(57)【要約】  核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させて、伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップであって、混合物が４種類の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であるステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップであって、塩基マルチプレットが、第１の塩基タイプおよびそれに続く次の塩基を含むステップと、を含む方法。
2021512648.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を特徴付ける方法であって、
（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、
前記混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、前記第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が、可逆的ターミネーターを含み、前記第２、第３、または第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップと、
（ｂ）前記伸長したプライマーのハイブリッドを、前記異なる塩基タイプのうちの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させて、前記伸長したプライマーのハイブリッド、前記ポリメラーゼおよび前記テンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、
（ｃ）前記次の塩基を前記テンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、前記安定化三元複合体を検出するステップと、
（ｄ）前記第１の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含む前記テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
（ｅ）前記プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして前記伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、
（ｆ）前記テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において、前記第２、第３、および第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、伸長可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、前記第２の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第１、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された前記塩基マルチプレットが、前記第２の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含む、ステップをさらに含み、
それにより、前記テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｈ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、前記第３の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第１、第２、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された前記塩基マルチプレットが、前記第３の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含む、ステップと、
（ｉ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、前記第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第１、第２、および第３の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された前記塩基マルチプレットが、前記第４の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含む、ステップと、をさらに含み、
それにより、前記テンプレート核酸における塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸の配列を決定するために塩基マルチプレットの４つの連続を整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）において、前記第１および第２の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記第３および第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が伸長可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、前記第３および第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｈ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、前記第１および第３の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第２および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記伸長したプライマーのハイブリッドから前記伸長したプライマーを除去し、次いで第２のプライマーを前記テンプレートにハイブリダイズした後、前記テンプレート核酸を使用してステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返す、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）で使用される前記テンプレート核酸と同じ配列を有する第２のテンプレート核酸分子を使用してステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返す、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）の前記プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドが、シーケンシングプロセス中のポリメラーゼ伸長の産物であり、前記シーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列を示すシグナルを検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記テンプレートの配列を参照ゲノムの領域に整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含み、前記整列させることが、前記参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列に整列させることによって実行される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｇ）第２のシーケンシングプロセスにおいて前記伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップをさらに含み、前記第２のシーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側である前記テンプレートの配列を示すシグナルを検出する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記テンプレートの配列を前記参照ゲノムの領域に整列させる前記コンピュータ支援プロセスをさらに含み、前記整列させることが、前記参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続、および少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側である前記テンプレートの配列に整列させることによって実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、ステップ（ｃ）で検出される外因性標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、ステップ（ｃ）で検出される外因性標識を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼが、ステップ（ｃ）で検出される外因性標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）が、前記伸長したプライマーのハイブリッドとの接触から前記混合物を除去した後に実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
核酸を特徴付ける方法であって、
（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、前記伸長したプライマーのハイブリッド、前記ポリメラーゼ、および前記テンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、
前記混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、前記第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が、可逆的ターミネーターを含み、前記第２、第３、または第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップと、
（ｂ）前記次の塩基を前記テンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、前記安定化三元複合体を検出するステップと、
（ｃ）前記第１の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含む前記テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む、方法。
【請求項２１】
（ｄ）前記プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして前記伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、
（ｅ）前記テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）において、前記第２、第３、および第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、伸長可能である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、前記第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第１、第３、および第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された前記塩基マルチプレットが、前記第２の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含む、ステップをさらに含み、
それにより、前記テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、前記第３の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第１、第２、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された前記塩基マルチプレットが、前記第３の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含むステップと、
（ｈ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、前記第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第１、第２、および第３の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された前記塩基マルチプレットが、前記第４の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含むステップと、をさらに含み、
それにより、前記テンプレート核酸における塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸の配列を決定するために塩基マルチプレットの４つの連続を整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）において、前記第１および第２の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記第３および第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が伸長可能である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、前記第３および第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、前記第１および第３の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、前記混合物中の前記第２および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記伸長したプライマーのハイブリッドから前記伸長したプライマーを除去し、次いで第２のプライマーを前記テンプレートにハイブリダイズした後、前記テンプレート核酸を使用してステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返す、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）で使用される前記テンプレート核酸と同じ配列を有する第２のテンプレート核酸分子を使用してステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返す、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）の前記プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドが、シーケンシングプロセス中のポリメラーゼ伸長の産物であり、前記シーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列を示すシグナルを検出する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記テンプレートの配列を前記参照ゲノムの領域に整列させる前記コンピュータ支援プロセスをさらに含み、前記整列させることが、前記参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列に整列させることによって実行される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ｆ）第２のシーケンシングプロセスにおいて前記伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップをさらに含み、前記第２のシーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側である前記テンプレートの配列を示すシグナルを検出する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記テンプレートの配列を前記参照ゲノムの領域に整列させる前記コンピュータ支援プロセスをさらに含み、前記整列させることが、前記参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続、および少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側である前記テンプレートの配列に整列させることによって実行される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、ステップ（ｂ）で検出される外因性標識を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、ステップ（ｂ）で検出される外因性標識を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリメラーゼが、ステップ（ｂ）で検出される外因性標識を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
核酸を特徴付ける方法であって、
（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、前記混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうち、３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それにより、さらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、
（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、
（ｄ）前記次の塩基を前記テンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、前記安定化三元複合体を検出するステップと、
（ｅ）前記４種類の異なる塩基タイプのうちの前記第４のものとそれに続く前記次の塩基を含む前記テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む、方法。
【請求項３９】
（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとしてさらに伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、
（ｇ）前記テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ｈ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、前記第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、前記第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されずに他の３種類のヌクレオチド同族体が使用されるステップをさらに含み、
それにより、前記テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
（ｉ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、前記第１の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、前記第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されずに他の３種類のヌクレオチド同族体が使用されるステップと、
（ｊ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、前記第２の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、前記第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されずに他の３種類のヌクレオチド同族体が使用されるステップと、をさらに含み、
それにより、前記テンプレート核酸における塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸の配列を決定するために塩基マルチプレットの４つの連続を整列させる前記コンピュータ支援プロセスをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
生成されたプライマー−テンプレート核酸を使用してステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返し、前記伸長したプライマーのハイブリッドから前記伸長したプライマーを除去し、別のプライマーを前記テンプレートにハイブリダイズする、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ａ）で使用される前記プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドと同じ配列を有するプライマー−テンプレート核酸のハイブリッド分子を使用してステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返す、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ａ）の前記プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドが、シーケンシングプロセス中のポリメラーゼ伸長の産物であり、前記シーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列を示すシグナルを検出する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記テンプレートの配列を前記参照ゲノムの領域に整列させる前記コンピュータ支援プロセスをさらに含み、前記整列させることが、前記参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列に整列させることによって実行される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記シーケンシングプロセスが、前記テンプレートの各位置で安定化三元複合体を検出するステップ、前記テンプレートの各位置でプライマーに組み込まれた標識ヌクレオチドを検出するステップ、前記プライマーにライゲーションされた標識オリゴヌクレオチドを検出するステップ、前記テンプレートの各位置でプライマーに組み込まれたヌクレオチドにより生成されるピロリン酸塩を検出するステップ、または前記テンプレートの各位置でプライマーに組み込まれたヌクレオチドにより生成されるプロトンを検出するステップ、を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項４８】
（ｈ）第２のシーケンシングプロセスにおいて前記伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップをさらに含み、前記第２のシーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側である前記テンプレートの配列を示すシグナルを検出する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記テンプレートの配列を前記参照ゲノムの領域に整列させる前記コンピュータ支援プロセスをさらに含み、前記整列させることが、前記参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である前記テンプレートの配列、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続、および少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側である前記テンプレートの配列に整列させることによって実行される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、ステップ（ｄ）で検出される外因性標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、ステップ（ｄ）で検出される外因性標識を含まない、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリメラーゼが、ステップ（ｄ）で検出される外因性標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ（ｂ）が、前記伸長したプライマーのハイブリッドとの接触から前記混合物を除去した後に実行される、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
ステップ（ｃ）が、前記４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体を除去した後に実行される、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
テンプレート核酸を特徴付ける方法であって、前記テンプレートが、前記テンプレート核酸の第１の領域と第２の領域に隣接し、それらの間にあるリンカー領域を含み、
（ａ）前記テンプレート核酸の前記第１の領域に沿ってプライマーを伸長することにより前記第１の領域の単一塩基の解像配列を取得し、それにより伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）
（ｉ）ヌクレオチドの混合物を使用して前記伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの前記伸長したプライマーをさらに伸長することであって、ヌクレオチドの前記混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、前記第１の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体が、可逆的ターミネーターを含み、前記第２、第３、または第４の塩基タイプの前記ヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、伸長すること、および
（ｉｉ）安定化三元複合体を検出することであって、前記安定化三元複合体が、前記さらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、および前記テンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含み、前記シグネチャーが、前記第１の塩基タイプとそれに続く前記次の塩基を含む塩基マルチプレットを含む、検出すること、により前記リンカー領域のシグネチャーを取得するステップと、
（ｃ）さらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドのさらに伸長したプライマーを伸長することにより、第２の領域の単一塩基の解像配列を取得するステップと、を含む、方法。
【請求項５６】
核酸を特徴付ける方法であって、前記テンプレートが、前記テンプレート核酸の第１の領域と第２の領域に隣接し、それらの間にあるリンカー領域を含み、
（ａ）前記テンプレート核酸の前記第１の領域に沿ってプライマーを伸長することにより前記第１の領域の単一塩基の解像配列を取得し、それにより伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）
（ｉ）ヌクレオチドの混合物を使用して、前記伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの前記伸長したプライマーをさらに伸長することであって、前記ヌクレオチドの混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうち３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、伸長すること、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記ヌクレオチド同族体の不在下で、前記４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体でステップ（ｉ）の前記伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドをさらに伸長すること、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記さらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、および前記テンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を検出することであって、前記シグネチャーが、前記４種類の異なる塩基タイプのうちの前記第４のものとそれに続く前記次の塩基を含む塩基マルチプレットを含む、検出すること、により前記リンカー領域のシグネチャーを取得するステップと、
（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）のさらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドのさらに伸長したプライマーを伸長することにより、第２の領域の単一塩基の解像配列を取得するステップと、を含む、方法。
【請求項５７】
核酸を特徴付ける方法であって、前記テンプレートが、前記テンプレート核酸の第１の領域と第２の領域に隣接し、それらの間にあるリンカー領域を含み、
（ａ）前記テンプレート核酸の前記第１の領域に沿ってプライマーを伸長することにより前記第１の領域の単一塩基の解像配列を取得し、それにより伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）前記伸長したプライマーに組み込まれたヌクレオチドのタイプを区別せずに、前記伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの前記伸長したプライマーをさらに伸長することにより、前記リンカー領域のシグネチャーを取得するステップであって、前記シグネチャーが、前記リンカー領域内の前記ヌクレオチドの数を含む、ステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの前記プライマーを伸長することにより、前記第２の領域の単一塩基の解像配列を取得するステップと、を含む、方法。
【請求項５８】
ステップ（ｂ）が、標識されたヌクレオチドと標識されたポリメラーゼを使用せずに実行される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ステップ（ｂ）が、前記伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドに組み込まれた異なるタイプのヌクレオチドを区別する標識を使用せずに実行される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ｂ）が、前記伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを検出することなく実行される、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６２６，８３６号の権益を主張し、参照によりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩファイルとして提出される「配列表」、表、またはコンピュータプログラムリスト付属書類を参照
２０１９年２月１日に作成された、１，８６５バイトの機械フォーマット、ＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ  Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムである、ファイル０５３１９５−５０５００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記載の配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、一般に分子分析および診断に関連し、核酸シーケンシングに特定の適用性を有する。
【０００４】
ヒトゲノムのシーケンシングに必要な時間は、過去１０年間で急激に減少している。これまで数年かかって何百万ドルもかかっていた手順を数時間のうちの数千ドルで完了できるようになった。改善の速度は目覚しいものであるが、現在利用可能な市販の方法は、多くの臨床応用にはまだ不十分である。
【０００５】
シーケンシングは、多くの臨床医の心の中で、患者に致命的な疾患があるかどうかに関する信頼できる診断を開発するための重要な情報を提供し、高価なまたは人生を変える治療選択肢を選択する際のガイダンスを提供するという見込みがある。例えば、シーケンシングは、予備的ながんの診断を確証し、患者が治療選択肢を決定するのを助ける上で重要な役割を果たすことができる。このような確証を受け取ることが数日遅れても、患者の感情的および心理的状態に重大な悪影響を与える可能性がある。
【０００６】
一部の状況では、臨床転帰は迅速な診断に強く依存している。例えば、新生児集中治療室ではシーケンシングが使用されて、新生児の謎の病気が特定され、他の方法では認識されていない、命を救う治療選択肢に医師を導いてきた。それにもかかわらず、タイムリーな診断がないために、毎年多くの新生児が亡くなっている。
【０００７】
したがって、核酸シーケンシングの精度、速度、およびコストを改善する必要がある。本発明はこの必要性を満たしており、かつ、関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、核酸を特徴付ける方法を提供する。方法は、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物は、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体は、可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップと、（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプのうちの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させて、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含み得る。任意選択で、方法は、（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である。代替的に、第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを有し、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である。
【０００９】
さらなる実施形態では、核酸を特徴付ける方法は、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物は、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である、ステップと、（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプのうちの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させ、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットは、第２の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップと、を含み得、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する。任意選択で、方法は、（ｈ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットは、第３の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップをさらに含み得、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの３つの連続の存在を判定する。さらなる任意選択として、方法は、（ｉ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットは、第４の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップを含み得、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する。
【００１０】
別の実施形態では、核酸を特徴付ける方法は、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物は、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である、ステップと、（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させ、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域は、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、を含み得る。任意選択で、方法は、（ｇ）第２のシーケンシングプロセスにおいて伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップであって、第２のシーケンシングプロセスは、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、ステップをさらに含む。
【００１１】
本開示は、核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物は第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類は伸長可能である、ステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む方法を提供する。任意選択で、方法は、（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、（ｅ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である。代替的に、第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを有し、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である。
【００１２】
さらなる実施形態では、核酸を特徴付ける方法は、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物は、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である、ステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、（ｅ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットは、第２の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップと、を含み得、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する。任意選択で、方法は、（ｇ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットは、第３の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップをさらに含み得、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの３つの連続の存在を判定する。さらなる任意選択として、方法は、（ｈ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを有し、混合物中の第１、第２、および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットは、第４の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップと、を含み、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する。
【００１３】
別の実施形態では、核酸を特徴付ける方法は、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物は、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体は可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である、ステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、（ｅ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域は、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、を含み得る。任意選択で、方法は、（ｆ）第２のシーケンシングプロセスにおいて伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップであって、第２のシーケンシングプロセスは、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、ステップを含み得る。
【００１４】
本開示は、核酸を特徴づける方法であって、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物は、４種類の異なる塩基タイプのうちの３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それによりさらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｄ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｅ）４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含み得る、方法を提供する。任意選択で、方法は、（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとしてさらに伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、（ｇ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む。
【００１５】
さらなる実施形態では、核酸を特徴付ける方法は、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうちの３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それによりさらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｄ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｅ）４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、（ｇ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、（ｈ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体はステップ（ａ）で使用されないステップと、を含み得、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する。任意選択で、方法は、（ｉ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体はステップ（ａ）で使用されないステップと、をさらに含み得、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの３つの連続の存在を判定する。さらなる選択肢として、方法は、（ｊ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体はステップ（ａ）で使用されないステップと、を含み得、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する。
【００１６】
別の実施形態では、核酸を特徴付ける方法は、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物は、４種類の異なる塩基タイプのうちの３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それによりさらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｄ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｅ）４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとしてさらに伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、（ｇ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域は少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、を含み得る。任意選択で、方法は、（ｈ）第２のシーケンシングプロセスにおいて伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップであって、第２のシーケンシングプロセスは、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、ステップを含み得る。
【００１７】
１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。他の特徴、目的、および利点は、説明、および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｔｏｕｇｈ−２２（配列番号１）プライマー−テンプレートのハイブリッドからの非伸長プライマーについて（図１Ａ）、伸長ステップ中に４種類の可逆的ターミネーターヌクレオチドを使用する１０のＳＢＢ（商標）サイクル後のプライマーについて（図１Ｂ）、伸長ステップ中にｄＴ−アミノオキシ、可逆的ターミネーターヌクレオチドおよび３種類の天然ヌクレオチドを使用する１０のＳＢＢ（商標）サイクル後のプライマーについて（図１Ｃ）、および伸長ステップ中に４種類の天然ヌクレオチドを使用する１０のＳＢＢ（商標）サイクル後のプライマーについて（図１Ｄ）、キャピラリー電気泳動トレースを示す。
【図２】Ｔｏｕｇｈ−２９（配列番号２）プライマー−テンプレートのハイブリッドからの非伸長プライマーについて（図２Ａ）、伸長ステップ中に４種類の可逆的ターミネーターヌクレオチドを使用する１０のＳＢＢ（商標）サイクル後のプライマーについて（図２Ｂ）、伸長ステップ中にｄＴ−アミノオキシ、可逆的ターミネーターヌクレオチドおよび３種類の天然ヌクレオチドを使用する１０のＳＢＢ（商標）サイクル後のプライマーについて（図２Ｃ）、および伸長ステップ中に４種類の天然ヌクレオチドを使用する１０のＳＢＢ（商標）サイクル後のプライマーについて（図２Ｄ）、キャピラリー電気泳動トレースを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
蛍光ベースのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）（ＳＢＢ（商標））テクノロジーなどの多くの核酸シーケンシング技術は、検出中に光照射を使用する。光に基づく検出の望ましくない影響は、繰り返しまたは長時間の光照射が、反応を妨害する副産物またはアーチファクトを生成する可能性があることである。例えば、光酸化は、他の成分への架橋または断片化により、シーケンシング反応中に核酸を進行することができないようにすることができる。放射線の累積的な影響により、シーケンスリードの長さとスループットが悪影響を受ける可能性がある。
【００２０】
本開示は、核酸が曝される反応サイクルの数を減少させることによってリード長を増加させるために使用できる方法を提供する。サイクルが少ないほど、核酸が光に曝されて化学物質に損傷を与える可能性が低くなる。ＳＢＢ（商標）テクノロジーには、他のシーケンシング法と比較して、プライマー伸長とヌクレオチド検出を２つのステップに分離できるという独特の特性がある。通常、各サイクルの伸長ステップ中に１つのヌクレオチドがプライマーに追加され、次のサイクルが始まる前に次の正しいヌクレオチドが検出されるため、ＳＢＢ（商標）技術はテンプレート内の各位置を増分的に検出する。この場合、サイクル数はリードの長さと同等である。
【００２１】
本明細書に記載の方法の特定の構成では、プライマー伸長ステップは、プライマーに付加されるヌクレオチドの数が必ずしも既知または決定されないように行われる。しかしながら、プライマーの３’末端のヌクレオチドのタイプ、またはプライマーの３’末端に隣接するヌクレオチドのタイプは既知であるか、または決定することができる。ヌクレオチドタイプは、伸長産物を検出する必要なしに、伸長中に使用されるヌクレオチド混合物の組成から決定することができる。例えば、ヌクレオチドの混合物は、４種類の異なる塩基タイプを含むことができ、第１の塩基タイプのヌクレオチドは可逆的ターミネーターを有し、他の３種類のヌクレオチドタイプは伸長可能である。この場合、伸長産物は、その３’末端に第１の塩基タイプを有するヌクレオチドを有するであろう。別の例では、ヌクレオチドの混合物は、テンプレート中に相補的塩基を有すると予想される４種類の異なる塩基タイプのうちの３種類のみを含むことができる。伸長産物は、省略された塩基タイプを補足するテンプレート位置を超えて伸長されない。これらの例の両方で、複数のサイクルから生成される伸長産物の長さは可変であり、多くの場合、不明である。しかしながら、伸長産物となる特定のタイプのヌクレオチドの数は、実行されたサイクルの数から決定することができる。ヌクレオチド数は、核酸テンプレートの組成に関する有用な情報、例えば、テンプレートのシグネチャーとして、または他の情報と組み合わせて、テンプレートの配列を決定するために使用できる情報を提供できる。
【００２２】
本方法の特定の構成では、シーケンシング手順の伸長ステップは、各サイクル中に可変数のヌクレオチドが付加され、次いで次の正しいヌクレオチドが検出されるように改変される。以下に示すように、伸長は、プライマーの３’末端のヌクレオチドのタイプが既知である方法で実行することができる。最終的な結果として、各サイクル中に次の正しいヌクレオチドを検出すると、プライマーの３’末端にあるヌクレオチドと検出されたヌクレオチドを含むジヌクレオチドを特定できる。ステップを繰り返すことでジヌクレオチドの連続が識別され、各ジヌクレオチドを分離するテンプレート内のヌクレオチドの数とタイプは必ずしもわからない。一部の伸長ステップには１つを超えるヌクレオチドが組み込まれるため、ジヌクレオチドの連続は、実行されたサイクル数よりも長いテンプレートの長さに及ぶ場合がある。ジヌクレオチドの連続は、テンプレートに低解像度のシグネチャー配列を提供する。
【００２３】
ジヌクレオチドは、本開示の方法で同定および使用することができる１つのタイプの塩基マルチプレットである。上述の可変長伸長ステップに続き、１サイクルを超える検査と単一ヌクレオチド伸長を行うことにより、特定のテンプレート核酸についてより長い塩基マルチプレットを特定できる。例えば、トリヌクレオチドは、第１に、伸長したプライマーの３’末端のヌクレオチド（すなわち、トリヌクレオチドの１番目のヌクレオチド）のタイプがわかるように可変長伸長ステップを実行して、第２に、次の正しいヌクレオチド（すなわち、トリヌクレオチドの２番目のヌクレオチド）の検査と単一ヌクレオチドによるプライマーの伸長を含むサイクルを実行し、第３に、伸長したプライマーの次の正しいヌクレオチド（すなわち、トリヌクレオチドの３番目のヌクレオチド）の検査ステップを実行することによって識別できる。したがって、様々な長さのいずれかの塩基マルチプレットは、テンプレート核酸を特徴付けるシグネチャーの基礎を形成することができる。
【００２４】
特定の実施形態では、同じテンプレート核酸から得られた低解像度のシグネチャーを組み合わせることにより、より高い解像度のシグネチャー配列を得ることができる。具体的には、以前のシーケンシング実行で生成された伸長したプライマーをテンプレートから削除し、可変伸長ＳＢＢ（商標）技法を繰り返すことができる。しかしながら、繰り返し実行では、可変伸長ステップは、前回のシーケンシング実行で使用されたタイプとは異なるヌクレオチドタイプでプライマーをキャップするように構成される。以下でさらに詳細に説明するように、３つまたは４つの塩基マルチプレットの連続（それぞれが異なるタイプのプライマーキャッピングヌクレオチドで生成される）を組み合わせて、単一塩基の解像度で決定されるテンプレートの配列に到達できる。
【００２５】
特定の実施形態では、本開示の方法は、テンプレート中の特定のタイプの塩基で終結するヌクレオチドの混合物を使用する伸長ステップを使用する。例えば、伸長に使用される混合物は、テンプレート中の３種類のタイプの塩基と対になる伸長可能なヌクレオチド、およびテンプレート中の第４の塩基タイプと対になる可逆的に終結したヌクレオチドを含むことができる。伸長ステップにより、３’末端に第４の塩基タイプの同族体を有する伸長したプライマーが生成される。したがって、伸長したプライマーの３’末端のヌクレオチドの同一性は、伸長混合物のヌクレオチド組成から推定することができる。テンプレート内の次の正しいヌクレオチドは、伸長したプライマーの末端での安定化三元複合体の形成を介して検出できる。次に、伸長したプライマーを脱ブロックし、サイクルを繰り返して、テンプレートに存在するジヌクレオチドの連続を判定する。
【００２６】
代替的に、伸長ステップで使用されるヌクレオチドの混合物は、テンプレート中の３種類のタイプのみの塩基のヌクレオチド同族体を含むことができる（すなわち、テンプレート中の第４の塩基のタイプのヌクレオチド同族体を省略する）。伸長したプライマーの３’末端にあるヌクレオチドのタイプは、必ずしもわかっているとは限らない。しかしながら、次の正しいヌクレオチドの識別は、伸長混合物のヌクレオチド組成から推定することができる。この例では、次のテンプレート塩基は第４の塩基のタイプである。第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のみを使用したその後の伸長は、３’末端に第４の塩基タイプの同族体を持つことが知られている伸長したプライマーとなる。次の正しいヌクレオチド、または次のテンプレート塩基は、伸長したプライマーの末端での安定化三元複合体の形成を介して検出できる。伸長したプライマーを終結する必要はない。むしろ、伸長のためにポリメラーゼが必要とする触媒金属の不在、非触媒金属などのポリメラーゼ阻害剤の存在、または三元複合体を形成するがプライマー伸長を触媒できないポリメラーゼバリアントの使用によって、三元複合体に安定性をもたらすことができる。代替的に、プライマーの３’末端のヌクレオチド同族体は、三元複合体に安定性を提供する可逆的ターミネーターを含み得る。この場合、可逆的に終結したプライマーを脱ブロックして、ジヌクレオチドをより長いマルチプレットに伸長し、および／またはサイクルを繰り返すことを可能にする。
【００２７】
本明細書に記載される方法の特定の実施形態は、核酸配列を同定するためのシグネチャーとして使用され得る１つ以上の塩基マルチプレットの連続を同定する。例えば、シグネチャージヌクレオチドの連続を標的核酸について決定することができ、シグネチャーを既知の核酸配列のシグネチャーと比較して、標的核酸が既知の核酸と同じ配列を有することを確認または却下することができる。そのようなシグネチャーの利点は、それらが完全な配列よりも迅速に得られ、それによって標的核酸の迅速な同定を可能にすることである。さらなる利点は、シグネチャーがまたがるゲノムの長さが、通常、標準的な実行がまたがる長さよりも長くなること、およびシグネチャーがもたらす情報が、標準的な実行と同じサイクル数から生成された短いリードでは提供されない長い範囲のゲノム構造情報をもたらすことである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、標的核酸の第１の領域について単一塩基の解像配列（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を決定することができ、標的核酸の第２の領域についてシグネチャーを取得することができる。シグネチャーは、例えば、塩基マルチプレットの連続または特定のタイプのヌクレオチドの数であり得る。次いで、配列の単一塩基の解像度領域だけでなくシグネチャー領域も整列させることにより、標的をより長い配列で整列させることができます（例えば、ゲノムフラグメントをゲノムに整列させることができる）。シグネチャー領域から追加された情報は、リードを整列するための詳細情報を提供する。シグネチャーは、例えば、標準のＳＢＢ（商標）技法で以前に伸長されたプライマーで可変伸長ＳＢＢ（商標）技法を実行する（またはその逆）ことにより、高解像度のリードに追加されるテールとなり得る。同様に、可変伸長ＳＢＢ（商標）技法を実行して、２つの単一塩基の解像度のリードの間にシグネチャーリンカーを生成できる。得られた配列は、「ペアリード」として整列することができ、ここでリンカーのシグネチャーは、参照配列への整列のために、単一塩基の解像度のリードとともに使用される。リンカーシグネチャーは、リンカーの距離のみが整列の決定に入る標準的なペアリードの整列手法（当技術分野では「対となる末端」整列技法とも呼ばれる）に代替情報または追加情報を追加できる。具体的には、ペアリードは、参照内の２つのリードの整列の近接度だけでなく、観測されたシグネチャー領域と、２つのリードを整列する領域に介在する参照の領域との比較に基づいて、参照ゲノムに整列され得る。例えば、観測されたシグネチャー内の特定のタイプのヌクレオチドの数を、参照配列の関連領域の数と比較できるか、または観測されたシグネチャー内の塩基マルチプレットの連続を、参照配列の関連領域の連続と比較できる。
【００２９】
別のペアリード構成では、リンカー領域のヌクレオチドの数を経験的に決定して、リンカー領域のシグネチャーとして使用できる。より具体的には、テンプレート核酸の第１の領域は、単一塩基の解像技法を使用してテンプレートに沿ってプライマーを伸長することによりシーケンシングでき、次いで、伸長したプライマーは、「ダーク」伸長技法を使用してテンプレートの第２の領域に沿ってさらに伸長することができ、次いでさらに伸長したプライマーは、単一塩基の解像技法を使用して、テンプレートの第３の領域に沿ってさらに伸長することができる。ダーク伸長は、プライマー伸長のサイクルを繰り返すことで実現でき、ここで各サイクルには、他ではプライマー伸長産物の観察に使用される検出ステップが含まれていない。例えば、各ダーク伸長サイクルは、ＳＢＢ（商標）技法においてプライマー伸長を達成するために本明細書に記載される１つ以上のステップを使用し得るが、各サイクルは、本明細書に記載されるかまたはそうでなければ当該技術分野で公知の検出ステップを省略し得る。それぞれのダーク伸長サイクルは、テンプレートにあると予想される全ての塩基タイプにヌクレオチド同族体（例えば、ネイティブゲノムＤＮＡにあると予想される４種類全ての塩基タイプの同族体）を使用できる。それらは検出されないので、ヌクレオチド同族体は標識される必要がない。しかしながら、ヌクレオチド同族体は、可逆的ターミネーターを含むことができ、その場合、各サイクルは、脱ブロッキングステップを含むことができる。この例示的な構成では、実行されるダーク伸長サイクルの数は、テンプレートの第２の領域の長さ（すなわち、第２の領域の塩基の数）と相関し、この経験的に決定された長さは転じて、単一塩基の解像技法によってシーケンシングされた第１の領域と第３の領域の間のリンカー領域のシグネチャーを提供する。単一塩基の解像技法は、第１と第３の領域で同じでも異なっていてもよい。必要に応じて、単一塩基の解像技法の１つまたは両方をＳＢＢ（商標）技法とすることができる。
【００３０】
本明細書で使用される用語は、別段の定めがない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味を持つと理解されるであろう。ここで使用されるいくつかの用語とその意味を以下に示す。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「隣接する」という用語は、核酸分子または配列の２つのヌクレオチドに関して使用される場合、ヌクレオチドの１つが分子または配列の他のヌクレオチドの直後に続くことを意味する。したがって、隣接するヌクレオチドは、核酸分子中で互いに共有結合している。対照的に、互いに近い２つのヌクレオチドは、任意選択で、核酸分子または配列中の１つまたはいくつかの介在ヌクレオチドによって分離することができる。
【００３２】
本明細書中で使用されるとき、用語「整列すること」は、核酸配列に関して使用される場合、類似の領域を同定するために２つ以上の配列を比較することを意味する。整列された配列は、マトリックスの個別の行として表すことができる。特定の配列（またはマトリックスの行）は、別の配列（またはマトリックスの行）に整列されたときに１つ以上のギャップを持つ可能性がある。ギャップは、例えば、ギャップがある配列内の不明、不明瞭、または存在しない１つ以上の位置を表すことができる。例えば、第１の配列は、第１の配列が参照配列に整列されたときにギャップが２つ以上の塩基マルチプレットを分離し得る塩基マルチプレットの連続として表すことができる。この例では、第１の配列が参照配列に整列されている場合、各ギャップは１つの塩基マルチプレットを別のマルチプレックスから分離し得る。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「アレイ」という用語は、１つのフィーチャーの分子を他のフィーチャーの分子と区別できるように、１つ以上の固相基板に結合している分子の集団を指す。アレイは、固相基板上の異なるアドレス可能なフィーチャーにそれぞれ位置する異なる分子を含むことができる。代替的に、アレイは、それぞれが異なる分子を有するフィーチャーとして機能する別個の固相基質を含むことができ、異なる分子は、固相基質が結合する表面上の固相基質の位置に従って、または流体流などの液体中の固相基質の位置に従って識別され得る。アレイの分子は、例えば、ヌクレオチド、核酸プライマー、核酸テンプレート、またはポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼもしくはそれらの組み合わせなどの核酸酵素であり得る。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「塩基マルチプレット」という用語は、核酸配列中の少なくとも２つの隣接する塩基、または５’から３’へのホスホジエステル結合を介して互いに結合している少なくとも２つのヌクレオチドを指す。一般に、塩基マルチプレットのヌクレオチドは５’から３’の方向に列挙される（例えば、別の慣例が指定されていない限り、５’ＧＴ３’は一般にＧＴジヌクレオチドとして言及される）。例示的な塩基マルチプレットには、例えば、２つの隣接する塩基またはヌクレオチドを含むジヌクレオチド、３つの隣接する塩基またはヌクレオチドを含むトリヌクレオチド、４つの隣接するヌクレオチドまたは塩基を含むテトラヌクレオチドなどが含まれる。マルチプレット内の各塩基は、特定の塩基タイプ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ）として明確に識別できる。代替的に、マルチプレット中の塩基は、例えば、Ｒ（すなわち、ＡもしくはＧ）、Ｍ（すなわち、ＡもしくはＣ）、Ｗ（すなわち、ＡもしくはＴ）、Ｓ（すなわち、ＣもしくはＧ）、Ｙ（すなわちＣもしくはＴ）、Ｋ（すなわちＧもしくはＴ）、Ｂ（すなわちＣもしくはＧもしくはＴ）、Ｄ（すなわちＡもしくはＧもしくはＴ）、Ｈ（すなわちＡもしくはＣもしくはＴ）、Ｖ（すなわちＡもしくはＣもしくはＧ）、またはＮ（すなわち、ＡもしくはＣもしくはＧもしくはＴ）として識別される、縮重であり得る。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「ブロッキング部分」という用語は、ヌクレオチドに関して使用される場合、核酸重合反応の間にヌクレオチドの３’酸素が次の正しいヌクレオチドへの共有結合を形成することを阻害または防止するヌクレオチドの一部を意味する。「可逆的ターミネーター」ヌクレオチドのブロッキング部分は、ヌクレオチド類似体から除去するか、そうでなければ修飾して、ヌクレオチドの３’−酸素を次の正しいヌクレオチドに共有結合することを可能にできる。そのようなブロッキング部分は、本明細書では「可逆的ターミネーター部分」と呼ばれる。例示的な可逆的ターミネーター部分は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２７，６７３号、同第７，４１４，１１６号、同第７，０５７，０２６号、同第７，５４４，７９４号、もしくは同第８，０３４，９２３号；またはＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０６６７８号もしくは同第ＷＯ０７／１２３７４４号に記載される。ブロッキング部分または可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドは、プライマーなどの核酸の３’末端にあってもよく、または核酸に共有結合されていないモノマーであってもよい。
【００３６】
「備える」という用語は、本明細書では、列挙された要素だけでなく、任意の追加の要素をさらに含む、無制限であることを意図している。
【００３７】
本明細書で使用される「各」という用語は、アイテムのコレクションに関連して使用される場合、コレクション内の個々のアイテムを特定することを意図しているが、必ずしもコレクション内のすべてのアイテムを指すとは限らない。明示的な開示またはコンテキストが明らかにそうでない場合、例外が発生する可能性がある。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、分子の部分に関して使用される場合、分子の天然の類似体には存在しない化学的部分を意味する。例えば、ヌクレオチドの外因性標識は、天然に存在するヌクレオチドには存在しない標識である。同様に、ポリメラーゼに存在する外因性標識は、その本来の環境ではポリメラーゼには見られない。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「伸長」という用語は、核酸に関して使用される場合、少なくとも１つのヌクレオチドを核酸の３’末端に付加するプロセスを意味する。「ポリメラーゼ伸長」という用語は、核酸に関して使用される場合、核酸の３’末端に少なくとも１つのヌクレオチドを付加するポリメラーゼ触媒プロセスを指す。伸長により核酸に付加されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、核酸に組み込まれると言われている。したがって、「組み込むこと」という用語は、ホスホジエステル結合の形成によってヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを核酸の３’末端に結合するプロセスを指すために使用することができる。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「伸長可能」という用語は、ヌクレオチドに関して使用される場合、ヌクレオチドが３’位に酸素またはヒドロキシル部分を有し、次の正しいヌクレオチドが核酸に組み込まれる場合およびそのときに、次の正しいヌクレオチドへの共有結合を形成できることを意味する。伸長可能なヌクレオチドは、プライマーの３’位にあってもよいし、単量体ヌクレオチドであってもよい。伸長可能なヌクレオチドは、可逆的ターミネーター部分などのブロッキング部分を欠いている。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「伸長したプライマーのハイブリッド」という用語は、少なくとも１つのヌクレオチドがプライマーに組み込まれた後のプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを指す。組み込み事象は、例えば、プライマーの３’末端への１つ以上のヌクレオチドのポリメラーゼ触媒付加であり得る。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「フィーチャー」という用語は、アレイに関して使用される場合、特定の分子が存在するアレイ内の場所を意味する。フィーチャーには、単一の分子のみを含めることも、同じ種のいくつかの分子の集団（すなわち、分子の集合）を含めることもできる。代替的に、フィーチャーは、異なる種である分子の集団（例えば、異なるテンプレート配列を有する三元複合体の集団）を含み得る。アレイのフィーチャーは通常、個別である。個別のフィーチャーは隣接していても、相互にスペースがあってもよい。本明細書で有用なアレイは、例えば、１００ミクロン、５０ミクロン、１０ミクロン、５ミクロン、１ミクロン、または０．５ミクロン未満離れているフィーチャーを有することができる。代替的または追加的に、アレイは、０．５ミクロン、１ミクロン、５ミクロン、１０ミクロン、５０ミクロン、または１００ミクロンを超えて離れている特徴を有することができる。フィーチャーはそれぞれ、１平方ミリメートル未満、５００平方ミクロン、１００平方ミクロン、２５平方ミクロン、１平方ミクロンまたはそれ以下の面積を有することができる。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「標識」という用語は、検出可能な特性を提供する分子またはその部分を指す。検出可能な特性は、例えば、放射の吸収、蛍光発光、ルミネセンス発光、蛍光寿命、蛍光偏光などの光シグナル、レイリーおよび／またはミー散乱、リガンドまたは受容体に対する結合親和性、磁気特性、電気的特性、電荷、質量、放射能などであり得る。例示的な標識には、フルオロフォア、発光団、発色団、ナノ粒子（例えば、金、銀、カーボンナノチューブ）、重原子、放射性同位元素、質量標識、電荷標識、スピン標識、受容体、リガンドなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「次の正しいヌクレオチド」という用語は、プライマーがハイブリダイズするテンプレート鎖の塩基と相補的なプライマーの３’末端に結合および／または組み込まれるヌクレオチドタイプを指す。テンプレート鎖の塩基は「次の塩基」と呼ばれ、プライマーの３’末端にハイブリダイズするテンプレートの塩基のすぐ５’側にある。次の正しいヌクレオチドは、次の塩基の「同族体」と呼ばれ、逆も同様である。三元複合体または二本鎖核酸において互いに相互作用するヌクレオチド同族体は、互いに「対となる」と言われる。次のテンプレート塩基に相補的ではない塩基を有するヌクレオチドは、「正しくない」、「ミスマッチ」、または「非同族体」ヌクレオチドと呼ばれる。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、天然のヌクレオチドまたはその類似体を指すために使用することができる。例には、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、またはジデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）などの非天然類似体、または可逆的な終結ヌクレオチド三リン酸（ｒｔＮＴＰ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーゼ、およびトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない核酸合成酵素を指すために使用することができる。典型的には、ポリメラーゼは、ヌクレオチド結合および／またはヌクレオチド重合の触媒作用が起こり得る１つ以上の活性部位を有する。ポリメラーゼは、二本鎖核酸分子の第１の鎖の３’末端へのヌクレオチドの重合を触媒することができる。例えば、ポリメラーゼは、ホスホジエステル結合を介して二本鎖核酸分子の第１の鎖の３’酸素基への次の正しいヌクレオチドの付加を触媒し、それによって二本鎖核酸分子の第１の鎖にヌクレオチドを共有結合的に組み込む。任意選択で、ポリメラーゼは、本明細書に記載の方法で使用される１つ以上の条件下でヌクレオチドを組み込むことができる必要はない。例えば、変異型ポリメラーゼは、三元複合体を形成することができるが、ヌクレオチドの組み込みを触媒することができない場合がある。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「プライマー−テンプレート核酸のハイブリッド」または「プライマー−テンプレートのハイブリッド」という用語は、鎖の１つが、ポリメラーゼによって伸長できる３’末端を有するような二本鎖領域を有する核酸のハイブリッドを指す。二本鎖は、隣接する核酸分子（例えば、ヘアピン構造）の一部であり得るか、または二本鎖は、互いに共有結合されていない分離可能な分子であり得る。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、「プライマー」という用語は、テンプレート配列またはその近くの核酸に結合する配列を有する核酸を指す。一般に、プライマーは、例えば、プライマーのポリメラーゼ伸長を介して、テンプレートの複製を可能にする構成で結合する。プライマーは、核酸分子の第２の部分に結合する核酸分子の第１の部分であり得、第１の部分はプライマー配列であり、第２の部分はプライマー結合配列（例えばヘアピンプライマー）である。代替的に、プライマーは、テンプレート配列を有する第２の核酸分子に結合する第１の核酸分子であり得る。プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体からなることができる。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、「塩基マルチプレットの連続」という用語は、配列内の特定の塩基マルチプレットの相対的順序の表現を指す。連続内の塩基マルチプレットは、互いに同じでも、互いに異なっていてもよい。例えば、連続内のジヌクレオチドは、ジヌクレオチドの３’位、ジヌクレオチドの５’位、またはその両方に存在するヌクレオチドのタイプの変動性により、互いに異なる可能性がある。いくつかの実施形態では連続内のジヌクレオチドは、３’位に存在するヌクレオチドのタイプの変動性により互いに異なり得、一方で５’位のヌクレオチドタイプは均一である。代替的に、連続内のジヌクレオチドは、３’位に均一なタイプのヌクレオチドを有することができ、一方で、５’位のヌクレオチドタイプに関して可変である。同様に、より長い塩基マルチプレットは、１つの位置では均一で、他の位置では可変である可能性がある。マルチプレット内の位置の１つは、２つ以上のヌクレオチドタイプで縮退している可能性がある。ＩＵＰＡＣシンボルを例にとると、位置の１つは、Ｒ（すなわち、ＡもしくはＧ）、Ｍ（すなわち、ＡもしくはＣ）、Ｗ（すなわち、ＡもしくはＴ）、Ｓ（すなわち、ＣもしくはＧ）、Ｙ（すなわちＣもしくはＴ）、Ｋ（すなわちＧもしくはＴ）、Ｂ（すなわちＣもしくはＧもしくはＴ）、Ｄ（すなわちＡもしくはＧもしくはＴ）、Ｈ（すなわちＡもしくはＣもしくはＴ）、Ｖ（すなわちＡもしくはＣもしくはＧ）、またはＮ（すなわち、ＡもしくはＣもしくはＧもしくはＴ）として識別できる。連続内の塩基マルチプレットは、参照配列と整列するときに連続的である必要はない。したがって、連続内の２つの塩基マルチプレットは、参照配列と整列したときにギャップによって分離することができる。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「三元複合体」という用語は、ポリメラーゼ、二本鎖核酸、およびヌクレオチドの間の分子間会合を指す。典型的には、ポリメラーゼは、次の正しいヌクレオチドとプライムされた核酸のテンプレート鎖との間の相互作用を促進する。次の正しいヌクレオチドは、ワトソンクリック水素結合を介してテンプレート鎖と相互作用することができる。「安定化三元複合体」という用語は、存在が促進または長期化された三元複合体、または破壊が阻害された三元複合体を意味する。一般に、三元複合体の安定化は、三元複合体のプライムされた核酸成分への三元複合体のヌクレオチド成分の共有結合による組み込みを妨げる。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「タイプ」という用語は、同じ化学構造を共有する分子を識別するために使用される。例えば、ヌクレオチドの混合物は、いくつかのｄＣＴＰ分子を含み得る。ｄＣＴＰ分子は互いに同じタイプであると理解されるが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなどと比較して異なるタイプである。同様に、ヌクレオチドの同じ配列を持つ個々のＤＮＡ分子は同じタイプであるが、異なる配列のＤＮＡ分子は異なるタイプである。「タイプ」という用語は、同じ化学構造を共有する部分を識別することもできる。例えば、テンプレート核酸におけるシトシン塩基は、テンプレート配列におけるそれらの位置とは無関係に、互いに同じタイプの塩基であると理解されるであろう。
【００５２】
以下に記載され、特許請求の範囲に記載される実施形態は、上述の定義を考慮して理解することができる。
【００５３】
本開示は、核酸を特徴付ける方法を提供する。方法は、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が、可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップと、（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプのうちの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させて、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含み得る。任意選択で、方法は、（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む。実施形態では、ステップ（ｅ）の前に、方法は、伸長したプライマーから可逆的ターミネーターを除去することをさらに含む。
【００５４】
同様に提供されるのは、核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む方法である。任意選択で、方法は、（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、（ｅ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、を含む。
【００５５】
本開示は、核酸を特徴づける方法であって、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうちの３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それによりさらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｄ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｅ）４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む、方法をさらに提供する。任意選択で、方法は、（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとしてさらに伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、（ｇ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む。
【００５６】
本明細書の方法または組成物で使用される核酸は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのＤＮＡであり得る。ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡなどのＲＮＡも使用できる。本明細書では、核酸類似体もテンプレートとして使用できる。したがって、本明細書で使用されるテンプレート核酸は、生物学的供給源、合成供給源、または増幅産物に由来し得る。本明細書で使用されるプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体であり得る。
【００５７】
特に有用な核酸テンプレートは、ゲノムの一部と同一の配列を含むゲノムフラグメントである。ゲノムフラグメントの集団には、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、または４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のゲノムを含めることができる。ゲノムフラグメントは、例えば、ゲノムの少なくとも約２５、５０、７０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００、またはそれ以上のヌクレオチドと実質的に同一である配列を有することができる。代替的にまたは付加的に、ゲノムフラグメントは、ゲノムの１×１０５、１×１０４、１×１０３、８００、６００、４００、２００、１００、７５、５０、または２５ヌクレオチドと実質的に同一であるか、それ以下の配列を有することができる。ゲノムフラグメントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体であり得る。
【００５８】
核酸が由来し得る例示的な生物には、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、馬、羊、豚、ヤギ、牛、猫、犬、霊長類、ヒトもしくは非ヒト霊長類などの哺乳動物、シロイヌナズナ、トウモロコシ、モロコシ、エンバク、小麦、米、キャノーラ、もしくは大豆などの植物、クラミドモナスなどの藻類、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓなどの線虫、キイロショウジョウバエ、蚊、ショウジョウバエ、ミツバチ、クモなどの昆虫、ゼブラフィッシュなどの魚、爬虫類、カエルもしくはアフリカツメガエルなどの両生類、ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、ニューモシスティスカリニ、タキフグルブリペス、酵母、サッカロモイセスセレビシエもしくはシゾサッカロミセスポンベなどの真菌、または熱帯熱マラリア原虫からのものが含まれる。核酸は、細菌、大腸菌、ブドウ球菌、肺炎マイコプラズマなどの原核生物、古細菌、Ｃ型肝炎ウイルスもしくはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス、またはウイロイドからも誘導できる。核酸は、上記の生物の均質な培養物または集団から、または代替的に、例えば、コミュニティまたは生態系内のいくつかの異なる生物のコレクションから得ることができる。核酸は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）、またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９８）に記載のものを含む、当該技術分野で既知の方法を使用して単離することもでき、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
テンプレート核酸は、ゲノム単離、ゲノム断片化、遺伝子クローニングおよび／または増幅などの調製方法から取得することができる。テンプレートは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）などの増幅技術から取得することができる。核酸を単離、増幅、および断片化して、アレイ上で分析するためのテンプレートを生成する例示的な方法は、米国特許第６，３５５，４３１号または第９，０４５，７９６号に記載されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。増幅は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）、またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９８）に記載の方法を使用して実行することもでき、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本開示の方法は、伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップを含むことができる。混合物中の１種類以上のヌクレオチドを可逆的に終結させることができる。例えば、混合物中の少なくとも１、２、３、４種類、またはそれ以上のヌクレオチドタイプを可逆的に終結させることができる。代替的に、または追加的に、混合物中の多くとも４、３、２、または１のヌクレオチドを可逆的に終結させることができる。同様に、混合物中で可逆的に終結する１種類以上のヌクレオチドタイプは、テンプレート核酸の少なくとも１、２、３、または４種類の塩基タイプに相補的であり得る。代替的に、または追加的に、混合物中の可逆的な終結ヌクレオチドタイプは、テンプレート核酸中の多くとも４、３、２、または１種類の塩基タイプに相補的であり得る。可逆的な終結ヌクレオチドと終結していないヌクレオチドが伸長反応で同時に存在し得る。例えば、ヌクレオチドタイプのいくつかまたは全てを、単一の伸長反応で同時に送達することができる。代替的に、異なるヌクレオチドタイプは、それらが単一の伸長反応に組み合わされるように（個別にまたはサブセットで）連続的に送達され得る。ヌクレオチドタイプは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらの類似体に見られるものなど、本明細書に記載されているものから選択される塩基部分を有することができる。
【００６１】
可逆的な終結ヌクレオチドをプライマーの３’末端に付加すると、伸長ステップ中に後続のヌクレオチドがプライマーに追加されるのを防ぎ、さらに後続の検査ステップでプライマーが不要に伸長するのを防ぐ。したがって、特定のタイプのヌクレオチドに隣接するテンプレート内の位置を調べることができる。そのような実施形態では、安定化三元複合体をその位置に形成し、検査して、伸長した可逆的に終結したプライマーにハイブリダイズするテンプレートの次の正しいヌクレオチドを検出することができる。この方法は、その後、伸長した可逆的に終結したプライマーから可逆的ターミネーター部分を除去または修飾して、伸長可能なプライマーを生成することにより、段階的に繰り返すことができる。
【００６２】
典型的には、本明細書に記載の方法でプライマーに付加される可逆的な終結ヌクレオチドは、外因性標識を持たない。これは、本明細書に記載の方法では伸長したプライマーを検出する必要がないためである。しかしながら、必要に応じて、本明細書に記載の方法で使用される１種類以上タイプの可逆的な終結ヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチドに結合した外因性標識を介して検出することができる。例示的な可逆的ターミネーター部分、それらをプライマーに組み込む方法、およびさらなる伸長のためにプライマーを修飾する方法（しばしば「脱ブロッキング」と呼ばれる）は、米国特許第７，５４４，７９４号、同第７，９５６，１７１号、同第８，０３４，９２３号、同第８，０７１，７５５号、同第８，８０８，９８９号、または同第９，３９９，７９８号に記載されている。さらなる例は、Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）、ＷＯ０４／０１８４９７、米国特許第７，０５７，０２６号、ＷＯ９１／０６６７８、ＷＯ０７／１２３７４４、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、およびＵＳ２００８／０１０８０８２に記載され、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
上述のように、可逆的な終結ヌクレオチドは、テンプレート核酸の特定の塩基タイプで伸長を終結する手段を提供する。このタイプの伸長制御を達成する別の手段は、テンプレート核酸に存在すると予想される１種類以上のタイプのヌクレオチドと対になることができるヌクレオチドタイプを欠くヌクレオチドの混合物を使用して伸長を行うことである。例えば、伸長に使用されるヌクレオチドの混合物は、テンプレート内の塩基と対になると予想される少なくとも１、２、または３種類のタイプのヌクレオチドを欠き得る。代替的にまたは追加的に、ヌクレオチドタイプの多くとも３、２、または、１種類が混合物中に存在しなくてもよい。同様に、混合物は、テンプレート核酸中に存在すると予想される３、２、または１種類以下の塩基タイプに相補的なヌクレオチドを含むことができる。代替的にまたは追加的に、混合物は、テンプレート核酸中に存在すると予想される塩基タイプの少なくとも１、２、または３種類に相補的であるヌクレオチドを含む。異なるヌクレオチドタイプは、伸長反応と同時に存在することも、連続伸長反応に参加することもできる。例えば、ヌクレオチドタイプのいくつかまたは全てを、単一の伸長反応で同時に送達することができる。代替的に、異なるヌクレオチドタイプは、それらが単一の伸長反応に組み合わされるように、または連続伸長反応が起こるように、（個別にまたはサブセットで）連続的に送達され得る。ヌクレオチドタイプは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらの類似体に見られるものなど、本明細書に記載されているものから選択される塩基部分を有することができる。
【００６４】
プライマー伸長ステップは、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを伸長反応混合物と接触させることにより実施することができる。通常、前の検査ステップで存在していた流体は除去され、伸長反応混合物で置き換えられる。代替的に、伸長反応混合物は、検査ステップに存在した流体に１つ以上の試薬を添加することによって形成され得る。必要に応じて、伸長反応混合物は、検査ステップとは異なるヌクレオチドの組成を含む。例えば、検査ステップは、伸長反応に存在しない１種類以上のヌクレオチドタイプを含むことができ、その逆も同様である。より具体的な例として、伸長ステップは、少なくとも１種類のタイプのヌクレオチドを省くことができ、検査ステップは、少なくとも４種類のタイプのヌクレオチドを使用することができる。必要に応じて、プライマー伸長ステップのために、１種類以上のヌクレオチドタイプが試験混合物に添加される。
【００６５】
検査ステップに存在するヌクレオチドは、伸長ステップに持ち越された場合、不要なヌクレオチドの組み込みを引き起こす可能性がある。したがって、ヌクレオチドを除去するためにプライマー伸長ステップの前に洗浄ステップを使用することができる。必要に応じて、遊離ヌクレオチドは、ホスファターゼ、アピラーゼ、もしくはヘキソキナーゼなどの酵素によって、化学修飾によって、または、液相抽出、固相抽出、もしくは電気泳動分離などの物理的分離技術によって除去されてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、伸長および検査のための試薬が同時に存在し得る。例えば、反応混合物は、ポリメラーゼ、プライマー−テンプレートのハイブリッド、テンプレートに存在すると予想される１種類の塩基タイプに同族である可逆的な終結ヌクレオチド、およびテンプレートに存在すると予想される他の３種類の塩基タイプに同族である心象可能なヌクレオチドを含み得る。この場合、可逆的な終結ヌクレオチドが組み込まれるまでプライマーの伸長が起こり、三元複合体が伸長したプライマーの終結した末端に形成される。三元複合体は、適切な次の正しいヌクレオチドである４種類のヌクレオチドのうちの１種類を含む。三元複合体は、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、またはその両方の標識を介して検出できる。例えば、標識はヌクレオチドの５’位に存在することができ、標識は伸長中にプライマーに組み込まれる任意のヌクレオチドから除去されるが、三元複合体形成に関与する任意のヌクレオチドについては保持される。したがって、組み込まれたヌクレオチドからの望ましくないシグナルを回避しながら、三元複合体を検出することができる。
【００６７】
プライマー伸長ステップでは、標識されたポリメラーゼを使用する必要はない。例えば、伸長ステップに使用されるポリメラーゼは、外因性標識に（例えば、共有結合的またはその他の方法で）結合される必要はない。代替的に、プライマー伸長に使用されるポリメラーゼは、外因性標識、例えば、前の検査ステップで使用された標識を含み得る。
【００６８】
本開示の方法は、三元複合体が形成および検出される検査ステップを含み得る。方法の実施形態は、ポリメラーゼがプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドおよび次の正しいヌクレオチドとともに安定化三元複合体を形成することができる特異性を利用する。次の正しいヌクレオチドは、安定化三元複合体に非共有結合で結合でき、非共有相互作用のみを介して複合体の他のメンバーと相互作用する。安定化三元複合体を形成するための有用な方法および組成物は、以下でさらに詳細に、また共同所有の、米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号または米国特許出願第１５／６７７，８７０号（ＵＳ２０１８／００４４７２７Ａ１として公開）、ＵＳ２０１８／０１８７２４５Ａ１（米国特許出願第６２／４４０，６２４号に対する優先権を主張する）、またはＵＳ２０１８／０２０８９８３Ａ１（米国特許出願第６２／４５０，３９７号に対する優先権を主張する）記載され、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
典型的には、検査ステップは、例えば、ステップ間の試薬交換により、伸長ステップとは別である。しかしながら、上述のように、いくつかの実施形態では、伸長および検査ステップは、同じ混合物で起こり得る。
【００７０】
三元複合体は、特定の触媒金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋）が存在しない場合、ポリメラーゼ、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッド、および次の正しいヌクレオチドの間で形成できるが、触媒金属イオンがない場合、ヌクレオチドの化学的付加が阻害される。触媒金属イオンのレベルが低いか不足していると、安定化三元複合体の次の正しいヌクレオチドが非共有結合で隔離される。本明細書に開示される他の方法もまた、安定化三元複合体を生成するために使用され得る。
【００７１】
任意選択で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドのプライマーが、プライマーに入ってくるヌクレオチドの酵素的組み込みを妨げるブロッキング部分（例えば、可逆的ターミネーター部分）を含む場合、安定化三元複合体を形成することができる。相互作用は、安定剤の存在下で起こり得、それにより、ポリメラーゼ−核酸相互作用は、次の正しいヌクレオチドの存在下で安定化される。プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドのプライマーは、任意選択で、伸長可能なプライマー、またはその３’末端で伸長からブロックされたプライマーのいずれかであり得る（例えば、ブロッキングは、プライマーの３’末端上の可逆的ターミネーター部分の存在により達成され得る）。プライマー−テンプレート核酸のハイブリッド、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド同族体は、ヌクレオチド同族体の塩基がプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドの次の塩基に相補的である場合、安定化三元複合体を形成することができる。
【００７２】
上記のように、三元複合体を支持または安定化する条件は、プライマーに入ってくるヌクレオチドの酵素的組み込みを妨げるブロッキング基（例えば、プライマーの３’ヌクレオチド上の可逆的ターミネーター部分）または触媒金属イオンの欠如によってもたらされる。他の有用な条件は、ヌクレオチドの組み込みまたは重合を阻害する非触媒イオン（例えば、二価または三価の非触媒金属イオン）などの三元複合体安定剤の存在を含む。非触媒金属イオンには、カルシウム、ストロンチウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ロジウム、ユーロピウム、およびテルビウムイオンが含まれるが、これらに限定されない。任意選択で、二元複合体（すなわち、ポリメラーゼとプライムされた核酸との間の複合体であるがヌクレオチド同族体を欠く）を不快または不安定にする条件は、１つ以上の一価カチオンおよび／またはグルタミン酸アニオンの存在によってもたらされる。さらなる選択肢として、触媒活性が低下するように操作されたか、またはバイナリ複合体形成の傾向が低下するように操作されたポリメラーゼを使用することができる。
【００７３】
上述のように、三元複合体安定化条件は、例えば、二元複合体を不安定化することにより、異なるヌクレオチドの存在下でのプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドに対するポリメラーゼの親和性の差を際立たせることができる。任意選択で、条件は、異なるヌクレオチドの存在下で、プライマー−テンプレートに対するポリメラーゼの異なる親和性を引き起こす。例として、条件には、高塩およびグルタミン酸イオンが含まれるが、これらに限定されない。例えば、塩は水溶液に溶解して、一価金属カチオン（例えば、ナトリウムイオンまたはカリウムイオン）などの一価カチオンを生成することができる。任意選択で、一価カチオン（例えば、一価金属カチオン）を提供する塩は、グルタミン酸イオンをさらに提供する。任意選択で、グルタミン酸イオンの供給源は、グルタミン酸カリウムであり得る。場合によっては、プライマー−テンプレートのハイブリッドのポリメラーゼ親和性を変更するために使用できるグルタミン酸カリウムの濃度は、１０ｍＭから１．６Ｍのグルタミン酸カリウム、または１０ｍＭから１．６Ｍの間の任意の量に及ぶ。上述のように、高塩分とは、５０〜１，５００ｍＭの塩の塩濃度を指す。
【００７４】
三元複合体を安定化するために本明細書に記載されている選択肢は、相互に排他的である必要はなく、代わりに様々な組み合わせで使用できることが理解されよう。例えば、三元複合体は、ポリメラーゼドメインの架橋、ポリメラーゼの核酸への架橋、三元複合体を安定化するポリメラーゼ変異、少分子によるアロステリック阻害、非競合的阻害剤、競合的阻害剤、非競合的阻害剤、触媒金属イオンの不在、プライマー上のブロッキング部分の存在、および本明細書に記載の他の手段を含むがこれらに限定されない手段の１つまたは組み合わせによって安定化することができる。
【００７５】
安定化三元複合体は、方法の特定の用途または構成に適合するように所望されるように、天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、または修飾ヌクレオチドを含むことができる。必要に応じて、ヌクレオチド類似体は、窒素塩基、五炭糖、およびリン酸基を有し、ヌクレオチドの任意の部分は、天然ヌクレオチドと比較して、改変、欠失および／または置換され得る。ヌクレオチド類似体は、組み込み不可能なヌクレオチド（すなわち、プライマーの３’酸素と反応して共有結合を形成することができないヌクレオチド）であり得る。組み込むことができないそのようなヌクレオチドには、例えば、一リン酸および二リン酸のヌクレオチドが含まれる。別の例では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドを組み込まないようにする三リン酸基への修飾を含み得る。組み込み不可能なヌクレオチドの例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４８２，１２０号に見出し得る。いくつかの実施形態では、組み込み不可能なヌクレオチドは、その後、組み込み可能になるように修飾され得る。組み込み不可能なヌクレオチド類似体には、アルファ−リン酸修飾ヌクレオチド、アルファ−ベータヌクレオチド類似体、ベータ−リン酸修飾ヌクレオチド、ベータ−ガンマヌクレオチド類似体、ガンマ−リン酸修飾ヌクレオチド、またはケージドヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチド類似体の例は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，０７１，７５５号に記載されている。
【００７６】
安定化三元複合体に関与するヌクレオチド類似体は、類似体がプライマーに組み込まれた後、プライマーの３’末端でのその後のヌクレオチド組み込みを可逆的に防止するターミネーターを含むことができる。例えば、米国特許第７，５４４，７９４号および米国特許第８，０３４，９２３号（これらの特許の開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、３’−ＯＨ基が３’−ＯＮＨ２部分により置換されている可逆的ターミネーターを記載する。別のタイプの可逆的ターミネーターは、例えば、米国特許第８，８０８，９８９号（その開示は参照により本明細書に組み入れられる）に示されるように、ヌクレオチドの窒素含有塩基に連結される。本明細書に記載の方法に関連して同様に使用できる他の可逆的ターミネーターには、本明細書のいずこかまたは米国特許第７，９５６，１７１号、米国特許第８，０７１，７５５号、および米国特許第９，３９９，７９８号に引用されている参考文献に記載されているものが含まれる（これらの米国特許の開示は参照により本明細書に組み入れられる）。特定の実施形態では、可逆的ターミネーター部分は、「脱ブロッキング」として知られるプロセスによってプライマーから除去することができ、その後のヌクレオチド組み込みを可能にする。脱ブロッキングのための組成物および方法は、可逆的ターミネーターとの関連で本明細書に引用される参考文献に示されている。３’酸素に結合できる他の例示的なターミネーター部分には、−ＣＨ２Ｎ３（アジ化メチル）、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、光反応性部分、または参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ＆  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１：３４−４０（２０１３）、または参照により本明細書に組み込まれる他の参考文献に記載されている他の部分が含まれる。
【００７７】
代替的に、ヌクレオチド類似体は、それらが組み込まれているプライマーの３’末端でのヌクレオチドの組み込みを不可逆的に防止する。不可逆的なヌクレオチド類似体には、２’、３’−ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰなどのｄｄＮＴＰ）が含まれる。ジデオキシヌクレオチドは、そうでないときにポリメラーゼが介在するプライマー伸長に関与するｄＮＴＰの３’−ＯＨグループを欠いている。したがって、３’位は、天然のヒドロキシル部分の代わりに水素部分を有する。不可逆的な終結ヌクレオチドは、ジェノタイピングアプリケーションや、テンプレート核酸に沿ったプライマー伸長や逐次検出が望ましくない他のアプリケーションに特に有用である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、三元複合体の形成に関与するヌクレオチドは、外因性標識を含み得る。例えば、外因的に標識されたヌクレオチドは、可逆的または不可逆的なターミネーター部分を含み得、外因的に標識されたヌクレオチドは、組み込み不可能であり得、外因的に標識されたヌクレオチドは、ターミネーター部分を欠き得、外因的に標識されたヌクレオチドは、組み込み可能であり得るか、または外因的に標識されたヌクレオチドは、組み込み可能であるものと終結されていないものの両方であり得る。外因的に標識されたヌクレオチドは、標識されていないポリメラーゼと安定化三元複合体を形成するために使用される場合に特に有用であり得る。代替的に、ヌクレオチド上の外因性標識は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対の一方のパートナーを提供することができ、ポリメラーゼ上の外因性標識は、対の第２のパートナーを提供することができる。このように、ＦＲＥＴ検出は、両方のパートナーを含む安定化三元複合体を識別するために使用できる。代替的に、三元複合体の形成に関与するヌクレオチドは、外因性標識を欠いていてもよい（すなわち、ヌクレオチドは「非標識」であり得る）。例えば、非標識ヌクレオチドは、可逆的または不可逆的なターミネーター部分を含み得、非標識ヌクレオチドは、組み込み不可能であり得、非標識ヌクレオチドは、ターミネーター部分を欠き得、非標識ヌクレオチドは、組み込み可能であり得るか、または非標識ヌクレオチドは、組み込み可能であるものと終結されていないものの両方であり得る。非標識ヌクレオチドは、ポリメラーゼの標識を使用して、安定化三元複合体を検出する場合に有用である。非標識ヌクレオチドはまた、本明細書に記載される方法の伸長ステップにおいて有用であり得る。ヌクレオチドの部分または機能がないことは、そのような機能または部分を持たないヌクレオチドを指すことが理解されるであろう。しかしながら、ヌクレオチドまたはその類似体について本明細書に記載されている、またはそうでなくてもヌクレオチドまたはその類似体について当技術分野で知られている機能または部分の１つ以上は、本明細書に記載される方法または組成物において具体的に省略できることも理解されよう。
【００７９】
任意選択で、ヌクレオチド（例えば、天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）は、安定化三元複合体の形成の間、混合物中に存在する。例えば、少なくとも１、２、３、４種類、またはそれ以上のヌクレオチドタイプが存在し得る。代替的に、または追加的に、多くとも４、３、２、または１種類のヌクレオチドが存在し得る。同様に、存在する１種類以上のヌクレオチドタイプは、テンプレート核酸の少なくとも１、２、３、または４種類の塩基タイプに相補的であり得る。代替的に、または追加的に、存在する１種類以上のヌクレオチドタイプは、テンプレート核酸中の多くとも４、３、２、または１種類の塩基タイプに相補的であり得る。
【００８０】
三元複合体においてポリメラーゼを安定化させる任意のヌクレオチド修飾は、本明細書に開示される方法において使用され得る。ヌクレオチドは、永久的または一時的にポリメラーゼに結合することができる。任意選択で、ヌクレオチド類似体は、例えば、共有リンカーを介して、ポリメラーゼに融合される。任意選択で、複数のヌクレオチド類似体は複数のポリメラーゼに融合され、各ヌクレオチド類似体は異なるポリメラーゼに融合される。任意選択で、安定化三元複合体に存在するヌクレオチドは、三元複合体が安定化される手段ではない。したがって、ヌクレオチド類似体を利用する反応において、様々な他の三元複合体安定化方法のいずれかを組み合わせることができる。
【００８１】
特定の実施形態では、安定化三元複合体に存在するプライマー−テンプレートのハイブリッド分子のプライマー鎖は、本明細書に記載の方法の１つ以上ステップ中に存在するポリメラーゼによって化学的に変化しない。例えば、プライマーは、新しいホスホジエステル結合の形成によって伸長される必要はなく、安定化三元複合体を形成するためのステップ中、または安定化三元複合体を検出するためのステップ中に核酸分解によって短縮される必要もない。
【００８２】
本明細書に記載の方法で安定化三元複合体を形成するために、様々なポリメラーゼのいずれかを使用することができる。使用され得るポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼおよびそれらの改変されたバリエーションを含み、変異体、組換え体、融合体、遺伝子改変体、化学的改変体、合成物、および類似体を含むがこれらに限定されない。天然に存在するポリメラーゼおよびその改変されたバリエーションは、重合反応を触媒する能力を有するポリメラーゼに限定されない。任意選択で、その天然に存在するおよび／または改変されたそのバリエーションは、安定化三元複合体の形成または検査中に使用されない少なくとも１つの条件で重合反応を触媒する能力を有する。任意選択で、安定化三元複合体に関与する天然および／または改変されたバリエーションは、改変された特性、例えば、核酸への増強された結合親和性、核酸への減少した結合親和性、ヌクレオチドへの増強された結合親和性、ヌクレオチドへの減少した結合親和性、次の正しいヌクレオチドへの向上した特異性、次の正しいヌクレオチドへの低下した特異性、低下した触媒速度、触媒不活性などを有している。変異型ポリメラーゼには、例えば、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたポリメラーゼ、または１つ以上のアミノ酸の挿入もしくは欠失が含まれる。安定化三元複合体を形成するために使用することができる例示的なポリメラーゼ変異体には、例えば、米国特許出願第１５／８６６，３５３号（現在はＵＳ２０１８／０１５５６９８Ａ１として公開）、または米国特許出願公開第２０１７／０３１４０７２Ａ１号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
改変されたポリメラーゼは、外因性標識部分（例えば、外因性フルオロフォア）を含むポリメラーゼを含み、これは、ポリメラーゼを検出するために使用され得る。任意選択で、タンパク質単離技法を使用して、ポリメラーゼが少なくとも部分的に精製された後に、標識部分が結合され得る。例えば、外因性標識部分は、ポリメラーゼの遊離スルフヒドリルまたは遊離アミン部分を使用して、ポリメラーゼに化学的に連結することができる。これには、システイン残基の側鎖を介した、またはＮ末端の遊離アミノ基を介した、ポリメラーゼへの化学結合が含まれる。外因性標識部分はまた、タンパク質融合を介してポリメラーゼに結合され得る。タンパク質融合を介して結合できる例示的な標識部分には、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコビリタンパク質（例えば、フィコシアニンおよびフィコエリトリン）、またはＧＦＰまたはフィコビリタンパク質の波長シフトバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ上の外因性標識は、ＦＲＥＴペアのメンバーとして機能することができる。ＦＲＥＴペアの他のメンバーは、安定化三元複合体のポリメラーゼに結合するヌクレオチドに結合している外因性標識であり得る。したがって、安定化三元複合体は、ＦＲＥＴを介して検出または識別できる。
【００８４】
代替的に、安定化三元複合体に関与するポリメラーゼは、外因性標識に結合される必要はない。例えば、ポリメラーゼは外因性標識に共有結合する必要はない。その代わり、ポリメラーゼは、それが標識ヌクレオチドおよび／または標識核酸（例えば、標識プライマーおよび／または標識テンプレート）と会合するまで、標識を欠いていてもよい。
【００８５】
本開示に従って作製または使用される三元複合体は、任意選択で、１つ以上の外因性標識を含み得る。標識は、三元複合体の形成前に、三元複合体の成分に結合（例えば、ポリメラーゼ、テンプレート核酸、プライマー、および／またはヌクレオチド同族体に結合）させることができる。例示的な結合には、共有結合または非共有結合、例えば、本明細書に記載されているか、本明細書で引用される参照文献に記載されるか、または当該技術分野で知られているものが含まれる。いくつかの実施形態では、標識された成分は、非標識成分に結合している固体支持体に溶液で送達され、それにより、安定化三元複合体を形成することにより、標識は固体支持体に動員される。そのため、支持体に結合した成分は、動員された標識の観察に基づいて検出または識別できる。外因性標識は、溶液相で使用する場合でも、固体支持体で使用する場合でも、検査ステップ中に、安定化三元複合体またはその個々の成分を検出するのに有用である。外因性標識は、安定化三元複合体を形成していた他の成分から成分が分離した後、成分に結合されたままとなり得る。例示的な標識、標識を結合する方法、および標識された成分を使用する方法は、共同所有の米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号または米国特許出願第１５／６７７，８７０号（ＵＳ２０１８／００４４７２７Ａ１として公開）、同第１５／５８１，３８３号（ＵＳ２０１８／０１８７２４５Ａ１として公開）同第１５／８７３，３４３号（ＵＳ２０１８／０２０８９８３Ａ１として公開）、または米国特許出願公開第２０１８／０２０８９８３Ａ１号（米国特許出願第６２／４５０，３９７号および同第６２／５０６，７５９号に対する優先権を主張する）に示す方法を使用して実行することもでき、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
有用な外因性標識の例には、放射性標識部分、発光団部分、フルオロフォア部分、量子ドット部分、発色団部分、酵素部分、電磁スピン標識部分、ナノ粒子光散乱部分、および当技術分野で知られている他の様々なシグナル生成部分のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。適切な酵素部分には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。例示的なフルオロフォア部分には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー（商標）、カスケードブルー（商標）、テキサスレッド（商標）、塩化ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、ユーロピウムおよびテルビウムを含むものなどの蛍光ランタニド錯体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ならびにＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ  Ｃｏｒｐ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  １９９９）  ａｎｄ  ｔｈｅ  ６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｂｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈｏａｇｌａｎｄに記載されるものなどの当該技術分野で公知のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
本開示の方法では二次標識を使用することができる。二次標識は、パートナー部分に特異的に結合できる結合部分である。例えば、リガンド部分をポリメラーゼ、核酸、またはヌクレオチドに結合させて、標識された受容体に対する特異的親和性を介した検出を可能にすることができる。使用することができる例示的な結合部分の対には、限定されないが、抗原と免疫グロブリンまたはそれらの活性フラグメント、例えばＦＡｂ、免疫グロブリンと免疫グロブリン（またはそれぞれ活性フラグメント）、アビジンとビオチン、またはアビジンに特異性を有するその類似体、ストレプトアビジンとビオチン、またはストレプトアビジンに特異性を有するそれらの類似体、または炭水化物とレクチンが含まれる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、二次標識は、化学的に修飾可能な部分であり得る。この実施形態では、反応性官能基を有する標識を、安定化三元複合体に組み込むことができる。続いて、官能基を一次標識部分と共有結合的に反応させることができる。適切な官能基には、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基、およびチオール基が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
別の実施形態では、三元複合体は外因性標識を欠く可能性がある。例えば、三元複合体および三元複合体に関与する全ての成分（例えば、ポリメラーゼ、テンプレート核酸、プライマー、および／またはヌクレオチド同族体）は、本明細書または上述の組み込まれた参考文献に記載される外因性標識の１つ、いくつかまたは全てを欠く可能性がある。そのような実施形態では、三元複合体は、質量、電荷、固有の光学特性などのような、安定化三元複合体の固有の特性に基づいて検出することができる。非標識三元複合体を検出するための例示的な方法は、共同所有の米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６８９１６号（ＷＯ２０１７／１１７２４３として公開）、または米国特許出願第６２／３７５，３７９号または同第１５／６７７，８７０号（ＵＳ２０１８／００４４７２７Ａ１として公開）に記載され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
一般に、検出は、検査ステップにおいて、三元複合体またはそれに結合した標識部分に固有の特性を感知する方法によって達成することができる。検出の基礎となることができる例示的な特性には、質量、導電率、エネルギー吸収、蛍光などが含まれるが、これらに限定されない。発光の検出は、核酸アレイに関する当該技術分野で既知の方法を使用して実施することができる。発光団は、例えば、発光波長、励起波長、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）強度、消光、異方性、または寿命を含む、様々な発光特性のいずれかに基づいて検出することができる。本明細書に記載の方法で使用することができる他の検出技術には、例えば、質量を感知するために使用することができる質量分析、表面への結合を感知するために使用できる表面プラズモン共鳴、標識が吸収するエネルギーの波長を感知するために使用できる吸光度、標識の存在による温度の変化を感知するために使用できる熱量測定、標識の電気特性を感知するために使用できる電気コンダクタンスまたはインピーダンス、または他の既知の分析技術が含まれる。安定化三元複合体を作成、操作、および検出するために使用できる試薬および条件の例には、例えば、共同所有の米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６８９１６号（ＷＯ２０１７／１１７２４３として公開）、または米国特許出願第１５／６７７，８７０号（ＵＳ２０１８／００４４７２７Ａ１として公開）、同第１５／８５１，３８３号（ＵＳ２０１８／０１８７２４５Ａ１として公開）同第１５／８７３，３４３号（ＵＳ２０１８／０２０８９８３Ａ１として公開）、または米国特許出願公開第２０１８／０２０８９８３Ａ１号（米国特許出願第６２／４５０，３９７号および同第６２／５０６，７５９号に対する優先権を主張する）に記載されているものが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本明細書に記載される方法の特定の実施形態は、いくつかの成分を含む混合物を形成するステップを含む。例えば、混合物は、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッド、ポリメラーゼ、および１種類以上のヌクレオチドタイプの間で形成され得る。混合物の成分は、任意の所望の順序で容器に送達され得るか、またはそれらは同時に送達され得る。さらに、いくつかの成分を互いに混合して、第１の混合物を形成し、その後、他の成分と接触させて、より複雑な混合物を形成することができる。例として、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッド、ポリメラーゼ、および複数の異なるヌクレオチドタイプを含む混合物を形成するステップを考えると、複数の異なるヌクレオチドタイプは、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとの接触の前に互いに接触させることができることが理解されよう。代替的に、２種類以上のヌクレオチドタイプが、プライマー−テンプレートのハイブリッドおよび／またはポリメラーゼに別々に送達され得る。したがって、第２のヌクレオチドタイプと接触させる前に、第１のヌクレオチドタイプをプライマー−テンプレートのハイブリッドと接触させることができる。代替的に、または追加的に、第１のヌクレオチドタイプは、第２のヌクレオチドタイプと接触させる前に、ポリメラーゼと接触させることができる。
【００９２】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態は、安定化三元複合体を互いに区別するため、および／またはテンプレート核酸中の１種類の塩基タイプを別の塩基タイプから区別するために２つ以上の区別可能なシグナルを利用する。例えば、２つ以上の発光団は、励起のための固有の波長または発光の固有の波長などの固有の光学特性に基づいて互いに区別することができる。特定の実施形態では、方法は、発光強度の差に基づいて、異なる安定化三元複合体を区別することができる。例えば、第１の三元複合体は、第２の三元複合体よりも低い強度で発光する状態で検出することができる。このような強度スケーリング（しばしば「グレースケーリング」と呼ばれる）は、任意の識別可能な強度の違いを利用できる。例示的な差異には、検出される別の安定化三元複合体の強度と比較して、１０％、２５％、３３％、５０％、６６％、または７５％の強度を有する特定の安定化三元複合体が含まれる。
【００９３】
強度の違いは、それぞれが異なる消衰係数（すなわち、異なる励起特性をもたらす）および／または異なる発光量子収量（すなわち、異なる発光特性をもたらす）を有する異なる発光団を使用して達成することができる。代替的に、同じ発光団タイプを使用することができるが、異なる量で存在することができる。例えば、三元複合体の第１の集団の全てのメンバーは、特定の発光団で標識することができるが、第２の集団は、発光団で標識されたそのメンバーの半分だけを有する。この例では、第２の集団は第１の集団のシグナルの半分を生成すると予想される。第２の集団は、例えば、標識されたヌクレオチドと非標識ヌクレオチド（主に標識されたヌクレオチドを含む第１の集団とは対照的）の混合物を使用することにより生成され得る。同様に、第２の集団は、例えば、標識されたポリメラーゼと非標識ポリメラーゼ（主に標識されたポリメラーゼを含む第１の集団とは対照的）の混合物を使用することにより生成され得る。代替的な標識スキームでは、三元複合体の第１の集団は、特定の発光シグナルを生成する複数の標識を有するポリメラーゼ分子を含むことができ、三元複合体の第２の集団は、発光シグナルを生成する標識のうちの１つのみをそれぞれ有するポリメラーゼ分子を含むことができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、検査ステップは、例えば、共有されている米国特許第９，９５１，３８５号として発行された米国特許出願第１５／７１２，６３２号に記載されているように、少なくとも１種類のヌクレオチドタイプの識別が帰属されるように実行され、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、検査ステップは、（ａ）三元複合安定化条件下で混合物を形成するステップであって、混合物がプライムされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ、およびテンプレート中の第１、第２、および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体を含むステップと、（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを判定するステップと、（ｃ）プライムされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定するステップであって、ステップ（ｂ）で三元複合体が検出された場合、次の正しいヌクレオチドが第１、第２、または第３の塩基タイプの同族体として特定され、ステップ（ｂ）で三元複合体が存在しないことに基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体であると推定されるステップと、を含み得る。
【００９５】
帰属を使用することの代替的に、または追加的に、検査ステップは、例えば、共有されている米国特許第９，９５１，３８５号として発行された米国特許出願第１５／７１２，６３２号に記載されているように、明確化を使用して１種類以上ヌクレオチドタイプを識別することができ、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、検査ステップは、（ａ）三元複合安定化条件下で、プライムされたテンプレート核酸を少なくとも２つの別々の混合物と連続的に接触させるステップであって、少なくとも２つの別々の混合物の各々が、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含み、それによって、連続的に接触させるステップが、プライムされたテンプレート核酸が、三元複合安定化条件下で、テンプレート内の第１、第２、および第３の塩基タイプの塩基タイプのヌクレオチド同族体と接触するステップと、（ｂ）少なくとも２つの別々の混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを判定するステップと、（ｃ）プライムされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定するステップであって、ステップ（ｂ）で三元複合体が検出された場合、次の正しいヌクレオチドが第１、第２、または第３の塩基タイプの同族体として特定され、ステップ（ｂ）で三元複合体が存在しないことに基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体であると推定されるステップと、を含み得る。
【００９６】
特定の実施形態では、検査は、（ａ）三成分複合体安定化条件下で、プライムされたテンプレート核酸をポリメラーゼおよびヌクレオチドの第１の混合物と接触させるステップであって、第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体と第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｂ）プライムされたテンプレート核酸を、三元複合体安定化条件下でポリメラーゼおよびヌクレオチドの第２の混合物と接触させるステップであって、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体と第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｃ）プライムされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ、および次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されるシグナルについてステップ（ａ）および（ｂ）の生成物を検査するステップであって、ステップ（ａ）の生成物について取得されたシグナルが第１および第２の塩基タイプについて不明瞭であり、ステップ（ｂ）の生成物について取得されたシグナルが第１および第３の塩基タイプについて不明瞭である、ステップと、（ｄ）次の正しいヌクレオチドに結合する塩基のタイプを識別するために、ステップ（ｃ）で取得したシグナルを明確化するステップとによって実行され得る。任意選択で、明確化を実現するために、（ｉ）第１の塩基タイプはステップ（ａ）の生成物についてのシグナルの存在とステップ（ｂ）の生成物のシグナルの存在とに相関し、（ｉｉ）第２の塩基タイプはステップ（ａ）の生成物についてのシグナルの存在とステップ（ｂ）の生成物のシグナルの不在とに相関し、（ｉｉｉ）第３の塩基タイプは、ステップ（ａ）の生成物についてのシグナルの不在とステップ（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在とに相関する。
【００９７】
同様に提供されるのは、検査が、（ａ）プライムされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ、テンプレート内の第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体、およびテンプレート内の第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体を含む第１の混合物と接触させるステップであって、接触が、（ｉ）プライムされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ、および次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体を安定化し、（ｉｉ）次の正しいヌクレオチドのプライマーへの組み込みを妨げる結合反応で起こる、ステップと、（ｂ）結合反応を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを判定するステップと、（ｃ）プライムされたテンプレート核酸をステップ（ａ）および（ｂ）の繰り返しにかけるステップであって、第１の混合物を第２の混合物で置き換え、第２の混合物が、ポリメラーゼ、テンプレート内の第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体、テンプレート内の第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体を含むステップと、（ｄ）結合反応またはその生成物の検査を使用して、プライムされたテンプレート核酸の次の正しいヌクレオチドを特定するステップであって、（ｉ）三重複合体がステップ（ｂ）で検出され、かつステップ（ｂ）の繰り返しで検出される場合、次の正しいヌクレオチドは第１の塩基タイプの同族体として特定され、（ｉｉ）ステップ（ｂ）で三元複合体が検出され、かつ繰り返しで検出されなかった場合、次の正しいヌクレオチドは、第２の塩基タイプの同族体として識別され、（ｉｉｉ）ステップ（ｂ）で三元複合体が検出されず、かつステップ（ｂ）の繰り返しで検出された場合、次の正しいヌクレオチドは第３の塩基タイプの同族体として識別されるステップ、を含む方法である。
【００９８】
上述のように、ポリメラーゼの異なる活性は、本明細書に示される方法において利用され得る。ポリメラーゼは、例えば、伸長ステップ、検査ステップ、またはその両方において有用であり得る。様々な活性が、構造の違いに従い得る（例えば、天然の活性、変異、または化学修飾による）。それにもかかわらず、ポリメラーゼは、様々な既知の供給源から得ることができ、本明細書に記載されている教示および認められているポリメラーゼの活性に従って適用することができる。有用なＤＮＡポリメラーゼには、細菌ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、およびファージＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。細菌ＤＮＡポリメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ（Ｃｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（Ｃｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓｏ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。真核生物ＤＮＡポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δ、
【数１】
2021512648.tif 000003
、η、ζ、λ、σ、μ、およびｋ、ならびにＲｅｖ１ポリメラーゼ（ターミナルデオキシシチジルトランスフェラーゼ）およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が含まれる。ウイルスＤＮＡポリメラーゼには、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＧＡ−ｌ、ｐｈｉ−２９様ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＺＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ−１５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｐｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｐ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４ポリメラーゼが含まれる。その他の有用なＤＮＡポリメラーゼには、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓｕ（Ｔｆｌ  ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｕｒｂｏ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属ＧＢ−Ｄポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス属ＪＤＦ−３（ＪＤＦ−３）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス属Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ株ＴＯＫ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ．Ｔｏｋ  Ｐｏｌ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびヘテロダイマーＤＮＡポリメラーゼＤＰ１／ＤＰ２などの熱安定性および／または好熱性ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。操作および改変されたポリメラーゼもまた、開示された技法に関連して有用である。例えば、高度に好熱性の海洋古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎの改変バージョン（例えば、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；  Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用することができる。３ＰＤＸポリメラーゼを含むさらに他の有用なＤＮＡポリメラーゼは、ＵＳ８，７０３，４６１に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９９】
有用なＲＮＡポリメラーゼには、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、およびＫｌｌポリメラーゼなどのウイルスＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、およびＲＮＡポリメラーゼＶなどの真核生物のＲＮＡポリメラーゼ、ならびに古細菌ＲＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
別の有用なタイプのポリメラーゼは、逆転写酵素である。例示的な逆転写酵素には、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＰＤＢ  １ＨＭＶ）由来のＨＩＶ−１逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス２型由来のＨＩＶ−２逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルスのＡＭＶ逆転写酵素、および真核生物の染色体のテロメアを維持するテロメラーゼ逆転写酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
固有の３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、いくつかの実施形態に有用であり得る。３’−５  ’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているポリメラーゼはまた、いくつかの実施形態、例えば、ほとんどの遺伝子型決定およびシーケンシングの実施形態において有用である。エキソヌクレアーゼ活性の欠如は、野生型の特徴、またはバリアントもしくは操作されたポリメラーゼ構造によって付与される特徴であり得る。例えば、エキソマイナスクレノウフラグメントは、クレノウフラグメントの変異バージョンであり、３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠く。クレノウフラグメントおよびそのエキソマイナスバリアントは、本明細書に記載の方法または組成物において有用であり得る。
【０１０２】
ポリメラーゼベースのプライマー伸長ステップに使用できる試薬および条件の例には、例えば、共同所有の米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号、または米国特許出願第１５／６７７，８７０号およびその公開であるＵＳ２０１８／００４４７２７Ａ１、同第１５／５８１，３８３号およびその公開であるＵＳ２０１８／０１８７２４５Ａ１またはＵＳ２０１８／０２０８９８３Ａ１、ならびにその優先出願であるＵＳ第６２／４５０，３９７号および６２／５０６，７５９号に記載され、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ポリメラーゼベースのプライマー伸長のための他の有用な試薬および条件は、Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）、ＷＯ０４／０１８４９７、ＷＯ９１／０６６７８、ＷＯ０７／１２３７４４、米国特許第７，０５７，０２６号、同第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、または同第７，４０５，２８１号、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２Ａ１号に記載され、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
特定の実施形態では、プライマー伸長ステップ中に使用される試薬は、プライマー−テンプレートのハイブリッドとの安定化三元複合体を形成するステップの前に、プライマー−テンプレートのハイブリッドとの接触から除去される。例えば、混合物中の１種類以上のヌクレオチドのタイプがその後の検査ステップでの三元複合体の形成または検出を妨害する場合、伸長ステップに使用されたヌクレオチド混合物の除去が望ましい場合がある。同様に、プライマー伸長ステップで使用されたポリメラーゼまたは補因子を除去して、検査ステップ中の望ましくない触媒活性を防止することが望ましい場合がある。除去に続いて洗浄ステップを行うことができ、不活性流体を使用して、伸長混合物の残留成分のプライマー−テンプレートのハイブリッドをパージする。
【０１０４】
洗浄ステップは、本明細書に記載されている様々なステップのいずれかの間で行うことができる。例えば、洗浄ステップは、三元複合体安定化条件下でプライマー−テンプレートのハイブリッドと接触させた他の試薬からプライマー−テンプレートのハイブリッドを分離するために有用であり得る。そのような洗浄は、混合物の検査を妨害することから、または以前に第１の混合物と接触していた基板上（または容器内）に形成される第２の混合物を汚染することから、１つ以上の試薬を取り除くことができる。例えば、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを、三元複合体安定化条件下でポリメラーゼおよび少なくとも１種類のヌクレオチドタイプと接触させて、第１の混合物を形成することができ、第１の混合物を検査することができる。任意選択で、検査の前に洗浄を行って、安定化三元複合体の形成に関与していない試薬を除去することができる。代替的または追加的に、検査ステップの後に洗浄を行って、プライマー−テンプレートのハイブリッドから第１の混合物の１つ以上の成分を除去することができる。次いで、プライマー−テンプレートのハイブリッドを、三元複合体安定化条件下でポリメラーゼおよび少なくとも１種類の他のヌクレオチドと接触させて、第２の混合物を形成し、第２の混合物を三元複合体形成について検査することができる。前と同様に、２回目の検査の前に任意選択の洗浄を行って、安定化三元複合体の形成に関与していない試薬を除去することができる。
【０１０５】
本開示の方法は、本明細書に記載されるステップの複数の繰り返しを含み得る。そのような繰り返しは、テンプレート核酸の配列またはテンプレート核酸のシグネチャーを提供することができる。特定の実施形態では、繰り返しにより、テンプレート核酸のシグネチャーを提供する塩基マルチプレットの連続を判定するために使用できる情報が生成される。プライマーを脱ブロックするステップ、または不要な反応物や生成物を様々なステップの間に洗浄する任意選択のステップと同様に、検査と伸長のステップを複数回繰り返すことができる。したがって、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドは、本明細書に記載の方法の少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００またはそれ以上のステップにかけることができる。全てのステップを繰り返す必要はなく、繰り返されるステップは、各繰り返しで同じ順序で発生する必要はない。例えば、テンプレートの各位置における次の正しいヌクレオチドは、リアルタイム分析を使用して（すなわち、シーケンシング方法の流体および検出ステップと並行して）同定することができる。しかしながら、リアルタイム分析は必須ではなく、代わりに、流体および検出ステップの一部または全てが完了した後で、次の正しいヌクレオチドを特定できる。
【０１０６】
したがって、本開示は、核酸を特徴付ける方法をさらに提供する。方法は、（ａ）プ伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である、ステップと、（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させ、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第２の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップと、を含み得、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する。任意選択で、方法は、（ｈ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第３の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップをさらに含み得、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの３つの連続の存在を判定する。さらなる任意選択として、方法は、（ｉ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップを含み、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第４の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップを含み得、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する。ステップ（ａ）から（ｆ）が繰り返される場合、それらは前回のステップ（ａ）から（ｆ）と同じ手順を使用して繰り返され得るが、同じ方法においてステップ（ａ）から（ｆ）の前回の１回以上の反復とは異なる、可逆的ターミネーターおよび伸長可能なヌクレオチド同族体を含むヌクレオチド同族体を伴うことは、当業者に理解できるであろう。
【０１０７】
本開示は、核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である、ステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、（ｅ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第２の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップと、を含み、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、方法をさらに提供する。任意選択で、方法は、（ｇ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第３の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップをさらに含み得、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの３つの連続の存在を判定する。さらなる任意選択として、方法は、（ｈ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、混合物中の第１、第２、および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第４の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップと、を含み、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する。ステップ（ａ）から（ｅ）が繰り返される場合、それらは前回のステップ（ａ）から（ｅ）と同じ手順を使用して繰り返され得るが、同じ方法においてステップ（ａ）から（ｅ）の前回の１回以上の反復とは異なる、可逆的ターミネーターおよび伸長可能なヌクレオチド同族体を含むヌクレオチド同族体を伴うことは、当業者に理解できるであろう。
【０１０８】
同様に提供されるのは、核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である、ステップと、（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させ、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｄ）テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップと、を含み、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、方法である。任意選択で、方法は、（ｈ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第１および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第２および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であるステップをさらに含み得、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの３つの連続の存在を判定する。さらなる任意選択として、方法は、（ｉ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第２および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であるステップを含み得、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する。ステップ（ａ）から（ｆ）が繰り返される場合、それらは前回のステップ（ａ）から（ｆ）と同じ手順を使用して繰り返され得るが、同じ方法においてステップ（ａ）から（ｆ）の前回の１回以上の反復とは異なる、可逆的ターミネーターおよび伸長可能なヌクレオチド同族体を含むヌクレオチド同族体を伴うことは、当業者に理解できるであろう。
【０１０９】
本開示は、核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体は伸長可能である、ステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、（ｅ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であるステップと、を含み、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、方法をさらに提供する。任意選択で、方法は、（ｇ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第１および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、混合物中の第２および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であるステップをさらに含み、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの３つの連続の存在を判定する。さらなる任意選択として、方法は、（ｈ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第２および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、混合物中の第１および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であるステップを含み、それにより、テンプレート核酸内の塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する。ステップ（ａ）から（ｅ）が繰り返される場合、それらは前回のステップ（ａ）から（ｅ）と同じ手順を使用して繰り返され得るが、同じ方法においてステップ（ａ）から（ｅ）の前回の１回以上の反復とは異なる、可逆的ターミネーターおよび伸長可能なヌクレオチド同族体を含むヌクレオチド同族体を伴うことは、当業者に理解できるであろう。
【０１１０】
本開示は、核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうちの３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それによりさらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｄ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｅ）４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、（ｇ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、（ｈ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されないステップと、を含み、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する方法をさらに提供する。任意選択で、方法は、（ｉ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されないステップと、を含み得、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの３つの連続の存在を判定する。さらなる選択肢として、方法は、（ｊ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されないステップと、を含み得、それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する。ステップ（ａ）から（ｇ）が繰り返される場合、それらは前回のステップ（ａ）から（ｇ）と同じ手順を使用して繰り返され得るが、同じ方法においてステップ（ａ）から（ｇ）の前回の１回以上の反復とは異なる、可逆的ターミネーター、伸長可能であるヌクレオチド同族体、および、使用されていないヌクレオチド同族体を含むヌクレオチド同族体を伴うことは、当業者に理解できるであろう。
【０１１１】
上述の方法の特定の実施形態では、同じ配列を有するテンプレートを使用していくつかのステップが繰り返される。場合によっては、同じテンプレート分子が使用される。例えば、テンプレートにハイブリダイズした伸長したプライマーを生成するステップを実行することができ、伸長したプライマーはテンプレートから除去でき、繰り返されるステップのために新しいプライマーをテンプレートにハイブリダイズすることができる。伸長したプライマーは、例えば熱または化学変性剤を含む二本鎖核酸を変性するための当該技術分野で公知の方法を使用して除去することができる。核酸を変性するための例示的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）、またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９８）に記載され、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。一般に、テンプレート核酸は、共有結合または強力な非共有結合を介して表面に結合する。したがって、核酸鎖の分離には効果的であるが、テンプレートの表面への結合を維持するのに十分穏やかな変性条件を使用できる。次いで、テンプレートを表面に残したまま、表面を洗浄またはフラッシュして、伸長したプライマーを除去できる。いくつかの実施形態では、伸長された鎖は、例えば、化学物質、ヌクレアーゼ酵素、または物理的剪断を介して分解され得る。代替的に、テンプレート分子は再利用されず、代わりに第２のテンプレート分子が方法の２回目の反復で使用され、第２の分子は、方法の１回目の反復で使用されたテンプレートと同じ配列のテンプレート領域を有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、（単一塩基の解像度で）１つの領域の配列を決定し、テンプレートの第２の領域にシグネチャーを提供する１つ以上の塩基マルチプレットの連続を決定することを特徴とすることができる。例えば、２つの領域は、シーケンシングされた領域がシグネチャー塩基マルチプレットの連続を有するテール領域に隣接するように連続し得る。このテールシグネチャーは、シーケンシングされた領域の上流または下流に位置し得る。２つの領域からの情報は、例えば、再シーケンシングアプリケーション中に、テンプレートの配列を参照配列と整列させるのを支援するために使用できる。
【０１１３】
したがって、本開示は、核酸を特徴付ける方法を提供する。方法は、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップと、（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させ、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域が、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、を含み得る。
【０１１４】
さらなる実施形態では、核酸を特徴付ける方法は、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類は伸長可能である、ステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、Ｉテンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域が、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、を含み得る。
【０１１５】
本開示は、核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうちの３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それによりさらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｄ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｅ）４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、（ｇ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域が少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、を含む、方法をさらに提供する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、（単一塩基の解像度で）２つの領域の配列を決定し、２つのシーケンシングされた領域に介在するテンプレートの第３の領域にシグネチャーを提供する１つ以上の塩基マルチプレットの連続を決定することを特徴とすることができる。２つの領域は、塩基マルチプレットの連続のシグネチャーや長さシグネチャーなどのシグネチャーを有するリンカーによって分離されたペアリードとして分析できる。典型的なペアリードの整列方法は、２つのシーケンシングされた領域を参照ゲノムに整列するだけでなく、整列の基礎としてリンカーシグネチャーを使用することによっても改善できる。
【０１１７】
したがって、本開示は、テンプレート核酸を特徴づけるペアリード方法を提供し、テンプレートは、テンプレート核酸の第１および第２の領域に隣接してそれらの間にあるリンカー領域を含み、方法は、（ａ）テンプレート核酸のリンカー領域に沿ってプライマーを伸長することにより、第１の領域の単一の塩基解像配列を取得し、それにより伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、（ｂ）（ｉ）ヌクレオチドの混合物を使用して伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの伸長したプライマーをさらに伸長するステップであって、ヌクレオチドの混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基のヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップ、および（ｉｉ）安定化三元複合体を検出するステップであって、安定化三元複合体がさらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含み、シグネチャーが、第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む塩基マルチプレットを含む、ステップによって、リンカー領域のシグネチャーを取得するステップと、（ｃ）さらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドのプライマーを伸長することにより、第２の領域の単一の塩基解像配列を取得するステップと、を含む。
【０１１８】
本開示はまた、核酸を特徴づけるペアリード方法を提供し、テンプレートは、テンプレート核酸の第１および第２の領域に隣接してそれらの間にあるリンカー領域を含み、方法は、（ａ）テンプレート核酸のリンカー領域に沿ってプライマーを伸長することにより、第１の領域の単一の塩基解像配列を取得し、それにより伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、（ｂ）（ｉ）ヌクレオチドの混合物を使用して伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの伸長したプライマーをさらに伸長するステップであって、ヌクレオチドの混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうち３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップ、（ｉｉ）ステップ（ｉ）のヌクレオチド同族体の不在下で、４種類の異なる塩基タイプの第４のヌクレオチド同族体でステップ（ｉ）の伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドをさらに伸長するステップ、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を検出するステップであって、シグネチャーが、４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含む塩基マルチプレットを含むステップ、によって、リンカー領域のシグネチャーを取得するステップと、（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）の伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドのプライマーを伸長することにより、第２の領域の単一の塩基解像配列を取得するステップと、を含む。
【０１１９】
本開示はまた、核酸を特徴づけるペアリード方法であって、テンプレートが、テンプレート核酸の第１および第２の領域に隣接し、それらの間にあるリンカー領域を含み、方法は、（ａ）テンプレート核酸のリンカー領域に沿ってプライマーを伸長することにより、第１の領域の単一の塩基解像配列を取得し、それにより、伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、（ｂ）伸長したプライマーに組み込まれたヌクレオチドのタイプを区別することなく、伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの伸長したプライマーをさらに伸長することによってリンカー領域のシグネチャーを取得するステップであって、シグネチャーが、リンカー領域内のヌクレオチドの数を含むステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドのプライマーを伸長することにより、第２の領域の単一の塩基解像配列を取得するステップと、を含む、方法を提供する。任意選択で、ステップ（ｂ）が、標識されたヌクレオチドと標識されたポリメラーゼを使用せずに実行される。任意選択で、ステップ（ｂ）が、伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドに組み込まれた異なるタイプのヌクレオチドを区別する標識を使用せずに実行される。任意選択で、ステップ（ｂ）が、伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを検出することなく実行される。
【０１２０】
上に例示されたペアリード方法は、核酸分子の一本鎖に沿ってプライマーを伸長することにより、テンプレート核酸の隣接領域をシーケンシングすることを可能にする。これは、第１のプライマーがテンプレートの第１の鎖に沿って伸長され、その後プライマー伸長産物がテンプレートから除去され、次にテンプレートが複製されて第２の鎖（すなわち、第１の鎖の相補体である第２の鎖）を生成し、次いで、第２の鎖に沿った第２のプライマーの伸長が続く、対となる末端方法とは対照的である。本明細書に記載のペアリード方法の特定の構成は、第２のペア配列リードを実行する前に、テンプレートから読み取られた第１の配列の産物を変性させるプロセスステップを含む必要はない。本明細書に記載のペアリード方法の特定の構成は、第２のプライマー伸長プロセスのための第２の鎖を生成するためにシーケンシングされた後、テンプレートの第１の鎖を複製するプロセスステップを含む必要はない。本明細書に記載されたペアリード方法の特定の構成では、２つのリードをそれぞれ取得するために、プライマーをテンプレートの逆鎖に沿って反対方向に伸長させる必要はない。
【０１２１】
本開示はまた、核酸を特徴付ける方法を提供する。方法は、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを有し、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップと、（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプのうちの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させ、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域が、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、（ｇ）第２のシーケンシングプロセスで伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を実行するステップであって、第２のシーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、ステップと、を含み得る。
【０１２２】
同様に提供されるのは、核酸を特徴付ける方法であって、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類は伸長可能である、ステップと、（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｃ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、（ｅ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域が少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、（ｆ）第２のシーケンシングプロセスで伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を実行するステップであって、第２のシーケンシングプロセスが、少なくとも２つのマルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出するステップと、を含む、方法である。
【０１２３】
別の実施形態では、核酸を特徴付ける方法は、（ａ）（ｉ）テンプレートにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長を含むシーケンシングプロセスを実行し、それによりプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを生成し、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３‘側であるテンプレートの第１の領域の配列を示すシグナルを検出するステップと、（ｉｉ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうちの３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それによりさらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、（ｄ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、（ｅ）４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用して、ステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、（ｇ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップであって、テンプレートの第１の領域が少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側である、ステップと、（ｈ）第２のシーケンシングプロセスで伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を実行するステップであって、第２のシーケンシングプロセスが少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、ステップと、を含む。
【０１２４】
本明細書に記載の方法を使用して得られるシグネチャーは、様々な用途を有することができ、そのいくつかが本明細書に例示されている。本明細書に記載の方法を使用して得られるシグネチャーの別の用途は、特定のテンプレート核酸に存在する繰り返し配列の数を提供することである。例えば、単一タンデムリピート（ＳＴＲ）または他の繰り返し配列要素を数えるための米国特許出願公開第２０１７／０１３７８７３Ａ１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載された方法は、本明細書に記載の方法を使用するように改変することができる。代替的に、本明細書に記載の方法またはシグネチャーは、繰り返し配列要素を数えること以外の目的で使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法は、繰り返し配列単位を含まないテンプレート配列に使用することができる。そのような場合、テンプレートまたはテンプレートに由来するシグネチャーは、繰り返し配列単位を欠く可能性があり、欠けている繰り返し単位の長さは、少なくとも３、４、５、１０またはそれ以上のヌクレオチド長である。代替的または追加的に、テンプレートまたはテンプレートに由来するシグネチャーは、互いに隣接する繰り返し単位を欠いている可能性がある。例えば、テンプレートまたはシグネチャー内の任意の繰り返し単位は、少なくとも３、４、５、１０、またはそれ以上のヌクレオチド長である非繰り返し配列の領域によって互いに分離することができる。
【０１２５】
安定化三元複合体、または三元複合体を形成する（すなわち、その形成に参加する）ことができる成分は、固体支持体に結合させることができる。固体支持体は、生化学分析に使用される様々な材料のいずれかから作成できる。適切な材料には、ガラス、ポリマー材料、シリコン、石英（溶融シリカ）、ホウフロートガラス、シリカ、シリカベースの材料、炭素、金属、光ファイバーまたは光ファイバーの束、サファイア、またはプラスチック材料が含まれ得る。特定の材料は、特定の用途に望まれる特性に基づいて選択することができる。例えば、所望の波長の放射線を透過する材料は、その波長の放射線を利用する分析技法に有用である。逆に、特定の波長の放射線を通過させない材料（例えば、不透明、吸収性、または反射性）を選択することが望ましい場合がある。利用できる材料の他の特性は、本明細書に記載されているものなどの下流プロセスで使用される特定の試薬に対する不活性または反応性、または操作の容易さ、または製造コストの低さである。
【０１２６】
特に有用な固体支持体は、ビーズまたはミクロスフェアなどの粒子である。ビーズの集団は、安定化三元複合体の集団または複合体を形成することができる成分（例えば、ポリメラーゼ、テンプレート、プライマー、またはヌクレオチド）の結合に使用することができる。いくつかの実施形態では、各ビーズが単一のタイプの安定化三元複合体または複合体を形成することができる単一のタイプの成分を有する構成を使用することが有用であり得る。例えば、個々のビーズは、単一タイプの三元複合体、単一タイプのテンプレート対立遺伝子、単一タイプの対立遺伝子特異的プライマー、単一タイプの遺伝子座特異的プライマー、または単一タイプのヌクレオチドに結合させることができる。代替的に、異なるタイプの成分をビーズごとに分離する必要はない。したがって、単一のビーズは、複数の異なるタイプの三成分複合体、テンプレート核酸、プライマー、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッド、および／またはヌクレオチドを担持することができる。ビーズの組成は、例えば、使用される結合の形式、化学物質、および／または方法に応じて異なり得る。例示的なビーズ組成物は、タンパク質および核酸捕捉法で使用される、固体支持体、およびそれに付与された化学的機能性を含む。そのような組成物には、例えば、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メラミン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、またはセファロース（商標）、セルロース、ナイロン、クロスなどの架橋デキストラン、架橋されたミセルおよびテフロン（商標）、ならびに参照により本明細書に組み込まれている、“Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ”  ｆｒｏｍ  Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｄ．，に記載されている他の材料が含まれる。
【０１２７】
粒子、ビーズ、またはミクロスフェアの形状も、多種多様な異なる形態および形状に対応することができる。例えば、それらは、対称的な形状（例えば、球形または円筒形）、または不規則な形状（例えば、制御された細孔ガラス）であり得る。加えて、ビーズは多孔性であり得、したがって、三元複合体またはその成分の捕捉に利用可能な表面積を増加させる。本明細書で使用されるビーズの例示的なサイズは、ナノメートルからミリメートル、または約１０ｎｍ〜１ｍｍの範囲であり得る。
【０１２８】
特定の実施形態では、ビーズは、配列され得るか、さもなければ空間的に区別され得る。使用され得る例示的なビーズベースのアレイには、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なＢｅａｄＣｈｉｐ（商標）アレイ、あるいは米国特許第６，２６６，４５９号、第６，３５５，４３１、第６，７７０，４４１号、第６，８５９，５７０号、もしくは第７，６２２，２９４号、またはＰＣＴ公開第ＷＯ００／６３４３７号に記載されているようなアレイが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ビーズは、固体支持体上のウェルなどの別々の場所に配置することができ、それによって各場所は単一のビーズを収容する。代替的に、ビーズが存在する別個の場所は、例えば、参照によりそのそれぞれが本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０２６３９２３Ａ１号、同第２００４／０２３３４８５Ａ１号、同第２００４／０１３２２０５Ａ１号、もしくは同第２００４／０１２５４２４Ａ１号に記載されているように、複数のビーズをそれぞれ含むことができる。
【０１２９】
上述のビーズアレイの実施形態から認識されるように、本開示の方法は、本明細書に記載の方法で複数の異なるタイプの核酸が並行して検出される多重フォーマットで実行することができる。本明細書に記載の方法の１つ以上ステップを使用して異なるタイプの核酸を連続的に処理することも可能であるが、並行処理は、コストの節約、時間の節約、および条件の均一性を提供できる。本開示の装置または方法は、少なくとも２、１０、１００、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０９、またはそれ以上の異なる核酸を含むことができる。代替的にまたは追加的に、本開示の装置または方法は、多くとも１×１０９、１×１０６、１×１０５、１×１０４、１×１０３、１００、１０、２、またはそれ以下、異なる核酸を含むことができる。したがって、装置または方法において有用であるとして本明細書に示される様々な試薬または生成物（例えば、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドまたは安定化三元複合体）は、これらの範囲の異なるタイプまたは種を有するように多重化され得る。
【０１３０】
使用できる市販のアレイのさらなる例には、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）アレイが含まれる。いくつかの実施形態によれば、スポットアレイ基質も使用することができる。例示的なスポットアレイは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）アレイである。有用な別のアレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＳｕｒｅＰｒｉｎｔ（商標）テクノロジーなどのインクジェット印刷方法を使用して製造されたものである。
【０１３１】
他の有用なアレイ基質には、核酸シーケンシングの用途で使用されるものが含まれる。例えば、ゲノムフラグメントの付加アンプリコン（しばしばクラスターと呼ばれる）を結合するために使用されるアレイは、特に有用である。本明細書で使用できる核酸シーケンシングアレイの例には、  Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０６６７８号、ＷＯ０４／０１８４９７、もしくはＷＯ０７／１２３７４４、米国特許第７，０５７，０２６号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，３２９，４９２号、もしくは同第７，４０５，２８１号、または米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されたものが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
核酸は、単一分子レベルまたは集合レベルでの検出を提供する方法で支持体に結合させることができる。例えば、支持体上の１つの核酸分子上に形成される個々の安定化三元複合体が、支持体上の核酸分子上に形成される全ての隣接する三元複合体と区別できるように、複数の異なる核酸を固体支持体に結合させることができる。このように、１つ以上の異なるテンプレートは、各単一分子テンプレートが物理的に分離され、単一分子が固体支持体上の他の全ての分子から解像されるように検出される形式で、固体支持体に結合させることができる。
【０１３３】
代替的に、本開示の方法は、１つ以上核酸アンサンブルについて実施することができ、アンサンブルは、共通のテンプレート配列を有するヌクレオチドの集団である。クラスター法を使用して、１つ以上のアンサンブルを固体支持体に結合させることができる。このように、アレイは複数のアンサンブルを持つことができ、アンサンブルのそれぞれはそのフォーマットでクラスターまたはアレイフィーチャーと呼ばれる。クラスターは、ブリッジ増幅またはエマルジョンＰＣＲなどの当該技術分野で公知の方法を使用して形成することができる。有用なブリッジ増幅方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６５８号もしくは同第７，１１５，４００号、または米国特許出願公開第２００２／００５５１００Ａ１号、同第２００４／０００２０９０Ａ１号、同第２００４／００９６８５３Ａ１号、同第２００７／０１２８６２４Ａ１号、もしくは同第２００８／０００９４２０Ａ１号に記載される。エマルジョンＰＣＲ方法には、例えば、例えば、Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：８８１７−８８２２（２００３）、ＷＯ０５／０１０１４５、または米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３Ａ１号もしくは同第２００５／００６４４６０Ａ１号に記載される方法が含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。表面上の核酸を増幅するための別の有用な方法は、例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８）、またはＵＳ２００７／００９９２０８Ａ１に記載されているローリングサークル増幅（ＲＣＡ）であり、それぞれこれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
特定の実施形態では、安定化三元複合体、ポリメラーゼ、核酸、またはヌクレオチドは、フローセル表面またはフローセル内の固体支持体に結合される。フローセルは、支持体に結合した三元複合体に接触する流体チャンバーに溶液を出し入れすることにより、便利な流体操作を可能にする。フローセルはまた、流体で操作される成分の検出を提供する。例えば、検出器は、安定化三元複合体の形成により固体支持体に動員される標識からのシグナルなどの固体支持体からのシグナルを検出するように配置することができる。使用することができる例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８Ａ１号、ＷＯ０５／０６５８１４、または米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５Ａ１号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
本開示は、例えば、本明細書に記載される方法を使用して、核酸を検出するためのシステムを提供する。例えば、システムは、ヌクレオチドの存在下でのポリメラーゼとプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとの間の相互作用の検査を含み、テンプレート核酸配列における１つ以上の塩基を同定することを含む反応のために構成され得る。任意選択で、システムは、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッド、ポリメラーゼ、および次の正しいヌクレオチドの間の少なくとも１つの安定化三元複合体を形成するステップ、安定化三元複合体を検出するステップ、各プライマー−テンプレートのハイブリッドのプライマーを伸長するステップ、および／またはヌクレオチド、ヌクレオチドの配列、またはテンプレートに存在する塩基マルチプレットの連続を同定するステップを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つ以上のステップを実行するための成分および試薬を含む。
【０１３６】
本開示のシステムは、核酸検出方法を実施するための容器または固体支持体を含み得る。例えば、システムは、アレイ、フローセル、マルチウェルプレート、または他の便利な装置を含み得る。容器または固体支持体は取り外し可能であり得、それにより、それをシステムに配置したり、システムから取り外したりすることができる。したがって、システムは、複数の容器または固体支持体を順次処理するように構成することができる。システムは、本明細書に記載の１つ以上の試薬（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、テンプレート核酸、三元複合体形成用のヌクレオチド、プライマー伸長用のヌクレオチド、脱ブロッキング試薬またはそのような成分の混合物）を含むためのリザーバを有する流体システムを含むことができる。流体システムは、例えば、チャネルまたは液滴移送装置（例えば、エレクトロウェッティング装置）を介して、試薬を容器または固体支持体に送達するように構成され得る。様々な検出装置のいずれも、試薬が相互作用する容器または固体支持体を検出するように構成することができる。例には、発光検出器、表面プラズモン共鳴検出器、および当該技術分野で知られている他のものが含まれる。本明細書のシステムで使用するために容易に改変することができる流体および検出構成要素を有する例示的なシステムには、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／０２８０９７５Ａ１号とその優先権主張米国特許出願第６２／４８１，２８９号、米国特許第８，２４１，５７３号、同第７，３２９，８６０号、もしくは同第８，０３９，８１７号、または米国特許出願公開第２００９／０２７２９１４Ａ１号、もしくは同第２０１２／０２７０３０５Ａ１号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３７】
任意選択で、本開示のシステムは、システム成分を動作させるように構成されたコンピュータ処理ユニット（ＣＰＵ）をさらに含む。同一または異なるＣＰＵがシステムと対話して、信号（例えば、本明細書に記載の方法で検出された信号）を取得、保存、および処理できる。特定の実施形態では、ＣＰＵを使用して、信号から、テンプレート核酸の特定の場所に存在するヌクレオチドの同一性を決定することができる。場合によっては、ＣＰＵは、検出された信号からテンプレートのヌクレオチドの配列を特定する。特定の実施形態では、ＣＰＵは、伸長混合物中のヌクレオチドの組成から判定されるように、テンプレートにハイブリダイズするプライマーの末端のヌクレオチドの同一性に基づいて、およびプライマー−テンプレートのハイブリッドを使用して実行された特定の結合反応から判定される、次の正しいヌクレオチドの同一性に基づいて、配列中に存在する塩基マルチプレットを同定するようにプログラムされる。
【０１３８】
有用なＣＰＵには、例えば、パーソナルコンピュータシステム、サーバーコンピュータシステム、シンクライアント、シッククライアント、ハンドヘルドもしくはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースのシステム、セットトップボックス、プログラマブルコンシューマエレクトロニクス、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータシステム、メインフレームコンピュータシステム、スマートフォン、または上記のシステムもしくはデバイスのいずれかを含む分散クラウドコンピューティング環境などのうちの１つ以上が含まれる。ＣＰＵは、１つ以上のプロセッサまたは処理ユニット、ＲＡＭおよび不揮発性メモリを含み得るメモリアーキテクチャを含むことができる。メモリアーキテクチャは、取り外し可能／取り外し不能、揮発性／不揮発性のコンピュータシステム記憶媒体をさらに含むことができる。さらに、メモリアーキテクチャには、ハードドライブ、リムーバブル、不揮発性磁気ディスクから読み取りまたは書き込みを行う磁気ディスクドライブ、および／またはＣＤ−ＲＯＭもしくはＤＶＤ−ＲＯＭなどの取り外し可能な不揮発性光ディスクから読み取りまたは書き込みを行う光ディスクドライブなどの、取り外し不能な不揮発性の磁気メディアを読み書きするための１つ以上のリーダーを含んでもよい。ＣＰＵはまた、様々なコンピュータシステム可読媒体を含むことができる。このようなメディアは、揮発性および不揮発性メディア、取り外し可能および取り外し不能メディアなど、クラウドコンピューティング環境からアクセス可能な任意の利用可能なメディアであり得る。
【０１３９】
メモリアーキテクチャは、本明細書に記載の方法の１つ以上のステップを実行するように構成された実行可能命令として実装された少なくとも１つのプログラムモジュールを有する少なくとも１つのプログラム製品を含み得る。例えば、実行可能な命令には、オペレーティングシステム、１つ以上のアプリケーションプログラム、他のプログラムモジュール、およびプログラムデータが含まれる場合がある。一般に、プログラムモジュールは、本明細書に記載されている特定のタスクを実行するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、ロジック、データ構造などを含み得る。
【０１４０】
ＣＰＵの構成要素は、メモリバスまたはメモリコントローラ、周辺バス、高速グラフィックスポート、および様々なバスアーキテクチャのいずれかを使用するプロセッサまたはローカルバスを含む、いくつかの種類のバス構造の１つ以上として実装できる内部バスによって結合できる。限定ではなく例として、このようなアーキテクチャには、業界標準アーキテクチャ（ＩＳＡ）バス、マイクロチャネルアーキテクチャ（ＭＣＡ）バス、拡張ＩＳＡ（ＥＩＳＡ）バス、ビデオエレクトロニクス標準協会（ＶＥＳＡ）ローカルバス、および周辺機器相互接続（ＰＣＩ）バスが含まれる。
【０１４１】
ＣＰＵは、キーボード、ポインティングデバイス（マウスなど）、グラフィカルユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）などのディスプレイ、または使用と核酸検出システムの相互作用を促進するその他のデバイスなど、１つ以上の外部デバイスとオプションで通信できる。同様に、ＣＰＵは（ネットワークカード、モデムなどを介して）他のデバイスと通信できる。このような通信は、Ｉ／Ｏインターフェースを介して発生し得る。さらに、本明細書のシステムのＣＰＵは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、一般的なワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、および／または適切なネットワークアダプタを介したパブリックネットワーク（例えば、インターネット）などの１つ以上のネットワークと通信できる。
【０１４２】
この開示は、核酸を特徴付けるためのキットをさらに提供する。キットは、本明細書に記載の方法の１つ以上を実行するための試薬を含むことができる。例えば、キットは、１つ以上のプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドと混合されたときに安定化三元複合体を生成するための試薬を含み得る。より具体的には、キットは、例えば、以下の実施例のセクションに示される方法を含む、本明細書に示される方法で使用されるヌクレオチドの混合物の１つ以上を含み得る。ヌクレオチド混合物に加えて、キットは、安定化三元複合体を形成することができるポリメラーゼおよび／または伸長ステップに使用されるポリメラーゼを含むことができる。ヌクレオチド、ポリメラーゼ、またはその両方は、例えば、様々な方法の文脈で本明細書に示されるように、外因性標識を含み得る。
【０１４３】
したがって、本明細書に記載の方法を実行する際に使用される成分または物品のいずれも、キットに有用にパッケージ化することができる。例えば、キットは、本明細書に記載の方法を実施する際に使用される成分または物品の一部、多く、または全てを含むように梱包することができる。例示的な成分としては、例えば、本明細書および本明細書に引用される参考文献に記載される、標識ヌクレオチド（例えば、伸長可能な標識ヌクレオチド）、ポリメラーゼ（標識または非標識）、ターミネーター部分を有するヌクレオチド（例えば、非標識、可逆的な終結ヌクレオチド）、脱ブロッキング試薬などが挙げられる。そのような試薬のいずれかは、例えば、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドの分析のための後続のステップの１つ以上を実行するために使用される緩衝液、成分、および／または物品の一部、多く、または全てを含み得る。キットはプライマーまたはテンプレート核酸を含む必要はない。むしろ、キットのユーザーは、キットの成分と組み合わせられるプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを提供することができる。
【０１４４】
１つ以上の補助試薬もキットに含めることができる。そのような補助試薬は、上記で例示された試薬のいずれかおよび／または本明細書に記載の方法を実施するのに有用な他のタイプの試薬を含み得る。説明書をさらにキットに含めることができる。説明書は、例えば、本明細書に記載の方法で使用される任意の成分または物品を作製し、本明細書に記載の方法の任意の実施形態の１つ以上のステップを実行するための手順および／またはプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを使用する後続の分析ステップのいずれかを実行するための指示を含み得る。
【０１４５】
特定の実施形態では、キットは、試薬を収容するためのリザーバを有し、試薬をリザーバから検出機器に移送するための流体成分をさらに有するカートリッジを含む。例えば、流体成分は、安定化三元複合体が検出されるフローセルに試薬を移送するように構成され得る。本開示のキット（またはシステム）に含まれ得る例示的な流体カートリッジは、米国特許出願公開第２０１８／０２８０９７５号およびその優先権主張米国特許出願第６２／４８１，２８９号に記載され、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
追加の実施形態
１．核酸を特徴付ける方法であって、
（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、
混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が、可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１つが伸長可能である、ステップと、
（ｂ）伸長したプライマーのハイブリッドを、異なる塩基タイプのうちの少なくとも１種類についてのヌクレオチド同族体およびポリメラーゼと接触させて、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、
（ｃ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、
（ｄ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む、方法。
【０１４７】
２．
（ｅ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）から（ｃ）を繰り返すステップと、
（ｆ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【０１４８】
３．ステップ（ａ）において、第２、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が、伸長可能である、実施形態２に記載の方法。
【０１４９】
４．
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第２の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップをさらに含み、
それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、実施形態３に記載の方法。
【０１５０】
５．
（ｈ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第３の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップと、
（ｉ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第４の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップと、をさらに含み、
それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する、実施形態３または４に記載の方法。
【０１５１】
６．核酸の配列を決定するために塩基マルチプレットの４つの連続を整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含む、実施形態５に記載の方法。
【０１５２】
７．ステップ（ａ）において、第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、実施形態２に記載の方法。
【０１５３】
８．
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップをさらに含む、実施形態７に記載の方法。
【０１５４】
９．
（ｈ）ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、第１および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第２および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップをさらに含む、実施形態８に記載の方法。
【０１５５】
１０．伸長したプライマーのハイブリッドから伸長したプライマーを除去し、次いで第２のプライマーをテンプレートにハイブリダイズした後、テンプレート核酸を使用してステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返す、実施形態２〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
１１．ステップ（ａ）で使用されるテンプレート核酸と同じ配列を有する第２のテンプレート核酸分子を使用してステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返す、実施形態２〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
１２．ステップ（ａ）のプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドが、シーケンシングプロセス中のポリメラーゼ伸長の産物であり、シーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、実施形態２に記載の方法。
【０１５８】
１３．テンプレートの配列を参照ゲノムの領域に整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含み、整列させることが、参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列に整列させることによって実行される、実施形態１２に記載の方法。
【０１５９】
１４．（ｇ）第２のシーケンシングプロセスにおいて伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップをさらに含み、第２のシーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、実施形態１３に記載の方法。
【０１６０】
１５．テンプレートの配列を参照ゲノムの領域に整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含み、整列させることが、参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続、および少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列に整列させることによって実行される、実施形態１４に記載の方法。
【０１６１】
１６．第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体が、ステップ（ｃ）で検出される外因性標識を含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６２】
１７．第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体が、ステップ（ｃ）で検出される外因性標識を含まない、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
１８．ポリメラーゼが、ステップ（ｃ）で検出される外因性標識を含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
１９．ステップ（ｂ）が、伸長したプライマーのハイブリッドとの接触から混合物を除去した後に実行される、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
２０．核酸を特徴付ける方法であって、
（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成し、伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成する条件下で、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、
混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が、可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１つが伸長可能である、ステップと、
（ｂ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、
（ｃ）第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む、方法。
【０１６６】
２１．
（ｄ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとして伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、
（ｅ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む、実施形態２０に記載の方法。
【０１６７】
２２．ステップ（ａ）において、第２１、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が、伸長可能である、実施形態２に記載の方法。
【０１６８】
２３．
（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第３、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第２の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む、ステップをさらに含み、
それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、実施形態３に記載の方法。
【０１６９】
２４．
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第３の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むステップと、
（ｈ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１、第２、および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能であり、ステップ（ｃ）で判定された塩基マルチプレットが、第４の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含むステップと、をさらに含み、
それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する、実施形態２３に記載の方法。
【０１７０】
２５．核酸の配列を決定するために塩基マルチプレットの４つの連続を整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含む、実施形態２４に記載の方法。
【０１７１】
２６．ステップ（ａ）において、第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、実施形態２１に記載の方法。
【０１７２】
２７．
（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第３および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第１および第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップをさらに含む、実施形態２６に記載の方法。
【０１７３】
２８．
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップであって、第１および第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体が可逆的ターミネーターを含み、混合物中の第２および第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が伸長可能である、ステップをさらに含む、実施形態２７に記載の方法。
【０１７４】
２９．伸長したプライマーのハイブリッドから伸長したプライマーを除去し、次いで第２のプライマーをテンプレートにハイブリダイズした後、テンプレート核酸を使用してステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返す、実施形態２１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
３０．ステップ（ａ）で使用されるテンプレート核酸と同じ配列を有する第２のテンプレート核酸分子を使用してステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返す、実施形態２１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１７６】
３１．ステップ（ａ）のプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドが、シーケンシングプロセス中のポリメラーゼ伸長の産物であり、シーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、実施形態２１に記載の方法。
【０１７７】
３２．テンプレートの配列を参照ゲノムの領域に整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含み、整列させることが、参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列に整列させることによって実行される、実施形態３１に記載の方法。
【０１７８】
３３．（ｆ）第２のシーケンシングプロセスにおいて伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップをさらに含み、第２のシーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、実施形態３２に記載の方法。
【０１７９】
３４．テンプレートの配列を参照ゲノムの領域に整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含み、整列させることが、参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続、および少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列に整列させることによって実行される、実施形態３３に記載の方法。
【０１８０】
３５．第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体が、ステップ（ｂ）で検出される外因性標識を含む、実施形態２０〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０１８１】
３６．第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体が、ステップ（ｂ）で検出される外因性標識を含まない、実施形態２０〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０１８２】
３７．ポリメラーゼが、ステップ（ｂ）で検出される外因性標識を含む、実施形態２０〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０１８３】
３８．核酸を特徴付ける方法であって、
（ａ）伸長したプライマーのハイブリッドを生成する条件下でプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドをポリメラーゼおよびヌクレオチドの混合物と接触させるステップであって、混合物が、４種類異なる塩基タイプのうち、３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップと、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長し、それにより、さらに伸長したプライマーのハイブリッドを生成するステップと、
（ｃ）さらに伸長したプライマーのハイブリッド、ポリメラーゼおよびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を形成するステップと、
（ｄ）次の塩基をテンプレート内の他の塩基タイプから区別するために、安定化三元複合体を検出するステップと、
（ｅ）４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含むテンプレート核酸内の塩基マルチプレットの存在を判定するステップと、を含む、方法。
【０１８４】
３９．
（ｆ）プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドとしてさらに伸長したプライマーのハイブリッドを使用してステップ（ａ）から（ｄ）を繰り返すステップと、
（ｇ）テンプレート核酸における少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続の存在を判定するステップと、をさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
【０１８５】
４０．
（ｈ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体が第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されずに他の３種類のヌクレオチド同族体が使用されるステップをさらに含み、
それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの２つの連続の存在を判定する、実施形態３９に記載の方法。
【０１８６】
４１．
（ｉ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであって、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されずに他の３種類のヌクレオチド同族体が使用されるステップと、
（ｊ）ステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返すステップであて、第２の塩基タイプのヌクレオチド同族体が第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体に置き換えられ、第３の塩基タイプのヌクレオチド同族体がステップ（ａ）で使用されずに他の３種類のヌクレオチド同族体が使用されるステップと、をさらに含み、
それにより、テンプレート核酸における塩基マルチプレットの４つの連続の存在を判定する、実施形態４０に記載の方法。
【０１８７】
４２．核酸の配列を決定するために塩基マルチプレットの４つの連続を整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含む、実施形態４１に記載の方法。
【０１８８】
４３．生成されたプライマー−テンプレート核酸を使用してステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返し、伸長したプライマーのハイブリッドから伸長したプライマーを除去し、別のプライマーをテンプレートにハイブリダイズする、実施形態４１または４２に記載の方法。
【０１８９】
４４．ステップ（ａ）で使用されるプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドと同じ配列を有するプライマー−テンプレート核酸のハイブリッド分子を使用してステップ（ａ）から（ｇ）を繰り返す、実施形態４１または４２に記載の方法。
【０１９０】
４５．ステップ（ａ）のプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドが、シーケンシングプロセス中のポリメラーゼ伸長の産物であり、シーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、実施形態３９に記載の方法。
【０１９１】
４６．テンプレートの配列を参照ゲノムの領域に整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含み、整列させることが、参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列に整列させることによって実行される、実施形態４５に記載の方法。
【０１９２】
４７．シーケンシングプロセスが、テンプレートの各位置で安定化三元複合体を検出するステップ、テンプレートの各位置でプライマーに組み込まれた標識ヌクレオチドを検出するステップ、プライマーにライゲーションされた標識オリゴヌクレオチドを検出するステップ、テンプレートの各位置でプライマーに組み込まれたヌクレオチドにより生成されるピロリン酸塩を検出するステップ、またはテンプレートの各位置でプライマーに組み込まれたヌクレオチドにより生成されるプロトンを検出するステップ、を含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
４８．（ｈ）第２のシーケンシングプロセスにおいて伸長したプライマーのポリメラーゼ伸長を行うステップをさらに含み、第２のシーケンシングプロセスが、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列を示すシグナルを検出する、実施形態４７に記載の方法。
【０１９４】
４９．テンプレートの配列を参照ゲノムの領域に整列させるコンピュータ支援プロセスをさらに含み、整列させることが、参照ゲノムの領域を、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して３’側であるテンプレートの配列、少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続、および少なくとも２つの塩基マルチプレットの連続に対して５’側であるテンプレートの配列に整列させることによって実行される、実施形態４８に記載の方法。
【０１９５】
５０．第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体が、ステップ（ｄ）で検出される外因性標識を含む、実施形態２１〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
５１．第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体が、ステップ（ｄ）で検出される外因性標識を含まない、実施形態２１〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
５２．ポリメラーゼが、ステップ（ｄ）で検出される外因性標識を含む、実施形態２１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
５３．ステップ（ｂ）が、伸長したプライマーのハイブリッドとの接触から混合物を除去した後に実行される、実施形態３６〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
５４．ステップ（ｃ）が、４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体を除去した後に実行される、実施形態３６〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
５５．テンプレート核酸を特徴付ける方法であって、テンプレートが、テンプレート核酸の第１の領域と第２の領域に隣接し、それらの間にあるリンカー領域を含み、
（ａ）テンプレート核酸の第１の領域に沿ってプライマーを伸長することにより第１の領域の単一塩基の解像配列を取得し、それにより伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）
（ｉ）ヌクレオチドの混合物を使用して伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの伸長したプライマーをさらに伸長するステップであって、ヌクレオチドの混合物が、第１、第２、第３、および第４の異なる塩基タイプのヌクレオチド同族体を含み、第１の塩基タイプのヌクレオチド同族体が、可逆的ターミネーターを含み、第２、第３、または第４の塩基タイプのヌクレオチド同族体のうちの少なくとも１種類が伸長可能である、ステップ、および
（ｉｉ）安定化三元複合体を検出するステップであって、安定化三元複合体が、さらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含み、シグネチャーが、第１の塩基タイプとそれに続く次の塩基を含む塩基マルチプレットを含む、ステップ、によりリンカー領域のシグネチャーを取得するステップと、
（ｃ）さらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドのさらに伸長したプライマーを伸長することにより、第２の領域の単一塩基の解像配列を取得するステップと、を含む、方法。
【０２０１】
５６．核酸を特徴付ける方法であって、テンプレートが、テンプレート核酸の第１の領域と第２の領域に隣接し、それらの間にあるリンカー領域を含み、
（ａ）テンプレート核酸の第１の領域に沿ってプライマーを伸長することにより第１の領域の単一塩基の解像配列を取得し、それにより伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）
（ｉ）ヌクレオチドの混合物を使用して、伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの伸長したプライマーをさらに伸長するステップであって、ヌクレオチドの混合物が、４種類の異なる塩基タイプのうち３種類以下のヌクレオチド同族体を含む、ステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のヌクレオチド同族体の不在下で４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のヌクレオチド同族体で伸長したプライマーのハイブリッドをさらに伸長するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のさらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、およびテンプレート内の次の塩基のヌクレオチド同族体を含む安定化三元複合体を検出するステップであって、シグネチャーが、４種類の異なる塩基タイプのうちの第４のものとそれに続く次の塩基を含む塩基マルチプレットを含む、ステップ、によりリンカー領域のシグネチャーを取得するステップと、
（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）のさらに伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドのさらに伸長したプライマーを伸長することにより、第２の領域の単一塩基の解像配列を取得するステップと、を含む、方法。
【０２０２】
５７．核酸を特徴付ける方法であって、テンプレートが、テンプレート核酸の第１の領域と第２の領域に隣接し、それらの間にあるリンカー領域を含み、
（ａ）テンプレート核酸の第１の領域に沿ってプライマーを伸長することにより第１の領域の単一塩基の解像配列を取得し、それにより伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを生成するステップと、
（ｂ）伸長したプライマーに組み込まれたヌクレオチドのタイプを区別せずに、伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの伸長したプライマーをさらに伸長することにより、リンカー領域のシグネチャーを取得するステップであって、シグネチャーが、前記リンカー領域内のヌクレオチドの数を含む、ステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドの伸長したプライマーを伸長することにより、第２の領域の単一塩基の解像配列を取得するステップと、を含む、方法。
【０２０３】
５８．ステップ（ｂ）が、標識されたヌクレオチドと標識されたポリメラーゼを使用せずに実行される、実施形態５７に記載の方法。
【０２０４】
５９．ステップ（ｂ）が、伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドに組み込まれた異なるタイプのヌクレオチドを区別する標識を使用せずに実行される、実施形態５７に記載の方法。
【０２０５】
６０．ステップ（ｂ）が、伸長したプライマー−テンプレートのハイブリッドを検出することなく実行される、実施形態５７に記載の方法。
【０２０６】
実施例１
３種類の伸長可能なヌクレオチドと１種類の可逆的な終結ヌクレオチドを使用した混合伸長
この実施例では、テンプレート核酸の４つのジヌクレオチドの連続を判定する方法について説明する。１つ以上のジヌクレオチドの連続をテンプレートのシグネチャーとして使用できる。４つのジヌクレオチドの連続を整列させて、単一のヌクレオチドの解像度でテンプレートの配列を決定できる。
【０２０７】
テンプレート核酸は、光学的に透明なフローセルの内面に結合している。プライマーはテンプレート核酸にハイブリダイズする。プライマーは、３’可逆的なターミネーター部分を含み、ターミネーター部分は、例えば、化学合成を介して、または可逆的な終結ヌクレオチドを使用するポリメラーゼ触媒伸長を介して導入されている。可逆的ターミネーター部分の脱ブロッキングに続くプライマーの伸長は、プライマーに以下のヌクレオチドの配列を付加すると予想される。
５’−ＴＡＧＣＣＡＴＣＴＧＡＣＴＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＴＴ−３’（配列番号３）
【０２０８】
プライムされた核酸テンプレートは、次のようにＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）手順にかけられる。
（１）第１のヌクレオチドの任意選択の検査−ポリメラーゼと４種類の標識ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）からなる検査溶液を、プライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、および次の正しいヌクレオチドからなる安定化三元複合体を形成する条件下でフローセルに導入する。三元複合体は、三元複合体に参加するときに各ヌクレオチドによって生成されるシグナルを区別する条件下で検出される。次の正しいヌクレオチドはｄＴＴＰ結合を示すシグナルを生成するため、伸長産物の第１のヌクレオチドはＴとして識別される。
【０２０９】
（２）脱ブロッキング−検査溶液をフローセルから除去し、プライマーから可逆的ターミネーター部分を除去する脱ブロッキング試薬と交換し、それによりプライマーを伸長可能にする。
【０２１０】
（３）１回目の実行の伸長−脱ブロッキング溶液がフローセルから除去され、ポリメラーゼと３種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）と可逆的な終結ヌクレオチド（ｒｔｄＴＴＰ）を含む伸長混合物で置き換えられる。ヌクレオチドは標識されていない。フローセルは、次のｒｔｄＴＴＰが組み込まれるまでプライマー伸長が可能な条件でインキュベートされる。
【０２１１】
（４）１回目の実行の検査−検査溶液を安定化三元複合体を形成する条件下でフローセルに導入し、三元複合体を検出して、ｒｔｄＴＴＰに続くヌクレオチドの同一性を判定する。ジヌクレオチドはＴＮとして識別され、Ｔは組み込まれたｒｔｄＴＴＰであり、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧのいずれか１種類である。１つの構成では、伸長と検査ステップは、伸長混合物を検査溶液で置き換えることによって流体的に分離される。代替的に、伸長混合物および試験溶液は、フローセル中に一緒に存在することができる（例えば、ステップ（３）および（４）が効果的に組み合わされるように、共送達または付加的送達を介して）。
【０２１２】
（５）１回目の実行が完了したことを示すシグナル対ノイズ減衰までステップ（２）〜（４）を繰り返す−結果はジヌクレオチド［ＴＡ］［ＴＣ］［ＴＧ］［ＴＡ］［ＴＡ］［ＴＧ］［ＴＴ］［ＴＴ］の連続であり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２１３】
（６）１回目の実行の伸長産物をストリップする−フローセルを化学変性剤および／または熱で処理して、伸長したプライマーをテンプレート核酸から除去する。
【０２１４】
（７）プライマーの再適用−フローセルは、以前に使用されたものと同じ配列および可逆的ターミネーターを有するプライマーとともにインキュベートされ、それにより、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを再形成する。
【０２１５】
（８）任意選択で、ステップ（１）に記載したように、１回目のヌクレオチドを再度検出する。
【０２１６】
（９）脱ブロッキングは、ステップ（２）と同様に実行される。
【０２１７】
（１０）２回目の実行の伸長−脱ブロッキング溶液がフローセルから除去され、ポリメラーゼと３種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）と可逆的な終結ヌクレオチド（ｒｔｄＡＴＰ）を含む伸長混合物で置き換えられる。ヌクレオチドは標識されていない。フローセルは、次のｒｔｄＡＴＰが組み込まれるまでプライマー伸長が可能な条件でインキュベートされる。
【０２１８】
（１１）２回目の実行の検査−検査溶液を安定化三元複合体を形成する条件下でフローセルに導入し、三元複合体を検出して、ｒｔｄＡＴＰに続くヌクレオチドの同一性を判定する。ジヌクレオチドはＡＮとして識別され、Ａは組み込まれたｒｔｄＴＴＰであり、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧのいずれか１種類である。同様に、伸長と検査は、流体的に分離することも、同時に行うこともできる。
【０２１９】
（１２）２回目の実行が完了したことを示すシグナル対ノイズ減衰までステップ（９）〜（１１）を繰り返す−結果はジヌクレオチド［ＡＧ］［ＡＴ］［ＡＣ］［ＡＡ］［ＡＣ］［ＡＣ］の連続であり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２２０】
（１３）ステップ（６）から（１２）を繰り返し、２回目の実行の伸長混合物を、ポリメラーゼ、３種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＡＴＰ）ならびに可逆的な終結ヌクレオチド（ｒｔｄＣＴＰ）を含む３回目の実行の伸長混合物で置き換える。結果はジヌクレオチド［ＣＣ］［ＣＡ］［ＣＴ］［ＣＴ］［ＣＣ］［ＣＴ］［ＣＴ］の連続であり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２２１】
（１４）ステップ（６）から（１２）を繰り返し、２回目の実行の伸長混合物を、ポリメラーゼ、３種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＣＴＰ）ならびに可逆的な終結ヌクレオチド（ｒｔｄＧＴＰ）を含む４回目の実行の伸長混合物で置き換える。結果はジヌクレオチド［ＧＣ］［ＧＡ］［ＧＴ］の連続であり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２２２】
４回の実行のそれぞれに使用された伸長混合物と、実行から判定されたジヌクレオチドの連続を表１に示す。
【表１】
2021512648.tif 000004
【０２２３】
表１に示す１つ以上のジヌクレオチドの連続をテンプレートのシグネチャーとして使用できる。試料内のバックグラウンド配列の複雑さが低いと予想される場合、試料内のテンプレートを識別するための一意のシグネチャーとして、比較的短いジヌクレオチドの連続で十分である。連続が長くなるほど、配列がますます複雑化する背景において、その区別する力がより強くなる。
【０２２４】
さらに、４つのジヌクレオチドの連続を組み合わせて、単一のヌクレオチドの解像度でテンプレートの配列を決定できる。概念的には、ジヌクレオチドを整列させることによって配列を決定できる。整列は、最初の検査ステップから判定された（または他の方法で知られている）第１のヌクレオチドＴから開始できる。配列の２番目のヌクレオチドはＴに続くと理解されているため、伸長がｒｔＴで終了した実行（すなわち、１回目の実行）から判定できる。この場合、２番目のヌクレオチドはＡである。配列の３番目のヌクレオチドはＡに続くと理解されているため、伸長がｒｔＡで終了した実行（すなわち、２回目の実行）から判定できる。プロセスはこの方法で継続でき、表２の整列に視覚的に示されている。
【表２】
2021512648.tif 000005
【０２２５】
実施例２
３種類のヌクレオチドのみを使用した混合伸長
プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドは、実施例１に示すように、光学的に透明なフローセルの内面に結合している。プライマー−テンプレートのハイブリッドは、実施例１に示されるものと同じ配列を有し、プライマーは、その３’末端に任意選択で３’可逆的ターミネーター部分を有する。
【０２２６】
プライムされた核酸テンプレートは、次のようにＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）手順にかけられる。
（１）第１のヌクレオチドの任意選択の検査−ポリメラーゼと４種類の標識ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）からなる検査溶液を、プライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、および次の正しいヌクレオチドからなる安定化三元複合体を形成する条件下でフローセルに導入する。三元複合体は、（ａ）プライマーの３’末端の可逆的ターミネーター部分、（ｂ）非触媒金属などのポリメラーゼ阻害剤、（ｃ）触媒金属の非存在、および／または（ｄ）プライマーを伸長する能力が阻害されているポリメラーゼ変異体によって安定化される。三元複合体は、三元複合体に参加するときに各ヌクレオチドによって生成されるシグナルを区別する条件下で検出される。次の正しいヌクレオチドはｄＴＴＰ結合を示すシグナルを生成するため、伸長産物の第１のヌクレオチドはＴとして識別される。
【０２２７】
（２）活性化−検査溶液がフローセルから除去される。プライマー−テンプレートのハイブリッドは、（ａ）プライマーの可逆的ターミネーターの脱ブロック化、（ｂ）ポリメラーゼ阻害剤の除去、（ｃ）触媒金属イオンの添加、および／または（ｄ）触媒活性ポリメラーゼの添加により活性化される。したがって、プライマーは伸長のために準備される。
【０２２８】
（３）１回目の単一ヌクレオチド伸長−非標識ｄＴＴＰ（または、ｒｔｄＴＴＰ）とポリメラーゼを含む単一ヌクレオチド伸長溶液をフローセルに添加する。フローセルは、以前に省略されたｄＴＴＰ（または、ｒｔｄＴＴＰ）を添加することによってプライマーを伸長できる条件でインキュベートされる。次いで、ステップ（２）のように活性化が実行される。
【０２２９】
（４）１回目の混合伸長−単一ヌクレオチド伸長混合物が除去され、ポリメラーゼと３種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）を含む伸長混合物で置き換えられる。ヌクレオチドは標識されていない。フローセルは、次の正しいヌクレオチドが失われたｄＴＴＰになるまでプライマーの伸長を可能にする条件でインキュベートされる。
【０２３０】
（５）１回目の実行の検査−検査溶液を安定化三元複合体を形成する条件下でフローセルに導入し、三元複合体を検出して、ｄＴＴＰに続くヌクレオチドの同一性を判定する。ジヌクレオチドはＴＮとして識別され、ＮはＴに続くヌクレオチドである。
【０２３１】
（６）１回目の実行が完了したことを示すシグナル対ノイズ減衰までステップ（２）〜（５）を繰り返す−結果はジヌクレオチド［ＴＡ］［ＴＣ］［ＴＧ］［ＴＡ］［ＴＡ］［ＴＧ］［ＴＴ］［ＴＴ］の連続であり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２３２】
（７）１回目の実行の伸長産物をストリップする−フローセルを化学変性剤および／または熱で処理して、伸長したプライマーをテンプレート核酸から除去する。
【０２３３】
（８）プライマーの再適用−フローセルは、以前に使用されたものと同じ配列を有するプライマーとともにインキュベートされ、それにより、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを再形成する。
【０２３４】
（９）任意選択で、ステップ（１）に記載したように、１回目のヌクレオチドを再度検出する。
【０２３５】
（１０）活性化は、ステップ（２）と同様に実行される。
【０２３６】
（１１）２回目の実行の混合伸長−ポリメラーゼと３種類の伸長可能なヌクレオチド（ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＴＴＰ）を含む伸長混合物がフローセルに添加される。ヌクレオチドは標識されていない。フローセルは、次の正しいヌクレオチドが失われたＡＴＰになるまでプライマーの伸長を可能にする条件でインキュベートされる。
【０２３７】
（１２）２回目の実行の単一ヌクレオチド伸長−伸長混合物を除去し、非標識ＡＴＰ（またはｒｔＡＴＰ）およびポリメラーゼを含む単一ヌクレオチド伸長溶液で置き換える。フローセルは、以前に省略されたＡＴＰ（または、ｒｔＡＴＰ）を添加することによってプライマーを伸長できる条件でインキュベートされる。
【０２３８】
（１３）２回目の実行の検査−検査溶液を安定化三元複合体を形成する条件下でフローセルに導入し、三元複合体を検出して、ＡＴＰに続くヌクレオチドの同一性を判定する。ジヌクレオチドはＡＮとして識別され、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧのいずれか１種類である。
【０２３９】
（１４）２回目の実行が完了したことを示すシグナル対ノイズ減衰までステップ（１０）〜（１３）を繰り返す−結果はジヌクレオチド［ＡＧ］［ＡＴ］［ＡＣ］［ＡＡ］［ＡＣ］［ＡＣ］の連続であり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２４０】
（１５）ステップ（７）から（１４）を繰り返し、２回目の実行の伸長混合物を、ポリメラーゼ、ならびに３種類の伸長可能なヌクレオチド（ＧＴＰ、ＴＴＰ、およびＡＴＰ）を含む３回目の実行の伸長混合物で置き換える。結果はジヌクレオチド［ＣＣ］［ＣＡ］［ＣＴ］［ＣＴ］［ＣＣ］［ＣＴ］［ＣＴ］の連続であり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２４１】
（１６）ステップ（７）から（１４）を繰り返し、２回目の実行の伸長混合物を、ポリメラーゼ、ならびに３種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＣＴＰ）を含む４回目の実行の伸長混合物で置き換える。結果はジヌクレオチド［ＧＣ］［ＧＡ］［ＧＴ］の連続であり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２４２】
４回の実行のそれぞれに使用された伸長混合物と、実行から判定されたジヌクレオチドの連続を表３に示す。
【表３】
2021512648.tif 000006
【０２４３】
表３に示す１つ以上のジヌクレオチドの連続をテンプレートのシグネチャーとして使用できる。さらに、４つのジヌクレオチドの連続を組み合わせて、上記の実施例１に示したものと同様の整列方法を使用して、単一のヌクレオチドの解像度でテンプレートの配列を決定できる。
【０２４４】
実施例３
ジヌクレオチドシグネチャー決定と組み合わせた単一ヌクレオチド解像方法を使用したシーケンシング
この実施例では、テンプレートの第１の領域の配列を単一のヌクレオチドの解像度で決定し、テンプレートの隣接するテール領域のシグネチャージヌクレオチドの連続を決定することにより、テンプレート配列を識別する方法について説明する。シグネチャーテール領域は、テンプレートと参照ゲノムの整列を支援し、ゲノムに関する長距離の構造情報を提供できる。
【０２４５】
複数のテンプレート核酸は、光学的に透明なフローセルの内面に結合している。プライマーはテンプレート核酸にハイブリダイズする。プライマーは、３’可逆的なターミネーター部分を含む（例えば、ターミネーター部分は、化学合成を介して、または可逆的な終結ヌクレオチドを使用するポリメラーゼ触媒伸長を介して導入されている）。
【０２４６】
プライムされた核酸テンプレートは、次のようにＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）手順にかけられる。
（Ａ）テンプレート検査、脱ブロッキング、および単一ヌクレオチド伸長の第１の領域の単一ヌクレオチド解像ＳＢＢ（商標）手順は、以下のように実行される。
（１）検査−ポリメラーゼと４種類の標識ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）からなる検査溶液を、ポリメラーゼおよび次の正しいヌクレオチドを含むそれぞれのプライマー−テンプレートのハイブリッドからなる安定化三元複合体を形成する条件下でフローセルに導入する。三元複合体は、三元複合体に参加するときに各ヌクレオチドによって生成されるシグナルを区別する条件下で検出される。
【０２４７】
（２）脱ブロッキング−検査溶液をフローセルから除去し、プライマーから可逆的ターミネーター部分を除去する脱ブロッキング試薬と交換し、それによりプライマーを伸長可能にする。
【０２４８】
（３）単一ヌクレオチド伸長−脱ブロッキング溶液がフローセルから除去され、４種類の可逆的な終結ヌクレオチド（ｒｔｄＴＴＰ、ｒｔｄＡＴＰ、ｒｔｄＣＴＰ、およびｒｔｄＧＴＰ）がフローセルに導入される。可逆的な終結ヌクレオチドは標識されていない。フローセルは、次の正しいヌクレオチドがプライマーに付加される条件でインキュベートされる。
【０２４９】
（４）ステップ（１）〜（３）を９９回繰り返して、テンプレートの第１の末端領域をカバーする１００塩基のリードを取得し、第１の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物を生成する。
【０２５０】
（Ｂ）テンプレートの第２の領域のシグネチャージヌクレオチドの連続の決定−実施例１のステップ（１）から（５）は、テンプレートの第１の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物を使用して実行される。これらのステップは、必要な回数、またはシグナル対ノイズが実行が完了したことを示す点まで減衰するまで繰り返される。
【０２５１】
上記のシーケンシング手順の結果、２つの領域を含むリードのコレクションが得られ、単一ヌクレオチド解像領域とジヌクレオチドの連続のシグネチャー領域である。リードは、２つの領域の並置に基づいて参照ゲノムに整列できる。各リードのジヌクレオチドシグネチャー領域、しかしながら低い解像度は、リードの単一ヌクレオチドの解像領域の整列を確認するのを助ける。各リードのジヌクレオチドシグネチャー領域は、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）がシグネチャーで区別されている場合、およびリードの長さがハプロタイプを形成するＳＮＰをカバーするのに十分な長さである場合に、リードの位相化を支援することもできる。
【０２５２】
実施例４
ジヌクレオチドシグネチャー決定と組み合わせた単一ヌクレオチド解像方法を使用したペアリードシーケンシング
この実施例では、テンプレートの２つの領域の配列を単一のヌクレオチドの解像度で決定し、テンプレートの介在領域のシグネチャージヌクレオチドの連続を決定することにより、テンプレート配列を識別する方法について説明する。得られたリードは、既知のペアリード方法（当該技術分野では「ペアエンド」方法としても知られている）を使用して整列でき、シグネチャー領域を使用して整列を確認するという追加の利点がある。
【０２５３】
複数のテンプレート核酸は、光学的に透明なフローセルの内面に結合している。プライマーはテンプレート核酸にハイブリダイズする。プライマーは、３’可逆的なターミネーター部分を含む（例えば、ターミネーター部分は、化学合成を介して、または可逆的な終結ヌクレオチドを使用するポリメラーゼ触媒伸長を介して導入されている）。
【０２５４】
プライムされた核酸テンプレートは、次のようにＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）手順にかけられる。
（Ａ）テンプレート検査、脱ブロッキング、および単一ヌクレオチド伸長の第１の領域の単一ヌクレオチド解像ＳＢＢ（商標）手順は、実施例３のステップ（Ａ）で説明されているように実行される。手順では、テンプレートの第１の末端領域をカバーし、第１の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物を生成する１００塩基のリードを決定する。
【０２５５】
（Ｂ）テンプレートの介在領域のシグネチャージヌクレオチドの連続の決定−実施例１のステップ（Ｂ）は、テンプレートの第１の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物を使用して実行される。これらのステップは、必要な回数、またはシグナル対ノイズが事前定義された点まで減衰するまで繰り返される。ステップ（Ａ）と（Ｂ）の結果は、２つの領域を含むリードのコレクションであり、単一ヌクレオチド解像領域（すなわち、第１の末端領域）とジヌクレオチドの連続のシグネチャー領域（すなわち、介在領域）である。産物は、第１の領域と第２の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物である。
【０２５６】
（Ｃ）テンプレートの第２の末端領域に対する一塩基解像ＳＢＢ（商標）手順−ステップ（Ａ）は、テンプレートの第１の領域と第２の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物を使用して実行される。
【０２５７】
ステップ（Ａ）から（Ｃ）の結果は、３つの領域を含むリードのコレクションであり、第１の単一ヌクレオチド解像領域（第１の末端領域）、ジヌクレオチドの連続のシグネチャー領域（介在領域）、および第２の単一ヌクレオチド解像領域（第２の末端領域）である。リードは、第１と第２の末端領域の近接性に基づいて、参照ゲノムに整列させることができる。各リードの介在領域、しかしながら低い解像度は、リードの単一ヌクレオチドの解像末端領域の整列を確認するのを助ける。各リードのジヌクレオチドシグネチャー領域は、例えば、結合された領域全体のリードの長さが、ハプロタイプを形成するＳＮＰをカバーするのに十分な長さである場合に、リードの位相化を支援することもできる。
【０２５８】
実施例５
２種類の伸長可能なヌクレオチドと２種類の可逆的な終結ヌクレオチドを使用した混合伸長
この実施例では、テンプレート核酸のジヌクレオチドの連続を判定する方法について説明する。ジヌクレオチドの連続は、単独または組み合わせて、テンプレートのシグネチャーとして使用できる。２つ以上のジヌクレオチドの連続を整列させて、単一のヌクレオチドの解像度でテンプレートの配列を決定できる。さらに、第３のジヌクレオチドの連続は、エラーチェック機能を提供できる。
【０２５９】
テンプレート核酸は、光学的に透明なフローセルの内面に結合している。プライマーはテンプレート核酸にハイブリダイズする。プライマーは、３’可逆的なターミネーター部分を含む（例えば、ターミネーター部分は、化学合成を介して、または可逆的な終結ヌクレオチドを使用するポリメラーゼ触媒伸長を介して導入されている）。可逆的ターミネーター部分の脱ブロッキングに続くプライマーの伸長は、プライマーに以下のヌクレオチドの配列を付加すると予想される。
５’−ＡＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＴＧＴＡ−３’（配列番号４）
【０２６０】
プライムされた核酸テンプレートは、次のようにＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）手順にかけられる。
（１）１回目の実行の検査−ポリメラーゼと４種類の標識ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）からなる検査溶液を、プライマー−テンプレートのハイブリッド、ポリメラーゼ、および次の正しいヌクレオチドからなる安定化三元複合体を形成する条件下でフローセルに導入する。三元複合体は、三元複合体に参加するときに各ヌクレオチドによって生成されるシグナルを区別する条件下で検出される。次の正しいヌクレオチドはｄＡＴＰ結合を示すシグナルを生成するため、伸長産物の第１のヌクレオチドはＡとして識別される。
【０２６１】
（２）１回目の実行の脱ブロッキング−検査溶液をフローセルから除去し、プライマーから可逆的ターミネーター部分を除去する脱ブロッキング試薬と交換し、それによりプライマーを伸長可能にする。
【０２６２】
（３）１回目の実行の伸長−脱ブロッキング溶液がフローセルから除去され、ポリメラーゼ、２種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ）、ならびに２種類の可逆的な終結ヌクレオチド（ｒｔｄＣＴＰおよびｒｔｄＧＴＰ）を含む伸長混合物で置き換えられる。ヌクレオチドは標識されていない。フローセルは、次のｒｔｄＣＴＰまたはｒｔｄＧＴＰが組み込まれるまでプライマー伸長が可能な条件でインキュベートされる。１つの構成では、伸長と検査ステップは、伸長混合物を検査溶液で置き換えることによって流体的に分離される。代替的に、伸長混合物および試験溶液は、フローセル中に一緒に存在することができる（例えば、共送達または付加的送達を介して）。
【０２６３】
（４）１回目の実行が完了したことを示すシグナル対ノイズ減衰までステップ（１）〜（３）を繰り返す−結果はジヌクレオチド［ＳＣ］［ＳＡ］［ＳＧ］［ＳＣ］［ＳＡ］［ＳＴ］［ＳＴ］の連続であり、Ｓ＝ＣまたはＧであり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。ジヌクレオチドの連続は、テンプレートのシグネチャーとして機能する。任意選択で、テンプレート核酸に対して以下のステップを実行することにより、さらなるシグネチャー情報を得ることができる。
【０２６４】
（５）１回目の実行の伸長産物をストリップする−フローセルを化学変性剤および／または熱で処理して、伸長したプライマーをテンプレート核酸から除去する。
【０２６５】
（６）プライマーの再適用−フローセルは、以前に使用されたものと同じ配列および可逆的ターミネーターを有するプライマーとともにインキュベートされ、それにより、プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを再形成する。
【０２６６】
（７）２回目の実行の検査−次の正しいヌクレオチドがステップ（１）で説明したように検出される。
【０２６７】
（８）脱ブロッキングは、ステップ（２）と同様に実行される。
【０２６８】
（９）２回目の実行の伸長−脱ブロッキング溶液がフローセルから除去され、ポリメラーゼと２種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＣＴＰとｄＧＴＰ）と２つの可逆的な終結ヌクレオチド（ｒｔｄＡＴＰおよびｒｔｄＴＴＰ）を含む伸長混合物で置き換えられる。ヌクレオチドは標識されていない。フローセルは、次のｒｔｄＡＴＰまたはｒｔｄＴＴＰが組み込まれるまでプライマー伸長が可能な条件でインキュベートされる。
【０２６９】
（１０）２回目の実行が完了したことを示すシグナル対ノイズ減衰までステップ（７）〜（９）を繰り返す−結果はジヌクレオチド［ＷＡ］［ＷＡ］［ＷＴ］［ＷＧ］［ＷＴ］［ＷＴ］［ＷＧ］［ＷＧ］［ＷＧ］［ＷＡ］の連続であり、Ｗ＝ＡまたはＴであり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２７０】
（１１）ステップ（５）から（１０）を繰り返し、２回目の実行の伸長混合物を、ポリメラーゼ、２種類の伸長可能なヌクレオチド（ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）ならびに２種類の可逆的な終結ヌクレオチド（ｒｔｄＡＴＰおよびｒｔｄＧＴＰ）を含む３回目の実行の伸長混合物で置き換える。結果はジヌクレオチド［ＲＡ］［ＲＡ］［ＲＴ］［ＲＣ］［ＲＴ］［ＲＧ］［ＲＣ］［ＲＧ］［ＲＴ］［ＲＴ］の連続であり、Ｒ＝ＡまたはＧであり、各ジヌクレオチド間のヌクレオチドの数とタイプは明らかに不明瞭である。
【０２７１】
３回の実行のそれぞれに使用された伸長混合物と、実行から判定されたジヌクレオチドの連続を表４に示す。
【表４】
2021512648.tif 000007
【０２７２】
表４に示す１つ以上のジヌクレオチドの連続をテンプレートのシグネチャーとして使用できる。バックグラウンド配列の複雑さが低いと予想される場合、テンプレートの一意のシグネチャーとして、比較的短いジヌクレオチドの連続で十分である。連続が長くなるほど、配列がますます複雑化する背景において、その区別する力がより強くなる。シグネチャーは、２つまたは３つのジヌクレオチドの連続からなる。
【０２７３】
さらに、第１と第２のジヌクレオチドの連続は互いに直交しており、組み合わせて、単一のヌクレオチドの解像度でテンプレートの配列を決定できる。概念的には、ジヌクレオチドを整列させることによって配列を決定できる。整列は、最初の検査ステップから判定された（または他の方法で知られている）第１のヌクレオチドＡから開始できる。配列の２番目のヌクレオチドはＡに続くと理解されているため、伸長がｒｔＡで終了した実行（すなわち、２回目の実行）から判定できる。この場合、２番目のヌクレオチドはＡである。配列の３番目のヌクレオチドはＡに続くと理解されているため、伸長がｒｔＡで終了した実行（すなわち、２回目の実行）から判定できる。プロセスはこの方法で継続でき、表５の整列に視覚的に示されている。
【表５】
2021512648.tif 000008
【０２７４】
第３のジヌクレオチドの連続は、エラーチェックとして機能する。表６に示すように、３回目の実行からのジヌクレオチドは、表５から決定された配列と正しく整列した。具体的には、配列内の全てのＡおよびＧ塩基をＲＮジヌクレオチド（Ｎは４種類のヌクレオチドのいずれか）に整列し、全てのＲＮジヌクレオチドを配列に整列した。したがって、３回目の実行からの情報は、１回目と２回目の実行から識別された配列が正しかったことを示した。
【表６】
2021512648.tif 000009
【０２７５】
上記のように、２種類の可逆的な終結ヌクレオチドと２種類の伸長可能なヌクレオチドの直交する相補体を持つ２種類の異なる伸長混合物を使用した２つのシーケンシング実行から決定された配列は、第３の異なる伸長混合物で実行された実行の結果を使用してエラーチェックできる。３回目の実行では、３種類のヌクレオチドタイプに関連するエラーを識別する。エラーが識別された場合（例えば、第１と第３のリードの不一致）、配列リードを破棄できる。必要に応じて、第３の伸長混合物に直交する伸長ミックス（すなわち、Ａ／ｒｔＴ／ｒｔＣ／Ｇ）を使用して、４回目の実行を実行できる。４つ全ての実行の組み合わせにより、全てのランダムエラーを検出できる。さらに、４つ全ての実行で、各ヌクレオチドは２種類の異なる伸長混合物で可逆的に終結し、４種類のヌクレオチドタイプ全てに関連するエラーを修正するための十分な情報を提供する。
【０２７６】
上記のエラー検出戦略（２種類の天然ヌクレオチドと２種類のブロックされたヌクレオチドの直交組み合わせによる３つのリード）では、特定の（全てではない）エラーのクラスを検出できる。さらに、（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許出願第１５／７１２，６３２号およびそこから発行された米国特許第９，９５１，３８５号に記載されているように）検査ステップに存在するヌクレオチドの混合物は、異なるクラスのエラーを検出し、したがって前者の戦略を補完し、誤ったリードをフィルタリングすることによってシーケンシングの精度をさらに改善することができる。
【０２７７】
実施例６
オクテット装置での混合伸長
この例では、伸長中に４種類の可逆的な終結ヌクレオチド、または伸長中に４種類の伸長可能なヌクレオチドを使用する方法と比較した、伸長中に３種類の伸長可能なヌクレオチドと１種類の可逆的な終結ヌクレオチドの混合物を使用するＳＢＢ（商標）手順の産物を区別することの実現可能性を示している。
【０２７８】
バイオレイヤー干渉法を使用して光ファイバー先端の表面での結合反応を測定するＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）のオクテット装置を、マルチウェルプレート形式で使用した。標準的な手順を使用して、テンプレート鎖の５’末端でビオチン化されたプライマー−テンプレート核酸のハイブリッドを、ストレプトアビジン（ＳＡ）で官能化された光ファイバー先端に固定化した。プライマーは５’末端に蛍光標識を含んでいた。この手順におけるＴｏｕｇｈ−２２プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドは、プライマーの下流で読み取られるテンプレート配列として図１に示される配列を有していた。Ｔｏｕｇｈ−２９プライマー−テンプレート核酸のハイブリッドについて読み取られるテンプレート配列を図２に示す。
【０２７９】
サイクリング手順には、次の手順が含まれる。
ａ）可逆的ターミネーターの組み込みに必要な全ての成分（ステップｂ）から可逆的ターミネーターヌクレオチド、塩化マグネシウム、およびＤＮＡポリメラーゼを除いたものを含む溶液で５秒間平衡化する。
ｂ）参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２９：８７９−８９５（２０１０）（ＤＯＩ：１０．１０８０／１５２５７７７０．２０１０．５３６１９１）に記載されている条件下で３０秒間可逆的ターミネーターを使用してハイブリダイズしたプライマーを伸長する。
ｃ）ステップａ）と同様に溶液中で５秒間平衡化する
ｄ）上述のＨｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に記載された条件下での可逆的ターミネーター上のキャッピング部分の５秒間の切断。
ステップａ）〜ｄ）を１０回繰り返し、その後、伸長したプライマーを光ファイバーの先端からジメチルホルムアミドで溶出し、ＡＢＩ  ３５００キャピラリー電気泳動装置で分析する。
【０２８０】
Ｔｏｕｇｈ−２２プライマー−テンプレートのハイブリッドに対して上記の手順を１０サイクル実行した結果を図１に示す。プライマーのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）トレースを図１Ａに示す。それぞれ４種類の可逆的な終結ヌクレオチドを使用する１０の伸長ステップは、プライマーを１０ヌクレオチド伸長することが期待されていた。図１ＢのＣＥトレースで示されるように、伸長は９．６ヌクレオチドにほぼ等しいことが観察された。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｒｔｄＴＴＰを使用する１０の伸長ステップは、プライマーを４２ヌクレオチド伸長することが期待されていた。図１ＣのＣＥトレースで示されるように、伸長は３９．７ヌクレオチドにほぼ等しいことが観察された。それぞれ４種類の伸長可能なヌクレオチドを使用する１０の伸長ステップは、プライマーをその全長である、５８ヌクレオチド伸長することが期待されていた。図１ＤのＣＥトレースで示されるように、伸長は５３．１ヌクレオチドにほぼ等しいことが観察された。
【０２８１】
Ｔｏｕｇｈ−２９プライマー−テンプレートのハイブリッドに対して上記の手順を１０サイクル実行した結果を図２に示す。プライマーのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）トレースを図２Ａに示す。それぞれ４種類の可逆的な終結ヌクレオチドを使用する１０の伸長ステップは、プライマーを１０ヌクレオチド伸長することが期待されていた。図２ＢのＣＥトレースで示されるように、伸長は１０．０ヌクレオチドにほぼ等しいことが観察された。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｒｔｄＴＴＰを使用する１０の伸長ステップは、プライマーを３１ヌクレオチド伸長することが期待されていた。図２ＣのＣＥトレースで示されるように、伸長は３１．２ヌクレオチドにほぼ等しいことが観察された。それぞれ４種類の伸長可能なヌクレオチドを使用する１０の伸長ステップは、プライマーをその全長である、５８ヌクレオチド伸長することが期待されていた。図２ＤのＣＥトレースで示されるように、伸長は５５．５ヌクレオチドにほぼ等しいことが観察された。
【０２８２】
測定されたプライマー伸長の長さは、予想される長さの妥当な誤差の範囲内であると判断された。したがって、結果は、１種類の可逆的な終結ヌクレオチドと３種類の伸長可能なヌクレオチドの混合物をＳＢＢ（商標）手順において使用して、可逆的な終結ヌクレオチドのみの使用と比較してプライマー伸長の長さを増加できることを示す。
【０２８３】
実施例７
核酸配列の再位相化
プライマー伸長の非効率性と可逆的ターミネーター部分の切断は、シーケンシングプロトコルに累積的な影響を及ぼす。複数のサイクルにわたって、実行中に少なくとも１回は伸長に失敗したプライマー分子が蓄積し、シーケンシングされている核酸のクラスターまたは他のアンサンブル内で逆相化を引き起こす。逆相化は、正しいシグナルの希釈と誤ったシグナルの上昇を引き起こす。次のシーケンシングプロトコルを使用して、段階化されたシグナルを復元し、段階のシグナルと合体させることにより、この問題を軽減できる。
１．１００サイクルの間、またはシグナルの位相の散逸まで、単一ヌクレオチドの解像シーケンシングを実行する。
【０２８４】
２．次の手順を実行して、シグナルを再位相化する。
ａ．伸長可能な第１、第２、および第３のヌクレオチド類似体と、可逆的に終結する第４のヌクレオチド類似体の混合物による単一サイクルの伸長。
ｂ．第１、第２、および第４の天然ヌクレオチドの伸長可能な類似体および第３のヌクレオチドの可逆的な終結類似体を含む混合物による単一の伸長サイクル。
ｃ．第１、第３、および第４の天然ヌクレオチドの伸長可能な類似体および第２のヌクレオチドの可逆的な終結類似体の混合物による単一の伸長サイクル。
ｄ．第２、第３、および第４の天然ヌクレオチドの伸長可能な類似体および第１のヌクレオチドの可逆的な終結類似体の混合物による単一の伸長サイクル。
【０２８５】
３．位相の散逸の際、別の１００サイクルの間、またはシグナルの位相の散逸まで、単一ヌクレオチドの解像シーケンシングを実行する。
【０２８６】
４．シグナルとシグナル対ノイズ比が、塩基を合理的に確実に識別できないレベルまで低下するまで、ステップ２と３を繰り返す。
【０２８７】
この戦略のステップ２では、逆相の配列を「捕捉」し、メインの「全長」配列と同期させることができる。次のモデル配列を使用して、再位相化ステップ２の効果を下の表７に示す。
ＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＧＧＡＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴ（配列番号５）
【０２８８】
第１、第２、第３、第４のヌクレオチドは、それぞれｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴに対応する。
【表７】
2021512648.tif 000010
【０２８９】
実施例８
ダーク伸長と組み合わせた単一ヌクレオチド解像方法を使用したペアリードシーケンシング
この実施例では、単一ヌクレオチドの解像度でテンプレートの第１および第２の領域の配列を決定し、伸長ステップを数えることによってテンプレートのリンカー領域の長さを決定することにより、テンプレート配列を識別する方法について説明する。この実施例では、リンカー領域は、第１の領域と第２の領域に介在して、第１の領域と第２の領域の配列リードがペアリードを提供するようにする。この例示的な方法では、プライマーは、検出ステップを含むサイクルを使用して第１の領域を介して伸長され、伸長したプライマーは、検出ステップを含まないサイクルを使用してリンカー領域を介してさらに伸長され、次いで、さらに伸長したプライマーは、検出ステップを含むサイクルを使用して第２の領域を通じてさらに伸長する。
【０２９０】
複数のテンプレート核酸は、光学的に透明なフローセルの内面に結合している。プライマーはテンプレート核酸にハイブリダイズする。プライマーは、３’の可逆的ターミネーター部分を含む。
【０２９１】
プライムされた核酸テンプレートは、次のようにＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）手順にかけられる。
（Ａ）テンプレート検査、脱ブロッキング、および単一ヌクレオチド伸長の第１の領域の単一ヌクレオチド解像ＳＢＢ（商標）手順は、実施例３のステップ（Ａ）で説明されているように実行される。手順では、テンプレートの第１の末端領域をカバーし、第１の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物を生成する１００塩基のリードを決定する。
【０２９２】
（Ｂ）テンプレートの介在領域のシグネチャーヌクレオチド数の決定−ステップ（Ａ）に続いてテンプレートの第１の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物は、改変されたＳＢＢ（商標）手順のサイクルにかけられる。改変は、ステップ（Ａ）で使用される検査ステップを省略して、各サイクルは脱ブロック化とブロックされたヌクレオチドを使用した単一ヌクレオチドの伸長が含まれるようにすることである。サイクルは、必要な回数繰り返される。ステップ（Ａ）と（Ｂ）の結果は、２つの領域を含むリードのコレクションであり、第１の領域に隣接しているリンカー領域のヌクレオチド位置の数で数えられた単一ヌクレオチド解像領域（すなわち第１の領域）と長さである。産物は、第１の領域とリンカー領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物である。
【０２９３】
（Ｃ）テンプレートの第２の領域に対する単一ヌクレオチド解像ＳＢＢ（商標）手順−ステップ（Ａ）の手順は、ステップ（Ｂ）の完了後にテンプレートの第１の領域と第２の領域にハイブリダイズするプライマー伸長産物を使用して実行される。
【０２９４】
ステップ（Ａ）〜（Ｃ）の結果は、３つの領域を含むリードのコレクションであり、第１の単一ヌクレオチド解像領域、リンカー領域のシグネチャーヌクレオチド数、および第２の単一ヌクレオチド解像領域である。リードは、第１と第２の末端領域の近接性に基づいて、参照ゲノムに整列させることができる。リンカー領域の長さは、参照ゲノムに整列したときにリード間の距離を制限することにより、第１と第２の単一ヌクレオチド解像領域の整列を通知できる。各リードのシグネチャー領域は、例えば、結合された領域全体のリードの長さが、ハプロタイプを形成するＳＮＰをカバーするのに十分な長さである場合に、リードの位相化を支援することもできる。ペアリードを組み合わせてゲノム配列を決定するための例示的なアルゴリズムには、Ｈｏｒｍｏｚｄｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：１２７０−１２７８（２００９）またはＳｉｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５：ｉ２２２−ｉ２３０（２００９）に記載されているもの、または当技術分野で知られている他のものが含まれるが、これらに限定されず、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９５】
この実施例で説明するペアリード技法の利点は、シーケンシングの精度とリード長に悪影響を与える検出ステップを回避できることである。メカニズムに限定されるつもりはないが、単一ヌクレオチド解像ＳＢＢ（商標）手順で使用される蛍光検出ステップ中のフルオロフォアの励起は、シーケンシングされる核酸およびシーケンシングに使用される試薬に光損傷を引き起こすと考えられている。シーケンシングは累積的なプロセスであるため、この光損傷は、配列リードの個々の塩基のコールの精度に影響を与えるだけでなく、シグナル減衰の累積的な影響および／または実行中のエラーの累積により、リード長が短くなる。
【０２９６】
複数のゲノムフラグメントからの短いリードを組み立てて、フラグメントの派生元であるより大きな染色体を再構築できるが、特定のタイプの構造情報は、組み立てられた配列から明確に推測できない。ヒトなどの二倍体生物を例にとると、２つの別々のフラグメントからのリードで観察される多型が同じ親に由来するのか、異なる親に由来するのかを判断するのは難しい場合がある。しかしながら、この実施例に示されているように、２つのリードがペアリードを介して連結されている場合、リードが同じ鎖から、すなわち同じ親からのものであると判断できる。したがって、本明細書に記載のペアリード法は、単一リード方法からは容易に得られないゲノム（例えば、ハプロタイプ）の構造的特徴を特定するという利点を提供する。
【０２９７】
この出願を通して、様々な出版物、特許および／または特許出願が参照されている。これらの文書の開示全体は、参照により本出願に組み込まれている。
【０２９８】
多くの実施形態が説明された。それにもかかわらず、様々な修正が行われ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2021512648.tif 000011
【図２】
2021512648.tif 000012
【配列表】
2021512648000001.app
【国際調査報告】
2021512648.tif 000013
2021512648.tif 000014
2021512648.tif 000015