(57)【要約】  本明細書に記載されるのは、それぞれが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体リガンド、例えばＡ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の細胞外ドメインの部分を含む、２つ以上の細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞を産生及び利用する方法である。本明細書に記載されるＣＡＲは、例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及び／又は膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）を標的とすることができる。さらに、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ標的化療法に対する抵抗性を克服し、最適な機能のための膜貫通型ドメインのダイマー形成及びトリマー形成を利用する。さらに、本発明は、がん（例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ））、形質細胞疾患若しくは障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植拒絶反応を処置する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）それぞれが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体リガンド又はその部分を含む２つ以上の細胞外ドメイン；
ｂ）膜貫通型ドメイン；及び
ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
【請求項２】
膜貫通型ドメインがヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項３】
一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項４】
ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドが、Ａ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項５】
ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドが、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＬＩＧＨＴ、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ）、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、核因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連の弱いアポトーシスの誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、カルシウム調節リガンド（ＣＡＭＬＧ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）関連タンパク質（ＧＩＴＲ）リガンド、又はエクトジスプラシンＡ２（ＥＤＡ−Ａ２）である、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項６】
２つ以上の細胞外ドメインがそれぞれ、同じＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも２つの細胞外ドメインがそれぞれ、異なるＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項８】
２つ以上の細胞外ドメインが、一又は複数のリンカー配列によって互いに連結されている、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項９】
各リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１０】
各リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１】
リーダー配列をさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１２】
リーダー配列がＣＤ８リーダー配列である、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１３】
ＣＤ８リーダー配列が、配列番号２０、２６、又は３２の配列を含む、請求項１２に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１４】
ＡＰＲＩＬの部分が、ＡＰＲＩＬのリジンリッチな領域を含まない、請求項４に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１５】
ＡＰＲＩＬの部分が、フリン切断部位を含まない、請求項４に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１６】
ＡＰＲＩＬの部分が、配列番号２１、２７、３３、又は４０の配列を含む、請求項４に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１７】
ヒンジ及び膜貫通型ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ及び膜貫通型ドメインを含む、請求項２に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１８】
ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通型ドメインが、配列番号２２又は４２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１９】
４−１ＢＢヒンジ及び膜貫通型ドメインが、配列番号２８又は３４のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項２０】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、又はＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項２１】
ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２４、３０、又は４４のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項２２】
ＣＤ３θ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項２３】
共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の細胞内ドメインを含む、請求項３に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項２４】
共刺激ドメインが、４−１ＢＢの細胞内ドメインである、請求項２３に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項２５】
４−１ＢＢの細胞内ドメインが、配列番号２３、２９、３５、又は４３のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項２６】
ＣＡＲポリペプチドが、それぞれがＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む３つの細胞外ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は配列番号４５の配列と少なくとも９５％の配列同一性を含む配列によってコードされる、ＣＡＲポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列を含むか、又は配列番号４５の配列によってコードされる、ＣＡＲポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列に対応する配列を含むか、又は配列番号４５の配列によってコードされる、ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１に記載のＣＡＲポリペプチドの２つ以上を含むポリペプチド複合体。
【請求項３１】
ポリペプチド複合体が、請求項１に記載の３つのＣＡＲポリペプチドを含む、請求項３０に記載のポリペプチド複合体。
【請求項３２】
ａ）請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド；
ｂ）請求項１に記載のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸；又は
ｃ）請求項１に記載のＣＡＲポリペプチドの２つ以上を含むポリペプチド複合体
を含む哺乳類細胞。
【請求項３３】
細胞が、Ｔ又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
細胞がヒト細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３５】
細胞が、がん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を有するか、或いは有すると診断された個体から得られる、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３６】
対象におけるがん、形質細胞障害、アミロイドーシス、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法であって、
ａ）Ｔ細胞表面上に請求項１に記載のＣＡＲポリペプチドを含むようにＴ細胞を操作すること；及び
ｂ）操作されたＴ細胞を対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項３７】
対象におけるがん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法であって、請求項３２に記載の細胞を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
いくつかの実施態様において、がんは、ＢＡＦＦ＋、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）＋及び／又は膜貫通活性化因子及びカルシウム調節リガンド（ＣＡＭＬ）相互作用物質（ＴＡＣＩ）＋である、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
対象が、抗ＢＣＭＡ療法をさらに投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４０】
対象が、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４１】
がんが、多発性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４２】
自己免疫疾患が、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４３】
対象が、高レベルの抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体を有する、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４４】
がんの処置のため製剤された、請求項１に記載のＣＡＲポリペプチドを含む組成物。
【請求項４５】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である対象を処置する方法であって、ＣＡＲ及び／又はＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、ここでＣＡＲは、２つ以上のＡＰＲＩＬドメインを含む細胞外標的結合ドメインを含む、方法。
【請求項４７】
対象が、がん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
がんが、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを発現する細胞を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
がんが、ＢＣＭＡ発現が低下した細胞を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
がんが、骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
がんが、多発性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
形質細胞障害がアミロイドーシスである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
自己免疫疾患又は障害が、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
対象が、高レベルの抗ＨＬＡ抗体を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
ＣＡＲが、膜貫通型ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
ＣＡＲが、一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
膜貫通型ドメインが、ヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ヒンジ／膜貫通型ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ヒンジ／膜貫通型ドメインが、任意選択的に配列番号２２又は４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ヒンジ／膜貫通型ドメインが、任意選択的に配列番号２８又は３４のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
細胞内シグナル伝達ドメインが、任意選択的に配列番号２４、３０、又は４４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
細胞内シグナル伝達ドメインが、任意選択的に配列番号３６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ４０の共刺激ドメインを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
共刺激ドメインが、任意選択的に配列番号２３、２９、３５、又は４３のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
各ＡＰＲＩＬドメインが、配列番号２１、２７、３３、又は４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６７】
各ＡＰＲＩＬドメインが、配列番号２１、２７、３３、又は４０のアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＡＰＲＩＬドメインが、一又は複数のリンカー配列によって互いに連結されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項６９】
リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
細胞外標的結合ドメインが３つのＡＰＲＩＬドメインを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７２】
細胞外標的結合ドメインが、配列番号５６又は５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７３】
細胞外標的結合ドメインが、配列番号５６又は５９のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７４】
ＣＡＲが、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７５】
ＣＡＲが、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７６】
ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、自殺遺伝子をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７７】
ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、シグナル配列をコードする配列をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７８】
免疫細胞がＴ又はＮＫ細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項７９】
免疫細胞がヒト細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項８０】
３つのＡＰＲＩＬドメインを含む細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲ。
【請求項８１】
ＣＡＲが、膜貫通型ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項８０に記載のＣＡＲ。
【請求項８２】
ＣＡＲが、一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む、請求項８１に記載のＣＡＲ。
【請求項８３】
膜貫通型ドメインが、ヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項８１に記載のＣＡＲ。
【請求項８４】
ヒンジ／膜貫通型ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項８３に記載のＣＡＲ。
【請求項８５】
ヒンジ／膜貫通型ドメインが、任意選択的に配列番号２２又は４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項８４に記載のＣＡＲ。
【請求項８６】
ヒンジ／膜貫通型ドメインが、任意選択的に配列番号２８又は３４のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、請求項８４に記載のＣＡＲ。
【請求項８７】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項８１に記載のＣＡＲ。
【請求項８８】
細胞内シグナル伝達ドメインが、任意選択的に配列番号２４、３０、又は４４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項８７に記載のＣＡＲ。
【請求項８９】
細胞内シグナル伝達ドメインが、任意選択的に配列番号３６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項８７に記載のＣＡＲ。
【請求項９０】
共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ４０の共刺激ドメインを含む、請求項８２に記載のＣＡＲ。
【請求項９１】
共刺激ドメインが、任意選択的に配列番号２３、２９、３５、又は４３のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む、請求項９０に記載のＣＡＲ。
【請求項９２】
各ＡＰＲＩＬドメインが、配列番号２１、２７、３３、又は４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載のＣＡＲ。
【請求項９３】
各ＡＰＲＩＬドメインが、配列番号２１、２７、３３、又は４０のアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載のＣＡＲ。
【請求項９４】
ＡＰＲＩＬドメインが、一又は複数のリンカー配列によって互いに連結されている、請求項８０に記載のＣＡＲ。
【請求項９５】
リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載のＣＡＲ。
【請求項９６】
リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列を含む、請求項９５に記載のＣＡＲ。
【請求項９７】
細胞外標的結合ドメインが、配列番号５６又は５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載のＣＡＲ。
【請求項９８】
細胞外標的結合ドメインが、配列番号５６又は５９のアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載のＣＡＲ。
【請求項９９】
ＣＡＲが、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載のＣＡＲ。
【請求項１００】
ＣＡＲが、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載のＣＡＲ。
【請求項１０１】
配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲ。
【請求項１０２】
配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列を含むＣＡＲ。
【請求項１０３】
請求項８０に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
自殺遺伝子をさらに含む、請求項１０３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
シグナル配列をコードする配列をさらに含む、請求項１０３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
請求項８０に記載のＣＡＲ及び／又はＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
【請求項１０７】
免疫細胞がＴ又はＮＫ細胞である、請求項１０６に記載の免疫細胞。
【請求項１０８】
免疫細胞がヒト細胞である、請求項１０６に記載の免疫細胞。
【請求項１０９】
請求項８０に記載のＣＡＲを含む薬学的組成物。
【請求項１１０】
対象におけるがん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法であって、請求項１０６に記載の免疫細胞及び／又はその薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１１】
がんが、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを発現する細胞を含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
がんが、ＢＣＭＡ発現が低下した細胞を含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
対象が、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
がんが、骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
骨髄腫が、多発性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
形質細胞障害がアミロイドーシスである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１７】
自己免疫疾患又は障害が、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１８】
対象が、高レベルの抗ＨＬＡ抗体を有する、請求項１１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１８年１月１０日に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１３２２１、２０１８年２月１２日に提出された米国仮出願番号６２／６２９５５８、２０１８年１１月２７日に提出された６２／７７１９９８、及び２０１８年１１月２９日に提出された６２／７７３００１に基づく優先権を主張し、これらの内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
【０００２】
本明細書に記載される技術は、免疫療法に関する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が出典明示により本明細書に援用される。ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１月１０日に作成され、５１２９５−０１２ＷＯ４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１．１０．１９＿ＳＴ２５と命名され、大きさは８３，４０２バイトである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、選択された標的抗原、ほとんどの場合、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原を発現する標的細胞へと、細胞傷害性Ｔ細胞応答を指向化させる方法をもたらす。ＣＡＲは、抗原結合ドメインが、例えば、由来標的抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインで置き換えられている、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の適応である。Ｔ細胞上で発現されたＣＡＲ（「ＣＡＲ  Ｔ細胞」）による標的細胞の表面上での標的抗原の結合は、標的細胞の殺傷を促進する。
【０００５】
多発性骨髄腫は、全ての血液悪性腫瘍の約１３％を占め、骨髄中の形質細胞のモノクローナル増殖の結果であり、パラプロテインの産生につながる。患者はほとんどの場合、痛みを伴う骨病変、貧血、高カルシウム血症、及び腎障害を示す。全身処置ための標準治療は現在、化学療法、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）、プロテアソーム阻害剤、及び自家幹細胞移植で構成されている。近年の治療の進歩にもかかわらず、難治性を増す疾患の再発は依然として一般的である。したがって、多発性骨髄腫の改善された治療に対する満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、がんの処置において良好な兆候を示す最前線の治療である。そのような治療は、様々な非固形がん、例えば、白血病、リンパ腫及び骨髄腫に対して特に有効であることが証明されている。規定の疾患又は障害についてのＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するという最大の課題の１つは、サイトカイン放出症候群のような非特異的かつ全身的な作用からの副作用を克服することである。サイトカイン放出症候群は、一般に、処置可能である一方、この合併症のための処置が、ＣＡＲ  Ｔ細胞処置の有効性及び／又は長期持続効果を制限し得るという懸念が存在する。
【０００７】
ＣＡＲ  Ｔ療法設計で遭遇する別の問題は、ＣＡＲにより認識される標的抗原又は腫瘍関連因子の喪失を通じた腫瘍回避である。腫瘍が、標的抗原若しくは因子の細胞表面発現をダウンレギュレーションするか、又はそうでなければ喪失させるとき、それは、もはや、その抗原又は因子を標的にするよう設計されたＣＡＲ  Ｔ細胞により効率的に攻撃されない。これは、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫において発現される、例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的にするＣＡＲ  Ｔ療法において観察されている。
【０００８】
非特異的な効果を回避し、標的抗原の喪失による腫瘍回避の可能性を低減するＣＡＲ設計における改善が、本明細書に記載される。
【０００９】
したがって、本明細書に記載される本発明の１つの態様は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む一又は複数の細胞外ドメイン；ヒンジ及び膜貫通型ドメイン；共刺激ドメイン；並びに細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関する。１つの実施態様において、２種の異なる腫瘍関連抗原又は因子に結合する単一リガンドを使用する、ＢＣＭＡ関連タンパク質を腫瘍関連標的の例として使用して示されたアプローチが、本明細書に記載される。いくつかの実施態様において、単一リガンドは、本質的には、当該技術分野において公知のＣＡＲの場合と同様に、膜貫通型及びＴ細胞受容体細胞内エフェクタードメインに、任意選択的に共刺激ドメインを伴って、融合される。単一抗原の代わりに、２種の異なる腫瘍関連抗原又は因子に結合するリガンドを有することは、抗原若しくは因子の一方又は他方が、腫瘍細胞によりダウンレギュレーションされても、ＣＡＲは有効性を喪失しないことを意味する。これは、別の腫瘍関連抗原又は因子であるＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方に高い親和性で結合する、ＡＰＲＩＬ（Ａ増殖誘導リガンド）ポリペプチドの部分をリガンドとして使用して、本明細書において説明される。本明細書に記載される態様の何れかのいくつかの実施態様において、リガンドは、例えば、自己オリゴマー形成により、オリゴマー形成する（例えば、ダイマー形成するか、又はトリマー形成する）。例えば、いくつかの実施態様において、リガンドは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分である。いくつかの態様において、ＣＡＲ設計は、１を超えるリガンド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のリガンド）を含む。
【００１０】
したがって、本明細書に記載される本発明の１つの態様は、内在性切断部位のＮ末端である、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む細胞外ドメイン、ヒンジ及び膜貫通型ドメイン、共刺激ドメイン、並びに細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲポリペプチドに関する。１つの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＡＰＲＩＬである。他の実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１５４、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＬＩＧＨＴ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、ＴＬ１Ａ、又はＥＤＡ−Ａ２である。
【００１１】
したがって、本明細書に記載される本発明の１つの態様は、内在性切断部位のＮ末端である、ＡＰＲＩＬの部分を含む細胞外ドメイン、ヒンジ及び膜貫通型ドメイン、共刺激ドメイン、並びに細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲポリペプチドに関する。
【００１２】
任意の態様の１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ８リーダー配列をさらに含む。１つの実施態様において、ＣＤ８リーダー配列は、配列番号２０、２６、若しくは３２から選択される配列を含むか、又は配列番号２、８、９、若しくは１４から選択される配列を含む核酸によりコードされる。
【００１３】
１つの実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、配列番号２１、２７、若しくは３３から選択される配列を含むか、又は配列番号３、９、若しくは１５から選択される配列を含む核酸によりコードされる。任意の態様の１つの実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、ＡＰＲＩＬのリジンリッチな領域を含まない。
【００１４】
任意の態様の１つの実施態様において、ヒンジ及び膜貫通型ドメインは、ＣＤ８又は４−１ＢＢのヒンジ及び膜貫通型ドメインを含む。１つの実施態様において、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通型ドメイン配列は、配列番号２２の配列を含むか、又は配列番号４の配列を含む核酸によりコードされる。１つの実施態様において、４−１ＢＢヒンジ及び膜貫通型ドメイン配列は、配列番号２８若しくは３４から選択されるか、又は配列番号１０若しくは１６の配列を含む核酸によりコードされる。
【００１５】
任意の態様の１つの実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３エータ、又はＣＤ３シータのシグナル伝達ドメインを含む。１つの実施態様において、ＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン配列は、配列番号２４若しくは３０から選択されるか、又は配列番号６若しくは１２の配列を含む核酸によりコードされる。１つの実施態様において、ＣＤ３シータ細胞内シグナル伝達ドメイン配列は、配列番号３６の配列を含むか、又は配列番号１８の配列を含む核酸によりコードされる。
【００１６】
任意の態様の１つの実施態様において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、ＣＤ２８  ＩＣＤ、ＣＤ２７  ＩＣＤ、ＩＣＯＳ  ＩＣＤ、又はＯＸ４０  ＩＣＤである。１つの実施態様において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ  ＩＣＤである。１つの実施態様において、４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列は、配列番号２３、２９、若しくは３５から選択される配列を含むか、又は配列番号５、１１、若しくは１７の配列を含む核酸によりコードされる。
【００１７】
任意の態様の１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上）の細胞外ドメインを含む。１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む３つの細胞外ドメインを含む。
【００１８】
本明細書に記載される本発明の別の態様は、配列番号１９、２５、若しくは３１から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を含むか、又は配列番号１、７、若しくは１３から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を含む配列によりコートされる、ＣＡＲポリペプチドに関する。
【００１９】
本明細書に記載される本発明の別の態様は、配列番号１９、２５、若しくは３１から選択される配列を含むか、又は配列番号１、７、若しくは１３から選択される配列によりコードされる、ＣＡＲポリペプチドに関する。
【００２０】
本明細書に記載される本発明の別の態様は、配列番号１９、２５、若しくは３１から選択される配列に対応する配列を含むか、又は配列番号１、７、若しくは１３から選択される配列によりコードされる、ＣＡＲポリペプチドに関する。
【００２１】
本明細書に記載される本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかのうちの２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上）を含むポリペプチド複合体に関する。１つの実施態様において、ポリペプチド複合体は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかのうち３つを含む。
【００２２】
本明細書に記載される本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れか；本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかをコードする核酸；又は本明細書に記載されるポリペプチド複合体の何れかを含む哺乳類細胞に関する。
【００２３】
任意の態様の１つの実施態様において、細胞は、Ｔ細胞である。１つの実施態様において、細胞は、ヒト細胞である。１つの実施態様において、細胞は、がん、形質細胞障害、若しくは自己免疫疾患を有するか、又は有すると診断された個体から得られる。
【００２４】
本明細書に記載される本発明の別の態様は、対象においてがん、形質細胞障害、アミロイドーシス、又は自己免疫疾患を処置する方法であって、Ｔ細胞を操作して、Ｔ細胞表面上に本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかを含ませること；操作されたＴ細胞を対象に投与することを含む方法に関する。
【００２５】
本明細書に記載される本発明の別の態様は、対象においてがん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患を処置する方法であって、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れか、又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかをコードする核酸を含む細胞を投与することを含む方法に関する。
【００２６】
任意の態様の１つの実施態様において、がんは、ＢＡＦＦ＋、ＢＣＭＡ＋及び／又はＴＡＣＩ＋である。１つの実施態様において、がんは、多発性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫である。
【００２７】
任意の態様の１つの実施態様において、対象は、抗ＢＣＭＡ療法をさらに投与される。１つの実施態様において、対象は、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である。
【００２８】
任意の態様の１つの実施態様において、自己免疫疾患は、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される。
【００２９】
本明細書に記載されるテクノロジーの別の態様は、がんの処置のため製剤された本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含む組成物に関する。１つの実施態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００３０】
本明細書に記載されるテクノロジーの別の態様は、がんの処置のため製剤された本明細書に記載されるタンパク質複合体を含む組成物に関する。１つの実施態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００３１】
本明細書に記載されるテクノロジーの別の態様は、がんの処置のため製剤された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物に関する。１つの実施態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００３２】
さらに他の態様において、本発明は、ａ）各々が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む２つ以上の細胞外ドメイン；ｂ）ヒンジ及び膜貫通型ドメイン；ｃ）共刺激ドメイン；並びにｄ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを特徴とする。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ａ）各々が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体リガンド又はその部分を含む２つ以上の細胞外ドメイン；ｂ）膜貫通型ドメイン；及びｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを特徴とする。いくつかの実施態様において、膜貫通型ドメインは、ヒンジ／膜貫通型ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む。
【００３４】
１つの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、Ａ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である。さらなる実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＬＩＧＨＴ、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ）、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、核因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連の弱いアポトーシスの誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、カルシウム調節リガンド（ＣＡＭＬＧ又はＣＡＭＬ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）関連タンパク質（ＧＩＴＲ）リガンド、又はエクトジスプラシンＡ２（ＥＤＡ−Ａ２）である。
【００３５】
いくつかの実施態様において、２つ以上の細胞外ドメインはそれぞれ、同じＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む。さらに他の実施態様において、少なくとも２つの細胞外ドメインはそれぞれ、異なるＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む。
【００３６】
さらなる実施態様において、２つ以上の細胞外ドメインは、一又は複数のリンカー配列、例えば、配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むリンカー配列、又は、配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３のアミノ酸配列を含むリンカー配列によって互いに連結されている。
【００３７】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、リーダー配列、例えば、ＣＤ８リーダー配列をさらに含む。特定の実施態様において、ＣＤ８リーダー配列は、配列番号２０、２６、若しくは３２の配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含み、又は配列番号２０、２６、若しくは３２の配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、ＡＰＲＩＬのリジンリッチな領域（例えば、配列番号３８のリジンリッチ配列）を含まない。なおさらなる実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、フリン切断部位（例えば、配列番号６６又は６７のフリン切断部位）を含まない。特定の実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、配列番号２１、２７、３３、若しくは４０の配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含み、又は配列番号２１、２７、３３、若しくは４０の配列を含む。
【００３９】
さらなる実施態様において、ヒンジ及び膜貫通型ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８又は４−１ＢＢのヒンジ及び膜貫通型ドメインを含む。特定の実施態様において、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通型ドメインは、配列番号２２若しくは４２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２２若しくは４２のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、４−１ＢＢヒンジ及び膜貫通型ドメインは、配列番号２８若しくは３４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２８若しくは３４のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、又はＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２４、３０若しくは４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２４、３０若しくは４４のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、ＣＤ３θ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
さらなる実施態様において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の細胞内ドメインを含む。特定の実施態様において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢの細胞内ドメインであり、例えば、ここで、４−１ＢＢの細胞内ドメインは、配列番号２３、２９、３５、若しくは４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２３、２９、３５、若しくは４３のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
特定の実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、各々がＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む３つの細胞外ドメイン（例えば、３つのＡＰＲＩＬドメイン、本明細書ではＴｒｉＰＲＩＬとも呼ばれる）を含む。
【００４３】
別の態様において、本発明は、配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を含むか、又は配列番号４５の配列と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を含む配列によってコードされるＣＡＲポリペプチドを特徴とする。
【００４４】
別の態様では、本発明は、配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列を含むか、又は配列番号４５の配列によってコードされるＣＡＲポリペプチドを特徴とする。
【００４５】
別の態様では、本発明は、配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列に対応する配列を含むか、又は配列番号４５の配列によってコードされるＣＡＲポリペプチドを特徴とする。
【００４６】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれか１つのＣＡＲポリペプチドの２つ以上を含むポリペプチド複合体を特徴とする。いくつかの実施態様において、ポリペプチド複合体は、前述の態様のいずれか１つのうちのいずれか１つの３つのＣＡＲポリペプチドを含む。
【００４７】
別の態様において、本発明は、以下を含む哺乳類細胞を特徴とする：ａ）前述の態様のいずれか１つのＣＡＲポリペプチド；ｂ）前述の態様のいずれか１つのＣＡＲポリペプチドをコードする核酸；又はｃ）前述の態様のいずれか１つのＣＡＲポリペプチドの２つ以上（例えば３つ）を含むポリペプチド複合体。
【００４８】
いくつかの実施態様において、細胞は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は、がん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を有するか、或いは有すると診断された個体から得られる。
【００４９】
別の態様において、本発明は、対象におけるがん、形質細胞障害、アミロイドーシス、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法を特徴とし、この方法は、以下：ａ）Ｔ又はＮＫ細胞表面上に前述の態様のいずれか１つのＣＡＲを含むようにＴ又はＮＫ細胞を操作すること；及びｂ）操作されたＴ又はＮＫ細胞を対象に投与することを含む。
【００５０】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれか１つの細胞を対象に投与することを含む、対象を処置する方法を特徴とする。いくつかの実施態様において、対象は、がん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を有する。
【００５１】
いくつかの実施態様において、がんは、ＢＡＦＦ＋、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）＋及び／又は膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）＋である。いくつかの実施態様において、対象は、抗ＢＣＭＡ療法をさらに投与される。さらなる実施態様において、対象は、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である。
【００５２】
特定の実施態様において、がんは、多発性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である。
【００５３】
さらに他の実施態様において、自己免疫疾患は、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される。
【００５４】
さらなる実施態様において、対象は、高レベルの抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体を有する。
【００５５】
別の態様において、本発明は、ＣＡＲポリペプチド、ポリペプチド複合体、又はがんの処置のために製剤された前述の態様のいずれか１つの細胞を含む組成物を特徴とする。いくつかの実施態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００５６】
他の態様において、本発明は、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性のある対象におけるがん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法であって、ＣＡＲ及び／又はＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、ここでＣＡＲは、２つ以上のＡＰＲＩＬドメインを含む細胞外標的結合ドメインを含む、方法を特徴とする。
【００５７】
いくつかの実施態様において、がんは、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを発現する細胞を含む。いくつかの実施態様において、がんは、ＢＣＭＡ発現が低下した細胞を含む。いくつかの実施態様において、がんは、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫）又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である。
【００５８】
他の実施態様において、形質細胞障害はアミロイドーシスである。
【００５９】
いくつかの実施態様において、自己免疫疾患又は障害は、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される。
【００６０】
さらなる実施態様において、対象は、高レベルの抗ＨＬＡ抗体を有する。
【００６１】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲは膜貫通型ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。さらなる実施態様において、ＣＡＲは、一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む。
【００６２】
いくつかの実施態様において、膜貫通型ドメインは、ヒンジ／膜貫通型ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ヒンジ／膜貫通型ドメインは、免疫グロブリン様タンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む。特定の実施態様において、ヒンジ／膜貫通型ドメインは、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通型ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号２２若しくは４２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２２若しくは４２のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、ヒンジ／膜貫通型ドメインは、４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号２８若しくは３４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２８若しくは３４のアミノ酸配列を含む。
【００６３】
さらなる実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号２４、３０、若しくは４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２４、３０、若しくは４４のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施態様において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ４０の共刺激ドメインを含む。特定の実施態様において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号２３、２９、３５、若しくは４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２３、２９、３５、若しくは４３のアミノ酸配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施態様において、各ＡＰＲＩＬドメインは、配列番号２１、２７、３３、若しくは４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２１、２７、３３、若しくは４０のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
さらなる実施態様において、ＡＰＲＩＬドメインは、一又は複数のリンカー配列によって互いに連結されている。いくつかの実施態様において、リンカー配列は、配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３のアミノ酸配列を含む。
【００６７】
特定の実施態様において、細胞外標的結合ドメインは、３つのＡＰＲＩＬドメインを含む。いくつかの実施態様において、細胞外標的結合ドメインは、配列番号５６若しくは５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号５６若しくは５９のアミノ酸配列を含む。
【００６８】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲは、配列番号３９、５７、６４、若しくは６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３９、５７、６４、若しくは６５のアミノ酸配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、自殺遺伝子をさらに含む。さらなる実施態様において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、シグナル配列をコードする配列をさらに含む。
【００７０】
さらなる実施態様において、免疫細胞は、Ｔ又はＮＫ細胞、例えば、ヒト細胞である。
【００７１】
別の態様において、本発明は、３つのＡＰＲＩＬドメインを含む細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲを特徴とする。
【００７２】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲは膜貫通型ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。さらなる実施態様において、ＣＡＲは、一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む。
【００７３】
いくつかの実施態様において、膜貫通型ドメインは、ヒンジ／膜貫通型ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ヒンジ／膜貫通型ドメインは、免疫グロブリン様タンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む。特定の実施態様において、ヒンジ／膜貫通型ドメインは、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通型ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号２２若しくは４２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２２若しくは４２のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、ヒンジ／膜貫通型ドメインは、４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号２８若しくは３４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２８若しくは３４のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
さらなる実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号２４、３０、若しくは４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２４、３０、若しくは４４のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施態様において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ４０の共刺激ドメインを含む。特定の実施態様において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含み、これは任意選択的に、配列番号２３、２９、３５、若しくは４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２３、２９、３５、若しくは４３のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
いくつかの実施態様において、各ＡＰＲＩＬドメインは、配列番号２１、２７、３３、若しくは４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２１、２７、３３、若しくは４０のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
さらなる実施態様において、ＡＰＲＩＬドメインは、一又は複数のリンカー配列によって互いに連結されている。いくつかの実施態様において、リンカー配列は、配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
特定の実施態様において、細胞外標的結合ドメインは、３つのＡＰＲＩＬドメインを含む。いくつかの実施態様において、細胞外標的結合ドメインは、配列番号５６若しくは５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号５６若しくは５９のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
特定の実施態様において、ＣＡＲは、配列番号３９、５７、６４、若しくは６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３９、５７、６４、若しくは６５のアミノ酸配列を含む。
【００８０】
別の態様において、本発明は、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲを特徴とする。
【００８１】
別の態様において、本発明は、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列を含むＣＡＲを特徴とする。
【００８２】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれか１つのＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを特徴とする。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子をさらに含む。さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドは、シグナル配列をコードする配列をさらに含む。
【００８３】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれか１つのＣＡＲ及び／又はポリヌクレオチドを含む免疫細胞を特徴とする。
【００８４】
いくつかの実施態様において、免疫細胞は、Ｔ又はＮＫ細胞、例えば、ヒト細胞である。
【００８５】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれか１つのＣＡＲ、ポリヌクレオチド、及び／又は免疫細胞を含む薬学的組成物を特徴とする。
【００８６】
別の態様では、本発明は、対象におけるがん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法であって、前述の態様の免疫細胞及び／又は薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を特徴とする。
【００８７】
いくつかの実施態様において、がんは、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを発現する細胞を含む。いくつかの実施態様において、がんは、ＢＣＭＡ発現が低下した細胞を含む。さらなる実施態様において、対象は、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である。特定の実施態様において、がんは、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫）又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である。
【００８８】
他の実施態様において、形質細胞障害はアミロイドーシスである。いくつかの実施態様において、自己免疫疾患又は障害は、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される。さらなる実施態様において、対象は、高レベルの抗ＨＬＡ抗体を有する。
【００８９】
定義
便宜上、明細書、実施例、及び添付の請求の範囲において使用されるいくつかの用語並びに語句の意味が、以下で提供される。別段示されないか、又は文脈から暗に示されていない限り、次の用語及び語句は、以下で提供される意味を含む。定義は、特定の実施態様を記載するのに役立つよう提供され、テクノロジーの範囲は、請求項によってのみ制限されるので、請求されたテクノロジーを制限することは意図されない。別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本テクノロジーが属する当該技術分野における当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。当該技術分野における用語の使用と本明細書におけるその定義の間に明らかな食い違いが存在するなら、明細書内で提供される定義が優先する。
【００９０】
免疫学及び分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．により２０１１年に出版された、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１９編（ＩＳＢＮ  ９７８−０−９１１９１０−１９−３）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により１９９９−２０１２年に出版された、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．  Ｐｏｒｔｅｒ等（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＳＢＮ９７８３５２７６００９０８）；及びＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により１９９５年に出版された、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）；Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより２００６年に出版された、Ｗｅｒｎｅｒ  ＬｕｔｔｍａｎｎによるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ、Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ、Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（編）、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、２０１４年（ＩＳＢＮ  ０８１５３４５３０５、９７８０８１５３４５３０５）；Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより２０１４年に出版されたＬｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ及びＪｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ（２０１２年）（ＩＳＢＮ１９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ等、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、米国（２０１２年）（ＩＳＢＮ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ、Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２０１３年（ＩＳＢＮ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ）、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２０１４年（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ、９７８０４７１５０３３８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）、Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、２００５年；並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ（編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、２００３年（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５、９７８０４７１１４２７３７）において見られ、それらの内容は、それらの全体が出典明示により本明細書に全て援用される。
【００９１】
用語「ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体に結合するリガンドに関する。ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、非共有結合性オリゴマー（例えば、トリマー）として活性であり得る。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ホモオリゴマー（例えば、ホモトリマー）として活性である。しかしながら、いくつかのＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＢＡＦＦを含む、ヘテロオリゴマー（例えば、ヘテロトリマー）として活性であり得、それは、ＡＰＲＩＬを有するヘテロオリゴマーを形成し得る。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、Ａｇｇａｒｗａｌ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、３：７４５−７５６、２００３年又はＣｒｏｆｔ等、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、９（４）：２７１−２８５、２００９年に記載されるものである。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＬＩＧＨＴ、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ）、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、核因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連の弱いアポトーシスの誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＬＩＧＨＴ、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、カルシウム調節リガンド（ＣＡＭＬＧ又はＣＡＭＬ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）関連タンパク質（ＧＩＴＲ）リガンド、ＴＬ１Ａ、又はエクトジスプラシンＡ２（ＥＤＡ−Ａ２）である。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、上記のＡｇｇａｒｗａｌ、又は上記のＣｒｏｆｔ等に記載されているＴＮＦスーパーファミリー受容体、例えば、腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）、ＣＤ９５、デコイ受容体３（ＤＣＲ３）、細胞死受容体３（ＤＲ３）、細胞死受容体４（ＤＲ４）、細胞死受容体５（ＤＲ５）、デコイ受容体１（ＤＣＲ１）、デコイ受容体２（ＤＣＲ２）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、エクトジスプラシンＡ受容体（ＥＤＡＲ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、核因子カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）、リンホトキシンベータ受容体（ＬＴｂｅｔａＲ）、線維芽細胞成長因子誘導性１４（ＦＮ１４）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通型活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦＲ）、Ｘ結合エクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ）、ＴＲＯＹ、又はリンパ組織で発現する受容体（ＲＥＬＴ）に結合する。
【００９２】
用語「部分」は、ポリペプチド、例えば、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ）の一部を指す。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分は、内在性切断部位のＮ末端であり、少なくともＴＮＦ様ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分は、オリゴマー形成（例えば、ダイマー形成又はトリマー形成）する能力がある。オリゴマー形成は、ホモオリゴマー形成又はヘテロオリゴマー形成であってもよい。特定の実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分は、切断型ＡＰＲＩＬなどのＡＰＲＩＬの部分である。典型的な切断型ＡＰＲＩＬは、配列番号２１、２７、３３、及び４０に示されている。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＡＰＲＩＬドメイン」とは、ＣＡＲポリペプチドに組み込まれる、ＡＰＲＩＬの完全長配列又はその部分を指す。「ＡＰＲＩＬドメイン」は、ＡＰＲＩＬの完全長配列と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個のアミノ酸置換若しくは欠損を有するアミノ酸配列、若しくはその部分、又は配列番号２１、２７、３３、４０、若しくは６０の配列と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個のアミノ酸置換若しくは欠損を有するアミノ酸配列も指す。「ＡＰＲＩＬドメイン」はさらに、ＡＰＲＩＬの完全長配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくはその部分、又は配列番号２１、２７、３３、４０、若しくは６０のＡＰＲＩＬ配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９４】
用語「減少する」、「低減した」、「低減」、又は「阻害する」は、全て、統計上有意な量での減少を意味するために本明細書において使用される。いくつかの実施態様において、「低減する」、「低減」又は「減少する」又は「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、規定の処置又は薬剤の不存在）と比較して少なくとも１０％での減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％以上での減少を含み得る。本明細書において使用される、「低減」又は「阻害」は、参照レベルと比較して完全な阻害又は低減を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較して１００％の阻害である。適用できる場合、減少は、好ましくは、規定の障害を有さない個体についての正常な範囲内として許容されるレベルまで下げられ得る。
【００９５】
用語「増大した」、「増大させる」、「増強する」、又は「活性化する」は、全て、統計上有意な量での増大を意味するために本明細書において使用される。いくつかの実施態様において、用語「増大した」、「増大させる」、「増強する」、又は「活性化する」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増大、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％の増大、又は１００％以下の増大若しくは１０−１００％の任意の増大、或いは参照レベルと比較して少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍、若しくは少なくとも約１０倍の増大、又は２倍から１０倍以上の任意の増大を意味し得る。マーカー又は症状の文脈において、「増大」は、かかるレベルにおける統計上有意な増大である。
【００９６】
本明細書において使用される、「対象」は、ヒト又は動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜又は狩猟動物のような脊椎動物である。霊長類は、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルを含む。げっ歯類は、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターを含む。家畜又は狩猟動物は、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼育ネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、オーストリッチ、並びに魚、例えば、マス、ナマズ及びサケを含む。いくつかの実施態様において、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。用語「個体」、「患者」及び「対象」は、本明細書において互換的に使用される。
【００９７】
好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、疾患、例えば、がんの動物モデルを表す対象として有利に使用され得る。対象は、オス又はメスであり得る。
【００９８】
対象は、既に、処置の必要な状態（例えば、特に、白血病若しくは別の種類のがん）又はかかる状態に関連する一若しくは複数の合併症に罹患しているか或いは有すると診断されたか、或いは同定されたもの、及び任意選択的に、状態又は状態と関連する一若しくは複数の合併症のための処置を既に経験したものであり得る。或いは、対象はまた、かかる状態又は関連する合併症を有すると以前に診断されていないものであり得る。例えば、対象は、状態又は状態と関連する一若しくは複数の合併症についての一或いは複数のリスク因子を示すもの、或いはリスク因子を示さない対象であり得る。
【００９９】
特定の状態のための処置を「必要とする対象」は、その状態を有する、その状態を有すると診断された、又はその状態を発症するリスクのある対象であり得る。
【０１００】
「疾患」は、動物が、ホメオスタシスを維持することができず、疾患が改善されないなら、次に、動物の健康が悪化し続ける、動物、例えば、ヒトの健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、動物がホメオスタシスを維持できるが、動物の健康状態が、障害の非存在下にあるよりあまり好ましくない、健康状態である。未処置のままでいると、障害は、必ずしも、動物の健康状態においてさらなる減少を引き起こさない。
【０１０１】
本明細書において使用される、用語「腫瘍抗原」及び「がん抗原」を互換的に使用して、がん細胞により異なって発現され、それにより、がん細胞を標的にするために利用され得る抗原を指す。がん抗原は、潜在的に、腫瘍特異的な免疫応答を明らかに刺激し得る抗原である。これらの抗原のいくつかは、正常細胞により必ずしも発現されないが、正常細胞によりコードされる。これらの抗原は、正常細胞において通常サイレントである（すなわち、発現されない）もの、分化のある特定のステージでのみ発現されもの並びに胚及び胎児抗原のような、一時的に発現されるものとして特徴付けられ得る。他のがん抗原は、がん遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓがん遺伝子）のような変異細胞遺伝子、抑制遺伝子（例えば、変異ｐ５３）、及び内部の欠損又は染色体転座から生じる融合タンパク質によりコードされる。さらに他のがん抗原は、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルス上に担持されるもののような、ウイルス遺伝子によりコードされ得る。多くの腫瘍抗原は、複数の固形腫瘍：免疫により定義されるＭＡＧＥ１、２、及び３；ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２、ムチン（すなわち、ＭＵＣ−１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、並びに前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）に関して同定された。加えて、肝炎Ｂ（ＨＢＶ）、エプスタイン・バー（ＥＢＶ）、及びヒトパピローマ（ＨＰＶ）によりコードされるいくつかのようなウイルスタンパク質は、それぞれ、肝細胞癌、リンパ腫、及び子宮頚がんの発症において重要であると示されている。
【０１０２】
本明細書において使用される、用語「キメラ」は、少なくとも２種以上の異なるポリヌクレオチド分子の部分の融合の産物を指す。１つの実施態様において、用語「キメラ」は、公知のエレメント又は他のポリヌクレオチド分子の操作を通じて産生される遺伝子発現エレメントを指す。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指すことができる。いくつかの実施態様において、活性化は、誘導されたサイトカイン産生を指すことができる。他の実施態様において、活性化は、検出可能なエフェクター機能を指すことができる。少なくとも、本明細書において使用される「活性化されたＴ細胞」は、増殖性Ｔ細胞である。
【０１０４】
本明細書において使用される、用語「特異的な結合」及び「特異的に結合する」は、第１の実体が、第２の、標的、実体に、標的でない第３の実体に結合するより高い特異性及び親和性で結合する、２種の分子、化合物、細胞並びに／又は粒子間の物理的相互作用を指す。いくつかの実施態様において、特異的な結合は、同じ状態下で第３の非標的実体についての親和性より少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上高い、第２の標的、実体についての第１の実体の親和性を指すことができる。規定の標的に特異的な試薬は、利用されるアッセイ条件下でその標的についての特異的な結合を示すものである。非限定的な例は、コグネート結合パートナー（例えば、Ｔ細胞上に存在する刺激及び／若しくは共刺激分子）タンパク質を認識し、結合する、抗体、又はリガンドを含む。
【０１０５】
本明細書において使用される「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、人工ＡＰＣ等）上に存在するとき、Ｔ細胞上のコグネート結合パートナー（本明細書において「刺激分子」又は「共刺激分子」として言及される）と特異的に結合し、これにより、増殖、活性化、免疫応答の開始等を含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞による一次応答を仲介し得るリガンドを指す。刺激リガンドは、当該技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチド、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体をロードされたＭＨＣクラスＩ分子を包含する。
【０１０６】
本明細書において使用される用語としての「刺激分子」は、抗原提示細胞上に存在するコグネート刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【０１０７】
本明細書において使用される用語としての「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上のコグネート共刺激分子に特異的に結合し、これにより、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のペプチドをロードされたＭＨＣ分子との結合によりもたらされる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化等を含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞応答を仲介する、ＡＰＣ上の分子を含む。共刺激リガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、誘導可能な共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌ様受容体に結合するアゴニスト又は抗体、及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含み得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドはまた、非限定的に、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのような、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を含み得るが、これに限定されない。
【０１０８】
４−１ＢＢＬは、ＴＮＦＲ／ＴＮＦリガンドスーパーファミリーに属する２型膜貫通型糖タンパク質である。４−１ＢＢＬは、Ｔ細胞上で発現される受容体４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に結合する共刺激リガンドである。４−１ＢＢＬは、樹状細胞、マクロファージ、及び活性化されたＢ細胞を含むプロフェッショナルＡＰＣ上で発現される。４−１ＢＢＬ配列は、多数の種について公知であり、例えば、ヒト４−１ＢＢＬであり、ＴＮＦＳＦ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号：８７４４）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００３８１１．３）としても知られている。４−１ＢＢＬは、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒト４−１ＢＢＬを指すことができる。態様の何れかのいくつかの実施態様において、例えば、獣医適用において、４−１ＢＢＬは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の４−１ＢＢＬを指すことができる。ヒト４−１ＢＢＬの相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照４−１ＢＢＬ配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。
【０１０９】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、これにより、非限定的に増殖のような、Ｔ細胞による共刺激応答を仲介する、Ｔ細胞上のコグネート結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３を含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
１つの実施態様において、本明細書において使用される用語「操作された」及びその文法上同等なものは、核酸、例えば、生物のゲノム内の核酸の一又は複数のヒトにより設計された変化を指すことができる。別の実施態様において、操作されたとは、遺伝子の変化、付加、及び／又は欠損を指すことができる。「操作された細胞」は、付加、欠損及び／又は変化した遺伝子を有する細胞を指すことができる。本明細書において使用される用語「細胞」又は「操作された細胞」及びそれらの文法上同等なものは、ヒト又は非ヒト動物起源の細胞を指すことができる。
【０１１１】
本明細書において使用される、用語「作動可能に結合された」は、ポリヌクレオチド分子が、第２のポリヌクレオチド分子の機能に影響するよう配置されている、目的の遺伝子のような第２の転写可能なポリヌクレオチド分子と結び付けられた、プロモーターのような第１のポリヌクレオチド分子を指す。２種のポリヌクレオチド分子は、単一の連続するポリヌクレオチド分子の一部であっても、又はなくてもよいし、隣接するものであっても、又はなくてもよい。例えば、プロモーターが、細胞において目的の遺伝子の転写を制御するか、又は仲介するなら、プロモーターは、目的の遺伝子に作動可能に結合されている。
【０１１２】
本明細書に記載される様々な実施態様において、記載される特定のポリペプチドの何れかのバリアント（天然に存在する又はそれ以外）、対立遺伝子、相同体、保存的に修飾されたバリアント、及び／又は保存的置換バリアントが包含されることが、さらに企図される。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸若しくは低いパーセンテージのアミノ酸を変化させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠損或いは付加は、変化が化学的に同様のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保持する「保存的に修飾されたバリアント」であることを認識する。かかる保存的に修飾されたバリアントは、開示と一致する多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子に加えるものであり、それらを排除しない。
【０１１３】
規定のアミノ酸は、同様の生理化学的特徴を有する残基、例えば、ある脂肪族残基を別のもの（例えば、互いにＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、若しくはＡｌａ）と置換すること又はある極性残基の別のものとの置換（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；若しくはＧｌｎとＡｓｎ）により置換され得る。他のかかる保存的置換、例えば、同様の疎水性特徴を有する全領域の置換は、周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドを、本明細書に記載されるアッセイの何れか１つにおいて試験して、天然又は参照ポリペプチドの所望の活性、例えば、リガンドにより仲介される受容体活性及び特異性を保持するのを確認し得る。
【０１１４】
アミノ酸は、それらの側鎖の特性における類似性に従いグループ化され得る（Ａ．  Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２編、ｐ７３−７５、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５年）における）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）無電荷の極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。或いは、天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づきグループに分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向性に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらの種類の１つのメンバーの別の種類への交換を伴う。特定の保存的置換は、例えば；ＡｌａからＧｌｙ若しくはＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ若しくはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＡｌａ若しくはＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ若しくはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ若しくはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ若しくはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ若しくはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ若しくはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ若しくはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ；及び／又はＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ若しくはＬｅｕを含む。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（又はかかるポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載されるアミノ酸配列の１つの機能的フラグメントであり得る。本明細書において使用される、「機能的フラグメント」は、当該技術分野において公知又は本明細書において以下で記載されるアッセイに従い、野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持する、ペプチドのフラグメント又はセグメントである。機能的フラグメントは、本明細書において開示される配列の保存的置換を含み得る。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチド又は分子のバリアントであり得る。いくつかの実施態様において、バリアントは、保存的に修飾されたバリアントである。保存的置換バリアントは、天然のヌクレオチド配列等の変異により得ることができる。本明細書において言及される「バリアント」は、天然又は参照ポリペプチドと実質的に相同なポリペプチドであるが、一又は複数の欠損、挿入若しくは置換のため、天然或いは参照ポリペプチドのものと異なるアミノ酸配列を有する。バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然若しくは参照ＤＮＡ配列と比較したとき、ヌクレオチドの一若しくは複数の付加、欠損、又は置換を含むが、非バリアントポリペプチドの活性を保持するバリアントタンパク質又はそのフラグメントをコードする配列を包含する。多種多様なＰＣＲベースの部位特異的変異アプローチが、当該技術分野において公知であり、当業者により適用され得る。
【０１１７】
バリアントアミノ酸又はＤＮＡ配列は、天然又は参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一であり得る。天然配列と変異配列の間の相同性（パーセント同一性）の程度は、例えば、ワールド・ワイド・ウェブ上のこの目的のため通常利用される無料で入手可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定を有するＢＬＡＳＴｐ又はＢＬＡＳＴｎ）を使用して２つの配列を比較することにより、決定することができる。
【０１１８】
天然のアミノ酸配列の変化は、当業者に公知の多数の技術の何れかにより成し遂げることができる。変異は、例えば、特定の遺伝子座で、天然の配列のフラグメントへのライゲーションを可能にする制限酵素部位に隣接する変異体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより導入することができる。ライゲーション後、生じた再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、又は欠損を有するアナログをコードする。或いは、オリゴヌクレオチド定方向部位特異的変異手法を利用して、要求される置換、欠損、又は挿入により変化した特定のコドンを有する変化したヌクレオチド配列をもたらし得る。かかる変化を作る技術は、十分に確立されており、例えば、Ｗａｌｄｅｒ等（Ｇｅｎｅ４２：１３３、１９８６年）；Ｂａｕｅｒ等（Ｇｅｎｅ３７：７３、１９８５年）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８５年１月、１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ等（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９８１年）；並びに米国特許第４５１８５８４号及び第４７３７４６２号により開示されるものを含み、それらは、それらの全体が出典明示により本明細書に援用される。ポリペプチドの適切な立体構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基をまた、一般に、セリンで置換して、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋結合を妨げ得る。逆に、システイン結合を、ポリペプチドに加えて、その安定性を改善するか、又はオリゴマー形成を促進し得る。
【０１１９】
本明細書において使用される、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸として定義される。用語「ポリヌクレオチド」を、「核酸」と互換的に本明細書において使用して、ヌクレオシドのポリマーを示す。典型的には、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により結び付けられたＤＮＡ又はＲＮＡにおいて天然に見られるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）から構成される。しかしながら、用語は、天然に存在する核酸において見られるかどうかにかかわらず、化学的若しくは生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格等を含有するヌクレオシド又はヌクレオシドアナログを含む分子を包含し、かかる分子は、ある特定の適用に好ましいことがある。この適用が、ポリヌクレオチドを指す場合、１本鎖と２本鎖形態（及びそれぞれの１本鎖分子の相補鎖）の両方の場合のＤＮＡ、ＲＮＡの両方が提供されることは理解される。本明細書において使用される「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド物質自体及び／又は特定の核酸を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、塩基についての略語として使用される文字の連続）を指すことができる。本明細書において提示されるポリヌクレオチド配列は、別段示されない限り、５’から３’方向で提示される。
【０１２０】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指す。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。ペプチドは、比較的に短いポリペプチドであり、典型的には、約２から６０個のアミノ酸長である。本明細書において使用されるポリペプチドは、典型的には、タンパク質において最も一般的に見られる２０個のＬ−アミノ酸のようなアミノ酸を含有する。しかしながら、他のアミノ酸及び／又は当該技術分野において公知のアミノ酸アナログを使用することができる。ポリペプチド中のアミノ酸の一又は複数は、例えば、炭水化物群、リン酸塩群、脂肪酸群、コンジュゲーション、機能付与のためのリンカー等のような化学実体の付加により修飾されてもよい。共有結合又は非共有結合で結び付けられた非ポリペプチド部分を有するポリペプチドは、依然、「ポリペプチド」とみなされる。典型的な修飾は、グリコシル化及びパラミトイル化を含む。ポリペプチドは、天然の供給源から精製され、組換えＤＮＡテクノロジーを使用して生成されるか、又は従来の固相ペプチド合成のような化学的手段を通じて合成され得る。本明細書において使用される用語「ポリペプチド配列」又は「アミノ酸配列」は、ポリペプチド物質自体及び／又はポリペプチドを生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、アミノ酸名についての略語として使用される文字若しくは３文字コードの連続）を指すことができる。本明細書において提示されるポリペプチド配列は、別段示されない限り、Ｎ末端からＣ末端方向で提示される。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、ＣＡＲポリペプチド）をコードする核酸は、ベクターにより含まれる。本明細書に記載される態様のいくつかにおいて、本明細書に記載される規定のポリペプチドをコードする核酸配列、又は任意のそのモジュールは、ベクターに作動可能に結合されている。本明細書において使用される用語「ベクター」は、宿主細胞へのデリバリー又は異なる宿主細胞間の移動のため設計された核酸コンストラクトを指す。本明細書において使用される、ベクターは、ウイルス又は非ウイルスであり得る。用語「ベクター」は、適切な制御エレメントと関連するとき、複製する能力があり、遺伝子配列を細胞に移し得る任意の遺伝子エレメントを包含する。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオン等を含み得るが、これらに限定されない。
【０１２２】
本明細書において使用される、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写制御配列に結合された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現された配列は、しばしば細胞にとって異種性であるが、必ずしも、細胞にとって異種性でない。発現ベクターは、追加のエレメントを含んでもよく、例えば、発現ベクターは、２種の複製システムを有し、これにより、それが、２種類の生物、例えば、発現のためのヒト細胞において並びにクローニング及び増幅のため原核生物の宿主において維持されることを可能にしてもよい。用語「発現」は、ＲＮＡ及びタンパク質の産生、並びに適用可能な場合、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳及びタンパク質フォールディング、修飾並びにプロセシングを含むが、これらに限定されない、適当な分泌タンパク質として関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られるポリペプチドを含む。用語「遺伝子」は、適当な制御配列に作動可能に結合されたとき、インビトロ又はインビボで（ＤＮＡ）からＲＮＡに転写される核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域前及び後の領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の間にある配列（イントロン）を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。
【０１２３】
本明細書において使用される、「シグナルペプチド」又は「シグナル配列」は、新生タンパク質を小胞体に導くのに役立つ、新しく合成されたタンパク質のＮ末端にあるペプチドを指す。いくつかの実施態様において、シグナルペプチドは、ＣＤ８シグナルペプチドである。
【０１２４】
本明細書において使用される、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する核酸ベクターコンストラクトを指す。ウイルスベクターは、必須でないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含有し得る。ベクター及び／又は粒子は、インビトロ又はインビボの何れかで核酸を細胞に移動させる目的のため利用され得る。多数の形態のウイルスベクターが、当該技術分野において公知である。
【０１２５】
「組換えベクター」により、異種性核酸配列、又はインビボで発現する能力がある「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本明細書に記載されるベクターが、いくつかの実施態様において、他の適した組成物及び療法と組合すことができることは理解されるべきである。いくつかの実施態様において、ベクターは、エピソームである。適したエピソームベクターの使用は、対象において目的のヌクレオチドを大きなコピー数の染色体外ＤＮＡで維持し、それにより、染色体組込みの可能性のある作用を除去する手段をもたらす。
【０１２６】
本明細書において使用される、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」又は「改善」は、目的が、疾患或いは障害、例えば、急性リンパ芽球性白血病若しくは他のがん、疾患、又は障害と関連する状態の進行或いは重症度を好転させること、緩和すること、改善すること、阻害すること、遅延させること、又は停止することである、治療処置を指す。用語「処置すること」は、少なくとも１種の副作用又は状態、疾患若しくは障害の症状を低減すること或いは緩和することを含む。一若しくは複数の症状又は臨床マーカーが、低減されるなら、処置は、一般に「有効」である。或いは、疾患の進行が低減されるか、又は停止されるなら、処置は、「有効」である。すなわち、「処置」は、症状又はマーカーの改善ばかりでなく、処置の非存在下で予測されるものと比較して症状の進行若しくは悪化の休止、又は少なくとも遅延も含む。有益又は所望の臨床結果は、検出可能若しくは検出可能でないかにかかわらず、一又は複数の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延又は遅くすること、疾患状態の改善又は緩和、寛解（部分的又は総合的の何れか）、及び／或いは減少した死亡率を含むが、これらに限定されない。用語、疾患の「処置」はまた、疾患の症状又は副作用からの解放（対症療法を含む）をもたらすことを含む。
【０１２７】
本明細書において使用される、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば、医薬産業において一般に使用される担体と組み合わせた有効な剤を指す。語句「薬学的に許容される」を、本明細書において利用して、合理的な恩恵／リスクの比と釣り合った過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題若しくは合併症なく、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに、正当な医療判断の範囲内で適当である化合物、物質、組成物、並びに／或いは投薬形態を指す。態様の何れかのいくつかの実施態様において、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であり得る。態様の何れかのいくつかの実施態様において、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ジェル、リポソーム、ナノ粒子、及び／又は軟膏であり得る。態様の何れかのいくつかの実施態様において、薬学的に許容される担体は、人工又は操作された担体、例えば、有効成分が天然で生じることが見出されていない担体であり得る。
【０１２８】
本明細書において使用される、用語「投与すること」は、所望の部位での薬剤の少なくとも部分的なデリバリーをもたらす方法若しくは経路による、対象への本明細書において開示される治療又は薬学的組成物の配置を指す。本明細書に記載される薬剤を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適当な経路により投与され得る。
【０１２９】
用語「統計学的に有意な」又は「有意に」は、統計学的な有意を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）又はそれ以上の差を意味する。
【０１３０】
操作例において以外、又は別段示されない場合、本明細書において使用される成分の量又は反応条件を表す全ての数は、用語「約」により全ての場合で修飾されると理解されるべきである。パーセンテージと関連して使用されるときの用語「約」は、±１％を意味し得る。
【０１３１】
本明細書において使用される、用語「含むこと」は、他のエレメントがまた、提示された所望のエレメントに加えて存在し得ることを意味する。「含むこと」の使用は、制限よりむしろ包含を示す。
【０１３２】
用語「からなる」は、本明細書に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指し、それらは、実施態様のその記載において列挙されない任意のエレメントを除外する。
【０１３３】
本明細書において使用される、用語「本質的にからなる」は、規定の実施態様について要求されるそれらのエレメントを指す。用語は、テクノロジーのその実施態様の基本的かつ新規又は機能的特徴に物質上影響しない追加のエレメントの存在を可能にする。
【０１３４】
単数の用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段明らかに示さない限り、複数の参照物を含む。同様に、単語「又は」は、文脈が別段明らかに示さない限り、「及び」を含むことが意図される。本明細書において記載されるものと同様又は同等の方法及び物質を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、適した方法及び物質が以下で記載される。略語「例えば」は、ラテン語の例を挙げると、に由来し、本明細書において使用して、非限定的な例を示す。したがって、略語「例えば」は、用語「例えば」と同義である。
【０１３５】
態様の何れかのいくつかの実施態様において、本明細書に記載される開示は、ヒトをクローニングするプロセス、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を修飾するプロセス、産業上若しくは市販目的のヒト胚の使用、又はヒト若しくは動物への実質的な医薬恩恵なく恐らくそれらを罹患させる動物の遺伝的同一性を修飾するプロセス、及びかかるプロセスから得られた動物に関係しない。
【０１３６】
他の用語は、以下のテクノロジーの様々な態様及び実施態様の記載内で定義される。
【０１３７】
本明細書に記載される方法及びコンストラクトは、いくつかの利点を提供する。例えば、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲを含む完全なヒトＣＡＲは、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入の免疫原性及び拒絶反応の発生率を低くする。さらに、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はマウスではそれほど急速に増殖しないため、急速なＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖に伴うサイトカイン放出症候群の発生率が低くなる可能性がある。ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲコンストラクトはまた、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーのトリマー構造を維持するが、ＣＡＲバックボーンの標準的な安定した構成を持つ。
【０１３８】
本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい実施態様の以下の説明、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、ｓｃＦｖベースの抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ対ＡＰＲＩＬ抗ＢＣＭＡ／ＴＡＣＩ  ＣＡＲの模式的な比較を示す。
【図２】図２は、本明細書に記載するＣＡＲのある特定の実施態様の模式図を示す。４−１ＢＢ膜貫通型ドメインの使用は、恐らくよりトリマー形成を促進すると予想される。
【図３】図３は、示した細胞種類における標的の表面発現を示す。
【図４】図４は、ＡＰＲＩＬ又はＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現する細胞についての増殖曲線を示す。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａは、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲのＣＡＲ−Ｔ細胞形質導入効率を示す。Ｘ軸は、ｍＣｈｅｒｒｙであり、ｙ軸は、側方散乱である。細胞に、生ＣＤ３＋Ｔ細胞上でゲートを掛ける。図５Ｂは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲのＣＡＲ−Ｔ細胞形質導入効率を示す。Ｘ軸は、ｍＣｈｅｒｒｙであり、ｙ軸は、側方散乱である。細胞に、生ＣＤ３＋Ｔ細胞上でゲートを掛ける。
【図６】図６は、ＡＰＲＩＬとＢＣＭＡ  ＣＡＲを比較する殺傷アッセイの結果を示す。
【図７】図７は、ＡＰＲＩＬとＢＣＭＡ  ＣＡＲを比較する活性化アッセイの結果を示す。ＣＡＲ介在性Ｔ細胞活性化を、ＮＦＡＴプロモーターの後にルシフェラーゼを発現するジャーカット細胞株（ＪＮＬ）において試験した。ＪＮＬ細胞に、示したＣＡＲをレンチウイルスにより形質導入し、ｘ軸上に示す標的に数時間曝露した。光放出を測定した（相対的光単位、ｙ軸）。
【図８】図８は、示した多発性骨髄腫細胞株におけるＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現のレベルを示す。
【図９】図９は、操作した細胞株におけるＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現を示す。
【図１０】図１０は、いくつかのＡＰＲＩＬ及びＢＣＭＡ  ＣＡＲの模式図並びにそれらの形質導入効率を示す。
【図１１】図１１は、ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬ  ＣＡＲが、ＲＰＭＩ８２２６ＢＣＭＡでの繰返し刺激の際に拡大することを示すグラフを示す。
【図１２】図１２は、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ発現細胞株のＡＰＲＩＬ−ＣＡＲ殺傷のグラフを示す。
【図１３】図１３は、ＡＰＲＩＬ−ＣＡＲの特異的活性化を示す。
【図１４】図１４は、ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬ  ＣＡＲが、ＲＰＭＩ８２２６親での刺激に応答して脱顆粒することを示す。
【図１５】図１５は、ＡＰＲＩＬ−ＣＡＲＴ細胞のサイトカインプロファイルを示す。
【図１６】図１６は、典型的なＴｒｉＰＲＩＬコンストラクトの模式図を示す。
【図１７】図１７は、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲのＣＡＲ−Ｔ細胞形質導入効率を示す。Ｘ軸は、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示し、ｙ軸は、側方散乱である。上部のパネルは、コントロールの非形質導入（ＵＴＤ）細胞を示し、下部のパネルは、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲを形質導入した細胞を示す。
【図１８】図１８は、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した細胞殺傷アッセイの結果を示す。
【図１９】図１９は、多発性骨髄腫患者（ｎ＝２５）から得られた形質細胞におけるＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現を示す。
【図２０】図２０は、初代ヒトＴ細胞（ＭＯＩ＝５、ｎ＝３）におけるＡＰＲＩＬベースのＣＡＲの形質導入効率を示す。
【図２１】図２１は、標的細胞株ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ．１Ｓ、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ、及びＫ５６２−ＴＡＣＩでのＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ発現を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ及び２２Ｂは、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いたインビトロのＣＤ６９活性化アッセイの結果を示す。図２２Ａは、ゲーティング戦略を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ及び２２Ｂは、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いたインビトロのＣＤ６９活性化アッセイの結果を示す。図２２Ｂは、標的細胞と１２時間共培養した後のＣＤ６９発現の割合に基づく活性化を示す。
【図２３】図２３は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８  ＣＡＲ、及びＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲを用いたインビトロ殺傷アッセイの結果を示す。
【図２４】図２４は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８  −ＣＡＲ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲを用いたインビトロ殺傷アッセイの結果を示す。
【図２５Ａ−Ｄ】図２５Ａは、ＮＯＤ  ｓｃｉｄγ（ＮＳＧ）マウスにおけるＭＭ．１Ｓ細胞を用いたインビボ実験の実験計画を示す。図２５Ｂは、示された時点でのＮＳＧマウスの腫瘍負荷の生物発光画像を示す。図２５Ｃは、示された時点でのＮＳＧマウスにおける腫瘍負荷の定量化を示す。図２５Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ又はＵＴＤ細胞の注射の６．５日後の血中のＣＤ３＋／ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の絶対数を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、多発性骨髄腫患者から得られた形質細胞におけるＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６及びＭＭ．１Ｓ、並びにＢＣＭＡ又はＴＡＣＩのいずれかを発現するように改変されたＫ５６２細胞におけるＢＣＭＡ（ＰＥ）及びＴＡＣＩ（ＡＰＣ）の発現レベルを示す。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、様々なＣＡＲの結合の説明図を示す。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ＢＣＭＡを個別に標的とし、ＢＣＭＡとＴＡＣＩを同時に標的とする第２世代ＣＡＲの設計を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、可溶性ＢＣＭＡ（ｓＢＣＭＡ）及び可溶性ＴＡＣＩ（ｓＴＡＣＩ）に対するＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲの親和性を示す。
【図２７Ｂ−Ｅ】図２７Ｂ−２７Ｅは、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩ発現標的細胞ＭＭ．１Ｓ（図２７Ｂ）、ＲＰＭＩ８２２６（図２７Ｃ）、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ（図２７Ｄ）及びＫ５６２−ＴＡＣＩ（図２７Ｅ）に応答した異なるＣＡＲコンストラクトの細胞毒性を示す。
【図２７Ｆ−Ｇ】図２７Ｆ及び２７Ｇは、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩ発現標的細胞に応答した異なるＣＡＲコンストラクトの脱顆粒（図２７Ｆ）及び活性化（図２７Ｇ）を示す。
【図２７Ｈ−Ｉ】図２７Ｈ及び２７Ｉは、ＢＣＭＡ（図２７Ｈ）又はＴＡＣＩ（図２７Ｉ）のいずれかでの繰り返される抗原刺激により誘導された異なるＣＡＲ  Ｔ細胞の長期増殖を示す。
【図２７Ｊ】図２７Ｊは、ヒトＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞との共培養時の異なるＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ試験の実験計画を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、骨髄腫異種移植片の代表的な生物発光イメージングを経時的に示しす。
【図２８Ｃ−Ｄ】図２８Ｃは、示された時点での４つの群におけるフラックス（光子／秒）の定量化を示す。図２８Ｄは、フローサイトメトリーにより末梢血で測定されたＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ＢＣＭＡノックアウトで生成されたＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞のＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ発現を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ  ＫＯ  Ｉ、及びＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ  ＫＯ  ＩＩ細胞株の集団倍加を示す。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、ＵＴＤ及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡノックアウトの特異的溶解を示す。
【図２９Ｄ】図２９Ｄは、インビトロでのＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡノックアウト細胞の殺傷を示す。
【図２９Ｅ】図２９Ｅは、ＮＳＧマウスにおけるＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ陰性細胞株の経時的な腫瘍増殖の動態を示す。
【図３０Ａ】図３０Ａ−３０Ｃは、ＢＣＭＡ陰性多発性骨髄腫の異種移植モデルにおいて評価されたＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果を示す。図３０Ａは実験計画を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａ−３０Ｃは、ＢＣＭＡ陰性多発性骨髄腫の異種移植モデルにおいて評価されたＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果を示す。図３０Ｂは、骨髄腫異種移植片の代表的な生物発光イメージングを経時的に示しす。
【図３０Ｃ】図３０Ａ−３０Ｃは、ＢＣＭＡ陰性多発性骨髄腫の異種移植モデルにおいて評価されたＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果を示す。図３０Ｃは、示された時点での３つの群におけるフラックス（光子／秒）の定量化を示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、３人のドナーから平均された様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞の多機能性を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、各個々のドナーからの様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞の多機能性を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、３人のドナーから平均化された様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞の多機能強度指数（ＰＳＩ）を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、各個々のドナーからの様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のＰＳＩを示す。
【図３３Ａ】図３３Ａは、３人のドナーから平均化されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能ヒートマップを示す。
【図３３Ｂ−１】図３３Ｂは、各個々のドナーからのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能ヒートマップを示す。
【図３３Ｂ−２】図３３Ｂは、各個々のドナーからのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能ヒートマップを示す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、３人のドナーから平均された様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のタンパク質分泌（％）を示す。
【図３４Ｂ−１】図３４Ｂ−３４Ｄは、各個々のドナーからの様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のタンパク質分泌（％）を示す。
【図３４Ｂ−２】図３４Ｂ−３４Ｄは、各個々のドナーからの様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のタンパク質分泌（％）を示す。
【図３４Ｃ−１】図３４Ｂ−３４Ｄは、各個々のドナーからの様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のタンパク質分泌（％）を示す。
【図３４Ｃ−２】図３４Ｂ−３４Ｄは、各個々のドナーからの様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のタンパク質分泌（％）を示す。
【図３４Ｄ−１】図３４Ｂ−３４Ｄは、各個々のドナーからの様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のタンパク質分泌（％）を示す。
【図３４Ｄ−２】図３４Ｂ−３４Ｄは、各個々のドナーからの様々なＣＡＲコンストラクトを有するＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のタンパク質分泌（％）を示す。
【図３５】図３５は、組換えヒト（ｒｈ）ＢＣＭＡ、ｒｈＴＡＣＩ及びｒｈＡＰＲＩＬの存在下でのＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲＴの細胞毒性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４０】
発明の詳細な説明
非特異的な効果を回避し、標的抗原の喪失による腫瘍回避の可能性を低減するＣＡＲ設計における改善が、本明細書に記載される。１つの実施態様において、２つの異なる腫瘍関連抗原又は因子に結合する単一リガンドを使用するアプローチが、本明細書に記載される。単一リガンドは、本質的には、当該技術分野において公知のＣＡＲの場合のように、膜貫通型及びＴ細胞受容体細胞内エフェクタードメインに、任意選択的に共刺激ドメインを伴って、融合される。抗原若しくは因子の一方又は他方が、標的細胞によりダウンレギュレーションされるなら、２つの異なる腫瘍関連抗原又は因子と結合するリガンドを有するＣＡＲは、有効性を失わない。いくつかの実施態様において、ＣＡＲは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含むリガンドを含む。これは、多発性骨髄腫及び白血病関連ＢＣＭＡポリペプチドと、多発性骨髄腫で発現される別の因子であるＴＡＣＩの両方に高い親和性で結合する、ＡＰＲＩＬポリペプチドの部分をリガンドとして使用して本明細書において説明される。
【０１４１】
本明細書に記載されるテクノロジーの実施態様は、細胞外ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分（例えば、ＡＰＲＩＬ）を含むＣＡＲポリペプチドを含むＴ細胞が、非特異的な効果若しくは有害反応を呼び出すことなく、がん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患を処置するための効率的な治療であるという発見に関する。
【０１４２】
したがって、本明細書に記載される本発明の１つの態様は、ａ）内在性切断部位のＮ末端である、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ）の部分を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドに関し、少なくともＴＮＦ様ドメイン、ｂ）ヒンジ及び膜貫通型ドメイン、並びにｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＡＰＲＩＬである。他の実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１５４、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＬＩＧＨＴ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、ＴＬ１Ａ、又はＥＤＡ−Ａ２である。
【０１４３】
さらに、本明細書に記載される本発明は、それぞれが本明細書に記載されるようなＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ）の部分を含む２つ以上（例えば、３つ）の細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチド、並びに抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である対象における障害（例えば、がん（例えば、多発性骨髄腫）、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応）を処置するためのそれらの使用の関連する方法に関する。
【０１４４】
テクノロジーのこれらの及び他の態様を成し、使用するのに必要不可欠なものの考慮が、以下で記載される。
【０１４５】
キメラ抗原受容体
本明細書に記載されるテクノロジーは、免疫療法における使用のための改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。以下は、ＣＡＲ及び様々な改善を考察する。
【０１４６】
本明細書において使用される用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲ（複数形）」は、例えば、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞若しくはその組合せ）にリガンド又は抗原特異性を移植する、操作されたＴ細胞受容体を指す。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体又はキメラ免疫受容体としても知られている。
【０１４７】
ＣＡＲは、標的に特異的に結合するキメラ細胞外標的結合ドメイン、例えば、膜貫通型ドメインを含む、コンストラクト上に免疫応答、例えば、Ｔ細胞応答について標的にされるべき細胞の表面上で発現されたポリペプチド、及びＴ細胞受容体分子の細胞内ドメイン（シグナル伝達ドメインを含む）を配置する。１つの実施態様において、キメラ細胞外標的結合ドメインは、免疫応答、例えば、Ｔ細胞応答のため標的にされるべき細胞上で発現された抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの特性は、当該技術分野において公知であり、本明細書において開示される通り変動し得るが、キメラ標的／抗原結合ドメインは、キメラ標的／抗原結合ドメインが、標的細胞の表面上の標的／抗原に結合するとき、シグナル伝達活性化に受容体感受性を与え得る。
【０１４８】
細胞内シグナル伝達ドメインに関して、いわゆる「第１世代の」ＣＡＲは、例えば、抗原結合の際にＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）をもっぱらもたらすものを含む。いわゆる「第２世代の」ＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ１３７）と活性化（ＣＤ３ζ）ドメインの両方を提供するものを含み、いわゆる「第３世代の」ＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）ドメイン並びに活性化ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を提供するものを含む。様々な実施態様において、標的／抗原について高い親和性又は結合活性を有するＣＡＲが選択され、例えば、抗体由来標的又は抗原結合ドメインは、一般に、天然に生じるＴ細胞受容体より、標的抗原について高い親和性及び／又は結合活性を有する。人が、抗体について選択し得る高い特異性と組み合わせた、この特性は、ＣＡＲ  Ｔ細胞による高度に特異的なＴ細胞標的化をもたらす。
【０１４９】
本明細書において使用される、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ−Ｔ」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。Ｔ細胞において発現されるとき、ＣＡＲは、非ＭＨＣ拘束性の方法で選択された標的に向けてＴ細胞特異性及び反応性を再指向化させ、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用する能力を有する。非ＭＨＣ拘束性抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに独立して抗原を認識し、これにより、腫瘍回避の主要な機序を迂回する能力を与える。
【０１５０】
本明細書において使用される、用語「細胞外標的結合ドメイン」は、標的への結合を促進するのに十分な細胞の外側において見られるポリペプチドを指す。細胞外標的結合ドメインは、その結合パートナーに特異的に結合する。非限定的な例として、細胞外標的結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン、又はリガンド（例えば、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド）を含み得る。いくつかの実施態様において、細胞外標的結合ドメインは、ＡＰＲＩＬ、又は２つ以上のＡＰＲＩＬドメイン、例えば、本明細書に記載の３つのＡＰＲＩＬドメイン（ＴｒｉＰＲＩＬ）を含み、該ＡＰＲＩＬは、コグネート結合パートナータンパク質を認識して結合する。この文脈において、リガンドは、タンパク質及び／又は受容体の部分に特異的に結合する分子である。本明細書に記載される方法及び組成物において有用なリガンドのコグネート結合パートナーは、一般に、細胞の表面上で見出され得る。リガンドとコグネートパートナーの結合は、リガンドにより生じる受容体の変化をもたらすか、又は生理学的応答、例えば、シグナル伝達経路若しくはカスケードを活性化し得る。１つの実施態様において、リガンドは、ゲノムに対して非天然であり得る。任意選択的に、リガンドは、少なくとも２つの種にわたり保存された機能を有する。
【０１５１】
抗体試薬
様々な実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲは、抗体試薬又は細胞外標的結合ドメインとしてのその抗原結合ドメインを含む。
【０１５２】
本明細書において使用される、用語「抗体試薬」は、少なくとも１個の免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、規定の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体の抗原結合ドメインを含む抗体又はポリペプチドを含み得る。態様の何れかのいくつかの実施態様において、抗体試薬は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）、及び軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）を含み得る。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体試薬」は、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、１本鎖抗体、Ｆａｂ及びｓＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、並びにドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（例えば、ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ等、Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６年；２６（３）：６２９−３９；それは、その全体が出典明示により本明細書に援用される））並びに完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ（並びにそのサブタイプ及び組合せ）の構造特性を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）を含む、任意の供給源由来であり、霊長類化抗体であり得る。抗体はまた、ミディボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体等を含む。完全ヒト抗体結合ドメインは、例えば、ファージディスプレイライブラリーから、当業者に公知の方法を使用して選択され得る。
【０１５３】
ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、高頻度可変性の領域、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存されている領域が分散する領域にさらに分けることができる。フレームワーク領域及びＣＤＲの程度は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５編、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ公開番号第９１−３２４２、及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．等、（１９８７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１９６：９０１−９１７を参照し、それらは、それらの全体が出典明示により本明細書に援用される）。それぞれのＶＨ及びＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。
【０１５４】
１つの実施態様において、抗体又は抗体試薬は、ヒト抗体又は抗体試薬ではない（すなわち、抗体若しくは抗体試薬は、マウスである）が、ヒト化されている。「ヒト化抗体又は抗体試薬」は、ヒトにおいて天然で産生される抗体若しくは抗体試薬バリアントに対するその類似性を増大するためにタンパク質配列レベルで修飾されている非ヒト抗体又は抗体試薬を指す。抗体をヒト化する１つのアプローチは、マウス又は他の非ヒトＣＤＲのヒト抗体フレームワークへの移植を利用する。
【０１５５】
１つの実施態様において、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインは、可動性のリンカーペプチドを介して、抗体、一般に、モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬドメインを融合することにより作製された、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含むか、又は本質的にからなる。様々な実施態様において、ｓｃＦｖは、膜貫通型ドメイン及びＴ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載される操作された細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。
【０１５６】
抗体結合ドメイン及びそれらを選択し、クローニングする方法は、当業者に周知である。
【０１５７】
１つの実施態様において、本明細書に記載されるテクノロジーにおいて有用なＣＡＲは、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインに少なくとも２つの抗原特異的標的化領域を含む。かかる実施態様において、２つ以上の抗原特異的標的領域は、少なくとも２つの異なる抗原を標的にし、タンデムに配置され、リンカー配列により分けられ得る。別の実施態様において、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。二重特異性ＣＡＲは、２つの異なる抗原に特異的である。
【０１５８】
ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド
１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドの細胞外ドメインは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含み、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分は、内在性切断部位のＮ末端であり、少なくともＴＮＦ様ドメインを含む。
【０１５９】
例えば、１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドの細胞外ドメインは、ＡＰＲＩＬの部分を含み、ＡＰＲＩＬの部分は、内在性切断部位のＮ末端であり、少なくともＴＮＦ様ドメイン（配列番号３７）を含む。
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【０１６０】
他の実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド又はその部分を含み、ここで、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＬＩＧＨＴ、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ）、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、核因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連の弱いアポトーシスの誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、カルシウム調節リガンド（ＣＡＭＬＧ又はＣＡＭＬ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）リガンド、又はエクトジスプラシンＡ２（ＥＤＡ−Ａ２）である。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド又はその部分、例えば、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１５４、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、又はＥＤＡ−Ａ２には、配列番号３７のＴＮＦ様ドメインが含まれる。
【０１６１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、それぞれがＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上）の細胞外ドメインを含み得る。本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの細胞外標的結合ドメインは、２つ以上の同じＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド又はその部分（例えば、ホモオリゴマー）を含み得、或いは、少なくとも１つの異なるＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド又はその部分（例えば、ヘテロオリゴマー）を含み得る。
【０１６２】
ＴｒｉＰＲＩＬ
いくつかの実施態様において、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインは、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩのリガンド、例えばＡＰＲＩＬ、又はその部分を含む。細胞外標的結合ドメインは、２つ以上のＡＰＲＩＬドメインを含み得る。一実施態様において、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインは、一又は複数のリンカー配列によって任意選択で連結される３つのＡＰＲＩＬドメインを含む。本明細書に記載される典型的なリンカーには、グリシン／セリンリンカー、並びにＷｈｉｔｌｏｗリンカーが含まれる。３つのＡＰＲＩＬドメインを含むそのようなポリペプチドは、本明細書ではＴｒｉＰＲＩＬと呼ばれる。
【０１６３】
ＡＰＲＩＬ（Ａ増殖誘導リガンド）、別名ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）は、腫瘍壊死因子リガンド（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーであり、ＢＣＭＡのリガンドとして機能する。ＡＰＲＩＬの配列は多くの種で知られており、例えば、ヒトＡＰＲＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ７５８８８；ＮＣＢＩ遺伝子番号：８７４１）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１８５５５１．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１９８６２２．１）である。ＡＰＲＩＬは、その天然に存在するバリアント、切断型（例えば、配列番号２１、２７、３３、又は４０）、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒトＡＰＲＩＬ（例えば、配列番号６０）を指すことができる。任意の態様のいくつかの実施態様において、例えば、獣医学的適用において、ＡＰＲＩＬは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどのＡＰＲＩＬを指すことができる。ヒトＡＰＲＩＬの相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＡＰＲＩＬ配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。いくつかの実施態様において、ヒトＡＰＲＩＬは、配列番号６０の配列に対応する：
2021510076.tif 000003
【０１６４】
１つの実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、配列番号３、８、９、１５、２１、２７、３３、若しくは４０から選択される配列に対応する配列を有するか、或いは配列番号３、８、９、１５、２１、２７、３３、若しくは４０から選択される配列を含むか、或いは配列番号３、８、９、１５、２１、２７、３３、若しくは４０から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。１つの実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、配列番号３、８、９、１５、２１、２７、３３、若しくは４０から選択される配列から本質的になるか、或いは配列番号３、８、９、１５、２１、２７、３３、若しくは４０から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列から本質的になる。１つの実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、内在性切断部位のＣ末端であるＡＰＲＩＬの部分に由来する配列を含まない。
【０１６５】
本発明に有用なリンカー配列は、例えば、２〜１００アミノ酸、５〜５０アミノ酸、１０〜１５アミノ酸、１５〜２０アミノ酸、又は１８〜２０アミノ酸の長さであり得、当該技術分野で公知の任意の適切なリンカーを含み得る。例えば、本発明に有用なリンカー配列には、限定されないが、グリシン／セリンリンカー、例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４１）、及び（Ｇ４Ｓ）３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１））及び（Ｇ４Ｓ）４（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６２））などのＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）リンカー；Ｗｈｉｔｌｏｗ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、６（８）：９８９−９５、１９９３年（その内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される）によって記載されているＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧのリンカー配列（配列番号５８）；Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ等、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ、２０１１年（９）、２０１１年（その内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される）によって記載されているＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧのリンカー配列（配列番号６３）；並びにＳｂｌａｔｔｅｒｏ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１８（１）：７５−８０、２０００年（その内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される）によって記載されている、機能性を付加されたリンカー配列、例えば、エピトープタグ又はＣｒｅ−Ｌｏｘ組換え部位を含むコード配列を含むリンカー配列が挙げられる。
【０１６６】
例えば、２つのＡＰＲＩＬドメインを連結するリンカー配列は、配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３の配列に対応することができ、又は配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３の配列を含むことができ、或いは配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含むことができ、或いは配列番号４１、５８、６１、６２、若しくは６３の配列と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸置換若しくは欠損を有する配列を含む。
【０１６７】
一例では、ＴｒｉＰＲＩＬは、各ＡＰＲＩＬドメイン間にグリシン／セリンリンカーを含む。グリシン／セリンリンカーを有する典型的なＴｒｉＰＲＩＬ配列は以下の通りである：
2021510076.tif 000004
ここで、リンカー配列は太字で下線が引かれている。いくつかの実施態様において、ＴｒｉＰＲＩＬのアミノ酸配列は、配列番号５６の配列に対応し、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、或いは配列番号５６の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
さらなる例において、ＴｒｉＰＲＩＬは、以下のようにＷｈｉｔｌｏｗリンカー配列によって連結された３つのＡＰＲＩＬドメインを含むことができる：
2021510076.tif 000005
ここで、リンカー配列は太字で下線が引かれている。いくつかの実施態様において、ＴｒｉＰＲＩＬのアミノ酸配列は、配列番号５９の配列に対応し、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、又は、配列番号５９の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
いくつかの実施態様において、ＴｒｉＰＲＩＬのそれぞれのＡＰＲＩＬドメインは、配列番号２１、２７、３３、４０、若しくは６０の配列に対応するか；或いは配列番号２１、２７、３３、４０、若しくは６０の配列を含むか；或いは配列番号２１、２７、３３、４０、若しくは６０の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。１つの実施態様において、ＡＰＲＩＬの部分は、配列番号２１、２７、３３、若しくは４０の配列から本質的になるか；或いは配列番号２１、２７、３３、若しくは４０の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列から本質的になる。１つの実施態様において、ＴｒｉＰＲＩＬのそれぞれのＡＰＲＩＬドメインは、内在性切断部位のＣ末端であるＡＰＲＩＬの部分に由来する配列を含まない。
【０１７０】
１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、そのコード領域内の一又は複数の変異を含むＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む。例えば、１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、そのコード領域内の一又は複数の変異を含むＡＰＲＩＬの部分を含む。典型的なアミノ酸変異は、配列番号２１のアミノ酸１８、６１、９１、９２、及び／又は１１７；配列番号２７のアミノ酸１８、６３、９１、９２、及び／又は１１７；配列番号３３のアミノ酸１８、６３、９１、９２、及び／又は１１７；配列番号４０のアミノ酸１８、６１、９１、９２、及び／又は１１７；並びに配列番号４０のアミノ酸１８、６３、９１、９２、及び／又は１１７に成された点変異を含む。別の例において、ＡＰＲＩＬの部分は、配列番号２１のアミノ酸１８、６１、９１、９２、及び／又は１１７；配列番号２７のアミノ酸１８、６３、９１、９２、及び／又は１１７；配列番号３３のアミノ酸１８、６３、９１、９２、及び／又は１１７；配列番号４０のアミノ酸１８、６１、９１、９２、及び／又は１１７；並びに配列番号４０のアミノ酸１８、６３、９１、９２、及び／又は１１７にアミノ酸置換若しくは欠損を含み得る。当業者は、標準的な技術を使用して、変異を遺伝子又は遺伝子産物の核酸配列に導入することができるであろう。例えば、点変異は、部位特異的点変異誘発、ＰＣＲ技術を介して導入され得る。部位特異的変異誘発キットは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡを通じて市販されている。点変異を遺伝子又は遺伝子産物の核酸配列に導入する代替の方法の非限定的な例は、カセット変異誘発又は全プラスミド変異誘発を含む。
【０１７１】
任意選択的に、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分（例えば、ＡＰＲＩＬ）は、リジンリッチな領域を含まない。１つの実施態様において、「リジンリッチな領域」は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％のリジンアミノ酸を含むアミノ酸配列の領域を指す。本明細書において使用される、「領域」は、少なくとも４個以上の連続するアミノ酸を指す。１つの実施態様において、リジンリッチな配列は、ＫＱＫＫＱＨ（配列番号３８）の配列を含む。
【０１７２】
さらに、別の例において、ＡＰＲＩＬの部分を含むＣＡＲポリペプチドは、Ｒ−Ｘ−Ｙ−Ｒ（配列番号６６）のフリン切断部位を含まず、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｙはリジン又はアルギニンである。例えば、ＡＰＲＩＬの部分は、Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｒ（配列番号６７）の配列を有するフリン切断部位を含まない。本明細書に記載されるヒトＡＰＲＩＬのフリン切断部位は、欠失又は変異され得る。
【０１７３】
任意の態様の１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ）の部分を含む２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上）の細胞外ドメインを含む。１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ）の部分を含む３つの細胞外ドメインを含む。例えば、ＣＡＲポリペプチドは、図１６に示されるように、それぞれがＡＰＲＩＬの部分を含む３つの細胞外ドメイン、すなわちＴｒｉＰＲＩＬを含む。例えば、いくつかの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上）のＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの反復配列（例えば、ＡＰＲＩＬが３重の反復配列として提供される図１６において示される、ＡＰＲＩＬ）を含み得る。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、同じである。他の実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドは、異なっていてもよい（例えば、ＣＡＲは、ＡＰＲＩＬの一又は複数の部分及び第２のＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（例えば、ＢＡＦＦ）の一又は複数の部分を含んでもよい。
【０１７４】
任意の態様の１つの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ）は、別のＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ）とオリゴマー形成する（例えば、ダイマー形成するか、又はトリマー形成する）。オリゴマー形成は、分子内又は分子間であってもよい。オリゴマーは、ホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーであってもよい。
【０１７５】
標的／抗原
任意の細胞表面部分は、ＣＡＲにより標的にされ得る。最も頻繁には、標的は、人が、Ｔ細胞応答について標的化することを望む細胞上で異なって又は優先的に発現される細胞表面ポリペプチドである。これに関して、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、魅力的な標的をもたらし、これが、非腫瘍細胞若しくは組織への二次的な損傷を回避するか、又は少なくとも制限しながら、腫瘍細胞を標的にする手段をもたらす。腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の非限定的な例は、ＣＥＡ、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウムにより活性化されたクロライドチャネル２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソセリウン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＭＵＣ１、並びにＴＧＦ−βＲＩＩを含む。１つの態様において、細胞表面部分は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体、例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＣＤ９５、ＤＣＲ３、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＣＲ１、ＤＣＲ２、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＮＧＦＲ、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＬＴベータＲ、ＦＮ１４、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、又はＲＥＬＴであってもよい。いくつかの実施態様において、ＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩである。
【０１７６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの標的／抗原は、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩである。
【０１７７】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は小さいＩＩＩ型膜貫通型タンパク質であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡは、低い親和性でＢＡＦＦ及び高い親和性でＡＰＲＩＬに結合し、ＢＣＭＡシグナル伝達は、骨髄腫細胞をアポトーシスから守る。ＢＣＭＡは、２種の近いファミリーメンバー：ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ受容体を有する。
【０１７８】
ＢＣＭＡの配列は多くの種で知られており、例えば、ヒトＢＣＭＡ（ＮＣＢＩ遺伝子番号：６０８）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１８３．２）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１９２．２）である。ＢＣＭＡは、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒトＢＣＭＡを指すことができる。任意の態様のいくつかの実施態様において、例えば、獣医学的適用において、ＢＣＭＡは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどのＢＣＭＡを指すことができる。ヒトＢＣＭＡの相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＢＣＭＡ配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。
【０１７９】
膜貫通型活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）は、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、及びＣＡＭＬを認識する受容体である。ＴＡＣＩは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、ＢＣＭＡと同様のレベルでＢ細胞の発生段階で発現している。ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方の細胞内ドメインが、ＴＲＡＦと相互作用し、恐らく形質細胞生存の促進において冗長機能を有する。ＴＡＣＩの配列は多くの種で知られており、例えば、ヒトＴＡＣＩ（ＮＣＢＩ遺伝子番号：２３４９５）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０３６５８４．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１２４５２．２）である。ＴＡＣＩは、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒトＴＡＣＩを指すことができる。任意の態様のいくつかの実施態様において、例えば、獣医学的適用において、ＴＡＣＩは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどのＴＡＣＩを指すことができる。ヒトＴＡＣＩの相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＴＡＣＩ配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。
【０１８０】
いくつかの実施態様において、ＡＰＲＩＬ又はその部分は、完全長ＡＰＲＩＬ（配列番号６０）の残基２０６を介してＴＡＣＩに結合する。いくつかの実施態様において、ＡＰＲＩＬ又はその部分は、完全長ＡＰＲＩＬ（配列番号６０）の残基１３２を介してＢＣＭＡに結合する。ＡＰＲＩＬのその受容体ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩへの結合に関する情報は、その全体が出典明示により本明細書に援用されるＫｉｍｂｅｒｌｅｙ等、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８７（４４）：３７４３４−３７４４６、２０１２年に詳細に記載されている。
【０１８１】
ヒンジ及び膜貫通型ドメイン
本明細書に記載されるそれぞれのＣＡＲは、必ず、細胞外標的結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結び付ける膜貫通型ドメインを含む。
【０１８２】
本明細書において使用される、「ヒンジドメイン」は、結合部分及びＴ細胞膜の分離並びに可動性を可能にするアミノ酸領域を指す。可動することができるヒンジの長さはまた、相対的にアクセス不可能であるエピトープへの良好な結合を可能にする、例えば、より長いヒンジ領域は、最適な結合を可能にする。当業者は、規定のＣＡＲ標的についての適当なヒンジを決定することができる。１つの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかの膜貫通型ドメイン又はそのフラグメントは、ＣＤ８又は４−１ＢＢヒンジドメインを含む。
【０１８３】
本明細書に記載されるそれぞれのＣＡＲは、必ず、細胞外標的結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結び付ける膜貫通型ドメインを含む。
【０１８４】
したがって、いくつかの実施態様において、ＣＡＲの結合ドメインの後に、任意選択的に一又は複数の「ヒンジドメイン」が続き、これは、標的結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して配置し、適切な細胞／細胞接触、標的結合及び活性化を可能にする役割を果たす。ＣＡＲは、結合ドメインと膜貫通型ドメイン（ＴＭ）との間に一又は複数のヒンジドメインを任意選択的に含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えのいずれかの供給源に由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域又は変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。本明細書に記載されるＣＡＲにおける使用に適した例示的なヒンジドメインには、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α）、ＣＤ４、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が含まれ、これらは、これらの分子の野生型ヒンジ領域であってもよく或いは変化していてもよい。いくつかの実施態様において、ヒンジ領域は、免疫グロブリン様タンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）、ＣＤ２８、又はＣＤ８のヒンジ領域に由来する。一実施態様において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０１８５】
明細書において使用される、「膜貫通型ドメイン」（ＴＭドメイン）は、細胞の細胞膜にわたるＣＡＲの一般的な疎水性領域を指す。ＴＭドメインは、膜貫通型タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通型タンパク質若しくは他の膜貫通型タンパク質）、人工疎水性配列、又はその組合せの膜貫通型領域或いはそのフラグメントであり得る。具体例が本明細書において提供され、実施例において使用される一方、他の膜貫通型ドメインは、当業者にとって明らかであり、代替の実施態様のテクノロジーと関連して使用され得る。選択された膜貫通型領域又はそのフラグメントは、好ましくは、ＣＡＲの意図される機能と干渉しない。タンパク質又はポリペプチドの膜貫通型ドメインと関連して使用される、「そのフラグメント」は、タンパク質を細胞表面に固定するか、又は結合させるのに十分である膜貫通型ドメインの部分を指す。
【０１８６】
１つの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかの膜貫通型ドメイン又はそのフラグメントは、ＣＤ８又は４−１ＢＢの膜貫通型ドメインから選択される膜貫通型ドメインを含む。任意の態様の代替の実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲの膜貫通型ドメイン又はそのフラグメントは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤｌ  ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ  ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ  ｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ  ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ  ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（タクチル）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃの膜貫通型ドメインから選択される膜貫通型ドメインを含む。
【０１８７】
４−１ＢＢは、ＣＤ１３７としても知られる膜受容体タンパク質であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである。４−１ＢＢは活性化Ｔリンパ球上に発現する。４−１ＢＢ配列は、多くの種、例えば、ＴＮＦＲＳＦ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号：３６０４）及びｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１５６１．５）としても知られている、ヒト４−１ＢＢについて知られている。４−１ＢＢは、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒト４−１ＢＢを指すことができる。任意の態様のいくつかの実施態様において、例えば、獣医学的適用において、４−１ＢＢは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの４−１ＢＢを指すことができる。ヒト４−１ＢＢの相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照４−１ＢＢ配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。
【０１８８】
本明細書で使用される、ヒンジ及び膜貫通型ドメイン又はヒンジ／膜貫通型ドメインは、ヒンジ及び膜貫通型ドメインの両方を含むドメインを指す。１つの実施態様において、４−１ＢＢヒンジ及び膜貫通型配列は、配列番号１０若しくは１６から選択されるヌクレオチド配列に対応するか、或いは配列番号１０若しくは１６から選択される配列を含むか、或いは配列番号１０若しくは１６から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。１つの実施態様において、４−１ＢＢヒンジ及び膜貫通型配列は、配列番号２８若しくは３４から選択されるアミノ酸配列に対応するか、或いは配列番号２８若しくは３４から選択される配列を含むか、或いは配列番号２８若しくは３４から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１８９】
ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞表面上で優先的に見られる抗原である。ＣＤ８は、免疫系内で細胞と細胞の相互作用を仲介し、Ｔ細胞共受容体として働く。ＣＤ８は、アルファ（ＣＤ８α又はＣＤ８ａ）及びベータ（ＣＤ８β又はＣＤ８ｂ）鎖からなる。ＣＤ８ａ配列は、多数の種について公知であり、例えば、ヒトＣＤ８ａ、（ＮＣＢＩ遺伝子番号：９２５）ポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３９３４５．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００００２．１２）である。ＣＤ８は、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒトＣＤ８を指すことができる。態様の何れかのいくつかの実施態様において、例えば、獣医適用において、ＣＤ８は、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等のＣＤ８を指すことができる。ヒトＣＤ８の相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＣＤ８配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。
【０１９０】
１つの実施態様において、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通型配列は、配列番号４若しくは５３のヌクレオチド配列に対応するか、又は配列番号４若しくは５３の配列を含むか、又は配列番号４若しくは５３の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。１つの実施態様において、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通型配列は、配列番号２２若しくは４２のアミノ酸配列に対応するか、又は配列番号２２若しくは４２の配列を含むか、又は配列番号２２若しくは４２の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１９１】
共刺激ドメイン
本明細書に記載されるそれぞれのＣＡＲは、任意選択的に、共刺激分子の細胞内ドメイン、又は共刺激ドメインを含む。本明細書において使用される、用語「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原への結合の際にＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に要求される第２のシグナルをもたらす抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。かかる共刺激分子の実例は、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０を含む。１つの実施態様において、細胞内ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ４０の細胞内ドメインである。
【０１９２】
１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、細胞内ドメインをさらに含む。本明細書において使用される、「細胞内ドメイン」は、細胞内に完全に含まれる核酸を指す。１つの実施態様において、細胞内ドメインは、受容体の細胞内ドメインを指す。細胞内ドメインは、細胞の内部と相互作用し得る。受容体の細胞内ドメインに関して、細胞内ドメインは、伝達されたシグナルを中継して機能し得る。受容体の細胞内ドメインは、酵素活性を含み得る。
【０１９３】
１つの実施態様において、細胞内ドメインは、４−１ＢＢの細胞内ドメインである。１つの実施態様において、４−１ＢＢ細胞内ドメイン配列は、配列番号５、１１、１７、若しくは５４から選択されるヌクレオチド配列に対応するか、或いは配列番号５、１１、１７、又は５４から選択される配列を含むか、或いは配列番号５、１１、１７、若しくは５４から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を含む。１つの実施態様において、４−１ＢＢ細胞内ドメインアミノ酸配列は、配列番号２３、２９、３５、若しくは４３から選択されるアミノ酸配列に対応するか、或いは配列番号２３、２９、３５、若しくは４３から選択される配列を含むか、或いは配列番号２３、２９、３５、若しくは４３から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を含む。
【０１９４】
細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に記載されるＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含む、活性化、サイトカイン産生、増殖及び細胞傷害性活性、又は抗原のＣＡＲの細胞外標的結合ドメインへの結合後に誘発された他の細胞応答を誘発する際に関与するＣＡＲポリペプチドの一部を指す。
【０１９５】
ＣＤ３は、適当な共刺激（例えば、共刺激分子の結合）と同時に関わるとき、Ｔリンパ球活性化を促進するＴ細胞共受容体である。ＣＤ３複合体は、４つの異なる鎖からなり、哺乳類ＣＤ３は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖からなる。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３ζとして公知の分子と関連して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生じる。完全なＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ、ＣＤ３ζ、及び完全なＣＤ３複合体を含む。
【０１９６】
任意の態様のいくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）、ＩＴＡＭ変異ＣＤ３ζ、ＣＤ３η、又はＣＤ３θ由来の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。任意の態様のいくつかの実施態様において、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζ（ＩＴＡＭ３）のＩＴＡＭの３つのモチーフを含む。任意の態様のいくつかの実施態様において、ＣＤ３ζのＩＴＡＭの３つのモチーフは、変異している。
【０１９７】
ＩＴＡＭＳは、刺激性の方法、又は阻害性の方法の何れかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次シグナル伝達ドメインとして知られている。刺激性の方法で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有してもよい。テクノロジーにおける特定の使用である細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの非限定的な例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３η、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものを含む。
【０１９８】
当業者は、標準的な技術を使用して、変異を遺伝子又は遺伝子産物、例えば、ＩＴＡＭの核酸配列に導入することができるであろう。例えば、点変異は、部位特異的点変異誘発、ＰＣＲ技術を介して導入され得る。部位特異的変異誘発キットは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡを通じて市販されている。点変異を遺伝子又は遺伝子産物の核酸配列に導入する代替の方法の非限定的な例は、カセット変異誘発又は全プラスミド変異誘発を含む。
【０１９９】
１つの実施態様において、ＣＡＲにおいて利用されるＩＴＡＭは、ＣＤ３ζ（３つのＩＴＡＭモチーフを含有する）由来の変異したＩＴＡＭを含むＣＤ３ζの代替物、ＣＤ３ζ、及びＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３θとして公知の代替のスプライスバリアントのトランケーション、並びにＣＤ３ε、ＣＤ３η、又はＣＤ３θとＣＤ３ζ間での融合物を発現するよう操作された人工コンストラクトに基づく。
【０２００】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ζのバリアント、例えばＩＴＡＭ変異ＣＤ３ζを含む）、ＣＤ３η、又はＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２０１】
例えば、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。１つの実施態様において、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列は、配列番号６、１２若しくは５５から選択されるヌクレオチド配列に対応するか、或いは配列番号６、１２若しくは５５から選択される配列を含むか、或いは配列番号６、１２若しくは５５から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。１つの実施態様において、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列は、配列番号２４、３０若しくは４４から選択されるアミノ酸配列に対応するか、或いは配列番号２４、３０若しくは４４から選択される配列を含むか、或いは配列番号２４、３０若しくは４４から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０２０２】
さらなる実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。１つの実施態様において、ＣＤ３θ細胞内シグナル伝達配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列に対応するか、又は配列番号１８の配列を含むか、又は配列番号１８の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも１００％の配列同一性の配列を含む。１つの実施態様において、ＣＤ３θ細胞内シグナル伝達配列は、配列番号３６のアミノ酸配列に対応するか、又は配列番号３６の配列を含むか、又は配列番号３６の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも１００％の配列同一性の配列を含む。
【０２０３】
ＣＡＲ及びＣＡＲ  Ｔ細胞のより詳細な記載は、Ｍａｕｓ等、Ｂｌｏｏｄ、２０１４年、１２３：２６２４−３５；Ｒｅａｒｄｏｎ等、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１４年、１６：１４４１−１４５８；Ｈｏｙｏｓ等、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、２０１２年、９７：１６２２；Ｂｙｒｄ等、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１４年、３２：３０３９−４７；Ｍａｈｅｒ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００９年、６９：４５５９−４５６２；及びＴａｍａｄａ等、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２０１２年、１８：６４３６−６４４５において見ることができ、それらのそれぞれは、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
【０２０４】
１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ８リーダー配列をさらに含む。本明細書において使用される、リーダーＲＮＡとしても知られる、「リーダー配列」は、開始コドンの直ぐ上流であるｍＲＮＡの領域を指す。リーダー配列は、転写物の翻訳の制御に重要であり得る。
【０２０５】
１つの実施態様において、ＣＤ８リーダー配列は、配列番号２、８、１４、又は４７から選択されるヌクレオチド配列に対応するか；或いは配列番号２、８、１４、又は４７から選択される配列を含むか；或いは配列番号２、８、１４、若しくは４７から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。１つの実施態様において、ＣＤ８リーダー配列は、配列番号２０、２６、又は３２から選択されるアミノ酸配列に対応するか；或いは配列番号２０、２６、又は３２から選択される配列を含むか；或いは配列番号２０、２６、若しくは３２から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０２０６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、細胞外ドメインを有するか、又は分泌される任意のタンパク質に由来することができる。本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、当該技術分野で公知の任意のシグナルペプチドを含み得る。いくつかの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ８シグナルペプチド、例えば、配列番号２０、２６、又は３２の配列に対応し、或いは配列番号２０、２６、又は３２のアミノ酸配列を含み、或いは配列番号２０、２６、若しくは３２の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＤ８シグナルペプチドを含む。さらなる実施態様において、ＣＤ８シグナルペプチドは、配列番号２、８、１４、又は４７から選択されるヌクレオチド配列に対応するか；或いは配列番号２、８、１４、又は４７から選択される配列を含むか；或いは配列番号２、８、１４、若しくは４７から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含む、ヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２０７】
１つの実施態様において、ＣＡＲは、リンカードメインをさらに含む。本明細書において使用される、「リンカードメイン」は、本明細書に記載されるＣＡＲのドメイン／領域のいずれと一緒に結合する、約２から１００個のアミノ酸長のオリゴペプチド又はポリペプチド領域を指す。いくつかの実施態様において、リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが、互いに関連して動くのが自由であるように、グリシン及びセリンのような可動性の残基を含むか、又はから構成される。本発明に有用なリンカー配列には、当該技術分野で公知の、又は本明細書に記載されている任意のリンカー配列、例えば、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のリンカー配列が含まれる。より長いリンカーは、立体的に互いに干渉しない２つの隣接するドメインを確実にすることを望むとき、使用され得る。リンカーは、切断可能であっても、又は切断可能でなくてもよい。切断可能なリンカーの例は、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はその機能的同等物及びその組合せを含む。１つの実施態様において、リンカー領域は、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａである。リンカーの非限定的な例は、ゾセア・アシグナウイルス由来のリンカー、及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列由来のリンカーを含む。
【０２０８】
１つの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲは、例えば、非侵襲性画像化（例えば、ポジトロン放出断層撮影ＰＥＴスキャン）を可能にするためのレポーター分子をさらに含む。レポーター分子を含む二重特異性ＣＡＲにおいて、第１の細胞外結合ドメイン及び第２の細胞外結合ドメインは、異なる又は同じレポーター分子を含み得る。二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞において、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは、異なる又は同じレポーター分子を発現し得る。別の実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲは、単独又は基質若しくは化学物質（例えば、９−［４−［１８Ｆ］フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン（［１８Ｆ］ＦＨＢＧ））と組み合わせて画像化され得るレポーター分子（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ））をさらに含む。別の実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲは、非侵襲性技術（例えば、６４Ｃｕ２＋で機能化された金ナノ粒子（ＧＮＰ））を使用して容易に画像化され得るナノ粒子をさらに含む。非侵襲性の画像化のためのＣＡＲ  Ｔ細胞の標識は、例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  Ｐ等、Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ、（Ｃａｍｂ）、２０１３年１月；５（１）：２３１−２３８、及びＫｅｕ  ＫＶ等、Ｓｄｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１７年１月、１８；９（３７３）において概説され、それらは、それらの全体が出典明示により本明細書に援用される。
【０２０９】
ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙは、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）上で発現されたＣＡＲを画像化するのに有用な蛍光タグとして本明細書において示される。当該技術分野において公知の本質的に任意の蛍光タンパク質が、この目的のための蛍光タグとして使用され得ることが予測される。臨床適用のため、ＣＡＲは、蛍光タグ又は蛍光タンパク質を含む必要はない。
【０２１０】
本発明の別の態様は、配列番号１９、２５、３１、３９、５７、６４、若しくは６５から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有する配列を含むか、或いは配列番号１、７、１３、若しくは４５の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる、ＣＡＲポリペプチドに関する。
【０２１１】
本発明の別の態様は、配列番号１９、２５、３１、３９、５７、６４、若しくは６５から選択される配列を含むか、又は配列番号１、７、１３、若しくは４５から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる、ＣＡＲポリペプチドに関する。
【０２１２】
本発明の別の態様は、配列番号１９、２５、３１、若しくは３９、５７、６４、若しくは６５から選択される配列に対応する配列を含むか、又は配列番号１、７、１３、若しくは４５から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる、ＣＡＲポリペプチドに関する。
【０２１３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、完全ヒト配列を含む。そのようなポリペプチドは、当該技術分野で知られている方法に従って生成される。
【０２１４】
任意の態様の１つの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上）の細胞外ドメインを含む。１つの実施態様において、ポリペプチド複合体は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかのうち３つを含む。
【０２１５】
核酸及び細胞
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチド（例えば、配列番号１９、２５、３１、３９、５７、６４、又は６５のＣＡＲポリペプチド）のいずれかは、ウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドによってコードされる。任意選択的に、本明細書中に記載されるようなＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現又は安定性を増強するためにコドン最適化され得る。コドン最適化は、当該技術分野において公知の任意の標準的な方法に従って実行することができる。
【０２１６】
レンチウイルスのようなレトロウイルスは、目的の遺伝子、又はキメラ遺伝子をコードする核酸配列のデリバリーのための好適なプラットフォームをもたらす。選択された核酸配列は、ベクターに挿入され、当該技術分野において公知の技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次に、組換えウイルスは、単離され、例えば、インビトロ又はエクスビボで細胞にデリバリーされ得る。レトロウイルスシステムは、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第５２１９７４０号；Ｋｕｒｔｈ及びＢａｎｎｅｒｔ、（２０１０年）、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｃａｌｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：９７８−１−９０４５５−５５−４）；並びにＨｕ及びＰａｔｈａｋ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０００年、５２：４９３−５１２において記載され、それらは、それらの全体が出典明示により本明細書に援用される。。効率的なＤＮＡデリバリーのためのレンチウイルスシステムは、ＯｒｉＧｅｎｅ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから購入することができる。代替の実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲの何れかのＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターのトランスフェクション又はエレクトロポレーションを介して哺乳類細胞において発現される。トランスフェクション又はエレクトロポレーション方法は、当該技術分野において公知である。
【０２１７】
本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかのＣＡＲポリペプチドの効率的な発現は、ＣＡＲをコードする核酸のｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又は遺伝子産物を検出する標準的なアッセイを使用して評価され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織化学。
【０２１８】
１つの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかのＣＡＲポリペプチドは、恒常的に発現される。１つの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかのＣＡＲポリペプチドは、組換え核酸配列によりコードされる。
【０２１９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れか、又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかをコードする核酸を含む哺乳類細胞に関する。１つの実施態様において、哺乳類細胞は、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れか、又はかかる抗体、抗体試薬、その抗原結合部分をコードする核酸、又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかを含む。哺乳類細胞又は組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ又はネコ起源のものであり得るが、任意の他の哺乳類細胞が使用されてもよい。任意の態様の好ましい実施態様において、哺乳類細胞は、ヒトである。１つの実施態様において、細胞は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。任意の態様の代替の実施態様において、細胞は、免疫細胞である。本明細書において使用される、「免疫細胞」は、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血性起源のものであり、Ｂ細胞及びＴ細胞のようなリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、並びに顆粒球のような骨髄細胞を含む。いくつかの実施態様において、細胞は、Ｔ細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；Ｂ細胞及びＴ細胞のようなリンパ球；並びに単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球のような骨髄細胞である。
【０２２０】
免疫細胞は、がん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を有するか、或いは有すると診断された対象から得ることができる。例えば、免疫細胞は、がん、例えば、多発性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有する対象から得ることができる。いくつかの実施態様において、免疫細胞は、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である対象から得られる。免疫細胞は、同種異系ドナーからも得ることができる。同種異系ドナーは、意図された細胞のレシピエントと同じ種の遺伝的に非同一の個体である。
【０２２１】
本発明で使用することができる免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）は、細胞が後に投与される対象から得られた、エクスビボでの修飾及び増殖後の自己細胞を含む。例えば、免疫細胞は、がん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を有するか、或いは有すると診断された個体から得ることができる。免疫細胞は、同種異系ドナーからも得ることができる。同種異系ドナーは、意図された細胞のレシピエントと同じ種の遺伝的に非同一の個体である。本発明に有用な免疫細胞には、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
【０２２２】
Ｔ細胞及びＮＫを得るための方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される操作された免疫細胞に有用であり得る。Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、典型的には、例えば、静脈穿刺又は移植されたポート又はカテーテルを介した回収により、対象から収集された末梢血から得られる。任意選択的に、血液は、対象の血液から白血球が得られ、一方他の血液成分が対象に戻される、白血球除去を含むプロセスによって得ることができる。血液又は白血球除去産物（新鮮又は凍結保存されたもの）は、当該技術分野で公知の方法を用いて、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を濃縮するために処理される。例えば、単核細胞（Ｔ細胞又はＮＫ細胞を含む）を濃縮するために、密度勾配遠心分離（例えば、Ｆｉｃｏｌｌを使用）及び／又は向流遠心分離溶出を実施することができる。一例では、Ｔ細胞について、例えば、磁気ビーズ上にコーティングされたＣＤ３／ＣＤ２８抗体、又は例えば細胞表面結合抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体フラグメントを発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用するＴ細胞刺激工程（下記参照）を、Ｔ細胞を刺激し、他の細胞、例えばＢ細胞を枯渇させるために、さらに行うことができる。その後、濃縮されたＴ細胞調製物のＴ細胞は、遺伝子組換えを受けることができる。
【０２２３】
末梢血の代替として、骨髄、リンパ節、脾臓、腫瘍などの組織をＴ細胞やＮＫ細胞の供給源として使用することができる。哺乳類細胞又は組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ又はネコ起源のものであってもよいが、他の哺乳類細胞が使用されてもよい。任意の態様の特定の実施態様において、Ｔ又はＮＫ細胞はヒトである。
【０２２４】
免疫細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチド（例えば、配列番号１９、２５、３１、３９、５７、６４、又は６５のＣＡＲポリペプチド）のいずれか；又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドのいずれかをコードする核酸（例えば、配列番号１９、２５、３１、３９、５７、６４、又は６５のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸）を含むように操作することができる。
【０２２５】
本発明はさらに、例えば、がん、自己免疫疾患若しくは障害、又は形質細胞疾患若しくは障害を含む疾患及び状態を処置及び予防するための組成物及び方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載されるように、ＣＡＲポリペプチドを含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）、又は前記ＣＡＲをコードする核酸の使用、及び、例えばがんを処置するために対象に修飾免疫細胞を投与することを含む。態様の何れかのいくつかの実施態様において、修飾免疫細胞（例えば、本明細書に記載の一又は複数の追加の修飾を含むＴ細胞又はＮＫ細胞）は、対象への投与前に刺激され、及び／又は活性化される。
【０２２６】
治療法
本発明は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを使用して、がん（例えば、多発性骨髄腫）、形質細胞障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を処置するための組成物及び方法を提供する。特定の実施態様において、がん、例えば、多発性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症は、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを発現する。さらなる実施態様において、がん、例えば、多発性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症は、ＢＣＭＡの発現を低減させるか又は排除する。さらに、本発明は、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である患者において、がん、例えば、多発性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症を処置する方法を提供する。
【０２２７】
本明細書において使用される「がん」は、固有の形質、正常な細胞制御の喪失が、未調節の成長、分化の欠如、局所組織浸潤、及び転移をもたらす細胞の過剰増殖を指すことができ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、又は固形腫瘍であり得る。白血病の非限定的な例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む。１つの実施態様において、がんは、ＡＬＬ又はＣＬＬである。リンパ腫の非限定的な例は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む。１つの実施態様において、がんは、ＤＬＢＣＬ又は濾胞性リンパ腫である。固形腫瘍の非限定的な例は、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞性腫瘍（固形腫瘍）、骨及び軟組織の巨細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、メラノーマ、腎腫瘍、ニューロブラストーマ、非横紋筋肉腫軟部肉腫（ＮＲＳＴＳ）、骨肉腫、傍脊柱肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、及びウィルムス腫瘍を含む。固形腫瘍は、骨、筋肉、又は器官において見ることができ、肉腫又は癌であり得る。本明細書に記載される発明の任意の態様を使用して、即時適用において挙げられていないがんを含む、全ての種類のがんを処置することができることが企図される。本明細書において使用される、用語「腫瘍」は、細胞又は組織の、例えば、悪性型若しくは良性型の異常な成長を指す。
【０２２８】
本明細書において使用される、「自己免疫疾患又は障害」は、人の免疫系が、外来細胞と健常な細胞を区別できないことにより、特徴付けられる。これは、人の健常な細胞をプログラム細胞死に標的化する人の免疫系をもたらす。自己免疫疾患又は障害の非限定的な例は、炎症性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、ＳＬＥ、及び脈管炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、及び接触過敏症のようなアレルギー性炎症、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーヴス病（甲状腺機能亢進）、橋本甲状腺炎（甲状腺機能不全）、慢性移植片対宿主病、凝固因子に対する抗体を有する血友病、セリアック病、クローン病及び潰瘍性大腸炎、ギランバレー症候群、原発性胆汁性硬化症／肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、慢性疲労性症候群ＣＦＳ）、乾癬、自己免疫アジソン病、強直性脊椎炎、急性散在性脳脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、イヌでの多発性関節炎、ライター症候群、高安動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症並びに線維筋痛症（ＦＭ）を含む。
【０２２９】
１つの実施態様において、哺乳類細胞は、外来細胞（すなわち、ウイルス若しくは細菌細胞）と戦う人の能力を妨げる、異常に低い活性の免疫系をもたらす免疫系障害、又は免疫不全障害を有する患者について得られる。
【０２３０】
形質細胞は、感染症と戦うために必要とされる抗体を生成し、放出するために機能するＢリンパ球から産生される白血球である。本明細書において使用される、「形質細胞障害又は疾患」は、形質細胞の異常な増殖により特徴付けられる。異常な形質細胞は、健常な形質細胞を「クラウディングアウト」させる能力があり、その結果、ウイルスや細菌細胞などの異物と戦う能力の低下をもたらす。形質細胞障害の非限定的な例は、アミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、くすぶり型骨髄腫、孤立性形質細胞腫、及び形質細胞骨髄腫を含む。
【０２３１】
本明細書に記載される本発明の１つの態様は、対象においてがん、形質細胞障害、アミロイドーシス、又は自己免疫疾患又は障害を処置する方法であって、Ｔ細胞を操作して、Ｔ細胞表面上に本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかを含ませること；操作されたＴ細胞を対象に投与することを含む方法に関する。
【０２３２】
本明細書に記載される本発明の別の態様は、対象においてがん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患又は障害を処置する方法であって、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れか、又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかをコードする核酸を含む細胞を投与することを含む方法に関する。
【０２３３】
１つの実施態様において、方法は、例えば、本明細書において他の所で記載される方法に従い、細胞を対象に投与する前に、ＣＡＲ−Ｔを活性化すること、又は刺激することをさらに含む。
【０２３４】
本明細書に記載される発明は、対象におけるがん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を処置する方法であって、免疫細胞（例えば、Ｔ又はＮＫ細胞）又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチド（例えば、配列番号１９、２５、３１、３９、５７、６４、又は６５のＣＡＲポリペプチド）及び／又は前記ＣＡＲをコードすることができる核酸を含むその組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、がんは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、及び／又は膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）を発現する細胞を含む。一実施態様において、がん細胞は、腫瘍抗原ＢＡＦＦ＋、ＢＣＭＡ＋、及び／又はＴＡＣＩ＋がんを含む。いくつかの実施態様において、対象は、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である。いくつかの実施態様において、がんは、ＢＣＭＡ発現が低下した細胞を含む。さらなる実施態様において、形質細胞障害はアミロイドーシスである。いくつかの実施態様において、自己免疫障害は、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、又は慢性移植片対宿主病である。
【０２３５】
１つの実施態様において、がんは、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である。
【０２３６】
さらに、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、対象における移植拒絶を処置又は予防する方法に使用することができる。いくつかの実施態様において、対象は、高レベルの抗ＨＬＡ抗体を有する。
【０２３７】
投与
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、がん、形質細胞疾患若しくは障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を有するか、或いは有すると診断された対象を、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れか、又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかをコードする核酸を含む哺乳類細胞で処置することに関する。本明細書において使用される、「本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞」は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れか、又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかをコードする核酸を含む哺乳類細胞を指す。本明細書において使用される、「状態」は、がん、形質細胞疾患若しくは障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を指す。状態を有する対象は、状態を診断する現在の方法を使用して医師により同定され得る。これらの状態を特徴付け、診断に役立つ、状態の症状及び／又は合併症は、当該技術分野において周知であり、疲労、持続感染、及び持続性出血を含むが、これらに限定されない。例えば、状態の診断に役立ち得る試験は、非限定的に、血液スクリーニング及び骨髄試験であり、規定の状態について当該技術分野において知られている。状態の家族歴、又は状態のリスク因子への曝露もまた、対象が状態を有しそうであるかどうかの決定、又は状態の診断をなすのに役立ち得る。
【０２３８】
本明細書に記載される組成物は、状態を有するか、又は状態を有すると診断された対象に投与され得る。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、状態の症状を緩和するために、有効量の活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞を対象に投与することを含む。本明細書において使用される、「状態の症状を緩和すること」は、任意の状態又は状態と関連する症状を改善することである。同等の未処置のコントロールと比較して、かかる低減は、任意の標準的技術により測定された少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上である。本明細書に記載される組成物を対象に投与する様々な手段は、当業者に知られている。１つの実施態様において、本明細書に記載される組成物は、全身又は局所投与される。好ましい実施態様において、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与される。別の実施態様において、本明細書に記載される組成物は、腫瘍の部位で投与される。
【０２３９】
本明細書において使用される用語「有効量」は、疾患若しくは障害の少なくとも一又は複数の症状を緩和するために必要とされる活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞の量を指し、所望の効果をもたらすための細胞調製物又は組成物の十分な量に関する。したがって、用語「治療上有効量」は、典型的な対象に投与されるとき、特定の抗状態効果をもたらすのに十分である活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞の量を指す。様々な文脈において、本明細書において使用される有効量はまた、疾患の症状の発症を遅延させる、症状疾患の経過を変化させる（例えば、非限定的に、状態の進行を遅くすること）か、又は状態の症状を好転させるのに十分な量も含む。したがって、正確な「有効量」を特定することは、一般に、実行可能ではない。しかしながら、任意の所定の場合について、適当な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して当業者により決定され得る。
【０２４０】
有効量、毒性、及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物において標準的な医薬手法により、評価することができる。投薬量は、利用される投薬形態及び利用される投薬経路に依存して変動し得る。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物及び方法が好ましい。治療上有効な用量は、細胞培養アッセイからまず推定され得る。また、用量は、細胞培養、又は適当な動物モデルにおいて決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半分の最大阻害を達成する、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。任意の特定の投薬量の効果は、適したバイオアッセイ、例えば、とりわけ、骨髄試験のためのアッセイによりモニターされ得る。投薬量は、医師により決定され、必要に応じて、処置の観察された効果に合うよう調整され得る。
【０２４１】
本発明の１つの態様において、本明細書に記載されるテクノロジーは、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞、及び任意選択的に、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物の有効成分は、少なくとも、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。いくつかの実施態様において、薬学的組成物の有効成分は、本質的に、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞からなる。いくつかの実施態様において、薬学的組成物の有効成分は、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞からなる。細胞ベースの治療製剤のための薬学的に許容される担体は、食塩水及び水性バッファー溶液、リンゲル液、並びに血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬのような、血清成分を含む。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等のような用語は、本明細書において互換的に使用される。
【０２４２】
いくつかの実施態様において、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞を含む薬学的組成物は、非経口投与形態であり得る。非経口投薬形態の投与は、典型的には、混入物に対する患者の天然の防御を迂回するので、ＣＡＲ  Ｔ細胞自体以外の成分は、無菌であるか、又は患者への投与に先立ち無菌化される能力がある。非経口投薬形態の例は、注射する準備が整った溶液、注射用の薬学的に許容されるビークルにおいて溶解されるか、又は懸濁される準備が整った乾燥製品、注射する準備が整った懸濁液、及びエマルジョンを含むが、これらに限定されない。これらの何れかを、投与に先立ち、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞調製物に加えることができる。
【０２４３】
ここで開示される活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞の非経口投薬形態をもたらすために使用され得る適当なビークルは、当業者に周知である。例は、非限定的に、食塩水溶液；グルコース溶液；塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液を含むが、これらに限定されない水性ビークル；非限定的に、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールのような水混和性ビークル；並びに非限定的に、コーン油、ココナッツ油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルのような非水性ビークルを含む。
【０２４４】
投薬量
本明細書において使用される用語としての「単位投薬形態」は、適当な１回の投与のための投薬量を指す。例示の目的で、単位投薬形態は、デリバリー装置、例えば、シリンジ又は静脈内ドリップバックに配置した治療剤の量であり得る。１つの実施態様において、単位投薬形態は、単一の投与において投与される。別の実施態様において、１回より多い単位投薬形態は、同時に投与することができる。
【０２４５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、単独療法として投与される、すなわち、状態のための別の処置は、対象に同時に投与されない。
【０２４６】
本明細書に記載されるＴ細胞を含む薬学的組成物は、一般に、体重１ｋｇ当たり１０４から１０９個の細胞、ある場合では、その範囲内の全ての整数値を含む、体重１ｋｇ当たり１０５から１０６個の細胞の投薬量で投与され得る。必要なら、Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を使用することにより、投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ、３１９：１６７６、１９８８年を参照）。
【０２４７】
ある特定の態様において、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞を対象に投与し、次に、血液を続いて再度抜き（又は除去療法を行い）、本明細書に記載されるそれ由来のＴ細胞を活性化し、患者にこれらの活性化され、拡大されたＴ細胞を再度注入することが望ましいことがある。このプロセスは、数週間毎に複数回行われ得る。ある特定の態様において、Ｔ細胞は、ｌ０ｃｃから４００ｃｃの抜かれた血液から活性化され得る。ある特定の態様において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又はｌ００ｃｃの抜かれた血液から活性化される。
【０２４８】
投与様式は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は注入を含み得る。本明細書に記載される組成物は、患者に経動脈、腫瘍内、節間、又は髄内投与され得る。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染の部位に直接注射されてもよい。１つの実施態様において、本明細書に記載される組成物は、体腔又は体液（例えば、腹水（ａｓｃｉｔｅ）、胸膜液、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、若しくは脳脊髄液）に投与される。
【０２４９】
特定の典型的な態様において、対象は、白血球を集めるか、濃縮するか、若しくはエクスビボで枯渇させて、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択し、及び／又は単離する、白血球除去療法を経験してもよい。これらのＴ細胞単離物は、本明細書に記載されるａＡＰＣ、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３ＣＤＲを発現するａＡＰＣと接触させることにより拡大され、本発明の一又は複数のＣＡＲコンストラクトが、導入され得るように、処理され、これにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞を生じ得る。それを必要とする対象は、続いて、高い用量の化学療法での標準的処置、続いて、末梢血幹細胞移植を経験し得る。移植後又は移植と同時に、対象は、拡大されたＣＡＲ  Ｔ細胞の注入を受けることができる。１つの実施態様において、拡大された細胞は、外科手術の前又は後に投与される。
【０２５０】
いくつかの実施態様において、リンパ球枯渇は、本明細書に記載される一又は複数のＣＡＲ  Ｔ細胞の投与に先立ち、対象において行われる。かかる実施態様において、リンパ球枯渇は、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミド、及びフルダラビンの一又は複数を投与することを含み得る。
【０２５１】
患者に投与されるべき上記の処置の投薬量は、処置される状態及び処置のレシピエントの正確な性質と共に変動する。ヒト投与のための投薬量の計量は、当該技術分野で許容される習慣に従い行われ得る。
【０２５２】
いくつかの実施態様において、単一の処置計画が要求される。他方、一又は複数の続く用量又は処置計画の投与は、行われ得る。例えば、３か月間の隔週での処置後、処置は、１か月当たり１回、６か月又は１年以上の間繰返され得る。いくつかの実施態様において、最初の処置の後、追加の処置は投与されない。
【０２５３】
本明細書に記載される組成物の投薬量は、医師により決定され、必要に応じて、処置の観察された効果に合うよう調整され得る。処置の持続時間及び頻度に関して、熟練した臨床医は、処置が治療効果をもたらすときを決定するために対象をモニターするか、さらなる細胞を投与するかどうかを決定するか、処置を中止するか、処置を再開するか、又は処置計画に他の変更を加えることは、典型的である。投薬量は、サイトカイン放出症候群のような、有害な副作用を引き起こすほど多いべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、及び性別と共に変動し、当業者により決定され得る。投薬量はまた、任意の合併症の現象において個々の医師により調節され得る。
【０２５４】
併用療法
本明細書に記載される活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、他の公知の薬剤及び療法と組合されて使用され得る。１つの実施態様において、対象は、抗ＢＣＭＡ療法をさらに投与される。１つの実施態様において、対象は、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である。本明細書において使用される「組み合わせて」投与されるは、２種（又はそれ以上の）異なる処置が、障害に伴う対象の苦痛の経過中対象にデリバリーされること、例えば、２種以上の処置が、対象が、障害と診断された後、かつ障害が、治癒していないか、若しくは除去されていないか、又は処置が、他の理由のため中止される前に、デリバリーされることを意味する。いくつかの実施態様において、投与に関して重複が存在するように、１種の処置のデリバリーは、第２のデリバリーが始まるときに依然として生じている。これは、時に、本明細書において「同時」又は「並行デリバリー」として言及される。他の実施態様において、他方の処置のデリバリーが始まる前に、一方の処置のデリバリーが終わる。何れかの場合のいくつかの実施態様において、処置は、併用された投与のため、より有効である。例えば、第２の処置は、第１の処置の非存在下で投与されたなら観察されるものより、より有効である、例えば、同等の効果が、第２の処置を少なくして観察されるか、若しくは第２の処置は、第２の処置が、より高い程度に症状を低減するか、又は類似の状況が、第１の処置に関しても観察される。いくつかの実施態様において、デリバリーは、症状における低減、又は障害と関連する他のパラメーターが、他方の非存在下でデリバリーされた一方の処置で観察されるものより大きくなるようなデリバリーである。２種の処置の効果は、部分的に相加、全体的に相加、又は相加より大きくあり得る。デリバリーは、デリバリーされる第１の処置の効果が、第２がデリバリーされるとき、依然として検出可能であるようなデリバリーであり得る。本明細書に記載される活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞及び少なくとも１種の追加の治療剤は、同じ組成物において、又は別々の組成物において、同時に、又は連続して投与され得る。連続投与について、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する細胞が、最初に投与され、追加の薬剤が、２番目に投与され得るか、又は投与の順が、逆であることもできる。ＣＡＲ  Ｔ療法及び／又は他の治療剤、手法若しくはモダリティは、活発な障害の期間中、又は寛解若しくはあまり活発でない疾患の期間中に、投与され得る。ＣＡＲ  Ｔ療法は、別の処置前、処置と同時、処置後、又は障害の寛解中に、投与され得る。
【０２５５】
組合せで投与されるとき、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞及び追加の薬剤（例えば、第２若しくは第３の薬剤）、又は全てが、例えば、単独療法として、個々に使用されるそれぞれの薬剤の量若しくは投薬量より多い、少ない、又は同じである量又は用量で投与され得る。ある特定の実施態様において、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞、追加の薬剤（例えば、第２若しくは第３の薬剤）、又は全ての投与される量或いは投薬量は、個々に使用されるそれぞれの薬剤の量又は投薬量より少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、若しくは少なくとも５０％）。他の実施態様において、所望の効果（例えば、がんの処置）をもたらす、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞、追加の薬剤（例えば、第２若しくは第３の薬剤）、若しくは全ての量又は投薬量は、同じ治療効果を達成するために個々に要求されるそれぞれの薬剤の量又は投薬量より少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％少ない）。さらなる実施態様において、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、外科手術、化学療法、放射線、及びｍＴＯＲ経路阻害剤、サイクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、及びＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体、又はＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体若しくは他の抗体療法のような他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、又はＩｚｕｍｏｔｏ等、２００８年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、１０８：９６３−９７１に記載されるもののようなペプチドワクチンと組み合わせた処置計画において使用され得る。
【０２５６】
１つの実施態様において、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。典型的なチェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１阻害剤（ニボルマブ、ＭＫ−３４７５、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４）、抗ＣＴＬＡ４阻害剤（イピリムマブ及びトレメリムマブ）、抗ＰＤＬ１阻害剤（アテゾリズマブ、アベロマブ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＥＤＩ４７３６、及びＭＰＤＬ３２８０Ａ）、並びに抗ＴＩＭ３阻害剤を含む。
【０２５７】
１つの実施態様において、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用され得る。典型的な化学療法剤は、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソーマルドキソルビシンン））、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツザマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗物質（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログ及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシン又はボルテゾミブ）、サリドマイド又はサリドマイド誘導体（例えば、レナリドミド）のような免疫調節物質を含む。併用療法での使用が考慮される一般的な化学療法剤は、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射液（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブチル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）又はＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射液（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメガン）、ダウノルビシン塩酸塩（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射液（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、フルダラビンリン酸塩（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチジビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ���登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロザン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、タモキシフェンクエン酸塩（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含む。典型的なアルキル化剤は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア及びトリアゼン）：ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ  Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブチル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスホルアミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））、並びにダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））を含むが、これらに限定されない。追加の典型的なアルキル化剤は、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）及びＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄとしても知られる、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭとしても知られる、Ｌ−サルコリシン、及びフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても知られる、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録���標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）及びＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵとしても知られる、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（ＣＤＤＰとしても知られる、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）及びＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）；クロラムブチル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）及びＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣ及びイミダゾールカルボキサミドとしても知られる、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチラミン（ＨＭＭ）としても知られる、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドヌマスチン；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン及び塩酸メクロエタミンとしても知られる、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ及びＴＳＰＡとしても知られる、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；並びにベンダムスチンＨＣ１（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））を含むが、これらに限定されない。典型的なｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス（公式には、デフェロリムスとして知られる、ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開第０３／０６４３８３号に記載される（ｌＲ，２Ｒ，４５）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９５，１２５，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３５，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０５，３２５，３５Ｒ）−ｌ，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３、２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−ｌｌ，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４’９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）又はＲＡＤＯＯｌ）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標）
）；シマピモド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；エムシロリムス、（５−｛２，４−ビス［（３５，）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−（ｉ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［イラウ５，−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ＪＪピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；並びにＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−ａ−アスパルチル−Ｌ−セリン−、分子内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）、並びにＸＬ７６５を含む。典型的な免疫調節物質は、例えば、アフツズマブ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）から入手可能）；ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））；レナリドミド（ＣＣ−５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、アクチミド（ＣＣ４０４７）；並びにＩＲＸ−２（インターロイキン１、インターロイキン２、及びインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）を含む。典型的なアントラサイクリンは、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）及びＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、及びルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダウノルビシンクエン酸リポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；並びにデスアセチルラビドマイシンを含む。典型的なビンカアルカロイドは、例えば、ビノレルビン酒石酸塩（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）））；ビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチン及びＶＬＢとしても知られる、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（登録商標）及びＶｅｌｂａｎ（登録商標））；並びにビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含む。典型的なプロテオソーム阻害剤は、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７、（５）−４−メチル−Ｎ−（（５）−ｌ−（（（５）−４−メチル−ｌ−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−ｌ−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−ｌ−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（５，）−２−（２−モルホリノアセタミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＴ００５２）；イキサゾミブクエン酸エステル（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）；並びにＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（１Ｓ’）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−１−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンアミド（ＯＮＸ−０９１２）を含む。
【０２５８】
当業者は、使用の化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｒｕｇ  Ｍａｎｕａｌ、２０１４年、Ｅｄｗａｒｄ  Ｃｈｕ、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｔ．  ＤｅＶｉｔａ  Ｊｒ．、Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１８編の第８５章；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ：Ｅｒａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ａｂｅｌｏｆｆ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１３年、ＥｌｓｅｖｉｅｒのＣｈｓ．２８−２９；及びＦｉｓｃｈｅｒ  Ｄ  Ｓ（編）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第４編、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ、２００３年を参照）。
【０２５９】
実施態様において、活性化された本明細書に記載されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＩＴＲを標的とする分子及び／若しくはＧＩＴＲ機能を調節する分子の活性並びに／又はレベルを減少する分子、制御性Ｔ細胞集団を減少する分子、ｍＴＯＲ阻害剤、ＧＩＴＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、非受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、並びに／或いはＢＴＫ阻害剤と組み合わせて対象に投与される。
【０２６０】
有効性
例えば、本明細書に記載される状態の処置における、又は本明細書に記載される応答（例えば、がん細胞における低減）を誘導するための活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性は、熟練した臨床医により決定され得る。しかしながら、本明細書に記載される状態の徴候若しくは症状の一又は複数が、有益な様式で変更されるか、他の臨床上許容される症状が、改善されるか、若しくは向上されるか、又は所望の応答が、本明細書に記載される方法による処置後、例えば、少なくとも１０％誘導されるなら、処置は、本明細書において使用される用語「有効な処置」であるとみなされる。有効性は、例えば、本明細書に記載される方法に従い処置される状態のマーカー、指標、症状、及び／若しくは発生率、又は任意の他の適当な測定可能なパラメーターを測定することにより、評価され得る。本明細書に記載される方法は、マーカーのレベル若しくは状態の症状を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％以上減少し得る。
【０２６１】
有効性はまた、入院により評価される、又は医療行為に必要とされる、悪化するという個体の失敗により測定され得る（すなわち、疾患の進行が、停止される）。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載される。
【０２６２】
処置は、個体又は動物における疾患の任意の処置を含み（いくつかの非限定的な例は、ヒト若しくは動物を含む）、（１）疾患を阻害すること、例えば、症状（例えば、疼痛若しくは炎症）の悪化を予防すること；又は（２）疾患の重症度を軽減すること、例えば、症状の後退を引き起こすことを含む。疾患の処置についての有効量は、それを必要とする対象に投与されたとき、その疾患について、その用語が、本明細書において定義された有効な処置をもたらすのに十分である量を意味する。薬剤の有効性は、状態の身体的指標又は所望の応答を評価することにより、決定され得る。かかるパラメーターの任意の１つ、若しくはパラメーターの任意の組合せを測定することにより、投与及び／又は処置の有効性をモニターすることは、十分に、当業者の能力内である。規定のアプローチの有効性は、本明細書に記載される状態の動物モデル、例えば、ＡＬＬの処置において評価され得る。実験動物モデルを使用するとき、マーカーにおける統計上有意な変化が観察されるとき、処置の有効性が証明される。
【０２６３】
本出願を通じて引用される、参照文献、取得された特許、公開された特許出願、及び係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載されるテクノロジーと関連して使用され得るかかる刊行物において記載される方法論を記載し、開示する目的で、出典明示により本明細書に明白に援用される。これらの刊行物は、本出願の出願日より前の開示について、もっぱら提供される。これに関していずれも、本発明者らが、先行発明の理由で、又は任意の他の理由のため、かかる開示に先行する権利がないという承認とみなされるべきではない。日付についての全ての宣誓、又はこれらの文書の内容についての表明は、出願人が入手可能な情報に基づき、日付の正確性又はこれらの文書の内容についての承認を構成しない。
【０２６４】
本開示の実施態様の説明は、包括的であるか、又は開示を開示される正確な形態に制限することを意図されない。開示の特定の実施態様、及び開示についての実施例は、説明の目的で本明細書において記載される一方、当業者は、容易に認識するので、開示の範囲内で様々な同等の修飾が可能である。例えば、方法の工程又は機能は、規定の順で提示される一方、代替の実施態様は、異なる順で機能してもよいか、又は機能は、実質的に同時に行われてもよい。本明細書において提供される開示の教示は、必要に応じて他の手法又は方法に適用され得る。本明細書に記載される様々な実施態様を組み合わせて、さらなる実施態様を提供し得る。開示の態様を、必要なら、修飾して、上記の参考文献及び出願の組成物、機能及び概念を利用して、開示のなおさらなる実施態様を提供し得る。さらに、生物学的な機能等価の考慮に起因し、いくつかの変更が、種類若しくは量において生物学的又は化学的作用に影響することなく、タンパク質構造において、なされ得る。これら及び他の変更は、詳細な説明に照らして、開示になされ得る。かかる修飾の全ては、添付の請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０２６５】
前述の実施態様の何れかの特定の構成要素は、他の実施態様における構成要素のため組合されるか、又は置き換えられ得る。さらに、開示のある特定の実施態様と関連する利点が、これらの実施態様の文脈で記載される一方、他の実施態様はまた、かかる利点を示してもよく、全ての実施態様が、開示の範囲内にあるかかる利点を必ずしも示す必要がない。
【０２６６】
本明細書に記載されるテクノロジーは、以下の実施例によりさらに説明され、それらは、決して、さらなる制限と解釈されるべきではない。
【０２６７】
本明細書に記載されるテクノロジーのいくつかの実施態様は、次の番号を付けられたパラグラフの何れかに従い定義され得る。
１．
ａ）それぞれが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体リガンド又はその部分を含む２つ以上の細胞外ドメイン；
ｂ）膜貫通型ドメイン；及び
ｃ）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
２．  膜貫通型ドメインがヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ１に記載のＣＡＲポリペプチド。
３．  一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む、パラグラフ１又は２に記載のＣＡＲポリペプチド。
４．  ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドが、Ａ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である、パラグラフ１から３の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
５．  ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドが、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＬＩＧＨＴ、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ）、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、核因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連の弱いアポトーシスの誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、カルシウム調節リガンド（ＣＡＭＬＧ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）関連タンパク質（ＧＩＴＲ）リガンド、又はエクトジスプラシンＡ２（ＥＤＡ−Ａ２）である、パラグラフ１から３の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
６．  ２つ以上の細胞外ドメインがそれぞれ、同じＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む、パラグラフ１から５の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
７．  少なくとも２つの細胞外ドメインがそれぞれ、異なるＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む、パラグラフ１から５の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
８．  ２つ以上の細胞外ドメインが、一又は複数のリンカー配列によって互いに連結されている、パラグラフ１から７の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
９．  各リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ８に記載のＣＡＲポリペプチド。
１０．  各リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列を含む、パラグラフ８又は９に記載のＣＡＲポリペプチド。
１１．  リーダー配列をさらに含む、パラグラフ１から１０の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
１２．  リーダー配列がＣＤ８リーダー配列である、パラグラフ１１に記載のＣＡＲポリペプチド。
１３．  ＣＤ８リーダー配列が、配列番号２０、２６、又は３２の配列を含む、パラグラフ１２に記載のＣＡＲポリペプチド。
１４．  ＡＰＲＩＬの部分が、ＡＰＲＩＬのリジンリッチな領域を含まない、パラグラフ４及び６から１３の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
１５．  ＡＰＲＩＬの部分が、フリン切断部位を含まない、パラグラフ４及び６から１４の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
１６．  ＡＰＲＩＬの部分が、配列番号２１、２７、３３、又は４０の配列を含む、パラグラフ４及び６から１５の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
１７．  ヒンジ及び膜貫通型ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ及び膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ１から１６の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
１８．  ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通型ドメインが、配列番号２２又は４２のアミノ酸配列を含む、パラグラフ１７に記載のＣＡＲポリペプチド。
１９．  ４−１ＢＢヒンジ及び膜貫通型ドメインが、配列番号２８又は３４のアミノ酸配列を含む、パラグラフ１７に記載のＣＡＲポリペプチド。
２０．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、又はＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ１から１９の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
２１．  ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２４、３０、又は４４のアミノ酸配列を含む、パラグラフ２０に記載のＣＡＲポリペプチド。
２２．  ＣＤ３θ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、パラグラフ２０に記載のＣＡＲポリペプチド。
２３．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の細胞内ドメインを含む、パラグラフ１から２２の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
２４．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢの細胞内ドメインである、パラグラフ１から２３の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
２５．  ４−１ＢＢの細胞内ドメインが、配列番号２３、２９、３５、又は４３のアミノ酸配列を含む、パラグラフ２４に記載のＣＡＲポリペプチド。
２６．  ＣＡＲポリペプチドが、それぞれがＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む３つの細胞外ドメインを含む、パラグラフ１から２５の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
２７．  配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列と少なくとも９５％の配列同一性を含むか、又は配列番号４５の配列と少なくとも９５％の配列同一性を含む配列によってコードされる、ＣＡＲポリペプチド。
２８．  配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列を含むか、又は配列番号４５の配列によってコードされる、ＣＡＲポリペプチド。
２９．  配列番号３９、５７、６４、若しくは６５の配列に対応する配列を含むか、又は配列番号４５の配列によってコードされる、ＣＡＲポリペプチド。
３０．  パラグラフ１から２９の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチドの２つ以上を含むポリペプチド複合体。
３１．  ポリペプチド複合体が、パラグラフ１から２９の何れか１つに記載の３つのＣＡＲポリペプチドを含む、パラグラフ３０のポリペプチド複合体。
３２．
ａ）パラグラフ１から２９の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド；
ｂ）パラグラフ１から２９の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸；又は
ｃ）パラグラフ３０若しくは３１のポリペプチド複合体
を含む哺乳類細胞。
３３．  細胞が、Ｔ又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、パラグラフ３２に記載の細胞。
３４．  細胞がヒト細胞である、パラグラフ３２又は３３に記載の細胞。
３５．  細胞が、がん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を有するか、或いは有すると診断された個体から得られる、パラグラフ３２から３４の何れか１つに記載の細胞。
３６．  対象におけるがん、形質細胞障害、アミロイドーシス、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法であって、
ａ）Ｔ細胞表面上にパラグラフ１から２９の何れか１つに記載のＣＡＲを含むようにＴ細胞を操作すること；及び
ｂ）操作されたＴ細胞を対象に投与すること
を含む、方法。
３７．  対象におけるがん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法であって、パラグラフ３２から３５の何れか１つに記載の細胞を対象に投与することを含む、方法。
３８．  がんが、ＢＡＦＦ＋、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）＋及び／又は膜貫通活性化因子及びカルシウム調節リガンド（ＣＡＭＬ）相互作用物質（ＴＡＣＩ）＋である、パラグラフ３６又は３７に記載の方法。
３９．  対象が、抗ＢＣＭＡ療法をさらに投与される、パラグラフ３６から３８の何れか１つに記載の方法。
４０．  対象が、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である、パラグラフ３６から３９の何れか１つに記載の方法。
４１．  がんが、多発性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である、パラグラフ３６から４０の何れか１つに記載の方法。
４２．  自己免疫疾患が、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される、パラグラフ３６から４１の何れか１つに記載の方法。
４３．  対象が、高レベルの抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体を有する、パラグラフ３６から４２の何れか１つに記載の方法。
４４．  がんの処置のため製剤された、パラグラフ１から２９の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド、パラグラフ３０若しくは３１に記載のポリペプチド複合体、又はパラグラフ３２から３５の何れか１つに記載の細胞を含む組成物。
４５．  薬学的に許容される担体をさらに含む、パラグラフ４４に記載の組成物。
４６．  抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である対象を処置する方法であって、ＣＡＲ及び／又はＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、ここでＣＡＲは、２つ以上のＡＰＲＩＬドメインを含む細胞外標的結合ドメインを含む、方法。
４７．  対象が、がん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を有する、パラグラフ４６に記載の方法。
４８．  がんが、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを発現する細胞を含む、パラグラフ４７に記載の方法。
４９．  がんが、ＢＣＭＡ発現が低下した細胞を含む、パラグラフ４７又は４８に記載の方法。
５０．  がんが、骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である、パラグラフ４７から４９の何れか１つに記載の方法。
５１．  がんが、多発性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫である、パラグラフ４７から５０の何れか１つに記載の方法。
５２．  形質細胞障害がアミロイドーシスである、パラグラフ４７に記載の方法。
５３．  自己免疫疾患又は障害が、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される、パラグラフ４７に記載の方法。
５４．  対象が、高レベルの抗ＨＬＡ抗体を有する、パラグラフ４７に記載の方法。
５５．  ＣＡＲが、膜貫通型ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ４６から５４の何れか１つに記載の方法。
５６．  ＣＡＲが、一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む、パラグラフ４６から５５の何れか１つに記載の方法。
５７．  膜貫通型ドメインが、ヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ５５又は５６に記載の方法。
５８．  ヒンジ／膜貫通型ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ５７に記載の方法。
５９．  ヒンジ／膜貫通型ドメインが、任意選択的に配列番号２２又は４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ５７又は５８に記載の方法。
６０．  ヒンジ／膜貫通型ドメインが、任意選択的に配列番号２８又は３４のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ５７又は５８に記載の方法。
６１．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ５５から６０の何れか１つに記載の方法。
６２．  細胞内シグナル伝達ドメインが、任意選択的に配列番号２４、３０、又は４４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ６１に記載の方法。
６３．  細胞内シグナル伝達ドメインが、任意選択的に配列番号３６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ６１に記載の方法。
６４．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ４０の共刺激ドメインを含む、パラグラフ５６から６３の何れか１つに記載の方法。
６５．  共刺激ドメインが、任意選択的に配列番号２３、２９、３５、又は４３のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む、パラグラフ６４に記載の方法。
６６．  各ＡＰＲＩＬドメインが、配列番号２１、２７、３３、又は４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ４６から６５の何れか１つに記載の方法。
６７．  各ＡＰＲＩＬドメインが、配列番号２１、２７、３３、又は４０のアミノ酸配列を含む、パラグラフ６６に記載の方法。
６８．  ＡＰＲＩＬドメインが、一又は複数のリンカー配列によって互いに連結されている、パラグラフ４６から６７の何れか１つに記載の方法。
６９．  リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ６８に記載の方法。
７０．  リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列を含む、パラグラフ６８又は６９に記載の方法。
７１．  細胞外標的結合ドメインが３つのＡＰＲＩＬドメインを含む、パラグラフ４６から７０の何れか１つに記載の方法。
７２．  細胞外標的結合ドメインが、配列番号５６又は５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ４６から７１の何れか１つに記載の方法。
７３．  細胞外標的結合ドメインが、配列番号５６又は５９のアミノ酸配列を含む、パラグラフ４６から７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．  ＣＡＲが、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ４６から７３の何れか１つに記載の方法。
７５．  ＣＡＲが、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列を含む、パラグラフ４６から７４の何れか１つに記載の方法。
７６．  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、自殺遺伝子をさらに含む、パラグラフ４６から７５の何れか１つに記載の方法。
７７．  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、シグナル配列をコードする配列をさらに含む、パラグラフ４６から７６の何れか１つに記載の方法。
７８．  免疫細胞が、Ｔ又はＮＫ細胞である、パラグラフ４６から７７の何れか１つに記載の方法。
７９．  免疫細胞がヒト細胞である、パラグラフ４６から７８の何れか１つに記載の方法。
８０．  ３つのＡＰＲＩＬドメインを含む細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲ。
８１．  ＣＡＲが、膜貫通型ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ８０に記載のＣＡＲ。
８２．  ＣＡＲが、一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む、パラグラフ８１に記載のＣＡＲ。
８３．  膜貫通型ドメインが、ヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ８１又は８２に記載のＣＡＲ。
８４．  ヒンジ／膜貫通型ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ８３に記載のＣＡＲ。
８５．  ヒンジ／膜貫通型ドメインが、任意選択的に配列番号２２又は４２のアミノ酸配列を含む、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ８３又は８４に記載のＣＡＲ。
８６．  ヒンジ／膜貫通型ドメインが、任意選択的に配列番号２８又は３４のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ８３又は８４に記載のＣＡＲ。
８７．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ８１から８６の何れか１つに記載のＣＡＲ。
８８．  細胞内シグナル伝達ドメインが、任意選択的に配列番号２４、３０、又は４４のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ８７に記載のＣＡＲ。
８９．  細胞内シグナル伝達ドメインが、任意選択的に配列番号３６のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３θの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ８７に記載のＣＡＲ。
９０．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ４０の共刺激ドメインを含む、パラグラフ８２から８９の何れか１つに記載のＣＡＲ。
９１．  共刺激ドメインが、任意選択的に配列番号２３、２９、３５、又は４３のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む、パラグラフ９０に記載のＣＡＲ。
９２．  各ＡＰＲＩＬドメインが、配列番号２１、２７、３３、又は４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ８０から９１の何れか１つに記載のＣＡＲ。
９３．  各ＡＰＲＩＬドメインが、配列番号２１、２７、３３、又は４０のアミノ酸配列を含む、パラグラフ９２に記載のＣＡＲ。
９４．  ＡＰＲＩＬドメインが、一又は複数のリンカー配列によって互いに連結されている、パラグラフ８０から９３の何れか１つに記載のＣＡＲ。
９５．  リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ９４に記載のＣＡＲ。
９６．  リンカー配列が、配列番号４１、５８、６１、６２、又は６３のアミノ酸配列を含む、パラグラフ９４又は９５に記載のＣＡＲ。
９７．  細胞外標的結合ドメインが、配列番号５６又は５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ８０から９６の何れか１つに記載のＣＡＲ。
９８．  細胞外標的結合ドメインが、配列番号５６又は５９のアミノ酸配列を含む、パラグラフ８０から９７のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
９９．  ＣＡＲが、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ８０から９８の何れか１つに記載のＣＡＲ。
１００．  ＣＡＲが、配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列を含む、パラグラフ８０から９９の何れか１つに記載のＣＡＲ。
１０１．  配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲ。
１０２．  配列番号３９、５７、６４、又は６５のアミノ酸配列を含むＣＡＲ。
１０３．  パラグラフ８０から１０２の何れか１つに記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
１０４．  自殺遺伝子をさらに含む、パラグラフ１０３に記載のポリヌクレオチド。
１０５．  シグナル配列をコードする配列をさらに含む、パラグラフ１０３又は１０４に記載のポリヌクレオチド。
１０６．  パラグラフ８０から１０２の何れか１つに記載のＣＡＲ及び／又はパラグラフ１０３から１０５の何れか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
１０７．  免疫細胞がＴ又はＮＫ細胞である、パラグラフ１０６に記載の免疫細胞。
１０８．  免疫細胞がヒト細胞である、パラグラフ１０６又は１０７に記載の免疫細胞。
１０９．  パラグラフ８０から１０２の何れか１つに記載のＣＡＲ、パラグラフ１０３から１０５の何れか１つに記載のポリヌクレオチド、及び／又はパラグラフ１０６から１０８の何れか１つに記載の免疫細胞を含む、薬学的組成物。
１１０．  対象におけるがん、形質細胞障害、自己免疫疾患若しくは障害、又は移植片拒絶反応を処置する方法であって、パラグラフ１０６から１０８の何れか１つに記載の免疫細胞及び／又はパラグラフ１０９に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
１１１．  がんが、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを発現する細胞を含む、パラグラフ１１０に記載の方法。
１１２．  がんが、ＢＣＭＡ発現が低下した細胞を含む、パラグラフ１１０又は１１１に記載の方法。
１１３．  対象が、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である、パラグラフ１１０から１１２の何れか１つに記載の方法。
１１４．  がんが、骨髄腫、又はヴァルデンストレームマクログロブリン血症である、パラグラフ１１０から１１３の何れか１つに記載の方法。
１１５．  骨髄腫が、多発性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫である、パラグラフ１１４に記載の方法。
１１６．  形質細胞障害がアミロイドーシスである、パラグラフ１１０に記載の方法。
１１７．  自己免疫疾患又は障害が、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される、パラグラフ１１０に記載の方法。
１１８．  対象が、高レベルの抗ＨＬＡ抗体を有する、パラグラフ１１０に記載の方法。
【０２６８】
本明細書に記載されるテクノロジーのさらに他の実施態様は、次のさらなる番号を付けられたパラグラフの何れかに従い定義され得る。
１
ａ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む一又は複数の細胞外ドメイン；
ｂ）ヒンジ及び膜貫通型ドメイン；
ｃ）共刺激ドメイン；及び
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
２．  ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドが、Ａ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である、パラグラフ１に記載のＣＡＲポリペプチド。
３．  ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドが、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１５４、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＬＩＧＨＴ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、ＴＬ１Ａ、又はＥＤＡ−Ａ２である、パラグラフ１に記載のＣＡＲポリペプチド。
４．  ＣＤ８リーダー配列をさらに含む、パラグラフ１から３の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
５．  ＣＤ８リーダー配列が、配列番号２０、２６、又は３２から選択される配列を含む、パラグラフ４に記載のＣＡＲポリペプチド。
６．  ＡＰＲＩＬの部分が、ＡＰＲＩＬのリジンリッチな領域を含まない、パラグラフ２、４、又は５の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
７．  ＡＰＲＩＬの部分が、配列番号２１、２７、又は３３から選択される配列を含む、パラグラフ２又は４から６の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
８．  ヒンジ及び膜貫通型ドメインが、ＣＤ８又は４−１ＢＢのヒンジ及び膜貫通型ドメインを含む、パラグラフ１から７の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
９．  ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通型ドメイン配列が、配列番号２２の配列を含む、パラグラフ１から８の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
１０．  ４−１ＢＢヒンジ及び膜貫通型ドメイン配列が、配列番号２８又は３４から選択される配列を含む、パラグラフ１から９の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
１１．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、又はＣＤ３θのシグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ１から１０の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
１２．  ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン配列が、配列番号２４又は３０から選択される配列を含む、パラグラフ１から１１の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
１３．  ＣＤ３θ細胞内シグナル伝達ドメイン配列が、配列番号３６の配列を含む、パラグラフ１から１２の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
１４．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢ  ＩＣＤ、ＣＤ２８  ＩＣＤ、ＣＤ２７  ＩＣＤ、ＩＣＯＳ  ＩＣＤ、及びＯＸ４０  ＩＣＤからなる群から選択される細胞内ドメインである、パラグラフ１から１３の何れかに記載のＣＡＲ。
１５．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢの細胞内ドメインである、パラグラフ１から１４の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド。
１６．  ４−１ＢＢ配列の細胞内ドメインが、配列番号２３、２９、又は３５から選択される配列を含む、パラグラフ１５に記載のＣＡＲポリペプチド。
１７．  ＣＡＲポリペプチドが、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む２つ以上の細胞外ドメインを含む、パラグラフ１から１６の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド。
１８．  ＣＡＲポリペプチドが、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンドの部分を含む３つの細胞外ドメインを含む、パラグラフ１７に記載のＣＡＲポリペプチド。
１９．  配列番号１９、２５、若しくは３１から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を含むか、又は配列番号１、７、若しくは１３から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を含む配列によりコードされるＣＡＲポリペプチド。
２０．  配列番号１９、２５、若しくは３１から選択される配列を含むか、又は配列番号１、７、若しくは１３から選択される配列によりコードされるＣＡＲポリペプチド。
２１．  配列番号１９、２５、若しくは３１から選択される配列に対応する配列を含むか、又は配列番号１、７、若しくは１３から選択される配列によりコードされるＣＡＲポリペプチド。
２２．  パラグラフ１から２１の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチドの２つ以上を含むポリペプチド複合体。
２３．  ポリペプチド複合体が、パラグラフ１から２１の何れか１つに記載の３つのＣＡＲポリペプチドを含む、パラグラフ２２に記載のポリペプチド複合体。
２４．
ａ）パラグラフ１から２１の何れかに記載のＣＡＲポリペプチド；
ｂ）パラグラフ１から２１の何れかに記載のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸；又は
ｃ）パラグラフ２２若しくは２３に記載のポリペプチド複合体
を含む哺乳類細胞。
２５．  細胞がＴ細胞である、パラグラフ２４に記載の細胞。
２６．  細胞がヒト細胞である、パラグラフ２４又は２５に記載の細胞。
２７．  細胞が、がん、形質細胞障害、若しくは自己免疫疾患を有するか、又は有すると診断された個体から得られる、パラグラフ２４から２６の何れかに記載の細胞。
２８．  対象においてがん、形質細胞障害、アミロイドーシス、又は自己免疫疾患を処置する方法であって、
ａ）Ｔ細胞表面上にパラグラフ１から２１の何れかに記載のＣＡＲを含むようにＴ細胞を操作すること；
ｂ）操作されたＴ細胞を対象に投与すること
を含む方法。
２９．  対象においてがん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患を処置する方法であって、パラグラフ２４から２７の何れかに記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
３０．  がんが、ＢＡＦＦ＋、ＢＣＭＡ＋及び／又はＴＡＣＩ＋である、パラグラフ２８又は２９に記載の方法。
３１．  対象が、抗ＢＣＭＡ療法をさらに投与される、パラグラフ２８から３０の何れかに記載の方法。
３２．  対象が、抗ＢＣＭＡ療法に抵抗性である、パラグラフ２８から３１の何れかに記載の方法。
３３．  がんが、多発性骨髄腫又はくすぶり型骨髄腫である、パラグラフ２８から３２の何れかに記載の方法。
３４．  自己免疫疾患が、凝固因子に対する抗体を有する血友病、重症筋無力症、多発性硬化症、及び慢性移植片対宿主病からなる群から選択される、パラグラフ２８から３２の何れかに記載の方法。
３５．  がんの処置のため製剤された、パラグラフ１から２１の何れか１つに記載のＣＡＲポリペプチド、パラグラフ２２若しくは２３に記載のポリペプチド複合体、又はパラグラフ２４から２７の何れか１つに記載の細胞を含む組成物。
３６．  薬学的に許容される担体をさらに含む、パラグラフ３５に記載の組成物。
【実施例】
【０２６９】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。
本明細書で提供される説明を前提として、様々な他の実施態様が実施されてもよいことが理解される。  
実施例１  ＡＰＲＩＬベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の設計
ＣＤ８又は４−１ＢＢの膜貫通型ドメインに融合したＡＰＲＩＬ（Ａ増殖誘導リガンド）の細胞外ドメイン及びＴ細胞活性化受容体ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３エータ、又はＣＤ３シータのシグナル伝達ドメインに基づくキメラ抗原受容体を、本明細書に記載する。これらのＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ標的化療法に対する抵抗性を克服し、最適な機能のための膜貫通型ドメインのダイマー形成及びトリマー形成を利用する。これらのＣＡＲは、がん、例えば、多発性骨髄腫、形質細胞障害、及び／又は重篤な自己免疫疾患の処置のために企図される。
【０２７０】
本発明は、ＢＣＭＡについての天然のリガンドを使用して、抗原結合部分を操作して、抗骨髄腫ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成し得ることを企図する。ｓｃＦｖ及び天然のリガンド（ＡＰＲＩＬ）に基づくＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、及び／又はＢＡＦＦ受容体を発現する骨髄腫細胞株において、細胞傷害活性、抗原特異的増殖、並びにサイトカイン産生について比較した。
【０２７１】
ＢＣＭＡは、低い親和性でＢＡＦＦ及び高い親和性でＡＰＲＩＬに結合する小さいＩＩＩ型膜貫通型タンパク質であり、ＢＣＭＡシグナル伝達は、骨髄腫細胞をアポトーシスから守る。
【０２７２】
ＢＣＭＡは、２種の近いファミリーメンバー：ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ受容体を有する。ＴＡＣＩは、Ｂ細胞発生の類似のレベル及びステージで発現し、一方、ＢＡＦＦ受容体は、Ｂ細胞発生の早期ステージにおいて発現し、ＡＰＲＩＬよりＢＡＦＦへの結合についてより高い親和性を有する。ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方の細胞内ドメインが、ＴＲＡＦと相互作用し、恐らく形質細胞生存の促進において冗長機能を有する。ＢＣＭＡに対して特異的に生じた抗体及びｓｃＦｖは、逆よりも、ＢＣＭＡのエピトープ結合領域が小さいので、ＴＡＣＩと交差反応しそうにない。事実、文献は、臨床設定における抗ＢＣＭＡ産物（抗体、ｓｃＦｖ、又は二重特異的Ｔ細胞エンゲイジャー）が、ＢＡＦＦ受容体又はＴＡＣＩと交差反応しないことを示している。
【０２７３】
新規の特異性を有するＣＡＲ  Ｔ細胞の設計における最大の課題の１つは、標的の腫瘍外発現を決定することである。頼もしいことに、抗ＢＣＭＡ産物は、腫瘍外反応性の証拠はなく、様々な臨床設定において安全であるとみなされている。ＢＣＭＡに指向化されたＣＡＲ  Ｔ細胞産物は、サイトカイン放出症候群と関連している。しかしながら、ＴＣＧＡ、ＥＮＣＯＤＥ、ＢＬＵＥＰＲＩＮＴ、並びにＧＴＥＸから公的に入手可能なデータは、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現特性は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を介した標的化に安全であるように思われること（データは示されていない）；どちらの分子も、形質細胞及びＢ細胞以外の健常な成人組織により発現されず、両方が、複数の骨髄腫及び慢性リンパ性白血病において高いレベルで発現されることを示す。さらに、抗ＣＤ１９により指向化されたＣＡＲ  Ｔ細胞を投与した急性リンパ芽球性白血病を有する患者における抗原回避バリアントに関する新たなデータを考慮すると、同様の発現特性及びシグナル伝達重複性で２種の抗原に結合する再指向化Ｔ細胞を開発することによって、回避バリアントを回避する機序がもたらされ得る。
【０２７４】
２種類の抗原に対して反応するよう設計された１つのＣＡＲを生成する３種の推定上の方法が存在する。（１）両方の標的と交差反応するｓｃＦｖを生成すること。このストラテジーに伴う危険は、乱雑なｓｃＦｖがまた、前臨床設定において推定することが困難であり得る腫瘍外反応性を有し得ることである。（２）タンデムで２種の異なる特異性を有するｓｃＦｖから構成されるＣＡＲを生成すること。このストラテジーは、ＣＤ１９及びＣＤ２２並びにＣＤ１９及びＣＤ２０等について追跡されている。しかしながら、２種のｓｃＦｖ間の最適なスペーシングは、経験的に決定されなければならず、交差反応する二重特異性抗体ｓｃＦｖの形成はまた、非特異的な結合をもたらし得る。特に、ｓｃＦｖが、生成され、個々に試験され、次に合わされなければならないので、この方法は、実現可能であるが、困難かつ高価である。（３）両方の受容体に結合し、それをキメラ抗原受容体の残る成分（膜貫通型及びシグナル伝達ドメイン）に融合させる高親和性リガンドを開発すること。この場合において、本発明者らは、ＡＰＲＩＬでの第３のアプローチを利用する独自の機会があることを理解した（図１）。
【０２７５】
ＡＰＲＩＬをＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞外結合ドメインとして使用することに関して、４つの可能性のある問題点が存在する：（１）ＡＰＲＩＬは、ホモトリマーを天然で形成し、一方、ｓｃＦｖベースのＣＡＲは、ホモダイマー形成すると考えられる。ＡＰＲＩＬホモダイマーが、ＢＣＭＡ／ＴＡＣＩに結合するかどうか、又はＣＡＲが、トリマーを形成する場合にシグナル伝達し得るかは、明確でない。注目すべきは、４−１ＢＢも、天然で、トリマーを形成し、依然、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＡＲコンストラクトは、非常に活性であり、これは、ホモダイマー形成とホモトリマー形成ＴＮＦ関連タンパク質の間の機能の可動性を示している。ＢＣＭＡ／ＴＡＣＩへの適当な結合を伴う活性なＣＡＲの形成は、可溶性ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩでのフローサイトメトリーを介して、並びにＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを発現する標的細胞に対する細胞傷害性アッセイを介してインビトロで容易に試験される。（２）ＡＰＲＩＬはまた、シンデカンファミリー（ＣＤ１３８、シンデカン−１を含む）と関連するヘパラン硫酸鎖に結合し、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡより散在した発現を有し、したがって、腫瘍外活性について増大した可能性が存在する。具体的には、ヘパラン硫酸鎖へのＡＰＲＩＬの結合は、そのＮ末端においてリジンリッチな領域を介して生じ、一方、ＴＮＦ様領域は、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ受容体と反応する。骨髄腫細胞において、ＣＤ１３８への結合は、ＴＡＣＩへのＡＰＲＩＬ結合について共受容体として働き得る。ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲの推定される結合とヘパラン硫酸プロテオグリカン分子との間の距離から、この相互作用は、細胞傷害性をもたらすとは予測されないが、この予想は、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡなしでＣＤ１３８を発現する細胞株において系統的に試験され得る。加えて、ヘパラン硫酸鎖への結合を回避するためのＮ末端のリジンリッチな領域を欠くＡＰＲＩＬの形態が、生成され得る。（３）確認されていないが、上皮組織上で発現されると仮定される、ＡＰＲＩＬについての推定上の受容体が存在し；この相互作用は、上皮細胞に対するＡＰＲＩＬ−ＣＡＲにより指向化された活性の試験及びモデリングを必要とする。（４）天然のＡＰＲＩＬ配列は、その内在性膜貫通型ドメインから切断され、骨髄腫細胞において生存シグナルを促進し得る；それ故、ＣＡＲ  Ｔ細胞からのＡＰＲＩＬのシェディングを回避するために、ＣＡＲの膜貫通型及び細胞内ドメインにＡＰＲＩＬのＮ末端ドメイン（切断部位に遠い）のみを固定することが提案される。
【０２７６】
実験設計
本発明者らのＣＡＲ骨格の文脈におけるマウス及びファージディスプレイ由来抗ＢＣＭＡ  コンストラクトの公開された配列に基づくＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ配列の小さなパネルの試験を、本明細書に記載する。加えて、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに結合するＡＰＲＩＬドメインの大部分の細胞外部分のみを利用する、ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲを、特徴付ける。ヘパラン硫酸鎖に結合するリジンリッチな領域を除去するためのＡＰＲＩＬのＮ末端の切断バージョンも記載する。次に、２つのｓｃＦｖ及び２つのＡＰＲＩＬベースのＣＡＲを有するレンチウイルスベクターを使用して、ビオチン化可溶性ＢＣＭＡ−Ｉｇ及びＴＡＣＩ−Ｉｇ（市販されている）での染色後、フローサイトメトリーを介してＣＡＲの発現について初代Ｔ細胞を試験する。最終的に、ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲが、Ｔ細胞培養物から上清を回収し、ＥＬＩＳＡを介して可溶性ＡＰＲＩＬを測定することにより、可溶性タンパク質としてＡＰＲＩＬを分泌し、切断しないことを、検証する。
【０２７７】
Ｋ５６２細胞に基づく標的細胞株を操作して、レンチウイルス伝達を介してＢＡＦＦ受容体、ＢＣＭＡ、及びＴＡＣＩを個別に及び組合せで発現させた。ＣＤ１３８（シンデカン−１）を発現するＫ５６２細胞を操作して、このヘパラン硫酸プロテオグリカンへのＡＰＲＩＬベースのＣＡＲの結合について試験する。これらの株は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−ＣＡＲ及びＡＰＲＩＬ−ＣＡＲを、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ発現標的を溶解するそれらの能力について試験し、抗原特異的増殖を起こす、標的並びに抗原提示細胞をもたらす。標的を生じるＣＤ１３８を、ヘパラン（ＡＰＲＩＬとヘパラン硫酸との間の結合を除去する）の存在下及び非存在下で、ＡＰＲＩＬ−ＣＡＲ介在性結合並びに毒性に対する感受性について試験する。様々な（Ｅ：Ｔ）比でエフェクター細胞を標的細胞と共培養することにより特異的溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ）を測定し、また、発光を測定することにより生存可能な標的細胞を定量することができるように、標的細胞を遺伝子的に修飾してルシフェラーゼを発現させる。
【０２７８】
可溶性ＢＣＭＡ及び可溶性ＴＡＣＩを、フローサイトメトリーにより評価すべきＣＡＲ  Ｔ細胞についての染色試薬として使用することにより、ＣＡＲへの結合の交差反応性をまた測定する。ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、又は両方を提示する標的に応答した抗原特異的な方法で、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ−ＣＡＲ  Ｔ細胞及びＡＰＲＩＬ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、増殖するそれらの能力について試験する。蛍光色素ＣＦＳＥの希釈、及び抗原刺激後１から２週間の経過にわたり、Ｔ細胞をカウントすることにより、増殖を測定する。
【０２７９】
最終的に、多発性骨髄腫を有する患者由来の初代ヒト形質細胞を、標準的フローサイトメトリーにより、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、及びＢＡＦＦ受容体のそれらの発現について調べる。ＭＧＨ骨髄腫群は、非特定化した試料を調べ得る、多発性骨髄腫を有する患者由来の骨髄標本のバイオバンクを有する。測定可能な形質細胞負荷を有する３０人の患者由来の形質細胞におけるＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、及びＢＡＦＦ−Ｒのレベルを、定量することができる。実現可能な場合、抗ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬベースのＣＡＲ  Ｔ細胞を、生存可能な初代骨髄腫形質細胞と共培養し、共培養物を、骨髄腫細胞の生存能及びＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖について評価する。加えて、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖベースのＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた患者の骨髄形質細胞におけるＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ発現のレベルを調べることができる。この場合において、ベースラインの骨髄試料において、本発明者らのサイトで処置した患者において、処置の１−３か月後、又は再発時に集める骨髄試料において、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ発現を定量することができる。
【０２８０】
ｓｃＦｖベース及びＡＰＲＩＬベースのＣＡＲを形質導入した初代Ｔ細胞が、細胞傷害活性を発揮し、Ｋ５６２形質導入細胞株、Ｕ２６６及びＲＰＭＩ−８２２６のような骨髄腫細胞株、又は初代患者骨髄腫細胞である、ＢＣＭＡを発現する標的細胞に応答して増殖することが予想される。対照的に、ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲのみが、ＴＡＣＩのみを発現する細胞株に対して細胞傷害効果を発揮する。ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲは、ＴＡＣＩとＢＣＭＡの両方の可溶性バージョンに結合し、一方、ｓｃＦｖベースの抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、可溶性ＢＣＭＡのみに結合する。
【０２８１】
非形質導入Ｔ細胞及びＣＤ１９−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞は、ＢＣＭＡを発現する標的細胞又は多発性骨髄腫細胞株に応答して細胞傷害活性を提示すると予測されず、これらの細胞は、陰性コントロールとして作用する。ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲは、可溶性ＡＰＲＩＬを培養培地に分泌すると予測されず、上清のＥＬＩＳＡ又はＬｕｍｉｎｅｘ解析により測定して、検出可能な分泌が生じるなら、ＣＡＲは、代替フォーマット（ＴＡＣＩとＢＣＭＡの間で交差反応性であるｓｃＦｖに基づく）に再設計し得、又は可能性のある切断部位をさらに除去するためにＡＰＲＩＬの細胞外遠位（Ｃ末端）部分のより少ないアミノ酸ドメインを含めることによって再設計し得る。ＡＰＲＩＬベース及びｓｃＦｖベースの抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＢＣＭＡを発現する標的に応答して同様のレベルのサイトカイン産生を生じ、同様に増殖すると予測されるが、ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲのみが、ＴＡＣＩを発現する標的に応答してＩＦＮγ及びＩＬ−２を生じると予想される。
【０２８２】
ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲは、結合部位の間の距離から、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの非存在下でＣＤ１３８を発現する標的の細胞溶解を仲介するとは予測されず、骨髄腫細胞株をインビトロ及びインビボで除去することが既に示されている、抗ＣＤ１３８−ｓｃＦｖベースのＣＡＲと比較する。しかしながら、ＣＤ１３８指向化細胞傷害性を、ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲで観察しないなら、この相互作用を抑止するためにヘパリンを加えることにより、ヘパラン硫酸機序を検証することができる。リジンリッチな領域を除去するが、ＣＡＲの細胞外結合ドメインとしてＴＮＦ様領域のみを維持するようなＡＰＲＩＬのＮ末端切断バージョンも、本明細書に記載する。ヘパラン硫酸プロテオグリカン又は上皮組織に対するＡＰＲＩＬベースのＣＡＲの可能性のある毒性についての何れかの残る問題が存在するなら、初代培養したケラチノサイトに対して、及び本発明者らの皮膚移植片インビボモデルにおいて、細胞傷害性を試験することができる。このモデルにおいて、免疫不全マウスに、ヒト皮膚（形成手術又は環状切除からの廃棄組織）を移植し、治癒させる。生検又は移植片切除から、ＣＡＲ  Ｔ細胞の皮膚毒性を組織病理学的にモニターし、移植片対宿主病の特徴的な徴候である、表皮／真皮結合の破壊及びケラチノサイトのアポトーシスを伴うリンパ球浸潤として皮膚毒性が現れる。ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲ  Ｔ細胞の可能性のある上皮毒性についての残る懸念が存在するなら、このモデルにおいて、ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲの安全性を評価することができる。
【０２８３】
多発性骨髄腫を有する患者から得た骨髄試料において、フローサイトメトリー及び適当なコントロール（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）により決定する場合、形質細胞における高いレベルのＴＡＣＩ及びＢＣＭＡの発現を、より低いレベルのＢＡＦＦ受容体と共に確認することが予測される。
【０２８４】
実施例２  二重抗原標的による多発性骨髄腫における抗原回避の制限
処置での最近の利点にもかかわらず、多発性骨髄腫は、依然、治癒不可能な疾患のままである。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に対して指向化させたＣＡＲ  Ｔ細胞のいくつかの最近の臨床試験は、多発性骨髄腫を有する患者において完全寛解を含む臨床応答を導いた。しかしながら、ＢＣＭＡの抗原喪失に起因した処置の失敗が、幾人かの患者において記載されている。膜貫通型活性化因子及びカルシウムモジュレーター及びシクロフィリンリガンド相互作用物質（ＴＡＣＩ）は、形質細胞生存の維持においてＢＣＭＡに対する重複する役割を有すると考えられ、多発性骨髄腫細胞上でも高度に発現する。本明細書に記載する仕事において、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩについての天然のリガンドであるＡＰＲＩＬを、ＣＡＲ結合部分として利用した。アプローチは、多発性骨髄腫において、複数の表面抗原の二重標的化により、抗原回避に起因する、疾患の再発を予防する（図３）。
【０２８５】
材料及び方法
ｓｃＦｖベースの抗ＢＣＭＡ、並びに全て４−１ＢＢ及びＣＤ３ゼータに融合した、異なるヒンジ並びに膜貫通型ドメイン（ＣＤ８又は４−１ＢＢ）を生じるＡＰＲＩＬベースのＣＡＲで、ＣＡＲコンストラクトを生成した（図２）。ヒト初代Ｔ細胞に、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ又はＡＰＲＩＬベースのＣＡＲの何れかをレンチウイルスにより形質導入した。変動する発現レベルのＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを有する細胞株のパネルに対してインビトロで、並びに多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおいてインビボで、細胞毒性、増殖及びサイトカイン産生を評価した。
【０２８６】
結果
ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲについて、ＢＣＭＡ＋又はＴＡＣＩ＋標的細胞に応答した増大した活性化を観察した。ＢＣＭＡ＋標的細胞に応答して、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲのみを活性化した。ＢＣＭＡとＡＰＲＩＬ−ＣＤ８ヒンジ／膜貫通型ＣＡＲの両方が、抗原特異的細胞傷害性を示した。興味深いことに、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲと比較して、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８ヒンジ／膜貫通型ＣＡＲについてのサイトカイン産生において、より低いレベルを見出した。この知見は、恐らく、ＡＰＲＩＬをＣＡＲ結合部分として使用するか、又はｓｃＦｖをＣＡＲ結合部分として使用するかの間の、結合親和性における差を反映する。ＡＰＲＩＬ−ＣＡＲにおける４−１ＢＢにヒンジ／膜貫通型ドメインを変えることは、細胞傷害性における低減及び制限されたサイトカイン産生を導く。異種移植片モデルを使用した、進行中の研究は、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ又はＡＰＲＩＬ−ＣＤ８ヒンジ／膜貫通型ＣＡＲで処置したいくつかのマウスにおいて、完全な腫瘍寛解を示した。
【０２８７】
考察
多発性骨髄腫における可能性のある抗原回避を制限するためにＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を認識することができる、天然のリガンドＡＰＲＩＬに基づく、ＣＡＲの設計を本明細書に記載する。ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通型領域の包含は、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ機能に最適であった。腫瘍細胞に対するＡＰＲＩＬ  ＣＡＲの細胞傷害有効性にもかかわらず、より低いレベルの効果又はサイトカイン産生を観察した。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、サイトカイン放出症候群を導き得るので、これは、重要な知見である。
【０２８８】
実施例３  ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲを発現するＴ細胞
ヒトＴ細胞を、０日目にＣＤ３／２８ビーズで刺激し、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８ＴＭ−４−１ＢＢｚＣＡＲ発現ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８ＴＭ−４−１ＢＢζＣＡＲ又はＢＣＭＡ−ＣＤ８ＴＭ−４−１ＢＢζＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。０日目の開始時に、細胞をカウントし、それらの成長を集団倍加としてプロットした（図４）。ｍＣｈｅｒｒｙ（レポーター）陽性により、形質導入効率を測定した（図５Ａ−５Ｂ）。
【０２８９】
ＣＡＲを形質導入したＴ細胞を、１８時間、ルシフェラーゼを発現するよう形質導入した標的ＢＣＭＡ＋ＴＡＣＩ＋複数細胞（ＲＭＰＩ−８２２６）と共にインキュベーションした。示したエフェクター：標的比で、標的細胞の特異的溶解を計算した（図６）。
【０２９０】
ＣＡＲ介在性Ｔ細胞活性化を、ＮＦＡＴプロモーターの後にルシフェラーゼを発現するジャーカット細胞株において試験した（図７）。
【０２９１】
実施例４  ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロ効果
ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの表面発現を、多発性骨髄腫細胞株において測定し（図８）、ＲＰＭＩ８２２６を操作して、様々なレベルのＢＣＭＡを発現させた（図９）。ＴＡＣＩをＲＰＭＩ−ＢＣＭＡ  ＫＯに形質導入した。
【０２９２】
多数のＡＰＲＩＬ及びＢＣＭＡ  ＣＡＲコンストラクトを設計し、これらのコンストラクトはＴ細胞に対して有効に形質導入を起こすことを示した（図１０）。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞での刺激の際に拡大した（図１１）。ＡＰＲＩＬ−ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを発現する細胞の特異的な殺傷を示し（図１２）、活性化は、同様に特異的であった（図１３）。
【０２９３】
ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬ  ＣＡＲは、ＲＰＭＩ８２２６親での刺激に応答して脱顆粒する（図１４）。ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲのサイトカインプロファイルを、図１５に示す。
【０２９４】
実施例５  ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲの核酸配列
ｐＭＧＨ７１（ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８  ＣＡＲ）−ＡＰＲＩＬ／ＣＤ８ＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ（配列番号１）は、ＣＤ８リーダー（ヌクレオチド１−６３（配列番号２））；ＡＰＲＩＬ配列（ヌクレオチド６４−４７１（配列番号３））；ＣＤ８ヒンジ及びＴＭ配列（ヌクレオチド４７２−６７８（配列番号４））；４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（ヌクレオチド６７９−８０４（配列番号５））；並びにＣＤ３ゼータ配列（ヌクレオチド８０５−１１４０（配列番号６））を含む。
2021510076.tif 000006
ＣＤ８リーダー（配列番号２（配列番号１のヌクレオチド１−６３））
2021510076.tif 000007
ＡＰＲＩＬ配列  配列番号３（配列番号１のヌクレオチド６４−４７１）
2021510076.tif 000008
ＣＤ８ヒンジ及びＴＭ配列（配列番号４（配列番号１のヌクレオチド４７２−６７８））
2021510076.tif 000009
４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（配列番号５（配列番号１のヌクレオチド６７９−８０４））
2021510076.tif 000010
ＣＤ３ゼータ配列（配列番号６（配列番号１のヌクレオチド８０５−１１４０））
2021510076.tif 000011
ｐＭＧＨ７６（ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ）−ＡＰＲＩＬ／４−１ＢＢＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ（配列番号７）は、ＣＤ８リーダー（ヌクレオチド１−６３（配列番号８））；ＡＰＲＩＬ配列（ヌクレオチド６４−４７１（配列番号９））；４−１ＢＢヒンジ及びＴＭ配列（ヌクレオチド４７２−６３３（配列番号１０））；４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（ヌクレオチド６３４−７５９（配列番号１１））；ＣＤ３ゼータ配列（ヌクレオチド７６０−１０９５（配列番号１２））を含む。
2021510076.tif 000012
ＣＤ８リーダー配列（配列番号８（配列番号７のヌクレオチド１−６３））
2021510076.tif 000013
ＡＰＲＩＬ配列（配列番号９（配列番号７のヌクレオチド６４−４７１））
2021510076.tif 000014
４−１ＢＢヒンジ及びＴＭ配列（配列番号１０（配列番号７のヌクレオチド４７２−６３３））
2021510076.tif 000015
４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（配列番号１１（配列番号７のヌクレオチド６３４−７５９））
2021510076.tif 000016
ＣＤ３ゼータ配列（配列番号１２（配列番号７のヌクレオチド７６０−１０９５））
2021510076.tif 000017
ＣＤ８リーダー（ヌクレオチド１−６３（配列番号１４））；ＡＰＲＩＬ配列（ヌクレオチド６４−４７１（配列番号１５））；４−１ＢＢヒンジ及びＴＭ配列（ヌクレオチド４７２−６３３（配列番号１６））；４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（ヌクレオチド６３４−７５９（配列番号１７））；ＣＤ３シータ配列（ヌクレオチド７６０−１２００）（配列番号１８））を含む、ｐＭＧＨ７７（ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢθ  ＣＡＲ）−ＡＰＲＩＬ／４−１ＢＢＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３シータ（配列番号１３）。
2021510076.tif 000018
ＣＤ８リーダー配列（配列番号１４（配列番号１３のヌクレオチド１−６３））
2021510076.tif 000019
ＡＰＲＩＬ配列（配列番号１５（配列番号１３のヌクレオチド６４−４７１））
2021510076.tif 000020
４−１ＢＢヒンジ及びＴＭ配列（配列番号１６（配列番号１３のヌクレオチド４７２−６３３））
2021510076.tif 000021
４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（配列番号１７（ヌクレオチド６３４−７５９  配列番号１３））
2021510076.tif 000022
ＣＤ３シータ配列（配列番号１８（配列番号１３のヌクレオチド７６０−１２００））
2021510076.tif 000023
【０２９５】
実施例６  ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲのアミノ酸配列
１つの実施態様において、本明細書において他の場所で記載した通り、特定の残基が、ＢＣＭＡ／ＴＡＣＩ、すなわち、ＡＰＲＩＬのＤ１３２、Ｔ１７５、Ｄ２０５、Ｒ２０６、Ｒ２３１への結合に関与する。これらの残基の位置を、以下で太字で示す。
ＣＤ８リーダー（アミノ酸１−２１（配列番号２０））；ＡＰＲＩＬ配列（アミノ酸２２−１５７（配列番号２１））；ＣＤ８ヒンジ及びＴＭ配列（アミノ酸１５８−２２６（配列番号２２））；４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（アミノ酸２２７−２６８（配列番号２３））；ＣＤ３ゼータ配列（アミノ酸２６９−３８０）（配列番号２４））を含む、ｐＭＧＨ７１（ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８  ＣＡＲ）−ＣＤ８リーダー／ＡＰＲＩＬ／ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ｚ（配列番号１９）。
2021510076.tif 000024
ＣＤ８リーダー配列（配列番号２０（配列番号１９のアミノ酸１−２１））
2021510076.tif 000025
ＡＰＲＩＬ配列（配列番号２１（配列番号１９のアミノ酸２２−１５７））
2021510076.tif 000026
ＣＤ８ヒンジ及びＴＭ配列（配列番号２２（配列番号１９のアミノ酸１５８−２２６））
2021510076.tif 000027
４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（配列番号２３（配列番号１９のアミノ酸２２７−２６８））
2021510076.tif 000028
ＣＤ３ゼータ配列（配列番号２４（配列番号１９のアミノ酸２６９−３８０））
2021510076.tif 000029
ｐＭＧＨ７６（ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ）−ＣＤ８リーダー／ＡＰＲＩＬ／４−１ＢＢヒンジ＋ＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ｚ（配列番号２５）は、ＣＤ８リーダー（アミノ酸１−２１（配列番号２６））；ＡＰＲＩＬ配列（アミノ酸２２−１５７（配列番号２７））；４−１ＢＢヒンジ及びＴＭ配列（アミノ酸１５８−２１１（配列番号２８））；４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（アミノ酸２１２−２５３（配列番号２９））；ＣＤ３ゼータ配列（アミノ酸２５４−３６５（配列番号３０））を含む。
2021510076.tif 000030
ＣＤ８リーダー配列（配列番号２６（配列番号２５のアミノ酸１−２１））
2021510076.tif 000031
ＡＰＲＩＬ配列（配列番号２７（配列番号２５のアミノ酸２２−１５７））
2021510076.tif 000032
４−１ＢＢヒンジ及びＴＭ配列（配列番号２８（配列番号２５のアミノ酸１５８−２１１））
2021510076.tif 000033
４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（配列番号２９（配列番号２５のアミノ酸２１２−２５３））
2021510076.tif 000034
ＣＤ３ゼータ配列（配列番号３０（配列番号２５のアミノ酸２５４−３６５））
2021510076.tif 000035
ｐＭＧＨ７７（ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢθ  ＣＡＲ）−ＣＤ８リーダー／ＡＰＲＩＬ／４−１ＢＢヒンジ＋ＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３シータ（配列番号３１）は、ＣＤ８リーダー（アミノ酸１−２１（配列番号３２））；ＡＰＲＩＬ配列（アミノ酸２２−１５７（配列番号３３））；４−１ＢＢヒンジ及びＴＭ配列（アミノ酸１５８−２１１（配列番号３４））；４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（アミノ酸２１２−２５３（配列番号３５））；ＣＤ３シータ配列（アミノ酸２５４−４００）（配列番号３６））を含む。
2021510076.tif 000036
ＣＤ８リーダー配列（配列番号３２（配列番号３１のアミノ酸１−２１））
2021510076.tif 000037
ＡＰＲＩＬ配列（配列番号３３（配列番号３１のアミノ酸２２−１５７））
2021510076.tif 000038
４−１ＢＢヒンジ及びＴＭ配列（配列番号３４（配列番号３１のアミノ酸１５８−２１１））
2021510076.tif 000039
４−１ＢＢ  ＩＣＤ配列（配列番号３５（配列番号３１のアミノ酸２１２−２５３））
2021510076.tif 000040
ＣＤ３シータ配列（配列番号３６（配列番号３１のアミノ酸２５４−４００））
2021510076.tif 000041
【０２９６】
実施例７  多量体抗原を標的にするＣＡＲを増強するためのリガンドオリゴマー形成
本研究において記載する仕事において、天然のオリゴマー形成（例えば、ホモトリマー形成）を使用して、それらのコグネート受容体を発現する細胞に対して増大した活性を有するリガンドベースのＣＡＲを開発した。ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドを含む、細胞表面受容体についてのある特定のリガンドは、オリゴマー形成して（例えば、トリマー形成して）、それらのコグネート受容体に結合することが知られている。例えば、上で記載した通り、ヒト骨髄腫は、有効な抗腫瘍抗原：ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩについて標的化し得る２種の表面抗原を発現することが知られている。ＢＣＭＩ及びＴＡＣＩは、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡに対するナノモルの親和性で結合する小型の自己形成トリマーである、一般的なリガンド、ＡＰＲＩＬを共有する。
【０２９７】
ホモトリマーＡＰＲＩＬ  ＣＡＲコンストラクトを設計し、構築した（図１６）。このコンストラクトを、本明細書において「ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ」として言及し、リンカーを介して連結された３つのタンデムＡＰＲＩＬポリペプチド、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通型ドメイン（ＣＤ８ＴＭ）、４−１ＢＢ細胞内ドメイン（４−１ＢＢ）、及びＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＣＤ３ζ）を含む。このコンストラクトを、プロモーター（例えば、ＥＦ１αプロモーター）に作動可能に結合する。
【０２９８】
初代ヒトＴ細胞へのＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲコンストラクトの伝達効率を、評価した（図１７）。非形質導入コントロールについてのおよそ０．４６％と比較して、細胞のおよそ２２．６％が、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性であった。それ故、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲコンストラクトを、初代ヒトＴ細胞に導入することができる。ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを発現する細胞の特異的殺傷を示した（図１８）。それ故、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、及び／又はＢＡＦＦ受容体を発現する腫瘍、例えば、骨髄腫の処置のための有用な治療剤である。
【０２９９】
他の自己オリゴマー形成リガンド（例えば、ＴＮＦスーパーファミリーリガンド（例えば、ＴＮＦ−アルファ、リンホトキシンベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１５４、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＬＩＧＨＴ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、ＴＬ１Ａ、又はＥＤＡ−Ａ２））を使用した類似のＣＡＲコンストラクトを使用して、コグネート受容体を発現する非所望の細胞、例えば、腫瘍細胞の殺傷を標的にすることができる。
【０３００】
実施例８  多発性骨髄腫に対するＡＰＲＩＬベースのＣＡＲ  Ｔ細胞
ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩは、ほとんど全ての悪性形質細胞で発現されるため、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩは、例えば多発性骨髄腫を治療するための有望な標的となる。多発性骨髄腫患者の形質細胞で測定されたＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現を図１９に示す（ｎ＝２５）。
【０３０１】
本明細書に記載されるように、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲと呼ばれる、短いペプチドリンカーによって一緒に融合された切断型ＡＰＲＩＬの３つのモノマーを含むＣＡＲは、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを同時に標的とするように設計された。
【０３０２】
この目的のために、ヒトＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたダイナビーズで活性化し、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ｐＭＧＨ８、図１０）、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８  ＣＡＲ（ｐＭＧＨ７１、図１０）、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ（ｐＭＧＨ７６、図１０）、又はＴｒｉｐｒｉｌ  ＣＡＲ（ｐＭＧＨ７１ｂ、図１６）を発現するようにレンチウイルスでトランスフェクトした（ＭＯＩ＝５、ｎ＝３）。図２０に示すように、ｍＣｈｅｒｒｙ発現に基づいて、ＣＡＲ  Ｔ細胞の導入効率を確立した。
【０３０３】
実施例９  ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲ  Ｔ細胞の脱顆粒と活性化
ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現を、標的細胞株ＲＭＰＩ８２２６、ＭＭ．１Ｓ、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ、及びＫ５６２−ＴＡＣＩについて決定した（図２１）。ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化は、インビトロＣＤ６９活性化アッセイにおいて測定された（図２２Ａ及び２２Ｂ）。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を評価した。同じドナーからのＵＴＤ及びＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ８２２６、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ及びＫ５６２−ＴＡＣＩターゲット細胞と１２時間インキュベートした。ＰＭＡ刺激と培地は、それぞれ陽性コントロールと陰性コントロールとして機能した。活性化は、ＵＴＤ及びＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現の割合に基づいて測定された（ｎ＝３）。
【０３０４】
実施例１０  インビトロでのＡＰＲＩＬベースのＣＡＲ  Ｔ細胞の殺傷及びサイトカイン産生
インビトロ殺傷アッセイが実施され、ここでは、同じドナーからのＵＴＤ及びＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ．１Ｓ、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ及びＫ５６２−ＴＡＣＩ標的細胞（全てＣＢＧ−ＧＦＰ）と異なる比率で１６時間インキュベートした。特異的溶解は、次の式を用いた生物発光測定に基づいて計算された：％特異的溶解＝１００ｘ（ｌｕｍ自然死−ｌｕｍ試験）／ｌｕｍ自然死；ここで、ｌｕｍ＝発光である。平均及び標準偏差は、三通りの試料から計算された。ＵＴＤ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８  ＣＡＲ、及びＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の殺傷を図２３に示す。同様に、ＭＭ．１Ｓ、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ、及びＫ５６２−ＴＡＣＩ標的細胞のＵＴＤ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８  ＣＡＲ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する殺傷が、図２４に示される。
【０３０５】
実施例１１  ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ効力
ＮＯＤ  ｓｃｉｄγ（ＮＳＧ）マウスに、５×１０６個のルシフェラーゼ発現ＭＭ．１Ｓ細胞を移植した。腫瘍注射から７日後、マウスを腫瘍負荷に応じて無作為化し、５×１０６個のＵＴＤ、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８、又はＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢＣＡＲ  Ｔ細胞の何れかを投与した（ｎ＝５−９ｐｒ．群）（図２５Ａ）。ＣＡＲ注射後１、３、６．５、及び２１日目の、ＵＴＤ、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−ＣＤ８又はＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与されたマウスの生物発光画像を図２５Ｂに示し、マウスにおける腫瘍負荷の経時的な定量化を図２５Ｃに示す。ＣＤ３＋／ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の絶対数を、ＴｒｕｅＣｏｕｎｔビーズ（ｎ＝４−９ｐｒ．群）を使用して、ＣＡＲ又はＵＴＤの注射から６．５日後に血中で定量化した（図２５Ｄに示す）。
【０３０６】
実施例１２  材料及び方法
初代の患者形質細胞のフローサイトメトリー
多発性骨髄腫の診断を受けた患者からの２９の骨髄穿刺液試料にＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの追加染色が行われ、臨床フローサイトメトリー検査室に送付された；追加染色は、ＩＲＢ承認のプロトコルの下で実施された。形質細胞は、前方散乱及び側方散乱に基づいてゲートを掛けられ、ＣＤ４５については弱陽性、ＣＤ１３８及びＣＤ３８については陽性であった。
【０３０７】
ＣＡＲコンストラクトの設計
全てのＣＡＲは、公開されている配列に基づいてアミノ酸レベルで分子設計され、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを使用して哺乳動物発現用にコドン最適化された。ヌクレオチド配列を合成し、ヒトＥＦ−１αプロモーターの制御下で、第３世代の自己不活性化レンチウイルスベクタートランスファープラスミドにクローニングした。ベクターはまた、形質導入効率の列挙を容易にするために、蛍光レポーターｍＣｈｅｒｒｙをコードする第２の導入遺伝子を含んでいた。レンチウイルスベクターは、標準的なプロトコルを使用して生成された。
【０３０８】
初代ヒトＴ細胞培養及びＣＡＲ  Ｔ細胞の製造
初代ヒトＴ細胞は、ＩＮＤ承認のプロトコルの下で匿名の健常ドナーロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）（ＭＧＨ血液バンクから購入）から精製（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５０６１）され、凍結保存された。増殖及びその後のアッセイのために、Ｔ細胞を解凍し、ＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、０．５−２ｘ１０６／ｍｌの細胞濃度で２０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を補足）中で培養した。ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１：３の比率で活性化し、ＣＡＲ  Ｔ細胞産生のために、レンチウイルスベクターを２４時間後に５−１０の多重度で加えた。培養１０〜１４日目に、ＣＡＲ発現を測定し、凍結保存の前にドナーに適合した活性化非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を加えることによって正規化した。インビトロ及びインビボ実験では、解凍後すぐにＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した。
【０３０９】
細胞株及び培養条件
ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ８２２６、Ｋ５６２、ジャーカット、及びＮＫ−９２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ  ＫＯ細胞は、最初にＭＭ．１Ｓ細胞にＣａｓ９をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いでＢｒｕｎｅｌｌｏライブラリー（Ｄｏｅｎｃｈ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（２）：１８４−１９（２０１６年））のガイドＲＮＡを用いてエレクトロポレーションし、抗生物質選択により作製した。Ｋ５６２細胞は、ＢＣＭＡ（Ｋ５６２−ＢＣＭＡ）又はＴＡＣＩ（Ｋ５６２−ＴＡＣＩ）を発現させるためにレンチウイルスベクターで安定的に形質導入された。ＣＤ３ζＫＯを含むジャーカット細胞は、我々の目的のＣＡＲを安定して発現させるために形質導入された。必要に応じて、クリックビートルグリーンルシフェラーゼ（ＣＢＧ−ｌｕｃ）を構成的に発現するように細胞株を改変した。改変後の純粋な細胞集団を得るために、所望の表現型を発現する細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）上で選別した。細胞株の増殖には、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ培地（Ｋ５６２細胞、ジャーカット細胞、ＮＫ−９２細胞）又は２０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ培地（ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ８２２６）を使用した。
【０３１０】
フローサイトメトリー
使用した抗体：ヒトＢＣＭＡ−ＰＥ（クローン１９Ｆ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ヒトＣＤ３−ＢＵＶ３９５（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤ）、ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ（クローンＳＫ７、ＢＤ）、ヒトＣＤ４−ＡＦ６４７、ヒトＣＤ４−ＢＶ５１０（クローンＳＫ３、ＢＤ）、ヒトＣＤ４−ＢＶ７８６（クローンＳＫ３、ＢＤ）、ヒトＣＤ８−ＡＦ６４７、ヒトＣＤ８−ＡＰＣ  Ｈ７（クローンＳＫ１、ＢＤ）、ヒトＣＤ８−ＢＵＶ３９５（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢＤ）、ヒト／マウスＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（クローンＭ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ヒトＣＤ６９−ＡＰＣ（クローンＦＮ５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ヒトＣＤ１０７ａ−ＡＦ７００（クローンＨ４Ａ３、ＢＤ）、マウスＬｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ（Ｇｒ−１）−ＡＰＣ（クローンＲＢ６−８Ｃ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、マウスＮＫ−１．１−ＡＰＣ（クローンＰＫ１３６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ヒトＴＡＣＩ−ＰＥ（クローン１Ａ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ヒトＴＡＣＩ−ＡＰＣ（クローン１Ａ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、マウスＴＥＲ−１１９／赤血球細胞−ＡＰＣ（クローンＴＥＲ−１１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。使用した生／死染色：ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＩ６２２４７）、Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３４９６５）。細胞を暗所で４℃で３０分間染色し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ＢＤ）で取得した。
【０３１１】
ＣＡＲ結合親和性を測定するために、可溶性（ｓ）ＢＣＭＡ及びｓＴＡＣＩを、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＡＰＣ抗体及びタンパク質標識サイズ（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＳＫＵ：７０５−００１０）を使用して、ＡＰＣにコンジュゲートさせた。細胞をＰＢＳ＋４％ウシ血清アルブミンで洗浄し、指示された量のＡＰＣコンジュゲートｓＢＣＭＡ及びｓＴＡＣＩと共に、４℃で、暗所で４５分間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。
【０３１２】
Ｔ細胞の脱顆粒及び活性化は、ブレフェルジンＡ及びＣＤ１０７ａ抗体の存在下でそれぞれ１：１の比率で５時間又は一晩、標的細胞と共培養した後に分析した。続いて、細胞をＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８又はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ６９の発現についてそれぞれ染色した。処置されたマウスの末梢血中のＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を、製造業者のプロトコルに従って、ＴｒｕｃｏｕｎｔＴＭチューブ（ＢＤ、カタログ番号３４０３３４）を使用して定量化した。細胞をヒトＣＤ３、ヒト／マウスＣＤ１１ｂ、マウスＬｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ、マウスＮＫ−１．１及びマウスＴＥＲ−１１９の発現について染色した。
【０３１３】
追加の薬剤
使用される追加の薬剤には、組換えヒトＡＰＲＩＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３１０−１０Ｃ）、組換えヒトＢＣＭＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３１０−１６）、組換えヒトＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００−０２）、組換えヒトＴＡＣＩ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３１０−１７）、細胞溶解液１０ｘ濃縮液（カタログ番号３４９２０２、ＢＤ）、ＰＭＡ／イオノマイシンを含む細胞刺激カクテル（５００ｘ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−４９７０−９３）、ブレフェルジンＡを含むタンパク質輸送阻害剤（ＧｌｏｇｉＰｌｕｇ  ＢＤ、カタログ番号５５５０２９）が挙げられる。
【０３１４】
細胞毒性、バルクサイトカイン分析、及び単一細胞３２プレックスＩｓｏＣｏｄｅチッププロテオミクス
細胞毒性アッセイでは、正規化ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＢＧ−ｌｕｃ発現標的細胞と指示された比率で８時間（ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ８２２６）又は一晩（Ｋ５６２−ＢＣＭＡ、Ｋ５６２−ＴＡＣＩ）共培養した。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１５０１）を製造業者のプロトコルに従って使用し、ルシフェラーゼ活性をＳｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２発光マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）で測定した。全ての試料は、技術的な三通りの測定で測定された。特異的溶解のパーセントは、次の式を使用して計算された：％特異的溶解＝（総ＲＬＵ／標的細胞のみのＲＬＵ）ｘ１００（ＲＬＵ：相対発光単位）。
【０３１５】
バルクサイトカイン分析を、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘアレイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、ＦＬＥＸＭＡＰ  ３Ｄ）を使用して、指示されたエフェクター細胞及び標的細胞の１：１の比率での一晩の共培養からの無細胞上清について行った。
【０３１６】
単一細胞３２プレックスＩｓｏＣｏｄｅチッププロテオミクスＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットは、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して分離され、次いでＫ５６２−ＢＣＭＡ及びＫ５６２−ＴＡＣＩ細胞で１：１：１の比率で２０時間刺激された。同じ刺激による非形質導入Ｔ細胞を陰性コントロールとして使用した。共培養されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗ＣＤ２３５ａコンジュゲート磁気ビーズを使用してＫ５６２細胞を枯渇させることによりさらに濃縮された。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ４及びＣＤ８発現について室温で１０分間染色し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回すすぎ、１ｘ１０６／ｍＬの密度で完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。約３０μｌの細胞懸濁液をＩｓｏＣｏｄｅチップにロードし、３７℃、５％ＣＯ２でさらに１６時間インキュベートした。〜１０００個の単一Ｔ細胞からのタンパク質分泌物を、３２プレックス抗体バーコードチップによって捕捉し、多機能プロファイルを、５つの機能グループにわたってＩｓｏＳｐｅａｋソフトウェアによって分析した。
エフェクター：グランザイムＢ、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ１α、パーフォリン、ＴＮＦβ；
刺激性：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１；
化学誘引性：ＣＣＬ１１、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＲＮＡＴＥＳ；
制御性：ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ｓＣＤ１３７、ｓＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦβ１；
炎症性：ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＩＬ−１β。
ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のＰＳＩは、多機能細胞のパーセンテージに、それらの細胞から分泌されるタンパク質の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を乗じたものとして定義された、予め指定された式を使用して計算された。
2021510076.tif 000042
単一細胞レベルでコンビナトリアルタンパク質を共分泌した多機能ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットは、多機能ヒートマップによってさらに明らかになった。
【０３１７】
長期増殖アッセイ
抗原刺激に応答したＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖は、以前に１０，０００ラドで照射されたＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを発現するＫ５６２細胞と１：１の比率で正規化されたＣＡＲ  Ｔ細胞を共培養することにより評価した。Ｔ細胞を計数し、週に１回、照射された標的細胞を再び播種した。
【０３１８】
インビボでの試験
全ての動物実験は、連邦及び施設の動物保護及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の要件に従って、ＭＧＨ承認のプロトコルの下で行われた。異種移植試験のために、ＮＯＤ  ＳＣＩＤγ鎖−／−マウス（ＮＳＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ＣＢＧ−ｌｕｃを発現するように形質導入された１×１０６個のＭＭ．１Ｓ又はＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ  ＫＯ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。腫瘍の生着が１４日後に生物発光イメージングによって確認された後、２×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞又はＵＴＤを静脈内に注射した。腫瘍負荷は生物発光イメージング（ＢＬＩ）によってモニターし、末梢血を採取してフローサイトメトリーによってＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を調べた。ＢＬＩは、Ｄ−ルシフェリン基質溶液（３０ｍｇ／ｍｌ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＩ８８２９４）の腹腔内注射後に、Ａｍｉスペクトルイメージング装置において実施され、ＩＤＬソフトウェアバージョン４．３．１を使用して分析された。マウスは、実験終了時又はＩＡＣＵＣが事前に設定したエンドポイントを満たした時のどちらかにおいて、実験プロトコルに指定された通りに安楽死させた。
【０３１９】
統計分析
別段の記載がない限り、両側スチューデントｔ検定又は二元配置分散分析検定を、等分散の正規データに使用した。有意性はｐ＜０．０５について考慮され、凡例では＊で示される。分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０で行った。
【０３２０】
実施例１３  ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩを標的とするように設計されたＣＡＲ
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞で標的化することは、多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療において大きな成功を示しているが、腫瘍細胞の不均一な抗原発現及び切迫した抗原回避によって制限されている。コンビナトリアル抗原ターゲティングは、これらの課題に対処するのに役立つ可能性がある。天然に存在する受容体−リガンドのペアをモデルとして、モノマー及びトリマーのＡ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）をベースとしたＣＡＲは、ＢＣＭＡと膜貫通型活性化因子とＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）を同時に標的とする。ＢＣＭＡとＴＡＣＩはどちらもＢ細胞でのみ発現しており、ほとんど全ての悪性形質細胞でアップレギュレートされているため、多発性骨髄腫の魅力的な標的となっている。
【０３２１】
ＭＭ患者２９人の骨髄試料から得られた形質細胞上のＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの表面発現を評価した。まず、多発性骨髄腫患者から形質細胞を得て、ＢＣＭＡ−ＰＥ又はＴＡＣＩ−ＰＥの何れかで染色し、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現を決定した。形質細胞は、前方及び側方散乱、ＣＤ４５ｄｉｍ、ＣＤ３８＋及びＣＤ１３８＋においてゲートを掛けられた。形質細胞の大部分がＢＣＭＡ及びＴＡＣＩに対して陽性であり、同様の分布パターンであることが観察された。ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方の発現は、以前の治療ラインの数に関係なく検出された。より進んだ治療段階（＞３の以前の治療ライン）では、ＢＣＭＡが高度陽性（＞＝８０％）又はわずかに陽性（２０−３０％）の何れかに分かれる傾向があったが、ＴＡＣＩ発現はそれほど変化しないようであった（図２６Ａ）。注目すべきは、より多くの治療を受けた患者においてＢＣＭＡの発現が低いのは、このコホートの１人の患者だけが以前にＢＣＭＡ指向の処置を受けていたため、ＢＣＭＡ指向の治療による前処置だけでは説明できないことである。骨髄腫患者におけるＢＣＭＡとＴＡＣＩの発現パターンを反映して、ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ８２２６とＭＭ．１Ｓはどちらも表面にＢＣＭＡとＴＡＣＩを発現している。さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞の試験を容易にするために、ＢＣＭＡ（Ｋ５６２−ＢＣＭＡ）又はＴＡＣＩ（Ｋ５６２−ＴＡＣＩ）の何れかを発現するＫ５６２人工抗原提示細胞を生成した。図２６Ｂに示すように、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＭＰＩ８２２６及びＭＭ．１Ｓ、ＢＣＭＡを発現するように改変されたＫ５６２細胞、及びＴＡＣＩを発現するように改変されたＫ５６２細胞におけるＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの発現レベルを決定した。
【０３２２】
ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を標的とするＣＡＲを設計するために、天然リガンドのＡＰＲＩＬを、細胞外標的結合ドメインの構成成分として機能するように使用した。潜在的な非特異的相互作用を回避するために、フリンプロテアーゼ切断及びプロテオグリカン結合部位を欠いた、ＡＰＲＩＬの切断バージョンを結合部分として使用した。３つの異なる第２世代のＣＡＲコンストラクトが設計された：コントロールとして機能する抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ（ＢＣＭＡ  ＣＡＲ）に基づく抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、１つの膜係留型切断型ＡＰＲＩＬモノマー（ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ）を含むＣＡＲ、及び３つの切断されて融合されたＡＰＲＩＬモノマーを含むＣＡＲ（ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ、例えば、配列番号３９）。設計された３つのＣＡＲの概略図を図２６Ｄに示す。ＢＣＭＡ及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ８膜貫通型ドメイン及び４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内ドメインを有し、一方、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲは、４−１ＢＢ膜貫通型ドメイン及び４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内ドメインを有する。コンストラクトをレンチウイルスベクターにクローニングし、ＥＦ−１αプロモーターの制御下で発現させた。さらに、全てのコンストラクトは、ＣＡＲ発現の簡便なフローベースの検出を可能にするために、２Ａエレメントに続くｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーターを含んでいた。インビトロでのエフェクター機能は、標的抗原に応答した、細胞毒性効力、活性化（ＣＤ６９）、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）、サイトカイン産生、及び増殖によって比較された。ＭＭの異種移植マウスモデルにおいて、インビボでの抗腫瘍効果を評価した。
【０３２３】
ＡＰＲＩＬはＴＮＦファミリーのメンバーであり、ＢＣＭＡとＴＡＣＩはＴＮＦＲファミリーのメンバーである；ＴＮＦ／ＴＮＦＲ相互作用は分子のトリマー形態で生じるため、ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲの結合とシグナル伝達は、ＴＮＦＲファミリーメンバーの膜貫通型ドメインを連結することにより、又は安定したＣＡＲ構成を維持しながらＡＰＲＩＬ部分のみをトリマー形成することにより、トリマー形成を促進することによって強化されるであろうと仮定された（図２６Ｃ）。ｓｃＦｖベースのバインダー及びＣＤ８膜貫通型ドメインを使用するＣＡＲは、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインを有する場合であっても、ホモダイマーを形成する（図２６Ｃ）（Ｉｍａｉ等、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１８（４）：６７６−８４（２００４年））。したがって、切断型ＡＰＲＩＬは、４−１ＢＢ膜貫通型及び細胞内ドメイン、次いでタンデムでＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合したモノマー（ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ）として、又はリンカーによって連結された３つのＡＰＲＩＬモノマー（ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ）として合成された。ＢＣＭＡに対する３つの異なるＣＡＲの理論的結合を描いた図が、図２６Ｃに示されている。左のパネルはＢＣＭＡ  ＣＡＲの結合を示しており、ここでＣＡＲは通常、シグナル伝達のためにダイマー形成する。中央のパネルは、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲの結合を示しており、ここでＡＰＲＩＬはＢＣＭＡ／ＴＡＣＩと結合するために自然にトリマー形成する。右のパネルはＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲの結合を示しており、ここでＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲはトリマー形成したＡＰＲＩＬを細胞外標的結合ドメインとして含む。３つのコンストラクト全てのＣＡＲ  Ｔ細胞の製造は、３人の異なるドナーから成功裏に行われた（形質導入効率４６−７８％）。ＣＡＲのウエスタンブロット分析は、ＴｒｉＰＲＩＬ及びＢＣＭＡ  ＣＡＲの多量体形態を示したが、一方、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲのモノマー形態のみが検出された。
【０３２４】
実施例１４  ＣＡＲ  Ｔ細胞の親和性とエフェクター機能
ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲを、ヒトＴ細胞に形質導入されたときの結合及び機能特性について試験した。まず、図２７Ａに示すように、可溶性ＢＣＭＡ及び可溶性ＴＡＣＩの結合親和性を決定した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＡＰＣにコンジュゲートした可溶性ＢＣＭＡ及び可溶性ＴＡＣＩとインキュベートし、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて結合親和性を決定した。ｓＢＣＭＡ及びｓＴＡＣＩへの結合親和性は、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲと比較してＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲの方が高かった。ＢＣＭＡ  ＣＡＲはｓＢＣＭＡに強く結合し、ｓＴＡＣＩにはほとんど結合しないことが観察され、これは、ｓｃＦｖが由来する抗体の記載された結合特性と一致している。ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲは、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの両方に対して低い結合親和性を示したのに対し、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲよりもＢＣＭＡに対して親和性が低いにもかかわらず、両方の抗原に結合した（図２７Ａ）。次に、３つの異なるＣＡＲ  Ｔ細胞コンストラクトを、ＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩ発現細胞株のＭＭ．１Ｓ（図２７Ｂ）、ＲＰＭＩ８２２６（図２７Ｃ）、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ（図２７Ｄ）、及びＫ５６２−ＴＡＣＩ（図２７Ｅ）に対する細胞毒性について試験した。ＭＭ．１ｓ（図２７Ｂ）及びＲＰＭＩ８２２６（図２７Ｃ）ＭＭ細胞株は、ＢＣＭＡ及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって高効率で溶解されたが、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって媒介される特異的な溶解は低かった。ＢＣＭＡのみを発現する標的細胞について、同様のパターンが観察された：ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴとＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による効率的な溶解、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲＴによる溶解は弱い（図２７Ｄ）。対照的に、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のみが、ＴＡＣＩのみを発現する標的細胞を溶解することができたが、ＡＰＲＩＬ媒介溶解は依然としてＴｒｉＰＲＩＬ媒介溶解よりも弱いように見えた（図２７Ｅ）。
【０３２５】
異なるＣＡＲ  Ｔ細胞の脱顆粒（図２７Ｆ）及び活性化（図２７Ｇ）も決定した。細胞毒性はルシフェラーゼベースの殺傷アッセイで測定され、脱顆粒と活性化はフローによって分析された。ＭＭ標的細胞と共培養した時に、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の強力な脱顆粒が観察され、一方、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はほんのわずかに脱顆粒し、各実験において同じドナーからの非形質導入Ｔ細胞は陰性コントロールとして機能した（図２７Ｆ）。同様に、ＢＣＭＡ陽性標的細胞との共培養により、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞においてＣＤ６９発現が誘導されたが、ＴＡＣＩ陽性の細胞のみでは活性化を引き起こさなかった。ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、高レベルのＴＡＣＩを発現する標的（Ｋ５６２−ＴＡＣＩ）に応答して、ＣＤ６９を最もアップレギュレートしたが、ＭＭ細胞株又はＢＣＭＡには弱い反応しか示さなかった。ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、又はその両方を発現する標的細胞に応答して、強力に活性化した（図２７Ｇ）。驚くべきことではないが、Ｔ細胞の活性化の尺度としてのＣＤ１０７ａとＣＤ６９の両方の発現の程度は、抗原の発現と相関しており（Ｋ５６２形質導入細胞＞ＭＭ．１ｓ＞ＲＰＭＩ８２２６）、ＣＤ２２（Ｈａｓｏ等、Ｂｌｏｏｄ．１２１（７）：１１６５−７４（２０１３年））及び他の抗原（Ｗａｌｋｅｒ等、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ、２５（９）：２１８９−２２０１（２０１７）；Ａｒｃａｎｇｅｌｉ等、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ、２５（８）：１９３３−１９４５（２０１７年）；Ｃａｒｕｓｏ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７５（１７）：３５０５−１８（２０１５年））を標的とするＣＡＲに関する公開データと一致している。
【０３２６】
実施例１５  ＣＡＲ  Ｔ細胞の長期増殖
短期間の活性化、溶解、結合アッセイはＣＡＲ  Ｔ細胞の特性評価の基盤であるが、ＣＡＲ  Ｔ細胞が経時的に反復抗原刺激に耐え（Ｍｉｌｏｎｅ等、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ、１７（８）：１４５３−６４（２００９年）；Ｋａｌｏｓ等、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ、３（９５）：９５ｒａ７３（２００９年）；Ｐｏｒｔｅｒ等、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ、７（３０３）：３０３ｒａ１３９（２０１５年））、多機能サイトカイン応答を生成する（Ｒｏｓｓｉ等、Ｂｌｏｏｄ、１３２（８）：８０４−８１４（２０１８年））能力は、Ｔ細胞の機能をより識別するアッセイであり、患者における有効性に必要な機能の種類をより明確に示していると考えられている。そのようなＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性、増殖、及び多機能性はまた、臨床転帰と相関している（Ｆｒａｉｅｔｔａ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ、２４（５）：５６３−５７１（２０１８年）；Ｍａｕｄｅ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ、３７１（１６）：１５０７−１７（２０１４年）；Ｎｅｅｌａｐｕ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ、３７７（２６）：２５３１−２５４４（２０１７年）；Ｒｏｓｓｉ等、Ｂｌｏｏｄ、１３２（８）：８０４−８１４（２０１８年））。
【０３２７】
図２７Ｈ及び２７Ｉに示すように、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩの何れかによる反復抗原刺激に応答した、異なるＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖能力を試験するために、長期増殖アッセイが行われた。解凍されたＣＡＲ  Ｔ細胞の調製から開始して、Ｋ５６２−ＢＣＭＡによる毎週の刺激は、４週間にわたってＢＣＭＡとＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の対数的な増殖をもたらした；ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２つの刺激の後に対数的に増殖したが、その後先細になった。対照的に、反復Ｋ５６２−ＴＡＣＩ刺激は、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の対数増殖のみを誘導し、それらの間に有意な差はなかった（図２７Ｉ）。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、非形質導入コントロール細胞よりも増殖しなかった（ｐ＝０．５４６４）（図２７Ｉ）。したがって、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢとＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能の違いの主な要因の１つは、ＢＣＭＡ刺激に対する応答性であるように見えるが、抗ＢＣＭＡとＴｒｉＰＲＩＬ機能の間の機能の違いの主な要因は、ＴＡＣＩに対する応答性である。ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲは、細胞毒性能、脱顆粒、活性化、及び長期的増殖において、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲを上回った。
【０３２８】
最後に、ヒトＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞との共培養時の異なるＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生を、１２−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイにより上清中で測定した（図２７Ｊ）。３つ全てのＣＡＲコンストラクトは、４−１ＢＢ共刺激を有する他のＣＡＲ  Ｔ細胞の設計と同様に、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αなどのＴｈ１型サイトカインの強力な抗原特異的産生を示した（Ｍｉｌｏｎｅ等、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ、１７（８）：１４５３−６４（２００９年）；Ｓｃａｒｆｏ等、Ｂｌｏｏｄ、１３２（１４）：１４９５−１５０６（２０１８年））。
【０３２９】
実施例１６  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ活性
多発性骨髄腫の異種移植モデルにおいて、ＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞の高腫瘍負荷を有するＮＳＧマウスを移植することにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果を評価した。ＮＳＧマウスに、クリックビートルグリーンルシフェラーゼ（ＣＢＧ−ｌｕｃ）を発現するように改変したＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞を１×１０６個注射し、腫瘍を１４日間かけて生着させた。腫瘍負荷は、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって経時的にモニターされた。腫瘍の生着と無作為化の後、マウスは、０日目に、同じドナーからの非形質導入（ＵＴＤ）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ、又はＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の何れかを２ｘ１０６個の単一用量静脈内（ｉ．ｖ．）投与量で注射された（図２８Ａ）。腫瘍負荷はＢＬＩによって毎週モニターされ、ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性はフローサイトメトリーによって毎週末梢血中で測定された。ＵＴＤ処置群では腫瘍負荷が持続的に進行していたが、ＣＡＲＴ処置群では全てのマウスが抗腫瘍反応を示した。図２８Ｂ及び２８Ｃは、代表的な生物発光イメージング及び経時的なフラックスの定量化を示す。この高腫瘍負荷モデルでは、ＢＣＭＡ及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲＴは腫瘍を根絶することができたが、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍負荷の安定化をもたらすだけであった（図２８Ｂ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与された３つの群全ての治療反応は、ＵＴＤコントロール群と比較して統計的に有意であった。腫瘍反応に関して、ＢＣＭＡとＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した動物の間に有意差はなかった（ｐ＝０．８４５１）（図２８Ｃ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を、フローサイトメトリーにより末梢血中で測定した（図２８Ｄ）。末梢血中では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞数は、ＣＡＲＴ投与後１４日目に急激な増加とその後の収縮を示した。対照的に、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はより遅い増殖速度を示し、ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後２１日目でも細胞数は依然として増加している。ＵＴＤ及びＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、分析した時点で血中における測定可能な増殖を示さなかった（図２８Ｄ）。これらのデータを総合すると、我々のＡＰＲＩＬベースのＣＡＲは、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩを保有するＭＭ細胞に対して最適に機能する可能性が低いことが示唆され、さらなる研究では、ＢＣＭＡに対するＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の比較、特にＢＣＭＡを喪失したＭＭに対する応答性に焦点が当てられた。ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ及びＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍を根絶することができたが、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍負荷の安定化をもたらすだけであった。
【０３３０】
実施例１７  ＢＣＭＡ抗原回避のモデリング
ＢＣＭＡ抗原回避をモデル化するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＢＣＭＡノックアウト（ＫＯ）を有するＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞を作製した。図２９Ａに示すように、ＢＣＭＡ発現の欠如が確認されたが、ＴＡＣＩ発現レベルはノックアウト細胞株では影響を受けないままであった。ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ  ＫＯ  Ｉ、及びＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ  ＫＯ  ＩＩ細胞株の集団倍加を図２９Ｂに示す。親及びＢＣＭＡ  ＫＯ  ＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞は、使用したガイドＲＮＡとは無関係に、インビトロで同一の増殖動態を示した。さらに、ＭＭ．１Ｓ細胞とＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ  ＫＯ細胞の腫瘍原性及び増殖速度は、ＮＳＧマウスにおいて本質的に同一であった（図２９Ｅ）。
【０３３１】
次に、ＢＣＭＡ及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡノックアウト細胞の殺傷をインビトロで試験した。ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲは、ＵＴＤ細胞と比較して、ＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ  ＫＯ細胞を効果的に溶解した（図２９Ｃ）。図２９Ｄに示されるように、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡノックアウト細胞の殺傷は、ＭＭ．１Ｓ細胞の殺傷と比較して有意に減少し、一方、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による殺傷は、２つの細胞株間では減少しなかった（ｐ＝０．８９８６）。ＮＳＧマウスにおけるＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ陰性細胞株の経時的な腫瘍増殖の動態を図２９Ｅに示し、変化がないことを示している。
【０３３２】
ＢＣＭＡ抗原回避モデルもまた、インビボで試験され、そのための実験計画が図３０Ａに示されている。ＮＳＧマウスに１ｘ１０６個のＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡノックアウト細胞を注射し、１４日間生着させた。腫瘍負荷を経時的にモニターした。ＢＬＩによる腫瘍生着の確認後、マウスは、０日目に、２ｘ１０６個の非形質導入ＢＣＭＡ  ＣＡＲ又はＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ細胞を単一の静脈内投与量で注射された。（図３０）。さらに、腫瘍原性を評価し、かつ、ＭＭモデルで頻繁に発生し、インビボ実験の評価可能な期間を制限する同種拒絶反応を制御するために、一群のマウスを未処置のままにした。腫瘍負荷をＢＬＩによって経時的にモニターした。実験の過程で、全ての処置マウスは腫瘍の退縮を示したが、「腫瘍のみ」群の疾病負荷は継続的に進行しており、内因性Ｔ細胞受容体を介した腫瘍に対する非抗原特異的同種反応を示していた。代表的な生物発光イメージングを図３０Ｂに示し、３つの群のフラックスの定量化を図３０Ｃに示す。ここでも、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、非形質導入及びＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡノックアウト細胞に対して効果的であることが観察された。ＴＲＩＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔで処置されたマウスのみが、１４日目までに腫瘍を排除した（図３０Ｂ）。これは、ＣＡＲ  Ｔ細胞により誘導される抗原特異的媒介応答と一致する。７日目の腫瘍負荷の定量化は、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた群と、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＵＴＤコントロール細胞を受けた群との間に統計的に有意な差を示した（ｐ＜０．０００１）（図３０Ｃ）。不明確な理由により、ＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡノックアウト細胞に対するＴ細胞の同種反応は、親のＭＭ．１Ｓ細胞を使用したモデルと比較して早期に観察された。
【０３３３】
ＡＰＲＩＬベースのＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞毒性を、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ陽性腫瘍細胞の両方にリダイレクトすることができた。これらの受容体は両方とも悪性形質細胞上で一貫してアップレギュレートされているため、これはＭＭを標的とする魅力的な方法である。さらに、ＣＡＲ結合ドメインとしてモノマー形態ではなくトリマー形態のＡＰＲＩＬを使用することで、インビトロ及びインビボでＭＭ抗原の認識が増加することが観察された。
【０３３４】
実施例１８  ＣＡＲ  Ｔ細胞の多機能性
単一細胞レベルでの多機能サイトカイン産生は、リンパ腫の患者における臨床応答を誘発する機能性ＣＡＲ  Ｔ細胞産物の間の相関機能として最近明らかとなり（Ｒｏｓｓｉ等、Ｂｌｏｏｄ．１３２（８）：８０４−８１４（２０１８年））、患者における有効性に必要な機能の種類をより示すことができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の多機能性もまた、臨床転帰と相関している。多機能性は、出発Ｔ細胞産物とＣＡＲ設計の両方の機能である可能性がある。
【０３３５】
多機能ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、３２プレックス抗体アッセイを用いて、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ刺激時に各ＣＡＲ  Ｔ細胞産物中で測定した。多機能性は、２つ以上（≧２）のサイトカインの分泌として定義された。多機能アップレギュレーションは、ＢＣＭＡ刺激時の非形質導入細胞と比較して、ドナー全体で、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲコンストラクトを含むＣＤ４＋及びＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方において観察された（図３１Ａ及び３１Ｂ）。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４＋サブセットは両方とも１０−２４％の多機能細胞で構成されていたが、多機能ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲＴの割合は有意に低かった（５−１０％；ｐ＝０．００６４）。ＣＤ８＋サブセットの違いはより顕著であり、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物には、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（８−１５％；ｐ＝０．０００３）及びＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（０−６％；ｐ＜０．０００１）産物よりも有意に多くの多機能細胞（１６−２１％）を含んでいた（図３１Ａ）。ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲは、３つのＣＡＲコンストラクトの中で最も低い多機能プロファイルを示したのに対し、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物中のＴｒｉＰＲＩＬは最も高い多機能性を示した。ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ及びＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＢＣＭＡ抗原刺激により、ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物において同等のレベルを示した。
【０３３６】
多機能アップレギュレーションに沿って、多機能強度指数（ＰＳＩ）のＢＣＭＡ特異的アップレギュレーションは、ＢＣＭＡ抗原刺激時の非形質導入細胞と比較して、ドナー全体で、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ、及びＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲコンストラクトを含むＣＤ４＋及びＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方において観察された（図３２Ａ及び３２Ｂ）。ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲのＰＳＩが最も高かったのに対し、ＡＰＲＩＬ−４−１ＢＢ  ＣＡＲは、ＢＣＭＡ抗原刺激時にＣＤ４＋及びＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方において３つのコンストラクトの中で最小のＰＳＩ増加を示した。ＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方の強化されたＰＳＩは、グランザイムＢ、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１ａ、パーフォリン、ＴＮＦ−α、及びＴＮＦ−βを含むエフェクタータンパク質が優勢であった。低レベルのＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ｓＣＤ４０Ｌ、及びＩＬ−１７Ａ分泌物は、ＣＤ４  ＰＳＩにおいて独自に構成され、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１ｂ、及びｓＣＤ１３７は、ＣＤ４及びＣＤ８  ＰＳＩの両方で同定された。
【０３３７】
多機能ヒートマップ（図３３Ａ及び３３Ｂ）は、強化された多機能細胞サブセットが、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方において別個のタンパク質の組み合わせを有することをさらに明らかにする。さらに、様々なＣＡＲ構築物を有するＣＤ４＋及びＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方において、様々なタンパク質分泌物の増加が観察された（図３４Ａ−３４Ｄ）。個々のサイトカインプロファイルの単一細胞分析により、ＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方において、主要なサイトカインと測定された生成タンパク質が、エフェクターサイトカインとして分類され、試験したＣＡＲコンストラクト間で、プロファイルは類似しているが頻度が低いことが示された（図３４Ａ）。
【０３３８】
実施例１９  敵対的なＭＭ環境におけるＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能
骨髄ニッチでは、ＡＰＲＩＬは骨髄間質細胞から分泌され、形質細胞に増殖シグナルを提供する。ＭＭ患者の骨髄及び末梢血において、ｓＢＣＭＡ、ｓＴＡＣＩ、及びｓＡＰＲＩＬの超生理的濃度が報告されている。ｓＢＣＭＡ、ｓＴＡＣＩ及びｓＡＰＲＩＬが、膜結合ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを発現するＭＭ細胞に対するＴｒｉｐｒｉｌ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の溶解をブロックするかどうかを確認した。この目的のために、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、培養物中のｓＢＣＭＡ、ｓＴＡＣＩ及びｓＡＰＲＩＬの濃度範囲にわたって、異なるエフェクター対標的比でＭＭ．１Ｓ標的細胞と共培養した。ｓＢＣＭＡ及びｓＡＰＲＩＬの最高濃度（１０００ｎｇ／ｍｌ）では、ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲの細胞毒性の低下は、試験した最も低いエフェクター：標的比（１：３及び１：１０）でのみ観察された（図３５）。重要なことに、我々が試験したｓＴＡＣＩとｓＡＰＲＩＬの濃度は、ＭＭ患者で報告されているレベルをはるかに超えている。しかし、試験された最高濃度のｓＢＣＭＡは、進行したＭＭ患者の一部で報告されているｓＢＣＭＡ濃度に相当する。これらのデータは、ｓＢＣＭＡのＴｒｉＰＲＩＬへの結合が、低いＥ：Ｔ比でその活性を阻害する可能性があることを示しているが、これは、より高用量のＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞により、又はリンパ球枯渇の条件付けとしても有用な化学療法などの他の治療法を受けている患者においてｓＢＣＭＡの濃度を下げることにより、潜在的に克服され得ることを示している。
【０３３９】
実施例２０  ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲの核酸配列
ｐＭＧＨ７１ｂ−ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ（配列番号４５）：ＥＦ１αプロモーター（配列番号４６（配列番号４５のヌクレオチド１−１１８４））；ＣＤ８シグナルペプチド（配列番号４７（配列番号４５のヌクレオチド１１８５−１２４７））；ＴｒｉＰＲＩＬ（切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４８（配列番号４５のヌクレオチド１２４８−１６５５）））−Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号４９（配列番号４５のヌクレオチド１６５６−１６９１））−切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号５０（配列番号４５のヌクレオチド１６９２−２０９９））−Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号５１（配列番号４５のヌクレオチド２１００−２１３５））−切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号５２（配列番号４５のヌクレオチド２１３６−２５４３）））；ＣＤ８ヒンジ＋膜貫通型ドメイン（配列番号５３（配列番号４５のヌクレオチド２５４４−２７５０））；４−１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号５４（配列番号４５のヌクレオチド２７５１−２８７６））；ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号５５（配列番号４５のヌクレオチド２８７７−３２１２））
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ＥＦ１αプロモーター（配列番号４５のヌクレオチド１−１１８４）
2021510076.tif 000045
ＣＤ８シグナルペプチド（配列番号４５のヌクレオチド１１８５−１２４７）
2021510076.tif 000046
切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４５のヌクレオチド１２４８−１６５５）
2021510076.tif 000047
Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号４５のヌクレオチド１６５６−１６９１）
2021510076.tif 000048
切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４５のヌクレオチド１６９２−２０９９）
2021510076.tif 000049
Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号４５のヌクレオチド２１００−２１３５）
2021510076.tif 000050
切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４５のヌクレオチド２１３６−２５４３）
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ＣＤ８ヒンジ＋膜貫通型ドメイン（配列番号４５のヌクレオチド２５４４−２７５０）
2021510076.tif 000052
４−１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号４５のヌクレオチド２７５１−２８７６）
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ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号４５のヌクレオチド２８７７−３２１２）
2021510076.tif 000054
【０３４０】
実施例２１  ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲのアミノ酸配列
ｐＭＧＨ７１ｂ−ＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ（配列番号３９）：ＴｒｉＰＲＩＬ（切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４０（配列番号３９のアミノ酸１−１３６）））−Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号４１（配列番号３９のアミノ酸１３７−１４８））−切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４０（配列番号３９のアミノ酸１４９−２８４））−Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号４１（配列番号３９のアミノ酸２８５−２９６））−切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４０（配列番号３９のアミノ酸２９７−４３２）））；ＣＤ８ヒンジ＋膜貫通型ドメイン（配列番号４２（配列番号３９のアミノ酸４３３−５０１））；４−１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号４３（配列番号３９のアミノ酸５０２−５４３））；ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号４４（配列番号３９のアミノ酸５４４−６５５））
2021510076.tif 000055
切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号３９のアミノ酸１−１３６）
2021510076.tif 000056
Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号３９のアミノ酸１３７−１４８）
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切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号３９のアミノ酸１４９−２８４）
2021510076.tif 000058
Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（配列番号３９のアミノ酸２８５−２９６）
2021510076.tif 000059
切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号３９のアミノ酸２９７−４３２）
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ＣＤ８ヒンジ＋膜貫通型ドメイン（配列番号３９のアミノ酸４３３−５０１）
2021510076.tif 000061
４−１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号３９のアミノ酸５０２−５４３）
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ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号３９のアミノ酸５４４−６５５）
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Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーを有するＴｒｉＰＲＩＬ  ＣＡＲ（配列番号５７）：ＴｒｉＰＲＩＬ（切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４０（配列番号５７のアミノ酸１−１３６）））−Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（配列番号５８（配列番号５７のアミノ酸１３７−１５４））−切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４０（配列番号５７のアミノ酸１５５−２９０））−Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（配列番号５８（配列番号５７のアミノ酸２９１−３０８））−切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号４０（配列番号５７のアミノ酸３０９−４４４）））；ＣＤ８ヒンジ＋膜貫通型ドメイン（配列番号４２（配列番号５７のアミノ酸４４５−５１３））；４−１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号４３（配列番号５７のアミノ酸５１４−５５５））；ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号４４（配列番号５７のアミノ酸５５６−６６７））
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切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号５７のアミノ酸１−１３６）
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Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（配列番号５７のアミノ酸１３７−１５４）
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切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号５７のアミノ酸１５５−２９０）
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Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（配列番号５７のアミノ酸２９１−３０８）
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切断型ＡＰＲＩＬ（配列番号５７のアミノ酸３０９−４４４）
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ＣＤ８ヒンジ＋膜貫通型ドメイン（配列番号５７のアミノ酸４４５−５１３）
2021510076.tif 000070
４−１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号５７のアミノ酸５１４−５５５）
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ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号５７のアミノ酸５５６−６６７）
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【０３４１】
他の実施態様
前述の本発明は、理解を明確にする目的で、図示及び例示の方法によりある程度詳細に説明されてきたが、これらの説明及び例示は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用された全ての特許及び科学文献の開示は、それらの全体が出典明示により本明細書に明示的に援用される。
【図１】
2021510076.tif 000073
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６】
2021510076.tif 000078
【図７】
2021510076.tif 000079
【図８】
2021510076.tif 000080
【図９】
2021510076.tif 000081
【図１０】
2021510076.tif 000082
【図１１】
2021510076.tif 000083
【図１２】
2021510076.tif 000084
【図１３】
2021510076.tif 000085
【図１４】
2021510076.tif 000086
【図１５】
2021510076.tif 000087
【図１６】
2021510076.tif 000088
【図１７】
2021510076.tif 000089
【図１８】
2021510076.tif 000090
【図１９】
2021510076.tif 000091
【図２０】
2021510076.tif 000092
【図２１】
2021510076.tif 000093
【図２２Ａ】
2021510076.tif 000094
【図２２Ｂ】
2021510076.tif 000095
【図２３】
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【図２４】
2021510076.tif 000097
【図２５Ａ−Ｄ】
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【図２６Ａ】
2021510076.tif 000099
【図２６Ｂ】
2021510076.tif 000100
【図２６Ｃ】
2021510076.tif 000101
【図２６Ｄ】
2021510076.tif 000102
【図２７Ａ】
2021510076.tif 000103
【図２７Ｂ−Ｅ】
2021510076.tif 000104
【図２７Ｆ−Ｇ】
2021510076.tif 000105
【図２７Ｈ−Ｉ】
2021510076.tif 000106
【図２７Ｊ】
2021510076.tif 000107
【図２８Ａ】
2021510076.tif 000108
【図２８Ｂ】
2021510076.tif 000109
【図２８Ｃ−Ｄ】
2021510076.tif 000110
【図２９Ａ】
2021510076.tif 000111
【図２９Ｂ】
2021510076.tif 000112
【図２９Ｃ】
2021510076.tif 000113
【図２９Ｄ】
2021510076.tif 000114
【図２９Ｅ】
2021510076.tif 000115
【図３０Ａ】
2021510076.tif 000116
【図３０Ｂ】
2021510076.tif 000117
【図３０Ｃ】
2021510076.tif 000118
【図３１Ａ】
2021510076.tif 000119
【図３１Ｂ】
2021510076.tif 000120
【図３２Ａ】
2021510076.tif 000121
【図３２Ｂ】
2021510076.tif 000122
【図３３Ａ】
2021510076.tif 000123
【図３３Ｂ−１】
2021510076.tif 000124
【図３３Ｂ−２】
2021510076.tif 000125
【図３４Ａ】
2021510076.tif 000126
【図３４Ｂ−１】
2021510076.tif 000127
【図３４Ｂ−２】
2021510076.tif 000128
【図３４Ｃ−１】
2021510076.tif 000129
【図３４Ｃ−２】
2021510076.tif 000130
【図３４Ｄ−１】
2021510076.tif 000131
【図３４Ｄ−２】
2021510076.tif 000132
【図３５】
2021510076.tif 000133
【配列表】
2021510076000001.app
【国際調査報告】
2021510076.tif 000134
2021510076.tif 000135
2021510076.tif 000136
2021510076.tif 000137
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