(57)【要約】  ヒトインスリンアナログのコドン最適化前駆体遺伝子およびシグナルペプチド遺伝子の核酸分子が提供される。核酸分子は、融合インスリンアナログの前駆体をコードする核酸分子、および酵母分泌シグナルペプチドα因子をコードする核酸分子を含む。核酸分子は、ピキア・パストリスにおけるインスリンアナログの前駆体の発現を改善し、ヒトインスリンアナログの生産コストを低減する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
５’−（ＰＳ）ａ−（ＳＰ）ｂ−（ＬＳ）ｃ−ＧＥ−（Ｐ’Ｓ）ｄ−３’
［式中、
ＰＳはプロセシング部位をコードする核酸分子であり、ａは０または１であり；
ＳＰはシグナルペプチドをコードする核酸分子であり、ｂは０または１であり；
ＬＳはスペーサーペプチドをコードする核酸分子であり、ｃは０または１であり；
ＧＥは関心のポリペプチドをコードする核酸分子であり；
Ｐ’Ｓはプロセシング部位をコードする核酸分子であり、ｄは０または１であり：
シグナルペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１で示される配列を含む］
で示される分子または構造を含む核酸分子。
【請求項２】
一般式：
５’−（ＰＳ）ａ−（ＳＰ）ｂ−（ＬＳ）ｃ−ＧＥ−（Ｐ’Ｓ）ｄ−３’
［式中、
ＰＳはプロセシング部位をコードする核酸分子であり、ａは０または１であり；
ＳＰはシグナルペプチドをコードする核酸分子であり、ｂは１であり；
ＬＳはスペーサーペプチドをコードする核酸分子であり、ｃは０または１であり；
ＧＥはヒトインスリンアナログ前駆体ポリペプチドをコードする核酸分子であり；
Ｐ’Ｓはプロセシング部位をコードする核酸分子であり、ｄは０または１であり；
ヒトインスリンアナログ前駆体ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号３で示される配列を含む］
で示される分子または構造を含む核酸分子。
【請求項３】
関心のポリペプチドがヒトインスリンアナログ前駆体であり、ヒトインスリンアナログ前駆体をコードする核酸分子が、配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含み、好ましくは配列番号３で示される核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
シグナルペプチドをコードする核酸分子が、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含み、好ましくは配列番号１または配列番号１２で示される核酸配列を含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
ヒトインスリンアナログ前駆体をコードする核酸分子が、配列番号３の位置８８〜９６において置換を含み、好ましくはＧＣＣＧＣＴＡＡＧ、ＧＣＴＧＣＣＡＡＧ、ＧＣＴＧＣＴＡＡＡまたはＧＣＣＧＣＣＡＡＧで置換されている、請求項２〜４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６】
スペーサーペプチドのアミノ酸配列がＥＥＧＥＰＫ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ）を含み、好ましくは、スペーサーペプチドをコードする核酸分子が配列番号５で示される配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１３および配列番号１５からなる群から選択される任意の１つを含むか、配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１３および配列番号１５からなる群から選択される任意の１つからなる、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８】
プロセシング部位が制限酵素部位であり、好ましくは、ＰＳがＥｃｏＲ Ｉ制限酵素部位をコードする核酸分子であり、および／またはＰ’ＳがＮｏｔ Ｉ制限酵素部位をコードする核酸分子である、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子を含む、好ましくは真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターである、ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子および／または請求項９に記載のベクターを含む、好ましくは酵母、より好ましくはピキア・パストリス（Pichia Pastoris）である、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子、請求項９に記載のベクターおよび／または請求項１０に記載の宿主細胞を使用することを含む、ヒトインスリンアナログを生産する方法。
【請求項１２】
１）ヒトインスリンアナログ前駆体を発現させるステップ；および
２）ステップ１）で得たヒトインスリンアナログ前駆体を酵素分解することにより、ヒトインスリンアナログを得るステップ
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトインスリンアナログが、Ｂ３０を欠失するヒトインスリンであり、および／またはヒトインスリンアナログがさらにアシル化基で置換され、好ましくは位置Ｂ２９のリジンがアシル化基で置換され、より好ましくは置換による生成物が、リジンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン脂肪二酸−Ｌ−リジン−Ｎε−オキソブチリル））デス（Ｂ３０）ヒトインスリンである、請求項１１または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コドン最適化ヒトインスリンアナログ前駆体遺伝子およびコドン最適化α因子シグナルペプチド遺伝子に関し、ヒトインスリンアナログ前駆体遺伝子を発現する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインスリンは、５１アミノ酸からなるポリペプチドで、Ａ鎖およびＢ鎖の２つの鎖を含む。インスリンの主な作用は、グルコース代謝を調節することである。糖尿病の治療法の１つまたは糖尿病の補助的治療法として、インスリン治療介入は最も直接的かつ効果的な方法である。インスリンはまた、脂肪合成の促進、脂肪分解の抑制、およびケトン体生成の低減の作用を示し、それによって、インスリンが関連するケトーシスおよびアシドーシスのさまざまな症状を改善するために用いられる。
【０００３】
インスリンは過去にはブタ、ウシおよび他の動物の膵臓から抽出されたが、そのような産物はヒトインスリンとは構造的に異なり、したがって免疫原性を有する。１９８０年代初期および中期にヒトインスリン生産のための遺伝子組換え技術がEli Lilly & Co. USAおよびNovo Nordisk Denmarkによって相次いで開発されたので、ヒトインスリンおよびそのアナログを遺伝子発現させることが、産業上の主要な手段となっている。しかしながら、これは、インスリンの効果持続が短時間であるゆえに、ヒトインスリンの注射を頻繁に受ける必要のある患者にとって非常に不便である。したがって、ヒトにおいて長時間効果を持続するインスリンアナログおよび誘導体を得る努力がなされている。なかでも、ヒトインスリンまたはそのアナログのアシル化基による改変は、その半減期を延長するのに有効な方法である。ヒトインスリンアナログがＷＯ２０１８０２４１８６に開示され、ここでは、位置Ｂ２９が長鎖脂肪酸で置換され、位置Ｂ３０のアミノ酸が欠失しており、ヒトインスリンアナログの構造および生物学的活性が開示されている。位置２９に１４−アシル側鎖が結合し、位置Ｂ３０のアミノ酸を欠失するインスリンアナログ、およびその製造が、ＷＯ９５０７９３１に開示されている。位置Ｂ２９がグルタミン酸および長鎖脂肪酸で置換され、位置Ｂ３０のアミノ酸を欠失するヒトインスリンアナログが、ＷＯ２００５０１２３４７に開示されている。ヒトインスリンおよびそのアナログの発現のために現在最も一般的に用いられる発現系は、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia Pastoris）であり、そのなかで、大腸菌においてヒトインスリンおよびそのアナログは包接体の形態で発現され、包接体の分解および復元が必要であり、そのため方法は煩瑣で収率も低い；サッカロミセス・セレビシエおよびピキア・パストリスは、取り扱いの容易さ、培養の容易さ、異種タンパク質の改変、分泌発現能を有すること等の理由で都合がよい。しかしながら、サッカロミセス・セレビシエの分泌効率は低く、発現用の株は安定でない。これに対し、ピキア・パストリスは、組換えタンパク質の工業生産に、より広く用いられている発現系である。工業的に、製造方法過程の発酵収率は、生産コスト調節における重要な因子である。商業的なインスリンの需要は大きいので、主要な生産者であるNovo Nordiskにおいては、酵母発現系における生産のためのタンクの規模は数十トンに及び、その設備および装置が満たすべき条件は高度であり、結果としてコストが高くなる。したがって、ヒトインスリンおよびそのアナログの工業生産における発酵収率を高めることには大きな意義がある。
【０００４】
遺伝子コドンは、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）において隣接する３塩基からなるトリプレット暗号である。６４種類の遺伝子コドンが存在する。しかしながら、コドンの使用頻度は生物によって異なり、同じ生物でもタンパク質コード遺伝子によって異なり、すなわち、コドンの選択性が存在する。異種遺伝子のコドンは主に翻訳レベルで遺伝子発現に影響する。ピキア・パストリスにおける異種タンパク質発現の増加に対して、コドン最適化が顕著に影響することを示す文献が数多く存在する。ピキア・パストリスにおいて外来遺伝子は、細胞内発現および分泌発現の形態で発現される。後者の場合、外来遺伝子により発現された産物が分泌されるためには、シグナルペプチドが必要とされる。現在最も一般的に用いられるシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのα因子シグナルペプチドに由来するものであり、そのヌクレオチド配列もサッカロミセス・セレビシエに由来する。ピキア・パストリスに対して最適化されたα因子シグナルペプチドヌクレオチド配列は、これまでに報告されていない。インスリン前駆体のコドン最適化に関する関連文献は数多く存在し、例えば、最適化されたヒトインスリン前駆体遺伝子配列およびピキア・パストリスにおけるその発現がGurramkondaら（Gurramkonda et al. Application of simple fed-batch technique to high-level secretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequent purification and conversion to human insulin. Microbial Cell Factories, 2010, 9:31）によって開示され、特許文献ＷＯ１９９８０２８４２９には、ヒトインスリンアナログ前駆体を発現する遺伝子配列が開示され、遺伝子によりコードされるインスリン前駆体アミノ酸配列はＥＥＧＥＰＫ−Ｂ（１−２９）−ＡＡＫ−Ａ（１−２１）であり、ここで、ＥＥＧＥＰＫは、スペーサーペプチドまたはリーダーペプチドと称される、インスリン前駆体のＮ末端伸長であり、これはインスリン前駆体のＮ末端を酵母プロテアーゼによる加水分解から保護することができ、また、インスリン前駆体の発現効率を改善することができ；Ｂ（１−２９）は、Ｂ３０スレオニンを欠失するヒトインスリンＢ鎖であり；Ａ（１−２１）は、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列であり：ＡＡＫは、Ｂ鎖とＡ鎖を連結するリンカーペプチドであり、Ｃペプチドとも称される。
【０００５】
ヒトインスリンおよびそのアナログ前駆体の収量をさらに高めるために、本発明者は、インスリンアナログ前駆体遺伝子およびα因子シグナルペプチド遺伝子を、ピキア・パストリスにおける分泌発現のためにピキア・パストリスにおけるコドン選択性にしたがって最適化した。得られた結果は、本発明によるコドン最適化遺伝子発現によってヒトインスリンアナログ前駆体の収量が、当分野で知られるヒトインスリンアナログ前駆体遺伝子（対照）と比較して、ほぼ２倍に増加したことを示す。ヒトインスリンおよびそのアナログの工業生産にかかるコストは後期段階において大幅に低減されうる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明のいくつかの態様において、式：
５’−（ＰＳ）ａ−（ＳＰ）ｂ−（ＬＳ）ｃ−ＧＥ−（Ｐ’Ｓ）ｄ−３’
［式中、
ＰＳはプロセシング部位をコードする核酸分子であり、ａは０または１であり；
ＳＰはシグナルペプチドをコードする核酸分子であり、ｂは０または１であり；
ＬＳはスペーサーペプチドをコードする核酸分子であり、ｃは０または１であり；
ＧＥは関心のポリペプチドをコードする核酸分子であり；
Ｐ’Ｓはプロセシング部位をコードする核酸分子であり、ｄは０または１である］
の構造を含む核酸分子が提供される。
【０００７】
いくつかの態様において、式：
５’−（ＰＳ）ａ−（ＳＰ）ｂ−（ＬＳ）ｃ−ＧＥ−（Ｐ’Ｓ）ｄ−３’
［式中、
ＰＳはプロセシング部位をコードする核酸分子であり、ａは０または１であり；
ＳＰはシグナルペプチドをコードする核酸分子であり、ｂは１であり；
ＬＳはスペーサーペプチドをコードする核酸分子であり、ｃは１であり；
ＧＥは関心のポリペプチドをコードする核酸分子であり；
Ｐ’Ｓはプロセシング部位をコードする核酸分子であり、ｄは０または１である］
の構造を含む核酸分子が提供される。
【０００８】
いくつかの態様において、シグナルペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１で示される配列を含む。
【０００９】
いくつかの態様において、関心のポリペプチドはヒトインスリンアナログ前駆体ポリペプチドであり、ヒトインスリンアナログ前駆体ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号３で示される配列を含む。
【００１０】
いくつかの態様において、シグナルペプチドをコードする核酸分子（ＳＰ）の核酸配列は配列番号１で示され、そのアミノ酸配列は配列番号２で示される。
2021513330.tif 000002
2021513330.tif 000003
【００１１】
いくつかの態様において、関心のポリペプチドをコードする核酸分子（ＧＥ）は、ヒトインスリンアナログ前駆体をコードする核酸分子であり得、ヒトインスリンアナログ前駆体は、位置Ｂ３０のスレオニンを欠失するヒトインスリンであり得る。ヒトインスリンアナログ前駆体の核酸分子配列は配列番号３で示され、そのアミノ酸配列は配列番号４で示される。
2021513330.tif 000004
2021513330.tif 000005
【００１２】
いくつかの態様において、ヒトインスリンアナログ前駆体をコードする核酸分子の位置８８〜９６（すなわち、ＧＣＴＧＣＴＡＡＧ）は、リンカーペプチド（Ｃペプチドとも称される）をコードする核酸分子を表し、これはＧＣＣＧＣＴＡＡＧ、ＧＣＴＧＣＣＡＡＧ、ＧＣＴＧＣＴＡＡＡ、ＧＣＣＧＣＣＡＡＧを包含するがそれに限定されない配列で置換されうる。
【００１３】
いくつかの態様において、スペーサーペプチドをコードする核酸分子（ＬＳ）の配列は、配列番号５で示される。
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【００１４】
いくつかの態様において、ＰＳおよび／またはＰ’Ｓは、制限酵素部位をコードする核酸分子である。
【００１５】
好ましくは、ＰＳは、ＥｃｏＲ Ｉ制限酵素部位をコードする核酸分子であり、および／またはＰ’Ｓは、Ｎｏｔ Ｉ制限酵素部位をコードする核酸分子である。
【００１６】
いくつかの態様において、ヒトインスリンアナログ前駆体を発現することのできる核酸分子が提供され、該核酸分子は、スペーサーペプチドをコードする核酸分子、およびヒトインスリンアナログ前駆体をコードする核酸分子を含み、シグナルペプチドを含むベクターとの組換えによってヒトインスリンアナログ前駆体を発現することができる。
【００１７】
いくつかの態様において、ヒトインスリンアナログ前駆体核酸分子によりコードされるヒトインスリンアナログ前駆体のアミノ酸配列は、次のとおりである：
ＥＥＧＥＰＫ−Ｂ（１−２９）−ＡＡＫ−Ａ（１−２１）
［ここで「ＥＥＧＥＰＫ（配列番号１６）は、スペーサーペプチドまたはリーダーペプチドと称される、インスリン前駆体のＮ末端伸長であり得；「Ｂ（１−２９）」は、位置Ｂ３０のスレオニンを欠失するヒトインスリンＢ鎖であり得；「Ａ（１−２１）」は、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列であり得；「ＡＡＫ」は、Ｃペプチドとも称される、Ｂ鎖とＡ鎖を連結するリンカーペプチドである］。
【００１８】
いくつかの態様において、ヒトインスリンアナログ前駆体核酸分子の配列は配列番号６で示され得、そのアミノ酸配列は配列番号７で示され得る。
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【００１９】
いくつかの態様において、ヒトインスリンアナログ前駆体をコードする別の核酸分子が提供される。核酸分子配列は、シグナルペプチド配列、スペーサーペプチド配列、およびヒトインスリンアナログ前駆体をコードする配列を含み、該核酸分子は、シグナルペプチドを含まないベクターとの組換えによってヒトインスリンアナログ前駆体を発現することができる。
【００２０】
いくつかの態様において、ヒトインスリンアナログ前駆体を発現する核酸分子の核酸配列は配列番号８で示され、コードされるアミノ酸配列は配列番号９で示される。
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【００２１】
いくつかの態様において、ヒトインスリンアナログ前駆体を発現する核酸分子は制限酵素部位をも含み得、好ましくは、制限酵素部位はＥｃｏＲ Ｉ制限酵素部位および／またはＮｏｔ Ｉ酵素制限部位である。
【００２２】
いくつかの態様において、原核生物または真核生物細胞においてヒトインスリンアナログ前駆体を分泌発現によって発現することができる、真核生物または原核生物細胞において発現可能なベクターが提供される。
【００２３】
いくつかの態様において、宿主細胞が提供される。宿主細胞は、好ましくは酵母、より好ましくはピキア（Pichia）であり、ヒトインスリンアナログ前駆体を分泌発現によって発現することができる。
【００２４】
いくつかの態様において、前記の核酸分子、ベクターおよび／または宿主細胞を使用することを含む、ヒトインスリンアナログを調製する方法が提供される。
【００２５】
該方法は、
１）真核生物細胞においてヒトインスリンアナログ前駆体をコードする核酸分子によりヒトインスリンアナログ前駆体を発現させるステップ；
２）ヒトインスリンアナログ前駆体の酵素分解により、ヒトインスリンアナログを得るステップ
をさらに含み得、ヒトインスリンアナログ前駆体をコードする核酸分子は配列番号６で示され得、インスリンアナログ前駆体は当業者に知られる方法で酵素分解され得る。
【００２６】
いくつかの態様において、ステップ１）は、ヒトインスリンアナログ前駆体を、シグナルペプチド配列を含む発現ベクターによって発現させることを含み、シグナルペプチド配列は配列番号１で示される。
【００２７】
いくつかの態様において、ヒトインスリンアナログは、Ｂ３０を欠失するヒトインスリンであり、ヒトインスリンアナログはさらにアシル化基で置換される。
【００２８】
いくつかの態様において、前記のＢ３０を欠失するヒトインスリンにおいて、位置Ｂ２９のリジンがアシル化基で置換される。
【００２９】
好ましくは、前記置換によって得られる生成物は、リジンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン脂肪二酸−Ｌ−リジン−Ｎε−オキソブチリル））デス（Ｂ３０）ヒトインスリンである。
【００３０】
略号および用語
「コドン最適化」とは、宿主細胞のコドン選択性のルールにしたがって、低頻度のコドンまたは稀なコドンの代わりに選択性の高いコドンで遺伝子が合成されることをいう。
【００３１】
「対照１」は、下記配列番号１０で示され、これは、「ＥＥＧＥＰＫ」をコードする核酸分子（ＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＣＡＡＡＧ、二重下線部）が、ＷＯ１９９８０２８４２９に記載されるインスリン前駆体遺伝子をコードする核酸分子と連結されたものである。
2021513330.tif 000009
【００３２】
「対照２」は、下記配列番号１１で示され、これは、「ＥＥＧＥＰＫ」をコードする核酸分子（二重下線部）が、Gurramkondaら（Microbial Cell Factories, 2010, 9:31）により開示された最適化インスリン前駆体遺伝子をコードする核酸分子と連結されたものである。
2021513330.tif 000010
【００３３】
「ＩＰ−Ｓ」は、コドン最適化後のインスリン前駆体遺伝子に対応する核酸分子である。
【００３４】
「α因子」は、Invitrogenにより提供されるサッカロミセス・セレビシエ由来のｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクターに含まれるα因子シグナルペプチド遺伝子に対応する核酸分子である。
【００３５】
「α因子−Ｓ」は、コドン最適化したα因子シグナルペプチド遺伝子に対応する核酸分子である。
【００３６】
「ベクター」は、それと連結する別の核酸を運ぶことができる核酸分子を包含し、プラスミドおよびウイルスベクターを包含するがそれに限定されない。いくつかのベクターは、導入された宿主細胞内で自律的に複製することができ、他のいくつかのベクターは、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製されることができる。さらに、いくつかのベクターは、それに作動可能に連結された遺伝子の発現を制御することができ、そのようなベクターを本書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称する。従来のベクターは、当分野において知られている。
【００３７】
「関心のポリペプチド」とは、酵素、抗体、インターフェロン、インスリン、インターロイキン等、およびそのバリアント、前駆体、中間体を包含するがそれに限定されない、酵母において発現可能なポリペプチドである。例えば、関心のポリペプチドは、インスリン前駆体でありうる。
【００３８】
用語「細胞」および「宿主細胞」は、互換的に用いられうる。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド分子」、「核酸分子」は、互換的に用いられ得、その配列はＤＮＡ配列でありうる。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【００４１】
本発明の実施例において用いたベクター、宿主細菌および培養培地は、Invitrogenから購入した。ピキア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋは、メタノールによって誘導されうるアルコールオキシダーゼＡＯＸ１プロモーターを含み、該ベクターはまた、α因子シグナルペプチド配列を含み、異種タンパク質を分泌発現により発現することができる。別のピキア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ３．５Ｋは、メタノールによって誘導されうるアルコールオキシダーゼＡＯＸ１プロモーターを含み、該ベクターは、α因子シグナルペプチド配列を含まない。ピキア・パストリスＧＳ１１５株を宿主細菌として用いた。培養培地の処方は、ピキア・パストリス・マニュアルにより提供された。
【実施例１】
【００４２】
インスリン前駆体の組換え発現ベクターの作製
Nanjing Kingsray Biotech Co., Ltd.によって、それぞれ対照１（配列番号１０）、対照２（配列番号１１）およびＩＰ−Ｓ（配列番号６）の５’および３’末端に、ＥｃｏＲ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限酵素部位を付加し、合成した。合成した核酸分子の配列をＴベクターにライゲートした。
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【００４３】
インスリン前駆体核酸分子を有するＴベクター、および発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋを、ＥｃｏＲ ＩおよびＮｏｔ Ｉの両方で消化し、次いで、標的フラグメントおよびベクターフラグメントをゲル回収キットによって個別に回収した。消化されたフラグメントの精製後、標的フラグメントをベクターｐＰＩＣ９ＫにＴ４リガーゼによってライゲートした。
【００４４】
上記ライゲーション液を大腸菌ＴＯＰ１０コンピテントセルに導入し、アンピシリン耐性でプレートに播種した。培養後、細菌コロニーを採り、プラスミドを抽出し、両制限酵素による消化によって確認した。対照１、対照２およびＩＰ−Ｓ配列をそれぞれ含む３種の組換え発現ベクターを最終的に得た。
【実施例２】
【００４５】
ピキア・パストリス組換え株によるインスリン前駆体の発現
実施例１において作製した３種の組換え発現ベクターをそれぞれピキア・パストリスＧＳ１１５に導入した。対照１および対照２を発現する株を対照株として用い、ＩＰ−Ｓを発現する組換え株を試験株として用いた。
【００４６】
３種の組換え細菌のコロニーを、５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃の一定温度で、ＯＤ６００値が約１０となるまで（１６〜１８時間）培養した。細胞を採取し、５０ｍｌのＢＭＧＹ培地に再懸濁し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃の一定温度で、ＯＤ６００値が約３０となるまで一晩培養した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより採取し、２５ｍｌのＢＭＭＹ培地に再懸濁した。１／２００体積のメタノール（終濃度０．５％）を培地に加え、２４時間毎に１／２００体積のメタノールを補充しながら、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃の一定温度で９６時間培養した。発現の終了後、１００００ｒｐｍで遠心分離することにより上清を得た。上清に含まれるインスリン前駆体の収量をＨＰＬＣにより測定し、対照株により発現されたインスリン前駆体の発現量に対するパーセンテージに変換した。インスリン前駆体発現レベルのパーセンテージを表１に示す。
【００４７】
【表１】
2021513330.tif 000014
【００４８】
表１のデータは、最適化インスリン前駆体遺伝子により発現されたインスリン前駆体の量は、２つの対照群と比較して１．８〜２．２５倍であったことを示している。最適化インスリン前駆体遺伝子はより高い発現効率を有し、発現されるインスリン前駆体の量を顕著に改善しうることがわかる。
【実施例３】
【００４９】
異なるα因子と融合されたインスリン前駆体遺伝子を含む組換え発現ベクターの作製
α因子（配列番号１２）およびα因子−Ｓ（配列番号１）が個別に、ＩＰ−Ｓの上流部位に融合されている、配列番号１３および配列番号８で示される核酸分子を合成した。ＥｃｏＲ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限酵素部位も、合成核酸分子の５’および３’両末端に組み込んだ。合成核酸分子をＴベクターにライゲートした。
【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
α因子（配列番号１２）およびα因子−Ｓ（配列番号１）が個別に、対照１の上流部位に融合されている、配列番号１４および配列番号１５で示される核酸分子を合成した。ＥｃｏＲ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限酵素部位も、合成核酸分子の５’および３’両末端に組み込んだ。合成核酸分子をＴベクターにライゲートした。
【００５３】
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【００５４】
前記Ｔベクターおよび発現ベクターｐＰＩＣ３．５Ｋを両エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ ＩおよびＮｏｔ Ｉの両エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、標的フラグメントおよびベクターフラグメントをゲル回収キットによって個別に回収した。消化されたフラグメントの精製後、標的フラグメントをベクターｐＰＩＣ３．５ＫにＴ４リガーゼによってライゲートした。
【００５５】
上記ライゲーション液を大腸菌ＴＯＰ１０コンピテントセルに導入し、アンピシリン耐性でプレートに播種した。培養後、細菌コロニーを採り、プラスミドを抽出し、両制限酵素による消化によって確認した。異なるヌクレオチド配列を有するインスリン前駆体遺伝子の発現のためのα因子またはα因子−Ｓシグナルペプチドを個別に組み込んだ４種の組換え発現ベクターを最終的に得た。
【実施例４】
【００５６】
最適化の前と後の、ピキア・パストリス組換え株によるインスリン前駆体の発現
実施例３において作製した組換え発現ベクターを個別にピキア・パストリスＧＳ１１５に導入した。
【００５７】
組換え細菌コロニーを、５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃の一定温度で、ＯＤ６００値が約１０となるまで（１６〜１８時間）培養した。細胞を採取し、５０ｍｌのＢＭＧＹ培地に再懸濁し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃の一定温度で、ＯＤ６００値が約３０となるまで一晩培養した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより採取し、２５ｍｌのＢＭＭＹ培地に再懸濁した。１／２００体積のメタノール（終濃度０．５％）を培地に加え、２４時間毎に１／２００体積のメタノールを補充しながら、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃の一定温度で９６時間培養した。発現の終了後、１００００ｒｐｍで遠心分離することにより上清を得た。上清に含まれるインスリン前駆体の収量をＨＰＬＣにより測定した。
【００５８】
α因子に融合された対照１遺伝子を発現する組換え細菌を、対照細菌として用いた。表２に示すように、他の株によるインスリン前駆体の量を、対照株により発現されたインスリン前駆体の量に対するパーセンテージに変換した。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
表２のデータは、インスリン前駆体の収量は、核酸分子中のシグナルペプチドのみの最適化によって１．５倍に増加し、インスリン前駆体遺伝子のみの最適化によって２．２５倍に増加したことを示している。一方、インスリン前駆体の収量は、シグナルペプチドおよびインスリン前駆体遺伝子の両方を最適化した場合には２．７５倍に増加した。したがって、コドン最適化によって、インスリン前駆体の発現レベルを１．５〜２．７５倍に増加することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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