(57)【要約】  修飾ＲＮＡを含むエキソソームが開示される。本開示の態様は、さらに、修飾ＲＮＡを含むエキソソームを使用する方法及び組成物にも関する。特定の態様では、本明細書に開示されるエキソソームは、修飾ＲＮＡを細胞に送達する上で有用である。特定の態様では、本明細書に開示されるエキソソームは、被験者の障害を処置又は予防する上で有用となり得る。開示されるエキソソームを生成するための方法及び組成物も提供される。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）修飾ＲＮＡを含む１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供するステップ；
（ｂ）細胞によるＬＮＰ取込みを可能にする条件下で、１つ以上の前記細胞をＬＮＰと接触させるステップ；及び
（ｃ）前記１つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップを含むプロセスにより調製される修飾ＲＮＡを含む単離エキソソームであって、ここで、前記少なくとも１つの単離エキソソームは、前記修飾ＲＮＡを含む、単離エキソソーム。
【請求項２】
前記ＬＮＰが、少なくとも１つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質を含む、請求項１に記載のエキソソーム。
【請求項３】
前記少なくとも１つのイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及び／又はＤＬｉｎ−ＤＭＡである、請求項２に記載のエキソソーム。
【請求項４】
前記少なくとも１つのイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである、請求項２又は３のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項５】
前記少なくとも１つのイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＤＭＡである、請求項２又は３のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項６】
前記少なくとも１つのリン脂質が、ＤＳＰＣである、請求項２〜５のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項７】
前記少なくとも１つの構造脂質が、コレステロールである、請求項２〜６のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ又はＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥである、請求項２〜７のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項９】
前記ＬＮＰが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ若しくはＤＬｉｎ−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＰＥＧ−ＤＭＰＥ若しくはＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥであるＰＥＧ脂質を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項１０】
前記ＬＮＰが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及びＰＥＧ−ＤＭＰＥ若しくはＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥであるＰＥＧ脂質を含有する、請求項９に記載のエキソソーム。
【請求項１１】
前記ＬＮＰが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及びＰＥＧ−ＤＭＰＥ若しくはＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥであるＰＥＧ脂質を含有する、請求項９に記載のエキソソーム。
【請求項１２】
前記ＬＮＰが、約２：１〜約４：１、又は約４：１、約３：１、又は約２：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項１３】
前記ＬＮＰが、約３：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項１４】
前記エキソソームが、少なくとも１つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質が、ＬＮＰに由来する、請求項１４に記載のエキソソーム。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及び／又はＤＬｉｎ−ＤＭＡである、請求項１４又は１５に記載のエキソソーム。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのイオン化脂質が、ＤＬｉｎ−ＤＭＡである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのリン脂質が、ＤＳＰＣである、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの構造脂質が、コレステロールである、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項２１】
前記エキソソームが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ若しくはＤＬｉｎ−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、及び／又はコレステロールである構造脂質を含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項２２】
前記エキソソームが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、及びコレステロールである構造脂質を含有する、請求項２１に記載のエキソソーム。
【請求項２３】
前記エキソソームが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、及びコレステロールである構造脂質を含有する、請求項２１に記載のエキソソーム。
【請求項２４】
前記エキソソームが、約１：１〜約３：１、又は約３：１、約２：１、約１：１、又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項２５】
前記エキソソームが、約１：１又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項２６】
前記エキソソームは、前記ＬＮＰが含むイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比より低いイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項２７】
前記エキソソームは、約１：１又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含み、前記ＬＮＰが、約３：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項２８】
前記エキソソームが、約３０ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項２９】
前記エキソソームが、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径を有する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３０】
前記細胞が、被験者から取得される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３１】
前記細胞が、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３２】
前記細胞が、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３３】
前記修飾ＲＮＡが、エリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３４】
前記修飾ＲＮＡが、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３５】
前記修飾ＲＮＡが、配列番号１のエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３６】
前記プロセスが、インビトロで実施される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３７】
１つ以上の細胞を前記ＬＮＰと接触させるステップが、ヒト血清の存在下で実施される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３８】
前記ヒト血清が、約０．５体積％、約１体積％、又は約１．５体積％で存在する、請求項３７に記載のエキソソーム。
【請求項３９】
前記ヒト血清が、約１体積％で存在する、請求項３７又は３８に記載のエキソソーム。
【請求項４０】
１つ以上の細胞を前記ＬＮＰと接触させるステップが、前記１つ以上の細胞を、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なる用量の前記ＬＮＰと接触させることを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項４１】
１つ以上の細胞を前記ＬＮＰと接触させるステップが、前記１つ以上の細胞を、少なくとも３つの異なる用量の前記ＬＮＰと接触させることを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項４２】
エキソソームを単離するステップが、インビトロ細胞培地のサンプルからエキソソームを単離するステップを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのエキソソームと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項４４】
修飾ＲＮＡを細胞に送達する方法であって、有効量の請求項１〜４２のいずれか１項に記載のエキソソーム又は請求項４３に記載の医薬組成物と前記細胞を接触させ、これにより、前記修飾ＲＮＡを前記細胞に送達するステップを含む方法。
【請求項４５】
前記細胞を接触させるステップが、前記エキソソーム若しくは医薬組成物をインビトロ細胞培養物に添加するか、又は前記エキソソーム若しくは医薬組成物を被験者に投与するステップを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が、インビトロ細胞培地中に存在する、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、被験者から取得される、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が、被験者に存在する、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞への修飾ＲＮＡの送達が、細胞世代時間を改変しない、請求項４４〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞への修飾ＲＮＡの送達が、重量単位での総細胞タンパク質含量を改変しない、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
細胞への修飾ＲＮＡの送達における、有効量の請求項１〜４２のいずれか１項に記載のエキソソーム又は請求項４３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５４】
前記細胞が、インビトロ細胞培地中に存在する、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記細胞が、被験者から取得される、請求項５３又は５４に記載の使用。
【請求項５６】
前記細胞が、被験者に存在する、請求項５３に記載の使用。
【請求項５７】
前記細胞が、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５８】
前記細胞が、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５９】
前記細胞への前記修飾ＲＮＡの送達が、細胞世代時間を改変しない、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６０】
前記細胞への前記修飾ＲＮＡの送達が、重量単位での総細胞タンパク質含量を改変しない、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６１】
被験者の障害を処置又は予防する方法であって、有効量の請求項１〜４２のいずれか１項に記載のエキソソーム又は請求項４３に記載の医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含み、ここで、前記エキソソームが、前記障害を処置する上で有効な修飾ＲＮＡを含む方法。
【請求項６２】
前記障害が、貧血、脊髄形成異常、免疫若しくは炎症性疾患、単一遺伝子病、及び複合病から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記障害が、貧血である、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記障害が、脊髄形成異常である、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記障害が、免疫若しくは炎症性疾患である、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記修飾ＲＮＡが、エリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記修飾ＲＮＡが、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記修飾ＲＮＡが、配列番号１のエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記被験者が、エキソソームの非存在下での処置に比べ、エキソソームの存在下での処置に対して低下した免疫及び／又は炎症反応を有する、請求項６１〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記免疫及び／又は炎症反応の低下が、少なくとも１つのサイトカインのレベルの増加又は減少を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫及び／又は炎症反応の低下が、少なくとも１つのサイトカインのレベルの減少を含み、ここで、前記サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、及びＫＣから選択される、請求項６９又は７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記エキソソームが、前記被験者から取得された細胞から単離される、請求項６１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
被験者の障害の処置又は予防における、有効量の請求項１〜４２のいずれか１項に記載のエキソソーム又は請求項４３に記載の医薬組成物の使用であって、前記エキソソームが、前記障害を処置する上で有効な修飾ＲＮＡを含む使用。
【請求項７４】
被験者の障害を処置又は予防する方法であって、以下：
（ａ）前記被験者から取得された１つ以上の細胞を提供するステップ；
（ｂ）前記細胞によるＬＮＰ取込みを可能にする条件下で、修飾ＲＮＡを含む１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と前記１つ以上の細胞を接触させるステップ；
（ｃ）前記１つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップであって、少なくとも１つの単離エキソソームが、前記修飾ＲＮＡを含むステップ；並びに
（ｄ）有効量の前記単離エキソソームを前記被験者に投与するステップ
を含み、ここで、前記修飾ＲＮＡは、前記障害を処置する上で有効である方法。
【請求項７５】
前記細胞が、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
前記細胞が、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である、請求項７４又は７５に記載の使用。
【請求項７７】
前記障害が、貧血、脊髄形成異常、免疫若しくは炎症性疾患、単一遺伝子病、及び複合病から選択される、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記障害が、貧血である、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記障害が、脊髄形成異常である、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記障害が、免疫又は炎症性疾患である、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記修飾ＲＮＡが、エリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項７４〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記修飾ＲＮＡが、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記修飾ＲＮＡが、配列番号１のエリスロポエチンポリペプチドをコードする、請求項７４〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記被験者が、エキソソームの非存在下の処置に比べ、エキソソームの存在下での処置に対して低下した免疫及び／又は炎症反応を有する、請求項７４〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記免疫及び／又は炎症反応の低下が、少なくとも１つのサイトカインのレベルの増加又は減少を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記免疫及び／又は炎症反応の低下が、少なくとも１つのサイトカインのレベルの減少を含み、ここで、前記サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、及びＫＣから選択される、請求項８４又は８５に記載の方法。
【請求項８７】
１つ以上の細胞を前記ＬＮＰと接触させるステップが、ヒト血清の存在下で実施される、請求項７４〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ヒト血清が、約０．５体積％、約１体積％、又は約１．５体積％で存在する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ヒト血清が、約１体積％で存在する、請求項８７又は８８に記載の方法。
【請求項９０】
１つ以上の細胞を前記ＬＮＰと接触させるステップが、前記１つ以上の細胞を、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なる用量の前記ＬＮＰと接触させることを含む、請求項７４〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
１つ以上の細胞を前記ＬＮＰと接触させるステップが、前記１つ以上の細胞を、少なくとも３つの異なる用量の前記ＬＮＰと接触させることを含む、請求項７４〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
エキソソームを単離するステップが、インビトロ細胞培地のサンプルからエキソソームを単離することを含む、請求項７４〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、修飾ＲＮＡを含むエキソソームに関する。本開示は、さらに、本明細書に開示されるエキソソームを使用するための方法及び組成物にも関する。特定の態様では、本明細書に開示されるエキソソームは、修飾ＲＮＡを細胞に送達する上で有用であり得る。特定の態様では、本明細書に開示されるエキソソームは、被験者の障害を処置又は予防する上で有用であり得る。開示されるエキソソームを生成するための方法及び組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡは、癌、感染症、及び遺伝性遺伝子疾患をはじめとする様々な疾患の処置にとって有望な治療用分子である（非特許文献１；非特許文献２）。ＲＮＡ療法は、一般に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡ）を用いて病原遺伝子を抑制する、又はｍＲＮＡを細胞に送達することにより治療用タンパク質を発現させることを含む。規制当局の承認を得るためには、ＲＮＡ送達のために使用されるビヒクルが、安全（すなわち、非免疫原性及び非毒性）であり、且つレシピエント細胞の細胞質に治療ＲＮＡを効率的に輸送する能力を有する必要がある。
【０００３】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）など、公知の薬物担体は、組織及び細胞への薬物の標的化、部位特異的送達を促進し、それにより、それらのバイオアベイラビリティを増大する。イオン化脂質を含有するＬＮＰは、ＲＮＡ送達のための１つのプラットフォームを表す（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。しかし、ＬＮＰ及び他のそうした担体を開発する上での障害は、それらの製剤の成分に関連する潜在的免疫原性応答である。
【０００４】
単核貪食細胞による認識を回避するために、ポリエチレングリコールシールドを添加するなどの、ＬＮＰに関連する免疫原性応答を最小化する取組みにもかかわらず、ＬＮＰは、依然として免疫応答を誘発することができる（非特許文献６）。例えば、特定のＬＮＰ製剤は、レシピエント細胞に対して一部毒性であり、宿主に望ましくない免疫応答を引き起こすことがわかっている（非特許文献７；非特許文献８）。
【０００５】
ＬＮＰの免疫刺激作用により、治療用ＲＮＡの安全且つ効果的な送達のためのそれらの使用は引き続き妨げられている。従って、免疫応答をトリガーすることなく、ＲＮＡを標的組織及び細胞に有効に送達することができる代替的ビヒクルの開発が必要とされている。
【０００６】
細胞外小胞（ＥＶ）は、ほぼ全ての細胞型により分泌される、異種クラスのナノ及びミクロサイズの小胞である（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。ＥＶは、ほとんどの生体体液、並びに培養細胞の上清中で検出され得る（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。ＥＶ生物発生中に、ＥＶは、多様な細胞質成分、例えば、脂質及びタンパク質、並びにコード及び非コードＲＮＡなどを取得し得る（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。細胞はまた、ＲＮＡメッセージをＥＶ中にパッケージすることにより、これらのメッセージを互いに送ることができる（非特許文献１８）。従って、ＥＶは、細胞間の核酸輸送のための内在性担体として作用し得る。最も広範に記載されているＥＶは、エキソソームであり、これらは、エンドソームに由来し、エキソサイトーシス経路を介して分泌される。
【０００７】
エキソソームは、ほぼ全ての種類の細胞によって分泌され、且つ実質的にあらゆる種類の体液中に安定して存在するナノスケールのＥＶである（非特許文献１９）。エキソソームは、核酸（例えば、ｍＲＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡ）、機能性タンパク質、及び脂質を含め、様々なシグナル伝達分子を伝達することができる（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。エキソソームのサイズが小さいために、これらは、単核貪食細胞による急速な食作用から脱出して、薬物を循環中に安定的に運搬及び送達し、血管内皮を通過して細胞をターゲティングすることができる（非特許文献２３）。加えて、エキソソームは、血液−脳関門及び胎盤関門などの厳重な生物学的バリアを通過することができる（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。これらの特徴の全てによって、エキソソームは、ＲＮＡ送達のための有望な担体となる。
【０００８】
非特許文献２７に報告されているエキソソーム−リポソームハイブリッドナノ粒子など、エキソソームに基づくいくつかの送達系が治療用途のために記載されている。しかし、これまで、これらの系のどれも、特定のＲＮＡ送達製剤から生じ得る毒性作用に対処するべく開発されていない。従って、副作用を最小限にすると共に、細胞及び組織における過度の毒性を回避する有効なＲＮＡ送達系が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１７（４）：２６１−７９
【非特許文献２】Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５９（６３７２）：ｅａａｎ４６７２
【非特許文献３】Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（２）：１７２−６
【非特許文献４】Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１７（９）：５７１１−８
【非特許文献５】Ｒｉｅｔｗｙｋ  ａｎｄ  Ｐｅｅｒ（２０１７）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１１（８）：７５７２−８６
【非特許文献６】Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３（ｅ２１０）
【非特許文献７】Ｂａｒｒｏｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｌｏｂ（２０１２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６４（１５）：１７３０−７
【非特許文献８】Ｋｕｌｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（４）：１３７７−８７
【非特許文献９】Ｒａｐｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８３（３）：１１６１−７２
【非特許文献１０】Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．４（５）：５９４−６００
【非特許文献１１】Ｎａｗａｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ．２０１６：１０７３１４０
【非特許文献１２】Ａｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．１２３（２）：２０５−１６
【非特許文献１３】Ｌａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．９：９
【非特許文献１４】Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｕｎｉｔ  ３．２２
【非特許文献１５】Ｋｅｅｒｔｈｉｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４２８（４）：６８８−９２
【非特許文献１６】Ｋａｌｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．１０（１２）：ｅ１００１４５０
【非特許文献１７】Ｆａｔｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ３（１）：１０
【非特許文献１８】Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９（６）：６５４−９
【非特許文献１９】Ｉｂｒａｈｉｍ  ａｎｄ  Ｍａｒｂａｎ（２０１６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７８：６７−８３
【非特許文献２０】Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９（６）：６５４−９
【非特許文献２１】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０８７２
【非特許文献２２】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２２（４）：６０６−１８
【非特許文献２３】ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（４）：３２５−６
【非特許文献２４】Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（４）：３４１−５
【非特許文献２５】Ｈｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｔｒａｆｆｉｃ  １７（２）：１６８−７８
【非特許文献２６】Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．４８３（１）：６０２−８
【非特許文献２７】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（（２０１８）  Ａｄｖ  Ｓｃｉ．（Ｗｅｉｎｈ）５（４）：１７００６１１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
様々な実施形態において、本開示は、一部に、治療用ＲＮＡの送達のためのエキソソーム（ＥＶ）を提供する。様々な実施形態において、本明細書に記載されるエキソソームは、細胞及び組織をターゲティングするために、高分子量ｍＲＮＡをはじめとする外性ＲＮＡを送達することができる。様々な実施形態において、本明細書に記載のエキソソームは、インビトロ又はインビボ輸送中に外性ＲＮＡを保護し、ＲＮＡをレシピエント細胞の細胞質に送達することができる。様々な実施形態において、送達されたＲＮＡは、機能性であり、治療用タンパク質を産生するように翻訳され得る。様々な実施形態において、本明細書に記載のエキソソームは、非免疫原性であってもよいし、又は代替的送達ビヒクル（例えば、ＬＮＰ）で観察される免疫及び／又は炎症反応と比較して低い免疫及び／若しくは炎症反応を誘発するものでもよい。様々な実施形態において、本明細書に記載のエキソソームは、約１：１若しくは約１：１未満、例えば、約０．１：１、約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、又は約０．９：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を有する。様々な実施形態において、約１：１若しくは約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を有するエキソソームは、約１：１超のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を有する代替的送達ビヒクルと比較して、宿主細胞及び組織において非毒性であるか、又は毒性が低いことがある（例えば、ＬＮＰ）。様々な実施形態において、エキソソーム及び代替的送達ビヒクルは、同じイオン化脂質（例えば、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ若しくはＤＬｉｎ−ＤＭＡ）及び同じ修飾ＲＮＡを含むが、異なるイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。
【００１１】
様々な実施形態において、本開示は、以下：（ａ）修飾ＲＮＡを含む１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供するステップ；（ｂ）細胞によるＬＮＰ取込みを可能にする条件下で、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップ；及び（ｃ）１つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップを含むプロセスにより調製される修飾ＲＮＡを含む単離エキソソームを提供し、ここで、少なくとも１つの単離エキソソームは、修飾ＲＮＡを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ＬＮＰに含有される少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及び／又はＤＬｉｎ−ＤＭＡである。一部の実施形態では、ＬＮＰに含有される少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。一部の実施形態では、ＬＮＰに含有される少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡである。一部の実施形態では、ＬＮＰに含有される少なくとも１つのリン脂質は、ＤＳＰＣである。一部の実施形態ではＬＮＰに含有される少なくとも１つの構造脂質は、コレステロールである。一部の実施形態では、ＬＮＰに含有される少なくとも１つのＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＰＥである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約２，０００Ｄａ（ＰＥＧ２０００）であってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰに含有される少なくとも１つのＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥである。
【００１４】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ若しくはＤＬｉｎ−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＰＥＧ−ＤＭＰＥ若しくはＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥであるＰＥＧ脂質を含有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及びＰＥＧ−ＤＭＰＥ若しくはＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥであるＰＥＧ脂質を含有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＬｉｎ−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及びＰＥＧ−ＤＭＰＥ若しくはＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥであるＰＥＧ脂質を含有する。
【００１５】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、約２：１〜約４：１、又は約４：１、約３：１、又は約２：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約３：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を有する。
【００１６】
一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させることにより産生されるエキソソームは、少なくとも１つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質を含む。一部の実施形態では、エキソソームにより含有される少なくとも１つのイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質は、ＬＮＰに由来する。
【００１７】
一部の実施形態では、エキソソームにより含有される少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及び／又はＤＬｉｎ−ＤＭＡである。一部の実施形態では、エキソソームに含有される少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。一部の実施形態では、エキソソームに含有される少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡである。一部の実施形態では、エキソソームに含有される少なくとも１つのリン脂質は、ＤＳＰＣである。一部の実施形態では、エキソソームに含有される少なくとも１つの構造脂質は、コレステロールである。
【００１８】
一部の実施形態では、エキソソームは、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ若しくはＤＬｉｎ−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、及び／又はコレステロールである構造脂質を含有する。一部の実施形態では、エキソソームは、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、及びコレステロールである構造脂質を含有する。一部の他の実施形態では、エキソソームは、ＤＬｉｎ−ＤＭＡであるイオン化脂質、ＤＳＰＣであるリン脂質、及びコレステロールである構造脂質を含有する。
【００１９】
一部の実施形態では、エキソソームは、約１：１〜約３：１、又は約３：１、約２：１、約１：１、又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、エキソソームは、約１：１又は約１：１未満、例えば、約０．１：１、約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、又は約０．９：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、エキソソームは、ＬＮＰが含むイオン化脂質：修飾ＲＮＡモル比より低いイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、エキソソームは、約１：１又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含み、ＬＮＰは、約３：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、エキソソームは、約３０ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、エキソソームは、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、エキソソームは、約４０ｎｍ〜約１２０ｎｍの直径を有する。
【００２１】
一部の実施形態では、ＬＮＰと接触させて、エキソソームを産生させるための細胞は、被験者から取得される。一部の実施形態では、細胞は、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である。
【００２２】
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、疾患を処置する上で有効なポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、エリスロポエチンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列番号１のエリスロポエチンポリペプチドをコードする。
【００２３】
一部の実施形態では、エキソソームは、インビトロで実施されるプロセスにより調製される。一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、ヒト血清の存在下で実施される。一部の実施形態では、ヒト血清は、約０．５体積％、約１体積％、又は約１．５体積％で存在する。一部の実施形態では、ヒト血清は、約１体積％で存在する。一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、１つ以上の細胞を、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なる用量のＬＮＰと接触させることを含む。一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、１つ以上の細胞を、少なくとも３つの異なる用量のＬＮＰと接触させることを含む。一部の実施形態では、エキソソームを単離するステップは、インビトロ細胞培地のサンプルからエキソソームを単離するステップを含む。
【００２４】
様々な実施形態において、本開示はまた、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）と細胞を接触させ、これにより修飾ＲＮＡを細胞に送達することにより、修飾ＲＮＡを細胞に送達する方法も提供する。一部の実施形態では、細胞を接触させるステップは、エキソソーム若しくは医薬組成物をインビトロ細胞培養物に添加するか、又はエキソソーム若しくは医薬組成物を被験者に投与するステップを含む。
【００２５】
また様々な実施形態において、細胞への修飾ＲＮＡの送達における、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）の使用も本明細書に提供される。
【００２６】
本明細書に記載される方法及び使用の一部の実施形態では、細胞は、インビトロ細胞培地中に存在する。一部の実施形態では、細胞は、被験者から取得される。一部の実施形態では、細胞は、被験者に存在する。一部の実施形態では、細胞は、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である。
【００２７】
本明細書に記載される方法及び使用の一部の実施形態では、細胞への修飾ＲＮＡの送達は、細胞世代時間を改変しない。一部の実施形態では、細胞への修飾ＲＮＡの送達は、重量単位での総細胞タンパク質含量を改変しない。
【００２８】
さらに、様々な実施形態において、少なくとも１つのエキソソーム（例えば、本明細書に記載のエキソソームのいずれか）と、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【００２９】
さらにまた、様々な実施形態では、例えば、障害の処置における、本明細書に開示のエキソソーム及び医薬組成物の治療方法及び使用も本明細書に提供される。
【００３０】
例えば、特定の態様では、本開示は、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）を被験者に投与することにより、被験者の障害を処置又は予防する方法を提供し、ここで、エキソソームは、障害を処置する上で有効な修飾ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、エキソソームは、被験者から得られる細胞から単離される。
【００３１】
特定の他の態様では、本開示は、被験者の障害の処置又は予防における、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）の使用を提供し、ここで、エキソソームは、障害を処置する上で有効な修飾ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、エキソソームは、被験者から得られる細胞から単離される。
【００３２】
さらに別の態様では、本開示は、以下：（ａ）被験者から取得された１つ以上の細胞を提供するステップ；（ｂ）細胞によるＬＮＰ取込みを可能にする条件下で、修飾ＲＮＡを含む１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と１つ以上の細胞を接触させるステップ；（ｃ）１つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップであって、少なくとも１つの単離エキソソームが、修飾ＲＮＡを含むステップ；並びに（ｄ）有効量の単離エキソソームを被験者に投与するステップにより、被験者の障害を処置又は予防する方法を提供し、ここで、修飾ＲＮＡは、障害を処置する上で有効である。一部の実施形態では、細胞は、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である。
【００３３】
さらにまた別の態様では、本開示は、以下：（ａ）被験者から１つ以上の細胞を取得するステップ；（ｂ）細胞によるＬＮＰ取込みを可能にする条件下で、修飾ＲＮＡを含む１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と１つ以上の細胞を接触させるステップ；（ｃ）１つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップであって、少なくとも１つの単離エキソソームが、修飾ＲＮＡを含むステップ；並びに（ｄ）有効量の単離エキソソームを被験者に投与するステップによる、被験者の障害の処置又は予防における有効量の単離エキソソームの使用を提供し、ここで、修飾ＲＮＡは、障害を処置する上で有効である。一部の実施形態では、細胞は、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である。
【００３４】
本明細書に開示される方法及び使用の一部の実施形態では、障害は、貧血、脊髄形成異常、免疫若しくは炎症性疾患、単一遺伝子病、及び複合病から選択される。一部の実施形態では、障害は、貧血である。一部の実施形態では、障害は、脊髄形成異常である。一部の実施形態では、障害は、免疫又は炎症性疾患である。一部の実施形態では、免疫又は炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一部の実施形態では、障害は、単一遺伝子病である。一部の実施形態では、単一遺伝子病は、神経変性疾患である。一部の実施形態では、障害は、複合病である。一部の実施形態では、複合病は、心筋梗塞である。一部の実施形態では、複合病は、癌である。
【００３５】
本明細書に開示される方法及び使用の一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、障害を処置する上で有効なポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、エリスロポエチンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列番号１のエリスロポエチンポリペプチドをコードする。
【００３６】
本明細書に開示される方法及び使用の一部の実施形態では、被験者は、エキソソームの非存在下の処置に比べ、エキソソームの存在下での処置に対して低下した免疫及び／又は炎症反応を有する。一部の実施形態では、免疫及び／又は炎症反応の低下は、少なくとも１つのサイトカインのレベルの増加又は減少を含む。一部の実施形態では、免疫及び／又は炎症反応の低下は、少なくとも１つのサイトカインのレベルの減少を含み、ここで、サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、及びＫＣから選択される。
【００３７】
本明細書に開示される方法及び使用の一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、ヒト血清の存在下で実施される。一部の実施形態では、ヒト血清は、約０．５体積％、約１体積％、又は約１．５体積％で存在する。一部の実施形態では、ヒト血清は、約１体積％で存在する。一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、１つ以上の細胞を少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なる用量のＬＮＰと接触させることを含む。一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、少なくとも３つの異なる用量のＬＮＰと１つ以上の細胞を接触させることを含む。一部の実施形態では、エキソソームを単離するステップは、インビトロ細胞培地のサンプルからエキソソームを単離することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】ＬＮＰ送達後にヒト上皮（ＨＴＢ−１７７）細胞中で検出されたｈＥＰＯｍＲＮＡの量を示す。各々１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する、ＤＬｉｎ−ＤＭＡイオン化脂質を含むＬＮＰ（ＤＤ−ＬＮＰ）、及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡイオン化脂質を含むＬＮＰ（ＭＣ３−ＬＮＰ）を、独立した実験で、ＨＴＢ−１７７細胞に移入した。非処理細胞、及びｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含まないＬＮＰで処理した細胞を対照として使用した。ＬＮＰ処理の９６時間後、ＲＴ−ｑＰＣＲによりレシピエント細胞中でｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを定量した。細胞中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの量は、ＬＮＰ処理の９６時間後に採取した細胞の総数に対して正規化した。
【図１Ｂ】ＬＮＰ送達後にＨＴＢ−１７７細胞中で検出されたｈＥＰＯタンパク質の細胞内量を示す。１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、ＬＮＰを介してＨＴＢ−１７７細胞に送達した。ＬＮＰ処理の９６時間後、細胞外送達されたｍＲＮＡからのｈＥＰＯタンパク質をＥＬＩＳＡによりレシピエントにおいて定量した。ｈＥＰＯタンパク質の量は、ＬＮＰ処理の９６時間後に採取した細胞の総数に対して正規化した。
【図１Ｃ】ＬＮＰ送達後にＨＴＢ−１７７馴化培地の上清中で検出されたｈＥＰＯタンパク質の細胞外量を示す。１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、ＬＮＰを介してＨＴＢ−１７７細胞に送達した。ＬＮＰ処理の９６時間後、分泌されたｈＥＰＯタンパク質を、ＥＬＩＳＡにより細胞培養馴化培地の上清中で定量した。ｈＥＰＯタンパク質の量は、ＬＮＰ処理の９６時間後に採取した細胞の総数に対して正規化した。
【図１Ｄ】ＬＮＰを介して投与されるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの総量（１００μｇ）に対する、ＬＮＰ処理細胞の細胞質中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのパーセンテージを示す。
【図１Ｅ】ＬＮＰのエンドサイトーシス後の細胞質中へのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのエンドソームからの脱出、並びにｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の例示的な概略図を示す。或いは、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、エンドソーム由来のＥＶ（エンド−ＥＶ）中にパッケージされて、エキソサイトーシスを介して分泌され得る。
【図１Ｆ】ＬＮＰ処理細胞から単離したＥＶ中で定量されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの総量を示す。細胞の細胞質中のＬＮＰ送達ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを検出した後、これらの細胞から分泌されたＥＶ中で、残りのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを評価した。ＥＶを単離し、ＥＶ中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲ（絶対定量）により定量した。
【図１Ｇ】ＬＮＰ中のイオン化脂質及びｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチド（ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ当たりのイオン化脂質）のモル濃度を示す。細胞送達のために用いられるＬＮＰ（ＭＣ３−ＬＮＰ及びＤＤ−ＬＮＰ）を、勾配高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を用いて、イオン化脂質及びｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチドのモル濃度について分析した。概して、ＬＮＰは、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチド（μｍｏｌ）に比べ、約３倍のイオン化脂質（μｍｏｌ）を含有した。
【図１Ｈ−１Ｉ】ＥＶ中のイオン化脂質及びｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチドのモル濃度（ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ当たりのイオン化脂質）を示す。ＥＶをＬＮＰ処理細胞から単離し、勾配高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を用いて、ＥＶ中のイオン化脂質及びｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチドのモル濃度を分析した。概して、ＭＣ３−ＥＶ（図１Ｈ）及びＤＤ−ＥＶ（図１Ｉ）は、ほぼ等濃度のイオン化脂質（μｍｏｌ）及びｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチド（μｍｏｌ）を含有した。
【図１Ｊ】ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチド当たりのイオン化脂質のモル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）についてＬＮＰ及びＥＶ間の比較を示す。ＥＶは、概して、１：１モル比（１ｍｏｌのｍＲＮＡヌクレオチド当たり１ｍｏｌのイオン化脂質）を含有したのに対し、ＬＮＰは、概して、３：１モル比（１ｍｏｌのｍＲＮＡヌクレオチド当たり３ｍｏｌのイオン化脂質）を含有した。
【図２Ａ】ＥＶを介したヒト上皮（ＨＴＢ−１７７）細胞へのＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡの送達を示す。７６μｇの蛍光シアニン５（Ｃｙ５）ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有するＤＤ−ＬＮＰをＨＴＢ−１７７細胞に投与した。ＬＮＰ処理の９６時間後、ＤＤ−ＬＮＰ処理細胞（ＤＤ−ＥＶ）からのＥＶを単離した。７８μｇのＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ含有ＤＤ−ＥＶをオートロガスＨＴＢ−１７７細胞に移入した。ＥＶ送達の５時間、２４時間、及び４８時間後、細胞中の蛍光に基づくＦＡＣＳにより、Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ送達を評価した。データは、各時点で、ＥＶ移入後にＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有するＨＴＢ−１７７細胞のパーセンテージとして表示される。データは、少なくとも３回の生物学的反復の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＤＤ−ＬＮＰ群を比較した。Ｐ値：＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、及びｎｓ＝有意ではない。略語：ＵＮＴ（ｗ／ｏ  ＥＶ）−非処理細胞；細胞＋ＥＶ（ｗ／ｏ  Ｃｙ５−ｍＲＮＡ）−ｍＲＮＡなしで移入されたＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰ；細胞＋ＥＶ（Ｃｙ５−ｍＲＮＡを含む）−ｍＲＮＡと共に移入されたＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰ。
【図２Ｂ−２Ｄ】ＥＶを介したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へのＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡの送達を示す。健康なヒトバフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、及びＣＤ１４（単球）に対して特異的表面マーカで染色した。７８μｇのＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ含有ＤＤ−ＥＶをレシピエント細胞に移入した。ＥＶ送達の５時間、２４時間、及び４８時間後に、ＦＡＣＳ分析を実施して、レシピエント免疫細胞中のＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを検出した。Ｂ細胞（図２Ｂ）、Ｔ細胞（図２Ｃ）、及び単球（図２Ｄ）中のＣｙ５−蛍光及び抗体−蛍光に基づいて、Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡの送達を推定した。データは、各時点でＥＶ移入後にＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有する細胞のパーセンテージとして表示される。データは、少なくとも３回の生物学的反復の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＤＤ−ＬＮＰ群を比較した。Ｐ値：＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、及びｎｓ＝有意ではない。略語：ＵＮＴ（ｗ／ｏ  ＥＶ）−非処理細胞；細胞＋ＥＶ（ｗ／ｏ  Ｃｙ５−ｍＲＮＡ）−ｍＲＮＡなしで移入されたＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰ；細胞＋ＥＶ（Ｃｙ５−ｍＲＮＡを含む）−ｍＲＮＡと共に移入されたＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰ。
【図３】ＥＶを介したｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達後のマウス血液中のｈＥＰＯタンパク質の検出を示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。マウス血漿中のｈＥＰＯタンパク質の濃度を、ＥＶ注射の０時間（非処理）、２時間、５時間、及び２４時間後、ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡにより決定した。ｈＥＰＯタンパク質は、ＥＶ注射から２時間後にマウス血液中で検出可能であった。対照マウスには、等量のＰＢＳを注射し、ＥＬＩＳＡによりｈＥＰＯタンパク質についてマウス血漿を検定した。データは、２時間（ｎ＝４）を除いて、各時点での８回の反復（ｎ＝８）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、２時間及び５時間の間で、ＭＣ３−ＥＶ送達後の血漿ｈＥＰＯタンパク質を比較した（ｎｓ：有意ではない）。
【図４Ａ−４Ｂ】ＥＶを介したｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのインビボ送達後のマウス心臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図４Ａ）及びｈＥＰＯタンパク質（図４Ｂ）の定量を示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＥＶ注射から５時間、２４時間、及び９６時間後に、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルをそれぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。ＰＢＳを注射したマウスを対照として使用した。データは、散布図として、各時点で４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、各時点で、ＥＶ処理及び非処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｃ−４Ｄ】マウス肺中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図４Ｃ）及びｈＥＰＯタンパク質（図４Ｄ）の定量を示す。ＥＶ注射（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）から５時間、２４時間、及び９６時間後に、肺中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで、また、ｈＥＰＯタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。データは、散布図として、各時点で４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、各時点で、ＥＶ処理及び非処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｅ−４Ｆ】マウス肝臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図４Ｅ）及びｈＥＰＯタンパク質（図４Ｆ）の定量を示す。ＥＶ注射（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）から５時間、２４時間、及び９６時間後に、肝臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで、また、ｈＥＰＯタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。評価した他の全ての臓器と比較して、最も多量のｈＥＰＯタンパク質が肝臓中で検出された。データは、散布図として、各時点で４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、各時点で、ＥＶ処理及び非処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｇ−４Ｈ】マウス脾臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図４Ｇ）及びｈＥＰＯタンパク質（図４Ｈ）の定量を示す。ＥＶ注射（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）から５時間、２４時間、及び９６時間後に、脾臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで、また、ｈＥＰＯタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。評価した他の全ての臓器と比較して、最も多量のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡが脾臓中で検出された。データは、散布図として、各時点で４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、各時点で、ＥＶ処理及び非処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｉ−４Ｊ】マウス腎臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図４Ｉ）及びｈＥＰＯタンパク質（図４Ｊ）の定量を示す。ＥＶ注射（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）から５時間、２４時間、及び９６時間後に、腎臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで、また、ｈＥＰＯタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。データは、散布図として、各時点で４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、各時点で、ＥＶ処理及び非処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｋ−４Ｌ】マウス胸腺中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図４Ｋ）及びｈＥＰＯタンパク質（図４Ｌ）の定量を示す。ＥＶ注射（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）から５時間、２４時間、及び９６時間後に、胸腺中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで、また、ｈＥＰＯタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。データは、散布図として、各時点で４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、各時点で、ＥＶ処理及び非処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｍ−４Ｎ】マウス膵臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図４Ｍ）及びｈＥＰＯタンパク質（図４Ｎ）の定量を示す。ＥＶ注射（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）から５時間、２４時間、及び９６時間後に、膵臓中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで、また、ｈＥＰＯタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。データは、散布図として、各時点で４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、各時点で、ＥＶ処理及び非処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｏ−４Ｐ】マウス脳中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図４Ｏ）及びｈＥＰＯタンパク質（図４Ｐ）の定量を示す。ＥＶ注射（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）から５時間、２４時間、及び９６時間後に、脳中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲで、また、ｈＥＰＯタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。データは、散布図として、各時点で４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用いて、各時点で、ＥＶ処理及び非処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血液及び臓器中のｈＥＰＯタンパク質レベルを示す。等量のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（マウス１匹当たり１．５μｇ）をマウスに送達した後、ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰをｈＥＰＯタンパク質の産生について比較した。臓器において、ＬＮＰからのｈＥＰＯタンパク質の量は、脾臓を除いてＥＶと概ね同等であり、脾臓は、タンパク質産生に有意な差を示し、これに心臓が続いた（タンパク質のより小さい有意差を示した）。最も有意な差は、ｈＥＰＯタンパク質の血漿レベルに認められ、これは、ＭＣ３−ＥＶ送達と比較して、ＭＣ３−ＬＮＰ送達後で高かった。データは、各時点で、反復（散布図中で各反復を表す点）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。パラメトリック独立２群両側ｔ検定を用い、各時点の各臓器又は血漿について、ＥＶ処理及びＬＮＰ処理群を比較した。有意な値はＰ値として示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図６Ａ】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血漿中のサイトカインＩＬ−６のレベルを示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ、又はＰＢＳの注射から５時間及び２４時間後に、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ磁気ビーズキットにより、マウス血漿中のＩＬ−６の濃度を決定した。データは、各時点で、４匹のマウス（ｎ＝４）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施した。有意な値はＰ値として示す。
【図６Ｂ】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血漿中のサイトカインＩＰ−１０のレベルを示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ、又はＰＢＳの注射から５時間及び２４時間後に、マウス血漿中のＩＰ−１０の濃度を決定した。データは、各時点で、４匹のマウス（ｎ＝４）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施した。有意な値はＰ値として示す。
【図６Ｃ】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血漿中のサイトカインＲＡＮＴＥＳのレベルを示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ、又はＰＢＳの注射から５時間及び２４時間後に、マウス血漿中のＲＡＮＴＥＳの濃度を決定した。データは、各時点で、４匹のマウス（ｎ＝４）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施した。有意な値はＰ値として示す。
【図６Ｄ】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血漿中のサイトカインＭＣＰ−１のレベルを示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ、又はＰＢＳの注射から５時間及び２４時間後に、マウス血漿中のＭＣＰ−１の濃度を決定した。データは、各時点で、４匹のマウス（ｎ＝４）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施した。有意な値はＰ値として示す。
【図６Ｅ】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血漿中のサイトカインＫＣのレベルを示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ、又はＰＢＳの注射から５時間及び２４時間後に、マウス血漿中のＫＣの濃度を決定した。データは、各時点で、４匹のマウス（ｎ＝４）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施した。有意な値はＰ値として示す。
【図６Ｆ】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血漿中のサイトカインＩＬ１−βのレベルを示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ、又はＰＢＳの注射から５時間及び２４時間後に、マウス血漿中のＩＬ１−βの濃度を決定した。データは、各時点で、４匹のマウス（ｎ＝４）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施した。有意な値はＰ値として示す。
【図６Ｇ】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血漿中のサイトカインＴＮＦ−αのレベルを示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ、又はＰＢＳの注射から５時間及び２４時間後に、マウス血漿中のＴＮＦ−αの濃度を決定した。データは、各時点で、４匹のマウス（ｎ＝４）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施した。有意な値はＰ値として示す。
【図６Ｈ】ＭＣ３−ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰ送達後のマウス血漿中のサイトカインＩＦＮ−γのレベルを示す。１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）をマウスに静脈内注射した。ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ、又はＰＢＳの注射から５時間及び２４時間後に、マウス血漿中のＩＦＮ−γの濃度を決定した。データは、各時点で、４匹のマウス（ｎ＝４）から表示される。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定を実施した。有意な値はＰ値として示す。
【図７Ａ】ヒトのＬＮＰの想定上の運命の例示的な概略図を示す。
【図７Ｂ】ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、酸性環境（ｐＨ５．８又は６．６）においてＬＮＰから放出されないことを示す。対照的に、生理的ｐＨ（７．４）では、ＬＮＰのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及び脂質成分は解離する。
【図７Ｃ】ＬＮＰ−エンドソームの想定上の運命の例示的な概略図を示す。
【図８Ａ】２つの異なるイオン化脂質、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及びＤＬｉｎ−ＤＭＡを含む例示的な脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の構造を示す。
【図８Ｂ】細胞増殖に対するＬＮＰの効果を示す。独立した実験で、各々１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰを、レシピエント細胞に移入した。また、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含まない対照ＬＮＰでも細胞を処理した。ＬＮＰ処理から９６時間後に、細胞を採取し、計数した後、細胞世代時間（細胞の集団が倍加するまでの時間（ｈｒ））を、ＬＮＰ処理間隔の始点及び終点での細胞数の差（ΔＮ（細胞数の変化）として定義される）に基づいて算出した。数（ｎ）は、各処理について評価した生物学的反復を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を用いて、各群の間の有意な差を評価した（有意なＰ値＜０．０５）。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図８Ｃ】全細胞ＲＮＡに対するＬＮＰの作用を示す。ＬＮＰ処理から９６ｈ後に、全細胞ＲＮＡを定量し、ΔＮに対して正規化した。数（ｎ）は、各処理について評価された生物学的反復を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を用いて、各群の間の有意な差を評価した（有意なＰ値＜０．０５）。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図８Ｄ−８Ｅ】全細胞内タンパク質（図８Ｄ）及び全分泌タンパク質（図８Ｅ）に対するＬＮＰの作用を示す。ＬＮＰ処理から９６時間後に、全細胞タンパク質（細胞内及び分泌）を定量し、ΔＮに対して正規化した。数（ｎ）は、各処理について評価された生物学的反復を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を用いて、各群の間の有意な差を評価した（有意なＰ値＜０．０５）。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図８Ｆ】ＥＶ中の全ＲＮＡに対するＬＮＰの作用を示す。ＬＮＰ処理から９６時間後に、ＥＶ中の全ＲＮＡを定量し、ΔＮに対して正規化した。数（ｎ）は、各処理について評価された生物学的反復を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を用いて、各群の間の有意な差を評価した（有意なＰ値＜０．０５）。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図８Ｇ】ＥＶ中の全タンパク質に対するＬＮＰの作用を示す。ＬＮＰ処理から９６時間後に、ＥＶ中の全タンパク質を定量し、ΔＮに対して正規化した。数（ｎ）は、各処理について評価された生物学的反復を表す。１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）検定、続いてテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を用いて、各群の間の有意な差を評価した（有意なＰ値＜０．０５）。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図９】ＬＮＰからＥＶへのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの直接移入の評価を示す。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＭＣ３−ＬＮＰ及びＤＤ−ＬＮＰを、いずれの事前の処理も受けていない（細胞の非存在下で）ＥＶと一緒に、３０ｍＬのＰＢＳ中に３７℃で２時間インキュベートした。２つの異なる割合のＥＶ及びＬＮＰをインキュベートした：２００μｇのＥＶ＋３００μＬのＬＮＰ（１×）、及び５０μｇのＥＶ＋３００μＬのＬＮＰ（４×）。２時間のインキュベーション後、超遠心分離によりＥＶを再度単離した。ＥＶからの全ＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲによりｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを定量して、ＬＮＰからＥＶへのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの直接移入を評価した。陽性対照として、ＥＶの非存在下で、等量のＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰをＰＢＳ中でインキュベートした後、超遠心分離した。全ＲＮＡを単離し、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをｑＰＣＲにより定量した。並列実験において、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＭＣ３−ＬＮＰ及びＤＤ−ＬＮＰを細胞に移入し、ＥＶを細胞から単離し；ＥＶからの全ＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲによりｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを定量して、ＬＮＰ処理細胞からのＥＶ中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを評価した。略語：ｄｄ−ＥＶ若しくはｍｃ３−ＥＶ、細胞由来−ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰで処理した細胞により産生されるＥＶ；混合ＥＶ＋ＬＮＰ（×１）−３００μＬのＬＮＰと混合したＥＶ（２００μｇ）；混合ＥＶ＋ＬＮＰ（×４）−３００μＬのＬＮＰと混合したＥＶ（５０μｇ）；ＬＮＰ、ｗ／ｏＥＶ−ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＬＮＰのみ、ＥＶと混合されていない。生物学的三重反復で、実験を実施した。データは、ＬＮＰにより細胞に送達されたｍＲＮＡの初期量又はＥＶと直接混合されたｍＲＮＡの量に対する、細胞へのＬＮＰ処理後若しくはＬＮＰとＥＶのインキュベーション（直接混合）後にＥＶ中に検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのパーセンテージとして表示される。反復の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値が示される。
【図１０Ａ】ＥＶによる細胞へのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達及び細胞質中の翻訳タンパク質の検出を示す。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡが組み込まれたＭＣ３−ＥＶ（ＭＣ３−ＬＮＰ処理細胞由来）、又はｈＥＰＯ  ｍＲＮＡが組み込まれたＤＤ−ＥＶ（ＤＤ−ＬＮＰ処理細胞由来）をＨＴＢ−１７７レシピエント細胞に移入した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含まないＥＶ（非処理細胞から取得）、及びｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含まないＬＮＰを対照として送達した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達から９６時間後に、ヒトエリスロポエチンに特異的なＥＬＩＳＡにより、細胞溶解物中でｈＥＰＯタンパク質を定量した。細胞溶解物中のｈＥＰＯタンパク質の量は、ΔＮ（細胞数の変化、すなわち、ＬＮＰ処理間隔の始点及び終点での細胞の数の差として定義される）に対して正規化した。データは、各時点での２回の（ｎ＝２）反復から表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。
【図１０Ｂ】ＥＶによる細胞へのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達及び分泌タンパク質の検出を示す。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達から９６時間後に、ヒトエリスロポエチンに特異的なＥＬＩＳＡを用いて、培養した馴化培地の上清中で、分泌されたｈＥＰＯタンパク質のレベルを定量した。上清中のｈＥＰＯタンパク質の量は、ΔＮに対して正規化した。データは、各時点での２回の（ｎ＝２）反復から表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。
【図１０Ｃ】細胞及び上清中で定量され、ΔＮに対して正規化されたｈＥＰＯタンパク質の合計を示す。データは、各時点での２回の（ｎ＝２）反復から表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。
【図１０Ｄ】ＥＶ処理物との９６時間の培養後の、レシピエント細胞の世代時間を示す。データは、各時点での２回の（ｎ＝２）反復から表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。
【図１０Ｅ】ΔＮに対して正規化された全細胞タンパク質を示す。データは、各時点での２回の（ｎ＝２）反復から表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。
【図１０Ｆ】ΔＮに対して正規化された上清中の全細胞タンパク質を示す。データは、各時点での２回の（ｎ＝２）反復から表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。
【図１１】ＥＶを介した上皮細胞及び初代免疫細胞へのＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡの送達のＦＡＣＳ分析を示す。上皮細胞（カラム１）：７６μｇのＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有するＤＤ−ＬＮＰをヒト上皮（ＨＴＢ−１７７）細胞に移入した後、９６時間のＬＮＰ処理後、これらの細胞からＥＶ（ｍＲＮＡが組み込まれたＤＤ−ＥＶ）を単離した。７８μｇのＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ含有ＤＤ−ＥＶをＨＴＢ−１７７細胞（ウェル当たり２×１０５細胞で培養）に移入した。ＥＶ移入後様々な間隔（２時間、２４時間、４８時間）で細胞を採取して、細胞中のＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡの存在をＦＡＣＳにより分析した。初代免疫細胞（カラム２〜４）：健康なヒトバフィーコートから単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養し（ウェル当たり２×１０５細胞）、７８μｇのＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ含有ＤＤ−ＥＶをＰＢＭＣに移入した。ＥＶ移入後様々な間隔（２時間、２４時間、４８時間）で細胞を採取して、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、及びＣＤ１４（単球）に対する表面マーカのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色した。ＦＡＣＳ分析を実施して、レシピエント細胞中のＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを検出した後、各細胞型に特異的なＣＹ５−蛍光及び抗体−蛍光に基づいて、各細胞型におけるＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡの存在を推定した。ＦＡＣＳドットプロットは、各時点でのＦＣＳ−Ａ（ｘ軸）に対するＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ（ｙ軸）を表す。Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡに陽性の細胞は、右上象限に掲示する。略語：細胞ｗ／ｏ  ＥＶ−非処理細胞；細胞＋ＥＶ（ｗ／ｏ  ｍＲＮＡ）−ｍＲＮＡを含有しないＥＶで処理した細胞；細胞＋ＥＶ（ｍＲＮＡを含む）−ｍＲＮＡを含有するＥＶで処理した細胞。
【図１２】ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）に対する特異性を確認すると共に、マウス血漿ＥＰＯタンパク質とその交差反応性を検定するためのヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の試験を示す。非処理マウスからの血漿及び正常なヒトからの新鮮な血漿（いずれも非希釈及び希釈済（２×−２倍：１０×−１０倍））を試験した。マウス血漿中のｈＥＰＯについてはシグナルが検出されなかった。
【図１３】ＭＣ３−ＬＮＰを介したｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達後のマウス血液中のｈＥＰＯタンパク質の検出を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（マウス１匹当たり）を含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。マウス血漿中のｈＥＰＯタンパク質の濃度は、注射から０時間、２時間、５時間、及び２４時間後、ＥＬＩＳＡにより決定した。２時間時点（ｎ＝４）を除いて、８匹のマウス（ｎ＝８）からデータを表示する。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。非処理マウス（ＰＢＳ）の数はｎ＝８であった。パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、２時間及び５時間の間で、ＭＣ３−ＬＮＰ送達からの血漿ｈＥＰＯタンパク質を比較した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、及びｎｓ＝非有意）。
【図１４Ａ−１４Ｂ】マウス心臓におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図１４Ａ）及びｈＥＰＯタンパク質（図１４Ｂ）の定量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルは、注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。データは、臓器重量に対して正規化した、全臓器中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の総量として表示される。各時点、及び各種処理（ＬＮＰ又はＰＢＳ）について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。データは、各時点で、４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。各時点について、パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＰＢＳ群を比較した。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１４Ｃ−１４Ｄ】マウス肺におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図１４Ｃ）及びｈＥＰＯタンパク質（図１４Ｄ）の定量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルは、注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。データは、臓器重量に対して正規化した、全臓器中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の総量として表示される。各時点、及び各種処理（ＬＮＰ又はＰＢＳ）について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。データは、各時点で、４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。各時点について、パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＰＢＳ群を比較した。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１４Ｅ−１４Ｆ】マウス肝臓におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図１４Ｅ）及びｈＥＰＯタンパク質（図１４Ｆ）の定量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルは、注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。データは、臓器重量に対して正規化した、全臓器中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の総量として表示される。各時点、及び各種処理（ＬＮＰ又はＰＢＳ）について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。データは、各時点で、４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。各時点について、パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＰＢＳ群を比較した。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１４Ｇ−１４Ｈ】マウス脾臓におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図１４Ｇ）及びｈＥＰＯタンパク質（図１４Ｈ）の定量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルは、注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。データは、臓器重量に対して正規化した、全臓器中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の総量として表示される。各時点、及び各種処理（ＬＮＰ又はＰＢＳ）について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。データは、各時点で、４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。各時点について、パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＰＢＳ群を比較した。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１４Ｉ−１４Ｊ】マウス腎臓におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図１４Ｉ）及びｈＥＰＯタンパク質（図１４Ｊ）の定量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルは、注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。データは、臓器重量に対して正規化した、全臓器中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の総量として表示される。各時点、及び各種処理（ＬＮＰ又はＰＢＳ）について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。データは、各時点で、４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。各時点について、パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＰＢＳ群を比較した。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１４Ｋ−１４Ｌ】マウス胸腺におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図１４Ｋ）及びｈＥＰＯタンパク質（図１４Ｌ）の定量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルは、注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。データは、臓器重量に対して正規化した、全臓器中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の総量として表示される。各時点、及び各種処理（ＬＮＰ又はＰＢＳ）について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。データは、各時点で、４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。各時点について、パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＰＢＳ群を比較した。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１４Ｍ−１４Ｎ】マウス膵臓におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図１４Ｍ）及びｈＥＰＯタンパク質（図１４Ｎ）の定量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルは、注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。データは、臓器重量に対して正規化した、全臓器中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の総量として表示される。各時点、及び各種処理（ＬＮＰ又はＰＢＳ）について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。データは、各時点で、４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。各時点について、パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＰＢＳ群を比較した。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１４Ｏ−１４Ｐ】マウス脳におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図１４Ｏ）及びｈＥＰＯタンパク質（図１４Ｐ）の定量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質のレベルは、注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより定量した。データは、臓器重量に対して正規化した、全臓器中で検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の総量として表示される。各時点、及び各種処理（ＬＮＰ又はＰＢＳ）について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。データは、各時点で、４回の反復（ｎ＝４）の標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として表示される。散布図中の各点は、各反復を表す。各時点について、パラメトリック独立両側ｔ検定を用いて、ＭＣ３−ＬＮＰ及びＰＢＳ群を比較した。有意なＰ値のみを示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１５Ａ−１５Ｈ】ＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰを介したヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡのインビボ送達後の臓器重量を示す。マウスには、１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり）、又は対照として等量のＰＢＳを静脈内注射した。注射から５時間、２４時間、及び９６時間後、各マウス臓器：胸腺（図１５Ａ）、腎臓（図１５Ｂ）、心臓（図１５Ｃ）、肝臓（図１５Ｄ）、膵臓（図１５Ｅ）、脳（図１５Ｆ）、膵臓（図１５Ｇ）、及び肺（図１５Ｈ）の重量を決定した。各注射（ＰＢＳ、ＥＶ、ＬＮＰ）の間に明らかな差は認められなかった。処理（ＭＣ３−ＥＶ、ＭＣ３−ＬＮＰ）及び非処理（ＰＢＳ）群について、４匹のマウス（ｎ＝４）を使用した。略語：ＰＢＳ−非処理マウス；ＥＶ−ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＭＣ３−ＥＶ；ＬＮＰ−ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＭＣ３−ＬＮＰ。データは、標準偏差（ＳＤ）を伴う平均値として示す。散布図中の各点は、各反復（マウス）を表す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】非処理又はＭＣ３−ＬＮＰ処理ＨＴＢ−１７７細胞由来の単離ＥＶのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）の結果を示す。図１６Ａは、非処理ＨＴＢ−１７７細胞（ｎ＝３、（ｉ）〜（ｉｉｉ））由来のＥＶの粒度分布及び濃度を示す。図１６Ｂは、ＭＣ３−ＬＮＰ処理ＨＴＢ−１７７細胞（ｎ＝３、（ｉ）〜（ｉｉｉ））由来のＥＶの粒度分布及び濃度を示す。平均粒径、モードサイズ、標準偏差（ＳＤ）、Ｄ１０、Ｄ５０、Ｄ９０、及び粒子濃度を表３〜８に示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】ＬＮＰ処理細胞から得られるＥＶの特性決定を示す。図１７Ａは、ＣＤ９（ｘ軸）に対するＣｙ５−ｍＲＮＡ（ｙ軸）を表すＦＡＣドットプロットを示す。Ｃｙ５−ｍＲＮＡを含有するＣＤ６３／ＣＤ９陽性ＥＶのパーセンテージを右上象限に表示する。ＥＶの代わりにＰＢＳとインキュベートしたビーズ単独を陰性対照として示す。２つの生物学的反復の１つを示す。図１７Ｂは、対照の純粋なｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（細胞フリー及びＥＶフリー（左側））又はＭＣ３−ＥＶ（右側）に対するＲＮａｓｅ処理の作用を示す。実験は、３回の生物学的反復（ｎ＝３）で実施され、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ  ｑＰＣＲデータを散布ドットプロット及び平均標準偏差（ＳＤ）として表す。
【図１８】エタノール、１％（ｗ／ｗ）トリトンＸ−１００、及び定量の「空の」ＥＶを添加した１％（ｗ／ｗ）トリトンＸ−１００中で調製したＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡサンプルのＵＰＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示をさらにわかりやすくするために、詳細な説明全体を通して、特定の用語を定義する。本明細書に他に定義されない限り、本開示に関連して使用される全ての科学及び技術用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４０】
本明細書で使用される通り、用語「細胞外小胞」又は「ＥＶ」は、細胞から分泌又は放出されるナノ若しくはミクロサイズの膜小胞を指す。ＥＶは、脂質二重層により封入され、粒径約３０ｎｍ〜１０，０００ｎｍの範囲のサイズである。特定の実施形態では、ＥＶは、エキソソームである。
【００４１】
本明細書で使用される通り、用語「エキソソーム」及び「エンド−ＥＶ」は、本明細書で置き換え可能に使用されて、エンドソーム由来のＥＶを指す。特定の理論に拘束されるものではないが、細胞又は他の細胞成分により貪食された物質は、エンドソームコンパートメントに分別され得て、腔内膜小胞（多胞性エンドソーム又は多胞体（ＭＶＢ））を形成すると考えられる。続いて、これらの小胞は、ＭＶＢと細胞膜との融合時に、細胞外環境に放出され得る。放出された小胞は、本明細書において、エキソソームと呼ばれ得る。一部の実施形態では、エキソソームは、ＬＮＰの食作用後に細胞から分泌又は放出される。一部の実施形態では、ＬＮＰと接触させるか、又はそれで処理した細胞から分泌又は放出したエキソソームは、１つ以上のＬＮＰ成分（例えば、１つ以上のイオン化脂質及び／又は１つ以上の修飾ＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、エキソソームは、エキソサイトーシス経路を介して分泌される。一部の実施形態では、エキソソームは、約３０ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、エキソソームは、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、エキソソームは、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、エキソソームは、約４０ｎｍ〜約１２０ｎｍの直径を有する。例示的なエキソソームとしては、本明細書に記載及び例示されるように、ＭＣ３−ＥＶ及びＤＤ−ＥＶがある。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「エンドソームからの脱出」は、エンドサイトーシス後に、エンドソーム経路から出て、細胞質に入るＲＮＡを指す。エンドサイトーシス経路は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはタンパク質などの生物学的作用物質の主な細胞取込み機序であると考えられる。こうした物質は、エンドソーム内に閉じ込められて、リソソーム内の特定の酵素により分解される。従って、一部の実施形態では、有効な生物学的療法を達成する際の制限ステップは、治療薬（例えば、修飾ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のエンドソームからの脱出を促進し、しかも、それらの細胞質送達を確実にすることである。一部の実施形態では、ＬＮＰを介して細胞に送達される全修飾ＲＮＡの約１％未満が、エンドソームからの脱出を経て、細胞質に放出され得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ成分の一部（例えば、非脱出修飾ＲＮＡ及び／又はＬＮＰ脂質成分の一部）は、ＬＮＰエンドサイトーシス後、最終的に、細胞から分泌されるエキソソーム内に到達する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」は、１つ以上の脂質及び１つ以上の治療薬（例えば、１つ以上の修飾ＲＮＡ）を含むナノ粒子である。ナノ粒子は、典型的に、マイクロメートルほどの、又はそれを下回る大きさである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰは、直径約２００ｎｍ以下、直径約１５０ｎｍ以下、直径約１００ｎｍ以下、直径約７５ｎｍ以下、又は直径約５０ｎｍ以下の平均粒径を有する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰは、エタノール中の脂質含有溶液と、修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含有する水溶液とのマイクロ流体混合により生成される高電子密度ナノ構造コアを有する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰには、５０体積％を超える連続水性領域がないため、単ラメラ小胞などの通常のリポソームを排除する。
【００４４】
様々な実施形態において、単離エキソソームは、以下：（ａ）修飾ＲＮＡを含む１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供するステップ；（ｂ）細胞によるＬＮＰ取込みを可能にする条件下で、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップ；及び（ｃ）１つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップを含むプロセスにより調製することができ、ここで、少なくとも１つの単離エキソソームは、修飾ＲＮＡを含む。
【００４５】
様々な実施形態において、ＬＮＰは、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、又は約８０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均粒径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ、約７１ｎｍ、約７２ｎｍ、約７３ｎｍ、約７４ｎｍ、約７５ｎｍ、約７６ｎｍ、約７７ｎｍ、約７８ｎｍ、約７９ｎｍ、約８０ｎｍ、約８１ｎｍ、約８２ｎｍ、約８３ｎｍ、約８４ｎｍ、約８５ｎｍ、約８６ｎｍ、約８７ｎｍ、約８８ｎｍ、約８９ｎｍ、又は約９０ｎｍの平均粒径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約８３ｎｍ、約８４ｎｍ、約８５ｎｍ、約８６ｎｍ、約８７ｎｍ、又は約８８ｎｍの平均粒径を有する。
【００４６】
様々な実施形態において、ＬＮＰは、約０．０１〜約０．１５、例えば、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、又は約０．１５の多分散指数（ＰＤＩ）を有する。本明細書で使用される場合、用語「多分散指数」又は「ＰＤＩ」は、ナノ粒子サンプル中のナノ粒子の分布の尺度を指す（ＮＩＳＴ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  １２００−６，“Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｉｚｅ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｔｃｈ  Ｍｏｄｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ”を参照）。
【００４７】
様々な実施形態において、ＬＮＰは、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の修飾ＲＮＡの封入効率（％ＥＥ）を有する。本明細書で使用される場合、用語「封入効率」又は「％ＥＥ」は、組成物中の総修飾ＲＮＡ含量に対するＬＮＰ中に封入された修飾ＲＮＡの比を指し、これは、界面活性剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いたＬＮＰの溶解により測定される。
【００４８】
様々な実施形態において、ＬＮＰは、脂質成分と、少なくとも１つの修飾ＲＮＡを含む。様々な実施形態において、１つ以上の細胞をＬＮＰ（例えば、本明細書に開示されるＬＮＰのいずれか）と接触させることによって生成される１つ以上のエキソソームは、脂質成分と、少なくとも１つの修飾ＲＮＡを含む。様々な実施形態において、エキソソームの脂質成分は、少なくとも部分的に、ＬＮＰの脂質成分に由来し得る。様々な実施形態において、エキソソームの脂質成分は、ＬＮＰの脂質成分と同じ１つ以上の脂質を含み得る。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「脂質成分」は、１つ以上の脂質を含むＬＮＰ及び／又はエキソソームの成分を指す。例えば、本明細書に開示されるＬＮＰ及び／又はエキソソームの脂質成分は、１つ以上のイオン化脂質、１つ以上のリン脂質、１つ以上の構造脂質、及び／又は１つ以上のＰＥＧ脂質を含み得る。様々な実施形態において、ＬＮＰ及び／又はエキソソームの脂質成分は、脂質単層及び／又は脂質二重層を含み得る。
【００５０】
様々な実施形態において、ＬＮＰの脂質成分は、通常のナノ粒子技術で使用される任意の材料、例えば、イオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質から構成され得る。様々な実施形態において、ＬＮＰの脂質成分に存在する少なくとも１つの脂質は、エキソソームの脂質成分中にも存在し、この場合、エキソソームは、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させることによって生成される。
【００５１】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるＬＮＰ及び／又はエキソソームの脂質成分は、１つ以上のイオン化脂質を含み得る。
【００５２】
イオン化脂質の非限定的例として、例えば、酸性ｐＨで陽電荷を含む脂質、例えば、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ；例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１５８，６０１号明細書を参照）、２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、Ｍｅｒｃｋ−３２（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０１８７５４号パンフレットを参照）、Ａｃｕｉｔａｓ−５（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１９９９５２号パンフレットを参照）、ＫＬ−１０（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２９５８３２号明細書を参照）、Ｃ１２−２００（例えば、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＮＡＳ  １０７（５）：１８６４−６９）などが挙げられる。様々な実施形態において、イオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。様々な実施形態において、イオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡである。
【００５３】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１つのイオン化脂質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのイオン化脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約５％〜約９０％、約１０％〜約８０％、約２５％〜約７５％、又は約４０％〜約６０％、例えば、約５０％（モルパーセント）の範囲の量でＬＮＰ中に存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのイオン化脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約５０％（モルパーセント）の量でＬＮＰ中に存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。一部の実施形態では、少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡである。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「ＭＣ３−ＬＮＰ」は、イオン化脂質の大部分：ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡイオン化脂質を含むＬＮＰを指すために用いられ得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＤ−ＬＮＰ」は、イオン化脂質の大部分：ＤＬｉｎ−ＤＭＡイオン化脂質を含むＬＮＰを指すために用いられ得る。
【００５６】
一部の実施形態では、エキソソームは、少なくとも１つのイオン化脂質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡである。一部の他の実施形態では、少なくとも１つのイオン化脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡである。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「ＭＣ３−ＥＶ」は、ＭＣ３−ＬＮＰと接触させるか、又はそれで処理した細胞から単離したエキソソーム（ＥＶ）を示すために用いられ得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＤ−ＥＶ」は、ＤＤ−ＬＮＰと接触させるか、又はそれで処理した細胞から単離したエキソソーム（ＥＶ）を示すために用いられ得る。
【００５９】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるＬＮＰ及び／又はエキソソームの脂質成分は、１つ以上のリン脂質を含み得る。様々な実施形態において、リン脂質は、１つ以上の脂質二重層にアセンブルされ得る。一般に、リン脂質は、リン酸部分及び１つ以上の炭素鎖、例えば、飽和脂肪酸鎖を含み得る。様々な実施形態において、リン脂質は、１つ以上の多重（例えば、二重又は三重）結合（すなわち、１つ以上の不飽和）を含み得る。様々な実施形態において、リン脂質は、膜との融合を促進し得る。様々な実施形態において、膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物の１つ以上の要素が膜を通過するのを可能にし、これにより、例えば、１つ以上の要素の細胞への送達を可能にし得る。
【００６０】
例示的なリン脂質として、限定されないが、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミサクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６ＬｙｓｏＰＣ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ラク−（１−グリセロ）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリンが挙げられる。様々な実施形態において、リン脂質は、ＤＳＰＣである。
【００６１】
例示的なリン脂質には、例えば、生理的ｐＨでゼロ実効電荷を含む中性脂質も挙げられる。中性脂質の非限定的な例として、生理的ｐＨで非荷電型又は中性双性イオン型で存在する脂質、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）などが挙げられる。様々な実施形態において、リン脂質は、ＤＳＰＣである。
【００６２】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１つのリン脂質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのリン脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約１％〜約５０％、約５％〜約２０％、約７．５％〜約１２．５％、例えば、約１０％（モルパーセント）の範囲の量でＬＮＰ中に存在してもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのリン脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約１０％（モルパーセント）でＬＮＰ中に存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのリン脂質は、ＤＳＰＣである。
【００６３】
一部の実施形態では、エキソソームは、少なくとも１つのリン脂質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのリン脂質は、ＤＳＰＣである。
【００６４】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるＬＮＰ及び／又はエキソソームの脂質成分は、１つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「構造脂質」は、ステロール（例えば、動物ステロール、植物ステロール、真菌ステロール）などの脂質成分の構造若しくは流動性を安定化及び／又は維持することができる分子を指す。例示的な構造脂質は、コレステロールである。
【００６５】
構造脂質の非限定的な例として、例えば、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、αトコフェロール、及びそれらの混合物が挙げられる。様々な実施形態において、構造脂質は、コレステロールである。
【００６６】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１つの構造脂質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの構造脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約１０％〜約９０％、約２０％〜約５０％、約３５％〜約４５％、例えば、約３８．５％（モルパーセント）の範囲の量でＬＮＰ中に存在してもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つの構造脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約３８．５％（モルパーセント）でＬＮＰ中に存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つの構造脂質は、コレステロールである。
【００６７】
一部の実施形態では、エキソソームは、少なくとも１つの構造脂質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの構造脂質は、コレステロールである。
【００６８】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるＬＮＰ及び／又はエキソソームの脂質成分は、１つ以上のＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質を含み得る。こうした脂質は、ＰＥＧ化脂質と呼ばれる場合もある。様々な実施形態において、ＰＥＧ脂質は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む。
【００６９】
例示的なＰＥＧ脂質として、限定されないが、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物が挙げられる。例えば、様々な実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ＯＴ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから入手可能）、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、又はＰＥＧ−ＤＳＰＥであってよい。様々な実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約２，０００Ｄａ（ＰＥＧ２０００）であってよい。様々な実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＰＥＧ２０００−ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＧ、ＰＥＧ２０００−ｃ−ＤＯＭＧ、又はＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＯＰＧであってよい。様々な実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ又はＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥである。様々な実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５００〜約１０，０００Ｄａ、又は約１，０００〜約５，０００Ｄａの範囲であってよい。
【００７０】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１つのＰＥＧ脂質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約０％〜約２０％、約０．５％〜約５％、約１％〜約２％、例えば、約１．５％（モルパーセント）の範囲の量でＬＮＰ中に存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約１．５％（モルパーセント）でＬＮＰ中に存在する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ又はＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥである。
【００７１】
一部の実施形態では、エキソソームは、少なくとも１つのＰＥＧ脂質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ又はＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥである。
【００７２】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるＬＮＰは、複数の脂質成分を組み合わせることにより調製することができる。例えば、様々な実施形態において、イオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質のうちの１つ以上を組み合わせることにより、ＬＮＰを調製することができる。様々な実施形態において、イオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質を組み合わせることにより、ＬＮＰを調製することができ、ここで、ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質に対して、約１．５％モルパーセントで、ＬＮＰ中に存在する。様々な実施形態において、イオン化脂質（例えば、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ又はＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣなど）、構造脂質（コレステロールなど）、及びＰＥＧ脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＰＥなど）を、存在する総脂質に対して、約５０：１０：３８．５：１．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモル比で組み合わせることにより、ＬＮＰを調製することができる。
【００７３】
本明細書に開示されるＬＮＰを含むイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質の選択、並びにこうした脂質の互いに対する相対モル比は、選択した脂質の特徴、意図される標的細胞の性質、並びに送達しようとする修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の特徴により決定することができる。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰ中のイオン化脂質のモル比は、存在する総脂質に対して、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、又は約７０％超であってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のリン脂質のモルパーセントは、存在する総脂質に対して、約５％超、約１０％超、約２０％超、約３０％超、又は約４０％超であってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中の構造脂質のモルパーセントは、存在する総脂質に対して、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、又は約５０％超であってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰ中のＰＥＧ脂質のモルパーセントは、存在する総脂質に対して、約０．２５％超、例えば、約１％超、約１．５％超、約２％超、約５％超、又は約１０％超であってよい。
【００７４】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるＬＮＰは、所望される任意の有用な配向で、イオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質の各々を含み得る。一部の実施形態では、ＬＮＰのコアは、イオン化脂質及び構造脂質を含んでもよく、続いて、リン脂質及び／又はＰＥＧ脂質を含む１つ以上の層がコアを取り囲んでもよい。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰは、イオン化脂質（例えば、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ又はＤＬｉｎ−ＤＭＡ）及び構造脂質（例えば、コレステロール）を任意の特定の比で含有するコアを含んでもよく、これらは、任意の特定の厚さのリン脂質単層（例えば、ＤＳＰＣ）で囲まれ、さらに、任意の特定の厚さの外側ＰＥＧ脂質単層により囲まれている。一部の実施形態では、意図される標的細胞の性質、並びに送達しようとする修飾ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡなどの特徴に応じてコア又はそれに続く層のいずれか１つに、修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を組み込むことができる。一部の実施形態では、コア及び外層は、当該技術分野で公知のＬＮＰに典型的に組み込まれた他の成分をさらに含んでもよい。
【００７５】
加えて、一部の実施形態では、ＬＮＰを含むイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質のモルパーセントは、１つ以上の脂質の表面積といったＬＮＰ全体の特定の物理的パラメータを提供するように、選択することもできる。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰを含むイオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質のモルパーセントは、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）当たりの表面積を達成するように選択してもよい。一部の実施形態では、イオン化脂質、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質のモルパーセントは、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）当たりの表面積約１．０ｎｍ２〜約２．０ｎｍ２を達成するように決定してよい。
【００７６】
脂質成分以外にも、様々な実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ及び／又はエキソソームは、少なくとも１つの修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をさらに含む。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「修飾ＲＮＡ」は、参照（非修飾）ＲＮＡ配列（例えば、天然に存在する同等物）に対して、修飾された任意のリボ核酸（ＲＮＡ）配列を指す。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、参照ＲＮＡと比較して、１つ以上のヌクレオシド／ヌクレオチド置換、欠失、及び／又は挿入を含む。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、参照ＲＮＡと比較して、１つ以上のヌクレオシド／ヌクレオチドに対する化学的変更を含む。一部の実施形態では、例えば、修飾ＲＮＡは、Ｎ１−メチル−プソイド−ＵＭＰを形成するように修飾される少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）を含み得る。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡ中の全てのＵＭＰは、Ｎ１−メチル−プソイド−ＵＭＰにより置換されている。修飾ＲＮＡは、必ずしも参照ＲＮＡの物理的操作を必要とするわけではない。修飾ＲＮＡ配列が、参照ＲＮＡ配列と比較して、少なくとも１つの修飾を含む限り、これは、どのようにしてそれが合成されたかにかかわらず、「修飾された」とみなされる。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、低分子量修飾ＲＮＡである。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、高分子量修飾ＲＮＡである。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、低分子量修飾ｍＲＮＡである。一部の他の実施形態では、修飾ＲＮＡは、高分子量修飾ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、エリスロポエチンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列番号１のエリスロポエチンポリペプチドをコードする。例示的なＲＮＡ及びアミノ酸配列を表１に記載する。
【００７８】
【表１】
2021528096.tif 000003
【００７９】
【表２】
2021528096.tif 000004
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「低分子量」は、修飾ＲＮＡを表すとき、約７５０未満、約６５０未満、約５５０未満、約４５０未満、約３５０未満、約２５０未満、又は約１５０未満のヌクレオチド長のＲＮＡ分子を指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「高分子量」は、修飾ＲＮＡを表すとき、約５５０超、約６５０超、約７５０超、約８５０超、約９５０超、約１０００超、約１５００超、又は約２０００超のヌクレオチド長のＲＮＡ分子を指す。例示的な高分子量ＲＮＡは、本明細書に記載及び例示される通り、ヒトエリスロポエチンｍＲＮＡ（配列番号２；コード領域、配列番号３）である。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「外性」は、細胞又は生物の外部に由来する、又は外部で産生される物質若しくは分子を指す。一部の実施形態では、細胞に送達されるか、又は被験者に投与される修飾ＲＮＡは、外性ＲＮＡ（例えば、外性ｍＲＮＡ）である。
【００８３】
一部の実施形態では、ＬＮＰ及び／又はエキソソームは、複数の修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ及び／又はエキソソームは、目的のポリペプチド若しくはタンパク質をコードする１つ以上の修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、ＬＮＰ及び／又はエキソソームは、約１：１〜約４：１、又は約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ及び／又はエキソソームは、約１：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ及び／又はエキソソームは、約１：１、例えば、約０．１：１、約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、又は約０．９：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。本明細書で使用される場合、語句「イオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比」は、本明細書に開示されるＬＮＰ及び／又はエキソソーム中のイオン化脂質と修飾ＲＮＡヌクレオチドのおおよそのモル比を指す。
【００８５】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、約２：１〜約４：１、又は約４：１、約３：１、又は約２：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約３：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、エキソソームは、約１：１〜約３：１、又は約３：１、約２：１、約１：１、若しくは約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、エキソソームは、約１：１、又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、エキソソームは、ＬＮＰに含まれるイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比より低いイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、エキソソームは、約１：１、又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含み、且つＬＮＰは、約３：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、約１：１、又は約１：１未満のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含むエキソソームは、約１：１を超えるイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含むＬＮＰ又は代替的送達ビヒクルと比較して、宿主細胞及び組織において非毒性であるか、又は低毒性であり得る。一部の実施形態では、エキソソーム及びＬＮＰ又は代替的送達ビヒクルは、同じイオン化脂質（例えば、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ又はＤＬｉｎ−ＤＭＡ）及び同じ修飾ＲＮＡヌクレオチドを含むが、異なるイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む。一部の実施形態では、電荷をもたない（すなわち、約１：１のイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む）修飾ＲＮＡ及び／又はエキソソームは、エンドソーム膜を通過することができるのに対し、陽電荷を帯びた（すなわち、約１：１を超えるイオン化脂質：修飾ＲＮＡヌクレオチドモル比を含む）修飾ＲＮＡ及び／又はＬＮＰは、エンドソーム膜を通過することができない。
【００８６】
組成物
様々な実施形態において、本開示は、少なくとも１つのエキソソーム（例えば、本明細書に記載のエキソソームのいずれか）を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、複数のエキソソームを含む。本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、被験者への投与に好適な他の成分、例えば、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤に加えて、少なくとも１つのエキソソームの調製物を指す。本明細書に提供される医薬組成物は、投与を可能にし、その後、有効成分の意図される生物活性を提供し、且つ／又は治療効果を達成するような形態である。本明細書に提供される医薬組成物は、好ましくは、製剤が投与される被験者に対して許容できない毒性の追加成分を一切含有しない。
【００８７】
語句「薬学的に許容可能な」は、本明細書において、正しい医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症を生じることなく、ヒト及び動物の組織との接触での使用に好適であり、妥当なベネフィット／リスク比に見合う化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を示すために使用される。薬物承認機関（例えば、ＥＭＡ、ＵＳ−ＦＤＡ）は指針を提供して、薬学的に許容可能な化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を承認する。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、被験者に有意な刺激を引き起こさず、且つ組成物中で投与されたエキソソームの生物活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。薬学的に許容可能な担体は、組成物を増強若しくは安定化し得るか、又は組成物の調製を容易にするために使用することができる。薬学的に許容可能な担体としては、溶剤、分散媒、コーディング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを挙げることができ、これらは、生理学的に適合性である。担体は、被験者における有害な副作用を最小限にし、且つ／又は活性成分の分解を最小限にするように選択してもよい。また、アジュバントをこれらの製剤のいずれに含有させてもよい。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために、医薬組成物に添加される不活性物質を指す。非経口投与の製剤は、例えば、滅菌水若しくは塩水などの賦形剤、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物油、又は水素化ナフタレンを含有し得る。他の例示的な賦形剤として、限定されないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖類及び各種デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、並びに例えば、ポリソルベート２０などの界面活性剤が挙げられる。
【００９０】
本開示の医薬組成物は、当該技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路及び／又は方法は、所望される結果に応じて変わり得る。一部の実施形態では、投与は、硝子体内、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下投与である。薬学的に許容可能な担体は、硝子体内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射若しくは注入による）に好適でなければならない。一部の実施形態では、少なくとも１つのエキソソームと、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物は、非経口投与に好適な形態であり得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、滅菌注射水性又は懸濁液の形態であってよく、これは、公知の手順に従って製剤化され得る。滅菌注射製剤はまた、非経口的に許容される非毒性緩衝液中の滅菌注射懸濁液であってもよい。
【００９１】
単一剤形を製造するために、エキソソーム中の修飾ＲＮＡの量及び／又は１つ以上の担体若しくは賦形剤と組み合わせた修飾ＲＮＡを含むエキソソームの数は、処置を受ける被験者及び具体的な投与経路に応じて必然的に変動する。典型的に、修飾ＲＮＡ及び／又は修飾ＲＮＡを含むエキソソームの治療有効量若しくは有効用量を本開示の医薬組成物に使用する。修飾ＲＮＡを含むエキソソームは、当業者には周知の従来の方法により、薬学的に許容可能な剤形に製剤化することができる。
【００９２】
エキソソームの投与レジメンは、所望される最適応答（例えば、治療応答）を提供するために、調節してもよい。例えば、エキソソームの単回ボーラスを１回で投与してもよいし、所定の期間にわたって複数の分割用量で投与してもよいし、又は治療状況の要件に応じて用量を漸減若しくは漸増してもよい。いずれか特定の被験者のために、個別のニーズ、並びに担当する臨床医の専門的な判断に応じて、時間の経過とともに具体的な投与レジメンを調節してもよい。非経口組成物は、投与しやすさ及び投与の均一性のために単位剤形に製剤化してもよい。本明細書で使用される単位剤形は、処置を受ける被験者のための単位用量（ｕｎｉｔａｒｙ  ｄｏｓａｇｅ）として適した物理的に別々の単位を指し；各単位は、所望の治療効果をもたらすように算出された所定量の有効成分（すなわち、エキソソーム）を、必要な製剤用担体と共に含有する。
【００９３】
少なくとも１つのエキソソームを含む組成物の用量の値は、有効成分のユニークな特性、及び達成しようとする具体的な治療効果に基づいて選択することができる。医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルより低いレベルで本開示のエキソソーム又は医薬組成物の用量を開始し、所望の効果が得られるまで、用量を漸増することができる。一般に、障害の処置の場合、本開示のエキソソーム又は医薬組成物の有効用量は、多くの様々な要因に応じて変動し得るが、そうした要因として、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒト又は動物のいずれであるか、投与される他の薬剤、並びに処置が予防的又は治療的のいずれであるかなどが挙げられる。選択される用量レベルはまた、多様な薬物動態要因に応じても変動し得るが、そうした要因として、使用される具体的なエキソソーム又は医薬組成物の活性、投与経路、投与時間、排泄率、処置期間、使用される具体的なエキソソーム又は医薬組成物と併用される他の薬剤、化合物及び／若しくは物質、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康状態及び病歴などが挙げられる。処置用量を定呈して、安全性及び効力を最適化してもよい。
【００９４】
本明細書に提供されるエキソソーム及び医薬組成物の毒性及び治療効果は、細胞培養又は動物モデルにおいて標準的な薬学的方法により決定することができる。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０、及びＩＣ５０を決定して、毒性及び治療効果の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）を治療指数として算出することができる。インビトロ及びインビボアッセイから得られたデータを、ヒトへの使用のための用量範囲の推定又は公式化に使用することができる。
【００９５】
様々な実施形態では、本明細書に記載の治療適用で使用するためのキットも本開示の範囲に含まれる。様々な実施形態では、本開示は、少なくとも１つのエキソソームを含むキットを提供する。様々な実施形態では、キットは、複数のエキソソームを含む。様々な実施形態では、キットは、１つ以上の追加成分をさらに含み、そうしたものとして、限定されないが、以下：使用説明；他の試薬、例えば、第２治療薬；投与のためにエキソソームを調製するための装置、容器、若しくは他の用具；薬学的に許容可能な担体；並びに被験者にエキソソームを投与するための装置、容器、若しくは他の用具が挙げられる。挿入片又はラベルのいずれかとしての使用説明は、提案される用量及び／又は投与方法をはじめ、治療適用のためのガイダンスを含み得る。様々な実施形態では、キットは、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）と、障害を処置若しくは予防するためにエキソソーム又は医薬組成物を使用する上での説明を含む。
【００９６】
方法
様々な実施形態では、本開示は、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）と細胞を接触させ、これにより修飾ＲＮＡを細胞に送達することによって、修飾ＲＮＡを細胞に送達する方法を提供する。
【００９７】
本開示は、様々な実施形態で、細胞への修飾ＲＮＡの送達における、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）の使用をさらに提供する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、用語「送達する」とは、ある実体をある目的地に提供することを意味する。例えば、一部の実施形態では、細胞への修飾ＲＮＡの送達は、修飾ＲＮＡを含有する少なくとも１つのエキソソーム、又は修飾ＲＮＡを含有する少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物と細胞を接触させるステップを含み得る。一部の実施形態では、被験者への修飾ＲＮＡの送達は、修飾ＲＮＡを含有する少なくとも１つのエキソソーム、又は修飾ＲＮＡを含有する少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物を被験者に投与するステップを含み得る。少なくとも１つのエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物の哺乳動物組織若しくは被験者への投与は、１つ以上の細胞をエキソソーム又は医薬組成物と接触させるステップを含み得る。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、所望の部位又は組織位置にエキソソーム及び／又は医薬組成物成分の少なくとも部分的な局在化を達成する方法若しくは経路による、哺乳動物組織内又は被験者体内への、少なくとも１つのエキソソーム及び／又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物の配置を指す。
【０１００】
用語「被験者」及び「患者」は、本明細書において置き換え可能に使用され、本明細書に記載の方法及び組成物を用いて、予防的処置を含め、処置が提供される任意のヒト又はヒト以外の動物を指す。ヒト被験者などの特定の動物に固有の状態又は疾患の処置のために、用語「被験者」は、特定の動物を指す。ヒト以外の動物は、任意の哺乳動物など、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物及び非哺乳動物）を含む。哺乳動物の非限定的な例として、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、及びブタが挙げられる。一部の実施形態では、被験者はヒトである。
【０１０１】
一部の実施形態では、有効量のエキソソーム又は医薬組成物と細胞を接触させるステップは、エキソソーム若しくは医薬組成物をインビトロ細胞培地に添加するか、又はエキソソーム若しくは医薬組成物を被験者に投与することを含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、細胞は、インビトロ細胞培地中に存在する。一部の実施形態では、細胞は、被験者から得られる。一部の実施形態では、細胞は、被験者に存在する。一部の実施形態では、細胞は、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である。
【０１０３】
一部の実施形態では、細胞への修飾ＲＮＡの送達は、細胞世代時間を変化させない。他の実施形態では、細胞への修飾ＲＮＡの送達は、細胞世代時間を変化させる。一部の実施形態では、細胞への修飾ＲＮＡの送達は、重量当たりの総細胞タンパク質含量を変化させない。他の実施形態では、細胞への修飾ＲＮＡの送達は、重量当たりの総細胞タンパク質含量を変化させる。
【０１０４】
様々な他の実施形態では、本開示は、さらに、例えば、疾患の処置における、本明細書に開示されるエキソソーム及び医薬組成物に関連する治療方法及びそれらの使用も提供する。一部の実施形態では、エキソソームは、障害を有し、且つ／又は処置を必要とする被験者から取得した細胞から単離される。
【０１０５】
例えば、特定の態様では、本開示は、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）を被験者に投与することにより、被験者の障害を処置若しくは予防する方法を提供し、ここで、エキソソームは、障害を処置する上で有効な修飾ＲＮＡを含む。
【０１０６】
特定の他の態様では、本開示は、被験者の障害の処置若しくは予防における、有効量のエキソソーム又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物（例えば、本明細書に記載のエキソソーム又は医薬組成物のいずれか）の使用を提供し、ここで、エキソソームは、障害を処置する上で有効な修飾ＲＮＡを含む。
【０１０７】
特定の他の態様では、本開示は、以下：（ａ）被験者から取得された１つ以上の細胞を提供するステップ；（ｂ）細胞によるＬＮＰ取込みを可能にする条件下で、修飾ＲＮＡを含む１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と１つ以上の細胞を接触させるステップ；（ｃ）１つ以上の細胞により産生されるエキソソームを単離するステップであって、少なくとも１つの単離エキソソームが、修飾ＲＮＡを含むステップ；並びに（ｄ）有効量の単離エキソソームを被験者に投与するステップにより、被験者の障害を処置又は予防する方法を提供し、ここで、修飾ＲＮＡは、障害を処置する上で有効である。一部の実施形態では、細胞は、上皮細胞、免疫細胞、前駆細胞、又は幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、又は単球である。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」及びその同根語は、疾患、障害、若しくは状態（例えば、貧血、脊髄形成異常、免疫若しくは炎症性疾患、単一遺伝子病（例えば、神経変性疾患）、又は複合病（例えば、心筋梗塞若しくは癌））、又は少なくとも１つのそれらの認識可能な症状の改善を指す。一部の実施形態では、「処置する」は、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指すが、これらのパラメータは、患者により必ずしも認識可能ではない。一部の実施形態では、「処置する」は、疾患、障害、若しくは状態の進行を、物理的に（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメータの安定化）阻害することのいずれか、又はその両方を指す。一部の実施形態では、「処置する」は、疾患、障害、若しくは状態の進行を緩徐にするか、又は反転させることを指す。本明細書で使用される場合、「処置する」及びその同根語は、さらに、所与の疾患、障害、若しくは状態の発症を遅らせるか、又はその獲得のリスクを低減することも含む。
【０１０９】
用語「疾患」又は「障害」は、本明細書において置き換え可能に使用され、罹患した人又は特定の人と接触した人の機能実行を中断若しくは妨害し、且つ／又はそれらの人に、不快感、機能不全、苦痛、或いは死亡などの症状を引き起こす身体若しくはいずれかの器官の状態の何らかの変化を指す。疾患又は障害は、不機嫌、病弱、不快、病気、気分の悪さ、体調不良、不満、軽い病気、又は罹患にも関係し得る。一部の実施形態では、障害は、貧血、脊髄形成異常、免疫又は炎症性疾患、単一遺伝子病（例えば、神経変性疾患）、及び複合病（例えば、心筋梗塞若しくは癌）から選択される。一部の実施形態では、障害は、貧血である。一部の実施形態では、障害は、脊髄形成異常である。一部の実施形態では、障害は、炎症性腸疾患である。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、エリスロポエチンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列番号１のエリスロポエチンポリペプチドをコードする。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、疾患若しくは障害の少なくとも１つ以上の症状を低減するか、又は所望の効果を提供する上で十分な修飾ＲＮＡを含むエキソソームの数又は修飾ＲＮＡを含有するエキソソームを含む医薬組成物の量を指す。例えば、これは、症状の治療的に有意な低減又は創傷治癒に関連する臨床マーカを誘導する量であり得る。エキソソーム、又は少なくとも１つのエキソソームを含む医薬組成物に関連して、用語「有効量」とは、修飾ＲＮＡを送達し、しかも、標的組織及び／又は細胞型におけるタンパク質発現を調節する上で十分なエキソソーム又は医薬組成物の量を指す。一部の実施形態では、エキソソーム又は医薬組成物の有効量は、修飾ＲＮＡにより発現されるタンパク質に関連する疾患又は障害を処置する上で十分な量である。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるエキソソーム及び医薬組成物は、免疫応答、例えば、代替的処置（例えば、ＬＮＰ）によって観察される免疫応答の少なくとも１つのバイオマーカ若しくは症状の発現若しくは活性を低減及び／又は阻害し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される治療方法は、代替的送達ビヒクル（例えば、ＬＮＰ）を用いた処置方法と比較して、炎症誘発性マーカ（例えば、サイトカイン、ケモカイン）の産生若しくは量を低減及び／又は阻害する。炎症誘発性マーカの非限定的な例として、サイトカイン及びケモカイン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＰ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＫＣ、ＭＣＰ−１、エキソタキシン（Ｅｘｏｔａｘｉｎ）、ＦＧＦ（塩基性）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１、ＩＮＦ−γ、ＩＮＦα２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、及びＩＬ−１βが挙げられる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、語句「低減及び／又は阻害する」とは、対照レベルと比較して、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、若しくは９０％以上の変化（プラス若しくはマイナス）を指す。本明細書で使用される場合、用語「対照レベル」とは、非処置サンプル若しくは被験者、又はエキソソームの非存在下で処置されたサンプル若しくは被験者のいずれかを示す。一部の実施形態では、対照レベルは、エキソソームの非存在下で処置された対照サンプル若しくは被験者における発現又は活性のレベル（例えば、１つ以上の炎症誘発性マーカの発現レベル）である。
【０１１３】
一部の実施形態では、被験者は、エキソソームの非存在下、又は修飾ＲＮＡを含有しないエキソソームの非存在下での処置に比べ、修飾ＲＮＡを含有するエキソソームの存在下での処置に対して低減した免疫及び／又は炎症反応を有する。一部の実施形態では、低減した免疫及び／又は炎症反応は、少なくとも１つのサイトカインのレベルの増加若しくは減少を含む。一部の実施形態では、低減した免疫及び／又は炎症反応は、少なくとも１つのサイトカインのレベルの減少を含み、ここで、サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、及びＫＣから選択される。
【０１１４】
一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、ヒト血清の存在下で実施される。一部の実施形態では、ヒト血清は、約０．５体積％、約１体積％、又は約１．５体積％で存在する。一部の実施形態では、ヒト血清は、約１体積％で存在する。一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、１つ以上の細胞を少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なる用量のＬＮＰと接触させることを含む。一部の実施形態では、１つ以上の細胞をＬＮＰと接触させるステップは、１つ以上の細胞を少なくとも３つの異なる用量のＬＮＰと接触させることを含む。一部の実施形態では、エキソソームを単離するステップは、インビトロ細胞培地のサンプルからエキソソームを単離することを含む。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例は、本開示の例示的な実施形態を提供する。当業者は、本開示の趣旨又は範囲を変えることなく実施され得る多数の修正及び変更を認識されよう。こうした修正及び変更は、本開示の範囲内に含まれる。提供される例は、本開示を何ら限定するものではない。
【０１１６】
Ｉ．材料及び方法
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤化及び特性決定
２つの異なるタイプのＬＮＰ、すなわち、修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（８５８ヌクレオチド）（５ｍｅＣ、Ψ）（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含有するＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３−ＬＮＰ）及びＤＬｉｎ−ＤＭＡ  ＬＮＰ（ＤＤ−ＬＮＰ）は、以前記載されている（Ｙａｎｅｚ  Ａｒｔｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）ＰＮＡＳ  １１５（１５）：Ｅ３３５１−６０）通りに、４つの異なる脂質成分と一緒にｍＲＮＡを沈殿させることによって調製した。４つの成分は、以下：低ｐＨでイオン化可能な（カチオン性）イオン化脂質（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ又はＤＬｉｎ−ＤＭＡ）；２つのヘルパー脂質（ＤＳＰＣ及びコレステロール）；並びにＰＥＧ化脂質（ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ）を含んだ。ＭｉｌｌｉＱ−ｗａｔｅｒに溶解させたｍＲＮＡ、１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ３）、及びＭｉｌｌｉＱ−ｗａｔｅｒを混合して、５０ｍＭクエン酸塩の溶液を取得することにより、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ水溶液を調製した。４つの脂質成分（イオン化脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ＝５０：１０：３８．５：１．５モルパーセント）及び総脂質含量１２．５ｍＭの組成物を用いて、エタノール中の脂質溶液（９９．５％）を調製した。容積調合比がＡｑ：ＥｔＯＨ＝３：１で、定全流量が１２ｍＬ／分のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）マイクロ流体混合システムで、ｍＲＮＡ及び脂質溶液を混合した。混合時に、イオン化脂質上の窒素原子とｍＲＮＡ鎖上のリン原子の比は、３．１であった。「空」のＬＮＰ（すなわち、ｍＲＮＡを含まないＬＮＰ）が調製された場合には、エタノール相を５０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ３）のみと混合した。調製されたＬＮＰ溶液の初期０．３５ｍＬと最終０．０５ｍＬを廃棄し、容積の残りをサンプル画分として収集した。
【０１１７】
上記と同じ手順を使用して、シアニン５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ（９９６ヌクレオチド）（５ｍｅＣ、Ψ）（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含有するＭＣ３−ＬＮＰ及びＤＤ−ＬＮＰを調製したが、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの代わりに、シアニン５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡをＬＮＰに組み込んだ。
【０１１８】
製剤化ＬＮＰの特性決定のために、２５μＬのサンプル画分を９７５μＬの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に注入し、これを用いて、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）で強度平均粒径（Ｚ平均）を測定した。サンプル画分を直ちにＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ  Ｇ２透析カセット（１００００  ＭＷＣＯ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した。ＰＢＳバッファーの体積は、６５０〜８００×サンプル画分体積であった。次に、サンプル画分を収集した。この体積から、２５μＬを９７５μＬの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に注入した後、粒径を再度測定した（透析後粒径）。Ｑｕａｎｔ−ｉｔ  Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、最終ｍＲＮＡ濃度及び封入効率（ＥＥ）を測定した。
【０１１９】
細胞培養
ヒト上皮ＨＴＢ−１７７（ＮＣＩ−Ｈ４６０）細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、ＡＴＣＣガイドラインに記載される通りに培養した。ピルビン酸ナトリウム及びＨＥＰＥＳを含まず、重炭酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ−１６４０増殖培地（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で、エキソソーム欠失ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％のＬ−グルタミン（２ｍＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。熱不活性化ＦＢＳは、７０Ｔｉロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を備えるＯｐｔｉｍａ  Ｌ−１００  ＸＰ超遠心分離機において１２０，０００×ｇ、４℃で２時間の超遠心分離によりエキソソームを欠失させ、エキソソーム欠失上清を０．２μｍフィルタで濾過した。
【０１２０】
健康なドナーからの新鮮なバフィーコートをＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）から取得し、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール、及び１０％ＦＢＳ（エキソソーム欠失）で補充した完全ＲＰＭＩ−１６４０増殖培地中でＰＢＭＣを培養し、ヤギ抗ヒトＩｇＡ／ＩｇＧ／ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２断片（２．５μｇ／ｍＬ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）及びホルボールミリステート酢酸塩（ＰＭＡ）（１μｇ／ｍＬ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で刺激した。
【０１２１】
ＬＮＰによる上皮細胞へのｍＲＮＡの送達
ヒト上皮（ＨＴＢ−１７７）細胞を、３０ｍＬの増殖培地に１７５Ｔフラスコ当たり３×１０６細胞の密度で接種し、２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、１％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、フラスコ当たり１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１ｍＬのＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰで細胞を処理した。１ｍＬのＬＮＰ溶液中１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、以下：（１）日目：２００μＬのＬＮＰ（２０μｇのｍＲＮＡ）；（２）日目：４００μＬのＬＮＰ（４０μｇのｍＲＮＡ）；（３）日目：４００μＬのＬＮＰ（４０μｇのｍＲＮＡ）のように３つの異なる用量で投与し、９６時間後に採取した。同量（２００μＬ、４００μＬ、４００μＬ）の対応する空のＤＤ−ＬＮＰ又は空のＭＣ３−ＬＮＰ（すなわち、ｍＲＮＡを含まないＬＮＰ）で処理した細胞、並びに非処理の細胞を陰性対照として使用した。
【０１２２】
エキソソーム細胞外小胞（ＥＶ）の単離及び特性決定
以前記載されている（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．７（１２）：２１１２−２６）通りに、ＬＮＰ処置細胞の馴化培地及び陰性対照からＥＶを単離した。手短には、細胞残屑を除去するために、４Ｋ１５遠心分離機（Ｓｉｇｍａ）により、４℃、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。得られた上清を収集し、４℃、６０，０００×ｇで３５分間の超遠心分離後、０．２μｍフィルタによる濾過を実施して、直径が２００ｎｍ未満のＥＶを取得した。続いて、濾過した上清を４℃、１２０，０００×ｇで７０分間超遠心分離して、ＥＶをペレット化した。ＥＶペレットを適切な量（５０〜８０μＬ）のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁させた。全ての超遠心分離工程は、７０Ｔｉロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いたＯｐｔｉｍａ  Ｌ−１００  ＸＰ超遠心分離機で実施した。
【０１２３】
タンパク質濃度に基づいてＥＶを定量した。２μＬのＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にインキュベートした２μＬのＥＶ懸濁液を、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃｌｅａｎｅｒ（ＶＷＲ）により５４℃で５分間超音波処理して、ＥＶ抽出物を生成した。Ｑｕｂｉｔ  ２．０フルオロメータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＥＶタンパク質を定量した。１μＬのＥＶ、１μＬのＱｕｂｉｔタンパク質試薬、及び１９８μＬのＱｕｂｉｔバッファーを混合してから、室温で１５分間インキュベートした。Ｑｕｂｉｔ  ２．０フルオロメータで、読取りを記録した。
【０１２４】
ＥＶ及びＬＮＰ投与後の細胞からのＲＮＡ単離
ｍｉＲＣＵＲＹ（商標）ＲＮＡ単離キット−細胞及び植物（Ｅｘｉｑｏｎ）を用いて、製造者の指示に従い、ＥＶ及びＬＮＰ処理細胞から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡは、Ｑｕｂｉｔ  ２．０フルオロメータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡ品質（２３０／２６０比）を評価した。
【０１２５】
ＥＶ粒径及び濃度決定のためのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）
Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ１１４４０−５０Ｂ／Ａ１１８９３−０２カメラを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＬＭ１０計器（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて、ＨＴＢ−１７７  ＭＣ３−ＥＶ及び非処理ＥＶを粒径（ｎｍ）及び濃度（粒子／ｍＬ）について評価した。解析の前に、粒子を０．１μＭ濾過ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中で５００倍希釈して、視野内の粒子数をフレーム当たり１８０粒子未満に減少させた。３回の独立した測定（生物学的反復）をスキャッターモードで実施した。各ＥＶサンプルについての測定読取りは、個別のサンプル及び手動での温度モニタリングに応じて、調節したカメラレベル（１０〜１６）及び検出閾値（５〜１５）、各々２５フレーム毎秒（ｆｐｓ）で、６０秒間５キャプチャーにて取得した。ブラー・マックスジャンプ距離（Ｂｌｕｒ  ａｎｄ  Ｍａｘ  Ｊｕｍｐ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ）は自動に設定した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＮＴＡ  ＬＭ１０ソフトウェア  バージョン３．３（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を用いて、読取り、収集、及びデータ解析を実施した。
【０１２６】
ＥＶ中のＬＮＰ由来外性ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの検出及びｑＰＣＲによる定量
ＥＶ、ＬＮＰ投与後のそれらの親細胞の溶解物、及び対応する陰性対照におけるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を用いて定量した。ＲＮＡ収率に基づき、０．２５〜１μｇの全ＥＶ  ＲＮＡ及び細胞の全ＲＮＡを、大容量ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡに変換した。製造者の指示に従い、ＶｉｉＡ（商標）７  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのＴａｑＭａｎプローブアッセイを用いて、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの定量に１００ｎｇの全ｃＤＮＡを使用した。２μｇの純粋なｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（ＴｒｉｌｉｎｋからのＲＮＡ）を逆転写し、得られたｃＤＮＡを段階希釈（１０倍）して、７つの標準（最高点：１００ｎｇ）を調製し、これらを３回技術反復することにより、標準曲線を作成した。続いて、ＥＶ  ｃＤＮＡ及び細胞ｃＤＮＡをｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ解析のために使用し；最小Ｒ２＞０．９７５の標準曲線に対して、絶対定量を補間した。ＧＡＰＤＨを内標準として使用した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのモル量を計算するために、以下のように推定した：１モルｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ＝８５８ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチド。
【０１２７】
ＥＶマーカ（ＣＤ６３及びＣＤ９）の検出並びにＣＤ６３／ＣＤ９陽性ＥＶ中の外来ｍＲＮＡの同定
ＨＴＢ−１７７細胞を、前述したように、１００μｇのＣｙ５−ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含有するＭＣ３−ＬＮＰで処理した。非処理細胞を対照として含んだ。９６時間後、分画超遠心分離（前濃縮）により、ＬＮＰ処理細胞（ＭＣ３−ＥＶ）及び非処理細胞（ＥＶ）の培地から全ＥＶを単離し、ＰＢＳに再懸濁させた後、定量した。前濃縮後、親和性に基づく方法を用いて、ＣＤ６３／ＣＤ９陽性ＥＶを単離し、ＦＡＣＳにより、Ｃｙ５−ｍＲＮＡの存在について評価した。細胞培地についてのエキソソーム−ヒトＣＤ６３単離／検出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造者の指示に従い、ＣＤ６３陽性ＥＶを常磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓに固定化した。結合反応の際に、２０μＬの常磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓを２５μｇ又は５０μｇの全ＭＣ３−ＥＶと一緒にインキュベートした。陰性対照として、２０μＬの常磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓを等量のＰＢＳ（ＥＶなし）と一緒にインキュベートした。ＣＤ６３陽性ＥＶの固定化後、ＥＶをマウス抗ヒトＰＥ−ＣＤ９抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５３７２）で、製造者の指示に従い染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＥＶを取得した後、ＣＤ９及びＣｙ５−ｍＲＮＡを検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて、データを解析した。実験は、生物学的二重反復で実施した。
【０１２８】
細胞の非存在下でのＬＮＰからＥＶへのｍＲＮＡの直接移入の解析
ＬＮＰとＥＶを直接混合した後、様々な割合（量）のＬＮＰ及びＥＶを用いて、３７℃でインキュベート（細胞の非存在下）した。いずれの事前の処理も受けていない２つの異なる割合（量）のＥＶを３００μＬのＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰ（３９μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）と一緒に、３７℃の３０ｍＬのＰＢＳ中で２時間インキュベートした。第１のセットアップにおいて、ＥＶとＬＮＰとの割合は、２００μｇのＥＶ＋３００μＬのＬＮＰ（１×）であったが、第２のセットアップでは、この割合は、５０μｇのＥＶ＋３００μＬのＬＮＰ（４×）であった。２時間のインキュベーション後、超遠心分離によりＥＶを再度単離し、ＥＶから全ＲＮＡを単離し、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをｑＰＣＲにより定量して、ＬＮＰからＥＶへのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの直接移入を評価した。陰性対照として、等量のＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰを、ＥＶを含まないＰＢＳ中でインキュベートした後、超遠心分離した。陽性対照として、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰを細胞に投与した後、ＥＶを単離した（それぞれ、ＤＤ−ＥＶ又はＭＣ３−ＥＶ）。ＲＮＡを単離し、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをｑＰＣＲにより定量した。実験は生物学的三重反復で実施した。データは、ＬＮＰにより細胞に送達されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの投与量又はＥＶと直接混合したｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの量に対して、ＥＶ中に検出されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのパーセンテージとして表示する。反復の標準偏差（ＳＤ）と共に平均値を示す。
【０１２９】
ＥＶ−ｍＲＮＡ保護アッセイ
前述したように、１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＭＣ３−ＬＮＰで、ＨＴＢ−１７７細胞を処理した。非処理細胞を対照として含んだ。９６時間後、ＥＶを単離し、定量した。初めに、ＲＮａｓｅ  Ａ活性（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の効率を評価するために、２８０ｎｇの純粋なｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）をＲＮａｓｅ  Ａ（０．５μｇ／μＬ）又は等量のＰＢＳと一緒に３７℃で２０分間インキュベートした。次に、同じ条件を用いて、２００μｇのＭＣ３−ＥＶをＲＮａｓｅ  Ａで処理した。陰性対照として、２００μｇのＭＣ３−ＥＶ及び１５０μｇの非処理ＥＶを、ＲＮａｓｅ  Ａの代わりにＰＢＳを用いた以外は同じ条件下でインキュベートした。インキュベーション後、ｍｉＲＣＵＲＹＴＭ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット−Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ（Ｅｘｉｑｏｎ）を用いて、ＥＶからの全ＲＮＡを単離した。ＥＶの外部に存在する場合に、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含量に対するＲＮａｓｅ  Ａの作用を評価するために、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをｑＰＣＲにより定量した。実験は、生物学的三重反復で実施した。
【０１３０】
勾配ＵＰＬＣによるＥＶ中のイオン化カチオン性脂質の分析
ＥＶの画分を使用して、ＥＶ中のＬＮＰ由来イオン化脂質の存在を検定した。５〜１０μＬの各ＥＶサンプル（ＭＣ３−ＬＮＰ及びＤＤ−ＬＮＰ処理細胞から取得）をＰＢＳで５０倍希釈した後、トリス／ＥＤＴＡバッファー中２ｗ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００の混合物でさらに１＋１希釈した。サンプルを３７℃で３０分間インキュベートした後、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｄ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＱＤ）（Ｗａｔｅｒｓ）に接続したＡｃｑｕｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣに注入した。分析カラムは、６０℃に維持したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＣＳＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍであった。流量は、水中の０．１％ギ酸（Ａ）と、アセトニトリル及びイソプロピルアルコールの等量混合物中の０．１％ギ酸（Ｂ）との移動相を用いて、０．５０ｍＬ／分であった。０．０ｍｉｎで１０％Ｂを、１．０から５．０ｍｉｎまで８５％Ｂに上昇させた後、７．５ｍｉｎまで８５％Ｂに維持する勾配ランを適用した。勾配ランには、７．６ｍｉｎから９．５ｍｉｎまで９９％Ｂの洗浄ステップを加えた。次に、１０％Ｂをコンディショニングのために９．６ｍｉｎから１２．０ｍｉｎまで適用した。これらの条件下で、ＤＬｉｎ−ＤＭＡの溶離時間は６．３ｍｉｎであり、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡの溶離時間は６．５ｍｉｎであった。エタノール９９．５％に溶解させたＤＬｉｎ−ＤＭＡ及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡの外部標準溶液を用いて、定量を決定した。エレクトロスプレー、ポジティブモードを用いて、ＳＱＤを実行し、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡの溶液による自動調整を用いて調整した。カチオン性脂質の記録は、各カチオン性脂質についてＭ＋１のＳｉｎｇｌｅ  Ｉｏｎ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ（ＳＩＲ）を用いて実施した。
【０１３１】
最後に、イオン化脂質及びｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチドのモル比（ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ当たりのイオン化脂質）をＥＶ及びＬＮＰの両方で決定した。少なくとも６回の生物学的反復で実験を実施した。
【０１３２】
ｈＥＰＯタンパク質定量
ＬＮＰ処理の後、細胞馴化上清を収集し、ｈＥＰＯタンパク質検出のために直接使用したのに対し、１％ハルト（ｈａｌｔ）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下、５００μＬのＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、細胞溶解物から全細胞タンパク質を抽出した。手短には、細胞を３次元Ｂｉｏ−ｒｏｃｋｅｒにより４℃で１０分間穏やかに攪拌し、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞残屑をペレット化した。得られた上清（タンパク質含有）を新しいチューブに移した。同時に、培養した上清を４Ｋ１５遠心分離機（Ｓｉｇｍａ）により４℃、３０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。得られた上清を新しいチューブに移した。また、ｈＥＰＯタンパク質は、エリスロポエチンＥＬＩＳＡキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の指示に従い、ＥＶ溶解物中でも分析した。２μＬのＥＶ懸濁液を２μＬのＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にインキュベートし、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃｌｅａｎｅｒ（ＶＷＲ）により５４℃で５分間超音波処理して、ＥＶ抽出物を生成した。培養上清からの全細胞タンパク質及び全タンパク質、並びに全ＥＶタンパク質を、Ｑｕｂｉｔ  ２．０フルオロメータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、定量した。ｈＥＰＯタンパク質を検出するために、エリスロポエチンＥＬＩＳＡキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示に従って使用した。５０μＬの全タンパク質溶液（細胞及び培養上清の両方について）を使用し、相対標準曲線に従って、ｈＥＰＯタンパク質レベルをｍＵ／ｍＬとして算出した。換算法（１１９ｍＵ＝１ｎｇ）を用いて、濃度をｆｇ／ｍＬに変換し、細胞の総数に対して正規化した。
【０１３３】
細胞増殖、ＲＮＡ、及びタンパク質含量に対するＬＮＰ投与の作用
細胞挙動に対するＬＮＰの作用を決定すると共に、ＬＮＰ処理（ＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰ）に対する細胞耐容性を評価するために、ＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰによる９６時間の処理後に、細胞世代時間（細胞増殖）、細胞全ＲＮＡ、細胞内タンパク質の総含量、及び分泌されたタンパク質の総含量を計算した。ＬＮＰによる処理後の全ＥＶ  ＲＮＡ及びタンパク質含量を定量することにより、ＥＶに対するＬＮＰの作用も検定した。
【０１３４】
細胞世代時間（Ｇ）（細胞の集団が倍加するまでの時間（ｈｒ）として定義される）は、以下の式：
Ｇ＝ｔ／ｎ
ｔ＝ＬＮＰ投与間隔（ｈ）
【数１】
2021528096.tif 000005
を用いて、処理間隔（ΔＮ）の始点及び終点での細胞の数の差に基づいて算出した。
【０１３５】
細胞及びＥＶ中の全ＲＮＡ、ＥＶ中の全タンパク質、細胞中（細胞内）の全タンパク質、及び培養上清中（分泌）の全タンパク質のばらつきを、対応するΔＮ（細胞数の変化）に対して正規化した。
【０１３６】
ＥＶを介したヒト上皮（ＨＴＢ−１７７）細胞へのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達
ヒト上皮（ＨＴＢ−１７７）細胞をＴ１７５フラスコ当たり５×１０６細胞の密度で接種し、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地中で培養した。ＭＣ３−ＬＮＰ処理細胞から単離した６００μｇのＭＣ３−ＥＶ（７００ｎｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）、及びＤＤ−ＬＮＰ処理細胞から単離した６００μｇのＤＤ−ＥＶ（１１００ｎｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）をＲＰＭＩ−１６４０培地中に溶解させ、以下の通り２日にわたり、独立したアッセイでレシピエント細胞に移入した：（１）日目：３００μｇのＭＣ３−ＥＶ、及び（２）日目：３００μｇのＭＣ３−ＥＶを、１５０μｇの２回の個別用量で各々８時間後。同様に、３００μｇのＤＤ−ＥＶ（１日目）及び３００μｇ（２日目）を独立したアッセイでレシピエント細胞に移入した。空のＥＶ（ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含まない）及び非処理細胞からのＥＶを、対照としてレシピエント細胞に送達した。４８時間後、細胞及び培養上清を収集し、全ＲＮＡを単離した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質を、それぞれＲＴ−ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより、前述のプロトコルに従って評価した。実験は、２回の独立した生物学的反復で実施した。
【０１３７】
ＥＶを介した上皮及び初代血液細胞へのシアニン５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ送達
１ｍＬのＬＮＰが、フラスコ当たり７６μｇの蛍光Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有する（これに対し、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、１００μｇ／ｍＬであった）以外は前述のプロトコルに従って、蛍光シアニン５（Ｃｙ５）−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有する１ｍＬのＤＤ−ＬＮＰを様々な用量（２００μＬ、４００μＬ、４００μＬ）でＨＴＢ−１７７細胞に送達した。ＬＮＰの投与から９６時間後、馴化培地（上清）並びに親細胞を採取し、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質について分析したか、又はさらなる試験のために保存した。空のＤＤ−ＬＮＰ（ｍＲＮＡを含まない）及び非処理細胞を対照として使用した。ＨＴＢ−１７７細胞並びに、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、前述した通り、バフィーコートから単離される）から精製したＢ細胞、Ｔ細胞、及び単球などの免疫細胞をウェル当たり２×１０５細胞の密度で接種し、９６ウェルの丸底プレート内の２００μＬの培地に培養し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。培養細胞の２４時間の刺激後、２５μＬのＰＢＳ溶液中のＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含有する７８μｇのＤＤ−ＥＶをレシピエント細胞に送達した。対照アッセイのために、空のＤＤ−ＥＶ（ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含まない）及びネイティブＥＶ（非処理細胞からのＥＶ）を細胞に送達するか、又は細胞を未処理のまま残した。５時間、２４時間、及び４８時間のＥＶ処理後、細胞を採取し、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、及びＣＤ１４（単球）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対し、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により表面マーカについて染色した。細胞は、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡは、各細胞型における蛍光に基づいて検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて、データを解析した。
【０１３８】
ＬＮＰからのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ放出に対するｐＨの作用
０．０１１ｍｇ／ｍＬの濃度でｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＭＣ３−ＬＮＰを、静止条件下、３７℃で、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４、６．６、若しくは５．８）と一緒に、１０ｍＭクエン酸−Ｎａ２ＨＰＯ４バッファー溶液中でインキュベートした。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにおいて０．１２５ｍＭ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＶＷＲ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｇｒａｄｅ）及び０．１２５ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を用い、ゼロ時点でｍＲＮＡの総量を測定した。様々なｐＨ（ｐＨ７．４、６．６、又は５．８）のＬＮＰから放出されたｍＲＮＡの画分を評価するために、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５５  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（例えば、４８０ｎｍ、ｅｍ：５２５ｎｍ）を用い、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で遊離量のｍＲＮＡを分析した。
【０１３９】
ＥＶ及びＭＣ３−ＬＮＰを介したｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのインビボ移入
実験手順は、ゴーテンバーグの地域実験動物倫理委員会（Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）により承認された（倫理審査申請書番号８３−２０１５）。手順は全て、スウェーデン動物保護法（Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ）及び規定ＳＪＶＦＳ  ２０１２：２６に準拠する。Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ  Ｃｒｌ雌マウス（ｎ＝３６）、９〜１０週齢をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎにある動物施設に収容した。マウスは、標準の条件（２１℃  ＲＴ、１２：１２ｈ光周期、４５〜５５％湿度）下でケージ当たり４匹のマウスの群で飼育し、通常の固形飼料（Ｒ７０、Ｌａｃｔａｍｉｎ  ＡＢ）及び水を自由に摂取させた。環境エンリッチメントを提供した（カートン、木製舌圧子、及び綿ネスティングパッド）。等量の１．５μｇ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有する１００μＬのＭＣ３−ＬＮＰ由来ＥＶ又はＭＣ３−ＬＮＰをマウスに静脈内注射した（群当たりｎ＝４）。１００μＬのＰＢＳを対照マウスに注射した。ＥＶ及びＬＮＰの注射から２、５、２４、及び４８時間後に伏在静脈（Ｖｅｎａ  Ｓａｐｈｅｎａ）マイクロサンプリングにより、血液サンプルをマウスの群（ｎ＝４）から収集した。３５μＬ  ＥＤＴＡ−プレップキャピラリーチューブに収集した血液サンプルを、血漿を収集するため１７００×ｇで遠心分離し、分析の時間まで−８６℃で冷凍保存した。注射から５、２４、及び９６時間後、臓器を収集するために、マウス群を死なせた。イソフルラン麻酔によりマウスを鎮静させ、眼窩静脈叢から採血した後、心臓を切除した。続いて、全臓器（肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、心臓、胸腺、肺、及び脳）を収集し、液体窒素でスナップ冷凍し、分析の時間まで−８６℃で保存した。
【０１４０】
マウス血漿中のヒトＥＰＯタンパク質の検出
ＭＣ３−ＬＮＰ及びＭＣ３−ＥＶによるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達後のマウス血漿中のｈＥＰＯタンパク質を分析するために、Ｇｙｒｏｓプラットフォーム上でｈＥＰＯアッセイを自社開発した。ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２１３２７）を用いて、キット添付文書に従って、補足抗体（３Ｆ６、ＭＡＩＩＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をビオチン化した。モノクローナル抗体標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ａ２０１８６）を用いて、検出抗体（７Ｄ３、ＭＡＩＩＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をＡｌｅｘａ  ６４７標識した。ｈＥＰＯタンパク質（自社製）を用いて、１２．２ｐｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲で、Ｒｅｘｘｉｐ  Ａバッファー（Ｇｙｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の標準曲線を作成した。分析前に、マウス血漿サンプルをＲｅｘｘｉｐ  Ａ−ｍａｘバッファー（Ｇｙｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１：１（ｖ：ｖ）希釈した。Ｇｙｒｏｌａｂ計器（Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Ｇｙｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えるＧｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  １０００  ＣＤ（Ｇｙｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でサンプルを分析した。標準曲線のために５パラメータ曲線当てはめを使用した。全ての標準及びサンプルは、１０％未満のＣＶを有した。
【０１４１】
マウス組織中のヒトＥＰＯタンパク質の検出
１％ハルト（ｈａｌｔ）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下、Ｍ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の指示に従い、臓器からの全タンパク質を抽出した。手短には、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）中のプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した２００〜３５０μＬの溶解バッファー（組織重量に応じて）において、最大速（３０Ｈｚ）で３〜５分間２０〜７０ｍｇの組織を溶解させた後、４℃、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離することにより、組織残屑を全て除去した。得られた上清は、Ｑｕｂｉｔ  ２．０フルオロメータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるタンパク質定量のために使用した。エリスロポエチンＥＬＩＳＡキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の指示に従い、ｈＥＰＯタンパク質検出について５０μＬの全タンパク質を分析した。各臓器中のｈＥＰＯタンパク質（ｎｇ）の量を相対臓器重量（ｇ）に対して正規化した。
【０１４２】
マウス血漿中のサイトカイン分析
ＭＣ３−ＬＮＰ及びＭＣ３−ＥＶの静脈内投与後、ＩＬ−６、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、及びＩＰ−１０の同時定量のために、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ’ｓ  ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ磁気ビーズキット（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、＃ＭＣＹＴＯＭＡＧ−７０Ｋ）により、マウスサイトカインの血漿中濃度を測定した。まず、サンプルをアッセイバッファーで１：２希釈し、次に、標準及び品質対照と一緒に９６ウェルプレート内に配置した。ビーズを含有する溶液を添加し；ビーズは、特定の抗体でコーティングした磁気ミクロスフィアである。混合物を４℃で一晩インキュベートした後、各ミクロスフィアの表面上での反応を完了させるために、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートと一緒にインキュベートした。プレートを分析装置Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００（登録商標）上で読み取った。個別のミクロスフィアを各々同定し、そのバイオアッセイの結果を、蛍光リポータシグナルに基づいて定量化した。５パラメータロジスティック曲線当てはめ法を使用し、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のデータを用いて、濃度を測定した。
【０１４３】
マウス臓器中のヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡの検出
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者の推奨に従い、マウス臓器から全ＲＮＡを単離した。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）中のＲＬＴバッファー（６００μＬ）において１０〜５０ｍｇの組織を最大速（３０Ｈｚ）で３〜４分間溶解させた後、２０℃、１０，０００×ｇで３分間遠心分離することにより、組織残屑を全て除去した。続いて、上清をカラムに移し、さらに処理した。ＲＮＡを定量し、Ｑｕｂｉｔ  ２．０フルオロメータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡを定量し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡ品質を評価した。ＲＮＡ収率に基づき、０．５〜１μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡにレトロ転写し、１００ｎｇを用い、ＲＴ−ｑＰＣＲにより、前述したプロトコルに従って、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを検出した。各臓器中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの量（μｇ）を相対臓器重量（ｇ）に対して正規化した。
【０１４４】
統計解析
全ての実験について、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．７（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、統計解析を実施した。インビトロデータは、独立２群両側スチューデントｔ検定を用いて解析したが、例外的に、ＨＴＢ−１７７増殖、ＲＮＡ含量、及びタンパク質含量に対するＬＮＰ投与の効果については、１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を用いて解析した（有意なＰ値＜０．０５）。マウス血漿及び臓器中のｈＥＰＯ含量は、独立２群両側スチューデントｔ検定を用いて解析したのに対し、マウス血漿中のサイトカインのレベルは、１元配置分散分析、続いてシダックの多重比較検定を用いて解析した。Ｐ値の有意性のレベルは、以下のように表示した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０１４５】
ＩＩ．結果
実施例１：脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の特性決定
本明細書に記載の実験で使用されるＬＮＰは、５つの主要成分、すなわち、イオン化脂質（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ又はＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、コレステロール、ＰＥＧ化脂質（ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ）、及びｍＲＮＡ（ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）を含んだ。ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡイオン化脂質を含有するＬＮＰは、ＭＣ３−ＬＮＰと呼ばれ；ＤＬｉｎ−ＤＭＡイオン化脂質を含有するＬＮＰは、ＤＤ−ＬＮＰと呼ばれる。両方のＬＮＰ製剤を、ローディング効率、平均粒径、多分散指数（ＰＤＩ）、及び個々のＬＮＰ成分間のモルパーセント比を含め、複数の生物物理的パラメータに関して、特性決定した（表２）。データは、表２に平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表示する（ＭＣ３−ＬＮＰ、ｎ＝４；ＤＤ−ＬＮＰ、ｎ＝９）。
【０１４６】
ＬＮＰ中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ構築物のローディング効率（封入効率（％ＥＥ）として定義される）は、９３〜９７％の範囲であった。ｍＲＮＡ構築物を含有するＬＮＰの平均測定粒径は、８２〜９０ｎｍの範囲であった。ＬＮＰ中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ構築物の濃度は、０．１ｍｇ（１００μｇ）であった。ＬＮＰ中の個々の成分の間のモルパーセント比は、５０：１０：３８．５：１．５（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ）及び５０：１０：３８．５：１．５（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ）であった。２つの異なるイオン化脂質、すなわち、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ及びＤＬｉｎ−ＭＣ３を含む例示的なＬＮＰの構造を図８Ａに示す。
【０１４７】
【表３】
2021528096.tif 000006
【０１４８】
実施例２：ＬＮＰによる細胞へのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達
ＬＮＰの２つの異なる製剤による、細胞へのヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯタンパク質）をコードするｍＲＮＡの送達を調べた。ＤＬｉｎ−ＤＭＡ−ＬＮＰ（ＤＤ−ＬＮＰと称する）及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＬＮＰ（ＭＣ３−ＬＮＰと称する）を介したｍＲＮＡ送達の有効性を、細胞内ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの量、並びに細胞内及び細胞外環境の両方で産生されたｈＥＰＯの量を決定することによって検定した。
【０１４９】
独立した実験で、ＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰを介して、１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをヒト上皮（ＨＴＢ−１７７）細胞に移入した。ＬＮＰ処理から９６時間後、レシピエント細胞の溶解物中でｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを定量した。また、ｈＥＰＯタンパク質も、レシピエント細胞の溶解物中、さらには細胞培地の上清中で定量した。ＬＮＰの両製剤とも、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを細胞に送達することができた（図１Ａ）。また、ＬＮＰの両製剤とも、レシピエント細胞に欠如する、外因的に送達されるｍＲＮＡからのｈＥＰＯタンパク質の産生を達成した（図１Ｂ及び１Ｃ）。ＭＣ３−ＬＮＰは、ＤＤ−ＬＮＰと比較して、有意に高い量のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを送達した。同様に、ＤＤ−ＬＮＰ送達と比較して、ＭＣ３−ＬＮＰ送達後に、有意に高い量のｈＥＰＯタンパク質が観測された。分泌性タンパク質として特性決定されている（Ｂｅｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２（３）：２０４−１０；Ｓｈａｐｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ．２６（４）：２１６−２７）ｈＥＰＯタンパク質は、細胞質（図１Ｂ）と比較して、細胞外画分（図１Ｃ）中により多くの量が検出された。
【０１５０】
ナノ粒子は、細胞ストレスを引き起こすこと、及び細胞挙動を変化させることが明らかにされている（Ｐａｎａｒｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．５：８７−１００；Ｈａｌａｍｏｄａ  Ｋｅｎｚａｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．４４１（３）：８１３−２１；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．７９（１）：１５０−６１）。ナノ粒子はまた、それらの化学組成物及び／又はｍＲＮＡ含量の結果として、オートファジーリソソーム活性化も誘導し得る（Ｋｌｉｏｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  １２（１）：１−２２２；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２７：１０７−３２；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｋｌｉｏｎｓｋｙ（２０１０）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２（９）：８１４−２２；Ｚａｂｉｒｎｙｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ３（３）：２７８−８１）。
【０１５１】
ＤＤ−ＬＮＰ又はＭＣ３−ＬＮＰが、細胞増殖、全ＲＮＡ合成、及び／又はタンパク質産生に影響を及ぼし得るか否かを決定するために、ＬＮＰで細胞を９６時間処理した後、ＨＴＢ−１７７上皮細胞を採取した。採取後、細胞を計数し、世代時間（すなわち、細胞の集団が倍加するまでの時間（ｈｒ））を算出した。細胞世代時間は、ＬＮＰ処理後、特にｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＬＮＰによる処理後、有意に増加した（図８Ｂ）。これは、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＬＮＰを受けると、細胞は、空のＬＮＰ（ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含まない）を受けた場合又はＬＮＰを全く受けない場合（非処理細胞）と比較して、より低速で増殖し得ることを示している。
【０１５２】
全ＲＮＡ含量は、ｍＲＮＡを含まないＬＮＰで処理した細胞でやや増加したが、統計学的有意性には達さなかった（図８Ｃ）。細胞内タンパク質の総含量は、ＬＮＰ処理後も不変のままであった（図８Ｄ）。しかし、細胞外環境における分泌タンパク質の総含量は、ＤＤ−ＬＮＰ、特にｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含むものによる処理後、有意に増加した（図８Ｅ）。
【０１５３】
ＥＶの全ＲＮＡ及びタンパク質含量の定量：細胞由来の細胞外小胞（ＥＶ）に対する、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含有ＬＮＰの作用の評価から、ｍＲＮＡロードＭＣ３−ＬＮＰで処理した細胞からのＥＶの全ＲＮＡ含量は、非処理細胞又はｍＲＮＡロードＤＤ−ＬＮＰで処理した細胞からのＥＶの全ＲＮＡ含量よりも高いことが判明した。ＭＣ３−ＬＮＰ、特にｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含むものによる処理後にＥＶの全ＲＮＡ含量は増加した（図８Ｆ）。これは、ＭＣ３−ＬＮＰによる処理の後、細胞ＲＮＡが最後にはＥＶ内に留まり得ることを示唆している。加えて、全ＥＶタンパク質含量は、ＭＣ３−ＬＮＰ処理後に増加した（図８Ｇ）。総合すると、これらの結果は、細胞が、ＬＮＰを受け取ると、より多くのタンパク質を分泌する可能性があり、分泌されたタンパク質は、培養上清及び分泌ＥＶの両方で検出され得ることを示唆している（図８Ｅ及び図８Ｇ）。従って、ＬＮＰの投与は、細胞ストレスを招き、その結果、細胞増殖及び／又は細胞により分泌されるタンパク質の量に変化を起こし得る。
【０１５４】
ＥＶの粒径決定及び濃度：ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）により、粒径及び濃度についてＥＶを特性決定した。平均値±ＳＥＭ  ＥＶモードサイズ（３重サンプルから測定）は、非処理細胞からは１００．２±３．７ｎｍ、ＭＣ３−ＬＮＰ処理細胞からは１１６．４±９．２３ｎｍであった（図１６Ａ及び図１６Ｂ；表３〜８も参照）。平均値±ＳＥＭ  ＥＶ濃度（３重サンプルから測定）は、非処理細胞からは５．８１×１０１１±２．２５×１０１０粒子／ｍＬ、ＭＣ３−ＬＮＰ処理細胞からは１．２５×１０１２±１．５４×１０１１粒子／ｍＬであった。
【０１５５】
【表４】
2021528096.tif 000007
【０１５６】
【表５】
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【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
【表７】
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【０１５９】
【表８】
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【０１６０】
【表９】
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【０１６１】
実施例３：ＥＶ中のＬＮＰ由来イオン化脂質及びｍＲＮＡの検出
研究から、大部分のＬＮＰで送達されたＲＮＡは、リソソーム分解及び／又はエンドサイトーシス再循環経路を経るのに対し、エンドソームから脱出するのは、僅かな量のみであり；例えば、ＬＮＰ送達ｓｉＲＮＡの正味脱出は、２％未満であり得ると推定されている（Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（２）：１７２−６；Ｓａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：６５３−８；Ｓａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４５（３）：８２−９５）。
【０１６２】
これらの結果と一致して、本明細書で実施及び記載される実験は、ＬＮＰ−ｍＲＮＡの送達によって、投与されたｍＲＮＡの１％未満がＬＮＰ処理細胞の細胞質中で検出され得ることも明らかにする（図１Ｄ）。ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ製剤を含むＬＮＰを介して送達されたｍＲＮＡは、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ製剤を含むＬＮＰを介して送達されたｍＲＮＡの約２倍のエンドソームからの脱出を呈示する。
【０１６３】
特定の理論に拘束されることは意図しないが、細胞内に取り込まれたＬＮＰ成分の一部は、最後には分泌エンドソーム由来ＥＶ（「エンドソーム」又は「エンド−ＥＶ」）内に留まる可能性があることから、エンドサイトーシス（ＬＮＰの取込み）とエキソサイトーシスの間には関連があると想定した（図１Ｅ）。細胞に取り込まれたときのＬＮＰ送達ｍＲＮＡ及びＬＮＰの他の成分の運命を調べるために、細胞へのＬＮＰ投与（１００μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）から９６時間後に、ｑＰＣＲによってＥＶ中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを定量した。これらの結果は、ＬＮＰ処理細胞から分泌されたエンド−ＥＶが、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを取得したことを示唆している（図１Ｆ）。ＭＣ３−ＬＮＰ処理細胞から得られるエンド−ＥＶは、同じ用量のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ投与を用いたＤＤ−ＬＮＰ処理細胞から得られるエンド−ＥＶに比べ、１０００倍近くのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有した（図１Ｆ）。特に、ＬＮＰ処理細胞の細胞質及びそれらの分泌ＥＶの双方でのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ定量は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ製剤によるｍＲＮＡが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ製剤によるｍＲＮＡよりも多く、エンドソームからの脱出を呈示することを示した。ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ製剤の場合、より多くのｍＲＮＡがＥＶ中でも検出された（図１Ｄ及び図１Ｆ）。
【０１６４】
さらに、ＬＮＰイオン化脂質（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ又はＤＬｉｎ−ＤＭＡ）の存在をＥＶ中で分析した。細胞に移入されたＭＣ３−ＬＮＰ及びＤＤ−ＬＮＰは、３：１モル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のイオン化脂質：ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチドを含有した（図１Ｇ）。また、ＬＮＰ処理細胞から分泌されたＥＶも、イオン化脂質を含有することが判明した。しかし、ＥＶは、ＬＮＰと比較して、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ分子当たり、より少数のイオン化カチオン性脂質を含有した（図１Ｈ及び図１Ｉ）。ＥＶは、１：１モル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のイオン化脂質：ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡヌクレオチドを含有した（図１Ｊ）。
【０１６５】
ＵＰＬＣ−ＭＳ分析のために、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡサンプルを、エタノール、１％（ｗ／ｗ）トリトンＸ−１００、又は定量の「空」ＥＶを添加した１％（ｗ／ｗ）トリトンＸ−１００に溶解させた後、ＵＰＬＣ−ＭＳ系に注入した。トリトンＸ−１００サンプル（「空」ＥＶを含む、及び含まない）の応答は、純粋エタノールに溶解させたサンプルの応答に比べて低かったが、定量の誤差は、１０％未満であると推定された（図１８）。サンプル調製物（ｍＲＮＡ及び脂質定量）並びにｑＰＣＲ（ｍＲＮＡ）及びＵＰＬＣ−ＭＳ（脂質）分析のばらつきを考慮すると、やはり、ｍＲＮＡ及びイオン化脂質は、分泌ＥＶ中に、化学量論的錯塩（１：１）として同時輸送されるようである。さらに、様々なＥＶサンプルについて、ｑＰＣＲを用いて測定されるヌクレオチド濃度と、ＵＰＬＣ−ＭＳを用いて決定される脂質濃度との間には強力な相関が認められた（図１Ｊ）。
【０１６６】
ＬＮＰ送達の後、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡが細胞質中に検出され、また、ｈＥＰＯタンパク質に翻訳され（図１Ａ〜Ｃ）、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡが分泌ＥＶ中に検出された（図１Ｆ）ことから、ＥＶが、ＬＮＰ処理細胞からのｈＥＰＯタンパク質を獲得しているか否かを調べるために、実験を実施した。手短には、ＬＮＰ処理細胞から単離したＥＶを溶解させた後、ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡによりｈＥＰＯタンパク質を分析した。ＥＶ中にｈＥＰＯタンパク質は一切検出されなかったが、これは、産生されるｈＥＰＯタンパク質が、ＥＶを介して送達されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡに由来し得ることを示唆している（データは示していない）。
【０１６７】
さらには、細胞外部のＬＮＰとＥＶの相互作用、並びにＥＶへのＬＮＰ−ｍＲＮＡの直接輸送の可能性を評価した。ＥＶを、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＬＮＰと直接混合した（細胞の非存在下で）。２時間のインキュベーション後、ＥＶを再度単離し、ＥＶ中のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの存在を評価した。結果から、ＥＶは、細胞の非存在下でＬＮＰと直接混合すると、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡについて陰性であることが判明し（図９）、これは、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを細胞外部のＥＶに直接輸送しないことを示唆している。そうではなく、ＥＶは、細胞をＬＮＰで処理したとき、ＬＮＰのエンドサイトーシスを介してｍＲＮＡを獲得し得る。
【０１６８】
実施例４：ＥＶを介した上皮及び免疫細胞へのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達
前述した実験は、ＬＮＰのエンドサイトーシスの後、外性ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをエンド−ＥＶに組み込むことができることを示唆している（図１Ｆ及び図９）。次に、（ａ）ＥＶが、その後、送達ビヒクルとして働くことにより、外性ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをレシピエント細胞に輸送することができるか否か；並びに（ｂ）ＥＶを介して細胞に送達されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡが、機能性である、すなわち、ｍＲＮＡを翻訳して、ｈＥＰＯタンパク質を産生することができるか否かを調べた。
【０１６９】
ＭＣ３−ＬＮＰ処理細胞から単離したＭＣ３−ＥＶ及びＤＤ−ＬＮＰ処理細胞から単離したＤＤ−ＥＶは、レシピエントＨＴＢ−１７７上皮細胞に輸送された。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達から９６時間後、細胞及びそれらの培養上清を収集し、ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡにより、ｈＥＰＯタンパク質を評価した。ｈＥＰＯタンパク質は、細胞溶解物中、並びにレシピエント細胞（すなわち、ｈＥＰＯタンパク質が欠失しているため、それら自体でｈＥＰＯタンパク質を発現しない細胞）の培養上清中で検出可能であった（図１０Ａ〜Ｃ）。ＭＣ３−ＬＮＰの細胞送達（図１Ｂ及び図１Ｃ）と一致して、ＭＣ３−ＥＶ媒介ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達は、ＤＤ−ＥＶ媒介ｈＥＰＯ送達に比べて高いレベルのｈＥＰＯタンパク質産生を示した（図１０Ｃ）。
【０１７０】
ＬＮＰによる送達では、細胞の挙動にいくらかの不都合な作用が生じた（図８Ｃ〜Ｅ）。対照的に、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含むＥＶ又はｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含まないＥＶのいずれかを使用すると、ＥＶによる送達は、細胞世代時間又は細胞タンパク質含量に影響を与えなかった（図１０Ｄ〜Ｆ）。これは、ＬＮＰによる送達に対してストレスを受けた細胞が、ＥＶによる送達に対してはより耐容性であり得ることを示唆している。
【０１７１】
次に、ＥＶが、一般に他の送達ビヒクルを用いて遺伝子導入するのが困難な細胞である免疫細胞に外性ｍＲＮＡ（すなわち、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）を送達することができるか否かを調べた。健康なヒトのバフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した後、接種した。適切な免疫細胞刺激の存在下で一晩インキュベートした後、Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有するＤＤ−ＥＶ（ＤＤ−ＬＮＰ処理細胞由来）を単回用量で、個別に５時間、２４時間、及び４８時間にわたりレシピエント細胞に送達した。
【０１７２】
様々な時間（５時間、２４時間、及び４８時間）の、ＥＶを介したＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡ輸送後に細胞を採取し、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）及びＣＤ１４（単球）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する表面マーカについてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色した。ＦＡＣＳ分析を実施して、レシピエント細胞中のＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを検出し、抗体−蛍光及びＣｙ５−蛍光に基づいて、Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有する各細胞型のパーセンテージを推定した。５時間のＥＶ媒介ｍＲＮＡ送達後、レシピエント免疫細胞中にＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡが検出可能であり、これは、ＥＶが、ｍＲＮＡを免疫細胞に送達し得ることを示している（図２Ｂ〜Ｄ及び図１１）。７０％近いＨＴＢ−１７７細胞が、ＥＶ送達の２４時間後にＣｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡの取込みを示した（図２Ａ）。ＥＶ送達の５時間、２４時間、及び４８時間後に、それぞれ６％、３０％、及び４０％のＢ細胞が、Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有した（図２Ｂ）。ＥＶ送達の５時間に、１７％のＴ細胞及び７１％の単球が、Ｃｙ５−ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡを含有した（図２Ｃ及び図２Ｄ）。
【０１７３】
実施例５：ＥＶを介したマウスへのヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達
エンド−ＥＶが、インビトロでｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを送達することができると判定した後、これらのＥＶが、外性ｍＲＮＡ（すなわち、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）をインビボで送達することもできるか否かを調べた。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをインビボで投与する前に、非処理の健康なＣ５７ＢＬ６／ＮＣｒｌマウスから血液を採取し、ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡによりｈＥＰＯタンパク質を検定して、レシピエントマウスにヒト型のＥＰＯタンパク質（ｈＥＰＯ）が欠失しており、且つこれを発現しないことを確認した。予想通り、非処理のマウスの血漿は、ｈＥＰＯタンパク質について陰性であった（図１２）。
【０１７４】
次に、Ｃ５７ＢＬ６／ＮＣｒｌマウスに、単回静脈内用量のＭＣ３−ＥＶ（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）を注射し、ｈＥＰＯタンパク質の産生を血漿及び臓器の両方で調べた。ＥＶ媒介ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達の２時間後、マウス血漿中にｈＥＰＯタンパク質が検出され、２４時間持続したが、これは、ＥＶが、外性ｍＲＮＡをマウスに送達することができ、しかも、目的のタンパク質の産生をもたらし得ることを示している（図３）。さらに、様々な時点（５時間、２４時間、及び９６時間）で犠牲にしたマウスの８つの臓器において、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質の存在を検定した。結果は、ＥＶが、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを様々な臓器に送達できるだけではなく、ｈＥＰＯタンパク質の産生を可能にし、これは、ＥＶが、機能性ｍＲＮＡを臓器に送達することができることを示している（図４Ａ〜Ｐ）。心臓、肺、肝臓及び脾臓において、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質は検出可能であった（図４Ａ〜Ｈ）。心臓及び肺において、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及び翻訳ｈＥＰＯタンパク質は、ＥＶ媒介ｍＲＮＡ送達の５時間後に検出可能であり、ｍＲＮＡは、２４時間持続した（図４Ａ〜Ｄ）。肝臓では、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、ＥＶ送達の５時間後にのみ検出可能であったが、翻訳ｈＥＰＯタンパク質は、５時間後に検出可能であり、２４時間持続した（図４Ｅ及び図４Ｆ）。しかし、脾臓では、パターンが逆であった。脾臓では、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは５時間後に検出可能であり、２４時間持続したが、翻訳ｈＥＰＯタンパク質は、５時間後にのみ検出可能であった（図４Ｇ及び図４Ｈ）。
【０１７５】
特に、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡについて陽性であった全４つの臓器のうち、肝臓は、最も多量のｈＥＰＯタンパク質を有する臓器であった（図４Ｆ）が、脾臓は、最も多量のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを有する臓器であった（図４Ｇ）。５時間後に脾臓に検出されたｈＥＰＯの量は、他の臓器に検出された量と同等であった。腎臓は、比較的少量のｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを示したが、タンパク質は検出不可能であった（図４Ｉ及び図４Ｊ）。分析した８つの臓器のうち３つ（胸腺、膵臓、及び脳）では、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質は検出不可能であった（図４Ｋ〜Ｐ）。
【０１７６】
ＬＮＰ媒介ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達を検定するために、ＭＣ３−ＬＮＰを用いて並列実験を実施した。Ｃ５７ＢＬ６／ＮＣｒｌマウスに、単一用量のＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）を静脈内注射し、ｈＥＰＯタンパク質の産生を血漿及び臓器の両方で調べた。データは、ＬＮＰ媒介ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達の２時間後、血漿中にｈＥＰＯタンパク質が検出可能であり、５時間持続したことを示す（図１３）。さらに、ＬＮＰ送達の５時間、２４時間、及び９６時間後に犠牲にしたマウスの８つの臓器において、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質の存在を検定した。５つの臓器、すなわち、心臓、肺、肝臓、脾臓、及び腎臓において、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質は検出可能であった（図１４Ａ〜Ｊ）。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質について陽性であった全ての臓器のうち、ほとんどのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは腎臓（２４時間持続した）で、次に脾臓（９６時間持続した）で検出された。ほとんどのｈＥＰＯタンパク質は、肝臓で検出された。しかし、心臓及び肺では、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質の両方が、注射から５時間後に検出された。胸腺、膵臓、及び脳は、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ及びｈＥＰＯタンパク質の両方について陰性であった（図１４Ｋ〜Ｐ）。
【０１７７】
総合すると、これらのデータは、外因的に存在するｍＲＮＡから目的の任意のタンパク質を発現するために、ＥＶが、送達ビヒクルとして使用され得ることを示唆している。
【０１７８】
実施例６：ＥＶ又はＬＮＰを介したマウスへのヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達
ＭＣ３−ＬＮＰに比べて、ＥＶが、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをいかに効率的に送達するかを決定するために、インビボでのＬＮＰ及びＥＶによるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの送達後に、ｈＥＰＯタンパク質の産生を比較した。臓器において、ＬＮＰによるｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ送達からのｈＥＰＯタンパク質の量は、脾臓を除いて概ねＥＶと同等であり、脾臓は、タンパク質産生に有意な差を示し、それに心臓が続いた（有意差はより小さい）（図５）。血液中のｈＥＰＯタンパク質の量は、ＥＶと比較して、ＬＮＰ送達の方が高かった（図５）。さらに、組織に対するＭＣ３−ＬＮＰ及びＭＣ３−ＥＶの作用を検定した。ＭＣ３−ＬＮＰ及びＭＣ３−ＥＶは、レシピエントマウスの臓器重量に有意な作用を示さなかった（図１５Ａ〜Ｈ）。
【０１７９】
実施例７：ＥＶは、ＬＮＰと比べて低い免疫／炎症反応を誘発する
ＥＶが、レシピエントマウスに対しＬＮＰと比べて低免疫原性であるか否かを調べるために、単回用量のＭＣ３−ＬＮＰ（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）及びＭＣ３−ＥＶ（マウス１匹当たり１．５μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ）をＣ５７ＢＬ６／ＮＣｒｌマウスに静脈内注射した。２つの時間間隔（５時間及び２４時間）で、一般に免疫及び炎症反応に関与する８つの異なるサイトカインの濃度をマウス血漿中で測定した。注射から５時間後に検出された複数の炎症誘発性サイトカイン（特に、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、及びＫＣ）の分泌レベルは、ＥＶ送達後よりＬＮＰ送達後で有意に高かった（図６Ａ〜Ｅ）。
【０１８０】
これらの結果は、ＬＮＰの全身送達が、高い炎症性反応を誘発し得るのに対し、ＥＶは、免疫原性が低く、レシピエントマウスによる耐容性が良好であることを示している。ＬＮＰは、ＥＶより多くｈＥＰＯタンパク質産生をもたらし得る（図５）が、ＬＮＰは、ＥＶより免疫原性が高いと考えられ、そのため、恐らく、ＥＶは、ヒト患者への治療用ＲＮＡの送達のためのより安全なビヒクルとなり得る。
【０１８１】
実施例８：ＣＤ６３／ＣＤ９陽性ＥＶ中のＥＶマーカ及び外来ｍＲＮＡの検出
ＬＮＰ−ｍＲＮＡが、ＥＶにより担持されていることを確認するために、ＨＴＢ−１７７細胞を、１００μｇのＣｙ５−ｍＲＮＡを含有するＭＣ３−ＬＮＰで処理するか、又はそれなしで処理した。９６時間後、ＬＮＰ処理細胞（ＭＣ３−ＥＶ）及び非処理細胞（ＥＶ）の培地から全ＥＶを分画超遠心分離により単離し、ＰＢＳ中に再懸濁させた後、定量した。２５μｇ若しくは５０μｇの全ＭＣ３−ＥＶ又は全非処理ＥＶを、抗ＣＤ６３抗体と共役した２０μＬの常磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓと一緒にインキュベートした後、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ６３  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＣＤ６３陽性ＥＶを特異的に単離した。次に、ＣＤ６３陽性ＥＶを、マウス抗ヒトＰＥ−ＣＤ９抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５３７２）で染色してから、Ｃｙ５−ｍＲＮＡ検出についてＦＡＣＳにより分析した。ＦＡＣＳ分析から、非処理細胞からの免疫沈降ＥＶ（５０μｇアッセイ）の約９６％は、ＣＤ６３及びＣＤ９について陽性であったが、ｍＲＮＡについては陰性であったことが明らかにされた。対照的に、ＬＮＰ−ｍＲＮＡ処理細胞からの免疫沈降ＥＶ（５０μｇアッセイ）の約８８％は、ＣＤ６３及びＣＤ９について陽性であったが、２６％が、Ｃｙ５−ｍＲＮＡを含有するＬＮＰのエンドサイトーシス後に分泌されたｍＲＮＡ（Ｃｙ５−ｍＲＮＡ）を含有する（図１７Ａ）。陰性対照（ビーズのみ、並びに非処理細胞から得られるＣＤ６３／ＣＤ９陽性ＥＶ）では、Ｃｙ５−ｍＲＮＡシグナルは一切検出されず、これは、ｍＲＮＡがＥＶ（ＣＤ６３／ＣＤ９陽性ＥＶ）により担持されていることを示している。
【０１８２】
実施例９：ＥＶ−ｍＲＮＡ保護アッセイ
ｍＲＮＡが、ＥＶ膜と結合しているのではなく、ＥＶ内部に位置し、且つ保護されていることを確認するために、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを含有するＭＣ３−ＥＶをＲＮａｓｅ処理に曝露した。ＲＮａｓｅ処理の後、全ＲＮＡをＥＶから単離し、ｑＰＣＲにより、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを定量した。ＲＮａｓｅの効率的なエンドヌクレオチド結合分解活性（ＥＶフリーＲＮＡに示される）にもかかわらず、ＲＮａｓｅで処理しなかったＭＣ３−ＥＶと比較して、ＲＮａｓｅ処理ＭＣ３−ＥＶでは、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ含量に２Ｃｔ倍率変化の減少しか認められなかった。３回の生物学的反復（ｎ＝３）で実験を実施し、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ  ｑＰＣＲデータを散布ドットプロット及び平均標準偏差（ＳＤ）として表す（図１７Ｂ）。ＲＮａｓｅ処理なしの非処理細胞から得られたＥＶは、陰性対照として使用した。送達ｍＲＮＡの僅かな部分がＥＶの外膜層に結合している可能性はあるが、ほとんどのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、エンドヌクレオチド結合分解活性から保護されて、ＥＶ内に存在することが判明した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図４−１４】
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【図４−１５】
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【図４−１６】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
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【図１４−９】
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【図１４−１０】
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【図１４−１１】
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【図１４−１２】
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【図１４−１３】
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【図１４−１４】
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【図１４−１５】
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【図１４−１６】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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