(57)【要約】  ＶＳＩＧ３に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物、ならびにポリクローナルおよびモノクローナル抗体および化合物を製造および使用する方法が本明細書に記載される。ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物を導入することによって、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節することを含む方法もまた、本明細書に記載される。【選択図】図９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節することを含む方法であって、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との前記相互作用を調節する化合物を導入することを含む、方法。
【請求項２】
ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との前記相互作用の前記調節が、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との前記相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との前記相互作用を調節することが、ＶＩＳＴＡもしくはＶＳＩＧ３またはその両方の多量体化を調節することを含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ＶＩＳＴＡが細胞の表面上で発現され、
ＶＳＩＧ３が細胞の表面上で発現され、または
ＶＩＳＴＡおよびＶＩＳＧ３の両方が細胞の表面上で発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が抗ＶＳＩＧ３抗体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体と同じＶＳＩＧ３エピトープに結合する抗体、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体、を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＶＳＩＧ３抗体が、
前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の重鎖可変領域、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、請求項５または６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＶＳＩＧ３抗体が、
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の重鎖可変領域のうちの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の軽鎖可変領域のうちの１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗ＶＳＩＧ３抗体が、前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が抗ＶＩＳＴＡ抗体をさらに含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が抗原結合フラグメントを含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記化合物がＶＳＩＧ３ポリペプチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物がＶＳＩＧ３の可溶性フラグメントを含む、請求項１２または１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物がＶＳＩＧ３の細胞外領域を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が配列番号２を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が融合タンパク質を含む、請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物がＦｃドメインを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が配列番号３を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物がＶＩＳＴＡポリペプチドを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物が、配列番号４、配列番号５、または配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物がＶＩＳＴＡの可溶性フラグメントを含む、請求項２０または２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がＶＩＳＴＡの細胞外領域を含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が配列番号５を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が融合タンパク質を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物がＦｃドメインを含む、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が配列番号６を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）のコイルドコイルドメインを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＯＭＰがラットＣＯＭＰまたはヒトＣＯＭＰである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記コイルドコイルドメインが、五量体コイルドコイルドメインである、請求項２８または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記コイルドコイルドメインが、ＶＳＩＧ３ポリペプチドもしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその両方に共有結合している、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物がリンカードメインを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記リンカードメインが、ＮＳＧＧＧＳＧＧＧＴＧ（配列番号１３）もしくはＬＤＲＮＬＰＰＬＡＰＬＧＰ（配列番号１４）またはその両方を含む、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記化合物がアルカリホスファターゼを含む、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物がＴＥＶ切断部位を含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物がＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との結合を阻害する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物がＶＩＳＴＡシグナル伝達を阻害する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物がＶＳＩＧ３シグナル伝達を阻害する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物が、ＣＤ３誘導性ＩＬ−２産生、ＣＤ３誘導性インターフェロン−γ産生、ＣＤ３誘導性ＲＡＮＴＥＳ産生、ＣＤ３誘導性ＭＩＰ−１アルファ産生、ＣＤ３誘導性ＩＬ−１７産生、もしくはＣＤ３誘導性ＣＸＣＬ１１産生、またはそれらの組み合わせに影響を及ぼす、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物がＴ細胞増殖に影響を及ぼす、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法が、治療有効量の前記化合物で対象を処置することをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ＶＳＩＧ３が、前記対象から得られた生物学的試料内に過剰発現される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＶＳＩＧ３に結合するモノクローナル抗体。
【請求項４４】
前記抗体が、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用、ＶＳＩＧ３−ＶＳＩＧ８相互作用、ＶＳＩＧ３の多量体化、もしくはＶＩＳＴＡの多量体化、またはそれらの組み合わせをブロックする、請求項４３に記載の抗ＶＳＩＧ３抗体。
【請求項４５】
前記抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体と同じＶＳＩＧ３エピトープに結合する抗体、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体、を含む、請求項４３または４４のいずれかに記載の抗ＶＳＩＧ３抗体。
【請求項４６】
抗ＶＳＩＧ３抗体が、
前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の重鎖可変領域、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の抗ＶＳＩＧ３抗体。
【請求項４７】
抗ＶＳＩＧ３抗体が、
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の重鎖可変領域のうちの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の軽鎖可変領域のうちの１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の抗ＶＳＩＧ３抗体。
【請求項４８】
抗ＶＳＩＧ３抗体が、前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体を含む、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の抗ＶＳＩＧ３抗体。
【請求項４９】
前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項５０】
表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の重鎖可変領域、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、モノクローナル抗体。
【請求項５１】
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の重鎖可変領域の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、モノクローナル抗体。
【請求項５２】
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の各々、または
表前記２Ａのクローンのうちの１つによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲの各々、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域のＣＤＲの各々、および前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲの各々、を含む、モノクローナル抗体。
【請求項５３】
表２Ａのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と少なくとも８０％同一である、または
表２Ａのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％同一である、または
表２Ａのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％同一であり、かつ表２Ａのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％同一である、アミノ酸配列、を含む、モノクローナル抗体。
【請求項５４】
前記抗体がＶＳＩＧ３に結合する、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５５】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ抗体を含む、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５６】
前記モノクローナル抗体が、ＶＳＩＧ３のＶＳＩＧ３リガンドへの結合を阻害する、請求項４９〜５５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５７】
前記モノクローナル抗体が、ＶＳＩＧ３のＶＩＳＴＡへの結合を阻害する、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５８】
前記モノクローナル抗体が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、もしくはＦｖフラグメント、またはそれらの組み合わせを含む抗原結合フラグメントを含む、請求項４９〜５７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５９】
請求項４３〜５８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗ＶＳＩＧ３抗体を含む組成物。
【請求項６０】
請求項４３〜５８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗ＶＳＩＧ３抗体を含むキット。
【請求項６１】
ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物。
【請求項６２】
抗ＶＳＩＧ３抗体を含む、請求項６１に記載の化合物。
【請求項６３】
前記抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体と同じＶＳＩＧ３エピトープに結合する抗体、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体、を含む、請求項６２に記載の化合物。
【請求項６４】
抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の重鎖可変領域、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６５】
抗ＶＳＩＧ３抗体が、
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の重鎖可変領域の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、または
前記表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６６】
抗ＶＳＩＧ３抗体が、表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体を含む、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６７】
前記化合物が抗原結合フラグメントを含む、請求項６２〜６６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６８】
前記化合物が、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との結合を阻害する、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６９】
前記化合物が、ＶＳＩＧ３の多量体化を調節する、請求項６１〜６８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７０】
前記化合物がＶＩＳＴＡシグナル伝達を阻害する、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７１】
前記化合物がＶＳＩＧ３シグナル伝達を阻害する、請求項６１〜７０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７２】
前記化合物が、ＣＤ３誘導性ＩＬ−２産生、ＣＤ３誘導性インターフェロン−γ産生、ＣＤ３誘導性ＲＡＮＴＥＳ産生、ＣＤ３誘導性ＭＩＰ−１アルファ産生、ＣＤ３誘導性ＩＬ−１７産生、またはＣＤ３誘導性ＣＸＣＬ１１産生、またはそれらの組み合わせに影響を及ぼす、請求項６１〜７１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７３】
前記化合物がＴ細胞増殖に影響を及ぼす、請求項６１〜７２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７４】
前記化合物がＶＳＩＧ３ポリペプチドを含む、請求項６１〜７３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７５】
前記化合物が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項７４に記載の化合物。
【請求項７６】
前記化合物が、ＶＳＩＧ３の可溶性フラグメントを含む、請求項７４または７５に記載の化合物。
【請求項７７】
前記化合物が、ＶＳＩＧ３の細胞外領域を含む、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７８】
前記化合物が配列番号２を含む、請求項７７に記載の化合物。
【請求項７９】
前記化合物が融合タンパク質を含む、請求項７７〜７８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８０】
前記化合物がＦｃドメインを含む、請求項７４〜７９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８１】
前記化合物が配列番号３を含む、請求項８０に記載の化合物。
【請求項８２】
前記化合物がＶＩＳＴＡポリペプチドを含む、請求項６１〜８１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８３】
前記化合物が、配列番号４、配列番号５、または配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項８２に記載の化合物。
【請求項８４】
前記化合物が、ＶＩＳＴＡの可溶性フラグメントを含む、請求項８２または８３に記載の化合物。
【請求項８５】
前記化合物が、ＶＩＳＴＡの細胞外領域を含む、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８６】
前記化合物が配列番号５を含む、請求項８５に記載の化合物。
【請求項８７】
前記化合物が融合タンパク質を含む、請求項６１〜８６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８８】
前記化合物がＦｃドメインを含む、請求項６１〜８７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８９】
前記化合物が配列番号６を含む、請求項８８に記載の化合物。
【請求項９０】
前記化合物が、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）のコイルドコイルドメインを含む、請求項６１〜８９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９１】
前記ＣＯＭＰがラットＣＯＭＰまたはヒトＣＯＭＰである、請求項９０に記載の化合物。
【請求項９２】
前記コイルドコイルドメインが五量体コイルドコイルドメインである、請求項９０または９１のいずれかに記載の化合物。
【請求項９３】
前記コイルドコイルドメインが、ＶＳＩＧ３ポリペプチドもしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその両方に共有結合している、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９４】
前記化合物がリンカードメインを含む、請求項９３に記載の化合物。
【請求項９５】
前記リンカードメインが、ＮＳＧＧＧＳＧＧＧＴＧ（配列番号１３）もしくはＬＤＲＮＬＰＰＬＡＰＬＧＰ（配列番号１４）またはその両方を含む、請求項９４に記載の化合物。
【請求項９６】
前記化合物がアルカリホスファターゼを含む、請求項９０〜９５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９７】
前記化合物がＴＥＶ切断部位を含む、請求項９０〜９６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９８】
前記化合物が、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との結合を阻害する、請求項６１〜９７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９９】
請求項６１〜９８のいずれかに記載の化合物を含む組成物。
【請求項１００】
請求項６１〜９８のいずれか１項に記載の化合物を含むキット。
【請求項１０１】
請求項６１〜９８のいずれか１項に記載の治療有効量の化合物で対象を処置することを含む、方法。
【請求項１０２】
ＶＳＩＧ３が、前記対象から得られた生物学的試料内に過剰発現される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
少なくとも１つの抗ＶＳＩＧ３抗体が表２Ａのクローンによって産生される抗体を含む、２つ以上の抗ＶＳＩＧ３抗体を含む組成物。
【請求項１０４】
それぞれの抗ＶＳＩＧ３抗体が、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ８相互作用、ＶＳＩＧ３の多量体化、およびＶＩＳＴＡの多量体化のうちの１つ以上をブロックする、請求項１０３に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記２つ以上の抗ＶＳＩＧ３抗体が異なるエピトープに結合する、請求項１０３または１０４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０６】
前記抗ＶＳＩＧ３抗体のうちの少なくとも１つが、ＶＳＩＧ３のＡＢＥ  Ｉｇ面と相互作用する、請求項１０３〜１０５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０７】
前記抗ＶＳＩＧ３抗体のうちの少なくとも１つが、ＶＳＩＧ３のＧＦＣ  Ｉｇ面と相互作用する、請求項１０３〜１０６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０８】
抗ＶＳＩＧ３抗体および抗ＶＩＳＴＡ抗体を含む組成物であって、
ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ８相互作用、ＶＳＩＧ３の多量体化、もしくはＶＩＳＴＡの多量体化、またはそれらの組み合わせをブロックし、
前記抗ＶＳＩＧ３抗体が表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体を含む、組成物。
【請求項１０９】
多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、もしくは多量体化ＶＳＩＧ８、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項１１０】
免疫原で免疫することによって生成されるポリクローナル抗体であって、前記免疫原がポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、表３Ａに記載されるポリペプチドのうちの１つ以上を含む、ポリクローナル抗体。
【請求項１１１】
免疫原で免疫することによって生成されるポリクローナル抗体であって、前記免疫原がポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、表３Ａに記載されるポリペプチドのうちの１つ以上からなる、ポリクローナル抗体。
【請求項１１２】
免疫原で免疫することによって生成されるポリクローナル抗体であって、前記免疫原がポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが表３Ａに記載のポリペプチドからなる、ポリクローナル抗体。
【請求項１１３】
ポリペプチドで免疫することによって生成されたポリクローナル抗体であって、前記ポリペプチドが表３Ａに記載のペプチドからなる、ポリクローナル抗体。
【請求項１１４】
前記ポリクローナル抗体がＶＳＩＧ３に結合する、請求項１１０〜１１３のいずれか一項に記載のポリクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月２日に出願された米国仮出願第６２／６２５，５９４号、および２０１８年２月７日に出願された米国仮出願第６２／６２７，４７８号の利益を主張し、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
この出願には、４５キロバイトのサイズを有し、かつ２０１９年１月１７日に作成された「０５４１−０００００７ＷＯ０２−ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するＡＳＣＩＩテキストファイルとして米国特許商標局に電子的に提出された配列表が含まれる。配列表の電子出願により、電子的に提出された配列表は、３７  ＣＦＲ§１．８２１（ｃ）が要求するハードコピーと、§１．８２１（ｅ）が要求するＣＲＦの両方の役割を果たす。配列表に含有された情報は、参照により本願明細書に組み込まれており、提出された国際出願における開示を超えるものではない。
技術分野
本発明は、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物ならびにその製造および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞活性化のＶ領域免疫グロブリン含有サプレッサー（本明細書では「ＶＩＳＴＡ」と呼ばれ、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー、ＰＤ−１Ｈ、Ｇｉ２４、Ｄｉｅｓ１、ＤＤ１α、またはＢ７−Ｈ５としても知られる）は、Ｔ細胞抑制を媒介するレセプターであることが報告されている。
【発明の概要】
【０００４】
１つの態様において、本開示は、ＶＩＳＴＡおよび「３を含有するＶセットおよび免疫グロブリンドメイン」（本明細書中では、「ＶＳＩＧ３」または「ＶＳＩＧ−３」と呼ばれ、ＩＧＳＦ１１としても知られる）の相互作用を調節する化合物、ならびにＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物を導入することによってＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節することを含む方法を記載する。ＶＳＩＧ３は上皮細胞および内皮細胞に発現する接着タンパク質であり、大腸癌、腸癌、肝細胞癌でアップレギュレートされている（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６：４９８）。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３は、ＶＩＳＴＡリガンドである。いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡはＶＳＩＧ３リガンドである。
【０００５】
いくつかの実施形態では、方法は、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＶＩＳＴＡまたはＶＳＩＧ３またはその両方の多量体化を調節することを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物は、ＶＳＩＧ３に対する抗体、ＶＳＩＧ３ポリペプチド、ＶＩＳＴＡポリペプチド、または軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）のコイルドコイルドメイン、またはそれらの組合せを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＶＩＳＴＡシグナル伝達およびＶＳＩＧ３シグナル伝達のうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｔ細胞増殖および／またはＴ細胞シグナル伝達（例えば、ＣＤ３誘導効果を含む）に影響を及ぼし得る。
【０００８】
別の態様では、本発明は、治療有効量の化合物で対象を処置することを記載する。
【０００９】
さらなる態様において、本開示は、モノクローナル抗体を含むＶＳＩＧ３に対する抗体を記載する。
【００１０】
さらなる態様において、本開示は、抗ＶＳＩＧ３抗体を含む組成物を記載する。さらなる態様では、本開示は、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および多量体化ＶＳＩＧ８を含む組成物を記載する。
【００１１】
さらなる態様において、本開示は、表３Ａに記載されるＶＳＩＧ３免疫原に対して産生されたポリクローナル抗体を記載する。
【００１２】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、目的の特定の抗原標的に免疫特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子をいう。したがって、用語「抗体」は、全長抗体および／またはその変異体、そのフラグメント（断片）、ペプチボディおよびその変異体、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに抗体またはその特定のフラグメントもしくは一部（単鎖状抗体およびそのフラグメントを含む）の構造および／または機能を模倣する抗体模倣物を含むが、これらに限定されない。標的への抗体の結合は、そのような結合が、少なくとも１つの標的活性もしくは結合を調節、減少、増加、アンタゴナイズ、アゴナイズ、鎮静、緩和、ブロック、阻害、排除、および／または干渉する場合、またはインビトロ、インサイチュ、および／またはインビボで、受容体活性もしくは結合を有する場合など、しかしこれらに限定されない、様々な効果を引き起こすことができる。従って、本発明の抗体は、生物学的分子（例えば、抗原またはレセプター）またはその部分に結合し得る抗体フラグメントを包含し、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｐＦｃ’、Ｆｄ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、単一鎖状可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）；ダイアボディまたは二価ダイアボディ；直鎖状抗体；単一鎖状抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。
【００１３】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原性部位に対して方向付けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられた異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して方向付けられる。モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリン産生細胞によって汚染されていないハイブリドーマ細胞によって合成され得る。あるいは、モノクローナル抗体は、例えば、モノクローナル抗体をコードする重鎖状および軽鎖状遺伝子で安定にまたは一時的にトランスフェクトされた細胞によることを含む、組換え的に産生され得る。
【００１４】
修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような、上で定義した抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の操作を必要とするものと解釈されるべきではない。いくつかの実施形態では、用語「モノクローナル」は、本明細書では、抗体が操作された方法ではなく、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む細胞のクローン集団に由来する抗体を指す。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「単離された」とは、その元の環境（例えば、天然に存在する場合、天然の環境）から除去された物質をいい、したがって、その天然の状態から「人間の手によって」改変される。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「室温」は、１６℃〜２６℃であり、または１８℃〜２４℃であることがより好ましい。いくつかの実施形態において、「室温」は、２０℃〜２２℃である。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書中で議論される場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドに対して少なくとも４０パーセント（％）、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるか否かは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）のような（しかし、これらに限定されない）当該分野で公知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを使用して決定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９のローカルホモロジーアルゴリズムを使用して、２つのシーケンス間のホモロジーの最良のセグメントを見つける。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、同一性のパーセンテージが、参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列中のアミノ酸の総数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、パラメータが設定される。
【００１８】
「結合親和性」または「親和性結合」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原または抗原エピトープ）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は、解離定数（ＫＤ）によって表され、これは、一般に、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から市販されているＢＩＡＣＯＲＥバイオセンサを使用して、当該分野で公知の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、ＶＳＩＧ３に対するそれらの結合親和性に関して記載され得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、解離定数（ＫＤ）が５×１０−６Ｍ以下、１×１０−６Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下、１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、１×１０−１２Ｍ以下、５×１０−１３Ｍ以下、１×１０−１３Ｍ以下、５×１０−１４Ｍ以下、１×１０−１４Ｍ以下、５×１０−１５Ｍ以下、または１×１０−１５Ｍ以下である抗原と相互作用する抗体を含む。
【００１９】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト脊椎動物を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物、特にヒトである。対象は個体であってもよい。対象は、「個体」、「患者」、または「宿主」であってもよい。非ヒト脊椎動物には、家畜動物、コンパニオンアニマル、および実験動物が含まれる。非ヒト対象はまた、ヒト以外の霊長類ならびに、ラットまたはマウスなどの、しかしこれらに限定されないげっ歯類も含む。非ヒト対象には、ニワトリ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンク、およびウサギも含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「インビトロ」は、細胞内培養であり、「インビボ」は、対象の身体内である。
【００２１】
用語「好ましい」および「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利益を与え得る本発明の実施形態を指す。しかし、同じまたは他の状況下で、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを暗示しておらず、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図していない。
【００２２】
用語「含む」およびその変形は、これらの用語が記述および特許請求の範囲に現れる場合、限定的な意味を有しない。
【００２３】
特に明記しない限り、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および「少なくとも１つ」は、交換可能に使用され、１つまたは複数を意味する。
【００２４】
また、本明細書において、端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。値の範囲が、特定の値まで、または少なくとも特定の値までである場合、その値は、その範囲内に含まれる。
【００２５】
個別の工程を含む、本明細書で開示される任意の方法について、工程は、任意の実現可能な順序で実行されてもよい。また、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に行ってもよい。
【００２６】
明細書および特許請求の範囲において使用される成分、分子量等の量を表す全ての数字は、別段の記載がない限り、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるものである。従って、これに反するとの別段の記載がない限り、明細書および特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明により得られるべき所望の特性に応じて変化し得る近似である。最低限でも、また均等論を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、それぞれの数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、通常の四捨五入技法を適用することによって解釈されるべきである。
【００２７】
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の具体例に示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、全ての数値は、それらのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる範囲を本質的に含む。
【００２８】
全ての見出しは、読者の利便性のためであり、そのように指定されない限り、見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されるべきではない。
【００２９】
本明細書の全体を通して「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「いくつかの実施形態」等への言及は、実施形態と関連して記載される特定の特徴、構成、組成物、または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通した様々な箇所におけるこのような語句の出現は、必ずしも本開示の同じ実施形態を指すものではない。さらに、特定の特徴、構成、組成物、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方式で組み合わせられてもよい。
【００３０】
上記の本発明の要約は、本発明の各々の開示される実施態様、またはあらゆる実装形態を記載することを意図するものではない。以下の記述は、例示的な実施態様をより具体的に例示する。本出願全体を通していくつかの箇所において、実施例のリストを通してガイダンスが提供され、これらの実施例は、様々な組み合わせで使用することができる。各事例において、列挙されたリストは、代表的なグループとしてのみ役立ち、そして排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１Ａは、例示的な機能的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）結合アッセイにおいて組換えヒトＶＩＳＴＡ  Ｆｃキメラ（「ｒｈＶＩＳＴＡ」）に特異的に結合する組換えヒトＶＳＩＧ３  Ｆｃキメラ（「ｒｈＶＳＩＧ３」または「ＶＳＩＧ０３  ＩｇＧ１  Ｆｃ」）を示す。図１Ｂは、ｒｈＶＳＩＧ３およびｒｈＶＳＩＧ３タンパク質の結合に対する抗ＶＳＩＧ３抗体の効果の代表的な結果を示す。抗体アイソタイプ対照（□−白四角）は、ブロッキングを示さず；抗体クローン９９３８２０（○−白丸）は、０．３２μｇ／ｍＬのＥＤ５０でＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の結合の８％ブロッキングを示した。ＥＤ５０は、最大ブロッキングの５０％を回収するのに必要な抗体の濃度を反映している。
【図２】図２は、ｒｈＶＳＩＧ３のｒｈＶＩＳＴＡへの結合をブロッキングするポリクローナルウサギ抗ヒトＶＳＩＧ３ペプチド抗体についての代表的な結果を示す。ｒｈＶＳＩＧ３−ｒｈＶＩＳＴＡ相互作用は、ストレプトアビジン−ＨＲＰとそれに続く色彩反応を用いて検出した。抗体Ｉ２０５（○−白丸）はブロッキングを示さず；ウサギ抗体Ｇ１２９（●−黒丸）は、２．５９ｕｇ／ｍＬのＥＤ５０でＶＳＩＧ−３とＶＩＳＴＡとの間の結合を７０％ブロッキングすることを示した。ＥＤ５０は、最大ブロッキングの５０％を回収するのに必要な抗体の濃度を反映する。
【図３】図３は、例示的なウサギポリクローナル抗ヒトＶＳＩＧ３抗体が、活性化Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を阻害するＶＳＩＧ３タンパク質の能力を弱めることを示す。マウス抗ヒトＣＤ３抗体を９６ウェルプレート上に１μｇ／ｍＬで、２〜８℃にて一晩コーティングした。組換えヒトＶＳＩＧ３（ｒｈＶＳＩＧ３）タンパク質を、アッセイプレート上に連続希釈（○−白丸）または２０μｇ／ｍＬで固定化し、３７℃で３時間インキュベートした。連続希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＶＳＩＧ３（Ｎ６６）またはアイソタイプ対照（ウサギＩｇＧ）を添加し、２０μｇ／ｍＬのｒｈＶＳＩＧ３タンパク質と共に室温にて１〜２時間共インキュベートした。ヒトＴ細胞を、ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔヒトＣＤ３＋単離キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてヒトＰＢＭＣから単離し、単離したヒトＴ細胞を、このプレートに添加し（２×１０５／ウェル）、５％ＣＯ２の存在下、３７℃にて２４時間培養した。分泌されたＩＬ−２を、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、細胞培養上澄み液において測定した。抗体アイソタイプ対照、ウサギＩｇＧ（□−白四角）は、ＩＬ−２分泌に対するＶＳＩＧ３の効果のブロッキングを示さなかった；ポリクローナル抗体クローンＮ６６（△−三角）は、ＩＬ−２分泌に対するＶＳＩＧ３の効果のブロッキングを示した。
【図４】図４は、ｒｈＶＳＩＧ３タンパク質が、正常なヒト末梢血Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導性細胞増殖を阻害することができることを示す。この抑制は、モノクローナル抗ヒトＶＳＩＧ３抗体クローン９７３４０４および９９３６２０によって逆転することができる。モノクローナル抗体クローン７７４２０８は、Ｔ細胞の増殖に影響を示さず、陰性対照を表す。
【図５】図５は、例示的なモノクローナル抗ヒトＶＳＩＧ３抗体が、活性化Ｔ細胞からのインターフェロン−γ分泌を阻害するＶＳＩＧ３タンパク質の能力を弱めることを示す。マウス抗ヒトＣＤ３抗体を９６ウェルプレート上に１μｇ／ｍＬで、２〜８℃にて一晩コーティングした。組換えヒトＶＳＩＧ３（ｒｈＶＳＩＧ３）タンパク質を、アッセイプレート上に連続希釈（□−白四角）または２０μｇ／ｍＬで固定化し、３７℃で３時間インキュベートした。連続希釈モノクローナル抗ヒトＶＳＩＧ３（９７３４０４または９７３４２２クローン）を添加し、２０μｇ／ｍＬのｒｈＶＳＩＧ３タンパク質と共に室温にて１〜２時間共インキュベートした。ヒトＴ細胞を、ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ  ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞単離キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてヒトＰＢＭＣから単離した。単離したヒトＴ細胞（２×１０５／ウェル）をプレートに添加し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃にて２４時間培養した。分泌されたインターフェロン−γを、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥヒトインターフェロン−γＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、細胞培養上澄み液において測定した。モノクローナル抗体クローン９７３４０４（○−白丸）は、ＶＳＩＧ３のインターフェロン−γ分泌に対する効果のブロッキングが示された。しかし、モノクローナル抗体クローン＃９７３４２２（△−三角）は、インターフェロン−γ分泌に対するＶＳＩＧ３の効果の更なる向上を示した。
【図６】図６は、ラット軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ、残基２６−７２、中央）の五量体コイルドコイルドメインに融合したＶＩＳＴＡ（左側）、ＶＳＩＧ３、またはＶＳＩＧ８（右側）、続いて６×Ｈｉｓタグからの細胞外ドメインの概略図を示す。
【図７】図７は、ラット軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ、残基２６−７２、中央）の五量体コイルドコイルドメインに融合したＶＩＳＴＡ（左側）、ＶＳＩＧ３、またはＶＳＩＧ８（右側）、続いてアルカリホスファターゼ、フラグおよび６ｘＨｉｓタグの概略図を示す。リンカー残基を緑色で示す。アルカリホスファターゼは、ＡＶＥＸＩＳアッセイにおける酵素検出に使用することができ、総タンパク質は、抗ポリＨｉｓ抗体を使用して正規化することができる。
【図８Ａ】図８Ａは、ＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰ構築物：ＶＩＳＴＡ（１−１９５）−ＣＯＭＰ−ＡｌｋＰｈｏｓ−Ｆｌａｇ／Ｈｉｓ（配列番号７）およびＶＩＳＴＡ（１−１９５）−ＣＯＭＰ−Ｈｉｓ（配列番号８）の配列を示し；図８Ｂは、ＶＳＩＧ３−ＣＯＭＰ構築物：ＶＳＩＧ３（１−２４５）−ＣＯＭＰ−ＡｌｋＰｈｏｓ−Ｆｌａｇ／Ｈｉｓ（配列番号９）およびＶＳＩＧ３（１−２４５）−ＣＯＭＰ−Ｈｉｓ（配列番号１０）の配列を示し；図８Ｃは、ＶＳＩＧ８−ＣＯＭＰ構築物：ＶＳＩＧ８（１−２６３）−ＣＯＭＰ−ＡｌｋＰｈｏｓ−Ｆｌａｇ／Ｈｉｓ（配列番号１１）およびＶＳＩＧ８（１−２６３）−ＣＯＭＰ−Ｈｉｓ（配列番号１２）の配列を示す。
【図８Ｂ】図８Ａのつづきである。
【図８Ｃ】図８Ｂのつづきである。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｄは、単量体ＶＩＳＴＡおよび多量体ＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰを用いた表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるＶＩＳＴＡ−ＶＳＩＧ３相互作用の動態および親和性の概略図および定量を示す。図９Ａおよび図９Ｃは、抗ポリＨｉｓ抗体を用いてＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面上でＶＩＳＴＡ（図９Ａ）またはＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰ（図９Ｃ）が捕捉される、Ｂｉａｃｏｒｅ実験の概略図を示す。被分析物、ＶＳＩＧ３−Ｆｃが、０．２ｎＭ〜２０μＭの範囲の濃度で、捕捉されたＶＩＳＴＡ上に流される。図９Ｂおよび図９Ｄは、単量体ＶＩＳＴＡ−ＶＳＩＧ３−Ｆｃ相互作用（図９Ｂ）および多量体ＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰ−ＶＳＩＧ３−Ｆｃ相互作用（図９Ｄ）の１：１モデルを用いて得られたセンサグラムおよび動態適合を示す。捕捉された単量体ＶＩＳＴＡについて、ＶＳＩＧ３−Ｆｃ被分析物を０．２４７μＭ〜２０μＭの範囲で試験した。捕獲された多量体ＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰについて、ＶＳＩＧ３−Ｆｃ被分析物を０．２ｎＭから５００ｎＭの範囲で試験した。多量体ＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰは、ＶＳＩＧ３−Ｆｃの親和性が約１５０倍高く、これは主にオフレートの上昇によるものである。
【図９Ｂ】図９Ａのつづきである。
【図９Ｃ】図９Ｂのつづきである。
【図９Ｄ】図９Ｃのつづきである。
【図１０】図１０は、ＶＳＩＧ３に対するブロッキング抗体について試験するために改変された、例示的な親和性に基づく細胞外相互作用スクリーニング（ＡＶＥＸＩＳ）の概略図を示す。ＶＳＩＧ３−ＦｃをプロテインＡプレート上にコーティングし、ブロックし、ＶＳＩＧ３に対するモノクローナル抗体のパネルからの個々のｍＡｂと共にインキュベートした。五量体化ラット軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）へリックスとアルカリホスファターゼに結合したＶＩＳＴＡ外部ドメイン（ＥＣＤ）を添加し、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をアルカリホスファターゼ活性に基づいて測定した。
【図１１】図１１は、ＢｌｕｅＰｈｏｓ試薬を用いて測定されたＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックするＶＳＩＧ３に対する抗体についてのＡＶＥＸＩＳアッセイスクリーニングからの例示的な結果を示す。バックグランドを差し引いて、結果を６５０ｎｍでの吸光度を用いて定量した。試験した抗体は、ｒｈＶＳＩＧ３（１〜２４５）に対して産生されたマウスモノクローナルである。示されているのは、少なくとも３回の反復の６５０ｎｍ±標準偏差での平均吸光度である。バックグラウンドレベルに近いレベルまでブロックする抗体クローン７７４２０６および７７４２０８が、図１２〜図１４において陽性対照として使用された。
【図１２】図１２は、ＢｌｕｅＰｈｏｓ試薬を用いて測定されたＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックするＶＳＩＧ３に対する抗体についてのＡＶＥＸＩＳアッセイスクリーニングからの例示的な結果を示す。バックグランドを差し引いて、結果を６５０ｎｍでの吸光度を用いて定量した。試験した抗体は、ｒｈＶＳＩＧ３（１〜２４５）に対して産生されたマウスモノクローナルである。示されているのは、少なくとも３回の反復の６５０ｎｍ±標準偏差での平均吸光度である。抗体クローン７７４２０６および７７４２０８が陽性対照として使用され、バックグラウンドを赤い破線で示す。
【図１３】図１３は、ＢｌｕｅＰｈｏｓ試薬を用いて測定されたＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックするＶＳＩＧ３に対する抗体についてのＡＶＥＸＩＳアッセイスクリーニングからの例示的な結果を示す。バックグランドを差し引いて、結果を６５０ｎｍでの吸光度を用いて定量した。試験した抗体は、ｒｈＶＳＩＧ３（１〜２４５）に対して産生されたマウスモノクローナルである。示されているのは、少なくとも３回の反復の６５０ｎｍ±標準偏差での平均吸光度である。抗体クローン７７４２０６および７７４２０８が陽性対照として使用され、バックグラウンドを赤い破線で示す。
【図１４】図１４は、ＢｌｕｅＰｈｏｓ試薬を用いて測定されたＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックするＶＳＩＧ３に対する抗体についてのＡＶＥＸＩＳアッセイスクリーニングからの例示的な結果を示す。バックグランドを差し引いて、結果を６５０ｎｍでの吸光度を用いて定量した。試験した抗体は、ｒｈＶＳＩＧ３（１〜２４５）に対して産生されたマウスモノクローナルである。示されているのは、少なくとも３回の反復の６５０ｎｍ±標準偏差での平均吸光度である。抗体クローン７７４２０６および７７４２０８が陽性対照として使用され、バックグラウンドを赤い破線で示す。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ２に対する抗体が陰性対照として使用され、相互作用の崩壊は示されなかった。
【図１５】図１５は、ＶＳＩＧ３  ＣＯＭＰがＴ細胞の増殖および活性化をブロックすることを示す。ｒｈＶＳＩＧ３は、正常ヒト末梢血Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導性ＣＤ２５アップレギュレーションおよび増殖を部分的に阻害することができ、一方、ＶＳＩＧ３−ＣＯＭＰは、抗ＣＤ３誘導性ＣＤ２５発現および増殖を完全に阻害することができる。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ｒｈＶＩＳＴＡが、正常なヒト末梢血Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導性増殖を阻害することができ、かつこの阻害を、抗ヒトＶＳＩＧ３抗体（９９３６２０）によって逆転することができることを示す。組換えヒトＶＳＩＧ８（ｒｈＶＳＩＧ８）タンパク質も抗ＣＤ３誘導性増殖を抑制できるが、ＶＳＩＧ３特異的抗体はこの抑制に影響しない。図１６Ｂは、ｒｈＶＩＳＴＡが、正常ヒト末梢血Ｔ細胞上で抗ＣＤ３誘導性ＣＤ２５発現を阻害することができ、かつこの阻害を、抗ヒトＶＳＩＧ３抗体（９９３６２０）によって逆転することができることを示す。ｒｈＶＳＩＧ８タンパク質は抗ＣＤ３誘導性ＣＤ２５発現も抑制できるが、ＶＳＩＧ３特異的抗体はこの抑制に影響しない。図１６Ｃは、ｒｈＶＩＳＴＡが、正常ヒト末梢血Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導性ＣＤ２５アップレギュレーションおよび増殖を阻害することができることを示す。この抑制は、アイソタイプ対照抗体（左上）の添加によって影響されなかったが、増殖（左の上下）は、ＶＳＩＧ３モノクローナル抗体９７３４０４の添加によって部分的に回復した。Ｔ細胞活性化の別の指標であるＣＤ２５発現（右の上下）は、ｒｈＶＩＳＴＡの存在下で同様に阻害され、この阻害は、ＶＳＩＧ３抗体の添加により部分的に逆転した。
【図１６Ｂ】図１６Ａのつづきである。
【図１６Ｃ】図１６Ｂのつづきである。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜図１７Ｄは、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用および関連化合物の複合体の例示的な概略モデルを示す。図１７Ａは、４：２の分子化学量論を有するＶＩＳＴＡ−ＶＳＩＧ３複合体を示す。図１７Ｂは、ＶＳＩＧ３−ＶＳＩＧ８ヘテロダイマーを含むＶＩＳＴＡ−ＶＳＩＧ３複合体を示す。図１７Ｃは、ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴ複合体の化学量論を示す。図１７Ｄは、ＰＤＬ１−ＰＤ１またはＰＤＬ２−ＰＤ１複合体の化学量論を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａのつづきである。
【図１７Ｃ】図１７Ｂのつづきである。
【図１７Ｄ】図１７Ｃのつづきである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本開示は、「Ｖ−Ｓｅｔおよび３を含有する免疫グロブリンドメイン」（本明細書では、「ＶＳＩＧ３」または「ＶＳＩＧ−３」と呼ばれ、ＩＧＳＦ１１としても知られる）に特異的に結合することができる抗体および多量体化タンパク質を含む化合物；例えば、ＶＳＩＧ３とＴ細胞活性化のＶ領域免疫グロブリン含有サプレッサー（本明細書では、「ＶＩＳＴＡ」とも呼ばれ、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー、ＰＤ−１Ｈ、Ｇｉ２４、Ｄｉｅｓ１、ＤＤ１α、またはＢ７−Ｈ５としても知られる）との間の相互作用を含む、ＶＳＩＧ３とその結合パートナーとの間の相互作用をブロッキングすることができる化合物；本明細書に記載の化合物を含む組成物；ならびにこれらの化合物および組成物を作製および使用する方法を記載する。
【００３３】
ＶＩＳＴＡはＴ細胞抑制を仲介するレセプターである。ＶＳＩＧ３はＶＩＳＴＡのための結合パートナーとして、Ｔ細胞寛容の維持に役割を果たしている可能性が高い。さらに、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用は、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、および／またはＴ細胞サイトカインまたはケモカイン産生に対して抑制作用を有する。したがって、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡの相互作用を阻害する化合物は、例えば、免疫反応の増加を含む免疫調節の変化を可能にし得る。
【００３４】
米国仮出願第６２／３７０，３９５号（２０１６年８月３日出願）およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３１４号（そのそれぞれが本明細書中に参照により組み込まれる）に以前に記載されているように、そして本明細書中にさらに記載されるように、ＶＳＩＧ３は、ＶＩＳＴＡのための結合パートナーとして特定され、そして特徴付けられている。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３はＶＩＳＴＡリガンドである。いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡはＶＳＩＧ３リガンドである。
【００３５】
本明細書および２０１６年８月３日に出願された米国仮出願第６２／３７０，３９５号、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３１４号にさらに記載されるように、中和抗体または他の化合物によるＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡ相互作用の遮断は、腫瘍および感染症の処置に効果的である場合があり、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡ相互作用を促進または増強するＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストは、自己免疫性、アレルギー性、および炎症性兆候、ＧＶＨＤ、移植、またはＴ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、もしくはサイトカイン産生の抑制が所望される他の兆候の処置に有用である場合がある。
【００３６】
ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡの相互作用を調節する化合物およびその使用方法
いくつかの態様において、本発明は、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物を記載する。いくつかの実施形態において、化合物は、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用を調節するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＳＩＧ３の多量体化の調節を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＩＳＴＡの多量体化の調節を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＩＳＴＡシグナル伝達またはＶＳＩＧ３シグナル伝達、またはその両方の阻害を含むことができる。例えば、相互作用の調節は、細胞増殖、サイトカイン産生、およびケモカイン産生のうちの少なくとも１つに対するＶＳＩＧ３またはＶＩＳＴＡの下流効果を増強または破壊することを含んでもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、化合物は、本明細書にさらに記載されるように、例えば、モノクローナル抗ＶＳＩＧ３抗体を含む抗ＶＳＩＧ３抗体を含んでもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、化合物は、抗ＶＩＳＴＡ抗体を含んでもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＶＳＩＧ３ポリペプチド、ＶＩＳＴＡポリペプチド、融合タンパク質、またはコイルドコイルドメイン、またはそれらの組合せを含んでもよい。いくつかの実施形態では、化合物はＦｃドメインを含んでもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態において、化合物は、ＶＳＩＧ３の可溶性フラグメントおよび／またはＶＳＩＧ３の細胞外領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、化合物は、ＶＩＳＴＡの可溶性フラグメントおよび／またはＶＩＳＴＡの細胞外領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、化合物は、表１の配列のうちの少なくとも１つによってコードされるタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、化合物は、表１の配列の少なくとも１つに対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するようにコードされるタンパク質を含んでもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本化合物は、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、または多量体化ＶＳＩＧ８、またはその組み合わせを含んでもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態において、化合物は、例えば、ＣＤ３誘導性ＩＬ−２産生、ＣＤ３誘導性インターフェロン−γ産生、ＣＤ３誘導性ＲＡＮＴＥＳ産生、ＣＤ３誘導性ＭＩＰ−１アルファ産生、ＣＤ３誘導性ＩＬ−１７産生、および／またはＣＤ３誘導性ＣＸＣＬ１１産生を含むＴ細胞シグナル伝達に影響する場合がある。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｔ細胞増殖に影響を及ぼす場合がある。理論に拘束されることを望むものではないが、ＶＩＳＴＡおよび／またはＶＳＩＧ３は、これらのＣＤ３誘導効果を阻害することができると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、化合物は、その阻害を逆転させることができる。
【００４３】
本発明はさらに、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物を導入することによって、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節することを記載する。例えば、対象は、治療有効量の化合物で処置されてもよい。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３は、対象から得られた生物学的試料内に過剰発現される場合がある。
【００４４】
抗体
いくつかの実施形態では、本開示は、ＶＳＩＧ３に結合する抗体（すなわち、抗ＶＳＩＧ３抗体）を記載する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＶＳＩＧ３（ｈＶＳＩＧ３）に結合する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、表２Ａに列挙されるハイブリドーマ細胞株（本明細書ではクローンとも呼ばれる）によって、および／または組換え方法によって産生されるモノクローナル抗体を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、表３Ａに列挙されるポリクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、表３Ａに列挙されるペプチド免疫原を使用して産生されたポリクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、ペプチド免疫原は、システイン修飾を伴う表３Ａに列挙される配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチド免疫原は、システイン修飾を伴わない表３Ａに列挙される配列を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、抗体は単離された抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、タンパク質Ａ−もしくはＧ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって単離または精製されてもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、ＶＳＩＧ３ポリペプチドを認識する。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３ポリペプチドは、ヒトＶＳＩＧ３（配列番号１；Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ５ＤＸ２１；遺伝子ＩＤ：１５２４０４）またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３ポリペプチドは、マウスＶＳＩＧ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号：Ｐ０Ｃ６７３；遺伝子ＩＤ：２０７６８３）またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、非還元ＶＳＩＧ３ポリペプチドを認識する。
【表１】
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【００４９】
いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、任意のタイプの分子の抗体への共有結合によって修飾またはコンジュゲートされる抗体の誘導体を含んでもよい。このような抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、毒素、または細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合によって修飾された抗体が含まれる。多数の化学修飾のいずれも、ツニカマイシンの特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、および代謝合成を含むが、これらに限定されない公知の技法によって実行することができる。さらに、誘導体は１つ以上の非古典的なアミノ酸を含有していてもよい。
【００５０】
ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、当該分野で周知の技法によって、検出可能なマーカーに直接的または間接的に結合されてもよい。検出可能なマーカーは、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段によって検出可能な薬剤である。有用な検出可能なマーカーには、蛍光染料、化学発光化合物、放射性同位元素、高電子密度試薬、酵素、補酵素、着色粒子、ビオチン、またはジオキシゲニンが含まれるが、これらに限定されない。検出可能なマーカーは、しばしば、放射能、蛍光、色彩、または酵素活性などの測定可能なシグナルを生成する。検出可能な薬剤にコンジュゲートされた抗体は、診断または治療目的のために使用されてもよい。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、様々な陽電子放出断層撮影法を用いた陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、当該分野で公知の技法を使用して、例えば、当該分野で公知のリンカーのような中間体を介して、抗体に直接的または間接的のいずれかで結合またはコンジュゲートされ得る。例えば、診断用途のための抗体への金属イオンのコンジュゲーションを記載している米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウムベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、およびフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェリン、エクオリンなどが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、および９７Ｒｕが挙げられる。このような治療部分を抗体にコンジュゲートさせるための技法は周知である。
【００５１】
これらのハイブリドーマ細胞株の子孫または誘導体によって産生されるモノクローナル抗体、当量または類似のハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体、および／またはそれらから作製される組換え誘導体もまた、本発明に含まれる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、例えば、ウサギＢ細胞由来モノクローナル抗体を含む組換え誘導モノクローナル抗体を含む。
【００５２】
無傷の抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖状可変領域（本明細書中ではＶＨと略される）および２つの軽（Ｌ）鎖状可変領域（本明細書中ではＶＬと略される）を有する。ＶＨおよびＶＬ領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができ、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域に散在する。ＦＲおよびＣＤＲの程度は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、および  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照のこと）。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００５３】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体と同じ重鎖を有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体と同じ軽鎖を有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体と同じ重鎖および同じ軽鎖を有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、上記で特定された重鎖および／または軽鎖において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むことができ、ここで、アミノ酸置換は、ＶＳＩＧ３への抗体の結合に実質的に影響を及ぼさない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローン化のうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体と同じＶＨドメインを有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローン化のうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体と同じＶＬドメインを有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体と同じＶＨドメインおよび同じＶＬドメインを有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、抗体のＶＳＩＧ３への結合に実質的に影響を及ぼさない、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を、上記で特定されたＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン中に含有することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローン化のうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲを有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲを有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローン化のうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲを有するモノクローナル抗体を含む。
【００５６】
さらに、またはあるいは、いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲを有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローン化のうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲを有するモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローン化のうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲを有するモノクローナル抗体を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＶＳＩＧ３への抗体の結合に実質的に影響を及ぼさない、上記で特定された１つ以上のＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むことができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、１つ以上のフレームワーク領域（ＦＲ）に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、置換またはフレームワーク領域（ＦＲ）における置換は、ＶＳＩＧ３への抗体の結合に実質的に影響を及ぼさない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体のＶｌドメインの少なくとも３つのＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、抗ＶＳＩＧ３抗体は、表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体と同じＶＳＩＧ３エピトープに結合する抗体を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、抗体は、表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むことができ、置換は、ＶＳＩＧ３への抗体の結合および／または抗体の機能に実質的に影響を及ぼさない。
【００６７】
いくつかの実施形態において、抗ＶＳＩＧ３抗体は、ＶＳＩＧ３のＡＢＥ  Ｉｇ面と相互作用する抗体を含む（図１７〜１８）。いくつかの実施形態において、抗ＶＳＩＧ３抗体は、ＶＳＩＧ３のＧＦＣ  Ｉｇ面と相互作用する抗体を含む（図１７〜１８）。
【００６８】
抗体は、任意の適切な種由来の抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体はマウス抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体はラット抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体はウサギ抗体であってもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体またはＩｇＧサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む）であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２ＣおよびＩｇＧ３のうちの１つのマウスＩｇＧであってもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、またはＩｇＧ２Ｃのうちの１つのラットＩｇＧであってもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、抗体はカッパ軽鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態では、該抗体は、ラムダ軽鎖を含んでもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、および／またはＦｖフラグメントを含む抗原結合フラグメントを含む。
【００７２】
モノクローナル抗体は、任意の適切な技法によって得られる場合がある。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、組換えＤＮＡ方法によって作製されてもよく、ファージディスプレイによって産生されてもよく、かつ／またはコンビナトリアル方法によって産生されてもよい。ＶＳＩＧ３に結合する抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定され得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立つ場合がある。いったん単離されるとＤＮＡは、宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ）、または免疫グロブリンタンパク質をそうでなければ産生しない骨髄腫細胞を含む）にトランスフェクトするか、またはゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いる）によって宿主細胞の中へと導入されて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る場合がある。ＶＳＩＧ３に結合する抗体をコードするＤＮＡは、例えば、抗体をヒト化するように修飾される場合がある。
【００７３】
いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体であってもよい。ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、任意の適切な方法によってヒト化され得る。ヒト化モノクローナル抗体を産生するための技法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２８４４に見出される場合がある。例えば、抗体のヒト化は、ヒトにおいて使用される場合、抗体の免疫原性を減少させるための抗体に対する変化を含む場合がある。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合するヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む場合がある。ＶＳＩＧ３に結合するヒト化抗体は、いくつかの実施形態において、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）を含む場合があり、ここで、受容者抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基は、ＶＳＩＧ３に結合する非ヒト種抗体（ドナー抗体）（マウス抗体、ラット抗体、またはウサギ抗体など）の１つ以上のＣＤＲ由来の残基によって置換される。いくつかの実施形態において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、ＶＳＩＧ３に結合する抗体由来の対応する非ヒト残基によって置換され得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体、すなわち、異なる部分が異なる動物種に由来する抗体を含む。キメラ抗体は、例えば、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的特異性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによって得られ得る。例えば、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：５４４を参照のこと。
【００７５】
いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異性または二機能性抗体を含む。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦ（ａｂ’）フラグメントの連結を含む種々の方法によって産生されてもよい。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７を参照のこと。さらに、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４）または「Ｊａｎｕｓｉｎ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５、Ｔｒａｕｎｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５１）として形成されてもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、抗体は、動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ウマ、ニワトリ、または七面鳥を含むが、これらに限定されない）によって産生され、動物からの細胞によって産生され、化学的に合成され、または組換え的に発現される。抗体は、免疫グロブリン分子の精製のための当該分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解性によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の通常の技法によって精製され得る。さらに、抗体は、本明細書に記載されるように、または、例えば、精製を容易にするためを含めて、別の方法で当技術分野で公知であるように、異種ポリペプチド配列に融合され得る。
【００７７】
モノクローナル抗体は、本明細書に記載の方法によって、および当技術分野で公知の任意の適切な方法によって、免疫特異的結合についてアッセイされてもよい。使用され得るイムノアッセイには、ＢＩＡＣＯＲＥ分析、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、イムノ拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Ａイムノアッセイなどの技法を使用する競合および／または非競合アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、ルーティンであり、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９９４）参照）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、ＶＳＩＧ３のＶＳＩＧ３リガンドまたはＶＳＩＧ３レセプターへの結合を阻害する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＶＳＩＧ３のＶＩＳＴＡへの結合を阻害する抗体を含む。いくつかの実施形態において、ＶＩＳＴＡは、ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号４；Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９Ｈ７Ｍ９；遺伝子ＩＤ６４１１５）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＶＳＩＧ３のＶＳＩＧ３リガンド（例えば、ＶＩＳＴＡを含む）への結合を、少なくとも１０パーセント（％）、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％低下させる場合がある。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、表２のハイブリドーマ細胞株（クローンまたは抗体クローンとも呼ばれる）のうちの少なくとも１つによって産生されるモノクローナル抗体を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、ＶＳＩＧ３の細胞外ドメインで動物を免疫することによって作製されてもよい。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、ヒトＶＳＩＧ３のアミノ酸１〜２４５（Ｕｎｉｐｒｏｔ数：Ｑ５ＤＸ２１；遺伝子ＩＤ：１５２４０４）で動物を免疫することによって作製されてもよい。いくつかの実施形態では、動物は哺乳動物であってもよい。例えば、動物は、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｔ）、ラマまたはラットであってもよい。いくつかの実施形態では、動物はニワトリであってもよい。
【００８１】
別の態様において、本開示は、単離されたポリヌクレオチド分子を記載する。いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子は、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子は、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチド分子は、抗体またはその相補体をコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントな条件」とは、第１のポリヌクレオチド分子が、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１ｍＭのＥＤＴＡ中の第２のフィルタ結合ポリヌクレオチド分子と６５℃にてハイブリダイズし、そして結合したままであり、続いて、０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中で、４２℃にて洗浄する（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、ｐ．２．１０．３を参照のこと）能力を指す。いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子は、ＣＤＲのうちの１つ以上または本発明のモノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖鎖状をコードするポリヌクレオチドを含む。免疫グロブリン可変ドメインおよび定常領域をクローニングおよび配列決定するための一般的な技法は周知である。例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３８３３を参照のこと。
【００８２】
別の態様において、本開示は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを記載する。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であってもよい。適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によってベクターに挿入されてもよい。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の手順によって、ベクター中の適切な制限エンドヌクレアーゼ部位の中へと挿入される。このような手順は、当業者の範囲内であると考えられる。多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、かつ市販されている。以下のベクターは、例として提供される。細菌ベクターには、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５が含まれる。真核生物ベクターには、例えば、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬが含まれる。しかしながら、任意の他のプラスミドまたはベクターが使用されてもよい。
【００８３】
さらなる態様において、本開示はまた、上述のベクターのうちの少なくとも１つを含む宿主細胞を含む。宿主細胞は、哺乳動物または昆虫細胞のような高等真核細胞、または酵母細胞のような低等真核細胞であってもよい。または、宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞、または植物細胞であってもよい。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、任意の適切な技術（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション）によって達成されてもよい。（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００８４】
本発明の抗体は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現されてもよい。無細胞翻訳系はまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパク質を産生するためにも使用されてもよい。原核および真核宿主と共に使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている。
【００８５】
また、本発明には、本発明の抗体から１つ以上の超可変領域を発現するファージディスプレイライブラリー、およびこのようなファージディスプレイライブラリーから得られるクローンも含まれる。ファージディスプレイライブラリーを用いて、抗体由来分子を産生する。抗体の抗原結合可変ドメインをコードする遺伝子セグメントは、バクテリオファージのコートタンパク質をコードする遺伝子に融合される。このような遺伝子融合体を含有するバクテリオファージは、バクテリアを感染させるために使用され、得られるファージ粒子は、バクテリオファージの外側に提示される抗原結合ドメインを有する、抗体融合タンパク質を発現するコートを有する。ファージディスプレイライブラリーは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから入手可能な、Ｐｈ．Ｄ．−７ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（カタログ番号Ｅ８１００Ｓ）またはＰｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（カタログ番号Ｅ８１１０Ｓ）を使用して調製され得る。例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ（１９９７）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．９７：３９１−４１０を参照のこと。
【００８６】
ハイブリドーマ細胞株
本開示はさらに、例えば、表２Ａのハイブリドーマ細胞株を含むモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株（本明細書では「クローン」または「抗体クローン」とも呼ばれる）を記載する。いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体は、ＶＳＩＧ３に結合する。いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体は、ＶＩＳＴＡへのＶＳＩＧ３の結合を阻害する。
【００８７】
ハイブリドーマ細胞株は、当業者によく知られた様々な技術によって得られ得る。例えば、所望の抗原で免疫された動物由来の細胞は、一般に骨髄腫細胞との融合によって不死化される（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１；  Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ  ｉｎ  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ  ５９−１０３（１９８６）；および  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐａｇｅ  ７２６（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂ．１９８８を参照のこと）。いくつかの実施形態では、免疫された動物は、好ましくは哺乳動物である。いくつかの実施形態において、免疫動物は、例えば、Ｗｉｓｔａｒラットを含むラット、または例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを含むマウスである。いくつかの実施形態では、動物由来の細胞は脾臓細胞である。いくつかの実施形態において、動物由来の細胞は、好ましくはリンパ球である。いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を含む。
【００８８】
モノクローナル抗体を産生する形質転換Ｂ細胞株を産生する他の公知の方法もまた、使用され得る。
【００８９】
組換え抗体
本開示は、組換え誘導モノクローナル抗体をさらに記載する。組換え由来のモノクローナル抗体は、例えば、ウサギＢ細胞由来のモノクローナル抗体を含み得る。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ファージディスプレイまたはコンビナトリアル法を含む任意の好適な組換え技法によって産生され得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；国際特許公開第９２／１８６１９号；同第９１／１７２７１号；同第９２／２０７９１号；同第９２／１５６７９号；同第９３／０１２８８号；同第９２／０１０４７号；同第９２／０９６９０号；または同第９０／０２８０９号を参照のこと。このような方法は、ヒトモノクローナル抗体を生成するために使用され得る。
【００９０】
抗ＶＳＩＧ３抗体に対する使用
本明細書中に記載されるように、ＶＳＩＧ３に結合する抗体は、任意の適切な適用のために使用され得る。例えば、モノクローナル抗体は、インビトロ診断およびインビボ診断の両方および治療方法において使用されてもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、抗体は、インビトロまたはインビボでのＶＳＩＧ３タンパク質の発現レベルを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、インビボまたはインビトロで細胞を標識するために使用され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、患者試料におけるＶＳＩＧ３タンパク質のレベル発現を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、患者試料は、哺乳動物癌細胞を含む場合がある。
【００９２】
いくつかの実施形態では、抗体は標識されてもよい。例えば、抗体は、細胞を標識するために使用されてもよく、また標識された細胞は、二次的な方法を介して直接的または間接的に画像化されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、対象由来の試料中のＶＳＩＧ３タンパク質の有無を特定するために、抗体を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３の存在を特定することは、対象由来の試料中のＶＳＩＧ３の量を特定することを含む場合がある。
【００９４】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用を調節するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＳＩＧ３の多量体化の調節を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＩＳＴＡの多量体化の調節を含むことができる。いくつかの実施形態においては、抗体は、ＶＳＩＧ３のＶＩＳＴＡとの相互作用をアゴナイズおよび／またはアンタゴナイズすることができる。このようなアゴニズムおよび／またはアンタゴニズムは、免疫療法効果を生成することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３またはＶＩＳＴＡ、あるいはその両方は、細胞の表面上で発現され得る。
【００９６】
本開示は、抗体を含むキットをさらに記載した。例えば、キットは、抗ＶＳＩＧ３モノクローナル抗体を含む組成物を含んでもよい。キット中の抗体は、本明細書中に記載されるように、１つ以上の検出可能なマーカーで標識されていてもよい。
【００９７】
キットは、本発明の１つ以上のモノクローナル抗体で満たされた１つ以上の容器を含んでもよい。さらに、キットは、緩衝剤および本発明を実施するために必要とされる溶液などの他の試薬も含んでもよく、これらも含まれる。任意選択で、そのような容器（複数可）には、通知または印刷されたインストラクションが関連付けられてもよい。本明細書で使用される「包装材料」という語句は、キットの中身を収容するために使用される１つ以上の物理的な構造を指し、包装材料は、好ましくは滅菌された汚染物質のない環境を提供するために、周知の方法によって構築される。本明細書で使用される「包装」という語は、ポリぺプチドを固定限度内に保持することができる、グラス、プラスチック、紙、箔などの固形マトリックスまたは材料を指す。
【００９８】
ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡの相互作用を調節する抗体および／または化合物を含む組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の抗体のうちの少なくとも１つ、および／または本明細書に記載のＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用を調節する化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物を記載する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、組成物はまた、例えば、ｐＨを許容可能な範囲に維持するのを助けるための緩衝剤、または微生物の増殖を遅延させるための保存剤も含んでもよい。組成物はまた、例えば、担体、賦形剤、安定剤、キレート剤、塩類、または抗菌剤も含んでもよい。許容される担体、賦形剤、安定剤、キレート剤、塩、保存剤、緩衝剤、または抗菌剤は、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；アジ化ナトリウム、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウムなどの防腐剤；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール；ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または非特異的免疫グロブリンなどのタンパク質；オリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリンを含む単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属複合体（例えば、亜鉛（Ｚｎ）−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
【０１００】
いくつかの実施形態では、組成物は医薬組成物であり、モノクローナル抗体および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。本明細書の教示に記載される抗体を含む医薬組成物の調製において、当業者に明らかであるように、種々のビヒクルおよび賦形剤が使用されてもよい。
【０１０１】
医薬組成物は、一般に、薬学的に許容可能な担体および薬理学的に有効量の抗体、または抗体の混合物を含む。
【０１０２】
医薬組成物は、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、エアロゾル、固体、丸薬、タブレット、カプセル、ゲル、局所クリーム、坐剤、経皮パッチ、および／または当技術分野で公知の別の剤型として製剤化されてもよい。
【０１０３】
本明細書中に記載される目的のために、抗体の薬学的に許容可能な塩は、有機および無機酸および／または塩基を含む、任意の当該分野で認識される薬学的に許容可能な塩を含むことが意図される。塩の例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、ならびに第一級、第二級および第三級アミン、メチル、エチルおよびプロピルなどの低級炭化水素のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。他の塩としては、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、サリチル酸などの有機酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、薬学的組成物を製剤化する際に当業者に公知の任意の標準的な薬学的に許容された担体を含む。例えば、抗体は、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水性エタノール水、またはグルコース、マンニトール、デキストラン、プロピレングリコール、油（例えば、植物油，動物油，合成油など）、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチン、ポリソルベート８０の溶液、または適切な賦形剤中の固形剤型を含む、薬学的に許容可能な希釈剤中の剤型として調製されてもよい。
【０１０５】
医薬組成物は、しばしば、１つ以上の緩衝液（例えば、中性緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、ショ糖またはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（グリシン、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソールなど）など）、静菌剤、キレート剤（ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、剤型を受容者の血と等張、低張または弱高張にする溶質、懸濁化剤、増粘剤および／または防腐剤をさらに含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【０１０６】
当業者に公知の任意の適切な担体を、本明細書に記載の抗体の少なくとも１つを含む組成物において使用してもよい。抗体組成物は、例えば、経口、鼻、粘膜、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、および筋肉内投与を含む、任意の適切な投与様式のために製剤化されてもよい。
【０１０７】
投与と処置
本開示の組成物は、選択された投与経路に適合した種々の形態の医薬品に製剤化することができる。当業者は、組成物が、投与の様式および投薬単位に依存して変化することを理解するであろう。例えば、非経口投与のために、等張生理食塩水が使用されてもよい。局所投与のために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの担体を含むクリーム、またはペプチドの活性をブロックまたは阻害しない局所クリーム中に典型的に見出される他の薬剤が使用されてもよい。他の好適な担体としては、アルコール、リン酸緩衝生理食塩水、および他の平衡塩類溶液が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物は、静脈内、局所、経口、皮下、腹腔内、および筋肉内送達を含むが、これらに限定されない、様々な方法で投与されてもよい。いくつかの態様において、本発明の化合物は、制御放出または持続放出のために製剤化されてもよい。いくつかの態様では、制御放出または持続放出のための剤型は、皮下移植に適している。いくつかの態様では、制御放出または持続放出のための剤型は、貼付剤を含む。化合物は、経腸投与のために製剤化されてもよく、例えば、カプセルまたはタブレットとして製剤化されてもよい。
【０１０８】
投与は単回投与としてであっても、複数回投与であってもよい。いくつかの実施形態では、用量は、本明細書に記載されるものを含むが、これに限定されない標準的な方法によって決定されるような有効量である。臨床試験の当業者は、標準的な研究を通して、特定の化合物の用量を最適化することができるであろう。さらに、組成物の適切な用量は、標準的な用量応答プロトコルを使用して、過度の実験なしに決定され得る。投与には、本添付の実施例に記載されている用量および投与スケジュール、投与間隔、および／または投与パターンのいずれかを含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
本開示による抗体を含む組成物は、例えば、経口、直腸、経鼻、局所（経皮、エアロゾル、頬側および／または舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、および／または静脈内を含む）、皮内、膀胱内、関節内、細動脈内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、吸入による、または病変内（例えば、腫瘍の中または周囲への注射による）を含むが、これらに限定されない任意の適切な手段によって投与されてもよい。
【０１１０】
水溶液での非経口投与に関しては、例えば、溶液は、必要な場合は適切に緩衝化し、希釈液を十分な生理食塩水またはグルコースでまず等張させる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適している。これに関して、使用され得る滅菌水系媒体は、当業者には公知であろう。用量のいくらかの変動は、処置される対象の状態に依存して必然的に生じることになる。いずれにしても、投与責任者が、個々の対象に適切な投与量を決定することになる。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、米国食品医薬品局によって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たすべきである。このような調製物は、発熱物質を含まない場合がある。
【０１１１】
放出される薬剤をカプセル化するポリマーまたはタンパク質微粒子、薬剤を投与するために局所に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）または局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）に使用され得る軟膏、ゲル、または溶液、および長期間にわたって制御放出を提供するパッチさえも含む、多くの好適な剤型が知られている。これらはまた、インプラントの形態をとってもよい。このようなインプラントは、腫瘍内に移植される場合がある。
【０１１２】
本発明の化合物はまた、凍結乾燥形態で提供され得る。このような組成物は、投与前に再構成するための緩衝液、例えば、重炭酸塩を含んでもよく、または緩衝液は、例えば、水で再構成するために凍結乾燥組成物中に含まれてもよい。凍結乾燥組成物は、適切な血管収縮剤、例えば、エピネフリンをさらに含んでもよい。凍結乾燥された組成物は、シリンジ内で提供されてもよく、場合により、再構成のための緩衝液と組み合わせて包装されてもよく、その結果、再構成された組成物は、直ちに患者に投与され得る。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、「処置する」または「処置」は、治療的および／または予防的処置を含んでもよい。本明細書中で使用される場合、「障害を処置する」は、絶対的な用語であることを意図されない。処置は、予後の改善または症状の頻度もしくは重症度の減少をもたらす場合がある。本明細書中で使用される場合、「治療的に有効である」濃度または量は、対象に対する何らかの向上または利益を提供する量である。処置の所望の効果は、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患のいずれかの直接的または間接的な病理学的結果の減少、疾患の進行の速度の減少、疾患状態の向上または緩和、ならびに寛解または予後の向上を含む。同様に、本明細書中で使用される場合、「予防する」という用語は、絶対的な用語として意図されない。その代わり、予防とは、発症の遅延、症状の頻度の低下、または障害に関連する症状の重症度の低下を指す。したがって、予防は、当業者によって理解される広範囲の予防手段を指す。状況によっては、症状の頻度および重症度を非病理学的量まで低下させる。いくつかの状況において、本発明の組成物を受容する個体の症状は、この障害を有する未処置の個体によって経験される症状として９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％のみの頻度または重症度である。
【０１１４】
治療有効濃度および量は、本明細書に記載されるような既知のインビトロおよびインビボ系において化合物を試験することによって、本明細書中の各適用について経験的に決定されてもよく、次いで、ヒトまたは他の動物についての用量は、それから推定されてもよい。
【０１１５】
正確な用量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、そして公知の試験プロトコルを使用して経験的に決定されてもよく、またはインビボもしくはインビトロ試験データからの推定によって決定されてもよいことが理解される。濃度および用量値はまた、緩和されるべき症状の重症度によって変化し得ることに留意されたい。任意の特定の対象について、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する人物の専門的判断に従って、具体的な投薬レジメンを経時的に調整すべきであり、また本明細書に記載の濃度範囲は単に例示的なものにすぎず、特許請求される組成物および方法の範囲または実施を限定することを意図しないことをさらに理解されたい。
【０１１６】
組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％に対する致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％に対して治療的に効果的な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＢ５０とＥＤ５０との間の比率で表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい場合がある。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を処方する際に使用される場合がある。このような組成物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある場合がある。投薬量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。厳密な処方、投与経路および用量は、患者の状態の視点から個々の医師によって選ばれてもよい。
【０１１７】
本明細書中に記載される組成物は、一度に投与されてもよく、または時間間隔で投与されるある数のより少ない用量に分割されてもよい。例えば、組成物は、繰り返し、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上の回数投与されてもよく、または連続注入によって投与されてもよい。正確な用量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、そして公知の試験プロトコルを使用して経験的に決定されてもよく、またはインビボもしくはインビトロ試験データからの推定によって決定されてもよいことが理解される。濃度および用量値はまた、緩和されるべき状態の重症度によって変化する場合があることに留意されたい。任意の特定の対象について、個々の必要性および組成物を投与する、もしくは投与を監督する人物の専門的判断に従って、具体的な投薬レジメンを経時的に調整すべきであり、また本明細書に記載の濃度範囲は単に例示的なものにすぎず、特許請求される組成物および方法の範囲または実施を限定することを意図しないことをさらに理解されたい。
【０１１８】
いくつかの治療用実施形態では、薬剤の「有効量」は、少なくとも１つの病理学的パラメータの減少をもたらす量である。したがって、例えば、本開示のいくつかの態様において、有効量は、薬剤で処置されていない個体におけるパラメータの予想される減少と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の減少を達成するのに有効な量である。
【０１１９】
本開示の方法のいくつかの態様において、方法は、１つ以上のさらなる治療薬剤の投与をさらに含む。本明細書に記載のモノクローナル抗体の投与の前、後、および／または投与と同時に、１つ以上のさらなる治療薬を投与してもよい。追加の治療薬は、例えば、化学療法、放射線療法などを含んでもよい。追加の治療薬は、別々に、または混合物もしくはカクテルの一部として投与されてもよい。本開示のいくつかの態様において、抗体の投与は、他の治療法単独の投与と比較した場合、他の治療法のより低い用量の有効性を可能にする場合があり、他の方法のより高い用量の投与で観察される毒性からの軽減を提供する。
【０１２０】
本開示の方法のいくつかの態様において、本明細書に記載されるような組成物および少なくとも１つのさらなる治療剤の投与は、治療的相乗効果を実証する。本開示の方法のいくつかの態様では、本明細書に記載の抗体および追加の治療薬剤の両方を投与した後に観察される処置に対する応答の測定は、抗体または追加の治療薬剤のいずれかを単独で投与した後に観察される処置に対する応答の同じ測定よりも改善される。
【０１２１】
ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストおよび／またはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストの特定および使用方法
ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用は、ＶＩＳＴＡとＶＩＳＩＧとの結合をアゴナイズおよび／またはアンタゴナイズするアゴニストまたはアンタゴニストを特定するため、および／またはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡ相互作用の作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズするために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡ相互作用は、Ｔ細胞免疫に対するＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡ相互作用である。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡ相互作用は、ＶＩＳＴＡシグナル伝達を含む。ある場合には、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、細胞増殖に対するＶＩＳＴＡの抑制効果を実質的に阻害または予防するであろう。特定の場合において、ＶＳＩＧ３および／またはＶＩＳＴＡアンタゴニストは、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用を実質的に阻害または予防する。ある場合には、ＶＳＩＧ３および／またはＶＩＳＴＡアンタゴニストは、ＣＤ３誘導性ＭＩＰ−１アルファ、ＣＤ３誘導性Ｒａｎｔｅｓ（ＣＣＬ５）、ＣＤ３誘導性ＣＸＣＬ１１、ＣＤ３誘導性インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａとしても知られる）産生の抑制をもたらすことになる。このような産生は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはＴ細胞において減少される場合がある。この抑制は、ＶＩＳＴＡおよび／またはＶＳＩＧ３を発現する細胞を用いたインビトロ細胞ベースのアッセイを使用して検出され得る。逆に、ある場合には、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストは、免疫に対するＶＩＳＴＡの抑制効果を実質的に強化または増強するであろう。この強化はまた、ＶＩＳＴＡおよび／またはＶＳＩＧ３を発現する細胞を用いた細胞ベースのアッセイを使用して、インビトロを使用しても検出することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズする。いくつかの実施形態において、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとのうちの少なくとも一方が細胞表面上で発現される場合、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズする。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、ＶＳＩＧ３の多量体化をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることができる。ＶＳＩＧ３の多量体化は、例えば、ＶＳＩＧ８を含む、ＶＳＩＧ３のホモ二量体化および／またはＶＳＩＧ３のヘテロ二量体化を含む場合がある。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、抗体を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、抗ＶＩＳＴＡ抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、抗ＶＳＩＧ３抗体を含む。
【０１２４】
ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストおよびＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストを、ヒトの治療に使用するために製剤化することができる。例えば、いくつかの場合において、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストを、１つ以上の好適な担体、賦形剤、安定剤、キレート剤、塩類、または抗菌剤と組合せて含む組成物を提供することができる。さらに、組成物中のＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、インビボ安定性を増強するように改変することができる。例えば、いくつかの場合において、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、１つ以上の所望の部分（ポリエチレングリコールポリマーなどの１つ以上の水溶性重合体など）に結合することができる。また、場合によっては、組成物は、２つ以上のＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストを含むこともできる。
【０１２５】
いくつかの場合において、自己免疫、アレルギーまたは炎症状態などの治療的に望ましい状態においてＴ細胞免疫を阻害するためのＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストを含有する組成物が提供される。このような組成物は、それを必要とする対象においてＴ細胞の活性化または増殖を抑制するのに効果的な量のＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストを含むことができる。例示的な自己免疫、炎症、およびアレルギー状態には、ＲＡなどの関節炎状態、乾癬性関節炎、強皮症、多発性硬化症、ループス、ＩＢＤ、ＩＴＰ、糖尿病、サルコイドーシス、アレルギー性喘息が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
他の場合において、Ｔ細胞免疫を促進し、そしてこれが治療的に望ましい状態（例えば、癌および感染性疾患の状態）を処置するために、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストを含む組成物が提供される。このような組成物は、それを必要とする対象（例えば、癌を有する対象）においてＴ細胞の活性化または増殖を促進するのに効果的な量の拮抗薬を含むことができる。
【０１２７】
ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、癌を処置するために使用される組成物内に提供することができる。癌には、黒色腫、リンパ腫、白血病、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、精巣癌、消化器癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌および皮膚癌を含むことができるが、これらに限定されない。また、出願人は、ＶＳＩＧ３が健常組織と比較して結腸癌組織および肝臓癌組織で高発現していることも発見した。従って、いくつかの場合において、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、結腸癌を処置するために使用される組成物内に提供することができる。また、いくつかの場合において、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストを、肝臓癌を処置するために使用される組成物内に提供することができる。ある場合には、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストを、ＰＢＭＣにおけるＭＩＰ−１アルファ、ランテス（ＣＣＬ５）、ＣＸＣＬ１１、およびＩＬ−１７分泌の抑制を防止するために、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用をブロッキングすることによって、癌を処置するために使用される組成物内に提供することができ、それは次に、Ｔ細胞、単球、樹状細胞およびマクロファージの癌組織への浸潤を可能にする。
【０１２８】
癌は、ＶＳＩＧ３および／またはＶＩＳＴＡを発現する癌または発現しない癌を含み、さらに、免疫、間質または疾患細胞によるＶＳＩＧ３および／またはＶＩＳＴＡ発現が抗腫瘍応答および抗侵襲性免疫応答を阻害する、非転移性または非浸潤性ならびに浸潤性または転移性癌、ならびに血管新生腫瘍を特徴とする癌を含む。
【０１２９】
ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストはまた、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、脳炎、疱疹、他の痘ウイルス、および他の既知のヒトウイルス、寄生性疾患、細菌性疾患、真菌または酵母関連疾患などのウイルス性疾患を含むがこれらに限定されない感染性疾患を処置するために使用される組成物内にも提供することができる。
【０１３０】
当然のことながら、本明細書中で特定される疾患の状態は、例示的であることが意図され、そして網羅的ではない。さらに、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストまたはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、同じまたは異なる組成物内で、同時にまたは異なる時に投与することができる他の治療薬と組み合わせることができる。例えば、ＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアゴニストもしくはＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡアンタゴニストは、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アゴニストもしくはアンタゴニスト、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、サイトカイン、サイトカインアゴニストもしくはアンタゴニスト、または別の受容体アゴニストもしくはアンタゴニストの投与を含む治療レジメン内で投与することができる。
【０１３１】
多量体化
理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶＳＩＧ３／ＶＩＳＴＡ相互作用は、多量体化複合体を含んでもよいと考えられる。例えば、図１７は、図９に示されるＢｉａｃｏｒｅによって測定されるような高親和性相互作用（約１７ｎＭ）と一致し、かつ図７および図１０に示される親和性に基づく細胞外相互作用スクリーニング（ＡＶＥＸＩＳ）相互作用アッセイに類似し、図１１〜図１４の結果を有する、予測される最小のＶＩＳＴＡ−ＶＳＩＧ３結合集合体を示す。この多量体相互作用はさらに、このような複合体の集合体が、抗ＶＳＩＧ３抗体の結合によってどのように破壊され得るかを例示する。ＡＶＥＸＩＳスクリーニングは、多量体化されたＶＩＳＴＡ外部ドメイン（ＥＣＤ）がＶＳＩＧ３  ＥＣＤのダイマーを結合できることを示したが、逆の状況では、ＶＩＳＴＡダイマーに対してペンタ−ＶＳＩＧ３をピッティングしても、結合事象のあるイベントは検出されなかった。
【０１３２】
理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、４つのＶＩＳＴＡ  ＥＣＤが２つのＶＳＩＧ３  ＥＣＤと係合する、ＶＩＳＴＡ分子とＶＳＩＧ３分子との間の４：２の化学量論を示唆する。この相互作用は、ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴ構成のＸ線構造解析によって捉えられた結合複合体を連想させ（Ｓｔｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：５３９９−５４０４）、これは、図１７Ｃに示されるように、安定に結合したＰＶＲとＴＩＧＩＴ  ＥＣＤの２：２化学量論を示す。ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴ複合体は、ＴＩＧＩＴの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインが、Ｉｇドメインβサンドイッチの「ＡＢＥ」または背面（これは、典型的には、７〜９個のβ−ストランド、標識Ａ−Ｇから構成される）を使用して、最初に、背中合わせの様式でホモ二量体として会合する必要があることを示す（Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９−３２０）。次いで、ＴＩＧＩＴ  ＥＣＤホモ二量体は、それぞれの向かい合わせの、または「ＧＦＣ」面相互作用を介して、一対のＰＶＲ  ＥＣＤを結合することができる。これらのＧＦＣ表面介在性Ｉｇドメイン相互作用は、Ｉｇドメインが結合するための最も一般的な方法であり、細胞表面免疫調節性レセプター間のほぼ全ての最小結合複合体において、Ｘ線構造解析（Ｓｔｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：５３９９−５４０４）、さらには抗体およびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６）によって捕捉されている。
【０１３３】
同様に、図１７Ｄは、ＰＤ−１と、そのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方との間の１：１結合複合体を示し、これらは、それぞれ、相互作用するＩｇ  ＥＣＤの同じ向かい合わせの面（またはＧＦＣ）を利用する（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６；  Ｌａｚａｒ−Ｍｏｌｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：１０４８３−１０４８８）。
【０１３４】
類推により、ＶＳＩＧ３は、最初に、図１７Ａに示されるような背中合わせ（ＡＢＥ面）のホモ二量体、またはおそらく、図１７Ｂに示されるようなＶＳＩＧ３−ＶＳＩＧ８ヘテロダイマーを形成し得る（両方が同じ細胞表面上に存在する場合）。ＶＳＩＧ３およびＶＳＩＧ８は、非常に類似したアーキテクチャを有するＩｇスーパーファミリータンパク質であり（それぞれのＥＣＤの両方は、一対のＩｇドメインを明らかにし、そのＮ−末端ドメインのみがＶＩＳＴＡ  ＥＣＤへの細胞間結合に関与することが予測される）、両クラスターは同一のＩｇサブファミリーに互いに近接しており、Ｉｇ免疫調節タンパク質の高感度配列に基づく分類から引き出している（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２１（５）：７６６−７７６）。ＶＳＩＧ３とＶＳＩＧ８との間のこの密接な配列および構造的関係は、それらのヘテロ二量体形成およびジョイントＶＩＳＴＡ結合を可能にすることができる。ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴで見られるように、中央のＶＳＩＧ３ホモ二量体は、図１７Ａおよび図１７Ｂに示されるように、向かい合わせの（またはＧＦＣ面）相互作用を通してＶＩＳＴＡ  ＥＣＤを係合する。しかしながら、ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴとは異なり、ＶＩＳＴＡはモノマーとしてＶＳＩＧ３と係合しているようには見えないが、おそらくそのＩｇ領域の中間における２０近い異例のアミノ酸挿入（ＶＩＳＴＡ  Ｉｇ  β−サンドイッチの折りたたみを不安定化させる（ｄｅｓｔａｂｌｉｚｅ）可能性がある）（Ｎｏｗａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２７６：６６−７９）は、それ自体が背中合わせのＶＩＳＴＡホモ二量体を介して安定化される必要があり、したがって、図１７Ａおよび図１７Ｂに示されるように、４つのＶＩＳＴＡ  ＥＣＤ（二対の背中合わせのホモ二量体における）が、それぞれの向かい合わせの相互作用でＶＳＩＧ３ホモ二量体（またはＶＳＩＧ３−ＶＳＩＧ８ヘテロダイマー）を把持するために最低限でも使用される。対照的に、図１７Ｃに示されるように、ＰＶＲは、従来のＩｇ構造を有するモノマーＥＣＤとして安定であり、したがって、ＴＩＧＩＴホモ二量体と係合するために２つのＰＶＲのみが必要とされる。
【０１３５】
従って、本明細書中にさらに記載されるように、ＶＳＩＧ３に対するブロッキング抗体は、いくつかの実施形態において、４：２のＶＩＳＴＡ−ＶＳＩＧ３複合体（または図１７Ａに示されるように、ＶＩＳＴＡ４−ＶＳＩＧ３２）の集合体を破壊し得る。
【０１３６】
多量体化ＶＳＩＧ３または多量体化ＶＩＳＴＡおよびその製造方法および使用方法
いくつかの実施形態では、本開示は、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および多量体化ＶＳＩＧ８；多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および多量体化ＶＳＩＧ８を作製する方法；ならびに多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および多量体化ＶＳＩＧ８を使用する方法を記載する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８は、コイルドコイルドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、コイルドコイルドメインは、五量体コイルドコイルドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、コイルドコイルドメインは、ＶＳＩＧ３、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８に共有結合してもよい。いくつかの実施形態では、コイルドコイルドメインは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）のコイルドコイルドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＯＭＰタンパク質は、ヒトタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＯＭＰタンパク質はラットタンパク質であってもよい。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８は、リンカードメインを含んでもよい。いくつかの実施形態において、リンカードメインは、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、または少なくとも１３アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、最高で１２個のアミノ酸、最高で１３個のアミノ酸、最高で１４個のアミノ酸、最高で１５個のアミノ酸、または最高で２０個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態において、リンカードメインは、ＮＳＧＧＧＳＧＧＧＴＧ（配列番号１３）またはＬＤＲＮＬＰＰＬＡＰＬＧＰ（配列番号１４）またはその両方を含んでもよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８は、アルカリホスファターゼを含んでもよい。アルカリホスファターゼは、親和性に基づくの細胞外相互作用スクリーニング（ＡＶＥＸＩＳ）アッセイにおける酵素的検出のために使用されてもよい。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡおよび／または多量体化ＶＳＩＧ８は、例えば、Ｈｉｓタグを含む、タンパク質タグを含んでもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８は、ＴＥＶ切断部位を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＴＥＶ切断部位は、ＧＳＥＮＬＹＦＱＧを含んでもよい。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８は、図８に開示される配列の各々の全部または一部を含み得る。
【０１４３】
理論に拘束されることを望むものではないが、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡと、およびＶＳＩＧ８とＶＩＳＴＡとの相互作用は、受容リガンド相互作用に典型的に見られる１：１の相互作用（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用）より大きい複合体ストイキオメトリーを示すと考えられる。例えば、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用は、４：２の化学量論を有する場合がある。したがって、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ３、およびＶＳＩＧ８の多量体化は、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間、またはＶＳＩＧ８とＶＩＳＴＡとの間の相互作用を複製し、破壊し、または検出を改善するのに役立つ可能性がある。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、多量体化タンパク質（例えば、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８）を用いて、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとまたはＶＳＩＧ８とＶＩＳＴＡとの相互作用を調節することができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ８とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＳＩＧ８とＶＩＳＴＡとの相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＳＩＧ３の多量体化の調節を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用の調節は、ＶＩＳＴＡの多量体化の調節を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ８およびＶＩＳＴＡの相互作用の調節は、ＶＩＳＴＡの多量体化の調節を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＶＳＩＧ８およびＶＩＳＴＡの相互作用の調節は、ＶＳＩＧ８の多量体化の調節を含むことができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡおよび／または多量体化ＶＳＩＧ８は、インビトロまたはインビボのスクリーニングアッセイで使用されてもよい。例えば、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８を用いて、ＶＳＩＧ３、ＶＩＳＴＡ、および／またはＶＳＩＧ８の結合パートナーをスクリーニングしてもよい。さらに、または代替として、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８を使用して、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用を調節する化合物をスクリーニングし；ＶＳＩＧ８およびＶＩＳＴＡの相互作用を調節する化合物をスクリーニングし；ＶＳＩＧ３のリガンドとのＶＳＩＧ３の相互作用を調節する化合物をスクリーニングし；またはＶＩＳＴＡのリガンドとのＶＩＳＴＡの相互作用を調節する化合物をスクリーニングしてもよい。いくつかの実施形態では、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８を使用して、ＶＩＳＴＡ／ＶＳＩＧ相互作用の結合親和性および動態を測定してもよい。いくつかの実施形態において、多量体は、ＶＳＩＧ３アゴニストおよび／またはＶＳＩＧ３アンタゴニストの開発および／または特徴付けにおいて使用することができる。いくつかの実施形態において、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡおよび／または多量体化ＶＳＩＧ８を使用して、非多量体化タンパク質を使用するスクリーニングアッセイと比較してスクリーニングアッセイにおける検出感度を増大させることができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８を使用して、ＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、および／またはＶＩＳＴＡシグナル伝達を調節してもよい。例えば、ＶＳＩＧ３多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８を用いて、例えばＴ細胞シグナル伝達またはＴ細胞増殖を含むＴ細胞に対するＶＳＩＧ３、ＶＳＩＧ８、またはＶＩＳＴＡの抑制効果を阻害または予防してもよい。さらに、または代替として、多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、および／または多量体化ＶＳＩＧ８を使用して、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの相互作用を阻害または予防してもよい。
【０１４７】
ある場合には、ＶＳＩＧ３−ＣＯＭＰおよび／またはＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰアンタゴニストは、例えば、ＣＤ３誘導性ＭＩＰ−１アルファ、ＣＤ３誘導性Ｒａｎｔｅｓ（ＣＣＬ５）、ＣＤ３誘導性ＣＸＣＬ１１、ＣＤ３誘導性インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａとしても知られる）産生を含む、ＣＤ３誘導性シグナル伝達の抑制をもたらすことになる。このようなＣＤ３誘導性シグナル伝達は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはＴ細胞において減少する場合がある。この抑制は、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ３および／またはＶＳＩＧ８を発現する細胞を用いたインビトロ細胞ベースのアッセイを使用して検出される場合がある。例えば、図１５に示されるように、ＶＳＩＧ３−ＣＯＭＰは、Ｔ細胞の増殖および活性化をブロックする。
【０１４８】
方法の実施形態
１．ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節することを含む方法であって、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物を導入することを含む方法。
【０１４９】
２．ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用の調節が、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることを含む、実施形態１の方法。
【０１５０】
３．ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節することが、ＶＩＳＴＡもしくはＶＳＩＧ３またはその両方の多量体化を調節することを含む、実施形態１または２のいずれかの方法。
【０１５１】
４．ＶＩＳＴＡが細胞の表面上で発現される、
ＶＳＩＧ３が細胞の表面上で発現される、または
ＶＩＳＴＡおよびＶＩＳＧ３の両方が細胞の表面上で発現される、
実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
【０１５２】
５．化合物が抗ＶＳＩＧ３抗体を含む、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
【０１５３】
６．抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つにより産生される抗体と同じＶＳＩＧ３エピトープに結合する抗体、または
表２Ａのクローンのうちの１つにより産生される抗体、を含む、実施形態５の方法。
【０１５４】
７．抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つ以上により産生される抗体の重鎖可変領域、または、
表２Ａのクローンのうちの１つ以上により産生される抗体の軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態５または６のいずれかの方法。
【０１５５】
８．抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つにより産生される抗体の重鎖可変領域の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、または、
表２Ａのクローンのうちの１つにより産生される抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態５〜７のいずれか１つの方法。
【０１５６】
９．抗ＶＳＩＧ３抗体が、表２Ａのクローンのうちの１つ以上により産生される抗体を含む、実施形態５〜８のいずれか１つの方法。
【０１５７】
１０．化合物がさらに抗ＶＩＳＴＡ抗体を含む、実施形態５〜９のいずれか１つの方法。
【０１５８】
１１．化合物が抗原結合フラグメントを含む、実施形態５〜１０のいずれか１つの方法。
【０１５９】
１２．化合物がＶＳＩＧ３ポリペプチドを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つの方法。
【０１６０】
１３．化合物が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つの方法。
【０１６１】
１４．化合物がＶＳＩＧ３の可溶性フラグメントを含む、実施形態１２または１３のいずれかの方法。
【０１６２】
１５．化合物がＶＳＩＧ３の細胞外領域を含む、実施形態１２〜１４のいずれか１つの方法。
【０１６３】
１６．化合物が配列番号２を含む、実施形態１５の方法。
【０１６４】
１７．化合物が融合タンパク質を含む、実施体１５または１６のいずれかの方法。
【０１６５】
１８．化合物がＦｃドメインを含む、実施形態１５〜１７のいずれか１つの方法。
【０１６６】
１９．化合物が配列番号３を含む、実施形態１８の方法。
【０１６７】
２０．化合物がＶＩＳＴＡポリペプチドを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つの方法。
【０１６８】
２１．化合物が配列番号４、配列番号５、または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態２０の方法。
【０１６９】
２２．化合物がＶＩＳＴＡの可溶性フラグメントを含む、上記実施形態２０または２１のいずれかの方法。
【０１７０】
２３．化合物がＶＩＳＴＡの細胞外領域を含む、実施形態２０〜２３のいずれかの方法。
【０１７１】
２４．化合物が配列番号５を含む、実施形態２３の方法。
【０１７２】
２５．化合物が融合タンパク質を含む、実施形態２０〜２４のいずれか１つの方法。
【０１７３】
２６．化合物がＦｃドメインを含む、実施形態２０〜２５のいずれか１つの方法。
【０１７４】
２７．化合物が配列番号６を含む、実施形態２６の方法。
【０１７５】
２８．化合物が軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）のコイルドコイルドメインを含む、実施形態１〜２７のいずれかの方法。
【０１７６】
２９．ＣＯＭＰがラットＣＯＭＰまたはヒトＣＯＭＰを含む、実施形態２８の方法。
【０１７７】
３０．コイルドコイルドメインが、五量体コイルドコイルドメインを含む、実施形態２８または２９のいずれかの方法。
【０１７８】
３１．コイルドコイルドメインがＶＳＩＧ３ポリペプチドまたはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその両方に共有結合される、実施形態２８〜３０のいずれか１つの方法。
【０１７９】
３２．化合物がリンカードメインを含む、実施形態３１の方法。
【０１８０】
３３．リンカードメインが、ＮＳＧＧＧＳＧＧＧＴＧ（配列番号１３）またはＬＤＲＮＬＰＰＬＡＰＬＧＰ（配列番号１４）またはその両方を含む、実施形態３２の方法。
【０１８１】
３４．化合物がアルカリホスファターゼを含む、実施形態２８〜３３のいずれか１つの方法。
【０１８２】
３５．化合物がＴＥＶ切断部位を含む、実施形態２８〜３４のいずれか１つの方法。
【０１８３】
３６．化合物がＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との結合を阻害する、実施形態１〜３５のいずれか１つの方法。
【０１８４】
３７．化合物がＶＩＳＴＡシグナル伝達を阻害する、実施形態１〜３６のいずれか１つの方法。
【０１８５】
３８．化合物がＶＳＩＧ３シグナル伝達を阻害する、実施形態１〜３７のいずれか１つの方法。
【０１８６】
３９．化合物が、ＣＤ３誘導性ＩＬ−２産生、ＣＤ３誘導性インターフェロン−γ産生、ＣＤ３誘導性ＲＡＮＴＥＳ産生、ＣＤ３誘導性ＭＩＰ−１アルファ産生、ＣＤ３誘導性ＩＬ−１７産生、もしくはＣＤ３誘導性ＣＸＣＬ１１産生、またはそれらの組み合わせに影響を与える、実施形態１〜３８のいずれかの方法。
【０１８７】
４０．化合物がＴ細胞増殖に影響を与える、実施形態１〜３９のいずれかの方法。
【０１８８】
４１．方法が、対象を治療有効量の化合物で処置することをさらに含む、実施形態１〜４０のいずれか１つの方法。
【０１８９】
４２．ＶＳＩＧ３が対象から得られた生物学的試料内に過剰発現される、実施形態４１の方法。
【０１９０】
抗体の実施形態
１．ＶＳＩＧ３に結合するモノクローナル抗体。
【０１９１】
２．抗体が、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用、ＶＳＩＧ３−ＶＳＩＧ８相互作用、ＶＳＩＧ３の多量体化、もしくはＶＩＳＴＡの多量体化、またはその組合せをブロックする、実施形態１の抗ＶＳＩＧ３抗体。
【０１９２】
３．抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つにより産生される抗体と同じＶＳＩＧ３エピトープに結合する抗体、または
表２Ａのクローンのうちの１つにより産生される抗体を含む、実施形態１または２のいずれかの抗ＶＳＩＧ３抗体。
【０１９３】
４．抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つ以上により産生される抗体の重鎖可変領域、または
表２Ａのクローンのうちの１つ以上により産生される抗体の軽鎖可変領域、
のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜３のいずれか１つの抗ＶＳＩＧ３抗体。
【０１９４】
５．抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つにより産生される抗体の重鎖可変領域の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、または
表２Ａのクローンのうちの１つにより産生される抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、
のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜４のいずれか１つの抗ＶＳＩＧ３抗体。
【０１９５】
６．抗ＶＳＩＧ３抗体が、表２Ａのクローンのうちの１つ以上により産生される抗体を含む、実施形態１〜５のいずれか１つの抗ＶＳＩＧ３防体。
【０１９６】
７．表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生されるモノクローナル抗体。
【０１９７】
８．表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の重鎖可変領域、または
表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の軽鎖可変領域、
のうちの少なくとも１つを含む、モノクローナル抗体。
【０１９８】
９．表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の重鎖可変領域の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、または
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、
のうちの少なくとも１つを含む、モノクローナル抗体。
【０１９９】
１０．表２Ａのクローンのうちの１つによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の各々、または
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲの各々、または
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域のＣＤＲの各々、および表２Ａのクローンのうちの１つによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲの各々、を含むモノクローナル抗体。
【０２００】
１３．表２Ａのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と少なくとも８０％同一であるか、または
表２Ａのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％同一であるか、または
表２Ａのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％同一であり、かつ表２Ａのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％同一である、アミノ酸配列、を含むモノクローナル抗体。
【０２０１】
１４．モノクローナル抗体がＶＳＩＧ３に結合する、実施形態７〜１３のいずれか１つのモノクローナル抗体。
【０２０２】
１５．モノクローナル抗体がＩｇＧ抗体を含む、実施形態７〜１４のいずれか１つのモノクローナル抗体。
【０２０３】
１６．モノクローナル抗体が、ＶＳＩＧ３リガンドへのＶＳＩＧ３の結合を阻害する、実施形態７〜１５のいずれか１つのモノクローナル抗体。
【０２０４】
１７．モノクローナル抗体が、ＶＩＳＴＡへのＶＳＩＧ３の結合を阻害する、実施形態７〜１６のいずれか１つのモノクローナル抗体。
【０２０５】
１８．モノクローナル抗体が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、もしくはＦｖフラグメント、またはその組み合わせを含む抗原結合フラグメントを含む、実施例７〜１７のいずれか１つの実施形態のモノクローナル抗体。
【０２０６】
１９．実施形態１〜１８のいずれか１つのモノクローナル抗体または抗ＶＳＩＧ３抗体を含む、組成物。
【０２０７】
２０．実施形態１〜１８のいずれか１つのモノクローナル抗体または抗ＶＳＩＧ３抗体を含むキット。
【０２０８】
化合物の実施形態
１．ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との相互作用を調節する化合物。
【０２０９】
２．抗ＶＳＩＧ３抗体を含む実施形態１の化合物。
【０２１０】
３．抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体と同じＶＳＩＧ３エピトープに結合する抗体、または
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体、を含む、実施形態２の化合物。
【０２１１】
４．抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の重鎖可変領域、または
表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体の軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜３のいずれか１つの化合物。
【０２１２】
５．抗ＶＳＩＧ３抗体が、
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の重鎖可変領域のうちの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、または
表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体の軽鎖可変領域のうちの１つ以上のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜４のいずれか１つの化合物。
【０２１３】
６．抗ＶＳＩＧ３抗体が、表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体を含む、実施形態１〜５のいずれか１つの化合物。
【０２１４】
７．化合物が抗原結合フラグメントを含む、実施形態２〜６のいずれか１つの化合物。
【０２１５】
８．化合物が、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との結合を阻害する、実施形態１〜７のいずれか１つの化合物。
【０２１６】
９．化合物が、ＶＳＩＧ３の多量体化を調節する、実施形態１〜８のいずれか１つの化合物。
【０２１７】
１０．化合物が、ＶＩＳＴＡのシグナル伝達を阻害する、実施形態１〜９のいずれか１つの化合物。
【０２１８】
１１．化合物が、ＶＳＩＧ３のシグナル伝達を阻害する、実施形態１〜１０のいずれか１つの化合物。
【０２１９】
１２．化合物が、ＣＤ３誘導性ＩＬ−２産生、ＣＤ３誘導性インターフェロン−γ産生、ＣＤ３誘導性ＲＡＮＴＥＳ産生、ＣＤ３誘導性ＭＩＰ−１アルファ産生、ＣＤ３誘導性ＩＬ−１７産生、もしくはＣＤ３誘導性ＣＸＣＬ１１産生、またはそれらの組み合わせに影響を与える、実施形態１〜１１のいずれか１つの化合物。
【０２２０】
１３．化合物がＴ細胞増殖に影響を与える、実施形態１〜１２のいずれか１つの化合物。
【０２２１】
１４．化合物がＶＳＩＧ３ポリペプチドを含む、実施形態１〜１３のいずれか１つの化合物。
【０２２２】
１５．化合物が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１４の化合物。
【０２２３】
１６．化合物が、ＶＳＩＧ３の可溶性フラグメントを含む、実施形態１４または１５の化合物。
【０２２４】
１７．化合物が、ＶＳＩＧ３の細胞外領域を含む、実施形態１４〜１６のいずれか１つの化合物。
【０２２５】
１８．化合物が配列番号２を含む、実施形態１７の化合物。
【０２２６】
１９．化合物が融合タンパク質を含む、実施形態１７〜１８のいずれか１つの化合物。
【０２２７】
２０．化合物がＦｃドメインを含む、実施形態１４〜１９のいずれか１つの化合物。
【０２２８】
２１．化合物が配列番号３を含む、実施形態２０の化合物。
【０２２９】
２２．化合物がＶＩＳＴＡポリペプチドを含む、実施形態１〜２１のいずれか１つの化合物。
【０２３０】
２３．化合物が、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、上記実施形態２２の化合物。
【０２３１】
２４．化合物が、ＶＩＳＴＡの可溶性フラグメントを含む、実施形態２２または２３の化合物。
【０２３２】
２５．化合物が、ＶＩＳＴＡの細胞外領域を含む、実施形態２２〜２４のいずれか１つの化合物。
【０２３３】
２６．化合物が配列番号５を含む、実施形態２５の化合物。
【０２３４】
２７．化合物が融合タンパク質を含む、実施形態１〜２６のいずれか１つの化合物。
【０２３５】
２８．化合物がＦｃドメインを含む、実施形態１〜２７のいずれか１つの化合物。
【０２３６】
２９．化合物が配列番号６を含む、実施形態２８の化合物。
【０２３７】
３０．化合物が、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）のコイルドコイルドメインを含む、実施形態１〜２９のいずれかの化合物。
【０２３８】
３１．ＣＯＭＰがラットＣＯＭＰまたはヒトＣＯＭＰを含む、実施形態３０の化合物。
【０２３９】
３２．コイルドコイルドメインが、五量体コイルドコイルドメインを含む、実施形態３０または３１のいずれかの化合物。
【０２４０】
３３．コイルドコイルドメインがＶＳＩＧ３ポリペプチドもしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその両方に共有結合される、実施形態３０〜３２のいずれか１つの化合物。
【０２４１】
３４．化合物がリンカードメインを含む、実施形態３３の化合物。
【０２４２】
３５．リンカードメインが、ＮＳＧＧＧＳＧＧＧＴＧ（配列番号１３）もしくはＬＤＲＮＬＰＰＬＡＰＬＧＰ（配列番号１４）またはその両方を含む、実施形態３４の化合物。
【０２４３】
３６．化合物がアルカリホスファターゼを含む、実施形態３０〜３５のいずれか１つの化合物。
【０２４４】
３７．化合物がＴＥＶ切断部位を含む、実施形態３０〜３６のいずれか１つの化合物。
【０２４５】
３８．化合物が、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ３との結合を阻害する、実施形態１〜３７のいずれか１つの化合物。
【０２４６】
３９．実施形態１〜３８のいずれかの化合物を含む、組成物。
【０２４７】
４０．実施形態１〜３８のいずれか１つの化合物を含む、キット。
【０２４８】
４１．治療有効量の実施形態１〜３８のいずれか１つの化合物で対象を処置することを含む、方法。
【０２４９】
４２．ＶＳＩＧ３が対象から得られる生物学的試料内に過剰発現される、実施形態４１の方法。
【０２５０】
組成物の実施形態
１．少なくとも１つの抗ＶＳＩＧ３抗体が表２Ａのクローンによって産生される抗体を含む、２つ以上の抗ＶＳＩＧ３抗体を含む組成物。
【０２５１】
２．各抗ＶＳＩＧ３抗体が、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ８相互作用、ＶＳＩＧ３の多量体化、ＶＩＳＴＡの多量体化の１つ以上をブロックする実施形態１の組成物。
【０２５２】
３．２つ以上の抗ＶＳＩＧ３抗体が異なるエピトープに結合する、実施形態１または２のいずれかの組成物。
【０２５３】
４．抗ＶＳＩＧ３抗体のうちの少なくとも１つがＶＳＩＧのＡＢＥ  Ｉｇ面と相互作用する実施体１〜３のいずれかの組成物。
【０２５４】
５．抗ＶＳＩＧ３抗体のうちの少なくとも１つがＶＳＩＧのＧＦＣ  Ｉｇ面と相互作用する実施体１〜４のいずれかの組成物。
【０２５５】
６．抗ＶＳＩＧ３抗体および抗ＶＩＳＴＡ抗体を含み、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ８相互作用、ＶＳＩＧ３の多量体化、もしくはＶＩＳＴＡの多量体化、またはそれらの組み合わせをブロックし、かつ抗ＶＳＩＧ３抗体が表２Ａのクローンのうちの１つ以上によって産生される抗体を含む、組成物。
【０２５６】
７．多量体化ＶＳＩＧ３、多量体化ＶＩＳＴＡ、もしくは多量体化ＶＳＩＧ８、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【０２５７】
ポリクローナル抗体の実施形態
１．免疫原で免疫することによって生成されるポリクローナル抗体であって、免疫原がポリペプチドを含み、ポリペプチドが、表３Ａに記載されるポリペプチドのうちの１つ以上を含む、ポリクローナル抗体。
【０２５８】
２．免疫原で免疫することによって生成されるポリクローナル抗体であって、免疫原がポリペプチドを含み、ポリペプチドが、表３Ａに記載されるポリペプチドのうちの１つ以上からなる、ポリクローナル抗体。
【０２５９】
３．免疫原で免疫することによって生成されるポリクローナル抗体であって、免疫原がポリペプチドを含み、ポリペプチドが表３Ａに記載のポリペプチドからなる、ポリクローナル抗体。
【０２６０】
４．ポリペプチドで免疫することによって生成されるポリクローナル抗体であって、ポリペプチドが表３Ａに記載のペプチドからなる、ポリクローナル抗体。
【０２６１】
５．ポリクローナル抗体がＶＳＩＧ３に結合する、実施形態１〜４のいずれか１つのポリクローナル抗体。
【０２６２】
本発明を以下の実施例により例示する。特定の実施例、材料、量、および手順は、本明細書に記載される本発明の範囲および趣旨に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
実施例
【０２６３】
別段の記載がない限り、以下の実施例における全てのインキュベーションは室温におけるものであり、全ての試薬、出発物質、および使用した溶媒は、商業的供給業者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯなど）から購入し、さらに精製することなく使用した。
【０２６４】
実施例１：モノクローナル抗体
組換えヒトＶＳＩＧ３  Ｆｃキメラ（「ｒｈＶＳＩＧ３」−配列番号３によってコードされる；表１を参照のこと）は、機能的ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、組換えヒトＶＩＳＴＡ  Ｆｃキメラ（「ｒｈＶＩＳＴＡ」−配列番号６によってコードされる；表１を参照のこと）に特異的に結合する。ｒｈＶＩＳＴＡを、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル上に、１００μＬの体積中２μｇ／ｍｌでコーティングした。ウェルを１％のＢＳＡでブロッキングした後、ビオチンで標識した様々な量のｒｈＶＳＩＧ３を添加した。ｒｈＶＳＩＧ３−ｒｈＶＩＳＴＡ相互作用に起因するプレートと結合したビオチン標識をストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。図１Ａに示されるように、ｒｈＶＩＳＴＡが、ウェルあたり１００μＬの体積中２μｇ／ｍＬでマイクロタイタープレートのウェル上に固定化される場合、最適な結合応答の５０％を生じるｒｈＶＳＩＧ３の濃度は、約０．２５μｇ／ｍＬである。非特異的結合を差し引き、全ての場合において、全シグナルの５％未満であった。
【０２６５】
モノクローナル抗ＶＳＩＧ３抗体を開発し、特異性を、２５０ｎｇ／ｍＬのＨｉｓタグ化ｒｈＶＳＩＧ３タンパク質を有するコーティングを用いた直接ＥＬＩＳＡ試験で試験した。表２のクローンによって産生された抗体の結果を、表２Ａの右端の列に示す。
【０２６６】
ｒｈＶＳＩＧ３−ｒｈＶＩＳＴＡ相互作用に対するモノクローナル抗ＶＳＩＧ３抗体（表２Ａのクローンのうちの１つによって産生される抗体を含む）の効果を試験するために、ＥＬＩＳＡプレートを、２〜８℃にて一晩、１００μＬの体積中２μｇ／ｍｌのｒｈＶＳＩＧ３でコーティングした。１％のＢＳＡでブロッキングした後、様々な量のｍｓ×ヒトＶＳＩＧ３を添加し、室温で２時間前処置した。ビオチン化ｒｈＶＩＳＴＡタンパク質を、１００μＬの体積中７．５μｇ／ｍｌで各ウェルに添加した。ｒｈＶＳＩＧ３−ｒｈＶＩＳＴＡ相互作用は、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて検出され、続いて色彩反応を行った。代表的な結果を図１Ｂに示す。
【０２６７】
ＶＩＳＴＡに特異的な抗体の存在下でＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験したｒｈＶＳＩＧ３とｒｈＶＩＳＴＡとの間の相互作用の特異性を示すさらなる結果を、表２Ｂにまとめる。３０のモノクローナル抗ヒトＶＳＩＧ３抗体を、機能的ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いて試験した。表２Ｂに示すように、試験したＶＳＩＧ３に対する３０個のモノクローナル抗体のうち２６個は、ｒｈＶＳＩＧ３とｒｈＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックした。
表２Ａ
【表２】
2021512120.tif 000004
2021512120.tif 000005
表２Ｂ
【表３】
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2021512120.tif 000007
【０２６８】
実施例２：ポリクローナル抗体
ウサギポリクローナル抗ヒトＶＳＩＧ−３抗体を、表３Ａに列挙されるポリペプチドを使用して生成し、そして実施例１に記載されるように試験した。簡潔には、ｒｈＶＳＩＧ−３を、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル上に、１００μＬの体積中２μｇ／ｍｌで、２〜８℃にて一晩、コーティングした。ウェルを１％のＢＳＡでブロッキングした後、様々な量のポリクローナルウサギ抗ｈＶＳＩＧ−３ペプチド抗体を添加し、室温にて２時間前処置した。次いで、７．５μｇ／ｍＬのビオチン化ｒｈＶＩＳＴＡを、１００μＬの体積中で各ウェルの中へと添加した。
【０２６９】
例示的な結果を図２および表３に示す。表３Ｂに示されるように、試験した１６個のウサギポリクローナル抗体のうちの６個は、ｒｈＶＳＩＧ３とｒｈＶＩＳＴＡとの間の相互作用をブロックした。ＥＤ５０は、最大ブロッキングの５０％を回収するのに必要な抗体の濃度を反映する。
表３Ａ
【表４】
2021512120.tif 000008
表３Ｂ
【表５】
2021512120.tif 000009
【０２７０】
実施例３：Ｔ細胞機能に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の効果
ＩＬ−２  分泌物
図３に示すように、ｒｈＶＳＩＧ３は、Ｔ細胞による抗ＣＤ３誘導性ＩＬ−２産生を用量依存的に有意に阻害した。ウサギポリクローナル抗ヒトＶＳＩＧ３抗体（Ｎ６６）は、活性化Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を阻害するＶＳＩＧ３の能力をブロックした。
【０２７１】
マウス抗ヒトＣＤ３抗体を９６ウェルプレート上に１μｇ／ｍＬで、２〜８℃にて一晩コーティングした。次いで、ｒｈＶＳＩＧ−３タンパク質を、連続希釈（白丸）または２０μｇ／ｍＬでアッセイプレート上に固定化し、３７℃にて３時間インキュベートした。連続希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトＶＳＩＧ−３（Ｎ６６）またはアイソタイプ対照（ウサギＩｇＧ）を添加し、２０μｇ／ｍＬのｒｈＶＳＩＧ−３タンパク質と共に室温にて１〜２時間共インキュベートした。ヒトＴ細胞を、ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３＋  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてヒトＰＢＭＣから単離し、単離したヒトＴ細胞を、このプレートに添加し（２×１０５／ウェル）、５％  ＣＯ２の存在下、３７℃にて２４時間培養した。分泌されたＩＬ−２を、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、細胞培養上澄み液内で測定した。結果を図３に示す。
【０２７２】
Ｎ６６について観察されたＮＤ５０は、約２．６７μｇ／ｍＬであり、固定化ｒｈＶＳＩＧ−３の濃度に依存すると予想される。
【０２７３】
Ｔ細胞の増殖と活性化
図４および表４に示すように、ｒｈＶＳＩＧ３タンパク質は、抗ＣＤ３誘導性細胞増殖および正常ヒト末梢血Ｔ細胞の活性化を阻害し、抗ＶＳＩＧ３抗体はこの阻害をブロックすることができる。
【０２７４】
抗ヒトＣＤ３（１〜５μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローンＵＣＨＴ１、ＭＡＢ１００）およびヒトＩｇＧ（対照タンパク質；１〜５μｇ／ｍＬ；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １００−ＨＧ）またはｒｈＶＳＩＧ３タンパク質（１０〜５０μｇ／ｍｌ）を、示された抗ヒトＶＳＩＧ３抗体（１〜１０μｇ／ｍｌ）と一緒に、４℃にて一晩インキュベートすることによって９６ウェルプレート上にコーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２．５％ヒトＡＢ血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｖｉ，ＭＩ）で３０分間ブロックした。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ増殖染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造業者の仕様に従って）で標識したＣＤ３＋Ｔ細胞単離キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＧＨ１０１）を用いてヒトＰＢＭＣからネガティブに選択し、２００μＬのＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清中でウェル（ウェル当たり５×１０４−２×１０５細胞）に添加した。プレートを３７℃にて７２〜９６時間インキュベートし、次いで細胞を回収し、増殖／細胞活性化をフローサイトメトリーによって分析した。
【０２７５】
図４および表４に示されるように、ヒトＴ細胞の抗ＣＤ３誘導性増殖（図４、最初の灰色の棒）は、ｒｈＶＳＩＧ３タンパク質（斜線の棒）によって阻害された。モノクローナル抗ヒトＶＳＩＧ３  Ａｂ  ７７４２０８との共培養は、この阻害に影響を及ぼさなかった。しかしながら、モノクローナル抗ヒトＶＳＩＧ３抗体クローン９７３４０４および９９３６２０を用いた培養は、ｒｈＶＳＩＧ３媒介抑制を逆転することができ、これらの抗体がＶＳＩＧ３誘導性Ｔ細胞増殖抑制をブロックすることを示した。さらに、ポリクローナル抗体Ｇ１２９およびＣ１２０もｒｈＶＳＩＧ３媒介抑制を逆転させることができ、これらの抗体がＶＳＩＧ３誘導性のＴ細胞増殖抑制をブロックすることを示した。
表４
【表６】
2021512120.tif 000010
【０２７６】
インターフェロンγ分泌
図５に示すように、ｒｈＶＳＩＧ３は、Ｔ細胞による抗ＣＤ３誘導性インターフェロンγ産生を用量依存的な様式で有意に阻害した。例示的なモノクローナル抗ヒトＶＳＩＧ−３抗体（９７３４０４）は、活性化Ｔ細胞からのインターフェロン−γ分泌を阻害するＶＳＩＧ３の性能をブロックした。
【０２７７】
マウス抗ヒトＣＤ３抗体を９６ウェルプレート上に１μｇ／ｍＬで、２〜８℃にて一晩コーティングした。次いで、ｒｈＶＳＩＧ−３タンパク質を、連続希釈（□−白四角）または２０μｇ／ｍＬでアッセイプレート上に固定化し、３７℃にて３時間インキュベートした。連続希釈モノクローナル抗ヒトＶＳＩＧ−３（９７３４０４または９７３４２２）を添加し、２０μｇ／ｍＬのｒｈＶＳＩＧ−３タンパク質とともに室温にて１〜２時間共インキュベートした。固定化の間、ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、キットからの挿入説明書に従ってヒトＴ細胞を単離した。単離したヒトＴ細胞（２×１０５／ウェル）をプレートに添加し、５％  ＣＯ２の存在下、３７℃にて２４時間培養した。分泌されたインターフェロン−γを、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥヒトインターフェロン−γＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、細胞培養上澄み液内で測定した。結果を図５に示す。
【０２７８】
９７３４０４について観察されたＮＤ５０（○−白丸）は約６．７μｇ／ｍｌであり、固定化ｒｈＶＳＩＧ３の濃度に依存すると予想される。
【０２７９】
実施例４：融合タンパク質
図６に概略的に示すように、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ３、またはＶＳＩＧ８を、ラット軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ、残基２６〜７２）の五量体コイルドコイルドメインに融合させた。配列を表５および図８Ａ〜図８Ｃに示す。
【０２８０】
図７に概略的に示すように、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ３、またはＶＳＩＧ８を、ラット軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ、残基２６−７２）の五量体コイルドコイルドメインに融合させ、続いてアルカリホスファターゼ、フラグ、および６ｘＨｉｓタグを融合させた。リンカー残基を緑色で示す。アルカリホスファターゼは、親和性に基づく細胞外相互作用スクリーニング（ＡＶＥＸＩＳ）アッセイにおける酵素的検出のために使用することができ、総タンパク質は、抗ポリＨｉｓ抗体を使用して正規化することができる。配列を表５および図８Ａ〜８Ｃに示す。
【０２８１】
これらの融合タンパク質は、高度の多量体化を有し、そして比較的多数のサブユニット（類似の構築物は、ほとんど全て、５個の代わりに２〜３個のサブユニットを含む）およびジスルフィド結合を介したテザリングから生じる高度に安定である。
表５
【表７】
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【０２８２】
実施例５−表面プラズモン共鳴によるＶＩＳＴＡ−ＶＳＩＧ３相互作用の動態および親和性の定量
ＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰ（それぞれ実施例４に記載のように調製）を、抗ポリＨｉｓ抗体を用いてＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳ）の表面に共有結合的に固定化した。次いで、ＶＳＩＧ３  Ｆｃ融合物の希釈物を、０．２ｎＭ〜２０μＭの範囲の濃度で表面上に流し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１により１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルへの二重参照減算データフィットを行った。
【０２８３】
図９に示すように、多量体ＶＩＳＴＡ−ＣＯＭＰは、単量体ＶＩＳＴＡ（約２．５μＭ）よりもＶＳＩＧ３−Ｆｃ（約１７ｎＭ）について約１５０倍高い親和性を有する。この増加は、主にオフレートの増加によるものである。
【０２８４】
実施例６−親和性に基づく細胞外相互作用スクリーニング
親和性に基づく細胞外相互作用スクリーニング（ＡＶＥＸＩＳ）を改変して、組換えヒトＶＳＩＧ３（ｒｈＶＳＩＧ３）とＶＩＳＴＡの相互作用をブロックするＶＳＩＧ３に対する抗体をスクリーニングした。アッセイの概略図を図１０に示す。簡潔には、精製された組換えＦｃ融合タンパク質（すなわち、例えば、ＶＳＩＧ３−Ｆｃを含むベイトタンパク質）を、プロテインＡ被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上で個々に捕捉し、次いで、１％のＢＳＡブロッキング緩衝液でブロックした。タンパク質Ａ被覆プレート上でＶＳＩＧ３−Ｆｃベイトを捕獲した後、ウェルをＶＳＩＧ３に対するモノクローナル抗体と共に個々にインキュベートした。次いで、ＣＯＭＰヘリカルオリゴマーおよびアルカリホスファターゼに融合したオリゴマープレイタンパク質を含む調整培地を添加し、インキュベートし、洗浄し、そしてＢＬＵＥＰＨＯＳ試薬（ＫＰＬ／Ｓｅｒａ  Ｃａｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してアルカリホスファターゼ活性を検出することによって相互作用を定量的に測定した。
【０２８５】
ヒトＶＳＩＧ３を認識するラットおよびマウスモノクローナル抗体を作製し、ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡの相互作用をブロックする機能について試験した。ＶＳＩＧ３−ＶＩＳＴＡ相互作用の抗体ブロックについてのＡＶＥＸＩＳアッセイスクリーニングを、上記のように行った。簡単に述べると、ベイトタンパク質ＶＳＩＧ３−Ｆｃをタンパク質Ａでコーティングしたプレート上に捕捉し、抗体無しで、または１０μｇ／ｍＬの抗体でブロックした。クローン７７４２０６および７４２０８由来の抗体は、図１１に示されるように、ＶＩＳＴＡ−ＶＳＩＧ３相互作用をほぼバックグランドレベルまでブロックすることが見出され、そして図１２、図１３、および図１４において陽性対照として使用された。プレイタンパク質、アルカリホスファターゼを有する多量体ＶＩＳＴＡを、抗ＶＳＩＧ３抗体の存在下でインキュベートした。洗浄後、ＶＳＩＧ３とＶＩＳＴＡとの間の相互作用を、アルカリホスファターゼ基質を用いて測定し、６５０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。結果を図１２、図１３および図１４に示し、表６に要約する。
【０２８６】
実施例７−ＶＳＩＧ３−ＣＯＭＰは、Ｔ細胞の増殖および活性化をブロックする
抗ヒトＣＤ３（１〜５μｇ／ｍｌ）およびｒｈＶＳＩＧ３（１０〜２５μｇ／ｍｌ）またはＶＳＩＧ３−ＣＯＭＰ（１０〜２５μｇ／ｍｌ）の組み合わせを、４℃にて一晩、９６ウェルプレート上にコーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ３＋Ｔ細胞単離キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＧＨ１０１）を用いてヒトＰＢＭＣからネガティブに選択し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ増殖染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造業者の仕様に従って）で標識し、２００μｌのＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清中のウェル（５×１０４−２×１０５細胞／ウェル）に添加した。プレートを３７℃にて４〜６日間インキュベートし、次いで細胞を回収し、ＣＤ２５発現および細胞増殖をフローサイトメトリーによって分析した。結果を図１５に示す。
【０２８７】
図１５に示されるように、抗ＣＤ３誘導性ＣＤ４＋ヒトＴ細胞の増殖（左上）は、細胞をｒｈＶＳＩＧ３の存在下で培養した場合に部分的に阻害され、ＶＳＩＧ３−ＣＯＭＰの存在下で完全に阻害された（左列点プロット）。Ｔ細胞活性化の別の指標としてのＣＤ２５発現は、ｒｈＶＳＩＧ３またはＶＳＩＧ３−ＣＯＭＰの存在下で同様に阻害された（右側の列の点プロット）。これらの結果は、多量体化ＶＳＩＧ３がｒｈＶＳＩＧ３よりもＴ細胞の活性化と増殖に強く影響することができることを示している。
【０２８８】
実施例８  −  ＶＳＩＧ３ブロッキング抗体は、ＶＩＳＴＡが誘導するＴ細胞増殖および活性化の抑制を回復する
抗ヒトＣＤ３（１〜５μｇ／ｍｌ）およびｒｈＶＳＩＧ８（１０〜２５μｇ／ｍｌ）またはｒｈＶＩＳＴＡ（１０〜２５μｇ／ｍｌ）の組み合わせを、４℃にて一晩インキュベートすることによって、９６ウェルプレート上にコーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２．５％ヒトＡＢ血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で３０分間ブロックした。次いで、可溶性抗ヒトＶＳＩＧ３抗体、９９３６２０または９７３４０４（１〜１０μｇ／ｍｌ）を、適切なウェルに添加した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ増殖染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造業者の仕様に従って）で標識したＣＤ３＋Ｔ細胞単離キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＧＨ１０１）を用いてヒトＰＢＭＣからネガティブに選択し、２００μＬのＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清中のウェル（ウェル当たり５×１０４〜２×１０５細胞）に添加した。プレートを３７℃にて３〜６日間インキュベートし、次いで細胞を回収し、増殖／細胞活性化をフローサイトメトリーによって分析した。抗体９９３６２０の結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。抗体９７３４０４の結果を図１６Ｃに示す。
【０２８９】
図１６Ａに示すように、抗ＣＤ３はＣＤ４＋ヒトＴ細胞の増殖を誘導し（左上のプロット）、これは細胞分裂毎の細胞トレーサーバイオレット染料の希釈、蛍光強度の低下、および右上の象限から左上の象限への細胞集団の動きによって証明される。ｒｈＶＳＩＧ８またはｒｈＶＩＳＴＡのいずれかを用いた培養は、右上の象限（上段、中央および右側のプロット）の細胞の維持によって示されるように、ＣＤ３誘導性増殖を阻害した。抗ヒトＶＳＩＧ３抗体クローン９９３６２０の添加は、ｒｈＶＳＩＧ８による増殖の阻害に影響を及ぼさなかったが、ｒｈＶＩＳＴＡタンパク質による増殖の阻害は、部分的に逆転した（右下）。これらの結果は、抗ＶＳＩＧ３モノクローナル抗体９９３６２０が、ｒｈＶＩＳＴＡ誘導性のＴ細胞増殖阻害をブロックすることができることを示す。さらに、抗ヒトＶＳＩＧ３抗体クローン９９３６２０の添加は、ｒｈＶＩＳＴＡで培養されたＴ細胞上でのＣＤ２５発現によって測定されるように、ＣＤ３誘導性Ｔ細胞活性化を部分的に回復させたが、ｒｈＶＳＩＧ８では回復させなかった（図１６Ｂ、下段）。
【０２９０】
図１６Ｃに示されるように、抗ＣＤ３誘導性のＣＤ４＋ヒトＴ細胞の増殖は、細胞をｒｈＶＩＳＴＡの存在下で培養した場合に阻害された。この阻害は、アイソタイプ対照抗体（左上）の添加によって影響されなかったが、増殖は、ＶＳＩＧ３モノクローナル抗体９７３４０４（左の点プロット）の添加によって部分的に回復した。Ｔ細胞活性化の別の指標であるＣＤ２５発現は、ｒｈＶＩＳＴＡの存在下で同様に阻害され、これは、ＶＳＩＧ３抗体の添加によって部分的に逆転した（右の点プロット）。これらのデータは、抗ＶＳＩＧ３ブロッキング抗体が、ｒｈＶＩＳＴＡ誘導性のＴ細胞増殖抑制をブロックすることができることを示す。
表６  ＡＶＥＸＩＳアッセイを用いた抗ＶＳＩＧ３抗体のスクリーニング。
【表８】
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【０２９１】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、ならびに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列提出物、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参照により組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書の開示との間に何らかの矛盾が存在する場合、本出願の開示が適用されるものとする。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためにのみ与えられたものである。不必要な限定は、それらからであるとは理解されない。本発明は、示され、かつ説明された厳密な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形は、実施形態によって定義される本発明の中に含まれることになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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