(57)【要約】  本明細書では、がんを処置するための、（ｉ）がん抗原に特異的に結合する二重特異性結合因子、（ｉｉ）除去剤、および（ｉｉｉ）放射線療法剤を伴う組成物、方法、および使用が提示される。本明細書ではまた、ＨＥＲ２関連がんを処置するための使用および方法も提示される。
2021517564.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、
（ａ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップであって、前記二重特異性結合因子が、第２の分子に（リンカーを介してもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記第１の分子が第１の結合性部位を含み、前記第１の結合性部位が第１の標的に特異的に結合し、前記第１の標的が前記がんにより発現されるがん抗原であり、前記第２の分子が第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位が第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的ががん抗原ではない、前記ステップ；
（ｂ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１２時間以内に対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップであって、前記除去剤が前記第２の結合性部位に結合し、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を低減するように機能する、前記ステップ；および
（ｃ）対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップであって、放射線療法剤が（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的であって、金属キレート剤である第２の標的；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的であって、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している第２の標的を含む、前記ステップを含む方法。
【請求項２】
対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）が、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１０時間以内、８時間以内、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１〜１２時間後、２〜１２時間後、１〜２時間後、１〜３時間後、１〜４時間後、２〜６時間後、２〜８時間後、２〜１０時間後、４〜６時間後、４〜８時間後、４〜１０時間後、２時間後、または４時間後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象へ、治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）が、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の約２時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、または約１０時間後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１〜２時間後、１〜３時間後、１〜４時間後、２〜６時間後、２〜８時間後、２〜１０時間後、４〜６時間後、４〜８時間後、４〜１０時間後、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、または６時間後に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、または約６時間後に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の約１時間後に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）が、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１６時間以内に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
除去剤が、主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により循環血から除去される分子に結合している第２の標的を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
除去剤が、第２の標的へとコンジュゲートされた５００ｋＤａのアミノデキストランを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
除去剤が、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの第２の標的分子約１００〜１５０個を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
金属キレート剤が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはその誘導体、ＤＯＴＡ−Ｂｎまたはその誘導体、ｐ−アミノベンジル−ＤＯＴＡまたはその誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはその誘導体、およびＤＯＴＡ−デフェロキサミンからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
金属キレート剤がＤＯＴＡまたはその誘導体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
金属キレート剤がＤＯＴＡ−Ｂｎまたはその誘導体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記金属放射性核種の金属が、ルテチウム（Ｌｕ）、アクチニウム（Ａｃ）、アスタチン（Ａｔ）、ビスマス（Ｂｉ）、セリウム（Ｃｅ）、銅（Ｃｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、エルビウム（Ｅｒ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ガリウム（Ｇａ）、ホルミウム（Ｈｏ）、ヨウ素（Ｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ランタン（Ｌａ）、鉛（Ｐｂ）、ネオジミウム（Ｎｄ）、プラセオジム（Ｐｒ）、プロメチウム（Ｐｍ）、レニウム（Ｒｅ）、サマリウム（Ｓｍ）、スカンジウム（Ｓｃ）、テルビウム（Ｔｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、イットリウム（Ｙ）、およびジルコニウム（Ｚｒ）からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
金属放射性核種が、211Ａｔ、225Ａｃ、227Ａｃ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、157Ｇｄ、166Ｈｏ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、212Ｐｂ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、47Ｓｃ、153Ｓｍ、166Ｔｂ、89Ｚｒ、86Ｙ、88Ｙ、および90Ｙからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
金属放射性核種が177Ｌｕである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
二重特異性結合因子がＦｃドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
二重特異性結合因子が少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａの間、１５０〜３００ｋＤａの間、または２００〜２５０ｋＤａの間である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
二重特異性結合因子が少なくとも１００ｋＤａであり、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）が、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の４時間以内に行われる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
第１の分子が抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片が第１の結合性部位を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が、免疫グロブリンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
放射線療法剤が（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的を含み、前記第２の標的が金属キレート剤である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
第２の分子が抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片が第２の結合性部位を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
第２の分子が単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖが第２の結合性部位を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
免疫グロブリンが、２つの同一な重鎖と、第１の軽鎖および第２の軽鎖である２つの同一な軽鎖とを含み、前記第１の軽鎖が、第２の結合性部位を含む第１のｓｃＦｖである第２の分子へ（第１のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第１の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第２の軽鎖が、第２のｓｃＦｖへ（第２のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第２の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとが同一である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
第１の軽鎖融合ポリペプチドが第１のペプチドリンカーを含み、前記第２の軽鎖融合ポリペプチドが第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列が、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第１の軽鎖融合ポリペプチドが第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドが第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列が、７〜３２、７〜２７、７〜１７、１２〜３２、１２〜２２、１２〜１７、１７〜３２、または１７〜２７アミノ酸長である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
第１の軽鎖融合ポリペプチドが第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドが第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列が、配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれかである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
第１の軽鎖融合ポリペプチドが第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドが第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列が、配列番号５１〜５６のうちのいずれかである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
第１のｓｃＦｖ内の、重鎖可変（ＶH）ドメインと軽鎖可変（ＶL）ドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
第１のｓｃＦｖ内の、ＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が、配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれか１つである、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
第１のｓｃＦｖ内の、ＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が、配列番号２７である、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
第１のｓｃＦｖ内の、ＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が、配列番号３０である、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列が配列番号２１の相補性決定領域（ＣＤＲ）の３つ全てを含み、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列が配列番号２２のＣＤＲの３つ全てを含む、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列が配列番号２１である、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列が配列番号２２である、請求項２５〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
第１のｓｃＦｖの配列が配列番号３１〜３６のうちのいずれかを含む、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
第１のｓｃＦｖの配列が配列番号３９〜４４のうちのいずれかを含む、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
第１のｓｃＦｖの配列が配列番号３３を含む、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
第１のｓｃＦｖの配列が配列番号４４を含む、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列が、配列番号２１のヒト化形態を含む、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
配列番号２１のヒト化形態が配列番号３７である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列が配列番号２２のヒト化形態を含む、請求項２５〜３４および４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
配列番号２２のヒト化形態が配列番号３８である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
放射線療法剤が（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
第２の分子がストレプトアビジンを含み、第２の標的が、ビオチンを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第２の標的がヒスタミンスクシニルグリシンを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
がん抗原が、ＨＥＲ２、ＣＡ６、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＦＲα、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、メソテリン、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ１、Ｔｒｏｐ−２、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、アルファｖベータ６、ＣＡ１９．９、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７４、ＣＤ１８０、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ７９ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＲＩＰＴＯ、ＤＬＬ３、ＤＳ６、エンドセリンＢ受容体、ＦＡＰ、ＧＤ２、メソテリン、ＰＭＥＬ  １７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＴＥＮＢ２、ＴＩＭ−１、ＣＤ９８、エンドシアリン／ＣＤ２４８／ＴＥＭ１、フィブロネクチン細胞外ドメインＢ、ＬＩＶ−１、ムチン１、ｐ−カドヘリン、ペリトシン、Ｆｙｎ、ＳＬＴＲＫ６、テネイシンｃ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＲＬＲ、ＣＤ２０、ＣＤ７２、フィブロネクチン、ＧＰＡ３３、テネイシンＣのスプライスアイソフォーム、ＴＡＧ−７２、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、およびポリシアル酸からなる群から選択される、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
がん抗原が、ＨＥＲ２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
がん抗原が、がん細胞へ内在化される抗原である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
がん細胞へと内在化されるがん抗原が、ＨＥＲ２、ＣＡ６、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＦＲα、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、メソテリン、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ１、Ｔｒｏｐ−２、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、アルファｖベータ６、ＣＡ１９．９、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７４、ＣＤ１８０、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ７９ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＲＩＰＴＯ、ＤＬＬ３、ＤＳ６、エンドセリンＢ受容体、ＦＡＰ、ＧＤ２、メソテリン、ＰＭＥＬ  １７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＴＥＮＢ２、ＴＩＭ−１、ＣＤ９８、エンドシアリン／ＣＤ２４８／ＴＥＭ１、フィブロネクチン細胞外ドメインＢ、ＬＩＶ−１、ムチン１、ｐ−カドヘリン、ペリトシン、Ｆｙｎ、ＳＬＴＲＫ６、テネイシンｃ、ＶＥＧＦＲ２、およびＰＲＬＲからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
がん細胞へと内在化されるがん抗原がＨＥＲ２である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
がん抗原がＨＥＲ２であり、免疫グロブリン内の重鎖が配列番号２０の３つの重鎖ＣＤＲ全てを含み、免疫グロブリン内の軽鎖が配列番号１９の３つの軽鎖ＣＤＲ全てを含む、請求項２１および２５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
がん抗原がＨＥＲ２であり、免疫グロブリン内の重鎖内のＶHドメインの配列、配列番号２０を含む、請求項２１、２５〜４４、および５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
がん抗原がＨＥＲ２であり、免疫グロブリン内の軽鎖内のＶLドメインの配列が配列番号１９を含む、請求項２１、２５〜４４、５３、および５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
がん抗原がＨＥＲ２であり、免疫グロブリン内の重鎖の配列が配列番号１４〜１７のうちのいずれかを含む、請求項２１、２５〜４４、および５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
がん抗原がＨＥＲ２であり、免疫グロブリン内の重鎖の配列が配列番号１５を含む、請求項２１、２５〜４４、および５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
がん抗原がＨＥＲ２であり、免疫グロブリン内の重鎖の配列が配列番号１６を含む、請求項２１、２５〜４４、および５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
がん抗原がＨＥＲ２であり、免疫グロブリン内の軽鎖の配列が配列番号１１を含む、請求項２１、２５〜４４、および５１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
がん抗原がＨＥＲ２であり、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号５〜１０のうちのいずれかである、請求項２５〜３７および３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
がん抗原がＨＥＲ２であり、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号７である、請求項２５〜３７および３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
がん抗原がＨＥＲ２であり、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号５〜１０のうちのいずれかであり、重鎖の配列が配列番号１４〜１７のうちのいずれかである、請求項２５〜３７および３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
がん抗原がＨＥＲ２であり、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号７であり、重鎖の配列が配列番号１５である、請求項２５〜３７および３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
がん抗原がＨＥＲ２であり、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号４５〜５０のうちのいずれかである、請求項２５に記載の方法。
【請求項６５】
がん抗原がＨＥＲ２であり、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号５０である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
がん抗原がＨＥＲ２であり、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号４５〜５０のうちのいずれかであり、重鎖の配列が配列番号１４〜１７のうちのいずれかである、請求項２５に記載の方法。
【請求項６７】
がん抗原がＨＥＲ２であり、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号５０であり、重鎖の配列が配列番号１６である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
がん抗原が、がん細胞へ内在化されない抗原である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
がん細胞へ内在化されないがん抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ７２、フィブロネクチン、ＧＰＡ３３、テネイシンＣのスプライスアイソフォーム、およびＴＡＧ−７２からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
二重特異性結合因子の治療有効量が、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇであり、対象がヒトである、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
二重特異性結合因子の治療有効量が、２５０ｍｇ〜７００ｍｇ、３００ｍｇ〜６００ｍｇ、または４００ｍｇ〜５００ｍｇであり、対象がヒトである、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、
（ａ）対象へ第１の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップであって、前記二重特異性結合因子の第１の治療有効量が、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇであり、前記二重特異性結合因子が第２の分子に（リンカーを介してもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記がんがＨＥＲ２を発現し、前記第１の分子が抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖを含み、前記抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖが、（ｉ）前記がん上のＨＥＲ２に結合し、（ｉｉ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲの３つ全て、および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲの３つ全て、を含み前記第２の分子が第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位が第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的ががん抗原ではない、前記ステップ；
（ｂ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の後で、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップであって、前記除去剤が前記第２の結合性部位に結合し、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を低減するように機能する、前記ステップ；および
（ｃ）対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップであって、放射線療法剤が（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的を含み、前記第２の標的が金属キレート剤である；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している、前記ステップ
を含み、
対象がヒトである
前記方法。
【請求項７３】
二重特異性結合因子の第１の治療有効量が、約４５０ｍｇである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
除去剤が、主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により循環血から除去される分子に結合している第２の標的を含む、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
除去剤が第２の標的へとコンジュゲートされた、５００ｋＤａのアミノデキストランを含む、請求項７２〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
除去剤が、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの第２の標的分子約１００〜１５０個を含む、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
金属キレート剤が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはその誘導体、ＤＯＴＡ−Ｂｎまたはその誘導体、ｐ−アミノベンジル−ＤＯＴＡまたはその誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはその誘導体、およびＤＯＴＡ−デフェロキサミンからなる群から選択される、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
金属キレート剤がＤＯＴＡまたはその誘導体である、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
金属キレート剤がＤＯＴＡ−Ｂｎまたはその誘導体である、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記金属放射性核種の金属が、ルテチウム（Ｌｕ）、アクチニウム（Ａｃ）、アスタチン（Ａｔ）、ビスマス（Ｂｉ）、セリウム（Ｃｅ）、銅（Ｃｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、エルビウム（Ｅｒ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ガリウム（Ｇａ）、ホルミウム（Ｈｏ）、ヨウ素（Ｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ランタン（Ｌａ）、鉛（Ｐｂ）、ネオジミウム（Ｎｄ）、プラセオジム（Ｐｒ）、プロメチウム（Ｐｍ）、レニウム（Ｒｅ）、サマリウム（Ｓｍ）、スカンジウム（Ｓｃ）、テルビウム（Ｔｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、イットリウム（Ｙ）、およびジルコニウム（Ｚｒ）からなる群から選択される、請求項７２〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
金属放射性核種が、211Ａｔ、225Ａｃ、227Ａｃ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、157Ｇｄ、166Ｈｏ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、212Ｐｂ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、47Ｓｃ、153Ｓｍ、166Ｔｂ、89Ｚｒ、86Ｙ、88Ｙ、および90Ｙからなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
金属放射性核種が177Ｌｕである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
二重特異性結合因子がＦｃドメインを含む、請求項７２〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
二重特異性結合因子が、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａの間、１５０〜３００ｋＤａの間、または２００〜２５０ｋＤａの間である、請求項７１〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
第１の分子の抗体内もしくはその抗原結合性断片内またはｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列が、配列番号２０を含む、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
第１の分子の抗体内もしくはその抗原結合性断片内またはｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列が、配列番号１９を含む、請求項７２〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
第１の分子が抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記第１の分子の前記抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖の配列が、配列番号１４〜１７のうちのいずれかを含む、請求項７２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
第１の分子が抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記第１の分子の前記抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖の配列が配列番号１５を含む、請求項７２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
第１の分子が抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記第１の分子の前記抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖の配列が配列番号１６を含む、請求項７２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
第１の分子が抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記第１の分子の前記抗体内またはその抗原結合性断片内の軽鎖の配列が配列番号１１を含む、請求項７２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
第１の分子の抗体内もしくはその抗原結合性断片内またはｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列が配列番号２０のヒト化形態を含む、請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
第１の分子の抗体内もしくはその抗原結合性断片内またはｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列が配列番号１９のヒト化形態を含む、請求項７２〜８４および９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
第１の分子が抗体を含む、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
抗体が免疫グロブリンである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
第１の分子が抗原結合性断片を含む、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
第１の分子がｓｃＦｖを含む、請求項７２〜８６、９１、および９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
第２の分子が第２の抗体またはその第２の抗原結合性断片を含む、請求項７２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
第２の分子が第２のｓｃＦｖを含む、請求項７２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
第１の分子が抗体を含み、前記抗体が、（ｉ）前記がん上のＨＥＲ２に結合し、（ｉｉ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲの３つ全て、および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲの３つ全て、を含み、前記抗体が免疫グロブリンであり、前記免疫グロブリンが、２つの同一な重鎖と第１の軽鎖および第２の軽鎖である２つの同一な軽鎖とを含み、前記第１の軽鎖が、第２の結合性部位を含む第２のｓｃＦｖである第２の分子へ（第１のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第１の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第２の軽鎖が、第３のｓｃＦｖへ（第２のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第２の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとが同一である、請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
第１の軽鎖融合ポリペプチドが第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドが第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列が、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
第１の軽鎖融合ポリペプチドが第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドが第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列が、配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれかである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
第１の軽鎖融合ポリペプチドが第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドが第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列が配列番号２３である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である、請求項９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が、７〜３２、７〜２７、７〜１７、１２〜３２、１２〜２２、１２〜１７、１７〜３２、または１７〜２７アミノ酸長である、請求項９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が、配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれか１つである、請求項９９〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が、配列番号５１〜５６のうちのいずれか１つである、請求項９９〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が配列番号２７である、請求項９９〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列が配列番号３０である、請求項９９〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
第２の結合性部位がＤＯＴＡに特異的に結合する、請求項９９〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列が配列番号２１のＣＤＲの３つ全てを含み、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列が配列番号２２のＣＤＲの３つ全てを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列が配列番号２１である、請求項１０９〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
第２のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列が配列番号２２である、請求項１０９〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
第１のｓｃＦｖの配列が、配列番号３１〜３６のうちのいずれかを含む、請求項１０９〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
第１のｓｃＦｖの配列が、配列番号３９〜４４のうちのいずれかを含む、請求項１０５または１０８〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
第１のｓｃＦｖの配列が配列番号３３を含む、請求項１０９〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
第２のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列が配列番号２１のヒト化形態を含む、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項１１７】
配列番号２１のヒト化形態が配列番号３７である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
第２のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列が配列番号２２のヒト化形態を含む、請求項１０９〜１１０および１１６〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
配列番号２２のヒト化形態が配列番号３８である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
重鎖内の、ＶHドメインの配列が配列番号２０を含む、請求項９９〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
軽鎖内の、ＶLドメインの配列が配列番号１９を含む、請求項９９〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
重鎖の配列が、配列番号１４〜１７のうちのいずれかを含む、請求項９９〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
重鎖の配列が配列番号１５を含む、請求項９９〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
重鎖の配列が配列番号１６を含む、請求項９９〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
軽鎖の配列が配列番号１１を含む、請求項９９〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
軽鎖融合ポリペプチドの配列が、配列番号５〜１０のうちのいずれかを含む、請求項９９〜１１５および１２０〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号７を含む、請求項９９〜１１５および１２０〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
軽鎖融合ポリペプチドの配列が、配列番号５〜１０のうちのいずれかを含み、重鎖の配列が、配列番号１４〜１７を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１２９】
軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号７を含み、重鎖の配列が配列番号１５を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１３０】
軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号４５〜５０のうちのいずれかを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１３１】
軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号５０を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号４５〜５０のうちのいずれかを含み、重鎖の配列が、配列番号１４〜１７を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１３３】
軽鎖融合ポリペプチドの配列が配列番号５０を含み、重鎖の配列が配列番号１６を含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
放射線療法剤が（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的を含み、前記第２の標的が金属キレート剤である、請求項７２〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
放射線療法剤が（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している、請求項７２〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
第２の分子がストレプトアビジンを含み、第２の標的がビオチンを含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
第２の標的がヒスタミンスクシニルグリシンを含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１〜２時間後、１〜３時間後、１〜４時間後、２〜６時間後、２〜８時間後、２〜１０時間後、４〜６時間後、４〜８時間後、４〜１０時間後、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、または６時間後に行われる、請求項７２〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、または約６時間後に行われる、請求項７２〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の約１時間後に行われる、請求項７２〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）が、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１６時間以内に行われる、請求項７２〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
がんが、乳がん、胃がん、骨肉腫、線維形成性小円形細胞がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、多形性神経膠芽腫、胃接合部腺癌、胃食道接合部腺癌、子宮頸がん、唾液腺がん、軟部組織肉腫、白血病、黒色腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、頭頸部がん、または神経芽細胞腫である、請求項５３、５６〜６９、および７２〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
がんが転移性腫瘍である、請求項５３、５６〜６９、および７２〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
転移性腫瘍が腹膜転移である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
対象へ細胞によるＨＥＲ２発現を増大させる薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項５３、５６〜６９、および７２〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
がんが、トラスツズマブ、セツキシマブ、ラパチニブ、エルロチニブ、または受容体のＨＥＲファミリーをターゲティングする、他の任意の低分子もしくは抗体による処置に対して耐性である、請求項５３、５６〜６９、および７２〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
免疫グロブリン内の重鎖が、Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するように変異が導入されている、請求項２１、２５〜４４、５３〜６８、および７２〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
重鎖が、Ｎ結合型グリコシル化部位であるアスパラギンをグリコシル化部位として機能しないアミノ酸で置きかえるアミノ酸置換を有する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
免疫グロブリン内の重鎖が、Ｃ１ｑ結合性部位を破壊するように変異が導入されている、請求項２１、２５〜４４、５３〜６８、および７２〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
二重特異性結合因子が補体を活性化させない、請求項１〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
二重特異性結合因子が、可溶性形態または細胞結合形態にあるＦｃ受容体に結合しない、請求項１〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
ｓｃＦｖがジスルフィド安定化型ｓｃＦｖである、請求項２４〜４４、５３〜６７、および７２〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
二重特異性結合因子が、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される、請求項１〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
二重特異性結合因子が対象へ静脈内投与される、請求項１〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
除去剤が対象へ静脈内投与される、請求項１〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
放射線療法剤が、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される、請求項１〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
放射線療法剤が対象へ静脈内投与される、請求項１〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５８】
除去剤の治療有効量が、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量の、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対する、１０：１のモル比をもたらす量であり、対象が、ヒトである、請求項１〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
除去剤の治療有効量が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である、請求項１〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
放射線療法剤の治療有効量が、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間であり、対象が、ヒトである、請求項１〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
（ｄ）対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）の１日間以内、２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、または１週間以内に、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ；
（ｅ）対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｄ）の後で、対象へ第２の治療有効量の除去剤を投与するステップ；および
（ｆ）対象へ第２の治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｅ）の後で、対象へ第２の治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ
を含む、請求項１〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｅ）が、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｄ）の１２時間以内に行われる、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
二重特異性結合因子の第２の治療有効量が、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇ である、請求項１６１または１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
除去剤の第２の治療有効量が、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量の、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対する、１０：１のモル比をもたらす量である、請求項１６１〜１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
除去剤の治療有効量が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である、請求項１６１〜１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
放射線療法剤の第２の治療有効量が、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間である、請求項１６１〜１６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６７】
二重特異性結合因子の第２の治療有効量が、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される、請求項１６１〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６８】
第２の治療有効量の二重特異性結合因子が対象へ静脈内投与される、請求項１６１〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
第２の治療有効量の除去剤が対象へ静脈内投与される、請求項１６１〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７０】
第２の治療有効量の放射線療法剤が、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される、請求項１６１〜１６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７１】
第２の治療有効量の放射線療法剤が、対象へ静脈内投与される、請求項１６１〜１６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７２】
（ｇ）対象へ第２の治療有効量の放射線療法を投与するステップ（ｆ）の１日間以内、２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、または１週間以内に、対象へ第３の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ；
（ｈ）対象へ第３の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｇ）の後で、対象へ第３の治療有効量の除去剤を投与するステップ；および
（ｉ）対象へ第３の治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｈ）の後で、対象へ第３の治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ
を含む、請求項１６１〜１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７３】
対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｇ）が、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｇ）の１２時間以内に行われる、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
二重特異性結合因子の第３の治療有効量が、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇである、請求項１７２または１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
除去剤の第３の治療有効量が、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量の、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対する、１０：１のモル比をもたらす量である、請求項１７２〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７６】
除去剤の治療有効量が、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である、請求項１７２〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７７】
放射線療法剤の第３の治療有効量が、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間である、請求項１７２〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
第３の治療有効量の二重特異性結合因子が、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される、請求項１７２〜１７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
第３の治療有効量の二重特異性結合因子が対象へ静脈内投与される、請求項１７２〜１７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８０】
第３の治療有効量の除去剤が対象へ静脈内投与される、請求項１７２〜１７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８１】
第３の治療有効量の放射線療法剤が、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される、請求項１７２〜１８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８２】
第３の治療有効量の放射線療法剤が対象へ静脈内投与される、請求項１７２〜１８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８３】
二重特異性結合因子が薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物中に含有される、請求項１〜１８２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それらの各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年３月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／６４１，６４５号、および２０１９年３月４日に出願された米国特許仮出願第６２／８１３，５９２号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、本出願と共に、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１３５４２−０６１−２２８．ｔｘｔ」と題され、２０１９年３月７日に作成され、１４４，８８８バイトのサイズを有する、テキストファイルとして提出された配列表を、参照により組み込む。
【０００３】
１．分野
本明細書では、ｉ）がんにより発現されるがん抗原である第１の標的、およびｉｉ）がん抗原ではない第２の標的に特異的に結合する二重特異性結合因子を伴う組成物、方法、および使用が提示される。本明細書で記載される二重特異性結合因子は、がんを処置するための方法において、有用である。本明細書ではまた、がんを処置するための、（ｉ）がん抗原に特異的に結合する二重特異性結合因子、（ｉｉ）除去剤、および（ｉｉｉ）放射線療法剤を伴う方法および使用も提示される。
【背景技術】
【０００４】
２．背景
治療用放射性同位元素（すなわち、放射免疫療法）の担体としての、フルサイズのＩｇＧモノクローナル抗体の薬物動態は、典型的に、放射免疫療法について、線量制限的な、血液毒性と共に、望ましくない治療指数（例えば、血液などの放射線感受性組織への線量で除された、腫瘍への放射線吸収線量の比（例えば、Larson et al., 2015, “Radioimmunotherapy of human tumours.” Nature Reviews Cancer; 15: 347-60を参照されたい））を示す。代替的に、循環中のリガンドの滞留時間を短縮するために、抗体に媒介されるターゲティングステップを、細胞傷害性リガンドを投与するステップから分離する、プレターゲティング型放射免疫療法（「ＰＲＩＴ」）戦略が、利用されうる（例えば、Kraeber-Bodere et al., 2015, “A pretargeting system for tumor PET imaging and radioimmunotherapy.” Front Pharmacol. 6:54を参照されたい）。典型的なＰＲＩＴ戦略は、３つのステップ：（ｉ）腫瘍ターゲティングステップ；（ｉｉ）除去ステップ；および（ｉｉｉ）放射線療法ステップを伴う。第１に、二特異性腫瘍ターゲティング剤が、腫瘍へとあらかじめ局在化することを可能とするように、腫瘍抗原に対する１つの特異性を有する二特異性腫瘍ターゲティング剤（例えば、二特異性抗体）が、対象へ投与される。第２に、循環する二特異性腫瘍ターゲティング剤（例えば、血中の結合していない二特異性腫瘍ターゲティング剤）を血液から除去するように、除去剤が対象へ投与される。第３に、腫瘍結合性二特異性腫瘍ターゲティング剤に結合し、腫瘍細胞を死滅させる、放射性標識された低分子ハプテンまたはペプチドが、対象へ投与される。除去ステップは、循環血中の二特異性腫瘍ターゲティング剤の量の低減を可能とし、二特異性腫瘍ターゲティング剤と、放射性標識された低分子ハプテンまたはペプチドとの血中の相互作用の低減を可能とする。実際、除去ステップは、ターゲティングされていない組織、とりわけ、血液に対する放射線曝露を低減することにより、ＰＲＩＴ法の治療指数を改善する結果として、線量制限毒性をもたらさずに高用量の放射性標識された低分子ハプテンまたはペプチドの投与を可能とする。
【０００５】
しかし、現行のＰＲＩＴ法の主要な欠点は、迅速に内在化される抗原をターゲティングできないことを含む（例えば、Walter et al., 2010, Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, 25(2):125-142を参照されたい）。そのペイロードの送達のために、細胞表面受容体への結合、ならびに細胞への結合時における内在化に依拠する、抗体−薬物コンジュゲートと異なり、非内在化抗体／細胞表面標的はＰＲＩＴに最適であると考えられる（例えば、Boerman et al., 2003, Pretargeted Radioimmunotherapy of Cancer: Progress Step by Step*. J. Nucl. Med. 44(3):400-411; Casalini et al., 1997, Tumor Pretargeting: Role of Avidin/Streptavidin on Monoclonal Antibody Internalization. J. Nucl. Med.; 38(9):1378-1381; Walter et al., 2010, Pretargeted Radioimmunotherapy for Hematologic and Other Malignancies, Cancer Biother Radiopharm.; 25(2):125-142; Cheal et al., 2014, “Preclinical evaluation of multistep targeting of diasialoganglioside GD2 using an IgG-scFv bispecific antibody with high affinity for GD2 and DOTA metal complex.” Molecular Cancer Therapeutics; 13:1802-12; Cheal et al., 2016, “Theranostic pretargeted radioimmunotherapy of colorectal cancer xenografts in mice using picomolar affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn binding scFv C825/GPA33 IgG bispecificimmunogonjugates.” European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging; 43:925-37; Green et al., 2016, “Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers.” Cancer Research; 76(22):6669-6679を参照されたい）。急速に内在化される抗原は、ＰＲＩＴにはターゲティング不能である（Walter et al., 2010, Pretargeted Radioimmunotherapy for Hematologic and Other Malignancies, Cancer Biother Radiopharm.; 25(2):125-142を参照されたい;Boerman et al., 2003, Pretargeted Radioimmunotherapy of Cancer: Progress Step by Step*. J. Nucl. Med. 44(3):400-411もまた参照されたい）。しかし、多くのがんは、がん細胞へ内在化する抗原と関連し；例えば、がん抗原であるヒト表皮増殖因子受容体２（「ＨＥＲ２」）は、細胞へのエンドサイトーシスを受けやすい（例えば、Austin et al., 2004, Molecular Biology of the Cell, 15:5268-5282を参照されたい）。したがって、細胞へ内在化する抗原（例えば、細胞へ内在化される抗原）と関連するがんを処置する方法に対する要求は満たされていない。さらに、腫瘍をターゲティングするステップと除去剤ステップとの間の時間が長いために（典型的に、２４〜１２０時間（例えば、Knox et al., 2000, Clinical Cancer Research, 6:406-414; Bodet-Milin et al. J Nucl Med 2016, vol 57, no 10, 1505-1511; Bodet-Milin et al. Front Med (Lausanne) 2015 Nov 27, 2:84; Schoffelen, R., Woliner-van der Weg, W., Visser, E.P. et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging (2014) 41: 1593; Forero, et al. Blood 2004 104(1) 227-36; Weiden, et al. Cancer Biother Radiopharm 2000 15(1): 15-29を参照されたい））、現行のＰＲＩＴ法は、複数回の来院、または一晩にわたる院内泊を要求することが多く、患者に対する費用および労力の負担となりうる。したがって、改善され、より効率的なＰＲＩＴ法もまた必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
３．概要
本明細書では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップであって、二重特異性結合因子が、第２の分子に（リンカーを介していてもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記第１の分子が第１の結合性部位を含み、前記第１の結合性部位が第１の標的に特異的に結合し、前記第１の標的が前記がんにより発現されるがん抗原であり、前記第２の分子が第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位が第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的ががん抗原ではないステップ；（ｂ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１２時間以内に、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップであって、前記除去剤が前記第２の結合性部位に結合し、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を低減するように機能するステップ；および（ｃ）対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップであって、放射線療法剤が、（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的を含み、前記第２の標的が金属キレート剤である；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合しているステップ、を含む方法が提示される。具体的な実施形態では、治療有効量の二重特異性結合因子は、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇであり、対象は、ヒトである。別の具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、２５０ｍｇ〜７００ｍｇ、３００ｍｇ〜６００ｍｇ、または４００ｍｇ〜５００ｍｇであり、対象は、ヒトである。具体的な実施形態では、がん抗原は、ＨＥＲ２、ＣＡ６、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＦＲα、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、メソテリン、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ１、Ｔｒｏｐ−２、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、アルファｖベータ６、ＣＡ１９．９、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７４、ＣＤ１８０、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ７９ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＲＩＰＴＯ、ＤＬＬ３、ＤＳ６、エンドセリンＢ受容体、ＦＡＰ、ＧＤ２、メソテリン、ＰＭＥＬ  １７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＴＥＮＢ２、ＴＩＭ−１、ＣＤ９８、エンドシアリン／ＣＤ２４８／ＴＥＭ１、フィブロネクチン細胞外ドメインＢ、ＬＩＶ−１、ムチン１、ｐ−カドヘリン、ペリトシン、Ｆｙｎ、ＳＬＴＲＫ６、テネイシンｃ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＲＬＲ、ＣＤ２０、ＣＤ７２、フィブロネクチン、ＧＰＡ３３、テネイシンＣのスプライスアイソフォーム、ＴＡＧ−７２、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、およびポリシアル酸からなる群から選択される。好ましい実施形態では、がん抗原は、ＨＥＲ２である。具体的な実施形態では、がん抗原はがん細胞へと内在化される抗原である。具体的な実施形態では、がん細胞へと内在化されるがん抗原は、ＨＥＲ２、ＣＡ６、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＦＲα、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、メソテリン、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ１、Ｔｒｏｐ−２、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、アルファｖベータ６、ＣＡ１９．９、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７４、ＣＤ１８０、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ７９ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＲＩＰＴＯ、ＤＬＬ３、ＤＳ６、エンドセリンＢ受容体、ＦＡＰ、ＧＤ２、メソテリン、ＰＭＥＬ  １７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＴＥＮＢ２、ＴＩＭ−１、ＣＤ９８、エンドシアリン／ＣＤ２４８／ＴＥＭ１、フィブロネクチン細胞外ドメインＢ、ＬＩＶ−１、ムチン１、ｐ−カドヘリン、ペリトシン、Ｆｙｎ、ＳＬＴＲＫ６、テネイシンｃ、ＶＥＧＦＲ２、およびＰＲＬＲからなる群から選択される。好ましい実施形態では、がん細胞へと内在化されるがん抗原はＨＥＲ２である。別の実施形態では、がん抗原は、がん細胞へと内在化されない抗原である。具体的な実施形態では、がん細胞へと内在化されないがん抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ７２、フィブロネクチン、ＧＰＡ３３、テネイシンＣのスプライスアイソフォーム、およびＴＡＧ−７２からなる群から選択される。好ましい実施形態では、がん抗原はＨＥＲ２であり、金属キレート剤はＤＯＴＡまたはその誘導体である。
【０００７】
本明細書ではまた、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）対象へ第１の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップであって、前記二重特異性結合因子の第１の治療有効量が１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇであり、二重特異性結合因子が第２の分子に共有結合的に（リンカーを介してもよく）結合している第１の分子を含み、前記がんがＨＥＲ２を発現し、前記第１の分子が、抗体もしくはその抗原結合性断片、または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖが、（ｉ）前記がん上のＨＥＲ２に結合し、（ｉｉ）配列番号２０の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の３つ全て、および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲの３つ全て、を含み、前記第２の分子が第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位が第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的が、がん抗原ではないステップ；（ｂ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の後で、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップであって、前記除去剤が前記第２の結合性部位に結合し、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を低減するように機能するステップ；および（ｃ）対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップであって、放射線療法剤が、（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的を含み、前記第２の標的が金属キレート剤である；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合しており、対象がヒトであるステップを含む方法も提示される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第１の治療有効量は、約４５０ｍｇである。
【０００８】
二重特異性結合因子についての、具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第１の分子は、抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片は、第１の結合性部位を含む。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンである。
【０００９】
第１の分子が、ＨＥＲ２に特異的に結合する、第１の結合性部位を含む、免疫グロブリンを含む、二重特異性結合因子についての、具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖は、配列番号２０の、３つの重鎖ＣＤＲ全てを含み、免疫グロブリン内の軽鎖は、配列番号１９の３つの軽鎖ＣＤＲ全てを含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の、重鎖内の重鎖可変（ＶH）ドメインの配列は配列番号２０を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖内のＶHドメインの配列は、配列番号２０のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖内の軽鎖可変（ＶL）ドメインの配列は配列番号１９を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖内のＶLドメインの配列は配列番号１９のヒト化形態を含む具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列は配列番号１４〜１７のうちのいずれかを含む。好ましい実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列は配列番号１５を含む。より好ましい実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列、配列番号１６を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖の配列は配列番号１１を含む。
【００１０】
二重特異性結合因子についての、具体的な実施形態では、第２の分子は第２の結合性部位を含むｓｃＦｖである。第２の分子がｓｃＦｖである具体的な実施形態では、第２の標的はＤＯＴＡまたはその誘導体である。第２の分子がｓｃＦｖであり、第２の標的がＤＯＴＡまたはその誘導体である、具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は、配列番号２１のＣＤＲの３つ全てを含み、ｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は、配列番号２２のＣＤＲの３つ全てを含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１である。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１のヒト化形態である。具体的な実施形態では、配列番号２１のヒト化形態は配列番号３７である。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２である。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２のヒト化形態である。具体的な実施形態では配列番号２２のヒト化形態は配列番号３８である。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号３１〜３６のうちのいずれかを含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は、配列番号３１〜３６のうちのいずれかである。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は、配列番号３９〜４４のうちのいずれかを含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は、配列番号３９〜４４のうちのいずれかである。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号３３を含む（例えば、ｓｃＦｖの配列は、配列番号３３である）。より好ましい実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号４４を含む（例えば、ｓｃＦｖの配列は配列番号４４である）。
【００１１】
第１の分子が免疫グロブリンである具体的な実施形態では、免疫グロブリンは、２つの同一な重鎖と、第１の軽鎖および第２の軽鎖である２つの同一な軽鎖、とを含み、前記第１の軽鎖は第２の結合性部位を含む第１のｓｃＦｖである第２の分子へと（第１のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第１の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第２の軽鎖は、第２のｓｃＦｖへ（第２のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第２の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとは同一である。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドは、第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドは、第２のペプチドリンカーを含み、第１のペプチドリンカーおよび第２のペプチドリンカーの配列は、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは、７〜３２、７〜２７、７〜１７、１２〜３２、１２〜２２、１２〜１７、１７〜３２、または１７〜２７アミノ酸残基の長さである。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドは、第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドは、第２のペプチドリンカーを含み、第１のペプチドリンカーおよび第２のペプチドリンカーの配列は、配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれかである。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内の、ＶHドメインとＶLドメインとの間の、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は、配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれか１つである。好ましい実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は配列番号２７である。より好ましい実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は配列番号３０である。具体的な実施形態では、第１の標的はＨＥＲ２である。具体的な実施形態では、第２の標的はＤＯＴＡまたはその誘導体である。
【００１２】
第１の分子が免疫グロブリンである二重特異性結合因子の具体的な実施形態では、免疫グロブリンは、２つの同一な重鎖と第１の軽鎖および第２の軽鎖である２つの同一な軽鎖とを含み、前記第１の軽鎖は第２の結合性部位を含む第１のｓｃＦｖである第２の分子へ（第１のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第１の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第２の軽鎖は、第２のｓｃＦｖへと（第２のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第２の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとは同一であり、この場合、第１の標的はＨＥＲ２であり、第２の標的はＤＯＴＡまたはその誘導体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖は配列番号２０の３つの重鎖ＣＤＲ全てを含み、免疫グロブリン内の軽鎖は配列番号１９の３つの軽鎖ＣＤＲ全てを含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖内のＶHドメインの配列は配列番号２０を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖内のＶHドメインの配列は配列番号２０のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内、軽鎖内のＶLドメインの配列は配列番号１９を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖内のＶLドメインの配列は配列番号１９のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列は配列番号１４〜１７のうちのいずれかを含む。好ましい実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列は配列番号１５を含む。より好ましい実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列は配列番号１６を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖の配列は配列番号１１を含む。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１のＣＤＲの３つ全てを含み、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２のＣＤＲの３つ全てを含む。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列、配列番号２１である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１のヒト化形態である。具体的な実施形態では、配列番号２１のヒト化形態は配列番号３７である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２のヒト化形態である。具体的な実施形態では、配列番号２２のヒト化形態は配列番号３８である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖの配列は配列番号３１〜３６のうちのいずれかを含む。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖの配列は配列番号３１〜３６のうちのいずれかである。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号３９〜４４のうちのいずれかを含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号３９〜４４のうちのいずれかである。好ましい実施形態では、第１のｓｃＦｖの配列は配列番号３３を含む（例えば、第１のｓｃＦｖの配列は、配列番号３３である）。より好ましい実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号４４を含む（例えば、ｓｃＦｖの配列は、配列番号４４である）。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号５〜１０のうちのいずれかである。好ましい実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号７である。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号５〜１０のうちのいずれかであり、重鎖の配列は配列番号１４〜１７のうちのいずれかである。好ましい実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号７であり、重鎖の配列は配列番号１５である。好ましい実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号５０であり、重鎖の配列は配列番号１６である。
【００１３】
二重特異性結合因子についての具体的な実施形態では、二重特異性結合因子はＦｃドメインを含む。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａの間、１５０〜３００ｋＤａの間、または２００〜２５０ｋＤａの間である。
二重特異性結合因子が免疫グロブリンを含む二重特異性結合因子についての具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖はＮ結合型グリコシル化部位を破壊するように変異が導入されている。具体的な実施形態では、重鎖はＮ結合型グリコシル化部位であるアスパラギンをグリコシル化部位として機能しないアミノ酸で置きかえるアミノ酸置換を有する。
免疫グロブリンを含む二重特異性結合因子についての具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖は、Ｃ１ｑ結合性部位を破壊するように変異が導入されている。
二重特異性結合因子についての、具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、補体を活性化させない。
【００１４】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、その可溶性形態または細胞結合形態にあるＦｃ受容体に結合しない。
二重特異性結合因子がｓｃＦｖを含む具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、ジスルフィド安定化型ｓｃＦｖである。
【００１５】
本明細書で提示される、がんを処置する方法についての、具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、二重特異性結合因子は、対象へ静脈内投与される。
【００１６】
本明細書ではまた、本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用のための除去剤も提示される。具体的な実施形態では、除去剤は、主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により、循環血から除去される分子に結合している第２の標的（すなわち、がんを処置する方法において使用される、二重特異性結合因子の第２の標的）を含む。具体的な実施形態では、除去剤は、第２の標的へとコンジュゲートされた、５００ｋＤａのアミノデキストランを含む。具体的な実施形態では、除去剤は、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの第２の標的分子、約１００〜１５０個を含む。
【００１７】
本明細書で提示される、がんを処置する方法についての、具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１０時間以内、８時間以内、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１〜１２時間後、２〜１２時間後、１〜２時間後、１〜３時間後、１〜４時間後、２〜６時間後、２〜８時間後、２〜１０時間後、４〜６時間後、４〜８時間後、４〜１０時間後、２時間後、または４時間後に行われる。別の具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の約２時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、または約１０時間後に行われる。別の具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、少なくとも１００ｋＤａであり、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の４時間以内に行われる。
【００１８】
本明細書で提示される、がんを処置する方法についての具体的な実施形態では、除去剤は対象へ静脈内投与される。本明細書で提示される、がんを処置する方法についての、具体的な実施形態では、除去剤の治療有効量は、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量の、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対する、１０：１のモル比をもたらす量であり、対象はヒトである。本明細書で提示される、がんを処置する方法についての、具体的な実施形態では、除去剤の治療有効量は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である。
【００１９】
本明細書ではまた、本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用のための放射線療法剤も提示される。具体的な実施形態では、放射線療法剤は、（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的（すなわち、がんを処置する方法において使用される、二重特異性結合因子の第２の標的）であって、金属キレート剤である第２の標的を含む。別の具体的な実施形態では、放射線療法剤は、（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的（すなわち、がんを処置する方法において使用される、二重特異性結合因子の第２の標的）であって、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している第２の標的を含む。放射線療法剤についての具体的な実施形態では、金属キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（１，４，７，１０−ｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＤＯＴＡ）またはその誘導体、ＤＯＴＡ−Ｂｎまたはその誘導体、ｐ−アミノベンジル−ＤＯＴＡまたはその誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはその誘導体、およびＤＯＴＡ−デフェロキサミンからなる群から選択される。具体的な実施形態では、金属キレート剤は、ＤＯＴＡまたはその誘導体である。別の具体的な実施形態では、金属キレート剤は、ＤＯＴＡ−Ｂｎまたはその誘導体である。放射線療法剤についての具体的な実施形態では、前記金属放射性核種の金属は、ルテチウム（Ｌｕ）、アクチニウム（Ａｃ）、アスタチン（Ａｔ）、ビスマス（Ｂｉ）、セリウム（Ｃｅ）、銅（Ｃｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、エルビウム（Ｅｒ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ガリウム（Ｇａ）、ホルミウム（Ｈｏ）、ヨウ素（Ｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ランタン（Ｌａ）、鉛（Ｐｂ）、ネオジミウム（Ｎｄ）、プラセオジム（Ｐｒ）、プロメチウム（Ｐｍ）、レニウム（Ｒｅ）、サマリウム（Ｓｍ）、スカンジウム（Ｓｃ）、テルビウム（Ｔｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、イットリウム（Ｙ）、およびジルコニウム（Ｚｒ）からなる群から選択される。放射線療法剤についての具体的な実施形態では、前記金属放射性核種の金属は、ルテチウム（Ｌｕ）、アクチニウム（Ａｃ）、アスタチン（Ａｔ）、ビスマス（Ｂｉ）、セリウム（Ｃｅ）、銅（Ｃｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、エルビウム（Ｅｒ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ガリウム（Ｇａ）、ホルミウム（Ｈｏ）、ヨウ素（Ｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ランタン（Ｌａ）、鉛（Ｐｂ）、ネオジミウム（Ｎｄ）、プラセオジム（Ｐｒ）、プロメチウム（Ｐｍ）、ラジウム（Ｒａ）、レニウム（Ｒｅ）、サマリウム（Ｓｍ）、スカンジウム（Ｓｃ）、テルビウム（Ｔｂ）、トリウム（Ｔｈ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、イットリウム（Ｙ）、およびジルコニウム（Ｚｒ）からなる群から選択される。放射線療法剤についての具体的な実施形態では、金属放射性核種は、211Ａｔ、225Ａｃ、227Ａｃ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、157Ｇｄ、166Ｈｏ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、212Ｐｂ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、47Ｓｃ、153Ｓｍ、166Ｔｂ、89Ｚｒ、86Ｙ、88Ｙ、および90Ｙからなる群から選択される。放射線療法剤についての具体的な実施形態では、金属放射性核種は、211Ａｔ、225Ａｃ、227Ａｃ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、157Ｇｄ、166Ｈｏ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、212Ｐｂ、223Ｒａ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、47Ｓｃ、153Ｓｍ、166Ｔｂ、227Ｔｈ、89Ｚｒ、86Ｙ、88Ｙ、90Ｙ、および前出のうちのいずれかの組合せからなる群から選択される。放射線療法剤についての具体的な実施形態では、金属放射性核種は、177Ｌｕと、227Ａｃとの組合せである。好ましい実施形態では、金属放射性核種は、177Ｌｕである。放射線療法剤が、（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している具体的な実施形態では、第２の分子はストレプトアビジンを含み、第２の標的はビオチンを含む。放射線療法剤が、（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している別の具体的な実施形態では、第２の標的は、ヒスタミンスクシニルグリシンを含む。
【００２０】
本明細書で提示される、がんを処置する方法についての、具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１〜２時間後、１〜３時間後、１〜４時間後、２〜６時間後、２〜８時間後、２〜１０時間後、４〜６時間後、４〜８時間後、４〜１０時間後、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、または６時間後に行われる。別の具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、または約６時間後に行われる。別の具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の約１時間後に行われる。別の具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１６時間以内に行われる。
【００２１】
本明細書で提示される、がんを処置する方法についての具体的な実施形態では、放射線療法剤は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、放射線療法剤は、対象へ静脈内投与される。具体的な実施形態では、放射線療法剤の治療有効量は、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間であり、対象はヒトである。放射線療法剤がアルファ線放射性同位元素、例えば、225Ａｃである、具体的な実施形態では、放射線療法剤の治療有効量は、０．１０８ｍＣｉ〜０．３５１ｍＣｉであり、対象はヒトである。
【００２２】
本明細書で提示される、がんを処置する方法は、２、３回以上にわたり、対象に対して繰り返されうる。がんを処置する方法についての、具体的な実施形態では、方法は、（ｄ）対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）の１日間以内、２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、または１週間以内に、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ；（ｅ）対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｄ）の後で、対象へ第２の治療有効量の除去剤を投与するステップ；および（ｆ）対象へ第２の治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｅ）の後で、対象へ第２の治療有効量の放射線療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｅ）は、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｄ）の１２時間以内に行われる。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第２の治療有効量は、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇである。具体的な実施形態では、除去剤の第２の治療有効量は、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量の、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対する、１０：１のモル比をもたらす量である。具体的な実施形態では、除去剤の治療有効量は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である。具体的な実施形態では、放射線療法剤の、第２の治療有効量は、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間である。具体的な実施形態では、第２の治療有効量の二重特異性結合因子は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、第２の治療有効量の二重特異性結合因子が対象へ静脈内投与される。具体的な実施形態では、第２の治療有効量の除去剤は、対象へ静脈内投与される。具体的な実施形態では、第２の治療有効量の放射線療法剤は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、第２の治療有効量の放射線療法剤は、対象へ静脈内投与される。
【００２３】
がんを処置する方法についての別の具体的な実施形態では、本方法は、（ｇ）対象へ第２の治療有効量の放射線療法を投与するステップ（ｆ）の１日間以内、２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、または１週間以内に、対象へ第３の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ；（ｈ）対象へ第３の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｇ）の後で、対象へ第３の治療有効量の除去剤を投与するステップ；および（ｉ）対象へ第３の治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｈ）の後で、対象へ第３の治療有効量の放射線療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｇ）は、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｇ）の１２時間以内に行われる。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第３の治療有効量は、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇである。具体的な実施形態では、除去剤の第３の治療有効量は、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量の、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対する、１０：１のモル比をもたらす量である。具体的な実施形態では、除去剤の治療有効量は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である。具体的な実施形態では、放射線療法剤の第３の治療有効量は、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間である。具体的な実施形態では、第３の治療有効量の二重特異性結合因子は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、第３の治療有効量の二重特異性結合因子は、対象へ静脈内投与される。具体的な実施形態では、第３の治療有効量の除去剤は、対象へ静脈内投与される。具体的な実施形態では、第３の治療有効量の放射線療法剤は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、第３の治療有効量の放射線療法剤は、対象へ静脈内投与される。
具体的な実施形態では、本明細書で提示される、がんを処置する方法の二重特異性結合因子は、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物中に含有される。
【００２４】
本明細書で提示される方法に従い処置されるがんが、ＨＥＲ２を発現する、具体的な実施形態では、がんは、乳がん、胃がん、骨肉腫、線維形成性小円形細胞がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、多形性神経膠芽腫、胃接合部腺癌、胃食道接合部腺癌、子宮頸がん、唾液腺がん、軟部組織肉腫、白血病、黒色腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、頭頸部がん、または神経芽細胞腫である。具体的な実施形態では、がんは、転移性腫瘍である。具体的な実施形態では、転移性腫瘍は、腹膜転移である。本明細書で提示される方法に従い処置されるがんが、ＨＥＲ２を発現する、具体的な実施形態では、がんを処置する方法は、対象へ細胞によるＨＥＲ２発現を増大させる薬剤を投与するステップをさらに含む。具体的な実施形態では、細胞によるＨＥＲ２の発現を増大させる薬剤は、例えば、一時的なカベオリン１（ＣＡＶ１）の枯渇により、ＨＥＲ２の半減期を延長し、細胞膜におけるアベイラビリティーを増大させるが使用されうるこのような薬剤の例は、ロバスタチンである。本明細書で提示される方法に従い処置されるがんがＨＥＲ２を発現する具体的な実施形態では、がんは、トラスツズマブ、セツキシマブ、ラパチニブ、エルロチニブ、または受容体のＨＥＲファミリーをターゲティングする他の任意の低分子もしくは抗体による処置に対して耐性である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特徴づけを示す図である。図１Ａ：ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム（ＵＶ：２８０ｎｍ）による、ＨＥＲ２−Ｃ８２５の生化学的純度を示す図である。メインピーク（１５．９３３分後）は、近似分子量を２１０ｋＤａとする、完全に対合したＢｓＡｂのピーク（＞９６％の積分曲線下面積）である。２５分後は塩緩衝液のピークである。
【図１Ｂ】抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特徴づけを示す図である。図１Ｂ：ＢＳＡ−（Ｙ）−ＤＯＴＡ−Ｂｎへの、ＢｓＡｂの結合についての、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図１Ｃ】抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特徴づけを示す図である。図１Ｃ：ＨＥＲ２（＋）乳がん細胞系ＡＵ５６５への抗体の結合についての、ＦＡＣＳヒストグラムである。左上のヒストグラムは、抗体の濃度（細胞１０6個当たりのμｇ）を記録し、リツキサンを陰性対照として使用した（ＭＦＩを５とした）。
【図２】ＨＥＲ２（＋）腫瘍の表面に結合した、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂが、急速に内在化されることを示す図である。抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５を放射性ヨウ素標識し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放射性トレーサー結合研究を、ＨＥＲ２（＋）ＢＴ−４７４細胞により実施して、３７℃における、131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の内在化および細胞内プロセシングを決定した。データは、ｎ＝３；平均値±標準偏差（ＳＤ）として提示する。
【図３】ＢｓＡｂを、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを伴う、抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ（５．５〜５．６ＭＢｑ；約３０ｐｍｏｌ）に最適化するための、皮下（ｓ．ｃ．）ＢＴ−４７４腫瘍を保有する、ヌードマウスの群（群１つ当たりのｎ＝４）の多様な組織における、177Ｌｕ放射能についてのｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布研究を示す図である。除去剤ステップは、行わなかった。多様な用量のＢｓＡｂ（マウス１匹当たり０．２５、０．５０、または０．７５ｍｇのＢｓＡｂ；マウス１匹当たり１．１９〜３．５７ｎｍｏｌ）を含む、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴの後の腫瘍内の、注射の２４時間後における、177Ｌｕ放射能の取込み（注射放射能パーセント（ＩＡ／ｇ％）；平均値±ＳＤ）を決定した。マウス１匹当たり０．２５ｍｇのＢｓＡｂまたはマウス１匹当たり０．５０ｍｇのＢｓＡｂを施された群の間で、177Ｌｕ放射能の腫瘍による取込みに有意差が見られなかった（ｎ．ｓ．）（Ｐ＞０．０５）ことから、マウス１匹当たり０．２５ｍｇのＢｓＡｂが最適であったことが示唆される。
【図４】注射の１時間後という早期における、最適化された抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによる、血液および腎臓を含む正常組織への取込みを最小限とする、177Ｌｕ放射能に対する、極めて高度の腫瘍ターゲティングを示す図である。５．５〜６．１ＭＢｑ（約３０ｐｍｏｌ）の、プレターゲティングされた177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの、注射の１〜３３６時間後における、逐次的生体内分布データは、皮下ＢＴ−４７４腫瘍および選択した正常組織における、組織への取込み（ＩＡ／ｇ％としての取込み；注：ｙ軸は、対数スケールとする）を示す。腫瘍による取込みが最大であった、注射後２４時間にわたるデータもまた表１０に提示する（下記の６節を参照されたい）。研究された全ての時点についてのデータは表形式で表１２に提示する（下記の６節を参照されたい）。
【図５Ａ】ＢｓＡｂ、およびプレターゲティングされた177Ｌｕ放射能の、ＢＴ−４７４腫瘍内分布についてアッセイする、代表的な組織学、免疫組織化学（ＩＨＣ）、およびオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏｒａｄ．）を示す図である。図５Ａ：抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂ（０．２５ｍｇ、１．１９ｎｍｏｌ）の、注射の２４時間後におけるＩＨＣを示す図である。スケールバーは１０００μｍである。画像ベースの濃度測定を使用したところ、ＢｓＡｂ−ＩＨＣおよびＨＥＲ２−ＩＨＣの陽性面積％は、それぞれ、５１および６１％であったことから、０．８４の（ＢｓＡｂ−ＩＨＣ）／（ＨＥＲ２−ＩＨＣ）比が得られる。
【図５Ｂ】ＢｓＡｂ、およびプレターゲティングされた177Ｌｕ放射能の、ＢＴ−４７４腫瘍内分布についてアッセイする、代表的な組織学、免疫組織化学（ＩＨＣ）、およびオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏｒａｄ．）を示す図である。図５Ｂ：注射の２４時間後における、プレターゲティングされた177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（５５．５ＭＢｑ、３００ｐｍｏｌ）についての、Ｈ＆Ｅおよびオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏｒａｄ．）を示す図である。スケールバーは、２０００μｍである。
【図６Ａ】ＩＡを５５．５ＭＢｑとする、１サイクル型抗ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴが、小サイズのＢＴ−４７４腫瘍を伴うマウスでは完全奏効（ＣＲ）をもたらすが、中サイズのＢＴ−４７４腫瘍を保有するマウスでは一般に無効であることを示す図である。腫瘍体積は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。黒矢印は、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射日を指し示す。図６Ａ：小サイズの腫瘍を保有するマウスの、１サイクル型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎによる処置を、対照群と対比して示す図である。
【図６Ｂ】ＩＡを５５．５ＭＢｑとする、１サイクル型抗ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴが、小サイズのＢＴ−４７４腫瘍を伴うマウスでは完全奏効（ＣＲ）をもたらすが、中サイズのＢＴ−４７４腫瘍を保有するマウスでは一般に無効であることを示す図である。腫瘍体積は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。黒矢印は、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射日を指し示す。図６Ｂ：中サイズの腫瘍を保有するマウスの、１サイクル型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋１１．１、３３．３、または５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎによる処置を、対照群と対比して示す図である。
【図７】セラノスティック用の抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを示す図である。抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（左画像）、または非ターゲティング型177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎによる処置（右画像）を受ける、皮下ＢＴ−４７４異種移植片（赤矢印；触知可能：３０ｍｍ3）を保有するマウスの群についての平面シンチグラフィーである。プレターゲティング特異的腫瘍による、177Ｌｕ放射能の取込みが明らかであった一方で、５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを投与されたマウスは、主に、腎臓内の取込みを示したことは、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの腎クリアランスと符合する。全ての画像は同じ縮尺上で提示する。
【図８】ＩＡを、１６７ＭＢｑとする、分割型抗ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴが、中サイズの異種移植片を伴うマウスにおいて１００％のＣＲをもたらし、８５日後においても再発をもたらさないことを示す図である。腫瘍体積は平均値±ＳＥＭとして提示する。黒矢印は177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射日を指し示す。
【図９Ａ】ＳＰＥＣＴ／ＣＴによる、分割型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置のモニタリングを示す図である。イメージングの視野は、腫瘍（白矢印）に重点を置くために、動物の尾側半身（尾までの正中線）に限定した。適切な場合は、黄矢印で膀胱を指し示す。図９Ａ：対照ＩｇＧ−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ、または抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴでプレターゲティングされた、サイクル１の177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（５５．５ＭＢｑ、３００ｐｍｏｌ）の注射の２４時間後における、ＢＴ−４７４腫瘍保有動物についての代表的なＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像（左から右へ：腫瘍の中心を通る、冠状断面および横断面、最大値投影法（ＭＩＰ））を示す図である。
【図９Ｂ】ＳＰＥＣＴ／ＣＴによる、分割型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置のモニタリングを示す図である。イメージングの視野は、腫瘍（白矢印）に重点を置くために、動物の尾側半身（尾までの正中線）に限定した。適切な場合は、黄矢印で膀胱を指し示す。図９Ｂ：各サイクルの放射能注射の２４時間後に撮影された、分割型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ（左）を受ける、ＢＴ−４７４腫瘍保有動物についての、代表的な、逐次的ＳＰＥＣＴ／ＣＴ  ＭＩＰ画像を示す図である。サイクル１、２、または３の、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（５５．５ＭＢｑ、３００ｐｍｏｌ）の注射の２４時間後における、腫瘍による取込みについての、画像から導出された対象領域（ＲＯＩ）値（マウス１（Ｍ１）、Ｍ２、およびＭ３）は、ＭＢｑ／ｇ（平均値±ＳＤ）として提示する。
【図１０】セラノスティック用の分割型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを示す図である。抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎによる、分割３サイクル型処置を受ける、８匹中３匹の動物（皮下ＢＴ−４７４腫瘍；無作為に選択された動物である、マウス１（Ｍ１）、Ｍ２、およびＭ３）についての、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像である。白矢印は下脇腹における腫瘍を指し示す。
【図１１】１サイクル型抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋１１．１〜５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎによる処置前（ベースライン、０日目）から処置の約８５〜２００日後までの動物の体重を示す図である。データは平均値±ＳＤとして提示する。
【図１２Ａ】処置対照（図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃ）による処置前（ベースライン、０日目）から処置の８０日後までの動物の体重を示す図である。黒矢印は177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射日を指し示す。アステリスクは過剰な体重減少（すなわち、体重がベースラインの８０％まで降下する場合）に起因する、安楽死日または死亡が発見された日を表示する。
【図１２Ｂ】処置対照（図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃ）による処置前（ベースライン、０日目）から処置の８０日後までの動物の体重を示す図である。黒矢印は、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射日を指し示す。アステリスクは過剰な体重減少（すなわち、体重がベースラインの８０％まで降下する場合）に起因する、安楽死日または死亡が発見された日を表示する。
【図１２Ｃ】処置対照（図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃ）による処置前（ベースライン、０日目）から処置の８０日後までの動物の体重を示す図である。黒矢印は、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射日を指し示す。アステリスクは、過剰な体重減少（すなわち、体重がベースラインの８０％まで降下する場合）に起因する、安楽死日または死亡が発見された日を表示する。
【図１２Ｄ】分割型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ（図１２Ｄ）による処置前（ベースライン、０日目）から処置の８０日後までの動物の体重を示す図である。黒矢印は、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射日を指し示す。アステリスクは過剰な体重減少（すなわち、体重がベースラインの８０％まで降下する場合）に起因する、安楽死日または死亡が発見された日を表示する。
【図１３】８５日後における、ＢＴ−４７４腫瘍接種部位についてのＨ＆Ｅ染色を介する形状解析により、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによる処置が、治癒（８例中５例）または顕微鏡的残存疾患（８例中３例）をもたらす一方で、対照（１０例中１０例）は、バルク腫瘍が存在すること（詳細な説明については表２４を参照されたい）を示す図である。
【図１４】ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ法を示す図である。
【図１５】皮下ＢＴ−４７４腫瘍を保有するヌードマウスにおける、124Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５についての、逐次的ＰＥＴイメージングを示す図である。
【図１６】質量１００〜２００ｍｇの、ＢＴ−４７４異種移植片を示す図である。抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂ抗体注射の２８時間後において注射された、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの取込みである。除去剤は使用せず、全抗原用量は、個々の実験において、０．０２５ｍｇ〜０．７５ｍｇで変動した。腫瘍は、放射能注射の２４時間後（「ｐ．ｉ．」）、または初期抗体注射の５２時間後に採取した。抗体へ接合させた高アフィニティーＦｖ断片への、放射性ハプテンの結合に依存する取込みは、用量の関数であることが示され、約１２５〜２５０マイクログラムにおけるプラトーまで増大した。
【図１７】腫瘍部位における、投与された用量の関数として計算される、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂの貯留、および血中の抗体濃度を示す図である。これは、図１５における取込み曲線が当てはまることを仮定する。取込み曲線は通例の取込み結合曲線に従うことに注目されたい。全結合量は、飽和反応速度によりプラトーまで増大する。
【図１８】抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによりプレターゲティングされた、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（５５．５ＭＢｑ、約３００ｐｍｏｌ）の注射の２４時間後における、皮下ＢＴ−４７４腫瘍保有マウス（外部のキャリパー測定により、２１６ｍｍ3）についての、代表的なＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を示す図である。イメージングの視野は、腫瘍（白矢印）に重点を置くために、動物の尾側半身（尾までの正中線）に限定した。イメージングの直後にマウスを安楽死させ、腫瘍内の放射能濃度をｅｘ  ｖｉｖｏにおける生体内分布（減衰を補正した、組織１グラム当たりの注射放射能パーセント（ＩＡ／ｇ％））により、６．０６（ｎ＝３について、５．５３±０．２７ＩＡ／ｇ％）と決定した。ＭＩＰ＝最大値投影法。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
５．詳細な説明
本明細書では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ、（ｂ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１２時間以内に、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップであって、前記除去剤が前記第２の結合性部位に結合し、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を低減するように機能するステップ；および対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップを含む方法が提示される。本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用のための二重特異性結合因子は、（ｉ）本方法により処置されるがんにより発現されるがん抗原；（ｉｉ）除去剤；および（ｉｉｉ）放射線療法剤、に特異的に結合することが可能である。特定の態様では、本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用のための二重特異性結合因子は、（ｉ）処置されるがんにより発現されるがん抗原；および（ｉｉ）放射線療法剤に、同時に特異的に結合する。特定の理論に束縛されずに述べると、二重特異性結合因子は、がん細胞と放射線療法剤との間に架橋を形成し、放射線療法剤による、二重特異性結合因子に結合しているがん細胞の殺滅を可能とする。驚くべきことに、本明細書で提示される、がんを処置する方法は、がん細胞へ内在化されるがん抗原をターゲティングする場合であってもなお有効である（例えば、６節を参照されたい）。さらに、本明細書で提示されるがんを処置する方法は、除去剤を投与するステップが、二重特異性結合因子の投与の１時間後という早期になされうる（腫瘍ターゲティング剤の投与と除去剤の投与との間の、２４〜１２０時間という標準的な待機時間と比較して）ため、例えば、１６時間未満で実施されうるので有利である。
【００２７】
本明細書ではまた、本明細書で記載される方法における使用のための、二重特異性結合因子（例えば、５．２節を参照されたい）、除去剤（例えば、５．３節を参照されたい）、および放射線療法剤（例えば、５．４節を参照されたい）も提示される。本明細書ではまた、前記二重特異性結合因子、除去剤、および／または放射線療法剤を含む、組成物（例えば、医薬組成物）およびキット（例えば、５．５節を参照されたい）も提示される。
【００２８】
５．１  がんを処置する方法
本明細書の、具体的な実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法であって、（ａ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップであって、前記二重特異性結合因子が、第２の分子に共有結合的に（リンカーを介してもよく）結合している第１の分子を含み、前記第１の分子が第１の結合性部位を含み、前記第１の結合性部位が第１の標的に特異的に結合し、前記第１の標的が前記がんにより発現されるがん抗原であり、前記第２の分子が第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位が第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的ががん抗原ではないステップ；（ｂ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１２時間以内に対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップであって、前記除去剤が前記第２の結合性部位に結合し、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を低減するように機能する、前記ステップ；および対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップであって、放射線療法剤が（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的を含み、前記第２の標的が金属キレート剤である；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している、好ましくは、共有結合的に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している、前記ステップを含む方法が提示される。
【００２９】
本明細書ではまた、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）対象へ第１の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップであって、前記二重特異性結合因子の第１の治療有効量が、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇであり、前記二重特異性結合因子が第２の分子に（リンカーを介してもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記がんが、ＨＥＲ２を発現し、前記第１の分子が、抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖを含み、前記抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖが、（ｉ）前記がん上のＨＥＲ２に結合し、（ｉｉ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲの３つ全て、および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲの３つ全て、を含み、前記第２の分子が第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位が第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的が、がん抗原ではない、前記ステップ；（ｂ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の後で、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップであって、前記除去剤が、前記第２の結合性部位に結合し、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を低減するように機能する、前記ステップ；および（ｃ）対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップであって、放射線療法剤が（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的を含み、前記第２の標的が金属キレート剤である；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している、好ましくは、共有結合的に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している、前記ステップを含み、対象がヒトである方法も提示される。具体的な実施形態では、治療有効量の二重特異性結合因子は、約４５０ｍｇである。
【００３０】
本明細書ではまた、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）対象へ第１の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップであって、前記二重特異性結合因子の第１の治療有効量が、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、または約５００ｍｇであり、二重特異性結合因子が、第２の分子に（リンカーを介してもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記がんが、ＨＥＲ２を発現し、前記第１の分子が、抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖを含み、前記抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖが、（ｉ）前記がん上のＨＥＲ２に結合し、（ｉｉ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲの３つ全て、および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲの３つ全て、を含み、第２の分子が第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位が第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的が、がん抗原ではない、前記ステップ；（ｂ）対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の後で、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップであって、前記除去剤が前記第２の結合性部位に結合し、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を低減するように機能する、前記ステップ；および（ｃ）対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップであって、放射線療法剤が（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的を含み、前記第２の標的が金属キレート剤である；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的を含み、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している、前記ステップを含み、対象がヒトである方法も提示される。
【００３１】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、５．２節節に記載される二重特異性結合因子である。好ましい実施形態では、二重特異性結合因子の第１の標的は、ＨＥＲ２であり、二重特異性結合因子の第２の標的は、ＤＯＴＡである。具体的な実施形態では、治療有効量の二重特異性結合因子は、５．７節に記載される通りである。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、対象へ５．７節に記載される投与経路を介して投与される。
【００３２】
具体的な実施形態では、除去剤は、５．３節または６節に記載される除去剤である。具体的な実施形態では、除去剤の治療有効量は５．７節に記載される通りである。具体的な実施形態では、除去剤は対象へ５．７節に記載される投与経路を介して投与される。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１０時間以内、８時間以内、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１〜１２時間後、２〜１２時間後、１〜２時間後、１〜３時間後、１〜４時間後、２〜６時間後、２〜８時間後、２〜１０時間後、４〜６時間後、４〜８時間後、４〜１０時間後、２時間後、または４時間後に行われる。別の具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の約２時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、または約１０時間後に行われる。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は少なくとも１００ｋＤａであり、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の４時間以内に行われる。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の、本明細書で記載される時間より、最大で１０％長いか、または最大で１０％短い時間の後の時点において行われる。
【００３３】
具体的な実施形態では、放射線療法剤は５．４節または６節に記載される放射線療法剤である。好ましい実施形態では、放射線療法剤は金属放射性核種に結合しているＤＯＴＡまたはその誘導体を含む。放射線療法剤が金属放射性核種に結合しているＤＯＴＡまたはその誘導体を含む好ましい実施形態では、金属放射性核種は、177Ｌｕである。具体的な実施形態では、放射線療法剤の治療有効量は５．７節に記載される通りである。具体的な実施形態では、放射線療法剤は、対象へ５．７節に記載される投与経路を介して投与される。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１〜２時間後、１〜３時間後、１〜４時間後、２〜６時間後、２〜８時間後、２〜１０時間後、４〜６時間後、４〜８時間後、４〜１０時間後、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、または６時間後に行われる。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、または約６時間後に行われる。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の約１時間後に行われる。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の１６時間以内に行われる。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の、本明細書で記載される時間より、最大で１０％長いか、または最大で１０％短い時間の後の時点において行われる。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の、本明細書で記載される時間より、最大で１０％長いか、または最大で１０％短い時間の後の時点において行われる。
【００３４】
本明細書で記載される方法に従い処置されるがんは、当業者に公知である任意のがんでありうる。具体的な実施形態では、がんは５．６節または６節に記載されるがんである。具体的な実施形態では、がんは下記の表１に記載されるがんである。当業者は、本明細書で記載される方法に従い処置されるがんが本明細書で提示される方法において利用される二重特異性結合因子（例えば、５．２節および６節を参照されたい）の第１の標的のアイデンティティーを決定することを理解するであろう。例えば、本明細書で提示されるがんを処置する方法において、第１の標的をＨＥＲ２とする二重特異性結合因子を使用するために処置されるがんはＨＥＲ２を発現するがん（例えば、乳がん）である。具体的な実施形態では、がんは、乳がん、胃がん、骨肉腫、線維形成性小円形細胞がん、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、多形性神経膠芽腫、胃接合部腺癌、胃食道接合部腺癌、子宮頸がん、唾液腺がん、軟部組織肉腫、白血病、黒色腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、またはＨＥＲ２受容体を発現する、他の任意の新生物性組織を含むがこれらに限定されない、ＨＥＲ２を発現するがんである。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２を発現するがんは、トラスツズマブ、セツキシマブ、ラパチニブ、エルロチニブ、または受容体のＨＥＲファミリーをターゲティングする、他の任意の低分子もしくは抗体による処置に対して耐性である。具体的な実施形態では、トラスツズマブ、セツキシマブ、ラパチニブ、エルロチニブ、または受容体のＨＥＲファミリーをターゲティングする、他の任意の低分子もしくは抗体による処置に対して耐性である腫瘍は、本発明の二重特異性結合因子による処置に対して応答性である。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２を発現するがんは、ネシツムマブ、パンチツムマブ、ペルツズマブ、またはａｄｏ−トラスツズマブ・エムタンシンによる処置に対して耐性である。具体的な実施形態では、ネシツムマブ、パンチツムマブ、ペルツズマブ、またはａｄｏ−トラスツズマブ・エムタンシンによる処置に対して耐性である、ＨＥＲ２を発現するがんは、本発明の二重特異性結合因子による処置に対して応答性である。具体的な実施形態では、がんは、それが、治療の後で応答を示さないか、または不完全な応答（完全寛解に満たない応答）を示すか、または進行もしくは再発を示す場合、治療（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、ネシツムマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ａｄｏ−トラスツズマブ・エムタンシン、ラパチニブ、エルロチニブ、または受容体のＨＥＲファミリーをターゲティングする、任意の低分子）に対して耐性であると考えられる。
【００３５】
具体的な実施形態では、本明細書で提示されるがんを処置する方法は、５．７節に記載される、マルチサイクルレジメンの一部として実施される。
具体的な実施形態では、対象は５．６節に記載される対象である。
具体的な実施形態では、処置は、症状の緩和、疾患の広がりの減少、疾患状態の安定化（すなわち、非増悪）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または抑制、および寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）を含むがこれらに限定されない、有益であるか、または所望の臨床結果を達成するための処置でありうる。具体的な実施形態では、「処置」はまた、処置を受けなかった場合に期待される生存と比較して、生存を延長するための処置でもありうる。
【００３６】
５．２  二重特異性結合因子
本明細書では、本明細書で提示されるがんを処置する方法（例えば、５．１節および６節を参照されたい）における使用のための二重特異性結合因子が提示される。本明細書で記載される二重特異性結合因子は、第２の分子に共有結合的に（リンカーを介してもよく）結合している第１の分子を含み、前記第１の分子は第１の結合性部位を含み、前記第１の結合性部位は第１の標的に特異的に結合し、前記第１の標的は前記がんにより発現されるがん抗原であり、第２の分子は第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位は第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的はがん抗原ではない。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は６節に記載される二重特異性結合因子である。
二重特異性結合因子の第１の分子は、二重特異性結合因子のがん細胞への結合を媒介する。特に、二重特異性結合因子の第１の分子は第１の標的に特異的に結合する第１の結合性部位を含み、前記第１の標的は、本明細書で提示される方法（例えば、５．１節および６節を参照されたい）に従い、二重特異性結合因子により処置されるがんにより発現されるがん抗原である。
【００３７】
具体的な実施形態では、第１の分子は抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片は第１の結合性部位を含む。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第１の分子の抗体は免疫グロブリンである。本発明の二重特異性結合因子中の抗体は、非限定例として述べると、モノクローナル抗体、ネイキッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体でありうる。本明細書で使用される「免疫グロブリン」という用語は、当技術分野において周知の意味と符合して使用され、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む。抗体を作るための方法は本明細書の下記で記載される。
【００３８】
第１の分子が抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片が第１の結合性部位を含む、具体的な実施形態では、抗体はヒト抗体である。当業者には、例えば、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法、トランスジェニックマウスを使用する方法、ヒト末梢血白血球、脾臓細胞、または骨髄を移植されたマウスを免疫化する方法（例えば、ＸＴＬによるＴｒｉｏｍａ法）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化させたＢ細胞を使用する方法、「誘導選択」と称される技法を使用する方法など、ヒト抗体を作製する方法が公知である。例えば、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５６７，６１０号、および同第５，２２９，２７５号；ならびにＰＣＴ公開第９８／４６６４５号、同第９８／６０４３３号、同第９８／２４８９３号、同第９８／１６６６４号、同第９６／３４０９６号、同第９６／３３７３５号、同第９１／１０７４１号、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985)；およびBoerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)を参照されたい。
【００３９】
キメラ抗体は、１つの種に由来する抗体、好ましくは齧歯動物抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含有する組換えタンパク質であるが、抗体分子の定常ドメインは、異なる種の定常ドメインに由来する、例えば、ヒトへの適用が想定される場合は、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。獣医科適用では、キメラ抗体の定常ドメインは、例えば、ウマ、サル、ウシ、ブタ、ネコ、またはイヌなど、他の種の定常ドメインに由来しうる。例えば、イヌにおけるがんを処置する方法における二重特異性結合因子の使用のために、二重特異性結合因子の一部を形成するキメラ抗体の定常ドメインは、イヌ抗体の定常ドメインに由来しうる。
【００４０】
ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術により作製される抗体であり、この場合、抗原特異性（例えば、可変ドメインの定常領域およびフレームワーク領域）に必要とされない、ヒト免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のアミノ酸の一部または全部は、コグネイトの非ヒト抗体の軽鎖または重鎖に由来する、対応するアミノ酸を置換するのに使用される。例を目的として述べると、所与の抗原に対する非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形は、その重鎖および軽鎖の両方において、（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメインに由来するフレームワーク領域；および（３）非ヒト抗体に由来するＣＤＲを有する。必要な場合、ヒトフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基は、ヒト化抗体の抗原に対する結合アフィニティーを保存または改善するように、マウスの抗体内の対応する位置における残基へと変化させられうる。この変化は、しばしば「復帰変異」と呼ばれる。同様に、所望の理由で、例えば、安定性または抗原に対するアフィニティーのために、マウス配列への先祖返りのためのフォワード変異もなされ得る。いかなる理論にも束縛されずに述べると、ヒト化抗体は、大幅に少数の非ヒト構成要素を含有するため、一般に、キメラヒト抗体と比較してヒトにおいて免疫応答を誘発する可能性が低い。当業者には、ヒト化抗体を作るための方法が公知である。例えば、欧州特許第０２３９４００号；Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Queen et al., Proc. Nat. Acad. ScL USA 86:10029 (1989)；米国特許第６，１８０，３７０号；およびOrlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86:3833 (1989)を参照されたい。
【００４１】
抗原結合性断片は、本明細書で記載される抗体のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または抗体に、抗原に対するその特異性を付与するアミノ酸残基を含む部分（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））でありうる。抗体は、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）およびヒトなど、任意の動物種に由来しうる。当技術分野では、抗体の抗原結合性断片を作るための方法が公知である。例えば、抗原結合性断片は当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書で記載される通り、酵素による切断により作製される場合もあり、合成により作製される場合もあり、組換え法により作製される場合もある。
【００４２】
本明細書で使用される、抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は互換的に使用され、当技術分野では一般に公知である。一般に、可変ドメイン内のＣＤＲおよびＦＲの空間的配向性は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の通りである。特定の機構または理論に束縛されることを望まずに述べると、軽鎖および重鎖のＣＤＲは、抗体の、抗原との相互作用および特異性の主因となると考えられる。ある特定の実施形態では、可変領域は、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）可変領域である。ある特定の実施形態では、可変領域はヒト可変領域である。ある特定の実施形態では、可変領域は齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）ＣＤＲとヒトＦＲとを含む。特定の実施形態では、可変領域は、霊長動物（例えば、非ヒト霊長動物）可変領域である。ある特定の実施形態では、可変領域は、齧歯動物またはマウスのＣＤＲと霊長動物（例えば、非ヒト霊長動物）のＦＲとを含む。
【００４３】
当技術分野では、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴによる定義、ならびに例示的な定義を含む、多様な形で規定されている。Ｋａｂａｔによる定義は、配列多様性に基づく（Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983）。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムに照らすと、（ｉ）ＶH  ＣＤＲ１は、典型的に、アミノ酸位置３５に後続する、１つまたは２つのさらなるアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付けスキームでは、３５Ａおよび３５Ｂと称される）を含んでもよい、重鎖のアミノ酸位置３１〜３５に存在し；（ｉｉ）ＶH  ＣＤＲ２は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置５０〜６５に存在し；（ｉｉｉ）ＶH  ＣＤＲ２は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置９５〜１０２に存在する（Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983）。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムに照らすと、（ｉ）ＶL  ＣＤＲ１は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置２４〜３４に存在し；（ｉｉ）ＶL  ＣＤＲ２は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置５０〜５６に存在し；（ｉｉｉ）ＶL  ＣＤＲ３は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置８９〜９７に存在する（Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983）。当業者に周知の通り、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用すると、抗体可変ドメインの、実際の直鎖状アミノ酸配列は、ＦＲおよび／またはＣＤＲの短縮または延長に起因して、より少ないアミノ酸を含有する場合もあり、より多くのアミノ酸を含有する場合もあり、このように、Ｋａｂａｔによるアミノ酸の番号は、必ずしもその直鎖状アミノ酸の番号と同じではない。
【００４４】
Ｃｈｏｔｈｉａによる定義は、構造的ループ領域の場所に基づく（Chothia et al., (1987) J Mol Biol 196: 901-917；および米国特許第７，７０９，２２６号）。当技術分野では、「ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ」という用語、および同様の用語が認知されており、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917の方法に従い決定される、抗体のＣＤＲ配列であって、本明細書では、「ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ」（例えば、米国特許第７，７０９，２２６号；およびMartin, A., “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,” in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)もまた参照されたい）としても言及されるＣＤＲ配列を指す。Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けシステムに照らして、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用してＶH領域内のアミノ酸残基を番号付けすると、（ｉ）ＶH  ＣＤＲ１は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置２６〜３２に存在し；（ｉｉ）ＶH  ＣＤＲ２は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置５３〜５５に存在し；（ｉｉｉ）ＶH  ＣＤＲ３は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置９６〜１０１に存在する。具体的な実施形態では、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けシステムに照らして、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、ＶH領域内のアミノ酸残基を番号付けすると、（ｉ）ＶH  ＣＤＲ１は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置２６〜３２ または ３４に存在し；（ｉｉ）ＶH  ＣＤＲ２は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置５２〜５６（一実施形態では、ＣＤＲ２は５２Ａ〜５６位［番号付け中、５２Ａ位は、５２位に後続する］である）に存在し；（ｉｉｉ）ＶH  ＣＤＲ３は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置９５〜１０２に存在する（一実施形態では、９６〜１００と番号付けされる位置に、アミノ酸は存在しない）。Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けシステムに照らして、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、ＶL領域内のアミノ酸残基を番号付けすると、（ｉ）ＶL  ＣＤＲ１は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置２６〜３３に存在し；（ｉｉ）ＶL  ＣＤＲ２は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置５０〜５２に存在し；（ｉｉｉ）ＶL  ＣＤＲ３は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置９１〜９６に存在する。具体的な実施形態では、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けシステムに照らして、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムを使用して、ＶL領域内のアミノ酸残基を番号付けすると、（ｉ）ＶL  ＣＤＲ１は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置２４〜３４に存在し；（ｉｉ）ＶL  ＣＤＲ２は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置５０〜５６に存在し；（ｉｉｉ）ＶL  ＣＤＲ３は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置８９〜９７に存在する（一実施形態では、９６〜１００と番号付けされる位置にアミノ酸は存在しない）。これらのＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ位置は抗体に応じて変動する場合があり、当技術分野で公知の方法に従い決定されうる。
【００４５】
ＩＭＧＴ定義は、ＩＭＧＴ（創始者および運営者を、Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅとする、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）である、ＩＭＧＴ（登録商標）のウェブサイトは、ｉｍｇｔ．ｏｒｇである；例えば、それらのいずれもが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136 and Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212を参照されたい）による。ＩＭＧＴによる番号付けシステムに照らすと、（ｉ）ＶH  ＣＤＲ１は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置２５〜３５に存在し；（ｉｉ）ＶH  ＣＤＲ２は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置５１〜５７に存在し；（ｉｉｉ）ＶH  ＣＤＲ２は、典型的に、重鎖のアミノ酸位置９３〜１０２に存在する。ＩＭＧＴによる番号付けシステムに照らすと、（ｉ）ＶL  ＣＤＲ１は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置２７〜３２に存在し；（ｉｉ）ＶL  ＣＤＲ２は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置５０〜５２に存在し；（ｉｉｉ）ＶL  ＣＤＲ３は、典型的に、軽鎖のアミノ酸位置８９〜９７に存在する。
【００４６】
本明細書で記載される二重特異性結合因子の、第１の標的であるがん抗原は、当技術分野で公知である、任意のがん抗原でありうる。がん抗原の非限定例、および前記抗原を発現するがんの非限定例は、下記の表１に提示される。好ましい実施形態では、がん抗原は、ＨＥＲ２である。
【００４７】
表1.
【表１】
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【００４８】
従来、プレターゲティング型放射免疫療法（「ＰＲＩＴ」）戦略は、細胞表面上で発現し、エンドサイトーシスを受けにくい抗原に対して実施されてきた（例えば、Casalini et al., Journal of Nuclear Medicine, 1997; 38:1378-1381.; Liu, et al., Cancer Biother Radiopharm, 2007; 22(1):33-39.; Knight, et al., Molecular Pharmaceutics, 2017; 14(7): 2307-2313.; edited by Baum, Richard P. Therapeutic Nuclear Medicine 2014, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pg 612; edited by Oldham, Robert K. and Dillman, Robert O. Principles of Cancer Biotherapy 2009, Springer, ph 486を参照されたい）。特定の理論に束縛されずに述べると、がん抗原に結合している結合剤（例えば、抗体）の内在化は、腫瘍ターゲティング剤（例えば、二特異性抗体）の、がん細胞の表面上における、放射線療法剤との相互作用のための、最適の提示をもたらさないことが見出されている（例えば、Boerman et al., 2003, Pretargeted Radioimmunotherapy of Cancer: Progress Step by Step*. J. Nucl. Med. 44(3):400-411; Casalini et al., 1997, Tumor Pretargeting: Role of Avidin/Streptavidin on Monoclonal Antibody Internalization. J. Nucl. Med.; 38(9):1378-1381; Walter et al., 2010, Pretargeted Radioimmunotherapy for Hematologic and Other Malignancies, Cancer Biother Radiopharm.; 25(2):125-142を参照されたい）。しかし、本明細書で記載される実施例（６節を参照されたい）は、本明細書で記載されるがんを処置する方法（例えば、５．１節および６節を参照されたい）に従い使用される場合、驚くべきことにエンドサイトーシスを受けやすい（例えば、Austin et al., 2004, Molecular Biology of the Cell, 15:5268-5282を参照されたい）、ＨＥＲ２をターゲティングする本明細書で記載される二重特異性結合因子について、高治療指数が達成されうることを明らかにする。したがって、具体的な実施形態では、がん抗原はがん細胞へ内在化される抗原である。がん細胞へと内在化されるがん抗原の非限定例は、ＨＥＲ２、ＣＡ６、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＦＲα、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、メソテリン、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ１、Ｔｒｏｐ−２、５Ｔ４、ＡＧＳ−１６、アルファｖベータ６、ＣＡ１９．９、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７４、ＣＤ１８０、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ７９ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＲＩＰＴＯ、ＤＬＬ３、ＤＳ６、エンドセリンＢ受容体、ＦＡＰ、ＧＤ２、メソテリン、ＰＭＥＬ  １７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＴＥＮＢ２、ＴＩＭ−１、ＣＤ９８、エンドシアリン／ＣＤ２４８／ＴＥＭ１、フィブロネクチン細胞外ドメインＢ  ＬＩＶ−１、ムチン１、ｐ−カドヘリン、ペリトシン、Ｆｙｎ、ＳＬＴＲＫ６、テネイシンｃ、ＶＥＧＦＲ２、およびＰＲＬＲを含む。例えば、前出のがん抗原を発現する例示的ながんのリストについては、表１を参照されたい。
【００４９】
別の具体的な実施形態では、がん抗原はがん細胞へと内在化されない抗原である。がん細胞へと内在化されないがん抗原の非限定例は、ＣＤ２０、ＣＤ７２、フィブロネクチン、ＧＰＡ３３、テネイシンＣのスプライスアイソフォーム、およびＴＡＧ−７２を含む。例えば、前出のがん抗原を発現する例示的ながんのリストについては表１を参照されたい。がん抗原が卵巣がん抗原である具体的な実施形態では、第１の分子は抗体ＭＸ３５である。がん抗原がFyn３である具体的な実施形態では、第１の分子は抗体ＳＣ−１６である。がん抗原がＢ７-Ｈ３である具体的な実施形態では、第１の分子は抗体８Ｈ９である。
【００５０】
好ましい実施形態では、がん抗原はＨＥＲ２である。ＨＥＲ２は、受容体チロシンキナーゼの、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ２である。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号：ＮＭ＿００４４４８．３（配列番号１）は、例示的な、ヒトＨＥＲ２核酸配列を提示する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号：ＮＰ＿００４４３９．２（配列番号２）は、例示的なヒトＨＥＲ２アミノ酸配列を提示する。別の具体的な実施形態では、ＨＥＲ２はイヌＨＥＲ２である。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号：ＮＭ＿００１００３２１７．１（配列番号３）は、例示的な、イヌＨＥＲ２核酸配列を提示する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号：ＮＰ＿００１００３２１７．１（配列番号４）は例示的なイヌＨＥＲ２アミノ酸配列を提示する。
【００５１】
本発明の二重特異性結合因子についての、具体的な実施形態では、第１の分子はＨＥＲ２に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片である。好ましい実施形態では、抗体はＨＥＲ２に特異的に結合する免疫グロブリンである。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、トラスツズマブ（例えば、Baselga et al. 1998, Cancer Res 58(13): 2825-2831を参照されたい）、Ｍ−１１１（例えば、Higgins et al., 2011, J Clin Oncol, 29(Suppl): Abstract TPS119を参照されたい）、ペルツズマブ（例えば、Franklin et al., 2004, Cancer Cell, 5: 317-328を参照されたい）、エルツマキソマブ（例えば、Kiewe and Thiel, 2008, Expert Opin Investig Drugs, 17(10): 1553-1558を参照されたい）、ＭＤＸＨ２１０（例えば、Schwaab et al., 2001, Journal of Immunotherapy, 24(1): 79-87を参照されたい）、２Ｂ１（例えば、Borghaei et al., 2007, J Immunother, 30: 455-467を参照されたい）、およびＭＭ−３０２（例えば、Wickham and Futch, 2012, Cancer Research, 72(24): Supplement 3を参照されたい）など、当技術分野で公知のＨＥＲ２特異性抗体の重鎖および／または軽鎖を含む。
【００５２】
第１の分子がＨＥＲ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片である具体的な実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖は、トラスツズマブの重鎖可変（ＶH）ドメインの３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）全てを含み、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体内またはその抗原結合性断片内の軽鎖は、トラスツズマブの軽鎖可変（ＶL）ドメインの３つの軽鎖ＣＤＲ全てを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖は配列番号１４の３つの重鎖ＣＤＲ全てを含み、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体内またはその抗原結合性断片内の軽鎖は配列番号１１の３つの軽鎖ＣＤＲ全てを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖内のＶHドメインはトラスツズマブのＶHドメインを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖内のＶHドメインの配列は配列番号２０（表４を参照されたい）を含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、トラスツズマブのＶHドメインの天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、トラスツズマブのＶHドメインの変種を含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体内またはその抗原結合性断片内の軽鎖内の軽鎖ＶLドメインは、トラスツズマブのＶLドメインを含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体内またはその抗原結合性断片内の軽鎖内のＶLドメインの配列は配列番号１９（表４を参照されたい）を含む。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、トラスツズマブのＶLドメインの天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、トラスツズマブのＶLドメインの変種を含む。具体的な実施形態では、トラスツズマブのＶHドメインおよび／またはＶLドメインのそれぞれの天然配列と比べた、抗体またはその抗原結合性断片のＶHドメインおよび／またはＶLドメインのアミノ酸変異のうちの１つまたは複数は、トラスツズマブのＶHドメインおよび／またはＶLドメインのそれぞれの天然配列に照らして、保存的なアミノ酸置換である。好ましい実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体は免疫グロブリンである。
【００５３】
保存的アミノ酸置換とは、それらの側鎖が類縁であるアミノ酸のファミリー内で生じる、アミノ酸置換である。一般に、遺伝子によりコードされるアミノ酸は、（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む、酸性ファミリー；（２）アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む、塩基性ファミリー；（３）イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンを含む、非極性ファミリー；ならびに（４）システイン、トレオニン、グルタミン、グリシン、アスパラギン、セリン、およびチロシンを含む、非帯電極性ファミリーへと分けられ；加えて、脂肪族ヒドロキシファミリーは、セリンおよびトレオニンを含む。加えて、アミド含有ファミリーは、アスパラギンおよびグルタミンを含む。加えて、脂肪族ファミリーは、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。加えて、芳香族ファミリーは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンを含む。最後に、硫黄含有側鎖ファミリーは、システインおよびメチオニンを含む。例として述べると、当業者は、とりわけ、置きかえがフレームワーク部位内のアミノ酸を伴わない場合、ロイシンの、イソロイシンまたはバリンによる、単独の置きかえ、アスパラギン酸の、グルタミン酸による単独の置きかえ、トレオニンの、セリンによる単独の置きかえ、またはアミノ酸の構造的に類縁のアミノ酸による同様の置きかえが、結果として得られる分子の結合または特性に対して大きな影響を及ぼさないことを予測することが妥当であろう。好ましい、保存的アミノ酸置換群は、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、フェニルアラニン−チロシン、グルタミン酸−アスパラギン酸、バリン−ロイシン−イソロイシン、システイン−メチオニン、およびアスパラギン−グルタミンを含む。
【００５４】
第１の分子がＨＥＲ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片である具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片はトラスツズマブの重鎖を含む。具体的な実施形態では、重鎖の配列は配列番号１４〜１７のうちのいずれか１つ（表２を参照されたい）の配列を含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、トラスツズマブの重鎖の変種（例えば、配列番号１４〜１７（表２を参照されたい）を参照されたい）を含む。好ましい実施形態では、抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖の配列は配列番号１５を含む。より好ましい実施形態では、抗体内またはその抗原結合性断片内の重鎖の配列は配列番号１６を含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、トラスツズマブの重鎖の天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、トラスツズマブの重鎖の変種を含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片はトラスツズマブの軽鎖を含む。具体的な実施形態では、抗体内またはその抗原結合性断片内の軽鎖の配列は配列番号１１を含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、トラスツズマブの軽鎖の変種を含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、トラスツズマブの軽鎖の天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、トラスツズマブの軽鎖の変種を含む。具体的な実施形態では、トラスツズマブの重鎖および／または軽鎖のそれぞれの天然配列と比べた、抗体またはその抗原結合性断片の重鎖および／または軽鎖のアミノ酸変異のうちの１つまたは複数は、トラスツズマブの重鎖および／または軽鎖のそれぞれの天然配列に照らして保存的なアミノ酸置換である。
【００５５】
【表Ａ】
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【００５６】
【表Ｂ】
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【００５７】
表4:トラスツズマブのVLドメインおよびVHドメインの配列。
【表４】
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【００５８】
第１の分子が、ＨＥＲ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片である具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で公知のＨＥＲ２特異性抗体と同じエピトープに結合する。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、トラスツズマブと同じエピトープに結合する。同じエピトープへの結合は、例えば、変異解析または結晶解析研究など、当業者に公知のアッセイにより決定されうる。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＥＲ２への結合について、当技術分野で公知の抗体と競合する。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＥＲ２への結合についてトラスツズマブと競合する。ＨＥＲ２への結合についての競合は、例えば、フローサイトメトリーなど、当業者に公知のアッセイにより決定されうる。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で公知のＨＥＲ２特異性抗体のＶHドメインに対する、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％の類似性を伴うＶHドメインを含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で公知のＨＥＲ２特異性抗体のＶHドメインと比べて１つ〜５つの間の保存的アミノ酸置換を含む、当技術分野で公知のＨＥＲ２特異性抗体のＶHドメインを含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で公知のＨＥＲ２特異性抗体のＶLドメインに対する、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％の類似性を伴うＶLドメインを含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で公知のＨＥＲ２特異性抗体のＶLドメインと比べて１つ〜５つの間の保存的アミノ酸置換を含む、当技術分野で公知のＨＥＲ２特異性抗体のＶLドメインを含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、上記の表２に記載された重鎖のＶHドメイン（例えば、配列番号１４〜１７のうちのいずれか１つのＶHドメイン）を含む。具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、上記の表３に記載された軽鎖のＶLドメイン（すなわち、配列番号１１のＶLドメイン）を含む。
【００５９】
本明細書で記載される抗ＨＥＲ２抗体の、可変領域の配列は、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、およびＢｉａＣｏｒｅ（商標）により決定される通り、結果として得られる抗体がＨＥＲ２に特異的に結合する能力を維持する範囲において、挿入、置換、および欠失により修飾されうる。当業者は、例えば、結合解析および細胞傷害作用解析など、本明細書の下記に記載される機能的アッセイを実施することにより、この活性の維持を確認しうる。
第１の分子がＨＥＲ２に結合する免疫グロブリンである具体的な実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１免疫グロブリンである。
【００６０】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第１の分子は、リンカーを介して、二重特異性結合因子の第２の分子に共有結合的に結合している。具体的な実施形態では、第１の分子を第２の分子に共有結合的に結合させるリンカーは、ペプチドリンカーである。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸残基の間の長さである。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは、７〜３２、７〜２７、７〜１７、１２〜３２、１２〜２２、１２〜１７、１７〜３２、または１７〜２７アミノ酸残基の間の長さである。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは当業者に公知である、ペプチドリンカーに適する１つまたは複数の特徴を提示する。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは、例えば、セリンおよびトレオニンなどペプチドリンカーの可溶性を可能とするアミノ酸を含む。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは、例えば、グリシンなど、ペプチドリンカーの可撓性を可能とするアミノ酸を含む。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは、第１の分子のＮ末端を第２の分子のＣ末端へと接続する。好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、第１の分子のＣ末端を第２の分子のＮ末端へと接続する。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは下記の表５に記載されるリンカー（例えば、配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれか１つ）である。別の具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは下記の表５に記載されるリンカー（例えば、配列番号５１〜５６のうちのいずれか１つ）である。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは配列番号２３である。好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは配列番号５３である。
【００６１】
表5:ペプチドリンカー配列
【表５】
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【００６２】
別の具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第１の分子は、二重特異性結合因子の第２の分子に直接共有結合的に結合している（すなわち、二重特異性結合因子の第１の分子と第２の分子との間にリンカーは存在しない）。
【００６３】
二重特異性結合因子の第２の分子は、二重特異性結合因子、放射線療法剤との相互作用を媒介し、この場合、前記放射線療法剤は、（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的（二重特異性結合因子の第２の標的）であって、金属キレート剤である第２の標的；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している、好ましくは、共有結合的に結合している第２の標的（二重特異性結合因子の第２の標的）であって、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している第２の標的を含む。特に、二重特異性結合因子の第２の分子は、第２の標的に特異的に結合する、第２の結合性部位を含む。具体的な実施形態では、第２の標的は、放射線療法剤の一部を形成する金属キレート剤である。別の具体的な実施形態では、第２の標的は、放射線療法剤の一部を形成する金属キレート剤に結合している分子、好ましくは、共有結合的に結合している分子である。
【００６４】
具体的な実施形態では、第２の分子は、抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片は、第２の結合性部位を含む。好ましい実施形態では、第２の分子は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖは第２の結合性部位を含む。ｓｃＦｖは当技術分野で認知された用語である。ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの、ＶHドメインとＶLドメインとの融合タンパク質であり、融合タンパク質は全免疫グロブリンと同じ抗原特異性を保持する。ＶHドメインは、ペプチドリンカー（本明細書では、このようなペプチドリンカーは、場合によって、「ｓｃＦｖ内ペプチドリンカー」と称される）を介して、ＶLドメインへと融合される。
【００６５】
第２の分子が、ｓｃＦｖである、本発明の具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸残基の間の長さである、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーを有する。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーは、当業者に公知である、ペプチドリンカーに適する、１つまたは複数の特徴を提示する。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーは、例えば、セリンおよびトレオニンなど、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの可溶性を可能とするアミノ酸を含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーは、例えば、グリシンなど、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの可撓性を可能とするアミノ酸を含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーは、ＶHドメインのＮ末端をＶLドメインのＣ末端へ接続する。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーは、ＶHドメインのＣ末端をＶLドメインのＮ末端へ接続する。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーは、上記の表５に記載されたリンカー（例えば、配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれか１つ）である。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーは配列番号２７である。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーは配列番号３０である。
【００６６】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第２の標的は金属キレート剤である。このような実施形態では、二重特異性結合因子の第２の標的は、本明細書で提示されるがんを処置する方法（例えば、５．１節および６節を参照されたい）において、二重特異性結合因子と組み合わせて使用される放射線療法剤（例えば、５．４節を参照されたい）の金属キレート剤である。金属キレート剤は当技術分野で公知である、任意の金属キレート剤でありうる。金属キレート剤の非限定例は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）およびその金属キレート誘導体（例えば、ｐ−アミノベンジル−ＤＯＴＡ（ベンゼン環のパラ（「ｐ」）位に、アミノ基を伴う、ベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、ＤＯＴＡ−Ｂｎ（ベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、およびＤＯＴＡ−デフェロキサミン）、ならびにジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびその金属キレート誘導体を含む。第２の分子が金属キレート剤である具体的な実施形態では、金属キレート剤は、ＤＯＴＡもしくはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−ＢｎまたはＤＯＴＡ−デフェロキサミン）、またはＤＴＰＡもしくはその金属キレート誘導体である。ＤＯＴＡの誘導体の非限定例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Leon-Rodriquez & Kovacs, 2008, The Synthesis and Chelation Chemistry of DOTA-Peptide Conjugates, Bioconjugate Chemistry; 19(2):391-402において記載されている。好ましい実施形態では、第２の標的はＤＯＴＡ−Ｂｎである。
【００６７】
第２の分子が金属キレート剤に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖである具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の金属キレート剤への結合（その第２の分子を介する）は、金属キレート剤のキレート化能をそれほど損なわない。例えば、具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の金属キレート剤への結合（その第２の分子を介する）は、金属キレート剤のキレート化能を、第２の分子との相互作用の前における金属キレート剤のキレート化能と比較して３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％を超えて低減しない。本明細書で記載される二重特異性結合因子の存在下および非存在下における、金属キレート剤のキレート化能を決定するための方法は、例えば、金属キレート化（ｃｈｅｌａｔａｔｉｏｎ）法についてのAntczak, et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1551-1560など、当技術分野で公知である。
【００６８】
第２の分子が金属キレート剤に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖである具体的な実施形態では、第２の分子はＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する。好ましい実施形態では、第２の分子は、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合するｓｃＦｖである。別の好ましい実施形態では、第２の分子はＤＯＴＡ−Ｂｎに特異的に結合するｓｃＦｖである。具体的な実施形態では、第２の分子は、例えば、２Ｄ１２．５（例えば、Orcutt et al., “Engineering an antibody with picomolar affinity to DOTA chelates of multiple radionuclides for pretargeted radioimmunotherapy and imaging.” Nucl Med Biol 2011;38:223-33を参照されたい）、ベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ｔｅｔｒａａｚｏｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に対する高アフィニティーを伴う、マウスｓｃＦｖである、Ｃ８２５（例えば、Orcutt et al., 2011, Nucl. Med. Biol. 38:223-233；および米国特許第８，６４８，１７６号を参照されたい）、またはそれらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６４８，１７６号；およびOrcutt, et al. Mol Imaging Biol. 2011, 13(2) 215-21において記載されている、抗ＤＯＴＡ（またはその金属キレート誘導体）抗体のうちのいずれかなど、当技術分野で公知の、抗ＤＯＴＡ（またはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ））抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖのＶHドメインおよびＶLドメインを含む。
【００６９】
第２の分子がＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖである、具体的な実施形態では、第２の分子は、当技術分野で公知の、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖと同じエピトープに結合する。具体的な実施形態では、第２の分子はＣ８２５と同じエピトープに結合する。同じエピトープへの結合は、例えば、変異解析または結晶解析研究など、当業者に公知のアッセイにより決定されうる。具体的な実施形態では、第２の分子は、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）への結合について、当技術分野で公知の、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖと競合する。具体的な実施形態では、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する、第２の分子は、ＤＯＴＡ−Ｂｎへの結合についてＣ８２５と競合する。ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）への結合についての競合は、例えば、フローサイトメトリーなど、当業者に公知のアッセイにより決定されうる。具体的な実施形態では、第２の分子は、当技術分野で公知の、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖのＶHドメインに対する、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％の類似性を伴うＶHドメインを含む。具体的な実施形態では、第２の分子は、ＤＯＴＡまたはその誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖと比べて、１つ〜５つの間の保存的アミノ酸置換を含む、当技術分野で公知の、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖのＶHドメインを含む。具体的な実施形態では、第２の分子は、当技術分野で公知の、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖのＶLドメインに対する、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％の類似性を伴うＶLドメインを含む。具体的な実施形態では、第２の分子は、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖと比べて１つ〜５つの間の保存的アミノ酸置換を含む、当技術分野で公知のＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖのＶLドメインを含む。
【００７０】
第２の分子がＤＯＴＡ−Ｂｎに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖである具体的な実施形態では、第２の分子内のＶHドメインはＣ８２５のＶHドメインの３つのＣＤＲ全てを含み、第２の分子内のＶLドメインはＣ８２５のＶLドメインの３つのＣＤＲ全てを含む。具体的な実施形態では、第２の分子内のＶHドメインは、配列番号２１の３つのＣＤＲ全てを含み、第２の分子内のＶLドメインは配列番号２２の３つのＣＤＲ全てを含む。
【００７１】
第２の分子がＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖである、好ましい実施形態では、第２の分子はマウスＣ８２５に由来し、このため、マウスＣ８２５のＶHドメインおよびＶLドメイン（それぞれ、配列番号２１および２２（下記の表６を参照されたい））を含有する。具体的な実施形態では、第２の分子はｓｃＦｖである。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖはマウスＣ８２５に由来し、天然のマウスＣ８２５のＶHドメインおよび／またはＶLドメインの配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖのＶHドメインの配列は配列番号２１である。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖのＶLドメインの配列は配列番号２２である。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は下記の表７に明示されるマウス配列のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号３１〜３６のうちのいずれか１つ）を含む。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号３３を含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスＣ８２５のＶHドメインの天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、マウスＣ８２５のＶHドメインの変種を含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスＣ８２５のＶLドメインの天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、マウスＣ８２５のＶLドメインの変種を含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスＣ８２５のＶHドメインの天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、マウスＣ８２５のＶHドメインの変種である、ＶHドメインを含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスＣ８２５のＶLドメインの天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、マウスＣ８２５のＶLドメインの変種である、ＶLドメインを含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスＣ８２５のＶHドメインの天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有するマウスＣ８２５のＶHドメインの変種であるＶHドメインを含み、ｓｃＦｖは、マウスＣ８２５のＶLドメインの天然配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有するマウスＣ８２５のＶLドメインの変種である、ＶLドメインを含む。
【００７２】
表6:マウスC825およびヒト化C825のVHドメイン配列およびVLドメイン配列
【表６】
2021517564.tif 000011
【００７３】
【表Ｃ】
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2021517564.tif 000013
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【００７４】
第２の分子が、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖである具体的な実施形態では、第２の分子内のＶHドメインの配列は配列番号２１のヒト化形態を含む。第２の分子がＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖである具体的な実施形態では、第２の分子内のＶHドメインの配列は配列番号２１のヒト化形態である。好ましい実施形態では、配列番号２１のヒト化形態は配列番号３７である。具体的な実施形態では、第２の分子内のＶLドメインの配列は配列番号２２のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、第２の分子内のＶLドメインの配列は配列番号２２のヒト化形態である。好ましい実施形態では、配列番号２２のヒト化形態は配列番号３８である。好ましい実施形態では、第２の分子はｓｃＦｖである。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は上記の表７に明示されたヒト化配列のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号３９〜４４のうちのいずれか１つ）を含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖの配列は上記の表７に明示されたヒト化配列のうちのいずれか１つ（例えば、配列番号３９〜４４のうちのいずれか１つ）である。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号４４を含む（例えば、ｓｃＦｖの配列は、配列番号４４である）。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化形態のＶHドメインの配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、Ｃ８２５のヒト化形態のＶHドメインの変種であるＶHドメインを含む。具体的な実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化形態のＶLドメインの配列と比べて５つ以下のアミノ酸変異を有する、Ｃ８２５のヒト化形態のＶLドメインの変種であるＶLドメインを含む。当業者には、ヒト化抗体を作るための方法が公知であり、上記で記載した。
【００７５】
ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−Ｂｎ）に特異的に結合する第２の分子の可変領域の配列は、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、およびＢｉａＣｏｒｅ（商標）により決定される通り、結果として得られるｓｃＦｖが、ＤＯＴＡまたはその金属キレート誘導体に結合する能力を維持する範囲において、挿入、置換、および欠失により修飾されうる。当業者は、例えば、結合解析および細胞傷害作用解析など、本明細書の下記に記載される機能的アッセイを実施することにより、この活性の維持を確認しうる。
【００７６】
本発明の二重特異性結合因子についての、好ましい実施形態では、第１の分子は免疫グロブリンであり、第２の分子はｓｃＦｖである。具体的な実施形態では、第１の分子の免疫グロブリンは、２つの同一な重鎖と第１の軽鎖および第２の軽鎖である２つの同一な軽鎖とを含み、前記第１の軽鎖は、第２の結合性部位を含む第１のｓｃＦｖである第２の分子へ（第１のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第１の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第２の軽鎖は、第２のｓｃＦｖへと（第２のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第２の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとは同一である。前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとは同一であるので、二重特異性結合因子の第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーとは同一であり、二重特異性結合因子の第１のｓｃＦｖと第２のｓｃＦｖとは同一である。具体的な実施形態では、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドは第１のペプチドリンカーを含み、前記第２の軽鎖融合ポリペプチドは第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である。具体的な実施形態では、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドは第１のペプチドリンカーを含み、前記第２の軽鎖融合ポリペプチドは第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は、７〜３２、７〜２７、７〜１７、１２〜３２、１２〜２２、１２〜１７、１７〜３２、または１７〜２７アミノ酸長である。具体的な実施形態では、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドは第１のペプチドリンカーを含み、前記第２の軽鎖融合ポリペプチドは第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は、配列番号２３および２５〜３０からなる群から選択される。具体的な実施形態では、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は配列番号２３である。具体的な実施形態では、前記第１のｓｃＦｖは、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーを含む。具体的な実施形態では、前記ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である。具体的な実施形態では、前記ペプチドリンカー内の配列は配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれか１つからなる群から選択される。具体的な実施形態では、前記ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は配列番号２７である。具体的な実施形態では、前記ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は配列番号３０である。
【００７７】
本発明の二重特異性結合因子についての具体的な実施形態では、第１の分子はＨＥＲ２に特異的に結合する免疫グロブリンであり、第２の分子はＤＯＴＡ−Ｂｎに特異的に結合するｓｃＦｖである。具体的な実施形態では、第１の分子の免疫グロブリンは２つの同一な重鎖と、第１の軽鎖および第２の軽鎖である２つの同一な軽鎖とを含み、前記第１の軽鎖は、第２の結合性部位を含む第１のｓｃＦｖである第２の分子へ（第１のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第１の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第２の軽鎖は、第２のｓｃＦｖへ（第２のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第２の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとは同一である。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドは第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドは第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび第２のペプチドリンカーの配列は、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドは第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドは第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は、７〜３２、７〜２７、７〜１７、１２〜３２、１２〜２２、１２〜１７、１７〜３２、または１７〜２７アミノ酸長である。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドは第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドは第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は、配列番号２３および２５〜３０（表８を参照されたい）からなる群から選択される。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドは第１のペプチドリンカーを含み、第２の軽鎖融合ポリペプチドは第２のペプチドリンカーを含み、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は、配列番号５１〜５６（表８を参照されたい）からなる群から選択される。具体的な実施形態では、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は配列番号２３である。具体的な実施形態では、前記第１のペプチドリンカーおよび前記第２のペプチドリンカーの配列は配列番号５３である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖は本明細書で記載される重鎖である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖は本明細書で記載される軽鎖である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖は配列番号２０の３つの重鎖ＣＤＲ全てを含み、免疫グロブリン内の軽鎖は配列番号１９の３つの軽鎖ＣＤＲ全てを含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖内のＶHドメインの配列は配列番号２０を含む。好ましい実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖内のＶLドメインの配列は配列番号１９を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列は配列番号１４〜１７のうちのいずれかを含む。好ましい実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列は配列番号１５を含む。別の好ましい実施���態では、免疫グロブリン内の重鎖の配列は配列番号１６を含む。好ましい実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖の配列は配列番号１１を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖内のＶHドメインの配列は配列番号２０のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の軽鎖内のＶLドメインの配列は配列番号１９のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖは、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインとＶLドメインとの間のｓｃＦｖ内ペプチドリンカーを含む。具体的な実施形態では、前記ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は、５〜３０、５〜２５、５〜１５、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１５〜３０、または１５〜２５アミノ酸長である。具体的な実施形態では、前記ペプチドリンカー内の配列は配列番号２３および２５〜３０のうちのいずれか１つからなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は配列番号２７である。好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖ内ペプチドリンカーの配列は配列番号３０である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１のＣＤＲの３つ全てを含み、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２のＣＤＲの３つ全てを含む。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶHドメインの配列は配列番号２１のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、配列番号２１のヒト化形態は配列番号３７である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖ内のＶLドメインの配列は配列番号２２のヒト化形態を含む。具体的な実施形態では、配列番号２２のヒト化形態は配列番号３８である。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖは、本明細書で記載されるｓｃＦｖである。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖは、配列番号３１〜３６のうちのいずれかの配列を含む。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３３の配列を含む。具体的な実施形態では、第１のｓｃＦｖは配列番号３９〜４４のうちのいずれかの配列を含む。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは配列番号４４の配列を含む。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号５〜１０のうちのいずれかである。好ましい実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は、配列番号７である。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号４５〜５０のうちのいずれかである。好ましい実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は、配列番号５０である。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号５〜１０のうちのいずれかであり、重鎖の配列は配列番号１４〜１７のうちのいずれかである。好ましい実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号７であり、重鎖の配列は配列番号１５である。具体的な実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は、配列番号４５〜５０のうちのいずれかであり、重鎖の配列は、配列番号１４〜１７のうちのいずれかである。好ましい実施形態では、第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号５０であり、重鎖の配列は配列番号１６である。
【００７８】
【表Ｄ】
2021517564.tif 000015
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【００７９】
本発明の二重特異性結合因子についての好ましい実施形態では、二重特異性結合因子は、リンカーを介して、第２の分子に共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記第１の分子は第１の結合性部位を含み、前記第１の結合性部位は第１の標的に特異的に結合し、前記第１の標的は前記がんにより発現されるがん抗原であり、前記がん抗原はＨＥＲ２であり、前記第２の分子は第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位は第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的はＤＯＴＡ−Ｂｎであり、この場合、第１の分子は第１の結合性部位を含む免疫グロブリンを含み、前記免疫グロブリンは２つの同一な重鎖と第１の軽鎖および第２の軽鎖である２つの同一な軽鎖とを含み、前記第１の軽鎖は、第２の結合性部位を含む第１のｓｃＦｖである第２の分子へ（第１のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第１の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第２の軽鎖は、第２のｓｃＦｖへ（第２のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第２の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとは同一であり、この場合、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号７であり、前記重鎖の配列は配列番号１５である。
【００８０】
本発明の二重特異性結合因子についての、より好ましい実施形態では、二重特異性結合因子は、リンカーを介して、第２の分子に共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記第１の分子は第１の結合性部位を含み、前記第１の結合性部位は第１の標的に特異的に結合し、前記第１の標的は前記がんにより発現されるがん抗原であり、前記がん抗原はＨＥＲ２であり、前記第２の分子第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位は第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的はＤＯＴＡ−Ｂｎであり、この場合、第１の分子は第１の結合性部位を含む免疫グロブリンを含み、前記免疫グロブリンは２つの同一な重鎖と、第１の軽鎖および第２の軽鎖である２つの同一な軽鎖とを含み、前記第１の軽鎖は、第２の結合性部位を含む第１のｓｃＦｖである第２の分子へ（第１のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第１の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第２の軽鎖は第２のｓｃＦｖへ（第２のペプチドリンカーを介してもよく）融合されて第２の軽鎖融合ポリペプチドを創出し、前記第１の軽鎖融合ポリペプチドと前記第２の軽鎖融合ポリペプチドとは同一であり、この場合、第前記１の軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号５０であり、前記重鎖の配列は配列番号１６である。
【００８１】
別の具体的な実施形態では、第２の標的は、本明細書で記載される放射線療法剤の、金属キレート剤に結合している分子である。このような実施形態では、第２の分子および（第２の分子が結合する）第２の標的は、任意の周知の結合対（例えば、リガンド−受容体）のメンバーでありうるが、二重特異性結合因子の第２の分子と、放射線療法剤の金属キレート剤に結合している第２の標的との相互作用が、放射線療法剤の金属放射性核種のキレート化をそれほど損なわないように選択されなければならない。具体的な実施形態では、第２の標的はビオチンを含み、第２の分子はストレプトアビジンまたはアビジンを含む。具体的な実施形態では、第２の標的はヒスタミンスクシニルグリシンを含み、第２の分子は、ヒスタミンスクシニルグリシンに結合する抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖを含む。
【００８２】
特定の種の対象における、本明細書で提示される、がんを処置する方法において、本明細書で記載される二重特異性結合因子を使用するために、この特定の種の第１の標的に結合する二重特異性結合因子が使用される。例えば、ヒトを処置するために、二重特異性結合因子の第１の標的は第１の標的のヒト相同体に結合する。例えば、二重特異性結合因子の第１の標的がＨＥＲ２であり、ＨＥＲ２を発現するがんがヒトにおいて処置される場合、二重特異性結合因子はヒトＨＥＲ２に特異的に結合する、第１の結合性部位を含む。別の例では、イヌを処置するために、二重特異性結合因子の第１の標的は第１の標的のイヌ相同体に結合する。例えば、二重特異性結合因子の第１の標的がＨＥＲ２であり、ＨＥＲ２を発現するがんがイヌにおいて処置される場合、二重特異性結合因子は、イヌＨＥＲ２に特異的に結合する第１の結合性部位を含む。多様な種の第１の標的と交差反応性である二重特異性結合因子は、これらの種における対象を処置するのに使用されうる。例えば、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブは、トラスツズマブにより認識されるＨＥＲ２内のエピトープの相対的な保存のために、ヒトＨＥＲ２およびイヌＨＥＲ２の両方に結合することが予測される。例えば、Singer et al., 2012, Mol Immunol, 50: 200-209もまた参照されたい。
【００８３】
加えて、特定の種の対象における、本明細書で提示される、がんを処置する方法において、本明細書で記載される二重特異性結合因子を使用するために、二重特異性結合因子、好ましくは、二重特異性結合因子の免疫グロブリン部分の定常領域は、この特定の種に由来する。例えば、ヒトを処置するために、二重特異性結合因子は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリンである抗体を含みうる。別の例では、イヌを処置するために、二重特異性結合因子は、イヌ定常領域を含む免疫グロブリンである抗体を含みうる。具体的な実施形態では、ヒトを処置する場合、免疫グロブリンはヒト化免疫グロブリンである。別の具体的な実施形態では、ヒトを処置する場合、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。
【００８４】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、変種Ｆｃ領域を含み、前記変種Ｆｃ領域は、前記分子が、可溶性形態または細胞結合形態（例えば、ＮＫ細胞、単球、および好中球など、免疫エフェクター細胞上を含む）にあるＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合しないか、またはこれらへの結合を低減しているように、野生型Ｆｃ領域と比べて、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。これらのＦｃＲは、ＦｃＲ１（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含むがこれらに限定されない。新生児Ｆｃ受容体である、ＦｃＲ（ｎ）へのアフィニティーは、影響を受けず、したがって、二重特異性結合因子内で維持される。例えば、免疫グロブリンが、ＩｇＧである場合、好ましくは、ＩｇＧは、Ｆｃガンマ受容体に対するアフィニティーを低減しているか、またはこれを有さない。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子が、Ｆｃガンマ受容体に対するアフィニティーを低下させるか、またはこれを有さないように、例えば、アミノ酸２３４〜２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ’／Ｅループ）、およびアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇループ）など、Ｆｃガンマ受容体と直接接触する、Ｆｃ領域内の１つまたは複数の位置に変異が導入される。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Sondermann et al., 2000, Nature, 406: 267-273を参照されたい。好ましくは、Ｆｃ受容体への結合を破壊するように、ＩｇＧには変異Ｎ２９７Ａが施される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子またはその断片の、Ｆｃガンマ受容体に対するアフィニティーは、例えば、Okazaki et al., 2004. J Mol Biol, 336(5):1239-49において記載されている、例えば、ＢｉａＣｏｒｅ（商標）アッセイにより決定される。具体的な実施形態では、このような変種Ｆｃ領域を含む二重特異性結合因子は、参照Ｆｃ領域と比較して、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の結合で、ＦｃＲを保有する免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合する。特定の理論に束縛されずに述べると、このような変種Ｆｃ領域を含む二重特異性結合因子はサイトカインストームを誘導する能力を低下させているであろう。好ましい実施形態では、このような変種Ｆｃ領域を含む二重特異性結合因子は、可溶性形態にあるＦｃ受容体、または細胞結合形態としてのＦｃ受容体に結合しない。
【００８５】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、例えば、エフェクター機能を変更するか、または抗体の、ＦｃＲに対するアフィニティーを、増強もしくは減少させるために、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域内の、１つまたは複数のアミノ酸に対する、付加、欠失、および／または置換を伴うＦｃ領域などの、変種Ｆｃ領域を含む。好ましい実施形態では、抗体の、ＦｃＲに対するアフィニティーは減少する。例えば、その作用機構が、標的抗原を保有する細胞の遮断またはアンタゴニズムを伴うが、殺滅は伴わない抗体の場合など、ある特定の場合には、エフェクター機能の低減または消失が所望される。具体的な実施形態では、本明細書で提示されるＦｃ変種は、エフェクター機能を変更する修飾を含むがこれらに限定されない他のＦｃ修飾と組み合わされうる。具体的な実施形態では、このような修飾は、抗体またはＦｃの融合体において、相加的特性、相乗的特性、または新規の特性をもたらす。好ましくは、本明細書で提示されるＦｃ変種は、それらが組み合わされうる修飾の表現型を増強する。
【００８６】
具体的な実施形態では、本発明の二重特異性結合因子は、グリコシル化されていないか、または野生型免疫グロブリンと比較して、グリコシル化含量が低減されている。二重特異性結合因子が免疫グロブリンを含む別の具体的な実施形態では、免疫グロブリン内の重鎖は、グリコシル化されていないか、または野生型重鎖と比較して、グリコシル化含量が低減されている。好ましくは、これは、１つまたは複数のグリコシル化部位（例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位）を破壊するように、そのＦｃ受容体内で、二重特異性結合因子の、第１の分子部分の抗体またはその抗原結合性断片に変異を導入することにより達成される。別の具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の抗体またはその抗原結合性断片は、１つまたは複数のＮ結合型グリコシル化部位を破壊するように変異が導入される。ある特定の好ましい実施形態では、二重特異性結合因子の抗体またはその抗原結合性断片は、Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するように変異が導入されている。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子中の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖は、Ｎ結合型グリコシル化部位であるアスパラギンをグリコシル化部位として機能しないアミノ酸で置きかえるアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、二重特異性結合因子のグリコシル化含量の低減は、２９７位を、アスパラギンからアラニンへと改変すること（Ｎ２９７Ａ）により、二重特異性結合因子のＦｃ領域のグリコシル化部位を欠失させることにより達成される。例えば、具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は配列番号１５または１６の配列を伴う重鎖を含む。本明細書で使用される「グリコシル化部位」は、オリゴ糖（すなわち、一体に連結された２つ以上の単糖を含有する炭水化物）が、特異的かつ共有結合的に接合する、抗体内の、任意の特異的アミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は、典型的に、Ｎ結合またはＯ結合を介して抗体の骨格へと連結される。Ｎ結合型グリコシル化とは、オリゴ糖部分のアスパラギン残基の側鎖への接合を指す。Ｏ結合型グリコシル化とは、オリゴ糖部分のヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、トレオニンへの接合を指す。当技術分野では、抗体のグリコシル化含量を改変するための方法が周知であり、例えば、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０３５９０９６号；米国特許出願公開第２００２／００２８４８６号；国際公開第０３／０３５８３５号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号；を参照されたい。別の実施形態では、本発明の二重特異性結合因子の非グリコシル化は、例えば、細菌など、グリコシル化が不可能な細胞内または発現系内で、二重特異性結合因子を組換えにより作製することにより達成されうる。別の実施形態では、本発明の二重特異性結合因子の非グリコシル化またはグリコシル化含量の低減は、グリコシル化部位の炭水化物部分を酵素により除去することにより達成されうる。
【００８７】
具体的な実施形態では、本発明の二重特異性結合因子は、補体成分であるＣ１ｑに結合しないか、またはこれに対する結合アフィニティーを低減している（参照免疫グロブリンまたは野生型免疫グロブリンと比べて）。好ましくは、これは、Ｃ１ｑ結合性部位を破壊するように、二重特異性結合因子の、抗体またはその抗原結合性断片に変異を導入することにより達成される。ある特定の好ましい実施形態では、本方法は、３２２位をリシンからアラニンへと改変すること（Ｋ３２２Ａ）により、二重特異性結合因子のＦｃ領域のＣ１ｑ結合性部位を欠失させるステップ（Ｋ３２２Ａ修飾の記載については、例えば、Idusogie et al.,  2000. J Immunol. 164(8):4178-84を参照されたい）を包含する。例えば、具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、配列番号１６または１７の配列を伴う重鎖を含む。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子またはその断片の、補体成分であるＣ１ｑに対するアフィニティーは、例えば、Okazaki et al., 2004. J Mol Biol, 336(5):1239-49において記載されている、例えば、ＢｉａＣｏｒｅ（商標）アッセイにより決定される。具体的な実施形態では、Ｃ１ｑ結合性部位の破壊を含む二重特異性結合因子は、参照免疫グロブリンまたは野生型免疫グロブリンと比較して、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の結合で、補体成分であるＣ１ｑに結合する。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は補体を活性化させない。
【００８８】
具体的な実施形態では、本発明の二重特異性結合因子は、免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンは、（ｉ）前記分子が、可溶性形態にあるＦｃ受容体、または細胞結合形態としてのＦｃ受容体に結合しないか、またはこれらへの結合を低減しているように、野生型Ｆｃ領域と比べて、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み；（ｉｉ）Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するように、Ｆｃ領域内に１つまたは複数の変異を含み；（ｉｉｉ）補体成分であるＣ１ｑに結合しないか、またはこれに対する結合を低減している。例えば、具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、（ｉ）可溶性形態にあるＦｃ受容体、または細胞結合形態としてのＦｃ受容体への結合を消失させるか、または低減し；（ｉｉ）Ｆｃ領域内の、Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するように、Ｆｃ領域内に第１の変異であるＮ２９７Ａを含むＩｇＧを含み；（ｉｉｉ）補体成分であるＣ１ｑへの結合を消失させるか、または低減するように、Ｆｃ領域内に第２の変異であるＫ３２２Ａを含む。例えば、配列番号１６を参照されたい。
【００８９】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子はＦｃドメインを含む。好ましい実施形態では、二重特異性結合因子の第１の分子はＦｃドメインを含む。
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａの間、１５０〜３００ｋＤａの間、または２００〜２５０ｋＤａの間である。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、少なくとも１００ｋＤａである。
【００９０】
本明細書で提示される二重特異性結合因子は、広範にわたるアフィニティーで、第１の標的および第２の標的に結合しうる。抗体の、抗原に対するアフィニティーまたはアビディティーは、任意の適切な方法を使用して実験により決定されうる。例えば、Berzofsky, et al., “Antibody-Antigen Interactions,” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)；および本明細書で記載される方法を参照されたい。特定の抗体−抗原間相互作用について測定されたアフィニティーは、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定される場合、変動しうる。したがって、アフィニティーおよび他の抗原結合パラメータの測定は、好ましくは、抗体および抗原の標準化溶液と標準化緩衝液とによりなされる。アフィニティーであるＫDとは、ｋoff／ｋonの比である。一般に、マイクロモル範囲のＫDは低アフィニティーであると考えられる。一般に、ｐｍｏｌ範囲のＫDは高アフィニティーであると考えられる。
【００９１】
二重特異性結合因子の第１の標的がＨＥＲ２である具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、好ましくは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢｉａＣｏｒｅ（商標）、フローサイトメトリー、および細胞ベースのアッセイなど、当業者に公知のアッセイにより決定される通り、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＡＵ５６５、ＳＫＢＲ３、ＨＴＢ２７、ＨＴＢ２６、ＨＣＣ１９５４、ＭＣＦ７、ＯＶＣＡＲ３、ＳＫＯＶ３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ、ＡＧＳ、ＳＮＵ−１６、ＨＴ１４４、ＳＫＭＥＬ２８、Ｍ１４、ＨＴＢ６３、ＲＧ１６０、ＲＧ１６４、ＣＲＬ１４２７、Ｕ２ＯＳ、ＳＫＥＡＷ、ＳＫＥＳ−１、ＨＴＢ８２、ＮＭＢ７、ＳＫＮＢＥ（２）Ｃ、ＩＭＲ３２、ＳＫＮＢＥ（２）Ｓ、ＳＫＮＢＥ（１）Ｎ、ＮＢ５、１５Ｂ、９３−ＶＵ−１４７Ｔ、ＰＣＩ−３０、ＵＤ−ＳＣＣ２、ＰＣＩ−１５Ｂ、ＳＣＣ９０、ＵＭＳＣＣ４７、ＮＣＩ−Ｈ５２４、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ３４５など、１つまたは複数のＨＥＲ２陽性癌細胞系に結合することが示されている。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子はｎｍｏｌ範囲のＥＣ５０でＨＥＲ２陽性癌細胞系に結合する。
具体的な実施形態では、本明細書で記載される方法（例えば、５．１節および６節を参照されたい）における二重特異性結合因子の使用は、腫瘍の進行、転移、および／または腫瘍のサイズを低減する。例えば、６節を参照されたい。
【００９２】
５．２．１  二重特異性結合因子の作製
本明細書ではまた、５．１節および６節節に記載される二重特異性結合因子を作製するための方法も提示される。本明細書の具体的な実施形態では、第２の分子に（リンカーを介してもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含む二重特異性結合因子を作製するための方法が提示され、この場合、前記第１の分子は第１の結合性部位を含み、前記第１の結合性部位は第１の標的に特異的に結合し、前記第１の標的は前記がんにより発現されるがん抗原であり、第２の分子は第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位は第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的はがん抗原ではない。本明細書の具体的な実施形態では、第２の分子に（リンカーを介してもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含む二重特異性結合因子を作製するための方法が提示され、この場合、前記がんはＨＥＲ２を発現し、前記第１の分子が、抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖを含み、前記抗体もしくはその抗原結合性断片またはｓｃＦｖは、（ｉ）前記がん上のＨＥＲ２に結合し、（ｉｉ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲの３つ全て、および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲの３つ全て、を含み、前記第２の分子は第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位は第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的はがん抗原ではない。
【００９３】
本明細書で記載される二重特異性結合因子を作製するのに使用されうる方法は、例えば、化学合成によるか、生物学的供給源からの精製によるか、または組換え発現法による、当業者に公知の方法であり、例えば、哺乳動物の細胞またはトランスジェニック調製物からの作製を含む。本明細書で記載される方法は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドの合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに関連分野の従来の技法を利用する。これらの技法は、例えば、本明細書で引用される参考文献において記載されており、文献において、十分に説明されている。例えば、Sambrook et al.  (2001) Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates)  Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【００９４】
当技術分野では、二重特異性結合因子の作製のために使用されうる、様々な方法が存在する。例えば、二重特異性結合因子は、米国特許第４，８１６，５６７号において記載されている組換えＤＮＡ法などの組換えＤＮＡ法により作られうる。本明細書で提示される二重特異性結合因子をコードする、１つまたは複数のＤＮＡは、従来の手順（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖、またはヒト供給源、ヒト化供給源、もしくは他の供給源に由来する、このような鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能な、オリゴヌクレオチドプローブを使用することによる手順）を使用して、たやすく単離およびシーケンシングされうる。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターへと移入され、次いで、組換え宿主細胞内で二重特異性結合因子の合成が生じるように、ＮＳ０細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母細胞、藻類細胞、鶏卵、または形質転換されなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞へと形質転換される。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖およびヒト軽鎖のコード配列を、相同なヒト配列の代わりに所望の種の定常ドメインで置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al., supra）修飾される場合もあり、免疫グロブリンのコード配列へと、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を共有結合的に接続することにより修飾される場合もある。このような非免疫グロブリンポリペプチドにより、本明細書で提示される二重特異性結合因子の定常ドメインが置換されうる。具体的な実施形態では、ＤＮＡは、５．２．１．１節に記載されるＤＮＡである。
【００９５】
本明細書で提示される二重特異性結合因子はまた、抗体などのタンパク質である、少なくとも１つの二重特異性結合因子をコードするトランス遺伝子を、例えば、このような抗体をそれらのミルク中に産生するように含有し、発現する、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物などのトランスジェニック動物を使用しても調製されうる。このような動物は、公知の方法を使用してもたらされうる。例えば、それらの各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号；同第５，５６５，３６２号；同第５，３０４，４８９号などであるがこれらに限定されない参考文献を参照されたい。
【００９６】
本明細書で提示される二重特異性結合因子はまた、例えば、このような二重特異性結合因子を、植物の一部において、またはこれらから培養された細胞内で産生するように、少なくとも１つの二重特異性結合因子をコードするトランス遺伝子を含有し、発現する、トランスジェニック植物、および培養された植物細胞（例えば、タバコおよびトウモロコシであるがこれらに限定されない）を使用しても調製されうる。
本明細書で提示される二重特異性結合因子はまた、少なくとも１つの二重特異性結合因子をコードするプラスミドを含有し、発現するように形質転換された細菌、例えば、このような二重特異性結合因子を細菌内で産生するように形質転換された細菌を使用しても調製されうる。
【００９７】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、プロテインＡ精製、プロテインＧ精製、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、周知の方法により、組換え細胞培養物から、回収および精製されうる。例えば、Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), e.g., chapters 1, 4, 6, 8, 9, and 10を参照されたい。
【００９８】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される二重特異性結合因子は、例えば、化学合成手順の生成物、および組換え技法により真核宿主から作製される生成物、例えば、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む真核宿主から作製される生成物を含む。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、グリコシル化されないように、宿主内で作出される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、グリコシル化されないように、細菌細胞内で作出される。このような方法については、Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12-14など、多くの、標準的な実験室マニュアルにおいて記載されている。
精製された抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリー、免疫細胞学、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）解析、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  ＫｉｎＥｘＡ（商標）動的排除アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロットにより特徴づけられる場合もあり、ＨＰＬＣ解析により特徴づけられる場合もある。
本明細書で記載される二重特異性結合因子のデザインおよび作製のための、詳細な例については、６節もまた参照されたい。
【００９９】
５．２．１．１  ポリヌクレオチド
本明細書の、具体的な実施形態では、５．２節および６節に記載される通り、第１の標的（例えば、ＨＥＲ２）、および第２の標的（例えば、ＤＯＴＡまたはその誘導体）に特異的に結合する、本明細書で記載される二重特異性結合因子またはその断片（例えば、重鎖および／または軽鎖融合ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提示される。本明細書ではまた、このようなポリヌクレオチドを含むベクターも提示される。ポリヌクレオチドおよびベクターは、二重特異性結合因子またはその断片の、組換え作製のために使用されうる。
【０１００】
「精製された」という用語は、約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（特に、約１０％未満）の他の素材、例えば、細胞の素材、培養物培地、他の核酸分子、化学物質の前駆体、および／または他の化学物質を有する、ポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。具体的な実施形態では、本明細書で記載される二重特異性結合因子をコードする核酸分子は単離または精製されている。
核酸分子は、クローニングにより得られるか、または合成により作製されるか、またはこれらの任意の組合せである、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡなど、ＲＮＡの形態にある場合もあり、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡの形態にある場合もある。
【０１０１】
具体的な実施形態では、組換え作製のために使用されるポリヌクレオチドは、５．２節および６節に記載される二重特異性結合因子またはその断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、重鎖融合ポリペプチドまたは軽鎖融合ポリペプチド）を含み、二重特異性結合因子は、第２の分子に（リンカーを介してもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記第１の分子は第１の結合性部位を含み、前記第１の結合性部位は第１の標的に特異的に結合し、前記第１の標的は前記がんにより発現されるがん抗原であり、前記第２の分子は第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位が第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的はがん抗原ではない。ポリヌクレオチドが二重特異性結合因子の断片をコードするヌクレオチド配列を含む具体的な実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて二重特異性結合因子を作製するように組み合わされうる。例えば、二重特異性結合因子の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの翻訳産物と、二重特異性結合因子の軽鎖融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの翻訳産物とは、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて二重特異性結合因子を作製するように組み合わされうる。
【０１０２】
別の具体的な実施形態では、組換え作製のために使用されるポリヌクレオチドは５．２節および６節に記載される、二重特異性結合因子またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含み、二重特異性結合因子は、第２の分子に（リンカーを介してもよく）共有結合的に結合している第１の分子を含み、前記がんはＨＥＲ２を発現し、前記第１の分子は、抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖを含み、前記抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｓｃＦｖは、（ｉ）前記がん上のＨＥＲ２に結合し、（ｉｉ）配列番号２０の重鎖ＣＤＲの３つ全て、および配列番号１９の軽鎖ＣＤＲの３つ全て、を含み、前記第２の分子は第２の結合性部位を含み、前記第２の結合性部位は第２の標的に特異的に結合し、前記第２の標的はがん抗原ではない。
特定の実施形態では、組換え作製のために使用されるポリヌクレオチドは、（ｉ）ＨＥＲ２およびＤＯＴＡまたはその誘導体に特異的に結合し、（ｉｉ）本明細書で記載されるアミノ酸配列を含む、二重特異性結合因子またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０３】
具体的な実施形態では、本明細書で記載される二重特異性結合因子の１つまたは複数の部分は、表９に明示されるヌクレオチド配列からの発現により作製される。二重特異性結合因子を作製するための好ましい実施形態では、軽鎖の配列は配列番号１１であり、軽鎖を作製するために発現させる、軽鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号１３である。二重特異性結合因子を作製するための、好ましい実施形態では、ｓｃＦｖの配列は配列番号３３であり、ｓｃＦｖを作製するために発現させるｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列は配列番号３８である。二重特異性結合因子を作製するための好ましい実施形態では、軽鎖の配列は配列番号１１であり、ｓｃＦｖの配列は配列番号３３であり、軽鎖を作製するために発現させる軽鎖をコードするヌクレオチド配列、配列番号１３であり、ｓｃＦｖを作製するために発現させるｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列は配列番号３８である。二重特異性結合因子を作製するための好ましい実施形態では、軽鎖融合ポリペプチドの配列は配列番号７であり、軽鎖融合ポリペプチドを作製するために発現させる軽鎖融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号１８である。二重特異性結合因子を作製するための好ましい実施形態では、重鎖の配列は配列番号１５であり、重鎖を作製するために発現させる重鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号１２である。
【０１０４】
表9:例示的な核酸配列。
【表９】
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【０１０５】
本明細書で提示される使用のためのポリヌクレオチドは当技術分野で公知である、任意の方法により得られうる。例えば、本明細書で記載される二重特異性結合因子またはその断片をコードするヌクレオチド配列が既知である場合、二重特異性結合因子またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされる場合があるが（例えば、Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)において記載されている通りに）、これは、略述すると、抗体をコードする配列の部分を含有する、重複オリゴヌクレオチドの合成と、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングおよびライゲーションと、次いで、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅とを伴う。
【０１０６】
代替的に、本明細書で提示される使用のための二重特異性結合因子またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源に由来する核酸から作出されうる。特定の二重特異性結合因子またはその断片をコードする核酸を含有するクローンは利用可能ではないが、二重特異性結合因子またはその断片の配列は既知である場合、二重特異性結合因子またはその断片をコードする核酸は化学合成される場合もあり、配列の３’末端および５’末端とハイブリダイズする合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するのに特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、適切な供給源（例えば、抗体のｃＤＮＡライブラリー、または本明細書で提示される抗体を発現させるように選択される、ハイブリドーマ細胞など、抗体を発現する任意の組織または細胞から作出されたｃＤＮＡライブラリー、もしくはこれらから単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ）から得られる場合もある。次いで、ＰＣＲにより作出された増幅核酸は、当技術分野で周知である任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターへとクローニングされうる。例えば、５．２．１．２節を参照されたい。
【０１０７】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子のうちの、抗体のアミノ酸配列は、当技術分野で公知のアミノ酸配列である。このような実施形態では、このような抗体をコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野で周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ法、部位特異的変異導入、ＰＣＲなど（例えば、それらのいずれもが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.において記載されている技法を参照されたい）を使用して、異なるアミノ酸配列を有する、二重特異性結合因子を作出する、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を創出するように操作されうる。例えば、このような操作は、コードされたアミノ酸を、非グリコシル化するか、または抗体が、Ｃ１ｑ、Ｆｃ受容体に結合するか、もしくは補体系を活性化させる能力を破壊するように実施されうる。
【０１０８】
本明細書で提示される単離核酸分子は、１つまたは複数のイントロンを伴ってもよいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子であって、例えば、少なくとも１つの重鎖または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３など、少なくとも１つのＣＤＲのうちの、少なくとも１つの指定部分；抗ＨＥＲ２抗体もしくは可変領域、抗ＤＯＴＡ（またはその誘導体）ｓｃＦｖ、または単鎖融合ポリペプチドのコード配列を含む核酸分子；ならびに上記で記載したヌクレオチド配列と実質的に異なるが、遺伝子コードの縮重性のために、本明細書で記載される少なくとも１つの二重特異性結合因子および／または当技術分野で公知の少なくとも１つの二重特異性結合因子を依然としてコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むがこれらに限定されない核酸分子を含みうる。
【０１０９】
本明細書で提示される使用のための核酸は、本明細書で提示されるポリヌクレオチドに加えて、複数の配列を含むと好都合でありうる。例えば、ポリヌクレオチドの単離の一助となるように、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む多重クローニング部位が核酸へと挿入されうる。加えて、翻訳された本明細書で提示されるポリヌクレオチドの単離の一助となるように、翻訳可能な配列も挿入されうる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本明細書で提示されるポリペプチドを精製するための簡便な手段をもたらす。本明細書で提示される核酸（コード配列を除外する）は、本明細書で提示されるポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、アダプター、またはリンカーであってもよい。
【０１１０】
クローニングおよび／または発現における、それらの機能を最適化するか、ポリヌクレオチドの単離の一助となるか、またはポリヌクレオチドの、細胞への導入を改善するように、このようなクローニング配列および／または発現配列へと、さらなる配列もまた付加されうる。当技術分野では、クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、周知である（例えば、Ausubel, supra；またはSambrook, supraを参照されたい）。
具体的な実施形態では、抗体のヒト化のために、規定の組換えＤＮＡ法を使用して、本明細書で記載される抗体のＣＤＲのうちの１つまたは複数がフレームワーク領域内に挿入されうる。フレームワーク領域は天然に存在するフレームワーク領域の場合もあり、コンセンサスフレームワーク領域の場合もあるが、好ましくは、ヒトフレームワーク領域でありうる（ヒトフレームワーク領域の列挙については、例えば、Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998)を参照されたい）。好ましくは、フレームワーク領域と、ＣＤＲとの組合せにより作出されるポリヌクレオチドは、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体をコードする。フレームワーク領域内では、１つまたは複数のアミノ酸置換がなされる場合があり、好ましくは、アミノ酸置換は、抗体の、その抗原への結合を改善する。加えて、このような方法は、鎖内ジスルフィド結合に参与する１つまたは複数の可変領域のシステイン残基の、アミノ酸の置換または欠失を施して、１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作出するのに使用されうる。本明細書では、ポリヌクレオチドに対する他の変更も提示され、それらは当技術分野の範囲内にある。
【０１１１】
具体的な実施形態では、単離もしくは精製された核酸分子、またはその断片は、別の核酸分子と連結されると融合タンパク質をコードしうる。融合タンパク質の作出は、当技術分野の技術の範囲内にあり、制限酵素または組換えクローニング法の使用を伴いうる（例えば、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を参照されたい）。米国特許第５，３１４，９９５号もまた参照されたい。
具体的な実施形態では、本明細書で提示されるポリヌクレオチドは５．２．１．２節で記載されるベクター（例えば、発現ベクター）の形態にある。
【０１１２】
５．２．１．２  細胞およびベクター
本明細書の、具体的な実施形態では、本明細書で記載される二重特異性結合因子の作製における使用のために、本明細書で記載される二重特異性結合因子を発現する（例えば、組換えにより発現する）細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞）が提示される。本明細書ではまた、本明細書で記載される二重特異性結合因子の作製における使用のための、宿主細胞内の組換え発現、好ましくは哺乳動物細胞内の組換え発現のための、本明細書で記載される二重特異性結合因子またはその断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、５．２．１．１節を参照されたい）を含むベクター（例えば、発現ベクター）も提示される。本明細書ではまた、本明細書で記載される二重特異性結合因子を組換えにより発現させるための、このようなベクターまたはヌクレオチド配列を含む細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞）も提示される。本明細書ではまた、本明細書で記載される二重特異性結合因子を作製するための方法であって、このような二重特異性結合因子を細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞）から発現させるステップを含む方法も提示される。好ましい実施形態では、細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞である。
【０１１３】
本明細書の具体的な実施形態では、５．２．１．１節で記載された、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクターであって、本明細書で記載される二重特異性結合因子の作製における使用のためのベクターが提示される。
具体的な実施形態では、５．２．１．１節で記載されたポリヌクレオチドは、適切なベクターへクローニングされる場合があり、当技術分野で周知の方法を使用する、二重特異性結合因子の組換え作製に適する任意の適切な宿主を形質転換するか、またはこれにトランスフェクトするのに使用されうる。
具体的な実施形態では、ベクターは、哺乳動物の宿主または宿主細胞における二重特異性結合因子の組換え発現のために使用される哺乳動物ベクターである。哺乳動物発現ベクターの非限定例は、ｐＩＲＥＳｌｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、またはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）、またはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７１０９）などのベクターを含む。このような哺乳動物ベクターと組み合わせて使用されうる哺乳動物宿主細胞の非限定例は、ヒトＨｅｌａ  ２９３細胞、ヒトＨ９細胞、およびヒトＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびマウスＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞、およびＣＶ１細胞、ｑｕａｉｌ  ＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【０１１４】
具体的な実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、パルボウイルスベースのベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター、およびアデノウイルスベースのベクター、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのベクターなど、レンチウイルスベクターである。具体的な実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスを複製欠損とするように操作される。具体的な実施形態では、ウイルスベクターは宿主に対する毒性を消失させるように操作される。
【０１１５】
具体的な実施形態では、本明細書で記載される、ベクターまたはポリヌクレオチドは、従来の技法により、細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞）へ移入される場合があり、結果として得られる細胞は、従来の技法により、本明細書で記載される二重特異性結合因子を産生するように培養されうる。好ましい実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。とりわけ好ましい実施形態では、細胞はＣＨＯ−Ｓ細胞である。
具体的な実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを、細胞へと導入することにより、染色体へと組み込まれたポリヌクレオチドを含む、安定的細胞系内で発現させうる。
【０１１６】
５．３  除去剤
本明細書では、本明細書で提示されるがんを処置する方法（例えば、５．１節を参照されたい）における使用のための除去剤が提示される。上記で記載した通り、本明細書で提示される、がんを処置する方法において使用される場合、除去剤は、対象へ治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ａ）の後で（例えば、１２時間以内に）、対象へ投与される。本明細書で記載される除去剤は、対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップの前に、対象の血中を循環する二重特異性結合因子の量を低減するように機能する。具体的な実施形態では、除去剤は、主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により、循環血から除去される分子を含む。特定の理論に束縛されずに述べると、（ｉ）対象への、二重特異性結合因子の投与の後であるが、（ｉｉ）対象への、放射線療法剤の投与の前における、対象への除去剤の投与は、対象の血中を循環する二重特異性結合因子を、除去または低減する結果として、対象における、ターゲティングされない正常組織（例えば、がん抗原を発現させない組織）の、後続する放射線療法剤の投与への曝露の低減をもたらす。したがって、いかなる理論にも束縛されずに述べると、除去剤の投与は、ターゲティングされない正常組織（すなわち、がん抗原を発現させない組織）における放射線療法剤からの放射線を制限することにより、治療指数の改善を可能とすることから、放射線の線量制限毒性を結果としてもたらさずに、高線量の放射線療法剤を対象へ投与することを可能とする。
【０１１７】
本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用のために、除去剤は、がんを処置する方法において使用される二重特異性結合因子に結合する。したがって、本明細書で提示されるがんを処置する方法における除去剤の使用のために、本方法において使用される二重特異性結合因子に結合する除去剤が選択されるべきである。したがって、当業者は、除去剤は、本方法において使用される二重特異性結合因子の構造および特異性に基づき選択されることを理解するであろう。具体的な実施形態では、除去剤は、循環血から除去される分子に結合している第２の標的（二重特異性結合因子の第２の標的）、または第２の分子に結合する（好ましくは、第２の結合性部位において）能力を保持する第２の標的の誘導体を含む。本明細書で記載される第２の標的の誘導体は、第２の分子に結合する（好ましくは、第２の結合性部位において）能力を保持する。具体的な実施形態では、除去剤は、主に肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により循環血から除去される分子に結合している第２の標的（二重特異性結合因子の第２の標的）またはその誘導体を含む。例えば、二重特異性結合因子の第２の標的がＤＯＴＡである場合、二重特異性結合因子と組み合わせた使用のための除去剤は、主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により循環血から除去される分子に結合しているＤＯＴＡを含みうる。別の例では、二重特異性結合因子の第２の標的がＤＯＴＡである場合、二重特異性結合因子と組み合わせた使用のための除去剤は、主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により、循環血から除去される分子に結合しているＤＯＴＡの誘導体（例えば、イソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡ）を含みうる。除去剤における、第２の標的の誘導体（二重特異性結合因子の第２の標的）の使用のために、第２の標的の誘導体は二重特異性結合因子に結合する（二重特異性結合因子の第２の分子の、第２の結合性部位に特異的に結合する）、その能力を保持しなければならない。
【０１１８】
当業者には、主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により、循環血から除去される分子が公知である。主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により、循環血から除去される分子の非限定例は、アミノデキストラン、ガラクトシル化アルブミン、ガラクトース、ガラクトサミン、マンノース、ラクトース、ムラミルトリペプチド、ＲＧＤペプチド、およびグリチルリチンを含む（例えば、Mishra et al., 2013, Efficient Hepatic Delivery of Drugs: Novel Strategies and Their Significance, BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 32184, 20 pagesを参照されたい）。当業者は、主に、肝臓、固定食細胞系、脾臓、または骨髄により、循環血から除去される分子が、例えば、肝臓細胞上、脾臓細胞上、または骨髄細胞上の表面受容体タンパク質に結合する分子であって、細胞へと内在化される分子を含むことを理解するであろう。例えば、除去剤が、主に、肝臓により、循環血から除去されるために、除去剤は、肝臓細胞（例えば、肝細胞）と相互作用する分子を含むものとする。例えば、肝臓によるクリアランスのために、除去剤は、肝細胞上の受容体、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用する分子を含みうる。本実施例では、除去剤は、除去剤中の第２の標的が、循環血中の二重特異性結合因子に結合し、ガラクトシル化アルブミンが、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体と相互作用し（例えば、Stockert, Physiol Rev. 1995; 75:591-609を参照されたい）、除去剤に結合している二重特異性結合因子が肝細胞により内在化され、肝臓により対象から除去されるように、第２の標的（二重特異性結合因子の第２の標的）に結合しているガラクトシル化アルブミンを含みうる。
【０１１９】
具体的な実施形態では、除去剤は、第２の標的へとコンジュゲートされた５００ｋＤａのアミノデキストランを含む。具体的な実施形態では、第２の標的はＤＯＴＡである。具体的な実施形態では、除去剤はＤＯＴＡへとコンジュゲートされた、５００ｋＤａのアミノデキストランを含む。具体的な実施形態では、除去剤は、第２の標的の誘導体へとコンジュゲートされた５００ｋＤａのアミノデキストランを含む。具体的な実施形態では、第２の標的は、ＤＯＴＡである。第２の標的がＤＯＴＡである具体的な実施形態では、第２の標的の誘導体はイソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡである。具体的な実施形態では、除去剤は、イソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡへとコンジュゲートされた５００ｋＤａのアミノデキストランを含む。
【０１２０】
具体的な実施形態では、除去剤は、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの第２の標的分子、約１００〜１５０個を含む。具体的な実施形態では、第２の標的はＤＯＴＡである。具体的な実施形態では、除去剤は、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりのＤＯＴＡ分子約１００〜１５０個を含む。具体的な実施形態では、除去剤は、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの第２の標的の誘導体分子約１００〜１５０個を含む。具体的な実施形態では、第２の標的はＤＯＴＡである。第２の標的がＤＯＴＡである具体的な実施形態では、第２の標的の誘導体はイソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡである。具体的な実施形態では、除去剤は、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりのイソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡ分子約１００〜１５０個を含む。第２の標的がＤＯＴＡである具体的な実施形態では、除去剤は、非放射性のルテチウム分子またはイットリウム分子をさらに含む。
当業者は、本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用に適する除去剤が、好ましくは、容易に製造され、容易に特徴づけられ、一貫した組成を有する除去剤であることを理解するであろう。例えば、適切な除去剤は、例えば、完全に合成のデンドリマー（ｄｅｄｒｉｍｅｒ）をコンジュゲートさせた薬剤など、単一の化学的組成を有する薬剤を含む。
【０１２１】
当技術分野では、除去剤、および除去剤を作製する方法が公知である（例えば、Orcutt et al. Mol Cancer Ther 2012, 11(6) 1365-72、米国特許第６，０７５，０１０号、米国特許第６，４１６，７３８号、および国際特許出願公開第２０１２／０８５７８９号を参照されたい）。例えば、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりのイソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡ分子１００〜１５０個を含む除去剤を作製するために、アミノデキストランは、定量反応を達成するように、大過剰量のイソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡ中で反応させられる。本明細書で記載される除去剤を、どのようにして作製するのかの記載については、例えば、Orcutt et al., 2012, Effect of small-molecule-binding affinity on tumor uptake in vivo: a systematic study using a pretargeted bispecific antibody. Mol Cancer Ther; 11: 1365-72を参照されたい。
【０１２２】
除去剤が、金属キレート剤である第２の標的を含む具体的な実施形態では、除去剤は、金属キレート剤と相互作用することが可能な非放射性金属をさらに含む。例えば、除去剤がＤＯＴＡまたはその誘導体を含む場合、非放射性除去剤を作出するのに使用される非放射性金属は、175Ｌｕまたは89Ｙでありうる。具体的な実施形態では、除去剤はアミノデキストラン５００ｋＤａ当たりのイソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡ分子１００〜１５０個を含み、この場合、イソチオシアン酸ベンジル−ＤＯＴＡは175Ｌｕと複合体化している。
【０１２３】
本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用のために、結合していない二重特異性結合因子を、循環血から、数時間以内に除去する（場合によって、本明細書では、「クリアランス」とも称される）除去剤を利用することが好ましい。具体的な実施形態では、除去剤は、結合していない二重特異性結合因子を、循環血から、２４時間未満、２３時間未満、２２時間未満、２１時間未満、２０時間未満、１９時間未満、１８時間未満、１７時間未満、１６時間、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、または１時間未満で除去する。具体的な実施形態では、除去剤は、結合していない二重特異性結合因子を、循環血から、１〜２時間、１〜３時間、１〜４時間、２〜６時間、２〜８時間、２〜１０時間、４〜６時間、４〜８時間、４〜１０時間、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間で除去する。
【０１２４】
具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、除去剤を対象へ投与してから、１時間、２時間、３時間、または４時間以内に、二重特異性結合因子のうちの、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が循環血から除去される場合に、循環血から除去されると考えられる。循環血から除去された二重特異性結合因子のパーセントを決定するための方法は当業者に公知であり、例えば、Breitz, et al., J Nucl Med 2000 41(1) 131-40および６節に記載のアッセイを参照されたい。
【０１２５】
５．４  放射線療法剤
本明細書ではまた、本明細書で提示されるがんを処置する方法（例えば、５．１節および６節を参照されたい）における使用のための放射線療法剤も提示される。上記で記載した通り、本明細書で提示される、がんを処置する方法において使用される場合、放射線療法剤は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の後で対象へ投与される。特定の理論に束縛されずに述べると、本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用のために、放射線療法剤は二重特異性結合因子に結合し、クロスファイアー効果、放射線誘導性バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄａｒｄ）効果、および未照射部位効果により、他の細胞と共に二重特異性結合因子が結合しているがん細胞の殺滅を媒介する。本明細書で記載される、二重特異性結合因子（例えば、５．２節および６節を参照されたい）の第１の分子は、対象における、がん細胞上のがん抗原（すなわち、二重特異性結合因子の第１の標的）に特異的に結合し、二重特異性結合因子の第２の分子は放射線療法剤の一部を形成する、第２の標的に特異的に結合する。したがって、いかなる理論にも束縛されずに述べると、二重特異性結合因子は、がん細胞と放射線療法剤との間に架橋を形成し、放射線療法剤による二重特異性結合因子に結合しているがん細胞の殺滅を可能とする。したがって、本明細書で提示されるがんを処置する方法における、二重特異性結合因子と組み合わせた放射線療法剤の使用のために、二重特異性結合因子の第２の標的を含む放射線療法剤が選択されるべきである。放射線療法剤は、（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的であって、金属キレート剤である第２の標的；または（ｉｉ）金属キレート剤に結合している第２の標的であって、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している第２の標的を含む。したがって、当業者は、本明細書で提示される、がんを処置する方法における使用のための放射線療法剤が、本方法において使用される二重特異性結合因子の構造および特異性に基づき選択されることを理解するであろう。好ましい実施形態では、放射線療法剤は金属放射性核種に結合しているＤＯＴＡまたはその誘導体を含む。放射線療法剤が、金属放射性核種に結合しているＤＯＴＡまたはその誘導体を含む好ましい実施形態では、金属放射性核種は、177Ｌｕである。
【０１２６】
具体的な実施形態では、放射線療法剤は、（ｉ）金属放射性核種に結合している第２の標的（二重特異性結合因子の第２の標的）であって、金属キレート剤である第２の標的を含む。例えば、二重特異性結合因子の第１の分子が、がん細胞上のがん抗原であるＨＥＲ２（すなわち、第１の標的）に結合する（その第１の結合性部位を介して）免疫グロブリンであり、二重特異性結合因子の第２の分子が、金属キレート剤である、ＤＯＴＡまたはその誘導体（すなわち、第２の標的）に結合する（その第２の結合性部位を介して）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である場合、放射線療法剤は、金属放射性核種に結合している金属キレート剤であるＤＯＴＡまたはその誘導体を含みうる。放射線療法剤がＤＯＴＡまたはその誘導体を含む具体的な実施形態では、金属放射性核種は177Ｌｕである。
【０１２７】
別の具体的な実施形態では、放射線療法剤は、（ｉｉ）金属キレート剤に結合している、好ましくは、共有結合的に結合している第２の標的（がんを処置する方法において使用される、二重特異性結合因子の第２の標的）であって、前記金属キレート剤が金属放射性核種に結合している第２の標的を含む。例えば、二重特異性結合因子の第１の分子が、がん細胞上のがん抗原であるＨＥＲ２（すなわち、第１の標的）に結合する（その第１の結合性部位を介して）免疫グロブリンであり、二重特異性結合因子の第２の分子がビオチン（すなわち、第２の標的）に結合する（その第２の結合性部位を介して）ストレプトアビジンである場合、放射線療法剤は、金属放射性核種に結合している金属キレート剤に結合しているビオチンを含みうる。具体的な実施形態では、第２の標的は金属キレート剤に共有結合的に結合している。
【０１２８】
本明細書で記載される放射線療法剤の一部を形成しうる金属キレート剤は、当技術分野で公知である。金属キレート剤の非限定例は、ＤＯＴＡまたはその誘導体（例えば、ＤＯＴＡ−ＢｎおよびＤＯＴＡ−デフェロキサミン）、およびＤＴＰＡまたはその誘導体を含む。具体的な実施形態では、金属キレート剤は、ＤＯＴＡまたはその誘導体である。具体的な実施形態では、金属キレート剤はＤＯＴＡ−Ｂｎである。
【０１２９】
本明細書で記載される放射線療法剤の一部を形成しうる金属は、当技術分野で公知である。金属の非限定例は、ルテチウム（Ｌｕ）、アクチニウム（Ａｃ）、アスタチン（Ａｔ）、ビスマス（Ｂｉ）、セリウム（Ｃｅ）、銅（Ｃｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、エルビウム（Ｅｒ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ガリウム（Ｇａ）、ホルミウム（Ｈｏ）、ヨウ素（Ｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ランタン（Ｌａ）、鉛（Ｐｂ）、ネオジミウム（Ｎｄ）、プラセオジム（Ｐｒ）、プロメチウム（Ｐｍ）、レニウム（Ｒｅ）、サマリウム（Ｓｍ）、スカンジウム（Ｓｃ）、テルビウム（Ｔｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、イットリウム（Ｙ）、およびジルコニウム（Ｚｒ）を含む。具体的な実施形態では、金属は、イットリウム（Ｙ）である。好ましい実施形態では、金属は、ルテチウム（Ｌｕ）である。金属放射性核種の非限定例は、211Ａｔ、225Ａｃ、227Ａｃ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、157Ｇｄ、166Ｈｏ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、212Ｐｂ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、47Ｓｃ、153Ｓｍ、166Ｔｂ、89Ｚｒ、86Ｙ、88Ｙ、および90Ｙを含む。当業者は、放射線療法剤の金属放射性核種は、放射線療法剤の金属キレート剤に結合する能力に基づき選択されることを理解するであろう。例えば、放射線療法剤の金属キレート剤がＤＯＴＡである場合、ＤＯＴＡに結合することが可能な金属放射性核種、例えば、ＬｕまたはＹなどが使用される。具体的な実施形態では、金属放射性核種は、金属キレート剤に対してｐｍｏｌ単位のアフィニティーを有する。加えて、放射線療法剤の金属放射性核種は、放射性核種に結合している金属キレート剤を含む放射線療法剤が、二重特異性結合因子の結合を受ける（すなわち、二重特異性結合因子の、第２の結合性部位を介して）能力を保持するように選択されなければならない。放射性核種の金属キレート剤がＤＯＴＡまたはその誘導体である具体的な実施形態では、金属放射性核種は、86Ｙ、90Ｙ、88Ｙ、または177Ｌｕである。放射性核種の金属キレート剤がＤＯＴＡまたはその誘導体である好ましい実施形態では、金属放射性核種は177Ｌｕである。
別の具体的な実施形態では、本明細書で記載される放射線療法剤の金属キレート剤は、式Ｉ：
【０１３０】
【化１】
2021517564.tif 000022
(I)
［式中、Ｍ1は、175Ｌｕ3+、45Ｓｃ3+、69Ｇａ3+、71Ｇａ3+、89Ｙ3+、113Ｉｎ3+、115Ｉｎ3+、139Ｌａ3+、136Ｃｅ3+、138Ｃｅ3+、140Ｃｅ3+、142Ｃｅ3+、151Ｅｕ3+、153Ｅｕ3+、159Ｔｂ3+、154Ｇｄ3+、155Ｇｄ3+、156Ｇｄ3+、157Ｇｄ3+、158Ｇｄ3+、または160Ｇｄ3+であり；Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4は、各々独立に、孤立電子対（すなわち、酸素アニオンをもたらす）またはＨであり；Ｘ5、Ｘ6、およびＸ7は、各々、独立に、孤立電子対（すなわち、酸素アニオンをもたらす）またはＨであり；ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２である］の化合物または薬学的に許容されるこの塩を含む。ある特定の実施形態では、ｎは、３である。
【０１３１】
式Ｉの化合物についての、別の具体的な実施形態では、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4のうちの、少なくとも２つは、各々、独立に、孤立電子対である。式Ｉの化合物についての、具体的な実施形態では、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4のうちの３つは、各々独立に、孤立電子対であり、残りのＸ1、Ｘ2、Ｘ3、またはＸ4は、Ｈである。
【０１３２】
本明細書で記載される放射線療法剤の金属キレート剤が式Ｉの化合物を含む具体的な実施形態では、放射線療法剤は放射性核種のカチオンをさらに含む。具体的な実施形態では、式Ｉの化合物は、約１ｐＭ〜１ｎＭ（例えば、約１〜１０ｐＭ；１〜１００ｐＭ；５〜５０ｐＭ；１００〜５００ｐＭ；または５００ｐＭ〜１ｎＭ）のＫdで、放射性核種のカチオンに結合しうる。具体的な実施形態では、Ｋdは、約１ｎＭ〜約１ｐＭの範囲にある、例えば、約１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２．５ｐＭ、２ｐＭ、または１ｐＭ以下である。本明細書で記載される放射線療法剤の金属キレート剤が式Ｉの化合物を含む具体的な実施形態では、金属キレート剤は、式ＩＩ：
【０１３３】
【化２】
2021517564.tif 000023
(II)
［式中、Ｍ1は、175Ｌｕ3+、45Ｓｃ3+、69Ｇａ3+、71Ｇａ3+、89Ｙ3+、113Ｉｎ3+、115Ｉｎ3+、139Ｌａ3+、136Ｃｅ3+、138Ｃｅ3+、140Ｃｅ3+、142Ｃｅ3+、151Ｅｕ3+、153Ｅｕ3+、159Ｔｂ3+、154Ｇｄ3+、155Ｇｄ3+、156Ｇｄ3+、157Ｇｄ3+、158Ｇｄ3+、または160Ｇｄ3+であり；Ｍ2は放射性核種のカチオンであり；Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、およびＸ4は、各々独立に、孤立電子対（すなわち、酸素アニオンをもたらす）またはＨであり；Ｘ5、Ｘ6、およびＸ7は、各々独立に、孤立電子対（すなわち、酸素アニオンをもたらす）またはＨであり；ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２である］の化合物または薬学的に許容されるこの塩を含む。ある特定の実施形態では、ｎは３である。
【０１３４】
式ＩまたはＩＩの金属キレート剤についての、具体的な実施形態では、Ｘ5、Ｘ6、およびＸ7のうちの少なくとも２つは、各々独立に、孤立電子対である。加えて、または代替的に、ビスキレートについての一部の実施形態では、放射性核種のカチオンは、二価カチオンまたは三価カチオンである。放射性核種のカチオンは、アルファ粒子放出同位元素、ベータ粒子放出同位元素、オージェ放射体、またはこれらのうちの任意の２つもしくはこれを超えるカチオンの組合せでありうる。アルファ粒子放出同位元素の例は、213Ｂｉ、211Ａｔ、225Ａｃ、152Ｄｙ、212Ｂｉ、223Ｒａ、219Ｒｎ、215Ｐｏ、211Ｂｉ、221Ｆｒ、217Ａｔ、および255Ｆｍを含むがこれらに限定されない。ベータ粒子放出同位元素の例は、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、165Ｄｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、177Ｌｕ、および67Ｃｕを含むがこれらに限定されない。オージェ放射体の例は、111Ｉｎ、67Ｇａ、51Ｃｒ、58Ｃｏ、99mＴｃ、103mＲｈ、195mＰｔ、119Ｓｂ、161Ｈｏ、189mＯｓ、192Ｉｒ、201Ｔｌ、および203Ｐｂを含む。式ＩまたはＩＩの金属キレート剤についての、一部の実施形態では、放射性核種のカチオンは68Ｇａ、227Ｔｈ、または64Ｃｕである。
【０１３５】
式ＩまたはＩＩの金属キレート剤についての、一部の実施形態では、放射性核種のカチオンは、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する。崩壊エネルギーは、オージェ放射体については６０〜２００ｋｅＶ、ベータ放射体については１００〜２，５００ｋｅＶ、およびアルファ放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲内でありうる。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、２０〜５，０００ｋｅＶ、１００〜４，０００ｋｅＶ、または５００〜２，５００ｋｅＶの範囲でありうる。有用なオージェ放射体の崩壊エネルギーは、＜１，０００ｋｅＶ、＜１００ｋｅＶ、または＜７０ｋｅＶでありうる。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、３，０００〜８，０００ｋｅＶ、または４，０００〜７，０００ｋｅＶの範囲でありうる。
【０１３６】
具体的な実施形態では、放射線療法剤の金属放射性核種はセラノスティック用の同位元素である。本明細書で使用されるセラノスティック用の同位元素は、治療（例えば、がんを処置する治療）およびイメージング（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるイメージング）を同時に目的として利用されうる、金属放射性核種である。したがって、セラノスティック用の同位元素を含む放射線療法剤は、放射線療法剤が（ｉ）標的がん細胞を死滅させ、（ｉｉ）例えば、対象における、放射線療法剤の存在、場所、および量をモニタリングし、これにより、がんの処置のモニタリングを可能とするように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてイメージングされることを可能とする。具体的な実施形態では、セラノスティック用の同位元素はβ粒子およびγ放射線の両方の放射体である。特定の理論に束縛されずに述べると、β粒子の放射は治療目的（すなわち、がん細胞を死滅させる目的）を果たし、γ放射線の放射はイメージングを目的とするγシンチグラフィーを可能とする。さらに、γ放射は、例えば、二重特異性結合因子についての治療前の線量測定、および処置のモニタリングのための、高解像度単一光子放射型コンピュータ断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）によるイメージングを可能とする（例えば、Ljungberg et al., 2016, MIRD Pamphlet No. 26: Joint EANM/MIRD Guidelines for Quantitative 177Lu SPECT Applied for Dosimetry of Radiopharmaceutical Therapy.” Journal of Nuclear Medicine, 57:151-62; Delker et al., 2016, Dosimetry for (177)Lu-DKFZ-PSMA-617: a new radiopharmaceutical for the treatment of metastatic prostate cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imagine, 43:42-51を参照されたい）。セラノスティック用の同位元素の非限定例は、177Ｌｕ、155Ｔｂ、90Ｙ、131Ｉ、166Ｈｏ、152Ｓｍ、および111Ｉｎを含む。イメージングおよび治療のために使用されうる、同位元素対の非限定例は、111Ｉｎ／90Ｙ、111Ｉｎ／225Ａｃ、124Ｉ／131Ｉ、68Ｇａ／177Ｌｕ、68Ｇａ／90Ｙ、86Ｙ／90Ｙ、64Ｃｕ／67Ｃｕを含む。このような同位元素対は、治療用同位元素と、診断用同位元素とが、金属キレート剤に対する、同様の結合特性を有するように選択される（ｓｅｌｅｔｅｃｔｅｄ）。したがって、本明細書ではまた、がんを診断または予後診断する方法であって、セラノスティック用の同位元素を含む放射線療法剤を使用して本発明のがんを治療する方法を実行し、セラノスティック用の放射性核種を用いて対象における画像を検出することを含む、前記方法も提示される。
【０１３７】
当業者に明らかである通り、放射線療法剤の金属放射性核種は、金属キレート剤に結合している場合、金属キレート剤に、好ましくは、非共有結合的に（すなわち、キレート化により）結合している。
【０１３８】
放射線療法剤を作製する方法については、例えば、Cheal et al., 2014, Preclinical evaluation of multistep targeting of diasialoganglioside GD2 using an IgG-scFv bispecific antibody with high affinity for GD2 and DOTA metal complex, Molecular Cancer Therapeutics; 13:1803-12を参照されたい。
【０１３９】
５．５  医薬組成物およびキット
本明細書の、具体的な実施形態では、治療有効量の、本明細書で記載される二重特異性結合因子（例えば、５．２節または６節を参照されたい）を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提示される。本明細書の具体的な実施形態では、治療有効量の、本明細書で記載される除去剤（例えば、５．３節および６節を参照されたい）を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提示される。本明細書の具体的な実施形態では、治療有効量の、本明細書で記載される放射線療法剤（例えば、５．４節および６節を参照されたい）を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提示される。本明細書ではまた、治療有効量の、本明細書で記載される二重特異性結合因子（例えば、５．２節または６節を参照されたい）を含む、１つもしくは複数の組成物（例えば、医薬組成物）、治療有効量の、本明細書で記載される除去剤（例えば、５．３節および６節を参照されたい）を含む、１つもしくは複数の組成物（例えば、医薬組成物）、および／または治療有効量の、本明細書で記載される放射線療法剤（例えば、５．４節および６節を参照されたい）を含む、１つもしくは複数の組成物（例えば、医薬組成物）を含むキットも提示される。組成物は、個別の単一単位剤形の調製において使用されうる。本明細書で提示される二重特異性結合因子または本明細書で提示される放射線療法剤を含む組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、もしくは胸腔内投与、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の体内区画への投与のために製剤化されうる。本明細書で提示される除去剤を含む組成物は、静脈内投与のために製剤化されうる。二重特異性結合因子を含む組成物についての、具体的な実施形態では、組成物は、腹膜転移を処置するように、腹腔内投与のために製剤化される。二重特異性結合因子を含む組成物についての、具体的な実施形態では、組成物は、髄腔内投与のために製剤化される。二重特異性結合因子を含む組成物についての、具体的な実施形態では、組成物は、脳転移を処置するように、髄腔内投与のために製剤化される。例えば、Kramer et al., 2010, 97: 409-418を参照されたい。二重特異性結合因子を含む組成物についての、具体的な実施形態では、組成物は、脳における、脳室内投与のために製剤化される。二重特異性結合因子を含む組成物についての、具体的な実施形態では、組成物は、脳転移を処置するように、脳室内投与のために製剤化される。例えば、Kramer et al., 2010, 97: 409-418を参照されたい。二重特異性結合因子を含む組成物についての、具体的な実施形態では、組成物は、脳における実質内投与のために製剤化される。二重特異性結合因子を含む組成物についての、具体的な実施形態では、組成物は、脳腫瘍または脳腫瘍転移を処置するように実質内投与のために製剤化される。例えば、Luther et al., 2014, Neuro Oncol, 16: 800-806；および臨床試験番号：ＮＣＴ０１５０２９１７号を参照されたい。二重特異性結合因子を含む組成物についての、好ましい実施形態では、組成物は、静脈内投与のために製剤化される。除去剤を含む組成物についての好ましい実施形態では、組成物は静脈内投与のために製剤化される。放射線療法剤を含む組成物についての好まし��実施形態では、組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【０１４０】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される組成物は、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤（例えば、アスコルビン酸）、アジュバント、界面活性剤、または安定化させ、凝集を防止するための、他の賦形剤（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ）などであるがこれらに限定されない、任意の適切な補助剤のうちの少なくとも１つを含む。具体的な実施形態では、薬学的に許容される補助剤が好ましい。このような滅菌溶液の非限定例、およびこれらを調製する方法は、Gennaro, Ed., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990などであるがこれらに限定されない当技術分野で周知である。本明細書で記載される、二重特異性結合因子、除去剤、または放射線療法剤の投与方式、可溶性、および／または安定性に適する薬学的に許容される担体は、規定通りに選択されうる。
具体的な実施形態では、本明細書で記載される医薬組成物は、本明細書で提示される方法（例えば、５．１節および６節を参照されたい）に従い使用されるものとする。
【０１４１】
５．５．１  キット
本明細書では、本明細書で記載される、１つもしくは複数の二重特異性結合因子、除去剤、および／もしくは放射線療法剤、または本明細書で記載される、１つもしくは複数の組成物を含むキットが提示される。具体的な実施形態では、キットは、（ｉ）パッケージング材料と、（ｉｉ）本明細書で記載される、二重特異性結合因子またはその組成物を含む、少なくとも１つのバイアル、本明細書で記載される、除去剤またはその組成物を含む、少なくとも１つのバイアル、および／または本明細書で記載される、放射線療法剤またはその組成物を含む、少なくとも１つのバイアルとを含む。具体的な実施形態では、バイアルは、本明細書で記載される、少なくとも１つの二重特異性結合因子、除去剤、もしくは放射線療法剤、またはその組成物の溶液を、処方された緩衝剤および／または保存剤と共に含むが、水性希釈剤中に含んでもよい。具体的な実施形態では、本明細書で提示される組成物は、対象へ溶液として提供される場合もあり、水、保存剤、および／または賦形剤、好ましくは、リン酸緩衝液および／もしくは生理食塩液、ならびに水性希釈剤中の、選択した塩を含有する、第２のバイアルにより復元される、凍結乾燥させられた二重特異性結合因子、除去剤、もしくは放射線療法剤、またはこれらの組成物のバイアルを含む、二重バイアルとして提供される場合もある。単一の溶液バイアル、または復元を要求する二重バイアルは、複数回にわたり再使用される場合があり、単一サイクルまたは複数サイクルにわたる対象の処置に十分であることが可能であり、このため、現在利用可能な処置レジメンより簡便な処置レジメンをもたらしうる。
【０１４２】
具体的な実施形態では、本明細書で記載される、二重特異性結合因子、除去剤、および／もしくは放射線療法剤、またはこれらの組成物を含むキットは、即時〜２４時間以上の時間にわたる投与に有用である。具体的な実施形態では、本明細書で記載される、二重特異性結合因子、除去剤、および／もしくは放射線療法剤、またはこれらの組成物を含むキットは、任意に約２℃〜約４０℃の温度で安全に保管される場合があり、薬剤の生物学的活性を長期にわたり保持するので、パッケージ表示が、溶液は６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、または９６時間以上の時間にわたり保持および／または使用されうることを表示することを可能とする。保存された希釈剤が使用される場合、このような標識は、１〜１２カ月後、半年後、１年半後、および／または２年後までの使用を含みうる。
【０１４３】
キットは、薬局、診療所、または他のこのような機関および施設へと、溶液、または水性希釈剤を含有する、第２のバイアルにより復元される、凍結乾燥させられた二重特異性結合因子、除去剤、もしくは放射線療法剤、またはこれらの組成物のバイアルを含む多重バイアルを提供することにより、５．６節に記載される対象などの対象へ間接的に提供されうる。この場合における溶液は、最大で１リットル、なおまたはより大きなサイズであることが可能であり、そこから小型のバイアルへと移すために、少なくとも１つの、二重特異性結合因子溶液、除去剤溶液、または放射線療法剤溶液の小部分が、単回または複数回にわたり取り出され、薬局または診療所により、それらの顧客および／または患者へと提供される、大型のレザバーをもたらす。
【０１４４】
これらの単一バイアルシステムを含む、認知されたデバイスは、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．，）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｂｉｏｊｅｃｔ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、Ｏｒｅｇ．）；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ  Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）により、製造または開発されている、ＢＤ  Ｐｅｎｓ、ＢＤ  Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）など、溶液を送達するための、ペン型インジェクターデバイスを含む。二重バイアルシステムを含む、認知されたデバイスは、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（登録商標）など、復元された溶液を送達するために、凍結乾燥させられた薬物をカートリッジ内で復元するための、ペン型インジェクターシステムを含む。
【０１４５】
具体的な実施形態では、キットは、パッケージング材料を含む。具体的な実施形態では、パッケージング材料は、規制機関により要求される情報に加えて、製品が使用されうる条件も提示する。具体的な実施形態では、パッケージング材料は、多重バイアルによる、湿潤／乾燥製品について、少なくとも１つの、二重特異性結合因子、除去剤、および／または放射線療法剤を、水性希釈剤中で復元して、溶液を形成し、溶液を、２〜２４時間以上の時間にわたり使用するように、対象への指示を提示する。単一バイアルの溶液製品では、標識は、このような溶液が、２〜２４時間以上の時間にわたり使用されうることを指し示す。好ましい実施形態では、キットは、ヒト用医薬としての使用に有用である。具体的な実施形態では、キットは、獣医科用医薬としての使用に有用である。好ましい実施形態では、キットはイヌ用医薬としての使用に有用である。好ましい実施形態では、キットは静脈内投与に有用である。別の好ましい実施形態では、キットは、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与、髄腔内投与、脳室内投与、または実質内投与に有用である。
【０１４６】
５．６  患者集団
本明細書で提示される方法に従い処置される対象は、齧歯動物、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、霊長動物、またはヒトなど、任意の哺乳動物でありうる。具体的な実施形態では対象はイヌである。好ましい実施形態では対象はヒトである。
【０１４７】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される方法に従い処置される対象は、がんを伴うと診断されている。がんの非限定例は、膀胱がん、脳がん、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、子宮頸がん、腎明細胞がん、結腸がん、結腸癌、結腸直腸がん、線維形成性小円形細胞がん、子宮内膜がん、上皮腫瘍（例えば、乳腺腫瘍、消化管腫瘍）、食道がん、ユーイング肉腫、胃がん、胃接合部腺癌、胃食道接合部腺癌、神経膠芽腫（例えば、多形性神経膠芽腫）、神経膠腫、婦人科悪性腫瘍、頭頸部がん、肝細胞癌、白血病、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、非小細胞肺がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、小細胞肺がん、軟部組織肉腫、頭頸部扁平上皮癌、大半の新生物（例えば、とりわけ、結腸直腸新生物、膵臓新生物）の支質のがん、血管系と関連する腫瘍、パピローマウイルスと関連する腫瘍、尿路上皮がん、腫瘍関連血管新生のマーカーとしての、多種多様ながん、ウィルムス腫瘍、他のがん幹細胞、および浸潤性上皮腫瘍、および血管系と関連するがん（例えば、表１を参照されたい）を含む。具体的な実施形態では、がんは、転移性がんである。具体的な実施形態では、転移性がんは腹膜転移がんを含む。
【０１４８】
当業者は、本明細書で提示される方法に従い、本明細書で記載される二重特異性結合因子により処置されるがんが、がんを処置する方法において使用される二重特異性結合因子の第１の標的を指示することを理解するであろう。例えば、処置されるがんがＨＥＲ２を発現するがんである場合、ＨＥＲ２を発現するがんを処置する方法において使用される二重特異性結合因子は、ＨＥＲ２（すなわち、前記二重特異性結合因子の第１の標的）に特異的に結合する第１の結合性部位を含む。言い換えれば、本明細書で提示される方法に従い処置されるがんは、二重特異性結合因子の第１の標的であるがん抗原を発現する。
【０１４９】
好ましい実施形態では、二重特異性結合因子の第１の標的はＨＥＲ２であり、本明細書で記載される方法に従い処置される対象は、ＨＥＲ２を発現するがん（例えば、乳がん、胃がん、骨肉腫、線維形成性小円形細胞がん、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、多形性神経膠芽腫、胃接合部腺癌、胃食道接合部腺癌、子宮頸がん、唾液腺がん、軟部組織肉腫、白血病、黒色腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、またはＨＥＲ２受容体を発現する、他の任意の新生物性組織）を伴うと診断されている。ＨＥＲ２発現がんの処置についての具体的な実施形態では、対象は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ラパチニブ、エルロチニブ、または受容体のＨＥＲファミリーをターゲティングする、他の任意の低分子もしくは抗体による処置に対して耐性である。具体的な実施形態では、トラスツズマブ、セツキシマブ、ラパチニブ、エルロチニブ、または受容体のＨＥＲファミリーをターゲティングする、他の任意の低分子もしくは抗体による処置に対して耐性であるがんは、本発明の、がんを処置する方法（例えば、５．１節および６節を参照されたい）に対して応答性である。
【０１５０】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される方法に従い処置される対象は、転移性疾患のための、１つまたは複数の化学療法レジメン、例えば、脳転移または腹膜転移のための、１つまたは複数の化学療法レジメンをかつて施されたことがある。具体的な実施形態では、対象は、転移性疾患のための処置をいまだ施されたことがない。
【０１５１】
５．７  用量、投与経路、およびレジメン
具体的な実施形態では、本明細書で提示される方法（例えば、５．１節を参照されたい）に従い、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量は、対象の必要により決定される用量である。具体的な実施形態では、用量は、対象の必要に従い、医師により決定される。
【０１５２】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される、がんを処置する方法に従い、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量は、対象のがん細胞上の、がん抗原（すなわち、二重特異性結合因子の第１の標的であるがん抗原）の濃度、および／または前記がん細胞による、二重特異性結合因子の取込みの程度に基づき決定される。具体的な実施形態では、取込みの程度は、実験室状況および臨床状況のいずれについても、セラノスティック法により確認され、生検またはｅｘ  ｖｉｖｏにおける組織カウンティングにより確認されるであろう。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、質量作用の法則（例えば、O’Donoghue et al., 2011, 124I-huA33 antibody uptake is driven by A33 antigen concentration in tissues from colorectal cancer patients imaged by immune-PET. J. Nucl. Med.; 52(12):1878-85；および６．３節を参照されたい）を使用して、６．３節で記載される、動物モデル研究における結果に基づき決定される。特定の理論に束縛されずに述べると、がん抗原の準飽和は、最大量の放射線療法剤が対象におけるがん細胞に結合している二重特異性結合因子に結合することを可能とし、したがって、治療有効性をもたらし、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるイメージング結果を可能とするため、二特異性薬剤の治療有効量は、好ましくは、がん細胞上の標的がん抗原（すなわち、二重特異性結合因子の第１の標的）の、結合能の飽和（例えば、５０〜９０％の範囲の飽和）に近接するのに十分な二重特異性結合因子をもたらす量である。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、質量作用の法則に従う、がん細胞上の二重特異性結合因子による、がん抗原の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の飽和を達成すると推定される量である。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、質量作用の法則に従う、がん細胞上の二重特異性結合因子による、がん抗原の６０％〜１００％の間、７０％〜９９％の間、７０％〜９５％の間、７０％〜９０％の間、７５％〜８５％の間、８０％〜９０％の間の飽和を達成すると推定される量である。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、質量作用の法則に従う、がん細胞上の二重特異性結合因子による、がん抗原の約８０％の飽和を達成すると推定される量である。
【０１５３】
二重特異性結合因子の第１の標的がＨＥＲ２である具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の用量は、米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）により承認された、対象のがんのための、トラスツズマブの用量未満である。例えば、Trastuzumab [Highlights of Prescribing Information], South San Francisco, CA: Genentech, Inc.; 2014を参照されたい。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、ＦＤＡにより承認された、トラスツズマブの用量より、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％少ない。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇであり、対象はヒトである。治療有効量との関連で使用される場合の「約」とは、列挙された量から、１％、３％、５％、または１０％以内の量を指す。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、２５０ｍｇ〜７００ｍｇ、３００ｍｇ〜６００ｍｇ、または４００ｍｇ〜５００ｍｇであり、対象はヒトである。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の治療有効量は、１．０ｍｇ／ｋｇ〜８．０ｍｇ／ｋｇの間、２．０ｍｇ／ｋｇ〜７．０ｍｇ／ｋｇの間、３．０ｍｇ／ｋｇ〜６．５ｍｇ／ｋｇの間、４．０ｍｇ／ｋｇ〜６．５ｍｇ／ｋｇの間、または５．０ｍｇ／ｋｇ〜６．５ｍｇ／ｋｇの間である。
【０１５４】
具体的な実施形態では、治療有効量の二重特異性結合因子は３０分間にわたる静脈内注入を介して投与される。具体的な実施形態では、治療有効量の二重特異性結合因子は、３０〜９０分間にわたる静脈内注入を介して投与される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の一部の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、結合剤は対象へ静脈内投与される。
【０１５５】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される方法に従い、対象へ投与される除去剤の治療有効量は、対象の必要により決定される量である。当業者は、除去剤の治療有効量が、除去剤の構造、二重特異性結合因子の構造、および／または対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量に依存することを理解するであろう。具体的な実施形態では、除去剤の治療有効量は、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量に比例する。除去剤が、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの（ＹまたはＬｕ）ＤＯＴＡ−Ｂｎ分子、約１００〜１５０個を含む、具体的な実施形態では、除去剤の治療有効量は、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量を、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対して、１０：１のモル比とする量である。言い換えれば、具体的な実施形態では、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量は、対象へ投与される除去剤の治療有効量の、１０倍モル過剰量である量である。例えば、対象へ投与される、０．４７６マイクロモルである分子量２１０ｋＤａの二重特異性結合因子１００ｍｇにつき、０．０５マイクロモルである分子量５００ｋＤａの除去剤２５ｍｇが対象へ投与される。二重特異性結合因子が、配列番号１５の重鎖、および配列番号７の軽鎖融合ポリペプチドを含み、除去剤がアミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの（ＹまたはＬｕ）ＤＯＴＡ−Ｂｎ分子約１００〜１５０個を含む具体的な実施形態では、対象へ投与される二重特異性結合因子１００ｍｇにつき、１５ｍｇ〜３５ｍｇの間、２０ｍｇ〜３５ｍｇの間、または２０ｍｇ〜３０ｍｇの間の除去剤が対象へ投与される。
【０１５６】
具体的な実施形態では、除去剤の治療有効量は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である。二重特異性結合因子の血清濃度の低減パーセントを決定するための当業者に公知の方法は、当技術分野で公知の方法、例えば、除去剤の投与の前後における、血清試料に対するＥＬＩＳＡである。
好ましい実施形態では、除去剤は対象へ静脈内投与される。
【０１５７】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される方法に従い、対象へ投与される放射線療法剤の治療有効量は、対象の必要により決定される量である。当業者は、放射線療法剤の治療有効量が放射線療法剤の金属放射性核種のアイデンティティーに依存することを理解するであろう。例えば、放射線療法剤の金属放射性核種が、177Ｌｕまたは同等なβ放射体である、具体的な実施形態では、放射線療法剤の治療有効量は、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間である。放射線療法剤の金属放射性核種が、177Ｌｕまたは同等なβ放射体である、別の具体的な実施形態では、放射線療法剤の治療有効量は５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間である。
【０１５８】
具体的な実施形態では、放射線療法剤の治療有効量は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、放射線療法剤は対象へ静脈内投与される。
【０１５９】
本明細書で提示される、がんを処置する方法はまた、マルチサイクルの処置レジメンの一部も形成しうる。例えば、本明細書で提示される、がんを処置する方法は、２、３回以上にわたり同じ対象に対して繰り返されうる。具体的な実施形態では、本明細書で提示される、がんを処置する方法は、２回にわたり同じ対象に対して繰り返される。例えば、具体的な実施形態では、５．１節で記載されるがんを処置する方法は、（ｄ）対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）の１日間以内、２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、または１週間以内に、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ；（ｅ）対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｄ）の後で、対象へ第２の治療有効量の除去剤を投与するステップ；および（ｆ）対象へ第２の治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｅ）の後で、対象へ第２の治療有効量の放射線療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｅ）は、対象へ第１の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｄ）の１２時間以内に行われる。具体的な実施形態では、本明細書で提示される、がんを処置する方法は、３回にわたり同じ対象に対して繰り返される。例えば、具体的な実施形態では、５．１節で記載されるがんを処置する方法は、（ｄ）対象へ治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ（ｃ）の１日間以内、２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、または１週間以内に、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ；（ｅ）対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｄ）の後で、対象へ第２の治療有効量の除去剤を投与するステップ；（ｆ）対象へ第２の治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｅ）の後で、対象へ第２の治療有効量の放射線療法剤を投与するステップ；（ｇ）対象へ第２の治療有効量の放射線療法を投与するステップ（ｆ）の１日間以内、２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、または１週間以内に、対象へ第３の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ；（ｈ）対象へ第３の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｇ）の後で、対象へ第３の治療有効量の除去剤を投与するステップ；および（ｉ）対象へ第３の治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｈ）の後で、対象へ第３の治療有効量の放射線療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｅ）は、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｄ）の１２時間以内に行われる。具体的な実施形態では、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｇ）は、対象へ第２の治療有効量の二重特異性結合因子を投与するステップ（ｇ）の１２時間以内に行われる。
【０１６０】
本明細書で提示される、がんを処置するマルチサイクル法における、二重特異性結合因子の第２の治療有効量および／または第３の治療有効量は、ステップ（ａ）において対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量と比較して、同じ治療有効量の場合もあり、異なる治療有効量の場合もある。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第２の治療有効量は、ステップ（ａ）において対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量と同じである。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第２の治療有効量は、ステップ（ａ）において対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量未満である。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第２の治療有効量は、ステップ（ａ）において対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量を超える。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第３の治療有効量は、ステップ（ａ）において対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量と同じである。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第３の治療有効量は、ステップ（ａ）において対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量未満である。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第３の治療有効量は、ステップ（ａ）において対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量を超える。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第２の治療有効量は、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇである。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子の第３の治療有効量は、１００ｍｇ〜７００ｍｇ、２００ｍｇ〜６００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、または約６２５ｍｇである。具体的な実施形態では、第２の治療有効量の二重特異性結合因子は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、第２の治療有効量の二重特異性結合因子は対象へ静脈内投与される。具体的な実施形態では、第３の治療有効量の二重特異性結合因子は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、第３の治療有効量の二重特異性結合因子は対象へ静脈内投与される。
【０１６１】
本明細書で提示される、がんを処置するマルチサイクル法における、除去剤の第２の治療有効量および／または第３の治療有効量は、ステップ（ｂ）において対象へ投与される、除去剤の治療有効量と比較して、同じ治療有効量の場合もあり、異なる治療有効量の場合もある。具体的な実施形態では、除去剤の第２の治療有効量は、ステップ（ｂ）において、対象へ投与される除去剤の治療有効量と同じである。具体的な実施形態では、除去剤の第２の治療有効量は、ステップ（ｂ）において対象へと投与される除去剤の治療有効量未満である。具体的な実施形態では、除去剤の第２の治療有効量は、ステップ（ｂ）において対象へ投与される除去剤の治療有効量を超える。具体的な実施形態では、除去剤の第３の治療有効量は、ステップ（ｂ）において対象へ投与される除去剤の治療有効量と同じである。具体的な実施形態では、除去剤の第３の治療有効量は、ステップ（ｂ）において対象へ投与される除去剤の治療有効量未満である。具体的な実施形態では、除去剤の第３の治療有効量は、ステップ（ｂ）において対象へ投与される除去剤の治療有効量を超える。具体的な実施形態では、除去剤の第２の治療有効量は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である。除去剤がアミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの（Ｙ）ＤＯＴＡ−Ｂｎ分子、約１００〜１５０個を含む具体的な実施形態では、除去剤の第２の治療有効量は、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量の、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対する、１０：１のモル比をもたらす量である。具体的な実施形態では、除去剤の第３の治療有効量は、対象へ治療有効量の除去剤を投与するステップ（ｂ）の１時間、２時間、３時間、または４時間後における二重特異性結合因子の血清濃度の、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の低減をもたらす量である。除去剤が、アミノデキストラン５００ｋＤａ当たりの（Ｙ）ＤＯＴＡ−Ｂｎ分子、約１００〜１５０個を含む、具体的な実施形態では、除去剤の第３の治療有効量は、対象へ投与される二重特異性結合因子の治療有効量の、対象へ投与される除去剤の治療有効量に対する、１０：１のモル比をもたらす量である。好ましい実施形態では、第２の治療有効量の除去剤は対象へ静脈内投与される。好ましい実施形態では、第３の治療有効量の除去剤は対象へ静脈内投与される。
【０１６２】
本明細書で提示される、がんを処置する、マルチサイクル法における、放射線療法剤の、第２の治療有効量および／または第３の治療有効量は、ステップ（ｃ）において対象へ投与され、放射線療法剤の治療有効量と比較して、同じ治療有効量の場合もあり、異なる治療有効量の場合もある。具体的な実施形態では、放射線療法剤の第２の治療有効量は、ステップ（ｃ）において対象へ投与される放射線療法剤の治療有効量と同じである。具体的な実施形態では、放射線療法剤の第２の治療有効量は、ステップ（ｃ）において対象へ投与される放射線療法剤の治療有効量未満である。具体的な実施形態では、放射線療法剤の第２の治療有効量は、ステップ（ｃ）において対象へ投与される放射線療法剤の治療有効量を超える。具体的な実施形態では、放射線療法剤の第３の治療有効量は、ステップ（ｃ）において対象へ投与される放射線療法剤の治療有効量と同じである。具体的な実施形態では、放射線療法剤の第３の治療有効量は、ステップ（ｃ）において対象へ投与される放射線療法剤の治療有効量未満である。具体的な実施形態では、放射線療法剤の第３の治療有効量は、ステップ（ｃ）において対象へ投与され放射線療法剤の治療有効量を超える。具体的な実施形態では、放射線療法剤の、第２の治療有効量は、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間である。具体的な実施形態では、放射線療法剤の、第３の治療有効量は、２５ｍＣｉ〜２５０ｍＣｉの間、５０ｍＣｉ〜２００ｍＣｉの間、７５ｍＣｉ〜１７５ｍＣｉの間、または１００ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉの間である。具体的な実施形態では、第２の治療有効量の放射線療法剤は、対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、第２の治療有効量の放射線療法剤は対象へ静脈内投与される。具体的な実施形態では、第３の治療有効量の放射線療法剤は対象へ静脈内投与、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、腹腔内投与、胸腔内投与されるか、または髄腔内投与、脳室内投与、もしくは実質内投与など、他の任意の体内区画へと投与される。好ましい実施形態では、第３の治療有効量の放射線療法剤は対象へ静脈内投与される。
【０１６３】
５．８  組合せ療法
具体的な実施形態では、本明細書で提示される二重特異性結合因子は、１つまたは複数の、さらなる薬学的に活性の薬剤、例えば、がん用化学療法剤と組み合わせて投与されうる。具体的な実施形態では、このような組合せ療法は、処置の個別の構成要素の、同時的投与、逐次的投与、または個別投与により達成されうる。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子と、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤とは、構成要素の一方または両方の用量が単剤療法として施されるいずれかの構成要素の用量と比較して低減されうるように、相乗的でありうる。代替的に、具体的な実施形態では、二重特異性結合因子と、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤とは、二重特異性結合因子の用量と、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤の用量とが、単剤療法として施されるいずれかの構成要素の用量と同等であるか、または類似であるように、相加的でありうる。
【０１６４】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される二重特異性結合因子は、１つまたは複数の、さらなる薬学的に活性の薬剤と同じ日に投与される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間前に投与される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間後に投与される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤の、１、２、３日以上前に投与される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤の、１、２、３日以上後に投与される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤の、１、２、３、４、５、または６週間前に投与される。具体的な実施形態では、二重特異性結合因子は、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤の、１、２、３、４、５、または６週間後に投与される。
【０１６５】
がんが、乳がんである、具体的な実施形態では、さらなる薬学的に活性の薬剤は、ドキソルビシンである。がんが、乳がんである、具体的な実施形態では、さらなる薬学的に活性の薬剤は、シクロホスファミドである。がんが乳がんである具体的な実施形態では、さらなる、薬学的に活性の薬剤はパクリタキセルである。がんが乳がんである具体的な実施形態では、さらなる薬学的に活性の薬剤はドセタキセルである。がんが乳がんである具体的な実施形態では、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性の薬剤はカルボプラチンである。
【０１６６】
具体的な実施形態では、さらなる薬学的に活性の薬剤は、腫瘍細胞の細胞死、アポトーシス、オートファジー、または壊死を増大させる薬剤である。
具体的な実施形態では、本明細書で提示される二重特異性結合因子は、２つのさらなる薬学的に活性の薬剤と組み合わせて、例えば、ＨＥＲ２を発現するがんのために、トラスツズマブと組み合わせて使用される、２つのさらなる薬学的に活性の薬剤と組み合わせて投与される（Trastuzumab [Highlights of Prescribing Information]. South San Francisco, CA: Genentech, Inc.; 2014を参照されたい）。がんがＨＥＲ２を発現するがんである具体的な実施形態では、２つのさらなる薬学的に活性の薬剤は、ドキソルビシンおよびパクリタキセルである。がんがＨＥＲ２を発現するがんである具体的な実施形態では、２つの、さらなる薬学的に活性の薬剤は、ドキソルビシンおよびドセタキセルである。がんがＨＥＲ２を発現するがんである具体的な実施形態では、２つのさらなる薬学的に活性の薬剤は、シクロホスファミドおよびパクリタキセルである。がんがＨＥＲ２を発現するがんである具体的な実施形態では、２つのさらなる薬学的に活性の薬剤は、シクロホスファミドおよびドセタキセルである。がんがＨＥＲ２を発現するがんである具体的な実施形態では、２つのさらなる薬学的に活性の薬剤は、ドセタキセルおよびカルボプラチンである。がんがＨＥＲ２を発現するがんである具体的な実施形態では、２つのさらなる薬学的に活性の薬剤は、シスプラチンおよびカペシタビンである。がんがＨＥＲ２を発現するがんである具体的な実施形態では、２つのさらなる薬学的に活性の薬剤はシスプラチンおよび５−フルオロウラシルである。
【０１６７】
具体的な実施形態では、本明細書で提示される二重特異性結合因子は、マルチモダリティーの、アントラサイクリンベースの治療の後に投与される。
具体的な実施形態では、本明細書で提示される二重特異性結合因子は、転移性疾患のための、１つまたは複数の化学療法レジメン、例えば、脳転移または腹膜転移のための、１つまたは複数の化学療法レジメンの後で投与される。具体的な実施形態では、本明細書で提示される二重特異性結合因子は、腫瘍縮小化学療法と組み合わせて投与される。具体的な実施形態では、投与は、腫瘍縮小化学療法による対象の処置の後で実施される。
【０１６８】
がんが、ＨＥＲ２を発現するがんである具体的な実施形態では、さらなる薬学的に活性の薬剤は、例えば、体外照射または放射免疫療法など、細胞によるＨＥＲ２発現を増大させる薬剤である。例えば、Wattenberg et al., 2014, British Journal of Cancer, 110: 1472を参照されたい。具体的な実施形態では、さらなる薬学的に活性の薬剤は、ＨＥＲ２シグナル伝達経路を直接制御する薬剤、例えば、ラパチニブである。例えば、Scaltiri et al., 2012, 28(6): 803-814を参照されたい。
【実施例】
【０１６９】
６．例
（実施例１）
６．１  内在化充実性腫瘍抗原に対する、セラノスティック用抗ＤＯＴＡハプテン二特異性抗体によるプレターゲティング型放射免疫療法の前臨床モデル：ＨＥＲ２陽性乳癌に対する治癒的処置
本実施例で引用される参考文献は、カッコ内の番号により同定される。対応する引用文献は、６．１．５節に提示される。
【０１７０】
６．１．１  導入
治療用放射性同位元素（すなわち、放射免疫療法；ＲＩＴ）の担体としての、フルサイズのＩｇＧモノクローナル抗体の薬物動態は、典型的に、放射免疫療法（「ＲＩＴ」）について、線量制限的な、血液毒性と共に、望ましくない治療指数（「ＴＩ」；本明細書では、血液などの放射線感受性組織への線量で除された、腫瘍への放射線吸収線量の比［１］として規定される）を示す。代替的に、循環中のリガンドの滞留時間を短縮するために、抗体に媒介されるターゲティングステップを、細胞傷害性リガンドを投与するステップから分離する、プレターゲティング型ＲＩＴ（「ＰＲＩＴ」）戦略が、利用されうる［２］。
【０１７１】
炭水化物標的（ヒト神経芽細胞腫異種移植片上のジアシアロガングリオシド（ｄｉａｓｉａｌｏｇａｎｇｉｏｓｉｄｅ）であるＧＤ２［３］）または糖タンパク質標的（ヒト結腸がん異種移植片上のＧＰＡ３３［４］）についての、ヒト癌腫異種移植片による前臨床動物モデルにおける治癒であって、マウス１匹当たりの全注射放射能（「ＩＡ」）を約３０〜１１１ＭＢｑとする177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎによる処置の後における毒性が無視できるものである治癒により、プレターゲティング型「ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ」プラットフォームを使用する、高ＴＩターゲティングが裏付けられている。ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴに関しては、近年もまた、前臨床における、ＣＤ２０（＋）ヒトリンパ腫異種移植片について、全ＩＡを２６〜３７ＭＢｑとする90Ｙ−ＤＯＴＡ−ビオチン  Ｃ８２５−ハプテン［５］による、治癒を伴う高ＴＩターゲティングが裏付けられた。
【０１７２】
ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴでは、腫瘍抗原に対する、１つの特異性と、低分子量のキレート剤であるＳ−２−（４−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸の放射性金属錯体（例えば、β放射体である、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎとしての「［Ｍ］−ＤＯＴＡ−Ｂｎ」［６］）などのハプテンに対する第２の特異性とを伴う、非放射性二重特異性結合因子（例えば、二特異性抗体（「ＢｓＡｂ」））を使用しうる。腫瘍による十分な取込み、および結合していないＢｓＡｂのクリアランス（除去剤（「ＣＡ」）により加速化される）の後、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを投与するが、これは、腫瘍局在化ＢｓＡｂにより捕捉されるか、そうでなければ、腎臓により、体内から急速に除去される。本実施例では、極めて広域なスペクトルのヒトがんにおいて発現するが、エンドサイトーシスを受けやすく、他の一般に研究されるＰＲＩＴ標的とは異なる、固有の特性を伴う抗原である、ＨＥＲ２を使用して、ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴプラットフォームの変動について調べた。そのペイロードの送達のために、細胞表面受容体への結合、ならびに細胞への結合時における内在化に依拠する抗体−薬物コンジュゲートと異なり、非内在化抗体／細胞表面標的はＰＲＩＴに最適であると考えられる。具体的に、ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴでは、静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与された非放射性ＢｓＡｂは、腫瘍に蓄積され、続いて投与される放射性標識ハプテン（例えば、放射性標識されたＤＯＴＡ−Ｂｎ）のための受容体として用いられる。特定の理論に束縛されずに述べると、かつては、腫瘍表面において、ＢｓＡｂの広範な内在化が生じる場合、ハプテンターゲティングステップの効率に対して著明な影響が及びうると仮定された。
【０１７３】
抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、内在化抗体の例である［７］。ＨＥＲ２（膜貫通チロシンキナーゼ受容体ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２；分子量（ＭＷ）：１８５ｋＤ）は、細胞表面受容体の、ＨＥＲ／ｅｒｂＢファミリーのメンバーであり、高ＨＥＲ２発現は、乳がん［８］、胃がん［９］、および婦人科悪性腫瘍［１０］を含む、いくつかのがん型における生存について予後診断的である。トラスツズマブは、ＨＥＲ２陽性（「ＨＥＲ２（＋）」）疾患を伴う乳がん患者または卵巣がん患者における生存を延長しうる［１１、１２］。残念ながら、トラスツズマブに対する初期応答にもかかわらず、耐性は一般的である［１３］。トラスツズマブの有効性を増強するために、細胞毒素［１４］または治療的放射性核種［１５］の、抗体ベースの送達が試みられている。また、トラスツズマブ−放射性同位元素コンジュゲートによる、いくつかの前臨床ＲＩＴ研究についても記載されている（例えば、α放射体を伴う研究［１６〜２３］またはβ放射体を伴う研究［２４〜２８］）が、特定の理論に束縛されずに述べると、ＰＲＩＴ法によりＴＩを改善しうる可能性があることが仮定される。
【０１７４】
本実施例では、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴのために、同時的な治療およびイメージングを可能とする、セラノスティック用の同位元素を組み入れた。177Ｌｕは、６．７３日間（「ｄ」）の物理的半減期を有し、β粒子およびγ放射線の両方の放射体（β最大エネルギー：０．５ＭｅＶ；組織内のβ粒子範囲であるＲｍａｘ：２ｍｍ；γ：２０８ｋｅＶ、１１％の存在度）であり、治療およびγシンチグラフィーのそれぞれを可能とする。腫瘍内のＧＤ２およびＧＰＡ３３に対してプレターゲティングされた177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの生物学的貯留動態は、177Ｌｕの長い物理的半減期と良好に適合し、その比較的短いβ粒子範囲は、付随する正常組織への放射線損傷を最小化しながら小さな体積の腫瘍の処置に理論的によく適する（治癒確率を０．９とするのに最適の腫瘍直径＝２．０ｍｍ［２９］）ので、177Ｌｕは充実性腫瘍に対するＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置についての本実施例における取組みの焦点であった。最後に、177Ｌｕのγ放射は、177Ｌｕ放射性医薬品によるターゲティング療法のための定量的臨床イメージングモダリティーとして新たに出現しつつある、療前線量測定ならびに処置モニタリングのための、高解像度単一光子放射型コンピュータ断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）によるイメージングを可能とする［３０、３１］。
【０１７５】
本実施例における目的は、（１）抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによる概念実証研究を可能とする、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂを作製すること、（２）抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂ／ＨＥＲ２抗原複合体の、ＨＥＲ２（＋）腫瘍細胞表面における内在化動態を特徴づけること、（３）抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによる、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの、高度に特異的な腫瘍ターゲティングを裏付けること、および（４）ＴＩが、確立された、皮下（「ｓ．ｃ．」）ヒトＨＥＲ２（＋）乳癌異種移植片を保有するマウスにおける、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴの、安全かつ有効なセラノスティック適用に十分であったのかどうかを調べることであった。
【０１７６】
６．１．２  材料および方法
６．１．２．１  抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂのクローニングおよび発現
二重特異性結合因子である「ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂ」は、トラスツズマブ［３７］およびマウスＣ８２５［３８］の配列を使用する、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ［３６］フォーマットとして調製した。ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂ（本明細書ではまた、場合によって、「抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５」とも称する）の重鎖は配列番号１５のアミノ酸を含み、ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂの軽鎖融合ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を含む。既に記載されている［３］通り、ＢｓＡｂ（分子量：約２１０ｋＤａ）は、ＣＨＯ細胞内で作製し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。対照のＢｓＡｂであるｈｕＡ３３−Ｃ８２５は、既に記載されている［４］プラットフォームと、同じプラットフォームを使用して作った。ＢｓＡｂについての生化学的純度解析は、溶出させたＢｓＡｂを２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度により検出する、ＳＥ−ＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌ；ランニング緩衝液：４００ｍＭの過塩素酸ナトリウムｐＨ６．０；流量：０．５ｍＬ／分）を使用して実施した。
【０１７７】
６．１．２．２  表面プラズモン共鳴研究
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒの、ＣＭ５センサーチップ、および関連の試薬は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。ＢＳＡ−（Ｙ）−ＤＯＴＡ−Ｂｎコンジュゲートは、既に記載されている［３］通りに調製した。抗原は、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して固定化させた。精製されたＢｓＡｂを解析し、既に記載されている［３］通りに、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、データを、Ｂｉｖａｌｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｅモデルに当てはめた。
【０１７８】
６．１．２．３  細胞系
ＢＴ−４７４が、上皮形状を伴い、ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ亜型、エストロゲン受容体α陽性（「ＥＲ（＋）」）、プロゲステロン陽性／陰性（「ＰＲ（＋／−）」）、ＨＥＲ２（＋）である、乳管癌であるのに対しＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、上皮形状を伴い、ｃｌａｕｄｉｎ−ｌｏｗ亜型であり、トリプルネガティブの免疫プロファイル（ＥＲ（−）、ＰＲ（−）、およびＨＥＲ２（−））を有する、腺癌細胞系である［３９］。細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得、市販のキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマ陰性について定期的に調べた。全ての細胞系は、３７℃にて５％ＣＯ2を含有する加湿型インキュベーター内で継代１０代未満に限定し、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル高グルコース／Ｆ−１２（ＤＭＥ−ＨＧ／Ｆ−１２）培地中で培養して維持した。
【０１７９】
６．１．２．４  抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の内在化および細胞内プロセシング
トラスツズマブは、表面ＨＥＲ２抗原に結合すると内在化することが公知である［７］。既に記載されているアッセイ［７、４０］に基づき、放射性トレーサーである、131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５を使用して、３７℃で、ＢＴ−４７４細胞表面ＨＥＲ２抗原に結合した後における、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の内在化動態について評価した。略述すると、細胞を、１ｍＬ当たりの細胞５．０×１０5個の密度で１２ウェルプレートに播種し、一晩にわたり接着させた。細胞を、氷上で、131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５（ＩＯＤＯＧＥＮ法［４１］を使用して、１３２ＭＢｑ／ｍｇの比放射能へ調製し、ＳＥＣを使用して、＞９８％の放射化学純度へと精製し、完全培地中で、１６０ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎＭへと希釈した）と共に１時間にわたりプレインキュベートした。次に、細胞を、完全培地で十分に洗浄し、氷上で冷やし、プレートを３７℃のインキュベーターに入れた。２４時間後までの多様な時点において、ガンマカウンターにおける定量により、外部培地、細胞表面における放射能分布、ならびに細胞により内在化された放射能画分を決定した（時点１つ当たりのｎ＝３〜６）。細胞を、氷上で５分間（ｍｉｎ）ずつ、３回にわたり、２Ｍの尿素、５０ｍＭのグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．４により処理するステップと、上清をプールするステップとからなる、酸洗浄プロトコールを使用して細胞表面抗体を剥離させた。131Ｉ放射能が、抗体に結合していた（受動的解離または「剥落」［４０］を示唆する）のか、エクソサイトーシスに続く細胞内代謝を示唆する低分子量代謝物の形態にあったのかを決定するように、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿（回収された培地約１ｍＬを、２０質量／容量％のＴＣＡ  ０．９ｍＬと混合した）をさらに使用して、外部培地についてアッセイした。対照は、４℃におけるインキュベーション、または培地へと希釈された、131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５だけからなるウェルから構成された。これらの対照ウェルはまた、それぞれ、内在化を阻害し、トレーサーの基礎異化（分解を介する）速度を決定するためにも、ＴＣＡ沈殿にかけた。動態解析のために、Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡを使用して、データを、非線形モデルを使用する、単相会合による曲線に当てはめた。
【０１８０】
６．１．２．５  異種移植モデル
全ての動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）により承認され、調査研究における、動物の、適正かつ人道的な使用についての規制ガイドラインに従った。雌無胸腺ヌードマウス（６〜８週齢）は、Ｈａｒｌａｎ／Ｅｎｖｉｇｏから得た。マウスを、最低１週間にわたり馴致した。ＢＴ−４７４腫瘍モデルのために、細胞を接種する３日（ｄ）前に、トロカール注射により、マウスに、エストロゲン（１７β−エストラジオール；６０日間放出分である、ペレット１つ当たり０．７２ｍｇ；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を植え込んだ。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルには、エストロゲンの補充を要求しなかった。全ての腫瘍異種移植の確立のために、マウスの下脇腹に、皮下注射を介して、培地の、再構成された基底膜（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）との１：１混合物による、２００μＬの細胞懸濁液中の細胞５．０×１０6個を接種し、３〜４週間以内に使用した。腫瘍体積は、楕円体の体積（Ｖ）についての公式：寸法を、ミリメートル（ｍｍ）単位として、Ｖ＝４／３π（長さ／２×幅／２×高さ／２）を使用して推定した。
【０１８１】
６．１．２．６  抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ試薬および投与プロトコール
３つの抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ試薬は、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂ、除去剤、および放射線療法剤である、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎであった。全ての試薬は、外側尾静脈を介して静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与し、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射に照らした、以下の時点：抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５についての、［ｔ＝−２８時間（ｈ）後］に続く、［ｔ＝−４時間後］における除去剤、および［ｔ＝０時間後］における、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎにおいて施した。除去剤（５００ｋＤａのデキストラン−（Ｙ）−ＤＯＴＡ−Ｂｎコンジュゲート；デキストラン１モル当たり６１モルの（Ｙ）−ＤＯＴＡ−Ｂｎ）は、既に記載されている方法［４２］に従い調製し、注射用に、生理食塩液中で製剤化した。177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎもまた、既に記載されている方法［４］に従い調製した。試料中の放射能は、各同位元素に適切な設定を使用する、ＣＲＣ−１５Ｒ線量較正器（Ｃａｐｉｎｔｅｃ、Ｒａｍｓｅｙ、ＮＪ）を使用して測定した。
【０１８２】
６．１．２．７  ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴを最適化するための、生体内分布研究
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける効率的な腫瘍ターゲティングのための、ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ試薬用量を最適化するように、マウス１匹当たり５．６ＭＢｑ（約３０ｐｍｏｌ）の177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの放射能をトレーサーと共に投与されたＢＴ−４７４腫瘍保有マウスの群において、治療研究の前に、ＢｓＡｂおよび除去剤についての用量滴定実験を行った。この目的で、腫瘍内の放射能の取込みを最大化しながら、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射の２４時間後において、少なくとも、血液について２０：１であり、腎臓について１０：１である、具体的なＴＩ基準値を設定した。選択した組織内の177Ｌｕ放射能についての生体内分布アッセイのために、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射の２４時間後（「ｐ．ｉ．」）において群を犠牲にした。生体内分布解析のために、マウスをＣＯ2（気体）窒息により安楽死させ、腫瘍および選択された臓器を採取し、水ですすぎ、通気乾燥させ、秤量し、ガンマシンチレーション計数（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  ３インチ）により、ラジオアッセイにかけた。計数率は、同位元素に特異的な系較正因子を使用してバックグラウンド補正および減衰補正して活性に変換し、投与した活性に対して正規化して、ＩＡ／ｇ％（平均値±ＳＥＭ）として表した。
【０１８３】
６．１．２．８  線量測定の計算
線量計算のために、最適化されたＤＯＴＡ−ＰＲＩＴプロトコール＋５．５〜６．１ＭＢｑ（約３０ｐｍｏｌ）の177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎにより、ＢＴ−４７４腫瘍保有マウス（ｎ＝２４）において、逐次的生体内分布研究を行った。ＨＥＲ２（＋）ＢＴ−４７４腫瘍保有マウス（ｎ＝４〜５）の群に、ＰＲＩＴ＋５．５〜６．１ＭＢｑ（約３０ｐｍｏｌ）の177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを施し、注射の１．０（ｎ＝５）、２．５（ｎ＝５）、２４（ｎ＝５）、９６（ｎ＝５）、および３３６（ｎ＝４）時間後において、腫瘍および選択した正常組織における、177Ｌｕ放射能についての生体内分布解析のために犠牲にした（表１５）。各組織について、減衰補正を伴わない、時間−放射能濃度データを、Ｅｘｃｅｌを使用して適宜、１成分、２成分、またはこれを超えて複雑な指数関数へと当てはめ、解析的に積分して、単位照射放射能当たりの累積放射能濃度（１ＭＢｑ当たりのＭＢｑ×時間／ｇ）を求めた。177Ｌｕベータ線完全局所吸収のみを仮定し、ガンマ線および自己以外の線量寄与を無視して、腫瘍間および選択した臓器間の自己吸収線量を推定するのに、非透過照射についての177Ｌｕ平衡線量定数（８．４９ｇ×ｃＧｙ／ＭＢｑ×時間）を使用した。
【０１８４】
６．１．２．９  免疫組織化学（「ＩＨＣ」）およびオートラジオグラフィー実験
ＨＥＲ２発現腫瘍についてのＩＨＣのために、ＢＴ−４７４腫瘍保有ヌードマウスの群に、０．２５ｍｇ（１．１９ｎｍｏｌ）の抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５を、静脈内投与した。注射の２４時間後に、動物を犠牲にし、腫瘍を、ＯＣＴ内で凍結させた。ＩＨＣによるＨＥＲ２の検出は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴプロセッサー（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ、Ｔｕｃｓｏｎ−ＡＺ）を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて実施した。組織切片を、ＰＢＳ中に１０％の正常ヤギ血清、２％のＢＳＡ中で、３０分間（ｍｉｎ）にわたりブロッキングした。次に、切片を、５．０ｕｇ／ｍｌの濃度のウサギポリクローナルＨＥＲ２抗体（Ｅｎｚｏ；カタログ番：ａｌｘ−８１０−２２７）と共に、５時間にわたりインキュベートするのに続き、１時間にわたり、５．７５ｕｇ／ｍＬのビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ；カタログ番：ＰＫ６１０１）を伴うインキュベーションにかけた。検出は、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｄ，Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−  ＨＲＰ  ａｎｄ  ＤＡＢ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により実施した。全ての試薬は、製造元の指示書に従い使用した。抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５抗体の分布を決定するＩＨＣのために、一次抗体ステップを除外し、ビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ；カタログ番：ＢＡ３０００）抗体を使用した点を除き、同じ手順に従った。
【０１８５】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるオートラジオグラフィーのために、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射の２４時間後において動物を犠牲にし、腫瘍を切り出し、急速凍結させ、ＯＣＴ内に包埋した。厚さ１０μｍの一連の低温切片の系列を速やかに切り出し、177Ｌｕ放射能の分布の決定のために、−２０℃で一晩にわたりＰｈｏｓｐｈｏｒプレートへと曝露した。ピクセルサイズ２５μｍのデジタルオートラジオグラフィー画像は以下の通りに得た。腫瘍切片を−２０℃で一晩にわたりＰｈｏｓｐｈｏｒイメージングプレート（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＢＡＳ−ＭＳ２３２５；富士フイルム株式会社）へ曝露した。曝露が完了したら、イメージングプレートをカセットから取り出し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ７０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）に取り付けて画像を読み取った。イメージリーダーは、ピクセルサイズを２５μｍとする１６ビットのグレースケールによるデジタル画像を創出する。次いで、後続の解析のために、これらの画像をＴＩＦＦ画像フォーマットのファイルへと変換する。最後に、Ｈ＆Ｅ染色を実施して連続切片内の腫瘍の形状を可視化し、同様の方式で、画像を収集した。画像は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して手動で登録した。
【０１８６】
６．１．２．１０  セラノスティック用抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによる治療
抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ療法の毒性および有効性を、ヒト乳がんについての動物モデルにおいて査定するために、治療研究を、「小サイズ」または「中サイズ」の皮下異種移植片を伴うＢＴ−４７４腫瘍保有マウスにおいて行った。触知可能〜３０ｍｍ3の範囲の体積を伴う腫瘍を「小サイズ」と分類し、１００〜４００ｍｍ3の範囲の腫瘍体積を「中サイズ」と分類した。処置群を、８５〜２００日にわたりモニタリングし、生存例を組織病理学研究にかけた（下記を参照されたい）。
【０１８７】
まず、抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（３００ｐｍｏｌ）による、１サイクル型処置を、小型の皮下異種移植片を保有するマウス群において査定し、処置対照と比較した（腫瘍への推定線量：２２Ｇｙ）。これらの群を、処置後８５日間にわたりモニタリングした。この研究中に、平面シンチグラフィー（既に記載されている方法［３］を使用する）を、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射の７０時間後まで使用して、177Ｌｕ放射能の腫瘍へのターゲティングを検証した。
次に、中サイズの皮下異種移植片を保有するマウスの群を、１サイクル型抗ＨＥＲ２  ＰＲＩＴ用量漸増試験において、マウス１匹当たり１１．１、３３．３、または５５．５ＭＢｑ（６０〜３００ｐｍｏｌ）の177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎで処置し、対照群と比較した（腫瘍への推定吸収放射線量：４．４〜２２Ｇｙ）。腫瘍の再発、および抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴの慢性毒性について研究するために、これらの群を処置後約２００日間にわたりモニタリングした。
【０１８８】
第３の治療研究では、１サイクル当たり、マウス１匹当たり５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（３００ｐｍｏｌ）による、３サイクル分割型ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴレジメンを、中サイズの皮下異種移植片を保有するマウスの群において査定した（腫瘍への、推定吸収放射線量：７０Ｇｙ）。これを達成するために、マウス１匹当たりの全ＩＡを１６７ＭＢｑとする、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを、各サイクルにおいて、３つのＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ試薬の各々を施す、３サイクルにわたる、同等の、毎週の投与により施した（「抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ」と名指す）。有効性が、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の腫瘍特異的標的に依存することを検証するために、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５を、抗ＧＰＡ３３ターゲティングＢｓＡｂ  ｈｕＡ３３−Ｃ８２５［４］（「対照ＩｇＧ−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ」と名指す）で置きかえた、対照処置アームを組み入れた。これらの群を、処置後約８５日間にわたりモニタリングした。抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによる処置を受ける、３匹のマウス、ならびに対照ＩｇＧ−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴを受ける、１匹のマウスを、腫瘍ターゲティングについてアッセイし、177Ｌｕ放射能の腫瘍による取込みを定量するように、ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングのために、無作為に選択した。
【０１８９】
６．１．２．１１  治療への応答および毒性評価
マウスを、毎日モニタリングし、処置により誘導される毒性の証拠のために、毎週少なくとも２回秤量した。動物は、＞２５００ｍｍ3の過剰な腫瘍負荷のために、または、腫瘍が運動の懸念を引き起こす場合は、これ未満の腫瘍負荷で、犠牲にするまで観察した。１もしくは２日間で、それらの初期（処置前）体重から１５％を超える体重減少、またはそれらの処置前体重からの２０％以上の体重減少を示す動物は、その時点で群から除外し、犠牲にした。毒性について、さらに査定するために、無作為に選択された、処置を受ける動物を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙにおいて、研究委員会により認定された、獣医科病理医による、異種移植片、腎臓、骨髄（胸骨、椎骨、大腿骨、および脛骨）、肝臓、および脾臓の（そうでないことが注記されない限りにおいて）、組織病理学査定にかけた。血液学および臨床化学についてのパネルもまた回収した。ＣＲは、腫瘍の、測定不可能（＜１０ｍｍ3）となるまでの退縮と規定する。治癒は、剖検時の腫瘍接種部位において、新生物の組織病理学的証拠が見られないことと規定する。乳がんの異種移植片は、２００日後に、処置された生存例のうちの３３．３％（６例中２例）において遠隔転移を発症したが、８５日後に査定された動物では、発症が見られなかった（表２１、表２４、および表２７を参照されたい）。
【０１９０】
６．１．２．１２  統計学
全ての統計学は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡを使用して決定した。２つの個別の群の間の統計学的比較は、適切な場合、スチューデントの対応のないｔ検定により解析し、統計学的有意性水準は、Ｐ＜０．０５に設定した。
【０１９１】
６．１．２．１３  略号
ＢｓＡｂ：二特異性抗体；ＴＩ：治療指数；ＣＲ：完全奏効；ｄ：日；ＲＩＴ：放射免疫療法；ＰＲＩＴ：プレターゲティング型放射免疫療法；ＩＡ：注射放射能；［Ｍ］−ＤＯＴＡ−Ｂｎ：キレート剤である、Ｓ−２−（４−アミノベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸の放射性金属錯体；ＣＡ：除去剤；ＭＷ：分子量；ＳＰＥＣＴ／ＣＴ：単一光子放射型コンピュータ断層撮影；ｓ．ｃ．：皮下；ｈ：時間；ｐ．ｉ．：注射後；ＩＡ／ｇ％：１グラム当たりの注射放射能パーセント；ＳＥＭ：平均値の標準誤差；ＩＨＣ：免疫組織化学；ＲＯＩ：対象領域；ＲＢＣ：赤血球；ＨＧＢ：ヘモグロビン；ＰＬＴ：血小板；ｉ．ｖ．：静脈内；Ｖ：容量；ｍｉｎ：分である。
６．１．３  結果
【０１９２】
６．１．３．１  抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特徴づけ
サイズ除外高速液体クロマトグラフィー（「ＳＥ−ＨＰＬＣ」）による、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５についての生化学的純度解析を、図１Ａに示す。ＳＥ−ＨＰＬＣは、近似分子量（「ＭＷ」）を、２１０キロダルトン（「ｋＤ」）とするメインピーク（紫外光（「ＵＶ」）解析により、９６．５％）のほか、ゲル濾過により除去可能な凝集物であると仮定される、一部のマイナーピークも示した。ＢｓＡｂは、複数の凍結／融解サイクルの後のＳＥ−ＨＰＬＣで、安定を維持した（データは示さない）。
抗原である、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−（Ｙ）−ＤＯＴＡ−Ｂｎに対する結合アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００により測定した。抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５は、２．１０×１０4Ｍ-1秒-1のｋon、１．２５×１０-4秒-1のｋoff、および６．０ｎＭの全ＫD（対照のＢｓＡｂである、ｈｕＡ３３−Ｃ８２５（１．９０×１０4Ｍ-1秒-1のｋon、２．２０×１０-4秒-1のｋoff、および１１．６ｎＭの全ＫD；図１Ｂ）と同等である）を有した。腫瘍標的への結合は、フローサイトメトリーにより測定した。抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５は、ＨＥＲ２（＋）乳がん細胞系ＡＵ５６５への結合において、親トラスツズマブと同等に効率的であった（図１Ｃ）。まとめると、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５は、ＨＥＲ２およびＤＯＴＡのいずれの標的に対しても高度の結合能を保持した。
【０１９３】
６．１．３．２  抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の内在化動態および細胞内プロセシング
ＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２（＋））細胞による、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の内在化動態および細胞内プロセシングを特徴づけるために、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５を、ヨウ素１３１（131Ｉ）で放射性ヨウ素標識し、３７℃で最長２４時間（「ｈ」）にわたり、ＨＥＲ２（＋）ＢＴ−４７４細胞との、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞結合研究を行った。細胞表面131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５は、３７℃におけるインキュベーションの後、ＢＴ−４７４細胞により、急速に内在化され、添加された放射能のうちの２５．６±１．１６％が、２時間後においてピーク内在化を示した（図２）。
【０１９４】
加えて、４時間後にアッセイしたところ、４℃で内在化された放射能は、平均で、３７℃の場合の、約１５分の１であった（ｎ＝６；データは示さない）。３７℃で、２〜２４時間後、内在化放射能は、５．６±０．２１％へと減少することが観察されたことから、エクソサイトーシスが生じていたことが示唆される。これはまた、細胞外培地中で観察される、異化放射能百分率の増大（すなわち、低分子量異化生成物の蓄積）速度によっても明らかであり、Ｋ＝０．０５４および１２．８２時間の半減期（Ｒ2＝０．９９５）を示した。表面結合放射能画分について、放射能のうちの約５０％が３７℃におけるインキュベーションのうちの最初の２時間で失われたのに対し、残留放射能は８．５時間の半減期で減衰した（Ｒ2＝０．９９２）。２４時間にわたるインキュベーション（ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴにおける、ＢｓＡｂの注射と、除去剤の注射との間の時間間隔）の後、初期に結合した抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５のうちの、１１．１±０．４８％が細胞表面上に残存した。
【０１９５】
３７℃、０〜２４時間後における、培地中の131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの安定性についてアッセイするための対照実験が、これらの２つ時点の間の、抗体と会合した放射能の変化パーセントは−２．１％であると示したことから、細胞外培地画分中で観察される異化放射能は、主に131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の内在化およびエクソサイトーシスに起因することが示唆される。
【０１９６】
６．１．３．３  ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴの最適化
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴのための、ＢｓＡｂおよび除去剤の最適化用量は、ＢＴ−４７４腫瘍保有マウスの群を使用して、それぞれ、０．２５ｍｇ（１．１９ｎｍｏｌ）、および６２．５μｇ（０．１２５ｎｍｏｌのデキストラン；７．６３ｎｍｏｌの（Ｙ）−ＤＯＴＡ−Ｂｎ）であると決定した。これらの最適化の取組みからの、抜粋した生体内分布データの概要を表１０に提示する一方で、残りのデータは、図３および表１１に提示する。このターゲティングレジメンは、注射の２４時間後（「ｐ．ｉ．」）における、７．５８±０．７８（１グラム当たりの注射放射能パーセントＩＡ／ｇ％としての；平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ））の、腫瘍による取込みをもたらしながら、正常における最大の取込みを示す組織としての腎臓による取込みは、０．７３±０．０５であった。注目すべきことに、除去剤ステップの投与を伴わない場合（すなわち、［時間（「ｔ」）＝−２８時間後］において施される抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５に続く、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ［ｔ＝０時間後］）、注射の２４時間後における、腫瘍による177Ｌｕ放射能の取込みおよび血液による177Ｌｕ放射能の取込みのいずれも、それぞれ、１９．９４±３．５４ＩＡ／ｇ％および４．９５±１．１７ＩＡ／ｇ％と、はるかに高値であり、この結果として、望ましくない腫瘍対血液比（４．０±１．２）をもたらした（表１０）。除去剤の用量を最適化したところ、腫瘍および血液による平均の取込みは、除去剤を伴わない対照と比較して、それぞれ、約６０％（約２０から７．６ＩＡ／ｇ％へと）および約９５％（約５から０．３ＩＡ／ｇ％へと）低減され、腫瘍対血液比（２６．７±９．０）を著明に改善したが、腫瘍による取込みの低下を代償とした。
【０１９７】
表10:最適の抗HER2-DOTA-PRITプロトコールを同定するためにデザインされた個別の実験からの、177Lu-DOTA-Bn(そうでないことが注記されない限りにおいて、約5.6MBq、30pmol)の注射の24時間後における、抜粋した生体内分布データであり、皮下HER2(+)(BT-474)腫瘍または皮下HER2陰性(「HER2(-)」)(MDA-MB-468)腫瘍を保有するマウスにおける、HER2(+)腫瘍特異性標的を裏付ける。全ての腫瘍は、ex vivoにおいて100〜200mgの範囲であった。n.d.=決定なし。Int.=腸。データは、IA/g%(平均値±SEM)として提示する。
【表１０】
2021517564.tif 000024
a0.25mgの抗HER2-C825、62.5μg(25%(質量/質量))の除去剤、および約5.6MBqの177Lu-DOTA-Bn
b0.25mgの抗HER2-C825、62.5μg(25%(質量/質量))の除去剤、および55.5MBqの177Lu-DOTA-Bn
cBsAbまたは除去剤の注射を伴わず、約16.8MBqの177Lu-DOTA-Bn(90pmol)だけ
【０１９８】
表11:皮下BT-474腫瘍を保有するヌードマウスにおける、177Lu-DOTA-Bnを伴う、抗HER2 DOTA-PRITに対する除去剤の最適化のための、多様な組織内の177Lu放射能についてのex vivoにおける生体内分布研究。HER2(+)腫瘍を保有するマウスの群(群1つ当たりのn=4)に、0.25mg(1.19nmol)の抗HER2-C825[t=-28時間後]を注射した後、除去剤(マウス1匹当たり0〜70μgとして投与されたマウス1匹当たり0.25mgの、抗HER2-C825 BsAbの質量;0〜0.14nmolのデキストラン;0〜8.5nmolの(Y)-DOTA-Bnに照らして、マウス1匹当たり0〜28%(質量/質量))[t=-4時間後]および5.5〜5.6MBq(約30pmol)の177Lu-DOTA-Bn[t=0時間後]を施し、腫瘍内および正常組織内の生体内分布のために、注射の24時間後に犠牲にした。177Lu放射能濃度データはIA/g%(平均値±標準偏差(「SD」))として提示する。腫瘍サイズはグラム(g)(平均値±SD)として提示する。
【表１１】
2021517564.tif 000025
【０１９９】
ＨＥＲ２特異的ターゲティングを裏付けるために、生体内分布研究を、皮下ＨＥＲ２（−）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を保有するマウスにおいて実施した。ＨＥＲ２（−）腫瘍内の、注射の２４時間後における、プレターゲティングされた177Ｌｕ放射能の、腫瘍による取込みは、ＨＥＲ２（＋）ＢＴ−４７４腫瘍内（１９．９４±１．７ＩＡ／ｇ％）の、約７分の１（２．７５±０．１７ＩＡ／ｇ％）であった（表１０）。加えて、ＢＴ−４７４腫瘍を保有する動物への、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ単独（すなわち、ＰＲＩＴを伴わない対照）の注射は、注射の２４時間後において、腫瘍内の、無視できる取込み（０．０７±０．０１ＩＡ／ｇ％）、ならびに血中（０．００２±０．００ＩＡ／ｇ％）および腎臓（０．３８±０．０１ＩＡ／ｇ％）における、最小限の取込みを示したことから、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎは、急速な腎クリアランスのために、最小限の全身貯留を示すことが裏付けられる（表１０）。
【０２００】
腫瘍による取込みがピークとなる時点を決定し、後続の治療研究のための線量測定計算を実施するように、最適化された抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴレジメンを使用して、逐次的生体内分布研究を、ＢＴ−４７４腫瘍保有マウスへの注射の１〜３３６時間後の多様な時点において実施した。図４に示される通り（表１０および表１２もまた参照されたい）、プレターゲティングされた177Ｌｕ放射能（約５．６ＭＢｑ／約３０ｐｍｏｌ）の、腫瘍による取込みのピークは、注射の２４時間後において、７．５８±０．７８であることが観察されたが、血液について、対応する放射能は、０．２８±０．０９（腫瘍対血液比：２６．７±９．０）であり、腎臓については、０．７３±０．０５（腫瘍対腎臓比：１０．４±１．３）であった。また、腫瘍内の177Ｌｕ放射能が、注射の１〜２４時間後において、約５〜８ＩＡ／ｇ％の範囲で比較的一定を維持したことから、腫瘍ターゲティングは極めて急速であり、生体による腫瘍からの放射能のクリアランスは比較的緩徐であったことが示唆される。腫瘍内放射能は、注射の９６および３３６時間後に、それぞれ、２．２９±０．４１ＩＡ／ｇ％および０．３２±０．０６ＩＡ／ｇ％へと降下したことから、３８．６時間の、近似的な腫瘍クリアランス半減期がもたらされる（Ｒ2＝０．８９４）。
【０２０１】
表12:注射後表示の各時点(1〜336時間後)における、皮下BT-474腫瘍を保有するヌードマウス群による、ex vivoの生体内分布を使用して決定した177Lu放射能データはIA/g%(平均値±平均値の標準誤差(「SEM」))として提示する。これらのデータはまた、図4にも示し、線量測定計算にも使用した(表13)。
【表１２】
2021517564.tif 000026
2021517564.tif 000027
【０２０２】
治療研究を導き、線量制限組織を予測するために、生体内分布によりアッセイされた腫瘍および組織について、吸収線量の推定値を得た。表１３に示す通り、血液、腫瘍、肝臓、脾臓、および腎臓についての、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの推定吸収線量（ｃＧｙ／ＭＢｑとしての）は、それぞれ、１．４、３９．９、３．３、０．３、および５．６であった。腎臓への推定線量は、正常組織間で最高であり、７のＴＩをもたらした。血液（骨髄）および腎臓のそれぞれについての推定最大耐量である、２５０〜２０００ｃＧｙ［３２］に基づくと、推定最大忍容放射能は、血液（骨髄）を線量制限組織として、約１８０ＭＢｑである（血液についてのＴＩ：２８）。
【０２０３】
表13:177Lu-DOTA-Bnの注射の1.0〜336時間後における、逐次的生体内分布データに基づく、皮下HER2(+)BT-474腫瘍を保有するヌードマウスにおける、最適化された177Lu-DOTA-Bnを伴う、抗HER2-DOTA-PRITについての、推定吸収線量。
【表１３】
2021517564.tif 000028
【０２０４】
治療研究の前に、治療量ＩＡの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（約５６ＭＢｑ、３００ｐｍｏｌ）と共に、最適化された抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴを施されたＢＴ−４７４腫瘍保有マウスの群により、パイロットＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング研究を行った。画像が、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの、下脇腹への注射の２４時間後において、腫瘍の輪郭を明らかにした（図３）ことから、腫瘍による高絶対取込み量、ならびに高腫瘍対血液比が示唆される。イメージングの直後になされた生体内分布が、それぞれ、５．５３±０．２７、０．２９±０．０５、および０．５６±０．０８の、腫瘍、血液、および腎臓への取込みを示した（表１０）ことから、治療時の最重要組織に、高ＴＩが維持されることが示唆される。
【０２０５】
腫瘍内ＢｓＡｂターゲティング、およびＨＥＲ２発現とのその関係、ならびにプレターゲティングされた177Ｌｕ放射能の腫瘍における微小分布は、ＢｓＡｂまたはプレターゲティング型177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎのそれぞれの注射の２４時間後において切り出されたＢＴ−４７４腫瘍に対して、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）およびオートラジオグラフィーを使用して探索した。これらの研究は、ＨＥＲ２陽性腫瘍領域における、ＢｓＡｂの均質の取込み、およびプレターゲティングされた177Ｌｕ放射能の、腫瘍における極めて均一かつ均質の分布を明らかにした（図５）。
【０２０６】
６．１．３．４  治療研究
治療研究を行って、腫瘍における推定線量の応答に対する効果を、広範にわたる出発腫瘍サイズについて決定するほか、特に、腫瘍における推定吸収線量を約７０Ｇｙとする、線量測定ベースの処置計画により、高確率の治癒を達成することが実現可能であるのかどうかを決定した。３つの抗ＨＥＲ２  ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ治療研究についての概要を、表１４に提示する。
【０２０７】
表14:抗HER2 DOTA-PRIT有効性/毒性研究の概要
【表１４】
2021517564.tif 000029
【０２０８】
図６Ａに示す通り、５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（腫瘍における推定送達吸収線量：２２Ｇｙ）を伴う、１サイクル型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴは、小型の皮下異種移植片の処置において有効である結果として、高頻度の完全奏効（「ＣＲ」）（５例中５例、１００％）をもたらし、生存例（５例中４例、８０％）を、剖検にかけたところ、８５日後において、いずれの動物にも再発が観察されなかった。抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴを受けるマウス群、または５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎだけによる処置を受けるマウス群についての平面シンチグラフィーは、腫瘍によるプレターゲティング特異的取込みを注射の２０時間後において明らかに示した（注射の少なくとも７０時間後において腫瘍に存続する）（図７）。処置の約４０日後において腫瘍のＣＲへの退縮を示し、その後の再発を伴わなかったＢｓＡｂだけの群における１匹のマウス（５例中１例、２０％）を例外として、対照群では一般に腫瘍の応答が見られず、腫瘍は、ＣＲを伴わずに進行を示した。処置後の４０日目に、腫瘍体積の間で、対照群に照らした統計学的有意性は見られなかった（データは示さない）。加えて、８５日後に、対照群の腫瘍サイズは、平均で処置前体積の３８０〜３１３０％へと進行したが、ＢｓＡｂだけで処置された動物は最小の平均進行を示した。
【０２０９】
１１．１〜５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを伴う、１サイクル型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによる、中サイズの皮下異種移植片を保有するマウスの処置は、一般に、対照と比較して、顕著な腫瘍応答をもたらさなかったことから、腫瘍における４．４〜２２Ｇｙの推定吸収線量が高確率の腫瘍ＣＲをもたらすのに不十分であったことが示唆される（図６Ｂ）。処置後の４０日目に、対照群または処置群に照らした腫瘍体積の間に、統計学的有意性は見られなかった（データは示さない）。小さな比率の抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置動物（１５例中４例、２６．７％）は、ＩＡに関わらず、処置の約７５〜１００日後までにＣＲを示した（５例中２例：１１．１ＭＢｑ、および５例中１例：３３．３ＭＢｑ群または５５．５ＭＢｑ群）が、これは、ＢｓＡｂのトラスツズマブ様作用の効果である可能性が高い。
【０２１０】
１サイクル型処置が中サイズの腫瘍の処置に無効であるのに対し、腫瘍における大きな吸収放射線量の分割送達は高度に有効であることを示した。中サイズの皮下異種移植片を保有するマウス群の、３サイクル型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（１サイクル当たり５５．５ＭＢｑ、腫瘍における推定送達吸収線量：６６Ｇｙ）による処置が、１００％のＣＲ（８例中８例）をもたらしたのに対し、処置対照では、ＣＲを伴わない腫瘍の進行が観察された（図８）。８５日後における、対照である、非処置群、ＢｓＡｂ処置群、または対照ＩｇＧ−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ群についての腫瘍体積は、それぞれ、処置前体積の、１３４±８９％、３９６±２５２％、または１１４±１５５％であった。
【０２１１】
分割型処置を受ける、選択したマウスに対して、ＳＰＥＣＴ／ＣＴを行って、腫瘍による取込みを検証および定量した。図９Ａに示す通り、対照ＩｇＧ−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ、または抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴによりプレターゲティングされたサイクル１の177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射の２４時間後における、無作為に選択されたマウスのイメージングは、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５による、放射能の腫瘍特異的ターゲティングを示したが、対照ＩｇＧ−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴでは、腫瘍による取込みは無視できるものであった。また、分割型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴを受ける、３匹の、無作為に選択されたマウスも、ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングにより逐次的にイメージングした。177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの、サイクル１、２、および３の、注射の２４時間後における、動物のうちの１匹についての、代表的な画像を、図９Ｂに提示する一方で、２匹のマウスについてのデータを、図１０に提示する。また、画像に由来する、腫瘍領域についての対象領域（ＲＯＩ）解析も行い、処置の各サイクルの腫瘍における177Ｌｕ放射能（腫瘍１グラム当たりのＭＢｑ：ＭＢｑ／ｇとして表す）を、サイクル１の処置開始後の時間（ｈ）の関数として提示するグラフもまた、図９Ｂに提示するが、これは、腫瘍による平均取込みが、各処置サイクルにおける、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射の２４時間後において、約４．３〜６．１ＭＢｑ／ｇの範囲であったことを示す。
【０２１２】
６．１．３．５  毒性
まとめると、治療実験の各々では、処置群のうちのいずれにおいても、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを投与される対照を含む対照と比較した、有意の平均体重減少は見られなかった（図１１および図１２）。注目すべきことに、１サイクル当たり５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを伴う抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴレジメンについては、急性毒性が見られなかった（図１２）ことから、より侵襲性の処置レジメンであっても安全に利用しうることが示唆される。表１５、表１６、および表１７は、動物が、各治療実験から除外された基準についてまとめる。これらは、（１）過剰な体重減少のために必要とされる安楽死、（２）動物の死亡が判明したこと、および（３）過剰な腫瘍負荷のために必要とされる安楽死を含んだ。本発明者らは、このＢＴ−４７４動物モデルにおいて、少数の動物が、処置レジメン（非処置対照を含む）に関わらず、おそらく、植込み型エストロゲンペレットによる処理について公知の影響と類縁の、急速な悪化（例えば、尿中貯留［３３］および子宮内膜過形成［３４］）を示すことを観察した。したがって、分割型処置研究において、処置開始後１２〜２２日以内に、急速な体重減少を示した、３匹の、無作為に選択された動物（処置群：非処置、ＢｓＡｂだけ、および対照ＩｇＧ−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴから１匹ずつ）を完全剖検にかけて臨床状態不良の原因を決定した。臨床動物３匹中３匹（１００％）における病的状態が、エストロゲン処置の有害作用に明らかに起因することが決定された（表１７を参照されたい）。
【０２１３】
表15:中サイズの腫瘍を保有するマウス群に対する1サイクル型抗HER2-DOTA-PRIT+最大で55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnに関して、体重減少および腫瘍増殖についてあらかじめ規定された基準に基づき実験から除外された動物の数。研究の終点は、処置の約200日後であった。約85日目における生存例:処置なしからの5例中3例、BsAbだけからの5例中3例、55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnだけからの5例中5例、および抗HER2-DOTA-PRIT+55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnからの5例中5例。
【表１５】
2021517564.tif 000030
【０２１４】
表16:小サイズの腫瘍を保有するマウス群に対する1サイクル型抗HER2-DOTA-PRIT+55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnに関して、体重減少および腫瘍増殖についてあらかじめ規定された基準に基づき実験から除外された動物の数。研究の終点は、処置の約85日後であった。約85日目における生存例:処置なしからの5例中3例、BsAbだけからの5例中3例、55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnだけからの5例中5例、および抗HER2-DOTA-PRIT+55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnからの5例中5例。
【表１６】
2021517564.tif 000031
【０２１５】
表17:分割型抗HER2-DOTA-PRITに関して、体重減少および腫瘍増殖についてあらかじめ規定された基準に基づき実験から除外された動物の数、研究開始の約85日後における処置の終点。約85日目における生存例は、処置なしからの6例中4例、BsAbだけからの5例中3例、IgG-DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bnからの6例中3例、および抗HER2-DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bnからの8例中8例を含み、処置開始から12〜22日以内に急速な健康の悪化および有意の体重減少を示した、対照群からの3匹の動物は剖検にかけ、毒性の原因を決定した。1匹の非処置マウスが12日後に処置前体重からの急速な体重減少を示し、瀕死状態で、剖検にかけられる一方で、別の非処置対照マウスは18日後に死亡していることが見出された。瀕死状態の動物は、病変内球菌を伴う軽度の限局性片側性化膿性腎盂腎炎を有した。BsAbだけの群からの1匹のマウスは急速な体重減少を示し、20日後に瀕死状態で、剖検にかけられた。このマウスは、病変内細菌(大型の球菌)を伴う、好中球性の腎盂炎(両側性)および腎盂腎炎(片側性)を示した。BsAbだけの群からの第2のマウスは、35日後に死亡が判明した。対照IgG-DOTA-PRITによる処置では、3匹の動物が、4、11、および21日後において、処置前体重からの急速な体重減少を示した。この群からの1匹のマウスは、22日後において瀕死状態で、剖検にかけられた。このマウスは、飢餓による重度の低形成性(再生不良性)貧血および低形成長骨内の成長板、死戦期細菌性塞栓および死戦期出血を伴うと診断された。
【表１７】
2021517564.tif 000032
【０２１６】
６．１．３．６  血液学、臨床化学、および組織病理学
小サイズの皮下腫瘍を保有するマウスに対する、１サイクル型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎによる処置の約８５日後において、剖検にかけた、ＣＲを伴う、５匹の動物（ＢｓＡｂだけの処置群からの１匹のマウス、および抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置群からの４匹のマウス）のうち、ＢｓＡｂだけの群からの１例（３例中１例、３３．３％）、および抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置群からの３例（４例中３例、７５％）である、４例の治癒が見られた。顕著な処置に関連する形状変化は、見られなかった（表１８）。血液学値および臨床化学値（表１９および表２０）は、白血球（「ＷＢＣ」）、血小板（「ＰＬＴ」）、および好中球（「ＮＥＵＴ」）を例外として、一般に、正常範囲内にあったが、ＷＢＣ、ＰＬＴ、およびＮＥＵＴは、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置群（ｎ＝４；ＷＢＣ範囲：２．１３〜２．３６Ｋ／μＬ；ＰＬＴ範囲：２２９〜６７０Ｋ／μＬ；ＮＥＵＴ範囲：０．４７〜１．４２Ｋ／μＬ）では、非処置群（ｎ＝３；ＷＢＣ範囲：３．１５〜６．０１Ｋ／μＬ；ＰＬＴ範囲：６８６〜９４６Ｋ／μＬ；ＮＥＵＴ範囲：１．５１〜２．４７Ｋ／μＬ）と比較して、有意に低値（それぞれ、Ｐ＝０．０１３７、０．０１９５、または０．０１７）であった。また、ＢＵＮ（血中尿素窒素）も、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置群（ｎ＝４；ＢＵＮ範囲：２６．０〜３９．０ｍｇ／ｄＬ）では、非処置群（ｎ＝３；ＢＵＮ範囲：２０．０〜２３．０ｍｇ／ｄＬ）と比較して、有意に高値（Ｐ＝０．０２０２）であった。
【０２１７】
表18:1サイクル型抗HER2-DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bnを受けた、BT-474腫瘍保有マウス(小型腫瘍)からの、処置の約85日後における組織病理学所見。合計15匹の動物を、剖検により査定した。
【表１８】
2021517564.tif 000033
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【０２１８】
表19:1サイクル型DOTA-PRIT+55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnを受けた、皮下BT-474腫瘍保有マウス(小型腫瘍)からの、約85日後における血液学値。RBC:赤血球、HGB:ヘモグロビン、PLT:血小板、WBC:白血球、NEUT:好中球、LYMPH:リンパ球、MONO:単球である。注:2匹の動物:55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnだけ(PLT:57)で処置されたマウス、およびBsAbだけ(PLT:0)で処置されたマウスは、血小板について、低値を示したが、血小板凝集が認められたので、値を、解析から除外し、血液サンプリングについてのアーチファクトであると考えた。
【表１９】
2021517564.tif 000037
【０２１９】
表20:1サイクル型抗HER2-DOTA-PRIT+55.5MBqの177Lu-DOTA-Bnを受けた、皮下BT-474腫瘍保有マウス(小型腫瘍)からの、約85日後における臨床化学値。BUN:血中尿素窒素、CREA:クレアチニン、ALP:アラニンホスファターゼ、ALT:アラニンアミノトランスフェラーゼ、およびAST:アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼである。
【表２０】
2021517564.tif 000038
【０２２０】
中サイズの皮下腫瘍を保有するマウスに対する、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋１１．１〜５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎによる処置の約２００日後おいて、１１．１ＭＢｑ群および５５．５ＭＢｑ群の各々１例ずつ、２例のＣＲを含む、合計６例が生存した。いずれのＣＲ例も、治癒していると決定された。顕著な、処置に関連する組織病理学は見られなかった（表２１）。血液学値および臨床化学値は、正常範囲内にあった（表２２および表２３）。約２００日後において、非処置対照の生存例が存在せず、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置動物の生存例が少数であったため、本研究のための血液学パラメータおよび臨床化学パラメータについての統計学的比較は行わなかった。
【０２２１】
表21:1サイクル型抗HER2-DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bnを受けた、BT-474腫瘍保有マウス(中サイズの腫瘍)からの、処置の約200日後における組織病理学所見。合計6匹の動物を、剖検により査定した。
【表２１】
2021517564.tif 000039
2021517564.tif 000040
【０２２２】
表22:1サイクル型DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bnを受けた、BT-474腫瘍保有マウス(中サイズの腫瘍)からの、約200日後における血液学値。RBC:赤血球、HGB:ヘモグロビン、PLT:血小板、WBC:白血球、NEUT:好中球、LYMPH:リンパ球、MONO:単球である。エストロゲンまたは異種移植片の植込みを伴わない、約3カ月齢の雌である、正常動物:Harlan、無胸腺ヌードであるHsd:Athymic Nude-Foxn 1nuである。
【表２２】
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【０２２３】
表23:1サイクル型抗HER2-DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bnを受けた、BT-474腫瘍保有マウス(中サイズの腫瘍)からの、約200日後における臨床化学値。BUN:血中尿素窒素、CREA:クレアチニン、ALP:アラニンホスファターゼ、ALT:アラニンアミノトランスフェラーゼ、およびAST:アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼである。エストロゲンまたは異種移植片の植込みを伴わない、約3カ月齢の雌である、正常動物:Harlan、無胸腺ヌードであるHsd:Athymic Nude-Foxn 1nuである。
【表２３】
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【０２２４】
分割型処置研究では、処置の８５日後において、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴにより、高頻度の治癒が見られた（８例中５例、６２．５％）。他の３匹の処置動物（８例中３例、３７．５％）は、少数の、散在する新生物性細胞を伴う、主に、軟部組織の硬化からなる顕微鏡的残存疾患を示した（表２１）。全ての処置群について、腫瘍の接種部位から採取された組織切片についての代表的なＨ＆Ｅ染色を図１３に示す（表２４もまた参照されたい）。
【０２２５】
表24:分割型抗HER2-DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bnを受けた、BT-474腫瘍保有マウス(中サイズの腫瘍)からの、約85日における組織病理学所見。合計18匹の動物を、剖検により査定した。AC:未分化癌、L:リンパ形質細胞性、N:正常、EM:髄外造血、HH:造血過形成、LH:リンパ過形成、FE:病巣広汎性、FL:線維骨性病変、FM:限局性骨髄線維症、MH:骨髄過形成、MF:多巣性、MFR:多巣性ランダム、1:最小限、2:軽度、3:中等度、4:著明である。
【表２４】
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【０２２６】
処置の８５日後において、２匹の抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ動物（８例中２例）はまた、顕著な血液学値および臨床化学値も示した（表２５および表２６）。１匹のマウスは、軽度の貧血（７．７０Ｍ／μＬ；対照範囲：８．３８〜８．８８Ｍ／μＬ）およびヘモグロビンの減少（「ＨＧＢ」；１２．７ｇ／ｄＬ；対照範囲：１４．３〜１４．７ｇ／ｄＬ）、ならびにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（１５４Ｕ／Ｌ；対照範囲：５７〜８１Ｕ／Ｌ）およびアラニンホスファターゼ（１２８Ｕ／Ｌ；対照範囲：６４〜１１０Ｕ／Ｌ）の増大を示した。別のマウスは、軽度の貧血（７．８９Ｍ／μＬ）、ＨＧＢの減少（１３．１ｇ／ｄＬ）、および血小板減少症（５００Ｋ／μＬ；対照範囲：７８１〜９５３Ｋ／μＬ）を示したが、正常な臨床化学値を示した。８匹中６匹の動物では変化が観察されなかった。まとめると、少数の血液学パラメータについて、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ群では、処置なし群と対比して有意に異なる範囲が見られたが、臨床化学について有意差は見られなかった：ＲＢＣおよびＰＬＴに関して、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置群（ｎ＝８；ＲＢＣ範囲：７．７０〜８．６３Ｍ／μＬ；ＰＬＴ範囲：５００〜７９４Ｋ／μＬ）では、非処置群（ｎ＝４；ＲＢＣ範囲：８．３８〜８．８８Ｍ／μＬ；ＰＬＴ範囲：７８１〜９５３Ｋ／μＬ）と比較して有意に低値（Ｐ＜０．０５）であった。１匹の抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ処置マウス（８例中１例、１２．５％）について、顕著な骨髄組織病理学変化が見られたが、これは限局性骨髄線維症（重症度スコア：１；表２７）を有した。
【０２２７】
表25:分割型対照IgG-DOTA-PRIT、または177Lu-DOTA-Bnを伴う、抗HER2-DOTA-PRIT(マウス1匹当たりに投与される全放射能を167MBqとする)を受けた、BT-474腫瘍保有マウス(中サイズの腫瘍)からの、処置開始の約85日後における血液学値。RBC:赤血球、HGB:ヘモグロビン、PLT:血小板、WBC:白血球、NEUT:好中球、LYMPH:リンパ球、MONO:単球である。
【表２５】
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【０２２８】
表26:分割型対照IgG-DOTA-PRIT、または177Lu-DOTA-Bnを伴う、抗HER2-DOTA-PRIT(マウス1匹当たり167MBq)を受けた、BT-474腫瘍保有マウス(中サイズの腫瘍)からの、処置開始の約85日後における臨床化学値。BUN:血中尿素窒素、CREA:クレアチニン、ALP:アラニンホスファターゼ、ALT:アラニンアミノトランスフェラーゼ、およびAST:アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼである。
【表２６】
2021517564.tif 000048
【０２２９】
表27:顕著な形状変化についての、病理重症度の評定。分割型DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bnを受けた群からの、処置開始の約85日後の、異なる群における形状変化の分布および発生率についての概要。処置群は、処置なし、BsAbだけ(BsAb)、対照IgG-DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bn(IgG治療)、および抗HER2-DOTA-PRIT+177Lu-DOTA-Bn(抗HER2治療)を含んだ。評定については表28を参照されたい。
【表２７】
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【０２３０】
表28:表27に記載した臓器重症度スコアの計算
【表２８】
2021517564.tif 000052
組織病理学的病変の重症度評定システム:総評点の計算式:広がりスコア+分布スコア;臓器1つ当たりの全重症度:単一の組織病理学的病変についての、部分スコアの合計
【０２３１】
６．１．４  考察
進行型ヒト充実性腫瘍に対する安全かつ治癒的処置は、腫瘍学において満たされていない主要な要求である。これらの腫瘍は、肺がん、前立腺がん、乳がん、膵臓がん、神経膠腫、消化管悪性腫瘍；言い換えれば、事実上、全ての主要な腫瘍を含む。免疫チェックポイント遮断剤およびチロシンキナーゼ阻害剤であるターゲティング薬における大きなブレークスルーにもかかわらず、この事実はなおも正しい。特に、充実性腫瘍の、時間および空間における異質性、デノボであるのか、後天性であるのかの異質性、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、およびタンパク質レベルにおける異質性は、臨床における進行型充実性腫瘍における最も先進的な分子ターゲティング薬による真の治癒を妨げる。
【０２３２】
特定の理論に束縛されずに述べると、本実施例におけるＤＯＴＡ−ＰＲＩＴプラットフォーム（図１４を参照されたい）は、充実性腫瘍の処置における液体の放射線および薬物／毒素の特異性および効力を改善する、良好な潜在的可能性を有することが仮定される。ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ法は、正常組織を回避しながら大量の放射線を腫瘍へとターゲティングすることを可能とするようにＲＩＴを最適化した。実験室動物において、ＧＤ２およびＧＰＡ３３を発現するヒト異種移植片腫瘍をターゲティングするＤＯＴＡ−ＰＲＩＴが研究され、ＧＤ２およびＧＰＡ３３をターゲティングするＤＯＴＡ−ＰＲＩＴのために、毒性を制限しながら１００％のＣＲ、および高確率の組織学的治癒を達成することが可能である、有効な処置レジメンが開発されている。ＧＤ２陽性腫瘍に対しては、８４．９ｃＧｙ／ＭＢｑにより、血液について１４２であり、腎臓について２３であるＴＩが観察され、ＧＰＡ３３陽性腫瘍に対しては、６５．８ｃＧｙ／ＭＢｑにより、血液について７３であり、腎臓について１２であるＴＩが観察された。これらの２つの標的系は、ＧＰＡ３３については、結腸がん、膵臓がん、腹膜偽粘膜腫、および膵臓がんのサブセット、ならびにＧＤ２については、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、および小細胞肺がんを含む、様々なヒト充実性腫瘍に対する臨床有用性を有する。
【０２３３】
ＨＥＲ２抗原は、主要なヒト腫瘍、とりわけ、乳房、卵巣、胃腸接合部の腫瘍において、広く発現する。この理由で、本実施例では、放射線療法のために、ＨＥＲ２をターゲティングするＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ変種を開発した。ＧＰＡ３３およびＧＤ２とは対照的に、ＨＥＲ２系は、膜内で、はるかに不安定であり、また、そのコグネイト抗体に結合すると、急速な内在化もなされると考えられている。特定の理論に束縛されずに述べると、プレターゲティング型ＲＩＴが成功するためには、腫瘍表面に結合しているＢｓＡｂの滞留時間が、極めて重要であり、この場合、内在化しない抗体−抗原複合体であれば、明確な利点を有することが推論された。このことにも拘わらず、本実施例は、特定の理論に束縛されずに述べると、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴのＴＩは、抗ＧＰＡ３３−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴまたは抗ＧＤ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴのＴＩを下回るが、これらの研究は、エンドサイトーシスを受ける抗原の、ＰＲＩＴに対する動態的限界を定めるのに有益であろうという期待の下に、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴの概念実証を裏付けようとした。
【０２３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究に十分な、アフィニティー、生化学的純度、および収率を伴う抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５生成物を調製するのに成功した。ＨＥＲ２発現腫瘍である、ヒトＢＴ−４７４乳がん細胞系を、ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴの処置応答の比較のための動物モデル系として選び出した。最適化された抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴを使用したところ、実際に、他の２つの抗原系より低値のＴＩ：腫瘍に対する、３９．９ｃＧｙ／ＭＢｑにより、血液について、２８のＴＩであり、腎臓について、７のＴＩが観察された。予備的な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ内在化実験に基づき、ＴＩは、影響を受けるが、２４時間後において、ＴＩを、治癒的ＲＩＴに妥当なレベルへと改善するのに十分な、表面結合ＢｓＡｂ（１１％）が残存することが予期された。
【０２３５】
他の２つのＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ充実性腫瘍系との比較のための、最も直接的な処置レジメンは、１００〜４００ｍｇのサイズの範囲内の、中サイズの腫瘍に対する、３サイクル分割型レジメンであった。分割型処置法は、腫瘍に対する、約７０Ｇｙの、殺腫瘍吸収放射線量を達成するのに十分な177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ放射能の安全な投与に理想的であると推論された［１］ため、ＧＰＡ３３およびＧＤ２のターゲティングにもまた使用された、３サイクル法を選び出した。最適化された投与による、治癒を含む、ＨＥＲ２（＋）ＢＴ−４７４腫瘍増殖のコントロールが裏付けられた。３サイクル分割型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ（マウス１匹当たりの全ＩＡ：１６７ＭＢｑ）は、忍容良好かつ高度に有効であり、動物は、急性毒性を示さないことが見出された。腫瘍への、放射線の総用量は、約７０Ｇｙであり、８５日後において、高頻度のＣＲ（８例中８例、１００％）および腫瘍の治癒までの、完全な根絶（８例中５例、６２．５％）、ならびに３７．５％の顕微鏡的残存疾患（８例中３例）をもたらした。ＣＲは８５日以内に再発しなかった。逐次的ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングを使用して、各処置サイクルにおいて効率的な腫瘍ターゲティングが達成されることが検証された（図１８）。対照群における生存動物は、約８５日後において、処置前体積の２０７±２０１％の腫瘍進行を示し、ＣＲまたは治癒を伴わなかった。
【０２３６】
腫瘍応答に関して、有効性研究では、サイズ依存性効果が観察され、小型サイズの腫瘍は、高発生率のＣＲ（５例中５例、１００％）および治癒（４例中３例、７５％；８５日後における）を達成するのに、１サイクル型抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ＋５５．５ＭＢｑの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎだけを要求した。しかし、中サイズの腫瘍に対する単回投与型処置は、投与される177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎ（１１．１〜５５．５ＭＢｑ）に関わらず、低頻度のＣＲ（１５例中４例、２６．７％）または治癒（２００日後における、評価可能動物６例中２例）を示した。加えて、中サイズの腫瘍に対する単回投与は、処置後１００日以内の最終的再発ＣＲ（評価可能な３例中１例、３３．３％）をもたらすことが観察された。上記で記載した通り、５５．５ＭＢｑの３サイクル処置は中サイズ腫瘍に高度に有効であり、高頻度のＣＲおよび治癒をもたらした。
【０２３７】
まとめると、本実施例は、ＨＥＲ２（＋）疾患に対するＰＲＩＴのための、高ＴＩセラノスティック法の開発を伴う。ＨＥＲ２発現腫瘍のための治癒的治療は、満たされていない主要な要求である。ＨＥＲ２過剰発現がん、とりわけ、トラスツズマブおよびキナーゼ阻害剤に耐性であるＨＥＲ２過剰発現がんを伴う患者のための処置選択肢は限られている［３５］。ＨＥＲ２抗体−抗原系の成功は、他の内在化抗原標的の比較のための基準点であり、本実施例は、ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴのさらなる適応のための指針として用いられる。本実施例は、高ＴＩターゲティングが、正常組織を温存しながら、治癒への潜在的可能性を伴い、実現可能であることを示唆する。
【０２３８】
６．１．５  参考文献
2021517564.tif 000053
2021517564.tif 000054
2021517564.tif 000055
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【０２３９】
（実施例２）
６．２  抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５による腫瘍ターゲティング間隔の改変の、後続のプレターゲティングされた177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎハプテンの、腫瘍内の取込みに対する影響
ＨＥＲ２（＋）ＢＴ−４７４腫瘍を保有するマウス（ｎ＝４）における、抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５（ＢｓＡｂ；上記の６．１節で記載した）、腫瘍ターゲティングおよび薬物動態は、逐次的ＰＥＴイメージングを使用して査定した（図１５）。腫瘍による取込みは、注射の４、１２、２４、および４８時間後（ｐ．ｉ．）において、それぞれ、（平均値±ＳＤとして）８．８７±２．５０、１０．１６±４．０８、７．９６±２．３７、および５．６２±１．４４であった。注射の１２時間後のピークの取込み後における腫瘍における半減期の近似値は、３６時間である。血中放射能は、注射の４、１２、２４、および４８時間後において、それぞれ、（平均値±ＳＤとして）１１．３±０．７９、６．５７±０．４４、３．９８±０．２５、および２．２６±０．２３であった。血中半減期は、８．１時間後であると決定した（非線形の当てはめ、単相減衰；Ｒ２＝０．９８３７）。
【０２４０】
表29:注射の24時間後において観察された、腫瘍および血液における取込み値の、他のイメージング時点(注射の4、12、および48時間後)との統計学的比較を提示する
【表２９】
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初期では、ＢｓＡｂの注射と除去剤の注射との２４時間の間隔を利用した。３７℃で、131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５およびＢＴ−４７４細胞を伴う、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイに従い、131Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の内在化画分は広域にわたり、ｔ＝１分後、２時間後、４時間後、１９時間後、および２４時間後において、それぞれ、８９％、４６％、４１％、１４％、および１１％の残存表面であった（図２）。
２つの、個別のｉｎ  ｖｉｖｏ抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ実験を実施して、ＢｓＡｂの時間間隔の、組織内の、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの取込み（注射の２４時間後における）（平均値±ＳＤとする）に対する影響について研究した。表３０および表３１を参照されたい。
【０２４１】
表30
【表３０】
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【０２４２】
群１対群２の比較（表３０）：群１と、群２とを比較したところ、血液、腫瘍、または腎臓による取込みの間に有意差が見られなかった（それぞれ、Ｐ＝０．１３、０．４９、および０．２３）ことから、ＢｓＡｂの血中濃度は、４時間後において、約３倍（１１．３±０．７９および３．９８±０．２５；Ｐ＝１．０５×１０-6；それぞれ、４時間後および２４時間後について）であると推定されるが、除去剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同等の効果を及ぼすことが示唆される。腫瘍ターゲティングもまた、時間間隔の短縮に伴い低下することはなかった。
【０２４３】
群１対群３の比較（表３０）：群１と、群３とを比較したところ、血液または腫瘍による取込みの間に有意差が見られた（それぞれ、Ｐ＝０．０１９および０．０４７）ことから、除去剤の用量の増大は、血液による取込みの減少（平均：０．０６〜０．０３）時に有効であるが、腫瘍による取込みの減少（平均：１１．６２〜４．１４）を代償とすることが示唆される。腫瘍：血液比および腫瘍：腎臓比は、群１および群３についてほぼ同等であった。
群４（表３０）は、除去剤が、腫瘍：血液比および腫瘍：腎臓比を改善するのに明らかに必要とされることを示す。０〜６２．５μｇの間の除去剤の用量漸増は、４時間のＢｓＡｂターゲティング間隔で、抗ＨＥＲ２−ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴを最適化することが示唆される。
【０２４４】
実験の第２セット（表３１）では、ＢｓＡｂの時間間隔のほか、除去剤と177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎとの時間間隔も変動させた。177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの注射の２４時間後に全ての動物を犠牲にした。
【０２４５】
表31
【表３１】
2021517564.tif 000059
【０２４６】
群１対群２の比較（表３１）：血液については、群１と群２との間で有意差が見られなかったが、腫瘍については有意差が見られた（Ｐ＝０．００２）。
群１対群３の比較（表３１）：血液については、群１と群３との間で有意差が見られた（Ｐ＝０．０１）が、腫瘍については有意差が見られなかった（Ｐ＝０．０９）。
群１対群４の比較（表３１）：血液については、群１と群４との間で有意差が見られなかったが、腫瘍については有意差が見られた（Ｐ＝０．００５）。
【０２４７】
これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＥＲ２（＋）腫瘍細胞による取込みが、４時間と２４時間の間で、著明に変動しなかったことを裏付ける（表３０を参照されたい）。したがって、これらのデータは、事実上、腫瘍をターゲティングするＢｓＡｂの、平衡腫瘍−血液（血漿）間動態について記載し、同日型ＰＲＩＴ（すなわち、ＢｓＡｂ、除去剤、および放射性標識されたＤＯＴＡの、１日のうちの投与）のための根拠を提示する。さらに、同じ用量の除去剤（６２．５μｇ）を伴う、２４時間の間隔を伴うプレターゲティングを、４時間の間隔を伴うプレターゲティングと比較する場合、124Ｉ−二特異性抗体の血中濃度は、４時間後において、２４時間後におけるより、はるかに高濃度であると推定されるが、腫瘍による取込みと血液による取込みとは同等である（表３０における、群１と、群２とを比較されたい）。
【０２４８】
さらに、２時間の時間間隔を使用してもなお、有効なプレターゲティングが裏付けられた（表３１における群４を参照されたい）。同日プレターゲティングを行い、腫瘍対組織比が大きな（例えば、腫瘍による取込みが緩徐であることが予期される、比較的大型の二特異性抗体を伴うターゲティングにより、内在化標的についての基準比は、腫瘍：血液について、＞５０：１であり、腫瘍：腎臓について、＞１０：１である）、ｉｎ  ｖｉｖｏの薬物動態を、なおも得る能力は、驚くべきものである。
【０２４９】
（実施例３）
６．３  ヒト処置への拡張
かつて、ヒト結腸がんのＡ３３抗原（膜内に固定され、内在化しない抗原）をターゲティングする、放射性抗体の取込みの程度は、腫瘍上の、Ａ３３受容体の量に比例することが決定された（例えば、O’Donoghue JA, et al., 124I-huA33 antibody uptake is driven by A33 antigen concentration in tissues from colorectal cancer patients imaged by immuno-PET. J Nucl Med. 2011 Dec;52(12):1878-85を参照されたい）。この観察は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、抗体取込みの平衡動態と符合し、質量作用の法則が、124Ｉ−ｈｕＡ３３の投与後における、腫瘍内および正常組織内の抗体−抗原相互作用（この場合、ｈｕＡ３３抗体−ＧＰＡ３３抗原間相互作用）の定量的特徴を説明するのに使用されうることを意味する（O’Donoghue JA, et al. 124I-huA33 antibody uptake is driven by A33 antigen concentration in tissues from colorectal cancer patients imaged by immuno-PET. J Nucl Med. 2011 Dec;52(12):1878-85を参照されたい）。この手法が、内在化抗原抗体系に使用されうることは自明ではない。そこで、実験室において、ＨＥＲ２−Ｃ８２５  ＢｓＡｂを使用して、質量作用の法則の、ＢＴ４７４異種移植片上のＨＥＲ２抗原の場合への適用について探索した。
【０２５０】
平衡質量作用の法則から、抗体濃度［Ｌ］および腫瘍受容体濃度［Ｒ］は、
式１：Ｋa＝［ＬＲ］／［Ｌ］×［Ｒ］
であり、抗体が結合した、腫瘍受容体の割合である、［ＬＲ］／［Ｒ］について解くと、
式２：Ｋa×［Ｌ］＝［ＬＲ］／［Ｒ］
であると考えられる。
［Ｌ］は、血漿中で測定され、抗体についてのＫaは既知であるので、飽和度［ＬＲ］／［Ｒ］を計算することができる。
マウス１匹当たり２５０マイクログラム（μｇ）の最終用量における、124Ｉ−抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５の、マウスへの注射の後、腫瘍への初期取込みおよび血液からのクリアランスがなされることが判明した（図１５）。ある特定の時点（Ｔ）において、系は平衡に至り、腫瘍および血漿におけるシグナルは並行して減少し、注射後のこの時点において、血漿中濃度は、１ｍＬ当たりの注射用量の５％であり、これは、１ｍＬ当たり０．０６０ｎＭまたは１Ｌ当たり６０ｎＭへと変換される。
１０9Ｌ／ＭのＫa×６０ｎＭ／Ｌおよび式２を使用すると、２５０μｇ／ｍＬの用量では、［ＬＲ］／［Ｒ］＝６０となる。血液１ｍＬ当たり５％の用量では、２５０μｇは、１．２ｎＭの抗ＨＥＲ２−Ｃ８２５であり、これは、平衡時における約６０ｎＭ／Ｌである。ヒトへと拡大するために、下記では血液の総容量の推定値約５０００ｍＬを使用する。
【０２５１】
いかなる理論にも束縛されずに述べると、受容体の飽和近傍は、腫瘍部位において最大量のハプテン結合能を有するため、ヒトにおけるＨＥＲ２受容体の結合能の飽和（飽和）に近接するのに十分な抗体を有することが所望される。いかなる理論にも束縛されずに述べると、これは、腫瘍内の最大の177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎの取込みをもたらすであろう。除去剤は、血液および他の組織から全ての余分な（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）抗体を除去し、これにより、高治療指数をもたらすのに使用される。
【０２５２】
ヒトの血液容量（約５０００ｍＬ）へと拡大し、マウスの血液容量が約２ｍＬであることを考慮すると、注射される総用量の約２５００倍の増大（ヒトにおける５０００ｍＬの血液／マウスにおける２ｍＬの血液）、すなわち、２５００×２５０マイクログラムにより、ヒトの血漿中の平衡時における等価濃度がもたらされる。これは、［ＲＬ］／［Ｒ］＝６０（９８．４％）を達成するのに注射される、約６２５ｍｇのＨＥＲ２−Ｃ８２５をもたらす。この用量の１／２または３１２．５ｍｇを注射した場合、［ＲＬ］／［Ｒ］＝３０（９７％）となり、１５６．５ｍｇの用量では、［ＲＬ］／［Ｒ］＝１５（９４％）となる。特定の理論に束縛されずに述べると、これらの用量の全ては、受容体への全結合抗体または受容体への結合可能抗体に近接するので、腫瘍部位における二官能性抗体取込みに、ほとんど変化が見られない。これらは、通例投与される用量に極めて近い用量、例えば、治療にほぼ最適であると、経験的に決定されている、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの用量である（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの添付文書を参照されたい；例えば、胃がんでは、例えば、初期注入としての、９０分間にわたる、静脈内８ｍ／ｋｇ、または７０ｋｇの成人に対する、５６０ｍｇ）。
【０２５３】
この全体的知見を下記の実験により確認した。抗体を注射し、次いで、２４時間後に、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｂｎを注射した。マウスでは、腫瘍は、＞１００マイクログラムの用量で最も効果的にターゲティングされた（図１６および１７）。
［Ｒ］は、正確には既知ではない。しかし、１グラム当たりの細胞１０8個を使用して、細胞１個当たり約２１０７７０のＨＥＲ２抗原部位と計算する（平均で、抗体１つ当たり、１つの部位が標識付けされていると仮定する）と、図１７のグラフは、１グラム当たり約３５ｐｍｏｌである、「ｂｍａｘ」である［Ｒ］の粗推定値をもたらしうる。
【０２５４】
図２に、二官能性ＨＥＲ２−Ｃ８２５抗体の、ＢＴ４７４腫瘍への取込みの時間経過を示す。注射の４時間後までに取込みはほぼ最大となることから、除去剤による抗体クリアランスの過程を開始し、Ｌｕ１７７−ＤＯＴＡ−Ｂｎを注射して、二官能性抗体を腫瘍へとターゲティングするのに長時間待つ必要がない場合があることが示唆される。特定の理論に束縛されずに述べると、試薬の全ては１日のうちに容易に投与することができ、腫瘍：血液および腫瘍：肝臓についてのＴＩ、ならびに腫瘍内の絶対取込みが、この実験では、１０時間後において観察される、最高レベルの８０％以内のレベルで維持されるため、この時間は臨床適用に最適でありうる（表３２を参照されたい）。この取込みレベルではマウスにおける治癒が見られ、ＴＩは、２つの最重要臓器である、血液および腎臓に対して保護的である。この場合、膜のＨＥＲ２に結合している二重特異性結合因子により捕捉された、177Ｌｕ放射性金属は取り込まれ、放射性金属は腫瘍組織内に捕捉されるため、抗体−抗原の内在化は有用である可能性が高い。
【０２５５】
表32
【表３２】
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【０２５６】
高ＴＩを達成するのにはまた、除去剤も不可欠であることにも注目されたい。ＨＥＲ２発現腫瘍保有マウスにＢｓＡｂを４時間にわたり施し、次いで、除去剤（「ＣＡ」）媒体だけを施した場合（このため、ＢｓＡｂの全循環時間は、８時間であった；表３３を参照されたい）、腫瘍によるＬｕ１７７−ＤＯＴＡ−Ｂｎの取込みは約４０ＩＤ／ｇ％で、例外的であったが、血液による取込みもまた高度であった（１２．０７ＩＤ／ｇ％）ことから、この腫瘍：血液比（約３．２）は低ＴＩをもたらすことが示唆される。
【０２５７】
表33
【表３３】
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したがって、良好なＴＩを伴う、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける優れた局在についてのこのデータに基づき、ＤＯＴＡ−ＰＲＩＴ法は抗ＨＥＲ２抗体などの内在化抗体へと適用することができ、拡張によりＰＳＭＡ−Ｊ５９１（抗前立腺がん特異性膜抗原抗体）および除去剤であるＩＸ−ｃＧ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ抗体）へも適用しうる。
【０２５８】
７．均等物
本発明は、本明細書で記載される具体的な実施形態により範囲が限定されないものとする。実際、当業者には、前出の記載および添付の図から記載される実施形態に加えた、本発明の多様な改変が明らかとなろう。このような改変は付属の特許請求の範囲内に収まることが意図される。
【０２５９】
本明細書で引用される、全ての参考文献は、各個別の刊行物または特許もしくは特許出願が、具体的、かつ、個別に、全ての目的で、参照によりその全体において組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照によりその全体において、かつ、全ての目的で本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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