(57)【要約】グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の送達は、パーキンソン病患者に利益をもたらしており、現在、ＡＬＳ患者のためのフェーズ１／２ａの臨床試験で試験されている。しかし、長期間にわたる栄養因子送達は、用量調整を妨げるか、または副作用が発生した場合に停止する。これに対処するために、本発明者らは、安定的組み込み用の第３世代のドキシサイクリン制御ベクターを作製し、治療用分子の誘導可能及び可逆的な発現を可能にした。ヒトｉＰＳＣ由来神経前駆体を、ベクターで安定的にトランスフェクトし、増殖させ、成体マウス脳に移植した。ドキシサイクリンの添加及び離脱が、複数回誘導及び後退させることができるＧＤＮＦ発現をもたらすことを、本発明者らは観察した。これは、ドキシサイクリンがｉｎ  ｖｉｖｏで移植片に浸透して導入遺伝子発現を制御し得ることを示す。本発明者らの知見は、移植された細胞における異所性タンパク質発現の効果的な調節のために遺伝子及び幹細胞治療を組み合わせる概念実証を提供する。2021518365.tif 000005
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を、神経変性障害に罹患している個体に投与することを含む、前記個体の中枢神経系におけるグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）レベルを増加させる方法であって、
前記ｉＮＰＣが、
構成的プロモーター、
Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及び
ＧＤＮＦをコードする配列
を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセット
を発現する、前記方法。
【請求項２】
前記神経変性障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、及びアルツハイマー病から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経変性障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記神経変性障害が、パーキンソン病である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記中枢神経系が、脳の領域を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
脳の前記領域が、黒質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
脳の前記領域が、運動皮質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
脳の前記領域が、嗅内皮質及び／または海馬を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記個体が、ヒトである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、前記ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む細胞の発がん性形質転換の確率が低減したゲノムの領域に組み込まれている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、及びマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログから選択されるゲノムの領域に組み込まれている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、前記アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）に組み込まれている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、前記ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子に組み込まれている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、相同組み換えにより組み込まれている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、単一コピーとして組み込まれている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
テトラサイクリンクラス抗生物質を前記個体に投与することをさらに含み、前記テトラサイクリンクラス抗生物質が、前記複数の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞においてＧＤＮＦ  ｍＲＮＡの転写を誘導する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
疾患または状態に罹患している対象に、ある量の細胞を投与することを含み、前記細胞が、治療用タンパク質またはペプチドを発現し、さらに、前記細胞、治療用タンパク質もしくはペプチド、またはその両方が、前記疾患または状態を処置することが可能である、処置方法。
【請求項１９】
前記細胞が、神経系細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記神経系細胞が、神経前駆細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経前駆細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、１つ以上のベクター由来の発現カセットを発現する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上のベクター由来の前記発現カセットを発現する前記細胞が、ヌクレオフェクト、トランスフェクト、またはエレクトロポレーションされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上のベクターが、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター、ｐＢａｓｅベクター、またはその両方を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃベクターが、少なくとも２つのプロモーターを含み、少なくとも１つのプロモーターが、誘導性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの誘導性プロモーターが、ポリシストロニックである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの誘導性ポリシストロニックプロモーターが、双方向性である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記発現カセットが、ゲノムに組み込まれている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記発現カセットが、前記治療用タンパク質またはペプチドをコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療用タンパク質またはペプチドが、神経栄養因子を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記神経栄養因子が、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患または状態が、神経変性疾患である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ある量の細胞の投与が、注射を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
テトラサイクリン、そのアナログまたは誘導体の投与を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３６】
ある量の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞を提供すること、及び
前記ｉＰＳＣ由来細胞に少なくとも２つのベクターを導入すること
を含む、方法。
【請求項３７】
前記ｉＰＳＣ由来細胞が、神経前駆細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも２つのベクターの導入が、ヌクレオフェクション、トランスフェクション及びエレクトロポレーションのうちの１つ以上を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも２つのベクターが、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター及びｐＢａｓｅベクターを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃベクターが、
構成的プロモーター、
Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及び
タンパク質またはペプチドをコードする配列
を含む発現カセットと、
２つのトランスポゾン因子と
を含み、前記２つのトランスポゾン因子が、前記発現カセットに隣接する、
請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記タンパク質またはペプチドが、神経栄養因子を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記神経栄養因子が、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃベクターが、相同組み換え配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記相同組み換え配列が、ゲノムセーフハーバーを標的とすることが可能な配列を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ゲノムセーフハーバーが、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログのうちの１つである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｉＰＳＣ由来細胞が、ゲノムに組み込まれた発現カセットを発現する、請求項３６に記載の方法により作製された、ある量の細胞。
【請求項４７】
神経変性疾患に罹患している対象に、ある量の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を投与することを含み、前記細胞が、前記疾患を処置することが可能な神経栄養因子を誘導可能に発現する、方法。
【請求項４８】
前記ｉＮＰＣが、ヌクレオフェクションにより導入されたゲノムに組み込まれた発現カセットを発現し、前記発現カセットが、
構成的プロモーター、
Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及び
グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする配列
を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
テトラサイクリン、そのアナログまたは誘導体の投与を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
ある量の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を含む、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の誘導可能な発現を可能にするある量の神経前駆細胞であって、
前記ｉＮＰＣが、
構成的プロモーター、
Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及び
ＧＤＮＦをコードする配列
を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセット
を発現する、前記神経前駆細胞。
【請求項５１】
請求項５０に記載の細胞を使用して、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから授与されたＣＡ２０２９００に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
誘導可能な様式で異所性タンパク質を発現するように操作された細胞が本明細書に記載される。特許請求された発明は、再生医療、及び神経変性を含む変性疾患の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、急速に進行する疾患であるので、薬剤の継続的投与による長期的な影響を考慮せずに構成的栄養因子の放出で十分であり得る。対照的に、より長い寿命を有する他の多くの神経学的疾患は、持続的な成長因子分泌を必要としない場合があり、または長期間にわたる送達が有害である場合がある。実際に、尾状核、尾状核被殻でＧＤＮＦを一時的に受けただけのパーキンソン病患者の死後分析により、ＧＤＮＦ送達停止後の維持された効果を説明し得る持続的な神経発芽が示された。さらに、構成的成長因子の放出は、禁忌の場合における中止が可能ではない。例えば、試験より、ＧＤＮＦを受けた一部の患者がＬｈｅｒｍｉｔｔｅ症状を発症したことが報告されている。加えて、持続したＧＤＮＦ発現は、標的化ニューロンの異常な発芽及び脱感作を引き起こし得る。重要なことに、これらの影響は、ＧＤＮＦの停止時に後退した。全体として、これらのタイプの臨床用途の成長因子の制御に対する明確な理論的根拠、ならびにこれらの目標を達成する組成物及び手法の当該技術分野に大きいニーズがある。
【０００４】
細胞ニッチを活性化させ且つ罹患宿主細胞に治療分子を提供する細胞及び遺伝子治療アプローチの組み合わせは、神経障害の有望な新しい処置アプローチである。本発明者らのグループは、ＧＤＮＦを安定的に生成するように遺伝子操作されたヒト神経前駆細胞を広く使用しており、それらが生存し、移動し、ＧＤＮＦを放出し、変性ニューロンを保護することを示している。重要なことに、これらの細胞は、安全且つ非腫瘍形成性であることが確認されており、そのようなものであるから、ＡＬＳ患者の運動ニューロンの保護のために、史上初の細胞及び遺伝子治療のＦＤＡ承認のフェーズ１／２ａの臨床試験に目下使用されている。
【０００５】
ミフェプリストン、ラパマイシン、またはテトラサイクリン（Ｔｅｔ、及びそのアナログのドキシサイクリン、ｄｏｘ）などの外部因子は、遺伝子発現を制御するために使用することができる。齧歯動物における直接遺伝子導入により送達されるＧＤＮＦなどの神経栄養因子は制御されているが、これはＧＤＮＦなどの神経栄養因子を放出するように設計された移植ヒト神経細胞の場合まだ達成されていない。最終的に、繰り返されるオン／オフの適応性に対するニーズが必要とされ得るが、当該分野の現在の標準は、単一サイクルにわたって遺伝子を誘導または抑制することのみである。
【０００６】
成体マウス脳に移植されたヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）においてＧＤＮＦ発現を誘導するための及び後退させるためのｄｏｘを介した方法が本明細書に記載される。ｄｏｘ投与が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＤＮＦ分泌を誘導可能且つ可逆的に調節し得ることを、本発明者らは示す。よって、強力な技術であるｉＰＳＣ、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞工学、及び遺伝子制御は、障害を処置するために、タンパク質の送達を制御することが要求され得る特有のアプローチとして組み合わせることができることを、本発明者らは実証する。
【発明の概要】
【０００７】
疾患または状態に罹患している対象に、ある量の細胞を投与することを含む処置方法が本明細書に記載され、細胞は、治療用タンパク質またはペプチドを発現し、さらに細胞、治療用タンパク質もしくはペプチド、またはその両方は、疾患または状態を処置することが可能である。他の実施形態では、細胞は、神経系細胞である。他の実施形態では、神経系細胞は、神経前駆細胞である。他の実施形態では、神経前駆細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。他の実施形態では、細胞は、１つ以上のベクター由来の発現カセットを発現する。他の実施形態では、１つ以上のベクターからの発現カセットを発現する細胞は、ヌクレオフェクト、トランスフェクト、またはエレクトロポレーションされている。他の実施形態では、１つ以上ベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター、ｐＢａｓｅベクター、またはその両方を含む。他の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、少なくとも２つのプロモーターを含み、少なくとも１つのプロモーターは、誘導性である。他の実施形態では、少なくとも１つの誘導性プロモーターは、ポリシストロニックである。他の実施形態では、少なくとも１つの誘導可能なポリシストロニックプロモーターは、双方向性である。他の実施形態では、発現カセットは、ゲノムに組み込まれている。他の実施形態では、発現カセットは、治療用タンパク質またはペプチドをコードする。他の実施形態では、治療用タンパク質またはペプチドは、神経栄養因子を含む。
【０００８】
他の実施形態では、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。他の実施形態では、疾患または状態は、神経変性疾患である。他の実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。他の実施形態では、ある量の細胞を投与することは、注射を含む。他の実施形態では、方法は、例えば、ドキシサイクリンを含む、テトラサイクリン、そのアナログまたは誘導体の投与を含む。
【０００９】
また、ある量の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞を提供すること、及び少なくとも２つのベクターをｉＰＳＣ由来細胞に導入することを含む方法が本明細書に記載される。他の実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、神経前駆細胞である。他の実施形態では、少なくとも２つのベクターを導入することは、ヌクレオフェクション、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションのうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、少なくとも２つのベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター及びｐＢａｓｅベクターを含む。他の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性プロモーター、及びタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む発現カセット、２つのトランスポゾン因子を含み、２つのトランスポゾン因子は、発現カセットに隣接する。種々の実施形態では、誘導性プロモーターは、双方向性ポリシストロニックプロモーターである。他の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、神経栄養因子を含む。他の実施形態では、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。上述の方法により作製された、ある量の細胞がさらに本明細書に記載され、ｉＰＳＣ由来細胞は、ゲノムに組み込まれた発現カセットを発現する。
【００１０】
神経変性疾患に罹患している対象にある量の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を投与することを含む方法が本明細書に記載され、細胞は、疾患を処置することが可能な神経栄養因子を誘導可能に発現する。他の実施形態では、ｉＮＰＣは、ヌクレオフェクションにより導入されたゲノムに組み込まれた発現カセットを発現し、発現カセットは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性プロモーター、及びグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする配列を含む。種々の実施形態では、誘誘導性プロモーターは、双方向性ポリシストロニックプロモーターである。他の実施形態では、方法は、例えば、ドキシサイクリンを含む、テトラサイクリン、そのアナログまたは誘導体の投与を含む。
【００１１】
また、ある量の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を含むグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の誘導可能な発現を可能にする、ある量の神経前駆細胞が本明細書に記載され、ｉＮＰＣは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性プロモーター、及びＧＤＮＦをコードする配列を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットを発現する。種々の実施形態では、誘導性プロモーターは、双方向性ポリシストロニックプロモーターである。さらに、上述の細胞を使用して、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置する方法が本明細書に記載される。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、ゲノムに組み込まれた発現カセットから１０ｋｂ以内にトランスポゾン由来配列を欠いている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、ゲノムに組み込まれた発現カセットから１ｋｂ以内にトランスポゾン由来配列を欠いている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、ゲノムに組み込まれた発現カセットから１０ｋｂ以内にウイルス由来配列を欠いている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、ゲノムに組み込まれた発現カセットから１ｋｂ以内にウイルス由来配列を欠いている。
【００１２】
また、神経変性障害に罹患している個体の中枢神経系におけるグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）レベルを増加させる方法が本明細書に記載され、方法は、複数の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を個体に投与することを含み、ｉＮＰＣは、ゲノムに組み込まれた発現カセットを発現し、発現カセットは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及びＧＤＮＦをコードする配列を含む。種々の実施形態では、神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、及びアルツハイマー病から選択される。種々の実施形態では、神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。種々の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病である。種々の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病である。種々の実施形態では、中枢神経系は、脳の領域を含む。種々の実施形態では、脳の領域は、黒質を含む。種々の実施形態では、脳の領域は、運動皮質を含む。種々の実施形態では、脳の領域は、嗅内皮質及び／または海馬を含む。種々の実施形態では、個体は、ヒトである。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む細胞の発がん性形質転換の確率が低減したゲノムの領域に組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、及びマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログから選択されるゲノムの領域に組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）に組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子に組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、相同組み換えにより組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、転位因子に由来する配列を欠いている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、トランスポゾンにより組み込まれている。種々の実施形態では、方法はさらに、テトラサイクリンクラス抗生物質を個体に投与することを含み、テトラサイクリンクラス抗生物質は、複数の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞においてＧＤＮＦ  ｍＲＮＡの転写を誘導する。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、単一コピーとして組み込まれている。
【００１３】
また、神経変性障害に罹患している個体の中枢神経系でグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）レベルを増加させる方法における、複数の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）の使用が本明細書に記載され、ｉＮＰＣは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及びＧＤＮＦをコードする配列を含む、ゲノムに組み込まれる発現カセットを発現する。種々の実施形態では、神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、及びアルツハイマー病から選択される。種々の実施形態では、神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。種々の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病である。種々の実施形態では、神経変性障害は、アルツハイマー病である。種々の実施形態では、中枢神経系は、脳の領域を含む。種々の実施形態では、脳の領域は、黒質を含む。種々の実施形態では、脳の領域は、運動皮質を含む。種々の実施形態では、脳の領域は、嗅内皮質及び／または海馬を含む。種々の実施形態では、個体は、ヒトである。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む細胞の発がん性形質転換の確率が低減したゲノムの領域に組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、及びマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログから選択されるゲノムの領域に組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）に組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子に組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、相同組み換えにより組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、転位因子に由来する配列を欠いている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、トランスポゾンにより組み込まれている。種々の実施形態では、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、単一コピーとして組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃベクターの説明。（Ａ）ｐＢａｓｅプラスミドと組み合わせてトランスフェクトした時、ゲノムに安定して組み込まれるように設計されるｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃプラスミド。（Ｂ）ｐＢａｓｅプラスミド。（Ｃ）構成的に発現されるか、またはドキシサイクリンの存在下でのみ発現される導入遺伝子。（Ｄ）ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃでヌクレオフェクトされてニューロスフィアとして成長したヒトｉＮＰＣの未染色の蛍光ライブイメージング。（Ｅ）ｉＮＰＣのウミシイタケルシフェラーゼに対して正規化されたホタルルシフェラーゼ活性。条件毎にＮ＝４の生物学的複製。（Ｆ）ｉＮＰＣの生きた培養物におけるリアルタイムのホタルルシフェラーゼ活性。条件毎にＮ＝３の生物学的複製。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。
【図２】ドキシサイクリンは、ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃヌクレオフェクトｉＰＳＣ由来ＮＰＣのＧＤＮＦ発現を制御する。（Ａ）ｄｏｘの不存在下、または（Ｂ）ｄｏｘの存在下で成長したヌクレオフェクトｉＮＰＣ。（Ｃ）ｄｏｘを添加して除去した後の、ｄｏｘの不存在下で成長したヌクレオフェクトｉＮＰＣ。（Ｄ）（Ａ〜Ｃ）中の細胞の２４時間インキュベートされた培地、及び７日間のＧＤＮＦタンパク質蓄積を有する培養物のＥＬＩＳＡ。条件毎にＮ＝３の生物学的複製。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３】レポーター導入遺伝子の発現は、ｉＰＳＣ由来ＮＰＣ移植で誘導可能及び可逆的である。（Ａ）ヌクレオフェクション、増殖、ＦＡＣＳ、移植、処置、及び死後分析のための実験計画。（Ｂ）７週のｉｎ  ｖｉｖｏ実験期間にわたる各群の１匹の動物（Ａ群の動物番号９及びＢ群の動物番号３）の毎週の生物発光イメージング。ＯＮ／ＯＦＦボタンは、イメージングの前の週に、動物がｄｏｘを投与されたかどうかを示す。（Ｃ）全ての動物（Ｎ＝１４）の毎週の生物発光活性の概要。死後免疫組織化学により、異常に高い生物発光シグナルが観察され且つ誘導可能な導入遺伝子シグナルが観察されないので、１匹の動物（番号１３）を、この分析から除外した。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。
【図４−１】ドキシサイクリン投与は、移植ｉＰＳＣ由来ＮＰＣにおけるＧＤＮＦ発現を媒介する。（Ａ）実験的エンドポイント［オフで開始→オン→オフ→オンで終了］での動物番号１及び（Ｂ）実験のエンドポイント［オンで開始→オフ→オン→オフで終了］での動物番号７の線条体領域。（Ｃ）（Ａ）の正方形領域の高倍率画像。ピンクの矢印は、ＴａｇＢＦＰ＋細胞から離れた領域でのＧＤＮＦの発現を示し、これは、宿主細胞が分泌されたＧＤＮＦを取り込むことを示唆している。（Ｄ）（Ｂ）の正方形領域の高倍率画像。注記：オーバーラップ（Ｂ２／Ｂ３及びＤ２／Ｄ３）を考慮すると、Ｃｌｏｖｅｒシグナル及びＧＤＮＦシグナルは、バックグラウンドである可能性がある。
【図４−２】図４−１の説明を参照のこと。
【図５】ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃでヌクレオフェクトされたＩＰＳＣ由来ＮＰＣは、ｄｏｘの添加時に誘導される能力を保持する。ＢＦＰ＋細胞の８３％は、ヌクレオフェクション後６ヶ月間の培養で成長させた細胞にｄｏｘを添加してから２４時間後にＧＦＰ＋（Ｐ５ゲート）でもあった。注記：また、細胞を２回の凍結／解凍サイクルに曝露し、この期間中、合計１０ヶ月間凍結した。
【図６】動物のＧＤＮＦ  ＤＡＢ染色は、オンｄｏｘで試験を終了した動物でのシグナルの増加を表す。図４に関連する。
【図７】研究で使用された全ての動物の線条体／脳梁領域のＧＤＮＦ、ＳＣ１２１（ヒト細胞質）、及びＳＣ１０１（ヒト核）染色は、オンｄｏｘで試験を終了した動物でのＧＤＮＦシグナルの増加を表す。これらのデータは、表２に示されるＧＤＮＦシグナルのブラインドグレーディングに使用された（ＲＨ＝右半球、ＬＨ＝左半球）。
【図８】ＡＡＶＳ１−ｔｅｔｏｎ−ｈＧＤＮＦのベクターマップ。ＨＡ−Ｌ及びＨＡ−Ｒアームが示され、これらは、ＡＡＶＳなどのゲノムセーフハーバーを標的とするために使用することができる相同組み換え配列である。
【図９】誘導可能なＧＤＮＦ発現の評価のスキーム。
【図１０】ｐＤｏｎｏｒ−Ｔｅｔｏｎ３ｇ−２ａ−ＴａｇＢＦＰ−Ｖ５−ｎｌｓ−ｐ２ａ−ｐｕｒｏＲ  ＷＰＲＥ＿隔離型  ｍｐｃｌｏｖｅｒ−２ａ−ｌｕｃ２ｐｅｓｔ−２ａ−ｇｄｎｆ  ｗｐｒｅのベクターマップ。
【図１１】（Ａ）ヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のエクソン１及び２間の内因性遺伝子座のＡＡＶＳ１標的化の概略図。最初に、上流のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃに連結されているスプライスアクセプターにより駆動されるレポーター／選択カセット（蛍光及び抗生物質の選択のためのＴａｇＢＦＰ２及びＰｕｒｏＲ）で構成されるレシピエント「ランディング部位」、ならびにＬｏｘＰ及びＦＲＴ部位に隣接する、構成的ＣＡＧプロモーターにより駆動されるｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ赤色蛍光シストロンは、安定的に組み込まれた。続いて、これらのレポーターについて安定的に選択した時に、ＦｌｐＯ及びＣｒｅを発現するプラスミドで、これらの細胞をリポフェクトし、このドナープラスミドは、ＬｏｘＰ及びＦＲＴ隣接選択／レポーターカセットを含み、ならびにｄｏｘで誘導可能なｍｐＣｌｏｖｅｒ／Ｌｕｃ２ｐ／ＧＤＮＦシストロン含有プラスミドでリポフェクトする。（Ｂ）ドキシサイクリンの不存在下及び存在下での細胞の透過光及び緑色蛍光イメージングは、ｄｏｘ添加の２４時間後のｍｐＣｌｏｖｅｒの誘導性、及びｄｏｘの不存在下でのＧＦＰ「漏れ」の不存在を示す。さらに、ｍｐＣｌｏｖｅｒ集団が安定したトランスフェクションであるように、トランスフェクト細胞を富化させる選別のおよそ１週間後及びトランスフェクションの２週間後に、これらの細胞を試験した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書で引用される全ての参考文献は、完全に記載されているかのように、全体が参照により組み込まれる。別途記載のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願で使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。
【００１６】
本発明の実施において使用することができる本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法及び材料を、当業者は認識するであろう。実に、本発明は、決して、記載される方法及び材料に限定されない。
【００１７】
「制御因子」という用語は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集合的に指す。これらは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、及び翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、及び翻訳されることが可能である限り、これらの制御因子の全てが常に存在する必要はない。
【００１８】
「プロモーター領域」という用語は、本明細書では、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を指すために通常の意味で使用され、制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し且つ下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することが可能な遺伝子に由来する。
【００１９】
「作動可能に連結されている」は、そのように記載される構成要素が通常の機能を実施するように構成される因子の配置を指す。従って、コード配列に作動可能に連結されている制御因子は、コード配列の発現に影響を与えることが可能である。制御因子は、発現を誘導するように機能する限り、コード配列と隣接する必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列及びコード配列間に存在し得、プロモーター配列は依然として、コード配列に「作動可能に連結されている」と考えることができる。
【００２０】
幹細胞由来の神経前駆細胞を使用して、脳に栄養因子を送達することは、血液脳関門を迂回する強力な方法である。ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞を使用して、損傷部位に種々の成長因子を送達することにより、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）ならびにパーキンソン病、ハンチントン病、及びアルツハイマー病の疾患モデルで宿主ニューロンをサポートすることが示されている。並行して、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の送達は、パーキンソン病患者に利益を提供しており、現在、ＡＬＳ患者のためにフェーズ１／２ａの臨床試験で試験されている。栄養因子の利益を完全に活用し且つ細胞により送達される栄養因子の潜在的な望ましくない効果を回避するために、成長因子の分泌の制御は、いくつかの神経変性疾患のための有望な手段である。長期間にわたる栄養因子の送達は、遺伝子発現及び下流のシグナル伝達の活性化が密接に関連しているプロセスであるので、用量調整ができないか、または副作用が発生した場合に停止する。遺伝子発現のタイミング及び大きさの制御の欠如は、治療の有効性を制限し、意図しない細胞効果をもたらし得る。
【００２１】
これらの目的に向けて、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）制御システムは、種々の方法論で遺伝子発現を時間的及び空間的に制御するために使用されている。これは、Ｔｅｔアナログのドキシサイクリン（ｄｏｘ）の存在下でＴｅｔ制御プロモーターの下流にある遺伝子発現を抑制する細菌Ｔｅｔトランスアクチベーター（ｔＴＡ）を含む。この「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」システムに加えて、「Ｔｅｔ−Ｏｎ」システムは、ｄｏｘの存在下で導入遺伝子発現を活性化するために、リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を使用する。神経幹細胞集団におけるｔＴＡ及びｒｔＴＡ多様体の使用は、調査されていない。
【００２２】
治療用分子の誘導可能及び可逆的な発現を可能にする、安定に組み込まれた第３世代のドキシサイクリン制御ベクターが本明細書に記載される。ヒトｉＰＳＣ由来神経前駆細胞を、ベクターで安定的にトランスフェクトし、増殖させ、成体マウス脳に移植した。ドキシサイクリンの添加及び離脱が、複数回誘導及び後退させることができるＧＤＮＦ発現をもたらすことを、本発明者らは観察し、これは、ドキシサイクリンが、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植片に浸透して導入遺伝子発現を制御し得ることを示す。本発明者らの知見は、移植細胞における異所性タンパク質発現の効果的な調節のために、遺伝子及び幹細胞療法を組み合わせるための概念実証を提供する。
【００２３】
疾患または状態に罹患している対象に、ある量の細胞を投与することを含む処置方法が本明細書に記載され、細胞は、治療用タンパク質またはペプチドを発現し、さらに細胞、治療用タンパク質もしくはペプチド、またはその両方は、疾患または状態を処置することが可能である。他の実施形態では、細胞は、神経系細胞である。他の実施形態では、神経系細胞は、神経前駆細胞である。他の実施形態では、神経前駆細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。種々の実施形態では、神経前駆細胞は、高濃度のＥＧＦ及びＦＧＦ−２を含有する神経幹細胞培地中で培養することにより、ｉＰＳＣコロニーから生成される。細胞凝集体（ＥＺ  ｓｐｈｅｒｅと呼ばれる）は、細胞−細胞接触を維持したチョッピング法を使用して、長期間増殖させることができる。種々の実施形態では、ＥＺ  ｓｐｈｅｒｅは、神経誘導においてレチノイン酸ＲＡと共に培養されたＥＧＦ／ＦＧＦから取り出される。ｉＰＳＣに由来する神経前駆細胞に関連する手法は、Ｓａｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｓｕｒｖｉｖｅ，ｍｉｇｒａｔｅ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｏｄｅｎｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ”Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１４  Ａｕｇ  １５；５２２（１２）：２７０７−２７２８及びＥｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“ＥＺ  ｓｐｈｅｒｅｓ：ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｒｏｓｅｔｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳＣｓ  ａｎｄ  ｉＰＳＣｓ”Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ；１０（３）：４１７−４２７に記載され、これらは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。他の実施形態では、ｉＰＳＣは、線維芽細胞などの体細胞及び参照により本明細書に完全に組み込まれる米国公開第２０１７／０３６２５７４号に記載される方法に従ってリプログラムされた血液を含む。
【００２４】
他の実施形態では、細胞は、１つ以上のベクター由来の発現カセットを発現する。他の実施形態では、１つ以上のベクター由来の発現カセットを発現する細胞は、ヌクレオフェクト、トランスフェクト、またはエレクトロポレーションされているか、または当該技術分野で既知の他の遺伝子送達手法によるものである。他の実施形態では、１つ以上のベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター、ｐＢａｓｅベクター、またはその両方を含む。他の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、少なくとも２つのプロモーターを含み、少なくとも１つのプロモーターは、誘導性である。他の実施形態では、少なくとも１つの誘導性プロモーターは、ポリシストロニックである。他の実施形態では、少なくとも１つの誘導可能なポリシストロニックプロモーターは、双方向性である。他の実施形態では、発現カセットは、ゲノムに組み込まれている。他の実施形態では、発現カセットは、治療用タンパク質またはペプチドをコードする。他の実施形態では、治療用タンパク質またはペプチドは、神経栄養因子を含む。
【００２５】
種々の実施形態では、１つ以上のベクターは、２つのトランスポゾン因子に隣接する遺伝子発現カセットを有するベクターを含む。種々の実施形態では、２つのトランスポゾン因子は、ｐｉｇｇｙＢａｃ末端反復（ＰＢ  ＴＲ）を含む。種々の実施形態では、ベクターは、構成的プロモーターを含み、これは、ＣＭＶ／ニワトリβ−アクチン（別称ＣＡＧ）プロモーターを含む。種々の実施形態では、ベクターは、包含可能な双方向性プロモーターを含み、これは、ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターを含む。種々の実施形態では、構成的プロモーターは、Ｔｅｔ応答因子に作動可能に連結されている。種々の実施形態では、「Ｔｅｔ−Ｏｎ」因子は、例えば、ｒＴＡを含む。他の実施形態では、ｒＴＡは、ｒｔＴＡ−Ｖ１０を含む。種々の実施形態では、構成的プロモーターは、例えば、ネオマイシンまたはピューロマイシンを含む選択因子に作動可能に連結されている。種々の実施形態では、誘導性双方向性プロモーターは、ポリシストロニックである。種々の実施形態では、誘導性双方向性プロモーターは、第１、第２、もしくは第３、またはそれ以上のシストロンの因子に作動可能に連結されている。種々の実施形態では、第１、第２、もしくは第３、またはそれ以上のシストロンは、導入遺伝子を含む。種々の実施形態では、導入遺伝子の後に、１つ以上の転写後因子が続く。種々の実施形態では、１つ以上の転写後因子は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後因子（ＷＰＲＥ）を含む。種々の実施形態では、導入遺伝子の後に、１つ以上のポリＡテールが続く。これには、例えば、ウサギβ−グロビンポリＡが含まれる。種々の実施形態では、導入遺伝子は、神経栄養因子である。種々の実施形態では、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。追加情報は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／１３１９２６及びＡｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｌｉｎｅａｇｅｓ”Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５  Ｍａｒ  １０；４（３）：３２３−３３１に見出され、これは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００２６】
他の実施形態では、１つ以上のベクターは、ＶＣｒｅ（Ｖｌｏｘ及び誘導体）、ＳＣｒｅ（Ｓｌｏｘ及び誘導体）、Ｄｒｅ（Ｒｏｘ及び誘導体）、ならびにｐｈｉＣ３１（ａｔｔｂ）または当該技術分野で既知の他のリコンビナーゼを含むリコンビナーゼをコードするベクターを含む。
【００２７】
他の実施形態では、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。他の実施形態では、疾患または状態は、神経変性疾患である。他の実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。他の実施形態では、ある量の細胞を投与することは、注射を含む。他の実施形態では、方法は、例えば、ドキシサイクリンを含む、テトラサイクリン、そのアナログまたは誘導体の投与を含む。
【００２８】
種々の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの相同組み換え配列を含む。他の実施形態では、相同組み換え配列は、ゲノムセーフハーバーを標的とすることが可能な配列を含む。他の実施形態では、ゲノムセーフハーバーは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログのうちの１つである。上述のベクターのうちの１つの例示的な配列は、配列番号２及び配列番号３である。
【００２９】
ある量の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞を提供すること、及びｉＰＳＣ由来細胞に少なくとも２つのベクターを導入することを含む方法が本明細書に記載される。他の実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、神経前駆細胞である。他の実施形態では、少なくとも２つのベクターを導入することは、ヌクレオフェクション、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションのうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、少なくとも２つのベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター及びｐＢａｓｅベクターを含む。他の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及びタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む発現カセット、２つのトランスポゾン因子を含み、２つのトランスポゾン因子は、発現カセットに隣接する。他の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、神経栄養因子を含む。他の実施形態では、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。種々の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの相同組み換え配列を含む。種々の実施形態では、ベクター及び／またはベクターを含む細胞は、発現カセットの５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、５ｋｂ、または１０ｋｂ内の転位因子及び／またはトランスポゾン由来配列を欠く。種々の実施形態では、ベクター及び／またはベクターを含む細胞は、発現カセットの５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、５ｋｂ、または１０ｋｂ内のウイルス由来配列を欠く。種々の実施形態では、細胞は、ゲノムに組み込まれたベクターの１または２コピーを含む。種々の実施形態では、細胞は、単一のコピーとしてゲノムに組み込まれたベクターを含む。
【００３０】
また、上述の方法により作製された、ある量の細胞が本明細書に記載され、ｉＰＳＣ由来細胞は、ゲノムに組み込まれた発現カセットを発現する。例えば、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の誘導可能な発現を可能にする、ある量の神経前駆細胞が、ある量の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を提供すること、ならびにｉＮＰＣ由来細胞にｐｉｇｇｙＢａｃベクター及びｐＢａｓｅベクターを導入することを含む方法により作製され、ここで、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及びＧＤＮＦをコードする配列を含む。種々の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの相同組み換え配列を含む。
【００３１】
さらに、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患を含む、上述の細胞を使用して変性疾患及び／または状態を処置する方法が本明細書に記載される。
【００３２】
神経変性疾患に罹患している対象にある量の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を投与することを含む方法が本明細書に記載され、細胞は、疾患を処置することが可能な神経栄養因子を誘導可能に発現する。他の実施形態では、ｉＮＰＣは、ヌクレオフェクションにより導入されたゲノムに組み込まれた発現カセットを発現し、発現カセットは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及びグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする配列を含む。種々の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの相同組み換え配列を含む。他の実施形態では、方法は、テトラサイクリン、そのアナログまたは誘導体の投与を含む。
【００３３】
また、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の誘導可能な発現を可能にする、ある量の神経前駆細胞が本明細書に記載され、神経前駆細胞は、Ｔｅｔ応答因子を含む双方向性ポリシストロニックプロモーター、及びＧＤＮＦをコードする配列を含むゲノムに取り込まれた発現カセットを含む。さらに、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患を含む、上述の細胞を使用して変性疾患及び／または状態を処置する方法が本明細書に記載される。
【００３４】
構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性プロモーター、及びタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む遺伝子発現カセットを含むベクターが本明細書に記載される。種々の実施形態では、遺伝子発現カセットは、２つのトランスポゾン因子に隣接する。種々の実施形態では、２つのトランスポゾン因子は、ｐｉｇｇｙＢａｃ末端反復（ＰＢ  ＴＲ）を含む。種々の実施形態では、２つのトランスポゾン因子は、ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的、または当該技術分野で既知の他のトランスポゾン因子を含む。種々の実施形態では、構成的プロモーターは、ＣＭＶ／ニワトリβ−アクチン（別称ＣＡＧ）プロモーターを含む。種々の実施形態では、包含可能な双方向性プロモーターは、ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターを含む。種々の実施形態では、構成的プロモーターは、Ｔｅｔ応答因子に作動可能に連結されている。種々の実施形態では、Ｔｅｔ応答因子は、例えば、ｔＴＡを含む「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」因子、または、例えば、ｒＴＡを含む「Ｔｅｔ−Ｏｎ」因子である。他の実施形態では、ｒＴＡは、ｒｔＴＡ−Ｖ１０を含む。種々の実施形態では、構成的プロモーターは、例えば、ネオマイシンまたはピューロマイシンを含む選択因子に作動可能に連結されている。種々の実施形態、実施形態では、誘導性双方向性プロモーターは、ポリシストロニックである。種々の実施形態では、誘導性双方向性プロモーターは、第１、第２、もしくは第３、またはそれ以上のシストロンの因子に作動可能に連結されている。種々の実施形態では、第１、第２、もしくは第３、またはそれ以上のシストロンは、導入遺伝子を含む。種々の実施形態では、導入遺伝子の後に、１つ以上の転写後因子が続く。種々の実施形態では、１つ以上の転写後因子は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後因子（ＷＰＲＥ）を含む。種々の実施形態では、導入遺伝子の後に、１つ以上のポリＡテールが続く。これには、例えば、ウサギβ−グロビンポリＡが含まれる。種々の実施形態では、導入遺伝子は、神経栄養因子である。種々の実施形態では、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。種々の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶＳ１を含む安全なランディング部位の標的化を促進する１つ以上の因子を含む。種々の因子では、誘導可能なカセットの周りの１つ以上のインスレーター因子は、細胞分化中の潜在的なサイレンシングを減弱させる。種々の実施形態では、発現カセットは、１つ以上のサブカセットを含み、各サブカセットは、１）プロモーター、２）導入遺伝子、及び３）ポリＡ転写停止因子を含む。種々の実施形態では、１つ以上のサブカセットを含む発現カセットは、構成的サブカセット及び誘導可能なサブカセットを含む。例えば、構成的サブカセットは、ｒＴＡトランスアクチベーターを発現する構成的プロモーターを含み、誘導可能なサブカセットは、ＧＤＮＦ及び任意に１つ以上のレポータータンパク質などの神経栄養因子を発現する誘導性プロモーターを含む。
【００３５】
上述のベクターの例としては、ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃ［ｐｉｇｇｙＢａｃ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ／ＴａｇＢＦＰ２ｎｌｓ／ＰａｃＲ−Ｔｅｔ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｌｏｖｅｒ−Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ］［配列番号１］が挙げられ、これは、図１Ａに示される。ここで、ベクターは、２つのプロモーター（構成的に活性なＣＭＶ／ニワトリβ−アクチン（別称ＣＡＧ）プロモーター及び誘導性双方向性ＴＲＥ−Ｂｉプロモーター）を含む。ＣＡＧプロモーターは、ｒｔＴＡ−Ｖ１０（別称Ｔｅｔ−Ｏｎ）トランスアクチベーター、ＴａｇＢＦＰ２−Ｖ５ｎｌｓ（Ｖ５タグ及び核局在化配列を有する増強青色蛍光タンパク質）、ならびにピューロマイシン耐性遺伝子の構成的発現を駆動する。タンデムの導入遺伝子は、自己切断ペプチドリンカー（Ｐ２Ａ）により隔てられている。ここで、テトラサイクリンアナログまたは誘導体であるドキシサイクリンの添加により、ｒｔＴＡ−Ｖ１０トランスアクチベーターがＴＲＥ−Ｂｉプロモーターに結合して下流の導入遺伝子の転写を触媒するようになる。ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターの最初のシストロンは、ミリストイル化及びパルミトイル化（ＭｙｒＰａｌｍ）Ｃｌｏｖｅｒレポーター（ｍｐＣｌｏｖｅｒ）を有し、その後、不安定なホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２Ｐ）を有する。誘導可能なＴＲＥ−Ｂｉプロモーターの下流の第２のシストロンは、遺伝子発現の増加のために、ＧＤＮＦなどの神経栄養因子、その後、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後因子（ＷＰＲＥ）をコードし得る。ウサギβ−グロビンポリＡをそれぞれの因子の下流に配置させて、転写を停止させ、偽の導入遺伝子発現を防止した。ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃベクターは、安定したゲノム取り込みを促進するために、ｐＢａｓｅプラスミドと一緒にトランスフェクトすることができる。上述のベクターの別の例としては、図１０に示されるｐＤｏｎｏｒ−Ｔｅｔｏｎ３ｇ−２ａ−ＴａｇＢＦＰ−Ｖ５−ｎｌｓ−ｐ２ａ−ｐｕｒｏＲ  ＷＰＲＥ＿隔離型  ｍｐｃｌｏｖｅｒ−２ａ−ｌｕｃ２ｐｅｓｔ−２ａ−ｇｄｎｆ  ｗｐｒｅが挙げられる。
【００３６】
種々の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの相同組み換え配列を含む。他の実施形態では、相同組み換え配列は、ゲノムセーフハーバーを標的とすることが可能な配列を含む。他の実施形態では、ゲノムセーフハーバーは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログのうちの１つである。上述のベクターのうちの１つの例示的な配列は、配列番号２及び配列番号３である。
【００３７】
疾患または状態に罹患している対象へのある量の細胞を投与することを含む、処置の方法が本明細書に記載され、細胞は、治療用タンパク質またはペプチドを発現し、さらに、細胞、治療用タンパク質もしくはペプチド、またはその両方が、疾患または状態を処置することが可能である。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、細胞は、神経系細胞である。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、神経系細胞は、神経前駆細胞である。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、神経前駆細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、細胞は、１つ以上のベクター由来の発現カセットを発現する。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、１つ以上のベクター由来の発現カセットを発現する細胞は、ヌクレオフェクト、トランスフェクト、またはエレクトロポレーションされている。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、１つ以上のベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター、ｐＢａｓｅベクター、またはその両方を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、少なくとも２つのプロモーターを含み、少なくとも１つのプロモーターは、誘導性である。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、少なくとも１つの誘導性プロモーターは、ポリシストロニックである。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、少なくとも１つの誘導性ポリシストロニックプロモーターは、双方向性である。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、発現カセットは、ゲノムに組み込まれている。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、発現カセットは、治療用タンパク質またはペプチドをコードする。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、治療用タンパク質またはペプチドは、神経栄養因子を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、疾患または状態は、神経変性疾患である。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、ある量の細胞を投与することは、注射を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、方法は、テトラサイクリン、そのアナログまたは誘導体の投与を含む。
【００３８】
ある量の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞を提供すること、及びｉＰＳＣ由来細胞に少なくとも２つのベクターを導入することを含む方法が本明細書に記載される。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、ｉＰＳＣ由来細胞は、神経前駆細胞である。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、少なくとも２つのベクターを導入することは、ヌクレオフェクション、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションのうちの１つ以上を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、少なくとも２つのベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター及びｐＢａｓｅベクターを含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及びタンパク質またはペプチドをコードする配列を含む発現カセット、２つのトランスポゾン因子を含み、２つのトランスポゾン因子は、発現カセットに隣接する。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、タンパク質またはペプチドは、神経栄養因子を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、神経栄養因子は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、相同組み換え配列を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、相同組み換え配列は、ゲノムセーフハーバーを標的とすることが可能な配列を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、ゲノムセーフハーバーは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログのうちの１つである。
【００３９】
これは、方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにより作製されたある量の細胞をさらに含み、ｉＰＳＣ由来細胞は、ゲノムに組み込まれた発現カセットを発現する。
【００４０】
また、神経変性疾患に罹患している対象に、ある量の人工多能性幹細胞由来神経前駆細胞（ｉＮＰＣ）を投与することを含む方法が本明細書に記載され、細胞は、疾患を処置することが可能な神経栄養因子を誘導可能に発現する。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、ｉＮＰＣは、ヌクレオフェクションにより誘導されたゲノムに組み込まれた発現カセットを発現し、発現カセットは、構成的プロモーター、Ｔｅｔ応答因子を含む誘導性双方向性ポリシストロニックプロモーター、及びグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする配列を含む。方法の上述の実施形態のそれぞれ及び全てにおいて、方法は、テトラサイクリン、そのアナログまたは誘導体の投与を含む。
【実施例】
【００４１】
特許請求された発明の非限定例は、本明細書に記載される。
【００４２】
実施例１
細胞培養物または動物へのｉＰＳＣ及びｉＮＰＣのＤｏｘ添加
全ての実験では、Ｄｏｘ溶液を遮光して４℃に維持した。細胞培養では、ｄｏｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ６３１３１１）を１００ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、１ｍｌのシリンジ（ＢＤ  ３０９６５９、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に取り付けられた先端が柔らかい給餌針（Ｉｎｓｔｅｃｈ  ＦＴＰ−２０−３０、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を使用して、経口強制飼養（例えば、２０ｇの動物に対して６０μｌ）で３〜４日毎に、動物にｄｏｘ（１５μｇのｄｏｘ／ｇ体重）を投与した。
【００４３】
例えば、以下を含む、ｉＰＳＣを生成する体細胞のリプログラミング及び後続のｉＮＰＣ生成は、すでに説明されている。Ｓａｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｓｕｒｖｉｖｅ，ｍｉｇｒａｔｅ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｏｄｅｎｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ”Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１４  Ａｕｇ  １５；５２２（１２）：２７０７−２７２８、これは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００４４】
要約すると、リプログラミング及びｉＰＳＣ生成の場合、線維芽細胞などの細胞は、６因子：ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、及びｐ５３  ｓｈＲＮＡを有するエピソームプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を発現するＡｍａｘａヒト皮膚線維芽細胞ヌクレオフェクターキットを使用して、ウイルス不含ｉＰＳＣ株に再プログラミングされる。外因的に導入された遺伝子は、組み込まれず、代わりに、一過性の方法でエピソームに発現される。要約すると、線維芽細胞（ヌクレオフェクション当たり０．８×１０６の細胞）を採取し、２００ｇで５分間遠心分離し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）溶液（ＶＰＤ−１００１、Ｌｏｎｚａ）に注意深く再懸濁し、Ｕ−０２３プログラムを適用した。リプログラミング中に、全ての培養物を標準酸素条件（５％のＯ２）で維持し、これはさらに、ｉＰＳＣ生成の効率を高める。培地を４８時間に維持し、徐々に、再プログラミング効率を高めるために小分子を含有する化学的に定義されたｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に交換した。使用された小分子は、１）酪酸ナトリウム（０．５ｍＭ）、２）Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）、３）ＭＥＫ経路阻害剤（ＰＤ  ０３２５９０１、０．５μＭ）、４）ＴＧＦ−βＩ型受容体ＡＬＫ５キナーゼ、Ｉ型アクチビン／ｎｏｄａｌ受容体ＡＬＫ４、及びＩ型ｎｏｄａｌ受容体ＡＬＫ７（Ａ８３−０１、０．５μＭ）の選択的阻害剤、であった。ＥＳ／ｉＰＳＣ様形態のコロニーが、２５〜３１日後に現れた。続いて、最良の形態を有するコロニーは、フィーダー非依存６ＢＤマトリゲル（商標）マトリックス上に移し、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中で維持した。ｉＰＳＣクローンをさらに増殖させ、凍結保存した。
【００４５】
ｉＰＳＣから生成されたＥＺ  ｓｐｈｅｒｅは、アストログリア素因を有する、懸濁液中の神経前駆細胞（ｉＮＰＣｓＳＵ）の培養物に分化させることができる。ＥＧＦ／ＦＧＦ２／ヘパリンの離脱後、神経誘導培地（ＮＩＭ）でレチノイン酸ＲＡ（０．５μＭ）を使用して、ＥＺ  ｓｐｈｅｒｅを尾側化した（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％のＮＥＡＡ、１％のＮ２、ヘパリン２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）。次の１１日間、２日毎にこの培地を交換し、その後、毎週のチョッピング（ＥＺ  ｓｐｈｅｒｅと同様）による増殖のために、ｉＮＰＣｓＳＵの安定した集団をＳｔｅｍＨｉ  Ｅ／Ｆ／Ｈに再導入した。ｉＮＰＣｓＳＵは、２６〜３０継代のための増殖能及びアストログリア生成傾向を維持し、効率的に凍結保存することができる。さらに、ＳｔｅｍＨｉ  Ｅ／Ｆ／Ｈ中１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で、成長因子低減マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にプレーティングするために、付着培養物として成長し且つｉＮＰＣｓＡＤと称される付着形式のｉＮＰＣをＥＺ  ｓｐｈｅｒｅのアキュターゼ解離により生成して、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、毎週、継代した。アストロサイトへの分化に向かって、ｉＮＰＣｓＳＵを、アキュターゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で単一細胞に解離するか、またはＴｒｙｐＬＥを用いて採取されたｉＮＰＣｓＡＤを、ポリ−ｌ−オルニチン／マトリゲルコーティングガラスのカバーガラス上にＮＩＭ中２５０００細胞／ｃｍ２で、７〜２１日間プレーティングした。追加情報は、Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“ＥＺ  ｓｐｈｅｒｅｓ：ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｒｏｓｅｔｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳＣｓ  ａｎｄ  ｉＰＳＣｓ”Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ；１０（３）：４１７−４２７に見出すことができる。
【００４６】
実施例２
移植
ＢＦＰについてＦＡＣＳを２回受けたヌクレオフェクトｉＮＰＣを、６ヶ月齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（Ｎｏｄ．ｃｂ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ番号１３０３、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の線条体に移植した（各半球に１００，０００細胞／μｌの細胞を２μｌ）。移植の３日前に、細胞のサブセットをｄｏｘで処置した。移植のために、細胞を解離し、馴化培地中で最終濃度１００，０００細胞／μｌに希釈し、氷上に維持した。動物をイソフルランで麻酔し、定位フレームに置いた。前頂部に対して吻側に０．７ｍｍ、外側に＋／−２．０ｍｍの両方に、細胞を注射した。ＰＢＳで充填した５μｌのハミルトンマイクロシリンジに、２μｌの細胞溶液を充填し、深さ−４．００ｍｍに挿入した。次に、マイクロシリンジを−３．５０ｍｍに持ち上げ、細胞溶液を１μｌ／分で注射した。細胞注射後、マイクロシリンジを−３．００ｍｍに持ち上げ、２分間保持し、徐々に引き上げた。毎日、動物をチェックした。
【００４７】
実施例３
レポーター遺伝子及びＧＤＮＦの制御された発現を提供する新しいベクター
Ｔｅｔ−Ｏｎシステムは、ｒｔＴＡ−Ｖ１０トランスアクチベーター及びｄｏｘ応答ＴＲＥ−Ｂｉ（Ｔｅｔ応答因子双方向性）プロモーターの構成的発現に依存する。トランスアクチベーター及び誘導性プロモーターが異なるプラスミドで発現し且つ細胞に共トランスフェクトされた場合、細胞が増殖中にドリフトし、二重トランスジェニック集団に対して選択され、その結果、非誘導性細胞がもたらされる（データは示さず）ことを、本発明者らは観察した。単一のシステムに、これらの因子及びレポーター遺伝子を組み込むには、大きなベクターが必要となり、これは、本発明者らが新たに作成した、「ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃ」［ｐｉｇｇｙＢａｃ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ／ＴａｇＢＦＰ２ｎｌｓ／ＰａｃＲ−Ｔｅｔ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｌｏｖｅｒ−Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ］（図１Ａ）と呼ばれるベクターで達成された。ベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃ末端反復（ＰＢ  ＴＲ）が隣接しており（図１Ａ１）、これは、ｐＢａｓｅ酵素が一過性に発現された時に、安定したゲノム取り込みを可能にする。
【００４８】
ベクターは、２つのプロモーター（構成的に活性なＣＭＶ／ニワトリβ−アクチン（別称ＣＡＧ）プロモーター及び誘導性双方向性ＴＲＥ−Ｂｉプロモーター）を有する。ＣＡＧプロモーター（図１Ａ２）は、ｒｔＴＡ−Ｖ１０（別称Ｔｅｔ−Ｏｎ）トランスアクチベーター（図１Ａ３）、ＴａｇＢＦＰ２−Ｖ５ｎｌｓ（Ｖ５タグ及び核局在化配列を有する増強青色蛍光タンパク質）（図１Ａ４）、ならびにピューロマイシン耐性遺伝子（図１Ａ５）の構成的発現を駆動する。タンデムの導入遺伝子は、自己切断ペプチドリンカー（Ｐ２Ａ）により隔てられている。システムへのｄｏｘの添加（図１Ａ６）は、ｒｔＴＡ−Ｖ１０トランスアクチベーターに立体配座の変化（図１Ａ７）を起こさせ、その結果、それが、ＴＲＥ−Ｂｉプロモーター（図１Ａ８）に結合することが可能になり、下流の導入遺伝子の転写を触媒する。ｄｏｘの離脱は、誘導された遺伝子発現を後退させる。ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターの最初のシストロンは、ミリストイル化及びパルミトイル化（ＭｙｒＰａｌｍ）Ｃｌｏｖｅｒレポーター（ｍｐＣｌｏｖｅｒ）（図１Ａ９）、それに続く、不安定なホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２Ｐ）（図１Ａ１０）を有する。Ｃｌｏｖｅｒは、緑色蛍光タンパク質であり、ＭｙｒＰａｌｍ配列は、細胞膜に局在する。核周囲のＧＤＮＦの局在との視覚的な重複を避けるために、膜蛍光レポーターを選択した。野生型ルシフェラーゼより半減期が数倍短い、不安定なホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２Ｐ）を、経時的な生きている動物の遺伝子発現の分析に使用した。誘導可能なＴＲＥ−Ｂｉプロモーターの下流にある第２のシストロンは、遺伝子発現の増加のために、ＧＤＮＦ（図１Ａ１１）、それに続く、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後因子（ＷＰＲＥ）を有する（図１Ａ１２）。よく特徴付けられたウサギβ−グロビンポリＡをそれぞれの因子の下流に配置させ、転写を停止させ、偽の導入遺伝子発現を防止した。ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃベクターは、安定したゲノム組み込み（図１Ｂ１）を促進するために、ｐＢａｓｅプラスミド（図１Ｂ）と共にトランスフェクトされるように設計される。要約すれば、ｄｏｘの存在または不存在により、誘導可能な導入遺伝子（Ｃｌｏｖｅｒ、ルシフェラーゼ、及びＧＤＮＦ）の発現が影響されるが、ｒｔＴＡ−ｖ１０トランスアクチベーター、ＴａｇＢＦＰ−ｖ５−ｎｌｓ、及びピューロマイシン耐性遺伝子が構成的に発現される（図１Ｃ）。追加情報は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／１３１９２６及びＡｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｌｉｎｅａｇｅｓ”Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５  Ｍａｒ  １０；４（３）：３２３−３３１に見出され、これは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００４９】
実施例４
ヌクレオフェクトｉＰＳＣ由来ＮＰＣの免疫細胞化学
細胞接着を促進するために、カバーガラスをポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４６３８）でコーティングし、続いて、２５μｌのラミニン（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ２０２０）を用いて３７℃で１時間処理した。次に、コーティングを除去した。ＴｒｙｐＬＥ中で５分間インキュベートすることにより、６ウェルプレートからヌクレオフェクト細胞を取り出した。等量の培地を加えて、酵素反応を中和し、次に、解離細胞をカウントし、１５０ｒｃｆでペレット化し、１，０００細胞／μｌで培地に再懸濁し、２５μｌの細胞をカバーガラスのラミニンコーティング領域にピペッティングした。細胞接着させるために、３７℃で４〜６時間インキュベートした後、ウェルを５００μｌの成長培地で静かに満たした。半分の体積の培地を２４時間毎に交換した。
【００５０】
上述のように、免疫細胞化学を実施した。要約すると、細胞を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１２分間固定した。次に、ＰＦＡ溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、それぞれ５分間インキュベートした。次に、穏やかなロッカーで、０．３％のＴｒｉｔｏｎ（ＰＢＳ−Ｔ）及び３％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）を含むＰＢＳ中で希釈された１次抗体［表１に記載の濃度］中で、細胞を４℃で少なくとも１２時間インキュベートし、次に、５分間のＰＢＳ洗浄を室温で３回行った。２次抗体（Ａｌｅｘａ４０５、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ４８８、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９、Ａｌｅｘａ６４７、またはＤｙｌｉｇｈｔ６４９、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡとコンジュゲート）を１：１０００希釈でＰＢＳ−Ｔ中で希釈し、穏やかなロッカーで、室温で１時間インキュベートした。次に、カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、退色防止マウンティングゲル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ、Ｐ１０１４４）を用いてガラススライドに取り付けた。
【００５１】
（表１）本研究で使用された抗体
2021518365.tif 000003
【００５２】
実施例５
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡに使用される培地は、ＥＧＦ及びＦＧＦを含まず、１％の抗生物質−抗真菌剤が補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２（７０：３０）、及びビタミンＡを含まない２％のＢ２７からなる。２４時間または７日間のインキュベーション期間中に培地を添加する前に、古い培地を吸引し、ウェルを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。収集された培地を−８０℃で保存した。製造者の使用説明書に従って、ＧＤＮＦ  ＥＬＩＳＡを実施した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹ２１２，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。
【００５３】
実施例６
イメージング
免疫細胞化学及び免疫組織化学蛍光染色後、色を順番にイメージングし、シグナルクロストークを回避する適切な設定を有するＮｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で、共焦点画像を収集した。露出及び彩度の測定を利用して、最大ダイナミックレンジをキャプチャした。通常、露出が設定された後、群内の後続の試料に、同一の設定を再利用した。共焦点Ｚスタックを操作するか、または後続のＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６での編集用の単一のＺスライスから個々のチャネルを分離するために、最初に、ＮＤ２画像ファイルをＩｍａｇｅＪにインポートした。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６でダイナミックレンジ及び露出の一貫性のために画像曲線を調整し、トリミングし、次に、最終的な画像を準備するためにＡｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ６にインポートした。
【００５４】
実施例７
移植組織のＧＤＮＦスコア付け
Ｌｅｉｃａ  ＤＭ２００  ＬＥＤ顕微鏡を使用して、免疫染色された切片を撮影した。実験条件（ｄｏｘ対ｄｏｘなし）を盲検化された観察者が、ＤＡＢ  ＧＤＮＦ染色の染色強度に基づいて、画像をスコア付けした。
【００５５】
実施例８
レポータータンパク質の産生は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで可逆的に制御される。
治療関連細胞でのｄｏｘ制御システムを評価するために、ヒトｉＮＰＣをｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃ及びｐＢａｓｅベクターでヌクレオフェクトした。容易に維持し、急速に増殖させることができる浮動性スフィア（ＥＺ  ｓｐｈｅｒｅと呼ばれる）として、ヌクレオフェクト細胞を成長させた。ｄｏｘの不存在下では、スフィアは、ＢＦＰ＋を構成的発現し、ｄｏｘの添加から２４時間以内に、スフィアは、ＢＦＰ＋及びＧＦＰ＋の両方を発現した。これは、ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターがｄｏｘに応答したことを示す（図１Ｄ）。
【００５６】
ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターからのレポーター発現を定量的に評価するために、タンパク質の正規化ためのウミシイタケルシフェラーゼを構成的に発現するＥｆ１−ウミシイタケプラスミドと共に、上記のように、ｉＮＰＣをヌクレオフェクトした。デュアルルシフェラーゼアッセイにより、２４時間にｄｏｘ処置後に、細胞のホタルルシフェラーゼ活性（ウミシイタケに対して正規化された）が約１３００倍の増加を表し、これは、ｄｏｘ離脱（図１Ｅ）時に、ほぼ基礎レベルに戻ったことが明らかになった。ＴＲＥ−Ｂｉ誘導性プロモーターの反応速度論を評価するために、ホタルルシフェラーゼ活性を、甲虫ルシフェリンの存在下で成長させたヌクレオフェクトｉＮＰＣの生培養で定量した（図１Ｆ）。ホタル生物発光が、時間０のｄｏｘ添加後に急速に増加し、（４８時間での）ｄｏｘ除去後に徐々に減少したことを、結果は示した。ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターを可逆的に誘導することができるかどうかを評価するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３  Ｌｉｖｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓシステムを使用して、ヌクレオフェクトｉＮＰＣの１時間毎の画像を撮影した。培養物にｄｏｘを添加、除去、及び再添加することにより、ｃｌｏｖｅｒの発現を誘導、後退、及び再誘導することができることを、結果は示した。臨床的に関連する細胞生成物を増殖させて保存する必要があるので、本発明者らは、ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターが、大幅な細胞増殖及び凍結に伴い、機能的応答を維持するかどうかを評価した。フロー分析により、構成的にＢＦＰ＋細胞の８３％がＧＦＰを発現するように誘導されたことが明らかになり（図５）、これは、ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターが機能を維持したことを示した。
【００５７】
実施例９
ＧＤＮＦ産生は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで可逆的に制御される。
本発明者らのシステムが治療関連分子を確実に制御できるようにするために、次に、ＧＤＮＦの生成を、ヌクレオフェクトｉＮＰＣで評価した。免疫蛍光法により、ＧＤＮＦが、ｄｏｘの不存在下で細胞では見えないことが明らかになった。これにより、野生型細胞がＧＤＮＦを産生しないという本発明者らの以前の報告が確認される。レポータータンパク質であるＣｌｏｖｅｒ及びルシフェラーゼもｄｏｘの不存在下で生成されなかったが、ＢＦＰは構成的プロモーターの下で生成された（図２Ａ）。ｄｏｘの存在下では、ＢＦＰ産生の維持に加えて、ＧＤＮＦならびにＣｌｏｖｅｒ及びルシフェラーゼが検出された（図２Ｂ）。その後にｄｏｘが除去された時、ＧＤＮＦ及びレポーター遺伝子の産生は全て停止したが、ＢＦＰは維持された（図２Ｃ）。
【００５８】
ＧＤＮＦの制御を定量するために、ｄｏｘの存在下で（オン）、ｄｏｘの不存在下で（オフ）、ｄｏｘの存在下の後に不存在下で（オン→オフ）、及び長期間のｄｏｘの存在下で（オン→オン）、成長させた細胞でＥＬＩＳＡを使用し、培地は、変更しなかった（図２Ｄ）。ここでもまた、細胞は、ｄｏｘの不存在下で、目に見えるほどのＧＤＮＦを産生しなかった。対照的に、細胞は、わずか２４時間後にｄｏｘの存在下で強力なレベルのＧＤＮＦを産生し、これは、７日間にわたる継続的なｄｏｘ処置で蓄積された。重要なことに、ＧＤＮＦは、ｄｏｘの有無に基づいて、可逆的にオンになることも、ベースラインレベルに戻ることもできる。ＧＤＮＦ陽性細胞の立体解析学的なカウントを用いて、ＥＬＩＳＡの結果を正規化することにより、ｄｏｘ処置された培養物が、１時間毎に、ＧＤＮＦ陽性細胞当たり７．３４ｘ１０−４ピコグラムのＧＤＮＦを分泌したことが示された。まとめると、タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率よく誘導及び後退させることができるという実証により、移植後の細胞におけるタンパク質制御の土台が作られる。
【００５９】
実施例１０
成体脳へのｉＮＰＣ移植において、レポーター導入遺伝子発現は、誘導可能及び可逆的である。
このシステムがｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の発現を制御する能力を調査するために、ヌクレオフェクトｉＮＰＣを増殖させ、成体ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス脳に移植した（図３Ａ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖中に、細胞は、核ＢＦＰについて２回のＦＡＣＳを受け、親細胞集団は、１５．６％のＢＦＰ＋を含有しており、次に、これを、ニューロスフィアとして７週間増殖させ、２回目にＢＦＰについて選別した。これは、３２．４％のＢＦＰ＋細胞を生じた。第２の選別の３週間後、細胞を、２群に分け、一方の細胞群は、培養中、移植前の３日間ｄｏｘを受け、他方の細胞群は、ｄｏｘを受けなかった。６ヶ月齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１４）に２００，０００のｉＮＰＣを各線条体半球に移植し、１０匹の動物がｄｏｘで前処置された細胞を受け、４匹の動物が未処置の細胞を受けた。動物は、移植前にｄｏｘを受けなかった。
【００６０】
移植の１日後、ｄｏｘ処置細胞が移植された１０匹の動物全てがバックグラウンドを超えるルシフェラーゼシグナルを放出し、これを、ＣＮＳより遠位の動物の後部領域のシグナルに基づいて計算した（図３Ｂ〜Ｃ、０週目）。移植された細胞が、その後、ｄｏｘの投与及び離脱により複数回「オン」及び「オフ」にし得るかどうかを判断するために、動物を２群に分け、オン→オフ→オン→オフ→オン（Ａ群）またはオフ→オン→オフ→オン（Ｂ群）のように切り替えた。毎週の生物発光イメージングにより、ｄｏｘが、代表的な動物（オンｄｏｘで試験を開始し、オフｄｏｘで終了した動物、ならびにオフｄｏｘで開始し、オンｄｏｘで終了した動物）の両方において、ルシフェラーゼタンパク質を効果的にｉｎ  ｖｉｖｏで制御することが示された（図３Ｂ）。毎週のイメージングセッションでのルシフェラーゼ活性の定量化により、ｄｏｘ処置動物のルシフェラーゼ活性の増加及び経時的な遺伝子発現の誘導性の両方が確認された（図３Ｃ）。まとめると、これは、ｄｏｘで誘導可能な遺伝子発現についてｉｎ  ｖｉｖｏでの原理証明を提供する。
【００６１】
実施例１１
ｉＮＰＣ移植において、ＧＤＮＦ発現は、誘導可能及び可逆的である。
移植細胞でのＧＤＮＦ発現の制御を確認するために、最後のイメージングセッション後に動物を安楽死させ、蛍光免疫組織化学により、ＧＤＮＦ、Ｃｌｏｖｅｒ、及びＢＦＰ産生を評価した（図４）。オンｄｏｘで試験を終了した動物（図４Ａ）及びオフｄｏｘで試験を終了した同腹仔（図４Ｂ）における移植により、線条体領域にＢＦＰ＋細胞が示されたが、Ｃｌｏｖｅｒ及びＧＤＮＦは、ｄｏｘ動物でのみ検出された。高い増幅度により、ｄｏｘ処置動物では移植部位に隣接する宿主細胞がＧＤＮＦを吸収し得るのに対して（図４Ｃ、ピンクの矢印）、オフｄｏｘ動物ではこれが観察されなかった（図４Ｄ）ことが示された。まとめると、これらのデータにより、ＧＤＮＦ分泌が移植の数か月後のｉＮＰＣにおいて誘導及び後退させることができることが表された。
【００６２】
最終的に、タンパク質検出の高い感度を提供し、ヒトＧＤＮＦ発現ＮＰＣ移植を効果的に追跡しているＤＡＢ染色を使用して、ＧＤＮＦ発現のレベル及び位置を決定した（図６は、図４の同腹仔動物のＤＡＢ染色を示す）。盲検分析により、オンｄｏｘで試験を終了した全ての動物（１つ（動物番号８）を除く）がＧＤＮＦシグナルの増加を示し、オフｄｏｘで試験を終了した動物のいずれもが（表２）ＧＤＮＦシグナルを示さなかったことが明らかになった。
【００６３】
（表２）盲検死後ＧＤＮＦスコア付け
2021518365.tif 000004
（−）陽性染色なし、（＋）わずかな染色、（＋＋）中程度の染色、（＋＋＋）広範囲の染色。Ｓｔｒ＝線条体。ＣＣ＝脳梁。
【００６４】
この分析により、生物発光強度の変動が、移植片の位置の変化の結果である可能性があることも明らかになった。具体的には、著しく高い生物発光シグナルを示した一部の動物は、髄膜に移植細胞を有するが、これは、針の後退中の、注入管への細胞の逆流が原因である可能性がある（図７）。全体として、全ての研究動物の広範な分析により、生物発光シグナル及びＧＤＮＦ発現間の強い相関が確認された。
【００６５】
実施例１２
考察
このレポートは、ヒト神経前駆細胞の操作により産生されたＧＤＮＦは、ｉｎ  ｖｉｖｏで複数サイクルにわたって厳密に制御することができるという概念実証を提供する。この技術は、他の成長因子にも適用することができ、種々の疾患で損傷したニューロンを保護する有益な手段を提供する。ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃを使用して、ｄｏｘが、誘導可能なＴＲＥ−Ｂｉプロモーターからの導入遺伝子活性化を可能にするレベルまで、実質的な移植部位に浸透することを、本発明者らは観察した。本発明者らはまた、導入遺伝子活性が、複数サイクルで誘導及び後退させることができることを報告する。従って、疾患の進行中に患者が副作用、脱感作、または他の導入遺伝子関連現象を発症した場合、ＧＤＮＦ投与を減弱または停止することができる。あるいは、薬物レジメンは、宿主受容体及びシグナル伝達経路の再感作を可能にするように変化させることができる。これは、構成的遺伝子発現を伴うｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療とは著しく対照的である。重要なことに、遺伝子制御に必要なｄｏｘ濃度の量（１５μｇのｄｏｘ／ｇ重量）は、抗菌用量未満であり、ｄｏｘ耐性菌の存在を増加させないか、または腸内細菌叢に悪影響を及ぼさない。
【００６６】
興味深いことに、現在のＡＬＳ臨床試験に使用されるヒトＮＰＣのレンチウイルス形質導入と比較して、新規のｄｏｘ触媒システムは、ほぼ２倍高いＧＤＮＦ分泌を提供する。この増加は、レンチウイルスによる形質導入よりも多くのプラスミドゲノム挿入のコピーを媒介し得るｐｉｇｇｙＢａｃ転位に起因し得る。さらに、以前のレンチウイルス実験でのＧＤＮＦ転写は、内因性転写因子により活性化されるＰＧＫプロモーターに依存する。本研究では、ＧＤＮＦ転写は、Ｔｅｔ−Ｏｎトランスアクチベーターが、ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターに結合することにより開始される。ＴＲＥ−Ｂｉプロモーターは、ｄｏｘ投与により開始される立体配座の変化により触媒される。従って、転写は、天然に存在する転写因子により制限されることはなく、むしろ存在するトランスアクチベーター及びｄｏｘの量により制限される。本研究で行われたｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子操作された神経前駆細胞を移植すると、ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−Ｆｌｕのウイルス形質導入による宿主細胞の直接遺伝子操作と比較して、安全性のレベルが上がることに留意することが重要である。具体的には、脳への直接ウイルス形質導入は、罹患細胞に隣接する健康な細胞を標的とし得るだけでなく、さらに罹患宿主細胞も損ない得る。さらに、それ自体で、健康な神経前駆細胞／幹細胞を単に導入することは、種々の疾患の罹患宿主環境に有益な効果をもたらし得る。従って、細胞療法及び誘導可能な遺伝子療法の両方の相乗効果は、遺伝子療法単独を上回り得る。特に、神経細胞がヒトｉＰＳＣ供給源由来である場合、自己移植の将来性を決定的に提供する。
【００６７】
脳の検査に基づいて、異常行動または移植された線条体にいかなる明白な損傷も示した動物はいなかった。重要なことに、この研究または本発明者らの以前のｉＰＳＣ移植研究では、移植動物のいずれにも腫瘍または異所性腫瘍が観察されなかった。しかし、この治療法をクリニックに移転するには、さらに安全性及び有効性の試験が必要となるであろう。最初に、構成的に発現したトランスアクチベーター（ｒｔＴＡ−Ｖ１０）の長期的な有効性、毒性、及び潜在的な抗原性を試験しなければならない。次に、使用の容易さ故に、ｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃを安定して組み込む手段として、本発明者らの研究におけるｐＢａｓｅを使用した。ｐＢａｓｅはランダムな取り込みを媒介するが、本発明者らは、ｐＢａｓｅが使用された５００匹を超えるマウスで腫瘍を見たことはない。しかし、臨床グレードの製品は、単一コピーの部位特異的取り込みを必要とし得る。この目的に向けて、ＡＡＶＳ１安全なランディングを標的とすることは、長期の安定的な組み込み及び導入遺伝子のメチル化耐性発現を可能にし得る。重要なことに、本発明者らは、本研究で使用されたのと同じＴＲＥ−Ｂｉプロモーターを使用して、単一コピーレベルで著しいｄｏｘ媒介性導入遺伝子発現を観察している。
【００６８】
結論として、この原理証明研究は、神経変性疾患の処置に対する保護を提供するように機能する誘導可能な遺伝子治療及び細胞治療の組み合わせの基礎を築く。
【００６９】
実施例１３
ヒトｉＰＳＣ細胞株におけるＡＡＶＳ１「安全なランディング部位」からのヒトＧＤＮＦの誘導可能な発現
治療環境に上記構築物を適用すると、有害な影響を回避するための「安全な」組み込みから大いに利益を得るであろう。これは、任意に、制御可能な発現を含む、ヒトＧＤＮＦを産生するＤＮＡベクターの開発を含み、これは、ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座への組み込みを目的とすることができる。
【００７０】
出発点として、上述のヒトＧＤＮＦ産生プラスミドである、ＣＳＭＣのＢｒｅｕｎｉｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃを利用する。ＡＡＶＳ１  ＳＡ−２Ａ−ｐｕｒｏ−ｐＡドナープラスミドは、Ｒｕｄｏｌｆ  Ｊａｅｎｉｓｃｈからの贈与物であった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号２２０７５、ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：２２０７５、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿２２０７５）。ＡＡＶＳ１相同配列間のｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃのクローニングを容易にするために、ＳｆｉＩ制限部位を含むようにＡＡＶＳ１  ＳＡ−２Ａ−ｐｕｒｏ−ｐＡドナープラスミドを改変し得る。この新しい中間ベクターは、ＡＡＶＳ１−ＡＶＰＴと呼ばれる。
【００７１】
中間ベクターＡＡＶＳ１−ＡＶＰＴ及びｐＢ−ＲＴＰ−Ｔｅｔ−ＧＤＮＦ／ｍｅｍＣｌｏｖｅｒ−ＦＬｕｃは、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｆｉＩで消化される。適切なフラグメントを単離し、ＤＮＡライゲーションにより結合させた。得られる構築物をＤＮＡ塩基配列決定法で確認し、暫定的にＡＡＶＳ１−ｔｅｔｏｎ−ｈＧＤＮＦと命名した。図８に示される［配列番号２］。エレクトロポレーションにより、ＡＡＶＳ１−ｔｅｔｏｎ−ｈＧＤＮＦ構築物をヒトｉＰＳＣ株ＣＳ０００２ｉＣＴＲ−ｎ１１に導入した。ＡＡＶＳ１遺伝子座への組み込みの標的化は、プラスミドｈＡＡＶＳ１  １Ｒ  ＴＡＬＥＮ及びｈＡＡＶＳ１  １Ｌ  ＴＡＬＥＮを含むことにより達成される（ｈＡＡＶＳ１  １Ｒ  ＴＡＬＥＮは、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇからの贈与物であった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号３５４３２、ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：３５４３２、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿３５４３２）ｈＡＡＶＳ１  １Ｌ  ＴＡＬＥＮは、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇからの贈与物であった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号３５４３１、ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：３５４３１、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿３５４３１））。
【００７２】
実施例１４
ｉＰＳＣ細胞におけるＧＤＮＦの発現
蛍光タンパク質であるＣｌｏｖｅｒの発現に基づく、ＡＡＶＳ１−ｔｅｔｏｎ−ｈＧＤＮＦ含有細胞の同定を容易にするために、培養物をテトラサイクリンアナログであるドキシサイクリンの存在下に維持する。「緑色」コロニーを、増殖のために蛍光顕微鏡下で厳選した。十分な数の細胞が生成されると、クローンをＦＡＣＳ選別によりさらに精製した。同時に、培地をこれらのクローンから収集して、ＥＬＩＳＡアッセイによりＧＤＮＦ産生を確認した。
【００７３】
実施例１５
ＧＤＮＦ発現プラスミド（ＴＲＥＢｉ及びＴＲＢ３誘導性プロモーター）の単一コピー多様体のクローン
上述の別の例としては、ＧＤＮＦ発現プラスミドの単一コピー多様体が挙げられる。ＴＲＥＢｉ及びＴＲＢ３で誘導性プロモーターを使用して、そのようなベクターは、ｅＧＦＰ及びＬｕｃ２などのレポートを含み得る。例としては、図１０に示されるｐＤｏｎｏｒ−Ｔｅｔｏｎ３ｇ−２ａ−ＴａｇＢＦＰ−Ｖ５−ｎｌｓ−ｐ２ａ−ｐｕｒｏＲ  ＷＰＲＥ＿隔離型  ｍｐｃｌｏｖｅｒ−２ａ−ｌｕｃ２ｐｅｓｔ−２ａ−ｇｄｎｆ  ｗｐｒｅ［配列番号３］が挙げられる。そのようなベクターとしては、相同組み換え配列が挙げられる。ここでは、内因性遺伝子座のＡＡＶＳ１標的化は、ヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のエクソン１及びエクソン２間にある。レシピエント「ランディング部位」は、上流のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃに連結されているスプライスアクセプターにより駆動されるレポーター／選択カセット（蛍光及び抗生物質選択のためＴａｇＢＦＰ２及びＰｕｒｏＲ）を含み、ＬｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位に隣接する、構成的ＣＡＧプロモーターで駆動されるｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ赤色蛍光シストロンは、安定的に組み込まれた。続いて、これらのレポーターについて安定的に選択した時に、ＦｌｐＯ及びＣｒｅを発現するプラスミドで、これらの細胞をリポフェクトし、このドナープラスミドは、ＬｏｘＰ及びＦＲＴ隣接選択／レポーターカセットを含み、ならびにｄｏｘで誘導可能なｍｐＣｌｏｖｅｒ／Ｌｕｃ２ｐ／ＧＤＮＦシストロン含有プラスミドでリポフェクトした。
【００７４】
ドキシサイクリンの不存在下及び存在下での細胞の透過光及び緑色蛍光イメージングは、ｄｏｘ添加の２４時間後のｍｐＣｌｏｖｅｒの誘導性、及びｄｏｘの不存在下でのＧＦＰ「漏れ」の不存在を示す。この集団は、ピューロでは選択されていないので、純粋な集団ではないことに留意すべきである（従って、陰性細胞は、ドナー因子を含有しない）。さらに、ｍｐＣｌｏｖｅｒ集団が安定したトランスフェクションであるように、トランスフェクト細胞を富化させる選別のおよそ１週間後、及びトランスフェクションの２週間後に、これらの細胞を試験した。ｄｏｘの誘導性は、組み込みがない状態では機能しないであろう。
【００７５】
上記の種々の方法及び手法は、本発明を実施する多数の手段を提供する。当然、記載の目的または利点の必ずしも全てが、本明細書に記載の任意の特定の実施形態に従って達成されるわけではないことを理解すべきである。従って、例えば、方法が、本明細書で教示または示唆され得るように、他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書に教示の１つの利点または利点群を達成または最適化する様式で実施することができることを、当業者らは認識するであろう。様々な有利及び不利な代替物が、本明細書で述べられる。好ましい実施形態の一部が、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を具体的に含む一方、他のものは、１つの、別の、またはいくつかの不利な特徴を具体的に除外するが、さらに他のものは、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を含むことにより、本不利な特徴を具体的に軽減することが理解されるべきである。
【００７６】
さらに、当業者は、異なる実施形態の種々の特徴の適用性を認識するであろう。同様に、上述した種々の要素、特徴、及びステップ、ならびにそのような要素、特徴、またはステップそれぞれのための他の既知の等価物は、本明細書に記載の原理に従って方法を実施するために、当該技術分野の当業者が組み合わせることができる。多様な実施形態では、種々の要素、特徴、及びステップ中に、一部が具体的に含まれ、残りのものが具体的に除外されるであろう。
【００７７】
本発明は、特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されるが、本発明の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替実施形態及び／または使用ならびにその修正及び等価物にまで及ぶことは、当業者らに理解されるであろう。
【００７８】
本発明の実施形態では、多くの変形及び代替要素が開示されている。さらに別の変形及び代替要素は、当業者には明らかであろう。これらの変形には、限定されないが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関連する組成物及び方法、神経前駆細胞を含む分化したｉＰＳＣ、上述の細胞の操作に使用されるベクター、上述の組成物の使用に関する方法及び組成物、手法及び組成物ならびにそれに使用される溶液の使用、ならびに本発明の教示により作製される生成物の特定の使用がある。本発明の種々の実施形態は、これらの変形または要素のいずれかを具体的に含むか、または除外し得る。
【００７９】
一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明及び特許請求するために使用される成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数字は、一部の場合、「約」という用語で修飾されるものとして理解されるべきである。従って、一部の実施形態では、書面による説明及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、特定の実施形態により得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。一部の実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数の数を考慮して且つ通常の丸め手法を適用することにより解釈されるべきである。本発明の一部の実施形態の広い範囲について記載する数値範囲及びパラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は、実行可能な限り正確に報告される。本発明の一部の実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含有し得る。
【００８０】
一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明する文脈で（特に、以下の特許請求の範囲の特定の文脈で）使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示対象は、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈することができる。本明細書の値の範囲の列挙は単に、範囲内に入るそれぞれの別々の値を個々に指す簡単な方法として役立つことが意図される。本明細書で別途指示のない限り、各個別値は、本明細書で個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で別途指示のない限り、または別途文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で特定の実施形態に関して提供される任意の及び全ての例の使用、または例示的な言語（例えば、「など」）は、本発明をより適切に表すことが意図され、別途特許請求される本発明の範囲に制限を課さない。本明細書の言語は、本発明の実施に必須の、特許請求されていない任意の要素を示すと解釈されるべきではない。
【００８１】
本明細書に開示されている本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、制限として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素と任意の組み合わせで、参照して、特許請求することができる。グループの１つ以上のメンバーは、便宜及び／または特許性の理由により、グループに含まれるか、またはグループから削除され得る。そのような任意の包含または削除が生じた場合、本明細書は、本明細書にこのように修正されたグループを含有するとみなされ、添付の特許請求の範囲で使用される全てのＭａｒｋｕｓｈグループの書面による説明を満たす。
【００８２】
本発明を実施するための本発明者に既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形は、上述の説明を読むと当業者らに明らかになるであろう。当業者らが、必要に応じて、そのような変形を用い得ることが企図され、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外で実施することができる。従って、本発明の多くの実施形態は、適用法により許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正及び同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別途指示のない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【００８３】
さらに、本明細書を通して、特許及び印刷された出版物に対して、多数の参照がなされている。上記で引用された参考文献及び印刷された刊行物のそれぞれは、全体が参照により本明細書に個々に組み込まれる。
【００８４】
最後に、本明細書に開示の本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解すべきである。用いることができる他の修正は、本発明の範囲内であり得る。従って、限定ではなく例として、本発明の代替構成を、本明細書の教示に従って利用することができる。従って、本発明の実施形態は、示され、記載されるように正確に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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