(57)【要約】  本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適しており、好ましくは特定の細胞区画を標的とすることができる、ｃＧＭＰに結合することができ、好ましくはそれをキレートすることができる分子手段の分野に属する。本発明のポリペプチドは、ＰＫＧ−Ｉα及びＰＫＧ−ＩβのＮ末端部分に由来するキメラコンストラクト、並びに野生型ＰＫＧの２つのｃＧＭＰ結合部位を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって：
−配列番号１の配列及び配列番号２の配列に由来するキメラペプチドと；
−配列番号６の配列を含む又はそれからなるｃＧＭＰ結合ドメインと；を含み、
−前記ポリペプチドは任意の触媒ドメイン及びその機能的変異体を欠いている、
ポリペプチド。
【請求項２】
前記キメラペプチドが、配列番号３、配列番号４又は配列番号５、好ましくは配列番号３の配列、及びその機能的変異体からなるか又はそれらを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ｃＧＭＰ結合ドメインが、配列番号７の配列又は配列番号８の配列、及びその機能的変異体を含む又はそれからなる、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ｃＧＭＰ結合ドメインが配列番号９の配列又は配列番号１０の配列、及びその機能的変異体を含む又はそれからなる、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記キメラペプチド及び前記ｃＧＭＰ結合ドメインが隣接配列を形成し、更に好ましくは前記キメラペプチドのＣ末端が前記ｃＧＭＰ結合ドメインのＮ末端に融合している、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
ペプチドシグナルを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号７の配列又はその機能的変異体のタンデムリピートを含むペプチドシグナルを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＧＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）及びそれらの変異体からなる一覧から選択される蛍光ペプチドを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチド又は請求項１０に記載の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞又は非ヒト生物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のベクター、及び／又は請求項１１に記載の宿主細胞、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、好ましくはｃＧＭＰ濃度の安定化及び／又はｃＧＭＰシグナル伝達の阻害のためのｃＧＭＰキレータとしての請求項１〜８に記載のいずれかのポリペプチド、請求項９に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１０に記載のベクターの非治療的使用。
【請求項１４】
医薬品として使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、請求項９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の宿主細胞、又は請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞内ｃＧＭＰシグナル伝達機能障害に関連する病態、好ましくは網膜色素変性；好ましくは脳卒中、静脈血栓症又は動脈血栓症からなる一覧から選択される心血管疾患、；統合失調症；ハンチントン病；色覚異常；好ましくは結腸直腸癌、肺癌、肺疾患からなる一覧から選択される癌；勃起不全及び薬物乱用の予防及び／又は治療における使用のための請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド、請求項９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のベクター、請求項１１に記載の宿主細胞、又は請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適しており、好ましくは特定の細胞区画（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）を標的とすることができる、ｃＧＭＰに結合することができ、好ましくはそれをキレートすることができる分子手段の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ｃＧＭＰは、神経伝達、カルシウム恒常性、光伝達、脂質代謝、及びカチオンチャネル活動を含む広範囲のシグナル伝達経路及び細胞プロセスに関与するセカンドメッセンジャーである。これらのプロセスの多様性は、その下流の経路の特異的な調節を達成するためにｃＧＭＰシグナルが空間及び時間で厳しく制御されていることを示唆している。しかしながら、ｃＧＭＰの操作は大半が、この環状ヌクレオチドの合成又は分解を変更するか、下流のシグナル伝達経路を操作するいずれかの薬理学的アプローチを使用して達成される。この手法には、細胞特異性と細胞内特異性の両方が欠けている。現在、ｃＧＭＰを特異的に結合できるツールはなく、このセカンドメッセンジャーの生理学的バリエーションを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの細胞及び細胞内の特異性によって変更するために使用できる可能性がある。最近、ｃＧＭＰの急性及び外因性の調節を課し、ｃＧＭＰシグナル伝達のダイナミクスを調査するための光遺伝学的戦略が浮上している。しかしながら、それらはｉｎ  ｖｉｖｏ又は慢性的な操作に使用することは困難であり、内因性ｃＧＭＰシグナルを修飾することはできない。
【０００３】
ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）ファミリーからのタンパク質はｃＧＭＰに結合することができ、それらのｃＧＭＰ結合部位が特定されている。
【０００４】
ＰＫＧファミリーのタンパク質は、単細胞生物であるゾウリムシからヒトに至る様々な真核生物に存在するセリン／スレオニンキナーゼである。ＰＫＧタイプＩ（ＰＫＧ−Ｉ）及びタイプＩＩ（ＰＫＧ−ＩＩ）をコードする２つのＰＫＧ遺伝子が哺乳動物で同定されている。ＰＫＧ−ＩのＮ末端は、ＰＫＧ−Ｉα及びＰＫＧ−Ｉβアイソフォームを指定する２つの選択的にスプライスされたエクソンによってコードされる。ＰＫＧ−Ｉβは、ＰＫＧ−Ｉよりも約１０倍高いｃＧＭＰ濃度で活性化される。ＰＫＧ−Ｉ及びＰＫＧ−ＩＩは、２つの同一のサブユニット（それぞれ約７５ｋＤａ及び約８５ｋＤａ）のホモダイマーであり、共通の構造的特徴を共有している。
【０００５】
各サブユニットは、３つの機能ドメイン：
−ホモ二量体化、ｃＧＭＰの不在下でのキナーゼ活性の抑制、及びタンパク質基質を含む他のタンパク質との相互作用を仲介するＮ末端ドメイン；
−同一でない２つのｃＧＭＰ結合部位を含む調節ドメイン；
−ＡＴＰから標的タンパク質のセリン／スレオニン側鎖のヒドロキシル基へのリン酸転移を触媒するキナーゼドメイン、で構成されている。
【０００６】
ヒトでは、ＰＫＧ−Ｉの２つのアイソフォーム：ＰＫＧ−Ｉα及びＰＫＧ−Ｉβが記載されている。調節ドメイン及びキナーゼドメインは全てのＰＫＧ−Ｉアイソフォームで同一であるが、それらのＮ末端ドメインは異なる。
【０００７】
ｃＧＭＰキレータがこれらのタンパク質からどのように派生し得るかを想像することは困難である。一方で、ＰＫＧ触媒活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物学的ツールとして使用した場合、又は治療的処置で使用した場合の両方で、望ましくない副作用を誘発する可能性が高く、それによってタンパク質全体の使用が妨げられる。一方、非特許文献１は、ＰＫＧ−Ｉαの欠失変異体を使用して、触媒ドメインの欠失がｃＧＭＰに対するそれらの親和性定数に有害な影響を与えることを示したことから、ＰＫＧファミリーに由来する触媒欠損タンパク質の使用を排除する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｏｔｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．；２；３９８（２−３）：２０６−１０，１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、ｃＧＭＰシグナル伝達、特に細胞内ｃＧＭＰ濃度を操作するための改善された手段が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、いかなる触媒ドメインも欠くアイソフォームＰＫＧ−Ｉα及びＰＫＧ−Ｉβに由来するキメラポリペプチドを設計した。本発明のポリペプチドは、ＰＫＧ−Ｉα及びＰＫＧ−ＩβのＮ末端部分に由来するキメラコンストラクト、並びに野生型ＰＫＧの２つのｃＧＭＰ結合部位を含む。
【００１１】
驚くべきことに、ＰＫＧ−Ｉ親和性定数に影響を与えることが示されている触媒ドメインの欠失にもかかわらず、本発明のＰＫＧ−Ｉα／ＰＫＧ−Ｉβに基づくキメラポリペプチドは、ｃＧＭＰに効率的に結合して捕捉することができる。実験部分に示されるように、本発明のポリペプチドは、ＦＲＥＴセンサーであるＴｈＰＤＥ５ＶＶの存在下で、一酸化窒素誘発後にｃＧＭＰを捕捉することができるため、ｃＧＭＰに対するその高い親和性を示唆している。本発明のポリペプチドは、例えば蛍光ペプチドの添加により、単純な分子ツールを使用して容易に更に機能化され得る。したがって、本発明のポリペプチドは、例えば、ｃＧＭＰ依存性細胞プロセスの活性化を防止するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、多種多様な用途に利用することができる。これらの特性により、本発明のポリペプチドは、細胞内ｃＧＭＰシグナル伝達機能不全に関連する病態の予防又は治療に特に有用となる。
【００１２】
本発明は、以下を含むポリペプチドに関する：
−配列番号１の配列及び配列番号２の配列に由来するキメラペプチドと；
−配列番号６の配列を含む又はそれからなるｃＧＭＰ結合ドメインとを含み；
−当該ポリペプチドは、任意の触媒ドメイン
及びその機能変異体を欠いている。
【００１３】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された、組み換え又は合成のポリペプチドである。
【００１４】
配列番号１の配列は、ウシＰＫＧ−１の残基１〜８９に対応し、ヒトＰＫＧ−１の残基１〜８９と同一である。配列番号２の配列は、ウシＰＫＧ−１βの残基１〜１０４に対応し、ウシＰＫＧ−１βの残基１〜１０４と同一である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の文脈において、「配列番号１の配列及び配列番号２の配列に由来するキメラペプチド」という用語は、少なくとも配列番号１に対応する配列又はそのフラグメント、及び少なくとも配列番号２に対応する配列又はそのフラグメントを含む又はそれからなるペプチドを指す。
【００１６】
本発明者らは特に、配列番号１の配列及び配列番号２の配列に由来する以下のキメラペプチドが、ポリペプチドにおいて使用される場合に特に興味深いことを特定した：
−配列番号２の残基９４〜１０４に融合した、配列番号１の残基１〜７８に対応する配列番号３のペプチド。
−配列番号２の残基９４〜１０４に融合し、配列番号１の残基５１〜７８に融合した、配列番号２の残基１〜６５に対応する配列番号４のペプチド；及び
−配列番号２の残基９４〜１０４に融合し、配列番号１の残基６９〜７８に融合し、配列番号２の残基６６〜８３に融合した、配列番号１の残基１〜５０に対応する配列番号５のペプチド。
【００１７】
有利には、本発明のポリペプチドにおいて、キメラペプチドは、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の配列、好ましくは配列番号３の配列からなる又はそれらを含む。
【００１８】
好ましくは、キメラペプチド及びｃＧＭＰ結合ドメインは連続した配列を形成し、更に好ましくはキメラペプチドのＣ末端はｃＧＭＰ結合ドメインのＮ末端に融合される。
【００１９】
本発明によれば、ｃＧＭＰ結合ドメインは、配列番号６の配列を含む又はそれからなる。明確にするために、配列番号６の配列は、ＰＫＧ−Ｉ及びＰＫＧ−ＩＩの最小結合配列のコンセンサス配列に対応し、いずれもｃＧＭＰに特異的に結合する能力を有することが知られている。
【００２０】
好ましくは、ｃＧＭＰ結合ドメインは、配列番号７の配列又は配列番号８の配列を含む又はそれからなる。明確にするために、配列番号７及び配列番号８は、それぞれＰＫＧ−Ｉの最小結合配列及びＰＫＧ−ＩＩの最小結合配列に対応する。
【００２１】
更に好ましくは、ｃＧＭＰ結合ドメインは、配列番号９の配列又は配列番号１０の配列を含む又はそれからなる。明確にするために、配列番号９及び配列番号１０の配列は、それぞれ、ヒトＰＫＧ−１のｃＧＭＰ結合配列及びウシＰＫＧ−１のｃＧＭＰ結合配列に対応する。
【００２２】
本発明の文脈において、「いかなる触媒ドメインも欠く」という用語は、本発明のポリペプチドが、ＰＫＧ−Ｉα又はＰＫＧ−Ｉβのいずれの触媒ドメインも、それらに由来する他の触媒ドメインも含まないことを示すと解釈されるべきである。
【００２３】
本発明の文脈において、「ＰＫＧ−Ｉの触媒ドメイン」という用語は、配列番号１１の配列及びそれに由来する機能的変異体を指す。「ＰＫＧ−Ｉβの触媒ドメイン」という用語は、配列番号１２の配列及びそれに由来する機能的変異体を指す。
【００２４】
セリン／スレオニンキナーゼとして、ＰＫＧ−Ｉα及びＰＫＧ−Ｉβは、ＡＴＰからのリン酸の転移を触媒し、つまり、とりわけヒストンＨ２Ｂを含む多数の基質のセリン残基又はスレオニン残基のリン酸化を触媒する。
【００２５】
本発明の文脈において、配列番号１１の機能的変異体は、配列が、参照配列の１つ又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失によって配列番号１１の配列から派生し、ＰＫＧ−Ｉα基質、好ましくはＨ２Ｂのセリン／スレオニン残基をリン酸化する触媒能力を保持しているペプチドを包含する。特に興味深いのは、配列に保存的置換が含まれている機能的変異体であり、つまり、配列番号１１の配列のアミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に置換され、したがって分子の機能特性を変更しない。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野でよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、区別されなくてもよい。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置き換えられてもよい。互いに置換できる中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンが挙げられる。好ましくは、配列番号１１の機能的変異体は、配列が１つ又は複数の保存的置換によって配列番号１１の配列から派生するペプチドである。更に好ましくは、配列番号１１の機能的変異体は、配列番号１１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有する。好ましい実施形態において、配列番号１１の機能的改変体は、配列番号１１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有し、その配列が保存的置換によって配列番号１１の配列から派生するペプチドである。
【００２６】
本発明の文脈において、配列番号１２の機能的変異体は、配列が、参照配列の１つ又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失によって配列番号１２の配列から派生し、ＰＫＧ−Ｉβ基質、好ましくはＨ２Ｂのセリン／スレオニン残基をリン酸化する触媒能力を保持しているペプチドを包含する。特に興味深いのは、配列に保存的置換が含まれている機能的変異体であり、つまり、配列番号１２のアミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に置換され、したがって分子の機能特性を変更しない。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野でよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、区別されなくてもよい。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置き換えられてもよい。互いに置換できる中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンが挙げられる。好ましくは、配列番号１２の機能的変異体は、配列が１つ又は複数の保存的置換によって配列番号１２の配列から派生するペプチドである。更に好ましくは、配列番号１２の機能的変異体は、配列番号１２の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有する。好ましい実施形態において、配列番号１２の機能的改変体は、配列番号１２の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有し、その配列が保存的置換によって配列番号１２の配列から派生するペプチドである。
【００２７】
ＰＫＧ−Ｉ基質、特にＨ２Ｂのセリン／スレオニン残基のリン酸化を触媒する能力は、Ｇｌａｓｓ  ａｎｄ  Ｋｒｅｂｓ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２５４：９７２８−９７３８，１９７９）によって開示されるもの等、当該技術分野で知られている標準的な方法を使用して容易に決定され得る。
【００２８】
本発明の文脈において、本発明のポリペプチドを指す場合の「機能的変異体」という用語は、配列が、参照配列の１つ又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失により、本発明のポリペプチドの配列に由来し、ｃＧＭＰに結合する能力を保持しているポリペプチドを包含する。所与のポリペプチドへのｃＧＭＰの結合は、Ｄｏｔｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．に詳述されているような、当技術分野で知られている方法によって容易に判断され得る。
【００２９】
好ましくは、本発明のポリペプチドの機能的変異体は、配列が、１つ又は複数の保存的置換によって本発明のポリペプチドの配列から派生するペプチドである。更に好ましくは、本発明のポリペプチドの機能的変異体は、当該ポリペプチドの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有する。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの機能的変異体は、当該ポリペプチドの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有し、その配列が保存的置換によって本発明のポリペプチドの配列から派生するペプチドである。
【００３０】
本発明の意味において、核酸又はアミノ酸の２つの配列間の「パーセント同一性」又は「％同一性」は、最適なアラインメント後に得られる、比較される２つの配列間の同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、２つの配列間の差異はその長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸又はアミノ酸配列の比較は、伝統的には、それらを最適に整列させた後に配列を比較することによって行われ、当該比較は、セグメントによって、又は「アライメントウィンドウ」を使用することによって行われ得る。比較のための配列の最適なアラインメントを、手動による比較に加えて、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索方法により、又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータソフトウェアによって行うことができる（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、又は比較ソフトウェアＢＬＡＳＴ  ＮＲ若しくはＢＬＡＳＴ  Ｐによって）。２つの核酸又はアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、比較する核酸又はアミノ酸配列が、２つの配列間の最適なアライメントの参照配列と比較して、付加又は欠失を有する、２つの最適にアライメントされた配列を比較することによって決定される。同一性のパーセンテージは、アミノ酸、ヌクレオチド、又は残基が２つの配列間、好ましくは２つの完全な配列間で同一である位置の数を決定し、同一の位置の数をアラインメントウィンドウ内の位置の総数で除し、結果に１００を掛けて計算されて、２つの配列間の同一性パーセント得る。
【００３１】
好ましくは、本発明はまた、タンパク質の１つ又は複数のアミノ酸残基、ペプチド結合、Ｎ末端及び／又はＣ末端に化学修飾を導入することにより、本発明のポリペプチド又はその機能的変異体に由来し、修飾されたポリペプチドが機能的である限り、タンパク質の安定性、生物学的利用可能性又は生物学的活性を高めることを目的とする、修飾されたポリペプチドに関する。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出に有用となる特定の細胞内コンパートメント又は蛍光ペプチドに本発明のポリペプチドを標的化することを可能にする局在化配列であるペプチドシグナル等の目的の特性を有するペプチド配列で更に機能化することができる。
【００３３】
ペプチドシグナルは、ポリペプチドを特定の細胞内コンパートメントに標的化することができるペプチドであり、当技術分野でよく知られている。特に興味深いのは、ペプチドを原形質膜、より具体的には脂質ラフトに標的化することができる配列である。脂質ラフトはスフィンゴ脂質及びコレステロールに富む原形質膜マイクロドメインであり、シグナル伝達分子が受容体と相互作用するプラットフォームとして機能することが確認されて提唱されている。
【００３４】
有利には、本発明のポリペプチドはペプチドシグナルを含む。好ましくは、ペプチドシグナルは、本発明のポリペプチドを特定の細胞内コンパートメント、より好ましくは原形質膜、更に好ましくは脂質ラフトに標的化することができる。
【００３５】
原形質膜にペプチドを標的化することができるペプチドシグナルは、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｓｒｃファミリー由来のタンパク質のＮ末端ドメイン、特にＬｙｎキナーゼのＮ末端部分のパルミトイル化及びミリストイル化モチーフに対応する配列番号１３の配列のペプチドは、当該タンパク質の脂質ラフトへの局在を可能にすることが示されている。対照的に、タンパク質Ｋ−Ｒａｓに由来するＣａａＸ−ポリリジンモチーフに対応する配列番号１４のペプチドは、脂質ラフトへの局在を制限しながら、タンパク質を原形質膜に標的化することが知られている。これらの配列は、単独で又はタンデムリピートでペプチドシグナルとして使用できる。
【００３６】
好ましくは、本発明のポリペプチドにおいて、ペプチドシグナルは、配列番号１３又は配列番号１４の配列、より好ましくは配列番号１３の配列、又はそれに由来する機能的変異体を含む又はそれからなる。有利には、本発明のポリペプチドにおいて、ペプチドシグナルは、配列番号１３の配列のタンデムリピート、又はそれに由来する機能的変異体を含む又はそれらからなる。
【００３７】
本発明の文脈において、配列番号１３の機能的変異体は、配列が、参照配列の１つ又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失によって配列番号１３の配列から派生し、それに結合した又はそれを含むペプチドの脂質ラフトへの局在化を可能にする能力を保持しているペプチドを包含する。特に興味深いのは、配列に保存的置換が含まれている機能的変異体であり、つまり、配列番号１３の配列のアミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に置換され、したがって分子の機能特性を変更しない。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野でよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、区別されなくてもよい。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置き換えられてもよい。互いに置換できる中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンが挙げられる。好ましくは、配列番号１３の機能的変異体は、配列が１つ又は複数の保存的置換によって配列番号１３の配列から派生するペプチドである。更に好ましくは、配列番号１３の機能的変異体は、配列番号１３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有する。好ましい実施形態において、配列番号１３の機能的変異体は、配列番号１３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有し、その配列が保存的置換によって配列番号１３から派生するペプチドである。
【００３８】
本発明の文脈において、配列番号１４の機能的変異体は、配列が、参照配列の１つ又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失によって配列番号１４の配列から派生し、脂質ラフトを除いて、それに結合した又はそれを含むペプチドの細胞膜への局在化を可能にする能力を保持しているペプチドを包含する。特に興味深いのは、配列に保存的置換が含まれている機能的変異体であり、つまり、配列番号１４の配列のアミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に置換され、したがって分子の機能特性を変更しない）。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野でよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、区別されなくてもよい。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置き換えられてもよい。互いに置換できる中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンが挙げられる。好ましくは、配列番号１４の機能的変異体は、配列が１つ又は複数の保存的置換によって配列番号１４の配列から派生するペプチドである。更に好ましくは、配列番号１４の機能的変異体は、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有する。好ましい実施形態において、配列番号１４の機能的変異体は、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を持つ配列を有し、その配列が保存的置換によって配列番号１４から派生するペプチドである。
【００３９】
それに結合した又はそれを含むペプチドの細胞膜への、特に脂質ラフトへの、又は脂質ラフトの排除における局在化を可能にするペプチドシグナルの能力は、特に蛍光顕微鏡及び／又は本出願の実験部分で詳述されているような密度勾配に基づく標準的な方法を使用して容易に決定され得る。
【００４０】
ペプチドシグナルは、本発明のポリペプチドのＣ末端又はＮ末端にあり得る。好ましくは、ペプチドシグナルは、本発明のポリペプチドのＮ末端にある。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出に有用となる蛍光ペプチドで更に機能化されてもよい。
【００４２】
蛍光ペプチドは当技術分野でよく知られている。蛍光ペプチドの例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又はシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等のＧＦＰ変異体、並びに最適化ＣＦＰ  Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ又はＹＦＰ変異体Ｖｅｎｕｓ等のそれらの変異体である。有利には、本発明のポリペプチドは、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、並びに最適化ＣＦＰ  Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ又はＹＦＰ変異体Ｖｅｎｕｓ等のそれらの変異体からなる一覧から選択される蛍光ペプチドを更に含む。
【００４３】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに関する。
【００４４】
本発明の文脈において、「ポリヌクレオチド」という用語は、別個のフラグメント又はより大きなコンストラクトの形態のポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドを指し、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡの配列を含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、又は本来関連している他の物質を実質的に含まないポリヌクレオチドを含む。
【００４５】
好ましくは、当該組み換えベクターは、哺乳動物、細菌又は真菌細胞のような真核細胞又は原核細胞等の宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換された場合に当該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。「発現ベクター」は、クローン化されたＤＮＡの転写及び適切な宿主におけるそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列である。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、及び活性なプロモータを含み得る。適切な選択可能マーカーは、例えば、真核細胞培養のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンテターゼ、及びヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対するＴＲＰ１をコードする遺伝子の中から選択され得る。幾つかの発現ベクターには、宿主細胞における自律複製のための複製起点が含まれていないが、統合／維持を選択するマーカーを使用して、ベクターが（ランダムな又は相同的な統合の事象によって）安定して統合する能力に依存する。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するように指揮するＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモータは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモータである。ポリヌクレオチドは、発現のために適切な方向及び正しいリーディングフレームで発現ベクターに挿入される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写調節配列に、また任意に少なくとも１つの翻訳調節配列に制御可能に連結されている。かかるベクターには、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工）、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は染色体、非染色体、半合成若しくは合成ＤＮＡからなり得る直線若しくは環状のＤＮＡ又はＲＮＡ分子が含まれる。本発明による適切なベクターは、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工）、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は染色体、非染色体、半合成若しくは合成ＤＮＡからなり得る、直鎖若しくは環状のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。哺乳動物発現ベクターとして使用される適切なプラスミドとしては、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、及びλＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が挙げられるが、これらに限定されない。細菌発現ベクターとして使用される適切なプラスミドとしては、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、及びｐＱＥ７Ｏ、ｐＱＥ６Ｏ、ｐＱＥ−９を含むｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。真菌細胞において発現ベクターとして使用される適切なプラスミドとしては、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。昆虫細胞における発現ベクターとして使用される適切なプラスミドとしては、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）等のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルス等のプラス鎖ＲＮＡウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては：トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる。他の例としては、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。
【００４６】
本発明の別の態様は、当該ポリヌクレオチド又は組み換えベクターで形質転換された宿主細胞又は非ヒト生物を提供する。非ヒトトランスジェニック生物は、単細胞又は多細胞の微生物又は高等真核生物から得られる。発現ベクターは、感染、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、及びエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない多数の手法のいずれか１つを介して宿主細胞に導入され得る。発現ベクターを含む改変された宿主細胞は、クローン的に増殖され得て、それらが本発明のポリペプチドを産生するかどうかを判断するため個別に分析され得る。
【００４７】
好ましい実施形態では、当該改変宿主細胞は、ヒト細胞等の真核細胞である。別の実施形態では、当該非ヒトトランスジェニック生物は、トランスジェニック植物、線虫、ゼブラフィッシュ又は藻類である。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び非ヒトトランスジェニック生物は、周知の組み換えＤＮＡ技術を使用する本発明のポリペプチド／キメラタンパク質の産生に有用である。
【００４９】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの、ｃＧＭＰキレータとしての非治療的使用に関する。好ましくは、本発明は、ｃＧＭＰ濃度の安定化、及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのｃＧＭＰシグナル伝達の阻害のための本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターの非治療的使用に関する。更に好ましくは、非治療的使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる場合、健康な被験体で行われる。
【００５０】
「ｃＧＭＰ濃度の安定化」という用語は、当技術分野で一般に理解されているように解釈されるべきであり、すなわち、組成物中でのｃＧＭＰの添加又は誘発時に当該組成物中の遊離ｃＧＭＰの濃度の変動を最小限にする作用として解釈されるべきである。本発明の文脈において、「遊離ｃＧＭＰの濃度」という用語は、結合していないｃＧＭＰの濃度を指す。ｃＧＭＰ濃度の変動、特に増加は、実験部分で開示されているように、例えばバイオセンサーＴｈＰＤＥ５ＶＶを使用して、ＦＲＥＴ／ＣＦＰ比をモニターすることにより、容易に測定され得る。本発明の文脈において、ｃＧＭＰ濃度は、当該組成物におけるｃＧＭＰの添加又は誘発時に、バイオセンサーＴｈＰＤＥ５ＶＶのＦＲＥＴ／ＣＦＰ比が変動する場合、好ましくは本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターの不在下で検出される変動の１０％未満、好ましくは５％未満増加する場合、組成物中で安定していると見なすことができる。
【００５１】
「ｃＧＭＰシグナルを阻害する」、「ｃＧＭＰシグナル阻害」という用語は、当技術分野で一般に理解されているように解釈されるべきであり、すなわち、セカンドメッセンジャー、例えば環状ヌクレオチド開閉型カルシウムチャネル（ＣＮＧ：ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）として、ｃＧＭＰにより活性化されることが知られている下流エフェクターを阻害する作用として解釈されるべきである。桿体視細胞の環状ヌクレオチド開閉型（ＣＮＧ）チャネルは、光誘発型の細胞内ｃＧＭＰ濃度の変化に反応して、桿体外節（ＲＯＳ）へのＮａ＋及びＣａ２＋の流れを制御することにより、光伝達に重要な役割を果たす。ｃＧＭＰはＣＮＧの開口を活性化し、細胞内のＣＮＧチャネルを通るＮａ＋及びＣａ２＋イオンの流入をもたらす。外節膜パッチを使用して細胞質膜でｃＧＭＰ活性化電流を測定することにより、光受容体チャネルの活性化を評価する方法は、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８（７）：２７７６−８４，１９８９）に完全に開示されている。したがって、かかる方法に基づいて、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターの存在下で、細胞質膜における細胞内ｃＧＭＰ活性化電流をモニタリングすることにより、ｃＧＭＰシグナルの阻害を容易に評価することができる。
【００５２】
多くの病態がｃＧＭＰシグナル伝達機能障害に関連していることは十分に文書化されている。したがって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞は、かかる病態の予防又は治療に特に有用であり得る。この文脈において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞は、医薬用途に適した組成物へと製剤化され得る。
【００５３】
本発明の別の態様は、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び／又は宿主細胞と、好ましくは薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。本発明の文脈において、「薬学的に許容される」という用語は、一般的に安全で非毒性であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない医薬組成物の調製に使用でき、獣医用途と並んでヒトの薬学的な用途に許容される担体を指す。適切なビヒクル又は担体としては、緩衝剤、安定剤、希釈剤、塩、保存剤、及び乳化剤等の任意の薬学的に許容されるビヒクルが挙げられる。適切な緩衝剤の例としては、リン酸塩緩衝溶液、塩化物溶液又はリンガー溶液等の緩衝溶質が挙げられる。適切な安定剤の例として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリビニルピロリドン又はヒアルロン酸が挙げられる。
【００５４】
本発明の組成物は、意図された投与経路に従って処方され得る。例えば、経口投与に適した製剤としては、液体、又は錠剤、丸剤、粉末（硬質又は軟質ゼラチンカプセル）又は顆粒等の固体の製剤が挙げられる。典型的には、かかる製剤において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び／又は宿主細胞は、アルゴン流中で、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース又はシリカ等の１つ又は複数の不活性希釈剤と混合される。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤、着色剤、コーティング剤（被覆錠）又はワニスを含んでもよい。非経口投与で使用されるような注射に適した製剤は、好ましくは無菌且つ流動性であり、好ましくは水性又は非水性の溶液、懸濁液又はエマルジョンであってもよい。
【００５５】
本発明の別の態様は、医薬として使用するための、好ましくは細胞内ｃＧＭＰシグナル伝達機能不全に関連する病態の予防及び／又は治療に使用するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物に関する。
【００５６】
本発明の文脈において、「細胞内ｃＧＭＰシグナル伝達機能不全に関連する病態」という用語は、当技術分野におけるそれらの一般的な意味に従って解釈されるべきである。好ましくは、当該病態は、ｃＧＭＰの細胞内濃度が異常に高いことに起因する、細胞内ｃＧＭＰシグナル伝達機能障害に関連している。本発明の文脈において、「ｃＧＭＰの異常に高い細胞内濃度」は、健康なドナーに由来する細胞よりも有意に高いｃＧＭＰの細胞内濃度を指す。更に好ましくは、当該病態は、網膜色素変性症；好ましくは脳卒中、静脈血栓症又は動脈血栓症からなる一覧から選択される心血管疾患；統合失調症；ハンチントン病；色覚異常；好ましくは結腸直腸癌、肺癌、肺疾患からなる一覧から選択される癌；勃起不全及び薬物乱用からなる一覧から選択される。
【００５７】
言い換えると、本発明は、細胞内ｃＧＭＰシグナル伝達機能不全に関連する病態の予防及び／又は治療のための方法に関し、当該病態は、網膜色素変性症；好ましくは脳卒中、静脈血栓症又は動脈血栓症からなる一覧から選択される心血管疾患；統合失調症；ハンチントン病；色覚異常；好ましくは結腸直腸癌、肺癌、肺疾患からなる一覧から選択される癌；勃起不全及び薬物乱用からなる群から選択され、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物を、それを必要とする被験体に、好ましくは有効量で投与する工程を含む。本発明の文脈において、「有効量」という用語は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物の量が、上述の病態の症状の適切な予防及び又は退縮を得るのに十分な量であることを意味する。有効量及び投与計画は、通常の臨床的要因に基づいて主治医によって決定され得る。医学分野でよく知られているように、任意の一人の患者の投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、総合的な健康状態、並びに同時に投与されている薬物を含む多くの要因に依存している。
【００５８】
本明細書で言及される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物は、本明細書で述べる病態を予防又は治療するために、１回又は２回以上投与することができる。予防及び／又は治療の有効性は、定期的な評価によってモニターすることができる。
【００５９】
本明細書で言及される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物は、既知の投与経路を通じて局所的又は全身的に投与することができる。好ましくは、本明細書で言及される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物は、腸内経路を通じて、特に経口、舌下若しくは直腸投与によって、又は非経口経路を通じて、特に脳内、筋肉内、皮内、経皮、腹腔内若しくは経鼻の投与によって投与される。
【００６０】
前述の特徴に加えて、本発明は、本発明を例示する実施例と並んで添付の図面を参照する以下の説明から明らかになるその他の特徴を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明のポリペプチドはｃＧＭＰスカベンジャーであり、ｉｎ  ｖｉｖｏで皮質ニューロンの移動を変化させる。（Ａ）１分間のスペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ（ＮＯ）曝露は、対照Ｈ２９３細胞のｃＧＭＰ濃度の増加を誘発し、ＦＲＥＴバイオセンサーＴｈＰＤＥ５ＶＶによるＦＲＥＴ／ＣＦＰ比によってモニターされる。対照的に、細胞がｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを発現すると、この上昇は劇的に減少する。（Ｂ）ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの発現により、ｃＧＭＰ上昇の振幅及び上昇速度の両方が低下する。（Ｃ）Ｅ１４．５にｅＧＦＰ及びｍＲＦＰを同時エレクトロポレーションした皮質ニューロンは、Ｅ１８．５の辺縁帯に近い密な層に詰め込まれている（最上列）。対照的に、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの発現は、この層の発達を妨げ、ニューロンは発達中の皮質の深さ全体に散在し、皮質の表面にヘテロトピア（ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉａ）が形成される（最下列）。
【図２】本発明のポリペプチドｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを使用するｃＧＭＰ操作の細胞内制限。Ａ：ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの細胞内局在、Ｂ：Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの細胞内局在、Ｃ：ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの細胞内局在。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを、どの細胞区画も標的にしていない場合にｃＧＭＰシグナル伝達を包括的に変更するために、又は特定のコンパートメントを標的とするために使用した。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅは脂質ラフトを標的にすることを目的としているのに対し、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓが原形質膜の非ラフト画分に限定されることを意図している。（Ａ）ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅは細胞質で検出されたのに対し、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅとｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ  ｐ−Ｋｒａｓの両方が原形質膜で見られた（中段及び下段）。
【図３】原形質膜画分は、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ及びｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの明確な細胞内局在を強調した。Ａ：カベオリン、Ｂ：Ｌｙｎ−ＴＴｈＰＤＥ５ＶＶ、Ｃ：Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ、Ｄ：アダプチン、Ｅ：ＴＴｈＰＤＥ５ＶＶ−Ｋｒａｓ、Ｆ：ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓ。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅは画分３に非常に豊富であったのに対し、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの局在がより高い密度の画分（４から９）にシフトした。
【図４】ＳｐｏｎＧｅｅは、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅの長時間のパルスによって引き起こされるｃＧＭＰ濃度の上昇を低減し、細胞内ｃＧＭＰ濃度の持続的で大幅な上昇を遅らせる。（Ａ〜Ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を２分間のスペルミン−ＮＯＮＯａｔｅパルスに曝露した。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ発現細胞は、ＦＲＥＴ：ＣＦＰ比の振幅と、対照と比較した増加率の両方の減少を示す。（Ｄ〜Ｆ）１５分間のスペルミン−ＮＯＮＯａｔｅパルスは、ＴｈＰＤＥ５ＶＶＦＲＥＴ：ＣＦＰ比に大きな変化を引き起こす。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを発現する細胞は、同様の大きさのＦＲＥＴ：ＣＦＰ比の変化を示すが、ＳｐｏｎＧｅｅがない細胞と比較して遅延する（動画Ｓ３も参照されたい）。スケールバー、２０μｍ。（Ｂ、Ｅ）データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。（Ｃ、Ｆ）箱ひげ図の要素：中心線、平均；ボックス上限、四分位数の上限及び下限；ひげ、ｓ．ｄ．＊＊＊Ｐ≦０．００１；マン−ホイットニー検定。
【図５】ＳｐｏｎＧｅｅは細胞生存に影響を与えない。ＨＥＫ２９３細胞にｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ又はＲＦＰのいずれかをトランスフェクトした。活性化カスパーゼ３陽性細胞を免疫標識して、アポトーシスを起こしている細胞の数を評価した。ＳｐｏｎＧｅｅ発現細胞は、ＲＦＰ発現対照よりもアポトーシスプログラムに入る傾向がある。（Ａ）スケールバー、５０μｍ（Ｂ）データは個々のデータポイントで平均±ｓ．ｅ．ｍ．、マンーホイットニー検定。
【図６】ＳｐｏｎＧｅｅはｃＡＭＰよりもｃＧＭＰに非常に特異的である。（Ａ〜Ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、一定のＯＤＱ灌流下で２０秒間のＦｓｋパルスに曝露した。ｃＡＭＰバイオセンサーＨ１４７を同時発現するｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ陽性細胞は、対照と同様のＦＲＥＴ：ＣＦＰ比の振幅及び増加率を示す（動画Ｓ４も参照されたい）。（Ｄ〜Ｆ）細胞をＦｓｋに曝露してそれらのｃＡＭＰ濃度を高め、ＳｐｏｎＧｅｅがｃＧＭＰとｃＡＭＰを区別する能力に挑戦した。Ｆｓｋ上昇ｃＡＭＰ濃度は、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅがｃＧＭＰセンサーＴｈＰＤＥ５ＶＶによって検出されたスペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ誘発ｃＧＭＰシグナルの振幅を低減することを妨げなかった（動画Ｓ５も参照されたい）。スケールバー、２０μｍ。（Ｂ、Ｅ）データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。（Ｃ、Ｆ）箱ひげ図要素：中心線、平均；ボックスの上限、四分位数の上限及び下限；ひげ、ｓ．ｄ．；＊＊＊Ｐ≦０．００１；マン−ホイットニー検定。
【図７】ＳｐｏｎＧｅｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏで皮質ニューロンの移動を変化させる。（Ａ、Ｂ）Ｅ１４．５でエレクトロポレーションされた対照皮質ニューロンは、Ｅ１８．５での辺縁帯に近い密な層に詰め込まれている。対照的に、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ発現は、（Ａ）発達中の皮質の深さ全体に散在するニューロン（矢印）、及び（Ｂ）皮質の表面でのヘテロトピアの形成（矢印）により、この層の発達を妨げる。（Ｃ）Ｐ１０では、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−エレクトロポレーションされたニューロン、及びそれらのｍＲＦＰがエレクトロポレーションされた対照の両方が、皮質の表層に見られる。（Ｄ）ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによって胚段階で誘発されたヘテロトピアはＰ１０仔マウス（矢印）で維持され、ｃＧＭＰシグナル伝達の変更が皮質ニューロンの移動を妨げることを示す。箱ひげ図の要素：中心線、平均；ボックスの上限、四分位数の上限及び下限；ひげ、ｓ．ｄ．スケールバー、（Ａ）２５０μＭ、（Ｂ）１００μｍ、（Ｃ）５００μｍ、（Ｄ）２００μｍ。＊＊Ｐ≦０．０１；二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定。
【図８】ＳｐｏｎＧｅｅを使用するｃＧＭＰ操作の細胞内制限。（Ａ）ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを、任意の細胞区画を標的にしていない場合に細胞全体のｃＧＭＰシグナル伝達を変更するため、又は特定のコンパートメントにおけるｃＧＭＰ下流エフェクターの活性化を防ぐために使用した。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅは脂質ラフトを確認することを目的とするのに対し、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓは原形質膜の非ラフト画分に限定されることを意図している。（Ｂ）ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅは細胞質で検出される（上段）が、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅとｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの両方が原形質膜で見られる（中段及び下段）。（Ｃ、Ｄ）原形質膜分画は、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ及びｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの明確な細胞内局在を強調している。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅは画分４で高度に濃縮されているが、ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの局在はより高密度の画分（７〜９）にシフトしている（図Ｓ２も参照されたい）。（Ｅ）Ｓｌｉｔ１及び（Ｆ）ｅｐｈｒｉｎＡ５は、対照軸索の成長円錐の崩壊を誘発する。ＳｐｏｎＧｅｅとＬｙｎ−ＳｐｏｎＧｅｅは、成長円錐の崩壊を防ぐ。対照的に、ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓは、ｓｌｉｔ１とｅｐｈｒｉｎＡ５に対する軸索応答に影響を与えない（図Ｓ３及び図Ｓ４も参照されたい）。箱ひげ図の要素：中心線、平均；ボックスの上限、四分位数の上限及び下限；ひげ、ｓ．ｄ．スケールバー、（Ｂ）２０μＭ、（Ｅ）１０μｍ。（Ｃ、Ｄ）＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１；二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定。（Ｅ、Ｆ）＊Ｐ≦０．０１、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１；クラスカル−ウォリス検定とそれに続くマン−ホイットニー事後検定。
【実施例】
【００６２】
実施例１：
コンストラクト：
以後、ｃＧＭＰＳｐ、ｃＧＭＰＳｐｏｎｇｅ、ＳｐｏｎＧｅｅ又はｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅと指定される本発明によるポリペプチドの例をコードするポリヌクレオチドであって、これらの用語はいずれも以下を使用して調製される５’にＦＬＡＧタグを更に含む非常に等しいポリペプチドを表す。
【００６３】
−配列番号１６の配列：ＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧによってコードされるＬｙｎｌキナーゼＮ末端ドメインのタンデムリピートとインフレームの配列番号１５の配列：
−ＡＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＣＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣＡＴＣＴＣＧＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣＧＡＴＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＴＡＴＧＴＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＧＴＴＧＡＡＧＴＴＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴＡＴＣＣＴＴＴＡＣＡＡＣＴＧＴＡＣＣＣＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＣＧＴＣＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＴＡＴＣＡＡＧＣＡＴＡＣＣＧＡＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＴＴＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＣＴＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＧＴＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＣＣＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴＴＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＧＡＡＴＧＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＡＧ。
【００６４】
オリゴをアニーリングし、レポータ配列とインフレームでｐｃＤＮＡ３−ｍＲＦＰにクローニングした。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ変異体の脂質ラフト除外型及び細胞質型は、それぞれ、配列番号１７の配列：ＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＧＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧによってコードされるＫｒａｓのＣａａＸ−ポリリジンモチーフの有無にかかわらず、ｐｃＤＮＡ３にサブクローニングすることで得られた。
【００６５】
ＲＧＣでの発現のために、コンストラクトをｐｃＸにサブクローニングした。ＴｈＰＤＥ５ＶＶは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して膜マイクロドメインを標的とし、ｐｃＤＮＡ３又はｐｃＸにサブクローニングした。
【００６６】
切断型ヒトＰＤＥ５Ａ１（ｈＰＤＥ５）の配列を、ｐＵＣ５７ベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）での遺伝子合成によって得て、ＳｍａＩ及びＮｈｅＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。Ｅｐａｃ１配列を、ＥｃｏＲＶ及びＮｈｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）での消化によりＴＥｐａｃＶＶベクター（オランダ国アムステルダム、ＮＫＩ−ＡＶＬのＫｅｅｓ  Ｊａｌｉｎｋ博士から入手）から除去し、ｈＰＤＥ５により置き換えた。細胞培養：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに維持し、製造元のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトし、トランスフェクションの翌日に撮像するか、免疫細胞蛍光のために固定及び処理した。
【００６７】
洗浄剤を使用しない方法による膜分画：エレクトロポレーションを行った網膜をペレット化し（１９５ｇで４℃にて５分間）、プロテアーゼ阻害剤カクテル及びホスファターゼ阻害剤カクテル１、２及び３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１．３４ｍＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ１１．５に再懸濁した。ホモジネートを２６ゲージの針で剪断し、２０秒間のバーストで３回超音波処理した。ホモジネートをＭＢＳ（２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び２５０ｍＭ炭酸ナトリウム）中の２．０６ｍＬの６０％スクロースを添加して４０％スクロースに調整し、５％〜３０％の不連続スクロース勾配下に置き、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ  ４１Ｔｉローターで、４℃にて１５時間〜１８時間、３４０００ｒｐｍで遠心分離した。９画分（各１．２４ｍＬ）を９容量のＭＢＳと混合したチューブの上部から採取し、４℃にて１時間、４００００ｒｐｍで遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ−４１Ｔｉローター）。上清を廃棄し、膜ペレットを１００μｌの１％ＳＤＳに再懸濁した。
【００６８】
イムノブロッティングでは、サンプルを４％〜１５％のＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸ  Ｔｒｉｓ−ＧｌｙｃｉｎｅバッファーＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ）で分離し、０．２μｍ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏｒａｄ）に転写した。５％（重量／体積）乾燥脱脂粉乳を補完した１×ＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ）で、メンブレンを室温で１時間ブロックした。次の抗体：ウサギ抗ＧＦＰ（１／２００；Ａ１１１２２；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウサギ抗ＤｓＲｅｄ（１／２００；６３２４７６；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ウサギ抗β−アダプチン（１／２００；ｓｃ−１０７６２；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びウサギ抗カベオリン（１／５００；６１００６０；ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、一次抗体のインキュベーションを４℃で一晩行った。ヤギ抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体を検出に使用した（ペンシルベニア州ウェストグローブのＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。抗体のインキュベーション後、メンブレンをＴＢＳ  Ｔ（２．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）で徹底的に洗浄した。強化された化学発光法（ＥＣＬプライムウエスタンブロッティング検出試薬、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、ウエスタンブロットを可視化した。
【００６９】
崩壊アッセイ：Ｅ１４マウスの網膜に、ｍＲＦＰ、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ又はｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓを用いて、２回のポーリングパルス（方形波、１７５Ｖ、５０ミリ秒間隔で５ミリ秒間）に続いて４回の転送パルス（４０Ｖ、５０ミリ秒及び９５０ミリ秒のインターパルス）でエレクトロポレーションを行った。網膜を切開し、培養培地（グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びグルコースを補完したＤＭＥＭ−Ｆ１２）で２４時間、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで維持した。翌日、それらをＴｉｓｓｕｅ−Ｃｈｏｐｐｅｒ（ＭｃＩｌｗａｎ）で２００μｍの正方形に切り、外植片をポリ−Ｌ−リジン及びラミニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆したカバーガラス上にプレートした。細胞を、０．４％メチルセルロースを補完した培養培地で２４時間培養し、ｒｍＳｌｉｔ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１時間処理した。
【００７０】
免疫検出：
網膜外植片、又は標的化バージョンのＳｐｏｎＧｅｅ及びＧＦＰを共発現するＨＥＫ細胞を、ＰＢ中の４％ＰＦＡで３０分間固定し、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ及び３％ＢＳＡで透過処理及びブロックを行い、次いで、ＤｓＲｅｄに対する抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ロット＃１３０６０３７、以前に同様のアッセイで使用された抗体（Ａｖｅｒａｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．，７：１２８９６，２０１６）に続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＧＦＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロット番号１７８９９１１、以前にＮｉｃｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ：，１０：３４０−３４７，２００７で検証済み）に結合した二次抗体、又はα−チューブリン（Ｓｉｇｍａ、ロット番号Ｔ６１９９、以前にＮｉｃｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ：，１０：３４０−３４７，２００７で検証済み）に続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合した二次抗体と共にインキュベートした。
【００７１】
撮像：
画像は、４０倍の油浸対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．３）及びソフトウェアＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を連結させた倒立ＤＭＩ６０００Ｂ落射蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で取得した。ライブイメージング実験では、０．２ｍＭ又は２ｍＭのＣａＣｌを含むＨＢＳバッファーで細胞を灌流した。タプシガルギンを１ｍＭで使用した）。ＣＦＰ（４８３／３２ｎｍ）及びＹＦＰ（５４２／２７）チャネルの画像を２０秒ごとに同時に取得した。画像をＩｍａｇｅＪで加工し、バックグラウンド及びブリードスルー（ｂｌｅｅｄｔｈｒｏｕｇｈ）を補正した後、ＣＦＰ／ＹＦＰの比率を計算した。共焦点画像を６３倍の油浸対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．４５）で取得し、標本全体を含むＺスタックをナイキスト周波数でサンプリングした。画像をＩｍａｇｅＪ及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐで描画した。
【００７２】
動物：
妊娠中のＣ５７ＢＬ６／Ｊ及びＲｊＯｒｌ：ＳＷＩＳＳマウス、並びにＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓから購入した。動物の処理はいずれも、施設のガイドラインに従って行われ、地域の倫理委員会（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス、Ｃ２ＥＡ−０５：Ｃｏｍｉｔｅ  ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ  ｅｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｅ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｄａｒｗｉｎ；Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｃ２ＥＡ−５９：Ｃｏｍｉｔｅ  ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ  ｅｎ  ｍａｔｉｅｒｅ  ｄ’ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｅ  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｅｔ  Ｓｕｄ）によって承認された。動物を１２時間の明／１２時間の暗サイクルの下で飼育した。日付を付けた交配からの胚（個々の実験を説明する各欄に記載されている発生段階）は実験中には性別が決定されておらず、雌雄の比率は１に近いと予想される。
【００７３】
細胞死アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を、ポリリジン被覆カバーガラスにプレーティングし、翌日、製造元の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｐＣＸ−ｍＲＦＰ又はｐＣＸ−ＳｐｏｎＧｅｅベクターでトランスフェクトした。プレーティングの３日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、切断型カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；ロット＃００４３）及びα−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）に対する抗体で免疫細胞化学用に加工するか、又はＣｅｌｌＥｖｅｎｔ  カスパーゼ３／７グリーン検出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で３０分間処理した後、固定してα−チューブリン抗体で標識した。各実験で、ｍＲＦＰ又はＳｐｏｎＧｅｅの陽性細胞集団における非標識細胞に対するカスパーゼ３陽性の割合を、ＤＭ６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）の２０倍の空気対物レンズで取得された１０個のランダムに選択されたフィールドから計算した。
【００７４】
ラット海馬培養
海馬神経細胞培養を、本質的に以前に記載されたように行った（Ｌｅｔｅｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２６：３１４１−３１５３，２００６）。簡潔に言えば、ラット胚の海馬を胎生１８日目に解剖した。トリプシン処理後、火仕上げした（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ）パスツールピペットで分離を行った。細胞を計数し、ポリ−Ｄ−リジンで被覆した直径１８ｍｍのガラス製のカバーガラス上に３００〜４００細胞・ｍｍ−２の密度でプレーティングした。プレーティング培地は、２％Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補完し、安定化グルタミン（０．５ｍＭ）及びペニシリンＧ（１０Ｕ．ｍｌ−１）／ストレプトマイシン（１０ｇ．ｍｌ−１）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。プレーティングの４時間後、カバーガラスを、８０％コンフルエントなグリア層で２４時間順化した補完Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含むペトリ皿に移した。製造元の指示に従い、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで６日後に（ＤＩＶ）ニューロンにトランスフェクトした。
【００７５】
子宮内エレクトロポレーション
少なくとも５日間の適応を可能にするため、手術の１週間前に交配の日が明らかな（ｔｉｍｅｄ−ｐｒｅｇｎａｎｔ）雌性動物（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）を動物施設に配送した。子宮内（ｉｎ  ｕｔｅｒｏ）エレクトロポレーションを以前に記載されたように行った（Ｌｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．，７：ｅ１０００１７６，２００９）。Ｅ１４．５の雌性動物にケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、正中線開腹術を行って子宮角を露出させ、傾斜照明のもとで胚の可視化を可能にした。滅菌Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ色素（Ｓｉｇｍａ）と３：１で組み合わされた２つのプラスミドベクターを含む１μＬのＤＮＡを、ＩＮＪＥＣＴ＋ＭＡＴＩＣ（ＩＮＪＥＣＴ＋ＭＡＴＩＣ）マイクロインジェクターによって駆動されるガラスキャピラリーピペット（先端が面取りされている７５μｍ〜１２５μｍの外径）を各胚の側脳室に注入した。２つの異なるプラスミドベクターを同時に注入した。１つ目は、エレクトロポレーションの対照として使用される、ニワトリベータアクチンプロモータ（ｐＣＸ−ｅＧＦＰ）の制御下で緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドであった。２つ目は、赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）の対照コンストラクト又はＳｐｏｎＧｅｅ−ｍＲＦＰをコードするプラスミドであった。直径５ｍｍのピンセット電極（Ｓｏｎｉｄｅｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）の陽極を背側終脳の上に置き、５０ミリ秒の持続時間の４回の３５Ｖパルスを子宮嚢に印加した。子宮内手術後、切開部位を縫合糸（４−０、Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉じ、マウスを清潔なケージで回復させた。マウスを手術の４日後に安楽死させてＥ１８．５胚の脳を採取するか、又は出生後Ｐ１０で分析するために出産させた。胚の脳を解剖して取り出し、Ａｎｔｉｇｅｎｆｉｘ（Ｄｉａｐａｔｈ）固定液に一晩浸漬し、切片化する前にＰＢＳですすいだ。Ｐ１０マウスをペントバルビタールナトリウム（１５０ｍｇ・ｋｇ−１）で深く麻酔し、Ａｎｔｉｇｅｎｆｉｘ（Ｄｉａｐａｔｈ）で経心臓的に灌流し、脳を解剖して取り出し、同じ溶液で一晩、後固定した。胎児及び出生後の脳のサンプルを、振動するブレードミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ  １０００Ｓ）で２００μｍの厚さに切片化した。最後に、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ＋Ｄａｐｉ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にマウントするか、１０μｇ・ｍＬ−１ビス−ベンズイミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で２時間インキュベートし、Ｍｏｗｉｏｌ  ４−８８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）にマウントした。共焦点画像を１０倍の対物レンズ（ＮＡ  ０．４）で取得し、標本全体を含むＺスタックをナイキスト周波数でサンプリングした。画像をＩｍａｇｅＪ及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐで描画した。
【００７６】
ＦＲＥＴ撮像及び分析（ＨＥＫ細胞）
画像を、４０倍の油浸対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．３）及びソフトウェアＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を連結させた倒立ＤＭＩ６０００Ｂ落射蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で取得した。ライブイメージング実験では、ＴｈＰＤＥ５ＶＶ又はＨ１４７でトランスフェクトされたｍＲＦＰ又はＳｐｏｎＧｅｅを共発現する細胞を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３μＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．４μＭＭｇＳＯ４、４．２５ｍＭ  ＫＣｌ、１４μＭＮａＨＣＯ３、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０００４％ＣｕＳＯ４、１．２４μＭＦｅ（ＮＯ３）３、１．５μＭＦｅＳＯ４、１．５μＭチミジン、０．５１ｍＭリポ酸、１．５ｍＭ  ＺｎＳＯ４、０．５μＭピルビン酸ナトリウム（いずれもＳｉｇｍａ製）、１×ＭＥＭアミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭプトレシン（Ｓｉｇｍａ）、０．０１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．４６％グルコース（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２％ペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて灌流した。ビタミンＢ１２及びリボフラビンはそれらの自家蛍光のため省略された。スペルミンＮＯＮＯａｔｅは５０μＭ、ＯＤＱ（Ｔｏｃｒｉｓ）は１０μＭ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）は１０μＭで使用した。ＣＦＰ（４８３／３２ｎｍ）及びＹＦＰ（５４２／２７）チャネルの画像を２０秒ごとに同時に取得した。画像をＩｍａｇｅＪで加工し、バックグラウンド及びブリードスルーを補正した後、ＣＦＰ／ＹＧＰの比率をコンピュータで計算した。共焦点画像を６３倍の油浸対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．４５）で取得し、標本全体を含むＺスタックをナイキスト周波数でサンプリングした。画像をＩｍａｇｅＪ及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐで描画した。
【００７７】
ＦＲＥＴ撮像（ラット海馬培養）
ＴｈＰＤＥ５ＶＶプローブでトランスフェクトしたニューロンを、油浸ＣＦＩ  Ｐｌａｎ  ＡＰＯ  ＶＣ６０倍、ＮＡ１．４対物（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、３７℃の恒温チャンバー内のＰｅｒｆｅｃｔ  Ｆｏｃｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＦＳ）を備えた電動Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ／Ｂ倒立顕微鏡でＤＩＶ８及びＤＩＶ１１の間のビデオ顕微鏡によって撮像した。取得をＣＦＰの励起波長（４３４ｎｍ＋／−１５ｎｍ）で、Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して行った。放射光は、ＦＦ５０９−ＦＤｉ０１ダイクロイックミラー、ＦＦ０１−４８３／３２−２５ＣＦＰフィルター及びＦＦ０１−５４２／２７−２５ＹＦＰフィルターを備えたＯｐｔｏｓｐｌｉｔ  ＩＩビームスプリッター（Ｃａｉｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を通過し、２倍の拡大レンズの後ろに取り付けられたＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｅｖｏｌｖｅ５１２、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）によって収集された。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ７．７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）による設定を試験的に行うことで取得を実施した。全てのフィルターセットをＳｅｍｒｏｃｋから購入した。１８−ｍｍカバーガラス上の培養ニューロンを、撮像培地：１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、２％Ｂ２７、０，００１％ＢＳＡを含む閉じた撮像チャンバーに入れた。取得は７０分間継続し、２分ごとに１つの画像を登録し、同じカバーガラス上に４個〜６個のニューロンを並行して登録した。取得開始から３０分後、ビヒクル溶液又はＯＤＱ１００μＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を取得開始から４０分後に適用し、ＤＥＡ  ＮＯＮＯａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）５０μＭ又はＦｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）１０μＭを適用した。
【００７８】
ＦＲＥＴデータ分析（ラット海馬培養）
ＩｍａｇｅＪで画像を２つの部分に分割し、ＣＦＰチャネル及びＹＦＰチャネルを分離した。次いで、１つ又は幾つかの目的の領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）の各時間点でのＦＲＥＴ比を計算することにより、Ｍａｔｌａｂでデータを分析した。ユーザーは、各位置のＲＯＩを定義した。各画像についてＦＲＥＴ比の値は（ＩＹ−ＢＹ）／（ＩＣ−ＢＣ）に対応し、式中、ＩＹはＹＦＰチャネルのＲＯＩの平均強度であり；ＢＹは、ＹＦＰチャネルのバックグラウンドの平均強度であり；ＩＣは、ＣＦＰチャネルのＲＯＩの平均強度であり；ＢＣは、ＣＦＰチャネルのバックグラウンドの値である。各ＲＯＩについて、ＦＲＥＴ比はベースライン平均によって正規化され、最初の治療注入前の７つの時間点として定義された。ＦＲＥＴ比＝１００＊（Ｒｃ−Ｒｏ）／Ｒｏ、式中、Ｒｃは粗ＦＲＥＴ比の値であり、Ｒｏはベースラインの平均である。各ニューロンコンパートメントで得られた定量結果を共にグループ化し、ベースライン及びＳＥＭに対して正規化された平均ＦＲＥＴ比を各時点で計算した。Ｍａｔｌａｂ上の体細胞及び樹状突起の偏差を補正した。処理を追加する前の最後の７つの時間点で、体細胞及び樹状突起の全てのニューロンについて平均勾配をそれぞれ計算し、全てのＦＲＥＴ比率の時間点から差し引いた。
【００７９】
分析及び統計
分析から除外したデータはない。サンプルサイズの計算は行わなかった。数匹の動物、カバーガラス、又は生化学的アッセイが同じ実験条件で分析されることが多いため、サンプルサイズは３つの再現性のある独立した実験の後に十分であると見なされ、ｎ≧３に至った。動物又は培養物は同等であり、処理前は互いに区別できなかったため、形式的な無作為化プロセスを必要とせずに事実上サンプルを無作為化した。多くの場合、顕微鏡写真はその実験条件を目で容易に追跡できるため、データの盲検分析を達成することは困難である。注意深い盲検法が行われた場合、実験は、同一の実験条件での非盲検実験で得られた結果を再現した。Ｍａｔｌａｂを使用したＴｈＰＤＥ５ＶＶセンサーの検証を除いて、ＩｍａｇｅＪを使用して画像の計算及び分析を行った。統計学的検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して計算した。
【００８０】
結果：
本発明によるポリペプチドの例（本明細書で設計されたｃＧＭＰＳｐ、ｃＧＭＰ  Ｓｐｏｎｇｅ、ＳｐｏｎＧｅｅ又はｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ）は、ＰＫＧ−Ｉα及びＰＫＧ−Ｉβの一部を含むｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）の高親和性キメラ変異体に基づいて設計された。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅは、結合部位とキメラ親和性ドメインを含み、キナーゼドメインを除外して下流のエフェクターの活性化を防ぐ（図１）。このコンストラクトを、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ発現細胞の同定を容易にするために、蛍光タンパク質ｍＲＦＰに更に融合させた。
【００８１】
ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅのバッファリング特性を、最適化されたＣＦＰ（Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ）に融合したヒトバージョンのＰＤＥ５に基づくｃＧＭＰのＦＲＥＴセンサーであるＴｈＰＤＥ５ＶＶと、ＦＲＥＴドナー及びアクセプターとしてのタンデムのＹＦＰ変異体（Ｖｅｎｕｓ）でそれぞれ試験した。ＴｈＰＤＥ５ＶＶは、以前に記載されたｃＧＭＰバイオセンサーであるｃＧＥＳ−ＤＥ５に類似する（Ｎｉｋｏｌａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，３：２３−２５，２００６）．ｃＧＥＳ−ＤＥ５のドナー及びアクセプター蛍光タンパク質は、以前に記載された戦略に従って（Ｋｌａｒｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ１９１７０，２０１１）、それぞれ、それらの最適化変異体ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ及びタンデムのｍＶｅｎｕｓに置き換えられていた。可溶性グアニル酸シクラーゼによるｃＧＭＰ合成を活性化するＮＯのドナー、ＤＥＡ−ＮＯＮＯａｔｅに曝露されたラット海馬ニューロンにおいて、ＴｈＰＤＥ５ＶＶをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた（Ｂｈａｒｇａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，６，２６，２０１３）。
【００８２】
ＴｈＰＤＥ５ＶＶ発現細胞でのＣＦＰに対するＦＲＥＴ比のモニタリングは、ｃＧＭＰ濃度の細胞内変動を反映している。Ｈ２９３細胞は、ＮＯのドナーであるスペルミン−ＮＯＮＯａｔｅの短いパルスに曝露されると、ＣＦＰに対するＦＲＥＴの比の増加を示し、これは、可溶性グアニル酸シクラーゼによるｃＧＭＰ合成を活性化して、細胞内ｃＧＭＰ濃度の増加を明らかにする。実験の最後に、細胞を持続的なスペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ刺激に曝露し、大量のｃＧＭＰ合成を誘発し、それらの生存率を制御した。スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅの１分間のパルスにより、ＦＲＥＴ／ＣＦＰ比が２０％増加し、刺激の開始から１分間の遅延があった。この遅延は、灌流ラインのデッドボリュームによって部分的に説明される。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを発現すると、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅによって誘発されたＦＲＥＴ／ＣＦＰの変化が大幅に減少し、バイオセンサーの結合に利用可能なｃＧＭＰ分子の減少を反映する。この観察は、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅがｃＧＭＰスカベンジャーであり、その下流経路のこのセカンドメッセンジャーの可用性を低下させることを実証している。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによって誘発されたＦＲＥＴ／ＣＦＰ上昇の減少は、より長い（２分間）スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ曝露ではそれほど顕著ではなく、ｃＧＭＰ濃度の長期的な増加がｃＧＭＰ結合部位の飽和につながることを示唆している。
【００８３】
ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅがｉｎ  ｖｉｖｏの生理学的プロセスを妨害し、したがって無傷の生物の細胞機能を調査するためのツールとして使用できる可能性を評価するために、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅをＥ１４．５マウス胚の側脳室に子宮内エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションを行った皮質ニューロンの移動を妊娠１８日目に分析した。Ｅ１８  ｅＧＦＰ及びｍＲＦＰの同時エレクトロポレーションを行った動物では、ニューロンは典型的な移動を示し、トランスフェクションされた細胞の大部分が辺縁帯近くの皮質板に蓄積した（図１）。対照的に、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−ｍＲＦＰ及びＧＦＰで同時エレクトロポレーションを行ったニューロンは、移動の遅延を示し、脳室下帯を含む新皮質全体で多数のニューロンが失われた。さらに、エレクトロポレーションを行った幾つかの細胞は、皮質板で失速できず、辺縁帯に向かってオーバーシュートした。これは、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによるｃＧＭＰバッファリングが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの健全なニューロンの移動に必要な生理学的ｃＧＭＰ調節を変更するのに十分であることを実証している。
【００８４】
ｃＧＭＰ合成酵素であるグアニル酸シクラーゼは、細胞内コンパートメントに制限されており、細胞内でのｃＧＭＰシグナルのコンパートメント化に結び付く。遺伝的コード化は、標的化配列を使用してコンストラクトの発現を特定のオルガネラに制限する能力を与えるため、このシナリオではｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの機能性を評価した。ｃＧＭＰバッファーを膜に標的化し、その発現をＬｙｎキナーゼ（Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ）からのパルミトイル化−ミリストイル化標的化ペプチドのタンデムのＮ末端融合によって、又はＫ−Ｒａｓ（ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓ）に由来するＣａａＸ−ポリリジンモチーフのＣ末端融合による脂質ラフトドメインからそれを更に排除することによって、脂質ラフトマイクロドメインに更に制限する。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ及びｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの発現は、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅとは対照的に、膜に限定されていた（図２）。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ及びｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの種々の膜コンパートメントへの局在を、密度勾配での膜分画を使用して分析した。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの発現は、脂質ラフトマーカーであるカベオリンに付随して、低密度画分３〜４に限定されていた。対照的に、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓは、膜の非ラフトコンポーネントのマーカーであるβ−アダプチンと一緒に７〜９の高密度画分で濃縮された。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの区分化された変異体が、ｃＧＭＰ依存性の細胞応答に差次的に影響を与えるかどうかを評価するため、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ又はｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓのいずれかを発現する網膜神経節細胞成長円錐のｃＧＭＰを必要とするプロセスである軸索ガイダンス分子ｓｌｉｔ−１及びｅｐｈｒｉｎＡ５への応答を分析した。トランスフェクトされていない軸索では、ｓｌｉｔ−１及びｅｐｈｒｉｎ−Ａ５が成長円錐の崩壊を引き起こした。細胞質ゾルにおけるｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの発現は、両方のきっかけによって誘発される崩壊応答を消滅させ、このプロセスにおけるｃＧＭＰシグナル伝達の必要性を確認した。同様に、ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５は、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを発現する軸索において成長の崩壊を誘発することができなかった。対照的に、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓを発現する軸索は対照と区別がつかず、脂質ラフトの外ではなくｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによるｃＧＭＰシグナル伝達の遮断が、ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５によって誘発される成長円錐の崩壊を防ぐのに十分であることを実証している。したがって、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを別個のコンパートメントに標的化すると、細胞内分解能によるｃＧＭＰ及びその下流のシグナル伝達の制御が可能になる。
【００８５】
ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによるｃＧＭＰバッファリングの限界を調査するため、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ及びＴｈＰＤＥ５ＶＶを共発現する細胞をより長いスペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ刺激に曝露した（２分間のパルス、又は持続的な曝露）。ＳｐｏｎＧｅｅの発現は、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅへの２分間の曝露によって誘発されるＦＲＥＴ：ＣＦＰ上昇の振幅と遅延の両方を減少させるのに十分であった（図４Ａ〜図４Ｃ）。対照的に、持続的なスペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ刺激中にＴｈＰＤＥ５ＶＶによって検出されたｃＧＭＰの上昇は遅延したが、ピーク振幅には影響がなかったため（図４Ｄ〜図４Ｆ）、このセカンドメッセンジャーの安静時の濃度とは対照的に、ｃＧＭＰ濃度の大幅且つ長期的な増加がｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ  ｃＧＭＰ結合部位の飽和につながることを示唆している。
【００８６】
多くのシグナル伝達経路及び細胞プロセスにおけるこのセカンドメッセンジャーの役割のため、ｃＧＭＰの慢性的なスカベンジングは細胞生存に影響を与える可能性がある。しかしながら、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ発現細胞の形態はそれらの対照と差がなく、細胞死が影響を受けていないことを示唆している（図５）。カスパーゼ３は、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ発現ＨＥＫ２９３細胞の発現では活性化されず、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによるｃＧＭＰのバッファリングが細胞生存に影響を与えないことが確認された（図５）。
【００８７】
ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅのｃＧＭＰに対する特異性を密接に関連するｃＡＭＰと比較して評価するため、ｃＡＭＰバイオセンサーであるＨ１４７を使用してＦＲＥＴ実験を行った。多くのシステムでは、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰシグナル伝達が互いに影響を及ぼし、両方の環状ヌクレオチドの濃度が反対方向に変化する。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによるｃＧＭＰスカベンジングのｃＡＭＰ測定への影響を最小限に抑えるために、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅのｃＡＭＰバッファリング活性を、薬理学的に低減されて安定化されたｃＧＭＰ濃度の細胞で評価した。ＲＦＰ−又はｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを発現する細胞は、可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤ＯＤＱを使用してｃＧＭＰシグナル伝達を低下させて維持し、後で２０秒間のアデニリルシクラーゼ活性化因子Ｆｓｋのパルスに曝露した。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅは振幅を減少させず、ｃＡＭＰ濃度の上昇に遅延を引き起こさなかった（図６Ａ〜図６Ｃ）。ｃＡＭＰの高い細胞内濃度がｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅのｃＧＭＰ結合ドメインに結合して飽和し、ｃＧＭＰ特異的スカベンジャーとして作用する能力を低下させるかどうかを評価した。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによるＮＯによって誘発されるｃＧＭＰ上昇のバッファリングは、ｃＡＭＰ濃度のＦｓｋ誘発性の上昇後に影響を受けず（図６Ｄ〜図６Ｆ）、細胞ｃＡＭＰが高濃度でもｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅに結合しないことを示している。これらの観察は、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅが細胞内ｃＡＭＰをバッファーしないことを実証し、ｃＧＭＰに対するその特異性を強調している。
【００８８】
ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅがｉｎ  ｖｉｖｏの生理学的プロセスを妨害する能力を評価することで、無傷の生物の細胞機能を調査するツールとしてその可能性を評価するため、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅをＥ１４．５マウス胚の脳の側脳室に子宮内で（ｉｎ  ｕｔｅｒｏ）エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした皮質ニューロンの移動をＥ１８．５及びＰ１０で分析した。Ｅ１８．５の対照ｅＧＦＰ及びｍＲＦＰの同時エレクトロポレーションを行った動物では、ニューロンは典型的な移動を示し、トランスフェクトされた細胞の大部分が辺縁帯近くの皮質板に蓄積した（図７Ａ、図７Ｂ）。対照的に、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ及びＧＦＰで同時エレクトロポレーションを行ったニューロンは、移動の遅延を示し、ニューロンは中間帯を含む皮質板全体に散在ししていた（図７Ａ）。さらに、エレクトロポレーションを行った細胞の幾つかは皮質板で失速することができず、ｍＲＦＰのエレクトロポレーションを行った対照で観察された終末域（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｚｏｎｅ）をオーバーシュートした（図７Ｂ）。ヘテロトピアは９匹のｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅでエレクトロポレーションを行った動物のうち７匹で見られたが、１０ｍＲＦＰを発現する胚のうち２つは皮質板をオーバーシュートしているニューロンを示した（Ｐ＝０．００００３７、χ２検定）。誤って配置されたｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを発現するニューロンは依然として、２０％の対照動物（５匹のうち１匹、Ｐ＝０．００００２４、χ２検定）と比較すると、仔の７１％（７匹のうち５匹）でヘテロトピアを伴ってＰ１０で見られた（図７Ｃ、図７Ｄ）。これは、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによるｃＧＭＰバッファリングが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切なニューロンの移動に必要な生理学的ｃＧＭＰ調節を変更するのに十分であることを実証している。
【００８９】
その過剰の下流の標的の特定の活性化を達成するため、ｃＧＭＰシグナルは特定の細胞内コンパートメントに限定される。遺伝的コード化は、標的化配列を使用してコンストラクトの発現を特定のオルガネラに制限する能力を与えるため、このシナリオではｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの機能性を評価した。本発明者らは、ｃＧＭＰバッファーを膜に標的化し、その発現をＬｙｎキナーゼ（Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ）からのパルミトイル化−ミリストイル化標的化ペプチドのタンデムのＮ末端融合によって、又はＫ−Ｒａｓ（ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓ）に由来するＣａａＸ−ポリリジンモチーフのＣ末端融合による脂質ラフトドメインからそれを排除することによって、脂質ラフトマイクロドメインに更に制限する（図８Ａ）。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ及びｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの発現は、非標的化ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅとは対照的に、膜に限定されていた（図８Ｂ）。本発明者らは、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ及びｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓの種々の膜コンパートメントへの局在を、密度勾配での膜分画を使用して分析した。Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの発現は、脂質ラフトマーカーであるカベオリンに付随して、低密度画分に限定されていた。対照的に、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓは、膜の非ラフトコンポーネントのマーカーであるβ−アダプチンと一緒に高密度画分に濃縮されていた（図８Ｃ、図８Ｄ）。ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの変異体のコンパートメント化が、ｃＧＭＰ依存性の細胞応答に差次的に影響を与えるかどうかを評価するため、軸索ガイダンス分子ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５に曝露された場合のＬｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ又はｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓのいずれかを発現する網膜神経節細胞成長円錐の挙動を分析した。軸索成長円錐のＳｌｉｔ１とｅｐｈｒｉｎＡ５に依存する反発には、ｃＧＭＰシグナル伝達が必要である。トランスフェクトされていない軸索及びｍＲＦＰ−エレクトロポレーションされた軸索を含む対照条件では、ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５が成長円錐の崩壊を誘発した（図８Ｅ、図８Ｆ）。細胞質ゾルにおけるｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅの発現は、両方のきっかけによって誘発される崩壊応答を消滅させ、このプロセスにおけるｃＧＭＰシグナル伝達の必要性を確認した。同様に、ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５は、Ｌｙｎ−ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを発現する軸索において成長円錐の崩壊を誘発することができなかった。対照的に、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅ−Ｋｒａｓを発現する軸索は対照と区別がつかず（図８Ｅ、図８Ｆ）、脂質ラフトの外ではなくｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅによるｃＧＭＰシグナル伝達の遮断が、ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５によって誘発される成長円錐の崩壊を防ぐのに十分であることを実証している。したがって、ｃＧＭＰＳｐ／ＳｐｏｎＧｅｅを別個のコンパートメントに標的化すると、細胞内分解能によるｃＧＭＰ及びその下流のシグナル伝達の制御が可能になる。結論として、本発明のポリペプチドは、このセカンドメッセンジャーに依拠���る生理学的機能を妨害することができるｃＧＭＰスカベンジャーとして機能する。したがって、本発明のポリペプチドは、細胞特異的な方法で細胞内分解能によりｃＧＭＰ応答を変化させることができ、シグナル伝達カスケードの正確な研究のための新しい分野を開き、治療的実施への道を開く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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