(57)【要約】  サンプル（例えば、血漿または血清サンプル）中に存在する抗体の一部分を含むポリペプチドの量を定量化するための方法が提供され、ここで、抗体は、操作された突然変異を含む定常領域（例えば、重鎖または軽鎖定常領域）を含む。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドの量を定量化するための方法であって、
（ａ）抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを含むサンプルを消化することであり、ここで、抗体重鎖定常領域の一部分は、操作された突然変異を含み、消化は、５〜２６アミノ酸長であり操作された突然変異を含む抗体重鎖定常領域に由来するペプチド断片をもたらす、消化することと、
（ｂ）消化されたサンプルをマススペクトロメトリーによって分析して、ペプチド断片の量を判定することにより、サンプル中の抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドの量を判定することと
を含む前記方法。
【請求項２】
ペプチド断片は、メチオニン（Ｍ）またはシステイン（Ｃ）を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチド断片は、グリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）が続くアスパラギン（Ｎ）を含まない、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
消化されたサンプルをマススペクトロメトリー分析の前に精製および濃縮することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
消化されたサンプルは、固相抽出（ＳＰＥ）によって精製および濃縮される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
消化されたサンプルは、ＳＩＳＣＡＰＡ（安定同位体標準物質および抗ペプチド抗体による捕捉）によって精製および濃縮される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
サンプルは、全血サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、または組織サンプルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
サンプルは、マウス、非ヒト霊長類、またはヒトに由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
非ヒト霊長類は、カニクイザルまたはアカゲザルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルは、少なくとも１種の酵素で消化される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種の酵素は、トリプシン、キモトリプシン、グルタミルエンドペプチダーゼ、リジルエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ、臭化シアン（ＣｎＢｒ）、またはこれらの組合せである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
マススペクトロメトリーは、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含み、ＣＨ１ドメインは、操作された突然変異を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２ドメインは、操作された突然変異を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ３ドメインは、操作された突然変異を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける操作された突然変異は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ｖ、またはＹ４０７Ａである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける操作された突然変異は、Ｙ４０７Ｖであり、ＣＨ３ドメインは、配列番号６（ＤＧＳＦＦＬＶＳ）に示すアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
消化は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）、ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）、またはＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）を含むペプチド断片をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルは、トリプシンで消化され、該消化は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）からなるペプチド断片をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルは、Ａｓｐ−Ｎで消化され、該消化は、アミノ酸配列ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）からなるペプチド断片をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルは、Ｇｌｕ−Ｃで消化され、該消化は、アミノ酸配列ＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）からなるペプチド断片をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドは、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける操作された突然変異は、Ｎ４３４Ｓである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
サンプルは、Ｇｌｕ−Ｃおよびトリプシンで消化され、該消化は、アミノ酸配列ＡＬＨＳＨＹＴＱＫ（配列番号１１）からなるペプチド断片をもたらす、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、またはイムノアドヘシンである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドは、抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体は、治療用抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または多特異性抗体である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
抗体は、三重特異性抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
三重特異性抗体は、１つまたはそれ以上の抗原標的または標的タンパク質に特異的に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチドは、式：ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬによって表される構造を含み；第２のポリペプチド鎖は、式：ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３によって表される構造を含み；第３のポリペプチド鎖は、式：ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３によって表される構造を含み；第４のポリペプチド鎖は、式：ＶＬ３−ＣＬによって表される構造を含み、式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；第１および第２のポリペプチドは、交差する軽鎖−重鎖ペアを形成し；第２のポリペプチド鎖または第３のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）、ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）、またはＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１のポリペプチドは、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含み；第２のポリペプチドは、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含み；第３のポリペプチドは、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチドは、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗体は、薬物または標識にコンジュゲートされている、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
薬物は、化学療法剤、細胞傷害剤、または増殖阻害剤から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
標識は、放射性同位体、蛍光色素、または酵素である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体は、ヒトＩｇＧ抗体である、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体またはヒトＩｇＧ４抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
抗体は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤアーゼ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４／ＶＴＣＮ１、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１ｂ、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＣＣＬ８／ｍｃｐ−２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１ｄ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３ｂ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３ａ、ＣＣＬ２１／ＭＩＰ−２、ＣＣＬ２４／ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３／ＦＣＥＲ２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７／４１ＢＢ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３／ＰＤＬ２、ＣＤ２７４／ＰＤＬ１、ＣＤ２７５／Ｂ７Ｈ２、ＣＤ２７６／Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２７８／ＩＣＯＳ、ＣＤ２７９／ＰＤ−１、ＣＤＨ１／Ｅ−カドヘリン、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１／Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−２／ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−３／ＧＣＳＦ、ＣＸ３ＣＬ１／ＳＣＹＤ１、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ／ＩＬ２５、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４／ｂ４インテグリン、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤアーゼ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２／ＩＬ３３受容体、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ／ＩＬ７Ｒａ、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、またはＸＣＲ／ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１に結合する、請求項２７〜３２および３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
マウス、非ヒト霊長類、およびヒトにおける抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドの薬物動態試験に使用するための、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月１２日に出願された米国仮出願第６２／６１７，０８０号に基づく優先権の利益を主張し、この米国仮出願の内容全体を、参照によって本明細書に組み入れるものである。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
次のＡＳＣＩＩテキストファイルによる提出物の内容全体を、参照によって本明細書に組み入れる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１８３９５２０２８２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１９年１月１１日、サイズ：２９ＫＢ）。
【０００３】
発明の分野
本発明は、サンプル中の操作された突然変異を有する抗体定常領域（またはその一部分）を含むポリペプチドの量を定量化するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
抗体などのタンパク質は、増加し続ける治療薬のクラスの代表である。前臨床開発では、治療用タンパク質候補を動物モデルで徹底的な分析にかけ、薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、および毒物動態学（ＴＫ）の各特性を評価し、安全性プロファイルを評価し、ヒト初回投与試験のための安全な用量を判定する。臨床開発では、治療用タンパク質のＰＫ、ＰＤ、およびＴＫ特性を、ヒト対象においてさらに分析する。ヒトにおける試験から得たデータは、治療用タンパク質の安全性および効能を評価するため、投薬スケジュールを確立するため、ならびに／または患者の部分集団における投与量を調節するために使用される。したがって、治療用タンパク質を定量化するための方法は、前臨床サンプルおよび臨床サンプルの両方において、信頼度および感度の高いものであることが重要である。
【０００５】
リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）は、感度が高く、コストが低く、スループットが高いため、治療用タンパク質の定量化に従来用いられてきた。これらの利点にもかかわらず、ＬＢＡは、限定された線形ダイナミックレンジを有し、代謝物／類似体間の交差反応性のリスクを伴い、マルチプレックス化が困難である。さらに、新規の治療用タンパク質のためにＬＢＡで使用する新たな抗体を開発することは、多大なコストおよび労力の両方を要する。
【０００６】
液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）は、治療用タンパク質の数量化のための有望なアッセイプラットフォームとして浮上している。前臨床動物試験において治療用タンパク質の生物分析のために使用されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイは、治療用タンパク質の代理尺度として、「サロゲートペプチド」（すなわち、配列が治療用タンパク質に特有であり、前臨床種のプロテオームに存在しないペプチド）の数量化に依存することが多い。多くの治療用タンパク質はヒトタンパク質に由来するため、サロゲートペプチドの配列はヒトプロテオーム中に存在する可能性が高く、したがって、ヒト対象から得られたサンプルにおける治療用タンパク質の正確な定量化が妨げられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当該分野では、前臨床（非ヒト）サンプルおよび臨床（ヒト）サンプルの両方において治療用タンパク質を数量化するためのユニバーサルな方法が依然として必要とされている。本開示は、この必要性および他の必要性を対象とする。
【０００８】
本出願に引用した参考文献はすべて、参照によって本明細書に明示的に組み入れる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
サンプル中の抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドの量を定量化するための方法であって、（ａ）抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを含むサンプルを消化することであり、ここで、抗体重鎖定常領域の一部分は、操作された突然変異を含み、消化は、５〜２６アミノ酸長であり操作された突然変異を含む抗体重鎖定常領域に由来するペプチド断片をもたらす、消化することと、（ｂ）消化されたサンプルをマススペクトロメトリーによって分析して、ペプチド断片の量を判定することにより、サンプル中の抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドの量を判定することとを含む方法を提供する。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、ペプチド断片は、メチオニン（Ｍ）またはシステイン（Ｃ）を含まない。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、ペプチド断片は、グリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）が続くアスパラギン（Ｎ）を含まない。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、本方法は、消化されたサンプルをマススペクトロメトリー分析の前に精製および濃縮することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、消化されたサンプルは、固相抽出（ＳＰＥ）によって精製および濃縮される。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、消化されたサンプルは、ＳＩＳＣＡＰＡ（安定同位体標準物質および抗ペプチド抗体による捕捉、Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｂｙ  Ａｎｔｉ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）によって精製および濃縮される。
【００１０】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、サンプルは、全血サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、または組織サンプルである。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、サンプルは、マウス、非ヒト霊長類、またはヒトに由来する。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、非ヒト霊長類は、カニクイザルまたはアカゲザルである。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、サンプルは、少なくとも１種の酵素で消化される。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、少なくとも１種の酵素は、トリプシン、キモトリプシン、グルタミルエンドペプチダーゼ、リジルエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ、臭化シアン（ＣｎＢｒ）、またはこれらの組合せである。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、サンプル中のポリペプチドの量を判定するために使用するマススペクトロメトリーは、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である。
【００１１】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含み、ＣＨ１ドメインは、操作された突然変異を含む。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２ドメインは、操作された突然変異を含む。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ３ドメインは、操作された突然変異を含む。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける操作された突然変異は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ｖ、またはＹ４０７Ａである。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける操作された突然変異は、Ｙ４０７Ｖであり、ＣＨ３ドメインは、配列番号６（ＤＧＳＦＦＬＶＳ）に示すアミノ酸配列を含む。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、消化は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）、ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）、またはＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）を含む（例えば、それからなる）ペプチド断片をもたらす。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、サンプルは、トリプシンで消化され、この消化は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）からなるペプチド断片をもたらす。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、サンプルは、Ａｓｐ−Ｎで消化され、この消化は、アミノ酸配列ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）からなるペプチド断片をもたらす。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、サンプルは、Ｇｌｕ−Ｃで消化され、この消化は、アミノ酸配列ＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）からなるペプチド断片をもたらす。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける操作された突然変異は、Ｎ４３４Ｓである。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、サンプルは、Ｇｌｕ−Ｃおよびトリプシンで消化され、この消化は、アミノ酸配列ＡＬＨＳＨＹＴＱＫ（配列番号１１）からなるペプチド断片をもたらす。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列を含む。
【００１２】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、またはイムノアドヘシンである。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドは、抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体は、治療用抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または多特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体は、三重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、三重特異性抗体は、１つまたはそれ以上の抗原標的または標的タンパク質に特異的に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチドは、式：ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬによって表される構造を含み；第２のポリペプチド鎖は、式：ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３によって表される構造を含み；第３のポリペプチド鎖は、式：ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３によって表される構造を含み；第４のポリペプチド鎖は、式：ＶＬ３−ＣＬによって表される構造を含み、式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；第１および第２のポリペプチドは、交差する軽鎖−重鎖ペア（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ−ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｐａｉｒ）を形成し；第２のポリペプチド鎖または第３のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）、ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）、またはＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）を含む。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含み；第２のポリペプチドは、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含み；第３のポリペプチドは、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチドは、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む。
【００１３】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体は、薬物または標識にコンジュゲートされている。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、薬物は、化学療法剤、細胞傷害剤、または増殖阻害剤から選択される。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、標識は、放射性同位体、蛍光色素、または酵素である。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体またはヒトＩｇＧ４抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、抗体は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤアーゼ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４／ＶＴＣＮ１、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１ｂ、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＣＣＬ８／ｍｃｐ−２、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１ｄ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３ｂ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３ａ、ＣＣＬ２１／ＭＩＰ−２、ＣＣＬ２４／ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３／ＦＣＥＲ２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７／４１ＢＢ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３／ＰＤＬ２、ＣＤ２７４／ＰＤＬ１、ＣＤ２７５／Ｂ７Ｈ２、ＣＤ２７６／Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２７８／ＩＣＯＳ、ＣＤ２７９／ＰＤ−１、ＣＤＨ１／Ｅ−カドヘリン、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１／Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−２／ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−３／ＧＣＳＦ、ＣＸ３ＣＬ１／ＳＣＹＤ１、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ／ＩＬ２５、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４／ｂ４インテグリン、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３Ｌ���１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤアーゼ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２／ＩＬ３３受容体、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ／ＩＬ７Ｒａ、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、またはＸＣＲ／ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１に結合する。上記の実施形態のいずれかによる（またはそれに適用される）ある特定の実施形態では、本方法は、マウス、非ヒト霊長類、およびヒトにおける抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドの薬物動態試験に使用するためのものである。
【００１４】
本明細書に記載する各実施形態は、明らかに別異に解される場合を除き、任意の他の実施形態または複数の実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましいものまたは有利なものとして示される構成または実施形態はいずれも、明らかに別異に解される場合を除き、好ましいものまたは有利なものとして示される任意の他の構成（単数もしくは複数）または実施形態（単数もしくは複数）と組み合わせることができる。本発明のこれらの態様および他の態様は、当業者には明らかになるであろう。本発明のこれらの実施形態および他の実施形態を、下記の詳細な説明によってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】いくつかの例示的な治療用抗体のＦｃ領域の配列アライメントを示す図である。少なくとも１つのアミノ酸置換を含む予測されるトリプシンペプチドに下線が引かれている。トリプシンペプチド中に存在するシステインは太い矢印で示されている。配列番号２および５は、ノブ突然変異Ｔ３６６Ｗを含む。配列番号３および４は、ホール突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、配列番号２および３に示すアミノ酸配列を有する重鎖を含む、トリプシンで消化された三重特異性構築物（ＴＲＩ−１）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。配列番号２は、操作された「ノブ」突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、配列番号３は、操作された「ホール」突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。配列番号３のトリプシン消化は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）を有するペプチド、すなわち、「操作されたＴＴＰＰペプチド」をもたらすと予測される。図２Ａは、ｍ／ｚ９０５．４０〜９０７．６０に対する抽出イオンクロマトグラムを示す。図２Ｂは、全イオンクロマトグラムを示す。図２Ｃは、操作されたＴＴＰＰペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、トリプシンで消化されたマウス血清（図３Ａ）、サル血清（図３Ｂ）、ヒト血清（図３Ｃ）、およびＰＢＳＴ中のＴＲＩ−１（図３Ｄ）の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。操作されたＴＴＰＰに関する実行時間は四角によって示されている。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｄは、マウス血清（図４Ａ）、サル血清（図４Ｂ）、ヒト血清（図４Ｃ）、およびＰＢＳＴ（図４Ｄ）における、トリプシンで消化されたＴＲＩ−１の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。操作されたＴＴＰＰに関する実行時間は四角によって示されている。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＰＢＳＴ中のトリプシンで消化されたＴＲＩ−１から得た、操作されたＴＴＰＰの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝９０５．３６〜９０５．５５）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、２０μｇ／ｍＬ（図５Ａ）、２μｇ／ｍＬ（図５Ｂ）、および０．２μｇ／ｍＬ（図５Ｃ）であった。ＴＴＰＰペプチドのピーク面積は、４４０６４８８６（図５Ａ）、２６３３１６６（図５Ｂ）、および３６８６４９（図５Ｃ）であった。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、ＰＢＳＴ中のトリプシンで消化されたＴＲＩ−１から得た、非標識ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１０）（ＦＮＷＹ）の抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝５５９．９０〜５５９．９８）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、２０μｇ／ｍＬ（図６Ａ）、２μｇ／ｍＬ（図６Ｂ）、および０．２μｇ／ｍＬ（図６Ｃ）であった。ＦＮＷＹペプチドのピーク面積は、７００９１２７９（図６Ａ）、１０７８３００（図６Ｂ）、および２０９１１０（図６Ｃ）であった。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＰＢＳＴ中のＴＲＩ−１消化のための内部標準として使用した、トリプシンで消化されたＳＩＬＵＭＡＢから得た、同位体標識されたＦＮＷＹ（ＦＮＷＹ（重））の抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝５６２．５８〜５６２．６３）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、２０μｇ／ｍＬ（図７Ａ）、２μｇ／ｍＬ（図７Ｂ）、および０．２μｇ／ｍＬ（図７Ｃ）であった。ＦＮＷＹペプチドのピーク面積は、１３６９０７８（図７Ａ）、３４３４８２（図７Ｂ）、および４７３７４３（図７Ｃ）であった。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、マウス血清中のトリプシンで消化されたＴＲＩ−１から得た、操作されたＴＴＰＰの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝９０５．３９〜９０５．５５）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、０μｇ／ｍＬ（対照）（図８Ａ）、０．２μｇ／ｍＬ（図８Ｂ）、２μｇ／ｍＬ（図８Ｃ）、および２０μｇ／ｍＬ（図８Ｄ）であった。ＴＴＰＰペプチドのピーク面積は、ＮＤ（検出されず）（図８Ａ）、ＮＤ（検出されず）（図８Ｂ）、２１６８４７１（図８Ｃ）、および１１８３３１２７（図８Ｄ）であった。
【図８−２】図８−１の続き。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｄは、マウス血清中のトリプシンで消化されたＴＲＩ−１から得た、非標識ＦＮＷＹの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝５５９．９０〜５５９．９８）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、０μｇ／ｍＬ（対照）（図９Ａ）、０．２μｇ／ｍＬ（図９Ｂ）、２μｇ／ｍＬ（図９Ｃ）、および２０μｇ／ｍＬ（図９Ｄ）であった。ＦＮＷＹペプチドのピーク面積は、ＮＤ（検出されず）（図９Ａ）、４１０３３０（図９Ｂ）、２５００１０９（図９Ｃ）、および２２０３９６２１（図９Ｄ）であった。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｄは、マウス血清中のＴＲＩ−１消化のための内部標準として使用した、トリプシンで消化されたＳＩＬＵＭＡＢから得た、ＦＮＷＹ（重）の抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝５６２．５８〜５６２．６３）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、０μｇ／ｍＬ（対照）（図１０Ａ）、０．２μｇ／ｍＬ（図１０Ｂ）、２μｇ／ｍＬ（図１０Ｃ）、および２０μｇ／ｍＬ（図１０Ｄ）であった。ＦＮＷＹペプチドのピーク面積は、１１８４１８１（図１０Ａ）、２３１０６７５（図１０Ｂ）、１１９９６４２（図１０Ｃ）、および９６７３０９（図１０Ｄ）であった。
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｄは、サル血清中のトリプシンで消化されたＴＲＩ−１から得た、操作されたＴＴＰＰの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝９０５．３９〜９０５．５５）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、０μｇ／ｍＬ（対照）（図１１Ａ）、０．２μｇ／ｍＬ（図１１Ｂ）、２μｇ／ｍＬ（図１１Ｃ）、および２０μｇ／ｍＬ（図１１Ｄ）であった。ＴＴＰＰペプチドのピーク面積は、ＮＤ（検出されず）（図１１Ａ）、ＮＤ（検出されず）（図１１Ｂ）、１０１３９６４（図１１Ｃ）、および３７５１０１７（図１１Ｄ）であった。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｄは、サル血清中のトリプシンで消化されたＴＲＩ−１から得た、非標識ＦＮＷＹの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝５５９．９２〜５５９．９５）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、０μｇ／ｍＬ（対照）（図１２Ａ）、０．２μｇ／ｍＬ（図１２Ｂ）、２μｇ／ｍＬ（図１２Ｃ）、および２０μｇ／ｍＬ（図１２Ｄ）であった。ＦＮＷＹペプチドのピーク面積は、７５６７５（図１２Ａ）、９７７３１（図１２Ｂ）、１２９８１５０（図１２Ｃ）、および１３３７８１８７（図１２Ｄ）であった。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｄは、サル血清中のＴＲＩ−１消化のための内部標準として使用した、トリプシンで消化されたＳＩＬＵＭＡＢから得た、ＦＮＷＹ（重）の抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝５６２．５８〜５６２．６３）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、０μｇ／ｍＬ（対照）（図１３Ａ）、０．２μｇ／ｍＬ（図１３Ｂ）、２μｇ／ｍＬ（図１３Ｃ）、および２０μｇ／ｍＬ（図１３Ｄ）であった。ＦＮＷＹペプチドのピーク面積は、１４４６２０３（図１３Ａ）、１２１６２５４（図１３Ｂ）、１２７１７２８（図１３Ｃ）、および１３４４９８３（図１３Ｄ）であった。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｄは、ヒト血清中のトリプシンで消化されたＴＲＩ−１から得た、操作されたＴＴＰＰの抽出イオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝９０５．３９〜９０５．５５）を示す図である。ＴＲＩ−１の濃度は、０μｇ／ｍＬ（対照）（図１４Ａ）、０．２μｇ／ｍＬ（図１４Ｂ）、２μｇ／ｍＬ（図１４Ｃ）、および２０μｇ／ｍＬ（図１４Ｄ）であった。ＴＴＰＰペプチドのピーク面積は、ＮＤ（検出されず）（図１４Ａ）、ＮＤ（検出されず）（図１４Ｂ）、１９４０６５（図１４Ｃ）、および１８４８３３２（図１４Ｄ）であった。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄは、面積比と抗体濃度の比較を示す図である。図１５Ａは、ＰＢＳＴ中の、操作されたＴＴＰＰ：ＦＮＷＹ（重）の面積比と、ＴＲＩ−１の抗体濃度との比較を示す。図１５Ｂは、ＰＢＳＴ中の、非標識ＦＮＷＹ：ＦＮＷＹ（重）の面積比と、ＴＲＩ−１の抗体濃度との比較を示す。図１５Ｃは、マウス血清中の、操作されたＴＴＰＰ：ＦＮＷＹ（重）の面積比と、ＴＲＩ−１の抗体濃度との比較を示す。図１５Ｄは、サル血清中の、操作されたＴＴＰＰ：ＦＮＷＹ（重）の面積比と、ＴＲＩ−１の抗体濃度との比較を示す。
【図１６】実施例２において数量化した例示的な三重特異性抗体の重鎖および軽鎖の配列を示す図である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイにおいて数量化したサロゲートペプチドの配列に下線が引かれている。
【図１７】例示的な三重特異性抗体、および図１６において下線が引かれたサロゲートペプチドの配列が三重特異性抗体中のどこに位置しているかを示す概略図である。
【図１８】ＴＴＰＰペプチドを使用して三重特異性抗体を数量化する方法の例示的なワークフロー図である。
【図１９】図１９Ａは、ＬＬＯＱ（数量化下限（ｌｏｗｅｓｔ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、２．５μｇ／ｍｌ）におけるＴＴＰＰペプチドの例示的なクロマトグラムを示す図である。図１９Ｂは、実施例３で内部標準として使用した安定同位体標識ＴＴＰＰペプチド（標準［１３Ｃ１１−１５Ｎ２］−ＬＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号２０）の例示的なクロマトグラムを示す図である。図１９Ｃは、２．５μｇ／ｍＬ〜１０，０００μｇ／ｍＬの範囲にわたるＴＴＰＰペプチドの較正曲線を示す図である。
【図２０】図２０Ａは、１／ｘの重み付けを用いる線形回帰分析を使用して分析した血清の較正曲線を示す図である。図２０Ｂは、１／ｘの重み付けを用いる線形回帰分析を使用して分析した第２の血清の較正曲線を示す図である。図２０Ａおよび２０Ｂにおける曲線を作図するために使用したサンプルは、実施例３に記載する別々の実験から得た。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、三重特異性抗体を投与したマウスから得られた血清中のＴＴＰＰペプチドのレベルを測定することによって検出された、三重特異性抗体の相対的レベルの比較を示す図である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、三重特異性抗体を投与したマウスから得られた血清中の、ＥＬＩＳＡによって検出された三重特異性抗体の相対的レベルの比較を示す図である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、ブランクのラット血清サンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、三重特異性抗体５μｇ／ｍｌをスパイクしたラット血清サンプルのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、ブランクのサル血清サンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、三重特異性抗体５μｇ／ｍｌをスパイクしたサル血清サンプルのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２２Ｅ】図２２Ｅは、ブランクのサル血清サンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２２Ｆ】図２２Ｆは、三重特異性抗体５μｇ／ｍｌをスパイクしたヒト血清サンプルのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本明細書で使用する、「抗体定常領域」とは、抗体のうち比較的保存された領域、例えば、可変ドメインの外側を指す。この用語は、軽鎖定常領域、すなわち、ＣＬドメイン、ヒンジ領域、ならびに重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および場合によりＣＨ４を含む場合がある。
【００１７】
本明細書で使用する、「操作された突然変異」という用語は、ヒトによる設計によって生み出された突然変異（すなわち、自然要因によって自然発生的に生じたものではない突然変異、および／または意図的なヒトによる操作の結果であった突然変異）を指す。
【００１８】
本明細書で使用する、「抗体」という用語は、インタクト抗体、重鎖定常領域の少なくとも一部分を含む抗体断片（限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または単一重鎖抗体を含む）（ただし、それらが所望の生物学的活性を呈することを条件とする）；モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；単一特異性抗体；多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体および三重特異性抗体）；および抗体様タンパク質を指す場合がある。
【００１９】
「抗体」という用語は、典型的には、２つの軽（Ｌ）鎖および２つの重（Ｈ）鎖を含むヘテロ四量体複合体を指す。鎖内ジスルフィド架橋に加えて、可変数のジスルフィド結合が２つの重鎖を連結し、１つのジスルフィド結合が各軽鎖を重鎖に連結している。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）に続いて（Ｎ末端からＣ末端へ）、３つまたは４つの定常ドメインを含む。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）に続いて１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含む。典型的に、哺乳動物の軽鎖は、アミノ酸配列に基づく２つのカテゴリー：カッパおよびラムダのうちの１つに分類される。
【００２０】
本明細書で使用する、「多特異性」という用語は、抗体または抗体断片に関連して使用される場合、２種またはそれ以上の異なる結合特異性を有する抗体または抗体断片（例えば、二重特異性抗体および三重特異性抗体）を含む。例えば、各結合特異性が、異なる抗原を認識してもよいし、または、各結合特異性が、異なる親和性および／もしくは正確なエピトープを有する同じ抗原を認識してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、第１の結合特異性を有する第１の抗原結合性ドメイン、第２の結合特異性を有する第２の抗原結合性ドメインなどが、多特異性抗体または抗体断片に含まれるように、異なる結合特異性の各々が、１つまたはそれ以上の異なる抗体抗原結合性ドメイン（例えば、可変ドメイン）を含む。種々の例示的な多特異性抗体フォーマット（例えば、二重特異性および三重特異性の抗体フォーマット）が当該分野で公知であり、これらについては、本明細書の他の箇所でさらに詳細に説明する。
【００２１】
本開示の実施形態を詳細に説明する前に、本開示は特定の組成物または生物システムに限定されず、これらは当然ながら様々でありうることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことを理解されたい。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、内容に明らかに別段の定めがある場合を除き、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「１個の分子（ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、場合により、２個またはそれ以上のかかる分子の組合せなどを含む。
【００２３】
本明細書で使用する、「約」という用語は、当該技術分野の当業者には容易に分かる、それぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」のつく値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体に関する実施形態を含む（また、説明する）。
【００２４】
本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含む」、それら「からなる」、およびそれら「から本質的になる」を含むものと理解される。
【００２５】
サンプル中のポリペプチドを定量化するための方法
マススペクトロメトリー（ＭＳ）は、例えば、前臨床動物試験から得られたサンプルにおける、治療用タンパク質の定量的分析のためのリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）に代わる、実行可能な代替策である。ＭＳに基づく数量化の典型的な手順は、各サンプルを消化してペプチド断片を生成し、治療用タンパク質自体のサロゲートとして、治療用タンパク質に由来する特定のペプチドの量を数量化することを必要とする。現在、ヒト抗体の定常領域に由来する「ユニバーサルな」サロゲートペプチドが、非ヒト動物モデルにおけるヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体の数量化のための一般的方法において使用されている。このような一般的方法は、「ユニバーサルな」サロゲートペプチドの配列が、すべてのヒトＦｃドメインにおいて保存されているが、前臨床効能試験および安全性試験を行う種（例えば、マウス、ラット、イヌ、サルなど）には存在しないという原理に基づいている。しかしながら、「ユニバーサルな」サロゲートペプチドの配列は内因性ヒト抗体にも存在するため、「ユニバーサルな」サロゲートペプチドを使用して、ヒト患者のサンプルにおける、例えば、ヒト抗体の定常領域を含む治療用タンパク質を正確に定量化することは不可能である。
【００２６】
ヒト抗体の定常領域を含む多くの治療用タンパク質（例えば、抗体）はまた、例えば、エフェクター機能をモジュレートしたり、血清半減期をモジュレートしたり、ヘテロ二量体化を促進したりするために定常領域に導入されている、操作された突然変異を含む。本出願者らは、操作された突然変異を含む定常領域の一部分に由来するペプチドが、非ヒトおよびヒトの両方のプロテオームバックグラウンドにおいて独特であることを見出した。したがって、本明細書に記載する方法は、前臨床サンプル（すなわち、動物種から得られるもの）と、臨床サンプル（すなわち、ヒト患者から得られるもの）との両方において、治療用タンパク質を定量化するために使用することができる。
【００２７】
サンプル中のポリペプチドの量を定量化するための方法であって、ポリペプチドは、抗体重鎖定常領域の一部分を含み、抗体重鎖定常領域の一部分は、操作された突然変異を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は：（ａ）ポリペプチドを含むことが疑われるサンプルを消化して、操作された突然変異を含むペプチド断片を含む、消化されたサンプルをもたらす工程と；（ｂ）消化されたサンプルをマススペクトロメトリーによって分析して、操作された突然変異を含むペプチド断片の量を判定することにより、ポリペプチドの量を判定する工程とを含む。本明細書に記載する方法を使用して数量化することができるポリペプチド（例えば、融合タンパク質、イムノアドヘシン、および抗体）については、本明細書の他の箇所でさらに詳細に説明する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に提示する方法を、薬物動態試験において（例えば前臨床研究または臨床治験において）使用する。いくつかの実施形態では、本方法は、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを、数量化の前に、例えば前臨床研究中の、動物に投与する工程を含む。操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを投与することができる例示的な非ヒト動物については、以下に詳細に説明する。いくつかの実施形態では、本方法は、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを、数量化の前に、ヒト、例えば臨床治験中のヒト患者に投与することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを含むサンプルは、動物に由来する、動物から得られる、または動物から分離した生物学的サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルが由来する、得られる、または分離される動物は、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを投与した動物である。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒト（例えば、ヒト患者）、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（例えば、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、リスザル、サバンナモンキー、ヒヒなど）、または齧歯類（例えば、マウスまたはラット）である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に提示する方法によって分析しようとするサンプルは、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを含むことが疑われる任意のサンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、唾液、胆汁、もしくは涙を含むがこれらに限定されない体液であるか、または体液に由来する。いくつかの実施形態では、サンプルは、組織または細胞を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、血清および既知量のペプチド（すなわち、「スパイクした」血清）を含む。いくつかの実施形態では、スパイクした血清は、緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、スパイクした血清は、動物に由来する、動物から得られる、または動物から分離したサンプル中に存在する、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドの量を数量化するための基準としての機能を果たす。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、サンプル中の操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドを濃縮するため、または、例えば、サンプル中の豊富なタンパク質（例えば血液、血清、または血漿サンプル中のアルブミン）を枯渇させるために、消化の前にサンプルを処理することをさらに含む。いくつかの実施形態では、サンプルを処理することは、抗体プルダウンアッセイを行うことを含む。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、サンプルを処理することは、ゲル電気泳動、抽出、沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー（例えば、親和性捕捉クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、限外濾過、および／または当業者に公知の１つまたはそれ以上のさらなる分離工程を行うことを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、サンプルを化学的切断によって消化する。ポリペプチド中の特定の部位を切断する例示的な化学試薬としては、例えば、ギ酸、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、およびＮＴＣＢ（２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、サンプルを、酵素、例えばエンドペプチダーゼで消化する。いくつかの実施形態では、酵素は、部位特異的エンドペプチダーゼである。例示的な部位特異的プロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン（高特異性、Ｐの前でないＦＹＷのｃ末端を切断する）、キモトリプシン（低特異性、Ｐの前でないＦＹＷＭＬのｃ末端を切断する）、グルタミルエンドペプチダーゼ、リジルエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、Ａｒｇ−Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌Ｖ８（グルタミルエンドペプチダーゼまたはＧｌｕ−Ｃプロテアーゼとしても公知である）、臭化シアン（ＣｎＢｒ）、エラスターゼ、ペプシン（ｐＨ＝１．３）、ペプシン（ｐＨ＞２）、ネプリライシン、ＢＮＰＳ−スカトール、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、クロストリパイン、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、グランザイムＢ、サーモリシン、プロリン−エンドペプチダーゼ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、トロンビン、およびタバコエッチウイルスプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、サンプルを、非特異的エンドペプチダーゼ、例えば、パパインまたはプロテイナーゼＫで消化する。いくつかの実施形態では、サンプルを、２種（またはそれ以上）のエンドペプチダーゼ（部位特異的および／または非部位特異的を含む）を含む混合物で消化する。いくつかの実施形態では、２種またはそれ以上のエンドペプチダーゼを同時に使用して、サンプルを消化する。いくつかの実施形態では、２種またはそれ以上のエンドペプチダーゼを連続的に使用して、サンプルを消化する。マススペクトロメトリーによる分析のための製造物中のポリペプチドを消化するための方法は、当該分野において周知である。例示的な方法は、例えば、Ｇｕｎｄｒｙら（２００９年）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ１０２５ｓ８８；Ｈｅｄｒｉｃｋら（２０１５年）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７巻（３号）：２０１〜２２２頁；Ｇｉａｎｓａｎｔｉら（２０１６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１１巻：９９３〜１００６頁；Ｎｏｒｄｈｏｆｆら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔ．２２６巻（１号）：１６３〜１８０頁；およびＺｈａｎｇら（２０１４年）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ１０２１ｓ１０８において提示されている。
【００３３】
サンプルの消化は、操作された突然変異を含むペプチド断片をもたらす。いくつかの実施形態では、消化によってもたらされるペプチド断片は、５〜４０アミノ酸長、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチド断片は、システイン（Ｃｙｓ）残基および／またはメチオニン（Ｍ）残基を含まない。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、ペプチドは、グリシン残基（Ｇ）またはセリン残基（Ｓ）が続くアスパラギン残基（Ｎ）（すなわち、ＮＧまたはＮＳ）を含まない。いくつかの実施形態では、ペプチド断片は、近接するエンドペプチダーゼ切断部位、例えば、６、５、４、３、２、または１つのアミノ酸を隔てた、２つまたはそれ以上の部位特異的エンドペプチダーゼ切断部位を含まない。消化（例えば、単一の酵素もしくは化学的切断試薬を用いた消化、または酵素および／もしくは化学的切断試薬の組合せを用いた消化）によってもたらすことができるペプチド集団を予測するために、種々のインシリコツールが開発されてきた。このようなツールは、ＰＣｈｏｐｐｅｒ、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒ、ＭＡＰＰＰ、ＩＰＥＰ、ＭＳ−Ｄｉｇｅｓｔ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｓｉｍｕｌａｔｏｒを含み（ただしこれらに限定されるものではない）、当該分野で周知であり、ワールドワイドウェブなどで公的に利用可能である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本方法は、消化されたサンプルをマススペクトロメトリーによる分析の前に精製および／または濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、消化されたサンプルを精製および／または濃縮することは、親和性捕捉クロマトグラフィーまたは固相抽出（ＳＰＥ）を行うことと、精製および濃縮したサンプルを溶出することとを含む。（例えば、Ｇｕｄｒｙら（２００９年）「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ａ  Ｂｏｔｔｏｍ−Ｕｐ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｆｌｏｗ．」Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．ＣＨＡＰＴＥＲ：Ｕｎｉｔ１０．２５．ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ１０２５ｓ８８を参照されたい。）いくつかの実施形態では、消化されたサンプルを精製および／または濃縮することは、安定同位体標準物質および抗ペプチド抗体による捕捉（ＳＩＳＣＡＰＡ）を行うことを含む。いくつかの実施形態では、サンプルを抗体プルダウンアッセイに供し、消化し（例えば、当該分野で公知の１つまたはそれ以上のエンドペプチダーゼを使用して）、ＳＩＳＣＡＰＡによって精製および／または濃縮する。ＳＩＳＣＡＰＡに関する詳細は、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００４年）「Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｂｙ  Ａｎｔｉ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＳＩＳＣＡＰＡ）．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．３巻（２号）：２３５〜４４頁；米国特許第７，６３２，６８６号および同第９，１６４，０８９号；Ｗｈｉｔｅａｋｅｒら（２０１１年）「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｓｓａｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１０巻（４号）：Ｍ１１０．００５６４５；ならびにＲａｓａｖｉら（２０１６年）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ＤＢＳ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＳＩＳＣＡＰＡ  ｗｏｒｋｆｌｏｗ．」Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ．８巻（１５号）：１５９７〜１６０９頁において提示されている。
【００３５】
いくつかの実施形態では、消化されたサンプルを、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、サンプル混合物をまず液体クロマトグラフィーによって分離し、その後イオン化し（例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、または大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）により）、２つの質量分析計を順番に使用して、質量対電荷比および相対的存在量による特性評価を行う方法である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに関する詳細は、例えば、Ｇｒｅｂｅら（２０１１年）「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｗｈｅｒｅ  ｔｏ  Ｆｒｏｍ  Ｈｅｒｅ？」Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖｉｅｗ．３２巻（１号）：５〜３１頁；Ｅｌ−Ｋｈｏｕｒｙら「Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．」Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．＆Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈ．４巻：ｅ１１５．ｄｏｉ：１０．４１７２／２１５７〜７０６４．１０００ｅ１１５；Ｓｈｕｓｈａｎら（２０１０年）「Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．」Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．Ｒｅｖ．２９巻：９３０〜９４４頁、２０１０年において提示されている。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に提示する方法を使用して、サンプル中のペプチドを検出することができ、ここで、サンプル中のペプチドの濃度は、約２００、１５０、１００、５０、１５、１０、５、１、０．５、０．２５、０．１、０．０７５、０．０５、０．０２５、または０．０１ｎｇ／ｍｌ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つである。
【００３７】
抗体重鎖定常領域における操作された突然変異
いくつかの実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化されるポリペプチドは、操作された突然変異を含むＣＨ１ドメイン（またはその一部分、例えば、１０〜５０個のアミノ酸）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ１ドメインは、Ｋａｂａｔ付番システムによると、抗体重鎖の約残基１１４から約残基２２３まで延びる。いくつかの実施形態では、ＣＨ１ドメインは、ＥＵ付番システムによると、抗体重鎖の約残基１１８から約残基２１５まで延びる。例えば、ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌにおけるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）のウェブ資料を参照されたい。これらのアミノ酸残基の位置は、ヒトＩｇＧに基づく；しかしながら、本明細書に提示する方法を、ヒトＩｇＧのＣＨ１ドメイン（またはその一部分）を含むポリペプチドでの使用に限定することを意図するものではない。他のヒトＩｇ由来の対応するＣＨ１ドメイン配列、および他の哺乳動物（例えば、マカク、カニクイザル、マウス、ラットなど）の対応するＣＨ１ドメイン配列は、公的に利用可能である。
【００３８】
ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドの所望の活性に影響を及ぼさない（または実質的に影響を及ぼさない）アミノ酸置換、挿入、または欠失を含む（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、非天然アミノ酸またはコンジュゲートされたアミノ酸の置換または挿入を含む。アミノ酸の置換、挿入、または欠失は、本明細書の他の箇所でさらに詳細に説明するように、ポリペプチドをコードする核酸を（例えば、部位特異的突然変異誘発によって）変化させることにより、またはペプチド合成により、ＣＨ１ドメイン（またはその一部分）に導入することができる。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（またはその一部分）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、Ｆｃヘテロ二量体化を推進する（例えば、二重特異性抗体、多特異性抗体、または１アーム抗体（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の生成のため）。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、Ｋ１４７またはＫ２１３における（ＥＵ付番システムによる）アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインにおける操作された突然変異は、アミノ酸置換Ｋ１４７Ｄ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｄ、またはＫ２１３Ｅ（ＥＵ付番システムによる）を含む（例えば、それからなる）。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、操作された突然変異を含むＣＨ２ドメイン（またはその一部分、例えば、１０〜５０個のアミノ酸）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＥＵ付番システムによると、抗体重鎖の約残基２３１から約残基３４０まで延びる。例えば、ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌにおけるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）のウェブ資料を参照されたい。これらのアミノ酸の位置は、ヒトＩｇＧに基づく；しかしながら、本明細書に提示する方法を、ヒトＩｇＧのＣＨ２ドメイン（またはその一部分）を含むポリペプチドでの使用に限定することを意図するものではない。他のヒトＩｇ由来の対応するＣＨ２ドメイン配列は、他の哺乳動物（例えば、マカク、カニクイザル、ラット、マウスなど）の対応するＣＨ２ドメイン配列と同様に、公的に利用可能である。ある特定の実施形態では、ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドの所望の活性に影響を及ぼさない（または実質的に影響を及ぼさない）アミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、非天然アミノ酸またはコンジュゲートされたアミノ酸の置換または挿入を含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、エフェクター機能をモジュレートする。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次の残基：Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｓ２３９、Ｆ２４３、Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｐ２５７、Ｓ２６７、Ｒ２９２、Ｑ２９５、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、Ｙ３００、Ｑ３１１、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｉ３３２、およびＥ３３３（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次のアミノ酸置換：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ａ、Ｐ２３８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｒ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｒ２９２Ｐ、Ｑ２９５Ｒ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｃ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｑ３１１Ｉ、Ｋ３２２Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｗ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｎ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｖ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｙ、Ｅ３３３Ａ、およびＥ３３３Ｓ（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）を含む。あるいは、またはさらに、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、ΔＧ２３６（ＥＵ付番システムによる）を含む（例えば、それからなる）。
【００４２】
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、エフェクター機能をモジュレートする。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次の残基：Ｋ３２６およびＥ３３３（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次のアミノ酸置換：Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓ（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）を含む。
【００４３】
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ２ドメインにおける操作された突然変異は、エフェクター機能をモジュレートする。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ２ドメインにおける操作された突然変異は、Ｅ２３５における（ＥＵ付番システムによる）アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｅ２３５Ｙを含む。
【００４４】
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、エフェクター機能をモジュレートする。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次の残基：Ｓ２２８、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｆ２９６、Ｇ３２７、およびＰ３２９（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、次のアミノ酸置換：Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｆ２３４Ｌ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ２９６Ｙ、Ｇ３２７Ａ、Ｐ３２９Ｇ、およびＰ３２９Ｎのうちの１つ（またはそれ以上）を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、操作された突然変異を含むＣＨ３ドメイン（またはその一部分、例えば、１０〜５０個のアミノ酸）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ＥＵ付番システムによると、約残基３４１から約残基４４７まで延びる。例えば、ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌにおけるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）のウェブ資料を参照されたい。これらのアミノ酸の位置は、ヒトＩｇＧに基づく；しかしながら、本明細書に提示する方法を、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインを含むポリペプチドでの使用に限定することを意図するものではない。他のヒトＩｇ由来の対応するＣＨ３ドメイン配列は、他の哺乳動物（例えば、マカク、カニクイザル、ラット、マウスなど）の他のＩｇ由来の対応するＣＨ３ドメイン配列と同様に、公的に利用可能である。ある特定の実施形態では、ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドの所望の活性に影響を及ぼさない（または実質的に影響を及ぼさない）アミノ酸置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、置換または挿入は、非天然アミノ酸またはコンジュゲートされたアミノ酸の置換または挿入を含む。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ４ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、エフェクター機能をモジュレートする。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、残基Ｒ４０９における（ＥＵ付番システムによる）アミノ酸置換を含む（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、アミノ酸置換Ｒ４０９Ｋを含む（例えば、それからなる）。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって定量化しようとするポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、エフェクター機能をモジュレートし、かつ／または血清半減期を向上させる。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次の残基：Ｎ３４３、Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｐ３９６、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、およびＹ４３６（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次のアミノ酸置換：Ｎ３４３Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ｖ、Ｐ３９６Ｌ、Ｍ４２８Ｉ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ｆ、およびＹ４３６Ｈ（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、Ｆｃヘテロ二量体化を推進する（例えば、二重特異性抗体、多特異性抗体、または１アーム抗体の生成のため）。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次の残基：Ｙ３４９、Ｓ３５４、Ｒ３５５、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、およびＫ４３９（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｒ３５５Ｄ、Ｒ３５５Ｅ、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３６０Ｄ、Ｋ３６０Ｅ、Ｔ３６６Ｒ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｎ、Ｔ３６６Ｑ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｅ、Ｔ３６６Ｇ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｋ、Ｌ３６８Ｑ、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ｇ、Ｌ３６８Ｈ、Ｌ３６８Ｉ、Ｌ３６８Ｎ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｓ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｗ、Ｋ３７０Ｗ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｄ３９９Ａ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｌ、Ｄ３９９Ｍ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ２９９Ｓ、Ｄ３９９Ｔ、Ｄ３９９Ｆ、Ｄ３９９Ｈ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、Ｋ４０９Ｒ、Ｋ４０９Ａ、Ｋ４０９Ｈ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｇ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅ（ＥＵ付番システムによる）のうちの１つ（またはそれ以上）を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）における操作された突然変異は、Ｙ４０７Ｖを含む（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドは、配列番号６（ＤＧＳＦＦＬＶＳ）に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＹ４０７Ｖ突然変異を有する抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドを含む（または含むことが疑われる）サンプルの消化は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）、ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）、またはＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）を含む（例えば、それからなる）ペプチド断片をもたらす。いくつかの実施形態では、操作されたＹ４０７Ｖ突然変異を有する抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドを含む（または含むことが疑われる）サンプルは、トリプシンで消化され、この消化は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）を含む（例えば、それからなる）ペプチド断片をもたらす。いくつかの実施形態では、操作されたＹ４０７Ｖ突然変異を有する抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドを含む（または含むことが疑われる）サンプルは、Ａｓｐ−Ｎで消化され、この消化は、アミノ酸配列ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）を含む（例えば、それからなる）ペプチド断片をもたらす。いくつかの実施形態では、操作されたＹ４０７Ｖ突然変異を有する抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドを含む（または含むことが疑われる）サンプルは、Ｇｌｕ−Ｃで消化され、この消化は、アミノ酸配列ＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）を含む（例えば、それからなる）ペプチド断片をもたらす。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインにおける操作された突然変異は、Ｎ４３４Ｓを含む（例えば、それからなる）。いくつかの実施形態では、操作されたＮ４３４Ｓ突然変異を有する抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドを含む（または含むことが疑われる）サンプルは、Ｇｌｕ−Ｃおよびトリプシンで消化され、この消化は、アミノ酸配列ＡＬＨＳＨＹＴＱＫ（配列番号１１）を含む（例えば、それからなる）ペプチド断片をもたらす。
【００５０】
ある特定の実施形態では、操作された突然変異を、当該分野で公知の標準的な分子生物学的技術によって、抗体重鎖定常領域（またはその一部分）に導入する。遺伝子操作のための種々の方法がこれまでに説明されている。このような突然変異誘発方法としては、例えば、組換え前の、エラープローンＰＣＲ、ループシャッフリング、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法に関するさらなる詳細は、例えば、Ａｂｏｕ−Ｎａｄｌｅｒら（２０１０年）Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂｕｇｓ．１巻、３３７〜３４０頁；Ｆｉｒｔｈら（２００５年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２１巻、３３１４〜３３１５頁；Ｃｉｒｉｎｏら（２００３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２３１巻、３〜９頁；Ｐｉｒａｋｉｔｉｋｕｌｒ（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９巻、２３３６〜２３４６頁；Ｓｔｅｆｆｅｎｓら（２００７年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ．１８巻、１４７〜１４９頁；および他の文献に記載されている。
【００５１】
抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチド
本明細書に提示する方法は、抗体重鎖定常領域の一部分を含む任意のポリペプチドを使用して行うことができ、ここで、抗体重鎖定常領域の一部分は、操作された突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインのすべてまたは一部分（例えば、１０〜５０個のアミノ酸）を含むが、ただし、ドメイン（またはその一部分）が、操作された突然変異（例えば、本明細書の他の箇所に記載する操作された突然変異）を含むことを条件とする。いくつかの実施形態では、操作された突然変異を含む重鎖定常ドメインの一部分は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラットなど）であるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、操作された突然変異を含む重鎖定常領域の一部分は、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ヒトＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＥ、もしくはヒトＩｇＤであるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、操作された突然変異を含む重鎖定常領域の一部分は、マウス（例えば、マウスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＭ抗体重鎖定常領域）であるか、またはそれに由来する。
【００５２】
ある特定の実施形態では、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも１つの操作された突然変異を含む、例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＥ、またはヒトＩｇＤの、定常領域を含む。
【００５３】
ある特定の実施形態では、操作された突然変異を有する抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドは、融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、抗体重鎖定常領域のＦｃドメイン（すなわち、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含む、Ｆｃ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、イムノアドヘシン、すなわち、結合性タンパク質の機能性ドメイン（例えば、受容体、リガンド、または細胞接着ポリペプチド）が抗体重鎖定常領域の一部分（典型的にはヒンジおよびＦｃドメイン）に融合している融合ポリペプチドである。
【００５４】
抗体
いくつかの実施形態では、操作された突然変異を含む抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、２つの軽（Ｌ）鎖および２つの重（Ｈ）鎖を含むヘテロ四量体複合体である。いくつかの実施形態では、２つの軽鎖および２つの重鎖は同一である。いくつかの実施形態では、２つの軽鎖は異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの重鎖は異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長抗体である（例えば、２つの完全長軽鎖および２つの完全長重鎖を含む）。いくつかの実施形態では、抗体は、操作された突然変異を含む重鎖定常ドメインの一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または単一重鎖抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、哺乳動物抗体（例えば、ヒト抗体、非ヒト霊長類抗体、マウス抗体、ラット抗体など）である。いくつかの実施形態では、抗体は、単一特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、多特異性抗体である。
【００５５】
多特異性抗体
多特異性抗体は、２種以上の抗原に対する結合特異性（例えば、２種、３種、または４種以上の結合特異性）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提示する方法を使用して数量化される抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、同じ抗原に対して２種の異なる結合特異性を含む（例えば、異なる結合親和性および／または同じ抗原の特定のエピトープを有する）。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２種の異なる抗原に対する結合特異性を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長抗体またはインタクト抗体である。本明細書に提示する方法は、当該分野で公知の二重特異性または多特異性の抗体フォーマットで使用することが想定される。例示的な二重特異性および多特異性の抗体フォーマットとしては、以下に記載するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
例えば、「ノブイントゥホール」は、抗体重鎖ホモ二量体をヘテロ二量体化するために（例えば、二重特異性抗体、多特異性抗体、または１アーム抗体の生成のために）操作するための設計方策である。一般的に、このような技術は、第１のポリペプチド（例えば第１の抗体重鎖における第１のＣＨ３ドメイン）の界面に隆起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチド（例えば第２の抗体重鎖における第２のＣＨ３ドメイン）の界面に対応する空洞（「ホール」）を導入することで、隆起が、ヘテロ二量体の形成を促進し、ホモ二量体の形成を妨げるように空洞内に位置することができるようにすることを含む。隆起は、第１のポリペプチド（例えば第１の抗体重鎖における第１のＣＨ３ドメイン）の界面における小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えばアルギニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン）に置き換えることによって構成される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン、セリン、バリン、またはスレオニン）に置き換えることにより、隆起と同一または同様のサイズの補整的な空洞が、第２のポリペプチド（例えば第２の抗体重鎖における第２のＣＨ３ドメイン）の界面に生み出される。例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第５，８０７，７０６号；同第５，８２１，３３３号；同第７，６４２，２２８号；同第７，６９５，９３６号；同第８，２１６，８０５号；および同第８，６７９，７８５号を参照されたい。これらの各々の内容全体を、参照によって本明細書に組み入れる。ノブイントゥホール突然変異の例示的なセットとしては、下記の表１に示すものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００５７】
【表１】
2021510813.tif 000003
【００５８】
ＷＯ２０１１／１３１７４６は、各ＣＨ３ドメインにおける３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、および４０７位（ＥＵ付番による）のうちの１つに非対称突然変異を含む二重特異性抗体について記載している。突然変異は、還元条件下でインキュベーションすると、２つの単一特異性ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ４抗体、またはＩｇＧ４様抗体間における方向性の「Ｆａｂアーム」または「半分子」交換を推進する。
【００５９】
ＵＳ２００９／０２３２８１１およびＳｃｈａｅｆｅｒら（２０１１年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．１０８巻（２７号）：１１１８７〜１１１９２頁は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術、すなわち、二重特異性抗体の半分の抗原結合性断片（Ｆａｂ）における１つまたはそれ以上の重鎖および軽鎖ドメインの交換を伴う二重特異性抗体フォーマットについて記載している。軽鎖およびそれらと同族の重鎖の正しい会合が、二重特異性抗体の半分の抗原結合性断片（Ｆａｂ）における重鎖および軽鎖ドメインの交換によって達成される。この「交差」は、抗原結合親和性を保持するが、軽鎖のミスペアリングが生じることができなくなるほど、２つのアームを異なるものにする。例示的なＣｒｏｓｓｍａｂフォーマットとしては、ＣｒｏｓｓｍａｂＦａｂ（すなわち、ＣＬおよびＶＬドメインをそれぞれＣＨ１およびＶＨドメインと交換したもの）、ＣｒｏｓｓｍａｂＶＨ−ＶＬ（すなわち、ＶＬおよびＶＨドメインを交換したもの）、およびＣｒｏｓｓｍａｂＣＨ１−ＶＣＬ（すなわち、ＣＨ１およびＣＬドメインを交換したもの）が挙げられる。ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、およびＷＯ２００９／０８０２５４も参照されたい。これらの各々の内容全体を、参照によって本明細書に組み入れる。
【００６０】
ＷＯ２００７／１４７９０１は、非対称突然変異をＦｃドメインに（すなわち、Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、Ｋ３２２Ｄを第１のＦｃドメインに、そしてＤ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、およびＫ２９２Ｄを第２のＦｃドメインに）、そしてＣＨ／ＣＬドメインに（すなわち、Ｋ９６ＥをＣＨ１に、そしてＥ１５ＫをＣＬに）導入することを必要とする、抗体重鎖をヘテロ二量体化するために（例えば、二重特異性抗体、多特異性抗体、または１アーム抗体の生成のために）操作するための方策について記載している。このような非対称突然変異は、半抗体のホモ二量体化を安定化させるイオン相互作用を破壊し、なおかつＦｃドメインのヘテロ二量体化を促進することが報告されている。
【００６１】
ＷＯ２００９／０８９００４は、Ｆｃホモ二量体化を静電気的に好ましくないものにするが、Ｆｃヘテロ二量体化を静電気的に好ましいものにする突然変異の非対称ペアをＣＨ３−ＣＨ３界面に含む、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、二重特異性抗体、多特異性抗体、または１アーム抗体）について記載している。例えば、ＷＯ２００９／０８９００４の表２ａおよび２ｂを参照されたい。
【００６２】
ＣＯＤＶ（交差する二重可変領域（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｄｕａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅ））を有するいくつかの抗体様タンパク質が、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら（２０１６年）ＭＡＢＳ．８巻（５号）：８６７〜８７８頁、ＷＯ２０１２／１３５３４５、ＷＯ２０１６／１１６６２６、および米国特許第９，１８１，３４９号、同第９，２２１，９１７号に記載されている。これらの各々の内容全体を、参照によって本明細書に組み入れる。ＣＯＤＶアーキテクチャは、両方の抗原に対する親抗体の親和性を維持する自立式トラスとして機能する、環状の自己完結型構造をもたらす。ＣＯＤＶ抗体様タンパク質は、（ａ）二価および／もしくは二重特異性；（ｂ）三価および／もしくは三重特異性；（ｃ）三価および／もしくは二重特異性；または（ｄ）四価および／もしくは二重特異性であってもよい。１つの例示的なフォーマットにおいて、ポリペプチドは、式：ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬによって表される構造を有する２つのポリペプチド鎖を含み、２つのポリペプチド鎖は、式：ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃによって表される構造を有し、式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、交差する軽鎖−重鎖ペアを形成する。別の例示的なフォーマットでは、ポリペプチドは、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチドは、式：ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ−Ｆｃによって表される構造を有し、第２のポリペプチド鎖は、式：ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨＩ−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃによって表される構造を有し、式中：ＶＬＩは、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；第１および第２のポリペプチドは、交差する軽鎖−重鎖ペアを形成する。第３の例示的なフォーマットでは、ポリペプチドは、２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬによって表される構造を有し、第２のポリペプチド鎖は、式：ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨＩ−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃによって表される構造を有��、第３のポリペプチド鎖は、抗体Ｆｃ領域を含み、式中：ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；第１および第２のポリペプチドは、交差する軽鎖−重鎖ペアを形成する。第４の例示的なフォーマットでは、ポリペプチドは、式：ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬによって表される構造を含む第１のポリペプチド鎖と、式：ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１によって表される構造を含む第２のポリペプチド鎖とを含み、式中：ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、交差する軽鎖−重鎖ペアを形成する。
【００６３】
四価二重特異性タンデム免疫グロブリン（ＴＢＴＩ）または二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）として公知の二重特異性四価免疫グロブリンは、Ｗｕら（２００７年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５巻：１２９０〜７頁に初めて記載された。従来のＩｇＧのように、ＴＢＴＩ−ＤＶＤ−Ｉｇは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。しかしながら、ＴＢＴＩ−ＤＶＤ−Ｉｇの重鎖および軽鎖はいずれも、既存のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＮ末端に、可動性のある天然に発生するリンカー配列を介して連結した、さらなる可変ドメインを含む。したがって、重鎖および軽鎖を組み合わせると、結果として生じるＴＢＴＩ−ＤＶＤ−Ｉｇは、４つの抗原認識部位を含む。米国特許第９，０２９，５０８号；同第９，１０９，０２６号；同第９，０３５，０２７号；同第９，０４６，５１３号、同第８，３８８，９６５号；同第９，７３２，１６２号；同第９，７３８，７２８号；欧州特許第２５７３１２１号Ｂ１の他、ＷＯ２０１２／１３５３４５も参照されたい。これらの各々の内容全体を、参照によって本明細書に組み入れる。
【００６４】
ＵＳ２０１７／００３２０９６７およびＷＯ２０１７／１８０９１３（これらの内容全体を参照によって本明細書に明示的に組み入れる）は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合性タンパク質（例えば三価および／または三重特異性抗体）について記載している。いくつかの実施形態では、結合性タンパク質は、三価である。いくつかの実施形態では、結合性タンパク質は、三重特異性である。１つの例示的なフォーマットにおいて、第１のポリペプチド鎖は、式：ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬによって表される構造を含み；第２のポリペプチド鎖は、式：ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３によって表される構造を含み；第３のポリペプチド鎖は、式：ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３によって表される構造を含み；第４のポリペプチド鎖は、式：ＶＬ３−ＣＬによって表される構造を含み、式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；第１および第２のポリペプチドは、交差する軽鎖−重鎖ペアを形成し；第２のポリペプチド鎖または第３のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）、ＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶ（配列番号８）、またはＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤ（配列番号９）を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸がないもの（長さ＝０）から、約１００アミノ酸長、または１００、５０、４０、３０、２０、もしくは１５アミノ酸未満もしくはそれ以下まで及ぶ。リンカーは、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸長であってもよい。１つの結合性タンパク質におけるＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、すべてが同じアミノ酸配列を有してもよいし、またはすべてが異なるアミノ酸配列を有してもよい。
【００６６】
好適なリンカーの例としては、単一のグリシン（Ｇｌｙ）残基；ジグリシンペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）；トリペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）；４つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号２１）；５つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号２２）；６つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号２３）；７つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号２４）；８つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号２５）が挙げられる。ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２６）、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２７）、およびペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２８）など、アミノ酸残基の他の組合せを使用してもよい。他の好適なリンカーとしては、単一のＳｅｒ、およびＶａｌ残基；ジペプチドＡｒｇ−Ｔｈｒ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、およびＳｅｒ−Ｌｅｕ；Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号２９）、Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号３０）、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号３９）、Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号３１）；Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号３７）、Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号３２）、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号３３）、ならびにＨｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（配列番号３４）が挙げられる。上記に列挙した例は、決して本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される、ランダムに選択されるアミノ酸を含むリンカーが、結合性タンパク質において好適であることが示されている。
【００６７】
リンカー内のアミノ酸残基の同一性および配列は、リンカーにおいて達成することが必要な二次構造要素のタイプに応じて異なりうる。例えば、グリシン、セリン、およびアラニンは、最大の可動性を有するリンカーに最適である。グリシン、プロリン、スレオニン、およびセリンのいくつかの組合せは、より強固で伸長したリンカーが必要な場合に有用である。所望の性質に応じて必要な場合、より大きなペプチドリンカーを構築するように、任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基と組み合わせてリンカーとみなすことができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、Ｌ１の長さは、Ｌ３の長さの少なくとも２倍である。いくつかの実施形態では、Ｌ２の長さは、Ｌ４の長さの少なくとも２倍である。いくつかの実施形態では、Ｌ１の長さは、Ｌ３の長さの少なくとも２倍であり、Ｌ２の長さは、Ｌ４の長さの少なくとも２倍である。いくつかの実施形態では、Ｌ１の長さは、アミノ酸残基３〜１２個分であり、Ｌ２の長さは、アミノ酸残基３〜１４個分であり、Ｌ３の長さは、アミノ酸残基１〜８個分であり、Ｌ４の長さは、アミノ酸残基１〜３個分である。いくつかの実施形態では、Ｌ１の長さは、アミノ酸残基５〜１０個分であり、Ｌ２の長さは、アミノ酸残基５〜８個分であり、Ｌ３の長さは、アミノ酸残基１〜５個分であり、Ｌ４の長さは、アミノ酸残基１〜２個分である。いくつかの実施形態では、Ｌ１の長さは、アミノ酸残基７個分であり、Ｌ２の長さは、アミノ酸残基５個分であり、Ｌ３の長さは、アミノ酸残基１個分であり、Ｌ４の長さは、アミノ酸残基２個分である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および／またはＬ４は、配列Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号３５）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号３５）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、配列Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号３５）を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および／またはＬ４は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号３３）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号３３）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号３３）を含み、Ｌ２は、配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号３６）を含み、Ｌ３は、配列Ｓｅｒを含み、Ｌ４は、配列Ａｒｇ−Ｔｈｒを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号３３）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列Ｓｅｒを含み、Ｌ２は、配列Ａｒｇ−Ｔｈｒを含み、Ｌ３は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号３３）を含み、Ｌ４は、配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号３６）を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含み；第２のポリペプチドは、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含み；第３のポリペプチドは、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチドは、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む。（配列番号１２、１３、１４、および１５は、それぞれ、ＷＯ２０１７／０７４８７８に開示されている配列番号３、４、１、および２に対応する。）さらなる例示的な三重特異性抗体のアミノ酸配列は、ＷＯ２０１７／０７４８７８に記載されている。この内容全体を、参照によって本明細書に組み入れる。
【００７２】
非対称かつ二重特異性抗体様分子を生成するように設計された、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ、ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメインにおける免疫グロブリンの構造的に関連する配列を交換することに基づく。ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインにおけるヒトＩｇＡおよびＩｇＧ由来の交互になった配列は、ＡＧおよびＧＡと呼ばれる２つの非対称だが相補的なドメインを生成する。ＳＥＥＤ設計は、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にし、ＡＧ／ＡＧおよびＧＡ／ＧＡホモ二量体の形成には不利である。例えば、Ｍｕｄａら（２０１１年）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．２４巻（５号）：４４７〜４５４頁、および米国特許第８，８７１，９１２号を参照されたい。これらの内容全体を、参照によって本明細書に組み入れる。
【００７３】
他の二重特異性および多特異性抗体のフォーマットについては、Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６号、６５３〜６６３頁；Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７巻（２号パートＡ）：９５〜１０６頁；Ｅｇａｎら（２０１７年）ｍＡｂｓ．９巻（１号）：６８〜８４頁；Ｌｉｕら（２０１７年）Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８巻：３８号；およびＷｅｉｄｌｅら（２０１３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１０巻（１号）：１〜１８頁に記載されている。
【００７４】
標的抗原
ある特定の実施形態では、本明細書に提示する方法によって数量化しようとするポリペプチド（すなわち、操作された突然変異を含む抗体重鎖定常領域の一部分を含むポリペプチド）は、標的抗原に特異的に結合する。例示的な標的抗原としては、限定されるものではないが、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤアーゼ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても公知である）、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１としても公知である）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａとしても公知である）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂとしても公知である）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳとしても公知である）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３としても公知である）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２としても公知である）、ＣＣＬ１１（エオタキシンとしても公知である）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄとしても公知である）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣとしても公知である）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂとしても公知である）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａとしても公知である）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ−２としても公知である）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２としても公知である）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫとしても公知である）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３としても公知である）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＦＣＥＲ２、ＩｇＥ受容体としても公知である）、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても公知である）、ＣＤ８６（Ｂ７−２としても公知である）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知である）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４としても公知である）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとしても公知である）、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２としても公知である）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１としても公知である）、ＣＤ２７５（Ｂ７Ｈ２としても公知である）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３としても公知である）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても公知である）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１としても公知である）、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリンとしても公知である）、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦとしても公知である）、ＣＳＦ−２（ＧＭ−ＣＳＦとしても公知である）、ＣＳＦ−３（ＧＣＳＦとしても公知である）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１としても公知である）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１としても公知である）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ−１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ���ＩＬ２５受容体としても公知である）、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリンとしても公知である）、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤアーゼ−１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２（ＩＬ３３受容体としても公知である）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ（ＩＬ７Ｒａ共受容体としても公知である）、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、およびＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１としても公知である）が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記の抗原標的のうちの１つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。操作された突然変異を含む抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドが二重特異性または多特異性の標的結合性タンパク質である実施形態において、標的抗原は、上記に列挙した例示的な抗原のうちのいずれか２つ（またはそれ以上）であってよい。
【００７５】
コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本明細書に提示する方法によって数量化しようとするポリペプチド（すなわち、操作された突然変異を含む抗体重鎖定常領域を含むポリペプチド）は、薬物、例えば、細胞傷害剤、化学療法剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはその断片）にコンジュゲートされている。例示的な薬物としては、限定されるものではないが、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン、および５−フルオロウラシルが挙げられる。例示的な毒素としては、限定されるものではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシン（または他のマイタンシノイド）、アウリスタチン、ドラスタチン、カリケアマイシン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、およびＣＣ１０６５が挙げられる。細胞傷害剤、および細胞傷害剤を抗体にコンジュゲートするリンカーは、当該分野で公知である；例えば、Ｐａｒｓｌｏｗ，Ａ．Ｃ．ら（２０１６年）Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ４巻：１４号、およびＫａｌｉｍ，Ｍ．ら（２０１７年）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．１１巻：２２６５〜２２７６頁を参照されたい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に提示する方法によって数量化しようとするポリペプチド（すなわち、操作された突然変異を含む抗体重鎖定常領域を含むポリペプチド）は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成することができる検出可能な部分にコンジュゲートされている。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、放射性核種である。種々の放射性核種が、臨床および研究の目的で使用するためのラジオコンジュゲートされたポリペプチドの生成のために利用可能である。例としては、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１９Ｆ、３２Ｐ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、ならびにＬｕ、Ｍｎ、Ｆｅ、およびＧｄの放射性同位体が挙げられる。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光化合物もしくは化学発光化合物；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素である。
【実施例】
【００７７】
前述した説明は、当業者が本発明を実践することを可能にするのに十分であると思われる。下記の実施例は、例示のみを目的として提示するものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。事実、本明細書に示し記載するものに加えて、様々な改変形態が前述の記載から当業者には明らかとなり、それらは添付の特許請求の範囲に含まれる。
【実施例１】
【００７８】
サンプル中の抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドを検出するための一般的なマススペクトロメトリーに基づくアッセイで使用するサロゲートペプチドの特定
マススペクトロメトリーによって生物学的サンプル中の治療用抗体を検出するためのサロゲートペプチドを特定するために、次の選択基準を適用した：
・６〜２６アミノ酸長であること；
・近接するエンドペプチダーゼ切断部位がないこと；
・ペプチド配列中にメチオニン（Ｍ）またはシステイン（Ｃ）がないこと；
・ペプチド配列中にグリシンまたはセリンが続くアスパラギン（すなわち、ＮＧまたはＮＳ）がないこと；
・抗体重鎖の定常領域に由来すること；および
・少なくとも１つの操作された置換突然変異を含むこと（すなわち、天然に発生する多型を除外する）。
【００７９】
まず、３つの例示的な治療用抗体のＦｃ配列をアラインした。図１を参照されたい。配列番号１は、抗標的Ａ抗体重鎖の一部分である。配列番号１は、操作された突然変異を含まない。配列番号２は、三重特異性構築物（すなわち、「ＴＲＩ−１」）の第１の鎖（すなわち、「鎖１」）の一部分である。ＴＲＩ−１−鎖１は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異（すなわち、「ノブ」突然変異）ならびにＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ突然変異（ＴＲＩ−１のインビボ半減期を延長するもの）を含む抗体重鎖を含む。配列番号３は、ＴＲ１の第２の鎖（すなわち、「鎖２」）の一部分である。ＴＲＩ−１−鎖２は、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／３６８Ａ／４０７Ｖ「ホール」突然変異およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ突然変異を含む抗体重鎖を含む。配列番号４は、第２の三重特異性構築物（すなわち、「ＴＲＩ−２」）の第１の鎖（すなわち、「鎖１」）の一部分である。ＴＲＩ−２−鎖１は、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／３６８Ａ／４０７Ｖ突然変異（すなわち、「ホール」突然変異）およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ突然変異を含む抗体重鎖を含む。配列番号５は、ＴＲ２の第２の鎖（すなわち、「鎖２」）の一部分である。ＴＲＩ−２−鎖２は、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ「ノブ」突然変異およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ突然変異を含む重鎖を含む。上述したアミノ酸位置はすべて、ＥＵ付番スキームに従って付番されている。
【００８０】
図１に示す、配列のトリプシン消化から生じると予測された、少なくとも１つの操作された置換突然変異を含む候補ペプチドには、下線が引かれている。ペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）は、上記に列挙した基準のすべてを満たした。
【００８１】
次に、マウス、カニクイザル、およびヒトのタンパク質データベースに対する問い合わせ配列として、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）、すなわち「操作されたＴＴＰＰペプチド」を使用してＢＬＡＳＴ検索を行い、これらの種のいずれかの天然タンパク質にこのような配列が見出されるかどうかを判定した。操作されたＴＴＰＰペプチドと１００％のアミノ酸同一性を呈する配列のみが、公知のノブインホール抗体であった。操作されたＴＴＰＰペプチドと９４％のアミノ酸同一性を呈した他の配列は、Ｙ４０７Ｖ以外のＹ４０７置換突然変異を含むヒトＦｃドメイン、および内因性ヒトＦｃドメインに対応した。
【００８２】
三重特異性構築物ＴＲＩ−１のトリプシン消化が、操作されたＴＴＰＰペプチドを生じさせた可能性を評価するために、以下に記載する実験を行った。簡潔に述べると、ＳＭＡＲＴ（商標）Ｄｉｇｅｓｔ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をメーカーの説明に従って使用し、ＴＲＩ−１（図１に示す配列番号２および３を含む）１０μｇを消化した。この消化反応物を１４００ｒｐｍで７５分間振盪しながら７０℃でインキュベートした。消化されたサンプルを次に１０００×ｇで２分間にわたって遠心分離し、上清を精製および濃縮のために収集した。
【００８３】
ＳＯＬＡμ  ＨＲＰ固相抽出（ＳＰＥ）プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のうち必要な数のウェルをアセトニトリル２００μＬで平衡化し、次に０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液２００μＬでコンディショニングした。次に、さらに４００μＬの０．１％ＴＦＡ水溶液を各ウェルに加えた。サンプル上清をウェルに加え、通過させた。次に、ウェルを０．１％ＴＦＡ水溶液５００μＬで洗浄し、次に０．１％ギ酸水溶液５００μＬで洗浄した。消化されたサンプルを、８０％アセトニトリルを含む０．１％ギ酸水溶液２５μＬで２回溶出させた。この溶出液を０．１％ギ酸水溶液５０μＬで希釈し、４００ｒｐｍで手短にボルテックスした。
【００８４】
典型的なペプチドマッピング条件で動作するＴｈｅｒｍｏ  ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計に連結したＷａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣを使用した液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリーによって、消化された各サンプル５０μＬを分析した。
【００８５】
図２Ａ〜２Ｃに示すように、ＴＲＩ−１のトリプシン消化は、操作されたＴＴＰＰペプチドを再現性よく生じさせ、このペプチドは容易に検出され、断片化された。操作されたＴＴＰＰの天然同位体の範囲のサブセットである、９０５．４０〜９０７．６０のｍ／ｚに対する抽出イオンクロマトグラムを、図２Ａに示す。操作されたＴＴＰＰは約１９分で溶出した。全イオンクロマトグラフ（図２Ｂに示す）において、操作されたＴＴＰＰは顕著なピークであった。さらに、操作されたＴＴＰＰは、ＭＳ／ＭＳ分析に良好な断片化を示した（図２Ｃ）。
【実施例２】
【００８６】
血清中のＴＴＰＰペプチドの検出
次に、操作されたＴＴＰＰペプチドが著しいバックグラウンド干渉を伴わずにヒト、サル、およびマウスの血清中でＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出されるかどうかを判定するために、一連の実験を行った。マウスおよびカニクイザルは前臨床治療用抗体試験において一般的に使用されるため、これらの動物の血清を試験した。
【００８７】
簡潔に述べると、ボルテックスしたプロテインＧ磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μＬ、およびＰＢＳＴ  １００μＬを、９６ウェルマイクロプレート（Ｑｉａｇｅｎ）のウェルに加えた。混合物が確実に均質になるように、プレートを穏やかに振盪した。９６ウェルプレートを、Ａｌｐａｑｕａ  ９６Ｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍａｇｎｅｔ  ９６ウェル磁石上に１分間、続いてＱｉａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ９６ウェル磁石上に１分間置き、次に溶液を除去した。この洗浄サイクルをさらに３回、ＰＢＳＴ  ２００μＬを用いて繰り返した。洗浄が完了した後、ビーズを含む各ウェルにＰＢＳＴ  １４０μＬを加えた。次に、（１）マウス血清、（２）サル血清、（３）ヒト血清、または（４）２μｇ／ｍＬのＴＲＩ−１各３０μＬをウェルに加えた。ビーズ、ＰＢＳＴ、および血清を含む別々のウェルに、３０μＬのキャリブレータ、ＱＣ、およびサンプルを加えた。次に９６ウェルプレートを覆い、１時間にわたって６００ＲＰＭで振盪し、４回洗浄した。０．１％ＴＦＡ  ９０μＬを各ウェルに加え、混合物が確実に均質になるようにプレートを穏やかにボルテックスすることにより、キャリブレータ、ＱＣ、およびサンプルを溶出させた。プレートを、Ａｌｐａｑｕａ  ９６Ｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍａｇｎｅｔ  ９６ウェル磁石上に１分間、続いてＱｉａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ９６ウェル磁石上に１分間置いた。この溶出液を次に、２．０ｍＬの９６ウェルディープウェルＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。次に、溶出手順を繰り返した。溶出液のｐＨを１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）２０μＬで中和し、総体積を２００μＬにした。簡潔に述べると、ＳＭＡＲＴ消化緩衝液２００μＬを溶出液の各々に加えた。サンプルを４００ｒｐｍで７５分間振盪しながら７０℃でインキュベートし、次に１０００×ｇで２分間遠心分離して、ＳＭＡＲＴ消化樹脂をペレット化した。
【００８８】
ＳＯＬＡμ  ＨＲＰ  ＳＰＥプレートのウェルをアセトニトリル２００μＬで平衡化し、次に０．１％ＴＦＡ水溶液２００μＬでコンディショニングした。さらに４００μＬの０．１％ＴＦＡ水溶液を各ウェルに加えた。各サンプル上清を別々のウェルに加え、通過させた。ウェルを０．１％ＴＦＡ水溶液５００μＬで洗浄し、次に０．１％ギ酸水溶液５００μＬで洗浄した。消化されたサンプルを、８０％アセトニトリルを含む０．１％ギ酸水溶液２５μＬで２回溶出させた。この溶出液を０．１％ギ酸水溶液５０μＬで希釈し、４００ｒｐｍで手短にボルテックスした。
【００８９】
標準的なペプチドマッピング条件下でＷａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣおよびＴｈｅｒｍｏ  ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を使用し、サンプルのＳＭＡＲＴ消化物を分析した。
【００９０】
ブランク血清中の操作されたＴＴＰＰペプチド（ｍ／ｚ９０５．４７２＋）に対する抽出イオンクロマトグラムを図３Ａ〜３Ｃに示し、ＴＲＩ−１消化物（ＰＢＳＴ中２μｇ／ｍＬ）中の操作されたＴＴＰＰペプチドに対する抽出イオンクロマトグラムを図３Ｄに示す。ＴＲＩ−１消化物における２０．６５分でのピークは、試験した血清バックグラウンドのいずれにも存在しない。
【００９１】
操作されたＴＴＰＰペプチドが血清バックグラウンド中で検出されることを確認するために、マウス、サル、およびヒトの血清サンプルに２０μｇ／ｍＬのＴＲＩ−１をスパイクし、上述のように抗体プルダウン、消化、およびマススペクトロメトリー分析に供した。
【００９２】
操作されたＴＴＰＰペプチド（ｍ／ｚ９０５．４７２＋）に対する抽出イオンクロマトグラムを図４Ａ〜４Ｃに示し、ＰＢＳＴ中のＴＲＩ−１消化物を図４Ｄに示す。ＴＲＩ−１を血清バックグラウンドの各々にスパイクすると、操作されたＴＴＰＰペプチドをすべてのバックグラウンドで明らかに見ることができる。
【００９３】
適切な血清バックグラウンドにおいて最終濃度を０．２、２、および２０μｇ／ｍＬとしたＴＲＩ−１の段階希釈物を製造し、シグナルがサンプル中の分析物の量に比例して増加したかどうかを判定した。抗体をスパイクしていない血清のアリコートをバックグラウンド対照として使用した。プルダウン、消化、ＳＰＥクリーンアップ、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを上述のように行った。
【００９４】
ＰＢＳＴ中のＴＲＩ−１の３種の試験濃度（２０、２、および０．２μｇ／ｍＬ）の分析から得られた、操作されたＴＴＰＰ、非標識ＦＮＷＹ、およびＦＮＷＹ（重）の抽出イオンクロマトグラムを、それぞれ図５Ａ〜５Ｃ、６Ａ〜６Ｃ、および７Ａ〜７Ｃに示す。マウス血清中のＴＲＩ−１の４種の試験濃度（２０、２、０．２、および０μｇ／ｍＬ）の分析から得られた、操作されたＴＴＰＰ、非標識ＦＮＷＹ、およびＦＮＷＹ（重）の抽出イオンクロマトグラムを、それぞれ図８Ａ〜８Ｃ、９Ａ〜９Ｃ、および１０Ａ〜１０Ｃに示す。サル血清中のＴＲＩ−１の４種の試験濃度（２０、２、０．２、および０μｇ／ｍＬ）の分析から得られた、操作されたＴＴＰＰ、非標識ＦＮＷＹ、およびＦＮＷＹ（重）の抽出イオンクロマトグラムを、それぞれ図１１Ａ〜１１Ｃ、１２Ａ〜１２Ｃ、および１３Ａ〜１３Ｃに示す。ヒト血清中のＴＲＩ−１の４種の試験濃度（２０、２、０．２、および０μｇ／ｍＬ）の分析から得られた、操作されたＴＴＰＰの抽出イオンクロマトグラムを、図１４Ａ〜１４Ｃに示す。
【００９５】
操作されたＴＴＰＰペプチドおよび重同位体ペプチドＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１０）のピーク面積を判定した。下記の表２を参照されたい。ＦＮＷＹ（重）は、安定同位体標識ユニバーサルモノクローナル抗体（ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＳＩＬＵ（商標）ＭＡＢ）の消化から得られた内部標準である。
【００９６】
【表２】
2021510813.tif 000004
【００９７】
また、ＰＢＳＴ、マウス血清、およびサル血清のバックグラウンドにおける、操作されたＴＴＰＰのＦＮＷＹ（重）に対する面積比を表２に示し、これを投入したＴＲＩ−１の濃度に対してプロットしたものを、図１５Ａ〜Ｄに示す。ＰＢＳＴにおける、操作されたＦＮＷＹのＦＮＷＹ（重）に対する面積比を表２に示し、これを投入した抗体の濃度に対してプロットしたものを、図１５Ａ、１５Ｃ、および１５Ｄに示す。
【００９８】
上記のデータは、マウス血清、サル血清、またはヒト血清におけるＴＴＰＰペプチドへのバックグラウンド干渉が皆無かそれに近いこと、および、ＴＴＰＰペプチドによって生成されるシグナルがサンプル中のペプチドの量に相関することを示す。
【００９９】
【表３】
2021510813.tif 000005
【実施例３】
【０１００】
例示的な三重特異性抗体を検出および数量化するための一般的なマススペクトロメトリーに基づくアッセイにおけるＴＴＰＰサロゲートペプチドの使用。
大要
治療用抗体は疾患を標的にするための魅力的なツールであり、その市場は速いペースで成長している。リガンド結合アッセイは、治療用抗体を測定するための標準的な方法である。しかしながら、その開発を支えるためには、新たな生物分析方策が必要である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、優良試験所基準（ＧＬＰ）試験に要求される特異性および高い再現性を提供する補完的な方法の代表である。さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、マトリックス干渉（例えば、治療用抗体の正確な数量化を妨げうるサンプル中の成分）などのリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）に関連する制限、ならびに高いコストおよび長時間を要する場合がある試薬の開発に関連する制限のいくつかを克服する。
【０１０１】
ＩｇＧは、診療所で現在用いられている治療用タンパク質の大多数に相当する。免疫原性を低減させるため、治療用抗体は、ヒトＩｇＧ定常領域などのヒト抗体定常領域を含むように操作される。このような治療用抗体を定量化するための生物分析用ＬＣ−ＭＳアッセイの開発は難易度の高いものであったが、それは、免疫親和性工程の助けを借りずにサンプル（例えば、血漿、血清、または血液サンプル）中の内因性ヒトＩｇＧと治療用ＩｇＧ抗体とを判別するために使用することができる好適なサロゲートペプチドを選択することが困難であるからである。この問題を克服するために、置換突然変異、例えば、ヒト抗体定常領域、または非ヒト霊長類もしくは前臨床動物（例えば、マウス）の抗体定常領域には天然に見出されない置換突然変異を含むように、例示的な治療用抗体の定常領域を操作した。この方略により、マトリックス干渉を伴わずに非ヒトサンプルおよびヒトサンプルの両方で治療用抗体の正確な数量化が可能になる。
【０１０２】
以下に、血漿中の可溶性標的に対する三価三重特異性抗体を高速かつ正確に定量化するための、親和性抽出を用いないＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを記載する。免疫親和性工程を回避することにより、この方法は、全薬物（標的に結合した薬物と遊離薬物の和）の正確な数量化を可能にする。さらに、置換突然変異が抗体定常領域内に存在するため、この方法を使用すれば、抗体定常領域を含むいかなる治療用タンパク質をも数量化することができる。
【０１０３】
分析手順
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる例示的な三重特異性抗体の数量化のために選択したサロゲートペプチドを、図１６および１７、ならびに下記の表４に示す。これらのサロゲートペプチドは、その線形応答に基づいて選択した。配列がヒトタンパク質または非ヒト霊長類のタンパク質に見出されないペプチド（すなわち、配列番号７、１６、および３８）を使用した。絶対数量化には、操作されたペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）を使用した（図１６および１７ならびに下記の表４を参照されたい）。分析物の完全性を保証するため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって数量化したサンプルにおいて、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）および表４に列挙した他のペプチドのピーク下面積間の比をモニタリングした。この比は、すべての時点で定常状態を保った（結果は示さない）。
【０１０４】
【表４】
2021510813.tif 000006
【０１０５】
ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７）の安定同位体標識バージョンを内部標準として使用した（図１９Ｂ）。
【０１０６】
前臨床試験を支えるための高速かつロバストなワークフローを開発した（図１８を参照されたい）。この方法は、Ｏｕｙａｎｇら（２０１２年）Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ．４巻（１号）、１７〜２８頁に記載されているペレット消化プロトコールに基づく。サンプルからの三重特異性抗体の回収およびサロゲートペプチドの検出が最大となるように、消化プロトコールにおける各工程を最適化した。（ヒト対象由来のサンプルのためのワークフローは、変性工程の前にプロテインＡ免疫精製工程を含んだ。）
【０１０７】
この方法では、血漿サンプル１０μＬのみを使用した。わずかなサンプル体積で十分であったため、このサロゲートペプチド数量化方法は、例えば、齧歯類由来の前臨床サンプルを測定するのに好適である。標準的な消化時間も最適化した。サンプルを２時間にわたって３７℃で消化したときに最も良好なシグナル強度が観察された。数量化方法の感度をさらに増加させるため、サンプルを固相抽出（ＳＰＥ）に供した。最も良好な回収は、ＯＡＳＩＳ  ＭＣＸカートリッジを使用した場合に得られた。
【０１０８】
ラット血漿の妥当性検証
ＧＬＰ毒性学的試験を支えるため、ラット血漿において方法の妥当性検証を行った。３回の反復試験での３つの独立した較正曲線および８つの濃度理論値による平均回帰係数が０．９７９の二次回帰モデルを選択した（図１９Ａ）。３つの独立した製造物のＬＬＯＱ（数量化下限）、低濃度（ＬＯＷ）、中濃度（ＭＩＤ）、および高濃度（ＨＩＧＨ）における品質管理（ＱＣ）サンプルの正確度および精度を測定することにより、アッセイの可変性を評価した。ラン内／ラン間の正確度および精度を表５にまとめる。６つの異なる血漿バッチを使用することにより、マトリックス効果を行った（下記の表６を参照されたい）。１〜３か月および６か月にわたって−８０℃で、そして２４時間にわたって３７℃で保存した、スパイクしたヒト血漿において、血漿中の抗体の安定性を評価した。これらの間隔において分解は観察されなかった。
【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
【表６】
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【０１１１】
三重特異性抗体５μｇ／ｍｌが、サル血漿およびヒト血漿にスパイクした場合に、サロゲートＴＴＰＰペプチド（配列番号７）を使用して検出されるかどうかを判定するために、さらなる実験を行った。図２２Ａ〜２２Ｆに示すように、ＴＴＰＰペプチドは、スパイクしたラット血漿（図２２Ｂ）、スパイクしたサル血漿（図２２Ｄ）、およびスパイクしたヒト血漿（図２２Ｆ）では検出されたが、ブランクのラット血漿（図２２Ａ）、ブランクのサル血漿（図２２Ｃ）、またはブランクのヒト血漿（図２２Ｅ）では検出されなかった。
【０１１２】
本明細書の他の箇所で述べたように、ＥＬＩＳＡなどのリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）は、生物学的サンプル中の治療用タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を検出および数量化するために従来使用されてきた。ＬＢＡによるモノクローナル抗体の数量化は、典型的には、捕捉剤または検出剤などの標的抗原を使用することを伴う。しかしながら、ＬＢＡは、三重特異性抗体および三重特異性抗体の可溶性標的を検出するために使用した場合、不正確な結果を生成する場合がある。三重特異性抗体の場合、ＬＢＡによる数量化は、３つの異なるアッセイ（すなわち、標的抗原１つ当たり１つのアッセイ）を開発することを必要とし、これにより、前臨床種またはヒトのＰＫ曝露評価において管理しにくい３つの異なる濃度データセットをもたらすことになる。さらに、ＬＢＡを使用して、サンプル中の全抗体に対する遊離抗体と標的結合抗体の量を区別することは困難である。この実施例において、前臨床期および臨床期の両方で使用することのできる一般的なＬＣ−ＭＳアッセイは、可溶性標的に対する三重特異性抗体を高い正確度で測定できることが示された。このアッセイは、ブランク血漿サンプル中に干渉シグナルが存在しないことによって示されるように（図２０Ａ〜２０Ｆを参照されたい）、特異的であることが示された。またこのアッセイは、表５における、生物分析方法の妥当性検証に関するＦＤＡおよびＥＭＡの指針によって定義される国際規制承認基準内である、正確度％推定差ならびにラン間およびラン内の精度％（すなわち、±２０％以下の正確度％および±２０％以下の精度％）によって示されるように、再現性があることが示された。
【０１１３】
前臨床種のための材料および方法
１０ｍＭヒスチジン、８％スクロース、０．０４％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０における濃度理論値が２５ｍｇ／ｍＬであるストック溶液として、三重特異性抗体を製造した。このストック溶液をラット血漿中に希釈することにより、較正標準およびＱＣを得た。
【０１１４】
三重特異性抗体を含むラット血漿のペレット消化を、過去にＯｕｙａｎｇら（２０１２年）Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ．４巻（１号）、１７〜２８頁において記載されている手順から最適化した。簡潔に述べると、三重特異性抗体を含む各ラット血漿サンプル１０μｌを１．５ｍＬのＬｏｂｉｎｄ管に入れ、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液等量と混合した。Ｌｏｂｉｎｄ管にメタノール３０μＬを加えることにより、各サンプル中の血漿タンパク質および治療用抗体を沈殿させた。ボルテックスした後、２０００ｒｃｆ（相対遠心力）で６分間にわたり５℃でサンプルを遠心分離した。上清を廃棄し、タンパク質ペレットを２００ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ＡＢＣ）４０μｌ中に再懸濁した。再懸濁したペレットの各々に１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）５μｌを加え、穏やかに撹拌しながら３０分間５６℃でインキュベートした。次にサンプルを室温で１０分間冷ました。次に、１０μｌの内部標準使用溶液（１００μｇ／ｍＬ）を各サンプルに加え、混合した。サンプルを光から保護しつつ室温で穏やかに回転しながら、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）（１００ｍＭ）を含む１００ｍＭ  ＡＢＣ緩衝液１０μＬと共に３０分間さらにインキュベートした。トリプシン３０μｇ／ｍＬおよびＡＢＣ緩衝液１００μＬを各サンプルに加え、次にサンプルを室温で穏やかに回転しながら２時間インキュベートした。
【０１１５】
消化反応を１０％ギ酸（ＦＡ）３０μＬで停止させ、１０分間にわたり１６０００ｒｃｆにて５℃で遠心分離した。上清を、陽圧プロセッサの多岐管を使用したＯＡＳＩＳ  ＭＣＸ溶出プレートを用いる固相抽出（ＳＰＥ）に供した。簡潔に述べると、プレートを２００μＬのメタノールで、そして次に２００μＬの０．５％ＦＡで平衡化した。各上清２００μＬをプレート上に適用し、０．５％ＦＡ  ２００μＬ、０．５％ＦＡ／８０％ＭｅＯＨ溶液２００μＬ、および０．５％ＦＡ／２０％ＭｅＯＨ溶液２００μＬで洗浄した。最後に、サンプルを水酸化アンモニウム緩衝液５％／メタノール（４０：６０、ｖ／ｖ）２５μＬで２回溶出させた。抽出物１０μＬを水／ギ酸（１００：０．５、ｖ／ｖ）２００μＬ中に希釈した。溶出した各サンプル１０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。
【０１１６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、ＡＮＡＬＹＳＴ（登録商標）ソフトウェアバージョン１．６．２を実行し、ＳＣＩＥＸ  ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＡＰＩ  ５５００質量分析計を用いて行った。このシステムを、ＡＧＩＬＥＮＴ  １２９０  ＩＮＦＩＮＩＴＹ液体クロマトグラフシステムに接続した。クロマトグラフィーは、５０°でＸ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  Ｃ４カラム；３００Å（Ｗａｔｅｒｓ  １００×２．１ｍｍ  ＩＤ、粒径３．５μｍ）を使用し、また溶媒Ａ（０．１％ＦＡ）およびＢ（０．１％ＦＡアセトニトリル溶液）の勾配を使用して行った。溶媒Ａで２．５分間にわたって平衡化した後、水溶液を６００μＬ／分の流速で５分後に５５％にした。
【０１１７】
ＭＳデータは、イオンスプレー電圧５５００Ｖ、ソース温度６００℃、および脱溶媒和温度６０℃のポジティブモードで取得した。ＣＥエネルギーは各ペプチドに合わせて最適化した（表４を参照されたい）。
【０１１８】
ヒトサンプルのための材料および方法
ＡｇｉｌｅｎｔのＡＳＳＡＹＭＡＰ（登録商標）ＢＲＡＶＯ液体ハンドリングプラットフォームを使用した親和性精製を、次のように行った：９６ウェルプレートにおいて、ＰＢＳＴ  ９０μｌおよびヒト血漿サンプル１０μｌを連続して加えた。プレートを５分間ボルテックスし、ＡＳＳＡＹＭＡＰ（登録商標）ＢＲＡＶＯデッキ上のおよそ２０℃に維持された位置４に置いた。９６ウェルプレートに１Ｍトリス２０μｌを充填し、リザーバに次の溶液を順番に充填した：プライムおよび平衡化緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ））、カートリッジ洗浄液１（ＰＢＳＴ中の１Ｍ  ＮａＣｌ）、カートリッジ洗浄液２（ＰＢＳＴ）、ならびに溶出およびシリンジ洗浄緩衝液（１％ギ酸）。次に、ＡＳＳＡＹＭＡＰ（登録商標）ＢＲＡＶＯ液体ハンドリングプラットフォームの親和性精製プロトコールを実行した。
【０１１９】
変性、還元、アルキル化、および消化の各工程は、次のように行った：位置９の９６ウェルプレートを３０秒間遠心分離した。０．２％のＲＡＰＩＧＥＳＴ（商標）界面活性剤を含む５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液５０μｌ、および１００ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトールを含む１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液２０μＬを連続して加えた。次に、プレートを３０秒間遠心分離し、穏やかに撹拌しながらおよそ５６℃で３０分間インキュベートした。サンプルを室温で冷ました。２５０ｍＭのヨードアセトアミドを含む５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液２０μＬ、ならびにＩＳＷおよび０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む２００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液５０μｌを加えた。プレートを３０秒間遠心分離し、次に遮光条件下で穏やかに撹拌しながらおよそ２０℃で３０分間インキュベートした。１μｇ／μＬの新鮮なトリプシンを含む５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液１００μＬを加え、サンプルをおよそ３７℃で一晩インキュベートした。次に、１０％ギ酸水溶液２０μＬを（消化を停止させるために）加えた。
【０１２０】
Ｏａｓｉｓ  ＰＲＩＭＥ  ＭＣＸ  μＥｌｕｔｉｏｎプレートを使用した固相抽出を、次のように行った：各上清２００μＬをプレート上に適用し、０．５％ＦＡ  ２００μＬおよび０．５％ＦＡ／８０％ＭｅＯＨ溶液２００μＬで洗浄した。最後に、サンプルを水酸化アンモニウム緩衝液５％／メタノール（４０：６０、ｖ／ｖ）５０μＬで溶出させ、０．５％ギ酸水溶液１５０μＬを溶出したサンプル中に加えた。プレートを＋１０℃に維持したオートサンプラートレイに装填し、各サンプル１０μＬを注入した。
【０１２１】
前臨床サンプルについて上述したように、ヒト血漿サンプルにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【０１２２】
【表７】
2021510813.tif 000009
【表８】
2021510813.tif 000010
【実施例４】
【０１２３】
マウスへの投与後の例示的な三重特異性抗体を検出および数量化するために一般的なマススペクトロメトリーに基づくアッセイにおいてＴＴＰＰサロゲートペプチドを使用するための概念実証試験。
材料／方法
この実施例において使用した材料は：三重特異性抗体、血清（マウス）、プロテインＧ樹脂チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｃ１８樹脂チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＳＩＬＵ（商標）ＭＡＢ安定同位体標識ユニバーサルモノクローナル抗体内部標準（Ｓｉｇｍａ）、重標識操作ペプチド（Ｈｅａｖｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）内部標準（Ｔｈｅｒｍｏ）、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、５５０ｍＭトリス塩基ｐＨ８を含む８Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水、１２５ｍＭジチオスレイトール、２５０ｍＭヨードアセトアミド、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＬｙｓＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、水、酢酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ギ酸、アセトニトリルであった。
【０１２４】
較正曲線の作成：
三重特異性抗体をマウス血清中で段階希釈することにより、較正曲線を作成した。この概念実証試験で試験した濃度は、０．０１２、０．０２４、０．０４９、０．０９８、０．１９５、０．３９１、０．７８１、１．５６３、３．１２５、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０、１００．０、２００．０、４００．０、および８００μｇ／ｍＬであった。三重特異性抗体を含まない血清を０点として使用した。
【０１２５】
安定同位体標識された内部標準の製造：
使用当日に、０．１％ギ酸５００μＬを、１００μｇバイアルのＳＩＬＵ（商標）ＭＡＢ安定同位体標識ユニバーサルモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に加え、メーカーの説明に従って室温で静置した。抗体濃度は０．２μｇ／μＬであった。
【０１２６】
重標識操作ペプチド内部標準の製造：
０．１％ギ酸を含む５％アセトニトリル２．５ｍＬを、凍結乾燥したＴＴＰＰペプチド（４９ｎｍｏｌ）に加え、１９．６ｐｍｏｌ／μＬの濃度を達成した。使用当日に、ＴＴＰＰペプチドの濃度を、０．１％ギ酸を含む４０％アセトニトリル中で０．０８ｐｍｏｌ／μＬまで希釈した。
【０１２７】
自動液体ハンドリングプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢＲＡＶＯ（商標））を使用した血清中の三重特異性抗体の数量化のためのハイスループットアッセイ
親和性精製
試験した較正曲線サンプルまたは血清サンプルの各々について、各サンプル１０μＬを９６ウェルマイクロプレートの別々のウェルに加えた。次に、さらなるマウス血清１０μＬおよび０．２μｇ／μＬの安定同位体標識ユニバーサルモノクローナル抗体内部標準３０μＬを各ウェルに加えた。９６ウェルプレートを自動液体ハンドリングプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢＲＡＶＯ（商標））のデッキに置き、下記の工程を含む親和性精製プロトコールを実行した：
１．初回シリンジ洗浄
２．プライム（３００μＬ／分にてＰＢＳ  １００μＬ）
３．平衡化（１０μＬ／分にてＰＢＳ  ５０μＬ）
４．サンプル負荷（５μＬ／分にて２０μＬ）
５．カップ洗浄１（脱イオン水２５μＬ）
６．内部カートリッジ洗浄１（１０μＬ／分にて１Ｍ  ＮａＣｌ／ＰＢＳ溶液５０μＬ）
７．カップ洗浄２（脱イオン水２５μＬ）
８．内部カートリッジ洗浄２（１０μＬ／分にてＰＢＳ  ５０μＬ）
９．ストリンジェントなシリンジ洗浄（５％酢酸５０μＬ）
１０．溶出（５μＬ／分にて５％酢酸１０μＬ）
【０１２８】
消化：
溶出したサンプルを含む９６ウェルプレートを自動液体ハンドリングプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢＲＡＶＯ（商標））のデッキに置き、下記の工程を含む消化プロトコールを行った：
１．５５０ｍＭトリスｐＨ８を含む８Ｍ尿素４０μＬを各ウェルに移す。
２．１２５ｍＭ  ＤＴＴ  ４．３μＬをウェルに移し、次に４０℃で６０分間インキュベートする。
３．２５０ｍＭ  ＩＡＭ  ４．７μＬをウェルに移し、次に２５℃で６０分間インキュベートする。
４．５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム１１１μＬを各ウェルに移す。
５．０．５μｇ／μＬのトリプシン（１：１０の酵素：基質）および０．２μｇ／μＬのｒＬｙｓＣ（１：２５の酵素：基質）２０μＬを各ウェルに移し、３７℃で１２０分間インキュベートする。
６．１０％ＴＦＡ  ２０μＬを各ウェルに移す。
７．０．０８ｐｍｏｌ／μＬの重標識操作ペプチド（ペプチド内部標準）３０μＬを各ウェルに移す。
【０１２９】
Ｃ１８クリーンアップ：
消化されたサンプルを含むプレートをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｒａｖｏシステムのデッキに置き、次の工程からなる「ペプチドクリーンアップ」プロトコールを実行した：
１．初回シリンジ洗浄
２．プライム（０．１％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル）
３．平衡化（２５μＬ／分にて０．１％ＴＦＡ  ５０μＬ）
４．サンプル負荷（５μＬ／分にて１９０μＬ）
５．カップ洗浄（脱イオン水５０μＬ）
６．内部カートリッジ洗浄（２５μＬ／分にて０．１％ＴＦＡ  ５０μＬ）
７．ストリンジェントなシリンジ洗浄（０．１％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル５０μＬ）
８．溶出（５μＬ／分にて０．１％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル２０μＬ）
【０１３０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：
溶出した各サンプル（０．１％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル中２０μＬ）を、アセトニトリル４０％およびギ酸０．１％に達するように、３５％アセトニトリルおよび０．１％ギ酸の溶液で１００μＬまで直ちに希釈した。各サンプルを個別のＬＣ−ＭＳバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムで分析した。保持時間、親質量、遷移、および最適化された断片化条件は、分析に使用するペプチド配列および機器に応じて異なる。ＴＴＰＰペプチド（ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫ（配列番号７））は、ＳＣＩＥＸ  ＱＴＲＡＰ（登録商標）６５００  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに連結したＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）Ｉ−Ｃｌａｓｓ液体クロマトグラフィーシステムにおいて、次の条件下で分析した：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８（２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）
カラム温度：３０℃
サンプル注入勾配：５％  Ｂにて勾配を開始し、１分間保持する。１７分間で４０％  Ｂに増加させる。流速は０．２５ｍＬ／分である。流速を０．４ｍＬ／分に増加させ、ブランク注入のために９０％  Ｂにする。
ブランク注入勾配：９０％  Ｂにて勾配を開始し、５分間保持する。流速は０．４ｍＬ／分である。流速を０．２５ｍＬ／分に減少させ、５％  Ｂで３分間保持する。
移動相：Ａは、０．１％ギ酸水溶液であり；Ｂは、０．１％ギ酸アセトニトリル溶液である。
保持時間：１２．９分
【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
この実施例では、較正曲線サンプルおよび６つの血清サンプルを２日に分けて分析した。マウスに腹腔内注射によって三重特異性抗体を１週間に２回、合計７用量投与した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した試験サンプルは、殺処分時（最後の投与からおよそ３０時間後）に収集し、食塩水を投与した対照動物（すなわち、図２１Ａおよび２１Ｂにおけるマウス６）、および三重特異性抗体３０ｍｇ／ｋｇを投与した５匹のマウス（すなわち、図２１Ａおよび２１Ｂにおけるマウス１〜５）を含んだ。
【０１３３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ後、ＴＴＰＰペプチドの、その重標識ペプチド内部標準に対する比を、理論濃度に対してプロットすることにより、１／ｘの重み付けを用いる線形回帰分析によって、各血清の較正曲線を分析した。図２０Ａおよび２０Ｂは、この分析の結果を示す。両方の血清曲線が、０．０１２μｇ／ｍＬ〜８００μｇ／ｍＬの範囲の濃度に対して良好な直線性（決定係数（ｒ−ｓｑｕａｒｅｄ）≧０．９９）およびバイアス（≦２５％）を示した。
【０１３４】
図２１Ａに示すように、血清サンプルは、三重特異性抗体を投与したマウス（＃１〜５）のほとんどで三重特異性ペプチドの高いレベルを示し、食塩水を投与したマウス（＃６）において低いレベルを示した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づくアッセイにおいて検出されたペプチドレベルは、２つのアッセイ間で一貫していた（図２１Ａ）。これらのサンプルには、ＥＬＩＳＡ（ｎ＝４の反復試験）を使用した分析も行った。ＥＬＩＳＡ分析の結果を図２１Ｂに示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＥＬＩＳＡによって検出された三重特異性抗体の相対的レベルは、すべてのサンプルで一貫した傾向を示す。
【０１３５】
本開示は様々な実施形態を含むが、当業者であれば変更形態および改変形態を考案するものと理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲に含まれるそのような等価の変更形態のすべてを対象とすることが意図される。加えて、本明細書で使用するセクションの見出しは、構成上の目的のためのものに過ぎず、記載する主題を限定するものと解釈されてはならない。
【０１３６】
本出願に引用した参考文献はすべて、参照によって本明細書に明示的に組み入れる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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