(57)【要約】  拍動心筋細胞を１種以上のＷＮＴアゴニスト、１種以上の生理活性脂質、又は１種以上のＷＮＴアゴニストと１種以上の生理活性脂質との組み合わせで処理することを含む、拍動心筋細胞を増殖させる方法。ｉＰＳ細胞を１種以上のＷＮＴアゴニストと１種以上の生理活性脂質との組み合わせで処理することを含む、ｉＰＳ細胞を含む幹細胞を拍動心筋細胞へと分化させる方法。拍動心筋細胞と１種以上のＷｎｔアゴニストと１種以上の生理活性脂質とを含む、再生医療用の組成物及びキット。【選択図】図１Ａ
2021518113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
拍動心筋細胞を増殖させる方法であって、前記拍動心筋細胞をＷＮＴアゴニスト、生理活性脂質、及び／又は前記ＷＮＴアゴニストと前記生理活性脂質との組み合わせで処理することを含む、方法。
【請求項２】
前記拍動心筋細胞は、ヒト心筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記拍動心筋細胞を処理する工程の前に、多能性幹細胞を前記拍動心筋細胞へと分化させる工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞前駆細胞、及び／又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＷＮＴアゴニストは、ＧＳＫ３β阻害剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生理活性脂質は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）及び／又はリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＷＮＴアゴニストは、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＷＮＴアゴニストは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、及び／又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜５又は請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記拍動心筋細胞を１日〜１２０日の期間の間処理する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＷＮＴアゴニスト及び／又は前記生体脂質を組織培養培地に前記生理活性脂質のそれぞれについては１μＭ〜５０μＭの最終濃度で、ＣＨＩＲ９９０２１又はＢＩＯについては１μＭ〜５０μＭで、そして前記組換えＷＮＴアゴニストのＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、及び／又はそれらの任意の組み合わせを１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬで添加することによって、前記拍動心筋細胞を処理する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞から拍動心筋細胞を産生する方法であって、
前記多能性幹細胞を少なくとも１種の生理活性脂質及び少なくとも１種のＷＮＴアゴニストで処理すること、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞は、ヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞前駆細胞、及び／又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＷＮＴアゴニストは、ＧＳＫ３β阻害剤である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生理活性脂質は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）及び／又はリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＷＮＴアゴニストは、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＷＮＴアゴニストは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、及び／又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記多能性幹細胞を１時間〜１０日の期間の間処理する、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｓ１Ｐ及びＬＰＡを組織培養培地にそれぞれ１μＭ〜５０μＭの最終濃度で、ＣＨＩＲ９９０２１又はＢＩＯについては１μＭ〜５０μＭで、そして前記組換えＷＮＴアゴニストのＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、及び／又はそれらの任意の組み合わせを１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬで添加することによって、前記多能性幹細胞を処理する、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト心筋細胞を得る方法であって、
ｈｉＰＳ細胞をプロトコルの第１段階の間の任意の時点で少なくとも１種のＷｎｔアゴニスト及び少なくとも１種の生理活性脂質で処理し、前記細胞をプロトコルの第２段階の間に少なくとも１種のＷｎｔアンタゴニストで更に処理する２段階のＷｎｔシグナル伝達プロトコルを介して、ｈｉＰＳ細胞を拍動心筋細胞へと分化させることにより、前記拍動心筋細胞を得ることと、
前記拍動心筋細胞を少なくとも１種の生理活性脂質、少なくとも１種のＷｎｔアゴニスト及びそれらの任意の組み合わせで処理することによって、前記拍動心筋細胞を増殖させることと、
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法により産生されるヒト拍動心筋細胞。
【請求項２３】
薬物スクリーニングの方法であって、請求項２２に記載のヒト心筋細胞を薬物と接触させることと、前記薬物の前記心筋細胞に対する効果をモニタリングすることとを含む、方法。
【請求項２４】
患者を心疾患から治療する方法であって、前記患者の心臓に請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法により得られる心筋細胞を直接投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記心疾患は、先天性心疾患、心筋梗塞、癌療法のためのアントラサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤等の心毒性剤、アルコール、シャーガス病若しくはライム病を引き起こす細菌等の細菌、心筋炎を引き起こすウイルス等の環境曝露、又は遺伝的／遺伝性心筋症からの心不全である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者の心臓に適用されるパッチを介して前記心筋細胞を前記患者に投与する、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者を心疾患から治療する方法であって、前記患者に少なくとも１種のＷｎｔアゴニスト、Ｗｎｔ代替物、生理活性脂質、及び／又はそれらの組み合わせを投与することを含む、方法。
【請求項２８】
患者を心疾患又は血管疾患から治療する方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法により得られる心筋細胞を含む組織工学血液ポンプを投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府資金］
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＬＭ０１２１７９及びＵ０１ＨＬ０９９７７６による政府の支援を一部受けてなされたものである。合衆国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年３月１６日付けで出願された米国仮特許出願第６２／６４４，０９１号に対する優先権の利益を主張するものである。この出願の全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００３】
本発明は、拍動心筋細胞を増殖させる試薬、組成物及び方法に関する。本発明はまた、ｉＰＳ細胞を含む様々な幹細胞から心筋細胞を産生する組成物及び方法に関する。本発明はまた、これらの心筋細胞が使用され得る心疾患の治療及びハイスループット薬物スクリーニング、心疾患モデリング、高精度医療、及び再生医療を含む様々な用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
心筋梗塞（ＭＩ）の後に、ヒトの心臓は１０億個ほどの心筋細胞（ＣＭ）が失われ得ることにより、急性心機能不全が引き起こされ、患者は慢性心不全の発症の危険にさらされる。成体哺乳動物の心臓は自己再生する能力には限界があり、ｈｉＰＳＣ−ＣＭの注入又は人工心臓組織を使用した心臓パッチの作製を含む現在の治療アプローチは、移植後の細胞死及び細胞レシピエントの不整脈によって妨害されることが実証されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。成体ＣＭとは異なり、胎児ＣＭは増殖性であり、大規模な有糸分裂を起こすことから、胚発生の間の指数関数的な心筋成長が説明される（非特許文献４、非特許文献５）。新生児の心臓は様々な形の傷害後に再生する能力を備えているが、この能力は出生直後に失われ、その結果、成体期に損傷を受けると心筋質量は大幅にかつ永続的に失われる（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。
【０００５】
成人の心臓の年間のＣＭターンオーバーは２％未満であると計算されるため、ヒトの心臓は一般的に分裂終了臓器とみなされる（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献３）。胎児ＣＭの大規模な自己複製特性は、成熟の進行に伴って徐々に低下する（非特許文献１２、非特許文献１３）。一貫して、この生物学はｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈｉＰＳＣ−ＣＭにより再現される。心筋細胞前駆細胞は容易に増殖し得るが、ＣＭ系譜に拘束されると、たちまちその増殖能力を失い、サルコメア組織化が増加する（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。多能性幹細胞の心臓分化には多くの胚経路が関係している（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。特にＷｎｔシグナル伝達は、心筋細胞発生の多くの異なる段階で極めて重要な役割を担い、心臓の特異化、成長及び分化に必要である。初期段階で、中胚葉が心臓前駆細胞に特異化するために、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害が必要とされる（非特許文献２４、非特許文献２５）。特異化に続いて、多能性の二次心臓領域の前駆細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達経路が刺激されると自己複製し、その後にＷｎｔシグナル伝達が停止すると心臓の３つの心血管系譜へと分化する（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９）。最終的に、心臓が形成されると、緻密心筋層ではＷｎｔシグナル伝達は大部分が活性なままであり、こうして心筋成長が促進される（非特許文献３０、非特許文献３１）。これらのｉｎ  ｖｉｖｏでの初期発生研究から得られた知識は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性幹細胞起源からＣＭを効果的に生成するための再現的な方法につながった。現在のｈｉＰＳＣ向けの分化プロトコルには、初期段階でのＷｎｔシグナル伝達の小分子に媒介される活性化に続いて後期段階のＷｎｔ阻害の後に高純度のＣＭを誘導するための簡略化された形のＷｎｔ調節が含まれる（非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献２１）。しかしながら、この分野での多数の制限により、拘束されたＣＭを効果的に増殖及び継代させて、組織工学又は真の再生アプローチに必要な数を生成することはできていない。
【０００６】
成体哺乳動物の心筋細胞は、細胞分裂の能力に限界がある（非特許文献３５）。放射性炭素年代測定研究により、成人の心臓では、年間の細胞ターンオーバーがベースラインで０．５％未満であることが示唆されている（非特許文献１０）。したがって、哺乳動物の成体の心臓再生は、心筋梗塞等の心傷害後に心筋細胞の大規模な損失を補うことができないことから、不利な心臓リモデリングにつながる。ヒトの心臓のこの限られた再生能力のため、心筋細胞を新たに作製すると共に、最終分化した心筋細胞に増殖を誘導するための新しい方法論の開発に大きな関心が集められている。
【０００７】
ヒト多能性幹細胞研究での主要な目標は、再生医療における細胞療法に適した心筋細胞を大量に提供することである（非特許文献３６、非特許文献７、非特許文献３７、非特許文献３８）。ヒト多能性幹細胞の心臓分化のためのプロトコルは１０年前と比べて大幅に改善されている。現在のプロトコルは、分化の間に９０％以上の純粋な心筋細胞を得た後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して、選択可能なマーカーをｈｉＰＳＣへと導入することによって更に強化することができる代謝選択を行うことができる（非特許文献３３、非特許文献３９）。最新の方略では、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から直接的に心臓分化させるために、２段階のＷｎｔ／β−カテニン調節が使用される（非特許文献３２、非特許文献３４）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの中胚葉誘導に必要とされる発生Ｗｎｔシグナルを模するために、ｈｉＰＳＣは、最初に非選択的グリコーゲンキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）で処理され、続いてＷｎｔ／β−カテニン阻害剤で処理されて、心臓細胞分化が促進される。
【０００８】
近年、多くの機能を有する生理活性脂質の総称であるリゾリン脂質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの幹細胞分化及びｉｎ  ｖｉｖｏでの心血管発生の重要な調節因子として裏付ける証拠が増えてきている（非特許文献４０）。これらの生理活性脂質のうち、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）及びリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が主要な構成員である（非特許文献４０）。
【０００９】
ｉｎ  ｖｉｖｏの研究では、マウスでの正常な心臓発生における心筋細胞中のＳ１Ｐ受容体を介したＳ１Ｐシグナル伝達の必須の役割が実証された（非特許文献４１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究では、これらのシグナル伝達分子がヒト胚性幹細胞における多能性及び細胞周期活性を調節可能であることが示された（非特許文献４２、非特許文献４３）。
【００１０】
生理活性脂質は、それらがＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路、Ｈｉｐｐｏ経路、及びＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路等の重要な細胞シグナル伝達経路を刺激する能力を介して、上皮細胞、線維芽細胞、及び様々な癌細胞系統における細胞増殖に関与することも報告されている（非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６、非特許文献４７）。
【００１１】
特許文献１及び特許文献２は、培養で心筋細胞を産生する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第９，０７４，１８８号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０２４４２６２号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Beltrami et al., 2001
【非特許文献２】Chong et al., 2014
【非特許文献３】Senyo et al., 2013
【非特許文献４】de Boer et al., 2012
【非特許文献５】Risebro et al., 2015
【非特許文献６】Foglia and Poss, 2016
【非特許文献７】Laflamme and Murry, 2011
【非特許文献８】Porrello et al., 2011
【非特許文献９】Uygur and Lee, 2016
【非特許文献１０】Bergmann et al., 2009
【非特許文献１１】Goldstein et al., 1974
【非特許文献１２】Bruneau, 2013
【非特許文献１３】Srivastava, 2006
【非特許文献１４】Birket et al., 2015
【非特許文献１５】Burridge et al., 2012
【非特許文献１６】Mauritz et al., 2008
【非特許文献１７】Zhang et al., 2009
【非特許文献１８】Zhang et al., 2016
【非特許文献１９】Kattman et al., 2011
【非特許文献２０】Lee et al., 2017
【非特許文献２１】Paige et al., 2010
【非特許文献２２】Protze et al., 2017
【非特許文献２３】Yang et al., 2008
【非特許文献２４】Foley and Mercola, 2005
【非特許文献２５】Schneider and Mercola, 2001
【非特許文献２６】Cohen et al., 2007
【非特許文献２７】Kwon et al., 2009
【非特許文献２８】Lin et al., 2007
【非特許文献２９】Qyang et al., 2007
【非特許文献３０】Buikema et al., 2013
【非特許文献３１】Ye et al., 2015
【非特許文献３２】Burridge et al., 2014
【非特許文献３３】Lian et al., 2012
【非特許文献３４】Lian et al., 2013
【非特許文献３５】Sharma et al. 2015
【非特許文献３６】Chuang et al. 2011
【非特許文献３７】Serpooshan et al. 2017
【非特許文献３８】Li et al. 2016
【非特許文献３９】Sharma et al. 2018
【非特許文献４０】Kleger et al. 2011
【非特許文献４１】Clay et al. 2016
【非特許文献４２】Avery et al. 2008
【非特許文献４３】Garcia-Gonzalo et al. 2008
【非特許文献４４】Harvey et al. 2013
【非特許文献４５】Marinissen et al. 2001
【非特許文献４６】Oskouian et al. 2007
【非特許文献４７】Yang et al. 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、最近の進展にもかかわらず、異なるｈｉＰＳＣ系統では、たとえ同じ個体に由来するものであっても、心筋細胞を再現的に生成する能力が様々であり得るため、相変わらず分化効率にはかなりのバッチ間変動が見られる。したがって、一貫して高い効率を有するｉｎ  ｖｉｔｒｏのｈｉＰＳＣ−ＣＭ生成プロトコルが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一態様では、本開示は、拍動心筋細胞を増殖させる方法であって、前記拍動心筋細胞をＷＮＴアゴニスト、生理活性脂質、及び／又は前記ＷＮＴアゴニストと前記生理活性脂質との組み合わせで処理することを含む、方法を提供する。前記拍動心筋細胞は、ヒト心筋細胞であり得る。前記処理は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。前記拍動心筋細胞を処理する工程の前に、多能性幹細胞を前記拍動心筋細胞へと分化させる工程を更に含むことができる。前記多能性幹細胞には、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞前駆細胞、及び／又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が含まれる。前記ＷＮＴアゴニストには、ＧＳＫ３β阻害剤が含まれる。１つの好ましいＧＳＫ３β阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。好ましい生理活性脂質には、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）及び／又はリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が含まれる。拍動心筋細胞を増殖させる本方法は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、及び／又はそれらの任意の組み合わせによる拍動心筋細胞の処理を含み得る。前記拍動心筋細胞を１日〜１２０日の期間の間処理することができる。
【００１６】
幾つかの実施の形態では、拍動心筋細胞を増殖させる方法は、前記ＷＮＴアゴニスト及び／又は前記生体脂質を組織培養培地に前記生理活性脂質のそれぞれについては１μＭ〜５０μＭの最終濃度で、ＣＨＩＲ９９０２１又はＢＩＯについては１μＭ〜５０μＭで、そして前記組換えＷＮＴアゴニストのＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、及び／又はそれらの任意の組み合わせを１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬで添加することによって、前記拍動心筋細胞を処理することを含む。
【００１７】
本開示の別の態様は、多能性幹細胞から拍動心筋細胞を産生する方法を含む。この方法は、前記多能性幹細胞を少なくとも１種の生理活性脂質及び少なくとも１種のＷＮＴアゴニストで処理することを含む。前記多能性幹細胞は、ヒト細胞であり得る。前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞前駆細胞、及び／又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり得る。前記ＷＮＴアゴニストは、ＧＳＫ３β阻害剤であり得る。好ましい生理活性脂質の幾つかは、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、及びそれらの組み合わせである。好ましいＷＮＴアゴニストには、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、及び／又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。前記多能性幹細胞を１時間〜１０日の期間の間処理することができる。
【００１８】
多能性幹細胞から拍動心筋細胞を生成する本方法の１つの好ましい実施の形態では、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡを、組織培養培地にそれぞれ１μＭ〜５０μＭの最終濃度で、ＣＨＩＲ９９０２１又はＢＩＯについては１μＭ〜５０μＭで、そして組換えＷＮＴアゴニストのＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、及び／又はそれらの任意の組み合わせを１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬで添加することによって、多能性幹細胞が処理される。
【００１９】
本開示はまた、ヒト心筋細胞を得る方法であって、ｈｉＰＳ細胞をプロトコルの第１段階の間の任意の時点で少なくとも１種のＷｎｔアゴニスト及び少なくとも１種の生理活性脂質で処理し、前記細胞をプロトコルの第２段階の間に少なくとも１種のＷｎｔアンタゴニストで更に処理する２段階のＷｎｔシグナル伝達プロトコルを介して、ｈｉＰＳ細胞を拍動心筋細胞へと分化させることにより、前記拍動心筋細胞を得ることと、前記拍動心筋細胞を少なくとも１種の生理活性脂質、少なくとも１種のＷｎｔアゴニスト及びそれらの任意の組み合わせで処理することによって、前記拍動心筋細胞を増殖させることとを含む、方法を提供する。
【００２０】
他の態様は、本方法のいずれかによって産生されたヒト拍動心筋細胞及びヒト心筋細胞を薬物と接触させた後に、薬物のヒト心筋細胞に対する効果をモニタリングする薬物スクリーニングの方法を含む。
【００２１】
更なる態様は、患者を心疾患から治療する方法を含む。本方法は、前記患者の心臓に本方法により得られる心筋細胞を直接投与することを含む。前記心疾患には、先天性心疾患、心筋梗塞、癌療法のためのアントラサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤等の心毒性剤、アルコール、シャーガス病若しくはライム病を引き起こす細菌等の細菌、心筋炎を引き起こすウイルス等の環境曝露、又は遺伝的／遺伝性心筋症からの心不全が含まれる。治療方法において、前記患者の心臓に適用されるパッチを介して前記心筋細胞を前記患者に投与することができる。
【００２２】
さらに、患者を心疾患から治療する方法は、前記患者に少なくとも１種のＷｎｔアゴニスト、Ｗｎｔ代替物、生理活性脂質、及び／又はそれらの組み合わせを投与することを含む方法を含む。
【００２３】
他の態様は、患者を心疾患又は血管疾患から治療する方法であって、本方法により得られる心筋細胞を含む組織工学血液ポンプを投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ−１Ｉ】Ｗｎｔシグナル伝達が、拍動ｈｉＰＳＣ−ＣＭの大量増殖及び長期継代を刺激することを示す図である。（Ａ）ｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖及び継代の図式的タイムライン。（Ｂ）０継代目（Ｐ０）の初期の１０ｃｍ２のコンフルエントな皿から後続の継代での複数のコンフルエントＴ−１７５ｃｍ２細胞培養フラスコまでのｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖の代表的な画像。（Ｃ）各継代でのｈｉＰＳＣ−ＣＭによる総表面積（ｃｍ２）被覆。（Ｄ）各継代でのＣＨＩＲ又はＤＭＳＯ（ＣＴＲ）の存在下でのコンフルエントなｈｉＰＳＣ−ＣＭの代表的な明視野画像。両方の処理条件に同じ希釈率を適用した。（Ｅ）Ｐ０からＰ５までの細胞の総数の定量。（Ｆ）ＤＭＳＯ（ＣＴＲ）又はＣＨＩＲで処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭについてのＰ３でのＴｎＴ発現に関する免疫蛍光分析。（Ｇ）各継代でのＣＨＩＲ処理された細胞対ＤＭＳＯ処理された細胞におけるＴｎＴ陽性細胞の増加倍率。（Ｈ）ＣＨＩＲ処理された細胞におけるＴｎＴ発現の代表的なフローサイトメトリープロット。（Ｉ）（Ｈ）でのフローサイトメトリー分析からのＴｎＴ陽性細胞のパーセンテージの定量。スケールバーは１００μｍを表し、データは平均（ｎ＝３〜５）±エラーバー（標準偏差を示す）であり、＊はｐ＜０．０５である。
【図２Ａ−２Ｋ】Ｗｎｔシグナル伝達によるｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖ウィンドウの拡張を報告する図である。（Ａ）分化１２日目（Ｐ０）から開始する各継代でのｈｉＰＳＣ−ＣＭの免疫蛍光顕微鏡画像。心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）。（Ｂ）ＣＨＩＲ又はＤＭＳＯ（ＣＴＲ）で処理した後のＴｎＴ陽性細胞における細胞周期指標であるｋｉ６７の発現。（Ｃ）ＣＨＩＲ処理又はＣＴＲ処理されたＴｎＴ陽性細胞における増殖指標であるｐＨＨ３の発現。（Ｄ）種々の有糸分裂期でのＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭの代表的な共焦点顕微鏡画像。（Ｅ）（Ｄ）とは異なる有糸分裂期での増殖性ｈｉＰＳＣ−ＣＭの定量。（Ｆ）細胞質分裂を経ているＴｎＴ陽性細胞におけるＡｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼ発現の免疫蛍光画像。（Ｇ）二核化されたｈｉＰＳＣ−ＣＭのパーセンテージの定量（総ＣＭの％として）及び（Ｈ）ＣＨＩＲ処理した後に更に６日間にわたりＣＴＲ、ＣＨＩＲ又はＣ５９のいずれかで処理されたＰ３細胞についてのｋｉ６７発現。（Ｉ）ＣＴＲ、ＣＨＩＲ又はＣ５９で２４時間（２４ｈ）処理されたＰ０のｈｉＰＳＣ−ＣＭの免疫蛍光画像。（Ｊ）（Ｉ）に記載された実験からの総ｈｉＰＳＣ−ＣＭのパーセンテージとしてのｋｉ６７発現（すなわち、細胞周期指標）の定量。（Ｋ）（Ｉ）に記載された実験からのｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーターを使用したＴＣＦ／ＬＥＦを介した古典的Ｗｎｔシグナル伝達の評価。ＣＨＩＲの存在下でのＴＣＦ／ＬＥＦ活性の劇的な増加に留意されたい。スケールバーは１００μｍを表し、データは平均（ｎ＝３〜５）±エラーバー（標準偏差を示す）であり、＊はｐ＜０．０５である。
【図３Ａ−３Ｍ】Ｗｎｔ刺激後のｈｉＰＳＣ−ＣＭの表現型評価を報告する図である。（Ａ）ＤＭＳＯ（ＣＴＲ）、ＣＨＩＲ（２．０μｍ）又はＣＨＩＲに続くＣ５９（ＣＨＩＲ＞Ｃ５９）のいずれかで処理し、トロポニンＴ（ＴｎＴ）及びα−サルコメアアクチン（α−ＳＡ）の発現について免疫染色されたマイクロパターン化された表面上のＰ３のｈｉＰＳＣ−ＣＭの共焦点顕微鏡画像。（Ｂ）サルコメア線維配列の自動的定量。縦軸はゼロ度と規定される。（Ｃ）示された角度で配向されたサルコメア領域のパーセンテージが定量される。（Ｄ）（Ａ）で処理された細胞における収縮性測定。（Ｅ）ｈｉＰＳＣ−ＣＭの代表的な活動電位のトレーシング。データは２８日目（Ｄ２８）のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける膜電位［Ｅｍ］の変化を表す。（Ｆ）９０％再分極における活動電位持続時間（ＡＰＤ）（ＡＤＰ９０）及び２８日目での各群についての最大拡張期電位（ＭＤＰ）を表すグラフ。（Ｇ）２８日目でのｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるベースラインに対して表されるＣａ２＋トランジェント（Ｆｌｕｏ−４ＡＭ）蛍光［Ｆ／Ｆ０］。（Ｈ）各群についての減衰タウを表すグラフ。Ｄ２８、Ｄ３５、Ｄ４２及びＤ４９での増殖性ＣＭについてのサルコメア遺伝子（Ｉ）発現、電気生理学的遺伝子（Ｊ）発現及び代謝遺伝子（Ｋ）発現の増加倍率。Ｄ２８の後に、細胞をＣＨＩＲで処理し続けるか、中止するか、又はＣ５９で処理する。（Ｌ）ＣＨＩＲ、ＣＴＲ及びＣＨＩＲ＞Ｃ５９で処理されたＰ３のＣＭにおけるＭＬＣ２Ｖ及びＴｎＴについての免疫組織化学。（Ｍ）ＭＬＣ２Ｖ及びＴｎＴ陽性細胞のパーセント。スケールバーは１００μｍを表す。データは平均（ｎ＝３〜５）±エラーバー（Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＨではＳＥＭを示し、Ｊ及びＬでは標準偏差を示す）であり、＊はｐ＜０．０５である。
【図４Ａ−４Ｋ】Ｗｎｔシグナルの増減に続くｈｉＰＳＣ−ＣＭの単一細胞ＲＮＡシーケンシング分析を報告する図である。（Ａ）ＤＭＳＯ  ＣＴＲ（灰色）、ＣＨＩＲ（黄色）又はＣ５９（黒色）で２４時間処理された１２日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭのｔ−ＳＮＥプロット。（Ｂ）（Ａ）の３つの群と発現に有意差がある遺伝子のヒートマップ。（Ｃ）Ｗｎｔ標的遺伝子の発現。（Ｄ及びＥ）増殖遺伝子の発現。ＣＨＩＲ処理された細胞における増殖遺伝子発現の増加に留意されたい。（Ｆ）（Ａ）からの単一のｈｉＰＳＣ−ＣＭの教師なしクラスタリングを表すｔ−ＳＮＥプロット。（Ｇ）教師なしクラスターにおける発現が異なる遺伝子のヒートマップ。（Ｈ）経路濃縮分析に使用されるクラスター当たりの遺伝子。（Ｉ）単一のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける心室マーカーの発現。（Ｊ）心房マーカー細胞の発現。（Ｋ）心室成熟マーカーの発現。示される全てのパネルについて、遺伝子はｐ＜０．０１を表す。
【図５Ａ−５Ｋ】ＧＳＫ３β阻害が、有糸分裂に必要とされるＡＫＴキナーゼのリン酸化を調節することを報告する図である。（Ａ）ＣＨＩＲ処理に対する増加倍率として表されるＴｎＴ陽性細胞の細胞数。（Ｂ）示された阻害剤での処理の２４時間後のＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼＴＣＦ／ＬＥＦ分析。（Ｃ）示された阻害剤についての遺伝子発現。（Ｄ）ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）によるＧＳＫ３阻害及びＰＮＵ７４６５４による下流の古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害の概略図。（Ｅ）４３個のスクリーニングされたリン酸化標的をＣＨＩＲで処理した後にリン酸化レベルが有意に変化したキナーゼを表すパネル。（Ｆ）ＣＨＩＲの存在下又は不存在下で１００分間培養された細胞におけるｐＡＫＴ  Ｔ３０８についてのウエスタンブロット分析。（Ｇ）ｐＡＫＴタンパク質発現を表すグラフ。（Ｈ）示された処理と共に６日間培養された１２日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるｐＡＫＴ  Ｔ３０８についての免疫蛍光分析。コントロールに対する倍率として表される、各処理についてのＴｎＴ（Ｉ）細胞数及びｐＡＫＴ  Ｔ  ３０８（Ｊ）細胞数の定量。（Ｋ）示された処理による処理の２４時間後のＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼＴＣＦ／ＬＥＦ分析。スケールバーは１００μｍを表し、データは平均（ｎ＝３〜５）±エラーバー（標準偏差を示す）であり、＊はｐ＜０．０５である。
【図６Ａ−６Ｅ】Ｗｎｔ受容体リガンドが、ＣＭ細胞周期の再活性化を誘導することを報告する図である。（Ａ）細胞周期の研究に使用されるｈｉＰＳＣ−ＣＭの時点の概略図。（Ｂ）Ｗｎｔ３Ａ、ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋ＲＳＰＯ、又はＨ２Ｏコントロール（ＣＴＲ）で処理された１２日目のＣＭの代表的な画像。（Ｃ）ＣＴＲに対する倍率として表されるＴｎＴ陽性細胞数の定量。（Ｄ）列記された処理についてのＤ６６のＣＭにおける免疫蛍光分析。（Ｅ）６６日目での有糸分裂ＣＭにおける増加倍率。スケールバーは１００μｍを表し、データは平均（ｎ＝３〜５）±エラーバー（標準偏差を示す）であり、＊はｐ＜０．０５である。
【図７Ａ−７Ｇ】Ｗｎｔ代替物が、心筋の成長を促進することを報告する図である。（Ａ）Ｗｎｔ代替物処理又はＣＴＲについての１２週齢のマウスの代表的な画像。（Ｂ）心臓重量と体重との比率を表すグラフ。（Ｃ）心室の３つのレベルでのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。（Ｄ）ＬＶ寸法を表すグラフ及び（Ｅ）壁厚（μｍ）を表すグラフ。（Ｆ）小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）及びｄａｐｉ（ＤＮＡ）についての免疫蛍光分析。（Ｇ）相対細胞数及び細胞サイズ（μｍ）を表すグラフ。スケールバーはＡ及びＣでは１０００μｍを表し、Ｆでは１００μｍを表し、データは平均（Ａではｎ＝３、Ｃ及びＤではｎ＝６、Ｅ〜Ｈではｎ＝４）±エラーバー（標準偏差を示す）であり、＊はｐ＜０．０５である。
【図８Ａ−８Ｃ】ｈｉＰＳＣの心臓分化の遺伝子発現分析を報告する図である。（Ａ）ｈｉＰＳＣ−ＣＭ分化の間の多能性、心臓中胚葉、心臓前駆細胞及び心筋細胞の転写因子発現。破線は１２日目から１４日目まで２．０μＭのＣＨＩＲで処理した試料における遺伝子発現を示した。ＣＨＩＲ又はＤＭＳＯ（ＣＴＲ）で処理された１４日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＩＳＬ１（Ｂ）発現及びカスパーゼ３（Ｃ）発現の免疫蛍光画像が示されている。
【図９Ａ−９Ｂ】Ｗｎｔ刺激に際してのｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖の表現型分析を報告する図である。（Ａ）ＣＨＩＲ又はＤＭＳＯ（ＣＴＲ）による処理後の様々な継代でのｈｉＰＳＣ−ＣＭのＴｎＴ発現及びｐＨＨ３発現の免疫蛍光画像。（Ｂ）ＣＴＲ処理された細胞ではなくＣＨＩＲ処理された細胞における種々の有糸分裂期での崩壊したサルコメア構造及び複数のｈｉＰＳＣ−ＣＭの存在を裏付ける、マイクロパターン化された基板上での３継代目（Ｐ３）のＣＴＲ及びＣＨＩＲで処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＴｎＴ  ｐＨＨ３発現の免疫蛍光画像。
【図１０】心臓遺伝子発現のリアルタイム定量的ＰＣＲ分析を報告する図である。最初の２ヶ月間にわたりＣＨＩＲで処理された又は処理されていない３ヶ月齢のｈｉＰＳＣ−ＣＭを心臓遺伝子発現のｑＰＣＲ分析のために採取した。
【図１１Ａ−１１Ｃ】ＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭを使用した３Ｄ心臓組織の生成を報告する図である。（Ａ）コラーゲンベースのヒドロゲルに封入され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間培養されたＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭの明視野画像。（Ｂ）（Ａ）の操作された心臓組織における組織化されたサルコメア及びＣｘ４３ギャップ結合タンパク質の発現を示す免疫蛍光画像。（Ｃ）示された開始数のＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭにより生成された３Ｄ心臓構造物における拍動領域及び収縮速度の量の定量。
【図１２Ａ−１２Ｅ】機能的な３次元心臓組織を作製するために利用されている事前に増殖されたＣＭを報告する図である。
【図１３】ＣＨＩＲを伴って３回継代されたｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるｐＡＫＴ  Ｔ３０８及びＴｎＴについての免疫組織化学を報告する図である。
【図１４Ａ−１４Ｂ】（Ａ）Ｗｎｔ代替物のｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ又はビヒクルコントロール（ＣＴＲ）で処理された８週齢のマウスの心臓の画像、（Ｂ）８週齢のマウスの心臓における平滑筋アクチン、ＤＮＡ及びＷＧＡ膜染色の共焦点画像を報告する図である。
【図１５Ａ−１５Ｃ】Ｗｎｔ活性化因子ＣＨＩＲ９９０２１と同時に添加した場合の、ｈｉＰＳＣ−心筋細胞分化のＳ１Ｐ／ＬＰＡに媒介される増大を図解する９６ウェル分化を報告する図である。Ａ）この研究で利用された「通常の」化学的に定義された心臓分化プロトコルの図。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡを、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ分化の種々の時点で添加した。Ｂ）２つの低分化ｈｉＰＳＣ系統の心筋細胞への２Ｄ単層ベースの化学的に定義された分化の心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）（緑色）及び核ＤＮＡ（青色）についての代表的な９６ウェル免疫蛍光画像。８日目の分化後ｈｉＰＳＣ−ＣＭに対して９６ウェルプレートの形式で染色を実施した。ｈｉＰＳＣ−ＣＭ分化過程の間の０日目〜２日目、４日目〜６日目又は６日目〜８日目にわたってＳ１Ｐ、ＬＰＡ又はその両方を添加した。Ｃ）Ｓ１Ｐ、ＬＰＡ又は両方が添加された各時点についてのＴｎＴ陽性細胞のパーセンテージとして表される、合計のＴｎＴ陽性細胞数の定量。エラーバーは標準偏差を表す。＊はコントロールに対するｐ＜０．０５を示す。２つの異なるｈｉＰＳＣ系統において３回〜６回の反復で実験を行った。
【図１６Ａ−１６Ｅ】生理活性脂質Ｓ１Ｐ及びＬＰＡが、β−カテニン核内蓄積を増加させ、ｈｉＰＳＣからの初期心臓分化の間にＷｎｔシグナル伝達を活性化することを報告する図である。Ａ）ＤＭＳＯ、小分子ＧＳＫ３β阻害剤／Ｗｎｔ活性化因子ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）、生理活性脂質Ｓ１Ｐ＋ＬＰＡ、又はＣＨＩＲ＋生理活性脂質によるｈｉＰＳＣの２時間の処理後のβ−カテニン（緑色）、多能性マーカーＮａｎｏｇ（赤色）及びＤＡＰＩ（ＤＮＡ）（青色）についての免疫蛍光。矢印は、特徴的なβ-カテニン核内蓄積を示す細胞を示している。Ｂ）ＤＭＳＯコントロールに対して正規化された処理群の細胞質強度に対する核強度として表されるβ−カテニン染色の定量。Ｃ）ｈｉＰＳＣにＴＯＰＦｌａｓｈ  Ｗｎｔ経路の活性レポーターをトランスフェクションし、ＣＨＩＲ、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ又はその両方で２時間処理した後の、ＤＭＳＯコントロールに対する増加倍率として表されるルシフェラーゼ発光強度。Ｄ）ｈｉＰＳＣの文脈における、生理活性脂質とＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路とを連係するシグナル伝達カスケードを図解するモデル。ｈｉＰＳＣでのＳ１Ｐ／ＬＰＡによる処理はβ−カテニンを接着結合及びＥ−カドヘリンから解離するため、下流のシグナル伝達及び遺伝子転写のために利用することができる全体的なβ−カテニンプールが増加する。ＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲでの処理はβ−カテニンを解放し、下流のシグナル伝達及び遺伝子転写のための全体の細胞内β−カテニンプールが増加する。Ｅ）生理活性脂質Ｓ１Ｐ／ＬＰＡを伴う又は伴わない小分子ＧＳＫ３β阻害剤／Ｗｎｔ活性化因子ＣＨＩＲによるｈｉＰＳＣの４８時間の処理後の遺伝子発現における主要な変化を示すマイクロアレイ分析。生理活性脂質による処理後の上方調節された遺伝子（赤色）及び下方調節された遺伝子（青色）のリストが示されている。３回又は４回の生物学的反復で実験を行った。
【図１７Ａ−１７Ｅ】生理活性脂質Ｓ１Ｐ／ＬＰＡが、ｈｉＰＳＣの形態を急速に変化させ、初期心臓分化の間にビメンチン発現を増加させることを報告する図である。Ａ）Ｓ１Ｐ及びＬＰＡで２４時間処理されたｈｉＰＳＣの免疫蛍光及び位相差像。カルセインＡＭ色素は膜を染色し、細胞体全体を染色する。Ｂ）ＤＭＳＯ又はＳ１ＰとＬＰＡとの組み合わせで処理されたｈｉＰＳＣについてのμｍで表示される細胞直径の定量。Ｃ）２４時間にわたるＤＭＳＯ又はＳ１Ｐ／ＬＰＡによる処理後の３つの個別のｈｉＰＳＣ系統の正規化された細胞数。Ｎ＝３回の生物学的反復実験。エラーバーはＳＥＭを表す。Ｄ）ＤＭＳＯ、ＧＳＫ３β阻害剤のＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）、生理活性脂質のＳ１Ｐ＋ＬＰＡ、又は組み合わせによるｈｉＰＳＣの４８時間の処理後の免疫蛍光染色。中間フィラメントタンパク質のビメンチン（緑色）は上皮間葉転換を表示し、ブラキウリ（赤色）は初期中胚葉を表示する。Ｅ）コントロール、ＣＨＩＲ、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ、及び組み合わせ処理に関する総細胞のパーセンテージとして表される、ビメンチン（ＶＩＭ）陽性細胞及びブラキウリＴ（ＢＲＹ）陽性細胞の定量。エラーバーは標準偏差を表す。エラーバーは標準偏差を表す。３回の生物学的反復で実験を行った。＊はＰ＜０．０５を示す。条件につきＮ＝９の画像で細胞を定量した。
【図１８Ａ−１８Ｇ】ＬＰＡ及びＳ１Ｐが、ｈｉＰＳＣ−ＣＭに対する細胞周期誘導効果を示すことを報告する図である。Ａ）ｈｉＰＳＣ−ＣＭを分化の種々の時点でダウンストリームアッセイ用の９６ウェル形式へと再プレーティングすることの概略図。Ｂ）３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭをＤＭＳＯ、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ単独、ＣＨＩＲ単独、又はＣＨＩＲと共にＳ１Ｐ／ＬＰＡと一緒に４８時間培養した後の、心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）（緑色）、細胞周期活性マーカーのｋｉ６７（赤色）及び核色素（ＤＮＡ）（青色）を示す代表的な画像。Ｃ）各処理の４８時間後のｋｉ６７陽性心筋細胞のパーセンテージ。Ｄ）各群についての４８時間の処理後のＣＭの総数に関する正規化された細胞数。Ｅ）３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭをＤＭＳＯ、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ単独、ＣＨＩＲ単独、又はＣＨＩＲ＋Ｓ１Ｐ／ＬＰＡと一緒に４８時間培養した後の、心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）（緑色）、有糸分裂マーカーのリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）（赤色）及び核色素（ＤＮＡ）（青色）についての免疫蛍光染色。Ｆ）様々な処理群間の有糸分裂（ｐＨＨ３）ＣＭのパーセンテージ。Ｇ）示された処理群内の二核化及び多核化されたＣＭのパーセンテージ。＊はコントロールと比べたＰ＜０．０５を示す。Ｎ＝３回の生物学的反復。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１９Ａ−１９Ｈ】Ｓ１Ｐ及びＬＰＡによるｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞周期の再活性化が、ＥＲＫシグナル伝達に依存していることを報告する図である。Ａ）３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにＴＯＰＦｌａｓｈ  Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性レポーターをトランスフェクションし、ＣＨＩＲ、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ又はその両方で２時間処理した後のルシフェラーゼ発光強度。示されるデータは、ＤＭＳＯコントロールに対する増加倍率を表す。Ｂ）０分、５分、１０分及び３０分のＳ１Ｐ／ＬＰＡ処理に応答するｈｉＰＳＣ−ＣＭキノームリン酸化における変化を示すキナーゼアッセイの定量。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊はＰ＜０．０５を示す。Ｃ）Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ（各１０μＭ）を伴って又は伴わずに小分子ＭＥＫ阻害剤のトラメチニブで処理された及び処理されていない３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭで行った代表的なキナーゼアッセイ。ＥＲＫリン酸化及び抗体コントロールに対応するスポットが標識されている。Ｄ）ＭＥＫ阻害剤のトラメチニブの存在下又は不存在下でのＳ１Ｐ及びＬＰＡで処理された３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）（緑色）、ｋｉ６７（赤色）及び核ＤＮＡ（青色）についての免疫蛍光。Ｅ）（Ｄ）におけるｋｉ６７陽性心筋細胞（ＣＭ）のパーセンテージの定量。＊はＰ＜０．００１を示す。Ｆ）５μＭのＳ１Ｐ受容体アンタゴニストのＶＰＣ２３０１９の存在下又は不存在下での生理活性脂質Ｓ１Ｐで処理された３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）（緑色）、ｋｉ６７（赤色）及び核ＤＮＡ（青色）についての免疫蛍光。Ｇ）５μＭのＶＰＣ２３０１９を伴う又は伴わないＳ１Ｐ処理後のｋｉ６７陽性ＣＭのパーセンテージの定量。Ｈ）分化したｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける生理活性脂質と古典的ＭＡＰＫ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路との間の連係を図解するモデル。Ｎ＝４。
【図２０Ａ−２０Ｂ】生理活性脂質Ｓ１Ｐ及びＬＰＡは、核内β−カテニンを増加させるが、初期中胚葉分化を誘導しないことを報告する図である。Ａ）０時間（ｈｒ）後、０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１６時間後、及び２４時間後の核内β−カテニン蓄積に対する時間経過研究。矢印は、深在性の核内β−カテニンを発現する細胞を示している。Ｂ）ＧＳＫ３β阻害剤のＣＨＩＲ９９０２１、生理活性脂質のＳ１Ｐ及びＬＰＡ、又はＤＭＳＯコントロールと一緒に２４時間培養されたｈｉＰＳＣにおける、多能性マーカーのＮａｎｏｇ（緑色）、初期中胚葉マーカーのブラキウリ（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）についての免疫蛍光。グラフは、列記された処理についてのブラキウリ（Ｂｒｙ）陽性細胞のパーセンテージの定量を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。＊はＰ＜０．０５を示す。Ｎ．Ｓ．＝有意でない。Ｎ＝３。
【図２１Ａ−２１Ｂ】ｈｉＰＳＣ−ＣＭが、最終分化に際して関連のＳ１Ｐ及びＬＰＡ受容体を発現し、Ｓ１Ｐ／ＰＡ処理に応答することを報告する図である。Ａ）５つの異なるｈｉＰＳＣ−ＣＭ系統からの３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭのトランスクリプトームプロファイリング。高いＴＮＮＴ２及び低いＰＥＣＡＭ１は、それぞれ高い心筋細胞純度及び低い内皮細胞コンタミネーションを示す。ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｓｅｑトランスクリプトームプロファイルを使用して行われた発現プロファイリング。エラーバーはＳＥＭを表す。Ｂ）生理活性脂質ＬＰＡ及びＳ１Ｐは、最終分化の種々の時点でｋｉ６７発現を誘導する。約２０日目及び約５０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＳ１Ｐ及びＬＰＡ、ＩＧＦ又はＤＭＳＯによる４８時間の処理後のα−アクチニン（緑色）、ｋｉ６７（赤色）及びｄａｐｉ（青色）についての免疫蛍光。
【図２２Ａ−２２Ｄ】３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける運動由来の収縮性パラメーターを報告する図である。Ａ）高解像度及び高周波数の動画から生成されたＤＭＳＯ、ＣＨＩＲ９９０２１、又はＳ１Ｐ／ＬＰＡで処理した３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭの代表的なヒートマップ（赤色＝高運動、青色＝低運動）。収縮頻度（拍動／分）Ｂ）、収縮変形距離Ｃ）、及び収縮速度Ｄ）を表すグラフ。データは平均として表される。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２３Ａ−２３Ｂ】ＬＰＡが、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＹＡＰ核内蓄積を増加させ得ないことを報告する図である。Ａ）ＤＡＰＩ（青色）、総ＹＡＰ（緑色）及び細胞型特異的マーカー（赤色）（ｈｉＰＳＣ用にＴｒａ−１−８１及びｈｉＰＳＣ−ＣＭ用にα−アクチニン）についての、未処理のｈｉＰＳＣ、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ及び非ＣＭ中胚葉派生物（黄色のボックスによって示される）における免疫蛍光染色。黄色の矢印により表示された代表的な細胞によって示されるように、ＹＡＰはベースラインで全ての３つの細胞型で核に局在化している。Ｂ）下流のＨｉｐｐｏ経路の転写エフェクターＹＡＰについて染色（緑色）された、ＬＰＡでの処理あり及び処理なしの純化された１０日目又は３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭについてのＹＡＰ免疫蛍光。１０日目又は３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭに対するＬＰＡ処理後に見られたＹＡＰの核内蓄積又はβ−カテニン移行における有意でない（Ｎ．Ｓ．）増加。条件につきＮ＝９の画像で細胞を定量した。データは平均±ＳＴＤとして表される。
【図２４】生理活性脂質が、未分化ｈｉＰＳＣにおいてＥＲＫリン酸化を変化させないことを報告する図である。５分間のＳ１Ｐ及びＬＰＡ（Ｓ＋Ｌ）処理あり及び処理なしで、未分化ｈｉＰＳＣにおいてＥＲＫ１／２リン酸化が行われた。ＥＲＫ１／２リン酸化及び抗体コントロールに対応するスポットが標識されている。
【図２５】Ｓ１Ｐ及びＬＰＡが、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいてＭＡＰＫ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達を活性化することを報告する図である。図１９の完全版。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ（各１０μＭ）を伴って又は伴わずに、小分子ＭＥＫ阻害剤トラメチニブで処理された及び処理されていない３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭで行ったキナーゼアッセイ。ＥＲＫリン酸化及び抗体コントロールに対応するスポットが標識されている。
【図２６】Ｓ１Ｐ及びＬＰＡが、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいて成熟又はサブタイプ特異化を変化させないことを報告する図である。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ（各１０μＭ）で処理された及び処理されていない３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭで行ったＱＰＣＲ遺伝子発現分析。心房、心室及び結節のサブタイプに対応する遺伝子並びに成熟マーカーが標識されている。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図２７】生理活性脂質Ｓ１Ｐ及びＬＰＡで処理されたｈｉＰＳＣ及びｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいてスクリーニングされた種々のリン酸化キナーゼのパネルを示す表Ｓ１である。表中、アスタリスク（＊）の付いたタンパク質は、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理後のリン酸化において有意な変化（Ｐ＜０．０５）を示している（図１９Ａ〜図１９Ｈも参照）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
一態様では、本開示は、ヒト拍動心筋細胞を含む拍動心筋細胞を増殖させる方法を提供する。この方法は、拍動心筋細胞を１種以上のＷＮＴアゴニスト、１種以上の生理活性脂質、又は１種以上のＷＮＴアゴニストと１種以上の生理活性脂質との組み合わせで処理することを含む。
【００２６】
本開示では、「拍動心筋細胞」という用語は、心筋細胞、心筋肉細胞、心臓筋肉細胞、筋肉心細胞、及び／又は心臓筋細胞等の他の用語と区別なく使用される。心筋細胞（ＣＭ）は、心臓筋肉を構成する細胞である。本開示では、「心筋細胞」は、心臓組織から単離された初代心筋細胞も、例えば幹細胞の分化等の組換え技術によって得られた心筋細胞も指す。
【００２７】
本開示では、心筋細胞は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞前駆細胞及び／又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は任意の他の心筋細胞前駆細胞等の多能性幹細胞の分化によって得られるものを含む。本開示では、ヒトｉＰＳ（ｈｉＰＳ）細胞を含むｉＰＳ細胞は、心筋細胞を得るために特に好ましい。本開示では、ｉＰＳ細胞に由来する心筋細胞は、ｉＰＳ由来の心筋細胞又は心筋細胞と区別なく呼称され得る。
【００２８】
拍動心筋細胞を１種以上のＷＮＴアゴニスト、１種以上の生理活性脂質、又は１種以上のＷＮＴアゴニストと１種以上の生理活性脂質との組み合わせで処理する本発明によって、初代拍動心筋細胞又は多能性幹細胞に由来するあらゆる拍動心筋細胞を増殖させることができる。本増殖法は、それらの増殖を刺激することにより、拍動心筋細胞の数を効果的に増加させる。拍動心筋細胞は典型的には、組織培養でさえも効果的に増殖しない非分裂細胞であるので、この結果は極めて予想外である。
【００２９】
拍動心筋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで収縮／弛緩周期を経るその能力を保持する。拍動心筋細胞の収縮性を検出し、高解像度の動画で記録することができる。追加の免疫組織化学試験を実施して、サルコメア配列を定量することができる。他の試験には、拍動心筋細胞の電位を鮮明な電流固定モードで記録する電気生理学的研究が含まれ得る。
【００３０】
「Ｗｎｔアゴニスト」という用語は、単独で又は他の試薬と組み合わせて、細胞内の古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する任意の試薬を意味する。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化とは、β−カテニンが細胞核に移行するβ−カテニンシグナル伝達の活性化を意味する。本開示の目的で、単独の又は他の試薬と組み合わせた、核内β−カテニンを有する拍動心筋細胞を生成する任意の試薬は、Ｗｎｔアゴニストと呼称される。
【００３１】
Ｗｎｔアゴニストには、小化合物、ペプチド、タンパク質、抗体及びそのフラグメント、ｓｉＲＮＡ、並びに代替ポリペプチドが含まれる。ＷＮＴアゴニストにはＧＳＫ３β阻害剤が含まれる。化合物ＣＨＩＲ９９０２１（Selleckchem社から入手可能なアミノピリミジン誘導体）は、１種の好ましいＧＳＫ３β阻害剤である。本開示では、ＣＨＩＲ９９０２１は、ＣＨＩＲと区別なく呼称され得る。別の好ましいＧＳＫ３β阻害剤は、ＢＩＯ（Sigma-Eldridge社から入手可能な６−ブロモインジルビン−３'−オキシム）である。
【００３２】
適切なＷｎｔアゴニストには、国際公開第２０１６０４０８９５号に開示されるような、Ｌｒｐ５／６と共にＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体を二量体化する代替ポリペプチドも含まれる。これらの代替ポリペプチドは、１以上のＦｚｄタンパク質に対して少なくとも１×１０−７ＭのＫＤで特異的親和性を有する結合ドメインと、Ｌｒｐ５タンパク質及びＬｒｐ６タンパク質の少なくとも一方又は両方に対して少なくとも１×１０−７ＭのＫＤで特異的親和性を有する結合ドメインとを含む。
【００３３】
Ｆｚｄ結合ドメインは、ノーリンタンパク質又はその結合断片であり得る。Ｆｚｄ結合ドメインは、抗Ｆｚｄ抗体の６つのＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖであり得る。特に好ましいＦｚｄ結合ドメインは、汎特異的Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５の６つのＣＤＲ領域を含む。Ｆｚｄ結合ドメインは、新たに設計されたＦｚｄ結合ドメインであり得る。
【００３４】
Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、ＤＫＫタンパク質の結合部を含み得る。特に、Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、ヒトＤＫＫ１のＣ末端ドメインを含み得る。
【００３５】
特に好ましい代替物のＷｎｔアゴニストは、国際公開第２０１６０４０８９５号に開示され、リンカーを介してヒトＤＫＫ−１のＣ末端ドメインに連結されたＯＭＰ−１８Ｒ５抗体（Oncomed社から入手可能）のｓｃＦｖフラグメントを含むＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃである。
【００３６】
適切なＷｎｔアゴニストには、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３又はＲ−スポンジン４とも呼ばれるＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３及びＲＳＰＯ４を含むＲＳＰＯファミリーのタンパク質リガンドも含まれる。適切なＷｎｔアゴニストには、Ｗｎｔ３（Ｗｎｔファミリーメンバー３）タンパク質及びＷｎｔアゴニストとして機能し得るそれらの任意の誘導体が更に含まれる。適切なアゴニストには、Ｗｎｔ３Ａ及びＷｎｔアゴニストとして機能し得るその任意の誘導体が更に含まれる。
【００３７】
ＷＮＴアゴニストのいずれか１種を他の任意のＷｎｔアゴニストと組み合わせて使用することができる。好ましい組み合わせの幾つかは、Ｗｎｔ３Ａ及び少なくとも１種のＲ−スポンジンタンパク質を含み得る。他の組み合わせは、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃと少なくとも１種のＲ−スポンジンタンパク質との組み合わせを含み得る。
【００３８】
生理活性脂質は、単独であるか、又はＷｎｔアゴニストとの共刺激物質として、細胞シグナル伝達経路を調節する脂質である。生理活性脂質には、多価不飽和脂肪酸及び一不飽和脂肪酸、リン脂質誘導体、並びに３炭素グリセロール骨格上のヒドロキシル基の１つが非エステル化のままである糖リン脂質ファミリーのサブグループであるリゾリン脂質が含まれる。リゾリン脂質は脂肪酸を１種だけ含んでいる。適切な生理活性脂質には、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、及びそれらの２つの化合物の組み合わせが含まれる。任意の他の適切な生理活性脂質には、心筋細胞の分化及び／又は増殖を刺激する又は１種以上のＷｎｔアゴニストと一緒に共刺激するあらゆる生体脂質（biolipids）が含まれる。
【００３９】
拍動心筋細胞を「処理する」及び／又はその「処理」という用語は広く理解されており、拍動心筋細胞が少なくとも幾つかのＷｎｔアゴニスト及び／又は生理活性脂質に曝されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでのあらゆる処置を含み得る。上記処理は、拍動心筋細胞をＷｎｔアゴニスト及び／又は生理活性脂質の少なくとも１種を含む配合物と共にインキュベートすることを含み得る。幾つかの実施形態では、拍動心筋細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートされる場合に、Ｗｎｔアゴニスト及び／又は生理活性脂質の少なくとも１種は溶剤中に溶解されて、組織培養培地に添加され得る。適切な溶剤には、水、バッファー、組織培養培地、有機溶剤及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【００４０】
幾つかの実施形態では、上記処理は、Ｗｎｔアゴニスト及び／又は生理活性脂質の少なくとも幾つかを患者の臓器及び／又は組織に投与することを含み得る。その投与には、静脈内注射若しくは心臓組織への直接注射を含む注射、パッチ及び／又は経口投与が含まれ得る。
【００４１】
心筋細胞を増殖させる本方法では、拍動心筋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１種以上のＷＮＴアゴニスト、１種以上の生理活性脂質、又は１種以上のＷＮＴアゴニストと１種以上の生理活性脂質との組み合わせで処理され得る。処理は１日〜１２０日の期間にわたり施され得る。
【００４２】
好ましい一実施形態では、拍動心筋細胞は、少なくとも１種のＷｎｔアゴニストと少なくとも１種の生理活性脂質との組み合わせを１日〜１２０日の期間にわたり組織培養培地に添加することによって処理される。生理活性脂質は１μＭ〜５０μＭの範囲内の最終濃度で添加され得る。ＧＳＫ３β阻害剤は１μＭ〜５０μＭの範囲内の最終濃度で添加され得る。Ｆｚｄリガンド及びＬｒｐ５／６リガンドを含む代替ポリペプチド等の組換えＷｎｔアゴニストは、１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲内の最終濃度まで添加され得る。
【００４３】
好ましい一実施形態では、拍動心筋細胞は、組織培養培地にＳ１Ｐ及びＬＰＡをそれぞれ１μＭ〜５０μＭの最終濃度で添加することによって処理される。別の好ましい実施形態では、拍動心筋細胞は、１μＭ〜５０μＭの最終濃度のＳ１Ｐ及びＬＰＡと、これまた１μＭ〜５０μＭの最終濃度のＣＨＩＲ９９０２１及びＢＩＯのうちの少なくとも１種とで処理される。更なる実施形態では、拍動心筋細胞は、１μＭ〜５０μＭの最終濃度のＳ１Ｐ及びＬＰＡと、１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度の組換えＷＮＴアゴニストのＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ又はＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジンのうちの少なくとも１種とで処理される。更なる実施形態では、拍動心筋細胞は、１μＭ〜５０μＭの最終濃度のＳ１Ｐ及びＬＰＡと、これまた１μＭ〜５０μＭの最終濃度のＣＨＩＲ９９０２１及びＢＩＯのうちの少なくとも１種と、１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度の組換えＷＮＴアゴニストのＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ又はＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジンのうちの少なくとも１種とで処理される。拍動心筋細胞はまた、心筋細胞を１μＭ〜５０μＭのＣＨＩＲ９９０２１及びＢＩＯのうちの少なくとも１種で処理すること、及び／又は１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度の組換えＷＮＴアゴニストのＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ又はＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジンのうちの１種以上で処理することによって産生され得る。
【００４４】
更なる態様は、拍動心筋細胞を１種以上のＷｎｔアゴニスト、１種以上の生理活性脂質、又は１種以上のＷｎｔアゴニストと１種以上の生理活性脂質との組み合わせで処理することによって得られた心筋細胞を提供する。
【００４５】
更なる態様では、本開示は、多能性幹細胞から心筋細胞を産生する方法を提供する。
【００４６】
多能性幹細胞には、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞前駆細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が含まれる。他の型の多能性細胞を同様に使用することができる。本開示では、ヒトｉＰＳ（ｈｉＰＳ）細胞を含むｉＰＳ細胞は、心筋細胞を得るために特に好ましい。ヒトｉＰＳ細胞を含むｉＰＳ細胞は、リプログラミングによって成体細胞から生成される多能性幹細胞である。ｉＰＳは、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＭＹＣを発現するように細胞をリプログラミングすることにより、ケラチノサイト又は血液細胞又は幾つかの他の適切な細胞から得ることができる。
【００４７】
本開示は、多能性幹細胞を１種以上の生理活性脂質と１種以上のＷＮＴアゴニストとの組み合わせで処理し、該幹細胞を拍動心筋細胞へと分化させることによって、拍動心筋細胞を生成する方法を提供する。予想外にも、多能性幹細胞から拍動心筋細胞を産生するための本方法では、生理活性脂質とＷＮＴアゴニストとの間に相乗作用がある。これらの方法では、ｈｉＰＳ細胞を含むｉＰＳ細胞が特に好ましい。本方法において特に好ましい生理活性脂質は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）及びリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）であり、これらは個別に又は組み合わせて使用することができる。好ましい方法は、Ｓ１ＰとＬＰＡとの組み合わせを含む。同様に、他の生理活性脂質を添加することもできる。
【００４８】
多能性幹細胞を拍動心筋細胞へと分化させる本方法では、任意のＷＮＴアゴニストを１種以上の生理活性脂質と組み合わせて使用することができる。そのようなＷＮＴアゴニストにはＧＳＫ３β阻害剤が含まれる。ＣＨＩＲ９９０２１及び／又はＢＩＯは、本方法において１種以上の生理活性脂質と組み合わせて使用することができる。また、１種以上の生理活性脂質とＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、Ｆｒｄリガンド及びＬｐｒ５／６リガンドを含むＷｎｔ代替物からの１種以上のＷＮＴアゴニストとを用いて方法を実施することもできる。
【００４９】
多能性幹細胞を拍動心筋細胞へと分化させる本方法の幾つかでは、多能性幹細胞は、組織培養において１種以上の生理活性脂質と１種以上のＷＮＴアゴニストとで１時間〜１０日の期間にわたり処理される。生理活性脂質は、組織培養培地にそれぞれ１μＭ〜５０μＭの最終濃度で添加される。ＣＨＩＲ９９０２１及び／又はＢＩＯは、組織培養培地にそれぞれ１μＭ〜５０μＭの最終濃度で添加される。ＷＮＴアゴニストのＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ＋Ｒ−スポンジン、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、ＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ＋Ｒ−スポンジン、又はそれらの任意の組み合わせは、組織培養培地にそれぞれ１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加される。
【００５０】
当業者であれば、１種以上の生理活性脂質と１種以上のＷｎｔアゴニストとの組み合わせを、任意の多能性幹細胞を拍動心筋細胞に分化させるための任意のプロトコルで使用することができることを理解するであろう。これらの分化プロトコルには、Ｗｎｔアゴニストを分化の第１段階の間に添加した後に、Ｗｎｔアンタゴニストを分化の第２段階の間に添加する２段階のＷｎｔシグナル伝達プロトコルが含まれる。２段階のＷｎｔシグナル伝達プロトコルでは、多能性幹細胞、すなわちｉＰＳ細胞は、上記プロトコルの第１段階の間に１種以上の生理活性脂質と１種以上のＷｎｔアゴニストとの組み合わせで処理される。
【００５１】
本開示の更なる態様は、ヒト心筋細胞を得る方法であって、
１）ｈｉＰＳ細胞をプロトコルの第１段階の間の任意の時点で１種以上のＷｎｔアゴニスト及び１種以上の生理活性脂質で処理し、引き続きプロトコルの第２段階の間に１種以上のＷｎｔアンタゴニストで処理する２段階のＷｎｔシグナル伝達プロトコルを介して、ｈｉＰＳ細胞を拍動心筋細胞へと分化させることと、
２）上記拍動心筋細胞を１種以上の生理活性脂質、１種以上のＷｎｔアゴニスト、又は１種以上の生理活性脂質と１種以上のＷｎｔアゴニストとの組み合わせで処理することによって、拍動心筋細胞を増殖させることと、
を含む、方法を含む。
【００５２】
更なる態様は、１種以上の生理活性脂質と１種以上のＷｎｔアゴニストとの組み合わせをプロトコルの第１段階の間に使用する２段階のＷｎｔプロトコルを介して、多能性幹細胞、好ましくはｈｉＰＳ細胞を分化させることにより得られるヒト拍動心筋細胞を含む。ｈｉＰＳ細胞が分化した拍動心筋細胞（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）を、１種以上の生理活性脂質、１種以上のＷｎｔアゴニスト、又は１種以上の生理活性脂質と１種以上のＷｎｔアゴニストとの組み合わせで処理することによって、ｈｉＰＳ細胞が分化した拍動心筋細胞を更に増殖させることができる。
【００５３】
本方法により提供される技術的利点の１つは、拍動心筋細胞は、典型的には非増殖細胞であるため、以前は達成が困難であった拍動心筋細胞を大量に産生することである。本方法によって産生される拍動心筋細胞は、拍動心筋細胞を薬物と接触させた後に、薬物の心筋細胞に対する効果をモニタリングするハイスループット薬物スクリーニングを含む、多くの用途で使用され得る。多くの薬物は心筋に対して細胞毒性がある。拍動心筋細胞を用いたハイスループット薬物スクリーニング法は、スクリーニングを組織培養で行うことができるので、細胞毒性の可能性がある薬物の迅速な同定を可能にし得る。
【００５４】
特に好ましい実施形態は、ｈｉＰＳ細胞からの心筋細胞分化を促進するために生理活性脂質Ｓ１Ｐ及びＬＰＡを使用する方法を含む。ＣＨＩＲ９９０２１と一緒の、未分化ｈｉＰＳ細胞におけるＳ１Ｐ及びＬＰＡの処理は、核内β−カテニン蓄積及び中胚葉表現型を相乗的に増加させる。ｈｉＰＳＣ−ＣＭ分化の後期では、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡの処理により、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞周期活性がＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達を介して刺激され、細胞増殖が促進される。
【００５５】
更なる態様は、心疾患の治療を必要とするヒト患者を治療する方法を含む。患者は、本分化法及び／又は本増殖法によって得られた拍動心筋細胞を患者の心臓に投与することによって治療され得る。上記治療法は、限定されるものではないが、先天性心疾患、心筋梗塞からの変性、癌療法のためのアントラサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤等の心毒性剤からの変性、アルコール、シャーガス病若しくはライム病を引き起こす細菌等の細菌、心筋炎を引き起こすウイルス等の環境曝露からの変性、又は遺伝的／遺伝性心筋症からの変性を含む、心筋細胞の変性に関連するあらゆる心疾患に対して有益であり得る。
【００５６】
上記治療法は、患者の心臓に適用されるパッチを介して、拍動心筋細胞を患者に投与することを含み得る。拍動心筋細胞を、同様にパッチに含まれ得る１種以上の生理活性脂質及び１種以上のＷｎｔアゴニストと組み合わせて投与することもでき、又はそれらを、例えば静脈内注射を介して又は経口により患者に別々に投与することもできる。
【００５７】
更なる態様は、患者を心疾患から治療する方法であって、患者に１種以上のＷｎｔアゴニスト、Ｗｎｔ代替物、生理活性脂質、及び／又はそれらの任意の組み合わせを投与することを含む、方法を提供する。
【００５８】
更なる態様では、本開示は、心疾患を治療するためのキットを提供する。上記キットは、本分化法及び／又は本増殖法の１つによって得られた拍動心筋細胞を含む。上記キットは、１種以上の生理活性脂質及び／又は１種以上のＷｎｔアゴニストを更に含み得て、例えばパッチとして設計されたマトリックスゲル等の細胞の送達のための媒体を更に含み得る。
【００５９】
更なる態様では、本開示は、本分化法及び／又は本増殖法によって得られた拍動心筋細胞から作製された組織工学血液ポンプ（tissue engineered blood pump）を提供する。本開示はまた、心臓疾患又は血管疾患から患者を治療する方法を提供する。上記方法は、組織工学血液ポンプを患者に投与することを含む。
【００６０】
本開示は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達刺激が、拍動心筋細胞（ＣＭ）の大量の増殖及び多数の継代を可能にする方法を提供する。Ｗｎｔアゴニストの中止は、急速な細胞周期離脱をもたらし、ＣＭの正常な収縮特性、電気生理学的特性及び細胞特性の回復をもたらす。
【００６１】
一態様では、このシステムを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖されたＣＭから機能的な心臓組織を作製し、成体心臓組織内でｉｎ  ｖｉｖｏで心筋成長を刺激し、これを患者固有の心筋の再生のために使用することができる。
【００６２】
心臓再生医療の「究極の目標」は、心筋梗塞後に機能的な心臓組織の回復を維持することである。しかしながら、この目標への大きな障害のため、患者固有の人工心臓組織の生成を可能にするための、或いはまた既存のＣＭの細胞分裂を増大させるための豊富な数のＣＭを生成することができずにいた。これまでに、ｈｉＰＳ細胞からのＣＭの増殖及び多数の継代は、極めて挑戦的であり大抵は上手くいかない課題であった。本開示は、この要求に対処することを目的とし、段階特異的な小分子のＧＳＫ３阻害剤処理に連続的に曝された場合に、未成熟なｈｉＰＳＣ−ＣＭが多数の継代にわたり大量に増殖する方法を提供する。これによりＣＭの純化が高められる（図１）。
【００６３】
ＧＳＫ３β阻害剤の中止後に、ＣＭは増殖を止め、自発的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで正常に成熟する能力を保持する（図２）。前臨床用途の実証として、事前に増殖されたＣＭを利用して、機能的な３次元心臓組織を作製した（図１２）。さらに、静止期ｈｉＰＳＣ−ＣＭ及び成体マウス心臓におけるＷｎｔ代替物受容体アゴニストによる古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の刺激は、ＣＭの複製を誘導し、心筋の成長を促進する（図６及び図７）。
【００６４】
幾つかの以前の研究は、様々なＧＳＫ３阻害剤による拍動心筋細胞の一過性の増殖を示しているが、多数の継代は可能ではなかった（非特許文献３０、Titmarsh et al., 2016、Uosaki et al., 2013）。最も可能性が高い理由は、これらの研究では他の種からの多能性幹細胞由来のＣＭが使用され、分化の後期の時点で処理が開始され、培養培地がウシ胎児血清を含み、及び／又は解離及び継代の際に失う細胞が多すぎることである。それに対して、本開示は、１２日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭを化学的に定義された培地及びＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされた単層培養で維持した場合に、それらのｈｉＰＳＣ−ＣＭを、継代後に推定９０％超の生存率で３回〜５回まで継代することができ、それによりＣＭ数の大幅な増加を獲得し得ることを提供する（図１）。
【００６５】
最近の２つの研究では、心血管前駆細胞の増殖に着目し、精製タンパク質、小分子及び／又は癌遺伝子の過剰発現の組み合わせにより、１０７倍及び１０１０倍の増殖が示された（非特許文献１４、非特許文献１８）。心血管前駆細胞の増殖能力は、ｈｉＰＳＣ−ＣＭの増殖と比べて高いにもかかわらず、多能性心血管前駆細胞の分化は依然として制御不能なプロセスのままであり、結果として最終分化時には混合された細胞集団が生ずる。本方法は、前駆細胞ではなく拍動ｈｉＰＳＣ−ＣＭを増殖させ（図９Ａ及び図９Ｂ）、再現的な後続の用途のために有益であるように、増殖の間に頑強に９５％を上回るＴｎＴ純度をもたらす（図１Ｈ及び図１Ｉ及び図１３）。ＣＨＩＲの中止後に、これらの心筋細胞は正常に成熟し、コントロールと同等のサルコメア組織化、電気生理学及び力発生を示す（図２）。
【００６６】
最終分化ＣＭの独特な特徴は、一生に何十億回もの収縮を伝播するように高度に組織化されたサルコメア構造を含む細胞骨格と一体になってそれらが増殖する可能性には限界があることである。最近の報告では、ＣＭ細胞分裂は主に単核二倍体細胞の画分内で生ずるが、四倍体又は多核化されたＣＭでは生じないこと、そしてサルコメア調節物質のＴＮＮＩ３ｋは、心臓のこれらのＣＭ集団間でのこの食い違いと相関していることが示された（Patterson et al., 2017）。
【００６７】
図２では、本開示は、増殖性細胞が単核化されていることを示している。図３では、本開示は、ＣＨＩＲの中止後に、多核化された細胞が増加し、増殖性細胞が減少したことを示している。本開示で示されるように、単一細胞ＲＮＡシーケンシングデータは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化のほとんどがＣＭの相対的な未成熟状態を維持し、それによりそれらの増殖ウィンドウが拡張されることを明らかにしている（図３）。このデータは、未成熟ＣＭ集団が増殖して心筋を再生するという以前のｉｎ  ｖｉｖｏでの所見と一致している（Kikuchi et al., 2010、Patterson et al., 2017）。
【００６８】
様々な研究では、Ｗｎｔシグナル伝達は心臓の成長及びＣＭの分裂に関連付けられているが、本開示では、代わりにＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達がＣＭの未成熟性を保持することで、この増殖性ＣＭのサブセットについての増殖ウィンドウが拡張されるという所見が得られている（図３及び図４）（非特許文献３０、Heallen et al., 2011、Kerkela et al., 2008、Titmarsh et al., 2016、Tseng et al., 2006、Uosaki et al., 2013）。これは概念的に新規であり、成体ではなく幼若マウスにおけるＷｎｔシグナル伝達に対する希少なＣＭ増殖応答についての機構的説明を形成する（図６）。
【００６９】
哺乳動物の心臓の生物学は、心臓の損傷に対する応答時にＷｎｔシグナル伝達が活性となる再生能力を有する比較的未成熟なゼブラフィッシュの心臓とは全く異なると思われる（Kikuchi et al., 2010、Stoick-Cooper et al., 2007）。最近の哺乳動物の研究により、再生を駆動する既存のＣＭの希少な集団が単核二倍体細胞であることが実証された（Patterson et al., 2017）。
【００７０】
本方法により得られた増殖性ＣＭが心房系譜又は心室系譜に向けてもう運命決定を行ったかどうかは明らかではないが、シーケンシングデータは、ＳＬＮ及びＨＥＹ１の発現によって特徴付けられる心房様集団についての証拠だけでなく、ＭＹＬ２と未成熟心室マーカーのＭＹＬ３及びＭＹＬ４とが富化された心室様集団についての証拠も提供する（Josowitz et al., 2014、Kurabayashi et al., 1988、非特許文献２２）。興味深いことに、心房様集団及び心室様集団は両方ともＷｎｔ刺激に応答し、ＣＨＩＲ処理された全ての細胞は再び心房様サブクラスター及び心室様サブクラスターと一緒になって異なるクラスターを形成した（図３）。β−カテニンシグナル伝達とは独立して、本開示は、ＣＨＩＲ／ＧＳＫ３が細胞質内のＡＫＴのターンオーバーを調節することを示している（図５）。重要なことに、本開示は、この成分が成熟変化の一部の原因となると共に、図１に見られるＣＨＩＲ曝露によって観察された増殖応答の約５０％の原因となることを示している。
【００７１】
本開示は、最終的に更に成熟する能力を保持する機能的に未成熟なＣＭの頑強で長期的なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖を提供し、したがって解明用途での有用性を提供する。本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達がＣＭの未成熟性を維持し、結果としてｈｉＰＳＣ−ＣＭの段階特異的な増殖を増加させる上で重要な役割を担うという概念的に新規の原理を示している。さらに、本開示は、成体心筋の成長を調節するためのｉｎ  ｖｉｖｏアプローチも提供する。これらの方法は、様々な個別療法のための患者特異的なＣＭ産生の規模拡大だけでなく、心臓修復のための新規のｉｎ  ｖｉｖｏ再生アプローチにも重要な影響を与える。
【００７２】
予想外にも、本開示はまた、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡがＧＳＫ３β阻害剤のＣＨＩＲと相乗的に作用して、核内β−カテニン蓄積を通じて初期ｈｉＰＳＣ中胚葉分化を調節することも示している。後期段階には、Ｓ１ＰとＬＰＡとの組み合わせ処理により、分化したｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞周期の活性化といった、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達により媒介されて、β−カテニンシグナル伝達と相乗作用することで、心筋細胞の増殖が増加する効果をもたらす。生理活性脂質は、ｈｉＰＳ細胞からの心臓分化に対して段階特異的な効果を示す。
【００７３】
本開示は、ｈｉＰＳＣ−ＣＭの分化の間のＳ１Ｐ／ＬＰＡに関する高度に段階特異的な役割を報告している。未分化ｈｉＰＳ細胞に単独で又はＣＨＩＲと組み合わせて投与すると、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡは、核内β−カテニンレベルを増加させ、中胚葉誘導を高める。心筋細胞分化の完了後に、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡの添加は、ＭＡＰＫ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の活性化によりｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞周期の再進入を引き起こし、ＣＨＩＲに誘導される心筋細胞増殖の増加を引き起こす。これらの所見は、ヒト心筋細胞発生に対するシグナル伝達経路の効果を研究するためのｈｉＰＳ細胞分化プラットフォームの汎用性を説明している。さらに、生理活性脂質の処理により分化したヒト心筋細胞を大量生産する能力は、心疾患モデリングのためのハイスループットアッセイの開発及び将来的な再生用途のための新しい分子の発見に使用することができる。
【００７４】
Ｓ１Ｐ及びＬＰＡが、未分化ｈｉＰＳ細胞における形態変化及び遺伝子発現の変化を急速に誘導する能力は予想外の所見である。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理の開始から１２時間〜２４時間以内に、ｈｉＰＳ細胞の形態に急速な変化が観察される。これらの変化はまた、ｈｉＰＳ細胞における中間フィラメントタンパク質のビメンチンの発現の増加といった、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の誘導を示唆する所見も伴う。
【００７５】
しかしながら、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理により、処理の２４時間後にＮａｎｏｇの発現の低下がもたらされなかったことから、ｈｉＰＳＣ心臓分化に対するＳ１Ｐ／ＬＰＡの全体的な効果ではなく、より中胚葉特異的な効果が示唆される（図２２Ｂ）。ＥＭＴの証しとなるのは、接着結合複合体によって通常介在される細胞間接触の喪失である（Lamouille et al. 2014）。
【００７６】
リゾリン脂質は、これらの接着結合を解離し、細胞間接触を劇的に緩め、接着結合により結合されたβ−カテニンを細胞質に放出する能力に関して十分に確立されている（Kam et al. 2009、Burkhalter et al. 40）。重要なことには、β−カテニンはまた、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のための下流の核転写エフェクターとしても機能する（非特許文献３３）。
【００７７】
Ｓ１Ｐ／ＬＰＡによる処理は、ｈｉＰＳＣにおいてβ−カテニンの細胞質及び核内の蓄積を急速に誘導する。したがって、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理はＣＨＩＲに媒介されるＧＳＫ３β阻害と相乗作用して、細胞質β−カテニンの全体的なプールを増大させ、その核内移行を促進する（図１６Ｄ）。β−カテニンの細胞質プールの増加を促進すること以外に、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理は、種々の機構を介してビメンチン発現の増加を誘導するように思われる。それというのも、Ｗｎｔ阻害剤が存在すると、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡがビメンチン発現を模する能力を抑止することができないからである。
【００７８】
β−カテニンの核内局在化の増加は、β−カテニンの安定化（すなわち、ＧＳＫ３βに媒介される分解の防止）又は原形質膜でのＥ−カドヘリンからのβ−カテニンのより多くの放出が原因である可能性がある。しかしながら、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡが、Ｂｒｙ  Ｔ等の初期中胚葉マーカーを直接誘導することできないことは（図１７Ｄ及び図１７Ｅ）、β−カテニンの核内移行の促進に加えて、ｈｉＰＳ細胞分化に対するそれらの独立した効果を裏付けている。これは、更にＬＥＦ／ＴＣＦレポーター発現に対するＳ１Ｐ／ＬＰＡの強力な作用が見られないことによって裏付けられ（図１６Ｃ、図１９Ａ）、こうしてｈｉＰＳＣの心筋細胞分化に対するＷｎｔ／β−カテニン非依存的な機構の関与が示唆される。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡによる中胚葉誘導に関与する追加のシグナル伝達経路の特定は、ｈｉＰＳＣ心臓分化を更に改善するのに役立ち得る。
【００７９】
Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理が、高分化型ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＭＡＰＫ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の強力かつ迅速な上方調節を誘導したという所見は予想外である。細胞増殖の既知の調節因子であるＥＲＫシグナル伝達を誘導するＳ１Ｐ／ＬＰＡの能力は、他の細胞型において説明されている（Hannun et al. 2008）。ＭＡＰＫ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路は、ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブでの処理がこれらの効果を効果的に消失させることを示すことによって、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡに誘導されるＥＲＫリン酸化及び細胞周期の再進入のために必要とされる（図１９Ｄ及び図１９Ｅ）。ＭＥＫシグナル伝達の関与は、ＥＲＫリン酸化に対抗する以前に報告されたＭＥＫの標的であるＨＳＰ２７リン酸化のＳ１Ｐ／ＬＰＡに誘導される下方調節によって更に裏付けられる（McMullen et al. 2005）。
【００８０】
興味深いことに、心筋細胞増殖に関与する既知の経路であるＰＩ３−Ａｋｔ経路（Lin et al. 2015）は、ベースラインで又はＳ１Ｐ／ＬＰＡ処理によって活性化されなかった。これは、これらのｈｉＰＳＣ−ＣＭが表現型的に未成熟であるか又はＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達を刺激するための至適培養条件を欠いていることを理由とし得る。これらの所見は、成体の心筋細胞分裂におけるＥＲＫ及びＹＡＰのシグナル伝達の関与を裏付ける最近の研究（Bassat et al. 2017）とも一致し、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの送達が心筋細胞分裂も増大し得ることを示唆している。
【００８１】
生理活性脂質及び／又はＷｎｔアゴニストを用いる本方法はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで胎児又は新生児の心筋細胞にも適用することができる。
【００８２】
ｈｉＰＳＣ分化及びｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖に対する生理活性脂質の段階特異的効果は、心筋細胞へのヒトｉＰＳＣ分化の増大における生理活性脂質の役割を裏付けている。ＣＭへのｈｉＰＳ細胞分化の効率は、近年著しく増加しているが、ヒトｉＰＳＣ系統間及び同じ系統からの異なる分化バッチ間では、依然として大きなばらつきがある。本開示は、心血管生物学における生理活性脂質の役割のより深い理解と、心血管疾患モデリング、薬物スクリーニング及び再生医療における下流の用途に使用することができるｈｉＰＳＣ−ＣＭの産生を高める新規の手段とを提供する。
【実施例】
【００８３】
実施例１〜実施例７のための材料及び方法
細胞培養：４種のｈｉＰＳ細胞系統（ＬＭＮＡ、２７３、２０２及びＨＳＰ８）を、ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｅ８）（Thermo Fisher社）成長因子を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Thermo Fisher社）中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Corning社）でコーティング（１：４００で２４時間）したポリスチレン２Ｄ培養システムにおいて維持した。８０％〜９０％のコンフルエンシーになったら、０．５％のＥＤＴＡを含むＰＢＳ中、３７度で５分間〜１０分間にわたって細胞を解離させた。解離を穏やかなピペッティングで行うことで、ｈｉＰＳ細胞の小さな集塊を得た。１：１５〜２０の分割比で継代を実施することで、４日間〜５日間以内に完全なコンフルエンシーに達した。最初の２４時間には、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤のＹ−２７６３２（Selleckchem社）をｈｉＰＳＣ維持培地中に含めた。
【００８４】
ＣＭの産生を、インスリンを除いたＢ２７（Invitrogen社）を含むＲＰＭＩ  １６４０（Thermo Fisher社）分化培地における上記の古典的Ｗｎｔ刺激及び阻害により行った。０日目〜２日目の間に、ＣＨＩＲ９９０２１（Seleckchem社）濃度の勾配（３．０μＭ、４．０μＭ、５．０μＭ、６．０μＭ、７．０μＭ、８．０μＭ）を使用した。３日目〜５日目に、Ｗｎｔ−Ｃ５９（Selleckchem社）を分化培地に添加した。７日目に、インスリンを含むＢ２７を分化培地に添加した。１１日目に、視覚的評価により８０％を超える拍動細胞を含むウェルを、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  １０Ｘ（Invitrogen社）と共に３７度で２０分間〜４０分間インキュベートした。１０分ごとに穏やかな揺動を実施した。細胞は穏やかなピペッティングでさえ解離し、これを、洗浄バッファー（２０％のＦＢＳを含むＰＢＳ）を含む１５ｍＬ容のコニカルチューブに移した。細胞を１０００ＲＰＭで３分間遠沈し、１０％のＫｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Gibco社）及びチアゾビビン１．０μＭ（Selleckchem社）を含むＲＰＭＩ  １６４０＋Ｂ２７中に１：１０〜１５の分割比で再プレーティングした。１２日目に、ｈｉＰＳＣ−ＣＭを、ダウンストリームアッセイのために２．０μＭ〜４．０μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Selleckchem社）を補充した分化培地中で更に培養した。継代後の最初の２４時間にわたって、１０％のＫｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ及びチオゾビビン１．０μＭを分化培地に添加した。
【００８５】
小分子／成長因子：ＰＮＵ７４６５４、ＭＫ２２０６、ＣＨＩＲ９９０２１及びＷｎｔ−Ｃ５９をSelleckchem社から入手した。ＳｃＦＶ−ＤＫＫ１ｃ及びＲＳＰＯは、ガルシア研究所（スタンフォード大学）において組換え細胞系統で生産された。精製Ｗｎｔ３Ａタンパク質はR&D systems社から購入した。
【００８６】
タンパク質発現分析：免疫組織化学は、一次抗体を一晩インキュベートした後に、様々なＡｌｅｘａ蛍光コンジュゲート二次抗体と共に２時間インキュベートすることで行った。共焦点顕微鏡検査（Zeiss社のＬＳＭ  ７１０）又は通常の免疫蛍光顕微鏡検査（Leica社のＤＭ  ＩＬ  ＬＥＤ）を用いて画像生成した。この研究で使用された主要材料は、心臓トロポニンＴ（ＭＳ−２９５、Fisher社）、Ｋｉ６７（ａｂ１５５８０、Abcam社）、ｐＨＨ３（番号９７０１、Cell Signaling社）、ａｕｒｏｒａ  Ｂ（ａｂ２２５４、Abcam社）、α−サルコメアアクチニン（Ａ７８１１、Sigma-Aldrich社）、ＭＬＣ２Ｖ（ａｂ４８００３、Abcam社）、ｐｈｏｓｐｈｏ  ＡＫＴ  Ｔ３１８（番号９２７５、Cell Signaling社）であった。
【００８７】
４３種のヒトキナーゼと２つの総量のタンパク質とを含むＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｋｉｎａｓｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（R&D Systems社）で、キナーゼリン酸化レベルをスクリーニングした。通常のウエスタンブロッティングで検証を行った。総タンパク質発現をゲル撮影装置（Biorad社）で測定し、ピクセル強度ソフトウェア（Biorad社）で処理した。
【００８８】
ルシフェラーゼアッセイ：１２日目に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Invitrogen社）を使用して、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにＴＣＦレポータープラスミド（ＴＯＰｆｌａｓｈ  Ｍ５０、Addgene社）又は突然変異レポータープラスミド（ＴＯＰｆｌａｓｈ  Ｍ５１、Addgene社）を４８時間トランスフェクションさせた。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を様々な小分子で２４時間処理した。細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ基質（Promega社）と混合し、９６ウェルマイクロプレートリーダー（Fisher社）でホタルルシフェラーゼ発現を測定した。
【００８９】
リアルタイムＰＣＲ発現分析：遺伝子発現の定量分析のために、溶解バッファー（Qiagen社）を用いて、ｈｉＰＳＣ−ＣＭからＲＮＡを抽出し、−８０℃で貯蔵した。各試料からのトータルＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（Qiagen社）を使用して細胞溶解物から精製した。ｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（BioRad社）を使用して作製した。定量的ＰＣＲは、９６ウェルサーモサイクラーシステム（Biorad社）と共にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ基質（Affymetrix社）を使用して４０サイクルで行った。全てのプライマー配列は、ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ（マサチューセッツ総合病院／ハーバード大学医学部）オンラインデータベースから取得した。オリゴはスタンフォード大学で合成された。
【００９０】
単一細胞遺伝子発現分析：単一細胞遺伝子発現のために、再プレーティングされたｈｉＰＳＣ−ＣＭを、１２日目にＤＭＳＯ、ＣＨＩＲ９９０２１又はＣ５９で２４時間処理した。１３日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅで約５分間消化し、穏やかなピペッティングで解離させた。試料を洗浄して、Ｂ２７サプリメントを含む氷冷ＲＰＭＩ  １６４０中に懸濁して、10x Genomics社の単一細胞捕捉用プラットフォームに供した。ｃＤＮＡライブラリーを作成し、Illumina社のＨｉＳｅｑシーケンシングに使用することで、細胞当たり平均９３．５２２個のリードが得られた。単一細胞分析は、Ｌｏｕｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウェアにより実施した。
【００９１】
フローサイトメトリー：分離されたばかりのｈｉＰＳＣ−ＣＭをＰＦＡ（４％）中で５分間固定し、ＴｎＴ（ＭＳ−２９５、Fisher社）について室温で１時間染色した。複数回洗浄した後に、Ａｌｅｘａ４８８マウス二次抗体を３０分間適用した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（BD Biosciences社）を使用したフローサイトメトリーにより、試料を分析した。フローサイトメトリーデータ及び細胞周期データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（BD Biosciences社）フローサイトメーターで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Treestar社）で処理した。
【００９２】
増殖性ｈｉＰＳＣ−ＣＭの電気生理学的研究：電気生理学的研究の前に、ＲＰＭＩ  １６４０＋Ｂ２７サプリメント＋ＣＨＩＲ９９０２１中で３回継代された増殖性ＨｉＰＳＣ−ＣＭ及びＲＰＭＩ  １６４０＋Ｂ２７サプリメント中で同日数にわたり保持したコントロールを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングされた８ｍｍカバースリップ上にまばらに播種した。１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．８ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭのグルコースを含むｐＨ７．４の細胞外溶液中に、カバースリップ上の細胞を浸した。ｐＨ７．３で１４０ｍＭのグルコン酸カリウム、１０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ、４ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、及び０．３ｍＭのＮａ−ＧＴＰを含むため、約２ＭΩから５ＭΩの抵抗が得られる細胞内溶液でパッチ電極を満たした。ＣＭの自発活動電位を、室温で鮮明な電流固定モードで記録した。
【００９３】
単一細胞のパターン形成及び収縮：マイクロパターン化されたタンパク質を上部に有する軟質基材上に細胞をプレーティングした。培養の３日〜６日後に、１群当たり少なくとも１０個の個別の細胞について高解像度の動画（Sony社の検鏡法）を記録し、運動速度分析をデジタル処理した。記録後に細胞を固定し、免疫組織化学及び共焦点イメージングのために使用した。サルコメア配列をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで定量した。
【００９４】
マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究：Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Jackson Laboratory社、メイン州、バーハーバー）に、生後４週目及び８週目に可溶性ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ  Ｗｎｔタンパク質を週２回注射した。第一にイソフルラン（吸入、１００％の酸素中２％、温かいパッドの上に新生児を置いた）によりマウスを鎮静させた後に、第二に頸椎脱臼を行うことによって安楽死を行った。安楽死後で処分前に死亡を確認した。全ての動物実験は、スタンフォード大学の実験動物委員会（animal care and use committee）（ＡＰＬＡＣ）によって承認された。全ての実験は、スタンフォード大学の関連のガイドライン及び規則に準じて実施した。体重及び心臓重量は盲目観察者によって測定された。分離されたばかりの成体心臓をマウスの胸腔から摘出し、ＰＢＳ中で洗浄して余分な血液を除去した。生後の心臓をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の３０％スクロース中で一晩インキュベートし、引き続き、凍結切片化のためにＰＢＳ中で勾配濃度のＯＣＴと一緒に段階的にインキュベートした。凍結保存後に、心臓を１０μｍの切片に切断し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で軽く固定してから免疫染色を行った。組織切片のヘマトキシリン及びエオシン染色は、製造元が提案するプロトコルに従って実施した。組織切片の全ての定量分析は、データ分析における主観バイアスを防ぐために、数値コード化された動物に対して観察者盲検様式で行われた。
【００９５】
データ解析：数値データは平均±標準偏差又はＳＥＭとして表される。統計的有意性は、等分散で対応のある両側t検定を使用して実施された。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなした。
【００９６】
実施例１．Ｗｎｔ刺激は、連続継代に際して拍動ｈｉＰＳＣ−ＣＭの大量増殖をもたらす
ｈｉＰＳ細胞の心臓分化の間に、拍動ｈｉＰＳＣ−ＣＭの分裂能力は急速に低下し、サルコメア組織化及び収縮力発生の増加を伴い、ｉｎ  ｖｉｖｏでの新生児心筋細胞の成熟過程を模する。後期胚発生の間のＷｎｔ活性化はマウスにおいてＣＭ増殖を増加させるように見えるが（非特許文献３０、Titmarsh et al., 2016、Uosaki et al., 2013）、拍動ｈｉＰＳＣ−ＣＭがｉｎ  ｖｉｔｒｏで同様に応答し得るかどうかと共に、連続継代後に達成され得る増殖の程度は不確かである。
【００９７】
これに対処するために、事前に検証された４つの野生型ｈｉＰＳ細胞系統を、確立された２段階のＷｎｔシグナル伝達プロトコルを使用して分化させて、分化１１日目までに約８５％のＣＭ純度が生じた（非特許文献３２、非特許文献３４）。これらの細胞は、多能性幹細胞（ＮＡＮＯＧ）、中胚葉（ＭＥＳＰ１）及び心臓前駆細胞（Ｉｓｌ１）の段階特異的な遺伝子を発現した後に、心筋形成系譜に拘束される（図８Ａ及び図８Ｂ）。
【００９８】
これらのｈｉＰＳＣ−ＣＭは分化７日目に拍動を開始し、１２日目に、古典的Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するＧＳＫ３β阻害剤である２．０μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）で処理して又は処理せず、連続継代した。注目すべきことに、ＣＨＩＲの存在下で、ｈｉＰＳＣ−ＣＭは目立った細胞死を伴わずに分裂を続け（図８Ｃ）、最大５回継代することができるのに対して、コントロールのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理された細胞は、最初の継代後に増殖を停止する（図１Ａ〜図１Ｃ）。興味深いことに、ＣＨＩＲ処理された初期継代ｈｉＰＳＣ−ＣＭは、活発に分裂しながら拍動し続け（補足動画１）、継代後５日〜７日以内にコンフルエンスに達し（図１Ｄ）、結果として、総細胞数（図１Ｅ）及びＣＭ数（図１Ｆ及び図１Ｇ）は１００倍を超えて増加した。
【００９９】
典型的には、２００万個の１２日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭを準備すると、３億個〜９億個のｈｉＰＳＣ−ＣＭが生成される。さらに、ＣＨＩＲ処理は、非筋細胞の過剰成長を原因とする可能性が最も高い各継代でＣＭ純度が低下したコントロールのＤＭＳＯ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭ（図１Ｈ及び図１Ｉ）とは対照的に、わずかな富化ではないとしても、ＣＭ純度を維持するように見える。まとめると、これらのデータは、ＧＳＫ３β阻害を介したＷｎｔシグナル伝達活性化及び連続継代がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拍動ｈｉＰＳＣ−ＣＭの大量増殖を達成する能力を裏付けている。
【０１００】
実施例２．Ｗｎｔシグナル伝達によるｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖ウィンドウの拡張
ＣＨＩＲ処理による拍動ｈｉＰＳＣ−ＣＭの大量増殖は、ｉＰＳＣ−ＣＭの分裂の増加の原因となる機構に関して興味深い問題を提起する。これを調べるために、ＣＨＩＲ又はＤＭＳＯ（ＣＴＲ）で処理した後に、各継代で細胞周期マーカーｋｉ６７又は有糸分裂マーカーのリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）を発現するトロポニンＴ（ＴｎＴ）陽性のｈｉＰＳＣ−ＣＭのパーセンテージを求めた（図２Ａ〜図２Ｃ）。
【０１０１】
興味深いことに、ＣＴＲのｈｉＰＳＣ−ＣＭは、各継代でそれらのｋｉ６７及びｐＨＨ３発現に急速な低下を示し、２継代目（Ｐ２）以降には少数の有糸分裂細胞しか観察することができないのに対して、ＣＨＩＲ処理は、増殖ウィンドウの大幅な拡張（最大５継代）をもたらした（図２Ｃ及び図９Ａ）。増殖性ＣＭの特性を更に解明するために、単一細胞のマイクロパターンに対して有糸分裂ＣＭの共焦点イメージングを実施した（Ribeiro et al., 2015）。ＣＨＩＲの存在下で、有糸分裂ＣＭは、特にサルコメア構造の崩壊を伴う後期及び終期に豊富に存在していた（図２Ｄ及び図２Ｅ及び図９Ｂ）。ＣＨＩＲで処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭのＡｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼ染色により、ｈｉＰＳＣ−ＣＭが細胞質分裂を起こして細胞分裂を完了し得ることが示された（図２Ｆ）。さらに、ＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭは、ＣＴＲ又はＣ５９で処理された細胞と比べてより少ない二核形成を示す（図２Ｇ及び図２Ｈ）。
【０１０２】
コントロールのＤＭＳＯ処理と比べてｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖を増加させるＣＨＩＲの能力は、ＣＭの増殖／分裂の速度を直接増加させることによるか、ＣＭの成熟及び細胞周期停止を防ぐことによるか、又はその両方により達成され得る。短期間（２４時間）の変化を、Ｗｎｔシグナル伝達の特異的阻害剤であるＣＨＩＲ−、ＣＴＲ−又はＣ５９による処理後の１２日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭ（Ｐ０）の増殖速度で評価した（図２Ｉ及び図２Ｊ）。
【０１０３】
ＣＨＩＲ処理とＣＴＲ／Ｃ５９処理との間のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいてｋｉ６７発現に有意差が見られた。しかしながら、ｈｉＰＳＣ−ＣＭの増殖頻度は、ＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭの間で開始時のｈｉＰＳＣ−ＣＭ集団（０時間でのＣＴＲ）から変化しないことが認められた（図２Ｉ及び図２Ｊ）。ｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖の直接的な刺激に対するＣＨＩＲのこの比較的控えめな効果は、ＣＨＩＲ処理がｈｉＰＳＣ−ＣＭの成熟及び細胞周期停止を防ぎ、長時間にわたる細胞数の大量増殖を達成する可能性を高める（図１）。さらに、これらのｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＷｎｔシグナル伝達活性のごくわずかなベースラインレベル（図２Ｋ）は、Ｃ５９による処理がＣＴＲ処理と比べてｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖速度の低下をもたらさなかった理由を説明している（図２Ｉ及び図２Ｊ）。
【０１０４】
これらの結果は、細胞周期活性を維持し、二核形成を防ぐことにより、ＣＨＩＲがｈｉＰＳＣ−ＣＭの増殖ウィンドウを大幅に拡張する能力を実証している。さらに、本免疫染色データは、ｈｉＰＳＣ−ＣＭが活発な有糸分裂の間にそれらのサルコメア配列を崩壊するといった、Ｗｎｔシグナル伝達によるｈｉＰＳＣ−ＣＭ成熟の抑制を示唆する所見を裏付けている。
【０１０５】
実施例３．Ｗｎｔ刺激後のｈｉＰＳＣ−ＣＭの表現型評価
ＣＭ成熟は、高度に構造化されたサルコメアの形成、二核形成又は多核形成、及び細胞周期離脱を伴う（Bassat et al., 2017、Bersell et al., 2009、Senyo et al., 2014、非特許文献９）。Ｗｎｔ刺激後の拍動ｈｉＰＳＣ−ＣＭの観察された大量増殖は、成熟停止がそれらの増殖能力の保持を伴う可能性を高める。これに対処するために、ＤＭＳＯ（ＣＴＲ）を含む培地に曝された同齢のｈｉＰＳＣ−ＣＭを、ＣＭ機能の様々な表現型アッセイを使用して２．０μＭのＣＨＩＲを含む培地中で３回継代を行ったものと比較した。サルコメア配列を評価するために、ＣＨＩＲ及びＣＴＲのｈｉＰＳＣ−ＣＭを７：１のアスペクト比のマイクロパターン（Ribeiro et al., 2015）上で培養し、ＴｎＴ抗体及びサルコメアアクチニン抗体で免疫染色した。
【０１０６】
ＣＴＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭは、高度に組織化され配列されたサルコメアを示したのに対して、ＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭは、マイクロパターン上で活発に分裂したが、サルコメアの配列及び組織化の著しい低下を示す（図３Ａ）。サルコメア線維配列のこの違いを、サルコメア線維の垂直（０度と定義）からのずれの角度の自動イメージング評価によって定量したところ（図３Ｂ及び図３Ｃ）、ＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭで観察されたサルコメアの崩壊が確認された。
【０１０７】
興味深いことに、事前にＣＨＩＲで処理された細胞にＣ５９を添加した場合に（ＣＨＩＲ＞Ｃ５９）、これらの細胞はまず分裂した後に、それらのサルコメアはＣＨＩＲ処理を受けていない同齢のコントロールｈｉＰＳＣ−ＣＭと同様の状態に再組織化された（図３Ａ〜図３Ｃ）。
【０１０８】
ＣＴＲ及びＣＨＩＲで処理された細胞の収縮特性の評価は、ＣＨＩＲ処理された細胞における力発生の減少を裏付けている（図３Ｄ及び補足動画２〜４）。同齢のＣＨＩＲ及びＣＴＲで処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭの単一細胞電気生理学的研究は、同様の自発活動電位（図３Ｅ及び図３Ｆ）及びカルシウムイメージング（図３Ｇ及び図３Ｈ）を示した。全体的に、これらのデータは、Ｗｎｔシグナル伝達活性化によるＣＭ成熟の阻害といった、Ｗｎｔ刺激に際して二次心臓領域由来の心臓前駆細胞及び他の細胞型でも観察されている現象を強く裏付けている（Qyang et al., 2009、Sato et al., 2004、Yin et al., 2014）。
【０１０９】
転写レベルでの成熟停止表現型を確認するために、分化１２日目〜２８日目のＣＨＩＲ含有培地で処理されたｉＰＳＣ−ＣＭを、ＣＨＩＲ（２．０μＭ）、ＤＭＳＯ（ＣＴＲ）又はＣ５９のいずれかの存在下で更に３週間培養し、ＲＮＡ精製及びリアルタイム定量的ＰＣＲ分析のために採取した。ＣＨＩＲで処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭと比較して、ＤＭＳＯ又はＣ５９で処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭは、心筋細胞成熟（ＭＹＬ２、ＴＮＮＩ３、ＭＹＯＭ２）、興奮（ＧＪＡ１）、収縮（ＲＹＲ２）及び代謝（ＣＯＸ６Ａ２、ＣＫＭＴ）に関連するマーカーの上方調節を示した（図３Ｉ〜図３Ｋ）。これらの所見は、ＣＨＩＲ処理された細胞と比較したＤＭＳＯ処理及びＣ５９処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＭＹＬ２についての免疫蛍光染色の増加によって、タンパク質レベルで裏付けられた（図３Ｌ及び図３Ｍ）。
【０１１０】
Ｗｎｔシグナル伝達が細胞系譜の運命拘束及び分化を調節する多様な役割を考慮すると、ＣＨＩＲへの長期の曝露は、適切な成熟を妨げるｈｉＰＳＣ−ＣＭ表現型変換又は発癌性形質転換といった、細胞療法又は創薬用途でのそれらの使用を著しく妨げることとなる所見につながる可能性がある。１２日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭをＣＨＩＲ中、連続継代で２ヶ月間連続的に培養し、その後に、更に１ヶ月間にわたりＣＨＩＲを中止した。
【０１１１】
３ヶ月の終わりに、ＣＭ遺伝子発現を測定し、１２日目以降にＣＨＩＲに曝されていないそれらの同齢のコントロールｈｉＰＳＣ−ＣＭと比較した（図１０）。成熟マーカー（例えば、ＭＹＬ２、ＴＮＮＩ３）の発現は、ＣＨＩＲで２ヶ月間処理された細胞においてわずかな増加ではないとしても同様であることから、長期のＷｎｔ刺激後のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいて異常な表現型変換がないことが裏付けられた。ＣＨＩＲ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭが拍動３Ｄ心臓組織を生成することができたという機能的な観点からも、この所見は確認された（図１１）。まとめると、これらのデータは、ＧＳＫ３β阻害によるＷｎｔ刺激はｈｉＰＳＣ−ＣＭの成熟を妨げるが、Ｗｎｔ刺激を中止すると、これらの細胞は成熟を受けることが可能となることを裏付けている。
【０１１２】
実施例４．Ｗｎｔシグナル伝達の増減に続くｈｉＰＳＣ−ＣＭの単一細胞ＲＮＡシーケンシング分析
Ｗｎｔシグナル伝達の増減に応答するｈｉＰＳＣ−ＣＭの全体的な転写変化を調査するために、ＤＭＳＯ（ＣＴＲ）、ＣＨＩＲ又はＣ５９のいずれかで２４時間処理された１２日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいて単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施した。合計８３８１個の細胞が捕捉され、細胞当たり９３５５２回の平均読み取りが行われ、細胞当たり１２９７個の中央値の遺伝子リードが得られた（図４）。
【０１１３】
単一細胞の遺伝子発現データを、最初にｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）アルゴリズムを使用して分析して、本発明者らの３つの処理試料で次元削減を実施した（図４Ａ）。成熟した心臓遺伝子は劇的に下方調節されたのに対して、Ｗｎｔシグナル伝達標的遺伝子及び心原性転写因子は、ＣＴＲ又はＣ５９で処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭに比べて、ＣＨＩＲで処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭの方が高度に上方調節されていた（図４Ｂ）。具体的には、Ｗｎｔ標的遺伝子ＡＸＩＮ２、ＬＥＦ１、ＢＭＰ４、ＤＯＫ４は、ＣＨＩＲで処理されたほとんど全ての細胞で上昇したが（図４Ｃ及び図４Ｄ）、ＣＣＮＤ２、ＭＫＩ６７及びＫＩＡＡ０１０１等の細胞周期活性化に関連する遺伝子は、ＣＨＩＲ処理後のｈｉＰＳＣ−ＣＭのサブセットにおいてのみ上方調節された（図４Ｄ及び図４Ｅ）。重要なことには、Ｗｎｔシグナル伝達を刺激しても、心臓前駆細胞マーカーのＩｓｌ１及びＭＥＳＰ１／２の発現の増加がもたらされなかったことから、ＣＨＩＲによるｈｉＰＳＣ−ＣＭの増殖は、残りの心臓中胚葉又は二次心臓領域前駆細胞の希少な集団の増殖につながらないことが示唆された（図１２Ｃ）（Wu et al., 2008）。
【０１１４】
Ｗｎｔシグナル伝達の存在下又は不存在下でのｈｉＰＳＣ−ＣＭの異なる亜集団を更に調査するために、全ての細胞の教師なしクラスタリングを実施することで、合計５つのクラスターが得られた（図４Ｆ）。心房ＣＭ対心室ＣＭについてのそれらの遺伝子発現シグネチャーに基づいて（図４Ｇ及び図４Ｈ）、これらのクラスターを、心室ＣＭ１〜３についてはＶ１〜３として再割り当てし、そして心房ＣＭ１又は２についてはＡ１又は２として再割り当てした。これらの割り当ては、ＭＹＬ２及び早期胎児心室マーカーＭＹＬ３及びＭＹＬ４等の心室遺伝子のＶ１〜３クラスター特異的発現（図４Ｉ）と、ＨＥＹ１及びＳＬＮ等の心房マーカーのＡ１又は２クラスター特異的発現（図４Ｊ）とによって確認された。
【０１１５】
ＭＹＨ７、ＴＮＮＩ３、ＴＮＮＣ１、ＡＣＴＮ２及びＭＹＯＭ１等の成熟心室遺伝子の発現を、心室クラスターＶ３（すなわち、ＣＨＩＲ処理された心室ｉＰＳＣ−ＣＭ）とＶ１又は２（ＣＴＲ及びＣ５９で処理された心室ｉＰＳＣ−ＣＭ）との間で比較したところ、Ｖ１又は２クラスター細胞と比べて、Ｖ３クラスター細胞の方で成熟マーカーの発現の劇的な低下が検出された（図４Ｋ）。これらのデータは、Ｗｎｔシグナル伝達によりｉＰＳＣ−ＣＭ成熟が抑制された結果、増殖ウィンドウが拡張し、ｈｉＰＳＣ−ＣＭが大量増殖することを更に裏付けている。
【０１１６】
実施例５．Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達非依存性のｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖におけるＡＫＴキナーゼリン酸化の必要性
ＣＨＩＲに媒介されるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達はＧＳＫ３β阻害を介して生ずるが、ＧＳＫ３βは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達のその阻害に加えて、複数の細胞プロセスに関与していることが知られている。非β−カテニン媒介性の事象がｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖に関与しているかどうかを調べるために、細胞を特定のＴＣＦ／ＬＥＦβ−カテニンシグナル伝達遮断薬であるＰＮＵ７４６５４（Trosset et al., 2006）の存在下で、ＣＨＩＲで処理し、ＣＨＩＲ単独で処理された細胞と比べてｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖の変化を評価する。
【０１１７】
興味深いことに、ＣＨＩＲに媒介されるｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖は約５０％減少したが（図５Ａ）、ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼレポーターのＣＨＩＲに媒介される活性化は消失した（図５Ｂ）。これは、非β−カテニン媒介性のシグナル伝達が、ＣＨＩＲ処理により観察される増殖活性の半分に寄与していることを示唆している。
【０１１８】
リアルタイム定量的ＰＣＲにより、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいてＣＨＩＲ処理後にＷｎｔシグナル伝達の標的遺伝子発現（例えば、Ａｘｉｎ２、ＬＥＦ及びＣＣＮＤ２）が誘導されること（図５Ｃ）及びＰＮＵ７４６５４処理がこの増加を消失させ得ることが確認された。ｈｉＰＳＣ−ＣＭ成熟のマーカー（ＭＹＬ２、ＭＹＨ７、ＭＹＯＭ１）の発現は、ＣＨＩＲ処理によって下方調節され、ＰＮＵ７４６５５４との同時処理により完全に回復した（図５Ｃ）。これらの結果は、β−カテニン依存性シグナル伝達がｈｉＰＳＣ−ＣＭの成熟を強力に調節する一方で、ＧＳＫ３βに媒介されるが、β−カテニン非依存性のシグナル伝達がｈｉＰＳＣ−ＣＭによる細胞周期を駆動することを裏付けている。
【０１１９】
ＣＨＩＲに媒介されるｈｉＰＳＣ−ＣＭの増殖に関与する１種以上の下流のキナーゼを特定するために、４３種類のキナーゼのライブラリーを既知の機能でスクリーニングし（図５Ｅ及び図１２）、ＡＫＴの活性化及び細胞分裂に必要とされる残基である残基Ｔ３０８でのＡＫＴ１／２／３リン酸化の有意な上方調節が見られた（図５Ｅ）（Liu et al., 2014）。
【０１２０】
さらに、ＡＫＴ結合タンパク質ＨＳＰ２７のリン酸化の増加も見られ、下流のＡＫＴ標的ｐ７０Ｓ６Ｋだけでなく、成長抑制因子Ｐ２７のリン酸化の微妙な増加も見られた（図５Ｅ）（Conejo et al., 2002、Song et al., 2005）。リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）のＴ３０８残基に対する抗体を使用すると、ＤＭＳＯ処理されたコントロールに対して細胞培養物にＣＨＩＲを添加した後に、ＡＫＴの活性型が急速に増加することが確認された（図５Ｆ〜図５Ｇ）。
【０１２１】
ＣＭ内のｐＡＫＴの局在化を調査するために、１２日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭをＤＭＳＯ（ＣＴＲ）中で又はＣＨＩＲと一緒に６日間培養したところ、有糸分裂ＣＭの細胞質中にＴ３０８  ｐＡＫＴが豊富に発現していることが判明した（図５Ｈ、左の２つのパネル及び図１２Ａ）。一貫して、胎児マウスの心臓内で活発に増殖しているＣＭも同様に細胞質のｐＡＫＴの増加を示した（図１３）。
【０１２２】
有糸分裂ＣＭにおけるＴ３０８  ｐＡＫＴの役割を、以前に記載された非常に選択的なＡＫＴリン酸化阻害剤ＭＫ２２０６（Lindsley et al., 2007）を使用することにより確かめた。細胞をＣＨＩＲ及びＭＫ２２０６で処理した場合に、ＣＭの複製はＣＨＩＲ処理単独と比べて減少し、ｐＡＫＴを発現する有糸分裂細胞ははるかに少なく観察された（図５Ｈ〜図５Ｊ）。全ての処理条件についてＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼ活性を調査すると、ＭＫ２２０６により観察されたｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖の低下は、下流のβ−カテニンシグナル伝達の下方調節が原因ではなく、むしろそれは、増殖の低下につながるｐＡｋｔの阻害が原因であることが裏付けられた（図５Ｋ）。これらのデータにより、ＡＫＴ経路の活性化におけるＣＨＩＲの役割が裏付けられ、成熟及び増殖の変化の調節におけるＷｎｔシグナル伝達の役割が確認される。
【０１２３】
実施例６．Ｗｎｔ受容体リガンドはＣＭ細胞周期の再活性化を誘導する
Ｗｎｔシグナル伝達の再活性化は、単に既存の増殖を維持するのではなく、非増殖性の加齢ＣＭにおける増殖を促進することができる（図６Ａ）。最初に、確立されたＷｎｔ受容体リガンドの有効性を１２日目の増殖性ｈｉＰＳＣ−ＣＭで試験したところ、実際にＷｎｔ３Ａ及びＷｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃがＣＭ増殖を促進することが判明した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。次に、ｈｉＰＳＣ−ＣＭを６０日間分化させ、Ｗｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃで処理した。小さいが大幅に増加したＣＭの画分が有糸分裂になることが観察された（図６Ｄ及び図６Ｅ）。これらの結果は、Ｗｎｔ活性化がＣＭの小さなサブセットにおいて細胞周期を再活性化して細胞増殖をもたらすのに十分であることを裏付けている。
【０１２４】
実施例７．Ｗｎｔ代替物は成体の心筋成長を促進する
Ｗｎｔシグナル伝達は、ｉｎ  ｖｉｖｏで成体の心筋層においてＣＭ増殖を促進するのに十分であり得る。Ｗｎｔ３Ａを含む多数のＷｎｔがマウス胎児の心臓に存在することが知られているが（Mazzotta et al., 2016）、その溶解性のためｉｎ  ｖｉｖｏでの用途にはあまり適していない。最近開発されたＷｎｔ代替物のＳｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃは完全に水溶性であるため、これらのｉｎ  ｖｉｖｏ試験で使用された（Janda et al., 2017）。８週齢の成体マウスを、Ｗｎｔ代替物又は担体コントロール（Ｈ２Ｏ）で４週間連続して処理した。４週間の処理後に、Ｗｎｔ代替物で処理されたマウスからの心臓が、担体コントロールで処理されたマウスよりも大きく見えることが観察された（図７Ａ及び図１３Ａ）。この観察は、心臓重量と体重との比率（図７Ｂ）及びＬＶ直径（図７Ｄ）の増加によって裏付けられた。Ｈ＆Ｅ染色により、寸法が増加した全体的に正常な心臓が示された（図７Ｃ〜図７Ｅ）。細胞分析により、相対的なＣＭサイズがＷｎｔ代替物で処理された又は処理されていないマウスで同等であることが明らかとなったことから（図７Ｆ及び図７Ｇ）、Ｗｎｔ代替物処理が成体の心筋成長を促進したことが示される。
【０１２５】
実施例８〜実施例１２のための実験手順
ｈｉＰＳＣ−ＣＭの化学的に定義された分化：多能性幹細胞からヒト心筋細胞を産生するために、ｈｉＰＳＣを、化学的に定義された心筋細胞分化プロトコルでｈｉＰＳＣ−ＣＭへと分化させた。これらのｈｉＰＳＣ−ＣＭを、組換えヒトアルブミン及びアスコルビン酸（ＣＤＭ３）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持した（１０）。簡潔には、ｈｉＰＳＣを最初にＧＳＫ３βシグナル伝達の小分子阻害剤のＣＨＩＲ９９０２１で処理して、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化した。２日後に、細胞を４日目までＷｎｔシグナル伝達阻害剤のＷｎｔ−Ｃ５９で処理した。その後に、小分子を一切含まないＣＤＭ３培地を２日ごとに交換した。心筋細胞を純化するために、細胞集団をグルコース飢餓状態にし、５ｍＭのＤＬ−乳酸ナトリウムを２日間〜４日間補充して、ｈｉＰＳＣ−ＣＭを代謝的に選択した（４４）。ｈｉＰＳＣ−ＣＭを再プレーティングしたら、細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Life Technologies社）で解離させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたプレートに再播種した。
【０１２６】
９６ウェルの分化、イメージング及び定量的生存率アッセイ：９６ウェルのｈｉＰＳＣ−ＣＭ分化アッセイのために、ｈｉＰＳＣをＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされた９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１０００個の細胞でプレーティングし、４日間かけて接着させた。引き続き、ｈｉＰＳＣを示された濃度及び期間で生理活性脂質によって処理し、化学的に定義されたｈｉＰＳＣ−ＣＭ分化プロトコルの８日目以降に評価した。以前に公開されたプロトコルを使用した免疫染色を行って、細胞生存率及び心筋細胞分化効率を定性的に評価した（Sharma et al. 2014）。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、蛍光強度及び細胞数を定量した。定量的生存率測定のために、細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ２．０  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Promega社）又はＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬（Life Technologies社）で製造業者が推奨する手順に従って処理した。９６ウェルのイメージング及び生存率アッセイを、Ｃｙｔａｔｉｏｎ  ５プレートリーダー／撮影装置（BioTek Instruments社）を使用して実施した。グラフ生成及び統計分析のためにＰｒｉｓｍ（GraphPad社）を利用した。共焦点イメージングは、Ｚｅｎソフトウェアを用いてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０Ｍｅｔａ顕微鏡（Carl Zeiss社）を使用して行った。
【０１２７】
小分子：Ｓ１Ｐ及びＬＰＡをSigma Aldrich社から入手し、水中に１ｍＭ及び１０ｍＭのストック溶液で溶解させた。特段の指定がない限り、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡは１０μＭの最終濃度で適用した。Ｃ５９及びＣＨＩＲ９９０２１をTocris Bioscience社から入手し、ＤＭＳＯ中に１０ｍＭストック濃度で溶解させた。Ｓ１ＰアンタゴニストのＶＰＣ  ２３０１９をTocris Bioscience社から入手し、酸性化されたＤＭＳＯ中に溶解させた。
【０１２８】
キナーゼリン酸化プロファイリング：ヒトキナーゼ及び他のリンタンパク質のリン酸化（表Ｓ１）を、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＲＴＫ）Ａｒｒａｙ又はＨｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｋｉｎａｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ（R&D Systems社）を使用して確かめた。示された濃度及び期間で細胞を生理活性脂質で処理した。ＲＴＫ又はホスホキナーゼのパネルを１０ｍｇの細胞タンパク質溶解物と一緒に一晩インキュベートし、引き続き、抗ホスホチロシン−西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体と一緒に一晩インキュベートして、リン酸化を評価した。Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ（BioRad社）を使用してブロットを現像した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してリン酸化強度を測定した。
【０１２９】
ルシフェラーゼ発光測定：ＨｉＰＳＣ及び３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭを９６ウェルプレートに再プレーティングし、２日間〜３日間培養した後に、リポフェクタミン（Invitrogen社）及びＴＯＰＦｌａｓｈ（ＴＣＦ／ＬＥＦ）ルシフェラーゼＷｎｔシグナル伝達レポータープラスミド（Ｍ５０、Addgene社)を１００ｎｇ／ウェルでトランスフェクションした。４８時間後に、培地を交換し、細胞を２時間にわたり種々の処理に供した後に、溶解させて、ルシフェラーゼ（Promega社）発光を標準的な発光プレートリーダーで測定した。
【０１３０】
遺伝子発現：定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、生理活性脂質処理後の対象の特定の遺伝子の遺伝子発現レベルを評価した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓキット（QIAGEN社）を使用して単離し、ｃＤＮＡをＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Applied Biosystems社）を使用して生成した。リアルタイムＰＣＲを、ＣＦＸ（商標）Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）でＵＳＢ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ−ＩＴ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２Ｘ）（Affymetrix社）を使用して実施した。ｑＰＣＲ反応を２回の反復で実施し、参照遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、比較Ｃｔ法（Schmittgen et al. 2008）を使用して評価した。生理活性脂質処理後のｈｉＰＳＣのより包括的なトランスクリプトーム分析のために、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを使用した（Affymetrix社）。
【０１３１】
統計学的方法：特段の指定がない限り、データは平均±標準偏差として表される。特段の指定がない限り、スチューデントのｔ検定によってＰ＜０．０５により規定される有意差（＊）で比較を行った。マイクロアレイの場合に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ２．０ソフトウェアを使用して、被験者間の一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｐ＜０．０５）を使用してＰ値の多重比較を行った。
【０１３２】
動画Ｓ１：グルコース除去による純化後のｈｉＰＳＣ−ＣＭ。分化後に、ｈｉＰＳＣ−ＣＭは、心臓の分化が開始した後の約８日目〜１０日目に自発的に収縮し始める。グルコース除去後に、細胞シートには、より純粋なｈｉＰＳＣ−ＣＭの集団が含まれていた。１０倍の倍率の動画。
【０１３３】
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の派生：この研究の全てのプロトコルは、スタンフォード大学治験審査委員会によって承認された。以前に公開されたプロトコル（Churko et al 2013）に従ってリプログラミングを実施した。まとめると、同意を得た個人から標準的な採血を行うことによって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取得し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配分離を使用して分離した。製造業者により提供されるプロトコルに従って、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＭＹＣ（ＯＫＳＭ）を発現するセンダイウイルスベクター（Life Technologies社）を使用して、ＰＢＭＣをリプログラミングした。リプログラミングの約１ヶ月後に、ｈｉＰＳＣクローンを分離し、成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Corning社）でコーティングされた６ウェル組織培養皿（Greiner社）上でＥ８多能性幹細胞培養培地（Life Technologies社）において培養した。
【０１３４】
遺伝子発現：Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ（Life Technologies社）を使用して、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける生理活性脂質受容体の発現を測定した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（Qiagen社）でＲＮＡを抽出した。Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキットを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを合成した。ライブラリーをＩｏｎ  ＰＩチップに加え、テンプレート調製のためにＩｏｎ  Ｃｈｅｆ機器に入れた。Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎシーケンシングシステム（Life Technologies社）でトランスクリプトームシーケンシングを行った。脂質処理後のｈｉＰＳＣ−ＣＭの発現分析のために、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを使用した（Affymetrix社）、又はｑＰＣＲ発現分析を実施した（BioRad社）。
【０１３５】
実施例８．生理活性脂質はｈｉＰＳＣからの心臓分化を段階特異的に増大させる
山中因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ）を発現するウイルスベクターを導入することにより５人の個人からの体組織をリプログラミングすることによって、５つのｈｉＰＳＣ系統を生成した。引き続き、化学的に定義されたプロトコルを使用して全てのｈｉＰＳ細胞系統を分化させ、心筋細胞を生成した（非特許文献３２、Churko et al. 2013）。ｈｉＰＳＣ系統３、ｈｉＰＳＣ系統４及びｈｉＰＳＣ系統５は、生理活性脂質を添加せずに拍動心筋細胞に適切に分化したので、心筋細胞へと分化する能力の低下を示したｈｉＰＳ細胞系統１及びｈｉＰＳ細胞系統２に対するＳ１Ｐ／ＬＰＡの効果を調査した。
【０１３６】
Ｓ１Ｐ及びＬＰＡの処理がこれらの２つの分化困難なｈｉＰＳ細胞系統における心筋細胞分化を改善することができるかどうかを調べた。生理活性脂質による処理の際のＣＭ分化の効率を評価する９６ウェル分化プラットフォームを確立した（図１５Ａ）。このプラットフォームを使用して、化学的に定義された分化プロトコルでの０日目〜２日目にＣＨＩＲと同時にＳ１Ｐ及び／又はＬＰＡを添加すると、８日目に心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）発現により評価されるように、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ生成がコントロールと比べて２倍〜３倍高まることが確かめられた（非特許文献３２、Churko et al. 2013）（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）。分化の４日目〜６日目の間又は６日目〜８日目の間にＳ１Ｐ／ＬＰＡを添加すると、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ分化の有意な増大は検出されなかった（図１５Ｃ）。これらの結果は、これらのそうでなければ低分化型のｈｉＰＳ細胞系統で心臓分化及び心筋細胞生成を高めるにあたり、生理活性脂質が早期の役割を担うことを示している。
【０１３７】
実施例９．生理活性脂質は、ｈｉＰＳ細胞においてＷｎｔ／β−カテニンと相乗作用して、中胚葉分化を誘導する
これらの研究の残りの部分を、心臓分化の正常な能力を示した３つの独立したｈｉＰＳ細胞系統で行った。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の誘導物質による未分化ｈｉＰＳＣの処理は、中胚葉分化を効果的に増大させることが以前に示されている（非特許文献３２）。生理活性脂質を早期に投与するとｈｉＰＳＣ−ＣＭの分化が増大することが判明したので、観察されたｈｉＰＳＣ−ＣＭ形成の増加は、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡによる核内β−カテニンのレベルの増加に起因する可能性があると仮定した。他の細胞系統での以前の研究では、生理活性脂質は接着結合でのＥ−カドヘリンからのβ−カテニンの解離を増大させ、核内の下流のシグナル伝達のために利用可能な細胞質β−カテニンが増加することが示された（Kam et al. 2009）。未分化ｈｉＰＳ細胞のＳ１Ｐ／ＬＰＡ処理が、単独で又はＣＨＩＲと組み合わせて核内β−カテニンのレベルを増加させ得るかどうかを研究した。まず、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理単独が、ｈｉＰＳ細胞においてβ−カテニンの有意な核内蓄積を誘導したことが認められた（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。さらに、種々の時点でのβ−カテニンの連続免疫染色により、この効果は早ければ処理後２時間以内に観察され得ることが明らかになった（図２０Ａ）。ＣＨＩＲと組み合わせると、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡはβ−カテニンの核内蓄積を更に促進したことから、これらの化合物間の相乗効果が示唆された（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。核内β−カテニンレベルの増加が転写レベルでＷｎｔシグナル伝達の活性化をもたらすかどうかを調べるために、ｈｉＰＳＣに前述のＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポータープラスミド（２３）（Veeman et al. 2003）をトランスフェクションした。このシステムは、生物発光を使用してＷｎｔ転写活性の相応の可視化を提供する。引き続き、これらの細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＣＨＩＲ、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ、又はＳ１Ｐ／ＬＰＡとＣＨＩＲとの組み合わせで処理した。興味深いことに、ＤＭＳＯコントロール群と比べると、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ単独での処理はＴＣＦ／ＬＥＦ−ルシフェラーゼ活性をわずかしか高めないのに対して（約１．２５倍）（図１６Ｃ）、ＣＨＩＲ単独での処理はＴＣＦ／ＬＥＦ−ルシフェラーゼ活性の非常に大きな約４０倍の増加をもたらした。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡをＣＨＩＲと組み合わせると、ＴＣＦ／ＬＥＦ−ルシフェラーゼ活性は、ＤＭＳＯコントロールと比べて６０倍超まで更に増加した（図１６Ｃ）。したがって、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理単独はＬＥＦ／ＴＣＦレポーターをわずかしか活性化しなかったのに対して、生理活性脂質はＣＨＩＲと相乗作用して、β−カテニンシグナル伝達を更に高めた（図１６Ｄ）。
【０１３８】
Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理後の遺伝子発現の重要な変化を明らかにするために、分化の２日目にｈｉＰＳ細胞に対してゲノムワイドなマイクロアレイ発現分析を実施した。興味深いことに、幹細胞の発生及び分化を制御することが良く知られているＷｎｔ阻害剤であるＤＫＫ４及びＤＫＫ１（図１６Ｅ）の有意な下方調節が見られた（非特許文献２１）。さらに、本発明者らのマイクロアレイデータは、ＣＯＬ１２Ａ１及びビメンチン（ＶＩＭ）（後者は、発生の間の上皮間葉転換に関連している）等の細胞骨格及び細胞外マトリックス遺伝子の発現の増加も明らかにした。
【０１３９】
まとめると、これらの結果は、生理活性脂質Ｓ１Ｐ及びＬＰＡがＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲと相乗的に作用して、ともすれば膜関連Ｅ−カドヘリンからのβ−カテニン放出の増大によって、ｈｉＰＳＣ分化の間のＷｎｔシグナル伝達／β−カテニン核内蓄積を増加させることを示唆している（図１６Ｄ）。Ｓ１Ｐ及びＬＰＡの処理はまた、ＤＫＫ１／４等のＷｎｔ阻害剤の発現を抑制し、細胞骨格／細胞外マトリックス遺伝子の発現を増加させる。
【０１４０】
実施例１０．生理活性脂質はｈｉＰＳＣ分化の間に細胞形態及び遺伝子発現の変化を誘導する
このマイクロアレイデータは、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理により誘導される細胞骨格及び細胞外マトリックス遺伝子（例えば、ＣＯＬ１２Ａ１及びＶＩＭ）の上方調節を示したことから、それらの生物学的表現型の変化が示唆される（図１６Ｅ）。さらに、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理の２４時間以内に、細胞形態の劇的な変化と細胞サイズの２倍の増加とが認められた（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。興味深いことに、これには細胞数の増加はほとんど伴わないか、全く伴わなかった（図１７Ｃ）。
【０１４１】
生理活性脂質又はＣＨＩＲによる処理後に免疫染色及び定量的ＰＣＲ分析によるマイクロアレイ研究から、遺伝子発現の変化を検証した（図１７Ｄ及び図１７Ｅ）。興味深いことに、ＣＨＩＲ処理だけでＶＩＭ及びブラキウリＴ（Ｂｒｙ  Ｔ）発現の両方を高めることができるのに対して（Menez et al. 2010）、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理はＢｒｙ  Ｔの発現に影響を与えずにＶＩＭの発現のみを高めることが判明した（図１７Ｄ及び図１７Ｅ）。結論として、これらの結果は、心臓の分化を増大させるｈｉＰＳＣのＷｎｔシグナル伝達に媒介される中胚葉分化に対する、生理活性脂質の相乗的であるが機構的に独立した効果を裏付けている。
【０１４２】
実施例１１．最終分化ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞周期活性を誘導する生理活性脂質及びＷｎｔ／β−カテニン活性化の相乗効果
以前の研究により、β−カテニン活性化はマウス胎児心臓及びヒト胚性幹細胞由来心筋細胞において心室心筋細胞増殖のために必要であることと、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ細胞周期停止の代謝調節はβ−カテニンシグナル伝達の活性化により逆転させることができることとが示された（非特許文献３０、Mills et al. 2017）。生理活性脂質とＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達との間の中胚葉分化を促進する相乗効果を考慮して（図１６、図１７）、生理活性脂質がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達と相乗作用してｈｉＰＳＣ−ＣＭの増殖も誘導し得るかどうかを調べた。
【０１４３】
これに対処するために、化学的に定義されたプロトコル（非特許文献３２、Churko et al. 2013、非特許文献３５）（動画Ｓ１）を使用して、高分化型ｈｉＰＳＣ−ＣＭを生成し（例えば、３０日目以降）、それらをＳ１Ｐ／ＬＰＡ若しくはＣＨＩＲ又はその両方で処理した（図１８Ａ）。最初に、これらの細胞におけるＳ１Ｐ／ＬＰＡ受容体の存在を検証した（図２１）。次に、心筋トロポニンＴ（ＴｎＴ）陽性細胞において、細胞周期活性のマーカーであるｋｉ６７及び有糸分裂マーカーであるリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）について免疫蛍光染色を行った。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ単独での処理は、未成熟（約２０日目〜３０日目）ｈｉＰＳＣ−ＣＭだけでなく、高分化型（約５０日目）ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいても、よく知られた有糸分裂促進剤（Titmarsh et al. 2016）であるＣＨＩＲ単独での処理と同様のレベルまでｋｉ６７発現を誘導し得ることが判明した（図１８Ｂ及び図１８Ｃ、図２１）。しかしながら、ｋｉ６７発現の増加にかかわらず、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理はｈｉＰＳＣ−ＣＭ数の増加をもたらさなかったことから、細胞（図１８Ｄ）及び核（図１８Ｅ及び図１８Ｆ）の分裂が不完全であったことが示唆される。それにもかかわらず、ＣＨＩＲ単独で処理すると細胞数の増加がもたらされ、ＣＨＩＲにＳ１Ｐ／ＬＰＡを加えると、細胞数及びｐＨＨ３発現の両方の増加により裏付けられるように、ＣＨＩＲにより媒介されるｈｉＰＳＣ−ＣＭの増殖が更に高められた（図１８Ｄ〜図１８Ｆ）。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ若しくはＣＨＩＲ又はその両方で２日間処理しても、二核化又は多核化された心筋細胞の数は増加しなかった（図１８Ｇ）。
【０１４４】
Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ又はＣＨＩＲで処理された３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭの追加の機能的分析では、コントロールの高分化型ｈｉＰＳＣ−ＣＭと比べて、拍動周波数又は収縮力発生に有意差は見られない（図２２）。これらの研究は、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡが高分化型ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞周期活性を調節し、β−カテニンシグナル伝達と相乗作用してｈｉＰＳＣ−ＣＭ増殖を高める追加の役割を説明している。
【０１４５】
実施例１２．生理活性脂質はｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＥＲＫシグナル伝達を活性化する
Ｓ１Ｐ／ＬＰＡがｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞周期活性を調節する機構を確かめるために、ＴＯＰＦｌａｓｈ（ＴＣＦ／ＬＥＦ−ルシフェラーゼ）レポーターを使用して、Ｓ１Ｐ及びＬＰＡの処理が３０日目の心筋細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を直接刺激し得るかどうかを評価した。本開示は、ＴＯＰＦｌａｓｈレポーターによって測定されるように古典的Ｗｎｔシグナル伝達がＣＨＩＲ単独の存在下で活性化されたのに対して、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡでの処理がＴＣＦ／ＬＥＦ−ルシフェラーゼ活性を高めることができなかったことを報告しており（図１９Ａ）、生理活性脂質の効果はｈｉＰＳＣ−ＣＭでのＷｎｔシグナル伝達により直接媒介されないことが示唆される。
【０１４６】
心筋細胞及び非筋細胞の増殖及び再生の調節におけるＨｉｐｐｏ／Ｙａｐシグナル伝達のよく知られた役割を考慮して（Yusuf et al. 2012、Heallen et al. 2011、Morikawa et al. 2017、Leach et al. 2017、von Gise et al. 2012）、生理活性脂質がＹａｐの核内蓄積を促進する能力を評価した（図２３）。驚くべきことに、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ並びに未分化ｈｉＰＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の非筋細胞を含む他の多くの細胞型において、ベースラインで強力な核内ＹＡＰ局在化（計数された全ての核の８５％超から９０％まで）が見出された（図２３Ａ）。したがって、生理活性脂質処理後に核内ＹＡＰ蓄積の増加は観察されなかった（図２３Ｂ）。
【０１４７】
Ｓ１Ｐ／ＬＰＡがｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞周期活性を調節する機構を更に解明するために、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡでの処理後の３０日目のｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいて広範なキナーゼリン酸化パネルのスクリーニングを実施した（表Ｓ１）。
【０１４８】
特に、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理後の細胞周期活性の既知の調節因子であるＥＲＫ１／２のリン酸化においては、急速な上方調節が観察された（図１９Ｂ）（Zang et al. 2002）。Ｓ１Ｐ／ＬＰＡでの処理の５分以内に、ＨＳＰ２７のリン酸化の下方調節も、ＧＳＫ３β及びＪＮＫのリン酸化における微妙な変化も観察された（図１９Ｂ）。古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に対するＳ１Ｐ／ＬＰＡの直接的な効果がないことと一致して、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡによる処理後にもβ−カテニンのレベルは変化しなかった。心臓分化を経ているｈｉＰＳＣにおけるＳ１Ｐ／ＬＰＡ処理の分析により、ＣＨＩＲに誘導される中胚葉誘導に対するＳ１Ｐ／ＬＰＡの効果（図１６）にもかかわらず、ＥＲＫ１／２リン酸化は０日目の未分化ｈｉＰＳＣにおいて活性ではないことが明らかになった（図２４）。
【０１４９】
Ｓ１Ｐ／ＬＰＡがＭＡＰＫ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達カスケードの刺激を通じてｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＥＲＫ１／２リン酸化を促進するかどうかに対処するために、ｈｉＰＳＣ−ＣＭを、ＥＲＫの上流のＭＥＫシグナル伝達の小分子阻害剤であるトラメチニブ（Kim et al. 2013）の存在下又は不存在下でＳ１Ｐ／ＬＰＡにより処理した。本開示は、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡがｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＥＲＫリン酸化を活性化する能力が、トラメチニブの存在下で消失したことを報告していることから、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡに誘導されるＥＲＫリン酸化が、ＭＡＰＫ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達によって媒介されることが確認される（図１９Ｃ、図２５）。
【０１５０】
トラメチニブの存在下及び不存在下でｈｉＰＳＣ−ＣＭをＳ１Ｐ／ＬＰＡで処理することによって、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡに誘導される細胞周期活性に対するＭＡＰＫ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の必要性を調べ、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるｋｉ６７の発現を評価した（図１９Ｄ及び図１９Ｅ）。本開示は、トラメチニブ処理がｋｉ６７のＳ１Ｐ／ＬＰＡに誘導される上方調節を消失させたことを報告している。これにより、ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＳ１Ｐ／ＬＰＡに媒介される細胞周期の活性化におけるＭＡＰ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の役割が確認される。
【０１５１】
Ｓ１Ｐ受容体シグナル伝達がＳ１Ｐに媒介されるｈｉＰＳＣ−ＣＭ細胞周期の活性化に関与するかどうかを評価するために、ｈｉＰＳＣ−ＣＭをＳ１Ｐ単独又はその受容体アンタゴニストのＶＰＣ２３０１９（Davis et al. 2005）と共に培養した。Ｓ１Ｐ処理されたｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるｋｉ６７の発現は、ＶＰＣ２３０１９の存在下で減少することが判明した（図１９Ｆ及び図１９Ｇ）。これは、Ｓ１Ｐ受容体が生理活性脂質に誘導されるｈｉＰＳＣ−ＣＭ細胞周期の活性化を媒介する役割を裏付けている（図１９Ｈ）。最後に、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理に応答してｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいて細胞周期活性の増加が観察されたが、Ｓ１Ｐ／ＬＰＡ処理後にｈｉＰＳＣ−ＣＭの成熟状態又はサブタイプの個性の変化は観察されなかった（図２６）。
【０１５２】
参考文献
Bassat, E., Mutlak, Y.E., Genzelinakh, A., Shadrin, I.Y., Baruch Umansky, K., Yifa, O., Kain, D., Rajchman, D., Leach, J., Riabov Bassat, D., et al. (2017). The extracellular matrix protein agrin promotes heart regeneration in mice. Nature 547, 179-184.
Beltrami, A.P., Urbanek, K., Kajstura, J., Yan, S.M., Finato, N., Bussani, R., Nadal-Ginard, B., Silvestri, F., Leri, A., Beltrami, C.A., et al. (2001). Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N Engl J Med 344, 1750-1757.
Bergmann, O., Bhardwaj, R.D., Bernard, S., Zdunek, S., Barnabe-Heider, F., Walsh, S., Zupicich, J., Alkass, K., Buchholz, B.A., Druid, H., et al. (2009). Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science 324, 98-102.
Bersell, K., Arab, S., Haring, B., and Kuhn, B. (2009). Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell 138, 257-270.
Birket, M.J., Ribeiro, M.C., Verkerk, A.O., Ward, D., Leitoguinho, A.R., den Hartogh, S.C., Orlova, V.V., Devalla, H.D., Schwach, V., Bellin, M., et al. (2015). Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 33, 970-979.
Bruneau, B.G. (2013). Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harb Perspect Biol 5, a008292.
Buikema, J.W., Mady, A.S., Mittal, N.V., Atmanli, A., Caron, L., Doevendans, P.A., Sluijter, J.P., and Domian, I.J. (2013). Wnt/beta-catenin signaling directs the regional expansion of first and second heart field-derived ventricular cardiomyocytes. Development 140, 4165-4176.
Burridge, P.W., Keller, G., Gold, J.D., and Wu, J.C. (2012). Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell stem cell 10, 16-28.
Burridge, P.W., Matsa, E., Shukla, P., Lin, Z.C., Churko, J.M., Ebert, A.D., Lan, F., Diecke, S., Huber, B., Mordwinkin, N.M., et al. (2014). Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods 11, 855-860.
Chong, J.J., Yang, X., Don, C.W., Minami, E., Liu, Y.W., Weyers, J.J., Mahoney, W.M., Van Biber, B., Cook, S.M., Palpant, N.J., et al. (2014). Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature 510, 273-277.
Cohen, E.D., Wang, Z., Lepore, J.J., Lu, M.M., Taketo, M.M., Epstein, D.J., and Morrisey, E.E. (2007). Wnt/beta-catenin signaling promotes expansion of Isl-1-positive cardiac progenitor cells through regulation of FGF signaling. J Clin Invest 117, 1794-1804.
Conejo, R., de Alvaro, C., Benito, M., Cuadrado, A., and Lorenzo, M. (2002). Insulin restores differentiation of Ras-transformed C2C12 myoblasts by inducing NF-kappaB through an AKT/P70S6K/p38-MAPK pathway. Oncogene 21, 3739-3753.
de Boer, B.A., van den Berg, G., de Boer, P.A., Moorman, A.F., and Ruijter, J.M. (2012). Growth of the developing mouse heart: an interactive qualitative and quantitative 3D atlas. Dev Biol 368, 203-213.
Foglia, M.J., and Poss, K.D. (2016). Building and re-building the heart by cardiomyocyte proliferation. Development 143, 729-740.
Foley, A.C., and Mercola, M. (2005). Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes & development 19, 387-396.
Goldstein, M.A., Claycomb, W.C., and Schwartz, A. (1974). DNA synthesis and mitosis in well-differentiated mammalian cardiocytes. Science 183, 212-213.
Heallen, T., Zhang, M., Wang, J., Bonilla-Claudio, M., Klysik, E., Johnson, R.L., and Martin, J.F. (2011). Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science 332, 458-461.
Janda, C.Y., Dang, L.T., You, C., Chang, J., de Lau, W., Zhong, Z.A., Yan, K.S., Marecic, O., Siepe, D., Li, X., et al. (2017). Surrogate Wnt agonists that phenocopy canonical Wnt and beta-catenin signalling. Nature 545, 234-237.
Josowitz, R., Lu, J., Falce, C., D'Souza, S.L., Wu, M., Cohen, N., Dubois, N.C., Zhao, Y., Sobie, E.A., Fishman, G.I., et al. (2014). Identification and purification of human induced pluripotent stem cell-derived atrial-like cardiomyocytes based on sarcolipin expression. PloS one 9, e101316.
Kattman, S.J., Witty, A.D., Gagliardi, M., Dubois, N.C., Niapour, M., Hotta, A., Ellis, J., and Keller, G. (2011). Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell 8, 228-240.
Kerkela, R., Kockeritz, L., Macaulay, K., Zhou, J., Doble, B.W., Beahm, C., Greytak, S., Woulfe, K., Trivedi, C.M., Woodgett, J.R., et al. (2008). Deletion of GSK-3beta in mice leads to hypertrophic cardiomyopathy secondary to cardiomyoblast hyperproliferation. J Clin Invest 118, 3609-3618.
Kikuchi, K., Holdway, J.E., Werdich, A.A., Anderson, R.M., Fang, Y., Egnaczyk, G.F., Evans, T., Macrae, C.A., Stainier, D.Y., and Poss, K.D. (2010). Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature 464, 601-605.
Kurabayashi, M., Komuro, I., Tsuchimochi, H., Takaku, F., and Yazaki, Y. (1988). Molecular cloning and characterization of human atrial and ventricular myosin alkali light chain cDNA clones. The Journal of biological chemistry 263, 13930-13936.
Kwon, C., Qian, L., Cheng, P., Nigam, V., Arnold, J., and Srivastava, D. (2009). A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nat Cell Biol 11, 951-957.
Laflamme, M.A., and Murry, C.E. (2011). Heart regeneration. Nature 473, 326-335.
Lee, J.H., Protze, S.I., Laksman, Z., Backx, P.H., and Keller, G.M. (2017). Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell stem cell 21, 179-194 e174.
Lian, X., Hsiao, C., Wilson, G., Zhu, K., Hazeltine, L.B., Azarin, S.M., Raval, K.K., Zhang, J., Kamp, T.J., and Palecek, S.P. (2012). Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E1848-1857.
Lian, X., Zhang, J., Azarin, S.M., Zhu, K., Hazeltine, L.B., Bao, X., Hsiao, C., Kamp, T.J., and Palecek, S.P. (2013). Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc 8, 162-175.
Lin, L., Cui, L., Zhou, W., Dufort, D., Zhang, X., Cai, C.L., Bu, L., Yang, L., Martin, J., Kemler, R., et al. (2007). Beta-catenin directly regulates Islet1 expression in cardiovascular progenitors and is required for multiple aspects of cardiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 9313-9318.
Lindsley, C.W., Barnett, S.F., Yaroschak, M., Bilodeau, M.T., and Layton, M.E. (2007). Recent progress in the development of ATP-competitive and allosteric Akt kinase inhibitors. Curr Top Med Chem 7, 1349-1363.
Liu, P., Begley, M., Michowski, W., Inuzuka, H., Ginzberg, M., Gao, D., Tsou, P., Gan, W., Papa, A., Kim, B.M., et al. (2014). Cell-cycle-regulated activation of Akt kinase by phosphorylation at its carboxyl terminus. Nature 508, 541-545.
Mauritz, C., Schwanke, K., Reppel, M., Neef, S., Katsirntaki, K., Maier, L.S., Nguemo, F., Menke, S., Haustein, M., Hescheler, J., et al. (2008). Generation of functional murine cardiac myocytes from induced pluripotent stem cells. Circulation 118, 507-517.
Mazzotta, S., Neves, C., Bonner, R.J., Bernardo, A.S., Docherty, K., and Hoppler, S. (2016). Distinctive Roles of Canonical and Noncanonical Wnt Signaling in Human Embryonic Cardiomyocyte Development. Stem Cell Reports 7, 764-776.
Paige, S.L., Osugi, T., Afanasiev, O.K., Pabon, L., Reinecke, H., and Murry, C.E. (2010). Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PloS one 5, e11134.
Patterson, M., Barske, L., Van Handel, B., Rau, C.D., Gan, P., Sharma, A., Parikh, S., Denholtz, M., Huang, Y., Yamaguchi, Y., et al. (2017). Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nat Genet 49, 1346-1353.
Porrello, E.R., Mahmoud, A.I., Simpson, E., Hill, J.A., Richardson, J.A., Olson, E.N., and Sadek, H.A. (2011). Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science 331, 1078-1080.
Protze, S.I., Liu, J., Nussinovitch, U., Ohana, L., Backx, P.H., Gepstein, L., and Keller, G.M. (2017). Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nat Biotechnol 35, 56-68.
Qyang, Y., Martin-Puig, S., Chiravuri, M., Chen, S., Xu, H., Bu, L., Jiang, X., Lin, L., Granger, A., Moretti, A., et al. (2007). The renewal and differentiation of Isl1+ cardiovascular progenitors are controlled by a Wnt/beta-catenin pathway. Cell stem cell 1, 165-179.
Ribeiro, A.J., Ang, Y.S., Fu, J.D., Rivas, R.N., Mohamed, T.M., Higgs, G.C., Srivastava, D., and Pruitt, B.L. (2015). Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, 12705-12710.
Risebro, C.A., Vieira, J.M., Klotz, L., and Riley, P.R. (2015). Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development 142, 3630-3636.
Sato, N., Meijer, L., Skaltsounis, L., Greengard, P., and Brivanlou, A.H. (2004). Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor. Nat Med 10, 55-63.
Schneider, V.A., and Mercola, M. (2001). Wnt antagonism initiates cardiogenesis in Xenopus laevis. Genes & development 15, 304-315.
Senyo, S.E., Lee, R.T., and Kuhn, B. (2014). Cardiac regeneration based on mechanisms of cardiomyocyte proliferation and differentiation. Stem Cell Res 13, 532-541.
Senyo, S.E., Steinhauser, M.L., Pizzimenti, C.L., Yang, V.K., Cai, L., Wang, M., Wu, T.D., Guerquin-Kern, J.L., Lechene, C.P., and Lee, R.T. (2013). Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature 493, 433-436.
Song, G., Ouyang, G., and Bao, S. (2005). The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival. J Cell Mol Med 9, 59-71.
Srivastava, D. (2006). Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell 126, 1037-1048.
Stoick-Cooper, C.L., Weidinger, G., Riehle, K.J., Hubbert, C., Major, M.B., Fausto, N., and Moon, R.T. (2007). Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development 134, 479-489.
Titmarsh, D.M., Glass, N.R., Mills, R.J., Hidalgo, A., Wolvetang, E.J., Porrello, E.R., Hudson, J.E., and Cooper-White, J.J. (2016). Induction of Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Proliferation Revealed by Combinatorial Screening in High Density Microbioreactor Arrays. Sci Rep 6, 24637.
Trosset, J.Y., Dalvit, C., Knapp, S., Fasolini, M., Veronesi, M., Mantegani, S., Gianellini, L.M., Catana, C., Sundstrom, M., Stouten, P.F., et al. (2006). Inhibition of protein-protein interactions: the discovery of druglike beta-catenin inhibitors by combining virtual and biophysical screening. Proteins 64, 60-67.
Tseng, A.S., Engel, F.B., and Keating, M.T. (2006). The GSK-3 inhibitor BIO promotes proliferation in mammalian cardiomyocytes. Chemistry & biology 13, 957-963.
Uosaki, H., Magadum, A., Seo, K., Fukushima, H., Takeuchi, A., Nakagawa, Y., Moyes, K.W., Narazaki, G., Kuwahara, K., Laflamme, M., et al. (2013). Identification of chemicals inducing cardiomyocyte proliferation in developmental stage-specific manner with pluripotent stem cells. Circ Cardiovasc Genet 6, 624-633.
Uygur, A., and Lee, R.T. (2016). Mechanisms of Cardiac Regeneration. Dev Cell 36, 362-374.
Wu, S.M., Chien, K.R., and Mummery, C. (2008). Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell 132, 537-543.
Yang, L., Soonpaa, M.H., Adler, E.D., Roepke, T.K., Kattman, S.J., Kennedy, M., Henckaerts, E., Bonham, K., Abbott, G.W., Linden, R.M., et al. (2008). Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature 453, 524-528.
Ye, B., Hou, N., Xiao, L., Xu, Y., Boyer, J., Xu, H., and Li, F. (2015). APC controls asymmetric Wnt/beta-catenin signaling and cardiomyocyte proliferation gradient in the heart. Journal of molecular and cellular cardiology 89, 287-296.
Yin, X., Farin, H.F., van Es, J.H., Clevers, H., Langer, R., and Karp, J.M. (2014). Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods 11, 106-112.
Zhang, J., Wilson, G.F., Soerens, A.G., Koonce, C.H., Yu, J., Palecek, S.P., Thomson, J.A., and Kamp, T.J. (2009). Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation research 104, e30-41.
Zhang, Y., Cao, N., Huang, Y., Spencer, C.I., Fu, J.D., Yu, C., Liu, K., Nie, B., Xu, T., Li, K., et al. (2016). Expandable Cardiovascular Progenitor Cells Reprogrammed from Fibroblasts. Cell stem cell 18, 368-381.
Sharma, A., Zhang, Y. & Wu, S. M. Harnessing the Induction of Cardiomyocyte Proliferation for Cardiac Regenerative Medicine. Current treatment options in cardiovascular medicine 17, 404, doi:10.1007/s11936-015-0404-z (2015).
Bergmann, O. et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science 324, 98-102, doi:10.1126/science.1164680 (2009).
Chuang, W. et al. Partial Reprogramming of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes into Neurons. Scientific reports 7, 44840, doi:10.1038/srep44840 (2017).
Laflamme, M. A. & Murry, C. E. Heart regeneration. Nature 473, 326-335, doi:10.1038/nature10147 (2011).
Serpooshan, V. et al. Nkx2.5+ Cardiomyoblasts Contribute to Cardiomyogenesis in the Neonatal Heart. Sci Rep 7, 12590, doi:10.1038/s41598-017-12869-4 (2017).
Li, G. et al. Transcriptomic Profiling Maps Anatomically Patterned Subpopulations among Single Embryonic Cardiac Cells. Dev Cell 39, 491-507, doi:10.1016/j.devcel.2016.10.014 (2016).
Lian, X. et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 109, E1848-1857, doi:10.1073/pnas.1200250109 (2012).
Sharma, A. et al. CRISPR/Cas9-Mediated Fluorescent Tagging of Endogenous Proteins in Human Pluripotent Stem Cells. Current protocols in human genetics 96, 21 11 21-21 11 20, doi:10.1002/cphg.52 (2018).
Sharma, A., Toepfer, C. N., Schmid, M., Garfinkel, A. C. & Seidman, C. E. Differentiation and Contractile Analysis of GFP-Sarcomere Reporter hiPSC-Cardiomyocytes. Current protocols in human genetics 96, 21 12 21-21 12 12, doi:10.1002/cphg.53 (2018).
Burridge, P. W. et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods 11, 855-860, doi:10.1038/nmeth.2999 (2014).
Lian, X. et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc 8, 162-175, doi:10.1038/nprot.2012.150 (2013).
Kleger, A., Liebau, S., Lin, Q., von Wichert, G. & Seufferlein, T. The impact of bioactive lipids on cardiovascular development. Stem cells international 2011, 916180, doi:10.4061/2011/916180 (2011).
Clay, H. et al. Sphingosine 1-phosphate receptor-1 in cardiomyocytes is required for normal cardiac development. Dev Biol 418, 157-165, doi:10.1016/j.ydbio.2016.06.024 (2016).
Avery, K., Avery, S., Shepherd, J., Heath, P. R. & Moore, H. Sphingosine-1-phosphate mediates transcriptional regulation of key targets associated with survival, proliferation, and pluripotency in human embryonic stem cells. Stem cells and development 17, 1195-1205, doi:10.1089/scd.2008.0063 (2008).
Garcia-Gonzalo, F. R. & Izpisua Belmonte, J. C. Albumin-associated lipids regulate human embryonic stem cell self-renewal. PloS one 3, e1384, doi:10.1371/journal.pone.0001384 (2008).
Pebay, A., Bonder, C. S. & Pitson, S. M. Stem cell regulation by lysophospholipids. Prostaglandins Other Lipid Mediat 84, 83-97, doi:10.1016/j.prostaglandins.2007.08.004 (2007).
Harvey, K. F., Zhang, X. & Thomas, D. M. The Hippo pathway and human cancer. Nat Rev Cancer 13, 246-257, doi:10.1038/nrc3458 (2013).
Marinissen, M. J. & Gutkind, J. S. G-protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci 22, 368-376 (2001).
Oskouian, B. & Saba, J. Sphingosine-1-phosphate metabolism and intestinal tumorigenesis: lipid signaling strikes again. Cell Cycle 6, 522-527, doi:10.4161/cc.6.5.3903 (2007).
Yang, M. et al. G protein-coupled lysophosphatidic acid receptors stimulate proliferation of colon cancer cells through the {beta}-catenin pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 6027-6032, doi:10.1073/pnas.0501535102 (2005).
Churko, J. M., Burridge, P. W. & Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods in molecular biology 1036, 81-88, doi:10.1007/978-1-62703-511-8_7 (2013).
Kam, Y. & Quaranta, V. Cadherin-bound beta-catenin feeds into the Wnt pathway upon adherens junctions dissociation: evidence for an intersection between beta-catenin pools. PloS one 4, e4580, doi:10.1371/journal.pone.0004580 (2009).
Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H. & Moon, R. T. Zebrafish prickle, a modulator of noncanonical Wnt/Fz signaling, regulates gastrulation movements. Curr Biol 13, 680-685 (2003).
Paige, S. L. et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PloS one 5, e11134, doi:10.1371/journal.pone.0011134 (2010).
Mendez, M. G., Kojima, S. & Goldman, R. D. Vimentin induces changes in cell shape, motility, and adhesion during the epithelial to mesenchymal transition. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 24, 1838-1851, doi:10.1096/fj.09-151639 (2010).
Buikema, J. W. et al. Wnt/beta-catenin signaling directs the regional expansion of first and second heart field-derived ventricular cardiomyocytes. Development 140, 4165-4176, doi:10.1242/dev.099325 (2013).
Mills, R. J. et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, doi:10.1073/pnas.1707316114 (2017).
Sharma, A. et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of visualized experiments : JoVE, doi:10.3791/52628 (2015).
Titmarsh, D. M. et al. Induction of Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Proliferation Revealed by Combinatorial Screening in High Density Microbioreactor Arrays. Scientific reports 6, 24637, doi:10.1038/srep24637 (2016).
Yusuf, S. W., Sharma, J., Durand, J. B. & Banchs, J. Endocarditis and myocarditis: a brief review. Expert review of cardiovascular therapy 10, 1153-1164, doi:10.1586/erc.12.107 (2012).
Heallen, T. et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science 332, 458-461, doi:10.1126/science.1199010 (2011).
Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y. & Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature 547, 227-231, doi:10.1038/nature22979 (2017).
Leach, J. P. et al. Hippo pathway deficiency reverses systolic heart failure after infarction. Nature 550, 260-264, doi:10.1038/nature24045 (2017).
von Gise, A. et al. YAP1, the nuclear target of Hippo signaling, stimulates heart growth through cardiomyocyte proliferation but not hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 2394-2399, doi:10.1073/pnas.1116136109 (2012).
Zhang, W. & Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell research 12, 9-18, doi:10.1038/sj.cr.7290105 (2002).
Kim, K. B. et al. Phase II study of the MEK1/MEK2 inhibitor Trametinib in patients with metastatic BRAF-mutant cutaneous melanoma previously treated with or without a BRAF inhibitor. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 31, 482-489, doi:10.1200/JCO.2012.43.5966 (2013).
Davis, M. D., Clemens, J. J., Macdonald, T. L. & Lynch, K. R. Sphingosine 1-phosphate analogs as receptor antagonists. The Journal of biological chemistry 280, 9833-9841, doi:10.1074/jbc.M412356200 (2005).
Hannun, Y. A. & Obeid, L. M. Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids. Nature reviews. Molecular cell biology 9, 139-150, doi:10.1038/nrm2329 (2008).
Lamouille, S., Xu, J. & Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nature reviews. Molecular cell biology 15, 178-196, doi:10.1038/nrm3758 (2014).
Burkhalter, R. J., Westfall, S. D., Liu, Y. & Stack, M. S. Lysophosphatidic Acid Initiates Epithelial to Mesenchymal Transition and Induces beta-Catenin-mediated Transcription in Epithelial Ovarian Carcinoma. The Journal of biological chemistry 290, 22143-22154, doi:10.1074/jbc.M115.641092 (2015).
McMullen, M. E., Bryant, P. W., Glembotski, C. C., Vincent, P. A. & Pumiglia, K. M. Activation of p38 has opposing effects on the proliferation and migration of endothelial cells. The Journal of biological chemistry 280, 20995-21003, doi:10.1074/jbc.M407060200 (2005).
Lin, Z. et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circulation research 116, 35-45, doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.304457 (2015).
Bassat, E. et al. The extracellular matrix protein agrin promotes heart regeneration in mice. Nature 547, 179-184, doi:10.1038/nature22978 (2017).
Tohyama, S. et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell 12, 127-137, doi:10.1016/j.stem.2012.09.013 (2013).
Sharma, A. et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation research 115, 556-566, doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.303810 (2014).
Schmittgen, T. D. & Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc 3, 1101-1108 (2008).
【図１】
2021518113.tif 000003
【図２】
2021518113.tif 000004
【図３】
2021518113.tif 000005
【図４】
2021518113.tif 000006
【図５】
2021518113.tif 000007
【図６】
2021518113.tif 000008
【図７】
2021518113.tif 000009
【図８】
2021518113.tif 000010
【図９】
2021518113.tif 000011
【図１０】
2021518113.tif 000012
【図１１】
2021518113.tif 000013
【図１２】
2021518113.tif 000014
【図１３】
2021518113.tif 000015
【図１４】
2021518113.tif 000016
【図１５】
2021518113.tif 000017
【図１６】
2021518113.tif 000018
【図１７】
2021518113.tif 000019
【図１８】
2021518113.tif 000020
【図１９】
2021518113.tif 000021
【図２０】
2021518113.tif 000022
【図２１】
2021518113.tif 000023
【図２２】
2021518113.tif 000024
【図２３】
2021518113.tif 000025
【図２４】
2021518113.tif 000026
【図２５】
2021518113.tif 000027
【図２６】
2021518113.tif 000028
【図２７】
2021518113.tif 000029
【国際調査報告】
2021518113.tif 000030
2021518113.tif 000031