(57)【要約】  本発明は、血管性認知症の治療におけるマンヌロン二酸オリゴ糖組成物の適用に関する。
2021528458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管性認知症の治療のための薬剤の製造における、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物の使用であって、前記マンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、式（ＩＩＩ）を有するマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩：
【化１】
2021528458.tif 000010
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
を含んでなり、
ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、６０％以上であり、
ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、６０％未満である、使用。
【請求項２】
前記マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、１０〜５０％、好ましくは２５〜５０％である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝４〜７であるマンヌロン二酸の総重量に対する、ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸の総重量の比率が、１．０〜３．５の間である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝１または２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、５０％以上、好ましくは６０％〜９０％、より好ましくは７０％〜９０％である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ｍ＋ｍ’＝１であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、１０％以上、好ましくは３０〜４０％である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ｍ＋ｍ’＝２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、１０％以上、好ましくは３０〜５０％である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、８０〜９５％である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、２０〜７０％である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ｎ＝４〜７であるマンヌロン二酸の総重量に対する、ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸の総重量の比率が、１．０〜３．０の間である、請求項４に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物においてそれぞれの重合度のマンヌロン二酸の重量パーセント含量が、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類５〜２５％、六糖類２〜２０％、七糖類２〜２０％、八糖類２〜２０％、九糖類２〜２０％、十糖類２〜２０％である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記組成物においてそれぞれの重合度のマンヌロン二酸の重量パーセント含量が、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１０〜２０％、六糖類５〜１５％、七糖類３〜１０％、八糖類２〜５％、九糖類１〜５％、十糖類１〜５％である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記組成物においてそれぞれの重合度のマンヌロン二酸の重量パーセント含量が、二糖類１０〜２０％、三糖類１８〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１５〜２０％、六糖類５〜１０％、七糖類３〜５％、八糖類２〜５％、九糖類１〜３％、十糖類１〜３％である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
薬学上許容可能な塩が、ナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、血管性認知症を有する患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性評価法により得られたマンヌロン二酸の最適な組成物の、血管性認知症の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管性認知症(vascular dementia)（ＶＤ）は、脳血管疾患により引き起こされる重篤な認知機能不全症候群を指す。中国におけるＶＤの有病率は１．１％〜３．０％であり、年間の罹患率は５〜９／１０００人である。その臨床診療は主として、原発脳血管疾患を治療すること、およびＶＤの発症を予防することである。ＶＤ患者には、支持療法としてビタミンＥ、ビタミンＣおよびイチョウ調製物が使用される。理想的な治療薬はこれまでに存在しない。
【０００３】
マンヌロン二酸は、その潜在的な医学的価値のために広く注目を集めている。マンヌロン二酸は通常、アルギン酸を原料として用いる多段階方法により調製される。
【０００４】
原料であるアルギン酸の多糖分子は、β−１，４−グルコシド結合により連結されたＤ−マンヌロン酸から形成されるＭセグメント、α−１，４−グルコシド結合により連結されたＬ−グルロン酸から形成されるＧセグメント、およびこの２つの糖のハイブリダイゼーションにより形成されるＭＧセグメントを含んでなる。Ｄ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸の構造式を以下の式（Ｉ）に示す。
【化１】
2021528458.tif 000003
【０００５】
ＭセグメントおよびＧセグメントは、原料であるアルギン酸から分離することができる。一般的な方法を、以下に簡単に記載することができる。アルギン酸を予め分解し、ポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の多糖混合物を得る。次いでこの多糖混合物を酸性沈殿に供し、その中のポリグルロン酸を除去し、さらに精製して純度が９０％を超えるホモポリマンヌロン酸（以後、「Ｍセグメント中間体」とも称する）を得る。例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号およびＣＮ０２８２３７０７．２号に開示された方法を参照。
【０００６】
オリゴマンヌロン酸の一般的な調製方法は次の通りである：上記で得たＭセグメント中間体を酸性条件下で加熱することによりさらに酸分解に供し、所望の範囲の分子量を有する小断片マンヌロン酸ポリマーを得る。さらに、分解効率は酸化的分解方法により向上させることができ、一方、還元末端は開環サッカリン二酸に酸化することができる。詳細については、Ｍｅｉｙｕ  Ｇｅｎｇらが出願した中国特許出願第２００５８０００９３９６．５号（特許文献１）および米国特許第８，８３５，４０３  Ｂ２号（特許文献２）を参照。便宜上、特許文献１および２を以後まとめて先行文献といい、引用することによりその全体が本明細書の開示の一部とされる。
【０００７】
先行文献において開示されているマンヌロン二酸を得る反応は、以下の反応式（ＩＩ）で表すことができる。すなわち、オリゴマンヌロン酸多糖の還元末端にあるマンヌロン酸のＣ１位のアルデヒド基が、カルボキシル基に酸化される。
【化２】
2021528458.tif 000004
【０００８】
上記の酸化変換過程において、慣用される酸化剤は、アルカリ性硫酸銅溶液、すなわちフェーリング試薬である。先行文献は、まさにこの酸化方法を採用している。具体的には、アルカリ性条件下で、反応基質のポリマンヌロン酸、すなわち、上記のＭセグメント中間体を硫酸銅溶液に加え、沸騰水浴中で１５分〜２時間反応させる。この方法は、アルデヒド基を酸化するためにＣｕ２＋イオンを酸化剤として用いており、赤れんが色の酸化第一銅の沈殿が、反応において生成される。この反応は、しばしば還元糖の同定に使用される。
【０００９】
先行文献は、オリゴマンナル酸が、アルツハイマー病（ＡＤ）および糖尿病に効果を有することを開示している。アルツハイマー病および２型糖尿病の病因は、アミロイド（β−アミロイドおよびアミリン）と密接に関連している。アミロイドタンパク質は、凝集し、次いでタンパク質オリゴマーを形成し、さらに凝集して線維を形成する。これらのタンパク質凝集物は細胞傷害性であり、細胞における酸化反応を誘導してミトコンドリアを損傷させ、血管性認知症反応などのカスケード反応を惹起して、多数のニューロンおよびβ細胞に損傷を引き起こし、最終的に、アルツハイマー病および２型糖尿病の発症に至る。オリゴマンナル酸はアミロイドタンパク質を標的とし、アミロイドタンパク質により誘導されるカスケード反応と拮抗するため、アルツハイマー病および２型糖尿病を予防および治療する効果を有する。
【００１０】
先行文献ＣＮ１０６３４４５９５Ａは、血管性認知症の治療におけるアルギン酸オリゴ糖およびその誘導体の適用を開示しており、また、血管性認知症の治療における四糖類〜十糖類混合物の薬力学的活性も開示している。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、血管性認知症の治療におけるマンヌロン二酸オリゴ糖組成物の使用に関する。本発明はまた、治療上有効な量の本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、血管性認知症を治療する方法にも関する。
【００１２】
本発明において使用されるマンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、式（ＩＩＩ）を有するマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩：
【化３】
2021528458.tif 000005
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
を含んでなり、
ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量の６０％以上であり、
ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量の６０％未満である特定の組成を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、生成物Ａにおける二糖類、三糖類および四糖類の質量スペクトルを示す。
【図２】図２は、生成物Ａにおける五糖類、六糖類および七糖類の質量スペクトルを示す。
【図３】図３は、生成物Ａにおける八糖類、九糖類および十糖類の質量スペクトルを示す。
【図４】図４は、両側総頸動脈閉塞により引き起こされた血管性認知症を有するマウスの暗所回避試験における潜時に対するオリゴ糖組成物、六糖類および比較実験サンプルの効果を示す。図の横座標の数字に対応するサンプルは、ｉ：対照群；ｉｉ：モデル群；ｉｉｉ：生成物Ａ；ｉｖ：生成物Ｂ；ｖ：生成物Ｃ；ｖｉ：生成物Ｄ；ｖｉｉ：比較実験サンプル；ｖｉｉｉ：六糖類である。
【図５】図５は、両側総頸動脈閉塞により引き起こされた血管性認知症を有するマウスの暗所回避試験における誤りの数に対するオリゴ糖組成物、六糖類および比較実験サンプルの効果を示し、横軸の記号は図４と同様である。
【図６】図６は、両側総頸動脈閉塞により引き起こされた血管性認知症を有するマウスの水迷路試験における逃避潜時に対するオリゴ糖組成物、六糖類および比較実験サンプルの効果を示し、横軸の記号は図４と同様である。
【図７】図７は、両側総頸動脈閉塞により引き起こされた血管性認知症を有するマウスにおけるプラットフォーム横断回数に対するオリゴ糖組成物、六糖類および比較実験サンプルの効果を示し、横軸の記号は図４と同様である。
【図８】図８は、中大脳動脈閉塞により引き起こされた血管性認知症を有するラットの水迷路試験における逃避潜時に対するオリゴ糖組成物、六糖類および比較実験サンプルの効果を示し、横軸の記号は図４と同様である。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明の種々の態様を以下に詳細に説明するが、本発明はこれらの特定の実施態様に限定されない。当業者ならば、以下の実質的な開示を踏まえ、本発明に多少の改変および調整を行うことができ、このような調整も、本発明の範囲に包含される。
【００１５】
本発明は、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物の血管性認知症の治療における使用に関する。本発明はまた、有効量の本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、血管性認知症を治療する方法に関する。
【００１６】
本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、式（ＩＩＩ）を有するマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩：
【化４】
2021528458.tif 000006
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
を含んでなり、
ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量の６０％以上であり、
ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量が、前記組成物の総重量の６０％未満である。
【００１７】
本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、重合度の異なるマンヌロン二酸の混合物であり、その主成分は２〜１０の重合度を有するマンヌロン二酸オリゴ糖である。マンヌロン二酸において最も活性が高い種は、四糖類〜十糖類、特に六糖類である。しかしながら、本発明者らは今般、活性が低い二糖類〜三糖類を最も活性が高い四糖類〜十糖類に特定の割合で加えると、同一質量の投与量のもとでは、生物活性は低下することなく、むしろ活性が高くなることを見出している。いかなる理論にも拘束されるものではないが、これは、低分子量の二糖類〜三糖類は、単独では作用できないものの、他のオリゴ糖と混合し場合に相乗作用を示すためと推測される。しかしながら、二糖類〜三糖類の割合が高すぎると、組成物の全体的な活性は低下する。従って、組成物中の二糖類〜三糖類の割合は特定の範囲内に制御しなければならない。
【００１８】
実際の調製工程では、酸化分解反応において多量の二糖類〜三糖類が生成され、通常、その活性の低さから、生成物の医薬効果に影響を及ぼすことを避けるため、分離後に生成物から除去される。しかしながら、本発明者らの上記発見に基づき、二糖類〜三糖類の割合を特定の範囲内に制御するために酸化分解反応の条件を制御することによれば、酸化分解生成物中の二糖類〜三糖類を分離および除去する必要はない可能性がある。得られた組成物の活性は、先願に開示されている組成物の活性と同等か、またはより高い可能性もある。さらに、二糖類および三糖類は除去すべき不純物とはみなされないため、生成物収量もまた、先願で開示されている生成物よりもかなり高い。このように、本発明は生産コストを大幅に削減し、廃棄物の排出を低減し、それにより実際の生産の実現が容易となり、産業的大規模生産の実現が容易となる。
【００１９】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝１または２であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量の５０％以上、好ましくは６０％〜９０％、より好ましくは７０％〜９０％である。特に、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝１であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量の１０％以上、好ましくは３０〜４０％である。別の好ましい実施態様では、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝２であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量の１０％以上、好ましくは３０〜５０％である。
【００２０】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量は、前記組成物の総重量の８０〜９５％である。
【００２１】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量は、前記組成物の総重量の１０〜５０％、好ましくは、２５〜５０％である。
【００２２】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量は、前記組成物の総重量の２０〜７０％である。
【００２３】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、ｎ＝４〜７であるマンヌロン二酸の総重量に対するｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸の総重量の比率は、１．０〜３．０の間である。
【００２４】
好ましい実施態様によれば、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、前記組成物のそれぞれの重合度のマンヌロン二酸の重量パーセント含量は、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類５〜２５％、六糖類２〜２０％、七糖類２〜２０％、八糖類２〜２０％、九糖類２〜２０％、および十糖類２〜２０％である。特に、前組成物におけるオリゴ糖の重量パーセント含量は、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１０〜２０％、六糖類５〜１５％、七糖類３〜１０％、八糖類２〜５％、九糖類１〜５％、および十糖類１〜５％である。より好ましくは、組成物におけるオリゴ糖の重量パーセント含量は、二糖類１０〜２０％、三糖類１８〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１５〜２０％、六糖類５〜１０％、七糖類３〜５％、八糖類２〜５％、九糖類１〜３％、および十糖類１〜３％である。
【００２５】
本発明のマンヌロン二酸オリゴ糖組成物において、その薬学上許容可能な塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩である。
【００２６】
本特許出願の発明者らは、新規構造を有する上記の９種類のオリゴ糖を特定の割合で配合すると、高活性オリゴ糖組成物を得ることができ、その活性は、最も活性が高い六糖類よりも高いことを見出した。特に、特定の割合で二糖類および三糖類を加えた組成物は、二糖類および三糖類を配合しない組成物よりも高い活性を有していた。高活性オリゴ糖組成物中のそれぞれのオリゴ糖の割合は、以下に示す割合に従って組み合わせる必要がある。
【００２７】
組成物中のｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量の６０％以上であり、好ましくは８０〜９５％である。ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量の６０％未満であり、好ましくは１０〜５０％、より好ましくは２５〜５０％である。ｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量は、前記組成物の総重量の２０〜７０％である。ｎ＝４〜７であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量に対するｎ＝１〜３であるマンヌロン二酸オリゴ糖の総重量の比率は、１．０〜３．５の間、好ましくは１．０〜３．０の間である。
【００２８】
本発明の血管性認知症の治療のための薬剤は、式（ＩＩＩ）を有するマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩、および１以上の薬学上許容可能な担体を含んでなる、マンヌロン二酸オリゴ糖組成物を含んでなる。本発明の薬剤は、経口または非経口投与のための錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、腸溶カプセル剤、マイクロカプセル、顆粒、シロップ、注射、顆粒、エマルジョン、懸濁液、溶液および徐放性製剤の形であり得る。
【００２９】
本発明の薬学上許容可能な担体とは、当業者に公知の薬学上許容可能な担体を指す。本発明の薬学上許容可能な担体には、限定されるものではないが、増量剤、湿潤剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、粘着剤、流動促進剤、矯味剤、界面活性剤、保存剤などが含まれる。増量剤には、限定されるものではないが、ラクトース、微晶質セルロース、デンプン、糖粉末、デキストリン、マンニトール、硫酸カルシウムなどが含まれる。湿潤剤および結合剤には、限定されるものではないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、スクロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。崩壊剤には、限定されるものではないが、カルボキシメチルデンプンナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが含まれる。滑沢剤には、限定されるものではないが、ステアリン酸マグネシウム、シリカゲル微粉末、タルク、水素化植物油、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムなどが含まれる。粘着剤には、限定されるものではないが、アラビアガム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、グルコース結合剤、デキストリン、デキストロース、エチルセルロース、ゼラチン、液状グルコース、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリドン、アルファー化デンプン、アルギン酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン、シロップ，およびトラガカントガムが含まれる。流動促進剤には、限定されるものではないが、コロイドシリカ、セルロース粉末、三ケイ酸マグネシウム、シリカおよびタルクが含まれる。矯味剤には、限定されるものではないが、アスパルテーム、ステビオシド、フルクトース、グルコース、シロップ、ハチミツ、キシリトール、マンニトール、ラクトース、ソルビトール、マルチトール、およびグリチルリチンが含まれる。界面活性剤には、限定されるものではないが、Ｔｗｅｅｎ−８０およびポロキサマーが含まれる。保存剤には、限定されるものではないが、パラベン、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムなどが含まれる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を達成することを指す。この効果は、疾患またはその症状の完全または部分的予防によれば、予防的なものであり得、ならびに／あるいは疾患および／または疾患による副作用の部分的または完全な安定化または治癒によれば、治療的なものであり得る。本明細書で使用する場合、「治療」は患者の疾患のいかなる治療をも対象とし、（ａ）疾患または症状を起こしやすいが、まだ疾患に罹患していると診断されていない患者において発現する疾患または症状の予防、（ｂ）疾患の症状の抑制、すなわちその発症の予防、または（ｃ）疾患の症状の軽減、すなわち疾患の発症または症状の悪化の軽減、を含む。
【００３１】
マンヌロン二酸オリゴ糖組成物
本発明の血管性認知症の治療のためのマンヌロン二酸オリゴ糖組成物は、式（ＩＩＩ）を有するマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩：
【化５】
2021528458.tif 000007
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
を含んでなり、
ｎ＝１〜５であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量の６０％以上であり、
ｎ＝１〜２であるマンヌロン二酸の総重量は、前記組成物の総重量の６０％未満である。
【００３２】
例示的な実施態様では、血管性認知症の治療のためのマンヌロン二酸オリゴ糖組成物の調製方法は、以下の工程を含んでなる。
【００３３】
（１）マンヌロン二酸生成物の調製：
Ｍセグメント中間体の調製。上記のように、本発明において用いる原料であるＭセグメント中間体は、従来技術において公知の方法、例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号およびＣＮ０２８２３７０７．２号に開示の方法により調製することができる。一般的な方法は、以下に簡単に説明することができる。アルギン酸を予め分解し、ポリマンヌロン酸およびポリグルロン酸の多糖混合物を得る。次いで多糖混合物を酸性沈殿に供し、その中のポリグルロン酸を除去し、さらに精製して純度が９０％を超えるホモポリマンヌロン酸、すなわちＭセグメント中間体を得る。
【００３４】
オゾン酸化分解。Ｍセグメント中間体を、適当な量の水に溶かし、室温でまたは加熱条件下で攪拌する。オゾンを連続的に導入し、反応を開始する。反応のｐＨ値は、希塩酸または希ＮａＯＨ溶液を滴下することにより、３〜１３、好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８に調整することができる。温度は、好ましくは０〜７０℃、より好ましくは１０〜４５℃である。反応完了後、オゾンの導入を停止し、ｐＨを中性に調整する。
【００３５】
膜分離および精製。上記で得た反応生成物を、約１０％の濃度の溶液に調合し、分子カットオフ膜により分離して、単糖類以下の分解生成物を除去する。保持液を回収する。使用する分子カットオフ膜は、１０００Ｄａ〜３０００Ｄａ、好ましくは２０００ＤａのＭＷＣＯを有する。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、オリゴマンヌロン二酸混合物を得る。分析の後、これらの生成物は総て、含量が特定の割合の範囲内である二糖類〜十糖類のオリゴ糖組成物であることが見出される。本方法は、実施例１〜３に例示される。
【００３６】
（２）単一の重合度を有するオリゴ糖の調製
工程（１）において得たオリゴ糖混合物を、約１０％の濃度まで溶解し、Ｐ６ゲルクロマトグラフィーカラムで分離し、紫外検出に供し、各溶出液成分を回収する。同じ重合度を有する成分を合わせる。二糖類〜十糖類の９種類の成分を回収し、それぞれＧ１０ゲルカラムクロマトグラフィーにより脱塩し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させる。特定の精製法および調製プロセスを実施例４に示す。カラムクロマトグラフィー、脱塩および乾燥のこれらの操作は、当業者に公知である。
【００３７】
単一の重合度を有するオリゴ糖の薬理活性を抗血管性認知症動物モデルで評価したところ、六糖類が最も活性が高いことが見出された。
【００３８】
（３）オリゴ糖組成物の活性の比較
オリゴ糖組成物と、精製された六糖類を、薬理活性に関して比較する。結果は、本発明のオリゴ糖組成物および比較実験サンプルは、単一の重合度のオリゴ糖において最も高い活性を有する六糖類よりも有意に活性が高いことを示し、一方、二糖類および三糖類を含んでなる組成物の活性は、六糖類の活性よりもわずかに低い。いかなる理論にも拘束されるものではないが、オリゴ糖は配合された後に相乗作用を示し得ると考えられる。組成物中の二糖類〜六糖類の割合が６０％以上である場合、ならびに二糖類および三糖類の割合が６０％未満である場合に、組成物の活性は最も高い。しかしながら、二糖類〜三糖類の割合が６０％を超える場合、組成物の活性はまた、低下する。
【００３９】
薬力学的活性を評価するための動物モデルおよび工程
１．抗血管性認知症の薬力学的評価のための動物モデル−両側総頸動脈閉塞（ＢＣＣＡｏ）により引き起こされる血管性認知症を有するマウスモデル
両側総頸動脈閉塞（ＢＣＣＡｏ）モデルは、全脳虚血および再潅流により確立される当分野で慣用されている血管性認知症モデルである。
【００４０】
１．１  動物の群分けおよび投与
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス、体重２２±２ｇを選択し、各群１０匹として、擬似手術群、３０分両側総頸動脈閉塞（Bilateral common carotid artery occlusion、ＢＣＣＡｏ）モデル群（３０分ＢＣＣＡｏ群と略す）、および薬物投与群に無作為に群分けした。動物を群分けした後に、擬似手術群および３０分ＢＣＣＡｏ群のマウスには、連続５日間、１日１回、蒸留水を胃内投与し、その後、ＢＣＣＡｏ手術を行った。薬物投与群のマウスには、連続５日間、１日１回、対応する薬物を胃内投与し、その後、ＢＣＣＡｏ手術を行った。ＢＣＣＡｏ手術は、各群のマウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、モデル群および薬物投与群のマウスの両側総頸動脈を分離して３０分間閉塞させた後、閉塞を除き、頚の創傷を縫合するというものであった。擬似手術群については、両側総頸動脈を分離した後に閉塞させずに、そのまま頚の切開部を縫合した。ＢＣＣＡｏの２４時間後に、各群のマウスに、さらに連続２３日の投与の間、術前の投与計画に従って対応する薬物または蒸留水の胃内投与を続けた。マウスの学習および記憶力に対するマンヌロン二酸組成物の改善効果を評価するために、暗所回避試験をＢＣＣＡｏ後７日目に行い、モリス水迷路試験を１３日目に開始した。この行動試験の後、マウスを屠殺し、脳組織を固定した。ＢＣＣＡｏ後のマウスの海馬のニューロン損傷および損傷したニューロンに対するマンヌロン二酸組成物の保護効果をＨＥ染色などの方法により評価した。
【００４１】
１．２  暗所回避試験
空間識別におけるマウスの学習および記憶力を試験するため暗所回避試験を使用する。空間的位置の記憶障害は、海馬または海馬周辺の領域が損傷を受けた際にのみ現れ得る。暗所回避試験ボックスは、マウスの暗闇を追跡し光を避ける習性を利用するように設計された装置である。ボックスの半分は暗室で、もう半分は明室であり、つなぐために中央に小さな孔がある。暗室の床は、電流が流れている銅グリッドで覆われている。動物は暗室に入ると電気ショックを受け、逃避して明室に戻る。動物を２４時間訓練した後に、再び試験を行う。暗所回避試験の潜時は、動物が明室に入れられてから最初に暗室に入るまでの時間を指す。暗所回避試験の潜時が長く、回避誤り回数が少ないほど、動物の記憶は良好である。
【００４２】
１．３  モリス水迷路行動検定
モリス水迷路(Morris water maze)（ＭＷＭ）試験は、実験動物が泳がされ、水中に隠れたプラットフォームを見つけることを学ぶという試験である。この試験は主として、空間的位置および方向（空間的位置認識）に関する実験動物の学習および記憶力を試験するために使用される。マウスモリス水迷路は主として、直径８０ｃｍ高さ７０ｃｍの円筒形のプールと直径８ｃｍの可動式プラットフォームから構成される。プール上の空間にあるデジタルカメラがコンピューターに接続されている。試験前に、予め透明な水をプールに注ぐ。水深は１５ｃｍであり、水面はプラットフォーム表面の０．５ｃｍ上である。プールの水を不透明にするために牛乳を加える。試験中、プラットフォームの位置は不変とする。モリス水迷路行動は以下の２つの指標を含む。
【００４３】
（１）空間定位試験は、水迷路を学習し記憶を獲得するマウスの能力を測定するために使用される。この試験は、ＢＣＣＡＯ後１３日目に開始し、４日間続けた。マウスを午前と午後の両方に１回、合計８回訓練した。訓練中、マウスは西の四分円の１／２弧においてプールに入り、頭をプールの壁面に向けて入水する。１２０秒以内にプラットフォームが見つけられなければ、実験者がマウスをプラットフォームに導き、学習および記憶を誘導するために３０秒間放置する。ルートマップおよびマウスがプラットフォームを見つけてよじ登るのに要した時間を観測および記録し、すなわち、モリス水迷路試験の逃避潜時と水泳速度を記録する。モリス水迷路試験の逃避潜時は、マウスが入水してからプラットフォームを見つけるまでの時間を指す。モリス水迷路試験の逃避潜時が短いほど、動物の記憶は良好である。
【００４４】
（２）空間探索試験は、プラットフォームを見つける学習をした後にプラットフォームの空間的場所の記憶を保持するマウスの能力を測定するために使用される。空間定位試験が終了した後に、１日おいてプラットフォームを除去した。マウスを同じエントリー地点から水に入れ、元のプラットフォームを横切る回数を測定した。データの取得および処理はイメージオートマチックモニタリングおよびプロセシングシステムによって完成させた。
【００４５】
２．抗血管性認知症薬力学的評価のための動物モデル−中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により引き起こされる血管性認知症を有するラットモデル
中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルは、局所的脳虚血により確立される当分野で慣用されている血管性認知症モデルである。
【００４６】
２．１  動物の群分けおよび投与
雄Ｗｉｓｔａｒラットを選択し、各群１０匹として、ブランク対照群、擬似手術群、モデル群（ＭＣＡＯ群）、および薬物投与群に無作為に群分けした。ブランク群、擬似手術群、およびＭＣＡＯ群の動物には、蒸留水を経口投与し、アルギン酸オリゴ糖群には総て、対応する用量のアルギン酸オリゴ糖を経口投与した。各群における連続７日の投与の後、ブランク群のラットを除き、他群のラットを３５０ｍｇ／ｋｇの抱水クロラールの腹腔内注射により麻酔し、ラットボードに左側臥位で固定した。手術顕微鏡下で、外耳道と眼角とをつなぐ中点に沿って皮膚を切開して頬骨弓を露出させた。リン酸塩骨と下顎間の距離を小型の伸延器で拡げた。頭骨の基部に２ｍｍ×２ｍｍの骨窓を開けた。硬膜を開放して中大脳動脈を露出させ、中大脳動脈の片側を高周波電気焼灼により凝固させて局所的虚血を生じさせた（擬似手術群の動物では、中大脳動脈を露出させただけで凝固は行わなかった）。切開部を層毎に縫合した。手術中および手術後の室温は２４〜２５℃に厳格に制御した。手術後、術前投与計画に従って各群に薬物または蒸留水を与え続けた。手術後１１日目に各群にモリス水迷路試験を行った。
【００４７】
この試験では、各群のラットを連続５日間、１日１回、訓練した（すなわち、空間定位試験）。動物がプラットフォームを見つけるのにかかった時間（すなわち、モリス水迷路試験の逃避潜伏時間）を記録した。約１２０秒間プラットフォームを見つけられなかった個体は、学習および記憶を促すために、プラットフォームに向かって一直線に泳いで３０秒間プラットフォームに立つように誘導した。空間定位試験が終了した後、１日おいてプラットフォームを除去した。ラットをエントリー地点から水に入れ、ラットが元のプラットフォームに到達する時間およびラットが元のプラットフォームを横断する回数を記録した（すなわち、空間探索試験）。動物の学習および記憶機能を評価した。モリス水迷路試験の逃避潜時は、ラットが入水してからプラットフォームを見つけるまでの時間を指す。モリス水迷路試験の逃避潜時が短いほど、動物の記憶は良好である。
【００４８】
本発明の利点を、以下の限定されない例においてさらに示す。しかしながら、実施例で使用される特定の材料およびその量、ならびに他の実験条件は、本発明を限定するものと解釈してはならない。特に断りのない限り、本発明における部、割合、パーセンテージ、および同様のものは総て、質量で算出する。
【実施例】
【００４９】
実施例１：
工程１）：マンヌロン二酸オリゴ糖混合物の調製
Ｍセグメント中間体を、先行特許に開示の方法により調製した。特定の操作を以下に簡単に記載する。５ｋｇのアルギン酸ナトリウムを約１０％の溶液に調合し、希塩酸を加えることにより、ｐＨを約３．０に調整した。この溶液を８０℃に加熱し、撹拌した。これを１０時間反応させた後、加熱を停止した。室温に冷却した後、ＮａＯＨを加えることによりｐＨを９．０に調整し、希塩酸を加えることにより、さらに２．８５に調整した、この溶液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収し、ＨＣｌを加えることによりｐＨを１．０に調整した。遠心分離後、沈殿を回収し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空乾燥して、１５００ｇのＭセグメント中間体を得た。Ｍセグメント中間体５００ｇを秤量し、蒸留水に溶かして、５Ｌの容量の溶液を調製した。溶液をＮａＯＨでｐＨ６．５に調整し、水浴中で加熱して、反応温度を７５℃に制御した。オゾンを質量濃度流速８ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。４時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約１０％に調整した。２，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、３５０ｇのマンヌロン二酸生成物Ａを得た。
【００５０】
工程２）：マンヌロン二酸生成物Ａにおける種々の重合度を有するオリゴ糖の割合および構造の分析
上記乾燥マンヌロン二酸生成物Ａ１００ｍｇを正確に秤量し、濃度１０ｍｇ／ｍＬまで水に溶かし、０．２２μｍ濾過膜に通して試験サンプル溶液を得た。組成物における異なる重合度を有するオリゴ糖の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により測定した。実験条件は、以下のとおりであった。
クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド１０／３００Ｇｌ
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ
注入量：１０μＬ
流速：０．３ｍＬ／分
試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は１９％、ｄｐ３は２５％、ｄｐ４は２２％、ｄｐ５は１３％、ｄｐ６は９％、ｄｐ７は６％、ｄｐ８は３％、ｄｐ９は２％、およびｄｐ１０は１％であった。
【００５１】
工程３）：マンヌロン二酸生成物Ａにおける種々の重合度を有するオリゴ糖の構造のＬＣ−ＭＳ分析
実験条件：
クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド１０／３００Ｇｌ
移動相：２０％メタノール＋８０％  ８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４Ａｃ
流速：０．１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃±０．８℃
質量分析条件：Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５４０  ＱＴＯＦ；イオン源：ＥＳＩ衝突電圧１２０Ｖ；陰イオンモード。取得したシグナルの幅（ｍ／ｚ）は、１００〜１０００であった。
【００５２】
種々の重合度を有するオリゴ糖の質量スペクトルを図１〜３に示す。質量スペクトルにおける種々のシグナルピークを割り当て、生成物Ａにおける全オリゴ糖の分子構造、すなわち一般式（ＩＩＩ）に示される構造を確認した。シグナルの割り当ておよびシグナルに対応する構造は、以下の表１を参照。
【００５３】
【表１】
2021528458.tif 000008
【００５４】
上記の質量分析構造解析から、生成物Ａにおける糖鎖の還元末端のマンヌロン酸は、サッカリン二酸構造（構造は一般式ＩＩＩを参照）に酸化され、この構造は、含量が約１０〜３０％である６個の炭素原子を含んでなるマンナル二酸構造（ｍ＋ｍ’＝３）であり得るか、または、マンナル二酸の脱炭酸生成物、すなわち、５個の炭素原子を含んでなるサッカリン二酸（ｍ＋ｍ’＝２）（３０〜５０％）および４個の炭素原子を含んでなるサッカリン二酸（ｍ＋ｍ’＝１）（３０〜４０％）であり得ることが分かった。
【００５５】
実施例２：
実施例１のＭセグメント中間体１００ｇを秤量し、蒸留水に溶かして、０．８Ｌの容量の溶液を調製した。溶液をＮａＯＨでｐＨ４．０に調整し、室温（２５℃）にて反応を行った。オゾンを質量濃度流速１ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。１０時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約１５％に調整した。１，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、８０ｇのマンヌロン二酸生成物Ｂを得た。
【００５６】
Ｂにおける種々の重合度を有するオリゴ糖成分の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により決定した。測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は２０％、ｄｐ３は２５％、ｄｐ４は１９％、ｄｐ５は１２％、ｄｐ６は９％、ｄｐ７は５％、ｄｐ８は５％、ｄｐ９は３％およびｄｐ１０は２％であった。
【００５７】
実施例３：
実施例１のＭセグメント中間体１００ｇを秤量し、蒸留水に溶かして、１．５Ｌ容量の溶液を調製した。溶液をＮａＯＨでｐＨ９．０に調整し、水浴中４５℃にて反応を行った。オゾンを質量濃度流速３ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。２時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約５％に調整した。３，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、６０ｇのマンヌロン二酸生成物Ｃを得た。
【００５８】
Ｃにおける種々の重合度を有するオリゴ糖の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により決定した。測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は８％、ｄｐ３は２０％、ｄｐ４は２８％、ｄｐ５は１９％、ｄｐ６は１３％、ｄｐ７は６％、ｄｐ８は３％、ｄｐ９は２％，およびｄｐ１０は１％であった。
【００５９】
実施例４：
単一の重合度を有するマンヌロン二酸オリゴ糖の調製は、以下のとおりであった。
１．サンプル調製：実施例１において調製したマンヌロン二酸生成物Ａ  ３００ｇを秤量し、水に溶かし、１０００ｍＬの濃縮液を調製し、使用するために、４℃の冷蔵庫に入れた。それぞれの使用のために、５０ｍＬを分取し、水で１：２に希釈した後、０．２２μｍ限外濾過膜で吸引濾過した。
【００６０】
２．クロマトグラフィー分離条件：クロマトグラフは、ＵＶ検出器および自動コレクターを備えたＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  １５０（ＧＥ  Ｃｏ．から購入）であった。分離クロマトグラフィーカラム：１．２ｋｇのＢｉｏＧｅｌ  Ｐ６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏ．から購入）を脱イオン水と混合し、真空脱気し、手動でガラスカラム（内径：１０ｃｍ）に充填し、１０カラム容量の純水ですすいだ。クロマトグラフィーカラムベッドは安定であり、高さは１．０ｍであった。次に、移動相を０．０２Ｍ  ＮａＣｌ溶液に変え、１０カラム容量で平衡化した後、サンプルローディングを開始した。
【００６１】
３．サンプルのローディングおよび分離：ポンプの流速を１ｍＬ／分に設定した。１００ｍＬのサンプル溶液をクロマトグラフ自体のポンプを介してカラムの上部に注入した後、これを移動相に切り替え、流速５ｍＬ／分で溶出させた。水のデッドボリュームを流出させた後、自動回収を開始し、チューブ１本あたり５０ｍＬを回収した。
【００６２】
４．サンプルローディングを繰り返し、調製を２０回繰り返した後、同じ画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して、二糖類〜十糖類の単一の重合度を有する計９種類のオリゴ糖を得た。
【００６３】
実施例５
組成物における異なる重合度を有するオリゴ糖の相乗作用およびオリゴ糖の割合の範囲を調べるために、組成物と六糖類との間での薬理活性評価を行った。
【００６４】
サンプル調製：
（１）組成物生成物Ｄ：
実施例４において調製した単一の重合度を有するマンヌロン二酸オリゴ糖を、重合度別に二糖類〜十糖類を正確に秤量した。用いた各糖類の重量は以下のとおりであった。二糖類３．０ｇ、三糖類３．０ｇ、四糖類１．５ｇ、五糖類１．５ｇ、六糖類０．４ｇ、七糖類０．２ｇ、八糖類０．２ｇ、九糖類０．１ｇ、および十糖類０．１ｇ。これらを均一に混合し、１０ｇの組成物生成物Ｄを得た。
【００６５】
（２）比較実験サンプルの調製
四糖類〜十糖類を含有する混合物は、先行特許文献ＣＮ１０６３４４５９２Ａの実施例１および２に開示された方法を参照して調製した。
【００６６】
１ｇのポリマンヌロン酸ナトリウム（重量平均分子量８２３５Ｄａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｒｅｅｎ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により提供）を秤量し、適当な量の蒸留水を加えて１％（重量パーセント）ポリマンヌロン酸ナトリウム水溶液を調製した。１％ポリマンヌロン酸ナトリウム水溶液のｐＨは塩酸を用いて４に調整し、次いで水溶液をオートクレーブ内においた。１１０℃で４時間加熱し、反応させた。反応溶液をオートクレーブから取り出し、放冷した。冷却後、ＮａＯＨ溶液を用いて反応溶液のｐＨ値を中性液体となるよう調整した。攪拌しながら、中性液体を容量の４倍の容量のエタノール中にゆっくりと加えた。アルコール沈殿を行い、溶液は一晩静置した。アルコール沈殿により得られた固形物質を濾過して分離し、無水エタノールを用いて、濾過および分離プロセス中に濾過および分離で得られた固形物質を洗浄した。最終的に、白色濾過ケーキが生成された。この濾過ケーキを６０℃のオーブン中で濾過し、粗アルギン酸オリゴ糖を得た。
【００６７】
５ｇの粗アルギン酸オリゴ糖を用いて５％（重量パーセント）水溶液を調製した。要時調製酸化剤である水酸化銅は、２５ｍｌの５％（重量パーセント）硫酸銅溶液を５０ｍｌの１０％（重量パーセント）水酸化ナトリウム溶液に加え、直ちに混合して調製した。要時調製酸化剤である水酸化銅を直ちに４０ｍｌの上記５％（重量パーセント）アルギン酸オリゴ糖溶液に加え、赤レンガ色の沈殿が生成されなくなるまで沸騰水浴中で加熱した。反応系を遠心分離し、沈殿を除去して上清を得た。酸化剤に少量の上清を再び加え、さらに赤レンガ色の沈殿が生成されるかどうかを確認した。赤レンガ色の沈殿がまだ生成された場合は、遠心分離から得られた総ての上清と残りの酸化剤との反応を、赤レンガ色の沈殿が生成されないことが確認されるまで継続した。最終反応系を遠心分離し、上清を得た。４倍の容量の９５％エタノールを上清に加え、アルコール沈殿に付し、溶液を一晩静置した。アルコール沈殿により得られた固形物質を濾過および分離し、固形物質を無水エタノールで洗浄した。得られた固形物質を６０℃のオーブンに入れて乾燥させ、式（ＩＩ）で表される粗アルギン酸オリゴ糖を得た。
【００６８】
１ｇの粗アルギン酸オリゴ糖で１０％（重量パーセント）水溶液を調製し、９５％エタノール溶液を用いて再度アルコール沈殿を行った。再アルコール沈殿により得られた沈殿を濾過および分離した後、所望により、無水エタノールを用いて洗浄した。沈殿物を分離および乾燥させて固形物質を得た。この固形物質で５％（重量パーセント）水溶液を調製した。この水溶液を３μｍ孔径の膜を用いて濾過し、濾液を回収した。濾液は、分子排除クロマトグラフィー  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ−Ｐ６ゲルカラム（１．６×１８０ｃｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｍｐａｎｙより購入）で溶出および分離した。移動相の溶出剤は０．２ｍｏｌ  Ｌ−１ＮＨ４ＨＣＯ３であった。カラムクロマトグラフィーの溶出液は複数の５ｍｌ試験管に順次回収し、次いで各試験管中の溶出液の糖類含量を硫酸−カルバゾール法を用いて検出した。検出結果に従って、様々な分子量のアルギン酸オリゴ糖成分を含有する溶出液をそれぞれ回収した。様々な分子量のアルギン酸オリゴ糖成分を含有する溶出液をそれぞれ減圧下で濃縮し、凍結乾燥した。成分１は廃棄して、式（ＩＩ）（ｎはそれぞれ０〜１０の重合度の値）に示される、様々な分子量を有するアルギン酸オリゴ糖成分２〜１２を得、式（ＩＩ）のｎ＝２〜８で示されるアルギン酸オリゴ糖溶出液を回収し、これらを合して乾燥させた。式（ＩＩ）においてｎ＝２〜８で示されるアルギン酸オリゴ糖混合物（四糖類〜十糖類混合物）は、比較実験サンプルとして生成した。
【００６９】
比較実験サンプルにおける種々の重合度を有するオリゴ糖成分の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド（ＧＥ  Ｃｏ．）分子排除クロマトグラフィーを用いて検出した。測定方法は、実施例１の関連部分と同じである。試験結果：四糖類〜十糖類はｄｐ４〜ｄｐ１０で表し、それぞれｄｐ４は１０％、ｄｐ５は１２％、ｄｐ６は１３％、ｄｐ７は１４％、ｄｐ８は１５％、ｄｐ９は１９％、およびｄｐ１０は１７％である。
【００７０】
実施例１、２および３においてそれぞれ調製した生成物Ａ、ＢおよびＣ、本実施例の生成物Ｄ、ならびに比較実験サンプル中のオリゴ糖の割合を以下の表２に示す。
【００７１】
【表２】
2021528458.tif 000009
【００７２】
上記４種類のサンプルＡ、Ｂ、ＣおよびＤそれぞれ１０ｇを取り出した。ヘキソース（６Ｔ）を含むこれらの組成物と比較実験サンプルの薬理活性を、「抗血管性認知症の薬力学的評価のための動物モデル」に記載の方法に従って比較した。
【００７３】
１．両側総頸動脈閉塞（ＢＣＣＡｏ）により誘発される血管性認知症のマウスモデル
１．１  暗所回避試験の試験結果
実験において、モデル群を擬似手術対照群と比較した。モデル群では、暗所回避試験の潜時は有意に短く、誤りの数は有意に増え、モデル群のマウスの記憶力が有意に低下しており、評価モデルの確立に成功していたことを示している。モデル群と比較して、各薬物投与群における暗所回避試験の潜時は有意に延長され、誤りの数は有意に減っていた。図４および５参照。
【００７４】
１．２  モリス水迷路試験の結果
実験において、擬似手術群と比較して、モデル群のマウスのモリス水迷路試験の逃避潜時は有意に長く、ＢＣＣＡｏ誘発マウス血管性認知症モデルの確立に成功していたことを示している。モデル群と比較して、各薬物投与群の逃避潜時は有意に短かった。図６参照。
【００７５】
水迷路空間定位試験の４日後に、空間探索試験のためにプラットフォームを除去して動物がプラットフォームを横断する回数を観察した。擬似手術群と比較して、モデル群におけるマウスが元のプラットフォームを横断した回数は有意に減り、ＢＣＣＡｏマウスの記憶力が有意に低下していたことを示し、一方、各薬物投与群におけるマウスが元のプラットフォームを横断した回数は増えた。図７参照。
【００７６】
２．中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により引き起こされる血管性認知症を有するラットにおける効果
実験において、擬似手術群と比較して、モデル群におけるラットのモリス水迷路試験の逃避潜時は有意に長く、ＭＣＡＯ誘発マウス血管性認知症モデルの確立に成功していたことを示している。モデル群と比較して、各薬物投与群の逃避潜時は有意に短かった。
【００７７】
空間探索試験は、空間定位試験が終了した後に１日おいて行い、２分以内に動物がプラットフォームを横断した回数を観察および決定した。擬似手術群と比較して、ラットが元のプラットフォームを横断した回数は、モデル群で有意に減り、ＭＣＡＯ群のラットの記憶力が有意に低下していたことを示し、一方、各薬物投与群における、ラットが元のプラットフォームを横断した回数は増えた。図８参照。
【００７８】
これらの実験結果は、生成物Ａ、ＢおよびＣの薬力学的活性は総て比較実験サンプルよりも良好であり、従前に予想されていた最も活性の高い、単一の重合度の六糖類よりも良好であることを示した。しかしながら、生成物Ｄの活性は六糖類よりも弱い。いかなる理論にも拘束されるものではないが、組成物中のオリゴ糖の割合が生成物の活性に重要な影響を及ぼし、特定の割合の二糖類および三糖類の添加が相乗作用を有すると推測される。しかしながら、二糖類および三糖類の割合が高すぎると、組成物の活性は低下すると思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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