(57)【要約】本発明は、細胞懸濁物に狭窄を通過させることによって、抗体産生をモジュレートするための方法およびシステムであって、狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生をモジュレートする化合物が細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こす方法およびシステムを提供する。一部の実施形態では、本発明は、細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための方法およびシステムを提供する。本発明は、抗体産生をモジュレートするための様々な分子を送達するために高度に有効な細胞内送達技術を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体産生細胞における内因性抗体産生を変更するための方法であって、前記抗体産生細胞を含む細胞懸濁物に狭窄を通過させるステップを含み、前記狭窄が前記細胞を変形させ、それによって、抗体産生を変更する化合物が前記抗体産生細胞に進入するような前記細胞の乱れを引き起こし、前記抗体産生細胞における内因性抗体産生が変更される、方法。
【請求項２】
前記内因性抗体産生が増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内因性抗体産生が減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含まれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記狭窄が、孔であるか、または孔内に含まれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記孔が、表面中に含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記表面がフィルターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記表面がメンブレンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記狭窄のサイズが、前記細胞の直径の関数である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記狭窄のサイズが、前記細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞懸濁物が、混合された細胞集団を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞懸濁物が全血である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞懸濁物が、精製された細胞集団を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞懸濁物が、哺乳動物細胞を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞懸濁物が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギの細胞を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞懸濁物が、ヒト細胞を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞懸濁物が、非哺乳動物細胞を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞懸濁物が、細菌、酵母、ニワトリ、カエル、昆虫または線形動物の細胞を含む、請求項１から１３または１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞懸濁物が、末梢血単核細胞を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体産生細胞が免疫細胞である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体産生細胞が、Ｂ細胞またはＢ細胞先駆体である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体産生細胞が、Ｂ細胞先駆体、ナイーブＢ細胞、活性化されたＢ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、Ｂ−１細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、調節性Ｂ細胞またはＢ細胞リンパ腫細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体産生細胞が骨髄由来Ｂ細胞先駆体である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、核酸を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸がプラスミドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、ペプチド核酸を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が、タンパク質−核酸複合体を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質−核酸複合体が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡをコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、タンパク質またはポリペプチドを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質が、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質が転写因子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質が、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が抗アポトーシスタンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物がＢ細胞活性化因子である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物が増殖誘導性リガンドである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物が、Ｂ細胞受容体シグナル伝達分子のアクチベーターである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物がＡＴＰである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物が細胞活性化因子である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物が細胞分化因子である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物が小分子である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物がナノ粒子中にある、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記化合物がリポソーム中にある、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物が、ウイルス、ウイルス粒子、またはウイルスカプシドを含むビヒクル中にある、請求項２４に記載の方法。
【請求項４８】
前記化合物が、アデノ随伴ウイルス、アデノ随伴ウイルス粒子、またはアデノ随伴ウイルスカプシドを含むビヒクル中にある、請求項２４に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が抗原結合性抗体バリアントである、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体のクラスが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤである、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が抗原結合性抗体断片である、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ断片である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体が全長抗体である、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体が、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片である、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が多特異性抗体である、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が抗体融合タンパク質である、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞懸濁物が、前記狭窄を通過させるステップの前に、それと同時に、またはその後に、前記化合物と接触される、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記チャネルが、約３０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記チャネルが、約１０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記孔のサイズが、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍまたは約１４μｍである、請求項１から３または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
約−５℃と約４５℃との間で実施される、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記内因性抗体産生が、少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約２００％よりも大きく変更される、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記内因性抗体産生が、前記狭窄を通過しなかった細胞による抗体産生よりも、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％長く、または約２００％を超えて長く持続される、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
請求項１から１６または１９から６５のいずれか一項に従って改変された前記抗体産生免疫細胞を患者に導入することによって、前記患者を処置する方法。
【請求項６７】
前記細胞が、患者から単離され、請求項１から１６または１９から６５のいずれか一項に記載の方法に従って改変され、前記患者中に戻し導入される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が、異なる個体から単離され、請求項１から１６または１９から６５のいずれか一項に記載の方法に従って改変され、患者中に導入される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
請求項１から１６または１９から６５のいずれか一項に従って改変された前記抗体産生免疫細胞を個体に導入することによって、前記個体における抗体産生を増強する方法。
【請求項７０】
前記細胞が、個体から単離され、請求項１から１６または１９から６５のいずれか一項に記載の方法に従って改変され、前記個体中に戻し導入される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞が、個体から単離され、請求項１から１６または１９から６５のいずれか一項に記載の方法に従って改変され、異なる個体中に導入される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞を、少なくとも１つの電極によって生成された電場と接触させるステップをさらに含む、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法における使用のための、前記狭窄、細胞懸濁物および化合物を含むシステム。
【請求項７４】
電場を生成するための少なくとも１つの電極をさらに含む、請求項７３に記載のシステム。
【請求項７５】
細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための方法であって、細胞懸濁物に狭窄を通過させるステップを含み、前記狭窄が前記細胞を変形させ、それによって、抗体産生を開始させる化合物が前記細胞に進入するような前記細胞の乱れを引き起こし、前記細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生が誘導される、方法。
【請求項７６】
前記狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含まれる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記狭窄が、孔であるか、または孔内に含まれる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記孔が、表面中に含まれる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記表面がフィルターである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記表面がメンブレンである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記狭窄のサイズが、前記細胞の直径の関数である、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記狭窄のサイズが、前記細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である、請求項７５から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞懸濁物が、混合された細胞集団を含む、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞懸濁物が全血である、請求項７５から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞懸濁物が、精製された細胞集団を含む、請求項７５から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞懸濁物が、哺乳動物細胞を含む、請求項７５から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞懸濁物が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギの細胞を含む、請求項７５から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞懸濁物が、ヒト細胞を含む、請求項７５から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞懸濁物が、非哺乳動物細胞を含む、請求項７５から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記細胞懸濁物が、細菌、酵母、ニワトリ、カエル、昆虫または線形動物の細胞を含む、請求項７５から８５または８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞懸濁物が、末梢血単核細胞を含む、請求項７５から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞が、免疫細胞、幹細胞、骨髄由来前駆細胞、赤血球先駆体、線維芽細胞、心臓細胞または細胞株細胞である、請求項７５から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または幹細胞である、請求項７５から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞が、Ｂ細胞またはＢ細胞先駆体である、請求項７５から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞が、Ｂ細胞先駆体、ナイーブＢ細胞、活性化されたＢ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、Ｂ−１細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、調節性Ｂ細胞またはＢ細胞リンパ腫細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞が骨髄由来Ｂ細胞先駆体である、請求項９４または９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記化合物が、核酸を含む、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記核酸が、免疫グロブリンをコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記核酸が、前記細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記核酸が、前記細胞のゲノム中に組み込まれない、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記核酸がプラスミドである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
前記化合物が、ペプチド核酸を含む、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記化合物が、タンパク質−核酸複合体を含む、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記タンパク質−核酸複合体が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記核酸が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡをコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０８】
ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記化合物が、タンパク質またはポリペプチドを含む、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記タンパク質が、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記タンパク質が転写因子である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記タンパク質が、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記化合物がＢ細胞活性化因子である、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記化合物が増殖誘導性リガンドである、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記化合物が、Ｂ細胞受容体シグナル伝達分子のアクチベーターである、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記化合物が細胞活性化因子である、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記化合物が細胞分化因子である、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記化合物が小分子である、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記化合物がナノ粒子中にある、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記化合物がリポソーム中にある、請求項７５から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記化合物が、ウイルス、ウイルス粒子、またはウイルスカプシドを含むビヒクル中にある、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記化合物が、アデノ随伴ウイルス、アデノ随伴ウイルス粒子、またはアデノ随伴ウイルスカプシドを含むビヒクル中にある、請求項９７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項７５から１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記抗体が抗原結合性抗体バリアントである、請求項７５から１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記抗体のクラスが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤである、請求項７５から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記抗体が抗原結合性抗体断片である、請求項７５から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ断片である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記抗体が全長抗体である、請求項７５から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記抗体が、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片である、請求項７５から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項７５から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記抗体が多特異性抗体である、請求項７５から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記抗体が抗体融合タンパク質である、請求項７５から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細胞懸濁物が、前記狭窄を通過させるステップの前に、それと同時に、またはその後に、前記化合物と接触される、請求項７５から１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記チャネルが、約３０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む、請求項７５から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記チャネルが、約１０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む、請求項７５から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記孔のサイズが、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍまたは約１４μｍである、請求項７５または７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
約−５℃と約４５℃との間で実施される、請求項７５から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
請求項７５から８８または９１から１３７のいずれか一項に従って改変された前記細胞を患者に導入することによって、前記患者を処置する方法。
【請求項１３９】
前記細胞が、患者から単離され、請求項７５から８８または９１から１３７のいずれか一項に記載の方法に従って改変され、前記患者中に戻し導入される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記細胞が、異なる個体から単離され、請求項７５から８８または９１から１３７のいずれか一項に記載の方法に従って改変され、患者中に導入される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
請求項７５から８８または９１から１３７のいずれか一項に従って改変された前記細胞を個体に導入することによって、前記個体におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導する方法。
【請求項１４２】
前記細胞が、個体から単離され、請求項７５から８８または９１から１３７のいずれか一項に記載の方法に従って改変され、前記個体中に戻し導入される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記細胞が、個体から単離され、請求項７５から８８または９１から１３７のいずれか一項に記載の方法に従って改変され、異なる個体中に導入される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記細胞を、少なくとも１つの電極によって生成された電場と接触させるステップをさらに含む、請求項７５から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
請求項７５から１４４のいずれか一項に記載の方法における使用のための、前記狭窄、細胞懸濁物および化合物を含むシステム。
【請求項１４６】
電場を生成するための少なくとも１つの電極をさらに含む、請求項１４５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１２月５日出願の米国仮出願第６２／５９４，９８１号に基ずく優先権を主張し、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本開示は、一般に、細胞懸濁物に細胞変形性狭窄を通過させることによって細胞中に化合物を送達することによって、抗体産生をモジュレートするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
抗体は、多数の診断、研究および治療目的のために一般に使用され、有効な免疫応答の媒介において重要な役割を有する。体液性免疫応答の間、シグナル伝達事象の複雑なセットが、抗体産生を調和させる。十分なｉｎ−ｖｉｖｏ抗体産生は、感染性疾患と戦うため、がんの間の抗腫瘍応答を媒介するため、および有効なワクチン媒介性免疫を生成するために重要である。逆に、内因性抗原に対する抗体の産生は、病原性自己免疫応答に寄与する。
【０００４】
所望の抗体の量および特異性を有する抗体レパートリーの迅速な生成は、有効な体液性免疫応答を開始する重要な部分である。内因性抗体産生を刺激するまたはｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するタンパク質、核酸または小分子の細胞内送達は、研究および治療目的のための抗原特異的抗体産生の精密なチューニングを可能にすることができる。例えば、腫瘍関連抗原に対する増大したまたはｄｅ  ｎｏｖｏの体液性免疫応答を誘導することは、がんを処置するために有用であり得る。
【０００５】
現行の細胞内送達方法は、抗体産生を刺激または誘導するために、感受性細胞型、例えば、初代免疫細胞および幹細胞へと分子を送達するために有効ではない。したがって、抗体産生をモジュレートするための様々な分子を送達するために高度に有効な細胞内送達技術の必要性が、いまだ満たされていない。さらに、抗体産生をモジュレートするための分子の迅速なハイスループット細胞内送達を可能にする方法は、治療的抗体ならびに研究および開発抗体を利用する大規模な臨床的適用および産業的適用に、より有効に適用され得る。細胞に化合物を送達するためにチャネルを使用する方法を記載する参考文献には、ＷＯ２０１３０５９３４３、ＷＯ２０１５０２３９８２およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８４８９が含まれる。
特許出願および公報を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０５９３４３号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０２３９８２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の簡単な要旨
本発明のある特定の態様は、抗体産生細胞における内因性抗体産生を変更するための方法であって、抗体産生細胞を含む細胞懸濁物に狭窄を通過させるステップを含み、前記狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生を変更する化合物が抗体産生細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、前記抗体産生細胞における内因性抗体産生が変更される、方法を提供する。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少される。一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含まれる。一部の実施形態では、狭窄は、孔であるか、または孔内に含まれる。一部の実施形態では、孔は、表面中に含まれる。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、メンブレンである。一部の実施形態では、狭窄のサイズは、細胞の直径の関数である。一部の実施形態では、狭窄のサイズは、細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。
【０００８】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、細胞懸濁物は、混合された細胞集団を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、全血である。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、精製された細胞集団を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギの細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、ヒト細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、非哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、細菌、酵母、ニワトリ、カエル、昆虫または線形動物の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、末梢血単核細胞を含む。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、Ｂ細胞またはＢ細胞先駆体である。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、Ｂ細胞先駆体、ナイーブＢ細胞、活性化されたＢ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、Ｂ−１細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、調節性Ｂ細胞またはＢ細胞リンパ腫細胞である。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、骨髄由来Ｂ細胞先駆体である。
【０００９】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、化合物は、核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、核酸は、プラスミドである。一部の実施形態では、化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。一部の実施形態では、化合物は、タンパク質−核酸複合体を含む。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体は、ドナーＤＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体は、ドナーＤＮＡをさらに含む。
【００１０】
一部の実施形態では、化合物は、タンパク質またはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼである。一部の実施形態では、タンパク質は、転写因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素である。一部の実施形態では、タンパク質は、抗アポトーシスタンパク質である。
【００１１】
一部の実施形態では、化合物は、Ｂ細胞活性化因子である。一部の実施形態では、化合物は、増殖誘導性リガンドである。一部の実施形態では、化合物は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達分子のアクチベーターである。一部の実施形態では、化合物は、ＡＴＰである。一部の実施形態では、化合物は、細胞活性化因子である。一部の実施形態では、化合物は、細胞分化因子である。一部の実施形態では、化合物は、小分子である。一部の実施形態では、化合物は、ナノ粒子中にある。一部の実施形態では、化合物は、リポソーム中にある。一部の実施形態では、化合物は、核酸送達ビヒクル中にある。一部の実施形態では、化合物は、ウイルス中にある。一部の実施形態では、化合物は、ウイルス粒子中にある。一部の実施形態では、化合物は、ウイルスカプシドを含むビヒクル中にある。一部の実施形態では、化合物は、アデノ随伴ウイルス中にある。一部の実施形態では、化合物は、アデノ随伴ウイルス粒子中にある。一部の実施形態では、化合物は、アデノ随伴ウイルスカプシドを含むビヒクル中にある。
【００１２】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性抗体バリアントである。一部の実施形態では、抗体のクラスは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤである。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ断片である。一部の実施形態では、抗体は、全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、単鎖抗体である。一部の実施形態では、抗体は、多特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗体融合タンパク質である。
【００１３】
一部の実施形態では、前記細胞懸濁物は、狭窄を通過させるステップの前に、それと同時に、またはその後に、化合物と接触される。一部の実施形態では、チャネルは、約３０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む。一部の実施形態では、チャネルは、約１０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む。一部の実施形態では、孔のサイズは、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍまたは約１４μｍである。一部の実施形態では、この方法は、約−５℃と約４５℃との間で実施される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約２００％よりも大きく変更される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、狭窄を通過しなかった細胞による抗体産生よりも、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％長く、または約２００％を超えて長く持続される。
【００１４】
一部の実施形態では、患者は、上述の方法のいずれか１つに従って改変された抗体産生免疫細胞を患者に導入することによって処置される。一部の実施形態では、細胞は、患者から単離され、上述の方法のいずれか１つに従って改変され、患者中に戻し導入される。一部の実施形態では、細胞は、異なる個体から単離され、上述の方法のいずれか１つに従って改変され、患者中に導入される。一部の実施形態では、個体における抗体産生は、上述の方法のいずれか１つに従って改変された抗体産生免疫細胞を個体に導入することによって増強される。一部の実施形態では、細胞は、個体から単離され、上述の方法のいずれか１つに従って改変され、個体中に戻し導入される。一部の実施形態では、細胞は、個体から単離され、上述の方法のいずれか１つに従って改変され、異なる個体中に導入される。一部の実施形態では、この方法は、細胞を、少なくとも１つの電極によって生成された電場と接触させるステップをさらに含む。本発明のある特定の態様は、上述の方法のいずれか１つにおける使用のための、狭窄、細胞懸濁物および化合物を含むシステムに関する。一部の実施形態では、このシステムは、電場を生成するための少なくとも１つの電極をさらに含む。
【００１５】
本発明のある特定の態様は、細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための方法であって、細胞懸濁物に狭窄を通過させるステップを含み、前記狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生を開始させる化合物が細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、前記細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生が誘導される、方法を提供する。一部の実施形態では、狭窄は、マイクロ流体チャネル内に含まれる。一部の実施形態では、狭窄は、孔であるか、または孔内に含まれる。一部の実施形態では、孔は、表面中に含まれる。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、メンブレンである。一部の実施形態では、狭窄のサイズは、細胞の直径の関数である。一部の実施形態では、狭窄のサイズは、細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。
【００１６】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、細胞懸濁物は、混合された細胞集団を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、全血である。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、精製された細胞集団を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギの細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、ヒト細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、非哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、細菌、酵母、ニワトリ、カエル、昆虫または線形動物の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、末梢血単核細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、幹細胞、骨髄由来前駆細胞、赤血球先駆体、線維芽細胞、心臓細胞または細胞株細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞またはＢ細胞先駆体である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞先駆体、ナイーブＢ細胞、活性化されたＢ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、Ｂ−１細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、調節性Ｂ細胞またはＢ細胞リンパ腫細胞である。一部の実施形態では、細胞は、骨髄由来Ｂ細胞先駆体である。
【００１７】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、化合物は、核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、免疫グロブリンをコードする。一部の実施形態では、核酸は、ｄｅ  ｎｏｖｏ抗体をコードする。一部の実施形態では、核酸は、細胞のゲノム中に組み込まれる。一部の実施形態では、核酸は、細胞のゲノム中に組み込まれない。一部の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、核酸は、プラスミドである。一部の実施形態では、化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。一部の実施形態では、化合物は、タンパク質−核酸複合体を含む。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体は、ドナーＤＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体は、ドナーＤＮＡをさらに含む。
【００１８】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、化合物は、タンパク質またはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼである。一部の実施形態では、タンパク質は、転写因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素である。
【００１９】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、化合物は、Ｂ細胞活性化因子である。一部の実施形態では、化合物は、増殖誘導性リガンドである。一部の実施形態では、化合物は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達分子のアクチベーターである。一部の実施形態では、化合物は、細胞活性化因子である。一部の実施形態では、化合物は、細胞分化因子である。一部の実施形態では、化合物は、小分子である。一部の実施形態では、化合物は、ナノ粒子中にある。一部の実施形態では、化合物は、リポソーム中にある。一部の実施形態では、化合物は、核酸送達ビヒクル中にある。一部の実施形態では、化合物は、ウイルス中にある。一部の実施形態では、化合物は、ウイルス粒子中にある。一部の実施形態では、化合物は、ウイルスカプシドを含むビヒクル中にある。一部の実施形態では、化合物は、アデノ随伴ウイルス中にある。一部の実施形態では、化合物は、アデノ随伴ウイルス粒子中にある。一部の実施形態では、化合物は、アデノ随伴ウイルスカプシドを含むビヒクル中にある。
【００２０】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性抗体バリアントである。一部の実施形態では、抗体のクラスは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤである。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ断片である。一部の実施形態では、抗体は、全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、単鎖抗体である。一部の実施形態では、抗体は、多特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗体融合タンパク質である。
【００２１】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、前記細胞懸濁物は、狭窄を通過させるステップの前に、それと同時に、またはその後に、化合物と接触される。一部の実施形態では、チャネルは、約３０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む。一部の実施形態では、チャネルは、約１０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む。一部の実施形態では、孔のサイズは、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍまたは約１４μｍである。一部の実施形態では、この方法は、約−５℃と約４５℃との間で実施される。
【００２２】
前述の実施形態と組み合わされ得る一部の実施形態では、患者は、上述の方法のいずれか１つに従って改変された細胞を患者に導入することによって処置される。一部の実施形態では、細胞は、患者から単離され、上述の方法のいずれか１つに従って改変され、患者中に戻し導入される。一部の実施形態では、細胞は、異なる個体から単離され、上述の方法のいずれか１つに従って改変され、患者中に導入される。一部の実施形態では、個体におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、上述の方法のいずれか１つに従って改変された細胞を個体に導入することによって誘導される。一部の実施形態では、細胞は、個体から単離され、上述の方法のいずれか１つに従って改変され、個体中に戻し導入される。一部の実施形態では、細胞は、個体から単離され、上述の方法のいずれか１つに従って改変され、異なる個体中に導入される。一部の実施形態では、この方法は、細胞を、少なくとも１つの電極によって生成された電場と接触させるステップをさらに含む。本発明のある特定の態様は、上述の方法のいずれか１つにおける使用のための、狭窄、細胞懸濁物および化合物を含むシステムに関する。一部の実施形態では、このシステムは、電場を生成するための少なくとも１つの電極をさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
本発明は、細胞懸濁物に狭窄を通過させることによって、抗体産生をモジュレートする方法であって、抗体産生をモジュレートする化合物の細胞への送達を可能にする方法を提供する。本発明は、抗体産生細胞を含む細胞懸濁物に狭窄を通過させることによって、抗体産生細胞における内因性抗体産生を変更するための方法であって、狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生を変更する化合物が抗体産生細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、抗体産生細胞における内因性抗体産生が変更される、方法を提供する。本発明は、細胞懸濁物に狭窄を通過させることによって、細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための方法であって、狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生を開始させる化合物が細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生が誘導される、方法もまた提供する。例えば、抗体をコードする核酸は、抗体を産生することが可能な細胞に送達され得る。
Ｉ．一般技術
【００２４】
本明細書で記載されまたは言及される技術および手順は、一般に、当業者によって、十分に理解され、従来の方法論、例えば、以下に記載される広く利用される方法論などを使用して一般に採用される：Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (Sambrook  et  al.,  4th  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.,  2012)；Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (F.M.  Ausubel,  et  al.  eds.,  2003)；the  series  Methods  in  Enzymology  (Academic  Press,  Inc.)；PCR  2:  A  Practical  Approach  (M.J.  MacPherson,  B.D.  Hames  and  G.R.  Taylor  eds.,  1995)；Antibodies,  A  Laboratory  Manual  (Harlow  and  Lane,  eds.,  1988)；Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique  and  Specialized  Applications  (R.I.  Freshney,  6th  ed.,  J.  Wiley  and  Sons,  2010)；Oligonucleotide  Synthesis  (M.J.  Gait,  ed.,  1984)；Methods  in  Molecular  Biology,  Humana  Press；Cell  Biology:  A  Laboratory  Notebook  (J.E.  Cellis,  ed.,  Academic  Press,  1998)；Introduction  to  Cell  and  Tissue  Culture  (J.P.  Mather  and  P.E.  Roberts,  Plenum  Press,  1998)；Cell  and  Tissue  Culture:  Laboratory  Procedures  (A.  Doyle,  J.B.  Griffiths,  and  D.G.  Newell,  eds.,  J.  Wiley  and  Sons,  1993-8)；Handbook  of  Experimental  Immunology  (D.M.  Weir  and  C.C.  Blackwell,  eds.,  1996)；Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells  (J.M.  Miller  and  M.P.  Calos,  eds.,  1987)；PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction,  (Mullis  et  al.,  eds.,  1994)；Current  Protocols  in  Immunology  (J.E.  Coligan  et  al.,  eds.,  1991)；Short  Protocols  in  Molecular  Biology  (Ausubel  et  al.,  eds.,  J.  Wiley  and  Sons,  2002)；Immunobiology  (C.A.  Janeway  et  al.,  2004)；Antibodies  (P.  Finch,  1997)；Antibodies:  A  Practical  Approach  (D.  Catty.,  ed.,  IRL  Press,  1988-1989)；Monoclonal  Antibodies:  A  Practical  Approach  (P.  Shepherd  and  C.  Dean,  eds.,  Oxford  University  Press,  2000)；Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual  (E.  Harlow  and  D.  Lane,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1999)；The  Antibodies  (M.  Zanetti  and  J.  D.  Capra,  eds.,  Harwood  Academic  Publishers,  1995)；およびCancer:  Principles  and  Practice  of  Oncology  (V.T.  DeVita  et  al.,  eds.,  J.B.  Lippincott  Company,  2011)。
ＩＩ．定義
【００２５】
本明細書を解釈することを目的として、以下の定義が適用され、適切な場合には、単数形で使用される用語は、複数形もまた含み、逆もまた同様である。以下に示される任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する場合、示される定義が支配する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「この（the）」は、特記しない限り、複数形の言及を含む。
【００２７】
本明細書に記載される発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「それらからなる」および「本質的にそれらからなる」を含むことが理解される。
【００２８】
用語「約」は、本明細書で使用される場合、本技術分野における当業者に容易に公知の、それぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書の「約」ある値またはパラメーターに対する言及は、その値またはパラメーター自体に関する実施形態を含む（および記載する）。
【００２９】
用語「抗体」には、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体、二重特異性抗体および単鎖分子）、一価抗体、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ）が含まれる。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書で、「抗体」と相互交換可能に使用される。一部の例では、抗体は、別のポリペプチド（例えば、毒性ポリペプチド、レポーターポリペプチドなど）に融合され得る。
【００３０】
用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」または「抗体全体」は、抗体断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態にある抗体を指すために、相互交換可能に使用される。具体的には、抗体全体には、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を有する抗体が含まれる。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。一部の場合には、インタクトな抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有し得る。
【００３１】
用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分；例えば、インタクトな抗体の抗原結合性および／または可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖抗体；単鎖抗体分子ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
【００３２】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される用語「単鎖抗体」または「単鎖可変断片」は、単一のポリペプチド鎖になるように接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片を指す。一部の実施形態では、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、抗原結合のための所望の構造をｓＦｖが形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。
【００３３】
「ｓｄＡｂ」または「ＶＨＨ」とも略される用語「単一ドメイン抗体」または「ナノボディ」は、単一のモノマー性可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。
【００３４】
用語「ヒト化」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。例えば、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の超可変領域（ＨＶＲ）の残基が、所望の特異性、親和性および／または能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のＨＶＲの残基によって置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり得る。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。
【００３５】
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を指す。
【００３６】
用語「ｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生」は、特定の細胞によって以前には産生されなかった抗体の産生を指す。一部の実施形態では、細胞によって産生された抗体は、前記細胞によって以前に産生された抗体（単数または複数）とは異なる抗原結合特異性または異なるアイソタイプを有する。一部の実施形態では、抗体は、以前には抗体を産生しなかった細胞によって産生される。
【００３７】
用語「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、一緒に共有結合された２つの部分を有するポリペプチドを指し、これらの部分の各々は、異なる特性を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、融合タンパク質は、異種タンパク質に結合された抗体を含む。この特性は、生物学的特性、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの活性であり得る。
【００３８】
用語「孔」は、本明細書で使用される場合、材料内の、穴、裂け目、空洞、開口、割れ目、間隙または穿孔が含まれるがこれらに限定されない開口部を指す。一部の例では、（示される場合）この用語は、本開示の表面内の孔を指す。他の例では、（示される場合）孔は、細胞膜中の孔を指し得る。
【００３９】
用語「メンブレン」は、本明細書で使用される場合、孔を含む選択的障壁またはシートを指す。この用語は、境界または裏打ちとして作用する柔軟なシート様構造を含む。一部の例では、この用語は、孔を含む表面またはフィルターを指す。この用語は、用語「細胞膜」とは別である。
【００４０】
用語「フィルター」は、本明細書で使用される場合、孔を介した選択的通過を可能にする多孔性物品を指す。一部の例では、この用語は、孔を含む表面またはメンブレンを指す。
【００４１】
用語「不均一」は、本明細書で使用される場合、構造または組成が混合されているまたは一様でないものを指す。一部の例では、この用語は、所与の表面内の、変動するサイズ、形状または分布を有する孔を指す。
【００４２】
用語「均一」は、本明細書で使用される場合、あらゆる場所で構造または組成が一貫しているまたは一様なものを指す。一部の例では、この用語は、所与の表面内の、一貫したサイズ、形状または分布を有する孔を指す。
【００４３】
用語「異種」は、本明細書で使用される場合、異なる生物に由来する分子を指す。一部の例では、この用語は、所与の生物内で通常は見出されることも発現されることもない核酸またはタンパク質を指す。
【００４４】
用語「相同」は、本明細書で使用される場合、同じ生物に由来する分子を指す。一部の例では、この用語は、所与の生物内で通常見出されるまたは発現される核酸またはタンパク質を指す。
【００４５】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖または複数鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいは、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（典型的には、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に見出され得るような）、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、合成サブユニット、例えば、ホスホロアミダートのポリマーを含み得、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミダート（Ｐ−ＮＨ２）または混合ホスホロアミダート−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下でそれらの鎖をアニーリングすることによって、または適切なプライマーと共にＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をｄｅ  ｎｏｖｏ合成することによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得られ得る。
【００４６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために相互交換可能に使用され、最小限の長さに限定されない。アミノ酸残基のかかるポリマーは、天然のまたは非天然のアミノ酸残基を含み得、これには、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基のダイマー、トリマーおよびマルチマーが含まれるがこれらに限定されない。全長タンパク質およびその断片は共に、この定義によって包含される。これらの用語には、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化などもまた含まれる。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変、例えば、欠失、付加および置換（一般に、性質が保存的）を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発などを介して意図的であり得、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどを介して、偶発的であり得る。
【００４７】
本明細書に記載される構造的および機能的特徴のいずれについても、これらの特徴を決定する方法は、当該分野で公知である。
ＩＩＩ．内因性抗体産生
【００４８】
ある特定の態様では、本発明は、抗体産生細胞における内因性抗体産生を変更するための方法であって、抗体産生細胞を含む細胞懸濁物に狭窄を通過させるステップを含み、狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生を変更する化合物が抗体産生細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、抗体産生細胞における内因性抗体産生が変更される、方法を提供する。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増加または増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少または下方調節される。
【００４９】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性抗体バリアントである。一部の実施形態では、抗体のクラスは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤである。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ断片である。一部の実施形態では、抗体は、全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、一価抗体である。一部の実施形態では、抗体は、単鎖抗体である。一部の実施形態では、抗体は、多特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗体融合タンパク質である。
【００５０】
一部の実施形態では、内因性抗体産生は、少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約２００％よりも大きく変更される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、狭窄を通過する前の細胞によって産生される抗体のレベルと比較して増加される。一部の実施形態では、細胞の集団によって産生される総内因性抗体産生は、増加される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、狭窄を通過する前の細胞によって産生される抗体のレベルと比較して減少される。一部の実施形態では、細胞の集団によって産生される総内因性抗体産生は、減少される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、細胞１つ当たりで変更される（即ち、個々の細胞が、変更された抗体レベルを産生する）。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、デバイスを通過する前の抗体産生の、細胞または細胞集団のレベルと比較して変更される。一部の実施形態では、増強された抗体産生は、経時的により持続したまたはより長い持続時間の抗体産生を指す。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、狭窄を通過しなかった細胞による抗体産生よりも、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％長く、または約２００％を超えて長く持続する。一部の実施形態では、内因性抗体産生の持続時間は、狭窄を通過しなかった細胞による抗体産生と比較して、約２５％、約５０％、約７５％または約１００％減少される。
【００５１】
一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の培養培地における内因性抗体産生は、約０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度の範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の培養培地における内因性抗体産生は、約０ｎｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約７５０μｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約５００μｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約２５０μｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約１μｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約７５０ｎｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約５００ｎｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約２５０ｎｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約１００ｎｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約５０ｎｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約２５ｎｇ／Ｌ、約０ｎｇ／Ｌ〜約１０ｎｇ／Ｌまたは約０ｎｇ／Ｌ〜約５ｎｇ／Ｌの範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の培養培地における内因性抗体産生は、約５ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約２５ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約５０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約７５ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１００ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約２５０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約５００ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約７５０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１μｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約２５０μｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約５００μｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約７５０μｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌまたは約７５０ｍｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の内因性抗体産生は、約０ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日の範囲、またはそれらの間の任意の量もしくは量の範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の内因性抗体産生は、約０ｐｇ／細胞／日〜約７５ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約５０ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約２５ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約１０ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約５ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約２．５ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約１ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約０．７５ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約０．５ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約０．２５ｐｇ／細胞／日、約０ｐｇ／細胞／日〜約０．１ｐｇ／細胞／日または約０ｐｇ／細胞／日〜約０．０５ｐｇ／細胞／日の範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の内因性抗体産生は、約０．０５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約０．２５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約０．５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約０．７５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約１ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約２．５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約１０ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約２５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約５０ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日または約７５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日の範囲であ��。
【００５２】
内因性抗体産生は、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する任意の直接的または競合的結合アッセイが含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、クロマトグラフィー法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定され得る。
【００５３】
一部の実施形態では、本発明は、抗体産生細胞における内因性抗体産生を変更するための方法であって、細胞が哺乳動物細胞である、方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、非哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、細菌、酵母、ニワトリ、カエル、昆虫または線形動物の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、抗体を産生するように以前に操作されたものである；例えば、抗体を産生するように操作された細菌細胞。
【００５４】
細胞懸濁物は、細胞の混合されたまたは精製された集団であり得る。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、混合された細胞集団、例えば、全血、リンパ液および／または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、精製された細胞集団である。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、初代細胞または細胞株細胞（例えば、不死化細胞株）である。一部の実施形態では、細胞は、ハイブリドーマである。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、血液細胞である。一部の実施形態では、血液細胞は、抗体産生免疫細胞である。一部の実施形態では、抗体産生免疫細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、Ｂ細胞またはＢ細胞先駆体である。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、Ｂ細胞先駆体、ナイーブＢ細胞、活性化されたＢ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、Ｂ−１細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、調節性Ｂ細胞またはＢ細胞リンパ腫細胞である。一部の実施形態では、抗体産生細胞は、骨髄由来Ｂ細胞先駆体である。
ＩＶ．ｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生
【００５５】
ある特定の態様では、本発明は、細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための方法であって、細胞懸濁物に狭窄を通過させるステップを含み、狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生を開始させる化合物が細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生が誘導される、方法を提供する。
【００５６】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性抗体バリアントである。一部の実施形態では、抗体のクラスは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤである。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ断片である。一部の実施形態では、抗体は、全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、一価抗体である。一部の実施形態では、抗体は、単鎖抗体である。一部の実施形態では、抗体は、多特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗体融合タンパク質である。
【００５７】
一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の培養培地におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、約１０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度の範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の培養培地におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、約１０ｎｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約７５０μｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約５００μｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約２５０μｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約１μｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約７５０ｎｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約５００ｎｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約２５０ｎｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約１００ｎｇ／Ｌ、約１０ｎｇ／Ｌ〜約５０ｎｇ／Ｌまたは約１０ｎｇ／Ｌ〜約２５ｎｇ／Ｌの範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の培養培地におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、約２５ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約５０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約７５ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１００ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約２５０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約５００ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約７５０ｎｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１μｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約２５０μｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約５００μｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約７５０μｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌまたは約７５０ｍｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの範囲である。
【００５８】
一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後のｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日の範囲、またはそれらの間の任意の量もしくは量の範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後のｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約７５ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約５０ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約２５ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約１０ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約５ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約２．５ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約１ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約０．７５ｐｇ／細胞／日、約０．１ｐｇ／細胞／日〜約０．５ｐｇ／細胞／日または約０．１ｐｇ／細胞／日〜約０．２５ｐｇ／細胞／日の範囲である。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後のｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、約０．２５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約０．５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約０．７５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約１ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約２．５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約１０ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約２５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日、約５０ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日または約７５ｐｇ／細胞／日〜約１００ｐｇ／細胞／日の範囲である。
【００５９】
ｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する任意の直接的または競合的結合アッセイが含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。一部の実施形態では、ｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生は、クロマトグラフィー法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定され得る。
【００６０】
一部の実施形態では、本発明は、細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための方法であって、細胞が哺乳動物細胞である、方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、非哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、細菌、酵母、ニワトリ、カエル、昆虫または線形動物の細胞を含む。
【００６１】
細胞懸濁物は、細胞の混合されたまたは精製された集団であり得る。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、混合された細胞集団、例えば、全血、リンパ液および／または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、精製された細胞集団である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞または細胞株細胞である。一部の実施形態では、細胞は、血液細胞である。一部の実施形態では、血液細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞またはＢ細胞先駆体である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞先駆体、ナイーブＢ細胞、活性化されたＢ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、Ｂ−１細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、調節性Ｂ細胞またはＢ細胞リンパ腫細胞である。一部の実施形態では、細胞は、骨髄由来Ｂ細胞先駆体である。
【００６２】
一部の実施形態では、細胞は、幹細胞である。例示的な幹細胞には、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、肝臓幹細胞、心臓幹細胞、神経幹細胞および造血幹細胞が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、細胞は、骨髄由来前駆細胞または赤血球先駆体である。一部の実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣまたはＥＳＣに由来する分化した細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞に由来する分化した細胞（例えば、造血幹細胞から分化したＢ細胞）である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞、例えば、初代線維芽細胞または新生児ヒト包皮線維芽細胞（Ｎｕｆｆ細胞）である。一部の実施形態では、細胞は、不死化細胞株細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、皮膚細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞である。一部の実施形態では、細胞は、生殖細胞、例えば、卵母細胞、卵子または接合子である。一部の実施形態では、細胞は、ニューロンである。一部の実施形態では、細胞は、細胞のクラスターが狭窄を通過した場合に破壊されないとすると、細胞のクラスター、例えば、胚である。
Ｖ．細胞変形性狭窄を提供するためのマイクロ流体チャネル
【００６３】
一部の実施形態では、本発明は、細胞懸濁物に狭窄を通過させることによって、抗体産生を変更するための方法または抗体のｄｅ  ｎｏｖｏ産生を誘導するための方法であって、狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生をモジュレートする化合物が細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含まれる、方法を提供する。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少される。一部の実施形態では、複数の狭窄が、マイクロ流体チャネル内に並行しておよび／または順番に配置され得る。本明細書で開示される方法における使用のための細胞変形性狭窄を含む例示的なマイクロ流体チャネルは、ＷＯ２０１３０５９３４３に記載されている。
【００６４】
一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、管腔を含み、緩衝液中に懸濁された細胞が通過できるように構成され、マイクロ流体チャネルは、狭窄を含む。マイクロ流体チャネルは、ケイ素、金属（例えば、ステンレス鋼）、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、セラミック、ガラス、結晶性基材、アモルファス基材またはポリマー（例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ＰＤＭＳ、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）など）を含むいくつかの材料のいずれか１つで作製され得る。マイクロ流体チャネルの製造は、ドライエッチング、ウェットエッチング、フォトリソグラフィー、射出成形、レーザーアブレーションまたはＳＵ−８マスクを含む、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得る。
【００６５】
一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄は、入口部分、中心部および出口部分を含む。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄の長さ、深さおよび幅は、変動し得る。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄の直径は、細胞または細胞のクラスターの直径の関数である。一部の実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄の直径は、細胞の直径の約２０％〜約９９％である。一部の実施形態では、狭窄のサイズは、細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。一部の実施形態では、チャネルは、約３０ｕｍの狭窄長さおよび約４ｕｍの狭窄幅を含む。一部の実施形態では、チャネルは、約１０ｕｍの狭窄長さおよび約４ｕｍの狭窄幅を含む。チャネル、入口部分、中心部および出口部分の断面もまた、変動し得る。例えば、断面は、形状が円形（circular）、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形または三角形であり得る。入口部分は、狭窄角度を規定し、狭窄角度は、チャネルの目詰まりを低減させるように最適化され、細胞中への化合物の増強された送達のために最適化される。出口部分の角度も同様に変動し得る。例えば、出口部分の角度は、非層流を生じ得る乱流の可能性を低減させるように構成される。一部の実施形態では、入口部分および／または出口部分の壁は、直線的である。他の実施形態では、入口部分および／または出口部分の壁は、カーブしている。
ＶＩ．細胞変形性狭窄を提供するための孔を有する表面
【００６６】
一部の実施形態では、本発明は、細胞懸濁物に狭窄を通過させることによって、抗体産生を変更するための方法または抗体のｄｅ  ｎｏｖｏ産生を誘導するための方法であって、狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生をモジュレートする化合物が細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、狭窄が、孔であるか、または孔内に含まれる、方法を提供する。一部の実施形態では、孔は、表面中に含まれる。本明細書で開示される方法における使用のための孔を有する例示的な表面は、２０１５年９月４日出願の米国仮出願第６２／２１４，８２０号に記載されている。
【００６７】
本明細書で開示される表面は、いくつかの材料のいずれか１つで作製され得、いくつかの形態のいずれか１つをとり得る。一部の実施形態では、表面は、フィルターである。一部の実施形態では、表面は、メンブレンである。一部の実施形態では、フィルターは、接線流フィルターである。一部の実施形態では、表面は、スポンジまたはスポンジ様マトリックスである。一部の実施形態では、表面は、マトリックスである。
【００６８】
一部の実施形態では、表面は、蛇行経路表面である。一部の実施形態では、蛇行経路表面は、酢酸セルロースを含む。一部の実施形態では、表面は、限定なしに、合成または天然のポリマー、ポリカーボネート、ケイ素、ガラス、金属、合金、硝酸セルロース、銀、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluorethylene）、混合セルロースエステル、磁器およびセラミックから選択される材料を含む。
【００６９】
本明細書で開示される表面は、当該分野で公知の任意の形状；例えば、３次元形状を有し得る。表面の２次元形状は、限定なしに、円形、楕円形、丸型（round）、正方形、星型、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形または八角形であり得る。一部の実施形態では、表面は、形状が丸型である。一部の実施形態では、表面の３次元形状は、円柱形、円錐形または立方体状である。
【００７０】
表面は、種々の断面幅および厚さを有し得る。一部の実施形態では、表面の断面幅は、約１ｍｍと約１ｍとの間、またはそれらの間の任意の断面幅もしくは断面幅の範囲である。一部の実施形態では、表面は、規定された厚さを有する。一部の実施形態では、表面の厚さは、一様である。一部の実施形態では、表面の厚さは、可変である。例えば、一部の実施形態では、表面の一部は、その表面の他の部分よりも厚いまたは薄い。一部の実施形態では、表面の厚さは、約１％〜約９０％、またはそれらの間の任意のパーセンテージもしくはパーセンテージの範囲、変動する。一部の実施形態では、表面は、約０．０１μｍ〜約５ｍｍの間の厚さ、またはそれらの間の任意の厚さもしくは厚さの範囲である。
【００７１】
一部の実施形態では、狭窄は、孔であるか、または孔内に含まれる。孔の断面幅は、処理される細胞の型に関連する。一部の実施形態では、孔のサイズは、処理される細胞または細胞のクラスターの直径の関数である。一部の実施形態では、孔のサイズは、細胞がその穴を通過する際に乱されるようなサイズである。一部の実施形態では、孔のサイズは、細胞の直径未満である。一部の実施形態では、孔のサイズは、細胞の直径の約２０％〜約９９％である。一部の実施形態では、孔のサイズは、細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。最適な孔のサイズは、適用および／または細胞型に基づいて変動し得る。一部の実施形態では、孔のサイズは、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍまたは約１４μｍである。
【００７２】
孔通路の入口および出口は、種々の角度を有し得る。孔の角度は、細胞が通過する間の孔の目詰まりを最小化するように選択され得る。一部の実施形態では、表面を通る流速は、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒〜約１００Ｌ／ｃｍ２／秒の間、またはそれらの間の任意の流速もしくは流速の範囲である。例えば、入口または出口部分の角度は、約０度と約９０度との間であり得る。一部の実施形態では、孔は、同一の入口および出口角度を有する。一部の実施形態では、孔は、異なる入口および出口角度を有する。一部の実施形態では、孔の縁は、滑らか、例えば、丸みを帯びているまたはカーブしている。滑らかな孔の縁は、隆起も畝も起伏のある部分もない、連続した平坦で平らな表面を有する。一部の実施形態では、孔の縁は、鋭い。鋭い孔の縁は、とがったまたは鋭角の薄い縁を有する。一部の実施形態では、孔通路は、まっすぐである。まっすぐな孔通路は、カーブも屈曲も角度も他の不規則性も含まない。一部の実施形態では、孔通路は、カーブしている。カーブした孔通路は、屈曲している、またはまっすぐな線から逸脱している。一部の実施形態では、孔通路は、複数のカーブ、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くのカーブを有する。
【００７３】
孔は、２次元または３次元形状を含む、当該分野で公知の任意の形状を有し得る。孔の形状（例えば、断面形状）は、限定なしに、円形、楕円形、丸型、正方形、星型、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形および八角形であり得る。一部の実施形態では、孔の断面は、形状が丸型である。一部の実施形態では、孔の３次元形状は、円柱形または円錐形である。一部の実施形態では、孔は、溝付きの（fluted）入口および出口形状を有する。一部の実施形態では、孔の形状は、所与の表面内の孔の間で均質（即ち、一貫したまたは規則的）である。一部の実施形態では、孔の形状は、所与の表面内の孔の間で不均一（即ち、混合されるまたは変動される）である。
【００７４】
本明細書に記載される表面は、様々な総孔数を有し得る。一部の実施形態では、孔は、総表面積の約１０％〜約８０％を覆う。一部の実施形態では、表面は、約１．０×１０５〜約１．０×１０３０個の総孔数、またはそれらの間の任意の数もしくは数の範囲を含む。一部の実施形態では、表面は、表面積１ｍｍ２当たり約１０個と約１．０×１０１５個との間の孔を含む。
【００７５】
孔は、所与の表面内に多数の方法で分布され得る。一部の実施形態では、孔は、所与の表面内に並行して分布される。かかる一例では、孔は、同じ方向で隣り合って分布され、所与の表面内で同じ距離離れている。一部の実施形態では、孔分布は、秩序づけられているまたは均一である。かかる一例では、孔は、規則的な整然としたパターンで分布される、または所与の表面内で同じ距離離れている。一部の実施形態では、孔分布は、ランダムまたは不均一である。かかる一例では、孔は、不規則な乱雑なパターンで分布される、または所与の表面内で異なる距離離れている。一部の実施形態では、複数の表面は、順番に分布される。複数の表面は、表面サイズ、形状および／または粗さが均一または不均一であり得る。複数の表面は、均一または不均一な孔サイズ、形状および／または数を有する孔をさらに含み得、それによって、異なる細胞型中への様々な化合物の同時送達を可能にする。
【００７６】
一部の実施形態では、個々の孔は、一様な幅寸法（即ち、孔通路の長さに沿って不変の幅）を有する。一部の実施形態では、個々の孔は、可変の幅（即ち、孔通路の長さに沿って増加するまたは減少する幅）を有する。一部の実施形態では、所与の表面内の孔は、同じ個々の孔の深さを有する。一部の実施形態では、所与の表面内の孔は、異なる個々の孔の深さを有する。一部の実施形態では、孔は、互いに直接隣接する。一部の実施形態では、孔は、互いに一定の距離分離される。一部の実施形態では、孔は、約０．００１μｍ〜約３０ｍｍの距離、またはそれらの間の任意の距離もしくは距離の範囲、互いに分離される。
【００７７】
一部の実施形態では、表面は、材料でコーティングされる。材料は、Ｔｅｆｌｏｎ、接着性コーティング、界面活性剤、タンパク質、接着分子、抗体、抗凝固剤、細胞機能をモジュレートする因子、核酸、脂質、炭水化物または膜貫通タンパク質が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の材料から選択され得る。一部の実施形態では、表面は、ポリビニルピロリドンでコーティングされる。一部の実施形態では、材料は、表面に共有結合される。一部の実施形態では、材料は、表面に非共有結合される。一部の実施形態では、表面分子は、細胞が孔を通過する際に放出される。
【００７８】
一部の実施形態では、表面は、改変された化学的特性を有する。一部の実施形態では、表面は、親水性である。一部の実施形態では、表面は、疎水性である。一部の実施形態では、表面は、荷電している。一部の実施形態では、表面は、正および／または負に荷電している。一部の実施形態では、表面は、一部の領域では正に荷電し得、他の領域では負に荷電し得る。一部の実施形態では、表面は、全体で正の電荷または全体で負の電荷を有する。一部の実施形態では、表面は、滑らかな、電解研磨された、粗い、またはプラズマ処理された表面のいずれか１つであり得る。一部の実施形態では、表面は、双性イオンまたは双極性化合物を含む。一部の実施形態では、表面は、プラズマ処理される。
【００７９】
一部の実施形態では、表面は、より大きいモジュール内に含まれる。一部の実施形態では、表面は、シリンジ、例えば、プラスチックまたはガラスシリンジ内に含まれる。一部の実施形態では、表面は、プラスチックフィルターホルダー内に含まれる。一部の実施形態では、表面は、ピペットチップ内に含まれる。
ＶＩＩ．細胞の乱れ
【００８０】
一部の実施形態では、本発明は、細胞懸濁物に狭窄を通過させることによって、抗体産生を変更するための方法または抗体のｄｅ  ｎｏｖｏ産生を誘導するための方法であって、狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生をモジュレートする化合物が細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、細胞における乱れが、細胞の外側から細胞中に材料を移動させる、細胞における破損（例えば、穴、裂け目、空洞、開口、孔、割れ目、間隙、穿孔）である、方法を提供する。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少される。変形は、例えば、機械的ひずみおよび／または剪断力によって誘導される圧力によって引き起こされ得る。一部の実施形態では、乱れは、細胞膜内の乱れである。一部の実施形態では、乱れは、一過的である。一部の実施形態では、細胞の乱れは、約１．０×１０−９秒間〜約２時間、またはそれらの間の任意の時間もしくは時間の範囲、持続する。一部の実施形態では、細胞の乱れは、約１．０×１０−９秒間〜約１秒間、約１秒間〜約１分間または約１分間〜約１時間にわたって持続する。一部の実施形態では、細胞の乱れは、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−２、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−３、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−４、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−５、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−６、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−７または約１．０×１０−９〜約１．０×１０−８秒間のいずれか１つの間にわたって持続する。一部の実施形態では、細胞の乱れは、約１．０×１０−８〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−７〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−６〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−５〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−４〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−３〜約１．０×１０−１または約１．０×１０−２〜約１．０×１０−１秒間のいずれか１つにわたって持続する。本明細書に記載される方法によって創出される細胞の乱れ（例えば、孔または穴）は、補体または細菌溶血素によって創出されるようなマルチマー性孔構造を形成するタンパク質サブユニットのアセンブリの結果として形成されるのではない。
【００８１】
細胞が狭窄を通過する際に、狭窄は、細胞膜に一時的に傷害を与え、これが、乱れを介した材料の受動拡散を引き起こす。一部の実施形態では、細胞は、細胞のシグナル伝達機構を介してアポトーシス経路を活性化する機会を最小化するために、短期間にわたって、１００μｓのオーダーでのみ変形されるが、他の持続時間が可能である（例えば、数ナノ秒間〜数時間の範囲）。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０−９秒間〜約２時間、またはそれらの間の任意の時間もしくは時間の範囲にわたって変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０−９秒間〜約１秒間、約１秒間〜約１分間または約１分間〜約１時間にわたって変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−２、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−３、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−４、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−５、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−６、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−７または約１．０×１０−９〜約１．０×１０−８秒間のいずれか１つの間にわたって変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０−８〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−７〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−６〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−５〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−４〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−３〜約１．０×１０−１または約１．０×１０−２〜約１．０×１０−１秒間のいずれか１つにわたって変形される。一部の実施形態では、細胞を変形させることは、限定なしに、約１μｓ〜少なくとも約７５０μｓの範囲の時間、例えば、少なくとも約１μｓ、１０μｓ、５０μｓ、１００μｓ、５００μｓまたは７５０μｓにわたって細胞を変形させることを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、細胞中への化合物の通過は、細胞が狭窄を通過するのとおよび／または細胞の乱れと同時に生じる。一部の実施形態では、細胞中への化合物の通過は、細胞が狭窄を通過した後に生じる。一部の実施形態では、細胞中への化合物の通過は、細胞が狭窄を通過した後数分のオーダーで生じる。一部の実施形態では、細胞中への化合物の通過は、細胞が狭窄を通過した約１．０×１０−２秒〜少なくとも約３０分後に生じる。例えば、細胞中への化合物の通過は、細胞が狭窄を通過した約１．０×１０−２秒〜約１秒、約１秒〜約１分または約１分〜約３０分後に生じる。一部の実施形態では、細胞中への化合物の通過は、細胞が狭窄を通過した約１．０×１０−２秒〜約１０分、約１．０×１０−２秒〜約５分、約１．０×１０−２秒〜約１分、約１．０×１０−２秒〜約５０秒、約１．０×１０−２秒〜約１０秒、約１．０×１０−２秒〜約１秒または約１．０×１０−２秒〜約０．１秒後に生じる。一部の実施形態では、細胞中への化合物の通過は、細胞が狭窄を通過した約１．０×１０−１秒〜約１０分、約１秒〜約１０分、約１０秒〜約１０分、約５０秒〜約１０分、約１分〜約１０分または約５分〜約１０分後に生じる。一部の実施形態では、細胞が狭窄を通過した後の細胞における乱れは、細胞が狭窄を通過した後約５分間のオーダー以内に修正される。
【００８３】
一部の実施形態では、狭窄を通過した後の細胞生存度は、約５％〜約１００％である。一部の実施形態では、狭窄を通過した後の細胞生存度は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である。一部の実施形態では、細胞生存度は、細胞が狭窄を通過した約１．０×１０−２秒〜少なくとも約１０日後に測定される。例えば、細胞生存度は、細胞が狭窄を通過した約１．０×１０−２秒〜約１秒、約１秒〜約１分、約１分〜約３０分または約３０分〜約２時間後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存度は、細胞が狭窄を通過した約１．０×１０−２秒〜約２時間、約１．０×１０−２秒〜約１時間、約１．０×１０−２秒〜約３０分、約１．０×１０−２秒〜約１分、約１．０×１０−２秒〜約３０秒、約１．０×１０−２秒〜約１秒または約１．０×１０−２秒〜約０．１秒後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存度は、細胞が狭窄を通過した約１．５時間〜約２時間、約１時間〜約２時間、約３０分〜約２時間、約１５分〜約２時間、約１分〜約２時間、約３０秒〜約２時間または約１秒〜約２時間後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存度は、細胞が狭窄を通過した約２時間〜約５時間、約５時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間または約２４時間〜約１０日後に測定される。
ＶＩＩＩ．送達パラメーター
【００８４】
いくつかのパラメーターが、本明細書に記載される方法によって抗体産生を変更するためまたは抗体のｄｅ  ｎｏｖｏ産生を誘導するための、細胞への化合物の送達に影響を与え得る。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少される。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、狭窄を通過させるステップの前に、それと同時に、またはその後に、化合物と接触される。送達する化合物を含む溶液中に懸濁された細胞が狭窄を通過し得るが、化合物は、細胞が狭窄を通過した後に細胞懸濁物に添加され得る。一部の実施形態では、送達される化合物は、狭窄上にコーティングされる。
【００８５】
細胞中への化合物の送達に影響を与え得るパラメーターの例には、狭窄の寸法、狭窄の入口角度、狭窄の表面特性（例えば、粗さ、化学的改変、親水性、疎水性など）、作動流スピード（例えば、狭窄を通る細胞の通過時間）、細胞濃度、細胞懸濁物中の化合物の濃度が含まれるがこれらに限定されず、狭窄を通過した後に細胞が回復するまたはインキュベートされる時間の量が、送達される化合物の細胞中への通過に影響を与え得る。細胞中への化合物の送達に影響を与えるさらなるパラメーターには、狭窄中での細胞の速度、狭窄中での剪断速度、細胞懸濁物の粘度、流れ速度に対して垂直な速度成分、および狭窄中での時間が含まれ得る。かかるパラメーターは、化合物の送達を制御するために設計され得る。一部の実施形態では、細胞濃度は、約１０〜少なくとも約１０１２細胞／ｍｌの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度の範囲である。一部の実施形態では、送達化合物濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍＬの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度の範囲であり得る。一部の実施形態では、送達化合物濃度は、約１ｐＭ〜少なくとも約２Ｍの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度の範囲であり得る。
【００８６】
本開示の方法において使用される温度は、化合物の送達および細胞生存度に影響を与えるために調整され得る。一部の実施形態では、この方法は、約−５℃と約４５℃との間で実施される。例えば、これらの方法は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度よりも高い温度（例えば、約３７℃よりも高い温度〜４５℃またはそれよりも上）もしくは低減された温度（例えば、約−５℃〜約４℃）、またはこれらの例示的な温度の間の温度において実施され得る。
【００８７】
種々の方法が、狭窄を通るように細胞を駆動するために利用され得る。例えば、圧力は、入口側のポンプ（例えば、ガスボンベまたはコンプレッサー）によって印加され得る、真空は、出口側の真空ポンプによって印加され得る、毛細管作用は、管を介して印加され得る、および／またはシステムは、重力送りされ得る。置き換えベースの流れシステム（例えば、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、手動シリンジまたはピペット、ピストンなど）もまた使用され得る。一部の実施形態では、細胞は、陽圧または陰圧によって狭窄を通過させられる。一部の実施形態では、細胞は、不変の圧力または可変の圧力によって狭窄を通過させられる。一部の実施形態では、圧力は、シリンジを使用して印加される。一部の実施形態では、圧力は、ポンプを使用して印加される。一部の実施形態では、ポンプは、蠕動ポンプまたは隔膜ポンプである。一部の実施形態では、圧力は、真空を使用して印加される。一部の実施形態では、細胞は、重力によって狭窄を通過させられる。一部の実施形態では、細胞は、毛細管圧によって狭窄を通過させられる。
【００８８】
一部の実施形態では、流体の流れが、狭窄を通るように細胞を導く。一部の実施形態では、流体の流れは、細胞が狭窄を通過する前には乱流である。乱流は、所与の地点における速度が大きさおよび方向において不安定に変動する流体の流れである。一部の実施形態では、狭窄を介した流体の流れは、層流である。層流には、あらゆる地点での流れの方向が不変のままである、固体境界近傍の流体における途切れなく続く流れが関与する。一部の実施形態では、流体の流れは、細胞が狭窄を通過した後に乱流である。細胞が狭窄を通過する速度は、変動され得る。一部の実施形態では、細胞は、一様な細胞スピードで狭窄を通過する。一部の実施形態では、細胞は、変動する細胞スピードで狭窄を通過する。
【００８９】
他の実施形態では、組合せ処理、例えば、本明細書に記載される方法と、その後の狭窄の下流での電場への曝露とが、抗体産生を変更するためまたはｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するために使用される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少される。一部の実施形態では、細胞は、狭窄を通過した後に、少なくとも１つの電極によって生成された電場を通過させられる。一部の実施形態では、電場は、細胞の内側の第２の位置、例えば、細胞核への、抗体産生を増強するまたはｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導する化合物の送達を補助する。例えば、細胞変形性狭窄と電場との組合せは、抗体をコードするプラスミドを細胞（例えば、細胞核）中に送達し、抗体のｄｅ  ｎｏｖｏ産生を生じる。一部の実施形態では、１つまたは複数の電極が、電場を生成するために、細胞変形性狭窄に近接する。一部の実施形態では、電場は、約０．１ｋＶ／ｍ〜約１００ＭＶ／ｍの間、またはそれらの間の任意の数もしくは数の範囲である。一部の実施形態では、集積回路が、電極を駆動するための電気信号を提供するために使用される。一部の実施形態では、細胞は、約１ｎｓ〜約１ｓの間のパルス幅および約１００ｎｓ〜約１０ｓの期間、またはそれらの間の任意の時間もしくは時間の範囲にわたって、電場に曝露される。
ＩＸ．抗体の産生のための細胞懸濁物
【００９０】
細胞懸濁物の組成（例えば、モル浸透圧濃度、塩濃度、血清含量、細胞濃度、ｐＨなど）は、抗体産生を変更するためまたはｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための化合物の送達に影響を与え得る。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少される。一部の実施形態では、懸濁物は、全血を含む。あるいは、細胞懸濁物は、生理食塩水溶液、または血液以外の生理学的媒体中の、細胞の混合物である。一部の実施形態では、細胞懸濁物は、水溶液を含む。一部の実施形態では、水溶液は、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、バルキング材料、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、アミノ酸、タンパク質、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）、ＩＭＤＭまたはＲＰＭＩである。さらに、溶液緩衝液は、例えば、表面の目詰まりを低減もしくは排除し、細胞生存度を改善するように設計され得る１つまたは複数の潤滑剤（ｐｌｕｒｏｎｉｃまたは他の界面活性剤）を含み得る。例示的な界面活性剤には、ポロクサマー、ポリソルベート、糖または糖アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、動物由来血清、およびアルブミンタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。
【００９１】
特定の型の細胞を用いる一部の構成では、細胞は、細胞の内部への化合物の送達を補助する１つまたは複数の溶液中でインキュベートされ得る。一部の実施形態では、水溶液は、アクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、アクチン重合に影響を与える薬剤は、ラトランクリンＡ、サイトカラシンおよび／またはコルヒチンである。例えば、細胞は、アクチン細胞骨格を脱重合させるために、送達前に１時間にわたって、脱重合溶液、例えば、ラトランクリン（Lantrunculin）Ａ（０．１μｇ／ｍｌ）中でインキュベートされ得る。さらなる例として、細胞は、微小管ネットワークを脱重合させるために、送達前に２時間にわたって、１０μＭのコルヒチン（Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートされ得る。
【００９２】
一部の実施形態では、細胞集団は、開示された方法における使用の前に富化される。例えば、細胞は、体液、例えば、末梢血から得られ、必要に応じて、Ｂ細胞を濃縮するために富化または精製される。細胞は、磁気細胞分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または密度勾配遠心分離が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって富化され得る。
【００９３】
細胞懸濁物の粘度もまた、本明細書で開示される方法に影響を与え得る。一部の実施形態では、細胞懸濁物の粘度は、約８．９×１０−４Ｐａ．ｓ〜約４．０×１０−３Ｐａ．ｓの範囲、またはそれらの間の任意の値もしくは値の範囲である。一部の実施形態では、粘度は、約８．９×１０−４Ｐａ．ｓ〜約４．０×１０−３Ｐａ．ｓ、約８．９×１０−４Ｐａ．ｓ〜約３．０×１０−３Ｐａ．ｓ、約８．９×１０−４Ｐａ．ｓ〜約２．０×１０−３Ｐａ．ｓまたは約８．９×１０−３Ｐａ．ｓ〜約１．０×１０−３Ｐａ．ｓのいずれか１つの間の範囲である。一部の実施形態では、粘度は、約０．８９ｃＰ〜約４．０ｃＰ、約０．８９ｃＰ〜約３．０ｃＰ、約０．８９ｃＰ〜約２．０ｃＰまたは約０．８９ｃＰ〜約１．０ｃＰのいずれか１つの間の範囲である。一部の実施形態では、細胞懸濁物の粘度が剪断ひずみの条件下で減少する、ずり流動化効果が観察される。粘度は、粘度計、例えば、ガラス毛細管粘度計、または血流計が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。粘度計は、１つの流れ条件下での粘度を測定するが、血流計は、流れ条件と共に変動する粘度を測定するために使用される。一部の実施形態では、粘度は、ずり流動化溶液、例えば、血液について測定される。一部の実施形態では、粘度は、約−５℃と約４５℃の間で測定される。例えば、粘度は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度よりも高い温度（例えば、約３７℃よりも高い温度〜４５℃またはそれよりも上）、低減された温度（例えば、約−５℃〜約４℃）、またはこれらの例示的な温度の間の温度において測定される。
Ｘ．抗体産生を変更または誘導するための化合物
【００９４】
一部の実施形態では、本発明は、抗体産生細胞における内因性抗体産生を変更するためおよび細胞における抗体のｄｅ  ｎｏｖｏ産生を誘導するための化合物であって、本明細書に記載される方法のいずれかによって細胞に送達される、化合物を提供する。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少される。一部の実施形態では、化合物は、単一の化合物である。一部の実施形態では、化合物は、化合物の混合物である。一部の実施形態では、化合物は、核酸を含む。一部の実施形態では、化合物は、核酸である。例示的な核酸には、組換え核酸、ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、この核酸は、細胞中の核酸に対して相同である。一部の実施形態では、この核酸は、細胞中の核酸に対して異種である。一部の実施形態では、核酸は、プラスミドである。
【００９５】
一部の実施形態では、核酸は、ｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生のための抗体をコードする。一部の実施形態では、核酸は、ヒトまたはヒト化抗体をコードする。一部の実施形態では、核酸は、抗原結合性抗体バリアントをコードする。一部の実施形態では、核酸は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体をコードする。一部の実施形態では、核酸は、抗原結合性抗体断片をコードする。一部の実施形態では、核酸は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ抗体断片をコードする。一部の実施形態では、核酸は、全長抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体、多特異性抗体または抗体融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸は、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片をコードする。
【００９６】
一部の実施形態では、化合物は、タンパク質−核酸複合体を含む。一部の実施形態では、化合物は、タンパク質−核酸複合体である。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ９は、ゲノム編集適用において使用される。これらの複合体は、非特異的ＤＮＡ切断ヌクレアーゼと組み合わせて、配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む。これらの複合体は、特定の遺伝子の配列を付加、破壊または変化させることを含む、標的化されたゲノム編集を可能にする。一部の実施形態では、機能しないＣＲＩＳＰＲが、標的遺伝子の転写を遮断または誘導するために使用される。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、タンパク質−核酸複合体は、相同組換えのためのドナーＤＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、化合物は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは、同じプラスミド構築物上にある。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは、異なるプラスミド構築物上にある。一部の実施形態では、化合物は、相同組換えのためのドナーＤＮＡをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、酵素、例えば、トランスポザーゼまたはインテグラーゼが、核酸組込みを媒介するために送達される。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法による遺伝子編集成分の送達は、疾患の媒介に関与する抗体の発現を変更するために使用され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ化合物の送達は、自己免疫疾患を媒介する自己反応性抗体の発現を阻害するために使用され得る。
【００９７】
一部の実施形態では、化合物は、タンパク質またはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、化合物は、タンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質は、遺伝子編集タンパク質またはヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはＣＲＥリコンビナーゼである。一部の実施形態では、タンパク質は、転写因子である。例示的な転写因子には、ＢＬＩＭＰ１、ＸＢＰ１、ＩＲＦ４およびＢＣＬ−６が含まれるがこれらに限定されない。
【００９８】
一部の実施形態では、タンパク質は、抗アポトーシスタンパク質である。例示的な抗アポトーシスタンパク質には、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質が含まれるがこれらに限定されない。抗アポトーシス性のＢｃｌ−２タンパク質には、Ｂｃｌ−２自体、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、ＭＣｌ−１、Ａ１およびＤｉｖａが含まれる。一部の実施形態では、タンパク質は、Ｂ細胞活性化因子である。例示的なＢ細胞活性化因子および増殖誘導性因子には、増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ）およびＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）が含まれるがこれらに限定されない。ＢＬｙＳ、ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫ、ｚＴＮＦ４またはＴＮＦＳＦ−１３Ｂとしても公知のＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）は、ＴＮＦファミリーのメンバーであり、下流のシグナル伝達経路を開始させ、その相同受容体への結合によって、Ｂ細胞の生存、成熟化および分化を調節する。ＢＡＦＦおよび３つのさらなるリガンド（ＡＰＲＩＬ、ＥＤＡおよびＴＷＥＡＫ）は、類似の機能および構造特徴を有する。ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬは、Ｂ細胞の成熟化、増殖および生存の強力な刺激因子である。ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟化抗原）、ＴＡＣＩ（膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬ相互作用因子）およびＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ受容体、Ｂｒ３）を含む、ＢＡＦＦの３つの受容体は、全て膜貫通タンパク質である。ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬは、高い親和性でＴＡＣＩおよびＢＣＭＡに結合することが可能であり、ＢＡＦＦは、ＢＡＦＦ−Ｒにも結合できる。Ｂ細胞の生存を促進する機能に加えて、ＢＡＦＦは、胚中心、アイソタイプスイッチングおよびＴ細胞活性化の調節においても役割を果たす。
【００９９】
一部の実施形態では、化合物は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達分子のアクチベーターである。例示的なＢ細胞受容体シグナル伝達分子には、キナーゼ、例えば、Ｓｒｃ、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、Ｅｒｋ、ＡｋｔおよびＪＮＫ、アダプタータンパク質、例えば、ＣＤ１９およびＢＬＮＫ、酵素、例えば、ＰＬＣおよびＰＩＫ３、ＧＴＰａｓｅ、ならびに核因子、例えば、ＮＦｋＢおよびＡｐ−１が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、化合物は、ＡＴＰである。一部の実施形態では、化合物は、細胞活性化因子である。一部の実施形態では、化合物は、細胞活性化因子をコードする核酸である。例示的な細胞活性化因子には、ＴＬＲアゴニスト、例えば、ＣＰＧおよびＬＰＳ、ＣＤ４０、ＣＤ２１、ＣＤ１９、ならびにＣＤ８１が含まれるがこれらに限定されない。例えば、ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達に関与し、Ｂ細胞の抗原受容体刺激のための閾値を低下させる。一部の実施形態では、化合物は、ケモカイン、サイトカインまたは接着分子が含まれるがこれらに限定されない、ＣＤ４  Ｔ細胞の助けを動員する因子である。
【０１００】
一部の実施形態では、化合物は、細胞の分化状態を変更する因子である。一部の実施形態では、細胞の分化状態を変更する因子は、細胞分化因子である。例示的な細胞分化因子には、ＣＸＣＬ１２、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−７、ＳＣＦ、ＲＡＮＫＬおよびニューロロイキンが含まれるがこれらに限定されない。Ｂ細胞の発生および分化は、系譜特異的な増殖因子および細胞接着分子によって緊密に調節される。間質細胞によって分泌されるインターロイキン７（ＩＬ−７）は、初期Ｂ細胞の発生にとって重要な増殖因子であり、プロおよびプレＢ細胞の増殖を刺激することができる。ＩＬ−７依存的プロ−Ｂ細胞増殖は、２つの間質増殖因子、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および幹細胞因子（ＳＣＦ）によって強化される。骨髄間質細胞によって産生される間質細胞由来因子１またはプレ−Ｂ細胞増殖刺激因子（ＳＤＦ−１／ＰＢＳＦ）は、プロおよびプレ−Ｂ細胞の増殖を誘導する。ＩＬ−３は、Ｂ細胞上のＩＬ−３受容体との相互作用を介してプレ−Ｂ細胞増殖を刺激し、ＩＬ−３は、ＩＬ−６と一緒になって、多分化能幹細胞およびＢ細胞前駆体を刺激することができる。ニューロロイキン、グルコース−６−リン酸異性体ホモログもまた、Ｂ細胞の発生を刺激する能力を有する。一部の実施形態では、細胞の分化状態を変更する因子は、リプログラミング因子である。一部の実施形態では、リプログラミング因子の送達は、抗体産生細胞の、あまり分化していない状態への変換（例えば、形質細胞の、メモリーＢ細胞への変換）を生じる。一部の実施形態では、リプログラミング因子の送達は、抗体クラススイッチングを生じる。例えば、リプログラミング因子の送達は、ＩｇＧ抗体からＩｇＡ抗体へのクラススイッチングを生じる。本明細書で開示される方法による、細胞へのリプログラミング因子の送達は、変更された抗体の特異性、機能的活性または分泌を生じ得る。
【０１０１】
一部の実施形態では、化合物は、小分子を含む。一部の実施形態では、化合物は、小分子である。例示的な小分子には、医薬品、代謝物または放射性ヌクレオチド（radionucleotide）が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、医薬品は、治療的薬物である。
【０１０２】
一部の実施形態では、化合物は、ナノ粒子中にある。ナノ粒子の例には、金ナノ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブ、ナノシェル、デンドリマーおよびリポソームが含まれる。一部の実施形態では、ナノシェルは、天然または合成のポリマーを含む。一部の実施形態では、化合物は、リポソーム中にある。一部の実施形態では、ナノ粒子は、治療的分子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、核酸、例えば、ｍＲＮＡを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、送達する化合物は、精製される。一部の実施形態では、化合物は、少なくとも約６０重量％（乾燥重量）の目的の化合物である。一部の実施形態では、精製された化合物は、少なくとも約７５％、９０％または９９％の目的の化合物である。一部の実施形態では、精製された化合物は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％または１００％（ｗ／ｗ）の目的の化合物である。純度は、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、ＮＭＲ、質量分析またはＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれるがこれらに限定されない、任意の公知の方法によって決定される。精製されたＤＮＡまたはＲＮＡは、外因性の核酸、炭水化物および脂質を含まないＤＮＡまたはＲＮＡとして定義される。
【０１０４】
一部の実施形態では、化合物は、中間体化合物である。中間体化合物は、先行する中間体から形成される分子実体であり得、最終反応産物を生じるようにさらに反応する。一部の実施形態では、中間体化合物は、タンパク質の成熟した機能的形態を産生するために酵素によって切断される、タンパク質先駆体、即ちプロ−タンパク質である。一部の実施形態では、中間体化合物は、活性な酵素を産生するために改変または切断を必要とする、不活性な酵素先駆体、即ち酵素原である。
ＸＩ．適用
【０１０５】
一部の態様では、本発明は、狭窄を通過させることによって抗体産生をモジュレートする化合物が細胞に進入するように改変された抗体産生免疫細胞を患者に導入することによって、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、患者から単離され、開示された方法に従って改変され、患者中に戻し導入される。例えば、Ｂ細胞の集団は、患者から単離され、抗体産生をモジュレートする化合物の送達を達成するために狭窄を通過させられ、次いで、治療的免疫応答を増大させるために患者中に再注入される。一部の実施形態では、細胞は、個体から単離され、開示された方法に従って改変され、個体中に戻し導入される。例えば、Ｂ細胞の集団は、個体から単離され、抗体産生をモジュレートする化合物の送達を達成するために狭窄を通過させられ、次いで、個体における抗体産生を増強させるために、患者中に再注入される。
【０１０６】
一部の実施形態では、本発明は、細胞における抗体産生を下方調節する方法を提供する。一部の実施形態では、遺伝子編集化合物、例えば、タンパク質−核酸複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）もしくはヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ）の送達、またはｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンは、病原性抗体産生に関与する特定の遺伝子を遮断することができる。例えば、遺伝子編集化合物またはｓｉＲＮＡの送達は、自己免疫疾患を処置するために自己反応性抗体の細胞産生を低減させるために使用され得る。一部の実施形態では、本発明は、細胞における抗体産生を制御する方法を提供する。例えば、細胞中への化合物の送達は、刺激または因子に応答した抗体の分泌を可能にし、それによって、ポジティブまたはネガティブフィードバック機構を可能にする。一部の実施形態では、細胞中への化合物の送達は、時間依存的様式での抗体の分泌を可能にする。例えば、細胞は、特定の時間枠の間に、または特定の長さの時間にわたって、抗体を産生する。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明は、狭窄を通過させることによってｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導する化合物が細胞に進入するように改変された細胞を患者に導入することによって、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、自家細胞である。例えば、細胞は、患者から単離され、開示された方法に従って改変され、患者中に戻し導入される。一部の実施形態では、細胞は、個体から単離され、開示された方法に従って改変され、同じ個体中に戻し導入される。一部の実施形態では、細胞は、同種細胞である。例えば、細胞は、異なる個体から単離され、開示された方法に従って改変され、患者中に導入される。一部の実施形態では、細胞は、個体から単離され、開示された方法に従って改変され、異なる個体中に導入される。一部の実施形態では、細胞の集団は、患者または異なる個体から単離され、ｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導する化合物の送達を達成するために狭窄を通過させられ、次いで、治療的応答を増大させるために、患者中に注入される。
【０１０８】
上記方法のいずれも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。ｉｎ  ｖｉｖｏ適用のために、動脈または静脈中のインラインステントなどのデバイスが、血管腔中に挿入され得る。一部の実施形態では、これらの方法は、患者細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ処理および患者中への細胞の即時再導入のためのベッドサイドシステムの一部として使用される。かかる方法は、がんまたは感染症に応答して免疫系を活性化する手段として、またはワクチン開発において、採用され得る。一部の実施形態では、この方法は、必要最小限の訓練を受けた実験助手がいる典型的な病院の実験室において実行され得る。一部の実施形態では、患者が操作する処理システムが使用され得る。一部の実施形態では、この方法は、インライン血液処理システムを使用して実行され、このシステムでは、血液は、患者から直接流用され、狭窄を通過させられて血液細胞への化合物送達を生じ、処理後に患者中に直接戻し輸注される。
ＸＩＩ．システムおよびキット
【０１０９】
一部の態様では、本発明は、本明細書で開示される方法における使用のための、抗体産生細胞における内因性抗体産生を変更するまたは細胞における抗体のｄｅ  ｎｏｖｏ産生を誘導する、狭窄、細胞懸濁物および化合物を含むシステムを提供する。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、増強される。一部の実施形態では、内因性抗体産生は、減少される。このシステムは、細胞変形性狭窄を提供するための孔を有するマイクロ流体チャネルもしくは表面、細胞懸濁物、細胞の乱れ、送達パラメーター、抗体産生を変更もしくは誘導する化合物、および／または適用などを含む、上で開示される方法について記載された任意の実施形態を含み得る。一部の実施形態では、細胞変形性狭窄は、内因性抗体産生を変更するための抗体産生細胞への送達のためのサイズにされる。一部の実施形態では、細胞変形性狭窄は、細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導する化合物の送達のためのサイズにされる。一部の実施形態では、送達パラメーター、例えば、作動流スピード、細胞および化合物の濃度、狭窄中での細胞の速度、ならびに細胞懸濁物の組成（例えば、モル浸透圧濃度、塩濃度、血清含量、細胞濃度、ｐＨなど）は、抗体産生を変更するためまたはｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための化合物の最大の抗体応答のために最適化される。
【０１１０】
細胞における抗体産生をモジュレートするための化合物を送達する際の使用のためのキットまたは製品もまた提供される。一部の実施形態では、キットは、適切な包装中に、本明細書に記載される組成物（例えば、孔を含むマイクロ流体チャネルもしくは表面、細胞懸濁物、および／または内因性抗体産生を変更するもしくはｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための化合物）を含む。適切な包装材料は、当該分野で公知であり、これには、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが含まれる。これらの製品は、さらに無菌化および／または密封され得る。
【０１１１】
本開示は、本明細書に記載される方法の成分を含むキットもまた提供し、内因性抗体産生を変更するまたはｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するために前記方法を実施するための使用説明書（複数可）をさらに含み得る。本明細書に記載されるキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載される任意の方法を実施するための使用説明書；例えば、抗体産生をモジュレートするためまたはｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための使用説明書、を有する添付文書を含む、他の材料をさらに含み得る。
ＸＩＩＩ．例示的な実施形態
【０１１２】
１．  抗体産生細胞における内因性抗体産生を変更するための方法であって、抗体産生細胞を含む細胞懸濁物に狭窄を通過させるステップを含み、前記狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生を変更する化合物が抗体産生細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、前記抗体産生細胞における内因性抗体産生が変更される、方法。
【０１１３】
２．  内因性抗体産生が増強される、実施形態１に記載の方法。
【０１１４】
３．  内因性抗体産生が減少される、実施形態１に記載の方法。
【０１１５】
４．  狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含まれる、実施形態１から３のいずれか１つに記載の方法。
【０１１６】
５．  狭窄が、孔であるか、または孔内に含まれる、実施形態１から３のいずれか１つに記載の方法。
【０１１７】
６．  孔が、表面中に含まれる、実施形態５に記載の方法。
【０１１８】
７．  表面がフィルターである、実施形態６に記載の方法。
【０１１９】
８．  表面がメンブレンである、実施形態６に記載の方法。
【０１２０】
９．  狭窄のサイズが、細胞の直径の関数である、実施形態１から８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２１】
１０．  狭窄のサイズが、細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である、実施形態１から９のいずれか１つに記載の方法。
【０１２２】
１１．  細胞懸濁物が、混合された細胞集団を含む、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１２３】
１２．  細胞懸濁物が全血である、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１２４】
１３．  細胞懸濁物が、精製された細胞集団を含む、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１２５】
１４．  細胞懸濁物が、哺乳動物細胞を含む、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
１５．  細胞懸濁物が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギの細胞を含む、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１２７】
１６．  細胞懸濁物が、ヒト細胞を含む、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１２８】
１７．  細胞懸濁物が、非哺乳動物細胞を含む、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
１８．  細胞懸濁物が、細菌、酵母、ニワトリ、カエル、昆虫または線形動物の細胞を含む、実施形態１から１３または１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３０】
１９．  細胞懸濁物が、末梢血単核細胞を含む、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
２０．  抗体産生細胞が免疫細胞である、実施形態１から１９のいずれか１つに記載の方法。
【０１３２】
２１．  抗体産生細胞が、Ｂ細胞またはＢ細胞先駆体である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１３３】
２２．  抗体産生細胞が、Ｂ細胞先駆体、ナイーブＢ細胞、活性化されたＢ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、Ｂ−１細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、調節性Ｂ細胞またはＢ細胞リンパ腫細胞である、実施形態２１に記載の方法。
【０１３４】
２３．  抗体産生細胞が骨髄由来Ｂ細胞先駆体である、実施形態２１または２２に記載の方法。
【０１３５】
２４．  化合物が、核酸を含む、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
２５．  核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする、実施形態２４に記載の方法。
【０１３７】
２６．  核酸がプラスミドである、実施形態２４に記載の方法。
【０１３８】
２７．  化合物が、ペプチド核酸を含む、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１３９】
２８．  化合物が、タンパク質−核酸複合体を含む、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４０】
２９．  タンパク質−核酸複合体が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む、実施形態２８に記載の方法。
【０１４１】
３０．  ドナーＤＮＡをさらに含む、実施形態２９に記載の方法。
【０１４２】
３１．  核酸が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡをコードする、実施形態２４に記載の方法。
【０１４３】
３２．  ドナーＤＮＡをさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
【０１４４】
３３．  化合物が、タンパク質またはポリペプチドを含む、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
３４．  タンパク質が、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼである、実施形態３３に記載の方法。
【０１４６】
３５．  タンパク質が転写因子である、実施形態３３に記載の方法。
【０１４７】
３６．  タンパク質が、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素である、実施形態３３に記載の方法。
【０１４８】
３７．  タンパク質が抗アポトーシスタンパク質である、実施形態３３に記載の方法。
【０１４９】
３８．  化合物がＢ細胞活性化因子である、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５０】
３９．  化合物が増殖誘導性リガンドである、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５１】
４０．  化合物が、Ｂ細胞受容体シグナル伝達分子のアクチベーターである、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
４１．  化合物がＡＴＰである、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
４２．  化合物が細胞活性化因子である、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５４】
４３．  化合物が細胞分化因子である、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
４４．  化合物が小分子である、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
４５．  化合物がナノ粒子中にある、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
４６．  化合物がリポソーム中にある、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５８】
４７．  化合物が、ウイルス、ウイルス粒子、またはウイルスカプシドを含むビヒクル中にある、実施形態２４に記載の方法。
【０１５９】
４８．  化合物が、アデノ随伴ウイルス、アデノ随伴ウイルス粒子、またはアデノ随伴ウイルスカプシドを含むビヒクル中にある、実施形態２４に記載の方法。
【０１６０】
４９．  抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、実施形態１から４８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６１】
５０．  抗体が抗原結合性抗体バリアントである、実施形態１から４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１６２】
５１．  抗体のクラスが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤである、実施形態１から５０のいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
５２．  抗体が抗原結合性抗体断片である、実施形態１から５０のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
５３．  抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ断片である、実施形態５２に記載の方法。
【０１６５】
５４．  抗体が全長抗体である、実施形態１から５１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
５５．  抗体が、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片である、実施形態１から５０のいずれか１つに記載の方法。
【０１６７】
５６．  抗体が単鎖抗体である、実施形態１から５０のいずれか１つに記載の方法。
【０１６８】
５７．  抗体が多特異性抗体である、実施形態１から５１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
５８．  抗体が抗体融合タンパク質である、実施形態１から５１のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
５９．  前記細胞懸濁物が、狭窄を通過させるステップの前に、それと同時に、またはその後に、化合物と接触される、実施形態１から５８のいずれか１つに記載の方法。
【０１７１】
６０．  チャネルが、約３０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む、実施形態１から２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７２】
６１．  チャネルが、約１０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法。
【０１７３】
６２．  孔のサイズが、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍまたは約１４μｍである、実施形態１から３または５のいずれか１つに記載の方法。
【０１７４】
６３．  約−５℃と約４５℃との間で実施される、実施形態１から６２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
６４．  内因性抗体産生が、少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約２００％よりも大きく変更される、実施形態１から６３のいずれか１つに記載の方法。
【０１７６】
６５．  内因性抗体産生が、狭窄を通過しなかった細胞による抗体産生よりも、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％長く、または約２００％を超えて長く持続される、実施形態１から６３のいずれか１つに記載の方法。
【０１７７】
６６．  実施形態１から１６または１９から６５のいずれか１つに従って改変された抗体産生免疫細胞を患者に導入することによって、患者を処置する方法。
【０１７８】
６７．  細胞が、患者から単離され、実施形態１から１６または１９から６５のいずれか１つに記載の方法に従って改変され、患者中に戻し導入される、実施形態６６に記載の方法。
【０１７９】
６８．  細胞が、異なる個体から単離され、実施形態１から１６または１９から６５のいずれか１つに記載の方法に従って改変され、患者中に導入される、実施形態６６に記載の方法。
【０１８０】
６９．  実施形態１から１６または１９から６５のいずれか１つに従って改変された抗体産生免疫細胞を個体に導入することによって、個体における抗体産生を増強する方法。
【０１８１】
７０．  細胞が、個体から単離され、実施形態１から１６または１９から６５のいずれか１つに記載の方法に従って改変され、個体中に戻し導入される、実施形態６９に記載の方法。
【０１８２】
７１．  細胞が、個体から単離され、実施形態１から１６または１９から６５のいずれか１つに記載の方法に従って改変され、異なる個体中に導入される、実施形態６９に記載の方法。
【０１８３】
７２．  細胞を、少なくとも１つの電極によって生成された電場と接触させるステップをさらに含む、実施形態１から７１のいずれか１つに記載の方法。
【０１８４】
７３．  実施形態１から７２のいずれか１つに記載の方法における使用のための、狭窄、細胞懸濁物および化合物を含むシステム。
【０１８５】
７４．  電場を生成するための少なくとも１つの電極をさらに含む、実施形態７３に記載のシステム。
【０１８６】
７５．  細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導するための方法であって、細胞懸濁物に狭窄を通過させるステップを含み、前記狭窄が細胞を変形させ、それによって、抗体産生を開始させる化合物が細胞に進入するような細胞の乱れを引き起こし、前記細胞におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生が誘導される、方法。
【０１８７】
７６．  狭窄が、マイクロ流体チャネル内に含まれる、実施形態７５に記載の方法。
【０１８８】
７７．  狭窄が、孔であるか、または孔内に含まれる、実施形態７５に記載の方法。
【０１８９】
７８．  孔が、表面中に含まれる、実施形態７７に記載の方法。
【０１９０】
７９．  表面がフィルターである、実施形態７８に記載の方法。
【０１９１】
８０．  表面がメンブレンである、実施形態７８に記載の方法。
【０１９２】
８１．  狭窄のサイズが、細胞の直径の関数である、実施形態７５から８０のいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
８２．  狭窄のサイズが、細胞の直径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である、実施形態７５から８１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９４】
８３．  細胞懸濁物が、混合された細胞集団を含む、実施形態７５から８２のいずれか１つに記載の方法。
【０１９５】
８４．  細胞懸濁物が全血である、実施形態７５から８３のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
８５．  細胞懸濁物が、精製された細胞集団を含む、実施形態７５から８４のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
８６．  細胞懸濁物が、哺乳動物細胞を含む、実施形態７５から８５のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
８７．  細胞懸濁物が、サル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギの細胞を含む、実施形態７５から８６のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
８８．  細胞懸濁物が、ヒト細胞を含む、実施形態７５から８６のいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
８９．  細胞懸濁物が、非哺乳動物細胞を含む、実施形態７５から８５のいずれか１つに記載の方法。
【０２０１】
９０．  細胞懸濁物が、細菌、酵母、ニワトリ、カエル、昆虫または線形動物の細胞を含む、実施形態７５から８５または８９のいずれか１つに記載の方法。
【０２０２】
９１．  細胞懸濁物が、末梢血単核細胞を含む、実施形態７５から８９のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
９２．  細胞が、免疫細胞、幹細胞、骨髄由来前駆細胞、赤血球先駆体、線維芽細胞、心臓細胞または細胞株細胞である、実施形態７５から９１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
９３．  細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または幹細胞である、実施形態７５から９２のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
９４．  細胞が、Ｂ細胞またはＢ細胞先駆体である、実施形態７５から９３のいずれか１つに記載の方法。
【０２０６】
９５．  細胞が、Ｂ細胞先駆体、ナイーブＢ細胞、活性化されたＢ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、Ｂ−１細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、調節性Ｂ細胞またはＢ細胞リンパ腫細胞である、実施形態９４に記載の方法。
【０２０７】
９６．  細胞が骨髄由来Ｂ細胞先駆体である、実施形態９４または９５に記載の方法。
【０２０８】
９７．  化合物が、核酸を含む、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２０９】
９８．  核酸が、免疫グロブリンをコードする、実施形態９７に記載の方法。
【０２１０】
９９．  核酸が、細胞のゲノム中に組み込まれる、実施形態９８に記載の方法。
【０２１１】
１００．  核酸が、細胞のゲノム中に組み込まれない、実施形態９８に記載の方法。
【０２１２】
１０１．  核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする、実施形態９７に記載の方法。
【０２１３】
１０２．  核酸がプラスミドである、実施形態９７に記載の方法。
【０２１４】
１０３．  化合物が、ペプチド核酸を含む、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
１０４．  化合物が、タンパク質−核酸複合体を含む、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
１０５．  タンパク質−核酸複合体が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む、実施形態１０４に記載の方法。
【０２１７】
１０６．  ドナーＤＮＡをさらに含む、実施形態１０５に記載の方法。
【０２１８】
１０７．  核酸が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡをコードする、実施形態９７に記載の方法。
【０２１９】
１０８．  ドナーＤＮＡをさらに含む、実施形態１０７に記載の方法。
【０２２０】
１０９．  化合物が、タンパク質またはポリペプチドを含む、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２１】
１１０．  タンパク質が、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼである、実施形態１０９に記載の方法。
【０２２２】
１１１．  タンパク質が転写因子である、実施形態１０９に記載の方法。
【０２２３】
１１２．  タンパク質が、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素である、実施形態１０９に記載の方法。
【０２２４】
１１３．  化合物がＢ細胞活性化因子である、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２５】
１１４．  化合物が増殖誘導性リガンドである、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２６】
１１５．  化合物が、Ｂ細胞受容体シグナル伝達分子のアクチベーターである、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２７】
１１６．  化合物が細胞活性化因子である、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２８】
１１７．  化合物が細胞分化因子である、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２９】
１１８．  化合物が小分子である、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２３０】
１１９．  化合物がナノ粒子中にある、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２３１】
１２０．  化合物がリポソーム中にある、実施形態７５から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０２３２】
１２１．  化合物が、ウイルス、ウイルス粒子、またはウイルスカプシドを含むビヒクル中にある、実施形態９７に記載の方法。
【０２３３】
１２２．  化合物が、アデノ随伴ウイルス、アデノ随伴ウイルス粒子、またはアデノ随伴ウイルスカプシドを含むビヒクル中にある、実施形態９７に記載の方法。
【０２３４】
１２３．  抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、実施形態７５から１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
１２４．  抗体が抗原結合性抗体バリアントである、実施形態７５から１２３のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
１２５．  抗体のクラスが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤである、実施形態７５から１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
１２６．  抗体が抗原結合性抗体断片である、実施形態７５から１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２３８】
１２７．  抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂまたはｄｓＦｖ断片である、実施形態１２６に記載の方法。
【０２３９】
１２８．  抗体が全長抗体である、実施形態７５から１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４０】
１２９．  抗体が、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ抗体断片である、実施形態７５から１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
１３０．  抗体が単鎖抗体である、実施形態７５から１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
１３１．  抗体が多特異性抗体である、実施形態７５から１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４３】
１３２．  抗体が抗体融合タンパク質である、実施形態７５から１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
１３３．  前記細胞懸濁物が、狭窄を通過させるステップの前に、それと同時に、またはその後に、化合物と接触される、実施形態７５から１３２のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
１３４．  チャネルが、約３０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む、実施形態７５から７６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４６】
１３５．  チャネルが、約１０μｍの狭窄長さおよび約４μｍの狭窄幅を含む、実施形態７５から７６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４７】
１３６．  孔のサイズが、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍまたは約１４μｍである、実施形態７５または７７のいずれか１つに記載の方法。
【０２４８】
１３７．  約−５℃と約４５℃との間で実施される、実施形態７５から１３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４９】
１３８．  実施形態７５から８８または９１から１３７のいずれか１つに従って改変された細胞を患者に導入することによって、患者を処置する方法。
【０２５０】
１３９．  細胞が、患者から単離され、実施形態７５から８８または９１から１３７のいずれか１つに記載の方法に従って改変され、患者中に戻し導入される、実施形態１３８に記載の方法。
【０２５１】
１４０．  細胞が、異なる個体から単離され、実施形態７５から８８または９１から１３７のいずれか１つに記載の方法に従って改変され、患者中に導入される、実施形態１３８に記載の方法。
【０２５２】
１４１．  実施形態７５から８８または９１から１３７のいずれか１つに従って改変された細胞を個体に導入することによって、個体におけるｄｅ  ｎｏｖｏ抗体産生を誘導する方法。
【０２５３】
１４２．  細胞が、個体から単離され、実施形態７５から８８または９１から１３７のいずれか１つに記載の方法に従って改変され、個体中に戻し導入される、実施形態１４１に記載の方法。
【０２５４】
１４３．  細胞が、個体から単離され、実施形態７５から８８または９１から１３７のいずれか１つに記載の方法に従って改変され、異なる個体中に導入される、実施形態１４１に記載の方法。
【０２５５】
１４４．  細胞を、少なくとも１つの電極によって生成された電場と接触させるステップをさらに含む、実施形態７５から１４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
１４５．  実施形態７５から１４４のいずれか１つに記載の方法における使用のための、狭窄、細胞懸濁物および化合物を含むシステム。
【０２５７】
１４６．  電場を生成するための少なくとも１つの電極をさらに含む、実施形態１４５に記載のシステム。
【実施例】
【０２５８】
ＸＩＶ．実施例
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を説明することを目的として与えられ、本開示を限定する意図は決してない。当業者は、本開示が、目標を達成し、言及された目的および利点、ならびに本明細書に固有の目標、目的および利点を得るために、十分に適応されることを容易に理解する。特許請求の範囲によって規定される本開示の精神の範囲内に包含される、本明細書における変化および他の使用は、当業者に想起される。
（実施例１）
ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ｂ細胞抗体産生を誘導するための、抗体をコードするｍＲＮＡの狭窄媒介性送達
【０２５９】
脾臓を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスから収集し、７０μｍセルストレーナーを介してすり潰す。赤血球を溶解させ、Ｂ細胞を、使用説明書に従ってＢ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、細胞懸濁物からさらに単離する。Ｂ細胞を、０．１〜０．４ｍｇ／ｍＬの濃度のｍＲＮＡと共に、１ｍＬ当たり１〜１０×１０６細胞の濃度でＰＢＳ中に懸濁する。対照として、Ｂ細胞を、ｍＲＮＡなしで処理する。細胞懸濁物に、９０ｐｓｉの圧力において１０−４チップまたは３０−４チップのいずれかを通過させる処理を行う。処理後、細胞を、その間の遠心分離を伴ってＲ１０中で３回洗浄し、最終的にＲ１０中に再懸濁し、９６ウェルのｕ底中に、１ｕｇ／ｍｌのＲ８４８＋１００単位／ｍｌのＩＬ−２と共に１０〜５０，０００細胞／ウェルでプレートする。細胞を３日間培養し、その後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって総抗体含量についてアッセイする。ｍＲＮＡが送達されたＢ細胞によって産生された総抗体含量を、ｍＲＮＡを受けていないＢ細胞によって産生された総抗体と比較する。
（実施例２）
Ｂ細胞抗体産生を増強するための、化合物の狭窄媒介性送達
【０２６０】
脾臓を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスから収集し、７０μｍセルストレーナーを介してすり潰す。赤血球を溶解させ、Ｂ細胞を、使用説明書に従ってＢ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、細胞懸濁物からさらに単離する。Ｂ細胞を、Ｂ細胞抗体産生を増強するための化合物と共に、１ｍＬ当たり１〜１０×１０６細胞の濃度でＰＢＳ中に懸濁する。対照として、Ｂ細胞を、化合物なしで処理する。細胞懸濁物に、９０ｐｓｉの圧力において１０−４チップまたは３０−４チップのいずれかを通過させる処理を行う。処理後、細胞を、その間の遠心分離を伴ってＲ１０中で３回洗浄し、最終的にＲ１０中に再懸濁し、９６ウェルのｕ底中に、１ｕｇ／ｍｌのＲ８４８＋１００単位／ｍｌのＩＬ−２と共に１０〜５０，０００細胞／ウェルでプレートする。細胞を３日間培養し、その後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって総抗体含量についてアッセイする。化合物が送達されたＢ細胞によって産生された総抗体含量を、その化合物を受けていないＢ細胞によって産生された総抗体と比較する。
【国際調査報告】
2021507689.tif 000002
2021507689.tif 000003
2021507689.tif 000004