(57)【要約】  本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドに関する。さらに、多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、ＴＣＲを発現する細胞、およびＴＣＲを含む医薬組成物に関わる。本発明はまた、医薬としての使用のためのＴＣＲ、特に、がんの処置における使用のためのＴＣＲに言及する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２】
−  配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖と、
−  配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖と
を含む、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、請求項１または２に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項５】
配列番号３のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型を特異的に認識する、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合型を特異的に認識する、先行する請求項のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項８】
配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項９】
配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、および配列番号１１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１０】
配列番号１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号１３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１１】
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１２】
単離または精製された、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１３】
そのアミノ酸配列が、１つまたは複数の表現型サイレント置換を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１４】
そのアミノ酸配列が、検出可能な標識、治療剤または薬物動態学的修飾部分を含むように修飾されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１５】
前記治療剤が、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択される、請求項１４に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１６】
前記免疫エフェクター分子が、サイトカインである、請求項１５に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１７】
可溶性または膜結合性である、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１８】
前記薬物動態学的修飾部分が、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはこれらの組合せである、請求項１４に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１９】
前記ＴＣＲα鎖および前記ＴＣＲβ鎖がリンカー配列により連結された、単鎖型のものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項２０】
前記ＴＣＲα鎖または前記ＴＣＲβ鎖が、エピトープタグを含むように修飾されている、請求項１〜１９に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項２１】
配列番号６および９のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載のＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
前記機能性部分が、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体。
【請求項２４】
前記ＴＣＲのうちの少なくとも１つが治療剤と会合している、請求項２３に記載の多価ＴＣＲ複合体。
【請求項２５】
配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより、ＩＦＮ−γ分泌が誘導される、請求項１〜２０に記載の単離されたＴＣＲ、請求項２１および２２に記載のポリペプチド、請求項２３および２４に記載の多価ＴＣＲ複合体。
【請求項２６】
配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される前記ＩＦＮ−γ分泌が、３ｎｇ／ｍｌよりも多く、例えば、４ｎｇ／ｍｌよりも多く、５ｎｇ／ｍｌよりも多く、より好ましくは６ｎｇ／ｍｌよりも多く、最も好ましくは、さらに７ｎｇ／ｍｌよりも多い、請求項２５に記載の単離されたＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体。
【請求項２７】
前記ＩＦＮ−γ分泌が、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合する場合、無関係なペプチド（例えば、配列番号１５または１６）のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型への結合と比較して、少なくとも４倍高くなる、請求項２５または２６に記載の単離されたＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体。
【請求項２８】
ＩＦＮ−γ分泌が、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つ、好ましくは配列番号３をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトしたＴ２細胞を、調査するＴＣＲを発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣとともにインキュベートするｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより測定される、請求項２５〜２７に記載の単離されたＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体。
【請求項２９】
配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそのＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される、ＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−１β分泌が、所定の閾値未満である、請求項２５〜２８に記載の単離されたＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体。
【請求項３０】
配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される前記ＭＩＰ−１α分泌が、１ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．８ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．７ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項２９に記載の単離されたＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体。
【請求項３１】
配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される前記ＭＩＰ−１β分泌が、３ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２．８ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは２．５ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項２９または３０に記載の単離されたＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体。
【請求項３２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするか、または請求項２１〜２２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３４】
発現ベクターである、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
レトロウイルスベクターである、請求項３３または３４に記載のベクター。
【請求項３６】
レンチウイルスベクターである、請求項３３または３４に記載のベクター。
【請求項３７】
請求項１〜２０に記載のＴＣＲを発現する細胞。
【請求項３８】
単離されているか、または天然に存在しない、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
請求項３２に記載の核酸または請求項３３〜３６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項４０】
ａ）請求項３５に記載の少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター
ｂ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む、請求項３７〜３９に記載の細胞。
【請求項４１】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
Ｔ細胞である、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に対する特異性を媒介する、請求項１〜２０に記載のＴＣＲの部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４４】
前記ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１特異性を媒介する、前記ＴＣＲの前記部分が、配列番号６のアルファ鎖のＣＤＲ３および／または配列番号９のベータ鎖のＣＤＲ３を含む、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４５】
請求項１〜２０および２５〜３１に記載の単離されたＴＣＲ、請求項２１〜２２および２５〜３１に記載のポリペプチド、請求項２３〜２４および２５〜３１のいずれか一項に記載の多価ＴＣＲ複合体、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜３６に記載のベクター、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の細胞、または請求項４３〜４４に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項４６】
少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
医薬としての使用のための、請求項１〜２０および２５〜３１に記載の単離されたＴＣＲ、請求項２１〜２２および２５〜３１に記載のポリペプチド、請求項２３〜２４および２５〜３１のいずれか一項に記載の多価ＴＣＲ複合体、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜３６に記載のベクター、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の細胞、または請求項４３〜４４に記載の抗体。
【請求項４８】
がんの処置における使用のための、請求項１〜２０および２５〜３１に記載の単離されたＴＣＲ、請求項２１〜２２および２５〜３１に記載のポリペプチド、請求項２３〜２４および２５〜３１のいずれか一項に記載の多価ＴＣＲ複合体、請求項３２に記載の核酸、または請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４９】
前記がんが、血液学的がん、または固形腫瘍である、請求項４８に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸または細胞。
【請求項５０】
前記がんが、肉腫、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部がん、胃がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胆管癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択される、請求項４８および４９に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸または細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドに関する。さらに、多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、ＴＣＲを発現する細胞、およびＴＣＲを含む医薬組成物に関わる。本発明はまた、医薬としての使用のためのＴＣＲ、特に、がんの処置における使用のためのＴＣＲに言及する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球（またはＴ細胞）は、細胞媒介性免疫系の一部を形成し、病原体の根絶において主要な役割を果たす。Ｔ細胞は、胸腺において発生してＴ細胞受容体分子をその表面上で発現し、これにより有核細胞上に発現する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子上に提示されるペプチド（抗原提示として知られる）の認識が可能となる。病原体に由来する抗原、すなわち、ＭＨＣ分子により提示される外来抗原は、強力なＴ細胞応答を誘発するが、このようなＴ細胞の発生中の胸腺における自己抗原特異的Ｔ細胞の負の選択により、自己抗原は通常、Ｔ細胞応答を生じない。したがって、免疫系は、外来抗原または自己抗原を提示する有核細胞を識別し、Ｔ細胞の強力なサイトカイン放出および細胞毒性機構により、感染細胞を特異的に標的として根絶することができる。
【０００３】
免疫系の能力は、将来のがん治療のための有望な手段として認識されている。過去１０年間において、ｅｘ  ｖｉｖｏで増やした患者由来のリンパ球の投与を必要とする、養子細胞移入（ＡＣＴ）を使用することにより、Ｔ細胞の固有の特性を開拓するための研究が始まった。ＡＣＴは、がんの処置に対する魅力的な概念であり、これは、患者の免疫適格性を必要とせず、非突然変異で、これにより免疫原性が低く、典型的に自家Ｔ細胞応答を効果的に誘発することができない腫瘍抗原に対して、移入するリンパ球の特異性を標的とすることができるためである。ＡＣＴは、各種のがんに有望な処置となることが示されているが、困難で時間がかかるだけでなく、多くの場合、高結合活性Ｔ細胞を得ることができない可能性のあるプロセスである、各患者由来の腫瘍特異的Ｔ細胞のカスタム単離および特徴付けの必要性により、臨床治療としてのその広範な適用は、阻まれている（Xue et al. Clin. Exp. Immunol. 2005 Feb; 139(2): 167-172；Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 2009 Nov; 20(11): 1240-1248）。
【０００４】
腫瘍抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の初代Ｔ細胞への遺伝的移入により、定義された抗原特異性を有する腫瘍反応性Ｔリンパ球の迅速な生成が、免疫不全患者においても可能となるため、ＡＣＴの現在の制限のうちの一部を克服し得る。しかし、腫瘍抗原を特異的に認識し、所望の抗腫瘍効果をｉｎ  ｖｉｖｏで示すＴＣＲを有する、適するＴ細胞クローンの同定は、未だ進行中の研究の主題である。２０１２年に約１４１０万人の新たながん症例が世界的に発生し、現在、世界的に、がんがヒトの死因の約１４．６％であることを考慮すれば、新規かつ効率的な処置の選択肢が、緊急に必要とされている。これは、上に提示の必要性に応じる本発明の目的である。
【０００５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＬＡＧＥ−１は、がん／精巣抗原ファミリーに属する重要な免疫治療標的抗原である。がん／精巣抗原は、種々の悪性腫瘍および精巣の胚細胞において発現するが、他の成体組織においては発現しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲまたはその誘導体を提供することが、特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの必要性を満たすために、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供することが、本発明の目的である。特に、ＴＣＲは、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する。より特に、ＴＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する。さらにより特に、ＴＣＲは、配列番号３のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する。
【０００８】
特に、本発明のＴＣＲは、標的細胞のＭＨＣ分子、具体的にはＭＨＣ−Ｉ分子、特にＨＬＡ−Ａ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２および具体的にはアレルＨＬＡ−Ａ＊０２：０１によりコードされるＨＬＡ−Ａ２分子上に提示される場合、抗原標的ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１を認識する（Ｔ細胞またはＴＣＲは、特定のＭＨＣ分子に「限定」されると言われる）。本発明のＴＣＲが、他のＨＬＡ−Ａ＊０２アレル上に提示される抗原標的を認識することもまた、考えられ得る。
具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型を認識する。具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合型を特異的に認識する。このＴＣＲは、ＮＹ−ＥＳＯに対して高度に特異的であり、他のペプチドに対して低い交差反応性を示す。
【０００９】
本発明は、特に、配列番号６の配列を含む、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むＴＣＲα鎖を有するＴＣＲに言及する。ＴＣＲは、配列番号９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を有し得る。
【００１０】
より具体的には、本発明によるＴＣＲは、
−  配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖と、
−  配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖と
を含み得る。
【００１１】
さらにより具体的には、本発明は、配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、単離されたＴＣＲに関する。特に、ＴＣＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、および配列番号１１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含み得る。
【００１２】
単離されたＴＣＲは、配列番号１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号１３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含み得る。より具体的には、単離されたＴＣＲは、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含み得る。
【００１３】
したがって、ＴＣＲは、
−  可変ＴＣＲα領域が、配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号６に提示するアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
−  可変ＴＣＲβ領域が、配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号９に提示するアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み得る。
【００１４】
本発明によるＴＣＲは、単離および／または精製されており、可溶性または膜結合性であり得る。
【００１５】
一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列は、１つまたは複数の表現型サイレント置換を含み得る。加えて、本発明のＴＣＲは、標識することができる。有用な標識は、当技術分野において公知であり、常法を使用して、任意選択で種々の長さのリンカーを介して、ＴＣＲまたはＴＣＲ変異体と共役させることができる。用語「標識」または「標識基」は、検出可能な任意の標識を指す。加えて、またはあるいは、アミノ酸配列は、治療剤または薬物動態学的修飾部分を含むように修飾され得る。治療剤は、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択され得る。免疫エフェクター分子は、例えば、サイトカインであり得る。薬物動態学的修飾部分は、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはこれらの組合せであり得る。
本発明によるＴＣＲ、特に可溶型のＴＣＲは、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）可溶性および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護の増強により）、ならびに／または血清半減期を延長させるために、追加の機能性部分を結合させることにより修飾することができる。他の有用な機能性部分および修飾は、「自殺」または「安全スイッチ」を含み、これを使用して、患者の体内で本発明のＴＣＲを保有するエフェクター宿主細胞を遮断するか、または作動させることができる。
グリコシル化パターンを改変したＴＣＲもまた、本明細書において想定される。
薬物または治療物質、例えば、低分子化合物をＴＣＲ、特に、可溶型の本発明のＴＣＲに加えることも考えられ得る。
ＴＣＲ、特に、可溶型の本発明のＴＣＲは、それぞれの分子（タグ）の同定、追跡、精製および／または単離に役立つ追加のドメインを導入するように、さらに修飾することができる。
【００１６】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖がリンカー配列により連結された単鎖型のものである。
【００１７】
本発明の別の態様は、配列番号６および９のアミノ酸配列のうちの１つを含む、本明細書に記載のＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドに言及する。
【００１８】
具体的な実施形態では、機能性部分は、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む。
【００１９】
具体的な実施形態は、本明細書に記載の少なくとも２つのＴＣＲを含む、多価ＴＣＲ複合体に言及する。より具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのうちの少なくとも１つは、治療剤薬と会合している。
【００２０】
一部の実施形態は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合すると、ＴＣＲを発現するエフェクター細胞においてＩＦＮ−γ分泌が誘導される、前述のエフェクター細胞上、特に、免疫エフェクター細胞上に、機能性ポリペプチドまたは機能性多価ポリペプチドとして発現した本発明のＴＣＲに言及する。
【００２１】
エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合する際に誘導されるＩＦＮ−γ分泌は、３ｎｇ／ｍｌよりも多く、例えば、４ｎｇ／ｍｌよりも多く、５ｎｇ／ｍｌよりも多く、より好ましくは６ｎｇ／ｍｌよりも多く、最も好ましくは、さらに７ｎｇ／ｍｌよりも多くなり得る。ＩＦＮ−γ分泌は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合する場合、無関係なペプチド（例えば、配列番号１５または１６）のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型への結合と比較して、少なくとも４倍高くなり得る。
【００２２】
一部の実施形態は、エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β分泌が、所定の閾値未満である、本発明による単離されたＴＣＲ、ポリペプチドまたは多価ＴＣＲ複合体に言及する。
【００２３】
エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される、ＭＩＰ−１α分泌は、１ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．８ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．７ｎｇ／ｍｌ未満であり得る。
【００２４】
エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される、ＭＩＰ−１β分泌は、３ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２．８ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは２．５ｎｇ／ｍｌ未満であり得る。
それぞれＣＬＬ３およびＣＬＬ４とも呼ばれる、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βなどのケモカイン、特にＭＩＰ−１αは、腫瘍増殖を助長することが知られているため（Liao et al. Oncotarget, 7(4): 4310-4325 (2015)；Silva et al. Oncotarget 8 (11): 51024-51036 (2017)）、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの分泌レベルが低いことは有利である。
【００２５】
サイトカインおよびケモカインの放出、例えば、ＩＦＮ−γ分泌ならびにＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの分泌は、Ｔ細胞抗体を固定化した磁気ビーズを使用して、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つ、好ましくは配列番号３をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトしたＴ２細胞（Greiner et al. 2006, Blood. 2006 Dec 15;108(13):4109-17）を、調査するＴＣＲを発現するＣＤ８＋富化および／もしくは非ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣとともにインキュベートするｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５（ＳＬＬ）ペプチド（配列番号３）もしくはＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する無関係なペプチド（例えば、配列番号１５または１６）のいずれかを負荷したＴ２細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定することができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のＴＣＲをコードするか、または上記のポリペプチドをコードする核酸に言及する。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、上記の本出願の核酸を含む、プラスミドまたはベクターに言及する。好ましくは、ベクターは、発現ベクター、または細胞、特に真核細胞の形質導入もしくはトランスフェクションに適するベクターである。ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。
【００２７】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のＴＣＲを発現する細胞に言及する。細胞は、単離されているか、または天然に存在しないものであり得る。
【００２８】
本発明の別の態様は、上記の核酸、または上記のプラスミドもしくはベクターを含む細胞に言及する。より具体的には、細胞は、
ａ）上記の少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含み得る。
【００２９】
細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。典型的には、細胞は、免疫エフェクター細胞、特に、Ｔ細胞である。他の適する細胞型は、ガンマデルタＴ細胞およびＮＫ様Ｔ細胞を含む。
【００３０】
別の態様は、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に対する特異性を媒介する、本明細書に記載のＴＣＲの部分に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片に言及する。具体的な実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１／Ｌａｇｅ−１特異性を媒介する、ＴＣＲの部分は、配列番号６のアルファ鎖のＣＤＲ３および／または配列番号９のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。
【００３１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のＴＣＲ、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の多価ＴＣＲ複合体、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の細胞、または本明細書に記載の抗体を含む、医薬組成物に言及する。
【００３２】
典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。
【００３３】
本発明の別の態様は、医薬としての使用のため、特に、がんの処置における使用のための、本明細書に記載のＴＣＲ、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の多価ＴＣＲ複合体、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の細胞、または本明細書に記載の抗体に言及する。がんは、血液学的がん、または固形腫瘍であり得る。がんは、肉腫、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部がん、胃がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胆管癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択され得る。好ましくは、がんは、肉腫または骨肉腫である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＣＴＡＧ１ＢがＮＹ−ＥＳＯ−１のヒト遺伝子コピーを示す（ＣＴＡＧ１Ｂ−００１、遺伝子ＩＤ  ＥＮＳＴ００００３５９８８７）、ＣＴＡＧ１Ｂ−ｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトした腫瘍細胞株Ｋ５６２−Ａ２（安定なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１形質導入Ｋ５６２細胞株、Ｋ５６２＿Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ）、または１０−５ＭのＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５ペプチド（Ｔ２＋ＳＬＬ）を負荷したＴ２細胞のいずれかによる刺激時のＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５特異的Ｔ細胞クローンＴ１１．８−１０−１７のＩＦＮ−γ分泌を示すグラフである。水によりエレクトロポレートしたＫ５６２−Ａ２（Ｋ５６２＿Ａ２＋Ｈ２Ｏ）または１０−５ＭのＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドを負荷したＴ２細胞（ＲＬＬＥＦＹＬＡＭ：Ｔ２＋ＲＬＬおよびＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ：Ｔ２＋ＦＴＶ）を陰性対照として使用した。ＩＦＮ−γ放出［ｐｇ／ｍｌ］を、標準的ＥＬＩＳＡを使用することにより検出した。
【図２−１】ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８−Ｔ１１．８−１０−１７）を発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣによる、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陽性腫瘍細胞株Ｍｅｌ６２４．３８（図２ａ）およびＭＭ４１５（図２ｂ）の殺傷を、ベンチマークＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）と比較して（図２ａ）示すグラフである。陰性対照として、非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣをエフェクター細胞（ＣＤ８＿ＵＴ）として使用するか、またはＨＬＡ−Ａ＊０２陽性であり、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陰性の腫瘍細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ２３を標的細胞株として使用した。標的細胞のアポトーシスの誘導を示す（アネキシンＶ、赤色）、赤色蛍光標的細胞の増加（ＧＣＵ×μｍ２／画像における総積分強度）を、生細胞イメージング（ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ）により６７時間の全期間にわたって４時間毎に試験した。
【図２−２】ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８−Ｔ１１．８−１０−１７）を発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣによる、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陽性腫瘍細胞株Ｍｅｌ６２４．３８（図２ａ）およびＭＭ４１５（図２ｂ）の殺傷を、ベンチマークＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）と比較して（図２ａ）示すグラフである。陰性対照として、非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣをエフェクター細胞（ＣＤ８＿ＵＴ）として使用するか、またはＨＬＡ−Ａ＊０２陽性であり、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陰性の腫瘍細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ２３を標的細胞株として使用した。標的細胞のアポトーシスの誘導を示す（アネキシンＶ、赤色）、赤色蛍光標的細胞の増加（ＧＣＵ×μｍ２／画像における総積分強度）を、生細胞イメージング（ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ）により６７時間の全期間にわたって４時間毎に試験した。
【図３】ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１を発現したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞（Ｍｅｌ６２４．３８、ＦＭ６、ＦＭ３．２９、ＭＭ４１５、ＳＡＯＳ２、Ｕ２６６）またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５ペプチド負荷Ｔ２細胞（Ｔ２＋ＳＬＬ）のいずれかとの共培養における、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）を発現するＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣの特異的ＩＦＮ−γ放出を示すグラフである。非形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＿ｕｔ）は、任意の腫瘍細胞株またはＴ２細胞との共培養時にＩＦＮ−γ放出を示さない。ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１  ｍＲＮＡに陰性であったＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性腫瘍細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ２３、ＳＫＭ１）またはＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ（無関係なペプチド）負荷Ｔ２細胞（Ｔ２＋ＦＴＶ）のいずれかと共培養した、陰性対照として、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）または非形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＿ｕｔ）は、ＩＦＮ−γ放出を示さない。さらなる対照として、エフェクターＴ細胞なしで培養した抗原提示細胞（ＡＰＣ）について、ＩＦＮ−γ分泌を試験した。Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を、標準的ＥＬＩＳＡを使用することにより測定し、ＩＦＮ−γ放出を［ｐｇ／ｍｌ］で測定した。
【図４】ペプチド負荷（１０−５Ｍ）Ｔ２細胞による刺激時のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ベンチマーク形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＴ１１．８−１０−１７−ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかのＩＦＮ−γ分泌を示すグラフである。試験したペプチドは、ＳＬＬペプチド配列に対して少なくとも５６％相同である（不適合最大４）ペプチドについて（表１参照）、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのＥｘｐｉｔｏｐｅ（登録商標）検索解析により同定した。陰性対照として、非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用するか、またはＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を無関係なペプチド（ｉｒｒ．；ＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ）を負荷したＴ２細胞で刺激した。陽性対照として、Ｔ細胞をＳＬＬペプチド負荷Ｔ２細胞により活性化した。ＩＦＮ−γ分泌を標準的ＥＬＩＳＡにより測定した。
【図５】ペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１トランスジェニックＫ５６２細胞（Ｋ５６２−Ａ２＋ｉｒｒ、Ｋ５６２−Ａ２＋ＳＬＬ）または標的ｉｖｒＲＮＡトランスフェクトＨＬＡ−Ａ＊０２：０１トランスジェニックＫ５６２−Ａ２（Ｋ５６２−Ａ２＋ＮＹＥＳＯ、Ｋ５６２−Ａ２＋ｅＧＦＰ）のいずれかとの共培養における、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）を発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣの特異的ＩＦＮ−γ放出を示すグラフである。陽性対照として、ＳＬＬペプチド（Ｋ５６２−Ａ２＋ＳＬＬ）またはＮＹ−ＥＳＯ−１コードするｉｖｔＲＮＡ（Ｋ５６２−Ａ２＋ＮＹＥＳＯ）のいずれかを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１トランスジェニックＫ５６２細胞でＴ細胞を刺激した。陰性対照として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１トランスジェニックＫ５６２に、無関係なペプチド（Ｋ５６２−Ａ２＋ｉｒｒ．、ＦＴＶ）またはｅＧＦＰをコードするｉｖｔＲＮＡ（Ｋ５６２−Ａ２＋ｅＧＦＰ）のいずれかを負荷した。加えて、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１トランスジェニックＫ５６２細胞に、本発明のＴ１１．８−１０−１７ＴＣＲ（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）のいずれかを発現するトランスジェニックＴ細胞により交差認識されるエピトープを含む、それぞれの抗原に由来する長いペプチドと組み合わせた（これにより細胞によって内部的にプロセシングされる）ｅＧＦＰをコードするｉｖｔＲＮＡ（Ｋ５６２−Ａ２＋＃３、Ｋ５６２−Ａ２＋＃６、Ｋ５６２−Ａ２＋＃１１、Ｋ５６２−Ａ２＋＃３２、Ｋ５６２−Ａ２＋＃３４、Ｋ５６２−Ａ２＋＃５１）をトランスフェクトした。
【図６−１】ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５（Ｔ２（ＳＬＬ））ペプチドまたはＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する無関係なペプチド（Ｔ２（ＦＴＶ））のいずれかを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞による刺激時に、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）を発現する、２人の異なる健常ドナー（図６ａ：ドナー１；図６ｂ：ドナー２）のＣＤ８＋富化ＰＢＭＣの、［ｎｇ／ｍＬ］で測定した、特異的サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）およびグランザイムＢ放出を示すグラフである。両方のトランスジェニックＴＣＲは、それぞれのＴ細胞により同量のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢ分泌を生じ、エフェクター機能に関して好ましいサイトカインプロファイルを示す。陰性対照として、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＦＴＶ負荷Ｔ２細胞（Ｔ２（ＦＴＶ））で刺激するか、または非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（ＣＤ８＿ｕｔ）をペプチド導入Ｔ２細胞と共培養した。顕著なサイトカイン放出は、すべての陰性対照について測定されない。さらに、単独で培養したＴ２細胞またはＴ細胞は、いかなるバックグラウンドのサイトカイン放出も示さなかった。Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかによるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢの分泌を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  Ｋｉｔを使用してマルチプレックスアッセイにより決定し、ＭａｇＰｉｘ解析装置により解析した。
【図６−２】ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５（Ｔ２（ＳＬＬ））ペプチドまたはＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する無関係なペプチド（Ｔ２（ＦＴＶ））のいずれかを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞による刺激時に、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）を発現する、２人の異なる健常ドナー（図６ａ：ドナー１；図６ｂ：ドナー２）のＣＤ８＋富化ＰＢＭＣの、［ｎｇ／ｍＬ］で測定した、特異的サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）およびグランザイムＢ放出を示すグラフである。両方のトランスジェニックＴＣＲは、それぞれのＴ細胞により同量のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢ分泌を生じ、エフェクター機能に関して好ましいサイトカインプロファイルを示す。陰性対照として、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＦＴＶ負荷Ｔ２細胞（Ｔ２（ＦＴＶ））で刺激するか、または非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（ＣＤ８＿ｕｔ）をペプチド導入Ｔ２細胞と共培養した。顕著なサイトカイン放出は、すべての陰性対照について測定されない。さらに、単独で培養したＴ２細胞またはＴ細胞は、いかなるバックグラウンドのサイトカイン放出も示さなかった。Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかによるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢの分泌を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  Ｋｉｔを使用してマルチプレックスアッセイにより決定し、ＭａｇＰｉｘ解析装置により解析した。
【図７−１】ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５（ＳＬＬ）ペプチド（Ｔ２（ＳＬＬ））またはＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する無関係なペプチド（ＦＴＶ）（Ｔ２（ＦＴＶ））のいずれかを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞による刺激時に、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）を発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（図７ａ：ドナー１または図７ｂ：ドナー２）の特異的ケモカイン放出（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）を示すグラフである。ベンチマークＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＳＬＬペプチド負荷Ｔ２細胞による刺激時にＴＣＲ  Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＴ細胞と比較して、高量のＭＩＰ−１αおよび著しく高量のＭＩＰ−１βを分泌した。  陰性対照として、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＦＴＶ負荷Ｔ２細胞で刺激するか、または非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（ＣＤ８＿ｕｔ）をペプチド負荷Ｔ２細胞と共培養した。ごくわずかなケモカイン放出は、すべての陰性対照について測定される。さらに、単独で培養したＴ２細胞またはＴ細胞は、いかなるケモカイン放出も示さない。Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかによるＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの分泌を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  Ｋｉｔを使用してマルチプレックスアッセイにより決定し、ＭａｇＰｉｘ解析装置により解析した。
【図７−２】ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５（ＳＬＬ）ペプチド（Ｔ２（ＳＬＬ））またはＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する無関係なペプチド（ＦＴＶ）（Ｔ２（ＦＴＶ））のいずれかを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞による刺激時に、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）を発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（図７ａ：ドナー１または図７ｂ：ドナー２）の特異的ケモカイン放出（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）を示すグラフである。ベンチマークＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＳＬＬペプチド負荷Ｔ２細胞による刺激時にＴＣＲ  Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＴ細胞と比較して、高量のＭＩＰ−１αおよび著しく高量のＭＩＰ−１βを分泌した。  陰性対照として、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＦＴＶ負荷Ｔ２細胞で刺激するか、または非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（ＣＤ８＿ｕｔ）をペプチド負荷Ｔ２細胞と共培養した。ごくわずかなケモカイン放出は、すべての陰性対照について測定される。さらに、単独で培養したＴ２細胞またはＴ細胞は、いかなるケモカイン放出も示さない。Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかによるＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの分泌を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  Ｋｉｔを使用してマルチプレックスアッセイにより決定し、ＭａｇＰｉｘ解析装置により解析した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明を、その好ましい実施形態のうちの一部に関して詳細に記載する前に、以下の一般的定義を提供する。
【００３６】
本発明は、以下において例示的に記載するように、本明細書で具体的に開示されない、任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で、適切に実施することができる。
【００３７】
本発明は、特定の実施形態に関し、ある特定の図を参照して説明するが、本発明は、それらには制限されず、特許請求の範囲のみに制限される。
【００３８】
本明細書および特許請求の範囲において用語「含む」を使用する場合、これは、他の要素を除外しない。本発明の目的において、用語「からなる」は、用語「で構成される」の好ましい実施形態であるとみなされる。群が少なくともある特定の数の実施形態を含むように以下に定義される場合、これはまた、好ましくは、これらの実施形態のみからなる群を開示すると理解される。
【００３９】
本発明の目的において、用語「入手する」は、用語「入手可能な」の好ましい実施形態であるとみなされる。例えば、抗体が特定の供給源から入手可能であると以下に定義される場合、これはまた、この供給源から入手する抗体を開示すると理解される。
【００４０】
名詞の単数形に言及する際に不定冠詞または定冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を使用する場合、他に特に明記されていない限り、これは、その名詞の複数形を含む。用語「約」または「およそ」は、本発明の文脈において、当業者が、問題となっている特色の技術的効果を依然として保証するために理解する精度の間隔を表す。用語は、典型的に、示された数値からの±１０％、好ましくは±５％の偏差を示す。
【００４１】
技術的用語は、当業者の常識または意味によって使用される。ある特定の用語に特定の意味を持たせる場合、用語の定義は、用語が使用される文脈において以下のように与えられる。
【００４２】
ＴＣＲの背景
ＴＣＲは、２つの異なる別々のタンパク質鎖、すなわちＴＣＲアルファ（α）およびＴＣＲベータ（β）鎖から構成される。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲβ鎖は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖の両方の再配列したＶ（Ｄ）Ｊ領域は、ＣＤＲ３領域により特異的エピトープの認識が決定する、高頻度可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有する。Ｃ末端領域において、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖はともに、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質尾部で終わる。
【００４３】
典型的には、ＴＣＲは、１つのα鎖および１つのβ鎖のヘテロ二量体である。このヘテロ二量体は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合することができる。
【００４４】
用語「可変ＴＣＲα領域」または「ＴＣＲα可変鎖」または「可変ドメイン」は、本発明の文脈において、ＴＣＲα鎖の可変領域を指す。用語「可変ＴＣＲβ領域」または「ＴＣＲβ可変鎖」は、本発明の文脈において、ＴＣＲβ鎖の可変領域を指す。
ＴＣＲ座位および遺伝子は、国際免疫遺伝学（International Immunogenetics、ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法を使用して呼ばれる（IMGT Database, www. IMGT.org；Giudicelli, V., et al.,IMGT/LIGM-DB, the IMGT(R) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979；T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12- 441352-8）。
【００４５】
標的
本発明の第１の態様は、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１は、いわゆるがん／精巣抗原の群に属する。がん／精巣抗原は、種々の悪性腫瘍および胚細胞において発現するが、他の成体組織においては発現しない。したがって、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１は、興味深い免疫治療標的抗原である。ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするヒト遺伝子は、ＣＴＡＧ１Ａ（ＥＮＳＧＴ０００００２６８６５１）と名付けられ、ＣＴＡＧ１Ａ−００２およびＣＴＡＧ１Ａ−２０１と呼ばれる２つのアイソフォーム（ＥＮＳＴ０００００５９９８３７およびＥＮＳＴ０００００５９３６０６）を有し、ＣＴＡＧ１Ｂ−００１およびＣＴＡＧ１Ｂ−００２と呼ばれる２つのアイソフォーム（ＥＮＳＴ０００００３５９８８７およびＥＮＳＴ０００００３２８４３５）を有するＣＴＡＧ１Ｂと名付けられたコピー（ＥＮＳＧ００００１８４０３３）を有する。ＬＡＧＥ−１をコードするヒト遺伝子は、ＣＴＡＧ２．１（ＥＮＳＧ００００１２６８９０）と名付けられ、ＣＡＴＧ２．１と名付けられたアイソフォームおよびＣＡＴＧ２．２と名付けられたアイソフォーム（ＥＮＳＴ００００２４７３０６およびＥＮＳＴ００００３６９５８５）を有する。
【００４６】
特に、ＴＣＲは、アミノ酸配列、配列番号１（ＬＬＭＷＩ）またはその断片を特異的に認識する。より特に、ＴＣＲは、アミノ酸配列、配列番号２（ＳＬＬＭＷＩ）またはその断片を特異的に認識する。さらにより特に、ＴＣＲは、アミノ酸配列、配列番号３（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）またはその断片を特異的に認識する。配列番号１〜３は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ならびにＬＡＧＥ−１の一部である。
【００４７】
典型的には、ＴＣＲは、それが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子により提示される場合、抗原のペプチド断片を認識する。
【００４８】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系または複合体は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質をヒトにおいてコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ−Ａ＊０２は、ＨＬＡ−Ａ座位にある、ある特定の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩアレル群である。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１は、特定のＨＬＡ−Ａ＊０２アレルである。
【００４９】
したがって、具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型を特異的に認識する。
【００５０】
さらにより具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合型を特異的に認識する。
【００５１】
ＴＣＲは、ＮＹ−ＥＳＯに対して高度に特異的であり、特に、内部的にプロセシングされる場合、他のペプチド、例えば、配列番号１７〜２２に提示するペプチドに対して低い交差反応性を示す。一実施形態では、ＴＣＲは、特に、内部的にプロセシングされる場合、配列番号１７のペプチドに対して交差反応性を実質的に示さない。一部の実施形態では、ＴＣＲは、特に、内部的にプロセシングされる場合、配列番号１７〜２２に提示するペプチドのうちの少なくとも１つに対して交差反応性を実質的に示さない。交差反応性は、本明細書に記載のようにＩＦＮγ分泌により測定することができる。
【００５２】
ＴＣＲ特異的配列
一部の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲであって、
−  ＴＣＲα鎖が、配列番号６の配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
−  ＴＣＲβ鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
単離されたＴＣＲに関する。
【００５３】
具体的な実施形態は、
−  配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖と、
−  配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖と
を含む単離されたＴＣＲに言及する。
【００５４】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、および配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。
【００５５】
好ましい実施形態は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、および配列番号１１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含むＴＣＲに関する。
【００５６】
実施例において使用するＴ細胞クローンのＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７は、配列番号６の配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むＴＣＲα鎖、および配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含む。特に、本発明のＴＣＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、および配列番号１１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。
【００５７】
実施例からわかるように、本発明によるＴＣＲは、ＮＹＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に対して特異的であり、他のエピトープまたは抗原に対して非常に低い交差反応性しか示さない。
【００５８】
他の実施形態は、配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲに関する。
【００５９】
具体的な実施形態は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲに言及する。したがって、本明細書に記載のＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の、配列番号１、配列番号２または配列番号３のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１ペプチドとの複合体に特異的であり、ＴＲＡＶ１２−２遺伝子によりコードされるＶα鎖、およびＴＲＢＶ１２−４遺伝子によりコードされるＶβ遺伝子を含む。
【００６０】
他の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲであって、
−  可変ＴＣＲα領域が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号６に提示するアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
−  可変ＴＣＲβ領域が、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号９に提示するアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
単離されたＴＣＲに言及する。
【００６１】
複数の配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ（商標）１０プログラムのＡｌｉｇｎＸアプリケーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して達成される。このプログラムでは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを修正して使用する（Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680；Invitrogen Corporation; Vector NTI AdvanceTM 10 DNA and protein sequence analysis software. User's Manual, 2004, pp.389-662）。パーセント同一性の決定は、ＡｌｉｇｎＸアプリケーションの標準パラメータにより実施する。
【００６２】
本発明によるＴＣＲは、単離または精製されている。「単離された」は、本発明の文脈において、ＴＣＲが、元来天然に生じる状況において存在しないことを意味する。「精製された」は、本発明の文脈において、例えば、ＴＣＲが、他のタンパク質、およびそれが元来由来する細胞の非タンパク質部分を含まない、または実質的に含まないことを意味する。
【００６３】
一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列は、１つまたは複数の表現型サイレント置換を含み得る。
【００６４】
「表現型サイレント置換」は、「保存的アミノ酸置換」とも呼ばれる。「保存的アミノ酸置換」の概念は、当業者により理解され、好ましくは、正荷電残基をコードするコドン（Ｈ、ＫおよびＲ）を、正荷電残基をコードするコドンと置換し、負荷電残基をコードするコドン（ＤおよびＥ）を、負荷電残基をコードするコドンと置換し、中性極性残基をコードするコドン（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹ）を、中性極性残基をコードするコドンと置換し、中性非極性残基をコードするコドン（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＶおよびＷ）を、中性非極性残基をコードするコドンと置換することを意味する。これらの変異は、自然発生し、ランダム突然変異誘発により導入され得るか、または定方向突然変異誘発により導入され得る。それらの変異は、これらのポリペプチドの本質的特徴を破壊することなく行うことができる。当業者は、変異アミノ酸および／またはこれをコードする核酸を容易かつ日常的にスクリーニングして、これらの変異が、リガンド結合能を実質的に低下させる、または破壊するかどうかを、当技術分野において公知の方法により決定することができる。
【００６５】
当業者は、また、ＴＣＲをコードする核酸を修飾することができることを理解する。全核酸配列における有用な修飾は、配列のコドン最適化を含む。発現したアミノ酸配列内で保存的置換を生じる改変を行うことができる。これらの変異は、機能に影響しないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定および非相補性決定領域において行うことができる。通常、付加および欠失は、ＣＤＲ３領域において実施するべきではない。
【００６６】
本発明の一部の実施形態によれば、ＴＣＲのアミノ酸配列は、検出可能な標識、治療剤または薬物動態学的修飾部分を含むように修飾される。
【００６７】
検出可能な標識の非限定的な例は、放射標識、蛍光標識、核酸プローブ、酵素および造影試薬である。ＴＣＲと会合し得る治療剤は、放射性化合物、免疫調節薬、酵素または化学療法剤を含む。治療剤は、ＴＣＲに連結するリポソームに封入して、標的部位において化合物をゆっくりと放出することができる。これにより、体内での輸送中の損傷が回避され、ＴＣＲの適切な抗原提示細胞への結合後に治療剤、例えば、毒素が最大の効果を有することが確実となる。治療剤の他の例は、ペプチド細胞毒、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質またはペプチド、例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス（pseudomonas）細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅである。低分子細胞毒性剤、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する化合物は、７００ダルトン未満の分子量を有する。このような化合物は、細胞毒性効果を有することが可能な毒性金属を含有し得る。さらに、これらの低分子細胞毒性剤がまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊するまたは転換されて細胞毒性剤を放出する化合物を含むことを理解されたい。このような薬剤は、例えば、ドセタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、メイタンシン誘導体、レイチェルマイシン（rachelmycin）、カリチアマイシン、エトポシド、イホスファミド、イリノテカン、ポルフィマーナトリウムであるフォトフリンＩＩ、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキセート、ミトキサントロン、アウリスタチンＥ、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５ならびにアスタチン２１３を含み得る。放射性核種のＴＣＲまたはその誘導体との会合は、例えば、キレート剤；免疫賦活薬としても知られる免疫刺激物質、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子により実行することができる。例示的な免疫刺激物質は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ、抗Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞決定抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ１６）を含む抗体またはその断片；抗体様結合特徴を有する代替タンパク質足場；スーパー抗原、すなわち、Ｔ細胞の非特異的活性化を引き起こし、ポリクローナルＴ細胞活性化およびサイトカインの大量放出を生じる抗原、ならびにその突然変異体；ケモカイン、例えば、ＩＬ−８、血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質などの補体活性化因子；異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌ペプチドである。
【００６８】
ヒトＴリンパ球上の抗原受容体分子（Ｔ細胞受容体分子）は、細胞表面上のＣＤ３（Ｔ３）分子複合体と非共有結合的に会合する。抗ＣＤ３モノクローナル抗体を有する、この複合体の摂動により、Ｔ細胞活性化が誘導される。したがって、一部の実施形態は、抗ＣＤ３抗体、または前記抗ＣＤ３抗体の機能性断片もしくは変異体と会合している（通常、アルファまたはベータ鎖のＮ末端またはＣ末端との融合により）本明細書に記載のＴＣＲに言及する。本明細書に記載の組成物および方法における使用に適しする抗体断片および変異体／類似体には、ミニボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ＜’＞）２断片、ｄｓＦｖおよびｓｃＦｖ断片、ナノボディ（商標）（NanobodiesTM）（Ａｂｌｙｎｘ（ベルギー）、ラクダ科の動物（例えば、ラクダまたはラマ）の抗体に由来する合成の単一の免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む分子）およびドメイン抗体（親和性が成熟した単一の免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン可変軽鎖ドメイン（Ｄｏｍａｎｔｉｓ（ベルギー））を含む）または抗体様結合特徴示す代替タンパク質足場、例えば、アフィボディ（Affibody）（改変タンパク質Ａ足場アフィボディ（スウェーデン）を含む）もしくはアンチカリン（Anticalin）（改変アンチカリンＰｉｅｒｉｓ（ドイツ））を含む）が含まれる。
【００６９】
治療剤は、好ましくは、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択され得る。好ましくは、免疫エフェクター分子は、サイトカインである。
【００７０】
薬物動態学的修飾部分は、例えば、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはこれらの組合せであり得る。少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基の会合は、当業者に公知のいくつかの方法により引き起こすことができる。好ましい実施形態では、単位は、ＴＣＲに共有結合的に連結する。本発明によるＴＣＲは、１つまたはいくつかの薬物動態学的修飾部分により修飾することができる。特に、可溶型のＴＣＲは、１つまたはいくつかの薬物動態学的修飾部分により修飾する。薬物動態学的修飾部分により、治療薬の薬物動態プロファイル、例えば、血漿半減期の向上、免疫原性の低下または増強、および可溶性の向上に有益な変化を達成することができる。
【００７１】
本発明によるＴＣＲは、可溶性または膜結合性であり得る。用語「可溶性」は、例えば、治療剤を抗原提示細胞に送達するための標的化剤としての使用のための、可溶型の（すなわち、膜貫通または細胞質ドメインを有しない）ＴＣＲを指す。安定性のためには、可溶性αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、国際公開第０３／０２０７６３号パンフレットに記載のように、好ましくは、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有する。本発明のαβヘテロ二量体に存在する定常ドメインの一方または両方では、Ｃ末端（単数または複数）で、例えば、最大１５、または最大１０または最大８またはそれよりも少ないアミノ酸が切断され得る。養子療法における使用では、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの両方を有する完全長鎖としてトランスフェクトされ得る。ＴＣＲは、アルファおよびベータ定常ドメインそれぞれの間で天然に見出されるジスルフィド結合に対応するジスルフィド結合を含有することがあり、加えて、またはあるいは、非天然ジスルフィド結合が存在することがある。
【００７２】
したがって、本発明によるＴＣＲ、特に可溶型のＴＣＲは、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）可溶性および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護の増強により）、ならびに／または血清半減期を延長させるために、追加の機能性部分を結合させることにより修飾することができる。
【００７３】
他の有用な機能性部分および修飾は、「自殺」または「安全スイッチ」を含み、これを使用して、患者の体内で本発明のＴＣＲを保有するエフェクター宿主細胞を遮断することができる。例としては、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）「安全スイッチ」があり、Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235により記載されている。簡潔には、エフェクター宿主細胞は、周知の方法により修飾して、二量体化が、低分子二量体化薬、例えば、ＡＰ１９０３／ＣＩＰに依存するカスパーゼ９ドメインを発現させると、修飾エフェクター細胞におけるアポトーシスの急速な誘導を生じる。このシステムは、例えば、欧州特許出願公開第２１７３８６９号明細書に記載されている。他の「自殺」「安全スイッチ」の例は、当技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、ＣＤ２０の発現および後続の抗ＣＤ２０抗体またはｍｙｃタグを使用した枯渇がある（Kieback et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15;105(2):623-8）。
グリコシル化パターンを改変したＴＣＲもまた、本明細書において想定される。当技術分野において公知のように、グリコシル化パターンは、アミノ酸配列（例えば、以下に考察する、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）および／またはタンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ連結型またはＯ連結型のいずれかである。Ｎ連結型は、糖鎖の、アスパラギン残基の側鎖への結合を指す。Ｎ連結型グリコシル化部位の結合分子への付加は、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）から選択される１つまたは複数のトリペプチド配列を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより、好都合に達成される。Ｏ連結型グリコシル化部位は、１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の開始配列への付加または置換により導入することができる。
【００７４】
ＴＣＲのグリコシル化の別の手段は、グリコシドのタンパク質との化学的または酵素的共役によるものである。使用する共役様式に応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）遊離のスルフヒドリル基、例えば、システインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離のヒドロキシル基、例えば、セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。同様に、脱グリコシル化（すなわち、結合分子上に存在する糖鎖の除去）は、例えば、ＴＣＲをトリフルオロメタンスルホン酸に曝露することにより化学的に、またはエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いることにより酵素的に達成することができる。
【００７５】
低分子化合物のような薬物を本発明のＴＣＲ、特に可溶型のＴＣＲに加えることもまた考えられ得る。共有結合的結合、または非共有結合的相互作用により、例えば、静電力により連結を達成することができる。当技術分野において公知の種々のリンカーを用いて、薬物コンジュゲートを形成することができる。
本発明のＴＣＲ、特に可溶型のＴＣＲは、加えて、それぞれの分子（タグ）の同定、追跡、精製および／または単離に役立つ追加のドメインを導入するように修飾することができる。したがって、一部の実施形態では、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖は、エピトープタグを含むように修飾され得る。
【００７６】
エピトープタグは、本発明のＴＣＲに組み込むことができるタグの有用な例である。エピトープタグは、短い一続きのアミノ酸であり、特異的抗体の結合を可能とし、これにより可溶性ＴＣＲまたは患者の体内の宿主細胞もしくは培養（宿主）細胞の結合および移動の同定および追跡を可能とする。エピトープタグ、およびこれによるタグ化したＴＣＲの検出は、いくつかの異なる技術を使用して達成することができる。
本発明のＴＣＲを保有する宿主細胞を刺激し、増やすために、タグに特異的な結合分子（抗体）の存在下で細胞を培養することにより、前記タグをさらに用いることができる。
【００７７】
一般に、ＴＣＲは、一部の例において、ＴＣＲの標的抗原との親和性および解離率を修飾する種々の突然変異により修飾することができる。特に、突然変異により、親和性が高まり、および／または解離率が低下し得る。したがって、ＴＣＲは、少なくとも１つのＣＤＲおよびその可変ドメインフレームワーク領域において突然変異され得る。
【００７８】
しかし、好ましい実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲ領域は、実施例におけるＴＣＲ受容体の場合のように、修飾されないか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性成熟させられる。これは、ＣＤＲ領域が、天然発生の配列を有することを意味する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの親和性成熟により、ＴＣＲ分子に対する免疫原性が生じ得るため、これは、有利となり得る。これにより、治療効果および処置を低下または不活化させる抗薬物抗体の産生が生じ、および／または有害効果を誘導し得る。
【００７９】
突然変異は、１つまたは複数の置換（複数可）、欠失（複数可）または挿入（複数可）であり得る。これらの突然変異は、当技術分野において公知の任意の適する方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素をベースとするクローニング、ライゲーション非依存的クローニング手法により導入することができ、これらは、例えば、Sambrook, Molecular Cloning - 4th Edition (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００８０】
理論上は、交差反応性のリスクを有する予測不可能なＴＣＲ特異性は、内因性および外因性ＴＣＲ鎖の間の誤対合のために発生する可能性がある。ＴＣＲ配列の誤対合を回避するために、最小マウス化ＣαおよびＣβ領域を含有するように組換えＴＣＲ配列を修飾することができ、これは、いくつかの異なる形質導入ＴＣＲ鎖の正しい対合を効率的に増強することが示されている技術である。ＴＣＲのマウス化（すなわち、アルファおよびベータ鎖のヒト定常領域のそれらのマウス対応物との交換）は、宿主細胞におけるＴＣＲの細胞表面発現を向上させるために一般的に適用される技術である。特定の論理に拘束されることは望まないが、マウス化ＴＣＲは、ＣＤ３共受容体とより効果的に会合すること、および／または優先的に相互に対合し、ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変したヒトＴ細胞上に混合ＴＣＲを形成して、所望の抗原特異性を有するＴＣＲを発現する傾向は低いが、その「オリジナル」ＴＣＲを依然として保持および発現することが考えられる。
【００８１】
マウス化ＴＣＲの発現の向上の原因となる９つのアミノ酸は、同定されており（Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184(11):6223-31）、ＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖定常領域内のアミノ酸残基のうちの１つまたはすべてをそれらのマウス対応残基と置換することが想定される。この技術はまた、「最小マウス化」と呼ばれ、細胞表面発現を増強するが、同時に、アミノ酸配列中の「外来」アミノ酸残基の数を減少させ、これにより免疫原性のリスクを低減する利点を提供する。
【００８２】
一部の実施形態は、ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖がリンカー配列により連結された単鎖型のものである、本明細書に記載の単離されたＴＣＲに言及する。
【００８３】
適する単鎖ＴＣＲ型は、可変ＴＣＲα領域に対応するアミノ酸配列で構成される第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端と融合する可変ＴＣＲβ領域に対応するアミノ酸配列で構成される第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含む。あるいは、第１のセグメントは、ＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列で構成される場合があり、第２のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端と融合するＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列で構成される場合がある。上記の単鎖ＴＣＲは、第１および第２の鎖の間のジスルフィド結合をさらに含むことがあり、この場合、リンカー配列の長さおよびジスルフィド結合の位置は、第１および第２のセグメントの可変ドメイン配列を、天然Ｔ細胞受容体の場合ように、実質的に相互に配向させるようにする。より具体的には、第１のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端と融合するＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列で構成される場合があり、第２のセグメントは、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端と融合するＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列で構成される場合があり、ジスルフィド結合は、第１および第２の鎖の間にもたらされる場合がある。リンカー配列は、ＴＣＲの機能を障害しない任意の配列であり得る。
【００８４】
本発明の文脈において、「機能性」ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、例えば、アミノ酸の付加、欠失または置換により修飾した、ＴＣＲまたはＴＣＲ変異体を意味することとし、これは、少なくとも実質的な生物学的活性を維持する。ＴＣＲのαおよび／またはβ鎖の場合では、このことは、両方の鎖が、その生物学的機能、特に、前記ＴＣＲの特異的ペプチドＭＨＣ複合体への結合、および／または特定のペプチドに対する機能性シグナル伝達、すなわちＭＨＣ相互作用を行使する、Ｔ細胞受容体を（非修飾αおよび／もしくはβ鎖により、または別の発明の融合タンパク質αおよび／もしくはβ鎖のいずれかにより）形成可能なままであることを意味することとする。
【００８５】
具体的な実施形態では、ＴＣＲを修飾して、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質とすることができ、この場合、前記エピトープタグは、６〜１５アミノ酸、好ましくは９〜１１アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ＴＣＲを修飾して、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質とすることができ、この場合、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、間隔をあけるかまたは直接縦列した、２つ以上のエピトープタグを含む。融合タンパク質の実施形態は、融合タンパク質が、その生物学的活性（単数または複数）（「機能性」）を維持する限り、２、３、４、５またはそれよりもさらに多いエピトープタグを含有することができる。
【００８６】
前記エピトープタグが、これらに限定されないが、ＣＤ２０もしくはＨｅｒ２／ｎｅｕタグ、または他の従来のタグ、例えば、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｔ７タグ、ＨＡ（赤血球凝集素）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、ＧＳＴタグ、もしくはＧＦＰタグから選択される、本発明による機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質であることが好ましい。ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰタグは、既存の分子に由来するエピトープである。対照的にＦＬＡＧは、高抗原性のためにデザインされた合成エピトープタグである（例えば、米国特許第４，７０３，００４号明細書および第４，８５１，３４１号明細書を参照）。ｍｙｃタグは、その検出に高品質試薬が利用可能であるため、好ましくは、使用され得る。エピトープタグは、言うまでもなく、抗体による認識超える１つまたは複数のさらなる機能を有し得る。これらのタグの配列は、文献に記載されており、当業者に周知である。
【００８７】
ＴＣＲ変異体
本発明の別の態様は、配列番号６および９のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、本明細書に記載のＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドに言及する。
【００８８】
機能性部分は、ＴＣＲの抗原への、特に、抗原ＭＨＣ複合体への結合を媒介し得る。
一実施形態では、機能性部分は、本明細書に記載のＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む。
【００８９】
ＴＣＲ変異分子は、ＴＣＲ受容体の結合特性を有し得るが、エフェクター細胞（Ｔ細胞以外）のシグナル伝達ドメインと、特に、ＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインと組み合わせることができる。したがって、一部の実施形態は、本明細書に記載のＴＣＲの機能性部分を、エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインと組み合わせて含む、タンパク質に言及する。
【００９０】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体に言及する。本態様の一実施形態では、少なくとも２つのＴＣＲ分子は、リンカー部分を介して連結されて、多価複合体を形成する。好ましくは、複合体は、水溶性であり、このためリンカー部分は、それに応じて選択すべきである。リンカー部分が、ＴＣＲ分子上の定義された位置に結合可能であり、これにより、形成される複合体の構造多様性が、最小化されることが好ましい。本態様の一実施形態は、ポリマー鎖またはペプチドリンカー配列が、ＴＣＲの可変領域配列に位置しない、各ＴＣＲのアミノ酸残基間で延長する、本発明のＴＣＲ複合体により提供される。本発明の複合体が医療における使用のためのものであり得るため、リンカー部分は、その薬学的安定性、例えば、その免疫原性を正当に考慮して選択されるべきである。上記の望ましい基準を満たすリンカー部分の例は、当技術分野、例えば、抗体断片を連結する技術分野において公知である。
【００９１】
リンカーの例は、親水性ポリマーおよびペプチドリンカーである。親水性ポリマーの例は、ポリアルキレングリコールである。このクラスのうちで最も一般的に使用されるものは、ポリエチレングリコール、すなわちＰＥＧをベースとする。しかし、他は、他の適する、任意選択で置換した、ポリアルキレングリコールをベースとし、これには、ポリプロピレングリコール、およびエチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマーが含まれる。ペプチドリンカーは、アミノ酸の鎖で構成され、ＴＣＲ分子が結合され得る、単純なリンカーまたは多量体化ドメインを産生するように機能する。
【００９２】
一実施形態は、前記ＴＣＲのうちの少なくとも１つが治療剤と会合している、多価ＴＣＲ複合体に言及する。
【００９３】
サイトカインおよびケモカインの放出
一部の実施形態は、エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより、ＩＦＮ−γ分泌が誘導される、本明細書に記載の単離されたＴＣＲ、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の多価ＴＣＲ複合体に言及する。
【００９４】
エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される、ＩＦＮ−γ分泌は、３ｎｇ／ｍｌよりも多く、例えば、４ｎｇ／ｍｌよりも多く、５ｎｇ／ｍｌよりも多く、より好ましくは６ｎｇ／ｍｌよりも多く、最も好ましくは、さらに７ｎｇ／ｍｌよりも多くなり得る。ＩＦＮ−γ分泌は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合する場合、無関係なペプチド（例えば、配列番号１５または１６）のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型への結合と比較して、少なくとも４倍高くなり得る。
【００９５】
サイトカインおよびケモカインの放出、例えば、ＩＦＮ−γ分泌ならびにＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの分泌は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つ、好ましくは配列番号３をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトしたＴ２細胞を、調査するＴＣＲを発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣとともにインキュベートするｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５（ＳＬＬ）ペプチドもしくはＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する無関係なペプチドのいずれかを負荷したＴ２細胞を使用することにより測定することができる。
【００９６】
一部の実施形態は、エフェクター細胞上に発現した本発明のＴＣＲが、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそのＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β分泌が、所定の閾値未満である、本明細書に記載の単離されたＴＣＲ、本明細書に記載のポリペプチドまたは本明細書に記載の多価ＴＣＲ複合体に言及する。閾値は、少なくとも１：１の特定のエフェクターと標的との比を使用することにより決定され得る。
【００９７】
エフェクター細胞上に発現した発明のＴＣＲが、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＩＰ−１α分泌は、少なくとも１：１のトランスジェニックＴＣＲ＋エフェクター細胞と標的細胞との比で、各１０，０００細胞を使用して、１ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．８ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．７ｎｇ／ｍｌ未満であり得る。配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合することにより誘導される、ＭＩＰ−１β分泌は、少なくとも１：１のトランスジェニックＴＣＲ＋エフェクターと標的との比で、各１０，０００細胞を使用して、３ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２．８ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは２．５ｎｇ／ｍｌ未満であり得る。
【００９８】
「エフェクター細胞」は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。典型的には、エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞、特に、Ｔ細胞である。他の適する細胞型は、ガンマデルタＴ細胞およびＮＫ様Ｔ細胞を含む。
【００９９】
ＭＩＰ−１α分泌は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合する場合、無関係なペプチド（例えば、配列番号１５または１６）のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型への結合と比較して、最大で１５倍高く、好ましくは最大で１０倍高くなり得る。ＭＩＰ−１β分泌は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型に結合する場合、無関係なペプチド（例えば、配列番号１５または１６）のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型への結合と比較して、最大で３０倍高く、好ましくは最大で２５倍高くなり得る。
【０１００】
本発明はまた、配列番号１〜３から選択される標的アミノ酸配列、またはそのＨＬＡ−Ａ＊０２結合型、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合型に結合する、ＴＣＲまたはその断片を同定するための方法であって、候補ＴＣＲまたはその断片を、配列番号１〜３から選択されるアミノ酸配列またはそのＨＬＡ−Ａ＊０２結合型、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合型に接触させるステップと、候補ＴＣＲまたはその断片が、標的に結合し、および／または免疫応答を媒介するかどうかを決定するステップとを含む方法に関する。
候補ＴＣＲまたはその断片が免疫応答を媒介するかどうかは、例えば、サイトカイン分泌、例えば、ＩＦＮ−γ分泌の測定により決定することができる。上記のように、サイトカイン分泌は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つ、好ましくは配列番号３をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトしたＫ５６２細胞（または他のＡＰＣ）を、調査するＴＣＲ、またはＴＣＲの断片を含む分子を発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣとともにインキュベートするｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより測定され得る。
【０１０１】
核酸、ベクター
本発明の別の態様は、本明細書に記載のＴＣＲをコードする、または本明細書に記載のＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをコードする核酸に言及する。
【０１０２】
「核酸分子」は、一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、これは、一本鎖または二本鎖、合成または天然の供給源から入手した（例えば、単離および／または精製されている）ものである場合があり、天然、非天然または改変したヌクレオチドを含有する場合があり、天然、非天然または改変したヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロアミデート連結またはホスホロチオエート連結を、非修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに含有する場合がある。好ましくは、本明細書に記載の核酸は、組換え型である。本明細書において使用する場合、用語「組換え」は、（ｉ）天然または合成核酸セグメントを、生細胞内で複製することができる核酸分子に接合させることにより、生細胞の外部で構築される分子、または（ｉｉ）上の（ｉ）に記載の分子の複製から生じる分子を指す。本明細書における目的において、複製は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製またはｉｎ  ｖｉｖｏでの複製であり得る。核酸は、当技術分野において公知の手法、または市販の手法（例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒおよび類似の企業による）を使用する化学的合成および／または酵素的ライゲーション反応をベースとして構築することができる。例えば、分子の生物学的安定性を高めるように、またはハイブリダイゼーション時に形成される二重鎖の物理的安定性を高めるようにデザインした、天然発生のヌクレオチドまたは様々に修飾したヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して核酸を化学的に合成することができる、例えば、Sambrook et al.を参照されたい。核酸は、組換えＴＣＲ、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはその機能性部分もしくは機能性変異体のうちのいずれかをコードする、任意のヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１０３】
本開示はまた、本明細書に記載のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸の変異体を提供する。このような変異ヌクレオチド配列は、ＮＹ−ＥＳＯ１／ＬＡＧＥ−１を特異的に認識する機能性ＴＣＲをコードする。
【０１０４】
本開示はまた、本明細書に記載の核酸のうちのいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、または本明細書に記載の核酸のうちのいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸を提供する。
【０１０５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」は、ヌクレオチド配列が、標的配列（本明細書に記載の核酸のうちのいずれかのヌクレオチド配列）に、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強力な量で、特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、正確な相補性配列を有するポリヌクレオチド、または点在するわずかな不適合のみを含有するポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列に適合する、わずかな小さい領域（例えば、３〜１０塩基）を期せずして有するランダム配列から識別し得る条件を含む。このような小さい相補性の領域は、１４〜１７またはそれを超える塩基の完全長の補体よりも容易に紛れ込むが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、これを容易に識別可能とする。相対的な高ストリンジェンシー条件は、例えば、低塩および／または高温条件、例えば、約５０〜７０℃の温度で、約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌまたは等価物によりもたらされるものを含み得る。このような高ストリンジェンシー条件は、たとえあったとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間の不適合をほとんど許容せず、本明細書に記載のＴＣＲのうちのいずれかの発現の検出に、特に適する。ホルムアミドの追加量を増加させることにより、条件が、よりストリンジェントとなり得ることが一般に理解される。
【０１０６】
本明細書において他に既に記載するように、ＴＣＲをコードする核酸は、修飾され得る。全核酸配列における有用な修飾は、コドン最適化であり得る。発現したアミノ酸配列内で保存的置換を生じる改変を行うことができる。これらの変異は、機能に影響しないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定および非相補性決定領域において行うことができる。通常、付加および欠失は、ＣＤＲ３領域において実施するべきではない。
【０１０７】
別の実施形態は、本明細書に記載のＴＣＲをコードする核酸を含むベクターに言及する。
【０１０８】
ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたは遺伝子治療において使用する粒子および／もしくはベクターである。
【０１０９】
「ベクター」は、コードされたポリペプチドの合成が起こり得る、適する宿主細胞内に、核酸配列を運ぶ能力を有する、任意の分子または組成物である。典型的には、および好ましくは、ベクターは、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術を使用して、所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込むように改変されている核酸である。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、および／またはリポソームを含み得る。ベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたは遺伝子治療において使用する粒子および／もしくはベクターであり得る。ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を可能とする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターはまた、当業者に公知の１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝的要素を含み得る。ベクターは、好ましくは、本発明による核酸の発現を可能とする配列に動作可能に連結した前記核酸を含む発現ベクターである。
【０１１０】
好ましくは、ベクターは、発現ベクターである。より好ましくは、ベクターは、レトロウイルスベクター、より具体的には、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【０１１１】
細胞、細胞株
本発明の別の態様は、本明細書に記載のＴＣＲを発現する細胞に言及する。
【０１１２】
一部の実施形態では、細胞は、単離されているか、または天然に存在しない。
【０１１３】
具体的な実施形態では、細胞は、本明細書に記載のＴＣＲをコードする核酸、または前記核酸を含むベクターを含み得る。
【０１１４】
細胞には、上記のＴＣＲをコードする核酸配列を含む上記のベクターを導入し得るか、または前記ＴＣＲをコードするｉｖｔＲＮＡを導入し得る。細胞は、末梢血リンパ球、例えば、Ｔ細胞であり得る。ＴＣＲのクローニングおよび外因性発現の方法は、例えば、Engels et al.（Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013）に記載されている。レンチウイルスベクターによる初代ヒトＴ細胞の形質導入は、例えば、Cribbs "simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells" BMC Biotechnol. 2013; 13: 98に記載されている。
【０１１５】
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、互換的であり、外因性核酸配列を宿主細胞に、例えば、真核宿主細胞に導入するプロセスを指す。核酸配列の導入または移入は、言及する方法に限定されないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、リポフェクション、スーパーフェクション（superfection）、およびレトロウイルスまたは形質導入もしくはトランスフェクションに適する他のウイルスによる、言及する感染を含む任意のいくつかの手段により達成することができることに留意されたい。
【０１１６】
一部の実施形態は、
ａ）本明細書に記載の少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む、細胞に言及する。
【０１１７】
一部の実施形態では、細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。細胞は、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞であり得る。好ましくは、細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
一部の実施形態では、細胞は、幹細胞様メモリーＴ細胞である。
【０１１８】
幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の低分化型亜集団であり、自己再生および長時間持続する能力を特徴とする。これらの細胞が、その抗原にｉｎ  ｖｉｖｏで遭遇すると、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、最終的には分化型エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ）にさらに分化し、一部のＴＳＣＭは、静止状態のままとなる（Flynn et al., Clinical & Translational Immunology (2014)）。これらの残存するＴＳＣＭ細胞は、耐久性の免疫記憶をｉｎ  ｖｉｖｏで構築する能力を示し、このため養子Ｔ細胞療法に重要なＴ細胞亜集団であると考えられている（Lugli et al., Nature Protocols 8, 33-42 (2013)；Gattinoni et al., Nat. Med. 2011 Oct; 17(10): 1290-1297）。免疫磁気選択を使用して、Ｔ細胞プールを幹細胞メモリーＴ細胞亜型に限定することができる（Riddell et al. 2014, Cancer Journal 20(2): 141-44を参照）。
【０１１９】
ＴＣＲを標的とする抗体
本発明の別の態様は、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に対する特異性を媒介する、本明細書に記載のＴＣＲの部分に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片に言及する。一実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１／Ｌａｇｅ−１特異性を媒介する、ＴＣＲの部分は、配列番号６のアルファ鎖のＣＤＲ３および／または配列番号９のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。
【０１２０】
抗体または抗原結合性断片は、ＴＣＲの活性を調節し得る。これにより、ＴＣＲのＮＹ−ＥＳＯとの結合をブロックし得るか、またはブロックしないことが可能である。これは、ＴＣＲの治療活性を調節するためまたは診断目的のために使用され得る。
【０１２１】
医薬組成物、医薬による処置およびキット
本発明の別の態様は、本明細書に記載のＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載の多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または本明細書に記載のＴＣＲの部分に特異的に結合する抗体を含む、医薬組成物に言及する。
【０１２２】
本発明のこれらの活性構成成分は、好ましくは、疾患が処置または少なくとも緩和され得る医薬組成物において、許容される担体または担体材料と混合した用量において使用される。このような組成物は、（活性構成成分および担体に加えて）充填材料、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および他の材料を含むことができ、これは、公知の現況技術である。
【０１２３】
用語「薬学的に許容される」は、非毒性材料を定義し、これは、活性構成成分の生物学的活性の有効性に干渉しない。担体の選択は、適用に依存する。
【０１２４】
医薬組成物は、活性構成成分の活性を増強するか、または処置を補う追加の構成成分を含有し得る。このような追加の構成成分および／または因子は、相乗効果を達成するか、または有害もしくは望まない効果を最小化する、医薬組成物のうちの一部であり得る。
【０１２５】
本発明の活性構成成分の製剤化または調製および適用／薬物療法のための技術は、"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版において公表されている。適切な適用は、非経口適用、例えば、筋肉内、皮下、髄内注射ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、結節内（intranodal）、腹腔内または腫瘍内注射である。静脈内注射は、患者に好ましい処置である。
【０１２６】
好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、輸注または注射である。
【０１２７】
注射用組成物は、少なくとも１つの活性成分、例えば、ＴＣＲを発現する増やしたＴ細胞集団（例えば、処置する患者に対して自家または同種である）を含む、薬学的に許容される液体組成物である。活性成分は、通常、生理学的に許容される担体に溶解または懸濁し、組成物は、少量の１つまたは複数の非毒性補助物質、例えば、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などをさらに含むことができる。本開示の融合タンパク質を用いた使用に有用な、このような注射用組成物は、従来確立されており、適切な製剤が、当業者に周知である。
【０１２８】
典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。
【０１２９】
したがって、本発明の別の態様は、医薬としての使用のための、本明細書に記載のＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載の多価ＴＣＲ複合体、前記ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または本明細書に記載のＴＣＲの部分に特異的に結合する抗体に言及する。
【０１３０】
一部の実施形態は、がんの処置における使用のための、本明細書に記載のＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載の多価ＴＣＲ複合体、前記ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞に言及する。
【０１３１】
一実施形態では、がんは、血液学的がん、または固形腫瘍である。
【０１３２】
血液学的がんは、血液がん（blood cancer）とも呼ばれ、これは、固形腫瘍を形成せず、このため体内に分散する。血液学的がんの例は、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である。固形腫瘍の２つの主要な型、肉腫および癌腫が存在する。肉腫は、例えば、血管、骨、脂肪組織、間膜、リンパ管、筋肉または腱の腫瘍である。
【０１３３】
一実施形態では、がんは、肉腫、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部がん、胃がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胆管癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択される。好ましくは、がんは、肉腫または骨肉腫である。
【０１３４】
ＴＣＲは、特に、骨肉腫および黒色腫、例えば、骨肉腫細胞株ＳＡＯＳ−２ならびに黒色腫細胞株ＭＭ４１５およびＭｅｌ６２４．３８を良好に認識する。
【０１３５】
（ｉ）本明細書に記載の単離されたＴＣＲ、（ｉｉ）組換えＴＣＲをコードする核酸を含むウイルス粒子、（ｉｉｉ）本明細書に記載の組換えＴＣＲを発現するように修飾した、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、（ｉｖ）本明細書に記載の組換えＴＣＲをコードする核酸のうちの１つまたは複数を含有する、医薬組成物およびキットもまた、本明細書において企図される。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組換えＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクター粒子（または本明細書に記載のベクター粒子を使用して、組換えＴＣＲを発現するように修飾したＴ細胞）を含む組成物を提供する。このような組成物は、本明細書にさらに記載するように本開示の方法で対象に投与することができる。
【０１３６】
本明細書に記載の修飾したＴ細胞を含む組成物は、養子免疫療法のための方法および組成物で、本開示に基づいて当業者に明らかな公知の技術またはその変形形態に従って利用することができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、細胞は、その培養培地から最初に採取し、次いで、投与に適する媒質およびコンテナシステム（「薬学的に許容される」担体）中で治療有効量に細胞を洗浄および濃縮することにより製剤化される。適する輸注媒質は、任意の等張媒質製剤、典型的には生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であり得るが、水中５％のブドウ糖、または乳酸リンゲル液を利用することもできる。輸注媒質には、ヒト血清アルブミンを添加することができる。
【０１３８】
有効な処置のための、組成物中の細胞数は、典型的に、１０細胞よりも多く、最大１０６、１０８または１０９細胞を含むそれ以下であり、１０１０細胞を超えることもある。細胞数は、組成物に含まれるように意図され、最終的に使用される細胞型に依存し得る。例えば、特定の抗原に特異的な細胞が所望される場合には、集団は、７０％よりも多く、一般に８０％、８５％および９０〜９５％よりも多く、このような細胞を含有する。本明細書において提供する使用では、細胞は、一般に、１リットル以下の容量であり、５００ｍｌ以下、さらに２５０ｍｌまたは１００ｍｌ以下であり得る。したがって、所望の細胞の密度は、典型的に１０６細胞／ｍｌよりも高く、一般に１０７細胞／ｍｌよりも高く、一般に１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に適切な免疫細胞数は、１０９、１０１０または１０１１細胞に累積的に等しいか、またはそれを超える複数の輸注に分配することができる。本明細書において提供する医薬組成物は、種々の形態、例えば、固形、液体、粉末、水性、または凍結乾燥した形態であり得る。適する医薬担体の例は、当技術分野において公知である。このような担体および／または添加剤は、従来の方法により製剤化することができ、適する用量で対象に投与することができる。安定化剤、例えば、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート剤は、組成物の体内での分解を防ぐ。注射による投与を意図する組成物には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤および等張剤のうちの１つまたは複数が含まれ得る。
【０１３９】
本明細書に記載の組換えＴＣＲ、または本明細書において提供する組換えＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージングすることができる。キットは、任意選択で、１つまたは複数の構成成分、例えば、使用説明書、デバイス、および追加の試薬、ならびに方法の実践のための構成成分、例えば、チューブ、容器およびシリンジを含むことができる。例示的なキットは、組換えＴＣＲをコードする核酸、組換えＴＣＲポリペプチド、または本明細書において提供するウイルスを含むことができ、任意選択で、使用説明書、対象においてウイルスを検出するためのデバイス、および組成物を対象に投与するためのデバイスを含むことができる。
【０１４０】
目的の遺伝子（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むキットもまた、本明細書において企図される。目的の配列（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするウイルスベクター、および任意選択で、免疫チェックポイント阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットもまた、本明細書において企図される。
【０１４１】
本明細書において企図されるキットはまた、本明細書に開示するＴＣＲのうちのいずれか１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するための方法を実行するためのキットを含む。特に、このような診断キットは、ディープシーケンシングを実施して本明細書に開示するＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを検出するための、適切な増幅および検出プライマーならびに他の関連する試薬のセットを含み得る。さらなる実施形態では、本明細書のキットは、本明細書に開示するＴＣＲを検出するための試薬、例えば、抗体または他の結合分子を含み得る。診断キットはまた、本明細書に開示するＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの存在を決定するため、または本明細書に開示するＴＣＲの存在を決定するための説明書を含有し得る。キットはまた、説明書を含有し得る。説明書は、典型的に、キットに含まれる構成成分、ならびに投与方法を説明する具体的表現を含み、対象の適切な状態、適切な投薬量、および適切な投与方法を決定するための方法を含む。説明書はまた、処置の持続期間にわたって対象をモニターするための手引きを含むことができる。
【０１４２】
本明細書において提供するキットはまた、本明細書に記載の組成物を対象に投与するためのデバイスを含むことができる。薬物療法またはワクチンを投与するための当技術分野において公知の様々なデバイスのうちのいずれかを、本明細書において提供するキットに含むことができる。例示的なデバイスは、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、針なし注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器を含むが、これらに限定されない。典型的には、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに適合し、例えば、針なし注射デバイス、例えば、高圧注射デバイスを、高圧注射により損傷しないウイルスとともにキットに含むことができるが、典型的には、高圧注射により損傷するウイルスとともにはキットに含まない。
【０１４３】
本明細書において提供するキットはまた、化合物、例えば、Ｔ細胞活性化因子もしくは刺激因子、またはＴＬＲアゴニスト、例えば、ＴＬＲ４アゴニストを対象に投与するためのデバイスを含むことができる。薬物療法を対象に投与するための当技術分野において公知の様々なデバイスのうちのいずれかを、本明細書において提供するキットに含むことができる。例示的なデバイスは、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、針なし注射デバイスを含むが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、針なし注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器に限定されない。典型的には、キットの化合物を投与するためのデバイスは、化合物を投与する所望の方法に適合する。
【実施例】
【０１４４】
実験
[実施例１]
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１特異的Ｔ細胞クローンの単離
所望の任意のＭＨＣ制限および抗原特異性のＴ細胞クローンを単離するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプライミングアプローチを使用した。プライミングシステムでは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性ドナーの成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を抗原提示細胞として、自家ＣＤ８＋富化Ｔ細胞を応答細胞として使用する。配列番号１４に言及する完全長ヒトＣＴＡＧ１Ａ／Ｂアミノ酸配列をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）は、特異的抗原の供給源として作用する。同時に、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２：０１をコードするｉｖｔＲＮＡを、ｍＤＣにトランスフェクトする制限要素の供給源として使用して、この特化したＨＬＡアレルに関する同種プライミングを設定する（国際公開第２００７／０１７２０１号パンフレットに記載のように）。ｍＤＣへのエレクトロポレーション後、ＣＴＡＧ１をコードするｉｖｔＲＮＡは、完全長タンパク質に翻訳され、その後、プロセシングされて、トランスフェクトしたｍＤＣにより発現するトランスジェニックＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子によりペプチドとして提示される。同一のドナー由来のＴ細胞の、ｉｖｔＲＮＡトランスフェクトｍＤＣとのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの共培養により、対応するＴＣＲの供給源として作用する抗原特異的Ｔ細胞のｄｅ  ｎｏｖｏ誘導が生じる。抗原特異的Ｔ細胞は、様々な方法により富化することができ、限界希釈またはＦＡＣＳをベースとする単一細胞選別によりクローン化する。
【０１４５】
[実施例１．１]
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトした成熟樹状細胞を使用する同種プライミングアプローチ
高親和性ＴＣＲによるＴ細胞の樹状細胞プライミングは、同種ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子によるペプチド提示を使用して、以下のプロトコールに従って達成した：
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＣＴＡＧ１プライミング
適する成熟混合物を使用して、ＤＣについてJonuleit et al.に従って（Jonuleit et al. 1997, Eur. J. Immunol. 1997, 27:3135-3142）、成熟樹状細胞を産生した（８日ｍＤＣ）。
抗原提示細胞（８日成熟ｍＤＣ）は、健常なドナーに由来し、所望の抗原およびＨＬＡ分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）をコードするｉｖｔＲＮＡ  ２０μｇによりエレクトロポレートした。その後、調製したｍＤＣは、健常ドナーのＣＤ８＋富化ＰＢＭＣと１：１０の比で約１４日間、ＩＬ−２を添加した（１日おきに５０単位／ｍｌ）適する細胞培地中に３７℃（６％のＣＯ２）で共培養した。その後、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５多量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）を使用してＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的細胞を同定し、その後、ＦＡＣＳ技術を使用して単一細胞選別により分離した。
【０１４６】
[実施例２]
機能／特異性の解析
ＨＬＡ−Ａ２上の所望のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１エピトープ（ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５）に結合する候補ＴＣＲ（Ｔ１１．８−１０−１７）の同定後、機能および特異性についての完全な特徴付けを行った。解析により、Ｔ細胞クローンＴ１１．８−１０−１７のＮＹ−ＥＳＯ−１、より正確には、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５に対する特異性（図１）、Ｔ１１．８−１０−１７形質導入ＣＤ８＋富化Ｔ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２陽性ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５ペプチド負荷腫瘍細胞株を特異的に溶解する能力（図２）およびＴ１１．８−１０−１７形質導入ＣＤ８＋富化Ｔ細胞の、種々のヒト腫瘍細胞株との共培養における腫瘍細胞認識（図３）が確認された。
【０１４７】
[実施例２．１]
オリジナルＴ細胞クローンＴ１１．８−１０−１７の解析
[実施例２．１．１]
抗原特異性
実験計画：ｉｖｔＲＮＡ負荷Ｋ５６２またはペプチド負荷Ｔ２細胞による刺激
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異性を以下のプロトコールに従って確認した：標準的サンドイッチＥＬＩＳＡ解析を実施し、ＩＦＮ−γを検出した（ＢＤヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡセット）。
標的細胞として、Ｔ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２ｐｏｓ）に飽和量（１０−５Ｍ）のＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５ペプチド（「ＳＬＬペプチド」；配列番号３）または無関係なＮＹ−ＥＳＯ−１由来のペプチド（「ＦＴＶペプチド」；配列番号１５）すなわち、ＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩペプチド（「ＦＴＶペプチド」）もしくはＲＬＬＥＦＹＬＡＭペプチド（「ＲＬＬペプチド」、配列番号１６）を負荷した。
加えて、Ｋ５６２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を形質導入；「Ｋ５６２−Ａ２」）に、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５をコードするｉｖｔＲＮＡ  ２０μｇをトランスフェクトするか、または対照として水によりエレクトロポレートした。各標的細胞株をＴ細胞クローンＴ１１．８−１０−１７と約２：１の比で、２０，０００個の標的細胞および１０，０００個のＴ細胞を使用して共培養した。ＩＦＮ−γを標準的サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した（ＢＤヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡセット）。
【０１４８】
結果
候補クローンは、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するＫ５６２−Ａ２細胞またはＳＬＬペプチド負荷Ｔ２細胞で刺激した場合にのみＩＦＮ−γを分泌したが、水によりエレクトロポレートしたＫ５６２−Ａ２または無関係なペプチド（ＦＶＴまたはＲＬＬ）を負荷したＴ２細胞との組合せでは、分泌しなかった（図１）。
【０１４９】
[実施例２．２]
腫瘍細胞の認識
実験計画：腫瘍細胞の殺傷
Ｔ１１．８−１０−１７形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８−Ｔ１１．８−１０−１７またはＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）の殺傷能を、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陽性腫瘍細胞株Ｍｅｌ６２４．３８と共培養することにより評価した（図２ａ）。加えて、ＣＤ８−Ｔ１１．８−１０−１７の殺傷もまた、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陽性腫瘍細胞株ＭＭ４１５を用いて試験した（図２ｂ）。陰性対照として、非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣをエフェクター細胞（ＣＤ８＿ＵＴ）として使用するか、またはＨＬＡ−Ａ＊０２陽性であるがＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陰性の腫瘍細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ２３を標的細胞として使用した。約４：１のエフェクターと標的との比で共培養を設定した。すなわち、共培養の１日前に１０，０００個の接着腫瘍細胞を播種し、その後、４０，０００個のトランスジェニックＴＣＲ＋Ｔ細胞を加えた。標的細胞のアポトーシスの誘導を示す（アネキシンＶ、赤色）赤色蛍光標的細胞の増加（ＧＣＵ×μｍ２／画像における総積分強度）を、生細胞モニタリング（ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ）を使用して６７時間の全期間にわたって４時間毎に測定した。
【０１５０】
結果
Ｔ１１．８−１０−１７形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陽性およびＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍細胞株Ｍｅｌ６２４．３８（図２ａ）またはＭＭ４１５（図２ｂ）のみの殺傷を示し、このことは、１０時間後から既に開始した、赤色蛍光（ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）アネキシンＶ）の増加により表された。対照的に、エフェクター細胞なしで培養した腫瘍細胞の場合、またはＴ１１．８−１０−１７形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞とともに培養した、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陰性およびＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ２３の場合は、赤色蛍光の増加は観察されず、標的細胞の殺傷がなかったことを示した。非形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞は、いかなる腫瘍細胞株の溶解も示さなかった。
【０１５１】
[実施例２．３]
腫瘍細胞の認識
実験計画：腫瘍細胞株による刺激
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを使用して、Ｔ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）による刺激時のサイトカイン分泌を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陽性ヒト腫瘍細胞株（Ｍｅｌ６２４．３８、ＦＭ６、ＦＭ３．２９、ＭＭ４１５、ＳＡＯＳ２、Ｕ２６６）のパネルを用いて評価した。ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１発現が、標的細胞において、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）解析により検出された。Ｔ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞の陽性対照として、Ｔ２細胞にＳＬＬペプチド（１０−５Ｍ）を負荷した。エフェクター機能の陰性対照として、Ｔ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞を、無関係な（ＦＴＶ）ペプチド（１０−５Ｍ）を負荷したＴ２細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ２３（ＨＬＡ−Ａ２ｐｏｓ、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１ｎｅｇ）もしくはＳＫＭ１（ＨＬＡ−Ａ２ｐｏｓ、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１ｎｅｇ）と共培養するか、または非形質導入Ｔ細胞を腫瘍細胞またはペプチド負荷Ｔ２細胞と共培養した。エフェクター細胞なしの標的細胞の培養は、追加の陰性対照として作用した。標的細胞は、Ｔ細胞と２：１の比で、４０，０００個のＴ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞および２０，０００個の標的細胞を使用して共培養した（図３）。
【０１５２】
結果
Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１ｐｏｓ、ＨＬＡ−Ａ＊０２ｐｏｓ腫瘍細胞株Ｍｅｌ６２４．３８、ＦＭ６、ＦＭ３．２９、ＭＭ４１５、ＳＡＯＳ２およびＵ２６６またはＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５負荷Ｔ２細胞との共培養における、高いＩＦＮ−γ分泌量を示す。対照的に、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１陰性腫瘍細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ２３およびＳＫＭ１または無関係なペプチドを負荷したＴ２細胞のＴ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞による認識は、検出されなかった。任意の標的細胞またはエフェクターＴ細胞なしの標的細胞と共培養した非形質導入Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ分泌を示さなかった（図３）。
【０１５３】
[実施例２．４］
不適合エピトープの認識
実験計画２．４．１：ペプチド負荷エピトープの認識
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ベンチマーク形質導入ＣＤ８＋（ＣＤ８−ベンチマーク−ＴＣＲ）Ｔ細胞またはＴ１１．８−１０−１７−ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋（ＣＤ８＿Ｔ１１−１０−１７）Ｔ細胞のいずれかのＩＦＮ−γ分泌を、ペプチド認識（ＩＦＮ−γ分泌）について、ペプチド負荷（１０−５Ｍ）Ｔ２細胞を用いて試験した。実行したすべてのデータベースのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのＥｘｐｉｔｏｐｅ（登録商標）解析（Expitope(R) 2.0; Jaravine et al. BMC Cancer 2017）、および合わせたスコア閾値を除去することにより（０に設定）、ＳＬＬペプチド配列（９ｍｅｒ）に対して少なくとも５６％相同であり（不適合最大４）、ＭＨＣ（ＩＣ５０）結合スコアが２０，０００ｎＭよりも低い、７５のペプチドを試験した。陰性対照として、非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（ＣＤ８＿ＵＴ）をエフェクター細胞として使用するか、またはＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を無関係なペプチド（ｉｒｒ．；ＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ）を負荷したＴ２細胞（１０−５Ｍ）で刺激した。標的細胞のバックグラウンドのＩＦＮ−γ分泌も試験した（標的のみ）。陽性対照として、ＳＬＬペプチド（＃１０＊）負荷Ｔ２細胞（１０−５Ｍ）によりＴ細胞を活性化した。標的細胞をＴ細胞と１：１の比で、２０，０００個の標的細胞および２０，０００個のＴ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞またはベンチマークＴＣＲ形質導入もしくは非形質導入Ｔ細胞を使用して共培養した。ＩＦＮ−γ分泌を標準的ＥＬＩＳＡにより［ｐｇ／ｍＬ］で測定した。６つの認識されたペプチドを示す（図４）。
【０１５４】
【表１】
2021510063.tif 000002
【０１５５】
結果
Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞およびベンチマークＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞により交差認識されたペプチドを示す（ペプチド配列を表１にまとめる）。トランスジェニックＴ細胞は、陽性対照ペプチド（ＳＬＬ、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）を認識したが、無関係なペプチド（ｉｒｒ．；ＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ）は認識せず、これにより、トランスジェニックＴ細胞の機能性が立証された。加えて、ペプチド＃３を交差認識したトランスジェニックＴ細胞と、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＴ細胞もともに、ペプチド＃６、＃１１、＃３２、＃３４および＃５１を負荷したＴ２細胞により、わずかに活性化された。非形質導入Ｔ細胞による、いかなるＴ２細胞の認識も観察されなかった。別々に培養したＴ細胞またはＴ２標的細胞は、ＩＦＮ−γを分泌しなかった（図４）。
【０１５６】
実験計画２．４．２：ｉｖｔＲＮＡ不適合エピトープの認識
ペプチド導入ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１トランスジェニックＫ５６２細胞（Ｋ５６２−Ａ２＋ｉｒｒ．、Ｋ５６２−Ａ２＋ＳＬＬ）または標的ｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトしたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＫ５６２（Ｋ５６２−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｋ５６２−Ａ２＋ｅＧＦＰ）のいずれかとの共培養における、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）を発現するＣＤ８＋富化ＰＢＭＣの特異的ＩＦＮ−γ放出を、共培養の設定１６時間後に試験した。この実験では、ＲＰＭＩ１６４０培地３００μｌ中のＫ５６２細胞３×１０６に、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはｅＧＦＰ−ｉｖｔＲＮＡのいずれか２０μｇを用いてエレクトロポレートした（３００ボルトおよび３００μＦ；指数パルス）。陽性対照として、ＳＬＬペプチド（１０−５Ｍ）（Ｋ５６２−Ａ２＋ＳＬＬ）またはＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするｉｖｔＲＮＡ  ２０μｇ（Ｋ５６２−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１）のいずれかを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１トランスジェニックＫ５６２細胞でＴ細胞を刺激した。陰性対照として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１トランスジェニックＫ５６２に、無関係なペプチド（１０−５Ｍ；Ｋ５６２−Ａ２＋ＦＴＶ）またはｅＧＦＰをコードするｉｖｔＲＮＡ  ２０μｇ（Ｋ５６２−Ａ２＋ｅＧＦＰ）のいずれかを負荷した。加えて、本発明のＴ１１．８−１０−１７ＴＣＲ（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）のいずれかを発現するトランスジェニックＴ細胞により交差認識されるエピトープおよび隣接する配列を含む、長いペプチドと組み合わせたｅＧＦＰをコードするｉｖｔＲＮＡ（Ｋ５６２−Ａ２＋＃３、Ｋ５６２−Ａ２＋＃６、Ｋ５６２−Ａ２＋＃１１、Ｋ５６２−Ａ２＋＃３２、Ｋ５６２−Ａ２＋＃３４、Ｋ５６２−Ａ２＋＃５１）２０μｇをＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｋ５６２細胞にトランスフェクトした。標的細胞をＴ細胞と２：１の比で、４０，０００個の標的細胞および２０，０００個のＴ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞またはベンチマークＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を使用して共培養した。ＩＦＮ−γ分泌を標準的ＥＬＩＳＡにより［ｐｇ／ｍＬ］で測定した（図５）。
【０１５７】
結果
Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞およびベンチマークＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞は、陽性対照、すなわち、ＳＬＬペプチド負荷Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性細胞（Ｋ５６２−Ａ２＋ＳＬＬ）またはＮＹ−ＥＳＯ−１−ｉｖｔＲＮＡトランスフェクトＫ５６２−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性細胞（Ｋ５６２−Ａ２＋ＮＹＥＳＯ）のいずれかを認識したが、無関係に負荷したＫ５６２−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性細胞（Ｋ５６２−Ａ２＋ｉｒｒ．およびＫ５６２−Ａ２＋ｅＧＦＰ）は認識せず、これにより、トランスジェニックＴ細胞の特異性および機能性が立証された。ベンチマークＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、細胞内でプロセシングされ、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性細胞上に提示された場合、ペプチド＃３を依然として認識することができたが、Ｔ１１．８−１０−１７は、内部的にプロセシングされたいずれのペプチド（＃３、＃６、＃１１、＃３２、＃３４および＃５１）の交差認識もそれ以上示さなかった。このことにより、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＴ細胞が、内部的にプロセシングされた場合、ベンチマークＴＣＲと比較して、試験したペプチドのいずれも交差認識しないという結論が導かれる。
【０１５８】
[実施例３]
サイトカインプロファイル
実験計画３．１：ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢの分泌
１０−５ＭのＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５（Ｔ２（ＳＬＬ））ペプチドまたは１０−５ＭのＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する無関係なペプチド（Ｔ２（ＦＴＶ））のいずれかを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞による刺激時に、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変した、２人の異なる健常ドナーの（図６ａ：ドナー１；図６ｂ：ドナー２）ＣＤ８＋トランスジェニックＴＣＲ富化ＰＢＭＣの特異的サイトカイン放出（［ｎｇ／ｍＬ］で測定したＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢ）を評価した。
陰性対照として、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＦＴＶ負荷Ｔ２細胞（Ｔ２（ＦＴＶ））で刺激するか、または非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（ＣＤ８＿ｕｔ）をペプチド負荷Ｔ２細胞と共培養した。さらに、Ｔ２細胞またはＴ細胞を別々に培養した。
標的細胞およびＴ細胞を１：１の比で、１０，０００個の標的細胞および１０，０００個のＴ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞またはベンチマークＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を使用して共培養した。Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかによるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢの分泌を、共培養の設定１８時間後に、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  Ｋｉｔを使用してマルチプレックスアッセイにより決定し、ＭａｇＰｉｘ解析装置により解析した。
【０１５９】
結果
顕著なサイトカイン放出は、すべての陰性対照について測定されない。両方のトランスジェニックＴＣＲは、それぞれのＴ細胞により同量のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびグランザイムＢ分泌を生じ、エフェクター機能に関して好ましいサイトカインプロファイルを示す。
【０１６０】
実験計画３．２：ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの分泌
１０−５ＭのＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５（ＳＬＬ）ペプチド（Ｔ２（ＳＬＬ））または１０−５ＭのＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する無関係なペプチド（ＦＴＶ）（Ｔ２（ＦＴＶ））のいずれかを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞による刺激時に、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１１５７−１６５特異的ＴＣＲであるＴ１１．８−１０−１７（ＣＤ８＿Ｔ１１．８−１０−１７）またはベンチマークＴＣＲ（ＣＤ８＿ベンチマーク−ＴＣＲ）を発現する、ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（図７ａ：ドナー１または図７ｂ：ドナー２）の特異的ケモカイン放出（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）。ベンチマークＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＳＬＬペプチド負荷Ｔ２細胞による刺激時に、ＴＣＲ  Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＴ細胞と比較して高量のＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを分泌した。
陰性対照として、Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＦＴＶ負荷Ｔ２細胞により刺激するか、または非形質導入ＣＤ８＋富化ＰＢＭＣ（ＣＤ８＿ｕｔ）をペプチド負荷Ｔ２細胞と共培養した。さらに、Ｔ２細胞またはＴ細胞を別々に培養した。
標的細胞およびＴ細胞を１：１の比で、１０，０００個の標的細胞および１０，０００個のＴ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞またはベンチマークＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を使用して共培養した。Ｔ１１．８−１０−１７トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞またはベンチマークトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかによるＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの分泌を、共培養の設定１８時間後に、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  Ｋｉｔを使用してマルチプレックスアッセイにより決定し、ＭａｇＰｉｘ解析装置により解析した。
【０１６１】
結果
ごくわずかなケモカイン放出は、すべての陰性対照について測定される。さらに、別々に培養したＴ２細胞またはＴ細胞は、いかなるケモカイン放出も示さない。Ｔ１１．８−１０−１７形質導入Ｔ細胞は、ベンチマークＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と比較して著しく低量のＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを放出した。それぞれＣＣＬ３およびＣＬＣ４とも呼ばれる、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βなどのケモカイン、特にＭＩＰ−１αは、腫瘍増殖を助長することが知られているため（Liao et al. Oncotarget, 7(4): 4310-4325 (2015)；Silva et al. Oncotarget 8 (11): 51024-51036 (2017)；Yu Wu et al. J Immunol., Nov 1;181(9):6384-93 (2008)）、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの分泌レベルが低いことは有利である。
【図１】
2021510063.tif 000003
【図２−１】
2021510063.tif 000004
【図２−２】
2021510063.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
2021510063.tif 000008
【図６−１】
2021510063.tif 000009
【図６−２】
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【図７−１】
2021510063.tif 000011
【図７−２】
2021510063.tif 000012
【配列表】
2021510063000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月8日(2020.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
−  配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖と、
−  配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖と
を含む、前記単離されたＴＣＲ。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、請求項１または２に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項４】
配列番号３のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２結合型を特異的に認識する、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合型を特異的に認識する、請求項１から５のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項７】
配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域、および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項８】
配列番号１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号１３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項９】
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１０】
そのアミノ酸配列が、検出可能な標識、治療剤または薬物動態学的修飾部分を含むように修飾されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１１】
前記ＴＣＲα鎖および前記ＴＣＲβ鎖がリンカー配列により連結された、単鎖型のものである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項１２】
配列番号６および９のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記機能性部分が、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体。
【請求項１５】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲをコードするか、または請求項１２または１３に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲを発現する細胞。
【請求項１８】
請求項１５に記載の核酸または請求項１６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９】
ａ）請求項１５に記載の少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター
ｂ）請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１に対する特異性を媒介する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲの部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２１】
前記ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１特異性を媒介する、前記ＴＣＲの前記部分が、配列番号６のアルファ鎖のＣＤＲ３および／または配列番号９のベータ鎖のＣＤＲ３を含む、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ、請求項１２または１３に記載のポリペプチド、請求項１４に記載の多価ＴＣＲ複合体、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載のベクター、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の細胞、または請求項２０または２１に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
がんの処置のための、請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記がんが、血液学的がん、または固形腫瘍である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記がんが、肉腫、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部がん、胃がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胆管癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2021510063.tif 000013
2021510063.tif 000014
2021510063.tif 000015
2021510063.tif 000016