(57)【要約】  本願は、対象から得られた血漿サンプルにおける止血障害のインビトロ診断方法であって、ａ）前記対象から得られた血漿サンプルを活性炭と接触させるステップ；ｂ）前記活性炭から前記血漿サンプルを回収するステップ；及びｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップ、を含み、前記血漿の血液凝固能は前記対象における止血障害の存在、進行、または重症度、および必要に応じて止血障害の素因を示す、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得られた血漿サンプルにおける止血障害のインビトロ診断方法であって、前記方法は：
ａ）前記対象から得られた血漿サンプルを活性炭と接触させるステップ；
ｂ）前記活性炭から前記血漿サンプルを回収するステップ；
ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップ；及び
ｄ）前記血漿の前記血液凝固能に基づいて、前記対象における止血障害の存在、進行、または重症度、および必要に応じて前記止血障害の素因を決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記活性炭から前記血漿サンプルを回収する前記ステップは、前記血漿サンプルを０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性炭から前記血漿を回収する前記ステップは、遠心分離ステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性炭は、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記血漿サンプルを、少なくとも２分間、好ましくは少なくとも５分間活性炭と接触させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、ステップ（ｃ）前に、前記血漿サンプルから血小板、血小板フラグメントおよび残りの血液細胞の１つ以上を取り除く追加ステップを含まない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定する前記ステップを、前記血漿サンプルを血液凝固活性化因子と接触させることによって行う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記血液凝固活性化因子は、ヒトカルシウムトロンビン、ウサギまたは組換えヒト組織因子、合成リン脂質、ラッセルヘビ毒、エカリン、テキスタリンまたはシリカ、コロイドシリカ活性化剤、トロンボモジュリン、活性化プロテインＣ、凍結乾燥ウシトロンビンおよびトロンビンの発色基質ＣＢＳ６１．５０、ヘビ毒由来第Ｖ因子活性化剤ならびにヘビ毒から単離された第Ｖａ因子依存性プロトロンビン活性化因子から成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定する前記ステップは、ステップ（ｃ）前に、前記血漿サンプルを免疫枯渇血清または血漿と接触させることを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫枯渇血清または血漿は、第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸ因子もしくは第Ｘ因子もしくは第ＸＩ因子もしくは第ＸＩＩ因子もしくは第ＸＩＩＩ因子もしくは第ＶＩＩ因子もしくは第Ｖ因子もしくは第ＩＩ因子欠乏血清または血漿から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定する前記ステップを、
プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、ループス抗凝固試験、フィブリノーゲンアッセイ（クラウスおよびＰＴ誘導フィブリノーゲン法の両方）、トロンビン時間、血液凝固因子活性アッセイ（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ；ＶＩＩ、Ｖ、ＩＩ、Ｘ）、活性化プロテインＣ抵抗性（ＡＰＣＲ）アッセイ、プロテインＣ活性アッセイ、プロテインＳ活性アッセイ、アンチトロンビン活性アッセイならびにトロンビン生成アッセイを含むリストから選択される凝固試験によって行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定する前記ステップを、フィブリノーゲン欠乏症、プロトロンビン欠乏症、第Ｖ因子欠乏症、第Ｖ因子ライデン、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、抗プラスミン欠乏症、アンチトロンビン欠乏症、プラスミノーゲン欠乏症、Ｄダイマー上昇、抗リン脂質症候群、ヘパリン起因性血小板減少症、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子合併欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症（血友病Ａ）、第ＩＸ因子欠乏症（血友病Ｂ）、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、グランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群または白血球粘着不全症を決定するための血液凝固をベースとする方法を使用して決定し、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記方法は、前記止血障害の素因の表示を更に提供する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定する前記ステップを、ループス抗凝固試験によって行う、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ループス抗凝固試験は、希釈ラッセルヘビ毒時間（ｄＲＶＶＴ）およびＬＡ−応答性ＡＰＴＴを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象は、直接抗凝固薬、好ましくは直接経口抗凝固薬（ＤＯＡＣ）で治療された患者である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象は、病歴が不明および／または確認することができない対象である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
止血障害のインビトロ診断用診断キットであって、前記キットは、
−  活性炭；
−  フィルターを含むバイアルであって、前記バイアルは１００μｌ〜１００００μｌの容積を有する、バイアル；及び
−  必要に応じて、止血障害のインビトロ診断に必要な１つ以上の化合物、
を含み、
必要に応じて、前記フィルターは０．２２〜０．６５μｍ、より特に０．４０〜０．６５μｍの細孔径を有する、
キット。
【請求項１８】
止血障害のインビトロ診断用サンプルの調製方法であって、前記方法は：
ａ）バイアル中において、１００μｌ〜１００００μｌの体積の前記血漿サンプルを活性炭と接触させるステップ；及び
ｂ）前記血漿サンプルを０．４０〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることによって、前記活性炭から前記血漿サンプルを回収するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、止血障害の診断方法の分野にある。より詳細には、本発明は、例えば、抗凝固薬で治療される患者の止血障害を診断するための方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
全体的に、原因不明の静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）患者は、抗凝固療法を一度中止すると再発リスクが高くなる。実際に、再発性ＶＴＥに対する累積リスクは、１年で約１０％、５年で３０％、１０年で５０％である。ルーチンかつ特異的血液凝固試験は、止血障害を検出する有用なスクリーニング試験である。いくつかの遺伝性条件（例えば、活性化プロテインＣ抵抗性、プロテインＣおよびＳ欠乏、抗トロンビン欠乏および第ＶＩＩＩ因子上昇）は、再発性血栓塞栓症のリスクを増大する。リスクの程度は前の状態に依存し、したがって、血栓形成リスク因子についての試験は、一般的な集団スクリーニングとして行うべきではなく、むしろ血栓塞栓症イベントを有する、または家族歴のある選択された患者において行うべきである。これらの患者は該患者らの血栓塞栓症に対して治療されることが多く、したがって、結果の判断は抗凝固薬物療法の効果によって複雑化される。さらに、抗血栓療法を受ける患者は、ビタミンＫ欠乏症、肝疾患、または後天性血友病Ａの開始後発症した止血障害を診断する凝固試験を必要とする場合がある。静脈血栓塞栓症に関する英国国立医療技術評価機構（ＮＩＣＥ）ガイドラインは、これらの試験の臨床的関連を認めているにもかかわらず、信頼できる診断を可能とする検査フェーズ中に患者が無保護／未治療でなければならないことを暗示しているので、これらの使用は安定した最適なものではない。
【０００３】
２００８年から、新規分類の抗凝固薬が抗凝固の市場に届いた：直接経口抗凝固薬（ＤＯＡＣ）。これらの化合物としては、１つのトロンビン阻害薬（ダビガトランエテキシラート−Ｐｒａｄａｘａ（登録商標））および３つの第Ｘａ因子阻害薬（リバーロキサバン−Ｘａｒｅｌｔｏ（登録商標）；アピキサバン−Ｅｌｉｑｕｉｓ（登録商標）；およびエドキサバン−Ｌｉｘｉａｎａ（登録商標））が挙げられ、以前から使用されているビタミンＫ拮抗薬および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）と対照的に抗凝固のルーチンモニタリングを必要としない。しかしながら、証拠は、いくつかの状態においてポイント測定は有用であり得、特異的試験を使用すべきであることを示唆している。他方では、凝固の１つの因子を直接標的とする薬物の導入は、当該血液凝固因子を含むいくつかの止血試験に影響を与え、偽陽性または偽陰性結果をもたらすだろう。したがって、凝固試験において直接抗凝固薬の影響を避けて、診断を容易にし、血栓形成促進性イベントの病因の適切な評価を保証するニーズがある。
【０００４】
ツールは、血液サンプル由来の色素など、低分子量化合物の除去について確認された（国際公開第９９／３４９１４（Ａ１）号など）。しかしながら、これらは、血漿の大きなバッチに対する使用について通常想定される。さらに、止血障害との関連でこれらの技術の関係は、まだ考慮されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、血漿サンプルから直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）を除去するため、止血障害の診断用インビトロ試験のための血漿の調製において、活性炭を使用することができることを見出した。本明細書に開示されている方法は、血液凝固能に対する直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）の干渉効果なく、対象から得られた血漿の血液凝固能の決定を可能とすることにより、前記対象の止血障害の存在を正確に検出することを可能とする。
さらに、本発明は、サンプル中の抗凝固薬の存在に基づいて止血障害のリスクの決定を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
対象から得られた血漿サンプルにおける止血障害のインビトロ診断方法は、前記対象から得られた血漿サンプルを活性炭上の前記ＤＯＡＣを吸着させるように前記活性炭と接触させるステップ；吸着された活性炭をサンプルから分離するステップ；及びこのように得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを含む。特定の実施形態では、方法は、（ａ）前記対象から得られた血漿サンプルを活性炭と接触させること；（ｂ）前記活性炭から前記血漿サンプルを回収すること；及びｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定することを含む。これらの方法では、前記血漿サンプルの血液凝固能は、前記対象における止血障害の存在、進行、または重症度、および必要に応じて止血障害の素因を効果的に示す。したがって、特定の実施形態では、前記方法は、前記血漿の前記血液凝固能に基づいて、前記対象の止血障害の存在、進行、または重症度を決定することを含むステップ（ｄ）を含む。
【０００７】
特定の実施形態では、血漿サンプルを、フィルターを通過させることによって活性炭から血漿サンプルを回収する。更なる実施形態では、フィルターは、活性炭だけでなく、血小板、血小板フラグメントおよび／または血漿中になお存在する血液細胞が血漿から除去されるように、０．２２〜０．６５ミクロンの細孔径を有するフィルターである。事実、特定の実施形態では、方法は、１つのステップでは、サンプルから血小板およびＤＯＡＣを除去し、前記血漿サンプルから血小板を除去する分離ステップを含まないことを特徴とする。
【０００８】
本明細書に開示されている方法は、例えば、観察された血液凝固能低下（例えば、血液凝固不良）が、患者のサンプルにおける抗凝固薬の存在が原因の止血障害または血液凝固能低下（例えば、血液凝固不良）に起因し得るかどうかを決定するためのインビトロ診断アッセイによって止血障害の迅速かつ信頼ある評価を可能とする。特定の実施形態では、前記血漿の前記血液凝固能に基づいて、前記対象の止血障害の存在、進行、または重症度を決定するステップを、前記サンプルの前記血液凝固能を標準値または参照値との比較によって行う。
【０００９】
したがって、第一態様は、対象から得られた血漿サンプルにおける止血障害のインビトロ診断方法であって、該方法は：
ａ）前記対象から得られた血漿サンプルを活性炭と接触させるステップ；
ｂ）前記活性炭から前記血漿サンプルを回収するステップ；及び
ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップ；
を含み、
前記血漿の血液凝固能は、前記対象における止血障害の存在、進行、または重症度、および必要に応じて止血障害の素因を示す、方法を提供する。特定の実施形態では、前記ステップ（ｂ）を、血漿サンプルをフィルターに通過させることによって行う。更なる特定の実施形態では、前記血漿サンプルは、０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有する。特定の実施形態では、活性炭から血漿を回収するステップは、遠心分離ステップを含む。特定の実施形態では、活性炭は、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。特定の実施形態では、血漿サンプルを、少なくとも２分間、好ましくは少なくとも５分間活性炭と接触させる。
【００１０】
特定の実施形態では、本明細書に開示されている止血障害のインビトロ診断方法は、ステップ（ｃ）前に、血漿サンプルから血小板、血小板フラグメントおよび残りの血液細胞の１つ以上を取り除く追加ステップを含まない。
【００１１】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを、血漿サンプルを血液凝固活性化因子と接触させることによって行う。
【００１２】
特定の実施形態では、血液凝固活性化因子は、ヒトカルシウムトロンビン、ウサギまたは組換えヒト組織因子、合成リン脂質、ラッセルヘビ毒、エカリン、テキスタリンまたはシリカ、コロイドシリカ活性化剤、トロンボモジュリン、活性化プロテインＣ、凍結乾燥ウシトロンビンおよびトロンビンの発色基質ＣＢＳ６１．５０、ヘビ毒由来第Ｖ因子活性化剤ならびにヘビ毒から単離された第Ｖａ因子依存性プロトロンビン活性化因子から成る群から選択される。
【００１３】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップは、ステップ（ｃ）前に、前記血漿サンプルを免疫枯渇血清または血漿と接触させることを更に含む。
【００１４】
特定の実施形態では、免疫枯渇血清または血漿は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子または第Ｘ因子または第ＸＩ因子または第ＸＩＩ因子または第ＸＩＩＩ因子または第ＶＩＩ因子または第Ｖ因子または第ＩＩ因子欠乏血清または血漿から成る群から選択される。
【００１５】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、ループス抗凝固試験、フィブリノーゲンアッセイ（クラウスおよびＰＴ誘導フィブリノーゲン法の両方）、トロンビン時間、血液凝固因子活性アッセイ（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ；ＶＩＩ、Ｖ、ＩＩ、Ｘ）、活性化プロテインＣ抵抗性（ＡＰＣＲ）アッセイ、プロテインＣ活性アッセイ、プロテインＳ活性アッセイ、抗トロンビン活性アッセイならびにトロンビン生成アッセイを含むリストから選択される凝固試験によって行う。
【００１６】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを、フィブリノーゲン欠乏症、プロトロンビン欠乏症、第Ｖ因子欠乏症、第Ｖ因子ライデン、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、抗プラスミン欠乏症、抗トロンビン欠乏症、プラスミノーゲン欠乏症、Ｄダイマー上昇、抗リン脂質症候群、ヘパリン起因性血小板減少症、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子合併欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症（血友病Ａ）、第ＩＸ因子欠乏症（血友病Ｂ）、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、グランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群または白血球粘着不全症を決定するための血液凝固をベースとする方法を使用して決定し、前記止血障害の素因の表示を更に提供する。
【００１７】
特定の実施形態では、対象は、直接抗凝固薬、好ましくは直接経口抗凝固薬（ＤＯＡＣ）で治療された患者である。
【００１８】
特定の実施形態では、対象は、病歴が不明および／または確認することができない対象である。
【００１９】
更なる態様は、止血障害のインビトロ診断用診断キットであって、前記キットは、
−  活性炭；及び
−  止血障害のインビトロ診断に必要とする１つ以上の化合物と
を含む、キットを提供する。特定の実施形態では、キットは、フィルターを含むバイアルを含む。更なる実施形態では、フィルターは、０．４５μｍの細孔径など、０．２２〜０
．６５μｍの細孔径を有する。本発明は、より詳細には、止血障害の診断試験用サンプルの調製のためのキットであって、前記キットは、１００μｌ〜１００００μｌの容積のバイアル；活性炭；及び０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターを含む、キットを更に提供する。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、止血障害のインビトロ診断用サンプルの調製方法であって、前記方法は：
ａ）バイアル中において、１００μｌ〜１００００μｌの体積の前記血漿サンプルを活性炭と接触させるステップ；及び
ｂ）前記血漿サンプルを０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることによって、前記活性炭から回収するステップ
を含む、方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】遠心分離によって乏血小板血漿を得るための例示的標準調製方法を示す。
【図２】直接経口抗凝固薬（ＤＯＡＣ）濃度の増加に対する、乏血小板血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）（ａ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）（ｂ）を示す。
【図３】密封可能なエッペンドルフチューブ（３）中に入れられた本明細書に開示されている活性炭（２）が詰め込まれている例示的スピンフィルターを示す。血漿（１）を、スピンフィルター中に投入してよく、スピンフィルターを遠心分離すれば、ＤＯＡＣＳ、血小板および活性炭を含まない血漿を密封可能なエッペンドルフチューブ（３）中に回収することができる。
【図４】ＤＯＡＣ濃度の増加に対する、本明細書に開示されている方法に付された血漿のａＰＴＴ（ａ）およびＰＴ（ｂ）を示す。
【図５】リバーロキサバン濃度の増加および活性炭濃度の増加に対する、本明細書に開示されている方法に付された血漿のａＰＴＴ（ａ）およびＰＴ（ｂ）を示す。
【図６】部分トロンボプラスチン時間−ループス抗凝固因子スクリーン（ＰＴＴ  ＬＡ）、ＰＴＴ  ＬＡ確認（Ｓｔａｃｌｏｔ  ＬＡ）、希釈ラッセルヘビ毒時間スクリーン（ＤＲＶＶＴ）およびＬＡ罹患が疑われる患者の血漿サンプルのＤＲＶＶＴ確認により得られた血液凝固時間を示し、乏血小板血漿（チェック模様）あるいは本明細書に開示されている方法に付された血漿（灰色）である。
【図７Ａ】ＬＡ−診断ファーストラインアッセイに対するＤＯＡＣの影響；（Ａ）ＤＲＶＶＴスクリーン；（Ｂ）ＤＲＶＶＴ確認；（Ｃ）ＰＴＴ−ＬＡ。
【図７Ｂ】図７Ａのつづき。
【図７Ｃ】図７Ｂのつづき。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明で使用される本方法および装を記載する前に、本発明は、記載される特定の方法、分子、または使用に限定されず、したがって、方法、分子、または使用は、言うまでもなく、変わってよいと理解されるものとする。本発明の範囲は附属の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語も限定的でないものとすると理解されるべきである。
【００２３】
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または均等ないずれもの方法および材料を本発明の実践または試験で使用してよいが、以下に、好ましい方法および材料を記載する。
【００２４】
本明細書および附属の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ
」は、文脈上別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から成る（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、非排他的またはオープンエンド型であり、追加の記載されていない数、要素または方法ステップを排除しない。
【００２６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から成る（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」も包含する。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、パラメーター、量、時間的期間、および同種のものなど測定可能な値を表す場合、指定された値のおよび値から±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、更により好ましくは±０．１％以下の変動を、かかる変動が開示されている本発明において実施するのに適している限りにおいて、包含することを意味する。修飾語「約（ａｂｏｕｔ）」が表す値も、それ自体、特に、好ましく、開示されていると理解されるべきである。
【００２８】
端点による数値範囲の記載は、記載されている端点だけでなく、それぞれの範囲内に包含される全ての数および小数を含む。
【００２９】
次の節では、本発明の種々の態様または実施形態をより詳細に定義する。そのように定義される各態様または実施形態を、反対であると明白に示されない限り、他の態様または実施形態と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であると示されているいずれもの特徴を、他の特徴または好ましいまたは有利であると示されている特徴と組み合わせてもよい。
【００３０】
本明細書全体にわたって、「１つの実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」と言うことは、該実施形態との関連で記載されている特定の特徴、構造または特性は本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたって様々な場所において、「１つの実施形態では（ｉｎ  ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態では（ｉｎ  ａｎ
ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」は、必ずしも同じ実施形態を表さないが、同じ実施形態を表してもよい。さらに、１つ以上の実施形態において本開示から当業者に明白であるとき、特定の特徴、構造または特性をいずれかの適切な方法で組み合わしてもよい。さらに、本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかだが他ではない特徴を含むが、異なる実施形態の特徴の組合せは本発明の範囲内であり、当業者により理解されるとき異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、附属の特許請求の範囲では、クレームされた実施形態のいずれかを、いずれかの組合せで使用することができる。プロトロンビン時間（ＰＴ）または活性化トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）などのスクリーニング試験に対する直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）の影響は検査室にとって問題であり、検査室は患者が受ける治療に必ずしも気付くとは限らない。意識不明または外傷患者において致命的出血の根本的原因の迅速かつ信頼ある決定は、充分な患者管理を保証するために必要である。直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）に対して感受性あるいは非感受性であり得るスクリーニング試験の有効性は、直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）の存在時に検査室に迅速に情報を与え得る。これは、無駄で高価で、時間のかかる研究を惜しまず、信頼ある診断を提供するだろう。加えて、サンプル中の直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）の存在は、標的の血液凝固因子を含む止血障害を評価するために使用される試験に影響を及ぼし、偽陽性または偽陰性の結果をもたらす。これらの試験のい
くつかはヘパリンに対して非感受性であるようになされるが、これらは直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）の存在下で行わないように設計する。したがって、これらの凝固試験において直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）の影響を回避して凝固性亢進の信頼ある評価を提供するニーズがある。
【００３１】
本発明者らは、血漿サンプルから直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）を除去するため、止血障害の診断用インビトロ試験のための血漿の調製において、活性炭を使用することができることが分かった。本明細書に開示されている方法は、血液凝固能に対する直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）の干渉効果の非存在下、血漿の血液凝固能の決定を可能とする。さらに、活性炭を用いた処理に加えて、血漿サンプルをフィルター、例えば、０．２２〜０．６５ミクロン、より特に０．４０〜０．６５ミクロンなどの０．２２〜０．６５ミクロンから成る細孔径を有するフィルターを通過させることにより血漿サンプルをろ過する場合、活性炭だけでなく、血小板、血小板フラグメントおよび／または血漿中になお存在する血液細胞を血漿から取り除くことができる。
【００３２】
本明細書に開示されている方法は、例えば、観察された血液凝固能低下（例えば、血液凝固不良）が、患者のサンプルにおける抗凝固薬の存在が原因の止血障害または血液凝固能低下（例えば、血液凝固不良）に起因し得るかどうかを決定するためのインビトロ診断アッセイによって止血障害の迅速かつ信頼ある評価を可能とする。フィルター、例えば、本明細書に開示されている方法により提供される０．４５μｍのフィルターなどの０．２２〜０．６５ミクロンから成る細孔径を有するフィルターと組み合わせて活性炭を使用することにより、ステップ数ならびに／または直接抗凝固薬、血小板、血小板フラグメントおよび／もしくは血液凝固障害を信頼して評価するために使用することができる血液細胞を（実質的に）含まない血漿サンプルを得るために必要な遠心分離時間を減らすことによって評価中、貴重な時間を節約することができる。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語止血障害は、出血および血液凝固間の平衡における障害を表す。障害は、先天性あるいは後天性のいずれかであり得る。止血障害は、過剰な出血または血栓症のリスクを生じ得る。
本発明の方法は、可能とする。
【００３４】
したがって、第一態様は、対象の止血障害のインビトロ診断方法であって、該方法は：
ａ）前記対象から得られた血漿サンプルを活性炭と接触させるステップ；
ｂ）前記活性炭から前記血漿サンプルを回収するステップ；及び
ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップ
を含み、前記血漿の血液凝固能は、前記対象における止血障害の存在、進行、または重症度、および必要に応じて止血障害の素因を示す、方法を提供する。
【００３５】
よく調節された止血は健康にとって極めて重要であり、遺伝性疾患の血友病においてなど不十分な血液凝固、および血栓形成傾向において起こるような過剰な血液凝固の両方は、出血および血栓症などの劇的な結果をもたらし得る。止血障害は２つの主要なグループ、すなわち、遺伝性または後天性に分けることができ、凝固因子欠乏症、血小板障害、血管障害および線維素溶解欠損症に更に分類されている。止血障害の非限定的例は、フィブリノーゲン欠乏症、プロトロンビン欠乏症、第Ｖ因子欠乏症、第Ｖ因子ライデン、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、抗プラスミン欠乏症、アンチトロンビン欠乏症、プラスミノーゲン欠乏症、Ｄダイマー上昇、抗リン脂質症候群、ヘパリン起因性血小板減少症、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子合併欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症（血友病Ａ）、第ＩＸ因子欠乏症（血友病Ｂ）、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、グランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群または白血球粘着不全症である。
【００３６】
これに限定されないが、発色抗第Ｘａ因子活性アッセイ、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ、プロトロンビン時間、トロンビン時間、活性化血液凝固時間、トロンボエラストグラフィー、トロンビン生成アッセイ、レプチラーゼ時間、希釈ラッセルヘビ毒時間、エカリン血液凝固時間、カオリン血液凝固時間、国際標準比（ＩＮＲ）、フィブリノーゲン時間（クラウス）、トロンビン時間（ＴＴ）、混合時間、およびオイグロブリン溶解時間を含む、血漿の血液凝固能の様々な測定方法により、止血障害を診断してよい。これらの方法は様々な凝固パラメーターを決定する助けとなり、当業者に公知である。
【００３７】
過敏性血液凝固をもたらす止血障害は、凝固阻害剤を用いて主に治療される。凝固阻害剤（本明細書では抗凝固薬とも呼ぶ）は、凝固過程を阻害する分子である。例示的凝固阻害剤としては、アンチトロンビン活性化薬（例えば、非分割ヘパリンおよびＬＭＷＨ）、第ＩＩａ因子阻害薬、および第Ｘａ因子阻害薬が挙げられるが、これらに限定されない。抗凝固薬効果は、凝固カスケード進行の阻止に起因する凝固阻害剤の効果である。抗凝固薬効果の非限定的例としては、アンチトロンビン活性の上方制御、第Ｘａ因子活性低下、第ＩＩａ因子活性低下、血液損失増加、および血液凝固因子の作用または濃度が血液凝固形成を阻害するように変わる他の条件が挙げられる。
【００３８】
上記のように、止血障害は、通常、（過剰な）出血または出血性素因、汎発性血管内凝固障害、血栓症などの疾病および障害の対象のリスクを増大する。したがって、本発明の方法は、止血障害に起因する疾病または障害の増大されたリスクの決定を可能とする。本明細書で使用されるとき、用語「直接抗凝固薬」は、トロンビンおよび／または第Ｘａ因子の酵素活性を直接的に標的とする抗凝固薬を表す。直接抗凝固薬としては、経口および非経口直接トロンビン（第ＩＩａ因子）阻害薬ならびに経口直接第Ｘａ因子阻害薬が挙げられる。直接抗凝固薬の非限定的例としては、ダビガトランエテキシラート（ＰＲＡＤＡＸＡ（登録商標））、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標））、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標））、エドキサバン（ＬＩＸＩＡＮＡ（登録商標））、フォンダパリナックス（ＡＲＩＸＴＲＡ（登録商標））、およびアルガトロバン（ＡＲＧＡＴＲＯＢＡＮ（登録商標））が挙げられる。
【００３９】
経口抗凝固薬ＰＲＡＤＡＸＡ（登録商標）、ダビガトランエテキシラートメシラート、直接トロンビン阻害薬の化学名は、β−アラニン，Ｎ−［［２−［［［４−［［［（ヘキシルオキシ）カルボニル］アミノ］イミノ−メチル］フェニル］アミノ］メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル］カルボニル］−Ｎ−２−ピリジニル−，エチルエステル，メタンスルホネートである。ダビガトランおよびそのアシルグルクロニドは、競合的直接トロンビン阻害薬である。トロンビン（第ＩＩａ因子、セリンプロテアーゼ）が凝固カスケード中にフィブリノーゲンをフィブリンに転換することを可能とするので、その阻害は血栓形成を予防する。
【００４０】
リバーロキサバン、第Ｘａ因子阻害薬は、ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標）の有効成分であり、化学名５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソ−４−モルホリニル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）−２−チオフェンカルボキサミドを有する。リバーロキサバンは、純粋（Ｓ）−鏡像異性体である。ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標）は、第Ｘａ因子の活性部位を選択的に遮断し、活性のために補助因子（アンチトロンビンＩＩＩなど）を必要としない経口的にバイオアベイラブルな第Ｘａ因子阻害薬である。
【００４１】
アピキサバンまたはＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標）は、１−（４−メトキシフェニル）−７−オキソ−６−［４−（２−オキソピペリジン−１−イル）フェニル］−４，５−ジヒドロピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−３−カルボキサミドである。これは、欧州におい
て承認された経口投与直接第Ｘａ因子阻害薬であり、現在、静脈血栓塞栓症などの予防に対して米国において第ＩＩＩフェーズ治験を行っている。
【００４２】
エドキサバンまたはＬＩＸＩＡＮＡ（登録商標）は、Ｎ’−（５−クロロピリジン−２−イル）−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ，４Ｓ）−４−（ジメチルカルバモイル）−２−［（５−メチル−６，７−ジヒドロ−４Ｈ−［１，３］チアゾロ［５，４−ｃ］ピリジン−２−カルボニル）アミノ］シクロヘキシル］オキサミドである。エドキサバンは、直接第Ｘａ因子阻害薬であり、静脈血栓塞栓症予防の用途に対して日本において承認された。
【００４３】
ＡＲＩＸＴＲＡ（登録商標）は、フォンダパリヌクスナトリウムである。これは、活性化第Ｘ（Ｘａ）因子の合成および特異的阻害薬である。フォンダパリヌクスナトリウムは、メチルＯ−２−デオキシ−６−０−スルホ−２−（スルホアミノ）−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−０−Ｐ−Ｄ−グルコピラ−ヌロノシル−（１→４）−０−２−デオキシ−３，６−ジ−０−スルホ−２−（スルホアミノ）−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−０−２−０−スルホ−ａ−Ｌ−ヨードピラヌロノシル−（１→４）−２−デオキシ−６−０−スルホ−２−（スルホアミノ）−ａ−Ｄ−グルコピラノシドデカナトリウム塩である。第Ｘａ因子の中和は血液凝固カスケードを妨げ、したがって、トロンビン生成および血栓形成を阻害する。フォンダパリヌクスのみを使用して抗Ｘａアッセイを較正することができる。ヘパリンまたはＬＭＷＨの国際標準は、この使用について適切でない。
【００４４】
ＡＲＧＡＴＲＯＢＡＮ（登録商標）は、Ｌ−アルギニンから誘導される合成直接トロンビン（第ＩＩａ因子）阻害薬である。ＡＲＧＡＴＲＯＢＡＮ（登録商標）の化学名は、１−［５−［（アミノイミノメチル）アミノ］−１−オキソ−２−［［１，２，３，４−テトラヒドロ−３−メチル−８−キノリニル）スルホニル］アミノ］ペンチル］−４−メチル−２−ピペリジンカルボン酸一水和物である。ＡＲＧＡＴＲＯＢＡＮ（登録商標）は、トロンビン活性部位と可逆的に結合する直接トロンビン阻害薬である。ＡＲＧＡＴＲＯＢＡＮ（登録商標）は、抗血栓作用に対して補助因子アンチトロンビンＩＩＩを必要としない。本発明で使用されるとき、用語「血漿サンプル」は、本明細書に開示されている方法を用いて診断しようとする対象または患者から得られたサンプルを表す。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「血漿」は従来の定義の通りであり、新鮮な血漿、解凍した凍結血漿、溶媒／界面活性剤処理血漿、加工血漿、またはこれらいずれかの２つ以上の混合物を含む。好ましくは、血漿は新鮮な血漿である。抗凝固薬（例えば、ヘパリン、クエン酸塩、オキサレートまたはＥＤＴＡ）と共に提供された、または接触させた全血のサンプルから、通常、血漿を得る。その後、血液サンプルの細胞成分を、適切な技術、通常、遠心分離（例えば、室温において１５００ｇで１５分間、赤血球から血漿を分離する）によって液体成分（血漿）から分離する。用語「血漿」は、ヒトまたは動物体の部分を形成しない組成物を表す。特定の実施形態では、用語「血漿」は、詳細には、加工血漿、すなわち、全血から分離後にその組成、詳細にはその化学、生化学、または細胞組成を変化させる１つ以上の処理ステップに付された血漿を含むことができる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「乏血小板血漿」は、大部分（例えば、少なくとも９５％）または全ての血小板、および必要に応じて大部分（例えば、少なくとも９５％）または全ての細胞成分を取り除いた血漿を表すことができる。乏血小板血漿を全血のサンプルから得ることができ、血液サンプルの細胞成分を、適切な技術、通常、遠心分離（遠心分離ステップ１：例えば、室温において１５００ｇで１５分間）によって液体成分（血漿）から分離し、その後、血漿中の残りの成分および／または血小板を、適切な技術、通常、遠心分離（遠心分離ステップ２：例えば、室温において１５００ｇで１５分間）によって血漿からほとんど完全に取り除く。例えば、乏血小板血漿は、最大でも１．０×１０４
血小板／μｌを含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「血小板フリー血漿」は、全て（すなわち、少なくとも９９．９％）の血小板、および必要に応じて全て（すなわち、少なくとも９９．９％）の細胞成分を取り除いた血漿を表すことができる。
【００４７】
特定の実施形態では、血漿サンプルは、血液凝固因子およびフィブリノーゲン／フィブリンを含む。
【００４８】
特定の実施形態では、ステップ（ｃ）（すなわち、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップ）前に、血漿サンプルから血小板、血小板フラグメントおよび残りの血液細胞の１つ以上を取り除く追加ステップ（例えば、追加の遠心分離ステップ）に血漿サンプルを付さない。事実、本発明者らは、本明細書に開示されている方法（すなわち、活性炭から血漿サンプルを回収するステップを含む）の使用によって、血漿の凝固活性の正確な決定を可能とするための血小板または残りの血液細胞の追加ステップは必要ないことが分かった。
【００４９】
しかしながら、特定の実施形態では、ステップ（ｂ）（すなわち、活性炭から血漿サンプルを回収するステップ）は、前記血漿サンプルをフィルターに通過させることを含む。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）が前記血漿サンプルをフィルターに通過させることを含む場合、フィルターは好ましくは０．４５μｍの細孔径などの０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターである。好ましくは、これらの実施形態では、ステップ（ｃ）（すなわち、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップ）前に、血漿サンプルから血小板、血小板フラグメントおよび残りの血液細胞の１つ以上を取り除く追加ステップ（例えば、ステップ（ｂ）に加えて）にさえ、血漿サンプルを付さない。
【００５０】
特定の実施形態では、活性炭と接触させる血漿サンプルの体積は、１００μｌ〜２０００μｌ、２５０μｌ〜１５００μｌ、２５０μｌ〜１０００μｌ、または５００μｌ〜１０００μｌであってよい。好ましくは、活性炭と接触させる血漿サンプルの体積は、５００μｌ〜１０００μｌである。
【００５１】
本発明の方法が対象の健康状態の決定に特に着目していることを考えると、血漿は検討中の対象のサンプルであり、前記対象由来のみであることは関連性がある。検出ステップ中にサンプルを参照サンプルと混合することに着目し得るが、これは参照サンプルの特性が既知であり、混合ステップが検出方法に適していることを意味する。
【００５２】
本発明の方法は、抗凝血剤により心房細動に関連する脳卒中のリスクを軽減する治療を受けている患者、より好ましくは、直接抗凝固薬で治療を受けている患者における止血障害の診断に特に目的にしている。したがって、特定の実施形態では、血漿サンプルを得る対象または患者は、インビトロ診断前に、直接抗凝固薬、好ましくはＤＯＡＣ、より好ましくはダビガトランエテキシラート、リバーロキサバン、アピキサバンおよびエドキサバンから成るリストから選択されるＤＯＡＣを用いた治療を行っていた患者群から選択される。
【００５３】
特定の実施形態では、方法は、より特に、例えば、対象または患者の病歴が不明および／または証明することができないおよび／または確認することができない場合など、患者が凝固阻害剤を用いて治療されたか否かにかかわらず、血液凝固能を決定する必要がある時、不明の対象または患者の血漿サンプルにおける止血障害のインビトロ診断のために想定される。特定の実施形態では、方法は、外傷および／または意識不明にある対象または患者の血漿サンプルにおける止血障害のインビトロ診断のために想定される。
【００５４】
特定の実施形態では、対象は、１つ以上の直接抗凝固薬、好ましくはベトリキサバン、
アルガトロバン、ダビガトランエテキシラート、リバーロキサバン、アピキサバンおよびエドキサバンから成るリストから選択される直接抗凝固薬を用いた治療を受けた患者である。
【００５５】
特定の実施形態では、対象は、１つ以上の直接経口抗凝固薬（ＤＯＡＣ）、好ましくはダビガトランエテキシラート、リバーロキサバン、アピキサバンおよびエドキサバンから成るリストから選択されるＤＯＡＣを用いた治療を受けた患者である。
【００５６】
対象の血漿サンプルを活性炭と接触させることにより、前記対象における血液止血障害の検出を保証するのに充分に信頼性がある程度まで、もはやＤＯＡＣを含有しない血漿サンプルを得ることを実証するのはこれが初めてである。より詳細には、本発明の方法は、抗凝固薬検出のより優れた有効性およびサンプル中のＤＯＡＣの存在が原因の偽陽性を回避する能力をもたらす。したがって、方法は、サンプル中のＤＯＡＣの存在に関わりなく血漿サンプルの血液凝固能を決定することを可能とする。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈａｒｃｏａｌ）」、「活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎ）」、「活性炭（ａｃｔｉｖｅ  ｃｈａｒｃｏａｌ）」または「活性炭（ａｃｔｉｖｅ  ｃａｒｂｏｎ）」は、微孔性炭素を表す。微孔性炭素は、表面積を増大するようにカーボンを処理することにより得ることができる。表面積が増大したカーボンを、当技術分野において公知のいずれもの方法によって得ることができる。非限定的例は、カーボンを化学的または物理的（例えば、炭素化または酸化）活性化することによって小さな低容量細孔の導入である。例えば、活性炭１グラムは、少なくとも３０００ｍ２の表面積を有し得る。
【００５８】
特定の実施形態では、活性炭は粉末である。より特定の実施形態では、活性炭は、０．５〜５μｍ、１〜４μｍ、または２．５〜３．５μｍの平均サイズを有する活性炭粒子から成る粉末である。例えば、３μｍの平均サイズを有する活性炭粒子。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、用語「平均サイズ」は、活性炭粒子が球状である場合の平均径および活性炭粒子が球状であに場合の平均体積粒度を表す。体積粒度は、所与の粒子と同じ体積を有する球の径に等しい。例えば、式：Ｄ＝２＊（３Ｖ／４π）１／３（式中、Ｄは代表的球の径であり、Ｖは粒子の体積である）を使用して、球状でない粒子の体積粒度を決定するための当技術分野に公知のいずれもの手段によって、体積粒度を決定してよい。
【００６０】
特定の実施形態では、活性炭の最小径は、少なくとも０．５μｍ、少なくとも０．６μｍ、少なくとも０．７μｍ、少なくとも０．８μｍ、少なくとも０．９μｍ、少なくとも１μｍ、少なくとも１．５μｍ、少なくとも２μｍ、または少なくとも２．５μｍである。
【００６１】
特定の実施形態では、活性炭の最大径は、最大でも１０００μｍ、最大でも５００μｍ、最大でも２５０μｍ、または最大でも１００μｍである。
【００６２】
使用される活性炭の絶対量は、血漿サンプルのサイズに依存するだろうと理解される。活性炭の平均量は、血漿ミリリットル当たり２ｍｇ〜２０ｍｇで変わるだろう。特定の実施形態では、血漿サンプルは、血漿ミリリットル当たり少なくとも２ｍｇ、少なくとも３ｍｇ、少なくとも４ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも６ｍｇ、少なくとも７ｍｇ、少なくとも８ｍｇ、少なくとも９ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１１ｍｇ、少なくとも１２ｍｇ、少なくとも１３ｍｇ、少なくとも１４ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも１６ｍｇ、少なくとも１７ｍｇ、少なくとも１８ｍｇ、少なくとも１９ｍｇ、または
少なくとも２０ｍｇの活性炭と接触させてよい（またはインキュベートしてよい）。好ましくは、血漿サンプルを、血漿ミリリットル当たり少なくとも３ｍｇの活性炭と接触させてよい（またはインキュベートしてよい）。より詳細には、血漿サンプルを、血漿ミリリットル当たり少なくとも５ｍｇの活性炭と接触させてよい。
【００６３】
特定の実施形態では、血漿サンプルを、血漿ミリリットル当たり２〜２０ｍｇの活性炭と、血漿ミリリットル当たり２〜１５ｍｇの活性炭と、血漿ミリリットル当たり５〜１５ｍｇの活性炭と、血漿ミリリットル当たり５〜１２ｍｇの活性炭と、血漿ミリリットル当たり８〜１２ｍｇの活性炭と、または血漿ミリリットル当たり９〜１１ｍｇの活性炭と接触させてよい（またはインキュベートしてよい）。好ましくは、血漿サンプルを、血漿ミリリットル当たり５〜１５ｍｇの活性炭と、例えば、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌまたは１５ｍｇ／ｍｌの活性炭と接触させてよい（またはインキュベートしてよい）。より詳細には、血漿サンプルを、血漿ミリリットル当たり１０ｍｇの活性炭と接触させてよい（またはインキュベートしてよい）。
【００６４】
特定の実施形態では、接触ステップ（またはインキュベーションステップ）を、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、または少なくとも１０分、好ましくは少なくとも２分、より好ましくは少なくとも５分の期間行ってよい。
【００６５】
本明細書に開示されている方法は意識不明または外傷患者における致命的出血などの緊急事態において使用され得るので、本明細書に開示されている方法のステップは好ましくは可能な限り短いが、なお信頼ある結果を提供すると、当業者は理解するだろう。したがって、特定の実施形態では、血漿を遠心分離前に３分間活性炭と接触させることが想定される。
【００６６】
方法を実施する温度は重要ではないが、好ましくはおよそ室温である。したがって、特定の実施形態では、接触ステップ（またはインキュベーションステップ）を、室温（すなわち、環境温度）で行ってよい。
【００６７】
通常、滅菌材料を用いて検査室環境において方法を行う。血漿サンプルを取り扱うための適切なツールは、当技術分野で公知である。特定の実施形態では、接触ステップ（またはインキュベーションステップ）を、コンテナにおいて行ってよい。コンテナの非限定的例は、エッペンドルフチューブ、マルチウォールプレート、バイアル、スピンフィルターおよび（遠心分離）チューブである。
【００６８】
血漿サンプルを活性炭と接触後、血漿サンプルの更なる試験において活性炭の干渉を防止するために、全てまたは一部のサンプルから、好ましくは、活性炭を取り除く。したがって、特定の実施形態では、少なくとも一部、好ましくは全ての血漿をサンプルから回収する、すなわち、活性炭との物理的接触から引き離す。特定の実施形態では、活性炭から血漿を回収することは、前記血漿サンプルをフィルターに通過させることを含んでよい。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「フィルター」はその通常の意味を有し、浮遊不純物もしくは固体粒子を取り除くため、および／または固体を回収するために液体を通過させる多孔質物質、デバイスまたは膜を表す。
【００７０】
本発明との関連で、特定の実施形態では、フィルターは、微孔プラスチックフィルムなどの膜フィルターである。
【００７１】
用語「細孔径」は、膜表面またはフィルターの細孔の平均サイズを表す。細孔径は、特定のサイズの粒子をろ過して取り除くフィルター能力にも関係する。例えば、０．５０μｍの細孔径を有する膜フィルターは、ろ過流から０．５０μｍ以上の径を有する粒子をろ過して取り除く。走査電子顕微鏡を使用する目視検査、ポロシメトリーおよび／またはパーティクルチャレンジなどの細孔径を決定するための当業者に公知のいずれもの方法によって、細孔径を決定してよい。細孔径は、円筒型またはスポンジ状細孔であってよい。
【００７２】
本発明の特定の実施形態では、活性炭から血漿を回収することは、前記血漿サンプルを０．１０〜０．７５μｍ、０．２０〜０．７０μｍ、０．２２〜０．７０μｍ、０．２２〜０．６５μｍ、最も好ましくは０．４０〜０．６５μｍ、０．５０〜０．６５μｍ、または０．６０〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることを含んでよい。特定の実施形態では、フィルターは、０．４５μｍの細孔径を有する。好ましくは、活性炭から血漿を回収することは、前記血漿サンプルを０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることを含んでよい。例えば、活性炭から血漿を回収することは、前記血漿サンプルを０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることを含んでよい。
【００７３】
特定の実施形態では、血漿サンプルをフィルターに通過させることを、当業者に公知のいずれかの方法によって行ってよい。例えば、血漿サンプルをフィルターに通過させることを、重力、真空、または圧によって行ってよい。好ましくは、血漿サンプルをフィルターに通過させることを、遠心分離によって行う。したがって、特定の実施形態では、活性炭から血漿を回収することは、遠心分離ステップおよび前記血漿サンプルをフィルター、好ましくは０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることを含んでよい。
【００７４】
特定の実施形態では、遠心分離ステップを使用して、血漿をフィルターに通過させる。これらの実施形態では、遠心分離ステップの持続時間は、２〜１０分、２〜７分、または２〜５分であってよい。好ましくは、２〜５分の遠心分離ステップ。さらに、遠心分離力は、１００〜５００ｇ、１００〜４００ｇ、１００〜３００ｇ、または１００〜２００ｇであってよい。好ましくは、遠心分離ステップを、１００ｇの遠心分離力で行う。
【００７５】
代替の実施形態では、活性炭から血漿を回収することは、フィルターを使用しない遠心分離ステップを含んでよい。活性炭および血漿の混合物の遠心分離は、混合物を血漿相（すなわち、上相）と活性炭相（すなわち、下相および／または沈殿物）とに分離し得る。それから、血漿相を遠心分離バイアルから別の容器に物理的に取り出し（例えば、ピペットまたは自動シリンジによって）、凝固試験を行ってよい。
【００７６】
サンプルを血漿相および活性炭相に分離するための遠心分離ステップの持続時間および遠心分離力は、当業者に公知である。
【００７７】
本発明の方法が血漿サンプルから血小板または他の細胞またはフラグメントを分離除去するニーズを取り除くことは想定されるが、特定の実施形態では、方法は、血漿サンプルから実質的に全ての血小板、血小板フラグメント、および／または血液細胞を取り除くための追加の遠心分離を含むことができる。遠心分離ステップが血漿サンプルから実質的に全ての血小板、血小板フラグメント、および／または血液細胞を取り除くことを目的とする場合、遠心分離ステップの持続時間は、５〜３０分、１０〜２０分、１５〜２０分であってよい。加えて、遠心分離力は、１０００ｇ〜３０００ｇ、１２００ｇ〜１８００ｇ、または１５００ｇ〜１８００ｇであってよい。
【００７８】
本発明の方法によれば、ステップ（ｂ）で得られた血漿は、１つ以上の直接抗凝固薬を
含まない。好ましくは、適切なフィルターおよび／または特に追加の遠心分離ステップを使用するこれらの実施形態では、ステップ（ｂ）で得られた血漿は、血小板、血小板フラグメント、残りの血液細胞の１つ以上も含まない。フィルターの細孔径は、血小板フラグメントがステップ（ｂ）で得られた血漿中になお存在するかどうか決定するだろうことを、当業者は理解するだろう。方法が前記血漿サンプルを０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることを含む場合、得られたサンプルは、血小板（０．５〜２．５μｍの平均サイズを通常有する）、血小板フラグメントおよび残りの血液細胞（６〜１４μｍの平均サイズを通常有する）を実質的に含まず、更なる遠心分離は必要としない。
【００７９】
上記、特に実施形態に沿って、本明細書に開示されている方法は、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップ前に、血漿サンプルから血小板、血小板フラグメントおよび残りの血液細胞の１つ以上（実質的に全てまたは全て）を取り除く追加ステップ（例えば、ステップ（ｂ）に加えて）を含まない。より詳細には、活性炭から血漿サンプルを回収するステップが、前記血漿サンプルをフィルター、好ましくは０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターに通過させることを含む場合、方法はこの追加の遠心分離ステップを含まない。例えば、全血サンプルから出発して血小板フリー血漿を得るための標準的方法は、少なくとも１５分（例えば、１５００ｇで）の２つの遠心分離ステップを通常含む。この観点から、本明細書に開示されている方法は、血小板フリー血漿を得るためのより迅速な手法を提供し、標準的方法において血小板および／または残りの血液細胞の大部分を除去する代わりに血漿サンプルから全ての血小板および／または残りの血液細胞の除去を可能とする。
【００８０】
特定の実施形態では、活性炭から血漿サンプルを回収するステップが、前記血漿サンプルをサンプルから血小板、血小板フラグメントおよび残りの血液細胞を取り除くために充分小さな細孔径を有するフィルターを通過させることを含まない場合、本明細書に開示されている方法は、ステップ（ｃ）（すなわち、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップ）前に、例えば、本明細書に記載されている遠心分離によって血漿から血小板、血小板フラグメントおよび残りの血液細胞の１つ以上を取り除く追加ステップを含んでよい。
【００８１】
もし、本発明の方法が血漿から直接抗凝固薬を取り除くことを目的とするならば、方法は、血漿中に存在する抗凝固薬を中和するための一般的または特定の抗凝固拮抗薬の使用を必要としない。したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ステップ（ｃ）あるいは凝固アッセイを行うためのサンプル調製のいずれかにおいて、血漿サンプルを１つ以上の一般的または特定の抗凝固拮抗薬と接触させることを含まない。
【００８２】
本発明の方法は、サンプル中に存在する直接抗凝固薬の可能性ある干渉なしで血漿サンプルの血液凝固能の決定を可能とする。活性炭により存在するだろういずれもの直接抗凝固薬を取り除くことによって行う。本発明の方法は、サンプル中に存在する直接抗凝固薬の全量の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％を取り除くこと；またはサンプル中に存在する実質的に全ての直接抗凝固薬を取り除くことを可能とする。本発明の方法は、サンプル中の止血障害のインビトロ診断を妨げる可能性がない直接抗凝固薬のレベルまで、サンプルから直接抗凝固薬を取り除くことを可能とする。
【００８３】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、血漿ミリリットル当たり少なくとも１００ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬、血漿ミリリットル当たり少なくとも２５０ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬、血漿ミリリットル当たり少なくとも５００ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬、血漿ミリリットル当たり少なくとも７５０ｎｇの１つ以上の直接抗凝
固薬、血漿ミリリットル当たり少なくとも１０００ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬、血漿ミリリットル当たり少なくとも１２５０ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬、血漿ミリリットル当たり少なくとも１５００ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬、血漿ミリリットル当たり少なくとも２０００ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬、血漿ミリリットル当たり少なくとも３０００ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬を取り除くことを可能とする。好ましくは、本明細書に記載されている方法は、血漿ミリリットル当たり少なくとも１０００ｎｇの１つ以上の直接抗凝固薬を取り除くことを可能とする。
【００８４】
特定の実施形態では、血漿からいずれもの可能性のある直接抗凝固薬を取り除いた後、方法は血漿の血液凝固能を決定するステップを含む。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、用語「血液凝固能」は、必要に応じて凝固カスケードの１つ以上の活性化因子の存在下；凝固する血漿の能力；ならびに／または内因性および／もしくは外因性凝固経路における１つ以上の凝固因子の機能性および／もしくは活性を表す。血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを、血液凝固能を決定するための当業者に公知のいずれもの方法によって行ってよい。非限定的例は、凝固検出（例えば、機械的、光学またはビスコエラストグラフィ技術によって）、活性化凝固時間、トロンビン生成試験、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、ループス抗凝固試験、フィブリノーゲンアッセイ（クラウスおよびＰＴ誘導フィブリノーゲン法の両方）、トロンビン（凝固）時間（ＴＣＴ）、特定因子活性アッセイ（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ；ＶＩＩ、Ｖ、ＩＩもしくはＸに対する凝固アッセイまたは発色アッセイ）、ビタミンＫ依存性凝固因子前駆体（ＰＩＶＫＡ）試験またはトロンボテスト、活性化プロテインＣ抵抗性（ＡＰＣＲ）アッセイ、プロテインＣ活性アッセイ、プロテインＳ活性アッセイ、アンチトロンビン活性アッセイおよびトロンビン生成アッセイおよび希釈ラッセルヘビ毒試験／時間（ｄＲＶＶＴ）などの凝固アッセイである。
【００８６】
特定の実施形態では、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップは、１つ以上の視覚、免疫、発色および／または蛍光性凝固アッセイを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップは、必要に応じて、凝固カスケードの１つ以上の活性化因子の存在下、検証サンプルが凝血塊を形成する能力を決定することを含む。凝血塊形成を、光学的または機械的に測定してよい。前記血漿サンプルが血液凝固できないことは、前記対象における止血障害の存在、進行、または重症度、および必要に応じて、止血障害の素因を示す。
【００８８】
特定の実施形態では、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップは、特定因子欠乏血漿の凝固時間延長を正規化する血漿サンプルの能力を決定することを含む。対象の前記血漿サンプルが特定因子欠乏血漿の凝固時間延長を正規化することができないことは、前記対象における止血障害の存在、進行、または重症度、および必要に応じて、止血障害の素因を示す。
【００８９】
特定の実施形態では、血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップは、蛍光／発色結合型（fluorogenic/chromogenic-linked）基質を切断する特定の凝固因子の能力を評価することを含む。前記血漿サンプルが蛍光／発色結合型基質を切断することができないことは、前記対象における止血障害の存在、進行、または重症度、および必要に応じて、止血障害の素因を示す。
【００９０】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを、血漿サンプルを血液凝固活性化因子と接触させることによって行ってよ
い。
【００９１】
特定の実施形態では、血液凝固活性化因子は、ヒトカルシウムトロンビン、ウサギまたは組換えヒト組織因子、合成リン脂質、ラッセルヘビ毒、エカリン、テキスタリンまたはシリカ、コロイドシリカ活性化剤、トロンボモジュリン、活性化プロテインＣ、凍結乾燥ウシトロンビンおよびトロンビンの発色基質ＣＢＳ６１．５０、ヘビ毒由来第Ｖ因子活性化剤ならびにヘビ毒から単離された第Ｖａ因子依存性プロトロンビン活性化因子から成る群から選択される。
【００９２】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）で得られた前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップは、ステップ（ｃ）前に、前記血漿サンプルを免疫枯渇血清または血漿と接触させることを更に含む。特定の実施形態では、前記免疫枯渇血清または血漿は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子または第Ｘ因子または第ＸＩ因子または第ＸＩＩ因子または第ＸＩＩＩ因子または第ＶＩＩ因子または第Ｖ因子または第ＩＩ因子欠乏血清または血漿から成る群から選択される。
【００９３】
更なる特定の実施形態では、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップは、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、トロンビン時間またはフィブリノーゲンを決定すること、活性化プロテインＣ抵抗性評価、トロンビン生成アッセイ、ループス抗凝固因子試験またはプロテインＣ、Ｓおよびアンチトロンビン測定を行うことの１つ以上を含む。
【００９４】
例えば、ループス抗凝固因子（ＬＡ）は、事実、リン脂質結合タンパク質、特に、β２糖タンパク質Ｉおよびプロトロンビンに対して向けられるが、抗リン脂質抗体（ＡＰＡ）として分類される。持続性ＬＡの存在は、固相アッセイにおいて検出される基準抗体（ａＣＬ及びａβ２ＧＰＩ）より、血栓症、不育症および再発と強い関連性を有する。ＬＡは、リン脂質依存性凝固アッセイにおけるこれらの挙動に基づいた推定によって検出することができる自己抗体の混成群である。しかしながら、これは、凝固時間上昇の他の可能性ある原因を排除する必要がある。特定の実施形態では、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、ループス抗凝固試験、フィブリノーゲンアッセイ（クラウスおよびＰＴ誘導フィブリノーゲン法の両方）、トロンビン時間、血液凝固因子活性アッセイ（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ；ＶＩＩ、Ｖ、ＩＩ、Ｘ）、活性化プロテインＣ抵抗性（ＡＰＣＲ）アッセイ、プロテインＣ活性アッセイ、プロテインＳ活性アッセイ、アンチトロンビン活性アッセイならびにトロンビン生成アッセイを含むリストから選択される凝固試験によって行う。事実、特定の実施形態では、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップは、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子または第Ｘ因子または第ＸＩ因子または第ＸＩＩ因子または第ＸＩＩＩ因子または第ＶＩＩ因子または第Ｖ因子または第ＩＩ因子欠乏血漿から選択される免疫枯渇血漿の１つ以上の種類とサンプルを接触させることによって、前記サンプルが免疫枯渇血漿を回収することができるかどうかを決定することを含む。
【００９５】
特定の実施形態では、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを、フィブリノーゲン欠乏症、プロトロンビン欠乏症、第Ｖ因子欠乏症、第Ｖ因子ライデン、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、抗プラスミン欠乏症、アンチトロンビン欠乏症、プラスミノーゲン欠乏症、Ｄダイマー上昇、抗リン脂質症候群、ヘパリン起因性血小板減少症、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子合併欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症（血友病Ａ）、第ＩＸ因子欠乏症（血友病Ｂ）、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、グランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群または白血球粘着不全症を決定するための血液凝固をベー
スとする方法を使用して決定し、前記方法は前記止血障害の素因の表示を更に提供する。
【００９６】
特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法において記載されている前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するステップを、次の試験の１つ、またはこれらの組合せを使用して行う：
−  好ましくは過剰の凍結乾燥ヒトカルシウムトロンビンをステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、フィブリノーゲンの定量。
−  好ましくは凍結乾燥ヒトカルシウムトロンビンをステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、トロンビン時間（ＴＴ）試験。
−  好ましくはウサギまたは組換えヒト組織因子、合成リン脂質および安定剤をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験。
−  好ましくはコロイドシリカ活性化剤を含有する合成リン脂質試薬をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の決定。
−  好ましくはラッセルヘビ毒、エカリン、テキスタリンまたはシリカ、リン脂質およびカルシウムをステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中のループス抗凝固因子の検出。
−  好ましくは第ＶＩＩＩ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＶＩＩＩ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＩＸ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＩＸ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＸＩ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＸＩ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＸＩＩ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＸＩＩ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＶＩＩ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＶＩＩ因子活性の決定。
−  好ましくは第Ｖ因子を人工的に枯渇させた凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第Ｖ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＩＩ因子を人工的に枯渇させた凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＩＩ因子活性の決定。
−  好ましくはセファリンおよび第ＸＩＩ因子活性剤、カオリンをステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、カオリン活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の決定。
−  好ましくはヘビ毒由来第Ｖ因子活性剤およびヘビ毒から単離された第Ｖａ因子依存性プロトロンビン活性化因子をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、第Ｖ因子ライデン変異に起因する活性化プロテインＣに対する抵抗性の決定。
−  好ましくは凍結乾燥ウシトロンビンおよびトロンビンの発色基質ＣＢＳ６１．５０をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、アンチトロンビン活性レベルの定量。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明の方法は、前記血漿サンプルの血液凝固能を決定するため
に必要なコントロールを減らすことを可能とする。事実、実際に、最も好ましくは、患者によってこれを確認することができない場合、得られた結果に対する抗凝固薬の影響を排除するために追加の試験を通常必要とする。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、１つのみまたは限定された数のアッセイを使用して、前記血漿の血液凝固能を決定することを含む。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明の方法は、患者の血漿中の抗凝固因子の代表的測定を可能とする。事実、本発明によるＤＯＡＣの除去は、充分に実証されたアッセイを使用して代表的結果を可能とする。
【００９９】
例えば、特定の実施形態では、前記血漿の血液凝固能を決定するステップは、血漿中のループス抗凝固因子の検出を含む。概して、ループス抗凝固因子の試験は、スクリーニング、検証的試験および混合試験を必要とする。スクリーニング試験は通常希釈リン脂質を使用して、ＬＡのインビトロ抗凝固薬効果を増強し、もし存在する場合、血液凝固時間を延長するだろう。しかしながら、スクリーニング試験をＬＡ以外の理由（すなわち、因子欠乏、抗凝固薬療法）で延長する可能性があるので、全ての上昇したスクリーニング試験はいずれもの異常の素因を定義する助けとなるフォローアップ分析を必要とする。確認試験は、概して、リン脂質濃度が著しく増加していることを除いて、同様にスクリーニング試験を行うことを含む。特定の実施形態では、ループス抗凝固因子試験は、希釈ラッセルヘビ毒時間（ｄＲＶＶＴ）、ＬＡ応答性ＡＰＴＴまたはこれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、ループス抗凝固因子試験は、希釈ＡＰＴＴ（ｄＡＰＴＴ）の使用を含み、シリカ活性剤およびＬＡ応答性であるリン脂質の種類の組成物から成るリン脂質の低濃度を使用する。本発明によるＤＯＡＣの事前除去は、これらの方法を使用してサンプル中のＬＡの代表的検出を可能とするだろう。
【０１００】
直接抗凝固薬の効果を逆転することにより、本明細書に開示されている方法を、経口または非経口直接抗凝固薬を用いて治療された患者における止血障害の診断において使用することができる。したがって、本明細書に開示されている方法は、血液凝固の観察された不良が止血障害または前記患者由来の血漿サンプル中の直接抗凝固薬の存在に原因があり得るのかどうか容易に決定することを可能とする。
【０１０１】
血漿サンプル中の抗凝固薬の存在により最も影響を受ける凝固試験またはアッセイは、凝固阻害剤が向けられる血液凝固因子を含み、偽陽性または偽陰性結果をもたらす試験であろう（表１）。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
好ましくは、活性炭から血漿サンプルを回収するステップが前記血漿サンプルを０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターを通過させることを含む場合、本明細書に開示されている方法の使用は、止血障害の診断の信頼性向上を可能とし、より特には、止
血障害または前記患者由来の血漿サンプル中の（直接）凝固阻害剤の存在が原因の血液凝固能低下（例えば、血液凝固不良）の差別化を可能とする。好ましくは、活性炭から血漿サンプルを回収するステップが前記血漿サンプルを０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターを通過させることを含む場合、本明細書に開示されている方法の使用は、別の病因からの抗血栓療法に関する血液凝固能低下の差別化を可能とする。
【０１０４】
好ましくは、活性炭から血漿サンプルを回収するステップが前記血漿サンプルを０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターを通過させることを含む場合、本明細書に開示されている方法の使用は、患者が前記情報を提供することができない状況など、患者が（直接）凝固阻害剤を用いて治療されたか否か不明の患者のサンプルの分析に特に着目にしている。事実、本発明は（直接）凝固阻害剤を用いた患者の事前治療が診断に影響しないことを保証するので、患者の事前治療が不明の場合に間違った診断のリスクを避ける。したがって、本明細書に提供されている方法の特定の実施形態では、患者の病歴は不明である。加えて、本発明は、患者が（直接）凝固阻害剤を用いて治療された場合に着目している。
【０１０５】
更なる態様は、止血障害のインビトロ診断および／または
−  活性炭；
−  フィルター、好ましくは０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有するフィルターを含むバイアル；及び
−  必要に応じて、止血障害のインビトロ診断に必要とする１つ以上の化合物
を含む止血障害のインビトロ診断用血漿サンプルの調製のためなどの診断キットに関する。
【０１０６】
特定の実施形態では、診断キットは、バイアル当たり、２ｍｇ〜２０ｍｇ、２ｍｇ〜１０ｍｇ、２．５ｍｇ〜７．５ｍｇ、または２．５ｍｇ〜５ｍｇの活性炭を含んでよい。好ましくは、診断キット、より好ましくはその中に提供されているバイアルは、バイアル当たり、２．５ｍｇ〜１０ｍｇの活性炭を含む。特定の実施形態では、バイアルは、５〜７ｍｇの活性炭など、４〜８ｍｇの活性炭を収容する。
【０１０７】
特定の実施形態では、バイアルは、１００μｌ〜１００００μｌ、１００μｌ〜５０００μｌ、２５０μｌ〜２５００μｌ、２５０μｌ〜２０００μｌ、２５０μｌ〜１５００μｌ、または５００μｌ〜１０００μｌの容積を有してよい。好ましくは、バイアルは、これに限定されないが、５００μｌ〜１０００μｌなど、１００μｌ〜１０００μｌの容積を有する。事実、本発明は、１００μｌ〜１００００μｌのバイアル、例えば、５００μｌのバイアルなど、通常、血液の限定的量の回収を含む患者サンプルの分析における方法の使用を特に想定する。
【０１０８】
特定の実施形態では、フィルターは、０．１０〜０．７５μｍ、０．２０〜０．７０μｍ、０．２２〜０．７０μｍ、０．２２〜０．６５μｍ、０．４０〜０．６５μｍ、０．５０〜０．６５μｍ、または０．６０〜０．６５μｍの細孔径を有してよい。好ましくは、フィルターは、０．４５μｍの細孔径など、０．２２〜０．６５μｍの細孔径を有する。
【０１０９】
特定の実施形態では、フィルターは、バイアル中の配置に適するフィルターデバイス内に配置され、それによりバイアルの遠心分離時にフィルターデバイス内に配置されている液体はフィルターを通ってバイアル中に入る。特定の実施形態では、フィルターデバイスは、２５０μｌ〜２０００μｌのエッペンドルフチューブ中の配置に適している。
【０１１０】
特定の実施形態では、フィルターデバイスは、活性炭を更に含む。更なる実施形態では
、フィルターデバイスは、５〜７ｍｇの活性炭を含む。
【０１１１】
特定の実施形態では、バイアルは、バキュテナーまたはエッペンドルフチューブであってよい。
【０１１２】
特定の実施形態では、止血障害のインビトロ診断に要する１つ以上の化合物は、凝固カスケードの１つ以上の活性化剤および／または免疫枯渇血漿である。
【０１１３】
診断キットは、すぐに使用できる基質溶液、洗浄溶液、希釈緩衝剤および追加の化合物（例えば、リン脂質、ヘビ毒、カルシウム、塩化カルシウム、組織因子、シリカ、セライト、カオリン、エラグ酸、ヒトまたは動物起源の凝固因子）を更に含んでよい。診断キットは、ポジティブおよび／またはネガティブコントロールサンプルも含んでもよい。例えば、溶解した凝固阻害剤、好ましくはトロンビンおよび第Ｘａ因子阻害薬、より好ましくはダビガトランエテキシラート、リバーロキサバン、アピキサバンまたはエドキサバン。
【０１１４】
止血障害のインビトロ診断のための１つ以上の化合物は、止血障害の検出を可能とする化合物である。特定の実施形態では、止血障害のインビトロ診断のための１つ以上の化合物は、血液凝固活性化剤を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示されている診断キットは、次の試験のいずれかまたはそれらの組合せを行うために必要な化合物を含む。
−  好ましくは過剰の凍結乾燥ヒトカルシウムトロンビンをステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、フィブリノーゲンの定量。
−  好ましくは凍結乾燥ヒトカルシウムトロンビンをステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、トロンビン時間（ＴＴ）試験。
−  好ましくはウサギまたは組換えヒト組織因子、合成リン脂質および安定剤をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験。
−  好ましくはコロイドシリカ活性化剤を含有する合成リン脂質試薬をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の決定。
−  好ましくはラッセルヘビ毒、エカリン、テキスタリンまたはシリカ、リン脂質およびカルシウムをステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中のループス抗凝固因子の検出。
−  好ましくは第ＶＩＩＩ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＶＩＩＩ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＩＸ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＩＸ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＸＩ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＸＩ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＸＩＩ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＸＩＩ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＶＩＩ因子を免疫吸着より除去された凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＶＩＩ因子活性の決定。
−  好ましくは第Ｖ因子を人工的に枯渇させた凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第Ｖ因子活性の決定。
−  好ましくは第ＩＩ因子を人工的に枯渇させた凍結乾燥クエン酸塩添加ヒト血漿をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、血漿中の第ＩＩ因子活性の決定。
−  好ましくはセファリンおよび第ＸＩＩ因子活性剤、カオリンをステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、カオリン活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の決定。
−  好ましくはヘビ毒由来第Ｖ因子活性剤およびヘビ毒から単離された第Ｖａ因子依存性プロトロンビン活性化因子をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、第Ｖ因子ライデン変異に起因する活性化プロテインＣに対する抵抗性の決定。
−  好ましくは凍結乾燥ウシトロンビンおよびトロンビンの発色基質ＣＢＳ６１．５０をステップ（ｂ）で得られた血漿に添加または混合することによる、アンチトロンビン活性レベルの定量。
【０１１５】
特定の実施形態では、診断キットは、例えば、分光光度法または機械的血液凝固検出による患者の血漿サンプルの血液凝固能の可視化および／または定性的読取りを可能とするキャリアを含んでよい。
【０１１６】
本明細書で使用されるとき、用語「キャリア」は、血液凝固反応が行われる小さなコンテナを表す。通常、コンテナが保持することができる最小体積は、起こる血液凝固反応に要する最小総体積より大きい。必要に応じて、これらのキャリアは、カスケード試験を可能としてもよい。キャリアの非限定的例は、半透明マイクロタイタープレート、半透明ストリップウェルまたは半透明チューブである。
【０１１７】
好ましくは、診断キットに含まれる説明書は当業者に明白、簡潔かつ理解可能である。説明書は、通常、キット内容物、血漿サンプルを得る方法、方法、実験の読取りとその解釈および注意と警告に関する情報を提供する。
【０１１８】
本発明を、次の非限定的例において更に例証する。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：止血障害のインビトロ診断のためのａＰＴＴおよびＰＴアッセイに対する血清サンプル中に存在するＤＯＡＣの影響
【０１２０】
例えば、病院検査室における止血障害のインビトロ診断のための標準的試験を、概して、患者から得られた血漿サンプルに対して行う。このような血漿サンプルの調製のため、患者由来血液サンプルの血液成分を、通常、両方共２５００ｇで１５分間の２つの遠心分離ステップによって分離する（図１）。第一遠心分離ステップは、固形物質（例えば、赤血球および白血球）（すなわち、下相）および血漿（すなわち、上相）に血液を分離するだろう。その後、血漿を集め、第二遠心分離ステップに付し、残りの血液細胞および／または血小板をペレット化する。第二遠心分離ステップにより得られた上相（すなわち、乏血小板血漿）を止血試験のために使用することができる。しかしながら、標準的方法により得られた乏血小板血漿は直接抗凝固薬（例えば、ＤＯＡＣ）を含み、それを用いて患者が治療される場合に、いくつかの血液凝固時間試験を妨げ得るだろう（表１）。
【０１２１】
リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ダビガトランおよびベトリキサバンなどのＤＯＡＣは、乏血小板血漿（すなわち、第二遠心分離ステップ後に得られた血漿）の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）（図２ａ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）（図２ｂ）を遅延させた。さらに、血液凝固時間の遅延は、ＤＯＡＣ濃度に比例する。
【０１２２】
実施例２：本明細書に開示されている方法は、止血障害のインビトロ診断のためのａＰＴＴおよびＰＴアッセイに対するＤＯＡＣの影響を取り除く
【０１２３】
対象から得られた血液サンプルを２５００ｇで１５分間遠心分離して、固形物質（例えば、赤血球および白血球）（すなわち、下相）および血漿（すなわち、上相）に血液を分離した。
【０１２４】
第一（および唯一の）遠心分離ステップから得られた血漿を活性炭（１０ｍｇ／血漿ｍｌ）と共に５分間インキュベートし、その後、０．６５μｍ細孔を有するフィルターに血漿を通過させることによって活性炭から回収した（図３）。フィルターに血漿を通過させることを、短時間の遠心分離によって行った。０．６５μｍ細孔を有するフィルターは、血液凝固試験を最小限に干渉して、血漿から、０．６５μｍより大きいサイズの活性炭および残りの血液細胞および／または血小板を効率的に取り除くことを可能とした。
【０１２５】
したがって、フィルターに血漿を通過させることによって活性炭から血漿を回収することを第二遠心分離ステップと置き換えて、実施例１に開示されている乏血小板血漿を得る。
【０１２６】
ろ過された血漿を、ａＰＴＴおよびＰＴアッセイにおいて使用した。この結果は、本明細書に開示されている方法によって、１０００ｎｇ／ｍｌ（図４ａおよび４ｂ）など、高濃度のＤＯＡＣにおいてさえ、ａＰＴＴおよびＰＴアッセイに対するＤＯＡＣの影響を完全に取り除いたことを示している。この観点から、本明細書に開示されている方法は、ＤＯＡＣを用いて治療された患者において凝固カスケードを調査することを可能とし、血漿サンプルの血液凝固能の信頼ある評価を提供する。
【０１２７】
実施例３：ａＰＴＴおよびＰＴアッセイに対するＤＯＡＣの影響の排除に対する活性炭濃度の影響
【０１２８】
実施例２に記載されている対象から得られた血液サンプルの１回の遠心分離によって血漿を得た。血漿サンプルを異なる濃度の活性炭（すなわち、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌまたは１５ｍｇ／ｍｌ）と共に５分間インキュベートし、その後、短時間遠心分離によって０．６５μｍ細孔を有するフィルターおよび活性炭に血漿を通過させることによって活性炭から血漿を回収した。
【０１２９】
ろ過された血漿サンプルを、ａＰＴＴおよびＰＴアッセイにおいて使用した。この結果は、１０００ｎｇ／ｍｌ（図５ａおよび５ｂ）など、高濃度のリバーロキサバンにおいてさえ、ａＰＴＴおよびＰＴアッセイに対するリバーロキサバンの影響を完全に排除したことを示している。さらに、５ｍｇ／ｍｌの活性炭はこの効果を得るのに既に充分であった。
【０１３０】
実施例４：本明細書に開示されている方法は、臨床背景における凝固試験に対するＤＯＡＣの影響を排除する
【０１３１】
本明細書に開示されている方法の有効性を、臨床的状況において評価した。図６は、血栓形成促進性疾患であるループス抗凝固因子（ＬＡ）罹患が疑われたリバーロキサバンを用いて治療された患者から得られた血漿サンプル（血漿サンプルは血漿ｍｌ当たり３３９ｎｇのリバーロキサバンを含んだ）に関する結果を示す。ＬＡ診断のため、部分トロンボプラスチン時間−ループス抗凝固因子スクリーン（ＰＴＴ  ＬＡ）、ＰＴＴ  ＬＡ確認（Ｓｔａｃｌｏｔ  ＬＡ）、希釈ラッセルヘビ毒時間スクリーン（ＤＲＶＶＴ）およびＤＲＶＶＴ確認を含む、患者の血漿について、いくつかのインビトロ診断アッセイを行った。
【０１３２】
図６は、未処理血漿（本明細書に開示されている方法によって治療されていない；実施例１で得られた乏血小板血漿）についての血液凝固時間は、全てのＬＡ診断アッセイ、特にＤＲＶＶＴおよびＤＲＶＶＴ確認について遅延されたことを示す。したがって、これは、患者がＬＡを有するこれらの試験から結論することができる。
【０１３３】
他方では、本明細書に開示されている方法によって処理された（すなわち、実施例２で得られた）血漿をＬＡ診断アッセイにおいて使用した場合、結果は、血液凝固時間は正常範囲内であることを明白に示す。したがって、これは、患者がＬＡを有しない本明細書に開示されている方法によって処理された血漿を使用する試験から結論することができる。
【０１３４】
上記を考慮して、患者の血漿中のリバーロキサバンの存在がＬＡ診断アッセイの血液凝固時間を遅延し、これは誤った診断をもたらし得ると思われる。本明細書に開示されている方法による血漿の処理は第二遠心分離ステップを置き換えて、実施例１に開示された乏血小板血漿を得て、したがって、標準的方法より短時間の方法である。さらに、本明細書に開示されている方法は、ＰＴＴ  ＬＡ、Ｓｔａｃｌｏｔ  ＬＡ、ＤＲＶＶＴおよびＤＲＶＶＴ確認など、ＬＡ診断アッセイにおける血液凝固時間に対するＤＯＡＣの存在の影響の排除を可能とする。
【０１３５】
実施例５：ループス抗凝固因子のインビトロ決定に対する血漿サンプル中に存在するＤＯＡＣの影響。
【０１３６】
ＬＡ検出は、スクリーニング、混合試験および検証的試験の使用を含む。スクリーニング試験は通常低リン脂質含有率試薬を使用して、ＬＡのインビトロ抗凝固薬効果を増強し、もし存在する場合、血液凝固時間を延長するだろう。スクリーニング試験をＬＡ以外の理由（すなわち、因子欠乏、抗凝固薬療法）で延長する可能性があるので、全ての上昇したスクリーニング試験はいずれもの異常の素因を定義する助けとなるフォローアップ分析を受ける。確認試験は、概して、リン脂質濃度が著しく増加していることを除いて、同じ環境においてスクリーニング試験を行うことを含む。これは、ＬＡを部分的または完全に圧倒する効果を有し、したがって、スクリーニング試験より短い血液凝固時間をもたらし、それによってリン脂質依存性を証明する。血液凝固時間を比に換算して、分析のばらつきの問題を軽減する。≧１０％の確認比によるスクリーン比の補正は、上昇する血液凝固時間の他の原因を除外するという条件で、ＬＡの存在と一致するとみなされる。
【０１３７】
不可避な希釈効果は分析のこの解釈を損ない得るが、試験血漿および正常血漿の１：１混合物についてスクリーンおよび検証的試験を行うことによって診断特異性は改善され、阻害を証明し、干渉を低減する。抗体不均一性および試薬ばらつきは、異なる分析原理の少なくとも２つのアッセイの使用を必要とし、許容される検出率を達成する。ファーストラインアッセイは、ＬＡ感受性ＡＰＴＴ（ＰＴＴ−ＬＡ）と組み合わせた希釈ラッセルヘビ毒時間（ｄＲＶＶＴ）であり、臨床的に有意な抗体を最も検出する組合せである。
【０１３８】
検査室におけるいくつかのサンプルのＬＡの試験のため、ｄＲＶＶＴおよびＬＡ感受性ＡＰＴＴの組合せを使用し、これはシリカ活性化剤およびＬＡ感受性であるリン脂質タイプの組成物から成る低濃度のリン脂質を使用する。確認試験は、濃縮血小板誘導リン脂質の添加を含む。ｄＲＶＶＴ分析のため、ラッセルクサリヘビ（ダボイアルッセリイ（Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉｉ））のヘビ毒由来希釈ＦＸ活性剤、ＬＡ−応答性およびカルシウムイオンであるリン脂質タイプの組成物からなる低濃度のリン脂質を使用した。確認試験は、より高濃度において同じリン脂質製剤を使用すること以外同じ試薬を含む。全ての上昇したＡＰＴＴ及びｄＲＶＶＴスクリーン結果を反映して確認試験およびスクリーンを受け、混合試験を確認し、解釈所見と共に報告する。ＬＡ患者は、ＰＴＴ−ＬＡ及び
ｄＲＶＶＴ試験メドレーの１つまたは両方において陽性であり得る。
【０１３９】
ＬＡ試験に対するＤＯＡＣの干渉を示すため、健常ドナー由来正常なプール血漿（ＮＰＰ）を、０−１００−３００−１０００ｎｇ／ｍｌの最終濃度においてダビガトラン、アピキサバン、リバーロキサバンまたはエドキサバンのいずれかでスパイクした。それから２条件を試験した：ｉ）スパイクしたＮＰＰをｄＲＶＶＴスクリーン／確認およびＰＴＴ−ＬＡの両方について直接試験した、またはｉｉ）デバイス（５〜７ｍｇ／フィルターの量で活性炭を含む）中で５分間インキュベートしてから、２００ｇ、２分間でセットされた遠心分離ステップによりろ過した。それから、バイアル中に集められた血漿は、ＤＯＡＣが枯渇し、ＤＯＡＣからの影響なく、ＤＲＶＶＴスクリーン／確認およびＰＴＴ−ＬＡアッセイについて試験することもできる。
【０１４０】
上記２条件の結果を図７に示す。これらの結果は、ＤＯＡＣを含む血漿サンプルは全ての検査した血液凝固試験のための参照範囲外である血液凝固時間延長を示し、偽陽性結果をもたらしたことを示している。これらのサンプルは、ＤＯＡＣが本発明により取り除かれる場合に参照範囲に戻る。これらの結果は、ＤＯＡＣの存在が原因のＬＡ診断に対する偽陽性を避けることを実証している。したがって、ファーストラインアッセイはＤＯＡＣの存在によって影響を受け、ＤＯＡＣの除去はｄＲＶＶＴスクリーン／確認比について図７Ａおよび７ＢならびにＬＡ感受性ＡＰＴＴについて図７Ｃに記載されているようにベースライン値（すなわち、ＮＰＰをＤＯＡＣでスパイクしない場合）の回復を可能とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【国際調査報告】
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