチンを含む洗浄溶液に関する。当技術分野において公知であるクレアチンの任意の適切な形態または供給源は、本開示の洗浄溶液中で使用することができ、例えば、クレアチン−ＨＣｌ、クレアチンエステル、クレアチンピルベート、クレアチンリン酸、クレアチンアルファ−ケトグルタレート、クレアチンシトレート、および／またはそれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、クレアチンは、クレアチン−ＨＣｌである。
【００６８】
一部の実施形態では、クレアチンは、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、クレアチンは、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、クレアチンは、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、クレアチンは、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、クレアチンは、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、または１００ｍＭのいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、クレアチンは、約５０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００６９】
アルギニン
一部の実施形態では、本開示は、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体をさらに含む洗浄溶液に関する。一部の実施形態では、洗浄溶液中へのアルギニンおよび／またはアルギニン誘導体の包含は、本明細書に記載される方法により、１つまたはそれ以上の不純物（例えば、宿主細胞不純物）からのＦｃ領域を含むポリペプチドの精製をさらに改善する。当技術分野において公知であるアルギニンおよび／またはアルギニン誘導体の任意の適切な形態または供給源は、本開示の洗浄溶液中で使用することができ、例えば、アルギニン、アルギニン−ＨＣｌ、アセチルアルギニン、アグマチン、アルギン酸、Ｎ−アルファ−ブチロイル−Ｌ−アルギニン、Ｎ−アルファ−ピバロイルアルギニン、および／またはそれらの任意の組合せが挙げられる。アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体は、Ｌ−アルギニンおよび／またはＤ−アルギニン、ならびにそれらの誘導体であり得る。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体は、アルギニン−ＨＣｌである。
【００７０】
一部の実施形態では、本開示は、安息香酸塩および／またはベンジルアルコールを含む洗浄溶液中のアルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）の使用に関する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩ならびにアルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、ベンジルアルコールならびにアルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩、ベンジルアルコール、ならびにアルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液は、本明細書に記載されるいずれかの濃度で、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンの１つまたはそれ以上（例えば、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つすべて）をさらに含む。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液は、約４．０〜約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液は、約４．０〜約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液は、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液は、約８．０〜約９．０のｐＨを有する。
【００７１】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンのうちの１つを含む。例えば、洗浄溶液は、安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ならびにベンゼンスルホン酸塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ならびにカプリル酸；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ならびにヘキシレングリコール；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ならびに非緩衝塩；または安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ならびにクレアチンを含むことができる。
【００７２】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンのうちの２つを含む。例えば、洗浄溶液は、安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、ならびにカプリル酸；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、ならびにヘキシレングリコール；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、カプリル酸、ならびにヘキシレングリコール；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、カプリル酸、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、カプリル酸、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ヘキシレングリコール、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ヘキシレングリコール、ならびにクレアチン；または安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、非緩衝塩、ならびにクレアチンを含み得る。
【００７３】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンのうちの３つを含む。例えば、洗浄溶液は、安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ならびにヘキシレングリコール；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、ヘキシレングリコール、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、ヘキシレングリコール、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、非緩衝塩、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、カプリル酸、ヘキシレングリコール、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、カプリル酸、ヘキシレングリコール、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、カプリル酸、非緩衝塩、ならびにクレアチン；または安息香酸塩および／もしくはベンジルアルコール、アルギニン、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、ならびにクレアチンを含み得る。
【００７４】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、および／またはクレアチンのうちの４つを含む。例えば、洗浄溶液は、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、ならびに非緩衝塩；安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、非緩衝塩、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニン、ベンゼンスルホン酸塩、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、ならびにクレアチン；安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニン、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、ならびにクレアチンを含むことができる。
【００７５】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、安息香酸塩および／またはベンジルアルコール、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、ならびにベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、非緩衝塩、およびクレアチンの５つすべてを含む。
【００７６】
一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．１Ｍ０．１Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．３Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．２Ｍ、約０．２Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．３Ｍ、約０．３Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．３Ｍ〜０．９Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．４Ｍ、約０．４Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．５Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．６Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．６Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．６Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．６Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．７Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．７Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．７Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．８Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．８Ｍ〜約０．９Ｍ、または約０．９Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）は、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）は、約０．１Ｍ〜約０．３Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００７７】
一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）は、約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、または１．０Ｍのいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）は、約０．５Ｍの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）は、約０．１Ｍもしくは約０．１Ｍ未満、約０．２Ｍもしくは約０．２Ｍ未満、約０．３Ｍもしくは約０．３Ｍ未満、約０．４Ｍもしくは約０．４Ｍ未満、約０．５Ｍもしくは約０．５Ｍ未満、約０．７５Ｍもしくは約０．７５Ｍ未満、または約１．０Ｍもしくは約１．０Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、アルギニンおよび／またはアルギニン誘導体（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）は、約０．５Ｍまたは約０．５Ｍ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００７８】
ｐＨ
一部の実施形態では、本開示は、約４．０〜約１０．０のｐＨを有する洗浄溶液に関する。例えば、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０、約５．０〜約１０．０、約６．０〜約１０．０、約６．５〜約１０．０、約７．０〜約１０．０、約７．５〜約１０．０、約８．０〜約１０．０、約９．０〜約１０．０、４．０〜約９．０、約５．０〜約９．０、約６．０〜約９．０、約６．５〜約９．０、約７．０〜約９．０、約７．５〜約９．０、約８．０〜約９．０、４．０〜約８．０、約５．０〜約８．０、約６．０〜約８．０、約６．５〜約８．０、約７．０〜約８．０、約７．５〜約８．０、４．０〜約７．５、約５．０〜約７．５、約６．０〜約７．５、約６．５〜約７．５、約７．０〜約７．５、約４．０〜約７．０、約５．０〜約７．０、約６．０〜約７．０、約６．５〜約７．０、４．０〜約６．５、約５．０〜約６．５、約６．０〜約６．５、４．０〜約６．０、約５．０〜約６．０、または約４．０〜約５．０のｐＨを有し得る。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約５．０〜約９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０〜約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０〜約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約８．０〜約９．０のｐＨを有する。
【００７９】
一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．２５、５．５、５．７５、６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、８．０、８．２５、８．５、８．７５、９．０、９．２５、９．５、９．７５、または１０．０のいずれかのｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約６．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約７．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約１０．０のｐＨを有する。
【００８０】
緩衝剤
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、１つまたはそれ以上（例えば、１つまたはそれ以上、２つまたはそれ以上、３つまたはそれ以上、４つまたはそれ以上、５つまたはそれ以上など）の緩衝剤をさらに含む。当技術分野において公知である任意の適切な緩衝剤は、本開示の洗浄溶液中で使用することができ、例えば、リン酸塩、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ビス−トリス、ビス−トリスプロパン、アルギニン、ヒスチジン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ギ酸塩、炭酸塩、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、トリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＥＳ（２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、カコジル酸（ジメチルアルシン酸）、ＳＳＣ（食塩水クエン酸ナトリウム）、および／またはそれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、緩衝剤は、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩の１つまたはそれ以上である。
【００８１】
一部の実施形態では、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、２００ｍＭ〜約５００ｍＭ、２５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、３００ｍＭ〜約５００ｍＭ、３５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、４００ｍＭ〜約５００ｍＭ、４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、１ｍＭ〜約４５０ｍＭ、１ｍＭ〜約４００ｍＭ、１ｍＭ〜約３５０ｍＭ、１ｍＭ〜約３００ｍＭ、１ｍＭ〜約２５０ｍＭ、１ｍＭ〜約２００ｍＭ、１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約６０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約６０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約ｔ１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００８２】
一部の実施形態では、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、または１００ｍＭのいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。あるいは、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、または５００ｍＭのいずれかの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約５００ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約５０ｍＭの濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約１０ｍＭもしくは約１０ｍＭ未満、約２５ｍＭもしくは約２５ｍＭ未満、約５０ｍＭもしくは約５０ｍＭ未満、約７５ｍＭもしくは約７５ｍＭ未満、または約１００ｍＭもしくは約１００ｍＭ未満、または約５００ｍＭもしくは約５００ｍＭ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約５０ｍＭまたは約５０ｍＭ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、アルギニン、酢酸塩、および／またはクエン酸塩）は、約５００ｍＭまたは約５００ｍＭ未満の濃度で洗浄溶液中に存在する。
【００８３】
例示的な洗浄溶液
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウムおよび／またはベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウムおよび／または約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウムおよび約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、リン酸緩衝液（例えば、約５０ｍＭの濃度）をさらに含む。
【００８４】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウム、安息香酸ベンジルアルコール、および／または塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および／または約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、リン酸緩衝液（例えば、約５０ｍＭの濃度）をさらに含む。
【００８５】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、アルギニン、および／または塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、約０．５Ｍの濃度のアルギニン、および／または約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、約０．５Ｍの濃度のアルギニン、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、リン酸緩衝液（例えば、約５０ｍＭの濃度）をさらに含む。
【００８６】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、リン酸緩衝液、および／またはアルギニンを含み、約９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、約５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液、および／または約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、約５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液、および約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約９．０のｐＨを有する。
【００８７】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、および／またはアルギニンを含み、約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および／または約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含み、約６．０のｐＨを有する。
【００８８】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、ヘキシレングリコール、安息香酸ナトリウム、および／またはベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約１０％（ｖ／ｖ）の濃度のヘキシレングリコール、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および／または約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約１０％（ｖ／ｖ）の濃度のヘキシレングリコール、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。
【００８９】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸ナトリウム、および／またはベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度のベンゼンスルホン酸塩、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および／または約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度のベンゼンスルホン酸塩、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、および約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約７．０のｐＨを有する。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、および／またはアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および／または約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約５．０のｐＨを有する。
【００９１】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、および／またはアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および／または約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコール、および約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約６．０のｐＨを有する。
【００９２】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、ベンジルアルコールおよび／またはアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールおよび／または約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約２％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールおよび約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）を含み、約５．０のｐＨを有する。
【００９３】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウム、アルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、カプリル酸、および／または塩化ナトリウムを含み、約９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、約５０ｍＭの濃度のカプリル酸、および／または約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、約５０ｍＭの濃度のカプリル酸、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約９．０のｐＨを有する。
【００９４】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウム、アルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、カプリル酸、および／または塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、約５０ｍＭの濃度のカプリル酸、および／または約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウム、約０．５Ｍの濃度のアルギニン（例えば、アルギニン−ＨＣｌ）、約５０ｍＭの濃度のカプリル酸、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。
【００９５】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、安息香酸ナトリウムおよび／または重炭酸ナトリウムを含み、約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウムおよび／または約５０ｍＭの濃度の重炭酸ナトリウムを含み、約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約０．５Ｍの濃度の安息香酸ナトリウムおよび約５０ｍＭの濃度の重炭酸ナトリウムを含み、約１０．０のｐＨを有する。
【００９６】
一部の実施形態では、本開示の洗浄溶液は、約４％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約５．０〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、約４％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含み、約９．０のｐＨを有する。
【００９７】
クロマトグラフィー前にＦｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を調整する
一態様では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法であって、（Ａ）Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの安息香酸塩の最終濃度、および約７．０〜約９．０のｐＨを達成するように調整して、（ｉ）Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料を生成する工程、ならびに（Ｂ）試料を少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスと接触させる工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスは、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスおよび／またはプロテインＧクロマトグラフィーマトリックスである。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスを少なくとも１つの洗浄溶液と接触させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスを溶出溶液と接触させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む溶出液を回収する工程をさらに含む。
【００９８】
一部の実施形態では、用語「回収物」とは、細胞培養の終了時または細胞培養後に存在する流体、例えば、細胞溶解物試料、または細胞培養上清試料（例えば、ポリペプチドを生成および分泌するように操作された、ＣＨＯ細胞などの細胞からの上清）を指す。一部の実施形態では、回収物は、無傷の宿主細胞および／または細胞破片を含む。一部の実施形態では、回収物は、無傷の宿主細胞および／または細胞破片を含まない。例えば、一部の実施形態では、細胞培養の終了時または細胞培養後に存在する流体は、調整前に、１つまたはそれ以上の遠心分離および／または濾過工程に供されて、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの安息香酸塩の最終濃度、および約７．０〜約９．０のｐＨを達成する。一部の実施形態では、回収物は、細胞培養の終了時または細胞培養後に存在する流体に由来する。例えば、一部の実施形態では、細胞培養の終了時または細胞培養後に存在する流体は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの細胞分離および／または精製のために最適化するために、１つまたはそれ以上の前処理工程に供される。
【００９９】
関連する態様では、本明細書に記載されるＦｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法のいずれか１つは、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を、０．１Ｍ〜約０．５Ｍの安息香酸塩の最終濃度、ならびに約７．０〜約９．０のｐＨを達成するように調節して、（ｉ）Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含む試料を生成する工程をさらに含む。
【０１００】
一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸アルカリ塩である。一部の実施形態では、安息香酸塩は、安息香酸ナトリウムである。一部の実施形態では、回収物は、これらの値の間の任意の範囲を含む、０．０２５Ｍ、０．０５Ｍ、０．０７５Ｍ、０．１Ｍ、０．１２５Ｍ、０．１５Ｍ、０．１７５Ｍ、０．２Ｍ、０．２２５Ｍ、０．２５Ｍ、０．２７５Ｍ、０．３Ｍ、０．３２５Ｍ、０．３５Ｍ、０．３７５Ｍ、０．４Ｍ、０．４２５Ｍ、０．４５Ｍ、０．４７５Ｍ、０．５Ｍ、０．５２５Ｍ、０．５５Ｍ、０．５７５Ｍ、０．６Ｍ、０．６２５Ｍ、０．６５Ｍ、０．６７５Ｍ、０．７Ｍ、０．７２５Ｍ、０．７５Ｍ、０．７７５Ｍ、または０．８Ｍのいずれかの約１つの最終濃度を達成するように調整される。一部の実施形態では、回収物のｐＨは、これらの値の間の任意の範囲を含む、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または１０．０のいずれか約１つに調整される。一部の実施形態では、回収物は、調整（例えば、安息香酸ナトリウムの添加およびｐＨの調整）前に清澄化される。一部の実施形態では、回収物は、調整（例えば、安息香酸ナトリウムの添加およびｐＨの調整）後に清澄化される。
【０１０１】
一部の実施形態では、本方法は、回収物を、約０．５Ｍの最終安息香酸ナトリウム濃度および約７のｐＨを達成するように調整することを含む。一部の実施形態では、本方法は、回収物を、約０．１Ｍの最終安息香酸ナトリウム濃度および約９のｐＨを達成するように調整することを含む。一部の実施形態では、本方法は、回収物を、約０．２Ｍの最終安息香酸ナトリウム濃度および９のｐＨを達成するように調整することを含む。一部の実施形態では、本方法は、回収物を、約０．３Ｍの最終安息香酸ナトリウム濃度および９のｐＨを達成するように調整することを含む。一部の実施形態では、本方法は、回収物を、約０．４Ｍの最終安息香酸ナトリウム濃度および９のｐＨを達成するように調整することを含む。一部の実施形態では、本方法は、回収物を、約０．５Ｍの最終安息香酸ナトリウム濃度および９のｐＨを達成するように調整することを含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、回収物の調整（例えば、安息香酸ナトリウムを添加し、ｐＨを調整すること）は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む回収物を調整して試料を生成する工程を欠く対応する方法よりも高い程度に、１つまたはそれ以上の不純物から精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の不純物は、ホスホリパーゼ、クラステリン、セリンプロテアーゼ、伸長因子、およびそれらの任意の組合せなどの宿主細胞タンパク質である。一部の実施形態では、ＨＣＰは、推定上のホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）である。
【０１０３】
一部の実施形態では、調整された回収物（例えば、本明細書に記載される最終濃度を達成するために安息香酸ナトリウムが添加され、そのｐＨが本明細書に記載されるように調整されている）は、（ｉ）Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および（ｉｉ）１つまたはそれ以上の不純物を含むかまたは含む試料である。一部の実施形態では、試料は、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスと接触される（例えば、試料は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程に供される）。一部の実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスは、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス、混在モードのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、マルチモードクロマトグラフィーマトリックス）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィーマトリックス、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックス、カチオン交換クロマトグラフィーマトリックス、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックス、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーマトリックス、および／または親水性相互作用液体クロマトグラフィーマトリックス（ＨＩＬＩＣ）などのいずれか１つもしくはそれ以上を任意の順序で含む。一部の実施形態では、試料は、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス、例えば、プロテインＡマトリックスまたはプロテインＧマトリックスと接触される。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスを少なくとも１つの洗浄溶液と接触させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィーマトリックスを溶出溶液と接触させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む溶出液を回収する工程をさらに含む。
【０１０４】
不純物除去
本開示のある種の態様は、１つまたはそれ以上の不純物からのポリペプチドの精製を改善するために、安息香酸塩および／またはベンジルアルコールを含む洗浄溶液を用いて、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）に結合したプロテインＡマトリックスを洗浄することにより、プロテインＡクロマトグラフィーを介してＦｃ領域を含むポリペプチドを精製する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）がプロテインＡに結合する条件下で、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスを、（１）Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）、および（２）１つまたはそれ以上の不純物（例えば、宿主細胞不純物）を含む試料と接触させる工程；ならびに約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度の安息香酸塩および／または約０．５％〜約４％体積／体積（ｖ／ｖ）濃度のベンジルアルコールを含む洗浄溶液を用いてマトリックスを洗浄する工程であって、洗浄溶液は、約４．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程を含む。一部の実施形態では、洗浄溶液を用いたプロテインＡマトリックスの洗浄は、マトリックスを洗浄溶液で洗浄する工程を欠く対応する方法（上記される）よりも高い程度に、１つまたはそれ以上の不純物から精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドをもたらす。
【０１０５】
標準的なプロテインＡプロセスは、典型的には、本明細書に記載される洗浄工程を使用することなく、約９５％の生成物純度をもたらす。生成物中の不純物の最大の割合は、生成物の高分子量（ＨＭＷ）凝集体および／または低分子量（ＬＭＷ）断片によるものである。これらの生成物変異体は、様々なパラメータ（例えば、電荷、疎水性、サイズの違いなど）に基づいて、生成物から分離されるそれらの能力により、不純物であると考えられる。これらのＨＭＷおよびＬＭＷ不純物は、プロテインＡプールの約４〜５％を占める。さらに、本明細書に記載される洗浄工程の使用を欠く標準的なプロテインＡプロセスではまた、典型的には、生成物プールの約１０００ｐｐｍのオーダーまたは約０．１％で宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物の包含をもたらす。しかしながら、注射可能なｍＡｂ生成物に設定された仕様（例えば、ＦＤＡガイドラインを参照されたい）のため、この０．１％のＨＣＰ不純物の減少および／または完全な除去は、非常に重要である。本明細書に記載される洗浄溶液を適用する工程の包含は、プールに存在するＨＣＰの量を約１００〜１０ｐｐｍに減らすことができ（本明細書に記載される洗浄工程を欠く同じプロテインＡプロセスと比較して、ＨＣＰが１０〜１００分の１に減少する）、９０〜９９％の相対的な改善を占める。（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイによって）試料タンパク質の純度および／または不純物レベルを測定する方法は、当業者に一般的に公知である。標準的な方法対本明細書に記載される方法のいずれかを使用して、１つまたはそれ以上の宿主細胞タンパク質からモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分離する例示的な精製を以下の表Ａに示す。
【０１０６】
【表１】
2021506925.tif 000003
【０１０７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、約５００ｐｐｍ（パーツ・パー・ミリオン）未満のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つまたはそれ以上のＨＣＰ）を含有するプロテインＡ溶出後に、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体）を含有するタンパク質プールを生成する。例えば、本明細書に記載される方法によって生成されたＦｃ領域を含むポリペプチドを含有するタンパク質プールは、約５００ｐｐｍ未満、約４５０ｐｐｍ未満、約４００ｐｐｍ未満、約３５０ｐｐｍ未満、約３００ｐｐｍ未満、約２５０ｐｐｍ未満、約２００ｐｐｍ未満、約１５０ｐｐｍ未満、約１００ｐｐｍ未満、約７５ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約２５ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、または約１ｐｐｍ未満のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つまたはそれ以上のＨＣＰ）を含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成されたＦｃ領域を含むポリペプチドを含有するタンパク質プールは、約１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つまたはそれ以上のＨＣＰ）を含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成されたＦｃ領域を含むポリペプチドを含有するタンパク質プールは、約１０ｐｐｍ未満のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つまたはそれ以上のＨＣＰ）を含有する。
【０１０８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、約０．１％未満のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つまたはそれ以上のＨＣＰ）を含有するプロテインＡ溶出後に、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体）を含有するタンパク質プールを生成する。例えば、本明細書に記載される方法によって生成されたＦｃ領域を含むポリペプチドを含有するタンパク質プールは、約０．１％未満、約０．０９％未満、約０．０８％未満、約０．０７％未満、未満約０．０６％、約０．０５％未満、約０．０４％未満、約０．０３％未満、約０．０２％未満、または約０．０１％未満のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つまたはそれ以上のＨＣＰ）を含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成されたＦｃ領域を含むポリペプチドを含有するタンパク質プールは、約０．０５％未満のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つまたはそれ以上のＨＣＰ）を含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成されたＦｃ領域を含むポリペプチドを含有するタンパク質プールは、約０．０１％未満のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つまたはそれ以上のＨＣＰ）を含有する。
【０１０９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドと共精製された１つもしくはそれ以上の不純物（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つもしくはそれ以上のＨＣＰなどの１つもしくはそれ以上のＨＣＰ）の量および／または濃度（例えば、パーツ・パー・ミリオン）を、プロテインＡマトリックスを洗浄溶液で洗浄する工程を欠く対応する方法によって精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドと共精製された１つまたはそれ以上の不純物の量と比較して少なくとも約１０％減少させる。例えば、本明細書に記載される方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドと共精製された１つもしくはそれ以上の不純物（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つもしくはそれ以上のＨＣＰなどの１つもしくはそれ以上のＨＣＰ）の量および／または濃度（例えば、パーツ・パー・ミリオン）を、プロテインＡマトリックスを洗浄溶液で洗浄する工程を欠く対応する方法によって精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドと共精製された１つまたはそれ以上の不純物の量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％減少させる。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドと共精製された１つもしくはそれ以上の不純物（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つもしくそれ以上のＨＣＰなどの１つもしくはそれ以上のＨＣＰ）の量および／または濃度（例えば、パーツ・パー・ミリオン）を、プロテインＡマトリックスを洗浄溶液で洗浄する工程を欠く対応する方法によって精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドと共精製された１つまたはそれ以上の不純物の量と比較して少なくとも１．５分の１に減少させる。例えば、本明細書に記載される方法は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドと共精製された１つもしくはそれ以上の不純物（例えば、ＣＨＯ細胞からの１つもしくはそれ以上のＨＣＰなどの１つもしくはそれ以上のＨＣＰ）の量および／または濃度（例えば、パーツ・パー・ミリオン）を、プロテインＡマトリックスを洗浄溶液で洗浄する工程を欠く対応する方法によって精製されたＦｃ領域を含むポリペプチドと共精製された１つまたはそれ以上の不純物の量と比較して、少なくとも約１．５分の１、少なくとも約２分の１、少なくとも約２．５分の１、少なくとも約３分の１、少なくとも約３．５分の１、少なくとも約４分の１、少なくとも約４．５分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約５．５分の１、少なくとも約６分の１、少なくとも約６．５分の１、少なくとも約７分の１、少なくとも約７．５分の１、少なくとも約８分の１、少なくとも約８．５分の１、少なくとも約９分の１、少なくとも約９．５分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約５０分の１、または少なくとも約１００分の１に減少させる。
【０１１０】
追加の工程
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたはそれ以上の追加の洗浄工程をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたはそれ以上の溶出工程をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたはそれ以上の洗浄工程および１つまたはそれ以上の溶出工程をさらに含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、本開示は、マトリックスを洗浄溶液で洗浄する前に、プロテインＡマトリックスを第１の溶液で洗浄することに関する。一部の実施形態では、マトリックスを洗浄溶液で洗浄する前に、マトリックスは、第１の溶液を用いて１回またはそれ以上（例えば、１回またはそれ以上、２回またはそれ以上、３回またはそれ以上、４回またはそれ以上、５回またはそれ以上など）洗浄される。一部の実施形態では、マトリックスを洗浄溶液で洗浄する前に、マトリックスは、第１の溶液を用いて１回洗浄される。一部の実施形態では、第１の溶液は、緩衝液を含む。当技術分野において公知である任意の適切な緩衝液が、第１の溶液において使用され、例えば、リン酸塩、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ビス−トリス、ビス−トリスプロパン、アルギニン、ヒスチジン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ギ酸塩、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、トリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＥＳ（２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、カコジル酸（ジメチルアルシン酸）、ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム食塩水）、および／またはそれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、第１の溶液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、および／またはクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、リン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、１つまたはそれ以上の追加の成分（例えば、安息香酸塩、ベンジルアルコール、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の添加剤など）を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、約５．０〜約１０．０（例えば、約６．０〜約１０．０、約６．０〜約９．０、約７．０〜約１０．０、約７．０〜約９．０、約８．０〜約１０．０、約８．０〜約９．０、約９．０〜約１０．０、約５．０〜約８．０、約６．０〜約８．０、約７．０〜約８．０、約５．０〜約７．０、約６．０〜約７．０、または約５．０〜約６．０）のｐＨを有する。一部の実施形態では、第１の溶液は、約７．０のｐＨを有する。
【０１１２】
一部の実施形態では、第１の溶液は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の緩衝液を含む。例えば、第１の溶液は、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約６０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約６０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度の緩衝液を含み得る。一部の実施形態では、第１の溶液は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の緩衝液を含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、第１の溶液は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、または１００ｍＭのいずれかの濃度の緩衝液を含む。あるいは、第１の溶液は、約１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、または５００ｍＭのいずれかの濃度の緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、約５００ｍＭの濃度の緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、約５０ｍＭの濃度の緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、約５００ｍＭの濃度のリン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、約５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液を含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、第１の溶液は、リン酸緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）および塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、リン酸緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）および塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、第１の溶液は、約５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）、および約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、約５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）、約０．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含み、約７．０のｐＨを有した。
【０１１５】
一部の実施形態では、本開示は、マトリックスを洗浄溶液で洗浄した後、プロテインＡマトリックスを第２の溶液で洗浄することに関する。一部の実施形態では、マトリックスを洗浄溶液で洗浄した後、マトリックスは、第２の溶液を用いて１回またはそれ以上（例えば、１回またはそれ以上、２回またはそれ以上、３回またはそれ以上、４回またはそれ以上、５回またはそれ以上など）洗浄される。一部の実施形態では、マトリックスを洗浄溶液で洗浄した後、マトリックスは、第２の溶液を用いて１回洗浄される。一部の実施形態では、第２の溶液は、緩衝液を含む。当技術分野において公知である任意の適切な緩衝液が、第２の溶液において使用され、例えば、リン酸塩、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ビス−トリス、ビス−トリスプロパン、アルギニン、ヒスチジン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ギ酸塩、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、トリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＥＳ（２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、カコジル酸（ジメチルアルシン酸）、ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム食塩水）、および／またはそれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、第２の溶液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、および／またはクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、リン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、実質的に低い塩を含むかまたは塩を含まない。一部の実施形態では、第２の溶液は、約４．０〜約８．０（例えば、約５．０〜約８．０、約６．０〜約８．０、約７．０〜約８．０、約４．０〜約７．０、約５．０〜約７．０、約６．０〜約７．０、約４．０〜約６．０、約５．０〜約６．０、または約４．０〜約５．０）のｐＨを有する。一部の実施形態では、第２の溶液は、約５．０〜約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、第２の溶液は、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、第２の溶液は、実質的に低い塩を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、塩を含まない。
【０１１６】
一部の実施形態では、第２の溶液は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の緩衝液を含む。例えば、第２の溶液は、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約６０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約６０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度の緩衝液を含み得る。一部の実施形態では、第２の溶液は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の緩衝液を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、第２の溶液は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、または１００ｍＭのいずれかの濃度の緩衝液を含む。あるいは、第２の溶液は、約１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、または５００ｍＭのいずれかの濃度の緩衝液を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、約５００ｍＭの濃度の衝液を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、約５０ｍＭの濃度の緩衝液を含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、第２の溶液は、リン酸緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、リン酸緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）を含み、約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、第２の溶液は、約５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）を含む。一部の実施形態では、第２の溶液は、約５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）を含み、約７．０のｐＨを有した。
【０１１９】
一部の実施形態では、本開示の方法は、プロテインＡマトリックスを洗浄溶液で洗浄することに関し、マトリックスを第１の溶液（洗浄溶液の前）または第２の溶液（洗浄溶液の後）で洗浄する工程を含まない。一部の実施形態では、本開示の方法は、プロテインＡマトリックスを第１の溶液で洗浄し、次いで、マトリックスを洗浄溶液で洗浄することに関し、マトリックスを第２の溶液（洗浄溶液の後）で洗浄する工程を含まない。一部の実施形態では、本開示の方法は、プロテインＡマトリックスを洗浄溶液で洗浄し、次いで、マトリックスを第２の溶液で洗浄することに関し、マトリックスを第１の溶液（洗浄溶液の前）で洗浄する工程を含まない。一部の実施形態では、本開示の方法は、プロテインＡマトリックスを第１の溶液で洗浄し、次いで、マトリックスを洗浄溶液で洗浄し、次いで、マトリックスを第２の溶液で洗浄することに関する。
【０１２０】
一部の実施形態では、プロテインＡマトリックスは、１つまたはそれ以上の洗浄工程の後、溶出溶液と１回またはそれ以上（例えば、１回またはそれ以上、２回またはそれ以上、３回またはそれ以上、４回またはそれ以上、５回またはそれ以上など）接触される。一部の実施形態では、マトリックスは、溶出溶液と１回接触される。プロテインＡマトリックスに結合したポリペプチドを溶出するのに適した、当技術分野において公知である任意の溶液が、本開示の方法における溶出溶液（例えば、約３．１のｐＨを有する４０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む溶出溶液）として使用することができる。一部の実施形態では、溶出溶液は、１つまたはそれ以上の追加の成分（例えば、本明細書に記載されるいずれかの濃度のアルギニン）をさらに含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む溶出液は、マトリックスを溶出溶液と接触させた後に回収される。一部の実施形態では、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを含む２つまたはそれ以上の溶出液は、マトリックスを溶出溶液と２回またはそれ以上接触させた後に回収される。一部の実施形態では、２つまたはそれ以上の溶出液は、溶出後に組み合わされる。一部の実施形態では、溶出液（単数または複数）は、濾過される。当技術分野において公知である溶出液を濾過する任意の適切な方法を使用することができ、例えば、深層濾過を介するものが含まれる。一部の実施形態では、溶出液（単数または複数）は、深層濾過を介して濾過される。
【０１２１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるプロテインＡマトリックスからの溶出液は、（例えば、追加のクロマトグラフィーおよび／または濾過工程を使用して（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、混在モードのクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外濾過、および／またはウイルス除去濾過のうちの１つもしくはそれ以上を使用することによって））、さらに処理および／もしくは精製され、ならびに／または製剤化（例えば、それを必要とする対象（ヒト対象など）への投与に適した医薬製剤を調製すること）される。
【０１２２】
前述の書面による説明は、当業者が本開示を実施し得るのに十分であると考えられる。以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本開示の範囲を限定することを意図していない。実際に、本明細書に示され、記載されたものに加えて、本開示の様々な修飾は、前述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内にある。
【実施例１】
【０１２３】
抗体精製中の不純物の除去を改善または促進するための洗浄溶液
以下の実施例は、プロテインＡクロマトグラフィー中の不純物の除去を改善／促進するための中間洗浄溶液における安息香酸ナトリウムおよびベンジルアルコールの様々な組合せの使用を記載する。
【０１２４】
材料および方法
試料の調製
２つの別々のヒトモノクローナル抗体回収物材料は、プロテインＡクロマトグラフィー用に以下のようにして調製した：回収物を、抗体のいずれか１つを構成的に発現するように操作された組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の懸濁培養物において生じさせた。組換え生成物を、培養培地中に分泌し、次いで遠心分離し、下流処理のために深層濾過により清澄化した。清澄化された回収物材料を、プロテインＡカラムにロードする前に０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過した。
【０１２５】
プロテインＡクロマトグラフィー
プロテインＡレジン／カラムは、以下のように調製した：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ＬＸプロテインＡクロマトグラフィーレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１７−５４７４）を、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を用いて重力沈降により交換した。カラムを、（Ａ）直径１．０ｃｍのカラム（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  １０／２５０  Ｓｎａｐカラム；カタログ番号Ｓ１０／２５０−ＰＰＳＬ−ＯＥ−ＦＰ１０）または（Ｂ）直径０．６６ｃｍのカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ（商標）６．６／１００；カタログ番号００６ＢＣＣ０６１０ＦＦ）のいずれかを使用して、ＡＫＴＡ  ＰｕｒｅまたはＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して充填した。レジンを、カラム（Ａ）の場合は２０ｃｍ±１０％のベッド高さ、またはカラム（Ｂ）の場合は５ｃｍ±１０％のビーズ高さまで充填した。カラム適格性評価は、０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化したカラムへの１．０Ｍ塩化ナトリウム溶液の１％カラム容量注入を用いて行い、導電率トレースは、Ｕｎｉｃｏｒｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して分析した。カラムの効率は、１メートルあたり少なくとも７７５理論段である必要があり、０．８〜１．８の非対称性を示す必要があった。
【０１２６】
回収物材料をロードする前に、カラムを逆浸透脱イオン水で洗い流して、２０％エタノールの貯蔵緩衝液を除去した。続いて、カラムを０．５Ｍ酢酸で洗い流して、平衡化前に結合したいかなるエンティティも確実に除去した。カラムのｐＨが＞６．５になるまで、カラムを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した。
【０１２７】
次いで、調製した試料を、プロテインＡカラムにロードした。カラムは、ｍＡｂ  Ａ（ＩｇＧ１サブタイプ）またはｍＡｂ  Ｂ（ＩｇＧ４サブタイプ）のいずれかを、目標の４０ｇ／Ｌレジンになるようにロードした。ロードしたカラムを、５０ｍＭリン酸および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液を用いて上記されるように洗浄した。次に、カラムを、試験洗浄溶液で洗浄し、続いてｐＨ７の緩衝液を用いて無塩洗浄液で洗浄した。最後に、ｐＨ３．１の４０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する溶液を使用して、抗体をカラムから溶出した。以下の表１は、例示的なクロマトグラフィープロセスを提供する。
【０１２８】
【表２】
2021506925.tif 000004
【０１２９】
宿主細胞タンパク質の検出
溶出後、抗体試料を、製造業者のプロトコールに従って第３世代のＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物の存在について試験した。ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、１：４００〜１：８００の間の希釈で行い、吸光度は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダーを使用して４５０／６００ｎｍで読み取った。
【０１３０】
特定の「ＨＣＰ−Ａ」の検出
特定のＨＣＰ（ＨＣＰ−Ａ）の濃度を、製造業者のプロトコールに従って市販のハムスター（ＣＨＯ）ＥＬＩＳＡキット（ＩＣＬ  Ｌａｂｓ）を使用して、溶出された抗体試料において定量化した。ＨＣＰ−Ａ  ＥＬＩＳＡは、１：１００と１：８００の間の希釈で行い、吸光度は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。
【０１３１】
結果
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共溶出することが示されており、これは、これらの抗体の下流への適用にとって問題となり得る。目的とするｍＡｂと共溶出する汚染ＨＣＰの量を減らすことができる潜在的な洗浄添加剤を特定するために、１．７ｍＬのプロテインＡクロマトグラフィーカラムに、ＣＨＯ細胞から回収された分泌型ＩｇＧ１ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ａ）を含有する試料をロードし、下流処理の前に、遠心分離と深層濾過による清澄化の両方を行った（表１を参照されたい）。最初にカラムをリン酸緩衝液で洗浄した。次に、カラムを、５０ｍＭリン酸および添加剤を含有する多数の試験洗浄溶液のうちの１つを用いて、個別に、または安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、およびアルギニンと組み合わせて、ｐＨ７．０で洗浄した（図１）。対照実験は、いずれの添加剤洗浄液も組み入れなかった。試験洗浄後、カラムを、無塩の５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０で洗浄した。最後に、モノクローナル抗体をカラムから溶出させ、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨを６．０に調整した。調整後、溶出液プールを０．２２μｍのＰＥＳフィルターを使用して濾過し、ＨＣＰ不純物の存在について試験した（図１）。興味深いことに、２％ベンジルアルコールおよび／または０．５Ｍ安息香酸ナトリウムを含有する洗浄液は、溶出された抗体試料中の汚染ＨＣＰのレベルを効果的に減少させた。洗浄液中へのアルギニンの包含はまたＨＣＰクリアランスを改善することが観察された。
【０１３２】
次に、プロテインＡカラムから溶出された抗体におけるＨＣＰ−Ａの特異的存在を調べた。この実験で使用した試験および対照洗浄溶液は、以下の表２に示される。
【０１３３】
【表３】
2021506925.tif 000005
【０１３４】
ＨＣＰ不純物を除去するためのベンジルアルコールおよび安息香酸ナトリウムの組合せの能力が実証されたので、ＨＣＰ−Ａの除去を標的とするために追加の製剤を試験した。公知の高ＨＣＰ−Ａ発現を有するＩｇＧ４抗体（ｍＡｂ  Ｂ）を使用して、カラムへのＨＣＰ−Ａ負荷を特異的に増加させた。表１は、精製プロセス中に行った工程の概要を提供する。簡単に述べると、ｐＨおよび導電率をロードするための平衡化後、１５．７ｍＬのプロテインＡクロマトグラフィーカラムに、下流処理の前に遠心分離および深層濾過による清澄化の両方でＣＨＯ細胞から回収された分泌型ヒトモノクローナル抗体を含有する試料をロードした。４０ｇ／Ｌ（レジンの）のロード量に達したら、リン酸緩衝液を使用してカラムを再平衡化した。次いで、表２に示された洗浄液（試験溶液１、２、および７）のうちの１つを２カラム体積（ＣＶ）として適用し、直後にｐＨ７．０の３ＣＶの無塩のリン酸緩衝液を適用した。４０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて溶出した後、溶出液プールを、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨ５．５に調整した。次いで、溶出液プールを０．２２μｍのＰＥＳフィルターまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃ０ＨＣ深層フィルターのいずれかで濾過し、ＥＬＩＳＡによってＨＣＰ−Ａ含有量について試験した（図２Ａ）。３つの洗浄条件（試験溶液１、２、および７）はすべて、対照（２９４ｐｐｍ）と比較して追加のＨＣＰ−Ａを取り除くことができた。また、結果は、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、およびアルギニンの組合せが、対照と比較してＨＣＰ−Ａのほぼ９０％を除去したため、ＨＣＰ−Ａの除去の効果が累積的であることを示唆した。さらに、深層濾過は、洗浄条件の溶出液に対してその後１５〜２５％の追加のＨＣＰ−Ａ除去をもたらした。
【０１３５】
上記と同様の手順に従って、次に、高ｐＨ洗浄液の有効性を、９．０または１０．０のｐＨでカラムを洗浄することによって試験した。ＩｇＧ４抗体（ｍＡｂ  Ｂ）は、プロテインＡカラムへのＨＣＰ−Ａの負荷を特異的に増加させるために、公知のＨＣＰ−Ａが高発現する細胞株において生成した。表１は、精製プロセス中に行った工程の概要を提供する。簡単に述べると、ｐＨおよび導電率をロードするための平衡化後、１５．７ｍＬのプロテインＡクロマトグラフィーカラムに、下流処理の前に遠心分離および深層濾過による清澄化の両方で回収されたＣＨＯ細胞から回収された分泌型ヒトモノクローナル抗体を含有する試料をロードした。６０ｇ／Ｌ（レジンの）のロード量に達したら、リン酸緩衝液を使用してカラムを再平衡化した。次いで、試験溶液８または９（表２）のいずれか１つを２ＣＶに適用し、直後にｐＨ７．０の３ＣＶの無塩のリン酸緩衝液を適用した。４０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて溶出した後、溶出プールを、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨ５．５に調整した。次いで、溶出液プールを０．２２μｍのＰＥＳフィルターで濾過した。図２Ｂに示されるように、ｐＨ１０．０の緩衝塩を有する０．５Ｍ安息香酸ナトリウムは、対照と比較してＨＣＰ−Ａの除去（９２％減少）に非常に効果的であった。さらに、ベンジルアルコールおよびアルギニンの添加は、やはり、補完的であり、ｐＨ９．０でのＨＣＰ−Ａのクリアランスを増加させた。まとめると、図２Ａ〜Ｂに示される結果は、ＨＣＰ−Ａの有意なクリアランスを可能にするその堅固な範囲のｐＨを示す。
【０１３６】
最後に、追加の添加剤をスクリーニングして、２％ベンジルアルコールおよび０．５Ｍ安息香酸ナトリウムによる洗浄をさらに促進した。同じＩｇＧ４  ｍＡｂ（ｍＡｂ  Ｂ）を１．７ｍＬスケールカラムに使用した。表１は、精製プロセス中に行った工程の概要を提供する。簡単に述べると、平衡化後、カラムに、４０ｇ／Ｌとなるようにロードした。次に、表２に示された４つの洗浄（試験溶液３〜６）のうちの１つをカラムに適用した。その後、２Ｍトリス塩基を用いて溶出試料をｐＨ５．５に調整し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを使用して濾過した。次いで、ＨＣＰ−Ａ特異的ＥＬＩＳＡを使用してＨＣＰ−Ａ含有量を測定した（図３）。試験溶液を用いた洗浄は、２％ベンジルアルコールおよび０．５Ｍ安息香酸ナトリウムの組合せ（２０１．３ｐｐｍ）と比較して、アルギニン、カプリル酸、ベンゼンスルホン酸塩、およびヘキシレングリコールの添加によるＨＣＰ−Ａ除去の累積応答を示した。２％ベンジルアルコール、０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、およびヘキシレングリコール、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、カプリル酸、またはアルギニンから選択される成分を含有する洗浄液は、ＨＣＰ−Ａの除去に非常に効果的であった。
【０１３７】
まとめると、この実施例において提供されたデータは、安息香酸ナトリウムおよび／またはベンジルアルコールを含有する中間洗浄工程が、ヒトモノクローナル抗体のプロテインＡ精製中に宿主細胞タンパク質不純物の優れたクリアランスを提供ですることができたことを示す。さらに、洗浄溶液へのベンゼンスルホン酸塩、カプリル酸、ヘキシレングリコール、および／またはアルギニンから選択される１つもしくはそれ以上の添加剤の包含は、標的モノクローナル抗体のプロテインＡ精製中の宿主細胞タンパク質不純物のクリアランスをさらに改善させた。
【実施例２】
【０１３８】
プロテインＡクロマトグラフィー後に存在する特定の宿主細胞タンパク質の同定、抗体精製中の不純物の除去を改善または促進するための洗浄溶液の開発、およびヒトモノクローナル抗体との推定上のホスホリパーゼＢ様２の相互作用の評価
以下の実施例は、プロテインＡクロマトグラフィー後の精製された抗体溶出液中の特定の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の同定を説明する。本実施例は、中間洗浄溶液中の安息香酸ナトリウムおよびベンジルアルコールを使用して、プロテインＡクロマトグラフィー中の推定上のホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）を含むＨＣＰの除去を改善／促進する方法についてさらに説明する。最後に、本実施例は、プロテインＡクロマトグラフィーの効率におけるローディング条件の影響について説明する。
【０１３９】
材料および方法
試料の調製
実施例１に記載されるように、プロテインＡクロマトグラフィー用にヒトモノクローナル抗体回収物材料を調製した。簡単に述べると、回収物を、ヒトモノクローナル抗体のいずれか１つを構成的に発現するように操作された組換えＣＨＯ細胞の懸濁培養物において生じさせた。組換え生成物を、培養培地中に分泌し、次いで、遠心分離し、下流処理のために深層濾過により清澄化した。清澄化された回収物材料を、プロテインＡカラムにロードする前に０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過した。
【０１４０】
プロテインＡクロマトグラフィー
プロテインＡレジン／カラムは、実施例１に記載されるように調製した。簡単に述べると、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ＬＸプロテインＡクロマトグラフィーレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１７−５４７４）を、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を用いて重力沈降により交換した。カラムを、（Ａ）直径１．０ｃｍのカラム（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  １０／２５０  Ｓｎａｐカラム；カタログ番号Ｓ１０／２５０−ＰＰＳＬ−ＯＥ−ＦＰ１０）または（Ｂ）直径０．６６ｃｍのカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ（商標）６．６／１００；カタログ番号００６ＢＣＣ０６１０ＦＦ）のいずれかを使用して、ＡＫＴＡ  ＰｕｒｅまたはＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して充填した。レジンを、カラム（Ａ）の場合は２０ｃｍ±１０％のベッド高さ、またはカラム（Ｂ）の場合は５ｃｍ±１０％のビーズ高さまで充填した。カラム適格性評価は、０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化したカラムに１．０Ｍ塩化ナトリウム溶液の１％カラム容量注入を用いて行い、導電率トレースは、Ｕｎｉｃｏｒｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して分析した。カラムの効率は、１メートルあたり少なくとも７７５理論段である必要があり、０．８〜１．８の非対称性を示す必要があった。
【０１４１】
回収物材料をロードする前に、カラムを逆浸透脱イオン水で洗い流して、２０％エタノールの貯蔵緩衝液を除去した。続いて、カラムを０．５Ｍ酢酸で洗い流して、平衡化前に結合したいかなるエンティティも確実に除去した。カラムのｐＨが＞６．５になるまで、カラムを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した。
【０１４２】
次いで、調製した試料を、プロテインＡカラムにロードした。一般的に、カラムは、ヒトモノクローナル抗体Ａ（ＩｇＧ１サブタイプ）またはヒトモノクローナル抗体Ｂ（ＩｇＧ４サブタイプ）のいずれかを、目標の４０ｇ／Ｌレジンになるようにロードした。ロードしたカラムを、５０ｍＭリン酸および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液を用いて上記されるように洗浄した。次に、カラムを、試験洗浄溶液で洗浄し、続いてｐＨ７の緩衝液を用いて無塩洗浄液で洗浄した。しかしながら、対照処理は、試験洗浄溶液を用いて洗浄しなかった。最後に、ｐＨ３．１の４０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する溶液を使用して、抗体をカラムから溶出した。表１は、例示的なクロマトグラフィープロセスを提供する。
【０１４３】
質量分析によるＨＣＰ検出
標準条件下でのプロテインＡカラム精製および溶出後、ヒトモノクローナル抗体溶出液を、質量分析によって分析して、各ＨＣＰの相対量を決定した。具体的には、クラステリンおよび推定上のホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）の相対量を、プロテインＡ精製されたヒトモノクローナル抗体試料において同定した。質量分析は、Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ  Ｑ−Ｔｏｆおよび２．１×１５０ｍｍ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣカラム１．７μｍ  ＣＳＨ  Ｃ１８を使用して行った。試料を、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の０．０５％Ｒａｐｉｇｅｓｔを使用して最初に変性し、次いで、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）および４０ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）を使用して還元およびアルキル化した。酵素消化を、２％ＬｙｓＣで一晩、続いて４％トリプシンで３時間行った。Ｒａｐｉｇｅｓｔを遠心分離により除去し、試料を、ギ酸を使用して酸性化した。次いで、２．５ｆｍｏｌ／μｌのＣｌｐＢ大腸菌のスパイクイン内部標準を追加して、ＨＣＰおよびＰＬＢＬ２の相対量を比較した。ロックマスキャリブレーションは、７８５．８４２６ｍ／ｚあたりで行った。ＭＳＥを使用して、イオンデータを分析し、ＨＣＰを同定した。
【０１４４】
ＥＬＩＳＡによるＨＣＰ検出
溶出後、ヒトモノクローナル抗体試料中の汎用ＨＣＰの存在を、実施例１に記載されるように評価した。簡単に述べると、抗体試料を、製造業者のプロトコールに従って、第３世代ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＣＰ不純物の存在について試験した。ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、１：４００〜１：８００の間の希釈で行い、吸光度は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダーを使用して４５０／６００ｎｍで読み取った。
【０１４５】
ＥＬＩＳＡによるＰＬＢＬ２検出
ＰＬＢＬ２の濃度を、製造業者のプロトコールに従って、市販のハムスター（ＣＨＯ）ＥＬＩＳＡキット（ＩＣＬ  Ｌａｂｓ、Ｅ−６５ＰＬＢ）を使用して、溶出された抗体試料において定量化した。ＰＬＢＬ２  ＥＬＩＳＡは、１：１００〜１：８００の間の希釈で行い、吸光度は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。
【０１４６】
結果
質量分析によるＨＣＰの検出
プロテインＡ精製後、ＨＣＰは、ヒトモノクローナル抗体と共溶出することが示されており、これは、これらの抗体の下流への適用にとって問題となり得る。プロテインＡ精製後、精製されたヒトモノクローナル抗体溶液中に存在する特定のＨＣＰを特定するために、１．７ｍＬのプロテインＡクロマトグラフィーカラムに、ＣＨＯ細胞から回収された分泌型ＩｇＧ１ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ａ）を含有する試料をロードし、下流処理の前に、遠心分離および深層濾過による清澄化の両方を行った（表１を参照されたい）。最初にカラムをリン酸緩衝液で洗浄した。次に、カラムを、無塩の５０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０で洗浄した。最後に、モノクローナル抗体を、カラムから溶出させ、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨを６．０に調整した。調整後、溶出液プールを、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを使用して濾過し、質量分析により分析して、ＨＣＰの相対量を同定した。特に、クラステリンおよびＰＬＢＬ２は、ヒトモノクローナル抗体溶出液中に存在する２つの最も豊富なＨＣＰであった。
【０１４７】
ＨＣＰ／ＰＬＢＬ２の除去を改善するための中間洗浄条件の同定
上で詳述された質量分析は、ＰＬＢＬ２を含むＨＣＰがプロテインＡ精製後にヒトモノクローナル抗体と共溶出するというさらなる証拠を提供した。次に、ＥＬＩＳＡスクリーンを開発して、ＨＣＰおよびＰＬＢＬ２の除去をさらに改善および促進するために使用され得る中間洗浄溶液を同定した（図４Ａおよび４Ｂ）。興味深いことに、４％ベンジルアルコールまたは０．５Ｍ安息香酸ナトリウムを含む中間洗浄液は、抗体溶出液試料中の汚染ＨＣＰおよびＰＬＢＬ２のレベルを効果的に減少させた。０．５Ｍアルギニンのみを含有する洗浄は、汎用ＨＣＰレベルを減少させなかったが、ＰＬＢＬ２の汚染レベルを減少させた。
【０１４８】
ＰＬＢＬ２  ＥＬＩＳＡスクリーンは、１）２％ベンジルアルコールおよび０．５Ｍアルギニン  ｐＨ５．０、２）２％ベンジルアルコールおよび０．５Ｍ安息香酸ナトリウム  ｐＨ７．０、または３）２％ベンジルアルコール、０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン  ｐＨ６．０を含む中間洗浄液と組み合わせた深層濾過は、プロテインＡ精製中にＰＬＢＬ２を効果的に除去したことをさらに示す。さらに、ｐＨレベルを上昇させた洗浄液（０．５Ｍ安息香酸ナトリウムおよび５０ｍＭ重炭酸ナトリウム  ｐＨ１０．０または２％ベンジルアルコール、０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン、および５０ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ９．０）は、プロテインＡ精製中のＰＬＢＬ２の除去に非常に効果的であった。確かに、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム  ｐＨ１０．０を含む安息香酸ナトリウム洗浄液は、対照処理と比較して、９２％を超えるＰＬＢＬ２を除去することができた。最後に、１）０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、２％ベンジルアルコール、および０．５Ｍベンゼンスルホン酸塩  ｐＨ７．０、２）０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、５０ｍＭカプリル酸、０．５Ｍアルギニン、および０．５Ｍ塩化ナトリウム  ｐＨ７．０、３）０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、２％ベンジルアルコール、および１０％ヘキシレングリコール  ｐＨ７．０、または４）０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、２％ベンジルアルコール、および０．５ＭアルギニンｐＨ  ６．０を含む洗浄液は、対照洗浄と比較して、ＰＬＢＬ２を除去する堅固な能力を示した。
【０１４９】
さらに、実験的洗浄と対照洗浄の両方の後の抗体溶出液の視覚的比較は、２％ベンジルアルコールおよび０．５Ｍ安息香酸ナトリウムで洗浄された試料が、対照で洗浄された試料と比較して清澄さが改善したことを明らかにした（図５）。
【０１５０】
上で詳述したＰＬＢＬ２  ＥＬＩＳＡは、ベンジルアルコールおよび安息香酸ナトリウムを含有する中間洗浄液が、プロテインＡ精製された抗体溶出液中のＰＬＢＬ２のレベルを効果的に減少することができることを示す。次に、この結果は、質量分析によって直交的にさらに確認された。質量分析の結果は、試験洗浄液である０．５Ｍ安息香酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン、５０ｍＭカプリル酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ９．０が、対照処理と比較して、溶出液からほぼ９３％のＰＬＢＬ２を除去したことを示す。
【０１５１】
収率およびＰＬＢＬ２除去に対するカラムローディングの影響の評価
上記の実験は、宿主細胞タンパク質ＰＬＢＬ２がプロテインＡ精製された抗体溶出液中に存在し、ベンジルアルコールおよび安息香酸ナトリウムを含有する中間洗浄溶液を使用して効果的に除去できることを示す。次に、オフカラム収率およびＰＬＢＬ２除去におけるプロテインＡカラムのローディングレベルの影響を評価した。オフカラム収率とＰＬＢＬ２除去の両方を最大化するための理想的なローディング条件を特定するために、プロテインＡカラムに４０〜６０ｇ／Ｌの範囲でロードした（図６Ａおよび６Ｂ）。結果は、４０ｇ／Ｌを超えてカラムロード量を増加させると、オフカラム収率とＰＬＢＬ２除去の両方が減少することを示す。
【０１５２】
まとめると、この実施例において提供されるデータは、ＰＬＢＬ２が、プロテインＡ精製後にヒトモノクローナル抗体と共溶出する宿主細胞タンパク質の中にあることを示す。さらに、データは、安息香酸ナトリウムおよび／またはベンジルアルコールを含有する中間洗浄工程が、ヒトモノクローナル抗体のプロテインＡ精製中に宿主細胞タンパク質不純物およびＰＬＢＬ２の優れたクリアランスを提供し得たことを示す。さらに、データは、プロテインＡレジンカラムの過剰ローディングが、オフカラム収率およびＰＬＢＬ２除去を減少させ得ることを示す。
【実施例３】
【０１５３】
抗体精製中の不純物の除去に対する、抗体を含む回収物におけるｐＨおよび安息香酸塩濃度の影響を評価する
以下の実施例は、モノクローナル抗体を含む回収物の安息香酸ナトリウム濃度およびｐＨを調整することが、抗体の精製中の不純物の除去を改善または促進するかどうかを決定するために行った実験を説明する。
【０１５４】
ヒトモノクローナル抗体回収物を、実施例１に記載されるように調製した。清澄化および深層濾過された回収物を、様々なｐＨおよび添加剤濃度に調整して、ＨＣＰおよびＰＬＢＬ２クリアランスに対する影響についてスクリーニングした。追加の洗浄工程の一部として以前にＰＬＢＬ２除去に効果的であることが示されている安息香酸ナトリウムを、所定体積の回収物について目標最終濃度に達するのに十分な量で固体として添加した。添加後、２Ｍトリス塩基を添加して目標ｐＨに達した。最初の回収物は、安息香酸ナトリウムを補充して、最終濃度の０．５Ｍ安息香酸ナトリウムを達成し、ｐＨ７．２に調整した。２番目の回収物は、安息香酸ナトリウムを補充して、最終濃度の０．５Ｍ安息香酸ナトリウムを達成し、ｐＨ９に調整した。３番目の回収物は、ｐＨ９に調整した（安息香酸ナトリウムは添加しなかった）。表３を参照されたい。
【０１５５】
【表４】
2021506925.tif 000006
【０１５６】
各々の回収物を調整し、０．２２μｍ濾過すると、３つのプロテインＡカラムを各々、調整した回収物を、目標の５０ｇ／Ｌレジンになるようにロードした。ロードしたカラムを、５０ｍＭリン酸および０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液を用いて洗浄した。次に、カラムを、逆浸透脱イオン（ＲＯＤＩ）水を用いて洗浄した。最後に、ｐＨ３．１の４０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する溶液を使用して、抗体をカラムから溶出した。以下の表４は、例示的なクロマトグラフィープロセスを提供する。
【０１５７】
【表５】
2021506925.tif 000007
次いで、３つのプロテインＡ溶出液の各々を、実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡにより宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物の存在について試験し、カスタムＥＬＩＳＡによりＰＬＢＬ２の存在について試験した。図７に示されるように、ｐＨ９．０の０．５Ｍ安息香酸ナトリウムは、ＰＬＢＬ２およびＨＣＰの不純物のレベルが最も低く、ｐＨ調整のみと比較して、ＰＬＢＬ２クリアランスの対数が大きいことを示した。ｐＨ７．２で０．５Ｍ安息香酸ナトリウムを回収物に添加した場合、ＨＣＰクリアランスのみが改善された。ＰＬＢＬ２への影響には、回収物に対するｐＨと安息香酸ナトリウムの調整の両方が必要であった。ＨＭＷは、調整の影響を受けなかった（示されていない）。プロテインＡ工程中にＲＯＤＩ洗浄のみを用いた未調整の回収物と比較して、ＨＣＰは６５％減少し、一方、ＰＬＢＬ２は約７９％減少した。
【０１５８】
次に、回収物に、安息香酸ナトリウムを補充して、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、または０．５Ｍの最終濃度を達成し、上記のようにプロテインＡ精製前にｐＨ９に調整した。表５を参照されたい。
【０１５９】
【表６】
2021506925.tif 000008
【０１６０】
次いで、各プロテインＡ溶出液を、カスタムＥＬＩＳＡを介してＰＬＢＬ２の存在について試験し、各溶出液中の抗体の収率を評価した。図８は、ＰＬＢＬ２含有量と安息香酸ナトリウム濃度との間の関係が、ほぼシグモイドであることを示す。ＰＬＢＬ２のクリアランス増加の低下は、０．４Ｍ安息香酸ナトリウムを超える濃度で観察された。安息香酸ナトリウムの濃度が増加すると、抗体の収率がわずかに減少した。０．１Ｍから０．５Ｍの安息香酸ナトリウムでは、抗体の収率は９４．８％から８９．４％に減少した。プロテインＡの精製前に０．４Ｍ安息香酸ナトリウムおよびｐＨ９．０に回収物を調整した場合、最高の収率および最高のＰＬＢＬ２クリアランスが観察された。安息香酸ナトリウムの濃度を０．４Ｍを超えて増加させると、抗体収率のわずかな減少の代償として、クリアランスの増加が減少した。０．１Ｍ安息香酸ナトリウムのすべての試料は、約２５０ｐｐｍに匹敵するＨＣＰクリアランスを有した。０．１Ｍ安息香酸ナトリウムおよびそれ未満では、ＨＣＰは約５００ｐｐｍであった。０．２Ｍ〜０．５Ｍの間の安息香酸ナトリウム濃度は、電荷変動プロファイルに影響を与えず、すべての溶出液は指定された制限内であった。
【０１６１】
まとめると、これらのデータは、溶液中の安息香酸ナトリウムの存在が、宿主細胞不純物とｍＡｂとの会合を高ｐＨで非常に不利にすることを示唆する。これらの条件は、ｍＡｂがプロテインＡレジンに結合した後の別の洗浄工程によって、またはカラムのロード段階の前もしくはその間に溶液において達成することができる。これは、プロテインＡ精製工程の操作の柔軟性が大きくなり、洗浄添加剤としての安息香酸ナトリウムの固有の特性をさらに支持した。
【０１６２】
前述の開示は、明確化および理解の目的で、例証および例としていくらか詳細に説明されているが、説明および例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】
2021506925.tif 000009
【図２Ａ】
2021506925.tif 000010
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2021506925.tif 000019