(57)【要約】本発明は、ＧＰＣ３に特異的に結合するマウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体ならびにこれらのコンジュゲートを提供する。抗ＧＰＣ３抗体およびＧＰＣ３に向けられた抗体−薬物コンジュゲートが本明細書において提供される。特に、ＧＰＣ３に向けられたチュブリシン抗体（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）−薬物コンジュゲートおよびＧＰＣ３を発現する障害を処置するためにかかるコンジュゲートを使用する方法が本明細書において提供される。好ましい抗ＧＰＣ３抗体は、マウスＧＰＣ３−１抗体のキメラ形態またはヒト化形態である。マウスＧＰＣ３−１抗体は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号９に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
2021513844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトグリピカン−３（ＧＰＣ３）タンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が配列番号１の３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列番号２の３つの軽鎖ＣＤＲを含み、前記ＣＤＲがＫａｂａｔによって定義されるとおりである、抗体。
【請求項２】
ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニヤ化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する成熟重鎖領域と配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域と配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体である、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
Ｈ２４がＶまたはＡによって占められ、Ｈ３８がＱ、ＲまたはＫによって占められ、Ｈ４８がＭまたはＩによって占められ、Ｈ６６がＲまたはＫによって占められ、Ｈ６７がＶまたはＡによって占められ、Ｈ６９がＬによって占められ、Ｈ７１がＡによって占められ、Ｈ７３がＫまたはＴによって占められ、Ｈ９３がＧまたはＡによって占められ、Ｈ９４がＲによって占められ、および前記軽鎖の以下のアミノ酸残基が存在する：Ｌ４５がＲまたはＫによって占められ、Ｌ４６がＬまたはＲによって占められ、Ｌ１０５がＥまたはＶによって占められ、Ｌ１０６がＩまたはＭによって占められ、付番がＫａｂａｔ付番システムによる、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
以下の可変領域フレームワーク位置が指定されているとおりに占められている：Ｈ２４がＶによって占められ、Ｈ３８がＱによって占められ、Ｈ４８がＭによって占められ、Ｈ６６がＲによって占められ、Ｈ６７がＶによって占められ、Ｈ６９がＬによって占められ、Ｈ７１がＡによって占められ、Ｈ７３がＫによって占められ、Ｈ９３がＧによって占められ、Ｈ９４がＲによって占められ、付番がＫａｂａｔ付番システムによる、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
以下の可変領域フレームワーク位置が指定されているとおりに占められている：Ｌ４５がＲによって占められ、Ｌ４６がＬによって占められ、Ｌ１０５がＥによって占められ、Ｌ１０６がＩによって占められ；付番がＫａｂａｔ付番システムによる、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ＨＡＬＡ、ＨＡＬＢ、ＨＡＬＣ、ＨＢＬＡ、ＨＢＬＢ、ＨＢＬＣ、ＨＢＬＤ、ＨＢＬＥ、ＨＢＬＢ−Ｑ、ＨＢＬＢ−Ｖ、ＨＣＬＡ、ＨＣＬＢ、ＨＣＬＣ、ＨＤＬＡ、ＨＤＬＢおよびＨＤＬＣである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合されており、前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合されている、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記重鎖定常領域が、天然のヒト定常領域に比してＦｃγ受容体に対する低下した結合を有する前記天然のヒト定常領域の変異体形態である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記重鎖定常領域がＩｇＧ１イソタイプの重鎖定常領域である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
前記重鎖定常領域が、配列番号５または配列番号６を含むアミノ酸配列を有し、および前記軽鎖定常領域が配列番号７を含むアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートしている、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記コンジュゲートした細胞傷害剤がチュブリシンである、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
【化１１】
2021513844.tif 000021
の構造を有するコンジュゲートしたチュブリシンであり、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示し；
Ｒ２Ａは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２Ｂであり、Ｒ２Ｂは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、２−メチル−プロパ−１−イル、２，２−ジメチル−プロパ−１−イルもしくはビニルであり、またはＲ２Ａは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、プロパ−２−エン−１−イルもしくは２−メチル−プロパ−２−エン−１−イルであり；および
Ｒ７Ｂは、−Ｈまたは−ＯＨである、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
【化１２】
2021513844.tif 000022
の構造を有するコンジュゲートしたチュブリシンであり、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は、前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示す、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１８】
前記コンジュゲートした細胞傷害剤が、
【化１３】
2021513844.tif 000023
の構造を有するコンジュゲートしたチュブリシンであり、
前記コンジュゲートしたチュブリシンが塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩形態またはその溶媒和物であり、式中、波線は、前記チュブリシンが前記抗体にコンジュゲートしている部位を示す、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１９】
塩形態、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式
【化１４】
2021513844.tif 000024
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物であって；式中、
Ａは、ストレッチャー単位であり；
Ｒ２Ａは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２Ｂであり、Ｒ２Ｂは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、２−メチル−プロパ−１−イル、２，２−ジメチル−プロパ−１−イルもしくはビニルであり、またはＲ２Ａは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、プロパ−２−エン−１−イルもしくは２−メチル−プロパ−２−エン−１−イルであり；
Ｒ７Ｂは、−Ｈまたは−ＯＨであり；
Ａｂは、請求項１〜１６のいずれか一項に記載された抗体であり；
Ｓは、前記抗体からの硫黄原子であり；および
下付き文字ｐは、１〜４の整数である、
抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物。
【請求項２０】
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化１５】
2021513844.tif 000025
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項１９に記載の抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物。
【請求項２１】
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化１６】
2021513844.tif 000026
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項１９に記載の抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物。
【請求項２２】
前記化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化１７】
2021513844.tif 000027
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項１９に記載の抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物。
【請求項２３】
Ａｂへの結合がＡｂの操作されたシステイン残基の硫黄原子を介している、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
【請求項２４】
Ａｂへの結合が、付番のＥＵインデックスシステムにしたがって、前記重鎖定常領域の２３９位における硫黄原子または操作されたシステイン残基を介している、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
【請求項２５】
ｐが２である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
【請求項２６】
抗体−薬物コンジュゲート組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態のもしくはその溶媒和物の式：
【化１８】
2021513844.tif 000028
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団を含み；式中、
Ａは、ストレッチャー単位であり；
Ｒ２Ａは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２Ｂであり、Ｒ２Ｂは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、２−メチル−プロパ−１−イル、２，２−ジメチル−プロパ−１−イルもしくはビニルであり、またはＲ２Ａは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、プロパ−２−エン−１−イルもしくは２−メチル−プロパ−２−エン−１−イルであり；
Ｒ７Ｂは、−Ｈまたは−ＯＨであり；
Ａｂは、請求項１に記載された抗体であり；
Ｓは、前記抗体からの硫黄原子であり；および
下付き文字ｐは、各抗体薬物コンジュゲート化合物に対して１〜４の整数であり；および
前記組成物の平均薬物負荷量が約２であり、
下付き文字ｐは、１〜４の整数であり；
前記組成物の平均薬物負荷量が約２である、抗体−薬物コンジュゲート組成物。
【請求項２７】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化１９】
2021513844.tif 000029
【化２０】
2021513844.tif 000030
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項２６に記載の抗体−薬物コンジュゲート組成物。
【請求項２８】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２１】
2021513844.tif 000031
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する、請求項２６に記載の抗体−薬物コンジュゲート組成物。
【請求項２９】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２２】
2021513844.tif 000032
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項２６に記載の抗体−薬物コンジュゲート組成物。
【請求項３０】
Ａｂへの結合がＡｂの操作されたシステイン残基の硫黄原子を介している、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート組成物。
【請求項３１】
Ａｂへの結合が、付番のＥＵインデックスシステムにしたがって、前記重鎖定常領域の２３９位における硫黄原子または操作されたシステイン残基を介している、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート組成物。
【請求項３２】
ＧＰＣ３を発現するがんを有する患者を処置する方法であって、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物の有効レジメンを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
前記がんが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌または肉腫である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんがＨＣＣである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
自己免疫疾患を有する患者を処置する方法であって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物の有効レジメンを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれかに記載の抗体と薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項３７】
前記３つの重鎖ＣＤＲが配列番号１０、１１および１２に記載されているとおりであり、ならびに前記３つの軽鎖ＣＤＲが配列番号１３、１４および１５に記載されているとおりである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３８】
前記抗体が配列番号１０、１１および１２に記載されているとおりの前記３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号１３、１４および１５に記載されているとおりの前記３つの軽鎖ＣＤＲとを含む、ヒトＧＰＣ３タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項３９】
配列番号１０、１１および１２に記載されているとおりの前記３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号１３、１４および１５に記載されているとおりの前記３つの軽鎖ＣＤＲとを含む重鎖可変領域をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４０】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号２に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する成熟重鎖領域を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載のポリヌクレオチドを含む単離されたベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項４３】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
抗ＧＰＣ３抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、
ａ）前記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で請求項４２に記載の宿主細胞を培養すること、および
ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片を単離すること、
を含む、方法。
【請求項４５】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
抗ＧＰＣ３抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）前記抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で請求項４２に記載の宿主細胞を培養すること、
ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片を単離すること、および
ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片に細胞傷害剤をコンジュゲートすること、
を含む、方法。
【請求項４７】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞傷害剤がチュブリシンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ＧＰＣ３を発現するがんを有する患者を処置する方法であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２３】
2021513844.tif 000033
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団を含む組成物の有効レジメンを前記患者に投与することを含み；式中、
Ａは、ストレッチャー単位であり；
Ｒ２Ａは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２Ｂであり、Ｒ２Ｂは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、２−メチル−プロパ−１−イル、２，２−ジメチル−プロパ−１−イルもしくはビニルであり、またはＲ２Ａは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、プロパ−２−エン−１−イルもしくは２−メチル−プロパ−２−エン−１−イルであり；
Ｒ７Ｂは、−Ｈまたは−ＯＨであり；
Ａｂは、請求項１に記載された抗体であり；
Ｓは、前記抗体からの硫黄原子であり；および
下付き文字ｐは、各抗体薬物コンジュゲート化合物に対して１〜４の整数であり；および
前記組成物の平均薬物負荷量が約２である、方法。
【請求項５０】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２４】
2021513844.tif 000034
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２５】
2021513844.tif 000035
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２６】
2021513844.tif 000036
有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記がんが、ＨＣＣ、肺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌または肉腫である、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記がんがＨＣＣである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
医薬組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２７】
2021513844.tif 000037
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団を含み；式中、
Ａは、ストレッチャー単位であり；
Ｒ２Ａは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２Ｂであり、Ｒ２Ｂは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、２−メチル−プロパ−１−イル、２，２−ジメチル−プロパ−１−イルもしくはビニルであり、またはＲ２Ａは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、プロパ−２−エン−１−イルもしくは２−メチル−プロパ−２−エン−１−イルであり；
Ｒ７Ｂは、−Ｈまたは−ＯＨであり；
Ａｂは、配列番号１の前記３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号２の前記３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体であり、
前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによって定義されているとおりであり、
Ｓは、前記抗体からの硫黄原子であり；および
下付き文字ｐは、２である、
医薬組成物。
【請求項５６】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２８】
2021513844.tif 000038
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化２９】
2021513844.tif 000039
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
抗体−薬物コンジュゲート化合物が、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化３０】
2021513844.tif 000040
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式の１つを有する、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
医薬組成物であって、塩形態の、特に、薬学的に塩形態の、もしくはその溶媒和物の式：
【化３１】
2021513844.tif 000041
を有するまたはチオ置換されたスクシンイミドが加水分解された形態である上式を有する抗ＧＰＣ３抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団を含み；式中、
Ａｂは、配列番号：１の前記３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２の前記３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体であり、
前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによって定義されているとおりであり、
Ｓは、前記抗体からの硫黄原子であり；および
下付き文字ｐは、２である、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年２月１５日に出願された米国出願第６２／６３１，３５３号の優先権の恩典を主張し、その内容全体が、参照により組み込まれる。
【０００２】
グリピカン３（ＧＰＣ３）は、肝細胞癌細胞上に発現されることが知られている細胞表面プロテオグリカンであり、多数の悪性細胞上に報告されている。本発明は、ＧＰＣ３抗体およびそのコンジュゲートを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
抗ＧＰＣ３抗体およびＧＰＣ３に向けられた抗体−薬物コンジュゲートが本明細書において提供される。特に、ＧＰＣ３に向けられたチュブリシン抗体（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）−薬物コンジュゲートおよびＧＰＣ３を発現する障害を処置するためにかかるコンジュゲートを使用する方法が本明細書において提供される。好ましい抗ＧＰＣ３抗体は、マウスＧＰＣ３−１抗体のキメラ形態またはヒト化形態である。マウスＧＰＣ３−１抗体は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号９に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、ヒトＧＰＣ３の配列を示す。
【０００５】
【図２】図２Ａは、ｈＧＰＣ３−１重鎖バリアントのヒトｖＨドナー配列、ＨＶ１−１８／ＨＪ４との配列アライメントを示している。
【０００６】
図２Ｂは、ｈＧＰＣ３−１重鎖バリアントのヒトｖＨドナー配列、ＨＶ１−６９−２／ＨＪ４との配列アライメントを示している。
【０００７】
【図３】図３は、ｈＧＰＣ３−１重鎖バリアントの配列アライメントを示している。
【０００８】
【図４】図４は、ｈＧＰＣ３−１軽鎖バリアントのヒトｖＬドナー配列、ＫＶ２−３０／ＫＪ２との配列アライメントを示している。
【０００９】
【図５】図５は、ｈＧＰＣ３−１軽鎖バリアントの配列アライメントを示している。
【００１０】
【図６】図６は、ｈＧＰＣ３−１ｅｃに対する表面プラズモン共鳴結合データを示す。（左）複数のセンサーグラムが、固定されたｈＧＰＣ３と会合しているいくつかの濃度（４００、１６０、６４、２５．６、１０．２、４．１および１．６４ｎＭ）のｈＧＰＣ３−１ｅｃを表す。（右）ＫＤを、各濃度に対して６００秒の最大応答をプロットすることによって決定し、１／２最大結合によって定義した。
【００１１】
【図７】図７は、ＪＨＨ７、Ｈｕｈ７およびＨｅｐ３Ｂを含むＧＰＣ３を発現するＨＣＣ細胞株のパネルに対して、ヒト化ＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３抗体−薬物コンジュゲートを試験するインビトロ細胞傷害アッセイの結果を示す。
【００１２】
【図８】図８は、ＮＣＩ−Ｈ６６１およびＮＣＩ−Ｈ４４６を含むＧＰＣ３を発現する肺癌細胞株のパネルに対して、ヒト化ＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３抗体−薬物コンジュゲートを試験するインビトロ細胞傷害アッセイの結果を示す。
【００１３】
【図９】図９は、ＨＣＣ異種移植モデルＪＨＨ７の結果を示す。
【００１４】
【図１０】図１０は、ＨＣＣ異種移植モデルＨｕｈ７の結果を示す。
【００１５】
【図１１】図１１は、ＨＣＣ異種移植モデルＨｅｐ３Ｂの結果を示す。
【００１６】
【図１２】図１２は、肺癌異種移植モデルＮＣＩ−Ｈ６６１の結果を示す。
【００１７】
【図１３】図１３は、Ｓ２３９Ｃまたは天然のシステインにコンジュゲートしたときの、チュブリシンＭアセテートの安定性およびリンカーマレイミドの安定性のインビボでの評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、微量に存在し得る天然に存在する可能性がある変異を除き、集団を構成する各抗体は同一である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られているという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法によって抗体を産生することを要求するものと解釈すべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーからも単離され得、またはその他の方法によって作製され得る。本明細書に記載されている抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１９】
抗体は、典型的には、単離された形態で提供される。これは、抗体が、典型的には、その産生または精製から生じる妨害タンパク質およびその他の夾雑物から少なくとも５０％ｗ／ｗ純粋であることを意味するが、抗体が過剰の薬学的に（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）許容され得る担体（複数可）またはその使用を容易にすることを目的とする他のビヒクルと組み合わされる可能性を除外しない。時には、抗体は、妨害タンパク質および作製または精製由来の夾雑物から少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５または９９％ｗ／ｗ純粋である。単離された抗体を含む抗体は、細胞傷害剤にコンジュゲートすることができ、抗体薬物コンジュゲートとして提供することができる。
【００２０】
「単離された」ポリヌクレオチドは、その天然の成分から同定され、分離され、および／または回収されたポリヌクレオチドを表す。
【００２１】
モノクローナル抗体のその標的抗原への特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的結合は、規模が検出可能により高く、少なくとも１つの無関係な標的に対して生じる非特異的結合と識別可能である。特異的結合は、特定の官能基または特定の空間的適合（例えば、ロックおよび鍵タイプ）間での結合の形成の結果であり得るのに対して、非特異的結合は、通常、ファンデルワールス力の結果である。ＧＰＣ３に向けられた抗体−薬物コンジュゲートおよび抗ＧＰＣ３抗体は、ＧＰＣ３に特異的に結合する。
【００２２】
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主として関与する約１００〜１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、当初、切断可能なシグナルペプチドに連結されて発現される。シグナルペプチドなしの可変領域は、成熟可変領域と称されることがある。したがって、例えば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドなしの軽鎖可変領域を意味する。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、それぞれ、抗体のイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして規定する。軽鎖および重鎖の中で、下付き文字と定常領域は、約１２またはそれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖も、約１０またはそれを超えるアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、Ｃｈ．７参照、あらゆる目的のために、その全体が参照により組み込まれる）。各軽／重鎖対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、完全な状態の抗体は２つの結合部位を有する。鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域によって連結された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同一の一般的構造を呈する。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列させられ、特異的なエピトープへの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖および重鎖はいずれも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ、１９８７  ａｎｄ  １９９１）またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。Ｋａｂａｔは、異なる重鎖可変領域間または異なる軽鎖可変領域間の対応する残基に同じ番号が割り当てられる、幅広く使用されるナンバリング規約（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）も提供する。重鎖定常領域のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているようにＥＵインデックスを通じて為される（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７および１９９１）。
【００２３】
「抗体」という用語は、完全な状態の抗体およびその抗原結合断片を含む。「完全な状態の抗体」とは、抗体のクラスに対して適切なように、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒトの天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。抗体断片は、標的への特異的な結合に関して、当該抗体断片が由来した完全な状態の抗体と競合し、それは、分離した重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、ダイアボディ、Ｄａｂ、ナノボディおよびＦｖを含む。断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または完全な状態のイムノグロブリンの酵素的または化学的分離によって作製することができる。「抗体」という用語は、ダイアボディ（ホモ二量体Ｆｖ断片）またはミニボディ（ＶＬ−ＶＨ−ＣＨ３）、二重特異的抗体なども含む。二重特異的または二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対と２つの異なる結合部位とを有する人工のハイブリッド抗体である（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−５３（１９９２）参照）。
【００２４】
「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよびその他の哺乳動物の被験体を含む。
【００２５】
アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的のために、アミノ酸は、以下のようにグループ分けされる。グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラス中のアミノ酸間での置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つの構成要素を別の構成要素と交換することから構成される。
【００２６】
パーセント配列同一性は、Ｋａｂａｔナンバリング規約によって最大限に合致するように整列させた抗体配列を用いて決定される。アライメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が参照抗体の同じ領域と比較されている場合、対象抗体領域と参照抗体領域間のパーセント配列同一性は、対象抗体領域と参照抗体領域の両方において同一のアミノ酸によって占められている位置の数を、ギャップは計数せずに、２つの領域の整列させた位置の総数によって除し、１００を乗じて百分率に変換したものである。
【００２７】
１またはそれを超える列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていないその他の要素を含み得る。例えば、抗体を含む組成物は、単独でまたは他の成分と組み合わせて該抗体を含有し得る。
【００２８】
「治療的有効量」または「有効量」という用語は、哺乳動物中の疾患または障害を処置するのに有効である抗体−薬物コンジュゲートの量を表す。がんの場合には、治療的有効量のコンジュゲートは、がん細胞の数を低下させ得；腫瘍サイズを縮小させ得；末梢臓器中へのがん細胞の浸潤を阻害し得（すなわち、ある程度遅らせ得る、好ましくは停止させ得る）；腫瘍転移を阻害し得（すなわち、ある程度遅らせ得る、好ましくは停止させ得る）；腫瘍成長を阻害し得；および／またはがんと関連する症状の１またはそれより多くを緩和し得る。がん治療に関しては、有効性は、例えば、無増悪期間（ＴＴＰ）を評価し、および／または奏効率（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。「有効レジメン」という用語は、障害の処置を達成するのに十分な、投与されているコンジュゲートの量および投薬頻度の組み合わせを表す。
【００２９】
「処置する」または「処置」という用語は、文脈によって別段の指示がなければ、その目的ががんの発達または拡散などの望ましくない生理学的変化または障害を阻害しまたは遅らせる（和らげる）ことである治療的処置を表す。有益なまたは所望の臨床的結果としては、検出可能かまたは検出不能かを問わない、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の軽減または寛解、緩解（部分的であるか、または完全であるかを問わない）が含まれるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比べて、生存期間を延長することも意味し得る。処置を必要とするものには、検出可能な疾患を有するものが含まれる。処置を必要とするものには、検出できない疾患を有するもの、例えば、ＧＰＣ３を発現する障害に対する処置後に完全な応答を達成したが、再発を予防するために治療を必要としている患者も含まれ得る。
【００３０】
本明細書において使用される「化合物」という用語は、文脈によって別段の指示または示唆がなければ、名称が付されたまたは構造によって表された化学的化合物それ自体を表しおよび包含し、塩形態が除外されるべきことを文脈が明らかにしていなければ、明示されているか否かを問わず、前記化学的化合物の塩形態（複数可）を表しおよび包含する。化合物の塩には、双性イオン塩形態、有機対イオンまたは無機対イオンを有する酸付加および塩基付加塩形態ならびに同一であり得るまたは異なり得る２またはそれを超える対イオンを含む塩形態が含まれる。いくつかの態様において、塩形態は、化合物の薬学的に許容され得る塩形態である。「化合物」という用語は、化合物のカルボニル基が水和されてジェミナルジオールを形成する場合のように、溶媒が化合物と非共有結合で会合しているか、または化合物と共有結合で可逆的に結合している化合物の溶媒和物形態をさらに包含する。溶媒和物形態は、化合物それ自体およびその塩形態（複数可）の溶媒和物を含み、水和物を含む、半溶媒和物、一溶媒和物、二溶媒和物を包含し、化合物が２またはそれを超える溶媒分子と会合することができる場合には、２またはそれを超える溶媒分子は同一であり得、または異なり得る。いくつかの事例では、本発明の化合物は、上記形態の１またはそれより多く、例えば、塩および溶媒和物の明示的な参照を含むが、これは、化合物の何らかの固体状態形態を示唆するものではなく、この参照は単に強調のためであり、上で特定されている形態とは別のものをすべて除外するものと解釈すべきではない。さらに、化合物または抗体薬物コンジュゲート組成物の塩および／または溶媒和物形態への明示的な参照が為されていない場合、その省略は、文脈がこのような塩および／または溶媒和形態を除外すべきことを明らかにしていなければ、化合物またはコンジュゲートの塩および／または溶媒和物形態（複数可）を除外すると解釈すべきではない。
【００３１】
本明細書において使用される「部分」という用語は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、分子または化合物の指定された区域、断片または官能基を意味する。化学的部分は、分子、化合物または化学式中に埋め込まれたまたは付加された化学的実体（すなわち、置換基または可変基）として時折表記される。
【００３２】
文脈によって別段の表記または示唆がなければ、所定の範囲の炭素原子によって本明細書中に記載されている任意の置換基または部分については、表記された範囲は炭素原子のあらゆる各数字が記載されていることを意味する。したがって、例えば、「必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ４アルキル」または「必要に応じて置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル」という表記は、それぞれ、本明細書に定義されているとおりの、必要に応じて置換された１、２、３もしくは４つの炭素のアルキル部分が存在すること、または本明細書に定義されているとおりの、必要に応じて置換された２、３、４、５もしくは６つの炭素のアルケニル部分が存在することを具体的に意味する。このような数的表記は全て、各炭素原子基の全てを開示することが明示的に意図されており、したがって、「必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ４アルキル」は、置換されているかまたは置換されていないかを問わず、メチル、エチル、３炭素アルキルおよび４炭素アルキルを含み、これらの位置異性体の全てを含む。したがって、アルキル部分が置換されている場合、数的表記は置換されていない基本部分を表し、その基本部分の置換基中に存在し得る当該基本部分に直接結合していない炭素原子を含むことは意図されない。炭素原子の与えられた範囲によって特定されている本明細書に定義されているとおりのエステル、カルボネート、カルバメートおよび尿素に関しては、表記された範囲は、それぞれの官能基のカルボニル炭素を含む。したがって、Ｃ１エステルはギ酸エステルを表し、Ｃ２エステルは酢酸エステルを表す。
【００３３】
本明細書に記載されている有機置換基、有機部分および有機基は、ならびに本明細書に記載されているその他の任意の他の部分に関しては、不安定な部分が、本明細書に記載されている使用の１またはそれより多くに対して十分な化学的安定性を有する化合物を作るために使用することができる一過性の種である場合を除き、通常、不安定な部分を除外する。５価の炭素を有する置換基、部分または基をもたらす本明細書に与えられた定義の運用による置換基、部分または基は、明確に除外される。
【００３４】
本明細書において使用される「アルキル」という用語は、単独でまたは別の用語の一部として、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、メチルを表すか、またはそのうちの１つが一価である連続する炭素原子の集合体であって、炭素原子の１またはそれより多くが飽和しており（すなわち、１またはそれを超えるｓｐ３炭素から構成される）、直鎖状、第二級、第三級または環状配置で、すなわち、直鎖、分岐、環状配置またはこれらのある組み合わせで、共に共有結合で連結している炭素原子の集合体を表す。連続する飽和炭素原子が環状配置である場合には、かかるアルキル部分は、いくつかの態様において、カルボシクリルと称される。
【００３５】
アルキル置換基としてアルキル部分を参照する場合、当該アルキル置換基が結合しているマーカッシュ構造または別の有機部分に対するそのアルキル置換基は、該アルキル置換基のｓｐ３炭素を通じて該構造または該部分に共有結合で付着されているメチルまたは連続する炭素原子の鎖である。したがって、本明細書において使用されているアルキル置換基は、少なくとも１つの飽和した部分を含有し、不飽和アルキル部分を規定するために１またはそれを超える独立に選択された二重結合および／または三重結合をさらに含有し得、本明細書に記載されているとおりの適切な必要に応じて存在する（ｏｐｔｉｏｎａｌ）置換基（複数可）を含む１〜４、典型的には１〜３または１もしくは２の他の部分によって置換されてもよい。飽和アルキル部分中の炭素原子の数は様々であって良く、典型的には、１〜８、１〜６または１〜４であり、不飽和アルキル部分においては、典型的には、３〜８、３〜６または３〜４の間で様々である。
【００３６】
文脈によって別段の表記または示唆がなければ、「アルキル」という用語は、表記されている数の共有結合で連結された飽和炭素原子を有する飽和非環式炭化水素ラジカルを示し、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」または「Ｃ１−Ｃ６アルキル」などの用語は、１つの飽和炭素原子（すなわち、メチル）または２、３、４、５もしくは６つの連続する非環式飽和炭素原子を含有するアルキル部分または基を意味し、「Ｃ１−Ｃ８アルキル」は、１つの飽和炭素原子または２、３、４、５、６、７もしくは８つの連続する飽和非環式炭素原子を有するアルキル部分または基を表す。
【００３７】
飽和アルキル置換基、飽和アルキル部分または飽和アルキル基が明記されている場合、種には、親アルカンから水素原子を除去することによって得られた種（すなわち、アルキル部分は一価である）が含まれ、メチル、エチル、１−プロピル（ｎ−プロピル）、２−プロピル（イソプロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−ブチル）、２−メチル−１−プロピル（イソブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓｅｃ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、アミル、イソアミル、ｓｅｃ−アミルならびにその他の直鎖および分岐鎖アルキル部分が含まれ得る。
【００３８】
本明細書に使用される「アルキレン」という用語は、単独でまたは別の用語の一部として、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、表記された数の炭素原子、通例１〜８、１もしくは６または１〜４の範囲の炭素原子の、２つのラジカル中心を有する（すなわち、二価である）飽和、分岐鎖または直鎖炭化水素ジラジカルであって、置換されておりまたは置換されておらず、炭素原子の１またはそれより多くが飽和している（すなわち、１またはそれを超えるｓｐ３炭素から構成される）飽和、分岐鎖または直鎖炭化水素ジラジカルを表す。これらのラジカル中心は、ジラジカルを形成するために、親アルカンの同じもしくは２つの異なる飽和（すなわち、ｓｐ３）炭素原子から、または別のその飽和炭素から１つの水素原子が除去されている本明細書に記載のアルキルラジカルから、またはアルキルラジカルのラジカル炭素から２つの水素原子を除去することによって誘導可能である。
【００３９】
アルキレン部分の例は、メチレン（−ＣＨ２−）、１，２−エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）および同様のジラジカルであるが、これらに限定されない。典型的には、アルキレンは、ｓｐ３炭素のみを含有する（すなわち、ラジカル炭素原子にかかわらず完全に飽和されている）分岐鎖または直鎖炭化水素であり、いくつかの態様では、置換されていない。他の態様において、アルキレンは、不飽和アルキレン部分の末端炭素が一価のｓｐ３炭素原子であるように、１またはそれを超える二重結合および／または三重結合官能基、典型的には１または２の、より典型的には１のこのような官能基の形態で不飽和の内部部位を含有する。さらに別の態様において、アルキレンは置換されておらず、または必要に応じて存在する置換基に対して本明細書で定義されているように、１〜４、典型的には１〜３、または１もしくは２の置換基で置換されている。
【００４０】
本明細書において使用される「必要に応じて置換されたアルキル」または「必要に応じて置換されたフェニル」は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、本明細書に定義されているとおりのアルキルまたはフェニル置換基、部分または基であって、その置換基、部分または基の１または複数の水素原子が、１または複数の異なる部分または基で必要に応じて置換されているアルキルまたはフェニル置換基、部分または基を表し、本明細書に定義されているとおりのシアノ、ハロゲン、−ＣＸ３（Ｘは、独立に、ハロゲンである）、Ｎ結合部分およびＯ結合部分からなる群より選択されるものを含む。
【００４１】
典型的には、必要に応じて存在する置換基は、−Ｘ、−Ｃｌ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−ＮＲ’（Ｒ’）２、−Ｎ（Ｒ’）３、−ＣＦ３、−ＣＮおよび−ＮＯ２からなる群より選択され、各Ｘは独立にハロゲンであり、各Ｒ’は独立にＣ１−Ｃ６アルキルである。
【００４２】
本明細書において使用される「Ｏ結合部分」は、その酸素原子を通じてＯ結合部分が会合しているマーカッシュ構造または別の部分に直接結合している酸素含有有機部分を表す。Ｏ結合部分には、−ＯＨ、アシルオキシ（すなわち、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ、ここで、Ｒａは、典型的には、−Ｈ、必要に応じて置換されたアルキルまたは必要に応じて置換されたフェニルであり、アルキル部分が飽和または不飽和であるＣ１−Ｃ６アルキルオキシなどのエーテル基が含まれる。他の例示的なＯ結合置換基は、カルバメートに対する定義によって与えられる。
【００４３】
本明細書において使用される「Ｎ結合部分」は、その窒素原子を通じてＮ結合部分が会合しているマーカッシュ構造または別の部分に直接結合している含窒素有機部分を表す。Ｎ結合部分には、−ＮＨ２、−ＮＨＲａ、−Ｎ（Ｒａ）２およびアミド（すなわち、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒａ）が含まれ、ここで、Ｒａは、−Ｈ、必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ６アルキルおよび必要に応じて置換されたフェニルからなる群より典型的に選択される。他の例示的なＮ結合置換基は、カルバメートに対する定義によって与えられる。
【００４４】
本明細書において使用される「カルバメート」は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２によって表されるカルバメート官能基を含有する置換基、部分または基を意味し（ここで、式中、Ｒａは、独立に選択され、水素または必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ６アルキルである）、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（必要に応じて置換されたアルキル）または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（必要に応じて置換されたアルキル）２が含まれ、これらは、例示的なカルバメート置換基であり、必要に応じて置換されたアルキルは、独立に選択される必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ６アルキルである。カルバメートがマーカッシュ群（すなわち、置換基）として使用される場合、カルバメート官能基の単結合した酸素（Ｏ結合）または窒素（Ｎ結合）はそれが会合しているマーカッシュ式に結合している。カルバメート置換基の結合は、明示的に示されているか（Ｎ結合またはＯ結合）、またはこの置換基が言及されている文脈において暗に示されている。本明細書に記載されているＯ結合カルバメートが例示的な一価のＯ結合部分であり、Ｎ結合カルバメートが例示的なＮ結合部分である。
【００４５】
本明細書において使用される「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味し、典型的には−Ｆまたは−Ｃｌである。
【００４６】
本明細書において使用される「その塩」という句は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、化合物（例えば、薬物、薬物リンカー化合物または抗体薬物コンジュゲート化合物）の塩形態を表す。化合物の塩形態は、１またはそれを超える分子内塩形態であり、および／または酢酸イオン、コハク酸イオンまたはその他の対イオンなどの別の分子の包含を伴う。化合物の塩形態中の対イオンは、典型的には、親化合物上の電荷を安定化させる有機部分または無機部分である。化合物の塩形態は、その構造中に、１または１を超える帯電した原子を有する。複数の帯電した原子が塩形態の一部である場合には、複数の対イオンおよび／または複数の帯電した対イオンが存在する。このため、化合物の塩形態は、典型的には、該化合物の非塩形態の原子に対応する１またはそれを超える帯電した原子と１またはそれを超える対イオンとを有する。いくつかの態様において、化合物の非塩形態は、少なくとも１つのアミノ基またはその他の塩基性部分を含有し、したがって酸の存在下において、塩基性部分の酸付加塩が得られる。他の態様において、化合物の非塩形態は、少なくとも１つのカルボン酸基またはその他の酸性部分を含有し、したがって塩基の存在下において、カルボキシレートまたはその他の陰イオン性部分が得られる。
【００４７】
化合物の塩形態中の例示的な対陰イオンおよび対陽イオンには、硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
化合物の塩形態の選択は、投与の予定される経路（複数可）に応じた様々なｐＨ値での十分な水溶解度、流動特性を有する結晶化度および加速された（すなわち、４０℃および７５％相対湿度で保存されたときの分解または固体状態変化を決定するための）条件下での化学的安定性および固体状態安定性を決定することによる取り扱いおよび要求される貯蔵寿命に適した低い吸湿性（すなわち、相対湿度に対する水吸収）など、医薬品が示さなければならない特性に依存する。
【００４９】
「薬学的に許容され得る」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されたこともしくは承認可能であること、または動物における、より具体的にはヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくはその他の一般的に認められた薬局方に列記されていることを意味する。「薬学的に適合し得る成分」という用語は、抗体または抗体−薬物コンジュゲートがともに被験体に投与される薬学的に許容され得る希釈剤、佐剤、賦形剤またはビヒクルを表す。
【００５０】
「薬学的に許容され得る塩」は、本明細書に記載されているとおりの被験体に投与するのに適した化合物の塩形態であり、いくつかの態様において、Ｐ．Ｈ．ＳｔａｈｌおよびＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ、編集、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｚｕｅｒｉｃｈ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ／ＶＨＣＡ，２００２によって記載されている対陽イオンまたは対陰イオンを含む。
【００５１】
本発明の文脈における溶媒和物は、溶媒分子との配位を通じて錯体を形成する本発明の化合物の溶媒和物形態である。水和物は、配位が水とともに起こる溶媒和物の１つの特定の形態である。本発明の文脈における好ましい溶媒和物は水和物である。
【００５２】
本明細書において使用される「チュブリシン化合物」は（文脈によって別段の表記または示唆がなければ）、細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性を有する、テトラペプチドをベースとするチューブリン破壊剤であり、中央の５員環含窒素ヘテロアリーレン部分およびＮ末端のピペコリン酸残基を有する非天然アミノ酸残基によって特徴付けられ、いくつかの態様では、四級化された薬物単位として抗体薬物コンジュゲート中に取り込ませるために使用され得る第三級アミンを含有する。四級化に適した非限定的な例示的チュブリシンは、以下の構造：
【化１】
2021513844.tif 000003
【００５３】
またはその塩、特に、薬学的に許容され得る塩を有し、式中、表記された窒素原子は、チュブリシン化合物が四級化された薬物単位中に取り込まれるときの四級化の部位であり；円は、５員環含窒素ヘテロアリーレン部分を表し、そのヘテロアリールに対する示された置換基は、残りの位置における必要に応じて存在する置換と互いに１，３の関係性にあり；Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＲ２Ｂであり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立に、必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ７Ａは、必要に応じて置換されたフェニルであり；Ｒ２ＢおよびＲ８Ａは、独立に、水素または必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり；Ｚは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−もしくは−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｒ２Ａは、水素もしくは必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、または−ＸＲ２Ａは、一価のＯ結合置換基もしくは一価のＮ結合置換基を表す。
【００５４】
Ｓｈａｎｋａｒら、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ  Ｕ  ａｎａｌｏｇｓ−ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｂｕｖａｌｉｎｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ”  Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）１１：２２７３−２２８７；Ｘｉａｎｇｍｉｎｇら、“Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｂｕｌｙｓｉｎｓ”Ｍｉｎｉ−Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）１３：１５７２−８；Ｓｈａｎｋａｒら、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ−Ｕ”  Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．（２０１３）５４：６１３７−６１４１；Ｓｈａｎｋａｒら、“Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｘａｚｏｌｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ  Ｕ”  Ｓｙｎｌｅｔｔ（２０１１）２０１１（１２）：１６７３−６；Ｒａｇｈａｖａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００８）５１：１５３０−３；Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｒ．ら、“Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｄｅｓｍｅｔｈｙｌ  ａｎｄ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｔｕｂｕｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００８）１８：２９９６−９；およびＲａｇｈａｖａｎら、“Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ”  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００８）５１：１５３０−３によって、チュブリシン薬物を調製する例示的な方法および構造活性相関が提供される。
【００５５】
いくつかの態様において、四級化に適したチュブリシンには、以下の構造：
【化２】
2021513844.tif 000004
を有するもの、
【００５６】
またはその塩、特に、薬学的に許容され得る塩が含まれ、式中、Ｒ２Ａはメチル、エチルまたはプロピルまたは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２Ｂであり、Ｒ２Ｂは前に定義されており；およびＲ７Ｂは、水素または−ＯＨである。他の態様において、四級化に適したチュブリシンは、Ｒ２Ａが−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３であり、およびＲ７Ｂが水素である上記構造を有するチュブリシンＭであり、またはＲ２Ａがエチルであり、およびＲ７Ｂが水素である上記構造を有するチュブリシン化合物である。
【００５７】
本明細書において使用される「四級化されたチュブリシン薬物単位」は（文脈によって別段の表記または示唆がなければ）、その三級アミン窒素が四級アミン塩として四級化された薬物単位構造中に存在し、抗体薬物コンジュゲートの薬物リンカー部分からのその放出に際して、四級化された薬物単位が遊離の三級アミン含有チュブリシン化合物を与える三級アミン含有チュブリシン化合物に関する。いくつかの態様において、四級化されたチュブリシン薬物単位（Ｄ＋）は、チュブリシン化合物のＣ末端成分の三級アミン窒素を、適切な脱離基を有するリンカー単位前駆体と縮合させることによって得られる。他の態様において、Ｃ末端成分が、まず、チュブリシン化合物の残部と四級化され、次いで、付加されて、Ｄ＋単位を完成する。したがって、四級化されたチュブリシン薬物単位を含有する構造は、Ｄ＋が形成された特定の方法を暗に意味せず、その形成において使用される反応物が三級アミン含有薬物であることを必要とせず、Ｄ＋が抗体薬物コンジュゲート化合物から放出されることが予定される三級アミン含有の構造を取り込みまたはかかる構造に対応することのみを必要とする。
【００５８】
本明細書において使用される「ストレッチャー単位」は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、抗体に結合しているリンカー単位のコハク酸部分またはその加水分解された形態とグルクロニド単位との間に介在する、抗体薬物コンジュゲートのグルクロニドをベースとする薬物リンカー部分中のリンカー単位の成分を表す。または、ストレッチャー単位は、抗体薬物コンジュゲートの調製において使用することができる、リンカー単位のマレイミド部分とグルクロニド単位の間に介在するグルクロニドをベースとする薬物リンカー化合物中のリンカー単位の成分を表す。ストレッチャー単位（Ａ）は、単一の単位であり得、または複数のサブユニットを含有し得る。典型的には、Ａは１つの特有の単位を有し、または２〜４個の特有のサブユニットを有する。
【００５９】
いくつかの態様において、ストレッチャー単位またはその第一のサブユニットは、その二価の中心の１つがマレイミドもしくはスクシンイミド部分またはこれらの加水分解された形態の窒素原子に結合しており、他方がカルボニル残基に結合している必要に応じて置換されたＣ１−Ｃ６アルキレンから構成され、国際公開第２０１３／１７３３３７号に記載されているように自己安定化リンカーを与えるために、Ｃ１−Ｃ６アルキレンの必要に応じて存在する置換基が時に塩基性単位として存在する。Ａが２またはそれを超える特有のサブユニットを有する場合、第二のサブユニットは、典型的には、−Ｌｐ（ＰＥＧ）部分であり、式中、Ｌｐは、三官能性アミン含有アミノ酸残基から構成される平行コネクタ単位であり、ＰＥＧは本明細書に定義されているとおりのＰＥＧ単位であり、またはαアミノ酸、βアミノ酸もしくはその他のアミン含有酸残基である。いずれの事例でも、第二のサブユニットのアミン含有酸残基のアミン窒素原子は、第一のサブユニットのカルボニル残基に結合しており、第二のサブユニットのカルボニル残基の炭素原子は、グルクロニドをベースとするリンカー単位のグルクロニド単位にまたは通例、そのカルボニル残基がグルクロニドをベースとするリンカー単位のグルクロニド単位に結合している別のアミン含有酸残基であるＡの第三のサブユニットのアミン窒素原子に結合している。
【００６０】
本明細書において使用される「平行コネクタ単位」という用語は、文脈によって別段の表記または示唆がなければ、抗体薬物コンジュゲートの薬物リンカー部分のリンカー単位中の三官能性有機部分であり、またはＰＥＧ単位が疎水性薬物単位に「平行」配位して、その疎水性を少なくとも部分的に遮蔽することができるように、三官能性基の１つがＰＥＧ単位に結合しており、他の２つがリンカー単位内の平行コネクタ（ＬＰ）単位に結合している疎水性薬物単位を有する薬物リンカー化合物のリンカー単位中の三官能性有機部分である。ＬＰに結合したＰＥＧ単位は、その遮蔽を与えるために、典型的には８から２４の範囲の、エチレングリコールサブユニットの反復数を含有する。ＬＰ、ＰＥＧおよび疎水性薬物単位は、国際公開第２０１５／０５７６９９号によってさらに記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
文脈によって別段の表記または示唆がなければ、本明細書において使用される「グルクロニド単位」という用語は、抗体薬物コンジュゲートまたは薬物リンカー化合物のグルクロニドをベースとする薬物リンカー部分の薬物単位に結合したリンカー単位の切断可能な成分であり、アミノベンジル残基とグリコシド結合を通じてアミノベンジル残基にコンジュゲートした炭水化物残基とから構成され、ベンジル残基は、遊離の薬物として薬物単位を放出するために、そのグリコシド結合におけるグリコシダーゼによる酵素作用に際して、自壊することができる。いくつかの態様において、本明細書に定義されているとおりの四級化されたチュブリシン薬物単位などの四級化された薬物単位は、そのアミノ残基の窒素原子がリンカー単位の残部に共有結合で付着しているおよびそのアリーレン残基がグルクロン酸残基などのグリコシドコンジュゲートした炭水化物残基で置換されているアミノベンジル部分のベンジル炭素原子に共有結合で付着されており、前記炭素原子残基は、グリコシダーゼによるグリコシド結合の切断に際して、ベンジル部分が自発的な断片化を経て、遊離の三級含有薬物として四級化された薬物単位を放出するように、ベンジル炭素原子とオルトまたはパラの関係にある。他の態様において、カルバメート官能基が、ベンジル炭素原子と四級化されていないアミン含有薬物単位のアミン窒素原子との間に介在し、カルバメート官能基の一価の酸素原子はベンジル炭素原子に共有結合で付着されている。これらの態様において、自発的なＣＯ２の喪失を経て、遊離のアミン含有薬物を与えるカルバミン酸官能基含有薬物単位が放出される。四級化されていない薬物単位に結合したグルクロニド単位は国際公開第２００７／０１１９６８号によってさらに記載されており、四級化された薬物単位に結合したグルクロニド単位は、国際公開第２０１６／０４０６８４号によってさらに記載されている。
【００６２】
文脈から自明でなければ、「約」という用語は、表記された値の標準偏差内の値を包含する。
詳細な説明
Ｉ．総論
【００６３】
本発明は、一つには、ヒトＧＰＣ３へ標的化された抗体−薬物コンジュゲートなどの抗体−薬物コンジュゲートが、ＧＰＣ３＋発現細胞を死滅させるのに特に効果的であるという発見に基づいている。特に、重鎖可変領域アクセプター配列として、生殖系列ｈＩＧＨｖ１−１８またはｈＩＧＨＶ１−２６−２およびＪエキソンＪＨ−４を、軽鎖可変領域アクセプター配列に対しては、生殖系列ｈＩＧＫｖ２−３０およびＪエキソンＪＫ−２をとして使用し、１またはそれを超える鍵となる部位の残基をマウス抗体またはマウス生殖系列配列へ戻すように変異することによって、高親和性ＧＰＣ３−１ヒト化抗体を構築できることが見出された。重鎖については、これらの鍵となる部位には、位置Ｈ２４、Ｈ３８、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ６９、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ９３およびＨ９４の１またはそれより多くが含まれた。軽鎖については、これらの鍵となる部位には、位置Ｌ４５、Ｌ４６、Ｌ１０５およびＬ１０６の１またはそれより多くが含まれた。ＧＰＣ３−１ヒト化抗体は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の一部として、薬物送達において効果的であった。ＳＧＤ−６８５９チュブリシンＭ薬物−リンカーにコンジュゲートすると、得られるｈＧＰＣ３−１ｅｃチュブリシンＭコンジュゲート（ｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９）は、ＨＣＣ細胞株のパネルに対して極めて活性があった。ｈＧＰＣ３−１の後の「ｅｃ」という表記は、抗体が重鎖の位置２３９にシステイン置換を有することを示す（付番は、Ｋａｂａｔで表記されたＥＵインデックスによる）。
【００６４】
ｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９ＡＤＣは、肝細胞癌（ＨＣＣ）などのＧＰＣ３を発現する腫瘍を標的とすることができる。ＨＣＣは、一般に、化学療法抵抗性として分類されてきた。これは、ＨＣＣ細胞中での薬物排出輸送体の高い発現によるものである。これらのトランスフォーマは、全身の化学療法薬を効率的に排除する。チュブリシンＭは、薬物排出輸送体に対する不良な基質であり、このため、ＨＣＣを標的とするＡＤＣのための効果的な薬物−リンカーである。さらに、チュブリシンＭは、十分なバイスタンダー活性を有するのに十分に細胞透過性である。
ＩＩ．本発明の抗体
【００６５】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲが、ヒト「アクセプター」抗体配列中に移植されている遺伝子操作された抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｃａｒｔｅｒ、米国特許第６，４０７，２１３号；Ａｄａｉｒ、米国特許第５，８５９，２０５号；およびＦｏｏｔｅ、米国特許第６，８８１，５５７号参照）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、このような配列の複合物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列または生殖系列領域配列であり得る。
【００６６】
したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的に非ヒトドナー抗体に由来する一部または全部のＣＤＲと、存在する場合、ヒト抗体配列に完全にまたは実質的に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域とを有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来する少なくとも１つ、２つ、通常は全ての３つのＣＤＲと、存在する場合、ヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に実質的に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域とを有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖に由来する少なくとも１つ、２つ、通常は全ての３つのＣＤＲと、存在する場合、ヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に実質的に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域とを有する。ナノボディおよびダイアボディ以外、ヒト化抗体は、通例、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。（Ｋａｂａｔによって定義されるところにより）対応する残基の少なくとも６０％、８５％、９０％、９５％または１００％が各ＣＤＲ間で同一である場合に、ヒト化抗体またはヒト抗体中のＣＤＲは、非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに実質的に由来する、または対応するＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、各ＣＤＲ中に３つ以下の保存的アミノ酸置換が存在する場合に、ヒト化抗体またはヒト抗体中のＣＤＲは、非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに実質的に由来する、または対応するＣＤＲと実質的に同一である。Ｋａｂａｔによって定義される対応する残基の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が同一である場合に、抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、それぞれ、ヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。本発明のいくつかのヒト化抗体では、抗体の重鎖可変フレームワーク領域中に少なくとも３つおよび最大９つのマウスＧＰＣ３−１復帰突然変異が存在し、抗体の軽鎖可変領域中に最大４つのマウスＧＰＣ３−１復帰突然変異が存在する。
【００６７】
ヒト化抗体は、多くの場合、マウス抗体に由来する全ての６つのＣＤＲ（好ましくは、Ｋａｂａｔの定義による）を組み入れるが、全てのＣＤＲより少ない（例えば、少なくとも３、４または５の）マウス抗体由来のＣＤＲを用いて、ヒト化抗体を作製することもできる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【００６８】
ＣＤＲ立体構造および／または抗原への結合に対する影響の可能性に基づいて、ヒト可変領域フレームワーク残基のある種のアミノ酸を、置換のために選択することができる。このような影響の可能性の調査は、モデリング、特定の位置のアミノ酸の特徴の調査または特定のアミノ酸の置換または変異誘発の効果の経験的観察による。
【００６９】
本発明は、ヒトＧＰＣ３抗原に対して向けられた抗体を提供する。好ましい抗体は、マウスＧＰＣ３−１抗体に由来するキメラ抗体またはヒト化抗体である。重鎖可変領域に対する好ましいアクセプター配列は、生殖系列ｈＩＧＨＶ１−１８またはｈＩＧＨＶ１−６９−２およびＪエキソンＪＨ４である。軽鎖可変領域については、好ましいアクセプター配列は、生殖系列ｈＩＧＫＶ２−３０およびＪエキソンＪＫ２である。
【００７０】
例示的な抗ＧＰＣ３抗体は、配列番号１に記載されている重鎖ＣＤＲおよび配列番号２に記載されている軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％の同一性を有する成熟重鎖可変領域および配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％の同一性を有する成熟軽鎖可変領域をさらに有するヒト化抗体である。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによって定義されるところによる。好ましくは、重鎖可変ドメインフレームワークの以下のアミノ酸残基が維持されている：Ｈ２４がＶによって占められ、Ｈ３８がＱによって占められ、Ｈ４８がＭによって占められ、Ｈ６６がＲによって占められ、Ｈ６７がＶによって占められ、Ｈ６９がＬによって占められ、Ｈ７１がＡによって占められ、Ｈ７３がＫによって占められ、Ｈ９３がＧによって占められ、Ｈ９４がＲによって占められ、軽鎖の以下のアミノ酸残基が維持されている：Ｌ４５がＲによって占められ、Ｌ４６がＬによって占められ、Ｌ１０５がＥによって占められ、Ｌ１０６がＩによって占められている。
【００７１】
したがって、配列番号１に記載されている重鎖可変領域および配列番号２に記載されている軽鎖可変領域を含むが、Ｈ２４がＶまたはＡによって占められ、Ｈ３８がＱ、ＲまたはＫによって占められ、Ｈ４８がＭまたはＩによって占められ、Ｈ６６がＲまたはＫによって占められ、Ｈ６７がＶまたはＡによって占められ、Ｈ６９がＬによって占められ、Ｈ７１がＡによって占められ、Ｈ７３がＫまたはＴによって占められ、Ｈ９３がＧまたはＡによって占められ、Ｈ９４がＲによって占められ、および軽鎖の以下のアミノ酸残基が存在する：Ｌ４５がＲまたはＫによって占められ、Ｌ４６がＬまたはＲによって占められ、Ｌ１０５がＥまたはＶによって占められ、Ｌ１０６がＩまたはＭによって占められる、ヒト化抗体が本明細書において提供される。
【００７２】
マウスＧＰＣ３−１抗体のヒト化形態は、４つの例示されたヒト化重鎖成熟可変領域（ＨＡ−ＨＤ）および７つの例示されたヒト化軽鎖成熟可変領域（ＬＡ−ＬＥ、ＬＢ−Ｑ、ＬＢ−Ｖ）を含む。これらの鎖の順列には、ＨＡＬＡ、ＨＡＬＢ、ＨＡＬＣ、ＨＢＬＡ、ＨＢＬＢ、ＨＢＬＣ、ＨＢＬＤ、ＨＢＬＥ、ＨＢＬＢ−Ｑ、ＨＢＬＢ−Ｖ、ＨＣＬＡ、ＨＣＬＢ、ＨＣＬＣ、ＨＤＬＡ、ＨＤＬＢおよびＨＤＬＣが含まれる。これらの順列のうち、ＨＢＬＥが好ましい。ＨＢＬＥは、配列番号１に記載されている重鎖および配列番号２に記載されている軽鎖を含む。しかしながら、ＨＢＬＥに代えて、ＨＡＬＡ、ＨＡＬＢ、ＨＡＬＣ、ＨＢＬＡ、ＨＢＬＢ、ＨＢＬＣ、ＨＢＬＤ、ＨＢＬＥ、ＨＢＬＢ−Ｑ、ＨＢＬＢ−Ｖ、ＨＣＬＡ、ＨＣＬＢ、ＨＣＬＣ、ＨＤＬＡ、ＨＤＬＢおよびＨＤＬＣの任意の１つを使用することができる。
【００７３】
いくつかの態様において、ヒトＧＰＣ３に対するヒト化ＧＰＣ３−１抗体の見かけの解離定数（ｋｄ）は、好ましくは、０．１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲内、より好ましくは、０．１ｎＭ〜５ｎＭの範囲内、さらに好ましくは、１ｎＭ〜３ｎＭまたは２ｎＭ〜約３ｎＭの範囲内にある。いくつかの態様において、本発明の抗体は、ヒトＧＰＣ３に対するマウスＧＰＣ３−１抗体の見かけの解離定数の０．１〜１．５倍、または０．５〜２倍の範囲内の見かけの解離定数を有する。いくつかの態様において、ヒト化ＧＰＣ３−１に対する抗体の見かけの解離定数（ｋｄ）は約２．７である。
Ａ．定常領域の選択
【００７４】
ヒト化ＧＰＣ３−１抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択は、１つには、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用および／または補体依存性細胞傷害が望まれるかどうかに依存し得る。例えば、ヒトイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、強力な補体依存性細胞傷害を有し、ヒトイソタイプＩｇＧ２は、弱い補体依存性細胞傷害を有し、ヒトＩｇＧ４は、補体依存性細胞傷害を欠如する。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４より強力な細胞媒介性エフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含有する四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖サブスクリプトドメインがスペーサーを通じて連結されている一本鎖抗体として、発現され得る。
【００７５】
ヒト定常領域は、異なる個体間でのアロタイプの多様性およびイソアロタイプの多様性を示す、すなわち、定常領域は、１またはそれを超える多型位置において、異なる個体で異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が１またはそれを超える他のイソタイプの非多型領域に結合する点でアロタイプとは異なる。
【００７６】
重鎖のＣ末端リジンなど、軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端の１つまたはいくつかのアミノ酸は、分子の一部または全部において、欠損してもよく、または誘導体化されてもよい。補体媒介性細胞傷害もしくはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を低下もしくは増加させるために、（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏら、米国特許第５，８３４，５９７号；およびＬａｚａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３：４００５，２００６参照）、またはヒトでの半減期を延長するために（例えば、Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４参照）、定常領域中に置換を施すことができる。
【００７７】
薬物−リンカーの部位特異的コンジュゲーションを可能とするために、定常領域は修飾され得る。このような技術には、天然に存在するまたは操作されたシステイン残基、ジスルフィド架橋、ポリヒスチジン配列、糖鎖工学タグおよびトランスグルタミナーゼ認識配列の使用が含まれる。細菌のトランスグルタミナーゼを用いた部位特異コンジュゲーションのための例示的な置換は、Ｎ２９７ＳまたはＮ２９７Ｑである。操作されたシステインを用いる部位特異的コンジュゲーションのための例示的な置換は、Ｓ２３９Ｃである（米国特許出願公開第２０１００１５８９０９号；Ｆｃ領域の付番は、ＥＵインデックスにしたがう）。いくつかの態様において、追加のシステイン残基の存在は、鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とする。このような鎖間ジスルフィド結合の形成は、立体障害を引き起こすことができ、それにより、Ｆｃ領域−ＦｃγＲ結合相互作用の親和性を低下させる。ＩｇＧ定常領域のＦｃ領域中またはその近傍に導入されたシステイン残基（複数可）は、治療剤へのコンジュゲーションのための部位としての役割も果たすことができる（すなわち、薬物のマレイミド誘導体などのチオール特異的試薬を用いて細胞傷害薬物をカップリングする。治療剤の存在は立体障害を引き起こし、それにより、Ｆｃ領域−ＦｃγＲ結合相互作用の親和性をさらに低下させる。抗体断片も、薬物−リンカーの部位特異的コンジュゲーションのために修飾することができる、例えば、Ｋｉｍら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７（８）を参照。
Ｂ．組換え抗体の発現
【００７８】
ヒト化またはキメラＧＰＣ３−１抗体は、組換え発現によって作製することができる。組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、天然に付随するまたは異種のプロモーター領域などの、抗体鎖のコード配列に機能的に連結された発現調節配列を含む。好ましくは、発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換または形質移入することができるベクター中の真核プロモーター系である。ベクターが適切な宿主中に取り込まれたら、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交さ反応する抗体の収集および精製に適した条件下に維持される。
【００７９】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）参照。完全な状態の異種タンパク質を分泌することができる多数の適切な宿主細胞株が本分野において開発されており、ＣＨＯ細胞株（例えば、ＤＧ４４）、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞ならびにＳｐ２／０およびＮＳ０を含む非抗体産生骨髄腫が含まれる。好ましくは、細胞は、非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））などの発現調節配列ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現調節配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照。
【００８０】
発現されたら、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの本分野の標準的な手技にしたがって抗体を精製することができる（一般的に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）参照）。
ＩＩＩ．核酸
【００８１】
本発明は、さらに、本明細書に記載されているヒト化重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する。典型的には、該核酸は、成熟した重鎖および軽鎖可変領域に融合されたシグナルペプチドもコードする。核酸上のコード配列は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどの、コード配列の発現を確実にするための制御配列と機能的に連結され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、単離された形態で存在し得、または１もしくはそれを超えるベクター中にクローニングされ得る。核酸は、例えば、固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのＰＣＲによって合成することができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、例えば、発現ベクター内に１つの連続する核酸として連結することができ、または別々とすることができる、例えば、それぞれがその独自の発現ベクター中にクローニングされ得る。
【００８２】
一実施形態において、本開示は、ＨＡ、ＨＢ、ＨＣまたはＨＤに記載されているアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードすることができる。この単離されたポリヌクレオチドは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域をさらにコードすることができる。ＩｇＧ定常領域のイソタイプは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。一実施形態において、ＩｇＧ定常領域のイソタイプはＩｇＧ１である。別の実施形態において、コードされるＩｇＧ１定常領域は、Ｋａｂａｔシステムにおいて記載されているとおりにＥＵインデックスにしたがって、残基２３９に置換を含むアミノ酸配列、すなわち、Ｓ２３９Ｃを有する。本開示は、ＨＡ、ＨＢ、ＨＣまたはＨＤに記載されているアミノ酸配列（例えば、配列番号１またはそのバリアント）を含む抗体重鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供し、さらに、その発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【００８３】
別の実施形態において、本開示は、ＬＡ、ＬＢ、ＬＣ、ＬＤ、ＬＥ、ＬＢ−ＱまたはＬＢ−Ｖに記載されているアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチド。この単離されたポリヌクレオチドは、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域をさらにコードすることができる。ＩｇＧ軽鎖定常領域のイソタイプは、例えば、κ定常領域である。本開示は、ＬＡ、ＬＢ、ＬＣ、ＬＤ、ＬＥ、ＬＢ−ＱまたはＬＢ−Ｖに記載されているアミノ酸配列（例えば、配列番号２またはそのバリアント）を含む抗体軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供し、さらに、その発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【００８４】
別の実施形態において、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする１または複数の単離されたポリヌクレオチドを提供し、該重鎖可変ドメインおよび該軽鎖可変ドメインは、ヒトＧＰＣ３に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を形成する。本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする１または複数の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。１または複数の発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物の細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【００８５】
別の実施形態において、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第一および第二のベクターであって、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、ヒトＧＰＣ３に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を形成するベクターを提供する。ベクターを含む宿主細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物の宿主細胞が提供される。
ＩＶ．抗体−薬物コンジュゲート
【００８６】
抗ＧＰＣ３抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために、細胞傷害部分または細胞増殖抑制部分にコンジュゲートすることができる。抗体へのコンジュゲーションに特に適した部分は、細胞傷害剤（例えば、化学療法剤）、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは化合物または毒素（これらの部分は、治療剤と総称される）である。例えば、抗ＧＰＣ３抗体は、化学療法剤などの細胞傷害剤または毒素（例えば、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤）にコンジュゲートすることができる。細胞傷害剤の有用なクラスの例には、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡアルキル化剤および微小管破壊剤が含まれる。例示的な細胞傷害剤には、例えば、チュブリシン、アウリスタチン、カンプトテシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシノイド（例えば、ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３、ＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）およびビンカアルカロイドが含まれる。例示的な抗体−薬物コンジュゲートには、薬物成分がチュブリシン薬物であることを意味するチュブリシンベースの抗体−薬物コンジュゲート、薬物成分がアウリスタチン薬物であることを意味するアウリスタチンベースの抗体−薬物コンジュゲート、薬物成分がマイタンシノイド薬物であることを意味するマイタンシノイド抗体−薬物コンジュゲート、および薬物成分がベンゾジアゼピン（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）であることを意味するベンゾジアゼピン抗体薬物コンジュゲートが含まれる。
【００８７】
治療剤を抗体に結合するための技術は周知である。（例えば、Ａｌｌｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０  １４：１−９；Ｓｅｎｔｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．，２００８，１４（３）：１５４−１６９を参照。）治療剤は、（例えば、加水分解によって、タンパク質分解によって、または切断剤によって）抗体が切除されなければ、その活性を低下させるようにコンジュゲートすることができる。いくつかの態様において、ＧＰＣ３を発現するがん細胞によって内部に取り込まれたときにコンジュゲートが抗体から切断されるように（例えば、エンドソーム中で、または例えばｐＨ感受性もしくはプロテアーゼ感受性によって、リソゾームの環境中で、またはカベオラ（ｃａｖｅｏｌｅａｒ）の環境中で）、ＧＰＣ３を発現するがん細胞の細胞内環境中で切断に対して感受性であるが、細胞外環境に対しては実質的に感受性でない切断可能なリンカーを用いて、治療剤を抗体に結合させる。いくつかの態様において、治療剤は、非切断可能なリンカーを用いて、抗体に結合させることもできる。
【００８８】
本発明者らは、予想外のことに、四級化されたチュブリシン薬物−リンカーを含むＧＰＣ３標的化ＡＤＣが、とりわけ、リンカー単位がグルクロニド単位から構成されているときに、ＧＰＣ３を発現する障害を処置するために有効であることを見出した。
【００８９】
グルクロニドをベースとしたリンカーは、バリン−シトルリンおよびバリン−アラニンなどのプロテアーゼ切断可能なリンカーに対する親水性の代替物であり、薬物放出を開始するために細胞内βグルクロニダーゼを活用する。グリカン残基に近接するコンジュゲーションの部位が疎水性薬物を遮蔽する役割を果たすので、位置２３９または２３９／２９５または２９４におけるシステインバリアント（および二重システインバリアント）も、チュブリシンＭなどの疎水性薬物へのコンジュゲーションに特に適している。チュブリシンおよびチュブリシンに結合させたグルクロニドリンカーは、国際公開第２０１６／０４０６８４号により完全に記載されている。一実施形態において、ＧＰＣ標的化ＡＤＣは、内部取り込み後に、修飾されていないチュブリシンＭを細胞中に放出する。
【００９０】
したがって、本発明において使用するための四級化されたチュブリシン薬物単位を有する好ましいグルクロニドベースの薬物リンカー化合物は、塩形態、特に薬学的に許容され得る塩の構造：
【化３】
2021513844.tif 000005
【００９１】
を有し、式中、Ａは、ストレッチャー単位であり；Ｒ２Ａは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２Ｂであり、Ｒ２Ｂは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、２−メチル−プロパ−１−イル、２，２−ジメチル−プロパ−１−イルもしくはビニルであり、またはＲ２Ａは、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、プロパ−２−エン−１−イルもしくは２−メチル−プロパ−２−エン−１−イルであり；および
Ｒ７Ｂは、−Ｈまたは−ＯＨである。
【００９２】
より好ましい実施形態において、四級化されたチュブリシン薬物単位は、（αＳ，γＲ）−γ−［［［２−［（１Ｒ，３Ｒ）−１−（アセチルオキシ）−４−メチル−３−［メチル［（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−［［［（２Ｒ）−１−メチル−２−ピペリジニル］カルボニル］−アミノ］−１−オキソペンチル］アミノ］ペンチル］−４−チアゾリル］カルボニル］アミノ］−α−メチル−ベンゼンペンタン酸としても知られ、ＣＡＳ番号９３６６９１−４６−２を有するチュブリシンＭに関連する。したがって、より好ましい、四級化されたチュブリシン薬物単位を有するグルクロニドベースの薬物リンカー化合物は、Ｒ２Ａが−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３およびＲ７Ｂが水素である上記構造を有する。
【００９３】
したがって、特に好ましい、本発明において使用するためのグルクロニドベースの薬物リンカー化合物は、以下のとおりであり：
【化４】
2021513844.tif 000006
【００９４】
塩形態、特に、薬学的に許容され得る塩であり、式中、示されたｍＤＰＲ部分のアミン窒素原子は好ましくはプロトン化されており、またはＢＯＣなどの適切な酸に不安定な保護基によって保護されている。その他の特に好ましいグルクロニドベースの薬物リンカー化合物は、チュブバリンＮ−メチル置換基をエチルまたはｎ−プロピル置換基で置き換える。
【００９５】
その他のより好ましい実施形態、四級化されたチュブリシン薬物単位は、チュブバリン部分のＯ結合型酢酸置換基がＯ結合型エチルエーテル置換基によって置き換えられている（すなわち、Ｒ２Ａがエチルである）チュブリシンＭに関連する。
【００９６】
したがって、他の特に好ましい、本発明において使用するためのグルクロニドベースの薬物リンカー化合物は、以下のとおりであり：
【化５】
2021513844.tif 000007
【００９７】
塩形態、特に薬学的に許容され得る塩である。
【００９８】
グルクロニドベースのチュブリシン薬物リンカー化合物の調製は、国際公開第２０１６／０４０４６８４号に詳述されており、参照により本明細書に明確に組み込まれる。その調製は、以下の反応スキームによって例示される。
【化６】
2021513844.tif 000008
【００９９】
その活性化されたエステルｍＤＰＲ（ＢＯＣ）−ＯＳｕおよびｍＤＰＲ（ＢＯＣ）−ＯＰＦＦに変換されるｍＤＰＲ（ＢＯＣ）−ＯＨの調製は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１４，３２，１０５９−１０６２）に記載されており、そのための手法は、参照により本明細書に明確に組み込まれ、チュブリシンＭの四級化のために臭素化されているグルクロニド中間体の調製は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１６，１５，９３８−９４５によって記載されている、そのための手法は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１００】
本発明の抗体薬物コンジュゲートは、抗ＧＰＣ３抗体の位置２３９または２３９／２９５または２９４におけるシステインバリアント残基が、マイケル付加を通じて、当該化合物のマレイミド部分と縮合されており、これにより、その部分をスクシンイミド部分へ変換し、次いで、スクシンイミド部分がそのカルボニル炭素の１つにおいて加水分解を受け得るグルクロニドベースの薬物リンカー化合物の上記実施形態の任意の１つの構造を有する。
【０１０１】
チュブバリン残基の酢酸基が、チュブリシンＭｅｐ残基の三級アミン窒素へのその窒素原子の四級化を通じたグルクロニドリンカーの結合を有するエーテルまたは別のエステル基によって置き換えられており、上述されているものなどの薬物リンカー化合物から調製され得るチュブリシンＭおよびその類縁体の代表的な抗体薬物コンジュゲートは、以下のように例示され：
【化７】
2021513844.tif 000009
【０１０２】
必要に応じて、薬学的に許容され得る塩形態で、式中、下付き文字ｐは、薬物負荷量を表し、典型的には、１〜４の範囲であり、いくつかの態様において、２または４であり、Ａｂは、抗ＧＰＣ３抗体であり、Ｓは、システイン２３９またはシステイン２９５の硫黄原子である。
【０１０３】
抗体または融合タンパク質は、位置２３９または２９５を占めるシステインを介して、酵素、発色団または蛍光標識などの検出可能なマーカーへコンジュゲートすることもできる。後者のＡＤＣ構造は、そのカルボニル基の１つにおけるスクシンイミド部分の加水分解によって前者に関連し、いくつかの実施形態においては、ストレッチャー単位Ａが塩基性単位から構成されるときに起こる。
【０１０４】
他の例示的なＧＰＣ３標的化抗体薬物コンジュゲートが以下に示されている：
【化８】
2021513844.tif 000010
【化９】
2021513844.tif 000011
【化１０】
2021513844.tif 000012
【０１０５】
必要に応じて、薬学的に許容され得る塩形態で、式中、下付き文字ｐは、薬物負荷量を表し、典型的には、１〜４の範囲であり、いくつかの態様において、２または４であり、Ａｂは、抗ＧＰＣ３抗体であり、Ｓは、システイン２３９またはシステイン２９５の硫黄原子である。
【０１０６】
薬物または標識にコンジュゲートさせる他に、抗体は、抗体結合を阻害する阻害的ドメインまたは遮蔽ドメインへ結合させた切断可能なリンカーを介して連結することもできる（例えば、国際公開第２００３／０６８９３４号、国際公開第２００４／００９６３８号、国際公開第２００９／０２５８４６号、国際公開第２１０１／０８１１７３号および国際公開第２０１４／１０３９７３号参照）。リンカーは、ある種の組織または病変に対して特異的である酵素によって切断されるように設計することができ、これにより、抗体が所望の位置で優先的に活性化されることが可能となる。遮蔽部分は、抗体の結合部位へ直接結合することによって作用することができ、または立体障害を介して間接的に作用することができる。
薬物負荷量−「ｐ」
【０１０７】
上に示されているＧＰＣ３標的化抗体−薬物コンジュゲートを参照すると、下付き文字ｐは、抗体分子に対する薬物負荷量（抗体分子に結合させた薬物の分子の数）を表し、整数値である。標的細胞に送達することができる薬物の量を決定するので、抗体−薬物コンジュゲート分子の集団を含む組成物において、平均薬物負荷量（例えば、集団中の抗体当たりの薬物−リンカー分子の平均数）は、重要な品質特性である。平均薬物負荷量は整数値または非整数値であり得るが、典型的には、非整数値である。最適な平均薬物負荷量は、薬物または薬物−リンカーの組み合わせの種類に応じて様々である。
【０１０８】
抗体−薬物コンジュゲート組成物の不均一性は、いくつかの態様において、薬物−リンカー分子を抗体分子へコンジュゲートするために使用されるコンジュゲーション技術に依存する。例えば、いくつかの態様において、薬物−リンカー分子を抗体分子へコンジュゲートするために使用されるコンジュゲーション技術は、抗体上での薬物−リンカー分子の分布に関しておよび／または抗体分子上での薬物−リンカーの数に関して不均一である抗体−薬物コンジュゲート組成物をもたらす（例えば、非部位特異的技術を用いて鎖間ジスルフィドを介してコンジュゲートする場合）。他の態様において、薬物−リンカー分子を結合するために使用されるコンジュゲーション技術は、リガンド分子上での薬物−リンカー分子の分布に関しておよび／または抗体分子上での薬物−リンカー分子の数に関して実質的に均一である抗体−薬物コンジュゲート組成物をもたらす（例えば、部位特異的コンジュゲーション技術を用いる場合）。部位特異的方法と非部位特異的方法の両方で、通例、わずかな百分率のコンジュゲートしていない抗体分子も存在する。コンジュゲートしていない抗体分子の百分率は、平均薬物負荷量の値に含まれる。
【０１０９】
本発明の好ましい態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団を含む組成物を参照する場合の平均薬物負荷量は、約２〜約１４、好ましくは、約２〜約１０である。本明細書中に例示されているチュブリシンＭ抗体薬物コンジュゲートについては、特に好ましい平均薬物負荷量は約２である。いくつかの態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団中の各抗体分子に対する実際の薬物負荷量は、１〜４、１〜３または１〜２であり、一般的な薬物負荷量は２である。好ましい態様において、約２の平均薬物負荷量は、部位特異的コンジュゲーション技術（例えば、抗体に導入される操作されたシステイン）を介して達成される。
【０１１０】
本発明のいくつかの他の態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団を含む組成物を参照する場合の平均薬物負荷量は約３または約４であり、抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団中の各抗体分子に対する実際の薬物負荷量は１〜８である。
【０１１１】
いくつかの態様において、抗体−薬物コンジュゲート化合物の集団中の各抗体分子に対する実際の薬物負荷量は、１〜１０（または６〜１０もしくは６〜８）である。例えば、鎖間ジスルフィドの他に、（ＥＵインデックスにしたがって、位置２３９に導入されたシステイン残基などの）導入されたシステイン残基に薬物−リンカーがコンジュゲートしている場合には、より高い薬物負荷量を達成することができる。
Ｖ．治療上の適用
【０１１２】
本明細書に記載されているＧＰＣ３標的化抗体−薬物コンジュゲートは、ＧＰＣ３を発現するがんなどの、ＧＰＣ３を発現する障害を処置するために使用することができる。典型的には、このようながんは、タンパク質（例えば、イムノアッセイによって）またはＲＮＡレベルで測定される検出可能なレベルのＧＰＣ３を示す。このようながんのいくつかは、好ましくは同じ患者からの、同じ種類の非がん性組織と比べて上昇したレベルのＧＰＣ３を示す。必要に応じて、がん中のＧＰＣ３のレベルは、処置を行う前に測定される。
【０１１３】
ＧＰＣ３発現を伴うがんの例には、肝細胞癌（ＨＣＣ）および肺癌が含まれる（ＨＣＣのおよそ７０％において、および肺癌の２０％においてＧＰＣ３が発現される。）。その他のがんには、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌および肉腫が含まれる。
【０１１４】
本発明の方法は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを患者に投与することを含む、ＧＰＣ３を発現するがんを有する患者を処置することを含む。がんは、例えば、ＨＣＣ、肺癌、ウィルムス腫瘍、卵巣明細胞癌、結腸直腸癌または肉腫を含む、任意の、ＧＰＣ３を発現するがんであり得る。
【０１１５】
タンパク質の増加する発現ががん細胞からの治療剤の排出を増加させた後に、いくつかのがん細胞は治療剤への耐性を生ずる。このようなタンパク質には、Ｐ−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質、肺耐性関連タンパク質および乳がん耐性タンパク質が含まれる。がん細胞中の薬物耐性の検出は、当業者によって行うことができる。排出タンパク質を検出する抗体またはアッセイは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡｂｃａｍおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。本方法によって処置されるべきがんは、ＧＰＣ３を発現する多耐性がんであり得る。いくつかの態様において、がんは、多剤耐性ＧＰＣ３＋ＨＣＣである。
【０１１６】
ＧＰＣ３に向けられた抗体−薬物コンジュゲートは、発症を遅らせ、重度を低減し、さらなる悪化を阻止し、および／またはがんの少なくとも１つの徴候もしくは症状を寛解させる投薬量、投与の経路および投与の頻度を意味する有効レジメンで投与される。
【０１１７】
ＧＰＣ３に向けられたコンジュゲートに対する例示的な投薬量には、約１．０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．０μｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１．０μｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇまたは約１．０μｇ／ｋｇ〜５００．０μｇ／ｋｇまたは約１．０μｇ／ｋｇ〜８０．０、１００．０もしくは２００．０μｇ／ｋｇが含まれる。
【０１１８】
ＧＰＣ３に向けられたチュブリシンＭコンジュゲートに対する例示的な投薬量は、一般的には、約１．０μｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇまたは約１．０μｇ／ｋｇ〜５００．０μｇ／ｋｇまたは約１．０μｇ／ｋｇ〜８０．０、１００．０もしくは２００．０μｇ／ｋｇであるが、別の投薬量が考えられる。
【０１１９】
投与は、様々な投与経路によってでよい。ある種の実施形態において、コンジュゲートは、静脈内、筋肉内または皮下など非経口的に投与される。がんの処置のためのＡＤＣの投与については、送達は、静脈内または皮下投与による全身循環中への送達であり得る。特定の実施形態において、投与は、静脈内送達を介する。静脈内投与は、例えば、３０〜９０分などの期間にわたる注入によってでよいか、または単回ボーラス注射によってでよい。いくつかの態様において、投与は、末梢に挿入された中心静脈カテーテル中へのスローＩＶプッシュ（すなわち、３０〜６０秒にわたる）を介する。
【０１２０】
投与の頻度は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、および投与されている他の医薬など、多くの異なる要因に依存する。頻度は、毎日、毎週、毎月、年に４回または患者の症状もしくは処置されているがんの進行の変化に応じて不定期の間隔であり得る。静脈内投与のための例示的な頻度は、処置の継続する過程にわたって、週に２回から年に４回の間であるが、より高いまたは低い頻度の投与も可能である。静脈内投与のための他の例示的な頻度は、３週間ごと、または処置の継続する過程にわたって、毎週１回から（ｏｒ）毎月１回の間であるが、より高いまたは低い頻度の投与も可能である。皮下投与については、例示的な投与頻度は毎日〜毎月であるが、より高いまたは低い頻度の投与も可能である。
【０１２１】
非経口投与用の医薬組成物は、好ましくは、無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形で（すなわち、単回投与用の投薬量）で与えることができる。医薬組成物は、１またはそれを超える、生理的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を用いて製剤化することができる。製剤は、選択された投与の経路に依存する。注射のために、コンジュゲートは、水溶液中に、好ましくは、（注射の部位における不快感を軽減するために）ハンクス液、リンゲル液などの生理的に適合的な緩衝液、または生理的食塩水または酢酸緩衝液中に製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。または、抗体は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない無菌水で構成するための凍結乾燥された形態であり得る。液体製剤中のコンジュゲートの濃度は、幅広く様々であって良い。いくつかの態様において、ＡＤＣは、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬまたは約２ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【０１２２】
本発明のコンジュゲートでの処置は、化学療法、放射線、幹細胞処置、手術、および処置されている当該障害に対する標準的治療を含む、処置されている障害に対して有効なその他の処置と組み合わせることができる。したがって、本発明は、単独療法としての、または、例えば、本明細書に記載されている疾患および／または障害の処置ための標準的治療もしくは被験薬との併用治療における本明細書に記載されている疾患および障害を処置する方法を包含する。がんの処置方法は、さらなる抗癌剤またはがんを処置するための他の薬剤と組み合わされた、有効量の本発明のＧＰＣ３に向けられた抗体−薬物コンジュゲートを、これを必要としている患者に投与することを含む。
【０１２３】
併用治療のためのいくつかの薬剤には、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ニボルマブ、ドキソルビシン、ＦＥＭＯＸ（ゲムシタビンおよびオキサリプラチン）、ドキソルビン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｎ）、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビノレルビンおよびマイトマイシンＣが含まれる。一実施形態において、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ニボルマブ、ドキソルビシン、ＦＥＭＯＸ（ゲムシタビンおよびオキサリプラチン）、ドキソルビン、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビノレルビンおよびマイトマイシンＣの１またはそれより多くが、本発明のＧＰＣ３に向けられたＡＤＣとの併用治療において投与される。
【０１２４】
さらなる実施形態において、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ニボルマブ、ドキソルビシン、ＦＥＭＯＸ（ゲムシタビンおよびオキサリプラチン）、ドキソルビン、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビノレルビンおよびマイトマイシンＣの１またはそれより多くが、本発明のヒト化されたＧＰＣ３−１ＡＤＣとの併用治療において投与される。さらなる実施形態において、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ニボルマブ、ドキソルビシン、ＦＥＭＯＸ（ゲムシタビンおよびオキサリプラチン）、ドキソルビン、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ビノレルビンおよびマイトマイシンＣの１またはそれより多くが、本発明のｈＧＰＣ３−１ｅｃ−ＳＧＤ−６８５９との併用治療において投与される。
【０１２５】
本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態または態様は、具体的に別段の記載がなければ、他のいずれとも組み合わせて使用することができる。明確性および理解のために、例示および例によって、いくぶん詳しく本発明を記載してきたが、添付の特許請求の範囲の範囲内で、ある種の変更および改変を実施し得ることは自明である。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例で記載されている細胞株は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）またはドイツ微生物細胞培養保存機関ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ（ＤＭＳＺ）によって指定された条件に従ってまたは他の方法で知られているとおり培養で維持した。
方法
抗体選択
【０１２７】
リード抗体、ＧＰＣ３−１は、アミノ酸残基３７５〜５６３を包含する組換えＧＰＣ３でマウスを免疫することによって同定した（図１参照）。ＧＰＣ３抗体産生マウスの脾臓およびリンパ節から採集したリンパ球を骨髄腫細胞に融合した。ハイブリドーマ成長培地中に一晩、融合細胞を回収した。回収後、細胞を遠心沈殿させ、次いで、半固体培地中に播種した。ハイブリドーマをインキュベートし、ＩｇＧを産生するハイブリドーマクローンを選んだ。このハイブリドーマキャンペーン（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃａｍｐａｉｇｎ）由来の抗体を、ＧＰＣ３を発現する細胞株上でＡＤＣとしてスクリーニングした。いくつかのエピトープクラス由来の抗体がＡＤＣ活性を示した。その優れたＡＤＣ細胞傷害の他、シェディングをもたらすことができるタンパク質分解切断部位の近位の膜であるエピトープを有することに基づいて、リード抗体を選択した。
競合結合アッセイ
【０１２８】
１０万個のＧＰＣ３陽性細胞を９６ウェルプレートに移し、３〜５ｎＭのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８標識ｍＧＰＣ３−１および漸増濃度（１０ｐＭ〜２μＭ）の非標識ヒト化またはマウスＧＰＣ３−１ｍＡｂとともに、氷上で１時間インキュベートした。細胞を遠心し、ＰＢＳで３回洗浄し、１２５μＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ溶液中に再懸濁した。フローサイトメーターを用いて蛍光を分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して結合した標識ＧＰＣ３−１ｍＡｂのパーセントを決定した。可変の勾配を有するＳ字形用量応答曲線にデータをフィッティングすることによって、ＥＣ５０を外挿した。
飽和結合アッセイ
【０１２９】
１０万個のＧＰＣ３陽性細胞を９６ウェルプレートに移した。１０ｐＭ〜５μＭの範囲の濃度でＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８標識ＧＰＣ３ｍＡｂを添加し、氷上で３０分間細胞をインキュベートした。細胞を遠心分離によってペレットとし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ溶液で３回洗浄し、１２５μＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中に再懸濁した。フローサイトメーターを用いて蛍光を分析し、飽和蛍光シグナルのパーセントを使用して結合したパーセントを決定し、その後見かけのＫｄを計算した。
表面プラズモン共鳴によって測定された親和性
【０１３０】
ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからヒトＧＰＣ３（ｈＧＰＣ３  ＧＰ３−Ｈ５２５８）を購入し、Ｐｉｅｒｃｅ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンを用いて１．５：１のビオチン／タンパク質比のモル比でビオチン化した。ｈＧＰＣ３−１ｅｃを分析物として使用して、Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡＸ）ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓおよびプローブとしてのＧＰＣ３を用いるＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上でバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を実施した。結合したｈＧＰＣ３への二価結合は、６００秒の結合および１８００秒の解離ならびに４００、１６０、６４、２５．６、１０．２、４．１および１．６４ｎＭの８つの濃度点にわたる１：１の比でのフィットに対して、Ｘ２＝０．５９およびＲ２＝０．９９９８で、２．０４Ｅ−１０Ｍ（ｋｄｉｓｓ２．３Ｅ−５／ｋｏｎ１．１３４Ｅ５）であることが測定された。ｈＧＰＣ３−１ｅｃ（ＨＢＬＥ）の結合親和性（ＫＤ）は、１４ｎＭであることが決定された（図６）。
ヒト化抗体の設計
【０１３１】
ヒト化抗体は、マウスＧＰＣ３−１抗体から誘導した。異なる位置に復帰突然変異を取り込んで、４つのヒト化重鎖（ＨＡ−ＨＤ）および７つのヒト化軽鎖（ＬＡ−ＬＥ）を作製した。いくつかの事例では、復帰突然変異はマウス生殖系列と合致するが、その他の事例では、（体細胞変異を有する事例のように）合致しない。ヒト化重鎖および軽鎖を対にした。配列アライメントのための図２〜５および表１〜５を参照されたい。ＨＡ、ＨＢ、ＨＣ、ＨＤならびにＬＡ、ＬＢおよびＬＣバリアントを用いた最初のヒト化の後に、ＣＤＲ−Ｌ１中に見出される潜在的な脱アミド化モチーフ（「ＮＧ」）に対処するために、さらなるＬ鎖バリアントを開発した（配列番号１３）（表５）。
表１：ｈＧＰＣ３−１可変重（ｖＨ）鎖バリアント中のヒト化されている変異
【表１】
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表２：ｈＧＰＣ３−１可変軽（ｖＬ）鎖バリアント中のヒト化されている変異
【表２】
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表３：ｈＧＰＣ３−１重鎖バリアント中の特異的なフレームワーク変異
【表３】
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＊マウス残基
表４：ｈＧＰＣ３−１軽鎖バリアント中の特異的フレームワーク変異
【表４】
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＊マウス残基
表５：ｈＧＰＣ３−１軽鎖バリアント中の特異的ＣＤＲ−Ｌ１脱アミド変異
【表５−１】
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【表５−２】
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抗体薬物コンジュゲートの作製
【０１３２】
米国特許出願第６２／４６５，１２９号（２０１７年２月２８日出願）および米国特許出願第６２／５６１，１５１号（２０１７年９月２０日）に記載されているように、本明細書に記載されている抗ＧＰＣ３抗体を用いて抗体薬物コンジュゲートを調製した。ＩｇＧ１ｍＡｂのシステイン変異体の調製は、米国特許出願公開第２０１０／０１５８９０９号に一般的に記載されている。抗体のＩｇＧ１鎖の２３９位に導入されたシステイン残基のチオール基を介して抗ＧＰＣ３抗体に薬物−リンカーＳＧＤ−６８５９をコンジュゲートし、平均薬物負荷量は、抗体当たり約２個の薬物であった。２３９位にシステインを有する抗体は、表記ｅｃを有する。
インビトロ細胞傷害アッセイ
【０１３３】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）処理前に、細胞株を２４時間播種した。表記用量のＡＤＣで細胞を処理し、３７℃で９６時間インキュベートした。いくつかの実験では、非抗原結合ＡＤＣを陰性対照として含めた。製造業者の指示にしたがい、ＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、細胞株に対する細胞生存率を測定した。２５分間、室温で、ＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ試薬とともに細胞をインキュベートし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で発光を測定した。ビヒクル処理された細胞（対照＝１００％）と比較して、生存率を最大値の半分に低下させるために必要とされる化合物の濃度であるＩＣ５０として結果が報告されている。
インビボ活性研究
皮下ＨＣＣおよび肺癌モデル
【０１３４】
５×１０５のＪＨＨ７または２．５×１０６のＨｅｐ３Ｂまたは２．５×１０６Ｈｕｈ７ＨＣＣ細胞をヌードマウスの皮下に接種した。１×１０６のＮＣＩ−Ｈ６６１細胞をＮＳＧマウスの皮下に接種した。腫瘍成長はキャリパーでモニタリングし、式（０．５×［長さ×幅２］）を用いて平均腫瘍体積を計算した。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達した時点で、マウスは処置しないか、またはヒト化ＧＰＣ３−１ＡＤＣの単回用量を腹腔内に投与した。腫瘍体積が約４００ｍｍ３に達した時点で、マウスを安楽死させた。全ての動物の取り扱いは、実験動物管理評価・認定協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）によって認証された施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに基づいて行った。
Ｓ２３９Ｃまたは天然のシステインにコンジュゲート実験動物管理評価・認定協会したときの、ＳＧＤ−５９３７またはＳＧＤ−６８５９のマレイミドおよびチュブリシンＭアセテート安定性のインビボでの評価
【０１３５】
薬物−リンカー化学の関数としての薬物の安定性を、異種移植モデルで使用された系統であるＳＣＩＤマウス中で評価した。天然のシステイン上に４薬物／ｍＡｂおよび操作されたＳ２３９Ｃ上に２薬物／ｍＡｂで負荷したＭＰグルクロニド−チュブリシンＭ（ＳＧＤ−６８５９）およびｍＤＰＲグルクロニド−チュブリシンＭ（ＳＧＤ−５９３７）を含有するヒト化ＩｇＧコンジュゲートを調製した。３ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内用量としてＳＣＩＤマウスにコンジュゲートを投与し、次いで、投与の４日後および１０日後に終末放血に供した。ＥＤＴＡ被覆エッペンドルフ管中への遠心分離を用いて、各動物から得た血液試料を処理して血漿とした。抗ヒト捕捉アフィニティー樹脂（ＩｇＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２〜８℃で３時間、血漿をバッチ精製した。ＰＢＳｐＨ７．４（１×）＋０．５ＭＮａＣｌを用いて、結合した試料を洗浄し、５０ｍＭグリシン、ｐＨ３を用いて溶出した。溶出された試料をＴｒｉｓｐＨ７．４で中和し、ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ）を用いて脱グリコシル化し、次いで、１０ｍＭＤＴＴを用いて還元した。質量分析検出（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−Ｓ  ＱＴＯＦ）と結合した逆相ＵＰＬＣ（ＰＬＲＰ８μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて各試料を分析した。各試料の薬物−抗体比率（ＤＡＲ）は、負荷していないおよび薬物負荷した（アセチル化されたおよび脱アセチル化された）抗体ピークのデコンボリューションされた質量から得た総イオン数の相対比率を用いて計算した。完全な状態の薬物（％アセチル化）は、薬物を負荷した軽鎖および重鎖種の総イオン数を用いて計算し、４２ダルトンの喪失によって評価した。
結果
［実施例１］ヒト化ｍＡｂの設計および試験
【０１３６】
ｈＩＧＨｖ１−１８／ｈＩＧＨＪ４またはｈＩＧＨＶ１−６９−２／ｈＩＧＨＪ４重鎖可変領域ヒト生殖系列とｈＩＧＫ２−３０／ｈＩＧＫＪ２軽鎖可変領域ヒト生殖系列とをヒトアクセプター配列として用いて、いくつかのヒト化ＧＰＣ３−１抗体を構築した。これらの抗体では、マウス抗体またはマウス生殖系列配列へと戻り変異するべきアミノ酸残基の選択が異なった。ＨＢＬＥ（配列番号１に記載されている重鎖可変領域（ｖＨＢ）および配列番号２に記載されている軽鎖可変領域（ｖＬＥ））と表記される抗体を、その（ｉ）結合特性（表６および７参照）、（ｉｉ）薬物を送達する能力および（ｉｉｉ）他のバリアントと比較した復帰突然変異の数に基づいて、リードヒト化ＧＰＣ３−１抗体として選択した。
【０１３７】
ＨＡＬＡ（ｖＨＡと表記される重鎖可変領域およびｖＬＡと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＡＬＢ（ｖＨＡと表記される重鎖可変領域およびｖＬＢと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＡＬＣ（ｖＨＡと表記される重鎖可変領域およびｖＬＣと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＢＬＡ（ｖＨＢと表記される重鎖可変領域およびｖＬＡと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＢＬＢ（ｖＨＢと表記される重鎖可変領域およびｖＬＢと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＢＬＣ（ｖＨＢと表記される重鎖可変領域およびｖＬＣと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＢＬＤ（ｖＨＢと表記される重鎖可変領域およびｖＬＤと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＢＬＥ（ｖＨＢと表記される重鎖可変領域およびｖＬＥと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＢＬＢ−Ｑ（ｖＨＢと表記される重鎖可変領域およびｖＬＢ−Ｑと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＢＬＢ−Ｖ（ｖＨＢと表記される重鎖可変領域およびｖＬＢ−Ｖと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＣＬＡ（ｖＨＣと表記される重鎖可変領域およびｖＬＡと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＣＬＢ（ｖＨＣと表記される重鎖可変領域およびｖＬＢと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＣＬＣ（ｖＨＣと表記される重鎖可変領域およびｖＬＣと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＤＬＡ（ｖＨＤと表記される重鎖可変領域およびｖＬＡと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）、ＨＤＬＢ（ｖＨＤと表記される重鎖可変領域およびｖＬＢと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）およびＨＤＬＣ（ｖＨＤと表記される重鎖可変領域およびｖＬＣと表記される軽鎖可変領域を有する抗体）と表記される抗体を、ＨＢＬＥ抗体の代わりに本発明において使用することができる。ｖＨＡ、ｖＨＢ、ｖＨＣ、ｖＨＤ、ｖＬＡ、ｖＬＢ、ｖＬＢ−Ｑ、ｖＬＢ−Ｖ、ｖＬＣ、ｖＬＤおよびｖＬＥ配列については図２〜５を参照されたい。
表６：ｈＧＰＣ３−１抗体バリアントのｈＧＰＣ３結合
【表６】
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表７：ｈＧＰＣ３−１脱アミドバリアントのｈＧＰＣ３結合
【表７】
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［実施例２］ｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９／ＳＧＤ−６１８３のインビトロ抗腫瘍活性
【０１３８】
ＪＨＨ７、Ｈｕｈ７およびＨｅｐ３Ｂを含むＧＰＣ３を発現するＨＣＣ細胞株のパネルに対して、ヒト化ＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３抗体−薬物コンジュゲートの細胞傷害活性を評価した。図７に示されているように、ヒト化ＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３抗体−薬物コンジュゲートは、３つの細胞株全てにおいて活性であった。
【０１３９】
ＮＣＩ−Ｈ６６１およびＮＣＩ−Ｈ４４６を含むＧＰＣ３を発現する肺癌細胞株のパネルに対して、ヒト化ＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３抗体−薬物コンジュゲートの細胞傷害活性を評価した。図８に示されているように、ヒト化ＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３抗体−薬物コンジュゲートは、両細胞株中において活性であった。
［実施例３］ＨＣＣ腫瘍に対するヒト化ＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはＧＰＣ３−１（Ｓ２３９Ｃ、Ｑ２９５Ｃ）ＳＧＤ−５９３７またはＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３のインビボ抗腫瘍活性
【０１４０】
３つの皮下ＨＣＣ異種移植モデル、ＪＨＨ７、Ｈｕｈ７およびＨｅｐ３Ｂ中で、ｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−５９３７またはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３の活性を試験した。確立された（約１００ｍｍ３）腫瘍を有するヌードマウスに、ＪＨＨ７モデルに対しては図９に図示されているとおりにｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−５９３７もしくはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３、Ｈｕｈ７腫瘍モデルに対しては図１０中のｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９もしくはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３およびＨｅｐ３Ｂ腫瘍モデルに対しては図１１中のｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３を投与した。ｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−５９３７またはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３での処置は、非処置に比べて腫瘍成長を減少させた。単回ＡＤＣ投与後に、いくつかのマウス中で持続的な退行が得られた。１つの皮下肺癌異種移植モデル、ＮＣＩ−Ｈ６６１中で、ｈＧＰＣ３−１（Ｓ２３９Ｃ、Ｑ２９５Ｃ）ＳＧＤ−５９３７またはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３の活性を試験した。図１２に図示されているとおりに、ｈＧＰＣ３−１（Ｓ２３９Ｃ、Ｑ２９５Ｃ）ＳＧＤ−５９３７またはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３を、確立された（約１００ｍｍ３）腫瘍を有するＮＳＧマウスに投与した。ｈＧＰＣ３−１（Ｓ２３９Ｃ、Ｑ２９５Ｃ）ＳＧＤ−５９３７またはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３での処置は、非処置に比べて腫瘍成長を減少させた。単回ＡＤＣ投与後に、いくつかのマウス中で持続的な退行が得られた。データは、ｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−６８５９またはｈＧＰＣ３−１ｅｃＳＧＤ−５９３７またはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３がＧＰＣ３を発現するＨＣＣ異種移植モデル中で有意な用量依存的抗腫瘍活性を示し、ｈＧＰＣ３−１（Ｓ２３９Ｃ、Ｑ２９５Ｃ）ＳＧＤ−５９３７またはｈＧＰＣ３−１ＳＧＤ−６１８３がＧＰＣ３を発現する肺異種移植モデル中で有意な用量依存的抗腫瘍活性を示すことを実証する。
［実施例４］Ｓ２３９Ｃまたは天然のシステインに結合したときの、ＳＧＤ−５９３７またはＳＧＤ−６８５９のマレイミドおよびチュブリシンＭアセテート安定性のインビボでの評価
【０１４１】
チュブリシンＭの脱アセチル化は、その効力を著しく減少させる。Ｓ２３９ＣにコンジュゲートしたＤＡＲ２ＡＤＣとして、ｈ００ｅｃＳＧＤ−６８５９またはｈ００ｅｃＳＧＤ−５９３７を調製した。天然のシステインにコンジュゲートした混合された平均ＤＡＲ４のＡＤＣとして、ｈ００ＳＧＤ−６８５９またはｈ００ＳＧＤ−５９３７を調製した。３ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの１つを、ＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与した。ＰＬＲＰ−ＭＳによって、投与から０日、４日および１０日後に、マレイミド安定性およびチュブリシンＭアセテート安定性を評価した。天然のシステインにコンジュゲートしたＳＧＤ−６８５９およびＳＧＤ−５９３７の両方は、Ｓ２３９Ｃへのコンジュゲーションと比較すると、増加したマレイミドおよびチュブリシンＭ不安定性を示した（図１３）。このデータは、Ｓ２３９Ｃへのコンジュゲーションはより安定なＤＡＲをもたらし、効力に関して重要なチュブリシンＭアセテートに対する保護をもたらすことを示す。
【図１】
2021513844.tif 000042
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021513844.tif 000048
【図８】
2021513844.tif 000049
【図９】
2021513844.tif 000050
【図１０】
2021513844.tif 000051
【図１１】
2021513844.tif 000052
【図１２】
2021513844.tif 000053
【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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