(57)【要約】本発明は、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチーを、治療すること、診断すること、および監視することに有用な薬剤を生成およびスクリーニングするための方法を提供する。
2021513560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病（ＰＤ）および他のシヌクレイノパチーの治療に有用な抗体を生成する方法であって、前記方法は、（ａ）アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来のポリペプチドまたは前記ポリペプチドと同じ立体構造エピトープを示すポリマーを含む免疫原組成物で非ヒト動物を免疫する工程と、（ｂ）前記ポリペプチドを特異的に認識する１つ以上の抗体を単離する工程と、を含み、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、ミトコンドリア毒性を有する立体構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ変異体を含む、方法。
【請求項２】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドがリン酸化Ｓｅｒ１２９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、抗ホスホ−Ｓｅｒ１２９抗体ＧＴＸ５０２２２、ロット８２１５０５１７７と免疫反応性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦ−認識８１Ａおよび抗体ＭＪＦ−Ｒ１３の少なくとも一方と免疫反応性ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失の少なくとも一方を有するα−ｓｙｎ変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、細胞培養物、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの動物モデルの脳、またはＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの患者の脳に存在するＰα−ｓｙｎ＊封入体から抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫原組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がファージディスプレイによって単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
単離された抗体を治療活性について検査することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療活性は、シヌクレイノパチーの細胞モデルまたは生物モデルにおける毒性活性の阻害である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療活性は、病原性リン酸化α−ｓｙｎの生成および伝搬の減少である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドがヒトα−ｓｙｎに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ミトコンドリア毒性は、マイトファジーをもたらすミトコンドリア機能不全および構造的損傷を誘導することである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＤおよび他のシヌクレイノパシーを治療する潜在的な治療薬を同定する方法であって、前記方法は、（ａ）ＰＤおよび他のシヌクレイノパシーの細胞または動物モデルを複数の候補薬剤と接触させるまたは当該候補薬剤を投与することと、（ｂ）特定の候補薬剤治療モデルにおいて、未処理対照モデルと比較してアルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来ポリペプチドの破壊または形成低下を検出し、それによりＰＤおよび他のシヌクレイノパシーを治療する潜在的な治療薬として前記特定の候補薬剤を同定することと、を含み、前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、ミトコンドリア毒性を有する立体構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ変異体を含む、方法。
【請求項１７】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドがリン酸化Ｓｅｒ１２９を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失の少なくとも一方を有するα−ｓｙｎ変異体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ミトコンドリア毒性は、マイトファジーをもたらす、ミトコンドリアの機能不全および構造的損傷を誘導することである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記潜在的な治療薬は、リン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）凝集体のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介形成を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記潜在的な治療薬は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８または細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）を含むマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介リン酸化を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記潜在的な治療薬は、リン酸化タウ凝集体のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介形成を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記潜在的な治療薬は、α−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介シナプス毒性およびニューロンの樹状突起棘の喪失を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、抗ホスホ−Ｓｅｒ１２９抗体ＧＴＸ５０２２２、ロット８２１５０５１７７と免疫反応性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦ−認識８１Ａおよび抗体ＭＪＦ−Ｒ１３の少なくとも一方と免疫反応性ではない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記潜在的な治療薬を治療活性について検査することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療活性は、シヌクレイノパチーの細胞モデルまたは生物モデルにおける毒性活性の阻害である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療活性は、病原性リン酸化α−ｓｙｎの生成および伝搬の減少である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドがヒトα−ｓｙｎに由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＤおよび他のシヌクレイノパシーを治療する潜在的な治療薬を同定する方法であって、前記方法は、（ａ）ＰＤおよび他のシヌクレイノパシーの細胞もしくは動物モデル、または細胞培養物、動物モデルの脳もしくはＰＤおよびその他のシヌクレイノパチー患者の脳に存在するＰα−ｓｙｎ＊封入体から抽出されたα−ｓｙｎ由来ポリペプチドを、複数の候補薬剤と接触させるか、あるいはそれらに投与することと、（ｂ）未処理の対照モデルと比較して、処理された候補薬剤に特異的なアルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来ポリペプチドへの候補薬剤の結合を検出し、それによりＰＤおよび他のシヌクレイノパシーを治療する潜在的な治療薬として特定の候補薬剤を同定することと、を含み、前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、ミトコンドリア毒性を有する立体構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ変異体を含む、方法。
【請求項３３】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドがリン酸化Ｓｅｒ１２９を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失の少なくとも一方を有するα−ｓｙｎ変異体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ミトコンドリア毒性は、マイトファジーをもたらす、ミトコンドリアの機能不全および構造的損傷を誘導することである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記潜在的な治療薬は、リン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）凝集体のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介形成を阻害する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記潜在的な治療薬は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８または細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）を含むマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介リン酸化を阻害する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記潜在的な治療薬は、リン酸化タウ凝集体のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介形成を阻害する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記潜在的な治療薬は、α−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介シナプス毒性およびニューロンの樹状突起棘の喪失を阻害する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、抗ホスホ−Ｓｅｒ１２９抗体ＧＴＸ５０２２２、ロット８２１５０５１７７と免疫反応性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦ−認識８１Ａおよび抗体ＭＪＦ−Ｒ１３の少なくとも一方と免疫反応性ではない、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記潜在的な治療薬を治療活性について検査することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療活性は、シヌクレイノパチーの細胞モデルまたは生物モデルにおける毒性活性の阻害である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療活性は、病原性リン酸化α−ｓｙｎの生成および伝搬の減少である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドがヒトα−ｓｙｎに由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
ＰＤおよび他のシヌクレイノパシーに罹患した患者の疾患の進行を診断または監視する方法であって、前記方法は、ミトコンドリア毒性を有する立体構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ変異体の存在を検出することおよびその量を定量すること、のうちの少なくとも一方を含む、方法。
【請求項４９】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドがリン酸化Ｓｅｒ１２９を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記α−ｓｙｎ変異体は、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失の少なくとも一方を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ミトコンドリア毒性は、マイトファジーをもたらすミトコンドリアの機能不全および構造的損傷を誘導することである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法は、リン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）凝集体のα−ｓｙｎ変異体媒介形成を検出する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８および細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）のようなマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のα−ｓｙｎ変異体媒介リン酸化を検出する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法は、リン酸化タウ凝集体のα−ｓｙｎ変異体媒介形成を検出する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法は、α−ｓｙｎ変異体媒介シナプス毒性およびニューロンの樹状突起棘の喪失を検出する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記診断または疾患の監視は、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーに罹患した対象から得られた組織または体液試料を用いて行われる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む操作された細胞またはトランスジェニック非ヒト動物であって、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドが、全長α−ｓｙｎタンパク質の、約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失からなる、操作された細胞またはトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５８】
前記操作された細胞は神経細胞である、請求項５７に記載の操作された細胞。
【請求項５９】
前記トランスジェニック非ヒト動物はげっ歯類である、請求項５７に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６０】
アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む操作された細胞またはトランスジェニック非ヒト動物であって、前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドが、全長または切断されたα−ｓｙｎタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸残基における突然変異を有し、前記α−ｓｙｎ変異体は、ミトコンドリア毒性を有する明確かつ非フィブリル性のα−ｓｙｎ立体配座を採用する傾向がある、操作された細胞またはトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６１】
前記操作された細胞は神経細胞である、請求項６０に記載の操作された細胞。
【請求項６２】
前記トランスジェニック非ヒト動物はげっ歯類である、請求項６０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６３】
パーキンソン病（ＰＤ）および他のシヌクレイノパチーの治療に有用な小分子を生成する方法であって、前記方法は、（ａ）アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来のポリペプチドまたは前記ポリペプチドと同一の立体構造エピトープを示すポリマーを含む免疫原組成物の立体構造エピトープに向けた構造に基づく薬物設計を行う工程と、（ｂ）α−ｓｙｎ由来のポリペプチドの立体構造エピトープを特異的に認識する小分子を選択する工程と、を含み、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、ミトコンドリア毒性を有する立体構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ変異体を含む、方法。
【請求項６４】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドがリン酸化Ｓｅｒ１２９を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、抗ホスホ−Ｓｅｒ１２９抗体ＧＴＸ５０２２２、ロット８２１５０５１７７と免疫反応性である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦ−認識８１Ａおよび抗体ＭＪＦ−Ｒ１３の少なくとも一方と免疫反応性ではない、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失の少なくとも一方を有するα−ｓｙｎ変異体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ミトコンドリア毒性は、マイトファジーをもたらすミトコンドリアの機能不全および構造的損傷を誘導することである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記小分子は、リン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）凝集体のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介形成を阻害する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記小分子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８および細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）のようなマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介リン酸化を阻害する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記小分子は、リン酸化タウ凝集体のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介形成を阻害する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記小分子は、α−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介シナプス毒性およびニューロンの樹状突起棘の喪失を阻害する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、細胞培養物、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの動物モデルの脳、またはＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの患者の脳に存在するＰα−ｓｙｎ＊封入体から抽出される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
前記選択された小分子を治療活性について検査することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７５】
前記治療活性は、シヌクレイノパチーの細胞モデルにおける毒性活性の阻害、または病原性リン酸化α−ｓｙｎの生成および伝搬の減少である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリペプチドがヒトα−ｓｙｎに由来する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７７】
前記ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントを含む、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病およびシヌクレイノパチーに関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は、加齢に伴うタンパク質のミスフォールディングによる神経変性疾患（ＰＭＮＤ）で、米国だけでも１００万人以上が罹患している。これは、アルツハイマー病（ＡＤ）に次いで二番目に多い神経変性疾患である。６０歳以上の人口のおおよそ１〜２％および８５歳以上の４〜５％がＰＤに罹患している。ＰＤは安静時振戦、運動緩慢、硬直、歩行障害、姿勢不安定を特徴とする。運動障害は黒質緻密部（ＳＮｐｃ）のドーパミン作動性ニューロンの変性とそれに続く線条体におけるドーパミン神経支配の喪失に起因する。罹患したニューロンは、レビー小体（ＬＢ）として知られる細胞質内封入体を蓄積する。
【０００３】
ＰＤ症例の約８５〜９０％は特発性と考えられる。少なくとも５つの遺伝子、ＳＮＣＡ、ＧＢＡ、ＰＡＲＫ２／Ｐａｒｋｉｎ、ＰＩＮＫ１、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２が遺伝性ＰＤと関連している。ＰＤでＳＮＣＡ遺伝子によりコードされるアルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）は、ＬＢの主要な成分であり、ＰＤの病因において中心的な役割を果たす。α−シヌクレインの細胞内蓄積は、レビー小体型認知症、レビー小体型ＡＤ、多系統萎縮症など、シヌクレイノパチーと呼ばれるいくつかの疾患の特徴でもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、ＰＤおよびシヌクレイノパチーに対する疾患修飾治療は存在していない。本発明は、当技術分野におけるこの必要性および他の満たされていない必要性に対処することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）および他のシヌクレイノパチーの治療に有用な抗体を生成する方法を提供する。同方法は、（ａ）アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来のポリペプチドまたはポリペプチドと同じ立体構造エピトープを示すポリマーを含む免疫原組成物で非ヒト動物を免疫することと、（ｂ）ポリペプチドを特異的に認識する１つ以上の抗体を単離することと、を含む。これらの方法において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、ミトコンドリア毒性（ｍｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する立体構造的に（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ）異なる非フィブリル性（ｎｏｎｆｉｂｒｉｌｌａｒ）のα−ｓｙｎ変異体を含む。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、リン酸化Ｓｅｒ１２９を含む。いくつかの実施形態において、使用されるα−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、抗ホスホ−Ｓｅｒ１２９抗体ＧＴＸ５０２２２、ロット８２１５０５１７７と免疫反応性である。付随的にまたは代替的に、これらの実施形態で使用されるα−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦ−認識８１Ａおよび／または抗体ＭＪＦ−Ｒ１３と免疫反応性ではない。
【０００６】
いくつかの方法において、使用されるα−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および／または約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失を有するα−ｓｙｎ変異体である。いくつかの実施形態において、使用されるα−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、マイトファジーをもたらすミトコンドリアの機能不全および構造的損傷を誘導するミトコンドリア毒性を有する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体はリン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の小凝集体の形成を誘導し、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８および細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）のようなマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体は、リン酸化タウ（ｐｔａｕ）の小凝集体の形成を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体は、シナプス損傷および樹状突起棘の喪失を誘導する。ある実施形態において、α−ｓｙｎ変異体（本明細書ではＰα−ｓｙｎ＊と呼ばれる）は、ＭＫＫ４、ＪＮＫ、ｐＥＲＫ５およびｐ３８を含むいくつかのＭＡＰＫの活性化、ならびにミトコンドリア膜でのタウのリン酸化を誘発する。様々な実施形態において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、細胞培養物、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの動物モデルの脳、またはＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの患者の脳に存在するＰα−ｓｙｎ＊封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）から抽出することができる。いくつかの実施形態において、免疫原組成物はさらにアジュバントを含む。いくつかの方法において、抗体はファージディスプレイによって単離される。いくつかの方法において、単離された抗体は、治療活性についてさらに検査される。例えば、抗体は、シヌクレイノパチーの細胞モデルにおける毒性活性の阻害、または病原性リン酸化α−ｓｙｎの生成および伝搬の減少について検査することができる。いくつかの方法において、ポリペプチド免疫原は、ヒトα−ｓｙｎ、例えば、配列番号１に示されるようなヒトα−ｓｙｎに由来する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド免疫原は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異体によってコードされる。特定の実施形態において、ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む。特定の実施形態において、ヒトα−ｓｙｎは、配列番号１、その変異体またはフラグメントを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーを治療するための潜在的な治療薬を同定する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの細胞または動物モデルを複数の候補薬剤と接触させる、またはそれらに当該候補薬剤を投与することと、（ｂ）特定の候補薬剤処理モデルにおいて未処理対照モデルと比較してアルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来ポリペプチドの破壊または形成低下を検出することと、を含む。代替的に、（ｂ）は、未処理の対照モデルと比較して処理された候補薬剤に特異的なアルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来ポリペプチドへの候補薬剤の結合を検出することを含み得る。これらの方法において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、ミトコンドリア毒性を有する立体構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ変異体を含む。これらの方法のいくつかにおいて、使用されるα−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、リン酸化Ｓｅｒ１２９を含む。これらの方法のいくつかにおいて、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および／または約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失を有するα−ｓｙｎ変異体である。いくつかの実施形態において、使用されるα−ｓｙｎ変異体のミトコンドリア毒性は、マイトファジーをもたらすミトコンドリアの機能不全および構造的損傷を誘導することである。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体はリン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の小凝集体の形成を誘導し、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８および細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）のようなマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体は、リン酸化タウ（ｐｔａｕ）の小凝集体の形成を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体は、シナプス損傷および樹状突起棘の喪失を誘導する。ある実施形態において、α−ｓｙｎ変異体（本明細書ではＰα−ｓｙｎ＊と呼ばれる）は、ＭＫＫ４、ＪＮＫ、ｐＥＲＫ５およびｐ３８を含むいくつかのＭＡＰＫの活性化、ならびにミトコンドリア膜でのタウのリン酸化を誘発する。いくつかの方法において、使用されるα−ｓｙｎ変異体ポリペプチドは、ヒトα−ｓｙｎ、例えば、配列番号１に示されるようなヒトα−ｓｙｎに由来する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド免疫原は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異体によってコードされる。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーに罹患した患者における疾患の進行を診断または監視する方法を提供する。これらの方法は、患者において、ミトコンドリア毒性を有する立体構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ変異体の存在を検出および／またはその量を定量することを伴う。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体はリン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の小凝集体の形成を誘導し、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８および細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）のようなマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体は、リン酸化タウ（ｐｔａｕ）の小凝集体の形成を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体は、シナプス損傷および樹状突起棘の喪失を誘導する。ある実施形態において、α−ｓｙｎ変異体（本明細書ではＰα−ｓｙｎ＊と呼ばれる）は、ＭＫＫ４、ＪＮＫ、ｐＥＲＫ５およびｐ３８を含むいくつかのＭＡＰＫの活性化、ならびにミトコンドリア膜でのタウのリン酸化を誘発する。いくつかの実施形態において、使用されるα−ｓｙｎ変異体は、リン酸化Ｓｅｒ１２９を含む。いくつかの実施形態において、使用されるα−ｓｙｎ変異体は、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して、約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および／または約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態において、使用されるα−ｓｙｎ変異体のミトコンドリア毒性は、マイトファジーをもたらすミトコンドリアの機能不全および構造的損傷を誘導することである。いくつかの実施形態において、診断または疾患の監視は、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーに罹患した対象から得られた組織または体液試料を用いて行われる。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来のポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む操作された細胞（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ）またはトランスジェニック非ヒト動物を提供する。α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、全長α−ｓｙｎタンパク質の約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は神経細胞である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物はげっ歯類である。
【００１０】
別の態様において、本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）および他のシヌクレイノパチーの治療に有用な小分子を生成する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）由来のポリペプチドまたは該ポリペプチドと同じ立体構造エピトープを示すポリマーを含む免疫原組成物の立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）に向けた構造ベースの薬物設計を行うことと、（ｂ）α−ｓｙｎ由来ポリペプチドの立体構造エピトープを特異的に認識する小分子を選択することと、を含む。これらの方法において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、ミトコンドリア毒性を有する立体構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ変異体を含有する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、リン酸化Ｓｅｒ１２９を含む。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、抗ホスホ−Ｓｅｒ１２９抗体ＧＴＸ５０２２２、ロット８２１５０５１７７と免疫反応性である。付随的にまたは代替的に、使用されるα−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦ−認識８１Ａおよび／または抗体ＭＪＦ−Ｒ１３と免疫反応性ではない。いくつかの実施形態において、使用されるα−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、全長α−ｓｙｎタンパク質に対して約０〜２５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失および／または約０〜２５個のＣ末端アミノ酸残基の欠失を有するα−ｓｙｎ変異体である。いくつかの方法において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドのミトコンドリア毒性は、マイトファジーをもたらすミトコンドリアの機能不全および構造的損傷を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体はリン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の小凝集体の形成を誘導し、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８および細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）のようなマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体は、リン酸化タウ（ｐｔａｕ）の小凝集体の形成を誘導する。いくつかの実施形態において、α−ｓｙｎ変異体は、シナプス損傷および樹状突起棘の喪失を誘導する。ある実施形態において、α−ｓｙｎ変異体（本明細書ではＰα−ｓｙｎ＊と呼ばれる）は、ＭＫＫ４、ＪＮＫ、ｐＥＲＫ５およびｐ３８を含むいくつかのＭＡＰＫの活性化、ならびにミトコンドリア膜でのタウのリン酸化を誘発する。様々な実施形態において、α−ｓｙｎ由来ポリペプチドは、細胞培養物、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの動物モデルの脳、またはＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの患者の脳に存在するＰα−ｓｙｎ＊封入体から抽出することができる。いくつかの実施形態において、方法は、治療活性、例えば、シヌクレイノパチーの細胞モデルにおける毒性活性の阻害、または病原性リン酸化α−ｓｙｎの生成および伝搬の減少について、選択された小分子を検査することをさらに含む。いくつかの実施形態において、使用されるα−ｓｙｎ変異体は、ヒトα−ｓｙｎ、例えば、配列番号１に示されるようなヒトα���ｓｙｎに由来する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド免疫原は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異体によってコードされる。
【００１１】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによって実現され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＰＦＦ処理ニューロンにおける非フィブリル性リン酸化α−ｓｙｎコンフォーマ（Ｐα−ｓｙｎ＊）の出現の経時変化。初代海馬マウスニューロンをＤＩＶ７で予め形成されたフィブリル（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ）（ＰＦＦｓ）に曝露し、２日目から１４日目までの様々な時点でＩＣＣにより検査した。ＰＢＳのみで同様に処理した細胞を対照とする。写真は、それぞれＰα−ｓｙｎ＊またはＰα−ｓｙｎＦを認識するＰα−ｓｙｎ抗体による標識、および核を示すＤＡＰＩ染色であり、これらはマージ画像（ｍｅｒｇｅｄ  ｉｍａｇｅ）においてそれぞれ緑、赤および青に色分けされている。ＰＢＳ対照由来のニューロンも同様に標識し、マージ画像を示した。我々の実験条件では対照細胞ではＰα−ｓｙｎは観察されなかった。スケールバー＝１０μｍ。
【図２】ＰＦＦ注入マウスの脳およびＰＤ患者の脳におけるＰα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊の両方の検出。上部パネル：ＰＦＦを播種したマウスの海馬または皮質の初代ニューロンでは、Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊封入体の両方が形成されている。中央パネル：線条体にＰＦＦを定位的に注入したマウスでは、皮質および黒質にＰα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊の両方の封入体が形成されており、形態と細胞内局在は細胞培養物と同一である。下部パネル：Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊封入体の両方がＰＤを伴いＬＢを抱える３人の患者の皮質で観察された（表１、上部パネル：症例ＩＤ１０−８９；中央パネル：症例ＩＤ１２−６９、下部パネル：症例ＩＤ１１−５１）。また、Ｐα−ｓｙｎ＊は、検討を行った、「高ＬＢ」１例を除くすべての症例と、「低ＬＢ」２例でも観察された。ＬＢを囲む点状（ｐｕｎｃｔａ）のＰα−ｓｙｎ＊に留意されたい。ＬＢはＰα−ｓｙｎＦ特異的抗体を用いて検出する。Ｐα−ｓｙｎＦ、Ｐα−ｓｙｎ＊およびＤＡＰＩの標識は、マージ画像において、それぞれ緑、赤、青に色分けされている。スケールバー＝２０μｍ。
【図３】Ｐα−ｓｙｎ＊は、Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルの部分的分解に起因する。（Ａ−Ｄ）薄いＰα−ｓｙｎＦフィブリルは、フィブリルコア全体でパッチ状にＰα−ｓｙｎ＊への変換を受け、Ｐα−ｓｙｎＦコアの進行性消失と、顆粒状および蛇行状のＰα−ｓｙｎ＊構造の放出をもたらす。（Ｃ）Ｐα−ｓｙｎ＊「ビーズ」（矢印）。（Ｄ）Ｐα−ｓｙｎＦコアは完全に消失し、Ｐα−ｓｙｎ＊のリボンが残る。（Ｅ−Ｇ）絡み合った太いＰα−ｓｙｎＦフィブリルの分解：一方の鎖がまず分解され、残った鎖を取り囲んでいる顆粒状のＰα−ｓｙｎ＊が放出される。（Ｈ）太くまっすぐなＰα−ｓｙｎＦフィブリルは、一端からＰα−ｓｙｎ＊に変換される。高倍率画像の中央パネルは、フィブリルコアにおける劣化した最先端（ｆｒｏｎｔ）を示す。細胞を、Ｐα−ｓｙｎＦ、Ｐα−ｓｙｎ＊またはｐ６２抗体で標識し、マージ画像において緑、赤および青として色分けした。ｐ６２の標識はＰα−ｓｙｎＦに厳密に限定されており、Ｐα−ｓｙｎＦはオートファジーを受けるが、Ｐα−ｓｙｎ＊はオートファジー過程の産物のようであることを示していることに注意されたい。（Ｉ）ウエスタンブロットは、左側のスキームに示したエピトープを認識するα−ｓｙｎのＮ末端、中央領域およびＣ末端に向けられた抗体を用いた全α−ｓｙｎの検出、ならびにＰα−ｓｙｎ＊特異的抗体（右側のスキームに示されたエピトープ）を用いたＰα−ｓｙｎ＊の検出を示す。赤色矢印で示したＰα−ｓｙｎ＊は１２．５ｋＤａで移動し、ＰＦＦ処理ニューロンに特異的に存在する。Ｐα−ｓｙｎ＊ダイマーも２５ｋＤａで検出され、ＰＦＦ処理ニューロンに特異的である。Ｐα−ｓｙｎ＊は可溶性細胞画分（ＴＸ−１００抽出）と不溶性細胞画分（ＳＤＳ抽出）の両方に存在する。ユビキチン化されたＰα−ｓｙｎ＊に対応するかすかなバンドは、Ｐα−ｓｙｎ＊抗体により１３ｋＤａで検出可能であり、成熟したＰα−ｓｙｎ＊凝集体はユビキチン化されていないので、Ｐα−ｓｙｎＦに結合した未熟なＰα−ｓｙｎ＊に対応すると思われる。Ｐα−ｓｙｎ＊は、マッピング目的で使用されるＮ末端、中央ドメイン、およびＣ末端の全α−ｓｙｎ抗体を使用しても検出可能である。Ｐα−ｓｙｎＦは、特異的Ｐα−ｓｙｎＦ抗体（右側のスキームで示されたエピトープ）によって、前述のように全長タンパク質に対応する１５ｋＤａおよびユビキチン化形態（緑の矢印）に対応する１７ｋＤａで検出される。スケールバー＝５μｍ。
【図４】Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊とオートファゴリソソーム（ａｕｔｏｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ）経路のマーカーとの関連は、Ｐα−ｓｙｎ＊がＰα−ｓｙｎＦのオートファジー産物であることを示す。（Ａ）Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルはユビキチンで完全に覆われており、分解の標識となる（図１６の共局在化分析も参照）。（Ｂ）Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルはアダプタータンパク質ｐ６２で標識され、オートファジーによる分解の標的となる。矢印は、ｐ６２で標識されたＰα−ｓｙｎＦフィブリルと直接接触した新生Ｐα−ｓｙｎ＊封入体を示す。（Ｃ）ＬＣ３はＰα−ｓｙｎＦフィブリルを覆う。矢印は、ＬＣ３で標識されたＰα−ｓｙｎＦフィブリルと直接接触した新生Ｐα−ｓｙｎ＊封入体を示す。（Ｄ）Ｐα−ｓｙｎ＊封入体はＬＡＭＰ１陽性小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）に含まれる。細胞をユビキチン、ｐ６２、ＬＣ３、ＬＡＭＰ１およびＰα−ｓｙｎ＊抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像において緑、赤および青として色分けした。スケールバー＝１０μｍ。
【図５】Ｐα−ｓｙｎ＊は、オートファゴリソソームおよびリソソーム中に見出される。（Ａ−Ｃ）Ｐα−ｓｙｎＦ凝集体は、細胞内にフィブリルが見られる前の２〜３日目にＬＡＭＰ１小胞（オートファゴリソソームまたはリソソーム）に取り込まれる；ＢとＣには小さな点状のＰα−ｓｙｎ＊が見られる。（Ｄ−Ｆ）Ｐα−ｓｙｎＦの短いプロトフィブリルがＬＡＭＰ１小胞に取り込まれている。（Ｇ）図３（Ａ−Ｄ）に示すように、細いＰα−ｓｙｎＦ線維（ｆｉｂｅｒ）がコア内で分解され、ユビキチンとＬＡＭＰ１染色の重複をもたらす（矢印）。コアから外れたＰα−ｓｙｎ＊はユビキチン標識されていない（矢じり）（Ｈ）厚いＰα−ｓｙｎＦ繊維がＰα−ｓｙｎ＊を放出している；フィブリルコアのユビキチン染色とＰα−ｓｙｎ＊標識の間には重複はない。矢じり（ａｒｒｏｗｈｅａｄ）は、リソソームの存在と一致するフィブリルのくぼみを示している。（Ｉ−Ｋ）Ｐα−ｓｙｎ＊がリソソームから出るのが見える（矢印は破壊されたリソソームから出てくるＰα−ｓｙｎ＊凝集体を示す）。（Ｌ）Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＤＮＤ−９９に陽性で、ＬＡＭＰ１で弱く標識された伸長小胞は、鎖状に組織化されたＰα−ｓｙｎ＊封入体を含み、フィブリルを分解するオートファゴリソソームである可能性が高い（図５Ｌ、左挿入図の矢じり）。一方、ＬＡＭＰ１陽性Ｐα−ｓｙｎ＊含有小胞（図５Ｌの右挿入図の矢印）では、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＤＮＤ−９９染色は存在せず、これらのオルガネラの酸性内部環境の欠如を示した。対照的に、近くの大部分のＬＡＭＰ１陽性、Ｐα−ｓｙｎ＊陰性小胞は、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＤＮＤ−９９に対して強いシグナルを示す。細胞を、Ｐα−ｓｙｎＦおよびユビキチン抗体またはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＤＮＤ−９９、Ｐα−ｓｙｎ＊およびＬＡＭＰ１抗体またはＤＡＰＩで標識し、マージ画像において緑、赤、青およびターコイズとして色分けした。スケールバー＝５μｍ（Ａ−Ｃ、Ｄ−Ｆ、Ｉ−Ｋ）、１０μｍ（Ｇ、Ｈ、Ｌ）。
【図６】オートファジーの変調（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）はＰα−ｓｙｎ＊の生成を変化させる。（Ａ−Ｄ）ニューロンをＰＦＦ曝露後３．５日からＰＦＦ曝露後６日まで、示されたように、ビヒクル（Ａ）、ラパマイシン（Ｂ）、クロロキン（Ｃ）または３−ＭＡ（Ｄ）で処理した。（Ｂ）の多数の大きなＰα−ｓｙｎ＊凝集体に留意されたい。（Ｃ）画像の右側のニューロン（右ズーム領域）はＰα−ｓｙｎ＊凝集をほとんど示さず、画像の左側のニューロン（左ズーム領域）はＰα−ｓｙｎ＊凝集を示すが、Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルはみられない。（Ｄ）３−ＭＡでの処理により、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体が減少した。（Ｅ）細胞あたりの、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体の数を、各培養物の２００細胞で盲検法にて計数した。グラフは、各培養条件下で、少数（１〜１０）から多数（７１〜８０）の凝集体を有する細胞の数を示す。細胞を、Ｐα−ｓｙｎＦ、Ｐα−ｓｙｎ＊およびＬＡＭＰ１抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像において緑、赤、青およびターコイズとして色分けした。画像は、個々のニューロンに存在する小胞の総数を捉えるために、６つの共焦点画像のＺスタックである。スケールバー＝１０μｍ。
【図７】Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリアおよびフラグメント化したミトコンドリアに局在する。（Ａ）未熟な蛇行性Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリアの近傍に存在するが、ミトコンドリアとは共局在しない（Ｔｏｍ２０で標識されている）。（Ｂ，Ｃ）顆粒状Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリア細管（ｔｕｂｕｌｅｓ）に結合する。（Ｄ−Ｇ）ミトコンドリア細管に付着したＰα−ｓｙｎ＊凝集体のＳＴＥＤナノスコピックイメージング（Ｄ，Ｅ、Ｆ）。（Ｆ）において、矢印は、ミトコンドリア細管または環状構造に結合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）小さなＰα−ｓｙｎ＊凝集体を指す。（Ｇ）大きなＰα−ｓｙｎ＊凝集体は、フラグメント化したミトコンドリアに結合している。細胞を、Ｔｏｍ２０抗体およびＰα−ｓｙｎ＊で標識し、マージ画像において緑および赤としてそれぞれ色分けした。スケールバー＝５μｍ（Ａ−Ｃ）、１μｍ（Ｄ−Ｇ）。
【図８】Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリア膜電位の喪失を誘導する。（Ａ）ＰＢＳ処理した細胞におけるＴｏｍ２０およびＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓ標識は、管の末端まで重なっている（矢じり）。（Ｂ）Ｐα−ｓｙｎ＊標識はミトコンドリア細管の末端でＴｏｍ２０と共局在するが、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓは破壊されてボイド領域（矢印）を示す。細胞を、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓ、Ｐα−ｓｙｎ＊およびＴｏｍ２０抗体で標識し、マージ画像においてそれぞれ緑、赤および青として色分けした。スケールバー＝１μｍ。
【図９】Ｐα−ｓｙｎ＊はシトクロムＣおよびｐＡＣＣ１と共局在し、ミトコンドリア−ＭＡＭ係留の領域に見出される。（Ａ）Ｐα−ｓｙｎ＊のミトコンドリアとの接触点は、シトクロムＣ密度が上昇した領域に相当する（挿入図内の矢印）。（Ｂ）Ｐα−ｓｙｎ＊の強い共局在化が、Ｐα−ｓｙｎ＊封入体と一部のｐＡＣＣ１顆粒と完全に重複するｐＡＣＣ１で観察される（挿入図内の矢印）。（Ｃ）Ｐα−ｓｙｎ＊はまたＢｉＰとも共局在し、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体がミトコンドリア外膜とミトコンドリア関連ＥＲ膜の間の界面に位置することを示している（ＭＡＭ、挿入図内の矢印）。（Ｄ）損傷ミトコンドリアにおけるＰα−ｓｙｎ＊蓄積部位へのｐＡＣＣ１の動員。ＰＡＣＣ１、Ｐα−ｓｙｎ＊、シトクロムＣの標識は共局在し、Ｐα−ｓｙｎ＊とｐＡＣＣ１の標識は完全に重なる（挿入図内の矢印）。（Ａ−Ｃ）細胞をシトクロムＣ、ｐＡＣＣ１、ＢｉＰおよびＰα−ｓｙｎ＊抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像において緑、赤および青として色分けした。（Ｄ）細胞を、シトクロムＣ、Ｐα−ｓｙｎ＊、ｐＡＣＣ１抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像において緑、赤、青およびターコイズとして色分けした。（Ｅ）外側ミトコンドリア膜（Ｔｏｍ２０）、ミトコンドリア膜の完全性の喪失（シトクロムＣ）、ＭＡＭｓ（ＢｉＰ）およびｐＡＣＣ１のマーカーとのＰα−ｓｙｎ＊凝集体のマンダース相関係数を示すグラフ。Ｍａｎｄｅｒｓの共局在係数は、１５〜２０ニューロンで記録した免疫蛍光強度を用いて計算した。統計的有意性の要点：ｎｓ：有意でない；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００５；＊＊＊＊：ｐ＜０．００１。スケールバー＝１０μｍ。
【図１０】Ｐα−ｓｙｎ＊はマイトファジーを誘発する。（Ａ）ミトコンドリアネットワークフラグメンテーションの領域におけるＬＡＭＰ１陽性マイトファジー小胞はＰα−ｓｙｎ＊と小さなＴｏｍ２０のレムナントを含む（矢印）。矢じりはＴｏｍ２０と共局在する大きなＰα−ｓｙｎ＊凝集体を示す。（Ｂ）ＭＡＭでマイトファジーを制御するＥ３−ユビキチンリガーゼであるパーキン（Ｐａｒｋｉｎ）は、ＬＡＭＰ１陽性マイトファジー小胞を含むＰα−ｓｙｎ＊と共局在する（矢印）。細胞を、Ｔｏｍ２０、Ｐａｒｋｉｎ，Ｐα−ｓｙｎ＊およびＬＡＭＰ１抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像において緑、赤、青およびターコイズとして色分けした。スケールバー＝１０μｍ。（Ｃ）Ｐα−ｓｙｎ＊を担持するマイトファジー液胞（ｍｉｔｏｐｈａｇｉｃ  ｖａｃｕｏｌｅｓ）の電子顕微鏡写真。ＰＦＦ曝露後１４日のニューロンを、Ｐα−ｓｙｎ＊（赤）とシトクロムＣ（緑）のＩＦと超微細構造解析のＥＭで検査し、画像を重ね合わせた。すべてのＰα−ｓｙｎ＊凝集体は、ミトコンドリア残屑（ｄｅｂｒｉｓ）に相当すると思われる小さな電子密度の封入体も含むマイトファジー液胞で見られた。これらのマイトファジー液胞は、直接隣接するシトクロムＣ陽性のフラグメント化ミトコンドリアであった。領域ＡおよびＢは拡大画像のために選択され、２つの隣接するＥＭセクションが示される（カラーオーバーレイ（ｃｏｌｏｒ  ｏｖｅｒｌａｙ）がある場合とない場合のＡ１−Ａ２およびＢ１−Ｂ２）。スケールバー＝５μｍ。
【図１１】Ｐα−ｓｙｎ＊のライフサイクル。（Ａ）ＰＦＦを播種したニューロンでは、内因性のα−ｓｙｎがＰα−ｓｙｎＦのコンホメーションでミスフォールドし凝集する（緑色で描かれる）。（Ｂ）Ｐα−ｓｙｎＦは絡み合ったフィブリルを形成する。（Ｃ）Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルはオートファジー分解を受ける（図３および図４を参照）。しかしながらこの過程は不完全であり、異なる立体構造を有するＰα−ｓｙｎ種、Ｐα−ｓｙｎ＊（赤で描かれる）が生成する。（Ｄ）Ｐα−ｓｙｎ＊含有リソソームは、Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルコアまたはフィブリル表面上に見られる（図３および５）。オートファゴリソソーム／リソソームは青色で表示されている。（Ｅ）Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体はリソソームを出て（図５）、ミトコンドリアに局在する（図７）。Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体は、Ｐａｒｋｉｎ依存性ミトコンドリア分裂およびマイトファジーの部位であるＭＡＭと共局在する。それらはミトコンドリア膜脱分極、シトクロムＣ放出、酸化的およびエネルギー的ストレス、ｐＡＣＣ凝集体の形成、ミトコンドリアフラグメント化およびマイトファジーを誘導する（図７〜図１０）。
【図１２】Ｐα−ｓｙｎ＊とｐＴａｕとの共局在化。ＰＦＦ／ＰＢＳ曝露後８日目のニューロンを固定し、Ｐαｓｙｎ＊およびｐＴａｕ（Ｔａｕ  ｐＳ２０２−Ｔ２０５に特異的な抗体クローンＡＴ８）について標識した。矢印は、Ｐαｓｙｎ＊とｐＴａｕシグナルの重なりを示す。矢じりは、中央に小さな重複領域を有するＰαｓｙｎ＊封入体と並置されたｐＴａｕ封入体を示す。
【図１３】アルファ−ｓｙｎモノマーは、Ｐα−ｓｙｎ＊およびＰα−ｓｙｎＦ凝集体をシードしない。初代海馬マウスニューロンをＤＩＶ７でα−シヌクレインモノマーに曝露し、６日目と１４日目の２時点でＩＣＣ検査のために固定した。ＰＢＳのみで同様に処理した細胞を対照とする。写真は、それぞれＰα−ｓｙｎ＊またはＰα−ｓｙｎＦを認識するＰα−ｓｙｎ抗体による標識、および核を示すＤＡＰＩ染色を示す。ＰＢＳ対照に対応するニューロンも同様に標識したが、マージ画像のみを示した。我々の実験条件ではα−シヌクレインモノマー処理ニューロンまたはＰＢＳ処理細胞のいずれでもＰα−ｓｙｎは観察されなかった。スケールバー＝１０μｍ。
【図１４】Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊はニューロン細胞でのみ検出される。ＰＦＦを播種したマウスの海馬または皮質初代ニューロンでは、Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊封入体の両方が形成される。（Ａ−Ｂ）ＰＦＦ播種後７日目に細胞を固定し、ＮｅｕＮおよびＰα−ｓｙｎ＊抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像に示されるように緑、赤および青で色分けした。ＮｅｕＮは神経細胞のマーカーである。Ｐα−ｓｙｎ＊標識はＮｅｕＮ陽性細胞に限定されており、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体はニューロンでのみ形成されることを示していることに注目されたい。（Ｃ）ＰＦＦ播種後７日目に海馬ニューロンを固定し、ＧＦＡＰおよびＰα−ｓｙｎＦ抗体とＤＡＰＩで標識し、マージ画像において緑、赤および青に色分けした。ＧＦＡＰは、星状細胞のマーカーとして使用される。星状細胞にはＰα−ｓｙｎＦ標識がないことに注目されたい。スケールバー＝５０μｍ。
【図１５】Ｐα−ｓｙｎ凝集体は、ＰＦＦを注入したマウスの脳の皮質および黒質に見られる。線条体にＰＦＦを定位的に注入した成体マウスは、皮質と黒質にＰα−ｓｙｎＦとＰα−ｓｙｎ＊の両方の封入体を形成する。（Ａ）ＰＦＦ播種の３０日後にマウスを安楽死させ、脳を固定し、免疫組織化学のために処理し、いくつかの脳切片を、Ｐα−ｓｙｎＦおよびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像に示されるように、緑、赤および青として色分けした。ＴＨは、黒質のドーパミン作動性ニューロンを標識する。Ｐα−ｓｙｎＦ標識は主にＴＨ陽性細胞（矢印）で観察されることに注目されたい。（Ｂ）ＰＦＦを注入したマウス脳切片をＡと同様に処理し、Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像に示されるように、緑、赤および青に色分けした。Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊標識は、大脳皮質のニューロンで観察されることに注目されたい（矢印）。脳スキームの淡赤色の四角形（マージ画像を参照）は、示されている脳の領域を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図１６】２０ＳプロテアソームとＰα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊との関連、およびＰα−ｓｙｎＦ／Ｐα−ｓｙｎ＊とタンパク質分解プロセシングのマーカーとの間の定量的共局在の研究。ＰＦＦｓ播種後１４日目にマウス海馬初代ニューロンを固定し、２０Ｓプロテアソーム、Ｐα−ｓｙｎ＊およびＰα−ｓｙｎＦ抗体、ならびにＤＡＰＩで標識し、マージ画像に示されるように、緑、赤、青およびターコイズとして色分けした。（Ａ）高負荷のＰα−ｓｙｎＦ（Ｃに示したＰα−ｓｙｎＦ標識）を担持するニューロンでは、２０Ｓプロテアソームがα−ｓｙｎ＊と共局在することはまれで、部分的にしかみられない（矢印）。（Ｂ）低負荷のＰα−ｓｙｎＦ（Ｄに示したＰα−ｓｙｎＦ標識）を担持するニューロンでは、２０Ｓプロテアソームのα−ｓｙｎ＊との共局在が頻繁に観察される（矢印）。しかしながら、低Ｐα−ｓｙｎＦ負荷細胞は高Ｐα−ｓｙｎＦ負荷細胞よりも豊富ではなかった。（Ｃ、Ｄ）写真は、（Ａ）および（Ｂ）と同じであるが、Ｐα−ｓｙｎＦ標識が追加されている。（Ｄ）において、矢印は、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体を有するものとは異なる別の神経細胞に属する神経プロセス（おそらく軸索）を示している。スケールバー＝１０μｍ。（Ｅ）Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊凝集体とタンパク質分解マーカーとのマンダース相関係数を示すグラフ。Ｐα−ｓｙｎＦはオートファジーのマーカーと密接に関連しているが、Ｐα−ｓｙｎ＊の約８０％はＬＡＭＰ１と関連している。Ｐα−ｓｙｎＦとＰα−ｓｙｎ＊はいずれも２０Ｓプロテアソームと関連しており、両タイプのＰα−ｓｙｎ凝集体の分解にプロテアソームが関与していることを示している。注：ＬＣ３抗体は週の（ｗｅｅｋ）シグナルが得られたため、検出されたＰα−ｓｙｎＦ染色とＬＣ３に対するマンダース相関係数は過小評価と考えられる。
【図１７】Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリア細管に結合している。ミトコンドリア細管の末端に結合したＰα−ｓｙｎ＊のＺ−スタック画像。Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体は、ミトコンドリア末端からぶら下がっているようである。ミトコンドリア末端でのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓ標識の破壊は、Ｐα−ｓｙｎ＊近傍でのミトコンドリア膜電位の局所的消失を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１８】Ｐα−ｓｙｎ＊は、ミトコンドリア関連ＥＲ膜（ＭＡＭ）におけるミトコンドリアおよび細胞ストレスマーカーと共局在するが、初期エンドソームまたはペルオキシソームとは共局在しない。（Ａ）Ｔｏｍ２０、Ｐα−ｓｙｎ＊、およびＢｉＰは共局在しており、ミトコンドリア外膜およびＭＡＭの間の接触点にてＰα−ｓｙｎ＊凝集体が存在していることを示している。（Ｂ，Ｃ）ペルオキシソームとの共局在化の欠如。（Ｂ）Ｐα−ｓｙｎ＊がミトコンドリア外膜タンパク質Ｔｏｍ２０と共局在することは、Ｐα−ｓｙｎ＊がミトコンドリアと直接接触していることを示している。対照的に、カタラーゼはＰα−ｓｙｎ＊とは共局在しないが、Ｔｏｍ２０とはある程度共局在していることが観察される。矢印は、ミトコンドリアのネットワークおよびＰα−ｓｙｎ＊管状構造の間の接触領域を示す。（Ｃ）Ｐα−ｓｙｎ＊はＢｉＰと共局在し、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体がミトコンドリア関連ＥＲ膜（ＭＡＭｓ、矢印）の界面に位置していることを示している。しかしながら、カタラーゼはＰα−ｓｙｎ＊とは共局在しない。顕著な量のカタラーゼとＰα−ｓｙｎ＊陽性構造を発現している細胞においてさえ、両方のタンパク質の間の並置領域のみが観察される（矢じり）。（Ｄ）初期エンドソームとの共局在の欠如。マウス海馬初代ニューロンにＰＦＦを播種し、７日目に固定し、ＥＥＡ１およびＰα−ｓｙｎ＊抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像に示されるように、緑、赤および青に色分けした。ＰＢＳ対照由来のニューロンも同様に標識したが、マージ画像のみを示した。ＥＥＡ１は、初期エンドソームの十分に確立されたマーカーであるために選択した。Ｐα−ｓｙｎ＊を担持するニューロンの内部に多数のＥＥＡ１陽性小胞が存在するにもかかわらず、これら２つのタンパク質の間には共局在は存在しない。マウス海馬初代ニューロンにＰＦＦを播種し、７日目に固定した。それらは、Ｔｏｍ２０、ＢｉＰ／カタラーゼおよびＰα−ｓｙｎ＊抗体およびＤＡＰＩで標識され、マージ画像において緑、青、赤およびターコイズとして色分けされ（Ａ、Ｂ）、ＢｉＰ、カタラーゼ、Ｐα−ｓｙｎ＊抗体およびＤＡＰＩで標識され、マージ画像において緑、青、赤およびターコイズとして色分けされ（Ｃ）、またはＥＥＡ１、Ｐα−ｓｙｎ＊抗体およびＤＡＰＩで標識され、マージ画像において緑、赤および青として色分けされた（Ｄ）。倍率バー＝１０μｍ。
【図１９】ｐＪＮＫはＰα−ｓｙｎ＊と共局在するが、Ｐα−ｓｙｎＦとは共局在しない。ｐＪＮＫ陽性封入体は、Ｐα−ｓｙｎ＊封入体と完全に一致する。染色の強度は変化する可能性があり、マージ画像においては、緑または赤が優勢な封入体が見られることがある。一方、Ｐα−ｓｙｎＦ抗体は、ｐＪＮＫ標識を除外したフィブリル構造を標識した。挿入図（ｉｎｓｅｔ）Ａ１およびＢ１では、Ｐα−ｓｙｎＦの部分的消化によるＰα−ｓｙｎ＊の形成に対応して、Ｐα−ｓｙｎＦ標識におけるいくつかのインデント（ｉｎｄｅｎｔｓ）が見られる（グラッシー（Ｇｒａｓｓｉ）他、２０１８年）。写真は、Ｐα−ｓｙｎ＊、ｐＪＮＫおよびＰα−ｓｙｎＦの標識をそれぞれ緑、赤、青で示す。スケールバー＝５μｍ。
【図２０】Ｐ−αｓｙｎ＊はＭＡＰＫ経路の活性化を誘導する。図２０Ａ：ｐＪＮＫ陽性封入体は、Ｔ２６１でリン酸化されたＭＫＫ４（活性化ＭＫＫ４）と共局在する。図２０Ｂ：Ｓ８０でリン酸化されたＭＫＫ４（不活性ＭＫＫ４）に対応するドットはほとんど検出されないが、ｐＭＫＫ４（Ｔ８０）陽性ドットはｐＪＮＫ陽性封入体と共局在する。図２０Ｃ−２１Ｄ：ｐｐ３８およびｐＥＲＫ５の標識は、ｐＪＮＫ陽性封入体と大部分で重複する。図２０Ｅでは、ｐＧＳＫ３β陽性ドットは、ｐＪＮＫ陽性封入体に近接して検出され、重複はないか、または部分的な重複のみである。細胞を、リン酸化部位特異的ｐＭＫＫ４、ｐＧＳＫ３β、ｐｐ３８またはｐＥＲＫ５、ならびにｐＪＮＫ抗体およびＤＡＰＩで標識し、マージ画像においてそれぞれ緑、赤および青として色分けした。スケールバー＝１０μｍ。
【図２１】Ｐ−αｓｙｎ＊凝集体は、ｐｔａｕ凝集体と共局在する。図２１Ａ：ｐＪＮＫはＰα−ｓｙｎ＊封入体に局在化する。図２２Ｂ−２２Ｃ：ｐＴａｕ陽性封入体は、ｐＪＮＫ陽性封入体と並置または共局在していた。これは、ｐＳ１９９（図２１Ｂ）またはｐＳ２０２／Ｔ２０５（図２１Ｃ）のいずれかを標的とする、使用された両方のｐｔａｕ抗体で見出された。図２１Ｄ：Ｐα−ｓｙｎ＊およびｐＪＮＫの共局在化を示す三重標識、ｐｔａｕ封入体は共局在化されているか、または直接並置されている（ｊｕｘｔａｐｏｓｅｄ）。図２１Ａ−２１Ｄ：細胞を、リン酸化部位特異的なｐｔａｕまたはＰα−ｓｙｎ＊、およびｐＪＮＫ抗体ならびにＤＡＰＩ染色で標識し、マージ画像においてそれぞれ緑、赤および青として色分けした。スケールバー＝１０μｍ。
【図２２】ｐＪＮＫはミトコンドリア膜でＰα−ｓｙｎ＊と共局在する。Ａ−Ｂ：Ｐα−ｓｙｎＦ線維ではなく、ｐＪＮＫ陽性封入体は、Ｔｏｍ２０と共局在し、ミトコンドリア膜とのそれらの関連を示す。Ｃ−Ｅ：ｐＪＮＫ陽性Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体は、Ｔｏｍ２０と共局在化する。写真は、フラグメント化されたミトコンドリアネットワークに関連付けられた、豊富なＰα−ｓｙｎ＊凝集体を含む細胞を示す。写真は、Ｔｏｍ２０、ｐＪＮＫ、Ｐα−ｓｙｎＦ、またはＰα−ｓｙｎ＊、および核のＤＡＰＩ染色の標識をそれぞれ緑、赤、青で示す。スケールバー＝５μｍ。
【図２３】ｐＴａｕは、ミトコンドリア損傷領域においてｐＪＮＫ陽性Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体と共局在する。図２３Ａ：Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓ染色は、ｐＪＮＫ陽性封入体のミトコンドリア付着部位には存在しない。矢印は、中断されたＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓ染色を有するＴｏｍ２０陽性領域を示す。図２３Ｂ：ｐＪＮＫ陽性封入体は、ミトコンドリア膜で、ｐＡＣＣ１およびシトクロムＣと共局在する。図２３Ｃ：ｐＪＮＫ陽性封入体はＢｉＰおよびＴｏｍ２０と共局在し、ミトコンドリア関連ＥＲ膜へのそれらの局在を示す（ＭＡＭ、矢印）。図２３Ｄ：ｐＪＮＫ陽性封入体およびｐｔａｕの共局在化は、損傷したミトコンドリア（矢印）を示すシトクロムＣ蓄積領域で起こる。写真は、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓ／ｐＡＣＣ１／ＢｉＰ／ｐｔａｕ、ｐＪＮＫ、Ｔｏｍ２０／シトクロムＣの標識および核ＤＡＰＩ染色をそれぞれ、緑、赤、青およびターコイズで示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図２４】ｐＪＮＫ陽性Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体およびｐｔａｕはマイトファジー液胞に共局在する。図２４Ａ：ＬＡＭＰ１陽性小胞はｐＪＮＫおよびＴｏｍ２０染色を含み、それらがマイトファジー液胞であることを示す。図２４Ｂ：Ｐａｒｋｉｎ標識は、ＬＡＭＰ１陽性小胞におけるｐＪＮＫ陽性封入体に関連付けられる。図２４Ｃ：ｐＪＮＫ陽性Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体はｐｔａｕおよびｐａｒｋｉｎと共局在する。画像は、Ｔｏｍ２０またはｐａｒｋｉｎ、ｐＪＮＫ、ＬＡＭＰ１またはｐｔａｕの標識、および核ＤＡＰＩ染色をそれぞれ緑、赤、青、およびターコイズで示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図２５】定量的共局在研究。図２５Ａ：ｐＪＮＫのＰα−ｓｙｎ＊、ｐｔａｕおよび他のキナーゼとのマンダース相関係数を示すグラフ。ｐＪＮＫ標識はＰα−ｓｙｎ＊標識と密接に関連しているが、ｐＭＫＫ４（活性化）、ｐＥＲＫ５、およびｐＰ３８（８０％以上の共局在）とも関連している。図２５Ｂ：Ｐα−ｓｙｎ＊のｐｔａｕとのマンダース相関係数を示すグラフ。図２５Ｃ：Ｐα−ｓｙｎ＊、ｐＪＮＫおよびｐｔａｕのＬＡＭＰ１およびｐａｒｋｉｎとのマンダース相関係数を示すグラフ。図２５Ａ−２５Ｃ：統計解析の要点：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ａでは、＊＊＊＊は、ｐＧＳＫ３βがｐＪＮＫと共局在することについて、ｐＭＫＫ４、ｐｐ３８およびｐＥＲＫ５がｐＪＮＫと共局在することよりも有意に低いｐ＜０．０００１を示す。図２５Ｃにおいて、ｐは、ＬＡＭＰ１とのｐｔａｕ共局在化およびＬＡＭＰ１とのＰα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ共局在化の間の差について０．０５であった。
【図２６】ミトコンドリア損傷およびマイトファジーをもたらす、Ｐα−ｓｙｎ＊によって誘導される分子カスケードおよびＴａｕ動員のモデル。図２６Ａ：Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体はミトコンドリア膜に結合し、ＭＡＰＫの活性化を誘発する。Ｐα−ｓｙｎ＊は、これらのＭＡＰＫによってリン酸化されるタウに結合する。図２６Ｂ：Ｐα−ｓｙｎ＊およびｐｔａｕ凝集体はサイズが大きくなり、ミトコンドリアの損傷を引き起こす。α−ｓｙｎに結合することが知られているＧＳＫ３βは、ＭＡＰＫと協力してタウのリン酸化に寄与する。図２６Ｃ：Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ凝集体はミトコンドリアのフラグメント化を誘導し、ｐａｒｋｉｎを動員してマイトファジーを開始する。図２６Ｄ：マイトファジー液胞は、Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ／ＭＡＰＫ凝集体とともに、ミトコンドリア残屑を含む。
【図２７】ＰＦＦ処理されたヒトドーパミン作動性ニューロンにおけるＰα−ｓｙｎ＊の蓄積は、樹状突起棘の喪失を誘導する。ｐα−ｓｙｎ＊のレベルの低下は、神経保護と樹状突起棘の保存に関連している。神経幹細胞から３０日間分化したドーパミン作動性ニューロンに５０μｇ／ｍｌのＰＦＦを播種し、２μＭの神経保護化合物で１７日間処理したか、または処理しなかった。図２７Ａ：ファロイジン−ｉＦｌｕｏｒ４８８（Ａｂｃａｍ）を用いて、樹状突起棘マーカーＦ−アクチン（緑色）を標識した；図２７Ｂ：抗体ＧＴＸ５０２２２（ＧｅｎｅＴｅｘ、赤色）およびＤＡＰＩ（青色）を用いてのｐα−ｓｙｎ＊標識。右に示す定量はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて実施し、一元配置分散分析（Ｐｒｉｓｍ７．０４）による統計解析を行った。条件ごとに８画像（Ａ）または６画像（Ｂ）の平均値とＳＤを示した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ＝有意ではない。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）（編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（第１版、１９９２年）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、スミス（Ｓｍｉｔｈ）他（編）、オックスフォード大学出版局（改訂版、２０００年）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、クマール（Ｋｕｍａｒ）（編）、Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２年）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、シングルトン（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）他（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（第３版、２００２年）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ハント（Ｈｕｎｔ）（編）、Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（第１版、１９９９年）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ナラー（Ｎａｈｌｅｒ）（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４年）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、クマール（Ｋｕｍａｒ）およびアナンダンド（Ａｎａｎｄａｎｄ）（編）、Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２年）；およびＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）およびハイン（Ｈｉｎｅ）（編）、オックスフォード大学出版局（第４版、２０００年）。さらに、以下の定義は、本発明の実施において読者を支援するために提供される。
【００１４】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形も含むことを意図する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「と共に（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変形が、詳細な説明および／または請求項のいずれかで使用される範囲で、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に包括的であることを意図している。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、用語「または（ｏｒ）」は、その内容が明確に別段の指示をしない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味で一般に使用される。本明細書で使用されているように、特に明記されていないかまたは文脈から明らかでない限り、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内で理解される。約（Ａｂｏｕｔ）は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解することができる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、約という用語によって変更される。
【００１６】
「薬剤」という用語は、治療的または薬理学的活性を有する、または有し得る化合物を説明するために使用される。薬剤には、既知の薬物である化合物、治療活性が同定されているが、さらなる治療評価を受けている化合物、および薬理活性についてスクリーニングされるべきコレクションおよびライブラリのメンバーである化合物が含まれる。
【００１７】
ミトコンドリア毒性（Ｍｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、ミトコンドリアに対する毒性活性を示すことを意味する。
Ｐα−ｓｙｎ＊は、ミトコンドリア毒性活性（例えば、膜電位の損失およびミトコンドリアフラグメント化およびマイトファジーをもたらす構造的損傷を伴うミトコンドリア機能障害を誘導する）を有する構造的に異なる非フィブリル性のα−ｓｙｎ種を指す。Ｐα−ｓｙｎ＊はまた、シナプス毒性と関連しており、ｐＡＣＣ凝集体の形成、ＧＳＫ３βおよびＭＡＰＫｓ  ＭＫＫ４、ＪＮＫ、ｐ３８およびＥＲＫ５のリン酸化、ならびに典型的にはミトコンドリアの近傍における小さなリン酸化タウ凝集体の形成を伴う。典型的には、それはリン酸化された残基Ｓ１２９を含む。α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）はシナプス前ニューロンタンパク質であり、ヒトでは１４０アミノ酸残基からなり、ＳＮＣＡ遺伝子によってコードされている。ＰＤまたは他のシヌクレイノパチーの患者の脳では、かなりの量のα−ｓｙｎが残基Ｓ１２９でリン酸化される（Ｐα−ｓｙｎ）。いくつかの実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊は、トリトンＸ１００の可溶性および不溶性画分中に、約１２．５ｋＤａのモノマー、約２５ｋＤａのダイマーおよび／またはより大きなオリゴマーとして存在し得る。いくつかの実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊は、ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州アーバイン）から入手可能な抗ホスホ−Ｓｅｒ１２９抗体ＧＴＸ５０２２２（ランドロック（Ｌａｎｄｒｏｃｋ）他、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、１６７９：１５５−１７０、２０１８）によって認識される特異的立体配座を有するリン酸化α−シヌクレイン（Ｐα−ｓｙｎ）の毒性変異体である。付随的または代替的に、本発明のこれらの実施形態におけるＰα−ｓｙｎ＊免疫原は、Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）およびＡｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のような商業業者から入手可能な、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦを特異的に認識する抗体８１Ａ（ボルピセリ−デレイ（Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ）他、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、９：２１３５−２１４６、２０１４）および／または抗体ＭＪＦ−Ｒ１３（ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）他、Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２：２０、２０１４）と免疫反応性ではない。いくつかの実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊は、本明細書に記載されるようなＰα−ｓｙｎのＮ末端およびＣ末端切断型種を包含し得る。それは、Ｐα−ｓｙｎのＣ末端で２５残基以下、Ｎ末端で２５残基以下の切断を含むことができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、α−ｓｙｎ由来ポリペプチド免疫原は、抗ホスホ−Ｓｅｒ１２９抗体ＧＴＸ５０２２２と免疫反応性である。付随的にまたは代替的に、これらの実施形態におけるα−ｓｙｎ由来免疫原は、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦ−認識８１Ａおよび／または抗体ＭＪＦ−Ｒ１３と免疫反応性ではない。
【００１８】
「アジュバント」という用語は、免疫原と組み合わせて投与した場合、抗原に対する免疫応答を増大させるが、単独で投与した場合、抗原に対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球の動員、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激およびマクロファージの刺激を含む、いくつかのメカニズムによって免疫応答を増強することができる。
【００１９】
抗体間の競合は、試験中の免疫グロブリンが、α−ｓｙｎのような共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって決定される。多くのタイプの競合的結合アッセイが知られており、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ；１−１２５ラベルを用いる固相直接標識ＲＩＡ；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ；および直接標識されたＲＩＡ、である。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面またはこれらのいずれかを担持する細胞に結合した精製抗原、非標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合的アッセイ（競合抗体）によって識別される抗体には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体と、立体障害が発生するために参照抗体が結合するエピトープの十分近位の隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。通常、競合する抗体が過剰に存在する場合、参照抗体と共通の抗原との特異的結合が少なくとも５０または７５％阻害されるであろう。
【００２０】
用語「抗体」は、本明細書中に記載される抗体フラグメントを含めて、同義的に「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれ、所与の抗原、エピトープまたは複数のエピトープに対する強い一価、二価または多価結合を示すポリペプチド鎖を指す。特に明記しない限り、本発明で使用される抗体または抗原結合フラグメントは、任意の脊椎動物種に由来する配列を有することができる。それらは、任意の適切な技術、例えば、ハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリ、半合成または完全合成ライブラリまたはそれらの組み合わせを使用して生成することができる。特に明記しない限り、本発明で使用される「抗体」という用語は、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体、抗原結合ポリペプチドフラグメント、および以下に記載されるかまたは当技術分野で周知の他のデザイナー抗体を含む。
【００２１】
無傷の「抗体」は、典型的には、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤ）を含む。抗体鎖をコードする認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ミューの定常領域遺伝子、および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。
【００２２】
抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域で構成されている。大部分のＩｇＧアイソタイプ（サブクラス）の重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインから構成され、ＩｇＭまたはＩｇＥのようないくつかのＩｇＧアイソタイプは、第４の定常領域ドメイン、ＣＨ４を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインで構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞および古典的補体系の最初の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００２３】
本明細書で使用される「併用療法」という用語は、対象が両方の薬剤に同時に曝露されるように、２つ以上の異なる薬剤が重複するレジメンで投与される状況を指す。併用療法で使用する場合、２つ以上の異なる薬剤を同時にまたは別々に投与することができる。この組み合わせでの投与は、同じ剤形での２つ以上の薬剤の同時投与、別個の剤形での同時投与、および別個の投与を含み得る。すなわち、２つ以上の薬剤を同じ剤形で一緒に処方し、同時に投与することができる。代替的に、２つ以上の薬剤を同時に投与することができ、これらの薬剤は別々の製剤中に存在する。別の代替案において、第１の薬剤を投与し、直後に１つまたは複数の追加の薬剤を投与することができる。別個の投与プロトコルにおいて、２つ以上の薬剤を、数分間隔で、または数時間間隔で、または数日間隔で投与することができる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、項目、構成、装置、方法、プロセス、システムなどの定義されたまたは説明された要素に関して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「構成され（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」という用語、およびそれらの変形は、包括的またはオープンエンドであることを意味し、追加の要素を許可するものであり、従って、定義されたまたは説明された項目、構成、装置、方法、プロセス、システムなどがそれらの指定された要素または適切な場合はそれらの同等物を含み、他の要素が含まれていてもよく、かつ他の要素は、定義された項目、構成、装置、方法、プロセス、システムなどの範囲／定義に含まれる。
【００２５】
「保存的に改変された変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、機能的に同一の多数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるすべての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異（ｓｉｌｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）」であり、保存的に改変された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異を説明する。当業者は、核酸の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が機能的に同一の分子を生じるように修飾され得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に内在している。
【００２６】
タンパク質またはポリペプチドに関する「保存的置換」とは、あるアミノ酸を類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置き換えることを指す。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。タンパク質活性を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、ブルメル（Ｂｒｕｍｍｅｌｌ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２：１１８０−１、１８７（１９９３）；コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；およびブルクス（Ｂｕｒｋｓ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４１２−４１７（１９９７）を参照されたい）。
【００２７】
「接触する」という用語は、その通常の意味を有し、２つ以上の薬剤（例えば、ポリペプチドまたはファージ）を組み合わせること、薬剤と細胞を組み合わせること、または異なる細胞の２つの集団を組み合わせること、を指す。接触することは、インビトロで、例えば、抗体と細胞を混合すること、または試験管または増殖培地中で抗体の集団を細胞の集団と混合することで起こり得る。接触することはまた、細胞内またはインサイチュで起こり得、例えば、２つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの細胞内での共発現によって細胞内の２つのポリペプチドを接触させること、または細胞溶解物中で２つのポリペプチドを接触させること、で起こり得る。接触させることはまた、例えば、薬剤を標的細胞に送達するために薬剤を対象に投与することにより、対象または非ヒト動物の内部でインビボにて起こり得る。
【００２８】
「決定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定すること（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「検出すること（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」および「アッセイすること（ａｓｓａｙｉｎｇ）」という用語は、本明細書において互換的に使用され、測定の任意の形態を指し、要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語には、定量的および／または定性的な決定が含まれる。評価は、相対的または絶対的であり得る。「〜の存在を評価すること」は、存在するものの量を決定すること、ならびにそれが存在するかまたは存在しないかを決定することを含む。
【００２９】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」またはパーセント「同一性」は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動整列および目視検査によって測定されるように、比較ウインドウまたは指定された領域にわたり最大の一致を得るために比較および整列されるときに、特定のパーセンテージの同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、６０％同一性、任意選択的には、特定の領域にわたる６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性、または特定されない場合には、全配列にわたる同一性）を有する場合、２つの配列は「実質的に同一である」である。任意選択的に、この同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０のアミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００から５００または１０００以上のヌクレオチド（２０、５０，２００以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００３０】
比較のために配列をアライメントさせる方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２ｃ、１９７０）の局所ホモロジーアルゴリズムによって；ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３、１９７０）のホモロジーアライメントアルゴリズムによって；ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４、１９８８）の類似性を調べる方法によって；これらのアルゴリズム（ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）をコンピュータで実装することによって；または、手動によるアライメントおよび目視検査（例えば、ブレント（Ｂｒｅｎｔ）他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（ｒｉｎｇｂｏｕ編、２００３））によって、実施することができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２、１９７７、およびアルトシュル他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０、１９９０、にそれぞれ記載されている。
【００３１】
用語「モジュレータ（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」は、関心のある活性が観察される系内の存在が、モジュレータが存在しない場合の他の比較可能な条件下で観察されるものと比較して、その活性のレベルおよび／または性質の変化と相関関係を有する実体を指すために使用される。いくつかの実施形態において、モジュレータは、モジュレータが存在しない場合、他の比較可能な条件下で観察されるものと比較して、活性がその存在下で増加するアクティベーターである。いくつかの実施形態において、モジュレータは、モジュレータが存在しない場合、他の比較可能な条件下で観察されるものと比較して、活性がその存在下で低下するインヒビターである。いくつかの実施形態において、モジュレータは、その活性が注目される標的実体と直接相互作用する。いくつかの実施形態において、モジュレータは、その活性が注目される標的実体と間接的に（すなわち、標的実体と相互作用する中間薬剤と直接的に）相互作用する。いくつかの実施形態において、モジュレータは、関心のある標的実体のレベルに影響を与える；代替的または付随的に、いくつかの実施形態において、モジュレータは、標的実体のレベルに影響を与えることなく、関心のある標的実体の活性に影響を与える。いくつかの実施形態において、モジュレータは、関心のある標的実体のレベルと活性の両方に影響を与えるため、観察された活性の差は、観察されたレベルの差によって完全には説明されないか、またはそれと釣り合っていない。
【００３２】
「薬学的に許容される担体」という語句は、治療薬の投与のための担体を指す。例示的な担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。経口投与される薬物の場合、薬学的に許容される担体には、限定されるものではないが、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤などの薬学的に許容される賦形剤が含まれる。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれる一方で、コーンスターチおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよびゼラチンを含み得、一方、存在する場合、潤滑剤は、通常、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。必要に応じて、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングして、胃腸管での吸収を遅らせてもよい。
【００３３】
シヌクレイノパチー（α−シヌクレイノパチーとも呼ばれる）は、ニューロン、神経線維またはグリア細胞におけるアルファ−シヌクレインタンパク質の凝集体の異常な蓄積を特徴とする神経変性疾患である。それらは、ドーパミン作動系および中枢神経系の他の領域の変性を特徴とする。それらは、臨床的に運動変化、認知障害、自律機能障害、および神経病理学的にアルファ−シヌクレイン凝集体の形成を伴い、時にはレビー小体（ＬＢ）の形で現れる。シヌクレイノパチーには、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型、パーキンソン病（ＰＤ）とアルツハイマー病（ＡＤ）の合併、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が含まれる。
【００３４】
治療活性とは、疾患の予防または治療において有用であるか、または有用であり得る薬剤の活性を指す。スクリーニングシステムは、インビトロ、細胞、動物またはヒトであり得る。疾患の治療における実際の予防的または治療的有用性を確立するためにさらなる試験が必要とされ得るにもかかわらず、薬剤は、治療活性を有するものとして記載され得る。
【００３５】
「特異的に結合する」という語句は、タンパク質および他の生物学の不均一な集団の存在下でのタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。従って、指定された条件下では、特定のリガンドは特定のタンパク質に優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には有意な量では結合しない。タンパク質に特異的に結合する抗体のような分子は、多くの場合、少なくとも１０６Ｍまたは１０７Ｍ−１、好ましくは１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、より好ましくは約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１またはそれ以上の会合定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）を有する。様々なイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用される。特定の免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイのフォーマットと条件の説明については、例えば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ニューヨーク）を参照されたい。
【００３６】
本発明の免疫原または治療剤は、典型的には、望ましくない汚染物質から実質的に純粋である。これは、薬剤が典型的には少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であり、干渉タンパク質および汚染物質を実質的に含まないことを意味する。時として、薬剤は少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０または約９５％ｗ／ｗの純度である。しかしながら、従来のタンパク質精製技術を使用して、少なくとも９９％ｗ／ｗの均一なペプチドを得ることができる。
【００３７】
「対象」とは、本発明の方法を適用することができるおよび／または本発明の薬剤を投与することができる生物を意味する。対象は、ヒトを含む哺乳動物、またはヒトの臓器および／もしくはヒトの細胞を含む哺乳動物の臓器もしくは哺乳動物の細胞であり得る。
【００３８】
本発明の特定の方法論は、値、レベル、特徴、特性、特性などを「適切な（ｓｕｉｔａｂｌｅ）対照」と比較することを包含するステップを含み、「適切な対照」は、本明細書では「適した（ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ）対照」と交換可能に参照される。「適切な対照」または「適した対照」は、比較目的に有用な当業者によく知られている対照または標準である。一実施形態において、「適切な対照」または「適した対照」は、本明細書に記載されるように、治療および／または薬剤投与方法論を実施する前に決定される値、レベル、特徴、特性、特性などである。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物活性、細胞の特徴または特性、遺伝子型、表現型などは、本発明の治療および／または薬剤を対象に導入する前に決定することができる。別の実施形態において、「適切な対照」または「適した対照」は、例えば正常な形質を示す、細胞または生物、例えば対照または正常な細胞または生物において決定される値、レベル、特徴、特徴、特性などである。さらに別の実施形態において、「適切な対照」または「適した対照」は、予め定義された値、レベル、特徴、特性、特性などである。
【００３９】
「治療すること」または「治療」は、哺乳動物の病状の治療を包含し、以下を含む：（ａ）哺乳動物における疾患状態の発生を防止すること、特に、そのような哺乳動物が疾患状態の素因を有するが、まだそれを有すると診断されていない場合；（ｂ）疾病の状態を阻止すること、例えば、発生を阻止すること；および／または（ｃ）疾患状態を緩和すること、例えば所望のエンドポイントに達するまで疾患状態の退縮を引き起こすこと。治療はまた、疾患の症状の改善（例えば、疼痛または不快感を軽減する）を含み、そのような改善は、疾患（例えば、原因、伝染、発現など）に直接影響を及ぼしても及ぼさなくてもよい。
【００４０】
「ベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンであり、これに別のポリヌクレオチドセグメントが付着して、付着したセグメントの複製をもたらすことができる。１つまたは複数のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。
【００４１】
本明細書において提供される範囲は、範囲内のすべての値の省略形であると理解される。例えば、１から５０までの範囲は、任意の数、数の組合せ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの部分範囲を含むことが理解される。濃度、量、細胞数、パーセンテージおよび他の数値は、本明細書においては範囲形式で提示され得る。なお、このような範囲形式は、単に便宜的かつ簡潔に記載されたものであって、範囲の限界として明示的に記載された数値だけでなく、その範囲内に含まれる個々の数値又は部分範囲を、あたかも各数値及び部分範囲が明示的に記載されているかのように、すべて含むように柔軟に解釈すべきである。
【００４２】
本明細書に引用された受入番号で示されるＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩの提出物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されたすべての公開された参考文献、文書、原稿、科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【００４３】
ＩＩ．概観
培養初代ニューロンを予め形成されたα−シヌクレインフィブリル（ＰＦＦ）に曝露すると、内因性α−シヌクレインが動員され、その鋳型化された変換によってフィブリル性（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）リン酸化α−シヌクレイン（Ｐα−ｓｙｎＦ）凝集体が形成されるが、これはパーキンソン病（ＰＤ）の病因に関係するものに類似している。Ｐα−ｓｙｎＦは、ＰＤ患者のレビー小体およびレビー神経突起に形態学的に類似した封入体として以前に記載されていた。本発明は、マイトファジーをもたらすミトコンドリア機能障害および構造的損傷、ｐＡＣＣおよびｐｔａｕ凝集体の形成、ＭＡＰＫ経路のいくつかの酵素ならびにＧＳＫ３βのリン酸化、ならびに樹状突起棘の喪失を引き起こすことができる、立体構造的に異なる非フィブリル性のリン酸化α−ｓｙｎ種（本明細書ではＰα−ｓｙｎ＊と呼ばれる）の存在の本発明者による発見に一部基づいている。以下に詳述するように、Ｐα−ｓｙｎ＊はＰＦＦを播種した初代ニューロン、マウスの脳、およびＰＤ患者の脳に存在することが明らかとなった。免疫蛍光および薬理学的操作により、Ｐα−ｓｙｎ＊はＰα−ｓｙｎＦの不完全なオートファジー分解から生じることが観察された。Ｐα−ｓｙｎＦはオートファジーマーカーで修飾されていたが、Ｐα−ｓｙｎ＊は修飾されていなかった。いくつかの実験条件において、ウエスタンブロットは、α−ｓｙｎのＮ末端および／またはＣ末端トリミングからおそらくは生じ、ＳＤＳ耐性ダイマーとして、１２．５ｋＤａで移動するＰα−ｓｙｎ＊を明らかにした。リソソームからの放出後、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体はミトコンドリアと会合し、ミトコンドリア膜の脱分極、シトクロムＣの放出、ミトコンドリアのフラグメント化を誘導した（ＳＴＥＤナノスコピーで可視化）。Ｐα−ｓｙｎ＊は、リン酸化されたアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）小凝集体の形成を誘導し、この小凝集体とともに顕著に共局在した。ＡＣＣは脂肪酸合成の最初の関与段階であるマロニル−ＣｏＡの合成を触媒する酵素である。ＡＣＣリン酸化は、ＡＴＰレベルの低下、ＡＭＰＫの活性化、酸化ストレスを示す。ＡＣＣリン酸化はＡＣＣの活性を低下させ、その結果、デノボ脂肪酸合成を減少させ、リポ化を減少させたミトコンドリアフラグメント化をもたらす。また、Ｐα−ｓｙｎ＊は、アンフォールドタンパク応答（ＵＰＲ）のマスターレギュレータであるＢｉＰや、ミトコンドリアの分裂やマイトファジーの部位であるミトコンドリア関連ＥＲ膜（ＭＡＭ）の常駐タンパク質とも共局在していた。さらに、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体はＰａｒｋｉｎ陽性のマイトファジー液胞で見つかり、電子顕微鏡で画像化された。Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体は、リン酸化タウの小凝集体と同様に、リン酸化ＭＡＰＫｓ（ＭＫＫ４、ＪＮＫ、ｐ３８、ＥＲＫ５）およびＧＳＫ３βを誘導し、共局在することを見出した。ｐＴａｕ凝集体はミトコンドリア膜、特にフラグメント化ミトコンドリア領域でＰα−ｓｙｎ＊と共局在していた。Ｐα−ｓｙｎ＊レベルの上昇は樹状突起棘の減少と相関し、化合物治療によって誘発されたＰα−ｓｙｎ＊レベルの減少は、シナプスの健康を定量化するために使用される樹状突起棘の数の増加と相関した。これらの結果は、Ｐα−ｓｙ���＊がミトコンドリア毒性および分裂、エネルギーストレス、脂質代謝の変化、マイトファジー、キナーゼ活性化、ｐｔａｕ凝集体の形成およびシナプス毒性を誘導することを示し、重要な神経毒性α−ｓｙｎ種および新規治療標的としてＰα−ｓｙｎ＊を意味する。
【００４４】
これらの研究に従って、本発明は、様々な製薬および工業用途における免疫原またはアッセイマーカーとしてＰα−ｓｙｎ＊および関連するポリペプチドを使用する方法を提供する。以下に詳述するように、本発明は、Ｐα−ｓｙｎ＊を使用して、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの治療および／または診断に有用であり得る抗体を生成する方法を提供する。本発明はまた、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーを治療するための新規治療薬をスクリーニングするマーカーとして、ならびにＰＤおよび他のシヌクレイノパチーにおける疾患状態および／または疾患進行のバイオマーカーとしてＰα−ｓｙｎ＊を使用する方法を提供する。本明細書に記載されるように、Ｐα−ｓｙｎ＊は、可溶性および不溶性の両方の形態で存在することができる。それは、ヒトα−ｓｙｎまたは他の種（例えば、マウス）からのα−ｓｙｎに由来し得る。このような免疫原は、本開示に基づいて容易に得ることができる。例えば、本明細書に詳述されるように、組換えα−ｓｙｎのフィブリル（予め形成されたフィブリルまたはＰＦＦ）を使用して、細胞株および初代ニューロンにおける内因性α−ｓｙｎのミスフォールディングおよび凝集を播種し、大きなトリトン不溶性α−ｓｙｎフィブリルの形成をもたらすことができる。これらのフィブリルは、Ｓ１２９でリン酸化されたα−ｓｙｎ（Ｐα−ｓｙｎ）からなり、α−ｓｙｎの＞９０％がＳ１２９でリン酸化されるＰＤ患者脳におけるＬＢの形成を模倣している。ＰＦＦ播種ニューロンはまた、Ｐα−ｓｙｎ＊を産生する。それらは、オートファジーおよび代謝障害、ミトコンドリア病理、小胞輸送障害、シナプス機能障害および神経細胞死を受ける。次いで、Ｐα−ｓｙｎ＊は、例えば、免疫沈降、細胞溶解物の電気泳動およびゲル抽出、クロマトグラフィーまたは当業者によって使用され得る他のタンパク質精製方法によって、細胞培養物から単離され得る。シヌクレイノパチーの動物モデルまたはシヌクレイノパチーに罹患した患者からの脳抽出物を使用して、神経培養物を播種することもできる。播種された初代ニューロン以外に、Ｐα−ｓｙｎ＊免疫原は、組換えα−シヌクレインフィブリルが注入されたマウスの脳、シヌクレイノパチーの動物モデルからの脳抽出物、またはシヌクレイノパチーに罹患した患者の脳からも分離できる。
【００４５】
いくつかの他の実施形態において、本発明の実施に使用されるべきＰα−ｓｙｎ＊ポリペプチド免疫原は、例えば、組換え発現によって、または化学合成によって、インビトロで生成され得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるべきα−ｓｙｎ由来の免疫原またはポリペプチドは、組換えにより生成することができる。本発明の方法の実施において、組換えにより産生されたα−ｓｙｎ免疫原は、リン酸化（Ｐα−ｓｙｎ＊）または非リン酸化（α−ｓｙｎ＊）のいずれかであり得る。組換えにより生成されたα−ｓｙｎフラグメントのインビトロリン酸化は、当技術分野、例えば、シュロイアー（Ｓｃｈｒｅｕｒｓ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、１５：１０４０−６７、２０１４およびルー（Ｌｕ）他、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１１、２：６６７−６７５、２０１１、に記載されるように実施することができる。ヒトおよび他の多くの種のアルファ−シヌクレインの配列は、当技術分野で周知であり、特徴付けられている。これらには、α−ｓｙｎアミノ酸配列およびそれらをコードするｃＤＮＡ配列が含まれる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＲ５４１６５３．１およびＣＡＧ４６４５４．１；ウエダ（Ｕｅｄａ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：１１２８２−１１２８６、１９９３；キャンピオン（Ｃａｍｐｉｏｎ）他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２６：２５４−２５７、１９９５；およびタッチマン（Ｔｏｕｃｈｍａｎ）他、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１１：７８−８６、２００１、を参照されたい。たとえば、ヒトＰα−ｓｙｎアイソフォーム（受入番号ＮＰ＿００１１３９５２６）のアミノ酸配列を以下に示す。
【００４６】
【化１】
2021513560.tif 000003
【００４７】
いくつかの実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊免疫原またはその非リン酸化対応物（α−ｓｙｎ＊）は、Ｎ末端および／またはＣ末端で切断されたα−ｓｙｎに由来する。完全長の野生型α−ｓｙｎタンパク質と比較して、組換えにより作製された免疫原は、（１）約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基のＮ末端欠失、および／または（２）約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基のＣ末端欠失、を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊（またはα−ｓｙｎ＊）免疫原は、完全長のα−ｓｙｎタンパク質の最初の３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＮ末端残基の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）を含む。いくつかの他の実施形態において、免疫原は、完全長のα−ｓｙｎタンパク質の最初の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のＮ末端残基の切断を含む。いくつかの他の実施形態において、免疫原は、完全長のα−ｓｙｎタンパク質の最初の１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のＮ末端残基の切断を含む。Ｎ末端の切断に加えて、免疫原は、代替的にまたは付随的に、最初の３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＣ末端残基の切断を含む。いくつかの他の実施形態において、免疫原のＣ末端切断は、最初の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のＣ末端残基の欠失を構成する。いくつかの他の実施形態において、免疫原のＣ末端切断は、最初の１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のＣ末端残基の欠失を構成する。種々の実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊又はα−ｓｙｎ＊免疫原は、１〜約２５残基のＮ末端切断及び１〜約２５残基のＣ末端切断の組み合わせを有することができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊またはα−ｓｙｎ＊免疫原は、完全長のα−ｓｙｎタンパク質の（１）最初の１３、１４、または１５個のＮ末端残基、および（２）最初の８、９、または１０個のＣ末端残基、の切断を含む。いくつかの実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊またはα−ｓｙｎ＊免疫原は、完全長のα−ｓｙｎタンパク質の最初の１５個のＮ末端残基および最初の１０個のＣ末端残基、の切断を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、完全長のα−ｓｙｎタンパク質は、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を構成する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド免疫原は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するその変異体によってコードされる。
【００４８】
本明細書に例示されるヒトα−ｓｙｎ配列に加えて、本発明に適したＰα−ｓｙｎ＊またはその非リン酸化対応物（α−ｓｙｎ＊）は、対立遺伝子、種および誘導変異体を含むα−ｓｙｎ類似体からも誘導され得る。野生型α−ｓｙｎ配列と比較して、変異体は、多くの場合、保存的置換により、１つ、２つ、またはいくつかの位置で異なるアミノ酸配列を含むことができる。たとえば、変異体はＡ３０Ｐおよび／またはＡ５３Ｔの置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、変異体は、天然に存在するα−ｓｙｎの配列と実質的に同一である配列（例えば、配列番号１）を含む。いくつかの実施形態において、変異体は１つまたは複数の非天然アミノ酸残基を含む。非天然に存在するまたは非ヒトα−ｓｙｎ配列が本発明の実施において使用される場合、それらのアミノ酸残基は、類似体およびヒト配列が最大に整列している場合、天然ヒト配列中の対応するアミノ酸と同じ番号が割り当てられる。したがって、例えば切断されたα−ｓｙｎ配列中のリン酸化されたＳｅｒ１２９残基は、ヒトα−ｓｙｎ配列（例えば：配列番号１）に従って番号付けされた残基、すなわち、ヒトα−ｓｙｎ配列中の残基Ｓｅｒ１２９に対応する残基を指す。さらにいくつかの他の実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊の特定の構造または立体配座を模倣する合成ポリマーを、免疫原としてのＰα−ｓｙｎ＊の代わりに使用することができる。
【００４９】
本明細書に記載される全長またはＮ末端および／またはＣ末端切断α−ｓｙｎポリペプチドを生成するために、様々な組換え発現系を使用することができる。例えば、ウイルスベースおよび非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞においてポリペプチドを産生することができる。非ウイルスベクターおよびシステムには、プラスミド、典型的にはタンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを有するエピソームベクター、およびヒト人工染色体が含まれる（例えば、ハリントン（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１５：３４５、１９９７を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば：ヒト）細胞におけるポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ、Ｂ＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓＡ、Ｂ＆Ｃ（カリフォルニア州サンディエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭＰＳＶベクター、および他のタンパク質を発現するための当技術分野で公知の多数の他のベクターを含む。他の有用な非ウイルスベクターには、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃｋおよび他のトランスポゾン系と共に動員することができる発現カセットを含むベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスに基づくベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびＳｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス（ＳＦＶ）が含まれる。宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたは昆虫細胞株）での発現およびポリペプチドの精製は、当技術分野で日常的に実施されている方法に従って容易に行うことができる。前述のブレント（Ｂｒｅｎｔ）他；スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４９：８０７、１９９５；カン（Ｋｈａｎ）、Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．、３（２）：２５７−２６３、２０１３；およびローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）他、Ｃｅｌｌ、６８：１４３、１９９２、を参照されたい。
【００５０】
特に明記しない限り、本発明は、当技術分野の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用することができる。そのような技術は文献で完全に説明されている。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他編、（１９８９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他編、（１９９２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）編、（１９８５年）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第１巻および第２巻、；ゲイト（Ｇａｉｔ）編、（１９８４年）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）他、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；ハメス（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、（１９８４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ハメス（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、（１９８４年）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；フレッシュネイ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、（１９８７年）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８６年）；パーバル（Ｐｅｒｂａｌ）、（１９８４年）、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク）；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびカロス（Ｃａｌｏｓ）編、（１９８７年）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ウー（Ｗｕ）他編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻；メイヤー（Ｍａｙｅｒ）およびウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）編、（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ロンドン）；ウィーアー（Ｗｅｉｒ）およびブラックウェル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）編、（１９８６年）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ−ＩＶ巻；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク）、（１９８６年）；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、（１９８９年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）、を参照されたい。
【００５１】
ＩＩＩ．ＰＤおよびその他のシヌクレイノパチーを治療するための新規抗体を生成する方法
一態様において、本発明は、Ｐα−ｓｙｎ＊を特異的に標的とする治療剤（例えば、治療用抗体）を生成するための方法を提供する。このような薬剤は、パーキンソン病およびシヌクレイノパチーの治療に有用である。パーキンソン病およびレビー小体型認知症などのシヌクレイノパチー、ならびに多系統萎縮症に対する疾患修飾療法は現在のところ存在していない。試薬（特に抗体）を開発する現在の努力は、レビー小体（Ｌｅｗｙ  Ｂｏｄｉｅｓ）／レビー神経突起（Ｌｅｗｙ  Ｎｅｕｒｉｔｅｓ）型のα−シヌクレイン凝集体（本明細書に記載のＰα−ｓｙｎＦと類似）または天然の内因性のα−シヌクレインに対して向けられている。本明細書に示されているように、Ｐα−ｓｙｎ＊は、ミトコンドリアと直接会合してそれらの損傷を誘発する実体（ｅｎｔｉｔｙ）であるため、より優れた治療標的である。ミトコンドリアの損傷、分裂、およびマイトファジーは、パーキンソン病のドーパミン作動性ニューロンの死の鍵であることが知られているが、レビー小体／神経突起とミトコンドリアの損傷との間の直接的な関連は確立されていない。Ｐα−ｓｙｎ＊はこのようなミトコンドリアの損傷を誘発するため、パーキンソン病やシヌクレイノパチーの進行を遅らせたり停止させたりすることができる治療薬を開発するための特権的標的である。
【００５２】
Ｐα−ｓｙｎ＊は、ＭＡＰＫやＧＳＫ３βなどのいくつかのキナーゼのリン酸化、ならびに脂肪酸合成の律速酵素であるリン酸化されたＡＣＣの小凝集体の形成を誘発することも見出されている。したがって、Ｐα−ｓｙｎ＊を標的とすることにより、いくつかの病原性事象を阻止する準備が整っている。さらに、Ｐα−ｓｙｎ＊はリン酸化タウ（ｐＴａｕ）に関連していることがわかっている。リン酸化Ｔａｕは神経変性のもう１つの分子プレーヤーであることが知られており、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病のレビー小体型変異およびダウン症候群におけるＰα−ｓｙｎ封入体と関連して見出される。本明細書に記載されているように、Ｐα−ｓｙｎ＊はｐＴａｕ凝集体の形成を誘発する。ｐＴａｕの減少は、Ｐα−ｓｙｎ＊標的化の別の有益な効果を提供する。大きな「プラーク」や「フィブリル」ではなく、特定のタイプのより小さなアミロイド凝集体を標的とすることの重要性は、より小さな毒性のＡβ凝集体ではなくＡβアミロイドプラークに対する抗体の使用を含む、アルツハイマー病の臨床試験の最近の失敗によってさらに例証されている。
【００５３】
したがって、本発明のいくつかの方法は、Ｐα−ｓｙｎ＊に特異的な抗体を生成することを対象とする。これらの方法において、Ｐα−ｓｙｎ＊またはα−ｓｙｎ＊ポリペプチドを含む免疫原組成物を使用して、非ヒト動物（例えば、マウス、ウサギまたはラクダ）を免疫化する。α−ｓｙｎ由来ポリペプチドに加えて、免疫原組成物は、ポリペプチドに対する免疫応答を増強することができる他の添加物を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は１つ以上のアジュバントを含むことができる。典型的には、アジュバントは混合され、ポリペプチド免疫原と共に動物に注入される。適切なアジュバントの例には、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡまたはＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムの溶液（ミョウバン）が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の免疫原組成物はまた、免疫応答の誘発を助ける担体タンパク質を含み得る。典型的には、担体タンパク質は、α−ｓｙｎに対して異種であり、Ｐα−ｓｙｎ＊または関連するポリペプチド免疫原に共有結合または非共有結合でコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、担体タンパク質は、上記のように完全長α−ｓｙｎ配列のＮ末端および／またはＣ末端切断を含むＰα−ｓｙｎ＊免疫原にコンジュゲートされる。これらの実施形態において、異種担体タンパク質以外に、本発明の免疫原組成物中のＰα−ｓｙｎ＊または関連ポリペプチドは、完全長α−ｓｙｎ配列のいかなるＮ末端および／またはＣ末端フラグメント配列にも連結されていない。言い換えれば、本発明のこれらの実施形態における免疫原組成物は、完全長のα−ｓｙｎタンパク質、または無傷のＮ末端および／または無傷のＣ末端を有するα−ｓｙｎ変異体を包含しない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、免疫原組成物は、Ｐα−ｓｙｎ＊にその独特の神経毒性特性を与える立体構造エピトープと同一の構造決定基を有する別のポリペプチドまたは合成ポリマーを含む。
【００５５】
Ｐα−ｓｙｎ＊に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、抗体工学の分野でよく知られている標準的な技術または本明細書に例示されている特定のプロトコルに従って作製することができる。例えば、非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットの産生は、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ，１９８８）に記載されているように行うことができる。当技術分野で日常的に実施されているように、実験動物の免疫化には、完全フロイントアジュバントとそれに続く不完全アジュバントが好ましい。ウサギまたはモルモットは、ポリクローナル抗体を生成するために使用することができる。マウスはモノクローナル抗体の作製に使用できる。結合は、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたは免疫細胞化学によって評価することができる。
【００５６】
Ｐα−ｓｙｎ＊に特異的な抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体が含まれる。キメラ抗体およびヒト化抗体は、マウスまたは他の非ヒト抗体と同じまたは類似の結合特異性および親和性を有し、キメラまたはヒト化抗体の構築のための出発材料を提供する。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学によって、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４などのヒト定常（Ｃ）セグメントに連結され得る。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。いくつかの方法において、抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。ＩｇＭ抗体は、いくつかの方法で使用することもできる。したがって、典型的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のＶまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体由来のＣまたはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。
【００５７】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体由来の可変領域フレームワーク残基および実質的にマウス抗体由来の相補性決定領域を有する。クイーン（Ｑｕｅｅｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９−１００３３（１９８９）、国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，５３０，１０１号明細書およびウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）、米国特許第５，２２５，５３９号明細書を参照されたい。存在する場合、定常領域はまた、実質的または完全にヒト免疫グロブリンに由来する。ヒト可変ドメインは、通常、そのフレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するマウス可変領域ドメインと高度の配列同一性を示すヒト抗体から選択される。重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であり得るか、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。カーター（Ｃａｒｔｅｒ）他の国際公開第ＷＯ９２／２２６５３号を参照されたい。ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸は、ＣＤＲ立体構造および／または抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づいて、置換のために選択される。
【００５８】
Ｐα−ｓｙｎ＊に対するヒト抗体は、当技術分野でよく知られているいくつかの技法に従って生成することもできる。一部のヒト抗体は、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように、競合的結合実験などによって選択される。ヒト抗体を作製するための技術としては、オーストベルク（Ｏｅｓｔｂｅｒｇ）他のトリオーマ方法論、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２：３６１−３６７（１９８３）；オーストベルク（Ｏｅｓｔｂｅｒｇ）、米国特許第４，６３４，６６４号明細書；およびエングルマン（Ｅｎｇｌｅｍａｎ）他、米国特許第４，６３４，６６６号明細書（これらのそれぞれがすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれている），例えばロンベルク（Ｌｏｎｂｅｒｇ）他に記載されているヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくともセグメントをコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の使用、国際公開第ＷＯ９３／１２２２号、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、Ｎａｔｕｒｅ  １４８、１５４７−１５５３（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８２６（１９９６）、クッヘルラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）、国際公開第ＷＯ９１／１０７４１号（これらのそれぞれがすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれている）およびファージディスプレイ法（例えばドゥワー（Ｄｏｗｅｒ）他、国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号およびマッカフェルティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）他、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、米国特許第５，８７７，２１８号明細書、米国特許第５，８７１，９０７号明細書、米国特許第５，８５８，６５７号明細書、米国特許第５，８３７，２４２号明細書、米国特許第５，７３３，７４３号明細書、および米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）、が含まれる。
【００５９】
Ｐα−ｓｙｎ＊免疫原を認識する抗体が生成されると、ＰＤおよびその他のシヌクレイノパシーの治療に有用な治療活性についてさらに検査することができる。これらの疾患の潜在的な治療効果を示すあらゆる活性は、これらのアッセイで調べることができる。これらには、例えば、α−ｓｙｎ凝集体の減少、α−ｓｙｎ凝集体の破壊、Ｐα−ｓｙｎ＊および／またはＰα−ｓｙｎＦ形成の遅延、Ｐα−ｓｙｎ＊および／またはＰα−ｓｙｎＦの消失が含まれる。アッセイにおいて監視される活性はまた、ＰＦＦを播種した初代ニューロンにおける任意の他のミトコンドリア毒性活性の阻害、または本明細書に例示した別の細胞アッセイ、例えば、ミトコンドリア内膜の脱分極、シトクロムＣ放出、ミトコンドリアフラグメント化、小凝集体の形態でのｐＡＣＣ動員、および異常なマイトファジーであり得る。監視されるべき活性は、リン酸化タウ（ｐＴａｕ）の形成の減少であってもよい。監視されるべき活性は、ＭＫＫ４、ＪＮＫ、ｐ３８、ＥＲＫ５またはＧＳＫ３βリン酸化の低下であってもよい。監視されるべき活性は、シナプス病理の減少と樹状突起棘密度の増加であってもよい。そのような活性を評価するために適切な細胞または動物モデルを使用する方法は、本明細書に記載されている。
【００６０】
生成された抗体／試薬は、体液および／または組織の前臨床および／または臨床ＰＤまたは他のシヌクレイノパチーを診断するための診断ツールとして、および／または臨床治験時を含む疾患の進行を監視するために使用できる。Ｐα−ｓｙｎ＊は、ＰＤおよびその他のシヌクレイノパチーの疾患重症度のバイオマーカーとして使用できる。
【００６１】
生成された抗体は、Ｐα−ｓｙｎ＊の特異性と選択性についてさらに調べることができる。この方法では、さまざまな競合的および非競合的結合アッセイを採用することができる。いくつかの実施形態において、標識または固定化されたＰα−ｓｙｎ＊またはＰα−ｓｙｎ＊への特異的結合は、非標識天然α−ｓｙｎタンパク質またはＰα−ｓｙｎＦの存在下で検出することができる。いくつかの実施形態において、Ｐα−ｓｙｎ＊を認識する既知の抗体を競合アッセイで使用して、同定された抗体のＰα−ｓｙｎ＊結合特異性を確認することができる。いくつかの実施形態において、抗体の大きなライブラリは、ファージディスプレイ技術を使用して同時にスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態において、単離された抗体は、α−ｓｙｎまたはＰα−ｓｙｎの他の変異体、例えばＰα−ｓｙｎＦに対するＰα−ｓｙｎ＊の選択性についてスクリーニングすることができる。本明細書に記載されるように、ミトコンドリア毒性Ｐα−ｓｙｎ＊は、フィブリル性Ｐα−ｓｙｎＦと比較して、オリゴマー凝集体を形成する。α−ｓｙｎやＰα−ｓｙｎＦなどの他の変異体よりもＰα−ｓｙｎ＊に対して選択的な抗体は、ＰＤや他のシヌクレイノパチーの治療におけるＰα−ｓｙｎ＊のミトコンドリア毒性活性に対抗するのにより効果的である。α−ｓｙｎまたはＰα−ｓｙｎＦのような他の変異体に対するＰα−ｓｙｎ＊に対する同定された抗体の選択性は、当技術分野において周知であるかまたは本明細書において具体的に例示された標準的な免疫学的技術、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、または免疫細胞化学を介して容易に調べることができる。
【００６２】
特定の実施形態において、抗体は以下を含む：ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、無傷の抗体を含むラクダ科抗体（ｃａｍｅｌｉｄｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、およびフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントを含む機能性（抗原結合）抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒｌｇＧ）フラグメント、抗原に特異的に結合することができる可変重鎖（ＶＨ）領域、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体フラグメント、および単一ドメイン抗体（例：ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）フラグメント、遺伝子操作されたおよび／またはその他の修飾をされた形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプティボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性、抗体、ジアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデム型ジ−ｓｃＦｖ、タンデム型トリ−ｓｃＦｖ。単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物の重鎖抗体（ＶＨＨ）または軟骨魚類のＩｇＮＡＲ（ＶＮＡＲ）のいずれかの単一モノマー可変ドメインから操作することができる。特に明記しない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体フラグメントを包含すると理解されるべきである。用語はまた、ＩｇＧおよびそのサブクラスを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む、無傷または完全長の抗体を包含する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはそのフラグメントである。「ヒト化」抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲアミノ酸残基がヒトＦＲに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、典型的にはヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化を受けた非ヒト抗体の変異体を指す。いくつかの実施形態において、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、抗体の重鎖および軽鎖は、完全長であり得るか、または抗原結合部分（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））であり得る。その他の実施形態において、抗体重鎖定常領域は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択され、特に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、より具体的にはＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）から選択される。別の実施形態において、抗体軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダ、特にカッパから選択される。
【００６５】
提供される抗体には、抗体フラグメントがある。「抗体フラグメント」は、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ジアボディ、直鎖抗体；可変重鎖（ＶＨ）領域、ｓｃＦｖｓおよび単一ドメインＶＨ単一抗体のような単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体、が含まれる。特定の実施形態において、抗体は、可変重鎖領域および／またはｓｃＦｖなどの可変軽鎖領域を含む単鎖抗体フラグメントである。
【００６６】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体、例えば抗体フラグメントに関して使用される場合、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖（それぞれＶＨとＶＬ）の可変ドメインは、一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む。（例えば、キント（Ｋｉｎｄｔ）他、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７））、を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分な場合がある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、ポルトラノ（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ）他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０：８８０−８８７（１９９３）；クラークソン（Ｃｌａｒｋｓｏｎ）他、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）、を参照されたい。
【００６７】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部、あるいは軽鎖可変ドメインの全てまたは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。
【００６８】
抗体フラグメントは、限定されるものではないが、無傷の抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞による産生を含む様々な技術によって作製することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、天然には存在しない配列を含むフラグメント、例えば、合成リンカー（例えばペプチドリンカー）によって連結された２つ以上の抗体領域または鎖を有するフラグメント、および／または天然に存在する無傷の抗体の酵素消化によって産生されない可能性があるフラグメントのような組換えにより産生されたフラグメントである。いくつかの態様において、抗体フラグメントはｓｃＦｖｓである。
【００６９】
抗体工学の一般原則は、ボレベック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）編、（１９９５年）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版；オックスフォード大学出版局）に記載されている。タンパク質工学の一般原則は、リックウッド（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）他編、（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（オックスフォード大学出版局のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、英国オックスフォード）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原則は、ニソノフ（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ）、（１９８４年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，マサチューセッツ州サンダーランド）；およびスチュアート（Ｓｔｅｗａｒｄ）、（１９８４年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，ニューヨーク州ニューヨーク）に記載されている。さらに、当技術分野で知られており、具体的に説明されていない免疫学の標準的な方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク）；スティテス（Ｓｔｉｔｅｓ）他編、（１９９４年）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，コネチカット州ノーウォーク）およびミシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシーギ（Ｓｈｉｉｇｉ）編、（１９８０年）、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ニューヨーク州）に従うことができる。
【００７０】
免疫学の一般原則を説明する標準的な参考文献には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク）；クライン（Ｋｌｅｉｎ）、（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州）；ケネット（Ｋｅｎｎｅｔｔ）他編、（１９８０年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州）；キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、（１９８４年）、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，編、バーデン（Ｂｕｒｄｅｎ）他、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，アムステルダム）；ゴールズバイ（Ｇｏｌｄｓｂｙ）他編、（２０００年）、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．）；ロイット（Ｒｏｉｔｔ）他、（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版、ロンドン：モスビー（Ｍｏｓｂｙ））；アッバス（Ａｂｂａｓ）他、（２００５年）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第５版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；コンターマン（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ）およびドゥベル（Ｄｕｂｅｌ）、（２００１年）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；ルウィン（Ｌｅｗｉｎ）、（２００３年）、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，２００３年）；ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）およびデベクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）、（２００３年）、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）が含まれる。
【００７１】
ＩＶ．Ｐα−ｓｙｎ＊または関連するα−ｓｙｎ変異体を利用する他の方法
ＰＤおよびその他のシヌクレイノパシーの治療に有用な新規抗体の生成に加えて、Ｐα−ｓｙｎ＊またはその非リン酸化対応物を他の治療薬の入手に使用することもできる。例えば、それをマーカーまたはツールとして使用して、新規治療化合物をスクリーニングすることができる。また、ｐα−ｓｙｎ＊に特異性を付与する立体構造エピトープを認識する抗体ではなく、ポリマーを生成するために用いることもできる。一態様において、本発明は、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの治療に有用であり得る治療活性を有する薬剤を同定する方法を提供する。様々な実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、インビトロで、細胞内で、またはトランスジェニック動物を用いて行うことができる。好ましくは、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーの細胞または動物モデルが方法において使用される。例えば、モデルは、本明細書に例示されるように、α−ｓｙｎ（ＰＦＦ）の予め形成されたフィブリルが注入された培養初代ニューロンまたは細胞株であり得る。モデルはまた、ＰＤまたは他のシヌクレイノパチーの特徴を示すトランスジェニック動物であってもよい。典型的には、細胞または動物モデルは、複数の候補薬剤と接触されるか、または同候補薬剤を投与される。次に、細胞または動物を、潜在的な治療活性を証明する細胞応答または表現型について検査する。上記のように、本発明のこれらの方法では、様々な治療活性を調べることができる。例えば、方法は、Ｐα−ｓｙｎ＊の形成またはミトコンドリア毒性活性を破壊または阻害する能力について候補薬剤を試験することを含み得る。いくつかの実施形態において、候補薬剤は、Ｐα−ｓｙｎ＊の形成の阻害における活性についてスクリーニングすることができる。本明細書に示されるように、Ｐα−ｓｙｎ＊は、Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルの部分的な分解により形成することができる。いくつかの実施形態において、候補薬剤は、Ｐα−ｓｙｎ＊の分解における活性についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、候補薬剤は、Ｐα−ｓｙｎ＊への結合についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、候補薬剤は、ミトコンドリアの機能障害およびフラグメント化、シナプスの病理、ｐＡＣＣ凝集体の形成、ＭＡＰＫまたはＧＳＫ３βのリン酸化、ミトコンドリアにおけるｐｔａｕ凝集体の形成など、Ｐα−ｓｙｎ＊の神経毒性を予防する活性についてスクリーニングすることができる。これらの方法において、候補薬剤（抗体または小分子などの他の化合物）を、本明細書に記載のように、ＰＦＦを播種した初代ニューロンまたは細胞株またはα−ｓｙｎ＊ポリペプチドを発現する操作された細胞と接触させることができる。代替的に、候補薬剤は、本明細書に記載されるように、α−ｓｙｎ＊ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物に投与されてもよい。Ｐα−ｓｙｎＦからＰα−ｓｙｎ＊への変換に対する候補薬剤の効果は、本明細書に例示されるように容易に監視することができる。いくつかの方法において、Ｐα−ｓｙｎ＊形成を実質的に阻害または遅延するか、またはＰα−ｓｙｎ＊分解を誘導することができる候補化合物は、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーを治療するための潜在的な��療薬として同定される。これらのアッセイにおけるＰα−ｓｙｎ＊の検出と定量は、Ｐα−ｓｙｎ＊に選択的な抗体を使用して容易に実施できる。例示として、Ｐα−ｓｙｎ＊を特異的に認識するがＰα−ｓｙｎＦを特異的に認識しない１つの抗体は、本明細書中に記載されているウサギ抗−ｐＳ１２９α−ｓｙｎ抗体ＧＴＸ５０２２２ロット８２１５０５１７７である。ミトコンドリアの正常性、樹状突起の正常性、キナーゼ活性化、ｐＡＣＣ凝集体の形成、ｐｔａｕ凝集体の形成についての候補薬剤の効果は、本明細書に例示するように容易に監視することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、そのような活性を有すると細胞モデルで同定された薬剤は、ＰＤの動物モデルの二次スクリーニングにおいて、または疾患の運動、行動、認知または他の症状に対する活性を決定するための臨床治験において、さらに評価することができる。いくつかの関連する実施形態において、本発明は、ＰＤおよびシヌクレイノパチーの治療に対する既知の薬物および他の薬剤の効果を評価するための方法も提供する。同様に、これらの方法は、Ｐα−ｓｙｎ＊の形成またはミトコンドリア毒性活性、Ｐα−ｓｙｎ＊のシナプス毒性活性、Ｐα−ｓｙｎ＊のキナーゼ活性化活性、またはＰα−ｓｙｎ＊によって誘導されるｐＡＣＣまたはｐｔａｕ凝集体の形成を破壊または阻害する能力に関して、既知の薬物または薬剤をテストすることを含む。特定の実施形態において、候補薬剤または潜在的な治療薬は、インビボまたはインビトロでα−ｓｙｎ由来ポリペプチドのいくつかの活性または機能を阻害する。特定の実施形態において、候補薬剤または潜在的な治療薬は、リン酸化アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）凝集体のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介の形成を阻害する。ある実施形態において、候補薬剤または潜在的な治療薬は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８、細胞外シグナル制御キナーゼ５（ＥＲＫ５）などのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介のリン酸化を阻害する。ある実施形態において、候補薬剤または潜在的な治療薬は、リン酸化タウ凝集体のα−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介の形成を阻害する。ある実施形態において、候補薬剤または潜在的な治療薬は、α−ｓｙｎ由来ポリペプチド媒介のシナプス毒性およびニューロンの樹状突起棘の喪失を阻害する。
【００７３】
ある実施形態において、スクリーニングアッセイに基づいて特定された潜在的な治療薬は、それらの治療活性を試験するために選択される。ある実施形態において、治療活性は、シヌクレイノパチーの細胞モデルにおける毒性活性の阻害、または病原性リン酸化α−ｓｙｎの生成および伝搬の減少である。
【００７４】
候補薬剤／試験薬剤：本発明のスクリーニング方法では、天然に存在するまたは人工的に生成された薬剤を含む、様々な候補薬剤を使用することができる。それらは、抗体、タンパク質、ペプチド、低分子有機化合物、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、核酸、および様々な構造類似体またはそれらの組み合わせなど、任意の化学クラスのものであり得る。いくつかの実施形態において、スクリーニング方法は、候補薬剤のコンビナトリアルライブラリを利用する。コンビナトリアルライブラリは、段階的な方法で合成することができる多くの種類の化合物について生成することができる。そのような化合物には、ポリペプチド、ベータターン模倣物、核酸、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシンおよびオリゴカルバメートが含まれる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリは、Ａｆｆｙｍａｘ、国際公開第ＷＯ９５／１２６０８号、Ａｆｆｙｍａｘ、国際公開第ＷＯ９３／０６１２１号、コロンビア大学、国際公開第ＷＯ９４／０８０５１号、薬局方（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、国際公開第ＷＯ９５／３５５０３号およびスクリプス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）、国際公開第ＷＯ９５／３０６４２号（それらの各々は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているコード化合成ライブラリ（ＥＳＬ）方法によって構築することができる。ペプチドライブラリは、ファージディスプレイ法によって生成することもできる。例えば、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）の国際公開第ＷＯ９１／１８９８０号を参照されたい。いくつかの方法において、細胞または動物モデルにおけるＰα−ｓｙｎ＊形成を破壊または阻害する能力を調べる前に、候補薬剤のコンビナトリアルライブラリを、Ｐα−ｓｙｎ＊に結合するそれらの能力を決定することにより、適合性について最初に調べることができる。
【００７５】
候補薬剤には多数の化学クラスが含まれるが、通常は低分子有機化合物を含む有機化合物、オリゴヌクレオチドを含む核酸、ペプチド、または抗体である。低分子有機化合物は、適切には、例えば約４０または５０超であるが、約２５００未満の分子量を有し得る。候補薬剤は、タンパク質および／またはＤＮＡと相互作用する官能性化学基を含み得る。
【００７６】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリを含む多種多様な供給源から入手することができる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向性合成のための多数の手段が利用可能である。代替的に、例えば細菌、真菌および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリが入手可能であるか、または容易に作製される。
【００７７】
化学ライブラリ：コンビナトリアルケミストリの開発により、数百から数千の個別の化合物を迅速かつ経済的に合成することが可能である。これらの化合物は、通常、効率的なスクリーニングのために設計された小分子の中程度のサイズのライブラリに配列される。コンビナトリアル法を使用して、新規化合物の同定に適した偏りのないライブラリを生成できる。さらに、以前に決定された生物学的活性を有する単一の親化合物に由来する、より小さく多様性の少ないライブラリを生成することができる。
【００７８】
コンビナトリアル化学ライブラリは、試薬などのいくつかの化学物質「ビルディングブロック」を組み合わせることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化学化合物のコレクションである。たとえば、ポリペプチドライブラリなどの線形コンビナトリアル化学ライブラリは、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、可能な限りあらゆる方法で、多数の組合せで、一組の化学物質ビルディングブロック（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ）（アミノ酸）を組み合わせることによって形成される。何百万もの化学化合物は、化学物質ビルディングブロックのこのようなコンビナトリアルな混合によって合成することができる。
【００７９】
「ライブラリ」は、２〜５０，０００，０００の多様なメンバー化合物を含み得る。好ましくは、ライブラリは、少なくとも４８の多様な化合物、好ましくは９６以上の多様な化合物、より好ましくは３８４以上の多様な化合物、より好ましくは１万以上の多様な化合物、好ましくは１０万以上の多様なメンバー、最も好ましくは１００万以上の多様なメンバー化合物を含む。「多様な（ｄｉｖｅｒｓｅ）」とは、ライブラリ内の化合物の５０％以上が、ライブラリの任意の他のメンバーと同一ではない化学構造を有することを意味する。「多様な（ｄｉｖｅｒｓｅ）」とは、ライブラリ内の化合物の５０％以上が、ライブラリの任意の他のメンバーと同一ではない化学構造を有することを意味する。
【００８０】
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は、当業者によく知られている。総説については、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）他、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９６：５５５−６００、１９９６；ケナン（Ｋｅｎａｎ）他、Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｈａｐｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ、１９：５７−６４、１９９４；ジャンダ（Ｊａｎｄａ）、Ｔａｇｇｅｄ  ｖｅｒｓｕｓ  ｕｎｔａｇｇｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、９１：１０７７９−８５、１９９４；レブル（Ｌｅｂｌ）他、Ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、３７：１７７−９８、１９９５；アイヒラー（Ｅｉｃｈｌｅｒ）他、Ｐｅｐｔｉｄｅ，ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ，ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．、１５：４８１−９６、１９９５；チャバラ（Ｃｈａｂａｌａ）、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｌｅａｄｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６：６３２−９、１９９５；ドール（Ｄｏｌｌｅ）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．、２：２２３−３６、１９９７；フォーシュレ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ）他、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅａｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｏｂｏｔｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃａｎ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７５：６８３−９、１９９７；アイヒラー（Ｅｉｃｈｌｅｒ）他、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ、１：１７４−８０、１９９５；およびケイ（Ｋａｙ）他、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ、４：５３５−４３、２００１、を参照されたい。
【００８１】
化学的多様性ライブラリを生成するための他の化学物質も使用できる。そのような化学物質には、限定されるものではないが、ペプチド（国際公開第ＷＯ９１／１９７３５号）；コード化されたペプチド（国際公開第ＷＯ９３／２０２４２号）；ランダムバイオオリゴマー（国際公開第ＷＯ９２／０００９１号）；ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号明細書）；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー（ホッブス（Ｈｏｂｂｓ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６９０９−６９１３（１９９３））；ビニル性ポリペプチド（ハギハラ（Ｈａｇｉｈａｒａ）他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：６５６８（１９９２））；β−Ｄ−グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（ヒルシュマン（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ）他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：９２１７−９２１８（１９９２））；低分子化合物ライブラリの類似の有機合成（チェン（Ｃｈｅｎ）他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１６：２６６１（１９９４））；オリゴカルバメート（チョ（Ｃｈｏ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３（１９９３））；および／またはペプチジルホスホネート（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５９：６５８（１９９４））；核酸ライブラリ（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），全て前述、を参照されたい）；ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号明細書を参照されたい）；抗体ライブラリ（例えば、ヴォーン（Ｖａｕｇｈｎ）他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７、を参照されたい）；炭水化物ライブラリ（例えば、リアン（Ｌｉａｎｇ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号明細書を参照されたい）；小有機分子ライブラリ（例えば、ベンゾジゼピン，Ｂａｕｍ  Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ、１月１８日、３３頁（１９９３）を参照されたい）；イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号明細書）；チアゾリジノンおよびメタチアザノン（米国特許第５，５４９，９７４号明細書）；ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号明細書および米国特許第５，５１９，１３４号明細書）；モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号明細書）；ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号明細書）；など、が含まれる。
【００８２】
コンビナトリアルライブラリの調製のためのデバイスは市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ，３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ（ケンタッキー州ルイビル）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ（マサツーセッツ州ウーバン）、４３３Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州、フォスターシティ）、９０５０  Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ベッドフォード）、を参照されたい）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリ自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ（ニュージャージー州プリンストン）、Ａｓｉｎｅｘ（ロシア、モスクワ）、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントルイス）、ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ．（ロシア、モスクワ）、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ペンシルバニア州エクストン）、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ（メリーランド州コロンビア）など、を参照されたい）。
【００８３】
本発明のスクリーニングアッセイは、適切には、動物モデル、細胞ベースのシステムおよび非細胞ベースのシステムを含み、具体化する。同定された遺伝子、変異体、フラグメント、またはそのオリゴペプチドは、例えば、化合物のライブラリをスクリーニングすることによって、または他の方法で、種々の薬物スクリーニングまたは分析技術のいずれかによって、目的の化合物を同定することによって、治療上の目的の物質を同定するために使用される。そのようなスクリーニングで使用される遺伝子、対立遺伝子、フラグメント、またはオリゴペプチドは、溶液中で遊離しているか、固体支持体に固定されているか、細胞表面上に存在するか、または細胞内に位置する。測定は、以下の実施例のセクションで詳細に説明されているように実施される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、候補治療剤を同定する方法は、ハイスループットスクリーニングアッセイで特定の標的分子を含む試料をスクリーニングすることを含む。
別の実施形態において、治療剤を同定する方法は、（ｉ）標的分子を候補治療剤と接触させることと、（ｉ）候補治療剤がペプチドの機能またはパートナー分子とのペプチドの相互作用を調節するかどうかを決定すること；または（ｉｉ）候補治療剤が、本明細書に具体化される発光アッセイによって測定される標的の核酸配列の発現および／または機能を調節するかどうかを決定することと、を含む。
【００８５】
別の実施形態において、疾患の治療のための候補治療剤を同定する方法は、標的分子を発現する単離された細胞を培養することと、候補治療剤を培養細胞に投与することと、標的細胞の発現、活性および／または機能を、対照細胞と比較して候補治療剤の存在下または非存在下で相関させることと、を含み、薬物は望ましい治療結果に基づいて同定される。例えば、標的分子のレベルを調節する薬物であって、それによって、そのようなレベルが疾患状態の原因となるか、または標的分子が、経路の上流または下流にかかわらず、別の分子の活性または量を調節する薬物。他の例において、アッセイはキナーゼ活性を測定する。他の例において、アッセイは結合パートナーを測定する。他の例において、アッセイは望ましい治療結果を提供する候補治療薬の量を測定する。
【００８６】
診断および候補薬物発見のための別の適切な方法は、標的分子を発現する細胞と試験試料を接触させることと、標的分子、その対立遺伝子もしくはフラグメント、または標的分子の発現産物、その対立遺伝子もしくはフラグメントとの試験物質の相互作用を検出することと、を含む。
【００８７】
別の好ましい実施形態において、例えば患者からの細胞または体液などの試料を単離し、候補治療分子と接触させる。遺伝子、それらの発現産物は、どの遺伝子または発現産物が薬物によって調節されているかを特定するために監視される。
【００８８】
別の態様において、本発明は、ＰＤおよび他のシヌクレイノパチーに罹患した対象おける疾患の進行を診断または監視する方法を提供する。Ｐα−ｓｙｎ＊は、シヌクレイノパシーに罹患したヒトまたはシヌクレイノパシーの動物モデルにおける疾患の進行のバイオマーカーとして使用できる。実際、Ｐα−ｓｙｎ＊は、ミトコンドリアおよびシナプスの正常状態に影響を与える多くの毒性事象と因果関係があるため、細胞の病状が進行するにつれてＰα−ｓｙｎ＊の量が増加する。脳、その他の組織および体液のＰα−ｓｙｎ＊レベルは、ヒトまたは動物の疾患の進行を予測どおりに反映し、Ｐα−ｓｙｎ＊レベルを測定することは、臨床治験における疾患修飾治療の治療効果を監視するバイオマーカーとして使用できる。これらの方法は、対象由来の生物学的試料（例えば、組織または体液試料）において、本明細書に記載のＰα−ｓｙｎ＊免疫原またはＰα−ｓｙｎ＊に特異的な立体構造および毒性を示す関連変異体の存在および／または量を検出および測定することを必要とする。いくつかの方法において、生物学的試料は対象の脳から得られる。いくつかの実施形態において、検査したＰα−ｓｙｎ＊免疫原または変異体は、全長α−ｓｙｎタンパク質の、Ｎ末端アミノ酸残基約０〜２５個の欠失および／またはＣ末端アミノ酸残基約０〜２５個の欠失を有するα−ｓｙｎ変異体である。これらの実施形態のいくつかにおいて、検出および定量化されるべきα−ｓｙｎポリペプチドは、リン酸化されたＳｅｒ１２９をさらに含む。生物学的試料中のＰα−ｓｙｎ＊免疫原または変異体の検出および定量は、本明細書に例示される技術または当該分野で日常的に実施されているプロトコルに従って容易に行うことができる。
【００８９】
本発明はまた、上記のようにＰα−ｓｙｎ＊またはα−ｓｙｎ＊を生成する傾向があるα−ｓｙｎ構築物を発現する操作された細胞（例えば、神経細胞）およびトランスジェニック動物を提供する。操作された細胞およびトランスジェニック動物は、インビトロまたは動物モデルにて使用して、上記のようにＰＤおよびシヌクレイノパシーを研究するか、または治療剤の効力を試験することができる。導入遺伝子は、好ましくは、トランスジェニック動物の体細胞および生殖系列細胞のすべてまたは実質的にすべてに存在する。完全長の、および／または突然変異の、および／または短縮されたα−ｓｙｎをコードするポリヌクレオチドは、α−ｓｙｎ変異体が動物の神経細胞で発現されることを可能にする１つ以上の調節セグメントに機能的に連結される。導入遺伝子の発現には、ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター、プリオンタンパク質プロモーター、ヒトβアクチン遺伝子プロモーター、ヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）鎖遺伝子プロモーター、ラットナトリウムチャネル遺伝子プロモーター、マウスミエリン塩基性タンパク質遺伝子プロモーター、ヒト銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子プロモーター、および哺乳動物ＰＯＵ−ドメイン調節遺伝子プロモーターなどのプロモーターを用いることができる。任意選択的に、誘導プロモーターを使用することができる。亜鉛等の重金属をマウスの水又は飼料に添加することにより調節できるマウスメタロチオネインプロモーターが好適である。本発明の操作された細胞またはトランスジェニック動物は、当技術分野において記載されている一般的なアプローチ（例えば、マスリー（Ｍａｓｌｉａｈ）他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４８：２０１−１０、１９９６；フェニー（Ｆｅａｎｙ）他、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：３９４−８、２０００；および米国特許第５，８１１，６３３号明細書）によって作製できる。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供されるが、その範囲を限定するものではない。本発明の他の変形は、当業者には容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【００９１】
実施例１：Ｐα−ｓｙｎの２つの配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒｓ）Ｐα−ｓｙｎ＊とＰα−ｓｙｎＦの同定
α−ｓｙｎの予め形成されたフィブリル（ＰＦＦｓ）を有する初代ニューロンの播種は、異なる形態および細胞局在性を有するＰα−ｓｙｎの２つの配座異性体：Ｐα−ｓｙｎ＊およびＰα−ｓｙｎＦの細胞内蓄積をもたらすことが観察された。リン酸化Ｓ１２９α−ｓｙｎに特異的な２つの異なる抗体を使用して、１４日間にわたって徐々に蓄積する２つの異なるタイプのＰα−ｓｙｎ凝集体の存在を観察した（図１）。ニューロン死により、播種後２週間以上培養を維持できなかった。最初に出現した最も豊富な凝集体は、誘導後２〜３日でドット状の構造物および急速に形成された細長い束状凝集体、として可視化された。この形のＰα−ｓｙｎはフィブリル性（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）であることが知られており、Ｐα−ｓｙｎＦと命名された。４日目にはすでにＰα−ｓｙｎＦがＰＤ患者で報告されているＬｅｗｙ神経突起（ＬＮ）に類似した長繊維として現れ、６日目からは核の周囲に密に充填されたかご状構造として、常に極性を備えており、Ｌｅｗｙ小体（ＬＢ）を連想させるものであった（図１の１１日目および１４日目を参照）。加えて、より少なく、ほとんどが点状のＰα−ｓｙｎの実体も観察され、核周辺領域のＰα−ｓｙｎＦが密に充填された領域に次第に蓄積し、このＰα−ｓｙｎの特徴的な形はＰα−ｓｙｎ＊と呼んだ。ＰＦＦの代わりにα−ｓｙｎモノマーに曝露した細胞はＰα−ｓｙｎ凝集体を蓄積しなかった（図１３）。Ｐα−ｓｙｎ＊は、神経細胞に独占的に蓄積することがわかった（図１４）。培養物は約７０％の神経細胞からなり、非神経細胞の大部分は星状細胞であった。
【００９２】
Ｐα−ｓｙｎのリン酸化Ｓ１２９を含むエピトープを認識する２つの異なる抗体（方法に記載されているポリクローナルおよびモノクローナル）に対するＰα−ｓｙｎ＊およびＰα−ｓｙｎＦの厳密に選択的かつ相互排他的な免疫反応性は、これらの凝集体がＰα−ｓｙｎの異なる立体配座体を表し、Ｐα−ｓｙｎ＊抗体が立体構造エピトープを認識することを示した。この時点で、Ｐα−ｓｙｎＦとＰα−ｓｙｎ＊は同じ細胞インタラクトームでも生物学的効果でもないと推測された。
【００９３】
実施例２：Ｐα−ｓｙｎ＊は、ＰＦＦ注入マウスおよびＰＤ患者においてインビボでも見出される。
この知見のインビボでの関連性を確立するために、ＰＦＦを定位的に注入し、３０日後に安楽死させたマウスの脳を検査した。Ｐα−ｓｙｎＦとＰα−ｓｙｎ＊封入体の両方が観察され、ニューロン培養物と著しく類似した形態と細胞局在性を示した。線条体に注入したにもかかわらず、Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊封入体が皮質および黒質の両方に存在し、線条体に投射する脳領域に病原性Ｐα−ｓｙｎが出現することを示した。それらは、黒質よりも皮質に多かった（図２および図１５）。重要なことに、Ｐα−ｓｙｎ＊配座異性体もＰＤ患者の脳切片で観察され、このＰα−ｓｙｎ種のヒトＰＤ病因への関連性を示した。ニューロン培養物における観察と同様に、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体は、ＰＤ患者の脳におけるＬＢの近傍で一般的に観察された（図２）。しかしながら、ＬＢ負荷とＰα−ｓｙｎ＊の検出の間の定量的関係は確立されなかった。患者の特徴を表１に示す。
【００９４】
【表１】
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【００９５】
性別、１＝男性、２＝女性；満了年齢とは、個人の死亡時の年齢である；ＰＭＩ、剖検間隔、死亡から脳摘出までの時間数；統一（Ｕｎｉｆｉｅｄ）ＬＢステージ、統一レビー小体病期スコア、０＝レビー小体なし、Ｉ＝脳幹のみにレビー小体が存在する、ＩＩ＝脳幹および辺縁系にレビー小体が存在する、ＩＩＩ＝脳幹および辺縁系にレビー小体が存在し、大脳新皮質にびまん性に存在する；ＩＶ＝脳幹、辺縁系および大脳新皮質にレビー小体が存在する。
【００９６】
実施例３：Ｐα−ｓｙｎ＊は、Ｐα−ｓｙｎ＊フィブリルの不完全な分解から生じ得る。
用いた実験系では、Ｐα−ｓｙｎ＊はＰα−ｓｙｎＦフィブリルの不完全な分解の結果であった。Ｐα−ｓｙｎ＊はＰα−ｓｙｎＦフィブリル内の立体構造の変化に由来することを発見した。この変換は、元のＰα−ｓｙｎＦフィブリルの密度と厚さに依存して、３つのシナリオに従って起こるようであった。これらのフィブリルは二本鎖構造をとることが示されていることに注意することが重要である。第１のシナリオは、Ｐα−ｓｙｎ＊が低密度の薄いＰα−ｓｙｎＦフィブリルから脱落するというものである（図３Ａ〜Ｄ）。この場合、フィブリルのＰα−ｓｙｎＦコアの進行性崩壊とともに、Ｐα−ｓｙｎ＊がフィブリルから脱落しているように見えた。Ｐα−ｓｙｎ＊のパッチはＰα−ｓｙｎＦのパッチと混在し、最終的にフィブリル性コアは完全に消失し、新しく生じたＰα−ｓｙｎ＊凝集体のみが残った（図３Ｄ）。第２のシナリオは、密なＰα−ｓｙｎＦフィブリルがより明確にらせん状に絡み合っている場合に観察された。らせんの１本の鎖がほどけて「消化」され、残った鎖を修飾するＰα−ｓｙｎ＊凝集体が生じる（図３Ｅ〜Ｇ）。第３のシナリオでは、Ｐα−ｓｙｎＦの密な繊維は繊維の一端からＰα−ｓｙｎ＊に変換され、変換は他端に向かって進行するようであった（図３Ｈ）。この場合、フィブリルの一端はＰα−ｓｙｎＦ免疫反応性を示し、他端はＰα−ｓｙｎ＊免疫反応性を示し、明らかに分解フロントが観察された。
【００９７】
ウエスタンブロット分析は、これらの実験条件で、Ｐα−ｓｙｎ＊が１２．５ｋＤａで移動するＰα−ｓｙｎの切断種として検出できることを明らかにした（図３Ｉ、右側パネル、赤い矢印）。Ｐα−ｓｙｎ＊は、トリトンＸ−１００可溶性および不溶性画分の両方でＰＦＦ処理ニューロンにおいて特異的に検出され、おそらく遊離およびフィブリン結合凝集体に相当した。Ｐα−ｓｙｎ＊はまたＰＦＦ処理細胞の可溶性及び不溶性画分中に２５ｋＤａの二量体で検出された。加えて、Ｐα−ｓｙｎ＊抗体は、ＰＢＳおよびＰＦＦ処理細胞の両方の可溶性画分に存在する完全長のリン酸化α−ｓｙｎ（１５ｋＤａバンド）の基礎レベルも検出した。Ｃ末端（アミノ酸１２９〜１３０を含む）およびＮ末端α−ｓｙｎ抗体（α−ｓｙｎの最初の２５アミノ酸内にあるエピトープ）の両者は、Ｐα−ｓｙｎ＊を検出できた（図３Ｉ、最初の３つのパネル、赤い矢印）。このことは、この実験で検出されたＰα−ｓｙｎ＊の切断形が、２５Ａａ以下の損失、より可能性が高いのはＰα−ｓｙｎのＣ末端で１０Ａａ以下、Ｎ末端で２５Ａａ以下の損失から生じたことを示している（図３Ｉのスキーム）。注目すべきは、Ｐα−ｓｙｎＦ抗体は全長のＰα−ｓｙｎを認識した（図３Ｉの第４のパネル、緑色の矢印）が、１２．５ｋＤａのＰα−ｓｙｎ＊種もその２５ｋＤａの二量体も認識しなかったことであり、Ｐα−ｓｙｎ＊とＰα−ｓｙｎＦの免疫反応性の差が強調された（図３）。
【００９８】
まとめると、これらの形態学的および生化学的データは、Ｐα−ｓｙｎ＊がＰα−ｓｙｎＦフィブリルの部分的なタンパク質分解によって生じうることを示している。これらのデータはまた、Ｐα−ｓｙｎ＊とＰα−ｓｙｎＦとの間の異なる免疫反応性、したがって異なる立体構造エピトープを示している。
【００９９】
実施例４：Ｐα−ｓｙｎ＊はＰα−ｓｙｎＦの不完全なオートファジー分解の結果である。
ユビキチン化されたタンパク質凝集体を新生オートファゴソームの膜に固定されたＬＣ３に連結するアダプタータンパク質であるＰ６２は、Ｐα−ｓｙｎＦを顕著な一致で標識したが、Ｐα−ｓｙｎ＊は標識しなかった（図３Ａ〜Ｈ）。このことは、Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルがオートファジーを受けており、Ｐα−ｓｙｎ＊がこのタンパク質分解過程の結果である可能性を強く示唆した。この仮説を確認するために、ＰＦＦ処理細胞をオートファジーのいくつかの主要段階を再現する種々のマーカーで標識した。ユビキチン、ｐ６２およびＬＣ３抗体は、フィブリル性凝集体を示し、Ｐα−ｓｙｎ＊（図４Ａ〜Ｃ）をほとんど排除した。しかしながら、Ｐα−ｓｙｎ＊は、ＬＡＭＰ１陽性リソソームにおいて見出された（図４Ｄ）。これらの結果は、Ｐα−ｓｙｎＦがオートファジーを受けるが、オートファゴリソソーム消化が不完全であり、Ｐα−ｓｙｎ＊含有リソソ−ムを生じることを確認した。一方、２０Ｓプロテアソーム分解は非特異的であると思われた。Ｐα−ｓｙｎＦが豊富な細胞では、２０ＳプロテアソームはＰα−ｓｙｎＦフィブリルと会合していたが、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体とは会合していなかった（図１６ＡおよびＣ）。Ｐα−ｓｙｎＦ負荷の低い細胞では、２０ＳプロテアソームもＰα−ｓｙｎ＊と局在していた（図１６ＢおよびＤ）。豊富なＰα−ｓｙｎＦの状況では、２０Ｓプロテアソームのサブユニットは、ＰＢＳ対照または「低フィブリル」の状況と比較した場合に、細胞質および核の両方でより豊富な染色によって見られるように、上方制御されて現れた（図１６）。２０Ｓプロテアソームの上方制御は、高負荷のフィブリルを有するニューロンにおいてＰＦＦ播種後８日目から観察され、大きなＰα−ｓｙｎＦフィブリルを含む細胞の障害に対する反応であると考えられた。定量的共局在分析を行った。図１６Ｅは、Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊についてのマンダース共局在化係数を示し、Ｐα−ｓｙｎＦの大部分が、分解のためにユビキチンによってタグ付けされ、続いて、ｐ６２およびＬＣ３と係合するという観察を確認した。一方、Ｐα−ｓｙｎ＊は、ほとんどＬＡＭＰ１と共局在化し、Ｐα−ｓｙｎＦおよびＰα−ｓｙｎ＊の両方が２０Ｓプロテアソームと共局在化した。
【０１００】
Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルの成長は非常に動的であり、ＬＡＭＰ１小胞（オートファゴリソソームまたはリソソーム）に取り込まれたα−ｓｙｎＦ凝集体が２〜３日目、フィブリルが細胞内に見られる前（図５Ａ〜Ｃ、ＢおよびＣにおける小さなＰα−ｓｙｎ＊の点を参照）およびＰα−ｓｙｎＦが短いプロトフィブリルを形成する前（図５Ｄ〜Ｆ）に認められたことから、Ｐα−ｓｙｎ＊の同時形成を伴っていたと考えられる。その後、細胞がＰα−ｓｙｎＦフィブリルを含むようになると、ＬＡＭＰ１小胞がフィブリルのコアを貪食したり（図５Ｇ）、フィブリルを取り囲んだりし（図５Ｈ）、常にＰα−ｓｙｎ＊凝集体を含んでいることがわかった。Ｐα−ｓｙｎ＊形成の最後の段階は、図５Ｉ〜Ｋに示すように、リソソームから出ていくこと（ｅｘｉｔ）であった（崩壊したリソソームから出るＰα−ｓｙｎ＊凝集体を示す矢印を参照）。
【０１０１】
酸性オルガネラを染色する蛍光染料Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９を用いた。Ｐα−ｓｙｎ＊を取り込んだリソソーム（図５Ｌ、右ズーム正方形内の矢印）では、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＤＮＤ−９９染色は存在せず、近くにあるＰα−ｓｙｎ＊陰性ＬＡＭＰ１陽性小胞の陽性のＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＤＮＤ−９９シグナルとは対照的であった。この観察は、Ｐα−ｓｙｎ＊封入体を担持するリソソームが、おそらくＰα−ｓｙｎ＊蓄積の結果として、酸性の内部環境を欠いているという証拠を裏付けている。興味深いことに、弱いＬＡＭＰ１染色を示すが、良好なＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＤＮＤ−９９シグナルを示すいくつかの伸長した小胞は、ビーズ様の形に組織化されたＰα−ｓｙｎ＊封入体を含み、それらがフィブリルを分解するオートファゴリソソームである証拠を示した（図５Ｌ、左のズーム正方形矢じりは、弱ＬＡＭＰ１陽性小胞のＰα−ｓｙｎ＊凝集体を指す）。
【０１０２】
実施例５：オートファジー調節がＰα−ｓｙｎ＊の形成に影響を及ぼす。
ここでは、Ｐα−ｓｙｎ＊はＰα−ｓｙｎＦのオートファジー分解に起因することが明らかになったので、オートファジーフラックス（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｆｌｕｘ）の変調がＰα−ｓｙｎ＊形成速度に影響を与えるかどうかを試験した。ニューロンを２．５日間（ＰＦＦ曝露後３．５日目から）オートファジーモジュレータで処理し、処理終了時に検査した。オートファジーアクチベータであるラパマイシンで処理すると、より大きな（図６Ｂ）およびより多数の（図６Ｅ）Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体が形成された。リソソームの機能を破壊する化合物であるクロロキンで処理すると、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体の正味産生量が減少した（図６Ｅ）；さらに、ごく少数の細胞では、Ｐα−ｓｙｎＦの非存在下で多数のＰα−ｓｙｎ＊凝集を示す独特の表現型が認められた（図６Ｃ）。この表現型は、そうでなければＰα−ｓｙｎ＊が常にＰα−ｓｙｎＦを含む細胞にみられるのとは対照的である。クロロキン処理によりリソソームが機能しなくなるため、Ｐα−ｓｙｎ＊の排出速度が低下し、食作用流動が遅くなり、オートファゴソームにおけるＰα−ｓｙｎＦの保持時間が長くなり、Ｐα−ｓｙｎＦからＰα−ｓｙｎ＊への変換がより完全になると仮定された。この仮説はまた、Ｐα−ｓｙｎ＊がオートファゴリソソーム経路で生成されることを支持しており、オートファゴリソソームの特徴を示す小胞におけるＰα−ｓｙｎ＊封入体の観察と一致する（上述のように、図５Ｌの左ズーム正方形を参照されたい）。最後に、オートファゴソームの形成を阻害する化合物である３−メチルアデニン（３−ＭＡ）で処理すると、生成するＰα−ｓｙｎ＊凝集体の数が減少した（図６のＤおよびＥ）。
【０１０３】
全体として、これらのデータは、細胞オートファジー活性レベルがＰα−ｓｙｎ＊の形成速度に直接影響することを示した。
実施例６：Ｐα−ｓｙｎ＊はリソソーム放出後にミトコンドリアを標的とする。
【０１０４】
リソソーム放出に先立って、新生Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体がミトコンドリアネットワークの近傍に認められたが、それらと共局在しておらず、それらは時に蛇行形態を呈していた（図７Ａおよび図３Ａ〜Ｄ）。一方、成熟した顆粒状のＰα−ｓｙｎ＊凝集体がミトコンドリア細管（ｔｕｂｕｌｅｓ）の末端に接して認められた（図７Ｃ）。共焦点およびＳＴｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＳＴＥＤ）ナノスコピー（空間分解能５０ｎｍ未満）を行い、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体のミトコンドリア外膜（Ｔｏｍ２０で標識される）との直接会合を検証した。Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリア細管上でＴｏｍ２０と共局在することが見出された（図７ＤおよびＥ）。図７Ｆは、より小さいＰα−ｓｙｎ＊凝集体を示し、これにより、ミトコンドリア細管、および分裂したミトコンドリアを表し得る環状ミトコンドリア構造（図７Ｆ、右上パネル）との会合を視覚化することができる。Ｐα−ｓｙｎ＊沈着はミトコンドリアフラグメント化領域としばしば関連した（図７Ｇ）。
【０１０５】
実施例７：Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリア毒性（ｍｉｔｏｔｏｘｉｃ）である。
Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリア内膜の脱分極を誘導することが分かった。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓは、ミトコンドリア内膜の電気化学的勾配を測定し、それによりミトコンドリアが酸化的リン酸化を行いＡＴＰを生成する能力をスコア化する試薬である。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓを用いたミトコンドリア標識により、Ｐα−ｓｙｎ＊が膜電位を欠くミトコンドリア細管の末端に結合していることが示された（図１７）。この点をさらに実証するために、タンパク質インポート機構の一部であるミトコンドリア外膜の常在タンパク質であるＴｏｍ２０と、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓについてニューロンを共標識した。Ｔｏｍ２０抗体はＰα−ｓｙｎ＊が付加されたミトコンドリア末端を標識していたが、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ標識はそのような末端で完全に破壊された（ＰＢＳ処置ニューロンにおけるＴｏｍ２０およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓの共局在化について、図８Ｂを図８Ａと比較する）。これらのデータは、Ｐα−ｓｙｎ＊が、それが結合しているミトコンドリア部分の膜電位の消失を誘導することを示している。
【０１０６】
さらに、Ｐα−ｓｙｎ＊はシトクロムＣ放出、ミトコンドリアフラグメント化、ｐＡＣＣ凝集体形成、およびマイトファジーを誘導することが観察された。ミトコンドリア膜では、Ｐα−ｓｙｎ＊は通常、シトクロムＣ染色が増加した領域に局在していた（図９Ａの矢印）。シトクロムＣはミトコンドリア電位の喪失の結果としてミトコンドリア膜間腔に蓄積し、外膜透過後に放出される。シトクロムＣの蓄積および放出の領域に対応するＰα−ｓｙｎ＊封入体の観察は、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体によってキャップされたミトコンドリア細管の領域におけるミトコンドリア電位の消失の所見と一致している（上記参照）。
【０１０７】
注目すべき観察は、Ｐα−ｓｙｎ＊とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのリン酸化型との広範な共局在であった（ｐＡＣＣ、図９Ｂ、ＤおよびＥ）。繊維状ｐＡＣＣネットワークは、６日目から始まり、Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体を担持する細胞にて次第に失われ、点状（ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）ｐＡＣＣのミトコンドリアへの動員、Ｐα−ｓｙｎ＊との共局在化を伴った（図９Ｂの矢印）。ＡＣＣはミトコンドリア生合成に必須な脂肪酸合成の基質であるマロニルＣｏＡの産生を介して脂質代謝に関与する。ＡＣＣはリン酸化によって不活性化される。Ｐα−ｓｙｎ＊は初期ミトコンドリアストレスおよびＡＴＰ産生低下を誘導し、高レベルのＡＭＰとＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化をもたらすと提案されている。活性化されるとＡＭＰＫは多数の標的をリン酸化し、ＡＣＣが主要な基質となる。さらに、Ｐα−ｓｙｎ＊蓄積の結果としての損傷ミトコンドリアでのリン酸化ＡＣＣの正味の増加は、ＡＣＣノックダウンの効果、すなわちリポイル化欠損を再現することが提案されている。このように、ｐＡＣＣとＰα−ｓｙｎ＊の広範な共局在は、Ｐα−ｓｙｎ＊がエネルギー産生と脂肪酸合成を阻害し、構造的ミトコンドリア損傷を誘導することを強く証明する。当然のことながら、Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐＡＣＣ染色はシトクロムＣ放出領域と共局在していた（図９Ｄ）。
【０１０８】
Ｐα−ｓｙｎ＊は、非折畳みタンパク質応答およびミトコンドリア関連ＥＲ膜（ＭＡＭ）の常在タンパク質であるＴｏｍ２０およびＢｉＰの両方と共局在し、Ｐα−ｓｙｎ＊がミトコンドリア−ＭＡＭ接触領域に局在することを示した（図９Ｃおよび図１８Ａ）。ＢｉＰおよびＴｏｍ２０の共局在性はＰＢＳ対照と比較してＰＦＦ−播種培養物において増強された。定量的共局在分析は、全ての細胞Ｐα−ｓｙｎ＊の約半分がＭＡＭｓでＴｏｍ２０およびＢｉＰと関係することを示した（図９Ｅ）。ミトコンドリアストレスシグナルに連結したＭＡＭ−ミトコンドリア接触への障害はＰＤ、ＡＤおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含むいくつかの神経変性疾患で見出され、より精査が必要とされる領域を構成している。ＭＡＭはミトコンドリア分裂とオートファジー誘導の部位に対応することが分かった。従って、Ｐα−ｓｙｎ＊がＭＡＭｓでＢｉＰと共局在するという事実は、Ｐα−ｓｙｎ＊がミトコンドリアの構造的および機能的損傷を誘導してミトコンドリア分裂とマイトファジーをもたらすという発明者らのデータを支持する。マイトファジーはｐａｒｋｉｎ依存的な過程である。なぜなら、ｐａｒｋｉｎはミトコンドリア損傷領域にユビキチンをタグ付けして、マイトファジー除去を開始するからである。図１０Ａおよび１０Ｂは、ｐａｒｋｉｎと共局在するＴｏｍ２０／Ｐα−ｓｙｎ＊を担持するマイトファジーリソソーム（ｍｉｔｏｐｈａｇｉｃ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ）の存在を示す。
【０１０９】
Ｐα−ｓｙｎ＊と前述のマーカーとの関連とは対照的に、Ｐα−ｓｙｎ＊とエンドソームマーカーＥＥＡ１との共局在は認められなかった（図１８）。Ｐα−ｓｙｎ＊とペルオキシソームとの直接の関連（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は認められなかった（マーカーカタラーゼの使用、図１８）。
【０１１０】
Ｐα−ｓｙｎ＊を担持するマイトファジー食胞（ｍｉｔｏｐｈａｇｉｃ  ｖａｃｕｏｌｅｓ）の電子顕微鏡イメージングを行った。電子顕微鏡および相関光電子顕微鏡（ＣＬＥＭ）分析を用いて、（ミトコンドリア損傷部位を局在化するために）Ｐα−ｓｙｎ＊およびシトクロムＣの免疫蛍光（ＩＦ）標識の画像を超微細構造画像と重ね合わせた。後期段階（ＰＦＦ暴露後１４日間）の細胞の検査により、事実上全てのＰα−ｓｙｎ＊凝集体がマイトファジー食胞に含まれることが明らかになった（図１０Ｃ、赤色で標識され、タンパク質性凝集体に対応する中密度沈着物を含む食胞を参照されたい）。これらのマイトファジー食胞は、フラグメント化ミトコンドリアと直接接触していた（シトクロムＣに緑色の標識がついている、挿入図Ａ、Ｂおよび拡大図を参照されたい）。
【０１１１】
実施例８：ミトコンドリア毒性Ｐα−ｓｙｎ種のライフサイクル
Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルの分解不全に起因するミトコンドリア毒性Ｐα−ｓｙｎ種のライフサイクルを検査した。ユニークな立体配座α−ｓｙｎ種としてのＰα−ｓｙｎ＊の一次観察から始めて、Ｐα−ｓｙｎ＊がどのように発生し、どの細胞小器官に局在化し、その生物学的効果は何かを決定するために一連の実験を行った。「Ｐα−ｓｙｎ＊のライフサイクル」を図１１に示す。このモデルは次の通りである：ＰＦＦを播種したニューロンでは、α−ｓｙｎはミスフォールドされ、主にフィブリル性のＰα−ｓｙｎＦ凝集体を形成する。Ｐα−ｓｙｎＦはオートファジーによって分解される。しかしながら、フィブリルのオートファゴリソソーム分解は不完全かつ／または異常であり、Ｎ末端および／またはＣ末端がトリミングされていてもされていなくてもよい立体構造が変化したＰα−ｓｙｎ種である、Ｐα−ｓｙｎ＊を生じる。この立体構造の変化は、ｐＳｅｒ１２９を含むＣ末端の立体構造エピトープの曝露において直接またはアロステリックに生じ、Ｐα−ｓｙｎ＊の新規な免疫反応性を与える。Ｐα−ｓｙｎ＊はオートファゴリソソームで産生され、リソソームを損傷し、最終的にそこから出る。Ｐα−ｓｙｎ＊はその後ミトコンドリアに結合し、そこで、機能的損傷（ＡＣＣ不活性化、酸化およびエネルギーストレスに関連するミトコンドリア電位の損失）および構造的損傷（ミトコンドリアフラグメント化）ならびにシトクロムＣの放出を誘導する。Ｐα−ｓｙｎ＊はミトコンドリアとＭＡＭの接触部位に局在し、ミスフォールドしたタンパク質応答タンパク質ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）を含んでいる。ＭＡＭはＰα−ｓｙｎ＊誘導ミトコンドリア分裂に起因するｐａｒｋｉｎ依存性マイトファジー誘導に関与する。Ｐα−ｓｙｎ＊のライフサイクルは、Ｐα−ｓｙｎ＊とともにミトコンドリアの残屑のマイトファジー処分（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）で終わる。
【０１１２】
実施例９：Ｐα−ｓｙｎ＊はｐＴａｕ凝集体の形成を誘導する。
図１２に示すように、Ｐα−ｓｙｎ＊はｐＴａｕ凝集体と共局在していた。これは、Ｐα−ｓｙｎ＊がミトコンドリア膜でＴａｕのリン酸化とｐＴａｕ凝集体の形成を引き起こすことができることを示している。これらのｐＴａｕ凝集体は、Ｐα−ｓｙｎ＊の毒性作用に付加する可能性が高い。
【０１１３】
実施例１０：材料および方法
抗体リスト：
一次抗体：Ｐα−ｓｙｎ＊ではなく、Ｐα−ｓｙｎＦを認識するｐＳ１２９α−ｓｙｎに特異的なアルファ−ｓｙｎ抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからのマウス抗ｐＳ１２９α−ｓｙｎクローン８１Ａ（ＩＦ濃度１／５，０００、ＩＨＣ濃度１／５００）およびＡＢＣＡＭからのウサギ抗ｐＳ１２９α−ｓｙｎ［ＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）］（濃度１／１０００にてＷＢに使用される）であった。Ｐα−ｓｙｎ＊を認識するが、Ｐα−ｓｙｎＦを認識しないｐＳ１２９α−ｓｙｎに特異的なアルファ−ｓｙｎ抗体は、ＧｅｎｅＴｅｘからのウサギ抗ｐＳ１２９α−ｓｙｎ抗体ＧＴＸ５０２２２（ロット８２１５０５１７７）（ＩＦ濃度１／１，０００、ＩＨＣ濃度１／２００、ＷＢ濃度１／２５０）であった。本明細書に記載のデータは、この抗体が、Ｐα−ｓｙｎのｐＳｅｒ１２９を中心とする線形エピトープに対して向けられている一方で、立体構造エピトープを認識することを示している。他のα−ｓｙｎ抗体は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからのウサギ抗α−ｓｙｎ（ＮＴ）クローンＥＰ１６４６Ｙ（ＷＢ濃度１／５００）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのウサギ抗α−ｓｙｎクローンＤ３７Ａ６（Ｇｌｕ１０５）（ＷＢ濃度１／１０００）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのウサギ抗α−ｓｙｎ（ＣＴ）（ＷＢ濃度１／５００）であった。他の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのウサギ抗ホスホアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＳｅｒ７９（ＩＦ濃度１／１５０）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのウサギ抗ＢｉＰクローンＣ５０Ｂ１２（ＩＦ濃度１／１００）；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌからのヤギ抗カタラーゼ（ＩＦ濃度１／１５０）；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからのマウス抗シトクロムＣクローン６Ｈ２．Ｂ４（ＩＦ濃度１／１５０）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのウサギ抗ＥＥＡ１クローンＣ４５Ｂ１０（ＩＦ濃度１／１００）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのウサギ抗ＧＡＰＤＨ（ＷＢ濃度１／１，０００）；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからのニワトリ抗ＧＦＡＰ（ＩＦ濃度１／４，０００）；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのヤギ抗ＬＡＭＰ１（ＩＦ濃度１／４００）；ＭＢＬからのウサギ抗ＬＣ３（ＩＦ濃度１／５０）；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからのマウス抗ＮｅｕＮクローンＡ６０（ＩＦ濃度１／１５０）；Ａｂｎｏｖａからのマウス抗ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１クローン２Ｃ１１（ＩＦ濃度１／１５０）；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのマウス抗Ｐａｒｋｉｎ（ＰＲＫ８）（ＩＦ濃度１／５０）；Ｅｎｚｏからのウサギ抗プロテアソーム２０Ｓコアサブユニット（ＩＦ濃度１／５０）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのマウス抗ｐＴａｕ（ｐＳ２０２−Ｔ２０５）クローンＡＴ８（ＩＦ濃度１／２００）；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからのマウス抗Ｔｏｍ２０クローン２８Ｆ８．１（ＩＦ濃度１／７５）；Ａｂｃａｍからのウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＩＨＣ濃度１／７５０）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのマウス抗ユビキチンクローンＵｂｉ−１（ＩＦ濃度１／７５０、ＷＢ濃度１／３５０）、であった。
【０１１４】
二次抗体：Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの以下の二次抗体を使用した：ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８−コンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８−コンジュゲートロバ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４−コンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４−コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４−コンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４−コンジュゲートロバ抗ニワトリＦａｂ２フラグメントＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−コンジュゲートロバ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）。分子プローブ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）抗体は：ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ２）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ２）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ２）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−コンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、であった。Ａｂｂｅｒｉｏｒ  ＧｍｂＨ抗体はＡｂｂｅｒｉｏｒ  ＳＴＡＲ  ＲＥＤヤギ抗マウスＩｇＧであった。さらに、核の対比染色にはＤＡＰＩ染色を使用した。
【０１１５】
Ａｂｂｅｒｉｏｒ  ＳＴＡＲ  ＲＥＤ（１／１００）を除くすべての二次抗体を、１／１５００〜１／２０００の濃度でＩＦに用いた。ＩＨＣアッセイでは、使用濃度は１／５００であった。ウェスタンブロットアッセイには、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）およびＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＬＴヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を１／２５００の濃度で使用した。
【０１１６】
初代ニューロン培養物およびＰＦＦ播種：初代ニューロン培養物を、標準手順を用いてＥ１６−Ｅ１８  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から調製した。免疫蛍光実験のために、解離した海馬ニューロンを、２４ウェルプレートに配置されたポリ−Ｌ−リジン被覆ガラスカバーガラス上に、１２５，０００細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングした。生化学的アッセイのために、解離した皮質ニューロンを１，０００，０００細胞／ウェルの細胞密度でポリ−Ｌ−リジン−被覆６−ウェルプレート上にプレーティングした。
【０１１７】
プレーティング中、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ウマ血清およびペニシリン／ストレプトマイシン中に１時間維持した。その後、培地を交換し、ニューロンを無血清のニューロン特異的培地（ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（登録商標）培地、Ｎ２、Ｂ２７、ピルビン酸ナトリウムおよびＧＬＵＴＡＭＡＸ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。培養物を、５％ＣＯ２で加湿した３７℃インキュベーター内に維持した。
【０１１８】
ニューロン培養物に、インビトロ（ＤＩＶ）で５〜６日目にＰＦＦを播種した。組換え全長の野生型α−ｓｙｎＰＦＦを精製し、前述のように調製した（ボリピセリ（Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ）−ダレイ（Ｄａｌｅｙ）他、２０１１，２０１４を参照されたい）。簡単に述べれば、精製したα−ｓｙｎ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で５日間一定攪拌してインキュベートし、次いでアリコートを調製し、−８０℃で保存することによってα−ｓｙｎＰＦＦを生成した。播種の直前に、ＰＦＦを０．１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳで希釈し、３０秒間超音波処理（０．５秒ＯＮ、０．５秒ＯＦＦ、出力３０％）し、ニューロン培地で希釈した。ウェル当たり２μｇ／ｍｌのＰＦＦ（最終）を、免疫蛍光実験のために２４ウェルプレート上に添加し、ウェル当たり４μｇ／ｍｌのＰＦＦ（最終）を、生化学アッセイのために６ウェルプレートに添加した。対照条件の場合、ＰＢＳの等量をニューロン培養物に添加した。
【０１１９】
２４ウェルプレート上でウェル当たりモノマー４μｇ／ｍｌの濃度のα−ｓｙｎモノマーの添加を対照として行った。
オートファジー調節アッセイ：解離した海馬ニューロンを、１２５，０００細胞／ウェルの細胞密度で、２４ウェルプレートに配置したポリ−Ｌ−リジンコーティングガラスカバースリップ上にプレーティングし、５〜６ＤＩＶでＰＦＦ（または対照用の等量のＰＢＳ）を播種した。細胞を、これらの条件下で３．５日間（この時点までに、ＰＦＦの接種材料はニューロンに取り込まれ、そして／または分解された）増殖させ、次いで、オートファジーモジュレータまたはビヒクル対照：ビヒクル（ＤＭＳＯまたは水）、ラパマイシン３００ｎＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｓ１０３９）、クロロキン１μＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｃ６６２８）および３−メチルアデニン１ｍＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｍ９２８１）、を添加した。その後、ニューロン培養物を、ＰＦＦ播種後の合計６日まで余分に２．５日間増殖させ、固定し、免疫蛍光のために処理した。Ｐα−ｓｙｎ＊生成に及ぼすオートファジー調節の影響を評価するために、処理当たり合計２００細胞を評価し、細胞当たりのＰα−ｓｙｎ＊凝集体の数を、倍率１００倍にて盲検様式で計数した。
【０１２０】
免疫蛍光実験：４％（ｗ／ｖ）スクロースを含有するＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを用いて、ニューロンを室温で３０分間固定した。ニューロンをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で６分間透過処理し、再びＰＢＳ中で洗浄し、室温で１時間ブロックした。第１の一次抗体（４℃で一晩）で標識し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８，５９４または６４７コンジュゲート二次抗体（暗所室温１時間）とインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、ＰＲＯＬＯＮＧ（登録商標）金褪色防止（ａｎｔｉｆａｄｅ）剤を顕微鏡スライド上に載せた。
【０１２１】
同じ種にホストされた抗体を用いて実施された二重標識実験の場合、アッセイは以下のように行われた。免疫蛍光プロトコルは、第１の一次抗体および二次抗体を用いて前述したように実施した。ＤＡＰＩ染色後、一次／二次抗体複合体を固定化するために、４％（ｗ／ｖ）スクロース含有ＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドによる第２の固定ステップを含めた。培養物をＰＢＳで洗浄し、再び室温で１時間ブロックした。第２の一次抗体（通常は、ＣｏｖａｎｃｅからのＰα−ｓｙｎ８１ＡまたはＧｅｎｅＴｅｘからのｐＳ１２９α−ｓｙｎ）を、製造業者の説明書に従って、Ｍｉｘ−ｎ−Ｓｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を用いてコンジュゲートした。次いで、このコンジュゲート抗体を細胞に添加し、暗所かつ室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＲＯＬＯＮＧ（登録商標）金褪色防止剤を用いて顕微鏡スライド上に載せた。
【０１２２】
Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９の使用を含むアッセイを、以下のように実施した。細胞を２５０μＭの濃度のＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９で負荷し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）スクロースを含有するＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．０１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３分間穏やかな透過化工程に供した（適切な抗体染色を可能にし、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）色素の除去を回避するのに十分なように）。その後のステップ（ブロッキング、標識付け、マウンティング）は、上記と同様であった。
【０１２３】
Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓの使用を含むアッセイを以下のように実施した。細胞に２５０μＭの濃度のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓを負荷し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）スクロースを含有するＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。その後のステップ（ブロッキング、標識付け、マウンティング）は既に記載したものと同様であった。注目すべきことに、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓは、生細胞中のミトコンドリアを染色する赤色蛍光色素であり、その蓄積は膜電位に依存する、ことである。
【０１２４】
共焦点およびＳＴｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＳＴＥＤ）ナノスコピー：スペクトル共焦点顕微鏡（オリンパス、ＦＶ１０００）を用いて細胞を可視化した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いてキャプチャされデジタル化された。場合によっては、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像を分析した。画像はすべてＡｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を用いて処理した。ＩｍａｇｅＪプラグインＪＡＣｏＰを使用して、共局在分析を実行した。図１、２、３、６、１３、１４、および１５は（４〜６の共焦点画像の）Ｚ−スタック再構築である。その他の図は共焦点画像（０．２μｍ）から構成される。
【０１２５】
パルス化７７５ｎｍＳＴＥＤレーザと組み合わせた５６１ｎｍおよび６４０ｎｍのパルス励起レーザを用いて、２色Ｅｘｐｅｒｔ  Ｌｉｎｅ  Ａｂｂｅｒｉｏｒ  ＳＴＥＤ（ドイツ、ゲッティンゲン所在のＡｂｂｅｒｉｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ）によるＰＦＦまたはＰＢＳでの処置７日後に初代ニューロンのＳＴＥＤナノスコープを実施した。画像はＱＵＡＤビームスキャナを用い、１００倍油浸対物レンズ（ＮＡ１．４）で記録した。全画像を共焦点解像度（すなわち、非活性化ＳＴＥＤビーム）と２Ｄ−ＳＴＥＤ解像度の両方で記録した。画素サイズ（ｘ，ｙ）は共焦点画像とＳＴＥＤ画像で同様に２５ｎｍであり、画素滞留時間（ｐｉｘｅｌ  ｄｗｅｌｌ  ｔｉｍｅｓ）は、共焦点画像の１０〜１５μｓおよびＳＴＥＤ画像の３０〜６０μｓであった。画像スタックは、典型的には、２〜４μｍの間の総距離にわたる４００ｎｍの軸方向ステップサイズで記録された。画像はラインインタリーブ取得を用いて記録した；すなわち、すべてのラインを、共焦点およびＳＴＥＤ解像度の両方のカラーチャネルに対して連続的に記録した。ＳＴＥＤレーザ出力は典型的には１２５０ｍＷ  ＳＴＥＤビームの４０〜８０％（出力電力）であった。画像は、ＩｍＳｐｅｃｔｏｒソフトウェアパッケージ（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）を用いて取得および処理し、輝度およびコントラストレベルは、画像スタック全体にわたって均一に調整した。
【０１２６】
電子顕微鏡および相関光電子顕微鏡（ＣＬＥＭ）分析：蛍光画像を撮影した後、カバーグラスをＰＢＳ中のスライドグラスから穏やかに取り外し、カバーグラス上の細胞を、４℃にて一晩、１５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２．５％グルタルアルデヒド（ＥＭグレード、５０％水溶液、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で固定した。緩衝液中、次いで水中で洗浄した後、細胞を氷上の１％ＯｓＯ４水溶液で１時間処理し、１％酢酸ウラニル水溶液で１時間一括染色し、エタノールおよびアセトン系で脱水し、Ｄｕｒｃｕｐａｎ樹脂（Ｓｉｇｍａ）中に平坦に包埋した。次に、試料を６０℃で２日間重合した。タイリング（ｔｉｌｉｎｇ）を備えた透過光（ＬＳＭ８８０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いてカバーガラス全体を画像化し、モンタージュ画像マップを用いて重合ＥＭ試料中の標的細胞位置を再発見した。共焦点顕微鏡で撮像した標的細胞を含む小領域をトリミングし、ＡＴＵＭｔｏｍｅ（ＲＭＣ  Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ）を用いて６０ｎｍの厚さで連続的に極薄切片を作製した。切片を導電性プラスチックテープに採取し、１００ｍｍシリコンウェハー上で整列させ、Ａｔｌａｓ  ５ＡＴソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いてＭｅｒｌｉｎ  ＶＰ  Ｃｏｍｐａｃｔ走査電子顕微鏡で調べた。関心領域を低倍率で連続的に画像化し、タイル状の（ｔｉｌｅｄ）光学顕微鏡画像マップに相関させた。２．５ｋＶのＢＳＥモードのＩｎＬｅｎｓ  Ｄｕｏ検出器を使用して、３０ｎｍ／ピクセル解像度で５×５のタイリングで標的細胞を再度連続的に画像化した。画像タイルは半自動的に貼り合わせして（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）、全ての第２の画像はフィジー（Ｆｉｊｉ）を使用して位置合わせした。このスタックから、代表的な共焦点画像（厚さ０．８４μｍ）に対応する７つの画像を選択し、さらに１５ｎｍ／ピクセル解像度で撮像した。７つのＥＭ画像のうちの１つを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳ６を用いて高倍率蛍光画像上に重ねた。以下のセクションを使用して、微細構造と図中の蛍光画像とのより良い対応を示す。
【０１２７】
逐次タンパク質抽出及びウエスタンブロット分析：ＴｒｉｔｏｎＸ−１００可溶性及び不溶性画分を以下のように得た：１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭＤＴＴ、４００ｎＭＰＭＳＦ及びプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加した塩基性溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物を含む溶解緩衝液中に４℃でニューロンを掻爬した。溶解物を１０回（０．５秒ＯＮ、０．５秒ＯＦＦ、出力１０％）超音波処理し、３０分間インキュベートし、２５，０００ｇで４５分間、４℃で遠心分離した。その後、上清をペレットから分離し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合し、煮沸し、−２０℃で保存した。ペレットをＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解緩衝液で洗浄し、１０回（０．５秒ＯＮ、０．５秒ＯＦＦ、出力１０％）超音波処理して再懸濁し、２５，０００ｇで４５分間、４℃で遠心分離した。上清をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合し、煮沸し、−２０℃で保存した。ペレットを、２％ＳＤＳを含む溶解緩衝液中に再懸濁し、４℃で１０回（０．５秒ＯＮ、０．５秒ＯＦＦ、出力１０％）超音波処理し、３／１を４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合し、煮沸し、−２０℃で保存した。
【０１２８】
試料を分離し、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１０％アクリルアミド）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。分離したタンパク質を、２０％メタノールを含有するＮＵＰＡＧＥ（登録商標）トランスファーバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のニトロセルロース膜に移した。膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＴＴＢＳ０．０５％）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で洗浄し、次いで、室温で、ＢｌｏｃｋＯｕｔ（登録商標）ブロッキングバッファー（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）中で１時間ブロックした。ブロットをＢＬＯＣＫＯＵＴ（登録商標）バッファー中、一次抗体と共に４℃で１２時間インキュベートした。ＴＴＢＳ０．０５％で洗浄した後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＩＲＤｙｅ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線画像システム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてブロットを画像化した。
【０１２９】
ローディング制御については、室温で１５分間、ＲＥＳＴＯＬＥＴＭ（商標名）ＰＬＵＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて膜を剥離した。その後、膜をＴＴＢＳ０．０５％で洗浄し、暗所で室温にてＢＬＯＣＫＯＵＴ（登録商標）緩衝液中で１時間ブロックした。次いで、ブロットをＧＡＰＤＨ一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。その後のステップは上記と同様であった。
【０１３０】
マウスにおけるアルファ−ｓｙｎＰＦＦ注入：すべての動物実験は、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｆｌｏｒｉｄａ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って行われた。体重２５〜３０ｇの３か月齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。それらを無作為に２群に分け、生理食塩水（ｎ＝６）またはα−ｓｙｎＰＦＦ（ｎ＝６）を投与した。マウスを試験開始前に１週間順化し、ケタミンおよびキシラジンの腹腔内注射により麻酔し、定位フレーム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に置いた。マウス線条体の右側に定位座標（ＡＰ＋０．２ｍｍ，ＭＬ＋２．０ｍｍ，ＤＶ−２．６ｍｍ）で片側注入（動物に単回投与）を行った。一定量の２μｇ／μｌの濃度のα−ｓｙｎＰＦＦを含有する２．５μｌの生理食塩水または対応する量の生理食塩水のみを、２６ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび電動定位注入器（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を用いて０．５μｌ／分の速度で注入した。注入路に沿って逆流を防ぐために針を後退させる前に、各注入後５分間、針を定位置に置いた。α−ｓｙｎ凝集体の形成は３０日間続けることが可能であった。その時点でＩＨＣのために脳を採取した。
【０１３１】
動物をケタミンおよびキシラジンの過量投与により安楽死させ、続いて０．９％生理食塩水、次いで４％パラホルムアルデヒドで心臓灌流した。脳を取り出し、さらに４％パラホルムアルデヒド中で４℃にて１日間、後固定し、その後３〜４日間、（凍結保護のために）３０％スクロースに浸漬した。脳を埋め込み、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中で凍結し、切片作製まで−８０℃で凍結保存した。対称な４０μｍ厚の切片をブレグマに対して＋０．２〜−４．０ｍｍのクライオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ）で切断し、線条体または黒質の部分を含むいくつかの切片（約２１〜２４のスライス）を遊離浮遊法によりＩＨＣ用に処理した。簡単に述べれば、遊離浮遊脳切片を、ＰＥＬＣＯ  ＰＲＥＰ−ＥＺＥ（商標名）ＴＭ２４ウェルプレートメッシュインサート（ＴｅｄＰｅｌｌａ社）中に一定の撹拌下で置き、ＴＴＢＳ０．１％で数回洗浄して、過剰のＯＣＴおよび凍結保護剤を除去した。次いで、試料を１５分間０．３％過酸化水素で前処理し、ＴＴＢＳ０．１％で洗浄し、次いで室温にて１時間４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。第１の一次抗体（４℃で一晩）で標識し、ＴＴＢＳ０．１％で洗浄した後、脳切片をＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８または５９４コンジュゲート二次抗体（暗所の室温で２時間）とインキュベートし、再度ＴＴＢＳ０．１％で洗浄した。切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド上にマウントし、ＤＡＰＩ（１：４）を含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ（商標名）マウンティング培地を各切片に滴下した。次にスライドをカバーガラスおよびマニキュア液を用いて密封し、４℃で保存した。
【０１３２】
黒質緻密部（ＳＮｐｃ）の適切な同定のために、いくつかの脳切片をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する抗体とともに４℃で一晩インキュベートしたことは注目に値する。次いで、ＴＨ陽性切片に隣接するこれらのスライスを選択して、ｐＳ１２９α−ｓｙｎ特異的抗体について染色した。
【０１３３】
スペクトル共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００）を用いて脳切片を可視化した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いてキャプチャされデジタル化された。場合によっては、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像を分析した。画像はすべてＡｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を用いて処理した。
【０１３４】
死後のヒト脳組織：６５歳〜９０歳の範囲の高齢の対象の前頭皮質の固定脳剖検切片は、パーキンソン病および関連疾患のためのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｂａｎｎｅｒ  Ｓｕｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（アリゾナ州サンシティ）−Ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｄｏｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＢＤＰ）−によって親切に提供された。受領した試料は、パーキンソン病に罹患していない８人の患者、「低レビー小体」に分類される８人のＰＤ患者、および「高レビー小体」に分類される８人のＰＤ患者からの、４％緩衝化ホルムアルデヒドで固定された４０μｍの遊離浮遊切片を含んでいた。対象をＩＩ〜ＶのＢｒａａｋスコアに従って分類した。非パーキンソン病の対象をこの研究の対照症例として用いた。
【０１３５】
ホスホ−α−シヌクレイン染色を行うために、全ＢＢＤＰ剖検脳の神経病理学的評価のための標準プロトコルを用いた（若干の修正を伴う）。簡単に述べれば、４０μｍ厚さの遊離浮遊脳切片を小片に切断し、一定の撹拌下でＰＥＬＣＯ  Ｐｒｅｐ−Ｅｚｅ（商標名）２４ウェルプレートメッシュインサート（ＴｅｄＰｅｌｌａ社）中に置き、ＰＢＳ＋ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中０．１％ＰＢＳＴ中０．１％で数回洗浄して、凍結保護剤を除去した。その後、切片をギ酸７０％とともに３７℃で１０分間インキュベートし（抗原検索）、再びＰＢＳＴ０．１％で洗浄し、次いでウマ血清１０％を用いて室温で２時間ブロックした。第１の一次抗体（４℃で一晩）で標識し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８または５９４コンジュゲート二次抗体（暗所室温２時間）でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、顕微鏡スライドとカバーガラス上にＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）金褪色防止剤とともにマウントし、４℃で保存した。
【０１３６】
スペクトル共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００）を用いて脳切片を可視化した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いてキャプチャされデジタル化された。場合によっては、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像を分析した。画像はすべてＡｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を用いて処理した。
【０１３７】
統計的分析：Ｐαｓｙｎ＊とＰαｓｙｎＦとの共局在の差の統計的有意性を、対応のないスチューデントｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６）を用いて評価した。
実施例１１：Ｐαｓｙｎ＊のミトコンドリア毒性はＭＡＰＫ活性化と関連しており、ミトコンドリアにおけるタウのリン酸化および凝集が関与している。
【０１３８】
ここでは、Ｐα−ｓｙｎ＊は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８および細胞外シグナル調節キナーゼ５（ＥＲＫ５）を含む、何種類かのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を誘発し、これらは全てＰα−ｓｙｎ＊封入体でリン酸化されることが見出されている。ｐＪＮＫはミトコンドリアおよびミトコンドリア関連ＥＲ膜でＰα−ｓｙｎ＊と共局在し、そこではそれぞれＥＲおよびエネルギー欠乏のマーカーであるＢｉＰおよびｐＡＣＣと関連していた。また、Ｐα−ｓｙｎ＊が非ＭＡＰＫグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）の活性化を誘発することも示されている。さらに、Ｐα−ｓｙｎ＊はＰα−ｓｙｎ＊と強く会合した小さなｐｔａｕ凝集体の形成を誘導することを示した。Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ封入体はミトコンドリア損傷領域およびマイトファジー小胞に局在し、ミトコンドリア毒性、マイトファジー誘導および損傷ミトコンドリアフラグメントと共にそれらの除去におけるそれらの役割を示した。これらの結果は、Ｐα−ｓｙｎ＊がＭＡＰＫ経路のいくつかのキナーゼのリン酸化やミトコンドリア膜でのｐｔａｕの形成などの毒性作用を発揮する機序についての洞察を加えており、これがミトコンドリア毒性に寄与している可能性が高い。このように、Ｐα−ｓｙｎ＊は、一連のキナーゼを介した病原性事象の引き金となり、α−ｓｙｎの病理学と、パーキンソン病やシヌクレイノパチーで凝集することが知られている別のタンパク質であるタウとの間に関連があると考えられる。
【０１３９】
材料および方法
抗体リスト：
一次抗体：Ｐα−ｓｙｎ＊ではなく、Ｐα−ｓｙｎＦを認識するｐＳ１２９α−ｓｙｎに特異的なアルファ−ｓｙｎ抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからのマウス抗ｐＳ１２９α−ｓｙｎクローン８１Ａ（ＩＦ濃度１／５，０００、ＩＨＣ濃度１／５００）およびＧｅｎＴｅｘからのウサギ抗ｐＳ１２９α−ｓｙｎ抗体ＧＴＸ５４９９１（ＩＦ濃度１／３５０）であった。Ｐα−ｓｙｎ＊を認識するが、Ｐα−ｓｙｎＦを認識しないｐＳ１２９α−ｓｙｎに特異的なアルファ−ｓｙｎ抗体は、ＧｅｎｅＴｅｘからのウサギ抗ｐＳ１２９α−ｓｙｎ抗体ＧＴＸ５０２２２（ロット８２１５０５１７７）（ＩＦ濃度１／１，０００、ＩＨＣ濃度１／２００、ＷＢ濃度１／２５０）であった。他の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのウサギ抗ホスホアセチルＣｏＡカルボキシラーゼＳｅｒ７９（ＩＦ濃度１／１５０）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのウサギ抗ＢｉＰクローンＣ５０Ｂ１２（ＩＦ濃度１／１００）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのウサギ抗ホスホ−ｃＪｕｎ  Ｓｅｒ７３（ＩＦ濃度１／１５０）；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌからのヤギ抗カタラーゼ（ＩＦ濃度１／１５０）；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからのマウス抗シトクロムＣクローン６Ｈ２．Ｂ４（ＩＦ濃度１／１５０）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのウサギ抗ＥＥＡ１クローンＣ４５Ｂ１０（ＩＦ濃度１／１００）；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからのマウス抗ホスホ−ＥＲＫ１  Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４クローン４Ｂ１１Ｂ６９（ＩＦ濃度１／１２５）；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚからのヤギ抗ホスホ−ＥＲＫ５  Ｔｈｒ２１８／Ｔｙｒ２２０（ＩＦ濃度１／２００）；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからのニワトリ抗ＧＦＡＰ（ＩＦ濃度１／４，０００）；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのヤギ抗ＬＡＭＰ１（ＩＦ濃度１／４００）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのウサギ抗ホスホ−ＧＳＫ３β  Ｓｅｒ９（ＩＦ濃度１／１２５）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのウサギ抗ホスホ−ＪＮＫ１＋ＪＮＫ２＋ＪＫＮ３  Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５（ＩＦ濃度１／６５０、ＩＨＣ濃度１／２００）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのニワトリ抗ホスホ−ＪＮＫ  Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５（ＩＦ濃度１／５００）；Ｇｅｎｅ  Ｔｅｘからのウサギ抗ホスホＭＫＫ４  Ｓｅｒ８０（ＩＦ濃度１／１００）；Ｇｅｎｅ  Ｔｅｘからのウサギ抗ホスホＭＫＫ４  Ｔｈｒ２６１（ＩＦ濃度１／１５０）；Ｂｉｏｓｓからのウサギ抗ホスホＭＫＫ７  Ｓｅｒ２７１／Ｔｈｒ２７５（ＩＦ濃度１／１５０）；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからのマウス抗ＮｅｕＮクローンＡ６０（ＩＦ濃度１／１５０）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのウサギ抗ホスホ−ｐ３８  Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２（ＩＦ濃度１／２５０）；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのマウス抗ｐａｒｋｉｎ（ＰＲＫ８）（ＩＦ濃度１／５０）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのマウス抗ホスホ−Ｔａｕ  Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５クローンＡＴ８（ＩＦ濃度１／２５０）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒからのウサギ抗ホスホ−Ｔａｕ  Ｓｅｒ１９９クローン２Ｈ２３Ｌ４（ＩＦ濃度１／１００）；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ��らのマウス抗Ｔｏｍ２０クローン２８Ｆ８．１（ＩＦ濃度１／７５）；Ａｂｃａｍからのウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＩＨＣ濃度１／７５０）、であった。
【０１４０】
二次抗体：Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの以下の二次抗体を使用した：ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８−コンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８−コンジュゲートロバ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４−コンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４−コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４−コンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４−コンジュゲートロバ抗ニワトリＦａｂ２フラグメントＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−コンジュゲートロバ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）。分子プローブ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）抗体は：ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ２）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ２）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ２）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７−コンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、であった。すべての二次抗体を、１／１，５００〜１／２０００の濃度でＩＦに用いた。
【０１４１】
初代ニューロン培養物およびＰＦＦ播種
初代ニューロン培養物を、標準手順を用いてＥ１６−Ｅ１８  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から調製した。
【０１４２】
免疫蛍光実験のために、解離した海馬ニューロンを、２４ウェルプレートに配置されたポリ−Ｌ−リジン被覆ガラスカバーガラス上に、１２５，０００細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングした。
【０１４３】
プレーティング中、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ウマ血清およびペニシリン／ストレプトマイシン中に１時間維持した。その後、培地を交換し、ニューロンを無血清のニューロン特異的培地（ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（登録商標）培地、Ｎ２、Ｂ２７、ピルビン酸ナトリウムおよびＧＬＵＴＡＭＡＸ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。培養物を、５％ＣＯ２で加湿した３７℃インキュベーター内に維持した。
【０１４４】
ニューロン培養物に、インビトロ（ＤＩＶ）で５〜６日目にＰＦＦを播種した。組換え全長の野生型α−ｓｙｎＰＦＦを精製し、前述のように調製した（ボリピセリ（Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ）−ダレイ（Ｄａｌｅｙ）他、２０１４ｂ；ボリピセリ−ダレイ他、２０１１）。簡単に述べれば、精製したα−ｓｙｎ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で５日間一定攪拌してインキュベートし、次いでアリコートを調製し、−８０℃で保存することによってα−ｓｙｎＰＦＦを生成した。播種の直前に、ＰＦＦを０．１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳで希釈し、３０秒間超音波処理（０．５秒ＯＮ、０．５秒ＯＦＦ、出力３０％）し、ニューロン培地で希釈した。ウェル当たり２μｇ／ｍｌのＰＦＦ（最終）を、免疫蛍光実験のために２４ウェルプレート上に添加した。対照条件の場合、ＰＢＳの等量をニューロン培養物に添加した。
【０１４５】
２４ウェルプレート上でウェル当たりモノマー４μｇ／ｍｌの濃度のα−ｓｙｎモノマーの添加を対照として行った。
免疫蛍光実験：
４％（ｗ／ｖ）スクロースを含有するＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを用いて、ニューロンを室温で３０分間固定した。ニューロンをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で６分間透過処理し、再びＰＢＳ中で洗浄し、室温で１時間ブロックした。第１の一次抗体（４℃で一晩）で標識し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８，５９４または６４７コンジュゲート二次抗体（暗所室温１時間）でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）金褪色防止剤とともに顕微鏡スライド上にマウントした。
【０１４６】
Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓの使用を含むアッセイを以下のように実施した。細胞に２５０μＭの濃度のＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓを負荷し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）スクロースを含有するＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。その後のステップ（ブロッキング、標識付け、マウンティング）は既に記載したものと同様であった。注目すべきことに、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓは、生細胞中のミトコンドリアを染色する赤色蛍光色素であり、その細胞内共局在は膜電位の存在が必要である、ことである。
【０１４７】
共焦点顕微鏡
スペクトル共焦点顕微鏡（オリンパス、ＦＶ１０００）を用いて細胞を可視化した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いてキャプチャされデジタル化された。図２２は、Ｚスタック再構成（４〜６の共焦点画像）である。その他の図は共焦点画像（０．２μｍ）から構成される。場合によっては、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像を分析した。画像はすべてＡｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を用いて処理した。
【０１４８】
定量的共局在研究
ＩｍａｇｅＪプラグインＪＡＣｏＰを使用して、共局在分析を実行した（ボルテ（Ｂｏｌｔｅ）およびコーデリエレス（Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ）、２００６）。マンダース共局在化係数（ＭＣＣ）を用いて、シグナル強度間の線形相関の存在とは無関係に、他のタンパク質と共局在するあるタンパク質の画分を測定した（ダン（Ｄｕｎｎ）他、２０１１；ジンチュック（Ｚｉｎｃｈｕｋ）およびグロッセンバッヘル（Ｇｒｏｓｓｅｎｂａｃｈｅｒ）−ジンチュック、２０１４）。
【０１４９】
２つの値を比較する場合は両側ｔ検定を用い、多重比較の場合はＡＮＯＶＡを用いて統計解析を行った（プリズムｖ７）。
アニソマイシン処理
ニューロンを２５μｇ／ｍＬの濃度のアニソマイシンまたはＤＭＳＯビヒクル（Ａ９７８９、Ｓｉｇｍａ）で処理し、３７℃で３０分間インキュベートした。処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）スクロースを含むＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。その後のステップ（ブロッキング、標識付け、マウンティング）は前述の通りであった。
【０１５０】
マウスにおけるアルファ−ｓｙｎＰＦＦ注入：
すべての動物実験は、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｆｌｏｒｉｄａ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って行われた。体重２５〜３０ｇの３か月齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。それらを無作為に２群に分け、生理食塩水（ｎ＝６）またはα−ｓｙｎＰＦＦ（ｎ＝６）を投与した。マウスを試験開始前に１週間順化し、ケタミンおよびキシラジンの腹腔内注射により麻酔し、定位フレーム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に置いた。マウス線条体の右側に定位座標（ＡＰ＋０．２ｍｍ，ＭＬ＋２．０ｍｍ，ＤＶ−２．６ｍｍ）で片側注入（動物に単回投与）を行った。一定量の２μｇ／μｌの濃度のα−ｓｙｎＰＦＦを含有する２．５μｌの生理食塩水または対応する量の生理食塩水のみを、２６ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび電動定位注入器（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を用いて０．５μｌ／分の速度で注入した。注入路に沿って逆流を防ぐために針を後退させる前に、各注入後５分間、針を定位置に置いた。α−ｓｙｎ凝集体の形成は３０日間続けることが可能であった。その時点でＩＨＣのために脳を採取した。
【０１５１】
動物をケタミンおよびキシラジンの過量投与により安楽死させ、続いて０．９％生理食塩水、次いで４％パラホルムアルデヒドで心臓灌流した。脳を取り出し、さらに４％パラホルムアルデヒド中で４℃にて１日間、後固定し、その後３〜４日間、（凍結保護のために）３０％スクロースに浸漬した。脳を埋め込み、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中で凍結し、切片作製まで−８０℃で凍結保存した。対称な４０μｍ厚の切片をブレグマに対して＋０．２〜−４．０ｍｍのクライオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ）で切断し、線条体または黒質の部分を含むいくつかの切片（約２１〜２４のスライス）を遊離−浮遊法によりＩＨＣ用に処理した。簡単に述べれば、遊離浮遊脳切片を、ＰＥＬＣＯ  ＰＲＥＰ−ＥＺＥ（商標名）ＴＭ２４ウェルプレートメッシュインサート（ＴｅｄＰｅｌｌａ社）中に一定の撹拌下で置き、ＴＴＢＳ０．１％で数回洗浄して、過剰のＯＣＴおよび凍結保護剤を除去した。次いで、試料を１５分間０．３％過酸化水素で前処理し、ＴＴＢＳ０．１％で洗浄し、次いで室温にて１時間４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。第１の一次抗体（４℃で一晩）で標識し、ＴＴＢＳ０．１％で洗浄した後、脳切片をＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８または５９４コンジュゲート二次抗体（暗所の室温で２時間）とインキュベートし、再度ＴＴＢＳ０．１％で洗浄した。切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド上にマウントし、ＤＡＰＩ（１：４）を含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ（商標名）マウンティング培地を各切片に滴下した。次にスライドをカバーガラスおよびマニキュア液を用いて密封し、４℃で保存した。
【０１５２】
黒質緻密部（ＳＮｐｃ）の適切な同定のために、いくつかの脳切片をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する抗体とともに４℃で一晩インキュベートしたことは注目に値する。次いで、ＴＨ陽性切片に隣接するこれらのスライスを選択して、ｐＳ１２９α−ｓｙｎ特異的抗体について染色した。
【０１５３】
スペクトル共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００）を用いて脳切片を可視化した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いてキャプチャされデジタル化された。場合によっては、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像を分析した。画像はすべてＡｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を用いて処理した。
【０１５４】
死後のヒト脳組織
６５歳〜９０歳の範囲の高齢の対象の前頭皮質の固定脳剖検切片は、パーキンソン病および関連疾患のためのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｂａｎｎｅｒ  Ｓｕｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（アリゾナ州サンシティ）−Ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｄｏｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＢＤＰ）−によって親切に提供された。受領した試料は、パーキンソン病に罹患していない８人の患者、「低レビー小体」に分類される８人のＰＤ患者、および「高レビー小体」に分類される８人のＰＤ患者からの、４％緩衝化ホルムアルデヒドで固定された４０μｍの遊離浮遊切片を含んでいた。対象をＩＩ〜ＶのＢｒａａｋスコアに従って分類した。非パーキンソン病の対象をこの研究の対照症例として用いた。
【０１５５】
全ＢＢＤＰ剖検脳の神経病理学的評価のための標準プロトコルを用いた（若干の修正を伴う）。簡単に述べれば、４０μｍ厚さの遊離浮遊脳切片を小片に切断し、一定の撹拌下でＰＥＬＣＯ  ＰＲＥＰ−ＥＺＥ（商標名）２４ウェルプレートメッシュインサート（ＴｅｄＰｅｌｌａ社）中に置き、ＰＢＳ＋ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中０．１％ＰＢＳＴ中０．１％で数回洗浄して、凍結保護剤を除去した。その後、切片をギ酸７０％とともに３７℃で１０分間インキュベートし（抗原検索）、再びＰＢＳＴ０．１％で洗浄し、次いでウマ血清１０％を用いて室温で２時間ブロックした。第１の一次抗体（４℃で一晩）で標識し、ＰＢＳで洗浄した後、切片をＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８または５９４コンジュゲート二次抗体（暗所室温２時間）とともにインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、顕微鏡スライドおよびカバーガラス上にＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）金褪色防止剤とともにマウントし、４℃で保存した。
【０１５６】
スペクトル共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００）を用いて脳切片を可視化した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いてキャプチャされデジタル化された。場合によっては、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像を分析した。画像はすべてＡｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を用いて処理した。
【０１５７】
結果
Ｐα−ｓｙｎ＊封入体におけるＪＮＫの早期活性化。目的は、Ｐα−ｓｙｎ＊により誘導されるミトコンドリア毒性にどの分子経路が関与するかを決定することであった。ＪＮＫリン酸化はＰＤ患者の脳およびＰＤマウスモデルで示されているので（フェラー（Ｆｅｒｒｅｒ）他、２００１；ハノット（Ｈｕｎｏｔ）他、２００４）、ＰＦＦ曝露初代マウスニューロンを、ｐＪＮＫに対する抗体で標識した。ｐＪＮＫ標識は、播種２日後に存在する小さな封入体として現れ、その数は、Ｐα−ｓｙｎ＊増殖を強く想起する様式で、培養物中で次第に増加した（本明細書の以前の説明を参照）。初代ニューロンを単量体α−ｓｙｎに曝露した後、ｐＪＮＫ標識は検出されなかった。ｐＪＮＫ標識はニューロン細胞に特異的であった。注目すべきことに、「ｐＪＮＫ標識」によって、生理学的軸索ｐＪＮＫが検出されなかった実験条件、すなわち、使用されたｐＪＮＫ抗体の濃度が、軸索ｐＪＮＫの生理学的レベルの有意な染色なしに体細胞ｐＪＮＫ凝集体の検出に適切であった実験条件において、ＰＦＦ処理ニューロンのみに見出されたｐＪＮＫ標識を記載している。
【０１５８】
ＪＮＫ活性化は、Ｐα−ｓｙｎ＊に対してＰα−ｓｙｎＦよりも特異的である。ｐＪＮＫ封入体は、小さなＰα−ｓｙｎ＊凝集体と密接に共局在しているが、Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルとは密接には共局在していない（図１９）。Ｐα−ｓｙｎ＊およびＰα−ｓｙｎＦは２つの異なるα−ｓｙｎ抗体によって認識される。Ｐα−ｓｙｎ＊／ＪＮＫ標識とＰα−ｓｙｎＦ標識とは相互に排他的であった。本明細書において既に記載したように、Ｐα−ｓｙｎ＊封入体はＰα−ｓｙｎＦから放出され、ｐＪＮＫは観察可能な限り早くＰα−ｓｙｎ＊陽性封入体中に存在した。図１９Ａ１および１９Ｂ１は、新たに形成されたｐＪＮＫ陽性Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体の存在を伴う、Ｐα−ｓｙｎＦ繊維におけるいくつかのインデント（ｉｎｄｅｎｔｓ）を示す。
【０１５９】
ＪＮＫはＰＦＦ注入マウスおよびＰＤ患者の脳でも活性化される。ｐＪＮＫ陽性封入体がＰＦＦを定位的に注入したマウスの脳とＰＤ患者の脳で観察され、初代ニューロン培養物における所見の生物学的関連性が確認された。
【０１６０】
Ｐα−ｓｙｎ＊封入体はＭＡＰＫファミリーのキナーゼのいくつかのメンバーのリン酸化を誘発する。ｐＪＮＫ活性化は正規のＪｕｎリン酸化とは関連しなかった。ＭＡＰＫファミリーのキナーゼの他のメンバーは、Ｐα−ｓｙｎ＊封入体においてリン酸化されることがさらに観察された（図２０Ａ〜２０Ｅおよび図２５Ａ〜２５Ｃ）。ＪＮＫおよびｐ３８を活性化するキナーゼであるＭＫＫ４の活性型（クエンダ（Ｃｕｅｎｄａ）、２０００）はｐＪＮＫと密接な共局在を示した。大量のＴ２６１リン酸化（活性化）ＭＫＫ４がＰα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ封入体に存在し（図２０Ａ）、非常に稀なＳ８０リン酸化（不活性化）（クリッテンデン（Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ）およびフィリポフ（Ｆｉｌｌｉｐｏｖ）、２０１１）ＭＫＫ４（図２０Ｂ）とは対照的であった。このことは、Ｐα−ｓｙｎ＊が酵素の活性型と関連しているが、不活性型とは関連していないことを示している。リン酸化ｐ３８も、ｐＥＲＫ５と同様にＰα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ封入体と共局在していた（図２０Ｃ〜２０Ｄ）。一方、ｐＭＫＫ７およびｐＥＲＫ１／２はＰα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ封入体と共局在せず、ＭＡＰＫ経路に属さないキナーゼであるｐＧＳＫ３βは部分的共局在を示した（図２０Ｅ）。
【０１６１】
Ｐα−ｓｙｎ＊封入体はｐｔａｕ凝集体と関連している。ミトコンドリアではｐｔａｕのオリゴマー凝集体が報告されており、これらはタウの毒性型を示すと考えられている（ラサグナ−リーブス（Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓ）他、２０１１）。さらに、タウの病状はＰＤ患者や動物のシヌクレイノパチーモデルにおいて見られ（ハゲルティ（Ｈａｇｇｅｒｔｙ）他、２０１１；イルビン（Ｉｒｗｉｎ）他、２０１３；セングプタ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ）他、２０１５）、タウはいくつかのＭＡＰＫタンパク質によるリン酸化の基質である（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）他、２０１３）。Ｐα−ｓｙｎ＊が、すでに特定された強く結合した活性化キナーゼを介して、ｐＪＮＫおよび／またはＰα−ｓｙｎ＊、およびｐｔａｕに対する共免疫標識により、タウのリン酸化を誘発する原因であるかどうかを検討した。Ｐα−ｓｙｎ＊およびｐＪＮＫは完全に共局在化していたが（図２１Ａ）、Ｐα−ｓｙｎ＊およびｐｔａｕ凝集体は大部分が重なっていた（図２１ＢおよびＤ）か並置していた（図２１ＣおよびＤ）。これらの観察は、Ｐα−ｓｙｎ＊がＭＡＰＫリン酸化を誘発し、活性化されたＭＡＰＫがＰα−ｓｙｎ＊の近傍でタウのリン酸化と凝集を誘導するという証拠を提供する。
【０１６２】
Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ凝集体は損傷したミトコンドリアに共局在する。図１９において、ＪＮＫは、Ｐα−ｓｙｎＦフィブリルから放出される初期Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体において活性化されることが示された。図２２Ａ〜Ｅにおいて、ｐＪＮＫは、ミトコンドリアに局在する成熟Ｐα−ｓｙｎ＊凝集体と依然として関連していることが示されている。ｐＪＮＫおよびＰα−ｓｙｎ＊は、ミトコンドリア外膜のマーカーであるＴｏｍ２０と共局在したが、Ｐα−ｓｙｎＦとは共局在しなかった。図２２Ｃ〜Ｅは、豊富なＰα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ封入体およびフラグメント化したミトコンドリアの領域を示す。本明細書において先にＰα−ｓｙｎ＊について述べたのと同様に、ｐＪＮＫ標識は、図２３に示すように、１）膜電位の消失（図２３Ａ）、２）ｐＡＣＣ１の隔離（図２３Ｂ）、３）シトクロムＣの染色（図２３Ｃ）によって、ミトコンドリア損傷の領域と絶妙に共局在していた。ミトコンドリア関連ＥＲ膜（ＭＡＭ）の常在タンパク質であるＢｉＰとの共局在は、Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ封入体がＭＡＭで生じることを示す（図２３Ｃ）。ミトコンドリア電位のマーカーであるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓ標識は、ｐＪＮＫの点（ｐｕｎｃｔａｅ）（図２３Ａ）の直接近傍で欠落していた。Ｐα−ｓｙｎ＊およびｐｔａｕはいずれもミトコンドリア（図２３Ｄ）での豊富なシトクロムＣ染色により囲まれており、ｐｔａｕがシヌクレイノパチーにおけるミトコンドリア毒性に関与することを支持する。少数のｐＪＮＫ陽性凝集体がカタラーゼ陽性ペルオキシソームに並置して認められた。ＥＥＡ１陽性初期エンドソームでは共局在は見られなかった。
【０１６３】
Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ凝集体はマイトファジーと関連している。本発明者らは、これまでにＰα−ｓｙｎ＊がミトコンドリアフラグメント化およびマイトファジーを誘導することを示した。ここでは、ｐＪＮＫ陽性封入体は、ｐａｒｋｉｎ陽性ＬＡＭＰ１小胞でＴｏｍ２０と共局在することを観察し（図２４Ａ〜２４Ｂ、図２４Ａはまた、フラグメント化されたミトコンドリアを示す）、それらがマイトファジーを受けることを示した。ｐＴａｕはマイトファジー性小胞においてｐＪＮＫと共局在した（図２４Ｃ〜２４Ｄ）。
【０１６４】
定量的共局在。Ｐα−ｓｙｎ＊染色の９０％はｐＪＮＫ染色と共局在し、逆も真であった（図２５Ａ）。重要なことは、ほとんどすべてのＰα−ｓｙｎ＊封入体（すべてのＰα−ｓｙｎ＊陽性ニューロン）がｐＪＮＫ陽性であったことである。時々、ある封入体におけるｐＪＮＫ染色は、Ｐα−ｓｙｎ＊染色より強いか、逆にＰα−ｓｙｎ＊染色はｐＪＮＫ染色より強い（図１９に示される）。共局在は、活性化ｐＭＫＫ４、ｐｐ３８およびｐＥＲＫ５と同程度のレベルに達したが、ｐＧＳＫ３βとは異なっていた（図２５Ａ）。
【０１６５】
ｐＪＮＫ陽性封入体は、阻害部位Ｓ８０でＭＫＫ４のリン酸化事象を非常に少なく誘発したため、ｐＪＮＫのｐＭＫＫ４（Ｓ８０）との共局在は不良であった（赤色のバー）。しかしながら、少数の陽性ｐＭＫＫ４（Ｓ８０）ドットはｐＪＮＫと共局在していた（緑色のバー）。ｐＪＮＫとｐＭＫＫ４（Ｔ２６１）またはｐＭＫＫ４（Ｓ８０）との共局在性の差は統計的に有意であった。
【０１６６】
最後に、Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ陽性凝集体とｐｔａｕの間に約６０％の共局在が認められ、両タンパク質凝集体が並置または共局在しているという観察と一致した（図２５Ａおよび２５Ｂ）。時として、Ｐα−ｓｙｎ＊封入体がｐｔａｕ無しで認められた。しかしながら、ｐｔａｕは常にＰα−ｓｙｎ＊凝集体と共局在していた。これらの知見の解釈は、Ｐα−ｓｙｎ＊がキナーゼを活性化し、それが次にタウをリン酸化するというものである。Ｐα−ｓｙｎ＊によるタウの動員と同様にリン酸化カスケードは、初期のＰα−ｓｙｎ＊凝集体ではまだ確立されておらず、したがって、一部のＰα−ｓｙｎ＊凝集体は、ｐｔａｕが存在しない状態で存在する。この事象のカスケードは、図２６Ａ〜２６Ｄに記載されている。
【０１６７】
図２５Ｃは、Ｐα−ｓｙｎ＊がマイトファジー小胞に豊富に見出されるという事実に従って、Ｐα−ｓｙｎ＊およびｐＪＮＫの８０％がＬＡＭＰ１と共局在することを示す。７０％近くのｐｔａｕはＬＡＭＰ１と共局在していた。ＰａｒｋｉｎはＰα−ｓｙｎ＊封入体とは直接結合していなかった（Ｐα−ｓｙｎ＊、ｐｔａｕまたはｐＪＮＫと３０％共局在化）。ｐａｒｋｉｎはミトコンドリア外膜タンパク質をユビキチン化し、ミトコンドリア損傷と外膜でのＰＩＮＫ１蓄積への応答として選択的オートファジーを誘発するので、ｐａｒｋｉｎとタンパク質凝集体とのより低い共局在化が予想される（ピックレル（Ｐｉｃｋｒｅｌｌ）およびヨウル（Ｙｏｕｌｅ）、２０１５）。
【０１６８】
議論
Ｐα−ｓｙｎ＊は、Ｌｅｗｙ小体型のＰα−ｓｙｎフィブリル（Ｐα−ｓｙｎＦ）の不完全なオートファジー分解から生じる、立体構造的に異なるＰα−ｓｙｎの小さな凝集体である。Ｐα−ｓｙｎ＊は、オートリソソームから出た後、ミトコンドリアの細管（ｔｕｂｕｌｅｓ）に結合し、代謝ストレス、膜の脱分極、ミトコンドリアのフラグメント化を引き起こす。Ｐα−ｓｙｎ＊は、ミトコンドリア残屑に囲まれたマイトファジー食胞に最終的に局在する（グラッシー（Ｇｒａｓｓｉ）他、２０１８）。
【０１６９】
この研究では、Ｐα−ｓｙｎ＊によって誘導される毒性経路において、いくつかの重要な分子因子が明らかにされた。注目すべきことに、Ｐα−ｓｙｎ＊はリン酸化ＪＮＫとの８０〜９０％の共局在化が観察された（ｐＪＮＫ、図１９、２１Ａ〜２１Ｄおよび２５Ａ〜２５Ｃ）。すなわち、Ｐα−ｓｙｎ＊がＰα−ｓｙｎＦから放出されるとすぐに、ｐＪＮＫはＰα−ｓｙｎ＊と早期に共局在化し、Ｐα−ｓｙｎＦから完全に排除された（図１９）。したがって、いくつかの実験では、ｐＪＮＫをＰα−ｓｙｎ＊凝集体の代理マーカーとして用いた。Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ凝集体はまた、リン酸化されたＭＫＫ４、ＪＮＫおよびｐ３８をリン酸化し活性化するＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）と共局在していた（クエンダ（Ｃｕｅｎｄａ）、２０００）（図２０Ａ〜２０Ｅおよび２５Ａ〜２５Ｃ）。Ｐα−ｓｙｎ＊にはその活性化部位Ｔ２６１で（キナーゼの不活性化をもたらすＳ８０とは対照的に）圧倒的にＭＫＫ４リン酸化を誘導した。Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ凝集体もｐｐ３８と共局在していることがわかった。一方、第２のＪＮＫ活性化ＭＡＰＫＫであるＭＫＫ７はＰα−ｓｙｎ＊近傍ではリン酸化されていなかった。まとめると、これらのデータは、Ｐα−ｓｙｎ＊によるＭＫＫ４の分子および部位特異的活性化を強く証明している。このデータは、ＭＡＰＫ経路の活性化がＰα−ｓｙｎ＊のミトコンドリア毒性作用に直接関与しているという証拠を提供する。
【０１７０】
この研究では、ｐｔａｕ凝集体がＰα−ｓｙｎ＊凝集体と直接並置および／または重複することを見出した（図２１Ａ〜２１Ｄ）。Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ凝集体は、ミトコンドリア膜、特にミトコンドリア損傷領域に局在した（Ｐα−ｓｙｎ＊の近傍でのｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＣＭＸＲｏｓ標識の絶妙な消失によって示される；ミトコンドリア膜構造損傷のマーカーであるｐＡＣＣ１のクラスター化；マイトファジーを開始するために動員されるＭＡＭの常駐タンパク質であるＢｉＰとの共局在化、図２３Ａ〜２３Ｄを参照）。大部分のＰα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ凝集体がＬＡＭＰ−１マイトファジー食胞で見つかった（図２４Ａ〜２４Ｄおよび２５Ａ〜２５Ｃ）。これらのデータは、Ｐα−ｓｙｎ＊とｐｔａｕが協調してミトコンドリア機能障害を誘導するという証拠を提供する。ミトコンドリア毒性、フラグメント化およびマイトファジー誘導におけるＰα−ｓｙｎ＊とｐｔａｕの協同を強調して、Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐＪＮＫ／ｐｔａｕ封入体がｐａｒｋｉｎ修飾ＬＡＭＰ１陽性マイトファジー性リソソームにおいてＴｏｍ２０（ミトコンドリア膜のマーカー）と共局在することを示した（図２４Ａ〜２４Ｄおよび２５Ａ〜２５Ｃ）。
【０１７１】
タウはどのようにしてリン酸化されるのだろうか？本明細書におけるデータは以下のように解釈される（図２６Ａ〜２６５Ｄ）。Ｐα−ｓｙｎ＊はＭＫＫ４を活性化し、ＪＮＫとｐ３８を活性化し、両リン酸化酵素はＰα−ｓｙｎ＊と忠実に共局在する。Ｐα−ｓｙｎ＊はタウと直接相互作用し、タウはｐＪＮＫとｐｐ３８によってリン酸化される（図２６Ａ）。Ｐα−ｓｙｎ＊とｐｔａｕはミトコンドリア細管の末端を囲む大きな封入体に凝集する。同時に、ＧＳＫ３βもＰα−ｓｙｎ＊と直接相互作用し、さらなるタウのリン酸化に寄与する。Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ凝集体は毒性があり、ミトコンドリアの機能不全およびフラグメント化を引き起こす（図２６Ｂ）。Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ凝集体に囲まれたフラグメント化ミトコンドリアは、ｐａｒｋｉｎによるマイトファジー分解のためにタグ付けされる（図２６Ｃ）。Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ、ｐＪＮＫ、ｐｐ３８、ｐａｒｋｉｎおよびミトコンドリア残屑を含むマイトファジー食胞が放出される（図２６Ｄ）。
【０１７２】
本明細書において、Ｐα−ｓｙｎ＊／ｐｔａｕ凝集体およびＭＡＰＫ活性化がミトコンドリア損傷およびマイトファジーと直接関連することを示した。理論に縛られることを望まないが、Ｐα−ｓｙｎ＊は、キナーゼ活性化およびミトコンドリアｐｔａｕ凝集体形成の両方の主たるトリガーとして作用し、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチーの病因におけるＰα−ｓｙｎ＊の中心的役割を強調すると仮定されている。
【０１７３】
参考文献
Ａｌｏｎｓｏ，Ａ．Ｄ．、Ｊ．Ｄｉ  Ｃｌｅｒｉｃｏ、Ｂ．Ｌｉ、Ｃ．Ｐ．Ｃｏｒｂｏ、Ｍ．Ｅ．Ａｌａｎｉｚ、Ｉ．Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌ、Ｋ．Ｉｑｂａｌ、２０１０、「Ｔｈｒ２１２、Ｔｈｒ２３１、およびＳｅｒ２６２の組み合わせによるタウのリン酸化は、神経変性を引き起こす（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｕ  ａｔ  Ｔｈｒ２１２，  Ｔｈｒ２３１，  ａｎｄ  Ｓｅｒ２６２  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｃａｕｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８５：３０８５１−３０８６０。
【０１７４】
Ａｒｉｍａ，Ｋ．、Ｋ．  Ｕｅｄａ、Ｎ．Ｓｕｎｏｈａｒａ、Ｋ．Ａｒａｋａｗａ、Ｓ．Ｈｉｒａｉ、Ｍ．Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｈ．Ｔｏｎｏｚｕｋａ−ＵｅｈａｒａおよびＭ．Ｋａｗａｉ．、１９９８、「多系統萎縮症の橋核におけるニューロンおよびオリゴデンドログリア細胞質封入体のフィブリル成分におけるＮＡＣＰ／α−シヌクレイン免疫反応性（ＮＡＣＰ／ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｎｔｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｉ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ）」、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、９６：４３９−４４４。
【０１７５】
Ａｔｈａｎａｓｓｉａｄｏｕ，Ａ．、Ｇ．Ｖｏｕｔｓｉｎａｓ、Ｌ．Ｐｓｉｏｕｒｉ、Ｅ．Ｌｅｒｏｙ、Ｍ．Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ、Ａ．Ｉｌｉａｓ、Ｇ．Ｍ．ＭａｎｉａｔｉｓおよびＴ．Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、１９９９、「α−シヌクレインをコードする遺伝子にＡｌａ５３Ｔｈｒ変異を保有するパーキンソン病の家族の遺伝分析（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈａｔ  ｃａｒｒｙ  ｔｈｅ  Ａｌａ５３Ｔｈｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）」、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、６５：５５５−５５８。
【０１７６】
Ｂｅｔａｒｂｅｔ，Ｒ．、Ｒ．Ｍ．Ｃａｎｅｔ−Ａｖｉｌｅｓ、Ｔ．Ｂ．Ｓｈｅｒｅｒ、Ｐ．Ｇ．Ｍａｓｔｒｏｂｅｒａｒｄｉｎｏ、Ｃ．ＭｃＬｅｎｄｏｎ、Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍ、Ｓ．Ｌｕｎｄ、Ｈ．Ｍ．Ｎａ、Ｇ．Ｔａｙｌｏｒ、Ｎ．Ｆ．Ｂｅｎｃｅ、Ｒ．Ｋｏｐｉｔｏ、Ｂ．Ｂ．Ｓｅｏ、Ｔ．Ｙａｇｉ、Ａ．Ｙａｇｉ、Ｇ．Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ、Ｍ．Ｒ．ＣｏｏｋｓｏｎおよびＪ．Ｔ．Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅ、２００６、「パーキンソン病における神経変性への交差経路：ＤＪ−１，α−シヌクレインおよびユビキチン−プロテアソーム系に対する農薬ロテノンの影響（Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  ｒｏｔｅｎｏｎｅ  ｏｎ  ＤＪ−１，ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ、２２：４０４−４２０。
【０１７７】
Ｂｏｌｔｅ，Ｓ．およびＦ．Ｐ．  Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ、２００６、「光学顕微鏡による細胞内共局在解析のガイドツアー（Ａ  ｇｕｉｄｅｄ  ｔｏｕｒ  ｉｎｔｏ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｓｃ、２２４：２１３−２３２。
【０１７８】
Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．、Ａ．Ｐａｃｈｏｒｉ、Ｓ．Ｈｏｗａｒｄ、Ｍ．Ｇａｎｎｏ、Ｄ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｊｒ．、Ｔ．Ｋａｍｅｎｅｃｋａ、Ｘ．Ｓｏｎｇ、Ｄ．Ｄｕｃｋｅｔｔ、Ｗ．Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｙ．Ｌｉｎｇ、Ｌ．Ｃｈｅｒｒｙ、Ｍ．Ｄ．Ｃａｍｅｒｏｎ、Ｌ．Ｌｉｎ、Ｃ．Ｈ．ＲｕｉｚおよびＰ．Ｌｏｇｒａｓｓｏ、２０１１、「低分子ｃ−ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤はパーキンソン病モデルにおけるドーパミン作動性ニューロンを保護する（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃ−ｊｕｎ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｋｉｎａｓｅ  （ＪＮＫ）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２：１９８−２０６。
【０１７９】
Ｃｈａｎｇ，Ｄ．、Ｍ．Ａ．Ｎａｌｌｓ、Ｉ．Ｂ．Ｈａｌｌｇｒｉｍｓｄｏｔｔｉｒ、Ｊ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇ、Ｆ．Ｃａｉ、Ｃ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｔ．およびＭｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｇ．Ａ．Ｋｅｒｃｈｎｅｒ、Ｇ．Ａｙａｌｏｎ、Ｂ．Ｂｉｎｇｏｌ、Ｍ．Ｓｈｅｎｇ、Ｄ．Ｈｉｎｄｓ、Ｔ．Ｗ．Ｂｅｈｒｅｎｓ、Ａ．Ｂ．Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、Ｔ．Ｒ．ＢｈａｎｇａｌｅおよびＲ．Ｒ．Ｇｒａｈａｍ、２０１７、「ゲノムワイド関連研究のメタアナリシスにより１７の新規パーキンソン病リスク遺伝子座が同定される（Ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  １７  ｎｅｗ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｉｓｋ  ｌｏｃｉ）」、  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、４９：１５１１−１５１６。
【０１８０】
Ｃｈａｎｇ，Ｌ．、Ｙ．Ｊｏｎｅｓ、Ｍ．Ｈ．Ｅｌｌｉｓｍａｎ、Ｌ．Ｓ．ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭ．Ｋａｒｉｎ、２００３、「ＪＮＫ１は神経微小管の維持に必要であり、微小管関連タンパク質のリン酸化を制御する（ＪＮＫ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４：５２１−５３３。
【０１８１】
Ｃｈａｒｎｉ，Ｓ．、Ｇ．ｄｅ  Ｂｅｔｔｉｇｎｉｅｓ、Ｍ．Ｇ．Ｒａｔｈｏｒｅ、Ｊ．Ｉ．Ａｇｕｉｌｏ、Ｐ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｓｅｎ、Ｄ．Ｈａｏｕｚｉ、Ｒ．Ａ．Ｈｉｐｓｋｉｎｄ、Ｊ．Ａ．Ｅｎｒｉｑｕｅｚ、Ｍ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｂｅａｔｏ、Ｊ．Ｐａｒｄｏ、Ａ．ＡｎｅｌおよびＭ．Ｖｉｌｌａｌｂａ、２０１０、「酸化的リン酸化はＥＲＫ５経路を介して腫瘍細胞におけるＭＨＣクラスＩのｄｅ  ｎｏｖｏ発現を誘導する（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ＥＲＫ５  ｐａｔｈｗａｙ）」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８５：３４９８−３５０３。
【０１８２】
Ｃｈｅｎ，Ｊ．、Ｙ．Ｒｅｎ、Ｃ．Ｇｕｉ、Ｍ．Ｚｈａｏ、Ｘ．Ｗｕ、Ｋ．Ｍａｏ、Ｗ．ＬｉおよびＦ．Ｚｏｕ、２０１８、「パーキンソン病の変異Ａ５３Ｔ  α−シヌクレインモデルにおけるｐ３８  ＭＡＰＫによるＰａｒｋｉｎのセリン１３１でのリン酸化はミトコンドリア機能障害と神経細胞死を促進する（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎ  ａｔ  ｓｅｒｉｎｅ  １３１  ｂｙ  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｍｕｔａｎｔ  Ａ５３Ｔ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ、９：７００。
【０１８３】
Ｃｈｏ，Ｊ．Ｈ．およびＧ．Ｖ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、２００４、「グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）によるＴｈｒ２３１でのタウのプライムリン酸化は、微小管に結合して安定化するタウの能力の調節に重要な役割を果たしている（Ｐｒｉｍｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｕ  ａｔ  Ｔｈｒ２３１  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３ｂｅｔａ（ＧＳＫ３ｂｅｔａ）  ｐｌａｙｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔａｕ’ｓ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｂｉｎｄ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ）」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、８８：３４９−３５８。
【０１８４】
Ｃｈｏｉ，Ｗ．Ｓ．、Ｇ．Ａｂｅｌ、Ｈ．Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ、Ｒ．Ａ．ＦｌａｖｅｌｌおよびＺ．Ｘｉａ、２０１０、「ＪＮＫ３はパラコートおよびロテノン誘導ドーパミン作動性ニューロン死を仲介する（ＪＮＫ３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐａｒａｑｕａｔ−  ａｎｄ  ｒｏｔｅｎｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｅａｔｈ）」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、６９：５１１−５２０。
【０１８５】
Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ，Ｐ．Ｌ．およびＮ．Ｍ．Ｆｉｌｉｐｏｖ、２０１１、「ＭＡＰＫ経路のマンガン調節：ミクログリア細胞における上流マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼとマイトジェン活性化キナーゼホスファターゼ−１に対する効果（Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡＰＫ  ｐａｔｈｗａｙｓ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、３１：１−１０。
【０１８６】
Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．２０００．「マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ４（ＭＫＫ４））」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、３２：５８１−５８７。
【０１８７】
Ｄａｗｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．およびＶ．Ｌ．Ｄａｗｓｏｎ、２００３．、「まれな遺伝子変異がパーキンソン病の病因に光を当てる（Ｒａｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｓｈｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１１１：１４５−１５１。
【０１８８】
Ｄｉ  Ｍａｉｏ，Ｒ．、Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｅ．Ｋ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｃ．Ｗ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ．Ｚｈａｒｉｋｏｖ、Ａ．Ｂｏｒａｈ、Ｘ．Ｈｕ、Ｊ．ＭｃＣｏｙ、Ｃ．Ｔ．Ｃｈｕ、Ｅ．Ａ．Ｂｕｒｔｏｎ、Ｔ．Ｇ．ＨａｓｔｉｎｇｓおよびＪ．Ｔ．Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅ、２０１６、「アルファ−シヌクレインはＴＯＭ２０に結合し、パーキンソン病におけるミトコンドリアタンパク質輸入を阻害する（ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ＴＯＭ２０  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、８：３４２ｒａ３７８。
【０１８９】
Ｄｕｋａ，Ｖ．，Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃｒｅｄｌｅ，Ｊ．Ｗｉｌｌｓ，Ａ．Ｏａｋｓ，Ｃ．Ｓｍｏｌｉｎｓｋｙ，Ｋ．Ｓｈａｈ，Ｄ．Ｃ．Ｍａｓｈ，Ｅ．ＭａｓｌｉａｈおよびＡ．Ｓｉｄｈｕ、２０１３、「シヌクレイノパチーおよびアルツハイマー病におけるタウ過剰リン酸化およびタウキナーゼの活性化部位の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｔａｕ  ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｕ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、８：ｅ７５０２５。
【０１９０】
Ｄｕｎｎ，Ｋ．Ｗ．、Ｍ．Ｍ．ＫａｍｏｃｋａおよびＪ．Ｈ．ＭｃＤｏｎａｌｄ、２０１１、「生物顕微鏡における共局在性を評価するための実用的ガイド（Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、３００：Ｃ７２３−７４２。
【０１９１】
Ｅｒｉｋｓｅｎ，Ｊ．Ｌ．、Ｓ．ＰｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉおよびＬ．Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ、２００５、「パーキンソン病の遺伝子量と病因（Ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、１１：９１−９６。
【０１９２】
Ｆａｒｒｅｒ，Ｍ．Ｊ．、２００６、「パーキンソン病の遺伝学：パラダイムシフトと将来展望（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｓｈｉｆｔｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、７：３０６−３１８。
【０１９３】
Ｆｅｒｒｅｒ，Ｉ．、Ｒ．Ｂｌａｎｃｏ、Ｍ．Ｃａｒｍｏｎａ、Ｂ．Ｐｕｉｇ、Ｍ．Ｂａｒｒａｃｈｉｎａ、Ｃ．ＧｏｍｅｚおよびＳ．Ａｍｂｒｏｓｉｏ、２００１、「パーキンソン病およびレビー小体を伴う認知症における活性、リン酸化依存性マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）、ストレス活性化プロテインキナーゼ／ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）、およびｐ３８キナーゼ発現（Ａｃｔｉｖｅ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  （ＭＡＰＫ／ＥＲＫ），ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ／ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ（ＳＡＰＫ／ＪＮＫ），ａｎｄ  ｐ３８  ｋｉｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）」、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ（Ｖｉｅｎｎａ）、１０８：１３８３−１３９６。
【０１９４】
Ｆｏｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．、Ｖ．Ｍ．ＬｅｅおよびＪ．Ｑ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ、２００５、「パーキンソン病の疫病分類学：泥沼から抜け出す道を探すこと（Ｎｏｓｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｌｏｏｋｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｗａｙ  ｏｕｔ  ｏｆ  ａ  ｑｕａｇｍｉｒｅ）」、Ｎｅｕｒｏｎ、４７：４７９−４８２。
【０１９５】
Ｆｏｘ，Ｓ．Ｈ．，Ｒ．Ｋａｔｚｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｓ．Ｙ．Ｌｉｍ，Ｂ．Ｂａｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ａ．ｄｅ  Ｂｉｅ，Ｋ．Ｓｅｐｐｉ，Ｍ．Ｃｏｅｌｈｏ，Ｃ．Ｓａｍｐａｉｏ，およびＣ．Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１８、「国際パーキンソン病運動障害学会エビデンスに基づく医療レビュー：パーキンソン病の運動症状に対する治療に関する最新情報（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｒｅｖｉｅｗ：Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｔｏｒ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ。
【０１９６】
Ｇａｌｖｉｎ，Ｊ．Ｅ．、Ｖ．Ｍ．ＬｅｅおよびＪ．Ｑ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ、２００１、「シヌクレイノパチー：臨床的および病理学的意味（Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ、５８：１８６−１９０。
【０１９７】
Ｇｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．、Ｋ．Ｍ．Ｆａｒｍｅｒ、Ｎ．Ｈｅｎｓｏｎ、Ｄ．Ｌ．Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｃａｒｒａｎｚａ、Ｍ．Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ  Ｍｕｒｉｌｌｏ、Ｕ．Ｓｅｎｇｕｐｔａ、Ａ．ＢａｒｒｅｔｔおよびＲ．Ｋａｙｅｄ、２０１８、「Ｔａｕのオリゴマーはアルファ−シヌクレイン毒性を媒介し、免疫療法の標的となりうる（Ｔａｕ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」、Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ、１３：１３。
【０１９８】
Ｇｒａｓｓｉ，Ｄ．、Ｓ．Ｈｏｗａｒｄ、Ｍ．Ｚｈｏｕ、Ｎ．Ｄｉａｚ−Ｐｅｒｅｚ、Ｎ．Ｔ．Ｕｒｂａｎ、Ｄ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ−Ｇｉｖｅｎ、Ｎ．Ｋａｍａｓａｗａ、Ｌ．Ａ．Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ、Ｐ．ＬｏＧｒａｓｓｏおよびＣ．Ｉ．  Ｌａｓｍｅｚａｓ、２０１８、「パーキンソン病におけるミトコンドリア損傷とマイトファジーを誘導する高度神経毒性アルファ−シヌクレイン種の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１１５：Ｅ２６３４−Ｅ２６４３。
【０１９９】
Ｇｕｏ，Ｊ．Ｌ．、Ｄ．Ｊ．Ｃｏｖｅｌｌ、Ｊ．Ｐ．Ｄａｎｉｅｌｓ、Ｍ．Ｉｂａ，Ａ．Ｓｔｉｅｂｅｒ、Ｂ．Ｚｈａｎｇ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｄｄｌｅ、Ｌ．Ｋ．Ｋｗｏｎｇ、Ｙ．Ｘｕ、Ｊ．Ｑ．ＴｒｏｊａｎｏｗｓｋｉおよびＶ．Ｍ．Ｌｅｅ、２０１３、「異なるアルファ−シヌクレイン株はニューロンにおけるタウ封入体を異なって促進する（Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔａｕ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ）」、Ｃｅｌｌ、１５４：１０３−１１７。
【０２００】
Ｈａｇｇｅｒｔｙ、Ｔ．、Ｊ．Ｃｒｅｄｌｅ、Ｏ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｊ．Ｗｉｌｌｓ、Ａ．Ｗ．Ｏａｋｓ、Ｅ．ＭａｓｌｉａｈおよびＡ．Ｓｉｄｈｕ、２０１１、「パーキンソン病のアルファ−シヌクレイン過剰発現トランスジェニックモデルにおける高リン酸化Ｔａｕ（Ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｔａｕ  ｉｎ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３３：１５９８−１６１０。
【０２０１】
Ｈａｎｓｅｎ，Ｃ．、Ｅ．Ａｎｇｏｔ、Ａ．Ｌ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ、Ｊ．Ａ．Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ｌ．Ｐｉｅｒｉ、Ｇ．Ｐａｕｌ、Ｔ．Ｆ．Ｏｕｔｅｉｒｏ、Ｒ．Ｍｅｌｋｉ、Ｐ．Ｋａｌｌｕｎｋｉ、Ｋ．Ｆｏｇ、Ｊ．Ｙ．ＬｉおよびＰ．Ｂｒｕｎｄｉｎ、２０１１、「アルファ−シヌクレインはマウス脳から移植ドーパミン作動性ニューロンに伝播し、培養ヒト細胞では凝集体を播種する（ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｔｏ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｅｅｄｓ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１２１：７１５−７２５。
【０２０２】
Ｈｕｎｏｔ，Ｓ．、Ｍ．Ｖｉｌａ、Ｐ．Ｔｅｉｓｍａｎｎ、Ｒ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ、Ｅ．Ｃ．Ｈｉｒｓｃｈ、Ｓ．Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ、Ｐ．ＲａｋｉｃおよびＲ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ、２００４、「パーキンソン病のマウスモデルにおける神経変性にはＪＮＫを介したシクロオキシゲナーゼ２の誘導が必要である（ＪＮＫ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１：６６５−６７０。
【０２０３】
Ｉｒｗｉｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｖ．Ｍ．ＬｅｅおよびＪ．Ｑ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ、２０１３、「パーキンソン病認知症：アルファ−シヌクレイン、タウおよびアミロイド−ベータ病理の収束（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ：ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ｔａｕ  ａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１４：６２６−６３６。
【０２０４】
Ｋｉ，Ｃ．Ｓ．、Ｅ．Ｆ．Ｓｔａｖｒｏｕ、Ｎ．Ｄａｖａｎｏｓ、Ｗ．Ｙ．Ｌｅｅ、Ｅ．Ｊ．Ｃｈｕｎｇ、Ｊ．Ｙ．ＫｉｍおよびＡ．Ａｔｈａｎａｓｓｉａｄｏｕ、２００７、「パーキンソン病の韓国人家族におけるアルファ−シヌクレイン遺伝子のＡｌａ５３Ｔｈｒ変異（Ｔｈｅ  Ａｌａ５３Ｔｈｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  Ｋｏｒｅａｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ、７１：４７１−４７３。
【０２０５】
Ｋｉｍ，Ｅ．Ｋ．およびＥ．Ｊ．Ｃｈｏｉ、２０１０、「ヒト疾患におけるＭＡＰＫシグナル伝達経路の病理学的役割（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＭＡＰＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１８０２：３９６−４０５。
【０２０６】
Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．およびＭ．Ｇ．Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｃｈｅｒ、２００７、「遺伝的革命から１０年後のパーキンソン病：複雑な疾患に対する複数の手がかり（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ，１０  ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｔｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｕｅｓ  ｔｏ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６９：２０９３−２１０４。
【０２０７】
Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，Ｊ．Ｈ．、Ｙ．Ｃｈｕ、Ｒ．Ａ．Ｈａｕｓｅｒ、Ｔ．Ｂ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣ．Ｗ．Ｏｌａｎｏｗ、２００８、「パーキンソン病における長期胚黒質移植におけるレビー小体様病理（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｎｉｇｒａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１４：５０４−５０６。
【０２０８】
Ｋｒｕｇｅｒ，Ｒ．，Ｗ．Ｋｕｈｎ，Ｔ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｄ．Ｗｏｉｔａｌｌａ，Ｍ．Ｇｒａｅｂｅｒ，Ｓ．Ｋｏｓｅｌ，Ｈ．Ｐｒｚｕｎｔｅｋ，Ｊ．Ｔ．Ｅｐｐｌｅｎ，Ｌ．ＳｃｈｏｌｓおよびＯ．Ｒｉｅｓｓ、１９９８、「パーキンソン病におけるアルファ−シヌクレインをコードする遺伝子のＡｌａ３０Ｐｒｏ変異（Ａｌａ３０Ｐｒｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、１８：１０６−１０８。
【０２０９】
Ｌａ  Ｖｉｔｏｌａ，Ｐ．、Ｃ．Ｂａｌｄｕｃｃｉ、Ｍ．Ｃｅｒｏｖｉｃ、Ｇ．Ｓａｎｔａｍａｒｉａ、Ｅ．Ｂｒａｎｄｉ、Ｆ．Ｇｒａｎｄｉ、Ｌ．Ｃａｌｄｉｎｅｌｌｉ、Ｌ．Ｃｏｌｏｍｂｏ、Ｍ．Ｇ．Ｍｏｒｇｅｓｅ、Ｌ．Ｔｒａｂａｃｅ、Ｌ．Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ、Ｄ．ＡｌｂａｎｉおよびＧ．Ｆｏｒｌｏｎｉ、２０１８、「アルファ−シヌクレインオリゴマーはグリア細胞の活性化およびＴｏｌｌ様受容体２を介して記憶を障害する（Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｍｐａｉｒ  ｍｅｍｏｒｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）」、Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  Ｉｍｍｕｎ、６９：５９１−６０２。
【０２１０】
Ｌａｎｇ，Ａ．Ｅ．およびＡ．Ｍ．Ｌｏｚａｎｏ、１９９８ａ、「パーキンソン病：２つの部分の１番目（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｉｒｓｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐａｒｔｓ．）」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３３９：１０４４−１０５３。
【０２１１】
Ｌａｎｇ，Ａ．Ｅ．およびＡ．Ｍ．Ｌｏｚａｎｏ、１９９８ｂ、「パーキンソン病：２つの部分の２番目（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｃｏｎｄ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐａｒｔｓ．）」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３３９：１１３０−１１４３。
【０２１２】
Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓ，Ｃ．Ａ．、Ｄ．Ｌ．Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｃａｒｒａｎｚａ、Ｕ．Ｓｅｎｇｕｐｔａ、Ａ．Ｌ．Ｃｌｏｓ、Ｇ．Ｒ．ＪａｃｋｓｏｎおよびＲ．Ｋａｙｅｄ、２０１１、「Ｔａｕオリゴマーは野生型マウスの記憶を障害し、シナプスおよびミトコンドリア機能障害を誘導する（Ｔａｕ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｍｐａｉｒ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｍｉｃｅ）」、Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ、６：３９。
【０２１３】
Ｌｉ，Ｊ．Ｙ．、Ｅ．Ｅｎｇｌｕｎｄ、Ｊ．Ｌ．Ｈｏｌｔｏｎ、Ｄ．Ｓｏｕｌｅｔ、Ｐ．Ｈａｇｅｌｌ、Ａ．Ｊ．Ｌｅｅｓ、Ｔ．Ｌａｓｈｌｅｙ、Ｎ．Ｐ．Ｑｕｉｎｎ、Ｓ．Ｒｅｈｎｃｒｏｎａ、Ａ．Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ、Ｈ．Ｗｉｄｎｅｒ、Ｔ．Ｒｅｖｅｓｚ、Ｏ．ＬｉｎｄｖａｌｌおよびＰ．Ｂｒｕｎｄｉｎ、２００８、「パーキンソン病患者の移植ニューロンにおけるレビー小体は宿主から移植片への疾患伝播を示唆する（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｕｇｇｅｓｔ  ｈｏｓｔ−ｔｏ−ｇｒａｆｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１４：５０１−５０３。
【０２１４】
Ｌｉｐｐａ，Ｃ．Ｆ．，Ｍ．Ｌ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｖ．Ｍ．ＬｅｅおよびＪ．Ｑ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ、１９９９、「アルツハイマー病のダウン症候群の脳の多くで、アルファ−シヌクレインに対する抗体によってレビー小体が検出される（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｄｅｔｅｃｔ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍａｎｙ  Ｄｏｗｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｂｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、４５：３５３−３５７。
【０２１５】
Ｌｉｕ，Ｈ．およびＭ．Ｚｈｏｕ、２０１７、「ＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫ経路の活性化を介したＹ７９網膜芽細胞腫細胞に対するクエルセチンの抗腫瘍効果（Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｏｎ  Ｙ７９  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＮＫ  ａｎｄ  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ｐａｔｈｗａｙｓ）」、ＢＭＣ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｌｔｅｒｎ  Ｍｅｄ、１７：５３１。
【０２１６】
Ｌｉｕ，Ｗ．、Ａ．Ｒｕｉｚ−Ｖｅｌａｓｃｏ、Ｓ．Ｗａｎｇ、Ｓ．Ｋｈａｎ、Ｍ．Ｚｉ、Ａ．Ｊｕｎｇｍａｎｎ、Ｍ．Ｄｏｌｏｒｅｓ  Ｃａｍａｃｈｏ−Ｍｕｎｏｚ、Ｊ．Ｇｕｏ、Ｇ．Ｄｕ、Ｌ．Ｘｉｅ、Ｄ．Ｏｃｅａｎｄｙ、Ａ．Ｎｉｃｏｌａｏｕ、Ｇ．Ｇａｌｌｉ、Ｏ．Ｊ．Ｍｕｌｌｅｒ、Ｅ．Ｊ．Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｙ．ＪｉおよびＸ．Ｗａｎｇ、２０１７、「代謝ストレス誘発性心筋症はＥｒｋ５シグナル伝達の減弱によるミトコンドリア機能障害によって引き起こされる（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｅｒｋ５  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）」、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ、８：４９４。
【０２１７】
Ｌｕｋ，Ｋ．Ｃ．、Ｖ．Ｋｅｈｍ、Ｊ．Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｂ．Ｚｈａｎｇ、Ｐ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｊ．Ｑ．ＴｒｏｊａｎｏｗｓｋｉおよびＶ．Ｍ．Ｌｅｅ、２０１２、「病理学的アルファ−シヌクレイン伝達は非トランスジェニックマウスにおいてパーキンソン様神経変性を開始する（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−ｌｉｋｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３８：９４９−９５３。
【０２１８】
Ｌｕｋ，Ｋ．Ｃ．、Ｃ．Ｓｏｎｇ、Ｐ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ａ．Ｓｔｉｅｂｅｒ、Ｊ．Ｒ．Ｂｒａｎｃｈ、Ｋ．Ｒ．Ｂｒｕｎｄｅｎ、Ｊ．Ｑ．ＴｒｏｊａｎｏｗｓｋｉおよびＶ．Ｍ．Ｌｅｅ、２００９、「外因性アルファ−シヌクレインフィブリルは培養細胞におけるレビー小体様細胞内封入体の形成の種となる（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｓｅｅｄ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０６：２００５１−２００５６。
【０２１９】
Ｌｕｔｈ，Ｅ．Ｓ．、Ｉ．Ｇ．Ｓｔａｖｒｏｖｓｋａｙａ、Ｔ．Ｂａｒｔｅｌｓ、Ｂ．Ｓ．ＫｒｉｓｔａｌおよびＤ．Ｊ．Ｓｅｌｋｏｅ、２０１４、「可溶性のプレフィブリルアルファ−シヌクレインオリゴマーは複合体Ｉ−依存性Ｃａ２＋−誘導ミトコンドリア機能障害を促進する（Ｓｏｌｕｂｌｅ，ｐｒｅｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｃａ２＋−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．）」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８９：２１４９０−２１５０７。
【０２２０】
Ｍａｎｃｚａｋ，Ｍ．およびＰ．Ｈ．Ｒｅｄｄｙ、２０１２、「アルツハイマー病ニューロンにおけるミトコンドリア分裂タンパク質Ｄｒｐ１と高リン酸化タウの間の異常な相互作用：ミトコンドリア機能障害とニューロン損傷に対する意味（Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｐ１  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｔａｕ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ）」、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２１：２５３８−２５４７。
【０２２１】
Ｍａｒｋｏｐｏｕｌｏｕ，Ｋ．、Ｚ．Ｋ．Ｗｓｚｏｌｅｋ、Ｒ．Ｆ．ＰｆｅｉｆｆｅｒおよびＢ．Ａ．Ｃｈａｓｅ、１９９９、「家族性パーキンソニズムにおけるＧ２０９Ａ  アルファ−シヌクレイン対立遺伝子の発現低下（Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ２０９Ａ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ａｌｌｅｌｅ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）」、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、４６：３７４−３８１。
【０２２２】
Ｍａｒｔｉｎ，Ｉ．、Ｖ．Ｌ．ＤａｗｓｏｎおよびＴ．Ｍ．Ｄａｗｓｏｎ、２０１１、「パーキンソン病の遺伝学における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１２：３０１−３２５。
【０２２３】
Ｍａｒｔｉｎ，Ｌ．、Ｘ．Ｌａｔｙｐｏｖａ、Ｃ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ａ．Ｍａｇｎａｕｄｅｉｘ、Ｍ．Ｌ．Ｐｅｒｒｉｎ、Ｃ．ＹａｒｄｉｎおよびＦ．Ｔｅｒｒｏ、２０１３、「Ｔａｕプロテインキナーゼ：アルツハイマー病への関与（Ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ、１２：２８９−３０９。
【０２２４】
Ｏｌａｎｏｗ，Ｃ．Ｗ．およびＷ．Ｇ．Ｔａｔｔｏｎ、１９９９、「パーキンソン病の病因と病態（Ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２２：１２３−１４４。
【０２２５】
Ｐａｎ，Ｊ．、Ｈ．Ｌｉ、Ｂ．Ｚｈａｎｇ、Ｒ．Ｘｉｏｎｇ、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｙ．Ｋａｎｇ、Ｗ．Ｃｈｅｎ、Ｚ．Ｂ．ＺｈａｏおよびＳ．Ｄ．Ｃｈｅｎ、２０１５、「ＪＮＫ３の小ペプチド阻害剤は、ＡＳＫ１−ＪＮＫ３シグナル伝達経路の阻害を介してＭＰＴＰ誘導損傷からドーパミン作動性ニューロンを保護する（Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＪＮＫ３  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ＭＰＴＰ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｖｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡＳＫ１−ＪＮＫ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１０：ｅ０１１９２０４。
【０２２６】
Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｎ．，Ｊ．Ｂ．Ｗｉｌｋ，Ｊ．Ｃ．Ｌａｔｏｕｒｅｌｌｅ，Ａ．Ｌ．ＤｅＳｔｅｆａｎｏ，Ｃ．Ｈａｌｔｅｒ，Ｅ．Ｗ．Ｐｕｇｈ，Ｋ．Ｆ．Ｄｏｈｅｎｙ，Ｊ．Ｆ．Ｇｕｓｅｌｌａ，Ｗ．Ｃ．Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｔ．ＦｏｒｏｕｄおよびＲ．Ｈ．Ｍｙｅｒｓ、２００９、「家族性パーキンソン病に寄与する感受性遺伝子に関するゲノムワイド関連解析（Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｆｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ  ｔｏ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１２４：５９３−６０５。
【０２２７】
Ｐｉｃｋｒｅｌｌ，Ａ．Ｍ．およびＲ．Ｊ．Ｙｏｕｌｅ、２０１５、「パーキンソン病におけるＰＩＮＫ１、パーキンおよびミトコンドリア忠実度の役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＰＩＮＫ１，ｐａｒｋｉｎ，ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｎｅｕｒｏｎ、８５：２５７−２７３。
【０２２８】
Ｒａｙ，Ａ．、Ｎ．Ｓｅｈｇａｌ、Ｓ．Ｋａｒｕｎａｋａｒａｎ、Ｇ．ＲａｎｇａｒａｊａｎおよびＶ．Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ、２０１５、「ＭＰＴＰはパーキンソン症候群マウスモデルにおいてＴＮＦ依存性Ｔｒｘ１酸化を介してＡＳＫ１−ｐ３８  ＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化する（ＭＰＴＰ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＡＳＫ１−ｐ３８  ＭＡＰＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＮＦ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｒｘ１  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ）」、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ、８７：３１２−３２５。
【０２２９】
Ｓｃｈａｐｉｒａ，Ａ．Ｈ．、Ｃ．Ｗ．Ｏｌａｎｏｗ、Ｊ．Ｔ．ＧｒｅｅｎａｍｙｒｅおよびＥ．Ｂｅｚａｒｄ、２０１４、「パーキンソン病およびハンチントン病における神経変性の遅延：将来の治療展望（Ｓｌｏｗｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｆｕｔｕｒｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ）」、Ｌａｎｃｅｔ、３８４：５４５−５５５。
【０２３０】
Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｕ．，Ｍ．Ｊ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ−Ｍｕｎｏｚ，Ｄ．Ｌ．Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｃａｒｒａｎｚａ，Ｃ．Ａ．Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓ，Ｊ．Ｅ．Ｇｅｒｓｏｎ，Ａ．Ａ．Ｐａｕｌｕｃｃｉ−Ｈｏｌｔｈａｕｚｅｎ，Ｓ．Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，Ｍ．Ｆａｒｈｅｄ，Ｇ．Ｒ．ＪａｃｋｓｏｎおよびＲ．Ｋａｙｅｄ、２０１５、「シヌクレイノパチーにおけるオリゴマーアルファ−シヌクレインとＴａｕの間の病理学的界面（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  Ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｔａｕ  ｉｎ  Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）」、Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ
Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，Ｍ．Ｇ．、Ｒ．Ａ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、Ｒ．Ｊａｋｅｓ、Ｍ．ＨａｓｅｇａｗａおよびＭ．Ｇｏｅｄｅｒｔ、１９９８、「パーキンソン病およびレビー小体を伴う認知症からのレビー小体の線維状封入体におけるアルファ−シヌクレイン（ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５：６４６９−６４７３。
【０２３１】
Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，Ｍ．Ｇ．、Ｍ．Ｌ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｖ．Ｍ．Ｌｅｅ、Ｊ．Ｑ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ、Ｒ．ＪａｋｅｓおよびＭ．Ｇｏｅｄｅｒｔ、１９９７、「レビー小体におけるアルファ−シヌクレイン（Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｉｎ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ、３８８：８３９−８４０。
【０２３２】
Ｓｐｉｒａ，Ｐ．Ｊ．，Ｄ．Ｍ．Ｓｈａｒｐｅ，Ｇ．Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｊ．ＣａｖａｎａｇｈおよびＧ．Ａ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、２００１、「Ａｌａ５３Ｔｈｒ  アルファ−シヌクレイン変異を有する家族におけるパーキンソン症候群の臨床的および病理学的特徴（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ａｌａ５３Ｔｈｒ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、４９：３１３−３１９。
【０２３３】
Ｓｕ，Ｃ．、Ｆ．Ｓｕｎ、Ｒ．Ｌ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｎ．ＲｙｂａｌｃｈｅｎｋｏおよびＭ．Ｓｉｎｇｈ、２０１４、「神経成長因子と過酸化水素プレコンディショニングの両方の神経保護効果の共通メディエーターとしてのＥＲＫ５／ＫＬＦ４シグナル伝達（ＥＲＫ５／ＫＬＦ４  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）」、Ａｇｅ（Ｄｏｒｄｒ）、３６：９６８５。
【０２３４】
Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｃ．、２０１１、「本物のＧＳＫ３基質とは？（Ｗｈａｔ  Ａｒｅ  ｔｈｅ  ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ  ＧＳＫ３  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ？）」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ、２０１１：５０５６０７。
【０２３５】
Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ，Ｌ．Ａ．、Ｋ．Ｌ．Ｇａｍｂｌｅ、Ｃ．Ｅ．Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｄｄｌｅ、Ａ．Ｂ．ＷｅｓｔおよびＶ．Ｍ．Ｌｅｅ、２０１４ａ、「軸索におけるアルファ−シヌクレインレビー神経突起様凝集体の形成は、異なるエンドソームの輸送を妨げる（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅ−ｌｉｋｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｉｎ  ａｘｏｎｓ  ｉｍｐｅｄｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）」、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、２５：４０１０−４０２３。
【０２３６】
Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ、Ｌ．Ａ．，Ｋ．Ｃ．ＬｕｋおよびＶ．Ｍ．Ｌｅｅ、２０１４ｂ、「レビー小体およびレビー神経突起様凝集体への内因性アルファ−シヌクレインの動員を播種するための初代ニューロン培養への外因性アルファ−シヌクレインの前形成フィブリルの添加（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｓｅｅｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｔｏ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅ−ｌｉｋｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）」、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、９：２１３５−２１４６。
【０２３７】
Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ，Ｌ．Ａ．、Ｋ．Ｃ．Ｌｕｋ、Ｔ．Ｐ．Ｐａｔｅｌ、Ｓ．Ａ．Ｔａｎｉｋ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｄｄｌｅ、Ａ．Ｓｔｉｅｂｅｒ、Ｄ．Ｆ．Ｍｅａｎｅｙ、Ｊ．Ｑ．ＴｒｏｊａｎｏｗｓｋｉおよびＶ．Ｍ．Ｌｅｅ、２０１１、「外因性アルファ−シヌクレインフィブリルは、シナプス機能障害とニューロン死につながるレビー小体型病理を誘発する（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｅａｔｈ）」、Ｎｅｕｒｏｎ、７２：５７−７１。
【０２３８】
Ｗａｎｇ，Ｗ．、Ｌ．Ｓｈｉ、Ｙ．Ｘｉｅ、Ｃ．Ｍａ、Ｗ．Ｌｉ、Ｘ．Ｓｕ、Ｓ．Ｈｕａｎｇ、Ｒ．Ｃｈｅｎ、Ｚ．Ｚｈｕ、Ｚ．Ｍａｏ、Ｙ．ＨａｎおよびＭ．Ｌｉ、２００４、「新規ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５はパーキンソン病のＭＰＴＰモデルにおいてドーパミン作動性ニューロンを保護する（ＳＰ６００１２５，ａ  ｎｅｗ  ＪＮＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＰＴＰ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ、４８：１９５−２０２。
【０２３９】
Ｗｕ，Ｒ．、Ｈ．Ｃｈｅｎ、Ｊ．Ｍａ、Ｑ．Ｈｅ、Ｑ．Ｈｕａｎｇ、Ｑ．Ｌｉｕ、Ｍ．ＬｉおよびＺ．Ｙｕａｎ、２０１６、「ｃ−Ａｂｌ−ｐ３８アルファ  シグナル伝達はＭＰＴＰ誘導神経細胞死において重要な役割を果たす（ｃ−Ａｂｌ−ｐ３８ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｌａｙｓ  ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ＭＰＴＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅａｔｈ）」、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ、２３：５４２−５５２。
【０２４０】
Ｘｉａ，Ｘ．Ｇ．、Ｔ．Ｈａｒｄｉｎｇ、Ｍ．Ｗｅｌｌｅｒ、Ａ．Ｂｉｅｎｅｍａｎ、Ｊ．Ｂ．ＵｎｅｙおよびＪ．Ｂ．Ｓｃｈｕｌｚ、２００１、「ＪＮＫ相互作用タンパク質−１の遺伝子導入はパーキンソン病のＭＰＴＰモデルにおけるドーパミン作動性ニューロンを保護する（Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＮＫ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＰＴＰ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８：１０４３３−１０４３８。
【０２４１】
Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｔ．、Ｈ．ＫａｗａｓａｋｉおよびＨ．Ｎｉｓｈｉｎａ、２０１２、「脳におけるＪＮＫおよびＭＫＫ経路の多様な役割（Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＪＮＫ  ａｎｄ  ＭＫＫ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ）」、Ｊ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ、２０１２：４５９２６５。
【０２４２】
Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｏ．、Ｄ．Ｊ．Ｐａｒｋ、Ｊ．Ｃ．Ｒｙｕ、Ｈ．Ｇ．Ｏｚｅｒ、Ｃ．Ｔｅｐ、Ｙ．Ｊ．Ｓｈｉｎ、Ｔ．Ｈ．Ｌｉｍ、Ｌ．Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ、Ａ．Ｊ．Ｋｕｎｗａｒ、Ｊ．Ｃ．Ｗａｌｔｏｎ、Ａ．Ｈ．Ｎａｇａｈａｒａ、Ｋ．Ｐ．Ｌｕ、Ｒ．Ｊ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｍ．Ｈ．ＴｕｓｚｙｎｓｋｉおよびＫ．Ｈｕａｎｇ、２０１２、「ＪＮＫ３はＡβペプチドにより誘導される代謝ストレスを持続する（ＪＮＫ３  ｐｅｒｐｅｔｕａｔｅｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、Ｎｅｕｒｏｎ、７５：８２４−８３７。
【０２４３】
Ｙｕｎ，Ｓ．Ｐ．、Ｄ．Ｋｉｍ、Ｓ．Ｋｉｍ、Ｓ．Ｋｉｍ、Ｓ．Ｓ．Ｋａｒｕｐｐａｇｏｕｎｄｅｒ、Ｓ．Ｈ．Ｋｗｏｎ、Ｓ．Ｌｅｅ、Ｔ．Ｉ．Ｋａｍ、Ｓ．Ｌｅｅ、Ｓ．Ｈａｍ、Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋ、Ｖ．Ｌ．Ｄａｗｓｏｎ、Ｔ．Ｍ．Ｄａｗｓｏｎ、Ｙ．ＬｅｅおよびＨ．Ｓ．Ｋｏ、２０１８、「Ｌ４４４Ｐ  ＧＢＡ変異によるアルファ−シヌクレイン蓄積とＧＢＡ欠損はＭＰＴＰ誘導パーキンソニズムに寄与する（ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＧＢＡ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｕｅ  ｔｏ  Ｌ４４４Ｐ  ＧＢＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ＭＰＴＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）」、Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ、１３：１。
【０２４４】
Ｚａｒｒａｎｚ，Ｊ．Ｊ．、Ｊ．Ａｌｅｇｒｅ、Ｊ．Ｃ．Ｇｏｍｅｚ−Ｅｓｔｅｂａｎ、Ｅ．Ｌｅｚｃａｎｏ、Ｒ．Ｒｏｓ、Ｉ．Ａｍｐｕｅｒｏ、Ｌ．Ｖｉｄａｌ、Ｊ．Ｈｏｅｎｉｃｋａ、Ｏ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｂ．Ａｔａｒｅｓ、Ｖ．Ｌｌｏｒｅｎｓ、Ｅ．Ｇｏｍｅｚ  Ｔｏｒｔｏｓａ、Ｔ．ｄｅｌ  Ｓｅｒ、Ｄ．Ｇ．ＭｕｎｏｚおよびＪ．Ｇ．ｄｅ  Ｙｅｂｅｎｅｓ、２００４、「アルファ−シヌクレインの新しい変異、Ｅ４６Ｋは、パーキンソンとレビー小体認知症を生じる（Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｍｕｔａｔｉｏｎ，  Ｅ４６Ｋ，  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）」、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、５５：１６４−１７３。
【０２４５】
Ｚｈａｏ，Ｆ．、Ｌ．Ｂｉ、Ｗ．Ｗａｎｇ、Ｘ．Ｗｕ、Ｙ．Ｌｉ、Ｆ．Ｇｏｎｇ、Ｓ．Ｌｕ、Ｆ．Ｆｅｎｇ、Ｚ．Ｑｉａｎ、Ｃ．Ｈｕ、Ｙ．ＷｕおよびＹ．Ｓｕｎ、２０１６、「グルコセレブロシダーゼ遺伝子の変異とパーキンソン病に対する感受性：ヨーロッパ人集団における最新メタ分析（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  Ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、３２０：２３９−２４６。
【０２４６】
Ｚｉｎｃｈｕｋ，Ｖ．およびＯ．Ｇｒｏｓｓｅｎｂａｃｈｅｒ−Ｚｉｎｃｈｕｋ、２０１４、「蛍光顕微鏡画像の定量的共局在分析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｍａｇｅｓ）」、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、６２：Ｕｎｉｔ  ４  １９  １１−１４。
【０２４７】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例証および例としていくらか詳細に説明されてきたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正が可能であることは、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかであろう。
【０２４８】
本明細書に引用される全ての刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許、および特許出願は、それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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