(57)【要約】  本明細書に開示の発明は、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療に適した新規のクラスに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
2021512925.tif 000017
の化合物であって、
式中、
ＲがＣ１−Ｃ５アルキルであり、
ｎが０又は１であり、
ｎが０で、Ｒがメチルである化合物を除く、化合物。
【請求項２】
ｎが１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｃ１−Ｃ５アルキルが、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｃ１−Ｃ５アルキルが、メチル、ｎ−ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル及びｎ−ペンチルから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｃ１−Ｃ５アルキルがメチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ｎが１で、Ｒがメチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の構造を有するドーパミンのＬ−ドーパ前駆体。
【請求項８】
請求項１に記載の構造を有する、酸化誘導炎症性分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の阻害剤。
【請求項９】
前記ＭＡＰＫがＪＮＫ及びＰ３８ＭＡＰＫである、請求項８に記載の阻害剤。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物を含む化合物。
【請求項１１】
医薬組成物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
経口投与、エアロゾルによる投与、吸入による投与、鼻腔投与、非経口投与、皮下投与、経皮投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、頬側投与、腹腔内投与、直腸投与又は膣内投与に適合された、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
経口投与に適した、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
細胞を酸化ストレスから保護するのに用いる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
ヒト又は動物細胞の酸化ストレス又は炎症状態を軽減する又は好転させる生体内での方法における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
神経変性疾患若しくは障害、又は脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、若しくはそれに関連する疾患若しくは障害に治療における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１７】
ヒト又は動物細胞の酸化ストレス又は炎症状態を軽減する又は好転させる方法であって、対象を式（Ｉ）の化合物で治療することを含み、
2021512925.tif 000018
式中、
ＲはＣ１−Ｃ５アルキルであり、
ｎは０又は１である
方法。
【請求項１８】
脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、又はそれに関連する疾患又は障害を治療するための、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
神経変性疾患若しくは障害、又は脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、若しくはそれに関連する疾患若しくは障害を治療する方法であって、それを患う、又はそれを罹患する素因を有する対象に化合物を投与することを含み、前記化合物が一般式（Ｉ）のものであり、
2021512925.tif 000019
式中、
ＲがＣ１−Ｃ５アルキルであり、
ｎが０又は１である
方法。
【請求項２０】
前記疾患又は障害が、中枢神経系への損傷によって引き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患又は障害が、シナプスによって相互につながっているニューロンの進行性の機能不全、変性及び死を特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患又は障害が、ヒト又は動物細胞の酸化ストレス又は炎症状態に関連する、又はそれを基礎とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患又は障害が、脳ドーパミンレベルの減少に関連する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経変性疾患及び障害が、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、パーキンソン病、続発性パーキンソニズム、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャイ・ドレーガー症候群、ドーパミン反応性ジストニア、嚢胞性線維症、家族性アミロイドポリニューロパチー、海綿状脳症、レビー小体病（ＬＢＤ）を伴う認知症、無動、動作緩徐、寡動、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、プリオン病、軽度脳外傷ｍＴＢＩ、アテローム性動脈硬化症、及びアレルギー性気道疾患から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患又は障害が、パーキンソン病又はドーパミン反応性ジストニアである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
ＲがＣ１−Ｃ５アルキルで、ｎが０又は１である請求項１に記載の前記化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の前記化合物が、ｎが１の化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の前記化合物が、ｎが０の化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の前記化合物が、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルがメチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルから選択される化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の前記化合物が、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルがメチル、ｎ−ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル及びｎ−ペンチルから選択される化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の前記化合物が、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルがメチルである化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の前記化合物が、ｎは０又は１で、Ｒがメチルである化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、
2021512925.tif 000020
又は
2021512925.tif 000021
である、請求項１７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、神経変性疾患又は障害の治療に有用な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は、ドーパミン作動性黒質線条体投射ニューロンが選択的に先に脆弱になり、消失することを特徴とする。いくつかの細胞メカニズムがＰＤの開始に示唆された。それらには、酸化ストレス及びミトコンドリアストレスが含まれる。脳内でドーパミンに変換されるレボドパはＬ−ドーパとも呼ばれ、今も依然としてパーキンソン病治療のゴールドスタンダードである。しかし、不足しているドーパミンを補充することを目的とする、主にレボドパ／カルビドパの組み合わせを用いる現在のこのＰＤ治療は効率的な対症療法であり、疾患の進行は抑えない。
【０００３】
くわえて、Ｌ−ドーパの不溶性と高投与量の頻繁な使用から多くの副作用が生じる。例えば、Ｌ−ドーパは吸収されにくく、胃に長期間とどまる場合がある。いくつかの研究は、Ｌ−ドーパ／ドーパミン分解の間の酸化的細胞死の誘導を示唆しており、Ｌ−ドーパ治療に伴ってさらなる困難が生じる。また、Ｌ−ドーパの毒性も黒質におけるドーパミン作動性細胞の早死の一因となる。
【０００４】
Ｌ−ドーパは吸収されにくく、いったん脳に入るとすぐにドーパミンに変換され、一部はオン／オフ変動（ｏｎ／ｏｆｆ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ）を引き起こす可能性がある。さらに、Ｌ−ドーパによる治療の４〜６年以内に、多くの患者の効果が次第になくなり始め、次の服用の効果はより急速に消失してしまう。これは「ウェアリング・オフ効果」と呼ばれる。くわえて、ドーパミン作動性ニューロンは劣化し続け、早死によって最終的に消失する。ドーパミン作動性細胞の消失は部分的にドーパミンの加水分解によるＲＯＳ産生に起因する。ドーパミン作動性細胞の酸化環境はアポトーシス及びさらなる細胞の劣化につながる。
【０００５】
これらの観察される困難のいくつかを克服するために、多くの戦略が開発されてきた。一部の患者では、Ｌ−ドーパとカルビドパの組み合わせ（シネメット）の液体形態の使用によって、錠剤投与と比較して変動が少なく、「オン」の時間が長くなる。しかし、早死から細胞を保護する治療法はない。
【０００６】
ＰＤの治療プロトコールにおける主要かつ最も重要なアンメットニーズの１つは、ドーパミン作動性ニューロンを細胞死からレスキューすることによって疾患の進行を阻止し、一定レベルのドーパミンを維持するために血中及び脳中のＬ−ドーパレベルの変動を防ぐ又は少なくとも減らすことである。
【０００７】
［先行技術文献］
［１］  米国特許第３，８０３，１２０号
［２］  国際特許出願第ＷＯ２００６／０５６６０４号
［３］  国際特許出願第ＷＯ２００９／００７６９６号
［４］  米国特許第５，０７３，５４７号
［５］  米国特許第４，０６５，５６６号
［６］  国際特許出願第ＷＯ２００７／０９１０１７号
［７］  国際特許出願第ＷＯ２０１３／１６８０２１号
［８］  国際特許出願第ＷＯ２０１３／０１７９７４号
［９］  米国特許第８，３０４，４５２号
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本明細書に開示された本発明の目的は、安定で、アポトーシス経路を阻害することによって細胞死を防ぐのに有効であり、かつＬ−ドーパを徐放モードで送達するための手段として作用する新しい種類（ｃｌａｓｓ）の化合物を導入することである。本発明のＬ−ドーパ誘導体の水溶性及びアミド形態は、ＰＤなどの神経変性疾患の標準的なＬ−ドーパ治療よりも、安定性及びバイオアベイラビリティを含むいくつかの利点を示している。
【０００９】
本発明の化合物を使用する治療法（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）は、Ｌ−ドーパでドーパミン作動性細胞を供給するのと同時に、ニューロン細胞、例えばドーパミン作動性ニューロンを細胞死からレスキューするための手段を提供する。これらは、脳へのＬ−ドーパの安定した供給を提供し、したがってＬ−ドーパのウェアリング・オフ効果を防ぎ、一方で黒質における細胞死からドーパミン作動性ニューロンを保護することによって達成可能である。
【００１０】
したがって、第１の態様では、一般式（Ｉ）の化合物が提供され、
【００１１】
2021512925.tif 000002
【００１２】
式中、
ＲはＣ１−Ｃ５アルキルであり、
ｎは０又は１である。
【００１３】
Ｒがメチルで、ｎが０である化合物は、本発明の新規化合物から除外される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ｎは１である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルは、メチル、ｎ−ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル及びｎ−ペンチルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルはメチルである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ｎは１で、Ｒはメチルである。
【００１７】
本明細書で提供される化合物がキラル中心を含むことは理解される。そのようなキラル中心は、（Ｒ）又は（Ｓ）配置のいずれかであってもよく、又はそれらの混合物であってもよい。したがって、本明細書で提供される化合物は、エナンチオマーとして純粋な形態で、又は立体異性体若しくはジアステレオマー混合物で提供されうる。化合物が生体内でエピ化を経る場合があることも理解されるべきである。したがって、例えばその（Ｒ）形態の化合物の投与は、生体内でエピ化する化合物の場合、その（Ｓ）形態の化合物の投与と同等であり、その逆も同様である。
【００１８】
くわえて、各アミノ酸残基はＬ−型又はＤ−型のいずれであってもよい。
【００１９】
本発明の化合物は、「遊離塩基」又は「遊離酸」形態、すなわち、プロトン化／アルキル化又は非プロトン化／非アルキル化形態で提供されうるか、又は薬学的に受容可能な塩の形態で与えられうる。そのような塩は、有機酸、例えば脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカンジオイック酸（ａｌｋａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄｓ）、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などから誘導される塩だけではなく、無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などから誘導することができる。これらの塩としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソ酪酸、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩が挙げられうる。さらなる塩については、Ｂｅｒｇｅ  Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６：１−１９（１９７７）を参照されたい。
【００２０】
本発明の化合物は、Ｌ−ドーパデポ剤又はＬ−ドーパのプロドラッグとみなすことができ、ドーパの前駆体として機能する。アミド結合の加水分解は、Ｌ−ドーパとドーパミンの産生を遅くする原因となる律速反応であり、脳へのドーパミンの安定した送達レベルを確実にする。
【００２１】
さらに、本発明の化合物は、１つ又は２つのシステイン残基（Ｃｙｓ）の存在に起因しうるレドックス活性を示す。１つ又は２つの残基はそれぞれ、活性酸素種（ＲＯＳ）スカベンジャーであり、銅と亜鉛のキレート化能力によるＲＯＳ生成の阻害剤である。この抗アポトーシス特性はドーパンミン作動性ニューロンニューロンを早死から保護する。また、隣接するペプチド結合を有する１つ又は２つのＣｙｓ残基の存在は、ＭＥＦ−２Ｃなどのタンパク質を脱ニトロシル化できる化合物を与える。当技術分野で知られているように、ＭＥＦ−２Ｃは、アルファ−シヌクレイン及びミトコンドリア標的毒素によってニトロシル化される転写因子であり、パーキンソン病に関連する神経細胞死の開始において主要な役割を果たす。
【００２２】
それらの化合物は、オーラノフィン誘発炎症性分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、特にＪＮＫ及びＰ３８ＭＡＰＫが引き起こす誘ポトーシスの効果的な阻害剤である。
【００２３】
したがって、本発明の目的は、一般式（Ｉ）の化合物を含む組成物、好ましくは医薬組成物を提供することである。
【００２４】
本発明の組成物は、当業者に周知のように、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、又は希釈剤などの好適な添加剤をさらに含むことができる。薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性なもの及び使用条件下で有害な副作用又は毒性を有しないものである。
【００２５】
担体の選択は、部分的には、組成物中で使用される本発明の特定の化合物によって、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定されることになる。したがって、本発明の医薬組成物の多種多様な適切な製剤が存在する。経口、エーロゾル、吸入、鼻腔、非経口、皮下、経皮投与（例えばパッチ）、皮内、静脈内、筋肉内、頬側、腹腔内、直腸及び膣投与のための組成物は、単に例示的であり、決して限定的ではない。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物及び組成物は、経口投与に好適である、又は経口投与に適合される。
【００２７】
経口投与用組成物は、（ａ）水、食塩水、又はオレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の化合物などの液体溶液、（ｂ）それぞれ所定量の有効成分を固体又は顆粒として含有する、カプセル剤、小袋剤（ｓａｃｈｅｔｓ）、錠剤、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、及びトローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、（ｃ）粉末、（ｄ）適切な液体中の懸濁液、並びに（ｅ）好適なエマルジョンを含みうる。液体製剤は、薬学的に許容される界面活性剤、懸濁剤、又は乳化剤の添加の有無にかかわらず、水及びアルコールなどの希釈剤、例えばエタノール、ベンジルアルコール、及びポリエチレンアルコールを含みうる。カプセル剤形態は、例えば界面活性剤、潤滑剤、並びにラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、及びコーンスターチなどの不活性充填剤を含有する通常のハード又はソフトシェルゼラチン型であることができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモでんぷん、アルギン酸、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、香料、及び薬理学的に適合性がある担体の１つ又は複数を含むことができる。トローチ剤形態は、香料、通常スクロース及びアカシア中の活性成分、並びにゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアなどの不活性基剤中の活性成分を含むトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）、エマルジョン、ゲルなどを含み、活性成分にくわえて当該技術分野で公知のかかる担体を含有することができる。
【００２８】
本発明の化合物は、単独で、又は他の好適な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧許容噴射剤に入れることができる。それらはまた、ネブライザー又はアトマイザー中などの非加圧調製物用の医薬として製剤化することができる。
【００２９】
非経口投与に適した組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有できる水性及び非水性の等張性無菌注射溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、保存剤を含む水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。化合物は、石鹸又は洗剤などの薬学的に許容される界面活性剤、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースなどの懸濁剤、又は乳化剤及び医薬補助剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）の添加の有無にかかわらず、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及び関連する糖溶液、エタノール、イソプロパノール、又はヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコール、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなどのグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００などのエーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はアセチル化脂肪酸グリセリドを含む無菌液体又は液体の混合物などの薬学的担体中の生理学的に許容される希釈剤中で投与することができる。
【００３０】
非経口製剤に用いられる油としては、石油、動物油、植物油、又は合成油が挙げられる。油の具体例としては、ピーナッツ、大豆、ゴマ、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリン、鉱物などが挙げられる。非経口製剤に用いるのに適した脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは好適な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤に用いるのに好適な石鹸としては、脂肪アルカリ金属（ｆａｔｔｙ  ａｌｋａｌｉ  ｍｅｔａｌ）、アンモニウム、及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、好適な洗剤としては、（ａ）例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライドなどのカチオン性洗剤、（ｂ）例えばアルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、及びオレフィンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、エーテル硫酸塩、及びモノグリセリド硫酸塩、及びスルホコハク酸塩などのアニオン性洗剤、（ｃ）例えば脂肪アミンオキシド（ｆａｔｔｙ  ａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅｓ）、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーなどの非イオン洗剤、（ｄ）例えばアルキル−β−アミノプリオピネート、及び２−アルキル−イミダゾリン第四アンモニウム塩などの両性洗剤、並びに（３）これらの混合物が挙げられる。
【００３１】
非経口製剤は、保存剤及び緩衝剤、並びに投与に際して刺激（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ）を低減する約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ又は複数の非イオン性界面活性剤を含有しうる。そのような製剤中の界面活性剤の量はさまざまでありうる。好適な界面活性剤としては、ソルビタンモノオレエートなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性塩基を有するエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位投与量又は複数回投与量（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）密封容器で提示することができ、使用直前に注射用の滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保存することができる。即時注射（Ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
【００３２】
本発明の化合物は、その要件が当該技術分野で公知である注射製剤にすることができる。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，２３８〜２５０頁（１９８２年）、及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ、第４版、６２２〜６３０頁（１９８６年）を参照されたい。
【００３３】
本明細書に示されるように、本発明の化合物は、おそらく酸化ストレスによって引き起こされる、オーラノフィン誘発形態学的変化から細胞を保護するのに有効であることが見出されている。使用したモデルでは、アウラノフィンはチオレドキシンレダクターゼを阻害し、チオレドキシンがその還元状態と活性状態を回復するのを妨げることによって酸化ストレスを誘発する。パーキンソン病（ＰＤ）などの神経変性疾患への主要な寄与因子の１つは、細胞の酸化状態及び炎症状態の増加である。このモデルを用いて、酸化／炎症誘導細胞死を抑える化合物の効力と可能性を調べた。
【００３４】
したがって、本発明の化合物又はそれらを含む組成物は、オーラノフィン誘発形態学的変化から細胞を保護する方法において使用することができる。本発明はさらに、生体内でヒト又は動物細胞の酸化ストレス又は炎症状態を軽減する又は好転させる方法における本発明の化合物又は組成物の使用に関する。
【００３５】
これらの形態学的変化から細胞を保護する、又はヒト若しくは動物細胞の酸化状態若しくは炎症状態を軽減するか、若しくは好転させるかのいずれかによって、本発明の化合物は、間接的又は直接的に、神経変性疾患若しくは障害、又は脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、若しくはそれに関連する疾患若しくは障害を治療することができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「神経変性疾患若しくは障害、又は脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、若しくはそれに関連する疾患若しくは障害」は、中枢神経系への損傷によって引き起こされ、しばしばシナプスによって相互につながっているニューロンの特定の集団の進行性の機能不全、変性、及び死によって同定できる疾患又は障害を指す。そのような神経変性疾患及び障害の限定されない例としては、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、パーキンソン病、続発性パーキンソニズム、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャイ・ドレーガー症候群、ドーパミン反応性ジストニア、嚢胞性線維症、家族性アミロイドポリニューロパチー、海綿状脳症、レビー小体病（ＬＢＤ）を伴う認知症、無動、動作緩徐、寡動、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、プリオン病、軽度脳外傷ｍＴＢＩ、アテローム性動脈硬化症及びアレルギー性気道疾患が挙げられる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、パーキンソン病及びドーパミン反応性ジストニアの治療に使用される。
【００３８】
別の態様では、神経変性疾患若しくは障害、又は脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、若しくはそれに関連する疾患若しくは障害を治療する方法が提供され、その方法は、有効量の一般式（Ｉ）の化合物を、そのような疾患若しくは障害を患う対象、そのような疾患若しくは障害に罹患する素因を有する対象、又はそのような疾患若しくは障害の初期発現に関連する１つ若しくは複数の症状を示す対象に投与することを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、一般式（Ｉ）の化合物は、ＲがＣ１−Ｃ５アルキルであり、ｎは０又は１である化合物である。いくつかの実施形態では、ｎは１であり、いくつかの他の実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルは、メチル、ｎ−ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル及びｎ−ペンチルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルはメチルである。いくつかの実施形態では、ｎは０又は１であり、Ｒはメチルである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、一般式（Ｉ）の化合物は、本明細書において（ＩＩ）で指定される化合物であり、いくつかの他の実施形態では、この化合物は、本明細書において（ＩＩＩ）で指定される化合物である。
【００４１】
2021512925.tif 000003
2021512925.tif 000004
【００４２】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、開示されているような疾患に関連する望ましくない症状を改善すること、そのような症状が現れるのを未然に防ぐこと、病気の進行を遅らせる、若しくは症状の悪化を遅らせること、寛解期の開始を促進し、進行性の慢性期に生じる不可逆的な障害を遅らせること、前記（ｓａｉｄ）進行期の開始を遅らせること、重症度を下げる、若しくは疾患を治癒すること、生存率を向上する、若しくは回復を早めること、若しくは疾患の発生を予防すること、又は上記のうち２つ以上の組み合わせ、及びレボドパとともにその時点で使用している薬剤の頻度を下げることに有効な本発明の組成物又は本発明の化合物の治療量の投与を指す。
【００４３】
本明細書において「有効量」は、当該技術分野で公知ありうるような考慮事項によって決定される。その量は、とりわけ、治療される疾患のタイプ及び重症度並びに治療計画に応じて、上記のように所望の治療効果を達成するのに有効でなければならない。典型的には、有効量は、適切にデザインされた治験（用量範囲試験）で決定され、当業者であれば有効量を決定するためにそのような試験を適切に行う方法を知っているであろう。一般に知られているように、有効量は、リガンドの受容体への親和性、体内でのその分布プロファイル、体内での半減期などのさまざまな薬理学的パラメーターを含むさまざまな因子、望ましくない副作用、もしあれば、年齢や性別などの因子に依存する。
【００４４】
したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、一般式（Ｉ）の化合物が提供され、
【００４５】
2021512925.tif 000005
【００４６】
式中、
ＲはＣ１−Ｃ５アルキルであり、
ｎは０又は１である。ｎが０で、Ｒがメチルである化合物は除く。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ｎは１である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルは、メチル、ｎ−ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル及びｎ−ペンチルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルはメチルである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ｎは１であり、Ｒはメチルである。
【００５０】
また、式（Ｉ）による構造を有するドーパミンのＬ−ドーパ前駆体も提供される。
【００５１】
式（Ｉ）による構造を有する、酸化誘導炎症性分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の阻害剤も提供される。いくつかの実施形態では、ＭＡＰＫはＪＮＫ及びＰ３８ＭＡＰＫである。
【００５２】
また、式（Ｉ）の化合物を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、その組成物は医薬組成物であり、任意選択で、経口投与、エアロゾルによる投与、吸入による投与、鼻腔投与、非経口投与、皮下投与、経皮投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、頬側投与、腹腔内投与、直腸投与又は膣内投与に適合される。いくつかの実施形態では、製剤／組成物は経口投与に適する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は細胞を酸化ストレスから保護するのに用いられる。
【００５４】
式（Ｉ）の化合物は、ヒト又は動物細胞の酸化ストレス又は炎症状態を軽減する又は好転させるための、例えば神経変性疾患若しくは障害、又は脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、若しくはそれに関連する疾患若しくは障害を治療するための生体内での方法に使用することができる。
【００５５】
したがって、ヒト又は動物細胞の酸化ストレス又は炎症状態を軽減する又は好転させるための方法が提供され、その方法は、対象を式（Ｉ）の化合物で治療することを含み、
【００５６】
2021512925.tif 000006
【００５７】
式中、
ＲはＣ１−Ｃ５アルキルであり、
ｎは０又は１である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、又はそれに関連する疾患又は障害を治療するためものである。
【００５９】
神経変性疾患若しくは障害、又は脳ドーパミンレベルの減少を特徴とする、若しくはそれに関連する疾患若しくは障害を治療するための方法であって、それを患う、又はそれを患う素因を有する対象に化合物を投与することを含み、その化合物が一般式（Ｉ）のものであり、
【００６０】
2021512925.tif 000007
【００６１】
式中、
ＲはＣ１−Ｃ５アルキルであり、
ｎは０又は１である
方法。
【００６２】
いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、中枢神経系への損傷によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、シナプスによって相互につながっているニューロンの進行性の機能不全、変性及び死を特徴とする。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ヒト又は動物細胞の酸化ストレス又は炎症状態に関連する、又はそれを基礎とする。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、脳ドーパミンレベルの減少に関連する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患及び障害は、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、パーキンソン病、続発性パーキンソニズム、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャイ・ドレーガー症候群、ドーパミン反応性ジストニア、嚢胞性線維症、家族性アミロイドポリニューロパチー、海綿状脳症、レビー小体病（ＬＢＤ）を伴う認知症、無動、動作緩徐、寡動、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性イギリス型認知症、家族性デンマーク型認知症、プリオン病、軽度脳外傷ｍＴＢＩ、アテローム性動脈硬化症、及びアレルギー性気道疾患から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、パーキンソン病又はドーパミン反応性ジストニアである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される化合物は、ＲがＣ１−Ｃ５アルキルで、ｎが０又は１である化合物である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。いくつかの実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルは、メチル、ｎ−ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル及びｎ−ペンチルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１−Ｃ５アルキルはメチルである。いくつかの実施形態では、ｎは０又は１であり、Ｒはメチルである。いくつかの実施形態では、化合物は以下のものである。
【００６６】
2021512925.tif 000008
【００６７】
又は
【００６８】
【化７】
2021512925.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００６９】
本明細書に開示の主題をよりよく理解し、それが実際にどのように実施されうるかを例示するために、添付の図面を参照して、非限定的な例としてのみ、以下の実施形態を説明する。
【図１】図１は、化合物ＳＤ−４４４が、オーラノフィン（ＡｕＦ）誘導細胞死からヒト神経芽細胞腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）をレスキューする能力を示す。５μＭのＡｕＦで３０分間前処理し、洗浄し、その後ＳＤ−４４４に濃度を高めながら曝露した細胞の生存率を２４時間後に測定した。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで示される。
【図２】図２は、ｐ３８ＭＡＰＫの阻害誘導リン酸化によって示されるように、酸化ストレス誘導炎症からヒト神経芽細胞腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を保護するＳＤ−４４４の能力を示す。細胞を、ＳＤ−４４４の有り無しで、１０μＭのＡｕＦで処理した。リン酸化はウェスタンブロット分析によって測定した。各バンドの量をデンシトメトリーによって定量し、β−カテニン（ｂ−ｃａｔ）で正規化した線形回帰プログラムでプロットした。
【図３】図３は、ＪＮＫの阻害誘導リン酸化による酸化ストレスから細胞を保護するＳＤ−４４４の能力を示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＳＤ−４４４の有り無しで、１０μＭのＡｕＦで処理した。リン酸化はウェスタンブロット分析によって測定した。各バンドの量をデンシトメトリーによって定量し、総ＪＮＫに正規化した線形回帰プログラムでプロットした。
【図４】図４は、ＳＤ−４４４を用いることによって、酸化ストレスによるＰＣ１２細胞の形態学的変化が抑えられることを示す。ＰＣ１２細胞を、ＳＤ−４４４の有り無しで、ＡｕＦで処理した。形態学的変化を４時間後に可視化した（倍率×２００倍）。
【図５】図５は、ＥＲＫ１／２の阻害誘導リン酸化によって示される、酸化ストレス誘導炎症からヒト神経芽細胞腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を保護するＳＤＡ−３４１の能力を示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＳＤＡ−３４１の有り無しで、１０μＭのＡｕＦで処理した。リン酸化はウェスタンブロット分析によって測定した。各バンドの量をデンシトメトリーによって定量し、ベータ−カテニンに正規化した線形回帰プログラムでプロットした。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、ＥＲＫ１／２のオーラノフィン誘導リン酸化を阻害することによって示される、酸化ストレス誘導炎症からＰＣ１２細胞を保護するＳＤＡ−３４１の能力を示す。細胞を、ＳＤＡ−３４１の有り又は無しで、１０μＭのＡｕＦで処理した。リン酸化はウェスタンブロット分析により測定した（図６Ａ）。各バンドの量をデンシトメトリーで定量し（図６Ｂ）、総ＥＲＫ２で正規化した線形回帰プログラムでプロットした（図６Ｃ）。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、ＳＤＡを用いることによって、酸化ストレスによるＰＣ１２細胞の形態学的変化が抑えられることを示す。（図７Ａ）対照未処理ＰＣ１２細胞。（図７Ｂ）ＡｕＦ（２μＭ、３０分）で処理したＰＣ１２細胞は、未処理細胞と比較して形態を失い、丸みを帯びた。（図７Ｃ）１５０μＭ  ＳＤＡとインキュベートしたＡｕＦ処理（２μＭ、３０分）細胞は正常な形態を示した（倍率×１００及び×２００）。細胞をＡｕＦ（２μＭ）で３０分間処理し、洗浄し、次いでＳＤＡを２５μＭ又は１００μＭで加えた。４時間後、細胞を可視化した（倍率１００×及び４００×）。
【図８】図８は、ラット及びマウスにおけるＰＤのモデルとして広く使用されている、ミトコンドリアにストレスを及ぼすことによってＰＤの疾患の特徴を模倣する殺虫剤ロテノンを投与したラットの動物体重をまとめたものである。ＳＤ又はＳＤＡとともにロテノンを投与したラット及び未投与（ｎａｉｖｅ）ラットの体重。
【図９】図９は、単独で、又はＳＤ若しくはＳＤＡのいずれかの存在下でロテノン処理したラット、及び未投与ラットの立ち上がり行動試験の結果を示す。ＳＤ−４４４（３３ｍｇ／ｋｇ）又はＳＤＡ−３４１（３３ｍｇ／ｋｇ）の有り無しでロテノン（３．０ｍｇ／ｋｇ）を投与したラット。単独で、又はＳＤ若しくはＳＤＡのいずれかの存在下でロテノンを投与したラット、ＳＤ又はＳＤＡとともにロテノンを投与した未投与ラット、及び未投与ラットの立ち上がり行動が、４、８、及び１０日目に示されている。
【図１０】図１０は、単独で、又はＳＤ若しくはＳＤＡのいずれかの存在下でロテノン処理したラット、及び未投与ラットのロータロッドの結果を示す。ＳＤ−４４４（３３ｍｇ／ｋｇ）又はＳＤＡ−３４１（３３ｍｇ／ｋｇ）の有り無しでロテノン（３．０ｍｇ／ｋｇ）を投与したラット。単独で、又はＳＤ若しくはＳＤＡのいずれかの存在下でロテノンを投与したラットのロータロッド行動を試験した。ＳＤ又はＳＤＡとともにロテノンを投与した未投与ラット、及び未投与ラットが４、８、及び１０日目に示されている。
【図１１】図１１は、単独で、又はＳＤ若しくはＳＤＡのいずれかの存在下でロテノン処理したラット、及び未投与ラットのラットビーム歩行試験の結果を示す。ＳＤ−４４４（３３ｍｇ／ｋｇ）  又はＳＤＡ−３４１（３３ｍｇ／ｋｇ）  の有り無しでロテノン（３．０ｍｇ／ｋｇ）を投与したラット。単独で、又はＳＤ若しくはＳＤＡのいずれかの存在下でロテノンを投与したラットの歩行ビーム行動を試験した。ＳＤ又はＳＤＡとともにロテノンを投与した未投与ラット、及び未投与ラットが４、８、及び１０日目に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
結果
合成
アセチル−Ｃｙｓ−２，３−ジヒドロキシフェニルアラニン−Ｃｙｓ−アミド（ＳＤ−４４４）は標準的なペプチド合成法によって調製した。
【００７１】
ＳＤ−４４４が神経細胞をアポトーシスシグナル伝達の活性化から保護するかどうか試験した。
【００７２】
Ａ）ＳＤ−４４４の抗アポトーシス活性をヒト神経細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙで試験した。チオレドキシンレダクターゼ活性を選択的に遮断することによって細胞ストレスを誘発するオーラノフィン（ＡｕＦ）を用いて細胞を誘発した。
【００７３】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェルプレート上に播き、さまざまな濃度のＡｕＦで３０分間処理した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、示されているように処理した。２４時間後、細胞を最終濃度０．５％のグルタルアルデヒドで１０分間固定した。細胞をＤＤＷで一晩乾燥させて３回洗浄し、ホウ酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）で１回洗浄した。固定した細胞を、ホウ酸バッファーに溶かした１％メチレンブルー２００μｌで１時間染色した。充分に洗浄し（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｗａｓｈｉｎｇ）、乾燥した後、色を２００μｌの０．１Ｍ  ＨＣｌで３７℃にて１時間抽出し、６３０ｎｍでの吸光度を分光光度計で読み取った。
【００７４】
ＳＤ−４４４を細胞に加えると、ＡｕＦ効果は部分的に抑えられ、神経細胞の生存率は部分的に回復した（図１）。
【００７５】
Ｂ）アポトーシスを防ぐＳＤ−４４４の能力をモニターし、細胞の保護を発揮もたらす分子機構がＡＳＫ−ＭＡＰＫ経路であることを同定した。
【００７６】
このアッセイでは、２０から３０マイクログラムのタンパク質試料を、１０−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせた。次いで、タンパク質を電気泳動的にニトロセルロース（ワットマン、ドイツ）に移した。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．９％ＮａＣｌ及び０．０２％ツイーン２０）中で、４％Ｄｉｆｃｏ脱脂乳（ＢＤ、米国）と室温で１時間インキュベートすることによってブロックし、一次抗体、ウサギｍＡｂのｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）及びウサギＡｂのｐ３８と４℃で一晩インキュベートした。
【００７７】
図２及び図３に示されるように、神経細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＡｕＦによって誘発されたストレスは、ＭＡＰＫ  ｐ３８及びＪＮＫの活性化を通して細胞死経路の活性化をもたらした。ＳＤＡ−４４４で処理した細胞では、ＪＮＫにおいて既に３０μＭ（図２）及び１０μＭ（図３）でｐ３８活性化の有意な減少があった。
【００７８】
Ｃ）位相顕微鏡研究：ＰＣ１２を２μＭのオーラノフィンに３０分間曝露し、洗浄後に２５０μＭのＳＤ−４４４と３７℃でさらに４時間インキュベートすることによって、酸化ストレスから細胞をレスキューするＳＤ−４４４の能力を試験した。
【００７９】
図４に示されるように、丸く見え、正常な形態を失ったオーラノフィンに曝露された細胞とは対照的に、ＡｕＦ、次いでＳＤ−４４４とインキュベートした細胞は、未処理の細胞と類似の形態を示した。
【００８０】
アセチル−Ｃｙｓ−２，３−ジヒドロキシフェニルアラニン−アミド（ＳＤＡ−３４１）は、合成、精製し、化学的に分析した。ＳＤＡ−３４１を従来の標準的な液相法で調製した。
【００８１】
ＳＤＡ−３４１の活性
ＳＤＡ−３４１が神経細胞をアポトーシスシグナル伝達の活性化から保護するかどうか試験した。
【００８２】
Ａ）アポトーシスを防ぐＳＤＡ−３４１の能力をモニターし、細胞の保護をもたらす分子機構がＡＳＫ−ＭＡＰＫ経路であることを同定した。
【００８３】
このアッセイでは、２０から３０マイクログラムのタンパク質試料を、１０−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせた。次いで、タンパク質を電気泳動的にニトロセルロース（ワットマン、ドイツ）に移した。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．９％ＮａＣｌ及び０．０２％ツイーン２０）中で、４％Ｄｉｆｃｏ脱脂乳（ＢＤ、米国）と室温で１時間インキュベートすることによってブロックし、一次抗体、ｐ−ＪＮＫＭＡＰＫ及びβ−カテニンと４℃で一晩インキュベートした。
【００８４】
図５に示されるように、神経細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＡｕＦによって誘発されたストレスは、ＭＡＰＫ  ＪＮＫの活性化を通して細胞死経路の活性化をもたらした。ＳＤＡ−３４１で処理した細胞では、ＪＮＫ活性化の低下における１００μＭのＥＣ５０。
【００８５】
図６に示されるように、対応する抗ＥＲＫ１／２及びＥＲＫ２抗体とともに、ＰＣ１２細胞でＡｕＦ誘発ＥＲＫ１／２活性化を低下させるＳＤＡ−３４１の能力も試験した。計算値ＥＣ５０＝８０μＭ。
【００８６】
Ｂ）位相顕微鏡研究：ＰＣ１２を、１５０μＭのＳＤＡの有り無しで２μＭのオーラノフィンに３０分間曝露することによって、酸化ストレスから細胞をレスキューするＳＤＡの能力を試験した。ＡｕＦを３０分後に洗浄し、１５０μＭのＳＤＡを加え、３７℃でさらに４時間インキュベートした。
【００８７】
位相顕微鏡は、図７に示されるように、４時間後の細胞の形態を示した。ＳＤＡとインキュベートしたＰＣ１２細胞は、ＡｕＦに曝露した細胞とは対照的に、未処理細胞と同様の形態を示し、丸くなって、正常な形態を失っているように見えた。
【００８８】
動物実験：目的
本研究の目的は、２つの新規化合物、スーパードパ（ＳｕｐｅｒＤｏｐａ）（ＳＤ；４４４）及びスーパードパマイド（Ｓｕｐｅｒｄｏｐａｍｉｄｅ）（ＳＤＡ；３４１）の生体内神経経路保護における効力を、ラットのパーキンソン病（ＰＤ）のロテノン誘発モデルを用いて検討することであった。本研究はスプラーグドーリーラットを用いて行った（表１及び表２）。
表１：試験系
【００８９】
2021512925.tif 000010
【００９０】
表２：ユーティリティと環境管理
【００９１】
2021512925.tif 000011
【００９２】
群及び実験デザイン
表３に示すように動物を４群に分けた。
【００９３】
１−ＳＤ（ロテノン＋ＳＤ）；２−ＳＤＡ（ロテノン＋ＳＤＡ）；３−対照（ロテノン）；４−未投与
実験群は、投与群（１〜３）に６匹の動物、未投与群（４）に２匹の動物から構成した。ロテノンは３．０ｍｇ／ｋｇを１日１回朝に腹腔内投与（ＩＰ）した（１〜９日目）。ＳＤ３３ｍｇ／ｋｇとＳＤＡ３３ｍｇ／ｋｇは１日１回午後に腹腔内投与した（１〜９日目）。
【００９４】
立ち上がり行動試験、ロータロッド試験及びビーム歩行試験を、投与の開始前（０日目）並びに実験の４、８及び１０日目行った。
【００９５】
投与の開始前（０日目）、実験期間中の４、７、９日、及び試験終了日の１１日目に動物の体重を測定した。１１日目に動物を犠牲にし、脳をさらなる組織病理学的分析用に採取した。
【００９６】
表３：動物の群
2021512925.tif 000012
【００９７】
実験手順
群の割り付け
馴化期間の最終日に、体重に基づいて動物を投与群（ケージ内に３匹のラット）に割り付けたが、平均体重はすべての投与群で同等であった。
【００９８】
体重のモニタリング
投与前にすべての動物の体重を測り、体重測定値を表４及び図８に示す。
【００９９】
表４：動物の体重
2021512925.tif 000013
【０１００】
薬剤投与
ＩＰ投与：ロテノンを群１〜３に投与した。ロテノンは３．０ｍｇ／ｋｇを１日１回朝に腹腔内注射した（１〜９日目）。ＳＤとＳＤＡは３３ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、１日１回午後に腹腔内注射した（１〜９日目）。第４群は未投与で、未投与群のまま残した。
【０１０１】
ラット立ち上がり行動試験
透明なガラス製のシリンダー（高さ４０ｃｍ、直径２０ｃｍ）に動物を入れ、２分間の立ち上がり回数を観察した。動物が肩より上に手を上げ、前肢でシリンダーの壁に接触するのを、立ち上がりとみなした。ラット立ち上がり行動試験の結果を表５及び図９に示す。
【０１０２】
表５：［立ち上がり行動（シリンダー）］試験の結果
2021512925.tif 000014
【０１０３】
ロータロッド行動試験
この試験を用いて運動協調性とバランスを評価した。装置は、４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで３００秒で加速するように設定し、同じケージからの動物を最初に４ｒｐｍで回転するロッド上の別々のレーンに置いた。ロータロッド試験の結果を表６及び図１０に示す。
【０１０４】
表６：ロータロッド結果
2021512925.tif 000015
【０１０５】
ラットビーム歩行試験
動物を、１ｍの長さの狭いアルミニウムビーム上に一方の端に向けてそっと置き、ビームの端まで歩行させた。ラットビーム歩行試験の結果を表７及び図１１に示す。
【０１０６】
表７：ラットビーム歩行試験の結果
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【０１０７】
試験の終了
ＣＯ２によって動物を安楽死させた。採血し、血清を分離した。２０匹のラットから、臓器（脳）、２０試料を採取し、２．５％ＰＦＡに固定した。ラット脳マトリックスを用いて、脳を解剖して、黒質緻密部（ＳＮＣ）及び線条体（ＳＴ）から切片を得た。脳切片ごとに標準的な位置（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）で切開した後、埋め込みカセットに入れた。
【０１０８】
試験結果
インビトロ  −  組織培養の研究は、ＳＤとＳＤＡがオーラノフィン（ＡｕＦ）によるチオレドキシンレダクターゼの選択的阻害によって誘発される酸化ストレスからヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を保護することを示した。ＡｕＦはＪＮＫ及びｐ３８のリン酸化を通してＭＡＰＫ経路の活性化を引き起こす。２つの化合物ＳＤ−４４４とＳＤＡ−３４１はＪＮＫとｐ３８リン酸化を阻害し、それによってアポトーシス経路を阻害する。アポトーシスを防ぐことは、位相顕微鏡で示された細胞生存率の増加を伴った。
【０１０９】
生体内  −  ラットをロテノンに曝露すると、黒質におけるドーパミン作働性ニューロンの消失や運動障害などのパーキンソン病の特徴が現れる。ロテノンはミトコンドリアにストレスを及ぼし、ＰＤのモデルとして広く使用されている。
【０１１０】
ロテノンラットモデルを用いて、ＳＤ−４４４とＳＤＡ−３４１はともに、腹腔内投与したとき、ロータロッド試験、シリンダー試験、及び歩行ビーム試験の３つの運動試験で運動活動をレスキューするようであった。
【０１１１】
歩行ビーム試験の目的は、運動バランスを評価し、ラットが直立したまま、幅が狭く、高くなったビームをわたって安全なプラットフォームまで歩行する能力を示すことである。この課題は、ロータロッドなどの他の運動試験では検出できない運動技能及びバランスのわずかな障害を検出するのに特に有用である。示されるように、ＳＤとＳＤＡはともにこの試験において非常に効果的であり、ロテノンが誘発した不均衡を抑えた。
【０１１２】
シリンダー試験は、ロテノンのような中枢神経系ＣＮＳ疾患の齧歯類モデルにおける運動非対称性を評価するためにデザインされている。その試験を使用して、新規化学成分（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）を運動性能に対する効果について評価することができる。ここでは、ＳＤとＳＤＡがロテノン投与ラットの自発運動活性（ｌｏｃｏｍｏｔａｃｔｉｖｉｔｙ）の維持に非常に効果的であることを示した。
【０１１３】
ロータロッド試験運動協調性は、強制運動活性を伴った回転ロッドに基づくロータロッド試験によっても評価した。バランス、握力、及び運動協調性を評価する試験は、ＳＤとＳＤＡがロテノンによって媒介される運動調節不全を有意に抑えることを示した。化合物はともに、バランス、握力及び運動協調性を有意に改善した。
【０１１４】
まとめると、著者らの研究はＳＤとＳＤＡがインビトロで神経細胞の生存率を増加させ、ＭＡＰＫアポトーシス経路を阻害することを示した。ＳＤとＳＤＡはともに、ＡｕＦ酸化ストレス効果を抑えるＡｕＦ誘導ＭＡＰＫリン酸化を阻害することで顕れる、効果的な抗アポトーシス試薬であると思われた。
【０１１５】
生体内では、これらは運動能力を効果的に改善し、ミトコンドリアストレスによって誘導される、ロテノンによって損なわれた運動能力を回復した。レスキュー活性は３つの運動試験で示された。したがって、ＳＤ及びＳＤＡは神経変性疾患と神経変性関連疾患の治療に潜在的に有効になる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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