(57)【要約】  本発明は、血清型２のストレプトコッカス・スイスによる感染および血清型９のストレプトコッカス・スイスによる感染からブタを保護する方法で使用するための、ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原を含むワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清型２のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染から豚を防御するための方法における使用のためのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原。
【請求項２】
前記方法が、前記抗原を豚に１回のみ投与することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのＩｇＭプロテアーゼ抗原。
【請求項３】
前記方法が、多くとも２８日齢の豚に前記抗原を投与することを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用のためのＩｇＭプロテアーゼ抗原。
【請求項４】
前記方法が、豚を離乳させる年齢前に前記抗原を投与することを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のためのＩｇＭプロテアーゼ抗原。
【請求項５】
前記方法が、母体由来の抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ抗体を有する豚に前記抗原を投与することを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のためのＩｇＭプロテアーゼ抗原。
【請求項６】
前記方法が、血清型２および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染に関連する死亡に対する防御を付与するためのものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のためのＩｇＭプロテアーゼ抗原。
【請求項７】
前記方法が、血清型２および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染に関連する臨床徴候に対する防御を付与するためのものであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の使用のためのＩｇＭプロテアーゼ抗原。
【請求項８】
血清型２のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染から豚を防御するためのワクチンの製造のためのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原の使用。
【請求項９】
豚にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原を含むワクチンを投与することにより、血清型２のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染から豚を防御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な血清型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ（豚レンサ球菌）細菌による病原性感染に対する豚の防御に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ（Ｓ．ｓｕｉｓ）は、豚の伝染性細菌性疾患の主要な病原体の１つである。この病原体は、髄膜炎、関節炎、心膜炎、多発性漿膜炎、敗血症、肺炎および突然死を含む様々な臨床症候群を引き起こし得る。Ｓ．ｓｕｉｓはグラム陽性の通性嫌気性球菌であり、元来Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ群Ｒ，Ｓ，Ｒ／ＳまたはＴと定義されていた。後に、細胞壁に位置する型特異的莢膜多糖類抗原に基づく新しいタイピングシステムが提案された。これにより、３５種類の血清型からなる系が導かれ（ＲａｓｍｕｓｓｅｎおよびＡｎｄｒｅｓｅｎ、“１６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ”、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第４８巻、１０６３−１０６５頁（１９９８））、そのうち血清型２、９、１、７および１／２が最も優勢である。豚群におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの防除は非常に困難であると思われる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓは豚の日和見共生菌である。明らかに、感染のたびに免疫系が誘因されるわけではない。このことに次いで、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓは十分にカプセル化された病原体であり、病原性因子の武器を用いて宿主免疫系を回避する。まとめると、これらの特性は、この重要な病原体と戦うための有効なワクチン開発に対抗してきた。最近、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに対するワクチンに関して総説論文が発表されている（Ｍａｒｉｅｌａ  Ｓｅｇｕｒａ、“Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ”、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第１４巻、第１２号、１５８７−１６０８頁（２０１５））。この総説では、以下に概説するように、臨床現場情報と実験データを集計し、それらをＳｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに対するワクチン開発の現状を概観するために比較している。
【０００３】
現在使用されているワクチンは、主に全細胞バクテリンである。しかし、現場の報告には疾病管理の困難さが記録されており、特に「ワクチンの失敗」は一般的である。保菌豚が主な感染源であり、垂直伝播と水平伝播の両方が群れ内での本疾患の拡大に関与している。離乳や輸送などのストレスの多い条件下で、キャリア動物と感受性動物を混合すると、通常は臨床疾患が生じる。早期に薬剤を投与して離乳したり、隔離して早期離乳を実践したりしても、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ感染を排除することはできない。したがって、疾病を防除するための効果的な防護対策は、予防／集団的発症防止処置（可能な場合）とワクチン接種にかかっている。現在、野外予防接種の取り組みでは、市販または自家バクテリンの使用に焦点が当てられている。これらのワクチン戦略は、子豚または雌豚のいずれかに適用されている。離乳期以降の子豚は、離乳や、その後一般的に行われる輸送に伴うストレスによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ感染症に罹りやすい。したがって、雌豚における分娩前免疫は、子豚に受動免疫を試み、伝達し、幼少期にこれらのストレスの多い状況下でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに対する防御を提供するためにしばしば用いられる。さらに、雌豚へのワクチン接種は費用がかからず、労働集約的であるため、子豚へのワクチン接種に代わる経済的な方法となっている。しかしながら、入手可能な結果は、バクテリンによる雌豚のワクチン接種も論争の的であることを示しているように思われる。多くの場合、ワクチン接種した雌豚は、分娩前に２回ワクチン接種しても、ワクチン接種にほとんど反応しないか、まったく反応せず、その結果、同腹児に移行した母体免疫が低くなる。そして、たとえ母体免疫が十分なレベルで移入されたとしても、多くの場合、母体抗体が低すぎて、４〜７週齢の最も重要な時期に防御ができない。
【０００４】
子豚では、現場で、特にヨーロッパで自家バクテリンが頻繁に使用されている。それらは臨床的に問題のある農場で分離された病原性株から調製し、同じ農場に適用する。自家バクテリンの欠点の１つは、ワクチンの安全性データが不足しており、重度の副反応が起こる可能性があることである。サンプリングミス（豚またはサンプルを１〜２頭のみ使用することによる）は、最近の集団発生に関連する株または血清型の同定に失敗する可能性がある。この失敗は、風土病群では特に問題となる可能性がある。最後に、自家バクテリンの最も重要なジレンマは、その実際の有効性がほとんど研究されていないことである。自家ワクチンの適用は経験的であるため、これらのワクチンで得られた結果が一貫していないことは驚くにあたらない。
【０００５】
他の実験的ワクチンも当該技術分野で記載されている。Ｋａｉ−Ｊｅｎ  Ｈｓｕｅｈらは、“Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｂａｃｔｅｒｉｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓａｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｏｗｓ  ｃｏｎｖｅｙｓ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｐｉｇｌｅｔｓ”（ＢＭＣ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＢＭＣ  ｓｅｒｉｅｓ−ｏｐｅｎ，ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｒｕｓｔｅｄ、１３：１５、２０１７年１月７日）において、サブユニット添加バクテリンが、子豚に対する防御免疫を付与するための雌豚のワクチン接種成功の基礎となる可能性を示している。
【０００６】
当該技術分野では、弱毒化生ワクチンも考えられている。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ血清型２の非莢膜同質遺伝子変異体は、無毒性であることが明確に示されている。しかしながら、非莢膜血清型２変異体を用いた生ワクチン製剤は、死亡に対して部分的な保護しかもたらさず、野生株で攻撃した豚での臨床兆候の発達を阻止することができなかった（Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  ＨＪ、Ｓｔｏｃｋｈｏｆｅ−Ｚｕｒｗｉｅｄｅｎ  Ｎ、Ｈｉｌｇｅｒｓ  ＬＡら、“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｎｄ  ｋｉｌｌｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｎｏｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２．”、Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第８４巻、１５５−１６８頁（２００２））。
【０００７】
過去数年間に、抗原性または免疫原性のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ分子の広範なリストが報告されており、これらの大部分は、感染豚またはヒト由来の回復期血清および／または実験室産生免疫血清のいずれかを用いた免疫プロテオミクスによって発見されている。ＷＯ２０１５／１８１３５６（ＩＤＴ  Ｂｉｏｌｏｇｉｋａ  ＧｍｂＨ）は、ＩｇＭプロテアーゼ抗原（全蛋白質または全蛋白質の約３５％に相当する高度に保存されたＭａｃ−１ドメインのいずれか）を、バクテリンを含むプライムワクチン接種と任意に組み合わせて、ＩｇＭプロテアーゼ抗原を２回投与するワクチン接種計画において、子豚に防御免疫応答を誘発することができることを示した。ＷＯ２０１７／００５９１３（Ｉｎｔｅｒｖａｃｃ  ＡＢ）も、ＩｇＭプロテアーゼ抗原（特に、ヌクレオチダーゼに融合したＩｇＭプロテアーゼポリペプチド）の使用について記載していることが注目される。しかしながら、血清反応を誘発することができるという特性のみが示されているにすぎない。ＩｇＭプロテアーゼ抗原についての保護効果は、当該国際特許出願において示されていない。
【０００８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに対する十分な防御を提供する問題を増大させる別の因子は、既存のワクチンの異種防御の欠如である。例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｓｔｒｅｐｓｕｉｓ（登録商標）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ血清型２から豚を保護するための登録ワクチン（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能）である。また、それは初乳の摂取を介して子豚を血清型２から受動的に防御する。また、ＷＯ２０１０／１０８９７７から知られているように、ワクチンを雌豚に投与した場合、子豚は異種攻撃に対してある程度の（非常に低い）レベルの防御を有するようである。しかし、このような受動的防御は非常に短寿命に過ぎない。これに続いて、このワクチンは他のどの血清型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ細菌に対する初乳の摂取を介した子豚の防御のために登録されたことはなかった。したがって、明らかに異種防御のレベルは登録基準を満たすには低すぎた。これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓワクチンについては、ワクチンに含まれない血清型の細菌に対する防御が起こらないという共通の知見と一致している。このことは、とりわけ、“Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｉｇｓ：Ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ”と題したＨｅｎｄｒｉｋｕｓ  Ｊａｎ  Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋの博士論文（２００１年１２月６日刊行）において確認されている。その要約（１２９頁）では、「Ｓ．ｓｕｉｓによる疾患を予防する戦略はワクチンの使用である。不活化全細胞ワクチンは、同族血清型の株による攻撃感染に対して有意な防御を誘導するようであるが、この防御はおそらく血清型特異的であると思われる。」と述べられている。
【０００９】
これらの所見は、Ｓｍｉｔｈ（ＵＳ７，１２５，５４８；２００６年１０月２４日公開）の所見と一致している。同博士は、「抗体は血清型特異的であり、多くの場合、連鎖球菌のグループ内で知られている多くの血清型のうちの１つに対してのみ防御を付与する。例えば、一般的に全細胞細菌調製物、またはＳ．ｓｕｉｓの莢膜強化画分に基づく現在の市販のＳ．ｓｕｉｓワクチンは、異種株に対して限定的な防御しか付与しない。」と述べている（当該米国特許、第４カラム、４２〜２８行）。２００８年１月に発表された研究（Ｍｅｄｙｃｙｎａ  Ｗｅｔｅｒｙｎａｒｙｊｎａ、第６４巻、第１号、１１３−１１６頁）では、血清型２および１／２のＳ．ｓｕｉｓ細菌に対する防御が記載されている。もし異なる血清型間で予想されるレベルの異種防御があれば、それらは免疫学的に非常に密接に関連しているので、これらの血清型間であるであろう。それでも、十分な防御を得るために両血清型をワクチンに含ませていた。英国を拠点とするＲＵＭＡ（Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ａｒｇｕｒｅ  Ａｌｌｉａｎｃｅ）は、２００６年１１月に豚生産におけるワクチンおよびワクチン接種の使用に関するガイドラインを発表している。Ｓ．ｓｕｉｓによる疾患に関しては、本ガイドライン（１９頁）では、雌豚へのワクチン接種により豚の防御が可能であるが、「他のＳｔｒｅｐ．ｓｕｉｓ血清型による疾患に対する防御は起こりにくい」と述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１５／１８１３５６号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１７／００５９１３号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２０１０／１０８９７７号
【特許文献４】米国特許第７，１２５，５４８号
【００１１】
【非特許文献１】ＲａｓｍｕｓｓｅｎおよびＡｎｄｒｅｓｅｎ、“１６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ”、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第４８巻、１０６３−１０６５頁（１９９８）
【非特許文献２】Ｍａｒｉｅｌａ  Ｓｅｇｕｒａ：“Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ”、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第１４巻、第１２号、１５８７−１６０８頁（２０１５）
【非特許文献３】Ｋａｉ−Ｊｅｎ  Ｈｓｕｅｈら、“Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｂａｃｔｅｒｉｎ  ｐｌｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓａｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｏｗｓ  ｃｏｎｖｅｙｓ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｐｉｇｌｅｔｓ”、ＢＭＣ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＢＭＣ  ｓｅｒｉｅｓ−ｏｐｅｎ，ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｒｕｓｔｅｄ、１３：１５、２０１７年１月７日
【非特許文献４】Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  ＨＪ、Ｓｔｏｃｋｈｏｆｅ−Ｚｕｒｗｉｅｄｅｎ  Ｎ、Ｈｉｌｇｅｒｓ  ＬＡら、“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｎｄ  ｋｉｌｌｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｎｏｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２．”、Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第８４巻、１５５−１６８頁（２００２）
【非特許文献５】Ｍｅｄｙｃｙｎａ  Ｗｅｔｅｒｙｎａｒｙｊｎａ、第６４巻、第１号、１１３−１１６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、豚のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対する防御、特に２つの最も蔓延している血清型２および９の細菌に対する防御に有効なワクチンを見出すことである。両血清型の細菌に対する防御レベルが、現在市販されているバクテリンワクチンの防御レベルに（少なくとも）相当するレベルに達することがさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の主な目的を満たすために、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原が、血清型２のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染から豚を保護する方法において使用できることが見出された。ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、典型的には、ワクチン組成物、すなわち、豚に投与されるのに安全な組成物に含有され、その組成物において、当該抗原は、投与の容易さのために薬学的に許容可能な担体と混合される。豚に当該抗原を投与することにより、血清型２および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ細菌による病原性感染から豚が防御されることがわかった。両血清型に対する防御レベルは、従来の血清型２バクテリンワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｓｔｒｅｐｓｕｉｓとの比較）を使用した場合に到達する相同防御レベルに相当することさえわかった。これは、少なくとも血清型２と９の間で、ＩｇＭプロテアーゼ抗原に対して異種防御が示されていることを意味する。これは、少なくとも血清型２および９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｓｕｉｓ細菌に対する十分な能動的防御が、１つの抗原のみを用いることによって示された初めてのものであり、特に、これはＩｇＭプロテアーゼ抗原を用いて示された初めてのものである。これは、ＷＯ２０１０／１０８９７７から知られるように免疫された母動物の初乳を介して得られる短期間の受動的防御に依存する代わりに、豚自身にワクチン接種し、能動的異種防御を誘導する独特の選択肢を提供する。これに続いて、相同性および異種性の両方である実際の防御レベルは、既知のバクテリン型ワクチンで得られるものよりも有意に優れているようである。
【００１４】
また、本発明は、血清型２のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染から豚を保護するためのワクチンの製造のためのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原の使用、並びにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原を含むワクチンを豚に投与することによる、血清型２のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染から豚を保護するための方法に関する。
【００１５】
上述のように、ワクチンにおいて、抗原は、典型的には、薬学的に許容可能な担体、すなわち生体適合性媒質、すなわち投与後に対象動物に重大な副反応を誘発せず、ワクチン投与後に宿主動物の免疫系に抗原を提示することができる媒質と結合される。そのような薬学的に許容可能な担体は、例えば、水および／または任意の他の生体適合性溶媒を含む液体、または凍結乾燥ワクチン（糖および／またはタンパク質に基づく）を得るために一般的に使用されるような固体担体であってよく、任意に免疫刺激剤（アジュバント）を含む。任意に、安定剤、粘度調整剤または他の成分のような他の物質を、ワクチンの意図された用途または必要とされる特性に応じて添加する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原は、豚ＩｇＭ（豚ＩｇＧまたは豚ＩｇＡではない；Ｓｅｅｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１９５巻、９３０−９４０頁（２０１３）；およびＶａｃｃｉｎｅ  ３３：２２０７−２２１２；２０１５年５月５日）を特異的に分解する酵素であり、ＩｄｅＳｓｕｉｓと表されるタンパク質、またはその免疫原性部分（典型的には全長酵素の少なくとも約３０〜３５％の長さを有する）である。酵素全体は、約１０００〜１１５０アミノ酸に相当する約１００〜１２５ｋＤａの重量を有し、そのサイズはＳ．ｓｕｉｓの血清型に依存する。ＷＯ２０１５／１８１３５６には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原を表すいくつかの配列、すなわち配列番号：１、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：５であり、後者は完全長酵素の免疫原性部分である（Ｍａｃ−１ドメイン、すなわち、配列番号：７のアミノ酸８０−４１４として表される）ものが記載されている。全長酵素の免疫原性部分の他の例は、ＷＯ２０１７／００５９１３に記載されている。特に、ＩｇＭプロテアーゼは、ＷＯ２０１５／１８１３５６の配列番号：１によるプロテアーゼ、または重複領域において少なくとも９０％、または９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％から１００％までの配列同一性を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、初期パラメータを有するｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて確立することができる。様々な血清型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼは、９０％より高い配列同一性を有すると予想され、特に１００％までの９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％と予想される。例えば、抗原の組換え産生系において収率を最適化するために作られた人工タンパク質は、必要とされる免疫原性機能を維持しながら、酵素全体と比較して８５％、８０％、７５％、７０％またはさらに６０％のような低いアミノ酸配列同一性に導くことができ、本発明の意味でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのＩｇＭプロテアーゼ抗原であると理解される。
【００１７】
微生物による病原性感染に対する防御は、防御免疫を達成するのと同じである。すなわち、その微生物による病原性感染またはその感染から生じる障害、例えば、実際の感染または病原体による病原性感染から生じる１つ以上の臨床徴候の防御または軽減のための予防、改善または治癒の補助となる。
【００１８】
抗原を１回だけ投与することを含む方法は、抗原の１回だけのショット後に防御免疫が付与されることを意味し、したがって、前記防御免疫を達成するための追加ワクチン接種が省略される。２ショット法では、最初の（プライム）ワクチン接種は、典型的には、最初の投与から６週間以内に、一般的には最初の投与から３または２週間以内に追加免疫され、当該２回目の（ブースト）投与後にのみ、防御免疫、すなわち上記で定義された成功的防御が得られると理解される。
【００１９】
本発明の実施形態
本発明の第１の実施形態では、本発明の方法は、豚に抗原を１回のみ投与することを含む。意外なことに、本発明の抗原のワンショットだけで豚の防御免疫を誘発することができるようである。当該技術分野では、非生Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓワクチンが常にプライム−ブースト法で投与されてきたが、その有効性は依然として比較的乏しかった。本発明で使用する抗原に関して、当該技術分野（ＷＯ２０１５／１８１３５６およびＷＯ２０１７／００５９１３参照）では、一貫して、任意に多元ワクチン（すなわち、ＩｇＭプロテアーゼ抗原のみをよりも多い種類）を使用する２ショット投与アプローチでこの抗原を使用してきている。したがって、ＩｇＭプロテアーゼを単回投与すると、豚に防御免疫を誘導できることがわかったのは非常に驚くべきことであった。
【００２０】
第２の実施形態では、本発明の方法は、多くても２８日齢の豚に前記抗原を投与することを含む。上述ように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓは豚の共生および日和見病原体である。特にストレス下では、細菌は病原性感染を引き起こし、疾患を誘発する可能性がある。現代の養豚条件下では、例えば子豚の離乳（３〜４週間）およびその後すぐの若齢子豚の輸送によって誘発されるような、豚が２８日齢に達したときまたは後に大きなストレスが誘発される。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染から防御されるためには、通常２８日齢に達する前に、非常に若い年齢で豚にワクチンを接種する必要がある。多くとも２８日齢の豚、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日齢のいずれの年齢においてもＩｇＭプロテアーゼ抗原を用いることにより、十分な（異種）防御が得られる得ることがわかった。当該技術分野で知られているように、特にＷＯ２０１７／００５９１３から、ＩｇＭプロテアーゼ抗原に対する免疫応答の陽性化を出生日以降から若齢豚において得ることができる。このことは、２５日齢の豚における実際の防御を示す本発明により、より若い年齢でも防御が得られることが理解されることを意味している。
【００２１】
別の実施形態では、本発明の方法は、豚を離乳させる年齢前に前記抗原を投与することを含む。言い換えれば、子豚を実際に離乳させる前（典型的には３〜４週齢時）に抗原を投与する。この早い時期にこの抗原を用いると、離乳直後の２〜３週間という短い期間内でストレスによって誘発されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの病原性感染に対して異種防御が得られることが示された。ＷＯ２０１５／１８１３５６では、ＩｇＭプロテアーゼを抗原としたワクチン接種が成功していることが認められている。しかしながら、異種防御が示されていないという事実は別としても、ワクチンは５〜７週齢の子豚に使用され、９週齢で攻撃感染を受けたため、離乳／輸送後２〜３週、すなわち５〜７週齢のリスク期間（すなわち、病原性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ感染のピーク発生期間）のかなり後に使用された。したがって、実際的な状況（離乳後２〜３週間の期間での攻撃感染および輸送ストレス）での有効性を証明することはなく、異種防御が得られるかどうかという疑問を別にしても、ＷＯ２０１５／１８１３５６に記載されているようなＩｇＭプロテアーゼ／バクテリン併用ワクチン戦略が現実的な状況であるかどうかは依然として疑問である（）。
【００２２】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、母体由来の抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ抗体を有する豚に抗原を投与することを含む。若齢動物への能動的なワクチン接種は、雌豚の自然感染または能動免疫によって産生される母体抗体に対する干渉の可能性が懸念されている（Ｂａｕｍｓ  ＣＧ、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  Ｃ、Ｋｏｃｋ  Ｃら、“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｂａｃｔｅｒｉｎ  ｉｎ  ｐｒｅｐａｒｔｕｒｉｅｎｔ  ｓｏｗｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｉｇｌｅｔｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｗｅａｎｉｎｇ”、Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１７巻：１５８９−１５９７頁（２０１０））。実際、授乳豚へのワクチン接種も、免疫化した雌豚から離乳した子豚へのワクチン接種も、顕著な能動免疫応答および８週齢での防御と関連していなかった。この失敗は、母体抗体または他の初乳成分の強い阻害作用と関連していた。この点に関して、Ｓ．ｓｕｉｓカプセル１／２型自家ワクチン製剤（Ｌａｐｏｉｎｔ  Ｌ、Ｄ‘Ａｌｌａｉｒｅ  Ｓ、Ｌｅｂｒｕｎ  Ａら、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｎ  ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｔｙｐｅ  １／２．”、Ｃａｎ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．、第６６巻、８−１４頁（２００２））を接種した後の野外試験においても、母体抗体とＳ．ｓｕｉｓに対する能動的な抗体産生との干渉が実証された。４日齢の哺乳子豚におけるＳ．ｓｕｉｓ血清型１４バクテリンの単回投与プロトコールの有効性を明らかにすることを目的とした野外研究でも、同種攻撃から子豚を防御することはできなかった（Ａｍａｓｓ  ＳＦ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＧＷ、Ｋｎｏｘ  ＫＥら、“Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐｉｇｌｅｔｓ”、Ｖｅｔ  Ｍｅｄ．、第９４巻、４８０−４８４頁（１９９９））。したがって、ＩｇＭプロテアーゼ抗原では、母体由来の抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ抗体の存在下でも十分な防御が得られることは驚
くべきことであった。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、血清型２および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染に関連する死亡に対する防御を付与するためのものである。
【００２４】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、血清型２および血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染に関連する臨床徴候に対する防御を付与するためのものである。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの病原性感染に関連する典型的な臨床徴候は、直腸温の上昇、運動障害（ふるえ、関節の腫脹）、呼吸数の増加および神経学的徴候（振戦、痙攣、斜頸、運動失調など）である。これらの徴候の１つ以上を予防、改善または治癒させることは、病原性感染が抑制されていることの指標であるだけでなく、豚にとって有益であろう。
【００２５】
次に、本発明について、以下の実施例に基づいてさらに説明する。
【実施例】
【００２６】
実施例１
最初の試験の目的は、ＩｇＭプロテアーゼ抗原、本実施例の場合、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ血清型２のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、死菌血清型２のＳ．ｓｕｉｓ細菌（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｓｔｒｅｐｓｕｉｓとの比較）を含む通常のバクテリンワクチンと比較して、血清型２のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる攻撃感染に対して防御能を示すかどうかを試験することであった。
【００２７】
研究デザイン
離乳豚３０頭を用いた。豚を各１０頭ずつ３群（異なる同腹児が均等に分布）に割り付けた。第１群には、水中油型アジュバント中の組換型ｒＩｄｅＳｓｕｉｓ  ＩｇＭプロテアーゼ抗原（Ｓｅｅｌｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ３３：２２０７−２２１２の２．２項（２０１５年５月５日）参照）を１用量あたり２３０μｇ（牛血清アルブミンを標準としたＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイにより確認）を、５週齢及び７週齢で２回筋肉内接種した。第２群には、水中油型アジュバント中の血清型２の全細胞バクテリン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｓｔｒｅｐｓｕｉｓとの比較）を５週齢および７週齢で２回筋肉内接種した（陽性対照）。第３群はワクチン未接種のままとし、攻撃感染対照とした。９週齢時に、豚にＳ．ｓｕｉｓ血清型２の病原性培養物を攻撃感染させた。攻撃感染前後の定期的な時期に、攻撃感染株の再分離のためにヘパリン血液を採取した。攻撃感染後、豚のＳ．ｓｕｉｓ感染の臨床徴候（うつ病、運動障害および／または神経学的徴候など）を毎日観察し、０（徴候なし）から重症例が３までの定期的なスコアリングシステムを用いてスコア化した。重度に罹患した動物を安楽死させ、剖検を行った。試験終了時（攻撃感染７日後）に、生存豚全頭を安楽死させ、剖検を行った。
【００２８】
結果
いずれのワクチンも許容できない部位または全身反応を誘発しなかったため、安全であると考えることができた。安楽死（７日目）前の期間の攻撃感染後のデータを表１に示す。攻撃感染当日、第１群の豚１頭は発育不良であると思われ、この動物には攻撃感染しないこととしたことに留意されたい。平均臨床スコア、攻撃感染後の死亡動物数、および血液から病原体を再分離できた動物数は、いずれのワクチンでも改善されたようであった。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
結論
予想通り、不活化全細胞ワクチンは有意な相同的防御を誘導した。ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ血清型２の感染に対してさらに良好な防御を誘導した。
【００３１】
実施例２
第２の試験の目的は、ＩｇＭプロテアーゼ抗原が血清型９のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる攻撃感染に対して防御能を示すかどうかを検証することであった。
【００３２】
研究デザイン
本試験のデザインは本質的には最初の試験と同じであった。１０頭の豚からなる群を用い、５週齢および７週齢時にＩｇＭプロテアーゼ抗原（第１群）を２回接種するか、ワクチン未接種の対照動物（第２群）とした。９週齢時に、豚にＳ．ｓｕｉｓ血清型９の病原性培養物を接種した。
【００３３】
結果
この試験でも、ワクチンは許容できない部位や全身反応を誘発しなかった。安楽死（７日目）前の期間の攻撃感染後のデータを表２に示す。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
結論
上記の結果は、ＩｇＭプロテアーゼ抗原がＳ．ｓｕｉｓ血清型９の攻撃感染に対する防御を誘導することを示している。これは、臨床スコアの減少、人道的なエンドポイントに達した動物の数、および攻撃感染細菌が血液から再分離された動物の数によって実証された。これに続いて、ワクチン接種動物の平均生存期間が有意に良好、つまり５．１日対２．４日であることが明らかになった（表２には示されていないデータ）。最初の試験のデータと合わせて、ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、血清型２および９の細菌による病原性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ感染に対する防御を提供できるという結論を導くことができる。このことは、血清型２のＩｇＭプロテアーゼと血清型９のＩｇＭプロテアーゼとの高い同一性も考慮に入れて、これらの血清型間の交差防御が実証されたことを意味する（すなわち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ血清型２のＩｇＭプロテアーゼは血清型９の攻撃感染に対して防御し、その逆もまた同様である）。また、両血清型に対する防御レベルは、一般的に利用可能な血清型２バクテリンワクチンで得られる同種防御レベルに相当する（またはさらに優れている）ようである。
【００３６】
実施例３
豚でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに対する防御は、リスク期間（典型的には４〜７週齢）に得られることが望ましいため、母体由来の抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ抗体陽性豚において、ワンショットワクチンとしてＩｇＭプロテアーゼ含有ワクチンが３週齢で有効であるかどうかを評価した。
【００３７】
研究デザイン
研究デザインは前記２つ研究デザインと同等であり、５週齢の動物の代わりに、３週齢の抗Ｓ．ｓｕｉｓ母体由来抗体（ＭＤＡ）陽性子豚（ＭＤＡレベルが検出限界以下らしかった動物は１０頭中１頭のみであった）にワクチンを接種したというのが主な相違点であった。第１群には、水中油型アジュバント中のＩｇＭプロテアーゼ抗原を１回筋肉内接種した。第２群は陰性攻撃感染対照群とした。４週齢で子豚を離乳させた。６週齢時に、子豚を攻撃室に搬送し、直ちに攻撃感染させた。輸送と自然ストレスを模倣する攻撃感染の間に馴化期間はなかった。子豚にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ血清型２の病原性培養物を攻撃感染させた。
【００３８】
結果
ワクチンは許容できない部位や全身反応を誘発しなかった。安楽死（７日目）前の期間の攻撃感染後のデータを表３に示す。攻撃感染当日、第２群の豚１頭は発育不良であると思われ、この動物には攻撃感染しないこととした。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
結論
結論として、上記の結果は、３週齢のＭＤＡ陽性子豚において、ワクチン接種後３週間、離乳後２週間および輸送直後に攻撃感染した場合でも、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる病原性感染に対して、ＩｇＭプロテアーゼ抗原を１回のみ投与することにより、十分な防御を誘導できることを実証している。これは血清型２の攻撃感染のみで実証されているが、実施例１および２は、その抗原が同様に血清型９に対する防御を誘導することができることを示しているので、この種の豚における血清型９感染に対する防御を目的とする場合も同等の結果が得られることが理解される。
【国際調査報告】
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