(57)【要約】  Ｆｅ（ＩＩ）塩、Ｚｎ（ＩＩ）塩、又はそれらの両方が、抗菌性化合物を含有する食品マトリックスを増菌させるための方法において使用される。Ｆｅ（ＩＩ）塩、Ｚｎ（ＩＩ）塩を含む、キットは、かかる方法にとって有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的微生物を増殖させる方法であって、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩の存在下で、前記標的微生物に対して活性である１種以上の抗菌性化合物を有するマトリックスをインキュベートすること、を含む、方法。
【請求項２】
前記マトリックスが、食品マトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マトリックスが、ナッツマトリックス、食品マトリックス、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的微生物が、リステリア菌又はサルモネラ菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、酵母でも、鉄酸化又は還元微生物でもない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
増菌培地を含有する培養ブロスに、前記マトリックスを溶解又は分散させること、を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記マトリックス、前記培養ブロス、及び前記Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を混和すること、を更に含み、前記Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、１００マイクロモル以上の濃度である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マトリックス、前記培養ブロス、及び前記Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を混和すること、を更に含み、前記Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、１，０００マイクロモル以下の濃度である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記増菌培地が、前記標的微生物に関して選択的である増菌培地である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｚｎ（ＩＩ）塩が、塩化亜鉛の形態である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｆｅ（ＩＩ）塩が、硫酸第一鉄の形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
標的微生物の存在を検出すること、を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
サルモネラ菌又はリステリア菌に関して選択的である増菌培地と、Ｚｎ（ＩＩ）塩又はＦｅ（ＩＩ）塩と、を含む、キット。
【請求項１４】
前記Ｚｎ（ＩＩ）塩又はＦｅ（ＩＩ）塩が、前記増菌培地の成分である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記Ｚｎ（ＩＩ）塩又はＦｅ（ＩＩ）塩が、前記増菌培地から分けられている、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
食品マトリックスなどの特定の供給源から微生物を培養するプロセスでは、マトリックスを処理し、次いで増菌培地と混合して、目的の微生物の増殖を促進する。増菌培地は、様々な微生物の増殖を促進するように設計される全般的な増菌培地であっても、所望の微生物のみの増殖を促進するように設計される特定の増菌培地であってもよい。次いで、増菌マトリックスを培養プレートに接種し、微生物の有無を検出することができる。
【発明の概要】
【０００２】
標的微生物を増殖させる方法は、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩の存在下で、標的微生物に対して活性である１種以上の抗菌性化合物を有するマトリックスをインキュベートすること、を含み得る。キット、例えば、この方法を実施するためのキットは、サルモネラ菌（Salmonella）又はリステリア菌（Listeria）に関して選択的である増菌培地と、Ｚｎ（ＩＩ）塩又はＦｅ（ＩＩ）塩と、を含み得る。
【発明を実施するための形態】
【０００３】
本開示を通じて、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの単数形は、しばしば便宜上使用されるが、単数形のみであることが明示的に指定されている場合又は文脈によって明確に示されている場合を除いて、単数形は複数形を含むことを意図している。単数形のみに言及する場合、典型的には「１つ、かつ１つのみ」などの用語が使用される。
【０００４】
本開示におけるいくつかの用語を、以下に定義する。他の用語は、当業者にはよく知られており、他の用語には、当業者であればそれらに割り当るであろう意味を付与することとする。
【０００５】
用語「一般的な」、「典型的な」、及び「通常の」、並びに「一般的に」、「典型的に」、及び「通常は」という用語は、本明細書では、本発明でしばしば用いられる特徴を指し、先行技術を参照して具体的に使用されない限りは、特徴が先行技術に存在することを意味することを意図するものではなく、これらの特徴が従来技術において、一般的、通常、又は典型的であることを意味することを意図するものではない。
【０００６】
食品マトリックスなどの試料マトリックスは、望ましくない微生物を極めて低いレベルで有している場合がある。そのような微生物の有無を正確に確認できるようにするために、培養前にマトリックスを増菌することができる。増菌は、典型的には、増菌培地においてマトリックスを分散又は溶解させることによって達成され、増菌培地は培養ブロスに添加することができる。増菌培地の２つの全般的なカテゴリーが存在する。第１の全般的な増菌培地は、様々な微生物の増殖を促進する。第２の選択的増菌培地は、少なくとも１種の他の非標的微生物を犠牲にして、１種以上の標的微生物の増殖を促進する。
【０００７】
いくつかのマトリックスは、微生物の増殖を阻害する抗菌性化合物を有し、例えば、ある特定の標的微生物の増殖を阻害し得る。一例として、ナッツ及びチョコレートマトリックスの両方は、コーヒー、茶、果実、及び野菜マトリックスと同様に、抗生物質特性を示すポリフェノール化合物を含有し得る。このため、多量の増菌培地が、抗生物質化合物を有するマトリックスを増菌するために必要とされ、特に、ナッツ及びチョコレートなどのポリフェノール抗生物質化合物を有するものが必要とされ、増菌及び検出には費用がかかる。
【０００８】
本発明者らは、この問題に関連するいくつかの技術的課題を特定した。１つの課題は、抗菌性化合物を有するマトリックスにおいて微生物を増菌するコストを低減する方法である。少し異なる定義をすると、この課題は、ポリフェノール抗菌性化合物を有する増菌マトリックスのコストを削減することに関する。少し異なる定義をすると、この課題は、リステリア菌又はサルモネラ菌に関して活性である抗菌性化合物を有するマトリックス中のリステリア菌又はサルモネラ菌を増菌するコストを削減することに関する。そのようなマトリックスは、例えば、ナッツ又はチョコレートマトリックスであることができ、抗菌性化合物はポリフェノールであることができる。関連する課題は、抗菌性化合物を有するマトリックス中の微生物を増菌するために必要とされる増菌培地の量をどのように減少させるかである。少し異なる定義をすると、この課題は、ポリフェノール抗菌性化合物を有するマトリックスを増菌する際に必要とされる増菌培地の量を低減することに関する。少し異なる定義をすると、この課題は、リステリア菌又はサルモネラ菌に対して活性である抗菌性化合物を有するマトリックスにおいてリステリア菌又はサルモネラ菌を増菌する際に必要とされる増菌培地の量を低減することに関する。
【０００９】
簡潔に述べると、本明細書でより詳細に記載される解決策は、増菌工程中の培養ブロス又は増菌培地におけるＦｅ（ＩＩ）又はＺｎ（ＩＩ）のイオンの使用にある。驚くべきことに、かつ予想外に、これらのイオンの一方又は両方の添加により、多量の増菌培地で試料を希釈しなくても、増菌後の微生物の収率が増加する。これにより、十分な微生物収率を達成するために多量の増菌培地を使用する必要性とコストが排除される。Ｆｅ（ＩＩＩ）を含む試験された他のイオンは、この結果を示さなかった。
【００１０】
食品マトリックスなどのマトリックスをインキュベートすることによって、標的微生物を増殖させることができ、又は標的微生物量が増菌したマトリックスとすることができる。任意のマトリックスを使用することができるが、本明細書に記載の方法は、標的微生物に対して活性である１種以上の抗菌性化合物を有するマトリックスで使用されるとき、最も有益である。マトリックスは、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩の存在下でインキュベートされ、Ｆｅ（ＩＩ）又はＺｎ（ＩＩ）のイオンを提供する。「Ｆｅ（ＩＩ）又はＺｎ（ＩＩ）」とは、Ｆｅ（ＩＩ）又はＺｎ（ＩＩ）のいずれか、又はＦｅ（ＩＩ）及びＺｎ（ＩＩ）の両方が、存在することができるが、ほとんどの場合、一方のみが必要であることを意味している。
【００１１】
最も一般的には、マトリックスは食品マトリックスであるが、他の生物学的マトリックス、例えば、血液、尿、粘液、唾液、糞便など、並びに環境からのマトリックス、例えば、排水も使用することができる。最も頻繁に使用される食品マトリックスは、ナッツ、例えば、ピーナッツ、ヘーゼルナッツ、カシュー、又はアーモンド、種子、例えば、ヒマワリ種子又はカボチャ種子、乾燥果実、例えば、レーズン、クランベリー、又はカレント（current）、チョコレート、例えば、ミルクチョコレート、ダークチョコレート、ホワイトチョコレート、又はフレーバーチョコレートである。マトリックスは、ピーナッツマトリックス、ヒマワリ種子マトリックス、及びアーモンドマトリックス、カシューマトリックス、レーズンマトリックス、又はカボチャ種子マトリックスのうちの１種以上を含むことができる。多くの場合、ナッツ又はチョコレートが、マトリックスである。場合によっては、マトリックスはナッツマトリックスである。
【００１２】
抗菌性化合物は、サルファ剤及びペニシリン若しくはペニシリン類似体又は誘導体などの医薬品を含む任意の抗菌性化合物であることができるが、ほとんどの場合、ポリフェノール化合物である。そのような化合物は、とりわけ、ナッツ又はチョコレートにおいて天然に生じる場合がある。
【００１３】
標的微生物は、原則として任意の微生物であることができる。最も一般的には、標的微生物はサルモネラ菌又はリステリア菌である。ほとんどの場合、微生物は、酵母でも、鉄酸化又は還元微生物でもない。
【００１４】
方法は、マトリックス、培養ブロス、及びＦｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を混和する工程を含むことができる。Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩は、任意の好適な濃度で使用することができる。好適な濃度は、過度に多量の増菌培地を必要とせずに、標的微生物が十分な収率で増殖することができる濃度である。典型的には、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩は、１ｍｇ／Ｌ以上、又は５ｍｇ／Ｌ以上、１０ｍｇ／Ｌ以上、２５ｍｇ／Ｌ以上、５０ｍｇ／Ｌ以上、７５ｍｇ／Ｌ以上、１００ｍｇ／Ｌ以上、２５０ｍｇ／Ｌ以上、５００ｍｇ／Ｌ以上、７５０ｍｇ／Ｌ以上、１，０００ｍｇ／Ｌ以上、１，２５０ｍｇ／Ｌ以上、１，５００ｍｇ／Ｌ以上、１，７５０ｍｇ／Ｌ以上、又は２，０００ｍｇ／Ｌ以上の濃度である。一般に、Ｆｅ（ＩＩ）イオン又はＺｎ（ＩＩ）イオンは、２，０００ｍｇ／Ｌ以下、１，７５０ｍｇ／Ｌ以下、１，５００ｍｇ／Ｌ以下、１，２５０ｍｇ／Ｌ以下、１，０００ｍｇ／Ｌ以下、７５０ｍｇ／Ｌ以下、５００ｍｇ／Ｌ以下、２５０ｍｇ／Ｌ以下、１００ｍｇ／Ｌ以下、７５ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、２５ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、又は５ｍｇ／Ｌ以下の濃度である。
【００１５】
Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩、マトリックス、及び培養ブロスを混和することができ、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩は、５０マイクロモル以上、１００マイクロモル以上、２５０マイクロモル以上、３００マイクロモル以上、４００マイクロモル以上、５００マイクロモル以上、６００マイクロモル以上、７００マイクロモル以上、８００マイクロモル以上、９００マイクロモル以上、又は１，０００マイクロモル以上の濃度である。Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩、マトリックス、及び培養ブロスを混和することができ、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩は、１，０００マイクロモル以下、９００マイクロモル以下、８００マイクロモル以下、７００マイクロモル以下、６００マイクロモル以下、５００マイクロモル以下、４００マイクロモル以下、３００マイクロモル以下、２００マイクロモル以下、又は１００マイクロモル以下の濃度である。
【００１６】
多くの場合、本明細書に記載の混和工程は、増菌培地を含有する培養ブロスに、マトリックスを溶解又は分散させること、を含む。Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩、又は複数種の塩は、増菌培地の一部であるか、又はそれから分けられて添加することができる。
【００１７】
任意のタイプの増菌培地を使用することができる。多くの場合、増菌培地は、標的微生物に関して選択的でない、多種多様な微生物の増殖を促進する、全般的な増菌培地である。よりしばしば、増菌培地は、他の微生物を犠牲にして標的微生物の増殖を優先的に可能にする、選択的増菌培地である。典型的な増菌培地は、例えば、塩、緩衝液、栄養素などを含むことができる。全般的増菌培地の例は、ペプトン、塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム及びリン酸一カリウムを含有する緩衝ペプトン水である。選択的増菌培地の例は、動物由来の酵素消化物、牛肉及び酵母抽出物、塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、エスクリン、アクリフラビン、ナリジキシン酸及び塩化リチウムを含有するＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒブロス（両方とも３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）から入手可能）である。
【００１８】
Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩は、特に、過度に多量の増菌培地を使用することなく、標的微生物の良好な収率を提供するのに有効な任意の塩であり得る。最も一般的には、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩は、水に少なくとも難溶性、例えば、水に部分的に可溶性であり、又は水に完全に可溶性である。例示的な鉄（ＩＩ）塩としては、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、臭化第一鉄、ヨウ化第一鉄、リン酸第一鉄、酢酸第一鉄、硝酸第一鉄、クエン酸第一鉄、酒石酸第一鉄、ベシル酸第一鉄、メシル酸第一鉄、炭酸第一鉄、又はトシル酸第一鉄が挙げられる。より一般的には、Ｆｅ（ＩＩ）塩は、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、又はクエン酸第一鉄の形態である。硫酸第一鉄が、最も一般的である。例示的なＺｎ（ＩＩ）塩としては、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、酢酸亜鉛、硝酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酒石酸亜鉛、ベシル酸亜鉛、メシル酸亜鉛、炭酸亜鉛、又はトシル酸亜鉛が挙げられる。より一般的には、Ｚｎ（ＩＩ）塩は、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、又は酢酸亜鉛の形態である。塩化亜鉛が、最も一般的である。
【００１９】
マトリックス、増菌培地、及び培養ブロスを混和し、マトリックスを増菌するために混和物をインキュベートすることができる。時間及び温度などの特定の増菌条件は、標的微生物に依存する。典型的な増菌時間は、１時間〜４８時間、例えば、１時間〜３６時間、１時間〜２４時間、１時間〜１２時間、又は更にそれより短い。典型的な増菌温度は、２０℃〜４０℃、例えば、２５℃〜３７℃である。１つの一般的な温度は、３７℃である。典型的には、標的微生物が、１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上の濃度で培養ブロスから回収される場合に、増菌は十分であると考えられる。これを行うために必要とされる増菌培地の量は、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を使用しない同一の増菌法と比較して、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、又は更には５０％以上だけ低減される。場合によっては、標的微生物は、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を使用しない場合には、１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上の濃度まで増菌することはできない。
【００２０】
方法は、培養プレート上に、マトリックスを接種する工程又はマトリックスの溶液若しくは分散液を接種する工程を含むことができる。これは、マトリックスの増菌の一部として行うことができ、又はマトリックスの増菌後に行うことができる。培養プレートは、寒天培養プレートであり、例えば、当該技術分野において一般的に知られている培養プレートであることができる。例えば、サルモネラ菌の場合はキシロースリジンデオキシコレート（ＸＬＤ）寒天（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能）、及びリステリア菌（Listeria spp）の場合はＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ（ＭＯＸ）寒天（商品名ＲＥＭＥＬで入手可能、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗａｌｔｈａｍ（ＭＡ，ＵＳＡ）のブランド）。培養プレートは、薄膜培養プレート、例えば、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）から市販されている培養プレートのＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（商標）ブランドであることもできる。
【００２１】
方法は、標的微生物の有無を検出すること、を更に含むことができる。培養プレート上への接種後、その培養プレートを更にインキュベートすることができ、標的微生物の有無を検出することができる。検出は目視検査によって行うことができるが、ほとんどの場合、３Ｍ  Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）などのプレートリーダーの使用によって行われる。
【００２２】
本明細書に記載される方法を行うためにキットを提供することができる。最も一般的には、キットは、増菌培地、特に、リステリア菌又はサルモネラ菌に関して選択的である増菌培地と、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩と、を含む。Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩は、増菌培地の成分として存在することができ、又は増菌培地から分けられて存在することができる。
【００２３】
以下の実施形態は、本開示の特定の態様を例示するために提示しており、限定することを意図するものではない。他の例示的な実施形態も開示する。
１．標的微生物を増殖させる方法であって、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩の存在下で、標的微生物に対して活性である１つ以上の抗菌性化合物を有するマトリックスをインキュベートすること、を含む、方法。
２．マトリックスが、食品マトリックスである、実施形態１に記載の方法。
３．１種以上の抗菌性化合物が、１種以上のポリフェノールを含む、実施形態１又は２のいずれか一つに記載の方法。
４．マトリックスが、ナッツマトリックス、種子マトリックス、乾燥果実マトリックス、又はチョコレートマトリックスのうちの１種以上を含む、実施形態１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．マトリックスが、ナッツマトリックスを含む、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の方法。
６．マトリックスが、種子マトリックスを含む、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．マトリックスが、乾燥果実マトリックスを含む、実施形態１〜６のいずれか一つに記載の方法。
８．マトリックスが、チョコレートマトリックスを含む、実施形態１〜７のいずれか一つに記載の方法。
９．マトリックスが、ピーナッツマトリックス、ヒマワリ種子マトリックス、及びアーモンドマトリックス、カシューマトリックス、レーズンマトリックス、又はカボチャ種子マトリックスのうちの１種以上を含む、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の方法。
１０．標的微生物が、リステリア菌又はサルモネラ菌である、実施形態１〜９のいずれか一つに記載の方法。
１１．微生物が、酵母でも、鉄酸化又は還元微生物でもない、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．マトリックス、培養ブロス、及びＦｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を混和すること、を更に含み、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、１ｍｇ／Ｌ以上、又は５ｍｇ／Ｌ以上、１０ｍｇ／Ｌ以上、２５ｍｇ／Ｌ以上、５０ｍｇ／Ｌ以上、７５ｍｇ／Ｌ以上、１００ｍｇ／Ｌ以上、２５０ｍｇ／Ｌ以上、５００ｍｇ／Ｌ以上、７５０ｍｇ／Ｌ以上、１，０００ｍｇ／Ｌ以上、１，２５０ｍｇ／Ｌ以上、１，５００ｍｇ／Ｌ以上、１，７５０ｍｇ／Ｌ以上、又は２，０００ｍｇ／Ｌ以上の濃度である、実施形態１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．マトリックス、培養ブロス、及びＦｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を混和すること、を更に含み、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、２，０００ｍｇ／Ｌ以下、１，７５０ｍｇ／Ｌ以下、１，５００ｍｇ／Ｌ以下、１，２５０ｍｇ／Ｌ以下、１，０００ｍｇ／Ｌ以下、７５０ｍｇ／Ｌ以下、５００ｍｇ／Ｌ以下、２５０ｍｇ／Ｌ以下、１００ｍｇ／Ｌ以下、７５ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、２５ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、又は５ｍｇ／Ｌ以下の濃度である、実施形態１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
１４．マトリックス、培養ブロス、及びＦｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を混和すること、を更に含み、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、５０マイクロモル以上、１００マイクロモル以上、２５０マイクロモル以上、３００マイクロモル以上、４００マイクロモル以上、５００マイクロモル以上、６００マイクロモル以上、７００マイクロモル以上、８００マイクロモル以上、９００マイクロモル以上、又は１，０００マイクロモル以上の濃度である、実施形態１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
１５．マトリックス、培養ブロス、及びＦｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩を混和すること、を更に含み、Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、１，０００マイクロモル以下、９００マイクロモル以下、８００マイクロモル以下、７００マイクロモル以下、６００マイクロモル以下、５００マイクロモル以下、４００マイクロモル以下、３００マイクロモル以下、２００マイクロモル以下、又は１００マイクロモル以下の濃度である、実施形態１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
１６．増菌培地を含有する培養ブロスに、マトリックスを溶解又は分散させること、を更に含む、実施形態１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
１７．増菌培地が、全般的な増菌培地である、実施形態１２に記載の方法。
１８．増菌培地が、標的微生物に関して選択的である、実施形態１２に記載の方法。
１９．増菌培地が、塩を含む、実施形態１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．増菌培地が、栄養素を含む、実施形態１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
２１．増菌培地が、緩衝液を含む、実施形態１〜２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．増菌培地が、を含む、実施形態１〜２１のいずれか一つに記載の方法。
２３．マトリックス又はマトリックスの溶液若しくは懸濁液を、培養プレート上に接種すること、を更に含む、実施形態１〜２２のいずれか一つに記載の方法。
２４．培養プレートが、寒天培養プレートである、実施形態１９に記載の方法。
２５．培養プレートが、薄膜培養プレートである、実施形態１９に記載の方法。
２６．Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、少なくとも水に難溶性である、実施形態１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
２７．Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、少なくとも部分的に水に可溶性である、実施形態１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
２８．Ｆｅ（ＩＩ）塩又はＺｎ（ＩＩ）塩が、水に易溶性である、実施形態１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
２９．Ｆｅ（ＩＩ）イオンが、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、臭化第一鉄、ヨウ化第一鉄、リン酸第一鉄、酢酸第一鉄、硝酸第一鉄、クエン酸第一鉄、酒石酸第一鉄、ベシル酸第一鉄、メシル酸第一鉄、炭酸第一鉄、又はトシル酸第一鉄の形態である、実施形態１〜２８のいずれか一つに記載の方法。
３０．Ｆｅ（ＩＩ）イオンが、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、又はクエン酸第一鉄の形態である、実施形態１〜２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．Ｆｅ（ＩＩ）イオンが、硫酸第一鉄の形態である、実施形態１〜３０のいずれか一つに記載の方法。
３２．Ｚｎ（ＩＩ）イオンが、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、酢酸亜鉛、硝酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酒石酸亜鉛、ベシル酸亜鉛、メシル酸亜鉛、炭酸亜鉛、又はトシル酸亜鉛の形態である、実施形態１〜３１のいずれか一つに記載の方法。
３３．Ｚｎ（ＩＩ）イオンが、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、又は酢酸亜鉛の形態である、実施形態１〜３２のいずれか一つに記載の方法。
３４．Ｚｎ（ＩＩ）イオンが、塩化亜鉛の形態である、実施形態１〜３３のいずれか一つに記載の方法。
３５．標的微生物の存在を検出すること、を更に含む、実施形態１〜３４のいずれか一つに記載の方法。
３６．（余白）
サルモネラ菌又はリステリア菌に関して選択的である増菌培地と、
Ｚｎ（ＩＩ）塩又はＦｅ（ＩＩ）塩と、
を含む、キット。
３７．Ｚｎ（ＩＩ）塩又はＦｅ（ＩＩ）塩が、増菌培地の成分である、実施形態３６に記載のキット。
３８．Ｚｎ（ＩＩ）塩又はＦｅ（ＩＩ）塩が、増菌培地から分けられている、実施形態３７に記載のキット。
【実施例】
【００２４】
材料
硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ４）、塩化バリウム（ＢａＣｌ２）、クエン酸第二鉄（Ｃ６Ｈ５ＦｅＯ７）、及びクエン酸第二鉄アンモニウム（Ｃ６Ｈ１１ＦｅＮＯ７）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【００２５】
Ｄｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ増菌培地は、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手した。
【００２６】
トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）は、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から入手した。
【００２７】
ＷＨＩＲＬ−ＰＡＫ滅菌サンプリングバッグは、Ｎａｓｃｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｏｒｔ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。
【００２８】
緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ（ＭＯＸ）寒天プレート、及びＥＺ  ＣＨＲＯＭ  サルモネラ菌＋寒天プレートは、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した。
【００２９】
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）（ＡＴＣＣ  １４０２８）及びリステリア・イノキュア（Listeria innocua）（ＡＴＣＣ  ３３０９０）は、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓｔ．Ｃｌｏｕｄ，ＭＮ）から入手した。
【００３０】
サルモネラ・チフィムリウム（ＡＴＣＣ  １４０２８）及びリステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ  ３３０９０）を、３７℃で１８時間、トリプシン大豆ブロスにおいて個別に一晩インキュベートした。各培養試料を、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）で連続希釈することによって、個々の接種液を調製した。細胞濃度（ｃｆｕ／試料）を測定するために、希釈した試料の１ｍＬのアリコートを、製造元の説明書に従って、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）上にプレーティングし、インキュベートし、カウントした。プレートからのカウント（ｃｆｕ）を使用して、標的接種液濃度を達成するために必要とされる最終的な希釈を計算した。
【００３１】
実施例１〜３及び比較例Ａ
２５ｇのトレイルミックスブレンド（ピーナッツ、レーズン、ヒマワリ種子、アーモンド、カシュー、カボチャ種子、及び植物油を含有）を含有する食品マトリックスに、１００マイクロリットルの希釈培養液を直接送達することによって、［約１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）と計算された］低レベルのサルモネラ・チフィムリウム（ＡＴＣＣ  １４０２８）を接種した。接種した試料を、１００ｍＬの緩衝ペプトン水増菌培地を含有したＷＨＩＲＬ−ＰＡＫ滅菌サンプリングバックに入れた。次に、硫酸第一鉄七水和物を、５０ｍｇ／Ｌ（実施例１）、５００ｍｇ／Ｌ（実施例２）、２０００ｍｇ／Ｌ（実施例３）、又は０ｍｇ／ｍＬ（比較例Ａ）のいずれかの濃度で、培地に添加した。そのバックを閉じ、試料を３０秒間混合し、続いて３５℃で２４時間インキュベートした。培地の１０ｍＬのアリコートを取り出し、Ｄｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）で連続希釈した。最終希釈液からの１００マイクロリットルの試料を、製造元の説明書に従って、ＥＺ  ＣＨＲＯＭ  サルモネラ菌＋寒天プレート上にプレーティングし、そのプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。形成されたコロニー（ｃｆｕ）を目視検査によりカウントした。増菌後の総コロニー数は、希釈の回数及び体積に基づいて、観察されたプレートカウントを調整することによって計算した。増菌後のサルモネラ・チフィムリウムの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表１に報告する。
【００３２】
【表１】
2021528070.tif 000002
【００３３】
実施例４〜６及び比較例Ｂ．
２５ｇのトレイルミックスブレンド（ピーナッツ、レーズン、ヒマワリ種子、アーモンド、カシュー、カボチャ種子、及び植物油を含有）を含有する食品マトリックスに、１００マイクロリットルの希釈培養液を直接送達することによって、［約１．４コロニー形成単位（ｃｆｕ）と計算された］低レベルのリステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ  ３３０９０）を接種した。接種した試料を、１００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ増菌培地を含有したＷＨＩＲＬ−ＰＡＫ滅菌サンプリングバックに入れた。次に、硫酸第一鉄七水和物を、５０ｍｇ／Ｌ（実施例４）、５００ｍｇ／Ｌ（実施例５）、２０００ｍｇ／Ｌ（実施例６）、又は０ｍｇ／Ｌ（比較例Ｂ）のいずれかの濃度で、培地に添加した。そのバッグを閉じ、試料を３０秒間混合し、続いて３５℃で２４時間インキュベートした。培地の１０ｍＬのアリコートを取り出し、新たなＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地で連続希釈した。最終希釈液からの１００マイクロリットルの試料を、製造元の説明書に従ってＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ（ＭＯＸ）寒天プレート上にプレーティングし、そのプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。形成されたコロニー（ｃｆｕ）を目視検査によりカウントした。増菌後の総コロニー数は、希釈の回数及び体積に基づいて、観察されたプレートカウントを調整することによって計算した。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表２に報告する。
【００３４】
【表２】
2021528070.tif 000003
【００３５】
実施例７及び比較例Ｃ．
５０ｇのトレイルミックスブレンド（ピーナッツ、レーズン、ヒマワリ種子、アーモンド、カシュー、カボチャ種子、及び植物油を含有）を含有する食品マトリックスに、１００マイクロリットルの希釈培養液を直接に送達することによって、［約３．７コロニー形成単位（ｃｆｕ）と計算された］低レベルのリステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ  ３３０９０）を接種した。接種した試料を、２００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ増菌培地を含有したＷＨＩＲＬ−ＰＡＫ滅菌サンプリングバックに入れた。次に、４５ｍｇ／Ｌ（３３０マイクロモル−実施例７）又は０ｍｇ／Ｌ（対照−比較例Ｃ）のいずれかの濃度で塩化亜鉛を培地に添加した。そのバッグを閉じ、試料を３０秒間混合し、続いて３５℃で２４時間インキュベートした。培地の１００マイクロリットルのアリコートを取り出し、新たなＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地で連続希釈した。最終希釈液からの１００マイクロリットルの試料を、製造元の説明書に従ってＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ（ＭＯＸ）寒天プレート上にプレーティングし、そのプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。形成されたコロニー（ｃｆｕ）を目視検査によりカウントした。増菌後の総コロニー数は、希釈の回数及び体積に基づいて、観察されたプレートカウントを調整することによって計算した。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表３（表４で繰り返した）に報告する。
【００３６】
【表３】
2021528070.tif 000004
【００３７】
比較例Ｄ．
ＺｎＣｌ２（４５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）を、無水ＣａＣｌ２（３６．５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）で置き換えた以外は、実施例７に記載したものと同じ手順（２００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地中５０ｇのトレイルミックスブレンド）で行った。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表４に報告する。
【００３８】
比較例Ｅ．
ＺｎＣｌ２（４５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）を、無水ＭｇＳＯ４（４０ｍｇ／Ｌ、３３２マイクロモル）で置き換えた以外は、実施例７に記載したものと同じ手順（２００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地中５０ｇのトレイルミックスブレンド）で行った。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表４に報告する。
【００３９】
比較例Ｆ．
ＺｎＣｌ２（４５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）を、クエン酸第二鉄（８１ｍｇ／Ｌ、３３１マイクロモル）で置き換えた以外は、実施例７に記載したものと同じ手順（２００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地中５０ｇのトレイルミックスブレンド）で行った。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表４に報告する。
【００４０】
比較例Ｇ．
ＺｎＣｌ２（４５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）を、クエン酸第二鉄アンモニウム（８７．５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）で置き換えた以外は、実施例７に記載したものと同じ手順（２００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地中５０ｇのトレイルミックスブレンド）で行った。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表４に報告する。
【００４１】
比較例Ｈ．
ＺｎＣｌ２（４５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）を、ＮｉＳＯ４六水和物（８７ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）で置き換えた以外は、実施例７に記載したものと同じ手順（２００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地中５０ｇのトレイルミックスブレンド）で行った。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表４に報告する。
【００４２】
比較例Ｉ．
ＺｎＣｌ２（４５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）を、ＢａＣｌ２二水和物（８１ｍｇ／Ｌ、３３１マイクロモル）で置き換えた以外は、実施例７に記載したものと同じ手順（２００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地中５０ｇのトレイルミックスブレンド）で行った。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表４に報告する。
【００４３】
比較例Ｊ．
ＺｎＣｌ２（４５ｍｇ／Ｌ、３３０マイクロモル）を使用しなかった以外は、実施例７に記載したものと同じ手順（２００ｍＬのＤｅｍｉ  Ｆｒａｓｅｒ培地中５０ｇのトレイルミックスブレンド）で行った。増菌後のリステリア・イノキュアの回収（ｃｆｕ／ｍＬ）を、２回反復の平均値として表４に報告する。
【００４４】
【表４】
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【国際調査報告】
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