(57)【要約】  本発明は、数個のアミノ酸が変異していることを除き、ヒトＩＬ−２と一次配列を共有している、ポリペプチドに関する。１つのＩＬ−２バリアントパネルは、エフェクターＴ細胞やＮＫ細胞以上に、免疫抑制性の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の増殖、生存、活性化および／または機能を優先的に促進する、目覚ましい製造性を有する変異を含む。Ｔｒｅｇ細胞欠乏、種々の自己免疫性・炎症性障害、臓器移植、および移植片対宿主病を治療するために、単独で、または免疫調節薬、もしくは患部組織を標的とする抗体、タンパク質もしくはペプチドと共に使用される、そのようなＩＬ−２選択的薬剤の治療用途も包含される。別の態様において、本発明は、本開示のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。最後に、本発明は、自己免疫性・炎症性障害のような疾患に対する免疫系の選択的調節効果による、本開示のポリペプチドおよび医薬組成物の治療用途に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）バリアントポリペプチドであって、Ｌ１９位、Ｄ２０位、Ｌ２１位、Ｑ２２位、Ｒ３８位、Ｆ４２位、Ｎ８８位、Ｓ１２５位、またはＱ１２６位のアミノ酸残基のうちの１または複数が別のアミノ酸と置換されている配列番号３のアミノ酸配列を含み、配列番号３によって示されるポリペプチドと比較してＩＬ−２Ｒβγ受容体複合体を活性化する能力は低減されているが、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体複合体を活性化する能力は保持されている、ＩＬ−２バリアントポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸置換が、配列番号３の、１９位におけるＬ１９Ｄ置換、Ｌ１９Ｈ置換、Ｌ１９Ｎ置換、Ｌ１９Ｒ置換、Ｌ１９Ｓ置換、Ｌ１９Ｐ置換、およびＬ１９Ｙ置換、２０位におけるＤ２０Ｅ置換、Ｄ２０Ｉ置換、Ｄ２０Ｎ置換、Ｄ２０Ｑ置換、Ｄ２０Ｓ置換、Ｄ２０Ｔ置換、およびＤ２０Ｙ置換、２１位におけるＬ２１Ｓ置換、Ｌ２１Ｒ置換、およびＬ２１Ｎ置換、２２位におけるＱ２２Ｎ置換、Ｑ２２Ｈ置換、Ｑ２２Ｋ置換、Ｑ２２Ｙ置換、Ｑ２２Ｉ置換、８８位におけるＮ８８Ｅ置換、Ｎ８８Ｇ置換、Ｎ８８Ｔ置換、Ｎ８８Ｍ置換、Ｎ８８Ｑ置換、Ｎ８８Ｒ置換、およびＮ８８Ｉ置換、１２５位におけるＳ１２５Ｅ置換、Ｓ１２５Ｋ置換、Ｓ１２５Ｈ置換、Ｓ１２５Ｗ置換、およびＳ１２５Ｉ置換、並びに１２６位におけるＱ１２６Ｄ置換、Ｑ１２６Ｅ置換、Ｑ１２６Ｈ置換、Ｑ１２６Ｋ置換、Ｑ１２６Ｌ置換、Ｑ１２６Ｍ置換、Ｑ１２６Ｎ置換、およびＱ１２６Ｙ置換からなる群から選択される、またはこれらの置換の任意の組み合わせである、請求項１に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３のＬ１９位およびＱ１２６位のアミノ酸残基に２つのアミノ酸置換を含む、請求項１および２のいずれか一項に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチド。
【請求項４】
配列番号３のＬ１９位、Ｓ１２５位、およびＱ１２６位のアミノ酸残基に３つのアミノ酸置換を含む、請求項１および２のいずれか一項に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、配列番号３の、１９位におけるＬ１９Ｄ置換、Ｌ１９Ｈ置換、Ｌ１９Ｎ置換、Ｌ１９Ｒ置換、Ｌ１９Ｓ置換、Ｌ１９Ｐ置換、およびＬ１９Ｙ置換、１２５位におけるＳ１２５Ｅ置換、Ｓ１２５Ｋ置換、Ｓ１２５Ｈ置換、Ｓ１２５Ｗ置換、およびＳ１２５Ｉ置換、並びに１２６位におけるＱ１２６Ｄ置換、Ｑ１２６Ｅ置換、Ｑ１２６Ｈ置換、Ｑ１２６Ｋ置換、Ｑ１２６Ｌ置換、Ｑ１２６Ｍ置換、Ｑ１２６Ｎ置換、およびＱ１２６Ｙ置換からなる群から選択される、請求項３および４のいずれか一項に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４〜４３、１０８〜１４６、および１９３〜１９７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチド。
【請求項７】
配列番号５〜１４、２６〜４３、１０８〜１１１、１２５〜１４６、および１９３〜１９７（をＩＬ−２バリアントは含む）に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチド。
【請求項８】
単離されたＩＬ−２バリアントポリペプチドであって、配列番号３に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３によって示されるポリペプチドと比較してＩＬ−２Ｒβγ受容体複合体を活性化する能力は低減されているが、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体複合体を活性化する能力は保持されている、ＩＬ−２バリアントポリペプチド。
【請求項９】
１）請求項１〜８のいずれか一項に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチドと、２）異種タンパク質と、を含む、単離された融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＩＬ−２バリアントポリペプチドが、そのＮ末端アミノ酸において、前記異種タンパク質のＣ末端アミノ酸に、所望によりペプチドリンカーを介して融合している、請求項９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＩＬ−２バリアントポリペプチドが、そのＣ末端アミノ酸において、前記異種タンパク質のＮ末端アミノ酸に、所望によりペプチドリンカーを介して融合している、請求項９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１２】
前記異種タンパク質が前記ＩＬ−２バリアントポリペプチドの循環半減期を延長させる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１３】
前記異種タンパク質が半減期の延長を可能にする完全長のヌル抗体または抗体断片からなる群から選択される、請求項１２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１４】
前記異種タンパク質が前記ＩＬ−２バリアントポリペプチドの発現レベルおよび総純度を増強する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１５】
前記異種タンパク質がマーカーまたはタグまたはターゲティング部分として働く、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１６】
二量体形態または単量体形態のいずれかである、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１７】
前記異種タンパク質が、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン、ＩｇＡのＦｃドメイン、ＩｇＤのＦｃドメイン、ＩｇＥのＦｃドメイン、ＩｇＧのＦｃドメイン、およびＩｇＭのＦｃドメインからなる群から選択されるＦｃドメインである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１８】
前記Ｆｃドメインが、エフェクター機能がサイレンシングされた、且つ／または、半減期を延長する機能を有する、Ｆｃドメインである、請求項１７に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１９】
前記Ｆｃドメインが、配列番号４４〜４７および２１２〜２１３に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＦｃドメインである、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＩＬ−２バリアントポリペプチドがペプチドリンカーを介して前記異種タンパク質と融合している、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ペプチドリンカーが１〜４０個のアミノ酸を含む、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
配列番号６９〜１０７、１４７〜１８９、および１９８〜２１１に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチドまたは単離された融合タンパク質を、薬剤的に許容できる担体と混合して含む、医薬組成物。
【請求項２４】
対象における自己免疫疾患の治療方法であって、治療有効量の請求項２３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
対象における自己免疫疾患を治療することが可能な第二の治療薬または治療方法を投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象における臓器移植の拒絶反応または関連する移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療方法であって、治療有効量の請求項２３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
対象における炎症性疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、糖尿病、および免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）の治療方法であって、治療有効量の請求項２３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
対象における炎症性疾患を治療することが可能な第二の治療薬または治療方法を投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３１】
請求項２９に記載の核酸分子または請求項３０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＩＬ−２バリアントポリペプチドまたは融合タンパク質の作製方法であって、前記ＩＬ−２バリアントポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を促進する条件下で請求項３１に記載の宿主細胞を培養することと、前記ＩＬ−２バリアントポリペプチドまたは融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法によって作製された、単離されたＩＬ−２バリアントポリペプチドまたは融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願
本出願は２０１８年１１月２日に出願された米国仮出願第６２／７５５，０１６号、および２０１８年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／６８９，０５５号の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン２（ＩＬ−２）はＴ細胞に関連して記述がなされた最初の増殖因子である。その発見以後、ＩＬ−２は、インビトロにおいてはＴ細胞の増殖および生存を促進することが示され（Ｓｍｉｔｈ、ＫＡ．（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２４０巻、頁１１６９−７６）、Ｔ細胞性ウイルス感染（Ｔ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（Ｂｌａｔｔｍａｎ、ＪＮら（２００３年）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９巻、頁５４０−７）やワクチン（Ｆｉｓｈｍａｎ、Ｍ．ら（２００８年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３１巻、頁７２−８０、Ｋｕｄｏ−Ｓａｉｔｏ、Ｃ．ら（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５６巻、頁１８９７−９１０；Ｌｉｎ、ＣＴ．ら（２００７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．、１１４巻、頁８６−９３）との関連においては免疫応答をブーストする能力が示されている。
【０００３】
ＩＬ−２はがん治療で用いられている。組換えヒトＩＬ−２は転移性黒色腫および腎がんに対する効果の高い免疫療法であり、およそ１０％の患者で持続的な反応が見られる。しかし、半減期が短く、毒性が強いことで、ＩＬ−２の最適用量は制限を受けている。さらに、ＩＬ−２は、そのヘテロ三量体型受容体のＩＬ−２Ｒαβγに対して、より大きな親和性で結合するため、高レベルのＩＬ−２Ｒαを恒常的に発現している免疫抑制的な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の優先的な増殖が起こる。Ｔｒｅｇの増殖はがん免疫療法にとってのＩＬ−２の望ましくない効果となる。しかし、低用量でもＴｒｅｇ細胞を刺激できるＩＬ−２の能力は、自己免疫性障害および種々の炎症性障害の治療で利用できる可能性があった。
【０００４】
Ｔｒｅｇは免疫系恒常性の中心となり、（自己反応性）エフェクターＴ細胞を抑制することにより末梢性免疫寛容の維持で主要な役割を担っている。複数の自己免疫性疾患および炎症性疾患において、Ｔｒｅｇ細胞数またはＴｒｅｇ機能の欠損が示された。結果として、Ｔｒｅｇ細胞の数および／または機能を増強する治療法の開発には大きな関心が寄せられている。検討中の自己免疫疾患に対する１つの治療アプローチは、Ｔｒｅｇ細胞のターゲティングのために低用量のＩＬ−２を用いるものであるが、これは、Ｔｒｅｇ細胞が、ＩＬ−２Ｒαレベルが恒常的に高いために、より低濃度のＩＬ−２に多くの他の免疫細胞種よりも応答するためである（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ  Ｄ、２０１５年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：頁２８３−９４）。種々のＧｖＨＤ患者（Ｋｏｒｅｔｈ、Ｊ．ら、２０１１年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３６５巻：頁２０５５−６６）およびＨＣＶ関連自己免疫性脈管炎患者（Ｓａａｄｏｕｍ、Ｄ．ら、２０１１年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３６５巻：頁２０６７−７７）の、低用量ＩＬ−２による治療の臨床試験は、Ｔｒｅｇレベルの増加と臨床効果の兆候を示した。しかし、これらの低い用量においても、安全性および忍容性において深刻な問題が生じた。以上のことから、ＩＬ−２よりも特異的にＴｒｅｇ細胞を標的とする、Ｔｒｅｇ細胞の数および機能を増強できる、効果的な自己免疫性／炎症性疾患治療が求められている。
【０００５】
さらに最近になって、細胞傷害性のエフェクターＴ細胞またはＴｒｅｇ細胞のどちらかを選択的に刺激するよう、ＩＬ−２を改変できることが分かった。様々なアプローチにより、免疫刺激能が改善され選択的となったＩＬ−２バリアントが作製された（例えば、米国特許第７，１８６，８０４号、米国特許第７，１０５，６５３号、米国特許第６，９５５，８０７号、米国特許第５，２２９，１０９号、米国特許出願公開第２００５０１４２１０６号を参照）。本発明においては、この分子の、主に高親和性の受容体（α鎖、β鎖、およびγ鎖）によりシグナル伝達する能力を増強し、中間親和性の受容体（β鎖およびγ鎖）によりシグナル伝達する能力は増強しないように、ＩＬ−２バリアントの設計を行った。基本的な考え方としては、確認された毒性作用の原因であると考えられた、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞におけるシグナル伝達は促進せずに、Ｔｒｅｇ細胞におけるシグナル伝達を促進することとした。重要なこととして、天然の調節性Ｔ細胞を刺激する能力に基づいて、インビボにおいてネイティブＩＬ−２よりも大きな治療効果を有するＩＬ−２バリアントに関する先行技術の開示はない。しかし、ＩＬ−２バリアントの初期の研究以後、この分野の研究によって、Ｔｒｅｇ細胞が、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）を、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃと共に恒常的に高発現していることの、より完全な証明がなされ、ＩＬ−２Ｒαβγ選択的アゴニストとしてのＩＬ−２バリアントはＴｒｅｇ細胞に対し選択的であるはずである。
【０００６】
要約すると、ＩＬ−２は、様々な細胞集団の生物活性に非常に関りがある、高度に多面的なサイトカインである。この特性は、ＩＬ−２を、免疫応答の制御における重要な交点とし、各治療方法および複雑な免疫調節の魅力的な標的としている。さらに、受容体サブユニットにバイアスがかかったＩＬ−２バリアントは、ヘルパー細胞および細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞を最小限としながら、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖および活性を促進するための、ＩＬ−２を介した選択的な免疫調節の達成を可能とし、炎症誘発性シグナル伝達分子のレベルを低下させた。
【発明の概要】
【０００７】
一つの態様において、本発明は、変異型のＩＬ−２バリアントの作製に関する。これらのバリアントは、通常ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞毒性効果を有するＣＤ８＋Ｔリンパ球、およびＮＫ細胞を超えて、Ｔｒｅｇ（Ｔ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）細胞刺激における選択性が増強されていることを特徴とする。具体的には、これらのバリアントは自己免疫性・炎症性障害におけるＩＬ−２療法を向上させるための実際的な解決法を提供する。本発明は、１個〜数個のアミノ酸が変異していることを除き、ヒトＩＬ−２と一次配列を共有している、ポリペプチドに関する。これらのバリアントは、ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒβおよび／またはγｃとの相互作用に対応する位置においてアミノ酸置換を有しており、その結果、これらのバリアントは、ＩＬ−２Ｒβγ受容体複合体に対する親和性が減少しており、ＩＬ−２Ｒβγ発現細胞を活性化する能力が低減または消失しているが、ＩＬ−２Ｒαに結合する能力と、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体複合体に結合しそれを活性化する能力は保持している。本発明はまた、自己免疫性障害および種々の炎症性障害を治療するための、これらの変異型バリアントの治療用途を包含する。
【０００８】
一つの態様において、本発明は、変異型のＩＬ−２バリアントの作製に関する。これらのバリアントは、Ｔｒｅｇ選択的活性、凝集低減、発現増加、製造性向上、および開発適合性向上による、属性の組み合わせを有する。これらのバリアントはまた、タンパク質の生物物理学的特性の向上と、ＩＬ−２分子に関連した免疫原リスクの低減と、をもたらす。これらのバリアントは、ＩＬ−２療法を向上させるためのより優れた解決法と、自己免疫性・炎症性障害における毒性の低減と、をもたらす。本発明は、１個〜数個のアミノ酸が変異していることを除き、ヒトＩＬ−２と一次配列を共有している、ポリペプチドに関する。
【０００９】
一つの態様において、本発明は、細菌性毒の成分に類似した提案された「１９ＬＤＬ」モチーフを除去することを特徴とした、変異型ＩＬ−２バリアントの作製に関する（Ｂａｌｕｎａ  Ｒ、Ｒｉｚｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９９年；９６巻：頁３９５７−６２）。この「毒性モチーフ」は、ＩＬ−２の直接的な血管毒性に部分的に関与している。毒素様ドメインの決定的な残基であるＤ２０または隣接する２つの残基を除去するために導入される変異は、毒性モチーフを除去し、内皮細胞の損傷を防ぎ、ＶＬＳを大幅に低減させることが期待される。重要なことに、このモチーフはＩＬ−２Ｒβとの接触面に位置しているため、このモチーフに対するアミノ酸置換はＩＬ−２Ｒβに対してのその親和性を減少させ、得られた分子は、Ｔｒｅｇ細胞活性化においての選択性および内皮損傷の低減を含む、２つの有益な特性を有することが期待されるだろう。本発明は、１個〜数個のアミノ酸が変異していることを除き、ヒトＩＬ−２と一次配列を共有している、ポリペプチドに関する。本発明はまた、Ｔｒｅｇ細胞欠損型の自己免疫性障害および種々の炎症性障害を治療するための、これらの変異型バリアントの治療用途を包含する。
【００１０】
本発明は、自己免疫性障害および種々の炎症性障害の治療における、現在のＩＬ−２ベースの免疫調節戦略の、実質的な改善を可能にする。具体的には、本明細書に記載の変異型バリアントによるネイティブＩＬ−２の置換によって、Ｔｒｅｇ細胞のＣＤ２５に偏った選択的刺激が生じる。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント（または変異体）は、配列番号３に記載の成熟ヒトＩＬ−２ポリペプチドの配列に由来するＩＬ−２バリアント（または変異体）の配列を含む。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントはＩＬ−２アゴニストとしての機能を有する。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントはＩＬ−２アンタゴニストとしての機能を有する。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントは、配列番号４〜４３、１０８〜１４６、および１９３〜１９７に記載の配列を含む。
【００１１】
本発明は、Ｔｒｅｇ細胞欠損型の自己免疫性障害および種々の炎症性障害の治療における、現在のＩＬ−２ベースの免疫調節戦略の、実質的な改善を可能にする。具体的には、本明細書に記載の変異型バリアントによるネイティブＩＬ−２の置換は、Ｔｒｅｇ細胞のＣＤ２５に偏った選択的刺激をもたらすこととなり、毒性モチーフを除去し、内皮細胞損傷を防ぎ、ＶＬＳを大幅に低減することが期待される。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント（または変異体）は、配列番号３に記載の成熟ヒトＩＬ−２ポリペプチドの配列に由来するＩＬ−２バリアント（または変異体）の配列を含む。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントはＩＬ−２アゴニストとしての機能を有する。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントはＩＬ−２アンタゴニストとしての機能を有する。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントは、配列番号５〜１４、２６〜４３、１０８〜１１１、１２５〜１４６、および１９３〜１９７を含む。
【００１２】
別の態様において、本発明のＩＬ−２バリアントは、少なくとも１つの異種タンパク質に取り付けられている。種々の実施形態において、Ｉｌ−２バリアントは、融合分子に延長された半減期を与える少なくとも１つのポリペプチドと融合している。このようなポリペプチドとしては、ＩｇＧ  Ｆｃもしくは新生児Ｆｃγ／受容体に結合する他のポリペプチド、ヒト血清アルブミン、または、ＦｃＲｎに対する定常ドメインもしくは断片の親和性を増大させる１もしくは複数のアミノ酸改変を有する、ＩｇＧ定常ドメイン、もしくはＦｃＲｎと結合するその一部の存在によって、延長されたインビボ半減期を有する、ＩｇＧ、ＩｇＧ以外の免疫グロブリン、タンパク質、および非タンパク質薬剤をはじめとする、長い血中半減期を有するタンパク質に結合するポリペプチド、が挙げられる。このような、延長された半減期を有するタンパク質および分子は、そのような分子の治療的、予防的、または診断的な使用において、必要とされる量および／または投与頻度が少なくなるという利点がある（例えば、米国特許第７，６５８，９２１号参照）。
【００１３】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントは、異種タンパク質のＮ末端またはＣ末端に連結させることができる。
【００１４】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントはＩｇＧ  Ｆｃ分子と融合している。種々の実施形態において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン配列に由来するものである。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ２重鎖定常ドメイン配列に由来するものである。種々の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメイン配列に由来するものである。
【００１５】
用語「Ｆｃ」は、単量体形態であっても多量体形態であってもよい、全長抗体の非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指す。ネイティブＦｃのオリジナルとなる免疫グロブリン供給源は、ヒト由来のものが好ましく、当該技術分野で開示がなされた任意の免疫グロブリンであってよい。ネイティブＦｃは、共有結合的結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合的結合により、連結されて二量体形態または多量体形態になり得る、単量体ポリペプチドから構成される。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の幅がある。ネイティブＦｃの一例として、ＩｇＧのパパイン分解から生じるジスルフィド結合二量体がある（Ｅｌｌｉｓｏｎら、（１９８２年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０巻：頁４０７１−９）。用語「ネイティブＦｃ」とは、本明細書で使用される場合、単量体形態、二量体形態、および多量体形態の総称である。プロテインＡに対する結合部位、プロテインＧに対する結合部位、種々のＦｃ受容体に対する結合部位、および補体タンパク質に対する結合部位を含有するＦｃドメイン。
【００１６】
種々の実施形態において、用語「Ｆｃバリアント」とは、ネイティブＦｃから改変を受けたが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎに対する結合部位を尚も含んでいる、分子または配列を指す。国際公開第９７／３４６３１号（１９９７年９月２５日に公開）および国際公開第９６／３２４５８号には、例示的なＦｃバリアント、およびサルベージ受容体との相互作用に関する記載があり、当該国際公開は参照により本明細書に援用される。さらに、ネイティブＦｃは、本発明の融合分子には必要とされない構造的特徴または生物活性を与えることから、除去されてもよい部位を含む。すなわち、種々の実施形態においては、用語「Ｆｃバリアント」は、以下に影響または関与する１または複数のネイティブＦｃ部位または残基を欠く分子または配列を含む：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現後のＮ末端の異種性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または、（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。
【００１７】
用語「Ｆｃドメイン」は、上記で定義された、ネイティブＦｃおよびＦｃバリアントの分子および配列を包含する。ＦｃバリアントおよびネイティブＦｃと同様、用語「Ｆｃドメイン」は、全長抗体から消化された、または組換え遺伝子発現もしくは他の手段で生成された、単量体形態または多量体形態の、分子を包含する。種々の実施形態において、「Ｆｃドメイン」とは、ヒンジ領域の全体または一部を通常含む、２つのＦｃドメイン単量体（配列番号４４）からなる二量体を指す。種々の実施形態において、Ｆｃドメインはエフェクター機能を欠くように変異を受けていてもよい。種々の実施形態において、ＦｃドメインのＦｃドメイン単量体の各々は、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用または結合を減少させるために、ＣＨ２抗体定常ドメインにアミノ酸置換を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減する２つのアミノ酸置換（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減する３つのアミノ酸置換（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ）を含む（配列番号４５）。
【００１８】
種々の実施形態において、Ｆｃドメインは生体内半減期をさらに延長させるように変異を受けていてもよい。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第７，６５８，９２１号で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強させる３つのアミノ酸置換（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第７，３７１，８２６号で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強させた１つのアミノ酸置換（Ｎ４３４Ａ）を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第８，５４６，５４３号で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強させた１つのアミノ酸置換（Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）を含む。種々の実施形態において、半減期延長変異は、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減するアミノ酸置換と組み合わせることができる。
【００１９】
種々の実施形態において、Ｆｃドメインの２つのＦｃドメイン単量体は、それぞれ、これら２つの単量体のヘテロ二量体化を促すアミノ酸置換を含む。種々の他の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体化は、２つのＦｃドメイン単量体に異なっているが適合性の置換（「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」残基対など）を導入することにより、促すことができる。この「ノブ・イントゥ・ホール」技術は米国特許第８，２１６，８０５号においても開示されている。さらに別の実施形態では、一方のＦｃドメイン単量体がノブ型変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃドメイン単量体がホール型変異のＴ３６６Ｓ、Ｌ３５８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。種々の実施形態において、安定化ジスルフィド架橋を形成する２つのＣｙ残基が（「ノブ」側のＳ３５４Ｃと「ホール」側のＹ３４９Ｃ）が導入された。ヘテロ二量体Ｆｃの使用により、一価ＩＬ−２バリアント構築体を得ることができる。
【００２０】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質は、単量体型となり、すなわち、１つのみのＩＬ−２変異タンパク質分子を含む。そのような実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ−２バリアントに連結されたヘテロ二量体型Ｋｎｏｂ−Ｆｃおよび対応するヘテロ二量体型Ｈｏｌｅ  Ｆｃにより、共発現される。上記２つのＦｃ含有ポリペプチドのヘテロ二量体が形成された場合、得られるタンパク質は１つのみのＩＬ−２バリアントを含む。
【００２１】
種々の実施形態において、配列番号６９〜１０７、１４７〜１８９、および１９８〜２０８に記載のＦｃ−ＩＬ−２融合タンパク質を作製するために、ＩＬ−２バリアントが用いられる。
【００２２】
種々の実施形態において、本発明のＩＬ−２バリアントは、抗キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）抗体などの、融合分子に対して半減期の延長をもたらす抗体に取り付けることができる。そのような抗体は、外来抗原を認識し、より長い半減期を与えるが、ヒトにおいて生物学的機能も害も持たない。ＩｇＧクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）とすることができた。
【００２３】
種々の実施形態において、異種タンパク質はリンカーペプチドおよび／またはヒンジリンカーペプチドによってＩＬ−２バリアントに取り付けられている。リンカーまたはヒンジリンカーは、二次構造が比較的少ない、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個（またはその間の数字）、またはそれ以上のアミノ酸からなる人工配列であり得る。
【００２４】
種々の実施形態において、異種タンパク質は、αヘリックス高次構造を示し、タンパク質ドメイン間の剛直なスペーサーとして働き得る、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個（またはその間の数字）、またはそれ以上のアミノ酸からなる剛直なリンカーペプチドによって、ＩＬ−２バリアントに取り付けられている。
【００２５】
別の態様において、ＩＬ−２バリアントは、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載の方法で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなどの種々のポリオールを含むがこれらに限定はされない、種々の非タンパク質性ポリマーに連結することができる。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント内の種々の位置でアミノ酸置換をなし、ＰＥＧなどのポリマーの付加を促してもよい。種々の実施形態において、そのようなＰＥＧ化タンパク質は、非ＰＥＧ化タンパク質よりも、半減期が延長され、且つ／または免疫原性が低減され得る。
【００２６】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」とは、共役化剤、または共役部分もしくは活性化部分（例えば、アルデヒド部分、ヒドロキシサクシニミジル部分、ヒドラジド部分、チオール部分、トリフレート部分、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）部分、アジリジン（ａｚｉｒｄｉｎｅ）部分、オキシラン部分、オルトピリジルジスルフィド部分、ビニルスルホン部分、ヨードアセトアミド部分、またはマレイミド部分）による誘導体化、を用いるまたは用いない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。種々の実施形態において、ＰＥＧは、実質的に直鎖のＰＥＧ、直鎖ＰＥＧ、分岐鎖ＰＥＧ、または樹状ＰＥＧを包含する。ＰＥＧは、市販されている、または当該技術分野において周知の方法（ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、アカデミック・プレス社、ニューヨーク、３巻、頁１３８〜１６１）に従ったエチレングリコールの開環重合により作製できる、周知の水溶性ポリマーである。
【００２７】
種々の実施形態において、Ｉｌ−２バリアントは、Ｎ末端またはＣ末端において、ＩｇＧ  Ｆｃもしくは新生児Ｆｃγ／受容体に結合する他のポリペプチド、ヒト血清アルブミン、または長期の血中半減期を有するタンパク質に結合するポリペプチド、または種々の非タンパク質性ポリマーに、非共有結合的または共有結合的に連結することができる。
【００２８】
別の態様において、本開示は、ＩＬ−２バリアントを、薬剤的に許容できる担体と混合して含む、医薬組成物を提供する。
【００２９】
別の態様において、ＩＬ−２バリアントは、ヒドロゲル、ナノ粒子などに共有結合的または非共有結合的に取り付けるなど、徐放用に製剤化することができる。
【００３０】
別の態様において、本開示は、対象における自己免疫疾患を治療するための方法において、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、上記対象はヒト対象である。本発明に係る自己免疫疾患は、個体それ自身の組織から生じた、個体それ自身の組織に対する疾患または障害、またはその共分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）もしくは発現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）、またはそれから生じる状態である。種々の実施形態において、自己免疫疾患としては、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）、関節炎（関節リウマチ、反応性関節炎を含む）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アトピー性皮膚炎、乾癬および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、脳脊髄炎、ブドウ膜炎、重症筋無力症、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、種々の皮膚炎、アジソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性脱毛症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛症、尋常性天疱瘡、シェーグレン症候群、川崎病、甲状腺機能亢進症／グレーブス病、甲状腺機能低下症／橋本病、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、ウェゲナー病（Ｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、糸球体腎炎、再生不良性貧血（頻回輸血再生不良性貧血患者を含む）、発作性夜間血色素尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＰＴ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、エヴァンス症候群、第ＶＩＩＩ因子阻害剤症候群（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎およびリウマチ熱、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性水疱性類天疱瘡、パーキンソン病、サルコイドーシス、白斑、原発性胆汁性肝硬変、並びに自己免疫性心筋炎が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３１】
別の態様において、本開示は、対象における自己免疫疾患を治療するための方法において、自己免疫疾患を治療することが可能な第二の治療薬と組み合わせて、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。
【００３２】
別の態様において、本開示は、対象における炎症性疾患を治療するための方法において、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、上記対象はヒト対象である。種々の実施形態において、治療対象の炎症性疾患としては、クローン病、大腸炎、皮膚炎、乾癬、憩室炎、肝炎、過敏性腸症候（ＩＢＳ）、エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓ）、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット症候群および分類不能大腸炎多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、関節炎、関節リウマチ、喘息、並びにアテローム性動脈硬化および脈管炎などの種々の心血管疾患が挙げられるが、これらに限定はされない。種々の実施形態において、炎症性疾患は、関節リウマチ、糖尿病、痛風、クリオピリン関連周期性症候群、および慢性閉塞性肺障害からなる群から選択される。
【００３３】
別の態様において、本開示は、対象における炎症性疾患を治療するための方法において炎症性疾患を治療することが可能な第二の治療薬と組み合わせて、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。
【００３４】
別の態様において、本開示は、対象における臓器移植または関連の移植片対宿主病に対する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、上記対象はヒト対象である。種々の実施形態において、移植は、心臓の臓器移植、腎臓の臓器移植、肝臓の臓器移植、肺の臓器移植、膵臓の臓器移植、腸の臓器移植、および胸腺の臓器移植から選択されるか、または、骨の組織移植、腱の組織移植、角膜の組織移植、皮膚の組織移植、心臓弁の組織移植、神経の組織移植、および静脈の組織移植から選択される。
【００３５】
別の態様において、本開示は、自己免疫疾患治療用の医薬を調製するためのＩＬ−２バリアントの使用を提供する。
【００３６】
別の態様において、本開示は、臓器移植およびＧｖＨＤの治療用の医薬を調製するためのＩＬ−２バリアントの使用を提供する。
【００３７】
別の態様において、本開示は、炎症性障害治療用の医薬を調製するためのＩＬ−２バリアントの使用を提供する。
【００３８】
別の態様において、本開示は、本開示のＩＬ−２バリアントをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターを提供する。種々の実施形態において、上記のベクターは発現ベクターである。別の態様において、本開示は、本開示の核酸を含む単離された細胞を提供する。種々の実施形態において、上記の細胞は、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞である。別の態様において、上記のタンパク質またはポリペプチドの発現を促進する条件下で上記の宿主細胞を培養することによる、ＩＬ−２バリアントの作製方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、例示的なＩＬ−２  Ｆｃ融合タンパク質である、Ａ）Ｐ−０２５０、Ｂ）Ｐ−０３１８、Ｃ）Ｐ−０３１７、Ｄ）Ｐ−０４４７、およびＥ）Ｐ−０５１１の、プロテインＡ精製後のサイズ排除クロマトグラムを示している。また、図１Ｄおよび図１Ｅは、各試料の、還元剤非存在下（レーン２）および還元剤存在下（レーン３）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。
【図２】図２は、ヒトＰＢＭＣアッセイにおける、野生型融合タンパク質（Ｐ−０２５０）を対照とした、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導に対する、２０位のアスパラギン酸のアミノ酸置換（Ｄ２０Ｘ）を有するＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質の、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）とＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（Ｂ）とにおける効果の違いを示している。
【図３】図３は、ヒトＰＢＭＣアッセイにおける、野生型タンパク質（Ｐ−０２５０）および基準タンパク質を対照とした、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導に対する、ＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質Ｐ−０３７５（Ｎ８８Ｑ）の、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）とＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（Ｂ）とにおける効果の違いを示している。
【図４】図４は、野生型（Ｐ−０２５０）を対照とした、１９位にアミノ酸置換を有するＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質によるＳＴＡＴ５リン酸化に対する、効果の違いを示している。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（ＡおよびＣ）およびＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（ＢおよびＤ）においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力は、ＦＡＣＳ分析によるヒトＰＢＭＣアッセイにおいて求めた。
【図５】図５は、野生型（Ｐ−０２５０）または基準−１タンパク質を対照とした組み合わせ変異（Ｐ−４１９）、１９位（Ｐ−０３７２）または１２６位（Ｐ−０３０３）に個別のアミノ酸置換を有するＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質によるＳＴＡＴ５リン酸化に対する、効果の違いを示している。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（Ａ、Ｃ、およびＥ）およびＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（Ｂ、Ｄ、およびＦ）においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力は、ＦＡＣＳ分析で求めた。
【図６】図６は、野生型（Ｐ−０２５０）を対照とした、異なる組み合わせの二重アミノ酸置換を有するＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質（Ｐ−０４１９、Ｐ−０４６４、Ｐ−０４７１、Ｐ−０４７４、Ｐ−０４１７、およびＰ−０３２２）によるＳＴＡＴ５リン酸化に対する、効果の違いを示している。また、Ｐ−０４１７およびＰ−０３２２の生物活性を、１アミノ酸置換を有するそれらの対応物であるＰ−０３７３およびＰ−０３６３と比較した。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（ＡおよびＣ）およびＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（ＢおよびＤ）においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力は、ＦＡＣＳ分析によるヒトＰＢＭＣアッセイにおいて求めた。
【図７】図７は、野生型（Ｐ−０２５０）を対照とした、１９位（Ｐ−０４２４）もしくは１２６位（Ｐ−０３０３）における個別のアミノ酸置換、または組み合わせ変異（Ｐ−０４４７）を有するＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質によるＳＴＡＴ５リン酸化に対する、効果の違いと、野生型（Ｐ−０２５０）および基準Ｆｃ融合タンパク質を対照とした、異なる組み合わせアミノ酸置換を有するＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質（Ｐ−０４１９、Ｐ−０４４７、Ｐ−０４４８、およびＰ−０４４９）によるＳＴＡＴ５リン酸化に対する、効果の違いと、を示している。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（ＡおよびＣ）およびＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（ＢおよびＤ）においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力は、ＦＡＣＳ分析によるヒトＰＢＭＣアッセイにおいて求めた。
【図８】図８は、ＩＬ−２融合タンパク質であるＰ−０２５０、Ｐ−０４２４、およびＰ−４４７の、Ｓ１２５Ｉ置換を有するその各々の対応物であるＰ−０５３１、Ｐ−０４９１、およびＰ−０５１１を対照とした、ｐＳＴＡＴ５刺激活性を示している。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（Ａ、Ｃ、およびＥ）およびＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（Ｂ、Ｄ、およびＦ）においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力は、ＦＡＣＳ分析によるヒトＰＢＭＣアッセイにおいて求めた。
【図９】図９は、下記の３種類のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおける、野生型（Ｐ−０２５０）および３種類の基準分子を対照とした、ＩＬ−２バリアントＦｃ融合体（Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２）によるＳＴＡＴ５リン酸化に対する、効果の違いを示している；Ａ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ２５＋活性化Ｔｃｏｎｖ細胞、およびＣ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ２５−ナイーブＴｃｏｎｖ細胞。ＳＴＡＴ５リン酸化誘導能はＦＡＣＳ分析によるヒトＰＢＭＣアッセイで求めた。
【図１０】図１０は、野生型（Ｐ−０２５０）および基準分子を対照とした、Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２によるＡ）ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ）ＮＫ細胞の増殖刺激に対する効果の違いを示している。細胞増殖はＣＦＳＥ希釈系のＦＡＣＳ分析によるヒトＰＢＭＣアッセイで求め、分裂細胞の割合（％）として表した。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、異なる細胞種における、野生型相当物であるＰ−０５３１を対照とした、ＩＬ−２バリアントＦｃ融合体であるＰ−０５１１によるＳＴＡＴ５リン酸化誘導に対する効果の違いを示している。Ａ）ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞、Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＤ）ＮＫ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力は、ＦＡＣＳ分析によるヒトＰＢＭＣアッセイにおいて求めた。  図１１Ｅは、ＥＬＩＳＡアッセイにおける、Ｐ−０５３１および基準−１を対照とした、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃ複合体に対するＰ−５１１の結合の強さを示している。
【図１２】図１２は、単回皮下注射後の、ＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質処置マウスおよび基準処置マウスにおける、Ｔｒｅｇ細胞の増殖能および増殖を示している。表示の時点で血液を採取し、増殖測定およびリンパ球表現型検査にかけた。（Ａ）増殖マーカーＫｉ６７陽性Ｔｒｅｇ細胞の割合；（Ｂ）総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の割合；（Ｃ）総血中リンパ球中のＴｒｅｇ細胞の割合。データは平均値±ＳＥＭとして表されている。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点のＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１３】図１３は、単回皮下注射後の、ＩＬ−２変異型Ｆｃ融合タンパク質処置マウスおよび基準処置マウスにおける、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖能を示している。表示の時点で血液を採取し、リンパ球増殖の測定を行った。（Ａ）Ｋｉ６７陽性ＣＤ４＋通常Ｔ（Ｔｃｏｎｖ）細胞の割合；（Ｂ）Ｋｉ６７陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合；（Ｃ）Ｋｉ６７陽性ＮＫ細胞の割合。データは平均値±ＳＥＭとして表されている。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点のＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１４】図１４は、単回皮下注射後の、ＩＬ−２変異型Ｆｃ融合タンパク質処置マウスおよび基準処置マウスにおける、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖を示している。（Ａ〜Ｂ）総ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）および総血中リンパ球（Ｂ）中のＣＤ４＋通常Ｔ（Ｔｃｏｎｖ）細胞の割合。（Ｃ）総血中リンパ球中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合；（Ｄ）総血中リンパ球中のＮＫ細胞の割合。データは平均値±ＳＥＭとして表されている。
【図１５】図１５は、ＩＬ−２変異型Ｆｃ融合タンパク質処置マウスおよび基準処置マウスにおける、Ａ）Ｋｉ６７陽性発現の割合、およびＢ）細胞数に基づいた、Ｔｃｏｎｖ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の比率を示している。データはＦＡＣＳで得たものであり、平均値±ＳＥＭで表している。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点のＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊ｐ＜０．０５。
【図１６】図１６は、単回皮下注射後の、ＩＬ−２変異型Ｆｃ融合タンパク質処置マウスおよび基準処置マウスにおける、Ｔｒｅｇ細胞上のＣＤ２５およびＦｏｘｐ３の発現を示している。Ａ）Ｆｏｘｐ３、およびＢ）ＣＤ２５の発現レベルはＦＡＣＳ分析で分析されたものであり、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表されている。データは平均値±ＳＥＭとして表されている。各時点のＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１７】図１７は、ＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質Ｐ−０５１１の単回注射後のマウスにおけるＴｒｅｇ細胞の増殖能および増殖の、用量依存的な増加を示している。表示の時点で血液を採取し、リンパ球表現型検査と、Ｋｉ６７増殖マーカー測定を行った。（Ａ）増殖マーカーＫｉ６７陽性Ｔｒｅｇ細胞の割合；（Ｂ）総ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴｒｅｇ細胞の割合；（Ｃ）全血１マイクロリットル当たりのＴｒｅｇ細胞の数；（Ｄ）各群におけるＴｒｅｇ細胞数のベースラインからの変化倍率。データは平均値±ＳＥＭとして表した。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点のＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１８】図１８は、単回注射後のマウスにおける全リンパ球中の、Ｔｒｅｇ細胞の割合（Ａ）、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞の割合（Ｂ）、ＣＤ８  Ｔ細胞の割合（Ｃ）、およびＮＫ細胞の割合（Ｄ）に対する、ＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質Ｐ−０５１１の用量依存効果を示している。表示の時点で血液を採取し、リンパ球表現型検査を行った。データはＦＡＣＳ分析で求めたものであり、平均値±ＳＥＭで表している。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点のＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１９】図１９は、Ｐ−０５１１の単回注射後のマウスにおける、Ａ）Ｔｃｏｎｖ細胞数に対するＴｒｅｇ細胞数の比率、Ｂ）Ｔｒｅｇ細胞上のＣＤ２５の発現、およびＣ）Ｔｒｅｇ細胞上のＦｏｘｐ３の発現における、用量依存的な増加を示している。データはＦＡＣＳ分析で求めたものであり、平均値±ＳＥＭで表している。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点のＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２０】図２０は、ＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質（Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２）の反復投与を受けたマウスにおいてはＴｒｅｇ細胞の増殖能および増殖は維持されたが、野生型のＦｃ融合タンパク質（Ｐ−０５３１）および基準）の場合では維持されなかったことを示している。化合物を３日毎に１回（Ｑ３Ｄ）皮下投与し、１回目および３回目の注射の３日後に血液を採取し、リンパ球表現型検査と増殖マーカーＫｉ６７測定を行った。（Ａ）Ｋｉ６７陽性Ｔｒｅｇ細胞の割合；（Ｂ）総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の割合；（Ｃ）総血中リンパ球中のＴｒｅｇ細胞の割合。データはＦＡＣＳ分析で求めたものであり、平均値±ＳＥＭで表している。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各ＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０５。
【図２１】図２１は、ＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質（Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２）の反復投与を受けたマウスにおいてはＴｒｅｇ細胞数の増加は維持されたが、野生型のＦｃ融合タンパク質（Ｐ−０５３１）および基準の場合では維持されなかったことを示している。化合物を３日毎に１回（Ｑ３Ｄ）皮下投与し、１回目および３回目の注射の３日後に血液を採取し、リンパ球表現型検査と増殖マーカーＫｉ６７測定を行った。（Ａ）全血１マイクロリットル当たりのＴｒｅｇ細胞の数；（Ｂ）ＰＢＳ対照群と比較した場合のＴｒｅｇ数の変化倍率。データはＦＡＣＳ分析で求めたものであり、平均値±ＳＥＭで表している。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各ＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２２】図２２は、ＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質（Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２）の反復投与を受けたマウスにおいてはＴｃｏｎｖに対するＴｒｅｇの比率の上昇が保持されたが、野生型のＦｃ融合タンパク質（Ｐ−０５３１）および基準の場合では保持されなかったことを示している。化合物を３日毎に１回（Ｑ３Ｄ）皮下投与し、１回目および３回目の注射の３日後に血液を採取し、Ｔｒｅｇ細胞表現型検査とＴｃｏｎｖ細胞表現型検査を行った。この比率は、総ＣＤ４細胞中の％Ｔｒｅｇおよび％Ｔｃｏｎｖに基づいて算出した。データはＦＡＣＳ分析で求めたものであり、平均値±ＳＥＭで表している。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。＊＊＊＊各ＰＢＳ群との比較でｐ＜０．０００１。
【図２３】図２３は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）抗原によって誘導される遅延型過敏（ＤＴＨ）のマウスモデルにおける、Ｐ−０５１１による抗原駆動型炎症の抑制を示している。マウスを０日目にＫＬＨで免疫し、５日目に右耳に再免疫した。−２日目から開始して３日おきまたは５日おきに、マウスをＰ−０５１１で処置した。Ａ）３日おき、およびＢ）５日おきの投与スケジュールの場合の、ＫＬＨ暴露後の種々の時点におけるベースライン値に対する耳厚の変化（Δ耳厚）を用いたＤＴＨ反応の動態を示した。データは平均値±ＳＥＭとして表されている。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点における各ＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図２４】図２４は、ＫＬＨ抗原によって誘導されるＤＴＨのマウスモデルにおける、基準分子（基準−１）を対照とした、Ｐ−０５１１による抗原駆動型炎症の抑制を示している。マウスを０日目にＫＬＨで免疫し、５日目に右耳に再免疫した。−２日目から開始して５日おきに、マウスを上記化合物で処置した。ＫＬＨ暴露後の種々の時点におけるベースライン値に対する耳厚の変化（Δ耳厚）を用いたＤＴＨ反応の動態を示した。データは平均値±ＳＥＭとして表されている。統計解析として、１元配置分散分析と、その後にテューキーの事後検定を行った。各時点の各ＰＢＳ群との比較で、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、１個〜数個のアミノ酸が変異していることを除き、ヒトＩＬ−２と一次配列を共有している、ポリペプチドに関する。ＩＬ−２バリアントの１つのパネルは、エフェクターＴ細胞やＮＫ細胞以上に、免疫抑制性の調節性Ｔ細胞（Ｔ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の増殖、生存、活性化および／または機能を優先的に促進する、変異を含む。本発明はまた、自己免疫性障害および種々の炎症性障害を治療するための、単独、または患部組織を標的とするタンパク質またはペプチドと共に使用される、このようなＩＬ−２選択的アゴニストの治療用途も包含する。別のＩＬ−２バリアントパネルは、これらのポリペプチドのＴｒｅｇ細胞またはＴｃｏｎｖ細胞を刺激する能力を大幅に低減し（受容体結合活性は有していてもよい）、当該ポリペプチドをＩＬ−２アンタゴニストとして有効なものにする、変異を含む。別の態様において、本発明は、本開示のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。最後に、本発明は、自己免疫性炎症性障害のような疾患に対する免疫系の選択的調節効果による、本開示のポリペプチドおよび医薬組成物の治療用途に関する。
【００４１】
定義
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は同義的に使用されており、アミノ酸残基のポリマーを指している。種々の実施形態において、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、α炭素同士がペプチド結合を通じて連結されているアミノ酸鎖である。鎖の一方の末端（アミノ末端）の末端アミノ酸はすなわち遊離アミノ基を有しており、一方、鎖の他方の末端（カルボキシ末端）の末端アミノ酸は遊離カルボキシル基を有している。本明細書で使用される場合、用語「アミノ末端」（Ｎ末端と省略）は、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離α−アミノ基を指すか、あるいは、ペプチド内の任意の他の場所のアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に参加している場合のアミノ基）を指す。同様に、用語「カルボキシ末端」は、ペプチドのカルボキシ末端の遊離カルボキシル基、またはペプチド内の任意の他の場所のアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドは、実質的に任意のポリアミノ酸も包含し、ペプチド模倣薬が挙げられるがこれに限定はされず、例えば、アミノ酸同士がアミド結合ではなくエーテルによって連結されているものなどである。
【００４２】
本開示のポリペプチドは、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性の低減、（２）酸化に対する感受性の低減、（３）タンパク質複合体形成を目的とした結合親和性の変化、（４）結合親和性の変化、および、（５）他の物理化学的特性または機能特性の付与または改変など、いかなる方法およびいかなる理由で改変されたポリペプチドも包含する。
【００４３】
アミノ酸の「置換」とは、本明細書で使用される場合、親ポリペプチド配列内の特定位置のあるアミノ酸の、異なるアミノ酸との、ポリペプチドにおける置換を指す。アミノ酸置換は、当該技術分野において周知の遺伝学的手法または化学的手法を用いて生じさせることができる。例えば、天然配列に（例えば、分子間接触を形成しているドメインの外側のポリペプチド部分に）、単一のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）がなされていてもよいし、複数のアミノ酸置換がなされていてもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、ポリペプチド内の、あるアミノ酸の、機能的に類似したアミノ酸との置換を指す。下記の６つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含んでいる。：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）、およびグルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）、およびリジン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）
【００４４】
「非保存的アミノ酸置換」とは、これらのクラスの１つの構成要素の別のクラスの構成要素への置換を指す。そのような変化を起こす際、種々の実施形態においては、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮される場合がある。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて、疎水性親水性指標が割り振られている。それぞれの疎水性親水性指標は以下である、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００４５】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のアミノ酸疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野においては理解されているところである（例えば、Ｋｙｔｅら、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５−１３１を参照）。ある特定のアミノ酸を、同様の疎水性親水性指標または疎水性親水性スコアを有する他のアミノ酸に置換しても、同様の生物活性が保持され得ることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化を起こす際、種々の実施形態においては、両者の疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸同士の置換が含まれる。種々の実施形態においては±１以内のものが含まれ、種々の実施形態においては±０．５以内のものが含まれる。
【００４６】
また、特に、このように作製された生物学的な機能を持つタンパク質またはペプチドの、本明細書において開示される免疫学的な実施形態での使用が意図されている場合、類似アミノ酸同士の置換は、親水性に基づくことで、効率的に為すことができると、当該技術分野では理解されている。種々の実施形態において、隣接アミノ酸の親水性によって制御される、タンパク質の局所的な平均親水性の最大値は、その免疫原性および抗原性と相関しており、すなわち、当該タンパク質の生物学的特性と相関している。
【００４７】
下記の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り振られている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋−．１）；グルタミン酸（＋３．０．＋−．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋−．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づいた変化を起こす際、種々の実施形態においては、親水性値が±２以内であるアミノ酸同士の置換が含まれ、種々の実施形態においては±１以内のものが含まれ、種々の実施形態においては±０．５以内のものが含まれる。
【００４８】
例示的なアミノ酸置換を表１に記載する。
【００４９】
2021528105.tif 000002
【００５０】
当業者であれば、周知の手法を用いて、本明細書に記載されているポリペプチドの好適なバリアントを決定することができる。種々の実施形態において、当業者は、活性に重要であるとは考えられていない領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく変化を起こすことができる、上記分子の好適な領域を、特定することができる。他の実施形態において、当業者は、類似ポリペプチド間で保存されている、上記分子の残基および部分を特定することができる。さらなる実施形態においては、生物活性または構造にとって重要であり得る領域でさえも、生物活性を破壊することも、ポリペプチド構造に悪影響を与えることもなく、保存的アミノ酸置換を起こすことができる。
【００５１】
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要な類似ポリペプチド内の残基を特定する構造・機能研究を調査することができる。そのような比較を考慮に入れて、当業者は、類似ポリペプチドの活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、ポリペプチド内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要アミノ酸残基のために、化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができる。
【００５２】
また、当業者は、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似ポリペプチドの当該構造と関連させて解析することができる。そのような情報に照らして、当業者は、その三次元構造に関して、ポリペプチドのアミノ酸残基の並びを予測することができる。種々の実施形態において、当業者は、ポリペプチドの表面上に存在すると予測されたアミノ酸残基に、このような残基は他の分子との重要な相互作用に関与している場合があるため、根本的な変化が生じないように、選択を行うことができる。さらに、当業者は、所望のアミノ酸残基のそれぞれに単一のアミノ酸置換を含む試験バリアントを作製することができる。その後、当業者に公知の活性定量法を用いて、バリアントのスクリーニングを行うことができる。そのようなバリアントを用いることで、好適なバリアントに関する情報を集めてもよい。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が活性の破壊、活性の好ましくない低減、または不適切な活性をもたらすことが分かった場合、そのような変化を有するバリアントを避けることができる。言い換えれば、そのような通例の実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独または他の変異と組み合わせた、さらなる置換が避けられるべきアミノ酸を容易に確認することができる。
【００５３】
用語「ポリペプチド断片」および「切断型ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、対応する完全長タンパク質と比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に欠失を有するポリペプチドを指す。種々の実施形態において、断片は、例えば、５以上、１０以上、２５以上、５０以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、または１０００以上のアミノ酸長とすることができる。種々の実施形態において、断片は、例えば、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下、１００以下、５０以下、２５以下、１０以下、または５以下のアミノ酸長ともすることができる。断片には、その一方または両方の末端に、１または複数の追加のアミノ酸をさらに含ませることができ、例えば、異なる天然タンパク質由来のアミノ酸配列（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）を含ませることができる。
【００５４】
「ポリペプチドバリアント」、「ハイブリッドポリペプチド」、および「ポリペプチド変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、別のポリペプチド配列と比較して、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入されている、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列から欠失している、且つ／または、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列中に置換されている、アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。種々の実施形態において、挿入、欠失、または置換されているアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００のアミノ酸長とすることができる。本開示のハイブリッドは融合タンパク質を包含する。
【００５５】
ポリペプチドの「誘導体」とは、化学的に修飾されたポリペプチドであって、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などの別の化学的部分への結合、リン酸化、およびグリコシル化などである。
【００５６】
本明細書において、用語「％配列同一性」は、用語「％同一性」と同義的に使用されており、配列アラインメント用プログラムを用いてアラインメントされた場合の、２以上のペプチド配列間のアミノ酸配列同一性の値、または２以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列同一性の値を指す。例えば、本明細書で使用される場合、８０％同一性は、規定のアルゴリズムで測定された８０％配列同一性と同じことを意味し、所与の配列が別の長さの別の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有することを意味している。種々の実施形態において、％同一性は、所与の配列に対しての、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性から選択される。種々の実施形態において、％同一性は、例えば、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の範囲内である。
【００５７】
本明細書において、用語「％配列相同性」は、用語「％相同性」と同義的に使用されており、配列アラインメント用プログラムを用いてアラインメントされた場合の、２以上のペプチド配列間のアミノ酸配列相同性の値、または２以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列相同性の値を指す。例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性は、規定のアルゴリズムで測定された８０％配列相同性と同じことを意味し、すなわち、所与の配列の相同体は所与の配列のある長さに亘って８０％超の配列相同性を有する。種々の実施形態において、％相同性は、所与の配列に対しての、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれ以上の配列相同性から選択される。種々の実施形態において、％相同性は、例えば、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の範囲内である。
【００５８】
２つの配列間の同一性を確認するために用いることができる例示的なコンピュータプログラムとしては、ＮＣＢＩウェブサイトにおいてインターネット上で一般に入手可能な一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ、が挙げられるが、これらに限定はされない。  また、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：頁４０３−１０、１９９０年（公表された初期設定、すなわち、パラメーターｗ＝４、パラメーターｔ＝１７、に特に関連して）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：頁３３８９−３４０２、１９９７年を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓや他の公開データベースのアミノ酸配列と比較して所与のアミノ酸配列を評価する場合、配列検索は通常、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて行う。Ｔｈｅ  ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓや他の公開データベースのアミノ酸配列に対して、全ての読み取り枠で翻訳された核酸配列の検索に好ましい。オープンギャップペナルティ＝１１．０、ギャップ伸長ペナルティ＝１．０という初期パラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸの両方を実行し、ＢＬＯＳＵＭ−６２行列を利用する。
【００５９】
パーセント配列同一性の算出に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：頁５８７３−５７８７、１９９３年を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性尺度の１つとして、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））があり、これは、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間で一致が偶然に生じる確率を示す。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した場合の最小和確率が、例えば、約０．１未満、約０．０１未満、または約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
【００６０】
用語「修飾」とは、本明細書で使用される場合、ペプチド骨格（例えばアミノ酸配列）の任意の操作またはポリペプチドの翻訳後修飾（例えばグリコシル化）を指す。
【００６１】
用語「ノブ・イントゥ・ホール修飾（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、本明細書で使用される場合、ＣＨ３ドメインにおける、２つの免疫グロブリン重鎖間の境界面内の修飾を指す。１つの実施形態において、「ノブ・イントゥ・ホール修飾」は、一方の抗体重鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗと所望によりアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃとを含み、他方の抗体重鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、所望によりＹ３４９Ｃとを含む。ノブ・イントゥ・ホール技術は、米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ、９巻、頁６１７−６２１（１９９６年）、およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ、２４８巻、頁７−１５（２００１年）などで説明されている。
【００６２】
用語「融合タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、元は別々のタンパク質をコードしていた２以上の遺伝子を含む融合ポリペプチド分子であって、その構成成分は、直接またはペプチドリンカーを介して、ペプチド結合で互いに連結されている、融合ポリペプチド分子を指す。用語「融合した」とは、本明細書で使用される場合、構成成分が、直接または１もしくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合で連結されていることを指す。
【００６３】
「リンカー」とは、共有結合的に、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、もしくは水素結合を通じて、２つの他分子を連結する分子のことをいい、例えば、ある相補的配列の５’末端にハイブリダイズし、さらに、別の相補的配列の３’末端にハイブリダイズすることで、２つの非相補的配列を連結する核酸分子である。「切断可能なリンカー」とは、切断可能なリンカーによって連結されている２つの成分を分離するために、分解または他の方法による切断が可能なリンカーを指す。切断可能なリンカーは一般的には酵素によって切断され、典型的にはペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼなどによって切断される。切断可能なリンカーは、例えば温度変化、ｐＨ変化、塩濃度変化などの、環境要因によって切断される場合もある。
【００６４】
用語「ペプチドリンカー」とは、本明細書で使用される場合、１または複数のアミノ酸、典型的には２〜２０個程度のアミノ酸、を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野において公知のものか、本明細書に記載のものである。好適な非免疫原性のリンカーペプチドとしては、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー、（ＳＧ４）ｎペプチドリンカー、またはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーなどが挙げられる。「ｎ」は通常は１〜１０の数字であり、典型的には２〜４の数字である。
【００６５】
「医薬組成物」は、動物における製薬学的用途において好適な組成物を指す。医薬組成物は、薬理学的有効量の活性薬剤と、薬剤的に許容できる担体と、を含む。「薬理学的有効量」とは、意図された薬理学的結果を得るのに有効な薬剤量を指す。「薬剤的に許容できる担体」とは、任意の標準的な医薬担体、溶媒、緩衝液、および医薬品添加物を指し、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、５％ブドウ糖水溶液、水中油型エマルションまたは油中水型エマルションなどのエマルション、並びに、様々な種類の湿潤剤および／または補助剤などである。好適な医薬担体および製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２１版、２００５年、マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ）、イーストン、に記載がある。「薬剤的に許容できる塩」は、製薬学的用途で化合物に配合できる塩であり、例えば、金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩など）、アンモニア塩、有機アミン塩が挙げられる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」や「治療すること」などのその文法的変形語）は、治療を受けている個体における病気の自然経過を変化させるための臨床的介入を指し、予防のために実施することもできるし、臨床病理の経過中に実施することもできる。望ましい治療効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理的帰結の低減、転移の予防、疾患増悪速度の減少、病状の改善または軽減、および寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態を「軽減する」とは、当該疾患、障害、または状態の症状の重症度および／または発生頻度を低減させることを意味する。さらに、本明細書における「治療」に関する記載は、治癒的、対症的および予防的な治療に関する記載を包含する。
【００６７】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、その症状の１または複数を改善、緩和、軽減、および／または遅延するなど、特定の障害、状態、または疾患を治療するのに十分な化合物または組成物の量を指す。がん、または他の望ましくない細胞の増殖に関して、有効量は、以下に十分な量を含む：（ｉ）がん細胞数の減少；（ｉｉ）腫瘍サイズの減少；（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害、遅滞、ある程度の減速、好ましくは停止；（ｉｖ）腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）；（ｖ）腫瘍増殖の阻害；（ｖｉ）腫瘍の発生および／もしくは再発の抑制または遅延；並びに／または、（ｖｉｉ）がんと関連した症状のうちの１もしくは複数のある程度の軽減。有効量は、一回または複数回の投与で投与することができる。
【００６８】
「投与する」または「投与させる（ｃａｕｓｅ  ｔｏ  ｂｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」という表現は、当該の薬剤／化合物の患者への投与を管理および／または許可する、医療専門家（例えば、医師）、または患者の医学的ケアを管理する人、によって行われる行為を指す。投与させることには、診断、および／または適切な治療レジメンの決定、および／または患者への特定の薬剤／化合物の処方が含まれ得る。このような処方は、例えば、処方箋書式の草案、医療記録の注釈などを包含し得る。投与が本明細書に記載されている場合、「投与させること」も企図される。
【００６９】
用語「患者」、「個体」、および「対象」は、同義的に使用されている場合があり、哺乳動物を指し、ヒトまたはヒト以外の霊長類が好ましいが、家畜化された哺乳類（例えば、イヌまたはネコ）、実験用の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）、および農業用の哺乳類（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）を指す場合もある。種々の実施形態において、患者は、病院、精神科医療施設で医師もしくは他の医療従事者の治療を受けている、外来患者としての、または他の臨床状況下の、ヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年期男性、青年期女性、男児、女児）とすることができる。種々の実施形態において、患者は、免疫無防備状態の患者または免疫系が弱まった患者としてもよく、例えば、原発性免疫不全症患者、エイズ患者；ある特定の免疫抑制剤を服用しているがん患者および移植患者；並びに、免疫系に影響を及ぼす遺伝病（例えば、先天性無ガンマグロブリン血症、先天性ＩｇＡ欠損症）を有する患者が挙げられるが、これらに限定はされない。種々の実施形態において、患者は免疫原性のがんを有しており、例えば、膀胱がん、肺がん、メラノーマ、および変異率が高いと報告されている他のがん（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４９９巻（７４５７号）：頁２１４−２１８、２０１３年）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７０】
「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で使用される場合、定常領域の一部を少なくとも含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語はネイティブ配列のＦｃ領域とバリアントＦｃ領域とを包含する。ＩｇＧのＦｃ領域はＩｇＧのＣＨ２ドメインとＩｇＧのＣＨ３ドメインとから構成される。ＣＨ３領域は、本明細書においては、ネイティブ配列のＣＨ３ドメインである場合と、バリアントＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に「凸部」（「ノブ」）が導入され、そのもう一方の鎖に対応する「凹部」（「ホール」）が導入された、ＣＨ３ドメイン；参照によって本明細書に明確に援用される、米国特許第５，８２１，３３３号を参照）である場合がある。このようなバリアントＣＨ３ドメインを用いることで、本明細書に記載されているような２つの同一でない免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化が促進され得る。本明細書においては特に記載がない限り、Ｆｃ領域または定常領域でのアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ付番方式に従うものとする。
【００７１】
用語「エフェクター機能」とは、本明細書で使用される場合、免疫グロブリンのＦｃ領域に起因する生物活性を指し、免疫グロブリンのアイソタイプによって異なる。  免疫グロブリンのエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑとの結合による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体との結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の発現低下、およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【００７２】
「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ細胞」という用語、本明細書で使用される場合、他のＴ細胞（エフェクターＴ細胞）の反応を抑制できる、特殊な種類のＣＤ４＋Ｔ細胞を意味する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４、ＩＬ−２受容体のａサブユニット（ＣＤ２５）、および転写因子であるフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現を特徴としており（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２巻、頁５３１−６２（２００４年））、腫瘍によって発現されたものを包含する抗原に対する末梢性自己寛容の誘導と維持において決定的役割な役割を果たす。
【００７３】
用語「通常ＣＤ４＋Ｔ細胞」とは、本明細書で使用される場合、制御性Ｔ細胞以外のＣＤ４＋Ｔ細胞を意味する。
【００７４】
用語「Ｔｒｅｇ細胞の選択的活性化」とは、本明細書で使用される場合、他のＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞など）、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を基本的に伴わない、Ｔｒｅｇ細胞の活性化を意味する。実施例で、これらの細胞型を同定・区別するための方法を説明している。活性化には、ＩＬ−２受容体シグナリングの誘導（リン酸化ＳＴＡＴ５の検出などにより測定）、増殖の誘導（Ｋｉ−６７の検出などにより測定）、および／または、活性化マーカーの発現の上方制御（例えばＣＤ２５など）、および細胞数の増加が含まれる場合がある。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であることを意味し、望ましくないまたは非特異的な相互作用とは区別できる。免疫グロブリンの特異的抗原に対する結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などの当業者に周知の他の方法を通じて測定できる。
【００７６】
「親和性」または「結合親和性」という用語は、本明細書で使用される場合、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合計強度を指す。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は解離定数（ＫＤ）で表すことができ、ＫＤは解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。親和性を測定するための特定の方法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）がある。
【００７７】
用語「結合性の減少」とは、本明細書で使用される場合、ＳＰＲなどで測定された場合の、それぞれの相互作用における、親和性の減少を指す。逆に、「結合性の増加」とは、それぞれの相互作用における、結合親和性の増加を指す。
【００７８】
用語「ポリマー」とは、本明細書で使用される場合、通常、ホモポリマー；例えば、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー、ランダムコポリマー、および交互コポリマーなどのコポリマー；並びにターポリマー；並びにこれらの混合物および修飾物を包含するが、これらに限定はされない。さらに、特に限定されていない限り、用語「ポリマー」は、その物質の全ての可能な幾何学的立体配置を包含するものとする。これらの立体配置は、アイソタクチックな対称性、シンジオタクチックな対称性、およびランダムな対称性を包含するが、これらに限定はされない。
【００７９】
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単位から構成される重合体を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）などの天然核酸だけでなく、核酸アナログも包含する。核酸アナログは、天然ホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの結合に参加しているヌクレオチドである非天然塩基を含むもの、ホスホジエステル結合以外の結合を通じて付加された塩基を含むもの、を包含する。すなわち、核酸アナログは、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホルアミダート、ボラノリン酸、メチルホスホン酸、キラル−メチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）などを包含し、これらに限定はされない。このようなポリヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置などを用いて合成することができる。用語「核酸」は、通常、大型のポリヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」は、通常は短いポリヌクレオチドを指し、通常は約５０ヌクレオチド以下である。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表されている場合、「Ｕ」が「Ｔ」と置き換わったＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）もこれに包含されることは理解されたい。
【００８０】
本明細書では従来の表示法を用いてポリヌクレオチド配列を記載している。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を５’方向と称する。新生ＲＮＡ転写物への５’方向から３’方向へのヌクレオチド付加を転写方向と称する。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖を「コード鎖」と称し；ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列を「上流配列」と称し；ＲＮＡと同じ配列を有し、コードＲＮＡ転写物の３’末端の３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列を「下流配列」と称する。
【００８１】
「相補的」とは、位相幾何学的な適合性、すなわち、２つのポリヌクレオチドの相互作用し合う表面同士の一致性をいう。すなわち、この２つの分子は相補的と記載することができ、さらには、接触表面特徴が互いに相補的である。第一のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が第二のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、または、第一のポリヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第二のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である場合、第一のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチドに相補的である。
【００８２】
「〜に特異的にハイブリダイズすること」または「特異的なハイブリダイゼーション」または「〜に選択的にハイブリダイズする」とは、核酸分子が、特定のヌクレオチド配列に対して、当該配列が混合物としての（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在している場合に、ストリンジェントな条件下で優先的に、結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブが、その標的物質には優先的にハイブリダイズするが、他の配列に対してはより小さな程度にしかハイブリダイズしないか、または全くハイブリダイズしないであろう、条件を指す。サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメーター下では異なったものとなる。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３年、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、エルゼビア社、ニューヨーク州；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー研究所、第３版、ニューヨーク州；および、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエート・アンド・ワイリー・インターサイエンス社（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク州に見出すことができる。
【００８３】
通常、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および高度にストリンジェントな洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）より５℃程度低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全一致プローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと同じになるように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルター上の約１００超の相補的残基を有する相補的核酸同士のハイブリダイゼーションのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルマリン＋１ｍｇヘパリン、４２℃、一晩のハイブリダイゼーション実行である。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、７２℃、約１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃、１５分である。ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。高度にストリンジェントな洗浄の前に、低度にストリンジェントな洗浄を行うことで、バックグラウンドのプローブシグナルを除去することができる。例えば約１００超のヌクレオチドの二本鎖に対する中程度にストリンジェントな洗浄の例は、１×ＳＳＣ、４５℃、１５分である。例えば約１００超のヌクレオチドの二本鎖に対する低度にストリンジェントな洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣ、４０℃、１５分である。通常、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、無関係のプローブにおいて確認されたシグナル・ノイズ比の２倍（以上）のシグナル・ノイズ比が、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００８４】
「プライマー」とは、指定のポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズし、相補的ポリヌクレオチドの合成開始点を与えることが可能な、ポリヌクレオチドを指す。このような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘導される条件下に、すなわち、ヌクレオチド類と、相補的ポリヌクレオチド鋳型と、ＤＮＡポリメラーゼなどの重合用の物質と、の存在下に、置かれた場合に生じる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、幅広い種類の合成プライマーおよび天然プライマーが多くの適用で有用である。プライマーは鋳型に対して相補的であり、鋳型にハイブリダイズして合成開始部位として働くように設計されているが、鋳型の配列を厳密に反映している必要はない。このような場合の、鋳型に対するプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー次第である。プライマーは、発色性部分、放射性部分、または蛍光性部分などで標識でき、検出可能な部分として使用できる。
【００８５】
「プローブ」とは、ポリヌクレオチドを指して使用されている場合、別のポリヌクレオチドの指定の配列に特異的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドをいう。プローブは、標的の相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするものであるが、鋳型の相補的配列を厳密に反映している必要はない。このような場合の、標的に対するプローブの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー次第である。プローブは、発色性部分、放射性部分、または蛍光性部分などで標識でき、検出可能な部分として使用できる。プローブが相補的なポリヌクレオチドの合成開始点を与える場合、プローブをプライマーとすることもできる。
【００８６】
「ベクター」は、それに連結した別の核酸を細胞に導入するのに使用できるポリヌクレオチドである。ベクターの１種として「プラスミド」があるが、プラスミドとは、その中に追加の核酸セグメントを連結することができる、直鎖状または環状の二本鎖ＤＮＡ分子をいう。別の種類のベクターとしてウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、複製欠損アデノウイルス、および複製欠損アデノ随伴ウイルス）があり、このウイルスゲノムの中には追加のＤＮＡセグメントを導入することができる。ある特定のベクターは導入された宿主細胞内で自律増殖が可能である（例えば、細菌性複製開始点を含む細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入後に宿主細胞のゲノムに組み入れられることで、宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は選択されたポリヌクレオチドの発現を指示することができるベクターの一種である。
【００８７】
「制御配列」は、それが機能的に連結された核酸の発現（例えば、発現量、発現タイミング、または発現場所）に影響を与える核酸である。制御配列は、例えば、被制御核酸に対して直接、あるいは、１または複数の他の分子（例えば、当該制御配列および／または当該核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じて、その効果を及ぼし得る。制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列のさらなる例が、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州、およびＢａｒｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３巻、頁３６０５−０６に記載されている。制御配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現量、発現タイミング、または発現場所）に影響を及ぼしている場合、当該ヌクレオチド配列は当該制御配列に「機能的に連結」されていることになる。
【００８８】
「宿主細胞」は、本開示のポリヌクレオチドの発現に用いることができる細胞である。宿主細胞は原核生物とすることができ、例えば、大腸菌とすることができ、あるいは、宿主細胞は真核生物とすることができ、例えば、単細胞の真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコ植物細胞またはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）、またはハイブリドーマとすることができる。通常、宿主細胞は、ポリペプチドコード核酸による形質転換またはそのトランスフェクトが可能な培養細胞であり、当該宿主細胞においてこのポリペプチドコード核酸の発現が可能となる。発現対象の核酸で形質転換された、またはそれをトランスフェクトされた宿主細胞を表すために、「組換え宿主細胞」という表現が用いられている場合がある。宿主細胞はまた、上記核酸を含んではいるが、それを所望のレベルでは発現していない細胞とすることもできるが、ただし、上記核酸と機能的に連結するように制御配列が当該宿主細胞に導入されている場合は除く。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫や潜在的な子孫も指すと理解される。突然変異や環境の影響などによってある特定の改変が後の世代において生じ得るため、そのような子孫は実際には親細胞と同一でない場合があるが、その場合であっても、本明細書で使用される上記用語の範囲内に包含される。
【００８９】
用語「単離された分子」（ここで、分子はポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどである）は、その起源または派生源に基づいて、（１）天然状態のそれに伴っている天然付随成分を付随していない分子、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含んでいない分子、（３）異なる種由来の細胞によって発現された分子、または（４）天然では生じない分子である。すなわち、化学的に合成された分子、または天然にそれが生じる細胞とは異なる細胞系で発現された分子が、その天然付随成分から「単離」されることとなる。当該技術分野において周知の精製法を用いて、分子を、単離により天然付随成分を実質的に含まないものとしてもよい。当該技術分野において周知のいくつかの手段で、分子の純度または均一性を評価することができる。例えば、当該技術分野において周知の方法を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲル染色によりポリペプチドを可視化することで、ポリペプチド試料の純度を評価することができる。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において周知の他の精製手段を用いることで、より高い解像度を得てもよい。
【００９０】
試料の少なくとも約６０％〜７５％が単一のポリペプチド種を示す場合に、タンパク質またはポリペプチドは「実質的に純粋な」、「実質的に均一な」、または「実質的に精製された」ものである。このポリペプチドまたはタンパク質は単量体であっても多量体であってもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、通常、タンパク質試料の約５０％（Ｗ／Ｗ）、約６０％（Ｗ／Ｗ）、約７０％（Ｗ／Ｗ）、約８０％（Ｗ／Ｗ）、または約９０％（Ｗ／Ｗ）を構成しており、より頻繁には約９５％を構成しており、９９％超純粋となることが好ましい。タンパク質の純度または均一性は、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、当該技術分野において周知の染色法によるゲル染色で単一ポリペプチドバンドを可視化するなどの、当該技術分野において周知のいくつかの手段で、示すことができる。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において周知の他の精製手段を用いることで、より高い解像度を得てもよい。
【００９１】
「標識」または「標識化」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体に別の分子を組み込むことをいう。１つの実施形態において、標識は検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み、またはマークを付けたアビジンにより検出可能なビオチニル部分のポリペプチドへの付加（例えば、光学的方法または熱量測定法（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）で検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）である。別の実施形態において、標識またはマーカーは、治療用の標識またはマーカーとすることができ、例えば、薬剤複合体または毒素である。ポリペプチドおよび糖タンパク質の種々の標識法が、当該技術分野において公知であり、使用されてよい。ポリペプチド用の標識の例として、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光ラベル（例えば、ＦＩＴＣ蛍光体、ローダミン蛍光体、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）、磁性を有する薬剤、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、並びにこれらのアナログまたはホモログ。種々の実施形態において、標識は、起こり得る立体障害を抑制するため、様々な長さのスペーサーアームによって付加される。
【００９２】
用語「異種の」とは、本明細書で使用される場合、構成や状態が天然のものではない、または天然には存在しないことを指し、例えば、既存の天然構成または天然状態を、別の供給源由来の構成または状態と置き替えることにより達成することができる構成や状態を指す。同様に、そのタンパク質が天然で発現される生物以外の生物でのタンパク質の発現は、異種の発現系および異種のタンパク質となる。
【００９３】
本明細書に記載の本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなるもの」、および／または態様および実施形態「から本質的になるもの」、を包含すると理解される。
【００９４】
本明細書における「約」値またはパラメーターを指す記載は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とした変動を包含（および説明）する。例えば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」という記載を包含する。
【００９５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈によって特に明示されていない限り、「ａ」、「または（ｏｒ）」、および「ｔｈｅ」といった単数形は複数形を包含する。本明細書に記載の本開示の態様および変更形態は、態様および変更形態「からなるもの」、および／または態様および変更形態「から本質的になるもの」、を包含すると理解される。
【００９６】
ＩＬ−２
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、古典的なＴｈ１サイトカインであり、Ｔ細胞抗原受容体と共起刺激分子ＣＤ２８を介した活性化後のＴ細胞によって産生される。ＩＬ−２の制御は、シグナル経路の活性化と、ＩＬ−２プロモーターに作用して遺伝子転写を新たに引き起こす転写因子と、を通じて起こるが、ＩＬ−２ｍＲＮＡの安定性の調節も伴う。ＩＬ−２は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を通じたシグナル伝達を仲介する、高度に制御されたα鎖とβ鎖とγ鎖を含む多鎖受容体に結合する。ＩＬ−２は、活性化シグナル、増殖シグナル、および分化シグナルをＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞に送達する。ＩＬ−２はまた、免疫応答を終了させるための必要不可欠な機構を与える機能である、活性化により誘導されるＴ細胞細胞死の媒介において重要である。市販の非グリコシル化ヒト組換えＩＬ−２製品である、アルデスロイキン（カリフォルニア州サンディエゴのプロメテウス・ラボラトリーズ社（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）から、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）という商標のデス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトインターロイキン−２として入手可能）は、転移性腎細胞癌患者および転移性黒色腫患者への投与用に承認されている。ＩＬ−２はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染患者、急性骨髄性白血病患者、非ホジキンリンパ腫患者、皮膚Ｔ細胞リンパ腫患者、若年性関節リウマチ患者、アトピー性皮膚炎患者、乳がん患者、および膀胱がん患者における投与が提唱されている。残念ながら、半減期の短さと毒性の強さがＩＬ−２の最適用量に制限を設けている。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ネイティブＩＬ−２」および「ネイティブインターロイキン−２」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの文脈の中で、未成熟型または前駆型、および成熟型を包含して、任意の天然哺乳類インターロイキン−２アミノ酸配列を指す。種々のネイティブ哺乳類インターロイキン−２種のアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の非限定例としては、ＮＰ＿０３２３９２．１（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、未成熟型）、ＮＰ＿００１０４０５９５．１（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、未成熟型）、ＮＰ＿０００５７７．２（ヒト、前駆型）、ＣＡＡ０１１９９．１（ヒト、未成熟型）、ＡＡＤ４８５０９．１（ヒト、未成熟型）、およびＡＡＢ２０９００．１（ヒト）が挙げられる。本発明の種々の実施形態において、ネイティブＩＬ−２は、天然哺乳類ＩＬ−２の未成熟型または前駆型である。他の実施形態において、ネイティブＩＬ−２は、天然哺乳類ＩＬ−２の成熟型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ−２は、天然ヒトＩＬ−２の前駆型である。種々の実施形態において、ネイティブＩＬ−２は、天然ヒトＩＬ−２の成熟型である。種々の実施形態において、ＩＬ−２は、下記の配列番号１に記載のヒトＩＬ−２前駆体配列のアミノ酸配列に由来するものである：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１）。
【００９８】
種々の実施形態において、ＩＬ−２は、下記の配列番号３に記載のヒトＩＬ−２成熟型野生型配列のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は１２５位にシステインからセリンへの置換を含むが、天然ＩＬ−２との比較でＩＬ−２受容体との結合性は変化させていない：
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３）。
【００９９】
ＩＬ−２バリアント
本発明は、１個〜数個のアミノ酸が変異していることを除き、ヒトＩＬ−２と一次配列を共有している、ポリペプチドに関する。ＩＬ−２バリアントの１つのパネルは、エフェクターＴ細胞やＮＫ細胞以上に、免疫抑制性の調節性Ｔ細胞（Ｔ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の増殖、生存、活性化および／または機能を優先的に促進する、変異を含む。また、Ｔｒｅｇ細胞欠損型の自己免疫性障害および種々の炎症性障害を治療するための、単独、または患部組織を標的とするタンパク質またはペプチドと共に使用される、このようなＩＬ−２選択的アゴニストの治療用途も包含される。別の態様において、本発明は、本開示のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。最後に、本発明は、自己免疫性・炎症性障害またはがんおよび種々の感染症のような疾患に対する免疫系の選択的調節効果による、本開示のポリペプチドおよび医薬組成物の治療用途に関する。
【０１００】
本発明は、見掛けの分子量が少なくとも１５ｋＤである、１００〜５００アミノ酸長、好ましくは１４０残基サイズのポリペプチドに関する。これらのポリペプチドはネイティブＩＬ−２と９０％を超える高い配列同一性を保持する。これらの位置において、これらのポリペプチドは、ネイティブＩＬ−２の同位置におけるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を導入する変異が生じている。
【０１０１】
本発明のポリペプチドは、他の名称のなかでも、免疫調節性ポリペプチド、ＩＬ−２類似体、またはＩＬ−２バリアントと称することがある。これらのポリペプチドは、ＩＬ−２受容体複合体の三次元構造（ＰＤＢ公開データベースで利用可能）に基づいて設計されており、主に、受容体サブユニットβまたはγまたはβγと相互作用するアミノ酸に対応するＩＬ−２の位置に、変異が導入されている。
【０１０２】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント（または変異体）は、配列番号３に記載の成熟ヒトＩＬ−２ポリペプチドの配列に由来する配列を含む。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントは、ネイティブ（または野生型）ＩＬ−２タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含む。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントは、ＩＬ−２Ｒαポリペプチドと結合し、ＩＬ−２のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する。種々の実施形態において、アゴニスト活性を有するＩＬ−２バリアントは、スーパーアゴニスト活性を有する。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントは、ＩＬ−２Ｒαとの結び付きとは無関係に、ＩＬ−２のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能できる。ＩＬ−２アゴニストは、野生型ＩＬ−２と比較した場合の同等または増加した生物活性により例証される。ＩＬ−２アンタゴニストは、野生型ＩＬ−２と比較した場合の生物活性の減少、またはＩＬ−２介在反応を阻害する能力により例証される。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントの配列は、ネイティブＩＬ−２配列と比較した場合に、少なくとも１つのアミノ酸変化、例えば置換または欠失、を有し、このような変化により、ＩＬ−２アゴニストまたはＩＬ−２アンタゴニスト活性が得られる。種々の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質としてのＩＬ−２バリアントは、配列番号４〜４３、１０８〜１４６、および１９３〜１９７に記載のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはγｃに対する結合性が減少しており、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性化および増殖における選択性が増強されている。
【０１０３】
例示的なＩＬ−２バリアントを表２Ａ〜表２Ｆに示す。
【０１０４】
2021528105.tif 000003
【０１０５】
2021528105.tif 000004
【０１０６】
2021528105.tif 000005
【０１０７】
2021528105.tif 000006
【０１０８】
2021528105.tif 000007
2021528105.tif 000008
【０１０９】
2021528105.tif 000009
【０１１０】
本発明は、上記のＩＬ−２バリアントクラス、特に表２Ａ〜表２Ｆに記載のものに対しての、追加の改変も包含する。当業者は理解できることであるが、表２Ａ〜表２Ｆに記載の好ましい変異を組み合わせた追加の組み合わせ変異は、Ｔｒｅｇ細胞選択性がより高いＩＬ−２アゴニストをもたらし得る。任意のさらなる組み合わせ変異は、ＩＬ−２受容体の特定成分に対するその親和性を増加させるものであっても、あるいはそのインビボ薬力学的特性（半減期を延長する、またはＴ細胞によるその内部移行を低減する）を向上させるものであっても、本発明の精神および範囲に包含される。これらの追加の変異は、バイオインフォマティクスツールを用いた合理的な設計によって、または様々な性質のコンビナトリアル分子ライブラリー（ファージライブラリー、酵母または細菌における遺伝子発現のライブラリー）を用いることによって、得てもよい。別の態様において、本発明は、担体タンパク質と結合した、上記の免疫調節性ポリペプチドのいずれかを含む、融合タンパク質に関する。担体タンパク質はアルブミンまたはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域とすることができる。
【０１１１】
Ｆｃドメイン
ＩｇＧクラスの免疫グロブリンはヒト血液中で最も豊富なタンパク質である。ＩｇＧクラス免疫グロブリンの循環血中半減期は２１日間もの長さに達し得る。ＩｇＧのＦｃ領域を種々のサイトカインや受容体などの別のタンパク質のドメインと組み合わせた、融合タンパク質の報告がある（例えば、Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻：頁５２５−５３１、１９８９年；Ｃｈａｍｏｗら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４巻：頁５２−６０、１９９６年）；米国特許第５，１１６，９６４号および同第５，５４１，０８７号を参照）。融合タンパク質の原型は、ＩｇＧのＦｃのヒンジ領域内のシステイン残基を介して連結された、重鎖の可変領域およびＣＨ１ドメインと軽鎖がないＩｇＧ分子に似た分子となった、ホモ二量体タンパク質である。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の二量体特性は、他の分子とのより高次の相互作用（すなわち二価または二重特異的結合）を実現する際に有利となり得る。構造的な相同性により、Ｆｃ融合タンパク質は、同様のアイソタイプをもつヒトＩｇＧと同等のインビボ薬物動態プロファイルを示す。
【０１１２】
用語「Ｆｃ」は、単量体形態であっても多量体形態であってもよい、全長抗体の非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指す。ネイティブＦｃのオリジナルとなる免疫グロブリン供給源は、ヒト由来のものが好ましく、任意の免疫グロブリンであってよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。ネイティブＦｃは、共有結合的結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合的結合により、連結されて二量体形態または多量体形態になり得る、単量体ポリペプチドから構成される。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の幅がある。ネイティブＦｃの一例として、ＩｇＧのパパイン分解から生じるジスルフィド結合二量体がある（Ｅｌｌｉｓｏｎら、（１９８２年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０巻：頁４０７１−９）。用語「ネイティブＦｃ」とは、本明細書で使用される場合、単量体形態、二量体形態、および多量体形態の総称である。プロテインＡに対する結合部位、プロテインＧに対する結合部位、種々のＦｃ受容体に対する結合部位、および補体タンパク質に対する結合部位を含有するＦｃドメイン。
【０１１３】
種々の実施形態において、用語「Ｆｃバリアント」とは、ネイティブＦｃから改変を受けたが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎに対する結合部位を尚も含んでいる、分子または配列を指す。国際公開第９７／３４６３１号（１９９７年９月２５日に公開）および国際公開第９６／３２４７８号には、例示的なＦｃバリアント、およびサルベージ受容体との相互作用に関する記載があり、当該国際公開は参照により本明細書に援用される。さらに、ネイティブＦｃは、本発明の融合分子には必要とされない構造的特徴または生物活性を与えることから、除去されてもよい部位を含む。すなわち、種々の実施形態においては、用語「Ｆｃバリアント」は、以下に影響または関与する１または複数のネイティブＦｃ部位または残基を欠く分子または配列を含む：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現後のＮ末端の異種性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または、（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。
【０１１４】
用語「Ｆｃドメイン」は、上記で定義された、ネイティブＦｃおよびＦｃバリアントの分子および配列を包含する。ＦｃバリアントおよびネイティブＦｃと同様、用語「Ｆｃドメイン」は、全長抗体から消化された、または組換え遺伝子発現もしくは他の手段で生成された、単量体形態または多量体形態の、分子を包含する。種々の実施形態において、「Ｆｃドメイン」とは、ヒンジ領域の全体または一部を通常含む、２つのＦｃドメイン単量体（配列番号４４）からなる二量体を指す。種々の実施形態において、Ｆｃドメインはエフェクター機能を欠くように変異を受けていてもよい。種々の実施形態において、ＦｃドメインのＦｃドメイン単量体の各々は、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用または結合を減少させるために、ＣＨ２抗体定常ドメインにアミノ酸置換を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減する２つのアミノ酸置換（Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減する３つのアミノ酸置換（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ）を含む（配列番号４５）。
【０１１５】
種々の実施形態において、Ｆｃドメインの２つのＦｃドメイン単量体は、それぞれ、これら２つの単量体のヘテロ二量体化を促すアミノ酸置換を含む。種々の他の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体化は、２つのＦｃドメイン単量体に異なっているが適合性の置換（「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」残基対など）を導入することにより、促すことができる。この「ノブ・イントゥ・ホール」技術は米国特許第８，２１６，８０５号においても開示されている。さらに別の実施形態では、一方のＦｃドメイン単量体がノブ型変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃドメイン単量体がホール型変異のＴ３６６Ｓ、Ｌ３５８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。種々の実施形態において、安定化ジスルフィド架橋を形成する２つのＣｙ残基が（「ノブ」側のＳ３５４Ｃと「ホール」側のＹ３４９Ｃ）が導入された。ヘテロ二量体Ｆｃの使用により、一価ＩＬ−２バリアントを得ることができる。
【０１１６】
種々の実施形態において、Ｆｃドメインは生体内半減期をさらに延長させるように変異を受けていてもよい。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第７，６５８，９２１号で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強させる３つのアミノ酸置換（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第７，３７１，８２６号で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強させた１つのアミノ酸置換（Ｎ４３４Ａ）を含む。種々の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、米国特許第８，５４６，５４３号で開示された、ヒトＦｃＲｎに対する結合性を増強させた１つのアミノ酸置換（Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）を含む。種々の実施形態において、半減期延長変異は、活性化性Ｆｃ受容体への結合性および／またはエフェクター機能を低減するアミノ酸置換と組み合わせることができる。
【０１１７】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント  Ｆｃ融合体の作製に使用されるＦｃドメイン配列は、エフェクター機能が低減／消失した、下記の配列番号４５に記載のヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメイン配列であり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４５）
【０１１８】
配列番号４５は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）を含む。
【０１１９】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント  Ｆｃ融合体の作製に使用されるＦｃドメイン配列は、半減期が延長され、エフェクター機能が低減／消失した、下記の配列番号４６に記載のＩｇＧ１−Ｆｃドメイン配列であり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４６）
【０１２０】
配列番号４６は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）と、融合タンパク質の血中半減期を延長させる置換（太字）とを含む。
【０１２１】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント  Ｆｃ融合体の作製に使用されるＦｃドメイン配列は、エフェクター機能が低減／消失し、半減期が延長された、下記の配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有する、ＩｇＧ１−Ｆｃドメインであり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４７）
【０１２２】
配列番号４７は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）と、融合タンパク質の血中半減期を延長させる置換（太字）とを含む。
【０１２３】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントＦｃ融合体の作製に使用されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン配列は、下記の配列番号２１２に記載の、生体内半減期が延長されたＫｎｏｂ−Ｆｃドメインであり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１２）
【０１２４】
配列番号２１２は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）と、半減期を延長させるアミノ酸置換（太字）とを含む。
【０１２５】
種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントＦｃ融合体の作製に使用されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン配列は、下記の配列番号２１３に記載の、生体内半減期が延長されたＨｏｌｅ−Ｆｃドメインであり：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１３）
配列番号２１３は、ＦｃγＲの結合やＣ１ｑの結合を断つアミノ酸置換（下線部）と、半減期を延長させるアミノ酸置換（太字）とを含む。
【０１２６】
リンカー
種々の実施形態において、異種タンパク質はリンカーペプチドおよび／またはヒンジリンカーペプチドによってＩＬ−２バリアントに取り付けられている。リンカーまたはヒンジリンカーは、二次構造が比較的少ない、またはαヘリックス高次構造を示す、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個（またはその間の数字）、またはそれ以上のアミノ酸からなる人工配列であり得る。
【０１２７】
ペプチドリンカーは、タンパク質ドメイン間に、共有結合と、構造的および／または空間的な追加の可動性とを与える。当該技術分野においては公知であるが、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリンなどの可動性アミノ酸残基を含む。種々の実施形態において、ペプチドリンカーは１〜１００個のアミノ酸を含み得る。種々の実施形態において、スペーサーには、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５５）のモチーフを含ませることができる。他の実施形態では、リンカーには、（ＧＧＧＧＳ）ｎモチーフ（ｎは１〜１０の整数）を含ませることができる。他の実施形態では、リンカーには、グリシンおよびセリン以外のアミノ酸を含ませることもできる。別の実施形態では、リンカーには、他のタンパク質モチーフを含ませることができ、例えば、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号５３）などのαヘリックス高次構造の配列が挙げられるが、これに限定はされない。種々の実施形態において、リンカーの長さおよび組成は、発現レベルおよび凝集傾向を含むがこれらに限定はされない、活性または開発適合性を最適化するように調整することができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、単純な化学結合であってよく、例えば、アミド結合（例えば、ＰＥＧの化学的な結合によるもの）である。
【０１２８】
例示的なペプチドリンカーを表３に示す。
【０１２９】
2021528105.tif 000010
【０１３０】
ポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、本開示のＩＬ−２、ＩＬ−２バリアント、ＩＬ−２融合タンパク質、またはＩＬ−２バリアント融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。主題の核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このような核酸はＤＮＡ分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ、およびこれらの組み合わせが挙げられる。ＩＬ−２ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、多くの種に対応したゲノムライブラリーから得られる。合成ＤＮＡは、重複するオリゴヌクレオチド断片を化学合成した後、それらの断片をアセンブルし、コード領域および隣接配列の一部または全部を再構成することにより得られる。ＲＮＡは、Ｔ７プロモーターを用いたベクターなどの高レベルのｍＲＮＡ合成を指示する原核生物発現ベクターと、ＲＮＡポリメラーゼとから得ることができる。ｃＤＮＡは、ＩＬ−２を発現する種々の組織から単離されたｍＲＮＡから調製されたライブラリーから得られる。本開示のＤＮＡ分子は、完全長遺伝子だけでなく、ポリヌクレオチドやその断片も包含する。完全長遺伝子は、Ｎ末端シグナル配列をコードする配列も包含し得る。このような核酸が、新規ＩＬ−２バリアントを作製するための方法などで使用され得る。
【０１３１】
種々の実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含み、さらに、本明細書に記載の少なくとも１つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、上記の核酸分子は、本明細書に記載のリンカーまたはヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【０１３２】
種々の実施形態において、本開示の組換え核酸は、発現コンストラクト内の１または複数の制御ヌクレオチド配列に機能的に連結されていてもよい。制御配列は、当該技術分野において承認されたもので、ＩＬ−２バリアントの発現を指示するように選択される。すなわち、制御配列という用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメントが包含される。例示的な制御配列が、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０）に記載されている。典型的には、上記の１または複数の制御ヌクレオチド配列として、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、並びにエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含むことができるが、これらに限定はされない。当該技術分野において公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが、本開示により企図されている。プロモーターは、天然プロモーターであってもよいし、あるいは、２つ以上のプロモーターエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターであってもよい。発現コンストラクトは、プラスミドなどの、細胞内またはエピソーム内に存在するものであってもよいし、あるいは、発現コンストラクトを染色体に挿入してもよい。種々の実施形態において、形質転換宿主細胞のセレクションを可能とするために、発現ベクターは選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。
【０１３３】
本開示の別の態様において、主題の核酸は、ＩＬ−２バリアントをコードしている、少なくとも１つの制御配列に機能的に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター内にある状態で、提供される。用語「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現させるための、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターを指す。宿主細胞における発現に好適なベクターは容易に利用可能なものであり、ベクターへの核酸分子の挿入は標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて行われる。そのようなベクターには、作動可能なように連結されている場合にＤＮＡ配列の発現を調節する、ＩＬ−２バリアントをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターに用いることができる、種々様々な発現調節配列を含ませることができる。このような有用な発現調節配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系またはＴＲＣ系、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって発現が指示されるＴ７プロモーター、λファージの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質に対する調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、ＰｈｏＳ）のプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、並びに、原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られている他の配列、並びにこれらの種々の組み合わせ、が挙げられる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が所望されるタンパク質の種類などの要因によって異なる場合があることは理解されよう。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、および当該ベクターにコードされる任意の他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現についても、考慮がなされるべきである。ｖＩＬ−２の発現に好適な例示的な発現ベクターとして、ｖＩＬ−２ポリヌクレオチドと、当該技術分野において公知または以下に記載の任意の追加の好適なベクターとを含有するｐＤＳＲａ（参照によって本明細書に援用される、国際公開第９０／１４３６３号に記載）、およびその誘導体がある。
【０１３４】
クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核細胞もしくは真核細胞（酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞）のいずれか、またはその両方での発現に好適なベクターにライゲーションすることで、本開示の組換え核酸を産生させることが可能となる。組換えＩＬ−２ポリペプチドを産生させるための発現用溶媒は、プラスミドと他のベクターを含む。例えば、好適なベクターとしては、大腸菌などの原核細胞における発現用の、以下の各種プラスミドが挙げられる：ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミド。
【０１３５】
哺乳類発現ベクターの中には、細菌内のベクターの増殖を促進する原核生物性配列と、真核細胞で発現される１または複数の真核生物性転写単位とを、両方含有するものがある。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ由来ベクター、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ由来ベクター、ｐＲｃ／ＣＭＶ由来ベクター、ｐＳＶ２ｇｐｔ由来ベクター、ｐＳＶ２ｎｅｏ由来ベクター、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ由来ベクター、ｐＴｋ２由来ベクター、ｐＲＳＶｎｅｏ由来ベクター、ｐＭＳＧ由来ベクター、ｐＳＶＴ７由来ベクター、ｐｋｏ−ｎｅｏ由来ベクター、およびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬剤耐性セレクションを促すための、ｐＢＲ３２２などの細菌性プラスミド由来の配列による改変を受けている。あるいは、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現のために、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を用いることができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、下記の遺伝子治療送達系の説明に見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で使用される種々の方法は、当該技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方に好適な他の発現系、並びに一般的な組換え法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（編）（コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、１９８９年）、１６章および１７章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系を使用して組換えポリペプチドを発現することが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（Ｂ−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩなど）が挙げられる。
【０１３６】
種々の実施形態において、主題のＩＬ−２バリアントをＣＨＯ細胞で産生させるためのベクターが設計されることとなり、例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）、およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）などである。後述するように、主題の遺伝子コンストラクトを用いて、培養液中で増殖された細胞において主題のＩＬ−２バリアントの発現を引き起こし、例えば、タンパク質（融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含む）を産生させ、精製を行うことができる。
【０１３７】
本開示はまた、１または複数の主題のＩＬ−２バリアントのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本開示のＩＬ−２バリアントは、大腸菌などの細菌細胞で発現されてもよく、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）で発現されてもよく、酵母で発現されてもよく、あるいは哺乳類細胞で発現されてもよい。他の好適な宿主細胞が当業者に公知である。
【０１３８】
これを受けて、本開示はさらに、主題のＩＬ−２バリアントを生産する方法に関する。例えば、ＩＬ−２バリアントをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、ＩＬ−２バリアントを発現させることができる。ＩＬ−２バリアントは、分泌後、当該ＩＬ−２バリアントを含有する細胞および培地の混合物から単離することができる。あるいは、ＩＬ−２バリアントを細胞質または膜画分に保持させ、細胞を回収、溶解し、上記タンパク質を単離してもよい。細胞培養液には宿主細胞、培地、および他の副生成物が含まれる。細胞培養に好適な培地は当該技術分野において周知のものである。
【０１３９】
本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、当業者に周知のタンパク質精製法に従って精製することができる。これらの方法は、あるレベルでの、タンパク質性画分と非タンパク質性画分の粗分画を含む。ペプチドポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、目的のペプチドまたはポリペプチドをクロマトグラフ法および電気泳動法によりさらに精製することで、部分的または完全な精製（すなわち均一になるまでの精製）を達成することができる。「単離されたポリペプチド」または「精製されたポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドがその天然で入手可能な状態に対し任意の程度精製されている、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図されている。精製されたポリペプチドとは、そのため、それを天然に生じ得る環境から分離されたポリペプチドも指す。一般に、「精製された」とは、分画を受けて種々の他成分を除去された、発現されたその生物活性を実質的に保持している、ポリペプチド組成物を指す。用語「実質的に精製された」が用いられている場合、この呼称は、ポリペプチドまたはペプチドが組成物の主成分を形成している、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、または約９０％以上を構成している、ペプチド組成物またはポリペプチド組成物を指す。
【０１４０】
精製に用いるのに好適な種々の方法は、当業者に周知なものである。これらの方法としては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）などを用いた沈降、または熱変性による沈降の後に、遠心分離；アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡカラム）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；これらの方法の組み合わせ、を行うことが挙げられる。当該技術分野では周知のことであるが、種々の精製工程を実行する順番は変更しても、あるいは、ある特定の工程を省いても、尚も、実質的に精製されたポリペプチドを調製するのに好適な方法となり得ると考えられる。
【０１４１】
医薬組成物
別の態様において、本開示は、ＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質を、薬剤的に許容できる担体と混合して含む、医薬組成物を提供する。そのような薬剤的に許容できる担体は、当業者に周知で理解されるものであり、広範に説明がなされている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、マック出版社、１９９０年を参照）。薬剤的に許容できる担体は、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度、遊離速度、吸着性、または浸透性などを変化、維持または保存する目的で含まれ得る。このような医薬組成物は、当該ポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響し得る。好適な薬剤的に許容できる担体（ｃａｒｒｉｅｒ）としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス塩酸、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）；単糖類；二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；着色剤；着香剤および希釈剤（ｄｉｌｕｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；  乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定化剤（スクロースまたはソルビトール）；等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール  ソルビトールなど）；送達担体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）；賦形剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）；医薬品添加物（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、および／または補助剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１４２】
医薬組成物中の主要な溶媒または担体は、本質的に水性であっても非水性であってもよい。例えば、好適な溶媒または担体は、注射用蒸留水であってもよく、生理的食塩水であってもよく、人工脳脊髄液であってもよく、非経口投与用の組成物に通常含まれる他の物質を添加することができる。さらなる例示的な溶媒として、血清アルブミンを混合した中性緩衝生理食塩水または生理食塩水がある。他の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝溶液を含み、当該緩衝液にはソルビトールまたはその好適な代替物をさらに含ませてもよい。本開示の１つの実施形態において、所望の純度を有する選択された組成物を任意の製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存用に、組成物を調製してもよい。さらに、治療用組成物は、スクロースなどの適切な医薬品添加物を用いて、凍結乾燥物として製剤化してもよい。最適な医薬組成物は、意図された投与経路、送達様式、および目的の用量などに基づいて、当業者によって決定される。
【０１４３】
非経口投与が企図される場合、治療用医薬組成物は、薬剤的に許容できる溶媒中に所望のＩＬ−２ポリペプチドまたはＩＬ−２ポリペプチド融合タンパク質を含む、発熱物質を含まない非経口投与において許容される水溶液の形態であり得る。特に好適な非経口注射用溶媒は滅菌蒸留水であり、滅菌蒸留水中では、ポリペプチドは適切に保存された無菌の等張液として製剤化される。種々の実施形態において、注射投与に好適な医薬製剤が、水溶液中で製剤化され得るが、ハンクス液、リンゲル液、または生理的緩衝食塩水などの生理的に適合性の緩衝液中で製剤化されることが好ましい。水性の注射用懸濁液には、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、当該懸濁液の粘度を増加させる物質を含有させてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注射用懸濁液として調製してもよい。所望により、懸濁液には、好適な安定剤、すなわち、化合物の溶解性を増加させることで高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤、を含有させてもよい。
【０１４４】
種々の実施形態において、治療用医薬組成物は、コロイド分散系を用いた標的化送達用に製剤化され得る。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質をベースとした系が挙げられる。リポソーム生成で有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームのターゲティングは、例えば、臓器特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づいても可能であり、当該技術分野において公知である。
【０１４５】
種々の実施形態において、医薬組成物の経口投与が企図される。この様式で投与される医薬組成物は、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の調剤で通例使用される担体を含ませて製剤化することもできるし、含ませずに製剤化することもできる。経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、粒剤など）では、１または複数の本開示の治療用化合物を、１または複数の薬剤的に許容できる担体と混合してよく、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または下記のうち任意のものである：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；（６）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、アセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤；（８）カオリン粘土およびベントナイト粘土などの吸着剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物などの滑沢剤；並びに、（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、医薬組成物は緩衝剤を含んでいてもよい。ラクトースすなわち乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールなどの医薬品添加物を用いた、軟ゼラチンカプセル中および硬ゼラチンカプセル中の充填剤として、同様の種類の固体組成物を使用してもよい。経口投与用の液体剤形としては、薬剤的に許容できる乳剤、マイクロエマルション、水剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。有効成分に加えて、液体剤形には、当該技術分野において一般に使用される不活性な賦形剤を含有させてもよく、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物などである。不活性な賦形剤に加えて、経口用組成物には、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、着香剤、着色剤、芳香剤、および保存剤などの補助剤を含ませることができる。
【０１４６】
種々の実施形態において、医薬組成物の皮膚または粘膜への局所投与が企図される。局所製剤には、皮膚浸透促進剤または角質層浸透促進剤として有効であると知られている各種薬剤のうちの１または複数をさらに含ませてもよい。これらの例としては、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾン（ａｚｏｎｅ）がある。製剤を美容上許容できるものにするために、追加の薬剤をさらに含ませてもよい。これらの例としては、脂肪、ろう、油、色素、香料、保存剤、安定剤、および界面活性剤がある。当該技術分野において公知のものなどの、角質溶解薬を含ませてもよい。例としてはサリチル酸および硫黄がある。局所的投与用または経皮投与用の剤形としては、散剤、噴霧剤、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、水剤、貼付剤、および吸入剤が挙げられる。活性化合物は、無菌条件下で、薬剤的に許容できる担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と、必要な場合、任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合してよい。軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、およびゲル剤には、本開示の主題の化合物（例えば、ＩＬ−２バリアント）の他に、動物性脂肪、植物性脂肪、油、ろう、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛などの医薬品添加物、またはこれらの混合物、を含有させてもよい。
【０１４７】
本明細書における使用が企図される追加の医薬組成物としては、持続送達製剤または送達制御製剤において、ポリペプチドを含む製剤が挙げられる。リポソーム担体、生体内分解性の微小粒子または多孔質ビーズ、およびデポ剤などの、種々の他の持続送達手段または制御送達手段を製剤化するための方法も、当業者に公知である。
【０１４８】
治療的に使用される医薬組成物の有効量は、治療の内容および目的などによって異なる。すなわち、当業者には理解されることであるが、治療に適した用量レベルは、部分的には、送達される分子、ポリペプチドが使用される予定の適応症、投与経路、並びに、患者のサイズ（体重、体表面、または臓器サイズ）および状態（年齢、および全体的な健康）に応じて変動することとなる。このため、臨床医は、最適な治療効果を得るために、用量設定と、投与経路の変更を行うことができる。典型的な用量は、上記の要因に応じて、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲を取り得る。好ましくは、ポリペプチド組成物を静脈内に注射または投与してもよい。持効性の医薬組成物を、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３日〜４日毎、毎週、または隔週、投与してもよい。投与頻度は、使用される製剤でのポリペプチドの薬物動態パラメーターに依存することとなる。典型的には、組成物は、目的の効果を達成する用量に達するまで投与される。組成物は、そのため、単回投与として投与されてもよいし、あるいは長期に亘る複数回投与（投与当たり同じまたは異なる濃度）として投与されてもよいし、あるいは持続点滴として投与されてもよい。適切な投与量のさらなる改善が定期的に行われる。適切な用量反応データを用いて、適切な投与量を確認してもよい。
【０１４９】
医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従うものであり、例えば、経口、静脈内経路、腹腔内経路、脳内経路（脳実質内経路）、脳室内経路、筋肉内経路、眼内経路、動脈内経路、門脈内経路、病巣内経路による注射、髄内、くも膜下腔内、心室内、経皮、皮下、もしくは腹腔内、もしくは腫瘍内；並びに、鼻腔内手段、経腸手段、局所的手段、舌下手段、経尿道手段、経膣手段、もしくは経直腸手段、持続放出系、または埋込デバイスによる投与経路である。所望により、組成物は、ボーラス投与で投与してもよいし、点滴で持続的に投与してもよいし、あるいは、埋込デバイスにより投与してもよい。あるいはまたはさらに、組成物は、目的分子が吸着または封入されている膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みによって、局所的に投与してもよい。埋込デバイスが使用される場合、デバイスは任意の好適な組織または臓器に埋め込むことができ、目的分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｏｌｕｓ）、または連続投与を介してもよい。
【０１５０】
治療用途
本開示は、対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、上記対象に、薬剤的に許容できる担体中の、治療有効量（単独療法レジメンとして、または併用療法レジメンにおいて）の本開示のＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質を投与することを含む、上記方法を提供する。本発明に係る自己免疫疾患は、個体それ自身の組織から生じた、個体それ自身の組織に対する疾患または障害、またはその共分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）もしくは発現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）、またはそれから生じる状態である。種々の実施形態において、自己免疫疾患としては、関節炎（関節リウマチ、反応性関節炎を含む）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、脳脊髄炎、ブドウ膜炎、重症筋無力症、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性脱毛症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛症、尋常性天疱瘡、シェーグレン症候群、川崎病、甲状腺機能亢進症／グレーブス病、甲状腺機能低下症／橋本病、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、ウェゲナー病（Ｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、糸球体腎炎、再生不良性貧血（頻回輸血再生不良性貧血患者を含む）、発作性夜間血色素尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、エヴァンス症候群、第ＶＩＩＩ因子阻害剤症候群（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎およびリウマチ熱、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性水疱性類天疱瘡、パーキンソン病、サルコイドーシス、白斑、原発性胆汁性肝硬変、並びに自己免疫性心筋炎が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１５１】
本開示は、対象における炎症性疾患を治療する方法であって、上記対象に、薬剤的に許容できる担体中の、治療有効量（単独療法レジメンとして、または併用療法レジメンにおいて）の本開示のＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質を投与することを含む、上記方法を提供する。「炎症性疾患」は急性炎症または種々の炎症を伴う全ての疾患を包含する。急性炎症は有害な刺激に対する身体の初期反応であり、血液から傷害組織への血漿および白血球（例えば顆粒球など）の移動が増加することにより生じる。局所的な脈管系と、免疫系と、傷害組織内の各種細胞とを含む、いくつかの生化学的イベントが、炎症反応を伝搬・成熟させる。遷延性の炎症を種々の炎症と呼び、炎症部位に存在する細胞の種類に段階的な変化をもたらし、炎症過程からの組織の破壊と回復が同時に起きていることを特徴とする。別の態様において、本開示は、対象における炎症性疾患を治療するための方法において、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、上記対象はヒト対象である。種々の実施形態において、治療対象の炎症性疾患としては、クローン病、大腸炎、皮膚炎、乾癬、憩室炎、肝炎、過敏性腸症候（ＩＢＳ）、エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓ）、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット症候群および分類不能大腸炎多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、関節炎、関節リウマチ、喘息、並びにアテローム性動脈硬化および脈管炎などの種々の心血管疾患が挙げられるが、これらに限定はされない。種々の実施形態において、炎症性疾患は、関節リウマチ、糖尿病、痛風、クリオピリン関連周期性症候群、および慢性閉塞性肺障害からなる群から選択される。
【０１５２】
別の態様において、本開示は、対象における臓器移植または関連の移植片対宿主病に対する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。１つの実施形態において、上記対象はヒト対象である。種々の実施形態において、移植は、心臓の臓器移植、腎臓の臓器移植、肝臓の臓器移植、肺の臓器移植、膵臓の臓器移植、腸の臓器移植、および胸腺の臓器移植から選択されるか、または、骨の組織移植、腱の組織移植、角膜の組織移植、皮膚の組織移植、心臓弁の組織移植、神経の組織移植、および静脈の組織移植から選択される。本明細書で使用される場合、用語「移植片対宿主病」または「ＧｖＨＤ」とは、ＧＶＨから生じた宿主細胞および組織に対する移植された（移植片）細胞の影響によって生じた、急性および慢性のものを含む、状態を指す。言い換えれば、移植片内に注入されたドナー免疫細胞または幹細胞から発生したドナー免疫細胞は、患者（宿主）細胞を外来と認識し、免疫応答によってそれらに敵対する場合がある。急性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、具体的には、同種の骨髄または血液細胞の移植を行った患者における、ドナー免疫細胞によって引き起こされる障害である。最も多い患部組織は皮膚  腸および肝臓である。重症例では、ＧｖＨＤは、皮膚における水疱形成や、過度な下痢と消耗を引き起こす可能性がある。急性移植片対宿主病の治療にはプレドニゾンおよび／または他の免疫抑制薬物が用いられる。
【０１５３】
初めに、ＥＣ５０測定により、細胞培養アッセイから治療有効量が評価され得る。次に、動物モデルにおいて、細胞培養液中で測定された上記ＥＣ５０を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、用量が製剤化され得る。そのような情報を用いることで、ヒトで有用な用量をより正確に求めることができる。血漿中レベルがＨＰＬＣなどによって測定され得る。対象の状態を鑑みて、個々の医師により、的確な組成、投与経路、および用量が選択され得る。
【０１５４】
投与計画は最適な所望の反応（例えば、治療的反応または予防的反応）が得られるように調整できる。例えば、単回ボーラス投与が行われ、何回かの分割量（複数回投与量または反復投与量または維持投与量）が長期に亘って投与され、治療状況の必要性に比例して用量が増減され得る。投与のしやすさと投与量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが、特に有利である。投薬単位形態とは、本明細書で使用される場合、治療される哺乳類対象に対する統一された用量として適した物理的に分離している単位を指し、それぞれの単位は必要な医薬担体と併せて目的の治療効果を生むと計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の投薬単位形態の規格は、主に、抗体の独自の特徴、および達成されるべき特定の治療効果または予防効果によって決定される。
【０１５５】
すなわち、当業者には理解されることであるが、本明細書に提供される開示に基づいて、用量および投与計画は当該治療分野で周知の方法に従って調整される。すなわち、最大耐量を容易に確立でき、検出可能な治療効果を対象に与える有効量も決定でき、同様に、検出可能な治療効果を対象に与えるようにそれぞれの薬剤を投与するための時間的要件も決定できる。よって、本明細書にはある特定の用量および投与計画が例示されているが、これらの例は、本開示を実施する際に対象に与えられ得る用量および投与計画を何ら限定するものではない。
【０１５６】
なお、用量の値は、改善されるべき状態の種類および重症度によって異なり、単回用量または反復用量を含み得る。さらには、いかなる特定の対象に対しても、具体的な投与計画は、個々の必要性や組成物の投与を管理または監督する人の専門家としての判断に従って長期間に亘って調整されるべきということ、並びに、本明細書に記載された用量範囲は例示のみを目的としており、特許請求された組成物の範囲や実践を限定する意図はないことも、理解されたい。さらに、本開示の組成物を用いた投与計画は、疾患の種類、対象の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用される特定の抗体を含む様々な要因に基づかせてもよい。すなわち、投与計画は多様であり得るが、標準的な方法を用いてルーチンに決定できる。例えば、用量は薬物動態パラメーターまたは薬力学的パラメーターに基づいて調整され得るが、これらのパラメーターとしては、毒性作用および／または実験室値などの臨床的効果が含まれ得る。すなわち、本開示は、当業者によって求められる、対象者内用量漸増を包含する。適切な用量および投与計画の決定は、関連技術分野で周知であり、本明細書で開示された教示が提供されれば当業者に達成されることは理解される。
【０１５７】
治療有効量または予防有効量の本開示のＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質の、例示的であり非限定的な一日量の範囲は、上記の要因に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲とすることができる。状態に依存して、数日またはそれ以上にかけて反復投与する場合、治療は通常、病徴の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。種々の実施形態において、用量は、上記の数字に基づいて、およそ、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜９０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜８０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜７０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜６０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜４ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜２ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１０〜１ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜４ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、１〜４ｍｇ／ｋｇ体重、１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、１〜２ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内などで、投与することができる。すなわち、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）の１回または複数回の投与を、患者に投与してよい。なお、用量の値は、改善されるべき状態の種類および重症度によって異なり得る。さらには、いかなる特定の対象に対しても、具体的な投与計画は、個々の必要性や組成物の投与を管理または監督する人の専門家としての判断に従って長期間に亘って調整されるべきということ、並びに、本明細書に記載された用量範囲は例示のみを目的としており、特許請求された組成物の範囲や実践を限定する意図はないことも、理解されたい。
【０１５８】
本開示の医薬組成物の毒性および治療指数は、ＬＤ５０（集団の５０％に対し致死的な用量）やＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある用量）などを求めるための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手法で求めることができる。中毒量と治療有効量との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が一般的に好ましい。
【０１５９】
ＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質医薬組成物の投与の投与頻度は、治療方法および治療される特定の疾患の性質に応じたものとなる。対象は、週２回、週１回、または月１回など、一定間隔を置いて、目的の治療結果が達成されるまで治療できる。例示的な投与頻度として、限定はされないが：毎週１回；２週間に１回；３週間に１回；２週間毎週１回、その後月１回；３週間毎週１回、その後月１回；月１回；２ヵ月に１回；３ヵ月に１回；４ヵ月に１回；５ヵ月に１回；もしくは６ヶ月に１回、または年１回が挙げられる。
【０１６０】
併用療法
本明細書で使用される場合、本開示のＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質と１または複数の他の治療薬とを参照した、「同時投与」、「同時投与される」、および「〜と組み合わせて」という用語は、以下を意味することが意図され、以下を指して包含する：治療を必要としている対象への本開示のＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質と治療薬とのそのような組み合わせの同時投与であって、そのような成分が合剤化されて単一剤形となり、上記各成分が実質的に同時に上記対象に放出される、同時投与；治療を必要としている対象への本開示のＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質と治療薬とのそのような組み合わせの実質的な同時投与であって、そのような成分が互いに別々に製剤化されて別々の剤形となり、それらが上記対象によって実質的に同時に摂取された際、上記各成分が実質的に同時に上記対象に放出される、実質的な同時投与；治療を必要としている対象への本開示のＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質と治療薬とのそのような組み合わせの連続投与であって、そのような成分が互いに別々に製剤化されて別々の剤形となり、それらが各投与の間にかなりの時間間隔を置いて上記対象によって連続した時間に摂取された際、上記各成分が実質的に異なる時間に上記対象に放出される、連続投与；並びに、治療を必要としている対象への本開示のＩＬ−２バリアントまたはＩＬ−２バリアント融合タンパク質と治療薬とのそのような組み合わせの連続投与であって、そのような成分が合剤化されて単一剤形となり、上記各成分が徐放的に放出される際、それらが同時および／または異なる時間に同時発生的、連続的、および／または重複的に上記対象に放出され、各部分は同じ経路または異なる経路で投与され得る、連続投与。
【０１６１】
別の態様において、本開示は、対象における自己免疫疾患を治療するための方法において、自己免疫疾患を治療することが可能な第二の治療薬と組み合わせて、治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。種々の実施形態において、第二の治療薬は、以下からなる群から選択される：免疫抑制剤、例えば、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、シクロホスファミド、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキサート、ラパマイシン、タクロリムス、生物学的作用物質、例えば、ＴＮＦ−αの遮断薬またはアンタゴニスト、ＩＬ−１０アゴニストまたは長期半減期延長型ＩＬ−１０（ＰＥＧ化した、抗体−またはＦｃ−融合ＩＬ−１０）；免疫抑制剤（例えば、他のリンパ球表面マーカー（例えば、ＣＤ４０、α−４インテグリン）に対する抗体またはサイトカインに対する抗体）、他の融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（オレンシア（ＯＲＥＮＣＩＡ）（登録商標））、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標）））、ＴＮＦ−α遮断薬、例えば、エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標）、レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（登録商標）、シムジア（ＣＩＭＺＩＡ）（登録商標）、およびヒュミラ（ＨＵＭＩＲＡ）（登録商標）、シクロホスファミド（ＣＴＸ）（すなわち、エンドキサン（ＥＮＤＯＸＡＮ）（登録商標）、シトキサン（ＣＹＴＯＸＡＮ）（登録商標）、ネオサル（ＮＥＯＳＡＲ）（登録商標）、プロシトックス（ＰＲＯＣＹＴＯＸ）（登録商標）、レブイミューン（ＲＥＶＩＭＭＵＮＥ）（登録商標））、メトトレキサート（ＭＴＸ）（すなわち、リウマトレックス（ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ）（登録商標）、トレキサル（ＴＲＥＸＡＬＬ）（登録商標））、リツキシマブ、ベリムマブ（すなわち、ベンリスタ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ）（登録商標））、抗ＩＬ−６抗体（例えば、サリルマブ）、または抗ＩＬ−６受容体抗体（例えば、トシリズマブ）、または他の免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６様化合物、ラパマイシン化合物、またはステロイド類）、抗増殖剤（ａｎｔｉ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｓ）、細胞傷害性薬物、または免疫抑制の助けとなり得る他の化合物、または任意の炎症性サイトカインを標的とする任意の他の生物学的作用物質、非ステロイド系抗炎症剤／Ｃｏｘ−２阻害剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン（ｓｕｌｐｈａｓａｌａｚｏｐｒｙｉｎｅ）、金塩、エタネルセプト、インフリキシマブ、ミコフェノール酸モフェチル、バシリキシマブ、アタシセプト、リツキシマブ、シトキサン、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、酢酸グラチラマー、塩酸ミトキサントロン、アナキンラ、および／または他の生物学的製剤、および／または静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）。そのような公知の治療薬の非限定例としては、インターフェロン、例えば、ＩＦＮ−β−１ａ（レビフ（ＲＥＢＩＦ）（登録商標）、アボネックス（ＡＶＯＮＥＸ）（登録商標）、およびシノベックス（ＣＩＮＮＯＶＥＸ）（登録商標））、およびＩＦＮ−β−１ｂ（ベタセロン（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ）（登録商標）、エクスタビア（ＥＸＴＡＶＩＡ）（登録商標）、ベタフェロン（ＢＥＴＡＦＥ���ＯＮ）（登録商標）、ジフェロン（ＺＩＦＥＲＯＮ）（登録商標））；酢酸グラチラマー（コパキソン（ＣＯＰＡＸＯＮＥ）（登録商標））、ポリペプチド；ナタリズマブ（タイサブリ（ＴＹＳＡＢＲＩ）（登録商標））；およびミトキサントロン（ノバントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）（登録商標））、細胞傷害性薬物が挙げられる。
【０１６２】
別の態様において、本開示は、対象における炎症性疾患を治療するための方法において、治療有効量の本発明の医薬組成物を、第二の治療薬と組み合わせて投与することを含み、上記の第二の治療薬は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、並びに／または、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰを含むがこれらに限定はされない炎症性分子を分泌する、もしくは他の細胞に上記炎症性分子を分泌させる他の細胞の分化を阻害または抑制することが可能な治療薬；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、並びに／または、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰを含むがこれらに限定はされない炎症性分子を分泌する、もしくは他の細胞に上記炎症性分子を分泌させる他の細胞の活性を阻害または抑制することが可能な治療薬；Ｔｈ１および／またはＴｈ１７の経路を阻害または抑制することが可能な治療薬；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、並びに／または、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰを含むがこれらに限定はされない炎症性分子を分泌する、もしくは他の細胞に上記炎症性分子を分泌させる他の細胞によるサイトカインの産生および／または分泌を阻害または抑制することが可能な治療薬；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、並びに／または、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰを含むがこれらに限定はされない炎症性分子を分泌する、もしくは他の細胞に上記炎症性分子を分泌させる他の細胞の増殖を阻害または抑制することが可能な治療薬である、上記方法を提供する。種々の実施形態において第二の治療薬は、非ステロイド系抗炎症剤であり、例えば、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムなどのオキシカム；アスピリン、ジサルシド（ｄｉｓａｌｃｉｄ）、ベノリレート、トリリサート、サファプリン（ｓａｆａｐｒｙｎ）、ソルプリン、ジフルニサル、およびフェンドサールなどのサリチル酸塩；ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパック、フロフェナク、チオピナック、ジドメタシン、アセメタシン（ａｃｅｍａｔａｃｉｎ）、フェンチアザク、ゾメピラック、クリダナク（ｃｌｍｄａｎａｃ）、オキセピナク、フェルビナク（ｆｅｌｂｍａｃ）、およびケトロラクなどの酢酸誘導体；メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸、およびトルフェナム酸などのフェナム酸塩；イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン（ｉｎｄｏｐｒｏｐｆｅｎ）、ピルプロフェン、カプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、およびチアプロフェン酸（ｔｉａｐｒｏｆｅｎｉｃ）などのプロピオン酸誘導体；フェニルブタゾン、���キシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、およびトリメタゾン（ｔｒｉｍｅｔｈａｚｏｎｅ）などのピラゾールが挙げられるが、これらに限定はされない。これらの非ステロイド系抗炎症剤の混合物を用いてもよい。種々の実施形態において、第二の治療薬はステロイド系抗炎症剤であり、例えば、副腎皮質ステロイド、例えば、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシル−トリアムシノロン、α−メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デスオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン（ｆｌｕａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ）、フルクロロロンアセトニド（ｆｌｕｃｌｏｒｏｌｏｎｅ  ａｃｅｔｏｎｉｄｅ）、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロン（ｆｉｕｏｓｉｎｏｌｏｎｅ）アセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチルエステル（ｆｌｕｃｏｒｔｉｎｅ  ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド（ｆｌｕｃｅｔｏｎｉｄｅ）、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロゾン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｓｏｎｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、フルラドレノロン（ｆｌｕｒａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ）、フルドロコルチゾン、二酢酸塩ジフルロゾン（ｄｉｆｌｕｒｏｓｏｎｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル（ａｍｃｉｎａｆｅｌ）、アムシナフィド（ａｍｃｉｎａｆｉｄｅ）、ベタメタゾンおよびそのエステルの残部（ｂａｌａｎｃｅ）、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルトロン（ｃｌｏｃｏｒｔｅｌｏｎｅ）、クレスシノロン（ｃｌｅｓｃｉｎｏｌｏｎｅ）、ジクロリゾン、ジフルプレドナート（ｄｉｆｌｕｒｐｒｅｄｎａｔｅ）、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメトロン（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｌｏｎｅ）、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン  プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１６３】
種々の実施形態において、併用療法は、同一の医薬組成物中で、または別々の医薬組成物中で、ＩＬ−２バリアントと第二の薬剤組成物とを同時に投与することを含む。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアントと第二の薬剤組成物は、逐次的に投与され、すなわち、第二の薬剤組成物の投与の前または後に、ＩＬ−２バリアント組成物が投与される。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント組成物と第二の薬剤組成物の投与は同時発生的であり、すなわち、ＩＬ−２バリアント組成物の投与時期と第二の薬剤組成物の投与時期は互いに重なっている。種々の実施形態において、ＩＬ−２バリアント組成物と第二の薬剤組成物の投与は、同時発生的ではない。例えば、種々の実施形態においては、ＩＬ−２バリアント組成物の投与は、第二の薬剤組成物が投与される前に終了される。種々の実施形態において、第二の薬剤組成物投与は、ＩＬ−２バリアント組成物が投与される前に終了される。
【実施例】
【０１６４】
以下の実施例は、本開示をより十分に例示するために提供されており、本開示の範囲を限定するものとは解釈されない。
【０１６５】
実施例１
Ｔｒｅｇ細胞を選択的に標的とするためのＩＬ−２バリアントの設計
一つの態様において、本発明は、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはγｃ受容体サブユニットに対するＩＬ−２の親和性を減弱するための１または複数の変異を対象とする。ＩＬ−２Ｒβγ相互作用が弱められた状況において、ＩＬ−２Ｒα発現によって与えられるＴｒｅｇのＩＬ−２感受性の増強は、この細胞サブセットに明白な増殖優位性をもたらし得る。結果として、これらの変異体は、自己免疫性疾患および炎症性疾患においてＴｒｅｇ促進物質として働くことができた。
【０１６６】
各バリアントは、蛋白質構造データバンクに報告されたヒトＩＬ−２の構（ＰＤＢコード２Ｂ５Ｉ）に基づいて、コンピュータを用いて設計した。ＩＬ−２Ｒβまたはγｃ受容体サブユニットと直接的な接触をなす接触面またはその付近に存在する残基に１〜３個の変異（保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換を導入する）を含む、バリアントパネルを作製した。例えば、Ｄ２０は、ＩＬ−２Ｒβ接触面における受容体サブユニット側鎖に対する大規模な水素結合ネットワークに関与している。同様に、Ｎ８８は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ相互作用の有力なホットスポットであり、受容体鎖との重要な水素結合に関与している。Ｑ１２６は、γｃ相互作用に不可欠であり、Ｑ２２も同様にγｃ接触面に存在する。本発明者らは、上記部位またはその付近の残基における変異により、ＩＬ−２の中間親和性受容体であるＩＬ−２Ｒβγと相互作用する能力に欠陥が生じる場合があると仮定した。
【０１６７】
興味深いことに、細菌性毒素の成分に似た提案された「１９ＬＤＬ」モチーフ（Ｂａｌｕｎａ  Ｒ、Ｒｉｚｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９９年；９６巻：頁３９５７−６２）は、ＩＬ−２Ｒβ接触面と重複している。この「毒性モチーフ」は、ＩＬ−２の直接的な血管毒性に部分的に関与している。結果として、その重要な毒性モチーフの残基Ｄ２０の置換、または隣接残基であるＬ１９およびＬ２１を非脂肪族残基と置換するために導入された変異は、毒性モチーフを除去し、内皮細胞損傷を抑制し、ＶＬＳも顕著に低減することが期待された。
【０１６８】
本発明において、以下の１〜３個のアミノ酸置換（Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２０Ｑ、Ｄ２０Ｓ、Ｄ２０Ｙ、Ｄ２０Ｉ、Ｌ１９Ｙ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｑ、Ｌ１９Ｈ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｐ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ２１Ｓ、Ｌ２１Ｎ、Ｌ２１Ｒ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｔ、Ｎ８８Ｍ、Ｑ１２６Ｅ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｎ、Ｑ１２６Ｄ、Ｑ１２６Ｍ、Ｑ１２６Ｋ、Ｑ１２６Ｈ、Ｑ１２６Ｙ、Ｑ１２５Ｅ、Ｓ１２５Ｋ、Ｓ１２５Ｈ、Ｓ１２５Ｗ、Ｓ１２５Ｉ、Ｑ２２Ｎ、Ｑ２２Ｈ、Ｑ２２Ｋ、Ｑ２２Ｙ、Ｑ２２Ｉ、Ｄ２０Ｉ／Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｉ／Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｔ／Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｉ／Ｎ８８Ｉ、Ｄ２０Ｔ／Ｑ１２６Ｅ、Ｄ２０Ｔ／Ｎ８８Ｒ／Ｑ１２６Ｅ、Ｄ２０Ｔ／Ｑ１２６Ｌ、Ｄ２０Ｔ／Ｎ８８Ｒ／Ｑ１２６Ｌ、Ｌ１９Ｎ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｒ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｈ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｑ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｓ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ１２６Ｋ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ１２６Ｈ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ１２６Ｙ、Ｌ１９Ｙ／Ｓ１２５Ｅ、Ｌ１９Ｙ／Ｓ１２５Ｋ、Ｌ１９Ｙ／Ｓ１２５Ｈ、Ｌ１９Ｙ／Ｓ１２５Ｗ、Ｌ１９Ｙ／Ｓ１２５Ｉ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ２２Ｎ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ２２Ｈ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ２２Ｋ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ２２Ｙ、Ｌ１９Ｙ／Ｑ２２Ｉ、Ｌ１９Ｈ／Ｑ１２６Ｋ、Ｌ１９Ｈ／Ｓ１２５Ｉ、Ｌ１９Ｄ／Ｓ１２５Ｉ、Ｄ２０Ｅ／Ｓ２５Ｉ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ１２５Ｉ、Ｌ１９Ｙ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｈ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｈ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｋ、Ｌ１９Ｑ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｅ、Ｌ１９Ｑ／  Ｑ１２６Ｋ、Ｌ１９Ｑ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｋ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｋ、Ｌ１９Ｎ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｋ、およびＬ１９Ｒ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｋ）を有するＩＬ−２バリアントパネル（配列番号４〜４３、１０８〜１４６、および１９３〜１９７）は、「ＧＧＧＳＧＧＧＳ」リンカー（配列番号５５）を介してＦｃホモ二量体にＣ末端融合したものとして発現させた。また、Ｄ２０Ｉアミノ酸置換、Ｄ２０Ｉ／Ｎ８８Ｇアミノ酸置換、Ｄ２０Ｅアミノ酸置換、またはＬ１９Ｎアミノ酸置換を有するＩＬ−２バリアントは、剛直な「ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ」リンカー（配列番号５３）を介してＦｃホモ二量体にＮ末端融合したものとして発現させた。まとめて、これらのＩＬ−２バリアントのＦｃとの融合体構築体の配列は、配列番号７３〜１０７、１４７〜１８９、および１９８〜２１１を伴って列挙されている。同じＦｃ融合型（Ｃ末端型およびＮ末端型の両方）の野生型ＩＬ−２を含む構築体も作製した（配列番号７１および配列番号７２）。
【０１６９】
上記のＩＬ−２バリアントＦｃ融合分子は全て、ＩＬ−２Ｒαを高発現する細胞に増殖優位性を与え、ＣＤ４＋通常Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を含む他のリンパ球の増殖よりＴｒｅｇ細胞が優先されるように、設計されている。さらに、１９位、２０位、または２１位の変異は血管毒性に関与する毒性モチーフを取り除くと期待されるため、得られた分子は、Ｔｒｅｇ活性化の選択性の増強および内皮細胞損傷の低減を含む２つの有益な特性を有し得る。しかしながら、Ｔｒｅｇ細胞の活性化に対する十分に高い効力を維持しながら、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化に対する障害レベルを調節することにより、Ｔｒｅｇサブセットの選択的ターゲティングの窓を最大化するためには、最適な変異または変異の組み合わせが非常に重要となる。
【０１７０】
さらに、単一点突然変異が特定され、タンパク質安定性の改善、発現レベルの向上、および凝集傾向の低下がもたらされた。凝集を低減させる変異とＴｒｅｇを標的にする変異の組み合わせは、タンパク質の開発適合性をより優れたものとし、Ｔｒｅｇ細胞の増殖優位性をもたらした。
【０１７１】
実施例２
ＩＬ−２  Ｆｃ融合構築体の構築および産生
全ての遺伝子には、哺乳類細胞における発現用のコドン最適化を行い、合成して、レシピエント哺乳類発現ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にサブクローニングした。ＣＭＶプロモーターによってタンパク質発現が駆動され、ＣＤＳの３’末端には合成ＳＶ４０ポリＡシグナル配列が存在している。上記コンストラクトのＮ末端にはリーダー配列が設けられており、これにより、分泌のための適切なシグナル伝達とプロセシングが実行される。
【０１７２】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分子量２５，０００、直鎖、ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて、浮遊液中で増殖中のＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を上記哺乳類発現ベクターでコトランスフェクトすることにより、上記構築体を産生させた。２種以上の発現ベクターが存在していた場合、ベクターは１：１の比でトランスフェクトした。トランスフェクションにおいては、ＨＥＫ２９３細胞は無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））中で培養した。１０００ｍｌの振盪フラスコ（ワーキングボリュームは３３０ｍＬ）内で産生させる場合、トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３細胞を０．８×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。合計３３０μｇのＤＮＡ発現ベクターを、１６．７ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と混合した。１６．７ｍｌのＯｐｔｉ−ＭｅＭ培地で希釈した０．３３ｍｇのＰＥＩを添加した後、その混合物を１５秒間ボルテックスし、次いで室温で１０分間静置した。その後、このＤＮＡ／ＰＥＩ液を上記細胞に添加し、８％ＣＯ２の恒温器内で３７℃でインキュベートした。酪酸ナトリウム（ミリポア・シグマ社）を４日目の細胞に最終濃度２ｍｇ／Ｌで添加し、タンパク質発現の維持を補助した。６日間の培養後、上清を収集し、２２００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により精製を行った。この液を滅菌ろ過（０．２２μｍフィルター、コーニング社）した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、細胞培養上清から分泌タンパク質を精製した。
【０１７３】
アフィニティークロマトグラフィーにおいては、２５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）に各上清をロードした。５カラム体積分のＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄することで未結合のタンパク質を除去し、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、２５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ３．２）で標的タンパク質を溶出させた。３％１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０．２）の添加によりタンパク質溶液を中和した。必要に応じて、イオン交換クロマトグラフィー、またはＣａｐｔｏＭＭＣ（ＧＥヘルスケア社）、セラミックハイドロキシアパタイト、もしくはセラミックフルオロアパタイト（バイオラド社）を含むがこれらに限定はされない混合モードクロマトグラフィーを用いて、プロテインＡ材のポリッシングも行った。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５コンセントレーター１０ＫＤａ  ＮＭＷＣ（メルクミリポア社）を用いて、標的タンパク質を濃縮した。
【０１７４】
精製された構築体の純度および分子量の分析は、還元剤の存在下および非存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥと、クーマシー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）Ｓｔａｉｎ）染色により、行った。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（４〜１２％または８〜１６％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を製造業者の説明書に従い使用した。２８０ｎｍのＵＶ吸光度を測定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数で除算することにより、精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を求めた。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで構築体の凝集量を分析した。２５℃の、１５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を移動相として用いる、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏサイズ排除カラム（３００Å、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、ＬＣカラム、アジレント社）に試料を注入した。
【０１７５】
変異部位が異なる構築体間で、または同じ変異部位を共有しているが残基置換が異なる変異体間で、ＩＬ−２バリアントＦｃ融合体の発現プロファイルおよび凝集傾向が顕著に異なっていることは、注目に値する。
【０１７６】
実施例３
ＩＬ−２における１アミノ酸置換は融合化合物の開発適合性に普遍的な改善をもたらす
所望の生物学的特性を有するバリアントタンパク質をもたらす変異の組み合わせを見つける設計アプローチは、ＩＬ−２に適用される際に大きな試練に直面した。当該技術分野において、天然起源のＩＬ−２タンパク質は、あまり安定ではない傾向にあり、凝集しやすいことが知られている。このことは、野生型ＩＬ−２  Ｆｃ融合タンパク質（Ｐ−０２５０）を低レベル（ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞で一過的に約３ｍｇ／Ｌ）で発現させた実験において、図１Ａに図示されるＳＥＣクロマトグラムにより高い凝集傾向が示されたことにより、実証された。所望の生物活性を目的としたＩＬ−２におけるアミノ酸置換として苦労して為された設計努力は、概して安定性がさらに低い変異タンパク質をもたらす結果となった。本研究のＩＬ−２バリアントのかなりの部分が極めて低いレベルで発現し、いくつかのバリアントは、図１Ｂに示されるＰ−０３１８（配列番号９５）のＳＥＣクロマトグラムによって例示されるように、凝集傾向が著しく強いものであった。これは治療薬の製造および保管において問題となる。
【０１７７】
また、変異部位が異なる構築体間で、または同じ変異部位を共有しているが残基置換が異なる変異体間で、ＩＬ−２バリアント融合体の発現プロファイルおよび凝集傾向が顕著に異なっていることが、確認された。この所見は、Ｐ−０３１７（配列番号９４）およびＰ−０３１８（配列番号９５）によって例示されている。両バリアント融合体は、第２０残基と第８８残基に同じ変異部位を共有しており、１つのアミノ酸だけが異なっている。Ｐ−０３１７はＤ２０Ｉアミノ酸置換とＮ８８Ｒアミノ酸置換を含み、Ｐ−０３１８はＤ２０Ｉ変異とＮ８８Ｉ変異を含む。両バリアント融合体は同様に低レベルで発現していた。図１Ｂから分かるように、Ｐ−０３１８は非常に凝集しやすく、６５％が高分子量種となり、これにより予想ピークがクロマトグラム中でより少数の種となっている（矢印で示されている）。対照的に、Ｐ−０３１７は比較的に純粋であり、凝集体は７．５％である（図１Ｃ）。Ｎ８８Ｒ変異は得られる融合タンパク質の凝集傾向を低減し得ることが推論されるであろう。しかし、Ｎ８８Ｒ単一突然変異を有するＩＬ−２、またはＤ２０Ｔ／Ｎ８８Ｒ二重変異を有するＩＬ−２、それぞれから得られる融合タンパク質である、Ｐ−０２５４（配列番号７１）およびＰ−０３２４（配列番号９６）は、凝集しやすく、凝集体は３０〜４０％であった。そのため、タンパク質安定性に対する個々のアミノ酸置換の寄与は、状況に依存すると考えられる。
【０１７８】
ＩＬ−２に対するアミノ酸置換が多くの場合でタンパク質の安定性を低下させるという事実は、タンパク質の安定性に対する種々の残基置換の予測不可能な寄与によって、さらにこじれた問題となった。そのため、安定性の改善、発現レベルの増加、および凝集傾向の低減を含む、タンパク質の開発適合性の普遍的な増強をもたらすことができる残基置換を見つけることが、非常に望ましい。
【０１７９】
１２５位のアミノ酸置換は、当該残基はγｃ相互作用に不可欠なＱ１２６のすぐ近くにあるため、元々はＩＬ−２の選択性の調整を意図したものであった。天然ＩＬ−２は１２５位に不対システインを含んでおり、これはプロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）ではセリンで置換されたが、本発明においてはＳ１２５は野生型ＩＬ−２残基と見なされる。１２５位にアラニン置換を含むＩＬ−２も広く用いられている。１２５位のシステインに対するセリン置換またはアラニン置換は完全な生物活性を保持したため、生物活性を改変するためにＱ１２６のγｃとの相互作用に干渉することを目的として、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｒｙ、Ｈｉｓ、およびＩｌｅを含む嵩のある荷電または疎水性の残基を１２５位に導入して、Ｐ−０３７２（配列番号７９）のＳｅｒを置換した。Ｐ−０４７１（配列番号１７８）以外の、得られた融合分子は全て、発現レベルが低すぎたため、特性評価できなかった。Ｐ−０４７１は、それに対して、そのＳ１２５対応物（Ｐ−０３７２）と比較した場合、有意により高いレベル（４．０ｍｇ／Ｌに対して１９．３ｍｇ／Ｌの滴定量）で発現し、凝集傾向は大きく低減していた（２１．７％に対して１％の凝集）。開発適合性における、特に製品純度に対する目覚ましい改善に促され、このような１２５位におけるイソロイシン置換による増強が異なる変異状況下で再現可能かどうかを評価した。
【０１８０】
そのため、Ｓ１２５Ｉ置換をいくつかのＩＬ−２バリアントＦｃ融合分子に導入した。ＩＬ−２にＩｌｅ−１２５置換を有する構築体を、Ｓｅｒ−１２５対応物と同じベクターを用い、同じ培養条件下で発現させ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅを用いて精製した。例示的な分子の、発現レベル（ｍｇ／Ｌ）、およびＳＥＣクロマトグラフィーで評価された純度（凝集率）を表４にまとめる。表４の同じ列にある２分子は、他のアミノ酸置換に関しては同じものを共有しており、１２５番残基がセリンであるかイソロイシンであるかのみ異なる。一例として、Ｐ−０４４７（配列番号１６８）およびそのＩｌｅ−１２５対応物Ｐ−０５１１（配列番号１９８）のＳＥＣクロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を、図１Ｄおよび図１Ｅにさらに図示した。表４から明らかであるように、１２５位のイソロイシン置換は、４〜１１倍に増強された発現レベルと、一様に低い凝集傾向をもたらした。
【０１８１】
2021528105.tif 000011
【０１８２】
本発明から、１２５位のイソロイシン置換が、生物活性を完全に保持したまま、ＩＬ−２融合構築体の開発適合性に普遍的な改善をもたらすことは、明らかである。Ｆｃ融合体型における、野生型ＩＬ−２、および異なる変異構成のＩＬ−２バリアント、の１２５位におけるＩｌｅ置換は、全て、４〜１１倍に増強された発現レベルおよび一様に低い凝集傾向をもたらした。例示的な分子の、発現レベル（ｍｇ／Ｌ）、およびＳＥＣクロマトグラフィーで評価されたプロテインＡ精製物の純度（凝集率）を表４にまとめる。辛うじて安定の野生型ＩＬ−２に改変を加えると多くの場合で安定性のより低い変異タンパク質が生じるという事実が、生物学的特性を好ましいものとするためのＩＬ−２の操作の障害となっていたため、この発見には特に価値がある。ＩＬ−２操作に付随する問題は、イソロイシンによる１２５位の１アミノ酸置換によって緩和できる。要約すると、ＩＬ−２の１２５位におけるイソロイシン置換すなわちＩＬ−２バリアントがタンパク質の開発適合性プロファイルを大幅に改善することが、ＩＬ−２構築体のタンパク質発現増加と凝集傾向のかなりの低減とにより示された。
【０１８３】
実施例４
Ｔｒｅｇリンパ球に対する選択性に違いを示す１アミノ酸置換のＩＬ−２バリアントの同定
ＩＬ−２に、受容体サブユニットのβまたはγまたはβγと相互作用するアミノ酸に対応する位置で、１アミノ酸置換を導入した。これらの置換は、ＩＬ−２の中間親和性ＩＬ−２Ｒβγ複合体を介したシグナル伝達能を低減し、高親和性ＩＬ−２Ｒαβγからのシグナル伝達に特異性を与えることを目的としたものである。１アミノ酸置換を含むＩＬ−２バリアントを、ＣＤ４陽性のＴｒｅｇ細胞およびＴｃｏｎｖ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する能力の差異について調べた。ＳＴＡＴ５は、膜貫通型ＩＬ−２受容体にＩＬ−２結合後の、下流のシグナル伝達カスケードに関与していることが知られている。定義されたリンパ球亜群におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を、新鮮ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて測定し、ＦＡＣＳ分析において、ｆｏｒｋｈｅａｄ転写因子ＦＯＸＰ３を用いてＴｒｅｇ集団を同定した。
【０１８４】
簡潔に説明すると、健常ドナーのバフィーコートからのフィコール・ハイパック遠心分離によって、ヒトＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを４℃の無血清ＭＡＣＳ緩衝液中で１時間飢餓状態においた。次に、２×１０５個のＰＢＭＣを試験化合物の段階希釈系列で３７℃で３０分間処理した。Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ＥＢＩＯ）を用いて、１×Ｆｏｘｐ３固定／透過処理用ワーキング溶液と一緒に３０分間インキュベートし、１×透過処理用緩衝液で洗浄することにより、細胞を固定および透過処理した。さらに、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液で固定し、Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）で透過処理した後、洗浄した。ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（１：５０希釈）を添加することでＦｃ受容体をブロッキングした後、製造業者が推奨する濃度の抗ＣＤ２５−ＰＥ抗体、抗ＦＯＸＰ３−ＡＰＣ抗体、抗ｐＳＴＡＴ５−ＦＩＴＣ抗体、および抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗体の混合物で、室温で４５分間、細胞を染色した。細胞を遠心分離で収集し、洗浄し、ＦＡＣＳ用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリーのデータにゲーティングをかけ、ＣＤ４陽性／Ｆｏｘｐ３陽性／ＣＤ２５高発現群およびＣＤ４陽性／Ｆｏｘｐ３陰性／ＣＤ２５低発現群（それぞれＴｒｅｇ細胞サブセットおよびＣＤ４通常Ｔ細胞サブセット）とした。データは、ゲーティングされた集団におけるｐＳｔａｔ５陽性細胞の割合（％）として表される。
【０１８５】
図２は、野生型融合タンパク質を対照とした、例示的なＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質の、ＣＤ４陽性のＴｒｅｇ細胞およびＴｃｏｎｖ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化に対する用量反応効果を示している。野生型ＩＬ−２  Ｆｃ融合タンパク質（Ｐ−０２５０）は、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞の両方でＳＴＡＴ５リン酸化を誘導し、ＥＣ５０値はそれぞれ０．１ｐＭおよび２５．４ｐＭであった。野生型ＩＬ−２の活性は、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞における活性よりもＴｒｅｇ細胞における活性が約２５０倍大きく、Ｔｒｅｇ細胞において高親和性三量体受容体の発現レベルがより高いことと合致している。
【０１８６】
２０位のアスパラギン酸の各種置換、Ｐ−０３６４（Ｄ２０Ｅ）、Ｐ−０３６３（Ｄ２０Ｔ）、Ｐ−０３６５（Ｄ２０Ｎ）、Ｐ−０３６６（Ｄ２０Ｑ）、およびＰ−０３６７（Ｄ２０Ｓ）は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力を示したが、そのような活性はＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞においては大部分が減弱または消失していた（図２Ａおよび図２Ｂ）。これらのバリアントは、自己免疫疾患治療用の、Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための、Ｔｒｅｇに偏ったＩＬ−２薬剤となる可能性がある。さらに、提案された毒素様モチーフの重要な残基であるＤ２０における変異は、当該毒性モチーフを取り除き、内皮細胞損傷を抑制することが期待される。従って、これらのバリアントは、Ｔｒｅｇ選択的活性を有し、ＶＬＳに関する安全性プロファイルが改善されることが期待される。さらに、Ｐ−０３６８は生物活性を示さなかった（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【０１８７】
図３は、それぞれＶ９１Ｋ変異およびＮ８８Ｒ変異を有する基準−１化合物および基準−２化合物を対照とした、ＩＬ−２バリアントＰ−０３７５（Ｎ８８Ｑ）の、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力を示している。Ｎ８８Ｑバリアントの活性プロファイルは基準−２の活性プロファイルと同様であった。
【０１８８】
図４は、野生型を対照とした、１９位に各種変異を有するＩＬ−２バリアントの生物活性を示している。バリアントのＰ−０３７２（Ｌ１９Ｙ）、Ｐ−０３７３（Ｌ１９Ｎ）、Ｐ−０３７４（Ｌ１９Ｒ）、Ｐ−０４２３（Ｌ１９Ｑ）、Ｐ−０４２４（Ｌ１９Ｈ）、およびＰ−０４２７（Ｌ１９Ｓ）は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導において、野生型と同様の活性を示した（図４Ａおよび図４Ｃ）。バリアントのＰ−０３７２、Ｐ−０３７４、Ｐ−０４２３、おおよびＰ−０４２７は、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞における生物活性も大部分保持したが（図４Ｂおよび図４Ｄ）、バリアントのＰ−０３７３およびＰ−０４２４の場合、このような活性はＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖで減少していた。変異型Ｐ−０４２５（Ｌ１９Ｄ）は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導活性にわずかな低減を示したが、このような活性はＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞においては著しく障害された（図４Ｃおよび図４Ｄ）。上記で示された、変異型Ｐ−０３７３、Ｐ−０４２４、およびＰ−０４２５による、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞に対して以上の、Ｔｒｅｇ細胞に対する選択的活性化、特に、Ｐ−０３７３およびＰ−０４２５のＴｒｅｇサブセットの選択的ターゲティングの窓の広さによって、当該変異型は、自己免疫疾患治療用のＴｒｅｇ細胞を活性化するための、Ｔｒｅｇに偏ったＩＬ−２薬剤候補となる。重要なこととして、Ｌ１９は提案された毒素様モチーフの一部であり、この部位の変異は安全性プロファイルを改善しＶＬＳを低減することも期待される。
【０１８９】
実施例５
Ｔｒｅｇリンパ球に対する選択性を異ならせるためのＩＬ−２におけるＩＬ−２Ｒβおよびγｃを標的としたアミノ酸置換の組み合わせ
実施例４では、ＩＬ−２Ｒβまたはγｃ受容体サブユニットに対するＩＬ−２の親和性を減弱することを目的とした指定の変異が、Ｔｒｅｇリンパ球に対する選択性に差異があるＩＬ−２変異体をもたらすことができることが示された。β受容体を標的としたあるアミノ酸置換とγ受容体を標的とした他の置換との組み合わせを介して、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃ受容体サブユニットの両方に対するＩＬ−２の親和性を調節することで、Ｔｒｅｇリンパ球に対する好ましい活性および選択性の窓がもたらされ得ることが、結論として得られた。
【０１９０】
そのような論理的根拠が図５に示される。図５Ａおよび図５Ｂは、野生型ＩＬ−２融合タンパク質Ｐ−０２５０を対照として、Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化に対するＩＬ−２Ｒβを標的とするバリアントＰ−０３７２（Ｌ１９Ｙ）の効果を示している。同様に、図５Ｃおよび図５Ｄは、γ受容体との相互作用を妨害することを目標としたアミノ酸置換を有するＰ−０３０３（Ｑ１２６Ｅ）の場合の、ＳＴＡＴ５リン酸化活性を示している。各１アミノ置換がｐＳＴＡＴ５活性化能に最小限の影響しかなかったが、Ｔｒｅｇリンパ球サブセットに対する選択性の窓に対しても野生型と比較してわずかな改善しか示さなかったことが、データから示された。図５Ｅおよび図５Ｆに示されているように、Ｐ−０４１９におけるＬ１９Ｙ変異とＱ１２６Ｅ変異との組み合わせにより、Ｔｒｅｇ細胞の選択的活性化の窓が有意に広げられた。Ｐ−０４１９ではＴｒｅｇ活性化能が大部分確保され、Ｐ−０４１９バリアントのこの活性プロファイルは、Ｖ９１Ｋ変異を含む基準−１分子のものと非常に類似したものであった。１９Ｌは提案された毒素様モチーフの一部でもあり、この部位の変異は安全性プロファイルを改善しＶＬＳを低減することも期待されるため、この戦略は特に魅力的である。
【０１９１】
しかしながら、β受容体を標的としたあるアミノ酸置換とγ受容体を標的とした他の置換とを組み合わせることは、好ましい活性および選択性の窓をもたらすわけではない。それには、各態様ごとの正しい活性調節量が必要となる。図６Ａおよび図６Ｂにおける、４種類のＩＬ−２バリアントは、β受容体を標的とする同じＬ１９Ｙ置換を共有しており、γｃ受容体を標的とするように設計された追加の変異は、Ｐ−０４１９ではＱ１２６Ｅであり、Ｐ−０４６４ではＱ１２６Ｋであり、Ｐ−０４７１ではＳ１２５Ｉであり、Ｐ−０４７４ではＱ２２Ｋである。全ての変異体が、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導において同等の活性を保持していたが（図６Ａ）、係る活性はＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞では顕著なばらつきがあり（図６Ｂ）、このことは、アミノ酸置換の組み合わせを介したＴｒｅｇ活性化の選択性調節における能力の違いを示している。
【０１９２】
しかしながら、Ｔｒｅｇサブセットに対する偏った特異性を既に示したＩＬ−２バリアントに、Ｑ１２６Ｅ置換を組み合わせることによるさらなる受容体減弱を掛け合わせることで、Ｔｒｅｇ細胞に対する活性が著しく減弱または除去され得る。（図６Ｃおよび図６Ｄ）に示されているように、Ｐ−０３７３（Ｌ１９Ｎ）およびＰ−０３６３（Ｄ２０Ｔ）の両バリアントは、Ｔｒｅｇ細胞に対していくらかまたは顕著な選択性の窓の偏りを既に示していた（図６Ｃおよび図６Ｄ）。追加のＱ１２６Ｅ置換を有するこれら各々の対応物であるＰ−０４１７およびＰ−０３２２は、Ｔｒｅｇ細胞活性化能に顕著な低減を示した。以上から、好ましい活性化能およびＴｒｅｇ細胞に対する特異性の偏りが得られるように、活性を調整するための正しい残基置換の組み合わせを見つけることが重要となる。
【０１９３】
Ｐ−０４４７（Ｌ１９Ｈ／Ｑ１２６Ｅ）、Ｐ−０４４８（Ｌ１９Ｑ／Ｑ１２６Ｅ）、およびＰ−０４４９（Ｌ１９Ｓ／Ｑ１２６Ｅ）を含む、Ｌ１９位およびＱ１２６位に二重アミノ酸置換を有するさらなるバリアントの評価を行い、その活性を図７Ａ〜図７Ｄに示した。それぞれ１アミノ酸置換を１つ含むＩＬ−２バリアントのＰ−０４２４（Ｌ１９Ｈ）およびＰ−０３０３（Ｑ１２６Ｅ）と比較して、２つのアミノ酸置換の組み合わせを有するバリアントのＰ−０４４７（Ｌ１９Ｈ、Ｑ１２６Ｅ）は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の刺激においてロバストな生物活性を示したが、係る活性はＴｃｏｎｖ細胞においてはほぼ完全に消失した（図７Ａおよび図７Ｂ）。２種類の基準化合物を対照としてＰ−０４１９、Ｐ−０４４７、Ｐ−０４４８、およびＰ−０４４９の評価を行う別の試験では、４種全てのバリアントが、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導能を顕著に示したが、係る活性はＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞においては大部分が消失した（図７Ｃおよび図７Ｄ）。図５Ｅおよび図５Ｆで示されたことと同様に、Ｐ−０４１９は基準−１と同等の活性プロファイルを有したが、Ｐ−０４４７、Ｐ−０４４８、およびＰ−０４４９は、Ｔｒｅｇ細胞に対する活性および選択性の窓の点で基準−３と同等である。
【０１９４】
これら全ての変異型は、自己免疫疾患治療用の、Ｔｒｅｇ細胞を活性化するための、Ｔｒｅｇに偏ったＩＬ−２薬剤となる可能性がある。さらに、これらの変異型は、安全性プロファイルが改善され、潜在的毒性モチーフの除去によりＶＬＳが低減されることも期待される。
【０１９５】
実施例６
１２５位にイソロイシン置換を有するＩＬ−２バリアントは完全な生物活性を保持する
実施例３において、１２５位のイソロイシン置換が、ＩＬ−２融合構築体の開発適合性に普遍的な改善をもたらすことが示された。Ｓ１２５Ｉ置換を、ＩＬ−２操作の開発適合性の問題を緩和するための実行可能なアプローチとするためには、係るアミノ酸置換が、得られる融合タンパク質の生物活性を、そのＳｅｒ−１２５対応物との比較において損なわないことを示すことが重要となる。
【０１９６】
そこで、Ｓ１２５Ｉ置換を、野生型ＩＬ−２、または受容体サブユニットβもしくはγもしくはβγを標的とした１つもしくは２つの変異を既に有するＩＬ−２バリアントに導入した。得られた、１２５位にイソロイシンを含むＩＬ−２バリアントを、その１２５位セリン対応物を対照として、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｃｏｎｖ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の刺激能について試験した。表５に、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２バリアントの活性および選択性を示す。表５の同じ列にある２分子は、他のアミノ酸置換に関しては同じものを共有しており、１２５位がセリンであるかイソロイシンであるかのみ異なる。データから、Ｓ１２５Ｉ置換が、Ｔｒｅｇ特異性を変えることなく、各種被験ＩＬ−２バリアントの生物活性を完全に保持するか、わずかに改善したことが示された。
【０１９７】
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【０１９８】
３種類の例示的な構築体、Ｐ−０２５０、Ｐ−０４２４、およびＰ−０４４７と、それらのＳ１２５Ｉ相当物であるＰ−０５３１、Ｐ−０４９１、およびＰ−０５１１から得られたデータを、図８に示した。Ｐ−０２５０は野生型ＩＬ−２  Ｆｃ融合分子であり、Ｐ−０４２４は１つのアミノ酸置換Ｌ１９Ｈを含むものであり、Ｐ−０４４７は２つのアミノ酸置換Ｌ１９Ｈ／Ｑ１２６Ｅを含むものである。Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化に対するそれらの用量依存効果を図８に示す。図８Ａ〜図８Ｆに示されているように、Ｓ１２５Ｉ置換は、３種類の被験化合物の活性をわずかに増加させ、Ｐ−０５３１およびＰ−０４９１についてはＴｒｅｇ選択性を変化させず、Ｐ−０５１１については、Ｓ１２５Ｉ置換はＴｒｅｇ選択性の窓をさらに広げた。
【０１９９】
データからは、このように、ＩＬ−２におけるＳ１２５Ｉ置換は、変異背景が異なるＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２活性プロファイルを保持することが示された。要約すると、ＩＬ−２の１２５位におけるイソロイシン置換は、ＩＬ−２、ＩＬ−２融合体、ＩＬ−２バリアント、およびＩＬ−２バリアント融合体の場合で、普遍的な開発適合性改善（生産収率の増加、凝集の低減、免疫原性の可能性の低下）をもたらし、生物活性および選択性を完全に保持した。この特定のアミノ酸置換は、ＩＬ−２操作に付随する問題に対処するための、実行可能な緩和戦略となる。
【０２００】
実施例７
ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＩＬ−２バリアントの効果
ＣＤ４陽性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４陽性／Ｆｏｘｐ３陽性／ＣＤ２５高発現）と、Ｔｃｏｎｖ細胞（ＣＤ４陽性／Ｆｏｘｐ３陰性／ＣＤ２５低発現）とにおける、ＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する能力の差異を評価したことに加えて、２種類のバリアント、Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２を、野生型ＩＬ−２（Ｐ−０２５０）、並びにＶ９１Ｋ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｄをそれぞれ含む３種類のＩＬ−２基準分子と比較して、ＣＤ４陽性Ｔｅｆｆ細胞（ＣＤ４陽性／Ｆｏｘｐ３陰性／ＣＤ２５陽性）、ＣＤ８細胞傷害性エフェクターＴ細胞、およびＮＫ細胞を含む、他のエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞を刺激する能力について、さらなるアッセイを行った。
【０２０１】
本発明のＩＬ−２バリアントはＩＬ−２Ｒβγ相互作用を減弱し、これらのバリアントによる、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖと比較した場合の、Ｔｒｅｇの顕著な増殖優位性が、ＴｒｅｇにおけるＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の恒常的な高発現によって与えられた。ＣＤ２５発現は免疫刺激後のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞において誘導される可能性がある。そのため、ＩＬ−２バリアントが、他のＣＤ２５＋リンパ球サブセットに対する以上のＴｒｅｇ特異性を保持していることを確認することが望ましい。中〜高のＣＤ２５発現レベルを有するリンパ球サブセットの例として、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）が挙げられる。
【０２０２】
ヒトＰＢＭＣ細胞を、試験化合物の連続希釈系列で処理し、固定し、透過処理し、洗浄し、抗ＣＤ２５−ＰＥ抗体、抗ＦＯＸＰ３−ＡＰＣ抗体、抗ｐＳＴＡＴ５−ＦＩＴＣ抗体、および抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗体の混合物を用いて染色した後、フローサイトメトリー分析でゲーティングを行い、ＣＤ４＋／Ｆｏｘｐ３＋／ＣＤ２５＋群、ＣＤ４＋／Ｆｏｘｐ３−／ＣＤ２５＋群、ＣＤ４＋／Ｆｏｘｐ３−／ＣＤ２５−群を、それぞれＴｒｅｇ細胞サブセット、ＣＤ４エフェクター細胞サブセット、およびＣＤ４ナイーブＴ細胞サブセットとした。データは、ゲーティングされた集団におけるｐＳＴＡＴ５陽性細胞の割合（％）として表され、図９に示される。Ｐ−０５１２は３種類全てのＴ細胞サブセットにおいて基準−１と同等の活性プロファイルを有し、Ｐ−５１１は、Ｔｅｆｆ細胞およびナイーブＣＤ４  Ｔ細胞の両方と比較しての、Ｔｒｅｇ細胞に対する活性および選択性の窓の点で、基準−２および基準−３の両方よりも優れている。基準−２が示した、３種類のサブセットの各々に対する活性化能は、ずっと弱いものであった。図９Ａおよび図９Ｂにおいて、Ｔｅｆｆ上では中〜高レベルでＣＤ２５が発現されているにもかかわらず、ＩＬ−２Ｒβγ相互作用が減弱されたＩＬ−２バリアント、特にＰ−０５１１による、Ｔｅｆｆに対して以上の、Ｔｒｅｇの優先的な活性化が、はっきりと示された。
【０２０３】
さらに、Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２を、野生型および基準分子と比較して、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激する能力について試験した。細胞内蛍光ラベル、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）法を用いた。簡潔に説明すると、ヒトＰＢＭＣ（１×１０５細胞／ウェル）を、ＣＦＳＥで標識し、９６ウェルプレートに播種し、漸増濃度の各種ＩＬ−２化合物と共にインキュベートした。その後、５日間または７日間のインキュベーション後に細胞を回収し、ＮＫ細胞の場合では抗ＣＤ５６−ＡＰＣ抗体を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合では抗ＣＤ８−ＡＰＣ抗体を用いて染色を行い、フローサイトメトリー分析にかけた。データは分裂細胞の割合（％）として表し、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖については図１０Ａに、ＮＫ細胞増殖については図１０Ｂに、示した。
【０２０４】
予想通り、全てのＩＬ−２バリアントが、野生型ＩＬ−２融合分子であるＰ−０２５０との比較で、ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激能およびＮＫ細胞刺激能の両方の減弱を示した。ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイで確認されたことを裏付けて（図９）、Ｐ−０５１２は基準−１と同等の活性プロファイルを有し、Ｐ−０５１１は両方のリンパ球サブセットに対する活性の点で基準−３と同等であり、一方、基準−２はずっと弱い活性を示した。
【０２０５】
Ｐ−０５１１による、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット以外のレスポンダー細胞に対するＳＴＡＴ５リン酸化活性を、野生型Ｐ−０２５０のＳ１２５Ｉ対応物であるＰ−０５３１と比較した。Ｐ−０５１１は、Ｐ−０５３１と同様に、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化刺激において顕著な活性を示したが（図１１Ａ）、係る活性はＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞（図１１Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１１Ｃ）、およびＮＫ細胞（図１１Ｄ）においてはほぼ完全に消失した。ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞上で発現されるＩＬ−２受容体は、主に二量体型のＩＬ−２Ｒであり、ＩＬ−２Ｒβとγｃとを含んでいる。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対するＰ−０５１１によるｐＳＴＡＴ５シグナル伝達の顕著な減弱が、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃによる相互作用の障害によるものであるかを確認するため、ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。
【０２０６】
簡潔に説明すると、ヘテロ二量体Ｆｃ鎖を介したＩＬ−２Ｒβ−ＥＣＤ（ＮＰ＿０００８６９）およびγｃ−ＥＣＤ（ＮＰ＿０００１９７）の非共有結合性複合体を、ヌンク社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに２μｇ／ウェルでコートした。４℃で一晩インキュベートし、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でブロッキングした後、１００ｎＭまたは２７０ｎＭから開始して３倍段階希釈したＩＬ−２  Ｆｃ融合タンパク質を各ウェルに１００μｌ／ウェルで添加した。室温で１時間インキュベートした後、１μｇ／ｍｌのビオチンマウス抗ヒトＩＬ−２抗体（ＢＤバイオサイエンス社）を各ウェルに添加し、その後、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ−アビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と共に１時間インキュベートした。各ステップの後、ウェルには十分な吸引を行い、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。最後に、１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、室温の暗所で１０分間プレートを発色させ、１００μｌ／ウェルの停止液（２Ｎ硫酸、リッカ・ケミカル社（Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））を添加した。４５０ｎｍの吸光度を求め、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（グラフパッド社）を用いて曲線の当てはめを行い、図１１Ｅに図示した。
【０２０７】
図１１Ｅに示されているように、開発適合性が改善された野生型ＩＬ−２融合タンパク質のＰ−０５３１は、ＩＬ−２二量体型受容体複合体にｎＭ以下の親和性（ＥＣ５０＝０．０６ｎＭ）で結合し；基準−１分子は結合性の減少を示し（ＥＣ５０＝１．６ｎＭ）、これは、当該分子のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化刺激能が減弱されたことと一致した（図１０Ａ〜図１０Ｂ）。対照的に、Ｐ−０５１１は、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃ複合体に対してはっきりとした結合性は示さず、βとの接触面とγｃ受容体サブユニットとの接触面の両方におけるＰ−０５１１の２つのＩＬ−２変異が、複合体との相互作用を劇的に障害することが示された。二量体型ＩＬ−２受容体複合体に対する結合性が実質的に消失したにもかかわらず、Ｐ−０５１１がＴｒｅｇに対して示した活性が、野生型ＩＬ−２融合体と比較して、わずかにしか減少していないことは、驚くべきことである。Ｐ−０５１１は、Ｔｒｅｇリンパ球に対し好ましい活性および選択性の窓を有するＩＬ−２バリアントの例示となる。
【０２０８】
要約すると、表２Ａ〜表２Ｆに記載の一連のＩＬ−２バリアントを、構築し、発現させ、インビトロアッセイで試験した。ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を含む、他のリンパ球サブセットと比較した、Ｔｒｅｇ細胞における、例示的なＩＬ−２バリアントの生物活性を、図２〜図１１に示した。多くのバリアントは、Ｔｒｅｇ細胞に対して高い活性を保持したが、Ｔｃｏｎｖ細胞および他のリンパ球サブセットに対する活性は低減または消失した。基準−１と同様の活性プロファイルを有したバリアントもあれば、基準−２または基準−３の活性特徴と似ているものもあった。さらに、これらのＩＬ−２バリアントの大部分は、ＶＬＳを低減することを目的として、提案された毒素様モチーフが除去された。重要なこととして、Ｓ１２５Ｉアミノ酸置換の組み入れは、Ｔｒｅｇ細胞における生物活性および選択性を保持しながら、より優れた開発適合性プロファイルを有する、ＩＬ−２バリアント融合体をもたらした。これらのバリアントは、安全性プロファイルが改善された、自己免疫疾患治療用の、強力にＴｒｅｇに偏ったＩＬ−２薬剤である。
【０２０９】
実施例８
ＩＬ−２バリアントのＦｃ融合タンパク質はマウスにおいてＴｒｅｇ細胞の増殖能および増殖を優先的に刺激する
ＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質をマウスに投与し、当該融合タンパク質の、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞に対して以上に、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞）の増殖能および増殖を優先的に刺激する能力を、インビボで求めた。
【０２１０】
雌Ｃ５７／ＢＬ６マウス（７週齢）をチャールスリバー研究所から入手し、試験前に少なくとも７日間自社で順化した。０日目、マウスに、溶媒（ＰＢＳ）、０．３ｍｇ／ｋｇの各試験化合物、またはＩＬ−２基準化合物を皮下投与した。処置後３日目、５日目、および７日目に、末梢血試料を採取し、ヘパリン処理チューブに入れた。各群には６匹のマウスを含ませ、ベースラインとなる血液を処置の２日前（−２日目）に採取した。赤血球を溶解させた後、トリパンブルー死細胞除外法で総生単核血液細胞数をカウントし、フローサイトメトリー分析を用いた免疫細胞表現型およびＫｉ６７増殖マーカーのための、細胞内染色に進んだ。細胞は、記載の通りの２種類の抗体パネルで別々の染色を行った：１）ＣＤ４＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の場合、抗マウスＦｏｘｐ３−ＦＩＴＣ、Ｋｉ６７−ＰＥ、抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ、および抗マウスＣＤ４−Ｐｅｒｃｐｃｙ５．５（１：５０希釈）；２）ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の場合、抗マウスＣＤ３−ＦＩＴＣ、Ｋｉ６７−ＰＥ、抗マウスＣＤ３３５−ＡＰＣ、および抗マウスＣＤ８−Ｐｅｒｃｐｃｙ５．５（１：５０希釈）。
【０２１１】
Ｋｉ６７陽性Ｔｒｅｇ細胞の増加と、総ＣＤ４＋Ｔ細胞または総リンパ球に対するＴｒｅｇ細胞の割合の上昇（図１２Ａ〜図１２Ｃ）によって示されているように、全ての被験ＩＬ−２化合物がＴｒｅｇ細胞の増殖能および増殖を刺激した。１回の単回注射後、この効果は注射の３日後に確認され、５日目または７日目まで持続した。基準−１はＴｒｅｇリン酸化誘導においてＩＬ−２バリアントの中でも最も高い活性を一貫して示すという、エキソビボで確認されたこととは対照的に、３種類全ての被験バリアント、Ｐ−０５１１、Ｐ−０５１２、およびＰ−０５１４は、マウスでは、Ｔｒｅｇ細胞の増殖能および増殖の刺激において基準分子よりも強いインビボ有効性を示した。Ｐ−０５１１、Ｐ−０５１２、およびＰ−０５１４は同等の活性を示した。３種類の基準間で順位付けた相対的なインビボ活性は、エキソビボヒトＰＢＭＣ細胞アッセイと一致し、すなわち、基準−１が最も活性が高く、次いで基準−３であった。基準−２はＴｒｅｇ細胞の増殖能および増殖の刺激においてずっと弱いものである（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。
【０２１２】
エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞に対して、基準−１は、細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する強いＫｉ６７刺激を示したが、基準−２および基準−３がＣＤ８Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対して示した効果は低かった（図１３Ａ〜図１３Ｃ）。バリアントＰ−０５１４は、基準−１と同様のＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＫｉ６７刺激を示し、バリアントのＰ−０５１１およびＰ−０５１２は、基準−２および基準−３のように、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対するマイルドなＫｉ６７刺激を示した（図１３Ａ〜図１３Ｃ）。バリアントのＰ−０５１１およびＰ−０５１２が、基準１および基準２と比較して、より優れたＴｒｅｇに対する生物活性および選択性を示すことを、データは示唆している。基準−３は、Ｔｒｅｇ細胞およびエフェクター細胞の両方の刺激および増殖に効果的ではなかった。
【０２１３】
Ｔｒｅｇ集団の増加により、全てのＩＬ−２バリアント処置群で、ＣＤ４＋通常Ｔ細胞の割合が減少した（図１４Ａ）。Ｔｒｅｇに偏ったＩＬ−２バリアント（Ｐ−０５１１、Ｐ−０５１２、およびＰ−０５１４）のいずれで処置されたマウスにおいても、３種類の基準で処置されたマウスにおいても、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、またはＮＫ細胞の有意な増加は確認されなかった（図１４Ｂ〜図１４Ｄ）。
【０２１４】
３種類の基準と比較して、３種類全てのバリアント、Ｐ−０５１１、Ｐ−０５１２、およびＰ−０５１４が、全ての測定時点における細胞数に基づいたＫｉ６７刺激および細胞増殖の両方の観点から、最も有益なＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比も示した（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。
【０２１５】
Ｆｏｘｐ３の発現は、注射の３日後に全ての被験ＩＬ−２化合物によりＴｒｅｇ細胞上で増加し（図１６Ａ）、３種類全てのバリアントが、３種類の基準よりも同程度に高い、ＣＤ２５マーカーおよびＦｏｘｐ３マーカーの発現を示し（図１６Ａおよび図１６Ｂ）、より優れたＴｒｅｇ活性化および機能性が示唆された。
【０２１６】
処置前および処置中に体重をモニターした。有意な体重変化は確認されなかった（データ未記載）。
【０２１７】
総じて、これらのデータから、バリアントのＰ−０５１１、Ｐ−０５１２、およびＰ−０５１４は、ＣＤ４＋通常細胞、細胞傷害性エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は見逃しつつ、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞の活性化、増殖能、および増殖を促進する能力を示すことが示された。これらのデータはまた、Ｔｒｅｇの増殖能および増殖に対する有効性および選択性の両方の観点から、基準分子に優る、これらの３種類のバリアントの優位性も証明した。これらのバリアントは、自己免疫性疾患および炎症性疾患、並びに臓器移植拒絶反応に対抗するための治療薬として役立ち得る。
【０２１８】
実施例９
単回注射後マウスにおけるＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質による用量反応性薬力学的試験
溶媒（ＰＢＳ）またはＰ−０５１１（１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．０３ｍｇ／ｋｇ）を雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５匹／群）に単回皮下投与した後、ベースラインとして−２日目、並びに投与後の３日目、５日目、および７日目に、末梢血を採取した。７日目、マウスを屠殺し、脾臓を摘出した。新鮮全血を用いた各時点におけるフローサイトメトリーにより、血中リンパ球表現型検査、増殖能および増殖の測定を行った。
【０２１９】
いずれの処置群においても、体重にも脾臓重量にも有意な変化はなかった（データ未記載）。
【０２２０】
図１７に示されているように、Ｋｉ６７陽性細胞の割合の増加（図１７Ａ）に反映されて、Ｔｒｅｇ細胞の増殖能の用量依存的な増加が、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇの用量レベルのＰ−０５１１で処置されたマウスで確認された。０．０３ｍｇ／ｋｇでの処置が、効果が最小であった。高い方から３つの服用レベルでは、３日目に、Ｔｒｅｇ細胞におけるＫｉ６７発現の刺激はピークとなり、５日目までプラトーを維持し、その後減少した。結果として、Ｐ−０５１１処置は、総ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの割合（図１７Ｂ）、Ｔｒｅｇ細胞の絶対数（図１７Ｃ）、およびベースラインからの細胞数の変化倍率（図１７Ｄ）を用量依存的に上昇させた。Ｔｒｅｇ細胞増殖の増加は増殖能／活性化Ｋｉ６７マーカーと同様の動態パターンを辿り（図１７）、すなわち、３日目に最高点となり、さらに５日目までのびた。１ｍｇ／ｋｇでの投与はより大きな規模および期間のＴｒｅｇを刺激し、シグナルは５日目まで持続した。
【０２２１】
また、Ｐ−０５１１の処置は、全リンパ球に対するＴｒｅｇの割合の、用量依存的且つ統計的に有意な上昇をもたらしたが（図１８Ａ）、一方では、全リンパ球に対してのＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞の割合にも（図１８Ｂ）、ＣＤ８  Ｔｅｆｆ細胞の割合にも（図１８Ｃ）、ＮＫ細胞の割合にも（図１８Ｄ）、統計的に有意な変化は確認されなかった。ピークにおいて、Ｔｒｅｇは、１ｍｇ／ｋｇ単回投与処置では全リンパ球の４．５％を占め、それに対し、０．３ｍｇ／ｋｇ投与では３．１％、０．１ｍｇ／ｋｇでは１．４％であった。溶媒対照群では、Ｔｒｅｇは全リンパ球の０．５％であった（図１８Ａ）。
【０２２２】
細胞数に基づきＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比を算出した（図１９Ａ）。Ｔｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比は、１ｍｇ／ｋｇで処置した場合は０．２７でピークとなり、０．３ｍｇ／ｋｇの場合は０．１８、０．１ｍｇ／ｋｇの場合は０．０６であり、それに対し、未処置では０．０２７となり（図１９Ａ）、Ｐ−０５１１によるＴｃｏｎｖ細胞を超えるＴｒｅｇ細胞の優先的な増殖が示唆された。加えて、ＣＤ２５（図１９Ｂ）、およびＦｏｘＰ３（図１９Ｃ）を含む、Ｔｒｅｇ細胞機能マーカーの発現も、用量依存的に増加した。ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加は、３日目にピークとなり、５日目にはより低いレベルにまで減弱していた。
【０２２３】
総じて、これらのデータからは、Ｐ−０５１１が強力且つ優先的なＴｒｅｇの活性化および増殖を用量依存的に示すことが示された。細胞傷害性エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は見逃しつつ、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞の活性化、増殖能、および増殖を促進する、活性の最大化を目的とした、最適化された投与戦略の達成には、慎重な考慮が必要となる。
【０２２４】
実施例１０
ＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質の反復投与後のマウスにおける薬力学的試験
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（７週齢）を試験前に５〜７日間自社で順化した。溶媒（ＰＢＳ）、０．３ｍｇ／ｋｇのＰ−０５１１、Ｐ−０５１２、Ｐ−０５３１、または基準−１化合物を、０日目、３日目、および６日目にマウス（ｎ＝５匹／群）に皮下投与した。最初の注射の３日後である３日目および複数回（３回）注射の３日後である９日目に、末梢血を採取した。それ以前のインビボ実験に基づき、Ｔｒｅｇ細胞の活性化、増殖能、および増殖は３日目にピークとなることが予想されたため、注射後３日間をデータの収集および解析用に選択した。血中リンパ球の活性化、増殖能、および増殖の変化を、フローサイトメトリーで測定した。Ｐ−０５３１は野生型ＩＬ−２融合タンパク質のＳ１２５Ｉ対応物である。基準−１はＶ９１Ｋ変異を含む。
【０２２５】
ＩＬ−２融合タンパク質の単回皮下投与の３日後、９０％近いＴｒｅｇ細胞が全ての試験群でＫｉ６７発現陽性を示し、このＫｉ６７陽性細胞は、全ての試験化合物の３回目の投与後も、有意に多いままであった（図２０Ａ）。興味深いことに、Ｔｒｅｇ細胞は、総ＣＤ４Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの割合（％）または総リンパ球に対するＴｒｅｇの割合（％）で表された場合、１回処置との比較で、３回の連続した３日おき処置の後では、Ｐ−０５３１処置マウスおよび基準−１処置マウスでは対照レベル近くにまで激減したが、Ｐ−０５１１処置マウスおよびＰ−０５１２処置マウスでは有意に高いレベルを維持した（図２０Ｂ〜図２０Ｃ）。データから、野生型ＩＬ−２または基準−１は、Ｔｒｅｇ刺激に対する活性がより強いために、Ｔｒｅｇ細胞の消耗を促進するか、あるいは、Ｔｒｅｇの脱感作を誘発し得ることが示唆される。さらなる説明として、半減期または非リンパ球上の「受容体シンク」の違いによって、薬剤暴露に変化が生じ、野生型ＩＬ−２または基準−１のＴｒｅｇ選択性の無さまたは小ささに繋がったことも挙げることができる。
【０２２６】
Ｔｒｅｇ細胞数およびＰＢＳ対照に対する変化倍率（図２１Ａ〜図２１Ｂ）、並びにＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比（図２２）についても、同様の知見が得られた。Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２は、Ｐ−０５３１および基準−１と比較してより優れた、Ｔｒｅｇプールを維持し、Ｔｒｅｇ選択性を維持する能力を示した。
【０２２７】
総じて、これらのデータから、Ｐ−０５１１およびＰ−０５１２が、複数回投与後に優先的且つ持続的なインビボＴｒｅｇ増殖を示すより優れたＩＬ−２分子であることが示された。ＩＬ−２バリアントＦｃ融合体の投与量および投与頻度などの投与計画を調節することにより、炎症誘発性の免疫活性化を超えた、Ｔｒｅｇに対する所望の活性および選択性のさらなる最適化がなされ得る。
【０２２８】
実施例１１
遅延型過敏（ＤＴＨ）マウスモデルにおけるＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質による抗原駆動型炎症の抑制
インビボにおける、ＩＬ−２バリアントによって誘導されたＴｒｅｇ細胞のＴ細胞抗原駆動型炎症を抑制する能力を、遅延型過敏（ＤＴＨ）モデルで評価した。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（７週齢）を７日間自社で順化し、無作為に群分けした。溶媒（ＰＢＳ）、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇのＰ−０５１１の皮下投与を−２日目に開始し、３回の注射の場合は３日毎に１回（３日おき）、または２回の注射の場合は５日毎に１回（５日おきに）、投与を行った。次いで０日目に、マウスを２００μｌの食塩水中の１００μｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の皮下投与により感作した。３日おきの投与の場合、１日目および４日目にＰＢＳまたはＰ−０５１１（０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇ）の２回のさらなる皮下注射を投与し；５日おきの投与の場合、追加で１回を皮下に行った。３日目、ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇのＰ−０５１１の注射を投与した。５日目、マウスの右耳皮内にＫＬＨ（５μｇ／１０μｌ食塩水）を投与した。５日目のＫＬＨ投与前、およびＫＬＨ投与の２４時間後、４８時間後、および７２時間後に相当する６日目から８日目までの毎日、ノギスを用いて右耳厚を測定した。また、陽性対照として、１つの群のマウスに、５日目から８日目まで毎日、５ｍｇ／ｋｇデキサメタゾンの腹腔内投与を行った。
【０２２９】
図２３に、ＫＬＨ暴露後の種々の時点におけるベースライン値に対する耳厚の変化（Δ耳厚）を用いたＤＴＨ反応の動態を示した。
【０２３０】
皮下のＫＬＨ抗原感作後、耳介の皮内ＫＬＨ投与の２４後に、顕著な耳の炎症および腫脹はピークとなり、この耳の腫脹はＰＢＳ群では７２時間長引いた。免疫抑制性ステロイドであるデキサメタゾンが、５ｍｇ／ｋｇでの４回の連続した毎日投与により、ＫＬＨ誘導性炎症反応を強力に阻害し、ＫＬＨ投与の７２時間後に約８５％阻害を達成していることは明らかである。Ｐ−０５１１によって誘導されたＴｒｅｇ細胞による抗原駆動型炎症の抑制も、０．３ｍｇ／ｋｇのＰ−０５１１で３日おきまたは５日おきに処置されたマウスにおいて、ＫＬＨ投与後の全ての時点で、明らかであった（図２３Ａ〜図２３Ｂ）。０．１ｍｇ／ｋｇの投与においては、３日おき投与および５日おき投与の両方の場合で類似のＤＴＨ炎症反応軽減傾向が確認されたが、この効果は大部分の時点で統計的有意性には至らなかった。３日おきの投与スケジュールおよび５日おきの投与スケジュールは両方とも効果的であった。
【０２３１】
別の研究で、ＫＬＨ誘導性ＤＴＨの抑制に対するＰ−０５１１（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ、５日おき）の用量依存反応を求め、基準−１（０．３ｍｇ／ｋｇ、５日おき）と比較した。図２４に示されているように、Ｐ−０５１１は耳炎症の用量依存的阻害を示した。１ｍｇ／ｋｇのＰ−０５１１を投与されたマウスは、ＫＬＨ誘導性ＤＴＨに対して強い抵抗を示し、ＫＬＨ投与後に最も少ない耳腫脹が確認された。０．３ｍｇ／ｋｇのＰ−０５１１および０．１ｍｇ／ｋｇのＰ−０５１１の場合で、それぞれ中間の阻害効果および軽度の阻害効果が確認された。基準−１は耳腫脹の軽度の阻害を示し、０．３ｍｇ／ｋｇの基準−１の効果は０．１ｍｇ／ｋｇのＰ−０５１１で達成された効果と同様であった（図２４）。
【０２３２】
要約すると、Ｐ−０５１１投与により誘導されたＴｒｅｇ細胞は、ＤＴＨモデルにおけるＴ細胞抗原駆動型炎症の抑制において効果的であった。加えて、Ｔｒｅｇ抑制はＫＬＨ投与後も反復投与なしで維持された。本実施例から明らかになったこととして、最適な効力を達成するように投与計画を調整することも非常に重要となる。
【０２３３】
実施例１２
カニクイザルにおけるＰ−０５１１の薬力学／薬物動態学的効果
ＩＬ−２バリアントＦｃ融合タンパク質であるＰ−０５１１のカニクイザルにおけるＰＫ／ＰＤ特性が、１４日おきに３回の投与スケジュールの後、評価されることとなる。薬剤未投与のカニクイザルが、３〜４週間順化され、４群（ｎ＝３〜４匹／群）に無作為に割り付けられ、その後、投与前ベースライン週間に進むこととなる。１日目、１５日目、および２９日目に、ある群が溶媒（ＰＢＳ）の皮下投与を受け、他の群は１００μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、または１０μｇ／ｋｇのＰ−０５１１を皮下投与されることとなる。
【０２３４】
血液採取を、−７日目、−３日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目、２８日目、３２日目、３５日目、４３日目、５０日目、５７日目に行う。全血を用いて、末梢血中Ｔｒｅｇ、非制御性ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、およびＮＫ細胞、ナイーブ細胞および記憶細胞のＦＡＣＳによる免疫表現型検査を行い、薬力学的特性を求める。ＣＤ６９およびＫｉ６７を測定することにより、細胞の活性化および増殖能もモニターされることとなる。また、全血を用いて、５分類（好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球）による全血球算定（ＣＢＣ）も行う。
【０２３５】
Ｐ−０５１１のＰＫ特性は、Ｐ−０５１１捕捉用に、９６ウェルプレートを被覆するためにマウス抗ヒトＩＬ−２モノクローナル抗体（ＢＤファーミンゲン社）を用いて、完全長インンタクトＰ−０５１１を測定することにより、カニクイザル血漿試料において評価されることとなる。Ｐ−０５１１はヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル−ＨＲＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて検出されることとなり、その後、その血漿中濃度が定量化されることとなる。−７日目、−３日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目、２８日目、３２日目、３５日目、４３日目、５０日目、５７日目に採取された血漿試料に加え、１日目の、Ｐ−０５１１の最初の投与の０．５時間後、３時間後、および６時間後に、３つのさらなる血漿試料が採取された。
【０２３６】
−８日目、８日目、２１日目、３５日目、４３日目、５７日目から得られた血漿試料を用いて、以下の臨床化学パラメーターも評価されることとなる：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、γグルタミルトランスフェラーゼ、アルブミン、総ビリルビン、クレアチニン、血中尿素窒素、およびＣ反応性タンパク質。
【０２３７】
さらに、各動物の体重および体温も、全試験期間中、週１回または週２回モニターされることとなる。
【０２３８】
本願で開示および特許請求されている物品および方法は全て、本開示に照らし合わせることで、必要以上の実験を行うことなく作製および実行することができる。本開示の物品および方法を好ましい実施形態の観点から説明したが、本開示の精神および範囲から逸脱しない範囲で、物品および方法に変更を適用してもよいことは、当業者には明らかである。当業者には明らかな、そのような変更形態および均等物は全て、現存するものであれ後に開発されるものであれ、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲に包含されると見なされる。本明細書で言及された特許、特許出願、および刊行物は全て、本開示が属する技術分野における当業者の水準を示すものである。全ての特許、特許出願、および刊行物は、あたかも個々の刊行物が、その全体があらゆる目的で参照により援用されると明確且つ個別に示されているのと同程度に、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に援用される。本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書に特には開示されていない任意の要素の非存在下で、好適に実施されている場合がある。すなわち、本開示は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書で開示された概念の変更および変形が当業者によって為されてもよいこと、並びに、そのような変更形態および変形形態が添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲内であると見なされることを理解されたい。
［配列表］
添付の配列表に列挙された核酸配列およびアミノ酸配列では、米国特許法施行規則§１．８２２の規定の通り、ヌクレオチド塩基は標準的な略語を用いて示しており、アミノ酸は１文字表記を用いて示している。
配列番号１はヒトＩＬ−２前駆体のアミノ酸配列である。
配列番号２はヒトＩＬ−２成熟型の天然アミノ酸配列である。
配列番号３はヒトＩＬ−２成熟型の野生型アミノ酸配列である。
配列番号４〜４３、１０８〜１４６、および１９３〜１９７は各種ＩＬ−２バリアントのアミノ酸配列である。
配列番号４４はヒトＩｇＧ１−Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号４５はエフェクター機能が低減／消失したヒトＩｇＧ１−Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号４６および４７および２１２〜２１３は、エフェクター機能が低減し、半減期が延長したヒトＩｇＧ１−Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号４８〜６７は各種ペプチドリンカー配列のアミノ酸配列である。
配列番号６８はヒトＩＬ−２受容体αＳｕｓｈｉドメインのアミノ酸配列である。
配列番号６９〜１０７、１４７〜１８９、および１９８〜２１１は各種Ｆｃ−ＩＬ−２融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１９０〜１９２は基準であるＦｃ−ＩＬ−２バリアント融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２１４〜２２２は各種Ｆｃ−ＩＬ−２融合タンパク質のヌクレオチド配列である。
配列表
ヒトＩＬ−２前駆体配列
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１）
ヒトＩＬ−２成熟型天然配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２）
ヒトＩＬ−２成熟型野生型配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３）
ＩＬ−２  Ｎ８８Ｒバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＲＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｔバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＴＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｅバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＥＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｎバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＮＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｑバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＱＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｓバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＳＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号９）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｙバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＹＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１０）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｉバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＩＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１１）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｙバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＹＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１２）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｎバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＮＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１３）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｒバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＲＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１４）
ＩＬ−２  Ｎ８８Ｇバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＧＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１５）
ＩＬ−２  Ｎ８８Ｉバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＩＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１６）
ＩＬ−２  Ｎ８８Ｑバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＱＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１７）
ＩＬ−２  Ｎ８８Ｅバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＥＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１８）
ＩＬ−２  Ｎ８８Ｔバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＴＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１９）
ＩＬ−２  Ｎ８８Ｍバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＭＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２０）
ＩＬ−２  Ｑ１２６Ｅバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＥＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２１）
ＩＬ−２  Ｑ１２６Ｌバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＬＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２２）
ＩＬ−２  Ｑ１２６Ｎバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＮＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２３）
ＩＬ−２  Ｑ１２６Ｄバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＤＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２４）
ＩＬ−２  Ｑ１２６Ｍバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＭＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２５）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｉ／Ｎ８８Ｇバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＩＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＧＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２６）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｉ／Ｎ８８Ｒバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＩＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＲＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２７）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｔ／Ｎ８８Ｒバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＴＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＲＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２８）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｉ／Ｎ８８Ｉバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＩＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＩＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２９）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｔ／Ｑ１２６Ｅバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＴＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＥＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３０）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｔ／Ｎ８８Ｒ／Ｑ１２６Ｅバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＴＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＲＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＥＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３１）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｔ／Ｑ１２６Ｌバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＴＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＬＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３２）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｔ／Ｎ８８Ｒ／Ｑ１２６Ｌバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＴＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＲＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＬＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３３）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｎ／Ｑ１２６Ｅバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＮＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＥＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３４）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｒ／Ｑ１２６Ｅバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＲＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＥＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３５）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｙ／Ｑ１２６Ｅバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＹＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＥＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３６）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｑバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＱＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３７）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｈバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＨＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３８）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｄバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＤＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３９）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｐバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＰＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４０）
ＩＬ−２  Ｄ２０Ｔ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｋバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＴＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＩＫＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４１）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｎ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｋバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＮＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＩＫＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４２）
ＩＬ−２  Ｌ１９Ｒ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｋバリアント配列
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＲＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＩＫＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４３）
ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４４）
エフェクター機能が低減／消失したヒトＩｇＧ１−Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４５）
エフェクター機能が低減／消失し、半減期が延長されたヒトＩｇＧ１−Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４６）
エフェクター機能が低減／消失し半減期が延長されたヒトＩｇＧ１−Ｆｃ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４７）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４８）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＳ（配列番号４９）
ペプチドリンカー配列
ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号５０）
ペプチドリンカー配列
ＧＳＳＧＴ（配列番号５１）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５２）
ペプチドリンカー配列
ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号５３）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５５）
ペプチドリンカー配列
ＧＳ（配列番号５６）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＳ（配列番号５７）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＳＧ（配列番号５９）
ペプチドリンカー配列
ＳＧＧＧ（配列番号６０）
ペプチドリンカー配列
ＧＳＧＳ（配列番号６１）
ペプチドリンカー配列
ＧＳＧＳＧＳ（配列番号６２）
ペプチドリンカー配列
ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号６３）
ペプチドリンカー配列
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号６４）
ペプチドリンカー配列
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号６５）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６６）
ペプチドリンカー配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６７）
ヒトＩＬ−２Ｒα  ｓｕｓｈｉドメイン配列
ＥＬＣＤＤＤＰＰＥＩＰＨＡＴＦＫＡＭＡＹＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲＲＩＫＳＧＳＬＹＭＬＣＴＧＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲＮＴＴＫＱＶＴＰＱＰＥＥＱＫＥＲＫＴＴＥＭＱＳＰＭＱＰＶＤＱＡＳＬＰＧＨＣＲＥＰＰＰＷＥＮＥＡＴＥＲＩＹＨＦＶＶＧ  ＱＭＶＹＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰＡＥＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ（配列番号６８）
Ｐ−０２５０
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６９）
Ｐ−０３０５
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７０）
Ｐ−０２５４
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＲＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ  （配列番号７１）
Ｐ−０３６３
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＴＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７２）
Ｐ−０３６４
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＥＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７３）
Ｐ−０３６５
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ
ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＮＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７４）
Ｐ−０３６６
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＱＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７５）
Ｐ−０３６７
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＳＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７６）
Ｐ−０３６８
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＹＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７７）
Ｐ−０２５２
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＩＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７８）
Ｐ−０３７２
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＹＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７９）
Ｐ−０３７３
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＮＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８０）
Ｐ−０３７４
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＲＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８１）
Ｐ−０２５３
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＧＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８２）
Ｐ−０３０２
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Ｐ−０３７５
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Ｐ−０４１２
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Ｐ−０３０６
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Ｐ−０３１９
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ＩＬ−２  Ｄ２０Ｅ／Ｓ１２５Ｉバリアント配列
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ＩＬ−２  Ｄ２０Ｔ／Ｓ１２５Ｉバリアント配列
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ＩＬ−２  Ｌ１９Ｙ／Ｓ１２５Ｉ／Ｑ１２６Ｅバリアント配列
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Ｐ−０４２３
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Ｐ−０４２４
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Ｐ−０６１６
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Ｐ−０６７２  Ｋｎｏｂ−Ｆｃ鎖
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Ｐ−０６７３  Ｋｎｏｂ−Ｆｃ鎖
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Ｐ−０６７４
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＨＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＩＥＳＩＩＳＴＬＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１１）
生体内半減期が延長されたＫｎｏｂ−Ｆｃドメイン
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生体内半減期が延長されたＨｏｌｅ−Ｆｃドメイン
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Ｐ−０５１１
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Ｐ−０５１２
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Ｐ−０５１４
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Ｐ−０５８２
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Ｐ−０５８３
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Ｐ−０５８４
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Ｐ−０５８５
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Ｐ−０５８６
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Ｐ−０６１６
ａｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｃｔｔｔｔｔｃｔｔｇｔｇｇｃｔａｔｔｔｔａａａａｇｇｔｇｔｃｃａｇｔｇｔｇａｔａａｇａｃｔｃａｃａｃｔｔｇｃｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｃａｇａｇｇｃｃｇｃｔｇｇｃｇｃｔｃｃｔｔｃｃｇｔｃｔｔｔｃｔｇｔｔｃｃｃａｃｃｔａａｇｃｃａａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｔａｇｇａｃａｃｃａｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｃｇｔｇｇｔｇｇａｔｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃａｇａｇｇｔｇａａａｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇａｇｔｃｇａｇｇｔｃｃａｃａａｃｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃａａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｔｔｃｃａｃａｔａｃａｇａｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｔｃａａｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａａｔｇｃａａｇｇｔｃａｇｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃａａｔｃｇａｇａａｇａｃａａｔｔｔｃｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｔａｇｇｇａｇｃｃａｃａａｇｔｇｔａｔａｃｔｃｔｇｃｃｔｃｃｔｔｃｔａｇｇｇａｃｇａｇｃｔｇａｃａａａｇａａｃｃａａｇｔｇｔｃｔｃｔｇａｃｔｔｇｔｃｔｇｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａａｔｇｇｇａｇｔｃｃａａｔｇｇａｃａｇｃｃａｇａｇａａｔａａｃｔａｔａａｇａｃｔａｃａｃｃｔｃｃａｇｔｃｃｔｃｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇａａｇｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｃｔｃｃａａｇｃｔｃａｃｔｇｔｇｇａｔａａｇｔｃｔａｇｇｔｇｇｃａａｃａａｇｇｃａａｃｇｔｃｔｔｃａｇｃｔｇｔａｇｃｇｔｃａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｃｃａｃｇｃｔｃａｃｔａｃａｃｔｃａｇａａｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｃｔｃｃｇｇａｇｇａｇｇａｔｃｃｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃａｃｔａａｇａａｇａｃａｃａｇｃｔｃｃａａｃｔｇｇａｇｃａｔｃｔｇｃｔｃｃａｔｇａｔｃｔｇｃａｇａｔｇａｔｔｃｔｇａａｃｇｇｃａｔｔａａｃａａｃｔａｔａａａａａｔｃｃａａａｇｃｔｇａｃｔａｇｇａｔｇｃｔｇａｃｔｔｔｔａａｇｔｔｃｔａｃａｔｇｃｃａａａｇａａａｇｃｃａｃａｇａｇｃｔｇａａａｃａｃｃｔｃｃａｇｔｇｃｃｔｃｇａｇｇａａｇａａｃｔｇａａｇｃｃａｃｔｃｇａｇｇａｇｇｔｇｃｔｇａａｃｃｔｃｇｃｃｃａｇｔｃｃａａｇａａｔｔｔｃｃａｔｃｔｇａｇｇｃｃａａｇｇｇａｔｃｔｇａｔｃａｇｃａａｃａｔｃａａｃｇｔｃａｔｔｇｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇａａａｇｇｃａｇｃｇａｇａｃｔａｃｔｔｔｃａｔｇｔｇｃｇａｇｔａｃｇｃｃｇａｔｇａｇａｃａｇｃｔａｃａａｔｃｇｔｇｇａｇｔｔｃｃｔｃａａｔａｇｇｔｇｇａｔｃａｃａｔｔｃａｔｃｇａａａｇｃａｔｃａｔｔａｇｃａｃａｃｔｇａｃａ（配列番号２２２）
【図１Ａ−１Ｃ】
2021528105.tif 000013
【図１Ｄ−１Ｅ】
2021528105.tif 000014
【図２】
2021528105.tif 000015
【図３】
2021528105.tif 000016
【図４−１】
2021528105.tif 000017
【図４−２】
2021528105.tif 000018
【図５−１】
2021528105.tif 000019
【図５−２】
2021528105.tif 000020
【図６−１】
2021528105.tif 000021
【図６−２】
2021528105.tif 000022
【図７】
2021528105.tif 000023
【図８−１】
2021528105.tif 000024
【図８−２】
2021528105.tif 000025
【図９】
2021528105.tif 000026
【図１０】
2021528105.tif 000027
【図１１−１】
2021528105.tif 000028
【図１１−２】
2021528105.tif 000029
【図１２】
2021528105.tif 000030
【図１３】
2021528105.tif 000031
【図１４】
2021528105.tif 000032
【図１５】
2021528105.tif 000033
【図１６】
2021528105.tif 000034
【図１７−１】
2021528105.tif 000035
【図１７−２】
2021528105.tif 000036
【図１８−１】
2021528105.tif 000037
【図１８−２】
2021528105.tif 000038
【図１９−１】
2021528105.tif 000039
【図１９−２】
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【図２０】
2021528105.tif 000041
【図２１】
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【図２２】
2021528105.tif 000043
【図２３】
2021528105.tif 000044
【図２４】
2021528105.tif 000045
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021528105.tif 000047
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