(57)【要約】  本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原、並びに薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体を含み、該ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量の量のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含み、家畜の真皮にワクチンを投与することによるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療での使用のための混合ワクチンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１又は複数の抗原、ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原、並びに薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体を含み、該ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量の量のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含む、家畜の真皮にワクチンを投与することによるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療での使用のための混合ワクチン。
【請求項２】
前記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の量が０．１μｇ／用量〜５μｇ／用量である、請求項１に記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項３】
前記ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の量が、０．５μｇ／用量〜４μｇ／用量である、請求項２に記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項４】
前記マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原が、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの単離タンパク質、弱毒化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選択される形態である、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項５】
前記マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原が、不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の形態であり、１０３細胞／用量〜１０１１細胞／用量の量である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項６】
ブタを冒す別の疾患又は病態に対する使用のための、下記によって形成される群から選択される微生物から選択される１又は複数のさらなる抗原を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための混合ワクチン：アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、イソスプラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後発育不全症候群（ｐｅｒｉｗｅａｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）作用物質、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ）。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項８】
前記アジュバントが、鉱油と、疎水性添加剤、両親媒性添加剤及びそれらの組み合わせから選択される添加剤とを含むアジュバントエマルジョンである、請求項７に記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項９】
前記添加剤が、イソプレン単位のポリマー、ブロックコポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項１０】
前記添加剤が、式（Ｉ）の非イオン性ブロックコポリマーである、請求項７〜９のいずれかに記載の使用のための混合ワクチン：
【化１】
2021506874.tif 000007
（式中、ａは２〜１３０までの整数であり、ｂは１５〜６７までの整数である。）
【請求項１１】
ａが１０１であり、ｂが５６である、請求項１０に記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項１２】
前記家畜がブタである、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項１３】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びブタサーコウイルスの１又は複数の抗原を含み、該ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量の量のブタサーコウイルスＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含む皮内混合ワクチン。
【請求項１４】
前記マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原が、弱毒化及び／又は不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の形態であり、１０３細胞／用量〜１０１１細胞／用量の量である、請求項１３に記載の皮内混合ワクチン。
【請求項１５】
以下からなる微生物の群から選択される１又は複数のさらなる抗原をさらに含む、第１３項〜第１４項のいずれかに記載の皮内混合ワクチン：アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びクラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エリシペロスリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イソスプラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、ローソニア属（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、並びにブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後発育不全症候群（ｐｅｒｉｗｅａｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）作用物質、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）及びそれらの組み合わせ。
【請求項１６】
アジュバントをさらに含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の皮内混合ワクチン。
【請求項１７】
前記アジュバントが、鉱油と、疎水性添加剤、両親媒性添加剤及びそれらの組み合わせから選択される添加剤とを含むアジュバントエマルジョンである、請求項１６に記載の皮内混合ワクチン。
【請求項１８】
前記添加剤が、式（Ｉ）の両親媒性非イオン性ブロックコポリマーである、請求項１７に記載の皮内混合ワクチン：
【化２】
2021506874.tif 000008
（式中、ａは２〜１３０までの整数であり、ｂは１５〜６７までの整数である。）
【請求項１９】
ａが１０１であり、ｂが５６である、請求項１８に記載の皮内混合ワクチン。
【請求項２０】
（ａ）請求項１３〜１９いずれかに定義される皮内混合ワクチン、
（ｂ）任意選択で、ワクチンの皮内送達に適した送達デバイス、及び
（ｃ）任意選択で、その使用に関する説明書、
を備えたワクチン接種パーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２２日に出願の欧州特許出願第１７３８２８９３号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ワクチンの分野に関し、より具体的には、様々な微生物に対して同時に防御する皮内送達用のワクチンに関する。特に、本発明は、マイコプラズマ抗原及びブタサーコウイルス抗原を含む皮内混合ワクチン、並びに家畜の免疫化のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は、ブタを冒す最も重要な病原体の２つであり、養豚業において大きな経済的損失を引き起こしている。
【０００４】
マイコプラズマは、細胞膜の周りに細胞壁がない細菌属である。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｈｙｏ）を含むいくつかの種はブタに病原性があり、ブタを冒す伝染性の高い慢性疾患であるブタ流行性肺炎を引き起こすことが知られている。他のモリキュート同様、Ｍ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はサイズが小さく（４００〜１２００ｎｍ）、ゲノムが小さく（８９３〜９２０キロベースペア）、細胞壁がない。
【０００５】
ブタ流行性肺炎は、体重増加の減少及び飼料効率の低下により、養豚業における経済的損失の重要な原因である。特に、この疾患は、数週間続く慢性的な咳、くすんだ被毛、成長の遅延、及び不潔な外観を引き起こす。感染した動物では、特に腹側の頂葉と心葉に、硬化した紫から灰色の領域の特徴的な病変が観察される。この疾患の死亡率は低いが、罹患したブタは日和見病原体による二次感染を起こしやすく、死亡又はストレスを引き起こす。
【０００６】
Ｍｈｙｏ感染症の治療は抗生物質に限定されており、この抗生物質は感染を完全に除去するものではないので、現在のところ効果がない。ワクチンは疾患の重症度を軽減することが判明しているが、感染したブタでの疾患の発生を防ぐことはできない。
【０００７】
畜産業界にとってもう１つの重要な病原体は、ブタサーコウイルスである。ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、サーコウイルス科のウイルスファミリーに属し、特有の一本鎖環状ゲノムを含む小さな非エンベロープＤＮＡウイルスである。ウイルスのカプシドは正二十面体で、直径約１７ｎｍである。
【０００８】
ＰＣＶには主に２つの認識された遺伝子型：ＰＣＶ１型（ＰＣＶ１）、及びＰＣＶ２型（ＰＣＶ２）がある。ＰＣＶ２は、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）と約８０％の配列同一性を共有している。ただし、一般的には非病原性のＰＣＶ１とは対照的に、ブタのＰＣＶ２感染は最近、まとめてブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）（ブタサーコウイルス疾患−ＰＣＶＤとしても知られている）と呼ばれる多くの疾患症候群に関連付けられている。離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）は、一般にＰＣＶＡＤの主要な臨床症状であると見なされている。ＰＭＷＳは５〜１８週齢のブタを冒す。ＰＭＷＳは臨床的に発育不良（ｗａｓｔｉｎｇ）、皮膚の蒼白、活力減退（ｕｎｔｈｒｉｆｔｉｎｅｓｓ）、呼吸窮迫、下痢、黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓ及びｊａｕｎｄｉｃｅ）を特徴とする。一部の罹患したブタでは、すべての症状の組み合わせが現れるが、他の罹患したブタは、これらの症状の１つ又は２つしか有さない。剖検中、顕微鏡的及び肉眼的病変も複数の組織及び臓器に現れ、病変の最も一般的な部位はリンパ系臓器である。ＰＣＶ２に感染したブタの死亡率は８０％に達し得る。現在、ブタをＰＣＶ２から防御するためのワクチンがいくつか市場に出ている。
【０００９】
Ｍｈｙｏ又はブタサーコウイルスに対する動物の免疫化に現在利用可能なワクチンの大部分は、皮下（皮下組織に）又は筋肉内（筋肉に）のいずれかに投与される。しかし、これらの投与経路は皮膚の免疫系を迂回し、抗原提示細胞の重要な常駐集団を有さない脂肪又は筋肉組織に抗原を送達する。筋肉組織に送達された抗原は、一過性の抗原提示細胞によってピックアップされるか、又は単に流入領域リンパ節に循環すると考えられる。
【００１０】
それとは反対に、近年、ワクチン投与の代替経路、すなわち皮内（ＩＤ）経路が主導権を獲得している。皮内ワクチンは、抗原提示細胞を多数含む解剖学的空間である真皮に直接抗原を送達するため、一定量の抗原を皮下又は筋肉内注射するよりも免疫原性が高くなる可能性がある。したがって、以下の両方におけるいくつかの利点：免疫原性（低応答者における免疫応答を改善する能力、及びいくつかのアジュバントの必要性の回避など）と、いくつかの実際的な問題（ＩＤワクチンは無針注射器による送達が一般的であるため、従来の皮下又は筋肉内経路より容易で安全な投与、及び医療従事者の針刺し損傷及び動物の血管又は神経損傷のリスクの減少）とによりＩＤ経路の使用が促されている。
【００１１】
ただし、ワクチンのタイプ（すなわち、不活化、弱毒化など）とその製剤化（用量、アジュバントなど）によって、特定のワクチンが皮内投与可能かどうかを条件付けすることができる。例えば、アルミニウムベース又は水中油型アジュバントを含有するワクチンは、皮内投与後に許容できない局所反応原性を示す可能性がある。
【００１２】
ＩＤワクチンの例として、次のいずれかに対するブタ免疫化のためのワクチン、Ｍｈｙｏ（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  Ｏｎｃｅ）又はブタサーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  ＩＤ）が現在市販されている。現在、ＰＣＶ２及びＭｈｙｏを含有する市販の二価ＩＤワクチンは市場では入手できない。
【００１３】
これら２つの一般的な感染症から動物を防御するために、従事者は２回のワクチン接種を行う必要があり、作業の時間と費用が重複し、上記のワクチン及び動物の取り扱いに関連するリスクが高まる。
【００１４】
複数回のワクチン接種に由来する警告を解決するために、免疫化の分野では、単一のワクチンにさまざまな抗原を組み合わせようとするのが一般的である。これは、防御が追求される病原体が特定の動物種の一般的な病原体である場合に特に重要である。しかし、混合ワクチンの開発は簡単ではない。単独で投与された特定の抗原と比較して、他の成分と組み合わせた場合の抗原の免疫原性の低下は、干渉として知られている。混合ワクチンの製剤化において遭遇するさらなる問題は、経時的なそれら複合抗原の固有の安定性である。溶液中のワクチンは、その抗原成分の免疫原性を低下させる経時的過程、例えば、抗原の分解又はそれらが吸着されていたアジュバントからの抗原の脱着を経る可能性がある。混合ワクチンに関連する別の問題は、新しい条件下ですべての抗原の安全性と活性を維持する必要があるため、投与又は製剤の経路の変更、又は用量節約戦略を実施したい場合に、さらに複雑な層が追加されることである。
【００１５】
混合ワクチンの例は、特許文献１に提供されており、マイコプラズマ及びブタサーコウイルス感染から動物を防御するための筋肉内組換え混合ワクチンの使用が開示されている。しかし、前記特許出願に開示されているワクチンの製剤は、その量の多さ、及びそのアジュバントの反応原性のため、皮内注射には適さない。また、前述のように、製剤及び／又は投与経路の変更は簡単ではなく、安全性及び有効性を判断するための広範なテストが必要である。
【００１６】
さらに最近、特許文献２は、マイコプラズマ及びブタサーコウイルスに対する皮内混合ワクチンを開示した。しかし、この文書では、著者らはアジュバントエマルジョンのいくつかの特定の組み合わせのみが効率的で安全なワクチンを提供することを示している。さらに、前記文書で提示された実験データは、免疫化を達成するために高濃度のＰＣＶ２抗原が必要であることを明らかにしている。
【００１７】
効果的なワクチンはＭｈｙｏ及びＰＣＶ２の影響を減らすことができたが、両方の病原体は世界中のブタ生産者に課題を作り続けている。前述のように、ＰＣＶ２及びＭｈｙｏを含有する市販の二価ＩＤワクチンは市場では入手できない。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍｈｙｏ及びＳｕｖａｘｙｎ（登録商標）Ｃｉｒｃｏ＋ＭＨ  ＲＴＵなど、ＩＭ投与用の２価ワクチンのみが存在する。
【００１８】
上記を考慮して、いくつかの感染症に対して防御しながらワクチン接種の数を減らすことを可能にする、ブタの防御のための皮内混合ワクチンのレパートリーを拡大する必要性が残っている。単純で安全な投与手順で異なる病態に対する複数の防御を可能にする新規の皮内混合ワクチンの開発は、動物の健康の分野における前進を表している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２０１４００９５８６号パンフレット
【特許文献２】国際出願公開第２０１７１６２７４１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明者らは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原とブタサーコウイルス抗原とを組み合わせる混合ワクチンが、皮内投与された場合でも、両方の微生物の感染から動物を防御する免疫応答を効率的に開始できることを発見した。
【００２１】
重要なことに、皮内経路を介した投与は、一般的に無針注射器を介して行われ、動物と従事者の両方への健康リスクを減らしながら、ワクチン接種手順を非常に容易にする。さらに、本発明のワクチンは、両方の病原体に由来する抗原を単一の作用組成物中に含有するという利点を示し、これにより、投与の回数及びそれらに関連するリスクを低減することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
したがって、第１の態様では、本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原、並びに薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体を含み、該ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量の量のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含み、家畜の真皮にワクチンを投与することによるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療での使用のための混合ワクチンを提供する。
【００２３】
この態様はまた、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びブタサーコウイルスの１又は複数の抗原を含み、該ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量の量のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含む混合ワクチンの、家畜の真皮に医薬品を投与することによるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療用医薬品の製造のための使用として製剤化することもできる。この実施形態はまた、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びブタサーコウイルスの１又は複数の抗原を含み、該ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量の量のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含む混合ワクチンを用いて、特に家畜の真皮にワクチンを投与することによるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療のために、それを必要とする家畜を皮内免疫化する方法として製剤化される。
【００２４】
驚くべきことに、そして実施例１で観察され得るように、本発明者らは、本発明の混合ワクチンが、ＰＣＶ２抗原量を大幅に減少させた場合であっても（１μｇ／用量未満でさえ）効率的かつ安全であることを見出した。さらに、混合ワクチンは単回用量で効果的であった。混合ワクチンは一般に、抗原干渉、すなわち他の抗原と組み合わせた場合の抗原免疫原性の低下を打ち消すために、一価ワクチンよりも高い抗原量を必要とするため、これは完全に予想外であった。
【００２５】
本発明の第２の態様は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びブタサーコウイルスの１又は複数の抗原を含み、該ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量の量のブタサーコウイルスＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含む皮内混合ワクチンを提供する。
【００２６】
第３及び最後の態様では、本発明は、（ａ）本発明の第２の態様で定義される皮内混合ワクチン、（ｂ）任意選択で、ワクチンの皮内送達に適した送達デバイス、及び（ｃ）任意選択で、その使用に関する説明書、を備えたワクチン接種パーツキットを提供する。
【００２７】
本発明者らはまた、皮内ワクチン用の特定のアジュバント製剤を使用することにより、免疫化の効率を維持し、同時に安全性が改善されたことも予期せず発見した（図１及び図２を参照）。
【００２８】
したがって、第４の態様では、本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原、鉱油と、疎水性添加剤、両親媒性添加剤及びそれらの組み合わせから選択される添加剤とを含むアジュバントエマルジョン、並びに薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体を含む皮内混合ワクチンに言及する。
【００２９】
第５の態様では、本発明は、家畜において医薬品として使用するための第４の態様の皮内混合ワクチンを提供する。
【００３０】
第６の態様では、本発明は、（ａ）第４の態様で定義される皮内混合ワクチン、（ｂ）任意選択で、ワクチンの皮内送達に適した送達デバイス、及び（ｃ）任意選択で、その使用に関する説明書、を備えたワクチン接種パーツキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１に関連する図１は、本発明のワクチンによるワクチン接種後の様々な時点におけるワクチン接種された子ブタの体温を示す。Ｄ０（＋３ｈ）はワクチン接種後３時間に相当し、Ｄ０（＋６ｈ）はワクチン接種後６時間、Ｄ１はワクチン接種の１日後、Ｄ２は、ワクチン接種の２日後に相当する。ワクチン接種された子ブタＡ〜Ｇの群は、実施例１に記載されている。
【図２】実施例１に関連する図２は、本発明のワクチンによるワクチン接種後の様々な時点における子ブタの局所反応スコアを示す。Ｄ０（＋３ｈ）はワクチン接種後３時間に相当し、Ｄ０（＋６ｈ）はワクチン接種後６時間、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ７、Ｄ１４及びＤ２１は、それぞれ、ワクチン接種の１日後、２日後、７日後、１４日後及び２１日後に相当する。ワクチン接種された子ブタＡ〜Ｇの群は、実施例１に記載されている。
【図３】実施例１に関連する図３は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエによるチャレンジ感染後２７日目におけるワクチン接種されたブタの肺病変スコアを示す。ワクチン接種された子ブタＡ〜Ｇの群は、実施例１に記載されている。
【図４】実施例２に関連する図４は、本発明のワクチンによるワクチン接種後の様々な時点における子ブタの局所反応スコアを示す。Ｄ０（＋３ｈ）はワクチン接種後３時間に相当し、Ｄ０（＋６ｈ）はワクチン接種後６時間、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ７、Ｄ１４及びＤ２１は、それぞれ、ワクチン接種の１日後、２日後、７日後、１４日後及び２１日後に相当する。ワクチン接種された子ブタＡ〜Ｅの群は、実施例２に記載されている。
【図５】実施例２に関連する図５は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエによるチャレンジ感染後２８日目におけるワクチン接種されたブタの中央肺表面の罹患領域の割合を示す。ワクチン接種された子ブタＡ〜Ｅの群は、実施例２に記載されている。
【図６】実施例２に関連する図６は、ＰＣＶ２チャレンジ後７日目（Ｄ７）、１４日目（Ｄ１４）、２１日目（Ｄ２１）、及び２８日目（Ｄ２８）におけるワクチン接種されたブタのＰＣＶ２  ＯＲＦ２のセロコンバージョン（Ｓ／Ｐ比）を示している。ワクチン接種された子ブタＡ〜Ｅの群は、実施例２に記載の通りである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の出願時点で本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。ただし、潜在的なあいまいさが発生した場合は、本明細書において提供される定義が、辞書や外部定義よりも優先される。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００３３】
「抗原」という用語は、対象が免疫応答、例えば、体液性及び／又は細胞性免疫応答を開始することができる分子を指す。組成物の意図される機能に応じて、１又は複数の抗原が含まれ得る。
【００３４】
本明細書において使用される「医薬品」という用語は、広く認められているヒトを含む動物の疾患を治癒、治療又は予防するために使用される医薬又は獣医薬（薬、薬品、又は単に薬物とも呼ばれる）の同義語である。薬物はさまざまな方法で分類される。１つの重要な区別は、通常は化学合成に由来する従来の低分子薬物と、組換えタンパク質、ワクチン、治療に使用される血液製剤（ＩＶＩＧなど）、遺伝子治療、モノクローナル抗体及び細胞治療（幹細胞治療など）を含む生物医薬品との区別である。本発明において、医薬品は、好ましくは獣医用医薬品であり、さらにより好ましくは獣医用のワクチンである。
【００３５】
本明細書で使用する「ワクチン」という用語は、動物に投与したときに、該動物の免疫応答を直接的又は間接的に誘発する、又は誘発できる、適切な賦形剤及び／又は担体を伴う免疫原性組成物を意味する。特に、本発明のワクチンは、対象への投与時に、宿主において防御的に細胞性又は抗体媒介性の免疫学的応答を誘発する。「皮内ワクチン」という用語は、真皮内に投与されるワクチンを指す。「混合ワクチン」という用語は、ワクチンが単一の調製物中に様々な抗原を含有し、２以上の疾患、又は２以上の微生物によって引き起こされる１つの疾患に対して防御することを意味する。したがって、ワクチンは、「有効成分」として「免疫原性組成物」を含み、本明細書で使用される場合、ヒトを含む脊椎動物に投与すると、該組成物に対して細胞性又は抗体媒介性免疫応答の免疫学的応答を宿主においてを誘発する物質を指す。免疫原性組成物は、とりわけ殺傷又は弱毒化された細菌又はウイルスなどの抗原特性を有する分子、及びさらに免疫原性ポリペプチドを含む。免疫原性ポリペプチドは一般に抗原性と呼ばれる。分子は、それが免疫グロブリン（抗体）又はＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができる場合、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５個、特に少なくとも約１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個又は少なくとも５０個のアミノ酸のエピトープを含む。エピトープとも呼ばれるポリペプチドの抗原性部分は、抗体又はＴ細胞受容体の認識に対して免疫優性の部分であるか、又は抗原性部分を免疫化のための担体ポリペプチドに結合させることにより、分子に対する抗体を生成するために使用される部分であり得る。免疫原性組成物は、この説明によれば、活性分子、前記分子を含む組成物、又は特定の免疫反応が望まれる複数の抗原分子を含む組成物に関する。
【００３６】
「免疫学的有効量」又は「免疫学的有効用量」という表現については、疾患の治療又は予防いずれかのために、動物において感染症の付随事象を低減する、若しくはその重症度を軽減する、又は疾患の発生を低減する免疫応答を、誘発する、又は誘発することができる量又は用量の抗原を、単回用量又は一連の一部として投与することを意味する。免疫学的有効量又は有効用量はまた、疾患の治療又は予防のいずれかのための抗体の産生を誘導することができる。この量は、対象の体調を含む様々な要因に応じて変化し、当業者が容易に決定することができる。
【００３７】
「不活性化細胞」という用語は、培養で増殖させた後、熟練者に完全に公知である主要な不活化方法として、物理的手段（熱など）又は化学的手段（ホルムアルデヒド、ＢＥＩ、又は他のよく知られた不活性化剤との接触など）で殺した細胞を指す。「不活性化細胞」は、全細胞、又は例えば、細胞溶解物及び上清回収細胞を含む部分細胞であり得る。「弱毒化細胞」という用語は、その毒性を低下させた生存能力のある複製コンピテント細胞を指す。
【００３８】
「家畜」という用語は、食糧などの商品を生産するために飼育された飼育動物又は家畜に関連する。特に、家畜は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、家禽（産卵家禽を含む）、及びウマ動物などの食品生産動物に関する。より具体的には、それは、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、家禽及びウマ動物などの食品生産動物に関する。さらにより詳細には、本発明はブタ種に関する。
【００３９】
「担体」という用語は、免疫原性成分以外の薬学的に許容される成分として理解されるべきである。担体は、有機、無機、又はその両方であり得る。当業者に周知の適切な担体には、限定するものではないが、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（油滴又はリポソーム）及び不活性ウイルス粒子などの大型のゆっくりと代謝される巨大分子が含まれる。
【００４０】
「薬学的に許容される賦形剤又は担体」という表現は、薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクルを指す。各成分は、医薬組成物の他の成分と適合性があるという意味で薬学的に許容されなければならない。また、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性又は他の問題若しくは合併症なしに、合理的な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織又は臓器と接触して使用するのに適している必要がある。特に、皮内経路での使用に適している必要がある。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「宿主」又は「対象」という用語は、本発明の免疫原性組成物又はワクチンが投与される、それを必要とする標的個体、とりわけヒト、哺乳動物、家畜、又は本発明の組成物をワクチン接種される感受性の高い任意の他の動物種を意図する。特に、哺乳動物はブタ種に由来し、より詳細にはブタである。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ブタ（ｐｉｇ）」又は「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、とりわけ、それらの生産サイクルの任意の年齢又は任意の段階のブタ、雄ブタ、雌ブタ、若雌ブタ及び子ブタを含む。
【００４３】
「予防する」、「予防すること」、又は「予防」という用語には、限定するものではないが、症状、臨床徴候、障害、状態又は疾患のリスクを減少、軽減又は改善すること、及び症状、臨床徴候、障害、状態又は疾患から動物を防御することが含まれる。予防は予防的に適用又は投与することができる。
【００４４】
「治療する」、「治療すること」又は「治療」という用語は、限定するものではないが、既存の症状、臨床徴候、障害、状態又は疾患の進行又は重症度を抑制、遅延、停止、軽減、改善又は逆転することを含む。治療は、治療的に適用又は投与することができる。
【００４５】
成分の「ｗ／ｗ％」又は「重量当たりの重量パーセント」という用語は、組成物の総重量に対する、又は特に述べられている場合は他の成分の総重量に対する単一成分の量を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「鉱油」は、石油及び／又は異なる医薬品グレードの流動パラフィンなどの無機物に由来する炭化水素の様々な複合混合物を指す。これらの混合物は、例えばＭａｒｃｏｌ５２、Ｄｒａｋｅｏｌ５、Ｅｏｌａｎｅ１３０などの商品名で販売されている。
【００４７】
「両親媒性化合物又は添加剤」については、親水性（水親和性、極性）及び親油性（脂肪親和性）の両方の特性を有する化合物と理解されるべきである。そのような化合物は、両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ又はａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）と呼ばれる。一般的な両親媒性物質は、石鹸、洗剤、及びリポタンパク質である。両親媒性化合物の他の例は、サポニン、リン脂質、糖脂質、ポリソルベートである。両親媒性化合物は、親油性（通常は炭化水素）構造と親水性極性官能基（イオン性又は非荷電のいずれか）を有する。ブロックコポリマーの特定のケースでは、ブロックの１つのモノマーユニットは親油性構造を有し、他のブロックのモノマーユニットは極性官能基を有する。両親媒性ブロックコポリマーの例は、ポロキサマー（ポリエチレン及びポリオキシプロピレンの単位を含むブロックコポリマー）である。親油性部分と親水性部分の両方を持つ結果として、一部の両親媒性化合物は水に溶解し、ある程度は非極性有機溶媒に溶解する。水性溶媒と有機溶媒とからなる非混和性の二相系に配置すると、両親媒性化合物は２つの相を分割する。疎水性部分と親水性部分の程度が、分割の程度を決定する。「疎水性添加剤又は化合物」は、水を阻む化合物として理解されるべきである。化学では、水をはじく物質の性質を指す。実際には、該物質は水にはじかれるのではなく、水に対する引力の欠如である。疎水性物質は疎水性を示し、疎水性物質（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｅ）と呼ばれることがある。疎水性分子は、水にさらされるのではなく、グループ化してミセルを形成する非極性分子になる傾向がある。一般的な疎水性物質は、油、コレステロール、レシチン、又はイソプレン単位のポリマーである。イソプレン単位の疎水性ポリマーの例はスクアレンである。本明細書で使用される「疎水性」は、とりわけ、ヒルデブランド溶解度パラメータδを使用して試験することができる。「ヒルデブランド溶解度パラメータ」という用語は、物質の凝集エネルギー密度を示すパラメータを指す。パラメータδは以下のように決定される：
【００４８】
δ＝（ΔЕ／Ｖ）１／２
【００４９】
式中、δは溶解度パラメータ（саｌ／сｍЗ）１／２であり、ΔЕは蒸発のエネルギー、ｃａｌ／モルであり、及びＶはモル体積、сｍЗ／モルである。代替の定義方法では、疎水性添加剤は分配係数（Ｐ）の対数（ｌｏｇＰ）が０より大きい（ｌｏｇＰ＞０）添加剤である（すなわち、スクアレンはオクタノール／水でｌｏｇＰ＝１４．１を有する）。逆に、親水性添加剤は、ｌｏｇＰ＜０の添加剤である。分配係数（Ｐ）又は分布係数（Ｄ）は、平衡状態にある２つの非混和性相の混合物中の化合物の濃度の比率である。したがって、この比率は、これらの２つの相における化合物の溶解度の差の尺度である。分配係数は一般に、化合物の非イオン化種の濃度比を指し、分布係数は、化合物のすべての種（イオン化＋非イオン化）の濃度比を指す。当業者は、このパラメータを計算する方法を知っていると思われる。
【００５０】
「ブロックコポリマー」は、共有結合によって連結された２以上のホモポリマーサブユニットを含むポリマーである。ホモポリマーサブユニットの結合には、ジャンクションブロックと呼ばれる中間の非繰り返しサブユニットが必要な場合がある。２つ又は３つの異なるブロックを有するブロックコポリマーは、それぞれジブロックコポリマー及びトリブロックコポリマーと呼ばれる。これらのジブロック及びトリブロックコポリマーは、連続ジブロック及びトリブロックコポリマー又はグラフト化されたジブロック及びトリブロックコポリマーであり得る。概略的に、連続ジブロックコポリマーは次の構造−（Ａ）ｎ−（Ｂ）ｍ−を有し、連続トリブロックコポリマーは、構造−（Ａ）ｎ−（Ｂ）ｍ−（Ａ）ｐ−に対応し、グラフトコポリマーは、１つの複合材料の線形主鎖と別の複合材料のランダムに分布した分枝とを有するセグメント化コポリマーである。
【００５１】
上記のように、本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びＰＣＶ２の１又は複数の抗原を含み、ブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療に使用するための皮内混合ワクチンを提供する。
【００５２】
ＰＣＶ２の異なる遺伝子型、例えば、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｃ及びＰＣＶ２ｄは、第１の態様の特定の実施形態に包含される。現在、ａ〜ｅと名付けられている５つの異なるＰＣＶ２遺伝子型がある。ＰＣＶ２の遺伝子型は、ＯＲＦ２（カプシド）中のヌクレオチド置換数をＯＲＦ２の総ヌクレオチド（７０２ｎｔ）で割ることによって決定され、この分率はｐ−距離（ｐ−ｄｉｓｔａｎｃｅ）と呼ばれる。ｐ−距離が０．０３５を超える場合、ウイルスには新しい遺伝子型が与えられる（Ｓｅｇａｌｅｓ  Ｊ．ら、「ＰＣＶ−２ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」、Ｖｅｔ  Ｒｅｃ．、２００８年、１６２（２６）巻、８６７〜８頁）。これは紛らわしい点があるが、少なくとも命名法は標準化されている。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は、約２３３アミノ酸のタンパク質をコードしている。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は全て、本発明での使用に適している。異なる遺伝子型のＰＣＶ２  ＯＲＦ２配列は、Ｓｅｇａｌｅｓら、２００８年、又はＸｉａｏら、「Ｇｌｏｂａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ２（ＰＣＶ２）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｎｆｉｒｍｓ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｍａｉｎ  ＰＣＶ２  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ＰＣＶ２ｄ」、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、２０１５年、９６（Ｐｔ  ７）巻、１８３０〜４１頁に開示されている。ＰＣＶ３などの他の新しいブタサーコウイルス（Ｐａｌｉｎｓｋｉ  Ｒ．ら、「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  Ｄｉｓｔａｎｔｌｙ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｋｎｏｗｎ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｅｓ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｆａｉｌｕｒｅ」、２０１６年、９１（１）巻に開示）もまた、本発明に包含される。
【００５３】
本発明は、すべてのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質変異体、例えば、とりわけ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ３５３１０（バージョンＡＡＣ３５３１０．１）、ＡＡＣ３５３３１（バージョンＡＡＣ３５３３１．１）、又はＡＢＸ７１７７９（バージョンＡＢＸ７１７７９．１）のものを包含することを意図する。
【００５４】
皮内混合ワクチン中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びブタサーコウイルスの１又は複数の抗原は、免疫学的有効量である。
【００５５】
第１の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチン中のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の量は、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量である。より特定の実施形態では、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の量は、０．１μｇ／用量〜５μｇ／用量であり、より好ましくは、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の量は、０．５μｇ／用量〜４μｇ／用量である。
【００５６】
以下の実施例に示されるように、家畜の効率的な免疫化は、本発明のワクチンが０．６μｇ／用量という低い量のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含有する場合であっても、これにより達成された。上述のように、混合ワクチンは一般に、抗原干渉を補償するために用量あたりより高い量の抗原を必要とすることを考えると、これは驚くべきことである。このワクチンはシングルショットのプロトコルでも効果的であり、さらなる追加免疫を必要としなかった。したがって、２用量プロトコルは必要なかった。
【００５７】
さらに、それは、大量の抗原を含有する、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ及びブタサーコウイルスに対する先行技術の皮内混合ワクチン（国際公開第２０１７１６２７４１号パンフレットなど）と比べて真の利点と考えられる。
【００５８】
この特定の組み合わせにより、そして実施例に示されるように、マイコプラズマ・ハイオニューモニエとブタサーコウイルスとの両方の抗原に対するブタの効果的な免疫化が達成された。
【００５９】
第１の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの単離タンパク質、弱毒化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞及びそれらの組合わせからなる群から選択される形態である。より具体的には、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原は、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の形態である。さらに具体的には、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原は、不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞溶解物の形態である。
【００６０】
特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、第１の態様の皮内混合ワクチン中の抗原は、ブタサーコウイルスの１又は複数のタンパク質を発現する不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ変異株細胞として提供される。これらのマイコプラズマ・ハイオニューモニエ変異株細胞は、特に、ゲノム又はそのサイトゾルに組み込まれた、ブタサーコウイルスの少なくとも１つのタンパク質をコードする１又は複数の外因性ＤＮＡ配列を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、本発明の混合ワクチンの不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏｓ  ＨＩＰＲＡ、Ｓ．Ａ．によってＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託された（そして申請者ＨＩＰＲＡに移された）Ｍｈｙｏの変異株に由来し、受託番号ＤＳＭ  ２６０２０のＭｈｙｏの変異株、受託番号ＤＳＭ２６０３４のＭｈｙｏの変異株、受託番号ＤＳＭ  ２６０２７のＭｈｙｏの変異株、及び受託番号ＤＳＭ２６０３３のＭｈｙｏの変異株から選択される。これらすべての変異株は、２０１２年５月２５日にＤＳＭＺに寄託された。これらは生存が宣言された。これらすべての変異株は、国際公開第２０１６１０２６１９号パンフレット（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【００６２】
第１の態様の別の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、１又は複数のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原は、１０３細胞／用量〜１０１１細胞／用量の量の弱毒化及び／又は不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の形態である。より具体的には、１０５細胞／用量〜１０１１細胞／用量、より具体的には１０９細胞／用量〜１０１１細胞／用量の量である。
【００６３】
第１の態様のより特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、第１の態様による使用のための皮内混合ワクチンはブタを冒す別の疾患又は病態に対する使用のためのものであり、該ワクチンは下記によって形成される群から選択される微生物から選択される１又は複数のさらなる抗原を含む：アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、イソスプラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後発育不全症候群（ｐｅｒｉｗｅａｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）作用物質、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ）。
【００６４】
予期せぬことに、本発明者らはまた、第１の態様による使用のための皮内混合ワクチンの製剤において、アジュバントの特定の選択を使用して、有効性を維持し、同時に安全性が改善されることも発見した。特に、以下の実施例１に示すように、特定のアジュバントはワクチン接種後の体温上昇を軽減し、局所反応の重症度を軽減した。
【００６５】
したがって、第１の態様のより特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチンはさらにアジュバントを含む。別の実施形態では、アジュバントは、鉱油及び添加剤を含むアジュバントエマルジョンであり、前記添加剤は、疎水性添加剤、両親媒性添加剤及びそれらの組み合わせから選択される。より特定の実施形態では、添加剤は、イソプレン単位のポリマー、ブロックコポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。より具体的には、イソプレン単位のポリマーはスクアレンであり、ブロックコポリマーは非イオン性ブロックコポリマーである。より具体的には、非イオン性ブロックコポリマーはポロキサマーである。さらに具体的には、ポロキサマーは、式（Ｉ）のものである（式中、ａは２〜１３０までの整数であり、ｂは１５〜６７までの整数である。）：
【化１】
2021506874.tif 000002
【００６６】
さらに具体的には、ａは１０１であり、ｂは５６である。
【００６７】
より特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、非イオン性ブロックコポリマーは、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７（Ｓｉｇｍａ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ａｃｏｆａｒｍａ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７（ＢＡＳＦ）、Ｋｏｌｉｐｈｏｒ  Ｐ１８８（ＢＡＳＦ）などのＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１（ＢＡＳＦ）などのＰｏｌｏｘａｍｅｒ  Ｌ１２１である。より具体的には、非イオン性ブロックコポリマーは、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７（シグマ）である。特に、有用なポロキサマーは、親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）が１０〜３０、より具体的には１８〜２４のものである。ＨＬＢは、化合物が親水性又は親油性であることの程度の尺度であり、当業者に公知の標準的な手順で決定される。
【００６８】
アジュバントにおける添加剤として使用されるイソプレン単位の他のポリマー候補としては、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、セスタテルペン、スクアレンとは異なる他のトリテルペン、及びテトラテルペンが挙げられる。
【００６９】
このアジュバントの組み合わせ（鉱油及び添加剤）は、以下に対する１価の抗原性ＩＤワクチン：Ｍｈｙｏ（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  Ｏｎｃｅ）又はブタサーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  ＩＤ）の直接的な組み合わせからは教示も示唆もされていない驚くべき効果と考えられる。上記のように、特定のワクチンを皮内投与できるかどうかを条件付ける要因は多く、混合ワクチンの開発は簡単ではない。克服すべき課題の中には、他の成分と組み合わせると抗原の免疫原性が低下するものがある。また、時間の経過に伴う複合抗原の固有の安定性、抗原の分解、用量節約戦略における各抗原の活性の維持、及び組み合わせて一緒に投与した場合のすべての抗原の安全性と有効性との間の適切なバランスを得ることの問題もある。
【００７０】
第１の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチンは、鉱油と、疎水性添加剤、両親媒性添加剤及びそれらの組み合わせから選択される添加剤とを含み、鉱油の濃度が５ｗ／ｗ％〜４０ｗ／ｗ％であり、添加剤の濃度が０．５ｗ／ｗ％〜５ｗ／ｗ％であるアジュバントエマルジョンをさらに含む。より具体的には、鉱油の濃度は１０ｗ／ｗ％〜２５ｗ／ｗ％であり、添加剤の濃度は０．５ｗ／ｗ％〜２ｗ／ｗ％である。より具体的には、鉱油の濃度は２１．２ｗ／ｗ％であり、添加剤の濃度は０．５ｗ／ｗ％である。すべてのパーセンテージは、組成物の総重量に対するものである。
【００７１】
さらに、第１の態様のより特定の実施形態では、皮内混合ワクチンは、５ｗ／ｗ％〜４０ｗ／ｗ％の濃度の鉱油、及び添加剤として０．５ｗ／ｗ％〜５ｗ／ｗ％の濃度の非イオン性ブロックコポリマーをアジュバント中に含む。さらにより特定の実施形態では、非イオン性ブロックコポリマーは、式（Ｉ）のポロキサマーである。より具体的には、ａが１０１であり、ｂが５６である式（Ｉ）のポロキサマーである。
【００７２】
【００７３】
より特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、第１の態様による使用のための皮内混合ワクチンは、アルキルフェノールエトキシレート、エトキシル化ソルビタンエステル、エトキシル化脂肪アルコール、エトキシル化脂肪酸、脂肪酸アルカノールアミド、エトキシル化脂肪酸アルカノールアミド、エトキシル化脂肪アミン、脂肪アミンオキシド、脂肪アミドアミンオキシド、脂肪酸グリセリド、スクロースエステル、アルキルポリグリコシド、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー、及びエトキシル化とプロポキシル化脂肪アルコール、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される界面活性剤を更に含む。より具体的には、界面活性剤はソルビタンモノオレエートである。
【００７４】
別の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチンは、ソルビタンＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０、Ｍｏｎｔａｎｏｘ８０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｉｍｕｌｓｏｌ、Ｍａｃｒｏｇｏｌ、及びそれらの混合物からなる群から選択される乳化剤をさらに含む。より具体的には、乳化剤はＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０である。
【００７５】
別の特定の実施形態では、本発明のような皮内混合ワクチンのワクチン用量は、０．０５〜０．５ｍｌ、特に０．１〜０．２ｍｌで構成される。
【００７６】
ワクチンは単回又は複数回用量で投与することができる。当技術分野で周知のように、複数回投与のワクチン接種は、最初の免疫化用量の投与、その後追加免疫用量として作用する１又は複数回の追加用量の投与からなる。本発明の実施形態では、ワクチンは、好ましくは単回投与である。
【００７７】
第１の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、家畜はブタである。
【００７８】
上記で詳述したように、本発明はまた、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びブタサーコウイルスの１又は複数の抗原を含む皮内混合ワクチンを提供する。
【００７９】
本発明の第１の態様による使用のための皮内混合ワクチンのすべての特定の実施形態は、本発明の第２の態様の皮内混合ワクチンにも当てはまる。
【００８０】
第２の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、１又は複数のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原は、１０３細胞／用量〜１０１１細胞／用量の量の弱毒化及び／又は不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の形態である。より具体的には、１０５細胞／用量〜１０１１細胞／用量、より具体的には１０９細胞／用量〜１０１１細胞／用量の量である。
【００８１】
この第２の態様の混合ワクチン中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びブタサーコウイルスの１又は複数の抗原は、免疫学的有効量である。
【００８２】
第２の態様の別の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチンは１つ又は複数のさらなる抗原をさらに含み、該さらなる抗原は、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びクラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エリシペロスリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イソスプラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、ローソニア属（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、並びにブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後発育不全症候群（ｐｅｒｉｗｅａｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）作用物質、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）及びそれらの組み合わせからなる微生物の群から選択される。
【００８３】
第２の態様の別の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、ワクチンはアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、アジュバントは、鉱油と、疎水性添加剤、両親媒性添加剤及びそれらの組み合わせから選択される添加剤とを含むアジュバントエマルジョンである。より特定の実施形態では、添加剤は、イソプレン単位のポリマー、ブロックコポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。より具体的には、イソプレン単位のポリマーはスクアレンであり、ブロックコポリマーは非イオン性ブロックコポリマーである。より具体的には、非イオン性ブロックコポリマーはポロキサマーである。さらに具体的には、ポロキサマーは、式（Ｉ）のものである（式中、ａは２〜１３０までの整数であり、ｂは１５〜６７までの整数である。）：
【化２】
2021506874.tif 000003
【００８４】
さらに具体的には、ａは１０１であり、ｂは５６である。より特定の実施形態では、非イオン性ブロックコポリマーは、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７（Ｓｉｇｍａ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ａｃｏｆａｒｍａ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７（ＢＡＳＦ）、Ｋｏｌｉｐｈｏｒ  Ｐ１８８（ＢＡＳＦ）などのＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１（ＢＡＳＦ）などのＰｏｌｏｘａｍｅｒ  Ｌ１２１である。より具体的には、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７（Ｓｉｇｍａ）である。
【００８５】
第２の態様のより特定の実施形態では、皮内混合ワクチンは、５ｗ／ｗ％〜４０ｗ／ｗ％の濃度の鉱油、及び添加剤として０．５ｗ／ｗ％〜５ｗ／ｗ％の濃度の非イオン性ブロックコポリマーをアジュバント中に含む。さらにより特定の実施形態では、非イオン性ブロックコポリマーは、式（Ｉ）のポロキサマーである。より具体的には、ａが１０１であり、ｂが５６である式（Ｉ）のポロキサマーである。
【００８６】
第２の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、第２の態様の皮内混合ワクチンは、家畜の医薬品として使用するためのものである。
【００８７】
より具体的には、第２の態様の皮内混合ワクチンは、家畜の真皮にワクチンを投与することによるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療での使用のためのものである。
【００８８】
本発明はまた、本発明の第２の態様のワクチンを含むワクチン接種キットを提供する。より詳細には、ワクチン接種キットは、マイコプラズマ属及び／又はブタサーコウイルスによって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に使用するためのものである。より詳細には、マイコプラズマによって引き起こされるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療に使用するためのものである。
【００８９】
上記で開示したように、本発明はまた、鉱油と、疎水性添加剤、両親媒性添加剤及びそれらの組み合わせから選択される添加剤とを含むアジュバントエマルジョンを含む皮内ワクチンを提供する。
【００９０】
第４の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチンの添加剤は、イソプレン単位のポリマー、ブロックコポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。より具体的には、イソプレン単位のポリマーはスクアレンであり、ブロックコポリマーは非イオン性ブロックコポリマーである。特定の実施形態では、添加剤はブロックコポリマーである。より具体的には、ブロックコポリマーは非イオン性ブロックコポリマーである。より具体的には、非イオン性ブロックコポリマーはポロキサマーである。さらに具体的には、非イオン性ブロックコポリマーは、式（Ｉ）のポロキサマーである（式中、ａは２〜１３０までの整数であり、ｂは１５〜６７までの整数である。）：
【化３】
2021506874.tif 000004
【００９１】
さらに具体的には、ポロキサマーはａが１０１、ｂが５６である。より特定の実施形態では、非イオン性ブロックコポリマーは、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７（Ｓｉｇｍａ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ａｃｏｆａｒｍａ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７（ＢＡＳＦ）、Ｋｏｌｉｐｈｏｒ  Ｐ１８８（ＢＡＳＦ）などのＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１（ＢＡＳＦ）などのＰｏｌｏｘａｍｅｒ  Ｌ１２１である。より具体的には、非イオン性ブロックコポリマーはＰｏｌｏｘａｍｅｒ４０７（Ｓｉｇｍａ）である。
【００９２】
アジュバントにおける添加剤として使用されるイソプレン単位の他のポリマー候補としては、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、セスタテルペン、スクアレンとは異なる他のトリテルペン、及びテトラテルペンが挙げられる。
【００９３】
第４の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチンは、鉱油の濃度が５ｗ／ｗ％〜４０ｗ／ｗ％であり、添加剤の濃度が０．５ｗ／ｗ％〜５ｗ／ｗ％であるアジュバントエマルジョンをさらに含む。より具体的には、鉱油の濃度は１０ｗ／ｗ％〜２５ｗ／ｗ％であり、添加剤の濃度は０．５ｗ／ｗ％〜２ｗ／ｗ％である。より具体的には、鉱油の濃度は２１．２ｗ／ｗ％であり、添加剤の濃度は０．５ｗ／ｗ％である。すべてのパーセンテージは、ワクチン組成物の総重量に対するものである。
【００９４】
さらに、この第４の態様のより特定の実施形態では、皮内混合ワクチンは、５ｗ／ｗ％〜４０ｗ／ｗ％の濃度の鉱油、及び添加剤として０．５ｗ／ｗ％〜５ｗ／ｗ％の濃度の非イオン性ブロックコポリマーをアジュバント中に含む。さらにより特定の実施形態では、非イオン性ブロックコポリマーは、式（Ｉ）のポロキサマーである。より具体的には、ａが１０１であり、ｂが５６である式（Ｉ）のポロキサマーである。
【００９５】
第４の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチン中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの単離タンパク質からなる群から選択される形態であり、例えば限定するものではないが、Ｍｉｎｉｏｎら、「Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｔｒａｉｎ  ２３２，ｔｈｅ  ａｇｅｎｔ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ  ｍｙｃｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００４年、１８６（２１）巻、７１２３〜７１３３頁に記載のＰ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、及びＰ１０２表面タンパク質；Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｏｓら、「Ｓｗｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｏｕｌｔｒｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ａｎｄ  ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００５年、１８７（１６）ら、５５６８〜５５７７頁に記載のＰ７６、Ｐ１４６、Ｐ２１６アドヘシン若しくはＰ９５膜タンパク質、又はＣａｒｏｎら、「Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ３６ａｎｄ  ｐ４６ｇｅｎｅｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００年、３８（４）巻、１３９０〜１３９６頁に記載のｐ３６細胞質タンパク質、又はリボソームＲＮＡ、弱毒化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞、及びそれらの組み合わせである。より具体的には、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原は、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の形態である。さらにより具体的には、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原は、不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞溶解物の形態である。
【００９６】
第４の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原は、不活化ブタサーコウイルス粒子、弱毒化ブタサーコウイルス粒子、ブタサーコウイルスの単離タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される形態である。より具体的には、ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原は、ブタサーコウイルスの単離タンパク質である。さらに具体的には、１又は複数の抗原は、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、及びＯＲＦ３タンパク質を含む群から選択される。より具体的には、抗原はＯＲＦ２タンパク質である。
【００９７】
別の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、ブタサーコウイルスは、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）である。
【００９８】
ＰＣＶ２の異なる遺伝子型、例えば、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｃ及びＰＣＶ２ｄは、第１の態様の特定の実施形態に包含される。現在、ａ〜ｅと名付けられている５つの異なるＰＣＶ２遺伝子型がある。ＰＣＶ２の遺伝子型は、ＯＲＦ２（カプシド）中のヌクレオチド置換数をＯＲＦ２の総ヌクレオチド（７０２ｎｔ）で割ることによって決定され、この分率はｐ−距離（ｐ−ｄｉｓｔａｎｃｅ）と呼ばれる。ｐ−距離が０．０３５を超える場合、ウイルスには新しい遺伝子型が与えられる（Ｓｅｇａｌｅｓら、２００８年）。これは紛らわしい点があるが、少なくとも命名法は標準化されている。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は、約２３３アミノ酸のタンパク質をコードしている。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は全て、本発明での使用に適している。さまざまな遺伝子型のＰＣＶ２  ＯＲＦ２配列は、Ｓｅｇａｌｅｓら、２００８年、又はＸｉａｏら、２０１５年に開示されている。ＰＣＶ３（Ｐａｌｉｎｓｋｉ  Ｒ．ら、２０１６年に開示されている）などの他の新しいブタサーコウイルスも本発明に包含される。
【００９９】
本発明は、すべてのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質変異体、例えば、とりわけ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ３５３１０（バージョンＡＡＣ３５３１０．１）、ＡＡＣ３５３３１（バージョンＡＡＣ３５３３１．１）、又はＡＢＸ７１７７９（バージョンＡＢＸ７１７７９．１）のものを包含することを意図する。
【０１００】
第４の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチン中の抗原は、ブタサーコウイルスの１又は複数のタンパク質を発現する不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ変異株細胞である。
【０１０１】
第４の態様の別の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｈｙｏ）細胞は、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺに寄託されたＭｈｙｏの変異株に由来し、受託番号ＤＳＭ  ２６０２０のＭｈｙｏの変異株、受託番号ＤＳＭ２６０３４のＭｈｙｏの変異株、受託番号ＤＳＭ２６０２７のＭｈｙｏの変異株、及び受託番号ＤＳＭ２６０３３のＭｈｙｏの変異株から選択される。
【０１０２】
この第４の態様の皮内混合ワクチン中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原、及びブタサーコウイルスの１又は複数の抗原は、免疫学的有効量である。特定の実施形態では、ブタサーコウイルス抗原の量は、０．１μｇ／用量〜１０μｇ／用量、より具体的には０．１μｇ／用量〜５μｇ／用量、さらにより具体的には０．５μｇ／用量〜４μｇ／用量である。別の特定の実施形態では、混合ワクチン中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの抗原の量は、１０３細胞／用量〜１０１１細胞／用量である。より具体的には、１０５細胞／用量〜１０１１細胞／用量、より具体的には１０９細胞／用量〜１０１１細胞／用量の量である。
【０１０３】
別の特定の実施形態では、本発明のような皮内混合ワクチンのワクチン用量は、０．０５〜０．５ｍｌ、特に０．１〜０．２ｍｌを含む。
【０１０４】
第４の態様の別の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、皮内混合ワクチンは１つ又は複数のさらなる抗原をさらに含み、該さらなる抗原は、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びクラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エリシペロスリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イソスプラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、ローソニア属（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、並びにブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後発育不全症候群（ｐｅｒｉｗｅａｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）作用物質、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）及びそれらの組み合わせからなる微生物の群から選択される。
【０１０５】
上記で開示したように、本発明はまた、家畜の医薬品として使用するための皮内混合ワクチンを提供する。
【０１０６】
第５の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、ワクチンは、家畜におけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエによって引き起されるブタ流行性肺炎、及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療に使用するためのものである。この実施形態は、本発明の第５の態様の皮内混合ワクチンの、家畜の真皮に医薬品を投与することによるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療用医薬品の製造のための使用として製剤化することもできる。この実施形態はまた、特にマイコプラズマよって引き起こされるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療のために、第５の態様の混合ワクチンを用いてそれを必要とする家畜を皮内免疫化する方法として製剤化することができる。
【０１０７】
第５の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、家畜はブタである。
【０１０８】
第５の態様の特定の実施形態では、ワクチンは、さらなる疾患の予防及び／又は治療に使用するためのものであり、該ワクチンは下記によって形成される群から選択される微生物から選択される１又は複数のさらなる抗原を含む：アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、イソスプラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後発育不全症候群（ｐｅｒｉｗｅａｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）作用物質、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ）。
【０１０９】
上記のように、本発明はまた、（ａ）第４の態様の皮内混合ワクチン、（ｂ）任意選択で、ワクチンの皮内送達に適した送達装置、及び（ｃ）任意選択で、その使用に関する説明書、を含むワクチン接種パーツキットに関する。
【０１１０】
第６の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、ワクチン接種キットは、マイコプラズマ属及び／又はブタサーコウイルスによって引き起される疾患の予防及び／又は治療に使用するためのものである。より具体的には、マイコプラズマによって引き起こされるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療に使用するためのものである。
【０１１１】
説明及び特許請求の範囲を通して、「含む」という単語及びその単語の変形は、他の技術的特徴、添加物、成分又は工程を除外することを意図するものではない。さらに、「含む」という言葉は、「からなる」という場合も包含する。本発明の追加の目的、利点及び特徴は、説明を検討することにより当業者に明らかになるか、又は本発明の実施により習得することができる。以下の実施例及び図面は例示のために提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。図面に関連し、特許請求の範囲の中で括弧内に配置された参照符号は、特許請求の範囲の明瞭度を高めるための試みであり、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本発明は、本明細書に記載された特定の好ましい実施形態のすべての可能な組み合わせを網羅する。
【０１１２】
本発明の具体的条項は以下の通りである：
【０１１３】
第１項  以下を含む皮内混合ワクチン：
−マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１又は複数の抗原；
−ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原；
鉱油と、疎水性添加剤、両親媒性添加剤及びそれらの組み合わせから選択される添加剤とを含むアジュバントエマルジョン；並びに
−薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体。
【０１１４】
第２項  添加剤が、イソプレン単位のポリマー、ブロックコポリマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、第１項に記載の皮内混合ワクチン。
【０１１５】
第３項  添加剤がブロックコポリマーである、第２項に記載の皮内混合ワクチン。
【０１１６】
第４項  ブロックコポリマーが非イオン性ブロックコポリマーである、第３項に記載の皮内混合ワクチン。
【０１１７】
第５項  非イオン性ブロックコポリマーがポロキサマーである、第４項に記載の皮内混合ワクチン。
【０１１８】
第６項  ポロキサマーが式（Ｉ）のものである、第５項に記載の皮内混合ワクチン（式中、ａが２〜１３０の整数であり、ｂが１５〜６７の整数である。）：
【化４】
2021506874.tif 000005
【０１１９】
第７項  ポロキサマーにおいて、ａが１０１であり、ｂが５６である、第６項に記載の皮内混合ワクチン。
【０１２０】
第８項  マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原が、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの単離タンパク質、弱毒化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選択される形態である、第１項〜第７項のいずれかに記載の皮内混合ワクチン。
【０１２１】
第９項  マイコプラズマ・ハイオニューモニエの１又は複数の抗原が、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の形態である、第８項に記載の皮内混合ワクチン。
【０１２２】
第１０項  ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、不活化ブタサーコウイルス粒子、弱毒化ブタサーコウイルス粒子、ブタサーコウイルスの単離タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される形態である、第１項〜第９項のいずれかに記載の皮内混合ワクチン。
【０１２３】
第１１項  ブタサーコウイルスの１又は複数の抗原が、ブタサーコウイルスの単離タンパク質の形態である、第１項〜第１０項のいずれかに記載の皮内混合ワクチン。
【０１２４】
第１２項  抗原が、ブタサーコウイルスの１又は複数のタンパク質を発現する不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ変異株細胞である、第１項〜第１１項のいずれかに記載の皮内混合ワクチン。
【０１２５】
第１３項  不活性化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞が、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺに寄託されたＭｈｙｏの変異株に由来し、受託番号ＤＳＭ２６０２０のＭｈｙｏの変異株、受託番号ＤＳＭ２６０３４のＭｈｙｏの変異株、受託番号ＤＳＭ  ２６０２７のＭｈｙｏの変異株、及び受託番号ＤＳＭ２６０３３のＭｈｙｏの変異株から選択される、第１２項に記載の皮内混合ワクチン。
【０１２６】
第１４項  以下からなる微生物の群から選択される１又は複数のさらなる抗原をさらに含む、第１項〜第１３項のいずれかに記載の皮内混合ワクチン：アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びクラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エリシペロスリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イソスプラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、ローソニア属（Ｌａｗｓｏｎｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、並びにブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後発育不全症候群（ｐｅｒｉｗｅａｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）作用物質、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）及びそれらの組み合わせ。
【０１２７】
第１５項  家畜の医薬品として使用するための、第１項〜第１４項のいずれかに定義されている皮内混合ワクチン。
【０１２８】
第１６項  マイコプラズマ・ハイオニューモニエによって引き起こされるブタ流行性肺炎及び／又はブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の予防及び／又は治療に、並びに任意選択で、ブタを冒す別の疾患又は病態に対して使用するための、第１５項に記載の使用のための皮内混合ワクチン。
【０１２９】
第１７項  家畜がブタである、第１５項〜第１６項のいずれかに記載の使用のための皮内混合ワクチン。
【０１３０】
第１８項  さらなる疾患の予防及び／又は治療に使用するためのものであり、下記によって形成される群から選択される微生物から選択される１又は複数のさらなる抗原を含む、第１５項〜第１７項のいずれかに記載の皮内混合ワクチン：アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、イソスプラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタインフルエンザウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ブタ離乳後発育不全症候群（ｐｅｒｉｗｅａｎｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）作用物質、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、カリシウイルス、伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）及びトルクテノウイルス（ＴＴＶ）。
【０１３１】
第１９項
（ａ）第１項〜第１４項のいずれかに定義されている皮内混合ワクチン、
（ｂ）任意選択で、ワクチンの皮内送達に適した送達装置、及び
（ｃ）任意選択で、その使用に関する説明書、を含むワクチン接種パーツキット。
第２０項マイコプラズマ属及び／又はブタサーコウイルスによって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に使用するための、第１９項に定義されたワクチン接種パーツキット。
【実施例】
【０１３２】
実施例１：
ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）、及び流行性肺炎に対するさまざまな皮内混合ワクチンの安全性及び有効性：用量あたり固定ＰＣＶ２  ＯＲＦ２濃度において。
【０１３３】
この研究の目的は、子ブタにおける流行性肺炎（ＥＰ）及びブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）に対する、Ｍ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）とＰＣＶ２との異なる混合皮内ワクチン製剤の安全性及び有効性を評価することであった。研究は無作為化された完全盲検ベースで行われた。
【０１３４】
Ｍ．ハイオニューモニエに対する抗体を有さない、６週齢の合計４７匹の子ブタを研究のために選択した。動物はＰＣＶ２に対する母体由来の抗体が高かった。子ブタを、５匹の子ブタを含むグループＦを除いて、それぞれ７匹の子ブタの６つの処置グループ（グループＡ〜Ｇ）に割り当てた。
【０１３５】
すべての子ブタに、無針装置（国際公開第２０１６１０２６１９号パンフレット、ＨＩＰＲＡ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｓ．Ｌ．Ｕ．、Ｓｐａｉｎに開示されているものなど）を用いて対応する製剤の単回用量０．２ｍｌを皮内経路により研究の０日目にワクチン接種した。グループＡ〜Ｅの混合ワクチンは、同じ抗原性物質、０．６μｇ／用量のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質と、１．５７ｘ１０１０のＭ．ハイオニューモニエ不活性化細胞／用量とを含有した。グループＦには、ＩＤＡＬワクチン接種器（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて市販ワクチンＰＯＲＣＩＬＩＳ（登録商標）ＭＨＹＯ  ＩＤ  ＯＮＣＥ（Ｍ．ｈｙｏ抗原のみを含有する一価ワクチン）の単回用量０．２ｍＬを投与し、同時に針付注射器系で筋肉内経路によって、市販のワクチンＰＯＲＣＩＬＩＳ（登録商標）ＰＣＶ（ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原のみを含有する一価ワクチン）の単回用量２ｍＬを投与した。最後に、グループＧには、グループＡ〜Ｅと同じ方法で皮内経路により０．２ｍｌのプラセボ（ＰＢＳ）を投与した。
【０１３６】
さらに各グループに対して異なるアジュバントを試験した。
・グループＡ：２１．２％の鉱油を含有するＭ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２混合ワクチン。
・グループＢ：２１．２％の鉱油と２％のブロックコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７、ＢＡＳＦ）とを含有するＭ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２混合ワクチン。
・グループＣ：３０％の鉱油と５％のスクアレンとを含有するＭ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２混合ワクチン。
・グループＤ：２１．２％の鉱油と５％のスクアレンとを含有するＭ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２混合ワクチン。
・グループＥ：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ２５１（ＳＥＰＰＩＣ）を含有するＭ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２混合ワクチン。
・グループＦ：ＰＯＲＣＩＬＩＳ（登録商標）ＭＨＹＯ  ＩＤ  ＯＮＣＥ及びＰＯＲＣＩＬＩＳ（登録商標）ＰＣＶ（それぞれ、Ｍ．ｈｙｏ一価ＩＤワクチン及びＰＣＶ２  ＯＲＦ２一価ＩＭワクチン；ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、両方とも、それぞれのＥＵ販売承認の製品概要（ＥＵ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ，Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）に基づいてアジュバントとして鉱油と酢酸ｄｌ−α−トコフェリルとを含有する。
・グループＧ：プラセボ、ＰＢＳを注射した。
【０１３７】
研究２９日目に、すべての子ブタに、病原性ＰＣＶ２ｂ及び病原性Ｍ．ハイオニューモニエをチャレンジした。３ｍｌ／子ブタのＰＣＶ２ｂ病原性株を鼻腔内（各鼻孔に１．５ｍｌ）に接種した。Ｍ．ハイオニューモニエ感染については、気管内経路を使用して、１０ｍｌ／子ブタの病原性Ｍ．ハイオニューモニエ株を接種した。
【０１３８】
安全性
すべての子ブタの臨床徴候を毎日観察した。安全性評価の主な変数は、体温とワクチン接種に対する局所的及び全身的反応とであった。
【０１３９】
ワクチン接種の日（ワクチン接種前、及びワクチン接種の３時間後と６時間後）及びワクチン接種後２日目まで、各子ブタの体温を観察し、記録した。
【０１４０】
ワクチンの局所反応を、０日目（ワクチン接種後３時間及び６時間）及びワクチン接種後１、２、７、１４及び２１日目に観察した。これらの反応を、局所反応スコアの平均によって評価した。スコアを、ワクチン接種の時点での病変のサイズ、色、及び外観（存在する場合）に基づいて計算した。
【０１４１】
結果を図１及び図２にまとめる。
【０１４２】
体温の上昇は、すべてのグループで、ワクチン接種後６時間で最大ピークに達した。ワクチン接種後の１日で体温は基礎値に戻った。高い平均ピーク値は、ＩＭＳ２５１（ＳＥＰＰＩＣ）を含有する、グループＥのＤ０（ワクチン接種後＋６ｈ）で最大１．７℃増加（４１．７℃）したのに対し、対照群の値は３９〜４０℃の範囲であった。異なる鉱油濃度（それぞれ２１．２％、３０％＋スクアレン、及び２１．２％＋スクアレン）を含有するワクチン接種グループＡ、Ｃ、Ｄの平均体温上昇は、０．９〜１．５℃であった。グループＢ（鉱油２１．２％＋Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７）は、対照グループＧ及びグループＦ（一価のＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＭＨＹＯ  ＩＤ  ＯＮＣＥとＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶとを同時にワクチン接種した）で得られた値と非常に近いわずか０．５℃の体温上昇を記録した。２％のＰｏｌｏｘａｍｅｒ４０７＋鉱油をアジュバントとして加えたワクチンを投与されたグループは、この成分を含まない同等の混合プロトコルのワクチングループの体温を低下させることが実証された。
【０１４３】
目視検査及び触診により評価された局所反応に関して、対照群の動物には局所反応がなかった。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ２５１（グループＥ）は、ワクチン接種後２日まで、他のグループの製剤と比較して高い局所反応スコアを記録した。この研究ではまた、混合ワクチン中の鉱油濃度が高いほど、最長の局所反応が記録されることが明らかになった。グループＦのＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＭＨＹＯ  ＩＤ  ＯＮＣＥは、グループＢと比較して、ワクチン接種後１４日目、及び２１日目まで持続する高い局所反応を有した。Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７を添加した２１．２％の鉱油を含有するグループＢにおいて、最高の局所安全性が達成された。
【０１４４】
有効性
ワクチン接種前の２１日目及び１日目、並びにワクチン接種後１４、２１、３１、４５、５３及び５６日目にすべての動物から血液サンプルを収集した。ＰＣＶ２及びＭｈｙｏに対する抗体についてサンプルを試験した。Ｍｈｙｏの有効性を、異なる処置グループのＭ．ハイオニューモニエ様病変に罹患した表面によって評価した。
【０１４５】
Ｍ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｉｎａｅ）の有効性
チャレンジの有効性評価の主な変数は、肺病変のスコア化であった。各肺葉を、Ｍ．ハイオニューモニエ様の病変（すなわち、肺硬化）に罹患した組織の割合に応じて０から５の間でスコア化した。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
総肺重量に対する各肺葉の寄与を考慮した０〜５の範囲の加重スコアを取得するために、次の式を適用した：
【０１４８】
（ＲＡ×０．１１）＋（ＬＡ×０．０５）＋（ＲＣ×０．１）（ＬＣ×０．０６）＋（ＲＤ×０．３４）＋（ＬＤ×０．２９）＋（Ｉ×０．０５）＝加重スコア
【０１４９】
次に、加重スコア値を使用して、罹患した肺の割合を計算した。
【０１５０】
感染２７日後（Ｄ５６）、すべての動物を人道的に安楽死させた。剖検中、動物をＭ．ハイオニューモニエの肺病変について分析した。すべてのワクチン接種グループは、対照ＰＢＳグループよりも病変スコアが低かった。
【０１５１】
研究では、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ２５１（グループＥ）及びＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＭＨＹＯ  ＩＤ  ＯＮＣＥ＋Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ（グループＦ）が最も高い肺病変スコアを示したのに対し、鉱油のみ、又はスクアレンやポロキサマー４０７などの他の成分との組合わせを含有する製剤に基づいたグループＡ〜Ｄは、より良好に作用し、肺病変スコアが比較的小さかった。より高い濃度（３０％）の鉱油を含有するグループＣは、Ｍｈｙｏのチャレンジに対する有効性の点でより良い結果をもたらしたが、２１．２％の鉱油と２％のブロックコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７）とを含有する製剤をワクチン接種したグループＢは、安全性及び有効性の両方においてよりよく作用した。
【０１５２】
ＰＣＶ２の有効性
ＰＣＶ２のセロコンバージョンを、ワクチン接種されずにチャレンジされたグループ（グループＧ）を除くすべてのグループでチャレンジ後に観察した。
【０１５３】
したがって、これらのＭ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２皮内混合ワクチン（グループＡ〜Ｅに投与された製剤）は、用量あたり含有されるＯＲＦ２  ＰＣＶ２カプシドタンパク質が少量であっても、ＰＣＶ２チャレンジに対する効果的な応答を達成することが実証された。
【０１５４】
実施例２：
ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）及び流行性肺炎に対する皮内ワンショット混合ワクチンの安全性及び有効性：用量あたり異なるＰＣＶ２  ＯＲＦ２濃度で。
【０１５５】
この研究の目的は、用量あたり異なる濃度のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含み、さらに異なる濃度の鉱油を含むように製剤化した場合の、子ブタにおける流行性肺炎（ＥＰ）及びブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）に対する、Ｍ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）とＰＣＶ２との異なる混合皮内ワクチンの安全性及び有効性を評価することであった。
【０１５６】
研究は無作為化された完全盲検ベースで行われた。
【０１５７】
この試験では、Ｍ．ハイオニューモニエに対する抗体を有さず、ＰＣＶ２に対する母親由来の抗体のレベルが低い、４週齢の雄又は雌の合計５０匹の子ブタを使用した。子ブタはそれぞれ１０匹の動物（Ａ〜Ｄ）の４つの処置グループに割り当てられ、グループＥは監視グループとして機能した。各グループは、研究の０日目に異なるワクチン接種処置を受けた。
【０１５８】
１．グループＡ：用量当たり３×１０１０の不活化Ｍ．ハイオニューモニエ細胞と１．２５μｇのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質とを含み、２１．２％の鉱油と０．５％のブロックコポリマーとをアジュバントとした混合ワクチンの単回用量０．２ｍｌを皮内にワクチン接種した。
２．グループＢ：用量当たり２．２×１０１０の不活化Ｍ．ハイオニューモニエ細胞と１．４９μｇのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質とを含み、１５％の鉱油と０．５％のブロックコポリマーとをアジュバントとして含有するワクチンの単回用量０．２ｍｌを皮内にワクチン接種した。
３．グループＣ：子ブタに２つの市販のワクチンを同時投与した。子ブタに、０．２ｍｌのＰＯＲＣＩＬＩＳ（登録商標）ＭＨＹＯ  ＩＤ  ＯＮＣＥ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）ワクチンを皮内投与で、及び２ｍｌのＰＯＲＣＩＬＩＳ（登録商標）ＰＣＶ２（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を首の反対側に筋肉内に投与した。
４．グループＤ：このグループには、ワクチン接種されずにチャレンジされたグループとして、２ｍｌのＰＢＳを筋肉内に投与した。
５．グループＥ：このグループは、ワクチン接種されず、チャレンジされていないグループとして、０．２ｍｌのＰＢＳを皮内に投与した。
【０１５９】
ＰＣＶ２とＭ．ハイオニューモニエとの同時感染モデルを使用して、ワクチンの有効性を評価した。実験的チャレンジを、ワクチン接種の４週間後にグループＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤに対して鼻腔内感染によって実施した。グループＥは感染させず、ワクチン接種されず、チャレンジされていない対照として機能した。子ブタに、以下の接種材料：（ｉ）カニューレにより各動物の鼻腔内に接種された３ｍｌの病原性ＰＣＶ２ｂ株（各鼻孔に１．５ｍｌ）、及び（ｉｉ）カニューレにより接種された５ｍｌ／子ブタの病原性Ｍ．ハイオニューモニエ株（各鼻孔に２．５ｍｌ）を投与した。Ｍ．ハイオニューモニエのチャレンジを３日間連続して繰り返した。
【０１６０】
チャレンジ後２８日目（試験５６日目）にブタを人道的に安楽死させた。混合ワクチンの有効性を評価するために、Ｍ．ハイオニューモニエの肺病変をスコア化した。扁桃、鼠径部、腸間膜及び縦隔のリンパ節をＱ−ＰＣＲによるＰＣＶ２定量化のために収集した。さらに、局所反応及び全身反応を研究中に評価した。
【０１６１】
結果
・安全性
ワクチン接種の前に、子ブタの健康状態を観察した。体温を、ワクチン接種前０日目、ワクチン接種後４時間及び６時間、並びにワクチン接種後１、２、及び３日目にすべての子ブタについて記録した。局所反応を、０日目（ワクチン接種後４時間及び６時間）、及びワクチン接種後１、２、３、７及び１４日目に記録した。
【０１６２】
各グループの平均体温上昇を計算した。すべてのワクチン接種グループでは、ワクチン接種後６時間で平均体温がわずかに上昇した。グループＡの最大温度上昇は１．０３℃であり、ブタのワクチンでは許容範囲であった。
【０１６３】
すべてのワクチン接種グループで、動物は局所反応を示した。しかし、鉱油＋ブロックコポリマーのアジュバントを含有するグループＡ及びＢの方がよりよく作用した。グループＡとＢの両方では、最初の局所反応スコアのピークはワクチン接種の日とワクチン接種後１日目に観察されたが、この局所反応はワクチン接種後３日後に急速に減少した。対照的に、グループＣ（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＭＨＹＯ  ＩＤ  ＯＮＣＥ及びＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶをワクチン接種）には、ＩＤ経路に関連する重要な局所病変があり、１４日目（局所病変が監視された最終日）まで持続した。
【０１６４】
この結果に基づいて、ＭｈｙｏとＰＣＶ２との皮内混合ワクチンＡ及びＢは良好な安全性プロファイルをもたらしたと結論付けることができる。局所反応に関しては、１価のＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＭＨＹＯ  ＩＤ  ＯＮＣＥワクチンは１４日目まで重要な局所反応を引き起こし、これと比較して二価の皮内ワクチンＡ及びＢは局所病変の減少がワクチン接種後２日目に見られたため、ＭｈｙｏとＰＣＶ２との皮内混合ワクチンＡ及びＢは、市販の１価ワクチンをワクチン接種した場合よりも安全であると結論づけることができる。
【０１６５】
さらに、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ２を筋肉内ワクチン接種されたグループＣの１０匹の子ブタのうち１匹はアナフィラキシー反応を示したが、皮内ワクチンをワクチン接種された２０匹の子ブタ（グループＡ及びＢ）は１匹も全身反応を示さなかった。皮内ワクチン接種は、どの製剤であっても、全身反応の点で筋肉内ワクチンよりも安全であったと結論付けることができる。
【０１６６】
・Ｍ．ハイオニューモニエの有効性
チャレンジの有効性評価の主な変数は、肺病変のスコア化であった。スコアは、実施例１に記載のように計算した。
【０１６７】
研究の終わりに、すべての動物を人道的に安楽死させた。剖検中、動物をＭ．ハイオニューモニエの肺病変について分析した。
【０１６８】
Ｍ．ハイオニューモニエの肺病変の結果から、二価の皮内混合ワクチンＡ及びＢは、陰性対照グループと比較して、罹患した肺の割合を明らかに減少させたことが示された（図２）。また、２価のＭｈｙｏとＰＣＶ２とのワクチンＡ及びＢを使用すると、肺病変領域の大幅な減少が観察されたことも示されている。
【０１６９】
・ＰＣＶ２の有効性。
有効性評価の主な変数は、Ｑ−ＰＣＲにより測定されたＰＣＶ２ウイルス血症の減少であった。ＰＣＶ２のセロコンバージョン、ＰＣＲ陽性動物の割合、及び臨床徴候も評価した。
【０１７０】
血清中のＰＣＶ２  ＩｇＧ抗体は、ブタサーコウイルス２型抗体テストキット（ＢｉｏＣｈｅｋ）を使用して、感染後７、１４、２１、２８日目に分析した。Ｓ／Ｐ比を計算した（図６）。結果は、すべてのワクチン接種グループが、対照グループと比較して大幅にセロコンバージョンを増加させたので、すべてのワクチンの有効性を実証している。
【０１７１】
Ｑ−ＰＣＲは、感染後７、１４、２１、及び２８日目（研究３５、４２、４９、５６日目）に血清及び鼻腔スワブについて行った。各サンプルのＰＣＶ２ゲノムＤＮＡをＰＣＲで定量化した。研究の最後にすべての動物を剖検し、肺、扁桃、縦隔、腸間膜、及び鼠径部のリンパ節などのさまざまな組織のＰＣＶ２力価を分析した。
【０１７２】
結果は、Ｑ−ＰＣＲによるＰＣＶ２陽性動物の割合が、陰性対照グループと比較してワクチン接種グループで減少したことを示した。
【０１７３】
さまざまな組織におけるＰＣＶ２力価の低下は、すべてのワクチン接種グループと陰性対照との間で有意差があった。これらの結果は、Ｍ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２混合ワクチンＡ及びＢがＰＣＶ２に対して有効であったことも実証した。
【０１７４】
結論として、鉱油及びブロックコポリマーを含有する皮内Ｍ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２混合ワクチンは、市販の１価のＩＤワクチンよりもさらに安全な安全プロファイルをもたらした。同時に、新しいＭ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２混合ワクチンＡ及びＢはまた、ＰＣＶ２及びＭ．ハイオニューモニエに対して有効な応答を示した。
【０１７５】
この研究では、これらのＭ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２皮内混合ワクチン（グループＡ及びＢ）は、用量あたり含有されるＯＲＦ２  ＰＣＶ２カプシドタンパク質が少量であっても、効果的なＰＣＶ２応答を達成することが実証された。
【０１７６】
引用リスト
ＷＯ２０１４００９５８６
ＷＯ２０１６１０２６１９
ＷＯ２０１７１６２７４１
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Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｏｓら、「Ｓｗｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｏｕｌｔｒｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ａｎｄ  ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００５年、１８７（１６）巻、５５６８〜５５７７頁。
Ｃａｒｏｎら、「Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ３６  ａｎｄ  ｐ４６  ｇｅｎｅｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００年、３８（４）巻、１３９０〜１３９６頁
Ｐａｌｉｎｓｋｉ  Ｒ．ら、「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  Ｄｉｓｔａｎｔｌｙ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｋｎｏｗｎ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｅｓ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｆａｉｌｕｒｅ」、２０１６年、９１（１）巻。
Ｘｉａｏら、「Ｇｌｏｂａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ２（ＰＣＶ２）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｎｆｉｒｍｓ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｍａｉｎ  ＰＣＶ２  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ＰＣＶ２ｄ」、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、２０１５年；９６（Ｐｔ７）巻、１８３０〜４１頁。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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