(57)【要約】  本発明は、遺伝子治療薬の投与、特に単一遺伝子疾患における遺伝子送達のための効果的な組合せ戦略の開発に関する。より具体的には、本発明は、組合せ治療薬、組合せ治療薬の作製方法、ならびに種々の関連する実施形態に関する。
2021528407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）目的のタンパク質をコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターと、（ｉｉ）ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ミニサークル、および／またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の形態の前記導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターとを含む、組合せ治療薬。
【請求項２】
前記導入遺伝子が前記ウイルスベクターを使用して最初に投与され、続いて前記ＥＶベースのベクターを使用して投与される、請求項１に記載の組合せ治療薬。
【請求項３】
前記導入遺伝子が、前記ウイルスベクターを使用して第１の用量で、および前記ＥＶベースのベクターを使用して第２の（および任意選択で後続の）用量（複数可）で投与される、請求項１または２に記載の組合せ治療薬。
【請求項４】
前記導入遺伝子が、ペプチドおよび／またはポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、コクサッキーウイルス、または任意の他の種類の天然もしくは組換えウイルスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項６】
前記ＥＶベースのベクターが、細胞外小胞、エキソソーム、および／または微小胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項７】
前記ＥＶベースのベクターが、前記導入遺伝子を含有するように外因的または内因的に修飾されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項８】
前記ＥＶベースのベクターが、ＥＶタンパク質および核酸（ＮＡ）結合タンパク質を含む融合タンパク質を含むように修飾されており、前記ＮＡ結合タンパク質が、前記ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークル、および／またはｐＤＮＡ導入遺伝子と相互作用して、これらを前記ＥＶベースのベクターに取り込む、請求項７に記載の組合せ治療薬。
【請求項９】
医薬に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１０】
遺伝子疾患の治療における使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１１】
前記遺伝子疾患が、リソソーム蓄積障害、遺伝性代謝異常、ミオパチー、ペルオキシソーム病、ミトコンドリア病、神経疾患および神経変性疾患、炎症性疾患、ならびに癌を含む群から選択される、請求項１０に記載の組合せ治療薬。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組合せ治療薬の製造方法であって、
（ａ）第１の宿主細胞を、前記導入遺伝子を含むウイルスベクターゲノムに感染させ、前記第１の宿主細胞によって産生される前記ウイルスベクターを収集するステップと、
（ｂ）第２の宿主細胞を遺伝子組換えして、ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークル、および／またはｐＤＮＡポリヌクレオチド中に前記導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターを産生し、前記第２の宿主細胞によって産生される前記ＥＶベースのベクターを収集するステップと、を含み、
ステップ（ａ）および（ｂ）は、任意の順序で順次行われ得るか、または並行して行われ得る、方法。
【請求項１３】
前記第１の宿主細胞および前記第２の宿主細胞が、同じ細胞型のものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）における前記遺伝子組換えが、前記第２の宿主細胞においてＥＶタンパク質およびＮＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質を発現することを含み、前記ＮＡ結合タンパク質が、前記ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡおよび／またはｐＤＮＡ導入遺伝子と相互作用して、これらを前記ＥＶベースのベクターに取り込む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターおよび前記ＥＶベースのベクターを１つ以上の医薬組成物に配合するステップをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療薬の投与、特に、とりわけ単一遺伝子疾患における遺伝子送達のための効果的な組合せ戦略の開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療薬は、疾患の発症の根底にある欠陥遺伝子を修正することを目的とする。この問題に対処するための一般的なアプローチは、正常な遺伝子を核に送達することを伴う。次いで、この遺伝子は、標的細胞のゲノムに挿入されてもよく、またはエピソームのままであってもよい。対象の標的細胞への修正遺伝子の送達は、ウイルスベクターの使用を含む多数の方法を介して行うことができる。近年、異なる種類のウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスなど）に基づく複数の修飾遺伝子導入ベクターが開発され、臨床試験で試験されている。異なる組織の異なる種類の分裂細胞および非分裂細胞を形質導入する能力、ならびに安定した長期導入遺伝子発現を確立する能力などの特性のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子導入ベクターが好ましいベクターになっている。
【０００３】
遺伝子送達のためのすべてのウイルスベクターの使用にはいくつかの不利点がある：（１）多数の臨床的に関連する細胞型および組織は、任意のベクターの種類で効率的に形質導入されていない。（２）かなりの割合の患者が、野生型ウイルスへの以前の曝露に起因して多くのウイルスベクターに対する既存の抗体（すなわち、血清陽性である）を有し、ウイルス媒介性形質導入の排除またはかなりの減少をもたらす。（３）体液性、先天性、および細胞性免疫応答の誘導は、すべてではないにしてもほとんどのウイルスベクターに対して、さらにはＡＡＶに対して報告されている（Ｃａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１８）。（４）症状が特定のタンパク質の完全または部分的な欠如によって引き起こされる疾患において、導入遺伝子産物の発現は、治療用タンパク質自体に対する、またはウイルスベクターで形質導入された細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を引き起こし得る（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ＆Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ，２０１８；Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１７）。（５）特定の導入遺伝子産物のウイルス媒介性発現は制御不能であり、しばしば予測することが困難である。これは、遺伝子発現のレベルが高すぎ、それにより毒性につながる、または低すぎ、したがって治療薬活性の欠如をもたらのいずれかにつながり得る。最後に、（６）エピソーム遺伝子発現（例えば、ＡＡＶ媒介性遺伝子治療薬の結果として）は、成長期の器官におけるＤＮＡ希釈の結果として経時的に自動的に減少している。これは、特に小児単一遺伝子障害にとってかなりの問題である。
【０００４】
したがって、遺伝子治療薬は、単一遺伝子障害の治療にとってかなり扱いやすいアプローチを表すが、ウイルスベクターを２回以上安全かつ効果的に投与することができないことは、この技術にとってかなりの制限である。ウイルスベクターの繰り返し投与を可能にし、導入遺伝子自体に対する免疫応答を回避するために、免疫抑制治療プロトコル（Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１７；Ｕｎｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ，２０１２）、患者が血清陽性ではないキメラウイルス血清型の開発、および免疫系が発達している間の羊水内遺伝子送達（Ｈａｙａｓｈｉｔａ−Ｋｉｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２０１５）を含み、種々のアプローチが開発されている。しかし、ウイルス遺伝子治療薬の繰り返し投与は、任意の遺伝子治療薬の適用、特に遺伝子ヌル障害にとって、依然としてかなりの課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、遺伝子治療薬の投与に関連する上記問題、特に導入遺伝子ポリヌクレオチドの繰り返し投与問題、ならびに導入遺伝子および／またはベクター自体に対する免疫応答を引き起こす問題を克服することが、本発明の目的である。さらに、本発明は、当該技術分野における他の既存のニーズ、例えば、ウイルスベクターに対する著しい免疫反応性を有する場合であっても、実行可能な長期治療パラダイムとしての遺伝子治療薬のための安全で効果的な治療戦略を開発することを満たすことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、発明の組合せアプローチを利用し、ウイルス遺伝子治療薬およびエキソソーム媒介性遺伝子送達の独自の強みを利用することによってこれらの目的および他の目的を達成する。第１の態様において、本発明は、本質的に２つの主要成分、すなわち（ｉ）目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターと、（ｉｉ）任意のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡまたは任意の他の種類の線形ＲＮＡポリヌクレオチド、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、線形ＤＮＡポリヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、ならびに／またはＲＮＡ残基およびＤＮＡ残基の両方を含む任意の種類のポリヌクレオチドの形態の導入遺伝子を含む細胞外小胞（ＥＶ）ベースのベクターと、を含む組合せ治療薬に関する。ＰＯＩは、タンパク質、ペプチド、タンパク質もしくはペプチドの任意の部分、もしくはそれらの任意の組合せ、またはその治療薬活性もしくは効力を増強するであろう１つ以上のドメイン（複数可）、領域（複数可）、コンストラクト（複数可）、部位（複数可）もしくはリンカー（複数可）に融合された任意のＰＯＩであり得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＯＩは、タンパク質またはペプチドの形態で、すなわち、ＥＶベースのベクターを操作して、タンパク質の形態でＰＯＩを送達することによって送達することもできる。目的のタンパク質および／またはペプチドを含むようなエキソソームなどのＥＶの操作は、例えば、ＥＶ産生細胞内でＰＯＩを過剰発現させることによって、またはＰＯＩをエキソソームポリペプチドに融合させ、続いてＥＶ産生細胞内でそのような遺伝子コンストラクトを発現させることによって、ＥＶベースのベクター内へのＰＯＩの直接的なＥＶ取り込みを可能にすることによって達成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＯＩをコードする導入遺伝子を送達するウイルスベクターは、タンパク質の形態でＰＯＩを送達するＥＶベースのベクターと組合せることができる。さらなる実施形態では、ＥＶベースのベクターは、ポリヌクレオチドの形態の導入遺伝子、および導入遺伝子がコードするＰＯＩの両方を含んでよく、このＥＶベースのベクターは、対応する導入遺伝子をコードするウイルスベクターと有利に組合せてよい。重要なことに、ウイルスベクターベースのシステムおよびＥＶベースのシステムを使用した導入遺伝子送達のこの発明の組合せは、ウイルスベクターによって送達された場合に免疫応答を引き起こす導入遺伝子産物の存在にもかかわらず、いくつかの意外な技術的効果、特に、ＥＶベースのベクターを使用して送達された場合に導入遺伝子によって引き起こされる免疫応答の非存在を示している。加えて、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡポリヌクレオチドを内因的に取り込んでいるＥＶベースのベクターは、抗導入遺伝子免疫応答を引き起こすさらに低い傾向を示す。これは、本発明が繰り返される長期遺伝子療法の問題に対する完全に新規かつ予想外の解決策を提供する、すなわち、例えば、ＰＯＩ（好ましくは内因性様式でＥＶベースのベクターに取り込まれた）をコードする線形ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子、例えばｍＲＮＡまたはｐＤＮＡのＥＶベースの送達を、同じ導入遺伝子産物のウイルス遺伝子治療薬送達と組合せて取り込まれる用いることにより、ウイルスベクターまたは導入遺伝子のいずれに対しても体液性、先天性、またはＴ細胞媒介性免疫応答を引き起こすことなく、長期にわたり安全かつ効果的な治療が可能になることを意味する。
【０００７】
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＥＶを使用して送達された場合、導入遺伝子に対するいかなる免疫応答の非存在は、少なくとも３つのメカニズム、すなわち、（ｉ）ＥＶベースのベクターを使用して導入遺伝子を送達した場合、種々のウイルス遺伝子エレメント（ＲＮＡウイルスの場合、折り畳まれたＲＮＡ安定化ドメインなど）の非存在、（ｉｉ）ＥＶベースのベクターの内部移行を引き起こす非ＴＬＲ、および／または（ｉｉｉ）ＥＶ中のＨＬＡ−Ｇなどの免疫調節分子の存在の結果であると推測される。
【０００８】
したがって、導入遺伝子（より具体的には、その導入遺伝子産物）の好ましい投与様式は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を使用した導入遺伝子の最初の送達、続いてＥＶベースのベクターを使用して送達される導入遺伝子の後続の用量である。重要なことに、本発明者らはまた、異なる身体区画を標的とする、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）を標的とするためのウイルス遺伝子治療薬、および末梢を標的とするためのＥＶベースのベクター、またはその逆を投与するための、組合せ治療薬を適用し得ることがわかった。上述のように、代替的な実施形態において、ＥＶベースのベクターおよびウイルスベクターは、例えば、同一の経路もしくは異なる経路を介して投与される２つの別々の医薬組成物として、またはＥＶベースのベクターおよびウイルスベクターの両方を含む１種の単一の医薬組成物として、同時に患者に送達され得る。
【０００９】
任意の特定の例示または例に束縛されることを望むものではないが、本発明の組合せ治療は、以下のように例示され得る：
−２種の医薬組成物の並行投与：１種の組成物は導入遺伝子を含むウイルスベクターを含み、別の種の組成物はポリヌクレオチドの形態で導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターを含む。並行投与には、１回以上の用量のウイルスベクターおよび、有利には、より多くの用量のＥＶベースのベクターのうちの１つが後に続き得る。
−２種の医薬組成物の連続投与：１種の組成物は導入遺伝子を含むウイルスベクターを含み、少なくとも１つの後続の投与では、別の種の組成物がポリヌクレオチドの形態で導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターを含む。
−２種の医薬組成物の並行投与：１種の組成物は導入遺伝子を含むウイルスベクターを含み、別の種の組成物は導入遺伝子がコードするＰＯＩを含むＥＶベースのベクターを含み、ＰＯＩはポリペプチドの形態で存在する。並行投与には、１回以上の用量のウイルスベクターおよび、有利には、より多くの用量のＥＶベースのベクターのうちの１つが後に続き得、ＰＯＩは、タンパク質の形態または導入遺伝子に対応するポリヌクレオチドの形態で存在する。
−２種の医薬組成物の連続投与：１種の組成物は導入遺伝子を含むウイルスベクターを含み、少なくとも１つの後続の投与では、ＥＶベースのベクターは導入遺伝子がコードするＰＯＩを含み、ＰＯＩはポリペプチドの形態で存在する。
−２種の医薬組成物の並行投与：１種の組成物は導入遺伝子を含むウイルスベクターを含み、別の種の組成物は導入遺伝子がコードするＰＯＩを含むＥＶベースのベクターを含み、ＰＯＩはポリペプチドおよび導入遺伝子ポリヌクレオチドの両方の形態で存在する。並行投与には、１回以上の用量のウイルスベクターおよび、有利には、より多くの用量のＥＶベースのベクターのうちの１つが後に続き得、ＰＯＩはタンパク質の形態で、および／または導入遺伝子に対応するポリヌクレオチドの形態で存在する。
−２種の医薬組成物の連続投与：１種の組成物は導入遺伝子を含むウイルスベクターを含み、少なくとも１つの後続の投与では、ＥＶベースのベクターは導入遺伝子がコードするＰＯＩを含み、ＰＯＩはポリペプチドの形態でおよび／またはポリヌクレオチド導入遺伝子の形態で存在する。
【００１０】
本発明は、小児遺伝子疾患、例えば、非限定的な例としてニーマンピックＣ型、ゴーシェ病Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型、アルギニノコハク酸尿症などの尿素サイクル異常症、ならびにデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などの治療に使用するのに非常に好適である。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、治療を必要とする対象に、（ｉ）導入遺伝子（導入遺伝子産物、すなわちＰＯＩをコードする）を含むウイルスベクターと、（ｉｉ）導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターとを投与するステップを含む治療方法に関する。有利なことに、上述のように、本発明は、患者が問題の導入遺伝子で２回以上治療される必要がある遺伝子疾患、特に小児単一遺伝子疾患を治療するのに特に好適である。特に、本発明は、患者が問題のウイルスベクターに対する既存の抗体を有するおよび／または患者が該ウイルスベクターの投与後にウイルスベクターに対する抗体を作る場合のいずれかの問題に対する非常に安全かつ有効な解決策を提供する。意外であるが重要な態様は、本発明がまた、導入遺伝子および／または導入遺伝子によって発現されるＰＯＩに対する抗体を作る患者の問題を解決することである。この問題は、安全性に有害な影響を与え、遺伝子治療薬の活性に重大な影響を及ぼし得るからである。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、同じ導入遺伝子の送達のためにウイルスベクターと、ＥＶベースのベクターとを含む組合せ治療薬の製造方法に関する。本発明の方法は、一般に（ａ）第１の宿主細胞を、導入遺伝子を含むウイルスベクターゲノムに感染させ、該第１の宿主細胞によって産生されるウイルスベクターを収集するステップと、（ｂ）第２の宿主細胞を遺伝子修飾して、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、および／またはｐＤＮＡポリヌクレオチド中に、該導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターを産生し、第２の宿主細胞によって産生されるＥＶベースのベクターを収集するステップと、を含む。ステップ（ａ）および（ｂ）は、コストおよびリソース効果の最も高いアプローチに応じて、任意の順序で順次行われてもよいか、または並行して行われてよい。重要な一実施形態では、ステップ（ａ）および（ｂ）で使用される宿主細胞は、同じ細胞型であってよい。導入遺伝子に対する免疫応答をうまく回避するための鍵は、導入遺伝子の内因的ＥＶベースのベクター取り込み戦略、すなわち、親ＥＶ産生細胞の遺伝子操作を介して導入遺伝子を担持するＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡおよび／またはｐＤＮＡポリヌクレオチドなどの取り込み、または問題の導入遺伝子、例えば、ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、線形ＤＮＡポリヌクレオチドおよび／またはｐＤＮＡの形態での高効率な外因的取り込みのいずれかの使用である。
【００１３】
したがって、本発明は、遺伝子治療薬の分野にかなりの影響を及ぼす可能性を有する、遺伝子治療薬のための導入遺伝子の繰り返し投与の問題に対する完全に予想外の解決策を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＥＶ産生細胞源の内因性遺伝子の操作を介して、目的の導入遺伝子をＥＶベースのベクターに取り込む概略図を示す。図は、ＥＶタンパク質と核酸結合タンパク質との間の融合タンパク質が、この場合、ｍＲＮＡ導入遺伝子の内因的な取り込みを可能にする方法を示す。
【図２】（第１の用量で）ＡＡＶベクターおよび（第２の用量で）ＭＳＣ由来ＥＶベースのベクターを使用した、ナノルシフェラーゼ導入遺伝子の繰り返し送達を示す。
【図３】（ａ）２用量のＡＡＶ、または（ｂ）１用量のＡＡＶと、ｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡを内因的に取り込んだ、１用量のＨＥＫ２９３ＴベースのＥＶのうちのいずれかを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与されたｅＧＦＰ導入遺伝子に対する、抗導入遺伝子（すなわち、抗ｅＧＦＰ）の抗体産生を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、一般に、ウイルス遺伝子治療薬の繰り返し投与に関連する問題、特に、患者において抗ベクターおよび潜在的にさらに重要な抗導入遺伝子抗体の産生を克服する必要性の解決に向けられる。
【００１６】
したがって、第１の態様において、本発明は、（ｉ）目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターと、（ｉｉ）導入遺伝子をＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、線形ＤＮＡ、および／またはｐＤＮＡの形態で含むＥＶベースのベクターとを含む、組合せ治療薬に関する。有利な一実施形態において、導入遺伝子は、最初にウイルスベクター送達を使用して投与され、続いてＥＶベースのベクターを使用して導入遺伝子の第２の投与、任意選択でさらなる用量投与で投与される。重要なことに、導入遺伝子は、異なる送達方法を使用して、すなわち、ウイルスベクター送達またはＥＶベースのベクターを使用した送達のいずれかを使用して、異なる器官、組織、および／または身体区画に送達され得る。以下でさらに概説を詳述するように、ＥＶベースのベクターおよびウイルスベクターは、ＥＶが多くの場合、ウイルスベクターに対する免疫応答を弱めるために利用され得る免疫調節効果を有するため、本質的に対象に同時に投与され得る。
【００１７】
本発明の導入遺伝子は、通常、タンパク質、ポリペプチド、またはそれらの任意の組合せ（いわゆるＰＯＩ）をコードし得る。ウイルス遺伝子治療薬の場合、導入遺伝子の送達、および対応するＰＯＩは、多くの場合、抗ＰＯＩ抗体の産生を引き起こし、ＰＯＩの活性の低下および／または完全な中和をもたらす。導入遺伝子自体、ＰＯＩ、またはウイルスベクターのいずれかに対する抗体の産生は、ウイルス遺伝子治療薬の繰り返し投与が従来通り不可能であることを意味する。しかし、本発明は、免疫応答を引き起こすことなく、同じ導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを内因的または外因的に取り込んだＥＶを使用することによって、この問題の予想外の解決策を提供する。
【００１８】
重要なことに、本発明は、種々のウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、コクサッキーウイルスなどから選択されるウイルスベクターに広く適用可能である。
【００１９】
用語「細胞外小胞」または「ＥＶ」は、本明細書で同義に使用され、任意の形態で細胞から得ることができる任意の種類の小胞、例えば、微小胞（例えば、細胞の形質膜から放出される任意の小胞）、エキソソーム（例えば、エンドソーム、リソソーム、および／またはエンドリソソーム経路に由来する任意の小胞）、アポトーシス小体、ＡＲＭＭ（アレスチンドメイン含有タンパク質１［ＡＲＲＤＣ１］媒介微小胞）、微小粒子構造および小胞構造などに関連すると理解されるべきである。ＥＶは、遺伝子修飾または遺伝子操作されてもよく、この場合、ＥＶは、通常、それらの細胞によって産生されるＥＶに組み込まれる組換え導入遺伝子またはタンパク質産物を含む遺伝子修飾された／遺伝子操作されたプロデューサー細胞に由来する。「修飾された」という用語は、例えば、ＥＶ産生細胞の遺伝子操作を介して、または例えば、エキソソーム表面に部分を付着させるための、例えば化学コンジュゲーションを介して、遺伝的アプローチまたは化学的アプローチのいずれかを使用して小胞が修飾されていることを示す。ＥＶのサイズはかなり変動し得るが、ＥＶは、一般にナノサイズの流体力学的直径、すなわち１０００ｎｍ未満の直径を有する。明らかに、ＥＶは、インビボ、エクスビボ、およびインビトロでの任意の細胞型に由来し得る。好ましいＥＶとしては、エキソソームおよび微小胞が挙げられるが、他のＥＶも、種々の状況において有利であり得る。さらに、上記の用語はまた、細胞外小胞模倣体、例えば膜押出、超音波処理、または他の技術などを介して得られる細胞膜ベースの小胞に関連すると理解されるべきである。さらに、本明細書における教示が、ＥＶを単数形で、および／または複数のＥＶを別々の天然のナノ粒子様小胞として指すとき、すべてのそのような教示は、複数のＥＶおよびＥＶの集団に対して等しく関連しており、適用可能であることを理解すべきである。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明のＥＶベースのベクターは、任意の細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エキソソーム、微小胞、またはそれらの任意の組合せである。本発明の好ましい実施形態は、問題の導入遺伝子の送達のためにアデノウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶベクターを含む組合せ治療薬を、同時にまたは順次与えられ得る同じ導入遺伝子のＥＶベースのベクター送達と組合せて使用することである。
【００２１】
非常に好ましい実施形態において、組合せ治療薬のＥＶベースのベクターは、目的の導入遺伝子を含有するように内因的に修飾されている。好ましくは、導入遺伝子は、ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、および／またはｐＤＮＡの形態で存在するが、他の形態のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチドも用いられてよい。ＥＶ産生細胞源の遺伝子操作により、導入遺伝子ポリヌクレオチドは、小胞が細胞によって産生されるとＥＶに内因的に取り込まれ、それによって、導入遺伝子およびそれがコードするＰＯＩの非免疫原性送達が可能になる。ＥＶへの内因的な取り込みは、通常、ＥＶタンパク質と核酸（ＮＡ）結合タンパク質との間の融合タンパク質の使用に基づき、ＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡポリヌクレオチド（好ましくはｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、線形ＤＮＡおよび／またはｐＤＮＡ導入遺伝子）に結合し（すなわち相互作用し）、ＥＶに取り込まれる。好ましい実施形態では、融合タンパク質に含まれるＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ６、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、ＰＵＦ、ＰＵＦ５３１、ＰＵＦｘ２、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガー、ヌクレアーゼ、転写因子、またはそれらの任意の組合せ、ドメイン、領域もしくはその変異体のうちの少なくとも１つである。重要なことに、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドのＥＶへの外因的取り込みは、導入遺伝子の繰り返し投与時に抗導入遺伝子抗体産生の問題を回避するように見える導入遺伝子取り込みに対する別の扱いやすいアプローチである。ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、線形ＤＮＡおよび／またはｐＤＮＡをＥＶに取り込むための外因的取り込み戦略としては、エレクトロポレーション、微小流体技術、細胞へのトランスフェクション、またはＥＶ産生細胞源から既に収集されているＥＶへの直接トランスフェクションなどが挙げられる。
【００２２】
本発明による組合せ治療薬は、医薬での使用に対してかなりの適用性を有し、遺伝性疾患、より具体的には単一遺伝子疾患の治療に有利である。本発明の組合せ治療薬が特に好適な疾患としては、リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）、遺伝性代謝異常（ＩＥＭ）、ミオパチー、ミトコンドリア病、ペルオキシソーム病、炎症性疾患、癌、神経変性疾患、神経疾患、ならびに本質的に任意の他の疾患、病気、状態、症候群または病状が挙げられる。本発明の組合せ治療薬に関連する特定の患者カテゴリには、導入遺伝子に対する抗体、導入遺伝子が送達される細胞に対する抗体、ＰＯＩに対する抗体、またはウイルスベクター自体に対する抗体を産生する患者が含まれる。さらに、ウイルスベクター投与時または投与後に先天性、体液性、またはＴ細胞媒介性の免疫応答が引き起こされる患者は、本発明のＥＶベースの導入遺伝子送達ベクターによるフォローアップ治療に非常に適している。同様に、患者がウイルスベクターまたは導入遺伝子産物に対する知られている既存の抗体を有する場合、本発明によるＥＶベースのベクターは、かなり扱いやすい、非免疫原性介入を表す。加えて、ウイルスベースのベクターとＥＶベースのベクターとの間の異なる薬物動態および薬物動態プロファイルの結果として、組合せ治療薬の２つの成分（すなわち、ウイルスベースのベクターおよびＥＶベースのベクター）に対して異なる投与経路および／または異なる製剤が用いられ得る。例えば、ウイルスベクターは、脳室内投与または髄腔内投与を介してＣＮＳに投与されることができ、一方、ＥＶは、特にウイルスベクターの種類、ＥＶベースのベクターの種類、および治療される疾患に応じて、静脈内、皮下、および／または筋肉内に投与されてもよく、またはその逆であってもよい。非限定的な例として、神経性障害を伴うリソソーム蓄積障害の適切な治療方法は、欠如もしくは欠損した酵素またはトランスポーター（例えば、ＧＢＡ、ＮＰＣ１，ＣＬＮ６、ＩＳ２、ＬＡＭＰ２、αマンノシダーゼもしくはβマンノシダーゼなど）をコードする導入遺伝子を、ＣＮＳ（例えば、髄腔内投与または脳室内投与を介して）に投与されるウイルスベクターを例えば、静脈内または皮下投与を介して全身投与される問題のＲＮＡまたはＤＮＡ導入遺伝子のＥＶベースのベクター送達と並行または連続して組合せて使用して、送達することであり得る。あるいは、上述のように、ウイルスベクターおよびＥＶベースのベクターは、別々の医薬組成物または同一の医薬組成物のいずれかで、同じ投与経路、例えば静脈内投与を使用して投与されてもよい。好ましい実施形態では、導入遺伝子のウイルスベクター媒介送達は、第１の用量に続いて、対応する導入遺伝子のＥＶベースのベクター送達の第２および後続の用量が投与される。第２の用量は、第１のウイルスベクター用量と同時に、またはウイルスベクター用量が投与された後に行われ得る。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、治療を必要とする対象に、（ｉ）ＰＯＩをコードする導入遺伝子を含むウイルスベクター、および（ｉｉ）導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターを投与するステップを含む治療方法に関する。
【００２４】
「同時または並行投与／送達／投薬」とは、同じ経路によって、かつ同時に、または実質的に同時に、少なくとも２種の活性成分を投与することを意味し得る。
【００２５】
「別々の投与／送達／投薬」とは、異なる経路によって、同時に、または実質的に同時に、少なくとも２種の活性成分を投与することを意味し得る。
【００２６】
「連続投与／送達／投薬」とは、異なる時間に少なくとも２種の活性成分を投与することを意味してもよく、投与経路は同一であるか、または異なる。より具体的には、「連続的」とは、活性成分のうちの１つの全投与が、もう一方の投与の前に、または他の投与を開始する前に行われることを意味し得る。したがって、もう一方の活性成分（複数可）を投与する前に、活性成分のうちの１つを数ヶ月にわたって投与することが可能である。この場合、同時治療はない。各活性成分の数週間にわたる交互投与も、想定され得る。
【００２７】
用語「投与」、「投薬」、および「送達」とは、本明細書において同義に使用される。本発明による組合せ治療薬は、種々の異なる投与経路を介して、例えば、耳介（耳）、頬側、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質性、腹腔内（ｉｎｔｒａ−ａｂｄｏｍｉｎａｌ）、羊水内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、仙骨内、洞内、腔内、大脳内、槽内、角膜内、歯冠内（歯）、冠動脈内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜内、前立腺内、肺内、鼻腔内、脊髄内、滑膜内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、尿細管内、腫瘍内、鼓膜内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、心室内、膀胱内、硝子体内、イオン浸透法、洗浄、喉頭、経鼻、経鼻胃、密封包帯法、眼、経口、口腔咽頭、その他、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、経直腸、呼吸器（吸入）、眼球後、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓膜、尿管、尿道、および／または膣の投与、および／または上述の投与経路の組合せで、ヒトまたは動物に投与され得る。これは、一般に治療すべき疾患、および／または投与される医薬組成物の特性に依存する。
【００２８】
上述のように、この組合せアプローチは、特に、ウイルスベクターまたは導入遺伝子産物に対する既存の抗体を有する患者、ウイルスベクターまたは導入遺伝子産物に対する抗体を作る患者、異なる器官、身体区画、または組織に異なるベクターなどで達することを必要とする疾患を患っている患者などに関連している。本発明の有利な一実施形態では、ウイルスベクターおよびＥＶベースのベクターは、異なる送達ベクターに関連する固有の利点を利用するために、同じまたは異なる投与経路を介して投与され得る。
【００２９】
さらなる実施形態において、ウイルスベクターおよびＥＶベースのベクター導入遺伝子送達は、事実上同時にまたは連続して行われる。投与レジメン間の選択は、実際のまたは予測される抗体価、ウイルス遺伝子治療薬に対する一般的な実際のまたは予測される免疫学的応答、異なる種類のベクターによって到達される標的器官などの態様に依存することになる。組合せ治療薬の１つの好ましい投与レジメンにおいて、導入遺伝子のウイルスベクターベースの送達は、１回、または最大２回もしくは数回行われるのに対して、導入遺伝子のＥＶベクター送達は、繰り返して、すなわち、１回を超えるが、通常２回を超える、もしくは慢性の長期治療のために行われる可能性もある（すなわち、数十〜数百〜数千回投与される）。ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、線形ＤＮＡまたはｐＤＮＡ）の形態で導入遺伝子を内因的に取り込んだＥＶベースのベクターが、抗導入遺伝子免疫応答を引き起こすことなく送達され得るという意外な実現は、ウイルス遺伝子治療薬が、ＥＶベースのベクターアプローチを使用して長期間にわたって「補充」され得、繰り返し遺伝子治療薬投与の問題に対する最適な解決策を提供することを意味する。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の組合せ治療薬の製造方法に関する。本発明の製造方法は、一般に（ａ）第１の宿主細胞を、導入遺伝子を含むウイルスベクターゲノムに感染させ、該第１の宿主細胞によって産生されるウイルスベクターを収集するステップと、（ｂ）第２の宿主細胞を遺伝子組換えして、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、線形ＤＮＡ、および／またはｐＤＮＡポリヌクレオチド中に該導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターを産生し組換えして、第２の宿主細胞によって産生されるＥＶベースのベクターを収集するステップと、を含み得る。これらの２つのステップは、同時に、任意の順序で順次行われてもよく、かつ／または並行して行われてもよい。
【００３１】
好ましい一実施形態では、ウイルスベクター産生に使用される第１の宿主細胞と、ＥＶベースのベクター産生に使用される第２の宿主細胞は、同じ細胞型である。好適な細胞源としては、羊膜由来細胞、胎盤由来細胞、羊膜上皮細胞、例えば、骨髄由来の間葉系間質細胞、脂肪組織、ワルトン膠様質、ＨＥＫ細胞などが挙げられる。好ましい一実施形態では、ステップ（ｂ）における遺伝子組換えは、第２の宿主細胞（上記の第１の宿主細胞と同じ細胞型であり得る）において、ＥＶタンパク質およびＮＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質を発現することを含み、該ＮＡ結合タンパク質は、ｍＲＮＡ、他の形態の線形ＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、線形ＤＮＡおよび／またはｐＤＮＡ導入遺伝子と相互作用して、これらをＥＶに取り込む。好ましい実施形態では、ＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ６、ＰＵＦ、ＰＵＦ５３１、ＰＵＦｘ２、Ｃａｓ６、またはそれらの任意のドメイン、セグメント、領域、配列、突然変異体、変異体、もしくはそれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む群から選択される。一般に、本発明の文脈において好適なＮＡ結合タンパク質としては、ＰＵＦ、ＰＵＦ５３１、ＰＵＦｘ２（ヒトＰｕｍｉｌｉｏ１タンパク質由来の２つのＰＵＦドメインを含む）、ＰＵＦｅｎｇ、ＤＤＸ３Ｘ、ＥＥＦ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＨＰＨ１、ＨＮＲＮＰＤ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＮＳＵＮ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ９、ＷＤＲ１、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰ９０  ＡＢ１、ＭＶＰ、ＰＣＢ１、ＭＯＣＳ３、ＤＡＲＳ、ＥＬＣ２、ＥＰＲＳ、ＧＮＢ２Ｌ１、ＩＡＲＳ、ＮＣＬ、ＲＡＲＳ、ＲＰＬ１２、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ３、ＲＵＶＢＬ１、ＴＵＦＭ、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＤＤＸ４、ＡＤＡＤ１、ＤＡＺＬ、ＥＬＡＶＬ４、ＥＬＡＶＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＨＮＲＮＰＱ、ＲＢＦＯＸ１、ＲＢＦＯＸ２、Ｕ１Ａ、ＰＰＲファミリー、ＺＲＡＮＢ２、ＮＵＳＡ、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、Ｌｉｎ２８、ＫＳＲＰ、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ＦＭＲ１、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＥＩＦ４Ａ１−３、ＭＳ２コートタンパク質、ＤＥＡＤ、ＫＨ、ＧＴＰ＿ＥＦＴＵ、ｄｓｒｍ、Ｇパッチ、ＩＢＮ＿Ｎ、ＳＡＰ、ＴＵＤＯＲ、ＲｎａｓｅＡ、ＭＭＲ−ＨＳＲ１、ＫＯＷ、ＲｎａｓｅＴ、ＭＩＦ４Ｇ、ｚｆ−ＲａｎＢＰ、ＮＴＦ２、ＰＡＺ、ＲＢＭ１ＣＴＲ、ＰＡＭ２、Ｘｐｏ１、Ｐｉｗｉ、ＣＳＤ、ＲｉｐＴＡＬ、ＢａｔおよびＭＯｒＴＬ１、ＭＯｒＴＬ２、ＢｕｒｒＨ、Ｒ２ＤＢＤ、ＭＢＰ１、Ｓｋｎ−１ｂＺＬ、ＲＯＲα１、ｄｎａＡ、ならびにそれらの任意の組合せ、誘導体、ドメイン、領域、部位、突然変異型変異体または部分（複数可）が挙げられる。
【００３２】
本発明による融合タンパク質に含まれるＥＶタンパク質は、以下の非限定的な例を含む群から選択され得る：ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ成分、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＡＲＲＤＣ１、ＰＤＧＦＲＮ、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１α、Ｍａｃ−１β、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、および任意の他のＥＶタンパク質、ならびにそれらの任意の組合せ、誘導体、ドメイン、変異体、突然変異体、または領域。特に有利なＥＶタンパク質としては、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＩＣＡＭ、インテグリン、ＡＲＲＤＣ１、シンデカン、シンテニン、およびＡＬｉＸ、ならびにそれらの誘導体、ドメイン、変異体、突然変異体、または領域が挙げられる。
【００３３】
ウイルスベクターおよびＥＶベースのベクターの産生に用いられる宿主細胞は、本質的に、初代細胞、細胞株、多細胞生物中に存在する細胞、または本質的に、ウイルスベクターおよび／またはＥＶを産生するために利用され得る任意の他の種類の細胞源を含む任意の種類の細胞源から選択され得る。宿主細胞は、浮遊培養、接着培養、ビーズもしくは他の移動要素、または任意の他の種類の培養系および任意の種類の容器において成長し得る。本発明による宿主細胞は、インビボでＥＶおよびウイルスベクターを産生する細胞も含み得る。本発明による宿主細胞は、広範囲の細胞、組織および／または細胞株、例えば、間葉系間質（ＭＳＣ）（例えば、骨髄、脂肪組織、ワルトン膠様質、周産期組織、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから得ることができる）、線維芽細胞、羊膜細胞、より具体的には任意選択で種々の早期マーカーを発現する羊膜上皮細胞、骨髄性抑制細胞、Ｍ２偏光マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、浮遊培養および／または無血清培養に適合したＨＥＫ細胞、微小血管またはリンパ管内皮細胞などの内皮細胞株、赤血球、赤血球前駆細胞、軟骨細胞、羊膜穿刺を介してもしくは胎盤から得られる任意の細胞、気道もしくは肺胞から得られる上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞などが選択される。また、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞（ＤＣ）も、本発明の範囲内であり、ウイルスベクターおよびＥＶを産生することができる任意の細胞型が本質的に本明細書に包含される。宿主細胞は、治療される患者に対して本質的に、同種異系、自己由来、または異種のいずれかであり得、すなわち、細胞は、患者自身由来、または、非血縁ドナー、適合するもしくは適合しないドナー由来であり得る。
【００３４】
さらなる一実施形態では、本発明による製造方法は、医薬組成物中のウイルスベクターおよび／またはＥＶベースのベクターを配合するステップをさらに含み得る。２つのベクターの種類は、同じ種類の医薬組成物に配合され得るか、または異なる種類の医薬組成物に配合され得る。この選択の鍵は、投与経路、異なるベクターの投与量、および治療される疾患である。一実施形態において、ウイルスベクターは、ＥＶベースのベクターとほぼ同時に、同じ医薬組成物または異なる医薬組成物のいずれかで送達され得る。本発明の製剤緩衝液は、一般に１種以上の添加剤を含有する水溶液である。かかる添加剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などのタンパク質、トレハロースまたはスクロースなどの糖類、高分子量構造添加剤（ＨＳＡなどのタンパク質であり得る）、および水中に緩衝成分を含み得る。本発明の文脈内で利用されるように、「緩衝化合物」または「緩衝成分」は、水性懸濁液を所望のｐＨに維持するように機能する物質を指すと理解されるべきである。水溶液はまた、１種以上のアミノ酸を含み得る。
【００３５】
製剤緩衝液は、ＥＶベースのベクターおよびウイルスベクターの一方または両方のための貯蔵緩衝液として有利に使用され得る。貯蔵は、−５℃またはそれ以上、好ましくは−２０℃、またはさらにより好ましくは−８０℃などの氷点下の温度で行われ得る。未精製または精製された形態のＥＶベースのベクターおよび／またはウイルスベクターの水性製剤は、代替的に、周囲温度での凍結乾燥または蒸発によって乾燥させることができる。
【００３６】
前述のように、製剤に使用される溶液は、有利には、糖類、ＨＳＡなどの高分子量構造添加剤、緩衝成分、および水のうちの１つ以上を含み得る。溶液はまた、１種以上のアミノ酸を含み得る。これらの成分の組合せは、凍結、解凍、凍結乾燥、および／または投与ならびに循環時にＥＶベースのベクターおよび／またはウイルスベクターの活性を維持するように作用する。好ましい糖類はトレハロースであるが、他の糖類、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、グルコース、イノシトール、フルクトース、マルトース、またはガラクトースが使用され得る。加えて、糖類の組合せ、例えば、トレハロースとマンニトール、またはスクロースとマンニトールを使用することができる。高分子量構造添加剤は、凍結中のベクター凝集を防止するのに役立ち、液体、凍結または凍結乾燥の状態で構造的支持を提供する。本発明の文脈において、構造添加剤が５０００ダルトンを超える場合、構造添加剤は「高分子量」であると見なされる。好ましい高分子量構造添加剤は、ヒト血清アルブミンである。しかし、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、デキストラン、セルロース、ゼラチン、またはポビドンなどの他の物質も使用され得る。アミノ酸は、水性懸濁液の冷却および解凍時にベクターの感染性をさらに維持するように機能し得る。好ましいアミノ酸はアルギニンであるが、リジン、オミチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）、セリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸またはアスパラギン酸などの他のアミノ酸も使用することができる。緩衝成分は、比較的一定のｐＨを維持することによって溶液を緩衝するように作用する。所望のｐＨ範囲に応じて、好ましくは７．０〜７．８の間で、種々の緩衝液が使用され得る。好適な緩衝液としては、リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられる。加えて、水溶液は、最終製剤を適切な等浸透塩濃度に調整するために使用される中性塩を含有することが好ましい。好適な中性塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化マグネシウムが挙げられる。好ましい塩は、塩化ナトリウムである。
【００３７】
ＥＶベースのベクターの下流プロセッシングおよび精製は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ビーズ溶出液クロマトグラフィー、スピン濾過、透析濾過、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）中空糸濾過、遠心、免疫沈降、フローフィールドフラクショネーション、透析、微小流体ベースの分離など、またはそれらの組合せを含む技術の群から選択される方法を用いて達成され得る。有利な一実施形態では、ＥＶベースのベクターの精製は、濾過（好ましくは透析濾過もしくは限外濾過（ＵＦ）もしくはタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ））、およびクロマトグラフィー、例えばサイズ排除ＬＣ、イオン交換ＬＣ、および／またはビーズ溶出ＬＣの連続組合せを使用して行われる。精製ステップを組合せることにより、通常、得られるＥＶベースのベクター調製物の純度が向上し、次に優れた治療薬活性がもたらされる。
【００３８】
同様に、ウイルスベクターの精製は、当技術分野において周知であり、遠心分離およびクロマトグラフィー技術などの精製技法を含む。当技術分野において周知の他のプロセスとしては、濃縮、濾過、透析濾過、または好適な緩衝液もしくは医薬品賦形剤との混合を挙げることができる。ＥＶベースのベクターおよびウイルスベクターの両調製物は、分配のための単位用量と多用量とのアリコートに分けることができ、これにより、バッチの本質的特性が保持される。本発明は、以下を含むがこれらに限定されない数多くの疾患、状態および病気において有利に利用され得る：αマンノ−ス症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩ型、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩＩ型、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩＩＩ型、ＧＭ２サンドホフ病、ＧＭ２テイサックス病、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ＡＢ変異型、ムコリピドーシスＩＩ、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ＭＰＳ  Ｉハーラー症候群、ＭＰＳ  Ｉシャイ症候群、ＭＰＳ  Ｉハーラー・シャイ症候群、ＭＰＳＩＩハンター症候群、ＭＰＳ  ＩＩＩＡサンフィリッポ症候群Ａ型、ＭＰＳ  ＩＩＩＢサンフィリッポ症候群Ｂ型、ＭＰＳ  ＩＩＩＢサンフィリッポ症候群Ｃ型、ＭＰＳ  ＩＩＩＢ−サンフィリッポ症候群Ｄ型、ＭＰＳ  ＩＶ−モルキオＡ型、ＭＰＳ  ＩＶ−モルキオＢ型、ＭＰＳ  ＩＸ−ヒアルロニダーゼ欠損症、ＭＰＳ  ＶＩ−マロトー・ラミー症候群、ＭＰＳ  ＶＩＩスライ症候群、ムコリピドーシスＩ−シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型、多発性スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症Ｔ１、神経セロイドリポフスチン症Ｔ２、神経セロイドリポフスチン症Ｔ３、神経セロイドリポフスチン症Ｔ４、神経セロイドリポフスチン症Ｔ５、神経セロイドリポフスチン症Ｔ６、神経セロイドリポフスチン症Ｔ７、神経セロイドリポフスチン症Ｔ８、ニーマンピック病Ａ型、ニーマンピック病タイプＢ、ニーマンピック病Ｃ型、ポンペ病、濃化異骨症、サルＩ病、シンドラー病、ウォルマン病、ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症、ミトコンドリア複合体ＩＩ欠損症、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠乏症、ミトコンドリア複合体ＩＶ欠乏症、ミトコンドリア複合体Ｖ（ＡＴＰシンターゼ）欠乏症、原発性補酵素Ｑ１０欠乏症（ＣＯＱ１０Ｄ）、脳、眼、歯科、耳介、骨格異常（ＣＯＤＡＳ）症候群、ＰｏｌＧの変異に起因するミトコンドリア病、慢性進行性外部眼筋麻痺症候群（ＣＰＥＯ）、Ａｌｐｅｒｓ−Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ症候群（ＡＨＳ）、小児筋脳肝障害スペクトラム（ＭＣＨＳ）、ミオクロニーてんかん筋症感覚性運動失調（ＭＥＭＳＡ）、運動失調ニューロパシースペクトラム（ＡＮＳ）、ミトコンドリア劣性運動失調症候群（ＭＩＲＡＳ）、感覚性運動失調ニューロパシーおよび眼筋麻痺（ＳＡＮＤＯ）、常染色体劣性進行性外部眼筋麻痺（ａｒＰＥＯ）、常染色体優性進行性外部眼筋麻痺（ａｄＰＥＯ）、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ミトコンド���アＤＮＡ枯渇症候群１、ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、Ｍｏｈｒ−Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ症候群、３−メチルグルタコン酸尿症、複合酸化リン酸化欠損症、筋障害、乳酸失調症、および鉄芽球性貧血（ＭＬＡＳＡ）、高尿酸血症、肺高血圧症、腎不全、およびアルカリ症（ＨＵＰＲＡ）症候群、リー症候群、リー症候群、フランス系カナダ人型、フリードライヒ運動失調、グラシエ症候群、ビョルンスタッド症候群、多発性ミトコンドリア機能障害症候群（ＭＭＤＳ）、眼球運動失調を伴う早期発症性運動失調および低アルブミン血症（ＥＡＯＨ）、シャルコー・マリー・トゥース病−２Ａ２、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、乳幼児突然死症候群、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）、ＭＥＲＲＦ／ＭＥＬＡＳオーバーラップ症候群、ニューロパシー、運動失調、色素性網膜炎（ＮＡＲＰ）、ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸酸症および脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ）、脳幹および脊髄の障害および乳酸上昇を伴う白質脳症（ＬＢＳＬ）、ＳＤＨ変異に起因するミトコンドリア病、痙性傍麻痺、傍神経節腫、フェオクロモサイトーマ、視神経萎縮１型、エチルマロン性脳症、ガルニチン−アシルカルニチントランスロカーゼ欠損症、原発性全身カルニチン欠損症、脳クレアチン欠乏症候群−１、脳クレアチン欠乏症候群−２または脳クレアチン欠乏症候群−３、脳クレアチン欠乏症候群−３、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ２（ＣＰＴ  Ｉ）欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ２（ＣＰＴ  ＩＩ）欠損症、短鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症、極長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症、長鎖３−ヒドロキシルＣｏＡ脱水素酵素（ＬＣＨＡＤ）欠損症、複数のアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症、グルタル酸血症ＩＩＡ、グルタル酸血症ＩＩＢ、グルタル酸血症ＩＩＣ、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、ピルビン酸脱水素酵素欠損症、ピルビン酸脱水素酵素Ｅｌ−α欠損症、ピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼ欠損症、ピルビン酸脱水素酵素Ｅ３結合タンパク質欠損症、ピルビン酸脱水素酵素Ｅ２欠損症、ピルビン酸脱水素酵素Ｅｌ−ベータ欠損症、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ脱水素酵素（ＳＣＨＡＤ）欠損症／（ＨＡＤＨ）欠損症、脳クレアチン欠損症候群（ＣＣＤＳ）１、ＣＣＤＳ２、ＧＬＵＴ１欠損症候群１、乳児発症、重度、進行性ミオクローヌスてんかん１Ａ型（ウンフェルリヒト・ルントボルク）、進行性ミオクローヌスてんかん２Ａ型（Ｌａｆｏｒａ）、進行性ミオクローヌスてんかん２Ｂ型（Ｌａｆｏｒａ）、てんかん性脳症、早期乳児（ＥＩＥＥ）１型、ＥＩＥＥ３型、ＥＩＥＥ８型、ＥＩＥＥ１２型、ＥＩＥＥ１５型、ＥＩＥＥ１６型、ＥＩＥＥ１８型、多発性先天性異常−筋緊張低下−発作症候群２（ＭＣＡＨＳ２）／ＥＩＥＥ２０型、ＥＩＥＥ２１型、ＥＩＥＥ２３型、ＥＩＥＥ２５型、ＥＩＥＥ２８型、ＥＩＥＥ２９型、ＥＩＥＥ３４型、ＥＩＥＥ３５型、小頭症、発作および発育遅延（ＭＣＳＺ）、Ａｉｃａｒｄｉ−Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ症候群（ＡＧＳ）１型、ＡＧＳ２型、ＡＧＳ３型、ＡＧＳ４型、ＡＧＳ５型、ＡＧＳ６型、先天性グリコシル化障害（ＣＤＧ）、Ｉａ型、ＣＤＧＩｂ型、ＣＤＧＩ���型、ＣＤＧＩｄ型、ＣＤＧＩｅ型、ＣＤＧＩｆ型、ＣＤＧＩｇ型、ＣＤＧＩｈ型、ＣＤＧＩｉ型、ＣＤＧＩｊ型、ＣＤＧＩｋ型、ＣＤＧＩｌ型、ＣＤＧＩｍ型、ＣＤＧＩｎ型、ＣＤＧｌｏ型、ＣＤＧＩｐ型、ＣＤＧＩｑ型、ＣＤＧＩｒ型、ＣＤＧＩｓ型、ＣＤＧＩｔ型、ＣＤＧＩｕ型、ＣＤＧＩｗ型、ＣＤＧＩｘ型、ＣＤＧＩｙ型、ＣＤＧＩｚ型、ＣＤＧＩＩａ型、ＣＤＧＩＩｂ型、ＣＤＧＩＩｅ型、ＣＤＧＩＩｄ型、ＣＤＧＩＩｅ型、ＣＤＧＩｌｆ型、ＣＤＧＨｇ型、ＣＤＧＩＩｈ型、ＣＤＧＩＩｉ型、ＣＤＧＩＩｊ型、ＣＤＧＩｌｋ型、ＣＤＧＩＩＩ型、ＣＤＧＩＩｎ型、脊髄小脳失調症、常染色体劣性１、運動失調、早期発症、眼球運動失調症および低アルブミン血症、Ｍａｒｉｎｅｓｃｏ−Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群、Ｃｏｃｋａｙｎｅ症候群、Ａ型／ＵＶ感受性症候群２、Ｃｏｃｋａｙｎｅ症候群、Ｂ型／脳眼球顔面骨格症候群１／ＤｅＳａｎｃｔｉｓ−Ｃａｃｃｈｉｏｎｅ症候群／ＵＶ感受性症候群、痙性運動失調、Ｃｈａｒｌｅｖｏｉｘ−Ｓａｇｕｅｎａｙ型、ペリツェウス・メルツバッハー病／痙性傍麻痺２、Ｘ連鎖、貧血、側方芽球性、運動失調、脊髄小脳形成不全（ＰＣＨ）、ｌａ型、ＰＣＨｌｂ型、ＰＣＨｌｃ型、ＰＣＨ２ａ型、ＰＣＨ２ｂ型、ＰＣＨ２ｃ型、ＰＣＨ２ｄ型、ＰＣＨ２ｅ型、ＰＣＨ３型、ＰＣＨ４型、ＰＣＨ５型、ＰＣＨ６型、ＰＣＨ８型、ＰＣＨ９型、ＰＣＨ１０型、脊髄小脳性運動失調、常染色体劣性（ＳＣＡＲ）２（ＳＣＡＲ２）、ＳＣＡＲ７、ＳＣＡＲ８、ＳＣＡＲ１０、ＳＣＡＲ１４、ＳＣＡＲ１６、ＳＣＡＲ１８、ＳＣＡＲ２０、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、シトルル貧血、アルギニノコハク酸尿症、アルギニン血症、カルバモイルリン酸シンテターゼＩ欠損症、ヘモクロマトーシス、モリブデン補因子欠損症Ａ型、モリブデン補因子欠損症Ｂ型、脳内鉄沈着を伴う神経変性（ＮＢＩＡ）１／ＨＡＲＰ症候群、ＮＢＩＡ  ２Ｂ／乳児神経軸索ジストロフィー１／パーキンソン病１４、常染色体劣性、ＮＢＩＡ３、ＮＢＩＡ４、ＮＢＩＡ６、Ｋｕｆｏｒ−Ｒａｋｅｂ症候群、痙性パラプレジア３５、ウッドハウス−サカティ症候群、フコシドーシス、痙性パラプレジア３０／神経障害、遺伝性感覚型ＩＩｅ／精神遅滞、常染色体優性９、チロシン血症（ＴＹＲＳＮ）、１型、ＴＹＲＳＮ２型、ＴＹＲＳＮ３型、ホモシステイン血症、亜硫酸オキシダーゼ欠損症、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）、Ｉａ型、ＭＳＵＤＩｂ型、−ＭＳＵＤ、ＩＩ型、グルタリン酸尿症、Ｉ型、メチルマロン酸尿症、ｍｕｔ（Ｏ）型、ホロカルボキシラーゼシンテターゼ欠損症、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症、ペルオキシソーム形成異常症１Ａ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症３Ａ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症４Ａ／４Ｂ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症５Ａ／５Ｂ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症６Ａ／６Ｂ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症７Ａ／７Ｂ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症８Ａ／８Ｂ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症１０Ａ（ツェルヴェーガー症候群）��ペルオキシソーム形成異常症１１Ａ／１１Ｂ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症１２Ａ（ツェルヴェーガー症候群）、ペルオキシソーム形成異常症１３Ａ（ツェルヴェーガー症候群）、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、ペロー症候群（ＰＲＬＴ）１、ＰＲＬＴＳ１、ＰＲＬＴＳ２、ＰＲＬＴＳ３、ＰＲＬＴＳ４、およびＰＲＬＴＳ５。
【００３９】
本発明およびその種々の態様、実施形態、代替案、および変形例は、以降、記載の非限定的な例を用いてさらに例示されるが、当然のことながら、本発明の範囲および要旨から逸脱することなく大きく修正し得る。
【００４０】
実験セクションおよび実施例
ベクターコンストラクト設計およびクローニング
単なる例示の目的のための非限定的な例として、ＥＶベースのベクターを使用したｍＲＮＡ形式の導入遺伝子の取り込みおよび送達のために、種々のＮＡ結合ドメインおよびその変異体（例えば、ＰＵＦ、ＰＵＦｅｎｇ（ＰＵＦタンパク質の操作されたバージョン）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３など）を、いくつかのエキソソームポリペプチド（ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、シンテニン、シンデカン、Ａｌｉｘ、ＣＤ１３３など）と組合せて使用した。ＯＲＦは、一般に合成によって生成し、哺乳動物発現ベクターｐＳＦ−ＣＡＧ−Ａｍｐにクローニングした。手短に、合成されたＤＮＡおよびベクタープラスミドを、メーカーの説明書（ＮＥＢ）に基づいて酵素ＮｏｔＩおよびＳＡｌＩで切断した。制限、精製ＤＮＡ断片を、メーカーの説明書（ＮＥＢ）に基づいてＴ４リガーゼを用いて一緒にライゲートした。成功したライゲーションイベントを、アンピシリン補充プレート上で細菌形質転換によって選択した。トランスフェクション用プラスミドは、メーカーの説明書に基づいて「ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ」によって生成した。
【００４１】
ウイルスベクターは、一般にウイルスベクターの商業メーカー、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、またはＶｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。手短に、ＡＡＶベクターについて以下に説明するように、目的の遺伝子（例えば、ナノルシフェラーゼもしくはＧＦＰなどのレポーター、またはＮＰＣ１もしくはＧＢＡなどの治療用ＰＯＩをコードするＧＯＩ）をｐＡＡＶシスプラスミドにクローニングした。続いて、ｐＡＡＶシスプラスミドおよびヘルパープラスミド（ＡｄヘルパーベクターおよびＡＡＶ  ｒｅｐ／ｃａｐベクター）を、メガまたはマキシ調製アプローチを使用して大規模に調製し、続いて２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの好適なウイルス産生細胞へのトランスフェクションを行った。目的のＡＡＶ血清型としては、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および合成ＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ−ＤＪまたはＡＡＶ６．２などが挙げられる。ＡＡＶを超える目的の他のウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルス、ならびに種々の他のウイルスベクターが挙げられる。
【００４２】
細胞培養およびトランスフェクション
実験デザインおよびアッセイに応じて、細胞培養は、ＥＶベースのベクターまたはウイルスベクターを安定して発現するように細胞の形質導入を含み、他の場合では、一過性トランスフェクションおよびＥＶ産生が十分であった。ウイルスベクターおよびＥＶベースのベクター用のプロデューサー細胞は、主に、浮遊培養または接着培養中で、ビーズもしくは他の可動性要素上で、または任意の他の種類の培養システムおよび任意の種類の容器中で成長した。本発明による産生細胞は、広範囲の細胞、組織、および／または細胞株、例えば、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）（例えば、骨髄、脂肪組織、ワルトン膠様質、周産期組織、胎盤、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから得られる）、線維芽細胞、羊膜細胞、より具体的には種々の初期マーカーを任意選択的に発現する羊膜上皮細胞、骨髄性抑制細胞、Ｍ２偏光マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、浮遊培養および／または無血清培養に適合したＨＥＫ細胞、微小血管またはリンパ管内皮細胞などの内皮細胞株、赤血球、赤血球前駆細胞、軟骨細胞、羊膜穿刺を介してまたは胎盤から得られる任意の細胞、気道または肺胞から得られる上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞などから選択され得る。簡潔にするために少数の例についてのみ本明細書で言及する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、一般にＡＴＣＣに推奨されるように、１５ｃｍシャーレに播種し（シャーレ当たり９×１０６細胞）、血清含有ＤＭＥＭ中に一晩放置した。翌日、細胞を、細胞に直接添加したリポプレックス化ＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。手短に、ＤＮＡおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を別々にＯｐｔｉＭＥＭ中で５分間インキュベートし、その後に、２０分間、室温で、一緒に混合した。リポプレックス化ＤＮＡと細胞を、６時間共インキュベートし、続いて、条件培地をＯｐｔｉＭＥＭに４８時間交換した。シャーレ、フラスコ、および他の細胞培養容器中で評価した他の細胞および細胞株には、骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）およびワルトン膠様質由来ＭＳＣ（ＷＪ−ＭＳＣ）、羊膜細胞、羊膜上皮細胞、線維芽細胞、種々の内皮細胞および上皮細胞、ならびに種々の免疫細胞および細胞株が挙げられる。
【００４３】
ＥＶベースのベクター産生システムを作製するためのウイルス形質導入および安定細胞株の作製の場合、ＢＭ−ＭＳＣ、ＷＪ−ＭＳＣ、線維芽細胞、羊膜上皮細胞、線維芽細胞、種々の内皮および上皮細胞などの細胞源は、一般にレンチウイルス（ＬＶ）形質導入を用いてウイルス形質導入された。一般に、感染の２４時間前に、１００，０００細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣなど）、または２００，０００細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）が６ウェルプレートに播種される。２ｕＬのＬＶと任意選択でポリブレン（または臭化ヘキサジメトリン、８ｕｇ／ｍＬのウェルでの最終濃度）を添加し、形質導入後２４時間で、形質導入細胞の細胞培地を新鮮な完全培地に変える。形質導入後７２時間で、ピューロマイシン選択（４〜６μｇ／ｍＬ）を、通常は７日間行い、続いて融合ポリペプチドの安定発現の解析を行う。また、エレクトロポレーション、リポフェクション、ＰＥＩなどのポリカチオン剤によるトランスフェクションなどを含む非ウイルス性トランスフェクション法を用いて安定した細胞を作製した。安定してトランスフェクトした細胞を、一般に懸濁バイオリアクター中、または接着細胞バイオリアクター中のいずれかで２次元培養し、続いてＥＶベースのベクター調製のために、条件培地を収集した。種々の調製および精製ステップを上述のように行った。その標準的なワークフローは、上清の事前清浄化、濾過ベースの濃縮、クロマトグラフィーベースの混入物の除去、任意選択で、インビトロアッセイおよび／またはインビボアッセイのための好適な緩衝液中で結果として得られたエキソソーム組成物の配合のステップを含んだ。
【００４４】
アッセイおよび解析
ウエスタンブロット、ｑＰＣＲ、およびＲＮＡ配列は、ＥＶ中の導入遺伝子の濃縮を評価する強力かつ簡便な解析方法である。手短に、ウエスタンブロットのためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを、メーカーの説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏｖｅｘ  ＰＡＧＥ  ４〜１２％ゲル）に従って行い、それによって１×１０１０のＥＶおよび２０ｕｇの細胞可溶化物をウェルごとに取り込んだ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのタンパク質をメーカーの説明書（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ＰＶＤＦ膜に移した。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液（Ｌｉｃｏｒ）中で遮断し、サプライヤーの説明書（一次抗体−Ａｂｃａｍ、二次抗体−Ｌｉｃｏｒ）に従って、ＮＡ結合ドメインポリペプチド（例えば、ＰＵＦ）および／またはエキソソームタンパク質に対する抗体を用いてプローブした。分子プローブを６８０ｎｍおよび８００ｎｍの波長で可視化した。ｑＰＣＲを、ベクターまたは標的細胞から抽出したＲＮＡを使用して行った。ｍＲＮＡ用のｏｌｉｇｏｄＴプライマーを使用して逆転写を行った。次いで、実施例１のＮａｎｏＬｕｃ定量化については、Ｎａｎｏｌｕｃ  ｍＲＮＡの５’末端の領域に対応するアンプリコンを、ｑＰＣＲを用いて定量化し、絶対定量化を標準曲線に対して行った。
【００４５】
ＥＶサイズ決定のために、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を、解析ソフトウェアを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）装置、または任意選択で粒子計量装置で行った。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）での記録のために、１３または１５のカメラレベルを用い、すべての取得後の設定については自動機能を用いた。電子顕微鏡および蛍光顕微鏡をしばしば使用して、ＥＶまたはウイルスの形態およびサイズを確認し、評価した。
【００４６】
上述のように、種々の方法、一般に、ＴＦＦなどの濾過と、サイズ排除液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはビーズ溶出液体クロマトグラフィーなどの組合せを用いてＥＶを単離し、精製した。一般には、ＥＶ含有培地を収集し、３００ｇの低速度回転に５分間かけ、続いて、２０００ｇの回転に１０分間かけて、大きな粒子および細胞片を除去した。次いで、上清を０．２２μｍシリンジフィルターで濾過して、種々の精製ステップにかけた。大量は、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ５０Ｒタンジェンシャルフロー（ＴＦＦ）装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、１００ｋＤａカットオフフィルターで、またはＫＲ２ｉ  ＴＦＦシステム（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ）を用いて、１００または３００ｋＤａカットオフ中空糸フィルターで、透析濾過し、およそ２０ｍＬに濃縮した。予め濃縮した培地を、続いてAＫＴＡｐｒｉｍｅ（登録商標）ｐｌｕｓまたはAＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ２５（登録商標）クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続したビーズ溶出カラム（ＨｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）またはＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に取り込んだ。カラム平衡化のための流速設定、試料の取り込み、および適切なカラム洗浄の手順は、メーカーの説明書に従って選択した。試料をＵＶ吸収クロマトグラムに従って収集し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ分子量カットオフスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、１００μＬの最終量に濃縮し、さらなる下流分析用に−８０℃で保存した。タンパク質およびＲＮＡの溶出プロファイルを評価するために、培地を濃縮し、１００ｋＤａおよび３００ｋＤａの中空糸フィルターを用いるＫＲ２ｉ  ＴＦＦシステムを用いて透析濾過し、試料をＴｒｉｃｏｒｎ  １０／３００  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｓ４ＦＦ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【００４７】
実施例１：ＡＡＶおよびＭＳＣ  ＥＶを使用してのナノルシフェラーゼ導入遺伝子の繰り返し送達
標準プロトコルに従って、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞中でアデノウイルスナノルシフェラーゼ発現コンストラクトを使用することによって、ＡＡＶベクターを調製した。ヒト不死化ＭＳＣを、レンチウイルス遺伝子導入によって操作し、ＣＤ６３とＮＡ結合タンパク質Ｃａｓ１３またはＰＵＦとの間の融合コンストラクトを安定に発現させ、ＥＶへのナノルシフェラーゼｍＲＮＡの内因的パッケージングをもたらした。ＥＶを単離し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）およびビーズ溶出クロマトグラフィープロトコルで濃縮した。ＡＡＶベクターおよび単離したＥＶの両方をナノ粒子トラッキング解析にかけて、粒子濃度を決定した。次いで、１×１０１０のＡＡＶ粒子、または１×１０１０のＥＶ、もしくは１×１０１０のＡＡＶ粒子と１×１０１０のＥＶの両方を、新鮮な培養培地と共に、Ｈｕｈ７細胞を５０％の集密度で播種した６ウェルに添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で３６時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を溶解させ、基質を添加し、ルシフェラーゼシグナルをメーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ）の説明書に従って定量化した。結果を図２に示す。ＡＡＶまたはＭＳＣ−ＥＶのいずれか、もしくはその両方を使用したときに、Ｈｕｈ７細胞へのナノルシフェラーゼｍＲＮＡの送達および翻訳が成功し、同等であったことが示されている。対照値は、ＡＡＶ／ＥＶを添加してないＨｕｈ７細胞に対応する。１×１０１０のＡＡＶまたは１×１０１０のＭＳＣ−ＥＶを添加した場合、Ｈｕｈ７細胞における導入遺伝子の発現量は同等であった。ＡＡＶに加えてＥＶでの処置（ｎ＝３）は、ほぼ２倍の導入遺伝子発現、すなわちルシフェラーゼシグナルをもたらした。
【００４８】
実施例２：抗ｅＧＦＰ抗体産生は、ＡＡＶ遺伝子治療薬とＥＶ媒介遺伝子治療薬との間で異なる
この実施例は、導入遺伝子送達のためのウイルスベクター（この場合はＡＡＶ９）と、同じ導入遺伝子の送達のためのＥＶベースのベクターとの組合せを使用した組合せ遺伝子治療薬が、抗導入遺伝子抗体が第２の用量に対して産生されることなく、インビボでの繰り返し投与を可能にすることを検証するために始めた。ｅＧＦＰをコードするＡＡＶベクターと、ｅＧＦＰをコードする対応するｍＲＮＡを内因的に取り込んだＥＶベースのベクター（ｍＲＮＡ取り込みのためにＣＤ８１−Ｃａｓ６融合タンパク質を使用）とを上記と同じ原理で調製したが、ここでは両方のベクター型をＨＥＫ２９３Ｔ宿主細胞内で作製して、ＡＡＶ９媒介送達に続くＥＶ媒介導入遺伝子送達をＡＡＶベクターの再投与と比較した。ｅＧＦＰに対する抗導入遺伝子抗体産生の定量化のためのインビトロ抗体ＥＬＩＳＡアッセイを、（ｉ）ＡＡＶ９ｅＧＦＰベクター（１×１０１０のＡＡＶ９粒子）を１回投与した後（図３のＡＡＶ）、（ｉｉ）ＡＡＶ９ｅＧＦＰベクター（図３のＡＡＶ＋ＡＡＶ）を繰り返し投与し、（ｉｉｉ）ＡＡＶ９ｅＧＦＰと、ＨＥＫ−ＥＶ−ｅＧＦＰｍＲＮＡ（１×１０１０のＥＶ粒子）（ＡＡＶ＋ＥＶ）とを連続投与して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取した血液試料で行った。標準物質で連続希釈し、ＰＢＭＣによって放出された抗体濃度を測定することができる標準曲線を作成した。図３に示すように、ＡＡＶ９ｅＧＦＰベクターの繰り返し投与は、抗ｅＧＦＰ抗体産生においてかなりの誘発をもたらしたが、ＡＡＶ９ｅＧＦＰベクターと、ＨＥＫ−ＥＶ−ｅＧＦＰｍＲＮＡとを使用した組合せ治療薬は、ＡＡＶ９ｅＧＦＰ単独と比較して、実質的にさらなる抗導入遺伝子抗体産生を示さなかった。
【図１】
2021528407.tif 000003
【図２】
2021528407.tif 000004
【図３】
2021528407.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月23日(2020.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医藥に使用するための組合せ治療薬であって、（ｉ）目的のタンパク質をコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターと、（ｉｉ）ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ミニサークル、および／またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の形態の前記導入遺伝子を含む細胞外小胞（ＥＶ）ベースのベクターと、を含み、
前記導入遺伝子が、最初に前記ウイルスベクターを使用して投与され、続いて前記ＥＶベースのベクターを使用して投与される、組合せ治療薬。
【請求項２】
遺伝子疾患の治療に使用するための組合せ治療薬であって、（ｉ）目的のタンパク質をコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターと、（ｉｉ）ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ミニサークル、および／またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の形態の前記導入遺伝子を含む細胞外小胞（ＥＶ）ベースのベクターと、を含み、前記導入遺伝子は最初にウイルスベクターを使用して投与され、続いて前記ＥＶベースのベクターを使用して投与される、組合せ治療薬。
【請求項３】
前記遺伝子疾患が、リソソーム蓄積障害、遺伝性代謝異常、ミオパチー、ペルオキシソーム病、ミトコンドリア病、神経疾患および神経変性疾患、炎症性疾患、ならびに癌からなる群から選択される、請求項２に記載の使用のための組合せ治療薬。
【請求項４】
前記導入遺伝子が、前記ウイルスベクターを使用して第１の用量で、および前記ＥＶベースのベクターを使用して第２の（および任意選択で後続の）用量（複数可）で投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組合せ治療薬。
【請求項５】
前記導入遺伝子が、ペプチドおよび／またはポリペプチドをコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ治療薬。
【請求項６】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、コクサッキーウイルス、または任意の他の種類の天然もしくは組換えウイルスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組合せ治療薬。
【請求項７】
前記ＥＶベースのベクターが、エキソソーム、および／または微小胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組合せ治療薬。
【請求項８】
前記ＥＶベースのベクターが、前記導入遺伝子を含有するように外因的または内因的に修飾されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組合せ治療薬。
【請求項９】
前記ＥＶベースのベクターが、ＥＶタンパク質および核酸（ＮＡ）結合タンパク質を含む融合タンパク質を含むように修飾されており、前記ＮＡ結合タンパク質が、前記ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークル、および／またはｐＤＮＡ導入遺伝子と相互作用して、これらを前記ＥＶベースのベクターに取り込む、請求項８に記載の使用のための組合せ治療薬。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組合せ治療薬の製造方法であって、
（ａ）第１の宿主細胞を、前記導入遺伝子を含むウイルスベクターゲノムに感染させ、前記第１の宿主細胞によって産生される前記ウイルスベクターを収集するステップと、
（ｂ）第２の宿主細胞を遺伝子修飾して、ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークル、および／またはｐＤＮＡポリヌクレオチド中に前記導入遺伝子を含むＥＶベースのベクターを産生し、前記第２の宿主細胞によって産生される前記ＥＶベースのベクターを収集するステップと、を含み、
ステップ（ａ）および（ｂ）は、任意の順序で順次行われ得るか、または並行して行われ得る、方法。
【請求項１１】
前記第１の宿主細胞および前記第２の宿主細胞が、同じ細胞型のものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）における前記遺伝子修飾が、前記第２の宿主細胞において、ＥＶタンパク質およびＮＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質を発現することを含み、前記ＮＡ結合タンパク質が、前記ｍＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ミニサークルＤＮＡおよび／またはｐＤＮＡ導入遺伝子と相互作用して、これらを前記ＥＶベースのベクターに取り込む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターおよび前記ＥＶベースのベクターを１つ以上の医薬組成物に配合するステップをさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象において遺伝子疾患を治療する方法であって、（ｉ）目的のタンパク質をコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターと、（ｉｉ）ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ミニサークル、および／またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の形態の前記導入遺伝子を含む細胞外小胞（ＥＶ）ベースのベクターと、を含む組合せ治療薬を対象に投与することを含み、前記導入遺伝子が最初に前記ウイルスベクターを使用して投与され、続いて前記ＥＶベースのベクターを使用して投与される、方法。
【国際調査報告】
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