(57)【要約】本発明は、ヒトＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列を含む少なくとも１つの挿入を含む、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質に関する。さらに、本発明は、タンパク質、ＶＬＰを含む多量体構造、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質を産生する方法、および白斑または他の自己免疫疾患を処置するために使用され得る突然変異したパルボウイルス構造タンパク質を含む医薬またはワクチンに関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異パルボウイルス構造タンパク質であって、ヒトＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６つの連続したアミノ酸の配列を含む少なくとも１つの挿入を含む、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項２】
前記挿入に含まれる前記アミノ酸配列が、ＨＳＰ７０ｉによる抗原提示細胞の活性化に関与するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項３】
前記挿入の前記アミノ酸配列が、ＨＳＰ７０ｉにおける対応する配列と比較して少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１または２に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項４】
前記挿入の前記アミノ酸配列がアミノ酸配列ＡＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧおよび／またはＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項５】
前記突然変異したパルボウイルス構造タンパク質がＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ２に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項６】
前記突然変異したパルボウイルス構造タンパク質が突然変異ＶＰ３タンパクである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項７】
前記突然変異したパルボウイルス構造タンパク質が請求項１〜６のいずれか一項に記載の２つ以上の挿入を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項８】
前記挿入がＩ−５８７位および／またはＩ−４５３位である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項９】
前記突然変異したパルボウイルス構造タンパク質がリンカー配列を含み、かつ／または
挿入、欠失、異種アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端融合および置換から選択される１以上の追加の突然変異を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質を含む、多量体構造、好ましくはウイルス様粒子。
【請求項１１】
突然変異したパルボウイルス構造タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質を含む組成物。
【請求項１３】
前記医薬がワクチンである、請求項１２記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記医薬および／またはワクチンが、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を処置または予防するための方法、あるいは免疫抑制の方法に使用するためのものである、請求項１２または１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記自己免疫疾患および／または炎症性疾患が、白斑、脱毛症、関節炎、特に慢性関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、多発性硬化症、パーキンソン病、自己免疫性糖尿病、移植片対宿主移植片反応、ならびにＨＳＰ７０を発現する視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、急性視神経炎（ＡＯＮ）、卵巣炎、および腫瘍から選択される、請求項１４に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列を含む少なくとも１つの挿入を含む、突然変異パルボウイルス構造タンパク質に関する。さらに、本発明は、タンパク質、ＶＬＰを含む多量体構造、突然変異パルボウイルス構造タンパク質を産生する方法、および白斑または他の自己免疫疾患を処置するために使用され得る突然変異パルボウイルス構造タンパク質を含む医薬またはワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
白斑は、世界中の人口の約０．５〜２％が罹患する最も頻繁に発生する色素脱失性障害である。白斑病変は、乳白色の斑点であり、形状および大きさが増大し得、体のほとんどの部分に影響を及ぼすことがある。この疾患は、あらゆる年齢で発症し得る。しかしながら、患者の半数は、２０歳以前に白斑に罹患している。白斑は、主に色素脱失により生じる患者の外観の変化により、生活の質に有害な影響を及ぼすことが示されている。この障害は、患者の情緒的および心理的健康に影響を及ぼしうる。白斑は窪みを発症するリスクの増加と関連しており、白斑患者の３分の１超は、臨床的窪みの全ての基準を必ずしも満たさずに何らかの種類のうつ症状を体験する（非特許文献１）。
【０００３】
白斑は、はるかに一般的な形態の非分節性白斑および分節性白斑に分化することができる。非分節性白斑は、身体の両方の側に色素脱失が生じるのが特徴であり、これに対して分節性白斑は体の一方の側に限定され、通常体の正中線を横断しない。非分節性白斑は通常、慢性的な経過をたどり、生涯を通して進行が続く。対照的に、分節性白斑は、急速な疾患の発症および１〜２年後の疾患の安定化を特徴とする。処置が著しく異なるため、白斑サブタイプの早期認知が不可欠である（非特許文献１）。
【０００４】
現在、局所コルチコステロイドは、白斑の管理のための確立された第一線の処置選択肢である。これらの化合物の抗炎症作用は、疾患の進行を低下させる可能性がある。しかし、再色素沈着に対するそれらの効果は限られている。一般に、ほとんどの色素沈着は顔面および頸部で観察でき、一方体幹、四肢、特に手には限定的な色素沈着の再発しか観察されない。コルチコステロイドの副作用には、皮膚萎縮、毛細血管拡張および線条が含まれる。処置はしばしば少なくとも６カ月間継続され、主な目的は疾患の安定化を達成することである。局所投与の代替として、コルチコステロイドを、中程度の用量で経口投与してもよい。経口コルチコステロイド療法は、大多数の患者で疾患の進行を止めることが示されている。しかし、経口投与されたコルチコステロイドについても、再色素沈着はまれにしか観察されない。さらに、経口的なコルチコステロイド投与は、長期使用を制限する体重増加、ざ瘡、睡眠障害、不穏、多毛症および月経異常などの様々な副作用と関連しており、それによって長期使用が制限される。コルチコステロイドの代わりに、白斑の局所処置は、Ｔ細胞活性を減弱させるタクロリムスまたはピメクロリムスのような局所免疫調節剤に基づくことができる。コルチコステロイドと同様に、処置は顔面にほとんどの色素沈着を示し、一方結果は男児の他の側面では中等度である。副作用としては、アルコール摂取後の灼熱感または潮紅などが含まれ、それはしばしば観察され、一部の患者には悩みを感じることがある（非特許文献１）。
【０００５】
薬理学的処置に加え、白斑に対する処置として光線療法、特にナローバンドＵＶＢ光線療法が確立されている。光療法は大多数の患者に再色素沈着の兆しを示すが、完全な再色素沈着は少数の患者にしか見られない。さらに、光線療法の中止後の再燃が、高頻度に認められる（非特許文献１）。要約すると、白斑に対する確立された療法は有効性が限られており、副作用を伴うことが多く、通常は数週間または数カ月のような長期間にわたって投与しなければならない。
【０００６】
拡大する白斑病変は、Ｍａｒｔ−１またはＧＰ１００などのメラノサイト分化抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞がしばしば浸潤するという観察に基づき、白斑は自己免疫疾患と考えられる。さらに、精神的ならびに化学的または機械的ストレスが白斑の自己免疫病因に寄与することが示されている（非特許文献２；非特許文献１）。従って、白斑の基礎となる細胞機構における熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、特にＨＳＰ７０の誘導性アイソフォーム（ＨＳＰｉ）の関与が、試験されている。ヒトＨＳＰ７０ｉは、ＨＳＰ７０Ａ１ＡまたはＨＳＰ７０Ａ１Ｂとしても知られており、同じアミノ酸配列を特徴とするが、まだ異なる調節領域をもつ別々の遺伝子によってコードされている。ＨＳＰ７０ｉは、一般にＨＳＣ７０と同様に細胞質タンパク質と考えられているが、ＨＳＰ７０タンパク質ファミリーの他の要素とは対照的に生細胞によっても分泌される（非特許文献２）。ＨＳＰ７０ファミリータンパク質は、樹状細胞（ＤＣ）の活性化および成熟、ＤＣによる抗原提示およびＴ細胞の活性化に関与することが知られている。ＨＳＰ７０は、ａ）ペプチド抗原と複合体を形成すること、ｂ）ペプチドを抗原提示細胞に送達し、ペプチドを細胞内に移入すること、ｃ）ＭＨＣクラスＩ提示のために抗原を細胞内にシャペロン化することにより、樹状細胞による抗原提示のプロセスに寄与する。抗原提示細胞の表面上で、ＨＳＰ７０−抗原複合体は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＣＤ９１のようなシグナル伝達受容体、またはＬＯＸ−１、ＳＲＥＣ−１、ＦＥＥＬ−１／ＣＬＥＶＥＲ−１またはＣＤ９１のようなスカベンジャー受容体のいずれかに結合し得る。シグナル伝達受容体へのＨＳＰ−抗原錯体の結合は、抗原提示細胞のサイトカイン産生を活性化し得、これに対してスカベンジャー受容体への結合は、錯体の受容体媒介エンドサイトーシスをもたらす。ＨＳＰ７０のこの刺激作用は、タンパク質のＣ末端ドメインによって媒介される（非特許文献３）。
【０００７】
Ｍｏｓｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によって示されるように、ＨＳＰ７０ｉは、非病変皮膚と比較して、病変皮膚または病変周囲皮膚において有意に高いレベルで発現される。さらに、白斑メラノサイトは、白斑の自己免疫病因におけるＨＳＰ７０ｉの想定されるストレス関連機能と一致して、対照メラノサイトと比較して、酸化ストレスに応答して有意に多くのＨＳＰ７０ｉを分泌した（非特許文献４）。
【０００８】
白斑におけるＨＳＰ７０ｉの役割は、また異なる動物モデルによって確認された。例えば、マウスにメラニン細胞分化抗原ＴＲＰ−２をコードする真核発現プラスミドをワクチン接種すると、ＨＳＰ７０ｉをコードするプラスミドと併用投与した場合、色素脱失が有意に増加し、これに対してメラニン細胞分化抗原のみをコードするプラスミドをワクチン接種した場合は、色素脱失が有意に低い程度まで増加したことを示すことができた。特に、ＨＳＰ７０ｉの効果は、ワクチン接種に応答して発現したＨＳＰ７０ｉ抗体によって減少しなかった（非特許文献５）。ＴＲＰ−２をコードするプラスミドとＨＳＰ７０ｉのＣ末端領域（アミノ酸３２０〜６４１）をコードするプラスミドとの併用でワクチン接種したマウスで、有意に増加した色素脱失がまた観察された。それとは対照的に、ＨＳＰ７０ｉのＮ末端領域（アミノ酸１〜３７７）をコードするプラスミドと組み合わせたＴＲＰ−２をコードするプラスミドでのワクチン接種では、色素脱失はほとんど増加しなかった（非特許文献２）。
【０００９】
ＨＳＰ７０ｉのＣ末端領域内で、ペプチド配列ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲは、樹状細胞の活性化に必要であると考えられる。それぞれの配列は、感染に応答して炎症中に樹状細胞の活性化を促すことが知られているＤｎａＫペプチドＱＰＳＶＱＩＱＶＹＱＧＥＲＥＩＡＡＨＮＫ（ＤｎａＫアミノ酸４０７〜４２６）と相同である。それぞれのペプチド配列中にアミノ酸交換Ｑ４３５Ａ（ＨＳＰ７０ｉＱ４３５Ａ）、Ｖ４３８ＫおよびＩ４４０Ａ（ＨＳＰ７０ｉＶ４３８Ｋ，Ｉ４４０Ａ）またはＶ４４２ＡおよびＹ４４３Ｖ（ＨＳＰ７０ｉＶ４４２Ａ，Ｙ４４３Ｖ）を含むＨＳＰ７０ｉ変異体は、上述のマウスワクチン接合モデル（非特許文献２）において有意に減少した脱着効果を示す。さらに、ヒトチロシナーゼ反応性ＴＣＲ導入遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２．１を有するＴ細胞を発現する初期および急速色素脱失マウス株ｈ３ＴＡ２において、ＨＳＰ７０ｉＱ４３５Ａを有するプラスミドでのワクチン接種は、空のベクターでワクチン接種したマウスとは対照的に色素沈着の回復をもたらした。野生型ＨＳＰ７０ｉでワクチン接種したマウスでは、炎症性サブセットに向かうＤＣ表現型の持続的な歪みが観察され、一方ＨＳＰ７０ｉＱ４３５Ａをワクチン接種したマウスでは逆に、寛容原性表現型に向かう歪みが観察された。ＨＳＰ７０ｉに対する体液性免疫応答の分析から、ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲペプチドの下流側に結合する抗体のみが生成されることが明らかになった（非特許文献２）。
【００１０】
白斑に加えて、抗原提示およびＤＣ活性化におけるＨＳＰ７０ｉの役割は、多くの他の自己免疫疾患および／または炎症性疾患、例えば乾癬およびエリテマトーデスなどの皮膚疾患（非特許文献６；非特許文献７）、自己免疫性糖尿病（非特許文献８）ならびに移植片対宿主病または多発性硬化症（非特許文献９）の病因に関与すると考えられる。
【００１１】
ＨＳＰ７０ｉに基づく自己免疫疾患、特に白斑の処置のためのいくつかの治療アプローチが、当技術分野で示唆されている。
【００１２】
特許文献１は、ＨＳＰ７０ｉポリペプチドＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥに結合する抗体またはその断片のような三量体化ドメインおよび少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質を開示する。さらに、白斑を処置するための前記融合タンパク質の使用が示唆される。しかしながら、抗体または開示された融合タンパク質を投与することによって得られる特異的抗体または治療効果は、提供されない。ＨＳＰ７０ｉのＣ末端の樹状細胞活性化特性に基づき、この文献は、癌の処置、特に黒色腫の処置のためのワクチンとして使用するための、三量体化ドメインおよびＨＳＰ７０ｉポリペプチドＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥを含む融合タンパク質の使用をさらに示唆する。
【００１３】
特許文献２は、自己免疫疾患の処置における突然変異ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧペプチド配列を含む完全長ＨＳＰ７０ｉ変異体の使用を示唆している。具体的には、当該文献は、ＨＳＰ７０ｉがＨＳＰ７０ｉＱ４３５Ａ突然変異体変形である完全長ＨＳＰ７０ｉをコードするプラスミドを含む、疾患、特に白斑を処置および変化させるためのＤＮＡワクチンを開示する。この文献は、野生型ＨＳＰ７０ｉを発現するＤＮＡ構築物によるワクチン接種が、色素脱失を加速したことを開示している。突然変異体ＨＳＰ７０ｉの配列を含むプラスミドの注射は、空の対照ベクターと比較して、色素脱失の減少を示した。しかしながら、これらのタイプのＤＮＡワクチンについては、免疫化ＤＮＡのゲノム取り込みの結果としての癌遺伝子の活性化が、安全性の主要な懸念事項である。さらに、ＤＮＡワクチン接種により抗ＤＮＡ抗体が誘発され得る。
【００１４】
特許文献３は、炎症性または自己免疫疾患の処置のためにＭＨＣクラスＩＩ分子から溶出されたＨＳＰ７０要素に由来するペプチドの使用を開示する。炎症性疾患には、クローン病、肉芽腫性大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、潰瘍性大腸炎、およびセリアック病が含まれる。自己免疫疾患には、関節炎、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症筋無力症、関節リウマチ、乾癬性関節炎および若年性関節炎が含まれる。しかし、白斑は開示されていない。開示されたペプチドは、ＨＳＰ７０ｉのＮ末端領域由来のペプチドならびにＣ末端領域のアミノ酸４１９〜４３６および４３５〜４６０に由来するペプチドを含む。しかしながら、これらのペプチドに関する実験データは、開示されていない。
【００１５】
要約すると、従来技術において開示されたＨＳＰ７０関連の病因を有する白斑または他の自己免疫疾患に対する処置選択肢は、限定された治療効果、重大な副作用または安全性の懸念に苦しむ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００９／０３６３４９  Ａ１号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０３３３９５  Ａ１号
【特許文献３】国際公開第２００９／００８７１９  Ａ２号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｐｅｅｃｋａｅｒｔ  ＆  ｖａｎ  Ｇｅｅｌ，２０１７
【非特許文献２】Ｍｏｓｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献３】Ｍａｌｙｓｈｅｖ，２０１３
【非特許文献４】Ｍｏｓｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献５】Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９
【非特許文献６】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１
【非特許文献７】Ｊａｃｑｕｅｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７
【非特許文献８】Ｍｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献９】Ｍａｎｓｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
先行技術を考慮して、先行技術の上記の欠点を克服するための活性剤、組成物、方法および使用を提供することは、本発明の基礎となる一般的な問題であった。特に、ＨＳＰ７０ｉ関連の病因、特に白斑を有する自己免疫疾患を処置または予防するのに適した薬剤、組成物および方法を、提供すべきである。さらに、薬剤および組成物は、簡便に投与可能、安全かつ製造が容易であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
驚くべきことに、本発明の基礎となる問題は、特許請求の範囲による突然変異パルボウイルスタンパク質、組成物、使用および方法によって解決されることが見出された。本発明のさらなる実施形態を、説明全体にわたって概説する。
【００２０】
第１の態様において、本発明は、ヒトＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を含む少なくとも１つの挿入を含む、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質に関する。
【００２１】
驚くべきことに、本発明のパルボウイルス構造タンパク質は、ヒトＨＳＰ７０ｉに対する高力価抗体を誘導する。さらに、図５から明らかなように、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質による免疫化は、自己免疫病因に基づく色素脱失化を阻害する。
【００２２】
本発明内の「突然変異」パルボウイルス構造タンパク質は、それぞれの野生型パルボウイルス構造タンパク質と比較して、連続配列としてヒトＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６つの連続したアミノ酸の配列を含む挿入を少なくとも含むパルボウイルス構造タンパク質である。突然変異したパルボウイルス構造タンパク質は、以下に記載される置換、挿入、および／または欠失などの追加の突然変異を含み得る。
【００２３】
本発明によれば、「ＨＳＰ７０ｉ」は、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７０Ａ１ＡまたはＨＳＰ７０Ａ１Ｂとしても知られるヒト誘導性熱ショックタンパク質７０を指し、これらは同一のアミノ酸配列によって特徴付けられるが、異なる調節領域を有する別々の遺伝子によってまだコードされている。ＨＳＰ７０ｉのアミノ酸配列はＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＱＹ７６８７３．１の配列と同等である。それぞれのアミノ酸配列は、本発明の文脈において配列番号１と表示される。
【化１】
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【００２４】
ＨＳＰ７０ｉのＣ末端は、配列番号１で下線を引いている。
【００２５】
本発明によれば、「ＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる」少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列は、ＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内のアミノ酸配列の一部を構成する少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列である。
【００２６】
好ましい実施形態では、挿入に含まれる少なくとも６つの連続したアミノ酸の配列は、連続した配列としてＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３７８〜６４１内に含まれる。
【００２７】
ヒトＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列を含む少なくとも１つの挿入はまた、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも１０個または少なくとも２１個のアミノ酸を含み得る。さらに好ましい実施形態において、挿入は、６〜４０個、１０〜３０個、または１２〜２５個のアミノ酸、好ましくは１３〜１８個、および最も好ましくは１５〜１７個のアミノ酸の配列を含み得る。これらのアミノ酸に加えて、挿入は、以下に記載されるように、ＮおよびＣ末端リンカー配列をさらに含むことができる。
【００２８】
１つの実施形態において、少なくとも１つの挿入は、完全長ＨＳＰ７０ｉでなくてもよい。好ましくは、挿入は、ヒトＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる５０個以下、４５個以下、４０個以下、および／または３５個以下の連続するアミノ酸の配列を含む。
【００２９】
突然変異したパルボウイルス構造タンパク質がＨＳＰ７０ｉに対する抗体の生成を誘導することは本発明の目的であるので、挿入のアミノ酸配列は、Ｂ細胞エピトープを含む。「Ｂ細胞エピトープ」は、免疫系によって、特に抗体またはＢ細胞によって認識される高分子の一部である。Ｂ細胞エピトープは、線状アミノ酸配列と、アミノ酸の二次構造によって、または他の有機物質と組み合わせて構築され得る巨大分子の表面によって定義される構造的エピトープの両方であり得る。
【００３０】
好ましい実施態様において、挿入のアミノ酸配列は、天然のＨＳＰ７０ｉの表面に少なくとも部分的に表示される配列に対応するアミノ酸の配列であってもよい。好ましくは、アミノ酸は、基質ポリペプチドがＨＰＳ７０ｉに結合している立体配座で、ＨＳＰ７０ｉの表面に少なくとも部分的に表示される。
【００３１】
ＨＳＰ７０ｉのＣ末端ドメインの構造は解決されており（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、目的のアミノ酸配列の位置に関して分析することができる。
【００３２】
好ましい実施形態では、挿入に含まれるアミノ酸配列は、ヒトＨＳＰ７０ｉによる抗原提示細胞、特に樹状細胞の活性化に関与するアミノ酸配列を含む。抗原提示細胞の活性化におけるヒトＨＳＰ７０ｉ内のアミノ酸配列の関与は、それぞれの配列に結合する抗体の効果、特に阻害効果を分析することによって、またはＨＳＰ７０ｉのそれぞれの配列に導入された１つ以上の突然変異の、ＨＳＰ７０ｉによる樹状細胞活性化に対する効果、特に阻害効果を分析することによって試験され得る。適当なアッセイの例を、本出願の実施例３に記載する。ＨＳＰ７０ｉによる樹状細胞の活性化は、例えば、Ｍｏｓｅｎｓｏｎら（２０１３）によって開示されているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイにおける未成熟樹状細胞の活性化によって分析することができる。それぞれの配列に結合する抗体、またはそれぞれの配列に導入された突然変異がＨＳＰ７０ｉによる樹状細胞の活性化を阻害する場合、それぞれの配列は、本発明の意味内で「抗原提示細胞の活性化に関与する配列」であると考えられる。
【００３３】
Ｍｏｓｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）によって開示されているように、アミノ酸配列ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ（配列番号２）を有するＨＳＰ７０ｉのアミノ酸４３５〜４４５は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞の活性化に関与する。したがって、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質における挿入が、アミノ酸配列ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ（配列番号２）を有するＨＳＰ７０ｉのアミノ酸４３５〜４４５の配列を含むことは、本発明の好ましい実施形態である。最も好ましくは、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質における挿入は、配列ＴＹＳＤＮＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲＡＭＴ（配列番号３）を有するＨＳＰ７０ｉのアミノ酸４３０〜４５０の配列を含む。本発明の具体的な実施形態では、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質における挿入は、ヒトＨＳＰ７０ｉのアミノ酸２９１〜３０４および／または４４５〜４６０内に含まれる少なくとも６つの連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含まない。
【００３４】
さらなる実施形態では、挿入に含まれるアミノ酸配列は、ＨＳＰ７０ｉ内の対応する配列と比較して少なくとも１つの突然変異を含む。「ＨＳＰ７０ｉ内の対応する配列」は、突然変異を導入することによって挿入の配列を導き出すことができる配列である。少なくとも１つの突然変異を含む挿入は、ＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１、好ましくはＨＳＰ７０ｉのアミノ酸４３０〜４５０、またはアミノ酸４３５〜４４５内のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。挿入の突然変異した配列は、前記挿入を含む本発明による突然変異したパルボウイルスタンパク質を投与する際に、ＨＳＰ７０ｉ内の対応する配列に対する抗体を誘導することができる。
【００３５】
本発明との関連において、アミノ酸配列内またはヌクレオチド配列内の突然変異は、少なくとも１つの置換、挿入または欠失であり得る。置換において、少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドは、それぞれの野生型または対照配列と比較して突然変異した配列中の別のアミノ酸またはヌクレオチドに対して交換される。挿入において、少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドは、それぞれの野生型または対照配列と比較して突然変異した配列に挿入される。欠失では、少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドは、それぞれの野生型または対照配列と比較して突然変異した配列において省略される。
【００３６】
置換は、一次配列における保存的アミノ酸置換であってもよい。当業者は、用語「保存的置換」が、タンパク質またはペプチドの１つまたは複数のアミノ酸を、類似の特性を有する代替のアミノ酸で置換し、天然のタンパク質の機能の物理化学的特性および／または構造を実質的に変化させない作用を包含することを意図することを理解するであろう。この種の類似体もまた、本発明の範囲内に包含される。１つの実施形態において、置換アミノ酸は、アミノ酸が属するクラスの他の要素から選択され得る。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンを含む。極性の中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性の）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。好ましい保存的置換の例としては、正電荷を維持するためのＡｒｇに対するＬｙｓ、およびその逆；負電荷を維持するためのＡｓｐに対するＧｌｕ、およびその逆；遊離ＯＨが維持されるようなＴｈｒに対するＳｅｒ；ならびに遊離のＮＨ２を維持するためのＡｓｎに対するＧｌｎが挙げられる。
【００３７】
好ましい実施形態では、挿入に含まれるアミノ酸配列は、ＨＳＰ７０ｉ内の対応する配列と比較して少なくとも１つの突然変異を有するＨＳＰ７０ｉのアミノ酸４３５〜４４５、より好ましくはアミノ酸４３０〜４５０を含むことができる。好適には、突然変異は、少なくとも１つのアミノ酸置換である。少なくとも１つの突然変異は、２つの置換または３つの置換またはそれ以上の置換であってもよい。好ましくは、挿入における少なくとも１つの突然変異は、対応するＨＳＰ７０ｉ配列において、置換Ｑ４３５Ａ（Ａに対する位置４３５のＱの置換）、Ｖ４３８ＫおよびＩ４４０Ａの組み合わされた置換またはＶ４４２ＡおよびＹ４４３Ｖの組み合わされた置換に相当する。最も好ましくは、この突然変異は、ＨＳＰ７０ｉにおけるＱ４３５Ａの置換に対応する置換である。したがって、挿入は、好ましくは、アミノ酸配列ＡＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ（配列番号４）、より好ましくはアミノ酸配列ＴＹＳＤＮＡＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲＡＭＴ（配列番号５）を含むことができる。上述のように、前述の突然変異は、ＨＳＰ７０ｉが樹状細胞を活性化する特性を排除する（Ｍｏｓｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【００３８】
突然変異したパルボウイルス構造の挿入に含まれる突然変異した配列によって構成されるエピトープが、対象に投与されると、ＨＳＰ７０ｉ内の対応するエピトープに結合する抗体の生成を誘導することが、本発明の好適な実施形態である。ＨＳＰ７０ｉ内の対応するエピトープは、挿入に含まれる配列に対応するＨＳＰ７０ｉ内のアミノ酸配列によって少なくとも部分的に構成される。種々のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに結合する抗体を誘導するエピトープは、「ミモトープ」を表す。したがって、本発明によれば、挿入に含まれる突然変異したアミノ酸配列は、ＨＳＰ７０ｉ内の対応する配列のミモトープを表す。
【００３９】
ＨＳＰ７０ｉ内の対応する配列と比較した突然変異した配列を有する挿入の使用は、本発明の特に有利な実施形態であり得る。突然変異したパルボウイルス構造タンパク質は、パルボウイルスタンパク質と共に投与された対象においてＨＳＰ７０ｉに対する抗体応答を誘発することが、本発明の目的である。しかし、ＨＳＰ７０ｉ内の抗原配列は、ヒト免疫系に対して「自己」抗原を示す。中枢性免疫寛容と呼ばれるプロセスで、自己抗原に対して反応性であるＢ細胞は負の選択を受け、したがって細胞成熟の間に大きい程度で欠失する。パルボウイルス構造タンパク質に含まれる挿入のアミノ酸配列が、ＨＳＰ７０ｉ内のそれぞれの配列と比較して突然変異を含む実施形態では、挿入のエピトープは、自己抗原から逸脱する。このように、ヒトＨＳＰ７０ｉ内で挿入に対して反応性であり、自己抗原に対して交差反応性であるＢ細胞が、中枢性免疫寛容の機序により枯渇していない確率が上昇する可能性がある。したがって、突然変異したアミノ酸配列の使用は、処理される対象にパルボウイルス構造タンパク質を投与した際のＨＳＰ７０ｉに対する抗体を誘導する確率を増加させ得る。
【００４０】
さらに、上述のような突然変異ＨＳＰ７０ｉ配列の使用は、本発明によるパルボウイルスタンパク質による樹状細胞の活性化を妨げる。したがって、上述のような突然変異したＨＳＰ７０ｉ配列での挿入を含むパルボウイルスタンパク質の投与は、樹状細胞の活性化を介して処置される自己免疫疾患を促進しない可能性がある。
【００４１】
本発明によるパルボウイルス構造タンパクは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ガチョウパルボウイルス、アヒルパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、Ｂ１９またはマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）に由来し得、本明細書に記載されるように変異し得る。本発明の文脈において、別のタンパク質から「誘導される」本発明による突然変異した構造タンパク質は、突然変異した構造タンパク質内の挿入の配列の外側で、それぞれのタンパク質に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。パルボウイルスの間のゲノム構成の高い保存のために、本発明は、他のパルボウイルス要素に容易に移転することができる。好適には、本発明による構造タンパク質は、ウイルスタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からの一般的なカプシド集合体を共有するパルボウイルスに由来し得る。これらのウイルスに由来する構造タンパク質は、後述するようにＶＰ３からのみウイルス様粒子（ＶＬＰ）産生を可能にするため、一般的に有利である。このサブグループの現在知られているウイルスには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ガチョウパルボウイルス、アヒルパルボウイルス、およびヘビパルボウイルスが含まれる。好ましくは、ＡＡＶは、ウシＡＡＶ（ｂ−ＡＡＶ）、イヌＡＡＶ（ＣＡＡＶ）、マウスＡＡＶ１、ヤギＡＡＶ、ラットＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ（ＡＡＡＶ）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３、特にＡＡＶ２からなる群から選択される。
【００４２】
好ましい実施形態では、突然変異したパルボウイルスタンパク質は、ＡＡＶ２に由来する。ヒト免疫系は、全般的に、ヒト集団の最大の画分がいかなる疾患とも関連しないこのウイルスに感染しているので、ＡＡＶ２カプシドタンパク質に良好に適応している。さらに、遺伝子治療ベクターとしてのＡＡＶ２は、多数のヒト患者において試験されており、免疫学的合併症または他の安全性の懸念と関連していないと見られた。したがって、Ｂ細胞エピトープを多量体構造にすることを目的とする他のバックボーンと比較して、ＡＡＶ２は、バックボーン自体が、ワクチン接種されたヒトの大部分にとって、ワクチン接種されたヒトにおいて自己免疫疾患を引き起こし得る前例のない免疫反応を生じないという巨大な利点を有する。
【００４３】
本発明による突然変異したパルボウイルス構造タンパク質は、多量体構造を形成することができ、挿入は、前記多量体構造の表面に位置する。多量体構造は、例えば、キャプソメア、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはウイルスであり得る。ウイルスまたはＶＬＰの秩序だった、多価の、高度に反復性の、かつしばしば剛性の構造によって提示されるエピトープは、Ｂ細胞の強い刺激および、広範に架橋されたＢ細胞受容体による強固であり長期間継続する抗体応答の誘導をもたらすことができる。強力なシグナル伝達は、Ｂ細胞寛容機構を無効にし、自己抗原に対する強力な抗体応答の誘導を可能にすることさえある（Ｆｒｉｅｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２１６；国際公開第２００８／１４５４０１  Ａ２号）。したがって、本発明によるパルボウイルス構造タンパク質のように、高度に反復性で剛性の構造に多量体化するタンパク質の使用は、ＨＳＰ７０ｉのような自己抗原に対する抗体を発生するのに特に有利である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、パルボウイルス突然変異した構造タンパク質は、突然変異したＶＰ３タンパク質である。ワクチンとして有用な多量体構造が、本質的にＶＰ３からなる多量体構造に基づいて生成され得ることが、以前に示された（国際公開第２０１０／０９９９６０  Ａ２号）。多量体構造に基づくワクチンの臨床的開発は、単一の活性化合物／タンパク質に基づく製品に対して単純化され、可能な限り純粋であることから、単一の構造タンパク質のみを含む多量体構造の使用は、一般に有利であると考えられる。例えばＶＬＰに関しては、ウイルスはしばしば１つより多いタンパク質から構成され、宿主細胞から特異的にウイルスＤＮＡまたは非特異的にＤＮＡをパッケージングすることが可能であるので、一般にこれは課題である。従って、可能な限り少数の異なるタンパク質を含み、好ましくは核酸分子を含まない「純粋な」ＶＬＰを得ることが望ましい。さらに、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含むワクチンは、一般にパルボウイルスＲｅｐタンパク質の存在下で生産される。Ｒｅｐは、ＶＬＰに結合しているさらなるタンパク質を表すだけでなく、ウイルスゲノムおよび非特異的ＤＮＡのあらかじめ形成されたカプシドへのパッケージングを担うように保持されている（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＤＮＡのパッケージングは、ＶＬＰが潜在的に患者の細胞に侵入し、それによってこのような汚染ＤＮＡをトランスフェクトすることができ、これがあらゆる種類の望ましくない影響を引き起こす可能性があるので、回避されるべきである。
【００４５】
唯一の構造タンパク質は、Ｒｅｐ独立プロモーターの制御下にある細胞において、ＶＰ３に由来する突然変異したパルボウイルス構造タンパク質を発現することによって得られ得るので、ＶＰ３に由来する突然変異したパルボウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子であって、ＶＰ３配列の少なくとも一部によってＮ末端に伸長されないもの。さらに、「アセンブリ活性化タンパク質」（ＡＡＰ）と命名されたポリペプチドは、Ｓｏｎｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０または国際公開第２０１０／０９９９６０  Ａ２号に開示されている方法に従って発現され、これにより、高収率、例えば、約１０５、好ましくは約１０６、より好ましくは約１０７のウイルス粒子が細胞当たり形成されることが可能となる。特定のウイルス型のＶＰ３に由来する突然変異したパルボウイルス構造タンパク質は、好ましくは、前記ウイルス型からの対応するＡＡＰタンパク質と共発現され得る（Ｓｏｎｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０または国際公開第２０１０／０９９９６０  Ａ２号）。あるいはまた、密接に関連するウイルス型からのＡＡＰを使用してもよい。ＡＡＰをコードする配列は、本質的にＶＰ３からなるキャプシドを集合させるために、シスまたはトランスのいずれかで提供され得る。ウイルス粒子の力価は、トランスフェクトされた細胞の溶解物（前述参照）から、未希釈の形態で、または市販の滴定ＥＬＩＳＡキットを用いた希釈で定量することができ、それは、組み立てられた状態でのウイルスカプシドへのモノクローナル抗体Ａ２０の結合に基づいて、ウイルス濃度を測定する。抗体Ａ２０は例えば異なるウイルス血清型のカプシドに結合しないので、粒子力価は電子顕微鏡で可視化し、計数により定量することができる。タンパク質発現を分析し、その量を推定するために、トランスフェクトされた細胞の同一部分の細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために処理することができる。ゲル電気泳動を行いニトロセルロース膜に移すと、標的タンパク質に特異的な結合剤（例えば、モノクローナル抗体Ｂ１、Ａ６９、抗ＧＦＰ）を用いてタンパク質をプローブすることができる。タンパク質翻訳の量は、タンパク質に特異的に結合する結合剤の量から推定することができる。これらの複合体は、例えば、免疫組織化学染色、免疫蛍光染色または放射性標識によって可視化し、定量化することができる。
【００４６】
Ｓｏｎｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０または国際公開第２０１０／０９９９６０  Ａ２号によって開示されているように、細胞溶解物からウイルス様粒子を得る代わりに、ウイルス様粒子は、好ましくは、培養上清から得ることができる。培養上清からウイルス様粒子を得ることは、製造における細胞溶解ステップに有利に取って代わり、粒子の精製を容易にする。
【００４７】
本発明によれば、挿入（複数可）は、Ｉ−２６１、Ｉ−２６６、Ｉ−３８１、Ｉ−４４７、Ｉ−４４８、Ｉ−４５３、Ｉ−４５９、Ｉ−４７１、Ｉ−５３４、Ｉ−５７０、Ｉ−５７３、Ｉ−５８４、Ｉ−５８７、Ｉ−５８８、Ｉ−５９１、Ｉ−６５７、Ｉ−６６４、Ｉ−７１３  およびＩ−７１６、好ましくはＩ−２６１、Ｉ−４５３、Ｉ−５３４、Ｉ−５７０、Ｉ−５７３およびＩ−５８７、より好ましくはＩ−４５３、Ｉ−５３４およびＩ−５８７、特にＩ−４５３およびＩ−５８７からなる群から選択される１つ以上の位置に挿入されることが好ましい。使用される命名法Ｉ−＃＃＃は、ＡＡＶ−２のＶＰ１タンパク質に対するアミノ酸番号を＃＃＃で命名した挿入部位を指すが、しかしながら、挿入が、所与のＡＡの５アミノ酸Ｎ端末またはＣ端末、好ましくは所与のＡＡの３、より好ましくは２、特に１ＡＡ（ｓ）Ｎ端末またはＣ端末の配列中の１アミノ酸のＣ端末に直接位置し得ることを意味する。ＡＡＶ−２以外のパルボウイルスでは、有用な場合には、アミノ酸配列を決定するか、またはカプシド構造を比較することにより、対応する挿入部位を同定することができる。このような位置合わせは、パルボウイルスＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ｂ−ＡＡＶ、ＧＰＶ、Ｂ１９、ＭＶＭ、ＦＰＶおよびＣＰＶに対して実施されている（国際公開第２００８／１４５４０１  Ａ２号の図３）。
【００４８】
挿入が導入された後、部位を命名したアミノ酸の位置に下線を付す。ＡＡＶ２カプシドのループ内に同様に位置しているので、下線を付したＡＡの隣に位置する５つの直接隣接するアミノ酸に挿入を導入することも、同様に可能である。例えば、挿入部位Ｉ−５８７は、強調によって示される以下のアミノ酸のものの前および／または後の挿入に対応する：ＡＡＶ１におけるＦＱＳＳＳ  ＴＤＰＡＴ、ＡＡＶ２におけるＬＱＲＧＮ５８７ ＲＱＡＡＴ、ＡＡＶ３ｂにおけるＬＱＳＳＮ  ＴＡＰＴＴ、ＡＡＶ６におけるＬＱＳＳＳ  ＴＤＰＡＴ、ＡＡＶ７におけるＬＱＡＡＴＡＡＱＴ、ＡＡＶ８におけるＬＱＱＱＮ  ＴＡＰＱＩ、ＡＡＶ１０におけるＬＱＱＡＮ  ＴＧＰＩＶ、ＡＡＶ１１におけるＮＱＮＡＴ  ＴＡＰＩＴ、およびＡＡＶ５におけるＮＱＳＳＴ  ＴＡＰＡＴ。
【００４９】
さらに、挿入部位Ｉ−４５３は、以下の１０個のアミノ酸のそれぞれの直接Ｎ末端またはＣ末端、好ましくは強調によって示されるアミノ酸の直接Ｃ末端の挿入に対応する。ＡＡＶ１におけるＱＮＱＳＧ  ＳＡＱＮＫ、ＡＡＶ２におけるＮＴＰＳＧ４５３ ＴＴＴＱＳ、ＡＡＶ３ｂにおけるＧＴＴＳＧ  ＴＴＮＱＳ、ＡＡＶ６におけるＱＮＱＳＧ  ＳＡＱＮＫ、ＡＡＶ７におけるＳＮＰＧＧ  ＴＡＧＮＲ、ＡＡＶ８におけるＧＱＴＴＧ  ＴＡＮＴＱ、ＡＶ１０におけるＱＳＴＧＧ  ＴＱＧＴＱ、ＡＡＶ１１におけるＬＳＧＥＴ  ＮＱＧＮＡ、およびＡＡＶ５におけるＦＶＳＴＮ  ＮＴＧＧＶ。
【００５０】
好ましい実施態様において、本発明のパルボウイルス突然変異構造タンパク質は、２つ以上の挿入を含み、各々は、ＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６つの連続したアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、各々はパルボウイルス突然変異構造タンパク質の異なる挿入部位に挿入され、好ましくは、１つの挿入がＩ−５８７にあり、１つがＩ−４５３にある。ＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６つの連続したアミノ酸の配列の２つ以上の挿入は、同一の配列または異なる配列であってもよい。好ましくは、配列は同じ配列であり、最も好ましくは少なくとも配列ＡＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧを含む。
【００５１】
上記のような長さを有する、ＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１内に含まれる少なくとも６つの連続したアミノ酸、またはその突然変異体のアミノ酸配列の挿入に加えて、挿入は、追加的に好ましくは、そのＮおよび／またはＣ末端上に、好ましくは、２〜１０個、より好ましくは３〜６個のアミノ酸の長さを有するリンカー配列を含むことができ、好ましくは、リンカーは、挿入されたエピトープが免疫系に十分に到達可能であるように支持する、小さな中性または極性のアミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｃ）を含むか、またはそれらからなる。Ｃは、リンカーの両側にある２個のＣが水素結合を形成できるという利点をもっている。したがって、Ｎ端末およびＣ端末リンカーの両方が少なくとも１つのＣを含むことが想定される。一般に、リンカー配列（複数可）は、Ａ、ＧおよびＳで構成されることが好ましい。
【００５２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、挿入に直接隣接する５個のアミノ酸のいずれもＲではなく、リンカーのアミノ酸のいずれも、存在する場合にはＲではない。挿入のごく近傍にあるＲは、発現および精製中に、突然変異した構造タンパク質／突然変異した構造タンパク質から構成される多量体構造の収率を低下させ、したがって回避することが好ましい。したがって、ＡＡＶ２に対する位置５８５および５８８のＲは、例えば、Ａによって置換されている。したがって、パルボウイルス突然変異構造タンパク質は、挿入、欠失、異種アミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端融合および置換、特に単一アミノ酸交換、またはこれらの組み合わせ、好ましくはＡＡＶ２のＲ５８５および／またはＡＡＶ２のＲ５８８の突然変異、特にＡＡＶ２のＲ５８５Ａおよび／またはＡＡＶ２のＲ５８８Ａの単一アミノ酸交換から選択される１以上の追加の突然変異を含む。
【００５３】
さらに、国際公開第２００８／１４５４０１  Ａ２号に記載されているようにＡＡＶ２のＩ−４５３位にエピトープが挿入されると、有用なエンドヌクレアーゼ制限部位の生成により、挿入の下流のリンカー内でＲの生成がもたらされる（実施例６．４．３、１０３頁、１２および１４行参照）。このＲを小さい中性もしくは極性アミノ酸に置き換えたパルボウイルス突然変異構造タンパク質は（Ｒ４５３Ｓ変異体におけるＳの例では）、発現およびその後の精製の間にＶＰ３唯一のＡＶウイルス様粒子（ＡＡＶＬＰ）のかなり高い収量につながる。したがって、リンカーは、存在する場合、Ｒを含まないこと、特にＩ−４５３での挿入されたエピトープの直接下流にあるリンカーがＲを含まないことが好ましい。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、特に少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも３０個、最も好ましくは少なくとも６０個の構造タンパク質を含む、上記のパルボウイルス突然変異構造タンパク質を含む多量体構造に関する。このような多量体構造は、キャプソメア、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはウイルスであり得る。キャプソメアはウイルス性キャプシドの多量体サブユニットであり、典型的には５〜６個のキャプシドタンパク質（五量体および六量体）からなる。ＶＬＰは、空のウイルスであり、ウイルスゲノムまたはその関連部分のような遺伝物質を含まないことを意味する。キャプソメア、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはウイルスのような順序立った構造の代わりに、多量体構造は、対称的な順序をもたない無定形構造をもつ凝集体であり得る。好ましくは、ＨＳＰ７０ｉのアミノ酸３２０〜６４１、またはその突然変異体内に含まれる少なくとも６つの連続したアミノ酸の配列を含む挿入は、多量体構造の表面に位置する。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの本発明のパルボウイルス突然変異構造タンパク質をコードする核酸に関する。本発明のさらなる実施形態は、ベクター、例えば、本発明のパルボウイルス突然変異構造タンパク質をコードする核酸分子を含むウイルスである。このようなウイルスは、感染性であっても不活性であってもよく、例えば、弱毒化または照射のような標準的な技術を介して不活性化されていてもよい。
【００５６】
さらなる実施形態では、本発明は、上記のパルボウイルス突然変異構造タンパク質をコードする核酸を含む細胞である。このような細胞は、細菌、好ましくは大腸菌、酵母細胞、好ましくは酵母細胞、好ましくは出芽酵母、ハンセヌラ・ポリモルファ（ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）またはピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、昆虫細胞、好ましくはＳＦ−９、ＳＦ＋もしくはＨｉｇｈ５、または哺乳動物細胞、好ましくはＨｅＬａ、２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲＣ６、ＢＨＫまたはＣＨＯであり得る。
【００５７】
本発明のパルボウイルス突然変異構造タンパク質は、次のステップを含む方法によって調製することができる：
ａ）適当な条件下で本発明による細胞を培養することによって構造タンパク質を生産し、それによって本発明の核酸分子を発現させ、かつ任意にアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする核酸分子を共発現させ、および
ｂ）ステップａ）で生産された発現したパルボウイルス突然変異構造タンパク質を任意に単離する。
【００５８】
好ましい実施形態では、本質的にＶＰ３のみが発現され、本質的にＶＰ３のみを含む多量体構造が得られる。この方法による発現および精製は、例えば、本出願の実施例１に従って実施することができる。得られたＡＡＶＬＰの挿入および精製を含むパルボウイルス突然変異構造タンパク質の発現は、さらに、哺乳動物細胞については国際公開第２０１２／０３１７６０  Ａ１号、実施例１、または昆虫細胞については国際公開第２０１０／０９９９６０  Ａ２号、実施例１に開示されている。
【００５９】
本発明の別の主題は、本発明による少なくとも１つのパルボウイルス突然変異構造タンパク質および／または本発明による核酸、および／または好ましくは本発明による少なくとも１つの多量体構造を含む組成物に関する。
【００６０】
さらなる態様において、本発明は、医薬として使用するための、本発明によるパルボウイルス突然変異構造タンパク質および／または本発明による核酸、好ましくは本発明による多量体構造に関する。さらに、本発明は、医薬として使用するための、少なくとも１つの本発明によるパルボウイルス突然変異構造タンパク質および／または本発明による核酸、好ましくは少なくとも１つの本発明による多量体構造を含む組成物に関する。
【００６１】
医薬は、好ましくは、本発明の少なくとも１つのパルボウイルス突然変異構造タンパク質および／または本発明の核酸分子、好ましくは本発明の少なくとも１つの多量体構造を含むワクチンとして使用することができる。
【００６２】
医薬および／またはワクチンは、好ましくは、自己免疫疾患および／もしくは炎症性疾患を処置もしくは予防する方法、または免疫抑制の方法で使用するためのものであり得る。自己免疫性および／または炎症性疾患は、白斑、脱毛症、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、多発性硬化症、パーキンソン病、自己免疫性糖尿病（１型糖尿病）、移植片対宿主、宿主対移植片反応視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、急性視神経炎（ＡＯＮ）、共生菌、およびＨＳＰ７０を発現する腫瘍から選択され得る。免疫抑制の方法は、好ましくは、移植された組織に対する、特に移植された臓器に対する対象における免疫反応が抑制される方法であってもよい。本発明の文脈内で、疾患または状態を「処置または予防する」とは、本明細書に記載される化合物または組成物の適用に関し、（ａ）その疾患または状態または症状が、その疾患または状態またはその症状にかかりやすい場合がある、および／または獲得する場合があるが、まだそれを有すると診断されていない対象において発生するのを防止すること；（ｂ）疾患または状態症状を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；あるいは（ｃ）疾患または状態症状を軽減または除去すること、すなわち、その疾患または症状または症状の退縮を引き起こすこと、に関する。白斑については、症状は、前述したような皮膚の色素脱失である。
【００６３】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明によるパルボウイルス突然変異構造タンパク質および／もしくは本発明による核酸分子の使用、ならびに／または本明細書に記載される自己免疫疾患および／もしくは炎症性疾患の処置もしくは予防における前記タンパク質もしくは核酸分子を含む組成物に関する。組成物は、本明細書に開示される任意の医薬であってもよい。
【００６４】
好ましい実施形態では、組成物、医薬またはワクチンは、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を包含する。本発明において有用な薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、従来のものであり、緩衝剤、安定剤、希釈剤、保存剤、および可溶化剤を含むことができる。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、第１５版（１９７５）によるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓは、本明細書に開示される（ポリ）ペプチドの医薬送達に適した組成物および処方物を記載する。一般に、担体または賦形剤の性質は、使用される特定の投与の様式に依存するであろう。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水、グリセロール、クエン酸などの薬学的および生理学的に許容可能な流体を含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル形態）の場合、従来の無毒性固体担体は、例えば、医薬階級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。
【００６５】
組成物、医薬またはワクチンは、アジュバントなどの免疫刺激物質をさらに含むことができる。アジュバントは、投与の方法に基づいて選択することができ、ミネラルまたは植物油ベースのアジュバント、ＩＳＡのようなモンタニド不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、Ｒｉｂｉアジュバント系のような水中油型エマルジョンアジュバント、ムラミルジペプチドを含有するシンタックスアジュバント製剤、またはアルミニウム塩アジュバントを含み得る。好適には、アジュバントは、油ベースのアジュバント、好適にはＩＳＡ２０６（ＳＥＰＰＩＣ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、最も好適にはＩＳＡ５１またはＩＳＡ７２０（ＳＥＰＰＩＣ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）である。別の好ましい実施形態では、パルボウイルス突然変異構造タンパク質は、ＣｐＧ、イミダゾキノリン、ＭＰＬ、ＭＤＰ、ＭＡＬＰ、フラゲリン、ＬＰＳ、ＬＴＡ、もしくはコレラ毒素またはその誘導体、サポニン、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭ、ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＭＦ５９、アダマンタン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはサイトカインのような少なくとも１つの適切なアジュバントと共配合される。
【００６６】
より好ましい実施形態において、免疫刺激物質は、ポリカチオン性ポリマー、特にポリアルギニンなどのポリカチオン性ペプチド、免疫刺激性デオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフ、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン、ａｌｕｍｎ、アジュバントまたはそれらの組み合わせを含有するペプチドを含む群から選択される。好適には、組合せは、ポリカチオン性ポリマーおよび免疫刺激性デオキシヌクレオチド、または少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフおよび免疫刺激性デオキシヌクレオチドを含むペプチドのいずれかである。尚さらに好ましい実施形態では、ポリカチオン性ポリマーは、ポリカチオン性ペプチドである。本発明のさらにより好ましい態様において、免疫刺激物質は、少なくとも１つの免疫刺激核酸である。免疫刺激核酸は、例えば、核酸を含む中性または人工ＣｐＧ、無脊椎動物由来の核酸の短い延伸、または定義されたベース文脈（例えば、国際公開第９６／０２５５５号に記載されている通り）における非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む短いオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の形態である。あるいは、例えば国際公開第０１／９３９０３号に記載されているようなイノシンおよびシチジンに基づく核酸、またはデオキシ−イノシンおよび／もしくはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（国際公開第０１／９３９０５号および国際公開第０２／０９５０２７号に記載されている）も、好ましくは、本発明における免疫刺激核酸として使用され得る。好適には、種々の免疫刺激核酸の混合物が、本発明で使用される。さらに、前述のポリカチオン性化合物を、前述の免疫刺激核酸のいずれかと組み合わせてもよい。好ましくは、このような組み合わせは、国際公開第０１／９３９０５号、国際公開第０２／３２４５１号、国際公開第０１／５４７２０号、国際公開第０１／９３９０３号、国際公開第０２／１３８５７号および国際公開第０２／０９５０２７号ならびにＡＵ出願Ａ  １９２４／２００１号に記載されているものによる。
【００６７】
好ましい態様において、組成物、医薬またはワクチンは、さらなる免疫刺激物質、例えば上記のようなアジュバントを含まない場合がある。有利には、ＡＡＶ骨格自体は、強い免疫刺激特性を有する。
【００６８】
本発明による組成物、医薬またはワクチンは、それを必要とする対象、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに、種々の経路、例えば静脈内、腹腔内、リンパ節内、皮下、皮内、筋肉内、局所、鼻腔内または気管支内投与を含む任意の従来の方法で投与することができる。好ましくは、組成物、医薬またはワクチンは、皮下または筋肉内に投与される。
【００６９】
投与のための各用量の体積は、好ましくは約５ｍｌまで、尚さらに好ましくは１ｍｌ〜３ｍｌ、最も好ましくは約２ｍｌである。筋肉内注射が選択された投与経路である場合の用量の体積は、好ましくは約５ｍｌまで、好ましくは３ｍｌまで、好ましくは１ｍｌ〜３ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｌ〜２ｍｌ、最も好ましくは約１ｍｌである。各用量におけるワクチンの量は、ＨＳＰ７０ｉタンパク質に対する有効な免疫を付与し、患者が罹患しているかもしくは発症する可能性を有する自己免疫疾患に関連する臨床的徴候を発症するリスクを低下させるか、またはそれを伴ってワクチン接種を受けている対象に対する臓器移植拒絶を予防もしくは復帰させるのに十分な量でなければならない。
【００７０】
好ましくは、タンパク質または核酸の単位用量は、約５μｇタンパク質／ｋｇ体重まで、より好ましくは約０．２〜３μｇ／ｋｇ、尚さらに好ましくは約０．３〜１．５μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．４〜０．８μｇ／ｋｇ、尚さらに好ましくは約０．６μｇ／ｋｇであるべきである。別の好ましい単位用量は、約６μｇのタンパク質または核酸／ｋｇ体重まで、より好ましくは約０．０５〜５μｇ／ｋｇ、尚さらに好ましくは約０．１〜４μｇ／ｋｇであり得る。
【００７１】
用量は、好ましくは、１〜４回、特に１〜３回、例えば１〜３カ月の間隔をあけて投与する。用量当たりのタンパク質の好ましい量は、約１μｇ〜約１ｍｇ、より好ましくは約５μｇ〜約５００μｇ、尚さらに好ましくは約１０μｇ〜約２５０μｇ、最も好ましくは約２５μｇ〜約１００μｇである。
【００７２】
さらに別の実施形態では、本発明は、患者、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに、本発明に従って、有効量のパルボウイルス突然変異構造タンパク質、核酸、組成物、医薬またはワクチンに投与することにより、本明細書に明記される疾患をワクチン接種および／または処置もしくは予防する方法に関する。従って、本発明によるパルボウイルス突然変異構造タンパク質、組成物またはワクチンは、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を予防または処置する方法において使用することができる。自己免疫性および／または炎症性疾患は、白斑、脱毛症、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、多発性硬化症、パーキンソン病、自己免疫性糖尿病（１型糖尿病）、移植片対宿主、宿主対移植片反応視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、急性視神経炎（ＡＯＮ）、卵巣炎、およびＨＳＰ７０を発現する腫瘍から選択され得る。
【００７３】
パルボウイルス突然変異構造タンパク質、核酸、組成物、医薬またはワクチンの「有効量」は、例えば、徴候または症状を予防または改善する、ｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示すことができる当該量として計算することができる。このような量は、当業者によって決定され得る。
【００７４】
上記の問題は、本発明によって、特許請求されるように、および本明細書に開示されるように解決される。
【００７５】
驚くべきことに、本発明のパルボウイルス構造タンパク質は、特に樹状細胞の活性化に関与するＨＳＰ７０ｉ内の配列に対して、ヒトＨＳＰ７０ｉに対する高力価抗体を誘発する。誘発された抗体は、自己免疫性色素脱失を阻害する。
【００７６】
本明細書の実施例２に示すように、ＨＳＰ７０ｉ（ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ−４５３Ｑ４３５Ａ）の変異した残基４３０〜４４５（ＴＹＳＤＮＡＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ）（配列番号５）を含む本発明のＡＡＶウイルス様粒子は、哺乳動物のワクチン接種時に有意な抗体価を誘導する。特に、図１に示すように、免疫化された動物の血清中に含まれる抗体は、ＨＳＰ７０ｉ野生型残基４３０〜４４５（ＴＹＳＤＮＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ）（配列番号３）、それぞれの変異した残基４３０〜４４５（ＴＹＳＤＮＡＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ）（配列番号５）を含むペプチドおよびまた完全長の天然に折りたたまれたヒト組換えＨＳＰ７０ｉタンパク質を含むペプチドを認識した。
【００７７】
実施例３に示されるように、本発明によるｉｎ  ｖｉｖｏ生成抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験されたＤＣ活性化の有意な阻害を促進する。特に、得られた阻害は、モノクローナル抗ＨＳＰ７０ｉ抗体による阻害と同じ範囲であった。したがって、本発明によるＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉでのワクチン接種は、この対象におけるＨＳＰ７０ｉ阻害に適したそれぞれの対象における抗体を誘発することができると結論付けることができる。
【００７８】
ＨＳＰ７０ｉによる樹状細胞の活性化は、自己免疫疾患の病因、特に白斑の病因に関与するため、パルボウイルス構造タンパク質は、自己免疫疾患、特に白斑の処置および／または予防に適している。したがって、本出願の実施例４の実験により、本発明によるウイルス様粒子での免疫化が、白斑ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおける色素脱失を阻害することが示され得た。
【００７９】
パルボウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰの使用は、これらのＶＬＰが高い抗体価を誘発するため、特に有利である。重大な副作用と関連するコルチコステロイドの投与とは対照的に、ＶＬＰの投与は、通常副作用と関連しない。さらに、長期間にわたって頻繁に投与されなければならない白斑の本処置とは対照的に、それぞれのパルボウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰでのワクチン接種は、実施例４によって確認されるように、通常、非常に少数の投与しか必要としない。
【００８０】
例えば、完全長Ｈｓｐ７０ｉをコードするプラスミドでのワクチン接種を用いる従来技術の療法とは対照的に、本発明は、自己抗原Ｈｓｐ７０ｉの短い配列のみを表示することによって治療効果を確立し、従って、国際公開第２０１３／０３３３９５  Ａ１号によって開示された従来技術のプラスミドワクチン接種療法において過剰発現されるタンパク質の残りの全体に対する自己抗体の生成を回避する。
【００８１】
本発明を、以下の図面および実施例により、より詳細に説明するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、ＨＳＰ７０ｉ野生型ペプチド（図１Ａ）で免疫化してから１５日後および４３日後に得られた免疫前血清からの抗体価のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示し、ＨＳＰ７０ｉ変異ペプチド（図１Ｂ）および完全な折りたたまれたＨＳＰ７０タンパク質（図１Ｃ）を異なる希釈でのＯＤ値としている。
【図２】図２は、実施例３で使用されるフローサイトメーター設定のスクリーンショットを示す。
【図３】図３は、前免疫血清（Ｐｒｅ）の存在下、免疫したラットからの血清（Ｐｏｓｔ）、組換えＨＳＰ７０タンパク質の１／３と同じ（Ｐｏｓｔ（０．３  ＨＳＰ））、またはモノクローナル抗ＨＳＰ７０抗体（ｒｅｃ．ＨＳＰ７０  ＡＰ）の存在下での、ＣＤ８３（図３Ａ）およびＣＤ８６（図３Ｂ）陽性ＤＣの形態の実施例３のＤＣ活性化および阻害アッセイの結果を示す。
【図４】図４は、精製および透析したＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３およびＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿５８７粒子ならびにそれぞれの透析のフロースルーのクーマシーブルー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを示す。
【図５】図５は、白斑ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルの結果を示す。ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３で免疫したマウスの色素脱失の、対照（ＡＡＶＬＰ−ＨＰＶ）との比較における変化を示す。
【実施例】
【００８３】
実施例１：ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ  ＶＬＰの生成
１．１  細胞株および培養条件
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、Ｔ１７５フラスコ中で培養し、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清、１００Ｕのペニシリン／ｍＬ、および１００μｇのストレプトマイシン／ｍＬで補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％のＣＯ２中３７℃で維持した。
【００８４】
１．２．ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉのクローニング
ＡＡＶＬＰは、ｐＣＩプラスミドのＸｈｏｌＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングされた重複ＡＡＶ２  ＶＰ２およびＶＰ３コード配列を含むプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から作製した。ＶＰ２の開始コドンは、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて点突然変異を導入して、プラスミドｐＣＩＶＰ２ｍｕｔＡＣＧを作製することにより破壊された。点突然変異は、ＡＣＧからＧＡＧへの突然変異をもたらした。ＶＰ３にペプチドを導入するために、プラスミドｐＣＩＶ２ｍｕｔＡＣＧを改変した。プラスミドｐＣＩＶＰ２ｍｕｔＡＣＧ−Ｉ５８７は、位置５８７のＮｏｔＩおよびＢｓｐＥＩ部位の導入によって作製した。プラスミドｐＣＩＶＰ２ｍｕｔＡＣＧ−Ｉ４５３は、位置４５３のＮｏｔＩおよびＢｓｐＥＩ部位の導入によって作製した。その後、さらに別の点突然変異が、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて導入されて、プラスミドｐＣＩＶＰ２ｍｕｔＡＣＧ＿ｍｕｔＮｏｔＩ−Ｉ５８７およびプラスミドｐＣＩＶＰ２ｍｕｔＡＣＧ＿ｍｕｔＮｏｔＩ−Ｉ４５３を生成するｐＣＩベクターの骨格内の追加のＮｏｔＩ部位が破壊された。
【００８５】
ＨＳＰ７０ｉの野生型残基４３０〜４４５（ＴＹＳＤＮＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ）およびＨＳＰ７０ｉの変異した残基４３０〜４４５（ＴＹＳＤＮＡＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ）のヌクレオチド配列を、ＮｏｔＩ  ／ＢｓｐＥＩ消化ｐＣＩＶＰ２ｍｕｔ  ＡＣＧ＿ｍｕｔＮｏｔＩ−Ｉ５８７またはＮｏｔＩ  ／ＢｓｐＥＩ消化ｐＣＩＶＰ２ｍｕｔＡＣＧ＿ｍｕｔＮｏｔＩ−Ｉ４５３のいずれかにクローニングして、ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ産生のための４つの異なるプラスミドを作製した。プラスミドおよび誘導されたタンパク質ＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３は、４５３挿入部位において変異した残基４３０〜４４５を含んでおり、これに対してＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿５８７は、５８７挿入部位において変異した残基４３０〜４４５を含んでいた。
【００８６】
１．３  ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉの製造および精製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、無血清ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓ中で、ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉプラスミドＤＮＡ（ＰＥＩ  Ｉ（１：４）と混合したＴ１７５フラスコあたり３６μｇ）でトランスフェクトした。３〜４日後に上清を採取し、濾過により培地をクリアし、希釈緩衝液（１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．００１％のＦ−６８、ｐＨ５．５±０．３）で３回希釈し、ｐＨ６．０に調整した。クロマトグラフィーにより粒子をさらに精製した。簡単に述べると、ＡＡＶＬＰを含むクリアされた上清を、Ｃａｐｔｏ  Ｓカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷させ、（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．００１％のＦ−６８、ｐＨ６．０±０．３）を含む緩衝液Ａで洗浄した後、０〜３０％からの勾配溶出を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．００１％のＦ−６８、ｐＨ８．５±０．３）で適用し、この勾配中に画分を収集した。
【００８７】
純度は、ウエスタンブロッティングにより測定した。力価は、ＡＡＶ２滴定ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００８８】
１．４  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング
精製したＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ粒子の画分を解析し、精製したＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａワクチン粒子の分子量を特定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により特定した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥの前に、試料を透析した（試料ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３＿ＤｉａｌｙｓｅおよびＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿５８７＿Ｄｉａｌｙｓｅ）。透析した試料に加えて、透析のフロースルーからの試料を分析した（試料ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３＿ＦＴおよびＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿５８７＿ＦＴ）。サイズ指標としてＣｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｄｕｏ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒ（Ｌｉｃｏｒ，＃９２８−６００００）を用いた。比較として、国際公開第２０１２０３１７６０（Ａ１）号に開示されているＨＰＶエピトープ挿入を含むＡＡＶＬＰを用いた。結果を図４に示す。ゲルレーンの装填は、１：ＤＮＡサイズラダー、２：空、３：ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３＿Ｄｉａｌｙｓｅ、４：空、５：ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿５８７＿Ｄｉａｌｙｓｅ、６：空、７：透析後ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３＿ＦＴ；８：透析後空ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿５８７＿ＦＴ、９：空、１０：ＡＡＶＬＰ−ＨＰＶであった。
【００８９】
ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ  ＶＰ３タンパク質ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３およびＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａは、同等の対照ＶＰ３タンパク質と一致して約６５ｋＤａの分子量を示す。
【００９０】
ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ  ＶＰ３タンパク質の発現および純度を、抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検証した。ブロットした膜を、１×ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中の５％脱脂乳と共にＲＴで１時間インキュベートし、続いて膜を抗体（決定するべき）と共にＲＴで１時間インキュベートする。洗浄後、結合した抗体を、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＦＣイメージングシステム（ＬｉＣｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＳＡ）により分析した１：２０，０００希釈ＨＲＰ標識抗Ｘ  ＩｇＧで検出する。
【００９１】
１．６  ＡＡＶ２滴定ＥＬＩＳＡによるカプシド力価測定
１．３の下で記載されているＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のカプシド力価は、製造者のマニュアルに従って市販のＡＡＶ２滴定ＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｏｇｅｎ，＃ＰＲＡＴＶ）を用いて測定することができる。簡単に説明すると、粒子を連続希釈し、マウスモノクローナル抗体で被覆した９６ウェルプレート中でＡＡＶ２に対して１時間、３７℃でインキュベートする。洗浄後、捕獲されたＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ粒子を、抗ＡＡＶ２ビオチン結合モノクローナル抗体と共に、３７℃で１時間インキュベートする。洗浄を繰り返し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ抱合体を加えてビオチン分子と反応させ、続いて３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加え、特異的に結合したウイルス粒子の量に比例する色反応が生じる。ＲＴで１５分間培養後に停止液を加える。吸光度（ＯＤ）は、４５０ｎｍのＥＬＩＳＡリーダーを用いて測光的に測定する。ＡＡＶ２粒子を含むキット対照を含み、２倍に連続希釈し、典型的な滴定曲線を生じる。この曲線により、ＡＡＶＬＰ−ＨＰＳ７０ｉカプシド力価の定量的測定が可能である。
【００９２】
以下の力価を測定した：
ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿５８７＿Ｑ４３５Ａ：１．６７  Ｅ＋１２粒子／ｍＬ（１．１８７ｍｇ／ｍＬ）
ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿４５３＿Ｑ４３５Ａ：１．２３  Ｅ＋１２粒子／ｍＬ（１．５３２ｍｇ／ｍＬ）
【００９３】
実施例２：ラットの免疫化
２．１  免疫化
ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ−５８７Ｑ４３５ＡまたはＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ−４５３Ｑ４３５Ａによって導入されたＨＳＰ７０ｉの突然変異したエピトープに対する特異的免疫応答を解析するために、４匹のＳＰＦウィスターラット（系統Ｃｒｌ：ＷＩ（Ｈａｎ）に、実施例１に従って得られた８μｇ／ｍＬのタンパク質（８．７〜１０．０Ｅ９粒子／ｍＬ）のＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ粒子を２回（１日目および２９日目）皮下接種した。血清試料は、最初の２回は舌下法により、最後の血清試料採取は眼窩周囲法により、処理前および各ワクチン接種１４日後に得た。
【００９４】
２．２  抗体価の判定
２．２．１  材料
−  ８つのラット血清試料
−  一次抗ＨＳＰ７０／７２、ｍＡｂマウスＩｇＧ１（Ｅｎｚｏ，＃Ｃ９Ｆ３Ａ−５，Ｌｏｔ．：０５０２１６４８，１ｍｇ／ｍＬ）
−  ペプチド：ＪＰＴ，ＨＳＰ７０ｉｗｔ（ｐｅｐ−１）およびＨＳＰ７０ｉＱ４３５Ａ（ｐｅｐ−２）
−  ヒト組換えＨＳＰ７０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｈ７２８３−５０ＵＧ、ストック３００．３μｇ／ｍＬ）
−  ９６ウェルプレートＦ底（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ）
−  リン酸緩衝生理食塩水（１０×）．０６７Ｍ（ＰＯ４）（ＨｙＣｌｏｎｅ，＃ＳＨ３０２５８．０１，Ｌｏｔ：ＡＡＤ２０２６０３）
−  無菌の１×ＰＢＳ
−  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０  ＢｉｏＸｔｒａ、粘性液体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，＃９００５−６４−５，Ｐ７９４９−５００ｍｌ，Ｌｏｔ：ＳＬＢＱ００９７Ｖ）
−  スキムミルクパウダーＳｋｉｍ  Ｍｉｌｋ  Ｐｏｗｄｅｒ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃９９９９９９−９９−４、カタログ番号：１．１５３６３．０５００）
−  ＢＳＡ（ＢＳＡ、ＨＳ、標準グレード、Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＃ＥＱＢＡＨ６２−１０００，Ｌｏｔ：６２−１３８１）
−  ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰ結合、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃６１−９５２０（１：１０００）
−  ポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン、ＨＲＰ結合体、Ｄａｋｏ  ＃Ｐ０４４７（１：５０００）
−  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃１２６１７０８７、カタログ番号：３４０２９）
−  １．０ＭのＨ２ＳＯ４（Ｂｉｅ  ＆  Ｂｅｒｎｔｓｅｎ，＃２２２９４２）
−  ＥＬＩＳＡリーダー
【００９５】
２．２．２  実験手順
抗変異ＨＳＰ７０ｉ特異性ＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に述べると、Ｆ９６マイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ビオチン化ＨＳＰ７０ｉ野生型またはＨＳＰ７０ｉ突然変異ペプチドのいずれかの１μｇ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。完全な折りたたまれたＨＳＰ７０タンパク質の認知を実証するために、１μｇ／ウェルのヒト組換えＨＳＰ７０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｈ７２８３）でコーティングしたプレートも含めた。プレートを、１×ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中の５％の脱脂乳でＲＴで１時間遮断し、続いて１：１０または１：１００希釈ラット血清のいずれかと共に３７℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０結合ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ抗体で洗浄した後、１：１０００希釈ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃６１−９５２０）と共にインキュベートした。酵素反応は、発色反応をもたらすＴＭＢ−基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃１２６１７０８７）を添加することによって検出され、ＯＤ値で測定された強度は、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを使用して分析された。
【００９６】
２．３  結果
免疫化の１５日後および４３日後に得られた免疫前の血清中の抗体価は、ＨＳＰ７０ｉ野生型ペプチドについては図１Ａ、ＨＳＰ７０ｉ突然変異ペプチドについては図１Ｂ、および完全な折りたたまれたＨＳＰ７０タンパク質については図１Ｃに、様々な希釈でのＯＤ値としてグラフで示される。
【００９７】
図面から明らかなように、抗体は、すべての動物で効率的に誘発された。抗体は、野生型ペプチド、突然変異ペプチドおよび天然の完全に折りたたまれたＨＳＰ７０ｉを認識する。したがって、データは、本発明によるＡＡＶＬＰでの免疫化によって、ＨＳＰ７０ｉに対する抗体を生成するアプローチを完全に確認する。
【００９８】
実施例３：ＤＣ活性化アッセイ
樹状細胞の活性化に対するＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉに対して生成された抗体の効果を、ｉｎ−ｖｉｔｒｏＤＣ活性化アッセイにおいて試験して、本発明の基礎となる細胞機構を証明した。
【００９９】
アッセイは、以下のように実施した：
【０１００】
３．１  末梢血からのＰＢＭＣの単離
３．１．１  序文
ＰＢＭＣは、１個の円形核を含む末梢血からの細胞である。これらの細胞には、すべての種類のリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）、単球ならびに樹状細胞が含まれる。ＰＢＭＣ集団におけるこれらの細胞の分布は、典型的には以下の通りである：Ｔ細胞、４５〜７０％、Ｂ細胞およびＮＫ細胞、最大１５％、単球１０〜３０％および樹状細胞１〜２％。ＰＢＭＣは、密度勾配遠心法を用いて、完全血液または軟膜から、ヒト血液から単離することができる。
【０１０１】
３．１．２  定義
ＰＢＭＣ−末梢血単核細胞
ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水
【０１０２】
３．１．３  材料
【表１】
2021513840.tif 000004
【０１０３】
【表２】
2021513840.tif 000005
【０１０４】
ＰＢＭＣ分離の１日前に緩衝液を調製した：
Ａ）５０ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１％のＰ／Ｓ）を、以下によって調製した：
−  ５０ｍＬプラスチック管に４５ｍＬのＲＰＭＩ培地を移送する
−  滅菌ＦＢＳ５ｍＬを加える
−  ５００μｌのＰ／Ｓを加える
Ｂ）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）５０ｍｌを、以下によって調製した：
−  ５０ｍＬ滅菌ＰＢＳを５０ｍＬ管に移送する
−  ＢＳＡ０．２５ｇを加える
−  ５００μｌのＥＤＴＡ（ストック２００ｍＭから）を加える
−  ０．２２μｍファイラーを用いて溶液を滅菌ろ過する
【０１０５】
３．１．４  実験手順
１件のアッセイでは、約９０×１０６のＰＢＭＣが、１２本の管の血液から単離された。
【０１０６】
調製は、以下のステップに従って、それぞれの順序で行った：
−  リンホプレップを含む遠心管は、以下によって調製された：
−  １５ｍｌ管：４ｍｌのリンホプレップを加える
−  ５０ｍｌ管：１５ｍｌのリンホプレップを加える
−  ヒトドナーからの血液を、７．５ｍｌのヘパリンナトリウム管に採取し／軟膜を得る
−  全血を、ＲＰＭＩ１６４０で１：２に希釈した
−  リンホプレップを含む遠心管に、リンホプレップの上に重ねて管の側面を下に走らせることにより、希釈した血液を注意深く加えた。
−  １５ｍｌの試験管については、８ｍｌの希釈した血液を加えた
−  ５０ｍｌの試験管については、３０ｍｌの希釈した血液を加えた
−  細胞を１８０ｇ、２０℃、加速：２、破損：０で２０分間遠心分離した。
−  上清の最上層を除去した
−  １５ｍｌの試験管については、２ｍｌの上清を除去した
−  ５０ｍｌの試験管については、７．５ｍｌの上清を除去した
−  細胞を３８０ｇで２０分間遠心分離し、２０℃、加速：２、破損：０であった。
−  ８ｍｌの低温ＰＢＳでの１５ｍｌの遠心管を準備した。
−  ＰＢＭＣを含む中間相を採取し、低温ＰＢＳを含む新しい遠心管に移した。
−  １５ｍｌの試験管については、２本の試験管から中間相を１本の新しい試験管に採取した
−  ｍｌ管については、１つの管からの中間相を、２つの新しい管に採取した
−  細胞およびＰＢＳを含む１５ｍｌの遠心管に、低温ＰＢＳを１５ｍｌに充填した
−  細胞を、３００ｇ、４℃、加速：９、破損：３で１０分間遠心分離した
−  上清を除去し、細胞を残りのＰＢＳに再懸濁した。２本の試験管からの細胞を、１５ｍｌ遠心管１本に採取した。
−  細胞を、１０ｍｌの低温ＰＢＳに再懸濁した
−  細胞を３００ｇ、４℃、加速：９、破損：３で１０分間遠心分離した
−  上清を除去し、細胞を残りのＰＢＳに再懸濁した。２本の試験管からの細胞を、１５ｍｌ遠心管１本に採取した。
−  細胞を、１０ｍｌの低温ＰＢＳに再懸濁した
−  細胞を３００ｇ、４℃、加速：９、破損：３で１０分間遠心分離した
−  上清を除去し、細胞を残りのＰＢＳに再懸濁した。残りのすべての管からの細胞を、１５ｍｌ遠心管１本に採取した。
−  細胞を、１０ｍｌの低温ＰＢＳに再懸濁した
−  細胞を、３００ｇ、４℃、加速：９、破損：３で１０分間遠心分離した
−  上清を除去し、細胞を低温ＰＢＳに再懸濁した
−  細胞を、血球計算器で計数した（希釈：１０μｌの細胞懸濁液＋１０μｌのメチルバイオレット＋８０μｌのＰＢＳ）
−  細胞数は、以下のように算出した：
−  １ｍＬ当たりのＰＢＭＣ：（計数した細胞／四分円の数）×希釈×１０４
総ＰＢＭＣ：（計数した細胞／四分円の数）×希釈×１０４×細胞懸濁液体積。
【０１０７】
３．２  ＰＢＭＣからの単球の単離
ＰＢＭＣからの単球の単離は、上記のＰＢＭＦ調製物と同日に行った
【０１０８】
３．２．１  序文
単球は白血球の一種であり、マクロファージおよび骨髄系樹状細胞に分化できる。単球は、すべてのＰＢＭＣの１０〜３０％を構成し、ＣＤ１４発現のレベルが高い。このプロトコルでは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの単球単離キットＩＩ、ヒトを用いて、陰性選択手順でＰＢＭＣから単球をどのように単離できるかについて記載する。
【０１０９】
３．２．２  定義
ＰＢＭＣ−末梢血単核細胞
ＥＤＴＡ−エチレンジアミン四酢酸
ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水
ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ−ペニシリン／ストレプトマイシン
【０１１０】
３．２．３  材料
【表３】
2021513840.tif 000006
【０１１１】
ＰＢＭＣは、３．１に従って調製した。
【０１１２】
【表４】
2021513840.tif 000007
【０１１３】
３．２．４．  実験手順
分離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ、ヒト、プロトコル、１−３に従って、それぞれの順序において以下のステップによって行った：
−  ３．１に従って得られた既知量のＰＢＭＣを、１５ｍｌ遠心管中のＰＢＳ中で調製した。
−  細胞を３００ｇ、４℃、加速：９、切断：３で１０分間遠心分離した
−  上清を完全に除去し、細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液（１０７のＰＢＭＣ当たり３０μｌ）に再懸濁した。
−  ＦｃＲ遮断試薬を加えた（１０７ＰＢＭＣ当たり１０μｌ）。
−  ビオチン抗体カクテルを加えた（１０７ＰＢＭＣ当たり１０μｌ）。
−  細胞懸濁液を完全に再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートした。
−  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液を加えた（１０７ＰＢＭＣ当たり３０μｌ）。
−  抗ビオチンマイクロビーズを加えた（１０７ＰＢＭＣ当たり２０μｌ）。
−  細胞懸濁液を完全に再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。
−  ２ｍｌのｍｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。
−  細胞を、３００ｇ、４℃、加速：９、破損：３で１０分間遠心分離した
−  ＭＡＣＳ分離装置を、ＭＡＣＳ  Ｍｕｌｔｉｓｔａｎｄ上に設置した。
−  ＬＳカラムを分離装置に設置し、カラムの下に廃棄管を設置した。
−  カラムをＭｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液（ＬＳ：３０００μｌ）ですすぎ、廃棄管に採取した。
−  廃液管を抜去し、カラムの下に採取管を設置した。
−  上清を遠心分離した細胞から完全に除去し、細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液（５００μｌのｍｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液あたり１０８細胞）に再懸濁させた。
−  細胞懸濁液をカラムの上に加え、沈殿させた。
−  カラムをＭｉｌｔｅｎｙｉ緩衝液（ＬＳ：すすぎ当たり３０００μｌ）で３回すすいだ
−  細胞を３００ｇ、４℃、加速：９、破損：３で１０分間遠心分離した
−  上清を完全に除去し、細胞を１ｍｌの温培地に再懸濁した
−  細胞を血球計算器で計数した（希釈：１０μｌの細胞懸濁液＋１０μｌのトリパンブルー＋使用した１０７ＰＢＭＣ当たり１０μｌのＰＢＳ）
−  細胞数を以下のように計算した：
（計数した細胞／四分円の数）×希釈×１０４
【０１１４】
３．３  ヒト血液単球からの樹状細胞の作製
ヒト血液単球からの樹状細胞の作製は、単球作製と同日に行った。
【０１１５】
３．３．１  序文
樹状細胞は、天然の免疫と適応した免疫との間の関連を生み出す抗原提示細胞である。これらの細胞は、血液中の細胞のごくわずかな百分率を占めるに過ぎず、これらの細胞を直接単離すると、非常に少数の細胞が得られる。樹状細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、このことが課題を生じさせる。単球は白血球の一種であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージおよび骨髄系樹状細胞に分化できる。単球は、全ＰＢＭＣの１０〜３０％を構成する。これらの細胞はまた、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む培地で培養すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹状細胞に分化することができる。このプロトコルでは、ヒト血液単球から樹状細胞を作製する方法について説明する（図３）。
【０１１６】
３．３．２  定義
ＰＢＭＣ−末梢血単核細胞
ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水
ＦＢＳ−ウシ胎児血清
ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン
ＩＬ−４−インターロイキン４
ＧＭ−ＣＳＦ−顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ−ペニシリン／ストレプトマイシン
ＬＰＳ−リポ多糖
【０１１７】
３．３．３  材料
【表５】
2021513840.tif 000008
【０１１８】
さらに、３．２に従って調製された新たに単離された単球を用いた。
【０１１９】
３．３．４  未成熟および成熟ＤＣの生成のための実験手順
３．２に従って得た新しく単離した単球を、１×１０６細胞／ｍｌの密度で温かい培地中で調製した。
【０１２０】
−  サイトカインＩＬ−４（４００ＩＵ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）を、培地に加えた。
−  細胞を、ウェルプレートに播種した（プレートで通常使用される培地の半分のみを加える）。１２ウェルプレート中の培地の通常量は、１ｍｌであった。単球細胞懸濁液０．５ｍｌを、加えた。これは、３日目の総培地交換を避けるために行われ、代わりに新鮮な培地のみを添加する必要があった。
−  細胞を、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で３日間インキュベートした
−  ３日目に、サイトカインＩＬ−４（４００ＩＵ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）と共に新鮮な温かい培地を加え、ウェル中の培地の量は、このステップによって倍増した。
−  細胞を、ＣＯ２インキュベーター中でさらに３日間インキュベートした。
−  ６日目に、ＤＣを、以下のようにＬＰＳ、ヒト組換えＨＳＰ、および抗ＨＳＰ７０／７２抗体で刺激した：
−  ウェルの総体積は、３００μｌであった。
−  以下の混合物を調製し、ウェルに加えた：
ＬＰＳ＋１：１００処理前血清
１．ａ，３μｌのＬＰＳ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）を３μｌのラット処理前血清と混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
ＬＰＳ＋１：１００処理後血清
１．ａ，３μｌのＬＰＳ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）を３μｌのラット処理後血清と混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
ＬＰＳ＋１：１０００処理後血清
１．ａ，３μｌのＬＰＳ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）を０．３μｌのラット処理後血清と混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えＨＳＰ７０（１００μｇ／ｍＬ）＋１：１００処理前血清
１．ａ，３μｌの組換えＨＳＰ７０を、３μｌのラット処理前血清と混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えＨＳＰ７０（１００μｇ／ｍＬ）＋１：１００処理後血清
１．ａ，３μｌの組換えＨＳＰ７０を、３μｌのラット処理後血清と混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えＨＳＰ７０（１００μｇ／ｍＬ）＋１：１０００処理後血清
１．ａ，３μｌの組換えＨＳＰ７０を、０．３μｌのラット処理後血清と混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
【０１２１】
プレート用に次のものを調製する：
ＬＰＳ＋１：１００抗ＨＳＰ７０／７２
１．ａ，３μｌのＬＰＳ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）を、３μｌの抗ＨＳＰ７０／７２と混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
ＬＰＳ＋ＰＢＳ
１．ａ，３μｌのＬＰＳ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）を、３μｌのＰＢＳと混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えＨＳＰ７０（１００μｇ／ｍＬ）＋１：１００抗ＨＳＰ７０／７２
１．ａ，３μｌの組換えＨＳＰ７０を、３μｌの抗ＨＳＰ７０／７２と混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えＨＳＰ７０（１００μｇ／ｍＬ）＋ＰＢＳ
１．ａ，３μｌの組換えＨＳＰ７０を、３μｌのＰＢＳと混合する。
２．ＲＴで２０〜３０分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
【０１２２】
調製した細胞を、ＣＯ２インキュベーター中で２４時間。
【０１２３】
３．４  フローサイトメトリー−採取、染色および分析
３．４．１  序文
フローサイトメトリーは、懸濁液中の細胞および粒子の分析に使用されるレーザーベースの技術である。細胞の大きさおよび顆粒度を分析すること、およびまた、典型的には蛍光標識抗体の強度を測定することによって、特異的な細胞外または細胞内分子を検出することが可能である。
【０１２４】
まず、本発明者らは、フローサイトメトリー試料中の生細胞と死細胞を識別できるように生存性色素で細胞を染色する。１つのタイプは、アミン反応性色素としても知られるタンパク質結合色素（それらはアミンに結合するため）または生存／死滅固定性色素である。これらの色素はタンパク質に結合し、したがって生細胞および死細胞の両方に結合する。しかし、死細胞には膜が損なわれているという原理に基づいて機能しており、このことは、色素が細胞内区画に入り込み、ここでタンパク質に結合し、死細胞に生細胞よりもはるかに高い蛍光を与えるできることを意味している。これらの色素の利点は、一旦細胞が生存性色素で染色されると、生細胞と死細胞との間の分解能のいかなる低下もなしに固定することができる（固定されずに使用することもできる）ことである。さらに、これらは広範囲の励起スペクトルおよび発光スペクトルで利用可能であり、多色フローサイトメトリーパネルに加えてそれらを簡便にする。このプロトコルでは、細胞を生／死染色で染色し、成熟マーカーについて染色する方法について述べる。本発明者らは、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ受容体を標的とすることによって樹状細胞の成熟を解析する。
【０１２５】
３．４．２  定義
ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水
ＰＰ管−ポリプロピレン管
【０１２６】
３．４．３  材料
【表６】
2021513840.tif 000009
【０１２７】
【表７】
2021513840.tif 000010
【０１２８】
【表８】
2021513840.tif 000011
【０１２９】
流れ緩衝液：
ＰＢＳ
０．１％のＢＳＡ
０．０１％のアジ化ナトリウム
この溶液を、ブルーキャップ瓶中で混合し、０．２２μｍの滅菌フィルターを備えたシリンジを調製し、新しいブルーキャップ瓶に集めたフィルターを通して溶液を流し込んだ。
４℃に保存
固定緩衝液：
ＰＢＳ
１％のホルムアルデヒド
４℃に保存
【０１３０】
３．４．４  実験手順
−  細胞を、３．３に従って調製したウェルから培地中でフラッシュすることによって回収し、対応するＰＰ管に移した。
−  各ウェルに５００μｌの低温ＰＢＳを加え、培地中でフラッシュし、対応するＰＰ管に移すことによって手順を繰り返した。各管から５０μｌを「アイソタイプ」と印を付けたＰＰ管に移し、各種類５０μｌを「未染色」と印を付けたＰＰ管に移す。
−  細胞を３００ｇ、４℃で５分間、加速：９、破損：３で遠心分離した。
−  上清を除去し、廃液管に廃棄した。
−  細胞を、短時間ボルテックスした
−  固定性生存性色素細胞染色ｅＦｌｕｏｒ  ７８０  １：１０００を、１×ＰＢＳ（Ｆｘ．１μｌの色素〜９９９μｌの１×ＰＢＳ）に混合した。
−  それぞれの試験管に前記混合物０．５ｍｌを加え、細胞を暗所で３０分間４℃でインキュベートした。
−  各管に２ｍｌの１×ＰＢＳを加え、細胞を再懸濁した。
−  細胞を３００ｇ、４℃で５分間、加速：９、破損：３で遠心分離した。
−  上清を除去し、廃液管に廃棄した。
−  ２ｍｌの流れ緩衝液を各管に加え、細胞をその中に再懸濁させた。
−  細胞を３００ｇ、４℃で５分間、加速：９、破損：３で遠心分離した。
−  上清を除去し、廃液管に廃棄した
−  細胞を、短時間ボルテックスした
−  以下を含む抗体のマスターミックス：
−  Ｆｘ．２０管＝２００μｌのＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ＋１００μｌのＰＥ−Ｃｙ７＋１００μｌのＢＶ４２１を調製した。
−  ２００μｌのＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ＋１００μｌのＰＥ−Ｃｙ７＋１００μｌのＢＶ４２１を含むマスターミックス２０μｌを、各ＰＰ管に加え、さらに１０μｌのアイソタイプＰＥ＋５μｌのアイソトープＰＥ−Ｃｙ７＋５μｌのＢＶ４２１を、アイソタイプ試料に加えたが、対照試料には加えなかった。
−  管を、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。
−  各管に２ｍｌの流れ緩衝液を加え、細胞をそこに再懸濁した。
−  細胞を３００ｇ、４℃で５分間、加速：９、破損：３で遠心分離した。
−  ２００μｌのＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ＋１００μｌのＰＥ−Ｃｙ７＋１００μｌのＢＶ４２１  ２ｍｌの流れ緩衝液を、各管に追加し、細胞を再懸濁した。
−  細胞を３００ｇ、４℃で５分間、加速：９、破損：３で遠心分離した。
−  上清を除去し、廃液管に廃棄した
−  フローベンチで以下を実施する：
−  フローベンチ下で、各管に１００μｌの固定緩衝液を加え、ピペットで５〜１０回上下に混合することによって、細胞を固定した。
−  試料を、一晩冷蔵庫に入れた。
−  翌日、試料を、局所排気換気下にＦｌｏｗ−ｌａｂでＶ−ボトムを有する９６ウェルプレートに移した。
【０１３１】
最後に、細胞を、フローサイトメーターで計数した。それぞれの設定を、図３に示す。
【０１３２】
【表９】
2021513840.tif 000012
【０１３３】
３．５  結果
図３は、ＣＤ８３（Ａ）およびＣＤ８６（Ｂ）陽性樹状細胞の数で表されるような、ＤＣ活性化および阻害の結果を示す。前免疫血清（Ｐｒｅ）の存在下で、樹状細胞は、ＬＰＳにより完全に活性化された。免疫化したラット番号２（Ｐｏｓｔ）から得た血清を添加すると、ＤＣ活性化の有意な阻害が観察できた。この阻害は、活性化アッセイで組換えＨｓｐ７０の３分の１のみを用いた場合に増加した（Ｐｏｓｔ（０，３  ＨＳＰ））。また、陽性阻害対照について予期されるように、組換え抗Ｈｓｐ７０抗体（ｒｅｃ．ＨＳＰ７０  ＡＰ）も、ＤＣ活性化を有意に阻害した。
【０１３４】
結果は、本発明によるＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＤＣ活性化の阻害に適した抗体を誘発することを確認する。したがって、本発明によるＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉの投与は、ＨＳＰ７０ｉによって駆動されるＤＣ活性化を有意に阻害することができるであろうと結論することができる。従って、これらのデータは、本発明によるＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ投与による自己免疫疾患を処置するための概念の証明を確立する。
【０１３５】
例４：ｉｎ  ｖｉｖｏ白斑モデル
４．１  方法
ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉワクチンの有効性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、４週齢から自然に表皮色素脱失を発症する白斑易発症マウスモデルを用いた。これらのｈ３ＴＡ２トランスジェニックマウスは、Ｔ細胞上にヒト由来のチロシナーゼ反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および、メラノサイトを認識する整合するＨＬＡ−Ａ２トランス遺伝子の両方を発現する（Ｅｂｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；  Ｍｅｈｒｏｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。マウスは、以上のように得られたＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａ＿４５３（１．５ｍｇ／ｍｌ、注射当たり０．１ｍｌ、ｎ＝７）を用いて、２週間間隔で２回皮下（ｓ．ｃ．）注射した５週齢からであった。負の対照として、マウスに、国際公開第２０１２０３１７６０  Ａ１号に開示されているように、ＨＰＶエピトープ挿入を含むＡＡＶＬＰをｓ．ｃ．注射した（８３μｇ／ｍＬ、注射当たり０．１ｍＬ、ｎ＝５）。色素脱失は、平板スキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびＡｄｏｂｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、５週齢から２週間間隔で１１週齢まで記録し、色素脱失は、Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）が以前に記載したように算出した。簡単に述べると、麻酔したマウスを平坦なスキャナー上に置き、得られた画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて画像解析に供した。色素脱失は、未処理マウスのピクセルの９５％を含むように設定したカットオフ値を超えるルミノシティで評価した１５０，０００超のうちのピクセルの割合として、最大評価可能領域から算出した。データの統計解析は、Ｓｉｄａｋの多重比較検定による反復測定二元配置分散分析により解析した。すべての統計量はＧｒａｐＨＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。データは平均値±ＳＤで示し、０．０５のＰ値を有意とみなした。５週齢（１回目接種時点）で確立された色素脱失を１とする。色素脱失の平均倍率変化は、５週齢での色素脱失に対して計算し、各群のマウスで平均した。
【０１３６】
４．２  結果
マウスの腹側の脱着における平均しゅう曲変化を、図５に示す。結果は、ＡＡＶＬＰ−ＨＳＰ７０ｉ＿Ｑ４３５Ａによる脱着の弦抑制を、ＡＡＶＬＰ−ＨＰＶ対照と比較して実証する。
【０１３７】
結果は、本明細書に記載される本発明の概念のｉｎ  ｖｉｖｏ証明を確立する。
【０１３８】
参考文献
Ｄｅｎｍａｎ  ＣＪ，ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  Ｊ，Ｈａｒｉｈａｒａｎ  Ｖ，Ｋｌａｒｑｕｉｓｔ  Ｊ，Ｏｙａｒｂｉｄｅ−Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｋ，Ｇｕｅｖａｒａ−Ｐａｔｉｎｏ  ＪＡ，Ｌｅ  Ｐｏｏｌｅ  ＩＣ．（２００８）ＨＳＰ７０ｉ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｅｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｖｉｔｉｌｉｇｏ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２８（８）：２０４１−８．
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Ｍｏｓｅｎｓｏｎ  ＪＡ，Ｆｌｏｏｄ  Ｋ，Ｋｌａｒｑｕｉｓｔ  Ｊ，Ｅｂｙ  ＪＭ，Ｋｏｓｈｏｆｆｅｒ  Ａ，Ｂｏｉｓｓｙ  ＲＥ，Ｏｖｅｒｂｅｃｋ  Ａ，Ｔｕｎｇ  ＲＣ，Ｌｅ  Ｐｏｏｌｅ  ＩＣ．（２０１４）Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＨＳＰ７０  ｂｙ  ｖｉｔｉｌｉｇｏ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．２７（２）：２０９−２０
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Ｗａｎｇ  Ｄ，Ｅｉｚ−Ｖｅｓｐｅｒ  Ｂ，Ｚｅｉｔｖｏｇｅｌ  Ｊ，Ｄｒｅｓｓｅｌ  Ｒ，Ｗｅｒｆｅｌ  Ｔ，Ｗｉｔｔｍａｎｎ  Ｍ．（２０１１）Ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｕｐｔａｋｅ．Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０（８）：６３７−４１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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