(57)【要約】  本発明は、第１の標的抗原（例えば、ＣＤ３などのＴ細胞抗原）に特異的な一価のアーム、及び、第２の標的抗原（例えば、ＨＥＲ２などの腫瘍抗原）に特異的な二価のアームを有する二重特異性抗原結合分子を提供する。二重特異性抗原結合分子は、癌（例えばＨＥＲ２陽性癌）などの障害の処置に有用である。本発明はまた、二重特異性抗原結合分子の作製方法、二重特異性抗原結合分子を使用する障害の処置方法、及び、二重特異性抗原結合分子を含む組成物を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）  前記一価のアームが第１の抗原結合部分を含み、前記第１の抗原結合部分のＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、
（ｂ）  前記二価のアームが第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分を含み、前記第３の抗原結合部分のＣ末端が前記第２の抗原結合部分のＮ末端に融合しており、前記第２の抗原結合部分のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、かつ
（ｃ）  前記第１のＦｃサブユニットが前記第２のＦｃサブユニットと会合して、Ｆｃドメインを形成し、
前記第１の抗原結合部分がＣＤ３に特異的に結合可能であり、前記第２の抗原結合部分及び前記第３の抗原結合部分がそれぞれ、ＨＥＲ２に特異的に結合可能である、二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
前記第２及び第３の抗原結合部分がＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
前記第２の抗原結合部分及び前記第３の抗原結合部分のそれぞれの一価の結合親和性（ＫＤ）が１０ｎＭ〜１００ｎＭである、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
前記第２の抗原結合部分及び前記第３の抗原結合部分のそれぞれの一価のＫＤが、２０ｎＭ〜５０ｎＭである、請求項３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
前記第２の抗原結合部分及び／又は前記第３の抗原結合部分の一価の解離速度が、１０−３／秒〜１０−１秒である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
前記第２の抗原結合部分及び前記第３の抗原結合部分のそれぞれの一価の解離速度が、１０−２／秒〜３０−２／秒である、請求項５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
前記第１の抗原結合部分の一価のＫＤが１０ｎＭ〜１００ｎＭである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
前記第１の抗原結合部分の一価のＫＤが２０ｎＭ〜８０ｎＭである、請求項７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
前記第１の抗原結合部分の一価のＫＤが４０ｎＭ〜６０ｎＭである、請求項８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
表面プラズモン共鳴を使用して測定した、前記第２の抗原結合部分の一価のＫＤが、Ｆａｂフォーマットにおける前記第２の抗原結合部分のＫＤであり、表面プラズモン共鳴を使用して測定した、前記第３の抗原結合部分の一価のＫＤが、Ｆａｂフォーマットにおける前記第３の抗原結合部分のＫＤである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
前記第１の抗原結合部分が、可変重鎖（ＶＨＡ）領域及び可変軽鎖（ＶＬＡ）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＡ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
前記第２の抗原結合部分が、可変重鎖（ＶＨＢ１）領域及び可変軽鎖（ＶＬＢ１）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＢ１）であり、かつ／又は、前記第３の抗原結合部分が、可変重鎖（ＶＨＢ２）領域及び可変軽鎖（ＶＬＢ２）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＢ２）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
前記第１の抗原結合部分が、ＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含むＦａｂＡであり、前記第２の抗原結合部分が、ＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含むＦａｂＢ１であり、前記第３の抗原結合部分が、ＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含むＦａｂＢ２である、請求項１２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
（ａ）前記ＶＨＢ１及び前記ＶＨＢ２が少なくとも９５％の配列同一性を共有している、（ｂ）前記ＶＬＢ１及び前記ＶＬＢ２が少なくとも９５％の配列同一性を共有している、又は、（ｃ）前記ＶＨＢ１及び前記ＶＨＢ２が少なくとも９５％配列同一性を共有しており、かつ、前記ＶＬＢ１及び前記ＶＬＢ２が少なくとも９５％の配列同一性を共有している、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
前記ＶＨＢ１領域及び／又は前記ＶＨＢ２領域が、Ｋａｂａｔの付番システムに従った、Ｎ５４、Ｄ９８、Ｆ１００、及び／又はＹ１０２の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つ全ての残基において、アミノ酸置換を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
前記ＶＨＢ１領域及び／又は前記ＶＨＢ２領域が、以下の残基：Ｋａｂａｔの付番システムに従ったＮ５４Ｅ、Ｄ９８Ａ、Ｄ９８Ｔ、Ｆ１００Ａ、及び／又はＹ１０２Ｖの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全てにおけるアミノ酸置換を含む、請求項１５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
前記ＶＬＢ１領域及び／又は前記ＶＬＢ２領域が、Ｋａｂａｔの付番システムに従った、Ｎ３０、Ｙ５５、及び／又はＨ９１の少なくとも１つ、２つ、又は３つ全ての残基において、アミノ酸置換を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
前記ＶＬＢ１領域及び／又は前記ＶＬＢ２領域が、以下の残基：Ｎ３０Ｓ、Ｙ５５Ｅ、及び／又はＨ９１Ａの１つ、２つ、又は３つ全てにおいて、アミノ酸置換を含む、請求項１７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
前記ＶＨＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
前記ＶＬＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
前記ＶＬＢ１領域が、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
前記ＶＬＢ１領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
前記ＶＨＢ１が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ１が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号２４のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
前記ＶＨＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
前記ＶＬＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
前記ＶＬＢ２領域が、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
前記ＶＬＢ２領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
前記ＶＨＢ２が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ２が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜３３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号２４のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３７】
前記ＶＬＢ１領域及び／又は前記ＶＬＢ２領域が、１つ以上の易罹病性固定残基を含む、請求項１２〜３６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３８】
前記１つ以上の易罹病性固定残基がＮ３０Ｓのアミノ酸置換を含む、請求項３７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３９】
前記ＶＨＢ１領域及び／又は前記ＶＨＢ２領域が、１つ以上の易罹病性固定残基を含む、請求項１２〜３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４０】
前記１つ以上の易罹病性固定残基が、Ｎ５４Ｅ、Ｄ９８Ａ、及びＤ９８Ｔからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項３９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４１】
前記ＶＨＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４２】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は４１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４３】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４４】
前記ＶＬＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は４１〜４３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４５】
前記ＶＬＢ１領域が、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は４１〜４４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４６】
前記ＶＬＢ１領域が配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４７】
前記ＶＨＢ１が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ１が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は４１〜４６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４８】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は４１〜４７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４９】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号３３のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５０】
前記ＶＨＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は４１〜４９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５１】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は４１〜５０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５２】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５３】
前記ＶＬＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は４１〜５２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５４】
前記ＶＬＢ２領域が、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は４１〜５３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５５】
前記ＶＬＢ２領域が配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５６】
前記ＶＨＢ２が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ２が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は４１〜５５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５７】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は４１〜５６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５８】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号３３のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５９】
前記ＶＨＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６０】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は５９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６１】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６２】
前記ＶＬＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は５９〜６１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６３】
前記ＶＬＢ１領域が、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は５９〜６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６４】
前記ＶＬＢ１領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６５】
前記ＶＨＢ１が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ１が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は５９〜６４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６６】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は５９〜６５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６７】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号４１のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６８】
前記ＶＨＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は５９〜６７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６９】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は５９〜６８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７０】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７１】
前記ＶＬＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は５９〜７０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７２】
前記ＶＬＢ２領域が、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は５９〜７１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７３】
前記ＶＬＢ２領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７４】
前記ＶＨＢ２が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ２が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１７、又は５９〜７３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７５】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は５９〜７４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７６】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号４１のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７７】
前記ＶＨＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７８】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は７７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７９】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８０】
前記ＶＬＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は７７〜７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８１】
前記第２の抗原結合部分の前記ＶＬ領域が、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は７７〜８０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８２】
前記ＶＬＢ１領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項８１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８３】
前記ＶＨＢ１が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ１が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は７７〜８２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８４】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は７７〜８３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８５】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号４４のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８６】
前記ＶＨＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は７７〜８５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８７】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は７７〜８６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８８】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項８７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８９】
前記ＶＬＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は７７〜８８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９０】
前記ＶＬＢ２領域が、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は７７〜８９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９１】
前記ＶＬＢ２領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９２】
前記ＶＨＢ２が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ２が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は７７〜９１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９３】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は７７〜９２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９４】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号４４のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９５】
前記ＶＨＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９６】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は９５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９７】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項９６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９８】
前記ＶＬＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は９５〜９７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９９】
前記ＶＬＢ１領域が、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は９５〜９８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１００】
前記ＶＬＢ１領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項９９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０１】
前記ＶＨＢ１が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ１が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は９５〜１００のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０２】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は９５〜１０１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０３】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号４１のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１０２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０４】
前記ＶＨＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は９５〜１０３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０５】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は９５〜１０４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０６】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１０５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０７】
前記ＶＬＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は９５〜１０６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０８】
前記ＶＬＢ２領域が、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は９５〜１０７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０９】
前記ＶＬＢ２領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１０８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１０】
前記ＶＨＢ２が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ２が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は９５〜１０９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１１】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は９５〜１１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１２】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号４１のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１１１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１３】
前記ＶＨＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１４】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は１１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１５】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１１４に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１６】
前記ＶＬＢ１領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１７】
前記ＶＬＢ１領域が、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１８】
前記ＶＬＢ１領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１１７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１９】
前記ＶＨＢ１が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ１が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２０】
前記ＶＨＢ１領域が、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２１】
前記ＶＨＢ１領域が配列番号４４のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１２０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２２】
前記ＶＨＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２３】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２４】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１２３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２５】
前記ＶＬＢ２領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２６】
前記ＶＬＢ２領域が、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２７】
前記ＶＬＢ２領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１２６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２８】
前記ＶＨＢ２が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＢ２が以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２９】
前記ＶＨＢ２領域が、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１８、又は１１３〜１２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３０】
前記ＶＨＢ２領域が配列番号４１のアミノ酸を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項１２９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３１】
前記ＶＨＡ領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は
（ｃ）  配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１１〜１３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３２】
前記ＶＨＡ領域が、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３３】
前記ＶＨＡ領域が配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１３２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３４】
前記ＶＬＡ領域が以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｂ）  配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は
（ｃ）  配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
の１つ、２つ、又は３つ全てを含む、請求項１１〜１３３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３５】
前記ＶＬＡ領域が、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３６】
前記ＶＬＡ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１３５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３７】
前記ＶＨＡが以下のＨＶＲ：
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）  配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
（ｃ）  配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含み、
前記ＶＬＡが以下のＨＶＲ：
（ｄ）  配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）  配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）  配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、請求項１１〜１３６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３８】
前記ＶＨＡ領域が、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡ領域が、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１３７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３９】
前記ＶＨＡ領域が配列番号７のアミノ酸を含み、前記ＶＬＡ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１３８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４０】
一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）  前記一価のアームがＦａｂＡを含み、前記ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｂ）  前記二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、前記ＦａｂＢ２のＣ末端が前記ＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１及び前記ＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｃ）  前記第１のＦｃサブユニットは前記第２のＦｃサブユニットと会合して、Ｆｃドメインを形成する、
二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４１】
（ａ）  前記ＦａｂＡがＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、前記ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡは、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＦａｂＢ１がＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、前記ＶＨＢ１は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）  前記ＦａｂＢ２がＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、前記ＶＨＢ２は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１４０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４２】
（ａ）  前記ＶＨＡ領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＶＨＢ１領域が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｃ）  前記ＶＨＢ２領域が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含む、
請求項１４１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４３】
一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）  前記一価のアームがＦａｂＡを含み、前記ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｂ）  前記二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、前記ＦａｂＢ２のＣ末端が前記ＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１及び前記ＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｃ）  前記第１のＦｃサブユニットは前記第２のＦｃサブユニットと会合して、Ｆｃドメインを形成する、
二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４４】
（ａ）  前記ＦａｂＡがＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、前記ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡは、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＦａｂＢ１がＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、前記ＶＨＢ１は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）  前記ＦａｂＢ２がＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、前記ＶＨＢ２は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１４３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４５】
（ａ）  前記ＶＨＡ領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＶＨＢ１領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｃ）  前記ＶＨＢ２領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号２５のアミノ酸配列を含む、
請求項１４４に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４６】
一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）  前記一価のアームがＦａｂＡを含み、前記ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＡ  が以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｂ）  前記二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、前記ＦａｂＢ２のＣ末端が前記ＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１及び前記ＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｃ）  前記第１のＦｃサブユニットは前記第２のＦｃサブユニットと会合して、Ｆｃドメインを形成する、
二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４７】
（ａ）  前記ＦａｂＡがＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、前記ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡは、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＦａｂＢ１がＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、前記ＶＨＢ１は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）  前記ＦａｂＢ２がＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、前記ＶＨＢ２は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１４６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４８】
（ａ）  前記ＶＨＡ領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＶＨＢ１領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｃ）  前記ＶＨＢ２領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、
請求項１４７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４９】
一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）  前記一価のアームがＦａｂＡを含み、前記ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｂ）  前記二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、前記ＦａｂＢ２のＣ末端が前記ＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１及び前記ＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｃ）  前記第１のＦｃサブユニットは前記第２のＦｃサブユニットと会合して、Ｆｃドメインを形成する、
二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５０】
（ａ）  前記ＦａｂＡがＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、前記ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡは、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＦａｂＢ１がＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、前記ＶＨＢ１は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）  前記ＦａｂＢ２がＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、前記ＶＨＢ２は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１４９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５１】
（ａ）  前記ＶＨＡ領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＶＨＢ１領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｃ）  前記ＶＨＢ２領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、
請求項１５０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５２】
一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）  前記一価のアームがＦａｂＡを含み、前記ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｂ）  前記二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、前記ＦａｂＢ２のＣ末端が前記ＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１及び前記ＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｃ）  前記第１のＦｃサブユニットは前記第２のＦｃサブユニットと会合して、Ｆｃドメインを形成する、
二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５３】
（ａ）  前記ＦａｂＡがＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、前記ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡは、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＦａｂＢ１がＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、前記ＶＨＢ１は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）  前記ＦａｂＢ２がＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、前記ＶＨＢ２は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１５２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５４】
（ａ）  前記ＶＨＡ領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＶＨＢ１領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｃ）  前記ＶＨＢ２領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、
請求項１５３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５５】
一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）  前記一価のアームがＦａｂＡを含み、前記ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｂ）  前記二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、前記ＦａｂＢ２のＣ末端が前記ＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、前記ＦａｂＢ１及び前記ＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：
（ｉ）  配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）  配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）  配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）  配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）  配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含み、
（ｃ）  前記第１のＦｃサブユニットは前記第２のＦｃサブユニットと会合して、Ｆｃドメインを形成する、
二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５６】
（ａ）  前記ＦａｂＡがＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、前記ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡは、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＦａｂＢ１がＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、前記ＶＨＢ１は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）  前記ＦａｂＢ２がＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、前記ＶＨＢ２は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１５５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５７】
（ａ）  前記ＶＨＡ領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＡ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）  前記ＶＨＢ１領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ１領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、かつ
（ｃ）  前記ＶＨＢ２領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬＢ２領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む、
請求項１５６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５８】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項１〜１５７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５９】
前記ＩｇＧ  ＦｃドメインがＩｇＧ１又はＩｇＧ４Ｆｃドメインである、請求項１５８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６０】
前記ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項１〜１５９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６１】
前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、かつ／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１６０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６２】
Ｆｃ受容体への結合を低下させる、かつ／又はエフェクター機能を低下させる前記１つ以上のアミノ酸置換がＮ２９７に存在する、請求項１６１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６３】
前記第１のＦｃサブユニット及び前記第２のＦｃサブユニットがそれぞれ、Ｎ２９７Ｇのアミノ酸置換を含む、請求項１６２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６４】
前記Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項１６１〜１６３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６５】
前記エフェクター機能が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項１６１〜１６４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６６】
前記Ｆｃドメインが、前記第１のＦｃサブユニットの前記第２のＦｃサブユニットとの会合を促進するように構成された改変を含む、請求項１〜１６５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６７】
前記第２のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より大きなサイズの側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、前記第１のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内の空洞に位置可能な前記第２のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内に突出部を生成し、前記第１のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より小さなサイズの側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、前記第２のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内の前記突出部が位置可能な前記第１のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する、請求項１６６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６８】
前記第２のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６のアミノ酸置換を含み、前記第１のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及び／又はＹ４０７の１つ、２つ、又は３つ全てのアミノ酸置換を含む、請求項１６７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６９】
前記第２のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｗのアミノ酸置換を含み、前記第１のＦｃサブユニットの前記ＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖの１つ、２つ、又は３つ全てのアミノ酸置換を含む、請求項１６８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７０】
前記第３の抗原結合部分の前記Ｃ末端が、ペプチドリンカーを介して前記第２の抗原結合部分の前記Ｎ末端に融合している、請求項１〜１６９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７１】
前記ペプチドリンカーが５〜２０アミノ酸長である、請求項１７０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７２】
前記ペプチドリンカーが配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項１７１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７３】
前記抗原結合分子が、配列番号５３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７４】
前記抗原結合分子が、配列番号５７、６１、８１、８３、８５、及び８７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７５】
前記抗原結合分子が、配列番号５７、６１、８１、８３、８５、及び８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１７４に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７６】
前記ペプチドリンカーが配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項１７５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７７】
前記抗原結合分子が、配列番号５６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７８】
前記抗原結合分子が、配列番号５８、６２、８２、８４、８６、及び８８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７７に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７９】
前記抗原結合分子が、配列番号５８、６２、８２、８４、８６、及び８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１７８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８０】
請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸。
【請求項１８１】
請求項１８０に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項１８２】
請求項１８０に記載の単離核酸、又は請求項１８１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８３】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１８２に記載の宿主細胞。
【請求項１８４】
前記哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１８３に記載の宿主細胞。
【請求項１８５】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１８４に記載の宿主細胞。
【請求項１８６】
前記原核細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１８５に記載の宿主細胞。
【請求項１８７】
請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子の作製方法であって、請求項１８２〜１８６のいずれか一項に記載の宿主細胞を培地で培養することを含む、方法。
【請求項１８８】
前記方法が、前記宿主細胞又は前記培地から前記二重特異性抗原結合分子を回収することを更に含む、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸のセット。
【請求項１９０】
ベクターのセットであって、前記セットの各ベクターが、請求項１８９に記載の単離核酸のセットの単離核酸を含む、ベクターのセット。
【請求項１９１】
宿主細胞のセットであって、前記セットの各宿主細胞が、請求項１８９に記載の単離核酸のセットの単離核酸、又は請求項１９０に記載のベクターのセットのベクターを含む、宿主細胞のセット。
【請求項１９２】
前記宿主細胞が哺乳類細胞を含む、請求項１９１に記載の宿主細胞のセット。
【請求項１９３】
前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１９２に記載の宿主細胞のセット。
【請求項１９４】
前記宿主細胞が原核細胞を含む、請求項１９１に記載の宿主細胞のセット。
【請求項１９５】
前記原核細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１９４に記載の宿主細胞のセット。
【請求項１９６】
請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子の作製方法であって、請求項１９１〜１９５のいずれか一項に記載の宿主細胞のセットを培地で培養することを含む、方法。
【請求項１９７】
前記方法が、前記宿主細胞又は前記培地のセットから前記二重特異性抗原結合分子を回収することを更に含む、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、及び細胞毒性剤を含む免疫抱合体。
【請求項１９９】
請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を含む組成物。
【請求項２００】
薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を更に含む、請求項１９９に記載の組成物。
【請求項２０１】
前記組成物が医薬組成物である、請求項１９９又は２００に記載の組成物。
【請求項２０２】
前記組成物がＰＤ−１軸結合アンタゴニスト又は追加の治療剤を更に含む、請求項１９９〜２０１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０３】
薬剤として使用するための、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０４】
ＨＥＲ２陽性癌の処置又は進行の遅延を必要とする対象における、ＨＥＲ２陽性癌の処置又は進行の遅延に使用するための、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０５】
ＨＥＲ２陽性癌を有する対象における免疫機能の増強に使用するための、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０６】
前記ＨＥＲ２陽性癌が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、頭頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、グリア芽腫、子宮体癌、及び骨肉腫からなる群から選択される、請求項２０５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０７】
前記ＨＥＲ２陽性癌が、細胞１個当たり２００，０００コピー以上の平均コピー数にてＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を特徴とする、請求項２０４〜２０６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０８】
ＨＥＲ２陽性癌の処置、又は進行の遅延用の薬剤の製造における、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項２０９】
ＨＥＲ２陽性癌を有する対象における、免疫機能を増強するための薬剤の製造における、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項２１０】
前記ＨＥＲ２陽性癌が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、頭頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、グリア芽腫、子宮体癌、及び骨肉腫からなる群から選択される、請求項２０８又は２０９に記載の使用。
【請求項２１１】
前記ＨＥＲ２陽性癌が、細胞１個当たり２００，０００コピー以上の平均コピー数にてＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を特徴とする、請求項２０８〜２１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１２】
ＨＥＲ２陽性癌の処置又は進行の遅延を必要とする対象における、ＨＥＲ２陽性癌の処置又は進行の遅延方法であって、前記対象に、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を投与することを含む、方法。
【請求項２１３】
ＨＥＲ２陽性癌を有する対象における免疫機能の増強方法であって、前記対象に、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を投与することを含む、方法。
【請求項２１４】
前記ＨＥＲ２陽性癌が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、頭頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、グリア芽腫、子宮体癌、及び骨肉腫からなる群から選択される、請求項２１２又は２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記ＨＥＲ２陽性癌が、細胞１個当たり２００，０００コピー以上の平均コピー数にてＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を特徴とする、請求項２１２〜２１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
ＨＥＲ２陽性癌の処置又は進行の遅延を必要とする対象における、ＨＥＲ２陽性癌の処置又は進行の遅延方法であって、前記方法が、
（ａ）  細胞１個当たり２００，０００コピー以上の平均コピー数にてＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞における、ＨＥＲ２の発現を測定することと、
（ｂ）  前記対象に、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を投与することと、
（ｃ）  を含む、方法。
【請求項２１７】
ＨＥＲ２陽性癌を有する対象における免疫機能の増強方法であって、前記方法が、
（ａ）  細胞１個当たり２００，０００コピー以上の平均コピー数にてＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞における、ＨＥＲ２の発現を測定することと、
（ｂ）  前記対象に、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を投与することと、
を含む、方法。
【請求項２１８】
前記ＨＥＲ２陽性癌が、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、頭頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、グリア芽腫、子宮体癌、及び骨肉腫からなる群から選択される、請求項２１６又は２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
前記二重特異性抗原結合分子が、前記対象に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項２１２〜２１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２０】
前記二重特異性抗原結合分子が、前記対象に約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記二重特異性抗原結合分子が、前記対象に約１ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記対象にＰＤ−１軸結合アンタゴニスト及び／又は追加の治療剤を投与することを更に含む、請求項２１２〜２２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２３】
前記ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト又は追加の治療剤が、前記二重特異性抗原結合分子の前記投与前に、又はこの後に投与される、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
前記ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト追加の治療剤が、前記二重特異性抗原結合分子と同時に投与される、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２５】
前記ＰＤ−１軸結合アンタゴニストがＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、及びＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストからなる群から選択される、請求項２１２〜２２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２６】
前記ＰＤ−１軸結合アンタゴニストがＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストである、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
前記ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストがＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）からなる群から選択される、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記ＰＤ−１軸結合アンタゴニストがＰＤ−１結合アンタゴニストである、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２９】
前記ＰＤ−１結合アンタゴニストがＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペムブロリズマブ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１（スパルタリズマブ）、ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ）、及びＢＧＢ−１０８からなる群から選択される、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記ＰＤ−１軸結合アンタゴニストがＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストである、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３１】
前記ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストが抗体又はイムノアドヘシンである、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３２】
前記二重特異性抗原結合分子が、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経口投与、経皮投与、腹腔内投与、眼窩内投与、移植投与、吸入投与、髄腔内投与、心室内投与、又は経鼻投与される、請求項２１２〜２３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記二重特異性抗原結合分子が皮下投与される、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記二重特異性抗原結合分子が静脈内投与される、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３５】
前記対象がヒトである、請求項２１２〜２３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３６】
（ａ）  請求項１９９〜２０２のいずれか一項に記載の組成物と、
（ｂ）  前記組成物を対象に投与して、ＨＥＲ２陽性癌を処置、又はその進行を遅延するための取扱説明書を含む添付文書と、
を含むキット。
【請求項２３７】
前記ＨＥＲ２陽性癌が、細胞１個当たり２００，０００コピー以上の平均コピー数にてＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を特徴とする、請求項２３６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式にて電子的に提出されており、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年２月６日に作製した上記ＡＳＣＩＩのコピーは、名前が５０４７４−１６２ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿０２．０６．１９＿ＳＴ２５であり、サイズが２９３，６４５バイトである。
【０００２】
本発明は概して、二重特異性抗原結合分子、その組成物、及び、癌などの疾患の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
患者の特定の細胞型間での、細胞どうしの接触を操作することは、様々な病状を処置するための有望なアプローチを示している。例えば、それぞれが異なる標的抗原に特異的な２つのアームを有する二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）は、免疫細胞を標的細胞と接触させるための能力の開発が行われている。このような二重特異性抗体は、癌などの様々な障害での有望性を示しており、強力な腫瘍標的細胞の免疫媒介殺傷が、臨床試験で観察されている。腫瘍特異性を付与するために、二重特異性抗体の腫瘍標的化アームが、腫瘍細胞で過剰発現する抗原を標的とするように設計されている。
【０００４】
既存の二重特異性抗体は、健全な組織に対する短い半減期及び毒性を含む、いくつかの制限を有する可能性がある。標的抗原の腫瘍細胞過剰発現に依存する二重特異性抗体は多くの場合、健全で、通常量の抗原を発現する非腫瘍細胞を殺傷する。このような、オンターゲット・オフ腫瘍効果は、対象が許容する最大投与量を制限することにより、二重特異性抗体の治療指数を制限する。したがって、当分野においては、標的細胞又は組織に対する選択性が向上した、二重特異性抗原結合分子（例えば二重特異性抗体）の開発に対する、満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一価のアーム及び二価のアームを有する二重特異性抗原結合分子（例えば、一価のアーム及び二価のアームを有するＴ細胞依存性二重特異性（ＴＤＢ）抗体に関する。
【０００６】
一態様では、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームが第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分のＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、（ｂ）二価のアームが第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分を含み、第３の抗原結合部分のＣ末端が第２の抗原結合部分のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に縮合しており、かつ（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成し、第１の抗原結合部分が第１の標的抗原に特異的に結合可能であり、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分がそれぞれ、第２の標的細胞抗原に特異的に結合可能である、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、第１の標的抗原は、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原であり、かつ／又は、第２の標的細胞抗原は腫瘍抗原（例えばＨＥＲ２）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、（ａ）対象の腫瘍細胞にて、及び（ｂ）対象の、少なくとも一種の非腫瘍細胞にて発現する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞に対する非腫瘍細胞の、腫瘍抗原コピー数の比は、１：１０〜１：１，０００（例えば１：１００〜１：２００）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原コピー数は、非腫瘍細胞にて１０２〜１０５個、そして、腫瘍細胞にて１０３〜１０７個である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞（例えば、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞）での腫瘍抗原コピー数（例えば、平均の腫瘍抗原コピー数、例えばＨＥＲ２コピー数、例えば平均のＨＥＲ２コピー数）は、細胞１個当たり、１０５より大きい（例えば細胞１個当たり１０５〜１０７個、又は、細胞１個当たり１０５〜１０６個）いくつかの実施形態では、腫瘍抗原コピー数（例えば、平均の腫瘍抗原コピー数、例えばＨＥＲ２コピー数、例えば平均のＨＥＲ２コピー数）は、腫瘍細胞（例えば、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞）１個当たり２００，０００個以上である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原コピー数（例えば、平均の腫瘍抗原コピー数、例えばＨＥＲ２コピー数、例えば平均のＨＥＲ２コピー数）は、非腫瘍細胞（例えば、非癌性細胞、例えば健常な細胞）１個当たり２００，０００個以下である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分及び／又は第３の抗原結合部分の一価の結合親和性（ＫＤ）は、１０ｎＭ〜１００ｎＭ（例えば、２０ｎＭ〜９０ｎＭ、３０ｎＭ〜８０ｎＭ、４０ｎＭ〜６０ｎＭ、例えば２５ｎＭ〜５５ｎＭ）である。一実施形態では、第２の抗原結合部分及び／又は第３の抗原結合部分の一価の結合親和性（ＫＤ）は、２０ｎＭ〜５０ｎＭである。一実施形態では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の一価の結合親和性（ＫＤ）は、２０ｎＭ〜５０ｎＭである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分の一価のＫＤは、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴）を使用して測定した、Ｆａｂフォーマットにおける第２の抗原結合部分のＫＤであり、第３の抗原結合部分の一価のＫＤは、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴）を使用して測定した、Ｆａｂフォーマットにおける第３の抗原結合部分のＫＤである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分及び／又は第３の抗原結合部分の一価の解離速度は、１０−３／秒〜１０−１／秒（例えば、１０−２／秒〜３０−２／秒）である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分の一価のＫＤは、１０ｎＭ〜１００ｎＭ（例えば、２０ｎＭ〜９０ｎＭ、２０ｎＭ〜８０ｎＭ、３０ｎＭ〜７０ｎＭ、又は４０ｎＭ〜６０ｎＭ）である。
【００１２】
上記実施形態のいずれかにおいて、第１の抗原結合部分は、可変重鎖（ＶＨＡ）領域及び可変軽鎖（ＶＬＡ）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＡ）であることができ、第２の抗原結合部分は、可変重鎖（ＶＨＢ１）領域及び可変軽鎖（ＶＬＢ１）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＢ１）であり、かつ／又は、第３の抗原結合部分は、可変重鎖（ＶＨＢ２）領域及び可変軽鎖（ＶＬＢ２）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＢ２）である。したがって、いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含むＦａｂＡであり、第２の抗原結合部分はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含むＦａｂＢ１であり、第３の抗原結合部分は、ＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含むＦａｂＢ２である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及びＶＨＢ２は、少なくとも９５％の配列同一性を共有している。加えて、又はあるいは、ＶＬＢ１及びＶＬＢ２は、少なくとも９５％の配列同一性を共有している。加えて、又はあるいは、ＶＨＢ１及びＶＨＢ２は、少なくとも９５％の配列同一性を共有しており、かつ／又は、ＶＬＢ１及びＶＬＢ２は、少なくとも９５％の配列同一性を共有している。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、Ｋａｂａｔの付番システムに従った、Ｎ５４、Ｄ９８、Ｆ１００、及び／又はＹ１０２の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つ全ての残基において、アミノ酸置換を含む。例えば、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、以下の残基：Ｋａｂａｔの付番システムに従った、Ｎ５４Ｅ、Ｄ９８Ａ、Ｄ９８Ｔ、Ｆ１００Ａ、及び／又はＹ１０２Ｖの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全てにおけるアミノ酸置換を特徴とし得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｋａｂａｔの付番システムに従った、Ｎ３０、Ｙ５５、及び／又はＨ９１の少なくとも１つ、２つ、又は３つ全ての残基において、アミノ酸置換を含む。例えば、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、以下の残基：Ｎ３０Ｓ、Ｙ５５Ｅ、及び／又はＨ９１Ａの１つ、２つ、又は３つ全てにおけるアミノ酸置換を特徴とし得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号１７のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号１７のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｈ９１にアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｈ９１残基が、無極性側鎖を有するアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１  領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｈ９１Ａのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｙ５５にアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｙ５５残基が、酸性側鎖を有するアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｙ５５Ｅのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、Ｆ１００及び／又はＹ１０２にアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆ１００残基及び／又はＹ１０２残基が、無極性側鎖を有するアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、Ｆ１００Ａ及び／又はＹ１０２Ｖのアミノ酸置換を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、１つ以上の易罹病性固定残基、例えば、Ｎ３０Ｓのアミノ酸置換を含む１つ以上の易罹病性固定残基を含む。加えて、又はあるいは、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、１つ以上の易罹病性固定残基、例えば、Ｎ５４Ｅ、Ｄ９８Ａ、及びＤ９８Ｔからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換基を含む、１つ以上の易罹病性固定残基を特徴とし得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号２４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号２４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号３３のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号３３のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号４４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号４４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号４４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、上記実施形態のいずれかの二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＡ領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＡ領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＡ領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＡ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＶＨＡは、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＡは、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００４８】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
更に別の態様では、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメイン、及び２つの４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ  ＨＥＲ２結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００５３】
更に別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメイン、及び２つの４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ  ＨＥＲ２結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００５４】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメイン、及び２つの４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ  ＨＥＲ２結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【００５５】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃドメイン）である。Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインであることができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、かつ／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、かつ／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９からなる群から選択される１つ以上の位置におけるものである（例えば、第１のＦｃサブユニット及び第２のＦｃサブユニットはそれぞれ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇのアミノ酸置換を含む）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、かつ／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、Ｎ２９７におけるものである（例えば、Ｎ２９７Ｇ）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
【００５６】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、第１のＦｃサブユニットの第２のＦｃサブユニットとの会合を促進するように構成された改変を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より大きなサイズの側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置可能な第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突出部を生成し、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より小さなサイズの側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突出部が位置可能な第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６のアミノ酸置換を含み、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及び／又はＹ４０７の１つ、２つ、又は３つ全てにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインはＴ３６６Ｗのアミノ酸置換を含み、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖの１つ、２つ、又は３つ全てのアミノ酸置換を含む。
【００５７】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、第３の抗原結合部分のＣ末端は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分のＮ末端に融合している。ペプチドリンカーは、５〜２０アミノ酸長（例えば、５〜１０、１０〜１５、又は１５〜２０、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸長）であることができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは配列番号５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号５５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号５５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号５５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号５５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号５５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号５５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号５９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号５９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号５９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号５９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号５９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号５９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号６３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号６３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号６３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号６３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号６３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号５６に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号５６に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号５６に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号５６に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号５６に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号５６に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号６０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号６０に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号６０に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６０に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号６０に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号６０に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号６４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号６４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号６４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号６４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号６４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８６に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８６に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８６に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８６に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８６に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８６に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号９０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号９０に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号９０に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号９０に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号９０に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号９０に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【００６０】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸を特徴とする。
【００６１】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【００６２】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸を含むベクターを含む宿主細胞（例えば、単離宿主細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）である。別の実施形態において、宿主細胞は原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）である。
【００６３】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子の作製方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、培地内で、上述した宿主細胞のいずれか（例えば、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸を含むベクターを含む宿主細胞）を培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、宿主細胞又は培地から二重特異性抗原結合分子を回収することを更に含む。
【００６４】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸のセット（例えば、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の単離核酸を含むセット）を特徴とする。いくつかの実施形態では、単離核酸のセットは、第１の単離核酸及び第２の単離核酸を含み、第１の単離核酸は、二重特異性抗原結合分子の第１アームの１つ以上のアミノ酸配列をコードし、第２の単離核酸は、二重特異性抗原結合分子の第２アームの１つ以上のアミノ酸配列をコードする。
【００６５】
別の態様において、本発明は、ベクターのセットを提供し、セットの各ベクターは、単離核酸のセットの単離核酸を含み、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸のセット（例えば、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の単離核酸を含むセット）。
【００６６】
別の態様において、本発明は、宿主細胞のセット（例えば、単離宿主細胞のセット）を提供する。いくつかの実施形態では、セットの各宿主細胞は、単離核酸のセットの単離核酸を含み、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸のセット（例えば、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の単離核酸を含むセット）。いくつかの実施形態では、セットの各宿主細胞は、単離核酸のセットの単離核酸を含むベクターを含み、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸のセット（例えば、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子をコードする２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の単離核酸を含むセット）。いくつかの実施形態では、宿主細胞のセットは哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞のセットは原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞）を含む。
【００６７】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子の作製方法を提供し、方法は、前述の態様の宿主細胞のセットを培地内で培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、宿主細胞のセット又は培地から、二重特異性抗原結合分子を回収することを更に含む。
【００６８】
別の態様において、本発明は、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子及び細胞毒性剤を含む免疫抱合体を特徴とする。
【００６９】
更に別の態様では、本発明は、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を更に含む。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト又は追加の治療剤を更に含む。
【００７０】
別の態様において、本発明は、薬剤として使用するための、前述の態様のいずれか１つの二重特異性抗原結合分子を特徴とする。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載される二重特異性抗原結合分子は、細胞増殖性障害（例えば癌）又は自己免疫性障害の処置又は進行の遅延を必要とする対象における、細胞増殖性障害（例えば癌）又は自己免疫性障害の処置又は進行の遅延に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子は、細胞増殖性障害（例えば癌、例えばＨＥＲ２陽性癌）又は自己免疫性障害を有する対象における、免疫機能の増強に使用するためのものである。
【００７１】
別の態様において、本発明は、障害の処置又は進行の遅延用の薬剤の製造における、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子の使用を特徴とする。別の態様において、本発明は、障害を有する対象における、免疫機能を増強するための薬剤の製造における、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子の使用を特徴とする。いくつかの実施形態では、障害は、細胞増殖性障害（例えば癌、例えばＨＥＲ２陽性癌）、又は自己免疫性障害である。
【００７２】
更に別の態様では、本発明は、障害の処置又は進行の遅延を必要とする対象における、障害の処置又は進行の遅延方法であって、該方法が、対象に、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子を投与することを含む方法を特徴とする。別の態様において、本発明は、障害を有する対象における免疫機能の増強方法であって、該方法が、対象に、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、細胞増殖性障害（例えば癌、例えばＨＥＲ２陽性癌）、又は自己免疫性障害である。
【００７３】
別の態様において、本発明は、障害の処置又は進行の遅延を必要とする対象における、障害の処置又は進行の遅延方法であって、該方法が、（ａ）腫瘍細胞でのＨＥＲ２の発現を測定する（腫瘍細胞はＨＥＲ２を、細胞１個当たり２００，０００コピー以上の、平均コピー数にて発現する）ことと、（ｂ）対象に、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子を投与することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、細胞増殖性障害（例えば癌、例えばＨＥＲ２陽性癌）、又は自己免疫性障害である。
【００７４】
別の態様において、本発明は、障害を有する対象における免疫機能の増強方法であって、該方法が、（ａ）腫瘍細胞でのＨＥＲ２の発現を測定する（腫瘍細胞はＨＥＲ２を、細胞１個当たり２００，０００コピー以上の、平均コピー数にて発現する）ことと、（ｂ）対象に、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子を投与することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、細胞増殖性障害（例えば癌、例えばＨＥＲ２陽性癌）、又は自己免疫性障害である。
【００７５】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、癌は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、頭頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、グリア芽腫、子宮体癌、及び骨肉腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、ＨＥＲ２陽性癌（例えばＨＥＲ２陽性乳癌、ＨＥＲ２陽性胃癌、ＨＥＲ２陽性結腸直腸癌、ＨＥＲ２陽性非小細胞肺癌、ＨＥＲ２陽性腎癌、ＨＥＲ２陽性膀胱癌、ＨＥＲ２陽性膵癌、ＨＥＲ２陽性前立腺癌、ＨＥＲ２陽性肝癌、ＨＥＲ２陽性頭頸癌、ＨＥＲ２陽性黒色腫、ＨＥＲ２陽性卵巣癌、ＨＥＲ２陽性中皮腫、ＨＥＲ２陽性グリア芽腫、ＨＥＲ２陽性子宮体癌、又はＨＥＲ２陽性骨肉腫）である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２陽性癌（例えばＨＥＲ２陽性乳癌、ＨＥＲ２陽性胃癌、ＨＥＲ２陽性結腸直腸癌、ＨＥＲ２陽性非小細胞肺癌、ＨＥＲ２陽性腎癌、ＨＥＲ２陽性膀胱癌、ＨＥＲ２陽性膵癌、ＨＥＲ２陽性前立腺癌、ＨＥＲ２陽性肝癌、ＨＥＲ２陽性頭頸癌、ＨＥＲ２陽性黒色腫、ＨＥＲ２陽性卵巣癌、ＨＥＲ２陽性中皮腫、ＨＥＲ２陽性グリア芽腫、ＨＥＲ２陽性子宮体癌、又はＨＥＲ２陽性骨肉腫）は、細胞１個当たり少なくとも２００，０００のコピー数（例えば、平均コピー数）（例えば、細胞１個当たり少なくとも２５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも３００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも４００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも６００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも７００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも７５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも８００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも９００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，２００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも２，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、又はそれ以上、例えば、細胞１個当たり２００，０００〜３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり２５０，０００〜２，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり３００，０００〜２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり４００，０００〜１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、若しくは、細胞１個当たり５００，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、例えば、細胞１個当たり２００，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー（例えば、細胞１個当たり２００，０００〜２５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり２５０，０００〜３００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり３００，０００〜４００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり４００，０００〜５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり５００，０００〜７５０，０００のＨＥＲ２のコピー、若しくは、細胞１個当たり７５０，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー）、又は、細胞１個当たり１，０００，０００〜３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー（例えば、細胞１個当たり１，０００，０００〜１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり１，５００，０００〜２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり２，０００，０００〜２，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、若しくは、細胞１個当たり２，５００，０００〜３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー））にてＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を特徴とする。
【００７７】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合分子は対象に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１ｍｇ／ｋｇ）の投与量で投与される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト及び／又は追加の治療剤が対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト又は追加の治療剤は、二重特異性抗原結合分子の投与前に、又はこの後に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト又は追加の治療剤は、二重特異性抗原結合分子と同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト（例えばアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ））、ＰＤ−１結合アンタゴニスト（例えばＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペムブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ピディリズマブ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１（スパルタリズマブ）、ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ）、及びＢＧＢ−１０８）、並びに、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニスト（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）からなる群から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経口投与、経皮投与、腹腔内投与、眼窩内投与、移植投与、吸入投与、髄腔内投与、心室内投与、又は経鼻投与される。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は皮下投与される。別の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は静脈内投与される。
【００８０】
前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００８１】
別の態様において、本発明は、（ａ）前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子を含む組成物；及び、（ｂ）組成物を対象に投与して、障害（例えば、細胞増殖性障害（例えば癌）、又は自己免疫性障害）を処置、又は障害の進行を遅延するための取扱説明書を含む添付文書を含むキットを特徴とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＳＫＢＲ３細胞及びＭＣＦ７細胞による、ＨＥＲ２タンパク質の相対的な発現を示すイムノブロットである。
【図２】様々な一価のＨＥＲ２  ＴＤＢ（ＩｇＧ  ＴＤＢ）分子による、ＳＫＢＲ３細胞（白色の正方形）及びＭＣＦ７細胞（黒丸）の相対的殺傷の用量反応曲線を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として表される。図２Ａは、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ）による標的細胞殺傷の用量反応曲線を示すグラフである。図２Ｂは、４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＴＤＢによる標的細胞殺傷の用量反応曲線を示すグラフである。図２Ｃは、４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢによる標的細胞殺傷の用量反応曲線を示すグラフである。図２Ｄは、４Ｄ５抗体バリアントのＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢによる標的細胞殺傷の用量反応曲線を示すグラフである。図２Ｅは、４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢによる標的細胞殺傷の用量反応曲線を示すグラフである。図２Ｆは、４Ｄ５抗体バリアントのＹ１００Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢによる標的細胞殺傷の用量反応曲線を示すグラフである。
【図３】１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ形式、フォーマットの例示的な三価抗体の略図である。この抗体は、２つの抗ＨＥＲ２結合部分を有する二価のアーム、及び１つの抗ＣＤ３結合部分を有する一価のアームを特徴とする。
【図４Ａ】フローサイトメトリーにより定量化した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体と比較しての、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の、ＳＫＢＲ３に対する結合を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。黒色の下向き三角形は、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ）を表し、黒色の正方形は、４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の上向き三角形は、４Ｄ５抗体バリアントのＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の下向き三角形は、４Ｄ５抗体バリアントのＹ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の菱形は、４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。
【図４Ｂ】フローサイトメトリーにより定量化した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体と比較しての、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の、ＭＣＦ７に対する結合を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。黒色の下向き三角形は、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ）を表し、黒色の正方形は、４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の上向き三角形は、４Ｄ５抗体バリアントのＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の下向き三角形は、４Ｄ５抗体バリアントのＹ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の菱形は、４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。
【図５Ａ】経時的に、カスパーゼ３／７活性により定量化した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の結果としてのＳＫＢＲ３細胞におけるアポトーシスの誘発を示すグラフである。黒丸は野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ）を表し、白色の正方形は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の三角形は４Ｄ５抗体バリアントのＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の三角形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の菱形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。データは、平均±標準偏差として表される。
【図５Ｂ】経時的に、カスパーゼ３／７活性により定量化した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の結果としてのＭＣＦ７細胞におけるアポトーシスの誘発を示すグラフである。黒丸は野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ）を表し、白色の正方形は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の三角形は４Ｄ５抗体バリアントのＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の三角形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の菱形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。データは、平均±標準偏差として表される。
【図６Ａ】ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイにより測定した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、５０ｎｇ／ｍＬの様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体でのインキュベーションに対応するＳＫＢＲ３細胞における細胞傷害性を示すグラフである。最初の棒（左側）は、野生型４Ｄ５  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ）を表し、２番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、３番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、４番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＹ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、５番目の棒（右側）は、４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。データは、平均±標準偏差として表される。
【図６Ｂ】ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイにより測定した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、５０ｎｇ／ｍＬの様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体でのインキュベーションに対応するＭＣＦ７細胞における細胞傷害性を示すグラフである。最初の棒（左側）は、野生型４Ｄ５  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ）を表し、２番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、３番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、４番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＹ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、５番目の棒（右側）は、４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。データは、平均±標準偏差として表される。
【図６Ｃ】ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイにより測定した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、５０μｇ／ｍＬの様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体でのインキュベーションに対応するＭＣＦ７細胞における細胞傷害性を示すグラフである。最初の棒（左側）は、野生型４Ｄ５  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ）を表し、２番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、３番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、４番目の棒は４Ｄ５抗体バリアントのＹ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、５番目の棒（右側）は、４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。データは、平均±標準偏差として表される。
【図７Ａ】フローサイトメトリーにより定量化した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ；黒色の三角形）と比較した、ＳＫＢＲ３細胞に対する、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の結合を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。白色の三角形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、正方形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ１００Ａａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、丸は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ．Ｎ３０Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。
【図７Ｂ】フローサイトメトリーにより定量化した、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（トラスツズマブ；黒色の三角形）と比較した、ＭＣＦ７細胞に対する、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の結合を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。白色の三角形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、正方形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ１００Ａａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、丸は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ．Ｎ３０Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。
【図８】ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイにより測定した、ＳＫＢＲ３細胞に対する、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の細胞傷害性を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。白色の正方形は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の正方形は４Ｄ５抗体バリアントのＹ１００Ａａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、丸は４Ｄ５抗体バリアントのＨ９１Ａ．Ｎ３０Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表す。データは、平均±標準偏差として表される。
【図９】４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の細胞傷害性を比較する用量反応曲線を示すグラフである。ＳＫＢＲ３細胞とＭＣＦ７細胞における、４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体により誘発される細胞傷害性を、それぞれ黒丸と黒色の正方形により表す。ＳＫＢＲ３細胞とＭＣＦ７細胞における、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体により誘発される細胞傷害性を、それぞれ、白色の三角形と白色の正方形で表す。データは、平均±標準偏差として表される。
【図１０】９０個の乳癌細胞株における、ＥｒｂＢ２  ＲＮＡ発現のＲＮＡ−ｓｅｑ分析の結果を示すグラフである。低ＥｒｂＢ２発現、中ＥｒｂＢ２発現、及び高ＥｒｂＢ２発現細胞株として、細胞株を分類した。
【図１１Ａ】低ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＰＣ３、ＭＣＦ７／ｎｅｏ−ｃｌ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＬＳ１０３４、及びＨＴ５５）、中ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＪＩＭＴ−１、及びＭＫＮ７）、並びに、高Ｅｒｂ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４−Ｍ１、ＳＫ−ＯＶ−３、及びＫＰＬ４）における、５０ｎｇ／ｍＬの濃度での４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の細胞傷害性を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として表される。
【図１１Ｂ】低ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＰＣ３、ＭＣＦ７／ｎｅｏ−ｃｌ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＬＳ１０３４、及びＨＴ５５）、中ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＪＩＭＴ−１、及びＭＫＮ７）、並びに、高Ｅｒｂ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４−Ｍ１、ＳＫ−ＯＶ−３、及びＫＰＬ４）における、５０μｇ／ｍＬの濃度での４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の細胞傷害性を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として表される。
【図１１Ｃ】低ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＰＣ３、ＭＣＦ７／ｎｅｏ−ｃｌ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＬＳ１０３４、及びＨＴ５５）、中ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＪＩＭＴ−１、及びＭＫＮ７）、並びに、高Ｅｒｂ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４−Ｍ１、ＳＫ−ＯＶ−３、及びＫＰＬ４）で培養したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化における、５０ｎｇ／ｍＬの濃度での４Ｄ５  ＴＤＢ抗体の効果を示すグラフである。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ６９及びＣＤ４５の二重発現により測定した。データは、平均±標準偏差として表される。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｃに表す細胞株のそれぞれによる、ＨＥＲ２タンパク質発現を示すイムノブロットである。
【図１２Ａ】低ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＰＣ３、ＭＣＦ７／ｎｅｏ−ｃｌ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＬＳ１０３４、及びＨＴ５５）、中ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＪＩＭＴ−１、及びＭＫＮ７）、並びに、高Ｅｒｂ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４−Ｍ１、ＳＫ−ＯＶ−３、及びＫＰＬ４）における、５０ｎｇ／ｍＬの濃度での４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の細胞傷害性を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として表される。
【図１２Ｂ】低ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＰＣ３、ＭＣＦ７／ｎｅｏ−ｃｌ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＬＳ１０３４、及びＨＴ５５）、中ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＪＩＭＴ−１、及びＭＫＮ７）、並びに、高Ｅｒｂ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４−Ｍ１、ＳＫ−ＯＶ−３、及びＫＰＬ４）における、５０μｇ／ｍＬの濃度での４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の細胞傷害性を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として表される。
【図１２Ｃ】低ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＰＣ３、ＭＣＦ７／ｎｅｏ−ｃｌ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＬＳ１０３４、及びＨＴ５５）、中ＥｒｂＢ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＪＩＭＴ−１、及びＭＫＮ７）、並びに、高Ｅｒｂ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４−Ｍ１、ＳＫ−ＯＶ−３、及びＫＰＬ４）で培養したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化における、５０ｎｇ／ｍＬの濃度での４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の効果を示すグラフである。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ６９及びＣＤ４５の二重発現により測定した。データは、平均±標準偏差として表される。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｃに表す細胞株のそれぞれによる、ＨＥＲ２タンパク質発現を示すイムノブロットである。
【図１３】ＨＢＬ−１００細胞における、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（正方形）及び４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（丸）の細胞傷害性を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。
【図１４Ａ】経時的な、ＨＢＬ−１００細胞における、様々な濃度の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の細胞毒性を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。黒丸は、５，０００ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の正方形は、５００ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の上向き三角形は、５０ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の下向き三角形は、５ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の菱形は、０．５ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の菱形は未処置対照を表す。
【図１４Ｂ】経時的な、ＨＢＬ−１００細胞における、様々な濃度の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の細胞毒性を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。黒丸は、５，０００ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の正方形は、５００ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の上向き三角形は、５０ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の下向き三角形は、５ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、白色の菱形は、０．５ｎｇ／ｍＬの用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを表し、黒色の菱形は未処置対照を表す。
【図１５Ａ】下にあるイムノブロット及び棒グラフにより示される、左から右に向かって、ＨＥＲ２の量を増加して発現する細胞株における、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢ及び４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢの殺傷効果を示す、ひとまとまりのグラフである。
【図１５Ｂ】相対的なＨＥＲ２発現のＩＨＣ及びＦＩＳＨ検出アッセイの結果を示す一続きの顕微鏡写真である。
【図１５Ｃ】４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢによる、図１５Ｂで特性決定される細胞の殺傷を示すグラフである。
【図１６】ＭＣＦ７細胞、ＨＴ５５細胞、及びＨＥＲ２増幅ＫＰＬ４細胞における、ＨＥＲ２タンパク質発現を示すイムノブロットである。
【図１７】ヒトＰＢＭＣを補充したマウスにおける、様々な用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体又は野生型４Ｄ５  ＴＤＢ抗体での処置にわたる、ＫＰＬ４腫瘍体積を示す格子状プロットである。確立したＫＰＬ４腫瘍を有するマウスは、０日目に指示用量にて、単回静脈内投与を受けた。格子内の各パネルは、パネルのヘッダーにより表されるように、１回の用量群を表す。黒色の太い実線は、各用量群に対する、適合した腫瘍体積を表す。太い破線は、ヒスチジン緩衝液ビヒクルを受けた対照群に対する、適合した腫瘍体積を表す。白丸が付いた破線は、個々の動物を表す。黒丸が付いた実線は、研究から取り除かれた動物を表す。水平な灰色の破線は、５００ｍｍ３の腫瘍体積をマークする。
【図１８】ヒトＰＢＭＣを補充したマウスにおける、様々な用量の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体又は野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体での処置にわたる、ＨＴ５５腫瘍体積を示す格子状プロットである。確立したＨＴ５５腫瘍を有するマウスは、０日目に指示用量にて、単回静脈内投与を受けた。格子内の各パネルは、パネルのヘッダーにより表されるように、１回の用量群を表す。黒色の太い実線は、各用量群に対する、適合した腫瘍体積を表す。太い破線は、ヒスチジン緩衝液ビヒクルを受けた対照群に対する、適合した腫瘍体積を表す。白丸が付いた破線は、個々の動物を表す。黒丸が付いた実線は、研究から取り除かれた動物を表す。水平な灰色の破線は、５００ｍｍ３の腫瘍体積をマークする。
【図１９】ヒトＰＢＭＣを補充したマウスにおける、様々な用量の４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体又は野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体での処置にわたる、ＫＰＬ４腫瘍体積を示す格子状プロットである。確立したＫＰＬ４腫瘍を有するマウスは、０日目に指示用量にて、単回静脈内投与を受けた。格子内の各パネルは、パネルのヘッダーにより表されるように、１回の用量群を表す。黒色の太い実線は、各用量群に対する、適合した腫瘍体積を表す。太い破線は、ヒスチジン緩衝液ビヒクルを受けた対照群に対する、適合した腫瘍体積を表す。白丸が付いた破線は、個々の動物を表す。黒丸が付いた実線は、研究から取り除かれた動物を表す。水平な赤色の破線は、５００ｍｍ３の腫瘍体積をマークする。
【図２０】ＳＫＢＲ３細胞における、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（黒丸）及び４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（白色の正方形）の細胞傷害性を定量化する、用量反応曲線を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２１Ａ】高ＨＥＲ２発現細胞株（ｎ＝２０）の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による殺傷を示すグラフである。高ＨＥＲ２発現細胞株は、Ｅｒｂ２  ＲＮＡの高発現を特徴とする。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２１Ｂ】高ＨＥＲ２発現細胞株（ｎ＝２０）の４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による殺傷を示すグラフである。高ＨＥＲ２発現細胞株は、Ｅｒｂ２  ＲＮＡの高発現を特徴とする。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２２】４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による高ＨＥＲ２発現細胞株の殺傷の、相対的潜在能を示すグラフである。データは、図２０Ａ及び２０Ｂから誘導する。
【図２３Ａ】中ＨＥＲ２発現細胞株（ｎ＝１２）の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による殺傷を示すグラフである。ＳＫＢＲ３細胞の殺傷を、陽性対照として提供する。中ＨＥＲ２発現細胞株は、Ｅｒｂ２  ＲＮＡの中発現を特徴とする。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２３Ｂ】中ＨＥＲ２発現細胞株（ｎ＝１２）の４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による殺傷を示すグラフである。ＳＫＢＲ３細胞の殺傷を、陽性対照として提供する。中ＨＥＲ２発現細胞株は、Ｅｒｂ２  ＲＮＡの中発現を特徴とする。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２４】４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による中ＨＥＲ２発現細胞株の殺傷の、相対的潜在能を示すグラフである。データは、図２２Ａ及び２２Ｂから誘導する。
【図２５Ａ】低ＨＥＲ２発現細胞株（ｎ＝１２）の４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による殺傷を示すグラフである。ＳＫＢＲ３細胞の殺傷を、陽性対照として提供する。低ＨＥＲ２発現細胞株は、Ｅｒｂ２  ＲＮＡの低発現を特徴とする。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２５Ｂ】低ＨＥＲ２発現細胞株（ｎ＝１２）の４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による殺傷を示すグラフである。ＳＫＢＲ３細胞の殺傷を、陽性対照として提供する。低ＨＥＲ２発現細胞株は、Ｅｒｂ２  ＲＮＡの低発現を特徴とする。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２６】４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体に対する、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体による低ＨＥＲ２発現細胞株の殺傷の、相対的潜在能を示すグラフである。データは、図２４Ａ及び２４Ｂから誘導する。
【図２７Ａ】図２７Ｂで試験した２つのペプチドリンカーの位置及び配列を示す略図である。各ペプチドリンカーは、遠位Ｆａｂの定常重鎖（ＣＨ）領域のＣ末端を、近位Ｆａｂの可変重鎖（ＶＨ）領域のＮ末端に融合する。図２７Ｂにおいて、ＤＫＴＨＴＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号５２）を白色の正方形で表し、ＤＫＴＨＴ（配列番号５０）を黒丸で表す。
【図２７Ｂ】ＤＫＴＨＴリンカーを有する４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（黒丸）に対する、ＤＫＴＨＴＧＧＧＧＳＧＧリンカーを有する４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（白色の正方形）の、ＭＣＦ７細胞への結合を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２７Ｃ】ＤＫＴＨＴリンカーを有する４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（黒丸）に対する、ＤＫＴＨＴＧＧＧＧＳＧＧリンカーを有する４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（白色の正方形）による、ＳＫＢＲ３細胞の殺傷を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として表される。
【図２８Ａ】経時的な、ＳＫＢＲ３細胞によるｐＡＫＴＳ４７３及びｐＨＥＲ３の発現における、抗ＨＥＲ２−ＣＤ３  １Ｆａｂ−ＩｇＧの効果を示す一続きのイムノブロットである。
【図２８Ｂ】抗ＨＥＲ２−ＣＤ３  １Ｆａｂ−ＩｇＧ、抗ＨＥＲ２−ＣＤ３  ＩｇＧ  ＴＤＢ、及びトラスツズマブでの処置に対応する、ＳＫＢＲ３細胞の生存能を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。
【図２９Ａ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、野生型４Ｄ５  Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。野生型４Ｄ５  Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図２９Ｂ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図２９Ｃ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図２９Ｄ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図３０Ａ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図３０Ｂ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図３０Ｃ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図３１Ａ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図３１Ｂ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図３１Ｃ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、直接不動化したヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂの結合動態を示すセンサーグラムである。４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂサンプルは、３倍希釈で０．２７ｎＭ〜２００ｎｍの濃度とした。
【図３２Ａ−３２Ｋ】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定した、ヒトＨＥＲ２に対する４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体の結合動態を示す一続きのセンサーグラムである。図３２Ａは、野生型４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｂは、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｃは、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｄは、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｅは、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｆは、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ．Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｇは、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｈは、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｉは、４Ｄ５  Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｊは、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。図３２Ｋは、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合動態を示すセンサーグラムである。
【図３３Ａ】４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（ロット１）抗体（白色の正方形）；４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（黒色の正方形）；４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（ロット２）抗体（白色の下向き三角形）；又は、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（黒色の上向き三角形）による、ＳＫＢＲ３細胞の殺傷を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。
【図３３Ｂ】４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（ロット１）抗体（白色の正方形）；４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（黒色の正方形）；４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（ロット２）抗体（白色の下向き三角形）；又は、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体（黒色の上向き三角形）による、ＭＣＦ７細胞の殺傷を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。
【図３４Ａ】フローサイトメトリーにより測定した、ＳＫＢＲ８細胞に対する、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢバリアントの結合を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。白色の正方形は４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（ロット１）抗体を表し、黒色の正方形は４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体を表し、白色の下向き三角形は４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（ロット２）抗体を表し、黒色の上向き三角形は４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体を表す。
【図３４Ｂ】フローサイトメトリーにより測定した、ＭＣＦ７細胞に対する、様々な１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢバリアントの結合を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。白色の正方形は４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（ロット１）抗体を表し、黒色の正方形は４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体を表し、白色の下向き三角形は４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（ロット２）抗体を表し、黒色の上向き三角形は４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体を表す。
【図３５Ａ】一価の高親和性結合を有する抗ＨＥＲ２−ＣＤ３  ＩｇＧ−ＴＤＢの結合及び活性を示す略図である。
【図３５Ｂ】一価の低親和性結合を有する抗ＨＥＲ２−ＣＤ３  ＩｇＧ−ＴＤＢの結合及び活性を示す略図である。
【図３５Ｃ】抗ＨＥＲ２−ＣＤ３  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのアビディティにより、適切な親和性（一価のＫＤが２０〜５０ｎＭ）における二価のＨＥＲ２結合が、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に非常に結合することをもたらすことを示す略図である。
【図３６】ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の結晶構造を提供し、異なるＨＥＲ２抗体が結合する領域を強調している。
【図３７】３８Ｅ４ｖ１  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢによるＳＫＢＲ３標的細胞の殺傷（白丸）；４０Ｇ５ｃ  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢによるＳＫＢＲ３標的細胞の殺傷（黒丸）；３８Ｅ４ｖ１  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢによるＭＣＦ７標的細胞の殺傷（白色の正方形）；及び、４０Ｇ５ｃ  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢによるＭＣＦ７標的細胞の殺傷（閉じた正方形）を定量化する用量反応曲線を示すグラフである。
【図３８Ａ】ＨＥＲ２発現細胞の存在下及び不存在下にて試験した、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ及び４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢが誘発する、ＨＥＲ２独立性のＴ細胞活性化のレベルを示すグラフである。
【図３８Ｂ】二価の抗ＣＤ３  ＯＫＴ３の存在下及び不存在下にて試験した、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ及び４Ｄ５  ＩｇＧ  ＴＤＢが誘発する、ＨＥＲ２独立性のＴ細胞活性化のレベルを示すグラフである。
【図３８Ｃ】カニクイザルに、Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ又はビヒクル対照を投与した２日後及び８日後に測定した、炎症（Ｃ反応性タンパク；ＣＲＰ）、Ｔ細胞の活性化（リンパ球の辺縁趨向）、並びに肝臓損傷（アラニン及びアスパルテートアミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ及びＡＳＴ）に対する血液マーカーを示す一続きのグラフである。
【図３８Ｄ】２０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの用量でＨ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを投与したカニクイザルからのＥＬＩＳＡにより検出した、ＰＫパラメータを示すグラフ及び概要表である。
【図３８Ｅ】投与をし、示した希釈液を用いて、健常なドナーＰＢＭＣ及びＳＫＢＲ３細胞に２４時間曝した７日後及び１４日後における、Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢカニクイザル血清量を示すグラフである。新鮮な４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（対照）の希釈液を使用して、平行実験を行った。
【図３９】４Ｄ５抗ＨＥＲ２  Ｆａｂバリアントの結合親和性における、様々なアミノ酸置換の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
Ｉ．  定義
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書での「約」の値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。
【００８４】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、合計の非共有性相互作用の強度を指す。別途の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原との）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、平衡解離定数（ＫＤ）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００８５】
本明細書で使用する場合、本明細書で使用する用語「に特異的に結合する」又は「に対して特異的な」とは、生体分子を含む分子の不均質な集団の存在下において標的の存在を決定する、標的と抗体の間の結合といった、測定可能であり再現可能な相互作用を意味する。例えば、標的（これはエピトープであることができる）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこの標的に結合する、抗体である。一実施形態において、抗体が無関係の標的に結合する程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定される、抗体の標的への結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、標的に特異的に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施形態において、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されるタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要としない。
【００８６】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた（これらに限定されない）、様々な抗体構造を包含する。
【００８７】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び、抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
「抗原結合部分」とは、標的エピトープ、抗原、リガンド、又は受容体に特異的に結合する化合物又は分子の一部を意味する。抗原結合部分を特徴とする分子としては、抗体（例えばモノクローナル、ポリクローナル、組み換え、ヒト化、及びキメラ抗体）、抗体断片又はその一部（例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ抗体、ＳＭＩＰ、ドメイン抗体、二重特異性抗体、低分子抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、アフィボディ、ナノボディ、並びに、抗体のＶＨ及び／又はＶＬドメイン）、受容体、リガンド、アプタマー、並びに、識別された結合パートナーを有する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の改変を有し、そのような改変により抗体の抗原に対する親和性が改善される抗体を指す。
【００８９】
本明細書で使用する場合、例えば、二重特異性抗原結合分子の一価のアームとの関係における、用語「一価の」とは、１つの抗原結合部分を有する分子又はその一部（例えば、抗原結合分子の一部、例えば、二重特異性抗原結合分子の２つのアームの１つ）を意味する。したがって、一価の分子又はその一部は、正確に１つの抗原に対して特異的に結合可能である。二重特異性抗体の二価のアームの２つの抗原結合部分のうちの１つの、「一価の結合親和性」又は「一価のＫＤ」（例えば、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのＨＥＲ２抗原結合部分のうちの１つ）とは、一価の形態における、即ち、２つの異なる抗原に対して特異的に結合可能な二重特異性抗体の一価のアームとしての、又はＦａｂ分子としての、抗原結合部分の結合親和性を意味する。
【００９０】
本明細書で使用する場合、例えば、二重特異性抗原結合分子の二価のアームとの関係における、用語「二価の」とは、それぞれが１つの抗原に特異的に結合可能な、２つの抗原結合部分を正確に有する分子又はその一部（例えば、抗原結合分子の一部、例えば、二重特異性抗原結合分子の２つのアームの１つ）を意味する。したがって、二価の分子又はその一部は、同一抗原上の２つの抗原又は２つの異なるエピトープ（例えば、１つの腫瘍細胞の表面に発現する２つのＨＥＲ２抗原）に特異的に結合可能である。
【００９１】
「表面抗原分類３」又は「ＣＤ３」という用語は、本明細書で使用されるとき、別途指示されない限り、霊長動物（例えばヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ３を指し、例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３α、及びＣＤ３β鎖を含む。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＤ３（例えば、プロセシングされていない、若しくは修飾されていないＣＤ３ε又はＣＤ３γ）、並びに細胞内のプロセシングから得られるＣＤ３の任意の形態を包含する。本用語はまた、例えばスプライスバリアント又はアレリックバリアントを含む、ＣＤ３の天然に発生するバリアントも包含する。ＣＤ３としては例えば、長さが２０７アミノ酸であるヒトＣＤ３εタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００７２４）、及び、長さが１８２アミノ酸であるヒトＣＤ３γタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００００６４）が挙げられる。
【００９２】
用語「抗ＣＤ３抗体」及び「ＣＤ３に結合する抗体」とは、抗体がＣＤ３の標的化において、診断及び／又は治療剤として有用であるような十分な親和性を有して、ＣＤ３に結合可能である抗体を意味する。一実施形態では、無関係の非ＣＤ３タンパク質への抗ＣＤ３抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定されるとき、ＣＤ３への抗体への結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、ＣＤ３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、異なる種に由来するＣＤ３間で保存されたＣＤ３のエピトープに結合する。
【００９３】
用語「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、本明細書で同じ意味で用いられ、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。この用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。この用語は、Ｃ末端切断（例えば、Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０１７，３３：７８６−７９４  ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２０１６，１０５：２０６６−２０７２に記載されている、例えばΔＧＫ切断）を有するものなどの、切断Ｆｃ領域を包含する。本明細書で特に指示がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番システムに従う。本明細書で使用する場合、Ｆｃドメインの「サブユニット」とは、二量体のＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定した自己会合が可能なポリペプチドを意味する。一実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常領域を含む。
【００９４】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変領域残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は通常、ＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００９５】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書で同じ意味で用いられ、自然抗体の構造に実質的に等しい構造を有する、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を意味する。
【００９６】
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により作製した、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用した、非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は特に、非ヒト抗原結合残基を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当技術分野で既知の種々の技術を使用して産生され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載されている方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）もまた参照のこと。ヒト抗体は、抗原投与に応答してこのような抗体を産生するよう改変されているが、その内在性遺伝子座は無能になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによって調製することが可能である（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照のこと）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成するヒト抗体に関する、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）もまた参照のこと。
【００９７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択にて、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選別は、可変ドメイン配列のサブグループから行う。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３におけるようなサブグループである。一実施形態では、ＶＬに関して、サブグループは、上記Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．におけるようなサブグループκＩである。一実施形態では、ＶＨに関して、サブグループは、上記Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．におけるようなサブグループＩＩＩである。
【００９８】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＨＶＲ（例えばＣＤＲ）、及びヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＦＲにおける、ほぼ全ての少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を意味する。
【００９９】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体を意味する。すなわち、母集団を含む個々の抗体が、可能性のあるバリアント抗体（例えば、天然に発生する変異を含有し、又はモノクローナル抗体の調製中に生じ、このような変異が通常少量存在する）を除いて同一である、及び／又は同一のエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製と比べて、モノクローナル抗体の調製における各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。したがって修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明において使用するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法作を含むがこれらに限定されない様々な技術により作製可能であり、このような方法、及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書で記載されている。
【０１００】
「天然抗体」とは、様々な構造を有する、天然に発生する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体とは、２つの同一軽鎖、及びジスルフィド結合した２つの同一の重鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられることができる。
【０１０１】
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」との用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。本明細書における例示的なＨＶＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
【０１０２】
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））；並びに
【０１０３】
（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組合せ、ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）及び９４−１０２（Ｈ３）が挙げられる。
【０１０４】
本明細書で別途示されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（上記参照）に従って本明細書において番号付けされる。
【０１０５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照のこと。抗原結合特異性を与えるには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをそれぞれスクリーニングして、単離されてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照のこと。
【０１０６】
「免疫抱合体」とは、細胞傷害性剤を含むが、これに限定されない１つ以上の異種分子（複数可）に抱合される抗体である。
【０１０７】
「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）又はクロマトグラフ（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％又は９９％を超える純度に精製される。抗体精製の試験方法を参照するには、例えばＦｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照のこと。
【０１０８】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野の範囲内の様々な方式で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作であり、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されて、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に利用可能であり、又はソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：
分率Ｘ／Ｙ×１００
【０１０９】
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムのＡとＢとのアラインメントにおいて完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性（％）は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性（％）と等しくはならないことが理解されるだろう。別段特に明示しない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性（％）の値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、用語「易罹病性固定」（及び、そのあらゆる文法的誘導形態）とは、例えば、アミド分解又は異性化を受けやすいアミノ酸残基を、比較的不活性なアミノ酸残基で置き換えることにより、又は、脱アミノ化又は異性化を受けやすい残基に隣接するアミノ酸を、比較的不活性なアミノ酸残基で置き換えることにより、抗体の化学的安定性を増強するように構成された（例えば、アミド分解及び／又は異性化の速度が低下した）アミノ酸置換を意味する。アミド分解を低下させるための易罹病性固定の例としては、アスパラギンの、セリン又はグルタミン酸での置換（例えばＮ３０Ｓ又はＮ５４Ｅ）が挙げられる。異性化を低下させるための易罹病性固定の例としては、アスパラギン酸の、アラニン又はスレオニンでの置換（例えばＤ９８Ａ又はＤ９８Ｔ）が挙げられる。
【０１１１】
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
【０１１２】
「抗ＣＤ３抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子（複数可）を含み、そのような核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【０１１３】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、連結している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及び導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【０１１４】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は同じ意味で用いられ、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を包含する。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、又は選択されるのと同じ機能若しくは生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。
【０１１５】
「添付文書」という用語は、そのような治療製品の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症、及び／又はその使用に関する警告についての情報を含有する、治療製品の商業用パッケージに通例含まれる指示書を指すために使用される。
【０１１６】
「薬学的製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、かつ製剤が投与され得る対象に許容できない毒性を有する追加の成分を含有しない、調製物を指す。
【０１１７】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書で使用されるとき、「投与する」とは、ある投薬量の化合物（例えば、本発明の抗ＣＤ３抗体若しくは本発明の抗ＣＤ３抗体をコードする核酸）又は組成物（例えば、医薬組成物、例えば、本発明の抗ＣＤ３抗体を含む医薬組成物）を対象に与える方法を意味する。本明細書に記載される方法に用いられる組成物は、例えば、筋肉内、静脈内、皮内、経皮的、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、腹膜内、皮下、結膜下、小胞内、経粘膜、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所的、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）、吸入、注射、注入、持続注入、標的細胞に直接的に流す局所灌流、カテーテル、洗浄、クリーム、又は脂質組成物で投与することができる。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物又は組成物、及び処置される状態、疾患、又は障害の重症度）に応じて多様であり得る。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「処置」（及び「処置する」又は「処置すること」などのその文法上の変形）とは、処置されている個体の自然経過を変更することを目的とした臨床介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過中に行われ得る。所望の処置効果として、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病的状態、転移の予防、疾患の進行率を下げる、疾患状態の軽減又は緩和、回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、障害又は疾患の「進行を遅らせること」とは、疾患又は障害（例えば細胞増殖性障害、例えば癌）の発達を延期する、妨げる、減速させる、遅滞させる、安定化させる、及び／又は延滞させることを意味する。この遅延は、処置されている病歴及び／又は個体に応じて時間の長さが異なり得る。当業者に明らかであるように、十分な、又は著しい遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で予防を包含し得る。例えば、転移の発症などの末期癌を遅延させることができる。
【０１２１】
「低下させる」又は「阻害する」とは、例えば、２０％以上の、５０％以上の、又は７５％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれ以上の全体的な減少を生じる能力を意味する。特定の実施形態では、低下させる、又は阻害するとは、抗体Ｆｃ領域によって媒介される抗体のエフェクター機能を指すことができ、そのようなエフェクター機能は、具体的に補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を含む。
【０１２２】
「対象」又は「個体」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、並びに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、対象又は個体はヒトである。
【０１２３】
「障害」とは、哺乳動物を問題の障害に罹患しやすくする病態を含む慢性及び急性の障害又は疾患を含むがこれらに限定されない、処置から恩恵を受け得る任意の状態である。
【０１２４】
「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は癌である。一実施形態では、細胞増殖性障害は、腫瘍である。
【０１２５】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には細胞の無秩序な成長によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、又はこの状態を説明するものである。この定義には、良性及び悪性癌が含まれる。「早期癌」又は「早期腫瘍」は、浸潤性又は転移性ではなく、病期０、１、又は２の癌と分類される癌を意味する。癌の例としては、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、腎癌、前立腺癌、肝癌、頭頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、神経膠芽腫、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ系白血病（ＣＬＬ）、辺縁層リンパ腫（ＭＺＬ）、小型リンパ性白血病（ＳＬＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、中枢神経系リンパ腫（ＣＮＳＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、脾臓辺縁層リンパ腫、毛様細胞性白血病、脾臓のリンパ腫／白血病、脾臓びまん性赤脾髄小型Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病異型、α重鎖病、γ重鎖病、μ重鎖病、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織の結節外辺縁層リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、結節辺縁層リンパ腫、小児結節辺縁層リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大型Ｂ細胞リンパ腫、中枢神経系の原発性ＤＬＢＣＬ、原発性皮膚ＤＬＢＣＬ（脚型）、老年者のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）陽性ＤＬＢＣＬ、ＤＬＢＣＬ随伴慢性炎症、リンパ腫肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大型Ｂ細胞リンパ腫、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性大型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８随伴多中心性キャッスルマン病にて生じる大型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の特徴を有する、分類不可能な大型Ｂ細胞リンパ腫、又は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的なホジキンリンパ腫との間の特徴を有する、分類不可能な大型Ｂ細胞リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、癌はＨＥＲ２陽性癌（例えば、ＨＥＲ２陽性乳癌又はＨＥＲ２陽性胃癌）である。
【０１２６】
用語「ＨＥＲ２陽性」癌は、通常量よりも多くのＨＥＲ２を有する癌細胞を含む。ＨＥＲ２陽性癌の例としては、ＨＥＲ２陽性乳癌及びＨＥＲ２陽性胃癌が挙げられる。任意に、ＨＥＲ２陽性癌は、２＋若しくは３＋の免疫組織化学（ＩＨＣ）スコア、及び／又は、≧２．０のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅を有する。
【０１２７】
「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、悪性であるか良性であるかにかかわらず、全ての腫瘍細胞の成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互排他的ではない。
【０１２８】
本明細書で使用される「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍細胞上に提示される抗原として理解され得る。これらの抗原は、分子の膜貫通及び細胞質部分と結合していることが多い細胞外部分とともに細胞表面に提示されることがある。これらの抗原は、腫瘍細胞によりのみ提示され、通常細胞によっては決して提示され得ない。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上にのみ発現されるか、又は通常細胞と比較して腫瘍特異的な変異を表すことがある。この場合、それらは腫瘍特異的抗原と称される。腫瘍細胞及び通常細胞により提示される腫瘍抗原がより一般的であり、それらは腫瘍関連抗原と称される。これらの腫瘍関連抗原は、通常細胞と比較して過剰発現される場合がある、又は通常組織と比較して腫瘍組織の構造が小さくないことから腫瘍細胞中で結合する抗体にアクセス可能である。
【０１２９】
「有効量」の化合物、例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその組成物（例えば医薬組成物）は、特定の障害（例えば細胞増殖性障害、例えば癌）の、測定可能な改善又は予防などの、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに必要な、少なくとも最小量にて存在する。本明細書における有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因に応じて異なり得る。有効量はまた、治療上有益な作用が、処置の任意の毒性作用又は有害作用を上回るものでもある。予防的使用の場合、有益な又は所望の結果には、疾患の生化学的、組織学的、及び／又は挙動的症状、その合併症、並びに疾患の発症中に現れる中間病理学的表現型を含む、疾患のリスクの排除若しくは低減、疾患の重症度の軽減、又は疾患の発生の遅延などの結果が含まれる。治療的使用の場合、有益な又は所望の結果には、疾患に起因する１つ以上の症状の減少、疾患に罹患している者の生活の質の向上、疾患の処置に必要な他の薬剤の用量の減少、別の薬剤の効果の増強（例えば、標的による）、疾患の進行の遅延、及び／又は生存期間の延長などの臨床結果が含まれる。癌又は腫瘍の場合、有効量の薬物は、癌細胞の数を減少させ、腫瘍サイズを低減させ、癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅らせるか、又は望ましくは停止し）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅らせるか、又は望ましくは停止し）、腫瘍成長をある程度阻害し、及び／又は障害に関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減する効果を有し得る。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明の目的に関しては、薬物、化合物、又は医薬組成物の有効量は、予防的又は治療的処置を直接又は間接的のいずれかで達成するのに十分な量である。臨床分野において理解されるように、薬物、化合物、又は医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、又は医薬組成物と併せて達成されても、されなくてもよい。したがって、「有効量」は、１つ以上の治療剤の投与に関連して考慮される場合があり、単一の薬剤は、１つ以上の他の薬剤と併せると望ましい結果が達成され得るか、又は達成される場合、有効量で与えられるとみなされ得る。
【０１３０】
「ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ−１シグナル伝達軸上のシグナル伝達に起因するＴ細胞機能障害を除去するように、ＰＤ−１軸結合パートナーとその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用を阻害し、結果として、Ｔ細胞機能が復元又は増強される分子を指す。本明細書で使用される場合、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−１結合アンタゴニスト及びＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト、並びにＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の相互作用を妨害する分子（例えば、ＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合体）を含む。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「ＰＤ−１結合アンタゴニスト」とは、ＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２などのその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用から生じるシグナル形質導入を低下、遮断、阻害、抑止、又は妨害する分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２への結合を阻害する。例えば、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体及びその抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、ポリヌクレオチドアンタゴニスト、並びにＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２との相互作用から生じるシグナル形質導入を低下、遮断、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を介してＴリンパ球及び他の細胞上で発現される細胞表面タンパク質により又はそれを介して媒介される負のシグナルを低減し、これにより、機能不全のＴ細胞の機能不全状態を軽減する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−１抗体である。特定の態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書に記載のＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書に記載のＭＫ−３４７５（ペムブロリズマブ）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書に記載のＣＴ−０１１（ピディリズマブ）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤＲ００１（スパルタリズマブ）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ）である。別の特定の態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストはＢＧＢ−１０８である。別の具体的な態様において、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書に記載されるＡＭＰ−２２４である。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１などのその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用から生じるシグナル形質導入を低下、遮断、阻害、抑止、又は妨害する分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合拮抗薬は、ＰＤ−Ｌ１の、その結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ−Ｌ１結合拮抗薬は、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、ポリヌクレオチドアンタゴニスト、並びにＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１などのその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用に起因するシグナル形質導入を低下、遮断、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１を通して、Ｔリンパ球及び他の細胞にて発現する細胞表面タンパク質により、又はこれを通して媒介される、負のシグナルを低減し、機能障害性Ｔ細胞の機能障害性を低下させる（例えば、増強エフェクターが抗原認識に対して応答する）。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合拮抗薬は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＭＤＸ−１１０５である。更に別の特定の態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書で記載される、ＭＰＤＬ３２８０Ａとしても知られているアテゾリズマブ（ＣＡＳ登録番号：１４２２１８５−０６−５）である。更に別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＭＥＤＩ４７３６（ドルバルマブ）である。また別の具体的な態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。
【０１３３】
「プログラム死リガンド１」及び「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、本明細書において、天然配列ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、ポリペプチドバリアント（即ち、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドバリアント）、並びに天然配列ポリペプチド及びポリペプチドバリアントの断片（これらは、本明細書において更に定義される）を指す。本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ヒト組織型から、若しくは別の源からなど、多様な供給源から単離されるか、又は組換え法若しくは合成法によって調製されたものであり得る。
【０１３４】
「天然配列ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド」とは、対応する、自然界に由来するＰＤ−Ｌ１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１３５】
「ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドバリアント」又はその変化形は、本明細書に定義されるＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、一般的には活性ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドであって、本明細書に開示される天然配列ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド配列のいずれかに対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。そのようなＰＤ−Ｌ１ポリペプチドバリアントには、例えば、天然アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に１つ以上のアミノ酸残基が付加又は欠失されたＰＤ−Ｌ１ポリペプチドが含まれる。通常、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドバリアントは、本明細書に開示される天然配列ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するだろう。通常、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドバリアントは、少なくとも約１０アミノ酸長であり、あるいは少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、若しくは２８９アミノ酸長、又はそれ以上である。任意で、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドバリアントは、天然ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド配列と比較して１つ以下の保存的アミノ酸置換、あるいは天然ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下の保存的アミノ酸置換を有する。
【０１３６】
「ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ−Ｌ２とその結合パートナーのうちのいずれか１つ以上、例えば、ＰＤ−１との相互作用に起因するシグナル伝達を減少させる、遮断する、阻害する、抑止する、又は妨害する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２の、その結合パートナーのうちの１つ以上への結合を阻害する分子である。具体的な一態様において、ＰＤ−Ｌ２結合拮抗薬は、ＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ２拮抗薬は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＰＤ−Ｌ２とその結合パートナーのうちのいずれか１つ以上、例えば、ＰＤ−１との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ２結合拮抗薬は、機能障害性Ｔ細胞の機能障害性を低下させる（例えば、抗原認識へのエフェクター応答を増強する）ように、ＰＤ−Ｌ２を介してＴリンパ球媒介シグナル伝達で発現された細胞表面タンパク質によって、又はそれを介して媒介される、負の共刺激性シグナルを低減させる。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ２結合拮抗薬は、イムノアドヘシンである。
【０１３７】
ＩＩ  組成物
一態様では、本発明は部分的に、二重特異性抗原結合分子（例えば二重特異性抗体）に基づく。特定の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第１抗原（例えばＴ細胞抗原、例えばＣＤ３）に特異的に結合可能な一価のアーム、及び、２つの更なる抗原（例えば腫瘍抗原、例えば２つのＨＥＲ２抗原）に特異的に結合可能な二価のアームを有する。例えば、二価のアームは、それぞれが、標的抗原（例えばＨＥＲ２）に特異的に結合し、多量の標的抗原を発現する細胞に対する二重特異性抗原結合分子のアビディティを増加させることができる、２つの抗原結合部分を含むことができる。本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば、細胞増殖性障害（例えば癌）若しくは自己免疫性障害を処置する、若しくはこれらの進行を遅延させるために、又は、このような障害を有する対象における免疫機能を増強させるために、有用である。
【０１３８】
本発明の１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、少量の標的化腫瘍抗原を発現する細胞（例えば通常又は健常なヒト組織の細胞）を救助しながら、高い潜在能を有する標的化腫瘍抗原を過剰発現する腫瘍細胞を、選択的に殺傷する。選択性は、腫瘍抗原を過剰発現する細胞における、高い標的密度に対する、２つの低親和性抗腫瘍抗原Ｆａｂアームのアビディティに基づく。細胞を過剰発現する腫瘍抗原に対する選択性が増加することにより、ＴＤＢのオンターゲット副作用が緩和される。例えば、ＨＥＲ２を標的化腫瘍抗原として使用することで、ＨＥＲ２に対する一価の高親和性結合を有する抗ＨＥＲ２−ＩｇＧ  ＴＤＢは、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞、及び、低量のＨＥＲ２を発現する細胞の両方に結合する。このＴＤＢの治療指数は、高いＨＥＲ２密度による、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞におけるより高い活性に基づく。ＴＤＢの多くの用量において、高親和性ＩｇＧ１  ＨＥＲ２−ＴＤＢは、低量のＨＥＲ２を発現する細胞に影響を及ぼす可能性があり、それ故、通常の組織におけるオンターゲット・オフ腫瘍自己免疫のリスクを有する（図３５Ａ）。ＨＥＲ２結合アームに、より低い親和力を持たせるように改変を行うことにより、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞、及び低量のＨＥＲ２を発現する細胞の両方における、より低い結合及びＴＤＢ活性がもたらされるが、選択性は改善しない（図３５Ｂ）。適切な親和性（一価のＫＤが約２０〜５０ｎＭ）における二価のＨＥＲ２結合により、抗ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのアビディティによって、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞への結合性の高さがもたらされる。アビディティの効果は高いＨＥＲ２の密度に左右されるため、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、低量のＨＥＲ２を発現する細胞、例えば、通常の、又は健常なヒト組織の細胞には結合しない。細胞結合は、ＴＤＢのＴ細胞活性をリクルートする能力と相関するため、抗ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞のみを選択的に殺傷し、通常の組織における、オンターゲット・オフ腫瘍自己免疫のリスクが低下する（図３５Ｃ）。
例示的な二重特異性抗原結合分子
【０１３９】
一態様では、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを有する、単離された二重特異性抗原結合分子（例えば二重特異性抗体）を提供する。例えば、一態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを有する二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームが第１の抗原結合部分を含み、（ｂ）二価のアームが第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分のＣ末端は第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合し、第３の抗原結合部分のＣ末端は第２の抗原結合部分のＮ末端に融合し、第２の抗原結合部分のＣ末端は第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃサブユニットは第２のＦｃサブユニットと会合して、Ｆｃドメインを形成する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、第１の標的細胞抗原に特異的に結合可能であり、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、第２の標的細胞抗原（例えば、同一のエピトープにおける、又は、第２の標的細胞抗原の異なるエピトープにおける）に特異的に結合可能である。
【０１４０】
第１の抗原結合部分は、可変重鎖（ＶＨＡ）領域及び可変軽鎖（ＶＬＡ）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＡ）であることができ、第２の抗原結合部分は、可変重鎖（ＶＨＢ１）領域及び可変軽鎖（ＶＬＢ１）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＢ１）であることができ、かつ／又は、第３の抗原結合部分は、可変重鎖（ＶＨＢ２）領域及び可変軽鎖（ＶＬＢ２）領域を含むＦａｂ分子（ＦａｂＢ２）であることができる。したがって、場合によっては、第１の抗原結合部分は、ＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含むＦａｂＡであることができ、第２の抗原結合部分は、ＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含むＦａｂＢ１であることができ、第３の抗原結合部は、ＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含むＦａｂＢ２であることができる。ＶＨＢ１及びＶＨＢ２は、少なくとも９５％の配列同一性（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性）を共有してよい。加えて、又はあるいは、ＶＬＢ１及びＶＬＢ２は、少なくとも９５％の配列同一性（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性）を共有してよい。
【０１４１】
１Ｆａｂ−ＩｇＧ分子とは、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分を有する二重特異性抗原結合分子を意味し、第１の抗原結合部分は、ＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含むＦａｂＡであり、第２の抗原結合部分は、ＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含むＦａｂＢ１であり、第３の抗原結合部分は、ＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含むＦａｂＢ２であり、ＶＨＢ１及びＶＨＢ２は、少なくとも９５％の配列同一性（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性）を共有し、ＶＬＢ１及びＶＬＢ２は、少なくとも９５％の配列同一性（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性）を共有する。１Ｆａｂ−ＩｇＧ分子は、第１の標的抗原に結合する第１の抗原結合部分を含む一価のアーム、並びに第２及び第３の抗原結合部分を含む二価のアームを有し、第２及び第３の抗原結合分子はそれぞれ、第２の標的細胞抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、１Ｆａｂ−ＩｇＧ分子は、一価のアームがＴ細胞の表面にて抗原に特異的に結合し、二価のアームの抗原結合部分のそれぞれが、第２の標的細胞（例えば腫瘍細胞）の表面にて抗原に特異的に結合する１Ｆａｂ−ＩｇＧ  Ｔ細胞依存性二重特異性分子（１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。標準的な二価のＩｇＧフォーマットを有するＴＤＢ（ＩｇＧ  ＴＤＢ）と同様に、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは細胞溶解Ｔ細胞をリクルートして、標的化した抗原を発現する細胞を殺傷する。
【０１４２】
例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、ＣＤ３（例えば、Ｔ細胞の表面におけるＣＤ３分子）に特異的に結合する一価のアーム、及び、それぞれ、ＨＥＲ２（例えば、腫瘍細胞の表面におけるＨＥＲ２分子）に特異的に結合する２つの抗原結合部分を有する二価のアームを有する。二価のアーム上の２つの抗原結合部分が同一のエピトープに結合することができる、又は、二価のアーム上のそれぞれの抗原結合部分が、同一抗原上の異なるエピトープに結合することができる。一実施形態では、二価のアームは４Ｄ５と同じエピトープに結合する。一実施形態では、二価のアームはＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する。一実施形態では、ＣＤ３に対して特異的な、一価のアーム上の抗原結合部分は４０Ｇ５ｃ  Ｆａｂであり、ＨＥＲ２に対して特異的な、二価のアーム上の２つの抗原結合部分のそれぞれは、４Ｄ５  Ｆａｂのバリアントである。特定の実施形態を本明細書で例示する。
【０１４３】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、多くの場合、（例えば、Ｔ細胞を活性化して、低量の腫瘍抗原を発現する健常な細胞ではなく、腫瘍細胞にエンゲージすることにより）健常組織への損傷を低下させる、高密度の抗原（例えば腫瘍抗原）を優先的に発現する細胞に対する感度の増加を提供することができる。したがって、いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、（ａ）対象の腫瘍細胞にて、及び（ｂ）（例えば、腫瘍細胞における発現よりも低い密度で）対象の、少なくとも一種の非腫瘍細胞にて発現する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞における腫瘍抗原のコピー数に対する、非腫瘍細胞における腫瘍抗原のコピー数の比は、１：２〜１：１，０００，０００（例えば１：３〜１：５００，０００、１：４〜１：１００，０００、１：５〜１：５０，０００、１：６〜１：４０，０００、１：７〜１：２０，０００、１：８〜１：１０，０００、１：９〜１：５，０００、１：１０〜１：１，０００、１：２０〜１：５００、１：５０〜１：４００、又は１：１００〜１：２００、例えば１：２〜１：１０、１：１０〜１：２０、１：２０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：２００、１：２００〜１：３００、１：３００〜１：４００、１：４００〜１：５００、１：５００〜１：６００、１：６００〜１：７００、１：７００〜１：８００、１：８００〜１：９００、１：９００〜１：１，０００、１：１，０００〜１：５，０００、１：５，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：５０，０００、１：５０，０００〜１：１００，０００、１：１００，０００〜１：５００，０００、又は、１：５００，０００〜１：１，０００，０００、例えば約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：３００、約１：４００、約１：５００、約１：１，０００、約１：１０，０００、約１：１００，０００、又は約１：１，０００，０００）である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞における腫瘍抗原のコピー数は、１０１〜１０６（例えば、１０１〜１０６、１０１〜１０５、１０１〜１０４、１０１〜１０３、１０１〜１０２、１０２〜１０６、１０２〜１０５、１０２〜１０４、１０２〜１０３、１０３〜１０６、１０３〜１０５、１０３〜１０４、１０４〜１０６、１０４〜１０５、又は、１０５〜１０６、例えば約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６）である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞における腫瘍抗原のコピー数は、１０２〜１０７（例えば、１０２〜１０７、１０２〜１０６、１０２〜１０５、１０２〜１０４、１０２〜１０３、１０３〜１０７、１０３〜１０６、１０３〜１０５、１０３〜１０４、１０４〜１０７、１０４〜１０６、１０４〜１０５、１０５〜１０７、１０５〜１０６、又は、１０６〜１０７、例えば約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、又は１０７）である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原のコピー数は、非腫瘍細胞にて１０１〜１０６、及び腫瘍細胞にて１０２〜１０８（例えば、非腫瘍細胞にて１０２〜１０５、及び腫瘍細胞にて１０３〜１０７、非腫瘍細胞にて１０２〜１０５、及び腫瘍細胞にて１０４〜１０７、非腫瘍細胞にて１０３〜１０５、及び腫瘍細胞にて１０５〜１０７、非腫瘍細胞にて１０３〜１０４、及び腫瘍細胞にて１０５〜１０６、又は、非腫瘍細胞にて１０４〜１０５、及び腫瘍細胞にて１０６〜１０７）である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原コピー数（例えば、平均の腫瘍抗原コピー数、例えばＨＥＲ２コピー数、例えば平均のＨＥＲ２コピー数）は、非腫瘍細胞にて１０１〜２．０×１０５、及び、腫瘍細胞にて少なくとも２．０×１０５である。
【０１４７】
本発明の抗原結合分子により結合される腫瘍細胞は、細胞１個当たり少なくとも２００，０００（例えば、細胞１個当たり少なくとも２５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも３００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも４００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも６００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも７００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも７５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも８００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも９００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，２００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも２，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、又はそれ以上、例えば、細胞１個当たり２００，０００〜３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり２５０，０００〜２，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり３００，０００〜２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり４００，０００〜１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、若しくは、細胞１個当たり５００，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、例えば、細胞１個当たり２００，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー（例えば、細胞１個当たり２００，０００〜２５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり２５０，０００〜３００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり３００，０００〜４００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり４００，０００〜５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり５００，０００〜７５０，０００のＨＥＲ２のコピー、若しくは、細胞１個当たり７５０，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー）、又は、細胞１個当たり１，０００，０００〜３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー（例えば、細胞１個当たり１，０００，０００〜１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり１，５００，０００〜２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり２，０００，０００〜２，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、若しくは、細胞１個当たり２，５００，０００〜３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー））のコピー数（例えば、平均コピー数）にて、ＨＥＲ２を発現し得る。上述のＨＥＲ２発現特性のいずれかを有するＨＥＲ２陽性腫瘍細胞は、本発明の抗原結合分子の結合時に、ほとんど、又は全くＨＥＲ２が発現しない（例えば、細胞１個当たり２００，０００未満のＨＥＲ２のコピー、例えば、細胞１個当たり０〜２００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり０〜１５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり０〜１００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり０〜５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり０〜２０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり０〜１０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり０〜５，０００のＨＥＲ２のコピー、又は、細胞１個当たり０〜１，０００のＨＥＲ２のコピー）非腫瘍細胞と比較して、Ｔ細胞により優先的に殺傷される（例えば、選択的に殺傷される）ことができる。
【０１４８】
腫瘍抗原コピー数（例えば、平均の腫瘍抗原コピー数、例えばＨＥＲ２コピー数、例えば平均のＨＥＲ２コピー数）は、当該技術分野において公知の、又は本明細書で記載される任意の好適な手段を使用して定量化することができる。例えば、ＨＥＲ２コピー数は、フローサイトメトリーによる蛍光定量化を使用して（例えば、既知の当量の可溶性蛍光分子数の分子（ＭＥＳＦ）のビーズを使用して）定量化することができる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分及び／又は第３の抗原結合部分の一価の結合親和性（ＫＤ）は、１０ｎＭ〜１００ｎＭ（例えば、２０ｎＭ〜９０ｎＭ、３０ｎＭ〜８０ｎＭ、４０ｎＭ〜６０ｎＭ、例えば２５ｎＭ〜５５ｎＭ）である。一実施形態では、第２の抗原結合部分及び／又は第３の抗原結合部分の一価の結合親和性（ＫＤ）は、２０ｎＭ〜５０ｎＭである。一実施形態では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の一価の結合親和性（ＫＤ）は、２０ｎＭ〜５０ｎＭである。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分及び／又は第３の抗原結合部分の一価の解離速度は、１０−３／秒〜１０−１／秒（例えば、１０−２／秒〜３０−２／秒）である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、第１の標的抗原は、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原である。様々なＴ細胞抗原結合部分が当技術分野において既知であり、本発明の一部として使用するのに好適である。例えば、本発明の特定の実施形態において、好適な第１の抗原結合部分は、例えば、その全体が本明細書に参照として組み込まれている米国特許出願公開第２０１５／０１６６６６１号に記載されている、抗体クローン４０Ｇ５ｃ、又はその断片及び／若しくはバリアントである。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１のＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のＨＶＲ−Ｈ２、配列番号３のＨＶＲ−Ｈ３、配列番号４のＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号６のＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＣＤ３  Ｆａｂ（例えば４０Ｇ５ｃ）である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬを含む抗ＣＤ３  Ｆａｂ（例えば４０Ｇ５ｃ）である。４０Ｇ５ｃのアミノ酸配列もまた、表１に示す。
【０１５２】
2021512613.tif 000002
【０１５３】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＣＤ３ポリペプチド、又はカニクイザル（カニクイザル）ＣＤ３ポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３ポリペプチド又はカニクイザルＣＤ３ポリペプチドは、それぞれ、ヒトＣＤ３εポリペプチド又はカニクイザルＣＤ３εポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３ポリペプチド又はカニクイザルＣＤ３ポリペプチドは、それぞれ、ヒトＣＤ３γポリペプチド又はカニクイザルＣＤ３γポリペプチドである。ＣＤ３に結合する更なる抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ分子）は、当技術分野において既知であり、例えば米国特許出願公開第２０１５／０１６６６６１号に記載されており、本発明の一部として使用するのに適合することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分の一価のＫＤは、２５０ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＤ３εポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、１００ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＤ３εポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、１５ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＤ３εポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、１０ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＤ３εポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、５ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＣＤ３εポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分の一価のＫＤは、１０ｎＭ〜１００ｎＭ（例えば、２０ｎＭ〜９０ｎＭ、２０ｎＭ〜８０ｎＭ、３０ｎＭ〜７０ｎＭ、又は４０ｎＭ〜６０ｎＭ）である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、第２の標的細胞抗原は腫瘍抗原である。
【０１５６】
腫瘍抗原はＨＥＲ２であり得る。ＨＥＲ２に結合する、好適な第２及び／第３の抗原結合部分は、抗体４Ｄ５、又はその断片及び／若しくはバリアントである。４Ｄ５、及びその置換バリアントのアミノ酸配列を表１に示し、これらは例えば、その全体が本明細書に参照として組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０１６６６６１号に記載されている。一実施形態では、第２及び／又は第３の抗原結合部分は、抗体４Ｄ５（トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）として知られている、そのヒト化版；Ｍｏｌｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１，６１（１２）：４７４４−４７４９）と同じエピトープに結合する。一実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分は、抗体４Ｄ５と同じエピトープに結合する。
【０１５７】
一実施形態では、第２及び／又は第３の抗原結合部分は、抗体２Ｃ４（ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）として知られている、そのヒト化版；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００４，５：３１７−３２８）と同じエピトープに結合する。一実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分は、抗体２Ｃ４と同じエピトープに結合する。
【０１５８】
一実施形態では、第２及び／又は第３の抗原結合部分は、抗体７Ｃ２（米国特許第９，５１８，１１８号）と同じエピトープに結合する。一実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分は、抗体７Ｃ２と同じエピトープに結合する。
【０１５９】
図３６は、ＨＥＲ２  ＥＣＤの結晶構造を提供し、異なるＨＥＲ２抗体が結合する領域を強調している。４Ｄ５は、細胞膜に最も近いタンパク質領域である、ＨＥＲ２のドメインＩＶにおけるエピトープに結合する。２Ｃ４は、ｈｕ４Ｄ５が結合する領域から５０オングストロームの距離である、ＨＥＲ２のドメインＩＩにおけるエピトープに結合する。７Ｃ２は、ｈｕ４Ｄ５により結合されるＨＥＲ２領域から１００オングストロームの距離である、ＨＥＲ２のドメインＩにおけるエピトープに結合する。
【０１６０】
一実施形態では、第２及び／又は第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する。一実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する。一実施形態では、第２及び／又は第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する。一実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する。
【０１６１】
一実施形態では、第２及び／又は第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩに結合する。一実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩに結合する。
【０１６２】
一実施形態では、第２の結合部分はＨＥＲ２のドメインＩＶに結合し、第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩに結合する。
【０１６３】
一実施形態では、第２の結合部分はＨＥＲ２のドメインＩＶに結合し、第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する。
【０１６４】
一実施形態では、第２の結合部分はＨＥＲ２のドメインＩＩに結合し、第３の抗原結合部分はＨＥＲ２のドメインＩに結合する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、上記実施形態のいずれかの二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＡ領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＡ領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＡ領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＡ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＶＨＡは、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＡは、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、Ｋａｂａｔの付番システムに従った、Ｎ５４、Ｄ９８、Ｆ１００、及び／又はＹ１０２の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つ全ての残基において、アミノ酸置換を含む。例えば、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、以下の残基：Ｋａｂａｔの付番システムに従った、Ｎ５４Ｅ、Ｄ９８Ａ、Ｄ９８Ｔ、Ｆ１００Ａ、及び／又はＹ１０２Ｖの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全てにおけるアミノ酸置換を特徴とし得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｋａｂａｔの付番システムに従った、Ｎ３０、Ｙ５５、及び／又はＨ９１の少なくとも１つ、２つ、又は３つ全ての残基において、アミノ酸置換を含む。例えば、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、以下の残基：Ｎ３０Ｓ、Ｙ５５Ｅ、及び／又はＨ９１Ａの１つ、２つ、又は３つ全てにおけるアミノ酸置換を特徴とし得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号１７のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号１７のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｈ９１にアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｈ９１残基が、無極性側鎖を有するアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１  領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｈ９１Ａのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｙ５５にアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｙ５５残基が、酸性側鎖を有するアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、Ｙ５５Ｅのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、Ｆ１００及び／又はＹ１０２にアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆ１００残基及び／又はＹ１０２残基が、無極性側鎖を有するアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、Ｆ１００Ａ及び／又はＹ１０２Ｖのアミノ酸置換を含む。
【０１７４】
二重特異性抗原結合部分のいくつかの実施形態において、ＶＬＢ１領域及び／又はＶＬＢ２領域は、１つ以上の易罹病性固定残基、例えば、Ｎ３０Ｓのアミノ酸置換を含む１つ以上の易罹病性固定残基を含む。加えて、又はあるいは、ＶＨＢ１領域及び／又はＶＨＢ２領域は、１つ以上の易罹病性固定残基、例えば、Ｎ５４Ｅ、Ｄ９８Ａ、及びＤ９８Ｔからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換基を含む、１つ以上の易罹病性固定残基を特徴とし得る。
【０１７５】
二重特異性抗原結合分子は、第２及び／又は第３の抗原結合部分の軽鎖の残基Ｈ９１における変異（例えばＨ９１Ａ）を特徴とし得る。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号２４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【０１７８】
場合によっては、ＶＨＢ２は以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号２４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０１７９】
別の場合において、二重特異性抗原結合分子は、第２及び／又は第３の抗原結合部分の重鎖の残基Ｄ９８、Ｆ１００、及びＹ１０２における変異（例えばＤ９８Ａ、Ｆ１００Ａ、及びＹ１０２Ｖ）を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号３３のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号３３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号３３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号３３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号２５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号３３のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０１８３】
別の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第２及び／又は第３の抗原結合部分の軽鎖の残基Ｙ５５及びＨ９１、並びに重鎖の残基Ｎ５４及びＤ９８における変異（例えばＹ５５Ｅ、Ｈ９１Ａ、Ｎ５４Ｅ、及びＤ９８Ｔ）を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０１８７】
別の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第２及び／又は第３の抗原結合部分の軽鎖の残基Ｙ５５及びＨ９１、並びに重鎖の残基Ｎ５４、Ｄ９８、及びＹ１０２における変異（例えばＹ５５Ｅ、Ｈ９１Ａ、Ｎ５４Ｅ、Ｄ９８Ｔ、及びＹ１０２）を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号４４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０１９１】
別の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第２及び／又は第３の抗原結合部分の軽鎖の残基Ｎ３０、Ｙ５５及びＨ９１、並びに重鎖の残基Ｎ５４及びＤ９８における変異（例えばＮ３０Ｓ、Ｙ５５Ｅ、Ｈ９１Ａ、Ｎ５４Ｅ、及びＤ９８Ｔ）を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４１に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４１に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号４１のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０１９５】
別の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、第２及び／又は第３の抗原結合部分の軽鎖の残基Ｎ３０、Ｙ５５及びＨ９１、並びに重鎖の残基Ｎ５４、Ｄ９８、及びＹ１０２における変異（例えばＮ３０Ｓ、Ｙ５５Ｅ、Ｈ９１Ａ、Ｎ５４Ｅ、Ｄ９８Ｔ、及びＹ１０２Ｖ）を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含むＶＨＢ１領域を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、ＶＨＢ１は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１領域は配列番号４４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、又は、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、又は、（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３の１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号４９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号４９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ２領域は配列番号４４のアミノ酸を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号３０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号３０の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号３１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号３１の配列を含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号３５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号３５の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２５の配列を含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号３９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号３９の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号４０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４０の配列を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４１の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号４２に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４２の配列を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４１の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２７の配列を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４４の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号４５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４５の配列を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２４の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号４０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４０の配列を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４１の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２５の配列を含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号４６に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４６の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号４０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４０の配列を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号４７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４７の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号４０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４０の配列を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号３０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号３０の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２５の配列を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２４の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号５４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号５４の配列を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２４の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号４８の配列を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号３３の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２５の配列を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、以下のＨＶＲ：（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、以下のＨＶＲ：（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＢ１及び／又はＶＨＢ２は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号３３の配列を含み、ＶＬＢ１及び／又はＶＬＢ２は、配列番号３１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、又は配列番号３１の配列を含む。
【０２１４】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０２１５】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【０２１６】
更に別の態様では、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
【０２１７】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【０２１８】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメイン、及び２つの４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ  ＨＥＲ２結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０２１９】
更に別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメイン、及び２つの４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ  ＨＥＲ２結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
【０２２０】
別の態様において、本発明は、一価のアーム及び二価のアームを含む二重特異性抗原結合分子であって、（ａ）一価のアームがＦａｂＡを含み、ＦａｂＡのＣ末端が第１のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＡが以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、（ｂ）二価のアームがＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２を含み、ＦａｂＢ２のＣ末端がＦａｂＢ１のＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１のＣ末端が第２のＦｃサブユニットのＮ末端に融合しており、ＦａｂＢ１及びＦａｂＢ２がそれぞれ、以下のＨＶＲ：（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び、（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、かつ、（ｃ）第１のＦｃサブユニットが第２のＦｃサブユニットと会合してＦｃドメインを形成する、二重特異性抗原結合分子を特徴とする。いくつかの実施形態では、（ａ）ＦａｂＡはＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域を含み、ＶＨＡ領域は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＦａｂＢ１はＶＨＢ１領域及びＶＬＢ１領域を含み、ＶＨＢ１領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＦａｂＢ２はＶＨＢ２領域及びＶＬＢ２領域を含み、ＶＨＢ２領域は、配列番号４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨＡ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬＡ領域は配列番号８のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＨＢ１領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ１領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＶＨＢ２領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＶＬＢ２領域は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、例えば、４０Ｇ５ｃ  ＣＤ３結合ドメイン、及び２つの４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ  ＨＥＲ２結合ドメインを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）である。
第２及び第３の抗原結合部分を融合するペプチドリンカー
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分のＣ末端が、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分のＮ末端に融合している構造を特徴とする。ペプチドリンカーは、５〜２０アミノ酸長（例えば、５〜１０、１０〜１５、又は１５〜２０、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸長）であることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、可変重鎖ヒンジ領域の天然アミノ酸配列（例えばＤＫＴＨＴ；配列番号５０）である。あるいは、いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４ＳＧ２リンカー（配列番号５１）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳＧ２リンカー及びヒンジ領域（例えば配列番号５２）を含む。
【０２２２】
Ｇ４ＳＧ２リンカーを含む、及び含まない、第２及び第３の抗原結合部分重鎖を含む例示的な重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を、表２に示す。
【０２２３】
2021512613.tif 000003
【０２２４】
特に、本発明の二重特異性抗原結合分子は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを特徴とし得る。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号５５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号５５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号５５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号５５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号５５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号５５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。別の場合において、抗原結合分子は、配列番号５９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号５９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号５９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号５９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号５９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号５９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、抗原結合分子は、配列番号６３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号６３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号６３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号６３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号６３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８３に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８３に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８３に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８３に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８３に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。別の場合において、抗原結合分子は、配列番号８５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８５に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８５に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８５に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８５に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８５に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８７に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８７に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８７に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８７に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８７に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８７に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８９に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８９に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８９に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８９に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８９に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８９に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【０２２５】
別の場合において、ペプチドリンカーは配列番号５１のアミノ酸配列を含む。抗原結合分子は、配列番号５６に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号５６に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号５６に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号５６に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号５６に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号５６に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号６０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号６０に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号６０に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６０に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号６０に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号６０に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号６４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号６４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号６４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号６４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号６４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８４に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８４に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８４に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８４に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８４に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８６に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８６に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８６に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８６に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８６に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８６に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号８８に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号８８に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号８８に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号８８に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号８８に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号８８に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、配列番号９０に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号９０に対して少なくとも９６％の配列同一性、配列番号９０に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号９０に対して少なくとも９８％の配列同一性、配列番号９０に対して少なくとも９９％の配列同一性、又は配列番号９０に対して１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
Ｆｃドメイン
【０２２６】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインを特徴とし得る。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン（例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃドメイン）であることができる。例えば、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインであることができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、かつ／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、かつ／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９からなる群から選択される１つ以上の位置におけるものである（例えば、第１のＦｃサブユニット及び第２のＦｃサブユニットはそれぞれ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇのアミノ酸置換を含む）。Ｆｃ受容体は例えば、Ｆｃγ受容体であることができる。したがって、本発明の二重特異性抗原結合分子は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させるように構成することができる。
【０２２７】
場合によっては、Ｆｃドメインは、第１のＦｃサブユニットの第２のＦｃサブユニットとの会合を促進するように構成された改変を含む。二重特異性抗体の「ノブインホール」工学的設計を利用して、ノブを含む第１アーム、及び第１アームのノブが結合することができるホールを含む第２アームを生成することができる。本発明の多重特異性抗体のノブは、一実施形態において、一価のアーム（例えば抗ＣＤ３アーム）であることができる。あるいは、本発明の多重特異性抗体のノブは二価のアーム（例えば抗腫瘍アーム）であることができる。本発明の多重特異性抗体のホールは、一実施形態において、一価のアーム（例えば抗ＣＤ３アーム）であることができる。あるいは、本発明の多重特異性抗体のホールは二価のアーム（例えば抗腫瘍アーム）であることができる。二重特異性抗体は、免疫グロブリンクロスオーバー（Ｆａｂドメイン交換又はＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットとしても知られている）技術を使用してもまた改変することができる（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号；Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１１１８７−１１１９２（２０１１）を参照のこと）。二重特異性抗体は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための、改変静電ステアリング効果（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）；又は、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと）によってもまた作製することができる。
【０２２８】
第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より大きなサイズの側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞（例えば、ホール）に位置可能な第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突出部（例えば、ノブ）を生成することができ、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より小さなサイズの側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突出部（例えば、ノブ）に位置可能な第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、空洞（例えば、ホール）を生成することができる。いくつかの実施形態では、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６のアミノ酸置換を含み、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及び／又はＹ４０７の１つ、２つ、又は３つ全てにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインはＴ３６６Ｗのアミノ酸置換を含み、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖの１つ、２つ、又は３つ全てのアミノ酸置換を含む。
【０２２９】
本明細書で列挙される例のいずれかにおいて使用するための、本明細書で記載される二重特異性抗原結合分子又は他の抗体は、以下のセクション１〜６に記載する特徴のいずれかを、単独で、又は組み合わせて有することができることが、明示的に企図されている。
【０２３０】
１．  抗体親和性
特定の場合において、二重特異性抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９〜１０−１３Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０２３１】
一例において、ＫＤは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一例において、ＲＩＡは、目的の抗体及びその抗原のＦａｂバージョンを用いて実施される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原によりＦａｂを平衡化し、次いで、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定する（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸塩（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、続いて、室温（約２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンによってブロッキングする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を、目的とされるＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一貫する）。次に、目的とするＦａｂを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が達成されることを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続し得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のため、捕捉プレートに移す。次に、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを１０分間ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイに使用するために選択する。
【０２３２】
別の一例によると、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標），Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイは、固定化抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で用いて２５℃で行われる。１つの事例では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標），Ｉｎｃ．）は、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化される。抗原をｐＨ４．８の１０ｍＭの酢酸ナトリウムによって５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μＬ／分の流量で注射し、カップリングされたタンパク質の約１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロックする。動態測定のため、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、約２５μＬ／分の流量で２５℃で０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中に注射する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２版）を使用して、会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時に適合することによって、計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと。上記表面プラズモン共鳴アッセイによるオンレートが１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オンレートは、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加又は減少を測定する蛍光消光技法を使用して決定することができる。
【０２３３】
２．  抗体断片
特定の場合において、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子は、１つ以上の抗体断片を含む。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに以下に記載する他の断片が挙げられるがこれらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の参照には、例えばＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープを含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２の議論には、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。
【０２３４】
二重特異性抗体は、二価であっても又は二重特異性であってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。三重特異性抗体及び四重特異性抗体については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）にもまた記載されている。
【０２３５】
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変領域の全部若しくは一部、又は軽鎖可変領域の全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の場合において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照のこと）。
【０２３６】
抗体断片は、本明細書に記載されるように、組み換え宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ又はファージ）による、インタクトな抗体のタンパク分解、及び産生を含むがこれらに限定されない各種技術により製造可能である。
【０２３７】
３．  キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の場合において、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子はキメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に開示されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のそれらから変更している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０２３８】
特定の場合において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。一般的に、非ヒト抗体をヒト化すると、ヒトに対する免疫原性は低下するが、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は維持される。通常、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ以上の可変領域を含み、ＦＲ（又はその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は所望により、ヒト定常領域の少なくとも一部もまた含む。いくつかの場合において、ヒト化抗体のＦＲ残基の中には、例えば、抗体の特異性又は親和性を維持又は向上するために対応する非ヒト抗体（例えばＨＶＲ残基が由来する抗体）で置換されるものもある。
【０２３９】
ヒト化抗体及びその作成方法は例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）で確認され、更に、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトに関する記述）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再構成」の記述）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲ再構成」の記述）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲ構築のための「誘導選択」アプローチの記述）に詳しく記載されている。
【０２４０】
ヒト化に用いるヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；重鎖又は軽鎖可変領域の特定の亜型のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照）；並びにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照）。
【０２４１】
４．  ヒト抗体
特定の場合において、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知である様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は通常、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０２４２】
抗原投与に対して応答するヒト可変領域を有する完全なヒト抗体又は完全な抗体を産生するために修飾したトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより、ヒト抗体を調製してよい。そのような動物は通常、内在性イムノグロブリン遺伝子座を置き換える、又は染色体外に存在する、若しくは動物の染色体中に無作為に導入したヒトイムノグロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は通常不活性である。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照のこと。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載した米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術について記載した米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載した米国特許第７，０４１，８７０号；並びにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載した米国特許出願公開第２００７／００６１９００号もまた参照のこと。そのような動物により産生された完全な抗体のヒト可変領域を、例えば異なるヒト定常領域を組み合わせることにより、更に修飾してよい。
【０２４３】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が説明されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照のこと。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２，２００６にも記載されている。更なる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。
【０２４４】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する技術について以下で説明する。
【０２４５】
５．  ライブラリ由来抗体
本発明の二重特異性抗原結合分子を、所望の活性（１つ又は複数）を有する抗体に対するコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を保有する抗体に関してそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で公知である。そのような方法は例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）で確認され、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）で更に説明されている。
【０２４６】
ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリ内で無作為に再結合され、次いでＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているような、抗原結合ファージに対してスクリーニングすることが可能である。ファージは通常、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片をディスプレイする。免疫化源からのライブラリは、ハイブリドーマの構築の必要なしに、免疫原に対して高親和性の抗体を付与する。あるいは、ナイーブなレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載するような任意の免疫付与を行わずに、単一源の抗体を、広範囲の非自己抗原及び自己抗原にすることができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を遂行することによって、合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０２４７】
ヒト抗体ライブラリから単離した抗体又は抗体断片は、本明細書におけるヒト抗体又はヒト抗体断片とみなされる。
【０２４８】
６．  抗原結合分子バリアント
特定の場合において、本発明の二重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントが企図されている。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構築物に到達するように、欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせてもよいが、但し、その最終構築物が、所望の特徴、例えば、抗原結合性を有することを条件とする。
【０２４９】
特定の実施形態において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、正しい重／軽鎖対形成を容易にするための、ＶＨ／ＶＬ領域、及び／又はＣＨ１／ＣＬ領域における、１つ以上の変更を含む。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗原結合分子の２つのアームのヘテロ二量体化を容易にするための、Ｆｃ領域内における１つ以上の変更を含む。ＶＨ／ＶＬ領域、ＣＨ１／ＣＬ領域、及び／又はＦＣ領域におけるそのような変更は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１７２４８５号に記載されている。
【０２５０】
Ａ．  置換、挿入、及び欠失バリアント
特定の場合において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗原結合部分バリアントが提供される。置換による変異誘発に関して目的とする部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表３において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表３において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載されるとおりである。アミノ酸置換は、目的の抗体中に導入され得、その産物は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善された抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）若しくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）についてスクリーニングされ得る。
【０２５１】
2021512613.tif 000004
【０２５２】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けされてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；又は
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２５３】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。
【０２５４】
ある種類の置換型バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、更なる研究のために選択される得られたバリアント（複数可）は、親抗体と比べて、特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加及び／又は免疫原性の低減）における変更（例えば、改善）を有し、かつ／又は実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有することになる。例示的な置換型バリアントは、例えば、本明細書に記載の技術などのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成され得る親和性成熟抗体である。要するに、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０２５５】
改変（例えば、置換）は、ＨＶＲ中で、例えば、抗体親和性を改善するために行われてもよい。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照のこと）、及び／又は抗原と接触する残基内で行われ得、結果として得られるバリアントＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの事例では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが創出される。次いで、このライブラリは、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、具体的に特定されてもよい。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的化される。
【０２５６】
特定の場合において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてもよい。そのような改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側であってもよい。上述のバリアントＶＨ及びＶＬ配列の特定の事例では、各ＨＶＲは、改変されていないか、又は１つ、２つ、又は３つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。
【０２５７】
変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、一残基又は一群の標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けたかどうかが決定される。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。あるいは、又は加えて、抗体と抗原との間の接点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
【０２５８】
アミノ酸配列挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドへの抗体のＮ末端若しくはＣ末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増大させる。
【０２５９】
Ｂ．  グリコシル化バリアント
特定の場合において、本発明の抗原結合分子を改変して、抗体がグリコシル化される度合いを増加又は低下させることができる。本発明の抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位を創出するか又は除去するように、アミノ酸配列を改変することによって簡便に達成され得る。
【０２６０】
抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合において、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２，１９９７を参照のこと。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの事例では、特定の特性が改善された抗体バリアントを作製するために、本発明の抗体中におけるオリゴ糖の修飾が行われ得る。
【０２６１】
一例では、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗原結合分子バリアントが提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、又は２０％〜４０％であってよい。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ付番）に位置するアスパラギン残基を指す；しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小規模な配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸の上流又は下流、すなわち、２９４〜３００位の間に位置してもよい。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、及び同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体バリアントに関する刊行物の例としては：米国特許第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；同第２００１／２９２４６号；米国特許第２００３／０１１５６１４号；同第２００２／０１６４３２８号；同第２００４／００９３６２１号；同第２００４／０１３２１４０号；同第２００４／０１１０７０４号；同第２００４／０１１０２８２号；同第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；同第２００３／０８４５７０号；同第２００５／０３５５８６号；同第２００５／０３５７７８号；同第２００５／０５３７４２号；同第２００２／０３１１４０号；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を生成可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化で欠失したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，特に実施例１１において）、並びにα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号）が挙げられる。
【０２６２】
例えば、抗体のＦｃ領域に付着した二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されるバイセクトオリゴ糖を含む、抗原結合分子バリアントが更に提供される。そのような抗体バリアントは、低減されたフコシル化機能を有しても、及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。そのような抗体バリアントの例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号；米国特許第６，６０２，６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に付着しているオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を含む抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、同第１９９８／５８９６４号、及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【０２６３】
Ｃ．  Ｆｃ領域バリアント
特定の例において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本発明の抗体のＦｃ領域内に導入され得、それによりＦｃ領域バリアントを生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含んでよい。
【０２６４】
特定の場合において、本発明は、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を有することにより、インビボでの抗体の半減期が重要ではあるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途に望ましい候補となる抗体バリアントを企図する。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認してもよい。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にし得る。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞が、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞内でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁、表３にまとめられている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照のこと）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣＹＴＯＴＯＸ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は更に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているように、動物モデルにおいてインビボで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができないためにＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号に記載されているＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定も、当該技術分野で既知の方法を使用して行われ得る���例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照のこと）。
【０２６５】
低減したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号及び同第８，２１９，１４９号）。そのようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上が置換されたＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７をアラニンに置換した、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号及び同第８，２１９，１４９号）を含む。
【０２６６】
ＦｃＲへの結合が向上又は低下した特定の抗体バリアントについて記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号，及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと。）
【０２６７】
特定の場合において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥＵ付番）での置換を有するＦｃ領域を含む。
【０２６８】
いくつかの場合において、例えば米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変化（すなわち向上又は低下のいずれか）をもたらすＦｃ領域内で変化が起こる。
【０２６９】
半減期が増大し、胎生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が向上した、母体ＩｇＧを胎児に移行する役割を果たす抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上する１つ以上の置換基を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４、例えばＦｃ領域残基４３４の置換の１つ以上において置換を有するものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０２７０】
Ｆｃ領域バリアントのその他の例に関係するＤｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０２７１】
Ｄ．  システイン改変抗体バリアント
特定の場合において、システイン改変抗体、例えば抗体の１つ以上の残基がシステイン残基により置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製するのが望ましい場合がある。特定の例において、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の接触可能部位に配置され、抗体を他の部位、例えば薬物部位、又はリンカー／薬物部位と結合させ、本明細書で更に記載する免疫抱合体を作製するのに用いられる場合がある。特定の例において、以下の残基のうちの任意の１つ以上を、システインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）。システイン改変抗体は、例えば米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように作製してよい。
【０２７２】
Ｅ．  抗体誘導体
特定の例において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、いずれの分子量のものであってもよく、分岐状であっても非分岐状であってもよい。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、２つ以上のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下である療法に使用されるかなどを含むが、これらに限定されない、考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
【０２７３】
別の例において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の抱合体が提供される。一例において、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、いずれの波長のものであってもよく、これには、限定するものではないが、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に近接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が挙げられる。
【０２７４】
Ｆ．  免疫抱合体
本発明はまた、化学療法剤若しくは薬剤、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、微生物、菌類、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素、若しくはこれらの断片）、又は放射性同位元素などの１つ以上の細胞毒性剤にコンジュゲートした二重特異性抗原結合分子を含む免疫抱合体も提供する。
【０２７５】
一例において、免疫抱合体は抗体薬剤抱合体（ＡＤＣ）であり、抗体が、これらに限定されるわけではないが、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照のこと）；モノメチルオーリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号、同第５，７８０，５８８号、及び同第７，４９８，２９８号を参照のこと）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）；並びにＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照のこと）；ダウノマイシン及びドキソルビシン等のアントラサイクリン（例えばＫｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８−３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１（２００５）；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９−８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９−１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３（２００２）；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照のこと）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル等のタキサン；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５を含む１つ以上の薬剤に結合している。
【０２７６】
別の例において、免疫抱合体は、本明細書に記載されるように、酵素活性毒素又はこれらの断片に結合する抗体を含む。これらは以下に限定されるわけではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、並びにトリコテセンを含む。
【０２７７】
別の例において、免疫抱合体は、放射性原子に複合され、放射性抱合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。放射性抱合体の作製のために、種々の放射性同位元素が利用可能である。例としてはＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性抱合体を検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ＭＲＩ）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄を含んでもよい。
【０２７８】
抗体及び細胞傷害性剤の抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合体化のための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内において細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してよい。
【０２７９】
本明細書における免疫抱合体又はＡＤＣは明確に、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホＥＭＣＳ、スルホＧＭＢＳ、スルホＫＭＵＳ、スルホＭＢＳ、スルホＳＩＡＢ、スルホＳＭＣＣ、スルホＳＭＰＢ、及び市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）ＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含む架橋剤により調製した抱合体を企図するが、これらに限定されない。
【０２８０】
ＩＩＩ．  組換え方法及び組成物
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、米国特許第４，８１６，５６７号、及び米国特許出願公開第２０１３／００７８２４９号に記載されている、組み換え方法及び組成物を使用して作製することができる。一実施形態では、本明細書で記載される二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。このような核酸は、二重特異性抗原結合分子のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、二重特異性抗原結合分子のいずれかのアームの軽鎖及び／又は重鎖）をコードすることができる。更なる実施形態では、そのような核酸を含む１つ又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。
【０２８１】
本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、１つのポリヌクレオチド分子として、又は、同時発現する複数の（例えば２つ以上の）ポリヌクレオチドとして、発現することができる。同時発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合、又は他の手段により会合し、機能性二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット、及び任意に、別の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによりコードすることができる。同時発現する際、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して、抗原結合部分を形成する。別の例において、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの１つ、及び任意に、１つ以上の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子の部分は、２つのＦｃドメインのサブユニットのうちのもう片方、及び任意に抗原結合部分を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによりコードすることができる。同時発現する際、Ｆｃドメインサブユニットが会合して、Ｆｃドメインを形成する。
【０２８２】
特定の実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、第１及び第２の抗原結合部分、並びに２つのサブユニットからなるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子の断片をコードする。一実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、第１の抗原結合部分、及びＦｃドメインのサブユニットをコードする。別の実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、第２の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードする。より特定の実施形態においては、単離ポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖が、ＦｃドメインサブユニットとＣ末端ペプチド結合を共有しているポリペプチドをコードする。更に他の実施形態では、本発明の単離ポリヌクレオチドは、第３の抗原結合部分の重鎖、第２の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードする。いくつかの実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分の軽鎖は同時発現し、重鎖領域と会合してＦａｂドメインを形成する。
【０２８３】
さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのそのような実施形態において、宿主細胞は、（１）二重特異性抗原結合分子の少なくとも１つのＶＬを含むアミノ酸配列、及び二重特異性抗原結合分子の少なくとも１つのＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は、（２）二重特異性抗原結合分子のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び、二重特異性抗原結合分子のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、これらで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞である。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子の作製方法であって、抗体の発現に好適な条件下にて、上述したとおりに、二重特異性抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意に、抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することと、を含む方法を提供する。
【０２８４】
二重特異性抗原結合分子の組み換え作製のために、例えば上述した、二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを単離して、宿主細胞で更にクローニング及び／又は発現するために、１つ以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、二重特異性抗原結合分子の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。
【０２８５】
二重特異性抗原結合分子をコードするベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞としては、本明細書で記載される原核細胞又は真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照のこと。（また、Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照のこと。）発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
【０２８６】
ＩＶ．  薬学的製剤
所望の純度を有する二重特異性抗原結合分子、任意に、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより、本発明の二重特異性抗原結合分子の治療用製剤を、保存のために調製する。製剤に関する一般的な情報については、例えば、Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０；Ａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０；ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒｓ（ｅｄ．）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ  １１９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，２００２を参照のこと。
【０２８７】
許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、レシピエントに対し、使用される用量及び濃度で非毒性であり、これらにはリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２８８】
本明細書の製剤は、２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有し得る。そのような薬剤の種類及び有効量は、例えば、製剤中に存在するアンタゴニストの量及び種類、並びに対象の臨床的パラメータに依存する。
【０２８９】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及び名のカプセル）中、又はマクロ乳濁液中に取り込まれ得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に開示されている。
【０２９０】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例としては、アンタゴニストを含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成型品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−Ｌ−グルタミン酸エチルとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２９１】
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
【０２９２】
Ｖ．  治療方法
本発明の二重特異性抗原結合分子（例えば、第１抗原に特異的に結合可能な一価のアーム、及び２つの第２の抗原に特異的に結合可能な二価のアームを有する二重特異性抗原結合分子）、又はそれらの組成物のいずれかを、本明細書で記載される治療方法のいずれかで使用することができる。
【０２９３】
一態様では、薬剤として使用するための二重特異性抗原結合分子が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載される二重特異性抗原結合分子は、細胞増殖性障害（例えば癌）又は自己免疫性障害の処置又は進行の遅延を必要とする対象における、細胞増殖性障害（例えば癌）又は自己免疫性障害の処置又は進行の遅延に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子は、細胞増殖性障害（例えば癌）又は自己免疫性障害を有する対象における、免疫機能の増強に使用するためのものである。特定の実施形態において、本発明は、個体に、有効な二重特異性抗原結合分子を投与して、エフェクター細胞（例えばＴ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）を活性化する、エフェクター細胞集団を拡張（増加）させる、標的細胞の集団（例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子により認識される第２の標的細胞抗原を発現する細胞の集団）を減少させる、及び／又は、標的細胞（例えば標的腫瘍細胞）を殺傷することを含む、細胞増殖性障害又は自己免疫性障害を有する個体における免疫機能の増強方法で使用するための二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０２９４】
本発明は、細胞増殖性障害（例えば癌）、又は自己免疫性障害などの障害の処置用、又は進行の遅延用の薬剤の製造における、本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を特徴とする。更なる実施形態では、薬剤は、細胞増殖性障害又は自己免疫性障害を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む、細胞増殖性障害又は自己免疫性障害を処置する方法において使用するためのものである。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば、以下に記載されるような、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。更なる実施形態において、薬剤は、エフェクター細胞（例えばＴ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）を活性化する、エフェクター細胞集団を拡張（増加）させる、標的細胞の集団（例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子により認識される第２の標的細胞抗原を発現する細胞の集団）を減少させる、及び／又は、標的細胞（例えば標的腫瘍細胞）を殺傷するためのものである。
【０２９５】
更なる態様において、本発明は、障害の処置又は進行の遅延を必要とする対象における、障害の処置又は進行の遅延方法であって、該方法が、対象に、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、方法は、そのような細胞増殖性障害又は自己免疫性障害を有する対象に、有効量の二重特異性抗原結合分子（例えば、一価の抗ＣＤ３アーム及び二価の抗腫瘍細胞抗原アームを有する二重特異性抗原結合分子）を投与することを含む。１つのそのような実施形態では、本方法は、例えば、以下に記載されるような、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。
【０２９６】
別の態様において、本発明は、障害を有する対象における免疫機能の増強方法であって、該方法が、対象に、前述の態様のいずれかの二重特異性抗原結合分子（例えば、一価の抗ＣＤ３アーム及び二価の抗腫瘍細胞抗原アームを有する二重特異性抗原結合分子）を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、細胞増殖性障害（例えば癌）又は自己免疫性障害である。特定の実施形態において、方法は、有効量の二重特異性抗原結合分子を投与して、エフェクター細胞（例えばＴ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）を活性化する、エフェクター細胞集団を拡張（増加）させる、標的細胞の集団（例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子により認識される第２の標的細胞抗原を発現する細胞の集団）を減少させる、及び／又は、標的細胞（例えば標的腫瘍細胞）を殺傷することを含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子、その組成物、及び使用方法は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、腎癌、前立腺癌、肝癌、頭頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、神経膠芽腫、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ系白血病（ＣＬＬ）、辺縁層リンパ腫（ＭＺＬ）、小型リンパ性白血病（ＳＬＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、中枢神経系リンパ腫（ＣＮＳＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、脾臓辺縁層リンパ腫、毛様細胞性白血病、脾臓のリンパ腫／白血病、脾臓びまん性赤脾髄小型Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病異型、α重鎖病、γ重鎖病、μ重鎖病、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織の結節外辺縁層リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、結節辺縁層リンパ腫、小児結節辺縁層リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大型Ｂ細胞リンパ腫、中枢神経系の原発性ＤＬＢＣＬ、原発性皮膚ＤＬＢＣＬ（脚型）、老年者のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）陽性ＤＬＢＣＬ、ＤＬＢＣＬ随伴慢性炎症、リンパ腫肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大型Ｂ細胞リンパ腫、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性大型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８随伴多中心性キャッスルマン病にて生じる大型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の特徴を有する、分類不可能な大型Ｂ細胞リンパ腫、又は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的なホジキンリンパ腫との間の特徴を有する、分類不可能な大型Ｂ細胞リンパ腫などの癌の処置のために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子、その組成物、及びその使用方法を、ＨＥＲ２陽性癌（例えばＨＥＲ２陽性乳癌、又はＨＥＲ２陽性胃癌）の処置のために使用する。
【０２９８】
本発明は更に、平行して投与される、又は複合レジメンの一部として投与される、二重特異性抗原結合分子を、１つ以上の追加の治療剤（例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の追加の治療剤）と共に投与することを含む、併用療法を提供する。一実施形態において、二重特異性抗原結合分子は、ＢＣＬ−２阻害剤（ＧＤＣ−０１９９／ＡＢＴ−１９９など）、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤（イデラリシブ（ＺＹＤＥＬＩＧ（登録商標））など）、アゴニスト、例えば、活性化する共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＯＸ４０（例えば、ＡｇｏｎＯＸ）、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、４−１ＢＢ、若しくはＩＬＡとしても知られている）、ＣＤ２７（例えば、ＣＤＸ−１１２７）、ＨＶＥＭ、又はＣＤ１２７などに対して作られる、アゴニスト抗体など、拮抗薬、例えば、抑制共刺激分子、例えば、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２としても知られている）、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ（例えば、１−メチル−Ｄ−トリプトファン（１−Ｄ−ＭＴとしても知られている））、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＧＩＴＲ（例えば、ＴＲＸ５１８）又はアルギナーゼなどに対して作られる、拮抗薬抗体など、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、若しくはＹＥＲＶＯＹ（登録商標）としても知られている）、トレメリムマブ（チシリムマブ若しくはＣＰ−６７５，２０６としても知られている）、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３としても知られている）、ＭＧＡ２７１、ＴＧＦベータに対して作られる拮抗薬、例えば、メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＡＴ−１９２としても知られている）、フレソリムマブ（ＧＣ１００８としても知られている）、ＬＹ２１５７２９９ｋ、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）の養子移入、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦベータ受容体、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦベータＩＩ型受容体を含むＴ細胞の養子移入から選択される１つ以上の生物学的修飾物質と同時に投与される。
【０２９９】
特定の実施形態において、生物学的改変剤はＰＤ−１軸結合アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト又は追加の治療剤は、二重特異性抗原結合分子の投与前に、又はこの後に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト又は追加の治療剤は、二重特異性抗原結合分子と同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト（例えばアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ））、ＰＤ−１結合アンタゴニスト（例えばＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペムブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ピディリズマブ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１（スパルタリズマブ）、ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ）、及びＢＧＢ−１０８）、並びに、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニスト（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）からなる群から選択される。
【０３００】
加えて、又はあるいは、本発明の二重特異性抗原結合分子は、（例えば、細胞増殖性障害、例えば癌を有する対象の処置方法の一部として）１つ以上の化学療法剤と共に同時投与することができる。
【０３０１】
更なる態様において、本発明は、ＨＥＲ２陽性癌の処置方法を提供する。一実施形態において、方法は、ＨＥＲ２陽性癌を有する個体に、有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子、例えば、二価のＨＥＲ２アーム及び一価の抗ＣＤ３アームを有する１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを投与することを含む。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２アームは、有効量で患者に投与された際に、許容される毒性プロファイルを有する。一実施形態では、許容される毒性プロファイルを有する１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ分子の抗ＣＤ３アームは、低親和性抗ＣＤ３抗原結合部分である。一実施形態では、許容される毒性プロファイルを有する１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢの抗ＣＤ３抗原結合部分は、４０Ｇ５ｃである。
【０３０２】
特定の実施形態では、ＨＥＲ２陽性癌は、ＨＥＲ２陽性乳癌又はＨＥＲ２陽性胃癌である。ＨＥＲ２陽性癌（例えば、ＨＥＲ２陽性乳癌又はＨＥＲ２陽性胃癌）は、細胞１個当たり少なくとも２００，０００のコピー数（例えば、平均コピー数）（例えば、細胞１個当たり少なくとも２５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも３００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも４００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも６００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも７００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも７５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも８００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも９００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，２００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも２，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり少なくとも３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、又はそれ以上、例えば、細胞１個当たり２００〜２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり３００，０００〜１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり４００，０００〜１，２００，０００のＨＥＲ２のコピー、又は、細胞１個当たり５００，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、例えば、細胞１個当たり２００，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー（例えば、細胞１個当たり２００，０００〜２５０，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり２５０，０００〜３００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり３００，０００〜４００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり４００，０００〜５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり５００，０００〜７５０，０００のＨＥＲ２のコピー、若しくは、細胞１個当たり７５０，０００〜１，０００，０００のＨＥＲ２のコピー）、又は、細胞１個当たり１，０００，０００〜３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー（例えば、細胞１個当たり１，０００，０００〜１，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり１，５００，０００〜２，０００，０００のＨＥＲ２のコピー、細胞１個当たり２，０００，０００〜２，５００，０００のＨＥＲ２のコピー、若しくは、細胞１個当たり２，５００，０００〜３，０００，０００のＨＥＲ２のコピー））にてＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を特徴とすることができる。
【０３０３】
一実施形態では、抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、ＨＥＲ経路を標的化する１つ以上の追加の治療剤と同時投与される。一実施形態では、ＨＥＲ経路を標的化する治療剤は、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、及び／又はＨＥＲ４阻害剤から選択される。一実施形態では、ＨＥＲ２  ＴＤＢ（例えば１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ）は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、Ｔ−ＤＭ１（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、及びペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））から選択される、１つ以上の追加の治療剤と同時投与される。一実施形態では、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３二重特異性抗原結合分子は、トラスツズマブと同時投与される。一実施形態では、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３二重特異性抗原結合分子は、Ｔ−ＤＭ１と同時投与される。一実施形態では、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３二重特異性抗原結合分子は、ペルツズマブと同時投与される。一実施形態では、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３二重特異性抗原結合分子は、トラスツズマブ及びペルツズマブと同時投与される。一実施形態では、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３二重特異性抗原結合分子は、Ｔ−ＤＭ１及びペルツズマブと同時投与される。
【０３０４】
上記の併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別の製剤に含まれている）、及び本発明の二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤（１つ又は複数）の前、同時、及び／又は後に発生することができる、個別投与を包含する。一実施形態では、抗ＣＤ３抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約一カ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行われる。
【０３０５】
本発明の二重特異性抗原結合分子（及び／又は任意の追加の治療剤）は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経口投与、経皮投与、腹腔内投与、眼窩内投与、移植投与、吸入投与、髄腔内投与、心室内投与、又は経鼻投与を含む、任意の好適な手段により投与することができる。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は皮下投与される。別の実施形態において、二重特異性抗原結合分子は静脈内投与される。いくつかの実施形態では、皮下注射により投与される二重特異性抗原結合分子は、静脈内注射により投与される同一の二重特異性抗原結合分子ほど、患者内で毒性応答を示さない。投薬は、投与が短期であるか長期であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によるものであってもよい。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
【０３０６】
本発明の二重特異性抗原結合分子を、良好な医事に合わせた方法で製剤化、投薬、及び投与することができる。この文脈における考慮の要因には、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の対象の臨床的病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理、及び医療従事者に既知の他の要因が含まれる。二重特異性抗原結合分子は、必ずしもではないが、任意に、問題の障害を予防又は処置するために同時に使用する１つ以上の作用物質と共に、製剤化される。有効量のそのような他の作用物質は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類、及び上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投薬量の約１〜９９％、又は適切であると経験的／臨床的に決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【０３０７】
疾患の予防又は処置に関して、（単独で、又は、１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用する場合の）本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な用量は、処置される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、二重特異性抗原結合分子が予防又は治療目的で投与されているか否か、治療歴、患者の臨床歴及び二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の自由裁量に応じて左右される。二重特異性抗原結合分子は、一度に、又は一連の処置にまたがり、患者に好適に投与される。
【０３０８】
一般的な提示として、ヒトに適用する二重特異性抗原結合分子の治療上の有効量は、１回以上の投与によるか否かに応じて、患者の体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜約１００ｍｇの範囲になるであろう。いくつかの実施形態では、使用する二重特異性抗原結合分子は例えば、１日当たりの投与において、約０．０１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、本明細書で記載される二重特異性抗原結合分子はヒトに、１〜２１日目のサイクルにおいて、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、又は約１４００ｍｇの用量で投与される。用量は、注入物などの、単回用量で、又は複数回用量（例えば、２回用量若しくは３回用量）で投与されてもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の投与量の１種以上を、対象に投与してよい。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週、又は３週間毎に投与されてもよい（例えば、患者が、約２回〜約２０回、又は例えば、約６回用量の抗ＣＤ３抗体を受容するようにする）。最初の多めの投与量、それに続く一回以上の量の少ない用量を投与してよい。この治療の進行は、従来技術及びアッセイによって容易に監視される。本発明の前述の態様のいずれかに関するいくつかの実施形態において、対象、患者、又は個体はヒトである。
【０３０９】
ＶＩ．  キット
１つ以上の本明細書で記載した組成物（例えば、二重特異性抗原結合分子、及び薬学的に許容される担体の１つ以上のいずれかを含む組成物）、並びに、組成物を対象に投与して、障害（例えば、細胞増殖性障害（例えば、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、腎癌、前立腺癌、肝癌、頭頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、神経膠芽腫、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ系白血病（ＣＬＬ）、辺縁層リンパ腫（ＭＺＬ）、小型リンパ性白血病（ＳＬＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、中枢神経系リンパ腫（ＣＮＳＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、脾臓辺縁層リンパ腫、毛様細胞性白血病、脾臓のリンパ腫／白血病、脾臓びまん性赤脾髄小型Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病異型、α重鎖病、γ重鎖病、μ重鎖病、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織の結節外辺縁層リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、結節辺縁層リンパ腫、小児結節辺縁層リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大型Ｂ細胞リンパ腫、中枢神経系の原発性ＤＬＢＣＬ、原発性皮膚ＤＬＢＣＬ（脚型）、老年者のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）陽性ＤＬＢＣＬ、ＤＬＢＣＬ随伴慢性炎症、リンパ腫肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大型Ｂ細胞リンパ腫、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性大型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８随伴多中心性キャッスルマン病にて生じる大型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の特徴を有する、分類不可能な大型Ｂ細胞リンパ腫、又は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的なホジキンリンパ腫との間の特徴を有する、分類不可能な大型Ｂ細胞リンパ腫などの癌））を処置する、又はこれらの進行を遅延させるための添付文書を含むキットを、本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、癌はＨＥＲ２陽性癌（例えば、ＨＥＲ２陽性乳癌又はＨＥＲ２陽性胃癌）である。加えて、又はあるいは、キットは、組成物を対象に投与して、自己免疫性障害を処置する、又は進行を遅延させるための添付文書を含んでよい。
【実施例】
【０３１０】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上述の概要を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０３１１】
実施例１材料及び方法
遺伝子の合成
Ｆａｂ
軽鎖及び重鎖可変ドメインの遺伝子合成により、抗ＨＥＲ２（４Ｄ５−８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９２，８９：４２８５−４２８９）Ｆａｂのバリアントをコードする遺伝子を得た。Ｅｘｐｉ２９３ＴＴＭ細胞内で、３０ｍＬのスケールで抗ＨＥＲ２．４Ｄ５  Ｆａｂ及びバリアントを作製し、抗Ｆｌａｇ親和性樹脂を使用して、バッチで精製した。３ｘＰＢＳ洗浄工程の後、Ｆａｂを５０ｍＭのリン酸（ｐＨ３．０）で溶出し、２０ｘＰＢＳ（ｐＨ１１．０）で中和して、フィルタにかけた。全てのＦａｂは≧９５％の純度であり、質量分析により確認した。
【０３１２】
ＩｇＧ  ＴＤＢ及び１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ
前述（Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ２０１７，９：２１３−２３０）のとおりに、ノブ（抗ＨＥＲ２．Ｎ２９７Ｇ．ノブ（４Ｄ５−８及びバリアント）；Ｋｅｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２：６８２８−６８３５）、及びホール（抗ＣＤ３．Ｎ２９７Ｇ．ホール（別に明記されない限り、４０Ｇ５ｃ））半抗体を生成した。１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ構築物に関して、抗ＨＥＲ２  Ｆａｂ（Ｅ１−Ｔ２２５）用のコード領域を直接、抗ＨＥＲ２．ノブ配列のコード領域に先行させ、これらの間にＧ４ＳＧＧリンカー有り、及び無しで、合成した。
【０３１３】
１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのルシフェラーゼ融合
ルシフェラーゼ（ＡＡＧ５４０９５．１）Ｋ１８−Ｄ１８５用の成熟タンパク質配列のＣ末端を、抗ＨＥＲ２．ｈｕ４Ｄ５軽鎖に融合した。ルシフェラーゼ軽鎖融合がある、及びない、抗ＨＥＲ２．ｈｕ４Ｄ５  Ｆａｂは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び以下に記載の方法を用いると、ＨＥＲ２に対する同様の結合動態を生み出した。
【０３１４】
抗体の発現及び精製
ＩｇＧ  ＴＤＢ、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、及び１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのルシフェラーゼ融合物を、以下のとおりに作製した。半抗体である抗ＨＥＲ２．ｈｕ４Ｄ５．ノブ及びバリアント、並びに抗ＣＤ３．４０Ｇ５ｃ．ホールを、≧１ＬにてＣＨＯ細胞内で産生し、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。半抗体からの、二重特異性ＩｇＧ  ＴＤＢ、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、又は１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢルシフェラーゼ融合物の組み立てを、Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４，７４：５５６１−５５７１；Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，３１：７５３−７５８に記載のとおりに実施した。
【０３１５】
ＨＥＲ２のウェスタンブロット分析
Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ細胞溶解緩衝液を使用して、細胞溶解物を生成した。ＢＣＡアッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２２８及び２３２２４）を使用して、タンパク質を定量化した。４０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、検出のためにＨＥＲ２抗体（Ｄａｋｏカタログ番号Ａ０４８５）を使用した。
【０３１６】
免疫組織化学法（ＩＨＣ）
Ｖｅｎｔａｎａ  ＤＡＢ検出と共に、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ−Ｂｅｎｃｈｍａｒｋシステムを使用して、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃｌｏｎｅ  ４Ｂ５，Ｔｕｓｃａｎ，ＡＺ）ウサギモノクローナル一次抗体を含む、５μｍのホルマリン固定した、パラフィン埋め込み組織サンプル及び組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）サンプルにて、ＨＥＲ２に対する免疫組織化学法を実施した。ＡＳＣＯ−ＣＡＰが推奨する、臨床ＨＥＲ２スコアリングガイドラインを使用して、染色結果を０、１＋、２＋、又は３＋としてスコア付けした。
【０３１７】
蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
プローブ
細胞株ＴＭＡの分析のために、Ｃｏｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓより市販されている、ＦＤＡ認可ＨＥＲ２  ＦＩＳＨプローブ（ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用した。ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ  ＨＥＲ−２  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅカクテルは、２つの標識したＤＮＡプローブからなる。ＨＥＲ２遺伝子全体にまたがるＬＳＩ  ＨＥＲ２プローブを、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅにて標識する。ＣＥＰ１７プローブをＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎで標識し、染色体１７のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡにハイブリダイズさせる（１７ｐ１１．１−ｑ１１．１）。ＣＥＰ１７プローブを含めることにより、ＨＥＲ２遺伝子の相対的なコピー数を測定することができる。
【０３１８】
アッセイ
ＴＭＡブロックの５μｍ厚のＦＦＰＥセクションを、変更を加えた前述したＦＩＳＨ分析に通した。５６℃で一晩インキュベーションした後、スライドを、それぞれ５分間、ＣｉｔｒｏＳｏｌｖで３回洗浄して脱パラフィン化し、２回のアルコール洗浄により脱水して空気乾燥させた。続いて、ＦＦＰＥセクションを、Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ試薬（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ＩＬ）で３０分間、８０℃でインキュベーションし、プロテアーゼＩＩ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ＩＬ）で処理した後、水、及び一続きのエタノールで更に処理した。次に、乾燥したスライドを７６℃にて、６分間プローブにより同時変性させ、一晩３７℃にてハイブリダイゼーションした（ＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）。ハイブリダイゼーション後の洗浄、及び対比染色を、前述のものに類似の方法で行った。
【０３１９】
コンピュータ駆動式イメージングシステム（ＢｉｏＶｉｅｗ  Ｄｕｅｔ，ＢｉｏＶｉｅｗ  Ｌｔｄ．）を装着した蛍光顕微鏡を使用して、断面を確認した。各サンプルからの、最小で５０個の非重複腫瘍細胞を、ＨＥＲ２及びＣＥＰ１７ハイブリダイゼーションシグナルに対して計数した。スライドの分析のために、現在のＨＥＲ２スコア付け基準及びガイドラインを使用した。細胞株が、２以上の、ＨＥＲ２：ＣＥＰ１７比率を有する、又は、２未満のＨＥＲ２：ＣＥＰ１７比率を有し、細胞内の細胞核１個当たり６を超えるシグナルの平均ＨＥＲ２コピー数を有する場合、細胞株をＦＩＳＨ陽性であるとみなした。２未満のＨＥＲ２：ＣＥＰ１７比率、及び、細胞核１個当たり４未満のシグナルの平均ＨＥＲ２コピー数を有するサンプルを陰性とみなし、２未満のＨＥＲ２：ＣＥＰ１７比率、及び細胞核１個当たり４〜６のシグナルの平均ＨＥＲ２コピー数を有するサンプルを、両方に取れるものとみなした。
【０３２０】
細胞ＨＥＲ２結合アッセイ
１Ｆａｂ−ＩｇＧのルシフェラーゼ融合物の細胞結合−直接結合アッセイ：
９６平底白色滅菌組織培養処理プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号１３６１０１）に細胞（ＳＫＢＲ３：ウェル当たり４０，０００個、ＭＣＦ７：ウェル当たり２００，０００個）をプレーティングし、一晩接着させた。次に、細胞を結合緩衝液（ＰＢＳ＋３％  ＢＳＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム；ｐＨ７．２）で洗浄し、結合緩衝液中の、様々な濃度（０．００２ｎＭ〜１００ｎＭ）のＴＤＢルシフェラーゼ融合タンパク質を各ウェルに添加した。次にプレートを４℃で４時間インキュベートし、その後、結合緩衝液で３回洗浄した。最後の洗浄の後、５０μＬのルシフェラーゼ基質（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，カタログ番号Ｅ３３００Ｌ）を含有する２０μＬの結合緩衝液を、各ウェルに添加した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒでルミネセンス値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍモデルの「Ｏｎｅ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ」を使用して結合データを適合させ、抗体の結合親和性を測定した。
【０３２１】
１Ｆａｂ−ＩｇＧのルシフェラーゼ融合物の細胞結合−競合結合アッセイ：
上述のとおりの細胞をプレーティングし、洗浄した。競合結合を測定するために、固定濃度のＴＤＢルシフェラーゼ融合タンパク質（１５ｎＭの４Ｄ５−ＷＴ、又は５０ｎＭの４Ｄ５−Ｈ９１Ａ）を、結合緩衝液中で、濃度を増加させたＴＤＢ（０．００７ｎＭ〜４００ｎＭ）と混合し、細胞に添加した。プレートを４時間、４℃にてインキュベートし、上述のとおりに読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍモデルの「Ｏｎｅ  Ｓｉｔｅ−Ｆｉｔ  Ｋｉ」を使用して結合データを適合させ、抗体の結合親和性を測定した。
【０３２２】
フローサイトメトリーによる細胞結合
５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡ、ＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡ）内の９６ウェル丸底プレート内で、ウェルあたり１００，０００個の細胞にて、ＭＣＦ７及びＳＫＢＲ３細胞をプレーティングした。試験物品を、５０μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬのいずれかにて開始して、ＦＡＣＳ緩衝液内で１：５に連続希釈し、氷上で３０分間、細胞と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で、１：２００希釈にて、１００μＬのＡｌｅｘａ  ６４７  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｏ．１０９−６０６−０９８）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃００−６９９０−５０）を１：１００希釈で含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒで分析した。
【０３２３】
血液細胞の分画
リンパ球分離培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して、健常なボランティアの血液からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ヒトＣＤ８＋単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｎｏ．１３０−０９４−１５６）を使用して、ネガティブ選択により、ＣＤ８＋細胞を抽出した。
【０３２４】
Ｔ細胞の活性化
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から、フローサイトメトリー細胞染色用の抗体を全て入手した。平底９６ウェルプレート（ＢＤ）内で、試験物品の存在下において２４時間、ヒトＰＢＭＣ及び標的細胞（１０：１の比）をインキュベートした。インキュベーション後、細胞を新しいＶ底９６ウェルプレートに移した。細胞を抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ６９−ＰＥ、及び抗ＣＤ２５−ＡＰＣで染色した。フローサイトメトリーにより、ＣＤ６９及びＣＤ２５の表面発現をＣＤ８＋Ｔ細胞で検出した。ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋の割合をＴ細胞の活性化として報告した。ＨＥＲ２とは独立したＴ細胞の活性化を測定するために、ＴＤＢ又はＯＫＴ  ＣＤ３抗体と共に２４時間、Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌ  ＮＦ−κΒ／ＩＲＦ受容体細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎカタログ番号  ｊｋｔｄ−ｉｓｎｆ）を３７℃でインキュベートした。各ウェルから１０μＬの上清を取り除き、白色で底が透明の９６ウェルプレートに添加した。１００μＬのＱｕａｎｔｉｌｕｃ溶液を（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）回収した上清に添加し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーでプレートを読み取った。
【０３２５】
インビトロアポトーシス
培養培地内で、ウェルあたり１０，０００個の細胞で、底が透明の黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｎｏ．３９０４）に標的細胞をプレーティングして、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベータに一晩配置した。試験物品、５０，０００個の精製したＣＤ８＋細胞、及び１：１０００のカスパーゼ３／７試薬（Ｅｓｓｅｎ  Ｎｏ．４４４０）の１：１０００希釈液を、予めプレーティングした細胞に添加し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  ｚｏｏｍに配置した。４時間ごとに、４０時間にわたり画像を収集し、１ｍｍ２当たりのアポトーシス事象の数を分析した。
【０３２６】
細胞生存能
１０％  ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトアビジン（１００μｇ／ｍＬ）、及びＬ−グルタメート（０．２ｍＭ）を補充したＲＰＭＩ内で細胞を増殖させ、コンフルエンスにした。ＰＢＳ系細胞解離培地を用いて細胞を解離させ、底が透明の黒色９６ウェルプレートに、ウェル当たり１０，０００個の細胞の密度でプレーティングした。４日目に培地を廃棄し、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬのＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存能試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を添加し、取扱説明書に記載のとおりに、照度計上でプレートを読み取った。
【０３２７】
乳癌細胞増殖
ＣＤ８＋細胞をエフェクターとして、３：１（エフェクター：標的）の比で使用した。ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、乳癌細胞増殖／生存能を検出した。アッセイのために、ウェルあたり１５×１０３個の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、処理前の細胞付着のために一晩インキュベートした。
【０３２８】
インビボ有効性
メスＮＯＤスキッドガンマ（ＮＳＧ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。マウスにて、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。リンパ球分離培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ，Ｓａｌｏｎ，Ｏｈｉｏ）を使用して、健常なドナーの血液からＰＢＭＣを精製し、−８０℃にて冷凍保存した。マウスに移植する前に、ＰＢＭＣを解凍して、ＲＰＭＩ培地含有の１０％  ＦＢＳ中で、３７℃、５％  ＣＯ２にて一晩培養した。腫瘍細胞播種の１日後に、１００μＬのＨａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液の体積で、マウス１匹当たり１０×１０６個の細胞の濃度で、ＰＢＭＣをマウスに腹腔内播種した。ＨＥＲ２増幅乳癌の処置における有効性を評価するために、右胸部乳房脂肪パッドに皮下投与を行うことで、動物にＨＢＳＳ／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）内の３×１０６個のＫＰＬ−４腫瘍細胞を播種した。ＨＥＲ２低発現腫瘍の処置における活性を評価するために、ＨＢＳＳ内の５×１０６個のＨＴ５５腫瘍細胞を動物に皮下播種した。図の一覧に示すように、０日目において、単回投与処置を静脈内投与した。
【０３２９】
カニクイザルの安全性及び薬物動態（ＰＫ）研究
１１匹のメスカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；投与開始時の年齢及び体重は、２４〜６０ヶ月、及び２〜５ｋｇの範囲）を無作為に、３つの群に割り当てた。動物は、２ｍＬ／ｋｇ／時間の体積で、１時間の静脈内注射により、ビヒクル対照（Ｎ＝３）、又は３ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝３）にて抗ＨＥＲ２−ＣＤ３  ４Ｄ４−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、又は２０ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝５）にてＴＤＢを受けた。動物の、痛み又は苦痛のあらゆる異常及び徴候を、１日２回監視した。更なるエンドポイントは、食物摂取、体重、身体検査、体温、呼吸速度、及び心拍数を含んだ。
【０３３０】
ＰＫ分析
研究を通して、様々な時点でカニクイザルの血液を収集し、薬学動態を評価した。血液を室温で少なくとも３０分間、凝固させた。収集から１時間以内に、サンプルを２〜８℃にて、約１５００〜２０００ｘｇで遠心分離した。分析のために、輸送されるまで、血清−６０℃〜−８０℃にて保管するように収集した。ＧＲＩＰ  ＥＬＩＳＡ（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００８，３３５：８−２０）により、血清ＰＫサンプルを分析した。血清濃度−時間プロファイルを使用して、非区画分析（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、バージョン５．２．１；Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用し、以下のＰＫパラメータを推定した：血清濃度−時間曲線（ＡＵＣ）、抗体クリアランス（ＣＬ）、及び観察される最大血清濃度（Ｃｍａｘ）の下での面積として定義される、合計の薬剤曝露。各動物を個別に分析し、各投与群の結果を平均±標準偏差（ＳＤ）としてまとめた。
【０３３１】
臨床での病状
投与前段階の間、並びに研究の２日目及び８日目に少なくとも２回、凝固試験のために、抗凝血物質のクエン酸ナトリウムを含有する、又は、血液学試験のために、カリウムＥＤＴＡを含有するチューブに、血液を収集した。
【０３３２】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）
抗ＨＥＲ２  Ｆａｂ又は抗ＨＥＲ２／ＣＤ３  Ｔ細胞依存性の二重特異性（ＴＤＢ）抗体の結合動態を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００又は８Ｋ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で表面プラズモン共鳴を使用して測定した。３７℃で３０μＬ／分の流速で、かつ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡのランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液）を使用して、全ての動態実験を実施した。ヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ；Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  １０００４−Ｈ０８Ｈ若しくはＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＮＢＰ１−９４７０２）、又はカニクイザルＨＥＲ２  ＥＣＤを、アミンベースのカップリングにより、ＣＭ５センサチップ上に不動化した。ヒトＨＥＲ２  ＥＣＤに関して、０．２７〜２００ｎＭの範囲の、３倍希釈系列の抗ＨＥＲ２  Ｆａｂ又はＴＤＢを使用して、結合を分析した。カニクイザルＨＥＲ２  ＥＣＤに関して、８７．８〜１０００ｎＭの範囲の、１．５倍希釈系列の抗ＨＥＲ２  Ｆａｂを使用して、結合を分析した。１８０秒の注入時間、続いて３００秒の解離時間及び、５０ｍＭ  ＨＣｌを用いた表面の再生を使用して、ＨＥＲ２を結合するためのセンサーグラムを記録した。定常状態結合モデルを使用して動態及び結合定数を計算した、カニクイザルＨＥＲ２への４Ｄ５  Ｆａｂバリアントの結合を除いて、１：１ラングミュア結合を使用して、抗体に対する抗原結合を観察したセンサーグラム全てを分析した。カニクイザルＨＥＲ２に対する弱い親和性を測定するためには高濃度のＦａｂが必要であるが故に、緩衝効果を防止し、正確な測定を確実にするために、実験前に、Ｆａｂバリアント全てを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にバッファー交換した。４Ｄ５バリアント全ての質量を、質量分析法により確認した。
【０３３３】
実施例２．抗ＨＥＲ２／ＣＤ３  ＩｇＧ  ＴＤＢのＨＥＲ２親和性は、ＨＥＲ２過剰発現細胞に対する選択性にではなく、殺活性に直接的な効果を有する
各結合アームに対して一価である、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３二重特異性抗体は、ＨＥＲ２増幅したインビトロ及びインビボ乳癌モデルにおいて、ロバストな活性を有することが示されている。しかし、ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマットは、通常のＨＥＲ２陽性ヒト上皮細胞と同様に、少量のＨＥＲ２を発現する細胞株に対する、低レベルの活性もまた保持する。オンターゲットオフ腫瘍活性のリスクを最小限にするために、ＨＥＲ２増幅細胞に対する、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３  ＴＤＢの選択性を増加させることにより、ＨＥＲ２標的化ＴＤＢの治療指数を増加させることが望ましい。最初に、ＨＥＲ２増幅細胞に対するＩｇＧ  ＴＤＢの選択性における、ＨＥＲ２親和性の影響を調査した。０．３〜２１３ｎＭの範囲のＦａｂとしての一価の結合親和性を有する抗ＨＥＲ２  ４Ｄ５の複数のバリアント（表４）を生成した。全てのバリアントに関して、親和力低下の主たる要因は、解離速度（ｋｄ）の増加（即ち、より速い解離速度）であった一方で、会合速度（ｋａ）は変化しないままだった。
【０３３４】
2021512613.tif 000005
【０３３５】
一次選択性試験のために、ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７をモデル細胞株として使用した。ＳＫＢＲ３はＨＥＲ２増幅乳癌細胞株である一方で、ＭＣＦ７は、培養した心筋細胞などの、非癌性細胞で検出される量と同様の少量のＨＥＲ２を発現する乳癌細胞株である（図１）（Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７４（１９）：５５６１−５５７１，２０１４）。ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７細胞における、ＨＥＲ２の細胞膜コピー数はそれぞれ、細胞１個当たり２×１０６個、及び細胞１個当たり１．５×１０４個と報告されている（Ａｇｕｉｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（４４）：６０５０−６０６２，１９９９）。ＨＥＲ２結合親和性が低下することにより、ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７細胞株の両方において、抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ  ＴＤＢの殺活性が徐々に低下した（図２Ａ〜２Ｆ）。ＨＥＲ２に対して４９ｎＭ以上の親和性を有するＩｇＧ  ＴＤＢにより、殺活性は実際的に消滅した。同様の活性レベルが、ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７細胞で観察された。まとめると、一価のＨＥＲ２親和性は、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３  ＩｇＧ  ＴＤＢの活性において重要な役割を果たすが、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する選択性には影響を及ぼさなかった。
【０３３６】
実施例３。ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する選択性における、二価の低親和性ＨＥＲ２結合の影響の特性決定
一価の４Ｄ５親和性バリアントをベースにして、二価のＨＥＲ２結合及び一価のＣＤ３結合（１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマット）を有する抗体を構築した（図３）。ＳＫＢＲ３細胞（図４Ａ及び７Ａ）、並びにＭＣＦ７細胞（図４Ｂ及び７Ｂ）に対する細胞結合について、並びに、ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７細胞のアポトーシス（図５Ａ及び５Ｂ）並びに殺傷（図６Ａ〜６Ｃ、及び８）を媒介する能力について、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを試験した。複数の４Ｄ５  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢバリアントは、野生型４Ｄ５をベースにする一価の高親和性ＨＥＲ２アームを有する対照ＩｇＧ  ＴＤＢ（トラスツズマブ）と比較して、ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７細胞に対して同様の結合を示した（図４Ａ及び４Ｂ）。Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ、Ｙ１００ａＡ、又はＮ３０Ａ．Ｈ９１Ａ置換（それぞれ、１７２、２１３、及び３５３ｎＭの一価のＫＤ）により、一価の高親和性ＨＥＲ２  ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマットと比較して、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマットにおいて、実質的に低下した細胞結合がもたらされた（図７Ａ及び７Ｂ）。低い結合は、実質的に低下した、ＳＫＢＲ３細胞の殺傷を反映した（図８）。１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマットにおける、Ｙ１０２Ｖ及びＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ置換（それぞれ、０．３及び２．６ｎＭの一価のＫＤ）により、対照ＩｇＧ  ＴＤＢと比較して、ＳＫＢＲ３及びＭＣＦ７細胞株の両方に対して、同様の結合がもたらされた（図４Ａ及び４Ｂ）。細胞結合に一致して、Ｙ１０２Ｖ及びＹ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢバリアントは、低ＨＥＲ２発現ＭＣＦ７細胞の殺傷における実質的な潜在能を示した。このことは、これらの改変が、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する選択性を改善しなかったことを示唆している（図５Ａ、５Ｂ、６Ｂ、及び６Ｃ）。
【０３３７】
２つの４Ｄ５バリアントである、Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ及びＨ９１Ａ（それぞれ、２３及び４９ｎＭの一価のＫＤ）は、ＭＣＦ７細胞に対する最小限の結合のみを示しながら、ＳＫＢＲ３細胞に対して高い細胞結合を維持した（図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、及び５Ｂ）。この細胞結合は、殺活性にて反映された。特に、Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ及びＨ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢバリアントは、ＳＫＢＲ３細胞の強力なアポトーシス及び殺傷を誘発したが、非常に高濃度（５０ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ）であるにもかかわらず、低ＨＥＲ２発現ＭＣＦ７細胞の殺傷を媒介することはできなかった。一価の高ＨＥＲ２親和性ＨＥＲ２−ＩｇＧ  ＴＤＢのインビトロ活性は、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度にて飽和することが報告されている（Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７４（１９）：５５６１−５５７１，２０１４）。これらの結果は、従来の抗体に対して増強された１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのアビディティにより、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞の選択性を増強することが可能であることを示唆している。選択性の増加をもたらした一価の親和性（ＫＤ）のウィンドウは、Ｆａｂとして測定すると、２０〜５０ｎＭの範囲であった。親和性の低下が小さいと選択性が改善されず、親和性の低下が大きいと、ＴＤＢの潜在能が著しく損なわれる。
【０３３８】
実施例４。ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマットの増強された選択性の特性決定
４Ｄ５のＨ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢバリアントを選択して、インビトロ活性を更に分析した。一価の高ＨＥＲ２親和性ＩｇＧ  ＴＤＢと比較して、ＳＫＢＲ３における４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ活性はほぼ同一であったことを、用量反応研究は示した（図９；それぞれＥＣ５０  ６．９及び６．３ｐＭ）。ＩｇＧ  ＴＤＢとは対照的に、ＭＣＦ７細胞に対しては、あらゆる投与量の１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢにおいて、活性は見られなかった（図９）。９０個の乳癌細胞株を適宜、高（＞４００ｎＲＰＫＭ（１００万個のマッピングした読み取り当たりの、転写長さ１キロベース当たりでの正規化読み取り））、中（５０〜４００ｎＲＰＫＭ）、及び低（＜５０ｎＲＰＫＭ）に分けた。ＨＥＲ２−ＲＮＡ発現をベースにするＨＥＲ２発現細胞は、Ｋｌｉｊｎ  ２０１５に報告されている（図１０；Ｋｌｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（３）：３０６−３１２，２０１５）。選択性研究を、変更可能なＨＥＲ２発現量で、１５個の細胞株に拡張した。高用量レベル（５０ｎｇ／ｍＬ）において、一価の高ＨＥＲ２親和性ＩｇＧ  ＴＤＢに対して、Ｔ細胞の活性化とＨＥＲ２発現との間には、明確な相関は見られなかった（図１１Ａ〜１１Ｄ）。はっきりと対照的に、Ｈ９１Ａ親和性バリアント１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを試験したときに、最も高いＨＥＲ２発現量を有する細胞株においてのみ、Ｔ細胞の活性化が誘発された（図１２Ａ〜１２Ｄ）。同様に、標的細胞の殺傷は、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ分子を有する高ＨＥＲ２発現細胞株に限られたが、高ＨＥＲ２親和性ＩｇＧ  ＴＤＢは、高用量レベルにて使用した場合に、低ＨＥＲ２発現細胞の殺傷の誘発においてもまた、広範囲にわたって活性であった（図１１Ａ〜１１Ｄ、及び１２Ａ〜１２Ｄ）。５０ｎｇ／ｍＬ用量の対照ＩｇＧ  ＴＤＢにより、低ＨＥＲ２発現細胞のＴ細胞の活性化及び殺傷が誘発された一方で、５０μｇ／ｍＬの１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、低ＨＥＲ２発現細胞の生存能に影響を及ぼさなかった。したがって、ＨＥＲ２に対する対照ＩｇＧ  ＴＤＢと比較した、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ分子の選択性の改善は、１０００倍以上であると計算された。
【０３３９】
活性を、肺、皮膚、及び胸組織に由来するヒトの非癌細胞株で、更に試験した。フローサイトメトリーにより試験した非癌性細胞の全てにおいて、低量のＨＥＲ２発現を確認した。表５は、これらの細胞の特性決定、並びにＩｇＧ  ＴＤＢ及び１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢの結合を示す。
【０３４０】
2021512613.tif 000006
【０３４１】
Ｈ９１Ａ親和性バリアント１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、≦５μｇ／ｍＬの濃度で、試験した８つの細胞のいずれに対しても、アポトーシス活性を示さなかった。ＨＢＬ−１００細胞で培養した１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢとＩｇＧ  ＴＤＢとの用量反応曲線の相対比較により、Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢとは対照的に、Ｈ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、低ＨＥＲ２発現ＨＢＬ−１００細胞を殺傷することが示される（図１３）。動態アッセイにより、経時的に、ＨＢＬ−１００殺傷におけるＨ９１Ａ−ＩｇＧ  ＴＤＢの用量依存が確認され、更に、Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢが誘発する殺傷が、７０時間にわたって最小限であることが示される（図１４Ａ及び１４Ｂ）。これらの結果は、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのインビトロ潜在能は、高ＨＥＲ２発現細胞株の殺傷における、一価の高ＨＥＲ２親和性ＩｇＧ  ＴＤＢに類似していることを示している。しかし、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、試験した低ＨＥＲ２発現細胞株の全てにおいて、検出可能な活性を有しなかった。このことは、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢがＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対して選択的であることを示唆している。
【０３４２】
Ｈ９１Ａ親和性バリアント１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢの活性に必要なＨＥＲ２発現量の閾値を、次に調査した。様々なＨＥＲ２発現プロファイルを有する１３個の標的細胞株を用いる１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのインキュベーションの際に、細胞１個当たり２００，０００を超えるＨＥＲ２分子のコピー数にてＨＥＲ２を発現する標的細胞において、殺傷が観察された（図１５Ａ）。特に、≧４８９ｎＲＰＫＭのＨＥＲ２  ＲＮＡを発現する全ての細胞株（即ち、≧２９０，５７９のコピー数にてＨＥＲ２を発現する細胞株）において、ロバストな殺活性が検出された。≦２６０ｎＲＰＫＭのＨＥＲ２  ＲＮＡを発現した全ての細胞株（即ち、≦１４６，２０８のコピー数にてＨＥＲ２を発現する細胞株）において、最小の活性が検出された。Ｑｕａｎｔｕｍ−Ａｌｅｘａ６４７  ＭＥＳＦビーズを使用するＦＡＣＳにより、各細胞株に対するＨＥＲ２コピー数を定量化し、結果を下表６にまとめている。
【０３４３】
2021512613.tif 000007
【０３４４】
臨床的に確認されたＨＥＲ２診断試験に対して活性を更にベンチマークし、患者の選択に使用した。試験した細胞株のうちの２０個の細胞から、Ｈ９１Ａ親和性バリアント１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを使用すると、ＩＨＣ  ３＋、ＦＩＳＨ＋細胞株においてのみ、実質的な殺活性が確認された（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。
【０３４５】
実施例５。ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍に対する、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのインビボ選択性の評価
Ｈ９１Ａ親和性バリアント１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢのインビボ活性を評価した。ヒトＰＢＭＣを補充したＮＳＧマウスに、ＨＥＲ２増幅ＫＰＬ４腫瘍又はＨＴ５５腫瘍を移植した。これは、ＭＣＦ７細胞と同様のレベルのＨＥＲ２を発現した（図１６）。Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの単回用量に応答して用量退行を誘発した（図１７）。一方で、一価の高ＨＥＲ２親和性ＩｇＧ  ＴＤＢは、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量にて退行を誘発した。これらは、１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢが約１０倍未満でインビボにて活性であることを示す。インビトロの結果に基づき予想されるように、ＨＴ５５腫瘍の処置において、より低い活性が検出された（図１８）。一価の高ＨＥＲ２親和性ＩｇＧ  ＴＤＢは、０．１ｍｇ／ｋｇの単回用量にてＨＴ５５腫瘍の退行を誘発した。Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、≦５０ｍｇ／ｋｇの用量にて、ＨＴ５５腫瘍の処置におけるあらゆる抗腫瘍活性を有しなかった。両方の分子が、ＨＥＲ２増幅腫瘍の処置において非常に強力であることを、これらの結果は示し、ＨＥＲ２増幅癌でのＨＥＲ２の発現レベルに基づき、前向きな治療指数を指示する。Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ  ＨＥＲ２  ＴＤＢは、通常の、低量の（例えば、通常のヒト組織に類似した）ＨＥＲ２を発現する腫瘍と比較して、ＨＥＲ２増幅腫瘍に対して、１００倍以上のインビボ選択性を示した。
【０３４６】
実施例６。増強された選択性に対するＨＥＲ２親和性の調整
１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマットにおける改善された選択性を示した２つの４Ｄ５バリアントである、Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ及びＨ９１Ａ（それぞれ、２３及び４９ｎＭの一価のＫＤ）を、更なる特性決定のために選択し、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する最大の選択性を達成するのに最適な親和性を同定した。ＳＫＢＲ３細胞に対するインビトロ用量反応アッセイにおいて、Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ及びＨ９１Ａバリアントは、ほぼ同一の活性を示した（図２０）。両方の分子が、ＨＥＲ２増幅ＫＰＬ４腫瘍異種移植片の処置において、０．５ｍｇ／ｋｇの用量でのロバストな抗腫瘍活性を示した（図１７及び１９）。高濃度（５０ｎｇ／ｍＬ）の１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢバリアント、Ｈ９１Ａ−１ＦａｂＩｇ（図２１Ａ、２３Ａ、及び２５Ａ）、並びにＤ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ（図２１Ｂ、２３Ｂ、及び２５Ｂ）を用いて、高、中、又は低レベルのＨＥＲ２を発現する複数の細胞株を処置することにより、インビトロ活性アッセイを延ばした。細胞株の応答はおおむね、両方の分子と同様であった。しかし、Ｈ９１Ａバリアントと比較して、Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖバリアントの潜在能が高いというはっきりとした傾向が観察された（図２２、２４、及び２６）。この傾向が低ＨＥＲ２発現細胞にて検出可能であったため、４９ｎＭの一価のＫＤでＨＥＲ２に結合する４Ｄ５  ＨＶＲにおけるＨ９１Ａ置換が、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対して最大の選択性をもたらすことが測定された。
【０３４７】
実施例７。リンカー配列長さの効果の特性決定
二価の重鎖ＨＥＲ２結合及び活性における、抗ＨＥＲ２Ｆａｂを融合するリンカー配列の長さの効果を定量化するため、２つのリンカー配列を試験した（図２７Ａ）。以前の実験における全ての１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ分子は、遠位Ｆａｂの上部ＩｇＧ１ヒンジに由来する天然ＤＫＴＨＴ配列（配列番号５０）を含む、延長されたリンカー配列（ＤＫＴＨＴＧＧＧＧＳＧＧ、配列番号５２）、続いてＧＧＧＧＳＧＧ延長（配列番号５１）を含んだ。延長されたリンカー配列を、天然ＤＫＴＨＴ配列（配列番号５０）のリンカーを有する１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ分子と比較した。リンカーの影響を、Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢを使用して試験した。ＳＫＢＲ３又はＭＣＦ７細胞に対する結合の差は、観察されなかった（図２７Ｂ及び２７Ｃ）。ＳＫＢＲ３殺傷におけるインビトロ用量反応、及び広範な細胞株活性スクリーンは、バリアント間でのほぼ同一の活性を示した。延長されたリンカーに対して、天然リンカーバリアントは、ＫＰＬ４及びＨＴ５５腫瘍異種移植片の処置において同様の性能であった。ＨＥＲ２に対する一価の親和性が、２３ｎＭ〜４９ｎＭのＫＤの範囲である抗ＨＥＲ２  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、好ましい活性プロファイルを示すことを、これらのデータは示唆している。これらの研究において、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する最大の選択性は、Ｈ９１Ａ  ４Ｄ５バリアントを使用して達成された（４９ｎＭのＫＤ）。
【０３４８】
実施例８。Ｔ細胞とは無関係な、トラスツズマブの抗シグナル伝達効果は、ＨＥＲ２に対する二価の親和性結合を有する１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ分子において弱められる
ＨＥＲ２増幅癌細胞において過剰発現したＨＥＲ２にトラスツズマブを結合させることにより、制御緩和されたＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体により示される、体質性リガンド独立性ＰＩ３Ｋシグナル伝達のロバストな干渉がもたらされる（Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７４（１９）：５５６１−５５７１，２０１４）。１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ分子は、二価の形態でＨＥＲ２に結合する。１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢと共にインキュベーションするＳＫＢＲ３細胞のインビトロ処理により、ＨＥＲ３リン酸化の検出可能な影響なく、一時的な非耐久性のｐＡＫＴの減少がもたらされて（図２８Ａ）。更に、一価の高ＨＥＲ２親和性ＩｇＧ  ＴＤＢも、二価の低ＨＥＲ２親和性１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢも、実質的にＳＫＢＲ３細胞の増殖／生存能に影響を及ぼさなかった（図２８Ｂ）。まとめると、ＨＥＲ２への二価の低親和性結合は、ＨＥＲ２増幅細胞の増殖を阻害しない。
【０３４９】
実施例９。４Ｄ５抗体バリアントの、易罹病性固定バリアントとの組み合わせ
４Ｄ５抗体親和性バリアントの安定性を高めるために、易罹病性固定を導入した。アミド分解を低下させるために、４Ｄ５軽鎖残基Ｎ３０をセリン残基で置換し（Ｎ３０Ｓ）、４Ｄ５重鎖残基Ｎ５４をグルタミン酸残基で置換した（Ｎ５４Ｅ）。異性化を低下させるために、４Ｄ５重鎖残基Ｄ９８を、アラニン残基（Ｄ９８Ａ）及び／又はスレオニン残基（Ｄ９８Ｔ）で置換した。野生型４Ｄ５  Ｆａｂ及びその親和性バリアント（４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂ、４Ｄ５  Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂ、及び４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−Ｆａｂ；図２９Ａ〜２９Ｄ）、易罹病性固定バリアント（４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ−Ｆａｂ、４Ｄ５  Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂ、及びＮ３０Ｓ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂ；図３０Ａ〜３０Ｃ）；並びに、易罹病性固定の親和性バリアント（４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂ、４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂ、及び４Ｄ５  Ｈ９１Ａ．Ｎ３０Ｓ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂ；図３１Ａ〜３１Ｃ）の結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により定量化した。
【０３５０】
易罹病性固定を有する４Ｄ５親和性バリアントを生成し、特性決定した。各４Ｄ５  Ｆａｂバリアントの分子量（ＭＷ；ダルトン）を質量分析により測定し、凝集度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により定量化した。結果を下表７に示す。観察された値と予想された値とのＭＷの、観察された差は、Ｃ末端リジンクリッピングに関連した。
【０３５１】
2021512613.tif 000008
【０３５２】
一価の４Ｄ５アームを抗ＣＤ３（４０Ｇ５ｃ  Ｎ２９７Ｇ）アームと会合させることにより、４Ｄ５親和性バリアントのバリアントをＩｇＧ  ＴＤＢ抗体にフォーマットした（例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれている米国特許出願公開第２０１５／０９５３９２号を参照のこと）。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により、抗体のヒトＨＥＲ２への結合を試験した。結果を図３２Ａ〜３２Ｋに示し、下表８にまとめる。
【０３５３】
2021512613.tif 000009
【０３５４】
Ｈ９１Ａ．Ｄ９８Ｔ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｄ９８Ａ．Ｆ１００Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢ、又はＹ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｙ１０２Ｖ−ＩｇＧ  ＴＤＢバリアントでは、結合は検出されなかった。一般に、ＫＤ値が低い（結合親和性が強力である）ことが、より遅いオフ速度と大いに関連した。ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマットにおいて、Ｆａｂフォーマットと比較して、約２倍弱い親和性が観察された（表９及び１０）。しかし、ＫＤ比（４Ｄ５バリアントのＫＤを４Ｄ５野生型のＫＤ割ったもの）を使用する場合、結果は、ＩｇＧ  ＴＤＢ又はＦａｂフォーマットのいずれかにおけるＨ９１Ａバリアントに対して、１００〜２００の比較的一定の値となる。
【０３５５】
2021512613.tif 000010
【０３５６】
Ｆａｂフォーマット内に４Ｄ５バリアントのパネルを生成し、ＩｇＧ  ＴＤＢ（表９）又は１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢフォーマット（表１０）のいずれかにおけるスクリーニングのための、一定範囲の親和性を得た。親和性及び動態は、Ｈ９１Ａバリアントで最も望ましいものであったため、このバリアントにおいて可能性のある分子の易罹病性の除去を行った。易罹病性は、ＨＶＲ−Ｌ１の軽鎖位置Ｎ（３０）Ｔ、並びにＨＶＲ−Ｈ２の重鎖位置Ｎ（５４）Ｇ、及びＨＶＲ−Ｈ３のＤ（９８）Ｇに含んだ。目的は、可能性のあるＤ（９８）Ｇ異性化、並びに、可能性のあるＮ（３０）Ｔ及びＮ（５４）Ｇアミド分解を防止することであった。まず、合理的な設計を使用して、バリアントをスクリーニングした。しかし、図３８に示すように、親和性の弱いバリアントを、高親和性バリアントと組み合わせても、予想した親和性は得られず、２つ又は３つのバリアントを組み合わせても、予想不可能な結果が得られた。例えば、Ｙ５５Ｅは典型的には、親和性を３．５〜２０倍弱めたが、ある場合においては、親和性の小さな増加がもたらされた。Ｈ９１Ａは親和性を９１〜１６３倍弱め、Ｙ１０２Ｖは、親和性を増加させたか、変化させなかったかのいずれかであった。したがって、Ｎ３０Ｓ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ａ／Ｔを使用して小さなマトリックスを試験し、分子の易罹病性を固定した。Ｎ３０Ｓを使用して、ＨＶＲ−Ｌ１における、可能性のあるアミド分解を防止した。これは親和性にほとんど、あるいは全く効果を有しなかった。Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔは親和性を０．０７ｎＭまで増加させたため、約５０ｎＭのＫＤを達成するために、親和性を弱める変異が必要であった。易罹病性固定に加えて、親和性変異Ｙ５５Ｅ、Ｈ９１Ａ、及び／又はＹ１０２Ｖを使用して、Ｈ９１Ａに対して同様の動態を有する２つのバリアントを同定した（表１０）。４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．ＨＣ−Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−Ｆａｂは３つ全ての易罹病性の固定を特徴とする一方で、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．ＨＣ−Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂは２つの易罹病性固定残基を特徴とする。これらは共に、約５０ｎＭのＫＤを有する。別のバリアントの４Ｄ５  Ｎ３０Ｓ．Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−Ｆａｂは、均一でわずかに速いオフ速度を示し、７０ｎＭのＫＤを有した。
【０３５７】
2021512613.tif 000011
【０３５８】
表１１に示すとおり、カニクイザルＨＥＲ２（３．３ｎＭ）に対する、野生型４Ｄ５  Ｆａｂの一価の親和性は、ヒトＨＥＲ２（０．３ｎＭ）よりもおよそ１０倍弱かった。４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−Ｆａｂ親和性バリアント、及び易罹病性固定バリアントは、カニクイザルＨＥＲ２に対して３００ｎＭを超える一価の親和性を示す（表１２）。しかし、カニクイザルバリアント４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−Ｆａｂ及び４Ｄ５野生型の、カニクイザルＨＥＲ２タンパク質に対するＫＤの比率は、およそ１００〜２００であり、ヒトフォーマットで観察されたものと同様の範囲内であった。
【０３５９】
2021512613.tif 000012
【０３６０】
実施例１０。４Ｄ５易罹病性固定親和性バリアントの特性決定
更なる特性決定のための、いくつかの４Ｄ５易罹病性固定親和性バリアントを選択した。Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ及びＹ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖバリアントを、天然（短）リンカーを有する１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ抗体内にフォーマットし（ヒンジ；ＤＫＴＨＴ）、用量反応アッセイでＨ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢと比較し、ＳＫＢＲ３（図３３Ａ）又はＭＣＦ７（図３３Ｂ）標的細胞の殺傷を定量化した。各ウェルに、１．５×１０４個のＳＫＢＲ３又はＭＣＦ７標的細胞を播種し、１：３のエフェクター：標的比で、ＰＭＢＣ由来ＣＤ８＋エフェクター細胞と同時培養した。結果を下表１２にまとめる。
【０３６１】
2021512613.tif 000013
【０３６２】
４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ及び４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ抗体の、ＳＫＢＲ３細胞（図３４Ａ）及びＭＣＦ７細胞（図３４Ｂ）への結合もまた、フローサイトメトリーによって特性決定した。概して、ＳＫＢＲ３細胞及びＭＣＦ７細胞に対する細胞傷害性及び結合の観点から、４Ｄ５  Ｙ５５Ｅ．Ｈ９１Ａ．Ｎ５４Ｅ．Ｄ９８Ｔ．Ｙ１０２Ｖ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ−１Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢに類似していた。
【０３６３】
実施例１１。細胞結合親和性
細胞ベースの親和性に対する、二価のＨＥＲ２エンゲージメント、又はアビディティの寄与をより詳しく理解するため、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７、及び、トランスフェクションにより、ＭＣＦ７に相当する量にてカニクイザルＨＥＲ２を発現する細胞に対する、４Ｄ５−ＷＴ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ及び４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ分子の見かけの親和性を測定した（表１３）。４Ｄ５と、一価のＦａｂとしての親和性減衰４Ｄ５−Ｈ９１Ａバリアントとにおいては、１６４倍の差があったにもかかわらず、１Ｆａｂ−ＩｇＧ分子のＳＫＢＲ３細胞に対する、細胞ベースの結合親和性は、直接の細胞結合、又は競合結合アッセイにより測定されるように、相当するものであった。ＳＫＢＲ３細胞で発現したＨＥＲ２に対する４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢの見かけの親和性は、１．５〜５ｎＭの範囲であり、これは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定した一価のＦａｂ親和性と比較して、約１０倍高かった。一価のＦａｂの低親和性は、細胞との関係における、ＨＥＲ２への二価の結合により媒介されるアビディティにより損なわれる可能性があることを、この結果は示唆している。対照的に、４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、ＭＣＦ７、又はＨＥＲ２を発現する細胞に対する実質的な結合は示さなかった（直接細胞結合においては、共にＫＤが＞１００ｎＭであり、競合結合においては結合は検出されなかった）。このことは、これらの細胞における少ないＨＥＲ２コピー数は、二価のＨＥＲ２のエンゲージメントには不十分であることを示唆している。結果を表１３にまとめている。
【０３６４】
2021512613.tif 000014
【０３６５】
ＴＤＢが媒介する標的細胞殺傷における、ＣＤ３結合親和性の効果もまた評価した。低親和性４０Ｇ５ｃ抗ＣＤ３アームを有する４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（「４０Ｇ５ｃ  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ」；ＣＤ３  約５０ｎＭのＫＤ）を、高親和性３８Ｅ４ｖ１抗ＣＤ３アームを有する類似の４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ（「３８Ｅ４ｖ１  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢ」；ＣＤ３  約１ｎＭのＫＤ）と比較した。高ＨＥＲ２発現標的細胞株のＳＫＢＲ３を使用するインビトロ細胞殺傷アッセイにおいて、４０Ｇ５ｃ  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、３８Ｅ４ｖ１  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢと同様の、標的細胞殺傷の潜在能を示した（図３７）。対照的に、低ＨＥＲ２発現標的細胞ＭＣＦ７を使用する類似のアッセイにおいて、３８Ｅ４ｖ１  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、４０Ｇ５ｃ  ４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢよりも標的細胞殺傷において一層、実質的に強力であり、このことは、細胞殺傷能力が非常に小さいことを示した。下表１４にまとめたこれらの結果は、低い抗ＣＤ３結合は、４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢの、多量のＨＥＲ２を発現する細胞を選択的に殺傷する能力を劇的に向上させることを示している。
【０３６６】
2021512613.tif 000015
【０３６７】
実施例１２。高用量の４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、ＨＥＲ２と独立性したＴ細胞の活性化をもたらさない
Ｆｃ領域におけるＮ２９７Ｇ置換により、ＦｃγＲ結合がＴＤＢで弱められている。高濃度において、ＴＤＢが標的とは独立したＴ細胞の活性化を誘発しないことを確認するために、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を使用した（図３８Ａ）。ＨＥＲ２発現細胞の存在下においてレポーター細胞をＴＤＢで刺激した際に、ロバストなシグナルが検出された。４Ｄ５−ＷＴ  ＩｇＧ  ＴＤＢも、４Ｄ５  Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢも、ＨＥＲ２の不在下でＴ細胞を活性化しなかった。多量のＴＤＢがヒトＰＢＭＣにスパイクされた（図３８Ｂ）。二価の抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）は、≧１０ｎｇ／ｍＬの濃度にてＴ細胞の活性化を誘発したが、１００μｇ／ｍＬの濃度では、Ｔ細胞の活性化は検出されなかった。このことは、ＴＤＢフォーマットも、高濃度にてＨＥＲ２とは独立したＴ細胞の活性化を誘発しないことを示す。
【０３６８】
実施例１３。４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは限定的な薬理活性を有し、カニクイザルにて十分許容される
カニクイザル（カニクイザル）組織は、ヒトの通常組織と同様に、低量のＨＥＲ２を発現する。４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは、低度から中度のカニクイザル−ＨＥＲ２を発現する細胞に、実質的に結合しない、又はこの細胞のアポトーシスを誘導しない（表１３）。４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢの忍容性を試験するために、単回投与忍容性試験を設計し、カニクイザルにおける薬力学活性（ＰＤ）及び薬学動態（ＰＫ）を試験した。３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）及び２０ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝５）用量レベルで低速静脈内注射により、メスザルに投与をした。忍容性／ＰＫ／ＰＤは、臨床観察、臨床化学、血液学、サイトカイン、及びＰＫを含んだ。組織病理学は分析に含めなかった。臨床観察において、試験物品関係の変化は検出されなかった、又は最小限に検出された（体重、心拍数、温度、呼吸速度）。典型的なＴＤＢ関連薬理学及び臨床病状応答（Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８，３２１：９７４−９７７；Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１０，１０７（２８）：１２６０５−１２６１０）は、著しく存在しなかった（図３８Ｃ）。Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ；炎症の急性反応体及びマーカー）の量は、バックグラウンドの量にて維持された。高いＴＤＢ用量にもかかわらず、リンパ球辺縁趨向、肝臓酵素（アラニン及びアスパルテートアミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ及びＡＳＴ）上昇、又は末梢血サイトカイン（図示せず）は検出されなかった。これらを合わせると、４Ｄ５−Ｈ９１Ａ  １Ｆａｂ−ＩｇＧ  ＴＤＢは高用量レベルにて十分耐用性であり、カニクイザルにおいて限定的な薬理活性を示した。
【０３６９】
ＴＤＢ曝露は、試験した用量レベル、及び通常のＰＫ特徴の両方で確認された（図３８Ｄ）。曝露はほぼ用量に比例して、最後に評価した時点まで維持された（１４日間）。ＴＤＢがカニクイザルにて不活性化されていないことを確認するため、２０ｍｇ／ｋｇのＴＤＢを投与した７日後、及び１４日後に収集したサンプルから、血清のアリコートを回収し、血清希釈液を使用して、健常なドナーヒトＴ細胞を使用して、ＳＫＢＲ３細胞のインビトロでの殺傷を媒介した（図３８Ｅ）。未希釈のサンプルにおいて測定したＴＤＢ血清の濃度はそれぞれ、７日目のサンプルで１９３μｇ／ｍＬ、１４日目のサンプルで６５μｇ／ｍＬであった。高（１μｇ／ｍＬ）濃度にて新鮮なＴＤＢを使用する平行殺傷アッセイで達成した最大活性と比較して、投与の１４日後の血清を１００倍に希釈すると、同様のレベルのＳＫＢＲ３殺傷を誘発した。これは通常、活性を飽和させるのに十分である。これらを合わせると、通常のカニクイザル組織における低ＨＥＲ２発現は、低量のＨＥＲ２を発現する通常の組織にて、Ｔ細胞の活性化又はオフ腫瘍Ｔ細胞活性をトリガするのに十分ではないことを、このデータは示唆する。
【図１】
2021512613.tif 000016
【図２】
2021512613.tif 000017
【図３】
2021512613.tif 000018
【図４】
2021512613.tif 000019
【図５】
2021512613.tif 000020
【図６】
2021512613.tif 000021
【図７】
2021512613.tif 000022
【図８】
2021512613.tif 000023
【図９】
2021512613.tif 000024
【図１０】
2021512613.tif 000025
【図１１Ａ−Ｂ】
2021512613.tif 000026
【図１１Ｃ−Ｄ】
2021512613.tif 000027
【図１２Ａ−Ｂ】
2021512613.tif 000028
【図１２Ｃ−Ｄ】
2021512613.tif 000029
【図１３】
2021512613.tif 000030
【図１４】
2021512613.tif 000031
【図１５Ａ】
2021512613.tif 000032
【図１５Ｂ】
2021512613.tif 000033
【図１５Ｃ】
2021512613.tif 000034
【図１６】
2021512613.tif 000035
【図１７】
2021512613.tif 000036
【図１８】
2021512613.tif 000037
【図１９】
2021512613.tif 000038
【図２０】
2021512613.tif 000039
【図２１】
2021512613.tif 000040
【図２２】
2021512613.tif 000041
【図２３】
2021512613.tif 000042
【図２４】
2021512613.tif 000043
【図２５】
2021512613.tif 000044
【図２６】
2021512613.tif 000045
【図２７】
2021512613.tif 000046
【図２８】
2021512613.tif 000047
【図２９】
2021512613.tif 000048
【図３０】
2021512613.tif 000049
【図３１】
2021512613.tif 000050
【図３２Ａ−Ｄ】
2021512613.tif 000051
【図３２Ｅ−Ｈ】
2021512613.tif 000052
【図３２Ｉ−Ｋ】
2021512613.tif 000053
【図３３】
2021512613.tif 000054
【図３４】
2021512613.tif 000055
【図３５Ａ】
2021512613.tif 000056
【図３５Ｂ】
2021512613.tif 000057
【図３５Ｃ】
2021512613.tif 000058
【図３６】
2021512613.tif 000059
【図３７】
2021512613.tif 000060
【図３８Ａ−Ｂ】
2021512613.tif 000061
【図３８Ｃ】
2021512613.tif 000062
【図３８Ｄ−Ｅ】
2021512613.tif 000063
【図３９】
2021512613.tif 000064
【配列表】
2021512613000001.app
【国際調査報告】
2021512613.tif 000065
2021512613.tif 000066