(57)【要約】  腎臓移植および心筋梗塞を含む２種類の前臨床モデルにおいて、ＰｒＣ−２１１およびＰｒＣ−２５２を含むＰｒＣ−２１０アミノチオールファミリーのメンバーは、局所的な虚血−再灌流障害を減少する面で非常に有効である。ＰｒＣ−２１０は良好な耐性を有し、０．５ＭＴＤ投与量で効能が１００％と高く、ここで、経口またはＩＰルートで全身投与する場合、明らかなげっ歯類動物毒性がない。局所的な虚血−再灌流障害の最も重要な点となる可能性のあるものが何かについては、インビトロＰｒＣ−２１０濃度が２〜３ｍＭである場合、ＰｒＣ−２１０をＩＰまたは経口で処理したげっ歯動物で測定された同じＰｒＣ−２１０濃度、ＰｒＣ−２１０は、直接的なＲＯＳスカベンジングアッセイにおけるＤＮＡ障害を１００％効果的に防止することができる。Ｉ−Ｒ腎臓障害の標準的なマウス腎臓クランプ／アンクランプモデルにおいて、全ての３種類のアミノチオールは、いずれも医薬で治療されていない対照グループに見られる腎臓カスパーゼレベルを著しく抑制（＞８０％）することができ、ＰｒＣ−２１０およびその類似体は同様にＩ−Ｒ腎臓マウスのＢＵＮレベルを低減する。マウス心筋梗塞モデルにおいて、ＰｒＣ−２１０を全身投与するとともに４０分間結紮して前冠動脈を放出する場合、心筋死の顕著な低減が観察される。初代の新生マウスの心筋細胞を用いて行われる補完的なインビトロ研究では、ＰｒＣ−２１０ファミリーのアミノチオールを同時に投与することにより、過酸化水素により誘発される心筋細胞の殺傷を高度に低減することができることが示される。ＰｒＣ−２１０ファミリーのアミノチオールは、多くの場合（臓器移植および心筋梗塞を含む）に局所的な虚血−再灌流により誘発される細胞および臓器の毒性作用を抑制することができる。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
前記細胞を、以下の構造を有する化合物またはその医薬的に許容される酸付加塩と接触させることを含む局所的な虚血イベントの影響を受けた細胞における局所的な虚血−再灌流細胞死を減少または予防する方法であって、
前記方法は人体外で実施される、方法。
【化１】
2021506982.tif 000014
（ただし、Ａ＝−ＣＨ２ＮＨＲ’且つＢ＝−ＣＨ２ＮＨＲであり、またはＡ＝−ＮＲＲ’且つＢ＝Ｈであり、且つ、
ＲおよびＲ’は、独立してＨ、アルキル基、およびヘテロアルキル基から選ばれ、
その条件は、Ｂ＝Ｈであれば、ＲとＲ’が共にＨではないことである。）
【請求項２】
前記化合物は、ＰｒＣ−２１０、ＰｒＣ−２１１、およびＰｒＣ−２５２またはその医薬的に許容される酸付加塩から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【化２】
2021506982.tif 000015
【請求項３】
細胞アポトーシスを減少または予防することにより、細胞死を減少または予防する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物に接触していない細胞と比べ、前記化合物に接触している細胞において、カスパーゼの活性は低下する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は移植臓器の一部である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
レシピエントに移植する前に、前記細胞と前記化合物とを接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物は、臓器保存溶液または臓器を洗浄するための溶液の一部である、請求項５または６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下の構造を有する化合物の、局所的な虚血イベントの影響を受けた細胞における局所的な虚血−再灌流細胞死を減少または予防するための治療薬または予防薬の調製における使用。
【化３】
2021506982.tif 000016
（ただし、Ａ＝−ＣＨ２ＮＨＲ’且つＢ＝−ＣＨ２ＮＨＲであり、またはＡ＝−ＮＲＲ’且つＢ＝Ｈであり、且つ、
ＲおよびＲ’は、独立してＨ、アルキル基、およびヘテロアルキル基から選ばれ、
その条件は、Ｂ＝Ｈであれば、ＲとＲ’が共にＨではないことである。）
【請求項９】
前記化合物は、ＰｒＣ−２１０、ＰｒＣ−２１１、およびＰｒＣ−２５２またはその医薬的に許容される酸付加塩から選ばれる、請求項８に記載の使用。
【化４】
2021506982.tif 000017
【請求項１０】
局所的な虚血−再灌流イベントの前、間、または後の有効時間において、有効量の前記化合物を全身投与する、請求項８または９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物を被験者に全身投与することは、前記被験者における局所的な虚血−再灌流細胞死を減少または予防する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記化合物は、局所的な虚血−再灌流臓器の毒性作用の影響から前記被験者を保護する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記化合物は、再灌流の前および間の局所的な虚血−再灌流細胞死を予防する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記被験者は移植レシピエントである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記被験者は、心臓病に罹患するか、または心臓病に罹患するリスクにある、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記被験者は、脳卒中に罹患するか、または脳卒中に罹患するリスクにある、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記細胞は、心臓外科手術の一部として心臓麻痺液で灌流された心臓の一部である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノチオール化合物を送達してそれを局所的な虚血イベントに曝露された細胞と接触させることにより、アミノチオールは局所的な虚血−再灌流（Ｉ−Ｒ）障害の細胞に対する重症度を著しく低減する技術を提供する。様々な環境で、投与されるアミノチオールがＩ−Ｒにより誘発される細胞死を減少することに関するいくつかのステップは、カスパーゼ活化および細胞アポトーシスの抑制、活性酸素種（ＲＯＳ）の除去、ＲＯＳにより誘発されるＤＮＡ障害の減少を含む。
【背景技術】
【０００２】
Ｌｏｒｅｎｚｅｎら（Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０１３年７月）は、局所的な虚血−再灌流障害の普遍的な重要性を「局所的な虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）障害による組織障害は、重篤なイベントを表し、通常、臓器機能の悪化をもたらし、更に臓器機能の喪失をもたらす。Ｉ／Ｒ障害は、血管閉塞に起因する一時的な組織の酸素欠乏およびその後の血流回復後の再灌流期間に関連する。再灌流期間において、活性酸素および窒素物質のバーストと炎症反応等のメカニズムにより、局所的な虚血に起因する初期組織障害は悪化する。Ｉ／Ｒ障害は、外科手術、臓器移植、心筋梗塞、循環系ショック、および中毒性障害等の疾患において発生する。」と要約し、ＰｕｂＭｅｄで「局所的な虚血−再灌流」という用語を検索すると、２１９００個以上の引用が識別でき、これらの例は、各臓器部位をほとんど網羅し、且つ、心筋梗塞の間およびその後の心筋乳酸脱水素酵素の血漿レベル、および脳動脈を一定の時間クランプした後に放出して一定の時間再灌流する場合のラットの脳組織における脂質過酸化レベルの２つのヒト臨床研究であって、局所的な虚血−再灌流障害に関連するいくつかのパラメータを測定するヒト臨床研究を含む。
【０００３】
臓器移植は、Ｉ−Ｒにより誘発される細胞死およびその結果の重要性の１つのインスタンスを提供する。世界範囲内に、末期腎不全は、毎年１２０万人以上の死亡を引き起こす。米国では、毎年１７０００例以上の腎臓移植を行う。過去の数十年間において、短期的な結果が改善されたが、長期的な移植生存率はわずかに改善された。腎臓移植の失敗の多くは、移植腎臓におけるＩ−Ｒ障害に起因する（Ｋｌｏｎｅｒ  ＲＡ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９８９；８０：１１１５−２７）。腎臓Ｉ−Ｒ障害は、原発性無機能または移植機能遅延として表現される。全ての腎臓移植における約３分の１は移植機能遅延に罹患する。循環死後に寄付された腎臓において、このような失敗率は５０％と高い。移植機能遅延は、移植生存率が低い公知の危険因子である。また、腎臓機能の回復を待つ必要があるため、移植機能遅延は、即時移植後の環境におけるリソース利用および費用を増加させる。従って、実体臓器移植における満足していない１つの重要な需要はＩ−Ｒ障害を予防することである。重要なのは、過去の５０年間で、Ｉ−Ｒ障害を減少可能な臓器保存ポリシーが著しく変化していないことである。そのため、腎臓移植分野において、移植腎臓に対するＩ−Ｒ障害を抑制し、最終的に生涯にわたる移植の生存を実現する新たな安全かつ有効な方法が差し迫って必要となる。腎臓移植におけるＩ−Ｒ障害の成功抑制は、他の移植臓器に広く適用でき、更に、全ての冠動脈バイパス手術、心臓切開手術および神経外科手術を含む、全ての外科手術中に血液の供給を中断した後に再確立した臓器外科手術に広く適用できる。
【０００４】
Ｉ−Ｒ障害を引き起こす完全なメカニズムは複雑で完全に理解されていないものであるが、酸化ストレス、カスパーゼ活性化、細胞アポトーシス、ＡＴＰ枯渇およびカルシウムダイナミックアンバランスは、いずれも該メカニズムに寄与し、且つ、Ｉ−Ｒ障害の原因であると広く考えられている（Ｗｅｉｇｈｔ  ＳＣ、Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ、１９９６；８３：１６２−７０）。再灌流期間において、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生はＤＮＡ変異を引き起こす。細胞アポトーシス死カスケードが開始され、最終的に細胞死となる。Ｉ−Ｒ障害を臓器移植中のみで抑制すると、移植手術の結果を改善し、全ての臓器移植における急性および慢性拒絶反応を減少する。
【０００５】
臓器移植と同様に、ＲＯＳ生成、カスパーゼ活性化、および細胞アポトーシス死カスケードは、実際にいずれも臓器を実験的または天然に局所的な虚血／梗塞にした後、梗塞を除去して臓器が酸素含有血液により再灌流され得るようにすることにより促成した臓器毒性モデルであるため、心筋梗塞および再灌流において同様に普遍的である。
【０００６】
以下、局所的な虚血−再灌流障害の一部のインスタンス（各臓器からの局所的な虚血−再灌流障害のＰｕｂＭｅｄ検索）、およびチオールの事前投与または共同投与が、局所的な虚血−再灌流障害の危険にある組織に対する重症度をどのように軽減するかのインスタンスである。
【０００７】
【表１】
2021506982.tif 000002
【０００８】
チオール化合物アミフォスチン、システアミンおよびＮ−アセチルシステインは、いくつかの局所的な虚血−再灌流臓器障害の動物モデルにおいて明らかな保護作用を有する。表１に言及さえた２つの例（ＭＫ  Ｃｈｏｋ、ＳＺ  Ｗｕ）において、アミフォスチンの全身投与は、カスパーゼ３の発現に対して作用があり、且つ抗細胞アポトーシス作用がある。
【０００９】
しかし、表１における各チオールはいずれも明らかな薬理学的欠点を有し、これらの薬理学的欠点はそれらの臨床応用を大きく制限し、且つ、アミフォスチン／ＷＲ−１０６５の場合、その臨床応用を阻止する。例えば、アミフォスチンは、人間において重篤な吐き気・嘔吐という副作用および低血圧・失神という副作用を引き起こす。アミフォスチン活性代謝産物ＷＲ−１０６５は、ラットにおいて低血圧という副作用を示し（Ｒｙａｎ、１９９６）、且つ、現在まで発表されていないが、ＷＲ−１０６５はアミフォスチンの投与と密接に関連する吐き気・嘔吐反応を誘発する可能性があることが知れている。Ｎ−アセチルシステインは、活性が限られた臭気性化合物であり、主にＧＳＨ前駆体の作用を間接的に果たすため、作用が遅い。吐き気から死亡まで、重篤な有害反応を引き起こす（Ｓａｎｄｉｌａｎｄｓ、２００９年）。嘔吐（Ｐａｋｒａｖａｎ、２００８）およびアナフィラキシー様反応（Ｋａｏ、２００３）が頻繁に見られる。そのため、局所的な虚血−再灌流細胞死の影響から被験者を保護するための適用した医薬製品に開発でき、且つアミフォスチン／ＷＲ−１０６５の臨床応用を阻止したその吐き気・嘔吐および低血圧という副作用がないとともに、大きな臨床効果を有する新たな薬剤が必要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の化合物がアミフォスチンおよびＷＲ−１０６５のような以前のアミノチオールに関する多くまたは全ての欠点を回避し、これにより、本発明の分子が根本的にヒトでの広範な使用により好適であり、様々な医療応用環境で保護性および治療性のメリットを提供することを、発明者はある程度で本発明に係る実施例により発見した。明らかに、腎臓移植においてカスパーゼ／細胞アポトーシスを徹底的に抑制すること（実施例３〜５）と、心筋梗塞において細胞アポトーシス／細胞死を徹底的に抑制すること（実施例６）とを含む。
【００１１】
本発明の分子は、局所的な虚血−再灌流障害を抑制でき（実施例３、４、５および６を参照）、吐き気・嘔吐（実施例１０を参照）および低血圧・失神（実施例１１を参照）という副作用を引き起こすことがなく、これらの副作用は、現在の世代のアミノチオール（すなわち、五炭アミノチオホスホン酸エステルのプロドラッグ―アミフォスチン）の使用を大きく制限することが発見された。本発明に使用されるアミノチオールの設計概念は以下のとおりである。（ｉ）フレキシブルなアルキル基鎖骨格は、１つまたは複数のアミン基によりｐＨ７．２で正の電荷を帯び、細胞における負の電荷を帯びているＤＮＡとの相互作用を実現し、且つ、細胞における負の電荷を帯びているＤＮＡの周りに集中する。（ｉｉ）遊離のメルカプト基が存在し、局所的な虚血−再灌流中に形成される酸素ラジカルを除去する。
【００１２】
この新たなアミノチオールファミリーの元の設計（ＰｒＣ−２１０を現在まで最も特徴がある原型とする）では、（ｉ）アミノチオール骨格中のアルキルアミン断片の数を系統的に増加して医薬−ＤＮＡ親和性およびイオン相互作用を増加し、このような医薬−ＤＮＡ相互作用の増加に関連する成長抑制作用を強化し、（ｉｉ）遊離のチオールＲＯＳ除去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）をアルキル基側鎖の末端に配置または「展示」し、除去剤の一部をＤＮＡ骨格から離れた位置に転移し、または除去剤の一部をＤＮＡ骨格から離れた位置に「展示」することにより、ＲＯＳが細胞ＤＮＡ内のｄＧ塩基を攻撃する前にＲＯＳを除去する（図１の模式図を参照）という１つの方法が探索された。この作業により、ＰｒＣ−２１０、ＰｒＣ−２１１およびＰｒＣ−２５２を含む１つの新型なアミノチオール分子ファミリーが生じる。
【化５】
2021506982.tif 000003
【００１３】
本発明は、原型ＰｒＣ−２１０について詳細に説明する。これらの化合物、特にＰｒＣ−２１０は、従来技術における化合物、例えば、アミフォスチン、ＷＲ−１０６５、Ｎ−アセチルシステイン、またはシステアミンに見られる欠点を示していない。本発明の化合物は、高い効能を有するとともに迅速に効果を奏する。それらは、吐き気も低血圧も引き起こすことなく、且つ、ほぼ臭気がない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
アミノチオール化学：
本発明において、アミノチオールおよびその医薬的に許容される酸付加塩を用いてカスパーゼおよび細胞アポトーシスを抑制してＲＯＳを除去することを、Ｉ−Ｒ障害を減少する手段とし、前記アミノチオールの構造は以下の構造を含む。
【化６】
2021506982.tif 000004
（ただし、Ａ＝−ＣＨ２ＮＨＲ’且つＢ＝−ＣＨ２ＮＨＲであり、またはＡ＝−ＮＲＲ’且つＢ＝Ｈであり、且つ、
ＲおよびＲ’は、独立してＨ、アルキル基、およびヘテロアルキル基から選ばれ、
その条件は、Ｂ＝Ｈであれば、ＲとＲ’が共にＨではないことである。）
【００１５】
好ましくは、アルキル基がＣ１〜Ｃ６アルキル基を指し、特にＣ１〜Ｃ３アルキル基、特にメチルを指す。好ましくは、ヘテロアルキル基がＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル基を指し、特にＣ１〜Ｃ３ヘテロアルキル基、特にＣ１ヘテロアルキル基を指す。
【００１６】
好ましい化合物は、下式を有する化合物およびその医薬的に許容される酸付加塩である。
【化７】
2021506982.tif 000005
（ただし、ＲおよびＲ’は、独立してＨ、アルキル基およびヘテロアルキル基から選ばれる。）
【００１７】
好ましくは、アルキル基がＣ１〜Ｃ６アルキル基を指し、特にＣ１〜Ｃ３アルキル基、特にメチルを指す。好ましくは、ヘテロアルキル基がＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル基を指し、特にＣ１〜Ｃ３ヘテロアルキル基、特にＣ１ヘテロアルキル基を指す。
【００１８】
他の好ましい化合物は、以下の化合物およびその医薬的に許容される酸付加塩である。
【化８】
2021506982.tif 000006
（ただし、ＲおよびＲ’は、独立してＨ、アルキル基、およびヘテロアルキル基から選ばれ、その条件は、ＲとＲ’が共にＨではないことである。）
【００１９】
好ましくは、アルキル基がＣ１〜Ｃ６アルキル基を指し、特にＣ１〜Ｃ３アルキル基、特にメチルを指す。好ましくは、ヘテロアルキル基がＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル基を指し、特にＣ１〜Ｃ３ヘテロアルキル基、特にＣ１ヘテロアルキル基を指す。
【００２０】
特に言及される化合物は、ＰｒＣ−２１０、ＰｒＣ−２１１、ＰｒＣ−２５２およびその医薬的に許容される酸付加塩である。ＰｒＣ−２１０またはその医薬的に許容される酸付加塩、例えば、塩酸塩が特に好ましい。
【００２１】
前述したルートを用いて上記分子およびこれらの分子の類似体を合成する（ＵＳ  ７、３１４、９５９；Ｃｏｐｐ、ＲＲら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  Ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏｔｈｉｏｌ  Ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１：７４２６−７４３０、２０１１）。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に使用される化合物、特にＰｒＣ−２１０アミノチオールが現在の使用可能な他のチオールまたはアミノチオールよりもＩ−Ｒ障害の減少に適する理由については、簡単に概説すると以下を含む。
【００２３】
１．３０分間（腎臓）または４０分間（心臓）のＩ−Ｒ障害を経験したマウス腎臓およびマウス心臓において、本発明の化合物、特にＰｒＣ−２１０およびそのＰｒＣ−２１１、ＰｒＣ−２５２類似体は、細胞アポトーシスに関連するカスパーゼレベルを非常に効果的に抑制することができる（実施例３〜６）。
【００２４】
２．ＰｒＣ−２１０は、非常に有効なインビトロＲＯＳ除去剤である（実施例１および２を参照）。
【００２５】
３．インビトロ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管、実施例１および２）および初代マウス心筋細胞（実施例７）の環境において、ＰｒＣ−２１０はいずれも有効なＲＯＳ除去剤である。〜３ｍＭ以下の濃度で、ＰｒＣ−２１０は、ＤＮＡ障害（ｐＵＣ１９  ＤＮＡ障害、図２を参照）を９０％抑制することができ、３ｍＭは、０．５ＭＴＤ投与量のＰｒＣ−２１０（すなわち、２５２μｇ／ｇｍ  ｂ．ｗ．）を受けたマウスで測定した同じＰｒＣ−２１０チオール血液濃度であり（実施例１５）、０．５ＭＴＤ投与量のＰｒＣ−２１０で、マウスは１００％致死量の放射を抵抗して１００％生存し、これらのマウスの死亡は、主に電離放射線で形成された細胞ＲＯＳによるものである。
【００２６】
４．ＰｒＣ−２１０は、ＰｒＣ−２１０アルキル−アミン骨格とイオン会合されたＤＮＡ骨格から少なくとも３つの結合長離れた位置に１つのメルカプト基を示す１つのアルキル基側鎖を含むように設計される。メルカプト基をＤＮＡ骨格周囲の環境に転移することにより、ＲＯＳがＤＮＡ骨格内のｄＧ塩基を攻撃する前に、より有効なＲＯＳ除去を実現することができると仮定する。
【００２７】
５．アミフォスチンと異なり、ＰｒＣ−２１０分子は低血圧反応を誘発しない。これは、ＰｒＣ−２１０がクリニック環境でモニタリングされていない患者に適用できることを意味する。同様に、これは、ＰｒＣ−２１０が集中モニタリング環境（例えば、心筋梗塞、脳卒中、または冠動脈バイパス手術）における患者に適用でき、必要な患者モニタリングを著しく増加しないことを意味する。これは、本発明に使用される他の化合物にも適用できると信じられる。
【００２８】
６．アミフォスチンと異なり、ＰｒＣ−２１０分子は、吐き気または嘔吐反応のいずれかを引き起こさない。これは、ＰｒＣ−２１０がクリニック環境でモニタリングされていない患者に適用できることを意味する。同様に、これは、ＰｒＣ−２１０が集中モニタリング環境（例えば、心筋梗塞、脳卒中、または冠動脈バイパス手術）における患者に適用でき、必要な患者モニタリングを著しく増加しないことを意味する。これは、本発明に使用される他の化合物にも適用できると再び信じられる。
【００２９】
７．本発明の化合物は、好ましくない臭気がない。ＰｒＣ−２１０は、ほとんど硫黄臭がない（実施例１２を参照）。これはチオール類Ｎ−アセチルシステインおよびシステアミンと異なり、この両者は、局所的な虚血−再灌流障害を抑制する面でいずれも少ないまたは中等の効能を有するが、これらの臨床関連投与量での使用に関連する一般的な匂いにより、これらは臨床上で依然としてヒトに使用できない。
【００３０】
８．アミフォスチンは、遊離のチオールになるために、ホスファターゼによる酵素活性化ステップを経る必要があり、且つ、それに関連する時間依存性薬物動態学を有する。Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）は、内因性チオール−グルタチオンの生物合成を増加することにより、その大部分の保護効果を実現するため、ＮＡＣの局所的な虚血−再灌流障害の抑制に関連するより長い時間（数時間〜１日間）の時間依存性要素が存在する。これらの化合物と逆に、本発明の化合物は即効的なものである。それらが血液、臓器保存溶液、または投与された任意の部位に入る瞬間、活性を有する。心筋梗塞、脳卒中、または他の心血管および／または血管イベント／病症中に、機能活性を有する即効性化合物を循環系に送達し（ここで、一部を梗塞の周囲に送達し、且つ梗塞が溶解した後に大量に送達する）、梗塞に関連する臓器障害の軽減の面で非常に有用である可能性がある。
【００３１】
移植に関連する血液停止および開始過程に遭遇したＩ−Ｒ障害から移植臓器を保護するために、１種または複数種の重なり方式で本発明に使用される化合物（例えば、ＰｒＣ−２１０）を投与して臓器を保護することができる。その主な使用は、臓器保存溶液の添加剤とすることである。通常、本発明に使用される化合物（例えば、ＰｒＣ−２１０）が添加された溶液でドナー臓器を洗浄することに関する。ドナー臓器を洗浄するための溶液は、その中に本発明に使用される化合物、例えば、ＰｒＣ−２１０が添加された常用の臓器保存溶液の１つであってもよい。実施例１４は、常用の臓器保存溶液「ＵＷ溶液」の組成を提供し、他の保存溶液は本分野で知られているものである。本発明に使用される１種または複数種の化合物（例えば、ＰｒＣ−２１０）が添加された任意の他の適当な溶液を用いてドナー臓器を洗浄してもよい。例えば、アルブミンおよびヘパリンを含む乳酸リンゲル液（Ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でドナー臓器を洗浄してもよい。本発明に使用される化合物の半減期に基づいて化合物の適当な濃度を選択し、異なる臓器（腎臓、心臓、肺等）、貯蔵温度に適応し、且つ、重要なのは、臓器レシピエントに移植する前に４°Ｃでの臓器貯蔵の持続時間に適する。例えば、ｐＨ７．２でのＰｒＣ−２１０の３．５時間の半減期に基づき、アミノチオールの添加範囲は５〜１００ｍＭの間にある可能性がある。添加型保存溶液（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でドナー臓器を「洗浄する」ことは、いくつかの形態を採用することができ、最も一般的に、外科医は臓器流出物が「清澄」となるまで除去された臓器を簡単に洗浄する。これは、寄付者が死んだと宣告されると、寄付者全体の血液容量を添加型保存溶液で全身的に置き換え、臓器を原位置に保持することに関する可能性がある。後者の方法は、同一のドナーからの複数の臓器を洗浄して寄付することができる。
【００３２】
臓器を移植する前に、添加型保存溶液、緩衝液、血液、または血液代替物を用いて単離した臓器をポンプにより連続的に循環的に通過することにより該臓器を維持してもよい。
【００３３】
移植する前に、ドナー臓器は通常５〜８時間またはより長い時間貯蔵するため、臓器の貯蔵過程において、本発明に使用される化合物の大部分は不活性な形態に転化できる。例えば、ＰｒＣ−２１０の場合、臓器移植および既知の新たに移植された臓器に関連する血流再確立時に発生するＲＯＳバーストの前に、１〜２半減期またはより多くのＰｒＣ−２１０は、その不活性ジスルフィド結合の形態に転化する。これにより、臓器を患者の体内に移植する数分前に、臓器に「負荷投与量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」を投与することができる。臓器およびその内部循環に基づき、負荷投与量の液体における本発明に使用される化合物の濃度は５〜５００ｍＭの間で変化できる。外科医は５０〜１００ｃｃの注射器を用いて臓器を洗浄し、添加型溶液を臓器の大動脈に簡単に押し込むことができる。数分間待った後、移植直前に、食塩水または乳酸リンゲル液を個別に用いて２回目洗浄すれば、本発明に使用される化合物で臓器の実質細胞を「負荷」するとともに、移植後に臓器レシピエントの全身の血液に分布されたこのような化合物の量を大きく減少することを実現することができる。
【００３４】
本分野において、新たに移植された臓器に持続的な炎症および関連するＲＯＳ、カスパーゼおよび細胞アポトーシスの発生が存在することが知られているため、臓器移植手術が完了してから１８時間〜４日間後に、本発明に使用される化合物（例えば、ＰｒＣ−２１０）を患者に全身投与することは有益である。動物研究から、臓器細胞死を防止したげっ歯動物において、ＰｒＣ−２１０の血液濃度が１〜３ｍＭであることが分かる。そのため、移植後の臓器レシピエントに使用する本発明に使用される化合物の血液濃度の目標は、０．５〜５ｍＭの範囲内にあるべきである。静脈内投与または経口投与により患者に本発明に使用される化合物を投与することができる。ＰｒＣ−２１０の場合、この２つのルートは動物研究でいずれも有効である（Ｓｏｒｅｆ、Ｃ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄ  Ｏｎｃ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  ８２：ｅ７０１〜ｅ７０７、２０１２）。
【００３５】
以前の作業において、ＰｒＣ−２１０は乾燥した結晶材料として空気が抜かれたバイアル瓶内に貯蔵されると、そのチオール形態で数年間安定していることが示された。ｐＨ６の水に溶解されると、室温で２週間内に、ＰｒＣ−２１０はそのジスルフィド結合の形態に明らかに転化することがない。ｐＨ７．２の場合、ＰｒＣ−２１０チオールの半減期は３．５時間である。この場合、本発明に使用される化合物（例えば、ＰｒＣ−２１０）を結晶または凍結乾燥粉末の形態で不活性ガス（例えば、窒素ガス）を用いてパージしたバイアル瓶内に保存し、その後、食塩水でそれを再溶解した後、保存溶液またはＩＶ袋内に入れることが好適である。本発明に使用される化合物の、不活性ガスでパージしたバイアル瓶（例えば、窒素ガスでパージしたバイアル瓶）内のカプセル形態は、分子を安定して貯蔵する別の方法であり、その後、該カプセルを患者に経口投与するか、またはカプセルを一定の体積の保存溶液または緩衝液に溶解してから単離した器官を洗浄して保存する。
【００３６】
多くの心臓外科手術では、まず、血流を機械式心肺機に転移し、その後、冷蔵した心臓麻痺液で心臓を洗浄し、その中の溶液のイオン含有量は、単離心臓の自発的な拍動を防止することを目的とする。標準的な心臓麻痺液の処方は実施例１３に示される。その後、例えば、冠動脈バイパス手術または弁膜修復手術中に、単離した、拍動のない心臓を手術で操作する。本発明に使用される化合物（例えば、ＰｒＣ２１０）が添加された心臓麻痺液は、ＲＯＳ、関連カスパーゼおよび細胞アポトーシスのバーストというイベントの影響から心臓の実質細胞を保護することができ、ＲＯＳ、関連カスパーゼおよび細胞アポトーシスのバーストは、酸素含有血流が心臓に回復した後、例えば、冠動脈バイパス手術の直後に心臓に発生することが知られている。添加型心臓麻痺液は、本発明に使用される化合物、例えば、ＰｒＣ−２１０を５〜５００ｍＭ含んでもよい。本発明に使用される化合物（例えば、ＰｒＣ−２１０）を、心臓手術後の患者に更に慢性静脈内投与（１８時間〜４日間）することも実用的な選択である。
【００３７】
外科手術介入を含まない他の局所的な虚血−再灌流障害の場合が無数に存在し、ここで、本発明に使用される化合物（例えば、ＰｒＣ−２１０）を全身投与（通常、ＩＶにより）することは、Ｉ−Ｒ障害の重症度を低減する。その原因は、新たに再灌流された組織に大きな投与量のＲＯＳが発生し、血液を介して伝播する化合物が、発生したＲＯＳをリアルタイムに除去する（実施例２を参照）ことにより、ＩＲ障害後の組織環境における関連カスパーゼおよび細胞アポトーシスの発生を大きく減少するためである。これらの非手術のＩＲ障害の場合の２つのインスタンスは、ｉ）心臓病および血管形成術または冠動脈バイパス手術による心筋梗塞の放出（これについてのマウスモデルの再現、およびＰｒＣ−２１０の全身投与に関連する心臓細胞死の顕著な減少は、実施例６を参照する）、およびｉｉ）脳卒中およびそのカテーテルまたは薬理学的解決手段を含む。これらの前述した実施形態において、いくつかの全身投与された化合物は、循環閉塞を通過するか、または循環閉塞周囲で「漏れる」。これにより、ｉ）化合物は、局所的な虚血組織内の反応性分子（例えば、亜酸化窒素）を除去することができ、ｉｉ）化合物は、以前の局所的な虚血組織へ流れる血流を再確立した後に形成された大きな投与量のＲＯＳを除去することができる。これらの非手術性ＩＲ障害環境で、該化合物は、数秒／分の時間内で１〜２０ｍＭの化合物の治療性全身血液レベルに達するように、十分に高い濃度で急性静脈内注入として投与される可能性が高い。
【００３８】
全てのＰｒＣ−２１０およびその関連する類似体の処方において、アミノチオールは、有機酸塩（通常、ＨＣｌ）の形態で合成され（Ｃｏｐｐ、Ｒ  Ｂｉｏ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ２１：７４２６〜７４３０、２０１１）、且つ、ほとんど数モルの濃度で直ちに水溶液に溶解できる。
【００３９】
本発明に含まれる教示に基づき、本発明の更なる実施形態は当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＰｒＣ−２１０により付与された細胞の局所的な虚血−再灌流障害に対する提案した保護メカニズムの１つの模式図を示す。
【図２】反応内に添加される場合に、１２種のよく見られる「酸化防止剤」に対するＰｒＣ−２１０の、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）により誘導されるｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡの切り欠きの生成を投与量依存的に抑制する効果を示す。
【図３】・ＯＨ障害が発生する３０秒間前に、反応混合物にＰｒＣ−２１０を加えると、・ＯＨにより誘導されるｐＵＣ１９プラスミド障害を完全に予防することができることを示す。
【図４】マウス腎臓をＩ−Ｒ障害してから２４時間後の腎臓カスパーゼおよび腎臓機能に対するＰｒＣ−２１０の影響を示す。（Ａ）実験設計は以下のとおりである。全てのグループはいずれも３０分間の左側（ＬＴ）の虚血（クランプ）および右側（ＲＴ）の腎臓摘出術を行い、その後、２４時間の再灌流を行う。ＬＴ腎臓をクランプする２０分前に、１回腹膜内（ＩＰ）注射でアミノチオール（ＰｒＣ−２１０、ＰｒＣ−２１１、またはＰｒＣ−２５２）を投与する。２４時間後に血清およびＬＴ腎臓を収集する。（Ｂ）実施例３に記載されるように、腎臓組織上清のカスパーゼ活性を測定する。まず、６０分間以内のカスパーゼ測定条件の線形性を確立する。（Ｃ）クランプしてから２４時間後に収集された血清でＢＵＮレベルを測定する。
【図５】クランプしてから２４時間後の左側腎臓のカスパーゼ活性に対するＰｒＣ−２１０の投与量依存的な抑制を示す。クランプする２０分前に、投与量のＰｒＣ−２１０を１回ＩＰ注射で投与し、２４時間後にカスパーゼ活性を測定する。ＰｒＣ−２１０の投与量は、以前野生型マウスで確定されたＩＰ最大許容投与量（ＭＴＤ、すなわち、５０４ｕｇ／ｇ体重（ｂ．ｗ．））の点数として示される。
【図６】Ｉ−Ｒが腎臓を３０分間障害した後に、指示された各アミノチオール（およびその構造）の２４時間の腎臓カスパーゼレベルを低減する能力を示す。左側腎臓を３０分間クランプする２０分前に、１回腹膜内注射でマウスに０．２４ＭＴＤ投与量の各アミノチオールを投与する。２４時間後に腎臓を収集し、カスパーゼ活性を測定する。
【図７】マウスの心筋死が著しく減少し、該マウスが全身投与量のＰｒＣ−２１０を受けてから１０分間後に、該マウス心筋梗塞局所的な虚血−再灌流モデルにおいて左側冠動脈の結紮および放出（４０分間後）を行うことを示す。心臓に対して冠動脈を結紮−放出するＩ−Ｒ障害を行ってから２４時間後に、心臓内の生きている組織を染色する。
【図８】筋細胞組織培地にＰｒＣ−２１０を同時に添加することにより過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）により誘導される心筋細胞死を著しく減少することを示す。
【図９】ＰｒＣ−２１０がＸ線で放射されたヒト血液リンパ球におけるγ−Ｈ２ＡＸ病巣（ｆｏｃｉ）（すなわち、ＲＯＳにより誘発されるＤＮＡ二本鎖切断）を著しく抑制することを示す。ヒト全血サンプルに指定濃度（０〜２３ｍＭ）のＰｒＣ−２１０を添加し、２時間後に全血サンプルを１００ｍｇｙ放射する。
【図１０】（左図）は、アミフォスチンがフェレットモデルで吐き気および嘔吐反応を誘発することを示す。（右図）は、ＰｒＣ−２１０がフェレットモデルで吐き気および嘔吐反応を誘発しないことを示す。
【図１１】ＰｒＣ−２１０は低血圧副作用を引き起こさないことを示す。左上図は、アミフォスチンを投与した後に記録された血圧を示す。左下図は、ＰｒＣ−２１０を投与した後に記録された血圧を示す。
【図１２】分子を（Ａ）１回腹膜内注射または（Ｂ）１回経口チューブフィードによりマウス胃内に送達して投与した後の異なる時間における活性ＰｒＣ−２１０チオール形態のマウス血漿レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４１】
本発明に係る技術の実施形態を開発する過程において、実験証明を行い、アガロースゲル上でｐＵＣ１９プラスミドを分離してスーパーコイル（Ｓｕｐｅｒｃｏｉｌ）形態および切り欠き付き（Ｎｉｃｋｅｄ）形態（図２、図Ａ）を表示することができた。結果に示すように、スーパーコイルプラスミドＤＮＡの主鎖における１つまたは複数の結合が、ｘ線放射中に発生した活性酸素（ＲＯＳ）によるプラスミドＤＮＡへの化学的攻撃により破壊されると、スーパーコイルプラスミドＤＮＡは切り欠き付きの形態に変わり、且つ、電気泳動中にアガロースゲル上でスーパーコイルプラスミドＤＮＡと分離することができた。該実施例において、ｘ線放射中に発生したＲＯＳは、標準的な局所的な虚血および再灌流循環中に形成された同じＲＯＳ物質を簡単に模倣した。裸のプラスミドＤＮＡ上のＲＯＳ攻撃は、リラックスしたプラスミド形態をもたらし、そのゲルにおける移動する速度はより遅くなった。該実施例において、ｘ線放射の１５分前に、指定された小分子を個別にプラスミド試験管に入れ、それらがｘ線放射中に発生した大量のＲＯＳに対してどのような保護を付与したか（存在すれば）を確定した。試験分子をｐＵＣ１９プラスミドインキュベーションに添加してから１５分間後に、試験管は３０分間内に９０Ｇｙ放射を受けた。（Ａ）その後、インキュベーションの等分試料を電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したゲルを定量的画像化した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて低いバンド（スーパーコイル）および高いバンド（切り欠き付き）の強度を定量化した。（Ｂ）Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてバンド強度を描画した。（Ｃ）いくつかの試験分子の構造を示した。培養物にＰｒＣ−２１０、ＷＲ−１０６５、またはシステアミンを加え、それぞれがＲＯＳにより誘発されるプラスミドＤＮＡ障害に対する投与量依存性の抑制を付与した。
【実施例２】
【００４２】
これらの実験は、プラスミドＤＮＡを６０秒パルスの・ＯＨジェネレータ（Ｈ２Ｏ２＋紫外光、Ｆｌｏｙｄら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８４；１０：２２１〜２３５）に曝露した後、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡのスーパーコイル形態と切り欠き付き／・ＯＨ障害形態のアガロースゲルが分離したことを示した（図３）。スーパーコイルＤＮＡを水（レーンａ、ｂ）または２０ｍＭのＰｒＣ−２１０（レーンｃ−ｈ）と指定時間インキュベートし、その後、・ＯＨジェネレータに１分間曝露した。各反応の等分試料を電気泳動し、ＥｔＢｒで染色してデジタル画像化した。３つの重複した反応およびゲルを行い、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いてバンド強度を定量化した。レーンａとレーンｇ中のスーパーコイルバンド強度を比較するためのＰ値を指定した。・ＯＨ障害の３０秒前にＰｒＣ−２１０を添加すればＲＯＳ  ＤＮＡ障害を完全に抑制することができた。
【実施例３】
【００４３】
実験証明を行い（図４）、ＰｒＣ−２１０（０．２４ＭＴＤ  ＝  ０．１１６ｍｇ／ｇ体重）を１回ＩＰ注射することにより、腎臓をＩ−Ｒ障害してから２４時間後に腎臓カスパーゼのレベルが８４％低下し、血清尿素窒素（ＢＵＮ）レベルが類似して低下した。（Ａ）実験設計は以下のとおりであった。全てのグループはいずれも３０分間の左側（ＬＴ）の局所的な虚血（クランプ）および右側（ＲＴ）の腎摘出術を行い、その後、２４時間の再灌流を行った。ＬＴ腎臓をクランプする２０分前に、１回腹膜内注射でＰｒＣ−２１０を投与した。２４時間後に血清およびＬＴ腎臓を収集した。（Ｂ）腎臓上清のカスパーゼ活性を以下のように測定した。Ａｐｏ−ＯＮＥ蛍光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて腎臓ホモジネート上清内のカスパーゼ３およびカスパーゼ７の活性を測定した。簡単に言えば、解凍した腎臓と８倍の過剰な分解緩衝液（５０ｍＭのＮａ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセリンを含み、ｐＨ７．４である）とを混合し、且つ４°Ｃにてステンレス羽根ホモジナイザー（５０００ｒｐｍ）で３０秒間均一化した。その後、腎臓ホモジネートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１８微量遠心機において４°Ｃにて１６、０００ｘｇで２０分間遠心した。得られた上清を直ちに凍結して−７０°Ｃに保存した。ウシ血清アルブミン標準液を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ方法により上清タンパク質を測定した。カスパーゼ測定を以下のように行った。上記分解緩衝液を用いて３８μｇの上清タンパク質を全体積５０ｕｌとなるまで希釈し、黒色の９６ウェルプレートのウェル内で５０μＬのＡｐｏ−ＯＮＥ基質と混合して６０分間の反応を開始した。プレートを３７℃にて２００ｒｐｍで６０分間振とうした。ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ蛍光プレートリーダを用いて４９９ｎｍの励起波長および５２１ｎｍの発光波長でＤＥＶＤカスパーゼ基質ペプチドの分解を測定した。各実験はいずれもカスパーゼ基準品を含んだ。（Ｃ）クランプしてから２４時間後に収集された血清中のＢＵＮレベルを測定し、Ｉ−Ｒ障害後の２４時間以内の腎臓健康の機能指標とした。
【実施例４】
【００４４】
実験証明を行い（図５）、３種類の投与量範囲（それぞれ０．１０５ＭＴＤ、０．１５２ＭＴＤ、０．２３０ＭＴＤ＝０．０５３、０．０７７、０．１１６ｍｇ／ｇｍ体重）でＰｒＣ−２１０を１回ＩＰ注射すると、腎臓をＩ−Ｒ障害してから２４時間後にＰｒＣ−２１０投与量依存性の腎臓カスパーゼが低下したと測定した。
【実施例５】
【００４５】
実験証明を行い（図６）、それぞれの０．２４ＭＴＤ投与量（ＰｒＣ−２１０ＭＴＤ＝５０４ｕｇ／ｇｍ体重、ＰｒＣ−２１１ＭＴＤ＝５００ｕｇ／ｇｍ体重、ＰｒＣ−２５２ＭＴＤ＝２８７ｕｇ／ｇｍ体重）でＰｒＣ−２１０、ＰｒＣ−２１１、またはＰｒＣ−２５２を１回ＩＰ注射すると、腎臓をＩ−Ｒ障害してから２４時間後に、腎臓カスパーゼのレベルは著しく低下した。
【実施例６】
【００４６】
実験証明を行い、左冠動脈を意図的に結紮したマウスに対してＰｒＣ−２１０（０．２５２ｍｇ／ｇ体重、３０分間後に０．０５ｍｇ／ｇ体重）を２回ＩＰ注射し（図７を参照）、４０分間の動脈結紮を放出してから２４時間後に死亡組織に染色された心筋全体の百分率は平均３６％低下した。ＰｒＣ−２１０を注射したマウスにおける手術により誘発される「梗塞」（４０分間の動脈結紮）による心筋組織の死亡程度は、生理食塩水（対照として）を注射したマウスにおける心筋組織の死亡程度（Ｐ＝０．０１４３）よりも明らかに低かった。
【実施例７】
【００４７】
実験証明を行い、３日齢のマウスからの初代の新生心筋細胞（３００００個の細胞／９６ウェル）を含む培養ウェル内の組織培地にＰｒＣ−２１０（２．３ｍＭ）を添加することは、濃度を増加するＨ２Ｏ２を細胞に添加することにより誘発される心筋細胞死を著しく低減した（図８を参照）。該実施例において、Ｈ２Ｏ２を添加する１５分前または３０秒前に、培地にＰｒＣ−２１０を添加すると、同じ結果を示し、約８０％のＨ２Ｏ２により誘発される細胞死が除去された。
【実施例８】
【００４８】
これらの実験により、ＰｒＣ−２１０が、ｘ線で放射されたヒト血液リンパ球におけるγ−Ｈ２ＡＸ病巣の形成（ＤＮＡ二本鎖切断を指示する）を高度に著しく抑制することが示された（図９）。ヒト全血サンプルに指定濃度（０〜２３ｍＭ）のＰｒＣ−２１０を添加し、２時間後にサンプルを１００ｍｇｙ放射した。インセットはヒトリンパ球におけるγ−Ｈ２ＡＸ病巣（緑色）の免疫染色であり、細胞核を４，６−ジアミジル−２−フェニルインドールで染色し、医薬（１００ｍｇｙ）を受けていないまたは２３ｍＭのＰｒＣ−２１０（１００ｍｇｙ＋ＰｒＣ−２１０）を受けてから２時間に、１００ｍｇｙのｘ線で全血サンプルを放射した。
【実施例９】
【００４９】
実験証明を行い（表２）、ラットが放射の３０分間前に１回ＩＰ注射を受け、または指定されたアミノチオールを局部的に４回使用した後、その背中の皮膚の指定された矩形領域（１．５×３．０ｃｍ）箇所に１７．２Ｇｙの１回のｘ線量を受けると、放射性皮膚炎は軽減した。医薬を使用して放射してから１３日間後に、放射後の皮膚領域内のｘ線により誘発される放射性皮膚炎の重症度を評価した。これらのアミノチオールＲＯＳ除去剤分子を経皮でラットに局部的投与または腹膜内投与することは、ラット皮膚を放射する間にｘ線から発生したＲＯＳによる放射性皮膚炎を１００％抑制した。
【００５０】
【表２】
2021506982.tif 000007
【実施例１０】
【００５１】
実験証明を行い、フェレット（ヒトと同じ吐き気・嘔吐反応を有する）が、マウスの０．５ＭＴＤ投与量のアミフォスチンに相当するフェレットの皮下投与量を受けた場合、全ての４匹のフェレット（ここで、０６２および０８９のデータを示す）は、いずれも明らかな吐き気および嘔吐を起こした（図１０、左図）。これは、マウスの０．５ＭＴＤ投与量のアミフォスチンに相当するヒトの投与量のアミフォスチンを受けたヒトの症例で報告された吐き気・嘔吐の高発率を複製した。
【００５２】
図１０の右図は、１０匹のフェレットがマウスの０．５ＭＴＤ投与量のＰｒＣ−２１０に相当するフェレットの皮下投与量を受けた場合、この１０匹のフェレット（ここで、１２３およびＡ４３のデータを示す）はいずれも識別可能な吐き気または嘔吐反応を発生しないことを示した。
【００５３】
陽性対照として、アミフォスチンまたはＰｒＣ−２１０攻撃投与量を投与した後に２週間休憩し、全てのフェレットはいずれも１回攻撃投与量のロペラミド（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）（既知のエメトゲン）を受け、１４匹のフェレットのうちのそれぞれは、激しい吐き気および嘔吐反応を表した。これらのデータは図１０においてインセットで示された。
【実施例１１】
【００５４】
実験証明を行い、ラット（動脈カテーテルが挿し込まれて血圧を測定する）がマウスの０．５ＭＴＤ投与量のアミフォスチンに相当するラットの１回ＩＰ投与量を受けた場合、不可逆的な血圧低下は直ちに発生し、攻撃投与量のＩＰエピネフリンは血圧に識別可能な影響がなかった（図１１）。記録期間のラットの慢性低血圧は識別可能な目表現型／毒性に関連していた。
【００５５】
マウスの０．５ＭＴＤ投与量のＰｒＣ−２１０に相当するラットの１回ＩＰ投与量を受けてカテーテルが挿し込まれたラットは、血圧低下を示せず、攻撃投与量のＩＰエピネフリンは血圧の顕著な上昇を引き起こした。
【実施例１２】
【００５６】
実験証明を行い、ＰｒＣ−２１０は、通常のチオール化合物に関連する有害臭気（すなわち、硫黄臭）を欠いていた。試験の被験者を、約１回のヒト投与量のＰｒＣ−２１０が予想する上限のＰｒＣ−２１０を含む溶液、および２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）の希釈系列に曝露した。ＰｒＣ−２１０および２−ＭＥ希釈液の匂いを比べることにより、各被験者はＰｒＣ−２１０に１つの「匂いスコア」を指定した。匂いスコアは、２−ＭＥ希釈液の硫黄チオールの匂いが１回ヒト投与量のＰｒＣ−２１０の硫黄チオールの匂いに最も近いことを示した。１名の被験者の指定した匂いスコアが８であり、他の被験者の指定した匂いスコアが７で、２−ＭＥの１：１８７５０および１：９３７５０の希釈に対応した。これらの結果により、濃度が約１回最大ヒト投与量のＰｒＣ−２１０のチオール臭気は、２−ＭＥよりも５６２５０倍（例えば、９３７５０−１８７５０＝７５０００、７５０００÷２＝３７５００、３７５００＋１８７５０＝５６２５０）低かったことが示された。２−ＭＥを５６２５０倍希釈すると、異臭はほとんどない。
【００５７】
【表３】
2021506982.tif 000008
【実施例１３】
【００５８】
通常、Ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて人の心臓を洗浄し、且つ、この過程において心臓の拍動を停止させ、その後、拍動しない心臓に対して外科手術（例えば、冠動脈バイパス手術または弁膜修復手術）を行い、該Ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎの１つの例は以下を含む（1リットル当たりの溶液）。
−    １１０ｍｍｏｌのナトリウム
−    １６ｍｍｏｌのマグネシウム
−    １６０ｍｍｏｌの塩素
−    １６ｍｍｏｌのカリウム
−    １．２ｍｍｏｌのカルシウム
−    ｐＨ７．４〜７．８に達するのに十分な炭酸水素ナトリウム
【実施例１４】
【００５９】
臓器保存溶液の１つの例（ここでの「Ｂｅｌｚｅｒ  ＵＷ  Ｃｏｌｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」、ウィスコンシン大学が発明）は、通常、４°Ｃで使用され、臓器レシピエント体内に移植する前に臓器ドナーから取り出された臓器を洗浄して維持するために用いられ、以下を含む。
【００６０】
2021506982.tif 000009
【実施例１５】
【００６１】
実験証明を行い（図１２）、マウスが１回ＩＰ注射の０．５ＭＴＤ  ＩＰ  ＰｒＣ−２１０投与量（２５２ｕｇ／ｇｍ体重）または１回経口胃内投与量の０．５ＭＴＤ経口ＰｒＣ−２１０投与量（９００ｕｇ／ｇ体重）を受けると、それ以降、活性形態のＰｒＣ−２１０チオールの明らかな血漿レベルを長期的に測定することができた。血漿濃度が１〜３ｍＭのＰｒＣ−２１０チオールは、放射により誘発される死亡の完全な抑制に関連し、そうでなければ、溶媒で処理されて放射されたマウスは、放射により誘発される死亡を１００％発生する。
【００６２】
本願発明の項目について
【００６３】
１、前記細胞を以下の構造を有する化合物と接触させることを含む局所的な虚血イベントの影響を受けた細胞における局所的な虚血−再灌流細胞死を減少または予防する方法。
【化９】
2021506982.tif 000010
（ただし、Ａ＝−ＣＨ２ＮＨＲ’且つＢ＝−ＣＨ２ＮＨＲであり、またはＡ＝−ＮＲＲ’且つＢ＝Ｈであり、且つ、
ＲおよびＲ’は、独立してＨ、アルキル基、およびヘテロアルキル基から選ばれ、
その条件は、Ｂ＝Ｈであれば、ＲとＲ’が共にＨではないことである。）
【００６４】
２、前記化合物は以下の構造を有する化合物である、前記１に記載の方法。
【化１０】
2021506982.tif 000011
（ただし、ＲおよびＲ’は、独立してＨ、アルキル基、およびヘテロアルキル基から選ばれる。）
【００６５】
３、前記化合物は以下の構造を含む、前記１に記載の方法。
【化１１】
2021506982.tif 000012
（ただし、ＲおよびＲ′は、独立してＨ、アルキル基、およびヘテロアルキル基から選ばれ、その条件は、ＲとＲ′が共にＨではないことである。）
【００６６】
４、前記化合物は、ＰｒＣ−２１０、ＰｒＣ−２１１、およびＰｒＣ−２５２から選ばれる、前記１に記載の方法。
【化１２】
2021506982.tif 000013
【００６７】
５、細胞アポトーシスを減少または予防することにより、細胞死を減少または予防する、前記１に記載の方法。
【００６８】
６、前記化合物に接触していない細胞と比べ、前記化合物に接触している細胞において、カスパーゼの活性は低下する、前記１に記載の方法。
【００６９】
７、活性酸素種を除去することを更に含む、前記のいずれか１項に記載の方法。
【００７０】
８、更に活性酸素種の影響から細胞のＤＮＡを保護する、前記のいずれか１項に記載の方法。
【００７１】
９、前記細胞は移植臓器の一部である、前記１に記載の方法。
【００７２】
１０、レシピエントに移植する前に、前記細胞と前記化合物とを接触させる、前記９に記載の方法。
【００７３】
１１、前記化合物は、臓器保存溶液または臓器を洗浄するための溶液の一部である、前記９に記載の方法。
【００７４】
１２、臓器を除去する前および間に、前記化合物をドナーに投与する、前記９に記載の方法。
【００７５】
１３、前記化合物を被験者に全身投与することは、前記被験者における局所的な虚血−再灌流細胞死を減少または予防する、前記１に記載の方法。
【００７６】
１４、前記化合物は、局所的な虚血−再灌流臓器の毒性作用の影響から前記被験者を保護する、前記１３に記載の方法。
【００７７】
１５、前記化合物は、再灌流の前および間の局所的な虚血−再灌流細胞死を予防する、前記１３に記載の方法。
【００７８】
１６、前記被験者は移植レシピエントである、前記１３に記載の方法。
【００７９】
１７、前記被験者は、心臓病に罹患するか、または心臓病に罹患するリスクにある、前記１３に記載の方法。
【００８０】
１８、前記被験者は、脳卒中に罹患するか、または脳卒中に罹患するリスクにある、前記１３に記載の方法。
【００８１】
１９、局所的な虚血−再灌流イベントの前、間、または後の有効時間において、有効量の前記化合物を全身投与する、前記１３に記載の方法。
【００８２】
２０、前記化合物は酸付加塩の形態である、前記のいずれか１項に記載の方法。
【００８３】
２１、前記細胞は、心臓外科手術の一部として心臓麻痺液で灌流された心臓の一部である、前記１に記載の方法。
【００８４】
２２、前記化合物を、ＩＲ損傷から臓器を保護するための任意の洗浄溶液内に添加する、前記１に記載の方法。
【００８５】
２３、前記１に記載の化合物は約１〜約１００ミリモルの濃度で存在する、臓器灌流溶液。
【００８６】
２４、空気が抜かれたバイアル瓶で前記化合物の酸塩の結晶または凍結乾燥粉末の形態を構成し、前記バイアル瓶は透過可能なセパレータを有し、前記セパレータは、前記化合物の最終濃度が１〜１００ｍＭに達するように、液体再構成を実現して臓器保存溶液、心臓麻痺液、またはＩＶ袋内に添加することができる、前記１に記載の化合物の単位投与量。
【００８７】
２５、前記１に記載の化合物は約１〜約１００ミリモルの濃度で存在する、心臓麻痺液。
【００８８】
２６、０．５〜５ｍＭの血漿濃度に達するように患者に経口投与できる、前記１に記載の化合物の乾燥錠剤またはカプセル剤の形態。
【参照資料】
【００８９】
Ａｂｔ，  Ｇ．，  Ｖａｇｈｅｆ，  Ｈ．，  Ｇｅｂｈａｒｔ，  Ｅ．，  Ｄａｈｌｇｒｅｎ，  Ｃ．  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｍａｎ，  Ｂ．    Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｏｎ  Ｘ−ｒａｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ａｓ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｂｙ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．    Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．，  ３８４：    ５５〜６４，  １９９７．
Ｃｈｏｋ  ＭＫ，  Ｃｏｎｔｉ  Ｍ，  Ａｌｍｏｌｋｉ  Ａ，  Ｆｅｒｌｉｃｏｔ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｒｅｎａｌ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２０１０  Ｄｅｃ；２５（１２）：３８４５−５１．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｎｄｔ／ｇｆｑ３１４．  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊｕｎ  ４．
Ｃｈｒｏｎｉｄｏｕ  Ｆ１，  Ａｐｏｓｔｏｌａｋｉｓ  Ｅ，  Ｐａｐａｐｏｓｔｏｌｏｕ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ  （ＷＲ−２７２１）  ｏｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  ２００９  Ｓｅｐ  １７；４：５０．  ｄｏｉ：  １０．１１８６／１７４９−８０９０−４−５０．
Ｋａｏ，  Ｌ．  Ｗ．，  Ｋｉｒｋ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｆｕｒｂｅｅ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｍｅｈｔａ，  Ｎ．  Ｈ．，  Ｓｋｉｎｎｅｒ，  Ｊ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｂｒｉｚｅｎｄｉｎｅ，  Ｅ．  Ｊ．    Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｏｒａｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ？    Ａｎｎ．  Ｅｍｅｒｇ．  Ｍｅｄ．，  ４２：    ７４１〜７５０，  ２００３．
Ｋａｔａｏｋａ，  Ｙ．，  Ｍｕｒｌｅｙ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｂａｋｅｒ，  Ｋ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｇｒｄｉｎａ，  Ｄ．  Ｊ．    Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２ＡＸ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  （ＨＭＥＣ）  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｒ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ．    Ｒａｄｉａｔ．  Ｒｅｓ．，  １６８：    １０６〜１１４，  ２００７．
Ｏｌｓｓｏｎ，  Ｂ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｂｏｌｍｅ，  Ｐ．    Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｎｄ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ．    Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ３４：    ７７〜８２，  １９８８．
Ｐａｋｒａｖａｎ，  Ｎ．，  Ｗａｒｉｎｇ，  Ｗ．  Ｓ．，  Ｓｈａｒｍａ，  Ｓ．，  Ｌｕｄｌａｍ，  Ｃ．，  Ｍｅｇｓｏｎ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｂａｔｅｍａｎ，  Ｄ．  Ｎ．    Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｎ  ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  ｏｖｅｒｄｏｓｅ．    Ｃｌｉｎ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  ４６：    ６９７〜７０２，  ２００８．
Ｐｅｅｂｌｅｓ，  Ｄ．  Ｄ．，  Ｓｏｒｅｆ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｃｏｐｐ，  Ｒ．  Ｒ．，  Ｔｈｕｎｂｅｒｇ，  Ａ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｆａｈｌ，  Ｗ．  Ｅ．    ＲＯＳ−Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ＰｒＣ−２１０  ａｍｉｎｏｔｈｉｏｌ．    Ｒａｄｉａｔ．  Ｒｅｓ．，  １７８：    ５７〜６８，  ２０１２．    
Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，  Ｌ．    Ｏｒａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｆｏｒ  ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ？    Ａｎｎ．  Ｅｍｅｒｇ．  Ｍｅｄ．，  ４５：    ４０９〜４１３，  ２００５．
Ｒｙａｎ，  Ｓ．  Ｖ．，  Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｓｋｕｒｋ，  Ｃ．，  Ｎｕｓｓ，  Ｃ．，  Ｐｏｏｌｅｒ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｏｗｅｎ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｌｅｆｅｒ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ，  Ｓ．  Ａ．    Ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ．    Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ３６：    ３６５〜３７３，  １９９６．
Ｓａａｄ  ＫＲ，  Ｓａａｄ  ＰＦ，  Ｄａｎｔａｓ  Ｆｉｌｈｏ  Ｌ，  Ｂｒｉｔｏ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ．  ２０１３  Ｊｕｎ  １；１８２（１）：１０８−１５．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｊｓｓ．２０１２．０７．０３７．  Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ａｕｇ  ２．
Ｓａｍｕｎｉ，  Ａ．  Ｍ．，  ＤｅＧｒａｆｆ，  Ｗ．，  Ｃｏｏｋ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｋｒｉｓｈｎａ，  Ｍ．  Ｃ，．  Ｒｕｓｓｏ，  Ａ，．  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｊ．  Ｂ．    Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｏｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ＴＫ６  ｃｅｌｌｓ．    Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ３７：    １６４８〜１６５５，  ２００４．
Ｓａｎｄｉｌａｎｄｓ，  Ｅ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂａｔｅｍａｎ，  Ｄ．  Ｎ．    Ａｄｖｅｒｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ．    Ｃｌｉｎ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  ４７：    ８１〜８８，  ２００９．
Ｓｉｌｖａ  ＳＭ１，  Ｃａｒｂｏｎｅｌ  ＡＡ，  Ｔａｈａ  ＭＯ，  Ｓｉｍｏｅｓ  ＭＪ，  Ｍｏｎｔｅｒｏ  ＥＦ．  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ：  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．  ２０１２  Ｏｃｔ；４４（８）：２３２１−５．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｔｒａｎｓｐｒｏｃｅｅｄ．２０１２．０７．００９．
Ｓｏｒｅｆ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｈａｃｋｅｒ，  Ｔ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｆａｈｌ，  Ｗ．  Ｅ．    Ａ  ｎｅｗ  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ，  ａｍｉｎｏｔｈｉｏｌ  ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｏｒ−ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｎａｕｓｅａ  ａｎｄ  ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｔ  ｉｔｓ  ｈｉｇｈｅｓｔ  ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅｓ．    Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．    ８２：    ｅ７０１〜ｅ７０７，  ２０１２．    
Ｔｕｒｋｍｅｎ  Ｓ，  Ｍｅｎｔｅｓｅ  Ａ，  Ｋａｒａｇｕｚｅｌ  Ｅ，  Ｋａｒａｃａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．  ２０１２  Ｓｅｐ；９８（３）：６２６−３１．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｆｅｒｔｎｓｔｅｒｔ．２０１２．０５．０３４．  Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊｕｎ  １９．
Ｗｕ  ＳＺ，  Ｔａｏ  ＬＹ，  Ｗａｎｇ  ＪＮ，  Ｘｕ  ＺＱ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｘｕｅ  ＹＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ  Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ／Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ．  Ｏｘｉｄ  Ｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｏｎｇｅｖ．  ２０１７；２０１７：４１３０８２４．  ｄｏｉ：  １０．１１５５／２０１７／４１３０８２４．  Ｅｐｕｂ  ２０１７  Ｍａｒ  １４
【図１】
2021506982.tif 000018
【図２】
2021506982.tif 000019
【図３】
2021506982.tif 000020
【図４】
2021506982.tif 000021
【図５】
2021506982.tif 000022
【図６】
2021506982.tif 000023
【図７】
2021506982.tif 000024
【図８】
2021506982.tif 000025
【図９】
2021506982.tif 000026
【図１０】
2021506982.tif 000027
【図１１】
2021506982.tif 000028
【図１２】
2021506982.tif 000029
【国際調査報告】
2021506982.tif 000030
2021506982.tif 000031
2021506982.tif 000032