(57)【要約】  本発明は、腫瘍微小環境内の腫瘍関連骨髄系細胞（ＴＡＭＣ）上のＣＤ１１ｂのＩ−ドメインの結合に基づく、免疫応答を調節するための方法に関する。特に、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体によるＣＤ１１ｂのＩ−ドメインへの結合は、腫瘍微小環境内の以下の影響のうちの１つまたは複数を有する免疫賦活性環境をトリガーする：腫瘍微小環境内の炎症性サイトカインの増加、ＩＤＯ＋骨髄系サプレッサー細胞の集団の減少、腫瘍関連マクロファージ上のＭ２マーカーを超えるＭ１マーカーの上方制御、Ｍ１：Ｍ２腫瘍関連マクロファージ比の増加、樹状細胞（ＤＣ）、ネイチャーキラー樹状細胞（ＮＫＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の分化の促進、４−１ＢＢ＋ＰＤ−１＋ネオアンチゲン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の集団の増加。抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体によるＣＤ１１ｂのＩ−ドメインへの結合による低温（非炎症性）腫瘍から高温（炎症性）腫瘍への変換は、免疫応答調節剤の有効性を増強させる。
2021517114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞上のＣＤ１１ｂのＩ−ドメインに特異的に結合する試薬を含む、免疫応答を調節することによるがんの治療における使用のための
医薬組成物。
【請求項２】
前記ＣＤ１１ｂは腫瘍関連骨髄系細胞（ＴＡＭＣ）上にある
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記試薬は、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインを結合する抗体である
請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
免疫応答調節剤をさらに含む
請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記免疫応答調節剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ４０、ＯＸ４０またはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に特異的に結合する試薬である
請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記免疫応答調節剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＯＸ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、腫瘍溶解性ウイルス、放射線療法または化学療法剤である
請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記免疫応答調節剤は抗ＣＴＬＡ４抗体である
請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記Ｔｏｌｌ様（ＴＬＲ）受容体アゴニストはＣｐＧである
請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記化学療法剤はタキソールである
請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫応答を調節するための方法であって、前記医薬組成物は、細胞上のＣＤ１１ｂのＩ−ドメインに特異的に結合する試薬を含む
方法。
【請求項１１】
前記ＣＤ１１ｂは腫瘍関連骨髄系細胞（ＴＡＭＣ）上にある
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬は、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインを結合する抗体である
請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記医薬組成物は免疫応答調節剤をさらに含む
請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫応答調節剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ４０、ＯＸ４０またはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に特異的に結合する試薬である
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫応答調節剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＯＸ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、腫瘍溶解性ウイルス、放射線療法または化学療法剤である
請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫応答調節剤は抗ＣＴＬＡ４抗体である
請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔｏｌｌ様（ＴＬＲ）受容体アゴニストはＣｐＧである
請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学療法剤はタキソールである
請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答を調節するための方法に関し、特に、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインへの結合を伴う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンアルファＭ（ＣＤ１１ｂ、ＣＲ３ＡまたはＩＴＧＡＭ）は、単球、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、ネイチャーキラー樹状細胞、形質細胞様樹状細胞および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む多数の自然免疫細胞の表面上で発現する、ヘテロダイマーのインテグリンアルファ−Ｍベータ−２（αＭβ２）分子を形成する１つのタンパク質サブユニットである。
【０００３】
ＣＤ１１ｂは、大きな細胞外領域、単一の疎水性膜貫通ドメインおよび短い細胞質側末端からなる。ＣＤ１１ｂの細胞外領域は、β−プロペラドメイン、ｔｈｉｇｈドメイン、ｃａｌｆ−１ドメインおよびｃａｌｆ−２ドメインを含む。ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインは、β−プロペラドメインに挿入されたおよそ１７９個のアミノ酸からなる。Ｉ−ドメインは、様々なリガンド（例えば、ｉＣ３ｂ、フィブリノゲン、ＩＣＡＭ−ＩおよびＣＤ４０Ｌなど）に対する結合部位であり、細胞の接着、遊走、走化性および食作用を制御することにより、炎症を媒介する。
【０００４】
ＣＤ１１ｂの連結は、Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）分化を阻害することにより末梢性寛容を生じさせやすくすることが示されている。加えて、抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージ）上で発現された活性のあるＣＤ１１ｂは、完全なＴ細胞活性化を直接阻害することができる。最近の研究による結果は、ＣＤ１１ｂが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を調節することにより、炎症において決定的な役割を果たすことを示す。ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメインの高結合活性の連結は、骨髄分化一次応答タンパク質８８（ＭｙＤ８８）およびＴＩＲドメイン含有アダプター誘導インターフェロン−β（ＴＲＩＦ）の分解を促進することにより、ＴＬＲシグナル伝達の迅速な阻害をもたらす。したがって、インテグリンαＭβ２は、自然免疫応答の負の制御因子として機能し得る。
【０００５】
抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体などの免疫チェックポイント遮断薬は、腫瘍破壊性免疫応答を与え、がん患者において持続的臨床反応を誘発することができる。しかし、これらの薬物は、「高温」腫瘍（すなわち、炎症性であり、高い変異原性負荷を伴い、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞浸潤を誘引することができる腫瘍）内で最も良く働く。対照的に、「低温」腫瘍（すなわち、非炎症性であり、低い変異原性負荷を伴い、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞浸潤を誘引することができない腫瘍）は、典型的には、免疫チェックポイント遮断療法に対する反応性がより低い。
【０００６】
腫瘍微小環境は複雑な環境であり、腫瘍は、持続的な増殖、侵襲および転移に関して、この環境に依存する。多くの調査が、腫瘍関連骨髄系細胞（ＴＡＭＣ）が腫瘍微小環境内の免疫細胞の主要成分であることを示しており、ＴＡＭＣが腫瘍進行を直接的または間接的に促進すると考えられる。腫瘍微小環境内のＴＡＭＣは、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、好中球、肥満細胞および樹状細胞から構成される。これらの細胞はＴ細胞機能の抑制に寄与し、そのような抑制は免疫チェックポイントブロッキング耐性と相関する。したがって、これらのＴＡＭＣは、新しいがん免疫療法の標的になり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、免疫応答を調節するための方法に関する。本発明の１つの実施形態による方法は、医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫応答を調節することを含み、医薬組成物は、腫瘍関連骨髄系細胞（ＴＡＭＣ）などの細胞上のＣＤ１１ｂのＩ−ドメインに特異的に結合する試薬を含む。試薬は、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインを結合する抗体であり得る。ＣＤ１１ｂのＩドメインは、様々な接着リガンドに対する主要認識部位を有する（ＭＳ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１２０（４）：１０３１）。接着機能で知られている、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインへの結合が免疫応答を調節し得ることは全く予想外である。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫応答を調節するための医薬組成物は、免疫チェックポイント遮断薬などの別の免疫応答調節剤をさらに含み得る。免疫チェックポイント遮断薬は、抗ＣＴＬＡ４抗体など、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する試薬である。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、免疫チェックポイント遮断薬をさらに含む。免疫チェックポイント遮断薬は、抗ＰＤ１抗体など、ＰＤ１に特異的に結合する試薬である。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、免疫チェックポイント遮断薬をさらに含む。免疫チェックポイント遮断薬は、抗ＰＤＬ１抗体など、ＰＤＬ１に特異的に結合する試薬である。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、免疫チェックポイント遮断薬をさらに含む。免疫チェックポイント遮断薬は、抗ＯＸ４０抗体など、ＯＸ４０（すなわち、ＣＤ１３４）に特異的に結合する試薬である。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、免疫チェックポイント遮断薬をさらに含む。免疫チェックポイント遮断薬は、抗ＣＤ４０抗体など、ＣＤ４０に特異的に結合する試薬である。
【００１３】
本発明の実施形態は、免疫応答を調節するためのＣＤ１１ｂのＩ−ドメインへの試薬の特異的結合を伴う。その結果、腫瘍微小環境が、低温腫瘍の微小環境から高温腫瘍の微小環境に変化し、化学療法および照射療法を含む様々な療法治療に対する腫瘍の感受性がより高くなる。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインに特異的に結合する試薬と別のがん治療様式（例えば、化学療法剤または放射線療法）とを使用する併用療法を伴う。化学療法剤の例には、タキソールまたは他の化学療法剤が含まれ得る。
【００１４】
本発明の他の態様は、以下の説明および関連する図面により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療後のＢ１６Ｆ１０腫瘍組織液中のサイトカインプロファイルを示す図である。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、２×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５００ｍｍ３であったとき、マウスに、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。１日後、マウスは屠殺され、腫瘍組織液中のサイトカイン濃度が、ＢＤ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）を使用して測定された。
【００１６】
【図２】抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療後のＩＤＯ＋ＭＤＳＣの百分率を示す図である。対照ＩｇＧまたは抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体の存在下、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）で２４時間〜７２時間刺激されたＭＤＳＣ内のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現が、抗マウスＧｒ−１  ＦＩＴＣ抗体による細胞表面染色および抗マウスＩＤＯ  ＡＰＣ抗体による細胞内染色により評価された。結果は、対照ＩｇＧによる治療と比較して、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療後にＩＤＯ＋ＭＤＳＣの時間依存的減少が存在することを示す。
【００１７】
【図３】ＭＤＳＣおよび対照ＩｇＧまたは抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体の存在下のＣＤ８細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖指数を示す図である。ＭＤＳＣは、Ｔ細胞を含む免疫細胞と相互作用し、これを抑制することができる。ここで、ＭＤＳＣの抑制活性は、ＣＤ８細胞増殖に伴い観察される、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によりＴ細胞活性化を阻害するその能力により評価される。図３に示す通り、対照ＩｇＧによる治療と比較して、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体の存在下、ＭＤＳＣのＴ細胞抑制能力は阻害され、ＣＤ８細胞増殖は増加する。
【００１８】
【図４】腫瘍関連マクロファージ表現型（Ｍ１またはＭ２）分極に対する抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（例えば、４４ａａｃｂ抗体およびＭ１／７０抗体）による治療の影響を示す図である。結果は、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療が、Ｍ２マクロファージに比べて、Ｍ１マクロファージを著しく増加させることを示す。加えて、ＣＤ１１ｃ樹状細胞マーカーおよびＤＣ−ＳＩＧＮ樹状細胞マーカーの増加から分かるように、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体による治療は樹状細胞集団も増加させる。
【００１９】
【図５】抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療後のＣＴ２６腫瘍内のＭ１／Ｍ２腫瘍関連マクロファージのフローサイトメトリーによる分析および定量化の結果を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウスに、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。第４の治療後、マウスは屠殺され、腫瘍関連マクロファージが単離された。腫瘍関連マクロファージのＭ１（ＭＨＣ  ＩＩ＋、ＣＤ２０６−）表現型およびＭ２（ＭＨＣ  ＩＩ−、ＣＤ２０６＋）表現型は、フローサイトメトリーによる分析であった。
【００２０】
【図６】抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療後のＣＴ２６腫瘍内の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）上のＭＨＣ  ＩＩのフローサイトメトリーによる分析および定量化を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウスに、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（５ｍｇ／ｋｇ）がｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。第４の治療後、マウスは屠殺され、腫瘍関連マクロファージが単離された。腫瘍関連マクロファージ上のＭＨＣ  ＩＩの強度は、フローサイトメトリーによる分析であった。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【００２１】
【図７】ＣＴ２６腫瘍の増殖に対する抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体とＣｐＧとの併用療法の影響を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウス（１群あたり５匹）に、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（クラスＢ、ＯＤＮ  １６６８）（５０μｇ）または抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）＋ＣｐＧオリゴヌクレオチド（クラスＢ、ＯＤＮ  １６６８）（５０μｇ）のいずれかがｉｐ注射された。第２の注射は、第１の治療の３日後に繰り返された。腫瘍体積が測定された。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【００２２】
【図８】ＣＴ２６腫瘍の増殖に対する抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体との併用療法の影響を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウス（１群あたり５匹）に、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＴＬＡ４抗体（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＣＴＬＡ４抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。腫瘍体積が測定された。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【００２３】
【図９】ＣＴ２６腫瘍の増殖に対する抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＰＤ１抗体との併用療法の影響を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウス（１群あたり５匹）に、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ１抗体（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＰＤ１抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。腫瘍体積が測定された。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【００２４】
【図１０】ＣＴ２６腫瘍の増殖に対する抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＯＸ４０抗体との併用療法の影響を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウス（１群あたり５匹）に、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＯＸ４０抗体（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＯＸ４０抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。腫瘍体積が測定された。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【００２５】
【図１１】ＣＴ２６腫瘍の増殖に対する抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＣＤ４０抗体との併用療法の影響を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウス（１群あたり５匹）に、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ４０抗体（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＣＤ４０抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。腫瘍体積が測定された。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【００２６】
【図１２Ａ】ＦＡＣＳにより分析される、担ＣＴ２６腫瘍マウスにおける古典的樹状細胞（ＤＣ）上の抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体の影響を示す図である。
【図１２Ｂ】ＦＡＣＳにより分析される、担ＣＴ２６腫瘍マウスにおけるナチュラルキラー樹状細胞（ＮＫＤＣ）上の抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体の影響を示す図である。
【図１２Ｃ】ＦＡＣＳにより分析される、担ＣＴ２６腫瘍マウスにおける形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上の抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体の影響を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウスに、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。第４の治療後、マウスは屠殺され、腫瘍関連マクロファージが単離された。腫瘍内の古典的樹状細胞、ナチュラルキラー樹状細胞および形質細胞様樹状細胞の量がフローサイトメトリーにより計数された。
【００２７】
【図１３】担ＣＴ２６腫瘍マウスからの腫瘍４−１ＢＢ＋ＰＤ−１＋ネオアンチゲン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞数のＦＡＣＳ分析を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に３×１０５個のＣＴ２６細胞が皮下注射された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウス（１群あたり５匹）に、対照ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＴＬＡ４抗体（５ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＣＴＬＡ４抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。第４の治療後、マウスは屠殺され、腫瘍関連マクロファージが単離された。腫瘍内の４−１ＢＢ＋ＰＤ−１＋ネオアンチゲン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の量がフローサイトメトリーにより計数された。
【００２８】
【図１４】最初の腫瘍接種の７７日後、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体とにより治療された生存マウス（免疫化マウスと呼ばれる）に、２回目に３×１０５個の親ＣＴ２６細胞が注射されたことを示す図である。２匹の非免疫化（ナイーブ）マウスに、対照群と同じように注射された。腫瘍体積は平均±ＳＥＭである。
【００２９】
【図１５】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の増殖に対する抗ＣＤ１１ｂ抗体とＴａｘｏｌとの併用療法の影響を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に２×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞が皮下注射された。７日目に、マウスに、Ｃｔｒｌ  ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）、抗マウスＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｔａｘｏｌ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｃｔｒｌ  ＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）またはＴａｘｏｌ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。腫瘍体積が測定された。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
「ＣＤ１１ｂ」という用語はインテグリンアルファＭ（ＩＴＧＡＭ）を指し、これは、ヘテロダイマーのインテグリンαＭβ２のサブユニットである。インテグリンαＭβ２の他のサブユニットは、ＣＤ１８として既知の一般的なインテグリンβ２サブユニットである。インテグリンαＭβ２は、単球、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびネイチャーキラー細胞を含む白血球の表面上で発現された、マクロファージ−１抗原（Ｍａｃ−１）または補体受容体３（ＣＲ３）とも呼ばれる。
【００３１】
「ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン」は「ＣＤ１１ｂ−Ａ−ドメイン」（フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）Ａ型ドメイン）とも呼ばれ、これは、β−プロペラドメインに挿入されており、以下のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む：
ＤＩＡＦＬＩＤＧＳＧＳＩＩＰＨＤＦＲＲＭＫＥＦＶＳＴＶＭＥＱＬＫＫＳＫＴＬＦＳＬＭＱＹＳＥＥＦＲＩＨＦＴＦＫＥＦＱＮＮＰＮＰＲＳＬＶＫＰＩＴＱＬＬＧＲＴＨＴＡＴＧＩＲＫＶＶＲＥＬＦＮＩＴＮＧＡＲＫＮＡＦＫＩＬＶＶＩＴＤＧＥＫＦＧＤＰＬＧＹＥＤＶＩＰＥＡＤＲＥＧＶＩＲＹＶＩＧＶＧＤＡＦＲＳＥＫＳＲＱＥＬＮＴＩＡＳＫＰＰＲＤＨＶＦＱＶＮＮＦＥＡＬＫＴＩＱＮＱＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）．
【００３２】
「免疫応答調節剤」という用語は、宿主における免疫応答を調節することができる薬剤を指す。「免疫チェックポイント遮断薬」という用語は、免疫チェックポイントを介して免疫抑制を軽減することができる「免疫チェックポイント阻害剤」を指す。
【００３３】
本発明の実施形態は、免疫応答を調節するための方法に関する。本発明の実施形態は、腫瘍微小環境内の腫瘍関連骨髄系細胞（ＴＡＭＣ）上のＣＤ１１ｂのＩ−ドメインに結合する試薬に基づく。本発明の実施形態によれば、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインに特異的に結合する試薬は、モノクローナル抗体またはその結合断片を含む抗体であり得る。
【００３４】
本発明の実施形態によれば、特定の試薬（例えば、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体）によるＣＤ１１ｂのＩ−ドメインへの結合は、免疫賦活応答を誘導またはトリガーすることができる。ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインは、接着へのその関与で知られているが、本発明の発明者らは、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインへのそのような試薬の特異的結合が、腫瘍微小環境内の以下の影響のうちの１つまたは複数を有し得ることを予想外にも見出した：腫瘍微小環境内の炎症性サイトカインの増加、ＩＤＯ＋骨髄系サプレッサー細胞の集団の減少、腫瘍関連マクロファージ上のＭ２マーカーを超えるＭ１マーカーの上方制御、Ｍ１：Ｍ２腫瘍関連マクロファージ比の増加、（古典的樹状細胞、ネイチャーキラー樹状細胞（ＮＫＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を含む）樹状細胞（ＤＣ）の分化の促進、４−１ＢＢ＋ＰＤ−１＋ネオアンチゲン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の集団の増加。これらの影響は、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインへの試薬（例えば、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体）の特異的結合が低温（非炎症性）腫瘍から高温（炎症性）腫瘍への変換を誘導することができ、これが免疫チェックポイント療法の効果を増強させ得ることを示唆する。
【００３５】
本発明の実施形態を以下の具体例により説明する。しかし、これらの具体例は例示のためだけであること、ならびに他の修正および変形が本発明の範囲から逸脱することなく可能であることを当業者なら理解するであろう。
【００３６】
抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療は、腫瘍微小環境内の炎症性サイトカイン放出を増強させた。
先の研究では、ＣＤ１１ｂ活性化が、ＴＬＲによりトリガーされた炎症反応を負に制御することが確証されていた。ＣＤ１１ｂは腫瘍関連骨髄系細胞（ＴＡＭＣ）上で発現されるので、本発明者らは、抗体を使用するＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン機能によるＣＤ１１ｂのブロッキングが腫瘍微小環境内の炎症性サイトカイン放出を増加させ得ると推論した。したがって、本発明者らは、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体による治療後のＢ１６Ｆ１０腫瘍内の炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１など）の分泌を評価した。
【００３７】
図１に示す通り、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）の分泌は、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療された腫瘍からの組織液中でより多く、一方、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ７０の分泌はより少ない。これらの結果は、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療が、炎症誘発性サイトカインの産生を増加させることができることを示す。言い換えれば、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療は、低温（非炎症性）腫瘍を高温（炎症性）腫瘍に変換することができる。
【００３８】
「高温腫瘍」は、Ｔ細胞により侵襲された腫瘍であり、炎症性微小環境を生じる。腫瘍微小環境内のＴ細胞は、腫瘍細胞と戦うために容易に動員され得る。例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体などの免疫チェックポイント遮断薬（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）は、Ｔ細胞上の腫瘍によりかけられたブレーキを解除することができる。これらの薬物は、「高温」腫瘍（すなわち、炎症性であり、高い変異原性負荷を伴い、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞浸潤を誘引することができる腫瘍）内で最も良く働く。したがって、「低温」腫瘍を「高温」腫瘍に変換することにより、本発明の方法は、免疫チェックポイント遮断療法の効果を増強させることができる。
【００３９】
抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療は、マウスＭＤＳＣ内のＩＤＯ＋集団を減少させ、ＭＤＳＣ誘導性のＴ細胞阻害を逆転させた
骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、骨髄細胞系列からの免疫細胞の異種群である。ＭＤＳＣは、他の骨髄系細胞に見られる免疫賦活特性の代わりに強い免疫抑制活性をＭＤＳＣが持つという点で他の骨髄細胞型とは区別される。その作用機序は十分理解されていないが、臨床的および実験的証拠は、ＭＤＳＣの高浸潤を伴うがん組織が患者の予後不良および療法抵抗性に関連することを示す。
【００４０】
ＭＤＳＣは、アルギナーゼＩ（ａｒｇ１）の産生およびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現など、いくつかの機序を通じて、免疫抑制を誘導することができ、Ｔ細胞阻害をもたらす。マウス腫瘍モデルにおいて、ＭＤＳＣは、高レベルのＣＤ１１ｂ（古典的骨髄細胞系列マーカー）を発現させる骨髄系細胞として見出される。したがって、本発明者らは、ＭＤＳＣ免疫抑制機能に対するＣＤ１１ｂ遮断の影響を調査することにより、ＭＤＳＣ上のＣＤ１１ｂの役割を調べ始めた。簡潔には、ＭＤＳＣが担ＬＬＣ１マウスから単離され、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体により治療される。ＭＤＳＣ特性に対するそのような治療の影響が評価される。
【００４１】
図２に示す通り、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療の結果、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）による刺激の後、時間に依存して、対照ＩｇＧによる同様の治療と比較してＩＤＯ＋ＭＤＳＣの集団が著しく減少した。ＩＤＯ＋ＭＤＳＣの減少に基づいて、ＭＤＳＣによって媒介される免疫抑制およびＴ細胞阻害は減少するはずであると予想されるであろう。
【００４２】
実際、図３に示す通り、ＭＤＳＣの存在下のＣＤ８細胞増殖は、対照ＩｇＧによる治療と比較して、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体による治療により増加される。これらの結果は、ＭＤＳＣのＣＤ１１ｂが抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体によりブロックされたとき、ＭＤＳＣ誘導性のＴ細胞阻害が著しく逆転されたことを示す。
【００４３】
抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療は、Ｍ２メーカーを超えてＭ１メーカーを上方制御した
マクロファージは、組織常在性のプロフェッショナル食細胞および抗原提示細胞である。マクロファージは血中単球に由来する。異なる組織環境において、マクロファージは、別個の機能的表現型へと特異的分化を経る。マクロファージは一般に２つのクラス：古典的活性化（Ｍ１）マクロファージおよび選択的活性化（Ｍ２）マクロファージに分けられている。Ｍ１マクロファージは炎症を助長し、一方、Ｍ２マクロファージは、炎症を減少させ、組織修復を助長する。この違いはそれらの代謝に反映されており、Ｍ１マクロファージは、アルギニンを代謝して一酸化窒素を発生させることができて、一方、Ｍ２マクロファージは、アルギニンを代謝してオルニチンを生成することができる。
【００４４】
表現型的に、Ｍ１マクロファージは、高レベルの主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）であるＣＤ３６、ならびに共刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する。対照的に、Ｍ２マクロファージは、ＣＤ１６３＋およびＣＤ２０６＋として特徴付けられている。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、Ｍ２様表現型を示し、腫瘍進行を促進する。抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療が腫瘍関連マクロファージをＭ１表現型に傾けることができるかを検討するために、ヒトマクロファージが、Ａ５４９肺がん細胞の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＢＭＣから分化された。
【００４５】
図４に示す通り、Ｍ１マーカーの発現は、対照ＩｇＧ治療群と比較して、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療群（抗ＣＤ１１ｂ（４４ａａｃｂ）および抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０））においてより大幅に高い。他方、Ｍ２マーカーの発現は、対照ＩｇＧ治療群と比較して、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療群において増強を示さなかったか、またはごくわずかな増強を示した。加えて、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療はまた、ＣＤ１１ｃおよびＤＣ−ＳＩＧＮを上方制御した。これらは樹状細胞マーカーである。合わせて、これらの結果は、ＣＤ１１ｂ遮断が腫瘍関連マクロファージをＭ１表現型に傾け、樹状細胞を成熟させて、免疫療法に役立つ炎症性微小環境をもたらすことを示した。
【００４６】
この実験では、２つの異なる抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（すなわち、４４ａａｃｂおよびＭ１／７０）を使用した。これらは市販されている。抗ＣＤ１１ｂ抗体４４ａａｃｂは、多くの商業的供給源、例えばＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、米国）およびＡＴＣＣから入手できる。抗ＣＤ１１ｂ抗体Ｍ１／７０は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｂｃａｍ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｔなどから入手できる。さらに、他の抗ＣＤ１１ｂ抗体も使用することができる。これらの実験による結果は、影響が任意の特定の抗体に限定されないことを示す。実際、ＣＤ１１ｂ  Ｉ−ドメインに結合することができる任意の抗体またはその結合断片を本発明の実施形態と共に使用することができる。
【００４７】
抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療は、腫瘍関連マクロファージの活性化を免疫抑制的なＭ２様状態からより炎症性のＭ１様状態に切り替える
上で論じた通り、ＣＤ１１ｂ遮断は、マクロファージをｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭ１表現型に傾ける。本発明者らは、この観察をＣＴ２６腫瘍モデルにおいてさらに確認した。担ＣＴ２６腫瘍マウスにおける腫瘍浸潤性白血球の分析は、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体による治療が、対照ＩｇＧによる治療と比較して、腫瘍関連マクロファージ内のＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させ、成熟樹状細胞集団を増加させ（図５）、ＭＨＣ  ＩＩの発現を著しく増加させた（図６）ことを示す。これらの結果は、抗原提示能の増強を示唆する。まとめると、これらの結果は、腫瘍関連マクロファージの抑制表現型からより免疫活性のあるものへの調節がＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン遮断により実現することができることを示す。
【００４８】
抗腫瘍免疫における抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体とＴＬＲアゴニスト治療との相乗効果
最近の研究による結果は、ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメインの高結合活性の連結が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達の迅速な阻害をもたらすことを示す。したがって、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体によるＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン活性のブロッキングは、ＴＬＲシグナル伝達の阻害を逆転させることができる。次に本発明者らは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９アゴニスト）とＣＤ１１ｂ遮断とによる併用免疫療法が抗腫瘍効果を増強させることができるかを検討する。Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスに、３×１０５個のＣＴ２６結腸がん細胞が皮下移植された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウスに、対照ＩｇＧ、５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体、５０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、または５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と５０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドとの組合せがｉｐ注射された。
【００４９】
図７に示す通り、ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる単剤療法は腫瘍増殖を阻害した。顕著には、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体とＣｐＧオリゴヌクレオチドとの併用により治療されたマウスは、最良の抗腫瘍反応を有していた。併用療法の劇的な影響は、相乗効果の存在を示唆する。
【００５０】
上の実験はＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９アゴニスト）を一例として使用しているが、他のＴＬＲアゴニストも同様に使用することができる。本発明の抗ＣＤ１１ｂ試薬もこれらの他のＴＬＲアゴニストアプローチと共に使用することができることを当業者なら理解するであろう。
【００５１】
抗腫瘍免疫における抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と免疫チェックポイント治療との相乗効果
上で述べたように、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインに特異的に結合することにより、本発明の方法は、「低温」腫瘍を「高温」腫瘍に変換することができ、それによって、免疫チェックポイント遮断療法の効果を増強する。次に本発明者らは、そのような併用療法の影響を調べる。
【００５２】
ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞によって発現された阻害性受容体であり、樹状細胞またはマクロファージ上で発現されたＣＤ８０／ＣＤ８６の連結（リガンド結合）後、Ｔ細胞応答のエフェクター相を負に制御する。抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療は、腫瘍関連マクロファージ上のＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を増強させるので、次に本発明者らは、ＣＤ１１ｂおよびＣＴＬＡ４遮断による併用免疫療法が抗腫瘍効果を増強させることができるかを検討する。Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスに、３×１０５個のＣＴ２６結腸がん細胞が皮下移植された。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、マウスに、対照ＩｇＧ、５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体、５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体、または５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体との組合せがｉｐ注射された。
【００５３】
図８に示す通り、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体による単剤療法は部分的に効果的であったが、抗ＣＴＬＡ４抗体による単剤療法は腫瘍増殖を著しく阻害した。顕著には、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体との併用により治療されたマウスは、最良の抗腫瘍反応を有し、退縮率は６０％となった。併用療法の劇的な影響は、相乗効果の存在を示唆する。
【００５４】
上の実験はＣＴＬＡ４を一例として使用しているが、他の免疫チェックポイント標的も同様に使用することができる。例えば、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１は免疫チェックポイント制御に関与することが示されており、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、免疫抑制の逆転において有効であることが示されている。ＯＸ４０（ＣＤ１３４または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＦＲＳＦ４）としても既知）ならびにＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ３）は、免疫チェックポイントの他の例である。ＯＸ４０またはＴＩＭ３の妨害は、腫瘍誘導性の免疫抑制を軽減することができる。
【００５５】
図９に示す通り、抗ＰＤ１抗体による単剤療法は腫瘍増殖をわずかに阻害したが、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＰＤ１抗体との併用により治療されたマウスは、最良の抗腫瘍反応を有していた。同様に、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と組み合わせた抗ＯＸ４０または抗ＣＤ４０抗体は、最良の抗腫瘍反応を有していた（図１０および図１１）。本発明の抗ＣＤ１１ｂ試薬もこれらの他の免疫チェックポイント妨害アプローチと共に使用することができることを当業者なら理解するであろう。
【００５６】
樹状細胞（ＤＣ）は、効率的な抗原提示細胞であり、治療ワクチンの改善のための有望な選択肢である。図１２Ａ〜図１２Ｃに示す通り、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体による治療は、腫瘍微小環境内の古典的樹状細胞（ＤＣ）（図１２Ａ）、ナチュラルキラー樹状細胞（ＮＫＤＣ）（図１２Ｂ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）（図１２Ｃ）の数を増加させた。
【００５７】
加えて、図１３に示す通り、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体による治療は、腫瘍微小環境内のエフェクターＰＤ−１＋４−１ＢＢ＋ネオアンチゲン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の数をわずかに増加させたが、抗ＣＴＬＡ４抗体単独による治療はほとんど影響を及ぼさなかった。対照的に、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体とによる併用治療は、腫瘍微小環境内のエフェクターＰＤ−１＋４−１ＢＢ＋ネオアンチゲン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の数を著しく増加させ、注目すべき相乗効果を示した（図１３）。まとめると、これらの結果は、腫瘍微小環境の調節、すなわち、免疫抑制的な腫瘍微小環境からより免疫賦活性のものへの変換が、ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン遮断（例えば、ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメインへの抗体の結合）により実現することができることを示す。その結果、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体は、免疫療法剤、例えば免疫チェックポイント妨害薬：抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ４抗体の効果を増強させることができる。
【００５８】
ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン遮断の長期メモリー効果
抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体などの免疫チェックポイント遮断薬は、がん患者において持続的臨床反応を誘発することができる。したがって、本発明者らは、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン治療の長期的影響も調べる。
【００５９】
簡潔には、最初の腫瘍接種および抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体との併用による治療の７７日後（免疫化マウスと呼ばれる）、生存マウスに、２回目に３×１０５個の親ＣＴ２６細胞（結腸がん細胞）が注射された。２匹のナイーブ（あらかじめ免疫化および治療されていない）マウスに、対照群と同じように注射された。マウスは監視され、接種後に腫瘍体積が測定された。
【００６０】
図１４に示す通り、対照群（ナイーブマウス）において腫瘍が急速に増殖した。対照的に、あらかじめ免疫化および治療された生存マウスは、腫瘍増殖を制限する能力を保持し、（例えば、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体による）ＣＤ１１ｂ  Ｉ−ドメインの遮断が長期的反応を誘発することができることを示した。
【００６１】
抗腫瘍免疫における抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と化学療法治療との相乗効果
次に本発明者らは、化学療法とＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン遮断とによる併用免疫療法が抗腫瘍効果を増強させることができるかを検討する。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、０日目に２×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫がん細胞が皮下移植された。７日目に、マウスに、５ｍｇ／ｋｇのＣｔｒｌ  ＩｇＧ、５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体、５ｍｇ／ｋｇのＣｔｒｌ  ＩｇＧと１０ｍｇ／ｋｇのＴａｘｏｌとの組合せ、または５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体と１０ｍｇ／ｋｇのＴａｘｏｌとの組合せがｉｐ注射された。注射は３〜４日毎に繰り返された。顕著には、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体とタキソールとの併用により治療されたマウスは、最良の抗腫瘍反応を有していた（図１５）。併用療法の劇的な影響は、相乗効果の存在を示唆する。
【００６２】
Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル）は、その微小管を結合する能力を主に通じて有糸分裂阻害剤として作用する化学療法剤として機能する。しかし、Ｔａｘｏｌは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞を含むリンパ球を活性化する活性を有することも明らかになっている。したがって、Ｔａｘｏｌは免疫応答調節剤と見なすこともできる。
【００６３】
放射線療法は、腫瘍細胞アポトーシスの誘導を含むいくつかの機序を介して免疫応答調節剤の効果を高めることができて、それによって、ＡＰＣおよび直接的Ｔ細胞活性化を介して腫瘍抗原提示を増加させる。放射線療法誘導性の殺腫瘍性効果は、より多くの腫瘍抗原を放出させて、活性化Ｔ細胞のクローン性増殖をもたらし、これを通じて、Ｔ細胞集団の多様性およびＴ細胞集団が活性化される速度の両方が向上する
【００６４】
腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞を直接溶解することができて、可溶性抗原、危険信号およびＩ型インターフェロンの放出をもたらし、これが抗腫瘍免疫を駆動する。加えて、一部の腫瘍溶解性ウイルスは、治療遺伝子を発現するように操作することができ、または腫瘍関連内皮細胞を機能的に変更することができ、免疫排除的なまたは免疫のない腫瘍微小環境内へのＴ細胞動員をさらに増強する。
【００６５】
上の実験はＴａｘｏｌを一例として使用しているが、他の化学療法試薬も同様に使用することができる。本発明の抗ＣＤ１１ｂ試薬もこれらの他の化学療法アプローチと共に使用することができることを当業者なら理解するであろう。
【００６６】
上の実験は明らかに、腫瘍微小環境内の炎症性サイトカインの増加、ＩＤＯ＋骨髄系サプレッサー細胞の集団の減少、腫瘍関連マクロファージ上のＭ２マーカーを超えるＭ１マーカーの上方制御、Ｍ１：Ｍ２腫瘍関連マクロファージ比の増加、樹状細胞（ＤＣ）、ネイチャーキラー樹状細胞（ＮＫＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の分化の増強、４−１ＢＢ＋ＰＤ−１＋ネオアンチゲン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の集団の増加から分かるように、ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインのブロッキングが腫瘍微小環境を免疫療法アプローチにより役立つより炎症性の状態に変換することができることを示す。これらの特性は、免疫療法の効果を増強させるために使用することができる。実際、抗ＣＤ１１ｂ抗体と、免疫チェックポイントを標的にする別の抗体とを使用する併用療法は、劇的な相乗効果を実現することができる。これらの併用療法は、がん療法に最も有益になる。ＣＤ１１ｂ  Ｉ−ドメインは接着機能に関与することが知られている。ＣＤ１１ｂのＩ−ドメインの妨害が腫瘍微小環境を免疫応答の誘導に役立つより炎症性の状態に変換することができるという知見は全く予想外である。
【００６７】
本発明の実施形態は、当技術分野において既知の任意の適した方法／手順により実施されてもよい。以下は、本発明の実施形態の具体例を説明する。しかし、これらの具体例は例示のためだけであること、ならびに他の修正および変形が本発明の範囲から逸脱することなく可能であることを当業者なら理解するであろう。
【００６８】
ヒト細胞単離および細胞株
ヒトＰＢＭＣを健康なボランティアドナーから静脈穿刺により単離した。調査への参加に関する書面によるインフォームドコンセントを得、これはマッカイ記念病院の施設内審査委員会により承認された。当技術分野において既知の方法を使用してヒト単球を単離した。簡潔には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配遠心を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
【００６９】
Ａ５４９肺がん細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含むＦ−１２Ｋ培地中で培養した。すべての細胞株を完全培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０）中、３７℃で維持した。加湿された５％  ＣＯ２インキュベーター内の組織培養フラスコ内で細胞を増殖させ、軽いトリプシン処理により週２〜３回継代した。
【００７０】
動物および腫瘍細胞株。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（台北、台湾）から購入した。すべての動物実験を特定病原体不在条件下、マッカイ記念病院（台北、台湾）の動物管理使用委員会により承認されたガイドラインに従って実施した。各マウスの体重を治療の始めおよび治療期間中毎日測定した。ＣＴ２６細胞は、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のマウス結腸がん細胞である。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、Ｃ５７／ＢＬ６マウス由来のマウス黒色腫がん細胞である。細胞を５％  ＣＯ２加湿雰囲気中のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）中、３７℃で維持した。
【００７１】
抗体および試薬
ヒトＰＢＭＣ調査用
モノクローナル抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体（４４ａａｃｂ）のハイブリドーマをＡＴＣＣから購入した。このハイブリドーマから産生された抗体を、プロテインＡ複合セファロースを使用して精製した。対照抗体として使用されたマウスＩｇＧ２ａはＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。
【００７２】
マウスがんモデル用
マウス／ヒトＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメインに対して特異的なラット抗体（クローンＭ１／７０）、マウスＰＤ１に対して特異的なラット抗体（クローンＲＭＰ１−１４）、マウスＯＸ４０に対して特異的なラット抗体（クローンＯＸ−８６）、マウスＣＤ４０に対して特異的なラット抗体（クローンＦＧＫ４．５）、ラット対照ＩｇＧ２ｂ抗体（クローンＬＴＦ−２）、シリアンハムスター抗マウスＣＴＬＡ４（クローン９Ｈ１０）およびシリアンハムスター対照ＩｇＧをＢｉｏＸｃｅｌｌ（Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）から購入した。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（クラスＢ、ＯＤＮ  １６６８）をＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ｔａｘｏｌをマッカイ記念病院から入手した。
【００７３】
腫瘍関連骨髄系サプレッサー細胞発生プロトコール
ｉ．誘導
静脈穿刺（全体積６０ｍＬ）とその後のディファレンシャル密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により、ヒトＰＢＭＣを健康なボランティアドナーから単離した。比４０：１でヒト腫瘍細胞株を含む２４ウェルプレート内の完全培地（１×１０６細胞／ｍＬ）中でＰＢＭＣを５〜６日間培養した。抗体治療実験のために、抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン（クローンＭ１／７０、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、抗ヒトＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン（クローン４４ａａｃｂ、ＡＴＣＣからのハイブリドーマ）、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＭＧ２ａ−５３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（クローンＬＴＦ−２、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を含む抗体ありまたはなしでＰＢＭＣ−腫瘍細胞株共培養を繰り返した。
【００７４】
ｉｉ．骨髄系サプレッサー細胞単離
５日後、すべての細胞を腫瘍−ＰＢＭＣ共培養から回収した。非プロテアーゼ細胞剥離溶液Ｄｅｔａｃｈｉｎ（商標）（ＧｅｎＬａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して接着細胞を除去した。次いで、製造者の指示に従って抗ＣＤ３３磁性マイクロビーズおよびＬＳカラム分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）を使用して、骨髄系細胞を共培養から単離した。単離細胞集団の純度は、フローサイトメトリーにより９０％を超えることが明らかになり、単離細胞の生存率は、トリパンブルー色素排除を使用して確認した。
【００７５】
ｉｉｉ．抑制アッセイ
腫瘍によって教育された骨髄系細胞の抑制機能を、以下の抑制アッセイにおける同種異系Ｔ細胞の増殖を阻害するその能力により測定した：Ｐａｎ  Ｔ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）により健康なドナーから単離されたＴ細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識（２．５μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）し、あらかじめ単離された骨髄系細胞を含む９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェル、比１：１で播種した。Ｔ細胞増殖を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）または被覆抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体により誘導した。３日後に抑制アッセイウェルをＴ細胞増殖に関してフローサイトメトリーにより分析した。対照は、正のＴ細胞増殖対照（ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ありのＴ細胞単独）および誘導陰性対照（培地のみ）を含んでいた。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）にかけ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータ取得および解析を実施した。
【００７６】
ヒト骨髄系サプレッサー細胞のキャラクタリゼーション
ｉ．細胞表現型のフローサイトメトリー分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生骨髄系サプレッサー細胞の表現型を、骨髄系細胞、抗原提示細胞およびサプレッサー細胞マーカーの発現に関して調べた。染色のために、細胞表面タンパク質分解を最小限にするためにＤｅｔａｃｈｉｎ（商標）を使用して２４ウェルプレートから細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％  ＦＣＳ）で２回洗浄した後、１０６個の細胞をＦＡＣＳ緩衝液１００μｌに再懸濁させた。細胞をＦｃブロッカー（Ｈｕｍａｎ  ＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ）で処理し、蛍光複合モノクローナル抗体またはアイソタイプ適合対照のカクテルで２０分間染色した。細胞内染色のために、細胞を固定し、表面染色後、固定／透過処理キット（ＢＤ）を使用して透過処理した。使用された抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＤ１１ｃ（クローンＢｕ１５）、ＣＤ３３（クローンＨＩＭ３−４）、ＨＬＡ−ＤＲ（クローンＬ２４３）、ＣＤ１１ｂ（クローンＩＣＲＦ４４）、ＣＤ８６（クローン２３３１）、ＣＤ８０（クローンＬ３０７．４）、ＣＤ５６（クローンＢ１５９）、ＣＤ２０６（クローン１９．２）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（クローンＤＣＮ４６）、７−ＡＡＤ）から、またはＢｉｏｌｅｇｎｅｄ（ＨＬＡ−ＤＲ（クローンＬ２４３）、ＣＤ１６３（クローンＲＭ３／１）、ＣＤ６８（クローンＹ１／８２Ａ））から、またはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ＩＤＯ（クローン７００８３８））から購入した。これらの抗体は例であり、その他の任意の適した抗体を使用することができる。例えば、Ｉ−ドメインを結合する任意の抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用することができる（例えば、抗ＣＤ１１ｂ（４４ａａｃｂクローン）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０クローンなど）。そのような抗ＣＤ１１ｂ抗体には、新たに作成されたもの、または商業的供給源（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなど）から入手されたものが含まれ得る。
【００７７】
サンプルをＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにかけ、データ取得および解析を上述の通り実施した。データは３〜６人のユニークなドナーからのものである。培地単独で培養されたＰＢＭＣを比較のために並行して試験した。
【００７８】
ｉｉ．ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙによるサイトカイン／ケモカインの測定
腫瘍組織液を抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメイン抗体治療後のＢ１６Ｆ１０腫瘍から回収し、−２０℃でアリコートで保管した。製造者の指示に従ってマウス炎症性サイトカインｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙキット（ＢＤ）を使用して、サンプル中のＩＦＮ−ガンマ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ１２ｐ７０およびＩＬ−１０のレベルを測定した。
【００７９】
がん治療のプロトコール
皮下腫瘍モデル
Ｂａｌｂ／ｃマウスに３×１０５個のＣＴ２６細胞を皮下接種した。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３であったとき、治療を開始した。担腫瘍マウスを異なる抗体で週２回、腹腔内（ｉｐ）治療した。マウスを監視し、毎週２回、触知可能な腫瘍の形成をスコア化し、腫瘍が３，０００ｍｍ３の所定のサイズを超えたら屠殺した。腫瘍体積をノギスで測定し、以下の式を用いて計算した：Ａ×Ｂ２×０．５４（式中、Ａは最大直径であり、Ｂは最小直径である）。
【００８０】
腫瘍離断および細胞集団解析
Ｂａｌｂ／ｃ腫瘍を収集し、秤量し、外科用メスを使用して片に細断し、製造者の指示に従って腫瘍離断キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、Ｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、さらに酵素的に離断した。１％  ＦＣＳを追加したＰＢＳに腫瘍の単細胞懸濁液を再懸濁させ、赤血球を溶解した。特異的標識前に非特異的標識を抗ＣＤ１６／３２（Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ；ＢＤ）でブロックした。以下のＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製ラット抗マウスＡｂｓで細胞を染色した：抗ＣＤ８ａフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ８ｂ  ＦＩＴＣ、抗Ｇｒ１  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８６  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２０６フィコエリトリン（ＰＥ）、抗ＣＤ８０  ＰＥ−Ｄａｚｚｌｅ５９４、抗ＣＤ１１ｂ−Ｉ−ドメインＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、抗ＰＤＬ１アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、抗ＣＤ４５  ＢＶ５１０、抗Ｆ４／８０  Ａｌｅｘａ  ７００、抗ＩＡＩＥ  ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗Ｌｙ６Ｃ  ＰＥＣｙ７、抗ＣＤ１１ｃ  Ａｌｅｘａ  ７００、抗Ｌｙ６Ｇ  ＰＥ−Ｄａｚｚｌｅ５９４、抗ＩＤＯ  ＡＦ６４７、抗ＣＤ３３５  ＢＶ４２１および抗ＣＤ３ｅ  ＰＥ  Ｄａｚｚｌｅ。固定可能な生存率色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０）を生死細胞の識別のために使用した。サンプルをＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ  Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターを使用して分析し、Ｋａｌｕｚａ（登録商標）ソフトウェアで解析した。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏマウスＭＤＳＣ単離および抑制アッセイ
脾臓を担ＬＬＣ１腫瘍マウスから回収した。製造者の指示に従って骨髄系由来サプレッサー細胞単離キットおよびＬＳカラム分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、脾細胞を収集し、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を単離した。単離細胞集団の純度は、フローサイトメトリーにより９０％を超えることが明らかになり、単離細胞の生存率は、トリパンブルー色素排除を使用して確認した。ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）で２４時間〜７２時間刺激されたＭＤＳＣ内のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を、抗マウスＧｒ−１  ＦＩＴＣ抗体による細胞表面染色および抗マウスＩＤＯ  ＡＰＣ抗体による細胞内染色により評価した。Ｔ細胞をナイーブマウスの脾細胞から回収し、抗マウスＣＤ９０．２磁性粒子（ＢＤ  ＩＭａｇ）を使用して単離した。抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）およびラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（クローンＬＴＦ−２、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を含む抗体なしまたはありで、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞をＭＤＳＣと比１：１または１：２で共培養した。Ｔ細胞増殖を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激抗体により誘導した。
【００８２】
統計解析
データをＰｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して解析し、平均±ＳＥＭとして表した。群間の比較をスチューデントｔ検定を使用して実施した。ピアソンの相関係数を用いて相関を判断した。０．０５未満のｐ値は有意であると見なした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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