(57)【要約】腫瘍関連抗原、ＮＫＧ２Ｄ受容体、及びＣＤ１６と結合する多特異的結合タンパク質を第２の抗がん剤と組み合わせて用いるがんの併用療法が記載されている。また、多特異的結合タンパク質の薬学的組成物、及び第２の抗がん剤と組み合わせたがんの治療に有用な治療方法も記載されている。本発明は、がん細胞上の腫瘍関連抗原ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体を結合させてナチュラルキラー細胞を活性化する多特異的結合タンパク質、そのような多特異的結合タンパク質を含む薬学的組成物、ならびにがんの治療のためのものを含む、そのような多特異的結合タンパク質及び薬学的組成物を使用する治療方法を提供する。【選択図】なし
2021512914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質に、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて曝露することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項２】
がんの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質または前記タンパク質を含む製剤を、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項３】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列、及び配列番号１１３のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号９３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号５９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１０４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１０３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質に、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて曝露することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項９】
がんの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質または前記タンパク質を含む製剤を、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号９０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号９１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号５６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号５３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号５６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質に、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて曝露することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項１３】
がんの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質または前記タンパク質を含む製剤を、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号９４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号９５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質に、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて曝露することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項１７】
がんの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質または前記タンパク質を含む製剤を、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１２０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１１８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１２０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質に、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて曝露することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項２１】
がんの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質または前記タンパク質を含む製剤を、
チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与することを含み、
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１２７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１２８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記重鎖可変ドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１２７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１２８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質に、
ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、養子ＮＫ療法、幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて曝露することを含む、前記方法。
【請求項２５】
がんの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、
を含むタンパク質または前記タンパク質を含む製剤を、
ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、及び抗ＴＩＭ３抗体から選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＮＦα、ＩＬ−２１、ＰＥＧ−ＩＬ−２及びＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒヘテロ二量体から選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、及びＴＬＲ３アゴニストから選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＡＤＵ−Ｓ１００である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学療法剤は、パクリタキセル、ナブ−パクリタキセルまたはシクロホスファミドである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、リリルマブ、及びモナリズマブから選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＬＲアゴニストは、Ｒ８４８／レシキモド、ＶＴＸ−２３３７、イミキモド、及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドから選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記がんは、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、乳癌、大腸癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃癌、消化管癌、消化管間質性腫瘍、膠芽腫、頭頸部癌、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、腎細胞癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、及び膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、Ｔ細胞リンパ腫精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、骨髄由来のサプレッサー細胞によって浸潤されたがん、細胞外マトリックス沈着を伴うがん、高レベルの反応性間質を伴うがん、及び血管新生を伴うがんからなる群から選択される、請求項２〜７、９〜１１、１３〜１５、１７〜１９、及び２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質の前記第１の抗原結合部位は、ヒト、非ヒト霊長類、及びげっ歯類におけるＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインは、同一のポリペプチドに存在する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の抗原結合部位もまた、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の抗原結合部位は、シングルドメイン抗体である、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記シングルドメイン抗体は、ＶＨＨフラグメントまたはＶＮＡＲフラグメントである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の抗原結合部位は、シングルドメイン抗体である、請求項１〜３６、３９、及び４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の抗原結合部位は、ＶＨＨフラグメントまたはＶＮＡＲフラグメントである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍関連抗原は、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記タンパク質は、ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部を含み、前記抗体Ｆｃドメインは、ヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記タンパク質は、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項２〜７、９〜１１、１３〜１５、１７〜１９、及び２１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６２８，１７８号の利益及び優先権を主張し、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
腫瘍関連抗原、ＮＫＧ２Ｄ受容体、及びＣＤ１６と結合する多特異的結合タンパク質を第２の抗がん剤と組み合わせて用いるがんの併用療法が記載されている。また、多特異的結合タンパク質の薬学的組成物、及び第２の抗がん剤と組み合わせたがんの治療に有用な治療方法も記載されている。
【背景技術】
【０００３】
がんは、この疾患を治療するために文献で報告されている相当な研究努力及び科学的進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの一部には、前立腺癌、乳癌、及び肺癌が含まれる。前立腺癌は、男性において最も一般的ながんの形態である。乳癌は、依然として女性における死亡の最多の原因である。これらのがんに対する現在の治療オプションは、すべての患者にとって有効なわけではなく、及び／または実質的な有害な副作用を有し得る。他の種類のがんもまた、既存の治療オプションを使用して治療することは課題のままである。
【０００４】
がん免疫療法は、特異性が高く、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進し得るので望ましい。二重特異的Ｔ細胞係合剤などの融合タンパク質は、腫瘍細胞及びＴ細胞に結合して腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。所定の腫瘍関連抗原及び所定の免疫細胞に結合する抗体が文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１及びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
【０００５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の構成要素であり、循環リンパ球のおよそ１５％を占める。ＮＫ細胞は、事実上すべての組織に浸潤し、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞を有効に殺傷するそれらの能力によって元々特徴付けられた。活性化したＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒を介して及び死受容体経路を介して標的細胞を殺傷する。活性化したＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ−ガンマ及びケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。
【０００６】
ＮＫ細胞は、それらの表面上の様々な活性化及び阻害受容体を介してシグナルに反応する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇した場合、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化を介して阻害される。代替的に、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇した場合、それらは、それらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面上のＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。ＮＫ細胞の活性化に対する全体的な感受性は、刺激性及び阻害性シグナルの合計に依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３４３７１号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０９５４１２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質に、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん細胞成長または生存に関与するがん細胞における特定の分子と干渉するがん標的薬剤（例えば、Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ、またはＧｌｅｅｖｅｃなどのキナーゼ阻害剤を含む）、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＮＫ細胞の注入を含む養子ＮＫ療法、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＴ細胞（キメラ抗原受容体を発現させるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変された細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む）の注入を含む養子Ｔ細胞療法、幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて曝露することを含む、方法を提供する。
【０００９】
一態様では、本発明は、がんの治療をそれを必要とする対象において行う方法であって、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質またはそのタンパク質を含む製剤を、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん標的薬剤、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＮＫ細胞の注入を含む養子ＮＫ療法、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＴ細胞（キメラ抗原受容体を発現させるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変された細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む）の注入を含む養子Ｔ細胞療法、幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、及び細胞老化を誘導する薬剤から選択される第２の治療剤と組み合わせて対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、及び抗ＴＩＭ３抗体から選択されるチェックポイント阻害剤と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【００１１】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＮＦα、ＩＬ−２１、ＰＥＧ−ＩＬ−２（ポリエチレングリコール変性インターロイキン−２）、及びＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒヘテロ二量体などのインターフェロン及びインターロイキンを含むサイトカインと組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【００１２】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、及びＴＬＲ３アゴニストから選択されるＴＬＲアゴニストと組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【００１３】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、ＳＴＩＮＧアゴニストであるＡＤＵ−Ｓ１００と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【００１４】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ニトロソウレア、テモゾロミド（経口ダカルバジン）などのアルキル化剤；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びバルビシンなどのアントラサイクリン；パクリタキセル、ナブ−パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、及びタキソテールなどの細胞骨格破壊剤；エポチロン；ボルリノスタット及びロミデプシンなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤；イリノテカン及びトポテカンなどのトポイソメラーゼＩの阻害剤；エトポシド、テニポシド及びタフルポシドなどのトポイソメラーゼＩＩの阻害剤；ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ及びビスモデギブなどのキナーゼ阻害剤；アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビンなどのヌクレオチドアナログ及び前駆体アナログ；ブレオマイシン及びアクチノマイシンなどのペプチド抗生剤；カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンなどの白金系薬剤；トレチノイン及びアリトレチノインなどのレチノイド；ならびにビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンなどのビンカアルカロイド及び誘導体を含む化学療法剤と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【００１５】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、リリルマブ、及びモナリズマブから選択されるチェックポイント阻害剤と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【００１６】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、Ｒ８４８／レシキモド、ＶＴＸ−２３３７、イミキモド、及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドから選択されるＴＬＲアゴニストと組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、がん細胞上の腫瘍関連抗原ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化する多特異的結合タンパク質、そのような多特異的結合タンパク質を含む薬学的組成物、ならびにがんの治療のためのものを含む、そのような多特異的結合タンパク質及び薬学的組成物を使用する治療方法を提供する。そのようなタンパク質は、複数種類のＮＫ活性化受容体と係合し得、ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンドの結合を阻害し得る。所定の実施形態では、そのタンパク質は、ヒトにおいて、及びげっ歯類及び／またはカニクイザルなどの他の種において、ＮＫ細胞を作動し得る。本発明の様々な態様及び実施形態を以下にさらに詳細に説明する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位とを組み込んでいてもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、３価であり、第１及び第２の抗原結合部位であって、その両方が同じ腫瘍関連抗原と結合する、第１及び第２の抗原結合部位と、ＮＫＧ２Ｄと結合する第３の抗原結合部位と、ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、４価であり、第１及び第２の抗原結合部位であって、その両方が同じ腫瘍関連抗原と結合する、第１及び第２の抗原結合部位と、第３及び第４の抗原結合部位であって、その両方がＮＫＧ２Ｄと結合する、第３及び第４の抗原結合部位と、ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部を含む。
【００２１】
抗原結合部位はそれぞれ、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体のように配列されているか、または一緒に融合してｓｃＦｖを形成する）を組み込んでいてもよく、または抗原結合部位の１つ以上が、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ科動物の抗体のようなＶＨＨ抗体または軟骨魚類に見られるもののようなＶＮＡＲ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＬＬ１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ−Ｅ、及びＰＤ−Ｌ１からなる群から選択され得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変のドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインはそれぞれ、表１に開示される抗原結合部位の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、抗原結合部位の表１に開示されているように、重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。
【００２３】
例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１１３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号９３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号５９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１０４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１０３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号９０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号９１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号５６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号５３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号５５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号５６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号９４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号９５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号６７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号６８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１２０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１１８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１２０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１２７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１２８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１２７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列、配列番号１２８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列、及び配列番号１２９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明の別の態様は、患者におけるがんを治療する方法を提供する。その方法は、それを必要とする患者に、治療的有効量の本明細書に記載の多特異的結合タンパク質を投与してがんを治療することを含む。多特異的結合タンパク質を使用する治療のための例示的ながんには、例えば、ＨＥＲ２を発現するがんが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（右アーム）、腫瘍関連抗原結合ドメイン（左アーム）及びＣＤ１６に結合するＦｃドメインまたはその一部を含有する多特異的結合タンパク質の図である。
【図２】ｓｃＦｖ形式のＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（右アーム）、腫瘍関連抗原結合ドメイン（左アーム）及びＣＤ１６に結合するＦｃドメインまたはその一部を含有する多特異的結合タンパク質の図である。
【図３】ＩｇＧ様形状を維持する三官能性二重特異的抗体であるトリオマブ形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体（それぞれが１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する）からなる。トリオマブ形態は、ラット抗体の１／２及びマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物である。
【図４】ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を伴う、ＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＫｉＨは、標的１及び２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦＣを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨ形式のＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖及び両方のＨＣと対を形成する共通軽鎖を含有する、標的１及び２に結合する２つのｆａｂを有するヘテロ二量体構築物であり得る。
【図５】柔軟性のある天然に存在するリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、４価のＩｇＧ様分子を生成する二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂの可変ドメインのＮ末端に融合したホモ二量体構築物であり、構築物は通常のＦｃを含有する。
【図６】Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、直交Ｆａｂ界面（Ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ）形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬＣ−ＨＣ対形成は、直交界面によって確保される。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける変異によって確保される。
【図７】ツーインワンＩｇ形式のＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【図８】Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電気的ステアリング変異によって確保される。
【図９】Ｆａｂアーム交換形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である：重鎖及び結合した軽鎖（半分子）を別の分子由来の重−軽鎖対と交換することによってＦａｂアームを交換する抗体であり、これにより二重特異的抗体がもたらされる）。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１及び２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦＣを含有するヘテロ二量体である。
【図１０】標的１及び２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦＣを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ  Ｂｏｄｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【図１１】２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用されている、ＬｕＺ−Ｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬｕＺ−Ｙ形態は、ＦＣに融合した、標的１及び２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦＣのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフを介して確保される。
【図１２】Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【図１３】ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの図である：抗原１を標的とするＦａｂ１は、カッパＬＣを含有するのに対し、抗原２を標的とする第２のＦａｂは、ラムダＬＣを含有する。Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの１つの形態の例示的な図であり；Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
【図１４】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の結合親和性を実証するグラフである。
【図１５】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の結合親和性を実証するグラフである。
【図１６】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の結合親和性を実証するグラフである。
【図１７】バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍数を示すフローサイトメトリーによるヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の結合を実証するグラフである。
【図１８】バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍数を示すフローサイトメトリーによるマウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の結合を実証するグラフである。
【図１９】天然リガンドＵＬＢＰ−６と競合することによって組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の特異的結合親和性を実証するグラフである。
【図２０】天然リガンドＭＩＣＡと競合することによって組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の特異的結合親和性を実証するグラフである。
【図２１】天然リガンドＲａｅ−１デルタと競合することによって組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の特異的結合親和性を実証するグラフである。
【図２２】ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−アルファ陽性細胞の割合を定量化することによってＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示すグラフである。
【図２３】マウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−アルファ陽性細胞の割合を定量化することによってＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示すグラフである。
【図２４】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。
【図２５】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。
【図２６】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。
【図２７】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。
【図２８】腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の細胞傷害性効果を示すグラフである。
【図２９】示差走査蛍光光度法によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙されている）の溶融温度を示すグラフである。
【図３０】多特異的結合タンパク質によるヒトＮＫ細胞の増進した活性化を示すグラフである。
【図３１】多特異的結合タンパク質が、ヒトＮＫ細胞による腫瘍標的細胞に対するより高いレベルの細胞傷害性を誘導したことを示すグラフである。
【図３２】多特異的結合タンパク質が、ヒトＮＫ細胞による腫瘍標的細胞に対するより高いレベルの細胞傷害性を誘導したことを示すグラフである。
【図３３】多特異的結合タンパク質が、ヒトＮＫ細胞による腫瘍標的細胞に対するより高いレベルの細胞傷害性を誘導したことを示すグラフである。
【図３４】多特異的結合タンパク質が、ヒトＮＫ細胞による腫瘍標的細胞に対するより高いレベルの細胞傷害性を誘導したことを示すグラフである。
【図３５】多特異的結合タンパク質が、マウスＮＫ細胞による腫瘍標的細胞に対するより高いレベルの細胞傷害性を誘導したことを示すグラフである。
【図３６】多特異的結合タンパク質が、マウスＮＫ細胞による腫瘍標的細胞に対するより高いレベルの細胞傷害性を誘導したことを示すグラフである。
【図３７】ＥＬ４細胞に発現したＮＫＧ２Ｄに対するＣＤ３３標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。図３７は、ＣＤ３３結合ドメインが第２の標的化アームとして使用された場合の２つのＴｒｉＮＫＥＴの結合を示している。
【図３８】ＥＬ４細胞に発現したＮＫＧ２Ｄに対するＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。図３８は、同じ２つのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ここではＨＥＲ２第２標的化アームと対を形成したことを示している。
【図３９】ＥＬ４細胞に発現したＮＫＧ２Ｄに対するＢＣＭＡ標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。
【図４０】ＥＬ４細胞に発現したＮＫＧ２Ｄに結合するＣＤ２０標的化ＴｒｉＮＫＥＴのヒストグラムである。未染色ＥＬ４細胞を蛍光シグナル用の陰性対照として使用した。未染色：塗りつぶし；ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４：実線；ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６：破線。
【図４１】ＭＶ４−１１ヒトＡＭＬ細胞に発現したＣＤ３３に対するＣＤ３３標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。
【図４２】ヒト７８６−Ｏ腎細胞癌細胞に発現したＨＥＲ２に対するＨＥＲ２標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。
【図４３】ＭＭ．１Ｓヒト骨髄腫細胞に発現したＢＣＭＡに対するＢＣＭＡ標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。
【図４４】Ｒａｊｉヒトリンパ腫細胞に発現したＣＤ２０に結合するＣＤ２０標的化ＴｒｉＮＫＥＴのヒストグラムである。未染色細胞を蛍光シグナル用の陰性対照として使用した。未染色：塗りつぶし；ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４：実線；ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６：破線。
【図４５】ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄを使用したＮＫ細胞の相乗活性化の棒グラフである。Ａは、ＣＤ１０７ａのレベルを実証し；Ｂは、ＩＦＮγのレベルを実証し；Ｃは、ＣＤ１０７ａのレベルを実証している。グラフは、平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。データは、５つの異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験の図である。
【図４６】ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６を標的とするＴｒｉＮＫＥＴを使用したＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。試験した抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであった。グラフは、平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。
【図４７Ａ】ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブが、ＨＥＲ２陽性ヒト腫瘍細胞との共培養において初代ヒトＮＫ細胞を活性化することができたことを実証しており、これはＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示唆されている棒グラフである。モノクローナル抗体のトラスツズマブと比較して、両ＴｒｉＮＫＥＴは、様々なヒトＨＥＲ２がん細胞でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した。図４７Ａは、ヒトＮＫ細胞が、ＳｋＢｒ−３細胞と共に培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示している。
【図４７Ｂ】ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブが、ＨＥＲ２陽性ヒト腫瘍細胞との共培養において初代ヒトＮＫ細胞を活性化することができたことを実証しており、これはＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示唆されている棒グラフである。モノクローナル抗体のトラスツズマブと比較して、両ＴｒｉＮＫＥＴは、様々なヒトＨＥＲ２がん細胞でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した。図４７Ｂは、ヒトＮＫ細胞が、Ｃｏｌｏ２０１細胞と共に培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示している。
【図４７Ｃ】ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブが、ＨＥＲ２陽性ヒト腫瘍細胞との共培養において初代ヒトＮＫ細胞を活性化することができたことを実証しており、これはＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示唆されている棒グラフである。モノクローナル抗体のトラスツズマブと比較して、両ＴｒｉＮＫＥＴは、様々なヒトＨＥＲ２がん細胞でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した。図４７Ｃは、ヒトＮＫ細胞が、ＨＣＣ１９５４細胞と共に培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示している。
【図４８】ＣＤ３３を発現するヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４−１１との共培養において休息したまたはＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を実証する線グラフである。Ａは、休息しているヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示している。Ｂは、同じドナーからのＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示している。
【図４９】ＩＬ−２で活性化した及び休息したヒトＮＫ細胞を使用した細胞傷害活性のＴｒｉＮＫＥＴ増進を実証する棒グラフである。Ａは、休息したヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の特異的溶解率を示している。Ｂは、ＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の特異的溶解率を示している。
【図５０】ＴｒｉＮＫＥＴがトラスツズマブと比較してＨＥＲ２中度及び低度がんに対して最も大きな利点を提供することを実証する棒グラフである。Ａは、ＨＥＲ２高度ＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の活性化ヒトＮＫ細胞殺傷を示している。Ｂは、ＨＥＲ２低度７８６−Ｏ腫瘍細胞のヒトＮＫ細胞殺傷を示している。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＨＥＲ２の発現が低いがん細胞に対してトラスツズマブと比較してより大きな利点を提供する。
【図５１】３つのヒトＡＭＬ細胞株、すなわち、Ｍｏｌｍ−１３細胞株（Ａ）、Ｍｖ４−１１細胞株（Ｂ）、及びＴＨＰ−１細胞株（Ｃ）での高親和性ＦｃＲγＩ（ＣＤ６４）の発現を示すヒストグラムである。
【図５２】Ｍｏｌｍ−１３（Ｂ）またはＴＨＰ−１（Ａ）のいずれかとの共培養におけるヒトＮＫ細胞のモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化の線グラフである。
【図５３Ａ】３つのヒトＡＭＬ細胞株を標的として使用したヒトＮＫ細胞傷害性アッセイの線グラフを示している。ＣＤ６４を発現するが、ＴＨＰ−１よりも低いレベルで発現するＭｖ４−１１細胞が、モノクローナル抗ＣＤ３３では減少した有効性を示したことを示している。
【図５３Ｂ】３つのヒトＡＭＬ細胞株を標的として使用したヒトＮＫ細胞傷害性アッセイの線グラフを示している。ＣＤ３３に対するモノクローナル抗体が、ＣＤ６４を発現しないＭｏｌｍ−１３細胞に対して良好な有効性を示すことを実証している。
【図５３Ｃ】３つのヒトＡＭＬ細胞株を標的として使用したヒトＮＫ細胞傷害性アッセイの線グラフを示している。ＴＨＰ−１細胞がモノクローナル抗ＣＤ３３単独では効果を示さなかったことを実証している。図５３Ｃに記載された線グラフの同一性はまた、図５３Ａ〜５３Ｂにおける線グラフにも適用可能である。
【図５４Ａ】健康ドナーからのＢ細胞が、ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解に対して感受性であることを示す棒グラフである。
【図５４Ｂ】健康ドナーからのＢ細胞が、ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解に対して感受性であることを示す棒グラフである。
【図５４Ｃ】骨髄細胞が、ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解に対して抵抗性であることを示す棒グラフである。
【図５４Ｄ】骨髄細胞が、ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解に対して抵抗性であることを示す棒グラフである。
【図５５】長期共培養におけるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介ｈＰＢＭＣ殺傷の線グラフである。
【図５６】ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２皮下ＳＣ２．２有効性の試験設計のフローチャートである。
【図５７】ＳＣ２．２が皮下ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２腫瘍成長に対して影響を有しないことを示す線グラフである。
【図５８】ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示すグラフである。４倍希釈した６０μｇ／ｍＬの示された抗体を２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（Ａ）またはＥＬ４−ｍＮＫＧ２Ｄ細胞（Ｂ）に添加した。結合は、ヤギ抗マウスＰＥ二次抗体を使用して評価し、続いてフローサイトメトリー分析をした。
【図５９】ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴによって媒介されたＮＫ細胞傷害性の増加を示すグラフである。
【図６０Ａ】Ｂ１６Ｆ１０ｓ．ｃ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍有効性を示している。マウスに、（Ａ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４及びマウス抗Ｔｙｒｐ−１モノクローナル抗体または（Ｂ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４及びｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴを１５０μｇの用量で注射して腹腔内処置した（６、８、１０、１２、１４、１６及び２１日目）。腫瘍成長を２８日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。
【図６０Ｂ】Ｂ１６Ｆ１０ｓ．ｃ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍有効性を示している。マウスに、（Ａ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４及びマウス抗Ｔｙｒｐ−１モノクローナル抗体または（Ｂ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４及びｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴを１５０μｇの用量で注射して腹腔内処置した（６、８、１０、１２、１４、１６及び２１日目）。腫瘍成長を２８日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。
【図６１】Ｂ１６Ｆ１０ｉ．ｖ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍有効性を示している。Ａは、抗体を１５０μｇ用量で投与した場合の腫瘍負担を表している（４、６、８、１１、１３、１５日目）。Ｂは、抗体を１５０μｇ用量で投与した場合の腫瘍負担を表している（７、９、１１、１３、１５日目）。腫瘍負荷の１８日後、マウスを安楽死させ、表面肺転移をスコア化した。
【図６２】ヒトＮＫ細胞が、ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞と共に培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示している。
【図６３】ＢＣＭＡ陽性ＭＭ．１Ｓヒト骨髄腫細胞との培養でのヒトＮＫ活性化を示す棒グラフである。
【図６４】ＴｒｉＮＫＥＴがＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞のヒトＮＫ細胞溶解を増進することを示すグラフである。
【図６５】異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを有するＢＣＭＡ標的化ＴｒｉＮＫＥＴが、ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞のヒトＮＫ細胞溶解を増進することを示すグラフである。
【図６６Ａ】Ｂ１６Ｆ１０ｓ．ｃ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ及び抗ＰＤ−１抗体を使用した併用療法の効果を示す線グラフである。アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４で、ラットＩｇＧ２ａモノクローナル抗体２Ａ３で、またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９で腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。
【図６６Ｂ】Ｂ１６Ｆ１０ｓ．ｃ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ及び抗ＰＤ−１抗体を使用した併用療法の効果を示す線グラフである。アイソタイプ対照または抗ＰＤ−１モノクローナル抗体クローンＲＰＭ１−１４で腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。
【図６６Ｃ】Ｂ１６Ｆ１０ｓ．ｃ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ及び抗ＰＤ−１抗体を使用した併用療法の効果を示す線グラフである。ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体との組み合わせで腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。腫瘍成長を３０日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。
【図６７Ａ】Ｂ１６Ｆ１０ｓ．ｃ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ及び組換えヒトＩＬ−２を使用した併用療法の効果を示す線グラフである。アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９で腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。
【図６７Ｂ】Ｂ１６Ｆ１０ｓ．ｃ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ及び組換えヒトＩＬ−２を使用した併用療法の効果を示す線グラフである。アイソタイプ対照またはＩＬ−２で腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。
【図６７Ｃ】Ｂ１６Ｆ１０ｓ．ｃ．モデルにおいてｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ及び組換えヒトＩＬ−２を使用した併用療法の効果を示す線グラフである。ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９とＩＬ−２との組み合わせで腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。無腫瘍を維持している併用群の３匹のマウスで腫瘍成長を４０日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。
【図６８】１分子内の三重特異的結合が最大のＮＫ細胞活性にとって重要であることを示す線グラフである。
【図６９】Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂ及び標的２に結合するｓｃＦａｂを含むＯａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける変異によって確保される。
【図７０】抗原１及び２に結合する２つの異なるＦａｂ及びヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦＣを含有するヘテロ二量体構築物であるＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ１及び２は、正しいＬＣ及びＨＣの対形成を確保する異なるＳ−Ｓ橋を含有する。
【図７１】ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した標的１及び２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物であるＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬ及びＣＨ１ドメインならびにＶＨ及びＶＬドメインは交換される。例えば、ＣＨ１はＶＬと直列で融合されるのに対し、ＣＬはＶＨと直列で融合される。
【図７２】抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合されているホモ二量体構築物であるＦｉｔ−Ｉｇである。構築物は、野生型ＦＣを含有する。
【図７３Ａ】トラスツズマブまたはＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で休息したＮＫ細胞（図７３Ａ）によって活性化したＮＫ細胞による７８６−Ｏ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７３Ｂ】トラスツズマブまたはＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−２（図７３Ｂ）によって活性化したＮＫ細胞による７８６−Ｏ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７３Ｃ】トラスツズマブまたはＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で休ＩＬ−１２（図７３Ｃ）によって活性化したＮＫ細胞による７８６−Ｏ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７３Ｄ】トラスツズマブまたはＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−１５（図７３Ｄ）によって活性化したＮＫ細胞による７８６−Ｏ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７４Ａ】リンツズマブ、私有の抗ＣＤ３３モノクローナル抗体、またはＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で休息したＮＫ細胞（図７４Ａ）によって活性化したＮＫ細胞によるＭｏｌｍ−１３標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７４Ｂ】リンツズマブ、私有の抗ＣＤ３３モノクローナル抗体、またはＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−２（図７４Ｂ）によって活性化したＮＫ細胞によるＭｏｌｍ−１３標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７４Ｃ】リンツズマブ、私有の抗ＣＤ３３モノクローナル抗体、またはＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−１２（図７４Ｃ）によって活性化したＮＫ細胞によるＭｏｌｍ−１３標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７４Ｄ】リンツズマブ、私有の抗ＣＤ３３モノクローナル抗体、またはＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−１５（図７４Ｄ）によって活性化したＮＫ細胞によるＭｏｌｍ−１３標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７５Ａ】ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ−９０１またはＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で休息したＮＫ細胞（図７５Ａ）によって活性化したＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７５Ｂ】ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ−９０１またはＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−２（図７５Ｂ）、ＩＬ−１２（図７５Ｃ）によって活性化したＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７５Ｃ】ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ−９０１またはＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−１２（図７５Ｃ）によって活性化したＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７５Ｄ】ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ−９０１またはＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−１５（図７５Ｄ）によって活性化したＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７６Ａ】ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ−９０１またはＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で休息したＮＫ細胞（図７６Ａ）によって活性化したＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７６Ｂ】ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ−９０１またはＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でポマリドマイド（図７６Ｂ）によって活性化したＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７６Ｃ】ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ−９０１またはＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−２（図７６Ｃ）によって活性化したＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７６Ｄ】ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ−９０１またはＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でＩＬ−２とポマリドマイドとの組み合わせ（図７６Ｄ）によって活性化したＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解割合を示す線グラフである。
【図７７Ａ】精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞及びＨＣＣ１９５４標的細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図７７Ｂ】精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞及びＨＣＣ１９５４標的細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図７８Ａ】ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ、ペムブロリズマブ（「キイトルーダ」）、またはその組み合わせの存在下でのＨＣＣ１９５４標的細胞の成長を示す線グラフである。図７８Ａで使用されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、異なるドナーから単離された。
【図７８Ｂ】ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ、ペムブロリズマブ（「キイトルーダ」）、またはその組み合わせの存在下でのＨＣＣ１９５４標的細胞の成長を示す線グラフである。図７８Ｂで使用されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、異なるドナーから単離された。
【図７９】ＰＢＭＣ及びＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ、ＴＬＲアゴニスト、またはその組み合わせの存在下でのＳｋｂｒ−３標的細胞の成長を示す線グラフである。
【図８０Ａ】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞が播種され、７．５ｍｇ／ｋｇのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴもしくは７．５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４（図８０Ａ）で処置された個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す線グラフである。
【図８０Ｂ】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞が播種され、１μｇの組換えマウスＩＬ−１２（ｒｍＩＬ−１２）もしくは７．５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４（図８０Ｂ）で処置された個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す線グラフである。図８０Ｂにおいて、下側のパネルは、ｙ軸の小さなスケールでのプロットを表している。
【図８０Ｃ】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞が播種され、７．５ｍｇ／ｋｇのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴと１μｇのｒｍＩＬ−１２との組み合わせ（図８０Ｃ）で処置された個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す線グラフである。図８０Ｃにおいて、下側のパネルは、ｙ軸の小さなスケールでのプロットを表している。
【図８１】Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞の播種及び７．５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４、７．５ｍｇ／ｋｇのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ、１μｇのｒｍＩＬ−１２、または７．５ｍｇ／ｋｇのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴと１μｇのｒｍＩＬ−１２との組み合わせでの処置の後に生存した動物の割合を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、がん細胞上の腫瘍関連抗原ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体を結合させてナチュラルキラー細胞を活性化する多特異的結合タンパク質、そのような多特異的結合タンパク質を含む薬学的組成物、ならびにがんの治療のためのものを含む、そのような多特異的結合タンパク質及び薬学的組成物を使用する治療方法を提供する。本発明の様々な態様をセクションにおいて以下に記載するが、１つの特定のセクションに記載された本発明の態様は、任意の特定のセクションに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の理解を容易にするために、多数の用語及び語句を以下に定義する。
【００３９】
本明細書で使用される用語「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が不適切でない限り、「１つ以上」を意味し、複数を含む。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合部位」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）及び軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に相違する伸張は、「超可変領域」と称され、これは「フレームワーク領域」、または「ＦＲ」として知られているより保存された隣接の伸張間に挟まれている。よって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間にそれらに隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに相対的に配置されて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」、または「ＣＤＲ」と称される。ラクダ及び軟骨魚類などの所定の動物では、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクト抗体において、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合フラグメントにおいて、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドにおいて、単一ポリペプチド中で重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結するためのペプチドリンカーを使用して存在し得る。
【００４１】
本明細書で使用される用語「腫瘍関連抗原」は、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない任意の抗原を意味する。そのような抗原は、悪性細胞上、または腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉間質、もしくは免疫浸潤物上などの腫瘍微小環境において発現し得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「対象」及び「患者」は、本明細書に記載の方法及び組成物によって治療される生物を指す。そのような生物には好ましくは、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれるがこれらに限定されず、より好ましくは、ヒトが含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量の化合物（例えば、本発明の化合物）を指す。有効量は、１回以上の投与、適用または投薬量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることは意図されていない。本明細書で使用される場合、用語「治療する」は、任意の効果、例えば、病態、疾患、障害などの改善をもたらす、軽減、減少、調節、改善もしくは除去、またはそれらの症状の改善を含む。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的組成物」は、活性剤と不活性または活性の担体との組み合わせであって、組成物をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に特に好適なものとするものを指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルションなど）、及び様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤及び防腐剤を含み得る。担体、安定剤及びアジュバントの例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照されたい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な塩」は、本発明の化合物の任意の薬学的に許容可能な塩（例えば、酸または塩基）であって、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝物もしくは残留物を提供することが可能なものを指す。当業者には知られているように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸及び塩基に由来し得る。例示的な酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含まれるがこれらに限定されない。本発明の化合物及びそれらの薬学的に許容可能な酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において、シュウ酸などの他の酸（それら自体は薬学的に許容可能ではない）が用いられ得る。
【００４７】
例示的な塩基には、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、及び式ＮＷ４＋（ＷはＣ１−４アルキルである）などが含まれるがこれらに限定されない。
【００４８】
例示的な塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、半硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれるがこれらに限定されない。塩の他の例には、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、及びＮＷ４＋（ＷはＣ１−４アルキル基である）などの好適なカチオンと化合した本発明の化合物のアニオンが含まれる。
【００４９】
治療的使用のため、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容可能なものとして企図される。しかしながら、薬学的に許容可能ではない酸及び塩基の塩もまた、例えば、薬学的に許容可能な化合物の調製または精製において利用され得る。
【００５０】
本明細書を通して、組成物が、特定の成分を有するか、含むか、またはそれらからなるものとして記載されている場合、またはプロセス及び方法が、特定の工程を有するか、含むか、またはそれらからなるものとして記載されている場合、追加的に、記述された成分から本質的になるか、またはそれらからなる本発明の化合物があること、及び記述された処理工程から本質的になるか、またはそれらからなる本発明によるプロセス及び方法があることが企図されている。
【００５１】
一般事項として、百分率を特定している組成物は、別段特定されない限り、重量による。さらに、可変要素に定義が伴っていない場合、そのときはその可変要素の先の定義が優先する。
【００５２】
Ｉ．タンパク質
本発明は、がん細胞上の腫瘍関連抗原ならびにナチュラルキラー細胞を活性化させるためのナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体と結合する多特異的結合タンパク質を提供する。多特異的結合タンパク質は、本明細書に記載の薬学的組成物及び治療方法に有用である。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に多特異的結合タンパク質が結合させることは、ナチュラルキラー細胞のがん細胞の破壊への活性を増進する。がん細胞上の腫瘍関連抗原に対する多特異的結合タンパク質の結合は、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近接させ、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的及び間接的な破壊を促進する。例示的な多特異的結合タンパク質のさらなる説明を以下に提供する。
【００５３】
多特異的結合タンパク質の第１の構成要素は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８＋αβＴ細胞を含み得るがこれらに限定されないＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合により、多特異的結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合することを阻害し得る。
【００５４】
多特異的結合タンパク質の第２の構成要素は、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ−Ｌ１を含み得るがこれらに限定されない１つ以上の腫瘍関連抗原に結合し得る。
【００５５】
多特異的結合タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、及び濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
【００５６】
多特異的結合タンパク質は、限定されないが以下の例に示されるように、いくつかの形式を取り得る。１つの形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多特異的抗体である。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第１の可変重鎖ドメイン及び任意の第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含み；免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位を形成する。免疫グロブリン軽鎖が第２の免疫グロブリン重鎖と対を形成する場合に、得られる抗原結合部位が腫瘍抗原に結合する場合を除き、第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の可変重鎖ドメイン、及び第１の免疫グロブリン重鎖と対を形成するものと同一の免疫グロブリン軽鎖と対を形成し得る第２の任意のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（図１）。
【００５７】
別の例示的な形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖及び第２の免疫グロブリン重鎖を含むヘテロ二量体多特異的抗体である。第１の免疫グロブリン重鎖は、ＮＫＧ２Ｄと結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）にリンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合された第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。ｓｃＦｖを第１のＦｃドメインにまたはｓｃＦｖ自体の中に連結するために様々なリンカーが使用され得る。また、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ全体の構造を安定化するためにジスルフィド結合の形成を可能にする変異を組み込んでいてもよい。ｓｃＦｖはまた、第１の免疫グロブリン重鎖全体の等電点を変更するために、及び／またはより容易な下流の精製を可能にするために変異を組み込んでいてもよい。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の可変重鎖ドメイン及び第２の任意のＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対を形成し、腫瘍抗原に結合する。第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（図２）。
【００５８】
ヘテロ二量体多特異的タンパク質の代替的な形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第１の可変重鎖ドメイン及び任意の第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と共に、腫瘍抗原と結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の可変重鎖ドメイン及び第２の任意のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と共に、同じ腫瘍抗原と結合する抗原結合部位を形成する。免疫グロブリン軽鎖が第２の免疫グロブリン重鎖と対を形成する場合に、得られる抗原結合部位が、腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合部位である場合を除き、第２の免疫グロブリン重鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と対を形成する免疫グロブリン軽鎖と同一であり得る免疫グロブリン軽鎖と対を形成し得る。所定の実施形態では、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（図１）。
【００５９】
１つ以上の追加の結合モチーフが、任意にリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。所定の実施形態では、抗原結合部位は、一本鎖またはジスルフィド安定化可変領域（ＳｃＦｖ）であり得るか、または４価もしくは３価の分子を形成し得る。
【００６０】
所定の実施形態では、多特異的結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三官能性二重特異的抗体であるトリオマブ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体（それぞれが１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する）からなる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、ＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態であり、これはノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を伴う。ＫＩＨは、ヘテロ二量体化を促進するために各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを創出するためにＣＨＨ３ドメインを遺伝子操作することを伴う。「ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背景にあるコンセプトは、小さな残基を嵩高い残基で置換することによって（すなわち、ＥＵナンバリングではＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）一方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」を導入することであった。「ノブ」を受け入れるために、ノブに最も近い隣接する残基をより小さな残基で置き換えることによって（すなわち、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）に相補的な「ホール」表面が創出された。「ホール」変異は、構造誘導型ファージライブラリースクリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９７）２７０（１）：２６−３５）。ＫｉＨ  ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＪＭ，Ｕｌｔｓｃｈ  Ｍ，Ｌｅｅ  Ｊ，Ｔｏｎｇ  Ｒ，Ｔａｋｅｄａ  Ｋ，Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ＣＨ２−ＣＨ３  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１４）４２６（９）：１９４７−５７；Ｍｉｍｏｔｏ  Ｆ，  Ｋａｄｏｎｏ  Ｓ，Ｋａｔａｄａ  Ｈ，Ｉｇａｗａ  Ｔ，Ｋａｍｉｋａｗａ  Ｔ，Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｋ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲｓ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４）５８（１）：１３２−８）は、ＣＨ３ドメイン間のコア界面における立体相補性によって駆動される疎水性相互作用によって熱力学的にヘテロ二量体化が優位になる一方で、ノブ−ノブ界面及びホール−ホール界面は、それぞれ、立体障害及び優位な相互作用の崩壊のため、ホモ二量体化を優位としないことを実証した。
【００６２】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、柔軟性のある天然に存在するリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、４価のＩｇＧ様分子を生成する二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、直交Ｆａｂ界面（Ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ）形態である。ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ  ＩｇＧアプローチ（Ｌｅｗｉｓ  ＳＭ，Ｗｕ  Ｘ，Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ  Ａ，Ｓｅｒｅｎｏ  Ａ，Ｈｕａｎｇ  Ｆ，Ｒｉｃｋ  ＨＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｆａｂ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３２（２）：１９１−８）では、構造ベースの領域設計は、他方のＦａｂに変更を加えることなく、一方のＦａｂのみにＬＣ及びＨＣＶＨ−ＣＨ１界面で相補的な変異を導入する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、ツーインワンＩｇ形式である。いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電気的ステアリング変異によって確保される。いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物であるκλ−Ｂｏｄｙ形態である：抗原１を標的とするＦａｂ１はカッパＬＣを含有するのに対し、抗原２を標的とする第２のＦａｂはラムダＬＣを含有する。図１３Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり；図１３Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖及び結合した軽鎖（半分子）を別の分子由来の重−軽鎖対と交換することによってＦａｂアームを交換する抗体であり、これにより二重特異的抗体がもたらされる）である。いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、ＳＥＥＤ  Ｂｏｄｙ形態である（ストランド交換遺伝子操作ドメイン（ＳＥＥＤ）プラットフォームは、天然抗体の治療的応用を拡大する能力である、非対称及び二重特異的抗体様分子を生成するように設計される。このタンパク質遺伝子操作化プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンの構造的に関連する配列を交換することに基づく。ＳＥＥＤ設計は、ＡＧ及びＧＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を好まないのに対し、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする。（Ｍｕｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１１，２４（５）：４４７−５４））。いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用されている、ＬｕＺ−Ｙ形態である。（Ｗｒａｎｉｋ，ＢＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２），２８７：４３３３１−９）。
【００６６】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態である（二重特異的Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙでは、２つの異なるペプチドが、分岐したアゼチジノンリンカーを使用して一緒に接続され、部位特異的様式でマイルドな条件下で骨格抗体に融合される。ファーマコフォアは機能活性を担っているのに対し、抗体骨格は長い半減期及びＩｇ様分布を付与する。ファーマコフォアは、化学的に最適化され得るか、または他のファーマコフォアに置き換えられて最適化されたもしくは独自の二重特異的抗体を生成し得る。（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ  ＶＲ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１０），１０７（５２）；２２６１１−２２６１６）．
【００６７】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１に結合するＦａｂ及び標的２に結合するｓｃＦａｂを含むＯａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体形態である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける変異によって確保される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、抗原１及び２に結合する２つの異なるＦａｂ及びヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦＣを含有するヘテロ二量体構築物であるＤｕｅｔＭａｂ形態である。Ｆａｂ１及び２は、正しいＬＣ及びＨＣの対形成を確保する異なるＳ−Ｓ橋を含有する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した標的１及び２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物であるＣｒｏｓｓｍＡｂ形態である。ＣＬ及びＣＨ１ドメインならびにＶＨ及びＶＬドメインは交換される。例えば、ＣＨ１はＶＬと直列で融合されるのに対し、ＣＬはＶＨと直列で融合される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、多特異的結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合されているホモ二量体構築物であるＦｉｔ−Ｉｇ形態である。構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【００７１】
表１は、ＮＫＧ２Ｄに組み合わさって結合し得る重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙している。別段示されない限り、表１に提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ下で決定されている。
【表１−１】
2021512914.tif 000003
【表１−２】
2021512914.tif 000004
【表１−３】
2021512914.tif 000005
【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
2021512914.tif 000011
【表１−１０】
2021512914.tif 000012
【００７２】
代替的に、配列番号６９によって定義される重鎖可変ドメインは、ＵＳ９，２７３，１３６に示されるように、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成するために配列番号７０によって定義される軽鎖可変ドメインと対を形成し得る。
配列番号６９
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号７０
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＦＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【００７３】
代替的に、配列番号７１によって定義される重鎖可変ドメインは、ＵＳ７，８７９，９８５に示されるように、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成するために配列番号７２によって定義される軽鎖可変ドメインと対を形成し得る。
配列番号７１
ＱＶＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＤＤＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＳＹＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＮＷＤＤＡＦＮＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号７２
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【００７４】
Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６の結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、及びＣＨ２ドメイン内の炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに焦点が当てられている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７−２７３を参照されたい）。既知のドメインに基づいて、変異は、ファージ表示ライブラリまたは酵母表面表示ｃＤＮＡライブラリなどを使用することによってＣＤ１６に対する結合親和性を増進または低減するように選択され得るか、または既知の相互作用の三次元構造に基づいて設計され得る。
【００７５】
ヘテロ二量体抗体重鎖のアセンブリは、同一細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成され得、これはヘテロ二量体のアセンブリだけでなく、各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリをもたらし得る。ヘテロ二量体の優先的なアセンブリを促進することは、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０、ＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおいて異なる変異を組み込むことによって達成され得る。例えば、ヒトＩｇＧ１に基づいて、また、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド内のアミノ酸置換（これらの鎖が、互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする）の異なる対を組み込んでＣＨ３ドメインに変異がなされ得る。以下に示されるアミノ酸置換の位置はすべて、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従って番号付けされている。
【００７６】
１つのシナリオでは、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸をアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸に置き換え、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸（複数可）をアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選ばれるより小さなアミノ酸（複数可）に置き換えることで、より大きなアミノ酸置換（突起）がより小さなアミノ酸置換（空洞）の表面にフィットする。例えば、一方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を組み込んでいてもよく、他方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込んでいてもよい。
【００７７】
本発明の抗体重鎖可変ドメインは任意に、ヒンジ、ＣＨ１ドメインを伴うかまたは伴わないＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの抗体定常領域と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列に結合され得る。いくつかの実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。いくつかの他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物に由来する抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及び／またはＫ４３９において１つ以上の変異が定常領域に組み込まれ得る。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが含まれ得る。
【００７８】
所定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／またはＶ１７３にあり得る。所定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／またはＴ１６４にあり得る。
【００７９】
代替的に、アミノ酸置換は、表２に示される以下の置換のセットから選択され得る。
【表２】
2021512914.tif 000013
【００８０】
代替的に、アミノ酸置換は、表３に示される以下の置換のセットから選択され得る。
【表３】
2021512914.tif 000014
【００８１】
代替的に、アミノ酸置換は、表４に示される以下の置換のセットから選択され得る。
【表４】
2021512914.tif 000015
【００８２】
代替的に、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は、表５から選択され得る。
【表５】
2021512914.tif 000016
【００８３】
代替的に、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表６における以下の置換のセットから選択され得、ここで、第１ポリペプチドカラムに示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドカラムに示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸によって置き換えられる。
【表６】
2021512914.tif 000017
【００８４】
代替的に、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表７における以下のセットから選択され得、ここで、第１ポリペプチドカラムに示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドカラムに示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸によって置き換えられる。
【表７】
2021512914.tif 000018
【００８５】
代替的に、または加えて、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、対向するポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入して、２つのポリペプチドの界面内に人工的なジスルフィド橋を形成することによってヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性が増加し得る。
【００８６】
上述の多特異的タンパク質は、当業者によく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列は、第１の発現ベクターにクローニングされ得；第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列は、第２の発現ベクターにクローニングされ得；免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列は、第３の発現ベクターにクローニングされ得；第１、第２、及び第３の発現ベクターは、一緒に宿主細胞に安定的にトランスフェクションされて多重性タンパク質を産生し得る。
【００８７】
多特異的タンパク質の最も高い収率を達成するため、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適な比を決定するために第１、第２、及び第３の発現ベクターの異なる比が探索され得る。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当該技術分野で知られている方法を使用して細胞バンク生成のために単一クローンが単離され得る。
【００８８】
クローンは、バイオリアクターのスケールアップに好適な条件下で培養され、多特異的タンパク質の発現が維持され得る。多特異的タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイズ、凍結融解、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含む当該技術分野で知られている方法を使用して単離及び精製され得る。
【００８９】
ＩＩ．ＴｒｉＮＫＥＴの特徴付け
所定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原に対する結合ドメインを含む本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する。所定特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原に対する結合ドメインを含むＴｒｉＮＫＥＴは、同じ腫瘍関連抗原結合ドメインを有するモノクローナル抗体と同等のレベルで腫瘍関連抗原に結合する。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及びトラスツズマブ由来のＨＥＲ２結合ドメインを含むＴｒｉＮＫＥＴは、トラスツズマブと同等のレベルで細胞上に発現したＨＥＲ２に結合し得る。
【００９０】
しかしながら、本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、腫瘍成長を低減し、がん細胞を殺傷するのにより有効である。例えば、ＨＥＲ２発現腫瘍／がん細胞を標的とする本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＳＣ２．２（ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドであるＵＬＢＰ−６に連結されたトラスツズマブ由来のｓｃＦｖから構築された一本鎖二重特異的分子）よりも有効である。ＳＣ２．２は、ＨＥＲ２＋がん細胞及びＮＫＧ２Ｄ＋ＮＫ細胞を同時に結合させる。そのため、ＨＥＲ２＋がん細胞数の減少におけるＳＣ２．２の有効性を調査した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化及び細胞傷害性アッセイは、ＳＣ２．２が、ＮＫ細胞の活性化及び殺傷に有効であることを実証した。しかしながら、ＳＣ２．２は、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２皮下腫瘍モデルにおいて有効性を実証することができなかった。ＳＣ２．２の有効性はまた、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２を過剰発現させた同系マウスモデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。このマウスモデルでは、ＳＣ２．２は、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長の制御を実証することができなかった。よって、ＳＣ２．２は、ＮＫ細胞を活性化及び殺傷することができ、ＨＥＲ２＋がん細胞に結合するものの、これらの特性は、ＨＥＲ２＋腫瘍の成長を有効に制御するには不十分であった。
【００９１】
所定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原に対する結合ドメインを含む本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、抗原を発現する腫瘍細胞と共に培養した場合、ヒト初代ＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示される。さらに、腫瘍関連抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体と比較して、ＴｒｉＮＫＥＴは、抗原を発現する腫瘍細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す。例えば、モノクローナル抗体トラスツズマブと比較して、ＨＥＲ２結合ドメインを有する本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＨＥＲ２発現がん細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を有する。
【００９２】
所定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原に対する結合ドメインを含む本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、抗原を発現する腫瘍細胞の存在下で、休息した及びＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞の活性を増進する。休息したＮＫ細胞は、ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞よりも小さなバックグラウンドＩＦＮγ産生及びＣＤ１０７ａ脱顆粒を示した。所定の実施形態では、ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞は、ＴｒｉＮＫＥＴでの刺激後に、ＩＦＮγ＋；ＣＤ１０７ａ＋になる細胞のより高い割合を示した。
【００９３】
所定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、抗原を発現する腫瘍細胞の存在下で、休息した及びＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を増進する。さらに、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含むＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）は、同じ腫瘍関連抗原結合部位を含むモノクローナル抗体と比較して、腫瘍細胞に対する活性化した及び休息したＮＫ細胞の反応をより強力に誘導する。所定の実施形態では、ＴｒｉＮＫＥＴは、同じ腫瘍抗原結合部位を含むモノクローナル抗体と比較して、中度及び低度腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に対する利点を提供する。そのため、ＴｒｉＮＫＥＴを含む療法は、モノクローナル抗体療法よりも優位であり得る。すべてのこれらの背景において、ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞をＩＬ−２と共にインキュベートした場合、ＩＬ−２を伴わないＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞のより高い活性化及びより高い腫瘍細胞殺傷を誘導し、ＴｒｉＮＫＥＴとＩＬ−２の間の相乗効果を実証した。
【００９４】
所定の実施形態では、モノクローナル抗体と比較して、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）は、高発現のＦｃ受容体（ＦｃＲ）を有するがん、または高いレベルのＦｃＲを有する腫瘍微小環境に存在するがんを治療するのに有利である。モノクローナル抗体は、とりわけ、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ファゴサイトーシス、及びシグナル遮断を含む複数のメカニズムを介して腫瘍成長に対してそれらの効果を発揮する。ＦｃγＲの中でもＣＤ１６は、ＩｇＧのＦｃに対して最も低い親和性を有し；ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、ＣＤ１６よりも約１０００倍の強さでＩｇＧのＦｃに結合する高親和性ＦｃＲである。ＣＤ６４は通常、骨髄系などの多くの造血系に発現しており、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの、これらの細胞型に由来する腫瘍に発現し得る。ＭＤＳＣ及び単球などの、腫瘍に浸潤する免疫細胞もまた、ＣＤ６４を発現し、腫瘍微小環境に浸潤することが知られている。腫瘍によるまたは腫瘍微小環境におけるＣＤ６４の発現は、モノクローナル抗体療法に有害な影響を及ぼし得る。腫瘍微小環境におけるＣＤ６４の発現により、これらの抗体は、ＮＫ細胞の表面上のＣＤ１６に係合することが困難となるが、それは抗体が、高親和性の受容体に結合することを好むからである。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞の表面上の２つの活性化受容体を標的とすることにより、モノクローナル抗体療法における（腫瘍または腫瘍微小環境のいずれかに対する）ＣＤ６４発現の有害な影響を克服し得る。腫瘍細胞上でのＣＤ６４発現にかかわらず、ＴｒｉＮＫＥＴは、すべての腫瘍細胞に対してヒトＮＫ細胞反応を媒介することができるが、その理由は、ＮＫ細胞上の２つの活性化受容体の二重標的化が、ＮＫ細胞に対するより強力な特異的結合を提供するからである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）は、標的照準（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）腫瘍外副作用の減少を介してより良好な安全性プロファイルを提供する。ナチュラルキラー細胞及びＣＤ８Ｔ細胞はいずれとも、腫瘍細胞を直接溶解することができるが、ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞が腫瘍細胞から正常な自己を認識するメカニズムは異なる。ＮＫ細胞の活性は、活性化（ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６など）受容体及び阻害（ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａなど）受容体からのシグナルのバランスによって制御される。これらの活性化及び阻害シグナルのバランスにより、ＮＫ細胞は、ストレスを受けた、ウイルス感染した、または形質転換した自己細胞から健康な自己細胞を決定することが可能となる。この自己耐性の「内蔵」メカニズムは、ＮＫ細胞反応から正常な健康組織を保護するのに役立つ。この原理を拡張するために、ＮＫ細胞の自己耐性により、ＴｒｉＮＫＥＴは、腫瘍外の副作用を伴わずに、または増大した治療ウィンドウを伴って、自己及び腫瘍の両方に発現した抗原を標的とすることが可能となる。ナチュラルキラー細胞とは異なり、Ｔ細胞は、活性化及びエフェクター機能のためにＭＨＣ分子によって提示される特定のペプチドの認識を必要とする。Ｔ細胞は、免疫療法の主要な標的であり、腫瘍に対するＴ細胞反応を再誘導するための多くの戦略が開発されてきた。Ｔ細胞二重特異性物質、チェックポイント阻害剤、及びＣＡＲ−Ｔ細胞はすべて、ＦＤＡによって承認されているが、しばしば用量制限毒性に悩まされている。Ｔ細胞二重特異性物質及びＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞の表面上の抗原を標的とする結合ドメインを使用し、遺伝子操作されたシグナル伝達ドメインを使用して活性化シグナルをエフェクター細胞に伝達することによってＴＣＲ−ＭＨＣ認識システムの周囲で機能する。これらの療法は、抗腫瘍免疫反応の誘発には有効であるものの、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及び標的照準腫瘍外副作用を伴うことが多い。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞の活性化及び阻害の天然システムを上書きしないので、この点に関して独特である。代わりに、ＴｒｉＮＫＥＴは、バランスに影響を及ぼすように設計されており、健康な自己へのＮＫ耐性を維持しつつ、ＮＫ細胞に追加の活性化シグナルを提供する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含む本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）は、同じ腫瘍抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体よりも有効に腫瘍の進行を遅らせる。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び腫瘍抗原結合ドメインを含むＴｒｉＮＫＥＴは、がん転移に対して、同じ腫瘍抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体よりも有効である。
【００９７】
上記の記載は、本発明の複数の態様及び実施形態を記載している。本特許出願は特に、その態様及び実施形態のすべての組み合わせ及び変更を企図している。
【００９８】
ＩＩＩ．治療適用
本発明は、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む本明細書に記載の多特異的結合タンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）及び／または本明細書に記載の薬学的組成物を使用してがんを治療するための方法を提供する。その方法は、固形腫瘍、リンパ腫、及び白血病を含む様々ながんを治療するために使用され得る。治療されるがんの種類は望ましくは、多特異的結合タンパク質が結合するがん細胞の種類と一致する。例えば、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するがん、例えばＥｐＣＡＭを発現する結腸癌の治療は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６及びＥｐＣＡＭに結合する本明細書に記載の多特異的結合タンパク質を使用して治療される。治療方法の追加的態様及び実施形態を以下に記載する。
【００９９】
したがって、本発明の一態様は、患者におけるがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、治療的有効量の本明細書に記載の多特異的結合タンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）を投与してがんを治療することを含む、方法を提供する。治療のための例示的ながんには、固形腫瘍、白血病、及びリンパ腫が含まれる。
【０１００】
治療方法は、治療されるがんに応じて特徴付けされ得る。例えば、所定の実施形態では、がんは固形腫瘍である。所定の他の実施形態では、がんは、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、または子宮癌である。さらに他の実施形態では、がんは、血管新生性腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、末端性黒子性黒色腫、光線性角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞性癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星状腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢絨乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織癌、嚢胞腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、上衣癌、上皮細胞癌、ユーイング肉腫、眼及び眼窩癌、女性生殖器癌、限局性結節性過形成症、胆嚢癌、胃前庭部癌、胃底癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平上皮新生物、肝内胆管癌、浸潤性扁平上皮癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、骨盤癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性生殖器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄様上皮腫、髄膜癌、中皮癌、転移性癌、口腔癌、粘膜表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻道癌、神経系癌、神経上皮性腺癌結節性黒色腫、非上皮性皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、希突起神経膠細胞癌、口腔癌、骨肉腫、乳頭漿液性腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、直腸癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、扁平上皮癌、横紋筋癌、中皮下癌、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌癌、未分化癌、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿器系癌、子宮頸癌、子宮体癌、ぶどう膜黒色腫、膣癌、いぼ状癌、ビポーマ、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。
【０１０１】
所定の他の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。所定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。所定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫、例えば、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫である。
【０１０２】
治療されるがんは、がん細胞の表面に発現した特定の抗原の存在に応じて特徴付けられ得る。所定の実施形態では、がん細胞は、次のうちの１つ以上を発現する：ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ−Ｌ１。
【０１０３】
所定の実施形態では、本開示のタンパク質は、腫瘍またはがん細胞及びナチュラルキラー細胞を、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む本開示のタンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）に曝露することによって腫瘍細胞死（溶解、殺傷、除去、生存率または細胞増殖の低下などと同義である）を直接的もしくは間接的に増進する方法、または腫瘍細胞死（溶解、殺傷、除去、生存率または細胞増殖の低下などと同義である）を直接的もしくは間接的に増進する方法で使用するための薬剤の製造において使用される。タンパク質に反応性である腫瘍細胞は、上述したように、タンパク質の第２の抗原結合部位が結合する腫瘍関連抗原を発現する。例えば、例示的な実施形態では、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０は、ＣＤ２０を発現する腫瘍またはがん細胞（休息したか、または活性化されたかのいずれか）を標的とするために使用され；別の例示的な実施形態では、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡは、ＢＭＣＡを発現する腫瘍またはがん細胞（休息したか、または活性化されたかのいずれか）を標的とするために使用される。
【０１０４】
所定の実施形態では、本開示のタンパク質は、がんの治療をそれを必要とする対象において行う方法、またはがんの治療をそれを必要とする対象において行う方法で使用するための薬剤の製造であって、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む本開示のタンパク質またはそのタンパク質を含む製剤（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）を対象に投与することを含むものにおいて使用される。タンパク質に対して反応性のがん細胞は、上述したように、タンパク質の第２の抗原結合部位が結合する腫瘍関連抗原を発現する。例えば、例示的な実施形態では、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０は、ＣＤ２０を発現するがん細胞（休息したか、または活性化されたかのいずれか）を標的とするために使用され；別の例示的な実施形態では、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡは、ＢＭＣＡを発現する腫瘍またはがん細胞（休息したか、または活性化されたかのいずれか）を標的とするために使用される。
【０１０５】
ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は、併用療法を提供する。本明細書に記載の多特異的結合タンパク質は、がんを治療するための追加の治療剤と組み合わせて使用される。
【０１０６】
一態様では、本発明は、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質に、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん細胞成長または生存に関与するがん細胞における特定の分子と干渉するがん標的薬剤（例えば、Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ、またはＧｌｅｅｖｅｃなどのキナーゼ阻害剤を含む）、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＮＫ細胞もしくはＴ細胞（キメラ抗原受容体を発現させるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変された細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む）の注入を含む養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）から選択される第２の治療剤と組み合わせて曝露することを含む、方法を提供する。
【０１０７】
所定の実施形態では、第２の治療剤は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む。ＣＡＲ−Ｔ技術は当該技術分野で知られており、米国特許第１０，１７４，０９５号、米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号に記載されており、Ｇｕｅｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ．（２０１８）１２：１４５−１５６で論評されている。ＣＡＲは、様々な抗原を標的とし得る。例えば、所定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＲＯＲ１、ＷＴ１、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＵＣ１６、またはＬｅＹを特異的に結合させるＣＡＲを発現するか、または発現することが可能である。所定の実施形態では、ＣＡＲによって結合される腫瘍関連抗原は、多特異的結合タンパク質の第２の抗原結合部位によって結合される抗原と同じである。所定の実施形態では、ＣＡＲは、多特異的結合タンパク質の第２の抗原結合部位と同じまたは実質的に同じである抗原結合部位を含む。
【０１０８】
一態様では、本発明は、がんの治療をそれを必要とする対象において行う方法であって、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質、またはそのタンパク質を含む製剤を、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、化学療法剤、がん細胞成長または生存に関与するがん細胞における特定の分子と干渉するがん標的薬剤（例えば、Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ、またはＧｌｅｅｖｅｃなどのキナーゼ阻害剤を含む）、腫瘍溶解性ウイルス、ワクチン、放射線、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＮＫ細胞もしくはＴ細胞（キメラ抗原受容体を発現させるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変された細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む）の注入を含む養子ＮＫ療法、及び幹細胞移植（ＳＣＴ）から選択される第２の治療剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
【０１０９】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、及び抗ＴＩＭ３抗体から選択されるチェックポイント阻害剤と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【０１１０】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＮＦα、ＩＬ−２１、ＰＥＧ−ＩＬ−２（ポリエチレングリコール変性インターロイキン−２）、及びＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒヘテロ二量体などのインターフェロン及びインターロイキンを含むサイトカインと組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【０１１１】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、及びＴＬＲ３アゴニストから選択されるＴＬＲアゴニストと組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【０１１２】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、ＳＴＩＮＧアゴニストであるＡＤＵ−Ｓ１００と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【０１１３】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ニトロソウレア、テモゾロミド（経口ダカルバジン）などのアルキル化剤；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びバルビシンなどのアントラサイクリン；パクリタキセル、ナブ−パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、及びタキソテールなどの細胞骨格破壊剤；エポチロン；ボルリノスタット及びロミデプシンなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤；イリノテカン及びトポテカンなどのトポイソメラーゼＩの阻害剤；エトポシド、テニポシド及びタフルポシドなどのトポイソメラーゼＩＩの阻害剤；ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ及びビスモデギブなどのキナーゼ阻害剤；アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビンなどのヌクレオチドアナログ及び前駆体アナログ；ブレオマイシン及びアクチノマイシンなどのペプチド抗生剤；カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンなどの白金系薬剤；トレチノイン及びアリトレチノインなどのレチノイド；ならびにビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンなどのビンカアルカロイド及び誘導体を含む化学療法剤と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【０１１４】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、リリルマブ、及びモナリズマブから選択されるチェックポイント阻害剤と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【０１１５】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、Ｒ８４８／レシキモド、ＶＴＸ−２３３７、イミキモド、及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドから選択されるＴＬＲアゴニストと組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。
【０１１６】
本開示は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部、またはＣＤ１６と結合する第３の抗原結合部位と、を含むタンパク質を、細胞老化を誘導する薬剤と組み合わせて用いて、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増進する方法及び／またはがんを治療する方法を提供する。その薬剤は、がん細胞を老化に誘導し、それにより免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）による殺傷及び／または消去に対して細胞が感受性になる。細胞老化は、細胞周期停止、ＤＮＡ損傷、及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの阻害などの多数の細胞性事象によって誘導され得る。細胞老化を誘導する薬剤は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｒｕｓｃｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１８）  ３６２，１４１６−２２；及びＨｅｒｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１８）１２８（４）：１２３８−１２４６に記載されている。所定の実施形態では、細胞老化を誘導する薬剤は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に対する阻害剤などの細胞周期停止を誘導する薬剤と、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫ）の阻害剤との組み合わせを含む。所定の実施形態では、細胞老化を誘導する薬剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、アベマシクリブ、またはリボシクリブ）とＭＥＫ１／２阻害剤（例えば、トラメチニブ、コビメチニブ、レファメチニブ、またはセルメチニブ）との組み合わせを含む。
【０１１７】
本発明のタンパク質はまた、原発病変の外科的除去に対する補助として使用され得る。
【０１１８】
多特異的結合タンパク質及び追加の治療剤の量、及び投与の相対的なタイミングは、所望の組み合わされた治療効果を達成するために選択され得る。例えば、併用療法の投与を、そのような投与を必要とする患者に行う場合、併用における治療剤、または治療剤を含む１種または複数種の薬学的組成物は、例えば、順次に、共に、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多特異的結合タンパク質は、追加の治療剤（複数可）がその予防的または治療的効果を発揮する時期に投与され得、またはその逆もあり得る。
【０１１９】
Ｖ．薬学的組成物
本開示はまた、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、治療的有効量の本明細書に記載のタンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）を含有する薬学的組成物を特徴とする。組成物は、様々な薬物送達システムでの使用のために製剤化され得る。適切な製剤化のために１つ以上の生理学的に許容可能な賦形剤または担体も組成物に含まれ得る。本開示で使用するための好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８５に記載されている。薬物送達のための方法の簡易なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０）を参照されたい。
【０１２０】
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、またはシリンジに含有され得る。所定の実施形態では、バッグは、チューブ及び／または針を含むチャンネルに接続され得る。所定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。所定の実施形態では、製剤は、冷凍乾燥（凍結乾燥）され、約１２〜６０個のバイアル中に含有され得る。所定の実施形態では、製剤は、冷凍乾燥され得、４５ｍｇの冷凍乾燥製剤が１つのバイアルに含有され得る。所定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇの冷凍乾燥製剤が１つのバイアルに含有され得る。所定の実施形態では、静脈内薬物製剤中のタンパク質の治療用量を得るために、１２個、２７個、または４５個のバイアルからの冷凍乾燥製剤が組み合わされる。所定の実施形態では、製剤は、液体製剤であり、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保存され得る。所定の実施形態では、製剤は、液体製剤であり、約６００ｍｇ／バイアルとして保存され得る。所定の実施形態では、製剤は、液体製剤であり、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存され得る。
【０１２１】
本開示は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療的有効量のタンパク質を含む液体水性薬学的製剤で存在し得る。
【０１２２】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、そのまま使用するために包装され得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは典型的には、３〜１１、より好ましくは５〜９または６〜８、最も好ましくは７〜８、例えば７〜７．５である。得られる固体形態の組成物は、固定量の前述の１つの薬剤または複数の薬剤をそれぞれ含有する複数の単回用量単位で包装され得る。固体形態の組成物はまた、変動する量のための容器に包装され得る。
【０１２３】
所定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと組み合わせて、本開示のタンパク質を含む、保存期間が延長された製剤を提供する。
【０１２４】
所定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４〜約８、例えば、約４．５〜６．０、または約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有し得るか、または約５．０〜約５．２のｐＨを有し得る。上記のｐＨに対して中間的な範囲もまた、本開示の一部であることが意図されている。例えば、上記の値のいずれかの組み合わせを上限値及び／または下限値として使用した値の範囲が含まれることが意図されている。この範囲内でｐＨを制御する緩衝剤の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が含まれる。
【０１２５】
所定の実施形態では、製剤は、約４〜約８の範囲のｐＨを維持するためにクエン酸塩及びリン酸塩を含有する緩衝系を含む。所定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５〜約６．０、または約４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲であり得る。所定の実施形態では、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。所定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約０．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約１．５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍｌ）、約０．９ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）、及び約６．２ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍｌ）を含む。所定の実施形態では、緩衝系は、１〜１．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び６．０〜６．４ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。所定の実施形態では、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。
【０１２６】
等張化剤として作用し、かつ抗体を安定化させ得るポリオールも製剤に含まれ得る。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。所定の実施形態では、水性製剤は、等張性であり得る。添加されるポリオールの量はまた、ポリオールの分子量に関して変化し得る。例えば、二糖類（トレハロースなど）と比較して、より少ない量の単糖類（例えば、マンニトール）が添加され得る。所定の実施形態では、等張化剤として製剤中で使用され得るポリオールは、マンニトールである。所定の実施形態では、マンニトール濃度は、約５〜約２０ｍｇ／ｍｌであり得る。所定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約７．５〜１５ｍｇ／ｍｌであり得る。所定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１０〜１４ｍｇ／ｍｌであり得る。所定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍｌであり得る。所定の実施形態では、ポリオールソルビトールが製剤に含まれ得る。
【０１２７】
洗浄剤または界面活性剤も製剤に添加され得る。例示的な洗浄剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性洗浄剤が含まれる。添加される洗浄剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減し、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小化し、及び／または吸着を低減するようなものである。所定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。所定の実施形態では、製剤は、洗浄剤のポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを記述するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，４ｔｈ  ｅｄｉ．，１９９６を参照されたい）。所定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含有し得る。所定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。
【０１２８】
実施形態では、本開示のタンパク質生成物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉鎖され、かつアルミニウムクリンプシール閉鎖材で密封されたＵＳＰ／Ｐｈ  ＥｕｒタイプＩ  ５０Ｒバイアル中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰ及びＰｈ  Ｅｕｒに準拠したエラストマーから作製され得る。所定の実施形態では、バイアルは、６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、６１．２ｍＬのタンパク質生成物溶液で満たされ得る。所定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈され得る。
【０１２９】
所定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液として調製され得る。所定の実施形態では、液体製剤は、水性担体中で調製され得る。所定の実施形態では、安定化剤は、静脈内投与に望ましくないまたは好適ではない粘度をもたらし得る量を超えない量で添加され得る。所定の実施形態では、糖は、二糖類、例えば、スクロースであり得る。所定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、及び防腐剤のうちの１つ以上を含み得る。
【０１３０】
所定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容可能な酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。所定の実施形態では、薬学的に許容可能な酸は、塩酸であり得る。所定の実施形態では、塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。
【０１３１】
凝集に加えて、脱アミド化は、発酵、採取／細胞浄化、精製、薬物物質／薬物製品貯蔵中、及びサンプル分析中に起こり得るペプチド及びタンパク質の一般的な生成物の変化である。脱アミド化は、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下では不安定なため困難である。このように、脱アミド化は典型的には、１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミド化は、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミド化の速度に影響を与えるパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所的ポリペプチド構造及び三次構造が含まれる。ペプチド鎖におけるＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を与える。タンパク質配列におけるＡｓｎに続くＧｌｙ及びＳｅｒは、脱アミド化に対してより高い感受性をもたらす。
【０１３２】
所定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質生成物の脱アミノ化を防止するためにｐＨ及び湿度の条件下で保存され得る。
【０１３３】
本明細書において対象となる水性担体は、薬学的に許容可能であり（ヒトへの投与に安全であり、非毒性である）、かつ液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１３４】
細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の製剤に任意に添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。
【０１３５】
静脈内（ＩＶ）製剤は、特定の場合、例えば、患者が病院において移植後にすべての薬物をＩＶ経路で受けている場合に好ましい投与経路であり得る。所定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。所定の実施形態では、注射用に希釈された薬物製品は、等張性であり、静脈内注入による投与に好適である。
【０１３６】
所定の実施形態では、塩または緩衝成分は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝液は、薬学的に許容可能であり、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）に由来する。所定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。所定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝液であり得、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
【０１３７】
細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の製剤に任意に添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。
【０１３８】
本明細書において対象となる水性担体は、薬学的に許容可能であり（ヒトへの投与に安全であり、非毒性である）、かつ液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１３９】
本開示は、タンパク質及び凍結保護剤を含む凍結乾燥製剤中に存在し得る。凍結保護剤は、糖類、例えば、二糖類であり得る。所定の実施形態では、凍結保護剤は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤及び／または防腐剤のうちの１つ以上を含み得る。
【０１４０】
凍結乾燥薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、１：２のタンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比であり得る。所定の実施形態では、タンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比は、１：２〜１：５であり得る。
【０１４１】
所定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容可能な酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。所定の実施形態では、薬学的に許容可能な酸は、塩酸であり得る。所定の実施形態では、薬学的に許容可能な塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。
【０１４２】
凍結乾燥の前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは、６〜８で調整され得る。所定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品のｐＨ範囲は、７〜８であり得る。
【０１４３】
所定の実施形態では、塩または緩衝成分は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝液は、薬学的に許容可能であり、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）に由来する。所定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。所定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝液であり得、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
【０１４４】
所定の実施形態では、「増量剤」が添加され得る。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放細孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール及びソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤は、そのような増量剤を含有し得る。
【０１４５】
細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の製剤に任意に添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。
【０１４６】
所定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は、水性担体中で構成され得る。本明細書において対象となる水性担体は、薬学的に許容可能であり（例えば、ヒトへの投与に安全であり、非毒性である）、かつ凍結乾燥後に、液体製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１４７】
所定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％塩化ナトリウム注射剤、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成中に、凍結乾燥粉末が溶液に溶解する。
【０１４８】
所定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、注射用の約４．５ｍＬの水に構成され、０．９％生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。
【０１４９】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物、及び投与様式について所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変更され得る。
【０１５０】
具体的な用量は、各々の患者にとって均一な用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であり得る。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に対して調整され得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、治療または予防すべき疾患または病態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別及び医学的状態が含まれ得る。治療のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる微調整は、特に本明細書に開示される投薬量情報及びアッセイに照らして、当業者によって慣習的になされ得る。投薬量はまた、適切な用量−反応データと併せて使用される投薬量を決定するための既知のアッセイの使用により決定され得る。個々の患者の投薬量は、疾患の進行をモニターしながら調整され得る。有効濃度に到達するか、またはそれを維持するために投薬量を調整する必要があるかどうかを確認するために患者における標的となり得る構築物または複合体の血中濃度が測定され得る。どの標的となり得る構築物及び／または複合体、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に対して最も有効である可能性が高いかを決定するためにファーマコゲノミクスが使用され得る（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ３０８：４３−５３，２００１；Ｓｔｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ３０８：３３−４１，２００１）。
【０１５１】
一般に、体重を基準とする投薬量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇｔｏ約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１５２】
用量は、１日、１週、１か月もしくは１年に１回以上、またはさらに２〜２０年に１回で与えられ得る。当業者は、測定された滞留時間及び体液または組織中の標的となり得る構造物または複合体の濃度に基づいて、投薬のための反復率を容易に推定し得る。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、硬膜内、髄腔内、腔内であるか、カテーテルを介した灌流によるか、または直接病巣内注射による場合がある。これは、１日に１回以上、１週に１回以上、１か月に１回以上、及び毎年１回以上投与され得る。
【０１５３】
上記の記載は、本発明の複数の態様及び実施形態を記載している。本特許出願は特に、その態様及び実施形態のすべての組み合わせ及び変更を企図している。
【実施例】
【０１５４】
ここで一般的に記載されている本発明は、本発明の所定の態様及び実施形態を例示する目的のためだけに含まれる以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、本発明を限定することは意図されていない。
【０１５５】
実施例１−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製された組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
ヒト、マウスまたはカニクイザルＮＫＧ２Ｄエクトドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させるべき哺乳動物細胞に導入した。精製後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防止するためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質が事前吸着されたウェルにＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを滴定し、添加した。一次抗体の結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼに複合体化され、ヒトカッパ軽鎖を特異的に認識してＦｃ交差反応性を回避する二次抗体を使用して検出した。ワサビペルオキシダーゼの基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽性対照（配列番号４５〜４８から選択される、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６及びＣＸ−５）を各ウェルに添加した。
【０１５６】
アイソタイプ対照は、組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対する最小限の結合を示したのに対し、陽性対照は、組換え抗原に対して最も強く結合した。すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、クローンによって親和性が変わるものの、ヒト、マウス、及びカニクイザルの組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質にわたって結合することを実証した。一般に、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図１４）及びカニクイザル（図１５）組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃには類似する親和性で結合したが、マウス（図１６）組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃにはより低い親和性で結合した。
【０１５７】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株をヒトまたはマウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作した。ＥＬ４細胞上に発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色するためにＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭの濃度で使用した。抗体結合は、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親のＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を計算した。
【０１５８】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ヒト及びマウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合したすべてのクローンによって産生された。陽性対照抗体（配列番号４５〜４８から選択される、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６及びＣＸ−５）は、最良のＦＯＢ結合シグナルを提供した。各クローンについてのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒト（図１７）及びマウス（図１８）ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞間で同様であった。
【０１５９】
実施例２−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンド結合を阻害する
ＵＬＢＰ−６との競合
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的な結合を低減するためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベート後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ被覆ウェルに結合したままのＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼに複合体化したストレプトアビジン及びＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対する結合が阻害されたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンの割合から計算した。陽性対照抗体（配列番号４５〜４８から選択される）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対するＵＬＢＰ−６の結合を阻害したのに対し、アイソタイプ対照は、ＵＬＢＰ−６とほとんど競合しないことを示していた（図１９）。
【０１６０】
ＭＩＣＡとの競合
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、ウェルをウシ血清アルブミンでブロッキングして非特異的結合を減少させた。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベート及び洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して、ＭＩＣＡ−Ｆｃ被覆ウェルに結合したままのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ＭＩＣＡ−Ｆｃ被覆ウェルに対する結合から阻害されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンの割合から計算した。陽性対照抗体（配列番号４５〜４８から選択される）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対するＭＩＣＡの結合を阻害したのに対し、アイソタイプ対照は、ＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図２０）。
【０１６１】
Ｒａｅ−１デルタとの競合
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、ウェルをウシ血清アルブミンでブロッキングして非特異的結合を減少させた。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベート及び洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃ被覆ウェルに結合したままのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃ被覆ウェルに対する結合が阻害されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンの割合から計算した。陽性対照（配列番号４５〜４８から選択される、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６及びＣＸ−５）及び様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンは、マウスＮＫＧ２Ｄに対するＲａｅ−１デルタの結合を阻害したのに対し、アイソタイプ対照抗体は、Ｒａｅ−１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図２１）。
【０１６２】
実施例３−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンは、ＮＫＧ２Ｄを活性化する
ヒト及びマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列をＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と融合させ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次いでＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物をＧｉｂｓｏｎアセンブリを使用してレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生用のｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションした。ＥＬ４細胞にＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを含有するウイルスを８μｇ／ｍＬポリブレンと共に感染させた。感染から２４時間後、ＥＬ４細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面上に高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。
【０１６３】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化するかどうかを決定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ  ＥＬ４細胞を抗体フラグメント被覆ウェル上でブレフェルディン−Ａ及びモネンシンの存在下で４時間培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化用の指標である細胞内ＴＮＦ−アルファ産生をフローサイトメトリーによってアッセイした。ＴＮＦ−アルファ陽性細胞の割合を陽性対照で処置した細胞に対して正規化した。すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ヒト（図２２）及びマウス（図２３）のＮＫＧ２Ｄの両方を活性化した。
【０１６４】
実施例４−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫ細胞を活性化する
初代ヒトＮＫ細胞
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣから磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９５％であった。次いで単離したＮＫ細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地で２４〜４８時間培養してから、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが吸着されたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォア複合体化抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルディン−Ａ、及びモネンシンを含有する培地で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６及びＩＦＮ−ガンマに対するフルオロフォア複合体化抗体を使用してフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＮＫ細胞活性化を評価するためにＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞においてＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−ガンマ染色を分析した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−ガンマ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の係合を介するより良好なＮＫ細胞活性化を示している。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び陽性対照（配列番号４５〜４８から選択される）は、アイソタイプ対照よりもＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ−ガンマ＋になるＮＫ細胞の高い割合を示した（図２４及び図２５は、ＮＫ細胞調製のために異なるドナーのＰＢＭＣをそれぞれ使用した２つの独立した実験を表している）。
【０１６５】
初代マウスＮＫ細胞
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレーナーで解砕して単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃Ａ１０４９２０１から購入；１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ｍＭの重炭酸カリウム、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２と共に７２時間培養してから、採取し、ＮＫ細胞単離のために調製した。次いで磁気ビーズを用いたネガティブデプレッションを使用して脾臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を典型的には＞９０％の純度で単離した。精製したＮＫ細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地で４８時間培養してから、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが吸着されたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォア複合体化抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルディン−Ａ、及びモネンシンを含有する培地で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインで被覆したウェル内での培養後、ＣＤ３、ＮＫ１．１及びＩＦＮ−ガンマに対するフルオロフォア複合体化抗体を使用してフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＮＫ細胞活性化を評価するためにＣＤ３−ＮＫ１．１＋細胞においてＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−ガンマ染色を分析した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−ガンマ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の係合を介するより良好なＮＫ細胞活性化を示している。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及び陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６及びＣＸ−５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高い割合のＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ−ガンマ＋になるＮＫ細胞を示した（図２６及び図２７は、ＮＫ細胞調製のための異なるマウスをそれぞれ使用した２つの独立した実験を表している）。
【０１６６】
実施例５−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
ヒト及びマウスの初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベート後のＮＫ細胞上の細胞傷害性マーカーの増加を実証する。これが腫瘍細胞溶解の増加につながるかどうかを取り組むために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを単特異的抗体に発展させた細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的アームとして使用したのに対し、Ｆａｂ領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）を別の標的アームとして作用させてＮＫ細胞を活性化させた。ヒト由来で高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ−１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ−１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識し、１０５細胞／ｍＬで培地に再懸濁した。次いで標識したＴＨＰ−１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わせ、マイクロタイタープレートのウェル内のマウスＮＫ細胞を３７℃で３時間単離した。インキュベート後、２０μｌの培養上清を除去し、２００μｌのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって経時的に蛍光を測定し、キットの指示に従って特異的な溶解を計算した。
【０１６７】
陽性対照であるＮＫＧ２Ｄに対するＵＬＢＰ−６天然リガンドは、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体はまた、ＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解を増加させたのに対し、アイソタイプ対照抗体は、減少した特異的溶解を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１細胞の特異的溶解を示している（図２８）。
【０１６８】
実施例６−ＮＫＧ２Ｄ抗体は、高い熱安定性を示す
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの溶融温度を示差走査蛍光光度法を使用してアッセイした。外挿された見かけの溶融温度は、典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高い（図２９）。
【０１６９】
実施例７−多特異的結合タンパク質は、ＮＫ細胞を活性化する能力の増進を示す
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣから磁気ビーズを使用したネガティブセレクションを使用してＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９５％であった。次いで単離したＮＫ細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地で２４〜４８時間培養してから、それらを、多特異的及び二重特異的結合タンパク質がそれぞれ吸着されたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォア複合体化抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルディン−Ａ、及びモネンシンを含有する培地で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６及びＩＦＮ−ガンマに対するフルオロフォア複合体化抗体を使用してフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＮＫ細胞活性化を評価するためにＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞においてＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−ガンマ染色を分析した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−ガンマ二重陽性細胞の増加は、良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＡＬ２．２は、ＨＥＲ２結合ドメイン（トラスツズマブ）、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（ＵＬＢＰ−６）及びヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含有する多特異的結合タンパク質である。これは、トラスツズマブホモ二量体及びＵＬＢＰ−６−Ｆｃホモ二量体から出発して制御されたＦａｂ−アーム交換反応（ｃＦＡＥ）を介して作製された（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ９，２４５０−２４６３をｓ参照されたい）。ＳＣ２．２は、トラスツズマブ、及びＵＬＢＰ−６に由来するｓｃＦｖを含む一本鎖タンパク質である（配列番号７３）。
配列番号７３
ＭＡＡＡＡＩＰＡＬＬＬＣＬＰＬＬＦＬＬＦＧＷＳＲＡＲＲＤＤＰＨＳＬＣＹＤＩＴＶＩＰＫＦＲＰＧＰＲＷＣＡＶＱＧＱＶＤＥＫＴＦＬＨＹＤＣＧＮＫＴＶＴＰＶＳＰＬＧＫＫＬＮＶＴＭＡＷＫＡＱＮＰＶＬＲＥＶＶＤＩＬＴＥＱＬＬＤＩＱＬＥＮＹＴＰＫＥＰＬＴＬＱＡＲＭＳＣＥＱＫＡＥＧＨＳＳＧＳＷＱＦＳＩＤＧＱＴＦＬＬＦＤＳＥＫＲＭＷＴＴＶＨＰＧＡＲＫＭＫＥＫＷＥＮＤＫＤＶＡＭＳＦＨＹＩＳＭＧＤＣＩＧＷＬＥＤＦＬＭＧＭＤＳＴＬＥＰＳＡＧＡＰＬＡＭＳＳＧＴＴＱＬＲＡＴＡＴＴＬＩＬＣＣＬＬＩＩＬＰＣＦＩＬＰＧＩ
【０１７０】
ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−ガンマ染色の分析は、アイソタイプ対照ＩｇＧがＮＫ細胞の活性化を示さなかったのに対し、多特異的結合タンパク質で刺激した後、二重特異的タンパク質と比較して、ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ−ガンマ＋になるＮＫ細胞のより高い割合を示しており、このことは１つだけ（ＮＫＧ２Ｄ）よりも２つの活性化受容体（ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６）の係合を介するより強いＮＫ細胞活性化を実証している（図３０）。このＮＫ細胞活性化の増加は、より強力な腫瘍細胞殺傷につながると予期される。
【０１７１】
実施例８−多特異的結合タンパク質は、標的腫瘍細胞に対して増進した細胞傷害性を示す
初代ヒトＮＫ細胞細胞傷害性アッセイ
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣから磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９５％であった。次いでＮＫ細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地で一晩培養してから、細胞傷害性アッセイに使用した。翌日、ＮＫ細胞を新鮮な培地に５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。ヒト乳癌細胞ＳｋＢｒ−３細胞をＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットに従ってＢＡＴＤＡ試薬で標識し、培地に５×１０４細胞／ｍＬで再懸濁した。多特異的結合タンパク質の様々な希釈を培地に行った。次いでＮＫ細胞、標識したＳｋＢｒ−３細胞及び多特異的結合タンパク質をマイクロタイタープレートのウェル内で組み合わせ、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、２０μｌの培養上清を除去し、２００μｌのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって経時的に蛍光を測定し、キットの指示に従って特異的な溶解を計算した。ＡＬ０．２は、ＨＥＲ２結合ドメイン（トラスツズマブ）、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（配列番号１〜４４から選択される）及びヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含有する多特異的結合タンパク質である。これは、トラスツズマブホモ二量体及び抗ＮＫＧ２Ｄホモ二量体から出発して制御されたＦａｂ−アーム交換反応（ｃＦＡＥ）により作製した。ＡＬ０．２ｓｉは、ＡＬ０．２をベースとしており、ＣＤ１６結合を無効化するＦｃドメインにおける追加のＤ２６５Ａ変異を含有する。トラスツズマブ−ｓｉは、トラスツズマブをベースとしており、ＣＤ１６結合を無効化するＦｃドメインにおける追加のＤ２６５Ａ変異を含有する。ＡＬ２．２は、ＨＥＲ２結合ドメイン（トラスツズマブ）、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（ＵＬＢＰ−６）及びヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含有する多特異的結合タンパク質である。ＳＣ２．２は、トラスツズマブ、及びＵＬＢＰ−６に由来するｓｃＦｖを含む一本鎖タンパク質である。
【０１７２】
ＡＬ０．２は、用量依存的様式で、トラスツズマブよりもヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３標的細胞の増進した溶解を示し、ＥＣ５０のｐ値は０．０３１１であった（図３１）。ＡＬ０．２ｓｉ（図３２）及びトラスツズマブ−ｓｉ（図３３）は、ＡＬ０．２と比較してＳｋＢｒ−３細胞の効力及び最大特異的溶解の両方の低減を示し、ＥＣ５０のｐ値はそれぞれ０．０００２、及び０．０００１であった（図３２〜３３）。また、ＡＬ０．２は、ＡＬ２．２よりも用量依存的様式でＳｋＢｒ−３細胞の増進した溶解を示した（図３４）。アイソタイプ対照ＩｇＧは、試験された濃度のいずれでも特異的溶解の増加を示さなかった。データにより、ＮＫ細胞上の２つの活性化受容体及び１つの腫瘍抗原に係合する多特異的結合タンパク質は、ＮＫ細胞上の１つの活性化受容体及び１つの腫瘍抗原に係合する二重特異的タンパク質と比較して、ヒトＮＫ細胞による腫瘍細胞のより強力な殺傷を誘導することを実証した。
【０１７３】
初代マウスＮＫ細胞細胞傷害性アッセイ
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレーナーで解砕して単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃Ａ１０４９２０１から購入；１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ｍＭの重炭酸カリウム、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−２と共に７２時間培養してから、採取し、ＮＫ細胞単離のために調製した。次いで磁気ビーズを用いたネガティブデプレッションを使用して脾臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を典型的には＞９０％の純度で単離した。精製したＮＫ細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地で４８時間培養してから、細胞傷害性アッセイのために１０６細胞／ｍＬで培地に再懸濁した。ＨＥＲ２及びｄＴｏｍａｔｏを発現するように遺伝子操作されたマウス腫瘍細胞株であるＲＭＡ−ＨＥＲ２−ｄＴｏｍａｔｏ、及びその対照カウンターパートであるｚｓＧｒｅｅｎを発現するＲＭＡ細胞を標的として使用した。細胞を２×１０５細胞／ｍＬで培地に再懸濁し、マイクロプレートのウェルに１：１の比で播種した。多特異的タンパク質の希釈物を培地中に作製し、ＮＫ細胞と共にＲＭＡ細胞に添加した。３７℃で５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、ＲＭＡ−ＨＥＲ２−ｄＴｏｍａｔｏ及びＲＭＡ−ｚｓＧｒｅｅｎ細胞の割合を、蛍光レポーターを使用するフローサイトメトリーによって決定して２つの細胞タイプを同定した。特異的標的細胞死＝（１−（（（処置群の％ＲＭＡ−Ｃａ２Ｔ−ｄＴｏｍａｔｏ細胞＊対照群の％ＲＭＡ−ｚｓＧｒｅｅｎ細胞）／（対照群の％ＲＭＡ−Ｃａ２Ｔ−ｄＴｏｍａｔｏ細胞＊処置群の％ＲＭＡ−ｚｓＧｒｅｅｎ細胞）））＊１００％。
【０１７４】
ＡＬ２．２は、ＳＣ２．２（図３６）及びトラスツズマブ（図３５）よりも腫瘍標的に対するＮＫ細胞反応の再誘導においてより強力である。対照タンパク質は、特異的標的死に対する影響がほとんどないことを示していた。これらのデータは、ＮＫ細胞上の２つの活性化受容体及び１つの腫瘍抗原に係合する多特異的結合タンパク質が、ＮＫ細胞上の１つの活性化受容体及び１つの腫瘍抗原に係合する二重特異的タンパク質と比較して、マウスＮＫ細胞による腫瘍細胞のより強力な殺傷を誘導することを実証している。
【０１７５】
実施例９−多特異的結合タンパク質はＮＫＧ２Ｄに結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株をヒトＮＫＧ２Ｄを発現するように遺伝子操作した。図１に示されるようにＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、腫瘍関連抗原結合ドメイン（ＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、またはＢＣＭＡ結合ドメインなど）、及びＣＤ１６に結合するＦｃドメインを含有する三重特異的結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）を、ＥＬ４細胞に発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの親和性について試験した。ＮＫＧ２Ｄに対する多特異的結合タンパク質の結合は、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親のＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を計算した。
【０１７６】
試験したＴｒｉＮＫＥＴには、ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６（ＡＤＩ−２８２２６及びＣＤ３３結合ドメイン）、ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４（ＡＤＩ−２９４０４及びＣＤ３３結合ドメイン）、ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６（ＡＤＩ−２８２２６及びＨＥＲ２結合ドメイン）、ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４（ＡＤＩ−２９４０４及びＨＥＲ２結合ドメイン）、ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６（ＡＤＩ−２８２２６及びＣＤ２０結合ドメイン）、ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４（ＡＤＩ−２９４０４及びＣＤ２０結合ドメイン）、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６（ＡＤＩ−２８２２６及びＢＣＭＡ結合ドメイン）、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４（ＡＤＩ−２９４０４及びＢＣＭＡ結合ドメイン）、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ４３（ＡＤＩ−２９４４３及びＢＣＭＡ結合ドメイン）、ならびにＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ４７（ＡＤＩ−２９４４７及びＢＣＭＡ結合ドメイン）が含まれる。試験された分子で使用されたＨＥＲ２結合ドメインは、トラスツズマブの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成されていた。ＣＤ３３結合ドメインは、以下に列挙される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成されていた。
配列番号７４：
【化１】
2021512914.tif 000019
配列番号７５：
【化２】
2021512914.tif 000020
試験された分子で使用されたＣＤ２０結合ドメインは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成されていた。試験された分子で使用されたＢＣＭＡ結合ドメインは、以下に列挙される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成されていた。
ＥＭ−８０１重鎖可変ドメイン（配列番号８２）：
【化３】
2021512914.tif 000021
ＥＭ−８０１軽鎖可変ドメイン（配列番号８３）：
【化４】
2021512914.tif 000022
ＥＭ−９０１重鎖可変ドメイン（配列番号７６）
【化５】
2021512914.tif 000023
ＥＭ−９０１軽鎖可変ドメイン（配列番号７７）
【化６】
2021512914.tif 000024
【０１７７】
データは、タンパク質がＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、及びＢＣＭＡなどの腫瘍抗原結合ドメインを含む場合、本開示のＴｒｉＮＫＥＴがＮＫＧ２Ｄに結合することを示している。
【０１７８】
実施例１０−多特異的結合タンパク質はヒト腫瘍抗原に結合する
三重特異的結合タンパク質はＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＣＤ２０及びＢＣＭＡに結合する
腫瘍関連抗原に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイするためにＣＤ３３を発現するヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４−１１を使用した。ＴｒｉＮＫＥＴ及び親の抗ＣＤ３３モノクローナル抗体を細胞と共にインキュベートし、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、二次抗体対照に対して正規化されたＴｒｉＮＫＥＴ及び親のモノクローナル抗ＣＤ３３抗体に由来する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を計算した。ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６及びＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４は、親の抗ＣＤ３３抗体と比較して、同等のレベルのＣＤ３３に対する結合を示す（図４１）。
【０１７９】
腫瘍関連抗原に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイするためにＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞株を使用した。腎細胞癌細胞株７８６−Ｏは、低レベルのＨＥＲ２を発現している。ＴｒｉＮＫＥＴ及び任意に親の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（トラスツズマブ）を細胞と共にインキュベートし、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、二次抗体対照に対して正規化されたＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を計算した。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６、及びＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４は、トラスツズマブと比較して、同等のレベルの７８６−Ｏ細胞に発現したＨＥＲ２に対する結合を示す（図４２）。
【０１８０】
腫瘍関連抗原ＢＣＭＡに対するＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイするためにＢＣＭＡを発現するＭＭ．１Ｓヒト骨髄腫細胞を使用した。ＴｒｉＮＫＥＴ及び任意に親の抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体（ＥＭ−８０１）を細胞と共にインキュベートし、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、二次抗体対照に対して正規化されたＴｒｉＮＫＥＴ及びＥＭ−８０１からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を計算した。Ｃ２６−−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ、及びＦ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、ＥＭ−８０１と比較して、同等のレベルのＭＭ．１Ｓ細胞に発現したＢＣＭＡに対する結合を示す（図４３）。
【０１８１】
腫瘍関連抗原ＣＤ２０に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイするためにＣＤ２０を発現するＲａｊｉヒトリンパ腫細胞を使用した。ＴｒｉＮＫＥＴを細胞と共にインキュベートし、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ヒストグラムをプロットした。図４４に示されるように、ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６及びＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４は、ＣＤ２０に対して等しく十分に結合する。
【０１８２】
実施例１１−多特異的結合タンパク質はＮＫ細胞を活性化する
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣから磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９０％であった。単離したＮＫ細胞を、活性化のために１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地で培養したか、またはサイトカインを用いずに一晩休息させた。ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞を、活性化後２４〜４８時間以内に使用した。
【０１８３】
腫瘍抗原を発現するヒトがん細胞を採取し、２×１０６細胞／ｍＬで培地に再懸濁した。腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培地で希釈した。活性化したＮＫ細胞を採取し、洗浄し、２×１０６細胞／ｍＬで培地に再懸濁した。次いでがん細胞をモノクローナル抗体／ＴｒｉＮＫＥＴと混合し、ＩＬ−２の存在下でＮＫ細胞を活性化した。ブレフェルディン−Ａ及びモネンシンも混合培養物に添加して、細胞内サイトカイン染色のために細胞の外へのタンパク質輸送を阻害した。フルオロフォア複合体化抗ＣＤ１０７ａを混合培養物に添加し、培養物を４時間インキュベートしてから、ＣＤ３、ＣＤ５６及びＩＦＮ−ガンマに対するフルオロフォア複合体化抗体を使用してＦＡＣＳ分析のためにサンプルを調製した。ＮＫ細胞活性化を評価するためにＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞においてＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−ガンマ染色を分析した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−ガンマ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の係合を介するより良好なＮＫ細胞活性化を示している。
【０１８４】
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮ−ガンマ産生の増加によって示されているように、ＨＥＲ２を発現するＳｋＢｒ−３細胞（図４７Ａ）、Ｃｏｌｏ２０１細胞（図４７Ｂ）、及びＨＣＣ１９５４細胞（図４７Ｃ）と共培養したヒトＮＫ細胞の活性化をそれぞれ媒介した。ＳｋＢｒ−３細胞及びＨＣＣ１９５４細胞は、高レベルの表面ＨＥＲ２発現を有し、Ｃｏｌｏ２０１は、中程度のＨＥＲ２発現を有する。モノクローナル抗体のトラスツズマブと比較して、ＴｒｉＮＫＥＴは、ヒトがん細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す。陰性対照としてＮＫ細胞単独、ＮＫ細胞にＳｋＢｒ−３細胞を加えたものを使用した。
【０１８５】
ＴｒｉＮＫＥＴ（Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２及びＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２）は、ＣＤ３３を発現するヒトＡＭＬ  Ｍｖ４−１１細胞と共培養したヒトＮＫ細胞の活性化を媒介し、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮ−ガンマ産生の増加を示した。モノクローナル抗ＣＤ３３抗体と比較して、ＴｒｉＮＫＥＴ（Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２及びＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２）は、ＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した（図４７Ａ〜４７Ｃ）。
【０１８６】
初代ヒトＮＫ細胞は、標的を発現するヒトがん細胞株との共培養においてＴｒｉＮＫＥＴによって活性化される
初代ヒトＮＫ細胞をＣＤ２０陽性ヒトがん細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化がもたらされた（図６２）。ＣＤ２０を標的とするＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０及びＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０）は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示されるように、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞と共培養されたヒトＮＫ細胞の活性化を媒介した（図６２）。モノクローナル抗体リツキシマブと比較して、両ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０及びＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０）は、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した（図６２）。
リツキシマブ＿ｖＨ
【化７】
2021512914.tif 000025
リツキシマブ＿ｖＬ
【化８】
2021512914.tif 000026
【０１８７】
初代ヒトＮＫ細胞をＢＣＭＡ陽性ＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴが媒介する活性化がもたらされた。ＢＣＭＡを標的とするＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ及びＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ）は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示されるように、ＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞と共培養されたヒトＮＫ細胞の活性化を媒介した（図６３）。アイソタイプＴｒｉＮＫＥＴと比較して、ＢＣＭＡを標的とするＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、及びＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ）は、増加したＮＫ細胞活性を示した（図６３）。
【０１８８】
実施例１２−三重特異的結合タンパク質は標的がん細胞の細胞傷害性を可能にする
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣから磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９０％であった。単離したＮＫ細胞を、活性化のために１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地で培養したか、またはサイトカインを用いずに一晩休息させた。ＩＬ−２で活性化したまたは休息したＮＫ細胞を、翌日に細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０１８９】
ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でがん細胞を溶解するヒトＮＫ細胞の能力を試験するために、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）からのｃｙｔｏ  Ｔｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイを製造者の指示に従って使用した。簡潔には、腫瘍抗原を発現するヒトがん細胞を採取し、洗浄し、１〜２×１０５／ｍＬで培地に再懸濁した。休息した及び／または活性化したＮＫ細胞を採取し、洗浄し、がん細胞と同じ培地に１０５〜２．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、がん細胞に発現した腫瘍抗原を標的とするＴｒｉＮＫＥＴを用いてまたは用いずに、５０μｌのがん細胞懸濁液を５０μｌのＮＫ細胞と混合した。３７℃で５％ＣＯ２で３時間１５分インキュベートした後、がん細胞のみを含有するウェル、及び最大溶解及び陰性試薬対照のための培地のみを含有するウェルに１０倍溶解緩衝液をそれぞれ添加した。次いでプレートをさらに４５分間インキュベーターに戻して、合計４時間のインキュベートを達成した。次いで細胞をペレット化し、培養上清を新しい９６ウェルプレートに移し、展開用基質と混合した。新しいプレートを室温で３０分間インキュベートし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘで４９２ｎｍで吸光度を読み取った。がん細胞の特異的溶解の割合は次のように計算した：％特異的溶解＝（（実験溶解−ＮＫ細胞のみからの自然溶解−がん細胞のみからの自然溶解）／（最大溶解−陰性試薬対照））×１００％。
【０１９０】
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ３３陽性Ｍｏｌｍ−１３ヒトＡＭＬ細胞株に対するヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介する。図５３Ｂに示されるように、休息したヒトＮＫ細胞をＭｏｌｍ−１３がん細胞と混合し、ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ３３及びＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ３３）は、がん細胞に対して休息したヒトＮＫ細胞の細胞傷害性活性を用量反応的様式で増進することができる。点線は、ＴｒｉＮＫＥＴを有しない休息したＮＫ細胞の細胞傷害性活性を示している。活性化したヒトＮＫ細胞をＭｏｌｍ−１３がん細胞と混合し、ＴｒｉＮＫＥＴは、抗ＣＤ３３抗体と比較して、がん細胞に対して用量反応的様式で、活性性化したヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性をさらに一層増進する（図５３Ｂ）。
【０１９１】
ＴｒｉＮＫＥＴは、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるトラスツズマブの細胞傷害性活性と比較して、表面発現が低い標的に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増進する。休息したヒトＮＫ細胞を高ＨＥＲ２発現ＳｋＢｒ腫瘍細胞及び低ＨＥＲ２発現７８６−Ｏがん細胞と混合し、高及び低ＨＥＲ２発現がん細胞に対する休息したヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を用量依存的様式で増進するＴｒｉＮＫＥＴの能力をアッセイした。図５０Ａ及び図５０Ｂにおける点線は、ＴｒｉＮＫＥＴの非存在下でのがん細胞に対する休息したＮＫ細胞の細胞傷害性活性を示している。図５０Ｂに示されるように、活性化したヒトＮＫ細胞を低ＨＥＲ２発現７８６−Ｏ細胞、及びＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、ＣＤ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２及びＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２）と混合すると、がん細胞に対する活性化したヒトＮＫ細胞の用量反応的細胞傷害活性が観察された。
【０１９２】
ＢＣＭＡ陽性骨髄腫細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解をアッセイした。図６４は、休息したヒトＮＫエフェクター細胞によるＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解を示している。同じＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（Ａ４９）であるが、異なるＢＣＭＡ標的化ドメインを使用する２つのＴｒｉＮＫＥＴ（ｃＦＡＥ−Ａ４９．８０１及びｃＦＡＥ−Ａ４９．９０１）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効性について試験した。いずれのＴｒｉＮＫＥＴも、ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞のＮＫ細胞溶解を同様の程度まで増進したが、ＥＭ−９０１標的化ドメインを使用するＴｒｉＮＫＥＴは、増大した効力を提供した。
【０１９３】
図６５は、異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（Ａ４０、Ａ４４、Ａ４４、Ａ４９、Ｃ２６、及びＦ４７）であるが、同じＢＣＭＡ標的化ドメインを使用するいくつかのＴｒｉＮＫＥＴの細胞傷害性活性を示している。ＢＣＭＡを標的としたＴｒｉＮＫＥＴのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの変更は、ＴｒｉＮＫＥＴの最大殺傷及び効力において変動を生じさせた。すべてのＴｒｉＮＫＥＴは、ＥＭ−９０１モノクローナル抗体と比較して、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の殺傷の増加を実証した（図６５）。
【０１９４】
実施例１３
ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化を調査した。
【０１９５】
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
密度勾配遠心分離を使用して末梢ヒト血液バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。負磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ＃１７９５５）を使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定して＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。次いで細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃２００−０２）を含有する培地で４８時間増殖させてから、活性化アッセイで使用した。抗体を９６ウェル平底プレートに１００μｌの滅菌ＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０２０１３）及び５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ＃ＭＡＢ１３９）の濃度で４℃で一晩被覆し、続いてウェルを全面的に洗浄して余剰の抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ２及び１μｇ／ｍＬのＡＰＣ複合体化抗ＣＤ１０７ａ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３２８６１９）が補填された培地に５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。次いで１×１０５細胞／ウェルを抗体被覆プレートに添加した。タンパク質輸送阻害剤ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃４２０６０１）及びモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃４２０７０１）をそれぞれ１：１０００及び１：２７０の最終希釈で添加した。プレート化した細胞を５％ＣＯ２中で３７℃で４時間インキュベートした。ＩＦＮ−γの細胞内染色については、ＮＫ細胞を抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００４５２）及び抗ＣＤ５６ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３１８３２８）で標識し、その後、固定及び透過化し、抗ＩＦＮ−γｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃５０６５０７）で標識した。ＮＫ細胞を、生存ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞に対してゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γの発現について分析した。
【０１９６】
受容体の組み合わせの相対的な効力を調べるために、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋及びプレート結合刺激による両受容体の共架橋を実施した。図４５（図４５Ａ〜４５Ｃ）に示されるように、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄの組み合わされた刺激は、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒）（図４５Ａ）及び／またはＩＦＮ−γ産生（図４５Ｂ）の高度に上昇したレベルをもたらした。点線は、各受容体の個々の刺激の相加的効果を表している。
【０１９７】
ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞のＣＤ１０７ａレベル及び細胞内ＩＦＮ−γ産生を、抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたはその両方のモノクローナル抗体の組み合わせを用いた４時間のプレート結合刺激の後に分析した。グラフは、平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。図４５Ａは、ＣＤ１０７ａのレベルを実証しており；図４５Ｂは、ＩＦＮγのレベルを実証しており；図４５Ｃは、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γのレベルを実証している。図４５Ａ〜４５Ｃは、５つの異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験の図である。
【０１９８】
ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ脱顆粒及び細胞内ＩＦＮ−γ産生を、トラスツズマブ、抗ＮＫＧ２Ｄ、またはトラスツズマブ及び抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ドメインに由来するＴｒｉＮＫＥＴを用いた４時間のプレート結合刺激の後に分析した（図４６）。すべての場合において、試験した抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであった。グラフは、平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。
【０１９９】
実施例１４
細胞に発現したヒトＮＫＧ２Ｄに対するＴｒｉＮＫＥＴの結合の評価
ヒトＮＫＧ２Ｄが形質導入されたＥＬ４細胞を、細胞に発現したヒトＮＫＧ２Ｄに対する結合を試験するために使用した。ＴｒｉＮＫＥＴを２０μｇ／ｍＬに希釈し、次いで順次希釈した。ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴ希釈物を使用して細胞を染色し、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用してＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂの結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、結合ＭＦＩを二次抗体対照に対して正規化し、バックグラウンド値に対する倍数を得た。
【０２００】
細胞に発現したヒトがん抗原に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合の評価
ＣＤ３３またはＨＥＲ２のいずれかを発現するヒトがん細胞株を使用して、異なるＮＫＧ２Ｄ標的化クローンに由来するＴｒｉＮＫＥＴの腫瘍抗原結合を評価した。ヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４−１１を使用して、細胞に発現したＣＤ３３に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合を評価した。ヒト腎細胞癌細胞株７８６−Ｏは、低レベルのＨＥＲ２を発現しており、これを使用して、細胞に発現したＨＥＲ２に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合を評価した。ＴｒｉＮＫＥＴを２０μｇ／ｍＬに希釈し、それぞれの細胞と共にインキュベートした。ＴｒｉＮＫＥＴの結合は、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、細胞に発現したＣＤ３３及びＨＥＲ２に対する結合ＭＦＩを二次抗体対照に対して正規化し、バックグラウンド値に対する倍数を得た。
【０２０１】
ヒトＨＥＲ２陽性がん細胞株の抗体結合能の決定
ＨＥＲ２陽性ヒトがん細胞株の抗体結合能（ＡＢＣ）を測定した。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂ製のＱｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒキットを使用し（＃８１５）、抗体標識ビーズの調製のために製造者の指示に従った。簡潔には、４つのビーズ集団の各々を抗ＨＥＲ２抗体の飽和量で染色し、細胞集団も同じ抗体の飽和量で染色した。細胞集団と同様に、各ビーズ集団についてサンプルデータを取得した。標準曲線の生成及び細胞株の各々についてのＡＢＣ値の外挿のためにキットに備えられたＱｕｉｃｋＣａｌワークシートを使用した。
【０２０２】
ＴｒｉＮＫＥＴによる初代ＮＫ細胞の活性化
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートからＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞の単離のために調製した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用して単離した；単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離したＮＫ細胞を、活性化のために１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地で培養したか、またはサイトカインを用いずに一晩休息させた。ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞は、２４〜４８時間後に使用した；休息したＮＫ細胞は常に、精製の翌日に使用した。
【０２０３】
対象となるがん標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞を２×１０６細胞／ｍＬに調整した。対象となるがん標的を標的とするモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培地で希釈した。休息した及び／または活性化したＮＫ細胞を培養物から採取し、細胞を洗浄し、２×１０６細胞／ｍＬで培地に再懸濁した。ＩＬ−２、及びフルオロフォア複合体化抗ＣＤ１０７ａを活性化培養のためにＮＫ細胞に添加した。ブレフェルディン−Ａ及びモネンシンを培地に希釈して、細胞内サイトカイン染色のために細胞の外へのタンパク質輸送を阻害した。９６ウェルプレートに、５０μｌの腫瘍標的、ｍＡｂ／ＴｒｉＮＫＥＴ、ＢＦＡ／モネンシン、及びＮＫ細胞を２００μｌの総培養体積になるように添加した。プレートを４時間培養してから、ＦＡＣＳ分析のためにサンプルを調製した。
【０２０４】
４時間の活性化培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６及びＩＦＮγに対するフルオロフォア複合体化抗体を使用してフローサイトメトリーによる分析のために細胞を調製した。ＮＫ細胞活性化を評価するためにＣＤ３−ＣＤ５６＋集団においてＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγ染色を分析した。
【０２０５】
初代ヒトＮＫ細胞細胞傷害性アッセイ
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートからＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞の単離のために調製した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用して単離した；単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離したＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地で培養したか、またはサイトカインを用いずに一晩休息させた。ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞または休息したＮＫ細胞を、翌日に細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０２０６】
Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６ＬＨＤ放出アッセイ：
腫瘍細胞を溶解させるヒトＮＫ細胞の能力を、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）からのｃｙｔｏ  Ｔｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイを使用して、ＴｒｉＮＫＥＴの添加の有無にかかわらず測定した。対象となるがん標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞をＰＢＳで洗浄し、標的細胞として使用するために１〜２×１０５細胞／ｍＬで成長培地に再懸濁した。５０μｌの標的細胞懸濁液を各ウェルに添加した。対象となるがん抗原を標的とするモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培地に希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休息した及び／または活性化したＮＫ細胞を培養物から採取し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比に応じて培地に１０５〜２．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加して、合計１５０μｌの培養体積とした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２で３時間１５分間インキュベートした。インキュベート後、標的細胞のみのウェル、ならびに最大溶解及び体積対照のための培地のみを含有するウェルに１０倍溶解緩衝液を添加した。次いでプレートをさらに４５分間インキュベーターに戻して、展開前に合計４時間のインキュベートとした。
【０２０７】
インキュベート後、プレートをインキュベーターから取り出し、２００ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。５０μｌの培養上清をきれいなマイクロプレートに移し、５０μｌの基質溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、室温で３０分間インキュベートした。５０μｌの停止溶液を各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘで４９２ｎｍで吸光度を測定した。％特異的溶解は次のように計算した：％特異的溶解＝（（実験放出−エフェクターからの自然放出−標的からの自然放出）／（最大放出／自然放出））＊１００％。
【０２０８】
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
対象となる標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識するために１０６細胞／ｍＬで成長培地に再懸濁した。標的細胞の標識のために製造者の指示に従った。標識後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．５〜１．０×１０５細胞／ｍＬで培地に再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識された細胞のアリコートを脇に置き、細胞を培地から回転除去した。１００μｌの培地を、ペレット化された細胞が乱されるのを避けるように慎重にウェルに三重に添加した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加によって標的細胞の最大溶解のためにウェルを調製した。対象となる腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培地に希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休息した及び／または活性化したＮＫ細胞を培養物から採取し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比に応じて１０５〜２．０×１０６細胞／ｍＬで培地に再懸濁した−５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加し、合計２００μｌの培養体積とした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２で２〜３時間インキュベートしてからアッセイを展開した。
【０２０９】
２〜３時間培養した後、インキュベーターからプレートを取り出し、２００ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。２０μｌの培養上清を製造者から提供されたきれいなマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカー上で２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。プレートをＶｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ装置のいずれかを使用して読み取った。％特異的溶解は次のように計算した：％特異的溶解＝（（（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）））＊１００％。
【０２１０】
長期ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性アッセイ：
ＳｋＢｒ−３標的細胞をＢａｃＭａｍ  ３．０  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ（＃４６２２）で標識して、標的細胞の追跡を可能にした。ＳｋＢｒ−３標的細胞の標識のために製造者のプロトコルに従った。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ｒｅｄ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃４６４１）を希釈し、製造者の指示に従って調製した。モノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培地に希釈した。５０μｌのｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴ、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、及び休息したＮＫ細胞を、標識したＳｋＢｒ−３細胞を既に含有する９６ウェルプレートのウェルに添加した；合計２００μｌの培養体積のために５０μｌの完全培地を添加した。
【０２１１】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３で画像収集を設定した。位相、緑、及び赤チャンネルについての画像を１ウェル当たり２つの画像で１時間ごとに収集した。画像分析は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ソフトウェアを使用して行った。腫瘍細胞、及びアネキシンＶ陽性細胞の数をそれぞれカウントするために緑及び赤チャンネルについてのマスクを作成した。％アネキシンＶ陽性Ｍｖ４−１１標的細胞を計算するために以下の式を使用した。アネキシンＶ陽性ＳｋＢｒ−３細胞＝（（重複物体数）／（緑物体数））＊１００％。
【０２１２】
ＨＥＲ＋がん細胞を標的とするＴｒｉＮＫＥＴとＳＣ２．２の比較
ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴは、ＳｋＢｒ−３細胞数の減少においてトラスツズマブよりも有効であり、６０時間後にはゼロ時からの細胞の６０％しか残っていなかった。ＨＥＲ２発現腫瘍／がん細胞を標的とする本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＳＣ２．２（ＮＫＧ２ＤのリガンドであるＵＬＢＰ−６に連結されたトラスツズマブ由来のｓｃＦｖから構築された一本鎖二重特異的分子）よりも有効である。ＳＣ２．２は、ＨＥＲ２＋がん細胞及びＮＫＧ２Ｄ＋ＮＫ細胞を同時に結合させる。そのため、ＨＥＲ２＋がん細胞数の減少におけるＳＣ２．２の有効性を調査した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化及び細胞傷害性アッセイは、ＳＣ２．２が、ＮＫ細胞の活性化及び殺傷に有効であることを実証した。しかしながら、ＳＣ２．２は、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２皮下腫瘍モデルにおいて有効性を実証することができなかった。ＳＣ２．２の有効性はまた、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２を過剰発現させた同系マウスモデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。このマウスモデルでは、ＳＣ２．２は、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長の制御を実証することができなかった。よって、ＳＣ２．２は、ＮＫ細胞を活性化及び殺傷することができ、ＨＥＲ２＋がん細胞に結合するものの、これらの特性は、ＨＥＲ２＋腫瘍の成長を有効に制御するには不十分であった。
【０２１３】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＳＣ２．２血清半減期の評価
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＳＣ２．２の血清半減期を決定するために、ＳＣ２．２を蛍光タグで標識して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその濃度を追跡した。ＳＣ２．２をＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（Ｌｉｃｏｒ＃９２９−７００２０）で標識した。標識したタンパク質を３匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射し、指示された時点で各マウスから血液を採取した。収集後、血液を１０００ｇで１５分間遠心分離し、各サンプルから血清を収集し、すべての時点が収集されるまで４℃で保存した。
【０２１４】
Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ赤外線画像化システムを使用して血清を画像化し、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して８００チャンネルからの蛍光信号を定量化した。画像強度を最初の時点に対して正規化し、データを二相減衰式に適合させた。この実験システムでは、ＳＣ２．２のベータ半減期は、約７時間と計算された。
【０２１５】
ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２皮下腫瘍に対するＳＣ２．２のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
皮下ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２腫瘍に対するＳＣ２．２の有効性を試験するために図５６に従ってｉｎ  ｖｉｖｏ試験を設計した。ヒトＨＥＲ２が形質導入された１０６個のＲＭＡ／Ｓ細胞を２０匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍播種後２日目から開始して、ＳＣ２．２をＩＰ注射で毎日投薬した。ＳＣ２．２は、ビヒクル対照と共に高濃度及び低濃度で投薬した。腫瘍播種後４日目から開始して、試験の継続期間の月曜日、水曜日、及び金曜日に腫瘍を測定した。腫瘍体積は次の式を使用して計算した：腫瘍体積＝長さ×幅×高さ
【０２１６】
ＴｒｉＮＫＥＴはヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合するＴｒｉＮＫＥＴの能力を決定した。図３７及び図３８は、異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含有する２つのＴｒｉＮＫＥＴの用量反応的結合を示している。図３７は、ＣＤ３３結合ドメインが第２の標的化アームとして使用された場合の２つのＴｒｉＮＫＥＴの結合を示している。図３８は、同じ２つのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ここではＨＥＲ２第２標的化アームと対を形成したことを示している。６つのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、両方の腫瘍標的化ドメインと同じ結合プロファイルを保持している。
【０２１７】
ＴｒｉＮＫＥＴはヒトがん抗原を発現する細胞に結合する
ヒトがん抗原を発現する細胞に結合するＴｒｉＮＫＥＴの能力を決定した。図４１及び図４２は、細胞に発現したＣＤ３３（図４１）及びＨＥＲ２（図４２）に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合を示している。細胞に発現した抗原に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン間で一貫していた。ＴｒｉＮＫＥＴは、親のモノクローナル抗体と同等のレベルまで結合した。
【０２１８】
ヒトＨＥＲ２陽性がん細胞株の抗体結合能
表８は、ＨＥＲ２表面の定量化の結果を示している。ＳｋＢｒ−３及びＨＣＣ１９５４細胞は、高レベル（＋＋＋）の表面ＨＥＲ２を有することが同定された。ＺＲ−７５−１及びＣｏｌｏ２０１は、中レベル（＋＋）の表面ＨＥＲ２を示し、７８６−Ｏは、最も低いレベルのＨＥＲ２（＋）を示した。
【０２１９】
【表８】
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【０２２０】
初代ヒトＮＫ細胞は、様々なレベルのＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞株との共培養においてＴｒｉＮＫＥＴによって活性化される
図４７Ａ〜４７Ｃは、ＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブが、ＨＥＲ２陽性ヒト腫瘍細胞との共培養において初代ヒトＮＫ細胞を活性化することができたことを示しており、これはＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮｇサイトカイン産生の増加によって示唆されている。モノクローナル抗体のトラスツズマブと比較して、両ＴｒｉＮＫＥＴは、様々なヒトＨＥＲ２がん細胞でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した。
【０２２１】
図４７Ａは、ヒトＮＫ細胞が、ＳｋＢｒ−３細胞と共に培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示している。図４７Ｂは、ヒトＮＫ細胞が、Ｃｏｌｏ２０１細胞と共に培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示している。図４７Ｃは、ヒトＮＫ細胞が、ＨＣＣ１９５４細胞と共に培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示している。
【０２２２】
ＴｒｉＮＫＥＴは、休息した及びＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞の活性を増進する
図４８Ａ〜４８Ｂは、ＣＤ３３を発現するヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４−１１との共培養において休息したまたはＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示している。図４８Ａは、休息しているヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示している。図４８Ｂは、同じドナーからのＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示している。休息したＮＫ細胞は、ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞よりも小さなバックグラウンドＩＦＮγ産生及びＣＤ１０７ａ脱顆粒を示した。休息したＮＫ細胞は、ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞と比較して、ＩＦＮγ産生及びＣＤ１０７ａ脱顆粒のより大きな変化を示した。ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞は、ＴｒｉＮＫＥＴでの刺激後に、ＩＦＮγ＋；ＣＤ１０７ａ＋になる細胞のより高い割合を示した。
【０２２３】
ＴｒｉＮＫＥＴは、休息した及びＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を増進する
図４９Ａ〜４９Ｂは、ＩＬ−２で活性化した及び休息したヒトＮＫ細胞を使用したＴｒｉＮＫＥＴの細胞傷害活性の増進を示している。図４９Ａは、休息したヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の特異的溶解率を示している。図４９Ｂは、ＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の特異的溶解率を示している。ＩＬ−２で活性化した及び休息したＮＫ細胞集団は、同じドナーに由来した。トラスツズマブと比較して、ＴｒｉＮＫＥＴは、活性化したまたは休息したＮＫ細胞集団のいずれかによってＳｋＢｒ−３細胞に対する反応をより強力に誘導する。
【０２２４】
ＴｒｉＮＫＥＴは、低い表面発現を有する標的に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増進する
図５０Ａ〜５０Ｂは、ＴｒｉＮＫＥＴがトラスツズマブと比較して、ＨＥＲ２中度及び低度がんに対して大きな利点を提供することを示している。図５０Ａは、ＨＥＲ２高ＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の活性化したヒトＮＫ細胞の殺傷を示している。図５０Ｂは、ＨＥＲ２低７８６−Ｏ腫瘍細胞のヒトＮＫ細胞の殺傷を示している。ＴｒｉＮＫＥＴは、低いＨＥＲ２発現を有するがん細胞に対してトラスツズマブと比較してより大きな利点を提供する。ＴｒｉＮＫＥＴは、低い表面発現を有する標的に対して最大の利点を提供する。
【０２２５】
高いＦｃＲ発現を有するがん、または高いレベルのＦｃＲを有する腫瘍微小環境中のがんを治療する際のＴｒｉＮＫＥＴの利点
モノクローナル抗体療法は、血液腫瘍及び固形腫瘍の両方を含む多くのがんの種類の治療に承認されている。がん治療におけるモノクローナル抗体の使用は患者の転帰を改善してきたが、依然として限界がある。メカニズム研究は、モノクローナル抗体が、とりわけ、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ファゴサイトーシス、及びシグナル遮断を含む複数のメカニズムを介して腫瘍成長に対してそれらの効果を発揮することを実証してきた。
【０２２６】
最も注目すべきは、ＡＤＣＣは、モノクローナル抗体がそれらの効果を発揮する主要なメカニズムであると考えられている。ＡＤＣＣは、腫瘍細胞の直接的溶解を媒介する、ナチュラルキラー細胞の表面上の低親和性ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の抗体Ｆｃ係合に依存する。ＦｃγＲの中でも、ＣＤ１６は、ＩｇＧのＦｃに対して最も低い親和性を有し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高親和性ＦｃＲであり、ＣＤ１６よりも約１０００倍強くＩｇＧのＦｃに結合する。
【０２２７】
ＣＤ６４は通常、骨髄系などの多くの造血系に発現しており、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの、これらの細胞型に由来する腫瘍に発現し得る。ＭＤＳＣ及び単球などの、腫瘍に浸潤する免疫細胞もまた、ＣＤ６４を発現し、腫瘍微小環境に浸潤することが知られている。腫瘍によるまたは腫瘍微小環境におけるＣＤ６４の発現は、モノクローナル抗体療法に有害な影響を及ぼし得る。腫瘍微小環境におけるＣＤ６４の発現により、これらの抗体は、ＮＫ細胞の表面上のＣＤ１６に係合することが困難となるが、それは抗体が、高親和性の受容体に結合することを好むからである。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞の表面上の２つの活性化受容体を標的とすることにより、モノクローナル抗体療法に対するＣＤ６４発現の有害な影響を克服することができる場合がある。
【０２２８】
３つのＡＭＬ細胞株上でのＦｃＲγＩ（ＣＤ６４）の発現
高及び低レベルのＣＤ６４表面発現を有する腫瘍に対するＴｒｉＮＫＥＴ及びモノクローナル抗体の活性を試験するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系を展開した。Ｍｏｌｍ−１３及びＴＨＰ−１は、表面ＣＤ３３の同様の発現を有する２つのヒトＡＭＬ細胞株であるが、Ｍｏｌｍ−１３細胞は、ＣＤ６４を発現しないのに対し、ＴＨＰ−１細胞は、それらの表面にＣＤ６４を発現する（図５１Ａ〜５１Ｃ）。ＣＤ３３を標的とするために誘導されたモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを使用して、モノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴ療法に対する腫瘍によるＣＤ６４発現の影響を試験した。図５１Ａ〜５１Ｃは、３つのヒトＡＭＬ細胞株、すなわち、Ｍｏｌｍ−１３細胞株（図５１Ａ）、Ｍｖ４−１１細胞株（図５１Ｂ）、及びＴＨＰ−１細胞株（図５１Ｃ）での高親和性ＦｃＲγＩ（ＣＤ６４）の発現を示している。Ｍｏｌｍ−１３細胞は、ＣＤ６４を発現しないのに対し、Ｍｖ４−１１細胞は、低レベルを有し、ＴＨＰ−１は、高レベルの細胞表面ＣＤ６４を有する。
【０２２９】
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＦｃＲの表面発現が高い腫瘍細胞を標的とした場合に有利である。
図５２Ａ〜５２Ｂは、Ｍｏｌｍ−１３（図５２Ｂ）またはＴＨＰ−１（図５２Ａ）細胞のいずれかとの共培養におけるヒトＮＫ細胞のモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを媒介した活性化を示している。ヒトＣＤ３３に対するモノクローナル抗体は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγ産生の増加によって明らかなように、Ｍｏｌｍ−１３共培養系においてヒトＮＫ細胞の良好な活性化を実証した。モノクローナル抗体は、腫瘍上に高レベルのＣＤ６４が存在するＴＨＰ−１共培養系では効果を有しない。興味深いことに、ＴｒｉＮＫＥＴは、Ｍｏｌｍ−１３（図５２Ｂ）及びＴＨＰ−１（図５２Ａ）の両方の細胞に対して有効であったのに対し、モノクローナル抗体は、ＦｃＲ−Ｈｉ  ＴＨＰ−１細胞との培養ではＮＫ細胞を活性化することができず、このことはＴｒｉＮＫＥＴが、腫瘍上のＣＤ６４との結合を克服し、ＮＫ細胞を活性化のために有効に標的とすることができることを示している。ＮＫ細胞上の２つの活性化受容体の二重標的化は、ＮＫ細胞に対するより強い特異的結合を提供した。ＮＫ細胞上のＣＤ１６のみを標的とするモノクローナル抗体は、他の高親和性ＦｃＲによって結合し、ＮＫ細胞上のＣＤ１６の係合を防止し得る。
【０２３０】
Ｍｏｌｍ−１３及びＴＨＰ−１共培養系を使用したヒトＮＫ細胞細胞傷害性アッセイは、高レベルのＣＤ６４の存在下でのＴｒｉＮＫＥＴの有効性を支持する追加的な証拠を提供する。これらの細胞傷害性アッセイでは、第３のヒトＡＭＬ細胞株であるＭｖ４−１１を使用した。Ｍｖ４−１１細胞は、低レベルのＣＤ６４を発現し、それらの表面上のＣＤ６４のレベルについてＴＨＰ−１とＭｏｌｍ−１３細胞の間に入る（図５１Ａ〜５１Ｃ）。
【０２３１】
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＦｃγＲＩの発現にかかわらずＡＭＬ細胞株に対して有効性を実証する
図５３Ａ〜５３Ｃは、３つのヒトＡＭＬ細胞株を標的として使用したヒトＮＫ細胞傷害性アッセイを示している。ＣＤ３３に対するモノクローナル抗体は、ＣＤ６４を発現しないＭｏｌｍ−１３細胞に対して良好な有効性を示す（図５３Ｂ）。ＣＤ６４を発現するが、ＴＨＰ−１よりも低いレベルで発現するＭｖ４−１１細胞（図５３Ａ）は、モノクローナル抗ＣＤ３３では減少した有効性を示した。ＴＨＰ−１細胞（図５３Ｃ）は、モノクローナル抗ＣＤ３３単独では効果を示さなかった。腫瘍細胞上でのＣＤ６４の発現にかかわらず、ＴｒｉＮＫＥＴは、ここで試験したすべての腫瘍細胞に対してヒトＮＫ細胞反応を媒介することができた。
【０２３２】
図５３Ａ〜５３Ｃは、ＴＨＰ−１細胞が、それらの表面上の高レベルの高親和性ＦｃＲ発現のために、モノクローナル抗体療法に対して保護されたことを示している。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞の表面上の２つの活性化受容体を標的とすることによってこの保護を回避した。細胞傷害性データは、共培養活性化実験で確認されたものと直接相関していた。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＴＨＰ−１細胞で確認されたｍＡｂ療法からの保護を回避し、高レベルのＦｃＲにもかかわらずＮＫ細胞が媒介する溶解を誘導することができた。
【０２３３】
ＰＢＭＣ培養物中の正常骨髄及び正常Ｂ細胞の殺傷：ＴｒｉＮＫＥＴは、より少ない標的照準腫瘍外副作用により、より良好な安全性プロファイルを提供する
ナチュラルキラー細胞及びＣＤ８Ｔ細胞はいずれとも、腫瘍細胞を直接溶解することができるが、ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞が腫瘍細胞から正常な自己を認識するメカニズムは異なる。ＮＫ細胞の活性は、活性化（ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６など）受容体及び阻害（ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａなど）受容体からのシグナルのバランスによって制御される。これらの活性化及び阻害シグナルのバランスにより、ＮＫ細胞は、ストレスを受けた、ウイルス感染した、または形質転換した自己細胞から健康な自己細胞を決定することが可能となる。この自己耐性の「内蔵」メカニズムは、ＮＫ細胞反応から正常な健康組織を保護するのに役立つ。この原理を拡張するために、ＮＫ細胞の自己耐性により、ＴｒｉＮＫＥＴは、腫瘍外の副作用を伴わずに、または増大した治療ウィンドウを伴って、自己及び腫瘍の両方に発現した抗原を標的とすることが可能となる。
【０２３４】
ナチュラルキラー細胞とは異なり、Ｔ細胞は、活性化及びエフェクター機能のためにＭＨＣ分子によって提示される特定のペプチドの認識を必要とする。Ｔ細胞は、免疫療法の主要な標的であり、腫瘍に対するＴ細胞反応を再誘導するための多くの戦略が開発されてきた。Ｔ細胞二重特異性物質、チェックポイント阻害剤、及びＣＡＲ−Ｔ細胞はすべて、ＦＤＡによって承認されているが、しばしば用量制限毒性に悩まされている。Ｔ細胞二重特異性物質及びＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞の表面上の抗原を標的とする結合ドメインを使用し、遺伝子操作されたシグナル伝達ドメインを使用して活性化シグナルをエフェクター細胞に伝達することによってＴＣＲ−ＭＨＣ認識システムの周囲で機能する。これらの療法は、抗腫瘍免疫反応の誘発には有効であるものの、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及び標的照準腫瘍外副作用を伴うことが多い。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞の活性化及び阻害の天然システムを「上書き」しないので、この点に関して独特である。代わりに、ＴｒｉＮＫＥＴは、バランスに影響を及ぼすように設計されており、健康な自己へのＮＫ耐性を維持しつつ、ＮＫ細胞に追加の活性化シグナルを提供する。
【０２３５】
密度勾配遠心分離によって全血からＰＢＭＣを単離した。任意の汚染された赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液中でのインキュベートによって溶解した。ＰＢＭＣをＰＢＳで３回洗浄し、総ＰＢＭＣをカウントした。ＰＢＭＣを初代細胞培地で１０６細胞／ｍＬに調整した。１ｍＬのＰＢＭＣを２４ウェルプレートのウェルに播種し、指されたＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを１０μｇ／ｍＬでＰＢＭＣ培養物に添加した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日（２４時間後）にＰＢＭＣを培養物から採取し、ＦＡＣＳ分析のために調製した。ＣＤ４５＋；ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ４５＋；ＣＤ３３＋；ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の割合を異なる治療群について分析した。
【０２３６】
図５４Ｂ及び５４Ｄは、自己骨髄腫細胞が、ＴｒｉＮＫＥＴ媒介ＮＫ細胞反応から保護されることを示している。図５４Ａ及び５４Ｂは、健康ドナーからのＢ細胞が、ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解に対して感受性であるのに対し、骨髄腫細胞は、ＴｒｉＮＫＥＴ溶解に対して抵抗性であることを示している。ＣＤ２０を標的とするＴｒｉＮＫＥＴで処置したＰＢＭＣは、ＣＤ４５＋リンパ球集団でＣＤ１９＋Ｂ細胞の頻度の減少を示したが（図５４）、ＣＤ４５＋、ＣＤＤ３−、ＣＤ５６−リンパ球集団では効果を示さなかった（図５４Ｃ）。これらの培養物では、ＣＤ４５＋、ＣＤ１９＋骨髄腫細胞の頻度（図５４Ｂ）、またはＣＤ３３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１１ｂ＋骨髄腫細胞の頻度（図５４Ｄ）は変化しなかった。
【０２３７】
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＳｋＢｒ−３腫瘍細胞のｈＰＢＭＣ殺傷を長期共培養で媒介する
初代ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性アッセイ
図５５は、ヒトＰＢＭＣとの培養でのＳｋＢｒ−３細胞の長期殺傷を示している。ＳｋＢｒ−３細胞は、単独で培養した場合、増殖して、６０時間でほぼ２倍になる。ヒトＰＢＭＣを培養下のＳｋＢｒ−３細胞に添加すると、増殖の速度が遅くなり、ＣＤ３３を標的とするアイソタイプ対照ＴｒｉＮＫＥＴを添加すると、増殖も遅くなるが、それはより低い低度である。培養物をトラスツズマブで処置した場合、ＳｋＢｒ−３はもはや増殖せず、６０時間後にはゼロ時からの細胞の８０％しか残らない。ＳｋＢｒ−３細胞は、ＨＥＲ２シグナル遮断に対して感受性であるため、ＳｋＢｒ−３細胞成長に対する影響は、ＨＥＲ２シグナル遮断によってまたはＡＤＣＣなどのＦｃエフェクター機能を介して媒介され得る。
【０２３８】
実施例１５
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍有効性
マウスｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴの結合活性を確認するために、Ｔｙｒｐ−１陽性Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（図５８Ａ）及びマウスＮＫＧ２Ｄを過剰発現するＥＬ４株（ＥＬ４−ｍＮＫＧ２Ｄ、図５８Ｂ）に対するフローサイトメトリーアッセイによって、直接結合をそのモノクローナル抗体と比較して測定した。
【０２３９】
ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴが細胞傷害性を媒介する能力を保持していたかどうかを試験するために、マウスＩＬ−２活性化ＮＫ細胞によるＴｙｒｐ−１陽性Ｂ１６Ｆ１０腫瘍標的の殺傷を測定した。図５９に示されるように、マウスＮＫ細胞は、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９の存在下でそれらの細胞傷害性活性を増加させた。重要なことに、抗Ｔｙｒｐ−１モノクローナル抗体ＴＡ９９は、わずかな効果しか示さなかった。
【０２４０】
ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴによって媒介されるＮＫ細胞傷害性の増加
１ウェル当たり約５×１０３個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をアッセイの２日前に播種した。実験日に、ＴＡ９９モノクローナル抗体またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で５×１０４個のマウスＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を添加した（ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９は、マウスＩｇＧ２ｃをＦｃとして有するｍＣ２６とＴＡ９９のヘテロ二量体である。Ｇｍ変異は、ヘテロ二量体を生成するために使用されるヘテロ二量体化変異を指す）。４倍希釈した２０μｇ／ｍＬの抗体を使用した。４時間の共培養後、ＬＤＨ放出についてＣｙｔｏＴｏｘ９６キットを使用して細胞傷害性の割合を評価した。点線は、抗体の非存在下でのベースラインの細胞傷害性を表している。
ｍＣ２６＿ｈｖＬ＿ｍＣＬ（太字部分）（イタリック体の下線を引いたアミノ酸は、ヘテロ二量体を生成するために使用されたヘテロ二量体化変異である）：
【化９】
2021512914.tif 000028
【０２４１】
実施例１６
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍有効性
ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９がｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍機能を発揮するかどうかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下注射した。マウスを、アイソタイプ対照、モノクローナルＴＡ９９抗体またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴのいずれかで処置した。モノクローナルＴＡ９９抗体での処置は、アイソタイプで処置した対照群と同様の腫瘍進行を示した。しかしながら、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴの投与は、アイソタイプで処置した群と比較して遅延した腫瘍進行をもたらした。約２×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍播種後６日目に、マウスを無作為化した（１群当たりｎ＝１０）。マウスに、（図６０Ａ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４及びマウス抗Ｔｙｒｐ−１モノクローナル抗体または（図６０Ｂ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４及びｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴを１５０μｇの用量で注射して腹腔内処置した（６、８、１０、１２、１４、１６及び２１日目）。腫瘍成長を２８日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。
【０２４２】
皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルに加えて、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴをまた、播種性腫瘍条件でのその腫瘍有効性について試験した。１×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞をマウスに静脈内注射した。処置は、低（３００μｇ／注射）及び高（６００μｇ／注射）抗体用量で４日目または７日目のいずれかに開始した。腫瘍播種後１８日目に、肺転移をカウントした。腫瘍播種後４日目及び７日目に開始した処置は、ＴＡ９９モノクローナル抗体またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴを高濃度で使用した場合、アイソタイプで処置した対照群と比較して減少した肺転移の数をもたらした。低濃度では、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴのみが腫瘍負担を減少させた（図６１Ａ）。腫瘍播種後７日目から開始して抗体を投与した場合、同様の効果が認められた。全体的に、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ療法は、すべての試験された条件において、モノクローナルＴＡ９９抗体と比較して、より少ない数の肺転移をもたらした。約１×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に静脈注射した（１群当たりｎ＝８）。マウスを未処置のままとしたか、または対照モノクローナル抗体（アイソタイプ、クローンＣ１．１８．４）、モノクローナルＴＡ９９抗体またはＴＡ９９ＴｒｉＮＫＥＴ（ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９）で腹腔内処置した。図６１Ａは、抗体を１５０μｇ用量で投与した場合の腫瘍負担を表している（４、６、８、１１、１３、１５日目）。図６１Ｂは、抗体を１５０μｇ用量で投与した場合の腫瘍負担を表している（７、９、１１、１３、１５日目）。腫瘍負荷の１８日後、マウスを安楽死させ、表面肺転移をスコア化した（図６１Ｂ）。
【０２４３】
実施例１７
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴを用いた併用療法
別の抗腫瘍剤と組み合わせた場合の本開示の多特異的タンパク質の抗腫瘍反応のレベルを決定した。ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９によって媒介される抗腫瘍免疫反応が増幅され得るかどうかを決定するために、抗ＰＤ−１抗体またはＩＬ−２サイトカインを使用した併用試験を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下注射した。マウスを、アイソタイプ対照、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体との組み合わせで処置した。ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９または抗ＰＤ−１のいずれかでの単剤療法は、１０％の反応マウスをもたらした。しかしながら、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９及び抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の併用療法は、腫瘍進行を遅らせ、アイソタイプ処置群と比較して４０％の反応マウスをもたらした。
【０２４４】
抗ＰＤ−１モノクローナル抗体との併用療法
２×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍後６日目に、播種したマウスを無作為化した（１群当たりｎ＝１０）。マウスを、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４で、ラットＩｇＧ２ａモノクローナル抗体２Ａ３及びｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９で、アイソタイプ対照及び抗ＰＤ−１モノクローナル抗体クローンＲＰＭ１−１４で、またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体との組み合わせで腹腔内処置した。動物に、１５０μｇ（ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９及びＣ１．１８．４）及び２００μｇ（抗ＰＤ−１モノクローナル抗体及び２Ａ３）の単回用量を上記のように注射した。腫瘍成長を３０日間評価した。図６６Ａ〜６６Ｃにおけるグラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。図６６Ａは、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４で、ラットＩｇＧ２ａモノクローナル抗体２Ａ３で、またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９で腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。図６６Ｂは、アイソタイプ対照または抗ＰＤ−１モノクローナル抗体クローンＲＰＭ１−１４で腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。図６６Ｃは、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体との組み合わせで腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。
【０２４５】
ＩＬ−２との併用療法
ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９と組換えヒトＩＬ−２との組み合わせの投与による腫瘍サイズへの影響も評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下注射した。これらのマウスを、アイソタイプ対照、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ、またはＩＬ−２で個別に処置したか、またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９とＩＬ−２との組み合わせで処置した。ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９（図６７Ａ）またはＩＬ−２（図６７Ｂ）のいずれかでの単剤療法は、１０％の反応マウスをもたらした。しかしながら、併用療法（図６７Ｃ）は、腫瘍進行を遅らせ、アイソタイプ処置群と比較して７０〜９０％の反応マウスをもたらした。
【０２４６】
この実験のため、２×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍後６日目に、播種したマウスを無作為化した（１群当たりｎ＝１０）。マウスに、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４もしくはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９を；アイソタイプ対照もしくはＩＬ−２を；またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９とＩＬ−２との組み合わせを腹腔内投与した。動物に、１５０μｇ（ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９及びＣ１．１８．４）及び１００，０００ＩＵ（ＩＬ−２、１日２回）の単回用量を上記のように注射した。無腫瘍を維持している併用群の３匹のマウスで腫瘍成長を４０日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示している。
【０２４７】
図６７Ａは、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９で腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。図６７Ｂは、アイソタイプ対照またはＩＬ−２で腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。図６７Ｃは、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９とＩＬ−２との組み合わせで腹腔内処置したマウスにおける腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示す線グラフである。
【０２４８】
実施例１８
ＨＥＲ２陽性細胞に対するＴｒｉＮＫＥＴ、モノクローナル抗体、または二重特異的抗体によって媒介される休息したヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートからＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞の単離のために調製した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用して単離した；単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離したＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地で培養したか、またはサイトカインを用いずに一晩休息させた。ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞または休息したＮＫ細胞を、翌日に細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０２４９】
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
対象となる標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞をＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識するために１０６細胞／ｍＬで成長培地に再懸濁した。標的細胞の標識のために製造者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、０．５〜１．０×１０５細胞／ｍＬで培地に再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識された細胞のアリコートを脇に置き、細胞を培地から回転除去した。１００μｌの培地を、ペレット化された細胞が乱されるのを避けるように慎重にウェルに三重に添加した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加によって標的細胞の最大溶解のためにウェルを調製した。対象となる腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培地に希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休息した及び／または活性化したＮＫ細胞を培養物から採取し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比に応じて１０５〜２．０×１０６細胞／ｍＬで培地に再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加し、合計２００μｌの培養体積とした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２で２〜３時間インキュベートしてからアッセイを展開した。
【０２５０】
２〜３時間培養した後、インキュベーターからプレートを取り出し、２００ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。２０μｌの培養上清を製造者から提供されたきれいなマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカー上で２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ装置のいずれかを使用してプレートを読み取った。％特異的溶解を次のように計算した：％特異的溶解＝（（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出））＊１００％。
【０２５１】
モノクローナル抗体と二重特異的ＮＫ細胞係合剤との組み合わせは、ＴｒｉＮＫＥＴ活性を反復させない
図６８は、ＨＥＲ２陽性Ｃｏｌｏ−２０１細胞株に対するＴｒｉＮＫＥＴ、モノクローナル抗体、または二重特異的抗体によって媒介された休息したヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を示している。ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＤＩ−２９４０４（Ｆ０４））は、休息したヒトＮＫ細胞によってＣｏｌｏ−２０１細胞の最大溶解を誘導した。Ｄ２６５Ａ変異をＴｒｉＮＫＥＴのＣＨ２ドメインに導入し、ＦｃＲ結合を無効化した。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＤＩ−２９４０４（Ｆ０４））−Ｄ２６５Ａは、Ｃｏｌｏ−２０１細胞の溶解を媒介することができず、ＮＫ細胞上のＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄの二重標的化の重要性を実証した。ＮＫ細胞に対する二重標的化の重要性をさらに実証するために、モノクローナル抗体のトラスツズマブを、ＨＥＲ２を標的とし、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣを媒介するために使用し、トラスツズマブ単独ではＣｏｌｏ−２０１細胞のＮＫ細胞溶解を増加させることができたが、トラスツズマブ単独で達成された最大溶解は、ＴｒｉＮＫＥＴと比較して約４倍低かった。同じ分子上のＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄ標的化の重要性を理解するために、ＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＤＩ−２９４０４（Ｆ０４））活性を、トラスツズマブと組み合されたＨＥＲ２及びＮＫＧ２Ｄを標的とする二重特異的抗体の活性と比較した。等モル濃度で使用した場合、二重特異性物質とトラスツズマブとの組み合わせは、休息したヒトＮＫ細胞によるＣｏｌｏ−２０１細胞の最大溶解を媒介することができなかった。トラスツズマブ＋二重特異性物質の組み合わせの失敗は、１分子内にＴｒｉＮＫＥＴの三重特異的結合を含有することの重要性を実証している。
【０２５２】
実施例１９
実施例１４は、ＨＥＲ２−、ＣＤ３３−、及びＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴが、休息した及びＩＬ−２で活性化したヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を増進したことを実証している。本実施例はさらに、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５で活性化したヒトＮＫ細胞に対するＴｒｉＮＫＥＴの効果をさらに特徴付ける。実施例１４に記載されたようにＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイを使用してヒトＰＢＭＣから単離されたＮＫ細胞を用いて、３つの異なる腫瘍関連抗原、すなわち、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、及びＢＣＭＡに関して細胞傷害性を測定した。
【０２５３】
ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞傷害性を測定するために、ヒトＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２、もしくはＩＬ−１５と共に培養したか、またはサイトカインを用いずに一晩休息させた。休息したまたはサイトカインで活性化したＮＫ細胞を、順次希釈したトラスツズマブまたはトラスツズマブ由来のＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で、ＨＥＲ２低７８６−Ｏ腫瘍細胞と共培養した。図７３Ａに示されるように、休息したヒトＮＫ細胞は、７８６−Ｏ標的細胞の殺傷を示さず、トラスツズマブは、７８６−Ｏ標的細胞の溶解を増加させることができなかった。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴは、７８６−Ｏ標的細胞の休息ＮＫ細胞溶解を増加させることができたが、溶解は約２０％にしか達しなかった。図７３Ｂ〜Ｄに示されるように、サイトカインで活性化したＮＫ細胞は、７８６−Ｏ標的細胞と共培養した場合、約２０％の特異的溶解を示した。休息したＮＫ細胞とは異なり、トラスツズマブは、サイトカインで活性化したＮＫ細胞の活性を約４０％の特異的溶解まで増加させることができた。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴは、７８６−Ｏ標的細胞のサイトカイン活性化ＮＫ細胞溶解をより強力に増進した。特異的溶解はまた、サイトカインで活性化したＮＫエフェクター細胞を用いたトラスツズマブと比較して、ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴでより高い最大値に到達した。
【０２５４】
ＣＤ３３発現細胞に対する細胞傷害性を測定するために、ヒトＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２、もしくはＩＬ−１５と共に培養したか、またはサイトカインを用いずに一晩休息させた。休息したまたはサイトカインで活性化したＮＫ細胞を、順次希釈したリンツズマブ、私有の抗ＣＤ３３モノクローナル抗体、または私有の抗ＣＤ３３抗体に由来するＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で、ＣＤ３３陽性Ｍｏｌｍ−１３腫瘍細胞と共培養した。図７４Ａに示されるように、休息したヒトＮＫ細胞は、Ｍｏｌｍ−１３標的細胞の殺傷を示さず、両モノクローナル抗体は、Ｍｏｌｍ−１３標的細胞のＮＫ細胞溶解のわずかな増加しかもたらさなかった。図７４Ｂ〜Ｄに示されるように、ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴは、Ｍｏｌｍ−１３標的細胞の休息ＮＫ細胞溶解を約３０％の特異的溶解まで増加させることができた。サイトカインで活性化したＮＫ細胞は、Ｍｏｌｍ−１３標的細胞と共培養した場合、約３５〜５５％の溶解を示した。休息したＮＫ細胞とは異なり、両モノクローナル抗体は、サイトカインで活性化したＮＫ細胞の活性を約６０〜７０％の特異的溶解まで増加させることができた。ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴは、Ｍｏｌｍ−１３標的細胞のサイトカイン活性化ＮＫ細胞溶解をより強力に増進した。特異的溶解はまた、サイトカインで活性化したＮＫエフェクター細胞を用いたいずれかのモノクローナル抗体と比較して、ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴでより高い最大値に到達した。
【０２５５】
ＢＣＭＡ発現細胞に対する細胞傷害性を測定するために、ヒトＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２、もしくはＩＬ−１５と共に培養したか、またはサイトカインを用いずに一晩休息させた。休息したまたはサイトカインで活性化したＮＫ細胞を、順次希釈したＥＭ−９０１抗ＢＣＭＡ抗体またはＥＭ−９０１由来のＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で、ＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１２−ＰＥ腫瘍細胞と共培養した。図７５Ａに示されるように、休息したヒトＮＫ細胞は、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の殺傷を示さず、ＥＭ−９０１及びＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴは、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞のＮＫ細胞溶解のわずかな増加しか示さなかった。図７５Ｂ〜Ｄに示されるように、サイトカインで活性化したＮＫ細胞は、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞と共培養した場合、約１０〜４０％の溶解を示し、溶解の程度は、異なるサイトカインで処置したＮＫ細胞について変化した。休息したＮＫ細胞とは異なり、ＥＭ−９０１は、サイトカインで活性化したＮＫ細胞の活性を、使用したサイトカインに応じて約４０〜８０％の特異的溶解まで増加させることができた。ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴは、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞のサイトカイン活性化ＮＫ細胞溶解をより強力に増進した。特異的溶解はまた、サイトカインで活性化したＮＫエフェクター細胞を用いた親のモノクローナル抗体と比較して、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴでより高い最大値に到達した。
【０２５６】
ポマリドマイドは、免疫調節活性を有することが報告されている化合物である。ＢＣＭＡ発現細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性に対するポマリドマイド及び／またはＩＬ−２の効果を評価するために、ヒトＮＫ細胞を一晩、休息させたか、またはＩＬ−２、ポマリドマイド、もしくはＩＬ−２とポマリドマイドとの組み合わせと共に培養した。休息したまたは活性化したＮＫ細胞を、順次希釈したＥＭ−９０１またはＥＭ−９０１由来のＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞と共培養した。図７６Ａに示されるように、休息したヒトＮＫ細胞は、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の殺傷を示さなかった。ＥＭ−９０１は、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞のＮＫ細胞溶解のわずかに増加しか示さなかったのに対し、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴは、より高く、より強力な特異的溶解を実証した。図７６Ｂに示されるように、ポマリドマイドで活性化したＮＫ細胞は、休息したＮＫ細胞と同様のＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の溶解を示した。ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴは、ポマリドマイドで活性化したＮＫ細胞による標的細胞の溶解を、休息したＮＫ細胞による溶解の増加よりも高い程度まで増加させた。図７６Ｃに示されるように、ＩＬ−２で活性化したＮＫ細胞は、共培養において約２０％の標的細胞を溶解させた。ＥＭ−９０１は、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞のＮＫ細胞溶解を約４０％まで増加させたのに対し、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴは、特異的溶解を約６０％まで増加させた。そのため、ＮＫ細胞は、ポマリドマイドでの処置と比較して、ＩＬ−２での処置後、より活性であった。ＮＫ細胞の活性化のためにＩＬ−２とポマリドマイドを組み合わせた場合、ＮＫ細胞は、約３０％の特異的溶解のより一層高い活性を実証した。ＥＭ−９０１は、ＩＬ−２／ポマリドマイドで活性化したＮＫ細胞による溶解を約６０％まで増加させ、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴは、溶解を約８０％まで増加させた。この結果は、ＴｒｉＮＫＥＴのその親抗体と比較したより高い効力を実証しており、本実施例で試験された他の条件と一貫している。
【０２５７】
実施例２０
本実施例は、ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ及び抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブの存在下でのＨＥＲ２発現標的細胞に対するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を示している。
【０２５８】
簡潔には、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートからヒトＰＢＭＣを単離した。単離されたＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（ＣｏｎＡ）で３７℃で１８時間刺激した。次いでＣｏｎＡを除去し、ＰＢＭＣを２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で３７℃で４日間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズを用いたネガティブセレクション法を使用して精製した。精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を含有する培地で３７℃で３〜１４日間培養した。
【０２５９】
細胞集団の純度、ならびにＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６及びＰＤ−１の発現を評価した。簡潔には、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６に対するフルオロフォア複合体化抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図７７Ａに示されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、高純度のものであった。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は一様に、ＮＫＧ２Ｄについて陽性であり、ＣＤ１６について陰性であった。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の約２０％がＰＤ−１を発現していた。
【０２６０】
細胞の追跡を可能とするためにＢａｃＭａｍ３．０  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ（＃４６２２）が形質導入されたＨＥＲ２を発現したヒトがん細胞株ＨＣＣ１９５４を標的細胞として使用した。ＨＥＲ２及びＰＤ−Ｌ１に対するフルオロフォア複合体化抗体で細胞を染色し、ＨＥＲ２及びＰＤ−Ｌ１の発現をフローサイトメトリーによって分析した。図７７Ｂに示されるように、ＨＥＲ２及びＰＤ−Ｌ１の発現をＨＣＣ１９５４細胞で検出した。
【０２６１】
ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ、ペムブロリズマブ、及びそれらの組み合わせのＴ細胞傷害性に対する効果を、長期ＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性アッセイを使用して評価した。簡潔には、ＨＣＣ１９５４標的細胞を培養物から採取し、洗浄し、成長培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに５，０００細胞／ウェルで播種した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ、ペムブロリズマブ、及びそれらのそれぞれのアイソタイプ対照を培地に希釈した。抗体及びＴｒｉＮＫＥＴを組み合わせた５０μｌを各ウェルに添加した。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を培養物から採取し、洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬ（１０：１のＥ：Ｔ比の場合）または２．５×１０６細胞／ｍＬ（２５：１のＥ：Ｔ比の場合）で培地に再懸濁した。５０μｌのＣＤ８＋Ｔ細胞をプレートの各ウェルに添加して、各ウェルにおいて合計で２００μｌの培養体積とした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２で最大７日間インキュベートした。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３装置を使用して、位相及び緑チャンネルについての画像を１ウェル当たり２つの画像で１時間ごとに収集した。画像をＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ソフトウェアを使用して分析した。ウェル内の生存腫瘍細胞の数は、緑色の物体の数によって表された。
【０２６２】
図７８Ａに示されるように、２０ｎＭのＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴと６．７ｎＭ、２０ｎＭ、または６７ｎＭのペムブロリズマブとの組み合わせは、ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴまたはペムブロリズマブ単独よりも強い腫瘍殺傷効果を示した。併用効果は、より高いＥ：Ｔ比及び上昇したペムブロリズマブ濃度でより実質的であった。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴを０．０４ｎＭの低用量で使用し、ペムブロリズマブを６７ｎＭで使用した場合、異なるドナーから単離されたＣＤ８＋エフェクターＴ細胞で同様の併用効果が観察された（図７８Ｂ）。
【０２６３】
実施例２１
本実施例は、ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ及びＴＬＲアゴニスト（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  ＴＬ８−５０６）の存在下でのＨＥＲ２発現ヒト乳癌細胞株Ｓｋｂｒ−３に対するヒトＰＢＭＣの細胞傷害性を示している。
【０２６４】
簡潔には、Ｓｋｂｒ−３細胞を、ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  ４４７５）を安定的に発現するように形質導入した。プロマイシン選択後、細胞を培養物から採取し、培地に再懸濁した。３×１０３個の標的細胞を、平底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌの培地中に添加した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。
【０２６５】
培地に希釈した５０μｌのＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ及び／またはＴＬＲアゴニストを、それぞれ１０μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌの最終アッセイ濃度で添加した。処理したばかりのヒトＰＢＭＣを１．２×１０６細胞／ｍＬで培地に再懸濁し、５０μｌのＰＢＭＣを標的のみの対照群（５０μｌの培地を受けた）を除くすべてのウェルに添加した。プレートをアッセイの継続期間中Ｉｎｃｕｃｙｔｅ装置（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）に入れ、位相及び緑色蛍光画像を４日間毎時取得した。デブリを除外するために最小の面積制限を有する緑事象マスクを使用して細胞数を得た。各時点での細胞数を開始時のＳＫＢＲ−３緑色細胞数のものに対して正規化して、成長率を得た。
【０２６６】
図７９に示されるように、ヒトＰＢＭＣ単独の添加は、ＳＫＢＲ−３標的細胞の増殖に影響を及ぼさなかったが、培養物中へのＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴの同時包含により、ＰＢＭＣは腫瘍細胞成長を実質的に阻害することができた。試験した用量では、ＴＬＲアゴニストは、ＰＢＭＣを刺激して、ＳＫＢＲ−３細胞の集団を最初の数から徐々に減少させた。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴとＴＬＲアゴニストとの組み合わせは、最も強力であり、４日以内にほとんどすべての標的細胞の殺傷を容易化した。
【０２６７】
実施例２２
実施例１７は、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴが、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞異種移植マウスモデルにおいて、単独でまたはＩＬ−２と組み合わせてもしくは抗ＰＤ−１モノクローナル抗体と組み合わせて腫瘍成長を抑制したことを実証している。本実施例は、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴとＩＬ−１２との組み合わせをさらに特徴付ける。
【０２６８】
簡潔には、２×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍後５日目に、播種したマウスを無作為化した（１群当たりｎ＝１０）。マウスに、（Ａ）７．５ｍｇ／ｋｇのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴもしくは７．５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４、（Ｂ）１μｇの組換えマウスＩＬ−１２（ｒｍＩＬ−１２）もしくは７．５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体Ｃ１．１８．４、または（Ｃ）７．５ｍｇ／ｋｇのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴと１μｇのｒｍＩＬ−１２との組み合わせを腹腔内注射した。腫瘍成長を６１日間評価し、マウスの生存をモニターした。
【０２６９】
図８０Ａ〜Ｃに示されるように、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ（図８０Ａ）またはマウスＩＬ−１２（図８０Ｂ）の単剤療法は、それ自体がＢ１６Ｆ１０腫瘍成長を抑制するのに有効であったが、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴとＩＬ−１２との併用療法（図８０Ｃ）は、より実質的な効果を有し、処置したマウスの４０％で完全な腫瘍退縮をもたらした。図８１に示されるように、全生存期間は、併用療法によって有意に延長した：併用療法で処置されたマウスの７０％が６１日目で依然として生存していた一方で、生存期間の中央値は、対照群及びＴｒｉＮＫＥＴ処置群ではわずか２０日であり、ＩＬ−１２単剤処置群で３７日であった。
【０２７０】
参照による組み込み
本明細書で言及されている特許文献及び科学論文の各々の開示全体は、すべての目的のために参照により組み込まれる。
均等物
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。そのため、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、あらゆる点で例示的であるとみなされるべきである。よって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内に入るすべての変更は、そこに含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５４Ｄ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６７Ｃ】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７３Ｃ】
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【図７３Ｄ】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７４Ｃ】
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【図７４Ｄ】
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【図７５Ａ】
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【図７５Ｂ】
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【図７５Ｃ】
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【図７５Ｄ】
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【図７６Ａ】
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【図７６Ｂ】
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【図７６Ｃ】
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【図７６Ｄ】
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【図７７Ａ】
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【図７７Ｂ】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
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【図７９】
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【図８０Ａ】
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【図８０Ｂ】
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【図８０Ｃ】
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【図８１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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