(57)【要約】本発明は、藻類に浸透圧ショックを与え、破壊された藻類を細胞壁分解酵素を含む酵素組成物で処理することにより、周囲温度で新鮮な藻類を処理する方法に関する。周囲温度でのこの穏やかなプロセスにより、塩の存在下でも良好な溶解性を持ち、起泡性、乳化性、および水結合性が良好な藻類タンパク質を分離できる。他の利点は、このタンパク質分離方法ではカスケード型バイオリファイナリーが可能になることである。これは、タンパク質分離の後に残りのバイオマスを炭水化物分解酵素で処理して、クリーンなバイオガスを高収率で生成し、ミネラル豊富な水流を嫌気性消化で生成できるためである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）藻類を浸透圧ショックに供する、
（ｉｉ）ショックに供した藻類を、細胞壁分解酵素を含む酵素組成物で処理する、
（ｉｉｉ）酵素処理した藻類を固相と液相に分離する、
ことを含み、藻類の酵素処理が、藻類を採取してから３時間以内に開始され、工程（ｉ）から工程（ｉｉｉ）の温度が４〜３０℃の範囲であることを特徴とする、藻類を処理する方法。
【請求項２】
藻類の処理が５〜２５℃の範囲、好ましくは１５〜２５℃の範囲の温度で行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
浸透圧ショックが５〜２０分かかることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
処理中のｐＨが調整されず、好ましくはｐＨ５．５〜７．５であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
藻類が海藻であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞壁分解酵素組成物が、セルラーゼ、キシラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼおよびホスホリパーゼの１つまたは複数を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉｉ）の液相を乾燥して、好ましくは噴霧乾燥によってタンパク質を得ることをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質収量が、藻類中の総タンパク質に基づいて、少なくとも６５％ｗ／ｗであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
バイオガス、バイオプラスチック、バイオエタノール、ミネラル、脂肪または油を生成するために工程（ｉｉｉ）で得られた固相を使用することをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
バイオガスが、炭水化物分解酵素調製物による加水分解とそれに続く微生物によるメタン生成を含む二段階の嫌気性消化プロセスによって工程（ｉｉｉ）で得られた固相から生成されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
嫌気性消化が、回収されるミネラルストリームを生成することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により得られるタンパク質。
【請求項１３】
ｐＨ２〜１０の範囲のｐＨまたは０．０５〜３％ｗ／ｖ  ＮａＣｌの範囲のＮａＣｌ濃度で、総タンパク質重量に基づいて、少なくとも６０％ｗ／ｗの溶解度を有することを特徴とする、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
食品産業、飼料産業、化粧品産業または製薬産業における、請求項１２または１３に記載のタンパク質の使用。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法で得られたミネラルストリーム。
【請求項１６】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるバイオガス。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法における使用のための、藻類を収穫するための収穫ユニット（２）、藻類を酵素的に消化するための処理ユニット（３）、および藻類からタンパク質を分離するための回収ユニット（４）を含むことを特徴とする、モバイル装置。
【請求項１８】
嫌気性消化ユニット（６）、嫌気性消化ユニット（６）から生成物を回収するための回収ユニット（７）、および回収ユニット（４）または（７）からの製品を配合するための配合ユニット（５）をさらに備えることを特徴とする、請求項１７に記載のモバイル装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類を処理して藻類タンパク質およびバイオガスを回収する方法に関する。本発明はまた、この方法により回収されたタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
藻類は、多糖類、タンパク質、ミネラル、油の貴重な供給源である。これらの貴重な成分を藻類から分離するために、藻類を処理する必要がある。淡水藻類は収穫され、その場で処理される。塩水藻類、いわゆる海藻、の場合、収穫および加工は別の場所で行われる。海藻はオフショア（ｏｆｆｓｈｏｒｅ）で収穫され、本土に輸送され、陸上で処理される。処理が開始される頃には、海藻の分解や劣化が始まっている。結果として、藻類は、集中的な処理の後、または相当量の抗菌保存剤を使用しない限り、食品、医薬品、または化粧品の用途に使用できない。さらに、藻類を陸上に運ぶ間、大量の水が輸送されるが、これは非常に重くて費用がかかる。
【０００３】
あるいは、藻類はオフショアで収穫され、オフショアで保存され、処理前に、保管または貯蔵寿命を延長する。保存された海藻は、陸上輸送されてさらに加工される。これにより、大量の水の輸送は回避されるが、タンパク質などの藻類成分への損傷は回避されない。保存はしばしば乾燥または凍結の形で行われる。非特許文献１は、冷凍または凍結乾燥した海藻からのタンパク質の抽出について記載する。非特許文献２は、乾燥した海藻からのさまざまなタンパク質抽出方法の研究である。非特許文献３は、乾燥した海藻からの最適化されたアルカリ性タンパク質の抽出について記載する。非特許文献４は、オーブンで乾燥させたダルス（Ｐａｌｍａｒｉａ  Ｐａｌｍａｔｅ）からの他の最適化されたアルカリ性タンパク質の抽出について記載する。保存、特に海藻の乾燥に使用される熱は、タンパク質の変形または変性を引き起こし、機能性の低下および関連する価値の低下を招く可能性がある。さらに、大量の湿った藻類バイオマスを乾燥させるための加熱には、かなりの量の（費用のかかる）エネルギーが必要となる。他の欠点は、防腐剤が通常藻類バイオマスに追加されることである。これらの防腐剤は最終的な食品に残る可能性があり、酸（貯蔵）処理の場合は藻類の成分も破壊されるため、望ましくない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Vilg & Undeland (2017) J. Appl. Phycol. 29:585
【非特許文献２】Postma et al J Appl Phycol (2018) 30:1281
【非特許文献３】Maehre et al. 2016 Mar. drugs 14:196
【非特許文献４】Harnedy & FitzGerald 2013 Food Sci technol 51:375
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
食品用途で使用でき、タンパク質分離後の残りのバイオマスからのさらなる価値の抽出を可能にする、良質で機能的な、典型的には無傷のタンパク質製品をもたらす、海藻加工のためのより効率的、より経済的かつより穏やかな方法を有することが望ましいであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】収穫および洗浄ユニット２；酵素消化のための処理ユニット３、タンパク質の分離および濃縮のための回収ユニット４、嫌気性消化処理ユニット６、６からの製品の回収のための回収ユニット７、および回収ユニット４または７からの製品８の配合のための配合ユニット５、を含む本発明による装置の一実施形態。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
一態様では、本発明は、藻類を処理するための方法に関する。この方法は、（ｉ）藻類を浸透圧ショックに供すること；（ｉｉ）ショックに供された藻類を、細胞壁分解酵素を含む酵素組成物で処理すること；（ｉｉｉ）酵素処理された藻類を固相と液相に分離すること、を含み、収穫後３時間以内に藻類の酵素処理が開始され、工程（ｉ）から工程（ｉｉｉ）の温度が４〜３０℃の範囲である。
【０００８】
従来の産業では、収穫と処理が異なる場所で行われる場合、バイオマスは典型的には、収穫場所から処理場所に輸送される。本発明による方法では、収穫されたバイオマスを処理場所に運ぶ代わりに、バイオマスができるだけ新鮮に処理されて成分の最高の機能的価値が得られるように、バイオマスが収穫される場所に処理プラントが運ばれる。本発明による方法では、藻類は収穫場所で、または収穫場所の非常に近くで処理される。これは、藻類が主要な処理場所とは別の場所、例えばオフショア、これは海藻（ｓｅａｗｅｅｄ）や大型藻類（ｍａｃｒｏ−ａｌｇａｅ）などとも呼ばれる海草（ｍａｒｉｎｅ  ａｌｇａｅ）の場合によく見られる、で収穫される場合に特に有利となる。本発明の方法を使用すると、処理が始まる前に藻類が分解または劣化する機会はほとんどない。例えば、海藻（海藻は９０％ｗ／ｗ以上の水で構成される）の加工処理場への運搬のための水運輸にかかる高額な費用も回避される。したがって、藻類から得られたタンパク質は良質であり、機能性、例えば良好な溶解性、を有し、より経済的に生産でき、食品用途に使用できる。
【０００９】
本発明による方法の他の利点は、タンパク質の抽出後、残りのバイオマスをさらなる価値のある抽出に使用できることである。例えば、バイオマスは、バイオガスの生産またはミネラルの回収に使用することができる。本発明の一実施形態では、タンパク質の抽出後に残っているバイオマスは、糖を放出するためにカルボヒドラーゼ酵素混合物に曝露される。次に、炭水化物が豊富な加水分解されたバイオマスが嫌気性消化装置に供給され、バイオガスとミネラルが豊富な水の流れが生成される。後者は、本発明の一部でもある肥料組成物として、または肥料組成物中で使用できる。この炭水化物に富む画分から、例えば糖、アルギン酸塩、カラギーナンおよびフコイダンなどの他の食品成分も回収され得る。
【００１０】
この方法は海藻を処理するのに非常に有利であるが、この方法は、陸上またはオフショアのいずれの種類の藻類処理にも使用できる。一実施形態では、この方法は、藻類、特に海藻または大型藻類のタンパク質へのオフショアでの処理に使用され、任意に、タンパク質回収後に残っている藻類バイオマスからバイオガスまたは肥料組成物をさらに生成する。「バイオガス」なる用語は、バイオマスの嫌気性消化または嫌気性発酵の産物を意味する。バイオガスは主にメタンと二酸化炭素で構成されており、少量の硫化水素、水分、シロキサンが含まれ得る。
【００１１】
本発明の方法は、バイオマスの即時処理を可能にするため、処理場所と収穫場所が離れている状況で、藻類などのバイオマスを収穫するときに特に有利である。処理は通常、藻類が空気または酸素に曝される時間を最小限に抑えるために迅速に、例えば、収穫から３０分以内、６０分以内、９０分以内、２時間以内、２．５時間以内、または３時間以内などで開始される。
【００１２】
本文脈における「処理」なる用語は、藻類細胞の破壊または細胞壁分解酵素による藻類バイオマスの処理を含むプロセスを意味する。細胞をさらに破壊したり、酵素処理を行ったりせずに単に藻類バイオマスを乾燥させることは、処理の開始とは見なされない。
【００１３】
本発明の文脈において、「オフショア」は、海、海洋、河口、川または湖、海岸または川の土手などの海洋または淡水の場所を意味する。一実施形態では、海洋または淡水の場所は、沿岸、海岸、または川岸から少なくとも１ｋｍ離れた場所、例えば沿岸、海岸、または川岸から１〜２００ｋｍ、１〜５０ｋｍ、または５０〜２００ｋｍ離れた場所である。オフショアは、陸上の池または水路を意味しない。
【００１４】
処理中の温度は３０℃を超えることはなく、好ましくは４〜３０℃、５〜２５℃、または１５〜２５℃であるため、藻類から分離されたタンパク質は変形や変性を受けず、その溶解性などの機能特性が保持される。本発明による方法を使用して、乾燥または濃縮液体藻類タンパク質を得ることができる。
【００１５】
本発明による方法では、新鮮な藻類が使用される。本発明の文脈において、「新鮮な藻類」は、乾燥および凍結などのさらなる処理なしで収穫されたままの藻類を意味する。したがって、「新鮮な藻類」という用語には、乾燥した、粉末化した、再水和した、冷凍した、サイロ化した、または解凍した藻類は含まれない。新鮮な藻類は、通常、８０〜９５％ｗ／ｗの範囲の含水率を有する。新鮮な収穫された藻類は、３時間前、２時間前、１時間前など、４時間よりも前に収穫されたものである。
【００１６】
藻類とは別に、収穫物には小さな海洋生物やプラスチックなどの他の固形物が含まれる場合があり、これらは藻類を処理する前に除去することが好ましい。藻類は、収穫時の海洋生物の８６％〜１００％ｗ／ｗを構成し得る。好ましい実施形態では、藻類は、収穫物中の海洋生物の９０％〜１００％ｗ／ｗまたは９９％〜１００％ｗ／ｗを構成する。収穫とは、湖、川、海、河口、または海洋などの海水または淡水の場所から藻を回収するなど、周囲の水から藻類を分離することを意味する。藻類は、任意の適切な手段によって、例えば、自由に浮遊する藻類を収集することによって、または藻類バイオマスをそれらが播種されて成長したネットおよびロープから切断または剥ぎ取ることによって、収穫できる。一実施形態では、藻類または海藻は、栽培ロープに播種される。次に、収穫は、ロープから藻類または海藻を剥ぎ取ることを含む。
【００１７】
海洋または淡水の場所から藻類を収穫してから３０分から２時間または３時間以内に、藻類を浸透圧ショックに供し、藻類を破壊し、細胞内容物を遊離させる。浸透圧ショックにより、細胞内容物が部分的または完全に遊離し得る。浸透圧ショックは、すべての藻類細胞または藻類細胞の一部、例えば、藻類細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７５％を破壊し得る。浸透圧ショックは、温度が３０℃を超えない限り、いかなる適切な手段、例えば水を使用するなど、で行うことができる。浸透圧ショック中の温度は、好ましくは４〜３０℃の間、５〜２５℃、または１５〜２５℃である。一実施形態では、海藻に浸透圧ショックを与えるために脱塩水が使用される。脱塩水は、湿潤藻類の重量に基づいて、藻類：水＝１：１〜１：１０の比率で使用することが好ましい。浸透圧ショック処理は、通常、５〜６０分、好ましくは５〜２０分持続させる。
【００１８】
それらを浸透圧ショックに供する前に、藻類を、例えばそれらを切断またはスライスするか、またはそれらをブレンダーまたはカッターに入れることにより、小片にサイジングしてもよい。一実施形態では、藻類は、脱塩水中で小片にサイジングされ、これは、それらが浸透圧ショックに供されながら、小片にサイジングされることを意味する。
【００１９】
収穫直後またはほぼ直後、浸透圧ショックに供する前に、藻類を洗浄して、魚、甲殻類、カニなどの小さな海の生物を除去し、プラスチック、流木、ブイなどの残骸を除去してもよい。洗浄には、例えば、４〜３０℃の過剰な海水を使用できる。
【００２０】
収穫直後またはほぼ直後、浸透圧ショックに供する前に、付着している海水を除去してもよい。付着した海水は、藻類を傷つけないように低速遠心分離で除去できる。一実施形態では、付着している海水は、１００〜５００ｒｐｍ、好ましくは１００〜２００ｒｐｍまたは２００〜３００ｒｐｍでの遠心分離によって除去される。
【００２１】
本発明の文脈において、「藻類」という用語は、海水、汽水または淡水の中またはその下に生息し、農業、化粧品業界、食品または飼料業界、または製薬業界で使用される多様な生物活性化合物を含む単細胞または多細胞光合成真核非血管水生生物のグループを意味する。特に海藻は、抗菌、抗酸化、抗ウイルス活性を示す多糖類に富む。海藻には、タンパク質、ビタミン、胞子要素、ポリフェノール、ヨウ素、アルギン酸とその誘導体、カラギーナン、クロロフィル、カロチノイド、寒天などの貴重な分子が含まれる。本発明による方法は、藻類、特に海藻または大型藻類とも呼ばれる、紅藻類（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）および褐藻類（Ｏｃｈｒｏｐｈｙｔａ、Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）を処理するために使用し得る。本発明による方法で使用し得る藻類には、これらに限定されないが、アラリア（Ａｌａｒｉａ）種、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）種、カウレルパ（Ｃａｕｌｅｒｐａ）種、コンドルス（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ）種、ダービレア（Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａ）種、エンテロモルファ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ）種、フカス（Ｆｕｃｕｓ）種、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）種、ラミナラ（Ｌａｍｉｎａｒａ）種、ペルベチア（Ｐｅｌｖｅｔｉａ）種、パイロピア（Ｐｙｒｏｐｉａ）種、ポルフィラ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）種、サルガッスム（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）種、サッカリナ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）種、ウルバ（Ｕｌｖａ）種、およびウンダリア（Ｕｎｄａｒｉａ）種が含まれる。特に興味深いものとして、アスコフィルム・ノドスム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）、ヤハズツノマタ（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｓｐｕｓ）、ボウアオノリ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、フカス・スピラリス（Ｆｕｃｕｓ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、フカス・ベシクロスス（Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）、シラモ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｂｕｒｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ）、グラシラリア・クラッサ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｃｒａｓｓａ）、グラシラリア・デュラ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｄｕｒａ）、グラシラリア・ロンガ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｌｏｎｇａ）、オゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、ラミナリア・ディギタータ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ）、ラミナリア・オクロロイカ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｏｃｈｒｏｌｅｕｃａ）、ラミナリア・パリダ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｐａｌｌｉｄａ）、レッソニア・ニグレッセンス（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、マクロシスティス・インテグリフォリア（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、オオウキモ（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ）、モズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ  ｄｅｃｉｐｉｅｎｓ）、ネレオシスティス・ルエトケアナ（Ｎｅｒｅｏｃｙｓｔｉｓ  ｌｕｅｔｋｅａｎａ）、ダルス（Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ）、ポルフィラ・プルプレア（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ポルフィラ・ウンビリカリス（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌｉｓ）、マコンブ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、カラフトコンブ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  ｌａｔ��ｓｓｉｍａ）、サッカリナ・ロンギクルリス（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  ｌｏｎｇｉｃｒｕｒｉｓ）、サッカリナ・セッシリス（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  ｓｅｓｓｉｌｉｓ）、サルガッスム・フィリペンデュラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａ）、ヒジキ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、タマハハキモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｍｕｔｉｃｕｍ）、ボウアオノリ（Ｕｌｖａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ヒラアオノリ（Ｕｌｖａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）、リボンアオサ（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ）、およびワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎａｎｔｉｆｉｄａ）が挙げられる。一実施形態において、上記の種の１つ以上、または言及された種の２つ以上の組み合わせが、本発明による方法で処理される。好ましい実施形態では、緑藻、特にウルバ（Ｕｌｖａ）種、より特にリボンアオサ（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ）が加工される。
【００２２】
収穫後２〜３時間以内に、破壊した藻類バイオマスを、細胞壁分解酵素を含む組成物で処理する。この組成物は、細胞壁や細胞小器官などの他の細胞塊に連結または関連するタンパク質を放出するために使用される。一実施形態では、酵素組成物は、酵素組成物の総重量に基づいて少なくとも０．１０％ｗ／ｗの細胞壁分解酵素、例えば０．１０％ｗ／ｗ〜１００％ｗ／ｗ、０．２０％ｗ／ｗ〜９５％ｗ／ｗ、０．５０％ｗ／ｗ〜９０％ｗ／ｗ、１．０％ｗ／ｗ〜９０％ｗ／ｗ、１．０％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ、１．０％ｗ／ｗ〜２０％ｗ／ｗ、１０％ｗ／ｗ〜２０％ｗ／ｗ、２０％ｗ／ｗ〜６５％ｗ／ｗ、７０％ｗ／ｗ〜９５％ｗ／ｗまたは８０％ｗ／ｗ〜９５％ｗ／ｗを含む（すべて酵素組成物の総重量に基づく）。他の実施形態では、酵素組成物は、細胞壁分解酵素からなる。
【００２３】
酵素組成物中に存在し得る適切な細胞壁分解酵素には、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８およびＥＣ３．２．１．３２）、ベータ−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．６）、アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１およびＥＣ３．２．１．２）、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８およびＥＣ３．１．３．２６）、ホスホリパーゼ（ＰＬＡ１、ＰＬＡ２、ＰＬＢ、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＥＣ３．１．１．４、ＥＣ３．１．４．１１およびＥＣ３．１．４．４）およびポリガラクツロナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、細胞壁分解酵素は酵素組成物における主要な活性であり、他の実施形態では、細胞壁分解酵素は酵素組成物における副次的またはマイナーな活性である。酵素組成物は、これらの細胞壁分解酵素の１つまたは複数を含む。当業者は、酵素の最適な混合物が藻類の種類と季節との間で異なり得ることを理解するであろう。したがって、あらゆる細胞壁分解酵素の混合物が、それが新鮮なまたは新たに収穫された藻類に使用される限り、使用できる。一実施形態では、破壊した藻類は、セルラーゼ、エンドキシラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼおよびホスホリパーゼＰＬＡ２の組み合わせを含む酵素組成物で処理される。他の実施形態では、破壊した藻類バイオマスは、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）およびホスホリパーゼ（ＰＬＡ１、ＰＬＡ２、ＰＬＢ、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＥＣ３．１．１．４、ＥＣ３．１．４．１１およびＥＣ３．１．４．４）を含む酵素組成物で処理される。他の実施形態では、破壊した藻類バイオマスは、エンドキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）およびホスホリパーゼ（ＰＬＡ１、ＰＬＡ２、ＰＬＢ、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＥＣ３．１．１．４、ＥＣ３．１．４．１１およびＥＣ３．１．４．４）を含む酵素組成物で処理される。一実施形態では、セルロース、キシラン、ベータグルカン、アミラーゼ、フィチン酸塩、ペクチン、ガラクツロン酸またはリン脂質に対して活性を有する酵素を含む酵素組成物が使用される。他の実施形態では、ベータ−グルカナーゼ、フィターゼ、ポリ−ガラクツロナーゼおよびホスホリパーゼを含む酵素組成物が使用される。他の実施形態では、少なくとも２０，０００ＡＶＪＰ／ｇの活性を有するポリガラクツロナーゼ；少なくとも８０ＢＧＬＵ／ｇの活性を有するエンド１，３βグルカナーゼ；少なくとも１００，０００ＢＧＦ／ｇの活性を有する真菌のベータグルカナーゼ；少なくとも７５００Ｕ／ｇの活性を有する細菌アミラーゼ；少なくとも５０００ＦＴＵ／ｇの活性を有するフィターゼ；ホスホリパーゼＡ２、およびキシラナーゼを含む酵素組成物が使用される。使用する前に、これらの酵素を１：１：１：１：１：１：１の比率で混合し、その混合物を１０００ｋｇの１００％乾物バイオマスあたり５００ｍｌの用量で使用する。これらの酵素は、例えば、ＤＳＭ（オランダ、Ｄｅｌｆｔ）から市販されている。
【００２４】
酵素組成物中の細胞壁分解酵素は、植物、細菌、真菌などからの単離によって、新規合成によって、または既知の酵素の突然変異誘発によって得られる。
【００２５】
細胞壁分解酵素は、他の細胞塊に連結するか関連するものを含む、細胞内タンパク質の一部またはすべてを放出するために使用される。一実施形態では、少なくとも３０％ｗ／ｗ、少なくとも４０％ｗ／ｗ、少なくとも５０％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、例えば３０％ｗ／ｗ〜６０％ｗ／ｗ、４５％ｗ／ｗ〜７０％ｗ／ｗ、または５０％〜９０％ｗ／ｗの細胞内タンパク質が放出される。
【００２６】
いかなる好適な用量の酵素製剤を使用できる。一実施形態では、１００％乾物バイオマス１０００ｋｇあたり、０．００１％ｗ／ｗ〜５％ｗ／ｗ、０．００５％ｗ／ｗ〜２％ｗ／ｗまたは０．０１％ｗ／ｗ〜１％ｗ／ｗの細胞壁分解酵素組成物が使用される。藻類の乾物含量は、当技術分野で知られている任意の方法によって測定でき、典型的には、例えば、代表的な藻類試料をオーブンで乾燥させることによって、水の蒸発によって藻類試料または藻類のすべての水分を除去し、乾燥前後の試料の重量を測定することを含む。
【００２７】
酵素の用量にもよるが、細胞内の一部または全部のタンパク質を利用可能とするには、約５分〜５０時間、３０分〜４８時間、６時間〜２４時間、１８時間〜３０時間、または３０時間〜５０時間かかり得る。一実施形態では、破壊された藻類バイオマスは、２４時間〜４８時間酵素処理される。酵素処理の間、温度は３０℃を超えず、好ましくは４〜３０℃、５〜２５℃、または１５〜２５℃である。
【００２８】
プロセスのどの工程でもｐＨを調整する必要はない。使用されるｐＨは、典型的にはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５、例えばｐＨ６．０〜７．５の範囲である。
【００２９】
酵素処理の後、好ましくは遠心分離または濾過により、固相および液相が分離される（工程（ｉｉｉ））。遠心分離を使用して、ペレットおよびタンパク質含有上清が得られる。濾過を使用して、保持液およびタンパク質含有濾液が得られる。
【００３０】
タンパク質は、典型的には濃縮により、上清または濾液から回収され得る。濃縮は、温度が３０℃を超えず、好ましくは４〜３０℃、５〜２５℃、または１５〜２５℃である限り、限外濾過、遠心分離、沈殿またはナノ濾過などの任意の適切な手段で行うことができる。濃縮されたタンパク質は、使用するまで保存できる。濃縮されたタンパク質は、別の場所、例えば、収穫と加工がオフショアで行われた場合、陸上に容易に輸送される。新鮮な藻類から分離されたタンパク質は、乾燥した藻類から主に調製される市販の藻類タンパク質よりも機能性が高く、食品業界、飼料業界、化粧品業界または製薬業界などにおいて、タンパク質または藻類タンパク質の既知の用途、例えば、発泡剤、ゲル化剤、増粘剤、乳化剤、着色剤、顔料、抗酸化剤または抗菌剤、で使用できる。
【００３１】
任意に、タンパク質は、オンショアまたはオフショアで、好ましくは噴霧乾燥などの即時乾燥法によって乾燥される。一実施形態では、タンパク質は、ボックス乾燥機（Ｓａｎｏｖｏ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａ／Ｓ、Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク）を使用して噴霧乾燥することにより即座に乾燥される。ボックス乾燥に適した条件は、例えば、１７５〜１８５℃の範囲の入口温度および９０〜９７℃の範囲の出口温度である。タンパク質は、乾燥前または乾燥中に濃縮し得る。
【００３２】
本発明による方法を使用して、タンパク質は、例えば、新鮮な藻類の総タンパク質を基として、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗ、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも８５％ｗ／ｗ、または少なくとも９０％ｗ／ｗの収率などの高収率で得ることができる。
【００３３】
タンパク質を分離した後の工程（ｉｉｉ）で得られる固相、例えばペレットまたは保持液、は、糖、脂肪、油およびミネラルを含む炭水化物を含む。固相の主成分である炭水化物は、バイオガス、バイオエタノール、バイオプラスチックなどの再生可能エネルギーの生産に使用できる。ミネラルは肥料として使用できる。油脂は、飼料、食品、化粧品、医薬品の用途に使用できる。したがって、タンパク質の抽出後、残りのバイオマスをさらなる価値の抽出に使用できる。
【００３４】
嫌気性消化によってバイオマスからバイオガスを生成するための多くの適切な方法、例えば、１つの反応器を使用する一段階プロセス、２つの反応器を使用する二段階プロセスなど、が公開されており、どちらのプロセスも（ａ）加水分解および酸性化、および（ｂ）酢酸生成またはメタン生成、を含む。二段階プロセスでは、工程（ａ）および（ｂ）は別々の反応器または区画で実施される。これらの工程は両方とも微生物学的に行われ得る。あるいは、例えばＷＯ２０１３／０００９２８に記載されているように、工程（ａ）は、酵素調製物を使用して酵素的に行われ、工程（ｂ）は微生物的に行われる。バイオガス生産の好ましい実施形態では、タンパク質抽出後に残っている固相を二段階プロセスに供し、メタン生成生物による微生物消化の前に最初に酵素処理に供する。酵素組成物中に存在し得る適切な炭水化物分解酵素には、アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１およびＥＣ３．２．１．２）、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８およびＥＣ３．２．１．３２）、ベータ−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．６）、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８およびＥＣ３．１．３．２６）、ホスホリパーゼ（ＰＬＡ１、ＰＬＡ２、ＰＬＢ、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＥＣ３．１．１．４、ＥＣ３．１．４．１１およびＥＣ３．１．４．４）およびポリガラクツロナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）が含まれるが、これらに限定されない。酵素組成物は、１つ以上の炭水化物分解酵素を含み得る。当業者は、酵素の最適な混合物が藻類の種類と季節との間で異なり得ることを理解するであろう。したがって、あらゆる炭水化物分解酵素の混合物が、それが新鮮なまたは新たに収穫された藻類に使用される限り、使用できる。一実施形態では、炭水化物分解酵素は酵素組成物における主要な活性であり、他の実施形態では、炭水化物分解酵素は酵素組成物における副次的またはマイナーな活性である。すべての酵素は、例えば、ＤＳＭ（Ｄｅｌｆｔ、オランダ）から市販されている。酵素製剤は、任意の適切な用量を使用できる。一実施形態では、少なくとも３５００ＣＭＣ  Ｕ／ｇの活性を有するセルロース、少なくとも１００，０００ＢＧＦ／ｇの活性を有するグルカナーゼ、少なくとも１２０，０００ＡＶＪＰ／ｇの活性を有するキシラナーゼ、および、少なくとも５０００ＦＴＵ／ｇの活性を有するフィターゼを含む酵素混合物が使用され、好ましくは１：２：２：１の重量比で酵素を含み、混合物はタンパク質抽出後にバイオマス１ｋｇあたり０．０５ｍｌ用量で使用される。
【００３５】
好ましくは、炭水化物の酵素的加水分解および微生物消化は、別々の反応器または別々の区画で行われる。本発明によるバイオガス製造には、いかなる適切な反応器構成、例えば、連続攪拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）、逐次バッチ反応器（ＳＢＲ）または嫌気性膜バイオリアクター（ＡｎＭＢＲ）を使用できる。好ましくは、上向流嫌気性汚泥ブランケット（ＵＡＳＢ）または拡張粒状汚泥床（ＥＧＳＢ）などのより洗練されたシステムが使用される。
【００３６】
タンパク質画分が最初に除去された新鮮な藻類からのバイオガス生成は、酵素処理の前にタンパク質が除去されなかった従来のバイオガスプロセスと比較して、バイオガスの収量が高くなり、窒素不純物が少ないクリーンなバイオガスになり得るため、非常に有利である。バイオガスの収量は、１２時間の滞留時間で、１０００ｋｇの１００％乾燥重量の藻類当たり、６０％〜８０％、例えば７０％メタンにて、２５０〜６００Ｎｍ３、例えば３００〜５００Ｎｍ３または４００〜５００Ｎｍ３であり得る。一実施形態では、１２時間の滞留時間で、１０００ｋｇの１００％乾燥重量の海藻当たり、７０％メタンにて、４６０Ｎｍ３のバイオガスが、生成された。
【００３７】
したがって、ほとんどまたはすべての藻類タンパク質を除去した後に新鮮な海藻から生成されたクリーンなバイオガスは、本発明の別の態様である。当業者は、バイオガス生産のために固相を分離した後に、タンパク質含有液相からタンパク質が抽出されてもされなくてもよいことを理解するであろう。いずれにしても、クリーンなバイオガスが得られる。したがって、一実施形態では、本発明は、
（ｉ）藻類を浸透圧ショックに供する；
（ｉｉ）ショック処理された藻類を、細胞壁分解酵素を含む酵素組成物で処理する；
（ｉｉｉ）酵素処理された藻類を固相と液相に分離する、ここで、収穫後３時間以内に藻類の酵素処理が開始され、工程（ｉ）から工程（ｉｉｉ）の温度が４〜３０℃の範囲である；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた固相を、好ましくは炭水化物分解酵素を使用する酵素加水分解とそれに続く微生物のメタン生成による、バイオガスの製造に使用する；
（ｖ）任意に、工程（ｉｉｉ）で得られた液相からタンパク質を回収する、
方法に関する。
【００３８】
バイオガスは、好ましくは、カルボヒドラーゼ酵素調製物を用いた固相の酵素的加水分解と、それに続く微生物のメタン生成を含む二段階プロセスによって生成される。あるいは、当技術分野で知られているガス化プロセスを使用して、固相を合成ガスに変換し得る。
【００３９】
他の態様では、本発明は、本発明による方法によって、すなわち、新鮮な藻類を処理することによって得られる藻類タンパク質調製物に関する。新鮮な藻類から得られる藻類タンパク質調製物は、例えば溶解性などの優れた機能性タンパク質特性を有する。その溶解性は、典型的には、乾燥などの保存された海藻から調製されたタンパク質の溶解性よりも、例えば２倍または３倍優れる。一実施形態では、新鮮な藻類から得られたタンパク質調製物は、ｐＨ３〜１０の範囲のｐＨで分散させた総タンパク質に基づいて、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、または少なくとも７０％ｗ／ｗの溶解度を有する。溶解性はＮａＣｌの存在下でも良好であり、通常、乾燥などの保存された海藻から調製したタンパク質の溶解性の、例えば３倍または４倍優れる。一実施形態では、新鮮な藻類から得られたタンパク質調製物は、分散させた総タンパク質に基づいて、ＮａＣｌの存在下で少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗまたは少なくとも８０％ｗ／ｗの溶解度を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質は、０．０５〜３％ｗ／ｖ  ＮａＣｌの範囲の任意のＮａＣｌ濃度で１ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。一実施形態では、本発明によるタンパク質は、ｐＨ３〜１０の範囲の任意のｐＨで、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗまたは少なくとも８０％ｗ／ｗの溶解度、０．０５〜３％ｗ／ｖ  ＮａＣｌの存在下で、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗ、または少なくとも８０％ｗ／ｗの溶解度を有する。異なるｐＨ値またはＮａＣｌ濃度での溶解度は、例えば、脱塩水に一定量の乾燥生成物を分散させ、次にリン酸または水酸化ナトリウムでｐＨを設定するか、ＮａＣｌで塩濃度を設定し、次に分散液／溶液を遠心分離することで測定できる。可溶化されたタンパク質は、例えば、ＰｉｅｒｃｅＴＭＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ、オランダ）などの市販のキットを使用し、分光計で５６２ｎｍの吸収を測定することにより、上清で測定できる。タンパク質は、７．５〜８．５の範囲のｐＨに等電点を有し得る。
【００４０】
当業者は、得られるタンパク質の正確なアミノ酸組成が海藻の種類によって異なり得ることを理解するであろうが、本発明によるタンパク質は高レベルの、例えば総アミノ酸の重量に基づいて少なくとも１０％ｗ／ｗまたは少なくとも１５％ｗ／ｗ、のアスパラギンまたはグルタミンを有し得る。それはまた、例えば総アミノ酸の重量に基づいて少なくとも５％ｗ／ｗ、少なくとも７％ｗ／ｗまたは少なくとも１０％ｗ／ｗの実質的な量のグリシン、プロリンまたはアラニンを有し得る。
【００４１】
タンパク質はまた、良好な栄養特性ならびに起泡性、乳化性または水結合性などの機能的特性を有し得、そして多くの用途、特に食品、製薬および化粧品ならびに飼料用途で使用され得る。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、以下の特徴：
ａ）総アミノ酸重量に基づいて、少なくとも１０％ｗ／ｗまたは少なくとも１５％ｗ／ｗのアスパラギンまたはグルタミンを含む；
ｂ）総アミノ酸重量に基づいて、少なくとも５％ｗ／ｗ、少なくとも７％ｗ／ｗまたは少なくとも１０％ｗ／ｗのグリシン、プロリンまたはアラニンを含む；
ｃ）ｐＨ３から１０の範囲の任意のｐＨにおいて、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗまたは少なくとも８０％ｗ／ｗの溶解度を含む；
ｄ）０．０５〜３％ｗ／ｖ  ＮａＣｌの範囲の任意のＮａＣｌ濃度において、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗ、または少なくとも８０％ｗ／ｗの溶解度；
ｅ）０．０５〜３％ｗ／ｖ  ＮａＣｌの範囲の任意のＮａＣｌ濃度において、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの溶解度を含む； 
ｆ）ｐＨ７〜ｐＨ９の範囲のｐＨに等電点を含む；
ｇ）卵タンパク質に匹敵する乳化特性を含む、
のうちの２つ以上を含む藻類タンパク質またはタンパク質調製物に関する。一実施形態では、本発明による藻類タンパク質またはタンパク質調製物は、これらすべての特徴を有する。
【００４３】
他の態様では、本発明は、本発明の処理方法に従って藻類を処理するための装置１（図１）に関する。装置１は可動式であり、したがって、収穫場所に移動する、または収穫場所に運搬することができる。この装置は、収穫、清掃および洗浄のための収穫ユニット２；収穫物の酵素消化のための処理ユニット３；およびタンパク質の分離および濃縮のための回収ユニット４、を含む。装置は、任意に、嫌気性消化処理ユニット６、６からの生成物の回収、任意に濃縮、のための回収ユニット７、および回収ユニット４または７からの生成物の配合のための配合ユニット５をさらに含み得る。装置は、藻類が繁殖したり、成長したり、養殖されたりする場所、例えば船、はしけ、船舶など、に航行できる、または牽引できるモバイルユニットを含んでもよく、またはモバイルユニット内、上、またはモバイルユニットに設置してもよい。このようにして、年間の特定の時期に藻類が存在する特定の場所で藻類を収穫することができる。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、藻類を処理する方法に関し、この方法は、
（ｉ）藻類を浸透圧ショックに供する；
（ｉｉ）ショック処理された藻類を、細胞壁分解酵素を含む酵素組成物で処理する；
（ｉｉｉ）酵素処理された藻類を固相と液相に分離する、ここで、収穫後３時間以内に藻類の酵素処理が開始され、工程（ｉ）から工程（ｉｉｉ）の温度が４〜３０℃の範囲である；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の液相を乾燥して、好ましくは噴霧乾燥によってタンパク質を得る；
（ｖ）任意に、工程（ｉｉｉ）で得られた固相をバイオガス、バイオプラスチック、またはバイオエタノールの製造に使用する、
ここで、工程（ｉ）から工程（ｖ）は、本発明によるモバイル装置上でオフショアで実施される、
を含む。
【００４５】
当業者は、上記の実施形態を組み合わせて新しい実施形態を形成することができることを理解するであろう。処理方法について述べた実施形態および好ましい実施形態はまた、タンパク質、バイオガス、ミネラルストリームおよびモバイル装置などの本発明による処理方法の生成物に適用され得、逆もまた同様である。
【実施例】
【００４６】
材料および方法
酵素調製Ａ
細胞内容物の放出に使用された酵素調製物は、以下の酵素を含んでいた（特に明記されていない限り、すべてＤＳＭ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）。
−２ｍｌ  セルラーゼ（Ｆｉｌｔｒａｓｅ  ＢＲＸ）
−２ｍｌ  キシラナーゼ（Ｆｉｌｔｒａｓｅ  ＮＬＣ）、
−２ｍｌ  アミラーゼ（ＭＡＴＳ  ｃｌａｓｓｉｃ）、
−２ｍｌ  フィターゼ（Ｐｈｙｔａｓｅ  ５０００Ｌ）、
−２ｍｌ  ホスホリパーゼＡ２（Ｐｕｒｉｆｉｎａｅ  ＰＬＡ２）、および
−９０ｍｌ  脱塩水
−２ｇ  ベータ−グルカナーゼ／エンドキシラナーゼ（Ｂａｔｔｏｎａｇｅ、Ｏｅｎｏｂｒａｎｄｓ、Ｍｏｎｔｆｅｒｒｅｒ−ｓｕｒ−ｌｅｚ、フランス）、前述の酵素を液体状態で穏やかに攪拌しながら溶解した。
酵素調製物を希釈する場合、酵素調製物を脱塩水で希釈した。
【００４７】
実施例１  本発明による方法を使用する緑藻の処理
新鮮な緑藻（Ｕｌｖａ  Ｌａｃｔｕｃａ、５ｋｇ）を収穫し、最大でも２０℃の温度の過剰な新鮮な海水を使用して洗浄した。付着した水を低速遠心分離で除去した。次に、５リットルの脱塩冷水を加え、ブレンダーで約１平方ｍｍの断片が得られるまで混合物を細断した。細断されたバイオマスは２つの部分に分けられた。一方の部分には、対照として、２５ｍｌの脱塩水を加えた。もう一方の部分は、収穫後１時間以内に細胞内容物を放出するために、１０倍に希釈した酵素調製物Ａ  ２５ｍｌとともにインキュベートした。
【００４８】
両方の部分を室温で２４時間攪拌し（実際には２０℃未満）、４℃、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。ペレットを脱塩水中に再懸濁し、再度遠心分離し、上清を収集して最初の上清に加えた。収集された上清は、さらなる分析まで凍結された。さらなる分析は、上清がタンパク質を含んでいたことを示した。これは、本発明による穏やかなプロセスを使用して、タンパク質を藻類から分離できることを示す。上澄みを噴霧乾燥することによりタンパク質を乾燥させ、さらなる分析のために保存した。
【００４９】
実施例２  本発明による方法を使用する紅藻の処理
新鮮な紅藻（Ｇｒａｃｉｌｌａｒｉａ、５  ｋｇ）を収穫し、最大でも２０℃の温度の過剰な新鮮な海水を使用して洗浄した。付着した水を低速遠心分離で除去し、約１平方ｍｍの断片に切断して、さらに収穫後２時間以内の酵素処理を含む、実施例１に記載のとおりに処理した。回収された上清は、さらなる分析まで凍結された。さらなる分析により、Ｇｒａｃｉｌｌａｒｉａの上清はタンパク質を含むことが示された。また、他の種類の紅藻、新鮮なＣｈｏｎｄｒｕｓを収穫し、収穫後２時間以内の酵素処理を含む、実施例１に記載のプロトコルを使用して処理した。回収された上清は、さらなる分析まで凍結された。さらなる分析により、Ｃｈｏｎｄｒｕｓの上清はタンパク質を含むことが示された。これは、本発明による穏やかなプロセスを使用してタンパク質を紅藻から単離できることを示す。
【００５０】
実施例３  本発明による方法を使用する褐藻の処理
新鮮な褐色藻類（Ｆｕｃｕｓ）を収穫し、最大でも２０℃の温度の過剰な新鮮な海水を使用して洗浄した。付着した水を低速遠心分離で除去し、藻類を約１平方ｍｍの断片に切断して、さらに収穫後２時間以内の酵素処理を含む、実施例１に記載のとおりに処理した。回収された上清は、さらなる分析まで凍結された。さらなる分析は、上清がタンパク質を含むことを示した。この例は、本発明による方法が、褐藻からのタンパク質単離にも使用できることを示す。
【００５１】
実施例４  カスケードプロセスでのタンパク質の分離とバイオガスの生産のための新鮮なＵｌｖａの大規模処理。
緑藻（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ、７６ｋｇ）を収穫し、最大でも２０℃の温度の過剰な新鮮な海水を使用して洗浄した。付着した水を低速遠心分離で除去した。海藻１ｋｇの部分を１リットルの脱塩水と混合し、ロボットクーペカッターＲ１０で約１平方ｍｍの断片に細断した。追加の１リットルの脱塩水と、細断した海藻を新しい１０００リットルのＩＢＣに入れた。合計７６ｋｇのＵｌｖａを、収穫後３時間以内に穏やかに攪拌しながら６００リットルの脱塩水と２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション期間の初めに、酵素調製物Ａ（５００ｍｌの酵素混合物／１０００ｋｇの１００％乾物バイオマス）を加えた。インキュベーション期間の後、残りの海藻固形物を、４回折りたたまれたチーズクロスで全スラリーを濾過することにより除去した。液体、タンパク質含有画分、チーズクロスを通過する濾液を収集し、入口温度１８０℃、出口温度９４℃のボックスドライヤー（Ｓａｎｏｖｏ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａ／Ｓ、Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク）を使用して上清を噴霧乾燥することによりタンパク質を乾燥させた。次に、噴霧乾燥タンパク質を、以下の実施例に記載されるように特徴付けた。本発明による方法のタンパク質抽出効率は、表１に示され、乾燥重量に基づいて、そして出発原料中に存在する総タンパク質のパーセンテージとして、約８１％ｗ／ｗであった。タンパク質は、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ、オランダ）を使用して測定した。
【００５２】
【表１】
2021507724.tif 000002
【００５３】
タンパク質抽出後、炭水化物を可能な限り加水分解して溶液にするため、次に、チーズクロスに保持された固形分を、セルラーゼＭｅｔｈａｐｌｕｓ  Ｌ１００（＞３５００ＣＭＣ  Ｕ／ｇ）／グルカナーゼＡｘｉａｓｅ１００（＞１２００００ＡＶＪＰ／ｇ）／キシラナーゼＦｉｌｔｒａｓｅ  ＮＬＣ（＞１０００００ＢＧＦ／ｇ）およびフィターゼＭａｘａｍｙｌ  Ｐ（＞５０００ＦＴｕ／ｇ）；を１：２：２：１の重量比で含むカルボヒドラーゼ酵素調製物（すべての酵素はＤＳＭ、Ｄｅｌｆｔ、オランダから）を湿重量バイオマス１ｋｇあたり０．０５ｍｌ（ミックス）を投与して、４８時間再インキュベートした。これらの加水分解された固形物は、バイオガスとミネラルに富む水流を生成するために嫌気性消化装置（ＨｙｄｏｔｈａｎｅのＥＧＳＢ−ｓｋｉｄ）に移された。ミネラル流は肥料として使用し得る。バイオガス変換は、ｐＨ安定剤も追加の栄養素も必要がないことを示し、１２時間の滞留時間で、７０％メタンで４６０Ｎｍ３バイオガス／１０００ｋｇ  １００％乾燥重量の海藻の結果を達成できた。これは、すべての微生物プロセスが使用された、すなわち酵素処理なしの場合、または最初にタンパク質を抽出せずに全海藻が使用された場合に予想されるよりもはるかに高い収量である。
【００５４】
実施例５  本発明の方法に従って分離されたＧＯＡタンパク質のＳＤＳページ分析。
実施例４で得られた噴霧乾燥タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：５２５９に従って行った。海藻を熱風で乾燥させ、フレークに粉砕し、８週間保存してからタンパク質を分離して、Ｕｌｖａから取得したタンパク質試料（Ｈｅｌｌｏ  Ｓｅａｗｅｅｄ、Ｆｕｚｈｏｕ  Ｂｅａｕｔｉｆｕｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ、中国）を参照として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、両方のサンプルを真水にさらした。どちらも穏やかに攪拌しながら、乾燥した海藻試料は数時間の再水和時間に、ＧＯＡサンプルは同じ時間で再溶解した。遠心分離後、ペレットを捨て、タンパク質を含む上清を回収した。各サンプルのアリコートを上澄みからピペットで取り、抽出バッファー（１．５％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）で希釈して同様のタンパク質濃度にした。ゲルタンパク質のバンドは、ｆａｓｔ−ｓｔａｉｎ  ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅゲル（ＳＥＲＶＡ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）で作成された。ゲル分析はフリーウェア：ＧｅｌＡｎａｌｙｚｅｒ２０１０で行われた。６ｋＤａ−６７ｋＤａのマーカーセットが使用された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、新鮮なＵｌｖａ海藻から得られたＧＯＡタンパク質試料が、乾燥材料から得られたＵｌｖａ参照試料よりも４０ｋＤａより大きい分子サイズを有するより多くのタンパク質を含むことを示した。ＧＯＡサンプルには、２７〜３０ｋＤａのタンパク質でほぼ２倍の量があり、６ｋＤａの範囲のサイズが小さいタンパク質が少なくなっている（表２）。これらの結果は、新鮮な海藻から得られたタンパク質試料は、乾燥した海藻からの試料よりも無傷のタンパク質が多く、分解されたタンパク質が少ないことを示している。より完全なタンパク質は、より機能的なタンパク質であることも意味する。タンパク質の分解は、乳化、粘度、ヒートセットゲル化などの機能特性に有害である。
【００５５】
【表２】
2021507724.tif 000003
【００５６】
実施例６  本発明によるタンパク質サンプルのアミノ酸組成
実施例４の噴霧乾燥タンパク質試料のアミノ酸組成は、酸加水分解およびＨＰＬＣによって測定され、表３に提示される。タンパク質は、高レベルのアスパラギン（総アミノ酸の１５％）およびグルタミン（アミノ酸の２０％）ならびに相当量のグリシン、プロリンおよびアラニンを含んでいた。
【００５７】
【表３】
2021507724.tif 000004
【００５８】
実施例７  異なるｐＨ値でのタンパク質溶解度
実施例４で得られた噴霧乾燥タンパク質試料（ＧＯＡ試料）のタンパク質溶解度を分析するために、ＧＯＡタンパク質試料の１ｇの乾燥品を１００ｍｌの脱塩水中に分散させた。乾燥し、粉砕したＵｌｖａから得た試料も同じ実験を実施した。Ｕｌｖａの試料は、２ｇの乾燥したＵｌｖａ／１００ｍｌの脱塩水を使用して、同等の量のタンパク質を試験においてロードした。分散液は、リン酸（低ｐＨ）と水酸化ナトリウム（高ｐＨ）でｐＨ３、４、４．５、５、６、７、８、９に設定した。次に、分散液／溶液を遠心分離した。それぞれの試験管の上清から１００マイクロリットルのアリコートをピペットで取り、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ／ＶＩＳ分光計を５６２ｎｍで使用して、ＰｉｅｒｃｅＴＭＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ、オランダ）での可溶性タンパク質分析に適した濃度範囲に希釈した。次に、測定されたタンパク質ｍｇ／ｍｌは、ＢＣＡアッセイで使用されたサンプル重量と希釈係数に対して補正される。海藻タンパク質の溶解度はほとんど変化せず、比較的一定であった。表４は、Ｕｌｖａタンパク質とＧＯＡタンパク質の溶解度の比較であり、ＧＯＡタンパク質試料の溶解度がＵｌｖａ参照試料の溶解度よりも３〜１２倍高いことを明確に示す。ＧＯＡタンパク質試料の平均タンパク質溶解度は５倍である。結果は、Ｕｌｖａの変動性が３８％であるのに対し、ＧＯＡの変動性はわずか５％であることを示す。これは、ＵｌｖａがＧＯＡよりもｐＨにはるかに敏感であり、ＵｌｖａがｐＨ６で最小の溶解度を示すことを示している。海藻は、溶解度がはるかに高く、乾燥海藻からのタンパク質試料よりもｐＨ範囲全体ではるかに一定なタンパク質試料の調製を可能にする。
【００５９】
【表４】
2021507724.tif 000005
【００６０】
提示された結果は、３つのタンパク質試料の異なる等電点も示す。溶解度の低下は、等電点を示す。このように、ＧＯＡ試料はｐＨ８付近、Ｕｌｖａ参照試料はｐＨ６付近の等電点である。これらの結果は、新鮮な海藻から分離されたタンパク質は、異なる等電点を持つタンパク質であり、その結果、用途において異なるｐＨ挙動を示す。
【００６１】
【表５】
2021507724.tif 000006
【００６２】
実施例８  新鮮な海藻からのタンパク質試料の塩分感受性
異なる濃度のＮａＣｌの存在下でのタンパク質の溶解度を分析するために、実施例４で得られた噴霧乾燥タンパク質試料（ＧＯＡ試料）の１ｇを１００ｍｌの脱塩水に分散させた。卵アルブミン（ＥＡ）試料と、乾燥して粉砕したＵｌｖａから得た試料について、参照として同じ実験を実施した。Ｕｌｖａ試料は、２ｇを使用して、試験において同等の量のタンパク質をロードした。ＧＯＡ、Ｕｌｖａ、およびＥＡからの可溶化タンパク質を脱塩水で希釈して、試料の塩分効果を減らした。次に、希釈した試料を０〜３％のＮａＣｌ濃度に設定した。タンパク質溶液を遠心分離し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ／ＶＩＳ分光計を５６２ｎｍで使用して、ＰｉｅｒｃｅＴＭＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｌｅｉｊｓｗｉｊｋ、オランダ）での可溶性タンパク質分析のために、各サンプルの上清から１００μｌをピペットで採取した。次に、測定されたタンパク質ｍｇ／ｍＬは、ＢＣＡアッセイで使用された試料重量と希釈係数に対して補正された。測定は２回行った。すべての塩濃度で、ＧＯＡタンパク質試料はＵｌｖａ試料よりもはるかに高い溶解度を有する。Ｕｌｖａの場合、平均して塩濃度の増加に対して４４±１２ｍｇのタンパク質が可溶性であった。ＧＯＡの場合、１９２±１１ｍｇのタンパク質は塩のパーセンテージの増加に対して可溶性であった。ＮａＣｌの存在下での溶解度のパーセンテージを表６に示す。ＧＯＡの平均タンパク質溶解度はＵｌｖａの４倍であり、Ｕｌｖａの変動性は２７％であるが、ＧＯＡの変動性はわずか６％である。Ｕｌｖａは塩分濃度の変化により敏感であることを示す。これは、本発明に従って得られた新鮮な海藻からのタンパク質試料が、乾燥海藻からのタンパク質試料よりも高い溶解度を有し、その安定性は高い塩濃度によって影響されないことを示す。
【００６３】
【表６】
2021507724.tif 000007
【００６４】
実施例９  スポンジケーキの調製
標準レシピ（イタリアンケーキバージョン）：全卵粉９グラム、水２２１グラム、砂糖２１０グラム、小麦粉１５０グラム、バレイショデンプン７５グラム。全卵粉末は、大豆、ホエイ、ヒマワリからのタンパク質または本発明によるＧＯＡタンパク質で置き換えられた。混合物を、Ｈｏｂａｒｔ  Ｎ５０を使用して生地に練り込んだ。生地を１０ｃｍの円に切ってケーキを調製した。生地をオーブンで１８０℃で２２分間、ケーキが金色／黄色になるまで焼成した。ケーキをオーブンから取り出し、冷却した。海藻（ＧＯＡ）タンパク質から調製されたケーキは、全卵タンパク質からのケーキに匹敵する非常に素晴らしい外観を有していた。（ＧＯＡ）海藻ケーキは、触ると崩れるかまたは非常に荒い／均一でない表面を有する大豆、ホエイ、ヒマワリのような他のタンパク質からのケーキとは異なり、丸い形を維持して崩れなかった。これは、生地のコンシステンシーとベーキング特性のために、ＧＯＡ（海藻）タンパク質を全卵粉の代わりとして使用できることを示す。
【００６５】
実施例１０  ７５％マヨネーズの調製
標準レシピ（Ｓａｎｏｖｏ  ｅｇｇ  ｇｒｏｕｐ）を使用した：１５％の卵黄粉末、１０７グラムの水、２グラムの塩、３７５グラムの（キャノーラ）油、および１０グラムの酢。定速ミキサー（Ｂｏｓｃｈ  ３００Ｗタイプ４１７９またはＨｏｂａｒｔ  Ｎ５０）を使用して、穏やかで連続した順序ですべて追加して混合した。エマルションを安定化させるために２〜５℃で２４時間保存した。２４時間後、粘度を測定した。比較のために、卵黄粉末をＧＯＡ（海藻）タンパク質、大豆、エンドウ豆、ヒマワリのタンパク質に置き換えた。また、全卵粉末／ＧＯＡ（海藻）タンパク質ミックス（５０／５０）も試験された。
【００６６】
実施例４で得られた海藻（ＧＯＡ）タンパク質からのマヨネーズは、良好なコンシステンシーであった。大豆タンパク質−マヨネーズエマルジョンまたはエンドウ豆タンパク質−マヨネーズエマルジョンは、形成される前から壊れていた。これは、ＧＯＡタンパク質が卵黄に匹敵する優れた乳化特性を有することを示す。また、ＧＯＡタンパク質乳濁液のすくいやすさと塗抹性も優れていた。全卵粉／ＧＯＡタンパク質の混合物は、個々の純粋なタンパク質よりも性能が劣ることはなかった。
【００６７】
ＧＯＡタンパク質で観察された主な違いとして、エマルジョンの離液が非常に低かった。後者は、ＧＯＡタンパク質が全卵粉末と比較してより安定したエマルジョンを形成し、大豆、エンドウマメまたはヒマワリタンパク質の他の試験されたエマルジョンよりも明らかに安定したエマルジョンを形成することを示している。２〜５℃で４週間冷蔵保存した後、ＧＯＡ（海藻）タンパク質乳濁液にはまだ離液はなかったが、他のすべてはほぼ完全に液体となった。すべての試料でカビが発生したため、実験は中止された。結論として、ａ）本発明による方法によって分離されたタンパク質は、優れたエマルジョン形成を可能にする。ｂ）本発明によるタンパク質と卵の混合物は、エマルジョンの特性を損なわなかった。ｃ）本発明によるタンパク質は、大豆タンパク質、ホエイタンパク質、ヒマワリタンパク質、またはエンドウ豆タンパク質などの試験されたタンパク質よりもはるかに低い離液を示し、食品用途におけるそのようなエマルジョンの使用に新しい機会を提供する。
【図１】
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【国際調査報告】
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