(57)【要約】本発明は、中心コアを取り囲む架橋ヒドロゲル外殻をそれぞれ含む複数のカプセルの製造方法であって、ここで、ヒドロゲル溶液および中心コアを形成するように設計された対象となる水性組成物は、同心円状に共押出されて、それぞれが対象組成物の液滴を取り囲むヒドロゲル溶液の層を含む混合液滴を形成し、混合された液滴が架橋性エアロゾルを通過するように、共押出工程が前記架橋性エアロゾルの上で実行され、その結果、ヒドロゲル溶液の層が前記エアロゾルと接触する対象組成物の液滴の周りで少なくとも部分的に架橋することを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心コアを取り囲む架橋ヒドロゲル外殻をそれぞれ含む複数のカプセルの製造方法であって、ここで、ヒドロゲル溶液および中心コアを形成するように設計された対象となる水性組成物は、同心円状に共押出されて、それぞれが対象組成物の液滴を取り囲むヒドロゲル溶液の層を含む混合液滴を形成し、混合された液滴が架橋性エアロゾルを通過するように、共押出工程が前記架橋性エアロゾルの上で実行され、その結果、ヒドロゲル溶液の層が前記エアロゾルと接触する対象組成物の液滴の周りで少なくとも部分的に架橋することを特徴とし、前記カプセルは球状であり、50〜500μmの直径を有する、方法。
【請求項２】
架橋性エアロゾルは、架橋性溶液の微小液滴から形成され、その直径は有利には0.5〜20μm、好ましくは1〜10μm、好ましくは5μm±2μmに等しい、請求項1に記載のカプセル製造方法。
【請求項３】
エアロゾルを形成する架橋性溶液の微小液滴は、混合液滴が架橋性エアロゾルを通る押出し流によって投射される速度よりも遅い落下速度を有する、請求項2に記載のカプセル製造方法。
【請求項４】
カプセルは架橋性エアロゾルを通過した後に回収浴に浸漬され、前記回収浴は有利には架橋性溶液を含む、請求項1〜3のいずれかに記載のカプセル製造方法。
【請求項５】
混合液滴は界面活性剤を含まない、請求項1〜4のいずれかに記載のカプセル製造方法。
【請求項６】
架橋性エアロゾルの浸透濃度は、カプセルの中心コアを形成する対象組成物の浸透濃度の0.1〜10倍、好ましくはカプセルの中心コアを形成する対象組成物の浸透濃度の0.3〜3倍である、または、架橋性エアロゾル及びカプセルの中心コアを形成する対象組成物は等浸透圧である、請求項1〜5のいずれかに記載のカプセル製造方法。
【請求項７】
混合液滴は分散するように荷電され、架橋性エアロゾルは反対に荷電されているかまたは中性である、請求項1〜6のいずれかに記載のカプセル製造方法。
【請求項８】
中心コアを形成するための対象組成物は、細胞溶液、食品組成物、化粧品組成物または医薬組成物から選択される、請求項1〜7のいずれかに記載のカプセル製造方法。
【請求項９】
ヒドロゲル溶液はアルギン酸塩溶液であり、中心コアを形成するための対象組成物は細胞を含み、架橋性エアロゾルは塩化カルシウム溶液の微小液滴を含む、請求項1〜8のいずれかに記載のカプセル製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体であり得る中心コアを取り囲む架橋ヒドロゲルの外殻から形成されるカプセルの製造方法に関する。より具体的には、本発明は、対象組成物の特性が保存されるカプセルを形成するために対象組成物をカプセル化するための製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カプセル化プロセスは、通常は液体である、中央の組成物を含む外殻からなるカプセルを製造するために近年開発されてきた。そのようなカプセルは、特に医薬品および化粧品の分野で使用されている。中心の組成物は、外部の損傷から保護され、その放出をよりよく制御できる活性剤を含む。
【０００３】
一般に、カプセルは、架橋後に外殻を形成することを目的としてヒドロゲル溶液を同心的に共押出しすることにより得られ、目的の組成物をカプセル化する。押出機の出口で、目的の組成物の液滴を取り囲むヒドロゲル溶液の層から構成される混合液滴が得られる。次に、混合された液滴は、ヒドロゲル層の架橋が行われる架橋剤を含む浴に落ちる。
【０００４】
しかしながら、混合液滴の崩壊は、それらが押出機から架橋浴に落下するとき、および/または混合液滴が架橋浴と衝突するときにしばしば観察される。ヒドロゲルの外層が衝撃力の下で部分的または全体的に壊れ、架橋前に目的の組成物の液滴とヒドロゲルの液体層が部分的に混合するか、目的の組成物の液滴がヒドロゲルの架橋中に混合液滴の外側に向かって排出される。また、回収されたカプセルは、規則的な形状またはサイズではなく、および/または制御されたトポロジーではない。
【０００５】
結果として、混合液滴が架橋浴との衝撃を受けて破裂するのを防ぐために、ヒドロゲル溶液に界面活性剤を加えることがしばしば必要である。界面活性剤は、カプセルの内容物と接触して、その特性を変える可能性がある。したがって、カプセルが活性剤または細胞を含む場合、これは、活性剤の有効性の低下または細胞死をもたらすなどの重大な悪影響をもたらす可能性がある。同様に、カプセルが農業食品組成物を含む場合、その組成物の官能特性は、界面活性剤との相互作用によって変化する可能性がある。
【０００６】
さらに、衝撃での液滴の構造を凍結させるために、架橋剤の濃度は必然的に高くなる。その結果、架橋剤は、架橋中にヒドロゲル溶液の層を通過し、カプセル内部に浸透する。界面活性剤との相互作用と同様に、架橋剤とカプセルの内部との接触は、その内容物の特性を変え得る。
【０００７】
これらの架橋剤および界面活性剤はまた、人体を刺激する可能性がある。したがって、特にカプセルの使用目的に応じて、完全なすすぎ工程を実施して、表面および/またはカプセル内のすべての微量の架橋剤および/または界面活性剤を除去する必要がある場合がある。これらのすすぎ工程は、そのようなカプセルの収率を著しく低下させ、製造コストを増加させる。
【０００８】
したがって、対象組成物、特に液体組成物を含むヒドロゲルカプセルを製造するための方法であって、それにより、制御された形状および構造のカプセルを過剰なコストなしに高スループットで得ることができる方法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
（原文に記載なし）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
これらの問題に取り組み、本発明者らは、カプセルが、それらが受け入れられる回収浴に影響を与える前に、対象組成物の液滴の周りのヒドロゲル層を少なくとも部分的に架橋することが可能であることを発見した。対象組成物の液滴の周りのヒドロゲルのそのような事前架橋は、カプセルが破壊するリスクを防ぐ。さらに、カプセル内容物が架橋剤および/または可能な界面活性剤と接触するリスクも低減される。このような早期の架橋を可能にするために、本発明者らは、従来、ヒドロゲル溶液と対象組成物の共押出によって得られた混合液滴が、架橋剤を含む微粒子(液体または固体)で形成されたエアロゾルを通過するプロセスを開発した。微粒子は、前記エアロゾルを通って落下する間に混合液滴の表面で合体し、ヒドロゲルの少なくとも部分的な架橋を可能にする。
【００１１】
有利には、ヒドロゲルの最外層が架橋され、対象組成物の液滴の周りに剛性または半剛性シェルを形成する。逆に、ジェットによる噴霧または曇りは、混合液滴の内部への架橋剤の微粒子の浸透を促進し、それにより、ヒドロゲルの外層は混合液滴のコアを形成する対象組成物の液滴と混ざり、混合液滴の構造を変更する。
【００１２】
ジェットによる噴霧とは対照的に、微粒子が空気中に浮遊しているミストまたはエアロゾルの使用は、混合液滴の周囲全体に架橋剤の薄層の堆積を促進し、ヒドロゲル層の表面の少なくとも部分的な架橋を引き起こす。そのようなプロセスは、有利には、界面活性剤の使用を省くことを可能にし、これは、細胞を含むカプセルの製造にとって特に興味深いものであり得る。必要であれば、架橋が不十分である場合、架橋浴中でそれを続けることが可能である。本発明によれば、ヒドロゲルの前架橋された層は、落下後にカプセルが受け入れられる液体との衝撃でカプセルを保護する。さらに、これらのカプセルが架橋浴に浸漬される際、予備架橋層が存在すると、たとえ非常に薄くても、カプセルの構造を保護してその変形を防ぐのに十分である。さらに、任意の架橋浴への浸漬時間を短縮でき、その後のすすぎ工程も短縮できる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明は、中心コアを取り囲む架橋ヒドロゲルの外殻をそれぞれ含む複数のカプセルを製造する方法に関し、ここで、ヒドロゲル溶液と、中心コアを形成するように設計された水性の対象組成物とは、同心円状に共押出されて、それぞれが対象組成物の液滴を取り囲むヒドロゲル溶液の層を含む混合液滴を形成し、共押出ステップは、混合液滴が前記架橋性エアロゾルを通過するように、架橋性エアロゾル上で行われ、これにより、ヒドロゲル溶液の層が、前記エアロゾルと接触する対象組成物の液滴の周囲で少なくとも部分的に架橋する。
【００１４】
本発明はまた、ヒドロゲル層の外表面が、衝撃によって引き起こされる表面の不規則性の形で架橋性エアロゾルとの接触の痕跡を支える、そのようなプロセスによって得られるカプセルに関する。したがって、そのようなカプセルは、対象組成物の一滴からなる中心コアを取り巻く架橋ヒドロゲルの外層によって特徴付けられ、ここで、ヒドロゲル層の外面はハニカム状、すなわちハニカムで覆われている。
【００１５】
本発明はまた、中心コアが、20%未満、好ましくは10%未満のカプセル化によって引き起こされる過剰な死亡率を有する細胞を含む、上記のカプセルに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本発明による方法は、微粒子がヒドロゲル層の表面に合体する架橋性エアロゾルによる、中心コアの周りのヒドロゲル層の少なくとも部分的な架橋の工程を特徴とする。
【００１７】
具体的には、押出機の出口で形成された混合液滴は、押出流によって受容表面に向かって突出し、押出機の出口と受容表面との間に配置されたエアロゾルを通過する。
【００１８】
受容表面は、架橋性エアロゾルを通過した後にカプセルが落下（fall on）する又は落入（fall into）する要素（element）を意味する。一実施形態では、受容表面は、場合により架橋性溶液を含む回収浴からなる。
【００１９】
本発明によれば、ヒドロゲル溶液および対象組成物を同心円状に共押出するための任意の押出プロセスを使用できる。特に、Alessandri et al. (PNAS, September 10, 2013 vol. 110 no.37 14843-14848; Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604)、または、Onoe et al. (Nat Material 2013, 12(6):584-90)に記載されている方法およびマイクロ流体デバイスを適合させて、溶液を架橋性エアロゾル上に共押出させることにより、混合液滴を作製することが可能である。例えば、本発明による方法は、特許FR2986165に記載されているように、二重または三重同心シェルを備えた押出装置によって行われる。
【００２０】
本発明によれば、「混合液滴」は、周囲のヒドロゲル溶液および中心にある対象組成物が同心円状に共押出されることにより押出機の出口で得られる液滴を意味する。したがって、混合液滴は、対象組成物の液滴を取り囲む非架橋ヒドロゲル溶液の層から構成される。「一滴の対象組成物」は、対象組成物の小容量として定義され、液体、溶液、コロイド、または懸濁液、例えばゲル、クリームなどであり得る。一般に、対象組成物は有利には水性である。したがって、それは、液体形態の水性組成物、ゲル、クリームなどであり得る。ゲル形態の対象組成物の場合、前記ゲルは、有利には、混合液滴の外層を形成するために使用されるヒドロゲルとは異なる。好ましくは、対象組成物はアルギン酸塩を含まず、より一般的には架橋性化合物を含まない。
【００２１】
逆に、「カプセル」は、ヒドロゲル層が少なくとも部分的に架橋した後の、混合液滴に由来する生成物を意味する。したがって、カプセルは、対象組成物の液滴の周りを架橋することによって少なくとも部分的に硬化された外側のヒドロゲルシェルで構成される。
カプセルなどの混合液滴は、有利には形状が球形である。
【００２２】
本発明の文脈において、「架橋ヒドロゲル外殻」は、液体、好ましくは水によって膨潤したポリマー鎖のマトリックスから形成された三次元構造を意味する。このような架橋ヒドロゲル外殻は、ヒドロゲル溶液を架橋することにより得られる。有利には、ヒドロゲル溶液の1つまたは複数のポリマーは、温度、pH、イオンなどの刺激を受けたときに架橋可能なポリマーである。有利には、使用されるヒドロゲル溶液は、細胞への毒性がないという意味で生体適合性である。カプセル化される対象組成物が細胞を含む場合、ヒドロゲル層は、酸素および栄養素、ならびに二酸化炭素および代謝廃棄物の拡散を有利に可能にし、細胞に供給（feed）し、それらの生存を可能にする。ヒドロゲル溶液中のポリマーは、天然または合成起源であり得る。例えば、ヒドロゲル溶液は、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムなどのスルホン酸塩ベースのポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムなどのアクリレートベースのポリマー、ポリエチレングリコールジアクリレートなどの１または２以上のポリマー、化合物ゼラチンメタクリレート、細菌由来の多糖類、例えばジェランガム、または植物由来の多糖類、例えばペクチンやアルギン酸塩を含む多糖類を含む。
【００２３】
一実施形態では、ヒドロゲル溶液は少なくともアルギン酸塩を含む。優先的には、ヒドロゲル溶液はアルギン酸塩のみを含む。本発明の文脈において、「アルギン酸塩」は、β-D-マンヌロナート(M)およびα-L-グルロン酸塩(G)、それらの塩および誘導体から形成される線状多糖を意味する。有利には、アルギン酸塩は、80%Gを超え20%M未満で構成され、平均分子量が100から400 kDa(例えば:PRONOVA（登録商標）SLG100)で、総濃度が密度(重量/体積)で0.5%から5%であるアルギン酸ナトリウムである。
【００２４】
本発明によれば、架橋性エアロゾルは、アルギン酸塩などの少なくとも1つの親水性ポリマーを含むヒドロゲルと接触したときに、それと架橋するように適合された少なくとも1つの架橋剤を含む。好ましくは、架橋性エアロゾルは界面活性剤を含まない。
【００２５】
一実施形態では、架橋性エアロゾルは、架橋性溶液の微小液滴から形成される。そのようなエアロゾルは、溶液、特に膜ミスターからエアロゾルを形成するために従来使用されている任意の手段によって得ることができる。別の実施形態では、架橋性エアロゾルは、例えば、炭酸塩および/または塩化カルシウム微小粉末の形態の、架橋剤の固体微小粒子から構成される。
【００２６】
架橋性溶液は、有利には、少なくとも1つの二価カチオンを含有する。架橋性溶液は、架橋されるアルギン酸塩または親水性ポリマーの別の既知の架橋剤、または照射または当技術分野で既知の任意の他の技術による架橋を可能にするように適合された溶媒、例えば水またはアルコールを含む溶液であってもよい。有利には、架橋性溶液は、少なくとも1つの二価カチオンを含む溶液である。好ましくは、二価カチオンは、アルギン酸塩が溶液中で架橋されることを可能にするカチオンである。それは、例えば、Ca2+、Mg2+、Ba2+およびSr2+を含む群から選択される二価カチオン、またはこれらの二価カチオンの少なくとも2つの混合物であり得る。二価カチオン、例えば、Ca2+は、対イオンと組み合わせて、例えば、当業者に周知のタイプCaCl2またはCaCO3の溶液を形成できる。架橋性溶液はまた、CaCO3-GDL溶液を形成するグルコノデルタラクトン(GDL)と結合したCaCO3を含む溶液であり得る。架橋性溶液は、CaCO3-CaSO4-GDLの混合物であってもよい。本発明による方法の特定の実施形態では、架橋性エアロゾルは、特にCa2+の形態のカルシウムを含む架橋性溶液の微小液滴からなる。当業者は、二価カチオンおよび/または対イオンの性質、ならびにその濃度を、本発明の方法の他のパラメータ、特に、使用されるポリマーの性質および架橋の望ましい速度および/または程度に調整することができる。例えば、架橋性溶液中の二価カチオンの濃度は、10〜1000 mMである。架橋性溶液は、特定の条件下、特定の時間および/または温度でのヒドロゲル鞘の架橋を改善するために、上記のもの以外に当業者によく知られている他の成分を含んでもよい。
【００２７】
有利には、架橋性エアロゾルは、架橋性溶液の微小液滴から形成され、その直径は、有利には0.5〜20μm、好ましくは1〜10μm、より好ましくは5μm±2μmである。
【００２８】
一実施形態では、架橋性溶液の微小液滴またはエアロゾルを形成する固体微粒子は、混合液滴が、架橋性エアロゾルを通る押し出し流によって投射される速度よりも遅い落下速度を有する。優先的には、架橋性溶液の微小液滴またはエアロゾルを形成する固体微小粒子は、空気中に静的に懸濁される。一実施形態では、混合液滴は、重力によって架橋性エアロゾルを通って落下し、架橋性エアロゾルを通した混合液滴の落下速度は、架橋微小液滴または固体微粒子の落下速度よりも速い。
【００２９】
一実施形態では、架橋性溶液の微小液滴のエアロゾルは、3×103微小液滴/cm3の密度を有する。
【００３０】
有利には、架橋性溶液の微小液滴のエアロゾル体積は、エンクロージャ内で維持され、その寸法は、所望のエアロゾル密度および/または濃度を維持するように適合される。そのような封じ込めは、前記エアロゾルを無菌に保つことをさらに可能にする。
【００３１】
架橋性溶液の微小液滴は、混合液滴の表面上で、好ましくは均一に合体し、混合液滴の表面全体にわたってヒドロゲル層の少なくとも部分的な架橋を促進する。たとえば、直径が50〜500μmの各混合液滴は、表面に到達する前に、少なくとも100個の架橋性溶液の微小液滴によって囲まれ、少なくとも部分的に架橋した混合液滴をカプセルで受け取る。当業者は、液滴の高さ、エアロゾル中の微小液滴の密度、および/またはエアロゾル流量を適合させて、それらの表面に従って各混合液滴の周りに微小液滴の層を得ることができる。落下高さは、押出機出口とカプセル内の前記少なくとも部分的に架橋された混合液滴の受容表面との間のエアロゾルを通って混合液滴が移動した距離として定義される。
【００３２】
特定の例示的な実施形態において、cm3あたり3×103のマイクロ液滴の密度を有する架橋性溶液のマイクロ液滴のエアロゾルが使用され、前記エアロゾルは、直径約20cmのエンクロージャ内で20L/hの流量で噴霧され、エアロゾル内の混合液滴の落下高さを60cmに保ちながら、周囲の空気からエアロゾルを隔離することにより、エアロゾルの十分な密度を維持することを可能にする。
【００３３】
特定の実施形態では、架橋性溶液の微小液滴は、それらが互いに反発するように帯電され、したがって、エアロゾル中の微小液滴の電気分散を促進する。これは、例えば、エアロゾルにスプレー（spraying）または噴霧（fogging）する前に、架橋性溶液に直流を印加することにより達成できる。
【００３４】
代替的または追加的に、混合液滴、より具体的にはヒドロゲル溶液の層が帯電される。このようにして、混合液滴は、架橋性エアロゾルを通過するときに、より大きい断面半径にわたって分散する。これは、架橋に有用なエアロゾルの量を増やすことにより、必要な液滴の高さを減らす。実際、前のものと同じ軌道を通過する混合液滴は、より少ない架橋微小液滴に遭遇する。さらに、これにより、飛行中および衝撃時の混合液滴の凝集/溶融のリスクも減少する。
【００３５】
架橋性溶液の微小液滴および混合液滴が帯電している場合、混合液滴の表面の周りの微小液滴の堆積に有利になるように、電荷は反対であるのが有利である。
【００３６】
一実施形態では、架橋性エアロゾルは、カプセルの中心コアを形成する対象組成物の浸透圧よりも0.1から10倍高い浸透圧または浸透圧濃度を有する。優先的には、架橋性エアロゾルは、カプセルの中心コアを形成する対象組成物の浸透圧よりも0.3から3倍高い浸透圧または浸透圧濃度を有する。別の実施形態では、架橋性エアロゾルおよびカプセルの中心コアを形成する対象組成物は、等浸透圧であり、すなわち、実質的に等しい浸透圧濃度を有する。例えば、対象組成物が細胞の組成物である場合、100mMのカルシウム溶液から架橋性エアロゾルが形成される。一般に、浸透圧によって発生する混合液滴の変形を回避し、カプセルの構造を維持するために、架橋性エアロゾルは高浸透性であるべきでない。
【００３７】
本発明によれば、回収浴中で架橋性エアロゾルを通過した後に、予め硬化したカプセルを受け取ることが可能である。この場合、回収浴は、カプセルの中心コアを形成する対象組成物と等浸透圧であることが好ましい。
【００３８】
一実施形態では、必要に応じて、回収浴は、ヒドロゲルをさらに架橋するための架橋性溶液を含んでもよい。このような架橋性溶液は、必要に応じて、界面活性剤を含んでもよい。そうでなければ、特に、架橋性エアロゾルを通って落下する際のヒドロゲルの架橋が十分である場合、架橋浴は、単純な生理食塩水を含み得る。
【００３９】
有利には、混合液滴は界面活性剤を含まない。特に、ヒドロゲル組成物は、有利には界面活性剤を含まない。同様に、本発明によるカプセルは、有利には、架橋されたヒドロゲル層および中心コアの両方に界面活性剤を含まない。
【００４０】
有利には、ヒドロゲル溶液および対象組成物は、混合液滴を形成するように共押出しされ、次いで、直径が50〜500μmの球状のカプセルを形成する。特定の実施形態では、外側のヒドロゲルシェルの厚さは、カプセルの半径の5〜40%を表す。本発明の文脈において、「厚さ」は、カプセルの中心から半径方向に延びる寸法である。当業者は、そのような寸法を得るために共押出パラメータをどのように適合させるかを知っている。
【００４１】
本発明によれば、対象組成物は、ヒドロゲル溶液と共押出して、一滴の前記対象組成物を含むカプセルを形成できる任意の組成物を意味する。有利には、対象組成物は、液体、水性またはゲル化組成物である。一実施形態では、水性組成物はゲル化水性組成物である。特に、細胞を含む組成物、食品組成物、化粧品組成物または医薬組成物を使用することが可能である。例えば、対象組成物は、タンパク質ゲルおよび/または細胞ゲルである。
【００４２】
本発明によれば、任意のタイプの細胞組成物を使用できる。特に、ヒト多能性幹細胞を取り囲むヒドロゲルカプセルを作ることが可能である。多能性幹細胞、または多能性細胞は、生物全体を形成できずに、起源の生物全体に存在するすべての組織を形成する能力を有する細胞として定義される。特に、本発明によるカプセルは、例えば体細胞からの人工多能性幹(IPS)細胞を含み得る。より一般的には、本発明の文脈において、細胞組成物は、ヒト胚に由来する細胞を含まない。
【００４３】
特定の実施形態において、ヒドロゲル溶液は、アルギン酸塩溶液(例えば、SLG100)であり、中心コアを形成するための対象組成物は、細胞(例えば、マトリゲル(登録商標)に再懸濁されたIPS細胞)を含み、そして架橋性エアロゾルは、塩化カルシウムの水性溶液の微小液滴を含む。
【実施例】
【００４４】
実施例1：ヒト多能性細胞の組成物を含むヒドロゲルカプセルを製造するためのプロトコル。
【００４５】
使用した溶液：
溶液1、2μMチアゾビビンを補添したDMEMF12培地ベース
溶液2、1μMチアゾビビンを補添したマグネシウムとカルシウムを含まないPBS
溶液3、非酵素的細胞剥離バッファー：2μMチアゾビビンを補添したRelesRTM。
溶液4、多能性幹細胞培養培地：MTeSR1TMhES/hIPS細胞培地STEMCELLTM)。
溶液4+、2μMチアゾビビンを補添した溶液4。
溶液5、MatrigelTM。
溶液6、2μMチアゾビビンを含む300mMソルビトール。
【００４６】
細胞溶液：
次に、90%コンフルエンスのヒトIPS細胞の25cm2ペトリ皿を使用して、推奨容量に一致させる。以降のすべてのステップは、押出機出口まで4℃で行なう。
ステップ1：細胞を溶液1ですすぐ。10分から1時間待つ。
ステップ2：4mLの溶液2で2回すすぐ。
ステップ3：溶液を静かに吸引する。
ステップ4：細胞を4mLの溶液3で5〜10分間インキュベートする。
ステップ5：剪断応力を軽減するために、幅の広いチップピペットを使用して、2mLの溶液4で細胞を分離する。
ステップ6：細胞懸濁液を360gで5分間遠心する。
ステップ7：上清を吸引する。
ステップ8：0.5mLの溶液4+で再懸濁する。
ステップ9：再度360rcfで遠心し、上清を吸引する。
ステップ10：細胞ペレットを70μLの溶液5と100μLの溶液6において再懸濁する(ペレット量は30μLにする必要がある)。細胞溶液は準備ができている。
【００４７】
カプセル化：
カプセル化デバイス(押出機)は、Alessandri et al.、2016(「ヒト神経幹細胞(hNSC)の培養および分化のための機能化ヒドロゲルマイクロカプセルの製造のための3Dプリントされたマイクロ流体デバイス」、Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604)に説明されるようにして、2つの変更を加えて準備する：アルギン酸塩溶液中の界面活性剤の不在と形成浴の周りの50 cmの高さのエンクロージャの存在により、架橋浴と同じ溶液(300 mosmol CaCl2)の噴霧からのエアロゾルを含ませる。
【００４８】
要約すると、デバイスのさまざまな部分を(オートクレーブによって)滅菌する；3つの必要な溶液を3つのシリンジバレル：i)アルギン酸塩溶液(蒸留水中2質量%のPRONOVA（登録商標）SLG100)、ii)中間溶液(300 mMソルビトール)、iii)細胞溶液(前のステップで調製) にロードする；3つの溶液を、マイクロ流体インジェクターを使用して同心円状に共注入し、これにより、液滴に分裂するジェットの形成が可能になり、その外層はアルギン酸塩溶液で、コアは細胞溶液となる。
【００４９】
液滴を電気分散させるために、アルギン酸塩を+2kVの直流で荷電（チャージ）した。直径2cmの接地リングを、マイクロ流体インジェクターを出るジェットの軸に垂直な平面の先端から2mmに配置し、電界を生成する。
【００５０】
ジェットの分割と液滴の電気分散の後、エンクロージャに含まれる架橋性溶液のエアロゾルを通過する(1立方メートルのガスあたり約3x10E9個の液滴のオーダーで、各液滴は直径が1〜10μmであり、100mMカルシウム水溶液を含有する)。混合液滴の表面での架橋性溶液の液滴の合体により、それらの表面を硬化させ、それらがそれらの内部構造を維持しながらカルシウム浴(回収/架橋浴)に浸透することが可能となる。これらの液滴は、アルギン酸塩溶液の架橋を完了させてシェルを形成するカルシウム浴(100mM)に収集される。
【００５１】
これらのカプセル化条件下では、アルギン酸塩層の架橋が自然に発生することに注意する。
【００５２】
カプセル化後の処理：
ステップ1：カプセルを40μmのセルシーブで回収し、溶液1ですすいだ後、20mLの溶液4+が入った75cm2フラスコに保存する。
ステップ2：フラスコを37℃、5%CO2のインキュベーターで12時間保持する。
ステップ3：溶液4の培地を交換して、嚢胞を形成させる。
ステップ4：24から72時間後、数ダースの細胞の嚢胞がカプセル内に形成される。細胞のマイクロコンパートメントは、5〜10日後に成熟する。
【国際調査報告】
2021504132.tif 000002
2021504132.tif 000003
2021504132.tif 000004
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