(57)【要約】  本発明は、概して、自己免疫障害を含む神経学的障害及び他の障害を治療する方法に関する。本発明の一態様は、骨髄分化一次応答８８（ＭｙＤ８８）への結合によるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）活性化が疾患の病態形成において役割を果たす障害を治療する方法に関し、一実施形態では、方法は、ＭｙＤ８８によるＴＬＲ２の活性化を阻害する、ペプチド配列を含む組成物の投与を含む。【選択図】図１８Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における障害を治療する方法であって、前記治療を必要とする前記患者に、治療的有効量の、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインを含むペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、前記治療的有効量は、少なくともＴＬＲ２−ＭｙＤ８８シグナル伝達を減少させる量であり、前記障害は、ＴＬＲ２−ＭｙＤ８８シグナル伝達が疾患の病態形成において役割を果たすものである、方法。
【請求項２】
前記ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインは、配列ＰＧＡＨＱＫ（配列番号１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインは、６〜１０個のアミノ酸を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドは、アンテナペディアホメオドメインをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アンテナペディアホメオドメインは、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインを含む前記ペプチドのＣ末端に連結する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ペプチド配列は、ｄｒｑｉｋｉｗｆｑｎｒｒｍｋｗｋｋｐｇａｈｑｋ（配列番号２）である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドは、細胞内送達細胞及び血液脳関門を越えるアクセスの少なくとも１つを提供する送達ベクターに連結する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記送達ベクターは、アンテナペディアホメオドメインであり、前記送達ベクターは、前記ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインを含む前記ペプチドのＣ末端に連結する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ハンチントン病及び多系統萎縮症からなる群から選択される神経学的障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記障害は、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、ウイルス感染症、敗血症及び脳膿瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記障害は、多発性硬化症及びリウマチ様関節炎からなる群から選択される自己免疫障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、鼻腔内投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物は、経口、皮下、関節内、皮内、静脈内、腹腔内及び筋肉内経路からなる群から選択される経路によって投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者は、ヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
患者における障害を治療する方法であって、前記治療を必要とする前記患者に、治療的有効量の、配列ＰＧＡＨＱＫ（配列番号１）を含むペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、前記治療的有効量は、少なくともＴＬＲ２−ＭｙＤ８８シグナル伝達を減少させる量であり、前記障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ハンチントン病及び多系統萎縮症からなる群から選択される神経学的障害である、方法。
【請求項１７】
前記ペプチドは、６〜１０個のアミノ酸を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドは、アンテナペディアホメオドメインをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記アンテナペディアホメオドメインは、前記配列ＰＧＡＨＱＫ（配列番号１）のＣ末端に連結する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ペプチド配列は、ｄｒｑｉｋｉｗｆｑｎｒｒｍｋｗｋｋｐｇａｈｑｋ（配列番号２）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞内送達細胞及び血液脳関門を越えるアクセスの少なくとも１つを提供する送達ベクターに連結されるペプチド配列ＰＧＡＨＱＫ（配列番号１）を含む組成物。
【請求項２２】
前記送達ベクターは、アンテナペディアホメオドメインである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ペプチド配列ｄｒｑｉｋｉｗｆｑｎｒｒｍｋｗｋｋｐｇａｈｑｋ（配列番号２）を含む、請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、２０１８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６１２，９０６号明細書の出願日の優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究及び開発の下でなされた発明に対する権利に関する声明
本発明は、米国陸軍医学研究・兵器司令部（Ｗ８１ＸＷＨ−１２−１−００６５）及びＮＩＨ（ＡＧ０５０４３１）からの助成金、アルツハイマー協会からのゼニス・フェロー賞（ＺＥＮ−１７−４３８８２９）及び米国退役軍人局からの功労賞（１Ｉ０１ＢＸ００３０３３）の政府支援を受けて実施された。連邦政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、自己免疫障害を含む神経学的障害及び他の障害を治療する方法に関する。本発明の一態様は、骨髄分化一次応答８８（ＭｙＤ８８）への結合によるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）活性化が疾患の病態形成において役割を果たす障害を治療する方法に関する。一実施形態では、方法は、ＭｙＤ８８によるＴＬＲ２の活性化を阻害する、ペプチド配列を含む組成物の投与を含む。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶喪失をもたらす最も一般的なヒト神経変性障害である。ＡＤは、遺伝的、環境的及び生活習慣的因子の混合物の影響を受ける多因子性障害であると広く考えられている（１−３）。神経病理学的に、ＡＤは、老人斑及び神経原線維の濃縮体（ＮＦＴ）の存在によって特徴付けられる（４−６）。いくつかの研究（７−１３）も、グリア活性化とそれに伴う炎症とが疾患病態形成において重要な役割を果たしていること、及び神経炎症の調節がＡＤにおける神経変性の減弱に治療的利益を有し得ることを示唆している。
【０００５】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、主に細菌、細菌産物、ウイルス、ウイルス産物及びフラジェリンに応答することにより、自然免疫と適応免疫との間の重要な接点として機能する（１４、１５）。現在、１１種の異なるＴＬＲがヒトに存在することが報告されており、全ての主要なＣＮＳ細胞型は、ＴＬＲを発現することが知られている（１５、１６）。しかし、小グリア細胞は、これまでに知られているほぼ全てのＴＬＲを発現する、ＣＮＳの唯一の細胞である（１６）。ＴＬＲ３の他に、全てのＴＬＲは、下流シグナル伝達のためにＭｙＤ８８を必要とする（１４、１５）。本発明者ら（１７）及び他の研究者ら（１８、１９）は、小繊維Ａβペプチドが小グリア細胞の炎症のためにＴＬＲ２を必要とすることを示した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、患者における障害を治療する方法であって、障害は、ＴＬＲ２−ＭｙＤ８８シグナル伝達が疾患の病態形成において役割を果たすものである、方法を提供する。一実施形態では、方法は、このような治療を必要とする患者に、治療的有効量の、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインを含有するペプチドを含む組成物を投与するステップを含む。治療的有効量は、少なくともＴＬＲ２−ＭｙＤ８８シグナル伝達を減少させる量である。
【０００７】
一実施形態では、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインは、配列ＰＧＡＨＱＫ（配列番号１）を含む。別の実施形態では、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインは、配列ＰＧＡＨＱＫ（配列番号１）を含む６〜１０個のアミノ酸を含有する。なおも別の実施形態では、ペプチドは、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインを含むペプチドのＣ末端に連結するアンテナペディアホメオドメインをさらに含む。別の実施形態では、ペプチド配列は、ｄｒｑｉｋｉｗｆｑｎｒｒｍｋｗｋｋｐｇａｈｑｋ（配列番号２）である。なおも別の実施形態では、ペプチドは、細胞内送達細胞及び血液脳関門を越えるアクセスの少なくとも１つを提供する送達ベクターに連結する。
【０００８】
特定の実施形態では、障害は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ハンチントン病又は多系統萎縮症などの神経学的障害である。他の実施形態では、障害は、例えば、多発性硬化症又はリウマチ様関節炎などの自己免疫障害である。なおも他の実施形態では、障害は、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、ウイルス感染症、敗血症又は脳膿瘍である。
【０００９】
本発明の別の態様は、細胞内送達細胞及び血液脳関門を越えるアクセスの少なくとも１つを提供する送達ベクターに連結するペプチド配列ＰＧＡＨＱＫ（配列番号１）を含む組成物を提供する。一実施形態では、送達ベクターは、アンテナペディアホメオドメインである。別の実施形態では、組成物は、配列ｄｒｑｉｋｉｗｆｑｎｒｒｍｋｗｋｋｐｇａｈｑｋ（配列番号２）を有するペプチドを含む。
【００１０】
組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体も含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、鼻腔内投与される。他の実施形態では、組成物は、経口、皮下、関節内、皮内、静脈内、腹腔内及び筋肉内経路からなる群から選択される経路によって投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−Ｓ】認知機能障害なし（ＮＣＩ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）と臨床的に診断された症例のＣＮＳにおけるＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＭｙＤ８８のレベルのモニタリングである。ＮＣＩ（淡青色）、ＭＣＩ（濃青色）及びＡＤ（灰色）からの前頭前皮質ホモジネート（２５μｇ）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＭｙＤ８８について免疫ブロットされた。アクチンを使用して、濃度測定（ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ）によって得られた信号を正規化した。クーマシーを使用して、タンパク質負荷が検証された。１２のＮＣＩ症例、１１のＭＣＩ症例及び１０のＡＤ症例は、３回の独立した実験で泳動された。ＭｙＤ８８（Ｂ）は、ＮＣＩ（ｐ＜．００１）及びＭＣＩ（ｐ＜．００１）の両方と比較してＡＤで有意に上昇した。クラスカル・ワリス検定によると、ＴＬＲ２（Ｃ）は、ＭＣＩ対象（ｐ＜．０５）と比較してＡＤで有意に高かった。ＴＬＲ４（Ｄ）は、３群間で有意差がなかった。クラスカル・ワリス検定によると、ＭｙＤ８８（Ｅ；．３７１、ｐ＝．０３３）及びＴＬＲ２（Ｆ；．４６３、ｐ＝．００７）は、Ｂｒａａｋスコアと正に相関した。ＴＬＲ４（Ｇ；−．０１２、ｐ＝．９４７）とＢｒａａｋスコアとの間にこのような相関は認められなかった。ＭｙＤ８８は、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）スコア（Ｈ；−．５３８、ｐ＝．００１）及び全体的認知性ｚスコア（ＧＣＳ）指標（Ｉ；−．４７５、ｐ＝−．００５）と負に相関した。しかし、ＴＬＲ２と、ＭＭＳＥ（Ｊ；−．２７８、ｐ＝．１１７）及びＧＣＳ（Ｋ；−．１７７、ｐ＝．３２６）とでは、負の相関は、有意でなかった。ＴＬＲ４は、ＭＭＳＥ（Ｌ；−．１７３、ｐ＝．３３６）及びＧＣＳ（Ｍ；．０４７、ｐ＝．７９４）とも負の相関がなかった。ｋＤａ、キロダルトン；ＯＤ、光学濃度。ＮＣＩ及びＡＤ脳の海馬切片は、Ｉｂａ−１（小グリア細胞）とＴＬＲ２、又はＴＬＲ４、又はＭｙＤ８８とで二重標識された。ＴＬＲ２（Ｎ、皮質；Ｏ、ＣＡ１）、ＭｙＤ８８（Ｐ、皮質；Ｑ、ＣＡ１）及びＴＬＲ４（Ｒ、皮質；Ｓ、ＣＡ１）に対して陽性の細胞は、４つの異なる症例のそれぞれの２枚の切片（１スライド当たり２枚の画像）でカウントされた。ａｐ＜０．００１対ＮＣＩ、２標本ｔ検定による。ＮＳ、有意でない。
【図２Ａ−Ｈ】ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８の相互作用を破壊するためのペプチドの設計である。（Ａ）マウスのＴＬＲ２（青色）及びＭｙＤ８８（緑色）の剛体インシリコドッキングポーズ（静電エネルギー＝−７．７５０ＫＣａｌ／ｍｏｌ；脱溶媒和エネルギー＝−２４．９９Ｋｃａｌ／ｍｏｌ；ＶＤＷエネルギー＝１０５．２５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ；総エネルギー＝−２２．２１６ＫＣａｌ／ｍｏｌ）は、ＭｙＤ８８のＣＤループの２４５〜２５０個のアミノ酸とＴＬＲ２のＢＢループとの間の強い相互作用を示す。そのため、ＭｙＤ８８（ＴＩＤＭ）のこのドメインに対応するペプチドを使用して、ＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の相互作用が解離される。Ｂ）ＴＬＲ２−ＭｙＤ８８相互作用は、ｗｔＴＩＤＭペプチドと複合体化された（静電エネルギー＝−４．５１６ＫＣａｌ／ｍｏｌ；脱溶媒和エネルギー＝−２４．０２７ＫＣａｌ／ｍｏｌ；ＶＤＷエネルギー＝１６．７２４ＫＣａｌ／ｍｏｌ；総エネルギー＝−２６．８７１ＫＣａｌ／ｍｏｌ）。Ｃ）ｃＭｙｃタグ付きＣ末端ＴＬＲ２（ｃＴＬＲ２）組換えタンパク質の生成。増加する用量のｗｔＴＩＤＭ（Ｄ）及びｍＴＩＤＭ（Ｅ）とｃＴＬＲ２との生体外結合親和性は、表面プラズモン共鳴分析を用いて調べられた（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／用量）。Ｆ）ｗｔＴＩＤＭ（丸）及びｍＴＩＤＭ（四角）ペプチドの濃度と対比した結合応答値のプロット。Ｇ）ｃＴＬＲ２タンパク質（黒色）単独及びｗｔＴＩＤＭ（緑色）との融解曲線。熱シフト分析は、融解温度の４．９６℃のシフト（ΔＴｍ）を示した（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／用量）。Ｈ）ｃＴＬＲ２タンパク質（黒）単独及びｍＴＩＤＭペプチド（赤）との融解曲線は、０．８７℃のΔＴｍを示した（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／用量）。
【図３Ａ−Ｌ】ｗｔＴＩＤＭによる、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８の相互作用の選択的破壊である。ｗｔＴＩＤＭと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９との相互作用のインシリコ分析。剛体相互作用分析は、インシリコ解析ツールｐｙｄｏｃｋを使用して実施された。ＴＬＲ１−ｗｔＴＩＤＭ（Ａ）、ＴＬＲ４−ｗｔＴＩＤＭ（Ｂ）、ＴＬＲ５−ｗｔＴＩＤＭ（Ｃ）、ＴＬＲ６−ｗｔＴＩＤＭ（Ｄ）、ＴＬＲ７−ｗｔＴＩＤＭ（Ｅ）及びＴＬＲ９−ｗｔＴＩＤＭ（Ｆ）の複合体が示された。Ｇ）ｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドと共に１時間プレインキュベートされたＢＶ−２小グリア細胞は、無血清条件下において１μＭの小繊維Ａβ１−４２で刺激された。１時間後、細胞抽出物は、抗ＭｙＤ８８抗体で免疫沈降され、ＴＬＲ２の免疫沈降物のウエスタンブロットがそれに続いた。対照として、細胞抽出物が正常なＩｇＧで免疫沈降された。入力は、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８でも免疫ブロットされた。Ｈ）バンドは、スキャンされ、値（ＴＬＲ２／入力）は、対照（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／条件）に対する相対値として示された。結果は、２標本ｔ検定で分析された。Ｉ）ｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドと共に１時間プレインキュベートされたＢＶ−２小グリア細胞は、無血清条件下においてＬＰＳで刺激された。１時間後、細胞抽出物は、抗ＭｙＤ８８抗体で免疫沈降され、ＴＬＲ４の免疫沈降物のウエスタンブロットがそれに続いた。対照として、細胞抽出物が正常なＩｇＧで免疫沈降された。入力は、ＴＬＲ４及びＭｙＤ８８でも免疫ブロットされた。Ｊ）バンドは、スキャンされ、値（ＴＬＲ４／入力）は、対照（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／条件）に対する相対値として示された。結果は、２標本ｔ検定で分析された。Ｋ）ＢＶ−２小グリア細胞は、ｐＬｅｎｔｉ−ｃＭｙｃ−ｃＴｌｒ２レンチビリオンで形質導入され、形質導入の４８時間後、細胞は、ｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭで１時間処理され、小繊維Ａβ１−４２での刺激がそれに続いた。１時間後、細胞抽出物は、抗ＭｙＤ８８抗体で免疫沈降され、ｃ−Ｍｙｃの免疫沈降物のウエスタンブロットがそれに続いた。免疫枯渇（ＩＤ）画分も、対照としてｃ−Ｍｙｃについて免疫ブロットされた。Ｌ）バンドは、スキャンされ、値（ｃ−Ｍｙｃ／入力）は、対照（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／条件）に対する相対値として示された。結果は、２標本ｔ検定で分析された。
【図４Ａ−Ｒ】小グリア細胞におけるＮＦ−κＢ活性化の誘導及び炎症促進性分子の発現に対するｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドの効果である。１０μＭのｗｔＴＩＤＭ／ｍＴＩＤＭペプチドと共に１時間プレインキュベートされたＢＶ−２小グリア細胞は、無血清条件下において、１μＭの小繊維Ａβ１−４２（Ａ〜Ｃ）、１μＭのＭＰＰ＋（Ｄ〜Ｆ）、２５０ｎｇ／ｍｌのＬＴＡ（Ｇ〜Ｉ）、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｊ〜Ｌ）、１μＭのフラジェリン（Ｍ〜Ｏ）及び１μＭのＣｐＧ  ＤＮＡ（Ｐ〜Ｒ）で刺激された。刺激の１時間後、ＥＭＳＡにより、核抽出物中でＮＦ−κＢの活性化がモニターされた（Ａ、小繊維Ａβ；Ｄ、ＭＰＰ＋；Ｇ、ＬＴＡ；Ｊ、ＬＰＳ；Ｍ、フラジェリン、Ｐ；ＣｐＧ  ＤＮＡ）。刺激の４時間後、リアルタイムＰＣＲにより、ＩＬ−１β（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ及びＱ）及びｉＮＯＳ（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ及びＲ）のｍＲＮＡ発現がモニターされた（Ｂ〜Ｃ、小繊維Ａβ；Ｅ〜Ｆ、ＭＰＰ＋；Ｈ〜Ｉ、ＬＴＡ；Ｋ〜Ｌ、ＬＰＳ；Ｎ〜Ｏ、フラジェリン；Ｑ〜Ｒ、ＣｐＧ  ＤＮＡ）（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／条件）。ａｐ＜０．００１対対照；ｂｐ＜０．００１対刺激、２標本ｔ検定による。
【図５Ａ−Ｑ】鼻腔内送達後、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、海馬に侵入してグリア活性化を抑制し、Ｔｇマウスの海馬の斑を減少させる。Ｔｇマウス（６ヶ月齢）にｗｔＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）の１回用量が鼻腔内経路を介して投与された。処置の６０分後、マウスは、無菌生理食塩水で灌流されて海馬が均質化され、上清がエレクトロスプレーイオン化共役質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）により、ｗｔＴＩＤＭについて分析された（Ａ、ｗｔＴＩＤＭ標準；Ｂ、未処置Ｔｇ；Ｃ、ｗｔＴＩＤＭ処置Ｔｇ）。Ｔｇマウスは、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。３０日後、海馬切片は、Ｉｂａ−１及びＰ−ｐ６５（Ｄ）と、Ｉｂａ−１及びｉＮＯＳとで二重標識された（図１６）。Ｉｂａ−１（Ｅ、ＣＡ１；Ｆ、ＣＡ３）、Ｐ−ｐ６５（Ｇ、ＣＡ１；Ｈ、ＣＡ３）及びｉＮＯＳ（Ｉ、ＣＡ１；Ｊ、ＣＡ３）に対して陽性の細胞は、１群当たり６匹の異なるマウス（ｎ＝６）のそれぞれの２枚の切片（１スライド当たり２枚の画像）でカウントされた。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ；ｂｐ＜０．００１対Ｔｇ、２標本ｔ検定による。全群のマウス（１群当たりｎ＝４）の海馬抽出物は、ｉＮＯＳについて免疫ブロットされた（Ｋ）。ローディング対照として、アクチンが泳動された。バンドは、スキャンされ、値（Ｌ、ｉＮＯＳ／アクチン）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ；ｂｐ＜０．００１対Ｔｇ、２標本ｔ検定による。Ｍ）海馬切片は、８２Ｅ１  ｍＡｂで免疫標識された。アミロイド斑（Ｎ、皮質；Ｏ、海馬）は、１群当たり６匹の異なるマウスのそれぞれの２枚の切片（１スライド当たり２枚の画像）でカウントされた。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ；ｂｐ＜０．００１対Ｔｇ、２標本ｔ検定による。Ｐ）海馬抽出物（１群当たりｎ＝４）は、６Ｅ１０  ｍＡｂを使用したウエスタンブロットにより、Ａβについて分析された。矢頭は、４ｋＤａのＡβバンドを示す。バンドは、スキャンされ、値（Ａβ／アクチン）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された（Ｑ）。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ；ｂｐ＜０．００１対Ｔｇ、２標本ｔ検定による。
【図６Ａ−Ｎ】ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内送達は、Ｔｇマウスの海馬における生体内神経細胞アポトーシスを阻害し、記憶及び学習を改善する。Ｔｇマウス（６ヶ月齢）は、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。処置の３０日後、マウスを殺処分し、海馬切片は、ＴＵＮＥＬとＮｅｕＮ（Ａ）とで二重標識された。ＴＵＮＥＬ陽性細胞（Ｂ、ＣＡ１；Ｃ、ＣＡ３）は、１群当たり６匹の異なるマウス（ｎ＝６）のそれぞれの２枚の切片（１スライド当たり２枚の画像）でカウントされた。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ；ｂｐ＜０．００１対Ｔｇ、２標本ｔ検定による。全群のマウス（ｎ＝４）の海馬抽出物は、切断されたカスパーゼ３について免疫ブロットされた（Ｄ）。ローディング対照として、アクチンが泳動された。Ｅ）バンドは、スキャンされ、値（切断されたカスパーゼ３／アクチン）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された。結果は、１群当たり４匹のマウスの平均値＋ＳＥＭとして表される。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ；ｂｐ＜０．００１対Ｔｇ、２標本ｔ検定による。ＰＳＤ−９５、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１のタンパク質レベルは、ウエスタンブロットによって海馬抽出物中でモニターされた（Ｆ）。バンドは、スキャンされ、値（Ｇ、ＰＳＤ−９５／アクチン；Ｈ、ＮＲ２Ａ／アクチン；Ｉ、ＧｌｕＲ１／アクチン）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された。結果は、１群当たり４匹のマウスの平均値＋ＳＥＭとして表される。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ；ｂｐ＜０．００１対Ｔｇ、２標本ｔ検定による。マウスは、バーンズ迷路（Ｊ、遅延；Ｋ、誤り数）及びＴ字型迷路（Ｌ、正の方向転換数；Ｍ、負の方向転換数）について試験された。短期記憶は、識別指数で表される新規物体認識試験によってもモニターされた（Ｎ）。各群で８匹のマウス（ｎ＝８）が使用され、結果は、一方向ＡＮＯＶＡによって分析された。
【図７Ａ−Ｖ】ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、マウスを実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）及びコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）から保護する。Ａ）ＥＡＥは、ＭＯＧ３５−５５免疫によってオスのＣ５７／ＢＬ６マウスで誘導され、免疫後１０目から、マウスは、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日）で処置された。マウス（２回の独立した実験で１群当たりｎ＝６）は、毎日採点された。一方向反復測定ＡＮＯＶＡによって明らかなように、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＥＡＥを有意に保護した［Ｆ２、９４＝２２．５９（＞Ｆｃ＝３．０９３）］。免疫後２２目にＥｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  ＸＴ  １３．０オープンフィールド行動システム（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して、一般的な運動活動がモニターされた（Ｂ、全体的な運動活動を表すヒートマップ画像；Ｃ、移動距離；Ｄ、立ち上がり行動；Ｅ、速度；Ｆ、加速度）及びロータロッド（Ｇ）。足跡解析（Ｈ、歩幅、Ｉ、足跡長、Ｊ、揺れ長さ、Ｋ、つま先の広がり）も実施された。Ｌ）ＣＩＡは、ウシＩＩ型コラーゲン免疫化によってオスのＤＢＡ／１Ｊマウスで誘導され、免疫後２９目から、マウスは、腹腔内注射を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（１ｍｇ／ｋｇ体重／日）で処置された。マウス（２回の独立した実験で１群当たりｎ＝６）は、毎日採点された。一方向反復測定ＡＮＯＶＡは、ｗｔＴＩＤＭペプチドがＣＩＡを有意に保護することを示す［Ｆ２、４５＝４．９２７（＞Ｆｃ＝３．０９３）］。免疫後６０目に一般的な運動活動がＥｔｈｏｖｉｓｉｏｎシステムによってモニターされた（Ｍ、全体的な運動活動を表すヒートマップ画像；Ｎ、移動距離；Ｏ、立ち上がり行動；Ｐ、速度）、ロータロッド（Ｑ）、握力（Ｒ）。足跡解析（Ｓ、歩幅；Ｔ、足跡長さ；Ｕ、揺れ長さ；Ｖ、つま先の広がり）も実施された。６匹のマウス（１群当たりｎ＝６）が２回の独立した実験で使用された。ａｐ＜０．００１及びｂｐ＜０．０５対対照；ｃｐ＜０．００１及びｄｐ＜０．０５対ＥＡＥ又はＣＩＡ、２標本ｔ検定による。
【図８Ａ−Ｄ】認知機能障害（ＮＣＩ）なし及びアルツハイマー病（ＡＤ）と臨床的に診断された症例のＣＮＳにおけるＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＭｙＤ８８のモニタリングである。ＮＣＩとＡＤ脳の海馬切片は、Ｉｂａ−１（小グリア細胞）及びＴＬＲ２（Ａ）と、Ｉｂａ−１及びＭｙＤ８８（Ｂ）と、Ｉｂａ−１及びＴＬＲ４（Ｃ）とで二重標識された。結果は、４つの異なる脳のそれぞれからの２枚の切片の分析を表す。Ｉｂａ１（Ｄ、皮質；Ｅ、ＣＡ１）に対して陽性の細胞は、４つの異なる症例のそれぞれの２枚の切片（１スライド当たり２枚の画像）でカウントされた。ａｐ＜０．００１対ＮＣＩ、２標本ｔ検定による。
【図９Ａ−Ｄ】非Ｔｇ及びＴｇ（５ＸＦＡＤ）マウスのＣＮＳにおけるＴＬＲ２の状態である。Ａ〜Ｂ）６ヶ月齢非Ｔｇ及びＴｇマウス脳の海馬切片は、Ｉｂａ−１（小グリア細胞）とＴＬＲ２とで二重標識された。結果は、６匹の異なるマウスのそれぞれからの２枚の切片の分析を表す。Ｃ）全群のマウス（ｎ＝４）の海馬抽出物は、ＴＬＲ２について免疫ブロットされた。ローディング対照として、アクチンが泳動された。Ｄ）バンドは、ＮＩＨ画像化Ｊソフトウェアを使用してスキャンされ、値（ＴＬＲ２／アクチン）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ、２標本ｔ検定による。
【図１０Ａ−Ｄ】非Ｔｇ及びＴｇ（５ＸＦＡＤ）マウスのＣＮＳにおけるＭｙＤ８８の状態である。Ａ〜Ｂ）６ヶ月齢非Ｔｇ及びＴｇマウス脳の海馬切片は、Ｉｂａ−１（小グリア細胞）とＭｙＤ８８とで二重標識された。結果は、６匹の異なるマウスのそれぞれからの２枚の切片の分析を表す。Ｃ）全群のマウス（ｎ＝４）の海馬抽出物は、ＭｙＤ８８について免疫ブロットされた。ローディング対照として、アクチンが泳動された。Ｄ）バンドは、ＮＩＨ画像化Ｊソフトウェアを使用してスキャンされ、値（ＭｙＤ８８／アクチン）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ、２標本ｔ検定による。
【図１１Ａ−Ｇ】異なるマウスＴＬＲのＴＬＲ相互作用ドメイン構造を構築するための、インシリコ相同性モデル化ストラテジーの実装である。ＴＩＲ（Ａ、ＴＬＲ１；Ｂ、ＴＬＲ２；Ｃ、ＴＬＲ４；Ｄ、ＴＬＲ５；Ｅ、ＴＬＲ６；Ｆ、ＴＬＲ７；Ｇ、ＴＬＲ９）の初期構造は、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥｘＰＡＳｙ）のオンライン高分子分析ツールであるＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ  ３．７β２を使用してモデル化された。モデル化された各構造の品質は、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｙｓツール（ＱＭＥＡＮ）を使用して評価された。
【図１２Ａ−Ｅ】ＴＬＲ２タンパク質のＴＩＲドメインと複合体化したｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭのドッキング解析である。Ａ）ＴＬＲ２及びｗｔＴＩＤＭペプチドのＴＩＲドメインのインシリコ構造分析。ドッキングポーズは、ｐｙｄｏｃｋ剛体タンパク質間ドッキングツールから得られた。ｊ  ｍｏｌビューアから最も安定な構造が得られ、提示された。Ｂ）同様の分析がｍＴＩＤＭを用いて実施された。Ｃ）さらなる分析は、ｗｔＴＩＤＭとＴＬＲ２との間の強い静電的相互作用（約２．３１Ａ°：左）及びｗｔＴＩＤＭとｍＴＩＤＭとの弱い相互作用（約７．２６Ａ°：右）を明らかにした。（Ｄ）ＴＬＲ２のＢＢループ（青色）とＭＹＤ８８のＣＤループ（緑色）との間の複合体の拡大図。ＶＤＷ液滴が互いに重なり合っていることが示された。Ｅ）ＭＹＤ８８（ピンク色）のＶＤＷ雲は、ｗｔＴＩＤＭ（緑色）と複合体化すると、ＴＬＲ２（青色）のＶＤＷ雲から離れたところに移動した。
【図１３Ａ−Ｆ】小グリア細胞における炎症促進性分子の発現に対するｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドの効果である。１０μＭのｗｔＴＩＤＭ／ｍＴＩＤＭペプチドと共に１時間プレインキュベートされたＢＶ−２小グリア細胞は、１μＭの小繊維Ａβ１−４２（Ａ）、１μＭのＭＰＰ＋（Ｂ）、２５０ｎｇ／ｍｌのＬＴＡ（Ｃ）、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｄ）、１μＭのフラジェリン（Ｅ）及び１μＭのＣｐＧ  ＤＮＡ（Ｆ）で刺激された。刺激の４時間後、ＲＴ−ＰＣＲによってＩＬ−１β及びｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現がモニターされた（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／条件）。
【図１４Ａ−Ｄ】小グリア細胞におけるＮＦ−κＢ活性化のポリＩＣ媒介活性化及び炎症促進性分子の発現に対するｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドの効果である。１０μＭのｗｔＴＩＤＭ／ｍＴＩＤＭペプチドと共に１時間プレインキュベートされたＢＶ−２小グリア細胞は、５０μＭのｐｏｌｙＩＣによって刺激された。Ａ）刺激の１時間後、ＥＭＳＡにより、核抽出物中でＮＦ−κＢの活性化がモニターされた。刺激の４時間後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）及びリアルタイムＰＣＲ（Ｃ、ＩＬ−１β；Ｄ、ｉＮＯＳ）により、ＩＬ−１β及びｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現がモニターされた（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／条件）。ａｐ＜０．００１対対照；ｂｐ＜０．００１対刺激、２標本ｔ検定による。
【図１５Ａ−Ｆ】小グリア細胞におけるｐ６５及びｐ５０の小繊維Ａβ及びＬＰＳ誘導核転移に対するｗｔＴＩＤＭペプチドの効果である。１０μＭのｗｔＴＩＤＭペプチドと共に１時間プレインキュベートされたＢＶ−２小グリア細胞は、無血清条件下において、１μＭの小繊維Ａβ１−４２（Ａ〜Ｃ）又は１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｄ〜Ｆ）のいずれかで刺激された。異なる分間隔において、ウエスタンブロットにより、核抽出物中でｐ６５及びｐ５０（Ａ、小繊維Ａβ；Ｄ、ＬＰＳ）のレベルがモニターされた。ローディング対照として、ヒストンＨ３が泳動された。バンドは、スキャンされ、ｐ６５／Ｈ３（Ｂ及びＥ）及びｐ５０／Ｈ３（Ｃ及びＦ）の値は、対照に対する相対値として示された（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／条件）。ａｐ＜０．０５、ｂｐ＜０．００１対対照；ｃｐ＜０．０１対３０分間の刺激；ｄｐ＜０．０５対１５分間の刺激；ＮＳ、有意でない、２標本ｔ検定による。
【図１６Ａ−Ｆ】ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＴＬＲ２（−／−）小グリア細胞における、小繊維Ａβ１−４２ペプチドが媒介するＮＦ−κＢの活性化及び炎症促進性分子の発現を阻害できないままであった。ＷＴ（Ａ）及びＴＬＲ２（−／−）（Ｂ）マウスから単離された一次小グリア細胞は、異なる濃度のｗｔＴＩＤＭペプチドで１時間処理され、無血清条件下における１μＭの小繊維Ａβ１−４２での刺激がそれに続いた。刺激の１時間後、ＥＭＳＡにより、ＮＦ−κＢの活性化がモニターされた。ＷＴ（Ｃ及びＤ）及びＴＬＲ２（−／−）（Ｅ及びＦ）小グリア細胞は、異なる濃度のｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドで１時間処理され、無血清条件下における１μＭの小繊維Ａβ１−４２での刺激がそれに続いた。刺激の１８時間後、ＥＬＩＳＡにより、上清中のＴＮＦα（Ｃ及びＥ）及びＩＬ−１β（Ｄ及びＦ）のレベルがモニターされた（３回の独立した実験でｎ＝２複製物／条件）。ａｐ＜０．００１対対照；ｂｐ＜０．００１対刺激、２標本ｔ検定による。
【図１７】鼻腔内投与後、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ｔｇマウスの海馬に侵入する。ｗｔＴＩＤＭペプチドは、製造業者のプロトコルに従ってＡｌｅｘａ  ６８０−ＳＥ  ＮＩＲ色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識され、Ａｌｅｘａ  ６８０標識ペプチド（２．５μｇ）は、各マウスの鼻腔内に投与された。また、対照としてＡｌｅｘａ６８０−ＳＥ  ＮＩＲ色素が投与された。６０分後、マウス（各群でｎ＝３）は、ＰＢＳ及びパラホルムアルデヒドで灌流され、脳の海馬領域が７００及び８００ｎｍチャネルでＯｄｙｓｓｅｙ（ＯＤＹ−０８５４、Ｌｉｃｏｒ−Ｉｎｃ）赤外線スキャナ内でスキャンされた。赤色の背景は、８００ｎｍのフィルターに由来した一方、緑色の信号は、７００ｎｍのチャネルのＡｌｅｘａ  ６８０標識ＮＢＤペプチドに由来した。
【図１８Ａ−Ｂ】鼻腔内送達後、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ｔｇマウスの海馬におけるＮＦ−κＢの活性化を抑制した。Ｔｇマウス（６ヶ月齢）は、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。処置の３０日後、全群のマウスの海馬抽出物は、ホスホ−ｐ６５について免疫ブロットされた（Ａ）。ローディング対照として、アクチンが泳動された。バンドは、スキャンされ、値（ｐ−ｐ６５／アクチン）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された（２回の独立した実験でｎ＝４）。ａｐ＜０．００１対非Ｔｇ；ｂｐ＜０．００１対Ｔｇ、２標本ｔ検定による。
【図１９】ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内送達は、Ｔｇマウスの海馬におけるｉＮＯＳの小グリア細胞発現を抑制する。Ｔｇマウス（６ヶ月齢）は、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。処置の３０日後、マウスを殺処分し、海馬切片をＩｂａ−１及びｉＮＯＳで二重標識した。結果は、１群当たり６匹の異なるマウスのそれぞれからの２枚の切片の分析を表す。
【図２０Ａ−Ｂ】ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内送達は、Ｔｇマウスの海馬におけるアミロイド斑の負荷を低下させる。Ａ）Ｔｇマウス（６ヶ月齢）は、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。処置の３０日後、８２Ｅ１  ｍＡｂを使用したウエスタンブロットにより、全群のマウス（１群当たりｎ＝４）の海馬抽出物をＡβのタンパク質レベルについて分析した。ローディング対照として、アクチンが泳動された。Ｂ）バンドは、スキャンされ、値（Ａβ／アクチン）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された。結果は、２標本ｔ検定で分析された。
【図２１Ａ−Ｆ】ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内送達は、Ｔｇマウスの血清及び海馬におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルを低下させる。Ｔｇマウス（６ヶ月齢）は、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。処置の３０日後、血清（Ａ及びＢ）、及びＴＢＳ抽出（Ｃ及びＤ）、及び（ＴＢＳ＋トリトンＸ−１００）（Ｅ及びＦ）抽出海馬組織中において、Ａβ１−４０（Ａ、Ｃ及びＥ）及びＡβ１−４２（Ｂ、Ｄ及びＦ）のＥＬＩＳＡ定量化が実施された。６匹のマウス（１群当たりｎ＝６）が２回の独立した実験で使用された。非Ｔｇと対比してａｐ＜０．０１及びｃｐ＜０．００１；Ｔｇと対比してｂｐ＜０．０１及びｄｐ＜０．００１、２標本ｔ検定による。
【図２２Ａ−Ｂ】ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内送達は、Ｔｇマウスの海馬におけるタウのリン酸化を減少させる。Ａ）Ｔｇマウス（６ヶ月齢）は、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。処置の３０日後、全群のマウスの海馬抽出物（１群当たりｎ＝４）は、ウエスタンブロットによってホスホ−タウ及び全タウについて分析された。Ｂ）バンドは、スキャンされ、値（Ｐ−タウ／タウ）は、非Ｔｇ対照に対する相対値として示された。結果は、２標本ｔ検定で分析された。
【図２３Ａ−Ｄ】ｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドの鼻腔内送達は、Ｔｇマウスの自発運動活性を調節しない。Ｔｇマウス（６ヶ月齢）は、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。処置の３０日後、マウスは、一般的な自発運動活性について試験された（Ａ、動きの数；Ｂ、水平活動；Ｃ、休止時間；Ｄ、常同行動回数）。各群で８匹のマウス（２回の独立した実験でｎ＝８）が使用された。ＮＳ、有意でない。
【図２４Ａ−Ｈ】ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内送達は、Ｔｌｒ２を欠失したＦＡＤ５Ｘ  Ｔｇマウス（Ｔｇ−Ｔｌｒ２−／−）において斑を減少させず、記憶力を改善しない。Ａ）Ｔｌｒ２−／−マウスはＴｇ（５ＸＦＡＤマウス）と交配され、６ヶ月齢の非Ｔｇ、Ｔｇ（５ＸＦＡＤ）、Ｔｇ−Ｔｌｒ２−／−（Ｆ７）及びＴｌｒ２−／−マウスについて、Ｔｌｒ２、Ａｐｐ６９５及びＰｓｅｎ１導入遺伝子ＤＮＡ発現の代表的なＰＣＲが示される。非Ｔｇ、Ｔｇ、Ｔｇ−Ｔｌｒ２−／−及びＴｌｒ２−／−マウスの平均体重（Ｂ）及び湿潤脳重量（Ｃ）。湿潤脳重量について、嗅小葉及び脳幹が除去された。Ｔｇ−Ｔｌｒ２−／−マウス（６ヶ月齢）は、鼻腔内経路を介してｗｔＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／２日）で処置された。処置の３０日後、海馬切片を６Ｅ１０  ｍＡｂで免疫標識した（Ｄ）。アミロイド斑は、１群当たり４匹の異なるマウスのそれぞれの２枚の切片（１スライド当たり２枚の画像）でカウントされた（Ｅ）。マウスは、バーンズ迷路について試験された（Ｆ、トラックプロット；Ｇ、遅延；Ｈ、誤り数）。各群で４匹のマウス（ｎ＝４）が使用された。ＮＳ、有意でない、２標本ｔ検定による。
【図２５Ａ−Ｄ】ｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドでの処置後におけるＥＡＥマウスの足跡解析である。歩行路上に白紙の短冊が貼られて、黒インクが使用され、紙の上に異なる群（Ａ、対照；Ｂ、ＥＡＥ；Ｃ、ＥＡＥ＋ｗｔＴＩＤＭ；Ｄ、ＥＡＥ＋ｍＴＩＤＭ）のマウスの足跡が得られた。各群について、合計３０〜４０のステップが判定された。４つの異なる足跡の測定、すなわち歩幅（ＳＬ）、足跡長（ＰＬ）、揺れ長さ（ＳＷＬ）及びつま先の広がり（ＴＳ）は、記録されたマウスの足跡からセンチメートル単位で計算された。ＳＬは、同一足の連続した２つの足跡の前縁間の距離を指す一方、ＳＷＬは、移動距離に垂直な足間の距離を指し、ＰＬは、足跡領域の長さの測定値を示す。他方、ＴＳは、足跡の第１趾と第５趾との間の距離を示す。６匹のマウス（１群当たりｎ＝６）が２回の独立した実験で使用された。
【図２６Ａ−Ｄ】ｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドでの処置後における、ＣＩＡを有するマウスの足跡解析である。歩行路上に白紙の短冊が貼られて、黒インクが使用され、紙の上に異なる群（Ａ、対照；Ｂ、ＣＩＡ；Ｃ、ＣＩＡ＋ｗｔＴＩＤＭ；Ｄ、ＣＩＡ＋ｍＴＩＤＭ）のマウスの足跡が得られた。各群について、合計３０〜４０のステップが判定された。マウスの記録された足跡から、４つの異なる足跡測定（ＳＬ、ＰＬ、ＳＷＬ及びＴＳ）がセンチメートル単位で計算された。６匹のマウス（１群当たりｎ＝６）が２回の独立した実験で使用された。
【図２７】小繊維Ａβ１−４２ペプチドの形態である。小繊維Ａβ１−４２ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、新鮮に可溶化された５０μＭのペプチドを無菌蒸留水中において３７℃で５日間インキュベートすることによって調製された。小繊維Ａβ１−４２ペプチドの形態は、透過電子顕微鏡法によって調べられた。
【図２８Ａ−Ｂ】鼻腔内ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ａ５３Ｔ  α−ｓｙｎ  Ｔｇマウスの黒質における小グリア細胞炎症を減弱させる。Ａ５３Ｔマウス（オス；９ヶ月齢；１群当たりｎ＝６）は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で３０日間、鼻腔内経路を介してＴＩＤＭペプチドで処置され、Ｉｂａ−１及び誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）に対する黒質切片の二重標識免疫蛍光分析がそれに続いた（Ａ）。選択された領域の拡大画像が下段に示される。ｉＮＯＳ（＋ｖｅ）細胞は、１群当たり６匹のマウスのそれぞれの２枚の切片でカウントされ、細胞／ｍｍ２として提示された。
【図２９Ａ−Ｂ】鼻腔内ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ａ５３Ｔ  α−ｓｙｎ  Ｔｇマウスの黒質における小グリア細胞のアルギナーゼ−１の発現を刺激する。Ａ５３Ｔマウス（オス；９ヶ月齢；１群当たりｎ＝６）は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で３０日間、鼻腔内経路を介してＴＩＤＭペプチドで処置され、Ｉｂａ−１及びアルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）に対する黒質切片の二重標識免疫蛍光分析がそれに続いた（Ａ）。選択された領域の拡大画像が下段に示される。ＡＲＧ（＋ｖｅ）細胞は、１群当たり６匹のマウスのそれぞれの２枚の切片でカウントされ、細胞／ｍｍ２として提示された。
【図３０Ａ−Ｃ】鼻腔内ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ａ５３Ｔ  α−ｓｙｎ  Ｔｇマウスの黒質におけるα−シヌクレイン症を減少させる。Ａ５３Ｔマウス（オス；９ヶ月齢；１群当たりｎ＝６）は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で３０日間、鼻腔内経路を介してＴＩＤＭペプチドで処置され、α−ｓｙｎに対する黒質抽出物のウエスタンブロット分析がそれに続いた（Ａ）。バンドは、スキャンされ、Ａ５３Ｔ対照に対する相対値として示された（Ｂ、モノマーα−ｓｙｎ；Ｃ、オリゴマーα−ｓｙｎ）。結果は、１群当たり６匹のマウスの平均値＋ＳＥＭである。
【図３１Ａ−Ｄ】鼻腔内ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ａ５３Ｔ  α−ｓｙｎ  Ｔｇマウスの黒質におけるα−シヌクレイン症を減少させる。Ａ５３Ｔマウス（オス；９ヶ月齢；１群当たりｎ＝６）は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で３０日間、鼻腔内経路を介してＴＩＤＭペプチドで処置され、ＴＨ及びα−ｓｙｎ（ｍｊｆｒ１  Ａｂ）に対する黒質切片の二重標識免疫蛍光分析がそれに続いた（Ａ）。選択された領域の拡大画像が一番左の列に示される。α−ｓｙｎ陽性細胞体の総面積（Ｂ）、平均サイズ（Ｃ）及び統合密度（Ｄ）が計算された。１群当たり６匹のマウスの２枚の黒質切片のそれぞれからの５つの細胞が分析された。
【図３２Ａ−Ｂ】鼻腔内ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ａ５３Ｔ  α−ｓｙｎ  Ｔｇマウスの黒質におけるα−シヌクレイン症を減少させる。Ａ５３Ｔマウス（オス；９ヶ月齢；１群当たりｎ＝６）は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で３０日間、鼻腔内経路を介してＴＩＤＭペプチドで処置され、小グリア細胞マーカーＩｂａ−１及びα−ｓｙｎ（ｍｊｆｒ１  Ａｂ）に対する黒質切片の二重標識免疫蛍光分析がそれに続いた（Ａ）。選択された領域の拡大画像が一番左の列に示される。（α−ｓｙｎ＋Ｉｂａ−１）陽性細胞体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が計算された。１群当たり６匹のマウスの２枚の黒質切片のそれぞれからの５つの細胞が分析された。
【図３３Ａ−Ｅ】鼻腔内ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ａ５３Ｔ  α−ｓｙｎ  Ｔｇマウスの自発運動活性を改善する。Ａ５３Ｔマウス（オス；９ヶ月齢；１群当たりｎ＝６）は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で３０日間、鼻腔内経路を介してＴＩＤＭペプチドで処置され、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  ＸＴ  １３．０  オープンフィールド行動システム（Ｎｏｌｄｕｓ）による自発運動活性のモニタリングがそれに続いた（Ａ、トラックプロット；Ｂ、移動累積期間；Ｃ、距離；Ｄ、速度；Ｅ、ロータロッド）。結果は、１群当たり６匹のマウスの平均値＋ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。好ましい方法及び材料が以下に記載されるが、ただし、本発明の実施又は試験において、本明細書に記載されるものと類似した又は均等な方法及び材料が使用され得る。
【００１３】
本発明の説明に関連して（特に以下の特許請求の範囲に関連して）、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その」及び類似した参照の使用は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含するものと解釈される。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各個別の値を個々に参照する簡略表記法として機能することのみを意図しており、各別個の値は、あたかもそれが本明細書で個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で特に断りのない限り又は他に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供されるあらゆる全ての実施例又は例示的言語（例えば、「などの」、「例えば」）の使用は、単に本発明の理解を容易にすることを意図し、別段の特許請求がない限り、本発明の範囲の限定を提起するものではない。本明細書のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠なものとして任意の非特許請求の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００１４】
「患者」という用語は、ヒト患者又は獣医学の患者を指す。
【００１５】
「治療効果」という用語は、本明細書の用法では、例えば神経学的、自己免疫性又は他の本明細書で開示されたものなどのヒト患者又は獣医学の患者の障害に屈することに関連する病理学的症状、疾患進行若しくは生理学的状態の改善又はそれに対する抵抗を誘導するか、寛解させるか又は別の様式で引き起こす効果を意味する。薬物に関して使用される「治療的有効量」という用語は、ヒト患者又は獣医学の患者に治療的効果を与える薬物の量を意味する。ＴＬＲ２／ＭｙＤ８８相互作用の選択的破壊を提供する組成物及び方法は、炎症を阻害し、神経学的及び他の疾患病理を弱める。
【００１６】
本出願人は、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８のレベルがＡＤ患者及び５ＸＦＡＤマウスの前頭前皮質及び海馬において生体内で増加したことを実証した。誘導されたＴＬＲ２の特異的標的化に対して利用できる選択肢はない。本出願人は、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメイン（ＴＩＤＭ）に対応するペプチドを設計し、これは、二本鎖ＲＮＡ、細菌ＬＰＳ、フラジェリン、ＣｐＧ  ＤＮＡ及び１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）媒介性の小グリア細胞活性化を調節することなく、誘導されたＴＬＲ２シグナル伝達及び小繊維Ａβ媒介性小グリア細胞炎症を特異的に阻害した。さらに、ＴＩＤＭペプチドの鼻腔内投与により、５ＸＦＡＤマウスにおいて、海馬小グリア細胞活性化の低下、Ａβ負荷の低下、神経細胞アポトーシスの抑制、記憶及び学習の改善がもたらされ、ＡＤにおけるＴＩＤＭペプチドの治療的有望性が強調された。
【００１７】
本発明は、概して、上昇したＴＬＲ２活性化が疾患の病態形成において役割を果たす疾患を治療するための組成物及び方法に関する。方法の一実施形態は、他のＴＬＲではなく、ＴＬＲ２のＢＢループのみに結合してＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の結合を破壊する、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメイン（ＴＩＤＭ）に対応するペプチド配列を含む組成物の治療的有効量を投与することを含む。組成物は、ＴＬＲ２によってのみ伝達されるシグナル伝達経路を阻害する。
【００１８】
一実施形態は、患者において障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療的有効量の、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインを含むペプチドを含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。治療的有効量は、少なくともＴＬＲ２−ＭｙＤ８８シグナル伝達を減少させる量である。障害は、ＴＬＲ２−ＭｙＤ８８シグナル伝達が疾患の病態形成において役割を果たすものである。例えば、障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ハンチントン病又は多系統萎縮症などの神経学的障害であり得る。別の実施形態では、障害は、多発性硬化症又はリウマチ様関節炎などの自己免疫障害である。なおも別の実施形態では、障害は、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、ウイルス感染症、敗血症又は脳膿瘍である。
【００１９】
一実施形態では、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインを含むペプチドは、配列ＰＧＡＨＱＫ（配列番号１）を含む。他の実施形態では、ペプチドは、配列番号１を含む６〜１０個のアミノ酸を含有する。例えば、ペプチドは、配列番号１を含む６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を含有し得る。他の実施形態では、ペプチドは、１２、１３、１４又は１５個未満のアミノ酸を含む。
【００２０】
別の実施形態では、ペプチドは、細胞内送達細胞及び血液脳関門を越えるアクセスの少なくとも１つを提供する送達ベクターに連結する。送達ベクターは、他の組成のペプチドであり得る。一実施形態では、送達ベクターは、アンテナペディアホメオドメインである。例えば、アンテナペディアホメオドメインは、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメインを含むペプチドのＣ末端に連結する。好ましい一実施形態では、ペプチド配列は、ｄｒｑｉｋｉｗｆｑｎｒｒｍｋｗｋｋｐｇａｈｑｋ（配列番号２）である。
【００２１】
ＡＤの疾患過程の機序を解読し、効果的な神経防護の治療アプローチを開発して、疾患進行を減速させるか又は食い止めることが最も重要である。ＴＬＲは、病原体関連の分子パターン及び内因性損傷関連の分子パターンを感知することにより、自然免疫応答を消散させることが知られている（１５）。ＣＮＳの小グリア細胞は、これまでに知られているほとんどのＴＬＲを発現し、本発明者らは、以前に、小繊維Ａβ１−４２が小グリア細胞炎症を刺激するために、様々なＴＬＲの中でもＴＬＲ２を必要とすることを示した（１７）。したがって、いくつかの研究は、ＴＬＲ２とＡβとの間の直接的相互作用を実証することによって又はＣＤ１４を介してこの知見を拡張している（１８、１９、３３）。ここで、本発明者らは、アルツハイマー病におけるＴＬＲ２の重要な役割について記載する。本発明者らは、ＭＣＩ又はＮＣＩを有する人々と比較して、ＡＤ認知症を有する人々の海馬及び前頭前皮質でより高いレベルのＴＬＲ２を検出した。いくつかの研究は、Ａβ媒介性小グリア細胞活性化におけるＴＬＲ４の関与を報告しているが、本発明者らは、ＡＤ認知症を有する人々のＣＮＳではより高レベルのＴＬＲ４を見いだしておらず、本発明者らの知見の特異性が示唆される。Ｔｌｒ２多型は、ＡＤの易罹患性に影響を及ぼすことが報告されており（３４）、ＡＤ患者のＰＢＭＣも、増加したレベルのＴＬＲ２を発現する（３５）。ＴＬＲ２と矛盾なく、ＡＤ認知症を有する人々のＣＮＳにおけるＭｙＤ８８の上方制御も観察され、興味深いことに、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８は、いずれもＢｒａａｋスコアと正に相関した。ＭｙＤ８８は、認知機能とも負に相関した。
【００２２】
ＴＬＲ２は、自然免疫の重要なメンバーであるが、ＴＬＲ２を標的とする特異的阻害剤はなかった。そのため、ＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の相互作用の構造分析を通じて、本発明者らは、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメイン（ＴＩＤＭ）に対応するペプチドをＣＤループから設計した。ＴＬＲ２のＢＢループは、ＭｙＤ８８のＣＤループと相互作用するため、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の結合を阻害する。興味深いことに、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、他のＴＬＲではなく、ＴＬＲ２のＢＢループを特異的に標的化する様式でドッキングし、それによりＴＬＲ２によって伝達されるシグナル伝達経路のみを阻害する。ＴＬＲ２及び小繊維Ａβ１−４２を特異的に標的化するｗｔＴＩＤＭペプチドは、小グリア細胞活性化のためにＴＬＲ２を必要とするため（１７、１８）、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＭＰＰ＋、ポリＩＣ（ＴＬＲ３の作動薬）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４の作動薬）、フラジェリン（ＴＬＲ５の作動薬）及びＣｐＧ  ＤＮＡ（ＴＬＲ９の作動薬）によってではなく、ＬＴＡ（ＴＬＲ２の既知の作動薬）及び小繊維Ａβ１−４２によってのみ誘導される小グリア細胞ＮＦ−κＢの活性化及び炎症を阻害し、ｗｔＴＩＤＭペプチドによるＴＬＲ２経路の選択的阻害が示唆される。さらに、ＴＬＲ２：ＭｙＤ８８相互作用の破壊と矛盾なく、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＴＬＲ２の非存在下で機能しない。
【００２３】
未修飾ペプチドは、通常、血液、腎臓又は肝臓における急速なタンパク質分解及び／又は加速された腎クリアランスに起因する短い半減期を有し、これは、ほとんどのペプチド治療法の大きい課題である。しかし、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディアホメオドメイン由来の細胞浸透性ペプチド（アンテナペディアのホメオドメイン）であるペネトラチンは、正荷電残基が豊富であり、カーゴペプチドが細胞内に移動することを促進して迅速なタンパク質分解を回避することが示されている（３６、３７）。さらに、未修飾ペプチドは、ＣＮＳに侵入せず、本発明者らは、ペネトラチンが緊密な内皮網状組織を突破し、ＢＢＢを越えてペプチドを輸送し得ることを認識した（２３、３８）。そのため、本発明者らは、ペネトラチン含有ｗｔＴＩＤＭペプチドの有効性をＴｇマウスで試験し、ｗｔＴＩＤＭペプチドが小グリア細胞の炎症を軽減し、神経細胞のアポトーシスを減少させ、認知機能をＡＤの毒性から保護することを実証した。本発明者らの結論は、以下に基づく。第一に、鼻腔内投与後、ＴＩＤＭペプチドは、海馬に侵入した。第二に、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドがＴｇマウスのＮＦ−κＢの海馬活性化及び小グリア細胞の炎症を阻害した。第三に、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドがＴｇマウスの海馬の神経細胞とＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ受容体タンパク質とをアルツハイマー病の毒性から保護した。第四に、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドがＴｇマウスの空間的学習及び記憶も改善した。さらに、本発明者らは、研究期間中に使用されたＴＩＤＭ処置マウスのいずれにおいても、いかなる薬物関連副作用（例えば、脱毛、食欲減退、体重減少、有害な感染症など）も見いださなかった。しかし、一研究では、ＴＬＲ２の遺伝子ノックダウンは、ＡＰＰ  Ｔｇマウスの認知低下を加速させることが示されている（３９）。ＴＬＲ２の完全なノックダウンは、基底並びに誘導ＴＬＲ２シグナル伝達経路を一掃するため、それは、間違いなく可能である。さらに、ＴＬＲ２は、ＭｙＤ８８依存型経路及び非依存型経路の両方を介して機能することが示されており（４０、４１）、本発明者らの発見の長所は、ＴＩＤＭペプチドが基底ＴＬＲ２活性を阻害することなく、ＭｙＤ８８依存型誘導ＴＬＲ２シグナル伝達経路のみを標的とすることである。
【００２４】
斑がＡＤの記憶喪失に直接関連するかどうかにかかわらず、アミロイド斑は、ＡＤの病理学的特徴の１つであり、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置がＴｇマウスの海馬の斑負荷を減少させたことも重要である。しかし、現在のところ、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置がどのように斑の減少に結び付いているかを理解していない。β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）は、Ａβの形成を開始する重要な酵素であり、ＮＦ−κＢの阻害がＡβ誘導ＢＡＣＥ１プロモータートランス活性化を防ぐこと、及び野生型又はスウェーデン変異型βＡＰＰの過剰発現が、ＮＦ−κＢ応答要素を欠くＢＡＣＥ１プロモーターコンストラクトのトランス活性化を変更しないことが示されている（４２）。ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＮＦ−κＢの小繊維Ａβ誘導活性化を抑制するため、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＮＦ−κＢ−ＢＡＣＥ１経路の減弱を介してＴｇマウスの斑負荷を軽減することが可能である。
【００２５】
ＡＤの進行を止めるための効果的な治療法はない。Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）、Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標）、Ｃｏｇｎｅｘ（登録商標）などの様々なコリンエステラーゼ阻害剤の投与がＡＤの標準的治療である（４３）。しかし、それには、いくつかの副作用と不満足な結果が伴うことが多い。本明細書では、本発明者らは、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８のレベルがＡＤ患者のＣＮＳで上方制御されていること、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８がＢｒａａｋスコアと正に相関すること、ｗｔＴＩＤＭペプチドが他のシグナル伝達経路を調節せずにＴＬＲ２のみを標的化すること、及び鼻腔内投与後、ｗｔＴＩＤＭペプチドが海馬に到達し、海馬のＮＦ−κＢ活性化を抑制し、小グリア細胞炎症を阻害し、脳の斑負荷を低下させ、神経細胞アポトーシスを弱め、Ｔｇマウスの学習及び記憶を保護することを実証している。これらの結果は、鼻腔内ｗｔＴＩＤＭペプチドによるＴＬＲ２の選択的標的化がＡＤにおける治療的重要性を有し得ることを示唆する。さらに、ｗｔＴＩＤＭペプチドはまた、マウスの機能障害を改善し、ＥＡＥ及びＣＩＡの疾患プロセスを抑制した。したがって、ＡＤに加えて、ＴＩＤＭペプチドは、他の多くの障害に対する機会を開き得る。
【００２６】
医薬組成物及び投与様式
本明細書で開示される治療方法は、ペプチド組成物又はペプチド組成物の医薬組成物を投与する任意の数の様式を含み得る。投与様式としては、錠剤、丸薬、糖衣丸、硬質及び軟質ゲルカプセル、顆粒、ペレット、水性、若しくは脂質、若しくは油性、若しくは他の溶液、水中油型エマルションなどのエマルション、リポソーム、水性又は油性懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、固体エマルション、固体分散体又は分散性粉末が挙げられ得る。経口投与のための医薬組成物の調製では、ペプチド組成物は、例えば、アラビアガム、滑石、デンプン、糖類（例えば、マンニトース、メチルセルロース、ラクトースなど）、ゼラチン、界面活性剤、ステアリン酸マグネシウム、水性又は非水性溶剤、パラフィン誘導体、架橋剤、分散剤、乳化剤、潤滑剤、保存剤、香味剤（例えば、エーテル性油）、溶解促進剤（例えば、安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール）又は生物学的利用能促進剤（例えば、ＧＥＬＵＣＩＲＥ）などの一般に知られて使用されている、アジュバント及び賦形剤と混合され得る。医薬組成物中では、薬剤は、例えば、ナノ微粒子などの微粒子組成物中に分散され得る。
【００２７】
非経口投与では、ペプチド組成物又はペプチド組成物の医薬組成物は、例えば、水、緩衝液、可溶化剤含有又は非含有の油、界面活性剤、分散剤又は乳化剤などの生理学的に許容可能な希釈剤に溶解又は懸濁され得る。油としては、例えば、限定されるものではないが、オリーブ油、落花生油、綿実油、大豆油、ヒマシ油及びゴマ油が使用され得る。より一般的に言えば、非経口投与では、薬剤又は薬剤の医薬組成物は、水性、脂質、油性若しくは他の種類の溶液若しくは懸濁液の形態であり得るか、又はリポソーム若しくはナノ懸濁液の形態で投与することさえできる。
【００２８】
本開示によって想定される治療方法において、ペプチド組成物は、単独で又は薬学的に許容可能な担体若しくは賦形剤と共に組成物中で使用され得る。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、あらゆるタイプの無毒で不活性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤助剤を意味する。薬学的に許容可能な担体の役割を果たし得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース並びにその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；滑石；カカオ脂及び坐薬ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイル及び大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチル及びエチルラウレートなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質非含有水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール及びリン酸緩衝液溶液；並びにラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒の適合性潤滑剤であり、且つ着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味剤及び香料、保存料及び抗酸化剤も配合者の判断次第で組成物中に存在し得る。他の適切な薬学的に許容可能な賦形剤は、その内容が明示的に参照により本明細書に援用される”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９１に記載されている。
【００２９】
特定の実施形態では、ペプチド組成物は、ヒト及び他の動物に経口投与され得る。組成物は、投与のために製剤化され得、製剤化の方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）を参照されたい）。
【００３０】
いくつかの実施形態では、製剤は、徐放性製剤であり得、これは、ペプチド組成物を長期にわたり着実に放出することを意味する。他の実施形態では、製剤は、遅延放出製剤であり得、これは、投与直後よりも後の時点でペプチド組成物を放出することを意味する。
【００３１】
本開示に従って使用するための医薬組成物は、無菌、非発熱性液体溶液若しくは懸濁液、コーティングされたカプセル、凍結乾燥粉末又は当技術分野で公知の他の形態であり得る。
【００３２】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末及び顆粒が挙げられる。このような固体剤形中では、活性化合物は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムなど、少なくとも１つの不活性の薬学的に許容可能な賦形剤又は担体、及び／又はａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸などの充填剤又は増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース及びアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの湿潤剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えばアセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセリンなどの湿潤剤、ｈ）カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤、及びｉ）滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物などの潤滑剤と混合される。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含み得る。
【００３３】
類似タイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても用いられ得る。
【００３４】
錠剤、糖衣丸、カプセル、丸薬及び顆粒の固体剤形は、腸内コーティング及び製剤処方技術分野で周知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製され得る。それらは、任意選択的に不透明剤を含有し得、それらは、腸管の特定部分のみで又は優先的に活性成分を任意選択的に遅延様式で放出する組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。
【００３５】
活性化合物は、上述したように、１つ又は複数の賦形剤と共に微小カプセル化された形態でもあり得る。錠剤、糖衣丸、カプセル、丸薬及び顆粒の固体剤形は、腸内コーティング、放出制御コーティング及び製剤処方技術分野で周知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製され得る。このような固体剤形中では、活性化合物は、スクロース、ラクトース又はデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。このような剤形は、通常の慣行のように、例えばステアリン酸マグネシウム及び微結晶セルロースなどの打錠潤滑剤及び他の打錠補助剤など、不活性希釈剤以外の追加的な物質も含み得る。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含み得る。それらは、任意選択的に不透明剤を含有し得、それらは、腸管の特定部分のみで又は優先的に活性成分を任意選択的に遅延様式で放出する組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。
【００３６】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤が挙げられる。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水；又はエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、ＥｔＯＡｃ、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実油、ピーナツ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル並びにそれらの混合物などの他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤などの当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、例えば、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味剤、香味料及び芳香剤などのアジュバントも含み得る。
【実施例】
【００３７】
実施例１  −  ヒト対象
Ｒｕｓｈ  Ｒｅｌｉｇｉｏｕｓ  Ｏｒｄｅｒ  Ｓｔｕｄｙ（ＲＲＯＳ）（４４、４５）から得られた、認知機能障害なし（ＮＣＩ；ｎ＝１２）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ；ｎ＝１１）及びＡＤ（ｎ＝１０）の死亡前臨床診断を有する３３症例を分析した（表Ｓ１）。全ての参加者は、詳細な年次臨床評価及び死亡時の脳供与に同意した。
【００３８】
実施例２  −  臨床的及び神経病理学的評価
ＮＣＩ、ＭＣＩ及びＡＤの診断のための臨床基準は、別の場所で報告されている（４４、４６）。ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）と一連の１９の認知性検査とを含む、最終的な臨床及び神経心理学的検査を死亡前２年以内に実施した。１９の検査を含む全体的認知性ｚスコア（ＧＣＳ）は、全ての症例で利用できた（４７）。神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）のＢｒａａｋ病期診断（４８）は、以前記載された通り実施した（４４）。ＡＤ以外の病理学的所見（例えば、脳卒中、パーキンソン病、レビー小体型認知症）を有する対象は、研究から除外した。組織及び臨床情報は、健康情報プライバシー管理規則の保護下にある。
【００３９】
実施例３  −  組織サンプル及びウエスタンブロット法
上前頭前皮質（ブロードマン野９）は、解凍を防ぐためのドライアイス上での剖検時、白質を含まない状態で解剖し、アッセイまで−８０℃に維持した。組織を均質化し、前述されたように（２２）処理した。組織抽出物及び細胞溶解産物（３０μｇ）は、連続緩衝系中の８又は１０％ビス−トリスＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、セミドライブロッター（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写して、前述されたように（２２、４９−５１）免疫ブロットした。ブロットをバイナリに変換し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して分析し、ローディング対照（β−アクチン）に対して正規化した。
【００４０】
実施例４  −  Ｃ末端ＴＬＲ２（ｃＴＬＲ２）の調製
ＴＬＲ２完全長コンストラクト（ｐＬｅｎｔｉ−ｃｍｙｃ−ＤＤＫ／ｔｌｒ２）は、Ｏｒｉｇｅｎｅから購入した。ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｋ５３１０−００；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｃ−ｍｙｃでタグ付けされたｃＴＬＲ２（６４０〜７８４個のアミノ酸）をレンチベクターにクローニングした。簡潔に述べると、ＴＬＲ２のＣ末端ＴＩＲドメインの上流にコザック配列を組み込んだ。次に、ｃＴＬＲ２をレンチベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を使用したレンチウイルス内のパッケージングがそれに続いた。４８時間後、培地を採取し、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ濃縮器で濃縮した（カタログ番号６３１２３１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。この濃縮レンチウイルスｓｕｐをウイルス形質導入に使用した。Ｍｙｃアフィニティカラムを通過させることにより、ｃＴＬＲ２タンパク質をＨＥＫ２９３細胞溶解産物から単離した。１０ｋＤ分子カットオフ濾過システムを使用することにより、精製タンパク質を脱塩し濃縮した。
【００４１】
実施例５  −  表面プラズモン共鳴
ＴＬＲ２とＴＩＤＭペプチドとの結合を分析するために、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ４ＳＰＲ機器（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を実行した。ＴＬＲ２を捕捉するために、５００ｋＤａのカルボキシメチルデキストランゴールドセンサースライド（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｉｎｃ．）を使用して、結合アッセイを実施した。タンパク質の固定化は、０．８ｍｇ／ｍＬのＴＬＲ２溶液を用いて、ＰＢＳ中で３０μｌ／分の流速で３分間であった。分析物の結合について、ＰＢＳ泳動用緩衝液中の異なる濃度のｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドを２．５分間３０μｌ／分の速度で注入し、３分間の解離期がそれに続いた。センサー表面は、緩衝液を４０μｌ／分で最低１５分間流すことにより、各解離サイクル後に再生させた。システムソフトウェアを用いて標準操作手順に従い、ＴＬＲ２結合表面で得られた信号から、参照セルで得られた信号を差し引いた。差し引かれた信号の濃度依存性を分析し、ＴＬＲ２とｗｔＴＩＤＭペプチド及びＴＬＲ２とｍＴＩＤＭペプチドの結合親和性を判定した。
【００４２】
実施例６  −  熱シフトアッセイ
前述されたように（５２、５３）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００の標準リアルタイムサーマルサイクラー装置内で熱シフトアッセイを実施した。各反応では、キットで提供される１８μＬの熱シフト緩衝液及び１〜２μＬの色素に精製タンパク質（０．５μｇ〜１μｇ）を添加した。反応は、９６ウェルＰＣＲプレートを暗所で設定し、次の二段階プログラムを用いて、サーマルサイクラー装置に入れた［（２５℃で２分間）１サイクル；（２７℃で１５秒間、２６℃で１分間）７０サイクル；両方の段階で１℃の自動増分］。クエンチャーフィルターなし、パッシブフィルターなしで、フィルターをＲＯＸに設定した。
【００４３】
実施例７  −  インシリコ構造分析
本発明者らは、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥｘＰＡＳｙ）のオンライン高分子分析ツールであるＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ３．７β２を利用して、様々なＴＬＲ（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９）のＴＩＲドメインの構造をモデル化した。モデル化された構造の品質を評価するために、本発明者らは、モデル全体の包括的な品質を推定する複合スコア付けツールであるＱｕａｌｉｔｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｙｓツール（ＱＭＥＡＮ）及びモデル内の異なる領域の局所的な残基毎の分析を使用した。残基レベルの相互作用は、Ｃβ原子ポテンシャルによって評価し、長距離相互作用は、全原子ポテンシャルによって検証した。溶媒和ポテンシャルを実装し、残基の埋没状況を分析した。各構造の局所的な幾何配置は、３つの連続アミノ酸にわたるねじれ角ポテンシャルによって分析した。ｗｔＴＩＤＭ又はｍＴＩＤＭペプチドのいずれかとＴＩＲドメインとのドッキングポーズは、ｐｙｄｏｃｋ剛体タンパク質間ドッキングツールから導出した。
【００４４】
実施例８  −  動物及びＴＩＤＭペプチド鼻腔内送達
Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｊ遺伝子組換え（５ＸＦＡＤ、本明細書ではＴｇと称される）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。６ヶ月齢のオスのＴｇマウスをｗｔＴＩＤＭ又はｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／Ｋｇ体重／２日）で３０日間鼻腔内処置した。簡潔に述べると、ＴＩＤＭペプチドを５μｌの生理食塩水に溶解し、マウスを背臥位に保ち、ピペットマンを使用して生理食塩水を１つの鼻孔に送達した。
【００４５】
実施例９  −  慢性ＥＡＥの誘導及びＴＩＤＭペプチドによる処置
オスのＣ５７ＢＬ／６マウスは、本発明者らによって記載されたように（５４、５５）、１００μｇのＭＯＧ３５−５５で免疫化した。マウスに対して、免疫後（ｄｐｉ）０日目及び２日目に２用量の百日咳毒素（１５０ｎｇ／マウス）も投与した。免疫後１０日目から開始して、ｗｔＴＩＤＭ又はｍＴＩＤＭペプチド（０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日）をマウスに鼻腔内投与した。
【００４６】
実施例１０  −  コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の誘導及びＴＩＤＭペプチドによる処置
オスのＤＢＡ／１Ｊマウス（８〜９週齢）は、フロイントの不完全アジュバントに乳化した１００μｇのウシＩＩ型コラーゲン及び結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡを用いて、尾の付け根で皮内免疫化した。免疫後２１日目に１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンの腹腔内注射によりマウスを追加免疫化した。ｗｔＴＩＤＭ又はｍＴＩＤＭペプチド（１ｍｇ／Ｋｇ体重／日）を免疫後２９日目から開始してマウスを処置した。
【００４７】
実施例１１  −  小繊維Ａβ１−４２の調製
小繊維Ａβ１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）は、５０μＭで新鮮に可溶化したペプチドを滅菌蒸留水中において３７℃で５日間インキュベートすることによって調製した（５６）。小繊維Ａβ１−４２の形態については、図２７を参照されたい。
【００４８】
実施例１２  −  半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
製造業者のプロトコルに従い、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ−ＩＩ  ＲＮＡ試薬（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して、海馬から全ＲＮＡを単離した。混入しているあらゆるゲノムＤＮＡを除去するために、全ＲＮＡをＤＮａｓｅで消化した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、前述されたように（２３、５７）実行した。
【００４９】
実施例１３  −  リアルタイムＰＣＲ分析
ＤＮａｓｅで消化されたＲＮＡは、前述されたように（２３、５７）、ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内でリアルタイムＰＣＲによって分析した。
【００５０】
実施例１４  −  電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）
核抽出物を単離し、前述されたように（２２、２３）、ＥＭＳＡを実行した。
【００５１】
実施例１５  −  バーンズ迷路及びＴ字型迷路：
迷路実験は、本発明者らによって記載されたように（５２、５７）実施した。簡潔に述べると、バーンズ迷路のために、マウスを２日間連続して訓練し、３日目の試験がそれに続いた。各訓練セッション後、迷路及び脱出トンネルを中性洗剤で徹底的に洗浄し、慣れた物体からのマウスの匂いに起因する本能的な匂い回避を避けた。３日目に、動物が脱出トンネルに入るように動機付けるのに十分な光及び熱を生成する高ワット数の光で迷路を照射し、遅延（４本の足が全て脱出ボックスの床にある前の時間）及び誤り（４本の足が全て脱出ボックスの床にある前の不正確な応答）を測定できるようにした。
【００５２】
Ｔ字型迷路では、マウスを食物枯渇状態でＴ字型迷路に２日間慣れさせ、動物が１０分間の訓練期間中に食物報酬を少なくとも５回得られるようにもした。各試験では、マウスを出発地点に３０秒間置き、次に常に着色フードチップでおびき寄せ、右側方向転換を強制した。各訓練セッション後、Ｔ字型迷路を中性洗剤で徹底的に洗浄した。３日目にマウスを正の方向転換及び負の方向転換について試験した。報酬側は、常に視覚的な手がかりに関連付けられる。動物が食物報酬を食べる回数は、正の方向転換と見なされる。
【００５３】
実施例１６  −  新規物体認識タスク
他の研究者ら（５８）及び本発明者ら（５７）によって記載されたように、新規物体認識タスクを実施して短期記憶をモニターした。簡潔に述べると、訓練中、赤外線センサーで囲まれた四角い新規な箱（長さ２０インチ×高さ８インチ）にマウスを入れた。互いに１８インチ離れた環境の特定の場所に、着色、形状及び質感が変化する２つのプラスチック製の玩具（２．５インチ〜３インチ）を配置した。マウスは、環境及び物体を１５分間自由に探索でき、次に個々のホームケージに戻された。３０分後、マウスは、同じ場所に２つの物体がある環境に戻されたが、今度はなじみ深い物体の１つを第３の新規物体に置き換えた。次に、再び１５分間、マウスに両方の物体を自由に探索させた。物体は、中性洗剤で徹底的に洗浄した。
【００５４】
実施例１７  −  免疫組織化学検査。
免疫蛍光顕微鏡観察のために、マウスをケタミン−キシラジン注射剤で麻酔し、ＰＢＳ、次にＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで灌流し、各マウスからの脳の解剖がそれに続いた（２３、５９）。簡潔に述べると、サンプルを４℃において、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）と１０％スクロースとを含有するＰＢＳ中で３時間、次に３０％スクロースを含有するＰＢＳ中で一晩インキュベートした。次に、脳を−８０℃でＯ．Ｃ．Ｔ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈ）に包埋し、従来の凍結切片作成のために処理した。凍結切片（３０μｍ）を冷エタノール（−２０℃）で処理し、ＰＢＳ中の２回の洗浄、ＰＢＳＴ中の３％ＢＳＡによるブロッキング及び２つの抗体による二重標識がそれに続いた（表Ｓ３）。ＰＢＳＴ中での３回の洗浄後、切片をＣｙ２及びＣｙ５と共にさらにインキュベートした（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。サンプルをマウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１蛍光顕微鏡下で観察した。タッチカウントモジュールを利用してＯｌｙｍｐｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｕｉｔｅ  Ｖソフトウェアを使用し、カウント分析を実施した。
【００５５】
実施例１８  −  ＤＮＡの断片末端標識：
これは、前述されたように（１０、２２）、市販のキット（ＴｄＴ  ＦｒａｇＥＬＴＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して実施した。
【００５６】
実施例１９  −  Ａβ１−４２及びＡβ１−４０のＥＬＩＳＡ
海馬組織をＴＢＳ中で均質化し、×１５０，０００ｇで３０分間ペレット化した。ペレットを３容積（ｗｔ／ｖｏｌ元の組織重量）のＴＢＳ＋１％トリトンＸ−１００に再懸濁し、×１５０，０００ｇで３０分間ペレット化して上清を回収し保存した。製造業者の使用説明（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に従ってＥＬＩＳＡを実施する前にサンプルのタンパク質濃度をアッセイして１０倍に希釈した。
【００５７】
実施例２０  −  統計学的解析
ヒト組織の臨床及び生化学的データは、外れ値、非正規性及び不均等サンプルサイズに対してより堅固なノンパラメトリック検定（すなわちクラスカル・ワリス検定又はフィッシャーの正確確率検定、多重比較のためのダンの補正を伴う）を用いて診断間で比較した。両側スピアマン順位相関は、認知試験スコアとタンパク質光学密度との間の可変的な関連性を評価した。これらの測定基準は、臨床群間で有意差がなかったため、相関関係は、人口統計情報（すなわち年齢、性別など）について調整しなかった。ＳＰＳＳ  １９（ＩＢＭ）を用いて統計学的検定を実施し、有意性はα＝．０５（両側）に設定した。
【００５８】
マウスの行動尺度は、ＳＰＳＳを使用して独立した一方向ＡＮＯＶＡによって調べた。試験群間の分散の均質性は、Ｌｅｖｅｎｅの検定を用いて調べた。事後解析は、必要に応じて、チューキー検定又はＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ検定を用いて実施した。他のデータは、３つの独立した実験の平均値±ＳＤとして表した。平均値間の統計学的差異は、スチューデントのｔ検定（両側）によって計算した。０．０５未満のｐ値（ｐ＜０．０５）は、統計学的に有意であると見なされた。
【００５９】
実施例２１  −  研究承認
ラッシュ大学医療センターのヒト調査委員会は、ＲＲＯＳ試験を承認した。米国国立衛生研究所ガイドラインに従い、動物を飼育して実験が実施され、ラッシュ大学医療センター施設内動物管理使用委員会によって承認された。
【００６０】
実施例２２  −  ＡＤにおけるＴＬＲ２の上方制御：
ＡＤの病態形成におけるＴＬＲ２の役割を調べるために、本発明者らは、ＡＤ認知症（ｎ＝１０）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ；ｎ＝１１）を有して死亡した個人及び認知機能障害がない年齢をマッチさせた個人（ＮＣＩ；ｎ＝１２）の３３人の対象からの前頭前皮質（ＰＦＣ；  ブロードマン野９）における免疫ブロット分析により、ＴＬＲ２のレベルをモニターした（表Ｓ１）。年齢、性別、死後の間隔、脳重量又はＢｒａａｋスコアに関して、群間に有意差は認められなかった（表Ｓ１）。比較のために、本発明者らは、ＴＬＲ４を含めた。ＴＬＲ３以外のＴＬＲは、全てＭｙＤ８８を用いているため、本発明者らは、ＭｙＤ８８についても調査した。ＰＦＣにおけるＴＬＲ２及びＭｙＤ８８の両方のレベルは、群間で有意に変化し、ＮＣＩ及びＭＣＩ症例と比較して、ＡＤ症例は、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８をより多く発現していた（図１Ａ〜Ｃ及び表Ｓ２）。対照的に、ＴＬＲ４レベルは、群間に有意差はなかった（図１Ａ及びＤ；表Ｓ２）。スピアマン順位相関は、前頭前皮質のＴＬＲ２及びＭｙＤ８８レベルの両方がＢｒａａｋ病期診断と正に相関することを示した（図１Ｅ〜Ｆ及び表Ｓ２）。他方、本発明者らは、ＴＬＲ４とＢｒａａｋスコアとの間にいかなる関連性も見いださなかった（図１Ｇ及び表Ｓ２）。重要なことに、ＭｙＤ８８は、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）及び全体的認知性ｚスコア（ＧＣＳ）とも負の相関がある（図１Ｈ〜Ｍ及び表Ｓ２）。
【００６１】
これらの知見を立証するために、本発明者らは、海馬切片の二重標識免疫蛍光分析を実施した。予測通り、Ｉｂａ−１（小グリア細胞マーカー）のレベルは、ＮＣＩと比較してＡＤの大脳皮質及び海馬でより高かった（図８Ａ〜Ｅ）。ウエスタンブロットの結果と同様に、本発明者らは、ＮＣＩと比較して、ＡＤの大脳皮質及び海馬でより高いレベルのＴＬＲ２（図８Ａ及び図１Ｎ〜Ｏ）及びＭｙＤ８８（図８Ｂ及び図１Ｐ〜Ｑ）を観察した。この場合も、ＴＬＲ４の発現には差がなかった（図８Ｃ及び図１Ｒ〜Ｓ）。
【００６２】
実施例２３  −  ５ＸＦＡＤ遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスにおけるＴＬＲ２の上方制御：
次に、本発明者らは、５ＸＦＡＤ  Ｔｇマウスの海馬におけるＴＬＲ２及びＭｙＤ８８の状態を調べた。ＡＤ対象のＣＮＳで観察されたのと同様に、本発明者らは、Ｔｇマウスの皮質及び海馬の異なる部分において、齢数をマッチさせた非Ｔｇマウスと比較してより高いレベルのＴＬＲ２（図９Ａ〜Ｂ）とＭｙＤ８８（図１０Ａ〜Ｂ）を認めた。本発明者らは、Ｔｇマウスの大脳皮質と海馬において、Ｉｂａ−１免疫反応性の増加及び多くのＩｂａ−１陽性細胞とＴＬＲ２（図９Ｂ）及びＭｙＤ８８（図１０Ｂ）との共局在も見いだした。ウエスタンブロット実験でも、非Ｔｇマウスと比較して、Ｔｇマウスの海馬でＴＬＲ２（図９Ｃ〜Ｄ）及びＭｙＤ８８（図１０Ｃ〜Ｄ）が増加していることが確認された。
【００６３】
実施例２４  −  ＴＬＲ２の特異的標的化のためのＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメイン（ＴＩＤＭ）に対応するペプチドの設計
ＴＬＲ２の特異的阻害剤がないことから、本発明者らは、治療目的でＴＬＲ２の標的化を試みた。リガンド結合後、ＴＬＲ２は、ＭｙＤ８８を介して機能する（１４、１５）。そのため、本発明者らは、剛体タンパク質間相互作用ツールを応用して、ＴＬＲ２のＴＬＲ相互作用ドメイン（ＴＩＲ）とＭｙＤ８８との間の相互作用をモデル化した。マウスＴＬＲのＴＩＲの結晶構造が入手できなかったため、本発明者らは、インシリコ相同性モデル化ストラテジーを採用し、全ての異なるＴＬＲからＴＩＲの三次元構造を構築した（図１１Ａ〜Ｇ）。以前の知見（２０）と同様に、本発明者らのインシリコモデル化解析から導き出されたＭｙＤ８８及びＴＩＲの複合体のドッキングポーズは、ＴＬＲ２のＢＢループがＭｙＤ８８のＣＤループと強いファンデルワールス（ＶＤＷ）相互作用によって結合していることを明らかにした（図２Ａ）。そのため、本発明者らは、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメイン（ＴＩＤＭ）に対応する以下のペプチドをＣＤループから設計して、ＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の相互作用を破壊した。
野生型（ｗｔ）ＴＩＤＭ：ｄｒｑｉｋｉｗｆｑｎｒｒｍｋｗｋｋＰＧＡＨＱＫ（配列番号２）
変異型（ｍ）ＴＩＤＭ：ｄｒｑｉｋｉｗｆｑｎｒｒｍｋｗｋｋＰＧＷＨＱＤ（配列番号３）
【００６４】
本発明者らは、これらのペプチドのＣ末端にアンテナペディアホメオドメイン（小文字）を付加し、細胞透過性を促進した。ＭｙＤ８８セグメントは、大文字であり、変異の位置に下線が引かれている。興味深いことに、ＴＬＲ２のＴＩＲとＭｙＤ８８との間の相互作用をｗｔＴＩＤＭペプチドでモデル化すると、本発明者らは、ＭｙＤ８８がある程度の回転に関連し、そのＣＤループがＴＬＲ２  ＢＢループから遠く離れたままになることを観察した（図２Ｂ）。Ｐｙｄｏｃｋ解析によると、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＴＬＲ２のＴＩＲドメインのＣＤループ、αＢらせん及びＢＢループの境界面にドッキングしていることが分かった（図１２Ａ）。ｗｔＴＩＤＭペプチドのその特定のポーズは、そのＶＤＷ表面をＴＬＲ２のＢＢループ上に分布させ（図１２Ａ）、これは、ｍＴＩＤＭペプチドの場合に可能でなかった（図１２Ｂ）。本発明者らは、ＣＤループの保存ヒスチジン残基（Ｈ８２）のＮＥ１原子とｗｔＴＩＤＭペプチドのヒスチジン残基（Ｈ４）のＮＤ原子との間に強い静電相互作用（２．３１Ａ°）があることを観察した（図１２Ｃ）。ｍＴＩＤＭとＴＬＲ２とのドッキング構造は、ＣＤループのＨ８２残基とｍＴＩＤＭペプチドのＨ４残基との間に非常に弱い静電相互作用（７．２６Ａ°）があったことを明確に示した（図１２Ｃ、右パネル）。さらに、リジンからアスパラギン酸へのｗｔＴＩＤＭの変異は、負の雲を生じさせ、これは、ｍＴＩＤＭのＣ末端もＢＢループからさらに遠ざけて、αＢらせんの溝に向けて移動させた（図１２Ｂ）。本発明者らは、ＴＬＲ２とＭｙＤ８８の２つの近い残基との間のＶＤＷ液滴の距離を測定することにより、その複合体におけるＶＤＷ相互作用の可能性も測定した（図１２Ｄ）。本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭの非存在下において、ＭｙＤ８８とＴＬＲ２との間に有意なＶＤＷの重なりがあることを観察した。しかし、ｗｔＴＩＤＭと複合体化した場合、ＴＬＲ２のＢＢループとＭｙＤ８８のＣＤループとは、互いに離れた位置にあり、ＶＤＷ相互作用のいかなる可能性も否定された（図１２Ｅ）。ｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭのＴＬＲ２に対する親和性を別の角度から比較するために、本発明者らは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を実施した。本発明者らは、最初に、ＴＬＲ２タンパク質全体をクローニングして精製した。しかし、それは、安定しておらず、ＴＬＲ２タンパク質全体も利用できないため、本発明者らは、ウイルスクローニングストラテジーを介してＴＬＲ２タンパク質（ｃＴＬＲ２）のＣ末端ＴＩＲドメインのみを調製し、ｍｙｃアフィニティカラムによってタンパク質を精製した（図２Ｃ）。動態プロット（図２Ｄ〜Ｅ）は、ｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭの両方の増加する用量がｃＴＬＲ２との結合を示したことを明確に示した。しかし、ｃＴＬＲ２に対して、ｗｔＴＩＤＭは、ｍＴＬＤＭよりもはるかに強い親和性を示した（図２Ｄ〜Ｆ）。平衡時のＳＰＲ応答対ペプチド濃度のプロット（図２Ｆ）によると、ｃＴＬＲ２に対するｗｔＴＩＤＭ（Ｋｄ＝８μＭ）の親和性は、ｍＴＩＤＭ（Ｋｄ＝１９μＭ）の約２．５倍強かった。さらなる実証のために、本発明者らは、熱シフトアッセイを実施し、それは、１０μＭのｗｔＴＩＤＭペプチドがｃ��ＬＲ２の融解曲線を強くシフトさせることを明らかにした（図２Ｇ）。他方、ｍＴＩＤＭでは、非常にわずかなシフトのみが観察された（図２Ｈ）。総合して、これらの結果は、ｗｔＴＩＤＭがＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の相互作用を強く妨害する強力な小分子ペプチドであることを示唆する。
【００６５】
次に、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭが他のＴＬＲに対して同様の親和性を有するかどうかを調べた。興味深いことに、本発明者らのインシリコ分析では、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＴＬＲ１（図３Ａ）、ＴＬＲ４（図３Ｂ）、ＴＬＲ５（図３Ｃ）、ＴＬＲ６（図３Ｄ）、ＴＬＲ７（図３Ｅ）及びＴＬＲ９（図３Ｆ）のＢＢループから離れてドッキングすることが明らかになり、ｗｔＴＩＤＭは、他のＴＬＲではなく、ＴＬＲ２のＢＢループを特異的に標的化することが示唆された。
【００６６】
次に、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭペプチドが内因性ＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の物理的結合を破壊し得るかどうかを調べた。以前、本発明者らは、小繊維Ａβ１−４２がＴＬＲ２を介して小グリア細胞を活性化することを記述している（１７）。本明細書では、ＴＬＲ２に対する抗体を用いたＭｙＤ８８免疫沈降物の免疫ブロット分析により、本発明者らは、小繊維Ａβ１−４２処理が小グリア細胞におけるＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の結合を増大させること、及びこの相互作用が、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドによって阻害されることを見いだした（図３Ｇ〜Ｈ）。入力は、異なる処理条件下における等量のＴＬＲ２及びＭｙＤ８８の存在を示した（図３Ｇ）。特異性を理解するために、ＴＬＲ４とＭｙＤ８８との間の相互作用に対するｗｔＴＩＤＭペプチドの効果を調べた。ＬＰＳは、ＴＬＲ４のプロトタイプ作動薬である。ＬＰＳ処理は、小グリア細胞におけるＴＬＲ４とＭｙＤ８８との間の結合を増大させ（図３Ｉ〜Ｊ）、ＴＬＲ２：ＭｙＤ８８相互作用の抑制（図３Ｇ〜Ｈ）とは対照的に、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＴＬＲ４とＭｙＤ８８との間の相互作用に影響を及ぼさなかった（図３Ｉ〜Ｊ）。次に、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭが、ＭｙＤ８８と、新たに形成されたＭｙｃタグ付きＣ末端ＴＬＲ２（ｃＴＬＲ２）との間の相互作用を妨げ得るかどうかを調べた。そのため、小グリア細胞をｐＬｅｎｔｉ−ｃＭｙｃ−ｃＴｌｒ２レンチビリオンで形質導入し、４８時間の形質導入後、ｗｔＴＩＤＭ／ｍＴＩＤＭの存在下又は非存在下で細胞を小繊維Ａβ１−４２で１時間処理した。ｃ−Ｍｙｃに対する抗体を用いたＭｙＤ８８の免疫沈降物の免疫ブロット分析は、Ａβ１−４２で処理された小グリア細胞で新たに形成されたｃＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の相互作用が、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドによって阻害されたことを示した（図３Ｋ〜Ｌ）。
【００６７】
実施例２５  −  ＴＩＤＭペプチドは、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）、二本鎖ＲＮＡ（ポリＩＣ）、細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）、フラジェリン及びＣｐＧ  ＤＮＡではなく、小繊維Ａβ１−４２及びリポテイコ酸（ＬＴＡ）によって誘導される小グリア細胞炎症を阻害する：
異なるＴＬＲを発現する小グリア細胞は、神経変性、炎症、ウイルス感染及び細菌感染などの様々な病理学的条件下で活性化される（７、２１）。そのため、本発明者らは、ＴＩＤＭペプチドが、異なる刺激によって誘導される小グリア細胞活性化を抑制できるかどうかを調査した。様々な濃度のｗｔＴＩＤＭ及びｍＴＩＤＭペプチドで１時間前処置された小グリア細胞は、小繊維Ａβ１−４２（ＡＤの病因試薬）、ＭＰＰ＋（パーキンソン病毒素）、ＬＴＡ（ＴＬＲ２の作動薬）、ポリＩＣ（ＴＬＲ３の作動薬）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４の作動薬）、フラジェリン（ＴＬＲ５の作動薬）及びＣｐＧ  ＤＮＡ（ＴＬＲ９の作動薬）で刺激した。予測通り、小繊維Ａβ（図４Ａ）、ＭＰＰ＋（図４Ｄ）、ＬＴＡ（図４Ｇ）、ポリＩＣ（図１４Ａ）、ＬＰＳ（図４Ｊ）、フラジェリン（図４Ｍ）及びＣｐＧ  ＤＮＡ（図４Ｐ）は、小グリア細胞においてＮＦ−κＢ活性化を誘導した。しかし、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、小繊維Ａβ媒介及びＬＴＡ媒介のＮＦ−κＢ活性化を阻害した（図４Ａ及び４Ｇ）。対照的に、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、小グリア細胞における、ＭＰＰ＋（図４Ｄ）、ポリＩＣ（図１４Ａ）、ＬＰＳ（図４Ｊ）、フラジェリン（図４Ｍ）及びＣｐＧ  ＤＮＡ（図４Ｐ）によって誘導されるＮＦ−κＢの活性化を抑制できないままであった。ｍＴＩＤＭペプチドは、いずれの刺激によって誘導されたＮＦ−κＢの活性化にも影響を及ぼさなかったことから、これらの結果は特異的であった。古典的なＮＦ−κＢ経路の活性化は、ＩκＢαのリン酸化と、それに続くｐ６５及びｐ５０の核転位を伴う。そのため、本発明者らは、活性化された小グリア細胞におけるｐ６５及びｐ５０の核転移に対するｗｔＴＩＤＭペプチドの効果についても調査した。予想通り、小グリア細胞では、小繊維Ａβ１−４２（図１５Ａ〜Ｃ）及びＬＰＳ（図１５Ｄ〜Ｆ）に応答して、ｐ６５及びｐ５０の核転移が増加していることが観察された。しかし、ｗｔＴＩＤＭペプチド処理は、ＬＰＳ（図１５Ｄ〜Ｆ）ではなく、小繊維Ａβ１−４２（図１５Ａ〜Ｃ）で刺激された小グリア細胞において、ｐ６５及びｐ５０の核転移を阻害し、ｗｔＴＩＤＭペプチドの特異性が示唆された。これらの結果を確認するために、本発明者らは、ＮＦ−κＢ活性化によって駆動される炎症促進性分子であるＩＬ−１β及びｉＮＯＳの発現もモニターした。全ての刺激は、小グリア細胞において、ＩＬ−１β及びｉＮＯＳの発現を誘導した（図４Ｂ〜Ｃ、４Ｅ〜Ｆ、４Ｈ〜Ｉ、４Ｋ〜Ｌ、４Ｎ〜Ｏ、４Ｑ〜Ｒ、図１３Ａ〜Ｆ及び図１４Ｂ〜Ｄ）。ＮＦ−κＢ活性化に対するｗｔＴＩＤＭの効果と矛盾なく、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＭＰＰ＋（図１３Ｂ及び図４Ｅ〜Ｆ）、ポリＩＣ（図１４Ｂ〜Ｄ）、ＬＰＳ（図Ｓ６Ｄ及び図４Ｋ〜Ｌ）、フラジェリン（図１３Ｅ及び図４Ｎ〜Ｏ）及びＣｐＧ  ＤＮＡ（図１３Ｆ及び図４Ｑ〜Ｒ）ではなく、小繊維Ａβ（図１３Ａ及び図４Ｂ〜Ｃ）及びＬＴＡ（図１３Ｃ及び図４Ｈ〜Ｉ）によってのみ誘導される炎症促進性分子の発現を阻害した。これらの結果は、ｗｔＴＩＤＭペプチドが、他のＴＬＲではなく、ＴＬＲ２の作動薬によって誘導される、小グリア細胞炎症を特異的に阻害することを示唆する。
【００６８】
実施例２６  −  ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＴＬＲ２の非存在下で小グリア細胞の小繊維Ａβ１−４２誘導活性化を阻害しない：
ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ＴＬＲ２とＭｙＤ８８との間の物理的結合を破壊することから、本発明者らは、機械論的な原理証明として、Ｔｌｒ２−／−小グリア細胞のＡβ１−４２誘導活性化に対するｗｔＴＩＤＭペプチドの効果を調べた。ＢＶ−２小グリア細胞と同様に、小繊維Ａβ１−４２ペプチドは、ＷＴマウスから単離された初代小グリア細胞においてＮＦ−κＢの活性化を強く誘導し、これは、ｗｔＴＩＤＭペプチドによって阻害された（図１６Ａ）。他方、小繊維Ａβ１−４２ペプチドは、Ｔｌｒ２−／−小グリア細胞においてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を弱く誘導した（図１６Ａ）。しかし、ＷＴ小グリア細胞とは対照的に、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ｔｌｒ２−／−小グリア細胞における、小繊維Ａβ１−４２が誘導するＮＦ−κＢの活性化を阻害できないままであった（図１６Ａ〜Ｂ）。さらに確認するために、本発明者らは、上清中の一般的な炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦα及びＩＬ−１β）のレベルも測定した。ＮＦ−κＢ活性化と同様に、小繊維Ａβ１−４２によるＴＮＦα及びＩＬ−１β産生の誘導は、ＷＴ小グリア細胞と比較してＴｌｒ２−／−小グリア細胞で低かった（図１６Ｃ〜Ｆ）。しかし、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ｔｌｒ２−／−、小グリア細胞ではなく、ＷＴで、小繊維Ａβ１−４２ペプチドが誘導するＴＮＦα及びＩＬ−１β産生を阻害した（図１６Ｃ〜Ｆ）ことから、ｗｔＴＩＤＭペプチドがその機能を示すためにＴＬＲ２が必要であることが示唆された。
【００６９】
実施例２７  −  ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内投与は、５ＸＦＡＤ  Ｔｇマウスの海馬において炎症を阻害し、斑負荷を低減し、タウの過剰リン酸化を減少させる：
グリア炎症がＡＤ及び他の神経変性障害における神経細胞の喪失に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある（７、９、２２〜２４）。ｗｔＴＩＤＭペプチドは、小繊維Ａβ１−４２媒介小グリア細胞活性化を特異的に阻害したことから、本発明者らは、５ＸＦＡＤＴｇマウスにおけるその治療的翻訳可能性を試験することにした。本発明者らは、まず、ｗｔＴＩＤＭペプチドが海馬に侵入できるかどうかを判定した。ＴｇマウスをＴＩＤＭペプチドの鼻腔内投与で処置し、投与の６０分後、本発明者らは、エレクトロスプレーイオン化共役質量分析法により、Ｔｇマウスの海馬中にｗｔＴＩＤＭペプチドを検出した（図５Ａ及びＣ）。対照的に、生理食塩水処置されたＴｇマウスの海馬は、ｗｔＴＩＤＭペプチドのいかなるピークも示さなかった（図５Ｂ）。ｗｔＴＩＤＭペプチドのレベルは、生理食塩水処置されたＴｇマウスでは皆無であったのと比較して、ｗｔＴＩＤＭ処置されたＴｇマウスの海馬では、脳組織１グラム当たり２３．３３±１４．１４ｎｇであった。赤外線スキャンにより、本発明者らは、鼻腔内処置後の海馬からもＴＩＤＭペプチドを検出した（図１７）。したがって、鼻腔内投与後、ＴＩＤＭペプチドは、海馬に侵入する。
【００７０】
次に、本発明者らは、鼻腔内ＴＩＤＭペプチドがＴｇマウスの海馬におけるＮＦ−κＢ活性化を調節できるかどうかを調査した。海馬切片の二重標識免疫蛍光によって見られるように、Ｉｂａ−１及びホスホ−ｐ６５のレベルは、非Ｔｇマウスと比較してＴｇマウスで顕著により高かった（図５Ｄ〜Ｈ）。しかし、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドによるＴｇマウスの鼻腔内処置は、Ｔｇマウスの海馬におけるＩｂａ−１及びホスホ−ｐ６５の両方の抑制をもたらした（図５Ｄ〜Ｈ）。これは、海馬組織のウエスタンブロット分析によっても確認された（図１８Ａ〜Ｂ）。さらに、活性化された小グリア細胞は、ｉＮＯＳを発現することが知られている（２１、２５）。したがって、Ｔｇマウスの海馬小グリア細胞もｉＮＯＳに対して陽性であった（図１９及び図５Ｉ〜Ｊ）。しかし、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ｔｇマウスの海馬におけるｉＮＯＳの発現を抑制した（図１９及び図５Ｉ〜Ｊ）。ウエスタンブロット分析も、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置による海馬のｉＮＯＳ発現の阻害を確認した（図５Ｋ〜Ｌ）。
【００７１】
アミロイド斑は、５ＸＦＡＤ  Ｔｇマウスでモデル化されたＡＤ病理の重要な特徴である（２６、２７）。そのため、次に、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭ処置がＴｇマウスの海馬からアミロイド斑の負荷を軽減できるかどうかを調べた。８２Ｅ１  ｍＡｂを用いた海馬切片の免疫染色（図５Ｍ〜Ｏ）及び６Ｅ１０  ｍＡｂ（図５Ｐ〜Ｑ）及び８２Ｅ１  ｍＡｂ（図２０Ａ〜Ｂ）を用いた海馬組織のウエスタンブロット分析は、非Ｔｇマウスと比較して、Ｔｇマウスの海馬における顕著により高いＡβペプチドのレベルを示した。同様に、血清（図２１Ａ〜Ｂ）、ＴＢＳ抽出海馬画分（図２１Ｃ〜Ｄ）及び（ＴＢＳ＋Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）抽出海馬画分（図２１Ｅ〜Ｆ）のＥＬＩＳＡも、非Ｔｇマウスと比較して、ＴｇマウスでＡβ１−４０及びＡβ１−４２が有意に増加していることを実証した。しかし、有意なＡβの減少は、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭ処置で見られた（図２０Ａ〜Ｂ、図２１Ａ〜Ｆ及び図５Ｍ〜Ｑ）。これらの結果は、ｗｔＴＩＤＭの鼻腔内投与が５ＸＦＡＤマウスの海馬におけるＡβ負荷を軽減できることを示唆する。
【００７２】
タウの過剰リン酸化は、ＡＤ病理の別の突出した特徴である（２８、２９）。５ＸＦＡＤマウスの海馬では、学習及び記憶障害の出現よりもはるかに早い段階でＳｅｒ３９６におけるタウの過剰リン酸化が起こることが示されている（３０）。そのため、本発明者らは、ＴＩＤＭペプチド処置がＴｇマウスの海馬における生体内タウリン酸化の状態に及ぼす影響を調べた。免疫ブロット分析は、非Ｔｇマウスと比較した、Ｔｇマウスの海馬抽出物中のホスホ−タウの著しい上昇を示す（図２２Ａ〜Ｂ）。しかし、Ｔｇマウスを、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドで処置した場合、タウタンパク質の総レベルに影響を及ぼすことなく、海馬のホスホ−タウの抑制がもたらされ（図２２Ａ〜Ｂ）、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置がＴｇマウスの海馬におけるタウリン酸化を減少させるのに適切であることが示唆された。
【００７３】
実施例２８  −  ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内投与による５ＸＦＡＤ  Ｔｇマウスにおける神経細胞アポトーシスの減少並びに記憶及び学習の保護：
神経炎症は、神経細胞のアポトーシスに関連し得るため、次に、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置がＴｇマウスの海馬における神経細胞のアポトーシスを減少できるかどうかを調べた。Ｔｇマウスの海馬では、非Ｔｇマウスと比較して、いくつかのＴＵＮＥＬ陽性体がＮｅｕＮと共局在していた（図６Ａ〜Ｃ）。しかし、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドが海馬の神経細胞のアポトーシスを弱めた（図６Ａ〜Ｃ）。この結果は、切断されたカスパーゼ３の検出によって確認された。予測通り、切断されたカスパーゼ３のレベルは、Ｔｇマウスの海馬において増加した（図６Ｄ〜Ｅ）。しかし、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドによるＴｇマウスの処置は、海馬において切断されたカスパーゼ３の上昇したレベルが減少し（図６Ｄ〜Ｅ）、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置がＴｇマウスの海馬における生体内での神経細胞のアポトーシスを減少できることが示唆された。したがって、可塑性関連分子（ＰＳＤ−９５、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１）のレベルは、非Ｔｇマウスと比較してＴｇマウスの海馬で低下した（図６Ｆ〜Ｉ）。しかし、神経細胞アポトーシスの抑制と矛盾なく、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドによるＴｇマウスの処置が海馬における生体内ＰＳＤ−９５、ＮＲ２Ａ及びＧｌｕＲ１タンパク質の有意な回復をもたらした（図６Ｆ〜Ｉ）。
【００７４】
ＡＤにおける神経保護の最終的な目的は、記憶の改善及び／又は保護である。海馬の主な機能は、長期記憶及び空間的学習を生成的し整理することである。そのため、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭペプチドがＴｇマウスの記憶及び学習を保護するかどうかを調べた。予測通り、Ｔｇマウスは、非Ｔｇマウスと比較して、バーンズ迷路において食物報酬の穴を見つけるのにはるかに長時間かかり、より多くの誤り［ｐ＜０．００１（＝０．００００２５１）］でより長い遅延［ｐ＜０．００１（＝０．００００２１３）］を示した。しかし、遅延［Ｆ３，２８＝９３．１５３、ｐ＜０．００１（＝０．００００１１２）］（図６Ｊ）及び誤り数［Ｆ３，２８＝３６．３３９、ｐ＜００１（＝０．００００８６３）］（図６Ｋ）によって示されるように、ｗｔＴＩＤＭ処置は、Ｔｇマウスの記憶機能を有意に改善した。ｗｔＴＩＤＭペプチド処置マウスの記憶機能は、ｍＴＩＤＭ処置マウスと比較してより小さい遅延［ｐ＜０．００１（＝０．００００６００）］及びより少ない誤り［ｐ＜０．００１（＝０．００００５７９）］で報酬の穴の位置を探し当てるのにも優れていた。同様に、Ｔ字型迷路上において、未処置Ｔｇマウスは、齢数をマッチさせた非Ｔｇマウスよりも少ない正の方向転換数［ｐ＜０．００１（＝０．００００４４０）］及びより多い負の方向転換数［ｐ＜０．００１（＝０．０００２２３）］も示した（図６Ｌ〜Ｍ）。しかし、ｗｔＴＩＤＭ処置は、Ｔｇマウスによる成功裏の正の方向転換［Ｆ３，２８＝３１．４７５、ｐ＜０．００１（＝０．００００４１１］（図６Ｌ）及びより少ない誤り数［Ｆ３，２８＝２６．６５３、ｐ＜０．００１（＝０．００００２３５］（図６Ｍ）にも有意な効果を示した。この場合も、ｗｔＴＩＤＭ処置マウスは、ｍＴＩＤＭ処置Ｔｇマウスと比較してより多数の正の方向転換［ｐ＜０．００１（＝０．００００９５４）］及びより少数の負の方向転換［ｐ＜０．００１（＝０．０００１２３）］を示した（図６Ｌ〜Ｍ）。本発明者らは、新規物体認識（ＮＯＲ）試験により、Ｔｇマウスの短期記憶もモニターした。Ｔｇマウスは、齢数をマッチさせた非Ｔｇマウスと比較して、ＮＯＲ試験において識別指数で証明される有意な欠損［ｐ＜０．００１（＝０．００００１４９）］を示した（図６Ｎ）。しかし、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置マウスは、未処置Ｔｇ又はｍＴＩＤＭ処置Ｔｇマウスと比較して、短期記憶において有意な改善（ｐ＜０．００１）を示した（図６Ｎ）。他方、Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの総運動量は、ほぼ同様であった（図２３）。さらに、ｗｔＴＩＤＭ又はｍＴＩＤＭペプチドは、運動回数、水平活動、休止時間及び常同行動から明らかなように（図２３Ａ〜Ｄ）、Ｔｇマウスの総運動活動を調節せず、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置による記憶の改善が総運動活動のいかなる変化にも起因するものではないことが示唆された。
【００７５】
実施例２９  −  ｗｔＴＩＤＭペプチドは、５ＸＦＡＤ  Ｔｇマウスにおいて斑を減少させ、記憶を改善するためにＴＬＲ２を必要とする：
ｗｔＴＩＤＭペプチドが、生体内でそのその機能を提示するために、実際にＴＬＲ２を必要とすることを立証するために、本発明者らは、Ｔｌｒ２−／−マウスとＴｇマウスを交配し、Ｔｌｒ２をヌルにした５ＸＦＡＤマウス（Ｔｇ−Ｔｌｒ２−／−）を作製した。Ｔｌｒ２ノックダウンは、５ＸＦＡＤ導入遺伝子の挿入又は発現を変化させず、その逆も同様であった（図Ｓ２４Ａ）。６ヶ月齢ＷＴ、Ｔｌｒ２−／−、Ｔｇ及びＴｇ−Ｔｌｒ２−／−マウスは、総体重又は湿潤脳重量に関して有意差がなかった（図２４Ｂ〜Ｃ）。本発明者らはまた、この齢数の遺伝子型間で食事、糞便塊、社会的交流及び興奮をはじめとする顕性表現型のいかなる差異も見いださなかった。ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ｔｇマウスにおいて斑負荷を減少させ、空間的学習及び記憶を改善したが（図５〜６）、Ｔｇ−Ｔｌｒ２−／−マウスではそれができないままであり（図２４Ｄ〜Ｇ）、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、Ｔｌｒ２の非存在下で効果がないことが示唆された。
【００７６】
実施例３０  −  ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドは、マウスの実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）及びコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の疾患プロセスを抑制する：
自然免疫経路の重要なメンバーであるＭｙｄ８８依存型ＴＬＲ２シグナル伝達は、多様な感染性及び自己免疫障害の病態形成に重要な役割を果たす（３１、３２）。そのため、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭペプチドの機能が５ＸＦＡＤマウスのみに限定されるか又は他の疾患モデルでも機能するかどうかを調べた。ＥＡＥは、多発性硬化症（ＭＳ）の広く使用されている動物モデルであり、ＥＡＥの慢性型は、ＭＯＧ３５−５５で免疫化されたオスのＣ５７／ＢＬ６マウスにおいてモデル化される。５ＸＦＡＤマウスにおけるその効果と同様に、ｗｔＴＩＤＭペプチドを用いたＥＡＥマウスの鼻腔内投与は、ＥＡＥの臨床症状を強く阻害した（図７Ａ）。ダネットの多重比較分析で群間の平均値を比較する間、本発明者らは、ＥＡＥとＥＡＥ＋ｗｔＴＩＤＭとの間に平均値の有意差があることを見いだした（調整後ｐ＜０．００１）。他方、ｍＴＩＤＭペプチドは、効果がなく（図７Ａ）、効果の特異性が示唆された。予測通り、ＥＡＥの誘導は、ヒートマップ解析（図７Ｂ）、移動距離（図７Ｃ）、立ち上がり行動（図７Ｄ）、速度（図７Ｅ）及び加速度（図７Ｆ）によって明らかなように、マウスの自発運動活性を低下させた。足跡解析（図２５）も、正常なマウスと比較して、ＥＡＥマウスにおける歩幅（図７Ｇ）、及び点長さ（図７Ｈ）の減少、及び揺れ長さ（図７Ｉ）、及びつま先の広がり（図７Ｊ）の増加を示した。本発明者らは、ＥＡＥマウスで足指の引きずりが頻繁であることも見いだした（図２５）。しかし、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドによる鼻腔内処置は、ＥＡＥマウスの自発運動活性を改善し、足跡を正常化した（図７Ａ〜Ｋ及び図２５）。ＣＩＡは、広く使用されているリウマチ様関節炎の動物モデルである。ＥＡＥマウスと同様に、ｍＴＩＤＭではなく、ｗｔＴＩＤＭペプチドがマウスにおけるＣＩＡの臨床症状も減少させた（図７Ｌ）。ダネットの多重比較分析で群間の平均値を比較する間、本発明者らは、ＣＩＡとＣＩＡ＋ｗｔＴＩＤＭとの間に平均値の有意差があることを見いだした［調整後ｐ＝０．０１４８（＜０．０５）］。ｗｔＴＩＤＭペプチドはまた、自発運動活性を増強し（図７Ｎ〜Ｒ）、足跡の挙動を改善した（図７Ｓ〜Ｖ及び図２６）。
【００７７】
実施例３１  −  ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメイン（ＴＩＤＭ）ペプチドの投与は、α−シヌクレイン症を減少させる：パーキンソン病、多発性萎縮症、レビー小体型認知症とのかかわり合い
パーキンソン病（ＰＤ）の病理学的所見としては、ＳＮｐｃのドーパミン作動性神経細胞の選択的喪失と、生き残った神経細胞中のレビー小体型のα−ｓｙｎタンパク質の細胞質内凝集の存在とが挙げられる。ＰＤに加えて、α−ｓｙｎの蓄積は、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）の重要な病理学的特徴でもある。したがって、レビー小体の病理を減少させることは、ＰＤ、ＤＬＢ及びＭＳＡにおいて治療的に重要である。小グリア細胞の活性化は、レビー小体疾患の病態形成に重要な役割を果たしており、小繊維α−ｓｙｎは、小グリア細胞の活性化のためにＴＬＲ２を必要とすることが示されている。最近、本発明者らは、ＭｙＤ８８のＴＬＲ２相互作用ドメイン（ＴＩＤＭ）に対応するペプチドがＴＬＲ２の活性化を選択的に阻害することを実証している。この研究は、α−シヌクレイン症の軽減におけるＴＩＤＭペプチドの重要性を強調する。野生型（ｗｔ）ＴＩＤＭペプチドの鼻腔内投与は、Ａ５３Ｔ遺伝子組換えマウスの黒質における誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の小グリア細胞発現を減少させた（図２８Ａ〜Ｂ）。ｗｔＴＩＤＭペプチドは、ｉＮＯＳの発現を阻害したが、本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭ処置後、Ａ５３Ｔマウスの黒質におけるアルギナーゼ−１の増加を観察し（図２９Ａ〜Ｂ）、ｗｔＴＩＤＭペプチドにより、小グリア細胞活性化がＭ１からＭ２モードに切り替えることが示唆された。ｗｔＴＩＤＭペプチドによるＡ５３Ｔマウスの毎日の鼻腔内処置はまた、オリゴマー及びモノマーα−ｓｙｎの減少（図３０Ａ〜Ｃ）並びにチロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミン作動性神経細胞内のα−ｓｙｎ封入体の抑制（図３１Ａ〜Ｄ）をもたらした。本発明者らは、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置後、Ａ５３Ｔマウスの黒質における小グリア細胞α−ｓｙｎの減少も観察した（図３２Ａ〜Ｂ）。最終的に、ｗｔＴＩＤＭペプチド処置は、Ａ５３Ｔマウスの自発運動活性を改善した（図３３Ａ〜Ｅ）。変異ＴＩＤＭペプチドは、Ａ５３Ｔマウスでいかなるこのような保護効果も示さなかったため、これらの結果は、特異的であった。したがって、ｗｔＴＩＤＭペプチドの鼻腔内処置は、ＰＤ、ＭＳＡ及びＤＬＢに有益であり得る。
【００７８】
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２５．Ｓａｈａ  ＲＮ，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ  Ｋ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．２００６；８（５−６）：９２９−４７．
２６．Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＧＴ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＦＪ，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ  Ｋ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ＡＤＡＭ１０−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＰＰ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１５；１１２（２７）：８４４５−５０．
２７．ＯａｋｌｅｙＨ，Ｃｏｌｅ  ＳＬ，Ｌｏｇａｎ  Ｓ，Ｍａｕｓ  Ｅ，Ｓｈａｏ  Ｐ，Ｃｒａｆｔ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｎｅｕｒｏｎａｌ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｆｉｖｅ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６；２６（４０）：１０１２９−４０．
２８．Ｍｏｎｄｒａｇｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｓ，Ｐｅｒｒｙ  Ｇ，Ｌｕｎａ−Ｍｕｎｏｚ  Ｊ，Ａｃｅｖｅｄｏ−Ａｑｕｉｎｏ  ＭＣ，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｓ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔ  ｓｉｔｅｓ  Ｓｅｒ（３９６−４０４）ｉｓ  ｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｉｅｓｔ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１４；４０（２）：１２１−３５．
２９．Ｒｅｇａｎ  Ｐ，Ｐｉｅｒｓ  Ｔ，Ｙｉ  ＪＨ，Ｋｉｍ  ＤＨ，Ｈｕｈ  Ｓ，Ｐａｒｋ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｔａｕ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｓｅｒｉｎｅ  ３９６  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ＬＴＤ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５；３５（１２）：４８０４−１２．
３０．Ｋａｎｎｏ  Ｔ，Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ａ，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｚａｋｉ  Ｔ．Ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｕ  ａｔ  Ｓｅｒ３９６  ｏｃｃｕｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｃｈ  ｅａｒｌｉｅｒ  ｓｔａｇｅ  ｔｈａｎ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ５ＸＦＡＤ  ｍｉｃｅ．Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２０１４；２７４：３０２−６．
３１．Ｌｉｕ  Ｙ，ＹｉｎＨ，Ｚｈａｏ  Ｍ，ａｎｄ  Ｌｕ  Ｑ．ＴＬＲ２  ａｎｄ  ＴＬＲ４  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｌｉｎ  Ｒｅｖ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；４７（２）：１３６−４７．
３２．Ｏｌｉｖｅｉｒａ−Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  Ｌ，Ｍａｓｓａｒｉ  Ｐ，ａｎｄ  Ｗｅｔｚｌｅｒ  ＬＭ．Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＴＬＲ２  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；３：７９．
３３．Ｒｅｅｄ−Ｇｅａｇｈａｎ  ＥＧ，Ｓａｖａｇｅ  ＪＣ，Ｈｉｓｅ  ＡＧ，ａｎｄ  Ｌａｎｄｒｅｔｈ  ＧＥ．ＣＤ１４  ａｎｄ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ２  ａｎｄ  ４  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ａ｛ｂｅｔａ｝−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９；２９（３８）：１１９８２−９２．
３４．Ｙｕ  ＪＴ，Ｍｏｕ  ＳＭ，Ｗａｎｇ  ＬＺ，Ｍａｏ  ＣＸ，ａｎｄ  Ｔａｎ  Ｌ．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２−１９６  ｔｏ  −１７４  ｄｅｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆＨａｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｐｅｏｐｌｅ  ｔｏ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１１；８：１３６．
３５．Ｚｈａｎｇ  Ｗ，Ｗａｎｇ  ＬＺ，Ｙｕ  ＪＴ，Ｃｈｉ  ＺＦ，ａｎｄ  Ｔａｎ  Ｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ＴＬＲ２  ａｎｄ  ＴＬＲ４  ｏｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．２０１２；３１５（１−２）：６７−７１．
３６．Ｂａｌａｙｓｓａｃ  Ｓ，Ｂｕｒｌｉｎａ  Ｆ，Ｃｏｎｖｅｒｔ  Ｏ，Ｂｏｌｂａｃｈ  Ｇ，Ｃｈａｓｓａｉｎｇ  Ｇ，ａｎｄ  Ｌｅｑｕｉｎ  Ｏ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６；４５（５）：１４０８−２０．
３７．Ｂｏｒｒｅｌｌｉ  Ａ，Ｔｏｒｎｅｓｅｌｌｏ  ＡＬ，Ｔｏｒｎｅｓｅｌｌｏ  ＭＬ，ａｎｄ  Ｂｕｏｎａｇｕｒｏ  ＦＭ．Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１８；２３（２）．
３８．Ｂｅｒａ  Ｓ，Ｋａｒ  ＲＫ，Ｍｏｎｄａｌ  Ｓ，Ｐａｈａｎ  Ｋ，ａｎｄ  Ｂｈｕｎｉａ  Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｌｅｖｅｌ：ＰｒｏｂｉｎｇＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１６；５５（３５）：４９８２−９６．
３９．Ｒｉｃｈａｒｄ  ＫＬ，Ｆｉｌａｌｉ  Ｍ，Ｐｒｅｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｐ，ａｎｄ  Ｒｉｖｅｓｔ  Ｓ．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｏ  ｃｌｅａｒ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  １−４２  ａｎｄ  ｄｅｌａｙ  ｔｈｅ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８；２８（２２）：５７８４−９３．
４０．Ｆｒｉｉｓ  ＬＭ，Ｋｅｅｌａｎ  Ｍ，ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ  ＤＥ．Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｄｒｉｖｅｓ  ＭｙＤ８８−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００９；７７（４）：１５５３−６０．
４１．Ｇａｏ  Ｑ，Ｑｉ  Ｌ，Ｗｕ  Ｔ，ａｎｄ  Ｗａｎｇ  Ｊ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＴＬＲ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＭｙＤ８８−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ＨＴ−２９  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２；３６１（１−２）：３１−７．
４２．Ｂｕｇｇｉａ−Ｐｒｅｖｏｔ  Ｖ，Ｓｅｖａｌｌｅ  Ｊ，Ｒｏｓｓｎｅｒ  Ｓ，ａｎｄ  Ｃｈｅｃｌｅｒ  Ｆ．ＮＦｋａｐｐａＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＢＡＣＥ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｂｅｔａ４２．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００８；２８３（１５）：１００３７−４７．
４３．Ａｔｒｉ  Ａ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｍａｎａｇ  Ｃａｒｅ．２０１１；１７  Ｓｕｐｐｌ  １３：Ｓ３４６−５５．
４４．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＤＡ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＪＡ，Ａｒｖａｎｉｔａｋｉｓ  Ｚ，Ｋｅｌｌｙ  ＪＦ，Ａｇｇａｒｗａｌ  ＮＴ，Ｓｈａｈ  ＲＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｏｌｄｅｒ  ｐｅｒｓｏｎｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００６；６６（１２）：１８３７−４４．
４５．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＤＡ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＪＡ，Ａｒｖａｎｉｔａｋｉｓ  Ｚ，ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  ＲＳ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｒｅｌｉｇｉｏｕｓ  ｏｒｄｅｒｓ  ｓｔｕｄｙ．Ｃｕｒｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２；９（６）：６２８−４５．
４６．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＤＡ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＪＡ，Ｂｉｅｎｉａｓ  ＪＬ，Ｅｖａｎｓ  ＤＡ，ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  ＲＳ．Ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００５；６４（５）：８３４−４１．
４７．Ｗｉｌｓｏｎ  ＲＳ，Ｂｅｃｋｅｔｔ  ＬＡ，Ｂａｒｎｅｓ  ＬＬ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＪＡ，Ｂａｃｈ  Ｊ，Ｅｖａｎｓ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｏｌｄｅｒ  ｐｅｒｓｏｎｓ．Ｐｓｙｃｈｏｌ  Ａｇｉｎｇ．２００２；１７（２）：１７９−９３．
４８．ＢｒａａｋＨ，ａｎｄ  Ｂｒａａｋ  Ｅ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｇｅｉｎｇ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１９９１；８２（４）：２３９−５９．
４９．Ｊａｎａ  Ａ，Ｍｏｄｉ  ＫＫ，Ｒｏｙ  Ａ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＡ，ｖａｎ  Ｂｒｅｅｍｅｎ  ＲＢ，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ  Ｋ．Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ｃｉｎｎａｍｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｅｎｚｏａｔｅ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３；８（３）：７３９−５５．
５０．Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＧＴ，Ｒｏｙ  Ａ，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ  Ｋ．Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ，ａ  ｌｉｐｉｄ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｄｒｕｇ，ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｅｌｆ−ｄｅｆｅｎｓｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９（２）：１００２−１３．
５１．Ｋｈａｓｎａｖｉｓ  Ｓ，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ  Ｋ．Ｓｏｄｉｕｍ  ｂｅｎｚｏａｔｅ，ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｏｆ  ｃｉｎｎａｍｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅ，ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＤＪ−１  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２；７（２）：４２４−３５．
５２．Ｒｏｙ  Ａ，Ｊａｎａ  Ｍ，Ｋｕｎｄｕ  Ｍ，Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＧＴ，Ｒａｎｇａｓｗａｍｙ  ＳＢ，Ｍｉｓｈｒａ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｂｉｎｄ  ｔｏ  ＰＰＡＲａｌｐｈａ  ｔｏ  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２０１５；２２（２）：２５３−６５．
５３．Ｒｏｙ  Ａ，Ｋｕｎｄｕ  Ｍ，Ｊａｎａ  Ｍ，Ｍｉｓｈｒａ  ＲＫ，Ｙｕｎｇ  Ｙ，Ｌｕａｎ  ＣＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＰＡＲａｌｐｈａ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅＨｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１６；１２（１２）：１０７５−８３．
５４．Ｍｏｎｄａｌ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ，Ｇｈｏｓｈ  Ｓ，Ｗａｔｓｏｎ  Ｒ，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ  Ｋ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｅｇｓ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｂｙ  ａ  ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓａｌｉｎｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．２０１２；７（１２）：０００．
５５．Ｍｏｎｄａｌ  Ｓ，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ  Ｋ．Ｃｉｎｎａｍｏｎ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｖｉａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｔｈｅｒａｐｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５；１０（１）：ｅ０１１６５６６．
５６．Ｐｉｋｅ  ＣＪ，Ｂｕｒｄｉｃｋ  Ｄ，Ｗａｌｅｎｃｅｗｉｃｚ  ＡＪ，Ｇｌａｂｅ  ＣＧ，ａｎｄ  Ｃｏｔｍａｎ  ＣＷ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｓｔａｔｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９３；１３（４）：１６７６−８７．
５７．Ｒｏｙ  Ａ，Ｊａｎａ  Ｍ，Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＧＴ，Ｒａｍａｓｗａｍｙ  Ｓ，Ｋｏｒｄｏｗｅｒ  ＪＨ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＦＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１３；４（４）：７２４−
５８．Ｍａｎｓｕｙ  ＩＭ，Ｍａｙｆｏｒｄ  Ｍ，Ｊａｃｏｂ  Ｂ，Ｋａｎｄｅｌ  ＥＲ，ａｎｄ  Ｂａｃｈ  ＭＥ．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｔｏ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｅｍｏｒｙ．Ｃｅｌｌ．１９９８；９２（１）：３９−４９．
５９．Ｋｈａｓｎａｖｉｓ  Ｓ，Ｒｏｙ  Ａ，Ｇｈｏｓｈ  Ｓ，Ｗａｔｓｏｎ  Ｒ，ａｎｄ  Ｐａｈａｎ  Ｋ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｈａｒｇｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｎａｎｏｂｕｂｂｌｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３；９（２）：２１８−３２．
【００７９】
2021517561.tif 000003
【００８０】
2021517561.tif 000004
【００８１】
2021517561.tif 000005
【図１Ａ−Ｄ】
2021517561.tif 000006
【図１Ｅ−Ｉ】
2021517561.tif 000007
【図１Ｊ−Ｍ】
2021517561.tif 000008
【図１Ｎ−Ｓ】
2021517561.tif 000009
【図２Ａ−Ｂ】
2021517561.tif 000010
【図２Ｃ】
2021517561.tif 000011
【図２Ｄ−Ｆ】
2021517561.tif 000012
【図２Ｇ−Ｈ】
2021517561.tif 000013
【図３Ａ−Ｆ】
2021517561.tif 000014
【図３Ｇ−Ｊ】
2021517561.tif 000015
【図３Ｋ−Ｌ】
2021517561.tif 000016
【図４Ａ−Ｆ】
2021517561.tif 000017
【図４Ｇ−Ｌ】
2021517561.tif 000018
【図４Ｍ−Ｒ】
2021517561.tif 000019
【図４Ｓ】
2021517561.tif 000020
【図５Ａ−Ｃ】
2021517561.tif 000021
【図５Ｄ−Ｆ】
2021517561.tif 000022
【図５Ｇ−Ｉ】
2021517561.tif 000023
【図５Ｊ−Ｏ】
2021517561.tif 000024
【図５Ｐ−Ｑ】
2021517561.tif 000025
【図６Ａ−Ｄ】
2021517561.tif 000026
【図６Ｅ−Ｇ】
2021517561.tif 000027
【図６Ｈ−Ｎ】
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【図７Ａ−Ｅ】
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【図７Ｆ−Ｋ】
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【図７Ｌ−Ｐ】
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【図７Ｑ−Ｖ】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【図９Ａ−Ｄ】
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【図１０−Ａ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｄ】
2021517561.tif 000036
【図１１Ｅ−Ｇ】
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【図１２Ａ−Ｅ】
2021517561.tif 000038
【図１３Ａ−Ｆ】
2021517561.tif 000039
【図１４Ａ−Ｄ】
2021517561.tif 000040
【図１５Ａ−Ｆ】
2021517561.tif 000041
【図１６Ａ−Ｆ】
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【図１７】
2021517561.tif 000043
【図１８Ａ−Ｂ】
2021517561.tif 000044
【図１９】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２１Ａ−Ｆ】
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【図２２Ａ−Ｂ】
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【図２３Ａ−Ｄ】
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【図２４Ａ−Ｃ】
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【図２４Ｄ−Ｅ】
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【図２４Ｆ−Ｈ】
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【図２５Ａ−Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７】
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【図２８Ａ−Ｂ】
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【図２９Ａ−Ｂ】
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【図３０Ａ−Ｃ】
2021517561.tif 000061
【図３１Ａ−Ｄ】
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【図３２Ａ−Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ−Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021517561.tif 000067
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