(57)【要約】  本発明は、リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡ及びその中間体を製造するための改善された方法、並びに、リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡを含む抗体薬物複合体の製造における当該改善された方法の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）：
【化１】
2021504351.tif 000021
で表される化合物。
【請求項２】
式（ＩＩＩ）：
【化２】
2021504351.tif 000022
で表される化合物を、1,4-ジオキサン中で塩化水素と反応させて、請求項１に記載された式（ＩＩ）で表される化合物を形成することを含む方法。
【請求項３】
式（Ｉ）：
【化３】
2021504351.tif 000023
で表されるvc-seco-ＤＵＢＡを製造するための、請求項１に記載された式（ＩＩ）で表される化合物の使用。
【請求項４】
請求項１に記載された式（ＩＩ）で表される化合物を、式（ＶＩＩ）：
【化４】
2021504351.tif 000024
表される化合物と反応させて、式（Ｉ）：
【化５】
2021504351.tif 000025
で表される化合物を形成することを含む、式（Ｉ）で表されるvc-seco-ＤＵＢＡの製造方法。
【請求項５】
前記式（ＩＩ）で表される化合物と前記式（ＶＩＩ）で表される化合物の反応が、N,N-ジイソプロピルアミンの存在下で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記式（ＩＩ）で表される化合物と前記式（ＶＩＩ）で表される化合物の反応が、N,N-ジメチルアセトアミド中、N,N-ジイソプロピルアミン及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の存在下で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記式（ＩＩ）で表される化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化６】
2021504351.tif 000026
で表される化合物を、1,4-ジオキサン中で塩化水素と反応させて、前記式（ＩＩ）で表される化合物を形成することにより製造された、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記式（ＩＩＩ）で表される化合物は、式（ＩＶ）：
【化７】
2021504351.tif 000027
で表される化合物を、クロロギ酸 4-ニトロフェニルと反応させて、式（Ｖ）：
【化８】
2021504351.tif 000028
で表される化合物を形成し、続いて、式（Ｖ）で表される化合物を、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の存在下で、式（ＶＩ）：
【化９】
2021504351.tif 000029
で表される化合物と反応させて、式（ＩＩＩ）で表される化合物を形成することにより製造された、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）で表される化合物を形成するための請求項４〜８のいずれか一項に記載された方法と、それに続く、式（Ｉ）で表される化合物と抗体又はその抗原結合断片の結合を含む、式（ＶＩＩＩ）：
【化１０】
2021504351.tif 000030
（式中、抗体は抗体又はその抗原結合断片であり、ｍは１〜８、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４の平均薬物抗体比である。）
で表される抗体薬物複合体の製造方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）で表される化合物が、抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブに結合している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）で表される化合物を形成するための請求項４〜８のいずれか一項に記載された方法と、それに続く、式（Ｉ）で表される化合物と抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブの結合を含む、式（ＩＸ）：
【化１１】
2021504351.tif 000031
（式中、２．６−２．９は、２．６〜２．９の平均薬物抗体比を表す。）
で表される抗体薬物複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡ及びその中間体を製造するための改善された方法、並びに、リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡを含む抗体薬物複合体の製造における当該改善された方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ及びＣＣ-１０６５を含む抗腫瘍性抗生物質である。それらは強力な抗腫瘍活性で知られているが、毒性が非常に高いので、通常、単独では使用されない。現在、デュオカルマイシンは抗体薬物複合体（ＡＤＣ）における細胞障害性薬物として検討されている。
【０００３】
ＡＤＣは、非常に強力な細胞障害性薬物をがん細胞に特異的に誘導して効力を増強し、一方で、低分子薬物の予想される全身に対する毒性の副作用を減らすことにより、がんに対する効果的な新しい治療法の満たされていない大きなニーズに取り組む可能性を有する。
【０００４】
ＡＤＣの将来の商業的成功の鍵となる点の１つは、細胞障害性薬物、及び、抗体への結合を促進するためにリンカー部分が細胞障害性薬物に結合した対応するリンカー薬物化合物の、工業的規模での生産に適した製造方法である。
【０００５】
国際公開第２０１１／１３３０３９号の２１０ページ２１〜２７行に化合物１８ｂとして最初に記載された、式（Ｉ）：
【０００６】
【化１】
2021504351.tif 000002
【０００７】
で表されるリンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡは、非常に強力なＣＣ-１０６５類似体の一例である。vc-seco-ＤＵＢＡと抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブのＡＤＣ、すなわち、ＳＹＤ９８５又は(vic-)トラスツズマブ デュオカルマジンは、いくつかの前臨床試験（M.M.C. van der Lee et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 14(3), 692-703；J. Black et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2016, 15 (8), 1900-1909）及び第Ｉ相臨床試験（ClinicalTrials.gov NCT02277717）で成功裏に使用された。現在、ＳＹＤ９８５は、ＨＥＲ２陽性の局所進行性又は転移性乳がん患者を対象とした第ＩＩＩ相臨床試験において、医師が選択した治療と比較されている（ＴＵＬＩＰ；ClinicalTrials.gov NCT03262935）。
【０００８】
国際公開第２０１１／１３３０３９号には、リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡを４工程で製造する方法が記載されている。この方法によるvc-seco-ＤＵＢＡの製造を５０〜１００ｍｇの実験室規模で行った場合、リンカー薬物化合物の総収率はわずか２１〜２５％であった。この製造方法全体から見て、後半の２つの工程、すなわち、工程３及び４は、vc-seco-ＤＵＢＡの全体的な収率にとって重要であるが、合計収率は約５０％にすぎなかった。工業的規模では、この方法の収率はさらに低くなる。
【０００９】
したがって、vc-seco-ＤＵＢＡを製造するための改善された方法が必要である。特に、収率及び化学的純度の点で優れ、試薬及び反応条件の点で費用対効果が高く、さらに、工業的規模での生産に適した方法が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡ及びその中間体を、工業的規模での生産に適した条件で製造するための改善された方法に関し、改善された収率で所望のvc-seco-ＤＵＢＡを提供する。
【００１１】
第一に、本発明は、式（ＩＩ）：
【００１２】
【化２】
2021504351.tif 000003
【００１３】
で表される化合物に関する。
【００１４】
第二に、本発明は、式（ＩＩＩ）：
【００１５】
【化３】
2021504351.tif 000004
【００１６】
で表される化合物を、1,4-ジオキサン中で塩化水素と反応させて、式（ＩＩ）で表される化合物を形成することを含む方法を提供する。
【００１７】
第三に、本発明は、式（Ｉ）：
【００１８】
【化４】
2021504351.tif 000005
【００１９】
で表されるvc-seco-ＤＵＢＡの製造における式（ＩＩ）で表される化合物の使用に関する。
【００２０】
第四に、本発明は、vc-seco-ＤＵＢＡ含有抗体薬物複合体の製造におけるvc-seco-ＤＵＢＡの製造方法の使用に関する。
【００２１】
発明の詳細な説明
デュオカルマイシンは、最初にストレプトマイセス属の培養液から単離された構造的に関連する毒素の一群である。それらには、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ及びＣＣ-１０６５を含む抗腫瘍性抗生物質が含まれる。デュオカルマイシンはＤＮＡの副溝に結合し、続いて、ＤＮＡの不可逆的アルキル化を引き起こす。これは核酸の構造を破壊し、最終的には腫瘍細胞の死につながる。
【００２２】
国際公開第２０１１／１３３０３９号は、デュオカルマイシン誘導体ＣＣ-１０６５を含む、式（Ｉ）
【００２３】
【化５】
2021504351.tif 000006
【００２４】
で表される非常に強力なリンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡを具体的に開示する（２０１ページ２１〜２７行、化合物１８ｂ）。
【００２５】
本発明は、驚くほど高い収率でvc-seco-ＤＵＢＡを製造するための改善された方法に関し、首尾よく工業的規模に応用することができる。
【００２６】
国際公開第２０１１／１３３０３９号の実施例１０におけるvc-seco-ＤＵＢＡリンカー薬物化合物の化学合成は、４工程
【００２７】
【化６】
2021504351.tif 000007
【００２８】
（ＰＮＰ-Ｃｌ；クロロギ酸 4-ニトロフェニル、Ｅｔ３Ｎ；トリエチルアミン、Ｂｏｃ；tert-ブチルオキシカルボニル、ＴＦＡ；トリフルオロ酢酸、ＣＨＣｌ３；クロロホルム、ＤＭＦ；N,N-ジメチルホルムアミド）
の方法として記載されている。
【００２９】
５０〜１００ｍｇの実験室規模では、この４工程の方法の全体の収率は、わずか２１〜２５％である。工業的規模では、この収率は大幅に低下する。
【００３０】
上述した４工程の方法の全体的な収率が低いのは、主に、実験室規模で最後の２工程（すなわち、工程３及び４）を組み合わせた収率が約５０％と低いことに起因する可能性がある。本発明者らは、驚くべきことに、工程３における酸の変更を含む修正された手順が、結晶化により単離することが可能な新しい中間体を生じることを見出した。予期せぬことに、工程３のこの変更と新しい中間体の使用により、vc-seco-ＤＵＢＡの収率が大幅に増加することがわかった。
【００３１】
生成物の純度を増加させる必要がある場合、通常、化学合成に結晶化工程が加えられる。しかし、母液中にかなりの生成物が残るので、そのような工程の追加は、通常、前記生成物の収率を低下させる。驚くべきことに、本発明者らは、上記のようにvc-seco-ＤＵＢＡの合成で結晶化工程を追加し、式（ＩＩ）
【００３２】
【化７】
2021504351.tif 000008
【００３３】
で表される新しい中間体を経由することは、純度の増加（９４〜９６％から９９．０％以上）をもたらすだけでなく、vc-seco-ＤＵＢＡの収率の予想外の大幅な増加（５３％から〜７９％）も示すことを見出した。
【００３４】
したがって、第１の態様では、本発明は、式（ＩＩ）で表される化合物に関する。
【００３５】
第２の態様では、本発明は、式（ＩＩＩ）：
【００３６】
【化８】
2021504351.tif 000009
【００３７】
で表される化合物を、1,4-ジオキサン中で塩化水素と反応させて、式（ＩＩ）で表される化合物を形成することを含む、式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法に関する。典型的には、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、1,4-ジオキサン中で１０〜２０質量％の塩化水素と反応させる。式（ＩＩＩ）で表される化合物は、好ましくは1,4-ジオキサン中で１２〜１８質量％の塩化水素と、より好ましくは1,4-ジオキサン中で１５質量％の塩化水素と反応させる。1,4-ジオキサン中の式（ＩＩＩ）で表される化合物：ＨＣｌの質量比は、通常、１：０．５〜１：２５である。好ましくは、1,4-ジオキサン中の式（ＩＩＩ）で表される化合物：ＨＣｌの質量比は、１：１〜１：１０で、より好ましくは、１：５〜１：１０である。
【００３８】
塩化水素の量は、通常、式（ＩＩＩ）で表される化合物の量のモル過剰である。好ましくは、塩化水素の量は、式（ＩＩＩ）で表される化合物の量の少なくとも２モル当量、より好ましくは、２〜５０当量である。
【００３９】
好ましくは、前記反応は、水及び／又はメタノール中、トリイソプロピルシランなどのスカベンジャーの存在下で行われる。前記水及び／又はメタノールは、全溶媒中、２５質量％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満であってもよい。
【００４０】
式（ＩＩＩ）で表される化合物は、例えば、R.C. Elgersma et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 12(6), 1813-1835に記載されているように、式（ＩＶ）：
【００４１】
【化９】
2021504351.tif 000010
【００４２】
で表される化合物とクロロギ酸 4-ニトロフェニルを反応させて、式（Ｖ）：
【００４３】
【化１０】
2021504351.tif 000011
【００４４】
で表される化合物を得、続いて、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の存在下で、式（Ｖ）で表される化合物と式（ＶＩ）：
【００４５】
【化１１】
2021504351.tif 000012
【００４６】
で表される化合物を反応させることにより製造することができる。
【００４７】
式（ＩＶ）で表される化合物とクロロギ酸 4-ニトロフェニルの反応は、通常、０〜２０℃で行われる。この温度は、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは０〜６℃、さらにより好ましくは２〜６℃、最も好ましくは３〜５℃である。
【００４８】
式（Ｖ）で表される化合物の製造に適した溶媒は、限定されるものではないが、有機溶媒、好ましくは非プロトン性溶媒、より好ましくは極性非プロトン性溶媒である。好ましい溶媒は、エーテル、アミド又はその混合物である。特に好ましい溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、N,N-ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）又はその混合物である。最も好ましくは、ＴＨＦとＤＭＡの混合物である。
【００４９】
式（Ｖ）で表される化合物の製造に適した塩基は、有機塩基、例えば第三級アミンである。特に適切な塩基はＥｔ３Ｎである。
【００５０】
式（Ｖ）で表される化合物と式（ＶＩ）で表される化合物との反応は、通常、０〜２０℃で行われる。この温度は、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは４〜１０℃である。
【００５１】
式（ＩＩＩ）で表される化合物の製造に適した溶媒は、限定されるものではないが、有機溶媒、好ましくは非プロトン性溶媒、極性溶媒又はその混合物である。好ましい溶媒は、エーテル、アミド又はその混合物である。特に好ましい溶媒は、ＴＨＦ、ＤＭＡ又はその混合物である。最も好ましくは、ＴＨＦとＤＭＡの混合物である。
【００５２】
式（ＩＶ）で表される化合物は、先行技術に記載の適当な方法、例えば国際公開第２０１５／１８５１４２号の実施例６ａに記載されている方法で、又はそれと同様の方法で得ることができる。
【００５３】
別の態様では、本発明は、vc-seco-ＤＵＢＡを製造するための式（ＩＩ）で表される化合物の使用に関する。
【００５４】
さらに別の態様では、本発明は、式（ＩＩ）で表される化合物を式（ＶＩＩ）：
【００５５】
【化１２】
2021504351.tif 000013
【００５６】
で表される化合物と反応させるvc-seco-ＤＵＢＡの製造方法に関する。
【００５７】
塩基として、国際公開第２０１１／１３３０３９号の実施例１０に記載されたトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）の代わりにN,N-ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いて、式（ＩＩ）で表される化合物と式（ＶＩＩ）で表される化合物を反応させた場合、予想に反して、vc-seco-ＤＵＢＡの収率はさらに増加した。式（ＩＩ）で表される化合物：ＤＩＰＥＡのモル比は、通常、１：１〜１：１５である。この比は、好ましくは１：１〜１：１０、より好ましくは１：２〜１：７、さらにより好ましくは１：３〜１：５、最も好ましくはこの比は約１：４である。
【００５８】
式（ＩＩ）で表される化合物と式（ＶＩＩ）で表される化合物との反応は、通常、０〜２０℃で行われる。この温度は好ましくは０〜１０℃、より好ましくは０〜５℃である。
【００５９】
式（ＩＩ）で表されると式（ＶＩＩ）で表される化合物との反応によりvc-seco-ＤＵＢＡを製造するのに適した溶媒は、限定されるものではないが、有機溶媒、好ましくは非プロトン性溶媒、より好ましくは極性非プロトン性溶媒である。好ましい溶媒は、エーテル、アミド又はその混合物である。特に好ましい溶媒は、ＴＨＦ、ＤＭＡ、N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はその混合物である。最も好ましくは、ＤＭＡである。
【００６０】
好ましい態様では、この方法は、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の存在下で行われる。式（ＩＩ）で表される化合物：１-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物のモル比は、通常、１：１〜１：１０である。この比は、好ましくは１：１〜１：７、より好ましくは１：２〜１：５、さらにより好ましくは１：２〜１：３、最も好ましくはこの比は約１：２．５である。
【００６１】
本発明はさらに、式（ＶＩＩＩ）
【００６２】
【化１３】
2021504351.tif 000014
【００６３】
で表されるvc-seco-ＤＵＢＡ ＡＤＣの製造方法に関し、リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡは、上述した本願発明に係る方法で製造される。ｍは１〜８、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４の平均薬物抗体比（ＤＡＲ）を示す。
【００６４】
本発明において、抗体−特に、治療活性を有することが知られている抗体、若しくはＡＤＣの分野で知られている抗体−又は、その抗原結合断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’フラグメント、一本鎖（ｓｃ）抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン（ｓｄ）抗体、ダイアボディ若しくはミニボディを、vc-seco-ＤＵＢＡの（野生型又は部位特異的な）結合に使用することができる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ抗体など任意のアイソタイプであってもよい。好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体である。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であってよい。好ましくは、抗体はヒト化されている。さらにより好ましくは、抗体はヒト化又はヒトＩｇＧ抗体、最も好ましくはヒト化又はヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。好ましくは、前記抗体はκ軽鎖を有し、すなわち、ヒト化又はヒトＩｇＧ１−κ抗体である。
【００６５】
ヒト化抗体では、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）は、非ヒト種（通常、マウス、ラット又はウサギ）の抗体に由来する。これらの非ヒトＣＤＲは、ＨＣ及びＬＣの可変領域のヒトフレームワーク（フレームワーク領域（ＦＲ）ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）内に配置することができる。ヒトＦＲの選ばれたアミノ酸は、低い免疫原性を保持しつつ結合親和性を改善するために、対応する元の非ヒト種のアミノ酸と交換することができる。代わりに、抗体の結合親和性を保持しつつ免疫原性を低下させるために、非ヒトＦＲが保持され、非ヒトＦＲの選ばれたアミノ酸を対応するヒトのアミノ酸と交換してもよい。このようにヒト化された可変領域は、ヒト定常領域と組み合わされる。
【００６６】
これらの抗体は、組換えにより、合成により、又は当該技術分野で既知の他の適当な方法により製造することができる。
【００６７】
通常、抗体は、アネキシンＡ１、Ｂ７Ｈ４、ＣＡ６、ＣＡ９、ＣＡ１５-３、ＣＡ１９-９、ＣＡ２７-２９、ＣＡ１２５、ＣＡ２４２（がん抗原２４２）、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０（腫瘍壊死因子８）、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８（サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）、ＣＤ５６（神経細胞接着分子）、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１１５（コロニー刺激因子１受容体）、ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体）、ＣＤ１３８（シンデカン１）、ＣＤ２０３ｃ（ＥＮＰＰ３）、ＣＤ３０３、ＣＤ３３３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ、ＣＬＣＡ-１（Ｃ型レクチン様分子１）、ＣＬＬ-−１、ｃ-ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、Cripto、ＤＬＬ３、ＥＧＦＬ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥＰｈ（例、ＥｐｈＡ２又はＥＰｈＢ３）、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、ＦＡＰ、ＦｃＲＬ５（Ｆｃ受容体様タンパク質５、ＣＤ３０７）、ＦＧＦＲ（例、ＦＧＦＲ３）、ＦＯＬＲ１（葉酸受容体α）、ＧＣＣ（グアニル酸シクラーゼＣ）、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＭＷ-ＭＡＡ（高分子量黒色腫関連抗原）、インテグリンα（例、αｖβ３及びαｖβ５）、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＭ４ＳＦ１（又はＬ６抗原）、ルイスＡ様糖質、ルイスＸ、ルイスＹ（ＣＤ１７４）、ＬＩＶ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＮ（ＣＡ９）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン-４、ＰＤ-１、ＰＤ-Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＴＲＡＰ-１、５Ｔ４抗原（又はＴＰＢＧ、栄養膜糖タンパク質）、ＴＦ（組織因子、トロンボプラスチン、ＣＤ１４２）、ＴＦ-Ａｇ、Ｔａｇ７２、ＴＮＦＲ、ＴＲＯＰ２（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２）、ＶＥＧＦＲ並びにＶＬＡからなる群から選択される標的に結合する少なくとも１つのＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域を含む単一特異性抗体（すなわち、１つの抗原に特異的な抗体；このような抗原は種間で共通であるかもしれず、又は、種間で類似したアミノ酸配列を有しているかもしれない）又は二重特異性抗体（すなわち、２つの異なる抗原に特異的な抗体）である。
【００６８】
適当な抗体の例には、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、イラツムマブ及びブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、バダスツキシマブ（ＣＤ３３）、テツルマブ（ＣＤ３７）、イサツキシマブ（ＣＤ３８）、ビバツズマブ（ＣＤ４４）、ロルボツズマブ（ＣＤ５６）、ボルセツズマブ（ＣＤ７０）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ポラツズマブ（ＣＤ７９）、ロバルピツズマブ（ＤＬＬ３）、フツキシマブ（ＥＧＦＲ）、オポルツズマブ（ＥＰＣＡＭ）、ファルレツズマブ（ＦＯＬＲ１）、グレンバツムマブ（ＧＰＮＭＢ）、トラスツズマブ及びペルツズマブ（ＨＥＲ２）、エタラシズマブ（インテグリン）、アネツマブ（メソセリン）、パンコマブ（ＭＵＣ１）、エンフォルツマブ（ネクチン-4）、並びに、Ｈ８、Ａ１及びＡ３（５Ｔ４抗原）が含まれる。
【００６９】
リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡの抗体への結合は、国際公開第２０１１／１３３０３９号、国際公開第２０１５／１７７３６０号及び国際公開第２０１７／１３７６２８号に記載されたように行ってもよい。
【００７０】
野生型のＡＤＣは、鎖間のジスルフィド結合を還元することで生成したシステインの遊離チオールを介して、リンカー薬物化合物と抗体を結合させることにより製造される。この方法は、溶媒にさらされた鎖間ジスルフィド結合の部分的な還元と、これに続く、マレイミド含有リンカー薬物化合物によるチオールの修飾を伴う。この方法では、還元されたジスルフィドあたり最大で２つの薬物が結合する。ほとんどのヒトＩｇＧ分子は溶媒にさらされたジスルフィド結合を４つ有するので、抗体あたり０〜８の薬物との結合が可能である。抗体あたりの薬物の正確な数は、ジスルフィド結合の還元の程度と、その後の結合反応において使用するリンカー薬物化合物のモル当量によって決まる。４つのすべてのジスルフィド結合の完全な還元により、抗体あたり８つの薬物が結合した均一なものを得られるが、部分的な還元では、通常、抗体あたり０、２、４、６又は８つの薬物が結合した不均一な混合物となる。
【００７１】
部位特異的なＡＤＣは、変異抗体の適当な位置にある組み込まれたシステイン残基の側鎖を介してリンカー薬物化合物と抗体を結合させることにより製造される。組み込まれたシステインは、通常、システインやグルタチオンなどの他のチオールと結合し、ジスルフィドを形成する。このチオールとの結合は、薬物との結合の前に切断する必要がある。この組み込まれた残基への薬物の結合は、抗体固有の鎖間ジスルフィド及び上記変異ジスルフィドの両者を還元し、次に、ＣｕＳＯ４やデヒドロアスコルビン酸といった穏やかな酸化剤で抗体固有の鎖間システインを再酸化し、その後、前記結合していない組み込まれたシステインとリンカー薬物化合物を通常の方法で結合することにより、又は、鎖間ジスルフィド結合を還元するよりも早く上記変異ジスルフィドを還元する穏やかな還元剤を使用し、その後、結合していない組み込まれたシステインとリンカー薬物化合物を通常の方法で結合することにより、行われる。最適な条件では、（１つのシステインがｍＡｂの重鎖又は軽鎖に組み込まれている場合、）抗体ごとに２つの薬物が結合する（すなわち、薬物抗体比ＤＡＲは２である）。
【００７２】
好ましい態様では、本発明で用いられる抗体は、抗ＨＥＲ２抗体であり、さらにより好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体のトラスツズマブである。
【００７３】
ある特定の態様では、本発明は、式（ＩＸ）
【００７４】
【化１４】
2021504351.tif 000015
【００７５】
で表される、トラスツズマブ vc-seco-ＤＵＢＡ ＡＤＣの製造方法に関し、リンカー薬物化合物vc-seco-ＤＵＢＡは、上述した本願発明に係る方法で製造される。２．６−２．９は、２．６〜２．９のＤＡＲを表す。
【実施例】
【００７６】
実施例１  メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-ＭＯＭ-Ｂｏｃ-エチレンジアミン-Ｄ（４）の製造
【００７７】
【化１５】
2021504351.tif 000016
【００７８】
トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（０．５５ｇ、４．９４ｍｍｏｌ）の存在下、メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-ＭＯＭ（１）（１．０ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）とクロロギ酸 4-ニトロフェニル（ＰＮＰ-Ｃｌ）（０．４３ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（４．５ｇ）とN,N-ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）（３．０ｇ）の混合物中で、０℃（６℃までの上昇を許容）で約１．５時間反応させた。メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-ＭＯＭ-ＰＮＰ（２）を含むスラリーを得た。
【００７９】
第２の工程では、tert-ブチル(2-((2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチル)アミノ)エチル)(メチル)-カルバメート（３）（０．５８ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）をＤＭＡ（１．７ｇ）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）（０．３５ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を上記スラリーと４℃（１０℃までの上昇を許容）で１．５時間反応させた。
【００８０】
反応の終了後、反応混合物に酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（８．８ｇ）を添加し、その溶液をブライン（１１．３ｇ）、飽和重炭酸ナトリウム溶液（３．８ｇ）、再び、ブライン（３．８ｇ）で洗浄した。有機層を分離し、カーボンろ過で精製した。ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させた。得られたメチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-ＭＯＭ-Ｂｏｃ-エチレンジアミン-Ｄ（４）をアセトン（２０ｇ）に溶解し、再度、カーボンろ過で精製した。
【００８１】
粗生成物を、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９７：３〜９４：６の移動相で溶出することにより、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物画分を濃縮し、真空で乾燥させて、メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-ＭＯＭ-Ｂｏｃ-エチレンジアミン-Ｄ（４）（１．２７ｇ、１．４８ｍｍｏｌ；収率８４％、純度９３．８２％）を得た。
【００８２】
実施例２  vc-seco-ＤＵＢＡの製造
メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-エチレンジアミン-Ｄ塩酸塩（５）の製造
【００８３】
【化１６】
2021504351.tif 000017
【００８４】
スカベンジャー（トリイソプロピルシラン（０．６３ｇ）、水（０．４ｇ）及びメタノール（０．３ｇ））の存在下、1,4-ジオキサン（７．５ｇ）中の１５％塩化水素（ＨＣｌ）により、メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミドＭＯＭ-Ｂｏｃ-エチレンジアミン-Ｄ（４（１．２７ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）のメトキシメチル基（ＭＯＭ）及びブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）を除去した。反応溶液から、メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-エチレンジアミン-Ｄ塩酸塩（５）を黄色の個体として結晶化した。
【００８５】
得られた黄色の固体をろ別し、アセトンで洗浄し、窒素及び真空を使用してフィルター上で乾燥させ、純粋な生成物（５）を得た（１．０ｇ、１．３３ｍｍｏｌ；収率９０％、純度９０％以上）。
【００８６】
vc-seco-ＤＵＢＡの製造
【００８７】
【化１７】
2021504351.tif 000018
【００８８】
N,N-ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．６５ｇ、５．１０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．４７ｇ、３．１６ｍｍｏｌ）の存在下、メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-エチレンジアミン-Ｄ塩酸塩（５）（１．０ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）と、マレイミド-ＯＥＧ２-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢＡ-ＰＮＰ（６）（０．９８ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）をＤＭＡ（１７．８ｇ）中で、０℃（５℃までの上昇を許容）の暗所で１．５時間反応させた。反応混合物を２３〜２５℃の水（２０１．１ｇ）に滴下（５０〜６０分）し、vc-seco-ＤＵＢＡ粗生成物の沈殿を得た。３０分間撹拌した後、沈殿した粗生成物を圧力フィルターでろ過した。フィルターケーキを水で徹底的に洗浄し、フィルター内でわずかな窒素流下減圧して乾燥させた。
【００８９】
最初にvc-seco-ＤＵＢＡ粗生成物を低圧フラッシュクロマトグラフィー（固定相−０．０４０〜０．０６３ｍｍシリカゲル；移動相−ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０）にかけた。条件を満たす画分（vc-seco-ＤＵＢＡ９０％以上のＵＰＬＣ-ＩＮ純度）をフラスコに収集し、ろ過し、蒸発させた。分取クロマトグラフィー（固定相−０．０１５〜０．０４０ｍｍシリカゲル；移動相−ジクロロメタン：メタノール＝９０：１０〜８５：１５）でさらに精製した。条件を満たす画分（vc-seco-ＤＵＢＡ９０％以上のＵＰＬＣ-ＩＮ純度）をフラスコに収集し、溶媒をＤＭＡに交換した。最高温度２５℃で濃縮した。濃縮した溶液を、０．２μｍフィルターでろ過し、水に加え、微細な黄色の粉末として純粋なvc-seco-ＤＵＢＡを沈殿させた（収率３５〜４５％；純度９９．０％以上）。
【００９０】
生成物をろ過し、水で洗浄し、最高温度２５℃で減圧下、窒素を使用してフィルター内で乾燥させた。
【００９１】
比較例  vc-seco-ＤＵＢＡの製造
vc-seco-ＤＵＢＡの合成を国際公開第２０１１／１３３０３９号の実施例１０の記載に従い行う。
【００９２】
【化１８】
2021504351.tif 000019
【００９３】
工程１
メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-ＭＯＭ-Ｂｏｃ-エチレンジアミン-Ｄ（０．１ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）（６ｍｌ）に懸濁し、氷冷した。２ｍｌの酸（トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又は1,4-ジオキサン（７．５ｇ）中の１５％ＨＣｌ）を加え、混合物を３時間撹拌した。次いで、混合物を真空で濃縮した。
【００９４】
工程２
残留物をN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４ｍｌ）に溶解し、溶液を氷で冷却し、マレイミド-ＯＥＧ２-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢＡ-ＰＮＰ（６）（０．１３ｍｍｏｌ）及び塩基（１ミリモル、Ｅｔ３Ｎ又はＤＩＰＥＡ）を添加した。混合物を２時間撹拌し、真空で濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ジクロロメタン：メタノール、１：０〜８：２）で精製した。
【００９５】
vc-seco-ＤＵＢＡの製造効率に対する酸及び塩基の影響を調べるために、工程１では、1,4-ジオキサン中のＨＣｌ又は従来技術による酸であるＴＦＡを用いて、メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-ＭＯＭ-Ｂｏｃ-エチレンジアミン-Ｄ（４）中のＭＯＭ基及びＢｏｃ基を除去し、工程２では、ＤＩＰＥＡ又は従来技術による塩基であるＥｔ３Ｎを用いて、メチルＣＢＩ-アザインドール-ベンズアミド-エチレンジアミン-Ｄ塩酸塩（５）とマレイミド-ＯＥＧ２-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢＡ-ＰＮＰ（６）のカップリング反応を促進し、上記の反応を行った。
【００９６】
以下の表はvc-seco-ＤＵＢＡの収率を示す。
【００９７】
【表１】
2021504351.tif 000020
【００９８】
工程１でＴＦＡの代わりに1,4-ジオキサン中のＨＣｌを用いた場合、ＨＰＬＣで求めたvc-seco-ＤＵＢＡの全収率が２５．８％増加した。工程２でＥｔ３Ｎの代わりにＤＩＰＥＡを用いた場合、ＨＰＬＣで求めたvc-seco-ＤＵＢＡの全収率が２３．６％減少した。しかしながら、工程１で1,4-ジオキサン中のＨＣｌを使用し、工程２でＤＩＰＥＡを使用すると、ＨＰＬＣで求めたvc-seco-ＤＵＢＡの全収率が２９．８％増加した。
【国際調査報告】
2021504351.tif 000032
2021504351.tif 000033
2021504351.tif 000034