(57)【要約】  非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）およびそれに関連する疾患状態の処置での使用のための、ヒト腫瘍ネクローシス因子１（ｈｕＴＮＦＲ１）を特異的に認識する抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）およびそれに関連する疾患状態の処置での使用のための、ヒト腫瘍ネクローシス因子１（ｈｕＴＮＦＲ１）を特異的に認識する抗体。
【請求項２】
ｈｕＴＮＦＲ１の膜遠位ＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２のサブドメインＡ１内のエピトープを特異的に認識し、好ましくは、ｈｕＴＮＦＲ１のＮ末端領域のアミノ酸１〜１１５によって表されるエピトープを特異的に認識する、請求項１に記載の使用のための抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の使用のための抗体。
【請求項４】
単一特異性、二価全長抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項５】
抗体が、エフェクター機能の媒介を欠損し、好ましくは、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含み、好ましくはＡ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる、請求項４に記載の使用のための抗体。
【請求項６】
一価的にｈｕＴＮＦＲ１を認識する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項７】
ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３；ならびに
ｂ）ＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）：ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３
ここで、
ｉ）
ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号１を含むまたはからなり；
ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号２を含むまたはからなり
ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号３を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号４を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号５を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号６を含むまたはからなり；
または、
ｉｉ）
ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号２３を含むまたはからなり；
ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号２４を含むまたはからなり
ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号２５を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号２６を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号２７を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号２８を含むまたはからなり；
ここで、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスにより；
または、ＣＤＲ配列のそれぞれに０、１、または２個の点変異を含み、ｈｕＴＮＦＲ１を特異的に認識する上記ｉ）またはｉｉ）のいずれかの機能的に活性なバリアント、
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項８】
配列番号７または９を含むまたはからなるＶＨ配列；および配列番号８または１０を含むまたはからなるＶＬ配列、またはＣＤＲ配列のそれぞれに最高１個の点変異、ならびにＶＨおよびＶＬのフレームワーク（ＦＲ）配列ＦＲ１〜４に少なくとも６０％の配列同一性を含む機能的に活性なそのバリアントを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項９】
疾患状態が、肝脂肪変性、炎症した肝臓、肝線維症および肝細胞癌のいずれかである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項１０】
有効量の抗体が、ＮＡＳＨを罹患している患者に投与され、ＴＮＦａ／ｈｕＴＮＦＲ１シグナリングをアンタゴナイズする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項１１】
有効量の抗体が、ＮＡＳＨを罹患している患者に投与され、
ａ）脂肪変性、トリグリセリド含量、炎症、および／または肝臓組織におけるアポトーシス；
ｂ）血清アミノトランスフェラーゼレベル；
ｃ）インシュリン耐性および任意選択によりグルコース耐性の改善；および／または
ｄ）ＮＡＦＬＤ活動性スコア
の１つまたはそれ以上のいずれかを低減する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
抗体が、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、ＮＡＳＨを罹患している患者に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項１３】
抗体が、抗炎症剤による処置、またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）アゴニスト、またはペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストを使用する治療と組み合わせてＮＡＳＨを罹患している患者に投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項１４】
抗体が、ＩＩ型糖尿病、Ｉ型糖尿病、糖尿病の予備軍、インシュリン耐性、または肥満も罹患している患者に投与され、ここで肥満は肥満度指数が少なくとも３０の患者として定義される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項１５】
有効量の抗体を含む医薬製剤が使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）およびそれに関連する疾患状態の新規の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコール中毒がない場合に生じる疾患のスペクトルを表し、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む。ＮＡＦＬＤは、欧米諸国では発生率の増加が示されており、肝細胞癌の発生に決定的に寄与する。
【０００３】
良性の脂肪肝から進行性の脂肪性肝炎への連鎖に沿った１つの基本的なステップは、アポトーシスと分類される肝細胞細胞死の発生である。ネクロトーシスは、代替のプログラム細胞死経路として明らかになり、ＮＡＳＨ患者の肝臓で活性化されることが見出された（Gautheron et al. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology 2015, 1:264-266）
Aparicio-Vergara et al. (Hepatology 2013, 57(2):566-576)は、肝脂肪変性またはインシュリン耐性の発生の防止におけるＴＮＦＲ１エクトドメインシェディングの役割を記載する。ＴＮＦＲ１シェディングができないことは、マウスにおいて、肥満、インシュリン耐性または肝脂肪変性を生じなかった。しかしながら、非シェディング変異を含むマウスは、ＮＡＳＨへの急激な進行を示した。ＴＮＦＲ１エクトドメインシェディングの活性化は、ＮＡＳＨへの進行の減衰に重要であることが見出された。
【０００４】
Cubero et al. (Cell Death and Differentiation 2013, 20:1580-1592)は、肝細胞および免疫細胞におけるＴＮＦＲ１が、慢性肝疾患の作用機序において異なる役割を有することを記載する。
【０００５】
Tomita et al. (Gut 2006, 55:415-424)は、ＴＮＦａ／ＴＮＦＲ媒介シグナリング経路の増強が、ＮＡＳＨ動物モデルにおける肝線維症の発病に決定的に関与し得ることを記載する。
【０００６】
Yaron Ilan (AASLD Liver Learning. Ilan Y. Nov 8 2014; 60709)は、脂肪性肝疾患を処置するための抗ＴＮＦベースの経口免疫治療を開示する。ＴＮＦαを結合する抗ＴＮＦ融合タンパク質（ＰＲＸ−１０６）は、高脂肪食マウスモデルにおいて使用された。
【０００７】
ＴＮＦＲ１に対する抗体は、リガンドを模倣する応答を誘導することによってアゴニスト性能を有することが見出された。この応答は、シグナル伝達が、多価のＴＮＦ三量体の結合による受容体の凝集によって開始されることを示す。
【０００８】
今までのところ、ＴＮＦＲ１選択的阻害は、ＴＮＦＲ１特異的抗体によって達成され得る。例えば、モノクローナルマウス抗体Ｈ３９８およびヒトＴＮＦＲ１に選択性を有するＵＳ５７３６１３８に記載の抗体は、ＴＮＦ媒介シグナル伝達および細胞傷害性の強力な阻害を示した（Moosmayer et al. 1995, Ther. Immunol. 2:31-40）。
【０００９】
Ｈ３９８のヒト化バージョンは、ＷＯ２００８／１１３５１５Ａ２に記載される。
ＷＯ２０１２０３５１４１は、エフェクター機能の媒介を欠損する抗ｈｕＴＮＦＲ１抗体を開示する。
【００１０】
一価の抗ｈｕＴＮＦＲ１抗体は、ＷＯ２０１７１７４５８６Ａ１に記載される。
Zettlitz et al. (LandesBioscience 2010, November/Dezember:639-647)は、ヒト化ＴＮＦＲ１特異的アンタゴニストモノクローナル抗体の生成を記載する。
【００１１】
Richter et al. (PLOS One 2013, 8(8):1 -13)は、ＴＮＦＲ２を未結合のままにしながら、ＴＮＦの抗炎症活性を低減するＴＮＦＲ１シグナル伝達の選択的阻害のためのヒト化アンタゴニスト抗ＴＮＦＲ１抗体の使用を記載する。
【００１２】
Berger et al. (Protein Engineering, Design & Selection 2013, 26(10):581-587)は、ＴＮＦ作用の選択的アンタゴニストとして抗ＴＮＦＲ１  ｓｃＦｖ−ＨＡＳ融合タンパク質を記載する。Feagins et al. (Eur J Gastroenterol Hepatol. 2015, 27(10):1154-1160)は、腫瘍ネクローシス因子阻害剤（ＴＮＦｉ）によって処置された患者が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＳＦまたは脂肪変性）を発症することを記載する。
【００１３】
ＮＡＳＨを処置する治療可能性は、これまでのところ特異的な薬物が利用できないため、限定てきであり、ライフスタイルの改善が制限される。したがって、ＮＡＳＨおよびそれと関連する疾患活動性の有効な処置を提供する必要がある。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の目的は、ＮＡＳＨおよびそれぞれの疾患状態の改善した処置を提供することである。
目的は、本発明の主題によって解決される。
【００１５】
本発明は、ＮＡＳＨおよび／または特にＮＡＳＨと関連するいずれかの疾患状態、中でも脂肪肝、ＮＡＦＬＤ疾患活動性（ＮＡＳ）、アポトーシス、線維症、および高アラニントランスアミラーゼ（ＡＬＴ）およびインシュリンレベルを罹患している患者を処置するためのヒト腫瘍ネクローシス因子１（ｈｕＴＮＦＲ１）を特異的に認識する抗体の新規の医学的使用を提供する。したがって、本発明は、ＮＡＳＨおよびそれに関連する疾患状態を罹患している患者の新規の医学的処置を提供する。
【００１６】
特に、本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）およびそれに関連する疾患状態の処置での使用のための、ｈｕＴＮＦＲ１を特異的に認識する抗体を提供する。
特定の態様により、抗体は、単離抗体である。
【００１７】
特定の態様により、抗体は、モノクローナルおよび／または組換え抗体である。
特定の態様により、抗体は、ｈｕＴＮＦＲ１の膜遠位ＣＲＤ１および／またはＣＲＤ２のサブドメインＡ１内のエピトープを特異的に認識し、好ましくは、ｈｕＴＮＦＲ１のＮ末端領域のアミノ酸１〜１１５、または１〜７０によって表されるエピトープを特異的に認識する。特に、ｈｕＴＮＦＲ１の配列は、配列番号３２として同定される。
【００１８】
特定の実施形態により、抗体は、単一特異性、二価全長抗体、または抗原結合抗体断片である。
別の特定の実施形態により、抗体は、ｈｕＴＮＦＲ１を結合する特異性を有するただ１つの抗原結合部位を含む、ｈｕＴＮＦＲ１の一価の結合剤である。特に、抗体は、一価的にｈｕＴＮＦＲ１を認識する。
【００１９】
特定の実施形態により、抗体は、Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ分子、単一可変ドメイン、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、半ＩｇＧ１抗体、およびＦｖドメイン、または先に記載のいずれかの機能的に活性な誘導体からなる「一価抗体」群から選択され、好ましくは抗体構築物が疎水性ポリマー、例えばＰＥＧに結合され、および／またはポリペプチド、例えばヒト（またはマウス）血清アルブミン、トランスフェリン、アルブミン結合ドメインまたはペプチド、Ｉｇ結合ドメインまたはペプチド、ＰＥＧ模倣ポリペプチド伸長、抗体Ｆｃ断片、好ましいヘテロ二量体化（ホモ二量体化よりも）を可能にする変異を持つ抗体Ｆｃ断片、または先に記載のポリペプチドのいずれかの機能性バリアントに融合される。
【００２０】
特に、抗体は、抗体Ｆｃ断片に融合されるＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦｖドメインのいずれかであり、ここでＦｃは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのヘテロ二量体からなり、ここでＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化よりも好ましいヘテロ二量体化を可能にする１つもしくはそれ以上の点変異を持つ。特に、ＦｃのＣＨ３ドメインの１つまたは両方は、ＣＨ３／ＣＨ３ドメインのヘテロ二量体を含有するＦｃを得るためなど、アミノ酸構造を変更するために改変される。
【００２１】
特に、抗体構築物は、さらなる抗体ドメインを含むまたは含まない、依然として、抗体の一価の結合構造を維持した、抗体Ｆｃ領域または断片に融合したＦｖドメインを含む。特定の例は、Ｆｃまたは改変Ｆｃに融合したＦａｂ部分またはＦｖ部分を指す。
【００２２】
好ましい抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖は、ＶＨドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなり、任意選択により１つまたはそれ以上のリンカーをさらに含み；軽鎖は、ＶＬドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなり、任意選択により１つまたはそれ以上のリンカーをさらに含む。
【００２３】
特定の実施形態は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含み、ここでＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、１つまたはそれ以上の「ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ」変異によってヘテロ二量体を形成し、例えば
「ｋｎｏｂｓ」変異は、ＣＨ３ベータシートの表面を改変し、１つのＣＨ３ドメイン単量体上に存在し、Ｔ３６６Ｗであり；および
「ｈｏｌｅｓ」変異は、ＣＨ３ベータシートの表面を改変し、他のＣＨ３ドメイン単量体上に存在し、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖからなる群から選択される。
【００２４】
特に、抗体は、エフェクター機能を下方制御する１つまたはそれ以上の変異を含むＦｃ領域を含む。特定の態様により、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を下方制御（downmodulate）するように糖鎖工学的に操作される。
【００２５】
特定の実施形態により、抗体構築物は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域または少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、もしくは９０％のいずれかの配列同一性を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃの機能性バリアントである人工ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含み、これが変異されてエフェクター機能を下方制御する。好ましくは、Ｆｃ領域は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する重鎖を含み、好ましくはＡ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号）を含む。好ましくは、少なくとも２つの前記変異、より好ましくは６個の変異の少なくとも３つ、４つ、５つ、または全てがＦｃ配列に工学的に操作される。配列番号３１はヒトIgG１  Fcの配列を識別する。
【００２６】
特に、抗体は、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化、またはＰＳＡ化される。
特に、抗体は、５，０００から１５０，０００ｇ／ｍｏｌの間の範囲の分子量のＰＥＧによってペグ化される。代表的な抗体構築物、例えばＦａｂは、ＰＥＧ４０，０００によってペグ化される。
【００２７】
特に、抗体は、ハーフ抗体ＩｇＧ１であり、１つだけのＦａｂ部分、ヒンジ領域および１つのＦｃ部分によって特徴付けられ、ここでヒンジ領域および／またはＦｃ部分（特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃ）は、１つまたはそれ以上の変異を含み、重鎖二量体化を避け（Gu et al. (2015) PLoS One 10(1):e0116419）、例えば、
−  ヒンジ領域における変異（配列番号３３）：Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ（ＥＵ番号付け）、および
−  Ｆｃ部分における変異：Ｐ３９５Ａ、Ｆ４０５Ｒ、Ｙ４０７Ｒ、Ｋ４０９Ｄ（ＥＵ番号付け）
からなる群から選択される。
【００２８】
特に、抗体は、Ｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質であり、ここでＦｖはＶＨ／ＶＬドメイン対からなり、ＶＨは、第１のヒンジ／リンカー領域を介して第１のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン鎖に融合され、ＶＬは、第２のヒンジ／リンカー領域を介して第２のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン鎖に融合される。好ましくは、第１および第２のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン鎖は、１つまたはそれ以上の点変異で互いに異なり、例えば第１および第２のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン鎖の間の好ましいヘテロ二量体化を可能にし、それにより、例えば、上述したように「ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ」変異によるＦｃヘテロ二量体によって特徴付けられるＦｖ−Ｆｃ調製物を得る。
【００２９】
特に、抗体は、１つまたはそれ以上のさらなる（人工的な）内部ドメインジスルフィド結合によって特徴付けられるジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）を含む。そのようなジスルフィド結合は、ＶＨおよびＶＬドメインを架橋するジスルフィド結合の橋脚として使用され得る好適な位置でＶＨおよびＶＬドメインのいずれかに、１つまたはそれ以上のさらなるシステイン残基を導入することによって得られ、そのジスルフィド結合はシステインの還元時に得られる。特定の実施例により、ジスルフィド結合は、ＶＨの以下の位置およびＶＬの対応する位置のいずれかにおいてＦｖに導入され得る：ＶＨの４４ＣおよびＶＬの１００Ｃ、ＶＨの１０８ＣおよびＶＬの５５Ｃ、ＶＨの１０６ＣおよびＶＬの５６Ｃ、またはＶＨの１０１ＣおよびＶＬの４６Ｃ。
【００３０】
特に、抗体は、
ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）：ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３；ならびに
ｂ）ＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）：ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３
ここで、
ｉ）
ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号１を含むまたはからなり；
ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号２を含むまたはからなり
ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号３を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号４を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号５を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号６を含むまたはからなり；
または、
ｉｉ）
ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号２３を含むまたはからなり；
ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号２４を含むまたはからなり
ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号２５を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号２６を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号２７を含むまたはからなり
ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号２８を含むまたはからなり；
ここで、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスにより；
または、ＣＤＲ配列のそれぞれに０、１、または２個（または最高１個、すなわち０または１個）の点変異を含み、ｈｕＴＮＦＲ１を特異的に認識する上記ｉ）またはｉｉ）のいずれかの機能的に活性なバリアント、
を含む。
【００３１】
特に、抗体は、ＶＨおよびＶＬ、
ここで、
ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号１を含むまたはからなり；
ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号２を含むまたはからなり；
ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号３を含むまたはからなり；
ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号４を含むまたはからなり；
ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号５を含むまたはからなり；および
ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号６を含むまたはからなり；
ここで、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスにより；
または、ＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに最高１個（すなわち０または１個）の点変異を含み、ｈｕＴＮＦＲ１を特異的に認識する機能的に活性なそのバリアント、
を含む。
【００３２】
特に、ＶＨおよびＶＬ配列は、ＶＨ−およびＶＬ−ＣＤＲ配列によって特徴付けられ、ここで、
ｉ）
ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号１を含むまたはからなり；
ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号１０を含むまたはからなり、ここで５位のＸはＳであり；
ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号３を含むまたはからなり；
ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号４を含むまたはからなり；
ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号５を含むまたはからなり；および
ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号１１を含むまたはからなり、ここで３位のＸはＧであり；
またはｉｉ）
ＶＨ−ＣＤＲ１は配列番号１を含むまたはからなり；
ＶＨ−ＣＤＲ２は配列番号１０を含むまたはからなり、ここで５位のＸはＳであり；
ＶＨ−ＣＤＲ３は配列番号３を含むまたはからなり；
ＶＬ−ＣＤＲ１は配列番号４を含むまたはからなり；
ＶＬ−ＣＤＲ２は配列番号５を含むまたはからなり；および
ＶＬ−ＣＤＲ３は配列番号１１を含むまたはからなり、ここで３位のＸはＳである。
【００３３】
特に、抗体は、配列番号７または９を含むまたはからなるＶＨ配列；および配列番号８または１０を含むまたはからなるＶＬ配列、またはＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに最高１個の点変異、ならびにＶＨおよびＶＬのフレームワーク（ＦＲ）配列ＦＲ１〜４の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに少なくとも６０％の配列同一性を含む機能的に活性なそのバリアントを含む。
【００３４】
ｈｕＴＮＦＲ１を特異的に認識し、結合することができる抗原結合部位を含む特定のＶＨ／ＶＬ組合せは：
ａ）配列番号７を含むまたはからなるＶＨ配列；および配列番号８を含むまたはからなるＶＬ配列；または
ｂ）配列番号９を含むまたはからなるＶＬ配列；および配列番号１０を含むまたはからなるＶＬ配列
のいずれかである。
【００３５】
特に、抗体は全長またはＦａｂを含むまたはからなる抗原結合抗体断片であり、
ａ）配列番号１１を含むまたはからなる重鎖（ＨＣ）配列；および
ｂ）配列番号１２を含むまたはからなる軽鎖（ＬＣ）配列；
またはそれぞれＨＣおよびＬＣに含まれるＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに最高１個の点変異、ならびにＶＨおよびＶＬドメインのＦＲ配列ＦＲ１〜４の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに少なくとも６０％の配列同一性を含む機能的に活性なそのバリアントを含む。
【００３６】
特に、抗体は、
ａ）配列番号１８を含むまたはからなるＨＣ配列；および
ｂ）配列番号１３を含むまたはからなるＬＣ配列；
またはそれぞれＨＣおよびＬＣに含まれるＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに最高１個の点変異、ならびにＶＨおよびＶＬドメインのＦＲ配列ＦＲ１〜４の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに少なくとも６０％の配列同一性を含む機能的に活性なそのバリアントを含む。
【００３７】
配列番号１８によって同定されるＨＣおよび配列番号１３によって同定されるＬＣを含む特定の機能的に活性な抗体のバリアントは、
ａ）配列番号１９を含むまたはからなるＶＨ、または少なくとも前記ＶＨ配列に含有されるＣＤＲ配列；
ｂ）４〜１０アミノ酸、例えば４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸からなる、好ましくは任意の組合せで、例えば配列番号１５からなるリンカーのような、多くのグリシン、セリンまたはスレオニンからなるリンカー配列；
ｃ）配列番号１６を含むまたはからなるＣＨ２ドメイン；および
ｄ）配列番号２０を含むまたはからなるＣＨ３ドメイン；
からなるＨＣ、ならびに
ａ）配列番号１４を含むまたはからなるＶＬ、または少なくとも前記ＶＬ配列に含有されるＣＤＲ配列；
ｂ）４〜１０アミノ酸、例えば４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸からなる、好ましくは任意の組合せで、例えば配列番号１５からなるリンカーのような、多くのグリシン、セリンまたはスレオニンからなるリンカー配列；
ｃ）配列番号１６を含むまたはからなるＣＨ２ドメイン；および
ｄ）配列番号１７を含むまたはからなるＣＨ３ドメイン；
からなるＬＣを含む。
【００３８】
特に、そのような抗原結合抗体は、
ａ）ＨＣコード配列配列番号２２；および
ｂ）ＬＣコード配列配列番号２１；
またはそれぞれＨＣおよびＬＣに含まれるＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに最高１個の点変異、ならびにＶＨおよびＶＬドメインのＦＲ配列ＦＲ１〜４の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに少なくとも６０％の配列同一性を含む機能的に活性なそのバリアントを含む、１つまたはそれ以上の核酸分子によってコードされる。
【００３９】
特定の実施形態により、抗体は、６つのＣＤＲ配列の以下の組合せによって特徴付けられる抗原結合部位を含み、それは、
配列番号２３：ＶＨ−ＣＤＲ１；
配列番号２４：ＶＨ−ＣＤＲ２；
配列番号２５：ＶＨ−ＣＤＲ３；
配列番号２６：ＶＬ−ＣＤＲ１；
配列番号２７：ＶＬ−ＣＤＲ２；および
配列番号２８：ＶＬ−ＣＤＲ３；
または、ＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに最高１個の点変異を含み、ｈｕＴＮＦＲ１を特異的に認識する機能的に活性なそのバリアント、
を含むまたはからなる。
【００４０】
特に、抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインに組み込まれる抗原結合部位、ここで、
ａ）ＶＨは配列番号２９を含むまたはからなり；および
ｂ）ＶＬは配列番号３０を含むまたはからなり；
またはＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに０、１、または２個（または最高１個）の点変異、ならびにＶＨおよびＶＬドメインのＦＲ配列ＦＲ１〜４の１つまたはそれ以上のいずれか、またはそれぞれに少なくとも６０％の配列同一性を含む機能的に活性なそのバリアントを含む。
【００４１】
特に、抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでＶＨおよびＶＬドメインの少なくとも１つが、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のいずれかに少なくとも１つの点変異を含む親ドメインの親和性成熟機能性バリアントであり、ここで
ａ）親ＶＨドメインはＣＤＲ配列：配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５によって特徴付けられ、
ｂ）親ＶＬドメインはＣＤＲ配列：配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８によって特徴付けられる。
【００４２】
特に、前記少なくとも１つの点変異は、配列番号２４および／または配列番号２８のいずれかにある。
特に、代表的な抗体（本明細書で提供した配列によって特徴付けられるそれらの抗体）のいずれかは、本発明に従って使用され得る。同様に、同じ抗原結合部位を含むおよび／または同じ標的結合特異性を有する任意の代替の抗体が使用され得る。特定の代替の抗体は、代表的な抗体の機能性バリアントであるものであり、ここで代表的な抗体のいずれかは、ｈｕＴＮＦＲ１標的を特異的に認識する機能を有するバリアントを産生する「親」として使用され得る。
【００４３】
特に、抗体は、本明細書に提供する配列によって特徴付けられる親抗体の親和性成熟抗体であり、特にここで、ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５、または６は、親抗体におけるそれぞれのＣＤＲと比較して最高１個の点変異を含む機能的に活性なＣＤＲバリアントである。
【００４４】
特定の実施形態では、機能的に活性なバリアント抗体は、ＣＤＲ配列のそれぞれに０、１、２、または３個の点変異のみ、好ましくはＣＤＲ配列のそれぞれに０、１、または２個の点変異のみを含み、ここで点変異は、１アミノ酸の置換、挿入または欠失のいずれかである。
【００４５】
本明細書に記載の抗体（親抗体）の機能的に活性なバリアントのいずれかは、ｈｕＴＮＦＲ１結合特異性によって特異的に特徴付けられる。機能的に活性なバリアントは、１つまたは複数の変異ＦＲ配列を含んでよく、１つまたはそれ以上の、例えばいくつかの点変異、例えば最高２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の点変異を含み、親抗体のそれぞれのＦＲ配列と比較して少なくとも６０％の配列同一性、または少なくとも７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント配列を得る。
【００４６】
特に、抗体は、１０−８Ｍまたは５×１０−９Ｍより低いＫＤ、および１０−３Ｓ−１より低いＫｏｆｆでｈｕＴＮＦＲ１を結合している抗原結合部分を含む。結合の親和性および結合特性（会合および解離）は、一価の結合を決定するための標準的な試験で特異的に決定され、二価の結合の結合活性効果を実質的に除外する。標準的な試験は、生理的温度（約３７℃、または３７℃＋／−１℃）での水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）による測定に基づく。そのような親和性測定は、特にＦａｂフォーマットで実施される。したがって、抗体がＦａｂ分子以外である場合、抗原結合部位は、特に３７℃でのＱＣＭによる親和性測定のためのそれぞれのＦａｂ分子に導入される。これは親和性測定と緩衝し得る結合活性効果にかかわらず一価の結合剤の親和性測定の結果の比較性を確実にする。特に好ましいＱＣＭは、中程度の受容体密度で実施される。特に、ｈｕＴＮＦＲ１に結合する抗体構築物の親和性は、３７℃でのＱＣＭ、および５０〜１００Ｈｚ、例えば約５０Ｈｚ、または５０Ｈｚ＋／−１０Ｈｚ、または５０Ｈｚ＋／−５Ｈｚの範囲内の中程度の受容体密度によりＦａｂフォーマットに関して決定される。
【００４７】
特に、ＫＤは、４×１０−９Ｍより低い、または３×１０−９Ｍより低い、または２×１０−９Ｍより低い、または１０−９Ｍより低い、または１０−１０Ｍより低い。
特に、Ｋｏｆｆは、１０−３より低い、５×１０−４ｓ−１より低い、１０−４ｓ−１より低い、または１０−５ｓ−１より低い。
【００４８】
特に、抗原結合部分は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１のＫｏｎでｈｕＴＮＦＲ１を認識する。
特定の態様により、疾患状態は、肝脂肪変性、炎症した肝臓、肝線維症（またはアポトーシス）および肝細胞癌のいずれかである。特に、疾患状態のいずれかを発症するリスクがあるまたはすでに罹患しているＮＡＳＨ患者が処置される。ＮＡＳＨまたは関連疾患状態のいくつかの指標は、ＮＡＦＬＤ疾患活動性（ＮＡＳ）、ならびに高ＡＬＴおよびインシュリン血清レベルを含み、それらは本明細書に記載の処置によって効果的に低減され得る。
【００４９】
特に、患者は、ＩＩ型糖尿病、Ｉ型糖尿病、糖尿病の予備軍、インシュリン耐性、または肥満も罹患しており、ここで肥満は肥満度指数≧３０の患者として定義される。
特に、抗体は、有効量で患者に投与される。特に、量は、ＴＮＦａ／ｈｕＴＮＦＲ１シグナリングをアンタゴナイズするのに有効である。抗体は、アンタゴニスト抗体であり、それにより、細胞ベースのアッセイにおいて測定されたように、実質的なＴＮＦａ／ＴＮＦＲ媒介シグナリングおよびシグナル伝達を回避することが特に好ましい。本明細書に記載のおよび本明細書で提供する抗体配列によって特徴付けられる抗体のいずれかは、アンタゴニスト抗体であるとして特に理解される。
【００５０】
特定の態様により、抗体は、細胞ベースのアッセイにおいて、好ましくはＫｙｍ−１細胞でのＴＮＦＲ１媒介細胞死の阻害に関するアッセイにより、またはそれぞれＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−６またはＩＬ−８放出の阻害に関するアッセイにより決定されたように、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１受容体相互作用を直接阻害する。特に、Ｋｙｍ−１細胞におけるＴＮＦＲ１媒介細胞死の阻害に関するアッセイにおいて、ＩＣ５０値は５．０×１０−９Ｍより低い。特に、ＨｅＬａ細胞からのＩＬ−６放出の阻害に関するアッセイにおいて、ＩＣ５０値は４．０×１０−８Ｍより低く、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出の阻害に関するアッセイにおいて、ＩＣ５０値は２．０×１０−８Ｍより低い。
【００５１】
特定の実施形態により、一価の相互作用によりｈｕＴＮＦＲ１に結合し、ＴＮＦ模倣アゴニスト活性を示すリスクが減少された抗体が使用される。特に好ましいのは、ＴＮＦＲ１への結合の高い親和性、および低い解離率を有する抗体であり、ＴＮＦＲ１依存的ＴＮＦ応答の優れた阻害を提供する。
【００５２】
特に、本明細書に記載の抗体は、抗体および薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬品で提供される。抗体のアンタゴニスト特性のため、医薬品は、高い抗体濃度を含むが、アゴニスト活性から生じる副作用を避けることができる。
【００５３】
特に、医薬品は、好ましくは静脈内または皮下投与による非経口使用のために製剤化される。
特に、本明細書に記載の抗体は、低い免疫原性を有し、阻害剤、例えば抗薬物抗体（ＡＤＡ）を形成せずに繰り返し使用され得る。
【００５４】
驚くべきことに、本明細書に記載の抗体、特に一価の抗体は、ＡＤＡを発生する、例えば、免疫グロブリンまたは抗体免疫治療に対して抗体を発生した患者の処置に使用され得ることが分かった。先行技術では、そのようなＡＤＡの存在は、ＡＤＡが細胞表面でＴＮＦＲ１の結合時に抗体を架橋する能力を有し、それによりＴＮＦＲ１シグナル伝達をアゴナイズすることができるため、ＴＮＦＲ１を指向する抗体によるさらなる免疫治療を特に遮断する。しかしながら、本明細書に記載の抗体は、ＡＤＡの存在下でさえもＴＮＦＲ１シグナリングをアゴナイズしない（または実質的にしない）。
【００５５】
特に、本明細書に記載の医薬品は、ＡＤＡ、例えば抗ｈｕＴＮＦＲ１抗体または任意のＩｇＧ構造に対するＡＤＡを発生した患者に投与され得る。
特に、有効量の抗体は、ＮＡＳＨを罹患している患者に投与され、
ａ）脂肪変性、トリグリセリド含量、炎症、および／または肝臓組織におけるアポトーシス；
ｂ）血清アミノトランスフェラーゼレベル；
ｃ）インシュリン耐性および任意選択によりグルコース耐性の改善；および／または
ｄ）ＮＡＦＬＤ活動性スコア
の１つまたはそれ以上のいずれかを低減する。
【００５６】
特に、抗体は、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でＮＡＳＨを罹患している患者に投与される。ヒトで有効な量は、記載したマウスモデルでの治療有効用量（２０ｍｇ／ｋｇ）から推測され得る。ＨＥＤ（ヒト等価用量）は、およそ１〜２ｍｇ／ｋｇである。
【００５７】
好ましい抗体用量は、例えば０．５〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇの範囲である。皮下に投与される場合、好ましい投与量は、０．５〜４００ｍｇの範囲である。
特定の態様により、抗体は、全身投与により、好ましくは静脈内注入またはボーラス注入により治療有効量で患者に投与される。
【００５８】
特定の実施形態により、抗体は、通常例えば毎週、ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．注射、例えば０．５〜５ｍｇ／ｋｇ、特に約２ｍｇ／ｋｇの用量で患者に繰り返し投与される。投与される薬物の頻度および用量は、疾患状態および治療に対する応答に適応され得る。
【００５９】
特に、抗体は、ＮＡＳＨを罹患している患者に、糖尿病処置と組み合わせて投与される。抗体処置は、特に、ＮＳＡＰ／ＮＳＡＩＤなどの抗炎症剤、またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）アゴニスト、またはペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストを使用する治療と組み合わされ得る。
【００６０】
他に示さない限り、位置は、本明細書ではＫａｂａｔのＥＵインデックスにより番号付けされる。Ｋａｂａｔの番号付けスキームの説明は、Kabat, EA, et al., Sequences of proteins of immunological interest (NIH publication no. 91-3242, 5th edition (1991))に見出される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】Ｂ６−ｈｕＴＮＦＲ１−ｋ／ｉマウスは、最後８週間の抗ＴＮＦＲ１またはコントロール抗体（Ａｂ）による処置を含む、３２週間、高脂肪食（ＨＦＤ）を受けた。図１Ａは、抗ＴＮＦＲ１−Ａｂによって処置されたＨＦＤマウスの肝臓組織が、コントロール抗体によって処置されたマウス由来の肝臓組織と比較して、肝臓組織における脂肪変性の著しい低減を示した図である。図１Ｂは、抗ＴＮＦＲ１−Ａｂによって処置されたＨＦＤマウスの肝臓組織が、コントロール抗体によって処置されたマウス由来の肝臓組織と比較して、肝臓組織におけるトリグリセリド含量の著しい低減を示した図である。図１Ｃは、抗ＴＮＦＲ１−Ａｂによって処置されたＨＦＤマウスの肝臓組織が、コントロール抗体によって処置されたマウス由来の肝臓組織と比較して、肝臓組織におけるＮＡＦＬＤ活動性スコアの著しい低減を示した図である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図２】Ｂ６−ｈｕＴＮＦＲ１−ｋ／ｉマウスは、最後８週間の抗ＴＮＦＲ１またはコントロール抗体（Ａｂ）による処置を含む、３２週間、高脂肪食（ＨＦＤ）を受けた。図２Ａは、抗ＴＮＦＲ１−Ａｂによって処置されたＨＦＤマウスの肝臓組織が、シリウスレッド染色によって評価された肝線維症の改善を示した図である。図２Ｂは、それがコントロール抗体によって処置されたマウス由来の肝臓組織と比較して有意であったことを示した図である。＊ｐ＜０．０５。
【図３】Ｂ６−ｈｕＴＮＦＲ１−ｋ／ｉマウスは、最後４週間の抗ＴＮＦＲ１またはコントロール抗体（Ａｂ）による処置を含む、２０週間、高脂肪食（ＨＦＤ）を受けた。図３は、コントロール抗体と比較して、抗ＴＮＦＲ１抗体処置が、肝臓組織におけるカスパーゼ３活性化の著しい低減をもたらしたことを示す図である。＊ｐ＜０．０５。
【図４】Ｂ６−ｈｕＴＮＦＲ１−ｋ／ｉマウスは、最後８週間の抗ＴＮＦＲ１またはコントロール抗体（Ａｂ）による処置を含む、３２週間、高脂肪食（ＨＦＤ）を受けた。図４は、コントロール抗体と比較して、抗ＴＮＦＲ１  Ａｂによる処置が、ＡＬＴおよびインシュリン血清レベルの著しい改善をもたらしたことを示す図である。＊ｐ＜０．０５。
【図５−１】配列    配列番号１：ＶＨ−ＣＤＲ１    配列番号２：ＶＨ−ＣＤＲ２    配列番号３：ＶＨ−ＣＤＲ３    配列番号４：ＶＬ−ＣＤＲ１    配列番号５：ＶＬ−ＣＤＲ２    配列番号６：ＶＬ−ＣＤＲ３    配列番号７：ＩｇＧ１３．７／Ｆａｂ１３．７のＶＨ    配列番号８：ＩｇＧ１３．７／Ｆａｂ１３．７のＶＬ    配列番号９：ＡＴＲＯＳＡＢ／ＩＺＩ０６．１のＶＨ
【図５−２】配列    配列番号１０：ＡＴＲＯＳＡＢ／ＩＺＩ０６．１のＶＬ    配列番号１１：（Ｆａｂ１３．７重鎖［太字＝ＶＨ］）    配列番号１２：（Ｆａｂ１３．７軽鎖［太字＝ＶＬ］）    配列番号１３：ＶＬ１Ｃ（ＶＬ１３．７−ＣＨ２−ＣＨ３１；ＶＬおよびＣＨ１含有鎖）：    配列番号１４：ＶＬ１３．７    配列番号１５：リンカー    配列番号１６：ＣＨ２    配列番号１７：ＣＨ３１：ＣＨ３１は、主にＣＨ３由来の残基だが、ＣＨ１からの残基も含有する、散在するＩｇ定常ドメインである；    配列番号１８：ＶＨｋＣ（ＶＨ１３．７−ＣＨ２−ＣＨ３カッパ；ＶＨおよびＣＬｋ含有鎖）：
【図５−３】配列    配列番号１９：ＶＨ１３．７    配列番号２０：ＣＨ３ｋ    配列番号２１：ＶＬ１Ｃ（ＶＬ１３．７−ＣＨ２−ＣＨ３１；ＶＬおよびＣＨ１含有鎖）：    配列番号２２：ＶＨｋＣ（ＶＨ１３．７−ＣＨ２−ＣＨ３カッパ；ＶＨおよびＣＬｋ含有鎖）：
【図５−４】配列    配列番号２３：ＡＴＲＯＳＡＢのＶＨ−ＣＤＲ１    配列番号２４：ＡＴＲＯＳＡＢのＶＨ−ＣＤＲ２    配列番号２５：ＡＴＲＯＳＡＢのＶＨ−ＣＤＲ３    配列番号２６：ＡＴＲＯＳＡＢのＶＬ−ＣＤＲ１    配列番号２７：ＡＴＲＯＳＡＢのＶＬ−ＣＤＲ２    配列番号２８：ＡＴＲＯＳＡＢのＶＬ−ＣＤＲ３    配列番号２９：ＡＴＲＯＳＡＢ  ＶＨ    配列番号３０：ＡＴＲＯＳＡＢ  ＶＬ    配列番号３１：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ    配列番号３２：ｈｕＴＮＦＲ１配列：    配列番号３３：ヒンジ領域
【図６】Ａｔｒｏｓｉｍａｂ（ＨＣ：配列番号１８、ＬＣ：配列番号１３）の生化学的特徴。図６ａは、Ａｔｒｏｓｉｍａｂの分子組成の代表的な画像を示す図である（白：Ｆｃ由来の定常Ｉｇドメイン；明るい灰色：ＶＨおよびＣＨ１由来の配列；暗い灰色：ＶＬおよびＣＬκ由来の配列）。図６ｂは、Ａｔｒｏｓｉｍａｂが、ＳＥＣ（ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ  ｍＡｂ  ＨＲ、流速０．５ｍｌ／分、移動相Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）によって特徴付けられた図である。図６ｃは、Ａｔｒｏｓｉｍａｂが、還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥＴＭ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ）によって特徴付けられた図である。Ｍ：マーカー。図６ｄは、Ａｔｒｏｓｉｍａｂの熱安定性が、動的光散乱および得られたデータポイントの視覚的解釈によって分析された図である。図６ｅは、ヒト血漿でのインキュベーション後のＡｔｒｏｓｉｍａｂの安定性が、ＥＬＩＳＡでのヒトＴＮＦＲ１への残存する結合活性の検出によって分析された図である。棒は、３回の個々の実験のＥＣ５０値を表す（平均±ＳＤ）。４℃でのＰＢＳ中でインキュベートされた試料およびヒト血漿中に希釈後直接−２０℃に凍結された試料はコントロールとして寄与した。
【図７】Ｆｃ受容体およびＣ１ｑ補体タンパク質との抗原結合および相互作用。図７ａは、ヒトＴＮＦＲ１−ＦｃへのＡｔｒｏｓｉｍａｂの平衡結合が、ＥＬＩＳＡによって分析された図である（ｎ＝３、平均±ＳＤ）。Ｆａｂ１３．７（同一のＶＨおよびＶＬを含有する）およびＡＴＲＯＳＡＢ（親和性の低い二価バージョン）は、コントロールとして寄与した。図７ｂは、データ分析のため、１：１結合アルゴリズムを使用して１２８ｎＭと４ｎＭの間の５つの濃度（１：２希釈ステップ）で、ＱＣＭによってリアルタイム結合動態が記録された図である。図７ｃは、固定化したＡｔｒｏｓｉｍａｂならびに２つのコントロールタンパク質ＡＴＲＯＳＡＢ（サイレントＦｃ）およびリツキシマブ（野生型Ｆｃ部分）のヒトＦｃγＲＩ、ＩＩｂおよびＩＩＩとの、また補体タンパク質Ｃ１ｑとの相互作用が、ＥＬＩＳＡによって分析された図である（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。
【図８】Ａｔｒｏｓｉｍａｂのアンタゴニスト生物活性およびアゴニズムの欠如。Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、３つの異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでのアゴニスト活性の完全な欠如を実証した。図８ａは、ＨｅＬａ細胞からのＩＬ６放出を示す図である。図８ｂは、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出を示す図である。図８ｃは、Ｋｙｍ１細胞を使用する細胞死誘導アッセイを示す図である。完全なアゴニスト特性を実証した親Ｆａｂ１３．７ならびに（図８ａ）および（図８ｂ）においてほんのわずかにアゴニスト効果を示す二価のＩｇＧ  ＡＴＲＯＳＡＢは、コントロールタンパク質として寄与した。図８ｄは、同じセットのタンパク質が、ＩＬ−６放出によって検出されたように、ＨｅＬａ細胞の細胞表面上でのＴＮＦＲ１の活性化を阻害する能力を分析された図である。図８ｅは、同じセットのタンパク質が、ＩＬ−８放出によって検出されたように、ＨＴ１０８０細胞の細胞表面上でのＴＮＦＲ１の活性化を阻害する能力を分析された図である。図８ｆは、同じセットのタンパク質が、細胞死誘導によって検出されたように、Ｋｙｍ−１細胞の細胞表面上でのＴＮＦＲ１の活性化を阻害する能力を分析された図である。ＴＮＦＲ１は０．１ｎＭ  ＴＮＦ（図８ｄおよび図８ｅ）または０．０１ｎＭ  ＴＮＦ（図８ｆ）を使用して活性化された。全てのグラフは、３つの個々の実験の平均を表し、エラーバーはＳＤを示す。
【図９】抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でのＡｓｔｒｏｓｉｍａｂのアゴニズムの欠如。図９ａは、一定濃度の（およそ１５．８ｎＭ）の薬物特異的抗体の存在下でのＡｔｒｏｓｉｍａｂによるＨＴ１０８０細胞の表面上のＴＮＦＲ１の活性化が、マウス抗ヒトＩｇＧ血清（ＩｇＧ＿Ａ）を使用するＩＬ８放出アッセイにおいて分析された図である。図９ｂは、一定濃度の（およそ１５．８ｎＭ）の薬物特異的抗体の存在下でのＡｔｒｏｓｉｍａｂによるＨＴ１０８０細胞の表面上のＴＮＦＲ１の活性化が、マウス抗ヒトＩｇＧ血清（ＩｇＧ＿Ｂ）を使用するＩＬ８放出アッセイにおいて分析された図である。図９ｃは、一定濃度の（およそ１５．８ｎＭ）の薬物特異的抗体の存在下でのＡｔｒｏｓｉｍａｂによるＨＴ１０８０細胞の表面上のＴＮＦＲ１の活性化が、マウス抗ヒトＩｇＧ血清（ＩｇＧ＿Ｃ）を使用するＩＬ８放出アッセイにおいて分析された図である。マウス抗ヒトＩｇＧ血清単独、未刺激細胞およびＴＮＦ（３３ｎＭ）はコントロールとして寄与した。３回の個々の実験の平均±ＳＤが示される。
【図１０】図１０は、Ａｔｒｏｓｉｍａｂの薬物動態分析を示す図である。Ａｔｒｏｓｉｍａｂの循環濃度は、完全マウスタンパク質の代わりにマウス膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに結合されたヒトＴＮＦＲ１の細胞外ドメインを発現する、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊノックインマウスでの４００μｇのタンパク質のボーラス注射後にマウス血清中で決定された。インタクトなタンパク質は、ＥＬＩＳＡでのヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合時に決定された。グラフは、５匹のマウスの平均±ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
用語「１つの（a）」および「１つの（an）」および「その（the）」および同様の指示語の使用は、本発明を記載する文脈で（特に以下の請求項の文脈で）、本明細書に他に指定しないまたは文脈によって明確に否定しない限り、単数と複数の両方を含むと解釈される。
【００６３】
用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、および「含有する（containing）」は、他に記載しない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）として解釈される。本発明のために、用語「からなる（consisting of）」は、用語「を含む（comprising of）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下に群が、少なくとも特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これは好ましくはこれらの実施形態のみからなる群も包含することを意味する。
【００６４】
用語「抗体」は、本明細書では、リンカー配列を含むまたは含まない、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常ドメインおよび／または可変ドメインとして理解される抗体ドメインからなるまたは抗体ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を包含すると理解される。ポリペプチドは、ループ配列によって結合された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータバレル構造を含む場合、抗体ドメインとして理解される。抗体ドメインは、天然構造であってよく、または例えば、抗原結合特性または任意の他の特性、例えば安定性または機能特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合を改変するために変異誘発もしくは誘導体化によって改変されてよい。
【００６５】
本明細書で使用する抗体は、ｈｕＴＮＦＲ１またはｈｕＴＮＦＲ１のエピトープを特異的に認識する少なくとも１つの抗原結合部位を含む。したがって、ｈｕＴＮＦＲ１受容体への抗体の結合は、抗体あたり１つだけのｈｕＴＮＦＲ１特異的結合部位による一価、または２つのｈｕＴＮＦＲ１特異的結合部位による二価であり得る。特に、抗原結合部位は、１つまたは２つの抗体ドメインのものである。可変抗体ドメイン単独または組合せのいずれか、例えばＶＨドメイン単独、またはＶＨおよびＶＬドメインの組合せが、抗原結合部位の構築に用いられてよい。特に、抗原結合部位は、ＣＤＲ配列の組合せによって形成される。ＣＤＲ配列のそのような組合せも、ＣＤＲ結合部位、例えば１つの可変ドメインの３つのＣＤＲ配列、例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の組合せ、またはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３、または２つの可変ドメインの他の６つのＣＤＲ配列の組合せ、例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の組合せによって形成された抗原結合ポケットとして理解される。あるいは、抗原結合部位は、受容体への自然のリガンド由来または人工的な構築物であるものを用いてよい。本明細書で参照したＣＤＲ配列は、以下として指定される：
ＶＨドメインのＣＤＲ：
ＶＨ−ＣＤＲ１＝ＣＤＲＨ１
ＶＨ−ＣＤＲ２＝ＣＤＲＨ２
ＶＨ−ＣＤＲ３＝ＣＤＲＨ３
ＶＬドメインのＣＤＲ：
ＶＬ−ＣＤＲ１＝ＣＤＲＬ１
ＶＬ−ＣＤＲ２＝ＣＤＲＬ２
ＶＬ−ＣＤＲ３＝ＣＤＲＬ３
特に、単一の可変抗体ドメインのＣＤＲ結合部位は、抗原結合部位、例えば可変領域（例えばｄＡｂ、Ｆｄ、ＶＬ、Ｖカッパ、Ｖラムダ、ＶＨ、ＶＨＨ）の重鎖および軽鎖のドメインの結合部位、または一対の可変抗体ドメインの結合部位、例えばＶＨ／ＶＬ対として使用され得る。
【００６６】
したがって、ＣＤＲ結合部位を含む抗体は、単一の可変抗体ドメインまたは一対の可変結合ドメインを含んでよく、任意選択により、同じまたは異なる抗原結合特異性を有する他の可変ドメイン、例えば１つの抗原結合部位のみがｈｕＴＮＦＲ１に向かい、少なくとも１つの別の抗原結合部位がｈｕＴＮＦＲ１とは異なる標的に向かう二重特異性または多特異性抗体をさらに含む。任意選択により、抗体構築物は、定常抗体ドメイン、または連結する配列またはヒンジ領域を含むまたは含まない可変および／または定常抗体ドメインの組合せをさらに含む。
【００６７】
特定の抗体フォーマットは、本明細書に記載のように、例えば、単一可変抗体ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨ、または連結配列もしくはヒンジ領域を含むまたは含まず、可変抗体ドメインの対、例えばＶＬ／ＶＨ対を含む可変抗体ドメインおよび／または定常抗体ドメインの組合せを含むまたはからなる抗体、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメイン、例えば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、または例えば、ＩｇＧ型（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体の全長抗体を含むまたはからなる抗体が使用され得る。用語「全長抗体」は、少なくとも自然発生の抗体単量体に一般に見出されるＦｃドメインおよび他のドメインの大部分を含む任意の抗体分子を指すために使用され得る。この句は、本明細書において特定の抗体分子が抗体断片ではないことを強調するために使用される。
【００６８】
代表的な一価、単一特異性の結合剤は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ドメイン抗体、ＩｇＧハーフ抗体、または一価ＩｇＧ、例えば完全軽鎖、１つの完全重鎖およびＦｄ（Ｆｄ＝ＶＨ−ＣＨ１）を欠損するさらなるＦｃ鎖からなる１つのアームのＩｇＧであり、それらはｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ技術によって産生され（または他の非対称なＦｃ部分）、Ｆｃドメインのホモ二量体化を避ける。
【００６９】
代表的な二価または多価結合剤は、免疫グロブリン型のいずれかの全長抗体、または例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、またはＦｖのいずれか１つまたはそれ以上の少なくとも２つの抗原結合部位を含む全長抗体のいずれかの抗原結合抗体断片である。
【００７０】
用語「Ｆｖ」は、本明細書では、例えばＶＨ、ＶＬまたはＶＨ／ＶＬのＣＤＲ結合部位を組み込む可変ドメインの領域として理解される。用語「Ｆｖ」は、したがって、特にＶＨ、ＶＬ、またはリンカーを含むまたは含まず、両方の可変ドメインのベータシート構造間の相互作用によってＶＨドメインがＶＬドメインに結合するＶＨ／ＶＬのいずれかに適用する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、特に、異なる標的抗原を指向する、または異なる構造様式の抗体ドメインを含む他の抗体を実質的に含まない、抗体調製物中の単離された形態の抗体を含む。依然として、単離された抗体は、単離された抗体と、例えば少なくとも１つの他の抗体、例えば異なる特異性を有するモノクローナル抗体または抗体断片との組合せを含有する組合せ調製物に含まれ得る。
【００７２】
用語「抗体」は、ヒト種、例えば哺乳動物、例えばヒトもしくはマウス、または鳥類、例えばニワトリを含む動物起源の抗体に適用し、その用語は、動物起源の配列、例えばヒト抗体のように、ヒト配列に基づく組換え抗体を特に含む。ヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を含む。ヒト抗体は、好ましくは、本明細書に記載のように使用され、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を、例えばＣＤＲに含み得る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つまたはそれ以上のヒト免疫グロブリンのトランスジェニック動物から単離された抗体を含む。
【００７３】
しかし、用語「抗体」は、異なる種起源の配列、例えば、マウスおよびヒト起源の配列とのキメラ抗体、またはヒト起源のおよび非ヒト、例えばげっ歯類起源のアミノ酸配列を含有するヒト化抗体にさらに適用する。
【００７４】
用語「抗体」は、任意のクラスまたはサブクラスの抗体に特に適用する。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は、抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの主要なクラスに割り当てられ、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。
【００７５】
用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、特に組換え抗体にさらに適用し、この用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離される全ての抗体および抗体構築物、例えば、異なる起源、例えば、マウスの遺伝子または配列を含む、動物、例えばヒトを含む哺乳動物起源の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来抗体を含む。さらなる例は、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、または、抗体もしくは抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または抗体遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングが関与する任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体に関する。
【００７６】
抗体ドメインは、天然構造であってよく、または例えば、抗原結合特性または任意の他の特性、例えば安定性もしくは機能特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体（ＦＣＧＲ）への結合を改変するために変異誘発もしくは誘導体化によって改変されてよい。
【００７７】
特定の例は、１つまたはそれ以上の人工的なＣＤＲ配列を含む少なくとも１つの抗原結合部位によって標的ｈｕＴＮＦＲ１を特異的に認識するように工学的に操作された、または自然発生の免疫グロブリン構造のいずれかとは異なる構造を有する非自然発生の抗体構築物を産生するように工学的に操作された人工構築物である非自然発生の抗体に関する。
【００７８】
本明細書にさらに記載する抗体の特定の例は、例えば、その組合せが自然に発生しない、別の抗体または活性剤との組合せ調製物で提供されるように、非自然発生である。さらなる特定の例は、自然発生の抗体の人工的な誘導体もしくはバリアント、または自然発生の抗体の最適化もしくは親和性成熟バリアント、または抗体の安定性を改善するように工学的に操作されるフレームワーク領域を有する抗体に関する。そのような最適化または工学的な操作により、抗体は自然の抗体に関しては見出されない、１つまたはそれ以上の合成構造もしくは配列もしくは特徴を含む。
【００７９】
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗体の誘導体、特に機能的に活性な誘導体も指し、本明細書では抗体の機能性バリアントとも呼ばれると理解される。
機能的に活性な誘導体は、特に、抗体自身の主要なアミノ酸配列を変更しない融合または共有化学修飾によって産生される。誘導体は、例えば、循環半減期の延長、安定性の増加、クリアランスの低減、または免疫原性の変更を含む所望の特性を有し得る。特定の抗体誘導体は、１つまたはそれ以上の抗体ドメインもしくは抗体の任意の組合せ、および／または抗体の任意のドメインが１つまたはそれ以上の他のタンパク質、例えば他の抗体の任意の位置に融合し得る融合タンパク質、例えば、ＣＤＲループ、受容体ポリペプチドを含むがリガンド、足場タンパク質、酵素、毒素等も含む結合構造体であると理解される。抗体の誘導体は、様々な化学技術、例えば共有結合、静電気的相互作用、ジスルフィド結合等によって他の物質に会合または結合させることによって得られ得る。抗体に結合する他の物質は、脂質、糖、核酸、有機および無機分子、またはこれらの任意の組合せ（例えば、ＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）であってよい。特定の実施形態では、抗体は、例えば抗体−薬物コンジュゲートを得るための薬物を含む誘導体である。
【００８０】
用語、誘導体は、例えば特定のグリコシル化パターンを有し、例えば糖鎖工学的な操作によって産生され、機能性であり、機能性バリアントとして寄与し得る、例えば特定の標的に結合する抗体の断片、バリアント、類似体または相同体も含む。
【００８１】
抗体配列に関する用語「糖鎖工学的に操作された」は、糖鎖工学的な操作の結果として改変された免疫原性、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを有するグリコシル化バリアントに関する。全ての抗体は、重鎖定常領域の保存された位置に糖構造を含有し、各アイソタイプはＮ−結合糖構造の明確なアレイを持ち、タンパク質のアセンブリ、分泌、または機能活性に多様に影響する。ＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に接着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋められ、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するのに必須である。例えば、Ｎ２９７の、例えばＡへの変異によるＮ２９７のＮ−グリカンの除去またはＴ２９９のＮ−グリカンの除去は、典型的にはＡＤＣＣが低減したアグリコシル化抗体をもたらす。
【００８２】
抗体グリコシル化の大きな違いは、細胞系間で生じ、軽微な違いは異なる培養条件下で増殖した所与の細胞系にすら見られる。細菌細胞での発現は、典型的にはアグリコシル化抗体を提供する。
【００８３】
抗体は、活性なＦｃ部分が欠如していてよく、したがって、特にＣＨ２およびＣＨ３ドメインの鎖が欠如している任意の抗体を含む、ＦＣＧＲ結合部位を持たない抗体ドメインから構成され、または例えば、Ｆｃエフェクター機能を低減する、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を抑止または低減する改変による、Ｆｃエフェクター機能を欠損する抗体ドメインを含む。そのような改変は、Ｆｃエフェクター機能の低減またはＦｃエフェクター機能の欠如を達成するような変異誘発、例えばＦＣＧＲ結合部位における変異によって、または抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性と干渉する誘導体もしくは薬剤によってもたらされ、これは典型的には、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性によって測定されたように、未改変（野生型）抗体の１０％より少ない、好ましくは５％より少ないＦｃエフェクター機能に関すると理解される。
【００８４】
代表的な抗体は、Ｆｃ断片または少なくともＦｃ断片の一部を含んでよく、ＦｃＲｎへの結合部位を維持し、それによりｉｎ  ｖｉｖｏでの実質的な半減期を有する抗体を得る。
【００８５】
しかし、Ｆｃは、例えばＩｇＧ１のＩｇＧ２サブタイプへの変更により、または、例えば、ヒトＩｇＧ１  ＦｃにおけるＥ２３３Ｐおよび／またはＬ２３４Ｖおよび／またはＬ２３５Ａおよび／またはＤ２６５Ｇおよび／またはＡ３２７Ｑおよび／またはＡ３３０Ａおよび／またはＧ２３６、欠失および／またはＡ３２７Ｇおよび／またはＡ３３０Ｓによる、Ｆｃ受容体への結合を低減する改変により、可能なＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を低減するために改変することができ、ここで番号付けは、Ｋａｂａｔ［ＥＵインデックス］による。
【００８６】
さらなる例は、例えば、Ｋ．Ｏ．グリコシル化部位、例えば、レクチン受容体への結合を損なうＮ２９７Ｑによって、免疫原性を低減する改変に関する。
用語「抗体」は、親ＣＤＲ配列の機能的に活性なＣＤＲバリアントを有する抗体、および親抗体の機能的に活性なバリアント抗体を含む、抗体のバリアントも指すことが理解される。例えば、ＣＤＲ結合配列によっておよび／または本明細書で提供する重鎖および軽鎖配列によって特徴付けられるこれらの抗体の機能性バリアントは、工学的に操作され、本明細書にさらに記載されるように使用される。
【００８７】
特に、親抗体の抗体バリアントは、本明細書で提供する代表的な抗体のいずれかのような親抗体の少なくとも１つの抗体配列を工学的に操作することによって産生することができ、例えば、抗体バリアントは重鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲ、さらに任意選択により軽鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲを含み、少なくとも１つのＣＤＲもしくはＦＲ領域、または重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）の定常領域に少なくとも１つの点変異を有し、標的ｈｕＴＮＦＲ１への特異的な結合によって測定された場合、依然として機能的に活性である。
【００８８】
特に、抗体バリアントは変異抗体または抗体断片であり、例えば変異誘発方法によって得られ、特に、特定の抗体アミノ酸配列または領域に欠失、交換、インサートを導入し、または化学的にアミノ酸配列を誘導し、例えば定常ドメインにおいて抗体安定性、エフェクター機能または半減期を工学的に操作し、または可変ドメインにおいて例えば当技術分野で利用可能な親和性成熟技術によって抗原結合特性を改善する。例えばランダム化技術によって得られる、所望の位置に点変異を含む、任意の公知の変異誘発法が用いられ得る。いくつかの場合、例えば任意の可能なアミノ酸または好ましいアミノ酸の選択のいずれかにより、位置はランダムに選ばれ、抗体配列をランダム化する。用語「変異誘発」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を変更する任意の当技術分野で認識された技術を指す。変異誘発の好ましい型は、エラープローンＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発、または他の部位定方向変異誘発を含む。
【００８９】
点変異は、特に、異なるアミノ酸の１つまたはそれ以上の単一（非連続）または二重のアミノ酸の置換もしくは交換、欠失もしくは挿入により、工学的に操作していないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの工学的な操作と理解される。
【００９０】
特に、機能的に活性なバリアント抗体は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上の挿入、欠失または置換による親抗体または親抗体配列の改変によって産生され、またはアミノ酸配列における１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基、またはヌクレオチド配列内のヌクレオチド、または配列の遠位端のいずれかもしくは両方、例えば、ＣＤＲ配列Ｎ末端および／またはＣ末端１、２、３、または４アミノ酸、および／または中心の１、２、３、または４アミノ酸（すなわち、ＣＤＲ配列の中央）の化学誘導体であり、その改変はこの配列の活性に影響、特に障害しない。選択された標的抗原に対する特異性を有する結合部位の場合、抗体の機能的に活性なバリアントは、事前に決定された結合特異性、または実質的に同じ生物活性をなお有するが、これは、例えば、特定のエピトープに対する良好な特異性、親和性、結合活性、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度等を変化させるために変化され得る。例えば、親和性成熟抗体は、機能的に活性なバリアント抗体として特に理解される。したがって、親和性成熟抗体において改変されたＣＤＲ配列は、機能的に活性なＣＤＲバリアントとして理解される。
【００９１】
親和性成熟は、それにより標的抗原への親和性が増加した抗体が産生されるプロセスである。当技術分野で利用可能な親和性成熟ライブラリーを調製および／または使用するいずれか１つまたはそれ以上の方法が、本明細書に開示の本発明の様々な実施形態に従って親和性成熟抗体を生成するために用いられ得る。代表的なそのような親和性成熟方法および使用、例えばランダム変異誘発、細菌変異誘発株継代、部位定方向変異誘発、変異ホットスポット標的化、簡潔な変異誘発、抗体シャッフリング、軽鎖シャッフリング、重鎖シャッフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１変異誘発、ならびに本明細書に開示の本発明の様々な実施形態に従って実行する方法および使用に受け入れられる親和性成熟ライブラリーを産生および使用する方法は、例えば、Wark & Hudson, 2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58: 657- 670に開示のものを含む。
【００９２】
アミノ酸変異誘発を含む、または免疫グロブリン遺伝子セグメントにおける体細胞変異の結果としての抗体の構造変化を用いて、抗原への結合部位のバリアントが産生され、より強い親和性のものが選択される。親和性成熟抗体は、親抗体よりも数ｌｏｇ倍大きな親和性を示し得る。単一の親抗体が、親和性成熟され得る。あるいは標的抗原に対する類似の結合親和性を有する抗体のプールは親構造とみなされ、それらを変化させて親和性成熟した単一抗体または親和性成熟したそのような抗体のプールを得ることができる。
【００９３】
本明細書に記載の抗体の好ましい親和性成熟バリアントは、結合の親和性の少なくとも２倍の増加、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、または好ましくは１００倍の増加を示す。親和性成熟は、親分子のそれぞれのライブラリーを用いる選択作戦の過程で、中程度の結合親和性を有する抗体について、本明細書に記載の抗体を得るために用いられ得る。あるいは、親和性は、本明細書に記載の抗体の親和性成熟によってさらにより増加され、１０−１０Ｍより低い、さらに１０−１１Ｍより低いＫＤに対応する高い値を得ることができる。
【００９４】
特定の実施形態では、結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。特定の実施形態では、結合親和性はＢＩＡｃｏｒｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＭＳＤアッセイによって決定される。特定の実施形態では、結合親和性は、動力学的方法によって決定される。特定の実施形態では、結合親和性は、平衡／溶液法によって決定される。特定の実施形態では、結合親和性は、標準的な水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定によって、特に生体条件（約３７℃、密度約５０Ｈｚ）に似ている、事前に決定された条件で決定される。
【００９５】
本明細書に記載の抗体の特定の機能は、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用の阻害剤（アンタゴニストとも呼ばれる）としての機能である。本明細書で理解される用語「阻害剤」は、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＴＮＦＲ１シグナリングを調節する（例えば、低減または排除する）、および／または
ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＴＮＦＲ１媒介細胞死を阻害する、および／または
ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで炎症性サイトカインを放出するＴＮＦ媒介細胞刺激を阻害する、
ｄ）異なるメカニズムによるＴＮＦＲ１シグナリングを阻害する
能力を有する物質である。
【００９６】
特に、本明細書で使用する場合、抗体は、細胞表面上のＴＮＦＲ１の１つまたはそれ以上の分子に対する１つまたはそれ以上の分子ＴＮＦの結合と干渉する。治療適用のため、理論に縛られるものではないが、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用阻害剤は、ＴＮＦの存在下でのｈｕＴＮＦＲ１シグナリング、またはＴＮＦの存在下でのｈｕＴＮＦＲ１媒介細胞死を阻害する、またはＴＮＦの存在下での炎症性サイトカインを放出する細胞刺激を阻害する能力を有し得る。
【００９７】
本明細書で使用する場合、用語「シグナリング（signaling）」および「シグナル伝達（signal transduction）」は、細胞表面受容体を介する特定のおよび連続的な一連の分子による、刺激に対する特定の細胞応答を生じる核における遺伝子への細胞外刺激の伝達が関与する生化学プロセスを表す。
【００９８】
ｈｕＴＮＦＲ１相互作用の阻害は、細胞ベースアッセイでｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで測定されたように、用量依存的な方法で、ＴＮＦＲ１シグナリングまたはシグナル伝達の効果の下方制御をもたらし得る。本明細書に記載の抗体の機能活性は、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞ベースアッセイで決定されたように、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用またはＬＴα−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用を阻害する阻害機能によって特に特徴付けられる。さらなるアッセイは、ＴＮＦ−ＴＮＦＲ１相互作用をアゴナイズするＴＮＦＲ１受容体の架橋と関連する実質的な副作用を除外するために用いられ得る。好適なアッセイは、それぞれ炎症性サイトカインＩＬ−６またはＩＬ−８を産生する刺激活性の不在に関し、ＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞上の抗体またはバリアントの活性を決定する。代表的な試験は、以下の実施例の節で記載する。
【００９９】
阻害は、典型的には、ｈｕＴＮＦＲ１相互作用または活性の効果の、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または最大レベルまでの低減をもたらす。本明細書に記載の抗体を産生および特徴付ける方法は、当技術分野で周知である。好ましい実施形態では、抗体バリアントが産生され、ｈｕＴＮＦＲ１発現細胞を用いる１つまたはそれ以上の細胞ベースアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して前規定された特性に関してスクリーニングされる。そのようなアッセイのため、抗体は、典型的には、例えば、ＴＮＦの存在下および不在下で、細胞が結合され得るように外因的に添加され、アンタゴニストおよびアゴニスト活性が決定される。これらのアッセイは、典型的には、免疫グロブリンの機能；すなわち、ｈｕＴＮＦＲ１に結合し、いくつかの生化学事象、例えば、競合結合アッセイにおける、例えば前記細胞へのＴＮＦ結合の遮断、ＴＮＦ／受容体結合阻害、ＴＮＦ、特に炎症性インターロイキン、例えばＩＬ−６またはＩＬ−８の存在または不在下でのサイトカイン発現の低減、アポトーシス等を媒介する抗体の能力に基づく。
【０１００】
本明細書に記載の抗体は、好ましくはＴＮＦアンタゴニスト活性のみ（特に、検出可能なアゴニスト活性無し）を有し、したがって、望まない炎症応答、アポトーシスおよびネクローシス、または臓器不全をもたらし得る循環中の増加したＴＮＦレベルによって引き起こされる炎症反応を低減する。好ましい抗体は、最大半量の飽和濃度、好ましくはそれぞれ０．０１〜０．１ｎＭ  ＴＮＦおよびＬＴアルファの範囲でＴＮＦまたはＬＴアルファを用いる細胞ベースアッセイで測定された場合、１００ｎＭより低い、好ましくは２０ｎＭより低い、より好ましくは１０ｎＭより低い、最も好ましくは１桁のナノモル範囲またはそれ以下のＩＣ５０に対応するアンタゴニスト活性を有する。
【０１０１】
潜在的なＴＮＦ模倣アゴニスト活性は、同じ細胞ベースアッセイで測定され得るが、ＴＮＦを用いない。本明細書に記載の抗体は、好ましくは、ＴＮＦの不在下でのＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞のインキュベーションが、サイトカインを誘導しないまたはわずかにしか誘導しない、例えば、少なくとも５ｎＭまたはおよそ１０ｎＭの抗体濃度で０．５ｎｇ／ｍｌより低い上昇したＩＬ−６またはＩＬ−８レベルの場合、著しいアゴニスト活性を持たない。好ましくは、サイトカイン産生無し、またはわずかのみ、または陰性であり、１０ｐｇ／１０５個の細胞より少ない量で決定され得る。好ましい例では、サイトカイン発現および放出は、１８時間で２．５ｐｇ／１００，０００個の細胞より少ない。好ましくは、アゴニスト活性は、したがって基底レベルより低い、または匹敵するＴＮＦ濃度の応答の２％より低い、好ましくは等価または最大ＴＮＦ応答の１％より少ない。
【０１０２】
本明細書に記載の抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインし、最大配列同一性パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後、保存的置換はいずれも配列同一性の一部とみなさず、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして規定される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するのに適切なパラメーターを決定することができる。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、用語「標的」または「標的抗原」と交換可能であり、全標的分子または抗体結合部位によって認識されるそのような分子の断片を指す。特に、抗原のサブ構造、例えば一般に「エピトープ」と呼ばれるポリペプチドまたは糖構造、例えば免疫関連のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープは、そのような結合部位によって認識され得る。ｈｕＴＮＦＲ１抗原は、ほとんどのヒト細胞の表面上の単量体または多量体サイトカイン受容体として、三量体ＴＮＦまたはＬＴαに特異的に結合することができる、受容体構造を含む抗原である。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、用語「ｈｕＴＮＦＲ１」は、ほとんどのヒト細胞上で一様に発現されるＣＤ１２０ａ  ＴＮＦＲ１（ｐ５５／６０、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ腫瘍ネクローシス因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ［ホモサピエンス（ヒト）］、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７１３２）受容体を指す。ｈｕＴＮＦＲ１の特定の代表的な配列は、配列番号３２として提供される。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、特に、抗体の結合部位に対して完全に特異的結合パートナーを構成するまたは特異的結合パートナーの一部であってよい分子構造を指す。エピトープは、糖、ペプチド構造、脂肪酸、有機物、生化学物質もしくは無機物、またはそれらの誘導体およびそれらの任意の組合せのいずれかから構成されてよい。エピトープがペプチド構造、例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に含まれる場合、通常少なくとも３アミノ酸、好ましくは５〜４０アミノ酸、より好ましくは約１０〜２０の間のアミノ酸を含む。エピトープは、線状または立体構造のいずれかのエピトープであり得る。線状エピトープは、ポリペプチドまたは糖の一次配列の単一セグメントから構成される。線状エピトープは、隣接またはオーバーラップし得る。
【０１０６】
立体構造エピトープは、ポリペプチドがフォールディングによって近づけられて三次構造を形成したアミノ酸または糖から構成され、アミノ酸は、線状配列において互いに必ずしも隣接しない。特に、ポリペプチド抗原に関して、立体構造または不連続エピトープは、一次配列中で離れるが、ポリペプチドがフォールドして天然のタンパク質／抗原になった場合、分子の表面上でアセンブルして統合された構造になった、２つまたはそれ以上の別々のアミノ酸残基の存在によって特徴付けられる。
【０１０７】
本明細書では、用語「エピトープ」は、特に、ｈｕＴＮＦＲ１に含まれるエピトープを指し、それは、膜遠位ＣＲＤ１およびｈｕＴＮＦＲ１のＣＤＲ２のサブドメインＡ１に組み込まれるエピトープである。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、核酸、抗体または他の化合物に関して用語「単離された」または「単離」は、自然に随伴していた環境から「実質的に純粋な」形態で存在するために、十分に分けられたそのような化合物を指す。「単離された」は、他の化合物もしくは材料との人工的もしくは合成混合物の除外、または基本の活性と干渉しない、例えば不完全な精製によって存在し得る不純物の存在の除外を必ずしも意味しない。
【０１０９】
ポリペプチドまたはタンパク質、例えば本明細書に記載の単離された抗体に関して、用語「単離された」は、特に、それらが自然状態で随伴する物質、例えばそれらの自然環境で、または調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施された組換えＤＮＡ技術による場合、それらがそのような調製がされる環境（例えば、細胞培養）で、それらと共に見出される他の化合物を含まないまたは実質的に含まない化合物を指す。単離された化合物は、希釈剤またはアジュバントと配合され、依然として実際的な目的のために単離されている、例えば、診断または治療で使用される場合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合され得る。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、「遺伝子工学な操作によって調製されたか、またはその結果」を意味する。組換え宿主は、特に、発現ベクターまたはクローニングベクターを含み、または特に宿主に外来のヌクレオチド配列を用いて組換え核酸配列を含有するように遺伝子工学的に操作されている。組換えタンパク質は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現させることによって産生される。
【０１１１】
本明細書にさらに記載される抗体は、組換え抗体であってよい。このため、本明細書で使用する場合、用語「組換え抗体」は、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマル（transchromosomal）である動物（例えばマウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーまたは抗体の抗原結合配列のライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングが関与する任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体などの組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体を含む。そのような組換え抗体は、例えば抗体成熟中に生じる再編成および変異を含むように工学的に操作された抗体を含む。本発明により、従来の分子生物学、微生物学、および当業者の範囲内の組換えＤＮＡ技術が用いられてよい。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)参照。
【０１１２】
本明細書に記載の抗体は、好ましくは、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔での発現により、または例えばＣＨＯ、ＨＥＫ、もしくはヒト産生宿主細胞系による、イーストもしくは哺乳動物など、真核細胞発現システムでの分泌タンパク質としての発現により、宿主細胞を用いる組換え発現システムによって産生される組換えタンパク質として提供される。
【０１１３】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体産生のために最も一般的に使用されている。好適なグリコシル化パターンの提供に加え、これらの細胞は遺伝的に安定な、高生産性のクローン細胞系の一貫した生成が可能である。これらは、無血清培地を使用する簡単なバイオリアクター中で高密度に培養され、安全および再生産可能なバイオプロセスの開発を可能にする。
【０１１４】
宿主細胞は、無血清条件下、および任意選択により動物起源の任意のタンパク質／ペプチドを含まない培地中で確立、適応、および完全に培養される場合、最も好ましい。
本明細書で使用する場合、「特異的」結合、認識または標的化は、結合剤、例えば抗体または抗体の抗原結合部位が、分子の異種集団における標的抗原またはそれぞれのエピトープに対する明らかな親和性を示すことを意味する。したがって、指定した条件（例えば、免疫アッセイ）下で、結合剤は標的抗原に特異的に結合し、試料中に存在する他の分子には有意な量で結合しない。特異的結合は、標的の同一性、または選択されるような高度、中度、もしくは低度の結合親和性または結合活性に関して結合が選択的であることを意味する。選択的結合は、通常、別の標的と比較して、結合定数または結合動態が少なくとも１０倍異なり（少なくとも１  ｌｏｇ差として理解される）、好ましくは差が少なくとも１００倍であり（少なくとも２  ｌｏｇ差として理解される）、より好ましくは少なくとも１０００倍である（少なくとも３  ｌｏｇ差として理解される）場合に達成される。差次的な結合は、免疫アッセイ、好ましくは免疫ブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法によって決定されてよい。特定の標的に対する抗体分子の特異性は、競合アッセイによって、例えばHarlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988に記載のように決定され得る。選択的結合は、当技術分野で公知の組換え抗体最適化方法によって、工学的に操作されるか、または改善され得る。例えば、本明細書に記載の免疫グロブリン鎖の可変領域の特定の領域は、選択されたＣＤＲまたはフレームワーク領域の軽鎖シャッフリング、部位指定変異誘発、ＣＤＲ融合、定方向変異誘発を含む１つまたはそれ以上の最適化戦略に供されてよい。
【０１１５】
用語「同じ特異性を有する」、「同じ結合部位を有する」または「同じエピトープを結合する」の使用は、同等なモノクローナル抗体が、同じまたは本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特性を示し、前選択された標的結合配列に対する結合と競合することを示す。特定の標的に対する抗体分子の相対的特異性は、例えば、Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988に記載される競合アッセイによって相対的に決定され得る。
【０１１６】
本明細書では、競合は、競合ＥＬＩＳＡ分析によりまたはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析により決定された場合、約３０％より大きな相対阻害を意味する。特定の状況において、例えば意図する抗原の結合機能を持つように設計された新規の抗体を選択またはスクリーニングするために競合分析が使用される場合、競合の好適なレベルの基準としてより高い相対阻害の閾値を設定することが望ましいことがある。したがって、抗体が十分に競合的であるとみなす前に、例えば少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはさらに少なくとも１００％の相対阻害が検出される場合に競合結合の基準を設定することが可能である。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、用語「患者」は、ヒトおよび他の哺乳動物対象を指す。特に、本明細書に記載の医学的使用またはそれぞれの処置の方法は、ＮＡＳＨまたはＮＡＳＨと関連する疾患状態の予防もしくは処置を必要とする対象に適用される。対象は、初期もしくは後期疾患を含む、ＮＡＳＨになるリスクのあるまたは罹患している患者であってよい。用語「患者」は、特に、予防処置および／または治療処置を受ける対象を含む。したがって、用語「処置」は、予防処置および治療処置の両方を含むことを意味する。
【０１１８】
特に、用語「治療」は、疾患を治癒するまたは疾患の症状を低減するための投与を包含することを意図する治療法を指す。
特に、用語「予防」は、防止法を指し、疾患発症、または疾患の再発のリスクを低減することを意図する。
【０１１９】
本明細書において、化合物、例えば本明細書に記載の抗体の用語「有効量」または「十分な量」のいずれかと交換可能に使用される用語「治療有効量」は、対象に投与した場合に有益または臨床結果を含む所望の結果を生じるのに十分な量または活性であり、したがって、有効量またはその同義語はそれが適用される状況に依存する。
【０１２０】
有効量は、そのような疾患または障害を処置、防止、または阻害するのに十分な化合物の量を意味するものとする。疾患に関して、治療有効量の本明細書に記載の抗体は、特に、ＴＮＦ−ＴＮＦＲ１相互作用の阻害が有益となる疾患または状態を処置、調節、減弱、反転し、またはそれに影響を及ぼすために使用される。
【０１２１】
そのような有効量に対応する化合物の量は、例えば、所与の薬物または化合物、医薬製剤、投与経路、疾患または障害の型、処置される対象または宿主の素性など、様々な因子に応じて変わるであろうが、それにもかかわらず当業者によって常法通りに決定され得る。
【０１２２】
本明細書にさらに記載するように、患者を処置する方法は、治療有効量の上記のｈｕＴＮＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む。典型的には、治療有効量は、０．５〜５００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇの範囲、さらにより好ましくは最高３００ｍｇ、最高２００ｍｇ、最高１００ｍｇまたは最高１０ｍｇであるが、例えば肥満患者または急性疾患状態を処置するためにはより高い用量が指定されてよい。
【０１２３】
本明細書に記載の好ましい医薬組成物は、治療有効量のｈｕＴＮＦＲ１抗体および任意選択により薬学的に許容される担体、薬学的に許容される塩、助剤、安定剤、希釈剤および溶媒、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたはそれ以上のさらなる成分を含む。
【０１２４】
一実施形態では、本明細書に記載の抗体は、患者に投与される治療活性剤のみである。あるいは、本明細書に記載の抗体は、限定はされないがＴＮＦアンタゴニスト、抗炎症剤、サイトカイン、増殖因子、または他の治療剤を含む、１つまたはそれ以上の他の治療剤と組み合わせて投与される。ＴＮＦＲ１アンタゴニスト抗体は、１つまたはそれ以上の他の治療レジメンと、好ましくは抗ＴＮＦ治療、例えば抗ＴＮＦ抗体と、同時にまたは連続して投与され得る。本明細書に記載の抗体は、抗ＴＮＦ治療が有効ではなかった場合に、急性または慢性処置のいずれかとして、好ましくは、第一選択処置として、または第二選択治療として患者に投与される。特に好ましい医学的使用は、慢性疾患の処置である。
【０１２５】
さらに、治療有効量の本明細書に記載の抗体による対象の処置または防止レジメンは、単回投与からなってよく、または代わりに一連の適用を含んでよい。例えば、抗体を少なくとも年に１回、少なくとも半年に１回、または少なくとも１ヵ月に１回投与することができる。しかし、別の実施形態では、抗体は、所与の処置のために約週１回から約１日１回の投与まで対象に投与され得る。処置期間の長さは、疾患の重症度、急性または慢性のいずれかの疾患、患者の年齢、抗体フォーマットの濃度および活性など、多様な因子に依存する。特定の処置または予防レジメンの過程にわたって処置または予防に用いる有効投与量を増加または減少させることができることも認識されるであろう。投与量の変更は、当技術分野で公知の標準的な診断アッセイにより得ることができ、明らかになる。いくつかの場合では、慢性投与が必要になることがある。
【０１２６】
「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」は肝臓疾患であり、アルコール消費量と関係せず、肝細胞の脂肪化（fatty change）によって特徴付けられ、小葉内の炎症および線維症を伴う。ＮＡＳＨは一般に、「サイレント」肝臓疾患であることが多い。それはアルコール性肝臓疾患に似ているが、アルコールをほとんど飲まないまたは飲まない人々に生じる。３つの主な性質がＮＡＳＨを特徴付け、代謝原因の他の肝臓疾患とそれを区別する：肝臓における異常な脂肪蓄積または堆積（脂肪肝）、肝臓炎症、および肝臓傷害または肝臓組織損傷（線維症）。
【０１２７】
ＮＡＳＨは、末期の肝臓疾患、肝硬変および肝細胞癌に進行する実質的なリスクを持つ深刻な状態である可能性がある。肝硬変を発症する患者の中には、肝臓損傷のリスクがあり、ついには肝臓移植を必要とすることがある。ＮＡＦＬＤは、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、脂肪変性（０〜３）、小葉の炎症（０〜２）、および肝細胞風船様変性（０〜２）の肝臓生検の病理組織学的スコアの合計によってＮＡＳＨから区別される。＜３のＮＡＳはＮＡＦＬＤに対応し、３〜４はボーダーラインのＮＡＳＨに対応し、＞５はＮＡＳＨに対応する。生検は、線維症に関してもスコア化（０〜４）される。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、ＮＡＳＨを罹患している患者は、ＮＡＳＨを有する、またはＮＡＳＨと診断された、またはＮＡＳＨを遺伝的に発生しやすい、または彼または彼女がメタボリックシンドローム、肥満、糖尿病または糖尿病予備軍を罹患しているためＮＡＳＨを発生しやすい可能性がある患者である。さらに他の実施形態では、ＮＡＳＨを罹患している患者は、試験され、彼または彼女がまだＮＡＳＨのいずれの身体的な症状も示していないかもしれない場合でさえも、ＮＡＳＨの臨床所見特徴（肝臓における脂肪の異常な蓄積、肝臓炎症および肝線維症）を示すことが見出された患者である。いくつかの例では、ＮＡＳＨを罹患している患者は、診断がまだなされていない場合でさえもＮＡＳＨの症状を示す。
【０１２９】
ＮＡＳＨの処置は、ＮＡＳＨの肝硬変への進行の減速または停止をもたらし得る。いくつかの処置レジメンは、ＮＡＳＨと関連する身体症状、または身体症状もしくは臨床症状もしくは臨床所見のセットの発症を遅延することを目的とする。いくつかの実施形態では、処置は、ＮＡＳＨの少なくとも１つの測定可能な身体症状、例えば体重減少、虚弱または疲労などの改善をもたらす。他の実施形態では、処置は、例えば異常な肝臓脂肪蓄積、生検によって決定された肝線維症、肝臓炎症、異常なレベルの肝臓酵素（例えばＡＬＴ）、異常なレベルの炎症性サイトカインまたはＮＡＳスコアなど、ＮＡＳＨの少なくとも１つの臨床指標または所見の改善をもたらす。他の実施形態では、処置は、例えば測定可能な症状または症状のセット（疲労、体重減少または虚弱など）の安定化により身体的に、または例えば肝臓における異常な脂肪蓄積、異常なレベルの肝臓酵素、異常なレベルの肝臓炎症マーカー、肝臓生検における異常な所見、ＮＡＳスコアなどの測定可能な指標の安定化により臨床的／生理学的にのいずれか、または両方でＮＡＳＨの進行の低減、阻害または減速をもたらす。別の実施形態では、処置は、疾患または障害がそれ自体完全に明らかになる前に、ＮＡＳＨの原因および／または効果もしくは臨床症状、またはＮＡＳＨの結果として発生した症状の１つの防止ももたらし得る。いくつかの実施形態では、処置は、ＮＡＳＨを有する患者の生存率または生存時間の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、処置は、ＮＡＳＨを有する患者の肝臓移植を必要とする可能性の低減をもたらす。他の実施形態では、処置は、ＮＡＳＨ患者の、肝臓移植を受ける必要性の排除をもたらす。他の実施形態では、それは、ＮＡＳＨを有する患者の肝硬変を発症する機会の低減をもたらす。他の実施形態では、それは、組織学によって決定されたように肝硬変への進行の防止をもたらす。
【０１３０】
本明細書に記載の特定の実施形態は、「モノクローナル」抗体（ｍＡｂ）を指す。モノクローナル抗体は、モノクローナル宿主細胞またはそれぞれの細胞系に抗体遺伝子をクローニングすることによって産生される。モノクローナル抗体は、例えば、組換え真核生物（哺乳動物または昆虫）または原核生物（細菌）宿主細胞を培養する、培養中の細胞系によって抗体分子を産生する任意の方法を使用して産生され得る。モノクローナル抗体を調製する好適な方法の例は、Kohler & Milstein (1975, Nature 256:495-497)のハイブリドーマ法およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001；およびBrodeur et al ., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51 -63）を含む。
【０１３１】
本明細書に記載の抗体は、ハイブリドーマ法を用いて同定され、または得られてよい。そのような方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターは、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発するように免疫される。あるいは、リンパ球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫され得る。次いでリンパ球は、好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを使用してミエローマ細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【０１３２】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原を指向するモノクローナル抗体の産生をアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降によって、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定される。
【０１３３】
次いで、モノクローナル抗体は、標的抗原のその特異的結合をさらに試験するため、および例えば異なる診断または治療目的のための抗体の工学的な操作のため、ハイブリドーマ上清から精製され得る。
【０１３４】
いくつかの例では、ｈｕＴＮＦＲ１特異的抗体は、ｈｕＴＮＦＲ１抗原に対するスクリーニングによって明らかになる。差次的に結合するクローンを単離する可能性を増加するため、異なる抗原またはエピトープに対して進化的にスクリーニングすることによって多重選択圧を適用する。
【０１３５】
所望の選択的結合特性を有する抗体を同定するためのスクリーニング方法は、ライブラリーディスプレイ抗体配列またはその抗原結合配列を使用するディスプレイ技術によって行われてよい（例えば、ファージ、細菌、酵母または哺乳動物細胞；または核酸情報をそれぞれの（ポリ）ペプチドに翻訳するｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイシステムを使用する）。反応性は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングまたはフローサイトメトリーを伴う表面染色に基づいて、例えば標準的なアッセイを使用して評価され得る。
【０１３６】
単離された抗体は、抗体ライブラリー、例えばファージ、ファージミドまたは酵母ディスプレイ抗体ライブラリーから抗体を選択するために使用され得る。
本明細書に記載の特定の実施形態は、「医薬組成物」に関し、そのような組成物は、本明細書に記載の抗体および薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含んでよく、特に人工的な、非自然発生の組成物を得る。これらの医薬組成物は、本発明に従ってボーラス注射もしくはボーラス注入として、または連続注入により投与され得る。そのような投与手段を容易にするのに好適な医薬担体は、当技術分野で周知である。
【０１３７】
薬学的に許容される担体は、通常、任意のおよび全ての好適な溶媒、分散培地、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤ならびに吸収遅延剤など、本明細書に記載の抗体または関連する組成物もしくは組合せと生理的に適合するものが含まれる。薬学的に許容される担体のさらなる例には、無菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらのいずれかの組合せが含まれる。
【０１３８】
そのような一態様では、抗体は、所望の投与経路に好適な１つまたはそれ以上の担体と組み合わせることができ、抗体は、例えば乳糖、ショ糖、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールのいずれかと混合され、任意選択により、従来の投与のためにさらに打錠またはカプセル封入することができる。あるいは、抗体は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム、および／または様々な緩衝液に溶解され得る。担体は、制御放出物質または時間遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル単独もしくはワックスとの併用、または当技術分野で周知の他の物質を含み得る。
【０１３９】
さらなる薬学的に許容される担体が当技術分野で公知であり、例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESに記載されている。液体製剤は、液剤、乳剤または懸濁液剤であってよく、懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤およびキレート化剤などの賦形剤を含み得る。
【０１４０】
本明細書に記載の抗体および１つまたはそれ以上の治療活性剤が配合された医薬組成物が検討される。本明細書に記載の抗体の安定製剤は、所望の純度を有する前記抗体を、場合により薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保管のため調製される。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は無菌である。これは、除菌濾過メンブレンによる濾過または他の方法によって容易に達成される。本明細書に開示する抗体および他の治療活性剤は、イムノリポソームとして製剤化し、および／またはマイクロカプセルに封入してもよい。
【０１４１】
本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳腔内、経皮、粘膜、局所、例えばゲル剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤など、腹腔内、筋肉内、例えば吸入技術もしくは肺送達システムを用いて肺内、膣内、非経口、直腸内、または眼内を含む様々な方法で行うことができる。
【０１４２】
非経口投与に使用される代表的な製剤は、皮下、筋肉内または静脈内注射に好適なもの、例えば無菌の液剤、乳剤または懸濁液剤を含む。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体は、例えば疾患修飾または防止のための単剤治療として対象に投与される唯一の治療活性剤である。
【０１４３】
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、例えば混合物またはキットの一部中でさらなる活性物質と組み合わされ、疾患修飾または防止併用治療などの治療または予防を必要とする対象を処置する。
【０１４４】
１つまたはそれ以上の他の治療剤または予防剤との組合せは、標準的な処置、例えば抗生物質、ステロイドおよび非ステロイドの炎症阻害剤、および／または他の抗体ベースの治療を含み得る。組合せは、炎症プロセスが二次炎症、変性または悪性疾患状態をもたらす、原疾患を処置するために使用される薬剤を特に含み得る。原疾患は、例えばＮＡＳＨであり、組合せは例えばＮＳＡＩＤまたは他の新規の薬剤、例えばＦＸＲアゴニスト、ＧＬＰ１Ｒアゴニスト、またはＰＰＡＲアゴニストを含む。
【０１４５】
組合せ治療では、抗体は混合物として、または１つまたはそれ以上の他の治療レジメンを併用して、例えば組合せ治療の前、同時または後に投与され得る。
本明細書に記載の抗体またはそれぞれの医薬調製物の生物学的特性は、細胞、組織、および全臓器実験においてｅｘ  ｖｉｖｏで特徴付けられ得る。当技術分野で公知のように、疾患または疾患モデルに対する処置の薬物の有効性を測定するため、または薬物の薬物動態、薬力学、毒性、および他の特性を測定するために、薬物は、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含む動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで試験されることが多い。動物は疾患モデルと呼ばれる。治療は、限定はされないが、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植片マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むマウスにおいて試験されることが多い。そのような実験は、受動免疫治療時に適切な半減期、エフェクター機能、阻害剤活性および／または免疫応答により治療用としてまたは予防用として使用される抗体の能力の決定のために有意義なデータを提供することができる。任意の生物、好ましくは哺乳動物は、試験のために使用され得る。例えば、そのヒトとの遺伝的類似性のため、霊長類、サルは好適な治療モデルであり、したがって、有効性、毒性、薬物動態、薬力学、半減期、または対象の薬剤もしくは組成物の他の特性を試験するために使用され得る。ヒトでの試験は、薬物としての認可のために最終的に必要であり、したがってもちろん、これらの実験は考慮される。したがって、本明細書に記載の抗体およびそれぞれの医薬組成物はヒトで試験され、それらの治療または予防有効性、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床特性を決定され得る。
【０１４６】
したがって、本発明は、ＮＡＳＨ、特にＮＡＳＨと関連するこれらの疾患状態の処置の新規の方法を提供する。マウスモデルにおいて示したように、抗ＴＮＦＲ１抗体が、脂肪肝およびＮＡＳＨの組織学的疾患活動性を著しく改善していたことは驚きであった。ＴＮＦＲ１阻害は、脂肪肝およびトリグリセリド含量のパーセンテージの著しい低減をもたらした。さらに、脂肪変性、風船様変性、および小葉の炎症を検討するＮＡＦＬＤ活動性スコアは、抗ＴＮＦＲ１抗体処置によって著しく減少された。選択的ＴＮＦＲ１阻害が、ＮＡＦＬＤマウスモデルの肝線維症を改善しており、肝臓組織における線維症を低減することによって肝線維症を処置することさえもできたことは予想外であった。抗ＴＮＦＲ１抗体処置が、肝臓組織においてアポトーシスを低減できたことがさらに示された。さらに、ＡＬＴおよびインシュリン血清レベルの著しい低減が達成された。したがって、抗ＴＮＦＲ１抗体による処置は、ＮＡＦＬＤにおける炎症およびインシュリン耐性の著しい改善をもたらした。
【０１４７】
ＮＡＳＨまたは脂肪変性の発症はＴＮＦｉ治療の副作用として報告されていたため、先行技術を考慮して、抗ＴＮＦＲ１抗体が、ＮＡＳＨでの脂肪肝および組織学的疾患活動性を著しく改善することは特に驚きであった。Feagins et al.は、インフリキシマブ、アダリムマブまたはエタネルセプトのいずれかによって処置されたクローン病、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎の患者が、ＴＮＦｉ処置中に異常なＡＬＴレベルを発生し、肝臓生検にＮＡＦＬＤ（ＮＡＳＨまたは脂肪症）を示したことを報告した（Eur J Gastroenterol Hepatol. 2015, 27(10):1154-1160）。したがって、ＴＮＦＲ１の選択的阻害がＮＡＳＨに対して有効であることは非常に予想外であった。
【０１４８】
本明細書に記載の代表的な抗体は、例えばＷＯ２０１２０３５１４１によって産生された全長抗体、および／またはＷＯ２００８１１３５１５Ａ２に記載のその親マウス抗体Ｈ３９８、親和性成熟の機能的に活性なバリアントおよび／または前述のいずれかの抗体断片、または一価の抗ｈｕＴＮＦＲ１結合剤であり、ＷＯ２０１７１７４５８６Ａ１に記載の一価の抗体などの前述のいずれかの抗原結合部位を含むこれらの抗体である。
【０１４９】
本発明は、それに限定されないいが以下の実施例によってさらに示される。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
実験的ＮＡＦＬＤを有するマウスにおける脂肪肝および組織学的疾患活動性の改善
方法：
Ｂ６−ｈｕＴＮＦＲ１−ｋ／ｉマウスは、飲用水中、６０％  ｋｃａｌ脂肪＋フルクトース／サッカロースからなる高脂肪食（ＨＦＤ）を２４週間受け（Kohli R et al., Hepatology 2010）、さらに８週間、抗ＴＮＦＲ１（Ａｔｒｏｓａｂ）またはコントロール抗体（セツキシマブ、抗ＥＧＦＲ抗体、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂｕｎｄ  Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）処置（２０ｍｇ／ｋｇ体重、２ｘ／ｗ）のいずれかによって補完された。
【０１５１】
本明細書で使用するＡｔｒｏｓａｂ抗体は、ＷＯ２０１２０３５１４１に従って産生された全長抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインの組合せに組み込まれた抗原結合部位を含み、６つのＣＤＲ配列を含み、それらは：
配列番号２３：ＶＨ−ＣＤＲ１
配列番号２４：ＶＨ−ＣＤＲ２
配列番号２５：ＶＨ−ＣＤＲ３
配列番号２６：ＶＬ−ＣＤＲ１
配列番号２７：ＶＬ−ＣＤＲ２
配列番号２８：ＶＬ−ＣＤＲ３
である。
【０１５２】
処置の最後に、差次的に処置されたマウスからの肝臓組織は、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ活動性スコア、アポトーシスおよび線維症を比較された。
Kleiner et al. (Hepatology 2005)により、脂肪変性のパーセンテージならびにＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）が、病理医によって評価された。トリグリセリド含量は、酵素試験（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することによって、ホモジナイズした肝臓組織において決定された。アポトーシスは、活性化カスパーゼ３に対する抗体を使用する免疫組織化学によって調べられた（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。線維症は、製造業者（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）のプロトコールに従ってＳｉｒｕｓ  Ｒｅｄ染色によって検出され、記載されたように定量された（Schindelin J et al., Nat Methods 2012）。
【０１５３】
血清は、動的ＵＶ試験（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってＡＬＴレベル分析され、インシュリンレベルは製造業者の指示に従って、超高感度マウスインシュリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ．）を使用して測定された。
【０１５４】
結果：
Ａｔｒｏｓａｂ処置は、実験的ＮＡＦＬＤを有するマウスにおいて、脂肪肝および組織学的疾患活動性の著しい改善をもたらした。
【０１５５】
抗ＴＮＦＲ１抗体（Ａｔｒｏｓａｂ）またはコントロール（セツキシマブ）抗体によって処置されたＨＦＤマウスの肝臓組織は、脂肪肝、トリグリセリド含量およびＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）によって評価された疾患活動性のパーセンテージを組織学的に分析された。コントロール抗体によって処置されたマウスと比較して、ＴＮＦＲ１阻害は、脂肪肝（ｐ＜０．０５；図１Ａ）ならびにトリグリセリド含量（ｐ＜０．０１；図１Ｂ）のパーセンテージの著しい低減をもたらした。さらに、脂肪変性、風船様変性、および小葉の炎症を検討するＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）は、コントロールマウスと比較してＡｔｒｏｓａｂ処置マウスで著しく（ｐ＜０．０５）減少した（図１Ｃ）。
【０１５６】
実施例２
選択的ＴＮＦＲ１阻害は、ＮＡＦＬＤマウスモデルの肝線維症の改善と関係する
選択的ＴＮＦＲ１阻害が脂肪肝およびＮＡＳを改善することが実証されると、線維症低減へのＡｔｒｏｓａｂの効果が分析された。コントロール抗体によって処置されたマウスと比較して抗ＴＮＦＲ１抗体によって処置されたマウスにおいて、肝線維症の改善が実証され、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色によって評価された（図２Ａ）。線維化領域の定量は、コントロールマウスと比較して抗ＴＮＦＲ１抗体によって処置されたマウスからの肝臓組織において著しい（ｐ＜０．０５）線維症の低減を明らかにした（図２Ｂ）。
【０１５７】
実施例３
抗ＴＮＦＲ１抗体によって処置されたＮＡＦＬＤマウスの肝臓組織におけるアポトーシスの低減
最初の実験では、マウスは、抗ＴＮＦＲ１抗体またはコントロール抗体のいずれかによる４週間の処置を含む２０週間ＨＦＤを受けた。抗ＴＮＦＲ１抗体処置は、４週間の処置期間内にすでに、活性カスパーゼ３の免疫組織学分析によって評価された、アポトーシスを低減できることが実証された。コントロール抗体と比較して、抗ＴＮＦＲ１抗体によって処置されたマウスの肝臓組織で、活性カスパーゼ３の著しい（ｐ＜０．０５）低減が観察できた。（図３）
実施例４
抗ＴＮＦＲ１抗体によって処置されたＮＡＦＬＤマウスの血清におけるＡＬＴおよびインシュリンレベルの改善
抗ＴＮＦＲ１抗体によって処置されたマウスの組織学的な改善の観察に則して（図１および図２）、コントロール抗体によって処置されたマウスと比較して抗ＴＮＦＲ１抗体によって処置されたマウスのＡＬＴ（図４Ａ）およびインシュリン血清レベル（図４Ｂ）の著しい（ｐ＜０．０５）低減が実証された。したがって、選択的抗ＴＮＦＲ１阻害は、炎症およびインシュリン耐性の著しい改善をもたらした。
【０１５８】
実施例５
Ａｔｒｏｓｉｍａｂの説明−産生および特徴付け
材料
Ａｔｒｏｓａｂ抗体は、実施例１に記載のように得られた。組換えヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＷＯ２０１２０３５１４１に記載のように産生された。Ａｔｒｏｓｉｍａｂ（ＨＣ：配列番号１８；ＬＣ：配列番号１３）は、Ｃａｔａｌｅｎｔ（Ｃａｔａｌｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、Ｅｗｉｎｇ、ＮＪ、ＵＳ）によるＣＨＯ細胞へのレンチウイルス形質導入後に産生および精製された。抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（ＨＩＳ−６  Ｈｉｓ−Ｐｒｏｂｅ−ＨＲＰ、ｓｃ−８０３６）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入された。抗ヒトＩｇＧ  Ａ（ヤギ、ポリクローナル、２０１０−０１）は、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈから得られ、抗ヒトＩｇＧ  Ｂ（ヤギ、ポリクローナル、ＭＢＳ５７１１６３）ならびに抗ヒトＩｇＧ  Ｂ（ヤギ、ポリクローナル、ＭＢＳ５７１６７８）はＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得られた。さらに、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的、Ａ  ０２９３）および抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的、Ａ  ０１７０）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。
【０１５９】
タンパク質産生
参照タンパク質Ｆａｂ１３．７は、ポリエチレンイミン（線状、２５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｅ細胞においてＷＯ２０１７１７４５８６Ａ１に記載のように産生され、製造業者に推奨されるように厳密にタンパク質親和性クロマトグラフィーによって精製された（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ−ＣＨ１  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ、１９４３２０００５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１６０】
タンパク質特徴付け
Ａｔｒｏｓｉｍａｂの純度および正確なアセンブリは、還元剤としてベータ−メルカプトエタノールの存在下および不在下で、４μｇの精製タンパク質を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。ゲル中のタンパク質は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅを使用して染色され、ゲルは水で脱染色された。インタクトなタンパク質は、Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  ＨＰＬＣおよびＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｙａｒｒａ  ＳＥＣ−２０００カラム（３００×７．８ｍｍ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって分析された。標準タンパク質：チログロブリン（６６９ｋＤａ）、アポフェリチン（４４３ｋＤａ）、アルコール脱水素酵素（１５０ｋＤａ）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）、ＦＬＡＧペプチド（１ｋＤａ）。
【０１６１】
熱安定性
Ａｔｒｏｓｉｍａｂの融解／凝集温度（Ｔｍ）は、ＰＢＳ中１００μｇの精製タンパク質を使用して動的光散乱法（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｈｅｒｒｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって決定された。適用した温度は、各測定の前に２分間の平衡化時間により、３５℃から８０℃まで１℃間隔で上げられた。Ｔｍは、増加するシグナルの視覚的解釈によって決定された（ｋｃｐｓ）。
【０１６２】
血漿安定性
精製されたＡｔｒｏｓｉｍａｂの試料は、１００ｎＭの濃度にヒト血漿中で希釈され、１、３および７日間３７℃でインキュベートされた。ヒトＴＮＦＲ１への残存する結合能力の次の分析は、１〜３．１６（１０の平方根）の段階によりＰＢＳ中２％スキムミルク（２％  ＭＰＢＳ）で段階希釈後にＥＬＩＳＡによって実施された。コントロール試料は、７日間ＰＢＳ中４℃でインキュベートされ、またはヒト血漿中での希釈後直接凍結された。
【０１６３】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
マイクロタイタープレートは、１００μｌのＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）でコートされ、４℃で終夜インキュベートされた。残りの結合部位は、室温で２時間、２％ＭＰＢＳ（ＰＢＳ中スキムミルク、ウェルあたり２００μｌ）でブロックされ、続いてＰＢＳで２回洗浄された。２％ＭＰＢＳ中で希釈した１００μｌの試料は、１００μｌの２％ＭＰＢＳ中ＨＲＰコンジュゲート検出抗体との最終インキュベーション段階の前に室温で１時間インキュベートされた。結合したタンパク質は、１００μｌ  ＴＭＢ基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン［ＴＭＢ］、１００ｍＭ  酢酸Ｎａ緩衝液中０．００６％  Ｈ２Ｏ２、室温でｐＨ６）で検出され、ＨＲＰ反応は５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止され、４５０ｎｍの波長での吸光度がＩｎｆｉｎｉｔｅマイクロタイタープレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定された。各インキュベーションステップの間および検出に先立ち、プレートはＰＢＳＴで２回、ＰＢＳで２回洗浄された。
【０１６４】
水晶振動子マイクロバランスを使用する親和性測定
タンパク質−タンパク質相互作用のリアルタイム結合動態は、水晶振動子マイクロバランス測定（Ｃｅｌｌ−２００  Ｃ−Ｆａｓｔ、Ａｔｔａｎａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって決定された。結合パートナー（ＴＮＦＲ１−Ｆｃ）の１つは、およそ９４ΔＨｚの適度な密度で、製造業者のプロトコールに従ってＬＮＢ  Ｃａｒｂｏｘｙｌ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（３６２３−３１０３、Ａｔｔａｎａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）上に化学的に固定化された。結合実験は、３７℃で２５μｌ／分の流速により、ｐＨ７．４の１２８ｎＭと４ｎＭの間（１：２希釈ステップ）にＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈された試料（分析物）によって実施された。チップは、２５μｌの２０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０で再生された。３回の測定ごとに、ランニング緩衝液の注射が測定され、データ分析の前に結合曲線から引かれた。データは、Ａｔｔａｎａによって提供されるソフトウェアを使用して回収され、Ａｔｔａｃｈｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｔｔａｎａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＴｒａｃｅＤｒａｗｅ（ｒｉｄｇｖｉｅｗ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖａｎｇｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって分析された。
【０１６５】
インターロイキン放出アッセイ
ウェルあたり２×１０４個のＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、１００μｌのＲＰＭＩ１６４０＋５％  ＦＣＳ中で終夜増殖させた。次の日、恒常的に産生されたサイトカインを除去するため、上清が交換された。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＣＳ中の希釈系列の試料とインキュベートされた。競合実験の場合、両方の分析したタンパク質試料は個々に調製され（単一濃度に滴定または希釈される）、続いてプレートに添加された。非刺激細胞はコントロールとして寄与した。１６〜２０時間後、プレートは５００ｇで５分間遠心分離され、細胞上清は、製造業者のプロトコールに従って実施されたＥＬＩＳＡによって直接分析された。上清はＲＰＭＩ１６４０（ＦＣＳ無し）で希釈され、抗体はＲｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（０．１％ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で希釈された。コートしたマイクロタイタープレートは、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用してブロックされ、洗浄ならびに検出および測定がＥＬＩＳＡについて上記のように実施された。細胞培養上清中のＩＬ−６およびＩＬ−８の検出のためのサンドウィッチＥＬＩＳＡキットは、ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ（Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。
【０１６６】
細胞傷害性／細胞生存率アッセイ
細胞（ウェルあたり１×１０４個）は、９６ウェルマイクロタイタープレートに播種され、３７℃および５％ＣＯ２で終夜インキュベートされた。タンパク質は、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ中で希釈され、細胞に添加された。細胞傷害性アッセイは、上清が廃棄され、５０μｌのクリスタルバイオレット溶液がウェルに添加される前に２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた。続いて、プレートは２０回ｄｄＨ２Ｏで洗浄され、乾燥された。染色溶液中に含有されるメタノールによって固定化された生存および接着細胞から生じる残存するバイオレット色素は、１０分間室温での振盪時に１００μｌのメタノールの添加によって溶解された。プレートはＩｎｆｉｎｉｔｅマイクロタイタープレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定された。
【０１６７】
薬物動態
特定のマウス遺伝子の遺伝子座にヒトＴＮＦＲ−１の細胞外ドメインの遺伝子を担持するトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/izi, Dong et al., 2016）は、４００μｇのＡｔｒｏｓｉｍａｂの静脈内注射を受けた。血液試料は、３分、３０分、１時間、２時間および６時間ならびに３日および７日後に採取され、すぐに氷上でインキュベートされた。血清は、遠心分離（１３．０００ｇ、４℃、１０分）によって分離され、−２０℃で保存された。血清中に残存するタンパク質は、上記のように結合ＥＬＩＳＡによって検出された。ＥＬＩＳＡシグナルは、分析したタンパク質の新しく作製した標準結合曲線から補間された。決定された濃度は、時間に対してプロットされ、薬物動態定数はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌのＰＫｓｏｌｖｅｒ  ａｄｄ−ｉｎを使用する分析で得られた。
【０１６８】
実施例５．１：Ａｔｒｏｓｉｍａｂの生化学特徴付け
Ａｔｒｏｓｉｍａｂと名付けられた、一価の腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）受容体１（ＴＮＦＲ１）−特異的アンタゴニストは、ヘテロ二量体化Ｆｃ分子Ｆｃ１ｋ（ワン／カッパ）のＮ末端にＦａｂ１３．７の可変ドメインを融合することによって生成された。このプロセスは、血清循環の延長を可能にするため、新生児期のＦｃ受容体と相互作用する能力を備えた、サイズの増加したＦａｂ様一価の分子を生じた（図６ａ）。生じる薬物候補Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、数回のレンチウイルス形質導入後にＣＨＯ細胞で産生され、Ｃａｔａｌｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｃａｔａｌｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、Ｅｗｉｎｇ、ＮＪ、ＵＳ）によるプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーおよび連続サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製された。
【０１６９】
Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、８１ｋＤａの補間分子量および３．５ｎｍのストークス半径ｒｓによって、保持時間１７．９分でＳＥＣにおいて単一のピークを示した（図６ｂ）。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、３８ｋＤａと４３ｋＤａの２つのバンドが検出され、非還元条件下では７０ｋＤａの１つのバンドが検出された（図６ｃ）。これらのデータは、７２ｋＤａの算出された分子量によく対応し（３５ｋＤａ鎖と３６ｋＤａ鎖から構成される）、両ポリペプチド鎖の適切な発現および機能性ヘテロ二量体タンパク質の正確なアセンブリを示す。さらに、Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、動的光散乱によって決定されたよう６４℃の凝集点（Ｔｍ）を示し（ＤＬＳ、図６ｄ）、それはＤＬＳによって分析されたインタクトなＩｇＧ分子のものに匹敵する（Martin et al., 2014, Brader et al., 2015）。最終的に、ヒトＴＮＦＲ１−ＦｃへのＡｔｒｏｓｉｍａｂの結合活性は、最高７日間のヒト血漿でのインキュベーション後変更されないままであり、良好な血漿安定性を示した（図６ｅ）。
【０１７０】
実施例５．２：ＡｔｒｏｓｉｍａｂのＴＮＦＲ１、Ｆｃγ受容体および補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合
Ａｔｒｏｓｉｍａｂのその標的受容体ＴＮＦＲ１との相互作用は、平衡条件下でＥＬＩＳＡによって分析され、０．４ｎＭのＥＣ５０値を生じ（図７ａ）、親Ｆａｂ１３．７と比較した場合、結合活性の２分の１の低減を表し、二価のＩｇＧ  ＡＴＲＯＳＡＢと比較して４分の１の低減を示した。さらに、Ａｔｒｏｓｉｍａｂは水晶振動子マイクロバランスを使用するリアルタイム結合試験においてヒトＴＮＦＲ１に結合し、およそ９４ΔＨｚの中程度の受容体密度で固定化され、１：１結合アルゴリズムによって分析されたように２．７ｎＭの明らかなＫＤ値、および３．７×１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎおよび９．８×１０−４ｓ−１のｋｏｆｆであった（図７ｂ）。注目すべきことに、Ａｔｒｏｓｉｍａｂは抗体媒介エフェクター機能を低減するように改変されるＦｃ領域を含む（Armour et al., 1999）。したがって、Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、ＥＬＩＳＡによって実証されたように、ヒトＦｃγ受容体Ｉａ、ＩＩｂおよびＩＩＩａならびに補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合のほぼ完全な欠如を示した（図７ｃ）。Ｆｃγ受容体およびＣ１ｑ結合に関して同一のＦｃ改変を保有する、前述の抗ヒトＴＮＦＲ１  ＩｇＧ  ＡＴＲＯＳＡＢ（Zettlitz et al., 2010）と比較した場合、結合は、同程度（ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩ）またはより明白（ＦｃγＲＩＩｂおよびＣ１ｑ）に低減した。
【０１７１】
実施例５．３：Ａｔｒｏｓｉｍａｂはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＮＦＲ１活性化を阻害し、任意のアゴニスト活性を欠如する
Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、ＩＬ−６を分析するためのＨｅＬａ細胞およびＩＬ−８のためのＨＴ１０８０細胞を使用する、インターロイキン（ＩＬ）放出実験、ならびにＫｙｍ−１細胞を使用する細胞死誘導アッセイにおいて、５０ｐＭと５００ｎＭの間の分析した濃度範囲内での任意のアゴニスト生物活性の完全な不在を明らかにした（図３ａ−ｃ）。アゴニズムの同一の欠如は、親Ｆａｂ１３．７の場合に検出された。対照的に、二価のＩｇＧ  ＡＴＲＯＳＡＢは、１ｎＭと１００ｎＭの間の濃度でＩＬ−６およびＩＬ−８のわずかな放出を誘導し（図８ａおよびｂ）、以前に報告されたデータを確認した（Richter et al., 2013）。対照的に、ＡＴＲＯＳＡＢのわずかなアゴニスト活性は、Ｋｙｍ−１細胞死誘導アッセイで検出できなかった（図８ｃ）。
【０１７２】
さらに、Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、ＨｅＬａ  ＩＬ−６放出アッセイおよびＨＴ１０８０  ＩＬ−８放出アッセイにおいて０．１ｎＭ  ＴＮＦによって誘導されたＴＮＦＲ１の活性化を阻害し、それぞれ５４．５ｎＭおよび２４．２ｎＭのＥＣ５０値であった（図８ｄおよびｅ）。さらに、Ｋｙｍ−１細胞において０．１ｎＭ  ＴＮＦによって誘導される細胞死は、１６．２ｎＭのＩＣ５０値でＡｔｒｏｓｉｍａｂによって阻害された（図８ｆ）。親Ｆａｂ１３．７と比較した場合、これらのデータは生物活性の１．５倍から１．９倍の低減を示す（表１）。しかしながら、二価のＩｇＧ  ＡＴＲＯＳＡＢの生物活性と比較して、Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、それぞれＩＬ−６放出アッセイ、ＩＬ−８放出アッセイおよび細胞死誘導アッセイにおいて決定されたように、ＴＮＦ媒介ＴＮＦＲ１活性化の３．０倍、３．５倍および４．０倍より強力な阻害を実証した（表１）
【０１７３】
【表１】
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【０１７４】
例えば抗薬物抗体（ＡＤＡ）によって媒介される、Ａｔｒｏｓｉｍａｂの二次的な架橋の潜在的リスクに対処するため、Ａｔｒｏｓｉｍａｂのアゴニスト性能は、ＨＴ１０８０細胞を使用するＩＬ−８放出アッセイにおける３つの異なるマウス抗ヒトＩｇＧ血清の存在下で分析された（Richter et al. 2013）。マウス抗ヒトＩｇＧ血清のＡｔｒｏｓｉｍａｂ、Ｆａｂ１３．７およびＡＴＲＯＳＡＢへの結合はＥＬＩＳＡによって実証された（データは示さない）。特に、Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、分析した濃度範囲（５０ｐＭから５００ｎＭ）内でのＩＬ−８のいずれの放出も誘導せず、これは親Ｆａｂ１３．７でも観察された（図９ａ−ｃ）。対照的に、図８で観察されたわずかな放出と比較した場合、二価のＩｇＧ  ＡＴＲＯＳＡＢは明確に増加したＩＬ−８の放出を誘導し（図９ａ−ｃ）、ＡＴＲＯＳＡＢと比較した場合、薬物特異的抗体の存在下でさえも、ＴＮＦＲ１の任意の活性化を媒介するＡｔｒｏｓｉｍａｂの明らかに低減した傾向を示した。
【０１７５】
実施例５．４：Ａｔｒｏｓｉｍａｂの薬物動態
最終的に、Ａｔｒｏｓｉｍａｂの薬物動態特性は、ヒトＴＮＦＲ１の細胞外ドメインの導入遺伝子を保有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｈｕＴＮＦＲＳＦ１Ａｅｃｄｔｍ１ＵＥＧ／ｉｚｉ（Dong et al., 2016）マウスを使用する４００μｇのタンパク質のボーラス注射後に記録された（図１０、表２）。Ａｔｒｏｓｉｍａｂは、２．２±１．２時間の初期の半減期と４１．８±１８．１時間の末期の半減期でマウス循環から排除され、５８５６.０±１３６９．９μｇ／ｍｌ×ｈの曲線下面積をもたらす。
【０１７６】
【表２】
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【０１７７】
参照
Armour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24.
Brader ML, Estey T, Bai S, Alston RW, Lucas KK, Lantz S, Landsman P, Maloney KM. Examination of thermal unfolding and aggregation profiles of a series of developable therapeutic monoclonal antibodies. Mol Pharm. 2015 Apr 6;12(4):1005-17. doi: 10.1021/mp400666b.
Dong Y, Fischer R, Naude PJ, Maier O, Nyakas C, Duffey M, Van der Zee EA, Dekens D, Douwenga W, Herrmann A, Guenzi E, Kontermann RE, Pfizenmaier K, Eisel UL. Essential protective role of tumor necrosis factor receptor 2 in neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 2016; 113:12304-9; PMID:27791020; https://doi.org:10.1073/pnas.1605195113
Martin N, Ma D, Herbet A, Boquet D, Winnik FM, Tribet C. Prevention of thermally induced aggregation of IgG antibodies by noncovalent interaction with poly(acrylate) derivatives. Biomacromolecules. 2014 Aug 11;15(8):2952-62. doi: 10.1021/bm5005756.
Zettlitz KA, Lorenz V, Landauer K, Munkel S, Herrmann A, Scheurich P, Pfizenmaier K, Kontermann R. ATROSAB, a humanized antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor one-specific antibody. MAbs. 2010 Nov-Dec;2(6):639-47. Epub 2010 Nov 1. 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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