(57)【要約】  本開示は、Ｂｃｌ−２タンパク質を含むヘテロ二量体を検出する抗体を使用して、治療に対するがん細胞の感受性を決定する組成物および方法に関する。本開示は、がん治療に対するがん患者の感受性を予測する方法も提供する。【選択図】図３７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん治療に対する患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を認識する抗体または抗体形式に試料を接触させることであって、前記試料が前記患者の固形腫瘍由来の標本である、接触させること、
（ｂ）前記ヘテロ二量体の量を標示するシグナルを検出すること、ならびに
（ｃ）参照値に対するステップ（ｂ）由来の前記試料中の前記ヘテロ二量体の量の比率を決定すること、を含み、
前記参照値が、前記試料中の前記ヘテロ二量体の前記ＢＣＬ−２タンパク質モノマーのうちの一方の量を含み、
前記比率が、前記がん治療に対する前記患者の感受性を予測するものである、方法。
【請求項２】
がん治療に対する患者の感受性を予測する方法であって、
（ａ）二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を認識する抗体または抗体形式、および前記ヘテロ二量体の前記ＢＣＬ−２タンパク質モノマーのうちの一方を認識する抗体または抗体形式に、試料を接触させることであって、前記試料が前記患者の固形腫瘍由来の標本である、接触させること、
（ｂ）前記ヘテロ二量体の量を標示するシグナルおよび前記モノマーの量を標示するシグナルを検出すること、ならびに
（ｃ）前記モノマーの量に対する前記ヘテロ二量体の量に基づき比率を決定することであって、前記比率が前記がん治療に対する前記患者の感受性を予測するものである、決定すること、を含む、方法。
【請求項３】
前記比率ががん治療に対する感受性を予測するものである場合に、前記患者に前記がん治療を施すことをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記比率が前記がん治療に対する感受性を予測するものである場合に、前記がん治療の用量を低減して、もしくは頻度を少なくして、および／またはレジメンを短縮して、前記患者を治療することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記比率が前記がん治療に対する感受性の欠如を予測するものである場合に、前記がん治療の用量を増加して、もしくは頻度を多くして、および／またはレジメンを延長して、前記患者を治療することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記比率が前記がん治療に対する感受性の欠如を予測するものである場合に、前記患者に対しがん治療を保留することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記比率が前記がん治療に対する感受性の欠如を予測するものである場合に、異なるがん治療を用いて前記患者を治療することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記患者の一つまたは複数の臨床因子を決定することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記患者の一つまたは複数の臨床因子に基づいて、前記がん治療に対する臨床応答の可能性について前記患者を分類することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者の一つまたは複数の臨床因子に基づいて、前記がん治療に対する前記患者の感受性の前記予測を、前記がん治療に対する臨床応答の前記可能性と比較することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記臨床因子が、年齢、細胞遺伝学的状態、遂行能力、組織学的サブクラス、性別、および病期のうちの一つまたは複数である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
突然変異状態、単ヌクレオチド多型、定常状態タンパク質レベル、および動的タンパク質レベルから選択される追加のバイオマーカーを測定することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘテロ二量体の検出が、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリー、または免疫蛍光法を採用する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＢＣＬ−２タンパク質がアクチベーターＢＨ３タンパク質である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アクチベーターＢＨ３タンパク質が、ＢＩＤおよびＢＩＭから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＢＣＬ−２タンパク質が、増感性ＢＨ３タンパク質である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記増感性ＢＨ３タンパク質が、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＨＲＫ、ＢＭＦ、およびＰＵＭＡから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＢＣＬ−２タンパク質が、マルチドメインのアポトーシス促進タンパク質である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記マルチドメインのアポトーシス促進タンパク質が、ＢＡＸおよびＢＡＫから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＢＣＬ−２タンパク質が、マルチドメインの抗アポトーシスタンパク質である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記マルチドメインの抗アポトーシスタンパク質が、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−Ｗ、およびＢＦＬ−１から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヘテロ二量体が、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヘテロ二量体が、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、ＢＣＬＸＬ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘテロ二量体が、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、ＢＣＬＷ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヘテロ二量体が、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、ＭＣＬ１、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヘテロ二量体が、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つとを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、ＢＦＬ１、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記がん治療がＢＨ３模倣体を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＢＨ３模倣体が、ＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３（ナビトクラクス）、ベネトクラクス（ベネクレクスタ、ＡＢＴ−１９９）、Ｓ６３８４５、ＡＭＧ１７６、ＡＤＺ５９９１、Ａ−１１５５４６３、Ａ１３３１８５２、ＥＵ５３４６、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記がん治療が、一つまたは複数の化学療法剤を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記がん治療が、ＳＭＡＣ模倣体、プロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、グルココルチコイド、ステロイド、モノクローナル抗体、抗体薬物コンジュゲート、またはサリドマイド誘導体のうちの一つまたは複数である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記がん治療が、検出される特定のヘテロ二量体の形成を遮断する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記がん治療が、検出される特定のヘテロ二量体の形成を撹乱させる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記がん治療がチェックポイント阻害剤を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記チェックポイント阻害剤が、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ４、ＧＩＴＲ、ガレクチン−９、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、およびＴＭＩＧＤ２のうちの一つを標的とする薬剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＰＤ−１を標的とする前記薬剤が、ＰＤ−１に特異的な抗体または抗体形式であって、任意選択的にニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＤ−Ｌ１を標的とする前記薬剤が、ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体または抗体形式であって、任意選択的にアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびＢＭＳ−９３６５５９から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ＣＴＬＡ−４を標的とする前記薬剤が、ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体または抗体形式であって、任意選択的にイピリムマブおよびトレメリムマブから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料が、腫瘍生検体、組織生検体、腫瘍切除物、凍結腫瘍組織標本、リンパ節、骨髄細胞、循環腫瘍細胞、培養細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織標本、気管支肺胞洗浄物、皮膚、髪、尿、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍生検体が、コア生検体、針生検体、外科手術生検体、および切除生検体から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、前記患者の浸潤リンパ球である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記固形腫瘍が、肺がん、乳がん、前立腺がん、黒色腫、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、および卵巣がんから選択される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記肺がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記乳がんが三重陰性乳がんである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記前立腺がんがアンドロゲン非依存性前立腺がんである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記感受性は、前記がん治療に対する応答の可能性が高いことによって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法が、ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の機能的読取りを伴わない、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、細胞膜電位の色素ベースの検出を伴わない、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体または抗体形式が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および抗体の抗原結合部分を含む融合タンパク質のうち一つまたは複数から選択される、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体または抗体形式が、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体または抗体形式が、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体または抗体形式が、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体または抗体形式が、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体または抗体形式が、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体または抗体形式が、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域であって、前記重鎖ＣＤＲ１配列がＧＨＴＦＴＥＨＹＩＮ（配列番号１）であり、前記重鎖ＣＤＲ２配列がＷＩＦＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）であり、前記重鎖ＣＤＲ３配列がＳＹＳＮＦＷＦＡＹ（配列番号３）である、重鎖可変領域と；（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域であって、前記軽鎖ＣＤＲ１配列がＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号４）であり、前記軽鎖ＣＤＲ２配列がＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号５）であり、前記軽鎖ＣＤＲ３配列がＱＱＳＮＳＷＰＴＴ（配列番号６）である、軽鎖可変領域と、を含む、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体または抗体形式が、式（ＦＷ１）−（ＣＤＲ１）−（ＦＷ２）−（ＣＤＲ２）−（ＦＷ３）−（ＣＤＲ３）−（ＦＷ４）に従って前記ＣＤＲ間に並置された可変領域フレームワーク（ＦＷ）配列をさらに含み、前記重鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列が、重鎖可変領域ＦＷ配列であり、前記軽鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列が、軽鎖可変領域ＦＷ配列である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記可変領域ＦＷ配列がヒトである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗体または抗体形式が、ヒトの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含む、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗体または抗体形式が、（ｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列または総計１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列または総計１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列とを含む、請求項５９〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗体または抗体形式が、配列番号７および／または配列番号８と少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
臨床応答の前記可能性が、以下の数式によって定義され：
【数１】
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式中、
ＡＵＣ（曲線下面積）は、均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）由来の平均シグナル強度によって確立された蛍光測定値の合計であり、前記シグナル強度は、プライミング開始後の約５分から約３００分の間に発生する単一の時点の測定値であり；
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、曲線下面積またはシグナル強度のどちらかに対するベースライン陰性対照を含み；
ＣＣＣＰ（カルボニルシアニド  ｍ−クロロフェニルヒドラゾン）は、酸化的リン酸化の化学阻害剤であり、ミトコンドリア中の電子伝達系内の電子担体の通常の活動の間に確立されたプロトン勾配の脱共役剤として役割を果たすことによるタンパク質合成のエフェクターを含み、前記ＣＣＣＰは、ベースライン陽性対照を含み；
ペプチドは、一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドであり、式中で（ｎ）は、ＤＭＳＯ対照およびＣＣＣＰ対照の反復の平均の数により正規化される、請求項９〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
臨床応答の前記可能性が、以下の数式によって定義され：
【数２】
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式中、
ＡＵＣ（曲線下面積）は、均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）由来の平均シグナル強度によって確立された蛍光測定値の合計であり、前記シグナル強度は、プライミング開始後の約５分から約３００分の間に発生する単一の時点の測定値であり；
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、曲線下面積またはシグナル強度のどちらかに対するベースライン陰性対照を含み；
ＣＣＣＰ（カルボニルシアニド  ｍ−クロロフェニルヒドラゾン）は、酸化的リン酸化の化学阻害剤であり、ミトコンドリアの電子伝達系内の電子担体の通常の活動の間に確立されたプロトン勾配の脱共役剤として役割を果たすことによるタンパク質合成のエフェクターを含み、前記ＣＣＣＰは、ベースライン陽性対照を含み；
ペプチドは、一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドであり、式中で（ｎ）は、ＤＭＳＯ対照およびＣＣＣＰ対照の反復の平均の数により正規化される、請求項９〜６５のいずれか１項に記載の方法
【請求項６８】
前記一つまたは複数の臨床因子が、臨床応答と関連付けのためにＢＨ３プロファイルの特異性および／または感受性を増加させるように選択される、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
Ｍｃｌ−１／ＢｉｍまたはＢＣＬＸＬ／Ｂｉｍのヘテロ二量体を含む抗体の量を測定することを含む、試料中のチェックポイント阻害剤に対する患者の応答性を予測する方法であって、前記試料が固形腫瘍由来の浸潤性リンパ球集団を含む方法。
【請求項７０】
前記チェックポイント阻害剤が、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ４、ＧＩＴＲ、ガレクチン−９、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、およびＴＭＩＧＤ２のうちの一つを標的とする薬剤である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ＰＤ−１を標的とする前記薬剤が、ＰＤ−１に特異的な抗体または抗体形式であって、任意選択的にニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブから選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ＰＤ−Ｌ１を標的とする前記薬剤が、ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体または抗体形式であって、任意選択的にアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびＢＭＳ−９３６５５９から選択される、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＣＴＬＡ−４を標的とする前記薬剤が、ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体または抗体形式であって、任意選択的にイピリムマブおよびトレメリムマブから選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域であって、前記重鎖ＣＤＲ１配列がＧＨＴＦＴＥＨＹＩＮ（配列番号１）であり、前記重鎖ＣＤＲ２配列がＷＩＦＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）であり、前記重鎖ＣＤＲ３配列がＳＹＳＮＦＷＦＡＹ（配列番号３）である、重鎖可変領域と；（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域であって、前記軽鎖ＣＤＲ１配列がＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号４）であり、前記軽鎖ＣＤＲ２配列がＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号５）であり、前記軽鎖ＣＤＲ３配列がＱＱＳＮＳＷＰＴＴ（配列番号６）である、軽鎖可変領域と、を含む、抗体または抗体形式を含む組成物。
【請求項７５】
前記抗体または抗体形式が、式（ＦＷ１）−（ＣＤＲ１）−（ＦＷ２）−（ＣＤＲ２）−（ＦＷ３）−（ＣＤＲ３）−（ＦＷ４）に従って前記ＣＤＲ間に並置された可変領域フレームワーク（ＦＷ）配列をさらに含み、前記重鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列が、重鎖可変領域ＦＷ配列であり、前記軽鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列が、軽鎖可変領域ＦＷ配列である、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記可変領域ＦＷ配列がヒトである、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記抗体または抗体形式が、ヒトの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記抗体または抗体形式が、（ｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列または総計１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列または総計１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列とを含む、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記抗体または抗体形式が、配列番号７および／または配列番号８と少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
請求項７４〜８０のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８２】
請求項８１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８３】
請求項８２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８４】
請求項７４〜８０のいずれか１項に記載の抗体または抗体形式と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項８５】
ヘテロ二量体抗体を生成する方法であって、
（ａ）ヘテロ二量体誘発性立体構造抗原を用いて対象を免疫すること、
（ｂ）前記ヘテロ二量体誘発性抗原を認識するＩｇＧを産生する脾臓Ｂ細胞を前記対象から単離すること、
（ｃ）前記脾臓Ｂ細胞を陰性選択用磁気カラムに通すことであって、前記陰性選択用磁気カラムが、前記ヘテロ二量体の一方のモノマーを含有する組換え融合タンパク質により被覆されている、通すこと、
（ｄ）前記陰性選択用磁気カラムから前記脾臓Ｂ細胞のフロースルーを採集し、陽性選択用磁気カラムに前記フロースルーを通すことであって、前記陽性選択用磁気カラムが、前記ヘテロ二量体抗原により被覆されている、通すこと、
（ｅ）前記陽性選択用磁気カラムに結合された前記脾臓Ｂ細胞を溶出し採集すること、
（ｆ）前記採集された細胞をＢ細胞培地中で培養すること、ならびに
（ｇ）前記培養細胞から前記ヘテロ二量体特異的抗体を単離し、それによってヘテロ二量体抗体を生成すること、を含む方法。
【請求項８６】
前記ヘテロ二量体抗原が、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ヘテロ二量体抗原が、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記ヘテロ二量体抗原が、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記ヘテロ二量体抗原が、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つである、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
前記ヘテロ二量体抗原が、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つである、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記ヘテロ二量体の前記一方のモノマーが、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＢＣＬＸＬ、ＨＲＫ、ＢＣＬＷ、およびＭＣＬ１から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記ヘテロ二量体の前記一方のモノマーがＭＣＬ１である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
前記ヘテロ二量体の前記一方のモノマーがＢＩＭである、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
前記ヘテロ二量体が、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９５】
前記ヘテロ二量体が、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９６】
前記ヘテロ二量体が、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９７】
前記ヘテロ二量体が、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
前記ヘテロ二量体が、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９９】
前記ヘテロ二量体が、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＢＣＬＸＬ、ＢＣＬＷ、およびＭＣＬ１のうちの二つから選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象がヒト、サル、マウス、ラット、またはハムスターである、請求項８５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｂｃｌ−２タンパク質を含むヘテロ二量体を検出する抗体を使用して、治療に対するがん細胞の感受性を決定する組成物および方法に関する。
【０００２】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年１１月２８日出願の米国仮特許出願第６２／７７２，３６８号、２０１８年８月２０日出願の米国仮特許出願第６２／７１９，７８９号、および２０１８年１月１８日出願の米国仮出願第６２／６１８，７８６号の優先権および利益を主張するものであり、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
電子提出されたテキストファイルの説明
電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＥＵＴＲ−０１８ＰＣ＿１０５４４４−５０１８＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５；記録日：２０１９年１月３日；ファイルサイズ：１３．４ＫＢ）。
【背景技術】
【０００４】
がんは世界中で主な死因であり続けている。当技術分野では、がんのさらに効果的な治療が求められている。数多くの分子標的剤が臨床試験に入っていることから、予測試験が非常に望ましいものとなっている。特に、臨床試験の登録のための、および承認時には治療のための、適正な患者の選択は、新しいがん療法の臨床開発のための主要な駆動力である。
【０００５】
アポトーシスの本来備わった経路は、Ｂ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）のタンパク質ファミリーの１５個を超えるメンバーが相互作用する、ミトコンドリアのレベルで調節される。数多くの化学療法剤がアポトーシスを引き起こし、その機構は多くの場合、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーのレベルおよび相互作用の変化を伴う。Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーは、Ｂｃｌ−２相同性（ＢＨ）ドメイン（ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、およびＢＨ４）と称する相同性のある四つの特徴的なドメインのうち、一つまたは複数を共有する。
【０００６】
ＢＨ３プロファイリングは、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のペプチド模倣型ＢＨ３ドメインへ曝露された後のミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）を測定することによって、腫瘍細胞のミトコンドリアプライミングを測定する、機能的アッセイである。ＭＯＭＰは、ミトコンドリア内膜を横断する電位を測定する蛍光色素ＪＣ−１によって、間接的に測定される。この電位は、ＭＯＭＰに応答して速やかに低下する。しかし、実際には、ＪＣ−１に基づくこの種の機能的測定は、一貫した蛍光シグナルを測定することの難しさに妨げられる。
【０００７】
さらに、機能的シグナルの代わりである個々のＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のタンパク質レベルの直接的な測定は、これらのレベルの変化が、供試される被験抗がん剤に対する感受性と一貫して相関しないという事実により、混乱を生じるものとなる。
【０００８】
さらに、機能的ＢＨ３測定を個々のＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のタンパク質レベルの直接的な測定に組み合わせることは、複雑であり、固形腫瘍または固定標本に適さない。
【０００９】
そのため、がん治療のための予測試験の改善をもたらす新しい組成物および方法が求められている。
【発明の概要】
【００１０】
したがって、本開示は、部分的には、Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体（例えば、Ｂｃｌ−ｘｌ／ＢＩＭ−ＢＨ３ヘテロ二量体）にそれぞれ特異的に結合するいくつかの抗体の発見に基づく。本開示はさらに、患者由来の固形腫瘍試料中の二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を検出して、参照値に対するヘテロ二量体の比率を決定するために、有用な抗体を提供し、上記比率は、がん治療に対する患者の感受性を予測するものである。このように、開示された抗体は、がん治療のための予測試験のための組成物および方法の改善をもたらす。
【００１１】
一部の態様では、本明細書に開示されるのは、がん治療に対する患者の感受性を予測する方法であって、本方法は、二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を認識する抗体または抗体形式に試料を接触させることであって、試料が患者の固形腫瘍由来の標本であること；ヘテロ二量体の量を標示するシグナルを検出すること；ならびに参照値に対する試料中に存在するヘテロ二量体の量に基づき比率を決定することであって、参照値が試料中のヘテロ二量体のＢＣＬ−２タンパク質モノマーのうちの一方の量を含み、上記比率ががん治療に対する患者の感受性を予測するものであることを含む。
【００１２】
別の態様では、本開示は、がん治療に対する患者の感受性を予測する方法を提供し、本方法は、二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を認識する抗体または抗体形式、およびヘテロ二量体のＢＣＬ−２タンパク質モノマーのうちの一方を認識する抗体または抗体形式に試料を接触させることであって、試料が患者の固形腫瘍由来の標本であること；ヘテロ二量体の量およびモノマーの量を標示するシグナルを検出すること；ならびにモノマーの量に対するヘテロ二量体の量に基づき比率を決定することであって、上記比率ががん治療に対する固形腫瘍患者の感受性を予測するものであることを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性を予測するものである場合に、患者にがん治療を施すことをさらに含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性を予測するものである場合に、がん治療の用量を低減して、もしくは頻度を少なくして、および／またはレジメンを短縮して、患者を治療することをさらに含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性を予測するものである場合に、がん治療の用量を増加して、もしくは頻度を多くして、および／またはレジメンを延長して、患者を治療することをさらに含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性の欠如を予測するものである場合に、患者に対するがん治療を保留することをさらに含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性の欠如を予測するものである場合に、異なるがん治療を用いて患者を治療することをさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本方法は、患者の一つまたは複数の臨床因子を決定することを含むことをさらに含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本方法は、患者の一つまたは複数の臨床因子に基づいて、がん治療への臨床応答の可能性について患者を分類することをさらに含む。
【００２０】
一部の実施形態では、本方法は、患者の一つまたは複数の臨床因子に基づいて、がん治療に対する患者の感受性の予測を、がん治療に対する臨床応答の可能性と比較することをさらに含む。臨床因子は、年齢、細胞遺伝学的状態、遂行能力、組織学的サブクラス、性別、および病期のうちの一つまたは複数とすることができる。
【００２１】
一部の実施形態では、本方法は、変異状態、一塩基多型、定常状態タンパク質レベル、および動的タンパク質レベルから選択される追加的なバイオマーカーを測定することをさらに含む。
【００２２】
一部の実施形態では、本方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリー、または免疫蛍光法を採用することによってヘテロ二量体を検出することをさらに含む。
【００２３】
一部の実施形態では、ＢＣＬ−２タンパク質は、アクチベーターＢＨ３タンパク質である。
【００２４】
一部の実施形態では、本方法は、ＢＩＤおよびＢＩＭから選択されるアクチベーターＢＨ３タンパク質をさらに含む。
【００２５】
一部の実施形態では、ＢＣＬ−２タンパク質は、増感性ＢＨ３タンパク質である。一部の実施形態では、増感性ＢＨ３タンパク質は、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＨＲＫ、ＢＭＦ、およびＰＵＭＡから選択される。
【００２６】
一部の実施形態では、ＢＣＬ−２タンパク質は、マルチドメインのアポトーシス促進タンパク質である。一部の実施形態では、マルチドメインのアポトーシス促進タンパク質は、ＢＡＸおよびＢＡＫから選択される。
【００２７】
一部の実施形態では、ＢＣＬ−２タンパク質は、マルチドメインの抗アポトーシスタンパク質である。一部の実施形態では、マルチドメインの抗アポトーシスタンパク質は、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−Ｗ、およびＢＦＬ−１から選択される。
【００２８】
一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、本方法は、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。
【００３０】
一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、本方法は、ＢＣＬＸＬ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。
【００３２】
一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、本方法は、ＢＣＬＷ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。
【００３４】
一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む。
【００３５】
一部の実施形態では、本方法は、ＭＣＬ１、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。
【００３６】
一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つとを含む。
【００３７】
一部の実施形態では、本方法は、ＢＦＬ１、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。
【００３８】
一部の実施形態では、がん治療はＢＨ３模倣体である。ＢＨ３模倣体は、ＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬ特異的なＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３（ナビトクラクス）、Ｂｃｌ−２特異的なベネトクラクス（ベネクレクスタ、ＡＢＴ−１９９）、ＭＣＬ−１特異的なＳ６３８４５およびＡＭＧ１７６およびＡＤＺ５９９１、ＢＣＬ−ＸＬ特異的なＡ−１１５５４６３およびＡ１３３１８５２、ＢＦＬ−１／ＭＣＬ−１特異的なＥＵ５３４６、またはそれらの組み合わせから選択されうる。
【００３９】
一部の実施形態では、がん治療は、抗がん剤、化学療法、抗アポトーシスタンパク質の拮抗剤、外科手術、アジュバント療法、およびネオアジュバント療法のうちの一つまたは複数である。がん治療は、ＳＭＡＣ模倣体、ＢＨ３模倣体、プロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、グルココルチコイド、ステロイド、モノクローナル抗体、抗体薬物コンジュゲート、またはサリドマイド誘導体のうちの一つまたは複数とすることができる。
【００４０】
一部の実施形態では、がん治療は、検出された特定のヘテロ二量体の形成を遮断する。
【００４１】
一部の実施形態では、がん治療は、検出された特定のヘテロ二量体の形成を攪乱する。
【００４２】
一部の実施形態では、がん治療はチェックポイント阻害剤である。
【００４３】
一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ４、ＧＩＴＲ、ガレクチン−９、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、およびＴＭＩＧＤ２のうちの一つを標的とする薬剤である。
【００４４】
一部の実施形態では、ＰＤ−１を標的とする薬剤は、ＰＤ−１に特異的な抗体または抗体形式であって、任意選択的にニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブから選択される。
【００４５】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体または抗体形式であり、任意選択的にアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびＢＭＳ−９３６５５９から選択される。
【００４６】
一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４を標的とする薬剤は、ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体または抗体形式であり、任意選択的にイピリムマブおよびトレメリムマブから選択される。
【００４７】
一部の実施形態では、試料は、腫瘍生検体、組織生検体、腫瘍切除物、凍結腫瘍組織標本、リンパ節、骨髄細胞、循環腫瘍細胞、培養細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織標本、気管支肺胞洗浄物、皮膚、髪、尿、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００４８】
一部の実施形態では、腫瘍生検体は、コア生検体、針生検体、外科手術生検体、および切除生検体から選択される。
【００４９】
一部の実施形態では、試料は患者の浸潤性リンパ球である。
【００５０】
一部の実施形態では、固形腫瘍は、肺がん、乳がん、前立腺がん、黒色腫、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、および卵巣がんから選択される。
【００５１】
一部の実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）から選択される。
【００５２】
一部の実施形態では、乳がんは三重陰性乳がんである。
【００５３】
一部の実施形態では、前立腺がんはアンドロゲン非依存性前立腺がんである。
【００５４】
一部の実施形態では、感受性は、（ａ）試料中のアポトーシスの存在、（ｂ）患者が抗アポトーシスＢｃｌ−２ヘテロ二量体の形成に干渉する薬剤に感受性であることを標示する、試料中の抗アポトーシスＢｃｌ−２ヘテロ二量体の存在、（ｃ）遺伝的なリスク要因、家族歴、個人歴、種および民族性、ある特定の組織の特徴、様々な良性の状態（例えば非増殖性の病変）、以前の胸部放射線照射、発癌物質への曝露などによって特徴付けられる。
【００５５】
一部の実施形態では、本方法は、ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の機能的読取りを伴わない。
【００５６】
一部の実施形態では、本方法は、細胞膜電位の色素ベースの検出を伴わない。
【００５７】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および抗体の抗原結合部分を含む融合タンパク質のうち一つまたは複数から選択される。
【００５８】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。
【００５９】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。
【００６０】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。
【００６１】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。
【００６２】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。
【００６３】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１配列がＧＨＴＦＴＥＨＹＩＮ（配列番号１）であり、前記重鎖ＣＤＲ２配列がＷＩＦＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）であり、重鎖ＣＤＲ３配列がＳＹＳＮＦＷＦＡＹ（配列番号３）である、重鎖可変領域と；（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、軽鎖ＣＤＲ１配列がＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号４）であり、軽鎖ＣＤＲ２配列がＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号５）であり、軽鎖ＣＤＲ３配列がＱＱＳＮＳＷＰＴＴ（配列番号６）である、軽鎖可変領域と、を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、式（ＦＷ１）−（ＣＤＲ１）−（ＦＷ２）−（ＣＤＲ２）−（ＦＷ３）−（ＣＤＲ３）−（ＦＷ４）に従ってＣＤＲ間に並置された可変領域フレームワーク（ＦＷ）配列をさらに含み、重鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列は、重鎖可変領域ＦＷ配列であり、軽鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列は、軽鎖可変領域ＦＷ配列である。
【００６５】
一部の実施形態では、可変領域ＦＷ配列はヒトである。
【００６６】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ヒトの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含む。
【００６７】
一部の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。
【００６８】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、（ｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列または総計１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列または総計１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列とを含む。
【００６９】
一部の実施形態では、本抗体または抗体形式は、配列番号７および／または配列番号８と少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、臨床応答の可能性は、以下の数式によって定義される：
【数１】
2021512288.tif 000003
式中、
上記ＡＵＣ（曲線下面積）は、均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）由来の平均シグナル強度によって確立された蛍光測定値の合計であり、上記シグナル強度は、プライミング開始後の約５分から約３００分の間に発生する単一の時点の測定値であり；
上記ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、曲線下面積またはシグナル強度のどちらかに対するベースライン陰性対照を含み；
上記ＣＣＣＰ（カルボニルシアニド  ｍ−クロロフェニルヒドラゾン）は、酸化的リン酸化の化学阻害剤であり、ミトコンドリアの電子伝達系内の電子担体の通常の活動の間に確立されたプロトン勾配の脱共役剤として役割を果たすことによるタンパク質合成のエフェクターを含み、上記ＣＣＣＰは、ベースライン陽性対照を含み；
上記ペプチドは、一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドであり、式中で（ｎ）は、ＤＭＳＯ対照およびＣＣＣＰ対照の反復の平均の数により正規化される。
【００７１】
一部の実施形態では、先述の数式と組み合わせて、一つまたは複数の臨床因子が、臨床応答との関連付けのためにＢＨ３プロファイルの特異性および／または感受性を増加させるように選択される。
【００７２】
一部の実施形態では、臨床応答の可能性は、ここに示されるように先の数式の簡略化された形により定義され：
【数２】
2021512288.tif 000004
式中、
上記ＡＵＣ（曲線下面積）は、均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）由来の平均シグナル強度によって確立された蛍光測定値の合計であり、上記シグナル強度は、プライミング開始後の約５分から約３００分の間に発生する単一の時点の測定値であり；
上記ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、曲線下面積またはシグナル強度のどちらかに対するベースライン陰性対照を含み；
上記ＣＣＣＰ（カルボニルシアニド  ｍ−クロロフェニルヒドラゾン）は、酸化的リン酸化の化学阻害剤であり、ミトコンドリアの電子伝達系内の電子担体の通常の活動の間に確立されたプロトン勾配の脱共役剤として役割を果たすことによるタンパク質合成のエフェクターを含み、上記ＣＣＣＰは、ベースライン陽性対照を含み；
上記ペプチドは、一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドであり、式中で（ｎ）は、ＤＭＳＯ対照およびＣＣＣＰ対照の反復の平均の数により正規化される。
【００７３】
一部の実施形態では、先述の数式と組み合わせて、一つまたは複数の臨床因子が、臨床応答との関連付けのためにＢＨ３プロファイルの特異性および／または感受性を増加させるように選択される。
【００７４】
一態様では、本開示は、Ｍｃｌ−１／ＢｉｍまたはＢＣＬＸＬ／Ｂｉｍのヘテロ二量体の量を測定することを含む、試料中のチェックポイント阻害剤に対する患者の応答性を予測する方法を提供し、その場合、試料は、固形腫瘍由来の浸潤性リンパ球集団を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ４、ＧＩＴＲ、ガレクチン−９、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、およびＴＭＩＧＤ２のうちの一つを標的とする薬剤である。
【００７６】
一部の実施形態では、ＰＤ−１を標的とする薬剤は、ＰＤ−１に特異的な抗体または抗体形式であって、任意選択的にニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブから選択される。
【００７７】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体または抗体形式であり、任意選択的にアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびＢＭＳ−９３６５５９から選択される。
【００７８】
一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４を標的とする薬剤は、ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体または抗体形式であり、任意選択的にイピリムマブおよびトレメリムマブから選択される。
【００７９】
一態様では、本開示は、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１配列がＧＨＴＦＴＥＨＹＩＮ（配列番号１）であり、前記重鎖ＣＤＲ２配列がＷＩＦＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）であり、重鎖ＣＤＲ３配列がＳＹＳＮＦＷＦＡＹ（配列番号３）である、重鎖可変領域と；（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、軽鎖ＣＤＲ１配列がＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号４）であり、軽鎖ＣＤＲ２配列がＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号５）であり、軽鎖ＣＤＲ３配列がＱＱＳＮＳＷＰＴＴ（配列番号６）である、軽鎖可変領域と、を含む、抗体または抗体形式を含む組成物を提供する。
【００８０】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１の配列を有する抗体または抗体形式を含むが、四つ以下のアミノ酸置換を有するか、または三つ以下のアミノ酸置換を有するか、または二つ以下のアミノ酸置換を有するか、または１アミノ酸置換を有する、組成物を提供する。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２の配列を有する抗体または抗体形式を含むが、四つ以下のアミノ酸置換を有するか、または三つ以下のアミノ酸置換を有するか、または二つ以下のアミノ酸置換を有するか、または１アミノ酸置換を有する、組成物を提供する。
【００８２】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号３を含む抗体または抗体形式の配列を有するが、四つ以下のアミノ酸置換を有するか、または三つ以下のアミノ酸置換を有するか、または二つ以下のアミノ酸置換を有するか、または１アミノ酸置換を有する、組成物を提供する。
【００８３】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号４の配列を有する抗体または抗体形式を含むが、四つ以下のアミノ酸置換を有するか、または三つ以下のアミノ酸置換を有するか、または二つ以下のアミノ酸置換を有するか、または１アミノ酸置換を有する、組成物を提供する。
【００８４】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５の配列を有する抗体または抗体形式を含むが、四つ以下のアミノ酸置換を有するか、または三つ以下のアミノ酸置換を有するか、または二つ以下のアミノ酸置換を有するか、または１アミノ酸置換を有する、組成物を提供する。
【００８５】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６の配列を有する抗体または抗体形式を含むが、四つ以下のアミノ酸置換を有するか、または三つ以下のアミノ酸置換を有するか、または二つ以下のアミノ酸置換を有するか、または１アミノ酸置換を有する、組成物を提供する。
【００８６】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、式（ＦＷ１）−（ＣＤＲ１）−（ＦＷ２）−（ＣＤＲ２）−（ＦＷ３）−（ＣＤＲ３）−（ＦＷ４）に従ってＣＤＲ間に並置された可変領域フレームワーク（ＦＷ）配列をさらに含み、重鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列は、重鎖可変領域ＦＷ配列であり、軽鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列は、軽鎖可変領域ＦＷ配列である。
【００８７】
一部の実施形態では、可変領域ＦＷ配列はヒトである。
【００８８】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ヒトの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含む。
【００８９】
一部の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。
【００９０】
一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、（ｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列またはアミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸付加のうち一つもしくは複数から選択される１０個以下の総アミノ酸変異を有する配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、（ｉｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列またはアミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸付加のうち一つもしくは複数から選択される１０個以下の総アミノ酸変異を有する配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列とを含む。
【００９１】
一部の実施形態では、本抗体または抗体形式は、配列番号７および／または配列番号８と少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９２】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるような抗体または抗体断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むベクターが提供され、一部の実施形態では、ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００９３】
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体のいずれかの抗体または抗体形式と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００９４】
一部の態様では、本開示は、ヘテロ二量体抗体を生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）ヘテロ二量体誘発性立体構造抗原を用いて対象（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、またはハムスター）を免疫すること、（ｂ）ヘテロ二量体誘発性抗原を認識するＩｇＧを産生する脾臓Ｂ細胞を対象から単離すること、（ｃ）陰性選択用磁気カラムに脾臓Ｂ細胞を通すことであって、陰性選択用磁気カラムが、ヘテロ二量体の一方のモノマーを含有する組換え融合タンパク質により被覆されていること、（ｄ）陰性選択用磁気カラムから脾臓Ｂ細胞のフロースルーを採集して、陽性選択用磁気カラムにそのフロースルーを通すことであって、陽性選択用磁気カラムが、ヘテロ二量体抗原により被覆されていること、（ｅ）陽性選択用磁気カラムに結合された脾臓Ｂ細胞を溶出し採集すること、（ｆ）採集された細胞をＢ細胞培地中で培養すること、ならびに（ｇ）培養細胞からヘテロ二量体特異的抗体を単離し、それによってヘテロ二量体抗体を生成することを含む。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗原は、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのものである。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗原は、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのものである。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗原は、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのものである。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗原は、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つとのものである。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗原は、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つとのものである。一部の実施形態では、ヘテロ二量体のうちの一方のモノマーは、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＢＣＬＸＬ、ＢＣＬＷ、およびＭＣＬ１から選択される。一部の実施形態では、ヘテロ二量体のうちの一方のモノマーは、ＭＣＬ１である。一部の実施形態では、ヘテロ二量体のうちの一方のモノマーは、ＢＩＭである。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つから選択される。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つから選択される。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つから選択される。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つから選択される。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つから選択される。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＢＣＬＸＬ、ＢＣＬＷ、およびＭＣＬ１から選択される。
【００９５】
本開示の一つまたは複数の例の詳細は、下記の説明に記載されている。本開示の他の特徴または利点は、以下の図面、いくつかの例の詳細な説明から、また添付の特許請求の範囲から、明らかになるものとなる。本開示の詳細は、下記の添付の説明に記載されている。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本開示の実践または試験に使用することができるが、ここでは例示的な方法および材料が説明されている。本開示の他の特徴、目的、および利点は、記載から、および特許請求の範囲から明らかになる。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形はまた、文脈が別段に明確に指示しない限り複数を含む。別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、ヘテロ二量体選択的なモノクローナル抗体を作製するためにどのように免疫原を使用しうるかを示す画像である。標的エピトープであるＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２タンパク質を用いた二量体化によって誘発されたマルチドメインのＢｃｌ−２タンパク質の構造変化がある。
【図２】図２は、免疫アッセイを介してＢｃｌ−２ヘテロ二量体に特異的な抗体をスクリーニングし選択するプロセスを図示する概略図である。ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡスクリーニングおよびカウンタースクリーニングを行い、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）に結合するＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体を選択した。左のパネルは、Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体に結合する抗体が陽性選択されていることを示す。このスクリーニングにより、選択的に結合する３９クローンを進めた。中間のパネルは、ヘテロ二量体Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍ  ＢＨ３へのｍＡｂ−ＨＳＢＸＢの選択的な結合を示す：すなわちＢｃｌ−ｘＬ−ＧＳＴであり、グルタチオン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合されたものである。Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドを添加して、または添加せず（右のパネル）、ＨＳＢＸＢ抗体を用いて複合体を検出した。これらの実験では、ヘテロ二量体の非二量体化メンバーに結合する抗体が陰性選択された。
【図３】図３は、グルタチオン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合し、ＢＣＬ２／Ｂｃｌ−ｘＬを標的とする化合物であるＡＢＴ−２６３（ナビトクラクス）を用いて処理した、Ｂｃｌ−ｘＬ−ＧＳＴ／完全長ＢＩＭタンパク質を含む非共有ヘテロ二量体を示すグラフである。ペプチドの添加後、モノクローナル抗体を添加する前に、化合物をＥＬＩＳＡプレートに添加した。完全長Ｂｉｍタンパク質を用いてヘテロ二量体を形成した。
【図４Ａ】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光（ＩＦ）によるＢｃｌ−ＸＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体の検出を示し、ＥＬＩＳＡのＨＳＢＸＢシグナルがミトコンドリアのＢＨ３プロファイリングの読取りと相関することを実証している。図４Ａでは、細胞を氷上で３時間インキュベートし、次いで洗浄して、１０ｕｇ／ｍＬにてＨＳＢＸＢ抗体またはＢｃｌ−ｘＬ抗体と共に２０分間インキュベートし、次いで二次のＡｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗マウス抗体により染色した。シグナルを、ＩｇＧ−２Ａアイソタイプまたは二次のみの対照について補正した。各シリーズでは、左のバーはＨＳＢＸＢ抗体であり、右のバーはアイソタイプ対照である。図４Ｂでは、三つの細胞株のミトコンドリアプロファイリングにおけるＨｒｋ−ＢＨ３のシグナルを、正規化されたＨＳＢＸＢ  ＦＡＣＳシグナルに対してプロットした。図４Ｃは、ＲＩＰＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）により溶解された細胞から得られたＢｃｌ−ｘＬ−Ｂｉｍ複合体の抗Ｂｃｌ−ｘＬによる捕捉を示す。各シリーズについて、左のバーはＡＨＲ７７細胞株であり、右のバーはＭｏｌｍ−１３細胞株である。次いで、捕捉された複合体をＨＳＢＸＢまたはＢｃｌ−ｘＬによりプロービングした。図４Ｄでは、ＳＫＢＲ３細胞を２％のＰＦＡ中に固定し、ＨＳＢＸＢ（マゼンタ）とＢｃｌ−ｘＬ（Ａｌｅｘａ  ４８８）により染色した。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図５−１】図５は、モノクローナル抗体のクローニング工程、ＨＳＢＸＢ抗体を生産するために用いる発現ベクター、クローニング戦略、重鎖可変領域（配列番号７）および軽鎖可変領域（配列番号８）のアミノ酸配列、ならびに重鎖可変領域および軽鎖可変領域（強調表示された灰色部分）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す画像である。
【図５−２】同上。
【図６】図６は、固定した細胞上で本開示に記載された抗体を用いて生成された免疫蛍光シグナルを示す。免疫蛍光顕微鏡を使用して、固定および／またはアーカイブされた腫瘍試料で使用可能なバイオマーカーとしてのＨＳＢＸＢ（例えば、ＨＳＢＸＢクローン３２）の有用性を確認した。黒色腫ＡＵＣＣ９０３Ｎ細胞を固定し、透過処理し、ＨＳＢＸＢ抗体と共にインキュベートした。次いで、黒色腫細胞で、Ｂｃｌ−ｘｌ−Ｂｉｍヘテロ二量体（緑色で示す）および核（ＤＡＰＩ；青色で示す）を染色した。固定は４％のパラホルムアルデヒドを使用して行い、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ１００緩衝液により透過処理を行った。これらのデータは、Ｂｃｌ−ｘｌ−Ｂｉｍヘテロ二量体が予想通りにミトコンドリアに存在することを示す。重要なことに、このデータは、ヘテロ二量体抗体を使用して、接着試料におけるプライミングを特定し、結果に基づき治療的介入を方向付けることができることを確定するものである。
【図７Ａ】図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃは、固定した細胞上で本開示に記載される抗体を使用することによって生成されたヒト腫瘍生検シグナルの免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を示す。固定は４％のパラホルムアルデヒドを使用して行い、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ１００緩衝液により透過処理を行った。免疫蛍光顕微鏡を使用して、固定およびアーカイブされた腫瘍試料で使用可能なバイオマーカーとしてのＨＳＢＸＢの有用性を確認した。黒色腫ＡＵＣＣ９０３Ｎ細胞を固定し、透過処理し、ＨＳＢＸＢ抗体と共にインキュベートした（図７）。図７Ａは、ＨＢＳＸＢクローン３２（４０×倍率）を使用した、患者２１の乳房切片００４０−３上でのＩＨＣ染色を示す。図７Ｂは、対照抗体（４０×倍率）を使用した、患者２１の乳房切片００４０−３でのＩＨＣ染色を示す。図７Ｃは、ＨＢＳＸＢクローン３２（４０×倍率）を使用した、患者１４の乳房切片００２０−３でのＩＨＣ染色を示す。これらのデータは、Ｂｃｌ−ｘｌ−Ｂｉｍヘテロ二量体を使用して、接着試料におけるプライミングを特定し、結果に基づき治療的介入を方向付けることができることを示す。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図８】図８は、がん細胞で検出されたＨＳＢＸＢヘテロ二量体シグナルをＢｃｌ−ｘＬ選択的ＢＨ３模倣体（Ａ１１５５４６３）がどのようにシフトさせるかを示す、二つのグラフからなる。各シリーズについて、左のバーはＨＳＢＸＢシグナルであり、右のバーは総Ｂｃｌ−ｘＬである。データはまた、準致死用量のＡ１１５５４６３で処理された細胞が１６時間後にシグナルを失うことを示している（下のグラフ）。グラフのｘ軸上の「Ｉ／Ｃ」という用語は、「アイソタイプ対照」を指し、グラフのｘ軸上の「ＣＣ」という用語は、未染色または「清浄な対照」を指す。フローサイトメトリーを使用してシグナルを検出した。
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、生検採取されたＡＭＬ芽球細胞のＢｃｌ−ｘＬ特異的なＨｒｋペプチドの読取りを用いたＢＨ３プロファイリングに対する、ＨＳＢＸＢ／総Ｂｃｌ−ｘＬシグナルのベンチマーキングを示す。図９Ａでは、ＡＭＬ患者試料をＢＨ３プロファイリングに供した。芽球細胞集団は、Ｈｒｋプライミング（Ｂｃｌ−ｘＬに選択的なＨｒｋ  ＢＨ３ペプチドに対する応答）を示した。並行して、ＡＭＬ患者試料を固定し、ＦＩＴＣ標識ＨＳＢＨＢ抗体およびＣｙ５標識Ｂｃｌ−ｘＬ抗体により染色した。芽球細胞をゲートしたシグナルをフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）上で解析した。ＨＳＢＸＢ／総Ｂｃｌ−ｘＬの比率を算出し、ＢＨ３プロファイル済み試料から得られたＨｒｋ読取り値と比較した。図９Ｂでは、ＨＳＢＸＢにより検出されたヘテロ二量体／総Ｂｃｌ−ｘＬのシグナルの比率を、図９Ａに記載されるＡＭＬ患者試料由来のＨｒｋペプチド生成シグナルに対してプロットした。
【図９Ｂ】同上。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃは、全ての試料（図１０Ａ）、骨髄（図１０Ｂ）、および末梢血（図１０Ｃ）についての状況依存的な読取りを示す。図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃでは、ＮＯＸＡ％プライミング（ｙ軸）はＭｃｌ−１依存性を標示する。骨髄のＮＯＸＡのプライミングは臨床応答（ＣＲ）と極めて関連しているのに対し、末梢血由来の試料はＣＲと関連しない。各グラフのｘ軸上で、ＮＲは「非応答者」を標示する。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、ＦＬＡＭ感受性に関連する末梢血（ＰＢ）または骨髄（ＢＭ）における状況特異的なＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ依存性を示す。図１１Ａでは、ＦＬＡＭ  ｔｘ応答は、ＢＭにおけるＮｏｘａ＋Ｂａｄプライミングに正に相関する（ｐ値＝０．０４９）。図１１Ｂでは、ＦＬＡＭ  ｔｘ応答は、Ｎｏｘａ＋Ｂａｄプライミングに負に相関し、ＰＢの依存性が明らかになった（ｐ値＝０．０００５）。図１１Ｃでは、ＢＭにおけるＮｏｘａ／Ｂａｄプライミング比率で、さらに高い相関関係が観察された（６倍差、ｐ値＝０．００２）。
【図１２】図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃは、ＨＳＢＸＢ抗体がＨＲＫおよび患者応答にどのように相関するかを示すグラフである。図１２Ａでは、ＨＳＢＸＢ／Ｂｃｌ−ｘＬシグナルの比率は、ＡＭＬ患者試料におけるＨＲＫプライミングに相関した（ｐ値＝０．０１０５）。図１２Ｂでは、ＨＳＢＸＢ／Ｂｃｌ−ｘＬシグナルの比率は、ＣＬＬ患者試料におけるＨＲＫプライミングに相関した（ｐ値＝０．０００３）。図１２Ｃでは、この患者群のＨＲＫシグナルによる前処理は、アルボシジブの応答と相関していた。図１２Ｃのｘ軸上で、「ＰＲ」は「部分応答」を指し、「ＰＤ」は進行性疾患を指す。
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂは、Ｂｃｌ−ＸＬ／ＢＩＭ−ＢＨ３ヘテロ二量体に対するＨＳＢＸＢ抗体の選択的な結合を示すグラフである。図１３Ａでは、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質をＥＬＩＳＡプレートに結合した。Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドを添加して、または添加せずに、ＨＳＢＸＢ抗体を用いて複合体を検出した。図１３Ｂでは、Ｂｃｌ−ｘＬ−ＧＳＴ／ＢＩＭ  ＢＨ３ヘテロ二量体をグルタチオン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合し、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラクス）により処理し、ＨＳＢＸＢシグナルを検出した。
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、Ａ−１１５５４６３により処理したときに、Ｂｃｌ−ｘＬ選択的なＢＨ３模倣体に応答して、ＨＳＢＸＢシグナルがシフトすることを示すグラフである。図１４Ａでは、異所性Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｉｍ（ＳＥＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ−Ｂｉｍ［ｒｅｆ］）を過剰発現するヒトの精嚢内皮細胞を、透過処理細胞にて、標示された濃度でＡ−１１５５４６３により２時間処理し、固定し、次いで、ＩｇＧ−２Ａアイソタイプに修正されたＨＳＢＸＢまたはＢｃｌ−ｘＬの抗体を用いて固定した。シグナル（ｙ軸）の比率を、フローサイトメトリーにより収集した。図１４Ｂでは、無傷のＳＥＶ−Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍ細胞を、図１４ＡのようにＡ−１１５５４６３により１６時間処理し、固定し、染色した。ＨＳＢＸＢとＢｃｌ−ｘＬのシグナルの比率を、以下に示すようなパーセンテージとして計算した。
【数３】
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図１４Ｃでは、ＳＫＢＲ３細胞を、ＭＥＫ阻害剤であるセルメテニブ（ｓｅｌｕｍｅｔｅｎｉｂ）のある場合またはない場合で、Ａ−１１５５４６３により処理した。
【図１５】図１５Ａ、図１５Ｂおよび図１５Ｃは、ＡＭＬ患者試料におけるＨＲＫとＨＳＢＸＢ／ＢＣＬＸＬとの対比のパーセントの相関を示すグラフである。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、乳がん（ＢＣ）細胞におけるＡ１３３１８５２に対する薬物応答を示すグラフである。
【図１７】図１７は、未処理の乳がん（ＢＣ）細胞におけるＨＳＢＸＢとＢＣＬ−ＸＬとの対比のＩＦ染色を示す。
【図１８】図１８は、二つのパネルからなり、左のパネルは、ＨＣＣ１９３７細胞＋／−  Ａ１３３１８５２におけるＨＳＢＸＢおよびＢＣＬ−ＸＬのＩＦを示し、右のパネルは、ＨＣＣ１９３７細胞における阻害剤および対照のシグナル強度を示す。右のパネルでは、各シリーズについて、左のバーはＢＣＬ−ＸＬ（Ａ４６８）であり、右のバーはＨＳＢＸＢ（Ａ４６８）である。
【図１９】図１９は、ＨＣＣ１９３７細胞における、Ａ１３３１８５２に応答したＢｃｌ−ｘＬの局在の変化  を示すグラフである。ソフトウェアＺｅｎ  ２０１１（Ｂｌｕｅ  ｅｄｉｔｉｏｎ、カールツァイス）を使用して定量的解析を行った。各パネルについて、最も左側のバーはＭｉｔｏ−ＢＣＬ−ＸＬであり、次のバーはＭｉｔｏ−ＨＳＢＸＢであり、次のバーはＢｃｌ−ＸＬ−ＨＳＢＸＢであり、次のバーはＢｃｌ−ＸＬ−ＤＡＰＩであり、最も右側のバーはＨＳＢＸＢ−ＤＡＰＩである。
【図２０】図２０は、ＨＣＣ１９３７細胞におけるｓｉＲＮＡ−ＢＣＬ−ＸＬのノックダウンを示すグラフおよびゲル画像である。ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊを使用して、定量的解析を実施した。
【図２１】図２１は、乳がん細胞におけるＨＣＣ１９３７のＢｃｌ−ｘＬノックダウンを示すＩＦ画像である。
【図２２】図２２は、ｓｉＲＮＡ  ＢＣＬ−ＸＬ  ＨＣＣ１９３７細胞におけるシグナルの低減を示すグラフである。ソフトウェアＺｅｎ  ２０１１（Ｂｌｕｅ  ｅｄｉｔｉｏｎ、カールツァイス）を使用して定量的解析を行った。各シリーズについて、左のバーはＢＣＬ−ＸＬ（Ａ５６８）であり、右のバーはＡ４８８−ＨＳＢＸＢである。
【図２３】図２３は、ＳＶＥＣ野生型とＭｉｔｏ−プライミングされたＳＶＥＣとの対比を示すＩＦイメージである。
【図２４】図２４Ａは、野生型とＢＣＬ−ｘｌ−／−ＭＥＦ細胞との対比でのＢＣＬ−ＸＬ発現のイムノブロットである。図２４Ｂは、ＭＥＦ細胞におけるＢＣＬ−ＸＬ（赤色）およびＨＳＢＸＢ（緑色）のＩＦ染色である。図２４Ｃは、ＭＥＦ細胞におけるＩＦ染色のシグナル強度を示すグラフである。各シリーズについて、左のバーはＢＣＬ−ＸＬ（Ａ５６８）であり、右のバーはＡ４８８−ＨＳＢＸＢである。
【図２５】図２５は、ＭＥＦの野生型およびＢＣＬｘＬ−／−細胞におけるＨＳＢｘＢの免疫組織化学（ＩＨＣ）である。
【図２６】図２６は、ＨＣＣ１９３７乳がん細胞におけるＨＳＢｘＢのＩＨＣアッセイである。
【図２７】図２７は、ＭＥＦ野生型およびＢＣＬｘＬ−／−ＭＥＦ細胞におけるＢｃＬｘＬのＩＨＣアッセイである。
【図２８】図２８は、ＨＣＣ１９３７処理された乳がん細胞におけるＢｃｌｘＬのＩＨＣアッセイである。
【図２９Ａ】図２９Ａおよび図２９Ｂは、Ｂｃｌ−ＸＬ−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＨＣＣ１９３７細胞における、ＨＳＢＸＢ（図２９Ａ）およびＢＣＬ−ＸＬ  ＩＨＣ（図２９Ｂ）のシグナル強度の低減を示すグラフである。ソフトウェアＡｐｅｒｉｏソフトウェアを使用して、定量的解析を実施した。
【図２９Ｂ】同上。
【図３０】図３０は、野生型ＭＥＦおよびＢＣＬ−ＸＬ−／−細胞におけるＨＳＢｘＢ／ＢｃｌｘＬを示すＩＨＣアッセイである。
【図３１】図３１は、未処理（左）、Ａ−１３３１８５２処理（中央）、およびｓｉＲＮＡ−Ｂｃｌ−ｘＬ処理（右）のＨＣＣ１９３７ヒト乳がん細胞を使用したＨＳＢｘＢ／ＢＣＬｘＬを示すＩＨＣアッセイである。デジタル画像をＡｐｅｒｉｏ  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ  ＸＴによって取得し、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓアルゴリズムパッケージを用いて画像を解析し、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ解析ソフトウェア（アペリオ・テクノロジーズ社）を適用してＩＨＣシグナル（茶色および青灰色）を定量化した。これらのアルゴリズムは、染色を分離するために色デコンボリューション法を使用しており、各染色は、単一染色切片を解析し、色相値および強度閾値を記録することによって、個別に較正された。アルゴリズムは、弱い（１＋）、中間（２＋）、および強い（３＋）陽性染色の割合を計算する。総陽性シグナルは、各試料中の弱い、中間の、および強い陽性染色の総数を表す。
【図３２】図３２は、ＳＶＥＣ  ＢＣＬ−ｘＬ：ＢＩＭ細胞におけるＨＳＢｘＢ／ＢＣＬｘＬ重複を示すＩＨＣアッセイである。
【図３３】図３３Ａ、図３３Ｂ、および図３３Ｃは、ＩＨＣを使用したＦＦＰＥ三重陰性乳がん切片へのＨＳＢＸＢの適用を示すＩＨＣアッセイである。図３３Ａでは、患者２１  ＨＢＳＸＢ  ４０×倍率。図３３Ｂでは、患者２１、対照抗体、４０ｘ倍率。図３３Ｃでは、患者１４、ＨＢＳＸＢ  ４０×倍率。
【図３４】図３４は、いくつかの組織由来がんを通じてＨＳＢＸＢ結合が実証されるものとして、ＩＨＣアッセイの広範な適用を示す表である。
【図３５Ａ】図３５Ａ、図３５Ｂ、および図３５Ｃは、１６時間のｚＶＡＤ＋Ａ１３３１８５２の処理を行った場合と行わなかった場合の、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）についての三重陰性乳がん細胞株ＨＣＣＣ１９３７におけるＨＳＢｘＢ／ＢＣＬｘＬ二重染色のＩＨＣの結果を示す。各シリーズについて、左のバーは陽性全体のＨＳＢＸＢの％であり、右のバーは陽性全体のＢＣＬ−ｘＬの％である。
【図３５Ｂ】同上。
【図３５Ｃ】同上。
【図３６】図３６は、ヘテロ二量体抗体を選択、単離、および精製するための方法の実験工程を示す概略図である。
【図３７】図３７は、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体へのＩｇＧクローンの選択的な結合を示すグラフである。グラフ全体にわたって増加する線は、ＭＣＬ−１−ＧＳＴ  ＢＩＭであり、グラフを通じて底部近くにある線は、ＭＣＬ−１−ＧＳＴである。
【図３８】図３８は、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体の形成に存在する修飾ＢＰＡ４ペプチドへの、ＩｇＧクローンの選択的な結合を示すグラフである。プレートをＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体、Ｍｃｌ−１モノマー、またはＢＰＡ４ペプチドのみのいずれかにより被覆した。グラフの上部に始まって、２．０の値に最も近い線は、非固定のＭｃｌ−１−ＧＳＴ−ＢＰＡ４試料であり、次の下の線は、固定化Ｍｃｌ−１−ＧＳＴ−ＢＰＡ４試料であり、次の線は、ＢＰＡ４のみの非固定の試料であり、次の二つの線は重なり合っており、それらはＢＩＭのない試料およびＢＰＡ４のみ固定された試料を指す。
【図３９】図３９は、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体の形成に存在する修飾ＢＰＡ４ペプチドへの、ＩｇＧクローンの選択的な結合を示すグラフである。プレートを、修飾ＢＰＡペプチドを伴うＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体、天然Ｂｉｍビオチン、または切頭型Ｂｉｍペプチドのいずれかで被覆した。グラフの上部から始まって、線は以下の順：ｂｐａ４、ｂｉｏ−ｂｉｍ、ｂｐａ１、およびｂｐａ２で現れ、ｂｈ３  ｂｉｍ、ｂｉｍなし、およびｂｐａ３に関連する線はそれぞれグラフの下部にある。
【図４０】図４０は、クローンＥ９０５およびＭｃｌ−１ポリクローナルウサギ抗体に特異的なＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体を示すＩＦ画像である。
【図４１】図４１は、クローンＥ９０５およびＭｃｌ−１ポリクローナルウサギ抗体に特異的なＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体を示すＩＦ画像である。
【図４２】図４２は、クローン１５Ｄ０２およびＭｃｌ−１ポリクローナルウサギ抗体に特異的なＭｃｌ−１モノマーを示すＩＦ画像である。
【図４３】図４３は、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体抗体（ＨＳＭＣＢ）がＢｉｍをｉｎ  ｓｉｔｕで結合する必要があることを示すＩＦ画像である。Ｂｉｍ  ｓｉＲＮＡをＭＣＦ−７（乳がん細胞）上で使用し、次いで細胞を固定し、抗ＢｉｍおよびＨＳＭＣＢ（Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体特異的ｍＡｂ）により染色した。Ｂｉｍを発現しない細胞は、赤色染色の欠如によって標示されているが（左の画像から２番目）、ＤＡＰＩおよびｍｉｔｏｖｉｅｗについては陽性であり、ＨＳＭＣＢにより染色されない。その他、Ｍｃｌ−１プライミングされた細胞において重ね合わされた視野（最も右側の画像）で予想されたように、ＢｉｍおよびＭｃｌ−１／Ｂｉｍ複合体は共局在する。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
本開示は、部分的には、例えばＢｃｌ−２ヘテロ二量体（例えば、Ｂｃｌ−ｘｌ／ＢＩＭ−ＢＨ３ヘテロ二量体）に特異的にそれぞれ結合するいくつかの抗体によって、患者ががん治療に感受性であるか否かを検出するための組成物および方法の発見に基づく。本開示はさらに、患者由来の固形腫瘍試料中の二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を検出して、参照値に対するヘテロ二量体の比率を決定するために有用な、組成物および方法を提供し、上記比率は、がん治療に対する患者の感受性を予測するものである。重要なことに、本方法は、直接的なシグナルに基づいてがん患者応答に関する情報を与え、機能的なものとは対照的である。
【００９８】
アポトーシスは、ミトコンドリアで収束する多数のシグナル伝達経路によって媒介されるプログラム細胞死のプロセスである。ミトコンドリアタンパク質の群、すなわち、Ｂ細胞白血病／リンパ腫−２（ＢＣＬ−２）タンパク質ファミリーは、このプロセスを調節する。より具体的には、アポトーシス促進性のおよび抗アポトーシス性のＢＣＬ−２タンパク質は、ＢＣＬ−２タンパク質を調節するその同系物（すなわち、ＢＨ３−ｏｎｌｙ  ＢＣＬ−２タンパク質）と共にヘテロ二量体を形成し、それによって細胞死または生存シグナルをもたらす。
【００９９】
アポトーシスの特徴の一つは、ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）であり、これはＢｃｌ−２タンパク質ファミリーによって調節されるプロセスである。このタンパク質ファミリーの活性は、リンパ球がんおよびいくつかの固形腫瘍がんの発症に連係しており、多くのがんにおいて化学療法に対する抵抗性の重要なメディエーターとなるものと考えられている。Ｂｃｌ−２タンパク質は、生存促進（抗アポトーシス）メンバーとアポトーシス促進メンバーとの間の別個のタンパク質−タンパク質相互作用によって調節される。これらの相互作用は、主にＢＨ３（Ｂｃｌ−２相同性ドメイン−３）媒介性結合を介して起こる。アポトーシス開始シグナル伝達は、ミトコンドリアの上流の大部分に起こり、短いＢＨ３−ｏｎｌｙのＢｃｌ−２ファミリーメンバーのミトコンドリアへの転位を引き起こし、その場合、それらのメンバーはＭＯＭＰを活性化または増感させる。アクチベーターＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質であるＢｉｍおよびＢｉｄは、エフェクターのアポトーシス促進タンパク質であるＢａｘおよびＢａｋに結合して直接的に活性化し、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリータンパク質であるＢｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬにも結合して阻害する。増感性ＢＨ３タンパク質、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｎｏｘａ、Ｈｒｋ、Ｂｍｆ、およびＰｕｍａは、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリータンパク質、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｃｌ−ｘＬにのみ結合し、それらの抗アポトーシス機能を遮断する。理論に拘束されることを望むものではないが、各増感性タンパク質は、固有の特異性プロファイルを有する。例えば、Ｎｏｘａ（ＡおよびＢ）は、高い親和性でＭｃｌ−１に結合し、Ｂａｄは、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２に結合するがＭｃｌ−１には弱く結合するに過ぎず、Ｐｕｍａは、三つ全ての標的に良好に結合する。これらのタンパク質の抗アポトーシス機能は、結合してヘテロ二量体を形成することによって、アクチベーターＢＨ３タンパク質ＢｉｍおよびＢｉｄを隔離することである。増感性ペプチドまたは処理によってこれらのアクチベーターが転置する結果、Ｂａｘ／Ｂａｋ媒介性アポトーシスの関与が生じる。これらの相互作用は、ホメオスタシス、細胞死、アポトーシスへの増感、アポトーシスの遮断を含めて様々なアウトカムを生じうる。
【０１００】
最も有効ながん薬剤は、標的がん細胞にアポトーシスを誘導する。しかし、現在のがん治療における一つの重大な欠陥は、異なるがん細胞が様々な様式でアポトーシス誘導性薬剤に応答する可能性があることである。これは、部分的には、それらのがん細胞におけるアポトーシス促進／抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質と調節性ＢＨ３−ｏｎｌｙ  ＢＣＬ−２タンパク質との間の各種ヘテロ二量体の存在に起因する。
【０１０１】
一部の態様では、本開示は、がん治療に対する患者の感受性を予測する方法を提供し、本方法は、二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を認識する抗体または抗体形式に試料を接触させることであって、試料が患者の固形腫瘍由来の標本であること；ヘテロ二量体の量を標示するシグナルを検出すること；ならびに参照値に対する試料中に存在するヘテロ二量体に基づき比率を決定することであって、参照値が試料中のヘテロ二量体のＢＣＬ−２タンパク質モノマーのうちの一方の量を含み、上記比率ががん治療に対する患者の感受性を予測するものであることを含む。
【０１０２】
別の態様では、本開示は、がん治療に対する患者の感受性を予測する方法を提供し、本方法は、二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を認識する抗体または抗体形式、およびヘテロ二量体のＢＣＬ−２タンパク質モノマーのうちの一方を認識する抗体または抗体形式に試料を接触させることであって、試料が患者の固形腫瘍由来の標本であること；ヘテロ二量体の量およびモノマーの量を標示するシグナルを検出すること；ならびにモノマーの量に対するヘテロ二量体の量に基づき比率を決定することであって、上記比率ががん治療に対する固形腫瘍患者の感受性を予測するものであることを含む。
【０１０３】
がん、Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体、Ｂｃｌ−２タンパク質、およびＢｃｌ−２ヘテロ二量体に結合する抗体
【０１０４】
本開示は、アポトーシスを受けるためのがん細胞の素因を決定することを用いて、特定の治療に対するがんの罹患性を明らかにする。これを行うことのできる一つの方法は、アポトーシスを調節するＢｃｌ−２ヘテロ二量体に結合する開示抗体を使用することによるものである。ヘテロ二量体の形成は、ヘテロ二量体の両方のメンバーに立体構造の変化を誘発し、その結果、二量体化前の両方のメンバーに隔離された抗原性エピトープの曝露を生じる。本開示の単離された抗体は、そのようなエピトープを特異的に認識し、Ｂｃｌ−２ファミリーのヘテロ二量体にのみ結合し、非二量体メンバーのいずれにも結合しない。
【０１０５】
本開示の一つの態様は、Ｂｃｌ−２ファミリーのヘテロ二量体（すなわち、Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体）に特異的に結合する単離された抗体を特徴とする。Ｂｃｌ−２ファミリーは、Ｂｃｌ−２タンパク質（モノマー）と、二つのＢｃｌ−２タンパク質の間に形成された天然に存在するヘテロ二量体との両方を含む。ヘテロ二量体は、第１のＢｃｌ−２タンパク質（例えば、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂａｋ、Ｈｒｋ、Ｂａｘ、またはＭｕｌｅ）と第２のＢｃｌ−２タンパク質（例えば、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｆｌ−１、またはＢｃｌ−ｗ）とを含有する。一部の実施形態では、ＢＣＬ−２タンパク質は、アクチベーターＢＨ３タンパク質であり、アクチベーターＢＨ３タンパク質は、ＢＩＤおよびＢＩＭから選択される。一部の実施形態では、ＢＣＬ−２タンパク質は、増感性ＢＨ３タンパク質である。増感性ＢＨ３タンパク質は、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＨＲＫ、ＢＭＦ、およびＰＵＭＡから選択される。一部の実施形態では、ＢＣＬ−２タンパク質は、マルチドメインのアポトーシス促進タンパク質であり、マルチドメインのアポトーシス促進タンパク質は、ＢＡＸおよびＢＡＫから選択される。一部の実施形態では、ＢＣＬ−２タンパク質は、マルチドメインの抗アポトーシスタンパク質であり、マルチドメインの抗アポトーシスタンパク質は、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−Ｗ、およびＢＦＬ−１から選択される。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含む。
【０１０６】
本開示の方法はまた、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。ヘテロ二量体は、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含みうる。本方法はまた、ＢＣＬＸＬ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらしうる。ヘテロ二量体は、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとを含むことがある。一部の実施形態では、本方法は、ＢＣＬＷ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。ヘテロ二量体は、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つとを含みうる。一部の実施形態では、本方法は、ＭＣＬ１、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つとを含む。一部の実施形態では、本方法は、ＢＦＬ１、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡモノマーのうちの一つに対するヘテロ二量体の比率をもたらす。
【０１０７】
本開示の方法はまた、ＢＣＬ２と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する抗体または抗体形式を提供する。一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＢＣＬＸＬと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＨＲＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＢＣＬＷと、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＭＣＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ、およびＢＭＦのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、ＢＦＬ１と、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ  Ａ、ＮＯＸＡ  Ｂ、およびＰＵＭＡのうちの一つとのヘテロ二量体を認識する。
【０１０８】
本開示の組成物は、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１配列がＧＨＴＦＴＥＨＹＩＮ（配列番号１）であり、前記重鎖ＣＤＲ２配列がＷＩＦＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）であり、重鎖ＣＤＲ３配列がＳＹＳＮＦＷＦＡＹ（配列番号３）である、重鎖可変領域と；（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、軽鎖ＣＤＲ１配列がＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号４）であり、軽鎖ＣＤＲ２  配列がＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号５）であり、軽鎖ＣＤＲ３  配列がＱＱＳＮＳＷＰＴＴ（配列番号６）である、軽鎖可変領域とを含む、抗体または抗体形式を含む。抗体または抗体形式は、（ｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列または総計１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列または総計１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列とを含みうる。本抗体または抗体形式は、配列番号７および／または配列番号８と少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【０１０９】
Ｂｃｌ−２タンパク質は、ミトコンドリアに存在し、プログラム細胞死および死／生存シグナルの実行因子への関与の主要な調節因子である。（例えば、Ｒｅｅｄ，Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：３８８−３９８（２００６），Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １：１９−３０（２００２），ａｎｄ  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７０：４６９−４７７（２００５）を参照）。四つのＢｃｌ−２タンパク質のサブグループがある：（ｉ）マルチドメインの抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質、（ｉｉ）マルチドメインのアポトーシス促進Ｂｃｌ−２タンパク質、（ｉｉｉ）アクチベーターＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２タンパク質、および（ｉｖ）増感性ＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２タンパク質。下記の表１は、主要なヒトＢｃｌ−２タンパク質およびそれらのＧｅｎＢａｎｋ受入番号を挙げている。
【表１】
2021512288.tif 000006
【０１１０】
他のＢｃｌ−２タンパク質は、もしあれば、既知のＢｃｌ−２タンパク質のアミノ酸配列をクエリとして用いて、相同性検索によって特定することができる。
【０１１１】
ポリペプチドは、ＢＨ３ドメインとの相同性に基づいて特定することができ、表１に開示されたポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列相同性を有しうる。好適なバリアントは、一つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基に施された保存的アミノ酸置換を有するものである。例えば、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられたものである。さらに別の実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは、アポトーシスのアクチベーターまたは増感物質である。好ましい実施形態では、ＢＨ３ドメインペプチドは増感物質である。
【０１１２】
一実施形態では、ヘテロ二量体は、Ｂｃｌ−２ファミリーの異なるメンバーを含む。別の実施形態では、Ｂｃｌ−２ファミリーのヘテロ二量体は、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂａｋ、Ｈｒｋ、Ｂａｘ、Ｂｍｆ、およびＭｕｌｅからなる群から選択されるＢｃｌ−２ファミリーの第１のメンバーと、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｆｌ−１、およびＢｃｌ−ｗからなる群から選択されるＢｃｌ−２ファミリーの第２のメンバーとを含有する。別の実施形態では、Ｂｃｌ−２ファミリーの第１のメンバーはＢｉｍであり、Ｂｃｌ−２ファミリーの第２のメンバーはＭｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、またはＢｃｌ−２である。一実施形態では、ヘテロ二量体は、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＢｉｍを含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢｉｍおよびＭｃｌ−１を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢｉｍおよびＢｃｌ−２を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＢｉｄおよびＢｃｌ−２を含む。
【０１１３】
細胞が薬物誘導性アポトーシスを経るように予め設定されている（例えば、細胞が生存のためのＢｃｌ−２ポリペプチド活性に依存する）場合に、本開示の抗体は、アポトーシスの遮断に関与する特定のＢｃｌ−２タンパク質を識別するために使用することができる。
【０１１４】
Ｂｃｌ−２タンパク質の一つのサブグループのメンバーは、アポトーシスを調節する異なるサブグループのメンバーと共にヘテロ二量体を形成することが知られている。図１に示されるように、ヘテロ二量体の形成は、ヘテロ二量体の両方のメンバーに立体構造の変化を誘発し、その結果、二量体化前の両方のメンバーに隔離されている抗原性エピトープの曝露を生じる。本開示の単離された抗体は、そのようなエピトープを特異的に認識する（例えば、図１に示される矢印のエピトープ）。換言すれば、本明細書に開示される抗体は、Ｂｃｌ−２ファミリーのヘテロ二量体に特異的に結合することができる。
【０１１５】
端的には、理論に拘束されることを望むものではないが、異常な表現型の結果として、がん細胞はアポトーシス経路に遮断を発生させる。これらの遮断は、いくつかの治療に対して抵抗性のあるがん細胞を作り出し、驚くべきことに、他の療法に感受性のあるがん細胞をいくらか作り出す。「癌遺伝子の嗜癖（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）」の概念は、生存のための特定のタンパク質に対する、がん細胞の獲得依存性または嗜癖を説明するものである。がん細胞は、必ずという訳ではないが、アポトーシスを経るように予め設定されることがあり、これは、そうでない場合の意図されない生存のための任意または全ての抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリータンパク質にこれらの細胞が依存することに応じたものである。これにより、がん細胞が治療に応答する可能性について洞察が得られる。
【０１１６】
理論に拘束されることを望むものではないが、がん細胞は、ＤＮＡ損傷、遺伝的不安定性、異常な成長因子シグナル伝達、およびマトリクス相互作用の異常または欠失などの異常を呈し、それらのいずれかは、典型的には、本来備わった（ミトコンドリアの）アポトーシス経路を介してアポトーシスを誘発するべきものである。しかし、これらのアポトーシスシグナルに応答するどころか、がん細胞は生存する。その際に、これらの細胞は、しばしば、慢性的なアポトーシスシグナルに対する選択された遮断に高く依存するものとなってゆく。この適応によって、がん細胞の生存機構がもたらされるが、これらの適応はまた、特定のアポトーシス誘発療法に対して影響を受けやすいがん細胞を生じることがある。本来備わったアポトーシスによる細胞を死滅させる非常に重要な事象は、ミトコンドリア外膜の透過化（ＭＯＭＰ）、およびエフェクターカスパーゼを活性化する分子の放出である。多くの場合、ＭＯＭＰは、本来備わったアポトーシス経路では元に戻せない。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、ＭＯＭＰの重要な調節因子であり、それらの活性は、リンパ球がんおよびいくつかの固形腫瘍がんの発症に連係しており、多くのがんにおいて化学療法に対する抵抗性の重要なメディエーターとなるものと考えられている。
【０１１７】
Ｂｃｌ−２タンパク質は、生存促進（抗アポトーシス）メンバーとアポトーシス促進メンバーとの間の別個のタンパク質−タンパク質相互作用によって調節される。これらの相互作用は、主にＢＨ３（Ｂｃｌ−２相同性ドメイン−３）媒介性結合を介して起こる。アポトーシス開始シグナル伝達は、ミトコンドリアの上流の大部分に起こり、短いＢＨ３−ｏｎｌｙのＢｃｌ−２ファミリーメンバーのミトコンドリアへの転位を引き起こし、その場合、それらのメンバーはＭＯＭＰを活性化または増感させる。アクチベーターＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質であるＢｉｍおよびＢｉｄは、エフェクターのアポトーシス促進タンパク質であるＢａｘおよびＢａｋに結合して直接的に活性化し、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリータンパク質であるＢｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｘＬにも結合して阻害する。増感性ＢＨ３タンパク質、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｎｏｘａ、Ｈｒｋ、Ｂｍｆ、およびＰｕｍａは、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリータンパク質、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｃｌ−ｘＬにのみ結合し、それらの抗アポトーシス機能を遮断する。理論に拘束されることを望むものではないが、各増感性タンパク質は、固有の特異性プロファイルを有する。例えば、Ｎｏｘａ（ＡおよびＢ）は、高い親和性でＭｃｌ−１に結合し、Ｂａｄは、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２に結合するがＭｃｌ−１には弱く結合するに過ぎず、Ｐｕｍａは、三つ全ての標的に良好に結合する。これらのタンパク質の抗アポトーシス機能は、アクチベーターＢＨ３タンパク質ＢｉｍおよびＢｉｄを隔離することである。増感性ペプチドによってこれらのアクチベーターが転置する結果、Ｂａｘ／Ｂａｋ媒介性アポトーシスの関与が生じる。これらの相互作用は、ホメオスタシス、細胞死、アポトーシスへの増感、アポトーシスの遮断を含めて様々なアウトカムを生じうる。
【０１１８】
アポトーシスシグナル伝達が遮断されるがん細胞の規定された特徴は、ミトコンドリア表面にＢＨ３−ｏｎｌｙアクチベータータンパク質が蓄積することであり、結果としてこれらのタンパク質は、抗アポトーシスタンパク質によって隔離される。この蓄積とエフェクター標的タンパク質への近さは、「ＢＨ３プライミングされた」状態におけるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の拮抗作用に対する感受性の増加の原因である。
【０１１９】
一部の実施形態では、Ｎｏｘａ（ＡまたはＢ）に対し高いアポトーシス応答を生じる細胞は、Ｍｃｌ−１によりプライミングされるのに対し、ペプチドＢａｄに対する高い応答は、Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−２がアポトーシスの遮断をもたらすことを標示する。一部の実施形態では、Ｐｕｍａは、ｐａｎ−Ｂｃｌ−２ファミリーのプライミングを反映する。このように、Ｍｃｌ−１とＢｃｌ−ｘＬのどちらかに、両方のタンパク質に、またはいくつかのＢｃｌ−２ファミリーメンバーのどちらかに依存する細胞は、容易に区別され、それゆえに、それに応じて適切な治療が調整されうる。これらのペプチドに対するミトコンドリア応答の区別により、Ｍｃｌ−１とＢｃｌ−ｘＬとのどちらかに影響される内因性シグナル伝達へと注ぎ込む経路を介して作用することが知られている療法の使用を手引きする。Ｂｃｌ−２阻害化合物またはＭｃｌ−１阻害化合物の使用が、そのような場合に標示されうる。一部の実施形態では、本方法はまた、Ｍｃｌ−１またはＢｃｌ−ｘＬの上流のエンティティを標的とする療法の適応性または禁忌を示す。
【０１２０】
抗体の生成および産生
本開示の抗体は、抗原結合活性を保持する免疫グロブリン全体またはその断片とすることができる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、ｓｃＦｖ抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体を含めた、遺伝子改変免疫グロブリンとすることができる。一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および抗体の抗原結合部分を含む融合タンパク質のうち一つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、抗体または抗体形式は、式（ＦＷ１）−（ＣＤＲ１）−（ＦＷ２）−（ＣＤＲ２）−（ＦＷ３）−（ＣＤＲ３）−（ＦＷ４）に従ってＣＤＲ間に並置された可変領域フレームワーク（ＦＷ）配列をさらに含み、重鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列は、重鎖可変領域ＦＷ配列であり、軽鎖可変領域の可変領域ＦＷ配列は、軽鎖可変領域ＦＷ配列である。一部の実施形態では、可変領域ＦＷ配列はヒトである。抗体または抗体形式は、ヒトの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含みうる。一部の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。本明細書で使用される際に、用語「単離された抗体」とは、天然に付随する分子、すなわち、抗体を含有する調製物の乾燥重量で最大２０％を占める天然に付随する分子を、実質的に含まない抗体を指す。
【０１２１】
本開示の抗体は、従来の方法によって調製されうる。（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）例えば、重要な結合モチーフの区画を別々に用いてヘテロ二量体タンパク質の二つのメンバーを生産した後、重要なエピトープを合成し、ヘテロ二量体の一方のメンバーの一部であるリガンドと、ヘテロ二量体の他方のメンバーの全長タンパク質である受容体とを誘導することによって、Ｂｃｌ−２ファミリーの合成ヘテロ二量体を調製してもよい。合成ヘテロ二量体の機能性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイを用いてチェックすることができる。決定されると、結合忠実性が合成ヘテロ二量体で維持され、次いで、リガンド部分が、いくつかの潜在的な芳香族アミノ酸のうちの一つの代わりにベンゾイルフェニルアラニン（アナスペック、フリーモント、カリフォルニア州、米国）を含有するように改変される。（図１、図２）各タンパク質断片は、上記に詳述されたように結合忠実性についてさらに試験することができる。選択されると、結合リガンドは、４５０ｎＭで最大８時間にわたるＵＶ光への活性化曝露への曝露によって共有結合することができる。次いで、合成ヘテロ二量体をＦＰＬＣによって精製し、マウス宿主への注射のための免疫原として使用することができる。
【０１２２】
ヘテロ二量体に結合する抗体を生産するために、ヘテロ二量体を、任意選択的に担体タンパク質（例えばＫＬＨ）に結合し、アジュバントと混合した後、宿主動物に注射してもよい。動物で産生された抗体は、次いで、ヘテロ二量体親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。一般的に採用される宿主動物としては、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットが挙げられる。様々なアジュバントが、免疫応答を増加させるために使用されうるが、そのようなアジュバントは、宿主の種に依存し、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、ＣｐＧ、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノールが挙げられる。有用なヒトアジュバントとしては、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルヴムが挙げられる。ポリクローナル抗体、すなわち、不均一な抗体分子の集団は、免疫した動物の血清中に存在する。
【０１２３】
モノクローナル抗体、すなわち、均一な抗体分子の集団は、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製される。（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，２９２；およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．））を参照）具体的には、モノクローナル抗体は、培養にて持続性のある細胞株による抗体分子の生産をもたらす任意の手法によって取得されうる。（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５；Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，２０２６、およびｔｈｅ  ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）を参照；またＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照）そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびその任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスでありうる。本開示のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養されうる。ｉｎ  ｖｉｖｏで高い力価のモノクローナル抗体を生成する能力によって、それは特に有用な生産方法となっている。
【０１２４】
さらに、「キメラ抗体」の生産について開発された手法を使用することができる。（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６０４；およびＴａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２を参照）キメラ抗体とは、異なる動物種に異なる部分が由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するものなどである。あるいは、単鎖抗体の生産について記載された手法（米国特許第４，９４６，７７８号および第４，７０４，６９２号）を、ｓｃＦｖ抗体のファージまたは酵母のライブラリーを生じるように適合させることができる。ｓｃＦｖ抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結することによって形成される。
【０１２５】
さらに、抗体断片が既知の手法によって生成され得る。例えば、そのような断片としては、以下に限定されないが、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）ｓｕｂ．２断片、およびＦ（ａｂ’）ｓｕｂ．２断片のジスルフィド架橋を低減することによって生成できるＦａｂ断片が挙げられる。抗体は、当技術分野に公知の方法によってヒト化することもできる。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体は、市販されているヒト化体（スコットジーン、スコットランド、およびオックスフォード・モレキュラー、パロアルト、カリフォルニア州）である。完全ヒト抗体、例えばトランスジェニック動物で発現されるものなどは、本開示の特徴である（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，１３；ならびに米国特許第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号を参照）。
【０１２６】
上述の方法のいずれかによって調製された抗体を、そのＢｃｌ−２ヘテロ二量体への結合について確認した。（すなわち、図３、図１３Ａ、図１３Ｂを参照）それらを陰性選択に供し、ヘテロ二量体の非二量体化メンバーにも結合したものを除外した。（図２）例えば、二つのメンバーのそれぞれ、すなわちモノマーＡおよびモノマーＢは、別個の蛍光色素、すなわち染料ｘおよび染料ｙそれぞれを用いて標識されうる。染料ｘおよびｙは、異なる最適な発光波長を有する。抗体を最初に標識モノマーＡ、標識モノマーＢ、またはＡ／Ｂヘテロ二量体（二重標識）と共に適切な時間の間インキュベートし、次いでＧａｍａＢｉｎｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅセファロースビーズによって捕捉した。抗体がどちらかのモノマーまたはヘテロ二量体に結合できたか否かを、捕捉された抗体から放出された蛍光シグナルに基づき決定した。ヘテロ二量体に結合しかつ非二量体メンバーのどちらにも結合しない抗体を選択した。（図２）
【０１２７】
本明細書に開示される抗体は、従来の方法、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって、対象（例えば患者）から得られた試料中、特に固定組織試料またはミトコンドリア画分中のＢｃｌ−２ヘテロ二量体の存在または不在を検出する方法で、使用することができる（図６）。例えば、様々なＢｃｌ−２ヘテロ二量体に特異的な複数の抗体を使用して、患者由来の複数の組織試料中のミトコンドリア外膜上の特定のＢｃｌ−２ヘテロ二量体の存在をプロファイリングしてもよい。様々な病期（例えば、悪性病変の段階）の組織を、同じ患者から採集することができる。ミトコンドリア画分を、これらの組織から、本開示の複数の抗体を用いて調製することができ、この画分を、Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体の存在／不在についてプロファイリングすることができる。
【０１２８】
また、本明細書に開示されるのは、特定のＢｃｌ−２ヘテロ二量体の形成に直接的または間接的に干渉する薬剤に対するヒト患者の応答性を、患者中のＢｃｌ−２ヘテロ二量体の存在に基づいて予測する方法である。
【０１２９】
Ｂｃｌ−２タンパク質は、異なるＢｃｌ−２サブグループのメンバー間のヘテロ二量体の形成を介して、アポトーシスの調節において必須の役割を果たすことがよく知られている。上記表１を参照されたい。アクチベーターＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２タンパク質（すなわち、ＢＩＤまたはＢＩＭ）は、マルチドメインのアポトーシス促進Ｂｃｌ−２タンパク質（すなわち、ＢＡＸまたはＢＡＫ）に結合し、細胞死を導くミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）を惹起する。マルチドメインの抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２またはＭｃｌ−１）は、ＢＡＸおよびＢＡＫに結合することができ、またＢＡＸまたはＢＡＫとの結合からアクチベーターＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質を隔てることもできる。そのため、ＭＯＭＰプロセスが阻害され、細胞の生存がもたらされる。マルチドメインの抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質の活性は、増感性ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質によって調節される。Ｂｃｌ−２タンパク質のこのサブグループは、抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質に結合し、ＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２タンパク質を転置させる結果それらが放出されてアポトーシス促進Ｂｃｌ−２タンパク質に結合し、それによりＭＯＭＰプロセスを惹起する、ということによってアポトーシスを促進する。端的に述べれば、二つのタイプのＢｃｌ−２ヘテロ二量体があり：すなわち（１）アクチベーターＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２タンパク質とマルチドメインのアポトーシス促進Ｂｃｌ−２タンパク質との間で、または増感性ＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２タンパク質とマルチドメインの抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質との間で形成される、アポトーシス促進Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体；および（２）マルチドメインの抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質とアクチベーターＢＨ３−ｏｎｌｙ  Ｂｃｌ−２タンパク質との間で、またはマルチドメインの抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質とマルチドメインのアポトーシス促進Ｂｃｌ−２タンパク質との間で形成される、抗アポトーシスＢｃｌ−２ヘテロ二量体がある。アポトーシス促進Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体の形成は、アポトーシスを促進するのに対し、抗アポトーシスヘテロ二量体の形成は、細胞の生存を促進する。
【０１３０】
対象（例えば患者）における特定のアポトーシス促進性または抗アポトーシス性のＢｃｌ−２ヘテロ二量体の存在は、特定のヘテロ二量体の形成を遮断しその機能を阻害する薬剤に対する患者の応答性を標示することが知られている。（例えば、Ｄｅｌｂｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｓｓｅｒ  Ａ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０１５  Ｊｕｌ；２２（７）：１０７１−８０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄ．２０１５．５０を参照）
【０１３１】
本開示の一部の実施形態では、上記薬剤は、その同族パートナーへの結合についてＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質に対して競合する、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の模倣体である。他の実施形態では、上記薬剤は、上流アポトーシス因子を標的とし、最終的にＢｃｌ−２ヘテロ二量体の形成を遮断する。
【０１３２】
数多くのがん薬剤が、抗アポトーシスＢｃｌ−２ヘテロ二量体の形成を遮断することによって、がん細胞にアポトーシスを誘発する。がん患者における特定の抗アポトーシスＢｃｌ−２ヘテロ二量体の存在は、この患者がこの抗アポトーシスＢｃｌ−２ヘテロ二量体の形成に干渉する薬剤に感受性であることを標示する。（Ｒｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０１；１，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１７を参照）。一方、アポトーシス阻害剤は、神経変性疾患または心血管疾患を治療するために使用することができ、これらの疾患の両方がアポトーシスを伴うものである。このコンテクストでは、神経変性疾患患者または心血管疾患患者の特定のアポトーシス促進Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体の存在は、例えば、このような患者が特定のアポトーシス促進Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体の形成を遮断するアポトーシス阻害剤に感受性であることを示す。
【０１３３】
一部の実施形態では、感受性は、（ａ）試料中のアポトーシスの存在、（ｂ）患者が抗アポトーシスＢｃｌ−２ヘテロ二量体の形成に干渉する薬剤に感受性であることを標示する、試料中の抗アポトーシスＢｃｌ−２ヘテロ二量体の存在、（ｃ）遺伝的なリスク要因、家族歴、個人歴、種および民族性、ある特定の組織の特徴、様々な良性の状態（例えば非増殖性の病変）、以前の胸部放射線照射、発癌物質への曝露などによって特徴付けられる。
【０１３４】
一部の実施形態では、本方法は、ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の機能的読取りを伴わない。一部の実施形態では、本方法は、細胞膜電位の色素ベースの検出を伴わない。
【０１３５】
例示的な臨床判断
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、診断、予後、および治療に対する応答を評価するために、患者由来の固形腫瘍試料の評価において有用である。様々な態様では、本開示は、固形腫瘍を評価することを含む。様々な実施形態では、評価は、診断、予後、および治療に対する応答から選択されうる。
【０１３６】
様々な態様では、本開示の方法を使用してがん患者を治療しうる。例えば、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性を予測するものである場合に、患者にがん治療を施すことをさらに含みうる。一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性を予測するものである場合に、がん治療の用量を低減して、もしくは頻度を少なくして、および／またはレジメンを短縮して、患者を治療することをさらに含みうる。一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性を予測するものである場合に、がん治療の用量を増加して、もしくは頻度を多くして、および／またはレジメンを延長して、患者を治療することをさらに含みうる。一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性の欠如を予測するものである場合に、患者に対するがん治療を保留することをさらに含みうる。一部の実施形態では、本方法は、上記比率ががん治療に対する感受性の欠如を予測するものである場合に、異なるがん治療を用いて患者を治療することをさらに含みうる。
【０１３７】
例えば、様々な実施形態では、試料は、モノマーよりも多くの二量体の比率を示す。例えば、二量体とモノマーとの比は、約２０：１、または約１５：１、または約１０：１、または約９：１、または約８：１、または約７：１、または約６：１、または約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１でありうる。様々な実施形態では、試料は、二量体よりも多くのモノマーの比率を示す。例えば、モノマーと二量体との比は、約２０：１、または約１５：１、または約１０：１、または約９：１、または約８：１、または約７：１、または約６：１、または約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１でありうる。様々な実施形態では、二量体とモノマーとの比は同等（すなわち約１：１）である。
【０１３８】
診断とは、例えばがんなどの可能性のある疾患または障害を決定または特定するプロセスを指す。予後とは、例えばがんなどの疾患または障害のあり得るアウトカムを予測することを指す。完全な予後は、多くの場合、予想される期間、機能、および疾患の経過の説明、例えば進行性の低下、間欠性の発作、または突然の予想外の発作などを含む。治療に対する応答とは、治療を受ける際の患者の医療アウトカムの予測である。治療に対する応答は、非限定的な例として、病理学的に完全な応答、生存、および無増悪生存期間、進行までの時間、ならびに再発の可能性であることがある。
【０１３９】
様々な実施形態では、本方法は、患者が特定の治療を受けるか否かに関する臨床判断を方向付ける。一実施形態では、本方法は、ネオアジュバントおよび／もしくはアジュバント化学療法に対する陽性応答の予測、またはネオアジュバントおよび／もしくはアジュバント化学療法に対する非応答性を予測するものである。一実施形態では、本方法は、アポトーシス促進剤、もしくはアポトーシスを介して動作する薬剤、および／もしくはアポトーシスを介して動作しない薬剤に対する陽性応答を、またはアポトーシスエフェクター剤、および／もしくはアポトーシスを介して動作しない薬剤に対する非応答性を、予測するものである。様々な実施形態では、本開示は、例えば、どのタイプの治療を投与または保留すべきかを含めて、がん患者の治療を方向付ける。
【０１４０】
一部の実施形態では、本方法は、抗がん剤、化学療法、抗アポトーシスタンパク質の拮抗剤、外科手術、アジュバント療法、およびネオアジュバント療法のうちの一つまたは複数に関するがん治療を方向付ける。
【０１４１】
一実施形態では、本方法は、患者が一次治療、主要治療、または初期治療の後にアジュバント療法を受けるか否かに関する臨床判断を方向付けるものであり、そのような療法としては、限定はないが単一の唯一つのアジュバント療法が挙げられる。アジュバント療法は、アジュバントケアとも呼ばれ、一次治療、主要治療、または初期治療に加えて与えられる治療である。非限定的な例として、アジュバント療法は、外科手術後に通常与えられる追加的な治療であることがあり、その外科手術では、検出可能な全ての疾患が除去されているが、潜在的な疾患により再発する統計的リスクが残っている。
【０１４２】
一部の実施形態では、本方法は、アジュバント療法を含めて患者の治療を方向付ける。例えば、特定の治療に応答するようにスコア付けされた患者は、そのような治療をアジュバント療法として受けることがある。さらに、本方法は、非限定的な例として、アポトーシス促進の様式で誘導および／もしくは動作する治療かまたはそうしないものとして、アジュバント療法のアイデンティティを方向付けることがある。一実施形態では、本方法は、患者が特定の治療に応答しないものとなるかまたはあまり応答しないものとなることを標示することがあり、それゆえに、そのような患者は、アジュバント療法としてそのような治療を受けないことがある。したがって、一部の実施形態では、本方法は、あり得る患者の応答に従ってアジュバント療法を提供または保留することを可能にする。このようにして、患者の生活の質およびケアコストが改善されうる。
【０１４３】
様々な実施形態では、本方法は、患者がネオアジュバント療法、例えば、外科手術前の腫瘍を縮小および／または低下させるための療法を受けるか否かに関する臨床判断を方向付ける。一部の実施形態では、ネオアジュバント療法は、外科手術前のがん患者に投与される化学療法を意味する。一部の実施形態では、ネオアジュバント療法は、本明細書に記載されるものを含めて、外科手術前にがん患者に投与される薬剤を意味する。ネオアジュバント化学療法が一般的に考慮されるがんの種類としては、例えば、乳房、結腸直腸、卵巣、子宮頸部、膀胱、および肺が挙げられる。
【０１４４】
一部の実施形態では、本方法は、ネオアジュバント療法を含めて患者の治療を方向付ける。例えば、特定の治療に応答するものとスコア付けされた患者は、そのような治療をネオアジュバント療法として受けることがある。さらに、本方法は、非限定的な例として、アポトーシス促進の様式で誘導および／もしくは動作する治療かまたはそうしないものとして、ネオアジュバント療法のアイデンティティを方向付けることがある。一実施形態では、本方法は、患者が特定の治療に応答しないものとなるかまたはあまり応答しないものとなることを標示することがあり、それゆえに、そのような患者は、ネオアジュバント療法としてそのような治療を受けないことがある。したがって、一部の実施形態では、本方法は、あり得る患者の応答に従ってネオアジュバント療法を提供または保留することを可能にする。このようにして、患者の生活の質およびケースのコストが改善されうる。
【０１４５】
一部の実施形態では、本方法は、患者が特定の種類の治療（例えば、抗がん剤、化学療法、抗アポトーシスタンパク質の拮抗剤、外科手術、アジュバント療法、およびネオアジュバント療法のうち一つまたは複数）を受けるか否かに関する臨床判断を方向付ける。一部の実施形態では、がん治療は、ＳＭＡＣ模倣体、ＢＨ３模倣体、プロテアソーム阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、グルココルチコイド、ステロイド、モノクローナル抗体、抗体薬物コンジュゲート、またはサリドマイド誘導体のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、本方法は、患者の治療のための手引きの試験である。
【０１４６】
一部の実施形態では、本方法はがん治療を含み、がん治療はチェックポイント阻害剤である。チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ４、ＧＩＴＲ、ガレクチン−９、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、およびＴＭＩＧＤ２のうちの一つを標的とする薬剤とすることができる。ＰＤ−１を標的とする薬剤は、ＰＤ−１に特異的な抗体または抗体形式とすることができ、任意選択的にニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブから選択される。ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体または抗体形式とすることができ、任意選択的にアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびＢＭＳ−９３６５５９から選択される。ＣＴＬＡ−４を標的とする薬剤は、ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体または抗体形式とすることができ、任意選択的にイピリムマブおよびトレメリムマブから選択される。
【０１４７】
一部の実施形態では、本方法は、患者が特定の治療に対して示す、あり得る応答についての情報を提供する。一部の実施形態では、本方法は、高い応答の可能性を示し、侵襲的な治療を含めて治療を方向付ける場合がある。一部の実施形態では、本方法は、低い応答の可能性を示し、生活の質をより良くするために効果のない化学療法による不必要な毒性を回避するべく、侵襲的な治療を含む治療の休止と緩和ケアとを方向付ける場合がある。
【０１４８】
例示的な実施形態では、本方法は、特定の治療への応答の可能性を標示するものとなる。例えば、一部の実施形態では、本方法は、アポトーシス促進剤、および／またはアポトーシスを介して動作する薬剤、および／または直接的なタンパク質の調節によって駆動されるアポトーシスを介して動作する薬剤に対する、高いまたは低い応答の可能性を標示する。様々な実施形態では、例示的なアポトーシス促進剤、および／またはアポトーシスを介して動作する薬剤、および／または直接的なタンパク質の調節によって駆動されるアポトーシスを介して動作する薬剤としては、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）、およびオバトクラックス、ＷＥＰ、ボルテゾミブ、およびカルフィルゾミブが挙げられる。一部の実施形態では、本方法は、アポトーシスを介して動作しない薬剤、および／または直接的なタンパク質の調節によって駆動されるアポトーシスを介して動作しない薬剤に対する、高いまたは低い応答の可能性を標示する。様々な実施形態では、アポトーシスを介して動作しない例示的な薬剤としては、キネシン紡錘体タンパク質阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、三酸化二ヒ素（トリセノックス）、ＭＥＫ阻害剤、ポマリドミド、アザシチジン、デシチビン（ｄｅｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ボリノスタット、エンチノスタット、ジナシクリブ、ゲムツズマブ、ＢＴＫ阻害剤、ＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤、レノリジミド（ｌｅｎｏｌｉｄｉｍｉｄｅ）、アントラサイクリン、シタラビン、メルファラム（ｍｅｌｐｈａｌａｍ）、Ａｋｙ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤が挙げられる。
【０１４９】
例示的な実施形態では、本方法は、アポトーシス促進剤かまたはがん治療のためにアポトーシスを介して動作する薬剤を患者が受けるか否かを標示するものとなる。別の例示的な実施形態では、本方法は、アポトーシスを介して動作されない薬剤を患者が受けることになるか否かを標示するものとなる。
【０１５０】
特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される治療（薬剤を含む）のいずれかに対するがん患者の応答を予測する際に有用である。
【０１５１】
様々な実施形態では、がん治療は、本明細書に記載される方法に基づいて投与されるかまたは保留される。例示的な治療としては、外科的切除、放射線療法（放射性増感剤としてまたはそれとの組合せでの本明細書に記載される化合物の使用を含む）、化学療法、薬力学療法、標的療法、免疫療法、および支持療法（例えば、鎮痛剤、利尿剤、抗利尿剤、抗ウイルス剤、抗生物剤、栄養補助剤、貧血治療薬、血液凝固治療薬、骨治療薬、および精神および心理治療薬）が挙げられる。
【０１５２】
例示的な治療
例示的な実施形態では、本開示は治療作因を選択する。そのような作因の例としては、以下に限定されないが、抗がん剤、化学療法、外科手術、アジュバント療法、およびネオアジュバント療法のうちの一つまたは複数が挙げられる。一実施形態では、がん治療は、ＢＨ３模倣体、エピジェネティクス修飾剤、トポイソメラーゼ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、およびキネシン紡錘体タンパク質安定化剤のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、ＢＨ３模倣体は、ＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３（ナビトクラクス）、Ｂｃｌ−２特異的なベネトクラクス（ベネクレクスタ、ＡＢＴ−１９９）、ＭＣＬ−１特異的なＳ６３８４５およびＡＭＧ１７６およびＡＤＺ５９９１、ＢＣＬ−ＸＬ特異的なＡ−１１５５４６３およびＡ１３３１８５２、ＢＦＬ−１／ＭＣＬ−１特異的なＥＵ５３４６、またはそれらの組み合わせから選択される。別の実施形態では、がん治療は、プロテアソーム阻害剤；ならびに／または細胞周期調節の調節因子（非限定的な例として、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤）；ならびに／または細胞のエピジェネティックな機構（非限定的な例として、一つもしくは複数のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）（例えば、ボリノスタットもしくはエンチノスタットのうち一つもしくは複数）、アザシチジン、デシタビン；ならびに／またはアントラサイクリンもしくはアントラセンジオン（非限定的な例として、エピルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシンのうち一つもしくは複数）；ならびに／または白金系治療剤（非限定的な例として、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンのうち一つもしくは複数）；シタラビンもしくはシタラビン系化学療法；ＢＨ３模倣体（非限定的な例として、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、もしくはＭＣＬ１のうち一つもしくは複数）；ならびにＭＣＬ１の阻害剤である。一部の実施形態では、がん治療は、検出された特定のヘテロ二量体の形成を遮断する。一部の実施形態では、がん治療は、検出された特定のヘテロ二量体の形成を攪乱する。
【０１５３】
様々な実施形態では、本開示はがん治療に関し、そのようなものとしては、限定はないが、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシトキサン・シクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）など；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなど；アルトレタミン、トリエチレンメタミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメナミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（例えば、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシンの合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体であるＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）；ダイネミシンＡを含む、ダイネミシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネートなど；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン・ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎剤、例えばミノグルテチミド（ｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン、トリロスタンなど；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル、アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサミトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体（ＪＨＳナチュラルプロダクツ、ユージーン、オレゴン州）；ラゾキサン；リゾキシン、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えばＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール・パクリタキセル（ブリストルマイヤーズ・スクイブ・オンコロジー、プリンストン、ニュージャージー州）、アブラキサン・クレモフォール不含、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（アメリカン・ファーマシューティカル・パートナーズ、シャウムベルク、１１１．）、およびタキソテール・ドクセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ローヌ−プーランク−ローラー、アントニー、フランス）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ジェムザール・ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン・ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵおよびロイコボリンを併用するイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン��など；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン、オキサリプラチン治療レジメン（フォルフォックス）を含む；ラパチニブ（タイケルブ）；細胞増殖を低減するＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えばエルロチニブ（タルセバ））、およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、ダコゲン、ベルケード、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、または誘導体のうち一つまたは複数が挙げられる。
【０１５４】
例示的な検出方法
様々な実施形態では、本方法は、がん治療に対する患者の感受性を予測することを含む。一部の実施形態では、ヘテロ二量体の検出は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリー、または免疫蛍光法を採用する。
【０１５５】
様々な実施形態では、本方法は、タンパク質および／または核酸の存在、不在、またはレベルを評価することを含む。様々な実施形態では、本方法は、ＢＨ３ヘテロ二量体比の特異性および／または感受性を高めることができるタンパク質および／または核酸の存在、不在、またはレベルを評価することを含む。一部の実施形態では、評価は、患者応答についてのマーカーである。一部の実施形態では、本方法は、免疫組織化学染色（すなわちＩＨＣ）、ウェスタンブロッティング、細胞ウェスタン、免疫蛍光染色、ＥＬＩＳＡ、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、または本明細書に記載もしくは当技術分野で公知の任意の他の方法のうち一つまたは複数を使用した測定を含む。本方法は、抗体を腫瘍標本（例えば、生検体、組織または体液）に接触させて、組織または体液に特異的であるかまたはがんの状態を標示するエピトープを特定することを含みうる。
【０１５６】
一般に、体液または組織における抗原上のエピトープの検出に使用される二つのストラテジー、すなわち直接的な方法および間接的な方法がある。直接的な方法は、一工程の染色を含み、体液または組織試料中の抗原に直接的に反応する標識抗体（例えば、ＦＩＴＣコンジュゲート抗血清）を含んでいてもよい。間接的な方法は、体液または組織抗原に反応する非標識一次抗体と、一次抗体に反応する標識二次抗体とを含む。標識としては、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素を挙げることができる。これらのアッセイを実施する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗら（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８８）、Ｈａｒｌｏｗら（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９９９）、Ｖｉｒｅｌｌａ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉｎｆｏｒｍａ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００７）、およびＤｉａｍａｎｄｉｓら（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）を参照されたい。これらのアッセイを実施するためのキットは、例えば、クロンテックラボラトリーズ社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）から市販されている。
【０１５７】
様々な実施形態では、抗体としては、抗体全体、および／または任意の抗原結合断片（例えば抗原結合部分）、および／またはこれらの単鎖（例えば、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖とを含む抗体、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された二つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片など）が挙げられる。様々な実施形態では、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、単離されたヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはその機能的断片であることから、有用である。
【０１５８】
様々な種の標的に向けた抗体の結合能力を評価する標準的なアッセイは、当技術分野に公知であり、そのようなものとしては例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、およびＲＩＡが挙げられる。抗体の結合カイネティクス（例えば結合親和性）も、Ｂｉａｃｏｒｅ解析などの当技術分野で公知の標準的なアッセイによって評価することができる。
【０１５９】
別の実施形態では、測定は、核酸の存在、不在、またはレベルを評価することを含む。当業者は、多くの方法を使用して適切なマーカーのＤＮＡ／ＲＮＡレベルを検出または定量化できることを理解するものとなる。
【０１６０】
遺伝子発現は、例えば、構成単位の少ないまたは中程度の手法を用いて測定することができ、そのようなものとしては、以下に限定されないが、レポーター遺伝子アッセイ、ノーザンブロット、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。遺伝子発現はまた、例えば構成単位の多い手法を用いて測定することができ、そのようなものとしては、以下に限定されないが、遺伝子発現の連鎖解析（ＳＡＧＥ）、ＤＮＡマイクロアレイ、タイリングアレイ、ＲＮＡ−Ｓｅｑ／全トランスクリプトームショットガンシーケンシング（ＷＴＳＳ）、ハイスループットシーケンシング、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存的プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、ライゲーションによるＤＮＡシーケンシング、およびＬｕｍｉｎｅｘ／ＸＭＡＰが挙げられる。当業者は、マイクロアレイなどのアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ（定量的ＰＣＲを含む）、ヌクレアーゼ保護アッセイ、およびノーザンブロット分析を含めた数多くの方法を用いて、試料内のバイオマーカーのＲＮＡ産物のレベルを検出または定量化できることを認識するものとなる。
【０１６１】
例示的ながんおよび患者
一部の実施形態では、本開示は、がん治療を決定するための方法を提供する、および／または患者の腫瘍もしくはがん細胞標本を含む。がんまたは腫瘍は、細胞の制御不能な増殖および／または細胞の生存の異常な増加および／またはアポトーシスの阻害を指し、これらは身体の器官およびシステムの正常な機能に干渉する。がんまたは腫瘍を有する対象は、対象の体内に客観的に測定可能ながん細胞が存在する対象である。本開示に含まれるのは、良性および悪性のがん、ならびに休眠腫瘍または微小転移である。元の場所から移動して生命に関わる器官に播種するがんは、罹患した器官の機能劣化を経て、遂には対象の死をもたらすことがある。
【０１６２】
様々な実施形態では、本開示は、前転移性がんまたは転移性がんに適用可能である。転移とは、その主要部位から体内の他の場所へのがんの拡散を指す。がん細胞は、原発腫瘍から離れ、リンパ管および血管内に浸透し、血流を通じて循環し、体内のいずれかの場所において正常組織で遠位巣に成長（転移）しうる。転移は局所的または遠位でありうる。転移は、原発腫瘍から切り離され、血流を通じて移動し、遠位で停止する、腫瘍細胞に付随する連続的なプロセスである。新しい部位で、細胞は、血液の供給を確立し、成長して生命を脅かす質量塊を形成しうる。腫瘍細胞内の刺激性分子経路および抑制性分子経路の両方がこの挙動を調節し、また、遠位の腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用も重要である。転移は、多くの場合、具体的な症状のモニタリングに加えて、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、血球および血小板の数、肝機能試験、胸部Ｘ線、および骨スキャンを、単独でまたは組み合わせて使用することを介して検出される。
【０１６３】
本明細書に記載される方法は、がんの予後、がんの診断、がんの治療、ならびに／または悪性腫瘍および細胞生存の増加もしくはアポトーシスの阻害に関連する増殖性障害の成長、進行、および／または転移の診断、予後、治療、予防、または寛解に向けられる。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり、以下に限定されないが、非小細胞肺がん、卵巣がん、および黒色腫を含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、試料は患者の浸潤性リンパ球である。
【０１６５】
一部の実施形態では、固形腫瘍は、肺がん、乳がん、前立腺がん、黒色腫、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、および卵巣がんから選択される。一部の実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）から選択される。一部の実施形態では、乳がんは三重陰性乳がんである。一部の実施形態では、前立腺がんはアンドロゲン非依存性前立腺がんである。
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示は、以下のがんのうち一つまたは複数に関する：副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫（例えば、小児の小脳または大脳）、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳幹神経膠腫、脳がん、脳腫瘍（例えば、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視覚路および視床下部の神経膠腫）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、胆嚢がん、胃（胃）がん、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫（例えば、脳幹、大脳星状細胞腫、視覚路および視床下部）、胃カルチノイド、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、下咽頭がん、視床下部および視覚路の神経膠腫、眼内黒色腫、島細胞癌（膵島）、腎がん（腎細胞がん）、喉頭がん、唇および口腔のがん、脂肪肉腫、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞、小細胞）、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性扁平上皮頸部がん、口がん、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄増殖性障害、慢性、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵臓がん、副鼻腔および鼻腔のがん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体の星状細胞腫および／または胚細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽細胞腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌（腎がん）、腎盂および尿管、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫（例えば、ユーイングファミリー、カポジ、柔組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚がん（例えば、非黒色腫、黒色腫、メルケル細胞）、小細胞肺がん、小腸がん、柔組織肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮頸部がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、咽頭がんｍ、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂のがん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、視覚路および視床下部の神経膠腫、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍。
【０１６７】
別段に定義のない限り本明細書で使用される場合、対象という用語は、哺乳類であり、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類、例えばサル、チンパンジー、またはヒヒなどである。用語「対象」および「患者」は互換的に使用される。
【０１６８】
例示的な標本
一部の実施形態では、本開示は、生検体または外科手術標本試料を含む腫瘍標本の測定を含む。一部の実施形態では、標本は、凍結腫瘍組織標本、培養細胞、循環腫瘍細胞、およびホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織標本から選択される。一部の実施形態では、生検体はヒト生検体である。様々な実施形態では、生検体は、凍結腫瘍組織標本、培養細胞、循環腫瘍細胞、およびホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織標本のうちいずれか一つである。
【０１６９】
一部の実施形態では、試料は、腫瘍生検体、組織生検体、腫瘍切除物、凍結腫瘍組織標本、リンパ節、骨髄細胞、循環腫瘍細胞、培養細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織標本、気管支肺胞洗浄物、皮膚、髪、尿、およびこれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、腫瘍生検体は、コア生検体、針生検体、外科手術生検体、および切除生検体から選択される。
【０１７０】
一部の実施形態では、腫瘍標本は、凍結腫瘍組織（凍結切片）標本などの生検試料であってもよい。当技術分野で知られているように、凍結切片は、マイクロトームを冷凍庫内に含むクライオスタットを利用することがある。外科手術標本は、金属組織ディスク上に置かれ、次いでチャックに固定され、速やかに約−２０℃から約−３０℃に凍結される。標本は、例えばポリエチレングリコールおよびポリビニルアルコールからなる、ゲル様媒体に包埋される。凍結組織は、クライオスタットのマイクロトーム部分を用いて凍結切削され、切片は、任意選択的にガラススライド上に取り上げられて染色される。
【０１７１】
一部の実施形態では、腫瘍標本は、培養細胞などの生検試料であってもよい。これらの細胞は、当技術分野で公知の通常の細胞培養手法を用いて処理されうる。これらの細胞は循環腫瘍細胞であってもよい。
【０１７２】
一部の実施形態では、腫瘍標本は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織標本などの生検試料であることがある。当技術分野に公知であるように、生検標本は、ホルマリン（水とホルムアルデヒドの混合物）またはそれを保持するための他の流体を含む容器内に置かれてもよい。組織試料は、ホットパラフィンワックスと共に型内に置かれる。ワックスは冷却されて、組織を保護する固体ブロックを形成する。包埋組織を用いたこのパラフィンワックスブロックは、組織の非常に薄い切片を切るマイクロトーム上に置かれる。
【０１７３】
特定の実施形態では、腫瘍標本（または生検体）は、１００ｍｇ未満の組織を含有するか、または特定の実施形態では、約５０ｍｇ以下の組織を含有する。腫瘍標本（または生検体）は、約２０ｍｇから約５０ｍｇまでの組織、例えば約３５ｍｇの組織などを含有しうる。
【０１７４】
組織は、例えば、一つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個）の針生検体（例えば、１４ゲージ針またはその他の適切なサイズを使用して）として取得されうる。一部の実施形態では、生検は穿刺吸引であり、その場合、疑いのある領域に長く鋭い針を挿入し、シリンジを用いて流体および細胞を分析用に抜き取る。一部の実施形態では、生検はコア針生検であり、その場合、先切りチップを付けた大きな針をコア針生検中に用いて、疑いのある領域から組織の柱を抜き取る。一部の実施形態では、生検は真空支援生検であり、その場合、吸引デバイスは、針を通して抽出される流体および細胞の量を増加させる。一部の実施形態では、生検は画像誘導生検であり、その場合、針生検は、例えばＸ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）、または超音波などの撮像手法と組み合わされる。他の実施形態では、試料は、乳房生検用の真空支援生検システムであるＭＡＭＭＯＴＯＭＥ（登録商標）生検システムなどのデバイスを介して取得されうる。
【０１７５】
特定の実施形態では、標本はヒト腫瘍由来細胞株である。特定の実施形態では、標本はがん幹細胞である。他の実施形態では、標本は、固形腫瘍の生検、例えば、結腸直腸、乳房、前立腺、肺、膵臓、腎臓、または卵巣の原発腫瘍の生検などに由来する。
【０１７６】
特定の実施形態では、標本は上皮系起源である。一部の実施形態では、上皮系標本は、固体マトリクスまたはビーズに結合した抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）または他の上皮細胞結合抗体を用いて生検試料から選択することによって濃縮される。
【０１７７】
特定の実施形態では、標本は間葉系起源である。一部の実施形態では、間葉系標本は、固体マトリクスまたはビーズに結合した神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）またはニューロピリンまたは他の間葉細胞結合抗体を用いて生検試料から選択することによって濃縮される。
【０１７８】
一部の実施形態では、標本は循環腫瘍細胞に由来する。
【０１７９】
例示的な臨床因子および追加的なバイオマーカー
一部の実施形態では、本開示は、患者の一つまたは複数の臨床因子を決定することを含む。本開示はさらに、患者由来の固形腫瘍試料中の二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を検出して、ヘテロ二量体の比率および／または臨床応答を決定して、がん治療に対する患者の応答を評価するかまたは患者の感受性を予測することを含みうる。一部の実施形態では、臨床因子は、患者の一つまたは複数の臨床因子に基づいて、がん治療への臨床応答の可能性について患者をさらに分類することを含む。一部の実施形態では、臨床因子は、患者の一つまたは複数の臨床因子に基づいて、がん治療に対する患者の感受性の予測を、がん治療に対する臨床応答の可能性と比較することをさらに含む。一部の実施形態では、患者の応答情報を比率試験と組み合わせて提供する臨床因子は、アポトーシスに連係していない場合がある。一部の実施形態では、臨床因子は、非アポトーシス的に影響を及ぼす。
【０１８０】
一部の実施形態では、臨床因子は、年齢、細胞遺伝学的状態、遂行能力、組織学的サブクラス、性別、および病期のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、臨床因子は、変異状態、一塩基多型、定常状態タンパク質レベル、および動的タンパク質レベルから選択される追加的なバイオマーカーを測定することをさらに含む。
【０１８１】
一実施形態では、臨床因子は年齢である。一実施形態では、患者の年齢のプロファイルは、約１０歳を超えるか、または約２０歳を超えるか、または約３０歳を超えるか、または約４０歳を超えるか、または約５０歳を超えるか、または約６０歳を超えるか、または約７０歳以上を超えるか、または約８０歳を超えるものとして分類される。
【０１８２】
一実施形態では、臨床因子は細胞遺伝学的状態である。例えば、ウィルムス腫瘍および網膜芽細胞腫などの一部のがんでは、腫瘍抑制因子に関連する染色体領域が一般に削除または変異していることから、遺伝子欠失または不活化は、がんの進行の開始に関与する。例えば、欠失、反転および転位は、一般に非小細胞肺がん、白血病、および黒色腫において染色体領域９ｐ２１に検出される。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの染色体の変化は、腫瘍抑制性サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａを不活化することがある。特定の遺伝子のこれらの欠失と併せて、染色体の大部分も失われる場合がある。例えば、染色体１ｐおよび１６ｑは、一般に固形腫瘍細胞で失われている。遺伝子重複および遺伝子コピー数の増加もがんに寄与することがあり、転写解析またはコピー数変動アレイを用いて検出することができる。例えば、染色体領域１２ｑ１３〜ｑ１４は、多くの肉腫で増幅されている。この染色体領域は、ＭＤＭ２とよばれる結合タンパク質をコードし、ＭＤＭ２は、ｐ５３とよばれる腫瘍抑制因子に結合することが知られている。ＭＤＭ２が増幅されると、ｐ５３が細胞成長を調節することが妨げられ、その結果、腫瘍形成を生じることがある。さらに、ある特定の乳がんは過剰発現に関連しており、ヒト上皮成長因子受容体２をコードするＥＲＢＢ２遺伝子のコピー数が増加する。また、染色体１ｑおよび３ｑなどの染色体の数の上昇も、がんリスクの増加と関連する。
【０１８３】
細胞遺伝学的状態は、当技術分野で公知の様々な様式で測定することができる。例えば、ＦＩＳＨ、古典的な核型分析、および仮想核型分析（例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ、ＣＧＨ、および一塩基多型アレイ）を使用してもよい。例えば、ＦＩＳＨが、特定の座位での染色体再編成を評価するために用いられることがあり、これらの現象は、疾患リスク状態に関連する。一部の実施形態では、細胞遺伝学的状態が好ましいか、中間的あるか、または好ましくない。
【０１８４】
一実施形態では、臨床因子は遂行能力である。遂行能力の状態は、任意のシステムを用いて定量化することができ、患者の遂行能力の状態をスコアリングするための方法は、当技術分野に公知である。この測定は、多くの場合、患者が化学療法を受けることができるか否か、用量調整の調整を決定するために、および対症ケアの強度を決定するために、使用される。カルノフスキースコアおよびズブロッドスコアを含む様々なスコアリングシステムがある。並行スコアリングシステムとしては、精神医学の診断および統計マニュアル（ＤＳＭ）の第５の軸として組み込まれている、機能の全体的評定（ＧＡＦ）スコアが挙げられる。高い遂行能力ステータス（例えば、カルノフスキースコアリングシステムを用いて、少なくとも８０％または少なくとも７０％）は、疾患状態の進行を防ぎ、患者の化学療法および／または放射線治療を受け入れる能力を増強するための、治療を標示することがある。例えば、これらの実施形態では、患者は外来であり、自己ケアが可能である。他の実施形態では、評価は、従来の放射線療法および／または化学療法に認容性のあるものとするように、遂行能力の状態の低い患者を標示する（例えば、カルノフスキーのスコアリングシステムを用いて５０％未満、３０％未満、または２０％未満）。これらの実施形態では、患者は、主にベッドまたは椅子に拘束され、自己ケアさえできない。
【０１８５】
カルノフスキースコアは１００から０で運用され、１００が「完璧な」健康状態であり、０は死亡である。スコアは間隔１０で採用されうる：１００％は正常であり、愁訴がなく、疾患の徴候がない；９０％は通常の活動が可能であり、疾患の症状または徴候が殆どなく、８０％はいくらかの困難を伴いながら通常の活動性であり、いくらかの症状または徴候がある；７０％は自分の世話をし、通常の活動または作業をできない；６０％はいくらかの助けを必要とし、殆どの個人的な要求に対処することができる；５０％は多くの場合に助けを必要とし、頻回の医療的なケアを必要とする；４０％は身体障害があり、特別なケアと助けを必要とする；３０％は重度に身体障害があり、入院適応となるが死亡のリスクはない；２０％は極めて病的にあり、緊急に入院を必要とし、支持的手段または治療を必要とする；そして１０％は瀕死にあり、速やかに進行する致死的な疾患の過程にある。
【０１８６】
遂行能力の状態のためのズブロッドスコアリングシステムは以下を含む：０は、完全に活動的であり、制限なく罹患前の全ての遂行能力を実行することができる；１は、物理的に激しい活動を制限されるが、外来であり、軽度のまたは坐位の性質の作業、例えば、軽度の家事、事務作業を行うことができる；２は、外来であり、全ての自己ケアを行うことができるが、覚醒時間の最大５０％でまたは約５０％を超えて任意の作業活動を行うことができない；３は、限られた自己ケアのみ行うことができ、覚醒時間の５０％超をベッドまたは椅子に拘束される；４は、完全に身体障害があり、自己ケアを何も行うことができず、総じてベッドまたは椅子に拘束される；５は死亡である。
【０１８７】
一実施形態では、臨床因子は組織学的サブクラスである。一部の実施形態では、腫瘍の組織学的試料は、Ｅｌｓｔｏｎ＆Ｅｌｌｉｓ，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９１，１９：４０３−１０に従って等級分けされ、その内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１８８】
一実施形態では、臨床因子は性別である。一実施形態では、性別は雄である。別の実施形態では、性別は女性である。
【０１８９】
一実施形態では、臨床因子は病期である。非限定的な例として、全体的な段階のグループ化を用いると、ステージＩのがんは身体の一部に局在化し、ステージＩＩのがんは局所的に進行し、ステージＩＩＩのがんも同様である。がんがステージＩＩまたはステージＩＩＩとして指定されるか否かは、がんの具体的なタイプに依存しうる。非限定的な一例としてホジキン病では、ステージＩＩは、横隔膜の片側のみのリンパ節の罹患を標示するのに対し、ステージＩＩＩは、横隔膜の上方および下方のリンパ節の罹患を標示する。したがって、ステージＩＩおよびＩＩＩの具体的な基準は、診断に従って異なる。ステージＩＶのがんは、多くの場合、他の器官にまたは身体全体にわたって、転移しているかまたは広がっている。
【０１９０】
別の実施形態では、本方法は、変異状態、一塩基多型、定常状態タンパク質レベル、および動的タンパク質レベルから選択される追加的なバイオマーカーの測定をさらに含む。別の実施形態では、本方法は、患者における臨床応答を予測することをさらに含む。別の実施形態では、臨床応答は、約１年、約２年、約３年、または約５年の進行／無イベント生存を含まない。
【０１９１】
年齢のプロファイルおよび遂行能力の状態など、様々な臨床因子が特定されている。細胞遺伝学的または分子的な事象など、数多くの診断の静的測定も利用されており、そのようなものとしては、限定はないが、遺伝子ＭＬＬ、ＡＭＬ／ＥＴＯ、Ｆｌｔ３−ＩＴＤ、ＮＰＭ１（ＮＰＭｃ＋）、ＣＥＢＰα、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＲＵＮＸ１、ｒａｓ、およびＷＴ１内、ならびにエピジェネティック修飾遺伝子ＴＥＴ２およびＡＳＸＬ内の変異、ならびに細胞シグナル伝達タンパク質プロファイルの変化が挙げられる。
【０１９２】
一部の実施形態では、予防方法は、本明細書に記載される方法によって手引きされるような、がんに罹患している可能性が高い患者に治療を施すことを含む。一部の実施形態では、がんについての高いリスク、がんに対する遺伝子的素因（例えば、遺伝的リスク要因）、以前のガンの発症（例えば、新しいがんおよび／または再発）、がんの家族歴、がん誘発作因への曝露（例えば、環境的な作因）、および薬理ゲノム学的情報（治療の薬物動態、薬力学、または有効性プロファイルに及ぼされる遺伝子型の影響）のうち一つまたは複数を有するという特徴が対象にある場合に、対象はがんを患う可能性がある。
【０１９３】
一部の実施形態では、対象ががんのリスクが高いという特徴を有する場合に、対象はがんを患う可能性が高い。一部の実施形態では、対象ががんに対する遺伝的素因という特徴を有する場合に、対象はがんを患う可能性が高い。一部の実施形態では、がんに対する遺伝的素因は、当技術分野で知られているように、遺伝的臨床因子である。そのような臨床因子としては、例として、少なくとも結腸がん、子宮がん、小腸がん、胃がん、尿路がんについて、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２が挙げられうる。一部の実施形態では、対象が以前のがんの発症という特徴を有する場合に、対象はがんに罹患する可能性が高い。一部の実施形態では、対象は、１件、または２件、または３件、または４件、または５件、または６件の以前のがんの発症を患っている。一部の実施形態では、対象ががんの家族歴があるという特徴を有する場合に、対象はがんを患う可能性が高い。一部の実施形態では、親および／または祖父母および／または兄弟姉妹および／または叔母／叔父および／または大叔母／大叔父、および／または従兄弟従姉妹が、がんを患ってきたか、または患っている。一部の実施形態では、対象がガン誘導性作因（例えば、環境的作因）への曝露という特徴を有する場合、対象はがんを患う可能性が高い。例えば、強い太陽光への皮膚の曝露は、皮膚がんの臨床因子である。例として、喫煙は、肺、口、喉頭、膀胱、腎臓、およびいくつかの他の器官のがんの臨床因子である。
【０１９４】
さらに、一部の実施形態では、以下の臨床因子のいずれか一つは、本明細書に記載される方法では有用である：性別、遺伝的リスク因子、家族歴、個人歴、人種および民族、特定組織の特徴、様々な良性状態の特徴（例えば、非増殖病変）、以前の胸部放射線照射、発癌物質の曝露など。
【０１９５】
さらにまた、一部の実施形態では、以下の臨床因子のいずれか一つは、本明細書に記載される方法に有用となりうる：細胞表面マーカーＣＤ３３、細胞表面マーカーＣＤ３４、ＦＬＴ３変異状態、ｐ５３変異状態、ＭＥＫ−１キナーゼのリン酸化状態、およびＢｃｌ−２の７０位のセリンのリン酸化のうち一つまたは複数。
【０１９６】
一部の実施形態では、臨床因子は、サイトカインの発現レベルであり、サイトカインとしては、限定はないがインターロイキン−６が挙げられる。一部の実施形態では、インターロイキン−６のレベルは、患者の予後不良や患者の予後良好を含めた、ＭＭ患者における応答の可能性に相関するものとなる。
【０１９７】
一部の実施形態では、応答の可能性は、プライミングのパーセントを評価することによって決定される。特定の実施形態では、プライミングは以下の数式によって定義される：
【数４】
2021512288.tif 000007
式中、
上記ＡＵＣ（曲線下面積）は、均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）由来の平均シグナル強度によって確立された蛍光測定値の合計であり、上記シグナル強度は、プライミング開始後の約５分から約３００分の間に発生する単一の時点の測定値であり；
上記陰性対照は、曲線下面積またはシグナル強度のどちらかに対するベースライン陰性対照を含み；
上記陽性対照は、曲線下面積またはシグナル強度のどちらかに対するベースライン陽性対照を含み（例えば、任意の脱共役剤）；
上記ペプチドは、一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドであり、式中で（ｎ）は、陰性対照および陽性対照の反復の平均の数により正規化される。
【０１９８】
一部の実施形態では、先述の数式と組み合わせて、一つまたは複数の臨床因子が、臨床応答との関連付けのためにＢＨ３プロファイルの特異性および／または感受性を増加させるように選択される。
【０１９９】
一部の実施形態では、応答の可能性は、プライミングのパーセントを評価することによって決定される。特定の実施形態では、プライミングは以下の数式によって定義される：
【数５】
2021512288.tif 000008
式中、
上記ＡＵＣ（曲線下面積）は、均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）由来の平均シグナル強度によって確立された蛍光測定値の合計であり、上記シグナル強度は、プライミング開始後の約５分から約３００分の間に発生する単一の時点の測定値であり；
上記ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、曲線下面積またはシグナル強度のどちらかに対するベースライン陰性対照を含み；
上記ＣＣＣＰ（カルボニルシアニド  ｍ−クロロフェニルヒドラゾン）は、酸化的リン酸化の化学阻害剤であり、ミトコンドリアの電子伝達系内の電子担体の通常の活動の間に確立されたプロトン勾配の脱共役剤として役割を果たすことによるタンパク質合成のエフェクターを含み、上記ＣＣＣＰは、ベースライン陽性対照を含み；
上記ペプチドは、一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドであり、式中で（ｎ）は、ＤＭＳＯ対照およびＣＣＣＰ対照の反復の平均の数により正規化される。
【０２００】
一部の実施形態では、先述の数式と組み合わせて、一つまたは複数の臨床因子が、臨床応答との関連付けのためにＢＨ３プロファイルの特異性および／または感受性を増加させるように選択される。
【０２０１】
一部の実施形態では、臨床応答の可能性は、ここに示されるように先の数式の簡略化された形により定義され：
【数６】
2021512288.tif 000009
式中、
上記ＡＵＣ（曲線下面積）は、均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）由来の平均シグナル強度によって確立された蛍光測定値の合計であり、上記シグナル強度は、プライミング開始後の約５分から約３００分の間に発生する単一の時点の測定値であり；
上記ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、曲線下面積またはシグナル強度のどちらかに対するベースライン陰性対照を含み；
上記ＣＣＣＰ（カルボニルシアニド  ｍ−クロロフェニルヒドラゾン）は、酸化的リン酸化の化学阻害剤であり、ミトコンドリアの電子伝達系内の電子担体の通常の活動の間に確立されたプロトン勾配の脱共役剤として役割を果たすことによるタンパク質合成のエフェクターを含み、上記ＣＣＣＰは、ベースライン陽性対照を含み；
上記ペプチドは、一つまたは複数のＢＨ３ドメインペプチドであり、式中で（ｎ）は、ＤＭＳＯ対照およびＣＣＣＰ対照の反復の平均の数により正規化される。
【０２０２】
一部の実施形態では、先述の数式と組み合わせて、一つまたは複数の臨床因子が、臨床応答との関連付けのためにＢＨ３プロファイルの特異性および／または感受性を増加させるように選択される。
【０２０３】
一部の実施形態では、曲線下面積が、均質な時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）によって確立される。一部の実施形態では、時間は、約０と約３００分との間から約０から約３０分までの時間帯にわたって発生する。一部の実施形態では、曲線下面積は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって確立される。一部の実施形態では、シグナル強度は、約５分から約３００分の間に発生する単一の時点の測定値である。
【０２０４】
一部の実施形態では、本開示は、Ｍｃｌ−１／ＢｉｍまたはＢＣＬＸＬ／Ｂｉｍのヘテロ二量体の量を測定することを含む、試料中のチェックポイント阻害剤に対する患者の応答性を予測する方法を提供し、その場合、試料は、固形腫瘍由来の浸潤性リンパ球集団を含む。チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ４、ＧＩＴＲ、ガレクチン−９、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＩＣＯＳ、ＣＤ１７２ａ、およびＴＭＩＧＤ２のうちの一つを標的とする薬剤とすることができる。ＰＤ−１を標的とする薬剤は、ＰＤ−１に特異的な抗体または抗体形式とすることができ、任意選択的にニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブから選択される。ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体または抗体形式とすることができ、任意選択的にアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびＢＭＳ−９３６５５９から選択される。ＣＴＬＡ−４を標的とする薬剤は、ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体または抗体形式とすることができ、任意選択的にイピリムマブおよびトレメリムマブから選択される。
【０２０５】
一部の実施形態では、本開示は、抗体または抗体断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むベクターが提供され、一部の実施形態では、ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０２０６】
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体のいずれかの抗体または抗体形式と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【０２０７】
本開示はまた、腫瘍細胞またはがん細胞の標本の評価を簡略化できるキットを提供する。本開示の典型的なキットは、ヘテロ二量体を検出するために有用な、例えば、一つまたは複数の薬剤（例えば、本明細書に開示される抗体）を含む様々な試薬を含む。キットは、ウェルプレート、シリンジなどを含めて、評価に必要な材料をさらに含みうる。キットは、記載された試薬の使用を指示するラベルまたは印刷された指示をさらに含みうる。キットは、試験される治療をさらに含みうる。
【０２０８】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単数形は、便宜上、本出願全体を通じて使用されるが、文脈または明示的な記述が別段に示される場合を除いて、単数形は複数を含むように意図されていることが理解されるべきである。さらに、本明細書に言及される全ての雑誌記事、特許、特許出願、刊行物などは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれることが理解されるべきである。数値範囲は全て、その数値範囲内のそれぞれのあらゆる数値点を含むものと理解されるべきであり、それぞれのあらゆる数値点を記載するものとして解釈されるべきである。同一の構成要素または特性を方向付ける全ての範囲の終点は包括的であり、独立して組み合わせることができることが意図されている。
【０２０９】
「約」は、参照値として実質的に同じ効果を有するかまたは実質的に同じ結果をもたらす全ての値を含む。このように、用語「約」によって包含される範囲は、その用語が使用される状況、例えば、参照値が関連付けられるパラメータに応じて異なるものとなる。したがって、文脈に応じて、「約」は、例えば±１５％、±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、または±１％未満を意味しうる。重要なことに、用語「約」によって前述された参照値のすべての記載はまた、参照値の記載に過ぎないことが意図されている。上述にもかかわらず、本願では、用語「約」は、曲線下面積（ＡＵＣ、ＡＵＣｔ、およびＡＵＣ∞を含む）、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘなどの薬物動態パラメータに関して特別な意味を有する。薬物動態パラメータの値と関係して使用される際に、用語「約」は、参照パラメータの８５％から１１５％までを意味する。
【０２１０】
本明細書で使用される際に、「含む」およびその変形の言葉は、列挙された項目の記載がこの技術の材料、組成、デバイス、および方法にも有用となりうる他の類似の項目の除外とはならないように、非限定的であることが意図される。同様に、用語「ｃａｎ」および「ｍａｙ」およびそれらの変形は、ある特定の要素または特徴を実施形態が含むことができるかまたは含んでいてもよいという記載が、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を除外しないように、非限定的であることが意図される。含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、有する（ｈａｖｉｎｇ）などの用語の同義語として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というオープン・エンドの用語が、本明細書で本開示を記載および請求するために使用されるが、本技術またはその実施形態は、代替的に、記載された成分の「から成る」または「から本質的に成る」などのより限定的な用語を用いて記載されることがある。
【０２１１】
別段に定義されない限り、本明細書のすべての技術用語および科学用語は、本開示の属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実践または試験に使用することができるが、好適な方法および材料が本明細書に記載される。引用された全ての刊行物、特許、および特許公開物は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１２】
本開示は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【０２１３】
実施例１：Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体に特異的なモノクローナル抗体の調製
ヒトＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、およびＭｃｌ−２をコードする遺伝子をクローニングし、それらの膜貫通ドメインを削除するよう変異させた。次いで、変異遺伝子を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするヌクレオチド配列に連結し、ｐＧＥＸ  ４Ｔ−１にクローニングして、Ｂｃｌ−ｘＬ（Δ）−ＧＳＴ、Ｂｃｌ−２（Δ）−ＧＳＴ、およびＭｃｌ−２（Δ）−ＧＳＴ融合タンパク質を発現するためのＤＮＡ構築物を得た。全てＧＳＴに融合した全長のヒトＢａｘ、Ｂａｋ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｐｕｍａ、およびＮｏｘａを発現するためのＤＮＡ構築物を、組換え技術によって調製した。
【０２１４】
全てのＤＮＡ構築物を、ＢＬ２１（Ｄ３）化学的受容性大腸菌細胞に導入した。陽性形質転換体を適切な培地で培養し、融合タンパク質の発現をイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドにより誘導した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｉｔｒａｐ  ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅカラムをＡＣＴＡ−ＦＰＬＣ（アマルシャム）上で使用して、発現した融合タンパク質を精製し、分光光度法により正確に定量した。
【０２１５】
次いで、Ｂｃｌ−ｘＬ（Δ）−ＧＳＴ、Ｂｃｌ−２（Δ）−ＧＳＴ、またはＭｃｌ−２（Δ）−ＧＳＴを、ＰＢＳ中、Ｂａｘ−ＧＳＴ、Ｂａｋ−ＧＳＴ、Ｂａｋ−ＧＳＴ、Ｂｉｍ−ＧＳＴ、Ｂｉｄ−ＧＳＴ、Ｂａｄ−ＧＳＴ、Ｐｕｍａ−ＧＳＴ、またはＮｏｘａ−ＧＳＴと等モル量で混合した。
【０２１６】
Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチド内の芳香族アミノ酸を、表２に記載されるようにＢＰＡにより誘導体化した。これらのペプチドのそれぞれを、結合親和性について、Ｒｉｃｈａｒｄ、Ｄ．Ｊ．；ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）のような蛍光偏向法を用いて試験した。
【表２】
2021512288.tif 000010
【０２１７】
次いで、選択されたペプチドを、ＵＶ光（４５０ｎＭ）に室温で８時間曝露することによって、精製ＧＳＴ抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリー融合タンパク質に結合した。Ｚｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１−７８８（２００７）に記載された方法に従って、セファロース１２カラム（ファルマシア）をＡＣＴＡ−ＦＰＬＣ（アマルシャム）上で用いて、ヘテロ二量体を精製した。
【０２１８】
次いで、各ヘテロ二量体（２．ｍｇ）を、モノホスホリル脂質Ａ・プラス・トレハロースジコリノミコレートアジュバント（リビイムノケムリサーチ社、ハミルトン、モンタナ州）に懸濁した。次いで、形成された混合物をＢａｌｂ／ｃマウスに、３〜４日ごとに１回を１４回、各後足肉趾で注射した。最後の注射の３日後、脾臓細胞をマウスから摘出し、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地（ギブコ／ＢＲＬ社）中で、単細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞を、３５％ポリエチレングリコールを使用してマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９７）と融合し、９６ウェル培養プレート中で培養した。
【０２１９】
１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、および１６μＭチミジン（ＨＡＴ）（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）を含有するスーパーＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清ＦＣＳ、１００ｍＭピルビン酸塩、１００Ｕ／ｍＬインスリン、１００ｍＭオキサロ酢酸、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）中で、ハイブリドーマを選択した。
【０２２０】
ハイブリドーマ細胞に、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を含有する２００μＬのスーパーＤＭＥＭを与えた。融合の１０日後、ハイブリドーマ培養物の上清を採集し、Ｃｅｒｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．，９（５）：３５１−３６５（２００６）に記載された捕捉ＥＬＩＳＡにおいて、同族のヘテロ二量体タンパク質に結合したおよび／またはヘテロ二量体（陰性対照として）のどちらかのメンバーに結合した抗体の存在についてスクリーニングした。
【０２２１】
簡潔に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ヌンク、カムストルプ、デンマーク）を５０μＬ（１μｇ／ｍＬ）のヘテロ二量体またはヘテロ二量体のメンバーにより、４℃で一晩被覆した。次いで、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）  ２０を含有するＰＢＳで、プレートを３回洗浄し、２．０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５０μＬのＰＢＳにより室温で１時間、ブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで再び３回洗浄した。その後、指定されたウェルに１００μＬのハイブリドーマ上清を添加した。プレートを攪拌装置上で１時間、室温でインキュベートし、次いで、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ中、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）  ２０、０．０１％チメルソール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ））中で１：１０００希釈した５０μＬのＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（カッペルラボラトリーズ）を、各ウェルに添加した。このプレートを、次いで、攪拌装置上、室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、５０μＬの基質ＤＡＣＯを添加して、室温で１０分間インキュベーションした。５０μＬのジエチルグリコールを各ウェルに添加して反応を停止し、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度をマイクロリットルプレートリーダーで読み取る。
【０２２２】
次いで、ヘテロ二量体に結合するがヘテロ二量体のいずれかのメンバーに結合しない抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した。これらの陽性ハイブリドーマ細胞を２回クローニングし、産生された抗体の特異性を再試験した。所望の特異性を有する抗体のアイソタイプを、従来の方法によって、例えば、アイソタイプ特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ（フィッシャーバイオテク、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）を用いて決定した。各抗血清中の抗体の特異性を従来の方法、例えば、下記の実施例４および実施例５に記載の免疫沈降およびＦＡＣＳアッセイによって調べた。
【０２２３】
実施例２：酵母ｓｃＦｖライブラリーを使用したＢｃｌ−２ヘテロ二量体に特異的なｓｃＦｖ抗体のスクリーニング
非免疫ヒトｓｃＦｖ酵母ライブラリー（発現ベクターｐＹＤ１を使用）を、太平洋北西部国立研究所から入手した。このライブラリーでは、可撓性のポリペプチドリンカーにより重鎖と軽鎖とが接続されたｓｃＦｖ抗体を、酵母凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニットおよびＨＡ−タグタンパク質に融合した。発現すると、ｓｃＦｖは、細胞表面タンパク質であるＡｇａ１ＰへのＡｇａ２Ｐの結合を介して、酵母宿主細胞の表面に位置した（図４Ａ〜図４Ｄ）。各酵母細胞は、典型的には、１×１０５コピーから１×１０６コピーのｓｃＦｖとｓｃＦｖの表面発現とを提示した。表面発現の変化は、ｓｃＦｖ領域に隣接するＨＡタグの免疫蛍光標識化を介して測定することができる（図４Ａ〜図４Ｄ）。
【０２２４】
上記のｓｃＦｖライブラリーを、酵母株ＥＢＹ１００（インビトロジェン）に導入し、所望の特異性を有するｓｃＦｖ抗体を以下のように特定した。ＥＢＹ酵母細胞をまず、１リットルのＳＤＣＡＡ培地（２０ｇのデキストロース、６．７ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース、５ｇのＢａｃｔｏカザミノ酸、５．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、および８．５６ｇのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ）中で一晩増殖させた。一晩培養から得た１ｘ１０１０個の酵母細胞を、２，５００ｇで５分間の遠心分離によって沈殿させ、ＳＧＣＡＡ培地（デキストロースの代わりにガラクトースを含有することを除いてＳＤＡＣＣと同一の培地）中、６００ｎｍで約０．５〜１の吸光度となるように再懸濁した。次いで、酵母細胞を２０℃で３６時間培養して、ｓｃＦｖ抗体を発現させた。その後、２，５００ｇで５分間遠心分離することによって細胞を採集する。細胞ペレットを２５ｍＬのＰＢＳで洗浄する。
【０２２５】
ｓｃＦｖ抗体を発現する酵母細胞を、フローサイトメトリーによってソーティングした。簡潔に述べると、約１×１０６個から１×１０７個の酵母細胞を上記に記載されたように調製し、１４，０００ｇで３０秒間の遠心分離を介して採集し、１ｍＬのＰＢＳ緩衝液で洗浄して、２μＬの／１０μｇ／ｍＬ抗ＨＡフィコエリスリンモノクローナル抗体（シグマ・アルドリッチ）およびＢｃｌ−２／Ｂｉｄヘテロ二量体と混合した。上記ヘテロ二量体では、Ｂｃｌ−２がＦＩＴＣにより標識され、Ｂｉｄがテキサスレッドにより標識されていた。室温で１時間インキュベートした後、混合物を１２，０００ｇで３０秒間遠心分離して、酵母細胞を沈殿させた。次いで、細胞ペレットを５００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（最終細胞密度約１０６個／ｍＬ）に再懸濁して、フローサイトメトリーによって以下のように細胞ソーティングに供した。
【０２２６】
陽性対照として抗ＨＡフィコエリスリン抗体と混合されたＥＢＹ１００酵母細胞を用いて、フローサイトメトリーのプロトコルを予め決定し、陰性対照としてＥＢＹ１００酵母細胞を二重標識ヘテロ二量体と混合した。蛍光検出器のＦＩＴＣ、テキサスレッド、およびフィコエリスリンのチャネル間のクロストークを除外するために補整を行った。標識された酵母細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  Ｃｅｌｌ−Ｓｏｒｔｅｒ（ベクトンディッキンソン、マウンテンビュー、カリフォルニア州）にロードし、前方散乱チャネルおよび側方散乱チャネル上でゲーティングした。ＦＩＴＣ／テキサスレッド／フィコエリスリン陽性の四分円中の適切なソートゲートを延伸し、上位５％の三重陽性酵母細胞を１ｍＬのＳＤＣＡＡ培地中に採集した。必要に応じて、上位０．１％の三重陽性酵母細胞を採集し、Ｂｃｌ−２／Ｂｉｄヘテロ二量体に対して高い親和性を有する細胞のみを確実にソーティングするようにした。
【０２２７】
特定された三重陽性細胞を１０ｍＬのＳＤＣＡＡに懸濁し、３０℃で一晩成長させた。次いで、これらの細胞を２ラウンドの陰性選択に供して、Ｂｃｌ−２またはＢｉｄのモノマーにも結合するｓｃＦｖ抗体を発現する細胞を除外する。より具体的には、細胞をＦＩＴＣ標識Ｂｃｌ−２およびテキサスレッド標識Ｂｉｄと共にインキュベートし、上述と同じ手順に従って、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド二重陰性細胞をソーティングした。採集した細胞を、二重標識Ｂｃｌ−２／Ｂｉｄヘテロ二量体により標識し、ヘテロ二量体へのそれらの結合を確認した。
【０２２８】
次いで、特定された酵母細胞を希釈して播種し、個別のクローンを形成させた。Ｗｅａｖｅｒ−Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌ．１８，ｎｏ．１１，ｐｐ  ５２７−５３６（２００５）に記載されるように、Ｚｙｍｏｐｒｅｐキット（ザイモリサーチ、オレンジ、カリフォルニア州）を用いて、これらのクローンからプラスミドＤＮＡを単離した。各プラスミドＤＮＡに含まれるｓｃＦｖ配列を、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：７５５−７６８（２００６）に記載される方法に従って決定した。
【０２２９】
特定されたｓｃＦｖ抗体を、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって分析して、Ｂｃｌ−２／Ｂｉｄヘテロ二量体に対するその特異性を確認した。次いで、抗体を変異誘発に供し、Ｂｃｌ−２／Ｂｉｄヘテロ二量体に対する高い親和性および特異性を有するｓｃＦｖ抗体を選択した。
【０２３０】
実施例３：免疫沈降によるＢｃｌ−２ヘテロ二量体に特異的な抗体の選択
免疫アッセイ（すなわち、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降アッセイ）を実施して、実施例１から得た抗体がＢｃｌ−２ヘテロ二量体に特異的であることを確認した。（図２、図１３Ａ、図１３Ｂ）Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体の二つのメンバーを、別個の発光スペクトルを有する二つの蛍光プローブにコンジュゲートした。すなわち、一方をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ；４８８ｎｍで発光する）で標識し、他方をテキサスレッド（５９０ｎｍで発光する）で標識した。（図４Ａ〜Ｄ）上記の実施例１に記載の方法に従って、標識したメンバーを共にインキュベートして、Ｂｃｌ−２ヘテロ二量体を形成させた。この実施例の実験では、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０と目的の抗体を産生するハイブリドーマクローンから得た５０ｕＬの上清とを含有する０．５ｍＬのＰＢＳと共にインキュベートした際に、０．１  μｇのヘテロ二量体が形成された。ヘテロ二量体の標識された非二量体のメンバーを、陰性対照として使用した。次いで、混合物を氷上で１時間インキュベートして抗体−抗原複合体を形成させ、その後、１０μＬのＧａｍｍａＢｉｎｄ−Ｇセファロースビーズ（ＧＥヘルスケア、ピスカタウェイ、ニューヨーク州）を混合物に添加した。回転させながら氷上で３０分間、氷上でインキュベートした後、混合物を１０，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。抗体−抗原複合体を付加させたビーズペレットを、次いで数回洗浄し、ＯＤ４８８ｎｍおよびＯＤ５９０ｎｍでの光学密度について測定した。次いで、抗体の特異性を、ＯＤ４８８ｎｍおよびＯＤ５９０ｎｍの値に基づいて決定した。
【０２３１】
実施例４：ＢＩＭ−ＢＨ３誘発性エピトープの選択的な結合および阻害
次いで、ヘテロ二量体特異的なＢｃｌ−ｘＬ  Ｂｉｍ（ＨＳＢＸＢ）として本明細書に開示されたモノクローナル抗体を調製した。ＨＳＢＸＢは、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｉｍ−ＢＨ３ドメインペプチドのヘテロ二量体に特異的に結合した。ＨＳＢＸＢの特性をさらに解析するために、ＢｉｍのＢＨ３ドメインにより媒介されるＢｃｌ−  ｘＬ／Ｂｉｍ結合を阻害した条件下で、抗体を評価した。ＡＢＴ−２６３は、ＢＨ３ドメイン媒介性の結合を競合的に阻害するＢＨ３ドメイン模倣体である。ＡＢＴ−２６３は、死促進タンパク質（例えばＢｉｍ）とのＢｃｌ−ｘＬの相互作用を攪乱し、ヘテロ二量体からのＢｉｍの放出を生じ、結果としてアポトーシスの開始をもたらす。ＡＢＴ−２６３を追加すると、ＢｉｍのＢＨ３ドメインを含むペプチドを含んで形成されたヘテロ二量体に、ヘテロ二量体抗体シグナルの用量依存的な阻害が観察された。Ｂｉｄ−ＢＨ３ドメインペプチド、またはペプチドなしは、モノクローナル抗体のヘテロ二量体特異性を確認する陰性対照としての役割を果たした。図３Ｃ、図１３Ａ、および図１３Ｂは、ヘテロ二量体Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍ−ＢＨ３へのＭａｂ  ＨＳＢＸＢの選択的な結合の結果を示す。図１３Ａに示される実験では、Ｂｃｌ−ｘＬ−ＧＳＴをグルタチオン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合した。次いで、Ｂｉｍ−ＢＨ３ペプチドを添加するかまたは対照として添加せず、ＨＳＢＸＢ抗体を用いて複合形成を検出した。図１３Ｂは、ＡＢＴ−２６３による結合の阻害を示す。非共有結合のＢｃｌ−ｘＬ−ＧＳＴ／Ｂｉｍ  ＢＨ３ヘテロ二量体を、グルタチオン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合し、ＡＢＴ−２６３により処理した。次いで、ペプチドの添加後、モノクローナル抗体を添加する前に、ＡＢＴ−２６３をＥＬＩＳＡプレートに添加した。図１３Ｂは、ＡＢＴ２６３により媒介されたＢｃｌ−ｘＬ結合Ｂｉｍ  ＢＨ３ペプチドの転置を実証しており、この転置は、ＨＳＢＸＢの結合の喪失に反映されていた。この実験の結果は、ＢＨ３ペプチドがヘテロ二量体へ極めて選択的に結合することを標示しており、この選択的な結合は、ＢＨ３ペプチドの結合の程度に相関し、結合のダイナミックレンジを実証するものである。Ｂｉｍペプチド、ＢＩＤペプチド、または全長Ｂｉｍタンパク質により形成されたヘテロ二量体において、ヘテロ二量体抗体シグナルの用量依存的な阻害が観察された。ＡＢＴ２６３は、Ｂｃｌ−ｘＬ結合ＢｉｍおよびＨＳＢＸＢ結合を転置させた。Ｂｃｌ−２／Ｂｉｍに特異的な抗体を選択する図３Ｃ。
【０２３２】
実施例５：細胞および組織中のＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体の検出
本明細書に開示されるのは、ＨＳＢＸＢ抗体を用いる細胞内染色のための、ならびにがん細胞のプライミング状態を決定する際の抗体の機能性を検討するためのＨＳＢＸＢの使用のための、方法の確立である。Ｈｒｋ  ＢＨ３ドメインペプチド（Ｂｃｌ−ｘＬ依存性のバイオマーカー）を用いて細胞をプロービングすることによって決定する場合にＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｉｍプライミングの程度を変化させる（図４Ｂ、ｙ軸）、三つの細胞株を選択した。細胞株Ｍｏｌｍ−１３、ＡＨＲ７７、およびＤＨＬ−６は、それぞれ１７％、５０％、および６０％でＢｃｌ−ｘＬ（Ｈｒｋ）プライミングされ、ＨｒｋプライミングとＨＳＢＸＢ抗体染色との間の相関（Ｒ＝０．９８２）が観察された（図４Ａおよび図４Ｂ）。また、ＨＳＢＸＢ染色のフローサイトメトリー検出を確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡベースのアプローチを利用して、Ｂｃｌ−ｘＬ抗体により被覆したプレートに、結合したＢｃｌ−ｘＬヘテロ二量体を捕捉し、次いでＨＳＢＸＢ抗体を用いて検出した（図４Ｃ）。このアプローチは、フローサイトメトリーで見られたものならびに（Ｐｉｅｒｃｅａｌ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１３  Ｄｅｃ；１２（１２）：２９４０−９）に記載されたものと同じＨＳＢＸＢの染色傾向を示した。さらに、ＩＦによってＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体の検出を実証するために、ＳＫＢＲ３細胞を２％ＰＦＡ中で固定し、ＨＳＢＸＢ（マゼンタ）およびＢｃｌ−ｘＬ（Ａｌｅｘａ  ４８８）により染色したが、このことはＨＳＢＸＢがヘテロ二量体を検出できることを示している。（図４Ｄ）
【０２３３】
４℃で３０分間インキュベートした後、細胞抗体混合物をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、０．３×ｇで５分間遠心分離して細胞を沈殿させた。細胞株から得られた細胞を、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、陰性対照試料としての対照細胞試料と陽性対照としての抗Ｂｃｌ−ｘＬローダミン標識ミトコンドリアとを使用して予め決定したフローサイトメトリーパラメーターを用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン、マウンテンビュー、カリフォルニア州）によって解析した。ミトコンドリア懸濁液を、ＦＡＣＳチューブを用いてフローサイトメトリー装置内にロードし、ＨＳＢＸＢ  ＦＩＴＣおよびローダミンから放出されたシグナルを検出した。ミトコンドリア懸濁液がＦＩＴＣおよびローダミンの両方に対して二重陽性であった場合、それは供試抗体がＢｃｌ−ｘＬ：Ｂｉｍヘテロ二量体に結合可能であったことを標示した。図１３Ａを参照されたい。
【０２３４】
実施例６：固定細胞中のＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体の検出
この研究では、広範に存在するＭｃｌ−１／ＢｉｍまたはＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍのヘテロ二量体の保有について、細胞を特性解析した。細胞をカバースリップ上に置き、次いでＰＢＳ中２〜４％ホルムアルデヒド（ホルムアルデヒド、１６％、メタノール不含、ポリサイエンス社）を用いて室温で１５分間固定した。次いで、細胞を含有するカバースリップを、ＰＢＳにより３回、各５分間リンスした。次いで、スリップをブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ／５％正常ヤギ血清：５ｍＬの１×ＴＢＳＴに２５０μＬの正常ヤギ血清を添加）に６０分間浸漬した。ブロッキング緩衝液を吸引除去した後、Ｍｃｌ−１／ＢｉｍまたはＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体のどちらにも特異的な抗体（すなわちＨＳＢＸＢ、図５を参照）をスリップに添加した。ミトコンドリアの場所を特定するために、抗ヒトＶＤＡＣ−１抗体も添加した。試料を４℃で一晩インキュベートした後、スリップをＰＢＳにより３回、５分間リンスした。次いで、希釈緩衝液中で希釈した蛍光色素結合二次抗体を添加した。暗所中、室温で１〜２時間インキュベートした後、スリップをＰＢＳで３回、２分間リンスし、続いて、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）により処理した。次いで、スリップの縁周りにマニキュアを塗ることによってスリップを密封し、次いで、倒立蛍光顕微鏡下でスリップを観察した。ミトコンドリア上の抗体の局在は、抗体がＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体またはＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体を認識したことを標示していた。
【０２３５】
実施例７：患者試料におけるＨＳＢＸＢによるＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体シグナルとミトコンドリアプロファイリングの読取りとの比較、および臨床応答との比較
従前の研究では、ミトコンドリアプライミングアッセイにおけるＨｒｋペプチドの読取りによって決定されたＢｃｌ−ｘＬ依存性が、ＣＤＫ−９阻害剤アルボシジブに対するＣＬＬ患者の応答に相関することが実証されている。（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１６／１１５１０５、がん治療を手引きするための状況依存的な診断テストを参照）その研究では、プライミングと患者応答との関連性が非常に有意であり、曲線下面積（ＡＵＣ）＝０．８３であった。ミトコンドリアプロファイリングでは、Ｈｒｋプライミングシグナルは、陽性シグナルの関数として測定され、ミトコンドリアの完全な脱分極が、化学阻害剤カルボニルシアン化物ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）によって誘発されるのに対し、陰性シグナルは、「プライミング指数」を得るための以下の式に概説したようにＤＭＳＯ処理に由来する。
【数７】
2021512288.tif 000011
【０２３６】
ＨＳＢＸＢ  ＥＬＩＳＡシグナルは、先に取得および記録されたＨｒｋプライミングシグナルに対し、それらの同じ試料からベンチマークすることができる。次いで、総Ｂｃｌ−ｘＬシグナル（結合および非結合）を決定することができる。Ｂｃｌ−ｘＬ捕捉分子および第２の非干渉性Ｂｃｌ−Ｘｌ検出抗体を、この目的のために使用することができる。ＨＳＢＸＢ  ＥＬＩＳＡシグナルは、最大（１００％）として総Ｂｃｌ−ｘＬ  ＥＬＩＳＡに、ゼロとしてバックグラウンドシグナルに、関連付けることができる。下記の式を用いて、ＢｉｍによるＢｃｌ−ｘＬの占有率のパーセンテージ、Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍプライミング指数を計算することができる：
【数８】
2021512288.tif 000012
【０２３７】
バイオマーカーの状態（Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍプライミングのパーセンテージ）と患者の応答者または非応答者の分類との間の関連性を検討することができる。システムは、ＡＢＴ−２６３に対する応答者および非応答者を含めて、細胞株を用いて最適化することができる。その後、針生検による新鮮な凍結乳がん腫瘍組織（アーカイブ）を、Ｉ−Ｓｐｅｃｉｍｅｎ、レキシントン、マサチューセッツ州から取得することができる。組織ドナーからの臨床応答およびアウトカムのデータは、供給業者を通じて入手可能である。最大４０個のそのような標本を得ることができ、ＥＬＩＳＡに供された。
【０２３８】
分析について：単変量比較は、ログランク（マン・ホイットニー）検定およびｔ検定を用いて行うことができ、全てのｐ値は、両側対立仮説を用いて計算することができる。ベンジャミニ・ホフバーグ法を用いた偽発見率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を説明することによって、複数の比較（二つのバイオマーカーの比率）を説明するように、ｐ値を調整することができる。マーカーの予測能は、理想的な閾値を特定するための受信者操作特性（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）統計を用いて評価することができる。多変量解析は、ロジスティック回帰を用いて行うことができ、有意調整変数は、病期、年齢、ホルモン受容体（ＰＲ／ＥＲ）の状態、および細胞遺伝学的リスクの状態を含むことがある。全生存期間（ＯＳ）および無イベント生存期間（ＥＦＳ）は、プライミングのパーセンテージとの有意な相関について、傾向解析のログランク検定（マンテル・ヘンツェル）によって検定することができる。
【０２３９】
免疫組織化学（ＩＨＣ）法を使用して、乳がん固形腫瘍生検体においてＨＳＢＸＢを最適化し、また臨床アウトカムに対しバイオマーカーを確立することができる。アルゴリズムベースのＩＨＣシグナル定量を用いたデジタル病理学を用いて、いくつかのＩＨＣの作業を実施することができる。本開示のプロトコルは、エピトープ検出シグナルを向上させることができる酵素的、化学的、温度、および圧力の処理条件の様々な用途を含む。
【０２４０】
ＩＨＣアッセイの開発を図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２５、図２６、図２７、図２８、図３０、図３１、および図３２に示す。ＭＥＦ  Ｂｃｌ−ｘＬ−／−細胞におけるＢｃｌ−ｘＬ発現のイムノブロットを図２４Ａに示し、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＨＳＢＸＢのＩＦ画像およびシグナル強度を図２４Ｂおよび図２４Ｃに示す。図２５では、ＭＥＦの野生型およびＭＥＦ  Ｂｃｌ−ｘＬｌ−／−細胞におけるＨＳＢＸＢ抗体のＩＨＣアッセイを示す。図２６では、未治療の（左）の、Ａ−１３３１８５２阻害剤（中央）により治療された、およびｓｉＲＮＡ−Ｂｃｌ−ｘＬで治療された（右）ＨＣＣ１９３７ヒト乳がん細胞を使用した、ＨＳＢＸＢ抗体のＩＨＣアッセイを示す。図２７では、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤のＩＨＣアッセイを、ＭＥＦ野生型（左）およびＭＥＦ  Ｂｃｌ−ｘＬ−／−（右）の細胞について示す。図２８では、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤のＩＨＣアッセイを、未処置の（左）およびｓｉＲＮＡ−Ｂｃｌ−ｘＬで治療された（右）ＨＣＣ１９３７ヒト乳がん細胞について示す。図３０は、ＭＥＦ野生型（左）およびＭＥＦ  Ｂｃｌ−ｘＬ−／−（右）についてのＨＳＢｘＢ／ＢＣＬｘＬのＩＨＣアッセイを示す。図３１は、未処置の（左）、Ａ−１３３１８５２で治療された（中央）、およびｓｉＲＮＡ−Ｂｃｌ−ｘＬで治療された（右）場合について、ＨＣＣ１９３７ヒト乳がん細胞を用いたＨＳＢｘＢ／ＢＣＬｘＬのＩＨＣアッセイを示す。図３２は、ＢＣＬｘＬ＋／＋であるＳＶＥＣ細胞におけるＢＣＬ−ｘＬ：ＢＩＭに対するＨＳＢｘＢ／ＢＣＬｘＬのＩＨＣアッセイを示す。
【０２４１】
初期データは、ＨＳＢＸＢ抗体がホルムアルデヒド固定およびパラフィン（ＦＦＰＥ）ＩＨＣ実験（例えば、図６を参照）、ならびにＩＨＣを用いたＦＦＰＥ三重陰性乳がん切片で良好に機能したことを示す（図３３Ａ、図３３Ｂ、図３３Ｃ、図３５Ａ、図３５Ｂ、および図３５Ｃ）。図３５Ａ、図３５Ｂ、および図３５Ｃは、ＦＦＰＥ乳がん細胞上の２色ＩＨＣの結果を示す。結果は、Ｂｃｌ−ｘＬ特異的ＢＨ３模倣体処理細胞におけるＨＳＢＸＢ／抗Ｂｃｌ−ｘＬシグナルの変化を示す。ＨＳＢＸＢ抗体のノイズ指数へのシグナルは、ヒト乳がん異種移植ＦＦＰＥ試料の追加的な固定後調製を検討することによって改善されることがあり、Ｉ−Ｓｐｅｃｉｍｅｎ、レキシントン、マサチューセッツ州、米国から得られる適合する新鮮凍結組織における、ならびに適合するＦＦＰＥおよび固定済みヒト／マウス異種移植生検体における、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーの読取りをベンチマークしてもよい。
【０２４２】
この例の実験は、ＨＳＢＸＢが複数の組織由来のがんにわたって結合することが観察されたことから、特にＩＨＣについて広範な適用があることを実証する（図３４）。
【０２４３】
ＩＨＣ染色条件は最適化することができ、またヘテロ二量体およびモノマーを検出するための感受性および特異性は、ＦＦＰＥ組織の切片で実行できる。カットオフ値は、定量値の最低レベル（ＬＬＯＱ）および定量値の最高レベル（ＨＬＯＱ）を確立することによって決定することができる。画像解析および視覚的スコアリングを介した定量化により、ＩＨＣの解釈をシグナル密度の単一の値および画定された境界内のシグナルの分布へと低減することが可能になる。
【０２４４】
実施例８：アーカイブされた患者試料におけるＨＳＢＸＢ／Ｂｃｌ−ｘＬシグナルと臨床応答との相関関係
アーカイブされた患者試料におけるＨＳＢＸＢ／Ｂｃ−ｘｌシグナルと臨床応答との間の相関を実証するために、約５０〜７５個のアーカイブされたＨｅｒ２＋乳がん腫瘍組織を、未治療の治療前の患者および難治性の治療前の患者から採取することができる（すなわち、Ｉ−ｓｐｅｃｉｍｅｎ、レキシントン、マサチューセッツ州から入手）。次いで、針生検体を薄切し、９６ウェルプレート内で８連で分散させることができる。次いで、個別のウェルを、該当する濃度（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）でＨＳＢＸＢ抗体に、ならびにＢｃｌ−ｘＬ抗体に、曝露することができる。次いで、ＨＳＢＸＢ／Ｂｃｌ−ｘＬシグナルを決定することができる。データを、臨床応答データ（ＰＩ３キナーゼデルタ治療を伴うまたは伴わないハーセプチン、ラパチニブ）と相関させることができる。
【０２４５】
次に、本実施例の実験は、特に、免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡によるＨＳＢＸＢおよびＢｃｌ−ｘＬｌシグナルを測定するための条件をどのように確立するかを実証するものである。これは、標準的な撮像システムおよび顕微鏡を使用して実施することができる。固定された組織の場合、Ｂｃｌ−ｘＬ／ＢＩＭヘテロ二量体の形成またはプライミングを引き起こすかまたは枯渇する原因はない。代わりに、Ｂｃｌ−ｘＬ抗体によって生成されるシグナルを、到達しうる内部の最大シグナルとして頼ることができる。固定された乳がん細胞については、これを、抗Ｂｃｌ−ｘＬ  ＩｇＧ細胞内結合についてのシグナル強度の中央値を用いて計算することができる。ＨＳＢＸＢにより決定されるプライミングの計算については、以下の式を使用することができる。
【数９】
2021512288.tif 000013
【０２４６】
撮像方法を確立すると、スライド（Ｉ−Ｓｐｅｃｉｍｅｎから購入）上のパラフィン包埋薄切片である最大５０〜７５個のアーカイブされたＨｅｒ２＋患者腫瘍生検試料を、蛍光顕微鏡法を用いて調べることができる。シグナル標本はそれぞれＨＥＲ２＋であり、臨床応答、臨床アウトカム、ならびに予後マーカーのアノテーションを有する。この分析は、定量的ＩＦ顕微鏡を使用して実施することができ、細胞ごとにミトコンドリア、細胞質、または微小管における、ＨＳＢＸＢならびに抗Ｂｃｌ−ｘＬの染色強度を測定するために用いることができる。これらの測定値を、隣接した非腫瘍組織からのシグナルと比較することができる。次いで、シグナルを、細胞全体当たりまたは特異的な細胞内領域当たりで報告し、各標本についての同じものと比較することができる。熟練した病理学者は、腫瘍内の組織学的バリエーションを使用することができ、また複製スライドでＢｃｌ−２およびＭｃｌ−１の発現レベルを測定することができる。これらの追加的な測定を、相関分析に含めるために考慮することができる。
【０２４７】
次いで、バイオマーカーは、バイオマーカーの状態（Ｂｃｌ−ｘＬプライミングのパーセンテージ）と患者の応答者または非応答者の分類との間の関連性を試験することにより、統計解析によって分析することができる。単変量比較は、マン・ホイットニー検定を用いて行うことができ、報告されたＰ値はすべて両側検定とすることができる。次いで、複数の比較（二つのバイオマーカーの比率）を説明するための一次解析についての有意性の閾値を決定することができる。マーカーの予測能は、曲線下面積（ＡＵＣ）の統計を用いて評価することができる。多変量解析は、ロジスティック回帰を用いて行うことができ、有意調整変数は、病期、年齢、ホルモン受容体（例えばＰＲ／ＥＲ）の状態、および細胞遺伝学的リスクの状態を含むことがある。次いで、全生存期間（ＯＳ）および無イベント生存期間（ＥＦＳ）を、ログランク検定によって、プライミングのパーセンテージとの有意な相関および傾向について検定することができる。
【０２４８】
Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍ（ＨＳＭＣＢ）およびＢｃｌ−２／Ｂｉｍ（ＨＳＢＬＢ）に特異的なモノクローナルＡｂを調製するために、ならびにミトコンドリアプライミング検出物質として検証するために、Ｂｃｌ−２ファミリーヘテロ二量体特異的抗体（ＨＳＡ）の範囲をＭｃｌ−１およびＢｃｌ−２に拡張してもよい。この目的で、精製されたＭｃｌ−１−ＧＳＴおよびＢｃｌ２−ＧＳＴ融合タンパク質を、共有結合によりＢｉｍ修飾ＢＨ３ペプチドにコンジュゲートすることができる。モノクローナル抗体は、Ａｂｐｒｏ（レキシントン、マサチューセッツ州）によって調製およびスクリーニングすることができる。ミトコンドリアプライミングを検出する際のバイオマーカー機能の読取り忠実性および有用性を、細胞株にて確立することができる。ハイブリドーマ作製のため、各標的抗原に対し、完全フロイントアジュバントと組み合わせた５０マイクログラムの抗原を用いて、５頭のスイスウェブスターマウスを免疫することができる。抗体は既に上述したように作製することができる。
【０２４９】
次いで、染色されたチップを、９５％エタノール中で２回各１０秒間、１００％エタノール中で２回各１０秒間、そして最後にキシレン中で２回各１０秒間、逐次的にインキュベーションすることによって脱水することができる。次いで、チップにカバースリップを取り付けて、染色パターンについて蛍光顕微鏡およびＵＶ顕微鏡を使用して調べることができる。次いで、がん組織試料から得られた染色パターンを、隣接する正常組織から得られたものと比較することができる。（例えば、図６を参照）
【０２５０】
実施例９：Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体シグナルは、ＡＭＬ患者試料由来のゲーティングされた芽細胞集団におけるＨｒｋプライミングに相関する。断定された読取りはバイオマーカー開発を手引きする
ＡＭＬ患者試料を、この実施例の実験でＢＨ３についてプロファイリングした。芽細胞群は、Ｈｒｋプライミング、ならびにＢｃｌ−ｘＬに選択的なＨｒｋ  ＢＨ３ペプチドに対する応答を示した。並行して、ＡＭＬ患者試料を固定し、ＦＩＴＣ標識ＨＳＢＸＢ抗体およびローダミン標識Ｂｃｌ−ｘＬ抗体により染色した。この芽細胞をゲーティングしたシグナルをＦＡＣＳで解析した。ＨＳＢＸＢにより生成されたＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体の読取りと総Ｂｃｌ−ｘＬシグナルとの比率を、ＡＭＬ患者試料由来のＨｒｋペプチドにより生成されたシグナルに対してプロットする。図９Ａ、図、図９Ｂを参照されたい。また、図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃを参照すると、ＨＳＢＸＢシグナルがＡＭＬ患者試料（図１２Ａ）およびＣＬＬ患者患者試料（図１２Ｂ）の両方においてＨＲＫおよび特許応答に相関することが示されている。この患者群の前処理ＨＲＫシグナルは、アルボシジブ治療に関連することが示された（図１２Ｃ）。また、図１５Ａ、図１５Ｂ、および図１５Ｃを参照すると、ＡＭＬ患者試料におけるＨＲＫとＨＳＢＸＢ／ＢＣＬＸＬとの対比のパーセントの相関が示されている。
【０２５１】
実施例１０：Ｂｃｌ−ｘＬを標的とするＢＨ３模倣体化合物による処理後の腫瘍細胞株におけるＢｃｌ−２ヘテロ二量体のプロファイリング
この実施例の実験は、ＨＳＢＸＢ抗体が薬力学的マーカーとして機能し、Ｂｃｌ−Ｘｌ選択的なＢＨ３模倣体Ａ１１５５４６３による処理の結果としてのＢｃｌ−ｘＬ／Ｂｉｍヘテロ二量体のシフトを検出することが示されたという、驚くべき結果を実証したものである。これらの実験では、Ｂｃｌ−ｘＬを発現するＡＴＨ６６細胞を１６時間にわたって化合物で処理し、次いで、パラホルムアルデヒドで固定して、非イオン性界面活性剤により透過処理し、ＨＳＢＸＢ−ＦＩＴＣおよび抗Ｂｃｌ−ｘＬ−ローダミンにより染色した。フローサイトメトリーを用いてシグナルを解析した。シグナルの比率によりＢｃｌ−ｘＬプライミング指標が与えられた。これは、アポトーシスの発生と一致した経時変化で減少することが観察され、このアポトーシスは、ＤＡＰＩ染色およびアネキシン５表面染色によって決定されたものである。例えば、図８および図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃを参照すると、Ａ−１１５５４６３で処理した際に、Ｂｃｌ−ｘＬに選択的なＢＨ３模倣体に応答してＨＳＢＸＢシグナルがシフトすることが示されている。
【０２５２】
実施例１１：ヒト乳がん細胞におけるＨＳＢＸＢ抗体の免疫蛍光（ＩＦ）染色、ＨＳＢＸＢの局在の変化、およびＢｃｌ−ｘＬのｓｉ−ＲＮＡノックダウン
Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤、Ａ−１３３１８５２、またはＭＥＫ阻害剤に対する薬物応答を、図１６Ａおよび図１６Ｂに示されるように、２種類のヒト乳がん細胞ＨＣＣ１９３７およびＢＴ−４７４で比較した。両方の細胞型で、Ａ−１３３１８５２阻害剤の添加の結果、細胞生存率の減少がもたらされたのに対し、ＭＥＫ阻害剤は、どちらの乳がん細胞型でも細胞生存率を減少させなかった。未処理のヒト乳がん細胞ＨＣＣ１９３７およびＢＴ−４７４におけるＨＳＢＸＢ抗体およびＢｃｌ−ＸＬ阻害剤Ａ−１３３１８５２の免疫蛍光（ＩＦ）染色を、図１７に示す。図１８に示されるように、Ａ−１３３１８５２阻害剤の存在もしくは不在下で処理されたか、またはＨＳＢＸＢ抗体の存在もしくは不在下で処理されたヒト乳がん細胞ＨＣＣ１９３７から、ＩＦ染色および相対的シグナル強度を得た。ＨＳＢＸＢ抗体は、阻害剤処理および対照試料においてシグナル強度が低かった。Ａ−１３３１８５２阻害剤に応答したＢｃｌ−ｘＬおよびＨＳＢＸＢの局在の変化が、ＨＣＣ１９３７細胞で観察された（図１９）。図２３では、野生型のＳＶＥＣ細胞およびミトコンドリアプライミングされたＳＶＥＣ細胞で、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＨＳＢＸＢの両方が観察されることを実証する、ＩＦ画像が示されている。
【０２５３】
ｓｉＲＮＡを用いて、Ｂｃｌ−ｘＬ−ｓｉＲＮＡをＨＣＣ１９３７細胞にトランスフェクトしてＢｃｌ−ｘＬをノックダウンし、その結果、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＨＳＢＸＢの両方のシグナル強度が低いものとなり（図２０、図２２）、ＨＳＢＸＢ（図２９Ａ）およびＢＣＬｘＬ（図２９Ｂ）の両方の総陽性のパーセンテージが低減された。ＨＣＣ１９３７細胞におけるＢｃｌ−ｘＬのノックダウンは、ＩＦ染色によって、ＨＳＢＸＢがｓｉＲＮＡ処理細胞に観察されなかったことから確認された（図２１）。
【０２５４】
実施例１２：ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＩＨＣにより非結合Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に対するＢｃｌ−２ファミリーヘテロ二量体を測定することによって、固形腫瘍における浸潤性リンパ球のアポトーシス能力を評価することにより、免疫腫瘍療法に対するがん患者の応答を予測する方法。
アポトーシスは、Ｔ細胞免疫において、選択中の細胞の排除を制御することにより重要な役割を果たし、そのような場には、これらの細胞が浸潤して腫瘍細胞に対する免疫応答を生じる腫瘍内が含まれる。例えば、ＰＤ−１／Ｌ１遮断抗体の有効性は、腫瘍内のＰＤ−Ｌ１発現細胞によって負に調節されている腫瘍特異的ＰＤ−１＋  Ｔ細胞の存在、ならびにこれらの細胞の持つ長寿命に付随する。（Ｋｕｈｎｇｅｒ，Ｍ．ｅｔ．Ａ．，ＡＳＣＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｊｕｎｅ  １２，２０１７  ｆｒｏｍ  １６２．２３４．１５０．１７７）これらの治療の目的は、機能的に無傷のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体をモノクローナル抗体により妨げることによって、腫瘍免疫に影響を与えることである。これにより、Ｔ細胞ががん細胞の死滅を媒介することが可能になる。ＰＤ−Ｌ１の発現レベル、腫瘍内の位置、および長寿命はそれぞれ、この治療戦略の有効性に影響を与える。ＰＤＬ−１調節療法または他の免疫腫瘍療法に応答する浸潤リンパ球の素因に関する正確な情報は、これらの薬剤の使用を手引きする際に重要である。
【０２５５】
この実施例の実験は、治療応答のための免疫腫瘍に影響を与えるための適応免疫系機構を理解することによって手引きされる。腫瘍抗原に対するＴ細胞応答は、周囲のリンパ球、例えば骨髄由来免疫抑制細胞および制御性Ｔ細胞からのシグナル伝達のキューを介して起こることが観察されている（Ｗｅｎｓｖｅｅｎ，１  Ｋｌａａｓ  Ｐ．Ｊ．Ｍ．ｖａｎ  Ｇｉｓｂｅｒｇｅｎ，１  ｅｔ  ａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３２，７５４−７６５，Ｊｕｎｅ  ２５，２０１０；Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＥＮ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ｜Ｍａｒｃｈ  ３１，２０１５｜ｖｏｌ．１１２｜ｎｏ．１３）。Ｂｃｌ−２ファミリーのヘテロ二量体の状態は、このシグナル伝達に影響を与え、腫瘍細胞に向けられた免疫応答の増強の成功を予測するための測定基準を提供する。
【０２５６】
一実施形態では、Ｔ細胞の長寿命および活性化の傾向は、アンタゴニストＭｃｌ−１に結合したアポトーシス促進分子Ｎｏｘａを調べることによって評価することができる。さらに、Ｔ細胞の長寿命および活性化の傾向は、ＦＦＰＥ非小細胞肺患者生検組織上でＩＨＣを用いてｉｎ  ｓｉｔｕでＢｉｍ／Ｍｃｌ−１ヘテロ二量体を測定することによって、評価することができる。これらの結果は、先天免疫においてＴ細胞集団を調節するこの機構が記載されている文献（すなわち、Ｗｅｎｓｖｅｅｎ，Ｋｌａａｓ  Ｐ．Ｊ．Ｍ．ｖａｎ  Ｇｉｓｂｅｒｇｅｎ，ｅｔ  ａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３２，７５４−７６５，Ｊｕｎｅ  ２５，２０１０）に示唆されているような相関と整合することがある。浸潤性Ｔ細胞集団中のＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体を測定することにより、ＰＤＬ−１を標的とする薬剤の応答性ならびに他の免疫腫瘍調節療法の応答性を予測するための測定基準を提供することができる。
実施例１３：ヘテロ二量体抗体を生成するための方法
【０２５７】
本明細書に開示されるのは、免疫されたマウスからヘテロ二量体抗体（例えば、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍ−ＢＨ３ヘテロ二量体抗体）を単離、選択、および精製する方法である。ヘテロ二量体抗体の単離、選択、および精製により、がん細胞のプライミングの状態を決定するなど、ヘテロ二量体の機能性の検討が可能になり、患者が免疫調節薬を含むがん治療に感受性であるか否かを検出することが可能になる。本明細書に開示される方法によって産生される精製ヘテロ二量体抗体は、患者由来の固形腫瘍試料または患者由来の液体腫瘍中の二つのＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）タンパク質を含むヘテロ二量体を検出するために使用することができる。
【０２５８】
図３６に概略的に示されるように、最初に、共有結合のヘテロ二量体抗原（例えば、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍ−ＢＨ３）によりマウスを免疫する。細胞全体の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、免疫化マウス血清中の抗原特異的抗体の存在を試験するとともに、抗体力価を分析することができる。抗体力価を増やすために追加免疫の繰り返しを実施することができる。力価の増加は、典型的には、追加免疫を繰り返す度に観察される。十分な力価が達成されれば（例えば、最大１：１５０，０００の血清希釈物）、マウスの脾臓を採取し、次いで、２段階の親和性ベースの選択ステップを用いて、ヘテロ二量体を含有する脾臓Ｂ細胞を選択する：すなわち、まず、脾臓Ｂ細胞を陰性選択用の磁気カラムに通し、次いで、脾臓Ｂ細胞を正電荷の磁気カラム選択に通す。陰性磁気カラムベース選択を実施するために、グルタチオン誘導体化された磁気ビーズと、ＧＳＴに融合されたヘテロ二量体の一方のモノマーを含有する組換え融合タンパク質（例えば、Ｍｃｌ−１ＧＳＴ）との両方で被覆されている負電荷のカラム上に、脾臓Ｂ細胞を配置する。次いで、陰性選択用の磁気カラムからのフロースルーを採集するが、このフロースルーは、モノマーの組換え融合タンパク質に結合しなかったことからヘテロ二量体を含有しない脾臓Ｂ細胞を表す。次いで、陰性選択用の磁気カラムから得たＢ細胞を含有するこのフロースルーを、陽性親和性選択用の共有結合のヘテロ二量体抗原（例えば、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍ−ＢＨ３）により陽性に被覆されている第２の磁気カラムに通した。ヘテロ二量体特異的抗体を含有する細胞を、陽性選択用の磁気カラムに結合させ、次いで陽性選択カラムから溶出して採集した。次いで、ヘテロ二量体抗体を含有する選択された細胞を、Ｂ細胞増殖のための補助物質（例えば、ＩＬ−４、ＬＰＳ、およびＣＤ４０リガンド）を含む培地中で成長させることができる。次いで、標準的なおよび定型的な分子生物学的方法によって、細胞を単離してサブクローニングすることができ、その後、優れたヘテロ二量体特異的結合および産生能を有する抗体について、上清をスクリーニングすることができる（例えば、ＥＬＩＳＡによって）。
【０２５９】
本方法のこの段階で、上清からの最適なスクリーニングシグナル（例えば、ＥＬＡＳＡに基づく）を示す抗体（例えば、Ｉｇの重鎖および軽鎖）の完全な配列を特定することができる。例えば、抗体の全長は、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅のための５’または３’のＲａｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（すなわちＲＡＣＥ  ＰＣＲ）を用いて決定することができる。本方法のこれらの実験では、マウスの重鎖および軽鎖の可変領域に由来する標準的な内部プライマーを使用して、全長配列を生成することができる。
【０２６０】
最適なヘテロ二量体抗体が単離されて選択されると、標準的および定型的な分子生物学的方法を用いて、単離されたヘテロ二量体抗体を、精製および大規模抗体生産のための発現ベクターおよび発現系（例えば２９３Ｔ細胞）にクローニングすることができる。次いで、抗体の特異的結合を対照アッセイで試験することができる。例えば、対照アッセイは、プレートがヘテロ二量体抗原（例えば、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍ、陽性）およびモノマー抗原（例えば、Ｍｃｌ−１、陰性）の両方で被覆されているＥＬＩＳＡとすることができる。一部の実施形態では、対照アッセイは、ヘテロ二量体の両方のタンパク質（例えば、Ｍｃｌ−１およびＢｉｍ）を発現する細胞株を用いた免疫蛍光（ＩＦ）染色である。例えば、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体の両方のタンパク質を発現する細胞におけるＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体のＩＦ染色を、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体の両方のタンパク質を発現しない（すなわち、対照としてタンパク質がノックダウンされていることがある）異なる細胞におけるＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体のＩＦ染色と比較することができる。一部の実施形態では、対照アッセイは、ヘテロ二量体の両方のタンパク質（例えば、Ｍｃｌ−１およびＢｉｍ）を発現する細胞株の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を、ヘテロ二量体の両方のタンパク質を発現しない細胞株のＩＨＣ染色と比較して含む。一部の実施形態では、対照アッセイは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロック上のＩＨＣ染色を含み、このブロックは、細胞株、対照細胞株、異種移植片組織、および患者組織を由来としうる。一部の実施形態では、対照アッセイはフローサイトメトリーを含む。
【０２６１】
ヘテロ二量体抗体の単離、選択、および精製に関連するこれらの方法の一例を図３７、図３８、および図３９に示す。図３７のデータは、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体へのＩｇＧクローン９Ｅ０５の選択的な結合を示す。本明細書に開示される方法を用いてこのクローンを作製した。クローン９Ｅ０５由来の精製上清を、上記に記載された親和性選択、すなわち、グルタチオンにより誘導体化された磁気ビーズ（陰性選択）、およびＧＳＴに融合されたヘテロ二量体の一方のモノマーを含有する組換え融合タンパク質（例えば、Ｍｃｌ−１ＧＳＴ）、およびＭｃｌ−１−ＧＳＴ／Ｂｉｍ  ＢＨ３で被覆されたビーズ（陽性選択）を用いて力価を評価し；次いで、ＥＬＩＳＡスクリーニングおよび定型的なクローニングを用いて、クローンをさらに分離し、図３７に示すような高純度のヘテロ二量体抗体を得た。図３８のデータは、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体の形成体に存在する修飾ＢＰＡ４ペプチドへの９Ｅ０５クローンの選択的な結合を示す。プレートをＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体、Ｍｃｌ−１モノマー、またはＢＰＡ４ペプチドのみのいずれかにより被覆した。図３９のデータは、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体の形成体に存在する修飾ＢＰＡ４ペプチドへの９Ｅ０５クローンの選択的な結合を示す。プレートを、修飾ＢＰＡペプチドを伴うＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体、天然Ｂｉｍビオチン、または切頭型Ｂｉｍペプチドのいずれかで被覆した。図４０は、クローンＥ９０５およびＭｃｌ−１ポリクローナルウサギ抗体に特異的なＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体を示すＩＦ画像である。図４１は、クローンＥ９０５およびＭｃｌ−１ポリクローナルウサギ抗体に特異的なＭｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体を示すＩＦ画像である。図４２は、クローン１５Ｄ０２およびＭｃｌ−１ポリクローナルウサギ抗体に特異的なＭｃｌ−１モノマーを示すＩＦ画像である。図４３は、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍヘテロ二量体抗体（ＨＳＭＣＢ）がＢｉｍをｉｎ  ｓｉｔｕで結合する必要があることを示すＩＦ画像である。
【０２６２】
一部の実施形態では、免疫されたマウスからヘテロ二量体抗体（例えば、Ｍｃｌ−１／Ｂｉｍ−ＢＨ３ヘテロ二量体抗体）を単離、選択、および精製することに関連する本開示の方法を、改変することができる。例えば、上記に記載されたように、ヘテロ二量体特異的抗体を含有する細胞を陽性選択カラムから溶出し採集する際に、ヘテロ二量体特異的抗体を含有する溶出された細胞を蛍光標識し（例えば、蛍光色素、タグ、プローブ）、その後に細胞の培養を行うことができる。一部の実施形態では、細胞は、共有結合のＭｃｌ−１−ＧＳＴ／Ｂｉｍ  ＢＨ３−  ＦＩＴＣにより標識されている。次いで、標識化細胞を、例えばフローサイトメトリーによってソーティングすることができ、最適なシグナルを提示するそれらの細胞を、フローサイトメトリー上でゲーティングして単離することができる。次いで、この工程を繰り返すことができ（すなわち、フローサイトメトリーから単離された細胞を培養した後、別ラウンドのフローサイトメトリーを行う）、最適な結合特性を提示する細胞を、上記に記載されたようにさらにクローニングすることができる。
【０２６３】
本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組合せで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同一、同等または類似の目的に適う代替的な特徴によって置き換えられうる。そのため、別途明示的に記述されない限り、開示された各特徴は、全体的な一連の同等または類似の特徴の一例に過ぎない。
【０２６４】
上記の説明から、当業者は、本開示の必須の特性を簡単に確かめることができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために本開示の様々な変更および修正を行うことができる。それゆえ、他の実施形態もまた特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月5日(2020.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021512288000001.app
【国際調査報告】
2021512288.tif 000071
2021512288.tif 000072
2021512288.tif 000073