(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリン遺伝子又はその断片を含む核酸分子を提供し、ＩｇＭ遺伝子（ＩｇＨＣμ）およびＩｇＭスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓμ）を含み、前記ＳμおよびＩｇＨＣμがすべて宿主動物配列であることを特徴とする。本発明は、完全ヒト抗体を直接取得し、後期段階での手作業による改変を減らせると共に抗体の医薬としての可能性を高められる。本発明のトランスジェニックのＢ細胞の初期発生と成熟およびＢ細胞数は、正常なマウスと完全に一致し、Ｂ細胞の分化が助長され；抗体産生の特異性および多様性が増加され；治療用抗体のスクリーニング効率を向上させる。【選択図】  図１
2021512651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン遺伝子又はその断片を含む核酸分子であって、ＩｇＭ遺伝子（ＩｇＨＣμ）およびＩｇＭスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓμ）を含み、前記ＳμおよびＩｇＨＣμは、すべて宿主動物配列であることを特徴とする、核酸分子。
【請求項２】
前記ＩｇＨＣμは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４エクソンおよびその間の配列と、ＴＭ１、ＴＭ２、ｐｏｌｙＡシグナル配列と、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記Ｓμのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１内の（２５５０）．．（４４５１）に示されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
宿主動物のＩｇＨ重鎖の５’末端のエンハンサー（５’−Ｅｎｈａｎｃｅｒ）を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
５’Ｅｎｈａｎｃｅｒのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（４３３）．．（１４４４）に示されることを特徴とする、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
その構造は、図１−１に示されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
ＩｇＧ遺伝子（Ｉｇγ）を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
ＩｇＧ遺伝子は、宿主動物／ヒトＩｇＧキメラエレメント又は完全ヒトＩｇＧ配列であることを特徴とする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記キメラエレメントは、宿主動物Ｉｇγのスイッチ領域（Ｓγ）とＴＭ１とＴＭ２、ｐｏｌｙＡ等の配列、およびヒトのＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２、ＣＨ３エクソンおよびその間の配列等が含まれることを特徴とする、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ＩｇＧ遺伝子の構造は、図２−１に示されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記完全ヒトＩｇγ配列は、ヒトスイッチ領域（Ｓγ）配列、ヒトＩｇγのＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３エクソンおよびその間の配列、およびヒトＩｇγのＰｏｌｙＡとＴＭ１、ＴＭ２等の配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記Ｉｇγ配列は、Ｉｇγの単一又は複数のサブタイプ、複数のＩｇγサブタイプ間のスイッチ領域（Ｓγ）を含むことを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
ヒトＩｇγサブタイプは、Ｉｇγ３、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２および／あるいはＩｇγ４を含み、マウスＩｇγサブタイプは、Ｉｇγ３、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２ａおよび／あるいはＩｇγ２ｂ等を含むことを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
ヒト又は宿主動物ＩｇＨ重鎖の３’位置発現制御配列（Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ）を含むことを特徴とする、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
ヒトＩｇＨ重鎖Ｖ領域配列又は断片、ヒトＩｇＨ Ｄ領域配列又は断片およびヒトＩｇＨ Ｊ領域配列又は断片を含むことを特徴とする、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
その構造組成は、図５又は図６に示されることを特徴とする、請求項８〜１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１〜１６に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１７に記載のベクターを含むことを特徴とする、細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１７に記載のベクター又は請求項１８に記載の細胞に由来することを特徴とする、ヒト化抗体。
【請求項２０】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡのコード化、アミノ酸配列の発現、タンパク質、ベクター、ハイブリドーマ培養、細胞株、トランスジェニック動物および／あるいはヒト化抗体調製における請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１７に記載のベクター又は請求項１８に記載の細胞の応用。
【請求項２１】
以下の工程（１）〜（５）を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１７に記載のベクター又は請求項１８に記載の細胞を用いてトランスジェニック動物を作製する方法。
（１）前記核酸分子を取得する工程
（２）前記核酸分子をベクターに構築する工程
（３）前記ベクターを宿主動物細胞又は胚に導入する工程
（４）前記ベクターを含む細胞を宿主動物の胚又は体細胞クローンに移植する工程
（５）ヘテロ接合、ホモ接合のトランスジェニック動物を繁殖する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野に属し、特に、核酸分子およびヒト化抗体における核酸分子の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
完全ヒト抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体Ｈｕｍａｎ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）Ａｎｔｉｂｏｄｙとも呼ばれ、腫瘍、自己免疫疾患、感染症および移植拒絶反応などの最も重要な疾患の治療において現在使用されているクラスＩのバイオテクノロジー製品である。世界の治療用モノクローナル抗体の中で、欧米に上市されている７２のモノクローナル抗体のうちの２７は、ヒト抗体である。ヒト抗体の由来は、２つあり、１つ目がヒトＢ細胞ファージ抗体ライブラリーを構築し、ファージディスプレイテクノロジーを組み合わせて親和性を向上させ得、２つ目は、トランスジェニック動物を使用し、動物自体の免疫グロブリン遺伝子を不活性化してから改変された一部（又は全部）ヒトの免疫グロブリン遺伝子に組み込み、動物の免疫機構を利用してヒト（又は一部のヒト化）抗体を産生する。トランスジェニック技術およびＢ細胞発生メカニズの研究が明確になったことで、ヒト化トランスジェニック動物の作製は、より合理化され、トランスジェニック動物のＢ細胞が正常に発生し、ＤＮＡの組換えと変異、抗体の成熟と特異性が非常に高かかった。
【０００３】
従来のトランスジェニック抗体動物のほとんどは、ヒト／マウスキメラ抗体しか産生できず、すなわち抗体の重鎖のＶＤＪはヒト由来であり、Ｃ領域が動物由来であり、創薬プロセスで、さらにヒト化させなければならない。このヒト化プロセスにより、抗体の親和性が変化し、抗体の医薬としての可能性が低下していた。したがって、動物から完全ヒト抗体を取得するのは、非常に重要な意味を持つ。
【０００４】
特許文献１は、ヒト／宿主動物のキメラＩｇＭ配列を採用して完全ヒト化抗体の作製を実現することができるが、（１）トランスジェニック動物の初期Ｂ細胞の数は、正常なマウスの数より少なく、（２）抗体の特異性と多様性を高める必要があるという欠陥が存在していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】中国特許番号第ＣＮ１０５４４１４５５Ａ号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、従来技術に存在する上記の問題点を解決し、トランスジェニック動物で完全ヒト抗体を発現し、後期段階での手作業による改変を減らすと共に抗体の医薬としての可能性を高めることができる核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、上記目的を達成するために、次の技術的手段を講じた。
【０００８】
免疫グロブリン遺伝子又はその断片を含む核酸分子であって、ＩｇＭ遺伝子（ＩｇＨＣμ）およびＩｇＭスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓμ）を含み、前記ＳμおよびＩｇＨＣμは、すべて宿主動物配列であることを特徴とする。
【０００９】
さらに、前記ＩｇＨＣμは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４エクソンおよびその間の配列と、ＴＭ１、ＴＭ２、ｐｏｌｙＡシグナル配列と、を含む。
【００１０】
本発明は、宿主動物のＢ細胞発生および抗体の成熟を確保する。
【００１１】
上記核酸分子は、宿主動物のＩｇＨ重鎖の５’末端のエンハンサー（５’−Ｅｎｈａｎｃｅｒ）をさらに含む。それとＳμおよびＩｇＨＣμの構造を図１−１に示し、構築プロセスを図１に示す。
【００１２】
上記核酸分子は、ＩｇＧ遺伝子（すなわち、Ｉｇγ）をさらに含む。ＩｇＧ遺伝子は、宿主動物／ヒトＩｇＧキメラエレメント又は完全ヒトＩｇＧ配列であり得る。上記キメラエレメントは、宿主動物Ｉｇγのスイッチ領域（Ｓγ）とＴＭ１とＴＭ２、ｐｏｌｙＡ等の配列、およびヒトのＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２、ＣＨ３エクソンおよびその間の配列等が含まれ、宿主／ヒトキメラＩｇγ発現調節エレメントを形成する。具体的に、前記Ｉｇγキメラエレメントの構造を図２−１に示し、構築を図２に示す。
【００１３】
上記完全ヒトＩｇγ配列は、ヒトスイッチ領域（Ｓγ）配列、ヒトＩｇγのＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３エクソンおよびその間の配列、およびヒトＩｇγの終結シグナル（ＰｏｌｙＡ）とＴＭ１、ＴＭ２等の配列も含む。
【００１４】
上記Ｉｇγ配列は、ヒトＩｇγの各種サブタイプおよびＩｇγ各サブタイプ間のスイッチ領域（Ｓγ）を含み得る。
例えばヒトＩｇγサブタイプは、Ｉｇγ３、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２および／あるいはＩｇγ４を含み、マウスＩｇγサブタイプは、Ｉｇγ３、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２ａおよび／あるいはＩｇγ２ｂ等を含む。
【００１５】
上記核酸分子は、ＩｇＨ ３’位置発現制御配列（Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ、ＬＣＲ）をさらに含む。ＬＣＲは、宿主動物配列（図６）又はヒト配列（図５）に由来してもよい。
【００１６】
上記核酸分子は、ヒトＩｇＨ重鎖Ｖ領域配列又は断片、ヒトＩｇＨ Ｄ領域配列又は断片およびヒトＩｇＨ Ｊ領域配列又は断片を含む。重鎖のＶ領域、Ｄ領域およびＪ領域は、図５および６に示すように、ヒトに由来する。
【００１７】
例えば、具体的に上記核酸分子は、複数（又はすべて）のヒト免疫グロブリン（ＩｇＨ）Ｖ領域、Ｄ領域およびＪ領域配列を含有し、マウス免疫グロブリン（ＩｇＨ）５’エンハンサー（５’−Ｅｎｈａｎｃｅｒ）、スイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓμ）配列とＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＰｏｌｙＡ、ＴＭ１とＴＭ２等の配列をリンクしてからヒトＩｇγスイッチ領域（Ｓγ）配列をリンクし、次にヒトＩｇγのＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３配列、およびヒトＰｏｌｙＡ、ＴＭ１およびＴＭ２等の配列をリンクし、最後にヒト重鎖ＩｇＨにリンクする３’位置発現制御（ＬＣＲ）配列をリンクする。図５に示すように、トランスジェニックマウスは、マウスＩｇＭとヒトＩｇＧ等の抗体を発現する。
【００１８】
又はトランスジェニックベクターは、複数（又はすべて）のヒト免疫グロブリン（ＩｇＨ）Ｖ領域、Ｄ領域およびＪ領域配列を含有し、マウス免疫グロブリン（ＩｇＨ）の５’エンハンサー（５’−Ｅｎｈａｎｃｅｒ）、スイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓμ）配列とＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＰｏｌｙＡ、ＴＭ１およびＴＭ２等の配列をリンクしてからマウスＩｇγのスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓγ）配列をリンクし、次にヒトＩｇγのＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３配列、マウスのＰｏｌｙＡ、ＴＭ１およびＴＭ２等の配列をリンクし、最後にマウス重鎖ＩｇＨの３’位置発現制御（ＬＣＲ）配列をリンクする。図６に示すように、トランスジェニックマウスは、マウスＩｇＭとヒトＩｇＧ等の抗体を発現する。
【００１９】
ベクターであって、上記核酸分子を含む。
【００２０】
上記核酸分子又はベクターを含む原核生物である。上記核酸分子又はベクターを含む細胞であって、これら核酸分子に由来するトランスジェニック動物の細胞のいずれかを含み、トランスジェニック動物に由来するリンパ球、ハイブリドーマ、抗体発現細胞等も含むが、これらに限定されない。
【００２１】
ヒト化抗体であって、上記核酸分子のいずれかを再配列およびコード化することにより作製され、上記核酸分子又は核酸分子トランスジェニック動物に由来するヒト化抗体のいずれかを含み、抗体タンパク質、ＤＮＡ・ｃＤＮＡ配列によってコードされる抗体および更なる修飾、改変された抗体等を含むがこれらに限定されない。
【００２２】
上記核酸分子又はベクター、細胞又は抗体を含有するトランスジェニック動物であって、動物はブタ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリおよびヒツジ等の哺乳動物であり得る。
【００２３】
上記核酸分子、ベクター、細胞又は動物は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡのコード化、アミノ酸配列の発現、タンパク質、ベクター、ハイブリドーマ培養、細胞株、トランスジェニック動物において応用される。
【００２４】
特に、上記トランスジェニックベクターを動物ゲノムにトランスフェクトすることにより得られるトランスジェニック動物、又は宿主動物自体の免疫グロブリン遺伝子を欠失する動物とのハイブリッドの子孫、宿主動物自体の重鎖および軽鎖が不活性化され、ヒト抗体タンパク質のみを発現する遺伝子工学動物であり、抗原免疫を上記改変後のヒト免疫グロブリン遺伝子にトランスフェクトした動物によって完全ヒト抗体を得る。
【００２５】
上記核酸分子又はベクターを用いてトランスジェニック動物を作製する方法は、以下の工程（１）〜（５）を含む。すなわち、
（１）前記核酸分子を取得する工程
（２）前記核酸分子をベクターに構築する工程
（３）前記ベクターを宿主動物細胞（幹細胞、誘導幹細胞および体細胞を含む）又は胚に導入する工程
（４）前記ベクターを含む細胞を宿主動物の胚（キメラ個体の作製）又は体細胞クローンに移植する工程
（５）ヘテロ接合、ホモ接合のトランスジェニック動物（宿主動物自体の免疫グロブリン遺伝子を欠失する動物との交配を含む）を繁殖する工程。
【００２６】
上記宿主動物とは、上記核酸分子を応用できるトランスジェニック動物、例えばブタ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリおよびヒツジ等の哺乳動物を指し、上記ベクターは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミドおよびＤＮＡ断片等を含む。上記ベクター導入方法は、エレクトロポレーション、ウイルス感染、脂質媒介導入およびマイクロインジェクションを含む。
【００２７】
ある（いくつか）具体的実施形態としてＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ１、ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ２、ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ３の上記核酸分子の配列は示されているとおりであるが、これは本発明の範囲を限定することを意図していない。当業者であれば、具体実施形態に基づいて、ヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドの削除、追加、置換など、非本質的な改善と調整することができる。
【発明の効果】
【００２８】
１．このトランスジェニック動物は、異なる抗原の刺激条件下で、様々な治療用完全ヒト抗体を産生させる。
２．本発明は、完全ヒト抗体を直接取得し、後期段階での手作業による改変を減らすと共に抗体の医薬としての可能性を高められる。
３．本発明トランスジェニック動物のＩｇＨトランスジェニックベクターは、トランスジェニック宿主動物自体のＩｇＨ５’末端エンハンサーおよびＩｇＭ配列を用いてトランスジェニック動物の初期Ｂ細胞の正常な発生を確保し、同時にトランスジェニック宿主動物自体のＩｇγスイッチ領域（ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｇｉｏｎ、Ｓγ）配列およびトランスジェニック宿主動物自体のＩｇγ終結シグナル（ＰｏｌｙＡ）とＴＭ１、ＴＭ２配列を用いてヒトＩｇγの発現を制御する。これは、ＤＮＡの組換え、変異およびＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）のシグナル伝達に役に立ち、抗原の刺激下でヒトＩｇγを成熟させる。トランスジェニック動物のＩｇＨトランスジェニックエレメントには、ヒトのＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域とＩｇγおよびヒトＩｇＫとヒトＩｇＬ配列であり、発現するのは完全ヒトＩｇＧであり、このベクターを用いて作製したトランスジェニック動物が発現するすべてのＩｇＧ抗体は完全にヒト抗体であり、後期段階での手作業による改変を減らすと共に抗体の医薬としての可能性を高められる。
４．本発明の利点は、次の通りであり、すなわち、（１）トランスジェニックのＢ細胞の初期発生と成熟およびＢ細胞の数は、正常なマウスと完全に一致し、Ｂ細胞の分化を助長し、（２）抗体産生の特異性および多様性を増加し、（３）治療用抗体のスクリーニング効率を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】５’エンハンサー（５’−Ｅｎｈａｎｃｅｒ）およびＩｇＭ発現エレメントの構築を示す概念図：ヒト５’エンハンサーとＩｇＭおよびヒトＩｇＤ発現エレメントをマウス５’エンハンサーとＩｇＭ発現エレメントで置き換える。ホモロジーアームは相同組換えに使用され（同じ色のホモロジーアームは同じＤＮＡ配列を示し、相同組換えを行う）、ｐＧＫ−Ｐｕｒｏは細菌と哺乳動物の耐性遺伝子であり、Ｌｏｘｐが３４の特定のＤＮＡ配列である。Ｎｏｔ１とＡｓｉＳ１は酵素切断部位である（赤色はヒトの配列、緑色がマウスの配列を示す）。
【図２】宿主動物／ヒトキメラＩｇＧ発現エレメントの構成構造および構築を示す概念図：ホモロジーアームは相同組換えに使用され、ヒトＣγはカウンターセレクション組換え（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）によりマウスＣγのＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３配列に置き換えられ、マウス／ヒトキメラＩｇγ３とＩｇγ１の発現調節エレメントを確立し、Ｎｏｔ１が酵素切断部位である（赤色はヒトの配列、緑色がマウスの配列を示す）。
【図３】核酸分子配列ＩｇＧ Ｃ領域の構築を示す概念図：マウス５’エンハンサー（５’−Ｅｎ）、マウスＳμとマウスＩｇＭ、およびヒトＩｇγ３とＩｇγ１および３’−ＬＣＲ配列およびリンク。２つの耐性遺伝子ＰｕｒｏとＺｅｏは、細菌と細胞においてスクリーニングすることができ、最後に、ＣＲＥ又はＦｌｐｏ発現プラスミド或いはタンパク質を使用して、Ｐｕｒｏ又はＮｅｏ配列を除去し、Ｌｏｘ（３４ｂｐ）およびＦｒｔ（３４ｂｐ）配列を１つだけ残す。この核酸分子はヒトＩｇＨ Ｖ領域、Ｄ領域、およびＪ領域にリンクされて、トランスジェニックベクターを形成する（赤色はヒトの配列、緑色がマウスの配列を示す）。
【図４】核酸分子配列ＩｇＧ Ｃ領域の構築を示す概念図：マウス５’エンハンサー（５’−Ｅｎ）、マウスＳμとマウスＩｇＭ、およびマウス／ヒトのキメラＩｇγ３とＩｇγ１発現調節エレメントとマウス３’−ＬＣＲ配列およびリンク。２つの耐性遺伝子ＰｕｒｏとＺｅｏは、細菌と細胞においてスクリーニングを行うことができ、最後に、ＣＲＥまたはＦｌｐｏ発現プラスミド又はタンパク質を使用して、ＰｕｒｏまたはＮｅｏ配列を除去し、Ｌｏｘ（３４ｂｐ）およびＦｒｔ（３４ｂｐ）配列を１つだけ残す。この核酸分子は、ヒトＶ領域、Ｄ領域、およびＪ領域にリンクされて、トランスジェニックベクターを形成する（赤色はヒトの配列、緑色がマウスの配列を示す）。
【図５】ＩｇＨ重鎖トランスジェニック核酸分子の構成要素の１つを示す図：トランスジェニックベクターは、ヒトＩｇＨ Ｖ領域、Ｄ領域およびＪ領域の配列、マウスＩｇＨ５’エンハンサーおよびマウスＩｇＭスイッチ領域（Ｓμ）配列とＩｇＭのすべてのエクソン配列および調節シグナル；ヒトＩｇγ３のスイッチ領域（Ｓγ３）配列とヒトＩｇγ３のＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３配列とヒトＩｇγ３のＰｌｏｙＡ、ＴＭ１とＴＭ２配列；ヒトＩｇγ１のスイッチ領域（Ｓγ１）配列とヒトＩｇγの１ＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３配列、およびヒトＩｇγ１のＰｌｏｙＡ、ＴＭ１とＴＭ２などの配列を含み、そしてヒトＩｇＨ ３’位置発現制御配列（ＬＣＲ）にリンクする（赤色はヒトの配列、緑色がマウスの配列を示す）。
【図６】ＩｇＨ重鎖トランスジェニック核酸分子の構成要素の１つを示す図：ヒトＩｇＨ Ｖ領域、Ｄ領域およびＪ領域の配列、マウスＩｇＨ５’エンハンサーおよびマウスＩｇＭスイッチ領域（Ｓμ）配列とＩｇＭのすべてのエクソン配列および調節シグナル；マウスＩｇγ３のスイッチ領域（Ｓγ３）配列とヒトＩｇγ３のＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ３配列とマウスＩｇγ３のＰｌｏｙＡ、ＴＭ１とＴＭ２配列；マウスＩｇγ１のスイッチ領域（Ｓγ１）配列とヒトＩｇγの１ＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２とＣＨ４配列、およびマウスＩｇγ１のＰｌｏｙＡ、ＴＭ１とＴＭ２などの配列を含み、そしてヒトＩｇＨ ３’位置発現制御配列（ＬＣＲ）にリンクする（赤色はヒトの配列、緑色がマウスの配列を示す）。図１乃至図６は、トランス遺伝子重要な遺伝子構造図である。
【図７】マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子ＩｇＨのＪ領域遺伝子ターゲティング：マウスＩｇＨのＪ領域はＪ１、Ｊ２、Ｊ３およびＪ４で構成され、遺伝子ターゲティング技術でＪ領域全体の配列を切り出される。Ｊ領域配列相同性を持たないマウスは、マウス由来Ｉｇ（ＩｇＭとＩｇＧ等を含む）を産生できない。
【図８】トランスジェニックマウス（ＨＧａ）のヒトＩｇＨＶ２−２６ＰＣＲ検出結果。
【図９】トランスジェニックマウス（ＨＧａ）血清のＥｌｉｓａ検出結果。
【図１０】トランスジェニックマウス（ＨＧｂ）のヒトＩｇＨＶ２−２６ＰＣＲ検出結果。
【図１１】トランスジェニックマウス（ＨＧｂ）血清のＥｌｉｓａ検出結果。
【図１２】トランスジェニック抗体マウス血清中のヒトＩｇＧ含有量（異なる希釈条件）。
【図１３】ＯＶＡ免疫後のマウスのＥｌｉｓａ（ＯＤ４５０）検出結果。
【図１４】ＯＶＡ免疫後のマウスのハイブリドーマＩｇＨ Ｖ領域の配列分析（変異の数量と位置）の統計結果。
【図１５】一部のハイブリドーマ細胞株上清液のＥｌｉｓａ分析結果。
【図１６】抗体とＨｅｐＧ２細胞との特異的な結合状況。
【図１７】トランスジェニックマウスで産生された抗原特異的な抗体の統計表。
【図１８】トランスジェニックマウス免疫後の脾臓の外観写真（Ａ．トランスジェニックマウス（ＨＧａ）、Ｂ．トランスジェニックマウス（ＨＧｂ）、Ｃ．正常なマウス））。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、具体的実施例を参照しつつ本発明を説明する。ここで、以下の実施例は、本発明をさらに説明するためにのみ使用され、本発明の保護範囲を非限定的に解釈すると指摘される。当業者であれば、上記発明内容に基づいて本発明に対して非本質的な改善と調整を行うことができる。
【００３１】
改変されたヒト免疫グロブリン遺伝子重鎖ベクターをマウスに形質転換し、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを免疫して、完全ヒト抗体を得る。具体的な工程は次のとおりである。
【００３２】
１．免疫グロブリン遺伝子のベクター的構築
１）免疫グロブリン重鎖遺伝子の構築（図５）
まずＰＣＲと遺伝子合成を用いて、マウスＩｇＭの５’エンハンサー配列、ＩｇＭのすべての発現調節配列およびホモロジーアームと耐性遺伝子（図１）を得た。次にヒトのＩｇγ３とＩｇγ１や３’−ＬＣＲ配列およびホモロジーアームと耐性遺伝子（図３）を得た。そしてすべてのＤＮＡ断片を相同組換えにより新しいＤＮＡ核酸分子を得てから、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子（Ｉｇ）を含むＹＡＣ又はＢＡＣベクター等に上記改変されたＤＮＡ断片をトランスフェクトし、図５に示すように、免疫グロブリン重鎖遺伝子の遺伝子クラスターを構築する（緑色はマウスの配列、赤色がヒトの配列である）。これには、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子のＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域、マウスＩｇＨ ５’エンハンサー、マウスＩｇＭ、ヒトＩｇγ３、ヒトＩｇγ１およびヒトＬＣＲが含まれる。
【００３３】
２）免疫グロブリン重鎖遺伝子の改変（図６）
まずＰＣＲと遺伝子合成を用いて、マウスＩｇＭの５’エンハンサー配列、ＩｇＭのすべての発現調節配列およびホモロジーアームと耐性遺伝子（図１）を得た。相同組換えおよびカウンターセレクション組換え技術により、ヒトＩｇγ３のＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３をマウスＩｇγ３のＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３の配列に置き換え、ヒトＩｇγ１のＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３をマウスＩｇγ１のＣＨ１、Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２およびＣＨ３の配列に置き換えてから、マウス３’−ＬＣＲ配列およびホモロジーアームと耐性遺伝子（図３）を得た。次に相同組換え技術により、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子（Ｉｇ）を含むＹＡＣ又はＢＡＣベクターに上記改変されたＤＮＡ断片をトランスフェクトし、図６に示すように、免疫グロブリン重鎖遺伝子の遺伝子クラスターを構築する（緑色はマウスの配列、赤色がヒトの配列である）。これには、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子のＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域、マウスＩｇＨ ５’エンハンサー、マウスＩｇＭ、ヒト／マウスＩｇｙ３、ヒト／マウスＩｇｙ１およびマウス３’−ＬＣＲが含まれる。
【００３４】
２．ヒト抗体トランスジェニックマウスの育成
１）ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子導入マウスの育成
Ａ．ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子導入マウス（抗体トランスジェニックマウスＨＧａ）の育成
従来のトランスジェニック技術を利用して、工程１の１）（図５）において構築されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子をマウスにトランスフェクトする。ＰＣＲ検出およびＥＬＩＳＡ検出の二重標準を通じてヒト免疫グロブリン重鎖ベクターをトランスフェクトしたトランスジェニックマウス（ＨＧａ）をスクリーニングした。
使用するＰＣＲ識別用プライマーは、次の通りである。
ヒトＩｇＨＶ２−２６ＰＣＲ：
Ｆｏｒ：ＧＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧ
Ｒｅｖ：ＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣ
ＰＣＲ産物のサイズ：４３３ｂｐ
ＰＣＲ検出の結果を図８に示す。注：ヒトＩｇＨＶ２−２６トランスジェニックマウスのＤＮＡ ＰＣＲ結果は、陽性マウスには４３３ｂｐのＰＣＲバンドがある（１％ゲル電気泳動）
ヒトＩｇγ１ ＰＣＲ：
Ｆｏｒ：ＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＴＡＡＣ
Ｒｅｖ：ＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣ
ＰＣＲ産物のサイズ：４１７ｂｐ
トランスジェニックマウスのＥｌｉｓａ検出：図９を参照して、健康な成人と健康なマウスの血清をコントロールとして使用した。注：血清は、１：１００希釈でヒトＩｇＧのＥｌｉｓａ検出が行われた。トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＧ陽性であり、ヒト血清、正常マウス血清およびブランクと比較した。ＥＬＩＳＡで識別された抗体はＧｏａｔ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ａｂｃａｍ、ａｂ９７２２１）、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＨＲＰ）（ａｂ９７２２５；ａｂｃａｍ）であった。
【００３５】
Ｂ．ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子導入マウス（抗体トランスジェニックマウスＨＧｂ）の育成
従来のトランスジェニック技術を利用して、工程１の２）（図６）において構築されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子をマウスにトランスフェクトする。ＰＣＲ検出およびＥＬＩＳＡ検出の二重標準を通じてヒト免疫グロブリン重鎖ベクターをトランスフェクトしたトランスジェニックマウス（ＨＧｂ）をスクリーニングした。
使用するＰＣＲ識別用プライマーは、次の通りである。
ヒトＩｇＨＶ２−２６ＰＣＲ：
Ｆｏｒ：ＧＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧ
Ｒｅｖ：ＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣ
ＰＣＲ検出の結果を図１０に示す。注：ヒトＩｇＨＶ２−２６トランスジェニックマウスのＤＮＡ ＰＣＲ結果は、陽性マウスには４３３ｂｐのＰＣＲバンドがある（１％ゲル電気泳動）
ヒトＩｇγ１ ＰＣＲ：
Ｆｏｒ：ＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＴＡＡＣ
Ｒｅｖ：ＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣ
ＰＣＲ産物のサイズ：４１７ｂｐ
トランスジェニックマウスのＥｌｉｓａ検出：図１１を参照して、健康な成人と健康なマウスの血清をコントロールとして使用した。注：血清は、１：１００希釈でヒトＩｇＧのＥｌｉｓａ検出が行われた。トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＧ陽性であり、ヒト血清、正常マウス血清およびブランクと比較した。ＥＬＩＳＡで識別された抗体はＧｏａｔ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ａｂｃａｍ，ａｂ９７２２１），Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＨＲＰ）（ａｂ９７２２５；ａｂｃａｍ）であった。
【００３６】
２）免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトマウスの育成（ｍＨ−−マウス、図７）
遺伝子ターゲティング技術により、免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトマウスを構築する。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子のＩｇＨ Ｊ領域を遺伝子ノックアウト部位として選択（ノックアウト部位および遺伝子ノックアウト効果は、図６を参照）選択して免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトマウスを得た。ＰＣＲ検出とＥＬＩＳＡ検出の二重標準を通じて得られた免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトマウスをスクリーニングした。
使用するＰＣＲ識別用プライマーは、次の通りである。
Ｆｏｒ：ＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＣ
Ｒｅｖ：ＴＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＡＣ
ＰＣＲ産物：Ｊ領域の遺伝子ターゲティング後のＰＣＲ産物のサイズは７３２ｂｐ、正常Ｊ領域のＰＣＲ産物のサイズが２４２２ｂｐであった。
３）免疫グロブリンｋａｐｐａ軽鎖遺伝子ノックアウトマウスの育成（ｍＫ−−マウス。特許文献１を参照）
４）ヒト免疫グロブリンｋａｐｐａ軽鎖トランスジェニックマウスの育成（ＨＫ＋マウス。特許文献１を参照）
５）ヒト免疫グロブリンＬａｍｂｄａ軽鎖トランスジェニックマウスの育成（ＨＬ＋マウス。特許文献１を参照）
６）ハイブリダイゼーションによりヒト化抗体トランスジェニックマウスを得る
工程２のＨＧａ又はＨＧｂトランスジェニックマウスをそれぞれステップ２）、３）、４）および５）で得られたマウスと交配して繁殖し、ＰＣＲとＥＬＩＳＡの検出を経て、最後にヒトＩｇＧ抗体マウス（ＨＧａ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−およびＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−）５遺伝子マウスを高発現した。マウス免疫グロブリンのトランスジェニックマウスを発現しなかった（又は低発現した）。
【００３７】
トランスジェニックマウスの識別
Ａ．５遺伝子トランスジェニックマウス血清中のマウスＩｇＭおよびヒトＩｇＧ含有量のＥｌｉｓａ検出結果
正常マウス血清のＩｇＭ含有量：０．８−６．５ｍｇ／ｍｌ
トランスジェニックマウス（ＨＧａ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−、重鎖、図５）血清中のマウスＩｇＭ含有量：０．１−２．８ｍｇ／ｍｌ
トランスジェニックマウス（ＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−、重鎖、図６）血清中のマウスＩｇＭ含有量：０．４−２．５ｍｇ／ｍｌ
正常ヒト血清のＩｇＧ含有量：３．５−１５ｍｇ／ｍｌ
トランスジェニックマウス（ＨＧａ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−、重鎖、図５）血清中のヒトＩｇＧ含有量：０．０８−１．２ｍｇ／ｍｌ
トランスジェニックマウス（ＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−、重鎖、図６）血清中のヒトＩｇＧ含有量：０．５−２．５ｍｇ／ｍｌ
トランスジェニックマウスのＩｇＭおよびＩｇＧ含有量は、正常ヒトのＩｇＭおよびＩｇＧ含有量より少し低く、これはトランスジェニックマウスが清浄で無菌の環境で飼育されていたためである。
Ｂ．トランスジェニック抗体マウス血清中のヒトＩｇＧ含有量（特許文献２のトランスジェニックマウスとの比較）（図１２）
注：トランスジェニック抗体マウスＨＧａ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−（ＨＧａ５遺伝子マウス）、ＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−（ＨＧｂ５遺伝子マウス）とＨＧ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−（ＨＧ５遺伝子マウス、特許文献１）およびヒト血清中にヒトＩｇＧを含むＥｌｉｓａ結果で、血清希釈は（１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００、１：１０００００、１：１００００００）（３〜５匹の５雑交マウスの平均値）。
【００３８】
３．完全ヒト抗体の取得
完全ヒト抗体トランスジェニックマウスを免疫してＢ細胞を得、さらにハイブリドーマ技術、細胞培養技術と組み合わせて治療用ヒト抗体を得た。
1）ＯＶＡ免疫により得られたヒト化抗体トランスジェニックマウスから８週齢のマウスを選択して免疫にした。
【００３９】
初回の免疫
（１）  ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ７６４１）抗原をＰＢＳで希釈し、最終濃度を２ｍｇ／ｍｌとし、２０ｕｇのＣｐＧ（ＯＤＮ１８２６、ｔｌｒｌ−１８２６、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を加え、適量の水酸化アルミニウム（ｖａｃ−ａｌｕ−５０、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）も加えて水酸化アルミニウム濃度を１％にさせた。
（２）  （１）で調製した抗原０．７５ｍＬとＣＦＡアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ｆ５８８１）を１：１の割合で混合し、ＭＩＸＰＡＣＴＭシリンジで乳化し、各マウスに２００ｕｌ（０．２ｍｇ）を注射して皮下投与による免疫を行った。
【００４０】
２回目の免疫
（１）  免疫後２１日目に、２回目の免疫を行い、抗原をＰＢＳで希釈し、最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｕｇのＣｐＧを加え、適量の水酸化アルミニウムも加えて水酸化アルミニウム濃度を１％にさせた。
（２）  （１）で調製した抗原０．７５ｍＬとＩＦＡアジュバントを１：１の割合で混合し、ＭＩＸＰＡＣＴＭシリンジで乳化し、各マウスに２００ｕｌ（０．１ｍｇ）を注射して腹腔内投与による免疫を行った。
【００４１】
３回目の免疫
（１）  免疫後２１日目に、３回目の免疫を行い、抗原をＰＢＳで希釈し、最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｕｇのＣｐＧを加え、適量の水酸化アルミニウムも加えて水酸化アルミニウム濃度を１％にさせた。
（２）  （１）の方法で調製した抗原タンパク質を直接注射し、各マウスに２００ｕｌ（０．１ｍｇ）を注射して腹腔内投与による免疫を行った。
【００４２】
４回目の免疫
（１）  免疫後２１日目に、４回目の免疫を行い、抗原をＰＢＳで希釈し、最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、１０ｕｇのＣｐＧを加え、適量の水酸化アルミニウムも加えて水酸化アルミニウム濃度を１％にさせた。
（２）  （１）の方法で調製した抗原タンパク質を直接注射し、各マウスに２００ｕｌ（０．１ｍｇ）を注射して腹腔内投与による免疫を行った。
【００４３】
追加免疫
４回目の免疫から２１日後、Ｅｌｉｓａ結果において要求を満たすマウスを追加免疫し、そして得られた脾臓のＢ細胞をハイブリドーマ融合、培養およびスクリーニングした。
【００４４】
２）マウスイムノアッセイ
４回目の免疫から１０日後、マウスから血液を採取してＥＬＩＳＡ検出を行い、免疫前マウスをコントロールとして使用して、免疫後マウス血清中のマウスＩｇＧ含有量およびヒトＩｇＧ含有量をそれぞれ検出した。結果は次の通りであった。
【００４５】
マウス血清中のヒトＩｇＧの検出：９６ウェルプレートに抗原ＯＶＡを包埋し、希釈後の免疫血清中の特異的な抗体含有量をｈＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１１３Ｐ））で検出した。昆明ホワイトマウス（コントロール）はマウスＩｇＧが検出された。
結果：免疫後のヒト化抗体マウスのヒト化ＩｇＧの発現量は、比較的高かった。免疫Ｅｌｉｓａ分析の結果、血清を１：８０００に希釈し、ＯＤ４５０＞１のマウス脾臓Ｂ細胞をハイブリドーマ融合に使用した。
ＯＶＡ免疫後のマウスのＥｌｉｓａ（ＯＤ４５０）検出結果（トランスジェニックマウスＨＧａ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−およびＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−）を図１３に示す。
注：ＨＧａトランスジェニックマウスは、ＨＧａ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−５遺伝子マウスであり、ＨＧｂトランスジェニックマウスは、ＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−５遺伝子マウスであり、昆明ホワイトマウスは、正常のコントロールマウスであった。マウスをＯＶＡで４回免疫した後、血清中の抗ＯＶＡ特異的な抗体のＥｌｉｓａ検出（異なる希釈濃度）を行った。
ＯＶＡ免疫後のマウスハイブリドーマＩｇＨ Ｖ領域の配列分析（変異の数量と位置）の統計結果を図１４に示す。
【００４６】
３）完全ヒト抗体の取得
ＧＰＣ３でトランスジェニックマウス（ＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−）を免疫し、マウスの脾臓細胞を収集し、Ｓｐ２／０と融合させて、モノクローナル抗体、すなわち、完全ヒト抗体を調製した。
【００４７】
トランスジェニック動物抗原で免疫した後、ハイブリドーマ試験を行った後、半固形培地でスクリーニングし、次にハイブリドーマクローンを９６ウェルプレートに採集して培養し、培養上清液のＥｌｉｓａ特異的な抗体を分析した。
【００４８】
ハイブリドーマ上清液のＥｌｉｓａ結果を図１５に示す。（ハイブリドーマ融合固形培地の１回のスクリーニング後、２つのハイブリドーマ９６ウェルプレートのＥｌｉｓａ結果として、赤いウェルは、抗ＧＰＣ３の完全ヒト抗体、ＧＰＣ３ポリペプチド免疫を発現）（９６ウェルプレートに抗原を包埋し、ハイブリドーマ上清液を加えてからヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体およびＴＭＢで発色させる）。
【００４９】
図１６は、４−１０Ｆ−４Ｇおよび６−７Ａ−２ＥがいずれもＧＰＣ３ポリペプチドで免疫した後のＥｌｉｓａ検出の陽性抗体であるが、ＨｅｐＧ２（ヒト癌細胞におけるＧＰＣ３発現）と組み合わせて分析した時、４−１０Ｆ−４Ｇは機能せず、６−７Ａ−２ＥがＨｅｐＧ２細胞に特異的に結合でき、トランスジェニック抗体マウスが抗原特異性の抗ＧＰＣ３抗体（６−７Ａ−２Ｅ）を産生できることを証明したことを示している。
【００５０】
図１７は、トランスジェニックマウスが産生する抗原特異性の抗体の統計表であり、ＯＶＡ、ＧＰＣ３ポリペプチドおよびＧＰＣ３タンパク質でＨＧａとＨＧｂトランスジェニックマウスに免疫、融合させることにより得られたハイブリドーマの抗体親和性の統計表である。どちらのトランスジェニックマウスも高親和性のヒト化抗体を得ることができた。
【００５１】
（１）本発明により得られるマウスの脾臓の大きさは、正常なマウスと同じであり、特許文献１のトランスジェニックマウスよりも大きく、
（２）本発明のトランスジェニックマウスの骨髄および脾臓内のＢ細胞は、特許文献１のトランスジェニックマウスよりも多く、
（３）本発明のトランスジェニックマウスのＩｇＭの量は高く、特許文献１のトランスジェニックマウス血清中のＩｇＭ含有量より多く、
（４）本発明のトランスジェニックマウスのＩｇＧの量は高く、同じ清浄で無菌の環境において、特許文献１のトランスジェニックマウス血清中のＩｇＧ含有量より高く、
（５）本発明のトランスジェニックＩｇＨ重鎖ＣＤＲ変異はより多い。同じ抗原免疫化条件下で、本発明のトランスジェニックマウスで得られるハイブリドーマＩｇＧ Ｖ−配列変異は、特許文献１のトランスジェニックマウスで得られるハイブリドーマＩｇＧＶ−配列変異よりも多い。
トランスジェニックマウスＨＧａ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−免疫後の脾臓Ｂ細胞数：６．２Ｘ１０７、１．０Ｘ１０８、９．５Ｘ１０７。
トランスジェニックマウスＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−免疫後の脾臓Ｂ細胞数：１．２Ｘ１０８、１．０２Ｘ１０８、１．２５Ｘ１０８。
正常なマウス免疫後の脾臓Ｂ細胞数：１．５Ｘ１０８、１．８Ｘ１０８、１．９Ｘ１０８。
【００５２】
図１８は、トランスジェニックマウス免疫後の脾臓の外観写真である。図１８−Ａは、トランスジェニックマウスＨＧａ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−免疫後の脾臓の外観写真、図１８−ＢがトランスジェニックマウスＨＧｂ＋ＨＫ＋ＨＬ＋ｍＫ−−ｍＨ−−免疫後の脾臓の外観写真、図１８−Ｃが正常なマウス免疫後の脾臓の外観写真である
【図１】
2021512651.tif 000003
【図２】
2021512651.tif 000004
【図３】
2021512651.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2021512651.tif 000008
【図７】
2021512651.tif 000009
【図８】
2021512651.tif 000010
【図９】
2021512651.tif 000011
【図１０】
2021512651.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021512651.tif 000015
【図１４】
2021512651.tif 000016
【図１５】
2021512651.tif 000017
【図１６】
2021512651.tif 000018
【図１７】
2021512651.tif 000019
【図１８】
2021512651.tif 000020
【配列表】
2021512651000001.app
【国際調査報告】
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2021512651.tif 000022
2021512651.tif 000023
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