(57)【要約】遺伝子を標的とする核酸を含む細胞外小胞を含み、腫瘍関連マクロファージのマクロファージ分極をもたらす組成物及び方法が、本明細書に開示される。特定の実施形態では、がんの治療のためにマクロファージ分極を増加させるための方法及び組成物が、本明細書に開示される。本開示の態様は、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージとの接触の際に、前記マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞。
【請求項２】
前記１つ以上の免疫調節成分（複数可）が少なくとも１つのマクロファージ標的遺伝子を阻害する、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項３】
前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項１または２に記載の細胞外小胞。
【請求項４】
前記免疫調節成分が核酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項５】
前記核酸が阻害性ＲＮＡである、請求項４に記載の細胞外小胞。
【請求項６】
前記阻害性ＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の細胞外小胞。
【請求項７】
前記核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項４に記載の細胞外小胞。
【請求項８】
前記免疫調節成分が、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、及びＰＫＭ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項９】
前記少なくとも１つの遺伝子が、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、ＫＲＡＳ、及びＨＩＦ１−アルファからなる群から選択される、請求項８に記載の細胞外小胞。
【請求項１０】
前記免疫調節成分が、配列番号１〜６から選択される配列と少なくとも９５％同一の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の細胞外小胞。
【請求項１１】
前記免疫調節成分が、配列番号１〜６から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の細胞外小胞。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの遺伝子がＳＴＡＴ３である、請求項９に記載の細胞外小胞。
【請求項１３】
前記免疫調節成分がＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の細胞外小胞。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの遺伝子がＫＲＡＳである、請求項９に記載の細胞外小胞。
【請求項１５】
前記免疫調節成分が野生型ヒトＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡである、請求項１４に記載の細胞外小胞。
【請求項１６】
前記阻害性ＲＮＡがマウスＫｒａｓＧ１２Ｄも標的とする、請求項１５に記載の細胞外小胞。
【請求項１７】
前記マクロファージが腫瘍常在マクロファージである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項１８】
前記腫瘍が膵腫瘍である、請求項１７に記載の細胞外小胞。
【請求項１９】
追加的な免疫調節成分を更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項２０】
前記追加的な免疫調節成分が、小分子薬物、抗体もしくはその活性断片または治療用タンパク質もしくはその活性断片である、請求項１９に記載の細胞外小胞。
【請求項２１】
前記追加的な免疫調節成分が、抗体またはその活性断片である、請求項２０に記載の細胞外小胞。
【請求項２２】
前記抗体またはその活性断片が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に結合する免疫チェックポイント阻害剤、またはＣＳＦ１−Ｒに結合する阻害剤である、請求項２１に記載の細胞外小胞。
【請求項２３】
前記抗体またはその活性断片が、イピリムマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはニボルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはセミプリマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはペムブロリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはアテゾリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはアベルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはデュルバルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはペキシダルチニブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはＰＬＸ７４８６のＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはＡＲＲＹ−３８２のＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはＪＮＪ−４０３４６５２７のＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはＢＬＺ９４５のＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはエマクツズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはＡＭＧ８２０のＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはＩＭＣ−ＣＳ４のＣＤＲに少なくとも９５％同一であるか、またはカビラリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含む、請求項２２に記載の細胞外小胞。
【請求項２４】
前記抗体またはその活性断片が、イピリムマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ−ＣＳ４、及びカビラリズマブからなる群から選択される少なくとも１つの抗体である、請求項２３に記載の細胞外小胞。
【請求項２５】
前記抗体またはその活性断片が、イピリムマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ−ＣＳ４、及びカビラリズマブからなる群から選択される抗体と結合について競合する少なくとも１つの抗体である、請求項２２に記載の細胞外小胞。
【請求項２６】
ＰＴＧＦＲＮまたはその断片を更に含む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項２７】
前記抗体またはその断片がＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される、請求項２６に記載の細胞外小胞。
【請求項２８】
比較が、細胞外小胞取り込みアッセイ、標的遺伝子発現アッセイ、下流遺伝子発現アッセイ、サイトカイン放出アッセイ及びマクロファージ細胞表面タンパク質アッセイからなる群から選択されるアッセイを使用して決定される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項２９】
前記Ｍ２マクロファージが、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、及びＭ２ｃマクロファージからなる群から選択される腫瘍関連マクロファージである、上記の請求項のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項３０】
前記Ｍ１マクロファージが、分極前の前記Ｍ２マクロファージと比較して、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＳＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１からなる群から選択される炎症性サイトカイン及びケモカインの増加した分泌を呈する、上記の請求項のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項３１】
前記Ｍ１マクロファージが、分極前の前記Ｍ２マクロファージと比較して、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４からなる群から選択される免疫抑制性サイトカイン及びケモカインの減少した分泌を呈する、上記の請求項のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項３２】
前記Ｍ１マクロファージが、分極前の前記Ｍ２マクロファージと比較して、増加した腫瘍関連抗原を発現する、上記の請求項のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項３３】
前記Ｍ１マクロファージが、分極前の前記Ｍ２マクロファージと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはナチュラルキラー細胞の刺激を増加させる、上記の請求項のいずれか一項に記載の細胞外小胞。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の細胞外小胞を含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
それを必要とする患者において疾患を治療する方法であって、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の細胞外小胞または請求項３４に記載の薬学的組成物を前記患者に投与し、それによって前記患者における前記疾患を治療することを含む、前記方法。
【請求項３６】
前記疾患ががんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記患者がヒトである、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫調節成分ががん原遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記がん原遺伝子がヒトＫＲＡＳである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記がんが膵癌である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも第２の療法で実行することを更に含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記投与することが、静脈内、腹腔内及び腫瘍内投与からなる群から選択される経路を介する、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
マクロファージにおいて遺伝子発現を調節する方法であって、前記マクロファージを等モル量（複数可）の免疫調節成分単体に接触させることと比較して、前記マクロファージを、少なくとも１つの遺伝子を阻害し、それによりＭ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させる１つ以上の前記免疫調節成分を含む細胞外小胞と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４５】
前記接触させることがエクスビボまたはインビボである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記接触させることがインビボである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記インビボで接触させることが対象に前記細胞外小胞を投与することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与することが、静脈内、腹腔内及び腫瘍内投与からなる群から選択される経路を介する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象がヒトである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象が、がん及び繊維症から選択される状態に罹患している、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記状態が膵癌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫調節成分が核酸である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸が阻害性ＲＮＡである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記阻害性ＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの遺伝子が、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、及びＰＫＭ２からなる群から選択される、請求項４４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの遺伝子が、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、ＫＲＡＳ、及びＨＩＦ１−アルファからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫調節成分が、配列番号１〜６から選択される配列と少なくとも９５％同一の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫調節成分が、配列番号１〜６から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの遺伝子がＳＴＡＴ３である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記免疫調節成分がＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの遺伝子がＫＲＡＳである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫調節成分が野生型ヒトＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
対象における膵癌を治療する方法であって、ヒト野生型ＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡを含む細胞外小胞を前記対象に投与することを含み、前記治療が、Ｍ２表現型からＭ１表現型への腫瘍常在マクロファージの分極の割合を、ヒトＫＲＡＳＧ１２Ｄを標的とする阻害性ＲＮＡで治療された患者において観察されるものよりも高いレベルに増加させる、前記方法。
【請求項６６】
前記腫瘍常在マクロファージの分極の割合が、腫瘍試料から得られた腫瘍常在マクロファージのエクスビボアッセイを使用して決定される、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子を標的とする核酸を保持する細胞外小胞を含み、腫瘍関連マクロファージのマクロファージ分極をもたらす組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、免疫応答を誘発、増強、または抑制することによる疾患の治療である。がん免疫療法は、通常、化学療法及び放射線療法のような従来のがん療法よりも少ない副作用を有する。１つのアプローチでは、がん免疫療法は、患者自身のマクロファージを刺激してがん細胞を攻撃するために使用されている。マクロファージは異なる表現型を示し、例えば、マクロファージはがん促進性であり得るか、またはマクロファージは抗がん活性を持つことができる。Ｍ２表現型、または「代替的に活性化されたマクロファージ」は、典型的には、免疫系の抑制ならびに細胞外のマトリックス及び組織リモデリング活動の産生のような、がん促進活性を呈する。Ｍ１表現型、または「古典的に活性化されたマクロファージ」は、典型的には、腫瘍細胞が認識及び攻撃され得るように、腫瘍細胞の食作用及び獲得免疫の刺激のような抗がん活性を呈する。マクロファージ分極（すなわち、Ｍ１表現型への変換）を促進する免疫調節方法及び組成物の改善が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示の態様は、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞を包含する。いくつかの態様では、本開示は、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分を含むエキソソームである細胞外小胞を包含する。
【０００４】
いくつかの態様では、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含み、免疫調節成分（複数可）は、核酸、例えば、阻害性ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡもしくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、または、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であるか、または、例えば、免疫調節成分は、配列番号１〜６から選択される配列に少なくとも９５％同一の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０００５】
いくつかの態様では、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含み、免疫調節（成分）、例えば、核酸、例えば、阻害性ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡもしくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、または、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、または、例えば、免疫調節成分は、配列番号１〜６から選択される配列に少なくとも９５％同一の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、例えば、少なくとも１つの遺伝子が、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、及びＰＫＭ２、例えば、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、ＫＲＡＳ、及びＨＩＦ１−アルファ、例えば、ＳＴＡＴ３、例えば、ＫＲＡＳからなる群から選択される、少なくとも１つのマクロファージ標的遺伝子を阻害する。
【０００６】
いくつかの態様では、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージと接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含み、免疫調節成分はＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０００７】
いくつかの態様では、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージと接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含み、免疫調節成分はＫＲＡＳを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０００８】
いくつかの態様では、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージと接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含み、免疫調節成分は、ＫＲＡＳ、例えば、野生型ヒトＫＲＡＳ、または野生型ヒトＫＲＡＳ及びマウスＫＲＡＳＧ１２Ｄも標的とする阻害性ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。
【０００９】
上記の態様のいずれかでは、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）、例えば、核酸、阻害性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはＡＳＯを含み、マクロファージは腫瘍（例えば、膵腫瘍）常在マクロファージである。
【００１０】
上記の態様のいずれかでは、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）、例えば、核酸、阻害性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはＡＳＯを含み、追加的な免疫調節成分、例えば、小分子薬剤、抗体もしくはその活性断片、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、もしくはＰＤ−Ｌ１に結合する免疫チェックポイント阻害剤、またはＣＳＦ１−Ｒに結合する阻害剤、または治療用タンパク質もしくはその活性断片を更に含む。
【００１１】
上記の態様のいずれかでは、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）、例えば、核酸、阻害性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはＡＳＯを含み、追加的な免疫調節成分、例えば、抗体またはその活性断片、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に結合する免疫チェックポイント阻害剤またはＣＳＦ１−Ｒに結合する阻害剤を更に含み、抗体もしくはその活性断片は、イピリムマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはニボルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはセミプリマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはペムブロリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはアテゾリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはアベルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはデュルバルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはペキシダルチニブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＰＬＸ７４８６のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＡＲＲＹ−３８２のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＪＮＪ−４０３４６５２７のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＢＬＺ９４５のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはエマクツズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＡＭＧ８２０のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＩＭＣ−ＣＳ４のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはカビラリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含むか、または抗体もしくはその活性断片は、イピリムマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ−ＣＳ４及びカビラリズマブからなる群から選択される少なくとも１つの抗体であるか、または抗体もしくはその活性断片は、イピリムマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ−ＣＳ４及びカビラリズマブからなる群から選択される抗体と結合について競合する少なくとも１つの抗体である。
【００１２】
細胞外小胞、例えば、エキソソームは、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）、例えば、核酸、阻害性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはＡＳＯを含み、追加的な免疫調節成分、例えば、抗体またはその活性断片、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に結合する免疫チェックポイント阻害剤またはＣＳＦ１−Ｒに結合する阻害剤を更に含み、抗体もしくはその活性断片は、イピリムマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはニボルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはセミプリマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはペムブロリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはアテゾリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはアベルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはデュルバルマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはペキシダルチニブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＰＬＸ７４８６のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＡＲＲＹ−３８２のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＪＮＪ−４０３４６５２７のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＢＬＺ９４５のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはエマクツズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＡＭＧ８２０のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはＩＭＣ−ＣＳ４のＣＤＲに少なくとも９５％同一、もしくはカビラリズマブのＣＤＲに少なくとも９５％同一であるＣＤＲを含むか、または抗体もしくはその活性断片は、イピリムマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ−ＣＳ４及びカビラリズマブからなる群から選択される少なくとも１つの抗体であるか、または抗体もしくはその活性断片は、イピリムマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ−ＣＳ４及びカビラリズマブからなる群から選択される抗体と結合について競合する少なくとも１つの抗体である、上記の態様のいずれかでは、それは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片を更に含み、抗体またはその断片は、任意選択で、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合され得る。
【００１３】
上記の態様のいずれかでは、比較は、細胞外小胞取り込みアッセイ、標的遺伝子発現アッセイ、下流遺伝子発現アッセイ、サイトカイン放出アッセイ及びマクロファージ細胞表面タンパク質からなる群から選択されるアッセイを使用して決定される。
【００１４】
上記の態様のいずれかでは、Ｍ２マクロファージは腫瘍関連マクロファージであり、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、及びＭ２ｃマクロファージからなる群から選択される腫瘍関連マクロファージである。
【００１５】
上記の態様のいずれかでは、Ｍ１マクロファージは、分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＳＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１からなる群から選択される炎症性サイトカイン及びケモカインの増加した分泌を呈し、及び／または分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２２、及びＣＣＬ２４からなる群から選択される免疫抑制性サイトカイン及びケモカインの減少した分泌を呈し、及び／または分極前のＭ２マクロファージと比較して、増加した腫瘍関連抗原を発現し、及び／または分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはナチュラルキラー細胞の刺激を増加させる。
【００１６】
態様では、本開示は、マクロファージとの接触の際に、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞、例えば、エキソソームを含む薬学的組成物を包含する。
【００１７】
いくつかの態様では、本開示は、それを必要とする患者（例えば、ヒト）において疾患（例えば、例えば膵癌のようながん）を治療する方法を包含し、上記の態様のいずれかの細胞外小胞、例えば、マクロファージとの接触の際に、マクロファージを上記の態様のいずれかのＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）（例えば、がん原遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳ））を含むエキソソームを投与すること（例えば、静脈内、腹腔内及び腫瘍内投与からなる群から選択される経路を介して）を含むか、または、上記の態様のいずれかの細胞外小胞、例えば、マクロファージとの接触の際に、マクロファージを上記の態様のいずれかのＭ２表現型からＭ１表現型に選択的に再分極させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含むエキソソームを含む薬学的組成物を投与することを含む。
【００１８】
いくつかの態様では、本開示は、上記の治療方法を包含し、第２の療法、例えば、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、または免疫療法を更に含む。
【００１９】
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの遺伝子を阻害し、それにより等モル量（複数可）の免疫調節成分単体とマクロファージを接触させることと比較して、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させる１つ以上の免疫調節成分を含む細胞外小胞とマクロファージを接触させることを含む、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する方法を包含する。
【００２０】
いくつかの態様では、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する方法は、少なくとも１つの遺伝子を阻害し、それによりマクロファージを等モル量（複数可）の免疫調節成分単体と接触させることと比較して、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させる１つ以上の免疫調節成分を含む細胞外小胞とマクロファージをインビボまたはインビトロで接触させることを含む。
【００２１】
いくつかの態様では、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する方法は、少なくとも１つの遺伝子を阻害し、それによりマクロファージを等モル量（複数可）の免疫調節成分単体と接触させることと比較して、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させる１つ以上の免疫調節成分を含む細胞外小胞とマクロファージをインビボで接触させる（例えば、静脈内、腹腔内、及び腫瘍内投与からなる群から選択される経路により、例えば、細胞外小胞を対象、例えば、ヒト対象に投与することによる）ことを含む。
【００２２】
いくつかの態様では、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する上に開示された方法の対象は、がん（例えば、膵癌）及び線維症から選択される状態に罹患している。
【００２３】
いくつかの態様では、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する上に開示された方法のいずれかにおいて使用される細胞外小胞はエキソソームであり、免疫調節成分は核酸、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのような阻害性ＲＮＡである。
【００２４】
いくつかの態様では、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する上に開示された方法のいずれかにおいて使用される細胞外小胞はエキソソームであり、免疫調節成分は核酸、例えば、ＡＳＯである。
【００２５】
いくつかの態様では、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する上に開示された方法のいずれかにおいて使用される細胞外小胞はエキソソームであり、免疫調節成分は核酸、例えば、配列番号１〜６から選択される配列に９５％同一の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは配列番号１〜６から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つの遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、及びＰＫＭ２からなる群から、またはＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、ＫＲＡＳ、及びＨＩＦ１−アルファから選択されるか、またはＳＴＡＴ３であるか、またはＫＲＡＳであり、ＫＲＡＳの場合には、免疫調節成分は任意選択で野生型ヒトＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡであり得る。
【００２６】
いくつかの態様では、本開示は、ヒト野生型ＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡを含む細胞外小胞を対象に投与することを含む、対象における膵癌を治療する方法を提供し、治療は、腫瘍常在マクロファージのＭ２表現型からＭ１表現型への分極の割合を、ヒトＫＲＡＳＧ１２Ｄを標的とする阻害性ＲＮＡで治療された患者において観察されるものよりも高いレベルに増加させる。
【００２７】
いくつかの態様では、本開示は対象における膵癌を治療する上記の方法を提供し、腫瘍常在マクロファージの分極の割合は、腫瘍試料から得られた腫瘍常在マクロファージのエクスビボアッセイを使用して決定される。
【００２８】
本明細書では、マクロファージの活性を改変できる１つ以上の免疫調節成分で選択、濃縮、または操作された細胞外小胞を含み、マクロファージのＭ２表現型からＭ１表現型へのスイッチングを促進し（マクロファージ分極）、がんと闘う患者の免疫系を高める組成物及び方法が、本明細書に提供される。
【００２９】
したがって、第１の態様では、１つ以上の免疫調節成分、例えば、標的細胞において少なくとも１つの遺伝子を阻害する核酸分子を含む細胞外小胞が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、標的細胞はマクロファージであり、遺伝子阻害は、等モル量の免疫調節成分（複数可）単体と比較して、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させる。ある特定の実施形態では、細胞外小胞はエキソソームである。ある特定の実施形態では、核酸は阻害性ＲＮＡである。ある特定の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、及びＰＫＭ２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、遺伝子はＫＲＡＳである。ある特定の実施形態では、核酸は、野生型ヒトＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡである。ある特定の実施形態では、阻害性ＲＮＡはまた、マウスＫｒａｓＧ１２Ｄを標的とする。ある特定の実施形態では、マクロファージは腫瘍常在マクロファージである。ある特定の実施形態では、がんは膵癌である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は追加的な免疫調節成分を更に含む。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、小分子薬物、抗体または治療用タンパク質である。ある特定の実施形態では、抗体は免疫チェックポイント阻害剤である。ある特定の態様では、上記の細胞外小胞のいずれかを含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。
【００３０】
ある特定の態様では、本明細書に記載の細胞外小胞または薬学的組成物を患者に投与し、それにより患者における疾患を治療することを含む、それを必要とする患者における疾患を治療する方法が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、この疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、がんは膵癌である。いくつかの実施形態では、疾患は線維化状態である。いくつかの実施形態では、線維化状態は、肺線維症、肝線維症、または膵線維症である。ある特定の実施形態では、肝線維症は、非アルコール性脂肪性肝炎、またはＮＡＳＨである。ある特定の実施形態では、患者はヒトである。ある特定の実施形態では、核酸は、がん原遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである。ある特定の実施形態では、がん原遺伝子はヒトＫＲＡＳである。ある特定の実施形態では、がんは膵癌である。ある特定の実施形態では、方法は、少なくとも第２の療法を実行することを更に含む。ある特定の実施形態では、第２の療法は、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、Ｍ２マクロファージは、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、及びＭ２ｃマクロファージからなる群から選択される腫瘍関連マクロファージである。ある特定の実施形態では、Ｍ１マクロファージは、分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＳＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１からなる群から選択される炎症性サイトカイン及びケモカインの増加した分泌を呈する。ある特定の実施形態では、Ｍ１マクロファージは、分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４からなる群から選択される免疫抑制性サイトカイン及びケモカインの減少した分泌を呈する。ある特定の実施形態では、Ｍ１マクロファージは、分極前のＭ２マクロファージと比較して、増加した腫瘍関連抗原を発現する。ある特定の実施形態では、Ｍ１マクロファージは、分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはナチュラルキラー細胞の刺激を増加させる。
【００３２】
ある特定の態様では、ヒト野生型ＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡを含む細胞外小胞を対象に投与することを含む、対象における膵癌を治療する方法が本明細書に記載され、治療は、腫瘍常在マクロファージのＭ２表現型からＭ１表現型への分極の割合を、ヒトＫＲＡＳＧ１２Ｄを標的とする阻害性ＲＮＡで治療された患者において観察されるものよりも高いレベルに増加させる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】遺伝子の各々を標的とする増加する量のｓｉＲＮＡのトランスフェクション後の、Ｓｔａｔ  ３、Ｓｔａｔ  ６、Ｃｅｂｐβ−１、Ｐｉ３Ｋγ、ＣＥＢＰβ−２、及びＫｒａｓの遺伝子発現レベルを示す。
【図２】それぞれＳｔａｔ  ３、Ｓｔａｔ  ６、Ｃｅｂｐβ−１、Ｐｉ３Ｋγ、ＣＥＢＰβ−２、及びＫｒａｓを標的とする増加する量のｓｉＲＮＡのトランスフェクション後のＡｒｇ１発現を示す。スクランブルされたｓｉＲＮＡトランスフェクトマクロファージを、対照として使用した。
【図３】６つのマクロファージ亜集団（Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２ａ、Ｍ２ｃ、Ｍ２＋＋、及びＴＡＭ）の総細胞ＧＦＰ強度により決定されたエキソソーム取り込みを示す。
【図４】総蛍光強度によって測定されたＭ２またはＭ０マクロファージによる遊離アンチセンスオリゴ（Ｆｒｅｅ−ＡＳＯ）及びＡＳＯ負荷されたエキソソーム（Ｅｘｏ−ＡＳＯ）の取り込みを示す。
【図５】図５Ａは、ナイーブマウスにおける１ｘ１０１１または１ｘ１０１２のＧＦＰ含有エキソソームの腹腔内注射後の、インビボでのマクロファージによるエキソソーム取り込みを示す。図５Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０担腫瘍マウスにおける単回用量のネイティブ非標識エキソソームまたはＣｙ５標識Ｅｘｏ−ＡＳＯの注射後のインビボでの腫瘍細胞及びマクロファージによるネイティブエキソソーム及びＥｘｏ−ＡＳＯの更新を示す。
【図６】５μＭの遊離コレステロールタグ付きＡＳＯ、またはコレステロールタグ付きＡＳＯで負荷された１×１０５または１×１０６のエキソソームのいずれかとのインキュベーション後のＭ２分極マウスＲＡＷ２６４．７細胞におけるＳｔａｔ３発現を示す。ＳＴＡＴ３を標的とする５つの異なるコレステロールタグ付きＡＳＯを、試験した。ＡＳＯ４．１、二本鎖ＭＯＥケミストリー；ＡＳＯ５．１及びＡＳＯ５．２、一本鎖Ｏ−メチルケミストリー；ＡＳＯ５．３及びＡＳＯ５．４、一本鎖ＭＯＥケミストリー。未処理の分極マクロファージ及び未修飾のエキソソームとインキュベートされた分極マクロファージを、陰性対照として使用した。Ｓｔａｔ３  ｓｉＲＮＡトランスフェクトマクロファージを、陽性対照として使用した。
【図７】５μＭの遊離コレステロールタグ付きＡＳＯ、またはコレステロールタグ付きＡＳＯで負荷された１×１０５または１×１０６のエキソソームのいずれかとのインキュベーション後のＭ２分極マウスＲＡＷ２６４．７細胞におけるＡｒｇ１転写レベルを示す。ＳＴＡＴ３を標的とする５つの異なるコレステロールタグ付きＡＳＯを、試験した。ＡＳＯ４．１、二本鎖ＭＯＥケミストリー；ＡＳＯ５．１及びＡＳＯ５．２、一本鎖Ｏ−メチルケミストリー；ＡＳＯ５．３及びＡＳＯ５．４、一本鎖ＭＯＥケミストリー。未処理の分極マクロファージ及び未修飾のエキソソームとインキュベートされた分極マクロファージを、陰性対照として使用した。Ｓｔａｔ３  ｓｉＲＮＡトランスフェクトマクロファージを、陽性対照として使用した。
【図８】図８Ａは、ＳＴＡＴ３についての高（４μＭ）用量のＡＳＯまたは高（４μＭ）用量及び低（０．４μＭ）用量のＥｘｏ−ＡＳＯとのインキュベーション後のＭ２分極マウスＲＡＷ２６４．７細胞におけるＳＴＡＴ３発現を示す。図８Ｂは、ＫＲＡＳについての高（４μＭ）用量のＡＳＯまたはＥｘｏ−ＡＳＯとのインキュベーション後のＭ２分極マウスＲＡＷ２６４．７細胞におけるＫＲＡＳ発現を示す。図８Ｃは、Ｃ／ＥＢＰβについての高（４μＭ）用量及び低（０．４μＭ）用量のＡＳＯまたはＥｘｏ−ＡＳＯとのインキュベーション後のＭ２分極マウスＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣ／ＥＢＰβ発現を示す。
【図９】図９Ａは、異なる用量の遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯまたはＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯでの処理後の、３名の別個のドナーからの初代ヒトマクロファージにおけるＳＴＡＴ３転写レベルを示す。各処理のＩＣ５０及び遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯと比較したＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯの改善倍率が提示される。図９Ｂは、異なる用量の遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯまたはＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯでの処理後の、３名の別個のドナーからの初代ヒトマクロファージにおけるＣＤ１６３レベルを示す。各処理のＩＣ５０及び遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯと比較したＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯの改善倍率が提示される。
【図１０】それぞれＨＩＦ１α、Ｐｉ３Ｋγ、ＣＥＢＰ／β、ＳＴＡＴ６、及びＳＴＡＴ３についての４μＭの遊離ＡＳＯまたはＥｘｏ−ＡＳＯでの処理後のヒトＭ２マクロファージにおける標的遺伝子発現を示す。未処理ヒトＭ２マクロファージ及び４μＭのスクランブルされたＥｘｏ  ＡＳＯで処理されたヒトＭ２マクロファージを、対照として使用した。
【図１１】それぞれＨＩＦ１α、Ｐｉ３Ｋγ、ＣＥＢＰ／β、ＳＴＡＴ６、及びＳＴＡＴ３についての４μＭの遊離ＡＳＯまたはＥｘｏ−ＡＳＯでの処理後のヒトＭ２マクロファージにおけるＣＤ１６３発現を示す。未処理ヒトＭ２マクロファージ及び４μＭのスクランブルされたＥｘｏ  ＡＳＯで処理されたヒトＭ２マクロファージを、対照として使用した。
【図１２】図１２Ａは、４μＭの遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ、４μＭのＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯ、４μＭのスクランブルされたＥｘｏ−ＡＳＯ、ネイティブエキソソーム、またはＣ１８８−９、ＬＰＳの存在下または非存在下でのＳＴＡＴ３の小分子阻害剤での処理後のＩＬ−１２の誘導を示す。図１２Ｂは、４μＭの遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ、４μＭのＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯ、４μＭのスクランブルされたＥｘｏ−ＡＳＯ、ネイティブエキソソーム、またはＣ１８８−９、ＬＰＳの存在下または非存在下でのＳＴＡＴ３の小分子阻害剤での処理後のＩＬ−２３の誘導を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、未修飾のエキソソーム（ＥＶのみ）、及び濃度一致したＳｔａｔ３遊離ＡＳＯ及びＳｔａｔ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯでの処理後のＳＴＡＴ３転写レベルを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、未修飾のエキソソーム（ＥＶのみ）、及び濃度一致したＳｔａｔ３遊離ＡＳＯ及びＳｔａｔ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯでの処理後のＣＤ１６３転写レベルを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、未修飾のエキソソーム（ＥＶのみ）、及び濃度一致したＳｔａｔ３遊離ＡＳＯ及びＳｔａｔ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯでの処理後のＴＧＦβ転写レベルを示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、未修飾のエキソソーム（ＥＶのみ）、及び濃度一致したＳｔａｔ３遊離ＡＳＯ及びＳｔａｔ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯでの処理後のＳＴＡＴ６転写レベルを示す。
【図１４】それぞれＳＴＡＴ３（ＭＯＥ及びＬＮＡケミストリーの両方）、ＳＴＡＴ６（ＭＯＥケミストリー）、ＣＥＢＰ／β（ＭＯＥケミストリー）に対してＡＳＯで負荷されたエキソソームでの処理後のＴＧＦβ発現レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
マクロファージ分極は、マクロファージがそれらの微小環境からの信号に応答して異なる機能プログラムを採用するプロセスである。この能力は、生物におけるそれらの複数の役割に関連する。それらは、自然免疫系の強力なエフェクター細胞であるが、細胞破片の除去、胚発生及び組織修復においても重要である。
【００３５】
マクロファージの表現型は大まかに２つの群、Ｍ１（古典的に活性化されたマクロファージ）及びＭ２（代替的に活性化されたマクロファージ）に分けられる。この大まかな分類は、培養されたマクロファージが特定の状態へスイッチングするそれらの表現型を刺激する分子で処理されたインビトロ研究に基づく。Ｍ１マクロファージは、炎症促進性であり、食作用ならびに炎症促進性サイトカイン及び殺菌分子の分泌のような、病原体に対する直接的な宿主防御において重要である。Ｍ２マクロファージは全く逆の機能、炎症の解消段階及び損傷した組織の修復の制御を有する。例えば、Ｗｙｎｎ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｗｌａ，Ａ．，＆  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．（２０１３）．Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ，４９６（７４４６），４４５−４５５、Ｍｉｌｌｓ，Ｃ．Ｄ．，Ｋｉｎｃａｉｄ，Ｋ．，Ａｌｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅｉｌｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，＆  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｍ．（２０００）．Ｍ−１／Ｍ−２  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４（１２），６１６６−６１７３を参照されたい。多くの固形腫瘍は、多くの場合、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）として知られるＭ２マクロファージの型を含む、骨髄リッチな細胞浸潤により特徴付けられる。Ｍ２マクロファージ（ＴＡＭのような）は、代謝酵素アルギナーゼ（Ａｒｇ１）の発現を促進する高レベルのリン酸化ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ６を発現する。ＴＡＭは、例えば、がん細胞の運動性、転移形成及び血管新生の促進のような多くの腫瘍促進活性を媒介し、ＴＡＭ形成は、発生する腫瘍に存在する微小環境因子に依存する。ＴＡＭは、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２のような免疫抑制性サイトカイン、及び非常に少量のＮＯまたはＲＯＩ、及び低レベルの炎症性サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６）を産生する。「古典的に活性化された」Ｍ１マクロファージと比較して、ＴＡＭによる腫瘍関連抗原の提示は、Ｔ及びＮＫ細胞の抗腫瘍機能の刺激もそうであるように、減少する。Ｍ１マクロファージとは異なり、ＴＡＭは腫瘍細胞を溶解できない。ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ＿ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−Ｓｉｃａ２００８−３１したがって、ＴＡＭ及び他のＭ２マクロファージを標的とすることは、ＴＡＭの動員と分布を変更するか、既存のＴＡＭを枯渇させるか、またはＭ２表現型からＭ１表現型へＴＡＭの再教育を誘導するいずれかが薬剤の送達を通じて実証されているように、がんに対する新規の治療戦略を提供する。
【００３６】
本発明のエキソソーム治療法は、これらの疾患の文脈において異常なマクロファージをＭ１表現型に「再分極すること」により、がん及び線維症のような疾患を治療するための組織常在微小環境を促進するためのＭ２マクロファージに対する選択的効果を有する。本明細書に記載のエキソソームは、ヒトの疾患を治療するためにＭ２マクロファージをＭ１表現型に再分極させる経路に関与する候補を作成するために、エキソソーム表面上またはエキソソーム内腔内で様々な生物学的活性分子を用いて精密に操作される。
【００３７】
腫瘍関連Ｍ２分極マクロファージ、またはＴＡＭは、Ｔ細胞増殖及びエフェクター機能を効果的に抑制し、腫瘍成長を促進できる。Ｍ１表現型へのＴＡＭの復帰もまた、ＣＳＦ−１受容体に配向されたマクロファージを枯渇させる抗体を使用して報告されている。これらのアプローチは、狭い治療ウィンドウ、及び意図されたよう異常なＭ２マクロファージだけでなく、全てのマクロファージを標的とすることによる特異性の欠如により、臨床試験において限定した成功を示している。かかるマクロファージの大量の枯渇は、増加した感染リスク及び他の安全上の懸念を生じると予想されるであろう。本発明のエキソソームは、マクロファージに対する天然のエキソソーム配向性により、Ｍ２マクロファージをより選択的に標的とし、機能のバランスを所望のＭ１表現型に傾ける。これらのエキソソームは、マクロファージを再分極させ、抗腫瘍免疫応答に必要な炎症性サイトカインの所望のスペクトルの産生を生じる。以下の例に示されるように、エキソソームは、インビトロで免疫抑制性Ｍ２マクロファージをＭ１表現型に再プログラムした。
【００３８】
腫瘍微小環境において誘導される免疫抑制に加えて、Ｍ２分極マクロファージは、線維芽細胞の蓄積を誘導してコラーゲン沈着及び組織再構築をもたらし、最終的には組織線維症を生じる、細胞シグナル伝達に関与する重要なサイトカインであるトランスフォーミング増殖因子ベータ、またはＴＧＦβを大量に分泌する。これらのＭ２マクロファージを再プログラミングしてＳＴＡＴ３のような主要なシグナル伝達分子を標的とすることによりＴＧＦβ産生を低下させることは、肺線維症の前臨床モデルにおいて有益な活性を有することが、示されている。ＳＴＡＴ３を標的とするいくつかの小分子アプローチが採用されているが、異常なＭ２マクロファージ内のみでの阻害の特異性の欠如は、処理に対するこのアプローチが実行可能になることを防止した。本明細書に記載されるある特定のエキソソームは、Ｍ２マクロファージにおける主要な経路を選択的に標的化し、それらが肺及び他の組織線維症症候群におけるＳＴＡＴ３及び他の細胞経路を標的とすることを可能にする。
【００３９】
免疫系のマクロファージを調節するために有用な細胞外小胞が、本明細書に開示される。これらの細胞外小胞は、等モル量（複数可）の１つ以上の免疫調節成分（複数可）単体と比較して、マクロファージとの接触の際に、少なくとも１つのマクロファージ標的遺伝子を阻害し、それによりマクロファージ分極をＭ２表現型からＭ１表現型に増加させる１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む。細胞外小胞を産生するための方法、ならびにがん及び、例えば、繊維症状態のような他の免疫系関連疾患を治療するためにこれらの細胞外小胞を使用する方法も、提供される。
【００４０】
本発明をより詳細に記載する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
【００４１】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値、及びその表示された範囲の任意の他の表示値（ｓｔａｔｅｄ  ｖａｌｕｅ）または介在値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）が、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれることができ、表示された範囲内の任意の具体的に除外された限界値を条件として、本発明内にも包含される。表示された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の片方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００４２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料は本発明の実施または試験においても使用され得るが、代表的な例示的方法及び材料が次に記載される。
【００４３】
本明細書に引用された全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物または特許が参照によって組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されるのと関連した方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。同様に、用語「少なくとも１つ」は、複数の指示対象を含む（すなわち、文脈が別途明確に指示しない限り、語句「１つ以上」と同等である）。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成し得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等のような排他的な専門用語の使用のため、または否定的な制限の使用のための先行詞として役立つよう意図される。
【００４５】
用語「約」は、数値を改変するために使用される際に、当業者によって容易に決定され得るように、記載された技術を実践する目的のために記載された値と機能的に同等である表示値の変動を包含することが意図される。ある特定の実施形態では、用語「約」は、表示値からの＋／−５％、＋／−１０％、＋／−２０％、＋／−３０％、＋／−４０％または＋／−５０％の変動を含む。
【００４６】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に切り離され得るか、または組み合わされ得る別個の成分及び特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順で、または論理的に可能な任意の他の順序で行われ得る。
【００４７】
本発明を更に説明する際に、本方法を実施する際の使用のための本系は、より詳細に議論され、その後、関連する方法の概説が後に続く。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「細胞外小胞」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞を含む。一般的に、細胞外小胞は直径が２０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲であり、内部空間内で、細胞外小胞の外部表面に表示されて、及び／または膜をまたいでのいずれかで、様々な高分子カーゴを含むことができる。カーゴは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。例として、かつ限定することなく、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的操作または間接的操作による細胞由来の小胞（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理による）、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合による）を含む。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植された組織もしくは器官、及び／または培養された細胞に由来し得る。細胞外小胞の種は、例えば、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第１０，１９５，２９０号に記載されるような、エキソソーム及びナノ小胞を含む。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「エキソソーム」は、内部空間を封入する膜を含み、直接原形質膜出芽によるか、または後期エンドソームの原形質膜との融合により細胞から生成される、細胞由来の小さい（直径２０〜３００ｎｍ、より好ましくは直径４０〜２００ｎｍ）小胞を指す。エキソソームは、細胞外小胞の一種である。エキソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）または他の分子を含む。エキソソームは、プロデューサー細胞に由来することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「ナノ小胞」は、内部空間を封入する膜を含み、ナノ小胞が操作なしではプロデューサー細胞によって産生されないように直接的操作または間接的操作により細胞から生成される、細胞由来の小さい（直径２０〜２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０〜１５０ｎｍ）小胞を指す。プロデューサー細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液での処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、プロデューサー細胞の破壊を生じ得る。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合により、プロデューサー細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、細胞外小胞の一種である。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）または他の分子を含む。ナノ小胞は、ナノ小胞が操作に従ってプロデューサー細胞に由来すると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。
【００５１】
本明細書で使用される用語「Ｍ２表現型」は、１つ以上の腫瘍促進活性を呈するか、または当業者に、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはナチュラルキラー細胞の低下した刺激または刺激の欠如；腫瘍細胞の食作用の欠如；Ｍ２関連サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４）の分泌及び／または発現；成長因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＥＧＦ、及びＴＧＦ−β）の分泌及び／または発現；転移酵素（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ２、ＭＭＰ９、システインカテプシンプロテアーゼ）の分泌及び／または発現；免疫抑制性因子（例えば、基質Ｌ−アルギニンを誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）から引き抜くアルギナーゼＩ（ＡｒｇＩ））の分泌／発現；細胞表面マーカーＹＭ１、ＦＩＺＺ１、デクチン−１、ＭＧＬの発現、Ｍ２関連ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ１４６ａ、ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ  ７ｂ、及びｍｉＲ−２２３）の発現（例えば、Ｍｏｓｓｅｒ，Ｄ．Ｍ．，＆  Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｐ．（２００８）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８（１２），９５８−９６；Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．，Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｉｓｗａｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ａ．，Ｇｉｌｒｏｙ，Ｄ．Ｗ．，Ｇｏｅｒｄｔ，Ｓ．，Ｗｙｎｎ，Ｔ．Ａ．（２０１４）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４１（１），１４−２０；ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｚｏｕ，Ｘ．Ｂ．，Ｃｈａｉ，Ｙ．Ｆ．，＆Ｙａｏ，Ｙ．Ｍ．（２０１４）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０（５），５２０−５２９９、及び、各々が全ての目的のために参照により組み込まれる、それらに引用される参照文献を参照されたい）及び／または以下に列挙されるＭ１関連因子の低下した発現／分泌または低下したＭ１関連活性に関連すると知られるマクロファージを指し、参照試料は、Ｍ１活性マクロファージの集団を含む。インビトロでのＭ１活性化は、グラム陰性細菌について典型的な細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）及びグラム陽性細菌について典型的なリポテイコ酸（ＬＴＡ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはＬＰＳ及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の組み合わせのような、ＴＬＲリガンドでの処理により誘発される。Ｍｉｌｌｓ，Ｃ．Ｄ．，Ｋｉｎｃａｉｄ，Ｋ．，Ａｌｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅｉｌｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，＆  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｍ．（２０００）Ｍ−１／Ｍ−２  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４（１２），６１６６−６１７３、Ｋｒａｕｓｇｒｕｂｅｒ，Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．”ＩＲＦ５  ｐｒｏｍ���ｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＴＨ１−ＴＨ１７  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２．３（２０１１）：２３１−２３８及びＭａｒｔｉｎｅｚ，Ｆ．Ｏ．，＆  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．（２０１４）Ｔｈｅ  Ｍ１  ａｎｄ  Ｍ２  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｆ１０００Ｐｒｉｍｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，６（Ｍａｒｃｈ），１−１３、及び、各々が全ての目的のために参照により組み込まれる、それらに引用される参照文献を参照されたい。
【００５２】
本明細書で使用される用語「Ｍ１表現型」は、これらに限定されないが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及び／またはナチュラルキラー細胞の刺激、腫瘍細胞の食作用、Ｍ１関連サイトカイン（例えば、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＣＬ５、ＣＳＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１）の分泌及び／または発現、Ｍ１関連ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ１５５、ｍｉＲ−３３）の発現（例えば、Ｍｏｓｓｅｒ，Ｄ．Ｍ．，＆Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｐ．（２００８）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８（１２），９５８−９６；Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．，Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｉｓｗａｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ａ．，Ｇｉｌｒｏｙ，Ｄ．Ｗ．，Ｇｏｅｒｄｔ，Ｓ．，Ｗｙｎｎ，Ｔ．Ａ．（２０１４）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４１（１），１４−２０；ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｚｏｕ，Ｘ．Ｂ．，Ｃｈａｉ，Ｙ．Ｆ．，＆  Ｙａｏ，Ｙ．Ｍ．（２０１４）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０（５），５２０−５２９９、及び、各々が全ての目的のために参照により組み込まれる、それらに引用される参照文献を参照されたい）及び／またはＭ２関連因子の低下した発現／分泌、または少なくとも１つの参照試料と比較して、上に列挙される低下したＭ２関連活性のようなＭ１表現型に関連すると当業者に知られる抗腫瘍活性またはマーカーを呈するマクロファージを指し、参照試料はＭ２関連マクロファージの集団を含む。インビトロでの  Ｍ２活性化は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３により誘発される（例えば、全ての目的のために参照により組み込まれるＬｉｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｚｏｕ，Ｘ．Ｂ．，Ｃｈａｉ，Ｙ．Ｆ．，＆Ｙａｏ，Ｙ．Ｍ．（２０１４）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０（５），５２０−５２９を参照されたい）。
【００５３】
本明細書で使用される用語「マクロファージ分極」は、マクロファージのＭ２表現型からＭ１表現型への変化を指し、及び／または少なくとも１つの参照試料（例えば、同じ患者から試験試料または履歴データの前に採取された試料）と比較して、Ｍ１表現型を呈するマクロファージの患者で見出されるマクロファージ（例えば、腫瘍に関連するマクロファージ、または循環マクロファージ）の集団の割合の増加を指す。例えば、全ての目的のために参照により組み込まれるＭｉｌｌｓ，Ｃ．Ｄ．，Ｋｉｎｃａｉｄ，Ｋ．，Ａｌｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅｉｌｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，＆  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｍ．（２０００）Ｍ−１／Ｍ−２  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４（１２），６１６６−６１７３、Ｍｏｓｓｅｒ，Ｄ．Ｍ．，＆  Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｐ．（２００８）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８（１２），９５８−９６９、及びＸｕｅ，Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．Ｖ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，Ｊ．Ｌ．（２０１４），Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４０（２）Ｌ  ２７４−２８８を参照されたい。
【００５４】
用語「細胞外小胞送達」または「細胞外小胞の送達」は、対象の標的組織、細胞及び／または器官への細胞外小胞の投与及び局在化を指す。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、標的細胞の細胞質に送達され得る。他の実施形態では、免疫調節成分は、標的細胞の膜に送達される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞の膜は、標的細胞の膜と融合する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「プロデューサー細胞」は、細胞外小胞が単離され得る任意の細胞を指す。プロデューサー細胞は、細胞外小胞に対する供給源として役立つ細胞である。プロデューサー細胞は、タンパク質、脂質、糖、または核酸成分を細胞外小胞と共有できる。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、改変された細胞または人工細胞である。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、培養または単離された細胞である。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、細胞株である。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞株は、ヒト胎児腎細胞株である。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞株は、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞株である。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、初代細胞である。いくつかの特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、抗原提示細胞、Ｔヘルパー細胞、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）のような免疫細胞である。
【００５６】
本明細書で使用される「膜」は、１つ以上の生物学的化合物、典型的には脂質、及び任意選択でポリペプチド及び／または炭水化物を含む外部空間から内部空間を分離する境界層である。いくつかの実施形態では、膜は脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。これらの実施形態のいくつかでは、膜は、１つ以上のポリペプチド及び／またはグリカンのような１つ以上の多糖類を更に含む。細胞外小胞は、本明細書で定義される膜を含む。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「免疫調節成分」は、薬剤と接触し、免疫細胞（例えばマクロファージまたは他の免疫細胞）を改変する標的（例えば、例としてこれらに限定されないが、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、及びＰＫＭ２を含む標的遺伝子）に作用する治療薬を指す。細胞外小胞及び／またはプロデューサー細胞中に導入され得る免疫調節成分は、阻害性核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、及び／または抗原結合断片、免疫チェックポイント阻害剤のモジュレーターまたは免疫チェックポイント阻害剤のリガンド、表面抗原及びそれらの誘導体、及び／またはサイトカイン及びそれらの誘導体のようなポリヌクレオチドのような治療薬を含むことができる。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、阻害性核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）である。例えば、全ての目的のために参照により組み込まれるＷｅｉｓｓ，Ｂ．（ｅｄ．）：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ：Ｎｏｖｅｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９７、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ  Ｊ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ  Ｗ，Ｙａｌｃｉｎ  Ａ，Ｗｅｂｅｒ  Ｋ，Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ（２００１）”Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”．Ｎａｔｕｒｅ．４１１（６８３６）：４９４−９８８、Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ（Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４）”ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ”．Ｃｅｌｌ．１１６（２）：２８１−９７、Ｐａｄｄｉｓｏｎ，ＰＪ；Ｃａｕｄｙ，ＡＡ；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ；Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ；Ｃｏｎｋｌｉｎ，ＤＳ（１５  Ａｐｒｉｌ  ２００２）．”Ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ  （ｓｈＲＮＡｓ）ｉｎｄｕｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１６（８）：９４８−５８、Ｍａ  Ｌ，Ｂａｊｉｃ  ＶＢ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ（Ｊｕｎｅ  ２０１３）”Ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ”．ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１０（６）：９２５−３３、及びＡｍｂｒｏｓ  Ｖ，Ｂａｒｔｅｌ  Ｂ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ，Ｂｕｒｇｅ  ＣＢ，Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｊ��，Ｃｈｅｎ  Ｘ，Ｄｒｅｙｆｕｓｓ  Ｇ，Ｅｄｄｙ  ＳＲ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｍ，Ｍａｔｚｋｅ  Ｍ，Ｒｕｖｋｕｎ  Ｇ，Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ（Ｍａｒｃｈ  ２００３）．”Ａ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ”．ＲＮＡ．９（３）：２７７−９を参照されたい。
【００５８】
本明細書で使用される場合、語句「阻害する核酸分子」または「阻害性核酸」は、標的遺伝子と相互作用するように細胞中に導入される際に、その標的遺伝子の発現または活性の阻害を生じる任意の核酸を指す。阻害する核酸分子、すなわち阻害性核酸は、ＤＮＡまたは阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）であり得、該ＲＮＡは一本鎖であるか、二本鎖であるか、または一本鎖及び二本鎖領域の両方を含有する。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ＡＳＯは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。例えば、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ：Ｎｏｖｅｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９７を参照されたい。「ＥＸＯ  ＡＳＯ」は、小胞膜（例えば、コレステロールまたは脂肪酸アシル誘導体化ＡＳＯと共に発生する）との相互作用を通じて、または電気穿孔のような技法を使用して小胞内腔中に負荷することによって、または、例えば、操作されたプロデューサー細胞からの細胞外小胞の単離が後に続く、所望のＡＳＯをコードする構築物をプロデューサー細胞中に導入するためのトランスフェクションまたは形質導入によるようなプロデューサー細胞の遺伝子操作を介して、例えば、エキソソームのような細胞外小胞に物理的に関連する。
【００５９】
用語「レシーバー」は、細胞外小胞を標的に導き、及び／または細胞外小胞の対象の標的との相互作用を促進する分子を指す。いくつかの実施形態では、レシーバーは、本明細書で「レシーバーポリペプチド」としても時々称されるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、レシーバーは、対象の標的組織へ導かれた輸送によるように、対象の組織中の免疫調節成分の濃度を増加させることができる。レシーバーの例は、表３に列挙される例を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
用語「標的」は、その活性が本開示の免疫調節成分（すなわち、標的遺伝子）によって調節される遺伝子を指すことができる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、阻害性ＡＳＯのような細胞外小胞に関連する（すなわち、膜表面に結合する、脂質二重層内に挿入される、または小胞の封入容積内に封入される）核酸分子によって阻害される。標的遺伝子の例は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、及びＰＫＭ２を含むが、これらに限定されない。「標的」はまた、本開示の細胞外小胞が導かれる細胞（すなわち、標的細胞）を指すことができる。ある特定の実施形態では、標的細胞は、免疫細胞（例えば、マクロファージ）である。ある特定の実施形態では、標的細胞は、造血幹細胞または多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、標的細胞は、循環マクロファージである。ある特定の実施形態では、標的細胞は、腫瘍常在マクロファージ（すなわち、腫瘍微小環境内、腫瘍組織内、または腫瘍表面近傍に位置するマクロファージ）である。追加的に、「標的」はまた、その活性が本開示の免疫調節成分との接触により調節される標的細胞上のタンパク質、または本開示の細胞外小胞に結合するためのリガンドとして作用するタンパク質（すなわち、標的タンパク質）を指し得る。したがって、ある特定の実施形態では、標的タンパク質は標的細胞上にあり、細胞外小胞と相互作用する。
【００６１】
「治療薬」または「治療分子」は、有効量で存在する際に、それを必要とする対象に所望の治療効果、薬理学的及び／または生理学的効果を生み出す化合物または分子を含む。それは、対象に投与される際に、対象に対する測定可能または伝達可能な効果を有する、例えば、それが疾患、障害または状態の症状を軽減または減少させる任意の化合物、例えば、小分子薬物、または生物製剤（例えば、ポリペプチド薬物または核酸薬物）を含む。
【００６２】
本明細書で使用される用語「免疫チェックポイント阻害剤」または「チェックポイント阻害剤」は、免疫細胞を抑制する免疫抑制性チェックポイント経路を低下させることによって免疫細胞活性を刺激する治療薬（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を阻害する薬剤（ＰＤ−１を標的とするニボルマブと、セミプリマブとペムブロリズマブ、及び各々ＰＤ−Ｌ１を標的とするアテゾリズマブと、アベルマブと、デュルバルマブのような）ならびにイピリムマブのようなＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２を阻害する薬剤）を指す。例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ（Ｍａｒｃｈ  ２０１２）”Ｔｈｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ．１２（４）：２５２−６４を参照されたい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、天然または部分的もしくは全体的に合成的に産生されていようとなかろうと、免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を網羅する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを更に含む。抗体という用語の使用は、抗体全体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらの断片を含むことを意味し、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、及び抗体関連ポリペプチドのような、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片を更に含む。抗体は、それらが所望の生物学的活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。例示的な抗体組成物は、例えば、イピリムマブのようなＣＴＬＡ−４を阻害する抗体、例えば、ニボルマブ、セミプリマブ及びペムブロリズマブのようなＰＤ−１を阻害するもの、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブのようなＰＤ−Ｌ１を阻害するもの、及び、例えば、ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ−ＣＳ４及びカビラリズマブのようなＣＳＦＲ１を阻害するものを含む。本明細書で使用される用語「抗原結合断片」は、無傷の免疫グロブリンの断片、及び抗原に特異的に結合する能力を有する抗原結合領域を含むポリペプチドの任意の部分を指す。例えば、抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片であり得るが、これらに限定されない。Ｆａｂ断片は、１つの抗原結合部位を有し、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、ならびに重鎖の第１の定常領域ＣＨ１を含有する。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ’断片が重鎖ＣＨ１領域のＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基を含む重鎖のヒンジ領域を追加的に含むという点で、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２は産生され、それにより、Ｆａｂ’断片のシステイン残基が、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合される。Ｆｖ断片は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を産生するための組換え技法は当該技術分野で周知である。二本鎖Ｆｖ断片は、重鎖可変領域が非共有結合によって軽鎖可変領域に連結されている構造を有することができる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は、一般に、重鎖可変領域がペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合されているか、または重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がそれらのＣ末端で互いに直接連結される二本鎖Ｆｖ断片のような二量体構造を有することができる。抗原結合断片は、プロテアーゼを使用して取得され得（例えば、抗体全体がＦａｂ断片を得るためにパパインで消化され、Ｆ（ａｂ’）２断片を得るためにペプシンで消化される）、遺伝子組換え技法により調製され得る。ｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる。一本鎖抗体分子は、多数の個々の分子を有するポリマー、例えば、二量体、三量体または他のポリマーを含むことができる。
【００６４】
語句「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。核酸分子は、染色体ＤＮＡ及び自己複製プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等を含む。核酸分子は組換え型であり得、核酸が細胞中に導入される際に、外因性ポリペプチドが発現され得る。用語は、例えば、Ｓｅｌｖａｍ  Ｃ，Ｍｕｔｉｓｙａ  Ｄ，Ｐｒａｋａｓｈ  Ｓ，Ｒａｎｇａｎｎａ  Ｋ，Ｔｈｉｌａｇａｖａｔｈｉ  Ｒ．“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ：Ｒｅｃｅｎｔ  ｔｒｅｎｄｓ，”Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２０１７  Ｎｏｖ；９０（５）：６６５−６７８に記載されるもののような化学的に改変された核酸、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｍ，Ｗｅｎｇｅｌ  Ｊ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００３）”ＬＮＡ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（２）：７４−８１に記載されるようなロックド核酸（ＬＮＡ）、及び、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ；Ｗｅｌｌｅｒ，Ｄ（１９９７）．”Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．７（３）：１８７−１９５、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ（２０１１）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．７６４．ｐｐ．１−１５に記載されるもののような、臨床的に適切な化学的に改変された核酸を包含し、各々は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
用語「アゴニスト」は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を生み出す分子を指す。受容体は、内因性アゴニストまたは外因性アゴニストのいずれかによって活性化され得る。内因性アゴニストの非限定的な例は、ホルモン及び神経伝達物質を含む。外因性アゴニストの非限定的な例は、小分子、抗体、合成ペプチド等を含む様々なクラスの化合物を含む。アゴニストは、完全、部分的、または逆アゴニストであり得る。
【００６６】
用語「アンタゴニスト」は、受容体に結合すると、それ自体が生物学的応答を誘発するよりも、むしろアゴニスト媒介性応答を遮断または抑制する分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に定義された結合部位で内因性リガンドまたは基質と競合することにより、それらの効力を達成する。アンタゴニストの非限定的な例には、アルファ遮断薬、ベータ遮断薬、及びカルシウムチャネル遮断薬が挙げられる。アンタゴニストは、競合的、非競合的、または不競合的アンタゴニストであり得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的組成物」は、例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤のような１つ以上の他の化学成分と混合または懸濁された細胞外小胞のような、本明細書に記載される１つ以上の化合物を指す。医薬組成物の１つの目的は、細胞外小胞の調製物の対象への投与を促進することである。用語「薬学的に許容される」及びその文法的変形例は、組成物の投与を禁止する程度に望ましくない生理学的効果を生み出すことなく、対象へのまたは対象に対する投与が可能な組成物、担体、希釈剤及び試薬を指す。用語「賦形剤」または「担体」は、化合物の投与を更に促進するために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。用語「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、ヒトを含む動物での使用について米国連邦政府の規制機関によって承認されたか、または米国薬局方に列挙されている任意の薬剤、同様に、対象に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を抑止しない任意の担体または希釈剤を包含する。薬学的組成物を調製するのに有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が、含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、同様に「抽出された」及び「抽出すること」は、互換的に使用され、精製、例えば、所望の細胞外小胞調製物の選択または濃縮の１つ以上のプロセスを経た所望の細胞外小胞の調製（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）の状態を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される単離することまたは精製することは、プロデューサー細胞を含有する試料から細胞外小胞を除去、部分的に除去する（例えば、画分）プロセスである。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は検出可能な望ましくない活性を有しないか、または、代替的には、望ましくない活性のレベルもしくは量は、許容されるレベルもしくは量未満である。他の実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は、許容される量及び／または量以上の所望の細胞外小胞の量及び／または濃度を有する。他の実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、プロデューサー細胞調製物）と比較して濃縮される。この濃縮は、出発材料と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞調製物は、残留生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞調製物は、いかなる汚染生物物質も１００％含まないか、９９％含まないか、９８％含まないか、９７％含まないか、９６％含まないか、または９５％含まない。残留生物学的産物は、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物を含むことができる。残留生物学的産物を実質的に含まないことはまた、細胞外小胞組成物が検出可能なプロデューサー細胞を含有しないことと、細胞外小胞のみが検出可能であることとを意味し得る。
【００６９】
用語「投与」、「投与すること」及びそれらの変形例は、細胞外小胞または薬剤のような組成物を対象中に導入することを指し、１つ以上の追加的な組成物または薬剤の治療効果を生み出すことに一致する任意の予定通りの同時及び順次導入を含む。用量投与のタイミングは、対象内で投与された薬剤の、または突発的曝露に対する一定のレベル（例えば、血漿レベル）を達成するために、例えば、毒性を低下させるか、または脱感作を防止するために選択され得る。これらの結果を達成する方法は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１３ｔｈ  Ｅｄ．）に示されている既知の薬物動態原理に基づいて、当該技術分野の開業医に周知である。対象中への組成物または薬剤の導入は、経口的、肺内、鼻腔内、非経口的（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸内、リンパ管内、くも膜下腔内、眼周囲、腫瘍内または局所的を含む、任意の好適な経路による。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を実行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈中に導入することによって投与される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「調節する」、「調節すること」、「改変する」及び／または「調節因子」は、一般に、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用するためのような、直接的または間接的に特定の濃度、レベル、発現、機能または行動を増加または減少により変更する、例えば、促進／刺激／上方制御または干渉／阻害／下方制御する能力を指す。いくつかの例では、調節因子は、対照に対して、または一般に予想されるであろう活性の平均的レベルに対して、または活性の対照レベルに対して、ある特定の濃度、レベル、活性または機能を増加及び／または減少させることができる。用語「阻害」、「抑制」、「調節」は、免疫調節成分（複数可）を伴わない状態と比較して、標的遺伝子の発現または活性の変化を説明するために本明細書で使用される。阻害は、遺伝子の発現または活性の消失または実質的な消失を指す。抑制は、遺伝子の発現または活性の低下を意味するが、完全な消失または実質的な消失を意味しない。調節は、遺伝子の発現または活性の任意の変更、上昇または下降を意味する。
【００７１】
用語「十分な量」は、所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、対象の状態を調節するのに十分な量を意味する。
【００７２】
用語「治療有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防が療法と見なされ得るため、治療有効量は、「予防的有効量」であり得る。
【００７３】
ヌクレオチド配列と参照配列との間の「同一性」パーセントは、必要な場合に、配列を整列させ、ギャップを導入した後、最大配列同一性パーセントを達成するための参照配列中の単一ヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列中の単一ヌクレオチドの割合として定義される。ヌクレオチド配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野内にある様々な手段で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡ、またはＭＵＳＣＬＥソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成され得る。当業者は、比較されている配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするために適切なパラメータを決定することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの更なる詳細については、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．Ｗ．（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２ｎｄ  ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ  ９７８−０−８７９６９−７１２−９を参照されたい。
【００７４】
ポリペプチド配列と参照配列との間の「同一性」パーセントは、必要な場合に、配列を整列させ、ギャップを導入した後、最大配列同一性パーセントを達成するための参照配列中のアミノ酸残基と同一であるポリペプチド配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野内にある様々な手段で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡ、またはＭＵＳＣＬＥソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成され得る。当業者は、比較されている配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするために適切なパラメータを決定することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの更なる詳細については、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．Ｗ．（２００４）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２ｎｄ  ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ  ９７８−０−８７９６９−７１２−９を参照されたい。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に」または「実質的な」は、例えば、特定の空間における実体の存在、レベル、もしくは濃度、別の実体に対するある実体の影響、または処理の影響を指す。例えば、実体の活性、レベル、または濃度は、増加がベースラインに対して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍である場合、実質的に増加している。実体の活性、レベル、または濃度はまた、増加がベースラインに対して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、または５００％である場合、実質的に増加している。
【００７６】
用語「インビボ」は、生きている生物において発生するプロセスを指す。
【００７７】
本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含む。
【００７８】
本出願で使用される略語は以下を含む。「ｍＲＮＡ」はメッセンジャーＲＮＡを指し、「ｍｉＲＮＡ」はマイクロＲＮＡを指し、「ｓｉＲＮＡ」は低分子干渉ＲＮＡを指し、「アンチセンスＲＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡを指すが、これはＤＮＡヌクレオチドを追加的に含むことができ、多くの場合アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは「ＡＳＯ」と称され、「ｓｈＲＮＡ」は小さいまたは短いヘアピンＲＮＡを指し、「ｌｎｃＲＮＡ」は長い非コードＲＮＡを指し、「ｄｓＤＮＡ」は二本鎖ＤＮＡを指す。
【００７９】
組成物
本開示の態様は、免疫系を制御できる組成物を含む。組成物は、細胞膜を含む細胞外小胞、及び細胞膜に関連するか、または膜結合封入容積内に封入された少なくとも１つの免疫調節成分を含む。膜結合容積内のエンクロージャは、電気穿孔、凍結乾燥を含む技法を使用して、または核酸（ＡＳＯをコードする）もしくはタンパク質のような免疫調節成分をコードする構築物を導入するためのプロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のような）を操作することを通じて、達成され得る。細胞膜との会合は、膜の内側または外側の脂質リーフレットへの結合及び脂質二重層への膜貫通挿入を包含する。いくつかの例では、膜会合は、例えば、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブ制御因子（ＰＴＧＦＲＮ）；ベイシジン；（ＢＳＧ）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）；インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１）；インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（足場及び免疫調節成分を含む融合タンパク質の要素を提供できるエキソソームの表面上で高度に濃縮されることが特定されている）（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４（共有の米国特許第１０，１９５，２９０号に記載されている）ようなタンパク質（例えば、足場タンパク質またはその断片）を使用して達成される。かかる細胞外小胞及び例示的技法は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第１０，１９５，２９０号に詳細に記載される。共有の米国特許第１０，１９５，２９０号に記載されるように、表面処理されたエキソソームは、これらの足場タンパク質（及びその断片）をエキソソームまたはプロデューサー細胞中に導入するためのＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合のような化学的及び／または物理的方法により生成され得る。複合体は、外因性治療用タンパク質と足場タンパク質との間に生成され得る。代替的には、融合タンパク質は、前述の化学的及び／または物理的方法を使用して、足場タンパク質と、例えば、免疫調節タンパク質のような外因性治療用タンパク質とを複合体化し、表面に複合体または融合タンパク質を含有する操作されたエキソソームを産生することによって産生され得る。治療用タンパク質のネイティブな完全長または生物学的活性断片は、足場タンパク質に複合体化することにより、エキソソームの表面に輸送され得る。かかるエキソソームは、細胞のゲノムに挿入された外因性配列を含むプロデューサー細胞から得られることもできる。例えば、外因性配列は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰトランスポーターをコードするゲノム配列の３’または５’末端に位置するゲノム部位に挿入され得る。例えば、外因性配列は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰトランスポーターをコードするゲノム配列に挿入され得る。細胞膜との会合は、免疫調節成分の内部膜表面または外部膜表面への結合、脂質二重層内での免疫調節成分の固定、または脂質二重層を通じた免疫調節成分の拡大を包含する。免疫調節成分は、足場タンパク質に繋留され得るか、または共有の米国特許第１０，１９５，２９０号に記載されるような足場タンパク質との融合タンパク質として発現され得る。
【００８０】
細胞外小胞
様々な実施形態では、組成物は、細胞外小胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、共有の米国特許第１０，１９５，２９０号に記載されるような、内部空間を封入する膜を含む細胞由来小胞である。
【００８１】
様々な実施形態では、細胞外小胞は、それが由来する細胞よりも小さな直径を有する膜結合小胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、約２０〜１００ｎｍ、２０−２００ｎｍ、２０−３００ｎｍ、２０−４００ｎｍ、２０−５００ｎｍ、２０−６００ｎｍ、２０−７００ｎｍ、２０−８００ｎｍ、２０−９００ｎｍ、３０−１００ｎｍ、３０−２００ｎｍ、３０−３００ｎｍ、３０−４００ｎｍ、３０−５００ｎｍ、３０−６００ｎｍ、３０−７００ｎｍ、３０−８００ｎｍ、３０−９００ｎｍ、４０−１００ｎｍ、４０−２００ｎｍ、４０−３００ｎｍ、４０−４００ｎｍ、４０−５００ｎｍ、４０−６００ｎｍ、４０−７００ｎｍ、４０−８００ｎｍ、４０−９００ｎｍ、５０−１５０ｎｍ、５０−５００ｎｍ、５０−７５０ｎｍ、１００−２００ｎｍ、１００−５００ｎｍ、または５００−１０００ｎｍのような、約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。
【００８２】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、エキソソームである。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、ナノ小胞である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、アポトーシス小体である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、細胞の断片である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、直接的操作または間接的操作によって細胞に由来する小胞である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、小胞化器官である。様々な実施形態では、細胞外小胞は、生細胞によって産生される小胞である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、生きている生物に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、死んだ生物に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、外植された組織に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、外植された器官に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、培養された細胞に由来する。これらの実施形態のいくつかでは、細胞外小胞が細胞培養系において生成される際に、細胞外小胞は、更に単離される（例えば、培養細胞から細胞外小胞を分離することによって）。分離は、沈降によって達成され得る。例えば、細胞外小胞は、０．５〜２．０、０．６〜１．０、０．７〜１．０、０．８〜１．０、０．９〜１．０、１．０〜１．１、１．１〜１．２、１．２〜１．３、１．４〜１．５、１．０〜１．５、１．５〜２．０、及び１．０〜２．０ｋｇ／ｍ３の比重を有することができる。分離は、アフィニティ精製によっても達成され得る。例えば、細胞外小胞は、細胞外小胞を含む集団を樹脂に結合することによって精製され得、該樹脂は、細胞外小胞の表面上の１つ以上のタンパク質に対して特異的親和性を有する複数のリガンドを含む。タンパク質は、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ＩＧＳＦ３）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣＤ９８ｈｃであり得る。
【００８４】
様々な実施形態では、細胞外小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、糖を更に含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、ポリヌクレオチドを更に含む。
【００８５】
様々な実施形態では、細胞外小胞膜は、内部表面及び外部表面を含み、内部空間を封入する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、本明細書に記載されるような免疫調節成分のようなペイロードを更に含む。ある特定の実施形態では、ペイロードは、内部空間内に封入される。ある特定の実施形態では、ペイロードは、細胞外小胞の外部表面上に表示される。ある特定の実施形態では、ペイロードは、細胞外小胞の膜をまたぐ。様々な実施形態では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含む。ペイロードを用いて細胞外小胞を産生するための方法は、電気穿孔、凍結乾燥、及び細胞外小胞が単離され得るプロデューサー細胞の遺伝子操作を含む。例えば、共有の米国特許第１０，１９５，２９０号及び上記を参照されたい。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、共有の米国特許第１０，１９５，２９０号に記載されるように、レシーバー、すなわち、器官、組織、または細胞に特異的であり得る標的化部分を更に含む。標的化部分を有する融合タンパク質が、使用される。例えば、融合タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片もしくは変異体、及び標的化部分を含むことができる。標的化部分は、エキソソームを使用した治療のために、エキソソームを特定の器官、組織、または細胞に標的化するために使用され得る。いくつかの実施形態では、標的化部分は、抗体またはその抗原結合断片である。抗体及びそれらの抗原結合断片は、抗体全体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらの断片を含み、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドのような、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片を更に含む。抗体及びそれらの抗原結合断片は、所望の生物学的活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体と多重特異性抗体も含む。
【００８６】
エキソソーム
様々な実施形態では、細胞外小胞はエキソソームである。ある特定の実施形態では、エキソソームは、プロデューサー細胞によって分泌された小さな膜結合小胞である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞からのエキソソームは、約２０〜２９０ｎｍ、２０〜２８０ｎｍ、２０〜２７０ｎｍ、２０〜２６０ｎｍ、２０〜２５０ｎｍ、２０〜２４０ｎｍ、２０〜２３０ｎｍ、２０〜２２０ｎｍ、２０〜２１０ｎｍ、２０〜２００ｎｍ、２０〜１９０ｎｍ、２０〜１８０ｎｍ、２０〜１７０ｎｍ、２０〜１６０ｎｍ、２０〜１５０ｎｍ、２０〜１４０ｎｍ、２０〜１３０ｎｍ、２０〜１２０ｎｍ、２０〜１１０ｎｍ、２０〜１００ｎｍ、２０〜９０ｎｍ、２０〜８０ｎｍ、２０〜７０ｎｍ、２０〜６０ｎｍ、２０〜５０ｎｍ、２０〜４０ｎｍ、２０〜３０ｎｍ、３０〜３００ｎｍ、３０〜２９０ｎｍ、３０〜２８０ｎｍ、３０〜２７０ｎｍ、３０〜２６０ｎｍ、３０〜２５０ｎｍ、３０〜２４０ｎｍ、３０〜２３０ｎｍ、３０〜２２０ｎｍ、３０〜２１０ｎｍ、３０〜２００ｎｍ、３０〜１９０ｎｍ、３０〜１８０ｎｍ、３０〜１７０ｎｍ、３０〜１６０ｎｍ、３０〜１５０ｎｍ、３０〜１４０ｎｍ、３０〜１３０ｎｍ、３０〜１２０ｎｍ、３０〜１１０ｎｍ、３０〜１００ｎｍ、３０〜９０ｎｍ、３０〜８０ｎｍ、３０〜７０ｎｍ、３０〜６０ｎｍ、３０〜５０ｎｍ、３０〜４０ｎｍ、４０〜３００ｎｍ、４０〜２９０ｎｍ、４０〜２８０ｎｍ、４０〜２７０ｎｍ、４０〜２６０ｎｍ、４０〜２５０ｎｍ、４０〜２４０ｎｍ、４０〜２３０ｎｍ、４０〜２２０ｎｍ、４０〜２１０ｎｍ、４０〜２００ｎｍ、４０〜１９０ｎｍ、４０〜１８０ｎｍ、４０〜１７０ｎｍ、４０〜１６０ｎｍ、４０〜１５０ｎｍ、４０〜１４０ｎｍ、４０〜１３０ｎｍ、４０〜１２０ｎｍ、４０〜１１０ｎｍ、４０〜１００ｎｍ、４０〜９０ｎｍ、４０〜８０ｎｍ、４０〜７０ｎｍ、４０〜６０ｎｍ、４０〜５０ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０〜２９０ｎｍ、５０〜２８０ｎｍ、５０〜２７０ｎｍ、５０〜２６０ｎｍ、５０〜２５０ｎｍ、５０〜２４０ｎｍ、５０〜２３０ｎｍ、５０〜２２０ｎｍ、５０〜２１０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、５０〜１９０ｎｍ、５０〜１８０ｎｍ、５０〜１７０ｎｍ、５０〜１６０ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、５０〜１４０ｎｍ、５０〜１３０ｎｍ、５０〜１２０ｎｍ、５０〜１１０ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、５０〜９０ｎｍ、５０〜８０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ、５０〜６０ｎｍ、６０〜３００ｎｍ、６０〜２９０ｎｍ、６０〜２８０ｎｍ、６０〜２７０ｎｍ、６０〜２６０ｎｍ、６０〜２５０ｎｍ、６０〜２４０ｎｍ、６０〜２３０ｎｍ、６０〜２２０ｎｍ、６０〜２１０ｎｍ、６０〜２００ｎｍ、６０〜１９０ｎｍ、６０〜１８０ｎｍ、６０〜１７０ｎｍ、６０〜１６０ｎｍ、６０〜１５０ｎｍ、６０〜１４０ｎｍ、６０〜１３０ｎｍ、６０〜１２０ｎｍ、６０〜１１０ｎｍ、６０〜１００ｎｍ、６０〜９０ｎｍ、６０〜８０ｎｍ、６０〜７０ｎｍ、７０〜３００ｎｍ、７０〜２９０ｎｍ、７０〜２８０ｎｍ、７０〜２７０ｎｍ、７０〜２６０ｎｍ、７０〜２５０ｎｍ、７０〜２４０ｎｍ、７０〜２３０ｎｍ、７０〜２２０ｎｍ、７０〜２１０ｎｍ、７０〜２００ｎｍ、７０〜１９０ｎｍ、７０〜１８０ｎｍ、７０〜１７０ｎｍ、７０〜１６０ｎｍ、７０〜１５０ｎｍ、７０〜１４０ｎｍ、７０〜１３０ｎｍ、７０〜１２０ｎｍ、７０〜１１０ｎｍ、７０〜１００ｎｍ、７０〜９０ｎｍ、７０〜８０ｎｍ、８０〜３００ｎｍ、８０〜２９０ｎｍ、８０〜２８０ｎｍ、８０〜２７０ｎｍ、８０〜２６０ｎｍ、８０〜２５０ｎｍ、８０〜２４０ｎｍ、８０〜２３０ｎｍ、８０〜２２０ｎｍ、８０〜２１０ｎｍ、８０〜２００ｎｍ、８０〜１９０ｎｍ、８０〜１８０ｎｍ、８０〜１７０ｎｍ、８０〜１６０ｎｍ、８０〜１５０ｎｍ、８０〜１４０ｎｍ、８０〜１３０ｎｍ、８０〜１２０ｎｍ、８０〜１１０ｎｍ、８０〜１００ｎｍ、８０〜９０ｎｍ、９０〜３００ｎｍ、９０〜２９０ｎｍ、９０〜２８０ｎｍ、９０〜２７０ｎｍ、９０〜２６０ｎｍ、９０〜２５０ｎｍ、９０〜２４０ｎｍ、９０〜２３０ｎｍ、９０〜２２０ｎｍ、９０〜２１０ｎｍ、９０〜２００ｎｍ、９０〜１９０ｎｍ、９０〜１８０ｎｍ、９０〜１７０ｎｍ、９０〜１６０ｎｍ、９０〜１５０ｎｍ、９０〜１４０ｎｍ、９０〜１３０ｎｍ、９０〜１２０ｎｍ、９０〜１１０ｎｍ、９０〜１００ｎｍ、１００〜３００ｎｍ、１１０〜２９０ｎｍ、１２０〜２８０ｎｍ、１３０〜２７０ｎｍ、１４０〜２６０ｎｍ、１５０〜２５０ｎｍ、１６０〜２４０ｎｍ、１７０〜２３０ｎｍ、１８０〜２２０ｎｍ、または１９０〜２１０ｎｍのような、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。
【００８８】
特に好ましい実施形態では、本明細書に記載されるプロデューサー細胞からのエキソソームは、約３０〜１００ｎｍの最長寸法を有する。別の好ましい実施形態では、プロデューサー細胞からのエキソソームは、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。別の好ましい実施形態では、プロデューサー細胞からのエキソソームは、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。別の実施形態では、本明細書に記載されるエキソソームの集団は、エキソソームの９０％が２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるエキソソームの集団は、エキソソームの９５％が２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるエキソソームの集団は、エキソソームの９９％が２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるエキソソームの集団は、エキソソームの９０％が４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるエキソソームの集団は、エキソソームの９５％が４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるエキソソームの集団は、エキソソームの９９％が４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるエキソソームまたはエキソソームの集団のサイズは、以下に記載される方法に従って測定される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、プロデューサー細胞によって生成される。いくつかの実施形態では、エキソソーム膜は、プロデューサー細胞に由来する１つ以上の分子を含む。いくつかの実施形態では、エキソソームは、細胞培養系中で生成され、単離される（例えば、プロデューサー細胞からエキソソームを分離することによって）。分離は、沈降によって達成され得る。例えば、エキソソームは、０．５〜２．０、０．６〜１．０、０．７〜１．０、０．８〜１．０、０．９〜１．０、１．０〜１．１、１．１〜１．２、１．２〜１．３、１．４〜１．５、１．０〜１．５、１．５〜２．０、及び１．０〜２．０ｋｇ／ｍ３の比重を有することができる。分離は、アフィニティ精製によっても達成され得る。例えば、細胞外小胞は、細胞外小胞を含む集団を樹脂に結合することによって精製され得、該樹脂は、細胞外小胞の表面上の１つ以上のタンパク質に対して特異的親和性を有する複数のリガンドを含む。細胞外小胞の表面上の１つ以上のタンパク質は、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１及び／またはＣＤ９）、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８及び／またはＩＧＳＦ３）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１及び／またはＩＴＧＡ４）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３及び／またはＡＴＰ２Ｂ４）ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣＤ９８ｈｃであり得る。タンパク質は、任意選択で、例えば、チェックポイント阻害活性を有する抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ等のような、所望の薬理学的活性を有するポリペプチド部分への融合を介して、エキソソームの表面上に表示される免疫調節成分としての活性を追加的に有することができる。かかる抗体は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＣＴＬＡ−４を標的とするイピリムマブ、ＰＤ−１を標的とするニボルマブ、セミプリマブ及びペムブロリズマブ、ならびに各々がＰＤ−Ｌ１を標的とするアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブである（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰａｒｄｏｌｌ  ＤＭ（Ｍａｒｃｈ  ２０１２）“Ｔｈｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ．１２（４）：２５２−６４を参照されたい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、エキソソーム膜は、内部表面及び外部表面を含む。ある特定の実施形態では、内部表面は、エキソソームの内側コアに面する。ある特定の実施形態では、外部表面は、プロデューサー細胞または標的細胞のエンドソーム、多小胞体、または膜／細胞質と接触し得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、エキソソーム膜は、脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、エキソソーム膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。いくつかの実施形態では、脂質及び脂肪酸は、表１に列挙されたもののうちの１つ以上であり得る。
【００９２】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、内側リーフレット及び外側リーフレットから構成される脂質二重層を含む。内側及び外側リーフレットの組成物は、当該技術分野で既知のトランスバイレイヤー（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ）分布アッセイによって決定され得、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９８５  ８１９：１７０を参照されたい。いくつかの実施形態では、外側リーフレットの組成物は、およそ７０〜９０％のコリンリン脂質、およそ０〜１５％の酸性リン脂質、及びおよそ５〜３０％のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの実施形態では、内側リーフレットの組成物は、およそ１５〜４０％のコリンリン脂質、およそ１０〜５０％の酸性リン脂質、及びおよそ３０〜６０％のホスファチジルエタノールアミンである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、エキソソーム膜は、１つ以上のポリペプチドを更に含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、スペクトリン、ミオシン様ポリペプチド、バンド３、ＳＬＣ４Ａ１、アクチン、アクチン様ポリペプチド、グリセルアルデヒド３−Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１及び／またはＣＤ９）、Ａｌｉｘ及びＴＳＧ１０１、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１及び／またはＩＴＧＡ４）、セレクチン、ＣＲ１、ＴＮＦＲＩ、タンパク質分解酵素、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質またはヒストン、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８及び／またはＩＧＳＦ３）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３及び／またはＡＴＰ２Ｂ４）、ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣＤ９８ｈｃ）を含むがこれらに限定されない、以下のリストから選択される１つ以上のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、エキソソームは、表２から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、その表面にポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、エキソソームは、１つ以上のポリペプチドを含有するように改変される。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、１つ以上のポリペプチドを含有するように改変される。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は１つ以上のポリペプチドを天然に含有し、そこに由来するエキソソームもポリペプチドを含有する。任意の所望の表面マーカーのレベルは、エキソソーム上で直接改変され得る（例えば、複合体を組換えにより産生されたポリペプチドと接触させて、複合体の膜への挿入または複合体化をもたらすことによって）。代替的にまたは加えて、任意の所望の表面マーカーのレベルは、プロデューサー細胞上で直接改変され得る（例えば、複合体を組換えにより産生されたポリペプチドと接触させて、細胞の膜への挿入または複合体化をもたらすことによって）。代替的には、プロデューサー細胞は、所望の表面マーカーを発現させるためにプロデューサー細胞中に外因性核酸を形質導入することにより改変され得る。表面マーカーは、プロデューサー細胞上にすでに天然に存在でき、その場合、外因性構築物は、マーカーの過剰発現及びプロデューサー細胞内またはプロデューサー細胞上でのマーカーの増加した濃度をもたらし得る。代替的には、天然に発現された表面マーカーは、プロデューサー細胞から除去され得る（例えば、プロデューサー細胞において遺伝子サイレンシングを誘導することによって）。ポリペプチドは、エキソソームに異なる機能性を付与できる（例えば、特定の標的化能力、送達機能（例えば、融合分子）、酵素機能、インビボでの増加または減少した半減期等）。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ４９、ＣＤ４０、ＣＤ１３３、ＣＤ５９、グリピカン−１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、インテグリン、セレクチン、レクチン、及びカドヘリンを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
特定の実施形態では、エキソソームは、その表面上に１つ以上のポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、エキソソームの表面上で濃縮されることが最近特定されたタンパク質の群から選択される（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる共有の米国特許出願第６２／５５０，５４３号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４８０２６に詳細に記載される）。このポリペプチドの群は、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブ制御因子（ＰＴＧＦＲＮ）、ベイシジン（ＢＳＧ）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、インテグリンベータ−１（ＩＴＧＢ１）、インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４））を含む。
【００９６】
様々な実施形態では、エキソソーム表面上の１つ以上のポリペプチドは、抗体または抗原結合断片を含む。抗体または抗原結合断片は、天然の供給源に由来するか、または部分的もしくは全体的に合成的に産生され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。いくつかの他の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片から選択される。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖまたは（ｓｃＦｖ）２断片である。ある特定の他の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ナノボディ（登録商標）（単一ドメイン抗体）である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、二重特異性または多重特異性抗体である。様々な実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、メソセリンに結合する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、その表面上に、（１）ＰＴＧＦＲＮまたはその断片及び（２）抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質を含み、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ−１、ＰＤ−１Ｌ、ＣＳＦ１−Ｒ、または他の免疫調節成分に結合する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、エキソソーム膜は、グリカンのような１つ以上の多糖類を更に含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、ペイロード（治療薬）を標的に送達する。ペイロードは、エキソソームと接触する標的（例えば、標的細胞）に作用する治療薬である。ある特定の実施形態では、ペイロードは、免疫調節成分、例えば、阻害性ＲＮＡである。接触は、インビトロで、または対象において発生できる。エキソソーム及び／またはプロデューサー細胞中に導入され得るペイロードは、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素のようなポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡのような制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、翻訳を妨害する検出可能な部分または毒素を含むアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、小分子（例えば、小分子薬物及び毒素）、ならびにそれらの組み合わせのような治療薬を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、２つ以上の治療薬を送達する。ある特定の実施形態では、治療薬は、１つ以上の標的遺伝子を阻害する１つ以上の核酸である。ある特定の実施形態では、治療薬は、抗体及び核酸を含む。ある特定の実施形態では、治療薬は、核酸及び小分子を含む。ある特定の実施形態では、治療薬は、臨床候補ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、及びＩＭＣ−ＣＳ４等のようなＣＳＦ１Ｒ阻害剤を含み、例えば、Ｃａｎｎａｒｉｌｅ  ＭＡ，Ｗｅｉｓｓｅｒ  Ｍ，Ｊａｃｏｂ  Ｗ，Ｊｅｇｇ  ＡＭ，Ｒｉｅｓ  ＣＨ，Ｒｕｔｔｉｎｇｅｒ  Ｄ（２０１７）”Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＳＦ１Ｒ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．５（１）：５３に記載される他のもののようなタンパク質性免疫調節成分を含む。Ｐａｔｅｌ  Ｓ，Ｐｌａｙｅｒ  ＭＲ（２００９）”Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．９：５９９−６１０も参照されたい。モノクローナル抗体であり、転移性膵癌の初期の臨床試験にあるカビラリズマブ（ｃａｂｉｒａ、ＦＰＡ−００８）（Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｄｏｓｅ  ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃａｂｉｒａｌｉｚｕｍａｂ（ｃａｂｉｒａ；ＦＰＡ−００８），ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＳＦ１Ｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ  ｔｅｎｏｓｙｎｏｖｉａｌ  ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ  （ＴＧＣＴ，ｄｉｆｆｕｓｅ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｖｉｌｌｏｎｏｄｕｌａｒ  ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ  Ｄ−ＰＶＮＳ、Ａ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃａｂｉｒａｌｚｕｍａｂ  Ｇｉｖｅｎ  ｂｙ  Ｉｔｓｅｌｆ  ｏｒ  Ｗｉｔｈ  Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈａｔ  Ｈａｓ  Ｓｐｒｅａｄ、及びＮｏｖｅｌ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｈｏｗｓ  Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｏｖ  ２０１７を参照されたい）。ある特定の実施形態では、治療薬は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、例えば、ＣＴＬＡ−４を標的とするイピリムマブ、ＰＤ−１を標的とするニボルマブ、セミプリマブ及びペムブロリズマブ、ならびに各々がＰＤ−Ｌ１を標的とするアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブのような抗体における免疫チェックポイント阻害剤。
【０１００】
エキソソームは、膜融合を介して標的細胞と相互作用し、エキソソーム組成物中のペイロード（例えば、治療薬）を標的細胞の表面または細胞質に送達できる。いくつかの実施形態では、膜融合は、エキソソームと標的細胞の原形質膜との間で発生する。他の実施形態では、膜融合は、エキソソームと標的細胞のエンドソーム膜との間で発生する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、レシーバーポリペプチドを含む。レシーバーポリペプチドは、合成的であり得る。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、プロデューサー細胞（例えば、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸はプロデューサー細胞中に導入される）、またはプロデューサー細胞の外側で作製される組換えレシーバーポリペプチド（例えば、タンパク質発現系により合成される）中に導入される。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチド（例えば、組換えにより産生されたポリペプチド）は、直接エキソソーム中に導入される（例えば、エキソソームがプロデューサー細胞から単離された後に）。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、エキソソームの表面上にあり得る。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、血液のような対象の循環系中を循環する特定の標的（例えば、病原体、代謝産物、タンパク質、ポリペプチド複合体または非機能細胞もしくはがん細胞のような細胞のような標的）、または組織（患部組織のような）に常在する標的にエキソソームを標的とすることができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、合成的である。つまり、エキソソームのプロデューサー細胞からの回収後、追加的な成分を添加するために改変が行われる。例えば、エキソソームは、例えば、プロデューサー細胞から回収された時にエキソソーム中に見出だされない治療用ポリペプチド、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのような）または他のポリヌクレオチド、多糖またはグリカン、脂質または脂肪酸、大きな生物学的、小分子または毒素のようなペイロードを含むことができる。いくつかの実施形態では、エキソソームは改変される（例えば、ペイロードを導入すること、または、他の方法では、膜のタンパク質、脂質またはグリカン含有量を変化させることによるように、複合体の含有量を改変することによって）。例えば、エキソソームは、まずプロデューサー細胞から単離され、次いで、必要に応じて改変され、それにより合成エキソソームを生成する。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、改変される。例えば、外因性核酸、外因性ポリペプチドまたは小分子または毒素は、プロデューサー細胞中に導入され得る。代替的にまたは加えて、プロデューサー細胞は、他の方法で改変され得る（例えば、細胞膜の脂質またはグリカン含有量を変化させることによるように、細胞または膜含有量を改変することによって）。改変されたプロデューサー細胞から生成されたエキソソームは、プロデューサー細胞の改変のうちの１つ以上を含む。このプロセスは、合成エキソソームを産生する。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞及びプロデューサー細胞から単離されたエキソソームの両方は、本明細書に記載されるように改変される。
【０１０３】
ナノ小胞
様々な実施形態では、細胞外小胞は、ナノ小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ小胞は、内部空間を封入する膜を含み、ナノ小胞が操作なしでは細胞によって産生されないように直接的操作または間接的操作により細胞から生成される、細胞由来の小さな小胞である。細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されず、いくつかの例では、プロデューサー細胞の破壊を生じ得る。
【０１０４】
様々な実施形態では、ナノ小胞は、約２０〜１００ｎｍ、２０〜１５０ｎｍ、２０〜２００ｎｍ、３０〜１００ｎｍ、３０〜１５０ｎｍ、３０〜２００ｎｍ、３０〜２５０ｎｍ、４０〜１００ｎｍ、４０〜１５０ｎｍ、４０〜２００ｎｍ、４０〜２５０ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、５０〜２５０ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、または１５０〜２５０ｎｍのような、約２０〜２５０ｎｍの最長寸法を有する。
【０１０５】
様々な実施形態では、ナノ小胞は、プロデューサー細胞に由来する。ある特定の実施形態では、ナノ小胞は、直接的操作または間接的操作によってプロデューサー細胞から生成される。適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。これらの実施形態のいくつかでは、操作は、プロデューサー細胞の破壊を生じ得る。いくつかの好ましい実施形態では、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合により、プロデューサー細胞に由来する小胞を実質的に含まない。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ナノ小胞は、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離される。ある特定の実施形態では、単離は、沈降によって達成され得る。例えば、ナノ小胞は、０．５〜２．０、０．６〜１．０、０．７〜１．０、０．８〜１．０、０．９〜１．０、１．０〜１．１、１．１〜１．２、１．２〜１．３、１．４〜１．５、１．０〜１．５、１．５〜２．０、及び１．０〜２．０ｋｇ／ｍ３の比重を有することができる。
【０１０７】
様々な実施形態では、ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ナノ小胞は、糖を更に含む。ある特定の実施形態では、ナノ小胞は、ポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ナノ小胞は、レシーバーを更に含む。いくつかの実施形態では、ナノ小胞は、ペイロードを更に含む。これらの実施形態のいくつかでは、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含む。
【０１０８】
免疫調節成分
一態様では、細胞外小胞、例えば、エキソソームは、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させる少なくとも１つの免疫調節成分を含む。一態様では、Ｍ２表現型からＭ１表現型への増加は、Ｍ２マクロファージの集団を含む参照試料に関して評価される。一態様では、本開示の細胞外小胞によって達成される増加は、等モル量の免疫調節成分単体によって達成されるもの以上である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、マクロファージ分極を増加させるポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、これらに限定されないが、以下の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、及びＰＫＭ２を例として含む、その阻害がＭ２表現型からＭ１表現型への増加した分極を促進するがん原遺伝子及び他の型の遺伝子のような、少なくとも１つの遺伝子を阻害する核酸である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドとタンパク質性免疫調節成分との組み合わせが企図され、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体または抗体断片（例えば、ＣＴＬＡ−４を標的とするイピリムマブ、ＰＤ−１を標的とするニボルマブ、セミプリマブ及びペムブロリズマブ、ならびに各々がＰＤ−Ｌ１を標的とするアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤（例えば、臨床候補ペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、及びＩＭＣ−ＣＳ４、及び、例えば、Ｃａｎｎａｒｉｌｅ  ＭＡ，Ｗｅｉｓｓｅｒ  Ｍ，Ｊａｃｏｂ  Ｗ，Ｊｅｇｇ  ＡＭ，Ｒｉｅｓ  ＣＨ，Ｒｕｔｔｉｎｇｅｒ  Ｄ（２０１７）”Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＳＦ１Ｒ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．５（１）：５３に記載される他のもののようなタンパク質性免疫調節成分、（Ｐａｔｅｌ  Ｓ，Ｐｌａｙｅｒ  ＭＲ（２００９）”Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．９：５９９−６１０も参照されたい。）モノクローナル抗体であり、転移性膵癌の初期の臨床試験にあるカビラリズマブ（ｃａｂｉｒａ、ＦＰＡ−００８）（Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｄｏｓｅ  ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃａｂｉｒａｌｉｚｕｍａｂ  （ｃａｂｉｒａ；ＦＰＡ−００８），ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＳＦ１Ｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ  ｔｅｎｏｓｙｎｏｖｉａｌ  ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ（ＴＧＣＴ，ｄｉｆｆｕｓｅ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｖｉｌｌｏｎｏｄｕｌａｒ  ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ  Ｄ−ＰＶＮＳ、Ａ  Ｓｔｕｄｙ  ��ｆ  Ｃａｂｉｒａｌｚｕｍａｂ  Ｇｉｖｅｎ  ｂｙ  Ｉｔｓｅｌｆ  ｏｒ  Ｗｉｔｈ  Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈａｔ  Ｈａｓ  Ｓｐｒｅａｄ、及びＮｏｖｅｌ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｈｏｗｓ  Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｏｖ  ２０１７を参照されたく、ならびに、がん及び炎症状態の治療に有用な他の免疫調節成分を含む。
【０１０９】
これらの実施形態のいくつかでは、核酸は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｄｓＤＮＡを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡ）である。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである際に、それは所望のポリペプチドに翻訳され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子である。これらの実施形態のいくつかでは、ｍｉＲＮＡ分子が標的細胞においてネイティブｍＲＮＡを発現停止できるように、ｍｉＲＮＡは、標的細胞の細胞質に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、がん遺伝子または他の制御不全ポリペプチドの発現に干渉できる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。これらの実施形態のいくつかでは、ｓｉＲＮＡ分子が標的細胞においてネイティブｍＲＮＡを発現停止できるように、ｓｉＲＮＡは、標的細胞の細胞質に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御し、疾患を調節することができる長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。様々な実施形態では、ＡＳＯは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。例えば、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ：Ｎｏｖｅｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９７を参照されたい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡに転写され得るＤＮＡである。これらの実施形態のいくつかでは、転写されたＲＮＡは、所望のポリペプチドに翻訳され得る。ある特定の実施形態では、核酸は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、グルタミナーゼ、及びＰＫＭ２からなる少なくとも１つの遺伝子を阻害する。ある特定の実施形態では、核酸は、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、ＫＲＡＳ、及びＨＩＦ１−アルファからなる少なくとも１つの遺伝子を阻害する。ある特定の実施形態では、核酸は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、グルタミナーゼ、及びＰＫＭ２からなる少なくとも１つの遺伝子を阻害する阻害性ＲＮＡである。ある特定の実施形態では、核酸は、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、ＫＲＡＳ、及びＨＩＦ１−アルファからなる少なくとも１つの遺伝子を阻害する阻害性ＲＮＡである。ある特定の実施形態では、核酸は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、グルタミナーゼ、及びＰＫＭ２からなる少なくとも１つの遺伝子を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ある特定の実施形態では、核酸は、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰ／β、Ｐｉ３Ｋγ、ＫＲＡＳ、及びＨＩＦ１−アルファからなる少なくとも１つの遺伝子を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ある特定の実施形態では、核酸は、ヒトＫＲＡＳがん原遺伝子を阻害する。ある特定の実施形態では、核酸は、ヒトＫＲＡＳがん原遺伝子を阻害する阻害性ＲＮＡである。ある特定の実施形態では、核酸は、ＳＴＡＴ３を阻害する。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態では、核酸は、既知のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、その例は表０に列挙される。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、既知のＡＳＯ、例えば、表０に列挙されるものに少なくとも９０％〜９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ３を阻害する。様々な実施形態では、ＡＳＯは、ＴＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＴＴＣＡＡＣＴＣＡ（配列番号１）に少なくとも９０％〜９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９０％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９１％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９２％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９３％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９４％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９６％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９７％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９８％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１に少なくとも９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＭＯＥ、Ｏ−メチル、またはＬＮＡケミストリーによって改変される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’または３’末端でコレステロールタグを更に含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＳＴＡＴ６を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。様々な実施形態では、ＡＳＯは、ＴＧＡＧＣＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＴＣＴＴ（配列番号２）に少なくとも９０％〜９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９０％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９１％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９２％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９３％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９４％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９６％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９７％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９８％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２に少なくとも９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＭＯＥ、Ｏ−メチル、またはＬＮＡケミストリーによって改変される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’または３’末端でコレステロールタグを更に含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＣｅｂｐＢを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。様々な実施形態では、ＡＳＯは、ＴＧＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣ（配列番号３）に少なくとも９０％〜９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９０％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９１％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９２％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９３％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９４％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９６％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９７％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９８％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に少なくとも９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＭＯＥ、Ｏ−メチル、またはＬＮＡケミストリーによって改変される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’または３’末端でコレステロールタグを更に含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｐｉ３Ｋγを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。様々な実施形態では、ＡＳＯは、ＴＴＧＧＧＴＡＡＡＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＡ（配列番号４）に少なくとも９０％〜９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９０％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９１％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９２％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９３％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９４％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９６％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９７％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９８％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４に少なくとも９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＭＯＥ、Ｏ−メチル、またはＬＮＡケミストリーによって改変される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’または３’末端でコレステロールタグを更に含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＨＩＦ１αを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。様々な実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９０％〜９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９０％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９１％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９２％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９３％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９４％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９６％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９７％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９８％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＭＯＥ、Ｏ−メチル、またはＬＮＡケミストリーによって改変される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’または３’末端でコレステロールタグを更に含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＨＩＦ１αを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。様々な実施形態では、ＡＳＯは、ＧＴＧＣＡＧＴＡＴＴＧＴＡＧＣＣＡＧＧＣ（配列番号５）に少なくとも９０％〜９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９０％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９１％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９２％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９３％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９４％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９６％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９７％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９８％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５に少なくとも９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＭＯＥ、Ｏ−メチル、またはＬＮＡケミストリーによって改変される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’または３’末端でコレステロールタグを更に含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｋｒａｓを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。様々な実施形態では、ＡＳＯは、ＧＴＡＧＣＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＧＣＣＣ（配列番号６）に少なくとも９０％〜９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９０％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９１％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９２％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９３％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９４％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９５％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９６％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９７％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９８％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６に少なくとも９９％同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＭＯＥ、Ｏ−メチル、またはＬＮＡケミストリーによって改変される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’または３’末端でコレステロールタグを更に含む。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、組成物は、細胞外小胞、例えば、エキソソームを含み、マクロファージ分極を促進することが知られている小分子、抗体または抗体断片である追加的な免疫調節成分を更に含む。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）阻害剤である。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、組成物は、抗腫瘍活性を有する追加的な免疫調節成分を含む。いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、自然免疫応答を制御する。これらの実施形態のいくつかでは、追加的な免疫調節成分は、ナチュラルキラー細胞を標的とする。いくつかの他の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、獲得免疫応答を制御する。これらの実施形態のいくつかでは、追加的な免疫調節成分は、細胞傷害性Ｔ細胞を標的とする。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、細胞外小胞の表面上に位置する。いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、細胞外小胞の内側に位置する。いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、細胞外小胞の表面上及び内側の両方に位置する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、その完全長形態でプロデューサー細胞において発現される。他の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、エキソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現され、エキソソームの表面上の免疫調節化合物の生物学的活性部分のより高いレベルの発現を生じる。いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節化合物は、該可溶性タンパク質がエキソソームの表面上に保持されるように、エキソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現される可溶性タンパク質である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、例えば、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）のようなネガティブチェックポイント制御因子に対する阻害剤である。いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、例えば、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２のようなネガティブチェックポイント制御因子の結合パートナーに対する阻害剤である。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）の阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、ＣＴＬＡ−４のモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ−４のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ＣＴＬＡ−４のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ−４に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、イピリムマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、トレメリムマブである。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２のモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ニボルマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ペムブロリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ピディリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、アテゾリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、アベルマブである。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、リンパ球関連遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＬＡＧ３の阻害剤は、例えば、ＢＭＳ−９８６０１６のようなＬＡＧ３のモノクローナル抗体である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖで”Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＬＡＧ−３  Ｗｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ”についての臨床試験番号ＮＣＴ０１９６８１０９を参照されたい）。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＣＤ２０、ＣＤ３９、またはＣＤ７３の阻害剤である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、正の共刺激分子に対する活性化剤である。いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、正の共刺激分子の結合パートナーに対する活性化剤である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、アゴニスト抗体または天然リガンドまたはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのような、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性化剤である。ある特定の実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＧＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーである。ある特定の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ−２からなる群から選択される。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＯＸ４０の活性化剤は、ＯＸ４０のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、ＯＸ４０の活性化剤は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）である。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＣＤ２７の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ２７の活性化剤は、ＣＤ２７のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、ＣＤ２７の活性化剤は、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）である。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＣＤ４０の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ４０の活性化剤は、ＣＤ４０のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、ＣＤ４０の活性化剤は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＧＩＴＲの活性化剤は、ＧＩＴＲのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、ＧＩＴＲの活性化剤は、ＧＩＴＲの天然リガンドである。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、４−１ＢＢの活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、４−１ＢＢの活性化剤は、４−１ＢＢのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、４−１ＢＢの活性化剤は、４−１ＢＢの天然リガンドである。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｆａｓ受容体（Ｆａｓ）である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｆａｓ受容体は、細胞外小胞の表面上に表示される。いくつかの他の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｆａｓリガンドは、細胞外小胞の表面上に表示される。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｆａｓ受容体の抗体である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｆａｓリガンドの抗体である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子の活性化剤である。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子は、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＩＣＯＳの活性化剤は、ＩＣＯＳのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、ＩＣＯＳの活性化剤は、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）である。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＣＤ２８の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ２８の活性化剤は、ＣＤ２８のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、ＣＤ２８の活性化剤は、ＣＤ２８の天然リガンドである。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８のリガンドは、ＣＤ８０である。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、エキソソーム表面タンパク質またはその断片に翻訳によって融合されている可溶性サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−７である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＴＣＲα鎖またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＴＣＲβ鎖またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｔ細胞またはその誘導体の共受容体である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンドからなる群から選択される。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）である。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチンである。これらの実施形態のいくつかでは、ムチンは、分泌型ムチンである。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、ムチンは、膜貫通ムチンである。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチン１（ＭＵＣ１）である。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、Ｔｎ−ＭＵＣ１である。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチン１６（ＭＵＣ１６）である。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）である。これらの実施形態のいくつかでは、ＭＡＧＥは、Ｉ型ＭＡＧＥである。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、ＭＡＧＥは、ＩＩ型ＭＡＧＥである。特定の実施形態では、Ｉ型ＭＡＧＥは、ＭＡＧＥ−Ａ２である。特定の実施形態では、Ｉ型ＭＡＧＥは、ＭＡＧＥ−Ａ４である。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、チロシナーゼである。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）である。様々な実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、及びＣＤ８６からなる群から選択される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンドのうちの１つ以上に結合する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＣＤ３の活性化剤である。ある特定の実施形態では、活性化剤は、ＣＤ３のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ＣＤ３のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態では、活性化剤は、ＣＤ３に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＣＤ２８の活性化剤である。ある特定の実施形態では、活性化剤は、ＣＤ２８のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ＣＤ２８のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態では、活性化剤は、ＣＤ２８に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、追加的な免疫調節成分は、ＭＨＣクラスＩまたはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、追加的な免疫調節成分は、ＭＨＣクラスＩＩまたはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、追加的な免疫調節成分は、ＭＨＣクラスＩＩＩまたはその誘導体である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、追加的な免疫調節成分は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、追加的な免疫調節成分は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、追加的な免疫調節成分は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、またはその誘導体である。
【０１４９】
様々な実施形態では、免疫調節成分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質、小分子、または毒素であり得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質であり得る。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、アゴニストである。これらの実施形態のいくつかでは、アゴニストは、ホルモンまたは神経伝達物質のような内因性アゴニストである。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、アゴニストは、薬物のような外因性アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体に結合することなくアゴニスト応答を生み出すことができる物理的アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、内因性アゴニストよりも大きな最大応答を産生できるスーパーアゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、受容体で完全な効力を有する完全アゴニストである。ある特定の他の実施形態では、アゴニストは、完全アゴニストと比較して、受容体で部分的効力のみを有する部分アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体の恒常的活性を阻害できる逆アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体に対する効果を産生するために他のコアゴニストと協働するコアゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、共有結合の形成を通じて受容体に永久的に結合する不可逆的アゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、特定の型の受容体に対する選択的アゴニストである。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、アンタゴニストである。これらの実施形態のいくつかでは、アンタゴニストは、競合的アンタゴニストであり、受容体を活性化することなく内因性リガンドまたはアゴニストと同じ結合部位で受容体に可逆的に結合する。競合的アンタゴニストは、最大応答を達成するために必要なアゴニストの量に影響できる。これらの実施形態のいくつかの他のものでは、アンタゴニストは非競合的アンタゴニストであり、受容体の活性部位または受容体のアロステリック部位に結合する。非競合的アンタゴニストは、任意の量のアゴニストによって達成され得る最大応答の規模を低下できる。いくつかの他の実施形態では、アンタゴニストは、別個のアロステリック結合部位へのその結合の前にアゴニストによる受容体活性化を必要とする不競合的アンタゴニストである。
【０１５３】
様々な実施形態では、免疫調節成分は、抗体または抗原結合断片を含む。免疫調節成分は、完全長タンパク質またはその断片であり得る。抗体または抗原結合断片は、天然の供給源に由来するか、または部分的もしくは全体的に合成的に産生され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。いくつかの他の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片から選択される。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖまたは（ｓｃＦｖ）２断片である。ある特定の他の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ナノボディ（登録商標）（単一ドメイン抗体）である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、二重特異性または多重特異性抗体である。
【０１５４】
様々な実施形態では、抗体または抗原結合断片は、完全にヒトである。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ヒト化される。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、キメラである。これらの実施形態のいくつかでは、キメラ抗体は、非ヒトＶ領域ドメイン及びヒトＣ領域ドメインを有する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、マウスまたは獣医学のような非ヒトである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
【０１５６】
様々な実施形態では、組成物は、原子、分子等の、混合物、融合物、組み合わせ、及び複合体を含む、２つ以上の上記の免疫調節成分を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、ポリペプチドと組み合わされた核酸を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、互いに複合体化した２つ以上のポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、生物学的活性分子に複合体化したタンパク質を含む。これらの実施形態のいくつかでは、生物学的活性分子は、プロドラッグである。
【０１５７】
薬学的組成物
薬学的組成物は、一般に、複数の細胞外小胞と、対象への投与に適した形態の薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む。薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的には、投与される特定の化合物によって、同様に組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、複数の細胞外小胞を含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤がある。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ  ｅｄ．（２００５）を参照されたい）。医薬組成物は一般に滅菌して製剤化され、米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載される１つ以上の治療薬及び細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、１つ以上の別個の治療剤と同時投与され、同時投与は、細胞外小胞の投与の前、後または同時の別個の治療剤の投与を含む。
【０１５９】
薬学的に許容される賦形剤は、ヒトの薬学的使用に対して同様に獣医学的使用に対して許容される賦形剤を含む、一般に安全で、非毒性で、望ましい賦形剤を含む。
【０１６０】
担体または希釈剤の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び化合物の使用は、当該技術分野で既知である。任意の従来の培地または化合物が本明細書に記載される細胞外小胞と不適合でない限り、組成物におけるその使用が企図される。補助的な治療薬はまた、組成物中に組み込まれ得る。典型的には、薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。細胞外小胞は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内経路または吸入剤によって投与され得る。ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む薬学的組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。細胞外小胞は、任意選択で、細胞外小胞が意図される疾患、障害または状態の治療に少なくとも部分的に有効である他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
【０１６１】
溶液または懸濁液は、以下の成分、水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗微生物化合物、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩のような緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧の調整のための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックから作製された複数用量バイアルに封入され得る。
【０１６２】
注射可能な使用に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与については、好適な担体は、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は一般に滅菌されており、容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散液であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。所望される場合、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、及び塩化ナトリウムは、組成物に添加され得る。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０１６３】
滅菌注射可能溶液は、細胞外小胞を、所望されるように、有効量で、かつ本明細書に列挙された成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に組み込むことによって調製され得る。一般に、分散液は、細胞外小胞を、基本的な分散媒と任意の所望の他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分と、事前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥である。細胞外小胞は、細胞外小胞の持続的または拍動性放出を可能にするような様式で製剤化され得るデポー注射またはインプラント調整物の形態で投与され得る。
【０１６４】
細胞外小胞を含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によることもできる。経粘膜投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は、一般に当該技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与のための、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、点鼻薬の使用を通じて達成され得る。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む薬学的組成物は、薬学的組成物の恩恵を受けるであろう対象に静脈内投与される。ある特定の他の実施形態では、組成物は、リンパ系に、例えば、リンパ内注射によってまたは結節内注射によって（例えば、Ｓｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０５（４６）：１７９０８（２００８）を参照されたい）、または筋肉内注射によって、皮下注射によって、胸腺もしくは肝臓への直接注射による皮下投与によって投与される。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む薬学的組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、投与に続いてデポーを形成できる製剤として投与される。ある特定の好ましい実施形態では、デポーは、細胞外小胞を循環中に緩徐に放出するか、またはデポー形態のままである。
【０１６７】
典型的には、薬学的に許容される組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、生体適合性があり、毒性がなく、対象への投与に適している。水が担体の構成要素である場合、水は、汚染物質、例えば、エンドトキシンを含まないように高度に精製及び加工される。
【０１６８】
薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム（ｇｕｍ  ａｃａｃｉａ）、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱油であり得るが、これらに限定されない。薬学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、風味増強剤、乳化剤、懸濁剤及び／または保存料を更に含むことができる。
【０１６９】
本明細書に記載される薬学的組成物は、本明細書に記載される細胞外小胞と、任意選択で、薬学的に活性な薬剤または治療剤と、を含む。治療剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、または核酸薬剤であり得る。
【０１７０】
本明細書に記載される細胞外小胞を含む薬学的組成物を含む剤形が、提供される。いくつかの実施形態では、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製物は、残留複製能のある（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）核酸を損傷するために、放射線、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、紫外線に曝される。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製物は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００超、または１００ｋＧｙ超の照射線量を使用するガンマ照射に曝される。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製物は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００超、または１００００ｍＳｖ超の照射線量を使用するＸ線照射に曝される。
【０１７４】
方法
本開示の態様はまた、細胞外小胞及び免疫調節成分を含む組成物を産生する方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、プロデューサー細胞から細胞外小胞を得ることであって、プロデューサー細胞が免疫調節成分を天然に含有する、得ることと、任意選択で、得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、プロデューサー細胞を免疫調節成分で改変することと、改変されたプロデューサー細胞から細胞外小胞を得ることと、任意選択で、得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの他の実施形態では、方法は、プロデューサー細胞から細胞外小胞を得ることと、得られた細胞外小胞を単離することと、単離された細胞外小胞を免疫調節成分で改変することと、を含む。ある特定の実施形態では、方法は、単離された細胞外小胞を薬学的組成物に製剤化することを更に含む。
【０１７５】
細胞外小胞を産生する方法
免疫調節成分でプロデューサー細胞を改変する方法
様々な実施形態では、方法は、免疫調節成分でプロデューサー細胞を改変することを含む。
【０１７６】
プロデューサー細胞は、哺乳動物細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、または原核細胞株であり得る。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、哺乳動物細胞株である。哺乳動物細胞株は、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ−１０８０細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＰＥＲＣ−６細胞株、ＣＥＶＥＣ細胞株、線維芽細胞株、羊膜細胞株、上皮細胞株、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞株を含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、哺乳動物細胞株は、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＪヒト包皮繊維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪性間葉系幹細胞、またはＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞であり得る。プロデューサー細胞はまた、初代細胞であり得る。様々な実施形態では、初代細胞は、初代哺乳動物細胞、初代植物細胞、初代昆虫細胞、初代真菌細胞、または初代原核細胞であり得る。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、抗原提示細胞、マクロファージ、Ｔヘルパー細胞、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）のような免疫細胞である。
【０１７８】
様々な実施形態では、免疫調節成分は、プロデューサー細胞中に導入された導入遺伝子またはｍＲＮＡからのプロデューサー細胞において発現され得るが、それはトランスフェクション（例えば、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ  Ｓ，Ｇｒａｈａｍ  ＦＬ（Ａｐｒｉｌ  １９７７）”Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｏ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．７４（４）：１５９０−４、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  Ｍ（１９９１）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ．ｐｐ．９６−９７、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ＰＬ，Ｇａｄｅｋ  ＴＲ，Ｈｏｌｍ  Ｍ，Ｒｏｍａｎ  Ｒ，Ｃｈａｎ  ＨＷ，Ｗｅｎｚ  Ｍ，Ｎｏｒｔｈｒｏｐ  ＪＰ，Ｒｉｎｇｏｌｄ  ＧＭ，Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９８７）”Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．８４（２１）：７４１３−７、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ＪＨ，Ｋｕｍａｒ  Ｒ，Ｓｒｉｄｈａｒ  ＣＮ，Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＣＪ，Ｔｓａｉ  ＹＪ，Ｂｏｒｄｅｒ  Ｒ，Ｒａｍｓｅｙ  Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｍ，Ｆｅｌｇｎｅｒ  ＰＬ（Ｊａｎｕａｒｙ  １９９４）”Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６９（４）：２５５０−６１を参照されたい）、ウイルス形質導入（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＪ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＨ，Ｓｕｚｕｋｉ  ＤＴ，Ｌｅｗｏｎｔｉｎ  ＲＣ，Ｇｅｌｂａｒｔ  ＷＭ（２０００）．”Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ”．Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（７ｔｈ  ｅｄ．）を参照されたい）、電気穿孔（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ，Ｍ；Ｗａｎｇ，Ｙ；Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ＰＨ（１９８２）”Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｌｙｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ”．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ．１（７）：８４１−５）を参照されたい）、押出（例えば、Ｓｈａｒｅｉ  Ａ，Ｚｏｌｄａｎ  Ｊ，Ａｄａｍｏ  Ａ，Ｓｉｍ  ＷＹ，Ｃｈｏ  Ｎ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｅ，Ｍａｏ  Ｓ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ，Ｈａｎ  ＭＪ，Ｌｙｔｔｏｎ−Ｊｅａｎ  Ａ，Ｂａｓｔｏ  ＰＡ，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ  Ｓ，Ｌｅｅ  Ｊ，Ｈｅｌｌｅｒ  ＤＡ，Ｋａ���ｇ  ＪＷ，Ｈａｒｔｏｕｌａｒｏｓ  ＧＣ，Ｋｉｍ  ＫＳ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＧ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＫＦ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３）”Ａ  ｖｅｃｔｏｒ−ｆｒｅｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．１１０（６）：２０８２−７を参照されたい、超音波処理（例えば、Ｙｉｚｈｉ  Ｓｏｎｇ（２００７）”Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５（１９）：ｅ１２９．を参照されたい）、細胞融合（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ＰＬ，Ｇａｄｅｋ  ＴＲ，Ｈｏｌｍ  Ｍ，Ｒｏｍａｎ  Ｒ，Ｃｈａｎ  ＨＷ，Ｗｅｎｚ  Ｍ，Ｎｏｒｔｈｒｏｐ  ＪＰ，Ｒｉｎｇｏｌｄ  ＧＭ，Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９８７）”Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．８４（２１）：７４１３−を参照されたい）、または当業者に既知の他の方法による。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、トランスフェクションによってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、カチオン性脂質及びポリマーのような合成高分子を使用して好適なプロデューサー細胞中に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１１８−Ｓ１３０（２００５））。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、電荷相互作用を通じて免疫調節成分と複合体を形成する。これらの実施形態のいくつかでは、正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞により取り込まれる。いくつかの他の実施形態では、カチオン性ポリマーは、プロデューサー細胞をトランスフェクトするために使用され得る。これらの実施形態のいくつかでは、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質は、免疫調節成分をプロデューサー細胞に導入するために使用され得る。免疫調節成分はまた、粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、または粒子衝撃技術のような物理的方法を使用してプロデューサー細胞中に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１１８−Ｓ１３０（２００５））。例えば、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子は、プロデューサー細胞のトランスフェクション効率を評価するために使用され得る。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ウイルス形質導入によってプロデューサー細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプマウイルスを含む多くのウイルスは、遺伝子導入ビヒクルとして使用され得る。ウイルス媒介性遺伝子導入ビヒクルは、レトロウイルスと同様に、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに基づくベクターを含む。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、電気穿孔によってプロデューサー細胞に導入される。電気穿孔は、細胞膜に一時的な孔を作成し、細胞中への様々な分子の導入を可能にする。いくつかの実施形態では、ポリペプチド及び非ポリペプチド治療薬と同様に、ＤＮＡ及びＲＮＡは、電気穿孔によってプロデューサー細胞中に導入され得る。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、マイクロ注射によってプロデューサー細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ガラス製マイクロピペットは、顕微鏡レベルで免疫調節成分をプロデューサー細胞中に注射するために使用され得る。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、押出によってプロデューサー細胞に導入される。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、超音波処理によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、高強度音波に曝露され、細胞膜の一時的な破壊を引き起こして、免疫調節成分の負荷を可能にする。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、細胞融合によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、電気的細胞融合によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの他の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、プロデューサー細胞を融合させるために使用される。いくつかの他の実施形態では、センダイウイルスは、プロデューサー細胞を融合させるために使用される。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、低張溶解によってプロデューサー細胞に導入される。これらの実施形態のいくつかでは、プロデューサー細胞は、低イオン強度緩衝液に曝露され、それらを破裂させて免疫調節成分の負荷を可能にする。いくつかの代替的な実施形態では、低張溶液に対する制御された透析は、プロデューサー細胞を膨潤させ、プロデューサー細胞膜に孔を作成するために使用される。プロデューサー細胞は、その後、膜のリシーリング（ｒｅｓｅａｌｉｎｇ）を可能にする条件に曝露される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、洗剤処理によってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、免疫調節成分の負荷を可能にする孔を作成することによってプロデューサー細胞膜を一時的に損なう穏やかな洗剤で処理される。プロデューサー細胞が負荷された後、洗剤は洗い流され、それによって膜をリシールする。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、免疫調節成分の結合時に受容体及び関連する免疫調節成分の内部移行を誘導する表面受容体を有する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、濾過によってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞及び免疫調節成分は、プロデューサー細胞より小さい孔径のフィルターを強制的に通して、プロデューサー細胞膜の一時的な破壊を引き起こし、免疫調節成分がプロデューサー細胞に入ることを可能にする。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、いくつかの凍結融解サイクルに曝され、細胞膜破壊を生じ、免疫調節成分の負荷を可能にする。
【０１９１】
免疫調節成分で細胞外小胞を改変する方法
様々な代替的実施形態では、免疫調節成分は、細胞外小胞の単離後に細胞外小胞に直接導入される。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、トランスフェクションによって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、カチオン性脂質及びポリマーのような合成高分子を使用して細胞外小胞中に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１１８−Ｓ１３０（２００５））。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質は、免疫調節成分を細胞外小胞に導入するために使用され得る。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、電気穿孔によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、細胞外小胞膜に一時的な孔を作成する電界に曝露され、免疫調節成分の負荷を可能にする。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、マイクロ注射によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、ガラス製マイクロピペットは、顕微鏡レベルで免疫調節成分を細胞外小胞中に直接注射するために使用され得る。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、押出によって細胞外小胞に導入される。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、超音波処理によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、高強度音波に曝露され、細胞外小胞膜の一時的な破壊を引き起こして、免疫調節成分の負荷を可能にする。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、細胞外小胞の表面に複合体化され得る。複合体化は、当該技術分野で既知の方法により、化学的または酵素的に達成され得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、化学的に複合体化される免疫調節成分を含む。化学的複合体化は、リンカーを有するか有しないかに関わらず、免疫調節成分を別の分子に共有結合させることによって達成され得る。かかる複合体の形成は当該技術分野の範囲内であり、複合体化を達成するための様々な技法が既知であり、特定の技法の選択は複合体化される材料によって導かれる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、細胞外小胞に複合体化される。ある特定の他の実施形態では、脂質、炭水化物、核酸、及び小分子のような非ポリペプチドは、細胞外小胞に複合体化される。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、低張溶解によって細胞外小胞に導入される。これらの実施形態のいくつかでは、細胞外小胞は、低イオン強度緩衝液に曝露され、それらを破裂させて免疫調節成分の負荷を可能にする。いくつかの代替的実施形態では、低張溶液に対する制御された透析は、細胞外小胞を膨潤させ、細胞外小胞膜に孔を作成するために使用される。細胞外小胞は、その後、膜のリシーリングを可能にする条件に曝露される。
【０２００】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、洗剤処理によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、免疫調節成分の負荷を可能にする孔を作製することによって細胞外小胞膜を一時的に損なう穏やかな洗剤で処理される。細胞外小胞が負荷された後、洗剤は洗い流され、それによって膜をリシールする。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、免疫調節成分の結合時に受容体及び関連する免疫調節成分の内部移行を誘導する表面受容体を有する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、機械的発射によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、金マイクロキャリアのような重い粒子または荷電粒子に付着された免疫調節成分を用いて衝撃され得る。これらの実施形態のいくつかでは、粒子は、粒子が細胞外小胞膜を横断するように機械的または電気的に加速され得る。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、濾過によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞及び免疫調節成分は、細胞外小胞より小さい孔径のフィルターを強制的に通して、細胞外小胞膜の一時的な破壊を引き起こし、免疫調節成分が細胞外小胞に入ることを可能にする。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、いくつかの凍結融解サイクルに曝され、細胞外小胞膜破壊を生じ、免疫調節成分の負荷を可能にする。
【０２０５】
細胞外小胞を単離する方法
細胞外小胞はプロデューサー細胞から単離され得る。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、プロデューサー細胞によって細胞培養培地中に放出される。細胞外小胞の単離の全ての既知の様式は、本明細書での使用に適すると思われることが企図される。例えば、細胞外小胞の物理的性質は、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるい等）、密度（例えば、通常遠心分離のまたは勾配遠心分離）、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ定数（例えば、外力を伴うまたは伴わない沈降等）に基づく分離を含む、培地または他の供給源材料からそれらを分離するために採用され得る。代替的にまたは追加的に、単離は、１つ以上の生物学的特性に基づくことができ、表面マーカーを採用できる方法を含む（例えば、沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合、アフィニティ精製等）。
【０２０６】
単離及び濃縮は、典型的には連続遠心分離を含む、一般的かつ非選択的様式で行われ得る。あるいは、単離及び濃縮は、細胞外小胞またはプロデューサー細胞特異的表面マーカーを使用するような、より特異的かつ選択的な様式で行われ得る。例えば、特異的表面マーカーは、免疫沈降、ＦＡＣＳソーティング、アフィニティ精製、及びビーズ結合リガンドを用いた磁気分離において使用され得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、細胞外小胞を単離するために使用され得る。サイズ排除クロマトグラフィー技法は、当技術分野で既知である。例示的で非限定的な技法は、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ボイド容積画分は、単離され、目的の細胞外小胞を含む。更に、いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、当該技術分野で一般に既知のように、（１つ以上のクロマトグラフィー画分の）遠心分離技法によるクロマトグラフィー分離後に更に単離され得る。いくつかの実施形態では、例えば、密度勾配遠心分離が、細胞外小胞を更に単離するために利用され得る。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞由来の細胞外小胞を他の起源の細胞外小胞から更に分離することが望ましい場合がある。例えば、プロデューサー細胞由来の細胞外小胞は、プロデューサー細胞に特異的な抗原抗体を使用する免疫吸着剤捕捉により、非プロデューサー細胞由来の細胞外小胞から分離され得る。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞の単離は、示差遠心分離、サイズに基づく膜濾過、免疫沈降、ＦＡＣＳソーティング、及び磁気分離を含むがこれらに限定されない方法の組み合わせに関与できる。
【０２０９】
細胞外小胞のサイズを測定する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞外小胞及び／または細胞外小胞の集団のサイズを測定することを含む。一般に、細胞外小胞サイズは、最も長い測定可能な寸法として測定される。一般に、細胞外小胞の最も長い測定可能な寸法はまた、その直径として参照される。
【０２１０】
細胞外小胞サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）及び／または多角度光散乱（ＭＡＬＳ）を使用して測定され得る。細胞外小胞のサイズを測定するためにＤＬＳ及び／またはＭＡＬＳを使用する方法は、当業者に既知であり、ナノ粒子追跡アッセイ（ＮＴＡ、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００ナノ粒子追跡デバイスを使用する）を含む。特定の実施形態では、細胞外小胞サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞は、ＮＴＡによって測定される場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞は、ＮＴＡによって測定される場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、ＮＴＡによって測定される場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、ＮＴＡによって測定される場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、ＮＴＡによって測定される場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、ＮＴＡによって測定される場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、ＮＴＡによって測定される場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、ＮＴＡによって測定される場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。
【０２１１】
細胞外小胞サイズは、調整可能な抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）を使用して測定され得る。特定の実施形態では、ＴＲＰＳによって測定される細胞外小胞サイズは、ｉＺＯＮ  ｑＮＡＮＯ  Ｇｏｌｄを使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞は、ＴＲＰＳによって測定される場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞は、ＴＲＰＳによって測定される場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄ）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、ＴＲＰＳによって測定される場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、ＴＲＰＳによって測定される場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、ＴＲＰＳによって測定される場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、ＴＲＰＳによって測定される場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、ＴＲＰＳによって測定される場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、ＴＲＰＳによって測定される場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。
【０２１２】
細胞外小胞サイズは、電子顕微鏡法を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、細胞外小胞サイズを測定するために使用される電子顕微鏡法は、透過型電子顕微鏡法である。特定の実施形態では、細胞外小胞サイズを測定するために使用される透過型電子顕微鏡は、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮである。電子顕微鏡を使用して細胞外小胞サイズを測定する方法は当業者に周知であり、任意のかかる方法は、細胞外小胞サイズを測定するために適切であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載される細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、走査型電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）によって測定される場合、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。
【０２１３】
マクロファージ分極を決定するための方法
マクロファージ標的遺伝子の発現を阻害する１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞を使用して、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させるための方法及び組成物が、本明細書に開示される。組成物は、マクロファージによって優先的に取り込まれ（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または樹状細胞のような他の細胞型と比較して）、等モル量の免疫調節成分単体よりもマクロファージ分極を増加させるのに同じまたはそれ以上に有効である。マクロファージのＭ２及びＭ１表現型の検出を含む、マクロファージ分極を決定するための方法は、Ｍ２及びＭ１表現型を決定するための当技術分野で既知の任意の方法によって実行され得る。組織切片（例えば、腫瘍生検から）、血液試料等は、Ｍ２細胞表面マーカー（例えば、ＹＭ１、ＦＩＺＺ１、デクチン−１、ＭＧＬ）、Ｍ２関連サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４）、Ｍ１関連サイトカイン（例えば、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＣＬ５、ＣＳＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１）、成長因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＥＧＦ、及びＴＧＦ−β）、酵素（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ２、ＭＭＰ９、システインカテプシンプロテアーゼ）、Ｍ２関連ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ１４６ａ、ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ  ７ｂ、及びｍｉＲ−２２３）及び／またはＭ１関連ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ１５５、ｍｉＲ−３３）を含むがこれらに限定されないＭ２及びＭ１マクロファージと同様に、汎マクロファージ（ｐａｎ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）のマーカーについてアッセイ（例えば、染色）され得る。例えば、Ｍｏｓｓｅｒ，Ｄ．Ｍ．，＆  Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｐ．（２００８）．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８（１２），９５８−９６９、Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．，Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｉｓｗａｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ａ．，Ｇｉｌｒｏｙ，Ｄ．Ｗ．，Ｇｏｅｒｄｔ，Ｓ．，Ｗｙｎｎ，Ｔ．Ａ．（２０１４）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４１（１），１４−２０を参照されたい。試料内のマクロファージ及び／またはマクロファージ成分、分泌またはマクロファージ活性（例えば、Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｈａｙ，Ｔ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｇｒｅｔｅｒ，Ｍ．，Ｊａｋｕｂｚｉｃｋ，Ｃ．，Ｉｖａｎｏｖ，Ｓ．，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｇ．Ｊ．（２００７）．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３（１１），１１１８−１１２８を参照されたい）は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、イムノブロッティング、定量ＰＣＲ、または生物学的試料中の細胞または細胞産物を検出するための当該技術分野で既知の任意の他の方法によって検出され得る。
【０２１４】
がんを治療する方法
また、対象におけるがんを治療する方法が、本明細書に提供される。
【０２１５】
様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝子を阻害し、それによりＭ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させる１つ以上の免疫調節成分を含む細胞外小胞、例えば、エキソソームの組成物は、がんを有する対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、免疫応答を上方制御し、対象の免疫系の腫瘍標的化を増強できる。いくつかの態様では、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極の増加は、それ自体で対象の免疫応答を上方制御し、対象の免疫系の腫瘍標的化を増強する。一部の著者はＩＬ−６及びアデノシンに対する応答としてＭ２ｄサブタイプの活性化に言及しており、これらのマクロファージは腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）とも称される。例えば、Ｒｏｓｚｅｒ，Ｔ．（２０１５）．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ  Ｍ２  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，２０１５，１−１６、Ｆｕｎｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｒｉｏｓ，Ｍ．，Ｅｓｃｏｂａｒ−Ｖｅｒａ，Ｊ．，＆  Ｋａｌｅｒｇｉｓ，Ａ．Ｍ．（２０１８）．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５４（２），１８６−１９５、及びＱ．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｎｉ，Ｌ．Ｌａｎ，Ｘ．Ｗｅｉ，Ｒ．Ｘｉａｎｇ，ａｎｄ  Ｙ．Ｗａｎｇ，“Ｆｒａ−１  ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＩＬ６  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ２ｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，”Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．６，ｐｐ．７０１−７１２，２０１０を参照されたい。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、典型的には、がん細胞の運動性、転移形成及び血管新生の促進などのそれらの腫瘍誘発（ｐｒｏｔｕｍｏｒａｌ）機能について典型的であり、それらの形成は、発生する腫瘍に存在する微小環境因子に依存する。ＴＡＭは、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２などの免疫抑制性サイトカインと、非常に少量のＮＯまたはＲＯＩと、低レベルの炎症性サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６）と、を産生する。腫瘍関連抗原を提示するＴＡＭの能力は、Ｔ及びＮＫ細胞の抗腫瘍機能の刺激と同様に、低下する。また、ＴＡＭは腫瘍細胞を溶解できない。ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ＿ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−Ｓｉｃａ２００８−３１  ＴＡＭの標的化は、ＴＡＭの動員及び分布を変更するか、既存のＴＡＭを枯渇させるか、またはＭ２表現型からＭ１表現型へＴＡＭの再教育を誘導するかのいずれかが薬剤の送達を通じて実証されているように、がんに対する新規の治療戦略である。例えば、Ｌｅｗｉｓ，Ｃｌａｉｒｅ  Ｅ．，ａｎｄ  Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｗ．Ｐｏｌｌａｒｄ．”Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ��”Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６．２（２００６）：６０５−６１２、Ｓｉｃａ，Ａｎｔｏｎｉｏ，ｅｔ  ａｌ．”Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．”Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．１８．Ｎｏ．５．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８、Ｓｉｃａ，Ａｎｔｏｎｉｏ，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１０  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＩＬ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｊａｎ  １５；１６４（２）：７６２−７、Ｃｕｃｃａｒｅｓｅ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆ．；Ｄｕｂａｃｈ，Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗ；Ｐｆｉｒｓｃｈｋｅ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ；Ｅｎｇｂｌｏｍ，Ｃａｍｉｌｌａ；Ｇａｒｒｉｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍｉｌｅｓ  Ａ．；Ｐｉｔｔｅｔ，Ｍｉｋａｅｌ  Ｊ．；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒａｌｐｈ（２０１７−０２−０８）”Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ３Ｄ  ｏｒｇａｎ  ｉｍａｇｉｎｇ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．８：１４２９３、Ｚｅｉｓｂｅｒｇｅｒ，Ｓ  Ｍ；Ｏｄｅｒｍａｔｔ，Ｂ；Ｍａｒｔｙ，Ｃ；Ｚｅｈｎｄｅｒ−Ｆｊａｌｌｍａｎ，Ａ  Ｈ  Ｍ；Ｂａｌｌｍｅｒ−Ｈｏｆｅｒ，Ｋ；Ｓｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ，Ｒ  Ａ（２００６−０７−１１）”Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ”．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．９５（３）：２７２−２８１、Ｒｏｄｅｌｌ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｂ．；Ａｒｌａｕｃｋａｓ，Ｓｅａｎ  Ｐ．；Ｃｕｃｃａｒｅｓｅ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆ．；Ｇａｒｒｉｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｓ．；Ｌｉ，Ｒａｎ；Ａｈｍｅｄ，Ｍａａｚ  Ｓ．；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｒａｉｎｅｒ  Ｈ．；Ｐｉｔｔｅｔ，Ｍｉｋａｅｌ  Ｊ．；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒａｌｐｈ（２０１８−０５−２１）”ＴＬＲ７／８−ａｇｏｎｉｓｔ−ｌｏａｄｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｇｕｅｒｒｉｅｒｏ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｌ．；Ｓｏｔａｙｏ，Ａｌａｂａ；Ｐｏｎｉｃｈｔｅｒａ，Ｈｏｌｌｙ  Ｅ．；Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎ，Ｊｅｓｓｉｃａ  Ａ．；Ｐｏｕｒｚｉａ，Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｌ．；Ｓｃｈａｄ，Ｓａｒａ；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓｈａｗｎ  Ｆ．；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｒｕｂｅｎ  Ｄ．；Ｌａｚｏ，Ｓｕｚａｎ  （Ｍａｒ���ｈ  ２０１７）．”Ｃｌａｓｓ  ＩＩａ  ＨＤＡＣ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ”．Ｎａｔｕｒｅ．５４３（７６４５）：４２８−４３２を参照されたい。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、治療されているがんは、白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）の腫瘍微小環境への浸潤、またはいわゆる「熱い腫瘍（ｈｏｔ  ｔｕｍｏｒ）」もしくは「炎症性腫瘍」により特徴付けられる。いくつかの実施形態では、治療されているがんは、腫瘍微小環境への低レベルもしくは検出不可能なレベルの白血球浸潤、またはいわゆる「冷たい腫瘍（ｃｏｌｄ  ｔｕｍｏｒ）」もしくは「非炎症性腫瘍」により特徴付けられる。いくつかの実施形態では、組成物は、「冷たい腫瘍」を「熱い腫瘍」に変換するのに十分な量及び時間投与され、すなわち、該投与は、白血球（Ｔ細胞のような）の腫瘍微小環境への浸潤を生じる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、組成物は、細胞外小胞と、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を促進する成分、ならびにチェックポイント遮断阻害剤、例えば、ＣＴＬＡ−４を標的とするイピリムマブ、ＰＤ−１を標的とするニボルマブ、セミプリマブ及びペムブロリズマブ、各々がＰＤ−Ｌ１を標的とするアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びペキシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ−３８２、ＪＮＪ−４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ−ＣＳ４及びカビラリズマブのようなＣＳＦＲ−１の阻害剤のような免疫応答を追加的に増強する成分を含む、２つ以上の免疫調節成分の組み合わせと、を含む。がんを有する対象に対する治療としてのこれらの組成物の投与は、免疫応答を更に上方制御し、免疫調節成分の組み合わされた作用を通じて対象の免疫系の腫瘍標的化を増強できる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、追加的な免疫調節成分は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＳＦ１−Ｒを標的とする抗体または活性断片である。実施形態では、抗体またはその活性断片は、イピリムマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ニボルマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、セミプリマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ペムブロリズマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、アテゾリズマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、アベルマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、デュルバルマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ペキシダルチニブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ＰＬＸ７４８６のＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ＡＲＲＹ−３８２のＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ＪＮＪ−４０３４６５２７のＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ＢＬＺ９４５のＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、エマクツズマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ＡＭＧ８２０のＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、ＩＭＣ−ＣＳ４のＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。実施形態では、抗体またはその活性断片は、カビラリズマブのＣＤＲに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞及び免疫調節成分を含む組成物は、がんワクチンとして対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、個別化されたがんワクチンとして対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、腫瘍抗原または腫瘍抗原に由来するペプチドである。好適な腫瘍抗原の例は、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンドを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、組成物を受容する対象のゲノム配列に由来する。
【０２２０】
組成物で治療され得るがんは、表５に列挙されるがんを含むが、これらに限定されない。
【０２２１】
マクロファージにおける遺伝子発現、転写ネットワーク及び分極を調節する方法
いくつかの実施形態は、対象に１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞を投与することを含む、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する方法を提供し、免疫調節成分は遺伝子に標的化され、調節は遺伝子に標的とされた等モル量の遊離免疫調節成分の投与により産生される調節以上である。また、対象に１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞を投与することを含む、マクロファージにおける遺伝子発現を阻害する方法が提供され、免疫調節成分は遺伝子に標的とされ、阻害は遺伝子に標的化された等モル量の遊離免疫調節成分の投与により生み出される阻害以上である。いくつかの実施形態は、対象に１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞を投与することを含む、マクロファージにおける遺伝子の下流標的を抑制する方法を提供し、免疫調節成分は遺伝子に標的とされ、抑制は遺伝子に標的化された等モル量の遊離免疫調節成分の投与により生み出される抑制以上である。いくつかの実施形態は、対象に１つ以上の免疫調節成分（複数可）を含む細胞外小胞を投与することを含む、マクロファージの集団の分極を変更する方法を提供し、免疫調節成分は遺伝子に標的とされ、分極の変更は遺伝子に標的化された等モル量の遊離免疫調節成分の投与により生み出される分極の変更以上である。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、エキソソームである。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、ＡＳＯである。いくつかの実施形態では、分極の変更は、Ｍ２表現型からＭ１表現型への変化である。
【０２２２】
線維化状態を治療する方法
また、マクロファージをＭ２表現型からＭ１表現型に再分極させる免疫調節成分を含むエキソソームを含む有効量の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、対象における線維化状態を治療する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、線維化状態は、肺線維症、肝線維症、または膵線維症である。ある特定の実施形態では、肝線維症は、非アルコール性脂肪性肝炎、またはＮＡＳＨである。例えば、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｓｔａｆｆ．”Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ［ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ］”．Ｍａｙｏ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｒｃｈｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｏｎ  １５  Ｊｕｌｙ  ２０１４．Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ２６  Ｊｕｌｙ  ２０１４，ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ａｔ  ｗｅｂｍａｙｏｃｌｉｎｉｃ．ｏｒｇ／ｄｉｓｅａｓｅｓ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ／ｐｕｌｍｏｎａｒｙ−ｆｉｂｒｏｓｉｓ／ｓｙｍｐｔｏｍｓ−ｃａｕｓｅｓ／ｓｙｃ−２０３５３６９０、Ｆｅｒｒｉ  ＦＦ．Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｉｎ：Ｆｅｒｒｉ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｄｖｉｓｏｒ  ２０１６．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．：Ｍｏｓｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；２０１６、Ｇｒｏｓｓ  ＴＪ，Ｈｕｎｎｉｎｇｈａｋｅ  ＧＷ（２００１）”Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ”．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３４５（７）：５１７−５２５、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＬＳ（２０１４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ２０１４．［Ｓ．ｌ．］：Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ．ｐｐ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １６．Ｌｉｖｅｒ，Ｂｉｌｉａｒｙ  Ｔｒａｃｔ，＆  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｃｈａｌａｓａｎｉ  Ｎ，Ｙｏｕｎｏｓｓｉ  Ｚ，Ｌａｖｉｎｅ  ＪＥ，Ｃｈａｒｌｔｏｎ  Ｍ，Ｃｕｓｉ  Ｋ，Ｒｉｎｅｌｌａ  Ｍ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＡ，Ｂｒｕｎｔ  ＥＭ，Ｓａｎｙａｌ  ＡＪ（Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１８）．”Ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ”．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．６７（１）：３２８−３５７、Ｘｕｅ  Ｊ，Ｓｈａｒｍａ  Ｖ，Ｈｓｉｅｈ  ＭＨ，Ｃｈａｗｌａ  Ａ，Ｍｕｒａｌｉ  Ｒ，Ｐａｎｄｏｌ  ＳＪ，Ｈａｂｔｅｚｉｏｎ  Ａ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５  Ｍａｙ  １８；６：７１５８を参照されたい。
【０２２３】
投与の機序
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の循環系に静脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体に注入され、対象の静脈中に投与される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の循環系に動脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体に注入され、対象の動脈中に投与される。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、組成物は、くも膜下腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管またはくも膜下腔への注射を介して投与される。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、組成物は、鼻腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与または全身投与のいずれかの形態で、鼻を通して通気され得る。ある特定の実施形態では、組成物は、点鼻薬として投与される。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、組成物は、腹腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体に注入され、対象の腹膜中に投与される。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、リンパ管への組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、胸腺、脾臓、及び／または骨髄への組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、１つ以上のリンパ節への組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節、胸骨リンパ節のうちの１つ以上への組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、膵臓への組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の分布を生じる。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、組成物は、眼球周囲投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、眼球周囲組織に注射される。眼球周囲薬物投与は、結膜下、前テノン嚢下、後テノン嚢下、及び眼球後投与の経路を含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の投与経路によって同じ対象に投与される。いくつかの実施形態では、該複数の投与経路は、静脈内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、及び／または眼球周囲投与を含む。好ましい実施形態では、該複数の投与経路は、静脈内投与及び腹腔内投与を含む。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の投与量は、１ｎｇ〜１０ｎｇ、１０ｎｇ〜１００ｎｇ、１００ｎｇ〜１μｇ、１μｇ〜５μｇ、５μｇ〜１０μｇ、１０μｇ〜５０μｇ、５０μｇ〜７５μｇ、７５μｇ〜１００μｇ、１００μｇ〜１５０μｇ、１５０μｇ〜２００μｇ、２００μｇ〜３００μｇ、３００μｇ〜５００μｇ、５００μｇ〜１ｍｇ、または１ｍｇ〜１０ｍｇである。
【０２３１】
組成物は、対象に一度投与され得る。代替的には、複数の投与は、一定期間にわたって実施され得る。例えば、２、３、４、５、またはそれ以上の投与が、対象に与えられ得る。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、疾患、障害または状態に関連する症状に対する限り、必要に応じて与えられ得る。いくつかの実施形態では、反復投与は、対象の生涯にわたって示され得る。治療期間は、変動でき、例えば、１年以内、６か月、３か月、２か月、１か月、２週間、１週間、３日、２日、または１日以内であり得る。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の用量は、１日１回、１日おき、週１回、週２回、月１回または月２回のような間隔で投与される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織中の免疫調節成分の濃度を、疾患、障害または状態の症状に関連するレベルを超えて効果的に増加させるのに十分な頻度で投与される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、組成物は、疾患、障害または状態が治療されるか、またはその症状が改善されるように、治療期間にわたって少なくとも２回投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、疾患、障害または状態が治療されるか、またはその症状が防止されるように、治療期間にわたって少なくとも２回投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、十分な量の免疫調節成分が治療期間中に標的細胞または組織に送達されるように、治療期間にわたって十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状が防止、減少、改善、または遅延されるように、十分な量の免疫調節成分が治療期間中に標的細胞または組織に送達されるように、治療期間にわたって十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、標的細胞または組織における免疫調節成分濃度を増加させることは、ピーク濃度を増加させることを含むが、他の実施形態では、それは、平均濃度を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、治療期間中の実質的な増加は、対象における治療前または治療後期間を比較することによって、または治療を受けている集団で行われた測定を対応する未治療の対照集団と比較することによって決定され得る。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織における免疫調節成分の濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月または６ヶ月以上の間増加するように、治療期間あたり十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織における免疫調節成分の濃度が少なくとも治療期間の間増加するように、治療期間あたり十分な回数投与される。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、治療期間内の反復投与間の時間間隔は、循環中の細胞外小胞の数が、投与された薬学的組成物中に存在する細胞外小胞の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％未満に低下する期間以下である。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、治療方法は、治療薬を保持する好適な治療用量の細胞外小胞の注射前に、１つまたは複数の用量の非治療用細胞外小胞を更に含む。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞は、治療用細胞外小胞とは別個に、異なる投与量で投与される。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞の投与量は、治療用細胞外小胞の投与量より大きい。ある特定の他の実施形態では、非治療用細胞外小胞の投与量は、治療用細胞外小胞の投与量よりも小さい。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞の投与量は、治療用細胞外小胞と同じである。様々な実施形態では、好適な用量の治療用細胞外小胞の注射前の非治療用細胞外小胞の方法は、肝臓、肺、及び／または脾臓における治療用細胞外小胞の更新を低下させる。全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、共有のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４７７９４を参照されたい。
【０２３８】
有効量の組成物は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与の手段、細胞外小胞の物理的特徴（例えば、サイズ、及びいくつかの場合では、送達される分子の程度）及び他の決定要因に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、標的細胞の効率的な細胞応答を提供する。増加した効率は、増加した細胞トランスフェクション（すなわち、細胞外小胞成分でトランスフェクトされた細胞の割合）、増加した細胞応答、または宿主対象の低下した自然免疫応答によって実証され得る。
【０２３９】
細胞外小胞及びその薬学的組成物の投与の用量及び頻度は、例えば、疾患の重症度、患者の年齢、性別及び食事、任意の炎症の重症度、投与時間ならびに他の臨床的因子のような様々な因子に基づいて主治医によって決定され得る。例において、静脈内投与は最小に有効である用量で開始され、用量は正の効果が観察されるまで、予め選択された時間経過にわたって増加される。その後、用量の漸増は、現れ得るすべての有害作用を考慮しながら、効果の対応する増加を生み出すレベルに限定して行われる。
【０２４０】
追加的な実施形態
他の態様及び実施形態は、以下の付番された項目で提供される。
１．  少なくとも１つの遺伝子を阻害し、それによってＭ２表現型からＭ１表現型へのマクロファージ分極を増加させる１つ以上の核酸分子を含む細胞外小胞。
２．  細胞外小胞がエキソソームである、実施形態１に記載の細胞外小胞。
３．  核酸が阻害性ＲＮＡである、実施形態１または２に記載の細胞外小胞。
４．  阻害性ＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＳｈＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の細胞外小胞。
５．  少なくとも１つの遺伝子が以下からなる群から選択される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の細胞外小胞：
ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＩＦ１−アルファ、ＨＩＦ１−ベータ、Ｓｐ１、Ｐ３００、ＬＫＢ１、ＡＭＰＫ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ｎ−ＭＹＣ、及びｃ−ＭＹＣ、ＨＣＡＲ１、Ａ２ＡＢ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ、及びＰＫＭ２。
６．  遺伝子がＫＲＡＳである、実施形態５に記載の細胞外小胞。
７．  核酸が野生型ヒトＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡである、実施形態６に記載の細胞外小胞。
８．  阻害性ＲＮＡがマウスＫｒａｓＧ１２Ｄも標的とする、実施形態７に記載の細胞外小胞。
９．  マクロファージが腫瘍常在マクロファージである、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の細胞外小胞。
１０．  腫瘍が膵腫瘍である、実施形態９に記載の細胞外小胞。
１１．  追加的な免疫調節成分を更に含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の細胞外小胞。
１２．  追加的な免疫調節成分が、小分子薬物、抗体または治療用タンパク質である、実施形態１１に記載の細胞外小胞。
１３．  抗体が免疫チェックポイント阻害剤である、実施形態１２に記載の細胞外小胞。
１４．  実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の細胞外小胞を含む、薬学的組成物。
１５．  それを必要とする患者において疾患を治療する方法であって、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の細胞外小胞または実施形態１４に記載の薬学的組成物を患者に投与し、それによって患者における疾患を治療することを含む、方法。
１６．  疾患ががんである、実施形態１５に記載の方法。
１７．  患者がヒトである、実施形態１５または１６に記載の方法。
１８．  核酸ががん原遺伝子を標的とする阻害性ＲＮＡである、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．  がん原遺伝子がヒトＫＲＡＳである、実施形態１８に記載の方法。
２０．  がんが膵癌である、実施形態１９に記載の方法。
２１．  少なくとも第２の療法を実行することを更に含む、実施形態１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．  第２の療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、実施形態２１に記載の方法。
２３．  Ｍ２マクロファージが、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、及びＭ２ｃマクロファージからなる群から選択される腫瘍関連マクロファージである、上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞外小胞。
２４．  Ｍ１マクロファージが、分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＳＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１からなる群から選択される炎症性サイトカイン及びケモカインの増加した分泌を呈する、上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞外小胞。
２５．  Ｍ１マクロファージが、分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４からなる群から選択される免疫抑制性サイトカイン及びケモカインの減少した分泌を呈する、上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞外小胞。
２６．  Ｍ１マクロファージが、分極前のＭ２マクロファージと比較して、増加した腫瘍関連抗原を発現する、上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞外小胞。
２７．  Ｍ１マクロファージが、分極前のＭ２マクロファージと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはナチュラルキラー細胞の刺激を増加させる、上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞外小胞。
２８．  ヒト野生型ＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡを含む細胞外小胞を対象に投与することを含む、対象における膵癌を治療する方法であって、治療が、腫瘍常在マクロファージのＭ２表現型からＭ１表現型への分極の割合を、ヒトＫＲＡＳＧ１２Ｄを標的とする阻害性ＲＮＡで治療された患者において観察されるものよりも高いレベルに増加させる、方法。
【実施例】
【０２４１】
実施例
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製および使用するかの完全なる開示および説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験がすべてまたは唯一の実行される実験であると表すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド等の、標準的な略語が使用され得る。
【０２４２】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野内の、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法及び薬理学の従来の方法を採用する。かかる技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００５）、Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【０２４３】
実施例１：Ｍ２マクロファージにおける転写因子のノックダウン
方法：
ＰＢＭＣからの単球分離：
・  ５０ｍｌのバフィーコートを入手した
・  １５ｍｌのフィコールを、５０ｍｌのＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＳｅｐＭａｔｅチューブにピペットで移した
・  バフィーコートを、最終容量が約２５０ｍＬであるようにＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡに希釈した
・  希釈したバフィーコート試料を、チューブの最終容量が約４５〜５０ｍｌになるまでＳｅｐｍａｔｅチューブ中に注いだ
・  ブレーキを１にして、チューブを１０００ｇで１５分間遠心した
・  回転させたチューブから血漿を吸引し、バフィーコート層を５０ｍｌのコニカルチューブへのピペットエイド（ｐｉｐｅｔａｉｄ）を用いて回収した。チューブを、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで満たし、細胞をペレット化するために５００ｇで３分間遠心分離した。
・  赤血球が大いに存在する場合、細胞を１０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１０４９２０１）に再懸濁させ、室温で３分間インキュベートした（製造業者のプロトコル）。チューブを、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで満たし、５００ｇで３分間遠心分離した。
・  チューブを４００ｘｇで５分間遠心沈殿させ、ペレットをＰＢＳ  ＥＤＴＡでもう一度洗浄し、再ペレット化した
・  ペレットをＲｏｂｏＳｅｐ緩衝液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号２０１０４）に再懸濁させ、細胞をトリパンブルー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）との１：１希釈を使用して計数した（約５億のＰＢＭＣが１つのバフィーコートから得られた）
・  ＣＤ１４＋単球を、製造業者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１９０５９ＲＦ）を使用して単離した（全細胞のうち約１０％を単球として単離した）
・  ５００万個の単球を、ＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳ  １％抗抗＋４０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの１つのプレートに播種した
マクロファージ分化及び分極：
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｓｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ｆｕｌｌ／１０．１１６５／ｒｃｍｂ．２０１５−００１２ＯＣから翻案した）
・  播種した細胞を、５％のＣＯ２、３７℃で５〜６日間、ＲＰＭＩ−１６４０  １０％ＦＢＳ  １％抗抗１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ＋４０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）において培養した。５ｍｌの同じ新鮮な培地を、播種後１日目と３日目に添加した。５日目に、極性化サイトカインを以下のように添加した（４０ｎｇ／ｍｌのＭＳＣＦ、全てのサイトカインは２０ｎｇ／ｍｌで添加された）：
・  Ｍ０：サイトカインなし
・  Ｍ２ａ：ＩＬ−４
・  Ｍ２ｃ：ＩＬ−１０
・  Ｍ２＋＋：Ｉｌ４、Ｉｌ１０、ＴＧＦｂ
・  Ｍ１：ＩＦＮ−ｇ＋ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）
・  ＴＡＭ：７５％Ｐａｎｃ−１上清
・  細胞をサイトカインと共に２４時間インキュベートした
・  ６日目に、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１０ｍｌのＰＢＳ  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ（氷冷）を、プレートごとに加え、４℃で３０分間インキュベートした。
・  細胞を、穏やかにプレートからこすり落とし、計数した。
・  次いで、ウェルあたり５０，０００個の細胞を、２４時間異なるマクロファージ集団（上記を参照）に対するそれぞれのサイトカインを用いて、ＲＰＭＩ−１６４０  １０％ＦＢＳ  １％抗抗１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ＋４０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の９６ウェルプレートに播種し、その後、処理を開始した。
【０２４４】
エキソソーム精製：
エキソソームを、９日後にＨＥＫ２９３  ＳＦ細胞の高密度懸濁培養物の上清から回収した。上清を、濾過し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画し、塩化ナトリウムの段階勾配で溶出した。最も高いタンパク質濃度を有するピーク画分は、エキソソーム及び汚染細胞成分が含有した。ピーク画分を、単離し、超遠心分離によるＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）（６０％イオジキサノールｗ／ｖ）密度勾配上で更に分画した。
【０２４５】
エキソソーム画分を、４°Ｃで３時間１３３，９００ｘｇでのＳＷ  ３２  Ｔｉローター用の３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブにおける超遠心分離により、濃縮した。ペレット化した材料を、１ｍＬのＰＢＳ及び３ｍＬのＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）に再懸濁させ、最終イオジキサノール濃度を４５％にした。Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配については、４層滅菌勾配を、再懸濁された材料を含有する４ｍＬの４５％イオジキサノール、３ｍＬの３０％イオジキサノール、２ｍＬの２２．５％イオジキサノール、２ｍＬの１７．５％イオジキサノール、及び１ｍＬのＰＢＳを、ＳＷ  ４１  Ｔｉローター用の１２ｍＬのＵｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブで調製した。Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）を、４℃で１６時間１５０，０００ｘｇで超遠心分離して、エキソソーム画分を分離した。超遠心分離は、エキソソームを含有することが知られている上層画分と、中程度の密度の細胞破片を含有する中層画分と、高密度の凝集体及び細胞破片を含有する下層画分を生じた。次いで、エキソソーム層を、チューブの上層約３ｍＬから穏やかに回収した。
【０２４６】
エキソソーム画分を、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブにおいて約３２ｍＬのＰＢＳに希釈し、４℃で３時間１３３，９００ｘｇで超遠心分離して、精製されたエキソソームをペレット化した。次いで、ペレット化したエキソソームを、最小量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁し、４℃で保存した。
【０２４７】
多くの固形腫瘍は、代替的に活性化された、またはＭ２表現型を有するものとして特徴付けられる腫瘍関連マクロファージを多くの場合含む、骨髄リッチな細胞浸潤により特徴付けられる。Ｍ２マクロファージは、代謝酵素アルギナーゼ（Ａｒｇ１）の発現を促進する高レベルのリン酸化ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ６を発現する。重要なＭ２遺伝子のノックダウンがインビトロ分化したマクロファージのＭ２表現型を変更することを実証するために、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージを、上記のようにＭ２状態に分極した。培養された分極マクロファージを、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＣＥＢＰβ−１、ＣＥＢＰβ−２、Ｐｉ３Ｋγ、またはＫＲＡＳ（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭ）を標的とする増加する量のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。遺伝子の各々は用量依存的様式で抑制され（図１）、各Ｍ２遺伝子のノックダウンによりＡｒｇ１の同時低下をもたらし（図２）、Ｍ２表現型が上流の制御因子の発現を低下させることにより変更され得ることを実証した。
【０２４８】
実施例２：マクロファージサブタイプによる志差的エキソソーム取り込み
マクロファージサブタイプは、代謝及び他の表現型活性の変更により特徴付けられる。ある特定のマクロファージサブタイプがエキソソームを優先的に取り込むかどうかを理解するために、６つのマクロファージ亜集団（Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２ａ、Ｍ２ｃ、Ｍ２＋＋、及びＴＡＭ）を、ルーメンＧＦＰを発現するように操作されたＨＥＫ２９３ＳＦ由来の増加するレベルのエキソソームと共にインキュベートした。エキソソーム取り込みを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において３６時間にわたって全細胞ＧＦＰ強度を測定することにより決定した。図３に示されるように、全てのマクロファージサブタイプがエキソソームの取り込みを示したが、Ｍ０マクロファージはエキソソームの取り込みに最も効率が悪かった一方で、Ｍ２＋＋マクロファージは、他のマクロファージのサブタイプと比較して、エキソソームの取り込みにおいて実質的により効率的であった。
【０２４９】
Ｍ２マクロファージはエキソソームの取り込みに効率的であるため、ＡＳＯ負荷されたエキソソームが、細胞間マクロファージ標的を標的とするのにＡＳＯ単体より効率的（例えば、標的遺伝子及び遺伝子のシグナル伝達経路内の下流エフェクター分子の発現をノックダウンするのにより効率的）であろうかどうかについて調査した。ＳＴＡＴ３を標的化し、Ｃｙ５蛍光トレーサー及び５’コレステロールリンカーを輸送する２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＡＳＯを、生成した。ＨＥＫ２９３ＳＦエキソソームをコレステロールタグ付き蛍光ＡＳＯと混合し、遊離ＡＳＯを超遠心分離及びＡＳＯを含有する上清の除去によって除去した。Ｍ２及びＭ０マクロファージを、同等の密度で播種し、総蛍光強度で測定される、一致した濃度の遊離ＡＳＯまたはＡＳＯ負荷されたエキソソーム（Ｅｘｏ−ＡＳＯ）と共にインキュベートした。総細胞蛍光を、４８時間にわたって測定し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムを使用して定量した。図４に示されるように、Ｍ２マクロファージは、Ｍ０マクロファージと比較して、遊離ＡＳＯ及びＥｘｏ−ＡＳＯの両方をより容易に取り込んだ。興味深いことに、Ｅｘｏ−ＡＳＯはＭ０及びＭ２マクロファージの両方によってより効率的に取り込まれ、Ｍ２マクロファージへのＡＳＯの送達がエキソソームへ負荷することによって強化され得ることを示唆している。
【０２５０】
エキソソームまたはＥｘｏ−ＡＳＯが、インビボで他の細胞型と比較される場合、マクロファージによって示差的に取り込まれるかどうかを決定するために、ナイーブマウスに、１ｘ１０１１または１ｘ１０１２のいずれかのＧＦＰ含有エキソソームを腹腔内投与した。注射後１時間で、総腹膜細胞を単離し、異なる免疫細胞サブセット、すなわち、Ｂ細胞、樹状細胞、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージ間のＧＦＰ陽性をフローサイトメトリーによって特徴付けた。図５Ａに示されるように、両方の用量で、マクロファージは、蛍光エキソソームを取り込む主要な細胞型であった。この差異が疾患設定（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｔｔｉｎｇ）で発生したかどうかを決定するために、Ｂ１６Ｆ１０担腫瘍マウスに、単回用量のＣｙ５標識Ｅｘｏ−ＡＳＯまたは天然の非標識エキソソームを注射した。注射された腫瘍を、単離し、解離し、フローサイトメトリーで測定した。図５Ｂに示されるように、マクロファージは腫瘍細胞よりもはるかに容易にＥｘｏ−ＡＳＯを取り込み（全体的なＣｙ５信号より約１００倍大きい）、Ｅｘｏ−ＡＳＯの送達がいくつかの複雑な細胞混合物におけるマクロファージ集団に到達できることを示唆している。更に、マクロファージによるＥｘｏ−ＡＳＯの優先的な取り込みは、他の試験された細胞型（Ｂ細胞、樹状細胞、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞）と比較して、Ｅｘｏ−ＡＳＯ組成物を対象に投与することを含む、マクロファージ細胞に標的とされたＡＳＯ送達の方法を可能にし、投与された組成物は、対象に存在するマクロファージによって優先的に取り込まれる（他の免疫細胞サブセット、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞による取り込みと比較して）。Ｅｘｏ−ＡＳＯ組成物のこの増強されたマクロファージ特異性は、標的外細胞における影響を低下することにより、投与された組成物の安全性を改善する。
【０２５１】
実施例３：アンチセンスオリゴのエキソソーム媒介性送達はマクロファージ転写ネットワークを強力に制御不全にして分極を変更する
以前の実験は、ＡＳＯのエキソソーム媒介性送達がマクロファージ遺伝子発現パターンを変更する効果的な方法であり得ることを示唆する。上記の方法に従って精製されたＨＥＫ２９３ＳＦ由来のエキソソームを、ＳＴＡＴ３を標的とする５つの異なるコレステロールタグ付きＡＳＯで負荷した（４．１、二本鎖ＭＯＥケミストリー；５．１及び５．２、一本鎖Ｏ−メチルケミストリー；５．３及び５．４、一本鎖ＭＯＥケミストリー）。ＡＳＯ配列は、表０に示される。Ｍ２分極マウスＲＡＷ２６４．７細胞を、５μＭの遊離コレステロールタグ付きＡＳＯ、またはコレステロールタグ付きＡＳＯで負荷された１×１０５もしくは１×１０６エキソソームのいずれかと共にインキュベートした。ＳＴＡＴ３転写産物レベルを処理後２４時間で測定し、遊離ＡＳＯと比較して、Ｅｘｏ−ＡＳＯ処理によるＳＴＡＴ３の同等または優れたノックダウンを明らかにした。分極マクロファージと共にインキュベートされた未修飾のエキソソームは、ＳＴＡＴ３発現に影響を与えなかった（図６）。ＳＴＡＴ３の下流標的を検討するために、ＡＲＧ１転写産物レベルを、処理後４８時間で測定した。図７に示されるように、遊離ＡＳＯまたはＥｘｏ−ＡＳＯをもちいたＳＴＡＴ３ノックダウンは、場合によっては９０％以上超のＡｒｇ１の頑健な抑制をもたらした（図７）。Ｍ２分極ＲＡＷ２６４．７細胞を、ＳＴＡＴ３、ＫＲＡＳ、及びＣ／ＥＢＰβに対する高（４μＭ）及び低（０．４μＭ）ＡＳＯまたはＥｘｏ−ＡＳＯと共にインキュベートした。図８Ａ〜図８Ｃに示されるように、Ｅｘｏ−ＡＳＯ試料は、全ての試験された用量で同等（ＳＴＡＴ３）またはより強力（ＫＲＡＳ、Ｃ／ＥＢＰβ）であった（図８Ａ〜図８Ｃ）。ＡＳＯ配列が、表０に示される。
【０２５２】
この結果は、Ｅｘｏ−ＡＳＯが、マクロファージ発現ネットワークの強力な調節因子であり、様々な治療用途についての遊離ＡＳＯの投与と比較して、優れた分化したモダリティを提供できることを実証する。対象にＥｘｏ−ＡＳＯを投与することを含む、マクロファージにおける遺伝子発現を調節する１つのかかる方法であって、該ＡＳＯは遺伝子に標的化され、調節は遺伝子に標的とされた等モル量の遊離ＡＳＯの投与により生み出される調節以上である、方法。別の実施形態は、対象にＥｘｏ−ＡＳＯを投与することを含む、マクロファージにおける遺伝子発現を阻害する方法を含み、該ＡＳＯは遺伝子に標的化され、阻害は遺伝子に標的とされた等モル量の遊離ＡＳＯの投与により産生される阻害以上である。別の実施形態は、対象にＥｘｏ−ＡＳＯを投与することを含む、マクロファージにおける遺伝子の下流標的を抑制する方法を含み、該ＡＳＯは遺伝子に標的化され、抑制は遺伝子に標的とされた等モル量の遊離ＡＳＯの投与により産生される抑制以上である。更に別の実施形態は、対象にＥｘｏ−ＡＳＯを投与することを含む、マクロファージの集団の分極を変更する方法を含み、該ＡＳＯはマクロファージにおける遺伝子発現に標的化され、分極の変更は遺伝子に標的とされた等モル量の遊離ＡＳＯの投与により産生される分極の変更以上である。かかる実施形態では、分極の変更は、Ｍ２表現型からＭ１表現型への変化であり得る。
【０２５３】
ヒト細胞におけるＥｘｏ−ＡＳＯの役割を試験するために、初代ヒトマクロファージを、Ｍ２表現型に分極させ、異なる用量の遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯまたはＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯで処理した。３人の別個のヒトドナーからのマクロファージを使用すると、Ｅｘｏ−ＡＳＯは、処理後２４時間でのＳＴＡＴ３転写産物レベルを抑制するのに一貫してより強力であった（図９Ａ）。Ｍ２分極の下流ヒトマーカーであるＣＤ１６３も、遊離ＡＳＯと比較して、Ｅｘｏ−ＡＳＯにより劇的により調節された（図９Ｂ）。ヒトＭ２マクロファージも、ＨＩＦ１α、Ｐｉ３Ｋγ、ＣＥＢＰ／β、ＳＴＡＴ６、及びＳＴＡＴ３に対する４μＭの遊離ＡＳＯまたはＥｘｏ−ＡＳＯを用いて処理した。図１０に示されるように、全ての処理群は標的遺伝子の抑制を生じたが、全ての場合でＥｘｏ−ＡＳＯは遊離ＡＳＯ処理よりも強力であった。重要なことに、マクロファージ標的うちのいずれのＥｘｏ−ＡＳＯノックダウンも、ＣＤ１６３発現の頑健な低下をもたらし（図１１）、ＡＳＯのエキソソーム媒介性送達が重要なマクロファージシグナル伝達ネットワークを強力かつ再現可能に破壊することを実証した。
【０２５４】
Ｍ２マクロファージ分極の機能的結果は、腫瘍化促進性微小環境に寄与する炎症促進性サイトカインの減少である。したがって、マクロファージのＭ２表現型からＭ１表現型への変換は、増強された炎症促進性シグナル伝達を生じるはずである。Ｍ２マクロファージのＭ１状態への変換は、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３を含むサイトカインの誘導をもたらすＬＰＳによって誘導される。ＳＴＡＴ３はこのサイトカイン発現ネットワークのネガティブ制御因子であり、したがって、ＬＰＳの存在下でのＳＴＡＴ３阻害が炎症促進性サイトカインの産生を更に増強できるかどうかを試験した。Ｍ２分極ヒトマクロファージを、４μＭの遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯ、４μＭのＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯ、４μＭのスクランブルＥｘｏ−ＡＳＯ、ネイティブエキソソーム、またはＳＴＡＴ３の小分子阻害剤であるＣ１８８−９で処理した。２４時間後、培地を１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含有する培地に交換し、上清を２４時間後に単離した。図１２に示されるように、ＬＰＳは、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の分泌を誘導した（ＬＰＳ  １０ｎｇ／ｍｌ群対ＬＰＳなし群）。遊離ＳＴＡＴ３  ＡＳＯでなくＳＴＡＴ３  Ｅｘｏ−ＡＳＯを用いた処理は、各サイトカインの発現を更に増強し、Ｅｘｏ−ＡＳＯが関連する免疫調節シグナルに応答してＭ１表現型の促進を更に強力にもたらし得ることを示唆している。
【０２５５】
ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、及び他のマクロファージ調節経路の制御不全は、遺伝子発現パターンに広範な変化をもたらす。Ｅｘｏ−ＡＳＯ処理の分化したグローバルな影響を理解するために、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｍＲＮＡ分析が、定常状態での、ならびに未修飾のエキソソーム（ＥＶのみ）及び濃度一致したＡＳＯとＥｘｏ−ＡＳＯとを用いた処理に応答するヒトＭ２マクロファージに対して、行った。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ヒト骨髄性先天性免疫パネルを使用する正規化されたｍＲＮＡ計数は、ＳＴＡＴ３転写物が遊離ＡＳＯ及びＥｘｏ−ＡＳＯ処理の両方の後に低下したことを実証した（図１３Ａ）。下流マーカーＣＤ１６３（図１３Ｄ）、ＴＧＦβ（図１３Ｃ）、及びＳＴＡＴ６（図１３Ｄ）は、ＡＳＯ処理後に全て強力に下方制御された。
【０２５６】
ＴＧＦβ（＜８５％）の頑健な抑制は、Ｍ２マクロファージ分極の重要な制御因子である（Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１７）１０：５８）。ＴＧＦβ発現に対するＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、及びＣＥＢＰ／β  Ｅｘｏ−ＡＳＯ処理の影響を検討した。ヒトＭ２分極マクロファージを、ＳＴＡＴ３（ＭＯＥ及びＬＮＡケミストリーの両方）、ＳＴＡＴ６（ＭＯＥケミストリー）、ならびにＣＥＢＰ／β（ＭＯＥケミストリー）に対してＡＳＯで負荷されたエキソソームを用いて処理した。全ての場合に、ＴＧＦβレベルは、マイクロモル未満レベルのＡＳＯでの処理後、劇的に低下した（図１４）。これらの結果は、多数のマクロファージ分極制御因子に対するＡＳＯのエキソソーム媒介性送達が、多数のがんの治療に影響を与え得る細胞プログラムの頑健で安定した制御不全もたらし得ることを実証する。重要なことに、このプロセスの制御因子としてＫＲＡＳの新規認識を含むマクロファージ標的の各々は、疾患及び他の細胞プロセスにおけるそれらの役割が十分に認識されているが、安全で効果的な治療が創薬の古典的アプローチを回避している点で、「新薬開発につながらない（ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」標的として特徴付けられている。
【０２５７】
実施例４：野生型ＫＲＡＳの阻害は、膵癌の同所性マウスモデルにおいて、増加したマクロファージ分極及びインビボでの低下した腫瘍サイズをもたらす。
方法：
ＫＲＡＳエキソソームの産生及び単離：電気穿孔方法は、エキソソームを機能的に損傷することなく、ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ構築物をエキソソーム中に挿入するために使用される。エキソソームは、確立された超遠心分離方法を使用して、化学的に定義された培地において成長したヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３ＳＦ懸濁細胞から単離される（Ｋａｈｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。エキソソームの純度及び均一性（直径８０〜１５０ｎｍの粒子）は、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（商標）測定、透過型電子顕微鏡法、及びＣＤ９イムノゴールド標識によって検証される。スクロース勾配超遠心分離及びｑＰＣＲも、ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡの存在及び存在量を検証するために実行される。エキソソームを含有するスクランブルｓｉＲＮＡも、生成される。
【０２５８】
ＲＮＡｉ戦略。マウス野生型ＫＲＡＳに対し標的とされたＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ配列は、サイレンシング効率を促進するＴＴヌクレオチドオーバーハングを含む。ＲＮＡｉはまた、その送達を追跡するために、センス鎖の３’端でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７フルオロフォアで標識される。
【０２５９】
マウス及び画像化法。４〜６週齢の雌胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ）は、２１〜２３℃及び湿度４０％〜６０％で１２時間の明暗サイクルで個別に換気されたケージに収容される。マウスは、照射された食餌及び滅菌水への自由なアクセスが可能である。全身麻酔下で、腫瘍化ヒト膵臓ＰＡＮＣ−１（Ｋｒａｓａｓｐ１２（Ｒｅｊｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１））細胞またはＢＸＰＣ−３細胞（１０６、１０μｌのＰＢＳに再懸濁された）は、２７ゲージの注射器を使用して膵臓の尾部中に注射される。同所性腫瘍サイズ／体積分析については、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅバージョン４．４（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、全ての腫瘍計算を定量化するために使用される。膵臓及び腫瘍の周りの円形の関心領域（ＲＯＩ）は、定義され、同じ実験群内の全ての画像を比較するための標準として設定される。加えて、全ての実験群の全ての測定について、曝露条件（時間、開口、ステージ位置、ビニング）が同一に保たれる。次いで、その後の腫瘍測定（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）は、全ての実験群について同じ条件下で得られる。マウスは、定期的に画像化され、処理のためにランダムに群に分けられる。マウスは、１日おきに１００μｌ容積のＰＢＳで腹腔内に２×１０８エキソソームを投与される。エキソソームは、２μｇのｓｉＲＮＡで電気穿孔され、注射前にＰＢＳで洗浄される。
【０２６０】
組織学、組織病理学、及び免疫組織化学。組織はホルマリンで固定され、パラフィン包埋のために処理される。５μｍの厚さの組織切片は、切断され、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにＭａｓｓｏｎのトリクローム（ＭＴＳ）（Ｌｅｉｃａ）に対して染色される。組織病理学的スコア化のために、Ｈ＆Ｅ染色されたスライドを、膵臓癌の形態学的段階：正常、膵臓上皮内新生物（ＰａＮＩＮ）及び膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に基づいてスコア化した。各組織切片について、３つの段階（正常、ＰａＮＩＮ、ＰＤＡＣ）の各々の割合スコアは、膵臓組織学における専門家によって盲検様式で手動で得られ、次いで平均化されて各コホートについての１００のうちの全体的なスコアを与える。次いで、これらの割合スコアの平均は、それぞれのコホートにおける各マウスについて取得される。腫瘍組織切片はまた、マクロファージに対して染色される（汎マクロファージマーカー（例えば、Ｆ４／８０抗体及び／または腫瘍常在マクロファージの検出のためのＭ２及びＭ１特異的細胞マーカー）。
【０２６１】
マクロファージ表現型特徴付けのためのアッセイ。血液試料及び腫瘍試料は、マウスから回収される。マクロファージは、単離され、フローサイトメトリーによるＭ１及びＭ２マーカーの分析のために染色される。マクロファージは、Ｍ２表現型細胞表面マーカー（例えば、ＹＭ１、ＦＩＺＺ１、デクチン−１及び／またはＭＧＬ）ならびにＭ１表現型細胞表面マーカーと同様に、汎マクロファージマーカーに対して染色される。次いで、Ｍ２及びＭ１マクロファージは、計数され、サイトカイン及び／またはＭ１及び／またはＭ２表現型のいずれかに関連するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現を検出する定量ＰＣＲのような更なる分析のために選別される。
【０２６２】
異種移植実験及び同所性腫瘍体積分析からの結果は、ＫＲＡＳ野生型ｓｉＲＮＡを含むエキソソームが膵腫瘍のサイズを効果的に低下させ、スクランブルｓｉＲＮＡを保持するエキソソームと比較してＭ１表現型腫瘍関連マクロファージの数を増加させることを確認し、ヒト野生型ＫＲＡＳを標的とする阻害性ＲＮＡを含むエキソソームの投与ががんの治療に有効であることを示している。
表
【表０】
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【表１−１】
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【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【０２６３】
本発明は、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定しない例示的な実施形態と見なされる代表的な例に関して記載されている。科学刊行物、専門書、教科書、特許出願、発行済み特許を含む、刊行物への全ての参照は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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