(57)【要約】  本発明は、リアルタイムなグルタチオンの測定により治療用細胞の品質を測定する方法を提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の細胞を分離するステップと、
分離した細胞のグルタチオンのレベルを測定するステップと、
グルタチオンのレベルによる細胞の品質を判断するステップと、
を含む細胞の品質を測定する方法において、
グルタチオンのレベルによる細胞の品質を判断するステップは、下記の評価パラメータのうちのいずれか１つ以上である方法：
ｉ）細胞のグルタチオン平均値又は中央値（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｍｅａｎ  Ｌｅｖｅｌ、ＧＭ）；
ｉｉ）細胞のグルタチオン散布度（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ、ＧＨ）；
ｉｉｉ）細胞のグルタチオン再生産能力（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＧＲＣ）；及び
ｉｖ）酸化ストレス抵抗能力（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＯＲＣ）
ここで、
ＧＭは、細胞ＦＲ（ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ  Ｒａｔｉｏ）又はＦ５１０の平均値又は中央値で算出し、
ＧＨは、細胞ＦＲ又はＦ５１０の変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）又はロバスト変動係数（Ｒｏｂｕｓｔ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）で算出し、
ＧＲＣは、生きている細胞に酸化剤処理後にリアルタイムにＦＲ又はＦ５１０をモニタリングして得られる数値で、第１酸化剤処理群の第１曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）から第２酸化剤処理群の第２曲線下面積を引いた値を、無処理対照群の第３曲線下面積から第２酸化剤処理群の第２曲線下面積を引いた値で割った後、１００を乗じた値で算出し、
ＯＲＣは、生きている細胞に第１酸化剤処理後にＧＳＨのレベルを定量して得られる数値で、ＧＳＨのレベルを、第１酸化剤処理しなかった対照群細胞又は第１酸化剤処理する前の対照群細胞で定量されたＧＳＨのレベルを比較して、ＧＳＨの発現が変動した細胞量で算出した値である、方法。
【請求項２】
グルタチオンのレベルの測定は、下記の化学式Ａ又はＢを添加してグルタチオンのレベルを測定する、請求項１に記載の方法：
【化１】
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前記化学式Ａにおいて、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素又はＣ１−４直鎖若しくは分枝鎖アルキルであるか、Ｒ１、Ｒ２及びＸがともに５員又は６員環をなすヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルであり；Ｒ３は、水素又はＣ１−４直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり；Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキルである（前記ｍは１〜５の整数である）か、Ｒ４、Ｒ５及びＹは、ともにＣ３−７ヘテロシクロアルキルをなし、前記ヘテロシクロアルキルは、非置換若しくはＲ６で置換されたヘテロシクロアルキルであり；前記Ｒ６は、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル（前記ｎは１〜５の整数である）、−（ＣＯＮＨ）−（ＣＨ２）ｏ−ＰＰｈ３＋Ｃｌ−（前記ｏは１〜５の整数である）又は−（ＣＯＮＨ）−ＣＨＲ７−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｐ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり（前記ｐは１〜５の整数である）；前記Ｒ７は、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｒ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル（前記ｑ及びｒはそれぞれ１〜５の整数である）であり；Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｎ又はＯであるか；
【化２】
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前記化学式Ｂにおいて、
Ｒ１は、１つ以上のＮを含む３〜７員環であるヘテロシクロアルキルである。
【請求項３】
化学式Ａ又はＢは、下記の化学式のうちのいずれか１つである、請求項２に記載の方法。
【化３】
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【請求項４】
ＦＲは、４３０〜５５０ｎｍにおける蛍光強度（Ｆ５１０）及び５５０〜６８０ｎｍにおける蛍光強度（Ｆ５８０）の比率である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酸化ストレスを処理する前又は処理した後に、細胞のグルタチオン平均値又は中央値は増加するほど良質の品質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酸化ストレスを処理する前又は処理した後に、細胞のグルタチオン散布度（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ、ＧＨ）は減少するほど良質の品質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞のグルタチオン再生産能力（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＧＲＣ）は増加するほど良質の品質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
酸化ストレス抵抗能力（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＯＲＣ）は、酸化剤処理時に測定したＧＳＨの量が、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞のＧＳＨの量に比べて減少した細胞の数が少ないか、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞のＧＳＨの量より高いか、その量と同じ細胞の数が多いほど良質の品質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第１酸化剤は、Ｈ２Ｏ２、及びｔｅｒｔ−ブチル過酸化物を含むヒドロ過酸化物（ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）；ジアミド、ＧＳＳＧ（ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＧＳＨ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸及びヨードアセトアミドを含むチオール酸化剤；ビス−クロロエチルニトロソウレアを含むグルタチオン還元酵素抑制剤；ＰＸ−１２を含むチオレドキシン抑制剤；アンチマイシンＡ、ロテノン、オリゴマイシン及びカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾンを含むミトコンドリア電子伝達系抑制剤；ホルボール１２−ミリステート１３−アセテートを含むＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤；１Ｓ，３Ｒ−ＲＡＳ−セレクティブリーサル３（１Ｓ，３Ｒ−ＲＡＳ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｔｈａｌ３；１Ｓ，３Ｒ−ＲＳＬ３）、ＤＰＩ１９、ＤＰＩ１８、ＤＰＩ１７、ＤＰＩ１３、ＤＰＩ１２、ＤＰＩ１０（ＭＬ２１０）、ＤＰＩ７（ＭＬ１６２）、又はアルトレタミンを含むｇｐｘ４抑制剤；エラスチン（Ｅｒａｓｔｉｎ）、スルファサラジン、ソラフェニブ、グルタメート、ピペラジンエラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、及びエラスチン類似体を含むシステムｘ−ｃ抑制剤；フェロトーシス誘導体５６（ＦＩＮ５６）を含むＧＰＸ４タンパク質量及びＣｏＱ１０量減少誘導剤；カスパーゼ−依存性リーサル５６（ＣＩＬ５６）及びフェロトーシス誘導体エンドペルオキシド（ＦＩＮＯ２）を含む脂質過酸化誘導剤；ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシミンを含むグルタミン酸塩システイン連結酵素（ＧＣＬ）抑制剤；ジエチルマレイン酸塩を含むＧＳＨ減少誘導剤；ＤＰＩ２、シスプラチン、システイナーゼ（ｃｙｓｔｅｉｎａｓｅ）、スタチン、クエン酸鉄アンモニウム、トリゴネリン、四塩化炭素、シリカ系ナノ粒子及び非熱プラズマを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第２酸化剤は、マレイミド、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、エチルマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、又はヨードアセトアミドプロピオン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
目的の細胞は、成体幹細胞、胚幹細胞及び誘導万能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）からなる群より選択されたいずれか１つである幹細胞；
樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞（Ｔ  ｃｅｌｌ）、Ｂ細胞（Ｂ  ｃｅｌｌ）、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ）、先天性リンパ球細胞（Ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、顆粒球（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｔ  ｃｅｌｌ）、リンホカイン活性キラー細胞（ＬＡＫ：Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ）及びサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ）からなる群より選択されたいずれか１つである兔疫細胞；
線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、滑液膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）、皮膚角質細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）及び末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）からなる群より選択されたいずれか１つである体細胞（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）；
ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞からなる群より選択されたいずれか１つであるタンパク質製剤の生産に使用される細胞株；又は
人体又は動物の口腔、鼻腔、肺、皮膚、胃腸管、泌尿管などに由来する微生物からなる群より選択されたいずれか１つである人体マイクロバイオーム（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌ）を除いたものである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムなグルタチオンの測定による細胞の品質を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体は抗酸化系の作用により活性酸素種を適切に除去して恒常性を維持するが、ＲＯＳの生成と抗酸化系作用との間のバランスが崩れると酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ）が増加し、これは、老化を含めて退行性関節炎、白内障、アルツハイマーなどの老化関連退行性疾患、各種癌、線維化疾患をはじめとして、最近は、糖尿病、肥満、心血管疾患などの代謝性症侯群の発病に重要な共通の原因因子として注目されている。前記ＲＯＳは、不安定で反応性が高く、生体分子を酸化させて生化学的、生理的損傷を誘発させるが、これは、老化の主要機序の一つである。したがって、人体の酸化度だけでなく、抗酸化度や抗酸化能力は生体年齢の計測において主なバイオマーカーになり得る。
【０００３】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、細胞の代謝、増殖及び生存を調節する重要なシグナル分子である。ＲＯＳの増加はシグナル伝達タンパク質上のシステイン残基のチオール酸化を誘導して、細胞の機能を調節するためのタンパク質活性の変化をもたらす。特に、ＲＯＳ媒介酸化は、ＯＣＴ４、ＮＲＦ２、ＦｏｘＯｓ、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１、ＡＴＭ、ＨＩＦ−１、ｐ３８、及びｐ５３を含めて自己再生能力、多能性、生存力及びゲノム安定性に影響を及ぼす幹細胞（ＳＣ）の多様なシグナルタンパク質を調節するのに重要な役割を果たす（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００４】
一方、幹細胞及び細胞培養物の品質、一貫性及び効能を評価するのに利用される多数の方法がある。幹細胞の場合、自己再生能（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｃａｐａｃｉｔｙ）及び特異的マーカーの発現によって定義される。所望する細胞群の同一性が定義されなければならない。現ｈＥＳＣ細胞株は、一連の標準化されたメトリックス（ｍｅｔｒｉｃｓ）、すなわち表面抗原、特定の酵素活性（例えば、アルカリ性ホスファターゼ）の発現、遺伝子発現、後生遺伝学的マーカー（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ）、ゲノム安定性評価、細胞学及び形態のみならず、試験管内（胚体形成）及び生体内分化潜在性（テラトーマ系異種移植類（ｔｅｒａｔｏｍａ−ｌｉｋｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）形成）を利用して（日本国登録特許第５１８５４４３号）、測定可能な微生物学的感染の不在によって特性化される。しかし、これら幹細胞の特性を評価するのに利用される手順は、熟練した人材を必要とするが、情報内容が相対的に少なく、時間消費的で費用が多くかかる。しかも、安全性プロファイル及び／又はこれから生成された細胞の目的適合性に関する決定的な情報を示すことができない。幹細胞の場合、未分化細胞の増殖を支援する条件下で細胞群の拡張を含むことで、培養において継続的な継代培養下で誘導段階の幹細胞株の品質及び一貫性に関する情報の提供及び正確な細胞の品質の測定及び品質の向上が必要なのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、リアルタイムなグルタチオンの測定により治療用細胞の品質を測定する方法を提供することである。また、本発明は、細胞を特性化し、及び／又は試験管内の細胞培養系の品質及び安全性プロファイルを向上させることを、目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以下、本願に記載の多様な具体例が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物及び工程などが記載されている。しかし、特定の具体例はこれらの特異的詳細事項の一つ以上なしに、又は他の公知の方法及び形態とともに実行可能である。他の例において、公知の工程及び製造技術は、本発明を不必要にあいまいにしないために、特定の詳細事項として記載されない。「一つの具体例」又は「具体例」についての本明細書全体を通した参照は具体例と結び付いて記載された特別な特徴、形態、組成又は特性が、本発明の一つ以上の具体例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一つの具体例において」又は「具体例」の状況は、必ずしも本発明の同一の具体例を示さない。さらに、特別な特徴、形態、組成、又は特性は、一つ以上の具体例において、何らかの好適な方法で組み合わされる。明細書で特別な定義がなければ、本明細書に使われたすべての科学的及び技術的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０００７】
本発明の一具体例において、用語「ＦｒｅＳＨ−トレーサー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＳＨ  ｇｒｏｕｐ−Ｔｒａｃｅｒ）」又は「ＦｒｅＳＨ」は、下記の化学式Ａで表される化合物又はその塩を含む化合物を意味し、細胞小器官に制限のないチオール検出用蛍光物質として使用される。したがって、ＦｒｅＳＨ−トレーサーは、細胞小器官に特異的な化合物及びこれに限定しない化合物をすべて含む。
【化１】
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前記化学式Ａにおいて、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素又はＣ１−４直鎖若しくは分枝鎖アルキルであるか、Ｒ１、Ｒ２及びＸがともに５員又は６員環をなすヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルであり；Ｒ３は、水素又はＣ１−４直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり；Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキルである（前記ｍは１〜５の整数である）か、Ｒ４、Ｒ５及びＹは、ともにＣ３−７ヘテロシクロアルキルをなし、前記ヘテロシクロアルキルは、非置換若しくはＲ６で置換されたヘテロシクロアルキルであり；前記Ｒ６は、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル（前記ｎは１〜５の整数である）、−（ＣＯＮＨ）−（ＣＨ２）ｏ−ＰＰｈ３＋Ｃｌ−（前記ｏは１〜５の整数である）又は−（ＣＯＮＨ）−ＣＨＲ７−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｐ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり（前記ｐは１〜５の整数である）；前記Ｒ７は、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｒ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル（前記ｑ及びｒはそれぞれ１〜５の整数である）であり；Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｎ又はＯである。
【０００８】
本発明の一具体例において、用語「ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサー（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＳＨ  ｇｒｏｕｐ−Ｔｒａｃｅｒ）」又は「ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサー（Ｇｏｌｇｉ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＳＨ  ｇｒｏｕｐ−Ｔｒａｃｅｒ）」は、下記の化学式Ｂで表される化合物又はその塩を含む化合物を意味し、これに限定されないが、ミトコンドリア又はゴルジ体内のチオールの量を測定するのに使用する。また、その具体例において、特に、化学式Ｂ−８で表される化合物は、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサーとして使用され、化学式Ｂ−４で表される化合物は、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーとして使用される。前記このような化合物を介してミトコンドリア又はゴルジ体内のチオールの量に応じて蛍光強度が連続的でレシオメトリックかつ可逆的に増減することを解明することができる。
【化２】
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【０００９】
前記化学式Ｂにおいて、Ｒ１は、１つ以上のＮを含む３〜７員環であるヘテロシクロアルキルである。
【００１０】
本明細書において、用語「レシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）」は、算出量が投入量（ｉｎｐｕｔ）に直接的に比例することを意味する。具体的には、本発明の一実施形態において、「レシオメトリック」は、本発明の組成物がチオールの投入量に応じて直接的に比例して蛍光強度又は蛍光強度の比率が増加又は減少することを意味する。
【００１１】
本明細書において、用語「検出」は、試料中で化学種や生物学的物質の存在の有無やその量を測定することを意味する。
【００１２】
本明細書において、用語「可逆的（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）」は、化学反応で反応物と生成物の混合物が平衡状態の混合物を生成することが可能な状態を意味する。
【００１３】
本明細書において、用語「チオール（ｔｈｉｏｌ）」は、炭素と結合したスルフヒドリル基を含む有機化合物を意味し、スルフヒドリル基又はチオール基は混用されて使用される。
【００１４】
本発明の一実施形態において、本発明のミトコンドリアは、生細胞（ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ）内に含まれたものである。本発明の組成物は、ミトコンドリア内のチオールレベルを測定するにあたり、細胞から分離されたミトコンドリアに限らず、細胞内に含まれた状態のミトコンドリア内のチオールレベルを測定できる特徴がある。特に、生きている細胞内のミトコンドリアにおけるチオールレベルを特異的に検出することができる。
【００１５】
本明細書において、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサーは、シアノアクリルアミド親電子体（ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ）を有するクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）誘導体であって、本願の化学式Ｂで表される化合物を意味し、本発明におけるゴルジ体内のチオール検出用蛍光物質として使用される。本発明者らは、細胞内ゴルジ体におけるチオールの量をリアルタイムに定量又は定性的に検出可能なバイオセンサであるＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサーを開発した。その結果、本願の化学式Ｂ−５で表される本発明のＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサー（Ｇｏｌｇｉ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＳＨ  ｇｒｏｕｐ−Ｔｒａｃｅｒ）が細胞内ゴルジ体におけるチオールの量に応じて蛍光強度が連続的でレシオメトリックかつ可逆的に増減することを見出し、細胞内ゴルジ体におけるチオールの量をリアルタイムに定量又は定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサとして有用に利用可能であることを立証した。
【００１６】
本発明の一実施形態において、細胞又は幹細胞の「安全性」及び「品質」に関連し、安全でない（例えば、腫瘍形成）細胞又は細胞及び／又は良くない品質（おそらく特異的マーカーの発現不足）の細胞間の表現型の差がある。これは、標準の方法によって検出されないことがある。本発明は、細胞又は細胞系（例えば、細胞培養物の細胞群）が一連の予め決定された標準に符合するか否かを決定し符合するように細胞の特性を向上させる高度かつ敏感で精巧な手段を提供する。従来においては、細胞の品質特性を把握するために、熟練者が一連の予め決定された安全性及び／又は品質標準に符合すると知られている細胞のマイクロＲＮＡプロファイルを確立し、同一類型の他の細胞に対してマイクロＲＮＡの比較によって予め決定された品質及び／又は特性に符合するかを評価することができた。
【００１７】
本発明の一実施形態において、「ブチオニンスルホキシミン（Ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ、ＢＳＯ）」は、グルタチオン（ＧＳＨ）の合成のための必須酵素であるγ−グルタミルシステイン合成酵素を不可逆的に抑制することにより、細胞に酸化ストレスを誘導する。ＧＳＨ欠乏によって誘導された酸化ストレスがＤＮＡ欠失のようなゲノム再配列を誘導できることが公知であり、外因性抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）による酸化促進条件を阻害することにより、ＤＮＡ欠失を抑制することができる。
【００１８】
本発明において、用語、「幹細胞」は、自己複製能及び分化増殖能を有する未分化細胞を意味する。幹細胞には、分化能力によって、万能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、単分化能幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）などの亜集団が含まれる。前記万能性幹細胞は、生体を構成するすべての組織や細胞に分化できる能力を有する細胞を意味する。また、多能性幹細胞は、すべての種類ではないが、複数種の組織や細胞に分化できる能力を有する細胞を意味する。単分化能幹細胞は、特定の組織や細胞に分化できる能力を有する細胞を意味する。万能性幹細胞としては、胚幹細胞（ＥＳ  Ｃｅｌｌ）、未分化生殖腺細胞（ＥＧ  Ｃｅｌｌ）、逆分化幹細胞（ｉＰＳ  ｃｅｌｌ）などが挙げられる。多能性幹細胞としては、間葉系幹細胞（脂肪由来、骨髓由来、臍帯血又は臍帯由来など）、造血系幹細胞（骨髓又は末梢血液などに由来）、神経系幹細胞、生殖幹細胞などの成体幹細胞などが挙げられる。また、単分化能幹細胞としては、普段は分裂能が低い状態で存在し、活性化後に旺盛な分裂でもっぱら幹細胞のみを作る幹細胞（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）などが挙げられる。特に、本願発明において、中間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、ｈＥＳ−ＭＳＣ（Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）、ＢＭ−ＭＳＣ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、ＵＣ−ＭＳＣ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、及びＡＤＳＣ（Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）であることが好ましく、これに限定されるものではない。
【００１９】
本発明において、用語、「胚幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＥＳＣ）」は、受精卵が着床する直前である胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内部細胞塊（細胞内塊、ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）を分離して体外で培養した細胞で、個体の全組織の細胞に分化できる万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する。広義では、胚幹細胞に由来する胚体を含む。本発明において、用語、「胚体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｂｏｄｙ又はｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ、ＥＢ）」は、浮遊培養状態で生成された球状の幹細胞の塊を意味し、潜在的に内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化できる能力を有していて、組織特異的分化細胞を確保するための大部分の分化誘導過程で前駆体として用いられる。
【００２０】
本発明において、用語、「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）」は、生薬を適切な浸出液に搾り出し、浸出液を蒸発させて濃縮した製剤を意味するもので、これに限定されないが、抽出処理によって得られる抽出液、抽出液の希釈液又は濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、これらの粗精製物又は精製物であってもよい。抽出方法としては、これに限定されないが、好ましくは、熱湯抽出、熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出又は超音波抽出などの方法を用いることができる。
【００２１】
本発明において、抽出物は、抽出溶媒で抽出するか、抽出溶媒で抽出して製造した抽出物に分画溶媒を加えて分画することにより製造することができる。前記抽出溶媒はこれに限定されないが、水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒などを使用することができ、前記有機溶媒は、炭素数１〜４のアルコールや、エチルアセテート又はアセトンなどの極性溶媒、ヘキサン又はジクロロメタンの非極性溶媒又はこれらの混合溶媒を使用することができる。
【００２２】
グルタチオンプローブを通して細胞全体又は細胞小器官によってＧＳＨの量を測定することができる。本発明のＦｒｅＳＨｒａｃｅｒは、生きている細胞内のグルタチオン（ＧＳＨ）の量を迅速かつ容易に測定できるように、新たに合成された蛍光染料である。ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒは、細胞と細胞小器官内に入りやすい小さい分子プローブでＧＳＨのチオール（−ＳＨ）基と結合して作用する（図１参照）。ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅがＧＳＨに結合すれば５１０ｎｍ（Ｆ５１０）の波長帯の蛍光を示し、ＧＳＨと結合しなければ５８０ｎｍ（Ｆ５８０）の波長帯の蛍光を示す。このように測定されたＦ５１０／Ｆ５８０の蛍光値で細胞内ＧＳＨの量を測定することができる。ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒとＧＳＨとの間の反応は可逆的で、測定するのに細胞内ＧＳＨを消費しない。
【００２３】
本発明において、用語「グルタチオン平均値又は中央値（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｍｅａｎ  Ｌｅｖｅｌ、ＧＭ）」は、前記グルタチオンの測定方法を利用して、培養された細胞でのＧＳＨの平均値又は中央値を測定して細胞の抗酸化能力を測定できるパラメータである。
【００２４】
本発明において、用語「グルタチオン散布度（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ、ＧＨ）」は、前記グルタチオンの測定方法を利用して、培養された細胞でのＧＳＨの分布様相を測定して細胞の抗酸化能力を測定できるパラメータである。この散布度は、変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）やロバスト変動係数（Ｒｏｂｕｓｔ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」であり、変動係数を求める法は図８に示されているものである。
【００２５】
本発明において、用語「グルタチオン再生産能力（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＧＲＣ）」は、ジアミドを処理してＧＳＨがＧＳＳＧに還元される条件を誘発し、細胞のＧＳＨの濃度をリアルタイムに測定して再度ＧＳＨに回復させる能力を測定して細胞の抗酸化能力を客観的に分析できるパラメータである。すなわち、生きている細胞に酸化剤処理後にリアルタイムにＦＲやＦ５１０をモニタリングして得られる数値で、第１酸化剤処理群の第１曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）から第２酸化剤処理群の第２曲線下面積を引いた値を、無処理対照群の第３曲線下面積から第２酸化剤処理群の第２曲線下面積を引いた値で割った後、１００を乗じた値で算出した値である。
【００２６】
本発明において、「可逆的酸化剤」又は「第１酸化剤」は、Ｈ２Ｏ２、及びｔｅｒｔ−ブチル過酸化物を含むヒドロ過酸化物（ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）；ジアミド、ＧＳＳＧ（ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＧＳＨ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸及びヨードアセトアミドを含むチオール酸化剤；ビス−クロロエチルニトロソウレアを含むグルタチオン還元酵素抑制剤；ＰＸ−１２を含むチオレドキシン抑制剤；アンチマイシンＡ、ロテノン、オリゴマイシン及びカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾンを含むミトコンドリア電子伝達系抑制剤；ホルボール１２−ミリステート１３−アセテートを含むＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤；１Ｓ，３Ｒ−ＲＡＳ−セレクティブリーサル３（１Ｓ，３Ｒ−ＲＡＳ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｔｈａｌ３；１Ｓ，３Ｒ−ＲＳＬ３）、ＤＰＩ１９、ＤＰＩ１８、ＤＰＩ１７、ＤＰＩ１３、ＤＰＩ１２、ＤＰＩ１０（ＭＬ２１０）、ＤＰＩ７（ＭＬ１６２）、又はアルトレタミンを含むｇｐｘ４抑制剤；エラスチン（Ｅｒａｓｔｉｎ）、スルファサラジン、ソラフェニブ、グルタメート、ピペラジンエラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、及びエラスチン類似体を含むシステムｘ−ｃ抑制剤；フェロトーシス誘導体５６（ＦＩＮ５６）を含むＧＰＸ４タンパク質量及びＣｏＱ１０量減少誘導剤；カスパーゼ−依存性リーサル５６（ＣＩＬ５６）及びフェロトーシス誘導体エンドペルオキシド（ＦＩＮＯ２）を含む脂質過酸化誘導剤；ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシミンを含むグルタミン酸塩システイン連結酵素（ＧＣＬ）抑制剤；ジエチルマレイン酸塩を含むＧＳＨ減少誘導剤；ＤＰＩ２、シスプラチン、システイナーゼ（ｃｙｓｔｅｉｎａｓｅ）、スタチン、クエン酸鉄アンモニウム、トリゴネリン、四塩化炭素、シリカ系ナノ粒子及び非熱プラズマを含むことができる。前記酸化ストレスの濃度は、０．０５〜２０μＭであってもよい。
【００２７】
本発明において、用語「不可逆的チオール酸化剤」、「不可逆的酸化剤」又は「第２酸化剤」は、細胞毒性剤内に任意の反応しない基（仮に、チオール）の鎮静を担保するのに用いられる製剤である。これは、細胞毒性剤、特に反応しないチオール基を有する細胞毒性剤（仮に、ＤＭ１）の二量体化を予防するのに用いられる。すなわち、不可逆的チオール酸化剤は、ＧＳＨを完全に無くすブランク（ｂｌａｎｋ）群を作るための物質である。例えば、マレイミド、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、エチルマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、又はヨードアセトアミドプロピオン酸が挙げられるが、これに限定されるものではなく、エチルマレイミドが好ましい。
【００２８】
一具体例において、幹細胞の品質は、ＧＭ、ＧＨ及びＧＲＣ基準値範囲に決定可能であるが、対象細胞のＧＭ、ＧＨ及びＧＲＣの値と対象細胞の標準幹細胞の値とを比較して決定することができる。
【００２９】
本発明において、用語「酸化剤」は、通常酸化させる物質の他に、細胞に酸化ストレスを誘発させる処理を含む。好ましくは、これは、第１酸化剤又は第２酸化剤を含む。
【００３０】
本発明において、用語「酸化ストレス抵抗能力（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＯＲＣ）」は、生きている細胞に第１酸化剤処理後にＧＳＨのレベルを定量して得られる数値で、ＧＳＨのレベルを、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞で定量されたＧＳＨのレベルを比較して、ＧＳＨの発現が変動した細胞量で算出した値である。例えば、好ましくは、細胞に酸化ストレスを加えた後、ミトコンドリアグルタチオン（ｍＧＳＨ）の発現レベルを正常レベルに維持できるかを測定することができる。また、一具体例において、幹細胞の品質は、ＯＲＣ値が１０％から１００％、好ましくは３０％から９０％、より好ましくは４０％から９０％に決定可能である。
【００３１】
本発明において、ＯＲＣにおける用語「酸化ストレス」は、細胞に第１酸化剤を加えたことを意味する。
【００３２】
本発明は、目的の細胞を分離するステップと、分離した細胞のグルタチオンのレベルを測定するステップと、グルタチオンのレベルによる細胞の品質を判断するステップと、を含む細胞の品質を測定する方法であって、グルタチオンのレベルによる細胞の品質を判断するステップは、下記の評価パラメータのうちのいずれか１つ以上であり：
ｉ）細胞のグルタチオン平均値又は中央値（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｍｅａｎ  Ｌｅｖｅｌ、ＧＭ）；
ｉｉ）細胞のグルタチオン散布度（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ、ＧＨ）；
ｉｉｉ）細胞のグルタチオン再生産能力（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＧＲＣ）；及び
ｉｖ）酸化ストレス抵抗能力（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＯＲＣ）が挙げられ、ここで、ＧＭは、細胞ＦＲ（ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ  Ｒａｔｉｏ）又はＦ５１０の平均値又は中央値で算出し、ＧＨは、細胞ＦＲ又はＦ５１０の変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）又はロバスト変動係数（Ｒｏｂｕｓｔ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）で算出し、ＧＲＣは、生きている細胞に酸化剤処理後にリアルタイムにＦＲ又はＦ５１０をモニタリングして得られる数値で、第１酸化剤処理群の第１曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）から第２酸化剤処理群の第２曲線下面積を引いた値を、無処理対照群の第３曲線下面積から第２酸化剤処理群の第２曲線下面積を引いた値で割った後、１００を乗じた値で算出し、ＯＲＣは、生きている細胞に第１酸化剤処理後にＧＳＨのレベルを定量して得られる数値で、ＧＳＨのレベルを、第１酸化剤処理しなかった対照群細胞又は第１酸化剤処理する前の対照群細胞で定量されたＧＳＨのレベルを比較して、ＧＳＨの発現が変動した細胞量で算出した値である、
方法を提供する。
【００３３】
本発明の一具体例において、グルタチオンのレベルの測定は、下記の化学式Ａ又はＢを添加してグルタチオンのレベルを測定する方法である：
【化３】
2021504727.tif 000005
前記化学式Ａにおいて、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素又はＣ１−４直鎖若しくは分枝鎖アルキルであるか、Ｒ１、Ｒ２及びＸがともに５員又は６員環をなすヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルであり；Ｒ３は、水素又はＣ１−４直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり；Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキルである（前記ｍは１〜５の整数である）か、Ｒ４、Ｒ５及びＹは、ともにＣ３−７ヘテロシクロアルキルをなし、前記ヘテロシクロアルキルは、非置換若しくはＲ６で置換されたヘテロシクロアルキルであり；前記Ｒ６は、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル（前記ｎは１〜５の整数である）、−（ＣＯＮＨ）−（ＣＨ２）ｏ−ＰＰｈ３＋Ｃｌ−（前記ｏは１〜５の整数である）又は−（ＣＯＮＨ）−ＣＨＲ７−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｐ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり（前記ｐは１〜５の整数である）；前記Ｒ７は、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｒ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル（前記ｑ及びｒはそれぞれ１〜５の整数である）であり；Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｎ又はＯであるか；
【化４】
2021504727.tif 000006
前記化学式Ｂにおいて、
Ｒ１は、１つ以上のＮを含む３〜７員環であるヘテロシクロアルキルである。本発明の他の具体例において、化学式Ａ又はＢは、下記の化学式Ａ−２〜化学式Ａ−６、化学式Ｂ−２〜化学式Ｂ−８のうちのいずれか１つである。本発明のさらに他の具体例において、ＦＲは、４３０〜５５０ｎｍにおける蛍光強度（Ｆ５１０）及び５５０〜６８０ｎｍにおける蛍光強度（Ｆ５８０）の比率である。本発明のさらに他の具体例において、酸化ストレスを処理する前や処理した後に、細胞のグルタチオン平均値又は中央値は増加するほど良質の品質である。本発明のさらに他の具体例において、酸化ストレスを処理する前や処理した後に、細胞のグルタチオン散布度（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ、ＧＨ）は減少するほど良質の品質である。本発明のさらに他の具体例において、細胞のグルタチオン再生産能力（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＧＲＣ）は増加するほど良質の品質である。本発明のさらに他の具体例において、酸化ストレス抵抗能力（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＯＲＣ）は、酸化剤処理時に測定したＧＳＨの量が、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞のＧＳＨの量に比べて減少した細胞の数が少ないか、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞のＧＳＨの量より高いか、その量と同じ細胞の数が多いほど良質の品質である。本発明のさらに他の具体例において、第１酸化剤は、Ｈ２Ｏ２、及びｔｅｒｔ−ブチル過酸化物を含むヒドロ過酸化物（ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）；ジアミド、ＧＳＳＧ（ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＧＳＨ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸及びヨードアセトアミドを含むチオール酸化剤；ビス−クロロエチルニトロソウレアを含むグルタチオン還元酵素抑制剤；ＰＸ−１２を含むチオレドキシン抑制剤；アンチマイシンＡ、ロテノン、オリゴマイシン及びカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾンを含むミトコンドリア電子伝達系抑制剤；ホルボール１２−ミリステート１３−アセテートを含むＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤；１Ｓ，３Ｒ−ＲＡＳ−セレクティブリーサル３（１Ｓ，３Ｒ−ＲＡＳ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｔｈａｌ３；１Ｓ，３Ｒ−ＲＳＬ３）、ＤＰＩ１９、ＤＰＩ１８、ＤＰＩ１７、ＤＰＩ１３、ＤＰＩ１２、ＤＰＩ１０（ＭＬ２１０）、ＤＰＩ７（ＭＬ１６２）、又はアルトレタミンを含むｇｐｘ４抑制剤；エラスチン（Ｅｒａｓｔｉｎ）、スルファサラジン、ソラフェニブ、グルタメート、ピペラジンエラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、及びエラスチン類似体を含むシステムｘ−ｃ抑制剤；フェロトーシス誘導体５６（ＦＩＮ５６）を含むＧＰＸ４タンパク質量及びＣｏＱ１０量減少誘導剤；カスパーゼ−依存性リーサル５６（ＣＩＬ５６）及びフェロトーシス誘導体エンドペルオキシド（ＦＩＮＯ２）を含む脂質過酸化誘導剤；ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシミンを含むグルタミン酸塩システイン連結酵素（ＧＣＬ）抑制剤；ジエチルマレイン酸塩を含むＧ��Ｈ減少誘導剤；ＤＰＩ２、シスプラチン、システイナーゼ（ｃｙｓｔｅｉｎａｓｅ）、スタチン、クエン酸鉄アンモニウム、トリゴネリン、四塩化炭素、シリカ系ナノ粒子及び非熱プラズマを含む。本発明のさらに他の具体例において、第２酸化剤は、マレイミド、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、エチルマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、又はヨードアセトアミドプロピオン酸を含む。目的の細胞は、成体幹細胞、胚幹細胞及び誘導万能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）からなる群より選択されたいずれか１つである幹細胞；樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）、Ｔ細胞（Ｔ  ｃｅｌｌ）、Ｂ細胞（Ｂ  ｃｅｌｌ）、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ）、先天性リンパ球細胞（Ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、顆粒球（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｔ  ｃｅｌｌ）、リンホカイン活性キラー細胞（ＬＡＫ：Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ）及びサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ）からなる群より選択されたいずれか１つである兔疫細胞；線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、滑液膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）、皮膚角質細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）及び末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）からなる群より選択されたいずれか１つである体細胞（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）；ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞からなる群より選択されたいずれか１つであるタンパク質製剤の生産に使用される細胞株；又は人体若しくは動物の口腔、鼻腔、肺、皮膚、胃腸管、及び泌尿管に由来する微生物からなる群より選択されたいずれか１つである人体マイクロバイオーム（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）である。本発明のさらに他の具体例において、Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌ）を除いたものである。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係るＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ及び評価パラメータは、生きている幹細胞の細胞内ＧＳＨのレベルをリアルタイムにモニタリングし、ＧＳＨのレベルによって細胞を分化するのに使用され、細胞治療剤の品質を測定することができ、かつ、その品質を評価することができる新規な方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明のＦｒｅＳＨ−トレーサーがグルタチオン（ＧＳＨ）と可逆的に反応する反応式（図１Ａ）、ＦｒｅＳＨ−トレーサーの可逆反応をＵＶ可視光線吸収スペクトルによって測定した結果（図１Ｂ）、４３０ｎｍ及び５２０ｎｍそれぞれで励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）によって発生したＦｒｅＳＨ−トレーサーの蛍光放出スペクトルを５１０ｎｍ（Ｆ５１０）及び５８０ｎｍ（Ｆ５８０）でそれぞれモニタリングした結果（図１Ｃ）、前記図１Ｃの結果をグラフで示した結果（図１Ｄ）、Ｆ５１０／Ｆ５８０（ＦＲ）に分けて計算し、増加した濃度のＧＳＨに合わせた放出比率（図１Ｅ）を示す。
【図２】図２は、ｈＢＭ−ＭＳＣをＦ５１０／Ｆ５８０（ＦＲ）でＦＡＣＳ選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）するステップを示すグラフである。
【図３】図３は、ＦｒｅＳＨ−トレーサーが細胞から除去可能であることを示すグラフで、ＦｒｅＳＨ−トレーサーで染色された細胞を洗浄後、新しい培養液で培養した後、時間に応じてＦＡＣＳ分析した結果（図３Ａ）、これを数値化したグラフ（図３Ｂ）を示す。
【図４】図４は、ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースでＦＡＳＣ分離したｈＢＭ−ＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ（図４Ａ）とＳＤＦ−１ａｌｐｈａとＰＤＧＦ−ＡＡに対する移動能（図４Ｂ）を測定した結果を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｆは、ＦｒｅＳＨ−トレーサーによって分離された線維芽細胞の抗老化活性を示した結果である。
【図６】図６は、ＦｒｅＳＨ−トレーサーによって分離された樹状細胞の活性を示した結果である。
【図７】図７は、ＦｒｅＳＨ−トレーサーによって分離されたＴ細胞におけるＴｒｅｇ細胞の活性を示した結果である。
【図８】図８は、治療用細胞の品質評価のための４つのグルタチオンパラメータ、導出式、その結果の例示を概略的に示す。
【図９】図９は、ｈＢＭ−ＭＳＣの継代培養によるＣＦＵ−Ｆ分析（図９Ａ）及びＳＤＦ−１ａｌｐｈａとＰＤＧＦ−ＡＡに対する移動能（図９Ｂ）を示した結果である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ｈＢＭ−ＭＳＣの継代培養によるＦｒｅＳＨ−トレーサーやＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサー、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＧＭとＧＨを分析した結果である。
【図１１】図１１は、ｈＢＭ−ＭＳＣの継代培養によるＦｒｅＳＨ−トレーサーやＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサー、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＧＲＣを分析した結果である。
【図１２】図１２は、ネズミ骨髓細胞をＬｉｎｅａｇｅによって分離した後、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＧＭとＧＨを分析した結果である。
【図１３】図１３は、ＦｒｅＳＨ−トレーサーを用いてＦＡＣＳ分離されたｈＥＳ−ＭＳＣ（図１３Ａ）又は分離なく培養したｈＥＳ−ＭＳＣ（図１３Ｂ）にＢＳＯやＧＳＨ−ＥＥを処理した後、ＣＦＵ−Ｆ（図１３Ａ）又はＰＤＧＦ−ＡＡに対する細胞移動能（図１３Ｂ）を分析した結果である。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ｈＵＣ−ＭＳＣをＡＡ２Ｇが含まれた培養液に３回継代培養した後、ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＧＲＣを分析した結果である。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣをＡＡ２Ｇが含まれた培養液に３回継代培養した後、ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＯＲＣを分析した結果である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＡＡ２Ｇ１２５μｇ／ｍＬ（左写真）又は２５０μｇ／ｍＬ（右写真）を３日間処理してＣＦＵ−Ｆアッセイを実施した結果を示す写真である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＡＡ２Ｇ１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬを３日間処理してＣＦＵ−Ｆアッセイ（ｎ＝３）を実施した結果のグラフである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＡＡ２Ｇ１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬを３日間処理してＰＤＧＦ−ＡＡによる移動能を示す写真である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＡＡ２Ｇ１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬを３日間処理してＰＤＧＦ−ＡＡによる移動能（ｎ＝３）を分析した結果のグラフである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＡＡ２Ｇ１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬを３日間処理してＴ細胞の増殖能低下効果（ｎ＝３）を観察したグラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＡＡ２Ｇ１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬを３日間処理してＴ細胞の分化能低下効果（ｎ＝３）を観察したグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＡＡ２Ｇ１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬを３日間処理してＴｒｅｇ細胞の分化促進効果（ｎ＝３）を観察したグラフである。
【図１９】図１９は、ｈＵＣ−ＭＳＣにガンマ−グルタミルシステイン（ＧＧＣ）０．１、０．２５、及び０．５ｍＭを２時間処理してＣＦＵ−Ｆアッセイ（ｎ＝３）を実施した結果のグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＧＧＣを処理せずにＳＤＦ１ａｌｐｈａとＰＤＧＦ−ＡＡによる移動能（ｎ＝３）を分析した結果のグラフである。ＳＴＩ５７１はＰＤＧＦＲキナーゼ抑制剤として用いた。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＧＧＣ０．１ｍＭを処理し、ＳＤＦ１ａｌｐｈａとＰＤＧＦ−ＡＡによる移動能（ｎ＝３）を分析した結果のグラフである。ＳＴＩ５７１はＰＤＧＦＲキナーゼ抑制剤として用いた。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、ｈＵＣ−ＭＳＣにＧＧＣ０．２５ｍＭを処理し、ＳＤＦ１ａｌｐｈａとＰＤＧＦ−ＡＡによる移動能（ｎ＝３）を分析した結果のグラフである。ＳＴＩ５７１はＰＤＧＦＲキナーゼ抑制剤として用いた。
【図２１】図２１は、ＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析により細胞のＧＳＨを調節する物質をスクリーニングする実験ステップを図式化した図である。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるリプロクススタチン−１のＯＲＣ分析結果である。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｃは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるビタミンＤ３のＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。
【図２４】図２４は、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるビタミンＥのＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｅは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるフラボノイドのＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣを分析した結果である。  図２５Ａは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるバイカリンのＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２５Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるバイカレインのＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２５Ｃは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるルテオリンのＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２５Ｄは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるクェルセチンのＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２５Ｅは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるブテインのＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。
【図２６】図２６Ａ〜図２６Ｆは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおける植物抽出物のＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣを分析した結果である。  図２６Ａは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおける菊の花抽出物のＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２６Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるチャンチン木の葉抽出物のＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２６Ｃは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるマツヨイグサ抽出物のＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２６Ｄは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるスギナ抽出物のＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２６Ｅは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるサツマイモの葉抽出物のＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。  図２６Ｆは、ｈＵＣ−ＭＳＣにおけるトマト抽出物（ＬＹＣＯＢＥＡＤＳ（登録商標））のＧＭ、ＧＨ、及びＯＲＣ分析結果である。
【図２７】図２７は、ｈＵＣ−ＭＳＣに０．２、１、２、及び４μＭのフェロスタチン−１（Ｆｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ−１）及び０．１、０．５、１、及び２μＭのリプロクススタチン−１（Ｌｉｐｒｏｘｓｔａｔｉｎ−１）を２４時間処理してＣＦＵ−Ｆアッセイ（ｎ＝３）を実施した結果のグラフである。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ｈＵＣ−ＭＳＣに１μＭのフェロスタチン−１を２４時間処理するか、０．２ｍＭ  ＧＧＣ又は２ｍＭ  ＧＳＨ−ＥＥを２時間処理した後、Ｔ細胞の増殖能低下効果（ｎ＝３）を観察したグラフである。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、ｈＵＣ−ＭＳＣに１μＭのフェロスタチン−１を２４時間処理するか、０．２ｍＭ  ＧＧＣ又は２ｍＭ  ＧＳＨ−ＥＥを２時間処理した後、Ｔ細胞の分化能低下効果（ｎ＝３）を観察したグラフである。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、ｈＵＣ−ＭＳＣに１μＭのフェロスタチン−１を２４時間処理するか、０．２ｍＭ  ＧＧＣ又は２ｍＭ  ＧＳＨ−ＥＥを２時間処理した後、Ｔｒｅｇ細胞の分化促進効果（ｎ＝３）を観察したグラフである。
【図２９】図２９は、継代培養４、７、１５に相当する細胞に対する、ｍＧＳＨ発現レベルのフロー細胞分析結果のヒストグラムである。
【図３０】図３０は、継代培養４、７、１５に相当する細胞に対する、ｍＧＳＨ発現レベルのＣｏｎｆｏｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇヒストグラム結果である。
【図３１】図３１は、幹細胞の継代培養数とＲＳＬ３の濃度によるｍＧＳＨ  Ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌとＬｏｗ  Ｃｅｌｌの分布様相分析結果である。
【図３２】図３２は、Ｆｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ−１の処理による中間葉幹細胞におけるＲＳＬ３処理効果の脂質酸化物依存性を確認した結果である。
【図３３】図３３は、ＲＬＳ３処理後、ｍＧＳＨ  Ｈｉｇｈ細胞とＬｏｗ細胞のＣＤ１４６の表面発現を比較した結果である。
【図３４】図３４は、線維芽細胞の継代培養程度によるｍＧＳＨ  Ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌとＬｏｗ  Ｃｅｌｌの分布様相を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明に係るＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ及び評価パラメータは、生きている幹細胞の細胞内ＧＳＨのレベルをリアルタイムにモニタリングし、ＧＳＨのレベルによって細胞を分化するのに使用され、細胞治療剤の品質を測定することができ、かつ、その品質を評価することができる。
【００３７】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００３８】
＜化合物の用意＞
ＦｒｅＳＨ−トレーサーで使用するために、下記の化学式Ａで表される化合物又はその塩を含む組成物を用意した：
【化５】
2021504727.tif 000007
前記化学式において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素又はＣ１−４直鎖若しくは分枝鎖アルキルであるか、Ｒ１、Ｒ２及びＸがともに５員又は６員環をなすヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルであり；Ｒ３は、水素又はＣ１−４直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり；Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキルである（前記ｍは１〜５の整数である）か、Ｒ４、Ｒ５及びＹは、ともにＣ３−７ヘテロシクロアルキルをなし、前記ヘテロシクロアルキルは、非置換若しくはＲ６で置換されたヘテロシクロアルキルであり；前記Ｒ６は、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル（前記ｎは１〜５の整数である）、−（ＣＯＮＨ）−（ＣＨ２）ｏ−ＰＰｈ３＋Ｃｌ−（前記ｏは１〜５の整数である）又は−（ＣＯＮＨ）−ＣＨＲ７−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｐ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり（前記ｐは１〜５の整数である）；前記Ｒ７は、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｒ−ＯＣＯ−Ｃ１−５直鎖若しくは分枝鎖アルキル（前記ｑ及びｒはそれぞれ１〜５の整数である）であり；Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｎ又はＯである。
【００３９】
より好ましくは、ＦｒｅＳＨ−トレーサーで使用するために、前記化学式Ａで表される化合物は、化学式Ａ−１〜化学式Ａ−６で表される化合物からなる群より選択される化合物であるものを使用した：
【化６】
2021504727.tif 000008
2021504727.tif 000009
【００４０】
さらに好ましくは、ＦｒｅＳＨ−トレーサーは、前記化学式Ａ−１の化合物を使用した。
【００４１】
次いで、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーで使用するために、下記の化学式Ｂで表される化合物又はその塩を含む組成物を用意した：
【化７】
2021504727.tif 000010
【００４２】
前記化学式Ｂにおいて、Ｒ１は、１つ以上のＮを含む３〜７員環であるヘテロシクロアルキルであり、前記ヘテロシクロアルキルは、Ｒ２置換基が結合しており；前記Ｒ２は、−（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ）−（ＣＨ２）ｍ−ＰＰｈ３＋Ｃｌ−（前記ｍは１−４の整数である）、−（ＣＨ２）ｎ−ＰＰｈ３＋Ｃｌ−（前記ｎは１〜６の整数である）、又は−（Ｃ（＝Ｏ））−（ＣＨ２）ｐ−Ｒ３（前記ｐは１〜４の整数である）であり；前記Ｒ３は、−Ｃ（ＮＨＣ（＝Ｏ）−Ｒ４）であり、前記Ｒ４は、下記の化学式Ｂ−１で表される置換基である。
【化８】
2021504727.tif 000011
【００４３】
前記化学式Ｂ−１において、前記ｘは、１〜４の整数である。
【００４４】
また、本発明のＲ１は、１又は２個のＮを含む６員環ヘテロシクロアルキルである。本発明において、「６員環ヘテロシクロアルキル」に含まれた用語「６員環」は、ビサイクリック化合物（ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）又はスピロ化合物（Ｓｐｉｒｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）のように複数の環が接合された環化合物形態ではないモノサイクリック化合物としての１つの６員環形態を意味し、「ヘテロシクロアルキル」は、非−芳香族性環状アルキルであって、環内に含まれた炭素原子のうちの少なくとも１つがヘテロ原子、例えば、窒素、酸素又は硫黄によって置換されているものを意味する。好ましくは、Ｒ１は、６員環ヘテロシクロアルキルとして１個又は２個の窒素を環内に含まれたヘテロ原子として含む。
【００４５】
より好ましくは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーで使用するために、前記化学式Ｂで表される化合物は、化学式Ｂ−２〜Ｂ−４で表される化合物からなる群より選択される化合物であるものを使用した：
【化９】
2021504727.tif 000012
【００４６】
さらに好ましくは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーは、前記化学式Ｂ−４の化合物を使用した。
【００４７】
次いで、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサーで使用するために、下記の化学式Ｂ−５で表される化合物又はその塩を含む組成物を用意した：
【化１０】
2021504727.tif 000013
【００４８】
前記化学式Ｂ−５において、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−（ＣＨ２）ｒ、又は−（ＣＨ２ＣＨ２）ｓ−である化合物（前記ｐ，ｑ，ｒ，ｓは１〜５の整数である）である。より詳細には、前記化学式Ｂ−５において、Ｒ４は、（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−、−（ＣＨ２ＣＨ２）−、及び−（ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ２）−うちのいずれか１つである。
【００４９】
より好ましくは、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサーで使用するために、前記化学式Ｂ−５で表される化合物は、化学式Ｂ−６〜Ｂ−８で表される化合物からなる群より選択される化合物であるものを使用した：
【化１１】
2021504727.tif 000014
【００５０】
さらに好ましくは、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサーは、前記化学式Ｂ−８の化合物を使用した。
【００５１】
本発明に係る化合物Ａ又はＢ又はこれを含む組成物を用いて、幹細胞を含むすべての細胞の細胞内小器官であるミトコンドリア又はゴルジ体の抗酸化能を測定して抗酸化能に関連する細胞の活性を正確に測定することができ、高活性の細胞の分類が可能である。本発明の組成物を用いた細胞の活性の測定は、抗酸化能測定を含むが、これに限定されるものではない。
【００５２】
また、化学式Ａ又はＢで表される化合物；そのラセミ体、光学異性体、部分立体異性体、光学異性体の混合物、又は部分立体異性体の混合物；その薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む細胞内小器官の抗酸化能測定用組成物を提供した。
【実施例】
【００５３】
［実施例１：ＦｒｅＳＨ−トレーサー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＳＨ  ｇｒｏｕｐ−Ｔｒａｃｅｒ）を用いた実験条件づくり及び細胞内発現様相の確認］
ＦｒｅＳＨ−トレーサーを用いて生細胞の細胞活性を測定し、細胞活性が高い細胞を分離するために、下記の実験条件構築を行った。
【００５４】
細胞は、ヒト骨髓間葉幹細胞（ｈＢＭ−ＭＳＣ；ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、Ｌｏｎｚａから購入）とヒト臍帯由来間葉幹細胞（ｈＵＣ−ＭＳＣ；ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ソウル大学病院産婦人科から臍帯試料を受けて作製）、ヒト胚幹細胞分化間葉幹細胞（ｈＥＳ−ＭＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、建国大学のチョン・ヒョンミン教授実験室から分譲される）を用いた。
【００５５】
この時、ＦｒｅＳＨ−トレーサーは前記化学式Ａ−１の化合物を使用し、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーは下記の化学式Ｂ−４の化合物を使用し、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサーは下記の化学式Ｂ−８を使用した。
【００５６】
ＧＳＨ（０〜２００ｍＭ）とＦｒｅＳＨ−トレーサー（１０μＭ）が混合された緩衝溶液（リン酸塩１０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７．４、Ｈ２Ｏ：ＤＭＳＯ＝９８：２）を製造し、この溶液の時間に応じたＵＶ可視光線吸収スペクトルと蛍光放出スペクトルの変化をそれぞれシンコＳ−３１００とＨｉｔａｃｈｉ  Ｆ−７０００分光光度計で測定した。具体的には、ＦｒｅＳＨ−トレーサーにＧＳＨの濃度を増加させながら添加した場合、紫外線及び可視光線に対する吸光度がλｍａｘ＝４３０ｎｍで増加し、λｍａｘ＝５２０ｎｍでは減少し（図１Ａ）、蛍光放出強度は約５１０ｎｍ（Ｆ５１０、λｅｘ＝４３０ｎｍ；λｅｍ＝５１０ｎｍ）で増加し、約５８０ｎｍ（Ｆ５８０、λｅｘ＝５２０ｎｍ；λｅｍ＝５８０ｎｍ）で減少した（図１Ｂ〜図１Ｃ）。また、ＦｒｅＳＨトレーサーのＦ５１０とＦ５８０の蛍光放出強度比（Ｆ５１０／Ｆ５８０、ＦＲ）が広いＧＳＨの濃度範囲で比例的に変化することを確認した（図１Ｄ）。ＦＲ蛍光比から得られた回帰曲線は、細胞内に存在するＧＳＨの濃度より広い範囲（０〜５０ｍＭ）で線形性（Ｒ２＝０．９９３８）を示した（図１Ｅ）。
【００５７】
加えて、ＦｒｅＳＨ−トレーサーに含まれる多様な誘導体（前記化合物Ａ又はＢ）も、紫外線及び可視光線に対する吸光度がλｍａｘ＝４３０ｎｍで増加し、λｍａｘ＝５２０ｎｍでは減少し、蛍光放出強度はＦ５１０で増加し、Ｆ５８０で減少することを確認した。同じく、Ｆ５１０とＦ５８０の蛍光放出強度比（Ｆ５１０／Ｆ５８０）も、化学式Ｂ−１のように広いＧＳＨの濃度範囲で比例的に変化することを確認した（データ記載せず）。詳しいデータは大韓民国特許出願第１０−２０１５−０１６１７４５号と第１０−２０１７−０１０７４２９を参照することができる。
【化１２】
2021504727.tif 000015
【００５８】
したがって、このような結果は、ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒが細胞均質液でＲＯＳ誘導されたＧＳＨの変化をモニタリングできることを示す。
【００５９】
［実施例２：ＦＡＣＳを用いてＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＧＳＨの濃度による生細胞の分離
２−１．ｈＢＭ−ＭＳＣの分離］
１×１０３細胞／ｃｍ２の密度でｈＢＭ−ＭＳＣ幹細胞を培養培地（ＭＳＣＧＭ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ；Ｌｏｎｚａ  ＃ＰＴ−３００１）に播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、３日後、２μＭ  ＦｒｅＳＨを含む培養液で１．５時間細胞を標識した。ＤＰＢＳ（ＷＥＬＧＥＮＥ  ＃ＬＢ  ００１−０２）で２回洗浄した後、ＴｒｙｐｓｉｎＬＥ（ｇｉｂｃｏ  ＃１２６０４−０１３）溶液を処理して細胞を脱着させた後、２μＭ  ＦｒｅＳＨを含む新しい培地でトリプシンを不活性化させた。この後、４℃、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、細胞を２μＭ  ＦｒｅＳＨを含む新しい培地で懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）した。これをＦＡＣＳにローディングする直前、２μＭ  ＦｒｅＳＨを含むＰＢＳで１／５希釈した（４℃維持のために１回に約１ｍｌずつ希釈）。
【００６０】
この後、次のようなＦＡＣＳ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ条件（ＢＤ  ＡＲＩＡＩＩＩ、波長４０５（Ｆ５１０測定のため）及び４８８（Ｆ５８０測定のため）のレーザ、ノズルサイズ１００μｍ、２，０００〜３，０００ｅｖｅｎｔｓ／ｓｅｃ）でＦ５１０／Ｆ５８０比率が全体細胞数の上位３．９−３５％と下位３．９−３５％をゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）してＦＡＣＳ分離を実施した。
【００６１】
ＧＳＨＨｉｇｈ（上位１．９−３５％細胞群）、ＧＳＨＭｉｄｄｌｅ（ＧＳＨＭｉｄ、上位３０．２−６２．５％細胞群）、ＧＳＨＬｏｗ（下位１．９−３５％細胞群）に分離後、新しい培養液で培養培地を入れ替えてＦｒｅＳＨ−トレーサーを除去した（図２）。ＦｒｅＳＨ−トレーサーはＧＳＨと可逆的に結合するため、培養液を入れ替えるとＦｒｅＳＨ−トレーサーは細胞から除去される（図３）。
【００６２】
［２−２．ヒト線維芽細胞の細胞分離］
ヒト陰茎の包皮から分離して製造したヒト線維芽細胞（ＨＤＦ：Ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を老化（Ｏｌｄ）細胞（ｐ３２）にした後［継代培養（ｐａｓｓｓａｇｅ）による複製性老化モデル］、１５０ｐｉ組織培養培地（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）に播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、２μＭ  ＦｒｅＳＨを含む１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）と１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むフェノールレッドを含まない（Ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地で２時間細胞を標識した。２時間後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＴｒｙｐｓｉｎＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液を処理して細胞を脱着させた後、新しい培地でトリプシンを不活性化させた後、氷上で５分間放置した。この後、４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、細胞を２×１０７細胞／ｍｌの密度となるように２μＭ  ＦｒｅＳＨを含む新しい培地で懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）した。
【００６３】
この後、次のようなＦＡＣＳ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ条件（ＢＤ  ＡＲＩＡＩＩＩ、波長４０５（Ｆ５１０測定のため）及び４８８（Ｆ５８０測定のため）のレーザ、ノズルサイズ１００μｍ）でＦ５１０／Ｆ５８０比率が全体細胞数のＧＳＨＨｉｇｈ（上位０．２−３０．２％細胞群）とＧＳＨＬｏｗ（下位０．２−３０．３％細胞群）をゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）してＦＡＣＳ分離を実施した。この後、新しい培養液で培養培地を入れ替えてＦｒｅＳＨを除去した（図４）。ＦｒｅＳＨはＧＳＨと可逆的に結合するため、培養液を入れ替えるとＦｒｅＳＨは細胞から直に除去される（データ記載せず）。
【００６４】
［２−３．単核球由来ヒト樹状細胞の培養］
ヒト血液を採取した後、ＤＰＢＳ（ＷＥＬＧＥＮＥ  ＃ＬＢ  ００１−０２）で３倍容量となるように希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０２）溶液を用いて密度差分離方式で有核細胞のみ分離する。分離された細胞の個数を確認し、１×１０７細胞あたり９０μＬの２％ＦＢＳが含有されたＤＰＢＳと１０μＬのＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃１３０−０５０−２０１）を入れて、１５分間４℃で反応させた後、ＬＳ  Ｃｏｌｕｍｎを用いてＣＤ１４＋単核球を分離した。６ウェルプレートにウェルあたり１×１０６個の細胞を２ｍＬの樹状細胞分化培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１００μＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２０ｎｇ／ｍＬ  ｈＧＭＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４）で６日間分化させた。６日後に分化完了した樹状細胞は未成熟樹状細胞と見なし、０．５μｇ／ｍＬ  ＬＰＳを２４時間処理して成熟樹状細胞を培養した。
【００６５】
実施例２−３のようにＦｒｅＳＨを含む培地で前記細胞を標識した。
【００６６】
［２−４．ネズミのＴリンパ球の分離］
５μｇ／ｍＬのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃１００３４０）を３７℃で４時間２４ウェルプレートにコーティングした後、ＤＰＢＳを用いて洗浄した。ネズミの脾臓とリンパ節からＭｏｕｓｅ  Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃１３０−０９５−１３０）を用いて分離したＴリンパ球をウェルあたり２×１０６個入れて、１μｇ／ｍＬの濃度のＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃１０２１１２）とともに１０％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養した。ＦｒｅＳＨを最終的に２μＭの濃度となるように培養培地に添加し、２時間細胞を標識後、４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞を２×１０７細胞／ｍｌの密度となるように２μＭ  ＦｒｅＳＨを含む新しい培地で懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）した。その後、次のようなＦＡＣＳ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ条件（ＢＤ  ＡＲＩＡＩＩＩ、波長４０５（Ｆ５１０測定のため）及び４８８（Ｆ５８０測定のため）のレーザ、ノズルサイズ７０μＭ）でＦ５１０／Ｆ５８０比率によって３つの細胞群に分離した。
【００６７】
［２−５．ｈＥＳ−ＭＳＣ幹細胞の分離］
３×１０６細胞／ｍｌの密度のｈＥＳ−ＭＳＣ幹細胞を１５０ｐｉ組織培養培地（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）に播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、１２時間後、３０ｍｌ  ＰＢＳで２回洗浄した後、２μＭ  ＦｒｅＳＨを含むＥＧＭ−２  ＭＶ培養液で２時間細胞を標識した。２時間後、２μＭ  ＦｒｅＳＨを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＴｒｙｐｓｉｎＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液を処理して細胞を脱着させた後、２μＭ  ＦｒｅＳＨを含む新しいＥＧＭ−２  ＭＶ培地でトリプシンを不活性化させた。この後、４℃、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、細胞を５×１０７細胞／ｍｌの密度となるように２μＭ  ＦｒｅＳＨを含む新しいＥＧＭ−２  ＭＶ培地で懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）した。これをＦＡＣＳにローディングする直前、２μＭ  ＦｒｅＳＨを含むＰＢＳで１／５希釈した（４℃維持のために１回に約１ｍｌずつ希釈）。
【００６８】
この後、次のようなＦＡＣＳ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ条件（ＢＤ  ＡＲＩＡＩＩＩ、波長４０５（Ｆ５１０測定のため）及び４８８（Ｆ５８０測定のため）のレーザ、ノズルサイズ１００μＭ、２，０００〜３，０００ｅｖｅｎｔｓ／ｓｅｃ）でＦ５１０／Ｆ５８０比率が全体細胞数の上位３．９−３５％と下位３．９−３５％をゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）してＦＡＣＳ分離を実施した。
【００６９】
ＧＳＨＨｉｇｈ（上位３．９−３５％細胞群）、ＧＳＨＬｏｗ（下位３．９−３５％細胞群）に分離後、新しい培養液（ＥＧＭ−２−ＭＶ  ｍｅｄｉａ、ＬＯＮＺＡ）で培養培地を入れ替えてＦｒｅＳＨを除去した（図４）。ＦｒｅＳＨはＧＳＨと可逆的に結合するため、培養液を入れ替えるとＦｒｅＳＨは細胞から直に除去される（データ記載せず）。
【００７０】
［実施例３：分離した細胞の特性分析］
［３−１：ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースの分離された幹細胞の細胞学的特性分析］
ｈＢＭ−ＭＳＣ幹細胞の治療効能を決定する主要因子であるコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ、ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）と生着率を細胞培養モデルで評価した。２００細胞／１００ｐｉ  ｄｉｓｈに播種後、１４日間培養した後、クリスタルバイオレット染色を実施した結果、ＧＳＨＨｉｇｈ細胞がＧＳＨＭｉｄやＧＳＨＬｏｗ細胞に比べて著しく高いＣＦＵ−Ｆ数値を示すことを確認した（図４Ａ）。また、トランスウェル培養を活用してＳＤＦ−１（１５０ｎｇ／ｍｌ）やＰＤＧＦ−ＡＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）±ＳＴＩ５７１（０．５μｇ／ｍＬ）に関する走化性を測定した結果、ＧＳＨＨｉｇｈ細胞がＧＳＨＬｏｗ細胞に比べて著しく高い細胞移動性を示すことを確認した（図４Ｂ）。
【００７１】
［３−２：ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースの分離された線維芽細胞における老化特性分析］
ヒト陰茎の包皮から分離して製造したヒト線維芽細胞（ＨＤＦ：Ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を若い（Ｙｏｕｎｇ）細胞（ｐ６）と老化（Ｏｌｄ）細胞（ｐ３２）［継代培養（ｐａｓｓｓａｇｅ）による複製性老化モデル］にした後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧＳＨ／ＧＳＳＧ−ＧｌｏＴＭ分析キットを用いてＧＳＨのレベルを測定した場合、老化細胞に比べて、若い細胞のＧＳＨのレベルが約４４％減少していることを確認した（図５Ａ）。
【００７２】
前記ヒト線維芽細胞を実施例２−２の方法によってＧＳＨＨｉｇｈ及びＧＳＨＬｏｗ線維芽細胞に分離した。細胞の大きさを測定した結果、ＧＳＨＬｏｗ細胞がＧＳＨＨｉｇｈ細胞に比べて１．５倍大きい結果を確認して、老化するほど細胞の大きさ（ＦＳＣ、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）が大きくなるという既存の発表（参考資料１を参照）に符合することを確認した（図５Ｂ）。５μＭ  ＤＨＲ１２３（Ｄｉｈｙｄｒｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）を細胞に処理後、３０分間３７℃で培養して細胞内のＲＯＳ量を測定した場合、ＧＳＨＬｏｗ細胞がＧＳＨＨｉｇｈ細胞に比べて染色の程度が良好であることを確認した（図５Ｃ）。
【００７３】
また、リポフスチン（ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ）量を、Ａｌｅｘａ４８８蛍光フィルタを用いて自己蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で測定して定量した時、ＧＳＨＬｏｗ細胞がＧＳＨＨｉｇｈ細胞に比べて強く測定され（図５Ｄ）、ＧＳＨＬｏｗ細胞がＧＳＨＨｉｇｈ細胞に比べてｋｉ６７  ｍＲＮＡ発現量は少ないのに対し、ｐ２１のｍＲＮＡ発現量は高かった（図５Ｅ）。また、ＳＡＳＰ関連遺伝子の発現量を前述したＲＱ−ＰＣＲで分析した時、ＧＳＨＬｏｗ細胞がＧＳＨＨｉｇｈ細胞に比べてＩＬ−１Ａ遺伝子及びＩＬ−１Ｂ遺伝子の発現が増加していることを確認した（図５Ｆ）。細胞の老化に伴ってリポフスチンが増加し（参考資料２を参照）、老化するほどｋｉ６７発現量は減少し、ｐ２１発現量は増加し（参考資料３を参照）、ＳＡＳＰ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）関連遺伝子の発現量が増加することが知られていることから（参考資料４を参照）、ＧＳＨＨｉｇｈ細胞がＧＳＨＬｏｗ細胞に比べて抗老化活性があることを確認することができた。本実施例の遺伝子の発現は前述したＲＱ−ＰＣＲ分析を用いて測定し、分析に使用されたすべてのプライマーはＱｕａｎｔＰｒｉｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｕａｎｔｐｒｉｍｅ．ｄｅ／）を用いてデザインし、配列は下記表１に示した。
【００７４】
【表１】
2021504727.tif 000016
【００７５】
［３−３：ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースの分離された樹状細胞における免疫活性分析］
ヒト単核球由来樹状細胞の免疫活性に関連する多様な表面タンパク質に対する抗体をＦｒｅＳＨ  Ｔｒａｃｅｒと同時に染色した後、フロー細胞分析法を利用して、ＧＳＨＨｉｇｈ（上位０．２−３０．２％細胞群）、ＧＳＨＭｉｄ（上位３０．２−６２．５％細胞群）とＧＳＨＬｏｗ（下位０．３−３２．７％細胞群）をゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）し、それぞれの細胞群における表面タンパク質の発現程度を確認した。その結果、Ｔリンパ球の活性に重要な役割を果たすと知られたＣＤ８０の細胞表面の発現程度が樹状細胞の成熟の有無にかかわらず、ＧＳＨＨｉｇｈ、ＧＳＨＭｉｄ、ＧＳＨＬｏｗの順に減少することを確認した（図６）。これによって、ＧＳＨが高い樹状細胞の免疫活性が大きいと予想することができる。実験に使用した表面タンパク質抗体は表２の通りである。
【００７６】
【表２】
2021504727.tif 000017
【００７７】
［３−４：ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースの分離されたＴ細胞におけるＴｒｅｇ細胞の活性分析］
ネズミのＴリンパ球をＣＤ３及びＣＤ２８抗体を用いて活性化させた後、ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを用いてＧＳＨの濃度によって３つの実験群に分離した。分離されたＴリンパ球をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５５９６０２６）を用いてｍＲＮＡを抽出し、Ｔｒｅｇ細胞特異的に発現する転写因子であるｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡのレベルをＲＱ−ＰＣＲにより分析した結果、ＧＳＨＨｉｇｈ、ＧＳＨＭｉｄに比べてＧＳＨＬｏｗで４倍程度増加していることを確認した（図７）。これによって、ＧＳＨが高いＴ細胞群でＴｒｅｇ細胞の存在比率が低いと予想することができる。
【００７８】
［実施例４：ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースの細胞治療剤の品質評価のための評価パラメータづくり］
治療用細胞の品質を評価するために、下記に述べるように、ＦｒｅＳＨ−トレーサーを用いたリアルタイムなグルタチオン測定法に基づく４つの評価パラメータを開発して分析した（図８）。その４つはそれぞれ、細胞のグルタチオン平均値（又は中央値；Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｍｅａｎ  Ｌｅｖｅｌ、ＧＭ）、及びグルタチオン散布度（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ、ＧＨ）、グルタチオン再生産能力（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＧＲＣ）、酸化ストレス抵抗能力（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＯＲＣ）である。
【００７９】
図８に示されるように、ＧＭは、細胞ＦＲの平均値や中央値で算出する。また、ＧＨは、細胞ＦＲの変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）やロバスト変動係数（Ｒｏｂｕｓｔ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）で算出する。ＧＲＣは、生きている細胞に酸化剤処理後にリアルタイムにＦＲをモニタリングして得られる数値で、酸化剤（ジアミド、Ｈ２Ｏ２など）処理群のＦＲ曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）から０．１〜１００ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）処理群のＡＵＣを引いた値を、何ら処理しなかった対照群のＡＵＣからＮＥＭ処理群のＡＵＣを引いた値で割った後、１００を乗じた値を意味する。ＮＥＭ処理群のＦＲは、当該細胞ＦＲのブランク値で処理してＧＲＣ数値の敏感性を高めるための数値である。また、ＯＲＣは、生きているｈＵＣ−ＭＳＣに酸化剤であるグルタチオンペルオキシダーゼ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ４、ＧＰＸ４）抑制剤ＲＳＬ３を０．５μＭや１μＭの濃度で処理して、３７℃で２時間培養した。ＲＳＬ３が含まれた培地を除去した後、１５μＭ  Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを１００μｌずつ入れて、３７℃で１時間培養した。この時使用される培地は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ＆＃３９；Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が使用された。測定前に培地上のＭｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを除去するために、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳに培地を交換した後、共焦点イメージ装置であるｏｐｅｒｅｔｔａを用いて蛍光イメージを測定した。ＲＳＬ３を処理しなかった対照群細胞又はＲＳＬ３処理する前の対照群細胞で定量されたＧＳＨのレベルを比較して、ＧＳＨの発現が変動した細胞分布で算出した。分布を示すヒストグラムが２つのｐｅａｋに分かれる地点を基準として、ＧＳＨ  Ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ（右側ピーク）、ＧＳＨ  Ｌｏｗ  ｃｅｌｌ（左側ピーク）を分けて、該当する細胞の比率を％で表した。
【００８０】
上記のグルタチオン評価パラメータの幹細胞の品質との関連性の有無を確認するために、ｈＢＭ−ＭＳＣ継代培養回数（ｐａｓｓａｇｅ、Ｐ）によるＣＦＵ−Ｆ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）と移動能を分析した。その結果、ｐ４．５のｈＢＭ−ＭＳＣがｐ９．５のｈＢＭ−ＭＳＣよりＣＦＵ−Ｆが著しく高く（図９Ａ）、ＳＤＦ−１ａ（血管新生因子）又はＰＤＧＦ−ＡＡ（血小板由来増殖因子−ＡＡ）依存的移動能が大きいことを確認した（図９Ｂ）。この条件下、細胞全般的グルタチオン測定用ＦｒｅＳＨ−トレーサーと、それぞれゴルジ体、及びミトコンドリア特異的なＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ−トレーサー、及びＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーを用いて幹細胞のグルタチオン評価パラメータを比較分析した（図１０Ａ）。ＧＭは、継代培養が高いほどｈＢＭ−ＭＳＣでＦＲ平均値及びＭｉｔｏ−ＦＲ平均値は有意に低くなったが、Ｇｏｌｇｉ−ＦＲ平均値は有意な変化が現れなかった（図１０Ｂ）。ＧＨは、継代培養が高いほどｈＢＭ−ＭＳＣでＦＲ  ｒＣＶ値とＭｉｔｏ−ＦＲ  ｒＣＶ値が有意に増加したが、Ｇｏｌｇｉ−ＦＲ  ｒＣＶ値は有意な変化がなかった（図１０Ｃ）。ＧＲＣは、継代培養が高いほどｈＢＭ−ＭＳＣでジアミド処理によるＦＲベースの％ＧＲＣとＭｉｔｏ−ＦＲベースの％ＧＲＣが減少したが、Ｇｏｌｇｉ−ＦＲベースの％ＧＲＣは変化がなかった（図１１）。これによって、幹細胞の品質とＦｒｅＳＨ−トレーサーやＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＧＭとＧＲＣは比例的相関関係を示し、ＦｒｅＳＨ−トレーサーやＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＧＨは、反比例的相関関係を示すことが分かった。特に、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのグルタチオン評価パラメータが幹細胞の品質に対する敏感性が大きいことを確認することができた。
【００８１】
次に、骨髓細胞の分化程度に応じたＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのグルタチオン評価パラメータの変化を観察した。ネズミから分離したＬｉｎｅａｇｅ＋細胞とＬｉｎ−細胞をそれぞれＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーを用いて染色を実施した後、Ｏｐｅｒｅｔｔａ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＦＲを測定し、細胞群ごとにＭｉｔｏＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのグルタチオン評価パラメータを確認した。その結果、分化が進行したＬｉｎｅａｇｅ＋細胞群に比べて、未分化されたＬｉｎ−細胞群でミトコンドリアＧＭは高くかつＧＨは低くなることを確認した（図１２）。これは、骨髓細胞の幹性をグルタチオン評価パラメータで区分できることを意味する。
【００８２】
［実施例５：ＦｒｅＳＨ−トレーサーを用いた細胞治療剤の品質向上物質の探索］
直接的に幹細胞内のＧＳＨの量を調節する場合、細胞機能の変化をもたらすかをテストするために、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ、ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ；グルタチオン合成抑制剤）とグルタチオンエチルエステル（ＧＳＨ−ＥＥ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）をＦｒｅＳＨ−トレーサーによって分離されたｈＥＳ−ＭＳＣに処理した。ＧＳＨＨｉｇｈ細胞にＢＳＯ（８０μＭ、２４ｈ）を処理して細胞内ＧＳＨを低下させる場合、ＣＦＵ−Ｆが増加することを確認し、逆に、ＧＳＨＬｏｗ細胞にＧＳＨ−ＥＥ（１ｍＭ、２ｈ）を処理してＧＳＨを高めた場合、ＣＦＵ−Ｆが減少することを確認した（図１３Ａ）。また、ＦｒｅＳＨ−トレーサーで分離しなかったｈＥＳ−ＭＳＣにＢＳＯを処理するか、ＧＳＨ−ＥＥを処理した場合、それぞれＰＤＧＦ−ＡＡに対する細胞移動能が減少又は増加することを確認した（図１３Ｂ）。
【００８３】
一方、ｈＵＣ−ＭＳＣを抗酸化剤アスコルビン酸２−グルコシド（ＡＡ２Ｇ、２５０μｇ／ｍＬ）を入れた培地で３回継代培養する場合、そうでないナイーブ細胞群に比べて、低い濃度のジアミド処理によるＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＧＲＣが高くなることを確認した（図１４）。これによって、グルタチオン評価パラメータ改善物質が細胞の機能を向上させることを確認した。
【００８４】
また、ｈＵＣ−ＭＳＣを抗酸化剤アスコルビン酸２−グルコシド（ＡＡ２Ｇ、２５０μｇ／ｍＬ）を入れた培地で３回継代培養する場合、そうでないナイーブ細胞群（ＮＣ）に比べて、ＦｒｅＳＨ−トレーサーベースのＯＲＣがＧＳＨＨｉｇｈ細胞でより高くなることを確認した（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。
【００８５】
本願の発明者らは、グルタチオン評価パラメータを改善する物質をそれぞれの幹細胞に処理して、幹細胞に対する前記物質の影響を観察した。Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド（Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  ２−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ＡＡ２Ｇ）を入れた培地でｈＵＣ−ＭＳＣ（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を継代培養した場合、ＣＦＵ−Ｆ、移動能、及び抗炎症効果を観察した。ｈＵＣ−ＭＳＣにＡＡ２Ｇを１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬで３日間処理してＣＦＵ−Ｆアッセイ（ｎ＝３）を実施した。図１６Ａ及び図１６Ｂに示されるように、ＡＡ２Ｇを処理した場合にＣＦＵ−Ｆが増加したことを確認することができた。また、ｈＵＣ−ＭＳＣに１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬのＡＡ２Ｇを３日間処理してＰＤＧＦ−ＡＡによる移動能（ｎ＝３）を分析した。図１７Ａ及び図１７Ｂに示されるように、ＡＡ２Ｇを処理した場合に移動能が増加したことを確認することができた。さらに、ｈＵＣ−ＭＳＣに１２５μｇ／ｍＬ又は２５０μｇ／ｍＬのＡＡ２Ｇを３日間処理してＴ細胞の増殖能の低下及びＴ細胞の分化能の低下を観察し、Ｔｒｅｇ細胞分化の促進を観察した。図１８Ａ〜図１８Ｃに示されるように、ＡＡ２Ｇを処理した場合に幹細胞の抗炎症効果を確認することができた。
【００８６】
一方、ｈＵＣ−ＭＳＣをグルタチオン前駆物質であるガンマ−グルタミルシステイン（ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ；ＧＧＣ、０．１、０．２５、及び０．５ｍＭ）で培養した。ｈＵＣ−ＭＳＣにそれぞれ濃度のＧＧＣを２時間処理してＣＦＵ−Ｆアッセイ（ｎ＝３）を実施した。その結果、図１９に示されるように、ＣＦＵ−Ｆが増加していることを確認した。また、ｈＵＣ−ＭＳＣにＧＧＣを処理せずにＳＤＦ１ａｌｐｈａとＰＤＧＦ−ＡＡによる移動能（ｎ＝３）を分析してから、ｈＵＣ−ＭＳＣにＧＧＣを前記濃度に増加させて処理し、ＳＤＦ１ａｌｐｈａとＰＤＧＦ−ＡＡによる移動能（ｎ＝３）を分析した。ＳＴＩ５７１はＰＤＧＦＲキナーゼ抑制剤として用いた。図２０Ａ〜２０Ｃに示されるように、ＧＧＣ 処理濃度の増加に伴い、ＳＤＦ１ａｌｐｈａとＰＤＧＦ−ＡＡによって移動能が向上することを確認した。
【００８７】
また、ＯＲＣ分析のために、図２１に示すように、生きている細胞を用意して、３×１０３の細胞をウェルにそれぞれ播種した。α−ＭＥＭ培地に１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１Ｘペニシリン−ストレプトマイシンを処理した。グルタチオンのレベルを高めることができる物質を処理した。その後、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ４、ＧＰＸ４）抑制剤であるＲＳＬ３を処理した。２時間程度培養した後、ＲＳＬ３が含まれた培地を除去した後、１５μＭ  Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを１００μｌずつ入れて、３７℃で１時間培養した。この時使用した培地は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用した。
【００８８】
本発明者らは、ｈＵＣ−ＭＳＣでグルタチオンのレベルを高めることができる物質として、リプロクススタチン−１、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、フラボノイド系であるバイカリン、バイカレイン、ルテオリン、クェルセチン、ブテイン、植物抽出物である菊の花抽出物、チャンチン木の葉抽出物、マツヨイグサ抽出物、スギナ抽出物、サツマイモの葉抽出物、及びトマト抽出物（ＬＹＣＯＢＥＡＤＳ（登録商標）を処理してＯＲＣを分析した（図２２Ａ〜図２６Ｆ参照）。例えば、図２２Ａに示されるように、リプロクススタチン−１の濃度をそれぞれ０、２．５、５、１０μＭで処理し、ＲＳＬ３もそれぞれ０、０．５、１μＭで処理した。ＲＳＬ３によって細胞の品質が低下しても、リプロクススタチン−１の濃度が高ければ細胞の品質が増加したことを観察した。すなわち、ＧＳＨＨｉｇｈ細胞の比率が増加することを確認した。
【００８９】
ｈＵＣ−ＭＳＣに０．２、１、２、及び４μＭのフェロスタチン−１（Ｆｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ−１）及び０．１、０．５、１、及び２μＭのリプロクススタチン−１（Ｌｉｐｒｏｘｓｔａｔｉｎ−１）を２４時間処理してＣＦＵ−Ｆアッセイ（ｎ＝３）を実施した。図２７, ２８Ａ〜２８Ｃに示すように、ＧＧＣ処理で抗炎症効果に対する変化は見えなかった。
【００９０】
また、脂質酸化を抑制して細胞内のグルタチオンレベルを調節するフェロスタチン−１（０．２、１、２、４μＭ）及びリプロクススタチン−１（０．１、０．５、１、２μＭ）でｈＵＣ−ＭＳＣを培養した。図２７に示されるように、ＣＦＵ−Ｆが向上することを確認することができた。一方、ｈＵＣ−ＭＳＣにそれぞれ１μＭのフェロスタチン−１を２４時間処理し、０．２ｍＭのＧＧＣを２時間処理し、２ｍＭのＧＳＨ−ＥＥを２時間処理した。これから、Ｔ細胞の増殖能の低下及びＴ細胞の分化能の低下を観察し、Ｔｒｅｇ細胞分化の促進を観察した。フェロスタチン−１及びリプロクススタチン−１のような物質は、図２７, ２８Ａ〜２８Ｃに示されるように、ｈＵＣ−ＭＳＣの抗炎症効果に対する変化は見えなかった。これによって、グルタチオン評価パラメータを改善する物質が治療用幹細胞の機能を向上させることを確認した。
【００９１】
また、本願の発明者らは、幹細胞の抗酸化能による軟骨再生効果を骨関節炎動物モデルから確認した。前方十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ、ＡＣＬ）を破裂して骨関節炎を誘導したラット（ｒａｔ）の関節を用意した。ＡＡ２Ｇ（２５０μｇ／ｍＬ）を含む培養液で３回継代培養したｈＥＳ−ＭＳＣ（２×１０５）を前記関節に注入した。その結果、図２９Ａに示すように、一般的な幹細胞と比較して、抗酸化能増加幹細胞移植（ｈｉｇｈ  ＧＳＨ  ＭＳＣ）時に軟骨再生効能が著しく優れていることを確認した。また、前記のようなｈＥＳ−ＭＳＣ（２×１０５）を注入した関節組織を用意して、Ｈ＆Ｅ及びサフラニン−Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ）で染色した（図２９Ｂ）。また、前記のようなｈＥＳ−ＭＳＣ（２×１０５）を注入した関節組織を用意して、２型コラーゲン（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）を免疫染色した（図２９Ｃ）。ＧＡＧ及び２型コラーゲン（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）の発現に優れていることを確認することができた。これによって、グルタチオンパラメータ改善物質が幹細胞の疾患治療効能を向上させることを確認した。
【００９２】
すべてのデータは、非母数検定のポストホックテスト（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔｓ）とともに一元分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）又は二元分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を利用して分析した。すべての分析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カナダ）で行い、ｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１の場合、統計学的に有意なものと決定した。
【００９３】
［実施例６：脂質酸化剤を用いたＧＳＨ発現レベルの測定］
本研究室で培養されたｈＵＣ−ＭＳＣ継代培養４、７、１５に相当する細胞にＲＳＬ３を多様な濃度で処理した後、Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨを用いて染色後、フロー細胞分析とコンフォーカルイメージングにより細胞のミトコンドリアＧＳＨ（ｍＧＳＨ）の分布様相を、ヒストグラムを通して確認した。
【００９４】
（１．ＲＳＬ３の濃度と継代培養数によるｍＧＳＨ発現レベルの変動）
１）実験過程
＜フロー細胞分析法によるＭＳＣにおけるＧＳＨ分布の測定＞
臍帯由来中間葉幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ｈＵＣ−ＭＳＣ）の継代培養４、７、１５を用意した後、６−ｗｅｌｌ細胞培養プレートにｗｅｌｌあたり７００００ｃｅｌｌｓを入れた後、３７℃で２４時間培養した。この時使用される培地は、α−ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１Ｘペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。培地を除去した後、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ４、ＧＰＸ４）抑制剤であるＲＳＬ３を０．１／０．５／１μＭの濃度で入れて、３７℃で１．５時間培養した。この時使用される培地は、α−ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１Ｘペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。ＲＳＬ３が含まれた培地を除去した後、５μＭ  Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを入れて、３７℃で１．５時間培養した。この時使用される培地は、α−ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１Ｘペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒが含まれた培地を除去した後、２ｍＬのＤＰＢＳで細胞を２回洗浄した。２５０μＬのＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓを入れて、３７℃で２分３０秒間反応した後、２％ＦＢＳが含まれたＤＰＢＳを同量入れて、細胞をプレートから引き離した。プレートから引き離した細胞をＦＡＣＳ  ｔｕｂｅに移して氷に保管した後、Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ装置を用いて蛍光値を測定した。
【００９５】
＜蛍光イメージングを利用したＧＳＨ分布の測定＞
臍帯由来中間葉幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ｈＵＣ−ＭＳＣ）の継代培養４、７、１５を用意した後、９６−ｗｅｌｌ細胞培養プレートにｗｅｌｌあたり７０００ｃｅｌｌｓ／１００μｌを入れた後、３７℃で２４時間培養した。この時使用される培地は、α−ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１Ｘペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。培地を除去した後、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ４、ＧＰＸ４）抑制剤であるＲＳＬ３を０．１／０．５／１μＭの濃度で１００μｌを入れて、３７℃で２時間培養した。この時使用される培地は、α−ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１Ｘペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。ＲＳＬ３が含まれた培地を除去した後、１５μＭ  Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを１００μｌずつ入れて、３７℃で１時間培養した。この時使用される培地は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が使用された。測定前に培地上のＭｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒを除去するために、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳに培地を交換した後、共焦点イメージ装置であるｏｐｅｒｅｔｔａを用いて蛍光イメージを測定した。
【００９６】
＜ヒストグラム分析方法＞
各細胞内のＦ５１０（Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒがＳＨ基と結合した時の蛍光値）とＦ５８０（Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒがＳＨと結合しない状態で自己蛍光値）の蛍光値を測定した後、Ｆ５１０値をＦ５８０値で割った値を、細胞内ＧＳＨの平均値を意味するＦ５１０／Ｆ５８０  ｒａｔｉｏ値として求めた。ｐｒｉｓｍ５プログラムを用いて、各細胞が有するＦ５１０／Ｆ５８０  ｒａｔｉｏ値をＸ軸とし、Ｆ５１０／Ｆ５８０  ｒａｔｉｏ値に相当する細胞の％量をＹ軸としてヒストグラムで示した。Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを分析するＦｌｏｗｊｏソフトウェアを用いて、すべてのサンプルでＡｌｅｘａ４３０／ＰＥ（Ｆ５１０／Ｆ５８０）パラメータを分析し、Ｆ５１０／Ｆ５８０の分布を示すヒストグラムが２つのｐｅａｋに分かれる地点を基準としてＧＳＨ  Ｈｉｇｈ（右側ピーク）、Ｌｏｗ  ｃｅｌｌ（左側ピーク）を分けて、該当する細胞の比率を％で表した。
【００９７】
２）実験結果
本研究室で培養されたｈＵＣ−ＭＳＣ継代培養４、７、１５に相当する細胞とも、ＲＳＬ３を処理しなかった場合、ほぼ同じパターンのｍＧＳＨの分布を示したが、ＲＳＬ３の濃度と継代培養数に依存的にｍＧＳＨ量が減少した集団が観察されることを確認することができた（図２９、図３０、及び図３１）。
【００９８】
継代培養を繰り返すほど細胞は抗酸化ストレスを受けると知られており、このような細胞は細胞老化を経験した細胞であり、幹細胞の機能が低下しているということは、多くの研究を通して裏付けられている。これに基づいて本結果を解釈すれば、ＲＳＬ３によって誘発された脂質酸化ストレス条件で抗酸化能が低下した細胞は、そうでない細胞に比べて、ｍＧＳＨレベルを正常に維持できないといえる。
【００９９】
図３２で細胞蛍光イメージ写真から示されるように、緑色に見える細胞はｍＧＳＨを維持する細胞であり、黄色に見える細胞はｍＧＳＨが減少した細胞である。継代培養が高い細胞であるほど黄色細胞の比率が多くなることを観察することができ、同じ細胞内で比較しても、黄色細胞が緑色細胞に比べて大きくかつ広く広がっている形状に観察される。また、Ｆｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ−１を処理するとＲＳＬ３の効果が無くなることからみて、これは、脂質酸化ストレスに依存した結果と見られる（図３２）。
【０１００】
（２．Ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｌａｓｔにおけるｍＧＳＨ発現レベルの変動）
ＭＳＣを通した実験と同じく、多様な回数で継代培養されたＨｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｌａｓｔにＲＳＬ３を処理した後、Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒで細胞を染色し、コンフォーカルイメージングによりｍＧＳＨの量を維持する細胞と維持できなかった細胞の比率を百分率で表した。その結果、中間葉幹細胞の結果と同じく、継代培養を続けるほどＲＳＬ３の処理によってｍＧＳＨが減少する細胞の比率が増加することが明らかになった（図３４参照）。
【０１０１】
（３．ｍＧＳＨ発現レベルとＣＤ１４６の発現量との関係）
１）実験過程
実際にＲＳＬ３処理による脂質酸化ストレス条件でｍＧＳＨレベルが低下した細胞は幹細胞の機能が低下しているかを確認するために、既存の文献を通して明らかになった良い幹細胞が高く発現すると知られた細胞表面タンパク質であるＣＤ１４６の発現量をフロー細胞分析により確認した。
【０１０２】
上記で言及したフロー細胞分析を利用したミトコンドリアＧＳＨレベルを測定する方式と同様の方法で細胞を染色し、トリプシンを用いて細胞をプレートから引き離す。引き離した細胞を蛍光物質であるＢＵＶ３９５が結合したＣＤ１４６に対するフロー細胞分析用の抗体を４℃で３０分間処理した後、ＰＢＳで洗う。Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ装置を用いて、ＧＳＨレベル測定のためのＦ５１０、Ｆ５８０蛍光値と、ＣＤ１４６発現測定のためのＢＵＶ３９５蛍光値を測定した。その後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、Ｆ５１０／Ｆ５８０の分布を示すヒストグラムが２つのｐｅａｋに分かれる地点を基準として、ＧＳＨ  Ｈｉｇｈ（右側ピーク）、Ｌｏｗ  ｃｅｌｌ（左側ピーク）を分けて、該当する細胞のＣＤ１４６の陽性比率を％で定量した。
【０１０３】
２）実験結果
ＲＳＬ３処理後、Ｍｉｔｏ−ＦｒｅＳＨとＣＤ１４６抗体を同時に染色してｍＧＳＨ  Ｈｉｇｈ細胞とＬｏｗ細胞においてＣＤ１４６の表面発現量を比較すれば、Ｐ４  ｈＵＣ−ＭＳＣでＲＳＬ３によってｍＧＳＨレベルが低くなった集団は、ＣＤ１４６  ｍＧＳＨレベルを維持した集団に比べて、ＣＤ１４６の陽性比率が２５％程度低くなったことを確認した（図３３）。これは、Ｐ１５幹細胞のＣＤ１４６の陽性比率と類似する数値であった。Ｐ７は、Ｐ４と比較してＣＤ１４６の陽性比率の差がないため、このような表面タンパク質の発現比率を用いた細胞の品質評価方法では２つの細胞の品質を区分することができなかったが、図３１のように、現技術を利用すればこれらの品質も区分して評価することができた。
【０１０４】
以上、本発明の特定の部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、よって、本発明の範囲が制限されるわけではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物によって定義される。
【０１０５】
［参考資料］
１．E. ROBBINS et al., J Exp Med. 1970 Jun 1;131(6):1211-22.
２．Georgakopoulou EA et al., Aging(Albany NY), 2013 Jan;5(1):37-50.
３．Thomas Kuilman et al.. Genes Dev. 2010 Nov 15;24(22):2463-79.
４．Jean-Philippe Copp et al., Annu Rev Pathol. 2010;5:99-118.
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に係るＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ及び評価パラメータは、生きている幹細胞の細胞内ＧＳＨのレベルをリアルタイムにモニタリングし、ＧＳＨのレベルによって細胞を分化するのに使用され、細胞治療剤の品質を測定することができ、かつ、その品質を評価することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２６Ｆ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
2021504727000001.app
【国際調査報告】
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2021504727.tif 000097
2021504727.tif 000098
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