(57)【要約】  トリプシン消化およびデュアルカラムＬＣ−ＭＳシステムによりモノクローナル抗体の完全配列カバレッジを実現するための方法が提供される。本開示方法は、標準的なペプチドマッピングのための現行の技術を改善する。【選択図】図５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の配列を決定する方法であって、
前記タンパク質を消化し、ペプチド断片を生成する工程、
前記ペプチド断片を、第一の高速液体クロマトグラフィーカラム上に、前記ペプチド断片の一部が第一のカラム上に保持され、前記ペプチド断片の一部が第一のカラム上に保持されない条件下でローディングする工程であって、前記第一のカラム上に保持されない前記ペプチドは第二の高速液体クロマトグラフィーカラム内にそのまま流入し、そこで前記第一のカラム上で保持されない前記ペプチドの少なくとも一部が前記第二のカラム上に保持される、工程、
前記第一のカラム上に保持される前記ペプチドを溶出させ、ここで前記溶出されたペプチドは前記第二のカラムをバイパスし、かつ前記溶出されたペプチドを質量分析計により分析して前記ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程、および、
前記第二のカラムからペプチドを溶出させ、かつ前記溶出されたペプチドを質量分析計により分析して前記溶出されたペプチドのアミノ酸配列を決定する工程であって、前記第一および第二のカラムから溶出されたペプチドの統合配列が、前記タンパク質の完全アミノ酸配列を提供する、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のカラムは、非極性ペプチドを分離するための物質で充填され、前記第二のカラムは、極性ペプチドを分離するための物質で充填される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のカラムが、Ｃ１８カラムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第二のカラムが、多孔質のグラファイトカラムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、消化の前に還元およびアルキル化される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、トリプシンで消化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ１８カラムから溶出されたペプチドが、３００〜２０００ｍ／ｚのスキャン範囲で質量分析計により分析される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＧＣカラムから溶出されたペプチドが、２００〜２０００ｍ／ｚのスキャン範囲で質量分析計により分析される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
デュアルカラム液体クロマトグラフィーシステムであって、
第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結している第一のカラム、
前記第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結している第二のカラム、
前記第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結している第二のマルチポートスイッチ誘導弁、
前記第二のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結している質量分析計、
前記第二のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結している収集容器、ならびに
前記デュアルカラムクロマトグラフィーシステムと電子的に連結しており、第一および第二のマルチポートスイッチ誘導弁のポートを複合的な配置に構成することにより前記システムを通る液体の流れを制御するための、コンピューター
を備える、デュアルカラム液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１２】
前記第二のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結している質量分析計をさらに備える、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記マルチポートスイッチ誘導弁が、１〜６個のポートを含む、請求項１１または１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第一のカラムおよび第二のカラムが、異なる充填材を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第一のカラムは、非極性ペプチドを分離するための物質で充填され、前記第二のカラムは、極性ペプチドを分離するための物質で充填される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一のカラムが、Ｃ１８カラムである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記第二のカラムが、多孔質のグラファイトカラムである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記マルチポートスイッチ誘導弁は、第一のカラムからの液体が第二のカラムを通って流れるように構成される、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記マルチポートスイッチ誘導弁は、前記第一のカラムからの液体が前記第二のカラムをバイパスして質量分析計へと流れるように構成される、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して、タンパク質配列解析の改善のためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
トリプシン消化後の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析による治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の一次配列の確認は、バイオテクノロジー業界で日常的に実施されている必須のアッセイである。治療用モノクローナル抗体のペプチドマッピング解析には完全配列カバレッジが非常に望ましいが、トリプシン消化単独では常に実現可能というわけではない。普遍的に使用されるＣ１８カラムにほとんど保持されない、または全く保持されない小さな、および／または疎水性のペプチドは多くの場合、ＭＳで検出されず、カバレッジマップ中にギャップを生じさせてしまう。失われた配列が重要な相補性決定領域に属していた場合、特に問題である。１００％のカバレッジを実現するために、しばしば二次的な酵素消化が必要とされている。あるいは質量分析と連結された新技術のキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＥ−ＭＳ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃ）法は１００％のカバレッジを実現できるが、そうしたプラットフォームの利用可能性はいまだ限定的である。
【０００３】
ゆえに本発明の目的は、タンパク質の完全アミノ酸配列を取得するためのシステムおよび方法を提供することである。
【発明の概要】
【０００４】
デュアルカラム液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）システム、およびその使用方法が提供される。１つの実施形態では、第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した第一のカラム；第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した第二のカラム；第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した第二のマルチポートスイッチ誘導弁；第二のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した質量分析計；第二のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した収集容器；およびデュアルカラムクロマトグラフィーシステムと電子的に連結しており、第一および第二のマルチポートスイッチ誘導弁のポートを複合的な配置に構成することによりシステムを通る液体の流れを制御するコンピューター、を含むデュアルカラム液体クロマトグラフィーシステムが提供される。システムは任意で、検出器、例えばＵＶ検出器、および／または質量分析計、ならびに収集容器を含んでもよい。多くの場合、第一のカラムは、非極性および疎水性のペプチドを分離するための物質で充填され、第二のカラムは、極性ペプチドを分離するための物質で充填される。例えば第一のカラムは、Ｃ１８カラムであってもよく、第二のカラムは、多孔質のグラファイトカラムであってもよい。
【０００５】
別の実施形態では、マルチポートスイッチ誘導弁は、第一のカラムからの液体が第二のカラムを通って流れるように構成される。さらに別の実施形態では、マルチポートスイッチ誘導弁は、第一のカラムからの液体が第二のカラムをバイパスして、質量分析計へと流れるように構成される。
【０００６】
別の実施形態では、タンパク質を消化して、タンパク質のペプチド断片を生成し、ペプチド断片の一部が第一のカラム上に保持され、ペプチド断片の一部は第一のカラム上に保持されない条件下で、ペプチド断片を第一の高速液体クロマトグラフィーカラム上にロードすることにより、タンパク質の配列を決定する方法が提供される。第一のカラム上に保持されないペプチドは、第二の高速液体クロマトグラフィーカラム内にそのまま流入し、そこで第一のカラム上に保持されなかったペプチドの少なくとも一部が、第二のカラム上に保持される。方法には、溶出されたペプチドが第二のカラムをバイパスするように、第一のカラム上に保持されたペプチドを溶出することが含まれる。溶出されたペプチドは、質量分析計により分析され、ペプチドのアミノ酸配列が決定される。第二のカラムからもペプチドが溶出されて、質量分析計により分析され、溶出されたペプチドのアミノ酸配列が決定される。第一および第二のカラムから溶出されたペプチドの統合配列が、タンパク質の完全アミノ酸配列を提供する。１つの実施形態では、配列解析されるタンパク質は、例えばモノクローナル抗体などの抗体、または融合タンパク質である。
【０００７】
別の実施形態では、第一のカラムは、非極性ペプチドを分離するための物質で充填され、第二のカラムは、極性ペプチドを分離するための物質で充填される。例えば第一のカラムは、Ｃ１８カラムであってもよく、第二のカラムは、多孔質のグラファイトカラムであってもよい。特定の実施形態では、タンパク質は、還元およびアルキル化され、その後に消化される。多くの場合、タンパク質は例えばトリプシンを使用して酵素的に消化される。
【０００８】
１つの実施形態では、Ｃ１８カラムから溶出されたペプチドは、３００〜２０００ｍ／ｚのスキャン範囲で質量分析計により分析され、ＰＧＣカラムから溶出されたペプチドは、２００〜２０００ｍ／ｚのスキャン範囲で質量分析計により分析される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、デュアルカラムＬＣ−ＭＳシステム例の略図である。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、デュアル誘導弁の構成の概略図である。線は、誘導弁が、「ローディング」、「Ｃ１８溶出」または「ＰＧＣ溶出」のいずれかモードで構成されたときの溶媒流路を示す。「１−ｘ／１−ｘ」の配置は、それぞれ誘導弁１および２のポート配置を指す。
【図３】図３は、デュアルカラムＰＧＣ−Ｃ１８構成のデータ取得に関する、質量分析法の設定例を示すユーザーインターフェースの画像である。
【図４】図４は、Ｃ１８−ＰＧＣ溶出勾配の代表例を示す表である。
【図５Ａ】図５Ａは、第二のマルチポートスイッチ変換弁の上にある第一のマルチポートスイッチ誘導弁の写真である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、第二のマルチポートスイッチ変換弁の上にある第一のマルチポートスイッチ誘導弁の写真である。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｃ１８溶出のパラメーターを示すユーザーインターフェースのスクリーンショットである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＧＣ溶出のパラメーターを示すユーザーインターフェースのスクリーンショットである。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、Ｃ１８−ＰＧＣペプチドマッピング分析の総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ：ｔｏｔａｌ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）の例である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書において使用される場合、「ペプチドマッピング」とは、タンパク質を特徴解析し、その一次アミノ酸構造を明らかにする技術を指す。モノクローナル抗体および他の組み換えタンパク質薬剤の特徴解析に広く利用されている技術である。
【００１１】
本明細書において使用される場合、「トリプシンペプチド」とは、セリンプロテアーゼのトリプシンを使用して、大きなタンパク質から小さなペプチドへと消化することで生成されるペプチドを指す。トリプシンは、タンパク質を、アルギニンアミノ酸残基およびリシンアミノ酸残基のカルボキシ末端側でペプチド結合を加水分解することにより、７００〜１５００ダルトンの平均サイズを有するペプチドに切断する。
【００１２】
本明細書において使用される場合、「多孔質グラファイトカーボン（ＰＧＣ：ｐｏｒｏｕｓ  ｇｒａｐｈｉｔｉｃ  ｃａｒｂｏｎ）カラム」とは、多孔質のグラファイトカーボンから構成されるクロマトグラフィーカラムを指す。液体クロマトグラフィーの優れた固定相であり、非常に極性の化合物を独自に保持および分離することができる。
【００１３】
本明細書において使用される場合、「Ｃ１８カラム」とは、液体クロマトグラフィーにおいて普遍的に使用される逆相クロマトグラフィーカラムを指す。Ｃ１８カラムは炭素鎖からなり、カラム内でシリカ粒子に結合される。これらのカラムは、シリカの炭素鎖に結合する疎水性および非極性の分子を分離するために普遍的に使用されている。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「液体クロマトグラフィー（ＬＣ：ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」とは、混合物中の化合物を分離、特定および定量するために使用される技術を指す。カラム液体クロマトグラフィーにおいて、液体の移動相がカラムを通過し、移動相の成分が固形の固定相と相互作用する。移動相の組成を分離中に変化させて、対象化合物の相互作用の強さを変えることができる。移動相が継続的にカラムを通って流れるとき、多くの場合、溶出液が分画中に集められながら、カラムから溶出される化合物の濃度が経時的にモニタリングされ、溶出曲線またはクロマトグラムが作成される。
【００１５】
液体クロマトグラフィーは通常、質量分析計と連結されて、アミノ酸のトリプトファンによる２８０ｎｍの光吸収を測定することにより、カラムからのタンパク質溶出を連続的に測定する。クロマトグラム上の別個のピークはそれぞれ、カラムにより分解された固有成分を表しており、ピーク下面積は、カラムから溶出された化合物の量に相当する。シングルピークは複数のタンパク質を含有する場合があり、そのため多くの場合、溶出された分画のさらなる解析が必要となる。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「固定相」とは、カラム中に固定されて留まる物質を指す。最も普遍的に使用されている固定相カラムは、炭素鎖−結合シリカ、フェニル−結合シリカ、およびシアノ−結合シリカである。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「移動相」および「液相」は相互交換可能に使用され、カラムから化合物を溶出するために使用される、水または水性緩衝液と有機溶媒の混合物を指す。最も普遍的な移動相の溶媒としては、限定されないが、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフラン、エタノール、またはイソプロピルアルコールが挙げられる。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「溶出」、「溶出すること」および「溶出された」とは、溶媒で洗浄することにより、１つの物質を別の物質から抽出するプロセスを指す。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ：ｔｏｔａｌ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）」は、同じスキャンに属するすべての質量スペクトルピークの強度を合算することで生成されるタイプのクロマトグラムである。ＴＩＣには、バックグラウンドノイズならびにサンプル成分が含まれる。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸の略語であり、逆相液体クロマトグラフィーのペプチド分離に普遍的に使用される調節剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）である。調節剤は、移動相に添加される物質であり、固定相とサンプルの両方と相互作用し、保持を変化させる。
【００２１】
「ＬＣ−ＭＳ」という用語は、液体クロマトグラフィー（またはＨＰＬＣ）の物理的な分離能力と、質量分析計（ＭＳ）の質量分析能力を組み合わせた分析化学技術を指す。
【００２２】
ＩＩ．デュアルカラムＬＣ−ＭＳシステム
標準的なペプチドマッピング構成において、ペプチドは、ＬＣシステムにインストールされたＣ１８カラム上に保持され、１つの６−ポートスイッチ誘導弁を使用して質量分析計へと溶出される。この弁は、質量分析計または廃液容器へのＬＣ流の誘導を切り替える。
【００２３】
１つの実施形態では、第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した第一のカラム；第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した第二のカラム；第一のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した第二のマルチポートスイッチ誘導弁；第二のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した質量分析計；第二のマルチポートスイッチ誘導弁と流体連結した収集容器；およびデュアルカラムクロマトグラフィーシステムと電子的に連結して、第一および第二のマルチポートスイッチ誘導弁のポートを複合的な配置に構成することにより、システムを通る液体の流れを制御するコンピューター、を含むデュアルカラム液体クロマトグラフィーシステムが提供される。
【００２４】
システムは任意で、検出器、例えばＵＶ検出器、および／または質量分析計、ならびに収集容器を含んでもよい。多くの場合、第一のカラムは、非極性ペプチドを分離するための物質で充填され、第二のカラムは、極性ペプチドを分離するための物質で充填される。例えば第一のカラムは、Ｃ１８カラムであってもよく、第二のカラムは、多孔質のグラファイトカラムであってもよい。
【００２５】
別の実施形態では、マルチポートスイッチ誘導弁は、第一のカラムからの液体が第二のカラムを通って流れるように構成される。さらに別の実施形態では、マルチポートスイッチ誘導弁は、第一のカラムからの液体が第二のカラムをバイパスして、質量分析計へと流れるように構成される。
【００２６】
図１は、例示的なシステム１００の略図である。システム１００は、カラム１０１を含む。カラム１０１は、典型的には、非極性および／または疎水性ペプチドを分離するための物質で充填されたＨＰＬＣカラムである。カラム１０１は、マルチポートスイッチ誘導弁１０３と流体連結している。システム１００はさらに、マルチポートスイッチ誘導弁１０３と流体連結している第二のカラム１０２も含む。マルチポート１０３は、第二のマルチポートスイッチ誘導弁１０４と流体連結している。マルチポートスイッチ誘導弁１０４は、質量分析計１０６および収集容器１０５と流体連結している。
【００２７】
Ａ．デュアル誘導弁
２つのスイッチ誘導弁の代表的な構成を、図２Ａ〜２Ｃに示す。図５Ａおよび５Ｂは、例示的なデュアル誘導弁の写真である。誘導弁の第一の配置は、「１−６」と呼称され、溶媒の流れは、ポート１を通して入り、ポート６を通して出る。誘導弁の第二の配置は、「１−２」であり、溶媒の流れは、ポート１を通して入り、ポート２を通して出る。「１−ｘ／１−ｘ」の配置は、それぞれ誘導弁１および２のポート配置を指す。ゆえに、例えば「１−６／１−６」は、ＬＣからの溶媒が、誘導弁１のポート１に入り、ポート６から出て、次いで誘導弁２のポート１に入り、ポート６から出ることを示す。第一の誘導弁は、「１−６」配置では、流れがＬＣからＰＧＣカラムを通り、そして第二の誘導弁の流入口へと誘導するように配管される。図２Ａに示されるように、ＰＧＣカラムへの接続は、誘導弁１のポート６と３に配置される。より具体的には、ＬＣからの流出線は、誘導弁１のポート１に接続され、ＰＧＣカラムは、ポート３と６で接続されて、ポート６からポート３、そして誘導弁１のポート２からの流出線への方向で流れ、流出線は誘導弁２のポート１に接続される。第二の誘導弁は、「１−６」配置では、誘導弁１の流出口から質量分析計内へと流れを誘導するように配管され、一方で「１−２」配置は、流れは廃液入れへと再誘導される。より具体的には、誘導弁１の流出線は、ポート１に接続され、誘導弁２の流出線は、ポート２と質量分析計を接続し、流出線は、ポート６と廃液入れを接続する。ペプチドは、「１−６／１−６」配置において、Ｃ１８カラムとＰＧＣカラムの両方にロードされ得る。
【００２８】
Ｃ１８カラムからのトリプシンペプチドの溶出は、図２Ｂに記載されるように、「１−２／１−２」配置で生じる。ＰＧＣカラムからのペプチド溶出は、図２Ｃに記載されるように、「１−６／１−２」配置で生じる。
【００２９】
１つの実施形態では、デュアルカラムＬＣ−ＭＳシステムを通過する流速は、０．２５ｍＬ／分であってもよい。当業者であれば、典型的なＬＣ−ＭＳで使用される他の流速を、本開示システムで使用し得ることを認識するであろう。
【００３０】
１つの実施形態では、移動相は、ローディングに対しては０．０５％ＴＦＡの水溶液、溶出相に対しては０．０４５％ＴＦＡのアセトニトリル溶液である。代表的な溶出勾配を、図４に示す。
【００３１】
１つの実施形態では、０．１％ギ酸（ＦＡ）をローディングに使用し、溶出には０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液が使用された。
【００３２】
誘導弁配置の切り替えは、図３に示される質量分析計の設定において制御することができる。切り替えのタイミングは、Ｃ１８−ＰＧＣ  ＬＣ勾配と相関し、その例を図３に示す。
【００３３】
Ｂ．ペプチド溶出
１つの実施形態では、タンパク質は、本明細書に開示されるデュアルカラムＬＣ−ＭＳシステムを使用して配列解析される。タンパク質は通常、ＴＣＥＰおよびヨードアセトアミドを使用して還元およびアルキル化され、その後、トリプシンで消化されて、トリプシンペプチドを生成する。Ｃ１８カラムおよびＰＧＣカラムからのトリプシンペプチドのローディングと溶出は、連続的に行うことができる。例えばトリプシン消化物をＬＣ−ＭＳに注入し、次いで誘導弁を「１−６／１−６」配置にしてＣ１８カラムとＰＧＣカラムの両方にロードする。トリプシンペプチドは最初にＣ１８カラムに保持される。Ｃ１８カラムに保持されない親水性ペプチドはその後、下流のＰＧＣカラムに溶出され、ＰＧＣカラム上に保持される。図６Ａおよび６Ｂは、例示的な溶出パラメーターを示す。ローディング工程の後、ペプチド溶出は最初にＣ１８カラムで生じ、「１−２／１−２」配置を使用して、ＰＧＣカラムをバイパスするように誘導弁は設定される。Ｃ１８カラムでの溶出が完了した後、勾配は、初期条件に平衡化される。ＰＧＣカラムの溶出は、「１−６／１−２」配置の誘導弁を用いて、ＰＧＣカラムを流れが通過するように誘導することで生じる。Ｃ１８カラム上で保持された大きなトリプシンペプチドでＰＧＣカラムが目詰まりすることを避けるために、またはＰＧＣカラム上で保持された小さな親水性ペプチドのシグナルが覆い隠されるのを避けるために、下流のＰＧＣカラムをバイパスしながらＣ１８溶出を行わなければならない。
【００３４】
Ｃ．質量分析
Ｃ１８カラムおよびＰＧＣカラムの両方からのペプチド溶出液は、質量分析計へと流れて、ＭＳ分析が行われる。１つの実施形態では、Ｃ１８溶出液のスキャン範囲は、３００〜２０００ｍ／ｚに設定され、通常のＴＩＣ基準が維持される。１つの実施形態では、ＰＧＣ溶出液のスキャン範囲は、２００〜２０００ｍ／ｚに設定され、小さなペプチドが検出される。本開示方法は、検証された全分子に対し、１００％の配列カバレッジを提供することが示された。
【００３５】
デュアルカラムＬＣ−ＭＳシステムは、現行のＣ１８ペプチドマッピング設定に対する若干の変更で実装されながら、より高い配列カバレッジと有益な情報をもたらすことができる。ゆえに、デュアルカラムＬＣ−ＭＳシステムは、１つのＬＣ−ＭＳ分析でｍＡｂの完全な配列カバレッジを実現するシンプルな解決法を提供するものである。
【実施例】
【００３６】
実施例１：配列カバレッジの分析
方法：
モノクローナル抗体サンプルは、最初にＴＣＥＰおよびヨードアセトアミドを使用して還元およびアルキル化され、その後にトリプシン消化された。次いで消化混合物を、Ｃ１８カラムとＰＧＣカラムからなるデュアルカラムＬＣ−ＭＳシステム上に注入した。ローディング工程中、トリプシンペプチドは最初にＣ１８カラム上に保持された。このカラム上に保持されなかった親水性ペプチドは溶出され、下流のＰＧＣカラム上に保持された。最初にＣ１８カラム上で溶出が行われながら、誘導弁により、流れはＰＧＣカラムをバイパスした。Ｃ１８カラムでの溶出が完了した後、勾配を初期条件に平衡化し、ＰＧＣカラム上のペプチドの溶出は、ＰＧＣカラムを流れが通過するように誘導することで開始された。
【００３７】
結果：
ＰＧＣカラム上で保持され、Ｃ１８カラム上では保持されなかった共通ペプチドは、Ｃ末端ＬｙｓまたはＡｒｇを含有するジペプチドであったことが観察された。ＨＣＤ断片化の間に正確なＭＳ１の質量と特徴的なインモニウムイオン（ｉｍｍｏｎｉｕｍ  ｉｏｎｓ）を使用することで、これら短いペプチドの同一性を明確に確認することができる。ＮＩＳＴ  ｍＡｂ参照標準と、複数の自作のｍＡｂ分子を使用することで、本開示方法が、検証されたすべての分子に対し、１００％の配列カバレッジを提供し得たことが実証された。図７は、配列解析されたタンパク質例の総イオンクロマトグラムを示す。
【図１】
2021513060.tif 000003
【図２】
2021513060.tif 000004
【図３】
2021513060.tif 000005
【図４】
2021513060.tif 000006
【図５Ａ】
2021513060.tif 000007
【図５Ｂ】
2021513060.tif 000008
【図６Ａ】
2021513060.tif 000009
【図６Ｂ】
2021513060.tif 000010
【図７】
2021513060.tif 000011
【国際調査報告】
2021513060.tif 000012
2021513060.tif 000013
2021513060.tif 000014