(57)【要約】  本明細書では、操作された非触媒性、非毒性破傷風菌毒素変異体及びそのような操作された破傷風菌毒素変異体を、非毒性及びそれらのそれぞれの化学的に不活化されたトキソイドよりも有効な低用量の予防ワクチンとして使用する方法が提供される。加えて、本明細書では、操作された破傷風菌毒素変異体を含むコンジュゲートワクチン担体及び単一のワクチンとして広域の微生物病原体を標的とし得るＴ細胞依存性免疫記憶応答を惹起するためにそのようなコンジュゲートワクチンを使用する方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有し、且つ、Ｒ３７２及びＹ３７５の各位置に突然変異を有し、更にＥ３３４、Ｋ７６８、Ｒ１２２６、及びＷ１２８９から選択される２つ以上の位置に突然変異を含む配列を含み、各位置は配列番号１に対して符番されている、改変された破傷風菌毒素ポリペプチドであって、配列番号１の毒性及び受容体結合に比べて毒性及び受容体結合が低減されているポリペプチド。
【請求項２】
Ｒ３７２の位置のアミノ酸Ｒがアミノ酸Ａに置換され、且つ、Ｙ３７５の位置のアミノ酸Ｙがアミノ酸Ｆに置換されている、請求項１に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項３】
前記突然変異がＲ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｒ１２２６Ｌ、及びＷ１２８９Ａを含む、請求項１に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４によりコードされる、請求項３に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項５】
前記突然変異がＲ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｋ７６８Ａ、Ｒ１２２６Ｌ、及びＷ１２８９Ａを含む、請求項１に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号５によりコードされる、請求項５に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項７】
Ｌ２３１及びＹ２６の一方又は両方の位置に突然変異を更に含み、各位置は配列番号１に対して符番される、請求項１に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項８】
Ｌ２３１及びＹ２６の一方又は両方の位置の突然変異がＬ２３１Ｋ及びＹ２６Ａを含む、請求項７に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号６又は配列番号７によりコードされる、請求項７に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項１０】
共有結合された糖鎖を更に含み、それにより、ポリペプチドはポリペプチド−糖鎖コンジュゲートである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたポリペプチド及び薬学上許容される担体を含む組成物。
【請求項１２】
対象が破傷風を発症するリスクを低減する方法であって、前記対象に治療上有効な量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたポリペプチドを投与することにより免疫応答を誘導することによる、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたポリペプチドのアジュバントとしての使用。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変されたポリペプチドのワクチンとしての使用。
【請求項１５】
ワクチンとしての効力が増強された操作された細菌タンパク質トキソイドを得る方法であって、
マルチドメイン細菌タンパク質毒素をコードするアミノ酸配列の各ドメインにおいて１以上のアミノ酸位置を選択すること、ここで、各位置は、各ドメインに関連するタンパク質機能を不活化するように選択され、前記ドメインは、触媒ドメイン、移行ドメイン、受容体結合ドメイン、及び基質結合ドメインのうち２つ以上を含む；
選択された各位置の天然アミノ酸残基を非天然アミノ酸残基で置換し、それにより、前記置換が前記ドメインに関連する１以上のタンパク質機能を不活化すること；及び
宿主細胞において前記置換非天然アミノ酸残基を含む全長細菌タンパク質毒素をコードする核酸配列を発現させ、それにより、発現されたタンパク質は、天然アミノ酸を含む全長細菌タンパク質毒素に比べて触媒活性、受容体結合活性、移行活性、又は基質結合活性の部分的又は完全喪失を示すこと、
を含む、方法。
【請求項１６】
選択が、細菌タンパク質毒素の一次配列又は構造に基づいて個々の機能的アミノ酸残基を同定することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記構造がＸ線結晶学、電子顕微鏡、核磁気共鳴法、コンピュータータンパク質構造モデリング、又はそれらの組合せを用いて得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
選択が、全長タンパク質を不安定化することなく、又は免疫原性の喪失なく改変され得る個々のアミノ酸残基を同定することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
置換が部位特異的突然変異誘発を含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１２月１５日出願の米国仮特許出願第６２／５９９，４４４号の優先権を主張するものであり、その全内容が本明細書に完全に示されているかのように本明細書の一部として援用される。
【０００２】
連邦政府資金による研究の記載
本発明は、ＮＩＨ−ＮＩＡＩＤにより授与された認可番号Ｒ０１  ＡＩ０３０１６２及びＡＩ１１８３８９の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトに対して最も有毒な物質であるボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴ）は、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)及び酪酸菌(Clostridium butyricum)及びクロストリジウム・バラティ(Clostridium baratii)の選抜株により産生されるタンパク質毒素である(Hill and Smith, 2013; Johnson and Montecucco, 2008)。ＢｏＮＴは、ジスルフィド結合によって連結された１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）と５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）から構成される１５０ｋＤａの２鎖タンパク質として合成される。ＨＣは更に、サイトゾルへのＬＣの移行を助けるＮ末端ドメイン（ＨN）と神経細胞の細胞表面受容体を認識してそれに結合するＣ末端ドメイン（ＨC）に分割される(Montal,2010)。ひと度細胞内に入ると、ＬＣは可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体(soluble N-ethylmaleimide sensitive-factor attachment protein receptors)（ＳＮＡＲＥ）の部分を特異的に切断し、それにより、神経伝達物質の放出を不活化する(Montecucco and Schiavo, 1993, Trends in biochemical sciences 18, 324-327;Schiavoら, 1995)。これまでに試験ワクチンが「リスクのある」集団をボツリヌスから保護するために使用されたが、この化学的に不活化されたＢｏＮＴトキソイドワクチンの使用は、効力の低下のために中断された。また、従来の破傷風菌毒素フラグメントワクチンは、低い抗原性及び免疫効力に伴う問題のために理想的ではない。よって、当技術分野では、アジュバント及びコンジュゲートワクチンとして使用するための破傷風及びボツリヌス菌毒素の非触媒性、非毒性変異体の必要がなおある。
【発明の概要】
【０００４】
開示の概要
本明細書では、破傷風菌毒素の組換え非触媒性、非毒性変異体形態及びこのような変異体毒素の使用が提供される。本明細書に記載のデータは、天然破傷風菌毒素に比べて、また、従前に記載された破傷風変異体に比べて毒性の著しい低減を示す。本発明者らは、破傷風菌毒素の固有の毒性を不活化し、安全且つ有効なワクチンを生産するために組み合わせることができる、毒素中毒の他の段階の中でも、限定されるものではないが、基質親和性の排除若しくは反応速度の低下による触媒活性の排除、受容体結合の排除、移行能の阻害、又は毒素のドメイン内切断若しくはジスルフィド結合の崩壊への干渉を含む、いくつかの独立した、操作された突然変異を想定する。本明細書では、本発明者らが触媒作用の低下とともに、宿主の受容体結合が低下した突然変異を有する毒素を操作した実験を記載する。これらのデータは、それらを非毒性、且つ、ワクチン及び毒性を軽減するための化学的架橋の必要のないコンジュゲートワクチンとして好適なものとする選択された独立の突然変異を含む組換え毒素の可能性を示す。
【０００５】
第１の態様において、本明細書では、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有し、且つ、Ｒ３７２及びＹ３７５の各位置に突然変異を有し、更にＥ３３４、Ｋ７６８、Ｒ１１２６、及びＷ１２８９から選択される２つ以上の位置に突然変異を含む配列を含み、各位置は配列番号１に対して符番されている、改変された破傷風菌毒素ポリペプチドであって、配列番号１の毒性及び受容体結合に比べて触媒活性、移行、及び受容体結合が低減されているポリペプチドが提供される。Ｒ３７２の位置のアミノ酸Ｒはアミノ酸Ａに置換することができ、且つ、Ｙ３７５の位置のアミノ酸Ｙはアミノ酸Ｆに置換することができる。突然変異はＲ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｒ１２２６Ｌ、及びＷ１２８９Ａを含み得る。改変されたポリペプチドは、共有結合された糖鎖を更に含むことができ、それにより、このポリペプチドは、ポリペプチド−糖鎖コンジュゲートとなる。改変されたポリペプチドは、配列番号２によりコードされ得る。
【０００６】
いくつかの場合、突然変異は、Ｒ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｋ７６８Ａ、Ｒ１２２６Ｌ、及びＷ１２８９Ａを含み得る。改変されたポリペプチドは、配列番号５によりコードされ得る。いくつかの場合、改変されたポリペプチドは、Ｌ２３１及びＹ２６の一方又は両方の位置に突然変異を更に含むことができ、各位置は配列番号１に対して符番されている。Ｌ２３１及びＹ２６の一方又は両方の位置の突然変異は、Ｌ２３１Ｋ及びＹ２６Ａを含む。改変されたポリペプチドは、配列番号６又は配列番号７によりコードされ得る。
【０００７】
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載されるような改変されたポリペプチド及び薬学上許容される担体を含む組成物が提供される。
【０００８】
更なる態様において、本明細書では、対象が破傷風を発症するリスクを低減する方法であって、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載されるような改変されたポリペプチドを投与することにより免疫応答を誘導することによる方法が提供される。いくつかの場合、改変されたポリペプチドは、アジュバントとして使用される。いくつかの場合、改変されたポリペプチドは、ワクチンとして使用される。
【０００９】
本発明の前記及びその他の態様及び利点は、以下の説明から明らかになる。説明では、その一部を成す添付図面が参照され、図面には例として本発明の好ましい実施形態が示される。このような実施形態は必ずしも本発明の全範囲を表すものではなく、従って、本発明の範囲を解釈するためには特許請求の範囲及び本明細書が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ワクチン接種に対する宿主免疫応答を評価するために使用される組換えタンパク質を示す。（上のパネル）本試験に使用したＢｏＮＴ誘導体の模式図を示す。示されている場合、２つのエピトープ（Ｈｉｓ6及びＳｔｒｅｐ）は、タンパク質精製のために使用された。３ＸＦＬＡＧ（３ＸＦ）及び２つの連続した血球凝集素（２ＨＡ）エピトープを細胞研究のために含めた。ドメイン接合点は、ＢｏＮＴ／Ａ１の結晶構造（ＰＤＢ：３ＢＴＡ）を用いて定義した。各模式図の上の一文字アミノ酸表記は、触媒作用（ＬＣ）又は受容体結合（ＨＣC）を低減するために導入されるアミノ酸置換の導入を示す。ワクチン接種には一本鎖ＢｏＮＴ及びＬＣＨＣNを使用したことに留意されたい。（下のパネル）４μｇの示されたタンパク質にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色を施した。レーン：１、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１；２、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１トリプシンによりニックを入れ、還元したもの；３、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１；４、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１トリプシンによりニックを入れ、還元したもの；５、ＬＣ／Ａ１RY；６、ＨＣC／Ａ１W；及び７、ＴｅＮＴRY。分子量マーカータンパク質（ｋＤａ）の移動を左のレーンに示す。レーン２では、ニックが入ったＨＣは約８０ｋＤａに泳動するが、これは他の実験でトリプシンによるＨＣのベルト領域の切断によるものであることが示されたことに留意されたい。
【図２】図２は、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１又はＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wを接種し、異種サブタイプである天然ＢｏＮＴ／Ａ２で抗原刺激したマウス由来の血清のＥＬＩＳＡである。マウスにＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１（上のパネル）又はＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１W（下のパネル）を接種し、１０6のＬＤ50の天然ＢｏＮＴ／Ａ２での抗原刺激の前に血清を採取した。抗原刺激から生き残ったマウス（Ａ）又は生き残らなかったマウス（Ｄ）を示す。ＥＬＩＳＡにより、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１；Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１；ＬＣ／Ａ１RY；ＨＣC／Ａ１W；ＴｅＮＴRY；及びタンパク質不含対照（Ｃｏｎ）の血清（１：２０，０００希釈）の抗体力価の測定を行った。結合したマウス抗体は、ＴＭＢ試薬を用い、ヤギα−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２０，０００希釈）で検出した。反応を希Ｈ2ＳＯ4で停止させ、４５０ｎｍで読み取った。データは、示された標準偏差で、二反復で行った２回の独立した実験からの、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１接種後ではマウス５個体（Ａ）及び４個体（Ｄ）、また、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種後ではマウス３個体（Ａ）及び６個体（Ｄ）の平均として示す。統計分析は本明細書に記載されるように行った：Ｐ，．０５＝*。
【図３】図３は、ＢｏＮＴ誘導体を接種し、天然ＢｏＮＴ／Ａ１で抗原刺激したマウス由来の血清のＥＬＩＳＡである。マウスにＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１W（０．３μｇ）、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１（０．２μｇ）、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１（０．２μｇ）＋ＨＣC／Ａ１W（０．１μｇ）、又はＨＣC／Ａ１W（０．３μｇ）を接種した。ＢｏＮＴ抗原刺激の前に血清を得た。ＥＬＩＳＡは、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１；Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１；ＬＣ／Ａ１RY；ＨＣC／Ａ１W；ＴｅＮＴRY；及びタンパク質不含対照（Ｃｏｎ）の血清（１：３０，０００希釈）の抗体力価を決定する。結合したマウス抗体は、ＴＭＢ試薬を用い、ヤギα−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２０，０００希釈）で検出した。反応を希Ｈ2ＳＯ4で停止させ、４５０ｎｍで読み取った。データが天然ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激の生存個体（Ａ）７又は非生存個体（Ｄ）３からのものであるＨＣC／Ａ１W接種マウスを除き、データは、示された標準偏差で、二反復で行った２回の独立した実験で分析した表１の実験３の、ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残ったマウスの１０の独立した血清の平均として表す。力価範囲の変動は、ＥＬＩＳＡ反復によるものではなく、個々のマウス間の抗体力価の変動によるものであった。統計分析は方法の節に記載されるように行った：Ｐ＜０．０５＝*、０．０１＝**、０．００１＝***、及び０．０００１＝****。
【図４】図４は、Ｍ−ＢｏＮＴ誘導体を接種した個々のマウス及び天然ＢｏＮＴ／Ａ１による抗原刺激から生き残った個々のマウス由来の血清のＥＬＩＳＡである。天然ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残った、ＢｏＮＴ／Ａ１W（＃７及び＃３）、ＨＣC／Ａ１W（＃７８）及びＬＣＨＣN／Ａ１（＃２１、＃２４、及び＃２５）を接種した個々のマウスからＢｏＮＴ抗原刺激前に得た血清を、抗原としてＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１；Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１；ＬＣ／Ａ１RY；ＨＣC／Ａ１Wを用いてＥＬＩＳＡにより分析した（１：３０，０００希釈）。結合したマウス抗体は、ＴＭＢ試薬を用い、ヤギα−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２０，０００希釈）で検出した。反応を希Ｈ2ＳＯ4で停止させ、４５０ｎｍで読み取った。示されたデータは、示された標準偏差で、それぞれ二反復で行った２回の独立した実験の平均である。
【図５】図５は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）におけるＳＮＡＰ２５の天然ＢｏＮＴ／Ａ１切断の血清中和を示す。ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残った、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W（＃７及び＃３）、ＨＣC／Ａ１W（＃７８）及びＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１（＃２１、＃２４、及び＃２５）を接種した個々のマウスからＢｏＮＴ抗原刺激前に得た血清を、天然ＢｏＮＴ／Ａ１を中和するそれらの能力に関して分析した。ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来ニューロンを、ポリ−Ｌ−オルニチン及びマトリゲルコーティングプレートにウェル当たり３５，０００〜４０，０００細胞の密度で播種し、中和アッセイ前の７日間、ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ培養培地で維持した。マウス血清中の中和抗体を検出するために、２ｐＭの天然ＢｏＮＴ／Ａ１を培養培地中、濾過除菌血清の連続希釈液と合わせ、３７℃で１時間インキュベートした。「抗体不含」バッファーを対照として使用した。ｈｉＰＳＣ由来ニューロンの１ウェル当たり５０μｌの各抗体−毒素混合物を少なくとも二反復で加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。毒素／抗体をこれらの細胞から吸引し、細胞溶解液にＰＡＧＥを行った後に、ＳＮＡＰ−２５切断に関してウエスタンブロットにより分析した(Pellettら, 2007;Pellettら, 2010)。非切断ＳＮＡＰ−２５に対する切断ＳＮＡＰ−２５を濃度計により定量し、保護％を、「抗体不含」対照との比較により決定した。ＩＣ50値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウエア及び非線形回帰、変動勾配、４パラメーターを用いて評価した。
【図６】図６は、ＢｏＮＴ／Ａ１による抗原刺激から生き残ったＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種マウス由来の血清の代表的なＥＬＩＳＡである。ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残ったマウスのＢｏＮＴ／Ａ１Wワクチン接種由来の血清を、示された抗原を用い、方法の節に記載されるようにＥＬＩＳＡにより分析した。値は、示された標準偏差で、二反復で行った代表的測定の平均である。
【図７】図７は、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１WはＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１、又はＬＣＨＣN／Ａ１＋ＨＣC／Ａ１Wよりも免疫原性が高いことを示す。１０6  ＬＤ50  ＢｏＮＴ／Ａ１での抗原刺激から生き残った、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１（０．３μｇ）、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１W（０．２μｇ）、又はＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１（０．２μｇ）＋ＨＣC／Ａ１W（０．１μｇ）を接種した個々のマウスに由来する血清を、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１、ＬＣ／Ａ１RY、ＨＣC／Ａ１W、ＴｅＮＴRY、又はタンパク質不含（Ｃｏｎ）に対する抗体に関してＥＬＩＳＡにより分析した。データは、示された標準偏差で、二反復で行った２回の独立した実験で分析した表１の実験３の、ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残ったマウスの１０の独立した血清の平均として表す。統計分析は本明細書に記載されるように行った：Ｐ＜０．０５＝*、０．０１＝**、０．００１＝***、及び０．０００１＝****。
【図８】図８は、野生型破傷風菌(Clostridium tetani)毒素をコードするアミノ酸配列である（配列番号１）。
【図９】図９は、２Ｍ−ＴＴをコードするアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図１０】図１０は、５Ｍ−ＴｅＮＴをコードするアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図１１】図１１は、６Ｍ−ＴｅＮＴをコードするアミノ酸配列である（配列番号５）。
【図１２】図１２は、７Ｍ−ＴｅＮＴをコードするアミノ酸配列である（配列番号６）。
【図１３】図１３は、８Ｍ−ＴｅＮＴをコードするアミノ酸配列である（配列番号７）。
【図１４】図１４は、Ｋ７６８は破傷風菌毒素において軽鎖移行を媒介することを示す。（左のパネル）ＴＴ767ＤＫＥ（ＷＴ）、ＴＴ767ＡＡＡ、ＴＴ767ＲＫＫ、又はＴＴ767ＤＡＥをニューロンとともにインキュベートし、移行に関してリポーター（β−ラクタマーゼ）ＣＣＦ２切断としてアッセイした。（右のパネル）767ＤＫＥにおけるＴＴ及びＢＴのアラインメント。毒素間で保存されたリシン（Ｋ）に注目されたい。
【図１５】図１５は、ＴｅＮＴＲＹ  ＰＤＢ：５ｎ０ｂの結晶構造である。４つのＴＴ機能を不活化した：軽鎖Ｅ２３４Ｑ、Ｒ３７３Ａ、Ｙ３７６Ｆ（Ｚｎ++結合）、Ｌ２３１Ｋ（ＶＡＭＰ−２切断）及びＹ２６Ａ（ＶＡＭＰ−２結合）、Ｋ７６８Ａ（ＬＣ移行）、及びＲ１２２６Ｌ及びＷ１２８９Ａ（受容体結合）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
開示の詳細な説明
本発明は、１以上の好ましい実施形態に関して説明されているが、当然のことながら、明示されているものの他に多くの等価物、代替、変形、及び改変が可能であり、本発明の範囲内にある。
【００１２】
本明細書に記載の方法及び組成物は、少なくとも部分的に、本発明者の非触媒性で、且つ神経細胞結合不能の遺伝的に操作された毒素の開発に基づいている。以下の段落及び例に記載されるように、触媒作用及び受容体結合を妨げる操作された欠陥を有する破傷風菌毒素及びボツリヌス菌毒素（ＢｏＮＴ）は、毒素介在疾患のワクチン開発のためのプラットフォームを提供する。例えば、操作された突然変異により非触媒性且つ受容体結合不能とされた改変型の破傷風菌毒素及びＢｏＮＴでは、毒性は検出されなかった。更に、このような改変された毒素は、ボツリヌス菌神経毒刺激から保護するためのワクチンとして好適であった。
【００１３】
組成物
好ましくは、本開示の遺伝的に改変された毒素は、野生型毒素に関する複数の標的における遺伝的改変を含み、このような改変は残留属性を排除し、安全性を高め、これを下記に詳説する。ＢｏＮＴ及び破傷風菌毒素は異なる基質及び受容体に作用するが、本発明者らは、免疫細胞は非触媒性、非受容体結合形態のＢｏＮＴ（本明細書では「Ｍ−ＢｏＮＴW」と呼称）を取り上げ、非触媒性ＢｏＮＴ（「Ｍ−ＢｏＮＴ」）で見られるものと同様の中和免疫応答を惹起することを示した。この所見に基づき、更なる独立した突然変異部位が、他の非触媒性、非受容体型毒素変異体を操作するために決定された。本明細書に記載のように改変すると、結果として操作された非触媒性、非受容体結合毒素は、ワクチン及びコンジュゲートワクチンのプラットフォームとして使用するのに好適である。
【００１４】
特定の理論又は作用様式に縛られるものではないかが、破傷風菌毒素及びボツリヌス菌毒素の独立した部位において操作された突然変異は、毒素タンパク質を独立した機序を介して毒性が発現できなくし、従って、不慮に毒性に遺伝的に復帰することに対するフェイルセーフ(fail-safe)を提供する。このような特性は、破傷風及びボツリヌス中毒に対するワクチンとしての、及びコンジュゲートワクチンのプラットフォームとしての変異体毒素の使用に有利である。
【００１５】
よって、本明細書では、不可逆的に非毒性で、現行の化学的に不活化されたトキソイドよりも有効で生産及び操作が容易であり、従って、改良型ワクチン及びコンジュゲートワクチン担体を提供する組換え的に不活化された細菌毒素が提供される。第１の態様において、本明細書では、組換えによる非触媒性、非毒性改変形態の細菌タンパク質毒素（例えば、破傷風菌毒素及びボツリヌス菌神経毒）の単離調製物が提供され、ここで、改変型の毒素は、タンパク質を独立した機序により毒性が発現できなくする少なくとも４つのアミノ酸置換を含む全長毒素である。「調製物」とは、その天然存在に対して濃縮又は精製されたいずれの濃度の毒素ポリペプチドも意味する。好ましくは、調製物は、実質的に純粋であるか、又は他の成分を組み合わせて医薬製剤とする。いくつかの場合、本発明の調製物は、免疫系を刺激する助けをする毒素ポリペプチド配列に結合されてもよい１以上のアジュバント又は担体を含み得る。他の場合では、調製物それ自体がアジュバント活性を有し、結合抗原又は併用投与抗原に対する免疫応答を増強するために有効である。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「毒素」は、特定の微生物の代謝及び成長中に、細胞若しくは組織の組み込み部分（内毒素）として、細胞内若しくは細胞外生成物（外毒素）として、又はこれらの組合せとして形成又は合成される有毒物質又は毒物（例えば、細胞毒素）を指す。本明細書で使用する場合、「改変された毒素」という用語は、非触媒性、非毒性変異体形態の毒素を指し、ここで、毒素は、ポリペプチド毒素のアミノ酸配列に対する遺伝的に操作された（例えば、非天然、人為的）改変により非触媒性且つ非毒性とされる。例示的実施形態では、改変された毒素は、クロストリジウム属の細菌（例えば、Ｃ．ディフィシル(C. difficile)、Ｃ．ノービー(C. novyi)、Ｃ．ソルデリー(C. sordellii)、ウェルシュ菌(C. perfringens)、破傷風菌(C. tetani)、及びボツリヌス菌(C. ｂotulinum)により産生される毒素の遺伝的に操作された又はそうでなければ改変された変異体である。これらの毒素は、組換え体、合成品、抗原に共有結合された、且つ／又は抗原と化学的に架橋された融合タンパク質（例えば、融合タンパク質の精製を容易にする抗原、又はポリペプチド（例えば、Ｈｉｓ6）を含む）の一部であり得る。いくつかの場合、非触媒性、非毒性形態の毒素はトキソイドと呼ばれる。トキソイドは毒性を欠くが、それらの抗原性及びそれらの免疫能を保持する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「毒性の低減」という用語は、特定のタンパク質有効成分（例えば、野生型ＴＴ）を含む第１の組成物に比べて、特定のタンパク質有効成分の改変された形態を含む第２の組成物は、第１の組成物では致死的な用量水準と同じか又はそれより多い用量水準で哺乳動物に、その哺乳動物に死に至らせることなく投与するができることを意味する。毒性の低減は、当技術分野の熟練者に公知の方法によって検出可能であるような毒性の部分的又は完全な除去を包含する。加えて、毒性の低減は、全身毒性の低減（すなわち、静脈投与の場合）又は筋肉投与時の毒性の低減を包含する。
【００１８】
特定の実施形態では、調製物は、改変された破傷風菌毒素を含む。一般に、本明細書に記載のように改変された破傷風菌毒素は、例えば、触媒活性及び受容体結合活性の有意な低下など、配列番号１に示される野生型破傷風菌毒素ポリペプチドと比較した場合に１以上の特性変化を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変された破傷風菌毒素は、野生型破傷風菌毒素の多くても１，０００，０００分の１の毒性である。
【表１】
2021506824.tif 000003
【００１９】
特定の実施形態では、調製物は、アミノ酸残基３７２及び３７５に突然変異を有し、更に残基３３４、１２２６、及び１２８９のうち１以上に突然変異を有する改変された破傷風菌毒素を含み、なお、これらの残基位置は配列番号１として示される全長野生型破傷風神経毒（破傷風菌ＣＮ３９１１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０６２１４）に対して符番されている。特定の実施形態では、残基３７２及び３７５のアミノ酸突然変異はＲ３７２Ａ及びＹ３７５Ｆであり、改変された毒素は、Ｅ３３４Ｑ、Ｒ１２２６Ｌ、及びＷ１２８９Ａから選択される少なくとも１つの突然変異を更に含む。いくつかの場合、改変された毒素は、配列番号１に対して符番された５つの突然変異（Ｒ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｒ１２２６Ｌ、及びＷ１２８９Ａ）を含み、本明細書で「５Ｍ−ＴｅＮＴ」又は「５Ｍ−ＴＴ」と呼称する。表１参照。いくつかの場合、５Ｍ−ＴｅＮＴは、配列番号４として示されるアミノ酸配列によりコードされる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、破傷風菌毒素は、改変された移行ドメインを有する。例えば、７６８の位置のリシン（Ｋ）残基は、２つの長いαヘリックスを接続するループ内に位置する。この単一アミノ酸のアラニン（Ａ）への突然変異は、軽鎖移行を不活化又は遮断する。いくつかの場合、５Ｍ−ＴＴ改変毒素にＫ７６８Ａ突然変異を付加して６Ｍ−ＴＴを作出し、それにより、得られた改変破傷風菌毒素は、６つの部位に独立した突然変異を含む（表２及び３参照）。いくつかの場合、改変された毒素は、配列番号１に対して符番された６つの突然変異（Ｒ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｋ７６８Ａ、Ｒ１２２６Ｌ、及びＷ１２８９Ａ）を含み、本明細書では「６Ｍ−ＴｅＮＴ」又は「６Ｍ−ＴＴ」と呼称する。いくつかの場合、６Ｍ−ＴｅＮＴは、配列番号５として示されるアミノ酸配列によりコードされる。特定の機序又は理論に縛られるものではないが、６Ｍ−ＴＴのワクチン効力は５Ｍ−ＴＴよりも高いと思われるが、５Ｍ−ＴＴよりも低い復帰率を持たなければならない。５Ｍ−ＴＴへのＤ７６７、Ｋ７６８、又はＥ７６９Ａのうち１以上における突然変異の付加は、触媒ドメイン及び受容体結合ドメインの機能の破壊に加えて移行ドメインの機能を不活化することにより、遺伝的に操作されたワクチンのより完全な不活性化をもたらす。
【表２】
2021506824.tif 000004
【００２１】
いくつかの実施形態では、破傷風菌毒素は、ＶＡＭＰ−２切断を阻害するように改変した。例えば、２３１の位置のロイシン残基の突然変異（例えば、ロイシンからリシン（Ｋ）への突然変異）は、ＶＡＭＰ−２切断に関する毒素の触媒活性を不活化する。いくつかの場合、６Ｍ−ＴＴ改変毒素にＬ２３１Ｋ突然変異を付加して７Ｍ−ＴＴを作出し、それにより、得られた改変破傷風菌毒素は、７つの部位に独立した突然変異を含む（表３）。いくつかの場合、改変された毒素は、配列番号１に対して符番された８つの独立した突然変異（Ｒ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｒ１２２６Ｌ、Ｗ１２８９Ａ、Ｋ７６８Ａ、及びＬ２３１Ｋ）を含み、本明細書では「７Ｍ−ＴｅＮＴ」又は「７Ｍ−ＴＴ」と呼称する。いくつかの場合、７Ｍ−ＴｅＮＴは、配列番号６として示されるアミノ酸配列によりコードされる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、破傷風菌毒素は、ＶＡＭＰ−２結合を阻害するように改変された。例えば、２６の位置のチロシン（Ｙ）残基の突然変異（例えば、チロシンからアラニン（Ａ）への突然変異）は、毒素のＶＡＭＰ−２結合能を不活化する。いくつかの場合、７Ｍ−ＴＴ改変毒素にＹ２６Ａ突然変異を付加して８Ｍ−ＴＴを作出し、それにより、得られた改変破傷風菌毒素は、８つの部位に独立した突然変異を含む（表３）。いくつかの場合、改変された毒素は、配列番号１に対して符番された８つの独立した突然変異（Ｒ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｒ１２２６Ｌ、Ｗ１２８９Ａ、Ｋ７６８Ａ、Ｌ２３１Ｋ、及びＹ２６Ａ）を含み、本明細書では「８Ｍ−ＴｅＮＴ」又は「８Ｍ−ＴＴ」と呼称する。いくつかの場合、８Ｍ−ＴｅＮＴは、配列番号７として示されるアミノ酸配列によりコードされる。
【表３】
2021506824.tif 000005
【００２３】
いくつかの場合、改変された破傷風菌毒素は、３７２、２７５、３３４、７６８、１２２６、１２８９、２３１、及び／又は２６の位置の残基にその他のアミノ酸置換を含む。例えば、列挙されたアミノ酸を置換可能なアミノ酸としては、元の残基とは逆の電荷又は疎水性とする置換、保存的アミノ酸置換、及び元の残基を欠失させる置換が含まれる。
【００２４】
当業者に周知のように、保存的アミノ酸置換によるポリペプチドの一次構造の変更は、その配列に導入されるアミノ酸の側鎖は置換されたアミノ酸の側鎖と類似の結合及び接触を形成し得るので、そのポリペプチドの活性を有意に変更しない。置換がポリペプチドの立体配座の決定に重要な領域にある場合であってもそうである。
【００２５】
保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸で、類似の特徴を有する別のアミノ酸を置換することと当技術分野で認識されている。保存的アミノ酸置換は、ヌクレオチド配列をその保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するように改変することによって達成され得る。例えば、各アミノ酸は、以下の特徴：電気的陽性、電気的陰性、脂肪族、芳香族、極性、疎水性及び親水性のうち１以上を有すると記述することができる。保存的置換としては、各群内のアミノ酸間での置換が含まれる。酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸が含まれる。塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リシン、アルギニンが含まれ；脂肪族アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン及びバリンが含まれる。芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、グリシン、チロシン及びトリプトファンが含まれる。極性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン及びチロシンが含まれる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン及びトリプトファンが含まれる。アミノ酸はまた、相対的大きさに関して記述することもでき、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、プロリン、トレオニン、セリン、バリンは小さいと見なされる。
【００２６】
いくつかの場合、非保存的置換も、これらの置換がポリペプチド内のエピトープの三次元構造を崩壊させない、例えば、ポリペプチドの免疫原性（例えば、抗原性）を妨害せず、且つ、毒性を復帰しない限り可能である。
【００２７】
特定の実施形態では、改変された破傷風菌毒素は、アミノ酸残基３７２及び３７５における突然変異を含み、更に残基３３４、１２２６、及び１２８９のうち１以上に突然変異を含み、ここで、改変された毒素は、適当な治療方法向けに、下記のように別のペプチドにコンジュゲート又はカップリングされている。有利には、本開示の改変された破傷風菌毒素は、ワクチン又はアジュバントとして使用するためにホルマリンで解毒する必要はない。いくつかの場合、少量のホルマリン（約０．０４％）又は別の固定剤又は安定化試薬（例えば、ホルマリン、グルタルアルデヒド、β−プロピオラクトンなど）が改変された破傷風菌毒素に分解防止剤として適用されるが、このような量は、野生型破傷風菌毒素（又は本明細書に記載されるように改変されていない破傷風菌毒素）を解毒して「破傷風トキソイド」を形成するために一般に使用される量（約０．４％）よりも少ない（例えば、一桁少ない）。
【００２８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の改変された毒素は、糖鎖、タンパク質又はペプチド（例えば、抗原）、及び化学部分などの分子を更に含む。特に、本明細書では、コンジュゲートされた又は化学的に連結された（例えば、架橋された）糖鎖を含むように更に改変された組換え非触媒性、非毒性変異体毒素形態（例えば、改変された破傷風菌毒素及び改変されたボツリヌス菌神経毒）が提供される。このように、糖鎖にコンジュゲートされた改変毒素は、Ｔ細胞依存性免疫原として使用するためのプラットフォームを提供する。いくつかの場合、他の分子又は部分（例えば、抗原）は、「積荷」として架橋部分に更に連結することができる。
【００２９】
いくつかの場合、改変された糖鎖コンジュゲート破傷風菌毒素は、配列番号１に対して符番された５つの突然変異（Ｒ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ、Ｅ３３４Ｑ、Ｒ１２２６Ｌ、及びＷ１２８９Ａ）を含み、本明細書では「ＴｅＮＴ（ＣＢ）」と呼称する。他の場合では、改変された糖鎖コンジュゲートＢｏＮＴ毒素は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１０８４５．４に対して符番された４つの突然変異（Ｅ２２４Ａ、Ｒ３６３Ａ、Ｙ３６６Ｆ、及びＷ１２６６Ａ）を含み、本明細書では「ＢｏＮＴ（ＣＢ）」と呼称する。いくつかの場合、糖鎖は、改変された毒素に化学架橋によりコンジュゲートされる。毒素などのポリペプチドに多糖を共有結合させるための一般的な化学反応としては、限定されるものではないが、還元的アミノ化、シアン化コンジュゲーション(cyanalation conjugation)、及びカルボジイミド反応が含まれる。他の場合では、糖鎖−毒素コンジュゲートは、Chuら,1983. Infect and Immun. 40(1):245-256が記載しているスキームなどの他の合成スキームによって調製される。
【００３０】
「糖鎖」という用語は、本明細書で使用する場合、モノマー糖を含め、多糖、オリゴ糖及び他の糖鎖ポリマーを含むことが意図される。一般に、多糖は約１０から最大２，０００又はそれを超える繰り返し単位、好ましくは約１００〜１９００の繰り返し単位を有する。オリゴ糖は一般に、約２〜１０の繰り返し単位から約１５、２０、２５、３０、又は３５〜約４０又は４５までの繰り返し単位を有する。いくつかの場合、本明細書で提供される改変された毒素へのコンジュゲーションに好適な糖鎖としては、限定されるものではないが、カルボキシル基を有する多糖が含まれる。このような場合、カルボキシル基を有する多糖は、改変された毒素に前記カルボキシル基のチオール誘導体を介してコンジュゲートすることができる。
【００３１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、主として共有アミド結合により相互に結合されたアミノ酸残基を含むポリマーを指す。「タンパク質」という用語により、本発明者らは、上記の定義を全て包含することを意味する。これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が天然アミノ酸の人工化学模倣物であり得るアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。本明細書で使用する場合、これらの用語は、アミノ酸が共有ペプチド結合により連結された、全長タンパク質を含むいずれの長さのアミノ酸鎖も包含し得る。タンパク質又はペプチドは、天然生物から単離されてもよいし、組換え技術により生産されてもよいし、又は当業者に公知の合成製造技術により生産されてもよい。
【００３２】
いくつかの場合、スペーサー部分は、改変された毒素と連結された分子の間のスペーサーアームブリッジとして使用される。スペーサー部分は、限定されるものではないが、デキストラン、ポリグルタミン酸、及びオリゴペプチドを含む多様な分子構造のいずれであってもよい。
【００３３】
アミノ酸配列間の配列同一性は、配列のアラインメントを比較することによって決定することができる。比較される配列の等しい位置が同じアミノ酸で占有されていれば、それらの分子はその位置で同一である。同一性パーセンテージとしてのアラインメントのスコア化は、比較される配列により共有される位置における同一のアミノ酸の数の関数である。配列を比較する場合、最適なアラインメントは、配列内にあり得る挿入及び欠失を考慮するために配列の１以上にギャップが導入される必要のある場合がある。配列比較法では、ギャップペナルティを使用することができ、従って、比較される配列の同数の同一分子に関して、できる限り少ないギャップを用いた配列アラインメント（２つの比較配列間のより高い関連を反映する）の方が多くのギャップを用いたものよりも高いスコアとなる。最大同一性パーセントの計算は、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの作成を含む。前述のように、配列同一性パーセンテージは、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで公開されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバル配列アラインメントツールを使用し、デフォルトパラメーター設定を用いて決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、J. Mol. Biol. (1970) vol. 48:443-53に公開されている。
【００３４】
本発明のポリペプチド及び核酸は、従来の合成装置を用いて合成により作製することができる。あるいは、それらは組換えＤＮＡ技術を用いて生産することもでき、好適な発現ベクターに組み込むこともでき、その後これを用いて大腸菌(E. coli)などの原核細胞などの好適な宿主細胞を形質転換させる。形質転換宿主細胞を培養し、それらからポリペプチドを単離する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、改変された毒素調製物をコードする核酸配列及び高ストリンジェンシー条件下で上記のヌクレオチド配列からなる核酸分子(nucleic molecule)とハイブリダイズする他の核酸配列である。本明細書において特定の実施形態で、アミノ酸残基３７２及び３７５に突然変異を有し、更に残基３３４、１２２６、及び１２８９のうち１以上に突然変異又は本明細書に記載の改変された触媒ドメインを含む改変された破傷風菌毒素をコードするＤＮＡ配列で提供される。いくつかの場合、改変された破傷風菌毒素をコードする核酸配列は配列番号３として示される。
【００３６】
「ストリンジェント条件」という用語は、本明細書で使用する場合、当技術分野で周知のパラメーターを意味する。例えば、核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、このような方法を編纂した参照文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrookら編,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら編, John Wiley & Sons, Inc., New Yorksに見出すことができる。より具体的には、高ストリンジェンシー条件は、本明細書で使用する場合、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７であり；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり；ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を室温にて２×ＳＳＣで、次いで、６８℃までの温度、例えば５５℃、６０℃、６５℃又は６８℃にて０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄する。あるいは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、製造者が記載しているハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用い、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）バッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて行うことができる。
【００３７】
また、本発明は、発現ベクターにおける、並びに宿主細胞及び細胞株（これらは、原核生物（例えば、大腸菌）、又は真核生物（例えば、樹状細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現系、昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現）である）をトランスフェクトするための配列の使用を包含することも理解されるであろう。これらの発現ベクターは、適切な配列、すなわち前記のものはプロモーターに機能的に連結されていることを必要とする。
【００３８】
本明細書において別の態様では、宿主に導入された際に、前記タンパク質を産生した宿主がその後同じ微生物（例えば、破傷風菌）に攻撃された場合に宿主に免疫を付与する、本明細書に記載されるような改変毒素を含む免疫原性組成物が提供される。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書に記載されるような改変毒素を含み、更に組成物が破傷風菌若しくはボツリヌス菌又はそれらの精製毒素により引き起こされる疾病の発症に対するワクチン接種を必要とする対象に投与される場合に適当な賦形剤及び／又は希釈剤を含むワクチンである。
【００３９】
「ワクチン」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原を含む組成物を指す。ワクチンはまた、特定の疾患に対する免疫を高める生物学的製剤も含み得る。ワクチンは一般に、疾患を引き起こす微生物に似た、抗原と呼ばれる薬剤を含有してよく、この薬剤は多くの場合、微生物の弱毒若しくは死滅形態、その毒素又はその表面タンパク質の１つから作製され得る。抗原は、身体の免疫系を、その薬剤を非自己と認識させ、それを破壊させ、それを「記憶させる」ように促し、その結果、この免疫系は、後にそれが遭遇するこれらの微生物のいずれをもより容易に認識し破壊することができる。同様に、改変された毒素調製物は、他の病原体に対するワクチンと合わせると、それら自体がワクチンアジュバントとして作用することにより対象とする病原体に対する免疫応答を「増強する」ことができる。アジュバントは、それらの物理化学的特性又は作用機序に従って分類することができる。２つの主要なクラスのアジュバントとしては、免疫応答を刺激する細菌毒素などの免疫系に直接作用する化合物及び担体としての制御された様式及び挙動で抗原提示を助けることができる分子が含まれる。
【００４０】
適当なワクチン成分の選択は、当業者の通常の能力の範囲内である。例えば、本発明のワクチン組成物は、好都合には、例えば、水性溶媒、非水性溶媒、非毒性賦形剤、例えば、塩、保存剤、バッファーなどのような薬学上許容される賦形剤又は希釈剤を用いて調剤することができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油及び注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性溶媒としては、水、アルコール／水溶液、生理食塩水、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖加リンゲル液などが含まれる。保存剤としては、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスが含まれる。ｐＨ及びワクチン組成物中の種々の成分の厳密な濃度は常法に従って調整される。
【００４１】
いくつかの場合、本明細書に記載の調製物は、部分的毒素複合体を含む調製物を含め、精製された改変毒素を含み得る。いくつかの実施形態では、調製物は、改変されたＢｏＮＴ及び破傷風菌毒素タンパク質を安定化することが知られている安定剤を更に含み得る。好適な安定剤は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、例えば、ヒト又はウシ血清アルブミン、ゼラチン、とりわけ米国特許出願第２００５／０２３８６６３号（その内容は全て本明細書の一部として援用される）に記載されているような組換えアルブミンが含まれる。
【００４２】
「対象」及び「患者」という用語は互換的に使用され、特定の処置のレシピエントとなる、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などを含むいずれの動物（例えば、哺乳動物）も指す。一般に、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書ではヒト対象に関して互換的に使用される。
【００４３】
本発明の調製物は、治療上有効な量で投与することができる。「有効量」又は「治療上有効な量」という用語は、抗原又はワクチンを受容した対象に、ウイルス又は細菌などの病原体の感染により引き起こされる、有害な健康作用又はその合併症を含む疾患の徴候又は症状を予防するために十分な免疫応答を誘導する抗原又はワクチンの量を指す。体液性免疫又は細胞媒介免疫又は体液性免疫と細胞媒介免疫の両方を誘導し得る。ワクチンに対する動物の免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイによって間接的に、又は野生株の投与の後に徴候及び症状の経過観察によって直接的に評価することができる。ワクチンにより付与される防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温、総合的な身体状態などの臨床徴候の軽減、並びに対象の総合的な健康及びパフォーマンスを測定することによって評価することができる。ワクチンの治療上有効な量は、使用する特定の調製物、又は対象の状態によって異なり、医師によって決定することができる。
【００４４】
本発明の調製物は、必要な処置のタイプに応じた治療上有効な量で投与することができる。個々の処置に好適な用量又は用量範囲を決定する方法は、当業者に公知である。本明細書で提供される方法に関して、本発明の調製物は、意図する目的を達成する、又は当業者により適当であると考えられるいずれの手段によって投与することもできる。例示的実施形態では、改変された毒素調製物は、単回用量として又は適当であれば、例えばミニポンプシステムを用いた連続投与として投与される。いくつかの場合、改変された毒素調製物は、液体剤形として又は例えば投与前に再構成される凍結乾燥剤形として提供される。
【００４５】
「保護される」という用語は、本明細書で使用する場合、疾患又は病態に対する患者の免疫誘導を指す。免疫誘導は、抗原を含むワクチンを投与することによって生じ得る。特に本発明では、免疫患者は破傷風疾患又はその症状から保護される。
一実施形態では、好適な用量は約１μｇ〜２０μｇである。
本明細書に記載の改変された毒素の調製物に関する好適な投与経路としては、限定されるものではないが、直接注射が含まれる。特定の実施形態では、各用量は筋肉内に投与される。
【００４６】
本技術の薬剤の用量、毒性、及び治療効力は、例えばＬＤ50（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ50（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための細胞培養又は試験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療係数であり、それはＬＤ50／ＥＤ50比として表すことができる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「治療上有効な量」は、疾患を治療するために対象に投与した場合に、その疾患に対するそのような治療に十分な化合物量を指す。「治療上有効な量」は、化合物、治療される病態、治療される疾患の重篤度(the severity or the disease treated)、対象の齢及び相対的健康状態、投与の経路及び形態、担当の医師又は獣医の判断、並びに他の因子によって異なる。本発明の目的では、「治療する」又は「治療」は、疾患、病態、又は障害に対抗するための患者の管理及びケアを言う。これらの用語は、防止的療法、すなわち、予防療法と待期療法の両方を包含する。
【００４８】
本明細書に記載のコンジュゲート型送達プラットフォームは、どのコンジュゲート型改変Ｔｅｔ毒素プラットフォームを使用するかを調整することによって特定の病態又は疾患を標的とするように調整することができる。
【００４９】
方法
本明細書において別の態様では、毒性が低減され且つ効力が増強されたワクチン及びコンジュゲートワクチンを操作するための方法が提供される。これらの方法は、マルチドメインタンパク質毒素のドメイン内の特定のアミノ酸残基を遺伝的に改変することを含み、それにより、その毒素は標的細胞（例えば、ニューロン）に対する触媒活性又は受容体結合活性のいずれかにより毒性を発現できなくされ、移行に欠陥があり、且つ、毒性形態に復帰する可能性が低減される。複数の独立したタンパク質機能の改変により、本明細書で提供される方法は有利には、タンパク質の毒性への復帰の可能性が実質的にない、強力なワクチン及びコンジュゲートワクチンの理想的な候補となる全長毒素を提供する。本明細書で使用する場合、「効力」という用語は、適当な臨床検査により又は十分に管理された臨床データにより示されるようなワクチンの特異的な防御免疫遂行力又は遂行能を指す。言い換えれば、効力はワクチンの強さの尺度である。
【００５０】
いくつかの場合、ワクチンとしての効力が増強された操作された細菌タンパク質トキソイドを得るための方法は、下記の工程：マルチドメイン細菌タンパク質毒素をコードするアミノ酸配列の各ドメインにおいて１以上のアミノ酸を選択すること、ここで、各位置は、各ドメインに関連するタンパク質機能を不活化するように選択され、これらのドメインは、触媒ドメイン、移行ドメイン、受容体結合ドメイン、及び基質結合ドメインのうち２つ以上を含む；選択された各位置の天然アミノ酸残基を非天然アミノ酸残基で置換し、それにより、その置換はそのドメインに関連する１以上のタンパク質機能を不活化すること；及び宿主細胞において置換された非天然アミノ酸残基を含む全長細菌タンパク質毒素をコードする核酸配列を発現させ、それにより、発現されたタンパク質は、天然アミノ酸を含む全長細菌タンパク質毒素に比べて触媒活性、受容体結合活性、移行活性、又は基質結合活性の部分的又は完全喪失を示すことを含むか、又はそれらから本質的になる。
【００５１】
改変のためのアミノ酸残基の選択は、タンパク質配列（例えば、一次アミノ酸配列）又は細菌タンパク質毒素の各ドメインの個々の機能的アミノ酸残基を同定するための構造情報の分析を含む。好ましくは、選択される残基は、全長タンパク質を不安定化することなく、且つ、免疫原性の喪失なく改変することができる各機能的ドメイン（例えば、触媒ドメイン、移行ドメイン、受容体結合ドメイン、基質結合ドメイン）の１以上の個々のアミノ酸残基である。タンパク質の安定性は、いずれの適当な方法によって評価してもよい。いくつかの場合、改変された毒素は安定性に関しては、トリプシン感受性3を測定することにより試験され、又、改変された毒素は免疫原性に関しては、マウスモデル4で改変された毒素接種に対する免疫応答を測定することにより試験される。
【００５２】
タンパク質構造情報は、例えば、Ｘ線結晶学、電子顕微鏡、核磁気共鳴法、コンピュータータンパク質構造モデリング、又はそれらの組合せなどのいずれの適当な方法によって得てもよい。いくつかの場合、対象とする細菌タンパク質毒素の結晶構造は、例えば、毒素の機能的ドメイン間の相互作用の特異的部位及び関連のタンパク質毒素間で機能的に保存されている残基を同定するために使用することができる。例えば、例としてジフテリア毒素を使用する場合、触媒作用、基質結合、移行、及び受容体結合に関与するアミノ酸残基が従前の研究からの文献で特定され、ジフテリア毒素の結晶構造内のアミノ酸配列のアラインメントに基づき、毒素の４つの機能的ドメインのそれぞれにおいて複数の独立した突然変異をコードする変異型ジフテリア毒素遺伝子を作出するために、ジフテリア毒素をコードする遺伝子中で操作を行う。変異型ジフテリア毒素をコードする核酸配列は大腸菌に形質転換され、タンパク質が組換え生産され、毒性の喪失、安定性の維持、及び免疫原性の保持に関して試験される。
【００５３】
例として、ドメイン間及びドメイン内の分子相互作用は、野生型細菌タンパク質毒素の結晶構造の分析から決定することができる。置換突然変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発、及び全遺伝子合成、並びに当技術分野で公知の他の方法など周知の方法を用いて達成することができる。突然変異誘発プロトコールの例示的方法は例えば下記の実施例で示される。いくつかの場合、単一のアミノ酸残基において突然変異を作出するために部位特異的突然変異誘発が使用される。いくつかの場合、部位特異的突然変異誘発のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにＰｒｉｍｅｒＸ（World Wide Web上のbioinformatics.org/primerx/で利用可能）などのソフトウエアプログラムが使用できる。例えばポリメラーゼ連鎖反応などの任意の適当な方法による突然変異誘発のための鋳型として供するために、野生型細菌タンパク質毒素遺伝子を発現ベクターにクローン化することができる。突然変異誘発は、核酸シーケンシングによって確認することができる。いくつかの場合、改変されたタンパク質毒素をコードするポリヌクレオチドは発現ベクター内に位置する。いくつかの場合、このベクターは宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、真核細胞）内にある。原核生物及び真核生物の両方で多くの発現ベクター及び発現系が知られ、適当な系の選択は意図による。本発明の改変されたタンパク質生成物の発現及び精製は当業者ならば容易に行うことができる。Sambrookら,“Molecular cloning-A Laboratory Manual,第2版”参照。
【００５４】
これらの方法は、細菌により分泌され、多くの場合、触媒的に働き基質特異性を示すという点で酵素に似たマルチドメインタンパク質である、外毒素としても知られる実質的にいずれの細菌タンパク質毒素にも適用可能である。細菌タンパク質毒素としては、限定されるものではないが、ボツリヌス菌毒素、破傷風菌毒素、志賀毒素、ジフテリア毒素、百日咳菌(Bordetella pertussis)毒素、大腸菌易熱性毒素ＬＴ、炭疽菌(Bacillus anthracis)毒素、シュードモナス外毒素Ａ、炭疽毒素致死因子（ＬＦ）、コレラ腸毒素、及び黄色ブドウ球菌エクスフォリアチンＢが含まれる。表４は、ワクチン及びコンジュゲートワクチンに特に有利である遺伝的に操作された組換え、非毒性、高効力トキソイドの設計に使用するために結晶構造情報が利用可能な例示的細菌タンパク質毒素を示す。
【００５５】
【表４】
2021506824.tif 000006
【００５６】
いくつかの場合、独立の不活化改変は、細菌タンパク質毒素の触媒ドメイン、基質結合ドメイン、移行ドメイン、及び受容体結合ドメインのうち１以上を破壊するように選択される。例えば、ジフテリア毒素は、アミノ酸５３５個の長さの細菌タンパク質毒素である。触媒機能（Ｅ１４９Ｓ）、基質結合機能（Ｈ２１Ａ）、移行機能（Ｅ３４９Ｋ、Ｅ３６２Ｋ）、及び受容体結合機能（Ｋ５１６Ａ、Ｋ５２６Ａ、Ｈ３９１Ａ）に関与するアミノ酸残基の不活化は、非毒性でありながらなお効力のあるジフテリアワクチンを生じる。
【００５７】
しかしながら、これらの方法は、アミノ酸配列及び／又は結晶構造情報が入手可能であり、不活性化改変が既知の構造機能特性に基づいて決定することができる複数の機能的ドメイン（例えば、エフェクタードメイン）を有する実質的にいずれのタンパク質にも適用できることが理解されるであろう。
【００５８】
特定の実施形態では、宿主の受容体活性を妨げるための遺伝的改変を重鎖のＣ末端部分（ＨＣC）に導入する。触媒活性を妨げるためには、軽鎖の、ＳＮＡＲＥ複合体を介する神経伝達物質の放出に必要な又は重要なアミノ酸残基に遺伝的改変を導入する。
【００５９】
本明細書に記載又は参照される技術及び手順は一般に、当業者により、例えば、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)に記載の広く使用されている分子クローニング法などの従来の方法を用いて十分に理解され、一般に使用される。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は一般に、特に断りのない限り、製造が規定しているプロトコール及び／又はパラメーターに従って実施される。
【００６０】
キット
本明細書において別の態様では、対象に本明細書に記載されるような改変された毒素ワクチンを含むワクチン又はアジュバントを投与するためのキットが提供される。一実施形態では、このキットは、改変された毒素（例えば、本明細書に記載されるような改変された破傷風菌毒素）の一形態を含む。このキットは更に、使用者が、破傷風菌により引き起こされる疾患、特に、破傷風菌毒素により引き起こされる疾患の発症に対して対象に予防接種を行う方法を実施することを可能とする説明書を含み得る。一実施形態では、本発明の改変された毒素は、生理学的条件で使用するために調剤され、配送され、且つ、保存される。好適な医薬担体としては、限定されるものではないが、例えば、生理食塩水（例えば、０．９％塩化ナトリウム）、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸加リンゲル液などが含まれる。
【００６１】
「使用説明書」により、本発明者らは、本明細書に示される目的の１つに対する本発明の有用性を伝えるために使用される出版物、記録、図、又は他のいずれかの表現媒体を意味する。キットの説明資料は、例えば、本発明を含有する容器に添付されてもよいし、又は本発明を含有する容器と一緒に輸送されてもよい。あるいは、説明資料は容器とは別に輸送されてもよく、又は説明資料と生体適合性ハイドロゲルがレシピエントによって協力的に使用されるという意図をもってインターネットウェブサイトに電子的にアクセス可能な形態で提供されてもよい。
【００６２】
本明細書及び特許請求の範囲では、「を含む(including)」及び「を含む(comprising)」という用語はオープンエンドの用語であり、「限定されるものではないが、〜を含むこと」を意味して解釈されるべきである。これらの用語は、「から本質的になる」及び「からなる」というより限定的な用語を包含する。
【００６３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」、及び「その(the)」は、そうではないことが明示されない限り、複数の指示物を含む。同様に、「１つの(a)」（又は１つの(an)）、「１以上の」及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用可能である。また、「を含む(comprising)」、「を含む(including)」、「を特徴とする」及び「を有する」という用語は互換的に使用可能であることにも留意されたい。
【００６４】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に特に記載されている全ての刊行物及び特許は、本発明に関連して使用され得る、刊行物に報告されている化学物質、装置、統計分析及び方法論の記載及び開示を含めあらゆる目的で、それらの全内容が本明細書の一部として援用される。本明細書に引用される全ての参照文献は、当技術分野の技術水準を示すと考えられる。本明細書において、先行発明のために本発明にそのような開示に先行する権利がないことを認めたものと解釈されるべきでない。
【００６５】
本発明は下記の限定されない例を考慮すればより詳しく理解される。
【実施例】
【００６６】
実施例１：Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１及びＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wの単離及び特性決定
本実施例は、触媒作用及び受容体結合に欠陥を持つように操作された全長ＢｏＮＴが１０6  ＬＤ50の天然ＢｏＮＴ／Ａ１による抗原刺激から保護したことを説明する。これらのデータは、ボツリヌス中毒及び他の毒素により媒介される疾患に対するワクチンの開発のために独立した機序により毒性を低減する複数の突然変異を有する遺伝的に操作された毒素の、プラットフォーム戦略としての可能性を示す。
【００６７】
材料及び方法：
バイオセーフティー及びバイオセキュリティー：  ウィスコンシン大学マディソン校で実施された実験は、所内バイオセーフティー委員会により承認されたものである。加えて、実験は、本研究に関して連邦指定生物剤プログラム(Federal Select Agent Program)により承認された実験室で、適合性評価を受けた研究者らにより、所内の方針及び手順を遵守して実施された。動物実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の動物実験委員会の指針に従って承認及び実施された。米国保健福祉省は、３つのＬＣ突然変異（Ｅ２２４Ａ／Ｒ３６３Ａ／Ｙ３６６Ｆ、Ｍと呼称）をコードするＢｏＮＴ／Ａの遺伝子及びタンパク質産物は、指定生物剤の規制定義を満たさず、指定生物剤登録なくＭ−ＢｏＮＴ／Ａの生産を可能とする（§７３．３  ＨＨＳ指定生物剤及び毒素  ４２  ＣＦＲ  ７３．３（ｅ）（１）。
【００６８】
ボツリヌス菌神経毒：  ＢｏＮＴ／Ａ１、／Ａ２、／Ａ３及び／Ａ５は、ボツリヌス菌株Ｈａｌｌ  Ａ−ｈｙｐｅｒ、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ、ＣＤＣ  Ａ３（Ｓｕｓａｎ  Ｍａｓｌａｎｋａ及びＢｒｉａｎ  Ｒａｐｈａｅｌ、疾病管理予防センターにより提供）及びＡ６６１２２２から標準的な毒素精製プロトコール(Jacobsonら, 2011; Linら, 2010; Malizioら, 2000; Teppら, 2012)により精製した。ＢｏＮＴ／Ａ６は、ＣＤＣ４１３７０  Ｂ２ｔｏｘ-（ＣＤＣ４１３７０株からＢｏＮＴ／Ａ６のみを産生するように改変）毒素から従前に記載された方法(Pellettら, 2016)を用いて精製した。毒素純度は分光法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(Whitemarshら, 2013)により確認した。精製された毒素は、４０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水中、−２０℃で使用まで保存した。５つのサブタイプの調製物の活性を、従前に記載されているような(Hatheway, 1988; Schantz, 1978)、標準的腹腔内マウス生物検定法（ＭＢＡ）を用いて決定した。各毒素の半致死量を１マウスＬＤ５０単位（Ｕ）として定義した。ＢｏＮＴ／Ａサブタイプの比活性は、８ｐｇ／Ｕ（Ａ１）、７．９ｐｇ／Ｕ（Ａ２）、１７ｐｇ／Ｕ（Ａ３）、７．３ｐｇ／Ｕ（Ａ５）、及び５．９ｐｇ／Ｕ（Ａ６）であった。
【００６９】
組換えＢｏＮＴ誘導体：  ＨＣC／Ａ１（Ｗ１２６６Ａ）（ＨＣC／Ａ１W）、ＬＣ／Ａ１（Ｒ３６３Ａ／Ｙ３６６Ｆ）（ＬＣ／Ａ１RY）、ＬＣＨＣN／Ａ１（Ｅ２２４Ａ／Ｒ３６３Ａ／Ｙ３６６Ｆ）（Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１）、ＢｏＮＴ／Ａ１（Ｅ２２４Ａ／Ｒ３６３Ａ／Ｙ３６６Ｆ）（Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１）、ＢｏＮＴ／Ａ１（Ｅ２２４Ａ／Ｒ３６３Ａ／Ｙ３６６Ｆ／Ｗ１２６６Ａ）（Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W）及び非触媒性破傷風菌毒素（Ｒ３７２Ａ／Ｙ３７５Ｆ）（ＴｅＮＴRY）の生産を従前に記載されたように（Ｐｒｚｅｄｐｅｌｓｋｉら，２０１３）に行った。簡単に述べれば、大腸菌を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上で３７℃にて一晩増殖させた。培養物を、カナマイシンを含有するＬＢ培地（４００ｍｌ）に植え込み、３７℃で振盪しながら３〜６時間、１．０ｍＭのＩＰＴＧを加えた場合にはＯＤ６００が約０．６となるまで培養した後、１６℃で振盪しながら一晩インキュベートした。細胞を採取し、ペレットを溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、及びプロテアーゼ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）に懸濁させた。細胞をフレンチプレスで破壊し、遠心分離により清澄化し、０．４５μｍの界面活性剤不含酢酸セルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）で濾過した。溶解液を、Ｎｉ2+−ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐ−アミノベンズアミジン−アガロース（Ｓｉｇｍａ）、及びＳｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙレジン（ＩＢＡ−ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるタンデム重力流クロマトグラフィーにより更に精製した。精製したタンパク質を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び４０％グリセロールに対して透析し、−２０℃で保存した。本試験に使用した組換えタンパク質を示す（図１）。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wをコードするヌクレオチド配列を配列番号４として示す（図９参照）。
【００７０】
ワクチン接種：  雌ＩＣＲマウス（１８〜２２ｇ）の群をアジュバントとしての等量のアルハイドロゲルを混合した示された濃度のＨＣC／Ａ１W、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１、又はＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wで腹膜内免疫した。非トリプシン処理Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１及びＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wをワクチンとして使用した。１日目及び１４日目にワクチンを投与し、２１日目に上顎採血により血液を採取し、２６日目に示されたようにマウスをＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、又はＢｏＮＴ−／Ａ２、／Ａ３、／Ａ５、Ａ６カクテルで抗原刺激した。示されているように、各実験に各群少なくとも８個体のマウスを使用した。結果の統計的適切性をｐ＝０．０５で対応のあるスチューデントの両側ｔ検定により評価した。
【００７１】
ＥＬＩＳＡ：  ＢｏＮＴ誘導体又はＴｅＮＴRY（２５０ｎｇ／ウェル）を高タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の０．１ｍｌのコーティングバッファー、５０ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ９．６）に加え、４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．３ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．２ｍｌのＰＢＳで室温（ＲＴ）にて３０分間ブロッキングした。プレートを、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡ（０．１ｍｌ）を含むＰＢＳ中、個々にワクチン接種を行ったマウスから１：２０，０００又は１：３０，０００のいずれかの示された希釈率の血清とともにＲＴで１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．３ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した後、プレートを、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡを含むＰＢＳ中、ヤギα−マウスＩｇＧ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（１：２０，０００希釈のＩｇＧ−ＨＲＰ；Ｔｈｅｒｍｏ）とともにＲＴで１時間インキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．３ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した後、基質としての０．１ｍｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ）とともにインキュベートした。１０分後に０．１ｍｌの０．１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。α−ＨＡ及びα−ＦＬＡＧ抗体と結合した抗原を測定する対照ＥＬＩＳＡは、各抗原内の適当なエピトープの存在が１５％以内であることを示した（データは示されていない）。ＥＬＩＳＡについては、免疫誘導時及び／又は抗原刺激条件時に基づき個々に分析した血清群（Ｎ＝１０）に対してＰ＜０．０５＝*、０．０１＝**、０．００１＝***、及び０．０００１＝****（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７）での対応のないスチューデントの両側ｔ検定により統計分析を行った。個々の血清を、二反復で行った少なくとも２回の独立したＥＬＩＳＡによって分析した。１：２０，０００〜１：３０，０００倍希釈でのマウス血清の分析は、いくつかの個々の血清の評価に基づいた。血清希釈は、ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残ったＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１接種マウス数個体の用量反応ＥＬＩＳＡから確定した。代表的なＥＬＩＳＡを図６に示す。
【００７２】
中和抗体の検出のための細胞に基づくアッセイ：  細胞に基づく中和アッセイは従前に記載されているように(Whitemarshら, 2012)行った。簡単に述べれば、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来ニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＷＩ）をポリ−Ｌ−オルニチン及びマトリゲル（商標）をコーティングした９６ウェルＴＰＰプレート（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＯ）に約３５，０００〜４０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、中和アッセイ前の７日間、ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ培養培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＷＩ）で製造者の説明書に従って維持した。マウス血清中の中和抗体を検出するために、２ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ１を培養培地中、濾過除菌血清の連続希釈液と合わせ、３７℃で１時間インキュベートした。血清不含のＢｏＮＴ／Ａ１を「抗体不含」参照として使用し、ナイーブマウス由来の血清を対照として使用した。毒素を含まない血清を陰性対照として使用した。ｈｉＰＳＣ由来ニューロンの１ウェル当たり５０μｌの各抗体−毒素混合物を少なくとも二反復でそれぞれ加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。毒素／抗体を細胞から吸引し、細胞溶解液を５０μｌのドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）サンプルバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に調製した。細胞溶解液を従前に記載されたように(Pellettら, 2007; Pellettら, 2010)、ＳＮＡＰ−２５切断に関してウエスタンブロットにより分析した。ＰｈｏｓｐｈａＧｌｏ試薬（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）及びＦｏｔｏｄｙｎｅ／ＦＯＴＯ／Ａｎａｌｙｓｔ  ＦＸイメージングシステム（Ｈａｒｌａｎｄ、ＷＩ）を用いて画像を得た。切断（２４ｋＤａ）シグナルと非切断（２５ｋＤａ）ＳＮＡＰ−２５シグナルを、ＴｏｔａｌＬａｂ  Ｑｕａｎｔソフトウエア（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ、Ｈａｒｌａｎｄ、ＷＩ）を用い、濃度計により分析した。保護のパーセンテージは、「抗体不含」対照と比較して決定され、ＩＣ50値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウエア及び非線形回帰、変動勾配、４パラメーターを用いて評価した。
【００７３】
結果
Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１は非近交系マウス又は培養細胞に毒性がない
腹腔内注射した１０μｇのトリプシン処理又は非トリプシン処理Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１／マウス（ＩＣＲ）は観察可能なボツリヌス中毒の徴候をもたらさなかったが、これはＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１が天然ＢｏＮＴ／Ａ１の多くても１００万分の１の毒性であったことを示す。加えて、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの８０ｎＭのＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１とのインキュベーションは検出可能なＳＮＡＰ−２５切断はもたらされなかったが、５０ｆＭの天然ＢｏＮＴ／Ａ１とのインキュベーションはＳＮＡＰ−２５を切断し、これは細胞に基づくアッセイにより多くとも１００万分の１の毒性を示す（データは示されていない）。
【００７４】
Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１及びＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１WはＨＣｃ／Ａ１Wよりも保護性の高いワクチンである
ワクチン投与は、初回免疫とその後の１回の追加免疫を用い、宿主内の自然免疫変動を表すために(Raiら, 2009)、非近交系ＩＣＲマウス（ｎ＝８〜１０）に対して行った。従前の研究がＨＣC／Ａ１（Ｗ１２６６Ａ）（ＨＣC／Ａ１W）はボツリヌス中毒のマウスモデルにおいてＨＣC／Ａ１と同等のワクチン効力を示した(Przedpelskiら, 2013)ことから、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wも操作した。０．３μｇ／マウスの一本鎖Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W又は０．２μｇ／マウスのＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１を接種したマウスは、１０6  ＬＤ50の天然ＢｏＮＴ／Ａ１又は１０5  ＬＤ50のＢｏＮＴ／Ａサブタイプカクテル（Ａ２、Ａ３、Ａ５、Ａ６各２．５×１０4  ＬＤ50）による抗原刺激から保護され、１０6  ＬＤ50の、異種サブタイプである天然ＢｏＮＴ／Ａ２による抗原刺激から部分的に保護された（表４）。０．１μｇ／マウスのＨＣC／Ａ１Wを接種したマウスは、１０3  ＬＤ50の天然ＢｏＮＴ／Ａ１又は天然ＢｏＮＴ／Ａ２による抗原刺激から部分的に保護された。これらのデータは、等モル用量で、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１WワクチンとＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１ワクチンは、ＨＣC／Ａ１Wワクチンよりも１，０００倍の毒素に対する保護を示したことを示す。体重等価用量を用いたワクチンの比較では、０．３μｇ／マウスのＨＣC／Ａ１Wを接種したマウスは１０5  ＬＤ50の天然ＢｏＮＴ／Ａ１又は１０5  ＬＤ50の天然ＢｏＮＴ／Ａサブタイプカクテルによる抗原刺激から部分的に保護された。このことは、等濃度（及び３倍モル過剰のＨＣC）であっても、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wワクチン及びＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１ワクチンは、同種及び異種ＢｏＮＴ／Ａ抗原刺激に対してより良好に保護を示したことを示す。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１WワクチンとＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１ワクチンの保護に差は見られず、付加的な「受容体結合」突然変異はワクチン効力に影響を及ぼさないことを示す。全体的にみれば、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W及びＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１は、ＨＣC／Ａ１Wよりも強力なワクチンであった。培養ニューロンにおける作用の持続期間をヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて、ニューロンをＢｏＮＴ／Ａ１又はＢｏＮＴ／Ａ６いずれかの連続希釈液に７２時間曝した後に細胞外毒素を完全に除去し、培養培地中で更にインキュベーションを行うことによって更に検討した。３、３９、及び７０日目に細胞を各希釈系とともに３反復で採取し、各時点のＳＮＡＰ−２５切断に対するＥＣ50を決定した。ＢｏＮＴ／Ａ６では、ＥＣ50値は、３、３９、及び７０日目でそれぞれ約０．０４、０．７、及び１Ｕ／５０μｌ／ウェル（３２、５６０、及び８００ｆＭ）であった（図２）。ＢｏＮＴ／Ａ１では、ＥＣ50値は、３、３９、及び７０日目で約０．７、６．３、及び２８Ｕ／５０μｌ／ウェル（それぞれ３１３、２９４０、及び１２，８８０ｆＭ）であった（図２）。これらのｈｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ１及び／Ａ６の半減期は、ＥＣ50値から経時的に決定した場合、ＢｏＮＴ／Ａ１及び／Ａ６の両方で同等であり、それぞれおよそ１２日及び１４日であった（図２）。これらの結果を考え合わせると、ＢｏＮＴ／Ａ６は他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと同様に作用持続期間が長いことを示す。
【００７５】
ＢｏＮＴ接種に対する抗体応答は非近交系マウスにおいて質的及び量的に変動した
Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W及びＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１のワクチン接種は、１０5  ＬＤ50のＢｏＮＴ／Ａ２による抗原刺激に対して完全な保護を、又、１０6  ＬＤ50の、異種サブタイプである天然ＢｏＮＴ／Ａ２による抗原刺激に対して部分的保護をもたらした（表５）。ＥＬＩＳＡにより分析したワクチン接種マウスの抗体応答は、天然ＢｏＮＴ／Ａ２抗原刺激から生き残ったマウスも生き残らなかったマウスもＢｏＮＴ及びＬＣＨＣNに対して同等の優勢な抗体力価を有したことを示し、これらに統計的な差はなかった（図２）。よって、天然ＢｏＮＴ／Ａ２抗原刺激からの部分的保護は、送達されたワクチンに対して免疫応答を惹起するワクチン接種マウスの能力ではなく、ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ間の中和エピトープの組成物における特定の違いによるものであると思われる。
【表５】
2021506824.tif 000007
【００７６】
ワクチン接種マウスの抗体応答は、ＬＣＡ１RY、ＨＣC／Ａ１W、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１、又はＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１ホロ毒素を結合基質として用い、個々の血清のＥＬＩＳＡにより分析した。ワクチン接種マウスの各群内の抗体応答は、群内で量的及び質的に変動があった。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種マウス（図３、左下）は、ＢｏＮＴ（平均力価２．２（範囲１．３〜２．６））及びＬＣＨＣN（平均力価１．７（範囲０．８〜２．４））に対して優勢な抗体力価を示した。ＨＣCに対する力価は、マウス間で変動があった（平均力価０．４１（範囲０．０７〜１．８３））。ＬＣに対する力価は対照を上回らず、抗体応答のほとんどがＨＣに対するものであったことを示す。力価範囲の変動は、ＥＬＩＳＡ反復のばらつきによるものではなく、個々のマウス間の抗体力価の変動によるものであった。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１接種に対しても同様の免疫応答が見られた（データは示されていない）。Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１接種マウス（図３、左上）もまた、ＢｏＮＴ及びＬＣＨＣNに対して優勢な抗体力価を示したが、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種マウスよりも平均して低い力価であった。Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１＋ＨＣC／Ａ１W接種マウスは、質的にはＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種マウス同様の抗体力価特性を示したが、量的には、それらはＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１単独を接種したマウスに匹敵した（図７）。ＨＣC／Ａ１W接種マウスは、ＨＣCに対して、ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激に対する生き残りに相関した抗体力価を示した（図３、右下）。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種マウスはＴｅＮＴRYに対して限定された抗体力価を有し（図３）、このことは、見られた抗体応答がＢｏＮＴ特異的であったことを示す。
【００７７】
ＢｏＮＴ抗原刺激から生き残った個々のワクチン接種マウス由来の血清の特性
天然ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残ったＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１W、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１、又はＨＣC／Ａ１W接種マウス由来の個々の血清の分析は、ワクチン接種に対するいくつかの代表的免疫応答を示した（図４）。本発明者らの初期の研究(Przedpelskiら, 2013 Infect Immun. 81(7):2638-44)では、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１接種に対する抗体応答の特性決定は行わなかったので、３個体のＬＣＨＣN／Ａ１接種マウス由来の血清を分析した。ＥＬＩＳＡ結果は、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種マウスは、ＢｏＮＴ及びＬＣＨＣN（＃７）又はＢｏＮＴ、ＬＣＨＣN、及びＨＣC（マウス＃３）に対して優勢な抗体力価を有したことを示した。Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１接種マウスは、ＢｏＮＴ及びＬＣＨＣNに対して優勢な抗体応答を示し（マウス＃２１、＃２４、及び＃２５）、一方、ＨＣC／Ａ１Wを接種し、且つ、ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残ったマウスは、ＨＣCに対して優勢な抗体応答を示した（マウス＃７８）。全体的に見れば、ＴｅＮＴRYに対する抗体応答は低く、このことは、ＥＬＩＳＡで検出された免疫反応性はＢｏＮＴ特異的であったことを示す。
【００７８】
ＢｏＮＴ／Ａ及びＨＣCワクチンはＬＣＨＣNワクチンよりも強い中和抗体応答を惹起する
ワクチン接種マウスの血清中の中和抗体は、ｈｉＰＳＣ由来ニューロンを用いた細胞系アッセイにより測定した。等モルのワクチンを接種した各ワクチン接種群から１０検体の血清をプールし、細胞系アッセイで、ＢｏＮＴ／Ａ１により誘導されたＳＮＡＰ２５の切断を中和するそれらの能力を試験した。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種プールはＩＣ50値０．００４で、最も中和効力が高く、これはＨＣC／Ａ１W接種プール及びＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１＋ＨＣC／Ａ１W接種プールの約２分の１で、Ｍ−ＬＣＨＣN／Ａ１接種プールの約５分の１であった（データは示されていない）。このＨＣC接種マウスとＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１接種マウスにおける中和抗体力価の類似性は、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１ワクチンがＨＣｃワクチンの１，０００倍を超える毒素刺激からマウスを保護したことを考えれば、著しいものであった。このことを更に検討するために、細胞系アッセイで、６検体の各個の血清の、ＳＮＡＰ２５のＢｏＮＴ／Ａ１切断を中和する能力も決定した（図５）。全体的に見れば、６検体の血清のそれぞれはＢｏＮＴ／Ａ１作用を中和し、血清効力の差は約１０倍であった。ＨＣCに対して優勢な抗体応答を含んだＨＣC／Ａ１W接種（マウス＃７８）及びＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１W接種（マウス＃３）からの血清（図４）は、ＳＮＡＰ−２５のＢｏＮＴ／Ａ１切断の最も極力な阻害剤であった。検出可能なＨＣC抗体応答のない血清（マウス＃７、＃２１、＃２４、及び＃２５）は、ＳＮＡＰ−２５切断の阻害においてあまり効果がなかった。よって、このアッセイでは、ＨＣｃエピトープを含むワクチンが、ＬＣＨＣNワクチンよりも大きな「中和／阻止抗体」応答を惹起した。これらのデータを考え合わせると、ＢｏＮＴ／Ａ１のＨＣCドメインはＨＣNドメイン又はＬＣドメインよりも強い中和／阻止抗体応答を惹起するが、このＨＣNドメイン及びおそらくはＬＣドメインが生体防御に主要な役割を果たすことを示す。
【００７９】
考察
ボツリヌス中毒の非近交系マウスモデルにおいて、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１W及びＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１はＨＣC／Ａ１Wよりも極力なワクチンであった。ＢｏＮＴ／Ａ１抗原刺激から生き残ったワクチン接種マウス由来の血清の評価は、ＬＣＨＣN内の中和エピトープの存在と一致するＬＣＨＣNに対する共通の応答を示した。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１に対して同様の防御免疫応答を惹起するＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wの能力は、宿主細胞結合の低減がワクチンの有効性に悪影響を及ぼさなかったことを示した。よって、触媒ドメインと受容体結合ドメインの両方に欠陥を有するように操作された全長ＢｏＮＴは、ボツリヌス中毒及びその他の毒素により媒介される疾患に対するワクチンの開発の新規なプラットフォーム戦略といえる。Ｃｏｌｌｉｅｒ及び共同研究者らは(Killeenら, 1992)は、ワクチン開発の試験として遺伝的に不活化したジフテリア毒素を部分的に復帰した第２の部位の突然変異を作出できることを示した。加えて、Ｓｍｉｔｈ及び共同研究者らによる最近の研究では、ＢｏＮＴに基づくワクチンのいくつかの血清型に対する単に触媒作用の低減以上の弱毒の必要が示されている(Webbら, 2017)。
【００８０】
初期の研究では、ＬＣＨＣNは、ＢｏＮＴワクチン候補とされていた(Shoneら, 2009)。ＬＣＨＣNは、発酵により大腸菌によって大量に生産され、低用量ＢｏＮＴ抗原刺激（１０3  ＬＤ50のＢｏＮＴ）に対する単回ワクチンとして有効であった。この報告では、本発明者らは、初回免疫と１回の追加免疫を用いた他のＢｏＮＴワクチン候補との直接比較によりＬＣＨＣNが有効なワクチンであることを認め、ＬＣＨＣN内に中和エピトープの存在を確認した(Shoneら, 2009)。Ｄｏｌｌｙ及び共同研究者らは、ＢｏＮＴ／Ａ作用を妨げたＬＣ特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を同定し(Cenci Di Belloら, 1994)、一方、Ｍａｒｋｓ及び共同研究者らは、ＳＮＡＲＥ切断を阻害したＬＣ機能を有するＢｏＮＴ／Ａ中和ｍＡｂ(Chengら, 2009)及びＨＣNを標的とし、いくつかのＢｏＮＴ血清型を中和したｍＡｂ(Garcia-Rodriguezら, 2011)を同定した。これらの研究を考え合わせると、ＢｏＮＴ接種はＬＣＨＣNドメイン内の中和エピトープに対する抗体の生産を惹起することが示される。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１WはＭ−ＬＣＨＣN／Ａ１より大きい抗体応答を惹起したことから（図７）、ＨＣCが培養細胞で最大の中和／遮断能を有する抗体を産生したという決定も伴って、Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１WなどのＨＣCを含むワクチンが、ＬＣＨＣN又はＨＣCワクチン誘導体よりも、「高用量」曝露下でより高い防御があると思われる。
【００８１】
ＨＣC、ＤＮＡベクター及びウイルスベクターを用いたボツリヌス中毒に対するワクチン、並びにＨＣCの中和効力(Claytonら, 1995)及び生産の容易さ(Baldwinら, 2008)が示されている初期の研究で構築されたタンパク質に基づくワクチンを開発するために定評のあるドメインである。Ｓｍｉｔｈ及び共同研究者らは酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）でＨＣCを発現させ、ＨＣ（ｃ）により惹起された防御免疫(Byrne及びSmith, 2000)、及び次に組換えＨＣC／Ａ及びＨＣC／Ｂ（ｒＢＶ  Ａ／Ｂ）から構成される二価ワクチンを報告し、このワクチンは現在臨床試験中である(Webb及びSmith, 2013)。大腸菌も、ＢｏＮＴ抗原刺激に対する７つの血清型（Ａ〜Ｇ）のＨＣCワクチンの生産を含むＢｏＮＴワクチン開発のための異種宿主として使用されている(Baldwinら, 2008)。ワクチン効力を高めるために、ＨＣCに宿主の受容体結合を遮断する突然変異を導入し、ここでＨＣCWはワクチン効力を保持していた(Przedpelskiら, 2013)。生産の容易さはＨＣCを魅力的なワクチンプラットフォームとするが、現在の研究はＨＣC／Ａ１WよりもＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wの方が強力なワクチンであったことを示している。このことは、ＢｏＮＴのＬＣＨＣNの免疫原性と一致しているＢｏＮＴ療法に耐性のある頸部ジストニア患者由来のヒト血清を用い、ＬＣ及びＨＣN内の免疫エピトープを検出したＡｔａｓｓｉ及び共同研究者らの所見(Atassiら, 2011; Dolimbekら, 2007)によって裏づけられる。
【００８２】
Ｓｍｉｔｈ及び共同研究者ら(Webbら, 2017)による最近の研究で、触媒的に不活性のＢｏＮＴは、単回接種の後の１０００ＬＤ50の毒素投与による抗原刺激に対して対応するＨＣCよりも大きな効力を示したことを報告した。Ｓｍｉｔｈ共同研究者らによって記載されている抗原刺激試験では閾値毒素刺激を測定し、これはエンドポイントの毒素刺激に対する防御を測定する現行の試験とは異なっていた。このデータは、閾値又はエンドポイントのいずれによるものであれ毒素刺激に対する防御を測定する両場合において、全長ＢｏＮＴワクチンはそれらの個々のＨＣCサブユニットよりも強力であった。触媒作用及び宿主受容体結合に欠陥があるＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wは、エンドポイント毒素刺激において、サブユニットよりも有効であった。細胞結合又は侵入による潜在的毒性を低減するために複数の機能的部位を不活化することで、ワクチン候補としてのＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wの有用性は、触媒機能だけの遺伝的不活化では全長ＢｏＮＴのワクチン開発の安全性の十分な余地をとることができない(Webbら, 2017)という懸念に取り組む。
【００８３】
ボツリヌス中毒に対するワクチン候補としてのＨＣCの有用性は確立されているが(Baldwinら, 2008; Henderson, 2006)、現在の研究では、ＢｏＮＴのマルチドメイン誘導体の方がＨＣCよりも強力なワクチンであることを示している。Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wは、非近交系マウスにおいて、ＬＣＨＣNに対して共通の優勢な抗体応答を惹起したが、ＨＣC抗体応答には変動があった。触媒作用と受容体結合の両方を低減できるということは、ボツリヌス中毒に対するワクチンプラットフォームとしてのＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wの使用の裏付けとなる。ＢｏＮＴ／Ａサブタイプカクテルからの保護は、このワクチンの広範な中和能を確実なものとする。この研究でワクチンとして使用されたＭ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wは、活性化型の二本鎖形態に加工されず、マウス又は細胞において毒性は検出されなかったが、このことは安全で有効なワクチンとしての一本鎖Ｍ−ＢｏＮＴ／Ａ１Wを示唆する。
【００８４】
実施例２−リシン７６８  ＴｅＮＴ変異体において障害された軽鎖移行の特性決定
この節は、軽鎖（ＬＣ）移行を遮断したＴＴの移行ドメイン内の一アミノ酸点突然変異の初めての同定及び特性決定を記載する。ＬＣ移行におけるＫ７６８の役割の特定により、組換えワクチンの開発のためにＴＴ、及び類似によればＢＴの独立した活性（表６参照）、触媒作用、移行、並びに受容体結合を不活化する機会を初めて提供される。
【００８５】
破傷風菌毒素を用い、本発明者らは最近、移行ドメイン内にコードされている軽鎖（ＬＣ）移行の律速段階を特定した。リシン（Ｋ）７６８は、２つの長いα−ヘリックス（ヘリックス１２−１３とヘリックス１６−１７）を連結するループ内に位置する。部位特異的突然変異誘発により、移行ドメインの２つの長いα−ヘリックスを接続するループ内に位置する、移行を阻害した点突然変異Ｋ７６８Ａを特定した（図１２）。細胞研究は、Ｍ−ＴＴ（Ｋ７６８Ａ）がニューロン膜に結合しなかったことを示し、これは膜透過におけるループの役割を裏づける。対照実験は、Ｋ７６８Ａ突然変異は宿主細胞においてＴＴの結合、侵入、輸送、又は膜孔形成を阻害せず、且つ、トリプシンによる軽鎖（ＬＣ）−重鎖（ＨＣ）の好ましい切断も阻害しなかったことを示し、このことはこの突然変異がＭ−ＴＴ構造全体を障害しなかったことを示し、又、軽鎖移行におけるこのループの直接的役割を暗に示す。他の実験では、Ｋ７６８はｐＨ誘因の成分ではなかったことが示された。これは軽鎖移行に必要とされる移行ドメイン内の一アミノ酸であり、毒素−膜相互作用における２つの長いα−ヘリックス（ヘリックス１２−１３及びヘリックス１６−１７）の役割を暗に示す。他の実験では、Ｄ７６７Ａ／Ｅ７６９Ａ突然変異も破傷風菌毒素において移行欠陥をもたらしたことを示し、破傷風菌毒素においてＬＣ移行を阻害するためにＤ７６７／Ｅ７６９をＫ７６８に捕足及び／又は付加するものとした。
【００８６】
ボツリヌス菌毒素（ＢＴ）（表６参照）及びＴＴワクチン候補中に独立した突然変異を作出することで毒素作用の３つの機能：触媒作用、移行、及び受容体結合のそれぞれを不活化し、従ってワクチンの安全性が高まる。複数の独立した突然変異は毒素効力を指数関数的に低減し、タンパク質構造及び恐らくは免疫原性を障害せずにワクチンの安全性を高め、大規模生産中の復帰の可能性を軽減する。
【表６】
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【００８７】
実施例３−低用量防御ワクチンとしての操作されたＭ−破傷風菌毒素（Ｍ−ＴＴ）
ＢＴと同様の構成の破傷風菌毒素（ＴＴ）は、Ｎ末端ドメイン（触媒軽鎖、ＬＣ）及びＣ末端ドメイン（移行及び受容体結合重鎖、ＨＣ）を含むＡＢ毒素である。ＴＴのＺｎ++結合ポケット内の２つのアミノ酸の突然変異（Ｒ３７２Ａ、Ｙ３７５Ｆ）は、Ｚｎ++結合を阻害し、天然破傷風菌毒素の１２５，０００分の１に毒性を低減した２Ｍ−ＴＴをもたらした。２Ｍ−ＴＴのアミノ酸配列は配列番号２として示され、ヌクレオチド配列は配列番号３として示される。毒性を更に低減するための予備実験で、Ｚｎ++結合の阻害の程度を増すために、Ｅ２３４が、Ｚｎ++結合に直接配位するＨ２３３を安定化することに基づいて付加的突然変異（Ｅ２３４Ｑ）を付加した。次に、二重のガングリオシド受容体結合へのニューロン結合(neuron binding to dual ganglioside receptor binding)を２つの独立した突然変異（Ｒ１２２６Ｌ、Ｗ１２８９Ａ）を作出することにより阻害して５Ｍ−ＴＴを作出した（表７参照）。原理証明として、本発明者らは、ＬＣ移行を阻害するために付加的突然変異（Ｋ７６８Ａ）を有するように６Ｍ−ＴＴを操作した（図１４）。６Ｍ−ＴＴは、破傷風菌毒素機能：触媒作用、移行、及び受容体結合のそれぞれに突然変異を含む。６Ｍ−ＴＴは、約６ｍｇ／リットルのバッチ培養で大腸菌から精製した。２０μｇの一本鎖又は二本鎖６Ｍ−ＴＴをそれぞれ注射した４個体のマウスは、破傷風の症状を示さなかった。よって、６Ｍ−ＴＴは、可溶性の、十分に発現される、非毒性のタンパク質である。
【表７】
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【００８８】
６Ｍ−ＴＴは、Ｙ２６及びＬ２３１の位置に突然変異を導入することにより、ＶＡＭＰ−２の結合及び切断を連続的に阻害するように更に操作され、７Ｍ−ＴＴ及び８Ｍ−ＴＴが作出される。Ｌ２３１は、この突然変異はＶＡＭＰ−２親和性に影響を及ぼさずにｋｃａｔを低下させたことを示した初期の研究に基づき、又、Ｌ２３１Ｋ突然変異はＬＣの構造全体に影響を及ぼさなかった9ことから選択した。Ｙ２６は、ＨＣＲ／ＴのＳ７ポケット内の位置及びＹ２６Ａ突然変異がＶＡＭＰ−２に対するＬＣ／Ｔの親和性を低下させた9という証拠に基づいて選択した（表７参照）。８Ｍ−ＴＴ及び中間生成物（６Ｍ−ＴＴ、及び７Ｍ−ＴＴ）に関して、二次構造を評価するために円偏光二色性を調べ、タンパク質全体の安定性を評価するためにトリプシン感受性を調べ、及びタンパク質組成を評価するために質量分析を行う42。
本発明者らにはこの段階で６Ｍ−ＴＴが可溶性タンパク質として生産され、発現が高く、マウスにおいて２０μｇの注射で非毒性であるという知見があるので、まず、６Ｍ−ＴＴ、７Ｍ−ＴＴ、及び８Ｍ−ＴＴの毒性を、細胞侵入後のＶＡＭＰ−２切断並びに細胞溶解液中のＶＡＭＰ−２切断を分析する64ヒト神経細胞に基づくアッセイで評価する。切断又は細胞傷害性が無いことが検出されれば、非近交系雌ＩＣＲマウス（１８〜２２ｇ、マウス５個体／群）を用い、マウスモデルでｉｎ  ｖｉｖｏ毒性が無いことが確認される（表８）。
【表８】
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【００８９】
最初の試験で、マウスの腹膜内にマウス当たり２０、５０、２５０、又は１０００μｇの８Ｍ−ＴＴ（質量１０００μｇは約４×１０7  ＬＤ50の野生型破傷風菌毒素に相当する）を注射する65。注射したマウスについてマウス生物検定で３日間生存スコアをとり、無体重増、ストレス徴候、臓器損傷、及び破傷風症状を含むＴＴ病理を示す症状に関して最大１４日間観察する。雄マウスも性差に関して試験する。
【００９０】
非近交系雌ＩＣＲマウス（８個体／群）を０．０１〜０．１μｇの最適化Ｍ−ＴＴ又は等量の化学的に不活化した破傷風トキソイドで免疫した後、１４日目に追加のワクチン接種を行う（表９）。２６日目にマウスの採血を行い、３０日目にマウスを１０3〜１０6Ｕの破傷風菌毒素で抗原刺激する。長期保護を調べるために、ワクチン接種マウスを１８０日間維持し、免疫応答の持続期間を試験するためにＴＴで抗原刺激する。３日生存したマウスを保護されたものと評価する。抗原刺激前に得た血清を従前に記載されたように6ＥＬＩＳＡにより抗ＴＴに関して、又、ＶＡＭＰ−２切断の阻害として71-72培養ニューロンの破傷風菌毒素中毒に対する中和効力に関して試験する。雄マウスも性差がないことを確認するために試験する。
【表９】
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【００９１】
本発明者らは、導入された独立した各ＬＣ点突然変異は触媒作用の独立した工程を阻害することから、これらのＬＣ突然変異は触媒活性に倍数的低下を示し、それを反映してＭ−ＴＴ毒性効力に低下を示すことを期待する。本発明者らは、これらのＬＣ又はＨＣ突然変異は、ＬＣ−ＴＴ又はＨＣ−ＴＴにおける個々の突然変異としてのそれらの効果に関する初期の研究に基づけばタンパク質の安定性又は免疫原性に影響を及ぼすとは思わない。１０００μｇの８Ｍ−ＴＴの注射は本発明者らのマウスモデルでは毒性があるとは思えず、８Ｍ−ＴＴは、化学的に不活化されたＴＴよりも高い中和免疫応答を有すると思われ、８Ｍ−ＴＴでは低用量の免疫誘導が可能となる。
【００９２】
最近の総説では、現行のコンジュゲートワクチンの潜在的免疫誘導効力の一部が達成されたに過ぎないと評価されている4。微生物病原体の研究では、有効なＴ細胞依存性免疫応答を生じるためにタンパク質トキソイドとのコンジュゲーションを要するさらなる免疫原が同定され続けている。これらには、限定されるものではないが、髄膜炎菌15、真菌16、及び肺炎球菌17-18の莢膜が含まれる。加えて、合成グリカンは、純度及び含量に変動のある天然多糖に基づくワクチンの有望な将来的代替となる20-22。破傷風トキソイドは、多糖のための免疫原性担体タンパク質である23。破傷風菌毒素は、ＴＴ構造−機能特性についての本発明者らの知見及び化学的に不活化されたトキソイドとしての破傷風菌毒素の基礎情報、並びに破傷風ワクチン接種の継続した世界的需要に基づけば、これらの次世代組換えコンジュゲートワクチンを開発するための最良の候補の中にある。安全で、生産が容易で、且つ、防御的組換えＴＴワクチンの生産は、初めて、コンジュゲートワクチン担体としての全長無毒（非毒性）の組換えＴＴの分析を可能とする。現在、破傷風トキソイドを含め、コンジュゲートワクチン担体の防御特性に関する知見はない73。無毒な組換えＭ−ＴＴは、化学的に不活化されたＴＴに対してＭ−ＴＴにコンジュゲートされた場合の抗原に対する免疫応答の増強を測定するためのいくつかの慣用抗原の担体として使用することができる。
【００９３】
Ｍ−ＴＴにオリゴ糖をコンジュゲートするためのプロトコールは、Ｌｅｅｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの公開プロトコール74に従う。簡単に述べれば、ＬＶ−１マイクロフルイダイザーを用いて多糖（ＰＳ）を分子量１００〜３００ｋＤａまで縮小する。ＰＳを水中５ｍｇ／ｍｌで調製し、１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ、０．５ｍｇ／ｍｇ）で活性化する74。等質量のタンパク質（５ｍｇ／ｍｌ）を加え、溶液をｐＨ９に維持する。反応をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣによりモニタリングし、過剰量のグリシンで急冷する。コンジュゲートをＳＥＣにより精製し、分子量をＳＥＣ多角度光散乱により決定する。認証された多糖及びペプチドを８Ｍ−ＴＴと架橋する：（ｉ）Ｂ群連鎖球菌属（ＧＢＳ）多糖血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＩＶ；（２）肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、及びセパシア菌群(Burkholderia cepacia complex)（ＢＣＣ）の候補広域ワクチンとしてバイオフィルムの形成を媒介するポリ−β−（１−６）−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＰＮＡＧ）45；（３）インフルエンザワクチンで現在試験中のペプチド。
【００９４】
非近交系雌ＩＣＲマウス（８個体／群）を０．０１〜０．１μｇのコンジュゲートされた最適化Ｍ−ＴＴ又は等量の化学的に不活化した破傷風トキソイドで免疫した後、１４日目に追加のワクチン接種を行う（表１０）。２６日目にマウスの採血を行い、３０日目にマウスを１０3〜１０6Ｕの破傷風菌毒素で抗原刺激する。長期保護を調べるために、ワクチン接種マウスを１８０日間維持し、免疫応答の持続期間を試験するためにＴＴで抗原刺激する。３日生存したマウスを保護されたものと評価する。抗原刺激前に得た血清を従前に記載されたように6 74ＥＬＩＳＡにより抗コンジュゲート及び抗ＴＴに関して試験する。雄マウスも性差に関して試験する。
【表１０】
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【００９５】
ＰＮＡＧオリゴ糖、ＧＢＳ多糖、及びインフルエンザペプチドを８Ｍ−ＴＴワクチンに個々にコンジュゲートする。続いての実験で、ＧＢＳとＰＮＡＧを組み合わせて多重多糖コンジュゲート８Ｍ−ＴＴワクチンを作出する。次に、インフルエンザペプチド及びＰＮＡＧを組み合わせて多重ペプチド−多糖コンジュゲート８Ｍ−ＴＴワクチンを作製する。これらの実験はワクチン担体としての８Ｍ−ＴＴの可能性を試験する。
【００９６】
個々のコンジュゲートワクチン、ＰＮＡＧ−８Ｍ−ＴＴ、ＧＢＳ−８Ｍ−ＴＴ、及びペプチド−８Ｍ−ＴＴは、そのコンジュゲートに対して同等の免疫応答を惹起し、ＴＴに対しては各コンジュゲート化学不活化ＴＴワクチンよりも強い免疫応答を惹起すると思われる。本発明者らはまた、８Ｍ−ＴＴワクチン内の多糖及びペプチドに対する免疫応答が個々の抗原が８Ｍ−ＴＴにコンジュゲートされた場合と同等の免疫応答を惹起すると予想する。本発明者らは、８Ｍ−ＴＴに対する免疫応答が天然ＴＴ抗原刺激に対する防御と相関すると予想する。
【００９７】
参照文献
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【００９８】
上記の説明、添付図面及びそれらの説明は例示を意図し、本発明を限定するものではないことに留意されたい。本発明の多くの主題及び変形が当業者に、又、本開示に鑑みて示唆されるであろう。このような主題及び変形は全てその企図の範囲内にある。例えば、本発明は上記に概略を示した種々の例示的実施形態に関して説明してきたが、種々の代替、改変、変形、改良、及び／又は実質的等価物は、既知であれ、希少であれ、又は現在予期されないものであれ、少なくとも当技術分野の通常の技術を持つ者には明らかとなろう。種々の変更が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行える。よって、本発明はこれらの例示的実施形態の全ての既知の又は今後開発される代替、改変、変形、改良、及び／又は実質的等価物を包含するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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