(57)【要約】本発明は、生物医学の分野に関する。詳細には、本発明は、スクレロスチンに対するアプタマー及びその使用、特に骨粗鬆症などのスクレロスチン関連疾患の処置における使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクレロスチンに対するアプタマーであって、
ｉ）配列番号１〜１７のいずれか１つに少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％若しくは少なくとも約９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又は
ｉｉ）配列番号１〜１７のいずれか１つの中の少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０若しくはこれを超える連続ヌクレオチドを含み、
好ましくは配列番号１〜１７又は１９〜２４のいずれか１つの配列を含み、
スクレロスチンに特異的に結合する、アプタマー。
【請求項２】
１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、好ましくは４０ｎＭ未満、好ましく３０ｎＭ未満、好ましくは２０ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満又はそれより低いスクレロスチンに対するＫｄを有する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
スクレロスチンの生物学的活性を阻害することができる、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項４】
細胞ベースＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいてスクレロスチンの拮抗作用を遮断できる、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項５】
スクレロスチンの生物学的活性を阻害すること、例えばＷｎｔシグナル伝達経路での前記スクレロスチンの拮抗作用を阻害することについて、１００μｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは４０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは３０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは２０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満又はこれより低いＥＣ５０値を有する、請求項１に記載のスクレロスチンに対するアプタマー。
【請求項６】
アプタマーにヌクレアーゼ耐性の増強を付与する、及び／又はアプタマーのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増強する１つ又は複数の修飾をさらに含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記修飾が３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾を含む、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記修飾が、１つ又は複数の天然に存在するヌクレオチドを、２’−フルオロ、２’−メトキシエチル、２’−メトキシ又は’−アリルオキシ修飾ヌクレオチドからなる群から選択される修飾ヌクレオチド、好ましくは２’−メトキシ修飾ヌクレオチドを用いて置換することを含む、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記修飾が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合修飾などのヌクレオチド間修飾を含む、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項１０】
前記修飾が、ＰＥＧ修飾を含み、好ましくは、前記ＰＥＧの分子量が約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、例えば約４０ｋＤａである、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項１１】
２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）修飾、３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾及び／又はＰＥＧ修飾を含む、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項１２】
スクレロスチン関連疾患を処置する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のスクレロスチンに対するアプタマーの治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、例えば前記対象がヒトである、方法。
【請求項１３】
前記スクレロスチン関連疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症及びミエローマから選択される、請求項１２に記載のスクレロスチン関連疾患を処置する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのスクレロスチンに対するアプタマー及び薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
スクレロスチン関連疾患を処置するための医薬の調製における、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のスクレロスチンに対するアプタマー又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
前記スクレロスチン関連疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症及びミエローマから選択される、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に関する。詳細には本発明は、スクレロスチンに対するアプタマー及びその使用、特に骨粗鬆症などのスクレロスチン関連疾患の処置における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、骨量及び骨強度の低減を有する疾患であり骨折のリスクの増加をもたらす（Ｈａｍｅｒｓｍａ，Ｇａｒｄｎｅｒら、２００３）。骨粗鬆症処置のための種々の薬物は、主に骨吸収抑制剤であり、さらなる骨量減少を予防するように骨吸収を阻害する（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗａｔｔｓら、２００８、Ｐｅｎｎｙｐａｃｋｅｒ，Ｄｕｏｎｇら、２０１１）。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペプチドは、確定した骨粗鬆症を逆行させるように骨形成を刺激するための唯一の利用可能なタンパク質同化剤である（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ  ２００７、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｂｏｎｅら、２００７）。残念ながら、ＰＴＨを使用する長期間の処置は、骨肉腫のリスクをもたらす（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ２００１、Ｏｒｗｏｌｌ，Ｓｃｈｅｅｌｅら、２００３）。したがって、いかなる有害作用も伴わずに骨形成を促進できる代替的タンパク質同化薬が非常に必要とされている。
【０００３】
スクレロスチンは、確定した骨粗鬆症における治療薬を開発するための有望な標的である（Ｒｅｙ及びＥｌｌｉｅｓ  ２０１０）。ヒトスクレロスチンに対するヒト化モノクローナル抗体は、臨床試験において良好なトレランスを有して骨形成を促進し、骨量を増加させることが報告されている。しかし、治療用抗体について、高い免疫原性（Ｐａｄｈｉ，Ｊａｎｇら、２０１１、Ｐａｄｈｉ，Ａｌｌｉｓｏｎら、２０１４）、高価で生産のために労力を要すること（Ｂａｋｅｒ  ２０１５、Ｂｒａｄｂｕｒｙ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  ２０１５、Ｇｒｏｆｆ，Ｂｒｏｗｎら、２０１５）、輸送及び保存のために連続したコールドチェーンを必要とする不安定さ（Ｊａｙａｓｅｎａ  １９９９）を含むいくつかの主要な懸案事項がある。したがって、免疫原性を有さず、生産が容易で、低コスト及び高い安定性を有する代替的抗スクレロスチン剤は、骨タンパク質同化治療のために望ましい。
【０００４】
アプタマーは、コンホメーション相補性を通じてそれらの標的に結合する短い１本鎖オリゴヌクレオチドである（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ  １９９０、Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ  １９９０）。アプタマーは、陽性及び陰性標的に対して選択されて適合され得る。治療用抗体と比較して、アプタマーは、同様の親和性及び特異性を有するが、いくつかの重要な有利点を有する。免疫原性について、アプタマーは、サイズが小さいことから免疫系によって外来性として認識されず、負の免疫応答を刺激しない（Ｋｅｅｆｅ，Ｐａｉら、２０１０）。生産及び費用について、アプタマーは、種々の選択条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定され、化学的方法によって容易に合成でき、そのため生産はあまり費用がかからず、リスクがより低い（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ２０１０）。安定性について、アプタマーは温度耐性であるため、それらは不確定な保存期間を有し、冷却についていかなる特別な要件も有さずに輸送を許容でき、連続したコールドチェーンの必要性を除く（Ｊａｙａｓｅｎａ  １９９９）。ペガプタニブ、加齢性黄斑変性症の処置のための血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するアプタマー、は臨床で良好に使用されている（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ，Ｇｒｅｅｎら、１９９４、Ｒｕｃｋｍａｎ，Ｇｒｅｅｎら、１９９８、Ｎｇ及びＡｄａｍｉｓ  ２００６、Ｑｕｅ−Ｇｅｗｉｒｔｈ及びＳｕｌｌｅｎｇｅｒ  ２００７）。
【０００５】
したがって、骨粗鬆症の処置のためのモノクローナル抗体に代わるスクレロスチンに対するアプタマーを開発することが望ましい。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、スクレロスチンに対するアプタマーであって、
ｉ）配列番号１〜１７のいずれか１つに少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％若しくは少なくとも約９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又は
ｉｉ）配列番号１〜１７のいずれか１つの中の少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０若しくはこれを超える連続ヌクレオチドを含み、
好ましくは、配列番号１〜１７又は１９〜２４のいずれか１つの配列を含み、
スクレロスチンに特異的に結合する、アプタマーを提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、アプタマーは１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、好ましくは４０ｎＭ未満、好ましく３０ｎＭ未満、好ましくは２０ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満又はそれより低いスクレロスチンに対するＫｄを有する。
【０００８】
一部の実施形態では、アプタマーは、スクレロスチンの生物学的活性を阻害できる。一部の実施形態では、アプタマーは、細胞ベースＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいてスクレロスチンの拮抗作用を遮断できる。一部の実施形態では、アプタマーは、スクレロスチンの生物学的活性を阻害すること、例えばＷｎｔシグナル伝達経路でのスクレロスチンの拮抗作用を阻害することについて、１００μｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは４０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは３０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは２０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満又はそれより低いＥＣ５０値を有する。
【０００９】
一部の実施形態では、アプタマーは、アプタマーにヌクレアーゼ耐性の増強を付与する、及び／又はアプタマーのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増強する１つ又は複数の修飾をさらに含む。一部の実施形態では、修飾は、３’逆位デオキシチミジン（inverted deoxythymidine）（３’ｉｄＴ）修飾を含む。一部の実施形態では、修飾は、１つ又は複数の天然に存在するヌクレオチドを、２’−フルオロ、２’−メトキシエチル、２’−メトキシ又は２’−アリルオキシ修飾ヌクレオチドからなる群から選択される修飾ヌクレオチド、好ましくは２’−メトキシ修飾ヌクレオチドを用いて置換することを含む。一部の実施形態では、修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合修飾などのヌクレオチド間修飾を含む。一部の実施形態では、修飾は、ＰＥＧ修飾を含む。一部の実施形態では、アプタマーは、２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）修飾、３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾及び／又はＰＥＧ修飾を含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、スクレロスチン関連疾患を処置する方法であって、本発明のスクレロスチンに対するアプタマーの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、例えば対象はヒトである、方法を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、スクレロスチン関連疾患は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症及びミエローマから選択される。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのスクレロスチンに対するアプタマー及び薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、スクレロスチン関連疾患を処置するための医薬の調製における、本発明のスクレロスチンに対するアプタマー又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、スクレロスチン関連疾患は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症及びミエローマから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】セレックス（ＳＥＬＥＸ）を通じたスクレロスチンに対する高親和性アプタマーの濃縮を示す図である。（Ａ）濃縮ｓｓＤＮＡ及び未選択ライブラリーのスクレロスチンへの結合親和性。（Ｂ）濃縮ｓｓＤＮＡライブラリー及び未選択ライブラリーの対照タンパク質への結合親和性。
【図２】アプタマー候補の特異性特徴付けを示す図である。肝細胞及びＰＢＭＣへの結合と比較して、アプタマー候補は、ヒトスクレロスチンに対する高い選択性を示す。
【図３】４０ｎｔランダム領域を有するｓｓＤＮＡライブラリーから同定されたアプタマー候補の組換えヒトスクレロスチンへの結合親和性を示す図である。アプタマー候補及び抗体のスクレロスチンに対する解離定数値（Ｋｄ）を非線形カーブフィッティング分析によって算出した。スクレロスチンへの各アプタマー候補についてのＫｄ値は：それぞれａｐｔｓｃｌ  ６について４．２ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ９について３．４ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  １５について４５．６ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ４６について４３．１ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ５６について４３．１ｎＭ及びａｐｔｓｃｌ  １３２について４２．２ｎＭであった。Ｋｄ値は、スクレロスチンへの抗スクレロスチン抗体について３．５５ｎＭであった。
【図４−１】２５ｎｔランダム領域を有するｓｓＤＮＡライブラリーから同定されたアプタマー候補の組換えヒトスクレロスチンへの結合親和性を示す図である。各候補についての解離定数値（Ｋｄ）を、非線形カーブフィッティング分析によって算出した。各アプタマー候補及び抗体についてのＫｄ値は：それぞれａｐｔｓｃｌ  ３２について０．１８ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ２９について０．２８ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ２２について０．７６ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  １６について０．２２、ａｐｔｓｃｌ  ３について０．０４ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ２について０．００６ｎＭ及びａｐｔｓｃｌ  １について０．０２ｎＭであった。Ｋｄ値は、スクレロスチンへの抗スクレロスチン抗体について３．５５ｎＭであった。
【図４−２】２５ｎｔランダム領域を有するｓｓＤＮＡライブラリーから同定されたアプタマー候補の組換えヒトスクレロスチンへの結合親和性を示す図である。各候補についての解離定数値（Ｋｄ）を、非線形カーブフィッティング分析によって算出した。各アプタマー候補及び抗体についてのＫｄ値は：それぞれａｐｔｓｃｌ  ３２について０．１８ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ２９について０．２８ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ２２について０．７６ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  １６について０．２２、ａｐｔｓｃｌ  ３について０．０４ｎＭ、ａｐｔｓｃｌ  ２について０．００６ｎＭ及びａｐｔｓｃｌ  １について０．０２ｎＭであった。Ｋｄ値は、スクレロスチンへの抗スクレロスチン抗体について３．５５ｎＭであった。
【図５】ＴＯＰ−Ｗｎｔ−誘導ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用するアプタマー候補及び抗体の阻害強度評価を示す図である。（Ａ）抗体と比較した、アプタマー候補を用いて処置したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＷｎｔシグナル伝達のルシフェラーゼ活性。ａｐｔｓｃｌ  ５６、ａｐｔｓｃｌ  ６、ａｐｔｓｃｌ  ３及び抗スクレロスチン抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達でのスクレロスチンの拮抗作用を効果的に阻害でき、Ｗｎｔ−誘導ルシフェラーゼ活性を放出する。応答は、ａｐｔｓｃｌ  ５６及び６の濃度がそれぞれ２５及び４７．４μｇ／ｍｌに達した場合に安定であった。抗体を用いて処置した場合、応答は、本実験において濃度が２０ｍｇ／ｍｌに増加してもまだ安定でなかった。（Ｂ）ａｐｔｓｃｌ  ５６の阻害強度分析。ａｐｔｓｃｌ５６についてのＥＣ５０は、１９．７μｇ／ｍｌであった。（Ｃ）ａｐｔｓｃｌ  ６の阻害強度分析。ａｐｔｓｃｌ  ６についてのＥＣ５０は、３６．８μｇ／ｍｌであった。（Ｄ）ａｐｔｓｃｌ  ３の阻害強度分析。ａｐｔｓｃｌ  ３についてのＥＣ５０は、１８．２μｇ／ｍｌであった。
【図６−１】スクレロスチンへのａｐｔｓｃｌ  ３切断の特徴付けを示す図である。（Ａ）切断ａｐｔｓｃｌ  ３−１、−２、−３、−４及び−５は、スクレロスチンへの高い親和性を残していた一方で、ａｐｔｓｃｌ  ３−６は、スクレロスチンへの低い結合能力を示し、親和性分析にフィットできなかった。
【図６−２】スクレロスチンへのａｐｔｓｃｌ  ３切断の特徴付けを示す図である。（Ｂ）高結合親和性を残した切断ａｐｔｓｃｌ  ３−５は、細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路でのスクレロスチンの拮抗作用への高い阻害強度を保持していた（ＥＣ５０＝２８．４μｇ／ｍｌ）。
【図７】未修飾ａｐｔｓｃｌ  ５６と比較した修飾ａｐｔｓｃｌ  ５６の血清安定性評価を示す図である。すべてのアプタマーは、１０％及び１００％マウス血清を用いて０〜７２時間処置された。ほとんどすべての未修飾ａｐｔｓｃｌ５６は、１０％マウス血清でのインキュベーション４８時間後に分解された。２’−ＯＭｅ及び３’ｉｄＴ修飾ａｐｔｓｃｌ  ５６は、１０％マウス血清中で４８時間存続できた。１００％血清では、未修飾ａｐｔｓｃｌ  ５６は、８時間後に急速且つ完全に分解された。７２時間では、少量の修飾アプタマーが残ったままであった。
【図８】未修飾ａｐｔｓｃｌ  ３−５と比較した修飾ａｐｔｓｃｌ  ３−５の血清安定性評価を示す図である。すべてのアプタマーは、１０％及び１００％マウス血清を用いて０〜７２時間処置された。Ａｐｔｓｃｌ  ３−５は、１０％マウス血清での２４時間インキュベーション後に分解された。２’−ＯＭｅ及び３’ｉｄＴ修飾ａｐｔｓｃｌ  ３−５は、１０％マウス血清中で４８時間持続できた。１００％血清中では、未修飾ａｐｔｓｃｌ  ３−５は、８時間後に急速且つ完全に分解された一方で、修飾ａｐｔｓｃｌ  ３−５は、７２時間後に完全性を残すことができた。
【図９】化学修飾ａｐｔｓｃｌ  ５６及びａｐｔｓｃｌ  ３−５の親和性及び阻害強度を示すグラフである。化学修飾を有して、ａｐｔｓｃｌ５６及びａｐｔｓｃｌ  ３−５の両方はスクレロスチンへの高親和性及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害強度を残していた。
【図１０】ラット６匹でのａｐｔｓｃｌ  ５６の単回皮下注射の薬物動態を示すグラフである：ソフトウェアＤＡＳによってフィットされた薬物動態曲線（左、オレンジ）、実際の薬物動態曲線（右）。
【図１１】ラット６匹でのａｐｔｓｃｌ５６−ＰＥＧの単回皮下注射の薬物動態を示すグラフである：ソフトウェアＤＡＳによるフィットされた薬物動態曲線（左）、実際の薬物動態曲線（右）。
【図１２】ラットでのａｐｔｓｃｌ  ５６（青）及びａｐｔｓｃｌ  ５６−ＰＥＧ（オレンジ）の単回皮下注射の薬物動態をそれぞれ示すグラフである。
【図１３−１】骨粗鬆症を有する卵巣切除をされたラットにおける骨代謝へのＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６／ａｐｔｓｃｌ  ３の有効性の評価を示す図である。（ａ）研究の実験設計を示す模式図。注：ＢＭＤ：骨塩密度；Ｔｂ．ＢＶ／ＴＶ：相対骨梁量；Ｔｂ．ｖＢＭＤ：骨梁量（trabecular volume）塩密度；Ｔｂ．Ｔｈ：骨梁幅；Ｔｂ．Ｎ：骨梁数；Ｔｂ．Ｓｐ：骨梁中心距離（Trabecular spacing）；Ｔｂ．ｃｏｎｎ．Ｄ：骨梁連結（Trabecularconnection）密度；Ｔｂ．ＳＭＩ：骨梁構造（Trabecular structure）モデル指標；ＭＡＲ：塩沈着速度；ＢＦＲ／ＢＳ：骨形成速度；Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ：骨芽細胞表面；及びＯｂ．Ｎ／Ｂ．Ｐｍ：骨芽細胞の数；ＰＩＮＰ：プロコラーゲンＩの完全なＮ末端；ＯＰＧ：骨髄保護（bone protection）。シャム−ＢＳ：シャムベースライン；ＯＶＸ−ＢＳ：処置前のＯＶＳベースライン；シャム＋Ｖｅｈ：ビヒクルを用いて処置したシャムラット；ＯＶＸ＋Ｖｅｈ：ビヒクルを用いて処置したＯＶＸラット；ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ５６：ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ５６を用いて処置したＯＶＸラット；ＯＶＸ＋ＲＳ：ＰＥＧ４０Ｋ−無作為配列を用いて処置したＯＶＸラット。無作為配列：５’−ＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＧＴＣＣＧ−３’。データは、平均±標準偏差及びＯＶＸ−ＢＳとして表される。各群についてｎ＝１０。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１．
【図１３−２】骨粗鬆症を有する卵巣切除をされたラットにおける骨代謝へのＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６／ａｐｔｓｃｌ  ３の有効性の評価を示す図である。（ｂ）各群の遠位大腿骨骨梁の代表的３Ｄ微小構造画像及びマイクロＣＴパラメーター。注：ＢＭＤ：骨塩密度；Ｔｂ．ＢＶ／ＴＶ：相対骨梁量；Ｔｂ．ｖＢＭＤ：骨梁量（trabecular volume）塩密度；Ｔｂ．Ｔｈ：骨梁幅；Ｔｂ．Ｎ：骨梁数；Ｔｂ．Ｓｐ：骨梁中心距離（Trabecular spacing）；Ｔｂ．ｃｏｎｎ．Ｄ：骨梁連結（Trabecularconnection）密度；Ｔｂ．ＳＭＩ：骨梁構造（Trabecular structure）モデル指標；ＭＡＲ：塩沈着速度；ＢＦＲ／ＢＳ：骨形成速度；Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ：骨芽細胞表面；及びＯｂ．Ｎ／Ｂ．Ｐｍ：骨芽細胞の数；ＰＩＮＰ：プロコラーゲンＩの完全なＮ末端；ＯＰＧ：骨髄保護（bone protection）。シャム−ＢＳ：シャムベースライン；ＯＶＸ−ＢＳ：処置前のＯＶＳベースライン；シャム＋Ｖｅｈ：ビヒクルを用いて処置したシャムラット；ＯＶＸ＋Ｖｅｈ：ビヒクルを用いて処置したＯＶＸラット；ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ５６：ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ５６を用いて処置したＯＶＸラット；ＯＶＸ＋ＲＳ：ＰＥＧ４０Ｋ−無作為配列を用いて処置したＯＶＸラット。無作為配列：５’−ＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＧＴＣＣＧ−３’。データは、平均±標準偏差及びＯＶＸ−ＢＳとして表される。各群についてｎ＝１０。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１．
【図１３−３】骨粗鬆症を有する卵巣切除をされたラットにおける骨代謝へのＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６／ａｐｔｓｃｌ  ３の有効性の評価を示す図である。（ｃ）各群の近位脛骨骨梁の代表的３Ｄ微小構造画像及びマイクロＣＴパラメーター。注：ＢＭＤ：骨塩密度；Ｔｂ．ＢＶ／ＴＶ：相対骨梁量；Ｔｂ．ｖＢＭＤ：骨梁量（trabecular volume）塩密度；Ｔｂ．Ｔｈ：骨梁幅；Ｔｂ．Ｎ：骨梁数；Ｔｂ．Ｓｐ：骨梁中心距離（Trabecular spacing）；Ｔｂ．ｃｏｎｎ．Ｄ：骨梁連結（Trabecularconnection）密度；Ｔｂ．ＳＭＩ：骨梁構造（Trabecular structure）モデル指標；ＭＡＲ：塩沈着速度；ＢＦＲ／ＢＳ：骨形成速度；Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ：骨芽細胞表面；及びＯｂ．Ｎ／Ｂ．Ｐｍ：骨芽細胞の数；ＰＩＮＰ：プロコラーゲンＩの完全なＮ末端；ＯＰＧ：骨髄保護（bone protection）。シャム−ＢＳ：シャムベースライン；ＯＶＸ−ＢＳ：処置前のＯＶＳベースライン；シャム＋Ｖｅｈ：ビヒクルを用いて処置したシャムラット；ＯＶＸ＋Ｖｅｈ：ビヒクルを用いて処置したＯＶＸラット；ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ５６：ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ５６を用いて処置したＯＶＸラット；ＯＶＸ＋ＲＳ：ＰＥＧ４０Ｋ−無作為配列を用いて処置したＯＶＸラット。無作為配列：５’−ＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＧＴＣＣＧ−３’。データは、平均±標準偏差及びＯＶＸ−ＢＳとして表される。各群についてｎ＝１０。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１．
【図１３−４】骨粗鬆症を有する卵巣切除をされたラットにおける骨代謝へのＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６／ａｐｔｓｃｌ  ３の有効性の評価を示す図である。（ｄ）各群における第５椎骨の代表的３Ｄ微小構造画像及びマイクロＣＴパラメーター。注：ＢＭＤ：骨塩密度；Ｔｂ．ＢＶ／ＴＶ：相対骨梁量；Ｔｂ．ｖＢＭＤ：骨梁量（trabecular volume）塩密度；Ｔｂ．Ｔｈ：骨梁幅；Ｔｂ．Ｎ：骨梁数；Ｔｂ．Ｓｐ：骨梁中心距離（Trabecular spacing）；Ｔｂ．ｃｏｎｎ．Ｄ：骨梁連結（Trabecularconnection）密度；Ｔｂ．ＳＭＩ：骨梁構造（Trabecular structure）モデル指標；ＭＡＲ：塩沈着速度；ＢＦＲ／ＢＳ：骨形成速度；Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ：骨芽細胞表面；及びＯｂ．Ｎ／Ｂ．Ｐｍ：骨芽細胞の数；ＰＩＮＰ：プロコラーゲンＩの完全なＮ末端；ＯＰＧ：骨髄保護（bone protection）。シャム−ＢＳ：シャムベースライン；ＯＶＸ−ＢＳ：処置前のＯＶＳベースライン；シャム＋Ｖｅｈ：ビヒクルを用いて処置したシャムラット；ＯＶＸ＋Ｖｅｈ：ビヒクルを用いて処置したＯＶＸラット；ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ５６：ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ５６を用いて処置したＯＶＸラット；ＯＶＸ＋ＲＳ：ＰＥＧ４０Ｋ−無作為配列を用いて処置したＯＶＸラット。無作為配列：５’−ＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＧＴＣＣＧ−３’。データは、平均±標準偏差及びＯＶＸ−ＢＳとして表される。各群についてｎ＝１０。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１．
【発明を実施するための形態】
【００１６】
そうでないと示す又は定義しない限り、使用されるすべての用語は、当業者に明らかである当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”；Ｌｅｗｉｎ、“Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ”；及びＲｏｉｔｔら、“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第８編）などの標準的ハンドブック及び本明細書に引用される一般的背景技術が、例えば参照される。さらに、そうでないと示されない限り、詳細に具体的に記載されていないすべての方法、ステップ、技術及び操作は、実施されてもよく、それ自体が公知であり、当業者に明らかである様式で実施される。例えば、標準的ハンドブック、上に参照される一般的背景技術及びそれらに引用されるさらなる参考文献は、再度参照される。
【００１７】
定義
本明細書において使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド又はこれらの修飾形態及びこれらの類似物を指す。ヌクレオチドとして、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン並びにこれらの誘導体及び類似物）並びにピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン並びにこれらの誘導体及び類似物）を含む化学種が挙げられる。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指して互換的に用いられ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド並びにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾を含み、任意の位置でのヌクレオチド単位への種々の実体又は成分の付着が含まれる。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」は、２本鎖又は１本鎖分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、用語アプタマーよりも上位語であり、そのため用語、核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、アプタマーを含むが、アプタマーに限定されない。
【００１９】
本明細書において使用される場合「アプタマー」は、標的分子に望ましい作用を有する天然に存在しない核酸を指す。望ましい作用として、これだけに限らないが、標的の結合、標的を触媒的に変化させること、標的又は標的の機能活性を改変する又は変更する方法で標的と反応すること、標的に共有結合で結合すること、及び標的と別の分子との間の反応を促進することが挙げられる。一実施形態では、作用は、標的分子（スクレロスチンなど）に対する特異的結合親和性であり、かかる標的分子はＷａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対合又は三重らせん形成と無関係である機序を通じて核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここでアプタマーは、標的分子によって結合される公知の生理学的機能を有する核酸ではない。この文脈において、その標的（スクレロスチンなど）に対するアプタマーの「特異的結合親和性」は、アプタマーが、混合物又は試料中の他の、非標的構成成分に結合するよりも、全般にさらに高い親和性の程度を有してその標的に結合することを意味する。
【００２０】
配列「同一性」は、当技術分野において認められている意味を有し、２つの核酸又はポリペプチド分子又は領域間の配列同一性の百分率は、公開されている技術を使用して算出され得る。配列同一性は、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの全長に沿って又は分子の領域に沿って測定され得る（例えば：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド間の同一性を測定するために多数の方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者に周知である（Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８））。配列同一性パーセントを決定するために好適であるアルゴリズムの一例は、ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ（本明細書以下「ＢＬＡＳＴ」）において使用されるアルゴリズムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、１９９０及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５：３３８９〜３４０２、１９９７を参照されたい。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（本明細書以下「ＮＣＢＩ」）を通じて公的に入手可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列について）を使用して配列同一性を決定することにおいて使用されるデフォルトパラメーターは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２：Ｗ２０−Ｗ２５、２００４に記載されている。
【００２１】
スクレロスチンに対するアプタマー
タンパク質−セレックス技術に基づいて、本発明者らは、陽性スクリーニングのための標的タンパク質としてスクレロスチン、及び陰性スクリーニングのために無関係のタンパク質を使用し、高親和性を有してスクレロスチンに特異的に結合するアプタマーを最終的に選択した。本明細書に記載のスクレロスチンは、好ましくはヒトスクレロスチン、例えばそのアミノ酸配列が配列番号１８に示されるスクレロスチンである。
【００２２】
例示的ヒトスクレロスチンアミノ酸配列：
QGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY（配列番号１８）。
【００２３】
したがって、一態様では本発明は、スクレロスチンに対するアプタマーであって、配列番号１〜１７のいずれか１つに少なくとも約９０％同一性、少なくとも約９１％同一性、少なくとも約９０％同一性、約９２％同一性、少なくとも約９３％同一性、少なくとも約９４％同一性、少なくとも約９５％同一性、少なくとも約９６％同一性、少なくとも約９７％同一性、少なくとも約９８％同一性若しくは少なくとも約９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はアプタマーは、配列番号１〜１７のいずれか１つの中の少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個若しくはこれを超える連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アプタマーは、スクレロスチンに特異的に結合する、アプタマーを提供する。一部の好ましい実施形態では、アプタマーは、配列番号１〜１７及び１９〜２４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、より好ましくはアプタマーは、配列番号１、３、１０又は１９〜２３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、好ましくは４０ｎＭ未満、好ましくは３０ｎＭ未満、好ましくは２０ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満又はそれより低いスクレロスチンに対するＫｄ（解離定数）を有する。Ｋｄは、例えば酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ）によって測定される。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、スクレロスチンの生物学的活性を阻害する。「阻害」は、スクレロスチンの生物学的活性が、アプタマーの非存在と比較して、アプタマーの存在下で低減される、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、さらに少なくとも約９０％まで低減されることを意味する。
【００２６】
本明細書において使用される場合、用語「生物学的活性」は、生理的又は病態生理学的プロセスに影響を与える場合がある１つ又は複数の細胞内又は細胞外プロセスへの影響を指す。スクレロスチンの生物学的活性として、これだけに限らないが、Ｗｎｔシグナル伝達経路と拮抗することが挙げられる。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、Ｗｎｔシグナル伝達経路でのスクレロスチンの拮抗作用を阻害できる。例えば、本発明のアプタマーは、細胞ベースＷｎｔシグナル伝達経路においてスクレロスチンの拮抗作用を遮断できる。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、Ｗｎｔシグナル伝達経路でのスクレロスチンの拮抗作用を阻害するなどの、スクレロスチンの生物学的活性を１００μｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは４０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは３０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは２０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満又はそれより低いＥＣ５０値を有して阻害する。一部の実施形態では、ＥＣ５０値は、骨芽細胞においてＴＯＰ−Ｗｎｔ−誘導ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定される。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、１つ又は複数の修飾も含み得る。例えば、修飾は、アプタマーにヌクレアーゼ耐性の増強を付与する、及び／又はアプタマーのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増強する修飾である。
【００３０】
修飾として、例えば３’及び５’キャッピングなどの３’及び５’修飾が挙げられる。一部の実施形態では、アプタマーは、３’末端での逆位デオキシチミジン、すなわち３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾を用いてキャップされる。
【００３１】
修飾は、１つ又は複数の天然に存在するヌクレオチドの修飾ヌクレオチドを用いた置換も含むことができる。例えば、修飾ヌクレオチドとして、これだけに限らないが、２’−フルオロ、２’−メトキシエチル、２’−メトキシ及び／又は２’アリルオキシ修飾ヌクレオチド（すなわち、リボースの２’位ヒドロキシ基がフッ素、メトキシエチル、メトキシ又はアリルオキシなどによって置換されている）が挙げられる。修飾ヌクレオチドは、Ｃ５修飾ピリミジンを含み得る。用語「Ｃ５修飾ピリミジン」は、Ｃ５位に修飾を有するピリミジンを指す。Ｃ５修飾ピリミジンは、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強でき、当技術分野において公知である。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ  ２０１１／１３０１９５及びその中に引用されている参考文献を参照できる。一部の好ましい実施形態では、修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）修飾である。一部の実施形態では、２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）修飾などの修飾は、アプタマーの５’及び／又は３’末端で１つ又は複数のヌクレオチド、例えば４ヌクレオチドに行われる。
【００３２】
修飾は、非荷電結合（uncharged bond）（メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミン（phosphoamine）エステル、カルバメートなど）を有するヌクレオチド間修飾、及び荷電結合（charged bond）（ホスホロチオエート、ジチオリン酸など）を有するヌクレオチド間修飾、挿入剤（アクリジン、ソラレンなど）を有するヌクレオチド間修飾、キレート剤（金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含有するヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含有するヌクレオチド間修飾、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸など）を含有するヌクレオチド間修飾、などのヌクレオチド間修飾も含む。
【００３３】
修飾は、ペグ化修飾（ＰＥＧ修飾）を含んでもよい。ＰＥＧを含むコンジュゲーションは、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期などのアプタマーの半減期を延長できる。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、アプタマーの５’末端にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、ＰＥＧは、アプタマーの３’末端にコンジュゲートされ得る。
【００３４】
一部の実施形態では、アプタマーは、上に記載される種々の修飾の組合せを含んでもよい。例えば、アプタマーは、２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）修飾、３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾及び／又はＰＥＧ修飾を含んでもよい。好ましくは、ＰＥＧの分子量は、約４０ｋＤａである。
【００３５】
疾患の処置
別の態様では、本発明は、本発明のスクレロスチンに対するアプタマーによって疾患を処置する方法であって、本発明のスクレロスチンに対するアプタマーの治療有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３６】
本発明のスクレロスチンに対するアプタマーによって処置される疾患は、例えばスクレロスチン介在性疾患などのスクレロスチン関連疾患である。
【００３７】
本明細書において使用される場合「スクレロスチン関連疾患」として、骨塩密度（ＢＭＤ）が健康な対象と比べて異常に及び／又は病理学的に低い疾患が挙げられる。低いＢＭＤ及び／又は骨の脆弱性によって特徴付けられる疾患として、これだけに限らないが、原発性及び二次性骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、無腐性壊死（骨壊死）、骨折及びインプラント治癒（歯科インプラント及び股関節インプラント（hip implant））、他の疾患による（例えば、ＨＩＶ感染、がん又は関節炎に伴う）骨量減少が挙げられる。他の「スクレロスチン関連疾患」として、これだけに限らないが関節リウマチ、変形性関節症、関節炎及び溶骨性病変が挙げられる。
【００３８】
本明細書において使用される場合「スクレロスチン関連疾患」として、ミエローマ（例えば、溶骨性病変を有する多発性骨髄腫）、乳がん、結腸がん、メラノーマ、肝細胞がん、上皮がん、食道がん、脳がん、肺がん、前立腺がん又は膵臓がん及びこれらの任意の転移などのスクレロスチン関連がんが挙げられる。
【００３９】
「スクレロスチン関連疾患」は、少なくとも、腎臓及び心臓脈管構造（cardiovasculature）におけるスクレロスチンの発現による腎臓及び心血管系の状態も含み得る。前記疾患として、これだけに限らないが、腎糸球体疾患などの腎障害（例えば、急性及び慢性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、巣状増殖性（focal proliferative）糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、グットパスチャー症候群、多発性骨髄腫、糖尿病、多発性嚢胞腎、新生物、鎌形赤血球症及び慢性炎症性疾患などの全身性疾患に伴う腎糸球体病変）、尿細管疾患（例えば、急性尿細管壊死及び急性腎不全、多発性嚢胞腎、海綿腎、髄質嚢胞腎疾患、腎性糖尿病及び尿細管性アシドーシス）、尿細管間質性疾患（例えば、腎盂腎炎、薬物及び毒素誘発尿細管間質性腎炎、高カルシウム血症性腎症及び低カリウム血性腎症）急性及び急速進行性腎不全、慢性腎不全、腎結石症、痛風、血管疾患（例えば、高血圧及び腎硬化症、微小血管症性溶血性貧血、アテローム塞栓性腎疾患、びまん性皮質壊死及び腎梗塞）又は腫瘍（例えば、腎細胞癌及び腎芽腫）が挙げられる。
【００４０】
前記疾患として、これだけに限らないが、虚血性心疾患などの心血管系障害（例えば、狭心症、心筋梗塞及び慢性虚血性心疾患）、高血圧性心疾患、肺心症、心臓弁膜症（例えば、リウマチ熱及びリウマチ性心疾患、心内膜炎、僧帽弁逸脱並びに大動脈弁狭窄）、先天性心疾患（例えば、弁及び血管の閉塞性病変、心房性又は心室中隔欠損、並びに動脈管開存症）又は心筋疾患（例えば、心筋炎、うっ血性心筋症及び肥大性心筋症（cariomyopathy））も挙げられる。
【００４１】
対象は、これだけに限らないがネコ、イヌ、ウマ、ブタ及びウシを含む任意の動物（家畜、飼育動物又は野生）であってもよく、ヒト対象が好ましい。本明細書において使用される場合、用語患者、個体及び対象は、互換的に使用され得る。
【００４２】
対象は、オス又はメスであり得る。好ましくは、ヒト対象は、骨折のリスクがある、より好ましくは、ヒト対象は骨粗鬆症のリスクがある又は骨粗鬆症を罹患している。ヒト対象は、好ましくは女性であり、より好ましくは、閉経後骨粗鬆症のリスクがある又は閉経後骨粗鬆症を罹患している女性である。本発明の方法が、骨粗鬆症の任意のステージで対象に有益であり得ることが予期される。
【００４３】
本明細書において使用される場合、疾患又は疾患状態を罹患している個体を「処置する」ことは、処置後に個体の症状が部分的に又は完全に緩和される、又は未変化のままであることを意味する。したがって処置は、予防、処置及び／又は治癒を含む。予防は、疾患の可能性の予防及び／又は症状の悪化若しくは疾患の進行の予防を指す。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「治療有効量」又は「治療有効用量」は、対象への投与後に治療効果を生じるために少なくとも十分である化合物を含む物質、化合物、材料又は組成物の量を指す。したがって、疾患又は状態の症状を予防、治癒、回復、停止又は部分的に停止するために必要な量である。本明細書において使用される場合、「治療効果」は、疾患若しくは疾患状態の症状を変化させる、一般に回復又は緩和する又は疾患若しくは疾患状態を治癒する個体の処置から生じる効果を意味する。
【００４５】
スクレロスチンに対するアプタマーの投薬レジメンは、例えば患者の型、人種、年齢、体重、性別及び医学的状態；処置される状態の重症度；投与の経路；患者の腎機能及び肝機能；並びに使用されるスクレロスチンに対する特異的アプタマー又はその塩を含む種々の要因に応じて選択される。通常の熟練した医師は、状態の進行を予防する、それと闘う又は妨げるために必要な組成物の有効量を容易に決定及び特定できる。
【００４６】
典型的には、スクレロスチンに対するアプタマーの投薬レジメンは、１日あたり約１μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００４７】
例示的処置レジメンは、１日１回、２日ごとに１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１ヵ月に１回、３ヵ月ごとに１回若しくは３〜６ヵ月ごとに１回、又は最初に短い投与間隔（１週間に１回から３週間ごとに１回など）の後に間隔を延長して（１ヵ月に１回から３〜６ヵ月ごとに１回など）の投与を伴う。投与の頻度及び間隔は、アプタマーの薬物動態パラメーターに応じて当業者によって決定され得る。
【００４８】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのスクレロスチンに対するアプタマー及び薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物も提供する。前記医薬組成物は、例えば、スクレロスチン関連疾患を処置するために使用される。
【００４９】
本明細書に記載のアプタマーは、これだけに限らないが、注射可能な剤形、液体分散剤、ゲル剤、アエロゾル剤、軟膏、クリーム剤、凍結乾燥製剤、乾燥粉剤、錠剤、カプセル剤、放出制御製剤、急速溶解（fast melt）製剤、放出遅延製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、即時放出製剤と放出制御製剤の混合物など、を含む薬学的に許容できる任意の剤形で利用され得る。詳細には、本明細書に記載のアプタマーは：（ａ）経口、肺、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、直腸内、点眼、結腸、非経口、大槽内、腟内、腹腔内、局所（local）、バッカル、経鼻及び局所投与のいずれかから選択される投与のために；（ｂ）液体分散剤、ゲル剤、アエロゾル剤、軟膏、クリーム剤、錠剤、サシェ剤及びカプセル剤のいずれかから選択される剤形に；（ｃ）凍結乾燥製剤、乾燥粉剤、急速溶解製剤、放出制御剤、放出遅延製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤及び即時放出製剤と放出制御製剤との混合物のいずれかから選択される剤形に；又は（ｄ）これらの任意の組合せに、製剤化され得る。
【００５０】
非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁物は、以下の構成成分の１つ又は複数を含み得る：（１）注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；（２）ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；（３）アルコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化物質；（４）エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；（５）酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤；及び（６）塩化ナトリウム又はブドウ糖などの浸透圧の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラス又はプラスチックで作られたアンプル、ディスポーザブルシリンジ又は複数用量バイアルに封入されてもよい。
【００５１】
注射可能な使用のために好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性である場合）又は分散剤及び、滅菌注射可能溶液又は分散剤の即時調製のための滅菌粉剤を含み得る。静脈内投与のために、好適な担体として、生理食塩水、静菌水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において組成物は、滅菌されていなければならず、容易なシリンジ使用可能性（syringability）が存在する程度に流体でなければならない。医薬組成物は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用に対抗して保存されなければならない。本明細書において使用される場合、用語「安定」は、患者への投与のために好適である状況又は状態のままであることを意味する。
【００５２】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）並びにこれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合は必要な粒子サイズの維持によって、及びサーファクタントの使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アルコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール又はソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムなどの無機塩を含むことは好ましい。注射可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【００５３】
滅菌注射可能溶液は、必要量の活性試薬（例えば、スクレロスチンに対するアプタマー）を上に列挙された成分の１つ又は組合せを含む適切な溶媒に組み込むことに続く、ろ過滅菌によって調製され得る。一般に、分散剤は、少なくとも１つのスクレロスチンに対するアプタマーを、塩基性分散媒及び任意の他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉剤の場合では、例示的調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、その両方は、スクレロスチンアプタマーに加えてその予め滅菌ろ過された溶液由来の任意の追加的な望ましい成分の粉剤を生じる。
【００５４】
経口組成物は、不活性希釈剤又は食用担体を一般に含む。それらは、例えば、ゼラチンカプセル中に封入又は錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、スクレロスチンアプタマーは、賦形剤を組み込まれてもよく、錠剤、トローチ剤又はカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物は口腔洗浄薬としての使用のために流体担体を使用しても調製されてもよく、ここで流体担体中の化合物は、経口適用され、すすがれ、吐き出される又は飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤及び／又はアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。
【００５５】
吸入による投与のために、化合物は、好適な噴霧剤、例えば二酸化炭素などの気体を含有する加圧した容器又はディスペンサーからのエアロゾルスプレー、噴霧液又は好適なデバイスからの乾燥粉剤の形態で送達される。経粘膜又は経皮投与のために、浸透されるバリアに好適な浸透剤が、製剤において使用される。かかる浸透剤は、一般に当技術分野において公知であり、例えば経粘膜投与のための、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬又は座薬の使用を通じて達成され得る。経皮投与のために、活性試薬は、一般に当技術分野において公知の軟膏、膏薬（salve）、ゲル剤又はクリーム剤に製剤化される。試薬は、直腸内送達のための座薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の座薬ベースを用いて）又は保持浣腸（retention enema）の形態でも調製され得る。
【００５６】
一実施形態では、スクレロスチンに対するアプタマーは、局所投与のために製剤化される。本明細書において使用される場合、「局所投与」は、動物の皮膚（表皮）のすべて又は一部にスクレロスチンに対するアプタマーを含む製剤を直接又はそれ以外の方法で接触させることによる、動物へのスクレロスチンに対するアプタマーの送達を指す。用語は、これだけに限らないが、局所及び経皮を含むいくつかの投与の経路を包含する。これらの投与様式についての一般的要求要件は、標的組織又は層への効率的な送達である。一態様では、局所投与は、表皮及び真皮に浸透させる、最終的にはアプタマーの全身性送達を達成するための手段として使用される。別の態様では、局所投与は、スクレロスチンに対するアプタマーを動物の表皮若しくは真皮に、又はそれらの特定の層に選択的に送達するための手段として使用される。
【００５７】
局所投与のために、スクレロスチンに対するアプタマーは、薬学的に許容できる軟膏、クリーム剤、ローション剤、眼軟膏、点眼剤、点耳剤、浸透包帯（impregnated dressing）及びアエロゾル剤、薬用粉剤、薬用粘着剤（medicatedadhesive）、フォーム剤に製剤化されてもよく、例えば、薬物の浸透及び軟化を補助するために、保存剤又は溶媒を含む適切な従来の添加剤及び賦形剤を軟膏、ゲル剤及びクリーム剤に含有する場合がある。かかる局所製剤は、適合する従来の担体、例えばローション剤のためのエタノール又はオレイルアルコールも含有し得る。かかる担体は、製剤の約１重量％〜約９８重量％を構成する場合があり；さらに一般的には、かかる担体は製剤の約８０重量％までを構成する。アプタマーの局所送達のための具体的な製剤は、当技術分野において記載されている。
【００５８】
一実施形態では、スクレロスチンに対するアプタマーは、身体からの急速な排出から保護する担体を用いて調製される。例えば、放出制御製剤を使用することができ、インプラント及びマイクロカプセル化送達系が挙げられる。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーも使用され得る。かかる製剤の調製のための方法は、当業者に明らかである。
【００５９】
リポソーム懸濁物も、薬学的に許容できる担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法により調製され得る。
【００６０】
加えて、スクレロスチンに対するアプタマーの懸濁物は、適切な油性注射懸濁物としても調製することができる。好適な親油性溶媒又はビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド若しくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。脂質ではないポリカチオンアミノポリマーも送達のために使用することができる。任意選択で懸濁物は、化合物の溶解度を増加させるため、及び高濃度の溶液の調製を可能にするために好適な安定剤又は薬剤も含むことができる。
【００６１】
一部の場合では、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、投薬単位形態で経口又は非経口組成物に製剤化されることは、特に有利である可能性がある。本明細書において使用される場合、投薬単位形態は、処置される対象への一体化された投薬として適する物理的に別々の単位を指し；各単位は、必要な医薬用担体と共に望ましい治療効果をもたらすように算出されたスクレロスチンに対するアプタマーの予め決定された量を含有する。本明細書に記載のスクレロスチンに対するアプタマーの投薬単位形態についての仕様書は、スクレロスチンに対する特定のアプタマーの固有の特徴、及び達成される詳細な治療効果及び個体の処置のための活性剤などを配合する当技術分野に内在する制限によって決定され、直接依存する。
【００６２】
少なくとも１つのスクレロスチンに対するアプタマーを含む医薬組成物は、１つ又は複数の医薬賦形剤を含み得る。かかる賦形剤の例として、これだけに限らないが、結合剤、充填剤、潤滑剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、保存剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤（effervescent agent）及び他の賦形剤が挙げられる。かかる賦形剤は、当技術分野において公知である。例示的賦形剤として：（１）種々のセルロース及び架橋ポリビニルピロリドン、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）ＰＨ１０１及びアビセルＰＨ１０２などの結晶セルロース、ケイ化結晶セルロース（プロソルブＳＭＣＣ（ＰｒｏＳｏｌｖ  ＳＭＣＣ（商標））、トラガカントガム並びにゼラチン、を含む結合剤；（２）種々のデンプン、乳糖、乳糖一水和物及び無水乳糖などの充填剤；（３）アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、コーンスターチ、軽度に架橋したポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン及び修飾デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン（cross-povidone）、デンプングリコール酸ナトリウム並びにこれらの混合物、などの崩壊剤；（４）ステアリン酸マグネシウム、エアロシル２００（Ａｅｒｏｓｉｌ  ２００）などのコロイド性二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム及びシリカゲルを含む、圧縮される粉末の流動性に作用する薬剤を含む潤滑剤；（５）コロイド性二酸化ケイ素などの滑剤；（６）ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸及びその塩、ブチルパラベンなどのパラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、エチル若しくはベンジルアルコールなどのアルコール、フェノールなどのフェノール化合物又は塩化ベンザルコニウムなどの四級化合物、などの保存剤；（７）結晶セルロース、乳糖、二塩基性リン酸カルシウム、糖類及び／又は前述のものの任意の混合物などの薬学的に許容できる不活性充填剤などの希釈剤；希釈剤の例として、アビセルＰＨ１０１及びアビセルＰＨ１０２などの結晶セルロース；乳糖一水和物、乳糖無水物及びファーマトース（Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ）ＤＣＬ２１などの乳糖；エムコンプレス（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ）などの二塩基性リン酸カルシウム；マンニトール；デンプン；ソルビトール；ショ糖；及びグルコースが挙げられる；（８）ショ糖、サッカリン、ショ糖、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム及びアセサルフェームなどの任意の天然又は人工甘味料を含む甘味剤；（９）ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味剤、マグナスイート（Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ）（ＭＡＦＣＯの商標）、バブルガム風味、果実香料などの香味剤；並びに（１０）有機酸と炭素塩又は炭酸水素塩などの発泡カップル（effervescent couple）を含む発泡剤、が挙げられる。
【実施例】
【００６３】
本発明は、以下の実施例によりさらに記載されるが、本発明の範囲は、記載される実施例に限定されない。
【００６４】
実施例１．スクレロスチンに対する高親和性アプタマーの濃縮及び選択
ｓｓＤＮＡライブラリーは、各末端の１８ｎｔ保存領域及び中央の無作為領域からなる。異なる長さの無作為化配列を含む２つのｓｓＤＮＡライブラリーを本プロジェクトにおいて使用した。長いｓｓＤＮＡライブラリーは、４０ｎｔランダム領域（５’−ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣ−（Ｎ）４０−ＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣ−３’）を含有し、短いｓｓＤＮＡは、２５ｎｔランダム領域（５’−ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣ−（Ｎ）２５−ＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣ−３’）を含有する。フォワードプライマー（ＦＰ：５’−ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣ−３’）及びビオチン化リバースプライマー（Ｂｉｏ−ＲＰ：５’−ビオチン−ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ−３’）を選択の際のｓｓＤＮＡの増幅のために合成した。すべてのオリゴは、合成後にＨＰＬＣによって精製した。
【００６５】
タンパク質−セレックス法を、高親和性アプタマーを同定するために実施した（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ  １９９０、Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ  １９９０）。１００〜３０ｐｍｏｌｅのＨｉｓ６−スクレロスチンタンパク質をＮＴＡ磁気ビーズに４℃で１時間、固定した（Ｍｕｒｐｈｙ、Ｆｕｌｌｅｒら、２００３）。１ｎｍｏｌｅのｓｓＤＮＡライブラリーを９５℃で５分間、変性させ、４℃に急速に冷却し、その後固定化スクレロスチンタンパク質とＲ．Ｔ．、０．５〜１時間インキュベーションした。未結合配列を洗浄緩衝液を用いて除去した。洗浄後、結合ＤＮＡタンパク質−ＮＴＡを回収し、Ｈ２Ｏ／ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０に再懸濁し、ＰＣＲ増幅に適用した。ＰＣＲを未修飾フォワードプライマー及びビオチン化リバースプライマーを用いて実施した（ステップ１：初期変性のために９５℃、１分間；ステップ２：変性のために９５℃、３０秒間、アニーリングのために５６℃、３０秒間、伸長のために７２℃、３０秒間、１２サイクル反復；及びステップ３：最終伸長のために７２℃、５分間）。ＰＣＲ産生物をビオチン−ストレプトアビジン結合を通じてストレプトアビジン磁気ビーズに適用した。１本鎖配列を０．２Ｍ  ＮａＯＨを用いて処置することによって再生した。陰性選択をＮＴＡ磁気ビーズに固定した他のＨｉｓ６−タグ化した無関係なタンパク質に対して実施した。合計２０ラウンドのセレックスを各選択のために実施した。最終ラウンドからのＤＮＡプールをハイスループット次世代シークエンス（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＮＧＳ）に出した。
【００６６】
図１は、スクレロスチンへのＤＮＡプールの親和性が１０回目及び２０回目の選択後に増加することを示しており、高親和性スクレロスチンアプタマーがセレックスによって濃縮されることを示している。
【００６７】
実施例２．候補スクレロスチンアプタマーの特異性特徴付け
ＮＧＳ結果により、高出現率を有する代表的なアプタマーを特異性アッセイのために合成した。これらのアプタマー候補の詳細な配列を表１に列挙した。
【００６８】
アプタマー候補のスクレロスチンへの特異性を決定するために、代表的なアプタマー候補及び無作為配列（ＲＳ）（陰性対照）を、Ｎ末端ビオチン化修飾を用いて合成し、１μＭの各アプタマー／ＲＳを、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ）を使用してスクレロスチンへの特異性を決定するために使用した。精製組換えヒトスクレロスチン１６０ｎｇを、９６ウエルマイクロタイタープレートに１００μｌ  ＰＢＳ中、４℃で一晩、インキュベートすることによってコートした。次にプレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ツイーン２０及び１％ＢＳＡ）を用いて１時間、室温でブロッキングし、セレックスＢ＆Ｗ緩衝液（ＰＢＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ツイーン２０及び０．１％ＢＳＡ）を用いて４回洗浄した。アプタマー候補を９５℃で１０分間変性させ、使用前に氷上で１０分間急速に冷却した。１μＭビオチン化アプタマーを各ウエルに加え、次にセレックスＢ＆Ｗ緩衝液を１００μｌまで加え、４５分間、室温で継続的に穏やかに振とうしながらインキュベートした。結合後、プレートをセレックスＢ＆Ｗ緩衝液を用いて、非特異的な及び非常に弱い結合を除去するために４回洗浄し、その後ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡを用いて４回洗浄した。１００μｌストレプトアビジン−ＨＲＰ／ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡに１：１００００希釈）を各ウエルに加え、３０／６０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡを用いて４回洗浄した。５０μｌ  ＴＭＢを各ウエルに加え、２０分間インキュベートした。反応を、５０μｌ  ２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した（Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ，Ｋｒａｆｃｉｋｏｖａら、２０１６）。肝細胞／ＰＢＭＣへのアプタマー候補の結合能力を決定するため、特徴付けステップはＥＬＯＮＡと同様であった。細胞３００，０００個を各アプタマー候補とインキュベートし、洗浄及び分離目的のために遠心分離を使用した。
【００６９】
長い及び短い両方のｓｓＤＮＡライブラリーから同定したアプタマー候補は、肝細胞及びＰＢＭＣへの結合を比較した場合にヒトスクレロスチンへの高い選択性を示した（図２）。アプタマー候補、長いｓｓＤＮＡライブラリーから同定されたａｐｔｓｃｌ  ６、９、１５、２７、３４、３６、４６、５１、５６、１３２及び１４０、短いｓｓＤＮＡライブラリーから同定されたａｐｔｓｃｌ  １、２、３、５、８、１２．１６、２２、２９及び３２は、スクレロスチンへの高い結合特異性を示し、それにより続く親和性特徴付けのために選択した。
【００７０】
実施例３．候補スクレロスチンアプタマーの結合親和性特徴付け
酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ）をスクレロスチンへのアプタマー候補の結合親和性を決定するために実施した（Ｄｒｏｌｅｔ，Ｍｏｏｎ−ＭｃＤｅｒｍｏｔｔら、１９９６）。同様に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、ヒトスクレロスチンへの抗スクレロスチン抗体の結合親和性を決定するために実施した（Ｅｎｇｖａｌｌ及びＰｅｒｌｍａｎｎ  １９７１）。精製組換えヒトスクレロスチン１６０ｎｇを、９６−ウエルマイクロタータープレートに１００μｌ  ＰＢＳ中、４℃で一晩、インキュベートすることによってコートした。次にプレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ツイーン２０及び１％ＢＳＡ）を用いて１時間、室温でブロックし、セレックスＢ＆Ｗ緩衝液（ＰＢＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ツイーン２０及び０．１％ＢＳＡ）を用いて４回洗浄した。アプタマー候補を９５℃で１０分間変性させ、使用前に氷上で１０分間急速に冷却した。適切な濃度のビオチン化アプタマー／抗体を各ウエルに加え、次にセレックスＢ＆Ｗ緩衝液を１００μｌまで加え、４５分間、室温で継続して穏やかに振とうしながらインキュベートした。結合後、プレートを非特異的な及び非常に弱い結合を除去するためにセレックスＢ＆Ｗ緩衝液を用いて４回洗浄し、その後ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡを用いて４回洗浄した。１００μｌストレプトアビジン−ＨＲＰ／ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡに１：１００００希釈）を各ウエルに加え、３０／６０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡを用いて４回洗浄した。５０μｌ  ＴＭＢを各ウエルに加え、２０分間インキュベートした。反応を、５０μｌ  ２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した（Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ，Ｋｒａｆｃｉｋｏｖａら、２０１６）。データをオリジンソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を用いて分析した。非線形カーブフィッティングモデルＨｙｐｅｒｂｌを、結合曲線をプロットするために使用した。Ｈｙｐｅｒｂｌモデルの式は、ｙ＝Ｐ１×ｘ／（Ｐ２＋ｘ）であり、Ｐ２はＫｄ値である。
【００７１】
４０ｎｔランダム領域を含有するｓｓＤＮＡライブラリーから同定されたアプタマー候補について、ａｐｔｓｃｌ  ６、９、１５、４６、５６及び１３２は、ナノモルレベルでの解離定数（Ｋｄ）値（Ｋｄ値は、それぞれ４．２、３．４、４５．６、４３．１及び４２．２ｎＭであった）を有してスクレロスチンに高親和性を示した（図３）。一方ａｐｔｓｃｌ  ３６、１４０、１３６及び無作為配列（ＲＳ）は、フィットできなかった。２５ｎｔランダム領域を含有するｓｓＤＮＡライブラリーから同定されたアプタマー候補について、ａｐｔｓｃｌ  ３２、２９、２２、１６、３、２及び１は、それぞれ０．１８、０．２８、０．７６、０．０２、０．０４、０．００６及び０．０２ｎＭのＫｄ値を有して、スクレロスチンにより高い結合親和性を示した（図４−１、図４−２）。無作為配列は、スクレロスチンに低い結合能力を示し、フィットできなかった。比較して、スクレロスチンへの抗スクレロスチン抗体のＫｄ値は、３．５５ｎＭであった。
【００７２】
実施例４．骨硬化症の活性への候補スクレロスチンアプタマーの阻害能力のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
Ｗｎｔシグナル伝達でのスクレロスチンに対するアプタマーの拮抗作用の阻害強度を研究するために、ＴＯＰ−Ｗｎｔ誘導ルシフェラーゼレポーターアッセイを骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において使用した（ｖａｎ  Ｂｅｚｏｏｉｊｅｎ，Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、２００７、Ｓｈｕｍ，Ｃｈａｎら、２０１１）。
【００７３】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２４ウエルプレートに播種し、細胞を対応するレポータープラスミド（１００ｎｇ）、Ｗｎｔ３ａプラスミド（８００ｎｇ）及びスクレロスチンプラスミド（８００ｎｇ）を用いてトランスフェクトし、必要に応じて翌日ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。トランスフェクションの１０時間後、培養培地を新鮮培地に交換し、細胞をアプタマー／抗体を用いて処置した。処置２４時間後、細胞の各ウエルを、１００μｌ受動的溶解緩衝液を用いて溶解し、２０μｌを分析のために採取した。ルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩ）及びＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬を調製し、製造者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってスペクトラマックスｉ３ｘマルチモードディテクションプラットフォーム（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘ  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）によって自動的に加え、それによりデータを分析した（Ｇｒｅｎｔｚｍａｎｎ，Ｉｎｇｒａｍら、１９９８、ＭｃＮａｂｂ，Ｒｅｅｄら、２００５）。
【００７４】
図５に示すとおり、ａｐｔｓｃｌ  ５６、ａｐｔｓｃｌ  ６、ａｐｔｓｃｌ  ３及び抗スクレロスチン抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達でのスクレロスチンの拮抗作用を有効に阻害でき、Ｗｎｔ誘導ルシフェラーゼ活性を放出できる。スクレロスチンへの阻害は、用量依存的であり、応答は、ａｐｔｓｃｌ  ５６及び６の濃度がそれぞれ２５及び４７．４μｇ／ｍｌに達した場合に安定であった。抗体を用いて処置している間、応答は、濃度が２０ｍｇ／ｍｌに増加してもまだ安定でなかった。さらにａｐｔｓｃｌ  ５６、ａｐｔｓｃｌ  ６及びａｐｔｓｃｌ  ３の阻害強度を、非線形カーブフィッティングを用いて分析した。ａｐｔｓｃｌ５６、ａｐｔｓｃｌ６及びａｐｔｓｃｌ  ３についてのＥＣ５０は、それぞれ１９．７μｇ／ｍｌ、３６．８μｇ／ｍｌ及び１８．２μｇ／ｍｌであった。
【表１】
2021513365.tif 000002
【００７５】
実施例５．ａｐｔｓｃｌ３の切断及び特徴付け
スクレロスチンへの高い親和性及び阻害強度を示したＡｐｔｓｃｌ３を、切断した（表２）。結合親和性及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害強度は、先の研究と同じプロトコールを使用して実施した。Ａｐｔｓｃｌ  ３−１、−２、−３、−４及び−５は、それぞれ０．８６、０．５２、０．２及び０．２２ｎＭのＫｄ値を有してスクレロスチンへの高い結合親和性を残していた。一方ａｐｔｓｃｌ  ３−６は、この濃度範囲で結合曲線にフィットできず、スクレロスチンへの低い結合能力を示している（図６−１）。さらに、ａｐｔｓｃｌ３−５は、Ｗｎｔシグナル伝達でのスクレロスチンの拮抗作用への高い阻害強度を保持していた（ＥＣ５０＝２８．４μｇ／ｍｌ）（図６−２）。
【表２】
2021513365.tif 000003
【００７６】
実施例６．化学修飾アプタマー候補の血清安定性評価
本発明者らは、スクレロスチンに対するＤＮＡアプタマーを選択し、ａｐｔｓｃｌ  ５６及びａｐｔｓｃｌ  ３−５と呼ばれ、低ナノモル範囲の解離定数を有してスクレロスチンに特異的且つ堅く結合する２つの切断アプタマーを最終的に開発した。核酸アプタマーのかさ高い２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾は、臨床例において見られるそれらのヌクレアーゼ耐性の増強及び２本鎖融解温度の上昇のために選択後修飾として以前から使用されている（Ｆｉｎｅ，Ｍａｒｔｉｎら、２００５；Ｇｕｐｔａ，Ｈｉｒｏｔａら、２０１４）。逆位ｄＴを用いた３’末端キャッピングも進行中又は完了した臨床試験での疾患治療のためのアプタマーにおける一般的戦略である（Ｐａｄｉｌｌａ，Ｓｏｕｓａら、１９９９；Ｒｕｃｋｍａｎ，Ｇｒｅｅｎら、１９９８）。合わせて、本実施例は、ａｐｔｓｃｌ  ５６及びａｐｔｓｃｌ  ３−５の血清安定性が２’−ＯＭｅ及び３’末端逆位ｄＴ（３’−ｉｄＴ）修飾によって改善され得るかどうかを評価するものである。
【００７７】
実験設計：
修飾ヌクレオチドは、合成中に導入された。修飾及び未修飾アプタマーの血清代謝安定性を新たに調製されたマウス血清において評価した。すべてのアプタマー試料を１０％及び１００％マウス血清を用いてそれぞれ３７℃で、０、２、４、８、１２、２４、３６、４８及び７２時間インキュベートした。指定時間に、アプタマー試料をドライアイス浴中で急速凍結し、次いで評価のためにすべての試料を採取するまで−８０℃で保存した。すべてのアプタマー試料の安定性は、アガロースゲル電気泳動によって決定できる、インキュベーション後に残っている未処置アプタマーのバンド密度で表された。
【００７８】
ＤＮＡ合成プロトコール
修飾及び未修飾ＤＮＡ配列を、商業的に入手可能な５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシヌクレオシド（ＡＢｚ、ＣＡｃ、ＧｉＢｕ及びＴ）ホスホラミダイトモノマー、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メチルヌクレオシド（ＡＢｚ、ＣＡｃ、ＧｉＢｕ及びＴ）ホスホラミダイトモノマー及び／又は５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｆ−ヌクレオシド（ＡＢｚ、ＣＡｃ、ＧｉＢｕ及びＴ）ホスホラミダイトモノマーを使用して、Ｋ＆Ａ  Ｈ８スダンダードＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で、１μｍｏｌスケールで合成した（Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ  ２００１）。ａｐｔｓｃｌ５６の修飾配列は、ＣＧＧＧＧ  ＴＧＴＧＧ  ＧＴＴＣＧ  ＴＣＧＴＴ  ＡＧＣＴＴ  ＧＡＴＴＴ  ＧＧＣＡＧ  ＣＴＧＣＣＣ−ｉｄＴであり、下線を付けたヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ修飾された。ａｐｔｓｃｌ  ３−５の修飾配列は、ＧＣＴＡＧ  ＣＴＧＴＴ  ＧＴＡＣＡ  ＴＣＧＣＣ  ＴＴＡＣＧ  ＣＡＣＧＴ  Ｇ−ｉｄＴであり、下線を付けたヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ修飾された。
【００７９】
評価プロトコール：
すべてのアプタマー試料のバンド密度をモレキュラーイメイジャー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｅｒ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によってアッセイした（Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｎｏｌｔｅら、１９９６、Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ，Ｍｅｒｈｉら、２０１２）。結合親和性及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害強度を先の研究と同じプロトコールを使用して実施した。
【００８０】
結果：
ａｐｔｓｃｌ  ５６について、未修飾アプタマーは、１０％血清中４８時間後では完全に分解され、１００％血清中わずか８時間では残存した。２’−ＯＭｅ及び３’ｉｄＴ修飾ａｐｔｓｃｌ  ５６は、１０％マウス血清中７２時間では残存し、１２時間後に分解された。７２時間では、少量の修飾アプタマーがまだ残っていた（図７）。
【００８１】
ａｐｔｓｃｌ  ３−５について、未修飾アプタマーは、１０％マウス血清中２４時間後に分解された。２’−ＯＭｅ及び３’ｉｄＴ修飾ａｐｔｓｃｌ  ３−５は、１０％マウス血清中４８時間で存続する場合があった。１００％血清では、未修飾ａｐｔｓｃｌ  ３−５は、８時間後に急速且つ完全に分解された一方で、修飾ａｐｔｓｃｌ  ３−５は、７２時間後に完全性を残すことができた（図８）。
【００８２】
化学修飾ａｐｔｓｃｌ  ５６及びａｐｔｓｃｌ  ３−５はそれぞれ６．５５及び０．５４ｎＭのＫｄ値を有して、スクレロスチンへの高い結合親和性を示した。さらに、化学修飾ａｐｔｓｃｌ  ５６及びａｐｔｓｃｌ  ３−５は、細胞中でＷｎｔシグナル伝達でのスクレロスチンの拮抗作用を、１４及び１１μｇ／ｍｌの阻害強度をそれぞれ有して有効に阻害できた（図９）。
【００８３】
結論：
２’−ＯＭｅ及び３’ｉｄＴを用いた修飾は、治療用ヌクレアーゼ耐性アプタマーに向けたａｐｔｓｃｌ  ５６及びａｐｔｓｃｌ  ３−５の開発をさらに促進できる。
【００８４】
実施例７．ＰＥＧ修飾を有するアプタマー
これは、ラットでの皮下投与後のスクレロスチンに対するＰＥＧ修飾を有する及び有さないアプタマー（ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６及びａｐｔｓｃｌ  ５６）の血漿薬物動態を決定するためである。ａｐｔｓｃｌ  ５６の配列は、ＣＧＧＧＧ  ＴＧＴＧＧ  ＧＴＴＣＧ  ＴＣＧＴＴ  ＡＧＣＴＴ  ＧＡＴＴＴ  ＧＧＣＡＧ  ＣＴＧＣＣＣ−ｉｄＴであり、開始ＣＧＧＧ及び末端ＧＣＣＣの各ヌクレオチドは、２’−ＯＭｅを用いて修飾される。これに基づいて、ＰＥＧ４０Ｋ（４０，０００の分子量を有するＰＥＧ）が、ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６を得るように５’末端にさらに付着される。
【００８５】
実験設計：
アプタマーａｐｔｓｃｌ５６及びＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の薬物動態研究を、標準的実験室餌を自由摂取させ、管理された条件（１２時間光サイクル、２０℃）で飼育された６ヵ月齢メスバージンスプラーグドーリーラットで実施した。ラットをそれぞれ、６．１ｍｇ／ｋｇ  ａｐｔｓｃｌ５６及び２５ｍｇ／ｋｇ  ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６を用いて単回皮下注射によって処置した。Ａｐｔｓｃｌ５６及びＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６は、投与のためにそれぞれ生理食塩水に１．６ｍｇ／ｍｌ及び６．２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した（Ｊｕｄｉｔｈ  Ｍ．Ｈｅａｌｙ，Ｒｙａｎ  Ｍ．Ｂｏｏｍｅｒら、２００４）。血液試料を各処置群のラット複製（ｎ＝６）からさまざまな時点（ａｐｔｓｃｌ５６：５分間、１５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間；ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６：３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、５４時間、６２時間、７０時間、７６時間、８４時間、９６時間、１０７時間）で回収し、血漿を単離した。プロテイナーゼＫによって処置した後、血漿中の残りのａｐｔｓｃｌ５６及びＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６をＨＰＬＣによって定量した。
【００８６】
評価プロトコール
試料調製：およそ８００μｌの血液を各ラットから眼窩静脈を介して取り、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを含有するチューブ（１．８ｍｌバキュテナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に回収し、次いで直ちに湿らせた氷の上に置いた（Ｈｅａｌｙ，Ｌｅｗｉｓら、２００４、Ｐｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｓｍｅｓｔａｄら、２０１５）。血漿を回収後１時間以内で可能な限り速やかに、６０００ｇ、１０分間、４℃での遠心分離によって単離し、分析まで−８０℃で保存した（Ｈｅａｌｙ，Ｌｅｗｉｓら、２００４、Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ，Ｍｅｒｈｉら、２０１２、Ｇａｏ，Ｓｈｅｎら、２０１６）。分析の前に、２５μｌ消化緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳ）並びに７５μｌのプロテイナーゼ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０％グリセロールｖ／ｖ中１ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）を５０μｌ血漿試料に加えた。次に試料を５５℃で一晩、振とうしながらインキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離（１４０００ｒｐｍ；４℃；１５分間）し、１００μｌの上清を取り、ＨＰＬＣインジェクションバイアルに移した（Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ，Ｍｅｒｈｉら、２０１２）。
【００８７】
ＨＰＬＣ定量：ＨＰＬＣ系は、さまざまな時点で回収された血漿試料中のＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６を定量するためにＣ４カラムを備えており、一方Ｃ１８カラムをａｐｔｓｃｌ  ５６の定量のために利用した。両法は、相Ａ（ＴＥＡＡ［ｐＨ７．０］）及び相Ｂ（アセトニトリル）から作製する移動相溶出グラジエントを使用した。流速は、両方とも１．０ｍＬ／分、カラムオーブン温度設定は５０℃であった。アッセイインジェクション体積は、２０ｕＬであった。標準物質は、さまざまな濃度のａｐｔｓｃｌ５６及びＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６をそれぞれ含むヘパリンナトリウムを含有するブランクラット血漿中に調製した（Ｇａｏ，Ｓｈｅｎら、２０１６）。ａｐｔｓｃｌ５６及びＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６のすべての報告された濃度は、ａｐｔｓｃｌ  ５６の質量に基づいた。血漿試料中のアプタマー濃度は、標準曲線により算出した。
【００８８】
薬物動態分析：Ａｐｔｓｃｌ  ５６及びＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６濃度対時間プロファイルを、ソフトウェアＤＡＳ３．０（ＢｉｏＧｕｉｄｅｒ  Ｃｏ．、上海、中国）によって各ラットについてプロットし、分析した。得られた薬物動態パラメーターを平均した。アプタマーの半減期（ｔ１／２）を、アプタマーが最大血漿濃度の半分に減少するまでにかかる時間により算出した（Ｇｒｉｅｋｅｎ及びＢｒｕｉｎ  １９９４）。最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）及び最大血漿濃度までの時間（Ｔｍａｘ）を、薬物動態曲線により得た。曲線下面積（ＡＵＣ）を、薬物が投与された時に開始して、血漿中の濃度が無視できた時に終了してコンピュータ処理した（Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｂｅｎｅｔら、１９７３、Ｔｏｕｔａｉｎ及びＢｏｕｓｑｕｅｔ−Ｍｅｌｏｕ  ２００４、Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ，Ｍｅｒｈｉら、２０１２）。続いて、ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の複数用量における投与間隔を、式：Ｄ＝１／１−ｅ−Ｋｅ・ｔ（Ｋｅ：排出定数、Ｋｅ＝ｌｎ２／Ｔ１／２；ｔ：投与間隔；Ｄ：用量比（dosing ratio）＝初期用量／維持用量）に従って算出した（Ｂｉｒｋｅｔｔ  １９９６、Ｊａｍｂｈｅｋａｒ  ２０１２）。
【００８９】
結果：
ａｐｔｓｃｌ  ５６についてのＨＰＬＣ定量の下限は、１０ｕｇ／ｍＬ〜３６０ｕｇ／ｍＬの線形濃度範囲を有して１０ｕｌ／ｍＬであった。皮下投与後のスプラーグドーリーラットにおけるａｐｔｓｃｌ５６アプタマーの排出半減期（Ｅｌｉｍ．Ｔ１／２）の平均値は、１．８時間であった。Ｔｍａｘは０．５時間で、Ｃｍａｘの平均値は２６５．５ｕｇ／ｍｌであった（図１０、表３）。
【００９０】
ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６についてのＨＰＬＣ定量の下限は、７．５ｕｇ／ｍＬ〜２４０ｕｇ／ｍＬの線形濃度範囲を有して７．５ｕｇ／ｍＬであった。皮下投与後のスプラーグドーリーラットにおけるＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の排出半減期（Ｅｌｉｍ．Ｔ１／２）の平均値は、６６．９時間であった。Ｔｍａｘは７２時間で、Ｃｍａｘの平均値は１５２．８ｕｇ／ｍｌであった（図１１、表４）。
【表３】
2021513365.tif 000004
【表４】
2021513365.tif 000005
【００９１】
考察：
本研究は、Ｓ．Ｄ．ラットに皮下投与されたａｐｔｓｃｌ５６−ＰＥＧ及びａｐｔｓｃｌ５６の薬物動態特徴を、それぞれ調査した。ａｐｔｓｃｌ  ５６の１．８時間の排出半減期と比較して、ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の半減期は、６５．１時間まで劇的に延長された。これは、ＰＥＧがａｐｔｓｃｌ５６のｉｎ  ｖｉｖｏ滞留時間の延長に顕著な効果を有したことを示している。しかし、血漿中のＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の濃度は、ａｐｔｓｃｌ５６の濃度より完全に低かった（図１２）。多数の研究は、ペグ化のサイズ拡大が、血液への吸収におけるシステマティックな減少をもたらしたことを実証した（Ｃａｌｉｃｅｔｉ  ２００３、Ｋａｍｉｎｓｋａｓ，Ｋｏｔａら、２００９）。血液へのａｐｔｓｃｌ  ５６の吸収は、ペグ化により妨げられる可能性がある。
【００９２】
ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の薬物動態研究では、吸収のために６０時間かかったが、排出には３５時間かかった。しかし、大部分のアプタマー−ＰＥＧの排出のために必要な時間は、常に吸収よりもずっと長い（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｅ．Ｔｕｃｋｅｒ  １９９９、Ｓｉｌｌｅｒ−Ｍａｔｕｌａ，Ｍｅｒｈｉら、２０１２）。一部の研究は、ペグ化のサイズ拡大が、浸透及び保持機構の受動的な増強によって、浸透性組織への蓄積を促進したことを示した（Ｃａｌｉｃｅｔｉ  ２００３）。浸透性組織へのＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の蓄積は、薬物動態曲線の排出相における急速な低下の一因である可能性がある。ａｐｔｓｃｌ５６−ＰＥＧのこの薬物動態現象についてのさらなる研究は、明快な説明のために実施される。
【００９３】
複数用量のアプタマーの投与間隔は、その排出半減期及び、初期用量と維持用量との用量比に基づいて定められ得る（Ｂｉｒｋｅｔｔ  １９９６、Ｊａｍｂｈｅｋａｒ  ２０１２）。ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の排出半減期は、６６．９時間である。用量比が２である場合、投与間隔は排出半減期（Ｔ１／２）に等しい。用量比が２未満である場合、投与間隔はＴ１／２より長くなければならない。ａｐｔｓｃｌ５６−ＰＥＧの薬物動力学研究では、提唱される用量比は１である（初期用量は維持用量と等しい）。したがって、ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６の投与間隔は、６６．９時間より少し長くなければならない。
【００９４】
実施例８．卵巣切除によって誘発された骨粗鬆症を有するラットにおける骨同化へのＰＥＧ化アプタマー候補の有効性の評価
骨粗鬆症ラットにおけるＰＥＧ４０Ｋコンジュゲートアプタマーの処置プロトコール。卵巣切除誘発骨粗鬆症ラットでの骨同化における化学修飾ａｐｔｓｃｌ５６／ａｐｔｓｃｌ３とＰＥＧ４０Ｋとの組合せの有効性を評価するために、３ヵ月齢のメススプラーグドーリーラット７０匹を卵巣摘出（ＯＶＸ、ｎ＝５０）又はシャム手術（シャム、ｎ＝２０）に供し、２ヵ月間処置しなかった。処置前に１０匹のＯＶＸラット及び１０匹のシャム手術ラットをベースライン（ＯＶＸ−ＢＳ及びシャム−ＢＳ）として安楽死させた。残りのシャム又はＯＶＸラットにビヒクル（Ｖｅｈ）、ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ５６／ａｐｔｓｃｌ３（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＥＧ４０Ｋ−無作為配列（ＲＳ、２５ｍｇ／ｋｇ）を６週間、１週間に１回、皮下注射した（１群あたりｎ＝１０）。すべての動物を最初の注射の６週間後に安楽死させた。安楽死の前に、すべての動物にカルセイン（２０ｍｇ／ｋｇ）を１３日目及び３日目に、それぞれ腹腔内注射した。安楽死後に、右大腿骨を回収し、骨微細構造をマイクロＣＴによって検査した。左大腿骨を、未脱灰切片及びさらなる組織形態学的分析のために回収した。すべての実験を関連する指針及び規制に従って実施し、すべての実験手順はＡｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ｂａｐｔｉｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認された。
【００９５】
マイクロＣＴ分析．マイクロＣＴ（バージョン６．５、ｖｉｖａＣＴ４０、ＳＣＡＮＣＯ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ、Ｂａｓｓｅｒｓｄｏｒｆ、スイス）を遠位右大腿骨の骨幹端、近位脛骨の骨幹端、第５腰椎及び右大腿骨の中心軸を分析するために使用した。椎骨及び大腿骨の画像を再構築し、それぞれ１２．５及び１７．５μｍの等方性ボクセルサイズを用いて校正した（７０ｋＶｐ、１１４μＡ、積分時間２００ｍｓ、閾値２６０、１２００ｍｇ  ＨＡ／ｃｍ３）。同じフィルタリング及びセグメンテーション値を各測定に使用する。皮質及び骨梁パラメーターについての目的の領域（ＲＯＩ）をＳｃａｎｃｏ評価ソフトウェアを使用して定めた。右遠位大腿の骨幹端及び右近位脛骨骨幹端について、大腿骨又は脛骨全体を再配向し、中間骨はＺ軸に平行であり、骨長は、近位及び遠位の横方向プレート（transverse plate）を含有する大腿骨の間の距離として測定した。成長帯の最も近い末端から開始して、成長帯から１．４ｍｍの距離での１００枚の連続したスライスで骨梁領域を選択した。骨梁を、皮質骨を除外するために手作業で輪郭を取ることによって分析した。第５椎骨について、椎体の高さの７０％に対応し、近位末端から遠位成長帯の末端に椎体に伸びる中央エリアを選択した。骨梁ＲＯＩを、それらが骨小嚢中にあることを確実にするように、１００個の連続するセクションにフリーハンドで描いた。右大腿軸について、自動閾値アルゴリズムを、大腿骨長の正確な中央及び５０％遠位での１００枚のスライスを測定するために使用した。皮質骨と接触している骨梁をＲＯＩから手作業で外した。骨梁パラメーターを、総体積あたりの骨梁量（Ｔｂ．ＢＶ／ＴＶ）、骨梁量塩密度（Ｔｂ．ｖＢＭＤ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、及び骨梁の数（Ｔｂ．Ｎ））、骨梁中心距離（Ｔｂ．Ｓｐ）、骨梁構造モデル指標（Ｔｂ．ＳＭＩ）、骨梁連結密度（Ｔｂ．ｃｏｎｎ．Ｄ）を含めて算出した。
【００９６】
統計解析．統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン８；Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して実施した。すべての数値データは、平均±標準偏差として表す。一元配置分散分析及びチューキーの事後検定を、すべてのパラメーターについて使用した。Ｐ＜０．０５を、統計的有意と見なした。
【００９７】
結果：
骨梁について、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）分析は、卵巣切除された（ＯＶＸ）ベースライン（ＯＶＸ−ＢＳ）ラットと比較して、シャムベースライン（シャム−ＢＳ）ラットの遠位大腿及び近位脛骨、遠位及び第５腰椎の海綿骨質は、顕著に高く、海綿骨構造性能は良好である（図１３−１〜１３−４）。ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ５６／ａｐｔｓｃｌ３、無作為配列又はベクターの６回の定期注射を、ＯＶＸラットを処置するために１週間間隔で使用した（それぞれ、ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ５６、ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ３、ＯＶＸ＋ＲＳ及びＯＶＸ＋Ｖｅｈと名付けた）。シャムラットを、ビヒクルを用いて６週間、１週間に１回処置した（シャム＋Ｖｅｈ）（図１３−１）。遠位大腿、近位脛骨及び第５腰椎の骨梁領域の定量的分析は、ＯＶＸ＋Ｖｅｈの骨量がシャム＋Ｖｅｈ対照と比較して顕著に低減したことを示した（図１３−２、１３−３及び１３−４）。これらのデータは、骨粗鬆症がＯＶＸラットにおいて良好に誘発されたことを示している。
【００９８】
遠位大腿の骨幹端領域のマイクロＣＴ分析は、ＢＭＤ及びＢＶ／ＴＶが顕著に高く、ＯＶＸ−ＢＳと比較してＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ５６ラットの骨梁骨量が有意に増加した（Ｐ＜０．００５）ことを示していることを示した。ＯＶＸ−ＢＳと比較して、ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ５６の骨梁構造も顕著に改善した（図１３−２）。しかし、ＯＶＸ＋Ｖｅｈ及びＯＶＸ＋ＲＳ群と同様に、ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ３群は、ＯＶＸ−ＢＳと比較して有意な骨量の増加及び構造の改善を示さなかった。
【００９９】
第５椎骨について、ＯＶＸ−ＢＳと比較して、ＯＶＸラットでの６週間のＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ５６処置は、骨量及び骨構造を完全に回復させた（図１３−４）。ＯＶＸ−ＢＳと比較して、ＯＶＸ＋ＲＳ及びＯＶＸ＋Ｖｅｈと同様に、ＯＶＸ＋ａｐｔｓｃｌ３は、骨量及び骨構造を変化させなかった。
【０１００】
要約すると、マイクロＣＴデータは、ＰＥＧ４０Ｋ−ａｐｔｓｃｌ  ５６がＯＶＸ誘発骨粗鬆症ラットにおいて骨形成を促進でき、骨微細構造を改善でき、骨量を増加できることを示している。
【０１０１】
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【図１】
2021513365.tif 000006
【図２】
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【図３】
2021513365.tif 000008
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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