(57)【要約】本開示は、細胞遊走および転移を減少させ、かつ腫瘍質量または負荷を減少させるために遺伝子療法を使用する組成物および方法を提供する。本明細書に開示される方法は、癌バイオマーカーの発現を阻害し、かつ細胞遊走または腫瘍サイズを減少させるＰＣＢＰ１および／またはＰＣＢＰ１変異体を含有するプラスミド、ベクター、および非ウイルスベクターを用いる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ＰＣＢＰ１核酸配列を含むベクターを細胞に導入することを含む、細胞遊走を阻害する、予防する、または減少させる方法。
【請求項２】
変異型ＰＣＢＰ１核酸配列を含むベクターを癌細胞に導入することを含む、癌を治療する方法。
【請求項３】
前記方法が、インビトロで実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、エクスビボで実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、インビボで実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、哺乳動物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞が、ヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞が、臓器細胞、組織細胞、または血液細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物細胞が、癌細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌細胞が、黒色腫、前立腺癌、または乳癌由来の細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異型ＰＣＢＰ１核酸配列が、完全にリン酸化されていないポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異型ＰＣＢＰ１が、ＰＡＫによって完全にリン酸化されていない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記変異型ＰＣＢＰ１核酸が、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号１）と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異型ＰＣＢＰ１核酸が、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号１）に対し少なくとも７５％の同一性パーセントを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記変異型ＰＣＰＢ１核酸が、配列番号３の配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異型ＰＣＢＰ１核酸が、配列番号５の配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベクターが、変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドをコードする変異型ＰＣＢＰ１核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドが、完全にリン酸化されていない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドが、ＰＡＫによって完全にリン酸化されていない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドが、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号２）と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドが、ＰＣＢＰ１型（配列番号２）との少なくとも７５％の同一性パーセントを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異型ＰＣＰＢ１ポリペプチドが、配列番号４の配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドが、配列番号６の配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、前記ＰＣＢＰ１核酸配列の複数のコピーを発現する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、ＰＣＢＰ１ポリペプチドの複数のコピーを発現する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクターが、ＰＣＢＰ１の１つ、２つ、および／または３つのドメインをコードする変異型ＰＣＢＰ１核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記変異型ＰＢＣＢ１の前記１つ以上のドメインが、完全にリン酸化されていない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
変異型ＰＣＢＰ１核酸配列を含むベクターを細胞に導入することを含む、細胞遊走および／または癌発生を経過観察するための方法。
【請求項２９】
前記細胞遊走が転移である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、治療的処置に曝露されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療的処置が、化学療法的処置である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌細胞が、インビトロで治療的処置に曝露された、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞が、インビボで治療的処置に曝露された、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月５日に出願された米国仮出願第６２／６２６，４２４号の利益を主張し、その内容は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０００２】
本開示は、細胞遊走および癌転移を阻害し、かつ腫瘍負荷を減少させるための組成物および方法に関する。具体的には、本開示は、癌細胞遊走ならびに癌発生および／または転移を阻害するための癌細胞の形質導入のための方法および組成物を提供する。組成物は、インビトロ、インビボ、エクスビボ、または原位置で投与され得る。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：ＩＢＥＸ−００３／０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、データ記録日：２０１９年２月５日、ファイルサイズ１５キロバイト）。
【背景技術】
【０００４】
再生肝臓のホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）は発癌因子であり、その活性化は腫瘍形成および転移と関連する場合が多い。これまでの研究は、ポリ（ｒＣ）結合タンパク質（ＰＣＢＰ１）がＰＲＬ−３の発現を減少させ、かつ発癌の発生を阻害することが可能であり得ることを示している。
【０００５】
癌に対する新規の遺伝子療法の将来性を現実化するために、癌細胞は、癌発生、ならびに腫瘍形成および転移に関連するバイオマーカーの発現が減少するか、または予防されるように操作されなければならない。これにより、癌細胞の発生を予防し、かつ／またはそれらが転移することを防ぎ、かつ全身にわたる組織および臓器の浸潤を最小限に抑える。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、遺伝子療法を使用して、ＰＣＢＰ１ポリペプチド、その変異体および／またはバリアントをコードする組成物で癌細胞をトランスフェクトまたは／および形質導入することによって、腫瘍発生、成長、細胞遊走、および／または転移を阻害する方法を提供する。
【０００７】
いくつかの態様において、本開示は、ＰＣＢＰ１または変異型ＰＣＢＰ１核酸配列を含むベクターを細胞に導入することを含む、細胞遊走を阻害する、予防する、または減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞遊走は、転移である。
【０００８】
いくつかの態様において、本開示は、ＰＣＢＰ１または変異型ＰＣＢＰ１核酸配列を含むベクターを癌細胞に導入することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、方法は、インビトロで実施される。いくつかの実施形態において、方法は、エクスビボで実施される。いくつかの実施形態において、方法は、インビボで実施される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒトである。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、臓器細胞、組織細胞、または血液細胞である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、癌細胞は、黒色腫、前立腺癌、膵臓癌、膠芽腫、網膜芽腫、または乳癌由来の細胞である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１核酸配列は、野生型ＰＣＢＰ１と比較してリン酸化することができないか、または完全にリン酸化することができないポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１は、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）によってリン酸化されていないか、または完全にリン酸化されていない。
【００１３】
いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１核酸は、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号１）と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１核酸は、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号１）との少なくとも７５％の同一性パーセントを有する。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＰＢ１核酸は、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１核酸は、配列番号５の配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ベクターは、変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドをコードする変異型ＰＣＢＰ１核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、野生型ＰＣＢＰ１と比較してリン酸化されていないか、または完全にリン酸化されていない。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、Ｐ２１活性化キナーゼ−１（ＰＡＫ１）によってリン酸化されていないか、または完全にリン酸化されていない。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１は、リン酸化ＰＣＢＰ１産生を阻害または防止する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号２）と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号２）との少なくとも７５％の同一性パーセントを有する。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＰＢ１ポリペプチドは、配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、配列番号６の配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、細胞は、野生型または変異型ＰＣＢＰ１核酸配列の複数のコピーを発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、野生型または変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドの複数のコピーを発現する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】野生型または変異型ＰＣＢＰ１配列を含む代表的なレンチウイルスベクターを示す。このベクターにおいて、ＰＣＢＰ１は、ＥＦ１ａプロモーター、続いてＩＲＥＳ−ＧＦＰレポーター遺伝子カセットを含む二次発現カセットによって駆動される。
【図１Ｂ】野生型または変異型ＰＣＢＰ１配列を含む代表的なＡＡＶベクターを示す。このベクターにおいて、ＰＣＢＰ１配列の発現は、ＥＦ１ａプロモーター、続いてＩＲＥＳ−ＧＦＰレポーター遺伝子カセットを含む二次発現カセットによって駆動される。このベクターは、ＧＦＰ配列の後に挿入されたＷＰＲＥフラグメントを含んで、導入遺伝子（複数可）の発現を増強することができる。
【図２Ａ】群間の倍率変化を測定する本開示の組成物でトランスフェクトした黒色腫細胞における遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す（ｄｄｃｔ）：それぞれ、ＧＦＰのみ対ＧＦＰおよび野生型ＰＣＢＰ１（ｗＰＣＢＰ１＿０）は、発現が４．０１２倍高いＰＣＢＰ１の上方調節を示し、ＧＦＰのみ対ＧＦＰおよびＰＣＢＰ１  Ｓ２２３Ｌ（ｍＰＣＢＰ１＿１）は、３．９７高いＰＣＢＰ１発現を示し、ＧＦＰのみ対ＧＦＰおよびＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ（ｍＰＣＢＰ１＿２）は、４．０２倍高いＰＣＢＰ１発現を示す（＊ｐ＜０．０１）。ハウスキーピング遺伝子は、ＧＡＰＤＨである。
【図２Ｂ】本開示の治療用遺伝子ベクターのインビトロトランスフェクション後の黒色腫細胞におけるＧＦＰ発現を示す。（Ａ）：ＧＦＰのみ、（Ｂ）ｗＰＣＢＰ１＿０−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、（Ｃ）ｍＰＣＢＰ１＿１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、（Ｄ）：ｍＰＣＢＰ１＿２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ。（スケールバー：２００μｍ）。
【図３】黒色腫細胞におけるＰＣＢＰ１（野生型および変異型）遺伝子の異なる形態をコードする遺伝子療法ベクターによる処置後のウエスタンブロット分析によるＰＲＬ−３タンパク質発現を示す。レーン１：ＧＦＰのみ、レーン２：ｍＰＣＢＰ１＿１＋ＧＦＰ、レーン３：ｗＰＣＢＰ１＿０＋ＧＦＰ、レーン４：ＰＣＢＰ１＿２＋ＧＦＰ。ベータ−アクチンは対照である。
【図４Ａ】トランスフェクトした黒色腫細胞の遊走を実証するために、ウェル内の全ての細胞と比較した遊走細胞の割合としての、円検出ゾーン（ＣＤＺ）における正味細胞数差の比較を示す。ＧＦＰ群における（ウェル当たりの）遊走細胞の割合（１１．３３）は、ｗＰＣＢＰ１＿０（本明細書において「ＰＣＢＰ１」とも称される野生型ＰＣＢＰ１）、ｍＰＣＢＰ１＿１、およびｍＰＣＢＰ１＿２よりも有意に高かった。これらの３つの群のうち、ｍＰＣＢＰ１＿２は、ウェル当たりの遊走細胞の割合が最も低い（１．８２）。（＊Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｂ】細胞遊走アッセイを示す。細胞遊走アッセイを１日目および５日目に読み取り、蛍光顕微鏡（緑色フィルタ）下で観察した。一番上の行は、１日目および５日目からのｗＰＣＢＰ１＿０の細胞遊走を示し、中間の行は、ｍＰＣＢＰ１＿２およびｍＰＣＢＰ１＿１を示し、一番下の行は、ＧＦＰ群を示す。Ａ列は、１日目の細胞遊走ウェル（白い点線の円は、円検出ゾーン、またはＣＤＺと呼ばれる）であり、Ｂ列は、５日目の細胞遊走ウェル（ＣＤＺは白い点線）であり、Ｃ列は、Ｂ列の拡大ＣＤＺである。
【図４Ｃ】１日目から５日目のＣＤＺにおける正味細胞数差の比較として、円検出ゾーン（ＣＤＺ）遊走アッセイにおける正味細胞数差を示す。黒色腫細胞をＧＦＰ、ｗＰＣＢＰ１＿０、ｍＰＣＢＰ１＿１、またはｍＰＣＢＰ１＿２によってトランスフェクトした。
【図５】乳癌（ＢＣ）細胞株（ＭＣＦ−７）におけるＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡレベルの倍率変化を示す。グラフは、ＭＣＦ−７にトランスフェクトしたＰＣＢＰ１（ＷＴ／変異型）またはＧＦＰのみのベクターにおけるＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡ倍率変化のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。ＧＦＰのみの群と比較して、全てのＰＣＢＰ１＋ＧＦＰ群（ＷＴおよび変異型）は、乳癌細胞におけるＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡ発現レベルの有意な増加を示す（図に示される倍率変化、＊Ｐ＜０．０１）。（ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質ベクター。ｗ  ＰＣＢＰ１＿０−ＧＦＰベクター；ｍＰＣＢＰ１＿１（１部位の変異（ｃ６６８ｔ））；ｍＰＣＢＰ１＿２（２部位の変異（ａ１７８ｇ  ＆  ａ３７９ｇ））。
【図６】ＧＦＰのみ（レーン１）、ｗＰＣＢＰ１＿０（レーン２）、ｍＰＣＢＰ１＿１（レーン３）、およびｍＰＣＢＰ１＿２（レーン４）をコードするベクターで処置した後の、形質転換された乳癌（ＭＣＦ−７）細胞におけるＰＲＬ３タンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す。
【図７Ａ】円検出ゾーン（ＣＤＺ）でカウントされた正味細胞差と、ウェル当たりの全細胞の蛍光強度との比較比率を示す。
【図７Ｂ】乳癌細胞（ＭＣＦ−７）遊走アッセイを示す。細胞遊走アッセイを１日目および５日目に読み取り、蛍光顕微鏡（緑色フィルタ）下で観察した。（ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質）。ｗ  ＰＣＢＰ１＿０−ＧＦＰベクター；ｍＰＣＢＰ１＿１（１部位の変異（ｃ６６８ｔ）−ＧＦＰベクター）；ｍＰＣＢＰ１＿２（２部位の変異（ａ１７８ｇ  ＆  ａ３７９ｇ）−ＧＦＰベクター）。
【図７Ｃ】ＧＦＰ、ｗＰＣＢＰ１＿０、ｍＰＣＢＰ１＿１、またはｍＰＣＢＰ１＿２によってトランスフェクトされた乳癌細胞（ＭＣＦ−７）についての細胞遊走アッセイを示す。
【図８Ａ】ＰＣＢＰ１（野生型／変異型）またはＧＦＰ（対照）トランスフェクション後の乳癌（ＭＣＦ−７）死細胞アッセイを示す。上清を除去し、市販の生／死細胞アッセイキットを適用することによって、死細胞を測定した。Ａ：ＧＦＰトランスフェクション後の乳癌細胞密度および明野顕微鏡による観察。Ｂ：野生型ＰＣＢＰ１トランスフェクション後の乳癌細胞密度および明野顕微鏡による観察。Ｃ：ｍＰＣＢＰ１＿１（１部位の変異）トランスフェクション後の乳癌細胞密度および明野顕微鏡による観察。Ｄ：ｍＰＣＢＰ１＿２（２部位の変異）トランスフェクション後の乳癌細胞密度および明野顕微鏡による観察。Ｅ：ＰＣＢＰ１（野生型／変異型）および／またはＧＦＰベクターによるトランスフェクション後のマイクロプレートリーダーを使用した蛍光強度測定による乳癌細胞の死細胞数。（ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質によってトランスフェクトされた細胞。ｗＰ：野生型ＰＣＢＰ１によってトランスフェクトされた細胞。Ｐ１：ｍＰＣＢＰ１＿１（１部位の変異）によってトランスフェクトされた細胞。Ｐ２：ｍＰＣＢＰ１＿２（２部位の変異）によってトランスフェクトされた細胞。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図８Ｄ】同上。
【図８Ｅ】同上。
【図９Ａ】本開示の組成物のうちの１つでのトランスフェクション後の膵臓癌細胞におけるＰＣＢＰ１発現を示す。グラフは、野生型ＰＣＢＰ１（処置）またはＧＦＰ（癌細胞）を含有するベクターが膵臓癌細胞にトランスフェクションされた後のＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡ倍率変化のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。ＧＦＰ群と比較して、ＰＣＢＰ１群は、膵臓癌細胞におけるＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡレベルの有意な増加を示す（図９Ａに示される倍率変化）。ＧＦＰ群はまた、ＰＣＢＰ１群と比較して高いＰＲＬ３  ｍＲＮＡ発現を示した（図９Ｂに示される倍率変化）。
【図９Ｂ】同上。
【図１０】ＧＦＰ群（対照）と比較した、前立腺癌細胞株（ＤＵ−１４５）におけるＰＣＢＰ１の野生型および変異型を有する処置群におけるＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡ発現レベルの倍率変化を示す。グラフは、ＰＣＢＰ１（ＷＴ／変異型）＋ＧＦＰまたはＧＦＰのみを含有するベクターでトランスフェクトした癌細胞（ＤＵ−１４５）におけるＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡ発現倍率変化を示すｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。ＧＦＰ群と比較して、全てのＰＣＢＰ１群（ＷＴおよび変異型）は、前立腺癌細胞におけるＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡレベルの有意な増加を示した（図に示される倍率変化、＊Ｐ＜０．０１）。（ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質ベクター。ｗＰＣＢＰ１＿０−ＧＦＰベクター；ｍＰＣＢＰ１＿１（１部位の変異）；ｍＰＣＢＰ１＿２（２部位の変異）。
【図１１】ｑＲＴ−ＰＣＲによる膠芽腫細胞株対皮質ニューロン細胞株（ＨＣＮ−２）におけるＰＲＬ３  ｍＲＮＡ発現レベルの測定を示す。正常な脳皮質細胞株と比較して、ＰＲＬ３  ｍＲＮＡは、試験した６つ全ての膠芽腫細胞株において過剰発現する。
【図１２】細胞特異的プロモーターの制御下でＰＣＢＰ１（野生型または変異型）を発現するＡＡＶベクターの概略図を示す。ここで、ＰＣＢＰ１配列（ｗｔ、ｍＰＣＢＰ１＿１、またはｍＰＣＢＰ１＿２）の発現は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターなどの細胞特異的プロモーターによって駆動されて、脳内の膠芽腫を治療する。ＧＦＰまたはＬａｃＺは、治療用タンパク質（例えば、ＰＣＢＰ１）の共局在化および特定の細胞型におけるマーカータンパク質発現を例示するために使用されるレポーター遺伝子である。
【図１３Ａ】膠芽腫（脳）細胞における特異的プロモーターによって駆動される導入遺伝子発現のインビトロ検出を示す。ｐｈＧＦＡＰ−ＬａｃＺベクターでトランスフェクトしたＬＮ２２９膠芽腫細胞を、免疫組織化学を介して分析した。癌細胞（ＬＮ２９９）を、明野顕微鏡によって観察した（パネルＡ）。特異的プロモーターによって駆動されるＬａｃＺ遺伝子由来の発現タンパク質を、抗β−ガラクトシダーゼ抗体Ａ１１１３２（１：７００に希釈）によって検出した。（パネルＢ）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｎｉｇｈｔｓ（商標）５５７コンジュゲート抗ウサギ抗体（ＮＬ００４、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を二次抗体（希釈１：２００）として使用し、赤色蛍光シグナルをもたらした。倍率は２０倍である。
【図１３Ｂ】同上。
【図１４Ａ】膠芽腫（脳）細胞における特異的プロモーターによって駆動される導入遺伝子発現のインビトロ検出を示す。ｐｈＧＦＡＰ−ＬａｃＺベクターでトランスフェクトしたＵ８７膠芽腫細胞を、免疫組織化学を介して分析した。癌細胞（Ｕ８７）を、明野顕微鏡によって観察した（パネルＡ）。特異的プロモーターによって駆動されるＬａｃＺ遺伝子由来の発現タンパク質を、抗β−ガラクトシダーゼ抗体Ａ１１１３２（１：７００に希釈）によって検出した。（パネルＢ）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｎｉｇｈｔｓ（商標）５５７コンジュゲート抗ウサギ抗体（ＮＬ００４、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を二次抗体（希釈１：２００）として使用し、赤色蛍光シグナルをもたらした。倍率は２０倍である。
【図１４Ｂ】同上。
【図１５Ａ】腎臓細胞における特異的プロモーターによって駆動される導入遺伝子発現のインビトロ検出を示す。ｐｈＧＦＡＰ−ＬａｃＺベクターでトランスフェクトした２９３ＦＴ腎臓細胞を、免疫組織化学を介して分析した。２９３ＦＴ腎臓細胞を、明野顕微鏡によって観察した（パネルＡ）。特異的プロモーターによって駆動されるＬａｃＺ遺伝子由来の発現タンパク質は、抗β−ガラクトシダーゼ抗体Ａ１１１３２（１：７００に希釈）によって検出されなかった。（パネルＢ）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｎｉｇｈｔｓ（商標）５５７コンジュゲート抗ウサギ抗体（ＮＬ００４、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を二次抗体（希釈１：２００）として使用し、これは、β−ガラクトシダーゼがこれらの細胞内で発現した場合、赤色蛍光シグナルをもたらしたであろう。倍率は２０倍である。
【図１５Ｂ】同上。
【図１６Ａ】眼細胞における特異的プロモーターによって駆動される導入遺伝子発現のインビトロ検出を示す。ｐｈＧＦＡＰ−ＬａｃＺベクターでトランスフェクトしたＡＲＰＥ−１９眼細胞を、免疫組織化学を介して分析した。ＡＲＰＥ−１９眼細胞を、明野顕微鏡によって観察した（パネルＡ）。特異的プロモーターによって駆動されるＬａｃＺ遺伝子由来の発現タンパク質は、抗β−ガラクトシダーゼ抗体Ａ１１１３２（１：７００に希釈）によって検出されなかった。（パネルＢ）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｎｉｇｈｔｓ（商標）５５７コンジュゲート抗ウサギ抗体（ＮＬ００４、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を二次抗体（希釈１：２００）として使用し、これは、β−ガラクトシダーゼがこれらの細胞内で発現した場合、赤色蛍光シグナルをもたらしたであろう。倍率は２０倍である。
【図１６Ｂ】同上。
【図１７】ｑＲＴ−ＰＣＲによる、異なる細胞型におけるｐｈＧＦＡＰプロモーターによって駆動されるＬａｃＺ  ｍＲＮＡ発現の検出を示す。異なる細胞（ＬＮ２２９、Ｕ８７、ＡＲＰＥ−１９、および２９３ＦＴ）におけるＬａｃＺ  ｍＲＮＡ発現レベルを、これらの細胞をｈＧＦＡＰの制御下でＬａｃＺを含有するベクターでトランスフェクトした後にモニタリングした。倍率変化を対照としてＡＡＶ−ＧＦＰベクターと比較した（＊ｐ＜０．０５）。これらのデータは、ＬａｃＺタンパク質がｈＧＦＡＰプロモーター下の膠芽腫（脳）細胞（例えば、Ｕ８７細胞およびＮＬ２２９細胞）で発現するが、他の細胞型（例えばＡＲＰＥ−１９細胞および２９３ＦＴ細胞）では発現しないことを確認する。
【図１８Ａ】ＧＦＰのみ、野生型ＰＣＢＰ１（ｗＰ）、ｍＰＣＢＰ１＿１（Ｐ１）、またはｍＰＣＢＰ１＿２（Ｐ２）のいずれかを含有するＡＡＶベクターでトランスフェクトした後の膠芽腫細胞株ＬＮ２２９およびＵ８７細胞の細胞生存率を示す。パネルＡは、ＬＮ２２９膠芽腫細胞の生存率を示す。パネルＢは、Ｕ８７膠芽腫細胞の生存率を示す。（＊ｐ＜０．０５対ＧＦＰ）．
【図１８Ｂ】同上。
【図１９Ａ】対照またはＰＣＢＰ−１含有ベクターによるトランスフェクション後のＵ８７膠芽腫細胞における生／死細胞シグナルを示す。細胞をＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（ｗＰ）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿１（Ｐ１）、またはＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿２（Ｐ２）でトランスフェクトし、４日後に細胞生存率を試験した。生細胞をカルセインＡＭで染色し（パネルＡ）、死細胞をＥｔｈＤ−１で染色した（パネルＢ）。ＧＦＰ対照ベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、ＰＣＢＰ１含有ベクターでトランスフェクトした後、死細胞は有意に増加した。＊ｐ＜０．０５
【図１９Ｂ】同上。
【図２０Ａ】ＡＡＶ−ＧＦＰ（パネルＡ）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（パネルＢ（ｗＰ））、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿１（パネルＣ（Ｍｕ１））、またはＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿２（パネルＤ（Ｍｕ２））によるトランスフェクション後の生および死Ｕ８７膠芽腫細胞の染色を示す。
【図２０Ｂ】同上。
【図２０Ｃ】同上。
【図２０Ｄ】同上。
【図２１】ＡＡＶ−ＧＦＰ（レーン１）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（レーン２）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿１（レーン３）、またはＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿２（レーン４）のいずれかでトランスフェクトしたＵ８７膠芽腫細胞におけるＰＲＬ３発現レベルを示す。ウエスタンブロットを使用して、ＰＲＬ３タンパク質レベルを試験した。ベータアクチンを内部負荷対照として使用した。
【図２２Ａ】対照またはＰＣＢＰ−１含有ベクターによるトランスフェクション後のＬＮ２２９膠芽腫細胞における生／死細胞シグナルを示す。細胞をＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（ｗＰ）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿１（Ｐ１）、またはＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿２（Ｐ２）でトランスフェクトし、４日後に細胞生存率を試験した。生細胞をカルセインＡＭで染色し（パネルＡ）、死細胞をＥｔｈＤ−１で染色した（パネルＢ）。ＧＦＰ対照ベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、ＰＣＢＰ１含有ベクターでトランスフェクトした後、死細胞は有意に増加した。＊ｐ＜０．０５
【図２２Ｂ】同上。
【図２３Ａ】ＡＡＶ−ＧＦＰ（パネルＡ）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（パネルＢ（ｗＰ））、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿１（パネルＣ（Ｍｕ１））、またはＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿２（パネルＤ（Ｍｕ２））によるトランスフェクション後の生および死ＬＮ２２９膠芽腫細胞の染色を示す。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２３Ｄ】同上。
【図２４】ＡＡＶ−ＧＦＰ（レーン１）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（レーン２）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿１（レーン３）、またはＡＡＶ−ＰＣＢＰ１＿２（レーン４）のいずれかでトランスフェクトしたＬＮ２２９膠芽腫細胞におけるＰＲＬ３タンパク質レベルを示す。ウエスタンブロットを使用して、ＰＲＬ３タンパク質レベルを試験した。ベータアクチンを内部負荷対照として使用した。
【図２５Ａ】ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＣＢＰ１および変異体によるトランスフェクション後の膠芽腫Ｍ０５９Ｊ細胞株の生／死分析を示す。ｗＰ＝野生型ＰＣＢＰ１、Ｐ１＝ｍＰＣＢＰ１＿１、Ｐ２＝ｍＰＣＢＰ１＿２。＊ｐ＜０．０５、ＧＦＰと比較して。
【図２５Ｂ】同上。
【図２６Ａ】ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＣＢＰ１および変異体によるトランスフェクション後の膠芽腫Ｍ０５９Ｋ細胞株の生／死分析を示す。ｗＰ＝野生型ＰＣＢＰ１、Ｐ１＝ｍＰＣＢＰ１＿１、Ｐ２＝ｍＰＣＢＰ１＿２。＊ｐ＜０．０５、ＧＦＰと比較して。
【図２６Ｂ】同上。
【図２７Ａ】ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＣＢＰ１および変異体によるトランスフェクション後の膠芽腫Ｕ１１８ＭＧ細胞株の生／死分析を示す。ｗＰ＝野生型ＰＣＢＰ１、Ｐ１＝ｍＰＣＢＰ１＿１、Ｐ２＝ｍＰＣＢＰ１＿２。＊ｐ＜０．０５、ＧＦＰと比較して。
【図２７Ｂ】同上。
【図２８Ａ】ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＣＢＰ１および変異体によるトランスフェクション後の膠芽腫Ｕ１３８ＭＧ細胞株の生／死分析を示す。ｗＰ＝野生型ＰＣＢＰ１、Ｐ１＝ｍＰＣＢＰ１＿１、Ｐ２＝ｍＰＣＢＰ１＿２。＊ｐ＜０．０５、ＧＦＰと比較して。
【図２８Ｂ】同上。
【図２９】ＰＣＢＰ１でトランスフェクトしたＵ８７膠芽腫細胞におけるウエスタンブロットによるｐＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）タンパク質レベルの測定を示す。細胞をＡＡＶ−ＧＦＰ（レーン１）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（レーン２）、ＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿１（レーン３）、またはＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿２（レーン４）でトランスフェクトした。膠芽腫細胞における全ての形態のＰＣＢＰ１で下方調節したＳＴＡＴ３レベルによる処置であり、ｍＰＣＢＰ１＿２が最も有意な効果を示す。ベータアクチンは内部対照として機能した。
【図３０】ＰＣＢＰ１でトランスフェクトしたＬＮ２９９膠芽腫細胞におけるウエスタンブロットによるｐＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）タンパク質レベルの測定を示す。細胞をＡＡＶ−ＧＦＰ（レーン１）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（レーン２）、ＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿１（レーン３）、またはＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿２（レーン４）でトランスフェクトした。全ての形態のＰＣＢＰ１による処置が、膠芽腫細胞においてＳＴＡＴ３レベルを下方調節し、ｍＰＣＢＰ１＿２が最も有意な効果を示す。（パネルＡ）。パネルＢは、パネルＡにおけるレーン１および２の反復ウエスタンブロット測定を示す。ベータアクチンは内部対照として機能した。
【図３１Ａ】ＰＣＢＰ１または変異体によるトランスフェクション後の卵巣ＳＫＯＶ３細胞の細胞増殖およびカウントを示す。ＧＦＰ＝対照ベクター、野生型ＰＣＢＰ＝ＰＣＢＰ１、ＰＣＢＰ１変異−１＝ｍＰＣＢＰ１＿１、ＰＣＢＰ１−変異−２＝ｍＰＣＢＰ１＿２。パネルＡは、ウェル当たり０．５μｇまたは２．０μｇのいずれかのベクターでトランスフェクトした細胞の顕微鏡観察を示す。パネルＢは、マイクロプレートリーダーによってカウントされる細胞数を示す。
【図３１Ｂ】同上。
【図３２】処置後のＳＫＯＶ３卵巣細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによるＰＣＢＰ１およびＰＲＬ３のｍＲＮＡ発現レベルの検出を示す。グラフは、処置群と対照との間のｍＲＮＡレベルの倍率変化の比較（ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される）を示す。ＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡ発現レベルは、野生型（１１．５倍増加）、ｍＰＣＢＰ１＿１（１１．３倍増加）、およびｍＰＣＢＰ１＿２（１１．４倍増加）を含む、全てのＰＣＢＰ１処置群において有意な増加を示す。対照的に、ＰＲＬ３  ｍＲＮＡレベルは減少した：野生型（１．４０３倍減少）、ｍＰＣＢＰ１＿１（１．９７８倍減少）、およびｍＰＣＢＰ１＿２（１．９８８倍減少）。ＧＦＰ＝対照ベクター、野生型ＰＣＢＰ＝ＰＣＢＰ１、ＰＣＢＰ１変異−１＝ｍＰＣＢＰ１＿１、ＰＣＢＰ１−変異−２＝ｍＰＣＢＰ１＿２。
【図３３】ＤＵ１４５前立腺癌細胞株増殖に対する野生型および変異型ＰＣＢＰ１過剰発現の影響を示す。ＧＦＰ＝ＰＣＢＰ１なしの処置群、ｗＰ＝野生型ＰＣＢＰ１、Ｐ１＝ｍＰＣＢＰ１＿１、Ｐ２＝ｍＰＣＢＰ１＿２。ＰＣＢＰ１またはその変異体の過剰発現は、対照と比較して前立腺癌細胞の増殖を有意に阻害した。
【図３４】ＰＣＢＰ１でトランスフェクトしたＤＵ１４５前立腺癌細胞におけるウエスタンブロットによるＰＲＬ３タンパク質レベルの測定を示す。細胞をＡＡＶ−ＧＦＰ（レーン１）、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（レーン２）、ＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿１（レーン３）、またはＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿２（レーン４）でトランスフェクトした。全ての形態のＰＣＢＰ１による処置が、前立腺癌細胞においてＰＲＬ３レベルを下方調節し、ｍＰＣＢＰ１＿２が最も有意な効果を示す。ベータアクチンは内部対照として機能した。
【図３５】正常な脳細胞株ＨＣＮ−２についての細胞毒性（ＬＤＨ）アッセイを示す。ＨＣＮ−２細胞をＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（ｗＰ）、ＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿１（Ｐ１）、またはＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿２（Ｐ２）でトランスフェクトした。ＧＦＰ対照群と比較して、処置群における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）間に有意な差はなかったが（ｐ＞０．０５）、下方傾向が観察された。陽性対照中の細胞を溶解緩衝液によって処置して、最大ＬＤＨ放出を引き出した（左の列）。実験を三連で実施した。
【図３６Ａ】正常な乳腺細胞株ＭＣＦ１０Ａについての細胞毒性（ＬＤＨ）アッセイを示す。ＭＣＦ１０Ａ細胞をＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１（ｗＰ）、ＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿１（Ｐ１）、またはＡＡＶ−ｍＰＣＢＰ１＿２（Ｐ２）でトランスフェクトした。ＧＦＰ対照群と比較して、処置群における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）間に有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。（パネルＡ）。ＡＮＯＶＡによって試験したように、これら４つの群間で有意な差は観察されなかった（ｐ＞０．０５）。（パネルＢ）。野生型ＰＣＢＰ１、ｍＰＣＢＰ１＿１、またはｍＰＣＢＰ１＿２による処置は、この正常な乳腺細胞株に対して細胞毒性ではない。
【図３６Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＰＲＬ−３発現は、卵巣癌、前立腺癌、および胃癌を含む転移性癌において上昇することが分かっており、ＰＲＬ−３の過剰発現は、より悪い肝臓癌予後と相関する（Ｂａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｐｏｌａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。ＰＣＢＰ１の過剰発現は、ＰＲＬ−３発現を減少させることが以前に示されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。本開示は、野生型ＰＣＢＰ１ポリペプチドまたは発現レベルよりも大きい程度までＰＲＬ−３を減少させ、したがって細胞の腫瘍形成性および遊走を減少させる新規のＰＣＢＰ１変異および／または過剰発現ＰＣＢＰ１を提供する。
【００１９】
したがって、本明細書に開示される組成物および方法は、細胞遊走および／または転移を低減または予防するために、変異型ＰＣＢＰ１または過剰発現ＰＣＢＰ１で（例えば、トランスフェクションまたは形質導入を通して）遺伝子改変された細胞を含む。変異型ＰＣＢＰ１配列は、疾患の治療のために細胞遊走を直接予防する、阻害する、減少させる、または遅延させるために、遺伝子療法のためのベクター系に組み込まれる。
【００２０】
ポリ（ｒＣ）結合タンパク質１（ＰＣＢＰ１）
いくつかの態様において、本開示は、転写因子ポリ（ｒＣ）結合タンパク質１（ｈｎＲＮＰ−Ｅ１およびαＣＰ１としても既知のＰＣＢＰ１）を含有するベクターを提供し、これは、腫瘍形成を阻害するか、もしくは遅延させ、かつ／または細胞成長もしくは転移を予防することができる。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、哺乳動物ＰＣＢＰ１である。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、ヒトＰＣＢＰ１、その変異体、フラグメント、またはバリアントである。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１、その変異体、フラグメント、またはバリアントは、発現タンパク質のリン酸化を防止するかまたは減少させる。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、本明細書に開示される変異型ＰＣＢＰ１＿１またはＰＣＢＰ１＿２である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、細胞増殖または遊走を減少させる。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、細胞生存率を減少させる。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、細胞死を増加させる。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、免疫細胞の成長および／または増殖に影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、炎症を治療する。いくつかの実施形態において、炎症は、癌に関連する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、癌を治療する。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、腫瘍形成または転移に関連する癌バイオマーカーの発現および／または翻訳を変化させることによって癌を治療する。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、腫瘍形成または転移に関連する癌バイオマーカーの発現および／または翻訳を減少させる。いくつかの実施形態において、癌バイオマーカーとしては、ＰＲＬ−３、ＣＤ４４バリアント、Ｅ−カドヘリン、ＳＴＡＴ−３、およびビメンチンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、転移に関連する癌バイオマーカーは、ＰＲＬ−３である。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、ＰＲＬ−３のｍＲＮＡ発現を阻害する過剰発現した野生型ＰＣＢＰ１または変異したＰＣＢＰ１である。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、ＰＲＬ−３のタンパク質発現を阻害する過剰発現した野生型ＰＣＢＰ１または変異したＰＣＢＰ１である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、遺伝子改変（例えばトランスフェクトまたは形質導入）された細胞における細胞遊走を減少させる。いくつかの実施形態において、細胞遊走は、転移である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１は、リン酸化を有しないかまたは減少している。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１は、ＰＡＫリン酸化を有しないかまたは減少している。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１は、リン酸化ＰＣＢＰ１産生を阻害または防止する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、過剰発現した野生型ＰＣＢＰ１である。いくつかの実施形態において、細胞は、野生型ＰＣＢＰ１の１つ以上のコピーで形質導入される。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、変異体である。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１は、単一変異体である。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１は、二重変異体である。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１は、三重変異体である。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、Ｓ２２３Ｌ、Ｔ６０Ａ、および／もしくはＴ１２７Ａ変異、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、単一ＰＣＢＰ１変異ポリペプチドは、Ｓ２２３Ｌ変異体（本明細書においてｍＰＣＢＰ１＿１と称される）である。いくつかの実施形態において、二重ＰＣＢＰ１変異ポリペプチドは、Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ変異体（本明細書においてｍＰＣＢＰ１＿２と称される）である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、核酸である。いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、配列番号１の核酸配列またはその変異体を含有する。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、配列番号１の完全長核酸配列またはその変異体である。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、配列番号１の核酸配列のフラグメントまたはその変異体である。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、配列番号１の核酸配列のバリアントまたはその変異体である。いくつかの実施形態において、変異型ＰＣＢＰ１核酸は、ｃ６６８ｔ、ａ１７８ｇ、および／もしくはａ３７９ｇ変異、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、単一ＰＣＢＰ１変異核酸は、ｃ６６８ｇ変異体（本明細書においてｍＰＣＢＰ１＿１と称される）である。いくつかの実施形態において、二重ＰＣＢＰ１変異核酸は、ａ１７８ｇ  ＆  ａ３７９ｇ変異体（本明細書においてｍＰＣＢＰ１＿２と称される）である。
【００２７】
理論に束縛されるものではないが、ＰＣＢＰ１内のＫＨドメインの各々は、異なるタンパク質のｍＲＮＡに結合することが示されており、１つ以上のＫＨドメインの使用は、所与のタンパク質の翻訳を選択的に阻害し得る。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１核酸は、３つ全てのＫ相同（ＫＨ）ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、ＰＣＰＢ１核酸は、２つのＫＨドメインをコードする。いくつかの実施形態において、ＰＣＰＢ１核酸は、１つのＫＨドメインをコードする。
【００２８】
さらに、核局在化シグナルにおける変異は、ＰＣＢＰ１が核内に移行する能力を変化させ、したがって、後の遺伝子発現に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、一方または両方の核局在化シグナルにおける変異を含む。いくつかの実施形態において、一方または両方の核局在化シグナルの変化は、ＰＣＢＰ１が核内に移行する能力を阻害する。
【００２９】
リン酸化はまた、ＰＣＢＰ１の活性においても役割を果たす（例えば、非リン酸化ＰＣＢＰ１は、活性を欠いている可能性があるか、またはより大きい活性を示す可能性がある）。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ヌクレオチド配列は、ＰＣＢＰ１ポリペプチドがリン酸化される能力に影響を及ぼす変異（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ヌクレオチド配列変異（複数可）は、ＰＣＢＰ１ポリペプチドリン酸化を防止する。いくつかの実施形態において、非リン酸化ＰＣＢＰ１または完全にリン酸化されていないＰＣＢＰ１ポリペプチドは、野生型レベルで活性ではない。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、多シストロン性ｍＲＮＡ転写物から発現する。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、２シストロン性ｍＲＮＡ転写物から発現する。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、融合タンパク質として発現する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ヌクレオチド配列は、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号１）と比較して点変異（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＰＢ１ヌクレオチド配列は、リン酸化に影響を及ぼす点変異（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１点変異は、リン酸化を増加させる。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１点変異は、リン酸化を減少させる。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ヌクレオチド配列は、核膜移行に影響を及ぼし得る変異（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ヌクレオチド配列は、表１に開示される点変異（複数可）を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、点変異は、Ｇ１３Ａ、Ｇ１２８Ｃ、Ａ１７８Ｇ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ａ、Ｇ３２６Ａ、Ａ３７９Ｇ、Ｇ５２７Ａ、Ｃ６５２Ｔ、Ｃ６８８Ｔ、Ｇ６７６Ａ、Ｇ７００Ａ、Ｇ７８１Ｔ、Ｔ８０８Ｇ、Ｇ８１４Ｔ、Ａ８７１Ｇ、Ｃ９４７Ｔ、Ｇ１０３３Ｃ、Ｃ１０３４Ｔ、Ｇ１０４８Ｃ、および／もしくはＡ１２７Ｇ、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。いくつかの実施形態において、リン酸化を増加させる点変異は、Ｇ１３Ａ、Ａ１７８Ｇ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ａ、Ｇ３２６Ａ、Ａ３７９Ｇ、Ｇ５２７Ａ、Ｃ６５２Ｔ、Ｇ７８１Ｔ、Ｇ８１４Ｔ、Ｃ９４７Ｔ、Ｇ１０３３Ｃ、Ｃ１０３４Ｔ、Ｇ１０４８Ｃ、および／もしくはＧ１０６７Ｔ、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。いくつかの実施形態において、リン酸化を減少させる点変異は、Ｃ６８８Ｔ、Ａ１２７Ｇ、もしくはＧ１２８Ｃ、Ａ１７８Ｇ、および／もしくはＡ３７９Ｇ、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｃ６６８Ｔ、Ａ１７８Ｇおよび／もしくはＡ３７９Ｇ、またはそれらの組み合わせである。
【表１−１】
2021512178.tif 000003
【表１−２】
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【表１−３】
2021512178.tif 000005
【００３３】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＰＣＢＰ１（配列番号１）の模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体を提供する。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列と比較して１つ以上の核酸置換を含む。いくつかの実施形態において、１〜２０個の核酸が置換される。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列（例えば、配列番号１）と比較して、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個の核酸置換を含む。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列（例えば、配列番号１）と比較して１つ以上の核酸欠失を含む。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、配列番号３（ｍＰＣＢＰ１＿１（ｃ６６８ｔ））を含む。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、配列番号５（ｍＰＣＢＰ１＿２（ａ１７８ｇ  ＆  ａ３７９ｇ）を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列（例えば、配列番号１）と比較して、１〜２０個の核酸残基が欠失している。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列（例えば、配列番号１）と比較して、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個の核酸残基欠失を有する。いくつかの実施形態において、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列（例えば、配列番号１）と比較して、１〜１０個の核酸残基がいずれかの末端で欠失している。いくつかの実施形態において、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列と比較して、１〜１０個の核酸残基が両方の末端から欠失している。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体の核酸配列は、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列と少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体の核酸配列は、天然ＰＣＢＰ１の核酸配列（例えば、配列番号１）と約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。同一性の割合は、アライメントプログラムＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅを使用して計算され得る。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、配列番号２の完全長アミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントである。いくつかの実施形態において、ＰＣＢ１は、配列番号２のアミノ酸配列のバリアントである。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１バリアントは、配列番号４のアミノ酸配列（ｍＰＣＢＰ１＿１（Ｓ２２３Ｌ））を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１バリアントは、配列番号６のアミノ酸配列（ｍＰＣＢＰ１＿２Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、配列番号２のアミノ酸配列の機能的フラグメントまたはバリアントである。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、３つ全てのＫ相同（ＫＨ）ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＰＢ１ポリペプチドは、２つのＫＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＰＢ１ポリペプチドは、１つのＫＨドメインを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、１つの変異Ｋ相同（ＫＨ）ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、２つの変異Ｋ相同（ＫＨ）ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ポリペプチドは、３つの変異Ｋ相同（ＫＨ）ドメインを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＫＨドメインにおける変異は、ＲＮＡ結合に影響を及ぼす。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１ポリペプチド配列は、野生型ＰＣＢＰ１（配列番号２）に対するアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＰＢ１ポリペプチド配列は、リン酸化に影響を及ぼすアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸変異は、Ｖ５Ｍ、Ｓ４３Ａ、Ｔ６０Ａ、Ｌ１００Ｐ、Ｌ１００Ｑ、Ｃ１０９Ｙ、Ａ１２７Ｇ、Ｇ１２８Ｃ、Ｔ２３７Ａ、Ｇ１７６Ｅ、Ｐ２１８Ｓ、Ｇ２２６Ｒ、Ｄ２３４Ｎ、Ｄ２６１Ｙ、Ｙ２７０Ｄ、Ａ２７２Ｓ、Ｉ２９１Ｖ、Ａ３１６Ｖ、Ａ３４５Ｐ、Ａ３４５Ｖ、Ｅ３５０Ｑ、Ｓ３５６Ｉ、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。いくつかの実施形態において、リン酸化を増加させる変異は、Ｖ５Ｍ、Ｌ１００Ｐ、Ｌ１００Ｑ、Ｃ１０９Ｙ、Ｇ１７６Ｅ、Ｄ２６１Ｙ、Ａ２７２Ｓ、Ａ３１６Ｖ、Ａ３４５Ｐ、Ａ３４５Ｖ、および／もしくはＥ３５０Ｑ、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。いくつかの実施形態において、リン酸化を減少させる変異は、Ｓ４３Ａ、Ｔ６０Ａ、Ｔ１２７Ａ、および／もしくはＳ２２３Ｌ、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸変異は、Ｔ６０Ａ、Ｓ２２３Ｌ、Ｓ４３Ａ、および／またはＴ１２７Ａである。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＰＣＢＰ１（配列番号２）の模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体を提供する。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、２０個を超えるアミノ酸が置換される。いくつかの実施形態において、１〜２０個のアミノ酸が置換される。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、もしくは約１０個、またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、配列番号６を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、天然ペプチド治療薬のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸欠失を含む。いくつかの実施形態において、２０個を超えるアミノ酸が欠失している。いくつかの実施形態において、天然タンパク質剤のアミノ酸配列と比較して、１〜２０個のアミノ酸が欠失している。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、もしくは約１０個、またはそれ以上のアミノ酸欠失を有する。いくつかの実施形態において、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、１〜１０個のアミノ酸がいずれかの末端で欠失している。いくつかの実施形態において、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、１〜１０個のアミノ酸が両方の末端から欠失している。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体のアミノ酸配列は、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体のアミノ酸配列は、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体のアミノ酸配列は、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であり、天然ＰＣＢＰ１の生物活性の全てまたはほとんどを保持する。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体のアミノ酸配列は、天然ＰＣＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）と約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であり、天然ＰＣＢＰ１と比較して生物活性が低減または改変している。
【００４０】
いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体のアミノ酸配列は、天然ＰＣＢＰ１の１つ以上のドメインのアミノ酸配列（配列番号２）と約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体のアミノ酸配列は、天然ＰＣＢＰ１の１つ以上のドメインのアミノ酸配列（配列番号２）と約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であり、天然ＰＣＢＰ１の生物活性の全てまたはほとんどを保持する。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体のアミノ酸配列は、天然ＰＣＢＰ１の１つ以上のドメインのアミノ酸配列（配列番号２）と約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であり、天然ＰＣＢＰ１と比較して生物活性が低減または改変している。同一性の割合は、アライメントプログラムＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅを使用して計算され得る。ペアワイズアラインメントには、次のデフォルトパラメータが使用され得る：タンパク質重量マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．１。
【００４１】
ベクターおよびプラスミド
標的組織または細胞への治療用遺伝子の効率的な送達は、遺伝子療法を成功させるための最も大きなハードルである。裸のＤＮＡが、食細胞性免疫細胞または細胞外ヌクレアーゼによってインビボで急速に除去または分解されるため、導入遺伝子を保護する手段が所望され得る。さらに、自発的なＤＮＡ取り込みの効率が悪いため、組織または細胞移入をもたらすためのビヒクルも必要である。したがって、ＤＮＡは通常、目的の遺伝子の効果的な組織または細胞移入を保護し、媒介するために、通称ベクターである何らかのタイプの遺伝子送達ビヒクルと組み合わされる。
【００４２】
遺伝子送達系は、非生物学的（例えば、哺乳動物細胞にプラスミドＤＮＡを導入する化学的および物理的アプローチ）または生物学的（例えば、ウイルスおよび細菌）に分類され得る。非ウイルス遺伝子送達系は通常、プラスミドＤＮＡ上に担持される伝達遺伝子を伴う。用いられるプラスミドは一般に、哺乳動物細胞において複製しない。
【００４３】
最も一般的に、組換えウイルスまたは裸のＤＮＡもしくはＤＮＡ複合体が使用される。例えば、ウイルスは、修正した治療用ＤＮＡを細胞に運ぶベクターを提供するために実験室で修飾され得、そこでウイルスは、異常な遺伝子発現を改変し、かつ遺伝的疾患を治療するためにゲノムに組み込まれ得る。あるいは、ベクターは、染色体外のままであり、一時的に発現し得る。
【００４４】
いくつかの態様において、本開示は、ウイルスベクターを使用する遺伝子療法の方法を提供する。遺伝子療法で使用され得るウイルスとしては、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、複製可能ベクター、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子療法で使用され得るウイルスベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、複製可能ベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
いくつかの態様において、本開示は、非ウイルスベクターを使用する遺伝子療法の方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、細菌ベクターを使用する遺伝子療法の方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子療法の方法は、裸の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の注入を伴う。これは、当該技術分野において既知の任意の適切な手段を使用して実施され得る。いくつかの態様において、本開示は、細菌送達系を使用する遺伝子療法の方法を提供する。いくつかの実施形態において、細菌細胞は、生存、弱毒化、または死滅している。いくつかの実施形態において、細菌送達系は、細胞が哺乳動物細胞または分泌系に付着して、核酸および／またはタンパク質を標的哺乳動物細胞に送達する能力を利用する。いくつかの実施形態において、細菌送達系は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓから選択されるが、これらに限定されない。
【００４６】
いくつかの態様において、本開示は、非ウイルスおよび非細菌ベクターを使用する遺伝子療法の方法を提供する。いくつかの実施形態において、非ウイルスベクターおよび非細菌ベクターは、真核生物ベクターである。いくつかの実施形態において、真核生物ベクターは、トランスポゾン系、ＣＲＩＳＰＲ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、またはＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）を含む。いくつかの実施形態において、トランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙまたはｐｉｇｇｙＢａｃまたはトランスポゾン系から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アルギニン豊富なペプチドまたはソノポレーションなど、核酸送達のための他の方法が使用されてもよい。
【００４７】
いくつかの態様において、本開示は、ナノ粒子を使用する遺伝子療法の方法を提供する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子である。いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。いくつかの実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、非構造化脂質担体（ＮＬＣ）である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ポリマーベースのナノ粒子である。いくつかの実施形態において、ポリマーベースのナノ粒子は、ナノスフェアまたはナノカプセルである。
【００４８】
プラスミドＤＮＡベースのベクターは、遺伝子療法において一般的に使用され、ＤＮＡの大きいセグメントを収容することができ、遺伝子移入および発現に影響を及ぼす様々な調節エレメントの操作を可能にする。最も基本的には、発現プラスミドは、発現カセットと骨格を含む。発現カセットは、目的の遺伝子（複数可）と、標的細胞における発現に必要な任意の調節配列とを含む転写単位である。骨格は、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性選択遺伝子）と、細菌におけるプラスミドの産生に必要な複製起点とを含み得る。
【００４９】
任意の適切なプラスミドが、本明細書に開示される方法で使用され得る。いくつかの実施形態において、プラスミドは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、プラスミドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドである。いくつかの実施形態において、代表的なプラスミドは、図１Ａ〜Ｂに開示される。発現カセットにおける遺伝子の発現を駆動するために、任意の適切なプロモーターが使用され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、レトロウイルスプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、ウイルスプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、哺乳動物プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、ヒトプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織または細胞特異的である。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、ヒト形質導入α−サブユニットプロモーター、ＧＡＮＴ２、ＶＭＤ２、ヒトＩＲＢＰ、Ｋ１４、ＩＲＳ２、およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターから選択される。選択されたプロモーターがキメラプロモーターとして使用され得る（例えば、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーターと共に）。いくつかの実施形態において、組織または細胞特異的プロモーターは、膵臓細胞、膵臓β細胞、皮膚細胞、角質細胞、光受容体細胞、上皮細胞、内皮細胞、および／または癌細胞（例えば、乳癌細胞、前立腺癌細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経癌細胞、膠芽腫など）に特異的である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、網膜または眼組織もしくは細胞に特異的である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、造血細胞に特異的である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、肝臓組織または細胞に特異的である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、肺組織または細胞に特異的である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、筋肉組織または細胞に特異的である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＨＩＶ感染細胞に特異的である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、エクジソン、またはラパマイシンが挙げられるが、これらに限定されない任意の適切な組成または刺激によって誘導される。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ＴＲＥ３Ｇ、テトラサイクリン、Ｌａｃ、エクジソン、およびラパマイシンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない、当業者に既知のいずれかから選択される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、合成プロモーターであるか、またはエンハンサー要素を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドプロモーターである。いくつかの実施形態において、ハイブリッドプロモーターは、遺伝子の調節領域を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｅｆ１ａ、ＣＡＧ、ｓｖ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｎａｎｏｇ、ＧＡＮＴ２、ＶＭＤ２、ｈＩＲＢＰ、ＴＥＴプロモーター、ＣＡＡＴボックス、ＧＣボックス、ＧＴ−１モチーフ、Ｉ−ボックス、ＡＴが豊富な配列、ＲＢＣＳ１、ＴＲＥ３Ｇ、ＧＡＬ１、Ｌａｐ２６７、ラパマイシン、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ベータ−グロビンプロモーター／ＬＣＲ、免疫グロブリンプロモーター、ＰＥＰＣＫプロモーター、アルブミンプロモーター、ｈＡＡＴ、ＳＰＣ、ＳＰ−Ａ、ＭＣＫ、ＶＬＣ１、ＨＩＶ−ＬＴＲ、Ｔａｔ／Ｒｅｖ応答性エレメント、Ｔａｔ誘導性エレメント、およびＦＭＲ１が挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、遺伝子療法を介して導入される遺伝子の全てを含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、ＰＣＢＰ１を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１は、変異型ＰＣＢＰ１である。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、配列番号３を含む。いくつかの実施形態において、模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、配列番号５を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＢＰ１模倣体、類似体、誘導体、バリアント、または変異体は、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本開示のベクターの導入は、細胞内の遺伝子コピー数を増加させる。いくつかの実施形態において、本開示のベクターの導入は、細胞内の遺伝子発現を増加させる。いくつかの実施形態において、本開示のベクターの導入は、細胞内のポリペプチド発現を増加させる。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＰＣＢＰ１またはその変異体である。
【００５５】
疾患および障害
本明細書に開示される組成物および方法は、任意の適切な細胞または組織の種類に用いられ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、インビトロで実施される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、エクスビボで実施される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、単離細胞に実施される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞培養に実施される。いくつかの実施形態において、単離細胞または細胞培養細胞は、対象から採取され、次いで、トランスフェクションまたは形質導入後に移植される。いくつかの実施形態において、細胞は、癌細胞である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物および方法は、インビボで用いられる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、原位置で用いられる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、眼、網膜、心臓、血液、白血球、赤血球、血小板、硝子体液、強膜、網膜、虹彩、角膜、骨格筋肉、心筋、平滑筋、軟骨、腱、骨、表皮、臓器、肝臓、心臓、腎臓、肺、胃、胃腸管、結腸、膀胱、卵巣、睾丸、膵臓、骨髄、脳、ニューロン、および／または腺が挙げられるが、これらに限定されない、身体の任意の適切な部分における細胞遊走を減少させるために使用される。
【００５７】
任意の適切な疾患の治療、予防、改善、または遅延のために、本明細書に開示される組成物および方法が使用され得る。例えば、治療、予防、改善、または遅延が可能な疾患は、細胞遊走によって特徴付けられる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、癌または制御されていない細胞増殖を治療するために、本明細書に開示される組成物および方法が使用され得る。いくつかの実施形態において、転移または制御されていない細胞遊走の予防、阻害、改善、または減少のために、本明細書に開示される組成物および方法が使用される。いくつかの実施形態において、癌は、固形癌である。いくつかの実施形態において、癌は、非固形癌である。いくつかの実施形態において、本開示は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫（例えば、小児小脳または大脳）、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳幹部神経膠腫、脳癌、脳腫瘍（例えば、膠芽腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーウイング肉腫、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、胆嚢癌、胃（腹部）癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（例えば、脳幹、大脳星細胞腫、視覚路および視床下部）、胃カルチノイド、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞）、口唇および口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞、小細胞）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞ホジキン、非ホジキン、中枢神経系原発）、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈ  ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性障害、慢性、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵臓癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、褐色細胞腫、松果体星細胞腫および／または胚腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、腎盂および尿管、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（例えば、ユーイングファミリー、カポジ、軟組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚癌（例えば、非黒色腫、黒色腫、メルケル細胞）、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁��上皮癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌（ｔｈｒｏａｔ  ｃａｎｃｅｒ）、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、尿管癌および腎盂癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰部癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない癌に関する。いくつかの実施形態において、本開示の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された細胞は、これらの種類の癌のうちの１つ以上から得られる。
【００５９】
投与
本開示の組成物は、任意の適切な手段を介して投与され得る。いくつかの実施形態において、核酸投与経路は、経皮、注射、筋肉内、皮下、経口、経鼻、膣内、直腸、経粘膜、腸内、非経口、局所、硬膜外、脳内、脳血管内、動脈内、関節内、皮内、病巣内、眼内、骨内、腹腔内、髄腔内、子宮内、静脈内、膀胱内注入、または硝子体内である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法を使用して組成物でトランスフェクトまたは形質導入された組成物または細胞は、患者に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法を使用して作られた組成物でトランスフェクトまたは形質導入された組成物または細胞は、疾患または障害の治療、予防、改善、またはその発症の遅延のために患者に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物の投与は、対象における細胞遊走を予防する、減少させる、改善する、または遅延させる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物の投与は、対象における細胞遊走を予防する、減少させる、改善する、または遅延させ、かつ疾患または障害を治療する、予防する、改善する、またはその発症を遅延させる。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、癌または転移性癌である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物の投与は、対象における腫瘍質量／負荷を減少させる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞は、患者に１回投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞は、患者に約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約２０回、約４０回、またはそれ以上投与される。本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞は、疾患または障害の症状が改善するまで投与される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクターまたは核酸の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者と比較して、処置患者における細胞遊走または増殖を予防する、改善する、減少させる、または遅延させる。いくつかの実施形態において、細胞遊走または増殖は、１日目〜１０年目に処置患者において予防される、改善する、減少する、または遅延する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるプラスミドまたはベクターの投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における細胞遊走または増殖と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に細胞遊走または増殖を予防する、改善する、減少させる、または遅延させる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸またはベクターの投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における細胞遊走または増殖と比較して、約１日、約１週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、細胞遊走または増殖を防止する、改善する、減少させる、または遅延させる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、細胞遊走または増殖は、他の細胞遊走または増殖阻害方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％減少する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の細胞遊走または増殖予防／阻害方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に、細胞遊走または増殖を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の細胞遊走または増殖予防／阻害方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、細胞遊走または増殖を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％低減する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクターまたは核酸の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者と比較して、処置患者における腫瘍質量または負荷を低減する。いくつかの実施形態において、腫瘍質量／負荷は、１日目〜１０年目に処置患者において減少する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるプラスミドまたはベクターの投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における腫瘍質量または負荷と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に腫瘍質量または負荷を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸またはベクターの投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における腫瘍質量または負荷と比較して、約１日、約１週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、腫瘍質量または負荷を低減する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、腫瘍質量または負荷は、他の腫瘍質量または負荷低減方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％減少する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の腫瘍質量または負荷低減方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に、腫瘍質量または負荷を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の腫瘍質量または負荷低減方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、腫瘍質量または負荷を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％低減する。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞は、インビトロで処置細胞における癌バイオマーカー発現を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞の投与は、処置患者における癌バイオマーカー発現を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞の投与は、１日目〜１０年目に、処置患者またはインビトロ細胞における癌バイオマーカー発現を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の癌バイオマーカー発現阻害方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に癌バイオマーカー発現を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるプラスミド、ベクター、または細胞の投与は、他の癌バイオマーカー発現阻害方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、癌バイオマーカー発現を低減する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、癌バイオマーカー発現は、他の癌バイオマーカー発現阻害方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％減少する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の癌バイオマーカー発現阻害方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に、癌バイオマーカー発現を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の癌バイオマーカー発現阻害方法で処置された対照または患者またはインビトロ細胞と比較して、約１、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、癌バイオマーカー発現を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％低減する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞の投与は、インビトロまたはエクスビボ臓器または組織における転移を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞の投与は、組織、臓器、または処置患者における転移を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞の投与は、１日目〜１０年目に、処置患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織における転移を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の転移阻害方法で処置された対照もしくは患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に転移を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の転移阻害方法で処置された対照もしくは患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、転移または腫瘍形成を低減する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、転移は、他の転移阻害方法で処置された対照または患者と比較して、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％減少する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の転移阻害方法で処置された対照もしくは患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に、転移を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の転移阻害方法で処置された対照もしくは患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、転移を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％低減する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞の投与は、組織、臓器、または処置患者における細胞死を増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター、核酸、または細胞の投与は、１日目〜１０年目に、処置患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織における細胞死を増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の細胞死滅方法で処置された対照もしくは患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に転移を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の細胞死滅方法で処置された対照もしくは患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、細胞死を増加させる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、細胞死は、他の細胞死滅方法で処置された対照または患者と比較して、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の細胞死滅方法で処置された対照もしくは患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に、細胞死を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、他の細胞死滅方法で処置された対照もしくは患者、またはインビトロもしくはエクスビボ臓器もしくは組織と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、細胞死を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加させる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者と比較して、処置患者における疾患または障害の症状を軽減する。いくつかの実施形態において、疾患または障害の症状は、１日目〜１０年目に処置患者において測定される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における疾患または障害の症状と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に疾患または障害の症状を軽減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における疾患または障害の症状と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、疾患または障害の症状を軽減する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、疾患または障害の症状は、未処置患者または処置前の同じ患者における疾患または障害の症状と比較して、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％軽減される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における疾患または障害の症状と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に、疾患または障害の症状を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％軽減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における疾患または障害の症状と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、疾患または障害の症状を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％軽減する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクターまたは核酸の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者と比較して、処置患者における癌の症状を軽減する。いくつかの実施形態において、癌の症状は、１日目〜１０年目に処置患者において測定される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における癌の症状と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に癌の症状を軽減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における癌の症状と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、癌の症状を軽減する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、癌の症状は、未処置患者または処置前の同じ患者における癌の症状と比較して、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％軽減される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における癌の症状と比較して、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約２０週目、約３０週目、約４０週目、約５０週目、約６０週目、約７０週目、約８０週目、約９０週目、約１００週目、約１年目、約２年目、または約３年目に、癌の症状を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％軽減する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、または細胞の投与は、未処置患者または処置前の同じ患者における癌の症状と比較して、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、約５年、もしくは約１０年、またはそれ以上にわたって、癌の症状を約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％軽減する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の組成物でトランスフェクトされた細胞を正確に追跡する方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、細胞の挙動を決定するためにトレースされる。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、それらの遊走を決定するためにトレースされる。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、それらの転移（またはその欠如）を決定するためにトレースされる。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで投与される任意の薬物に対するそれらの応答を決定するためにトレースされる。いくつかの実施形態において、細胞はまた、治療薬に曝露される。いくつかの実施形態において、治療薬は、化学療法薬である。いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロで治療薬に曝露される。いくつかの実施形態において、細胞は、インビボで治療薬に曝露される。
【００７７】
同時投与
いくつかの実施形態において、患者は、追加の療法に供される。いくつかの実施形態において、患者は、抗癌療法の一部として本開示の組成物で治療される。いくつかの実施形態において、抗癌療法は、放射線療法、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、幹細胞移植、およびＣＡＲ−Ｔ療法から選択されるが、これらに限定されない。抗癌療法は、本開示の組成物の投与の前、それと同時、またはその後に投与され得る。
【００７８】
キット
本開示はまた、細胞遊走または転移を減少させる、予防する、改善する、または遅延させるためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本開示のベクターまたは核酸を含む。キットは、記載の試薬の使用を指示するラベルまたは印刷された説明書をさらに含むことができる。キットは、試験される処置をさらに含むことができる。キットは、インビトロおよびインビボの細胞遊走または転移の予防、減少、改善、または遅延のために適用される。
【００７９】
別途定義されない限り、本明細書の全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が使用され得るが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「抗癌遺伝子」は、癌遺伝子の発現または活性を予防する、遅延させる、阻害する、または別様に改変する任意の遺伝子を指す。いくつかの実施形態において、抗癌遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子である。いくつかの実施形態において、抗癌遺伝子は、転移に関連する癌バイオマーカーの発現を減少させる。
【００８１】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単数形は、便宜上、本出願全体を通して使用されるが、文脈または明示的な記述がそうでないことを示す場合を除き、単数形は、複数形を含むよう意図されることを理解されたい。全ての数値範囲は、その数値範囲内のどの数値点も含むと理解され、どの数値点も個別に列挙するものとして解釈されるべきである。同じ構成要素または特性に向けられた全ての範囲の端点は包括的であり、独立して組み合わせ可能であることが意図される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「含む」という単語およびその変化形は、リスト内の項目の列挙が、本技術の材料、組成物、デバイス、および方法においても有用であり得る他の同様の項目を除外しないように、非限定的であることが意図される。同様に、「できる」および「してもよい」という用語ならびにそれらの変化形は、１つの実施形態がある特定の要素または特徴を含むことができる、または含み得る列挙が、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を除外しないように、非限定的であることが意図される。本開示を説明および請求するために、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する、または有するなどの用語の同義語として、オープンエンドな用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用されるが、本技術またはその実施形態は、代替的に、列挙される成分「からなる」または「から本質的になる」などのより限定的な用語を使用して説明され得る。
【００８３】
「約」という用語は、数として表される量を指すために本明細書で使用される場合、参照される数値表示の「正確に」プラスまたはマイナス最大１０％を含む。「約」という用語が、ある値の範囲に関して使用される場合、「約」という用語は、その範囲の最小値および最大値の両方を指す（例えば、「約１〜５０μｍ」は、「約１μｍ〜約５０μｍ」を意味する）。「密接に関連している」という用語は、組成物の２つ以上の構成成分間の空間関係を説明するために本明細書で使用される場合、例えば、混合物、コーティング、およびマトリックス中などで密接に混合されている構成成分を指す。
【００８４】
「形質導入」および「トランスフェクション」という用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞への遺伝物質の導入を指す。任意の適切な遺伝子修飾手段が、本開示によって想定される。
【００８５】
本開示は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【００８６】
実施例１−ＰＣＢＰ１変異ポリペプチドを発現するベクターの構築
研究は、ＰＲＬ−３のｍＲＮＡ発現が、卵巣癌、胃癌を含む転移性癌において上昇し、ＰＲＬ−３の過剰発現が、肝臓癌予後と負の相関関係があることを示している（Ｂａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｐｏｌａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。ＰＣＢＰ１は、ＰＲＬ−３発現を調節することが知られており、ＰＣＢＰ１発現とＰＲＬ−３発現との間の逆相関は、ＰＣＢＰ１がＰＲＬ−３のｍＲＮＡ翻訳を抑制し得ることを示唆する。ＰＲＬ−３の下方調節には、Ａｋｔ（ｐＳｅｒ４７３）のリン酸化活性形態の下方調節が伴う（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。例えば、Ａｋｔ−２（ｐＳｅｒ４７４）リン酸化の増加を示す癌細胞はまた、ＰＣＢＰ１発現の有意な低減も示す（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【００８７】
図１Ａおよび１Ｂに示されるように、レンチウイルス遺伝子療法ベクター（ＬＶＶ）、または／およびＰＣＢＰ１遺伝子をそれぞれ含有するＡＡＶ系を生成した。このベクター系は、ヒト伸長因子−１α（ＥＦ１ａ）プロモーター、およびｍＲＮＡ分子からのタンパク質翻訳の内部開始を提供するＩＲＥＳエレメントを含有する。したがって、ＩＲＥＳモチーフが、単一のＰＣＢＰＣ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ  ｍＲＮＡからの第２の遺伝子の独立した別個の翻訳を開始することができる２シストロン性ｍＲＮＡが作製される。以下の表２の戦略に基づいて、ＰＡＫ１によるタンパク質のリン酸化を減少させるように設計されたいくつかのＰＣＢＰ１変異体を構築した。ＰＣＢＰ１変異ヌクレオチド配列を図１Ａ〜Ｂに示されるベクターにクローニングして、ベクターＡ（ｍＰＣＢＰ１＿１、Ｓ２２３Ｌ）およびベクターＢ（ｍＰＣＢＰ１＿２、Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ）を作った。各ＰＣＢＰ１変異体における変異は、ＰＡＫ１によるＰＣＢＰ１リン酸化を防止する。異なる遺伝子のオンは、適切なプロモーター（複数可）によって駆動される。ＰＡＫ１は、アミノ酸６０および１２７の両方でＰＣＢＰ１をリン酸化するため、これらの部位での変異は、ＰＡＫ１によるＰＣＢＰ１リン酸化を防止する。
【表２】
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【００８８】
実施例２−ＰＣＢＰ１変異体は、内因性野生型よりも高いレベルで発現する
ＰＣＢＰ１  Ｓ２２３ＬおよびＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ変異が転写レベルに影響を及ぼしたかどうかを試験するために、黒色腫細胞におけるＰＣＢＰ１発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図２は、群間の倍率変化の分析を示す（ｄｄｃｔ）。ＧＦＰ発現と野生型ＰＣＢＰ１発現（ｗＰＣＢＰ１＿０）との比較は、ＰＣＢＰ１発現レベルが４．０１２倍大きかったことを示す。ＧＦＰ発現とＰＣＢＰ１  Ｓ２２３Ｌ（ｍＰＣＢＰ１＿１）の発現との比較は、ＰＣＢＰ１  Ｓ２２３Ｌ発現レベルが３．９７倍大きかったことを示す。ＧＦＰ発現とＰＣＢＰ１  Ｓ２２３Ｌ変異体の発現との比較は、ＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ（ｍＰＣＢＰ１＿２）発現レベルが４．０２倍大きかったことを示す。野生型ＰＣＢＰ１および２つの変異型は、同様のｍＲＮＡ発現を示す。このアッセイで使用したハウスキーピング遺伝子は、ＧＡＰＤＨである。
【００８９】
実施例３−黒色腫細胞におけるＰＣＢＰ１の発現
黒色腫細胞を４つの群に分割し、各群を、Ａ）ＧＦＰのみ、Ｂ）野生型ＰＣＢＰ１（ｗＰＣＢＰ１＿０−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）およびＧＦＰ、３）ＰＣＢＰ１  Ｓ２２３ＬおよびＧＦＰ（ｍＰＣＢＰ１＿１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）、またはＤ）ＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ（ｍＰＣＢＰ１＿２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を含有するベクターで、インビトロでトランスフェクトした。リポフェクタミンキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を使用した、野生型ＰＣＢＰ１または変異型ＰＣＢＰ１のいずれかを含有するレンチウイルスベクターのトランスフェクション後２４〜４８時間、ＧＦＰの発現が観察された（図２）。トランスフェクション率は、それぞれ約９０％であった（データは図示せず）。ＧＦＰ発現レベルの変動は、異なるベクターに起因する可能性がある。理論に束縛されるものではないが、ベクターでは、ＰＣＢＰ１はＧＦＰの上流にある。ＰＣＢＰ１効率が１００％であるとき、下流遺伝子（ＧＦＰ）は、より低い発現効率（例えば、約６０％〜８０％）を示す。対照ベクターがＧＦＰのみを含有し、ＰＣＢＰ１配列を含有しないため、ＧＦＰ発現効率はより高い。ＰＣＢＰ１およびＧＦＰが互いに相互作用することを示す証拠はない。
【００９０】
ウエスタンブロットについては、ＰＣＰＢ１処置後に短時間、細胞培養皿を氷上に置き、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、氷冷溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を含有する）を細胞に添加した。付着細胞を皿から削り取り、細胞懸濁液を予め冷却したマイクロ遠心分離管に移し、それを４℃で３０分間絶えず撹拌し、次いで遠心分離した。遠心分離後、管を氷上に置き、上清を新鮮な管に吸引し、ペレットを廃棄した。タンパク質定量化後、等体積の２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を添加することによって、各細胞溶解物のタンパク質濃度を決定した。試料を、この試料緩衝液中で１００℃において５分間沸騰させた。処置群および対照群からの等量のタンパク質を、分子量マーカーと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各ウェルに装填した。試験したタンパク質濃度は、細胞溶解物もしくは組織ホモジネートから約２０〜３０μｇ、または約１０〜１００ｎｇの精製タンパク質の範囲であった。ゲルを１００Ｖで１〜２時間電気泳動した。次いで、ゲル上のタンパク質を、転写緩衝液およびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｓｅｍｉ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）を使用して、活性ニトロセルロース膜に転写した。ブロッキング緩衝液を室温で１時間または４℃で一晩使用することによって膜をブロックし、次いで、ＴＢＳＴ緩衝液で３回（５分／各洗浄）洗浄した後、抗体染色を開始した。次いで、膜を化学発光基質と共に約５分間インキュベートして、キットメーカーの推奨に従ってタンパク質シグナルを可視化した（図３および図６を参照）。
【００９１】
図３は、異なる形態のＰＣＢＰ１をコードする遺伝子療法ベクターでトランスフェクトした細胞におけるＰＲＬ−３タンパク質発現を示す。図３に示されるように、野生型ＰＣＢＰ１を含有するベクターによる黒色腫細胞のトランスフェクションは、ＧＦＰのみのベクターと比較してＰＲＬ−３発現を減少させる。ＰＣＢＰ１変異体のいずれかを含有するベクターによる細胞のトランスフェクションは、ＰＲＬ−３発現をさらに減少させ、二重のＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ変異体は、単一のＰＣＢＰ１  Ｓ２２３Ｌ変異体によるトランスフェクションよりもさらに大きい程度までＰＲＬ−３発現を減少させる。
【００９２】
実施例４−変異型ＰＣＢＰ１によるトランスフェクションは、黒色腫細胞遊走を減少させる
変異型、脱リン酸化ＰＣＢＰ１変異体の細胞遊走に対する効果を、細胞遊走アッセイを使用して試験した。簡潔に、ＧＦＰのみ、野生型ＰＣＢＰ１（ｗＰＣＢＰ１＿０−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）およびＧＦＰ、またはＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ（ｍＰＣＢＰ１＿２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）でトランスフェクトした黒色腫細胞を、トランスフェクション後５日間観察した。
【００９３】
各処置群または／および対照からの同数の細胞を、リポフェクタミンキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ）を使用したマーカータンパク質をコードするベクター（すなわち、ＧＦＰ）によるトランスフェクションのために、２４（または６）ウェルプレートに播種した。次いで、ＧＦＰでトランスフェクトした細胞を、トリプシン（０．１％）を含有する培地によって懸濁し、培養培地によって洗浄した。次いで、同量の細胞数（例えば、各個々の群からの約８０，０００個の細胞）を再配置し、９６ウェルプレートの各ウェルに同量の細胞数を含有する１００μＬの装填体積で、Ｏｒｉｓ遊走アッセイプレート（Ｏｒｉｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）上に均一に分布した。次いで、Ｏｒｉｓ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｓｅｅｄｉｎｇ  Ｓｔｏｐｐｅｒ（ＯＣＳ）を含有する皿の各ウェルを加湿チャンバ（３７℃、５％ＣＯ２）内で５〜１０時間（細胞株依存的）インキュベートして、細胞付着を可能にした。細胞をカウントする前に、Ｏｒｉｓ（商標）Ｓｔｏｐｐｅｒツールを使用してＯＣＳを除去して、「円検出ゾーン（ＣＤＺ）」と呼ばれる、このＣＤＺの内側に遊走した任意の新しい細胞を新しい遊走細胞として検出するための領域を作った。次いで、ＣＤＺ内でＧＦＰを発現する細胞を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を使用して、または／および蛍光顕微鏡（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）下で、各時点でカウントした。
【００９４】
細胞を、ＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡法によって可視化および分析した。ＧＦＰは、各トランスフェクトした細胞における遺伝子の発現を反映するが、ＧＦＰの強度は、時間と共に強度のレベルを減少させる可能性があるが、結果に示されるように、５日間にわたって蛍光強度はあまり失われなかった。各ウェルの強度を示す細胞総数を、同じ時間（日）点（例えば、０日目または５日目）で測定した。ＧＦＰを有する細胞は、蛍光色素で免疫染色することによってではなく、ＧＦＰを含む遺伝子をコードするベクターによって形質導入されたため、蛍光シグナルは、基質から剥離されない。蛍光シグナルを示さない細胞は、本開示のベクターでトランスフェクションされず、したがって、この分析においてカウントされず、限定されない。
【００９５】
この細胞遊走アッセイの結果は、図４Ａ〜Ｃに示される。図４Ｂにおいて、白い点線の円は、円検出ゾーン（ＣＤＺ）である。Ａ列は、１日目であり、Ｂ列は、５日目の細胞遊走ウェルであり（ＣＤＺは白い点線である）、Ｃ列は、Ｂ列からの拡大ＣＤＺである。表３は、二重Ｔ６０Ａ＆Ｔ１２７Ａ変異体が、野生型ＰＣＢＰ１およびＧＦＰのみの細胞の両方と比較して、ＣＤＺ内で減少した正味細胞遊走を示す、細胞遊走アッセイからの定量化されたデータを示す。
【表３】
2021512178.tif 000007
【００９６】
図４Ａ〜４Ｃは、ウェル当たりの細胞の割合に調整された細胞遊走を示す。ＧＦＰ群における遊走細胞の割合（ウェル当たり）（１１．０７６）は、野生型ＰＣＢＰ１（ｗＰＣＢＰ１＿０）およびＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ（ｍＰＣＢＰ１＿２）よりも有意に高かった。これらの３つの群のうち、ｍＰＣＢＰ１＿２は、ウェル当たりの遊走細胞の最低の割合を示した（２．０８２）。これらの値を以下のように計算した。
【００９７】
各時点において、細胞総数をマイクロプレートリーダーによって検出した（基準分母として）。細胞を、円検出ゾーン（ＣＤＺ）の領域内で、時点当たりの遊走細胞としてもカウントした（分子として）。ＣＤＺ内の調整された正味細胞差を、以下に示される式に従って計算した。
【数１】
2021512178.tif 000008
【００９８】
実施例５−変異型ＰＣＢＰ１によるトランスフェクションは、乳癌細胞遊走を減少させる
ＭＣＦ−７細胞株からの乳癌細胞を、ＧＦＰのみ、野生型ＰＣＢＰ１（ｗＰＣＢＰ１＿０−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）およびＧＦＰ、またはＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ（ｍＰＣＢＰ１＿２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を含有するベクターでトランスフェクトし、トランスフェクション後５日間観察した。これらの細胞の遊走は、上記で詳述したように観察した。表４は、異なるトランスフェクトした細胞のＣＤＺ内の正味細胞遊走を示す。図７Ａ〜Ｃは、ウェル当たりの細胞の割合に調整された細胞遊走を示す。ＧＦＰ群における遊走細胞の割合（ウェル当たり）は、野生型ＰＣＢＰ１（ｗＰＣＢＰ１＿０）およびＰＣＢＰ１  Ｔ６０Ａ  ＆  Ｔ１２７Ａ（ｍＰＣＢＰ１＿２）よりも有意に高かった。これらの３つの群のうち、ｍＰＣＢＰ１＿２は、ウェル当たりの遊走細胞の最低の割合を示した。
【表４】
2021512178.tif 000009
【００９９】
実施例６−腫瘍転移を阻害するＰＣＢＰ１変異体の使用
癌遺伝子療法を研究する動物モデルの設計：
実験設計：癌細胞株（すなわち、ＭＣＦ−７、乳癌モデル−ＢＣのためのＡＴＣＣ）は、マウスにおいて腫瘍形成性であり、免疫不全動物（すなわち、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ，ＮＣからのヌードマウス株：ＢＡＬＢ／ｃ）における乳癌（ＢＣ）腫瘍成長を研究するために使用され得る。これらの細胞を使用して、治療有効性を試験するためのインビボ精密法を開発する。これは最初に、標識された遺伝子を有する、すなわち、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードするベクターによって安定して形質導入される注射可能な癌細胞株のために調製される。これにより、蛍光バイオイメージングシステムまたは蛍光顕微鏡によって例示またはモニタリングされる、癌細胞の成長および遊走をモニタリングすることが可能になる。癌細胞を調製した後、それらをマウスに皮下注射して、１週間後に乳癌腫瘍を発生させる。この新しい方法を使用することによって、ＡＡＶ−ＰＣＢＰ１ｍなどの遺伝子治療ベクターの治療後、癌細胞を、それらの転移中に精密にトレースおよび研究する。
【０１００】
手順を、ＢＣ研究の例と共に以下のように実施する。
【０１０１】
（１）ＲＦＰを、ＲＦＰレポーター遺伝子の安定した長期発現のために、ＲＦＰ遺伝子を細胞ゲノムに組み込むためのレンチウイルス骨格を使用することなどによって、ＢＣ細胞株（（ＭＣＦ−７、ＡＴＣＣ）に送達する。細胞へのＲＦＰ軽質導入に成功したことを（蛍光顕微鏡またはＦＡＣＳを使用することによって）確認した後、ＢＣ細胞を選択および注射する。
【０１０２】
（２）マウスを４つの群（ｎ＝６）に分割する。ＲＦＰ−ＢＣ細胞を、全ての群において同じ条件（同じ細胞数、注入時間）でマウスの脇腹に注射する。ＢＣ腫瘍サイズを毎日または週２回、評価および記録する。実験設計および期待される転帰は、以下の表５に記載されるとおりになる。
【表５】
2021512178.tif 000010
【０１０３】
治療用遺伝子を含有するベクターを、腫瘍に直接注射する。マウスを、処置の３週間後、組織学的研究のために屠殺する。腫瘍組織を、ＲＦＰ、ＧＦＰ、ＰＲＬ−３、ＰＣＢＰ１、およびＳＯＸ２（ＢＣ細胞マーカー）の免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイのために抽出する。上記の表に記載されるように、これらの組織上でＲＦＰおよびＧＦＰを検出して、ＢＣ細胞成長およびベクター送達を確認する。腫瘍形成性および転移研究のために追加の組織（肺、肝臓、脳、および膵臓を含む）を抽出する。これらの組織内でＲＦＰおよびＧＦＰを検出して、ＢＣがこれらの組織内に遊走したかどうかをモニタリングする。ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＷＢ、およびＩＨＣも実施する。プロテオミクス研究を、質量分析技術と組み合わせた二次元ゲル電気泳動によって行って、対照対ＰＣＢＰ１変異体形質導入で、マウスにおけるタンパク質発現を比較する。実験群間の差を、スチューデントのｔ検定を使用して比較する。統計的有意性を、Ｐ＜０．０５として決定する。
【０１０４】
（３）処置後の結果についての転帰の分析は、以下の表６のように予想され得る。
【表６】
2021512178.tif 000011
【０１０５】
実施例７−腫瘍細胞においてＰＣＢＰ１を発現することによる膠芽腫の治療
ＰＲＬ３  ｍＲＮＡのレベルの上昇は、膠芽腫細胞において見られる。図１１に示されるように、正常な脳皮質細胞株における発現と比較して、６つの異なる膠芽腫細胞株（Ｕ１３８ＭＧ、Ｍ０５９Ｋ、Ｍ０５９Ｊ、Ｕ１１８ＭＧ、Ｕ８７、およびＬＮ２２９）においてＰＲＬ−３発現の上昇を検出した。細胞株Ｕ８７およびＬＮ２２９は、ＰＲＬ−３  ｍＲＮＡ発現の最大の増加を示し、さらなる試験のために選択された。
【０１０６】
野生型または変異型ＰＣＢＰ１の過剰発現は、膠芽腫細胞におけるＰＲＬ３発現を減少させる
以前に実証したように、野生型または変異型ＰＣＢＰ１の発現は、転移に関連する遺伝子、ＰＲＬ−３の発現を減少させ、細胞遊走を阻害した。ＰＣＢＰ１配列の過剰発現の効果を試験するために、膠芽腫細胞におけるＡＰ−ＰＣＢＰ１の発現を可能にする膠芽腫細胞特異的プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の制御下において、本開示の野生型または変異型ＰＣＢＰ１配列を含有するｒＡＡＶ９発現ベクターで、６つの異なる膠芽腫細胞株をトランスフェクトした（図１２を参照）。図１３〜１６は、膠芽腫細胞におけるこのベクター発現の特異性を示す。図１３は、ｐｈＧＦＡＰ−ＬａｃＺベクターで処置されたＬＮ２９９膠芽腫細胞の免疫組織化学分析を示す。図１４は、ｐｈＧＦＡＰ−ＬａｃＺベクターで処置されたＬＮ２９９膠芽腫細胞の免疫組織化学分析を示す。図１３Ｂおよび１４Ｂに示されるように、ＧＦＡＰプロモーターによって駆動されるＬａｃＺ遺伝子を、両方のトランスフェクトされた膠芽腫細胞株における抗β−ガラクトシダーゼ特異的抗体、Ａ１１１３２（１：７００の希釈におけるＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって検出する。しかしながら、β−ガラクトシダーゼは、腎臓（図１５）または眼（図１６）細胞において検出されず、このベクターが膠芽腫細胞においてのみそのカーゴを発現することを示す。ＬａｃＺ  ｍＲＮＡ発現レベルの比較が図１７に示される。
【０１０７】
１）ＧＦＰのみ、２）野生型ＰＣＢＰ１、３）ｍＰＣＢＰ１＿１、または４）ｍＰＣＢＰ１＿２を含有する２マイクログラムのＡＡＶベクターを、ＬＮ２２９およびＵ８７膠芽腫細胞株にトランスフェクトし、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＭＴＴキットを使用することによって細胞増殖を試験した。図１８Ａ〜Ｂに示されるように、野生型ＰＣＢＰ１またはいずれかの変異体の過剰発現は、ＡＡＶ−ＧＦＰベクター対照による非処置と比較して、膠芽腫細胞の増殖を有意に阻害する。さらに、ＰＣＢＰ１  ｍＲＮＡの過剰発現は、図１９および２０に示されるように、培養物中の死細胞の数を増加させる。ＡＡＶ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＣＢＰ１および変異体によるトランスフェクション後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して、死および生Ｕ８７膠芽腫細胞を分析した。図１９Ａは、対照で処置した細胞培養物が、野生型または変異型ＰＣＰＢ１配列を含有するベクターでトランスフェクトした細胞よりも有意に多くの生細胞を含有していることを示し、図１９Ｂは、これらのＰＣＢＰ１細胞培養物が、対照で処置した細胞培養物より有意に多くの死細胞を含有していることを示す。図２０Ａ〜Ｄは、ＧＦＰ対照ベクターまたはＰＣＢＰ１配列を含有するベクターのいずれかによるトランスフェクション後の生／死Ｕ８７細胞の染色を示す。図２１に示されるように、全ての形態のＰＣＢＰ１による処置は、Ｕ８７膠芽腫細胞株におけるＰＲＬ３タンパク質発現を下方制御し、ｍＰＣＢＰ１＿２で処置した細胞においてＰＲＬ３発現の最大の減少が観察された。
【０１０８】
これらの結果は、Ｕ８７細胞株に特異的ではなく、他の膠芽腫細胞株でも実証された。野生型または変異型ＰＣＢＰ１によるＬＮ２９９膠芽腫細胞のトランスフェクションは、細胞培養物中の死細胞の数を増加させ（図２２および２３）、ＰＲＬ３タンパク質発現のレベルを減少させた（図２４）。この場合もやはり、ｍＰＣＢＰ１＿２での処置は、ＰＲＬ３タンパク質発現の最大の減少を示した（図２４）。Ｍ０５９Ｊ（図２５）、Ｍ０５９Ｋ（図２６）、Ｕ１１８ＭＧ（図２７）、およびＵ１３８ＭＧ（図２８）膠芽腫細胞株において、細胞生存率に対する同様の効果が観察された。
【０１０９】
野生型または変異型ＰＣＢＰ１の過剰発現は、膠芽腫細胞におけるＳＴＡＴ３発現を減少させる
ＰＲＬ３と同様に、癌のマーカーであるＳＴＡＴ３の発現は、野生型または変異型ＰＣＢＰ１配列を含有するベクターでトランスフェクトした膠芽腫細胞において減少した。図２９および３０は、野生型ＰＣＢＰ１、ｍＰＣＢＰ１＿１、またはｍＰＣＢＰ１＿２でトランスフェクトしたＵ８７およびＬＮ２９９膠芽腫細胞において、ＳＴＡＴ３タンパク質発現レベルが減少し、ｍＰＣＢＰ１＿２処置細胞が、ＳＴＡＴ３タンパク質レベルの最大の減少を示していることを示す。
【０１１０】
実施例８−腫瘍細胞においてＰＣＢＰ１を発現することによる卵巣癌および前立腺癌の治療
ＰＣＢＰ１過剰発現の効果が膠芽腫細胞に限定されないことを実証するために、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞株を、野生型または変異型ＰＣＢＰ１配列を含有するベクターでトランスフェクトした。ＳＫＯＶ３細胞を、ＧＦＰ、ＰＣＢＰ１、ｍＰＣＢＰ１＿１、またはｍＰＣＢＰ１＿２を含有する０．５μｇまたは２．０μｇのレンチベクターのいずれかでトランスフェクトした。ＭＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して細胞増殖をアッセイした。図３１に示されるように、３つ全てのＰＣＢＰ１含有ベクターのトランスフェクションは、用量依存的に細胞増殖の阻害を増加させた。さらに、図３２は、野生型または変異型ＰＣＢＰ１配列によるトランスフェクションが、ＰＲＬ３  ｍＲＮＡ発現を減少させることを示す。
【０１１１】
野生型または変異型ＰＣＢＰ１配列を含有するベクターでトランスフェクトしたＤＵ１４５前立腺癌細胞においても同様の結果が観察された。図３３は、ＰＣＢＰ１を過剰発現する細胞が、対照細胞と比較して、細胞増殖の有意な減少を示したことを示す。図３４は、ＰＲＬ３タンパク質発現レベルが同様に減少し、ｍＰＣＢＰ１＿２変異体が最大の減少を示していることを示す。
【０１１２】
実施例９−野生型または変異型ＰＣＢＰ１の過剰発現は、非癌性細胞に対して毒性ではない
ＰＣＢＰ１の過剰発現が非癌性細胞に対して毒性はないことを実証するために、野生型または変異型ＰＣＢＰ１を含有するベクターで２つの正常な細胞型をトランスフェクトし、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＨ）アッセイを実施した。乳酸デヒドロゲナーゼは、損傷した細胞から培地に放出され、したがって、ＬＨのレベルの上昇は、細胞毒性および細胞溶解のバイオマーカーである。正常な脳細胞（ＨＣＮ−２）および正常な乳房細胞（ＭＣＦ１０Ａ）をそれぞれ、１）ＧＦＰのみ（例えば、ＰＣＢＰ１処置なし）、２）野生型ＰＣＢＰ１、３）ｍＰＣＢＰ１＿１、および４）ｍＰＣＢＰ１＿２を含有するベクターでトランスフェクトした。図３３〜３４は、ＰＣＢＰ１での処置による正常な脳および乳房細胞の有意な死滅は示さない。
【０１１３】
参照による援用
引用される全ての参考文献、出願、出版物、特許、および特許公開は、全ての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
参考文献
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１０．Ｌａｉ，Ｚ．＆  Ｂｒａｄｙ，Ｒ．Ｏ．Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎａｔ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６７，３６３−３７１（２００２）．
１１．Ｌａｉ，Ｚ．，Ｈａｎ，Ｉ．，Ｐａｒｋ，Ｍ．＆  Ｂｒａｄｙ，Ｒ．Ｏ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ＨＩＶ−１  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ−ｔｒａｐ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，３６５１−６（２００２）．
１２．Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ｓ．Ｓａｈａ，Ｊ．Ａ．Ｓａｇｅｒ，Ｋ．Ｅ．Ｒｏｍａｎｓ，Ｂ．Ｘｉｎ，Ｓ．Ｄ．Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｃ．Ｌｅｎｇａｕｅｒ，Ｖ．Ｅ．Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｋ．Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（２００３），ＰＲＬ−３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒｓ  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，９  ｐｐ．５６０７−５６１５
１３．Ｆ．Ｐｏｌａｔｏ，Ａ．Ｃｏｄｅｇｏｎｉ，Ｒ．Ｆｒｕｓｃｉｏ，Ｐ．Ｐｅｒｅｇｏ，Ｃ．Ｍａｎｇｉｏｎｉ，Ｓ．Ｓａｈａ，Ａ．Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ｍ．Ｂｒｏｇｇｉｎｉ（２００５），ＰＲＬ−３  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１  ｐｐ．６８３５−６８３９
１４．Ｌ．Ｐｅｎｇ，Ｊ．Ｎｉｎｇ，Ｌ．Ｍｅｎｇ，Ｃ．Ｓｈｏｕ（２００４），Ｔｈｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＰＲＬ−３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒＪ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１３０  ｐｐ．５２１−５２６
１５．Ｗａｎｇ，Ｈａｉｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＣＢＰ１  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＰＲＬ−３  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８，Ｉｓｓｕｅ  １，５２−６２
１６．ＰＣＢＰ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ：ｈｔｔｐｓ：／／ｈｉｖｅ．ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｇｗｕ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｄ／ｂｉｏｍｕｔａ／ｓｅｒｖｌｅｔ．ｃｇｉ？ｇｐａｇｅｉｄ＝１１＆ｓｅａｒｃｈｆｉｅｌｄ１＝ｇｅｎｅ＿ｎａｍｅ＆ｓｅａｒｃｈｖａｌｕｅ１＝ＰＣＢＰ１．
１７．Ｑｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｍｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｓｐｌｉｃｉｎｇ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｄｅｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，ＰＣＢＰ１．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．５８６６−５８７１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７０１０６５１０４
１８．Ｂｒｏｗｎ，Ａ（２０１６）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｈｎＲＮＰ  Ｅ１  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｐ５８９２−５９０７．２０１６，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ２４１．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図８Ａ】
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【図９Ａ】
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【図１０】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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