(57)【要約】  本開示は、臓器における線維症に罹患している患者にｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤を投与して、病的な線維症を解消することを含む、臓器の線維症を治療する方法を提供する。ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、エアロゾル状態におけるネブライザー、静脈内、腹腔内または皮下注射を使用することを含む、様々な経路で投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのような治療を必要とする患者における臓器の線維症を治療する方法であって、有効量のコラーゲンプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（ｃ−Ｐ４Ｈ）阻害剤を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
臓器は、肺、腎臓および肝臓からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、断続的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、１日おき、３日ごと、５日ごと、または週１回投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、６時間ごと、または１２時間ごとに投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、またはエアロゾル化送達によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、小分子阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｃ−Ｐ４Ｈの小分子阻害剤は、プロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ）阻害剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＨＤ阻害剤は、ｃ−Ｐ４Ｈの活性を特異的に阻害する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＨＤ阻害剤は、ロキサデュスタット（ＲＸＤ）（ＦＧ−４５９２）、バダダスタット（ＡＫＢ−６５４８）、ダプロダスタット（ＧＳＫ−１２７８８６３）、およびモリダスタット（ＢＡＹ  ８５−３９３４）からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＨＤ阻害剤は、以下の化学構造：
【化１】
2021510175.tif 000008
（式中、Ｒ１は、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリールオキシ、および置換アリールオキシからなる群から選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から独立して選択されるか；またはＲ２およびＲ３は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、または置換ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ４は、水素、アルキル、および置換アルキルからなる群から選択され；
Ｒ５は、ヒドロキシル、アルコキシ、および置換アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ６は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アミノアシル、置換アミノアシル、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アリールオキシ、および置換アリールオキシからなる群から独立して選択される）を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ６はアルキルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルキルはメチルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ５はヒドロキシルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ８はアリールオキシである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ６はメチルであり、Ｒ５はヒドロキシルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＨＤ阻害剤は、ＦＧ−４５９２であり、該ＦＧ−４５９２は、化学名Ｎ−［（４−ヒドロキシ−１−メチル−７−フェノキシイソキノリン−３−イル）カルボニル］グリシンおよび以下の化学構造：
【化２】
2021510175.tif 000009
を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＨＤ阻害剤は、０．２ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間の量で投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＨＤ阻害剤は、５０ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの間の量で投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＨＤ阻害剤は、２−オキソグルタル酸アナログである、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
２−オキソグルタル酸アナログは、ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）であり、該ＤＭＯＧは、化学名Ｎ−（２−メトキシ−２−オキサオアセチル）グリシンメチルエステル）および以下の化学構造：
【化３】
2021510175.tif 000010
を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＭＯＧは、５０ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの間の量で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｃ−Ｐ４Ｈ酵素の活性の阻害は、核酸阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＴＡＬＥＮシステム、および相同組換えの導入からなる群から選択される方法によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
核酸阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡｉマイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
細胞内で機能する調節領域に動作可能に連結された、ｃ−Ｐ４Ｈ遺伝子の発現の核酸阻害剤に転写されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、核酸は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡｉマイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される、前記発現ベクター。
【請求項２６】
調節領域は、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは臓器特異的プロモーターを含む、請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
臓器特異的プロモーターは肺特異的プロモーター、腎臓特異的プロモーター、および肝臓特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項２６に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月９日に提出された米国仮出願第６２／６１５，１７０号、および２０１８年７月１７日に提出された米国仮出願第６２／６９９，４２４号の優先権の利益を主張し、その全ての内容は参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
線維症は先進国における死亡のおよそ４５％に寄与すると推定されている。細胞外マトリックス、特に線維性コラーゲンの異常または過剰な蓄積として定義される線維症は、特発性肺線維症、肝疾患、腎疾患を含む多くの炎症性および代謝性疾患における進行性臓器機能障害の主要な駆動力である。これらの状態の治療は不十分のままである。効果的な治療法はほとんどなく、線維形成を特異的に標的とする治療法はさらにない。これは、線維形成の病因のより深い理解の必要性、および新規治療へのこの知識の翻訳の必要性を強調する。
【０００３】
肺線維症は、肺組織の瘢痕であり、２００種を超える肺疾患の大きなグループに属する特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺間質の関与を特徴とし、高齢者に発生する原因不明の慢性で進行性の不可逆的線維化性間質性肺炎の特定の形態として定義される。米国では、１０万人が特発性肺線維症と共に生活しており、６５歳以上の４２０００人を超える人々が毎年ＩＰＦと診断されている。呼吸困難および肺機能の進行性悪化として臨床経過が記載され、予後不良と関連している。治療選択肢は、疾患の進行の停止と症状および臓器機能を改善するための酸素補給に限定されている。ＩＰＦの臨床経過には、しばしば入院を伴う急性増悪が含まれる。
【０００４】
炎症は、肺における線維症の発症の中心であり、マスト細胞を含む炎症細胞は、肺線維症に豊富に見られる。臨床的には、肺線維症の重症度とマスト細胞数との相関関係は十分に立証されている。肺線維症のマウスモデルにおける以前の研究では、マスト細胞は病理学的コラーゲン沈着に重要な寄与を果たすことが示されている。肺においては、マスト細胞は、コラーゲンの合成と分泌に関与する細胞である線維芽細胞に密接に並置されるように見出される。マスト細胞メディエーターは線維形成性であり、ヒト肺線維芽細胞のコラーゲン合成を刺激する。
【０００５】
コラーゲンの成熟した三重らせん型へのアセンブリには、プロコラーゲンにおけるプロリン残基のヒドロキシプロリンへの変換であるプロリルヒドロキシル化が必要である。コラーゲンプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（ｃ−Ｐ４Ｈｓ）は、プロリルヒドロキシル化に関与する酵素である。Ｃ−Ｐ４Ｈ酵素は、活性部位にＦｅ（ＩＩ）原子を有し、共基質として酸素と２−ＯＧを必要とする２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）依存性ジオキシゲナーゼのスーパーファミリーのメンバーである。ｃ−Ｐ４Ｈ酵素の触媒活性型は、コラーゲンにおけるヒドロキシプロリンの翻訳後形成を触媒するα−２  β−２四量体である。
【０００６】
プロリル４−ヒドロキシラーゼの別のグループは、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）に関連するプロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ）酵素である。ＨＩＦ  ＰＨＤ酵素はｃ−Ｐ４Ｈと構造的に関連しており、２−ＯＧ依存性ジオキシゲナーゼのスーパーファミリーにも属している。２−ＯＧと構造的に類似している競合阻害剤として機能するＨＩＦ  ＰＨＤ拮抗薬の複数の例がある。これらの阻害剤は、２番目の酸素がトランス−４−ヒドロキシプロリンを形成する際に、分子状の２個の酸素から１個の酸素を受け入れてコハク酸になる補因子である２−ＯＧの競合的拮抗薬として働く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一態様では、本開示は、有効量のコラーゲンプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（ｃ−Ｐ４Ｈ）阻害剤を患者に投与することを含む、そのような治療を必要とする患者の臓器の線維症を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、臓器は、肺、腎臓および肝臓からなる群から選択される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、断続的に投与される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、１日おき、３日ごと、５日ごと、または週１回投与される。いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、６時間ごと、または１２時間ごとに投与される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、またはエアロゾル化送達によって投与される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、小分子阻害剤である。いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈの小分子阻害剤は、プロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ）阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、ｃ−Ｐ４Ｈの活性を特異的に阻害する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、ロキサデュスタット（Ｒｏｘａｄｕｓｔａｔ）（ＲＸＤ）（ＦＧ−４５９２）、バダダスタット（Ｖａｄａｄｕｓｔａｔ）（ＡＫＢ−６５４８）、ダプロダスタット（Ｄａｐｒｏｄｕｓｔａｔ）（ＧＳＫ−１２７８８６３）、およびモリダスタット（Ｍｏｌｉｄｕｓｔａｔ）（ＢＡＹ  ８５−３９３４）からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、以下の化学構造を有する：
【化１】
2021510175.tif 000002
式中：Ｒ１は、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリールオキシ、および置換アリールオキシからなる群から選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から独立して選択されるか；またはＲ２およびＲ３は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、または置換ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ４は、水素、アルキル、および置換アルキルからなる群から選択され；
Ｒ５は、ヒドロキシル、アルコキシ、および置換アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ６は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アリールオキシ（ａｒｙｌｏｚｙ）、置換アリールオキシ（ａｒｙｌｏｚｙ）、アミノアシル、置換アミノアシル、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アリールオキシ、および置換アリールオキシからなる群から独立して選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｒ６はアルキルである。別の実施形態では、Ｒ６のアルキルはメチルである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｒ５はヒドロキシルである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｒ８はアリールオキシである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｒ６はメチルであり、Ｒ５はヒドロキシルである。
【００１８】
特定の実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、ＦＧ−４５９２であり、ＦＧ−４５９２は、化学名Ｎ−［（４−ヒドロキシ−１−メチル−７−フェノキシイソキノリン−３−イル）カルボニル］グリシン）］および以下の化学構造：
【化２】
2021510175.tif 000003
を有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、０．２ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間の量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、５０ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの間の量で投与される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、２−オキソグルタル酸アナログである。
【００２１】
特定の実施形態では、２−オキソグルタル酸アナログは、ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）であり、前記ＤＭＯＧは、化学名Ｎ−（２−メトキシ−２−オキサオアセチル）グリシンメチルエステル）および以下の化学構造を有する：
【化３】
2021510175.tif 000004
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＤＭＯＧは、５０ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの間の量で投与される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ酵素の活性の阻害は、核酸阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＴＡＬＥＮシステム、および相同組換えの導入からなる群から選択される方法によって達成される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、核酸阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡｉマイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される。
【００２５】
本発明の別の態様は、細胞内で機能する調節領域に動作可能に連結された、ｃ−Ｐ４Ｈ遺伝子の発現の核酸阻害剤に転写されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを対象とし、核酸は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡｉマイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、調節領域は、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは臓器特異的プロモーターを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、臓器特異的プロモーターは、肺特異的プロモーター、腎臓特異的プロモーター、および肝臓特異的プロモーターからなる群から選択される。
【００２８】
特許または出願書面は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願刊行物のコピーは、請求書および必要な手数料の納付に応じて官庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ａ．ヒト肺線維芽細胞は、蛍光色素で標識されたマスト細胞エキソソームを取り込むことを示す図である。線維芽細胞の核は蛍光ＤＡＰＩで標識されている。蛍光シグナルを重ね合わせた透過光の下での６０倍像。Ｂ．線維芽細胞に近接したマスト細胞を示す図である。マスト細胞（ＭＣ）、線維芽細胞（ＦＢ）、コラーゲン（ｃｏｌ）、血管（ｂｖ）間の関係を示す電子顕微鏡写真。７５００倍。Ｃ．エキソソーム（ＥＸＯ）は、ヒト肺線維芽細胞（ＨＬＦ）コラーゲン合成と分泌を誘導することを示す図である。ＨＬＦ細胞をＥＸＯ（４０ｕｇ／ｍｌ）と共培養し、新たに分泌されたコラーゲンを測定するために、２４、４８、および７２時間後に上清を回収した。正規化のため、細胞溶解物を使用して総タンパク質／ウェルを定量した。データは、３つの別々の実験（ｎ＝３）の平均±ＳＥＭであり、各点は三重試行された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２−１】Ａ．ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）がヒト肺線維芽細胞（ＨＬＦ）コラーゲン分泌に及ぼす影響を示す図である。２４、４８、７２時間後のＴＧＦβＲ１阻害剤ＳＢ  ５４３５５４（１ｕＭ）を使用した併用治療±。正規化のため、細胞溶解物を使用して総タンパク質／ウェルを定量した。データは、３つの別々の実験（ｎ＝３）の平均±ＳＥＭであり、各点は三重試行された。＊Ｐ＜０．０５。Ｂ．ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）またはエキソソーム（ＥＸＯ）（４０ｕｇ／ｍｌ）との併用治療の効果を示す図である。±ＴＧＦ−βＲ１阻害。正規化のため、細胞溶解物を使用して総タンパク質／ウェルを定量した。データは、３つの別々の実験（ｎ＝３）の平均±ＳＥＭであり、各点は三重試行された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｃ．リン酸化および非リン酸化Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３、標準的なＴＧＦ−ｂシグナル伝達メディエーターをプローブとしたヒト肺線維芽細胞（ＨＬＦ）ホモジネートのウエスタンブロットを示す図である。ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）またはエキソソーム（ＥＸＯ）（４０ｕｇ／ｍｌ）のいずれかで２４時間処理した後、細胞溶解物を調製した。ＧＡＰＤＨはハウスキーピング遺伝子として使用された。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３−１】Ａ．ＨＩＦ  ＰＨＤ阻害剤であるロキサデュスタット（ＲＸＤ）は、ヒト肺線維芽細胞における、構成的なＴＧＦ−βおよびエキソソーム（ＥＸＯ）誘導ヒト肺線維芽細胞のコラーゲン分泌を減少させることを示す図である。ヒト肺線維芽細胞をＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）に曝露するか、ＥＸＯ（４０μｇ／ｍｌ）と共培養し、新たに分泌されたコラーゲンの測定のために上清を収集した。ＲＸＤは１０μｇ／ｍｌで使用した。正規化のため、細胞溶解物を使用して総タンパク質／ウェルを定量した。データは、３つの別々の実験（ｎ＝３）の平均±ＳＥＭであり、各点は三重試行された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｂ．−Ｅ．ＲＸＤは、ＴＧＦ−βで観察される線維芽細胞の移動／蓄積／病巣を防止することを示す図である。未処理（Ｃｏｎ）（Ｂ）、＋ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｃ）、または＋ＴＧＦ−β＋ＲＸＤ（１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｄ）＆（Ｅ）トランスウェルプレート内のヒト肺線維芽細胞の低倍率の代表的画像。ＲＸＤは、ヒト肺線維芽細胞における平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の存在量を減少させる。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４】ＲＸＤは、コラーゲンＰ４Ｈの触媒活性型であるｃ−Ｐ４Ｈ四量体の相対発現を減少させることを示す図である。ヒト肺線維芽細胞ホモジネートについて、抗αサブユニット単量体（６０ｋＤ）をプローブとして、非変性条件下、勾配ゲルでウエスタンブロッティングを行った。四量体は矢印の２４０ｋＤに見られる。ＲＸＤは、αサブユニット単量体の存在量を全ての場合で増加させた（６０ｋＤバンド）。ＲＸＤは１０ｍｇ／ｍｌで使用した。
【図５−１】ＲＸＤは、インビトロでマスト細胞の酸素補給に応答した脱顆粒を減少させ、その後、室内の空気で回復することを示す図である。７２時間の時点、時間制御（室内空気（ＲＡ））で、Ａ．β−ヘキソサミナダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎａｄａｓｅ）（β−ｈｅｘ）およびＢ．マスト細胞トリプターゼを、マスト細胞上清中で測定した。ＨＯｒｅｃは、２日間の室内空気、その後、１日間の高酸素での回復と定義され、ＨＯｒｅｃ＋ＲＸＤは、細胞を浸す培地中にＰＨＤ阻害剤を添加。ＲＸＤは１０ｍｇ／ｍｌで使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝３実験。Ｃ．インビボで肺線維症に見られるマスト細胞の数の増加は、実験的なブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）マウスモデルにおいてＲＸＤで減少する。＊＊＊Ｐ＜０．００１、生理食塩水対ブレオマイシン処理；＊Ｐ＜０．０５、ｂｌｅｏ  ｖｓ  ｂｌｅｏ＋ＲＸＤ。ＮＳ＝顕著ではない。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】線維芽細胞（ＦＢ）のマスト細胞依存性活性化のモードを描いた図である。
【図７】コラーゲン合成のダイアグラムを示す図である。この図は古典的なリガンド−受容体を介した線維形成経路、および本出願で開示される追加の線維形成経路を図示する。トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）経路は、事実上全ての種類の線維症において重要である。これらの経路は、線維性遺伝子の核転写をもたらし、その後、小胞体（ＥＲ）におけるプレプロコラーゲンの翻訳後修飾が続く。核転写をバイパスし、ＥＲを直接標的とする可能性がある追加の線維形成経路には、本出願で実証されているマスト細胞エキソソームが含まれる。ｃ−Ｐ４Ｈによるプレプロコラーゲンの翻訳後修飾は、コラーゲンの前駆体であるプロコラーゲンを生成する際の律速段階である。
【図８】ヒト線維芽細胞を刺激すると、Ｃ−Ｐ４Ｈの存在量が増加することを示す図である。Ａ．未処理、Ｂ．＋ＴＧＦ−β、およびＣ．＋マスト細胞エキソソーム（ＥＸＯ）として示される、ヒト線維芽細胞における、コラーゲン合成の主要酵素、Ｐ４Ｈの免疫発現。ＤＡＰＩで染色された核（青）。スケールバー＝１０μｍ。
【図９】ロキサデュスタットが刺激されたヒト線維芽細胞のＣ−Ｐ４Ｈの増加を阻害することを示す図である。プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）の免疫発現。Ｐ４Ｈ免疫蛍光（緑）の相対的取得ピクセル強度は、未処理のヒト線維芽細胞と比較して、ＴＧＦ−βまたはマスト細胞エキソソーム（ＥＸＯ）に曝露されたＨＬＦで有意に高かった。＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０】ロキサデュスタット（ＲＸＤ）は線維芽細胞コラーゲン遺伝子転写物に影響しないことを示す図である。ロキサデュスタットのようなＨｉＦプロリルヒドロキシラーゼドメイン阻害剤は、転写レベルではなく、翻訳後修飾のレベルで作用する。したがって、ロキサデュスタットは、ＴＧＦ−β阻害で起こるような線維性遺伝子転写物の増加を変化させなかった。Ａ．列挙された条件下でのコラーゲン３の相対遺伝子発現。Ｂ．列挙された条件下でのコラーゲン１の相対遺伝子発現。
【図１１】肺線維症のインビボマウスモデル。ブレオマイシン誘導性肺線維症は、ロキサデュスタット処理で軽減される。１４ｄ時点からのブレオマイシン処理マウスのマッソンのトリクローム染色された肺の代表的顕微鏡写真。ロキサデュスタットは線維症を減少させた。
【図１２】ブレオマイシンによって誘導された肺コンプライアンスの減少がロキサデュスタットにより正常にされることを示す図である。肺機能検査は、ロキサデュスタット（ＲＸＤ）による処理がブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）に関連する肺コンプライアンスの減少を軽減することを示している。Ｓａｌ＝生理食塩水溶媒。
【図１３】ロキサデュスタット（ＲＸＤ）は肺コラーゲン遺伝子転写物に影響しないことを示す図である。ロキサデュスタットは、肺をブレオマイシンに曝すことで生じる線維性遺伝子転写物の増加を変化させなかった。Ａ．列挙された条件下でのコラーゲン１の相対遺伝子発現。Ｂ．列挙された条件下でのコラーゲン３の相対遺伝子発現。
【図１４】コラーゲン合成の新薬開発標的としてのＣ−Ｐ４Ｈのダイアグラムを示す図である。ロキサデュスタットのようなＨＩＦ  ＰＨＤ阻害剤を使用すると、プレプロコラーゲンペプチドのプロリンのヒドロキシル化を防止することにより、ＥＲにおけるプレプロコラーゲンの翻訳後修飾が中断される。不十分にヒドロキシル化された鎖は体温で安定な三重らせんドメインを形成せず、したがって分解を受ける。
【図１５】ロキサデュスタットと腎臓の片側尿管閉塞（ＵＵＯ）。全ての腎臓切片はマッソンのトリクロームで染色された。Ａ．片側尿管閉塞の１４日目の未処理腎臓（ＲＸＤ−）の皮質染色。Ｂ．片側尿管閉塞の１４日目の未処理腎臓（ＲＸＤ−）の髄質染色。Ｃ．片側尿管閉塞の１４日目にロキサデュスタットで処理（ＲＸＤ＋）した腎臓の皮質染色。Ｄ．片側尿管閉塞の１４日目にロキサデュスタットで処理（ＲＸＤ＋）した腎臓の髄質染色。
【図１６】ＲＸＤ処理はＵＵＯの腎線維症を減少させることを示す図である。マッソンのトリクロームで染色した、対照、ＵＵＯ、およびＵＵＯ＋ＲＸＤ腎臓の（同じ腎臓からの）代表的な対になった皮質および髄質切片。コラーゲンは青く染まる。Ａ．対照腎皮質のコラーゲン染色。Ｂ．ＵＵＯ腎皮質のコラーゲン染色。Ｃ．ＲＸＤで処理したＵＵＯ腎髄質のコラーゲン染色。Ｄ．対照腎髄質のコラーゲン染色。Ｅ．ＵＵＯ腎髄質のコラーゲン染色。Ｆ．ＲＸＤで処理したＵＵＯ腎髄質のコラーゲン染色。対照の腎臓切片（ＡおよびＤ）と比較して、ＵＵＯ腎臓（皮質および髄質）（ＢおよびＥ）ではコラーゲン染色が豊富であった。ＵＵＯ腎皮質および髄質（ＣおよびＦ）に見られるように、ＲＸＤでの処理により線維症が軽減した。
【図１７】ＲＸＤはＵＵＯ腎臓の線維症を低減することを示す図である。コラーゲン（青）染色は、複数の高強度視野でマッソンのトリクローム染色固定腎臓切片でピクセルごとに定量化された。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１  皮質ＵＵＯおよび皮質ＵＵＯ＋ＲＸＤ間；ならびに髄質ＵＵＯおよび髄質ＵＵＯ＋ＲＸＤ間。ＲＸＤの有無で対照の皮質と髄質コラーゲン染色の間に有意差はなかった。Ｎ＝４マウス／群。
【図１８】ＨＬＦによるＭＣ−ＥＸＯの取り込みがＳｍａｄ非依存性経路によるコラーゲン合成を刺激することを示す図である。Ａ．ＰＫＨ−６７（緑）で標識したＭＣ−ＥＸＯのＨＬＦ取り込み。核はＤＡＰＩ（青）で標識される。倒立落射蛍光顕微鏡で観察。スケールバー＝１５ｕＭ。Ｂ．共焦点画像：Ｉ．標識ＭＣ−ＥＸＯ（ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ）、ＩＩ．ＥＲの蛍光マーカー、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−ＫＤＥＬで一過性にトランスフェクトされたＨＬＦ、ＩＩＩ．核を示すＤＡＰＩ標識ＨＬＦ、ＩＶ．ＨＬＦ  ＥＲにおけるＭＣ−ＥＸＯの取り込みを示す重ね合わせ画像（Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ）。Ｃ．ＥＸＯ（４０μｇ）、およびＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＨＬＦからの溶解物を処理の７２時間後に回収し、ＲＴ  ｑＰＣＲをＧＡＰＤＨで正規化したコラーゲンＩおよびコラーゲン３の相対遺伝子発現に対して行った。Ｄ．ＭＣ−ＥＸＯ（４０ｕｇ）またはＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートしたＨＬＦからの溶解物のヒドロキシプロリン含有量。Ｅ．ＨＬＦ、ＨＬＦ＋ＭＣ−ＥＸＯ（４０ｕｌ）、ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＨＬＦ＋ＥＰＩ−ＥＸＯの上清中の分泌コラーゲンを測定した。コラーゲンは、Ｓｉｒｃｏｌアッセイで測定した。全てのアッセイは三重に行った。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＨＬＦ。
【図１９】ＨＬＦにおいて、ＲＸＤはプロリンのヒドロキシル化、ヒドロキシプロリン、Ｃ−Ｐ４Ｈの存在量、および分泌コラーゲンを阻害することを示す図である。Ａ．ＨＬＦ抽出タンパク質のＬＣ−ＭＣ分析により、ＲＸＤがコラーゲン１および３のプロリンヒドロキシル化を妨げたことが示される。Ｂ．ＲＸＤはＨＬＦのヒドロキシプロリンのＴＧＦ−βにより誘導される増加を阻害した。Ｃ．ＲＸＤは、ウエスタンブロットでＨＬＦ溶解物＋ＭＣ−ＥＸＯおよび＋ＴＧＦβのＣ−Ｐ４Ｈ存在量を減少させた。ローディング対照としてアクチンを泳動させた。Ｄ．ＲＸＤは、ＨＬＦ＋ＭＣ−ＥＸＯおよびＨＬＦ＋ＴＧＦ−βで測定されるＣ−Ｐ４Ｈ蛍光強度の増加を阻害した。Ｅ．分泌コラーゲン（Ｓｉｒｃｏｌ）は、＋ＭＣ−ＥＸＯおよび＋ＴＧＦ−βで未処理および処理されたＨＬＦからのＨＬＦ溶解物中のＲＸＤで遮断された。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＨＬＦ。全てのアッセイを三重に行った。
【図２０】ＲＸＤは、マウス肺のブレオマイシン誘導性線維症を阻害することを示す図である。Ａ．ＲＸＤ処理ブレオマイシンマウスでは、肺のヒドロキシプロリン含有量が顕著に減少している。Ｂ．−Ｅ．コラーゲン沈着についてのマッソンのトリクローム染色肺切片：Ｂ＝生理食塩水注入対照マウス、Ｃ＝ＲＸＤ処理生理食塩水注入対照マウス、Ｄ＝ブレオマイシン注入マウス、Ｅ＝ＲＸＤ＋ブレオマイシン注入マウス。＊＊Ｐ＜０．０１、Ｂｌｅｏ対Ｂｌｅｏ＋ＲＸＤ。ＮＳ＝顕著ではない。Ｎ＝５マウス／群。スケールバー＝２５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示の一態様は、臓器における線維症の予防、寛解および／または減弱の治療目的のためのコラーゲンプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（ｃ−Ｐ４Ｈ）経路の調節に少なくとも部分的に含意する。本明細書で使用される「予防」という用語は、線維症の発症を遅延もしくは排除すること、または患者集団間の線維症の発生を減少させることを意味する。本開示は、ｃ−Ｐ４Ｈ酵素の阻害が、既存のコラーゲンに影響を与えることなく、新たに合成されたコラーゲンの生成を防止する有効な抗線維化法であるという発見に基づく。
【００３１】
いくつかの実施形態では、患者は、肺（肺線維症）、腎臓（腎臓線維症）または肝臓（肝臓線維症）の線維症に罹患している。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈの阻害は、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤によって達成される。
【００３３】
一実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、対象に継続的に投与されない；むしろ、断続的に投与される。特定の実施形態では、断続的なＣ−Ｐ４Ｈ阻害剤投与は、１日おき、３日ごと、４日ごと、５日ごとに１回、または週１回行われる。別の特定の実施形態では、断続的なＣ−Ｐ４Ｈ阻害剤投与は、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、６時間ごと、１０時間ごと、または１２時間ごとに１回、行われる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤の有効量は、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤の有効量は、約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇまたは２００ｍｇ／ｋｇのＣ−Ｐ４Ｈ阻害剤である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、Ｃ−Ｐ４Ｈヒドロキシラーゼ活性を阻害する薬剤である。Ｃ−Ｐ４Ｈヒドロキシラーゼ活性を阻害する薬剤は、Ｃ−Ｐ４Ｈヒドロキシラーゼ酵素の活性を低下させるか、さもなければ調節する任意の薬剤である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は小分子化合物である。本明細書における「小分子化合物」という用語は、一般に、２０００ダルトン、１５００ダルトン、１０００ダルトン、８００ダルトン、または６００ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物を指す。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、ｃ−Ｐ４Ｈ（ＰＨＤ阻害剤）のプロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ）を阻害する。
【００３８】
特定の実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、ｃ−Ｐ４Ｈを特異的に阻害する。「特異的ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤」または「選択的ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤」という用語は、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）依存性ジオキシゲナーゼスーパーファミリーの他のメンバーよりもｃ−Ｐ４Ｈを選択的に阻害する化合物または化合物の混合物を指す。
【００３９】
本発明の特定の実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈヒドロキシラーゼ活性を阻害する薬剤は、２−オキソグルタル酸の構造模倣物である。そのような化合物は、標的の２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素ファミリーメンバーを競合的に阻害する可能性がある。
【００４０】
本発明で使用するためのＨＩＦヒドロキシラーゼ阻害剤の一般構造は、
【化４】
2021510175.tif 000005
式中：
Ｒ１は、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリールオキシ、および置換アリールオキシからなる群から選択され；
Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から独立して選択されるか；またはＲ２およびＲ３は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、または置換ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ４は、水素、アルキル、および置換アルキルからなる群から選択され；
Ｒ５は、ヒドロキシル、アルコキシ、および置換アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ６は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アリールオキシ（ａｒｙｌｏｚｙ）、置換アリールオキシ（ａｒｙｌｏｚｙ）、アミノアシル、置換アミノアシル、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アリールオキシ、および置換アリールオキシからなる群から独立して選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、Ｒ６はアルキルである。別の実施形態では、Ｒ６のアルキルはメチルである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ｒ５はヒドロキシルである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ｒ８はアリールオキシである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｒ６はメチルであり、Ｒ５はヒドロキシルである。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、１〜１０個の炭素原子、より具体的には１〜５個の炭素原子、さらにより具体的には１〜３個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖飽和炭化水素基を指す。代表的なアルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなどが含まれる。
【００４６】
「置換アルキル」という用語は、１〜５個の置換基、好ましくは１〜３個の置換基を有する、１〜１０個の炭素原子、より具体的には１〜５個の炭素原子のアルキル基を指し、各置換基は独立して、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールオキシアリール、置換アリールオキシアリール、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、オキソ、チオキソ、カルボキシル、カルボキシルエステル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、チオ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環チオ、置換複素環チオ、スルホニル、置換スルホニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、オキシカルボニルアミノ、オキシチオカルボニルアミノ、−ＯＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−置換複素環、および−ＯＳＯ２−ＮＲ１１Ｒ１１、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ１１−アルキル、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ１１−置換アルキル、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ１１−アリール、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ１１−置換アリール、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ１１−ヘテロアリール、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ１１−置換ヘテロアリール、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ１１−複素環、および−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ１１−置換複素環からなる群から選択され、ここで、各Ｒ１１は独立して水素またはアルキルから選択される。代表的な置換アルキル基には、トリフルオロメチル、ベンジル、ピラゾール−１−イルメチルなどが含まれる。
【００４７】
「アルコキシ」という用語は、「アルキル−Ｏ−」基を指し、これには、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシなどが含まれる。
【００４８】
「置換アルコキシ」という用語は、「置換アルキル−Ｏ−」基を指す。
【００４９】
「アシル」という用語は、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、アリール−Ｃ（Ｏ）−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）、複素環−Ｃ（Ｏ）−、および置換複素環−Ｃ（Ｏ）−基を指し、ただし、複素環または置換複素環の窒素原子は−Ｃ（Ｏ）−基に結合せず、ここで、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環は、本明細書に定義した通りである。
【００５０】
「アミノアシル」または「アミド」という用語、または接頭辞「カルバモイル」、「カルボキサミド」、「置換カルバモイル」もしくは「置換カルボキサミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１２基を指し、ここで各Ｒ１２は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環からなる群から選択され；または、各Ｒ１２が結合して、窒素原子と共に複素環または置換複素環を形成し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環は、本明細書に定義した通りである。
【００５１】
「アシルオキシ」という用語は、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アルキニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、複素環−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および置換複素環−Ｃ（Ｏ）Ｏ−基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環は、本明細書に定義した通りである。
【００５２】
「アルケニル」という用語は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子を有するビニル不飽和一価ヒドロカルビル基を指し、少なくとも１個、好ましくは１〜２個のビニル（＞Ｃ＝Ｃ＜）不飽和部位を有する。代表的なアルケニル基には、ビニル（エテン−１−イル）、アリル、ブタ−３−エニルなどが含まれる。
【００５３】
「置換アルケニル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、カルボキシル、カルボキシルエステル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環からなる群から選択される、１〜３個の置換基、好ましくは１〜２個の置換基を有するアルケニル基を指す。この用語には、必要に応じてＥ（トランス）異性体およびＺ（シス）異性体の両方が含まれる。ＥおよびＺ成分の両方の混合物もまた含まれる。
【００５４】
「アルキニル」という用語は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜３個の炭素原子を有するアセチレン不飽和一価ヒドロカルビル基を指し、少なくとも１個、好ましくは１〜２個のアセチレン（−Ｃ≡Ｃ−）不飽和部位を有する。代表的なアルキニル基には、エチン−１−イル、プロピン−１−イル、プロピン−２−イルなどが含まれる。
【００５５】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ２基を指す。
【００５６】
「置換アミノ」という用語は、基−ＮＲ１３Ｒ１３を指し、各Ｒ１３は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、スルホニル、および置換スルホニルからなる群から選択され、ただし、両方のＲ１３基は水素ではない；または、Ｒ１３基は、窒素原子と一緒に結合して、複素環または置換複素環式環を形成することができる。代表的な置換アミノ基には、フェニルアミノ、メチルフェニルアミノなどが含まれる。代表的な置換アミノ基には、（エタン酸（ｅｔｈａｎｉｃ  ａｃｉｄ）−２−イル）アミノなどが含まれる。
【００５７】
用語「アシルアミノ」は、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）アルキル、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）置換アルキル、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）シクロアルキル、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）置換シクロアルキル、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）アルケニル、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）置換アルケニル、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）アルキニル、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）置換アルキニル、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）アリール、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）置換アリール、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）置換ヘテロアリール、−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）複素環、および−ＮＲ１４Ｃ（Ｏ）置換複素環基を指し、ここでＲ１４は水素またはアルキルであり、ならびにここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環は、本明細書に定義されている。
【００５８】
「オキシカルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルケニル、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキニル、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環、および−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換複素環基を指し、ここでＲ１５は水素またはアルキルであり、ならびにここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環は、本明細書に定義した通りである。
【００５９】
「オキシチオカルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−アルキル、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−置換アルキル、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−アルケニル、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−置換アルケニル、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−アルキニル、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−置換アルキニル、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−シクロアルキル、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−置換シクロアルキル、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−アリール、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−置換アリール、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−ヘテロアリール、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−複素環、および−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）Ｏ−置換複素環基を指し、ここでＲ１６は水素またはアルキルであり、ならびにここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環は、本明細書に定義した通りである。
【００６０】
「アミノカルボニルオキシ」という用語または「カルバモイルオキシ」または「置換カルバモイルオキシ」という接頭辞は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１７Ｒ１７基を指し、ここで各Ｒ１７は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環からなる群から選択され；または、ここで各Ｒ１７が結合して、窒素原子と共に、複素環または置換複素環を形成し、ならびにここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環は、本明細書に定義した通りである。
【００６１】
「アミノカルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲ１８Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１８Ｒ１８基を指し、ここで各Ｒ１８は独立して、水素およびアルキルからなる群から選択される。
【００６２】
「アミノチオカルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲ１９Ｃ（Ｓ）−ＮＲ１９Ｒ１９基を指し、ここで各Ｒ１９は独立して、水素およびアルキルからなる群から選択される。
【００６３】
「アリール」という用語は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する６〜１４個の炭素原子の一価の芳香族炭素環式基を指し、結合点がアリール基であるならば、縮合環は芳香族（例えば、２−ベンゾオキサゾリノン、２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−３（４Ｈ）−オン−７−イルなど）であっても、なくてもよい。好ましいアリールには、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００６４】
「置換アリール」という用語は、ヒドロキシル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アミジノ（−Ｃ（＝ＮＨ）−アミノまたは置換アミノ）、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルオキシ、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、チオ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、複素環チオ、置換複素環チオ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、グアニジノ（−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−アミノまたは置換アミノ）、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、オキシカルボニルアミノ、オキシチオカルボニルアミノ、スルホニル、置換スルホニル、−ＯＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−置換複素環、および−ＯＳＯ２−ＮＲ２０Ｒ２０、−ＮＲ２０Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２０−アルキル、−ＮＲ２０Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２０−置換アルキル、−ＮＲ２０Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２０−アリール、−ＮＲ２０Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２０−置換アリール、−ＮＲ２０Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２０−ヘテロアリール、−ＮＲ２０Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２０−置換ヘテロアリール、−ＮＲ２０Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２０−複素環、−ＮＲ２０Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２０−置換複素環、からなる群から選択される１〜４個、特に１〜３個の置換基で置換された、本明細書で定義されるアリール基を指し、ここで各Ｒ２０は独立して水素またはアルキルから選択され、各々の用語は本明細書に定義した通りである。代表的な置換アリール基には、４−フルオロフェニル、３−メトキシフェニル、４−ｔ−ブチルフェニル、４−トリフルオロメチルフェニル、２−トリフルオロメトキシフェニル、３−トリフルオロメトキシフェニル、４−トリフルオロメトキシフェニル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロ−６−フルオロフェニル、２，４−ジクロロフェニル、４−メトキシフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、４−メタンスルホニルフェニル、ビフェニル−４−イルなどが含まれる。
【００６５】
「アリールオキシ」という用語は、例として、フェノキシ、ナフトキシなどを含む、アリール−Ｏ−基を指す。
【００６６】
「置換アリールオキシ」という用語は、置換アリール−Ｏ−基を指す。
【００６７】
用語「アリールオキシアリール」は、−アリール−Ｏ−アリール基を指す。
【００６８】
「置換アリールオキシアリール」という用語は、置換アリールについて上で定義したように、いずれかまたは両方のアリール環上で１〜３個の置換基で置換されたアリールオキシアリール基を指す。
【００６９】
「カルボキシル」という用語は、−ＣＯＯＨまたはその塩を指す。
【００７０】
「カルボキシルエステル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキニル、−Ｃ（Ｏ）β−シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環、および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換複素環基を指す。
【００７１】
「シアノ」という用語は、−ＣＮ基を指す。
【００７２】
「シクロアルキル」という用語は、例として、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、シクロヘキセニルなどを含む、単一または複数の環状環を有する、３〜１０、３〜８または３〜６個の炭素原子の飽和または不飽和であるが非芳香族の環状アルキル基を指す。
【００７３】
「置換シクロアルキル」という用語は、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、カルボキシル、カルボキシルエステル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、および置換複素環からなる群から選択される１〜５個の置換基を有するシクロアルキル基を指す。
【００７４】
「シクロアルキレン」および「置換シクロアルキレン」という用語は、上で定義したような二価のシクロアルキルおよび置換シクロアルキル基を指す。
【００７５】
「シクロアルコキシ」という用語は、−Ｏ−シクロアルキル基を指す。
【００７６】
「置換シクロアルコキシ」という用語は、−Ｏ−置換シクロアルキル基を指す。
【００７７】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
【００７８】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を指す。
【００７９】
「ヘテロアリール」という用語は、１〜１５個の炭素原子、好ましくは１〜１０個の炭素原子、ならびに酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択される環内の１〜４個のヘテロ原子の芳香環を指す。そのようなヘテロアリール基は、結合点がヘテロ原子を含む環を介していて、その環が芳香族である場合、単環（例えば、ピリジニル、フリル、またはチエニル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を持つことができる。窒素環原子および／または硫黄環原子は、場合により酸化されて、Ｎ−オキシドまたはスルホキシド、およびスルホン誘導体を提供する。代表的なヘテロアリール基には、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、インドリル、チオフェニル、チエニル、フリルなどが含まれる。
【００８０】
「置換ヘテロアリール」という用語は、置換アリールについて定義された同じ置換基群から選択される１〜３個の置換基で置換されているヘテロアリール基を指す。代表的な置換ヘテロアリール基には、５−フルオロ−ピリジン−３−イル、１−ベンジル−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル、５−ブロモ−フラン−２−イル、トリフルオロメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルなどが含まれる。
【００８１】
「ヘテロアリールオキシ」という用語は、−Ｏ−ヘテロアリール基を指し、「置換ヘテロアリールオキシ」は、−Ｏ−置換ヘテロアリール基を指す。
【００８２】
「ヘテロシクリル」または「複素環」という用語は、単環または複数の縮合環、環内に１〜１０個の炭素原子、および窒素、硫黄または酸素からなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する飽和または不飽和（しかし芳香族ではない）の基を指し、縮合環系では、結合点が複素環にある場合、１つまたはそれ以上の環はアリールまたはヘテロアリールであり得る。窒素環原子および／または硫黄環原子は、場合により酸化されて、Ｎ−オキシドまたはスルホキシド、およびスルホン誘導体を提供する。
【００８３】
「置換ヘテロシクリル」または「置換複素環」という用語は、置換シクロアルキルについて定義されたものと同じ１〜３個の置換基で置換されている複素環基を指す。
【００８４】
複素環およびヘテロアリールの例には、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも呼ばれる）、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２基を指す。
【００８６】
「オキソ」という用語は、原子（＝Ｏ）または原子（−Ｏ−）を指す。
【００８７】
「スルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）２Ｈ基を指す。
【００８８】
「置換スルホニル」という用語は、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アルケニル、−ＳＯ２−置換アルケニル、−ＳＯ２−アルキニル、−ＳＯ２−置換アルキニル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換シクロアルキル、−ＳＯ２−シクロアルケニル、−ＳＯ２−置換シクロアルケニル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換ヘテロアリール、−ＳＯ２−複素環、−ＳＯ２−置換複素環基を指し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環は、本明細書に定義される通りである。代表的なスルホニル基には、メチル−ＳＯ２−、フェニル−ＳＯ２−、４−メチルフェニル−ＳＯ２−などが含まれる。
【００８９】
「ヘテロシクリルオキシ」という用語は、−Ｏ−複素環基を指し、「置換ヘテロシクリルオキシ」は、−Ｏ−置換複素環基を指す。
【００９０】
「チオ」という用語は、−ＳＨ基を指す。
【００９１】
「アルキルスルファニル」、「アルキルチオ」、または「チオエーテル」という用語は、−Ｓ−アルキル基を指し、ここで、アルキルは上に定義した通りである。
【００９２】
「置換アルキルチオ」、「置換アルキルスルファニル」、または「置換アルキルチオ」という用語は、−Ｓ−置換アルキル基を指し、ここで置換アルキルは上に定義した通りである。
【００９３】
「シクロアルキルチオ」または「シクロアルキルスルファニル」という用語は、−Ｓ−シクロアルキル基を指し、ここでシクロアルキルは上に定義した通りである。
【００９４】
「置換シクロアルキルチオ」という用語は、−Ｓ−置換シクロアルキル基を指し、ここで置換シクロアルキルは上に定義した通りである。
【００９５】
「アリールチオ」または「アリールスルファニル」という用語は、−Ｓ−アリール基を指し、「置換アリールチオ」は、−Ｓ−置換アリール基を指し、ここでアリールおよび置換アリールは、上に定義した通りである。
【００９６】
「ヘテロアリールチオ」または「ヘテロアリールスルファニル」という用語は、−Ｓ−ヘテロアリール基を指し、「置換ヘテロアリールチオ」は、−Ｓ−置換ヘテロアリール基を指し、ここでヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールは、上に定義した通りである。
【００９７】
「複素環チオ」または「複素環スルファニル」という用語は、−Ｓ−複素環基を指し、「置換複素環チオ」は、−Ｓ−置換複素環基を指し、ここで複素環および置換複素環は、上に定義した通りである。
【００９８】
「エステル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２１基を指し、ここでＲ２１は、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールである。
【００９９】
一実施形態では、式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ５は、ヒドロキシルであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９、およびＲ１０は水素であり；Ｒ６はメチルであり；Ｒ８はフェノキシ（ｐｈｅｎｏｘ）であり、化合物は下の式（ＩＩ）に示される構造を有する。この分子はＦＧ−４５９２（別名ロキサデュスタット）とも知られ、化学名Ｎ−［（４−ヒドロキシ−１−メチル−７−フェノキシイソキノリン−３−イル）カルボニル］グリシン）］を持つイソキノロンである。
【化５】
2021510175.tif 000006
【０１００】
ＦＧ−４５９２（ロキサデュスタット）は、慢性腎臓病における貧血の治療のための第３相臨床試験中であり、有害な影響は報告されていない。
【０１０１】
特定の実施形態では、ＦＧ−４５９２（ロキサデュスタット）は、０．２ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間の量で投与される。別の実施形態では、ＦＧ−４５９２（ロキサデュスタット）の投与量は、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＦＧ−４５９２（ロキサデュスタット）アナログが使用される。ＦＧ−４５９２アナログは、米国特許第９，７０１，６４７号；第９，４３９，８８８号；第７，８６３，２９２号；ならびに米国特許出願番号第１３／１８６３５１号および第１１／５４９５７１号に記載されており、これらは全てそれらの全体が参照により組み入れられる。
【０１０３】
別の特定の実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ、隣接メチル基を有するアミノジカルボン酸；化学名Ｎ−（２−メトキシ−２−オキサオアセチル）グリシンメチルエステル）である。ＤＭＯＧは以下の化学構造を有する：
【化６】
2021510175.tif 000007
【０１０４】
特定の実施形態では、ＤＭＯＧは、５０ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの間の量で投与される。別の実施形態では、ＤＭＯＧの投与量は、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１６５ｍｇ／ｋｇ、１７０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、１８５ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇ、１９５ｍｇ／ｋｇ、または２００ｍｇ／ｋｇである。
【０１０５】
一実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、投与前に薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。この開示の目的のために、「薬学的に許容される担体」は、任意の標準的な薬学的担体を意味する。適した担体の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水および様々な湿潤剤のような任意の標準的な薬学的担体を含んでもよいが、これらに限定されない。他の担体には、錠剤、顆粒およびカプセルなどで使用される添加剤が含まれてもよい。典型的には、そのような担体には、デンプン、牛乳、砂糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物性脂肪または油、ガム、グリコールまたは他の既知の賦形剤のような賦形剤が含まれる。そのような担体にはまた、フレーバーおよび着色添加剤または他の成分が含まれてもよい。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される。
【０１０６】
Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、薬学的に許容される担体と混合して、とりわけ、錠剤、カプセル（例えば、ハードまたはソフトゼラチンカプセル）、丸剤、カシェ、粉末、顆粒などのような固体形態；溶液、懸濁液のような液体形態；または微粉化粉末、スプレー、エアロゾルなどを含む任意の従来の形態の薬学的製剤を作製することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、経口、経口腔鼻、または非経口経路のような異なる投与経路によって投与することができる。
【０１０８】
「経口」または「経口的な」投与は、口を経由して、または口を介して対象の体内に物質を導入することを指し、嚥下もしくは口腔粘膜を経由した輸送（例えば、舌下または口腔吸収）またはその両方を含む。
【０１０９】
「経口腔鼻」投与は、例えば、鼻に１つまたはそれ以上の液滴を配置することによって起こるように、鼻および口を経由して、または鼻および口を介して対象の体内に物質を導入することを指す。経口腔鼻投与には、経口および鼻腔内投与に関連する輸送プロセスが含まれる。
【０１１０】
「非経口投与」は、消化管を含まない経路を経由する、または介する対象の体内への物質の導入を指す。非経口投与には、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与、眼内投与、および静脈内投与が含まれる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤を含む組成物は、エアロゾルによって投与することができる。例えば、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤調製物を含む組成物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物または固体粒子を調製することによって、このことを達成することができる。非水性（例えば、フルオロカーボン噴霧剤）懸濁液を使用することができる。ソニックネブライザーもまた使用することができる。水性エアロゾルは、薬剤の水溶液または懸濁液を従来の薬学的に許容される担体および安定剤と共に製剤化することによって作製される。担体および安定剤は、特定の化合物の必要性によって異なる。
【０１１２】
本開示の別の態様では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、早期新生児のＣＬＤを予防する方法で使用される。特定の実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、使用されるＣ−Ｐ４Ｈ阻害剤および選択された投与経路に依存して、０．２ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの間の用量で早産児に投与される。他の実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤約０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１６５ｍｇ／ｋｇ、１７０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、１８５ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇ、１９５ｍｇ／ｋｇ、または２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１１３】
さらに別の実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、それを必要とする患者に毎日投与される。別の実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、２日ごとまたは３日ごとに断続的に投与される。さらに別の実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、酸素補給セッション中に投与され、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤の投与は、新生児がもはや補助酸素を摂取しなくなったら停止される。特定の実施形態では、Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は週に１回投与される。Ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤の投与は、新生児が室内の空気を自力で呼吸できるようになるまで続けることができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＰＨＤ阻害剤は、ロキサデュスタット（ＲＸＤ）（ＦＧ−４５９２）、バダダスタット（ＡＫＢ−６５４８）、ダプロダスタット（ＧＳＫ−１２７８８６３）、およびモリダスタット（ＢＡＹ  ８５−３９３４）からなる群から選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈ阻害剤は、核酸阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＴＡＬＥＮシステム、および相同組換えを導入することからなる群から選択される阻害剤である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈの核酸阻害剤は、ｃ０Ｐ４Ｈ遺伝子の発現を阻害する。特定の実施形態では、ｃ−Ｐ４Ｈの核酸阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡｉマイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される。
【０１１７】
本開示の別の態様は、細胞内で機能する調節領域に動作可能に連結された、ｃ−Ｐ４Ｈ遺伝子の発現の核酸阻害剤に転写されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関し、核酸は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡｉマイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、調節領域は、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは臓器特異的プロモーターを含む。特定の実施形態では、臓器特異的プロモーターは、肺特異的プロモーター、腎臓特異的プロモーター、および肝臓特異的プロモーターからなる群から選択される。
【０１１９】
他に定義されることがない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料も本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料がここで記載されている。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用する関連の方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２０】
以下に列挙する特定の例は、例示のみのためであり、限定するものでは決してない。
【実施例】
【０１２１】
実施例１：肺線維芽細胞によって取り込まれたマスト細胞エキソソームは、コラーゲンの合成および分泌を刺激する：線維芽細胞活性化の新規手段
【０１２２】
線維芽細胞およびマスト細胞は、組織のすぐ傍に見られる（図１Ｂ）。マスト細胞は粒子、エキソソームを放出し、そのサイズ範囲は２０〜１００ｎｍで、ＲＮＡおよびタンパク質を含む。質量分析によるマスト細胞エキソソームタンパク質含有量の分析により、マスト細胞エキソソームが、線維形成に関与するアネキシン２やｃ−Ｐ４Ｈのβサブユニットなどのタンパク質を含むことが明らかになった。マスト細胞エキソソームと共にインキュベートした線維芽細胞は、図１Ａに示されるようにエキソソームを内部移行する。透過および蛍光光の重ね合わせ画像の代表的な顕微鏡写真（図１Ａ）は、マスト細胞エキソソーム（緑色の点）が線維芽細胞（透過光）によって内部移行されることを示している。内部移行後、エキソソームは線維芽細胞を活性化して、新しく形成されたコラーゲンを分泌する（図１Ｃ）。早くて２４時間（Ｐ＜０．０１）で活性化が起き、４８時間（Ｐ＜０．０５）から７２時間（Ｐ＜０．００１）までヒト肺線維芽細胞コラーゲンの産生と分泌を刺激し続けた（図１Ｃ）。
【０１２３】
実施例２：マスト細胞エキソソームおよびＴＧＦ−βによる肺線維芽細胞の活性化は、異なる経路を介して相加的である。
【０１２４】
ヒト肺線維芽細胞のエキソソーム活性化を、ヒト肺線維芽細胞の古典的なＴＧＦ−β１刺激と比較した。ヒト肺線維芽細胞コラーゲン分泌のＴＧＦ−β１刺激は、４８時間のタイムラグで、エキソソーム誘導性コラーゲン分泌とは異なる時間経過をたどる。ＴＧＦ−β１の外因性添加は、７２時間の時点でヒト肺線維芽細胞による顕著なコラーゲン分泌を引き起こした（Ｐ＜０．０５）（図２Ａ対図１Ｂ）。
【０１２５】
ヒト肺線維芽細胞をエキソソームおよびＴＧＦ−β１とインキュベートすることは相加的であり、コラーゲン分泌は、それぞれＴＧＦ−β１単独（Ｐ＜０．０５）またはエキソソーム単独（Ｐ＜０．０１）と比較して、エキソソームおよびＴＧＦ−β１の両方に曝露されたヒト肺線維芽細胞において顕著に多い（図２Ｂ）。
【０１２６】
ＴＧＦ−β１およびエキソソームが、ヒト肺線維芽細胞のコラーゲン分泌を刺激するために同じシグナル伝達経路を利用するか否かを決定するために、ヒト肺線維芽細胞ホモジネートでウエスタンブロッティングを行った。期待通り、ヒト肺線維芽細胞をＴＧＦ−β１に曝露すると、ＳＭＡＤのリン酸化が起きた。これは、エキソソームに曝露されたヒト肺線維芽細胞では観察されなかった（図２Ｃ）。これらの結果は、エキソソームが、時間的経過が異なるものの、ＴＧＦ−β１と同様にヒト肺線維芽細胞において新たに合成されるコラーゲンの分泌を刺激できることを示している。これは、ヒト肺線維芽細胞においてコラーゲン合成を活性化するための様々な細胞内メカニズムの関与を示唆しており、ＳＭＡＤの結果によって確認された。
【０１２７】
図１および図２の結果は、肺でマスト細胞と線維芽細胞が連絡している新規の線維形成経路を示しており、肺線維症を遮断するためのさらなる治療標的を提示する。
【０１２８】
実施例３：ＨＩＦ  ＰＨＤ酵素阻害剤はヒト肺線維芽細胞活性を遮断する：コラーゲンの合成および分泌、増殖および移動。
【０１２９】
ＨＩＦ  ＰＨＤおよびｃ−Ｐ４Ｈ酵素の両方が構造的に類似しており、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）依存性ジオキシゲナーゼスーパーファミリーに属するため、分子状二酸素から１つの酸素を受け入れてコハク酸となり、２番目の酸素がトランス−４−ヒドロキシプロリンを形成する補因子、２−ＯＧのアナログとして機能するＨＩＦ  ＰＨＤアンタゴニストは、ｃ−Ｐ４Ｈ酵素活性も遮断することができると推論された。Ｃ−Ｐ４Ｈは新たに形成されるコラーゲンのアセンブリに必要である。
【０１３０】
ＲＸＤおよびコラーゲン分泌：ヒト肺線維芽細胞を用いたインビトロ実験は、ＲＸＤが、未処理の線維芽細胞、マスト細胞エキソソームと共培養された線維芽細胞、およびコラーゲン合成の古典的な誘導因子である外因性ＴＧＦ−β１に曝された線維芽細胞におけるコラーゲン分泌を阻害することを示す（図３Ａ）。提示される全ての値は、総タンパク質に対して正規化されている。
【０１３１】
ＲＸＤおよび線維芽細胞増殖：図３Ｂ〜３Ｄのデータは、線維芽細胞溶解物の総タンパク質含有量によって決定されるように、ＲＸＤもＴＧＦ−β線維芽細胞増殖を遮断することを示す：対照−０．８００μｇ／ｍｌ／ウェル（図３Ｂ）対＋ＴＧＦ−β  １．１３８μｇ／ｍｌ／ウェル（図３Ｃ）対＋ＲＸＤ＋ＴＧＦ−β  ０．８２８μｇ／ｍｌ／ウェル（図３Ｄ）。
【０１３２】
ＲＸＤおよび線維芽細胞の移動／蓄積／病巣形成および平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を介した線維芽細胞の活性化：定性的データはまた、ＲＸＤ処理が線維芽細胞の移動、蓄積、および病巣形成を妨げることを示す（図３Ｂ〜図３Ｄを比較）。ウエスタンブロットは、ＳＭＡ存在量が肺線維芽細胞においてＲＸＤでも減少することを示す（図３Ｅ）。
【０１３３】
実施例４：ＨＬＦによるＭＣ−ＥＸＯの取り込みは、Ｓｍａｄ非依存性経路によるコラーゲン合成を刺激する
【０１３４】
正常の廃棄組織標本から新たに単離されたＨＬＦ、およびヒトマスト細胞腫細胞（ＨＭＣ−１）上清から収穫されたＭＣ−ＥＸＯを使用したインビトロ実験では、色素、ＰＨＫ−６７（フルオレセイングリーン）で標識されたＭＣ−ＥＸＯがＨＬＦに取り込まれることが、倒立落射蛍光顕微鏡での可視化により実証された（図１８Ａ）。この取り込みは共焦点イメージングで確認され（図１８Ｂ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してＥＲの蛍光マーカーであるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−ＫＤＥＬと共に一過性にトランスフェクトされたＨＬＦの小胞体（ＥＲ）に局在する標識ＭＣ−ＥＸＯ（ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ）が示された（図１８Ｂ−ＩＩ）。一過性のトランスフェクションの２４時間後、細胞を標識ＭＣ−ＥＸＯに６０分間曝露し、Ｚｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ＳＤ回転ディスク共焦点顕微鏡で画像化した。代表的画像のように、ＭＣ−ＥＸＯの取り込み（赤）はＨＬＦに強く（図１８Ｂ−Ｉ、ＩＶ）、正しくトランスフェクトされたＨＬＦには、ＥＲに現れた。ＨＬＦの核はＤＡＰＩで染色されている（図１８Ｂ−ＩＩＩ）。
【０１３５】
ＨＬＦによるＭＣ−ＥＸＯの取り込みは、ＴＧＦ−βで観察されるものとは異なり、Ｓｍａｄのリン酸化（図２Ｃ）またはコラーゲン１もしくはコラーゲン３遺伝子発現の刺激（図１８Ｃ）をもたらさなかった。しかしながら、ＭＣ−ＥＸＯならびにＴＧＦ−βは、ヒドロキシプロリン含有量（図１８Ｄ）およびコラーゲン分泌（図１８Ｅ）（７２時間の時点）のＨＬＦ産生の増加をもたらした。並行実験において、肺上皮細胞（ＥＰＩ）ＥＸＯとインキュベートしたＨＬＦはコラーゲン分泌が増加せず（図１Ｅ赤いバー−７２時間の時点）、ＨＬＦでのＥＸＯの取り込みおよびコラーゲン合成の刺激は一般的現象ではないことを示唆している。これらの所見は、ＨＬＦへのＭＣ−ＥＸＯの取り込みとマスト細胞のエキソソームカーゴの放出が、ＴＧＦ−β−Ｓｍａｄ転写軸を迂回してコラーゲン合成に影響を与えることを示唆している。
【０１３６】
ＩＰＦの薬物療法の以前の大規模臨床研究は、主にＴＧＦ−βおよび線維芽細胞の増殖および活性化に関連するシグナル伝達経路に焦点を合わせてきたため、今日までの臨床試験の証拠の多数は、ＩＰＦの薬物療法が部分的にのみ有益であることを示唆している。これらの療法の正確な作用機序については、極めて情報が不足している。本明細書に開示された結果は、線維性遺伝子の転写を迂回するＥＲにおけるコラーゲン合成を誘発できるＭＣ−ＥＸＯカーゴからＨＬＦへの経細胞交換のような他の経路が存在することを示している（図１８Ｃ）。ＥＲ内のコラーゲン合成の細胞内事象は、新たに合成されるコラーゲン性ポリペプチド鎖のプロリン残基の翻訳後修飾からなる。この必須なプロリンヒドロキシル化反応は、律速酵素コラーゲンプロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ−Ｐ４Ｈ）によって触媒される。
【０１３７】
実施例５：ＲＸＤは、触媒活性形態のコラーゲンＰ４Ｈであるｃ−Ｐ４Ｈ四量体、新たに形成されたコラーゲンの合成におけるプロリルヒドロキシル化に関与する酵素の相対発現を減少させる。
【０１３８】
ＲＸＤがコラーゲン形成を阻害する潜在的な手段は、触媒的活性なｃ−Ｐ４Ｈ四量体の存在量を減少させることによると仮定されている。本発明者らは、ヒト肺線維芽細胞におけるｃ−Ｐ４Ｈの相対的存在量を、単独、マスト細胞エキソソームと共培養、または外因性ＴＧＦ−β±ＲＸＤの添加の条件で、ｃ−Ｐ４Ｈαサブユニットをプローブにしたウエスタンブロットにより推定した（図４）。
【０１３９】
ＲＸＤは、ｃ−Ｐ４Ｈ四量体の相対発現（矢印  −  ２４０ｋＤ）を約５％（Ｃｏｎ対ＲＸＤ）；約５５％（＋エキソソーム（ＥＸＯ）対ＥＸＯ＋ＲＸＤ）；約７５％（＋ＴＧＦ−β対ＴＧＦ−β＋ＲＸＤ）減少させることが観察された。これらの結果は、ＲＸＤの作用の１つの側面は、ｃ−Ｐ４Ｈ四量体形成に干渉し、それによりプロトコラーゲンのプロリンヒドロキシル化を妨害し、新たなコラーゲン形成を妨げることであることを示唆している。
【０１４０】
実施例６：ＲＸＤはマスト細胞安定剤として機能する。
【０１４１】
ＲＸＤは、２４時間の高酸素への曝露（８０％）、続いて２日間の室内空気中での回復の後、上清に浸したマスト細胞（ヒトマスト細胞腫細胞）に加えられた（高酸素回復（ＨＯｒｅｃ）および高酸素回復＋ＲＸＤ（ＨＯｒｅｃ＋ＲＸＤ））。マスト細胞脱顆粒は、マスト細胞脱顆粒の古典的な指標であるβ−ヘキソサミナダーゼ（β−ｈｅｘ）（図５Ａ）およびトリプターゼ（図５Ｂ）の放出を測定することにより評価した。ＲＸＤはマスト細胞を安定化させ、線維形成トリプターゼのような肺損傷を引き起こす可能性のある有害なマスト細胞産物の放出を防ぐことができる。このプロトコルは、急性増悪で入院したＩＰＦ患者に高酸素を投与し、その後室内空気に戻す臨床プロトコルを模倣するように設計された。
【０１４２】
実施例７：線維芽細胞（ＦＢ）のマスト細胞依存性活性化のモード。
【０１４３】
図６は、線維芽細胞のコラーゲン合成および分泌に対するマスト細胞の寄与を示す。図の左側は、ヒスタミン、トリプターゼ、レニン／ＡＮＧ  ＩＩ、ＴＧＦ−βなどのプロ線維形成性マスト細胞メディエーターが、例えば、どのように受容体活性化およびＳＭＡＤシグナル伝達経路を介してＦＢを活性化するかを示している。受容体を介したＦＢの活性化は、それらの増殖、移動、コラーゲン合成および分泌の活性化をもたらす。他の側は、本出願において開示された新規な経路を表しており、プロ線維性タンパク質を含むマスト細胞のエキソソームが隣接するＦＢに取り込まれ、非ＳＭＡＤ経路を介してコラーゲンの合成および分泌を刺激できることを示す。ＦＢ活性化における受容体媒介性およびエキソソーム性の経路は、ＲＸＤのようなＨＩＦ  ＰＨＤ阻害剤で遮断される（赤いバー）。
【０１４４】
実施例８：肺線維症のブレオマイシン実験モデルにおけるＲＸＤの効果。
【０１４５】
８週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用して、ＲＸＤがブレオマイシン誘導性肺線維症の発症を阻害するか否かを検討した。中咽頭へのブレオマイシンの単回投与の後、線維増殖の期間および線維症の確立を表す７、９、１１、１３、１５、１７、および１９日目にＲＸＤ（１０ｍｇ／ｋｇ）を治療的に送達させた。２１日目にマウスを犠牲にした。ブレオマイシンは肺ヒドロキシプロリン含有量の増加を引き起こしたが、それはＲＸＤで顕著に減少した（図２０Ａ）。マッソンのトリクローム染色された肺の組織学的評価は、ＲＸＤがブレオマイシンによる線維症の重症度を軽減したことを示した（図２０Ｅ対図２０Ｄを比較）。
【０１４６】
実施例９：ＲＸＤを用いた処理は、ＵＵＯにおける腎線維症を減少させる。インビボ片側尿管閉塞（ＵＵＯ）モデル
【０１４７】
全ての動物の処置および実験は、ワイルコーネル医科大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）（９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（４ｍｇ／ｋｇ）のカクテルでマウスを腹腔内麻酔した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）は、無菌条件下で腹部正中切開を通して４−０シルク縫合糸で右片側尿管結紮術を受けた。模擬操作対照（ＣＯＮ）動物は、右尿管のマニピュレーションのみで、同じ操作を受けた。０、２、４、６、８日目のロキサデュスタット（１０ｍｇ／ｋｇ）の送達は、ＩＰ投与でされた。１４日目にマウスを犠牲にした。
【０１４８】
腎臓を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、続いてパラフィンに包埋した。切片（５ｕｍ）を収集し、マッソンのトリクローム染色をキット（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、コラーゲン（青染色）を検出した。パラフィン処理した組織切片のスライドを脱パラフィンし、再水和して、蒸留水で洗浄した。その後、トリクロームキットの構成物を使用して、製造業者のプロトコルに従って切片を染色した。キシレンで脱水および清掃後、切片をＶｅｃｔａｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のカバーガラスにマウントした。組織切片を、ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ２メガピクセルカラーカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を取り付けた倒立落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ  ２０００−Ｕ）を用いて調査した。
【０１４９】
結果
【０１５０】
ＲＸＤでの処理は、ＵＵＯにおける腎線維症を減少させる。対照の腎臓切片（図１６Ａおよび１６Ｄ）と比較して、ＵＵＯ腎臓（皮質および髄質）（図１５Ａ、１５Ｂ、１６Ｂおよび１６Ｅ）ではコラーゲン染色（青）が豊富であった。ＲＸＤでの処理は、ＵＵＯ腎皮質および髄質に見られるように線維症を軽減した（図１５Ｃ、１５Ｄ、１６Ｃおよび１６Ｆ）。
【０１５１】
さらに、コラーゲン（青）染色は、マッソンのトリクローム染色された固定腎臓切片において、複数の高強度視野のピクセルごとに定量化した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１  皮質ＵＵＯおよび皮質ＵＵＯ＋ＲＸＤ間；ならびに髄質ＵＵＯおよび髄質ＵＵＯ＋ＲＸＤ。ＲＸＤの有無で対照の皮質および髄質コラーゲン染色の間に有意差は無かった。Ｎ＝４マウス／群。図１７を参照されたい。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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