(57)【要約】  本発明は、１以上のインフルエンザＡウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をコードするベクターおよび／または核酸構築物に関する。本発明はさらに、これらのベクターおよび／または核酸構築物を含むインフルエンザＡウイルスに対するワクチンに関する。本発明はまた、ワクチンを単独でまたは他の保護剤と組み合わせて作製および使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはその抗原性断片をコードする第１のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、および、第２のＮＡまたはその抗原性断片をコードする第２のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
但し、免疫原性組成物は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ−Ｓ）赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片を含まず、ＩＡＶ−Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まず、
そしてここで、第１のＮＡおよび第２のＮＡは、９８％以下の同一性を有するアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
第１のＮＡが第１の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来し、第２のＮＡが第２の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来する、請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第１の系統発生クラスターと第２の系統発生クラスターは異なり、
そしてここで、第１の系統発生クラスターおよび第２の系統発生クラスターは、Ｎ１−古典的クラスター、Ｎ１−パンデミッククラスター、Ｎ２−１９９８クラスターおよびＮ２−２００２クラスターからなる群から個別に選択される、免疫原性組成物。
【請求項３】
第１の系統発生クラスターがＮ１−古典的クラスターおよびＮ１−パンデミッククラスターからなる群から選択され、そして、第２の系統発生クラスターがＮ２−１９９８クラスターおよびＮ２−２００２クラスターからなる群から選択される、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
第１の系統発生クラスターがＮ１−古典的クラスターであり、第２の系統発生クラスターがＮ２−２００２クラスターである、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
第３のＮＡまたはその抗原性断片をコードする第３のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む、請求項２、３または４に記載の免疫原性組成物であって、ここで、第３のＮＡは、第３の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来し、そしてここで、第３の系統発生クラスターは、第１の系統発生クラスターおよび第２の系統発生クラスターとは異なる、免疫原性組成物。
【請求項６】
第４のＮＡまたはその抗原性断片をコードする第４のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む、請求項５に記載の免疫原性組成物であって、ここで、第４のＮＡは、第４の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来し、そしてここで、第４の系統発生クラスターは、第１の系統発生クラスター、第２の系統発生クラスター、および第３の系統発生クラスターとは異なる、免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の免疫原性組成物であって、ここで、第１の系統発生クラスターはＮ１−古典的クラスターであり、第２の系統発生クラスターはＮ２−２００２クラスターであり、第３の系統発生クラスターはＮ１−パンデミッククラスターであり、そして、第４の系統発生クラスターは、Ｎ２−１９９８クラスターである、免疫原性組成物。
【請求項８】
第１のＮＡが第１の系統のＩＡＶ−Ｓに由来し、第２のＮＡが第２の系統のＩＡＶ−Ｓに由来する、請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第１の系統と第２の系統は異なり、そしてここで、第１の系統および第２の系統は、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統、Ｎ１−ユーラシアトリ系統、Ｎ２−ゲント／１９８４系統、Ｎ２−イタリア／４６７５／２００３系統、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統およびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統からなる群から個別に選択される、免疫原性組成物。
【請求項９】
第１の系統が、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統およびＮ１−ユーラシアトリ系統からなる群から選択され、そしてここで、第２系統は、Ｎ２−ゲント／１９８４系統、Ｎ２イタリア／４６７５／２００３系統、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統、およびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統からなる群から選択される、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
２つ以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
但し、免疫原性組成物は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ−Ｓ）赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片を含まず、ＩＡＶ−Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まず、そしてここで、第１のＮＡおよび第２のＮＡは、９８％以下のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
【請求項１１】
第１のＮＡが第１の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来し、そして、第２のＮＡが第２の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来する、請求項１０に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第１の系統発生クラスターと第２の系統発生クラスターは異なり、
そしてここで、第１系統発生クラスターおよび第２系統発生クラスターは、Ｎ１−古典的クラスター、Ｎ１−パンデミッククラスター、Ｎ２−１９９８クラスター、およびＮ２−２００２クラスターからなる群から個別に選択される、免疫原性組成物。
【請求項１２】
第１の系統発生クラスターがＮ２−１９９８クラスターであり、第２の系統発生クラスターがＮ２−２００２クラスターである、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
第１の系統発生クラスターがＮ１−古典的クラスターであり、第２の系統発生クラスターがＮ１−パンデミッククラスターである、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
第３のＮＡまたはその抗原性断片および第４のＮＡまたはその抗原性断片をコードする第２のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む請求項１３に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第３のＮＡはＮ２−１９９８クラスターのＩＡＶ−Ｓに由来し、第４のＮＡはＮ２−２００２クラスターのＩＡＶ−Ｓに由来する、免疫原性組成物。
【請求項１５】
第１のＮＡが第１の系統からのＩＡＶ−Ｓに由来し、第２のＮＡが第２の系統からのＩＡＶ−Ｓに由来する請求項１０に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第１の系統と第２の系統は異なり、
そしてここで、第１の系統および第２の系統は、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統、Ｎ１−ユーラシアトリ系統、Ｎ２−ゲント／１９８４系統、Ｎ２−イタリア／４６７５／２００３系統、Ｎ２−スコットランド／１９９４系統（クレード１）およびＮ２−スコットランド／１９９４系統（クレード２）からなる群から個別に選択される、免疫原性組成物。
【請求項１６】
第１の系統がＮ１−パンデミック（ＥＵ）であり、第２の系統がＮ１−ユーラシアトリである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
第３のＮＡまたはその抗原性断片および第４のＮＡまたはその抗原性断片をコードする第２のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む、請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第３のＮＡは、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統およびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統からなる群から選択される系統のＩＡＶ−Ｓに由来し、
そしてここで、第４のＮＡは、Ｎ２−ゲント／１９８４系統およびＮ２−イタリア／４６７５／２００３系統からなる群から選択される系統からのＩＡＶ−Ｓに由来する、免疫原性組成物。
【請求項１８】
第１の系統がＮ２−ゲント／１９８４であり、第２の系統がＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
第１の系統がＮ２−イタリア／４６７５／２００３であり、第２の系統がＮ２−スコットランド／１９９４（クレード１）である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
１以上の追加のＮＡまたはその抗原性断片をコードする１以上の追加のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む、請求項１から１９に記載の免疫原性組成物であって、ここで、１以上の追加のＮＡは、ＩＡＶ−Ｓに由来する、免疫原性組成物。
【請求項２１】
すべてのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子がベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、請求項１〜２０の免疫原性組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２１の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む、インフルエンザウイルスによる疾患の予防を補助するワクチンであって、
但し、ワクチンは、ＩＡＶ−Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片を含まず、ＩＡＶ−Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まない、ワクチン。
【請求項２３】
非アジュバント化ワクチンである、請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
生分解性油、２．５−５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルション、及び、２．５−５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンと混合された生分解性油、よりなる群から選択されるアジュバンドを含む、請求項２２のワクチン組成物。
【請求項２５】
生分解性油がｄｌ−α−酢酸トコフェリルであり、鉱油が流動パラフィンである、請求項２４に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
請求項２２、２３、２４および２５に記載のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む、ブタインフルエンザウイルスに対してブタを免疫する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｃ）に基づき、２０１７年１２月１８日に提出された仮出願米国出願番号６２／６０７，１０１の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、１以上のインフルエンザＡウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をコードするベクターおよび／または核酸構築物に関する。本発明はさらに、これらのベクターおよび／または核酸構築物を含むインフルエンザＡウイルスに対するワクチンに関する。本発明はまた、ワクチンを作製および単独でまたは他の保護剤と組み合わせて使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）は、世界中で人間と動物の健康に大きな負担をかけている。ＯｒｔｈｏｍｙｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーであるＩＡＶは、ウイルスの表面糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて、異なるサブタイプに分類される。ＩＡＶは、家禽、ブタ、馬、猫、犬、海洋哺乳類（例えばクジラ）、コウモリ、人間に感染する。野生の水鳥とシギチドリ（アヒル、ガチョウ、白鳥、カモメ）は自然の貯水池であり、１６の異なるＨＡおよび９の異なるＮＡサブタイプに感染する可能性がある［Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５６：１５２−１７９（１９９２）］。最近２つの新しいサブタイプ、Ｈ１７Ｎ１０とＨ１８Ｎ１１がコウモリで確認された［Ｔｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． １０９（１１）：４２６９−４２７４（２０１２）、および、Ｍｅｈｌｅ、Ｖｉｒｕｓｅｓ  ６（９）：３４３８−３４４９（２０１４）］。ウイルスの種間感染は、野生の水鳥と飼育水鳥の間、およびブタとヒトの間で最も頻繁に発生する［Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖｉｎｃｅｎｔ、２３（３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４２−１５３（２０１５）］。ＩＡＶに感染した哺乳類は、エアロゾルのウイルス感染を引き起こす急性呼吸器疾患を示す。水鳥や家禽では、ウイルスは気道と腸管の両方で複製され、糞便から経口経路で拡散する。
【０００４】
そのようなＩＡＶの１つであるブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ−Ｓ）は、家畜のブタの深刻な呼吸器病原体であり、特に世界中の畜産業で経済的にコストがかかることが証明されている［Ｈｏｌｔｋａｍｐら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ（２００７）］。さらに、ブタ起源のインフルエンザウイルスの人間への伝染は十分に文書化されており、重大な公衆衛生上の脅威であるため、ブタの群れでインフルエンザＡウイルスを制御するインセンティブがさらに高まる［Ｋｒｕｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒａｙ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７０：２０１−２２５（２０１３）］。
【０００５】
この問題に対応して、多くの養豚農家は、今日市販のワクチンを使用して、ＩＡＶ−Ｓに対してブタにワクチンを接種している。しかし、多くの多様なＩＡＶ−Ｓ株が野外で循環し、進化し続けるため、従来のワクチンでＩＡＶ−Ｓを制御することは困難である［Ｇａｏら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９８（８）：２００１−２０１０（２０１７）］。ＩＡＶ−Ｓの多様性と変異性は、ウイルスの遺伝子構造によって引き起こされる。他のインフルエンザＡウイルスと同様に、ＩＡＶ−Ｓには、ＲＮＡの８つのセグメントにコードされた遺伝子と、頻繁な変異を導入するゲノム複製機構を有する。これらの遺伝的特性により、ＩＡＶ−Ｓは、以前の株への曝露によって誘発された既存の中和抗体からの逃避を含め、迅速な適応を可能にする。その結果、米国市場で市販されている不活化ウイルスＩＡＶ−Ｓワクチンは、連続的な抗原漂流の結果として発生する新たに出現する菌株のために、最大５つの異なるＩＡＶ−Ｓ菌株を含むにもかかわらず不十分であることが判明した。
【０００６】
インフルエンザＡウイルスの分類は、ウイルス表面の２つの主要な糖タンパク質であるＨＡとＮＡのサブタイピングから始まる。ＨＡタンパク質は、ウイルスの宿主細胞への付着と融合を仲介する。ＨＡに結合する抗体は、ウイルスの付着、ウイルスの複製を阻止し、そして、疾患を軽減または予防する。ノイラミニダーゼは、新たに形成されたウイルス粒子を宿主細胞から切断することによってインフルエンザウイルス複製サイクルの最終段階で機能する酵素であり、それによって新しい子孫ウイルスが他の細胞に広がり感染することを可能にする。ＮＡに結合する抗体は、その酵素活性を制限し、それにより特定の動物モデルでウイルスの拡散レベルと疾患の重症度を低下させることができる。
【０００７】
ヒトインフルエンザＡは、通常特定のインフルエンザシーズン中に世界中で１つまたは２つの優勢株を循環させるが、ＩＡＶ−Ｓのより多くの菌株が同時に循環し、これらの菌株は地域によって異なる。ＩＡＶ−Ｓ株は抗原的に可変であり、ＨＡのＨ１またはＨ３サブタイプ、およびＮＡのＮ１またはＮ２サブタイプを主に含む。ＩＡＶ−Ｓの各ＨＡおよびＮＡサブタイプ内には、さらに系統学的多様性がある。米国のブタの個体群には、Ｈ１の４つの優勢な系統発生クラスター（ガンマ、デルタ１、デルタ２、パンデミック）、Ｈ３の２つの優勢なクラスター（クラスターＩＶおよびヒト−様）、Ｎ１の２つの優勢なクラスター（古典的、パンデミック）、およびＮ２の２つの優勢なクラスター（Ｎ２−１９９８およびＮ２−２００２）がある［Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ７（補足４）、４２−５１（２０１３）；および、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ｍＳｐｈｅｒｅ  １（６）ｅ００２７５−１６：１−１４（２０１６）］。ヨーロッパには、Ｈ１の３つの主要な系統（ユーラシアトリ様Ｈ１、スコットランド／４１０４４０／１９９４様Ｈ１およびパンデミック２００９様Ｈ１）、Ｈ３の１つの主要な系統（ゲント／１／１９８４様Ｈ３）、Ｎ１の２つの主要な系統（ユーラシアトリ様Ｎ１、パンデミック２００９様Ｎ１）、Ｎ２の２つの主要な系統（Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｎ２、スコットランド／４１０４４０／１９９４様Ｎ２）、およびＮ２の２つのマイナーな系統（イタリア／４６７５／２００３様Ｎ４、ヒト季節様Ｎ２）［Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８９：９９２０−９９３１（２０１５）；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０−１５］がある。
【０００８】
特定の病原体から保護するために、ワクチンには長年にわたってベクターベースの戦略が数多く採用されてきた。そのようなベクター戦略の１つには、アルファウイルス由来のレプリコンＲＮＡ粒子（ＲＰ）の使用が含まれる［Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｅｅｎら、Ａｎｉｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１３（１）：１−９、（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１；Ｋａｍｒｕｄら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ。、９１（Ｐｔ  ７）：１７２３−１７２７（２０１０）］、これは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１（１９９７）］、Ｓｉｎｄｂｉｓ（ＳＩＮ）［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６４３９−６４４６（１９９３）］、およびＳｅｍｌｉｋｉを含むフォレストウイルス（ＳＦＶ）［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｇａｒｏｆｆ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６−１３６１（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発された。ＲＰワクチンは、増殖不全のアルファウイルスＲＮＡレプリコンを宿主細胞に送達し、ｉｎ  ｖｉｖｏで目的の抗原性導入遺伝子の発現を起こす［Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９（２）：３８９−４０１（１９９７）］。一部の従来のワクチン製剤と比較した場合、ＲＰは魅力的な安全性と有効性のプロファイルを有する［Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｅｅｎら、Ａｎｉｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１３（１）：１−９、（２０１２）］。ＲＰプラットフォームは、病原性抗原をコード化するために使用されており、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ承認ワクチンの基礎となっている。
【０００９】
上記のように、家畜のブタで使用できる市販のＩＡＶ−Ｓワクチンは、抗原が野外を循環する現代のすべての株と一致しないため、群れを保護できないことがよくある［Ｌｅｅら、Ｃａｎ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ  ７１（３）：２０７−１２（２００７）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（１５）：２７８２−２７８７（２０１０）］。不活化ウイルス抗原の従来のプラットフォームは、進行中のウイルス抗原ドリフトに応じてワクチン株を迅速に更新する能力を制限する規制および製造要因によって制約されている。従来の不活化ウイルスＩＡＶ−Ｓワクチンでは、ウイルス株の選択はＨＡ抗原の特性に基づいている。免疫応答の血清学的評価も同様に、そのＨＡに対する抗体の測定に焦点を当てている。ＨＡ抗原に対する同じ強さは、ヒト並びに他のインフルエンザ感受性動物種（例えばトリ、ウマ、イヌ）向けに市販されている商業的に不活性化されたインフルエンザウイルスワクチンにも当てはまる。ＨＡ阻害（ＨＩ）抗体価を誘発するＩＡＶ−Ｓワクチンは、抗原的に類似した菌株による実験的感染からブタを保護する［Ｋｙｒｉａｋｉｓら、Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４４（１−２）：６７−７４（２０１０）］。しかしながら、ＨＡ遺伝子の比較的急速な遺伝的ドリフトにより、ワクチン誘発ＨＡ抗体によって機能的に阻害されない新しい株が出現することができる。
【００１０】
臨床研究では、ＮＡ特異的抗体価とヒトのインフルエンザの罹患率の低下との間に統計的に有意な相関関係があることが示されている［Ｍｅｍｏｌｉら、ＭＢｉｏ  ７（２）：ｅ００４１７−１６、（２０１６）；Ｍｏｎｔｏら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２１２（８）：１１９１−１１９９（２０１５）；Memoliら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２８６（２５）：１３２９−３２（１９７２）］。近交系マウスで行われたさまざまな研究は、ＮＡ固有の免疫がチャレンジ感染から保護できることを示した［Ｂｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３９（２）：２７３−８０（２００５）；Johansson and Kilbourne、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（６）：２３５８−２３６１（１９９４）；Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８９（３）：４５９−４６１（２００４）］。Ｈｅｓｓｅｌら［ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（８）、ｅ１２２１７（２０１０）］は、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡをコードする組換えポックスウイルスベクターを含むワクチンが、ウイルスチャレンジに対するマウスの保護を部分的に誘導できることを示したが、ポックスウイルスベクターのＮＡは、対応するＨＡ遺伝子をコードする同等のワクチンよりも効果が低かった。しかし重要なのは、インフルエンザの動物モデルとしてのマウスの使用は、ワクチンの有効性の信頼できる予測因子とみなすことはできず、これは、ブタ、鳥類、および人間とは異なり、マウスはインフルエンザＡウイルスの自然な宿主ではないためである［Ｂｏｄｅｗｅｓら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９（１）：５９−７２（２０１０）；Ｔｒｉｐｐ  ａｎｄ  Ｔｏｍｐｋｉｎｓ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３３：３９７−４１２（２００９）；Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｅｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０（１１）：１９４４−１９５０（２０１２）］。実際、ウイルス株は最初にマウスで成長するように適応させる必要があり、というのも、この種はもともとインフルエンザＡウイルス感染の影響を受けにくいためである。したがって、病因および疾患は体重減少および死亡率によって表され、これは自然宿主に使用される感染パラメーターとは異なる。
【００１１】
インフルエンザの自然宿主種であるニワトリでも、ウイルス感染を誘発したチャレンジ感染に対するＮＡワクチンを使用して類似の研究が行われた。ニワトリのＮＡ免疫は感染に対する部分的な防御のみを与え、同等のベクター化されたＨＡワクチンによって誘発されるものよりもはるかに堅牢性が低かった［Ｎａｙａｋら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４（５）：２４０８−２４２０（２０１０）；Ｐａｖｌｏｖａら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７（５）：７７３−７８５（２００９）；Ｓｙｌｔｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５（１９）：３７６３−７２（２００７）］。同様の結果が別の自然に感染しやすいインフルエンザ宿主であるフェレットで報告され、可溶性組換えＮＡおよび／またはＨＡタンパク質でワクチン接種され、その後ウイルスチャレンジが行われた［Ｂｏｓｃｈら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４（１９）：１０３６６−１０３６７４（２０１０）］。これらのデータを総合すると、ＮＡ免疫は、より重要なＨＡ免疫に対して補足的または補完的な役割を果たすことができるだけであることを意味する。実際、赤血球凝集素抗原が存在しない場合、ノイラミニダーゼインフルエンザＡウイルスワクチンは、インフルエンザＡ感染から保護するか、インフルエンザＡウイルスによって誘発される疾患から保護するのに十分な効力がないようである。
【００１２】
単一の発表された研究では、ブタのウイルスチャレンジ感染に対する弱毒化狂犬病ウイルス（ＰｒＶ）媒介ＮＡワクチンをテストした［Ｋｌｉｎｇｂｅｉｌら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １９９：２０−３０（２０１５）］。特に、ＰｒＶ−ＮＡをＰｒＶ−ＨＡに含めることでは、ＰｒＶ−ＨＡ自体によって引き起こされる保護を大幅に改善することはなかった。この研究のデータは、ＰｒＶ−ＮＡワクチンが、単独で投与された場合でも、ＰｒＶ−ＨＡワクチンと同時投与された場合でも、ＮＡタンパク質に対する血清抗体を誘導したことを示していた。しかし、抗体が生成されているにもかかわらず、ＮＡワクチンを接種したブタは、ウイルス複製の程度の非常にわずかな減少しか示さなかった（単一サンプルの１日のみで、感染後４日で統計的に有意に）。予想どおり、ＰｒＶ−ＨＡベクターのみでワクチン接種されたブタはＨＩ抗体応答を誘導したが、これらの応答はウイルス排出のより顕著な減少と相関していた（感染後２〜６日で統計的に有意に）。実際、これまで対応する赤血球凝集素抗原の非存在下でインフルエンザＡノイラミニダーゼ抗原を含むおよび／またはコードするＩＡＶ−ＳワクチンがブタをＩＡＶ−Ｓ感染から適切に保護できることを示す研究は発表されていない。
【００１３】
本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５６：１５２−１７９（１９９２）
【非特許文献２】Ｔｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． １０９（１１）：４２６９−４２７４（２０１２）
【非特許文献３】Ｍｅｈｌｅ、Ｖｉｒｕｓｅｓ  ６（９）：３４３８−３４４９（２０１４）
【非特許文献４】ＮｅｌｓｏｎおよびＶｉｎｃｅｎｔ、２３（３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４２−１５３（２０１５）
【非特許文献５】Ｈｏｌｔｋａｍｐら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ（２００７）
【非特許文献６】ＫｒｕｅｇｅｒおよびＧｒａｙ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７０：２０１−２２５（２０１３）
【非特許文献７】Ｇａｏら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９８（８）：２００１−２０１０（２０１７）
【非特許文献８】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ７（補足４）、４２−５１（２０１３）
【非特許文献９】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ｍＳｐｈｅｒｅ  １（６）ｅ００２７５−１６：１−１４（２０１６）
【非特許文献１０】Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８９：９９２０−９９３１（２０１５）；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０−１５
【非特許文献１１】Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｅｅｎら、Ａｎｉｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１３（１）：１−９、（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１
【非特許文献１２】Ｋａｍｒｕｄら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ。、９１（Ｐｔ  ７）：１７２３−１７２７（２０１０）
【非特許文献１３】Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１（１９９７）
【非特許文献１４】Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６４３９−６４４６（１９９３）
【非特許文献１５】ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６−１３６１（１９９１）
【非特許文献１６】Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９（２）：３８９−４０１（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明は、１以上のインフルエンザＡウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をコードするベクターおよび／または核酸構築物を提供する。これらのベクターおよび／または核酸構築物は、これらのベクターを含む免疫原性組成物において使用され得る。本発明の免疫原性組成物は、インフルエンザＡウイルスに対するワクチン接種された対象（例えば、ヒト、コンパニオンアニマル、または家畜）の保護を補助し、例えば、インフルエンザＡウイルス感染の防止を補助するワクチンにおいて使用され得る。特定の実施形態では、インフルエンザＡ型ウイルスに由来する１以上のＮＡを含む本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片も、インフルエンザＡ型ウイルスＨＡまたはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まない。
【００１６】
特定の実施形態では、１以上のヒトインフルエンザＡウイルスＮＡ抗原をコードするベクターおよび／または核酸構築物が提供される。他の実施形態では、ベクターおよび／または核酸構築物は、１以上のイヌインフルエンザウイルスＮＡ抗原をコードする。さらに他の実施形態では、ベクターおよび／または核酸構築物は、１以上のウマインフルエンザウイルスＮＡ抗原をコードする。さらに他の実施形態では、ベクターおよび／または核酸構築物は、１以上のトリインフルエンザウイルスＮＡ抗原をコードする。さらに他の実施形態では、ベクターおよび／または核酸構築物は、１以上のウシインフルエンザウイルスＮＡ抗原をコードする。特定の実施形態では、ベクターおよび／または核酸構築物は、２〜４のインフルエンザウイルスＮＡ抗原をコードする。
【００１７】
特定の実施形態では、ベクターは、インフルエンザＡウイルスに由来する１以上の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、１以上のインフルエンザＡウイルスＮＡをコードする。関連する実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、１以上のインフルエンザＡウイルスＮＡの１以上の抗原断片をコードする。本発明はまた、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ−Ｓ）に由来する１以上の抗原をコードする他のベクターおよび／または核酸構築物を含む。特定の実施形態では、ベクターおよび／または核酸構築物はまた、１以上のＩＡＶ−Ｓノイラミニダーゼ抗原（ＮＡ）をコードし得る。関連する実施形態において、ベクターおよび／または核酸構築物は、１以上のＮＡの１以上のＩＡＶ−Ｓ抗原性断片をコードし得る。
【００１８】
本発明の１つの重要な局面において、１以上のブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ−Ｓ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をコードするベクターおよび／または核酸構築物が提供される。このようなベクターおよび／または核酸構築物は、これらのベクターを含む免疫原性組成物において使用され得る。本発明の免疫原性組成物は、ＩＡＶ−Ｓに対するワクチン接種されたブタ対象（例えば、雌ブタおよび／または子ブタ）の保護を補助し、例えば、ブタインフルエンザウイルス感染の防止を補助するワクチンにおいて使用され得る。特定の実施形態では、本発明のＩＡＶ−Ｓに由来する１以上のＮＡを含む免疫原性組成物およびワクチンは、ＩＡＶ−Ｓ  ＨＡまたはその抗原性断片を含まず、また、ＩＡＶ−Ｓ  ＨＡまたはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まない。本発明はさらに、ＩＡＶ−Ｓおよび他の疾患、例えば他のブタ感染症に対する防御免疫を誘発するための混合ワクチンを提供する。本発明の免疫原性組成物およびワクチンを作製および使用する方法も提供される。
【００１９】
より具体的な実施形態では、ベクターは、ＩＡＶ−Ｓに由来する１以上の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、１以上のＩＡＶ−Ｓ  ＮＡをコードする。関連する実施形態において、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、１以上のＩＡＶ−Ｓ  ＮＡの１以上の抗原性断片をコードする。特定の実施形態では、本発明のＩＡＶ−Ｓに由来する１以上のＮＡをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ−Ｓ  ＨＡまたはその抗原性断片を含まず、ＩＡＶ−Ｓ  ＨＡまたはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まない。
【００２０】
特定の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ１−古典的系統発生クラスターに由来する。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターに由来するＮＡの抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターに由来する。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターに由来するＮＡの抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターに由来する。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターに由来するＮＡの抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−２００２系統発生クラスターに由来する。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−２００２系統発生クラスターに由来するＮＡの抗原性断片をコードする。
【００２１】
類似の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統からのＮＡ（抗原性断片）に由来し、コードする。類似の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−ユーラシアトリ系統のＮＡ（その抗原性断片）に由来し、コードする。
【００２２】
類似の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（の抗原性断片）は、Ｎ２−ゲント／１９８４系統のＮＡに由来し、コードする。別の類似の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−イタリア／２００３系統のＮＡ（の抗原性断片）に由来し、コードする。さらに類似した実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−スコットランド／１９９４系統からのＮＡ（の抗原性断片）に由来し、コードする。このタイプの特定の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−スコットランド／１９９４系統（クレード１）からのＮＡ（の抗原性断片）に由来し、コードする。
【００２３】
このタイプの他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−スコットランド／１９９４系統（クレード２）からのＮＡ（の抗原性断片）に由来し、コードする。このタイプのさらに他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２と同様に、Ａ／ブタ／イタリア／４６７５／２００３からのＮＡ（の抗原性断片）に由来し、コードする。このタイプのさらに他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２のようなヒト季節性由来のＮＡ（の抗原性断片）に由来し、コードする。
【００２４】
特定の実施形態では、Ｎ１−古典的系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列と９５％同一性、９７％同一性、９８％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらに特定の実施形態では、ＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施形態では、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号４のアミノ酸配列と９５％同一性、９７％同一性、９８％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらに特定の実施形態では、ＮＡは、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号６のアミノ酸配列と９２％同一性、９４％同一性、９７％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、Ｎ２−２００２系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号８のアミノ酸配列と９２％同一性、９４％同一性、９７％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらに特定の実施形態では、ＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２５】
特定の実施形態では、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１１のヌクレオチド配列によってコードされる。このタイプの関連する実施形態では、ＮＡは、配列番号２３のヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施形態では、Ｎ１−ユーラシアトリ系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号１４のアミノ酸配列と８５％同一性、９０％同一性、９５％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、Ｎ２−ゲント／１９８４系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号１６のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらに特定の実施形態では、ＮＡは、配列番号１５のヌクレオチド配列によってコードされる。このタイプの関連する実施形態では、ＮＡは、配列番号２４のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、Ｎ２−イタリア／２００３系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号１８のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらに特定の実施形態では、ＮＡは、配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる。このタイプの関連する実施形態では、ＮＡは、配列番号２５のヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施形態では、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号２０のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらに特定の実施形態では、ＮＡは、配列番号１９のヌクレオチド配列によってコードされる。このタイプの関連する実施形態では、ＮＡは、配列番号２６のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号２２のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらに特定の実施形態では、ＮＡは、配列番号２１のヌクレオチド配列によってコードされる。このタイプの関連する実施形態では、ＮＡは、配列番号２７のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２６】
さらに特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらにより具体的な実施形態では、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＴＣ−８３  ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、シンドビス（ＳＩＮ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、セムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。代替の実施形態では、裸のＤＮＡベクターは、ブタの病原体に由来する１以上の抗原をコードする核酸構築物を含む。このタイプの特定の実施形態では、裸のＤＮＡベクターは、ＩＡＶ−Ｓまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする核酸構築物を含む。さらに他の実施形態では、裸のＲＮＡベクターは、ブタ病原体に由来する１以上の抗原をコードする核酸構築物を含む。このタイプの特定の実施形態では、裸のＲＮＡベクターは、ＩＡＶ−Ｓまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする核酸構築物を含む。
【００２７】
本発明は、２以上のＩＡＶ−Ｓ抗原またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を提供する。特定の実施形態では、本発明のＩＡＶ−Ｓに由来する１以上のＮＡをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ−Ｓ  ＨＡまたはその抗原性断片を含まず、ＩＡＶ−Ｓ  ＨＡまたはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列もコードしない。
【００２８】
特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ−Ｓまたはその抗原性断片に由来する２〜４またはそれ以上のＮＡ抗原をコードする。関連する実施形態において、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、異なるＩＡＶ−Ｓ系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来する２〜４以上のＮＡ抗原をコードする。特定の実施形態において、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。他の態様において、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−１９９８系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ１汎流行性系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。
【００２９】
特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ１−ユーラシアトリ系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−ゲント／１９８４系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−イタリア／２００３系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−ゲント／１９８４系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−ゲント／１９８４系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−イタリア／２００３系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−イタリア／２００３系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、ヨーロッパＮ１系統の１つまたはその抗原性断片に由来するＮＡは、ヨーロッパＮ２系統の１つまたはその抗原性断片に由来するＮＡとともにアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子にコードされている。同様に、本発明は、３、４、またはそれ以上のＮＡをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、各ＮＡは異なるヨーロッパ系統に由来する。さらに、本発明は、２、３、４、またはそれ以上のＮＡをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、各ＮＡは、異なるヨーロッパ系統および／または系統発生クラスターに由来する。
【００３０】
したがって、本発明はさらに、３または４のＩＡＶ−Ｓ抗原またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を提供する。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＩＡＶ−Ｓまたはその抗原性断片に由来する３または４のＮＡ抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。関連する実施形態において、免疫原性組成物は、異なるＩＡＶ−Ｓ系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来する３または４のＮＡ抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、Ｎ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、およびＮ２−１９９８系統発生クラスターまたはその抗原性断片をコードする。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、Ｎ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、およびＮ１−パンデミック系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、およびＮ１−パンデミック系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターまたはその抗原性フラグメントに由来するＮＡ、およびＮ１−パンデミック系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。
【００３１】
特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、４以上のＩＡＶ−Ｓ  ＮＡ抗原またはその抗原性断片をコードする。より具体的な実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、異なるＩＡＶ−Ｓ系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来する４以上のＮＡ抗原をコードする。さらに特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、およびＮ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。
【００３２】
上で概説した類似の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ−Ｓ  Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統、Ｎ１−ユーラシアトリ系統、ＮＡ系統、Ｎ２−ゲント／１９８４系統、Ｎ２−イタリア／２００３系統、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統、および／または、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統に由来する３つ、４つ、またはそれ以上のＩＡＶ−Ｓ  ＮＡ抗原またはその抗原性断片をコードする。
【００３３】
上記のように、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子はすべて、免疫原性組成物および／またはワクチンの成分であり得る。したがって、本発明の免疫原性組成物および／またはワクチンは、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の１以上を含むことができる。特定の実施形態では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、単一セットの同一のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子のみを含み、これは、上記で詳述したように、１以上の系統発生クラスターおよび／または１以上の系統に由来する１以上のＮＡをコードできる。
【００３４】
このタイプのより具体的な実施形態では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、Ｎ１系統発生クラスターに由来するＮＡ（またはその抗原断片）およびＮ２系統発生クラスターに由来するＮＡ（またはその抗原断片）の両方をコードするＲＮＡレプリコン粒子を含む。特に、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ＲＮＡレプリコンを含み、第１のＮＡは、Ｎ１−古典的およびＮ１−パンデミック系統発生クラスターの群から選択されるＮ１系統発生クラスターのものであり、第２のＮＡは、Ｎ２−１９９８−およびＮ２−２００２系統発生クラスターからなる群から選択されるＮ２−系統発生クラスターのものである。
【００３５】
このタイプの特定の実施形態では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ＲＮＡレプリコンを含み、ここで、最初のＮＡはＮ１−パンデミック（ＥＵ）およびＮ１−ユーラシアトリ系統からなる群から選択されるＮ１系統のものであり、第２のＮＡは、Ｎ２−ゲント／１９８４−、Ｎ２−イタリア／２００３、Ｎ２−スコットランド１９９４（クレード１）系統、およびＮ２−スコットランド１９９４（クレード２）系統よりなる群から選択されるＮ２系統のものである。
【００３６】
本発明はさらに、そのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の２以上の組を含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。このタイプの特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の１つの組は、１つの系統発生クラスターおよび／または系統に由来する１以上のＮＡをコードし、一方、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の別の組は、別の系統発生クラスターおよび／または系統に由来する１つ以上のＮＡをコードする。
【００３７】
このタイプの特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第１組は、Ｎ１系統発生クラスターおよび／または系統、またはその抗原性断片に由来する１以上のＮＡ抗原をコードし、そして、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第２の組は、Ｎ２系統発生クラスターおよび／または系統、またはその抗原性断片に由来する１以上のＮＡ抗原をコードする。特に、最初の組では、ＮＡ抗原（またはその断片）は、Ｎ１−古典的およびＮ１−パンデミック系統発生クラスターからなるグループから選択されたＮ１系統発生クラスターであり、第２の組では、ＮＡ抗原（またはその抗原断片）は、Ｎ２−１９９８−およびＮ２−２００２系統発生クラスターからなる群から選択されるＮ２−系統発生クラスターである。
【００３８】
同様に、第１組の並行する実施形態では、ＮＡ抗原（またはその断片）は、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）およびＮ１−ユーラシアトリ系統からなる群から選択されるＮ１系統の系統であり、そして第２組では、ＮＡ抗原（またはその抗原性断片）は、Ｎ２−ゲント／１９８４、Ｎ２−イタリア／２００３  −Ｎ２−スコットランド１９９４（クレード１）系統、およびＮ２−スコットランド１９９４（クレード２）系統からなる群から選択されるＮ２系統のものである。
【００３９】
さらに他の実施形態では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、第１の抗原をコードする第１組のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、別の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の別の組、および、第３の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第３組を含む。より具体的には、免疫原性組成物および／またはワクチンにおいて、抗原は、Ｎ１−古典的−、Ｎ１−パンデミック−、Ｎ２−１９９８−およびＮ２−２００２系統発生クラスターからなる群から選択される系統発生クラスターのＮＡ−抗原のいずれかであり、または、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）−、Ｎ１−ユーラシアトリ、Ｎ２−ゲント／１９８４−、Ｎ２−イタリア／２００３、Ｎ２−スコットランド１９９４（クレード１）からなる群から選択される系統のＮＡ抗原のいずれかである。
【００４０】
このタイプの特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の最初の組は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードし、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第２の組は、Ｎ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードし、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第３組は、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。
【００４１】
さらに他の実施形態では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、第１の抗原をコードする第１の組のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、第２の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の別の組、第３の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第３の組、および第４の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第４の組を含む。
【００４２】
より特定には、免疫原性組成物および／またはワクチンにおいて、抗原は、Ｎ１−古典的系統発生クラスター、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスター、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターおよびＮ２−２００２系統発生クラスターからなる群から選択される系統発生クラスターのいずれかのＮＡ抗原であり、または、それらは、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統、Ｎ１−ユーラシアトリ系統、Ｎ２ゲント／１９８４系統、Ｎ２イタリア／２００３系統、Ｎ２−スコットランド１９９４（クレード１）系統およびＮ２−スコットランド１９９４（クレード２）系統からなる群から選択される系統のＮＡ抗原である。
【００４３】
このタイプの特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第１組は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードし、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第２の組は、Ｎ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードし、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第３の組は、Ｎ２  １９９８系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードし、そして、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の第４組は、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。
【００４４】
したがって、本発明の一態様では、免疫原性組成物／ワクチンは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の複数の組（例えば、２−１０）を含む。このタイプの特定の実施形態では、１以上の組は、１以上の系統発生クラスター（またはその抗原性断片）または系統（またはその抗原性断片）に由来する１以上のＩＡＶ−Ｓ  ＮＡをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。このタイプの特定の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の系統発生クラスターまたは（またはその抗原性断片）または系統（またはその抗原性断片）に由来する１以上のＩＡＶ−Ｓ  ＮＡをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の１以上の組を含み、１以上の非ＩＡＶ−Ｓ抗原またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の１以上の組と組み合わされる。さらに特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の１以上の組は、１以上の系統発生クラスター（またはその抗原性断片）または系統（またはその抗原性断片）に由来する１以上のＩＡＶ−Ｓ  ＮＡ、および、１以上をコードするより多くの非ＩＡＶ−Ｓ抗原またはその抗原性断片の両方をコードする。このタイプの特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡおよび／またはＮ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡを、１〜３個の非ＩＡＶ−Ｓ抗原またはその抗原性断片とともにコードする。
【００４５】
特定の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）に由来する。他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ブタ偽狂犬病ウイルス（ＰＰＲＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ブタロタウイルス（ＰＲＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）に由来する。さらに他の実施形態では、１以上の非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、パスツレラ・マルトシダの１以上の血清型に由来する。さらに他の実施形態では、１以上の非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、サルモネラ属の１以上の血清型に由来する。さらに他の実施形態では、１以上の非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、大腸菌の１以上の血清型に由来する。さらに他の実施形態では、１以上の非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ヘモフィルスパラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）の１以上の血清型に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ローソニアイントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、マイコプラズマ属（例えば、マイコプラズマ  ハイオニューモニエ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、丹毒属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ  ｓｓｐ．）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、アクチノバシルスプルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に由来する。さらに他の実施形態では、非ＩＡＶ−Ｓ抗原は、クロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に由来する。
【００４６】
より特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらにより具体的な実施形態では、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＴＣ−８３  ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。
【００４７】
本発明はさらに、上記のように、ＩＡＶ−Ｓに由来する１以上のＮＡまたはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、さらに１以上の改変された生／弱毒化または死滅ブタ病原体を含む免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチン）の組み合わせを提供する。上記のように、ＩＡＶ−Ｓに由来する１以上のＮＡまたはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む、免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチン）の組み合わせを提供する。さらに、１以上の改変された生／弱毒化または死滅ブタ病原体を含む。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ＰＲＲＳウイルスをさらに含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ＰＣＶをさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ＴＧＥをさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ＰＰＲＶをさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ＰＰＶをさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ＰＲＶをさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ＰＥＤをさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）の１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅血清型をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、サルモネラ属の１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅血清型をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、大腸菌の１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅血清型をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ヘモフィルス・パラシュイ（Haemophilus parasuis）をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅ローソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅マイコプラズマ属をさらに含む（例えば、マイコプラズマハイオニューモニエ）（Mycoplasma hyopneumoniae）。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅気管支敗血症菌をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅丹毒菌種をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅カンピロバクター属（Campylobacter ssp）をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅アクチノバチルス・プレウロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１���上の改変された生／弱毒化および／または死滅クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）をさらに含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の改変された生／弱毒化および／または死滅クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）をさらに含む。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明の核酸構築物は、ＩＡＶ−Ｓ系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来する１以上のＮＡ抗原をコードする。したがって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は以下に具体的に例示されているが、本発明は、他のベクターおよび／または核酸構築物をさらに含むことを理解されたい。
【００４９】
したがって、特定の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡをコードする。他の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターに由来するＮＡの抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターに由来する。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターに由来するＮＡの抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターに由来する。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターに由来するＮＡの抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−２００２系統発生クラスターに由来する。さらに他の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ２−２００２系統発生クラスターに由来するＮＡの抗原性断片をコードする。
【００５０】
類似の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統由来のＮＡに由来する。類似の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ１−ユーラシアトリ系統由来のＮＡに由来する。類似の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−ゲント／１９８４系統からのＮＡに由来する。別の類似の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−イタリア／２００３系統に由来する。さらに類似した実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−スコットランド／１９９４系統に由来する。このタイプの特定の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−スコットランド／１９９４系統（クレード１）に由来する。このタイプの他の実施形態では、ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、Ｎ２−スコットランド／１９９４系統（クレード２）に由来する。
【００５１】
特定の実施形態では、Ｎ１−古典的系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列と９５％同一性、９７％同一性、９８％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号４のアミノ酸配列と９５％同一性、９７％同一性、９８％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号６のアミノ酸配列と９２％同一性、９４％同一性、９７％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、Ｎ２−２００２系統発生クラスターに由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号８のアミノ酸配列と９２％同一性、９４％同一性、９７％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号１２のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｎ１−ユーラシアトリ系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号１４のアミノ酸配列と８５％同一性、９０％同一性、９５％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、Ｎ２−ゲント／１９８４系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号１６のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性、またはそれ以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、Ｎ２−イタリア／２００３系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号１８のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号２０のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統に由来するＩＡＶ−Ｓ  ＮＡは、配列番号２２のアミノ酸配列と９０％同一性、９２％同一性、９５％同一性以上を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＮＡは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
本発明は、２以上のＩＡＶ−Ｓ抗原またはその抗原性断片をコードする核酸構築物を提供する。特定の実施形態では、核酸構築物は、ＩＡＶ−Ｓまたはその抗原性断片に由来する２〜４つまたはそれ以上のＮＡ抗原をコードする。関連する実施形態では、核酸構築物は、異なるＩＡＶ−Ｓ系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来する２〜４つまたはそれ以上のＮＡ抗原をコードする。特定の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに特定の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ２−２００２系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、Ｎ２−１９９８系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡ、およびＮ１−古典的系統発生クラスターまたはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。
【００５４】
特定の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ１−ユーラシアトリ系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。他の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ２−ゲント／１９８４系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−イタリア／２００３系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ２−ゲント／１９８４系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ２−ゲント／１９８４系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ２−イタリア／２００３系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、核酸構築物は、Ｎ２−イタリア／２００３系統またはその抗原性断片に由来するＮＡおよびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統またはその抗原性断片に由来するＮＡをコードする。さらに他の実施形態では、ヨーロッパＮ１系統の１つまたはその抗原性断片に由来するＮＡは、ヨーロッパＮ２系統の１つまたはその抗原性断片に由来するＮＡと同じ核酸構築物にコードされる。同様に、本発明は、３つ、４つ、またはそれ以上のＮＡをコードする核酸構築物を含み、各ＮＡは異なるヨーロッパ系統に由来する。さらに、本発明は、２、３、４、またはそれ以上のＮＡをコードする核酸構築物を含み、各ＮＡは、異なるヨーロッパ系統および／または系統発生クラスターに由来する。
【００５５】
したがって、本発明はまた、本発明のすべてのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、本発明の核酸構築物を含む裸のＤＮＡベクター、本発明の核酸構築物を含む裸のＲＮＡベクター、合成メッセンジャーＲＮＡ、およびＲＮＡレプリコンを含む本発明の核酸構築物を含み、並びに、本発明の核酸構築物（例えば、合成メッセンジャーＲＮＡ、ＲＮＡレプリコン）、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、裸のＲＮＡベクター、および／または裸のＤＮＡベクターを含むすべての免疫原性組成物および／またはワクチンを含む。
【００５６】
本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物を含むワクチン（多価）ワクチンを含む。特定の実施形態では、ワクチンは非アジュバント化ワクチンである。他の実施形態では、ワクチンはアジュバントを含む。特定の実施形態では、アジュバントは生分解性油である。このタイプの特定の実施形態では、生分解性油は酢酸ｄｌ−α−トコフェリル（酢酸ビタミンＥ）である。他の実施形態では、アジュバントは、２．５％〜５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。特定の実施形態では、アジュバントは、２．５％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。関連する実施形態では、アジュバントは、５％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンである。他の実施形態では、アジュバントは、１２．５％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。さらに他の実施形態では、アジュバントは、２５％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。さらに他の実施形態では、アジュバントは、５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。より具体的な実施形態では、アジュバントは、生分解性油と鉱油アジュバントとの混合物を含む。特定の実施形態では、生分解性油はｄｌ−α−酢酸トコフェリルであり、鉱油は流動パラフィンである。より具体的な実施形態では、生分解性油はｄｌ−α−酢酸トコフェリルであり、鉱油は軽質流動パラフィンである。
【００５７】
特定の実施形態では、ワクチンは、ＩＡＶ−Ｓに起因する疾患の予防を補助する。関連する実施形態では、ブタがワクチンで免疫されたとき、ブタ対象において抗体が誘導される。特定の実施形態では、ブタ対象は雌ブタである。関連する実施形態において、ワクチンは、ワクチン接種された雌ブタの子孫に対する防御的母体抗体を提供する。他の実施形態では、ブタ対象は子ブタである。このタイプの特定の実施形態では、ワクチンは早ければ３日齢の子ブタに投与される。特定の実施形態では、ワクチンはブースター免疫ワクチンとして投与される。特定の実施形態では、ワクチンは単回投与ワクチンとして投与される。このタイプの特定の実施形態では、ワクチンはブースターワクチンとして投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは複数回投与ワクチンとして投与される。このタイプの特定の実施形態では、ワクチンは２回投与ワクチンとして投与される。
【００５８】
本発明はまた、ブタに、病原体、例えば、ＩＡＶ−Ｓに対して免疫学的有効量のワクチンまたは本発明の多価を投与することを含む、ブタ（例えば、雌ブタまたは子ブタ）を免疫する方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンは筋肉内注射を介して投与される。別の実施形態では、ワクチンは皮下注射を介して投与される。他の実施形態では、ワクチンは静脈内注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは皮内注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは経口投与を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは鼻腔内投与を介して投与される。
【００５９】
したがって、本発明のワクチンおよび多価ワクチンは、プライマーワクチンおよび／またはブースターワクチンとして投与することができる。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、その後の投与を必要とせずに、ワンショットワクチン（１回用量）として投与される。特定の実施形態において、プライマーワクチンおよびブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは、同一の経路により投与され得る。このタイプの特定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは両方とも皮内注射によって投与される。このタイプの他の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは両方とも筋肉内注射によって投与される。代替の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンの投与は、１つの経路によって実施され、ブースターワクチンは別の経路によって実施され得る。このタイプの特定の実施形態では、プライマーワクチンは皮内注射によって投与することができ、ブースターワクチンは経口投与することができる。このタイプの関連する実施形態では、プライマーワクチンは筋肉内注射によって投与することができ、ブースターワクチンは経口投与することができる。このタイプの他の実施形態では、プライマーワクチンは筋肉内注射によって投与することができ、ブースターワクチンは皮内注射によって投与することができる。このタイプのさらに他の実施形態では、プライマーワクチンは皮内注射によって投与することができ、ブースターワクチンは筋肉内注射によって投与することができる。
【００６０】
本発明はさらに、ブタに上記の本発明のワクチンの免疫学的有効量を注射することを含む、ＩＡＶ−Ｓに対してブタ（例えば、雌ブタまたは子ブタ）を免疫する方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンは、例えば、約１×１０４〜約１×１０１０ＲＰまたはそれ以上を含むことができる。より特定の実施形態では、ワクチンは、約１×１０５〜約１×１０９のＲＰを含むことができる。さらに特定の実施形態では、ワクチンは、約１×１０６〜約１×１０８のＲＰを含むことができる。
【００６１】
特定の実施形態では、本発明のワクチンは、０．０５ｍＬ〜３ｍＬの用量で投与される。より特定の実施形態では、投与される用量は、０．１ｍＬから２ｍＬである。さらに特定の実施形態では、投与される用量は、０．２ｍＬから１．５ｍＬである。さらに特定の実施形態では、投与される用量は、０．３から１．０ｍＬである。さらに特定の実施形態では、投与される用量は、０．４ｍＬから０．８ｍＬである。
【００６２】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図および詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、以下の実施例１に記載されるワクチン組成物の４つすべてのＮＡ株に特異的な血清ノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体応答を示す。血清サンプルは、最初のワクチン接種の前（３週齢）、２回目のワクチンの前（６週齢）、およびチャレンジの前（９週齢）に収集された。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、以下の実施例１に記載されるワクチン組成物の投与後のブタの肺病変スコアを示し、（Ａ）Ｈ１−ガンマ−Ｎ１−古典的、または（Ｂ）Ｈ１−デルタ１−Ｎ２−２００２Ａウイルスによる感染に挑戦する。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、以下の実施例１に記載されるワクチン組成物の投与後のブタの鼻腔スワブにおけるウイルス力価を示し、（Ａ）Ｈ１−ガンマ−Ｎ１−古典的、または（Ｂ）Ｈ１−デルタ１−Ｎ２−２００２Ａウイルスである。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、以下の実施例１に記載されているワクチン組成物の投与後のブタの気管支肺胞洗浄液検体におけるウイルス力価を示し、（Ａ）Ｈ１−ガンマ−Ｎ１−古典的、または（Ｂ）Ｈ１−デルタ１−Ｎ２−２００２Ａウイルス、による感染に挑戦する。
【図５】図５は、実施例２に記載されているワクチン組成物のＮ１−古典的株に特異的な血清ノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体応答を示している。血清サンプルは、最初のワクチン接種の前（３週齢）、２回目のワクチン接種の前（７週齢）、およびチャレンジの前（１０週齢）に収集された。
【図６】図６は、実施例２に記載されているワクチン組成物の投与後のブタの肺病変スコアを示し、Ｈ１−ガンマ−Ｎ１−古典的ウイルスによるチャンジ感染である。
【図７】図７は、Ｈ１Ｎ２ウイルス感染５日後の肉眼的肺病変の割合を示す。
【図８】図８は、Ｈ１Ｎ２ウイルスによる感染後の鼻からの排出を示す。
【図９】図９は、ワクチン接種後のＮ２２００２ワクチン画分に対するノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）力価を示す。注：ＤＰＶ＝ワクチン接種後の日数
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明は、１以上のインフルエンザＡウイルス血清型からの１以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする免疫学的有効量の１以上のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンおよび免疫原性組成物を提供する。本発明の一態様では、ワクチンおよび免疫原性組成物は、赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片も、ＨＡまたはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まない。複数のＮＡに基づくインフルエンザＡウイルスワクチンの利点の１つは、ＨＡがないことで、ＮＡはＨＡよりも抗原ドリフトによる影響が少ないため、対応するワクチンがインフルエンザ分離株の数が少ない抗原を含むことができる。これにより、製造コストを節約できるだけでなく、与えられたインフルエンザワクチンの更新に必要な期間を延長できる。加えて、現在市販されているインフルエンザＡウイルスワクチンは不活化インフルエンザウイルスに基づいているため、動物被験者のＮＡ抗体よりもはるかに高い力価のＨＡ抗体を産生するため、動物被験者の子孫の免疫に対する母体抗体の悪影響はＮＡベースのワクチンでは大幅に減少した。
【００６５】
本発明の１つの重要な局面において、１以上のブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ−Ｓ）系統発生クラスターおよび／または系統からの１以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする免疫学的有効量の１以上のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンおよび免疫原性組成物が提供される。本発明の一態様では、ワクチンおよび免疫原性組成物は、ＩＡＶ−Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片も、ＩＡＶ−Ｓ  ＨＡまたはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まない。
【００６６】
上記のように、複数のＮＡに基づくＩＡＶ−Ｓワクチン、およびＨＡの不在により、対応するワクチンがより少ないＩＡＶ−Ｓ分離株からの抗原を含むことが可能になる。これにより、製造コストが節約されるだけでなく、与えられたＩＡＶ−Ｓワクチンの更新に必要な期間が延長される。さらに、現在市販されているＩＡＶ−Ｓワクチンは不活化インフルエンザウイルスに基づいているため、対象動物のＮＡ抗体よりもはるかに高い力価のＨＡ抗体を生成する。子ブタの免疫に対する母体抗体の悪影響は、ノイラミニダーゼベースのワクチンでは大幅に減少するはずである。
【００６７】
本発明をより完全に理解するために、以下の定義が提供される。
【００６８】
説明の便宜のために単数形の用語を使用することは、決してそのように限定することを意図するものではない。したがって、例えば、「ポリペプチド」を含む組成物への言及は、そのようなポリペプチドの１以上への言及を含む。さらに、「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」への言及は、他に示されない限り、複数のそのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への言及を含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「およそ」という用語は、「約」という用語と互換的に使用され、値が示されている値の５０パーセント以内であることを示し、即ち、ミリリットルあたり「約」１ｘ１０８のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む組成物は、ミリリットルあたり５ｘ１０７〜１．５ｘ１０８のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ブタ」（ｐｉｇ）または「ブタ」（ｓｗｉｎｅ）または「ブタ」（ｐｏｒｃｉｎｅ）という用語は、互換的に使用され、他に示されない限り、飼いならされたすべてのブタ種を含む。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「系統発生クラスター」は、系統樹または同じ（同種）祖先へと遡る進化樹にて（同じ枝上に）共に分類されてきている、一連のインフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼである（例５を参照）。米国で見つかったＩＡＶ−Ｓノイラミニダーゼ（ＮＡ）については、Ｎ１の２つの優勢な系統発生クラスターであるＮ１−古典的およびＮ１−パンデミック、Ｎ２の２つの優勢な系統発生クラスターである、Ｎ２−１９９８およびＮ２−２００２がある。Ｎ１の古典的な系統発生クラスターには、Ｈ１Ｎ１の古典的なブタインフルエンザウイルスのＮＡと一緒にグループ化されたＮＡが含まれている。Ｎ１−パンデミック系統発生クラスターには、Ｈ１Ｎ１−パンデミックインフルエンザウイルスに由来するＮＡと一緒にグループ化されたＮＡが含まれている。Ｎ２−１９９８系統発生クラスターには、１９９８年にブタに感染したヒトＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＮＡとグループ化されたＮＡが含まれている。一方、Ｎ２  ２００２系統発生クラスターには、２００２年にブタに感染したヒトＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＮＡとグループ化されたＮＡが含まれている［Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ７（Ｓｕｐｐｌ．４）：４２−５１（２０１３）を参照］。実施例５は、系統発生クラスターの決定を行うための方法論を示している。ＵＳ  ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡ系統発生クラスターＮ１−古典的  Ｎ１−パンデミック  Ｎ２−１９９８、Ｎ２−２００２の場合、対応する代表的なノイラミニダーゼは、以下のそれぞれのアミノ酸配列  配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８を有す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「系統」（ｌｉｎｅａｇｅ）は、類似の（相同）祖先に根ざした進化樹内で（同じ枝に）一緒にグループ化された一連のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼである（下記の実施例６を参照）。これらのグループはヨーロッパのノイラミニダーゼ用に作成されており、米国のウイルスの系統群に類似しているが、同等ではない。系統決定は、以下の実施例６に記載されるように、容易に入手可能なソフトウェア、すなわち、ＭＥＧＡ  Ｘを用いて得ることができる。Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）、Ｎ１−ユーラシアトリ、Ｎ２−ゲント／１９８４、Ｎ２−イタリア／４６７５／２００３、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）、またはＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）のＥＵ  ＩＡＶ−Ｓ  ＮＡ系統については、対応する代表的なノイラミニダーゼは、以下のそれぞれのアミノ酸配列、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、および２２を有する。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「レプリコン」という用語は、存在する場合に細胞培養または動物の宿主で親ウイルスの増殖を成功させることができる１以上の要素（例えば、構造タンパク質のコード配列）を欠く改変ＲＮＡウイルスゲノムを指す。適切な細胞の状況では、レプリコンはそれ自体を増幅し、１以上のサブゲノムＲＮＡ種を生成する可能性がある。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「ＲＰ」と略される「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」という用語は、構造タンパク質、例えばカプシドおよび糖タンパク質にパッケージされたアルファウイルス由来のＲＮＡレプリコンであり、これはまた、例えば、Ｐｕｓｈｋｏら［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９（２）：３８９−４０１（１９９７）］によって記載されているように、アルファウイルスに由来する。レプリコンはアルファウイルスの構造成分（キャプシドや糖タンパク質など）をコードしないため、ＲＰは細胞培養や動物宿主（ヘルパープラスミドや類似の成分なし）で増殖できない。
【００７５】
「非ＩＡＶ−Ｓ」という用語は、病原体、および／または抗原（または免疫原）などの用語を変更して、それぞれの病原体であることを示すために使用され、および／または、抗原（または免疫原）がＩＡＶ−Ｓ病原体でもＩＡＶ−Ｓ抗原（または免疫原）でもなく、そして、非ＩＡＶ−Ｓタンパク質抗原（または免疫原）がＩＡＶ−Ｓに由来しない。
【００７６】
用語「由来する」（ｏｒｉｇｉｎａｔｅ  ｆｒｏｍ）、「由来する」（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ  ｆｒｏｍ）および「由来する」（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ）は、所与のタンパク質抗原およびそれを天然にコードする病原体またはその病原体の株に関して交換可能に使用され、本明細書で使用される場合、未修飾および／またはその所与のタンパク質抗原の短縮アミノ酸配列は、その病原体またはその病原体の株によってコードされている。病原体に由来するタンパク質抗原についての本発明の核酸構築物内のコード配列は、発現されたタンパク質抗原のアミノ酸配列の改変および／または切断を結果として生じるように、由来する病原体または病原体の株（自然弱毒株を含む）におけるそのタンパク質抗原の対応する配列に対して遺伝子操作されている可能性がある。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「防御する」、「への防御の提供」、または「への防御免疫の誘発」、「疾患の予防の補助」、および「防御の補助」という用語は、感染の兆候からの完全な保護を必要としない。たとえば、「保護の補助」とは、保護が十分で、チャレンジ後に、根底にある感染症の症状は少なくとも軽減され、および／または、１以上の根本的な細胞、生理学的または生化学的原因または症状を引き起こすメカニズムが低減および／または排除される。この文脈で使用される「減少した」は、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子状態を含む感染の状態に関連することを意味すると理解される。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物（例えば、ブタ（特定の実施形態では、ヒトを含み、他の実施形態では特にヒトではない）を含む）への適用に適した、典型的には、水を含む液体のような薬学的に許容される担体と組み合わされた1以上の抗原を含む組成物であり、典型的には動物への投与時に、野生型微生物の感染から生じる疾患からの保護、すなわち、疾患の予防の補助、および／または疾患の予防、改善または治癒するに十分強力な免疫応答を誘導する。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、多価ワクチンは、２つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施形態では、多価ワクチンは、２つ以上の異なる病原体に対してレシピエントの免疫系を刺激する。
【００８０】
「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１以上の物質として定義される。これに関連して、アジュバントは、１以上のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するために使用される。したがって、「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増加させ、したがって、所与のワクチンに必要な抗原の量、および／または興味の抗原に対する適切な免疫応答を生成するために必要な注射の頻度を減らす薬剤である。これに関連して、アジュバントは、１以上のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するために使用される。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「非アジュバント化ワクチン」は、アジュバントを含まないワクチンまたは多価ワクチンである。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、修飾された名詞が医薬品での使用に適切であることを意味する形容詞的に使用される。たとえば、医薬品ワクチンの賦形剤を説明するために使用される場合、それは、賦形剤が組成物の他の成分と適合性であり、意図されるレシピエント動物、例えばブタに不利に有害ではないことを特徴とする。
【００８３】
「非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入が含まれる。
【００８４】
本明細書で使用する場合、特定のタンパク質（例えば、タンパク質抗原）に関する用語「抗原断片」は、抗原性である、すなわち、免疫系の抗原認識分子、例えば、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体と特異的に相互作用することができるそのタンパク質の断片である。例えば、ＩＡＶ−Ｓノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原性断片は、抗原性であるＮＡタンパク質の断片である。好ましくは、本発明の抗原性断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体の認識に対して免疫優性である。特定の実施形態では、所与のタンパク質抗原に関する抗原断片は、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも２５％を保持するそのタンパク質の断片である。好ましい実施形態では、抗原性断片は、全長タンパク質の抗原性の少なくとも５０％を保持する。より好ましい実施形態では、抗原性断片は、全長タンパク質の抗原性の少なくとも７５％を保持する。抗原性断片は、２０アミノ酸程度の小さなものから、極端な場合は、完全長タンパク質から１つのアミノ酸が失われていない大きな断片まである。特定の実施形態では、抗原性断片は、２５〜１５０アミノ酸残基を含む。他の実施形態では、抗原性断片は、５０から２５０のアミノ酸残基を含む。
【００８５】
本明細書で使用されるように、１つのアミノ酸配列は、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、第２のアミノ酸配列に対して１００％「同一」であるか、または１００％「同一性」を有する。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合、アミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列と５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えば、タンパク質、または比較されるポリペプチドの一部に含まれるアミノ酸残基の連続したブロックに対して行われる。特定の実施形態では、そうでなければ２つのアミノ酸配列間の対応を変更し得る選択された欠失または挿入が考慮される。
【００８６】
本明細書で使用するヌクレオチドおよびアミノ酸配列パーセント同一性は、Ｃ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ、ＮＣ  ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ、Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ  ＰＬＣ（１９９６）、および、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムには、配置のデフォルトパラメータと、アイデンティティのデフォルトパラメータを使用して決定できる。これらの市販のプログラムは、同じまたは類似のデフォルトパラメーターを使用して配列類似性を決定するために使用することもできる。あるいは、デフォルトのパラメーターを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージのプログラムマニュアル、バージョン７、マディソン、ウィスコンシン）のパイルアッププログラムを使用する、デフォルトのフィルター条件でのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｌａｓｔ検索を使用できる。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「不活化」微生物という用語は、「死滅」微生物という用語と互換的に使用される。本発明の目的のために、「不活性化された」微生物は、動物において免疫応答を誘発することができるが、動物に感染することができない生物である。本発明の抗原（例えば、不活性化されたマイコプラズマハイオニューモニエ）は、バイナリーエチレンイミン、ホルマリン、ベータ−プロピオラクトン、チメロサールからなる群から選択される薬剤または熱によって不活性化され得る。特定の実施形態では、本発明のＲＰと組み合わされた不活性化されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株は、バイナリーエチレンイミンによって不活性化される。
【００８８】
本発明はまた、複数のブタ病原体に対するワクチンを提供する。例えば、タンパク質抗原またはその抗原性断片のコード配列、またはブタのワクチンに有用なタンパク質抗原のそのようなコード配列の組み合わせは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）、および／またはワクチンのＩＡＶ−Ｓに由来するＮＡをコードするものと同じＲＰに組み合わせたものに追加することができる。タンパク質抗原またはその抗原性断片の１以上が由来し得る病原体の例には、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）、ブタ偽狂犬病ウイルス（ＰＰＲＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ブタロタウイルス（ＰＲＶ）、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤ）、複数の血清型のパスツレラムルトシダ、サルモネラ属、大腸菌、例えば（血清型Ｋ９９、Ｋ８８、９８７Ｐ、またはＦ４１）、ヘモフィルスパラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ローソニアイントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｓｐ）（例えば：マイコプラズマ  ハイオニューモニエ）（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、丹毒属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ  ｓｓｐ．，）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、アクチノバシルスプルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が含まれる。
【００８９】
加えて、本発明は、本発明の１以上のＲＰを、これらのブタ抗原の１以上をコードする１以上の他のベクター（例えば、ブタサーコウイルス−２由来のＯＲＦ２タンパク質をコードするバキュロウイルスベクター（ＰＣＶ２）および／またはブタサーコウイルス３（ＰＣＶ３）および／またはこれらのブタ病原体の１以上に由来する不活化トキソイド）と組み合わせて含むワクチンを提供する。さらに、そのようなワクチンは、本発明のワクチンにおいてＩＡＶ−Ｓに由来するＮＡをコードする任意のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、１以上の死滅および／または改変（弱毒化）生ブタウイルス分離株および／またはブタ細菌と共に含むことができる。そのような多価ワクチンはすべて本発明に含まれる。
【００９０】
したがって、ＩＡＶ−Ｓに由来する１以上のＮＡをコードする１以上のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）は、１以上のブタ抗原をコードする１以上の他のベクター、および／または１以上の死滅および／または改変（弱毒化）生ウイルス分離株、例えば１以上の死滅または改変生ＩＡＳ−Ｖ株、１以上の死滅および／または改変生ＰＲＲＳウイルス、１以上の死滅および／または改変生ＰＣＶ、１以上の死滅および／または改変生ＴＧＥ、１以上の死滅および／または改変生ＰＰＲＶ、１以上の死滅および／または改変生ＰＰＶ、１以上の死滅および／または改変生ＰＲＶ、および１以上の死滅および／または改変生ＰＥＤとともに加えることができる。さらに、ＩＡＶ−Ｓに由来する１以上のＮＡをコードする１以上のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）は、１以上のブタ抗原をコードする１以上の他のベクターと一緒に追加したり、および／または、ブタにも感染する可能性がある改変（弱毒化）生菌、例えば、１以上の死滅および／または改変生パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（１以上の複数の血清型）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（１以上の複数の血清型）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ローソニアイントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｓｐ）（例えば：マイコプラズマ  ハイオニューモニエ）（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、丹毒属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ  ｓｓｐ．，）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、アクチノバシルスプルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）と一緒に加えることができる。
【００９１】
本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、凍結乾燥し、そして、滅菌水希釈剤で再水和することができる。一方、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は別々に保管されているが、投与前に他のワクチン成分と混合することを意図している場合、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、それらの成分の安定化溶液、例えば高スクロース溶液中に保存することができる。
【００９２】
一態様では、本発明のワクチンはアジュバントを含むことができる。特定の実施形態では、アジュバントは生分解性油である。特定の製剤では、生分解性油は酢酸ｄｌ−α−トコフェリル（酢酸ビタミンＥ）である。他の製剤では、アジュバントは、２．５％〜５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。より具体的な製剤では、アジュバントは、５％〜２５％の鉱油を含む水中油型エマルジョンである。関連する製剤では、アジュバントは２つの成分の混合物である。第１の成分は、おおよそ平均（体積計量）サイズが約１μｍの鉱油の小滴よりなり、水中のポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）で安定化されている。第１の成分は、２５重量パーセントの鉱油および１重量パーセントのポリソルベート８０を含み、残りは水であることができる。第２の成分は、およそ４００ｎｍの平均（体積計量）サイズの生分解性酢酸ｄｌ−α−トコフェリルの液滴よりなり、これもポリソルベート８０で安定化される。特定の製剤は、１５重量パーセントの酢酸ｄｌ−α−トコフェリルと６重量パーセントのポリソルベート８０を含み、残りは水である。特定の実施形態では、アジュバントは、Ｘ−ＳＯＬＶＥＴＭである（２成分アジュバントの組み合わせである：ｄｌ−α−トコフェリルアセテートに基づくＤＩＬＵＶＡＣ  ＦＯＲＴＥＴＭおよび軽質流動パラフィンに基づくＭＩＣＲＯＳＯＬＴＭ）［例えば、ＵＳ８，５９７，６６２を参照］。関連する製剤では、アジュバントは、サブマイクロメートルサイズの油滴と生分解性油の液滴を含み、生分解性油の液滴は、鉱油の液滴の平均サイズとは異なる平均サイズを有する［たとえば、ＵＳ９，０８４，７６８を参照］。
【００９３】
本発明のワクチンは、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、皮内、および／または腹腔内ワクチン接種を含む任意の標準的な経路によって容易に投与することができる。当業者は、ワクチン組成物が、好ましくは各タイプのレシピエント動物および投与経路に適切に処方されることを理解するであろう。
【００９４】
したがって、本発明はまた、ブタをＩＡＶ−Ｓおよび／または他のブタ病原体に対して免疫する方法を提供する。そのような方法の１つは、ブタに本発明のワクチンの免疫学的有効量を注射することを含み、そうして、ブタは適切なＩＡＶ−Ｓ抗体を産生する。
【００９５】
また、本発明は、本明細書に開示される特定の構成、プロセスステップ、および材料に限定されず、そのような構成、プロセスステップ、および材料は、多少異なる場合があることも理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ制限されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ使用されており、限定することを意図していないことも理解されたい。
【００９６】
2021506835.tif 000002
2021506835.tif 000003
１  ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列としてのみ提供されるが、配列がＲＮＡ構築物に含まれる場合、対応するＲＮＡ配列（チミジン「ｔ」の代わりにウラシル「ｕ」を含む）であることを理解すべきである。
【００９７】
配列
N1-古典的(配列番号1)
atgaatactaatcaaaggatcattaccattgggacagtctgcatgattgtcggtatcatctctcttttgcttcagattggaaacattgtctcactttggattagccattcaattcagaccggatgggagaatcacactgagatgtgcaatcaaagtgtcattacttatgtcaataacacttgggtgaaccggacttatgtgaacattagcaatatcaagattgcaactattcaagatgtgactagtatcattttggccggaaattctagtctttgcccggtgtcagggtgggctgtctacagcaaagacaatagcattaggattggatcaaaaggggacattttcgtcattagagagcctttcatctcatgctcacaattggagtgccggaccttctttctgacccaaggggcattgctgaatgacaaacattcaaatggtaccgtcaaggacaggagtccttatagaaccctgatgagctgccctatcggtgaggccccttcgccatacaactcacggttcgaatctgtcgcatggtcagcatctgcttgtcatgatggaatgggatggcttacaatcgggatcagtggaccggataatggtgctgtcgcagtcttgaaatacaacggaatcattacagatacaatcaaatcttggaggaacaagattcttagaactcaagaatcagagtgtgtctgtatgaacggatcatgttttacagtcttgacagatggcccaagcaatggacaagcctcttacaaaatctttaaggtggaaaaaggaaagattatcaagtcgattgagctggatgcccccaattaccactatgaagaatgctcttgttatccagatactggcaaagtcatgtgtgtctgccgggacaattggcacgcctcaaaccggccatgggtgtcgttcaatcagaatcttgactatcaaattggatacatttgctctggagtctttggtgataaccctagatccaatgatgggaagggcaattgtggcccggtcctttctaatggagcaaatggagtgaaaggtttctcatatcggtatggaaatggtgtgtggattggtcggaccaagtcaatcaactctcggtcgggttttgagatgatttgggatccgaatggatggactgagacagattcatcattctcgatgaagcaggacattatcgctcttaatgattggtctggatactcgggatcttttgtccaacatccggagcttactggtatgaattgcattaggccttgtttctgggtggaattgatcagagggcaacccaaggaaagcactatctgggctagcggttccagcatctcattctgtggcgtcaattcggaaaccgcttcctggtcttggccagacggagctgatctgccattcaccattgacaag
【００９８】
N1-古典的(配列番号2)
MNTNQRIITIGTVCMIVGIISLLLQIGNIVSLWISHSIQTGWENHTEMCNQSVITYVNNT
WVNRTYVNISNIKIATIQDVTSIILAGNSSLCPVSGWAVYSKDNSIRIGSKGDIFVIREP
FISCSQLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPYRTLMSCPIGEAPSPYNSRFESVAWS
ASACHDGMGWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNKILRTQESECVCMNGSCFT
VLTDGPSNGQASYKIFKVEKGKIIKSIELDAPNYHYEECSCYPDTGKVMCVCRDNWHASN
RPWVSFNQNLDYQIGYICSGVFGDNPRSNDGKGNCGPVLSNGANGVKGFSYRYGNGVWIG
RTKSINSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSMKQDIIALNDWSGYSGSFVQHPELTGMNCIRP
CFWVELIRGQPKESTIWASGSSISFCGVNSETASWSWPDGADLPFTIDK
【００９９】
N1-パンデミック(配列番号3)
atgaatcctaaccaaaagatcattaccattggttcggtctgtatgacaattggaatggctaacctgatccttcaaattggaaacattatctcaatctgggtcagccactcaattcaaattggaaatcaatcgcagattgaaacatgcaaccaaagcgtcattacttacgaaaacaacacttgggtgaaccagacctacgtgaacatcagcaacaccaacttcgctgctggacagtccgtggtttccgtgaaactggcgggcaactcctctctctgccctgtgagcggatgggctatctactccaaagacaactcagtcagaatcggttccaagggggatgtgtttgtcataagggaaccattcatctcatgctctccccttgaatgcagaaccttcttcttgactcaaggggccttgctaaatgacaaacattccaacggaaccattaaagacaggagcccatatcggaccctgatgagctgtcctatcggtgaagtcccctcgccatacaactcaagatttgagtcagtcgcttggtcagcatccgcttgtcatgatggcatcaattggctcaccattggaatttctggcccagacagtggggcagtggctgtgctgaagtacaatggcattataacagacactatcaagtcgtggaggaacaacatattgagaactcaagagtctgaatgtgcatgtgtgaatggttcttgctttaccatcatgaccgatggaccatccgatggacaggcctcctacaagatcttcagaatcgaaaagggaaagatcgtcaaatcagtcgaaatgaatgcccctaactaccactatgaggaatgctcctgttatcctgattcctccgaaatcacgtgcgtgtgcagggataactggcatggctccaatcggccgtgggtgtctttcaaccagaatctggaatatcagatcggatacatttgctccggggtgttcggagacaatccgcgccctaatgataagacaggctcgtgtggtccagtctcgtctaacggagccaacggagtcaaaggattttcattcaaatacggcaatggagtgtggatagggagaactaagagcatttcctcaagaaaaggtttcgagatgatttgggatccgaatggatggactgggactgacaacaagttctcaatcaagcaagacatcgtgggaatcagcgagtggtcaggatatagcgggtcctttgtgcagcaccccgaactgaccgggctggattgtattagaccttgcttctgggtcgaactcatcagagggcgacccgaagagaacacaatctggactagcgggagcagcatctccttttgtggtgtgaactcggacactgtgggttggtcttggccagacggtgctgagttgccttttaccattgacaag
【０１００】
N1-パンデミック(配列番号4)
MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWVSHSIQIGNQSQIETCNQSVITYENNT
WVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREP
FISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWS
ASACHDGINWLTIGISGPDSGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFT
IMTDGPSDGQASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSN
RPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVWIG
RTKSISSRKGFEMIWDPNGWTGTDNKFSIKQDIVGISEWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRP
CFWVELIRGRPEENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
【０１０１】
N2-1998A(配列番号5)
atgaatccaaaccaaaagataatcacaattggctctgtttctctcactattgccacaatgtgcctccttatgcaaattgccatcctgattactaatgtcacattgcactccaatcagtacgaatgcaactaccccccaaacaaccaagtgatactgtgtgaaccaactatcatcaaaagaaacattactgagattgtgtatctggccaacaccaccatagagaaggaaatctgccccaagctggcagaatacagaaactggtcgaagccgcaatgtaaaattacagggtttgcacctttttccaaggacaattcgattaggctttctgcgggtggcgacatttgggtaacgagagaaccttatgtgtcatgcgatcctgataagtgttaccagtttgcccttggacaaggaacaacgctcaacaacagacattcaaacgacaccgtgcatgataggaccccttatcgaaccctattgatgaatgagttgggtattccattccatttggggaccaaacaagtgtgcatcgcatggtccagctcatcctgccatgatggacgggcttggcttcatgtctgtattactgggcatgacaacaatgcaactgccagcatcatttacaatggacgccttgtcgatagtattggttcatggtccaaaagaatcctcaggacccaggagtcggaatgcgtgtgcatcaatggaacttgtaccgtggtcatgactgatgggtccgcttcaggaatagctgacactaaaatcctgttcattgaagaggggaaaatcgtgcacattagcccactgctggggtccgctcagcacgtggaggagtgctcctgctatccccgatacccaggtgtcagatgcatctgtagagacaactggaaaggctccaacagacctgtcgtggatattaatgtgaaggattatagcattgtgtcctcctacgtgtgctccggactggtgggagacacccccagaaaagacgacagatccagctccagcaattgtctgaatcctaacaacgagaaaggggagcatggagtgaaaggctgggcctttgatgatggaaatgacgtgtggatggggaggacaatcaacgagacattacgctcaggttatgaaaccttcaaagtcattgaaggctggtccaaacctaattccaaattgcagataaatcgccaagtcattgttgaaagagatgataggtccggttattctggaattttctctgtcgaaggaaagagctgtatcaatcggtgtttttacgtggagctgatcagaggaaggaaacaggaaactgcagtgtggtggacgtcaaattccattgtggtgttttgtggcacctcaggtacctatggaaccggctcatggcctgatggggcggacatcaatctcatgcctgtg
【０１０２】
N2-1998A (配列番号6)
MNPNQKIITIGSVSLTIATMCLLMQIAILITNVTLHSNQYECNYPPNNQVILCEPTIIKR
NITEIVYLANTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCKITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREP
YVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNRHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGIPFHLGTKQVCIAWSS
SSCHDGRAWLHVCITGHDNNATASIIYNGRLVDSIGSWSKRILRTQESECVCINGTCTVV
MTDGSASGIADTKILFIEEGKIVHISPLLGSAQHVEECSCYPRYPGVRCICRDNWKGSNR
PVVDINVKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKDDRSSSSNCLNPNNEKGEHGVKGWAFDDGNDV
WMGRTINETLRSGYETFKVIEGWSKPNSKLQINRQVIVERDDRSGYSGIFSVEGKSCINR
CFYVELIRGRKQETAVWWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPV
【０１０３】
N2-2002A (配列番号7)
atgaatccaaatcaaaagatcattactattggatcagtctcactcatcattgccacaatttgtttccttatgcaaattgcaatccttgtcactactgtcacattgcatttcaagcagcatgactacaactcccccccaaacaaccaagctactctgtgtgaaccaacaatcattgaacggaaaacaactgaaattgtgtatcttactaacaccaccattgagaaagaagtctgccccaaacttgcagagtaccggaactggtcaaagcctcaatgtaacattactggatttgcaccattttcgaaagacaattctattcggttgtctgctggtggggacatctgggtgactagggaaccttatgtgtcatgcgatcctgacaagtgttaccaatttgcccttggacagggtacaactcttaacaacggacattcgaataacacagtccatgataggaccccgtatcggacccttcttatgaatgagcttggtgtcccttttcatcttggaaccagacaagtgtgcatggcttggtctagctcatcttgtcacgatgggaaagcatggctgcatgtctgtgtcactggaaatgataacaatgctactgctagcttcatctacaatggtaggcttgtggattctattggttcgtggtcgaaaaacattctccggacccaagagtcagaatgcgtctgtatcaatggaacatgtactgtcgtcatgactgatggatccgctagtggaaaagcagataccaaaatcttgttcgtcgaagaggggaagatcgtccatatcagcactctgttgggatctgcacagcacgtcgaggaatgctcctgttatcctaggtttccgggagtccggtgtgtctgccgggacaactggaaaggatctaatagacccatcgtcgacatcaatgtcaagaattacagcattgtctcttcgtatgtctgcagtggacttgtcggtgatactcccagagagagcgactcagtctcctcatcttattgcttggatccgaacaatgagaagggtggtcatggggtgaaagggtgggcctttgatgatggtaatgacgtgtggatgggaagaacaatcaacgagactttgcgcttgggatatgaaaccttcaaagtcattgaaggctggtccacagctaactccaagtcacagacaaatagacaagtgattgtcgaaaaaggagacaggtcaggatattctgggattttctcagtcgagggaaagaactgcatcaataggtgcttctatgtggagttgattagaggacggaaagaggagacaaaagtctggtggaccagtaactcaattgtcgtgttttgtggcacctcagggacttatggtactggctcttggccggatggtgctgacatcaatctcatgccaatt
【０１０４】
N2-2002A (配列番号8)
MNPNQKIITIGSVSLIIATICFLMQIAILVTTVTLHFKQHDYNSPPNNQATLCEPTIIER
KTTEIVYLTNTTIEKEVCPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREP
YVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNGHSNNTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTRQVCMAWSS
SSCHDGKAWLHVCVTGNDNNATASFIYNGRLVDSIGSWSKNILRTQESECVCINGTCTVV
MTDGSASGKADTKILFVEEGKIVHISTLLGSAQHVEECSCYPRFPGVRCVCRDNWKGSNR
PIVDINVKNYSIVSSYVCSGLVGDTPRESDSVSSSYCLDPNNEKGGHGVKGWAFDDGNDV
WMGRTINETLRLGYETFKVIEGWSTANSKSQTNRQVIVEKGDRSGYSGIFSVEGKNCINR
CFYVELIRGRKEETKVWWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
【０１０５】
N1-パンデミックEU (配列番号11)
atgaatccaaaccaaaagataataaccattggttcggtctgtatgacaattggaatggctaacttaatattacaaattggaaacataatctcaatatggattagccactcaattcaacttgggaatcaaagtcagattgaaacatgcaatcaaagcgtcattacttatgaaaacaacacttgggtaaatcagacatatgttaacatcagcaacaccaactttgctgctggacagtcagtggtttccgcgaaattagcgggcaattcctccctctgccctgttagtggatgggctatatacagtaaagacaacagtgtaagaatcggttccaagggggatgtgtttgtcataagggaaccattcatatcatgctcccccttagaatgcagaaccttcttcttgactcaaggggccttgctaaatgacaaacattccaatggaaccattaaagataggagcccatatcgaaccctgatgagctgtcctattggtgaagttccctctccatacaactcaagatttgagtcggtcgcttggtcagcaagtgcttgtcacgatggcatcaattggctaacaatcggaatttctggcccagacagtggggcagtggctgtattaaagtacaatggcataataacagacactatcaagagttggaaaaacaatatattgagaacacaagagtctgaatgtgcatgtgtaaatggttcttgctttaccataatgaccgatggaccaagtgatggacaggcctcatacaagatcttcagaatagaaaagggaaagatagtcaaatcagtcgaaatgaatgcccctaattatcactatgaggaatgctcctgttatcctgattctagtgaaatcacatgtgtgtgcagggataactggcatggctcgaatcgaccgtgggtgtctttcaaccagaatctggaatatcagataggatacatatgcagtgggattttcggagacaatccacgccctaatgataagacaggcagttgtggtccagtatcgtctaatggagcaaatggagtaaaaggattttcattcaaatatggcaatggtgtttggatagggagaactaaaagcattagttcaagaaaaggttttgagatgatttgggatccaaatggatggactgggacagacaaaaacttctcaataaagcaagatatcataggaataaatgagtggtcaggatacagcgggagttttgttcagcatccagaactaacagggctgaattgtataagaccttgcttctgggttgaactaatcagagggcgacccaaagagaacacaatctggactagcgggagcagcatatccttttgtggtgtaaacagtgacactgtgggttggtcttggccagacggtgctgagttgccatttaccattgacaagtaa
【０１０６】
N1-パンデミックEU (配列番号12)
MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISHSIQLGNQSQIETCNQSVITYENNTWVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSAKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDGINWLTIGISGPDSGAVAVLKYNGIITDTIKSWKNNILRTQESECACVNGSCFTIMTDGPSDGQASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSISSRKGFEMIWDPNGWTGTDKNFSIKQDIIGINEWSGYSGSFVQHPELTGLNCIRPCFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
【０１０７】
N1-ユーラシアトリ(配列番号13)
atgaacccaaatcagaagataataatcattagttcaatctgtatgacaaatggaattgctagcttgatattacaaattgggaacataatatcaatatggattagccattcaattcaaattgagaacccaaaccagaccgaccatgcaatcaaagcgttattatttacgaaaacaacacatgggtaaatcaaacgtatgttaacatcagcaacaataattttgttgttgaacagacagtggtttcaatgaaattagcgggcagttcttctctctgccctgttagtggatgggctatatacagtaaagataacagtgtaagaatcggttccaaaggggatgtgtttgtcataagagagccattcatctcatgctcccatttggaatgtagaaccttcttcttaactcaaggggccctactgaatgataaacattctaatggaaccgttaaagacagaagcccctatcgaaccctgatgagctgtcctattggtgaagtcccctctccatacaactcaaaatttgagtcagttgcttggtcagcaagtgcttgccatgatggcaccagttggttgacaattgggatttctggtccagacaatggagcagtggctgtgttgaaatacaatgacataataacagacactatcaagagttggaaaaacaacatattgagaacacaagaatctgaatgtgcatgtttgaatggttcttgctttactgtaatgaccgatggaccaagtaatgggcaggcctcatacaagatcttcaaaatagaaaaggggaaagtagtcaaatcagtcgagttgaatgctcctaattatcactatgaggaatgttcctgttatcctgattctggtgaaatcatatgtgtatgcagggacaattggcatggctcgaatcgaccatgggtgtctttcaatcagaatctggagtatcagataggatacatatgcagtggggttctcggagacaatccgcgccctaatgatagaacaggcagttgtggtccagtatcatctcatggagcaaatggggtaaaagggttttcgtttaaatacggcaatggaatttggatagggagaactaaaagcactattacaaggagtggttttgagatgatttgggacccaaacggatggactggaacagacaataatttctcagtgaagcaagatatcgtaggaataactaactggtcaggatacgcgggagttttgtccaacatccagaattaaccggattggattgtattagaccttgcttctgggttgaactaatcagagggagacccaaagagaacacaatctggactagcggaagcagcatatccttttgtggtgtaaatagtgacactgtgggttggtcttggccagacggtgctgagttgccatttaccattgacaagtaa
【０１０８】
N1-ユーラシアトリ(配列番号14)
MNPNQKIIIISSICMTNGIASLILQIGNIISIWISHSIQIENPNQTEPCNQSVIIYENNTWVNQTYVNISNNNFVVEQTVVSMKLAGSSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSKFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNDIITDTIKSWKNNILRTQESECACLNGSCFTVMTDGPSNGQASYKIFKIEKGKVVKSVELNAPNYHYEECSCYPDSGEIICVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVLGDNPRPNDRTGSCGPVSSHGANGVKGFSFKYGNGIWIGRTKSTITRSGFEMIWDPNGWTGTDNNFSVKQDIVGITNWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
【０１０９】
N2-ゲント/1984 (配列番号15)
atgaatccaaatcaaaagataataacaattggttctgtttctctcactattacaacaatgtgcctcttcttgcagattgccatcctagtaactactataacattgcatttcaagcaatatgaatgcgattcccctgcaaacaaccaagtaataccgtgtgaaccaataataatagaaaaaaacataacaaaaatagtgtatttgaccaataccaccatagagaaagaggtatgcccaaaattaggggaatacaggaattggtcaaaaccacaatgcaagatcacaggatttgcacctttttctaaggacaattcaattcggctctctgcgggtggggccatttgggtcacgagagaaccttatgtgtcatgcgaccctaacaagtgttatcaatttgcattaggacagggaaccacattagataacagacattcaaatgacacaatacatgatagaaccccttttagaaccctgttgatgagtgaattaggtgttccatttcatttgggaaccagacaagtatgcatagcatggtccagttcaagttgtcacgatgggaaagcttggttgcatgtttgtgtcactgggcatgataaaaatgcaactgctagtttcatttatgacggaaagcttgtagacagcatcagttcatggtccaaaaacatactccggactcaggaatcagaatgtgtttgtatcgatggaatctgtacagtggtgatgactgatggaagtgcttcagggaaagctgatactaagatactatttattgaaaaagggaagatcattcatattagtccattgttgggaagtgctcagcatgtagaagaatgttcctgttaccctagataccctgatgtcaggtgtatttgcagggataactggaaaggttcaaataggcccatcgtagacataagaatgaaaaattatagcattggttccagttatatgtgctcaggacttgttggcgacacacccaggaacaatgatgggtctagtaatagcaattgtcggaatcccaataatgaaagaggaaatcatggagtgaaaggttgggcctttgatgatggaaatgacacatggatgggaagaactatcagcaaggactcacgcttaggttacgaaaccttcaaagttgttggtggttggtcccaacccaattccaaatcccagataaatagacaagttattgttgacagcgataatagatcaggttactctggtattttctctgttgaggggaaagattgcattaataggtgtttttatgtggaactaataagaggaaggagacaggaaactagagtgtggtggacttcgaacagtattgttgtgttctgtggcacttctggcacctatgggtcaggctcatggcccgatggagcaaacatcaatttcatgcctgtataa
【０１１０】
N2-ゲント/1984 (配列番号16)
MNPNQKIITIGSVSLTITTMCLFLQIAILVTTITLHFKQYECDSPANNQVIPCEPIIIEKNITKIVYLTNTTIEKEVCPKLGEYRNWSKPQCKITGFAPFSKDNSIRLSAGGAIWVTREPYVSCDPNKCYQFALGQGTTLDNRHSNDTIHDRTPFRTLLMSELGVPFHLGTRQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGHDKNATASFIYDGKLVDSISSWSKNILRTQESECVCIDGICTVVMTDGSASGKADTKILFIEKGKIIHISPLLGSAQHVEECSCYPRYPDVRCICRDNWKGSNRPIVDIRMKNYSIGSSYMCSGLVGDTPRNNDGSSNSNCRNPNNERGNHGVKGWAFDDGNDTWMGRTISKDSRLGYETFKVVGGWSQPNSKSQINRQVIVDSDNRSGYSGIFSVEGKDCINRCFYVELIRGRRQETRVWWTSNSIVVFCGTSGTYGSGSWPDGANINFMPV
【０１１１】
N2-イタリア/4675/2003 (配列番号17)
atgaattcaaatcaaaagataataacaattggctctgtttctctcactattgccacactatgcctccttatgcaaattgctatcatggtaactactgtaacatttcatttcaagcagtatgaatacaactcccccccgaacaaccaagtaatgttgtgtgaaccaacgataattgaaagaaacataacagagacagtgtacatgaccaacaccaccatagtgaaagaaatatgccccaaactagcggaatacagaaattggtcaaaaccgcaatgcaaaattacaggatttgcacctttttcaaaggacaactcaattcggctttccgctggtggggacatctgggtgacaagagaaccttatgtgtcatgcgatcctaacaagtgttatcaatttgcccttgggcagggaacaacgttaaacaacaggcattcaaatgacacagtacatgatagaaccccttaccgaaccctgttgatgaatgaattgggtgttccatttcatttaggaaccaagcaggtttgcatagcttggtccagttcaagttgtcatgatggaaaagcatggttgcatgtttgtgtaactgggcatgatgaaaatgcaactgccagtttcatttacaacgagagacttgtagatagtattggttcatggtccaagaaaatcctcagaacccaggagtcggaatgcgtttgcataaatgggacttgtacagtggtgatgacagatgggagtgcttcaggtagagctgatactaaaatactattcattgaggaggggaaaatcgttcatgttagccaactgacaggaagtgctcagcatgtagaggagtgctcctgttatccccggtatcctggtgtcagatgtgtttgcagagataattggaaaggctccaataggcccattgtagatataaatgtaaaggatcatagcattgtttccagttatgtgtgctcaggacttgtcggagacacacccagaaaaaacgacagctctagcagtagtaactgcctgaatcctaacaatgaagaagggggtcatggggtgaaaggctgggcctttgatgatgaaaatgacttgtggatgggaagaacgatcagcgaaaagttacgattaggttatgaaaccttcaaggtcattgaaggctggtccaagcctaattccaaattgcagataaataggcaagtaatagttgacaaagataatagatccggttattctggtattttctctgttgaaagtaaaagttgcatcaatcggtgcttttatgtggagttgataagaggaaggaaacaggaaaatgaagtatggtggacctcaaacagcattgttgtattttgtggcacctcaggtacatatggaacaggctcatggcctgatggggcagacatcaatctcatgcctatatga
【０１１２】
N2-イタリア/4675/2003 (配列番号18)
MNSNQKIITIGSVSLTIATLCLLMQIAIMVTTVTFHFKQYEYNSPPNNQVMLCEPTIIERNITETVYMTNTTIVKEICPKLAEYRNWSKPQCKITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPNKCYQFALGQGTTLNNRHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGHDENATASFIYNERLVDSIGSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGRADTKILFIEEGKIVHVSQLTGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINVKDHSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSNCLNPNNEEGGHGVKGWAFDDENDLWMGRTISEKLRLGYETFKVIEGWSKPNSKLQINRQVIVDKDNRSGYSGIFSVESKSCINRCFYVELIRGRKQENEVWWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
【０１１３】
N2-スコットランド/1994 (クレード1) (配列番号19)
atgaatccaaatcagaagataataacaattggctctgtttctctcgtcattgcaacattatgcttcttaatgcagatggccatcctaataactactgtaaaattacatttcaaacaatatgagtgcggcttccctgcgaacaaccaagtaataacatgtgagccaacagtaatagaaaggaacacaacagagatagtgtacttaactaacaccaccatagagaaagaaacatgccacaaaacagtggaatacaggaattggtcaaagcctcaatgcaaaataacaggctttgcacctttttccaaggacaattcaattcgactttctgctggtggggacatatgggtgacgagggaaccttacgtgtcatgcgagcctggcaaatgttatcagtttgcactcgggcaagggaccacactagacaataaacattcaaacgatacaatacatgacagaaccccctatcgaactctattgatgaatgaattgggtgtcccatttcatttagggacaagacaagtgtgtattgcatggtccagctcaagttgttatgatgggaaagcatggttgcatgtctgtatcactggacatgataaaaatgcaactgccagtttcatttacgatggtagacttgtagatagcattggttcatggtctaaaaatatacttagaacccaggaatcagaatgcgtttgcatcaatggggtctgtacagtagtaatgactgatggaagtgcttcgggaagagctgatactaaaatactattcattgaagaagggaaaattgttcatattagcccattagcggggagtgcacagcatgtggaggagtgctcctgttatccccgatatcctggcgtaaggtgtatctgcagagacaactggaaaggctctaacagacccgttgtggatataaatatagaagattatagcattgattccagttatgtgtgttcagggcttgttggcgacacacccagaatcaatgacggatccagtagtagctactgccgtgatcctaacaacgaaaaaggaaatcacggagtgaagggctgggcttttgacgatggaaatgatgtgtggatgggaagaacgatcaacgaagattcacgctcaggttatgaaacattcaaagtcattggtggttggtccactcctaattccaaattgcagataaataggcaagtaatagttgatagcaacaataggtcaggttattctggtgttttctccgttgaaggcaaaagctgcatcaatagatgtttctacgtggagttgataagaggaagaaggtcagaagcgcgagtatggtggacctcaaacagtattgttgtattttgtggcacttcaggtacctatggaacaggctcatggcctgatggagcagacatcaacctcatgcctatatga
【０１１４】
N2-スコットランド/1994 (クレード1) (配列番号20)
MNPNQKIITIGSVSLVIATLCFLMQMAILITTVKLHFKQYECGFPANNQVITCEPTVIERNTTEIVYLTNTTIEKETCHKTVEYRNWSKPQCKITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCEPGKCYQFALGQGTTLDNKHSNDTIHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTRQVCIAWSSSSCYDGKAWLHVCITGHDKNATASFIYDGRLVDSIGSWSKNILRTQESECVCINGVCTVVMTDGSASGRADTKILFIEEGKIVHISPLAGSAQHVEECSCYPRYPGVRCICRDNWKGSNRPVVDINIEDYSIDSSYVCSGLVGDTPRINDGSSSSYCRDPNNEKGNHGVKGWAFDDGNDVWMGRTINEDSRSGYETFKVIGGWSTPNSKLQINRQVIVDSNNRSGYSGVFSVEGKSCINRCFYVELIRGRRSEARVWWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
【０１１５】
N2-スコットランド/1994 (クレード2) (配列番号21)
atgaatccaaaccagaaaataataacgatcggttctgtctccttgatcattgcaacaatgtgctttttcatgcaagttgccattctggtaactactgtaacattgcatttcaggcagtgcgaatgcaactcctccgcaaccaaccaaataatgccatgtaaaccaacaaaaatagagagaaacataactgaaattgtgtacttaaccaataccaccataaaaacagaggtatgccccaaactagtgaaatacagggattgggcaaaaccacaatgtagaatcacagggtttgcacctttttccaaggacaattcgattcggctttctgccggtggggccatttgggtaacgagagaaccctatgtatcatgcgatcttagcaagtgttaccagtttgcgctcggacaggggactacactagacaacagacattcaaatgacacaatacatgatagaactccttatcggaccctattgatgaatgaattgggtgttccatttcatttaggaaccaggcaagtgtgtatagcttggtccagttcaagttgtcacgatggaaaagcatggctgcatgtttgtgtcactgggtatgataaaaatgctactgctagcctcatttatgacggaaggcttgtggacagcatcggttcatggtcccaaaacatcctccggacccaggaatcggaatgtgtttgtataaatggtacttgcacagtggtaatgactgatgggagtgcttcaggaaaagctgataccagaatactatttattgaagaagggaagattattcacattagtccattgacaggaagtgcacagcatgttgaagagtgttcttgttatcctcgataccccggtgtaagatgtgtttgtagagacaactggaagggctctaacagacccgtcgtggatataaatgtaaaagattataaaattaactccagttatgtatgctcaggccttgttggcgatacacccagaaacaacgatagatctagcaatagcaactgccaaaatcctaacaaccagagagggaatcatggagtgaagggctgggcctttgacgatggaaatgacatatggatgggaagaaccatcagcaatgattcacgtttaggttatgaaactttcaaagttattggtggttggtccaaacccaactccaaagttcagacaaataggcaagtcatagttgacagcgataatagatcaggttattctggcgttttctctgttgaaggcaaaagctgcatcaataggtgcttttatgtagagctaataagaggaaggagacaggaagctagagtatggtggacttcgaacagtattgttgtgttttgtggtacttcgggtacatatggttcaggctcatggcctgatggggctgacatcaatcttatgcctatataa
【０１１６】
N2-スコットランド/1994 (クレード2) (配列番号22)
MNPNQKIITIGSVSLIIATMCFFMQVAILVTTVTLHFRQCECNSSATNQIMPCKPTKIERNITEIVYLTNTTIKTEVCPKLVKYRDWAKPQCRITGFAPFSKDNSIRLSAGGAIWVTREPYVSCDLSKCYQFALGQGTTLDNRHSNDTIHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTRQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGYDKNATASLIYDGRLVDSIGSWSQNILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTRILFIEEGKIIHISPLTGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPVVDINVKDYKINSSYVCSGLVGDTPRNNDRSSNSNCQNPNNQRGNHGVKGWAFDDGNDIWMGRTISNDSRLGYETFKVIGGWSKPNSKVQTNRQVIVDSDNRSGYSGVFSVEGKSCINRCFYVELIRGRRQEARVWWTSNSIVVFCGTSGTYGSGSWPDGADINLMPI
【０１１７】
以下の実施例は、本発明のさらなる評価を提供するのに役立つが、決して本発明の有効な範囲を制限することを意味するものではない。
【実施例】
【０１１８】
実施例１
４つの個別のＮＡ−ＲＰ構成物を含む、非アジュバンド化多価ＮＡ−ＲＰワクチンの離乳ブタでの有効性
イントロダクション
ＲＮＡウイルスは、ゲノムに遺伝子組み換えされたワクチン抗原を導入するためのベクタービヒクルとして使用されてきた。しかしながら、現在までのそれらの使用は、主にウイルス抗原をＲＮＡウイルスに組み込み、次いでウイルスをレシピエント宿主に導入することに限定されてきた。その結果、組み込まれたウイルス抗原に対する防御抗体が誘導される。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、病原性抗原をコードするために使用されている。このようなアルファウイルスレプリコンプラットフォームは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）を含む、いくつかの異なるアルファウイルスから開発されている［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：６４３９−６４４６（１９９３）その内容は本明細書に完全に組み込まれる］、およびＳｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＳＦＶ）［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｇａｒｏｆｆ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６−１３６１（１９９１）、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれている］。さらに、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ブタおよび家禽に対するいくつかのＵＳＤＡライセンスワクチンの基礎となっている。これらには、ブタ流行性下痢ワクチン、ＲＮＡ粒子（製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、鳥インフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）、および処方製品、ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）を含む。
【０１１９】
４種混合非アジュバント化ＮＡ−ＲＰワクチンの２つの用量レベルの有効性と免疫原性を決定するための研究が行われた。非アジュバント化ワクチンには４つのＲＰ構築物が含まれ、それぞれが当時の米国ＩＡＶ−Ｓ分離株の単一の異なるＮＡタンパク質を個別にコード化していた。これらのＮＡ遺伝子は一緒に、２回のＮ１系統発生クラスターと２つのＮ２クラスターを米国のブタ集団において優勢に存在する。非アジュバント化ワクチンは、２つの筋肉内（ＩＭ）ワクチン接種（投与あたり１ｍＬ）で、ワクチン画分とチャレンジ株に対して血清反応を起こした離乳ブタに投与された。次に、４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性を、異種Ｎ１（Ｈ１Ｎ１ウイルス）およびＮ２（Ｈ１Ｎ２ウイルス）チャレンジ感染に対して試験した。
【０１２０】
材料および方法
ＮＡ−ＲＰ抗原の構築：
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を発現するように設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以前に説明されているように［米国特許番号９，４４１，２４７Ｂ２を参照、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる］、以下の変更を伴い、構築された。ＴＣ−８３由来のレプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９，４４１，２４７Ｂ２号に開示および記載されている］を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。５’隣接配列（５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ３’）［配列番号９］および３’隣接配列（５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’）［配列番号１０］を含むＮ１またはＮ２遺伝子のコドン最適化オープンリーディングフレームシーケンス（表１）を含むＤＮＡプラスミドは、同様に制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化された。次に、合成遺伝子カセットを、消化したｐＶＥＫベクターにライゲーションし、得られたクローンの名前を「ｐＶＨＶ−Ｎ１−パンデミック」、「ｐＶＨＶ−Ｎ１−古典的」、ｐＶＨＶ−Ｎ２−２００２、および「ｐＶＨＶ−Ｎ２−１９９８」に変更した。「ｐＶＨＶ」ベクター命名法は、ｐＶＥＫのマルチクローニングサイトのＡｓｃＩおよびＰａｃＩサイトを介してクローニングされた導入遺伝子カセットを含むｐＶＥＫ由来のレプリコンベクターに向かうように選択された。
【０１２１】
ＴＣ−８３  ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の生産は、前述の方法に従って行われた［米国９，４４１，２４７Ｂ２および米国８，４６０，９１３Ｂ２、その内容は参照により本明細書に組み込まれる］。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡとヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で線形化した。重要なことに、生産に使用されるヘルパーＲＮＡは、以前に説明されているように、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く［Ｋａｍｒｕｄら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ  ７）：１７２３−１７２７（２０１０）］。レプリコン用の精製ＲＮＡおよびヘルパー成分を組み合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベットでエレクトロポレーションし、ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を精製し、５％スクロース（ｗ／ｖ）および１％ブタ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で製剤化し、０．２２ミクロンのメンブレンフィルターに通して、保存用に分注した。機能的なＲＰの力価は、感染したＶｅｒｏ細胞単層に対する免疫蛍光アッセイによって決定された。ＲＰのバッチは、パッケージ化されたレプリコンによってコードされる遺伝子に従って識別された。
【表１】
2021506835.tif 000004
【０１２２】
ウイルス：チャレンジウイルスは、USDA National Veterinary Services Laboratoriesから入手した。
【０１２３】
−  Ａ／ブタ／イリノイ／Ａ０１５５４３５１／２０１５（Ｈ１Ｎ１）は、Ｈ１ガンマクラスターのＨＡ遺伝子とＮ１−古典的クラスターのＮＡ遺伝子を所有する。
【０１２４】
−  Ａ／ブタ／アイオワ／Ａ０２０７６６５４／２０１５（Ｈ１Ｎ２）は、Ｈ１−デルタ１クラスターのＨＡ遺伝子とＮ２−２００２ＡクラスターのＮＡ遺伝子を所有する。
【０１２５】
ウイルスはＭＤＣＫ細胞培養で増殖した。細胞単層の７０％以上で細胞変性効果が明らかになるまで、コンフルエントな細胞を約４８時間感染させた。収穫時に、上清を容器から取り出し、遠心分離により清澄化した後、−６０℃以下でウイルスを保存した。
【０１２６】
動物：離乳した子ブタは、血清学スクリーニングに基づいて健康状態の高い群れから選択され、ワクチンおよびチャレンジ株に対する既存のＨＩまたはＮＩ抗体の欠如を確認した。これらの動物はオスとメスの混合であり、最初のワクチン接種の時点でおよそ３週齢であった。
【０１２７】
ワクチン接種とチャレンジ：治療群の概要を以下の表２に示す。４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンは、２つの用量レベルで処方された：機能的ＲＰを定量化するための免疫蛍光ベースの効力アッセイに基づいて、１０６コピーの各ＲＰ／用量（低用量）および１０７の各ＲＰ／用量（高用量）である。ＮＡ−ＲＰ抗原は、１％のブタ血清と５％のスクロースからなる安定剤中で配合された。プラセボワクチンは同じ安定剤からなり、抗原は含まれていなかった。非アジュバント化ワクチンは、３週齢および７週齢のブタに１ｍＬの用量でＩＭ投与された。用量レベルは、ワクチン接種後に保持されたワクチン材料に対するＩＦＡテストによって逆滴定された。最初のワクチン接種の日、２回目のワクチン接種の日、およびチャレンジ感染の日に血清サンプルを収集した。
【表２】
2021506835.tif 000005
【０１２８】
チャレンジ感染は、２回目のワクチン接種の３週間後にブタに投与された。Ｈ１Ｎ１（Ｈ１−ガンマ−Ｎ１−古典的）ウイルスとＨ１Ｎ２（Ｈ１デルタ１ｂ−Ｎ２−２００２Ａ）ウイルスのチャレンジ材料は、どちらも１０６．５ＴＣＩＤ５０／ブタ（６ｍＬ容量）の標的用量を目標に配合された。チャレンジ材料は気管内経路により投与された。チャレンジウイルスの用量は、保持されたチャレンジ材料の逆滴定によって確認された。チャレンジ後−１、１、３および５日目にすべてのブタから鼻腔スワブを収集した。
【０１２９】
剖検は、チャレンジ（ＤＰＣ）の５日後に行われた。資格のある獣医師の監督の下、５ＤＰＣでバルビツール酸の過剰摂取によりブタを安楽死させた。肉眼的病変の影響を受けた各葉の表面積を記録するために、肺を採取して観察し、包括的なパーセント肺病変スコアをもたらした。気管支肺胞洗浄液と鼻腔スワブをすべてのブタから採取し、ウイルス力価を測定した。微視的病変分析のために肺切片を収集した。
【０１３０】
免疫応答分析：ブタ血清サンプル中のＩＡＶ−Ｓ特異的抗体は、ＨＩおよびＮＩテストによって決定された。血清を５６℃で３０〜６０分間熱失活させた。ＨＩの場合、血清は受容体破壊酵素および／またはカオリンで処理され、非特異的凝集素を除去するために七面鳥の赤血球に吸収された。ＨＩテストは、シチメンチョウ赤血球を使用して、以前に説明されているように［Ｋｉｔｉｋｏｏｎら、、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１６１：２９５−３０１（２０１４）］実行された。ＮＩテストは、以前に記載された方法［ＳａｎｄｂｕｌｔｅおよびＥｉｃｈｅｌｂｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１６１：３３７−４５（２０１４）］により小さな変更を加えて実行された。簡単に言えば、血清の２倍連続希釈液を、フェチュインでコーティングした９６ウェルプレート上で等量の発現タンパク質抗原と混合し、３７℃で一晩インキュベートした。ピーナッツ凝集素西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＰＮＡ−ＨＲＰ）を室温で２時間加えて、シアル酸を取り除いたフェチュイン分子を結合させた。ＴＭＢ基質でシグナルを取得し、結果を６５０ｎｍで読み取った。陰性対照の平均光学密度（ＯＤ）（ＮＡ抗原を添加しない）を、すべてのウェルから差し引いた。次に、テストサンプルのＯＤ値を０〜１００％のスケールで正規化し、陽性対照ウェル（ＮＡ抗原を含むが血清を含まない）の平均ＯＤを１００％と定義した。ＮＩ抗体価は、ノイラミニダーゼ活性の５０％以上を阻害したサンプルの最高希釈率として定義した。
【０１３１】
肺の病理学的検査：すべての肺葉の外側に見られる肉眼的病変（境界がはっきりした紫色から梅色の統合）が、肺の前部と後部のグリッド図に記録された。各ブタの総合スコア（肺病変のパーセント）は、病変の影響を受けたグリッドの数に従って計算された。
【０１３２】
ウイルスの排出：鼻腔スワブとＢＡＬ液を感染培地で１０倍連続希釈し［０．３％ウシ血清アルブミン、フラクションＶを補充したＤｕｌｂｅｃｏの最小必須培地（ＤＭＥＭ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；２５μｇ／ｍＬゲンタマイシン；２μｇ／ｍＬトリプシンＩＸ］、そして、１００μＬの各希釈液を９６ウェルプレートのコンフルエントＭＤＣＫ細胞の４つ組のウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、７２時間後、各ウェルからの上清の血球凝集試験により感染性ウイルスの存在を観察した。ＩＡＶ−Ｓ力価はＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｅｒｂｅｒの方法で計算され、１ｍＬあたりのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０として表された。
【０１３３】
結果
多価ＮＡ−ＲＰでワクチン接種したブタの免疫応答、図１Ａ−１Ｄを参照のこと。
【０１３４】
−  ４種混合ＮＡ−ＲＰワクチン、高用量と低用量のワクチン（それぞれ１０７と１０６ＲＰコピー／用量）は、４つすべてのＮＡ構築物に対して機能的なＮＩ抗体価を誘発した。
【０１３５】
−  高用量ワクチンによって誘発されるＮＩ力価は、約１−２倍の２倍希釈で増加した。
【０１３６】
−  プラセボワクチン群のブタは、血清反応陰性のままであった。
【０１３７】
チャレンジ感染に対する４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性：
肺病変：図２Ａ−２Ｂを参照のこと。
【０１３８】
−  Ｈ１Ｎ１チャレンジ感染により、プラセボ対照ブタの肺に１３％以上の病変が発生した。高用量および低用量で免疫した両方の治療群は、Ｈ１Ｎ１チャレンジの５日後に、免疫学的にナイーブなプラセボ群よりも有意に低い肺病変スコアを示した（ｐ＜０．０５）。肺病変に関する保護は、ワクチンの用量レベルに関係なく強固であった。
【０１３９】
−  Ｈ１Ｎ２チャレンジ感染は、プラセボ対照ブタの肺に３．２％の病変のみを引き起こした。どちらの治療グループも、Ｈ１Ｎ２チャレンジの５日後の肺病変スコアは免疫学的にナイーブなプラセボグループよりも低く、平均肺病変スコアは１．１％および１．２％未満であったが、ワクチン接種グループとプラセボグループの差は統計的に有意ではなかった。
【０１４０】
鼻からの排出：図３Ａ−３Ｂを参照のこと。
Ｈ１Ｎ１チャレンジウイルスの排出は、３つの治療グループすべてで、３ＤＰＣで最大であった。
【０１４１】
−  ５ＤＰＣでは、プラセボ対照と比較して、高用量と低用量の両方の４種混合ＲＰ治療群でウイルス力価が大幅に低下した（ｐ＜０．０５）。
【０１４２】
−  Ｈ１Ｎ２チャレンジウイルスの鼻からの排出がさらに遅れ、プラセボ群の平均力価が５ＤＰＣまでアッセイの検出下限を超えなかった。５ＤＰＣでは、ワクチン接種グループの両方の用量レベルでＨ１Ｎ２ウイルス力価が有意に低下した（ｐ＜０．０５）。
【０１４３】
肺におけるウイルス：図４Ａ−４Ｂを参照のこと。
【０１４４】
−  ５ＤＰＣで収集された気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）のＨ１Ｎ１ウイルス力価は、プラセボワクチングループの方が、４種混合ＮＡ−ＲＰでワクチン接種されたグループのいずれよりも２ｌｏｇ以上大きく、陽性力価は検出されなかった。これは、両方のワクチン接種グループの統計的に有意な差を表している（ｐ＜０．０５）。
【０１４５】
−  Ｈ１Ｎ２チャレンジ群のウイルス力価は、ワクチン接種群とプラセボワクチン群の両方で２〜３ｌｏｇの減少を示し、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１４６】
要約
Ｈ１Ｎ１感染は、鼻および肺のウイルス力価を伴う高い肺病変スコアを伴う、より堅牢なチャレンジモデルであった。４種混合ＮＡ−ＲＰワクチン接種グループは、肺病変の重症度、鼻の排出およびＢＡＬＦウイルス力価に関して、Ｈ１Ｎ１ウイルスからの統計的に有意な防御を示した。より弱い血清ＮＩ力価（＜８０）を発現した低用量４種混合ＮＡ−ＲＰワクチン群の個々の動物も保護された。プラセボ群では肺病変が低かったため、Ｈ１Ｎ２チャレンジ感染はそれほど堅牢なモデルではなかった。しかしながら、このグループにおいてさえ、鼻からの排出および肺におけるウイルス力価の点でワクチン接種グループに対して有意な保護があった。アジュバントを含まない多価ＮＡ−ＲＰワクチン製剤は免疫原性があり、抗原的に類似したチャレンジＮＡ株に対して有効性を示した。
【０１４７】
実施例２
初回ワクチン接種時のＮ１抗体の離乳ブタにおけるＨ１Ｎ１感染に対するアジュバンド化４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性
４種混合アジュバント化ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性と免疫原性を決定するための研究が行われた。アジュバント化ワクチンには４つのＲＰ構築物が含まれ、それぞれ当時の米国ＩＡＶ−Ｓ分離株の単一の異なるＮＡ遺伝子を個別にコード化した。これらのＮＡ遺伝子は併せて、２つのＮ１系統発生クラスター（Ｎ１−古典的およびＮ１−パンデミック）および２つのＮ２クラスター（Ｎ２−１９９８およびＮ２−２００２）を表す。アジュバント化ワクチンは、最初のワクチン接種時にＮ１−古典的抗原に対して血清陽性の離乳したブタに、２回の筋肉内（ＩＭ）ワクチン接種（１用量あたり１ｍＬ）で投与された。アジュバント化４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性は、異種Ｎ１（Ｈ１Ｎ１ウイルス）チャレンジ感染に対して試験された。
【０１４８】
材料および方法
ＮＡ−ＲＰ抗原の構築：ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を発現するアルファウイルスレプリコンＲＮＡを含む複製欠陥ＲＮＡ粒子（ＲＰ）は、実施例１で説明したように調製した。
【表３】
2021506835.tif 000006
【０１４９】
ウイルス
チャレンジウイルスは、ＵＳＤＡ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。Ａ／ブタ／イリノイ／Ａ０１５５４３５１／２０１５（Ｈ１Ｎ１）は、Ｈ１ガンマクラスターのＨＡ遺伝子とＮ１−古典的クラスターのＮＡ遺伝子を所有している。ウイルスはＭＤＣＫ細胞培養で増殖させた。細胞単層の７０％以上で細胞変性効果が明らかになるまで、コンフルエントな細胞を約４８時間感染させた。収穫時に、上澄みを容器から取り出し、遠心分離により清澄化した後、ウイルスを−０℃以下で保存した。
【０１５０】
動物：
離乳した子ブタは、血清学スクリーニングに基づいて健康状態の高い群れから選択され、ワクチンおよびチャレンジ株に対する既存のＨＩまたはＮＩ抗体の欠如を確認した。これらの動物はオスとメスの混合であり、最初のワクチン接種の時点でおよそ３週齢であった。
【０１５１】
ワクチン接種とチャレンジ：
治療群を以下の表４に概説する。４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンは、機能的ＲＰを定量化するための免疫蛍光ベースの効力アッセイに基づいて、１０６コピー／ＲＰ／用量で処方された。ＮＡ−ＲＰ抗原は、１％のブタ血清と５％のスクロースからなる安定剤中で配合された。プラセボワクチンは同じ安定剤からなり、抗原は含まれていなかった。ワクチンを、Ｘｓｏｌｖｅアジュバント（１：１  ｖ／ｖ、１ｍＬ用量）と混合してから、３週間および７週齢のブタにＩＭルートで投与した。用量レベルは、ワクチン接種後に保持されたワクチン材料に対するＩＦＡテストによって逆滴定された。最初のワクチン接種の日、２回目のワクチン接種の日、およびチャレンジ感染の日に血清サンプルを収集した。
【０１５２】
最初のワクチン接種の前日に、すべてのブタの体重を測定し、Ｎ１−古典的抗体陽性グループのブタに、２ｍＬ／ｋｇの用量のＮ１−古典的高度免疫血清（ＮＩ力価：Ｎ１−古典的抗原に対する１：２５６０のＮＩ力価）を皮下注射した。
【表４】
2021506835.tif 000007
【０１５３】
チャレンジ感染は、２回目のワクチン接種の３週間後にブタに投与された。Ｈ１Ｎ１（Ｈ１−ガンマ−Ｎ１−古典的）のチャレンジ材料は、１０６．５ＴＣＩＤ５０／ブタ（６ｍＬ容量）の目標用量に処方された。チャレンジ材料は気管内経路により投与された。チャレンジウイルスの用量は、保持されたチャレンジ物質の逆滴定によって確認された。チャレンジ後−１、１、３、および５日目にすべてのブタから鼻腔スワブを収集した。
【０１５４】
チャレンジの５日後に剖検を行った。資格のある獣医師の監督の下、５ＤＰＣでバルビツール酸の過剰摂取によりブタを安楽死させた。肉眼的病変の影響を受けた各葉の表面積を記録するために、肺を採取して観察し、総合的な肺病変スコアのパーセントを得た。気管支肺胞洗浄液と鼻腔スワブをすべてのブタから採取し、ウイルス力価を測定した。顕微鏡的病変分析のために肺切片を収集した。
【０１５５】
免疫応答分析：ブタ血清サンプル中のＩＡＶ−Ｓ特異的抗体は、ＮＩテストによって決定された。血清を５６℃で３０〜６０分間熱失活させた。ＮＩテストは、以前に説明された方法に小さな変更を加えて実行された［ＳａｎｄｂｕｌｔｅおよびＥｉｃｈｅｌｂｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１６１：３３７−４５（２０１４）］。簡単に言えば、血清の２倍連続希釈液を、フェチュインでコーティングした９６ウェルプレート上で等量の発現タンパク質抗原と混合し、３７℃で一晩インキュベートした。ピーナッツ凝集素西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＰＮＡ−ＨＲＰ）を室温で２時間加えて、シアル酸を取り除いたフェチュイン分子を結合させた。ＴＭＢ基質でシグナルを取得し、結果を６５０ｎｍで読み取った。ＮＡ抗原を欠く陰性対照の平均光学密度（ＯＤ）をすべてのウェルから差し引いた。次に、テストサンプルのＯＤ値を０〜１００％のスケールで正規化し、陽性対照ウェル（ＮＡ抗原を含むが血清は含まない）の平均ＯＤを１００％と定義した。ＮＩ抗体価は、ノイラミニダーゼ活性の５０％以上を阻害したサンプルの最高希釈率として定義した。
【０１５６】
肺の病理学的検査：すべての肺葉の外側に見られる肉眼的病変（境界がはっきりした紫から梅色の統合）が、肺の前部と後部のグリッド図に記録された。各ブタの総合スコア（肺病変のパーセント）は、病変の影響を受けたグリッドの数に従って計算された。
【０１５７】
ウイルス排出：鼻腔スワブとＢＡＬ液は感染培地で１０倍に段階希釈され［０．３％ウシ血清アルブミン、フラクションＶを補充したＤｕｌｂｅｃｏの最小必須培地（ＤＭＥＭ）、２ｍＭＬグルタミン；２５μｇ／ｍＬゲンタマイシン；２μｇ／ｍＬトリプシンＩＸ］、そして、１００μＬの各希釈液を、９６ウェルプレートのコンフルエントＭＤＣＫ細胞の４つ組のウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、７２時間後、各ウェルからの上清の血球凝集試験により感染性ウイルスの存在を観察した。ＩＡＶ−Ｓ力価はＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｅｒｂｅｒの方法で計算され、１ｍＬあたりのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０として表された。
【０１５８】
結果
多価ＮＡ−ＲＰをワクチン接種したブタの免疫反応（図５を参照）
−  最初のワクチン接種を受ける前の１日にＮ１−古典的高度免疫血清で受動的に移植されたブタのワクチン接種時のＮ１−古典的抗体価は、４０〜８０であった。
【０１５９】
−  ４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンをＸｓｏｌｖｅ５０で２回ワクチン接種した後、Ｎ１−古典的抗体に対して陰性であったブタは、彼らの最初のワクチン接種の時にはＮ１−古典的抗体に対して陽性のブタと比較して、Ｎ１−古典的抗原に対して約３倍高いＮＩ力価を誘導した。
【０１６０】
−  Ｎ１−古典的陰性／プラセボワクチン接種グループのブタのＮＩ力価は、血清陰性のままであった。
【０１６１】
チャレンジ感染、肺病変に対する４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性（図６を参照）
−  ４種混合ＮＡ−ＲＰワクチン接種は、最初のワクチン接種時にＮ１−古典的抗体を含まないブタにワクチン接種した場合、肺病変の軽減に非常に効果的であった。肺病変の割合は、両方のプラセボワクチン接種群と比較して有意に減少した。
【０１６２】
−  Ｎ１−古典的ＮＩ力価の存在下でワクチン接種されたブタは、両方のプラセボワクチン接種グループと比較して、肺病変を有意に減少させた。
【０１６３】
要約
Ｎ１−古典的の血清陽性および血清陰性のブタの４種混合アジュバント化ＮＡ−ＲＰワクチン接種は、プラセボワクチン接種グループと比較して、肺病変の重症度の点でＨ１Ｎ１ウイルスからの統計的に有意な防御を示した。Ｎ１−古典的抗体価のレベルは低下したが、受動的に転送されたＮ１−古典的抗体の存在下でブタにワクチン接種した場合でも陽性である。加えて、Ｘｓｏｌｖｅアジュバントと共に使用される４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンは、驚くべきことに、Ｎ１−古典的血清陰性ブタにワクチン接種された場合、Ｎ１−古典的抗原に対して高度に免疫原性であった。
【０１６４】
実施例３
二重ＮＡ遺伝子ＲＰ構築物で処方された４種混合ノイラミニダーゼ（ＮＡ）ワクチンのワクチン有効性の評価
この研究のワクチンは、２つのＲＮＡ粒子構築物からなり、そのそれぞれが米国からの当時のＩＡＶ−Ｓ分離株の２つのＮＡ遺伝子をコードしている。１つの構成は２つのＮ１系統発生クラスター（Ｎ１−古典的およびＮ１−パンデミック）を有し、もう１つの構成は、２つのＮ２クラスター（Ｎ２−１９９８およびＮ２−２００２）を有す。ワクチンはアジュバントなしで異なる用量で処方された。目的は、ワクチン画分に対して血清陰性の離乳ブタにおけるＨ１Ｎ２（Ｎ２−２００２）ウイルス感染に対して異なる用量で処方された４種混合ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性と免疫原性を決定することであった。
【０１６５】
材料および方法
二重遺伝子（ＤＧ）ＮＡ−ＲＰ抗原およびワクチン製剤の構築
各構築物は、アルファウイルス非構造タンパク質オープンリーディングフレーム、サブゲノムプロモーターとそれに続く１つのＮＡ糖タンパク質遺伝子配列、中間部配列、第２のサブゲノムプロモーター配列とそれに続く第２のＮＡ糖タンパク質遺伝子、そして最後にアルファウイルス３’非翻訳領域よりなる。単一のＲＰ構築物に組み込まれたＮＡ  ＤＧは、米国で現在流行しているブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）分離株に由来し、プラスミドベクターｐＶＨＶでＮＡ遺伝子を合成するために使用された（表５を参照）。プラスミドベクターｐＶＨＶは、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＴＣ−８３）の非病原性ヒトワクチン株の派生物である。完成したレプリコンプラスミドは、配列構成について検証され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡに転写された。各ＮＡレプリコンＲＮＡは、ＶＥＥキャプシドヘルパーおよび糖タンパク質配列をコードするヘルパーＲＮＡとともにＶｅｒｏ細胞にエレクトロポレーションされ、ＮＡレプリコンＲＮＡがＲＰにパッケージ化された。多価免疫蛍光アッセイを使用して、機能的なＮ１およびＮ２特異的ＲＰを定量し、ワクチンの用量を決定した。試験材料を段階希釈し、４８ウェルプレートのＶｅｒｏ細胞単層に加え、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。細胞を固定し、一次Ｎ１またはＮ２−抗体で染色した後、ＦＩＴＣ標識二次抗体で染色した。個々の抗原陽性細胞をカウントし、力価をＲＰ／ｍＬの単位で計算した。
【表５】
2021506835.tif 000008
【０１６６】
ワクチンは、グルタミン酸ナトリウム、スクロース、ＰＶＰ、硫酸ナトリウム、およびＨＥＰＥＳからなる安定剤で４つの異なる用量レベル（表６を参照）になるように処方された。プラセボワクチンは、ＲＰ構築物を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）よりなった。
【表６】
2021506835.tif 000009
【０１６７】
ウイルス
チャレンジウイルスＡ／ブタ／ＩＬ／Ａ０１４７５４９５／２０１４（Ｈ１Ｎ２）は、ＵＳＤＡ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。Ｈ１Ｎ２分離株は、Ｈ１−デルタ１クラスターのＨＡ遺伝子とＮ２−２００２クラスターのＮＡ遺伝子を有する。ウイルスはＭＤＣＫ細胞培養で増殖した。細胞単層の７０％以上で細胞変性効果が明らかになるまで、コンフルエントな細胞を約４８時間感染させた。収穫時に、上清を容器から取り出し、遠心分離により清澄化した後、−６０℃以下でウイルスを保存した。
【０１６８】
動物
離乳した子ブタは、血清学スクリーニングに基づいて健康状態の高い群れから選択され、ワクチンおよびチャレンジ株に対する既存のノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体の欠如が確認された。これらの動物はオスとメスの混合であり、最初のワクチン接種時はおよそ３週齢であった。
【０１６９】
ワクチン接種、
チャレンジとサンプル収集；肺の病理学的検査；ウイルス排出とノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）テスト。
【０１７０】
上記のとおりである。
【０１７１】
結果
チャレンジ感染に対する４種混合ＮＡ−ＤＧ−ＲＰワクチンの有効性
肉眼的肺病変を図７に示す。Ｈ１Ｎ２チャレンジ感染により、プラセボ対照ブタの肺に平均１６．７％の病変が生じた。用量レベルと独立してワクチン接種されたブタは、平均３．３％以下の肺病変を有し、プラセボ群よりも有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。
【０１７２】
鼻からの排出（図8を参照）
すべてのブタは、チャレンジ前の時点でウイルス排出に陰性であった。ワクチン接種されたブタはいずれも１ＤＰＣでウイルスの排出はなかったが、プラセボ群の１頭のブタは１０２．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのウイルスを排出した。３ＤＰＣでは、処方された最初の２つの最高用量（ワクチン１および２）でワクチン接種されたブタは、プラセボブタと比較して、鼻腔内のウイルスを大幅に減少させた。５ＤＰＣでは、最高のワクチン用量（ワクチン１）でワクチン接種されたブタのみが、プラセボ群と比較してウイルス排出を有意に減少した。
【０１７３】
ワクチン接種に対する免疫学的反応
ノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）力価を図９に示す。異なる用量レベルで製剤化されたワクチンは、すべてのワクチン接種されたブタで血清変換を誘発し（Ｎ２−２００２力価＞４０）、ピークの力価は２回目のワクチン接種後１４日であった。１４ＤＰＶ２と−１ＤＰＣで検出された平均力価は、ワクチン接種グループ間で有意差はなかった。しかし、検出されたＮＩ力価のレベルは、ワクチン投与量に応じて傾向があるようである（より高い投与量、より高いＮＩ力価）。プラセボ群のブタは、サンプル採取の時点を通じて血清陰性のままであった。
【０１７４】
要約
Ｈ１Ｎ２感染は、高い鼻からの排出を伴う高い肺病変スコアを誘発した。肺病変に関する保護は、テストしたワクチンの投与量レベルに関係なく堅牢であった（最低のＮ２−ＤＧ−ＲＰ投与量は２．５ｘ１０５ＲＰ／ｍＬであった）。チャレンジ後の最初の５日間の脱落をＮ２−ＤＧ−ＲＰ構築物で大幅に削減するには、最小レベル２．５ｘ１０７ＲＰ／ｍＬが必要である。すべてのブタは、２回目のワクチン接種の２週間後にＮ２２００２力価が陽性であった。検出された抗体レベルは、ワクチンの用量に応じて傾向があるようであり、より高いレベルのワクチンを投与されたブタでより高いレベルが観察された。
【０１７５】
実施例４
単一ＮＡ遺伝子ＲＰ構築物で処方された２種混合ノイラミニダーゼ（ＮＡ）ワクチンのワクチン有効性の評価
５つの異なる二価アジュバント化ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性と免疫原性を決定するための研究が行われ、それぞれが当時のＥＵ  ＩＡＶ−Ｓ分離株の単一の異なるＮＡ遺伝子を個別にコード化した。これらのＮＡ遺伝子を合わせて、２つのＮ１系統と３つのＮ２系統を表す（以下の表７を参照）。アジュバント化ワクチンは、生後５週と８週の２回の筋肉内（ＩＭ）ワクチン接種でブタに投与された（１用量あたり１ｍＬ；５ｘ１０６ＲＰ／用量）。以下の表８に示すように、５つのアジュバント化ＮＡ−ＲＰワクチンの有効性を、対応するチャレンジ感染に対して個別に試験した。
【０１７６】
材料および方法
ＮＡ−ＲＰ抗原の構築：
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を発現するアルファウイルスレプリコンＲＮＡを含む複製欠陥ＲＮＡ粒子（ＲＰ）は、実施例１に記載のように調製した。
【０１７７】
血清学的反応実験：
治療群の概要を以下の表８に示す。ＮＡ−ＲＰワクチンは、アジュバント（ＸＳｏｌｖｅ５０）を使用して、１ｍＬの容量で５ｘ１０６ＲＰ／用量の用量レベルで処方された。ワクチンは、５および８週齢のブタに１ｍＬの用量でＩＭ投与された。最後のワクチン接種の２週間後に血清サンプルを収集して、それぞれの系統および相同ＮＡタンパク質に属する異種インフルエンザ株に対するＮＩ抗体力価を定量化した。
【０１７８】
ワクチン接種とチャレンジ：
Ｘ−Ｓｏｌｖｅ５０アジュバントを使用した２つの異なる系統のＮＡ抗原をコードするＲＰワクチンを使用して、グループあたり９匹のブタを５および８週齢の筋肉内経路で２回免疫した。プラセボ群はそれぞれ７匹のブタからなり、Ｘ−ｓｏｌｖｅ５０で無関係の抗原をコードするＲＰでワクチン接種された。２回目のワクチン接種の２週間後、すべてのブタから血液サンプルを収集し、それぞれの系統に属する異種インフルエンザ株に対するノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体力価を定量化し、平均ＮＩ力価を表に示す。血液サンプルを収集した後、ブタは、系統に一致する異種インフルエンザＡ株でワクチン成分の１つにチャレンジされた。チャレンジ後３日目にブタを犠牲にし、各ブタから６つの肺サンプル（各肺葉から１つずつ）を収集し、プールされた肺ホモジネートを使用してウイルス量を測定した。値はウイルス力価の幾何平均（ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）である。データは、マンホイットニーＵ検定で分析される。＊値は、それぞれの非ワクチン接種グループと大幅に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【表７】
2021506835.tif 000010
【表８】
2021506835.tif 000011
【０１７９】
結果
この実験の結果を表８に示す。ＮＡ−ＲＰワクチンの５つすべてが、それぞれの系統および相同ＮＡタンパク質に属する異種インフルエンザ株に対するブタの機能的ＮＩ抗体価を誘発した。
【０１８０】
各ブタからの肺サンプルを収集し、プールされた肺ホモジネートを使用してウイルス量を決定した。提供される値は、ウイルス力価の幾何平均（ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）である。表８から明らかなように、ワクチン接種されたブタの値は、それぞれの非ワクチン接種グループと大幅に異なり（Ｐ＜０．０５）、異種ウイルス株による感染時のウイルス負荷に関してＮＡ−ＲＰワクチンの成功を示す。
【０１８１】
実施例５
米国の系統発生クラスター決定
米国のノイラミニダーゼ（ＮＡ）クラスターの定義
米国Ｎ１クラスター：
（１）Ｎ１クラスター内のアミノ酸同一性
ａ．  Ｎ１パンデミックまたはＮ−パンデミックは、〜９７％−１００％（平均％多様性は３．１２％）であり、
ｂ．  Ｎ１古典的またはＮ１−古典的は、〜９５％−１００％（平均％多様性は４．９１％）である
（２）Ｎ１クラスター間のアミノ酸同一性は、〜８２％（平均％多様性は１８．２６％）である
米国Ｎ２クラスター：
（１）Ｎ２クラスター内のアミノ酸同一性
ａ．  Ｎ２１９９８またはＮ２−１９９８は、〜９４％−１００％（平均％多様性は５．９４％）であり、
ｂ．  Ｎ２２００２またはＮ２−２００２は、〜９４％−１００％（平均％多様性は６．３７％）である
（２）Ｎ２クラスター間のアミノ酸同一性は、〜８８％（平均％多様性は１１．８４％）である。
【０１８２】
方法
２０００年から現在までに収集されたＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ１ウイルスのＵＳ  Ｎ１（合計約１，５５０配列）、および、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２ウイルスのＵＳ  Ｎ２（合計約２，７００配列）の全長非重複アミノ酸配列は、インフルエンザリサーチデータベースからダウンロードされた。ＵＳ  Ｎ１およびＮ２データのクラスター内およびクラスター間のアミノ酸同一性パーセントは、バージョンＭＥＧＡ  ７．０．７を使用して分析された［Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８：２６８５−２６８６（２０１２）を参照］。ＭＡＦＦＴバージョン７．２９４ｂを使用した２つの配列アライメント［加藤ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３０５９−３０６６（２００２）；加藤ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ３０：７７２−７８０（２０１３）］、および２つの別々のＮ１およびＮ２最尤系統発生樹が、ＦａｓｔＴｒｅｅバージョン２．１．８で生成された［Ｐｒｉｃｅら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、５（３）２０１０：ｅ９４９０］。Ｎ１およびＮ２系統に基づいて、Ｎ１およびＮ２配列は、以前に記述された４つのＮＡ抗原系統の１つ、Ｎ１古典的、Ｎ１パンデミック、Ｎ２１９９８、およびＮ２２００２に割り当てられた［Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８６（１６）：８８７２−８８７８（２０１２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｓｕｐｐｌ  ４：４２−５１（２０１３）］。特定のクラスターにタグが付けられ、多様性メトリクスはさらに、ＭＥＧＡコマンドラインを使用してデフォルト設定で計算され、クラスター内およびクラスター間多様性のためのｐ距離計算がガンマ分散レート変動（アルファ０．５）および部分削除が９５％に設定された。
【０１８３】
実施例６
ヨーロッパの血統決定
ＥＵ−ＮＡパートの導入：
北米と同様に、インフルエンザＡウイルスの３つのサブタイプＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ２は、ヨーロッパのブタ集団のブタ間で同時に循環している。ただし、ＨＡおよびＮＡ遺伝子の系統は、各サブタイプ内で大幅に異なる［Ｋｕｎｔｚ−Ｓｉｍｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｄｅｃ  Ｚｏｏｎｏｓｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ．、５６（６−７）：３１０−３２５（２００９）を参照］。ヨーロッパのブタインフルエンザ分離株のＮＡ遺伝子は、Ｗａｔｓｏｎらによって説明されているように、４つの主要系統と２つのマイナー系統に属する［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：９９２０−９９３１（２０１５）；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０−１５］。
【０１８４】
主な系統は次のとおりである。
【０１８５】
１．  Ａ（Ｈ１Ｎ１）パンデミック２００９様Ｎ１
２．ユーラシアトリ様Ｎ１
３．  Ａ／ブタ／ゲント／１９８４様Ｎ２（ゲント／８４）、および
４．  Ａ／ブタ／スコットランド／４１０４４０／１９９４様Ｎ２（スコット／９４）。
【０１８６】
他のヨーロッパの主要な系統とは異なり、スコットランド／９４系統のＮＡセグメントには、ヨーロッパのブタ集団で循環している４つの主要なウイルス群が含まれている。マイナーなヨーロッパのインフルエンザＮＡ系統には次のものがある：
１．  Ａ／ブタ／イタリア／４６７５／２００３様Ｎ２、および
２．  ヒト季節様Ｎ２
【０１８７】
ＥＵ  ＮＡ−Ｎ１およびＮ２遺伝子セグメントの分析に使用される方法の記載：
２００５年から２０１８年の間に収集されたヨーロッパのブタ分離株の全長ＮＡ遺伝子のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩインフルエンザウイルスリソースから取得された［Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、ｒｅｆ．３２、８９：９９２０−９９３１（２０１５）；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０−１５を参照］］。Ｎ１およびＮ２配列は、ＭＥＧＡ  Ｘで提供されるデフォルト設定でマッスル（コドン）アライナーを使用して整列された［Ｋｕｍａｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ３５：１５４７−１５４９（２０１８）］。Ｗｈｅｌａｎ及びＧｏｌｄｍａｎモデルに基づく最尤法を使用して、進化の歴史を推測した［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  １８：６９１−６９９（２００１）］。系統発生テストでは、２５０回の複製を行うブートストラップ法を使用した。個別のガンマ分布を使用して、サイト間の進化速度差をモデル化した［５つのカテゴリ（＋Ｇ、パラメーター＝０．７２５８）］。レート変動モデルでは、一部のサイトを進化的に不変にすることができた｛［＋Ｉ］、３８．０８％サイト｝。分析は、２４４アミノ酸配列を含んでいた。サイトカバレッジが９５％未満のすべての位置が排除された。つまり、５％未満のアライメントギャップ、欠損データ及びあいまいな塩基がどの位置においても許可されていた。最終的なデータセットには合計４６９の位置があった。ＭＥＧＡ  Ｘで進化分析が行われた［Ｋｕｍａｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ３５：１５４７−１５４９（２０１８）］。Ｎ１分離株にはユーラシアトリＮ１のような系統またはパンデミック２００９−Ｎ１系統の系統が割り当てられ、Ｎ２分離株には、以前に説明されているように［Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８９：９９２０−９９３１（２０１５）］、スコットランド／４１０４４０／１９９４−Ｎ２様系統（例えばクレード１またはクレード２）、ゲント／１／１９８４−Ｎ２様系統、イタリア／４６７５／２００３−Ｎ２様系統またはヒト季節様Ｎ２が割り当てられた。系統内および系統間の遺伝的同一性は、ＭＥＧＡ  Ｘを使用して計算された。続いて、上記の系統のそれぞれからの代表的な株がワクチンの候補として選択された。
【０１８８】
それぞれの系統および/またはクレードの次のターゲット配列には、変動範囲を有することになる：
・変動率１０％のＡ／ブタ／イタリア／１７９０５７／２０１５（Ｈ１Ｎ１）配列
・変動率１５％のＡ／ブタ／イタリア／２８７６２−３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）配列
・変動率１０％のＡ／ブタ／イタリア／２４８１４７−８／２０１５（Ｈ３Ｎ２）配列
・変動率１０％のＡ／ブタ／イタリア／１２９４５２／２０１５（Ｈ１Ｎ２）配列
・変動率１０％のＡ／ブタ／イングランド／６１４７０／２０１３（Ｈ１Ｎ２）配列
・変動率１０％のＡ／ブタ／イタリア／２４６０８７／２０１４（Ｈ１Ｎ２）配列。
【０１８９】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【０１９０】
さらに、核酸またはポリペプチドに対して与えられるすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子量の値は概算であり、説明のために提供されることを理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月17日(2020.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々が個別に１以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはその抗原性断片をコードする２以上のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
ここで、第１のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、第１のノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはその抗原性断片をコードし、そして、第２のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、第２のＮＡまたはその抗原性断片をコードし、
ここで、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、２以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはその抗原性断片をコードし、
但し、免疫原性組成物は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ−Ｓ）赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片を含まず、ＩＡＶ−Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まず、
そしてここで、第１のＮＡおよび第２のＮＡは、９８％以下の同一性を有するアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
第１のＮＡが第１の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来し、第２のＮＡが第２の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来する、請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第１の系統発生クラスターと第２の系統発生クラスターは異なり、
そしてここで、第１の系統発生クラスターおよび第２の系統発生クラスターは、Ｎ１−古典的クラスター、Ｎ１−パンデミッククラスター、Ｎ２−１９９８クラスターおよびＮ２−２００２クラスターからなる群から個別に選択される、免疫原性組成物。
【請求項３】
第１の系統発生クラスターがＮ１−古典的クラスターおよびＮ１−パンデミッククラスターからなる群から選択され、そして、第２の系統発生クラスターがＮ２−１９９８クラスターおよびＮ２−２００２クラスターからなる群から選択される、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
第１の系統発生クラスターがＮ１−古典的クラスターであり、第２の系統発生クラスターがＮ２−２００２クラスターである、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
第３のＮＡまたはその抗原性断片をコードする第３のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む請求項２〜４のいずれかの請求項に記載の免疫原性組成物であって、ここで、第３のＮＡは、第３の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来し、そしてここで、第３の系統発生クラスターは、第１の系統発生クラスターおよび第２の系統発生クラスターとは異なる、免疫原性組成物。
【請求項６】
第４のＮＡまたはその抗原性断片をコードする第４のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む請求項５に記載の免疫原性組成物であって、ここで、第４のＮＡは、第４の系統発生クラスターからのＩＡＶ−Ｓに由来し、そしてここで、第４の系統発生クラスターは、第１の系統発生クラスター、第２の系統発生クラスターおよび第３の系統発生クラスターとは異なる、免疫原性組成物。
【請求項７】
第１の系統発生クラスターはＮ１−古典的クラスターであり、第２の系統発生クラスターはＮ２−２００２クラスターであり、第３の系統発生クラスターはＮ１−パンデミッククラスターであり、そして、第４の系統発生クラスターはＮ２−１９９８クラスターである、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が２以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはその抗原性断片をコードする請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第１のＮＡは第１の系統のＩＡＶ−Ｓに由来し、第２のＮＡは第２の系統のＩＡＶ−Ｓに由来し、
ここで、第１の系統と第２の系統は異なり、そしてここで、第１の系統および第２の系統は、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統、Ｎ１−ユーラシアトリ系統、Ｎ２−ゲント／１９８４系統、Ｎ２−イタリア／４６７５／２００３系統、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統およびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統からなる群から個別に選択される、免疫原性組成物。
【請求項９】
第１の系統が、Ｎ１−パンデミック（ＥＵ）系統およびＮ１−ユーラシアトリ系統からなる群から選択され、そしてここで、第２系統が、Ｎ２−ゲント／１９８４系統、Ｎ２イタリア／４６７５／２００３系統、Ｎ２−スコットランド／１９９４（クレード１）系統およびＮ２−スコットランド／１９９４（クレード２）系統からなる群から選択される、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
請求項２に記載の免疫原性組成物であって、ここで、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は２以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはその抗原性断片をコードし、
ここで、第１の系統発生クラスターはＮ１−古典的クラスターであり、第２の系統発生クラスターはＮ１−パンデミッククラスターである、免疫原性組成物。
【請求項１１】
第３のＮＡまたはその抗原性断片および第４のＮＡまたはその抗原性断片をコードする第２のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む請求項１０に記載の免疫原性組成物であって、
ここで、第３のＮＡはＮ２−１９９８クラスターのＩＡＶ−Ｓに由来し、第４のＮＡはＮ２−２００２クラスターのＩＡＶ−Ｓに由来する、免疫原性組成物。
【請求項１２】
すべてのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子がベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、請求項１〜１１のいずれかの請求項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかの請求項に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される担体を含む、インフルエンザウイルスによる疾患の予防を補助するワクチンであり、
但し、ワクチンは、ＩＡＶ−Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片を含まず、ＩＡＶ−Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列も含まない、ワクチン。
【請求項１４】
生分解性油、２．５−５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルション、及び、２．５−５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンと混合された生分解性油、よりなる群から選択されるアジュバンドを含む、請求項１３のワクチン組成物。
【請求項１５】
生分解性油がｄｌ−α−酢酸トコフェリルであり、鉱油が流動パラフィンである、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかの請求項に記載のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む、ブタインフルエンザＡウイルスに対してブタを免疫する方法。
【請求項１７】
ブタにおいてブタインフルエンザＡウイルスによる疾患の予防を補助するワクチンにおいて用いるための、請求項１〜１２のいずれかの請求項に記載の免疫原性組成物。
【国際調査報告】
2021506835.tif 000027
2021506835.tif 000028
2021506835.tif 000029