(57)【要約】【解決手段】本発明は試料中のキナーゼの活性または活性化のモニタリング方法に関する。該方法は、ａ）キナーゼを含む試料を提供するステップと、ｂ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、ステップａ）で提供したキナーゼをプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドに切断するステップと、ｃ）試料にホスホペプチド濃縮を適用するステップと、ｄ）液体クロマトグラフィー−質量分光法によってステップｃ）で得られた試料を分析するステップと、およびｅ）ステップａ）で提供したキナーゼのリン酸化を検出するステップと、を含み、キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみ、ステップｅ）の検出を行う。【選択図】図４Ｂ
2021528649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）キナーゼを含む試料を提供するステップと、
ｂ）前記試料をプロテアーゼとインキュベートして、ステップａ）で提供されたキナーゼをプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドに切断するステップと、
ｃ）試料にホスホペプチド濃縮を適用するステップと、
ｄ）ステップｃ）で得られた試料を液体クロマトグラフィー−質量分光法によって分析するステップと、
ｅ）ステップａ）で提供されたキナーゼのリン酸化を検出するステップと、を含み、
前記キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみ、ステップｅ）の検出が行われることを特徴とする試料中のキナーゼの活性または活性化のモニタリング方法。
【請求項２】
ｉ）モニターすべきキナーゼを決定するステップと、
ｉｉ）目的のキナーゼの活性化領域と関連しているプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドのみステップｅ）で検出するように、質量分光計の設定を調節するステップと、をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｆ）ステップｅ）で検出されたリン酸化を定量するステップをさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｆ）において、前記定量は、標的質量分光法によって達成される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップｆ）において、前記定量は、標的ＭＳ１、ＭＳ２またはＭＳｎに基づく定量によって達成される（ｎは２より大きい整数）請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記キナーゼの活性化領域と関連している前記タンパク質分解ペプチドは、前記キナーゼのｔ−ループと関連しているタンパク質分解ペプチドを含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、トリプシン、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、キモトリプシンおよびエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎからなる群より選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ホスホペプチド濃縮が、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＩＭＡＣ、Ｇａ（ＩＩＩ）−ＩＭＡＣ、Ｔｉ（ＩＶ）−ＩＭＡＣまたはＺｒ（ＩＶ）−ＩＭＡＣなどの固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、およびＴｉＯ２−ＭＯＡＣまたはＺｒＯ２−ＭＯＡＣなどの金属オキシド親和性クロマトグラフィー（ＭＯＡＣ）からなる群より選択される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ホスホペプチド濃縮がＦｅ（ＩＩＩ）−ＩＭＡＣを含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記液体クロマトグラフィーが逆相クロマトグラフィーを含む請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記液体クロマトグラフィーが、ナノ液体クロマトグラフィー、キャピラリーフロー液体クロマトグラフィーおよびキャピラリーマイクロフロー液体クロマトグラフィーからなる群より選択される請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記質量分光法が、選択反応モニタリング、多重反応モニタリング、並列反応モニタリングおよび高分解能多重反応モニタリングからなる群より選択される質量分光法解析方法を含む請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記質量分光法が、データ非依存型解析（ＤＩＡ）に基づく質量分光法および標的ペプチド定量からなる群より選択される質量分光法解析方法を含む請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記質量分光法が、タンデム質量分光法を含む請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記質量分光法が、四重極質量分光計または飛行時間質量分光計の使用を含む請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記質量分光法が、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計、または線形イオントラップ質量分光計などのイオントラップ質量分光計の使用を含む請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ステップｄ）において、液体クロマトグラフィー−質量分光法が、三重四重極質量分光計での選択反応モニタリングモードにおけるＭＳ／ＭＳとナノ液体クロマトグラフィーとを組み合わせて使用することを含む請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のキナーゼ活性のモニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質キナーゼは、細胞連絡の中枢の役割を果たし、異常なキナーゼ活性は、癌から糖尿病や心血管疾患にわたる多様な障害と関係している。キナーゼは細胞連絡の主要調節因子であり、それらの阻害剤は、標的治療および精密医療において中心的な役割を果たす。したがって、包括的なキナーゼ動態を調べることは、細胞機能の理解および合理的な薬剤開発の進行にとって重要である。キナーゼのこの明確な関連性は、カイノーム活性状態を評価する多くの試みを引き起こしている。しかしながら、それらの多くはかなりの短所に悩まされている。
【０００３】
その最も素朴な用途では、キナーゼの活性は、ショットガンプロテオミクス実験で得られるそれらの存在度から抽出される。多くのタンパク質キナーゼの存在量が低いことから、キナーゼ特異的な濃縮プロトコールが使用されている。該プロトコールは主に、固定化した広い特異性キナーゼ阻害剤および／またはＡＴＰ模倣物からなる。この種類のアプローチは実質的なキナーゼ濃縮をもたらすが、感度のコストで、相当な投入原料を必要とし、それによって、アプローチが細胞株に基づくモデルシステムに限定される。重要なことは、キナーゼ存在度の評価自体がキナーゼ活性を反映するのではなく、これまでに主にホスホプロテオミクスデータから主に抽出されていることである。ここで、ホスホプロテオミクスデータセットにおける過大評価または過小評価された配列モチーフのアライメントは、既知のキナーゼコンセンサス配列に関係している。しかしながら、この方法は、検出されたリン酸化部位の多くが機能性の観点から特徴付けられておらず、多くのキナーゼに対する基質特異性が冗長であるか、または単に道であることから、知識の大きなギャップを被る。
【発明の概要】
【０００４】
上記のように、今までいずれかのキナーゼタンパク質発現レベルまたは基質リン酸化のデータから主に抽出されていたキナーゼ活性の直接モニタリングが切迫して必要とされている。
【０００５】
本発明は、試料中のキナーゼ活性または活性化のモニタリング方法を提供する。該方法は、
ａ）キナーゼを含む試料を提供するステップと、
ｂ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、ステップａ）で提供したキナーゼをプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドに切断するステップと、
ｃ）試料にホスホペプチド濃縮を適用するステップと、
ｄ）ステップｃ）で得られた試料を液体クロマトグラフィー−質量分光法（ＬＣ−ＭＳ）によって分析するステップと、
ｅ）ステップａ）で提供したキナーゼのリン酸化を検出するステップと、を含み、
キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみ、ステップｅ）の検出を行う。
【０００６】
キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドを同定し、検出するために、本発明の方法は、
ｉ）モニターすべきキナーゼを決定するステップと、
ｉｉ）目的のキナーゼの活性化領域と関連しているプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドのみステップｅ）で検出されるように質量分光計の設定を調節するステップと、を含む。本発明の方法のインキュベーションステップｂ）の間に別のプロテアーゼが使用される場合よりも、１つのプロテアーゼとの試料のインキュベーションが、異なる目的のキナーゼの活性化領域と関連しているプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドをもたらすことに注目すべきである。結果として、ステップｉｉ）で決定したプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドが使用したプロテアーゼに基づいて変動し得る。その結果として、キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドのみ検出するために、プロテアーゼの選択がステップｉｉｉ）の質量分光計の異なる設定ももたらす。すなわち、質量分光計を使用して、目的のそれらのタンパク質分解ペプチドのみ、すなわち目的のキナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドのみを同定する（選択的に選択する）。また、決定したプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドの数が異なり得ることに注目すべきである。一方で、目的のキナーゼの活性または活性化のいずれかを検出するために、複数のプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドが決定される。他方で、目的のキナーゼの特異的な関連する活性または活性化のみを検出するために、例えば特定の疾患のシグナリング経路と関連している特異的なタンパク質分解ペプチドの検出のために、プロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドの高選択的なサブセットが決定される。ステップｉｉ）のプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドの決定が、質量分光計の設定を調節するために使用される参照リストをもたらし得ることにさらに注目すべきである。すなわち、目的のプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドの同定（選択的な選択）がステップｉｉ）で得られた参照リストに基づいている。目的のタンパク質分解ペプチドの決定が、インキュベーションステップの間に使用されるプロテアーゼと組み合わせて目的のキナーゼ（すなわちモニターすべきキナーゼ）に基づいて行われることにさらに注目すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】標的キナーゼが、ＭＥＴ、ＡＢＬ、ＳＲＣ、ＢＴＫ、ＪＡＫ３およびＫＩＴなどのＦＤＡが承認した阻害剤と臨床的に関連した多数のキナーゼを含むことを示す図である。
【図１Ｂ】標的キナーゼが、ＭＥＴ、ＡＢＬ、ＳＲＣ、ＢＴＫ、ＪＡＫ３およびＫＩＴなどのＦＤＡが承認した阻害剤と臨床的に関連した多数のキナーゼを含むことを示す図である。
【図２Ａ】３つの異なる細胞株、すなわちＪｕｒｋａｔ、ＰＣ９およびＨｅｋでの５２個のｔ−ループリン酸化部位の検出を示す図である（図２Ａ）
【図２Ｂ】ＴＮＦαの刺激により、受容体相互作用タンパク質セリン−トレオニンキナーゼ（ＲＩＰＫ）がＴＮＦ受容体複合体に入り、アポトーシスを仲介することを示す図である。
【図２Ｃ】ＴＮＦα処理により、セリンＳ１６１でのＲＩＰＫ１リン酸化が再現性よく検出され、リン酸化は非処理Ｊｕｒｋａｔ細胞で検出できなかったことを示す図である（図２Ｃ）。
【図３Ａ】キナーゼＤＤＲ２の３つのリン酸化部位についての一例を示す図である。
【図３Ｂ】ＪＡＫ３の残基Ｙ９８０およびＹ９８１のチロシンリン酸化を示す図である。
【図４Ａ】１分間および５分間のＰＡＲ１活性化それぞれのボルケーノプロットとして定量的な違いを示す図である。
【図４Ｂ】血小板活性化による種々の細胞内シグナリングの共通経路を示す図である。
【図４Ｃ】ＢｔｋおよびＴｅｃの活性化を示す図である（図４Ｃ）
【図４Ｄ】ＣａＭＫ２のｔ−ループ内の２個の隣接したリン酸化部位のＰＡＲ１活性化を示す図である。
【図４Ｅ】Ｐ３８ＡのＴ１７９およびＹ１８１のリン酸化におけるＰａｒ１活性化を示す図である（図４Ｅ）。
【図４Ｆ】ＭＡＰＫシグナリングカスケードの個別のメンバーについてのキナーゼ活性の増加を示す図である。
【図５Ａ】患者由来異種移植片から確立した治療未感作、治療感受性および耐性の腫瘍状態からの一致した患者由来メラノーマ細胞株でのｔ−ループリン酸化の調査を示す模式図である。
【図５Ｂ】患者由来異種移植片から確立した治療未感作および治療感受性の腫瘍状態のカイノーム活性の差異の比較によるｔ−ループリン酸化の定量を示す図である。
【図５Ｃ】患者由来異種移植片から確立した治療感受性および耐性の腫瘍状態のカイノーム活性の差異の比較によるｔ−ループリン酸化の定量を示す図である。
【図５Ｄ】患者由来異種移植片から確立した治療未感作および耐性の腫瘍状態のカイノーム活性の差異の比較によるｔ−ループリン酸化の定量を示す図である。）
【図５Ｅ】ＢＲＡＦＶ６００Ｅの阻害が、Ｅｒｋ３のｔ−ループリン酸化の低下と並行して進み、ＭＫ５の低下を伴うことを示す図である（図５Ｅ）。
【図６】トリプシン消化によって生じたペプチドの完全なリストを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の方法を提供することによって、リン酸化部位存在度とキナーゼ活性との間の直接の結びつけを可能にすることができることを見出した。キナーゼの活性化領域が、リン酸化される際に大部分のキナーゼを活性化する触媒ループの近くに位置する柔軟なループである。また、キナーゼの活性化領域は、ｔ−ループとして既知であり、Ｐ＋１ループと呼ばれる活性化ループの後の領域と共に、Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（ＤＦＧ）および（Ａｌａ）−ｐｒＯ−Ｇｌｕ（（Ａ）ＰＥ）モチーフに隣接した保存領域を含む。キナーゼの「保存領域」、「保存ドメイン」または「活性化領域」はキナーゼの分野で周知の用語であることに注目すべきである。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）は、多数のキナーゼの活性化領域を同定し、決定するいくつかのツール（例えば保存ドメインデータベースを介して）を提供する。そのようなデータベースによって提供されている情報に基づいて、本発明者らは４５６個のキナーゼの活性化領域を同定できた。
【０００９】
本発明の方法を提供することによって、これらのキナーゼの多くでの活性を開始する重要なスイッチであるリン酸化と関連している活性化領域、例えばキナーゼのｔ−ループリン酸化をモニターすることが可能である。特に、そのような部位の機能性、それらの高い配列類似性に基づいて、多数の代役を務めたキナーゼに直接移すことができる。先行技術の方法、例えばショットガンプロテオーーム解析では、リン酸化と関連している活性化領域、特にｔ−ループリン酸化が、それらの低い存在度、好ましくないＬＣ−ＭＳの特徴およびチロシンリン酸化の高い有病率により、悪名高くも過小評価されていることを見出した。
【００１０】
本発明の方法は、
ｆ）ステップｅ）で検出されたリン酸化を定量するステップをさらに含み得る。
【００１１】
好ましくは、定量は、標的質量分光法（標的ＭＳ１（前駆体イオンスキャン）、ＭＳ２（タンデム質量分光法または断片イオンスキャン）またはＭＳｎ（タンデム質量分光法）など）による定量、（ＭＳｎのｎは２より大きい整数）によって達成される。
【００１２】
好ましい実施形態では、キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドはキナーゼのｔ−ループと関連しているタンパク質分解ペプチドを含む。キナーゼのｔ−ループと関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみステップｅ）の検出を行うことによって、試料の更なる再処理を必要とせずに、本発明の方法を適用する前に、キナーゼ活性または活性化をモニターできる。既に述べたように、活性化領域関連タンパク質分解ペプチドは、使用したプロテアーゼに応じて変動する。本発明の実施形態は、プロテアーゼは、トリプシン、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、キモトリプシンおよびエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎからなる群より選択され得、それぞれ、トリプシン特異的タンパク質分解ペプチド（例えばトリプシン消化によって生じたペプチド）、Ｇｌｕ−Ｃ特異的タンパク質分解ペプチド、キモトリプシン特異的タンパク質分解ペプチド（例えばキモトリプシン消化によって生じたペプチド）およびＡｓｐ−Ｎ特異的タンパク質分解ペプチドを生じる。しかしながら、当業者に既知の他のプロテアーゼも本発明の方法の実施において同様に選択され得る。
【００１３】
ホスホペプチド濃縮は、好ましくは、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＩＭＡＣ、Ｇａ（ＩＩＩ）−ＩＭＡＣ、Ｔｉ（ＩＶ）−ＩＭＡＣまたはＺｒ（ＩＶ）−ＩＭＡＣなどの固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、およびＴｉＯ２−ＭＯＡＣまたはＺｒＯ２−ＭＯＡＣなどの金属オキシド親和性クロマトグラフィー（ＭＯＡＣ）、からなる群より選択される。最も好ましい実施形態では、ｔ−ループホスホペプチド濃縮は、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＩＭＡＣを含む。Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＩＭＡＣの使用が、特に、ｔ−ループリン酸化に対する高い特異性を有する方法をもたらしたことを見出した。
【００１４】
さらなる好ましい実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相クロマトグラフィーを含み得、ナノ液体クロマトグラフィー、キャピラリーフロー液体クロマトグラフィーおよびキャピラリーマイクロフロー液体クロマトグラフィーからなる群より選択され得る。一方、質量分光法は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）および高分解能多重反応モニタリング（ＭＲＭ−ＨＲ）からなる群より選択される質量分光法解析方法を含み得る。更なる質量分光法解析方法は、データ非依存型解析による質量分光法（ＤＩＡまたはＳＷＡＴＨ（商標））および標的ペプチド定量（例えばＱｕａｎＤｉｒｅｃｔ（商標））からなる群より選択され得る。質量分光法解析方法の選択が利用可能な質量分光計に依存することに注目すべきである。上述した質量分光法解析方法のいずれか、すなわち標的質量分光法が、本発明の方法を行うために選択され得ることを見出した。更なる質量分光法は、タンデム質量分光法を含み得る。好ましくは、質量分光法は、四重極質量分光計、例えば三重四重極質量分光計、または飛行時間質量分光計の使用を含む。また、質量分光法は、イオントラップ質量分光計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計など）、または線形イオントラップ質量分光計の使用を含み得る。三重四重極質量分光計でナノＬＣとＳＲＭモードのＭＳ／ＭＳとを組み合わせることによって、システム全体のｔ−ループリン酸化をキナーゼ活性のためのプローブとしてモニターするために、非常に特異的な方法が提供されることを見出した。
【００１５】
本発明の方法に基づいて、包括的なヒトカイノームのおおよそ３３％を示す１７８個のタンパク質キナーゼでのｔ−ループリン酸化アッセイが提供される。技術の強さは、限定した開始材料から実質的なカイノーム範囲を可能にする感度（ｔ−ループホスホペプチド濃縮およびＬＣ−ＭＳ）とスループットとの組み合わせにある。そのような高感度の範囲は、（自動化した）プラットフォームを並行したホスホペプチド濃縮の９６個までの試料と用いることによって、さらに促進され得る。合計で７４個のｔ−ループリン酸化が、多数の細胞タイプ（原発および患者由来）にわたる５８個のキナーゼについて検出された。標的キナーゼは、ＭＥＴ、ＡＢＬ、ＳＲＣ、ＢＴＫ、ＪＡＫ３およびＫＩＴなどのＦＤＡが承認した阻害剤と臨床的に関連した多数のキナーゼを含んでいた（図１Ａおよび図１Ｂも参照）。種々の細胞株にわたる検出されたｔ−ループリン酸化の完全な概観を表１に記載する。トリプシン消化によって生じたペプチドの完全なリストを図６に示す。
表１  種々の細胞株の検出されたｔ−ループリン酸化のリスト
【表１】
2021528649.tif 000003
2021528649.tif 000004
2021528649.tif 000005
2021528649.tif 000006
【００１６】
更なるカイノーム範囲増加が、別のプロテアーゼの採用、試料分別または核または細胞膜などの特定の細胞区画の濃縮の採用によってもたらされ得る。
【実施例】
【００１７】
（実験）
３つの異なる細胞株、すなわちＪｕｒｋａｔ、ＰＣ９およびＨｅｋのベースラインカイノーム活性状態を、いずれの刺激もなしで分析した。これによって、３つの細胞株について５２個のｔ−ループリン酸化部位の検出がもたらされた（図２Ａ）。キナーゼのｔ−ループ配列の高度に保存された性質により、代表的なトリプシン消化によって生じたペプチドは必ずしもユニークではない。これは、例えばキナーゼファミリーメンバーＭａｒｋ１、Ｍａｒｋ２、Ｍａｒｋ３およびＭａｒｋ４、またはチロシンキナーゼＦＹＮ、ＹＥＳ１およびＳＲＣなどの多くの場合冗長な機能を示す密接に関連したキナーゼについて、ある程度の曖昧さをもたらす。この曖昧さを対処するために、タンパク質グループ分けの原理に追随し、この調査を通じてキナーゼ群これらの例を称した。観察した５２個のリン酸化部位について、これは、４８個のキナーゼ群をもたらす。また、ｔ−ループが、隣接するＤＦＧおよび（Ａ）ＰＥモチーフを通じて明らかに定められる一方で、リン酸化が依然として種々のまたは多数の残基で生じ得る。一方、多数のキナーゼについて活性化残基が明らかに確立され、その他については、ｔ−ループ内のこれらの部位は知られていない。したがって、未知の事例について、種々のリン酸化部位異性体のＳＲＭアッセイの開発をもたらす多数の可能性を考慮した。
【００１８】
４８個の検出されたキナーゼ群の大部分が、ＣＤＫおよびＭＡＰＫ並びに２個の豊富なキナーゼＰＤＫ１およびＧＳＫ３などの、典型的な培養条件にて細胞を増殖するのに極めて重要な典型的なハウスキーピングキナーゼを示した。さらに、ＨＩＰＫ３などなどの、抗アポトーシスプロセスに関与するいくつかのキナーゼが活性状態で検出された。ＪｕｒｋａｔおよびＰＣ９細胞の両方が、Ｈｅｋ細胞と比較して、Ｃａ２＋／ＤＡＧ依存シグナリングの活性増加を示し、ＣａＭＫ群およびＰＫＣファミリーからのいくつかのキナーゼがそれらの活性状態で検出された。これらは、ＣａＭＫ１Ｄ、ＰＫＣθ、およびキナーゼ群ＰＫＣα／ＰＫＣβ／ＰＫＣγを含んでいた。他方で、ＣａＭＫＩＶ活性がＪｕｒｋａｔ細胞で独占的に検出された。
【００１９】
興味深いことに、多くのキナーゼが、細胞株依存活性プロファイルを示した。特に、Ｔ細胞を含む免疫システムと関連した細胞タイプで独占的に発現されるチロシンキナーゼＺＡＰ７０など、それらのうちのいくつかは、組織特異的な様式で発現されることが知られている。したがって、ＺＡＰ７０のｔ−ループリン酸化がＪｕｒｋａｔ細胞で独占的に検出された。
【００２０】
ＦＡＫ、ＭＥＴ並びに２つのキナーゼ群ＥＰＨＡ３／４／５およびＨＣＫ／ＬＹＮなどの他のチロシンキナーゼは、Ｊｕｒｋａｔ細胞で検出できなかった一方で、それらは、特にＰＣ９細胞で高い活性を示した。これは、ＰＣ９でのチロシンキナーゼ活性の上昇を示し、活性化したＥＧＦＲシグナリングによる可能性が高い。特に、これらの活性化するリン酸化は、ｔ−ループ配列内のチロシン残基で生じ、かなりの数のキナーゼでの主要な活性化を制御する。特に、チロシンキナーゼおよびＭＡＰキナーゼは、十分な活性化のためにそれらのｔ−ループのチロシンリン酸化を必要とする一方で、多くの他のキナーゼでの主要な活性化部位はトレオニン残基である。
【００２１】
チロシンリン酸化は、特異的なホスホチロシン濃縮を前もって実施しない限り、ホスホプロテオーム解析において当然過小評価される。であることを見出した敏感なＳＲＭ分析と組み合わせたＦｅ（ＩＩＩ）−ＩＭＡＣホスホペプチド濃縮によって、チロシンｔ−ループリン酸化の実質的な回復がもたらされた。
【００２２】
ＦＡＫおよびＭＥＴの場合、ＰＣ９での測定で、ｔ−ループ内のリン酸化部位局在化情報が得られた。
【００２３】
非刺激細胞のいくつかのｔ−ループリン酸化の検出に成功した後、カイノームの大部分が不活性（非リン酸化）状態で存在することから、方法をさらに微調整して、選択した刺激による定常状態のバックグランドからの特異的なキナーゼの活性化を明らかにした。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＴＮＦαで８時間処理し、細胞死を増加させた。ＴＮＦαの刺激により、受容体相互作用タンパク質セリン−トレオニンキナーゼ（ＲＩＰＫ）がＴＮＦ受容体複合体に入り、アポトーシスを仲介する（図２Ｂ）。ＴＮＦα処理により、セリンＳ１６１でのＲＩＰＫ１リン酸化が再現性よく検出され、リン酸化は非処理Ｊｕｒｋａｔ細胞で検出できなかった（図２Ｃ）。
【００２４】
細胞死でのＲＩＰＫ１のよく特徴付けられた役割にもかかわらず、細胞ライセートからのＲＩＰＫ１ｔ−ループリン酸化のＭＳによる直接検出が本発明の方法によって可能であることを見出した。したがって、ＲＩＰＫ１アッセイは、新しい堅固な読み出しをもたらして、細胞死の複雑な調節をモニターする一方で、発明者らの技術の類いまれな感度も実証する。
【００２５】
種々の位置異性体に存在する合計５１個のペプチド配列を含む本発明の方法に基づいてアッセイを開発した。それらのうちの４１個が２個の異なるアイソフォームに存在し、１０個が３個の異なるアイソフォームに存在した。リン酸化部位局在化異性体の多数が逆相ＬＣでのクロマトグラフの保持時間によって区別できないと一般に考えられているが、本発明の方法を用いて、ベースラインのクロマトグラフィーの分離が、５１個の配列のうち４７個についてのすべての位置異性体で示された。キナーゼＤＤＲ２の３つのリン酸化部位についての一例を図３Ａに示す。リン酸化部位局在化の特異的な推移を用いることによって、別の２個のペプチド配列が、複合資料における異なるリン酸化部位局在化の明確な区別を可能にする部分的なクロマトグラフィーの分離を示した。一例は、図３Ｂに示すＪＡＫ３の残基Ｙ９８０およびＹ９８１のチロシンリン酸化である。
【００２６】
主要な細胞からカイノーム動態の徹底解析を行うことによって、キナーゼ活性プロファイリングアプローチの感度が利用された。本発明の技術が血小板活性化のメカニズムを調べるのに適用された。プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）に結合するヘキサペプチド模倣トロンビンによって活性化した血小板を、１分間および５分間分析し、それらのキナーゼ活性プロフィールを未感作血小板と比較した。ホスホペプチド濃縮当たり３００μｇのタンパク質の投入量を用いることによって、２５個のキナーゼ群の３１個のｔ−ループリン酸化が検出され、定量された。活性化血小板と未感作血小板との間の比較定量分析によって、ＰＡＲ１活性化によるカイノーム活性レベルの劇的な変化が明らかとなった。
【００２７】
図４Ａは、１分間および５分間の活性化それぞれのボルケーノプロットとして定量的な違いを示す。血小板活性化は種々の細胞内シグナリング事象を伴い、その大半は、図４Ｂに示す共通経路に集束する。ここでは、２個のＴｅｃファミリーチロシンキナーゼＢｔｋおよびＴｅｃでのｔ−ループリン酸化の検出が注目に値し、それらの両方が血小板活性化と関連している。特に、ＰＬＣγ２の主要な活性化因子としてのＢｔｋの役割がよく確立されている一方で、Ｔｅｃは、例えばＸ連鎖無ガンマグロブリン血症の場合など、Ｂｔｋが存在しないか、または正常に機能しない場合に、より代償的な役割に関係している。ここで提示したキナーゼ活性プロファイルは、血小板活性化におけるＢｔｋおよびＴｅｃについてこれらの必須の役割を裏付ける。
【００２８】
興味深いことに、キナーゼ活性化の規模および動態が、２つのＴｅｃファミリーキナーゼの間で異なっていたことを見出した。Ｂｔｋ活性が１分のＰａｒ１活性化によりほぼ４倍増加し、５分にて増加を維持した場合、Ｔｅｃは、はるかに低い活性化を示し、時間とともに欠如し、これはＢｔｋの主要な役割の裏付けとなる（図４Ｃ）。
【００２９】
下流では、刺激後の中心の集束点は、細胞内Ｃａ２＋の増加をもたらし、それによって、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ（ＣａＭＫ）の活性を増加させるホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の活性化である。ｔ−ループ内の２個の隣接したリン酸化部位の定量によって、ＣａＭＫ２の活性化状態をモニターできることを見出した（Ｔ３０５およびＴ３０６、図４Ｄ）。リン酸化部位の両方が、１分のＰＡＲ１活性化により非常に急な山形を示し、５分後に大幅に低下した。これは、キナーゼ活性化に関与する短期間を実証する。興味深いことに、両方のリン酸化部位の特異的な動態がわずかに異なっていた。一方、Ｔ３０６リン酸化が１分後に１０倍より多く増加し、５分後にほとんどベースラインに戻り、Ｔ３０５の急な山形はあまり強くなかったが、より遅い減衰を示した。これは、ＣａＭＫ２  ｔ−ループで発生する２つのリン酸化事象の動的調節を示唆する。
【００３０】
ＰＬＣ活性の別の標的はＰＫＣであり、ＰＫＣはｐ３８を活性化する。ＰＫＣδ、ＰＫＣθ並びにＰＫＣα、ＰＫＣβおよびＰＫＣγの冗長なｔ−ループ配列を含むＰＫＣファミリーメンバーのいくつかのｔ−ループリン酸化を定量することが可能であることを見出した。興味深いことに、それらのうちどれもいずれの有意な差異を示さなかった一方で、それらの下流の標的ｐ３８Ａが非常に劇的に変化した。Ｐ３８Ａは、十分なキナーゼ活性のために、Ｔ１７９およびＹ１８１での二重リン酸化を必要とし、特に見られた状態は１分後の顕著なＰａｒ１活性化であり、この活性化は５分後に劇的に減少した（図４Ｅ）。同時に、Ｙ１８１でのみリン酸化したｐ３８Ａが１分後にベースラインレベルのままであり、５分後にわずかに増加したのみであった。これは、先の研究に沿って、ｐ３８Ａの急速な二重リン酸化に続いて、より遅い部分的な脱リン酸化が５分後に見られたＹ１８１単独のリン酸化の上方制御をもたらすことを示唆する。観察したＰＫＣとｐ３８ｔ−ループリン酸化とを組み合わせると、ＰＫＣ活性の極めて速い急伸が既に１分未満で既に消えるが、さらに下流でｐ３８を活性化できることを示すか、またはＰＫＣ活性レベルと比較して大きな山のｐ３８活性化のシグナル増幅を示す。
【００３１】
別のよく研究された細胞内Ｃａ２＋濃度増加の効果が、細胞膜への転座によるＲＡＳの活性化およびその後のＭＡＰＫカスケードの活性化である。血小板が、成長、分化または増殖する可能性がない無核細胞であることから、血小板でのＭＡＰＫカスケードの役割は十分に解明されていない。しかしながら、それは、上昇した細胞内Ｃａ２＋濃度の維持に関連する因子であると思われる。キナーゼ活性の増加がＭＡＰＫシグナリングカスケードの個別のメンバーについて示された。ＲＡＦ活性のわずかな増加が１分間のＰａｒ１活性化により見られ、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２の強い活性化をもたらした（図４Ｆ）。最後に、別の血小板活性化経路で機能するキナーゼについてのいくつかのｔ−ループリン酸化が見られた、例えばＦｙｎ、Ｌｙｎ、Ｙｅｓ、ＭＫＫ４、ＪＮＫ２およびＦＡＫ２、しかしながらリン酸化の実質的な違いが見られず、これはベースライン活性の存在を示唆する。
【００３２】
主要な細胞でのキナーゼ活性化の効果的な分析に続いて、疾患でのキナーゼの不安定な活性を調べることへの本発明の方法の有用性を調査した。キナーゼは、特に癌において薬剤標的の主要なクラスとなっており、２５個のキナーゼ標的化薬が承認されており、多数の候補が臨床評価の下にある。しかしながら、これらの候補の同定において、合成致死性評価によって、カイノームの残りに対する１つのキナーゼの阻害の（長期間の）効果が多くの場合無視される。これは、一貫して、シグナリングネットワークの適合による標的キナーゼ阻害にタイする治療耐性をもたらす。
【００３３】
本発明の方法の可能性を実証するために、メラノーマの後天性薬剤耐を調査した。メラノーマの大半は、ＢＲＡＦの常時活性をもたらすＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異によって引き起こされる。初期の成功にもかかわらず、ＢＲＡＦ阻害剤（ＢＲＡＦｉ）による患者の治療は、通常、後天性薬剤耐性の急速な獲得をもたらす。ここで、患者由来異種移植片から確立した治療未感作、治療感受性および耐性の腫瘍状態からの一致した患者由来メラノーマ細胞株でのｔ−ループリン酸化を調査した（図５Ａ）。ここで、後天性薬剤耐性はＮＲＡＳＱ６１Ｋ変異に基づいている。
【００３４】
すべての３つの状態のカイノーム活性の差異の比較によって、３９個のリン酸化部位が検出され、３６個のキナーゼ群のｔ−ループリン酸化が定量された（図５Ｂ〜５Ｄ）。
【００３５】
定量したキナーゼのいくつかが、治療未感作および感受性の細胞と比較して耐性細胞株での活性増加を示した。これらのキナーゼは、ＣａＭＫＩＶ、ＰＫＣキナーゼファミリーのいくつかのメンバー（ＰＫＣδ、ＰＫＣμ／νなど）、ＭＡＰＫカスケードに関連するいくつかのメンバー（ｐ３８Ａ、Ｅｒｋ２、Ｅｒｋ４およびＭＫＫ４など）並びにＭＡＰＫエフェクターキナーゼＮＬＫおよび細胞周期関連キナーゼＣＤＫ２／３およびＣｈｋ２を含んでいた。驚いたことに、薬剤耐性細胞株において特異的に活性化したいくつかのキナーゼが、Ｃｈｋ２、ｐ３８ＡおよびＥｒｋ４などの腫瘍抑制活性に主に関連していた。
【００３６】
キナーゼ  Ｅｒｋ４について〆最も強い  活性化  が見られ〆、Ｅｒｋ４は、同様に見られたＥｒｋ３と共に、活性化ループ内のチロシンドメインを欠いていることから、〆  非定型的な  ＭＡＰＫ  ファミリーに属する  〆。これまで、ＭＫ５  のみが  Ｅｒｋ３およびＥｒｋ４の両方の既知の基質である。ＭＫ５  は、ｐ５３およびＦＯＸＯ３の活性化などの  腫瘍  抑制  機能  について主に知られている。しかしながら、最近の  研究は、例えば  ＪＮＫ活性の阻害  および  血管新生の支持によって、Ｅｒｋ３／Ｅｒｋ４／ＭＫ５  モジュールについて発がん性の  可能性がある  ことも示した  〆。さらに、ＭＫ５のｍＲＮＡ発現の増加は  、  転移の発達の可能性の増加に関連していた。
【００３７】
興味深いことに、ＥＲＫ３／ＥＲＫ４発現の動態は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅおよび発がん性ＲＡＳの両方の発現増加に関連しており、Ｅｒｋ３およびＥｒｋ４それぞれの発現増加をもたらす。データは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅの阻害が、Ｅｒｋ３のｔ−ループリン酸化の低下と並行して進み、ＭＫ５の低下を伴うことを明らかにした（図５Ｅ）。後天性薬剤耐性により、Ｅｒｋ３レベルが回復し、著しく、発がん性ＲＡＳがＥｒｋ４ｔ−ループリン酸化を、未感作および感受性の細胞と比較して劇的に２０倍超上昇させる。包括的に、これは、治療未感作細胞と比較した場合に、耐性細胞でのより高いＭＫ５のキナーゼ活性をもたらす。結果は、メラノーマでのＮＲＡＳ誘発ＢＲＡＦｉ耐性におけるＥＲＫ３／ＥＲＫ４／ＭＫ５システムのあり得る興味深い役割を示し、標的腫瘍治療により変化したカイノーム活性を検出する本発明の方法の可能性を強調する。
【図１Ａ】
2021528649.tif 000007
【図１Ｂ】
2021528649.tif 000008
【図２Ａ】
2021528649.tif 000009
【図２Ｂ】
2021528649.tif 000010
【図２Ｃ】
2021528649.tif 000011
【図３Ａ】
2021528649.tif 000012
【図３Ｂ】
2021528649.tif 000013
【図４Ａ】
2021528649.tif 000014
【図４Ｂ】
2021528649.tif 000015
【図４Ｃ】
2021528649.tif 000016
【図４Ｄ】
2021528649.tif 000017
【図４Ｅ】
2021528649.tif 000018
【図４Ｆ】
2021528649.tif 000019
【図５Ａ】
2021528649.tif 000020
【図５Ｂ】
2021528649.tif 000021
【図５Ｃ】
2021528649.tif 000022
【図５Ｄ】
2021528649.tif 000023
【図５Ｅ】
2021528649.tif 000024
【図６−１】
2021528649.tif 000025
【図６−２】
2021528649.tif 000026
【図６−３】
2021528649.tif 000027
【図６−４】
2021528649.tif 000028
【図６−５】
2021528649.tif 000029
【図６−６】
2021528649.tif 000030
【図６−７】
2021528649.tif 000031
【図６−８】
2021528649.tif 000032
【図６−９】
2021528649.tif 000033
【図６−１０】
2021528649.tif 000034
【図６−１１】
2021528649.tif 000035
【図６−１２】
2021528649.tif 000036
【図６−１３】
2021528649.tif 000037
【図６−１４】
2021528649.tif 000038
【図６−１５】
2021528649.tif 000039
【図６−１６】
2021528649.tif 000040
【配列表】
2021528649000001.app
【国際調査報告】
2021528649.tif 000041
2021528649.tif 000042
2021528649.tif 000043
2021528649.tif 000044