(57)【要約】  スプライスアクセプター−スプライスドナー部位を標的とするように設計された塩基エディターおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用する、哺乳動物細胞における標的化遺伝子破壊（ノックアウト、ミスセンス変異）および標的化遺伝子ノックインのための方法および系が本発明において提供される。免疫療法関連遺伝子における標的化破壊および治療適用のためにＣＡＲ／ＴＣＲを含む普遍的に許容される遺伝子操作された細胞も本発明において提供される。【選択図】図１
2021517815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞を生成するための方法であって、
（ａ）リンパ球造血系細胞中に、
（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼドメインに融合したデアミナーゼドメインを含む塩基エディター融合タンパク質をコードするプラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質であって、前記ニッカーゼドメインが、塩基除去修復インヒビタードメインを含む、該プラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質、および
（ｉｉ）遺伝子改変される標的核酸配列に対する相補性を有する、１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡ
を導入することと、
（ｂ）前記１種以上のＳＡ−ＳＤ ｇＲＮＡによって標的とされるスプライス部位の破壊を促進する条件下で、導入を受けた前記細胞を培養することであって、それによって、前記標的核酸配列が、トランスフェクトされていないリンパ球造血系細胞と比べて、塩基前記エディター融合タンパク質および前記１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡによって改変され、かつそれによって、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞が生成されることと
を含む方法。
【請求項２】
１種以上の標的化ノックインまたはミスセンス変異を生じるように設計された１種以上のｇＲＮＡを前記リンパ球造血系細胞中に導入することをさらに含み、それによって、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞が、少なくとも１つの遺伝子ノックアウトおよび１種以上の遺伝子ノックインもしくはミスセンス変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１種以上の標的化ノックインおよび１種以上のミスセンス変異を生じるように設計された１種以上のｇＲＮＡを前記リンパ球造血系細胞中に導入することをさらに含み、それによって、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞が、少なくとも１つの遺伝子ノックアウト、少なくとも１つの遺伝子ノックイン、および少なくとも１つのミスセンス変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記塩基エディター融合タンパク質が、ＢＥ３、ＢＥ４、またはアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リンパ球造血系細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、またはＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１種以上のＳＡ−ＳＤ ｇＲＮＡが、各ｇＲＮＡの少なくとも１つの５’ヌクレオチドおよび少なくとも１つの３’ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾を含むように化学的に修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記塩基エディター融合タンパク質および１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡが、約５０％〜約９０％のＣからＴへの変換の効率を呈する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１種以上のＳＡ−ＳＤ ｇＲＮＡが、表１に示されている配列から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子改変されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）ヒトＴ細胞へと
（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼドメインに融合したデアミナーゼドメインを含む塩基エディター融合タンパク質をコードするプラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質であって、前記ニッカーゼドメインが、塩基除去修復インヒビタードメインを含む、プラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質、
（ｉｉ）ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１のそれぞれの発現を破壊するための１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡ、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするドナーＤＮＡ鋳型、ならびに
（ｉｖ）標的挿入部位に対して相補的な２つのｇＲＮＡ
をトランスフェクトすることと、
（ｂ）前記ＳＡ−ＳＤ ｇＲＮＡによって標的とされるスプライス部位の破壊を促進する条件下で、トランスフェクトされた前記Ｔ細胞を培養することであって、それによって、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１遺伝子産物の発現が、トランスフェクトされていないＴ細胞と比べて低減されることと、
（ｃ）前記標的挿入部位において、前記ドナーＤＮＡ鋳型の標的化ノックインを促進する条件下で、トランスフェクトされた前記Ｔ細胞を培養することと
を含む方法。
【請求項１０】
前記塩基エディター融合タンパク質が、ＢＥ３、ＢＥ４、またはアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種以上のＳＡ−ＳＤ ｇＲＮＡが、表１に示されている配列から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＡ−ＳＤ ｇＲＮＡおよび前記標的挿入部位に対して相補的なｇＲＮＡのうちの１種以上が、各ｇＲＮＡの少なくとも１つの５’ヌクレオチドおよび少なくとも１つの３’ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾を含むように化学的に修飾されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ドナーＤＮＡ鋳型が、ｒＡＡＶとして提供される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＣＲが、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＡＲが、腫瘍抗原に特異的に結合するＣＡＲ抗原結合ドメインを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＣＲおよび前記ＣＡＲが、異なる抗原に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法に従って得られる遺伝子改変された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６４２，１５１号からの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
初代ヒト細胞の正確なモジュレーションは、免疫療法、自己免疫および酵素異常症の分野で複数の適用を有する。遺伝子レベルでの患者の免疫細胞のモジュレーションは、処置の永続性および患者による拒絶のリスクが低いことにより、治療のための魅力的なルートである。免疫細胞の遺伝子編集の１つのアプローチは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用して、目的の遺伝子内の二重鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、それによって、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）経路による非常に可変的な修復によって創出される規模の小さい挿入または欠失（「インデル」と総称される）の形成をもたらすことである。あるいは、正確なゲノム変更を、相同組換え修復（ＨＤＲ）による修復のためのＤＮＡ鋳型の同時送達と共にＤＳＢを導入することによって達成することができる。このアプローチは、ＮＨＥＪによって単一の遺伝子を単に破壊する場合に効率的でありかつ信頼性が高いが、ＨＤＲによる単一のヌクレオチドの正確な変更は、効率性がはるかに低い。さらに、多重遺伝子編集手順の間に複数のＤＳＢを誘導することにより、望ましくない遺伝毒性および潜在的に発癌性の大規模な染色体転座の形成がもたらされる場合がある。したがって、毒性ＤＳＢの誘導が制限されたヒト免疫細胞の多重遺伝子操作の、より制御されかつより安全な方法が、この分野において依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
第１の態様では、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞を生成するための方法が本発明において提供される。この方法は、（ａ）（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼドメインに融合したデアミナーゼドメインを含む塩基エディター融合タンパク質をコードするプラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質であって、ニッカーゼドメインが、塩基除去修復インヒビタードメインを含む、プラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質、および（ｉｉ）遺伝子改変される標的核酸配列に対する相補性を有する１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡをリンパ球造血系細胞中に導入するステップと、（ｂ）１種以上のＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡによって標的とされるスプライス部位の破壊を促進する条件下で、導入を受けた細胞を培養するステップであって、それによって、標的核酸配列が、トランスフェクトされていないリンパ球造血系細胞と比べて、塩基エディター融合タンパク質および１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡによって改変され、かつそれによって、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞が生成されるステップとを含むかまたはそれらから本質的になり得る。一部の場合には、この方法は、１種以上の標的化ノックインまたはミスセンス変異を生じるように設計された１種以上のｇＲＮＡをリンパ球造血系細胞中に導入するステップであって、それによって、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞が、少なくとも１つの遺伝子ノックアウトおよび１種以上の遺伝子ノックインまたはミスセンス変異を含むステップをさらに含む。一部の場合には、この方法は、１種以上の標的化ノックインおよび１種以上のミスセンス変異を生じるように設計された１種以上のｇＲＮＡをリンパ球造血系細胞中に導入するステップであって、それによって、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞が、少なくとも１つの遺伝子ノックアウト、少なくとも１つの遺伝子ノックイン、および少なくとも１つのミスセンス変異を含むステップをさらに含む。塩基エディター融合タンパク質は、ＢＥ３、ＢＥ４、またはアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）であり得る。リンパ球造血系細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、またはＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（hematopoietic stem progenitor cell）（ＨＳＰＣ）であり得る。１種以上のＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡは、各ｇＲＮＡの少なくとも１つの５’ヌクレオチドおよび少なくとも１つの３’ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾を含むように化学的に修飾され得る。塩基エディター融合タンパク質および１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡは、約５０％〜約９０％のＣからＴへの変換の効率を呈し得る。１種以上のＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡは、表１に示されている配列から選択することができる。
【０００４】
別の態様では、遺伝子改変されたＴ細胞を生成するための方法が本発明において提供される。この方法は、（ａ）（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼドメインに融合したデアミナーゼドメインを含む塩基エディター融合タンパク質をコードするプラスミド、ｍＲＮＡ、もしくはタンパク質であって、ニッカーゼドメインが、塩基除去修復インヒビタードメインを含む、プラスミド、ｍＲＮＡ、もしくはタンパク質、（ｉｉ）ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１のそれぞれの発現を破壊するための１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするドナーＤＮＡ鋳型、ならびに（ｉｖ）標的挿入部位に対して相補的な２つのｇＲＮＡをヒトＴ細胞中に導入するステップと、（ｂ）ＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡによって標的とされるスプライス部位の破壊を促進する条件下で、（ａ）のＴ細胞を培養するステップであって、それによって、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１の発現が、トランスフェクトされていないＴ細胞と比べて低減されるステップと、（ｃ）標的挿入部位において、ドナーＤＮＡ鋳型の標的化ノックインを促進する条件下で、トランスフェクトされたＴ細胞を培養するステップとを含むかまたはそれらから本質的になり得る。塩基エディター融合タンパク質は、ＢＥ３、ＢＥ４、またはアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）であり得る。１種以上のＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡは、表１に示されている配列から選択することができる。ＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡおよび標的挿入部位に対して相補的なｇＲＮＡのうちの１種以上は、各ｇＲＮＡの少なくとも１つの５’ヌクレオチドおよび少なくとも１つの３’ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾を含むように化学的に修飾され得る。ドナーＤＮＡ鋳型は、ｒＡＡＶとして提供され得る。ＴＣＲは、腫瘍抗原に特異的に結合し得る。ＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的に結合するＣＡＲ抗原結合ドメインを含み得る。ＴＣＲおよびＣＡＲは、異なる抗原に結合し得る。
【０００５】
さらなる態様では、この開示の方法に従って得られる遺伝子改変された細胞が本発明において提供される。
本発明は、以下のその詳細な説明が考慮される場合、よりよく理解され、上記に示されたもの以外の特徴、態様および利点が明らかとなるであろう。このような詳細な説明では、以下の図面が参照される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】標的ＤＮＡに結合したＣａｓ９塩基エディター（ＢＥ）（左）およびＢＥ３およびＢＥ４（右）を用いて達成される塩基編集ウィンドウを示すプロトスペーサーを示す図を表す。哺乳動物のスプライスドナー（ＳＤ）およびスプライスアクセプター（ＳＡ）エレメントならびにスプライス部位の破壊によるＢＥノックアウトに利用されるプロトスペーサーの関連する方向を示すロゴ図も示される。
【図２】未成熟ＳＴＯＰ（ｐｍＳＴＯＰ）コドンの導入によるか、または塩基エディターによるスプライス部位の破壊による単一の遺伝子ノックアウトに関するワークフローの例を示す図である。
【図３】図３Ａ〜３Ｌは、ＰＤＣＤ１、Ｂ２Ｍ、およびＴＲＡＣにおける遺伝子破壊に関するガイドＲＮＡの活性の評価を実証する図である。（ａ）各ｓｇＲＮＡの相対的位置を示すＰＤＣＤ１遺伝子座の図。ボックスの着色した部分はタンパク質コード領域を表し、赤色の縦線はストップコドンを示す。（ｂ）サンガーシーケンシングトレースのＥｄｉｔＲ分析によって決定した（ｎ＝３の独立したＴ細胞ドナー）、ＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの同時送達後の、各ＰＤＣＤ１  ｓｇＲＮＡに関する標的塩基のＣからＴへの変換の定量。（ｃ）フローサイトメトリーによって決定した（ｎ＝３の独立したＴ細胞ドナー）、表示したｓｇＲＮＡとＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの送達後のＰＤＣＤ１タンパク質ノックアウトの頻度。（ｄ）サンガーシーケンシングトレースのＥｄｉｔＲ分析によって決定した（ｎ＝３の独立したＴ細胞ドナー）、ＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの同時送達後の、ＰＤＣＤ１  Ｅｘ１  ＳＤ  ｓｇＲＮＡの検出された編集ウィンドウ（赤色で示す）内のすべてのＣにおけるＣからＴ／Ａ／Ｇへの変換の定量。下線を付したＣは、適切なスプライシングに重要な標的ヌクレオチドを示す。（ｅ）各ｓｇＲＮＡの相対的位置を示すＴＲＡＣ遺伝子座の図。（ｆ）サンガーシーケンシングトレースのＥｄｉｔＲ分析によって決定した（ｎ＝３の独立したＴ細胞ドナー）、ＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの同時送達後の、各ＴＲＡＣ  ｓｇＲＮＡに関する標的塩基のＣからＴへの変換の定量。（ｇ）ＣＤ３損失に関するフローサイトメトリーによって決定した（ｎ＝３の独立したＴ細胞ドナー）、表示したｓｇＲＮＡとＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの送達後のＴＲＡＣタンパク質ノックアウトの頻度。（ｈ）サンガーシーケンシングトレースのＥｄｉｔＲ分析によって決定した（ｎ＝３の独立したＴ細胞ドナー）、ＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの同時送達後の、ＴＲＡＣ  Ｅｘ３  ＳＡ  ｓｇＲＮＡの検出された編集ウィンドウ（赤色で示す）内のすべてのシトシンにおけるＣからＴ／Ａ／Ｇへの変換の定量。（ｉ）各ｓｇＲＮＡの相対的位置を示すＢ２Ｍ遺伝子座の図。（ｊ）サンガーシーケンシングトレースのＥｄｉｔＲ分析によって決定した（ｎ＝３の独立したＴ細胞ドナー）、ＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの同時送達後の、各Ｂ２Ｍ  ｓｇＲＮＡに関する標的塩基のＣからＴへの変換の定量。（ｋ）Ｂ２Ｍ損失に関するフローサイトメトリーによって決定した（ｎ＝３の独立したＴ細胞ドナー）、表示したｓｇＲＮＡとＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの送達後のＢ２Ｍタンパク質ノックアウトの頻度。（ｌ）サンガーシーケンシングトレースのＥｄｉｔＲ分析によって決定した（平均±ＳＤとして表したデータ、ｎ＝３の独立した生物学的Ｔ細胞ドナー）、ＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡのいずれかとの同時送達後の、Ｂ２Ｍ  Ｅｘ１  ＳＤ  ｓｇＲＮＡの検出された編集ウィンドウ（赤色で示す）内のすべてのシトシンにおけるＣからＴ／Ａ／Ｇへの変換の定量。最も高い編集ガイドと２番目に高い編集処理���間で、スチューデントの対応のある両側ｔ検定によって計算したｐ値（非有意  Ｐ＞０．０５、*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１、****Ｐ≦０．０００１）。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、最適なｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣ  Ｅｘ３  ＳＡ、Ｂ２Ｍ  Ｅｘ１  ＳＤ、およびＰＤＣＤ１  Ｅｘ１  ＳＤ）を使用する多重編集の最適化を実証するグラフである。（ａ）３つの標的ｓｇＲＮＡおよび３μｇ用量で送達された第１世代のＢＥ３（ＢＥ３）ｍＲＮＡもしくはＢＥ４（ＢＥ４）ｍＲＮＡ；ｓｇＲＮＡと複合体形成したＢＥ４タンパク質（ＢＥ４  ＲＮＰ）；または１．５μｇもしくは４μｇ用量で送達されたコドン最適化ＢＥ４  ｍＲＮＡ（ｃｏＢＥ４）の同時送達後に、ＮＧＳによって分析した、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＢ２Ｍにおける標的シトシンのすべての他の塩基への変換頻度。（ｂ）３つの標的ｓｇＲＮＡおよび３μｇ用量で送達された第１世代のＢＥ３（ＢＥ３）ｍＲＮＡもしくはＢＥ４（ＢＥ４）ｍＲＮＡ；ｓｇＲＮＡと複合体形成したＢＥ４タンパク質（ＢＥ４  ＲＮＰ）；または１．５μｇもしくは４μｇ用量で送達されたコドン最適化ＢＥ４  ｍＲＮＡ（ｃｏＢＥ４）の送達後に、ＮＧＳによって分析した、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＢ２Ｍにおけるインデルの頻度。（ｃ）３つの標的ｓｇＲＮＡと１．５μｇまたは４μｇ用量のＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡとの同時送達後に、ＮＧＳによって分析した、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＢ２Ｍにおけるインデルの頻度。（ｄ）３つの標的ｓｇＲＮＡおよび３μｇ用量で送達された第１世代のＢＥ３（ＢＥ３）ｍＲＮＡまたはＢＥ４（ＢＥ４）ｍＲＮＡ；ｓｇＲＮＡと複合体形成したＢＥ４タンパク質（ＢＥ４  ＲＮＰ）；および１．５μｇまたは４μｇ用量で送達されたコドン最適化ＢＥ４  ｍＲＮＡ（ｃｏＢＥ４）の送達の７日後に、フローサイトメトリーによって測定した、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＢ２Ｍタンパク質損失の頻度。（ｅ）電気穿孔の７日後に実施した多重フローサイトメトリー分析のＳＰＩＣＥ表示。（ｆ）ＷＴ、単一の遺伝子ＫＯ、二重遺伝子ＫＯ、および三重遺伝子ＫＯの画分の定量。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝２の２つの独立した生物学的Ｔ細胞ドナーとして表した。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、多重編集Ｔ細胞における転座の頻度を実証する図である。（ａ）ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤＣＤ１、およびＰＤＣＤ１  ＯＴ部位における二本鎖切断誘導から生じる可能な転座の結果のＣｉｒｃｏｓプロット。（ｂ）転座の頻度のドロップレットデジタルＰＣＲによる定量。すべてのアッセイは、ｎ＝２の独立した生物学的Ｔ細胞ドナーにわたって、技術的二連で実行した。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、多重編集Ｔ細胞の機能を実証する図である。（ａ）編集および拡大後のメモリーマーカーＣＤ２７およびＣＤ４５ｒｏの発現。活性化後のＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞による（ｂ）サイトカインそれぞれの生成および（ｃ）それらを組み合わせたサイトカインの生成。（ｄ）Ｔ細胞との共培養後に、ルシフェラーゼルミネセンスアッセイによって測定した、ＣＤ１９ｎｅｇ  Ｋ５６２、ＣＤ１９ｐｏｓ  Ｒａｊｉ細胞、またはＣＤ１９ｐｏｓ／ＰＤ−Ｌ１ｐｏｓ  Ｒａｊｉ細胞を死滅させるＴ細胞の能力。グラフのタイトルは、Ｅ：Ｔの比を示す。データは、２つの独立した生物学的Ｔ細胞ドナーにおいて三連で実行したアッセイに関して、平均±ＳＤとして表した。（非有意  Ｐ＞０．０５、*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１、****Ｐ≦０．０００１）。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、図３Ａ〜３Ｌにおける各ｓｇＲＮＡに関する非標的編集を実証するグラフである。データをＮＧＳから分析する。積み重ねたバーの高さは、エラーバー±標準偏差１の平均を表す。ｎ＝３の独立したドナー。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、図３Ａ〜３Ｌにおけるすべての試料に関するインデルを表すグラフである。データをＮＧＳから分析する。積み重ねたバーの高さは、エラーバー±標準偏差１の平均を表す。ｎ＝３の独立したドナー。
【図９】第１世代の、低用量（１．５μｇ）ＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡを使用するＴ細胞の多重塩基編集を実証するグラフである。タンパク質レベルでＴＲＡＣ、Ｂ２ＭおよびＰＤＣＤ１の塩基エディターに媒介されるノックアウトを示す棒グラフ。タンパク質発現を、方法のセクションに記載したように、フローサイトメトリーによって評価した。ｎ＝２の独立したドナー。
【図１０】Ｔ細胞の電気穿孔後の塩基エディタータンパク質レベルを実証する図である。２つの独立したドナーにおいて、刺激したＴ細胞の電気穿孔の２４時間後に、Ｃａｓ９、ＢＥ３、ＢＥ４、およびコドン最適化ＢＥ４をコードするｍＲＮＡを使用して達成したタンパク質レベルを評価するデジタルウエスタンブロットの結果。精製したＢＥ３タンパク質も、ＢＥタンパク質の抗体検出の陽性対照として使用した。
【図１１】再刺激の際のＰＤＣＤ１、Ｂ２Ｍ、およびＴＲＡＣの代表的なフロープロットを表す図である。電気穿孔の５日後に、Ｔ細胞を再刺激し、ＰＤ−１タンパク質ノックアウトの頻度の評価を可能とするＰＤＣＤ１の発現を誘導した。多重ｃｏ−ＢＥ４  ｍＲＮＡ編集後のドナーに適合したＴ細胞のＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１発現およびパルスのみの対照（左の列）の代表的なフローサイトメトリープロットが、ここで示されている。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、計算により予測されるオフターゲット塩基編集およびインデル形成の評価を実証するグラフである。Ｔ細胞において、Ｃａｓ９またはＢＥ４  ｍＲＮＡと組み合わせて、ＴＲＡＣ、Ｂ２ＭまたはＰＤＣＤ１を標的とする最適なｓｇＲＮＡを使用する、次世代シーケンシングを使用して評価したオンターゲットおよび上位１０個の計算により予測されるオフターゲットｓｇＲＮＡ結合部位における塩基編集（Ａ）およびインデル（Ｂ）の頻度。
【図１３】３つの標的遺伝子座の間の転座の頻度を実証するグラフである。３つのｓｇＲＮＡおよびｓｐＣａｓ９タンパク質、ｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ、ＢＥ４タンパク質、またはｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡの送達後のＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１の間の転座の頻度のドロップレットデジタルＰＣＲによる定量。ｎ＝２の独立したＴ細胞ドナーを二連でアッセイした。
【図１４】標的遺伝子座とＰＤＣＤ１オフターゲット部位の間の転座の頻度を実証するグラフである。３つのｓｇＲＮＡおよびｓｐＣａｓ９タンパク質、ｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ、ＢＥ４タンパク質、またはｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡの送達後のＰＤＣＤ１  ＯＴ部位とＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１の間の転座の頻度のドロップレットデジタルＰＣＲによる定量。ｎ＝２の独立したＴ細胞ドナーを二連でアッセイした。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、ＣＡＲ形質導入およびＴ細胞拡大の効率を実証するグラフである。（Ａ．）２つの独立したドナーにおいて、ＲＱＲ８を染色することにより、ＭＯＩが２０のＭＮＤ−ＣＤ１９  ＣＡＲ−ＲＱＲ８レンチウイルスベクターを使用する形質導入を受けたＴ細胞の頻度を示す棒グラフ。ＲＱＲ８は、ＣＤ３４およびＣＤ２０に特異的な抗体で染色するためのドメインを含有するハイブリッド分子であり、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の頻度を決定するサロゲートとしての役割を果たす。（Ｂ．）電気穿孔および形質導入後５日目と１２日目の生存可能な細胞数を示す棒グラフ。ｎ＝２の独立したドナー。
【図１６】Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびＣａｓ９ニッカーゼと比べたＢＥニッカーゼの活性および効率を使用する、標的化ノックイン（ＫＩ）を例証する図である。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、転座接合部にわたるサブクローニングしたＰＣＲ産物のシーケンシングを実証する図である。（Ａ）記載したように、Ｃａｓ９またはＢＥのｍＲＮＡまたはタンパク質を使用して、記載した標的遺伝子間で実施した転座ＰＣＲの結果。ＡＡＶＳ１対照ＰＣＲも実施し、ＰＣＲに対するｇＤＮＡの質と官能性を確認した。（Ｂ）（Ａ）からのＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯプラスミド中にクローニングされたＴＡであり、次に、サンガーシーケンシングによって分析した。次いで、得られたクロマトグラムを、記載した標的遺伝子のｇＲＮＡ切断部位とアライメントした標的遺伝子のｇＲＮＡ切断部位の間の仮定の「完全な」接合配列に対してアライメントした。データを作成するために使用したｄｄＰＣＲプローブも示した。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃは、拡大した、活性化ＵＣＢ  ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにおける効率性の高い塩基編集を実証する図である。ＣからＴへの変換をＥｄｉｔＲを使用して計算した。
【図１９】プロリンに変異した場合、ＡＤＡＭ１７によってＣＤ１６切断不可能とみなされる重要なセリン（赤色）を有する、ＣＤ１６の以前に特定されたＡＤＡＭ１７により切断可能な領域を示す図である。Ｃ−Ｔ塩基エディターバリアントを使用して、本発明者らは、隣接するバリン（青色）を標的とすることができた。Ｃ−Ｔ塩基エディターバリアントを使用して達成可能な、このバリンへの可能なアミノ酸変化が示される。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｂは、代表的なサンガーシーケンシングクロマトグラムを示す。（Ａ）は、対照（ＢＥ３−ＶＱＲ単独）および編集した（ＢＥ３−ＶＱＲ＋ＣＤ１６  ｇＲＮＡ）試料（上）からのシーケンシングクロマトグラムを示す。ＣからＴへの変換をＥｄｉｔＲを使用して計算した。２つの別々のドナーからの結果を棒グラフ（下）で合わせた。（Ｂ）は、対照（ＡＢＥ単独）および編集した（ＡＢＥ＋ＣＤ１６ａ  ｇＲＮＡ）試料からのシーケンシングクロマトグラムを示す。ＴからＣへの変換をＥｄｉｔＲを使用して計算した。ＡＢＥ＋ＣＤ１６ａ  ｇＲＮＡ試料により、切断耐性ＣＤ１６ａバリアントへの変換が実証される。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｄは、ＤＮＡ修復欠損である、ファンコニー貧血（ＦＡ）線維芽細胞が、ＢＥ３およびＢＥ４を使用する塩基編集を受けることができることを実証する図である。（Ａ）ＢＥ４で処置したＦＡ患者由来の線維芽細胞のＦＡＮＣＡ  Ｅｘ．３９  ｃ．３９３４＋２  Ｔ＞Ｃ  ｐｏｓ．４  ｇＲＮＡ標的部位のシーケンシングクロマトグラム。塩基編集の頻度をＥｄｉｔＲソフトウェアにより定量した。（Ｂ）Ａに類似する実験であるが、ＡＢＥおよびＰＤＣＤ１  Ｅｘ．１  ＳＤ  ｇＲＮＡに関して実施した実験からの結果。（Ｃ）対照（ＭＰＳ１）の線維芽細胞およびＢＥ３を使用するＦＡ患者由来の線維芽細胞における塩基編集の詳細。（Ｄ）ＴＩＤＥアルゴリズムを使用して分析したサンガーシーケンシングデータからの、線維芽細胞におけるＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の結果。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、種々の修正および変更形態をとることが可能であるが、その例示的な実施形態が、図面において例として示され、本明細書において詳細に記載されている。しかし、例示的な実施形態の記載は、本発明を開示された特定の形態に限定することを意図するものではなく、反対に、添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の趣旨および範囲内にあるすべての修正、均等物および変更を網羅することを意図することが理解されるべきである。
詳細な説明
以下に限定されないが、この明細書で引用された特許および特許出願を含むすべての刊行物は、本出願においてその全体が示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
本明細書に記載の方法、系、および組成物は、少なくとも部分的に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９塩基エディターを使用する初代ヒトリンパ球造血系細胞のゲノム操作に関するプロトコールの本発明者らによる発見に基づく。相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用することなく点突然変異させるために、研究者らは、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはｄＣａｓ９をシチジンデアミナーゼ様ＡＰＯＢＥＣ１に融合させるＣＲＩＳＰＲ塩基エディターを開発した。ＣＲＩＳＰＲと異なり、塩基編集によって二本鎖ＤＮＡは切断されないが、代わりに、デアミナーゼ酵素を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡを構成する４つの塩基のうちの１つにおける原子のいくつかを正確に再配列させ、その周りの塩基を変更することなく塩基を変換する。塩基エディターはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって特定の遺伝子座へと標的化され、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位の近くの小さな編集ウィンドウ内で、シチジンをウリジンに変換することができる。次に、ウリジンは、塩基除去修復によってチミジンに変換され、ＣからＴへの変化（または反対の鎖におけるＧからＡへの変化）を創出する。塩基除去修復インヒビターＵＧＩがＣａｓ９ニッカーゼに融合されている第３世代の塩基エディター（ＢＥ３系）は、細胞が、ミスマッチ修復のための鋳型として編集された鎖の使用を促されるように、未修飾ＤＮＡ鎖をニックする。結果として、細胞は、鋳型としてＵを含有する鎖（シチジンの脱アミノ化によって導入された）を使用してＤＮＡを修復し、塩基編集を複製する。第４世代の塩基エディター（ＢＥ４系）には、塩基除去修復インヒビターＵＧＩの２つの複製が用いられる。産物の純度が高く（典型的には、少なくとも９９．９％）、インデルの割合が低い（典型的には、０．１％以下）ゲノムＤＮＡにおいて、標的化Ａ・Ｔ塩基対をＧ・Ｃに効率的に変換する（ヒトの細胞において０〜１００％の効率）アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）が開発された。例えば、Gaudelli et al., Nature 551:464-471 (2017)を参照されたい。
【０００９】
以下の段落および実施例に記載されているように、本発明者らのゲノム操作に対する合理化されたアプローチには、ＤＮＡドナー鋳型の存在下で、ノックアウトおよびミスセンス変異による標的化遺伝子破壊ならびに標的化遺伝子ノックインのために塩基エディター（例えば、第３世代および第４世代の塩基エディター、アデニン塩基エディター）が用いられる。これらの方法、系、および組成物の利点は多種多様である。特に、この方法は、単一の方法において遺伝子編集のトリオ：標的化遺伝子ノックアウト、標的化ミスセンス変異、および標的化遺伝子ノックインを作製するのに有用である。本明細書に記載の方法は、リンパ球造血系細胞の生物学および遺伝子機能を研究する、原発性免疫不全症などの疾患をモデル化すること、ならびに疾患を引き起こす点突然変異を修正すること、および治療適用のための新規細胞生成物（例えば、Ｔ細胞生成物）を生成するのに非常に適している。特定の理論または作用機序に拘束されることなく、所定のウイルス組込みパターンの使用および毒性の二本鎖切断の誘導の制限、本明細書に記載の方法、系、および組成物により、より安全で、制御可能な細胞の操作が可能になると考えられる。
【００１０】
したがって、標的遺伝子の転写または翻訳の標的化破壊のための方法が本明細書において提供される。特に、この方法は、スタートコドンの破壊、未成熟ストップコドンの導入、および／またはイントロン／エクソンスプライス部位の破壊の標的化によって、標的遺伝子の転写または翻訳の破壊の標的化を含む。一部の場合には、塩基編集融合タンパク質をコードする核酸配列をガイドＲＮＡと組み合わせるステップであって、それによって、特に、ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣ、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、およびＢ細胞などの初代細胞において、予期せずに高い割合の塩基編集が得られるステップを含む方法が本発明において提供される。本明細書に記載の方法を使用して、効率が改善され、オフターゲットインデル形成速度が低減した、初代細胞における目的の１種以上の遺伝子がノックインおよび／またはノックアウトされ得る。好ましい実施形態では、この方法は、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、およびミスセンス変異を含む多重化された塩基編集のために使用される。
【００１１】
第１の態様では、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞を生成するための方法が本発明において提供される。特に、この方法は、塩基編集成分をリンパ球造血系細胞へとトランスフェクトするステップを含み、ここで、この成分は、（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼドメインに融合したデアミナーゼドメインおよび塩基除去修復インヒビタードメインを含む塩基エディター融合タンパク質をコードするプラスミドであって、Ｃａｓ９ニッカーゼドメインが塩基除去修復ドメインに融合していてもよい、プラスミド；ならびに（ｉｉ）遺伝子改変される標的核酸配列に対する相補性を有する１種以上のｇＲＮＡを含む。トランスフェクトされた細胞を１種以上のｇＲＮＡによって標的とされるスプライス部位の破壊を促進する条件下で培養する場合、標的核酸配列は、トランスフェクトされていない細胞と比べて、塩基エディター融合タンパク質および１種以上のｇＲＮＡによって修飾され、それによって、遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞が生成される。本明細書で使用される場合、用語「リンパ球造血系細胞」は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、ＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）、ならびにリンパ球ならびに血液、骨髄、脾臓、リンパ節、および胸腺の細胞の生成に関与する他の細胞を指す。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「塩基エディター」（「核酸塩基エディター」としても公知）は、Ｃａｓ９ニッカーゼドメインまたはデアミナーゼに融合したデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を含むＣａｓ９融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＵＧＩドメインにさらに融合したＣａｓ９ニッカーゼを含む。一部の実施形態では、ＵＧＩドメインは、この系においても提供されるが、Ｃａｓ９ドメインに融合していない。一部の場合には、塩基編集融合タンパク質は、塩基エディター３（ＢＥ３）または塩基エディター４（ＢＥ４）であり、ここで、ＢＥ３およびＢＥ４は、それぞれ、第３世代の塩基エディターおよび第４世代の塩基エディターを指す。ＢＥ３およびＢＥ４は、Ｃ＞ＧもしくはＡまたはインデル変異を生じ得る。他の場合には、塩基編集融合タンパク質は、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、細菌およびヒトの細胞のＤＮＡにおいて、Ａ・Ｔ塩基対をＧ・Ｃ塩基対に変換するＡＢＥである。例えば、Gaudelli et al., Nature 551:464-471 (2017)を参照されたい。ＡＴＧ「開始」コドンにおいてヌル変異を導入し、標的化遺伝子の発現を破壊するものを含む他の塩基エディターが、本明細書に記載の方法に従って使用するのに好適であることが理解されるであろう。
【００１３】
ある特定の実施形態では、この方法は、スプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）部位または未成熟ＳＴＯＰ（ｐｍＳＴＯＰ）部位を標的とすることによって、遺伝子をノックアウトするステップを含む。このような方法では、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド配列内の１種以上のスプライスアクセプター／ドナー部位を破壊するように設計される。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）は、少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの配列、および多くの場合、生物のゲノム内の標的配列に対して相補的であり、標的塩基対を含む１７〜２３個の連続ヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ標的部位に対して、部分的にまたは全体的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡ標的部位は、標的部位からすぐ下流に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も含む。ＰＡＭ配列の例が知られている（例えば、Shah et al., RNA Biology 10 (5): 891-899, 2013）を参照されたい。
【００１４】
ＳＡ−ＳＤ部位における破壊は、ストップコドンをリードスルーせずに、コード配列および非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をノックアウトすることができるため、特に有利である。ヒトの長い非コードＲＮＡおよび免疫療法に関連するヒトのタンパク質コード遺伝子に対して設計される例示的なＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡを表１に示す。以下の実施例において実証されているように、ＳＡ−ＳＤ部位を標的とするｇＲＮＡを使用する破壊は、ノックアウト効率の観点で、未成熟ＳＴＯＰコドンの導入よりも優れている。塩基編集効率は、サンガーシーケンシングトレースのＥｄｉｔＲ分析によるか、または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による、ゲノムレベルでの、およびフローサイトメトリーによるタンパク質レベルに関して決定することができる。スプライスドナー領域およびスプライスアクセプター領域を標的とするスプライスアクセプター−スプライスドナー塩基編集ｇＲＮＡは、少なくとも５％、一部の場合には、少なくとも８０％またはそれより高い割合で（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）の塩基変換の効率を呈する。一部の場合には、ＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡは、未成熟ストップコドンの破壊を導入するｇＲＮＡよりも、ＣからＴへの変換が有意により効率的である。
【００１５】
ＳＡ−ＳＤ部位を標的とするためのガイドＲＮＡは、すべてのｎｃＲＮＡおよびタンパク質コード遺伝子のＳＡ−ＳＤ部位を標的とするｇＲＮＡを特定するＲベースのプログラムを使用して設計することができる。一部の場合には、ユーザーが、参照ゲノム、参照配列のＥｎｓｅｍｂｌの転写物番号、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位、およびエクソン−イントロン境界の上流と下流のサブセットへの距離を供給する。プログラムは、２０塩基対＋エクソン−イントロン境界の上流のＰＡＭの長さおよび下流の１５塩基対の配列を、スプライス部位のモチーフと共に抽出する。一部の実施形態では、ガイド分子は、２０〜１２０塩基長、またはそれより長い長さであり得る。ある特定の実施形態では、ガイド分子は、２０〜６０塩基長、または２０〜５０塩基、または３０〜５０塩基、または３９〜４６塩基であり得る。
【００１６】
一部の場合には、哺乳動物の細胞へとトランスフェクトされた場合に、安定性の増加した化学的に修飾されたｇＲＮＡを使用することが有利である。例えば、ｇＲＮＡは、各ｇＲＮＡの少なくとも１つの５’ヌクレオチドおよび少なくとも１つの３’ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾を含むように化学的に修飾され得る。一部の場合には、３つの末端５’ヌクレオチドおよび３つの末端３’ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾を含むように化学的に修飾される。
【００１７】
ある特定の実施形態では、この方法は、（ｉ）鋳型からの相同組換え修復（ＨＤＲ）または（ｉｉ）ウイルスベクターの組込みによって、ドナー配列の挿入を媒介する塩基編集ニッカーゼ活性を用いる。このような方法では、Ｃａｓ９ニッカーゼドメインによって、挿入部位を標的とするｇＲＮＡを使用して、ＤＮＡドナー鋳型の存在下で、標的化遺伝子ノックインが促進される。一部の場合には、ドナー配列は、内因性セーフハーバー遺伝子座、例えば、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、アデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）、ＲＯＳＡβｇｅｏ２６（Ｒｏｓａ２６）、アルブミン（ＡＬＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）、および／またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）に組み込まれる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするように設計することができる。このような場合には、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的部位に対して相補性を有する。標的化ノックイン（ＫＩ）を例証する図１６を参照すると、ＢＥニッカーゼ活性は、ｒＡＡＶ  ＤＮＡドナーの送達と組み合わせた場合にＨＤＲを刺激するのに非常に有効である。一部の場合には、標的挿入部位に対して相補的な２つのガイドＲＮＡを使用するＢＥの効率は、単一のｇＲＮＡの使用、またはＣａｓ９ヌクレアーゼもしくはＣａｓ９ニッカーゼの使用と比べて非常に改善された。
【００１８】
実施形態としては、同時に起こる多重遺伝子編集方法が挙げられる。例えば、塩基編集を使用する、ヒト細胞における多重操作のための方法が本発明において提供される。一部の場合には、この方法は、塩基エディター融合タンパク質（例えば、ＢＥ３、ＢＥ４、ＡＢＥ）および１種以上の遺伝子が破壊され（ノックアウトのために）、かつ１種以上の遺伝子が挿入のためにドナーＤＮＡ鋳型を使用してノックインされるｇＲＮＡを含む。図１２を参照すると、ヒトＴ細胞において、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１のノックアウト発現を成功させるために、塩基エディター３（ＢＥ３）および塩基エディター４（ＢＥ４）を３つのＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡと共に使用した。また、ＢＥ３およびＢＥ４を、ドナーＤＮＡ鋳型をノックインするために、２つのＡＡＶＳ１を標的とするｇＲＮＡを含むこれらの３つのＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡと共に使用した。これらのデータは、本発明において提供される塩基編集方法が、標的ＤＮＡ鋳型またはミスセンス変異のノックインの有無にかかわらず、細胞（例えば、Ｔ細胞）における免疫療法に関連する複数の遺伝子の多重破壊に有用であることを実証する。
【００１９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで、原核細胞または真核細胞においてゲノム操作するための（例えば、１種以上の遺伝子または１種以上の遺伝子産物の発現を変更するかまたは操作するための）方法も本明細書において提供される。特に、本発明において提供される方法は、ヒトＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、さい帯血ＨＳＰＣ）、および線維芽細胞（例えば、ＭＰＳ１線維芽細胞、ファンコニー貧血線維芽細胞）を含む哺乳動物細胞における標的化塩基編集による破壊に有用である。重要なことに、図２１Ａ〜２１Ｄに示されているように、ファンコニー貧血（よって、ＤＮＡ修復欠損の）患者由来の線維芽細胞は、依然として、例えば、ＢＥ３、ＢＥ４、またはＡＢＥを使用する塩基編集を受けることができる。したがって、本明細書に記載の方法に従って改変されたＴ細胞などの遺伝子操作されたリンパ球造血系細胞も本発明において提供される。
【００２０】
一部の場合には、この方法は、治療適用のために「普遍的に許容される」細胞として好適である遺伝子操作されたＴ細胞を生成するために構成される。本明細書で使用される場合、用語「普遍的に許容される」は、免疫学の用語において細胞産物の一般的許容性を指し、ここで、患者および細胞の交差マッチングは必要とされず、免疫抑制は必要とされない。このような細胞を得るために、この方法は、例えば、（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼドメインに融合したデアミナーゼドメインを含む塩基エディター融合タンパク質をコードするプラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質であって、ニッカーゼドメインが塩基除去修復インヒビタードメインを含む、プラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質、（ｉｉ）ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１のそれぞれの発現を破壊するための１種以上のスプライスアクセプター−スプライスドナー（ＳＡ−ＳＤ）ｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするドナーＤＮＡ鋳型、ならびに（ｉｖ）標的挿入部位に対して相補的な２つのｇＲＮＡをヒトＴ細胞へとトランスフェクトするステップを含み得る。この方法は、ＳＡ−ＳＤ  ｇＲＮＡによって標的とされるスプライス部位の破壊を促進する条件下で、トランスフェクトされたＴ細胞を培養するステップであって、それによって、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１遺伝子産物の発現が、トランスフェクトされていないＴ細胞と比べて低減されるステップと、標的挿入部位においてドナーＤＮＡ鋳型の標的化ノックインを促進する条件下で、トランスフェクトされたＴ細胞を培養するステップとをさらに含む。この例では、得られた遺伝子改変されたＴ細胞はＣＡＲ／ＴＣＲを発現し、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＢ２Ｍの発現を欠く。一部の場合には、この方法は、ＣＴＬＡ−４の発現を破壊するように設計されたｇＲＮＡを導入するステップをさらに含む。遺伝子ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＢ２Ｍにおける標的塩基を編集するための例示的なｇＲＮＡの配列を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2021517815.tif 000003
【００２２】
塩基編集融合タンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼドメインまたは不活性化Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメイン（デッドＣａｓ９またはｄＣａｓ９と称される）に融合したデアミナーゼドメインを含み、ここで、一部の場合には、デアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼである。ＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼドメインによって、シチジンの代わりにチミジンの単一塩基の置換がなされる標的化遺伝子破壊が可能となる。
【００２３】
別の態様では、塩基編集の修正のために疾患を標的とするための方法が本発明において提供される。標的配列は、当技術分野で確立されている、任意の疾患関連ポリヌクレオチドまたは遺伝子であり得る。内因性遺伝子配列の変異または「修正」の有用な適用の例としては、疾患関連遺伝子変異の変更、スプライス部位をコードする配列における変更、制御配列における変更、機能獲得型変異を引き起こす配列における変更、および／または機能喪失型変異を引き起こす配列における変更、ならびにタンパク質の構造的特徴をコードする配列の変更の標的化が挙げられる。
【００２４】
別の態様では、切断耐性Ｆｃ受容体を得るために塩基編集を使用するための方法が本発明において提供される。例えば、一部の場合には、塩基編集酵素の変異原性ドメインを使用して、より高い親和性を有するＦＣγＲＩＩＩａ（ＩｇＧ受容体ＩＩＩａのＦｃ断片）遺伝子産物（ＣＤ１６ａとしても公知）を生じる変異を誘導する。したがって、この方法は、塩基編集のための成分（例えば、ＢＥ３、ＢＥ４、ｇＲＮＡ、ドナー鋳型）をナチュラルキラー細胞中に導入し、ＮＫ細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増強するＣＤ１６ａにおける変異を導入するステップを含み得る。図１８Ａ〜１８Ｄを参照すると、本発明において提供される方法に従う塩基編集によって、ＣＤ１６ａを切断耐性形態へと改変することによって、ＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞の改変に成功した。ＢＥ３−ＶＱＲおよびＣＤ１６ａ  ｇＲＮＡを使用して、４０％のＣからＴへの編集効率が得られた。
【００２５】
一部の場合には、本明細書に記載の方法を使用して、細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、細胞を遺伝子改変することが有利であろう。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔ−ボディ」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることがある。本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインに作動可能に連結した抗体の細胞外抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ））を含む、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドを指す。一般的に、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、目的の標的細胞の表面に発現される特定の抗原に対して特異性を有する。例えば、Ｔ細胞は、Ｂ細胞リンパ腫上のＣＤ１９に対して特異的なＣＡＲを発現するよう操作され得る。ドナーマッチングによって制限されないアロジェニックな抗腫瘍細胞療法では、ＣＡＲをコードする核酸をノックインするだけではなく、ドナーマッチングを担う遺伝子（ＴＣＲマーカーおよびＨＬＡマーカー）をノックアウトするよう細胞を操作することができる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子改変された」および「遺伝子操作された」は交換可能に使用され、挿入するために使用される方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む原核細胞または真核細胞を指す。一部の場合には、エフェクター細胞は、ヒトの手によって創出または改変された天然に存在しない核酸分子を含むよう改変されるか（例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して）、またはこのような分子に由来する（例えば、転写、翻訳などによって）。外因性、組換え、合成、および／またはその他の場合には改変されたポリヌクレオチドを含有するエフェクター細胞は、操作された細胞であると考えられる。
【００２７】
一部の実施形態では、塩基エディターおよびガイド分子を含む成分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞に送達され得る。一部の場合には、ウイルスまたはプラスミドベクター系は、本明細書に記載の塩基編集成分を送達するために用いられる。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスまたはバキュロウイルスまたは好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであるが、送達の他の手段も公知であり（例えば、酵母系、マイクロベシクル、遺伝子銃／金ナノ粒子にベクターを付着する手段）、企図されている。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡおよび塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸は、細胞に送達するために、１種以上のウイルス送達ベクター内にパッケージングされる。好適なウイルス送達ベクターとしては、限定されないが、アデノウイルス／アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクターが挙げられる。一部の場合には、当技術分野で公知である非ウイルストランスファー方法を使用して、核酸またはタンパク質を哺乳動物細胞に導入することができる。核酸およびタンパク質は、薬学的に許容されるビヒクルと共に、または例えば、リポソーム内に封入されて送達され得る。他の送達手段も公知であり（例えば、酵母系、マイクロベシクル、遺伝子銃／金ナノ粒子にベクターを付着する手段）、企図されている。一部の場合には、細胞は、ｇＲＮＡおよび塩基エディター（例えば、ＢＥ３、ＢＥ４、ＡＢＥ）を取り込むために電気穿孔される。一部の場合には、ＤＮＡドナー鋳型は、電気穿孔によるｇＲＮＡ、塩基エディター、およびベクターの導入後に培養培地にウイルス上清を添加することによって、アデノ随伴ウイルス６型（ＡＡＶ６）ベクターとして送達される。
【００２８】
挿入または欠失（インデル）形成の割合は、適切な方法によって決定することができる。例えば、サンガーシーケンシングまたは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、インデル形成の割合を検出することができる。好ましくは、接触させることにより、塩基編集の際に２０％未満のオフターゲットインデル形成が生じる。接触させることにより、塩基編集の際に、少なくとも２：１の意図した産物対意図していない産物が生じる。
【００２９】
本発明において提供される方法に有用な細胞は、新たに単離された初代細胞であるか、または初代細胞培養の凍結されたアリコートから得ることができる。一部の場合には、細胞は、ｇＲＮＡおよび塩基編集融合タンパク質の取り込みのために電気穿孔される。以下の実施例において記載されているように、いくつかのアッセイのための（例えば、Ｔ細胞のための）電気穿孔条件は、１４００ボルト、１０ミリ秒のパルス幅、３パルスを含み得る。電気穿孔の後、電気穿孔されたＴ細胞は、細胞培養培地中で回収され、次いで、Ｔ細胞拡大培地中で培養することが可能である。一部の場合には、電気穿孔された細胞は、約５〜約３０分（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０分）間で、細胞培養培地中で回収することが可能である。好ましくは、回収細胞培養培地は、抗生物質または他の選択剤を含まない。一部の場合には、Ｔ細胞拡大培地は、ＣＴＳ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ  Ｔ細胞拡大完全培地である。
【００３０】
用語「核酸」および「核酸分子」は、本明細書で使用される場合、核酸塩基および酸性部分、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを含む化合物を指す。典型的には、ポリマー核酸、例えば、３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は、隣接するヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結している直鎖分子である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３つのヌクレオチドのストリング）を指すために交換可能に使用され得る。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＮＲＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体の文脈で天然に存在し得るか、または他の天然に存在する核酸分子であり得る。一方、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノム、もしくはその断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得るか、あるいは天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオシドを含み得る。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。核酸は、天然の供給源から精製され、組換え発現系を使用して精製され、任意に精製され、化学的に合成され得る。該当する場合、例えば、化学的に合成された分子の場合には、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖を有する類似体などのヌクレオシド類似体、および骨格修飾を含み得る。核酸配列は、別段に示されていなければ、５’から３’の方向に示される。一部の実施形態では、核酸は、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレートされた塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ）；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／もしくは修飾されたホスフェート基（例えば、ホスホロチオエートおよび５���−Ｎ−ホスホラミダイト連結）であるか、またはそれらを含む。
【００３１】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書において交換可能に使用され、ペプチド（アミド）結合によって互いに連結したアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長であることになる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集合を指し得る。例えば、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドにおけるアミノ酸のうちの１種以上は、例えば、炭水化物基、水酸基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能基化、または他の修飾のためのリンカーなどの化学的実体の付加によって修飾されてもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、単一の分子であってもよく、または複数の分子の複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なる断片であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するか、組換え体であるか、もしくは合成であるか、またはそれらの任意の組合せであってもよい。タンパク質は、様々なドメイン、例えば、核酸結合ドメインおよび核酸切断ドメインを含んでもよい。一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質性の部分、例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列、および有機化合物、例えば、核酸切断剤として作用することができる化合物を含む。
【００３２】
この開示を解釈する際に、すべての用語は、文脈に矛盾しない最も広い可能な意味で解釈されるべきである。この開示において記載されている本発明の特定の適応は、当業者にとって日常的な最適化の問題であり、本発明の趣旨、または添付の特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく実施することができる。
本明細書で使用される場合、用語「合成の」および「操作された」は交換可能に使用され、ヒトの手によって操作された態様を指す。
本発明において提供される組成物および方法をより容易に理解することができるように、特定の用語が定義される。
【００３３】
この明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段に明確に示していなければ、複数の対象を含む。本明細書において、「または（ｏｒ）」へのいずれの言及も、別段に記載されていなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を包含することを意図する。
【００３４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的であるかまたはオープンエンドであり、追加の、記載されていないメンバー、要素、または方法のステップを排除しない。本明細書で使用される表現法および用語法は、説明を目的とするものであり、限定とみなされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関与する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびこれらの変形は、以降に列挙される項目および追加の項目を包含することを意味する。ある特定の要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と言及された実施形態はまた、これらの要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」として企図される。特定の要素を修飾するための、請求項における順序を示す用語、例えば、「第１の」、「第２の」、「第３の」などの使用は、１つの請求項の要素について、別の請求項の要素に対するいかなる優先度、優位性、もしくは順序、または方法の行為が実施される時間順序も、それ自体では包摂しない。順序を示す用語は、請求項の要素を識別するために、特定の名称を有する１つの請求項の要素を同じ名称（順序を示す用語の使用がなければ）を有する別の要素と識別するための単なる標識として使用されるに過ぎない。
【００３５】
本明細書で使用される場合、１種以上の標的核酸配列を「改変する（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）」（「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」）とは、（１種以上の）標的核酸配列のすべてまたは一部を変更することを指し、標的核酸配列のすべてまたは一部の切断、導入（挿入）、置換え、および／または欠失（除去）を含む。標的核酸配列のすべてまたは一部は、本発明において提供される方法を使用して完全にまたは部分的に改変され得る。例えば、標的核酸配列を改変することは、標的核酸配列のすべてもしくは一部を１種以上のヌクレオチド（例えば、外因性核酸配列）と置き換えること、または標的核酸配列のすべてまたは一部（例えば、１種以上のヌクレオチド）を除去もしくは欠失することを含む。１種以上の標的核酸配列を改変することは、１種以上のヌクレオチド（例えば、外因性配列）を１種以上の標的核酸配列中（内）に導入または挿入することも含む。
【００３６】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、一般的に、測定値の性質または精度を考慮して、測定された量の誤差の許容される度合いを意味する。典型的には、例示的な誤差の度合いは、所与の値または値の範囲の１０％以内、好ましくは５％以内である。あるいは、および特に、生物系では、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所与の値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内である値を意味し得る。本明細書で与えられる数量は、別段に記載されていなければ、明確に記載されていない場合に用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が推測され得ることを意味する近似である。
【００３７】
別段に定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈において別段に明確に示されていなければ、単一および複数の参照を含む。よって、例えば、「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、単一の薬剤および複数のこのような薬剤を含む。本明細書において、「または（ｏｒ）」へのいずれの言及も、別段に記載されていなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を包含することを意図する。
この発明による組成物および方法の様々な例示的な実施形態を以下の非限定的な実施例において、ここに記載する。実施例は、例証の目的のためだけに与えられ、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際に、本明細書で示され、記載されているものに加えて、様々な修正が、前記説明および以下の実施例から当業者には明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【実施例】
【００３８】
このセクションは、８０％の高効率で、初代ヒトリンパ球造血系細胞における４つの異なる遺伝子をノックアウトするための、第３および第４世代の塩基エディターの使用の成功を実証する。スプライス部位の破壊は、遺伝子ノックアウトに関して未成熟ストップコドンよりもより有効であることが判明した。より後の世代の塩基エディターのＣａｓ９ニッカーゼ機能として、標的化遺伝子ノックインはまた、ドナー鋳型を送達するためにＡＡＶ６ベクターを投与した後に、最大７０％の効率で達成された。まとめると、本明細書に記載のアッセイおよび結果によって、操作されたＴ細胞ベースの免疫療法の安全性と有効性の両方を増強する多重遺伝子編集プラットフォームの改善が実証される。
【００３９】
（実施例１）
スプライス部位の塩基編集
以前に、塩基編集を使用して、マウスおよび哺乳動物細胞において、遺伝子ノックアウトのための未成熟ストップ（ｐｍＳＴＯＰ）コドンが誘導された15~18。しかし、本発明者らは、スプライス部位の破壊が、ｐｍＳＴＯＰコドンの誘導に優るいくつかの利点を有し得ると判断した（図１）。例えば、ストップコドンのリードスルーが一部の遺伝子において最大３１％の頻度で生じることが示され、細胞ストレスの条件下で促進される場合がある19、20。スプライス部位の編集は、翻訳レベルでは回避されにくい、ＲＮＡレベル２１での遺伝子のプロセシングを変更するため、この懸念を軽減する。さらに、現在の塩基エディターは、厳密なＣからＴへの編集を生じず、最近の塩基エディターでさえ、最大２５％の非標的編集（ＣからＧ／Ａへの）しか生じない22。ｐｍＳＴＯＰの文脈では、非標的編集によって未成熟ストップコドン形成が排除され、それによって、タンパク質ノックアウトの効率が低下し、代わりに、望ましくないアミノ酸変化が引き起こされることが予想される。
【００４０】
ｐｍＳＴＯＰの導入とスプライス部位の破壊の両方の性能を評価するために、本発明者らは、アミノ酸コドンをｐｍＳＴＯＰに変換するかまたはＰＤＣＤ１、ＴＲＡＣ、およびＢ２Ｍ内のスプライスドナー（ＳＤ）およびアクセプター（ＳＡ）配列を破壊するために単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のパネルを設計した（図２Ａ、２Ｅ、２Ｉ；表１）。個々のｓｇＲＮＡを、電気穿孔によって、Ｔ細胞へと、第１世代のＢＥ３13  ｍＲＮＡまたはＢＥ４22  ｍＲＮＡで化学的に修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチド23と同時送達した。標的ＣからＴへの編集の割合を、遺伝子レベルでの塩基編集の分析を効率化し、その費用を節約するために本発明者らのグループが開発した分析ソフトウェア24（ワールドワイドウェブのｂａｓｅｅｄｉｔｒ．ｃｏｍにおいて利用可能）である、サンガーシーケンシングおよびＥｄｉｔＲによって評価した。
【００４１】
最初に、本発明者らは、８つのｓｇＲＮＡ（そのうちの３つはｐｍＳＴＯＰコドンを導入することが予測され、２つはＳＤ部位の破壊を標的とし（ＧＴ：ＣＡ）、かつ３つはＳＡ部位の破壊を標的とした（ＡＧ：ＴＣ））を設計することによって、チェックポイント遺伝子ＰＤＣＤ１（ＰＤ−１としても公知）を標的とした（図３Ａ）。本発明者らは、ｓｇＲＮＡのＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡとの同時送達により、すべての標的遺伝子座における標的Ｃの測定可能な編集が媒介され、いくつかの候補ｓｇＲＮＡは、他のものより有意に高い編集割合を呈することを見出した（図３Ｂ；図７Ａ〜７Ｃ）。具体的には、本発明者らは、ＰＤＣＤ１のエクソン１のＳＤ部位を標的とすることによって、ＢＥ３（５１．３±７．０％、Ｍ±ＳＤ）ｍＲＮＡとＢＥ４（６３．７±２．１％）ｍＲＮＡの両方で、最も高い割合の標的ＣからＴへの編集が生じることを見出した（図３Ｂ）。次の２つの最も効率のよいｓｇＲＮＡは、エクソン３のＳＡ部位（ＢＥ３に関して３２．６±５．５％；ＢＥ４に関して３６．０±４．０％）およびエクソン２における候補ｐｍＳＴＯＰ部位（ＢＥ３に関して３７．１±１．２％；ＢＥ４に関して４８．５±３．７％）を標的とした（図３Ｂ）。遺伝子編集によってタンパク質損失が生じるか否かを決定するために、本発明者らは、フローサイトメトリーによってＰＤ−１タンパク質の発現を評価した。本発明者らの遺伝子分析と一致して、ＰＤＣＤ１のエクソン１のＳＤを標的とすることにより、最も高い割合のタンパク質損失が生じ（ＢＥ３に関して６９．５±７．０％；ＢＥ４に関して７８．６±４．１％）、続いて、エクソン３のＳＡ（ＢＥ３に関して４０．６±７．８％；ＢＥ４に関して４４．７±３．８％）、エクソン２のｐｍＳＴＯＰ（ＢＥ３に関して３７．９±３．４％；ＢＥ４に関して５１．５±９．０％）であった（図３Ｃ）。
【００４２】
本発明者らのＰＤＣＤ１の結果の情報を用い、本発明者らは、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡに焦点を当てたパネルを設計した。ここで、本発明者らは、ＣからＴへの変換が、エクソン１のＳＤ部位（ＢＥ３に関して４７．６±４．６％；ＢＥ４に関して６０．０±１１．３％）およびエクソン３のＳＡ部位（ＢＥ３に関して４０．３±９．７％；ＢＥ４に関して６２．３±１１．０％）で最も高く、ＢＥ４が、各標的においてＢＥ３よりも高い編集割合を呈したことを見出した（図３Ｆ）。効率的な編集は、いずれかのスプライス部位を破壊するｓｇＲＮＡのものよりも効率がより低いにもかかわらず、エクソン３における２つのｐｍＳＴＯＰ候補部位でも観察された。エクソン１のＳＤ部位とエクソン３のＳＡ部位の両方が同様の頻度で編集されたが、それにもかかわらず、エクソン３のＳＡ部位の破壊により、細胞表面のＣＤ３発現の損失によって測定した、最も高い割合のＴＣＲの破壊がもたらされた（ＢＥ３に関して６９±１５．３％；ＢＥ４に関して８３．７±５．８％）（図３Ｇ）。
【００４３】
次に、本発明者らは、同様の戦略を使用して、Ｂ２Ｍを標的とした（図３Ｉ）。エクソン１のＳＤ部位を標的とするｓｇＲＮＡと共に送達されたＢＥ４  ｍＲＮＡは、標的塩基の最も効率的なＣからＴへの変換を示し（ＢＥ３に関して５８．３±２．５％；ＢＥ４に関して７０．３±３．２％）（図３Ｊ）、Ｂ２Ｍタンパク質の有効なノックアウトをもたらす（ＢＥ３に関して７９．１±１．３％；ＢＥ４に関して８０．０±３．２％）（図３Ｋ）ことを示した。本発明者らはまた、比較的効率的なＣからＴへの編集（ＢＥ３に関して４３．３±５．７％；ＢＥ４に関して５５．７±５．０％）、およびタンパク質ノックアウト（ＢＥ３に関して５６．２±５．１％；ＢＥ４に関して６１．５±１．８％）（図３Ｊ、３Ｋ）をもたらしたエクソン２における候補ｐｍＳＴＯＰ部位を特定した。注目すべきことに、ノンコーディングエクソン３のＳＡ部位を標的とすることにより、効率的なＣからＴへの編集が生じたが、タンパク質発現において検出可能な低減はもたらさなかった（図３Ｊ、３Ｋ）。
【００４４】
非標的編集（すなわち、ＣからＡまたはＧへの）は、ＢＥ３に関して報告された13、Ｃ末端に連続して融合した第２のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含有するＢＥ４で低減する22。本発明者らは、ＢＥ３およびＢＥ４を含む本発明者らの最も効率的なｓｇＲＮＡの編集ウィンドウ（主に、プロトスペーサーの塩基４〜８）内のすべてのＣについて、非標的編集割合を評価した。期待した通り、ＢＥ４は、すべての遺伝子座で、ＢＥ３と比較して非標的編集の低減を示した（−１４％±６．６％、Ｐ＜２．２ｅ−１６、対応のある一元ｔ検定）（図３Ｄ、３Ｈ、３Ｌ；図７Ａ〜７Ｃ）。ニッカーゼ機能しか有さないにもかかわらず、ＢＥ３とＢＥ４の両方で、低レベルのインデル形成が観察された13、22。よって、本発明者らは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、編集後にすべての標的部位でインデルの頻度を測定した（図８Ａ〜８Ｃ）。インデルは、標的部位に基づいて変化するレベルで、ＢＥ３とＢＥ４の両方で検出可能であった。以前の刊行物と一致して、ＢＥ４は、全体的に低減したインデルの頻度を呈した（−４．８％±６．１％、Ｐ＜４．６ｅ−１６、対応のある一元ｔ検定）（図８Ａ〜８Ｃ）22。
【００４５】
機能が増強された、アロジェニックな「既製の」Ｔ細胞を生成するために利用され得る多重編集戦略を評価するという本発明者らの目的に向かって、本発明者らは、各遺伝子に対する本発明者らの最も上位のｓｇＲＮＡを第１世代のＢＥ３  ｍＲＮＡまたはＢＥ４  ｍＲＮＡと同時送達した。驚くべきことに、各標的におけるノックアウト効率は、多重設定で送達された場合、ＢＥ３とＢＥ４の両方について、実質的に低減した（図９）。編集効率の低減がタンパク質レベルが低いことに起因するかどうかを決定するために、本発明者らは、等用量のＢＥ３  ｍＲＮＡ、ＢＥ４  ｍＲＮＡ、およびヌクレアーゼ活性化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）  ｍＲＮＡをＴ細胞へと送達し、電気穿孔の２４時間後にタンパク質発現を測定した。際立ったことに、ＳｐＣａｓ９タンパク質発現は、これらの時点で容易に検出することができたが、ＢＥ３タンパク質およびＢＥ４タンパク質は検出不可能であった（図１０）。この問題に対処するために、本発明者らは、最初に、本発明者らの最初の多重実験で使用した用量（１．５μｇ）よりも２倍多い用量（３μｇ）のＢＥ３  ｍＲＮＡおよびＢＥ４  ｍＲＮＡを送達した。この戦略は、各遺伝子座における編集効率を改善したが、その効率は、本発明者らの単一の遺伝子標的実験で観察されたものよりも依然として低かった（図４Ａ）。
【００４６】
これらの実験の経過中、ヒト細胞において、転写効率と翻訳効率の両方を著しく低減する、第１世代のＢＥ３およびＢＥ４発現ベクターの使用に関する問題を特定する独立した報告が出現した17、25。この問題を回避するために、本発明者らは、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体として、精製したＢＥ４タンパク質を、各標的に対して最も効率的な本発明者らのｓｇＲＮＡと共に送達した。ＲＮＰ送達に関する本発明者らの電気穿孔プロトコールを最適化することによって、本発明者らは、ＢＥ４  ＲＮＰが、２倍用量の第１世代のＢＥ４  ｍＲＮＡに対して改善された編集効率を媒介したことを見出した（図４Ｃ）。次に、本発明者らは、ＢＥ４の配列をコドン最適化し（ｃｏＢＥ４）、ｍＲＮＡとして送達された場合に、タンパク質発現の増加を観察した（図１０）。ｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡが、本発明者らの標準的な用量（１．５μｇ）とより高い用量（４μｇ）の両方で、本発明者らの最適なｓｇＲＮＡのうちの３つすべてと共に送達された場合、本発明者らは、複数の独立したＴ細胞ドナーにわたって、３つの遺伝子座のすべてで、実質的により高い割合の多重標的ＣからＴへの編集を達成し、いくつかの例では９０％を超えた（図４Ａ）。第１世代のＢＥ３  ｍＲＮＡおよびＢＥ４  ｍＲＮＡで観察された非標的編集は、ＢＥ４  ＲＮＰを使用する場合にわずかに低減し、両方の用量のｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡでさらに低減した（図４Ａ）。次に、本発明者らは、以前の研究に従って、多重塩基編集後に、各標的部位におけるインデル形成の割合を評価し、ＢＥ３およびＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと比較して、ＢＥ４のすべての形態で、各部位におけるより低い割合のインデル形成を見出した（図４Ｂ、４Ｃ）。低用量のｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡと高用量のｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡの両方は、調べたすべての部位で、最も低いインデル形成の全体的頻度を呈した（図４Ｂ）。
【００４７】
フローサイトメトリーによって、各標的遺伝子に関して、多重タンパク質ノックアウトを分析し、タンパク質損失の頻度は、遺伝子編集の頻度と十分に相関した（図４Ｄ、ｒ＝０．９０、ｄｆ＝２８、Ｐ＝１．３ｅ−１１）。ＢＥ４  ＲＮＰは、第１世代のＢＥ３  ｍＲＮＡおよびＢＥ４よりも効率的なタンパク質ノックアウトを実証したが、それにもかかわらず、ｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡは最も効率的であり、低用量と高用量のｍＲＮＡの両方で、各遺伝子に対して９０％を超えるタンパク質損失であった（図４Ｄ；図１１）。多重編集についての重要な検討事項は、遺伝子ノックアウトのそれぞれ可能性のある組合せを有する得られた細胞の割合である。本発明者らの実験においてこの現象をより深く理解するために、本発明者らは、フローサイトメトリーによって、すべての標的遺伝子のタンパク質発現を同時に評価し、ＳＰＩＣＥ分析を使用して、ノックアウトなし、単一の遺伝子ノックアウト、二重遺伝子ノックアウト、または三重遺伝子ノックアウト；およびこれらの画分のそれぞれの中のタンパク質損失の組合せを有する個々の細胞の割合を決定した（図４Ｅ）。第１世代のＢＥ４  ｍＲＮＡは、様々な組合せのノックアウト表現型を有する終了時の細胞集団を生じたが、三重ノックアウト細胞の頻度が低かった（２１．９±１．１％）。三重ノックアウト細胞の割合は、ＢＥ４  ＲＮＰを使用すると実質的により高く（６８．６±０．３７％）、１．５μｇ（８６．６±３．７５％）と４μｇ（８９．５７±４．２％）のｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡではさらに増加した（図４Ｆ）。
【００４８】
オフターゲット（ＯＴ）ＤＳＢ誘導は、ヌクレアーゼプラットフォームが直面している重要な課題である26。本発明者らの最適なｓｇＲＮＡの特異性を決定するために、本発明者らは、それぞれを個別にＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＢＥ４  ｍＲＮＡと共に送達し、ＮＧＳによって予測される上位１０個のＯＴ部位で編集を評価した（表２）。ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＢＥ４の処理条件のいずれにおいても、予測されたＢ２ＭまたはＴＲＡＣのＯＴ部位のいずれにおいても編集は観察されなかった（図１２）。予測されたＰＤＣＤ１のＯＴ部位で、本発明者らは、ＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡを使用して、インデル頻度１３．０％を有する単一のＯＴ編集を観察した（図１２）。際立ったことに、この部位でのＣからＴへの編集は、ＢＥ４  ｍＲＮＡに関して０．９％に過ぎず、インデル形成は、本発明者らのアッセイの最低検出限界に近かった（０．２％）（図１２）。
【００４９】
表２  計算により予測される候補オフターゲット部位
【００５０】
【表２−１】
2021517815.tif 000004
【００５１】
【表２−２】
2021517815.tif 000005
【００５２】
【表２−３】
2021517815.tif 000006
【００５３】
【表２−４】
2021517815.tif 000007
【００５４】
【表２−５】
2021517815.tif 000008
【００５５】
【表２−６】
2021517815.tif 000009
【００５６】
【表２−７】
2021517815.tif 000010
【００５７】
【表２−８】
2021517815.tif 000011
【００５８】
【表２−９】
2021517815.tif 000012
【００５９】
【表２−１０】
2021517815.tif 000013
【００６０】
【表２−１１】
2021517815.tif 000014
【００６１】
ヌクレアーゼに媒介される多重編集はまた、ヒトＴ細胞において望ましくない転位を生じることが報告されている3。塩基編集は、ＤＳＢ形成の頻度を実質的に低減するため、本発明者らは、本発明者らの塩基編集アプローチを使用して転座が同様に低減されるはずだと判断した。本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して、本発明者らの３つの標的遺伝子座と単一の特定されたＯＴ部位の間に生じることが予測される１２の可能な転座の結果の頻度を定量した（図５Ａ）。ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼまたはｍＲＮＡのいずれかと本発明者らの２つの最適なｓｇＲＮＡの同時送達の後に、本発明者らは、様々な頻度で１２の予測された転座の結果すべてを検出することができた（図５Ｂ、図１３〜１４）。すべての場合で、ＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡは、最も高い割合の転座を生じ、ＴＲＡＣとＢ２Ｍの間の転座は、最も頻度が高かった（２．０４±０．０９％）（図５Ｂ）。対照的に、本発明者らの３つの標的遺伝子座の間の転座の結果は、本発明者らの最適なｓｇＲＮＡと共にＢＥ４  ＲＮＰまたはいずれかの用量のｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡを受けた細胞集団において事実上検出不可能であった（図５Ｂ、図１３）。１つのドナーからの単一の複製では、ＰＤＣＤ１：Ｂ２Ｍのアッセイによって、低用量のｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡに関して２つの陽性ドロップレットが生じた（計算された頻度＝０．００３±０．００６％）。ＢＥ４  ＲＮＰまたは高用量のｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡに関しては陽性ドロップレットが検出されなかったため、これらはアーチファクトであり得る（図１３）。本発明者らの３つの標的遺伝子座と単一の特定されたＯＴ部位の間の転座は、低頻度であるにもかかわらず、ＳｐＣａｓ９で処理されたＴ細胞においても検出されたが、ＢＥ４で処理した試料は、本発明者らのアッセイの検出限界（０．０１％）を超えるシグナルを示さなかった（図５Ｂ、図１４）。
【００６２】
次に、本発明者らは、本発明者らの塩基編集戦略を使用して生成した多重ノックアウトＴ細胞がサイトカインの機能性を保持しており、ＣＡＲを備えた場合に標的細胞の死滅を媒介することが可能であるか否かを決定しようと試みた。本発明者らは、分化マーカーを分析することによって、ＣＤ１９に特異的なＣＡＲの有無にかかわらず、電気穿孔パルス対照とｃｏＢＥ４ノックアウトＴ細胞の両方の表現型評価を実施した27。形質導入されていないＴ細胞とＣＡＲを形質導入したＴ細胞は両方、類似する分化表現型を呈し、エフェクターとメモリーの集団の画分は、対照とｃｏＢＥ４ノックアウトＴ細胞の間で類似していた（図６Ａ）。ＣＡＲの形質導入と細胞拡大は、パルス群とｃｏＢＥ４  ｍＲＮＡ群の間でも同等であった（図１５Ａ〜１５Ｂ）。活性化後、高頻度の形質導入されていないｃｏＢＥ４ノックアウトＴ細胞とＣＡＲを形質導入したｃｏＢＥ４ノックアウトＴ細胞の両方が、サイトカインＩＬ−２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγの頑健な生成を示した（図６Ｂ）。サイトカインの多機能性は、多重編集プロセスの後も同様に保持された（図６Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＣＡＲの形質導入と組み合わせた多重ｃｏＢＥ４編集は、Ｔ細胞の表現型または機能に負の影響を与えなかったことを実証する。最期に、ＣＤ１９  ＣＡＲを備えたｃｏＢＥ４ノックアウトＴ細胞が標的細胞を死滅させる能力を保持しているかどうかを決定するために、本発明者らは、通常は、細胞表面ＰＤ−１を発現するＴ細胞によって死滅を阻害するように作用する、非標的ＣＤ１９neg／ＰＤ−Ｌ１neg  Ｋ５６２；標的ＣＤ１９pos／ＰＤ−Ｌ１neg  Ｒａｊｉ；およびＰＤ−１を過剰発現するよう操作された標的ＣＤ１９pos／ＰＤ−Ｌ１pos  Ｒａｊｉとのｉｎ  ｖｉｔｒｏ同時培養アッセイを行った。対照とｃｏＢＥ４ノックアウトＴ細胞の両方がＣＤ１９posの特異的死滅を媒介したが、ＣＤ１９neg標的細胞の特異的死滅は媒介しなかった（図６Ｄ）。しかし、ｃｏＢＥ４ノックアウトＴ細胞のみが、ＣＤ１９pos／ＰＤ−Ｌ１pos標的細胞の有意な死滅を達成することができ、ＣＤ１９pos／ＰＤ−Ｌ１neg標的細胞のものと同等の死滅効率を有した（図６Ｄ）。
【００６３】
細胞ベースの免疫療法と遺伝子治療の成功のための要件がより理解されるようになり、普遍的な、アロジェニック細胞の生成への熱意が増すにつれて、高度な多重遺伝子編集はもっとありふれたものとなるであろう。しかし、ＤＳＢが、ゲノムの不安定性および細胞死を駆動し得る有毒な損傷であることは十分に報告されてきた11、12。このことは、研究のために細胞を操作する場合にはそれほど重要ではない問題であるが、治療用途のために細胞を遺伝子編集する場合には、形質転換または機能低下をもたらし得る。ＤＢＳ周辺の本発明者らの問題は、複数の、同時ＤＳＢが毒性を増す可能性のある多重遺伝子編集の文脈においてさらに強まる。このことは、別個のＤＳＢ部位の数と可能性のある転座の結果の間の放物線の関係によって強調され、その結果、１０の遺伝子座を標的とする編集戦略によって、インバージョンおよび大規模な欠失などの他の可能性のあるゲノム変更を考慮から外しても、９０の可能な転座が生じ得る。これらの問題を克服するために、本発明者らは、多重Ｔ細胞操作のために塩基エディター技術の使用を実施し、塩基編集によるスプライス部位の破壊によって、ＤＳＢが誘導する標的化ヌクレアーゼの使用と比較して、有効かつ安全なアプローチがもたらされる。
【００６４】
興味深いことに、本発明者らは、トランスフェクトされたｍＲＮＡから発現したｃｏＢＥ４と比較して、ＢＥ４  ＲＮＰを使用する場合に、非標的編集とインデル形成の両方の割合が高いことを見出した。この観察は、直接ＢＥ４タンパク質を送達するのとは対照的に、安定したｍＲＮＡから高いレベルで発現した場合に達成されるＢＥ４滞留時間の延長に起因する。遊離のＵＧＩでさえも、ＢＥ３の文脈で、インデルの頻度と非標的編集の両方を低減することが示されているので28、ｍＲＮＡによって達成された滞留時間の延長によって、ＤＳＢの形成および非標的編集を軽減するＢＥ４  ＵＧＩドメインの追加の能力が可能となり得る28。
【００６５】
本発明者らのこの研究では、本発明者らは、ＣＡＲ−Ｔ療法において現在の業界標準である、ＣＤ１９に特異的なＣＡＲのレンチウイルスによる送達を利用した。しかし、このアプローチには、挿入変異原性のリスク、可変的ＣＡＲ発現、および遺伝子のサイレンシングを含む多くの欠点がある29~31。これらの問題を克服するために、いくつかのグループは、相同組換え（ＨＲ）のためのｒＡＡＶに送達されるＤＮＡドナー鋳型と一緒にＣａｓ９ヌクレアーゼを使用する、高効率の、部位特異的組込みを実証した。これにより、ｒＡＡＶおよびＣａｓ９のオルソログ、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）またはフランシセラノベルラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｅｌｌａ）のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）32、33を使用する部位特異的様式で、治療用導入遺伝子を同時に導入して、安全かつ効率的に多重遺伝子をノックアウトするためにＢＥ４が採用され得る可能性が生じる。Ｃａｓ９オルソログの適用により、相互利用を懸念せずに、ＢＥ４およびＣａｓ９ヌクレアーゼに特異的な別個のｓｇＲＮＡを同時に使用することが可能となるであろう。あるいは、ＤＮＡニックを使用して、効率が低いにも関わらず、ＤＮＡドナー分子としてネイキッドＤＮＡまたはｒＡＡＶを使用して、ＨＲを刺激できることが実証されている34。このことによって、デアミナーゼ活性によって遺伝子ノックアウトを媒介するＢＥ４の能力が、興味深いことに強調されるが、一方、そのニッカーゼ機能によってＨＲが同時に媒介される。このシナリオでは、ｓｇＲＮＡ結合部位には、ＣからＴへの変換による配列変化に起因するＣａｓ９結合の損失を妨げるために、塩基編集ウィンドウ内にシトシンが存在しないことが必要とされ得る。
【００６６】
塩基エディターと標的化ヌクレアーゼの使用の間の注目すべき１つの差は、編集事象からの可能性のある結果の数である。ヌクレアーゼに媒介されるＤＳＢは、可変性の高い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介して修復され、インデルのスペクトラムをもたらし、そのうちの一部は、フレームシフト変異を導入せず、よって、遺伝子発現と機能に対して未知の重要性を有するであろう。代わりに、本発明者らの塩基編集アプローチは、限定された数の結果しか有さず、非標的編集を考慮した場合でさえ、すべてが、ネイティブスプライスドナーまたはアクセプターの機能損失をもたらす。但し、選択的または潜在性のスプライシングによって遺伝子の生物学的機能を維持できるので、ネイティブスプライス部位が、常に非機能的生成物をもたらすわけではないことを考慮することが重要である。
【００６７】
ｓｇＲＮＡ標的部位にわたる小さなｄｄＰＣＲアンプリコン（＞２００ｂｐ）を使用する転座分析によって、最適な試薬を用いる塩基編集によって、検出可能な転座は事実上排除されるが、一方、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは多数の転座を生じ、一部は１．５％もの高い頻度である。注目すべきことに、より規模の大きい欠失も、ＳｐＣａｓ９で処理した細胞からサブクローニングした接合ＰＣＲアンプリコン（約５００ｂｐ）のサンガーシーケンシングによって、転座の部位において特定された（図１７Ａ〜１７Ｂ）。これらのデータは、本発明者らの現在のｄｄＰＣＲアッセイによって検出されない、以前に報告された9、10ものに類似するより多くの複合体ゲノム再配列の存在を示唆する。電気穿孔による細胞間の核酸送達の効率の可変性を考慮して、高レベルのＳｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡを受ける細胞は、より高い頻度で転座を保有することが可能である。
【００６８】
本発明者らは、ＢＥ４が、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと比較して、ＤＳＢ誘導を実質的に低減し、検出可能な転座を生じないことを実証するが、望ましくない事象が生じる可能性は依然として存在する。例えば、ＢＥ４のｒＡＰＯＢＥＣ１は、ＤＮＡ複製の間に、一本鎖ＤＮＡのシトシンを非特異的に編集することが可能である35。あるいは、ＢＥ４のＵＧＩは、非特異的様式で、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを潜在的に阻害し、それによって、正常な哺乳動物細胞において、天然に存在し、かつ高頻度で存在するシトシンの脱アミノ化の塩基除去修復を妨げ得る36。このような意図しない出来事を確定的に記録することは困難であるが、これらの可能性のある事象を調べるさらなる研究は、塩基編集された細胞の臨床解釈の前に取り組まれるべきである。これらの領域の不確実さにもかかわらず、塩基エディターのプラットフォームは、現在のヌクレアーゼ技術と比較して、安全性プロファイルの改善された、治療用初代細胞の高効率な多重操作に関する新規アプローチとなる。
【００６９】
方法
クローニングおよびウイルス生成：Ｔ２ＡによってＲＱＲ８に連結したＣＤ１９キメラ抗原受容体に関するＤＮＡ配列をｇＢｌｏｃｋ  Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ［ＩＤＴ］）として合成した。断片をｐＲＲＬ中にＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ37した（ワールドワイドウェブのｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／３６２４７において利用可能）。Ｇｉｂｓｏｎ反応をＤＨ１０β大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）中に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してコロニーから精製した。サンガーシーケンシングによる確認後に、ウイルス粒子の生成および用量設定のために、クローンをミネソタ大学のＶｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＆  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｃｏｒｅ（ＶＶＣＣ）に送付した。
【００７０】
ガイドＲＮＡの設計：塩基編集によるスプライス部位の破壊のためのｓｇＲＮＡ設計プログラムであるＳｐｌｉｃｅＲ（ワールドワイドウェブのｚ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ｓｐｌｉｃｅｒにおいて利用可能）［ＫｌｕｅｓｎｅｒおよびＬａｈｒら、準備中］を使用して、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計した。ＳｐｌｉｃｅＲは、Ｒ統計プログラミング言語（ｖ．３．４．３）で記載されている。簡潔には、ＳｐｌｉｃｅＲは、標的Ｅｎｓｅｍｂｌの転写物番号、塩基エディターＰＡＭバリアント、およびインプットとしての種を得る。Ｅｎｓｅｍｂｌからのエクソンおよびイントロン配列を使用して、ユーザーに特異的なウィンドウに基づいて、各スプライス部位の周辺の領域をプログラムが抽出する。次いで、Ｎ20−ＮＧＧのパターンを抽出された配列のアンチセンス鎖に適合させる。次いで、適合したパターンを、以前の刊行物13に基づいて予測された編集ウィンドウ内の標的モチーフの位置に基づいてスコア化する。次に、ｓｇＲＮＡを転写物内のそれらの位置に基づいてスコア化し、ここで、転写物における早期のｓｇＲＮＡはより高いスコアを受ける。ｐｍＳＴＯＰを誘導するｇＲＮＡを、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ塩基編集ｇＲＮＡ設計ツール（ワールドワイドウェブのｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ／ｐｕｂ／ｌｉｕ−ｂａｓｅ−ｅｄｉｔｏｒにおいて利用可能）を使用して設計した。
【００７１】
ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離：塩化アンモニウムベースの赤血球溶解を使用して、Ｔｒｉｍａ  Ａｃｃｅｌ  ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎシステム（ＬＲＳ）チャンバーから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、免疫磁気陰性選択によって、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＰＢＭＣ集団から単離した。Ｔ細胞を１ｍＬのＣｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）当たり１０〜２０×１０6個の細胞で凍結させ、必要に応じて培養中に解凍した。
【００７２】
Ｔ細胞の培養：２．５％のＣＴＳ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  ＳＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（１０ｍＭ）、ＩＬ−２（３００ＩＵ）、ＩＬ−７（５ｎｇ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ  Ｔ細胞拡大ＳＦＭ中で、１ｍＬ当たり１×１０6個の細胞で、３７℃および５％のＣＯ2にて、Ｔ細胞を培養した。Ｔ細胞を、２：１のビーズ：細胞比で、電気穿孔前の４８〜７２時間、Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化した。
【００７３】
Ｔ細胞の電気穿孔：４８時間後、Ｄｙｎａｂｅａｄを磁気によって除去し、適切な電気穿孔緩衝液中に再懸濁する前に、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。シングルプレックス実験では、３×１０5個のＴ細胞を、以下の条件下で、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１０μＬのチップ中で、１μｇの化学的に修飾されたｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）と１．５μｇのＳｐＣａｓ９、ＢＥ３、またはＢＥ４のｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で電気穿孔した。１４００ボルト、１０ミリ秒のパルス幅、３回のパルス。２０μＬ当たり１×１０6個のＴ細胞、示したように１．５〜４μｇのＢＥ  ｍＲＮＡ、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムＥＯ−１１５を用いる多重研究のために、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）とＰ３キットを使用した。１０μｇのＳｐＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ  Ｉｏｗａ）、または１２μｇのＢＥ４タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ）の、３μｇの各化学的に修飾されたｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）との、室温で１５分間のインキュベーションによって、ＲＮＰを生成し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムＥＨ−１１５を使用して電気穿孔した。遺伝子移入の後、３７℃、５％のＣＯ2で２０分間、抗生物質を含まない培地中でＴ細胞が回収され、次いで、上記した完全ＣＴＳ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ  Ｔ細胞拡大ＳＦＭ中で培養した。
レンチウイルスによる形質導入：Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ）でコーティングしたプレート上でのスピンフェクションによって、ＭＯＩが２０のｐＲＲＬ−ＭＮＤ−ＣＡＲ１９−ＲＱＲ８レンチウイルスベクター（ＵＭＮ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＆  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｃｏｒｅ）で、トランスフェクションの２４時間後に、Ｔ細胞に形質導入した。
【００７４】
ゲノムＤＮＡの分析：スピンカラムベースの精製によって、電気穿孔の５日後に、ゲノムＤＮＡをＴ細胞から単離した。ＣＲＩＳＰＲにより標的化された遺伝子座のＰＣＲ増幅、ＰＣＲアンプリコンのサンガーシーケンシング、および前述したウェブアプリケーションＥｄｉｔＲ（ワールドワイドウェブのｂａｓｅｅｄｉｔｒ．ｃｏｍにおいて利用可能）24を使用するサンガーシーケンシングトレースの次の分析によって、塩基編集効率をゲノムレベルで分析した。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）も同じＰＣＲアンプリコンに関して実施した。
【００７５】
次世代シーケンシングおよび分析：Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓを使用して、目的の領域周辺の３７５〜４２５ｂｐの部位を増幅するために、Ｎｅｘｔｅｒａユニバーサルプライマーアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を有するプライマーを設計した（表２）。製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従って、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを使用し、［９４℃−２：００］−３０回の［９４℃−０：３０、５５℃−０：３０、６８℃−０：３０］−［６８℃−５：００］−［４℃−維持］のサイクルを使用して、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１％のアガロースゲルからアンプリコンを精製した。インデックスプライマーを用いる次の増幅とＭｉＳｅｑ  ２ｘ３００ｂｐのラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でのシーケンシングのために、試料をミネソタ大学のＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒに提出した。オンターゲット部位に対して、最小の１，０００個のアライメントしたリード対を生成し、オフターゲット部位に対しては、１０，０００個のリード対を生成した。以前に記載したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集分析パイプラインＣＲＩＳＰＲ−ＤＡＶ38を使用して、Ｒａｗ  ｆａｓｔｑファイルを参照配列とｓｇＲＮＡプロトスペーサー配列に対して分析した。出力された「ｓａｍｐｌｅ＿ｓｎｐ．ｘｌｓｘ」と「ｓａｍｐｌｅ＿ｌｅｎ．ｘｌｓｘ」をコンパイルし、カスタムのＲマークダウンスクリプト（Ｒ  ｖ３．４．２）を使用して分析した。
【００７６】
フローサイトメトリー：フローサイトメトリーの前に、シングルプレックスＰＤＣＤ１に破壊されたＴ細胞を、上記したように、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄを使用して、４８時間再刺激した。ＴＲＡＣノックアウトを用いる多重実験では、Ｔ細胞をホルボール１２−ミリステート  １３−アセテート（ＰＭＡ；１００ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とイオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍＬ；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で２４時間活性化した。ＰＭＡ／イオノマイシンで処理したＴ細胞をＰＢＳで洗浄し、培養培地中に再懸濁させ、フローサイトメトリーの前にさらに２４時間インキュベートした。Ｔ細胞を、フルオロフォアをコンジュゲートした抗ヒトＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｂ２Ｍ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体で染色した。抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体（ＱＢＥｎｄ１０）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＣＤ１９−Ｔ２Ａ−ＲＱＲ８  ＣＡＲの発現を検出した39。Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ７８０またはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、細胞生存率を評価した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して、ＬＳＲ  ＩＩまたはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリーにＴ細胞を捕捉し、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０ソフトウェアを使用して、データを分析した。刺激によって、すべての対照Ｔ細胞においてＰＤ−１発現が均一に上方調節されなかったので、ＰＤ−１＋細胞の頻度を正規化した。対照試料におけるＰＤ−１＋細胞のＰＤ−１−亜集団に対する比率（ｒＰＤ１）を使用して、以下のすべての試料について、正規化されていない値（Ｆ°posおよびＦ°pos）からＰＤ−１＋とＰＤ−１−亜集団の正規化された値（Ｆ’’pos’およびＦ’neg’）を計算した。
Ｆ’pos＝Ｆ°pos＋Ｆ°pos（１−ｒＰＤ１）
Ｆ’neg＝Ｆ°neg−Ｆp°os（１−ｒＰＤ１）
【００７７】
サイトカインのプロファイリング：簡潔には、Ｋ５６２細胞もしくはＲａｊｉ細胞、またはＰＤＬ１を過剰発現するように操作されたＲａｊｉ細胞の非存在下または存在下で、２．５％のＣＴＳ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  ＳＲ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、モネンシン（０．７μｇ／ｍｌ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有したＮ−アセチル−Ｌ−システイン（１０ｍＭ）を含有する２００μｌのＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ  Ｔ細胞拡大ＳＦＭ中で、２×１０5個のＴ細胞を１２時間培養した。洗浄後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、およびＣＤ４５ｒｏについて、細胞を表面染色し；ｅＦｌｕｏｒ７８０アミン反応性染料を使用して、分析から死細胞を排除した。透過処理（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）後、ＣＤ３、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）について、細胞を染色した。５×１０4〜１×１０5個の間の事象を、各場合に回収した。試験試料において使用した個々のｍＡｂに関して別々に染色したｍＡｂ捕捉ビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で電子補償を行った。修正Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、細胞を分析した。ＦｌｏｗＪｏバージョン９．９．３を使用して、データを分析した。前方散乱面積対前方散乱高さを使用して、細胞凝集物をゲートアウトし、バックグラウンド染色を低減するために分析から死細胞を除去した。染色とサイトカイン生成のバックグラウンドレベルを、刺激していないＴ細胞を使用して決定した。
【００７８】
転座アッセイ：転座ＰＣＲアッセイを、２回のプライマー＋プローブ  ｑＰＣＲに関する設定を使用して、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ  ＩＡ）を使用して設計した。内部参照プライマー＋プローブセット（ＨＥＸ）および実験プライマー＋プローブセット（ＦＡＭ）からなる二重アッセイとして、各試料をランした。プライマーとプローブをＩＤＴから取り寄せた。製造業者の説明書に従って、アッセイ毎に２００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、プローブとしてｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｄＵＴＰなし）（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して反応を設定した。ドロップレットを作成し、ＱＸ２００  ドロップレット−デジタルＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析した。
【００７９】
細胞毒性アッセイ：ルシフェラーゼを発現するＫ５６２、Ｒａｊｉ、またはＲａｊｉ−ＰＤＬ１細胞を９６ウェル丸底プレート中に播種した（３×１０4個の細胞／ウェル）。Ｔ細胞を計数し、示したＥ：Ｔ比で三連でウェルに添加した。エフェクターを含まない標的細胞は、陰性対照（自然に起こる細胞死）としての役割を果たし、１％のＮＰ−４０と共にインキュベートした標的細胞は、陽性対照（最大の死滅）としての役割を果たした。共培養は、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｄ−ルシフェリン（カリウム塩；Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を２５μｇ／ｍＬの最終濃度で各ウェルに添加し、イメージングの１０分前にインキュベートした。ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙマイクロプレートリーダーを使用して、エンドポイントモードでルミネセンスを読み取った。エフェクターを含まない標的細胞を１００％生存として設定し、実験試料における死滅をこのベースラインに対して測定した。
【００８０】
免疫ブロッティングアッセイ：プロテアーゼとホスファターゼのインヒビター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＯＥＤＴＡＦ−ＲＯ、Ｐ５７２６、およびＰ００４４）を含む完全ＲＩＰＡ緩衝液中で、１×１０6個の細胞からタンパク質を単離した。製造業者のプロトコールに従って、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、２３２２５）を使用して総タンパク質を定量した。３μｇ／μＬの細胞溶解液をランし、製造業者（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）のプロトコールに従って、９５℃で５分間変性した後にＷｅｓプラットフォームで分析した。ＳｐＣａｓ９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号１４６９７）およびアクチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号８４５７）に対する一次抗体を、キットで供給された緩衝液中で、それぞれ、１：１００と１：５０に希釈して使用し、プラットフォームを最適化した二次抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅから購入した。
【００８１】
データ分析および可視化：すべての統計分析をＲ  ｓｔｕｄｉｏで実施した。有意差のレベルをα＝０．０５に設定した。統計検定の前に正規性とホメオダシティ（ｈｏｍｅｏｄａｓｃｉｔｙ）の仮定について、データを分析にかけた。テキストで示したように、スチューデントのペアワイズ片側または両側ｔ検定を使用した。Ｐｒｉｓｍ  ８（Ｇｒａｐｈｐａｄ）、または様々なｔｉｄｙｖｅｒｓｅを用いるＲ  ｓｔｕｄｉｏ（ワールドワイドウェブのｗｗｗ．ｔｉｄｙｖｅｒｓｅ．ｏｒｇ／において利用可能）およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ワールドワイドウェブのｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／において利用可能）のパッケージを使用して、データを可視化した。
データの利用可能性：次世代シーケンシングリードは、公開前にＮＣＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄ  Ａｒｃｈｉｖｅのデータベースに寄託されることになる。
【００８２】
【表３】
2021517815.tif 000015
【００８３】
（実施例２）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における塩基編集
方法
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離：末梢血を冷やした１×ＰＢＳで３：１に希釈した。希釈した血液を１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して滴下添加した。細胞を、ブレーキなしで、４００×ｇで２５分間遠心分離した。バフィーコートを除去し、冷やした１×ＰＢＳで洗浄し、４００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞をＰＢＭＣで凍結させるかまたはＮＫ細胞を精製するために直ぐに使用した。
ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の単離：ＰＢＭＣの密度を１ｍＬ当たり５×１０7個の細胞に調整し、細胞を１４ｍＬのポリスチレン丸底チューブに移した。キットの説明書に従い、ヒトＮＫ細胞濃縮キットまたはヒトＮＫ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＮＫ細胞を単離した。濃縮した細胞を計数し、フローサイトメトリーによって純度（％ＣＤ５６＋、％ＣＤ３＋）を分析した。
【００８４】
ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の刺激：ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を計数し、１ｍＬ当たり１．２５×１０5個の細胞の密度でプレーティングし、トランスジェニックｍｂＩＬ２１  Ｋ５６２フィーダー細胞（クローン９；Denman et al. PLoS One, 2012）と、２：１（フィーダー：ＮＫ）の比で共培養した。共培養の前に、フィーダー細胞に１００グレイでＸ線照射した。フィーダー細胞とＮＫ細胞を５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＢ０培地中に再懸濁させた。３日目と５日目に、培地とＩＬ２を新しくした。７日目に、細胞を計数し、実験に使用した。
フローサイトメトリー：冷やした１×ＰＢＳ＋０．５％のＦＢＳで細胞を洗浄し、抗ヒトＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と抗ヒトＣＤ５６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で染色した。ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して、して、細胞を分析した。
【００８５】
ＮＫ細胞のネオン電気穿孔：刺激したＮＫ細胞をネオントランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。細胞を計数し、１ｍＬ当たり３×１０7個の細胞の密度で緩衝液Ｔ中に再懸濁させた。塩基編集試薬を電気穿孔の前に細胞に添加した：１．５μｇの塩基エディター、１μｇのｇＲＮＡ、１μｇのｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ。１８５０ボルトの１０ミリ秒のパルスを２回で、細胞を電気穿孔した。電気穿孔後に、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５を補充したＢ０培地中に細胞をプレーティングした。１日おきに培地を新しくした。５日目に、塩基編集効率について細胞を分析した。
【００８６】
材料
【００８７】
【表４】
2021517815.tif 000016
【００８８】
【表５】
2021517815.tif 000017
【００８９】
Ｂ０培養培地：６０％ｍＬのＤＭＥＭ  ３０％ｍＬのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２
１０％ｍＬのヒトＡＢ血清
１００Ｕ／ｍＬのペニシリン；
１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン
２０μＭの２−メルカプトエタノール
５０μＭのエタノールアミン
１０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸
１．６ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム
寒剤：ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０
細胞分離試薬：ヒトＮＫ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヒトＮＫ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
電気穿孔試薬：ネオン１０μＬのトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００９０】
（実施例３）
ＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）における塩基編集
材料および方法
培養培地：ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  ＩＩ（ＳＦＥＭ  ＩＩ）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号０９６０５）；１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）；１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）；１００ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ−３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）；１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）；ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１（０．７５μＭの最終濃度）Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ
凍結培地：Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ１０
細胞分離試薬：ヒトＵＣＢ  ＣＤ３４＋濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；複数のバリエーションが上記供給源によって利用可能である）。
他の試薬：他の試薬：ネオンキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、共有減に応じて、複数の選択肢が利用可能である）。
【００９１】
解凍試料：培養に使用したのと同じタイプの培地を使用して、予め温めた培養培地（３７℃）中で細胞を解凍した。１ｍＬの培養培地を１５ｍＬの滅菌コニカルチューブに添加した。単一の氷晶が残るまで、凍結バイアルを３７℃の水浴中で解凍した。バイアルをバイオセーフティキャビネットに直ぐに取り除き、７０％エタノールでスプレーして、ふき取った。バイアルを注意深く開けた。１つのバイアルから１５ｍＬの円錐チューブ中に細胞懸濁液を注意深くピペットで滴下した。さらに１ｍｌの培養培地を滴下添加し、穏やかに回転させた。別の１ｍｌの培養培地を滴下添加し、穏やかに回転させた。さらに４ｍｌの培養培地を添加し、穏やかに混合した。１７５ｇで１０分間遠心分離した。より高い遠心力は細胞死をもたらすであろう。上清を吸引し、細胞ペレットを培養培地中に懸濁させた。細胞を計数し、試験するかまたは培養に置いた。細胞を培養培地中およびインキュベーターに入れるのが遅くならないようにすることが重要である。
【００９２】
ＣＤ３４+ＨＳＰＣの培養：０日目：完全培地中２４ウェルプレートにおいて、１ｍＬ当たり１×１０6個の細胞の密度でプレーティングした。細胞を３７℃および５％のＣＯ2で７２〜９６時間インキュベートし、色と細胞密度に基づいて、必要に応じて培地を添加した。
ＣＤ３４+細胞のネオントランスフェクション：１０μｌのチップ中で３ｅ５の生存可能な細胞を電気穿孔した。電気穿孔パラメーター：１４５０Ｖ、１０ミリ秒、３回のパルス。
すべてのｍＲＮＡを使用するノックアウトでは：１００μｌのチップ：１５μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡ、１０〜２０μｇのｇＲＮＡ−ＲＮＡ；１０μｌのチップ：１．５μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡ、１〜２μｇのｇＲＮＡ−ＲＮＡ。
トランスフェクション後に、細胞を５％のＣＯ2を含有する抗生物質を含まない培地中で、１μｌ当たり３０００個の細胞の密度で、約２０分間細胞をプレーティングした。
回収期間後に、２倍の体積の抗生物質を含有する培地をウェルに添加した。５％のＣＯ2中３７℃で細胞を培養した。
ＣＤ３４＋細胞のｒＡＡＶ形質導入：ｒＡＡＶを氷上で解凍し、細胞を添加する前にウェルを混合した。電気穿孔後の以下の時点で添加した特定のＭＯＩ。
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡにより編集された細胞では：電気穿孔の４〜６時間後にウイルスを添加する。
Ｃａｓ９タンパク質（ＲＮＰ）では：電気穿孔の１５分後にウイルスを添加する。
【００９３】
電気穿孔後の拡大：培地添加の指標として観察された電気穿孔後の培地の色。タイミングは、特定の実験／ドナーに関する細胞の健康に応じて変わることになる。培地の色がオレンジ色に変わると（一部の場合には、早くても４８時間）、本発明者らは、２倍の濃度のサイトカインを含有する培養培地（「２×培地」）を使用して培養培地の体積を２倍にした。培養期間の経過に対して、このプロセスを必要に応じて継続した。
一部の場合には、細胞が非常に急速に成長し（特におよそ７〜９日目）、培地が素早く消費される場合、細胞をスピンダウンし、２〜３倍の体積の１倍の培地中で再構築した。
【００９４】
細胞の成長が乏しく、培地を２倍にする必要もなく３〜４日が経過した場合には、本発明者らは、上部からピペッティングによって約５０％の培地を注意深く取り除いた。本発明者らは、フラスコの底に沈降した細胞を注意深く濁らさないようにした。除去した培地を等量の２倍の培地で置き換えた。
【００９５】
（実施例３）
初代線維芽細胞における塩基編集
方法
細胞培養：ファンコニー貧血、またはＭＰＳ１を有する健康な患者（複数可）からの初代線維芽細胞を１ｍＬ当たり１×１０6個の細胞の濃度のＣｒｙｏＳｔｏｒ中で凍結させた。細胞をヒト初代線維芽細胞（ｈＦｉｂ）培地中で解凍した。ｈＦｉｂ培地は、５００ｍＬのＭＥＭアルファ配合培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ(商標)（１００ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｍＬのＦＢＳ、２．５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｍＬの非必須アミノ酸（１００×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５００μＬの抗酸化サプリメント（１０００ｘ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｕＬのｍＥＧＦ（５０ｎｇ／μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１００ｕＬのｈＦＧＦ（２．５μｇ／μＬ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる。培地を２日毎に新しくし、毎週継代培養することで、５％のＣＯ2および５％のＯ2で３７℃にて細胞を７０〜１００％のコンフルエンシーに維持した。
【００９６】
初代線維芽細胞のトランスフェクション：１日前に、９０〜１００％のコンフルエンシーの線維芽細胞を、１２ウェルプレートの１ウェル当たり３×１０5個の細胞の密度でプレーティングした。０日目に、培地を１ｍＬの３７℃のｈＦｉｂ培地で置き換えた。１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに対して、１．５μｇのＢＥ４ｍａｘ  ｍＲＮＡ、１μｇのｃｍ−ｓｇＲＮＡ、および１００ｎｇのｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを添加した。２μＬのｍＲＮＡブースト試薬（Ｍｉｒｕｓ）とその後の２μＬのＴｒａｎｓ−ＩＴ試薬（Ｍｉｒｕｓ）を、製造業者のプロトコールに従って添加した。室温で３分のインキュベーション後に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ溶液を細胞に対して滴下して分配した。１日目の、トランスフェクションの２４時間後に培地を交換し、細胞をＧＦＰに対して可視化した。３日目に、培地を交換し、４日目に、ゲノム分析のために細胞を採取した。
【００９７】
ゲノム分析：ゲノムＤＮＡ分析：スピンカラムベースの精製によって、ゲノムＤＮＡを線維芽細胞から単離した。ＣＲＩＳＰＲにより標的化された遺伝子座のＰＣＲ増幅、ＰＣＲアンプリコンのサンガーシーケンシング、および前述したウェブアプリケーションＥｄｉｔＲ（ｂａｓｅｅｄｉｔｒ．ｃｏｍ）を使用するサンガーシーケンシングトレースの次の分析によって、塩基編集効率をゲノムレベルで分析した。
【００９８】
材料
【００９９】
【表６】
2021517815.tif 000018
【０１００】
【表７】
2021517815.tif 000019
【０１０１】
結果：塩基編集を使用して、ファンコニー貧血の原因であるＦＮＡＣＡ遺伝子における病原性変異を修正できるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＢＥ４ｍａｘ  ｍＲＮＡとｃｍ−ｓｇＲＮＡを初代線維芽細胞に導入し、変異の修正を試みた。本発明者らは、本発明者らが、ＷＴ対立遺伝子に対して１９％の病原性変異の修正を達成することができたことを見出した（図２１Ａ）。さらなる実験では、この修正が、特に、クロスリンクしたＤＮＡのＤＮＡ修復および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）中に再プログラミングされる能力に関して、ＷＴ表現型の回復をもたらすかどうかが評価されるであろう。アデノシンデアミナーゼ塩基編集が初代ファンコニー貧血線維芽細胞において可能であるかどうかを決定するために、本発明者らは、ｃｍ−ｓｇＲＮＡと一緒にＡＢＥ７．１０  ｍＲＮＡを初代線維芽細胞に導入した。本発明者らは、本発明者らが、標的部位において４９％の編集を達成することができたことを見出し、これは、初代細胞に対する高効率の塩基編集であることを示した（図２１Ｂ）。この部位での高効率の塩基編集は、ＨＤＲの代わりに、単一のヌクレオチド編集に対するアプローチとして、塩基編集を使用することの実行可能性を示す。さらなる研究には、自己遺伝子修正および移植のために、造血系幹細胞への分化のためのｉＰＳＣを生成することを意図して、遺伝子疾患に罹患した様々な患者由来の初代線維芽細胞における病原性変異を修正するために、アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ塩基エディターが使用されるであろう。
【０１０２】
参考文献
2021517815.tif 000020
2021517815.tif 000021
2021517815.tif 000022
2021517815.tif 000023
2021517815.tif 000024
【０１０３】
当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書に開示されている、特許文献を含むすべての参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021517815.tif 000025
【図２】
2021517815.tif 000026
【図３−１】
2021517815.tif 000027
【図３−２】
2021517815.tif 000028
【図３−３】
2021517815.tif 000029
【図４−１】
2021517815.tif 000030
【図４−２】
2021517815.tif 000031
【図４−３】
2021517815.tif 000032
【図４−４】
2021517815.tif 000033
【図５Ａ】
2021517815.tif 000034
【図５Ｂ】
2021517815.tif 000035
【図６Ａ】
2021517815.tif 000036
【図６Ｂ】
2021517815.tif 000037
【図６Ｃ】
2021517815.tif 000038
【図６Ｄ】
2021517815.tif 000039
【図７】
2021517815.tif 000040
【図８−１】
2021517815.tif 000041
【図８−２】
2021517815.tif 000042
【図９】
2021517815.tif 000043
【図１０】
2021517815.tif 000044
【図１１】
2021517815.tif 000045
【図１２】
2021517815.tif 000046
【図１３】
2021517815.tif 000047
【図１４】
2021517815.tif 000048
【図１５】
2021517815.tif 000049
【図１６】
2021517815.tif 000050
【図１７−１】
2021517815.tif 000051
【図１７−２】
2021517815.tif 000052
【図１８−１】
2021517815.tif 000053
【図１８−２】
2021517815.tif 000054
【図１９】
2021517815.tif 000055
【図２０−１】
2021517815.tif 000056
【図２０−２】
2021517815.tif 000057
【図２１−１】
2021517815.tif 000058
【図２１−２】
2021517815.tif 000059
【図２１−３】
2021517815.tif 000060
【配列表】
2021517815000001.app
【国際調査報告】
2021517815.tif 000061
2021517815.tif 000062
2021517815.tif 000063
2021517815.tif 000064