(57)【要約】  タンパク質等の化合物の濃度を、化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法及びシステムが提供される。方法及びシステムは、包括的には、（ｉ）化合物のアジュバント化複合体を含む組成物の固有蛍光を測定することと、（ｉｉ）測定された蛍光強度値を、化合物の既知の濃度を使用して作成された較正曲線と比較することとを含む。選択された化合物のアジュバントに対するパーセント吸着を決定する方法及びシステムも提供される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された化合物の濃度を、前記選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法であって、
（ａ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物について蛍光強度値を得ることであって、前記選択された化合物は少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含み、前記組成物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、前記組成物についての前記蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定されることと、
（ｂ）（ａ）にて得られた前記蛍光強度値を、前記選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料の蛍光値を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、前記選択された化合物の濃度を前記選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
（ｂ）の較正曲線は、前記代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成され、前記較正試料内の前記代表的化合物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、前記較正試料のそれぞれについて３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）の較正曲線は、前記代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも５つの較正試料を使用して作成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）の較正曲線は、
（ａ）前記選択された化合物のアジュバント化複合体を含む前記組成物内で前記選択された化合物の疑わしい濃度の約５０％、７５％、１００％、１２５％、及び１５０％を示す濃度を有する前記代表的化合物の少なくとも５つの較正試料を調製すること、
（ｂ）（ａ）の各較正試料を、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長を使用して励起すること、
（ｃ）（ｂ）の各試料の放出スペクトルを、各較正試料について最大蛍光強度を生成する３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長を使用して決定すること、
（ｄ）前記最大蛍光強度を生成した（ｃ）の前記波長における蛍光強度の値を、前記較正試料内の前記代表的化合物の濃度に対してプロットすることであって、それにより、前記代表的化合物の較正曲線を作成すること、
によって作成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記選択された化合物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖タンパク質複合体、ウィルス様粒子、又はウィルス懸濁液からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記代表的化合物は前記選択された化合物と同一である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記代表的化合物は前記選択された化合物に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記代表的化合物は前記代表的化合物のアジュバント化複合体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記励起波長は２８０ｎｍから２９０ｎｍの間にあり、前記放出スペクトルは３２０ｎｍから３６０ｎｍの間の波長で決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
選択された化合物のパーセント（％）吸着を、前記選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法であって、
（ａ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物の２つの試験試料を得ることであって、前記選択された化合物は少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含み、第１の試験試料内で前記アジュバント化複合体は実質的に溶液内にあり、第２の試験試料内で前記アジュバント化複合体は実質的に溶液から分離して沈殿することと、
（ｂ）（ｉ）前記第１の試験試料について蛍光強度値を得ることであって、前記第１の試験試料は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、前記第１の試験試料についての前記蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定されること、及び、（ｉｉ）前記蛍光強度値を、前記選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、前記第１の試験試料内で前記選択された化合物の濃度を決定することによって、前記第１の試験試料内で前記選択された化合物の濃度を決定することと、
（ｃ）（ｉ）前記第２の試験試料の上澄みについて蛍光強度値を得ることであって、前記第２の試験試料の前記上澄みは２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、前記第２の試験試料の上澄みについての前記蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定されること、及び、（ｉｉ）前記蛍光強度値を、前記選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、前記第２の試験試料内で前記選択された化合物の濃度を決定することによって、前記第２の試験試料の上澄み内で前記選択された化合物の濃度を決定することと、
（ｄ）（ｃ）にて決定された濃度を（ｂ）にて決定された濃度で割ることによってパーセント（％）吸着を計算することであって、それにより、選択された化合物のパーセント（％）吸着を、前記選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する、計算することと、
を含む、方法。
【請求項１１】
（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、前記代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成され、前記較正試料内の前記代表的化合物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、前記較正試料のそれぞれについて３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、前記代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも５つの較正試料を使用して作成される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、
（ａ）前記第２の試験試料内で実質的に溶液から分離して沈殿した前記アジュバント化複合体の疑わしい濃度の約５０％、７５％、１００％、１２５％、及び１５０％を示す濃度を有する前記代表的化合物の少なくとも５つの較正試料を調製すること、
（ｂ）（ａ）の各較正試料を、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長を使用して励起すること、
（ｃ）（ｂ）の各試料の放出スペクトルを、各較正試料について最大蛍光強度を生成する３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長を使用して決定すること、
（ｄ）前記最大蛍光強度を生成した（ｃ）の前記波長における蛍光強度の値を、前記較正試料内の前記代表的化合物の濃度に対してプロットすることであって、それにより、前記代表的化合物の較正曲線を作成すること、
によって作成される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｂ）及び（ｃ）の較正曲線は同じ較正曲線である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択された化合物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖タンパク質複合体、ウィルス様粒子、又はウィルス懸濁液からなる群から選択される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記代表的化合物は前記選択された化合物と同一である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記代表的化合物は前記選択された化合物に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記代表的化合物は前記代表的化合物のアジュバント化複合体である、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記励起波長は２８０ｎｍから２９０ｎｍの間にあり、前記放出スペクトルは３２０ｎｍから３６０ｎｍの間の波長で決定される、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
蛍光強度値を得ることは、フローセルに取り付けられた蛍光プローブによる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
インライン、オンライン、又はオフラインで実施される、請求項１又は１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択された化合物は、アルミニウム塩、乳剤、ペプチド、核酸、及びその組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアジュバントによってアジュバント化される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルミニウム塩はＡｌＯＯＨ及びＡｌＰＯ４の１つ以上である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記芳香族アミノ酸は、トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニンからなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択された化合物の固有蛍光が決定される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記選択された化合物の固有蛍光は、付加された蛍光プローブ又はマーカーの非存在下で決定される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記選択された化合物は、約３２０ｎｍから３６０ｎｍの間の最大放出を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物を製造する方法であって、選択された化合物の濃度を、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記選択された化合物のアジュバント化複合体のバッチにて決定することを含み、前記選択された化合物の前記アジュバント化複合体の前記バッチを組み込んだ組成物を製剤化することは、前記決定の結果に基づいて進められる、方法。
【請求項２９】
ワクチン製剤内のタンパク質の濃度を測定するシステムであって、
前記ワクチン製剤がそこを通って流れることができる導管と、
蛍光強度センサーであって、前記導管に結合され、前記導管内の前記ワクチン製剤内の前記タンパク質の蛍光強度値を示す信号を出すことが可能な、蛍光強度センサーと、
前記センサーに結合され、前記センサーからの信号を受信し、プログラムを記憶する非一時的メモリを含むコンピューターと、
を備え、前記プログラムは、前記導管内の前記ワクチン製剤内の前記タンパク質の蛍光値を示す前記信号を、前記コンピューターにおいて前もって作成され記憶された較正曲線と比較し、前記信号と前記較正曲線の比較から、前記ワクチン製剤内の前記タンパク質の濃度の出力を提供する、システム。
【請求項３０】
前記導管は、内部にタンパク質を有する前記ワクチン製剤の供給部と前記センサーの下流に位置する前記ワクチン製剤の貯蔵コンテナーとの間に延在する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
ポンプは、前記センサーの上流の導管内にある、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記導管は前記ワクチン製剤の貯蔵コンテナーの入口と出口との間に延在し、前記センサーは前記入口と前記出口との間にある、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３３】
ポンプは、前記センサーの下流の前記導管内にある、請求項３２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ワクチン製剤内の抗原の濃度は、製造プロセス及び製品品質における一貫性を確保するために制御される必要がある重要なパラメーターである。そのような製剤の生産中に抗原の濃度をモニターすることは、製剤正確度（formulation accuracy）を制御すること、プロセス関連損失を推定すること、製品同質性をモニターすること、及び所与のアジュバントに対する抗原の適切な吸着を確保すること等の幾つかの理由からも重要である［１，２］。
【０００２】
通常、タンパク質ベースワクチン製剤は、懸濁液又は乳剤として生産されるが、これはアルミニウム塩（すなわち、ＡｌＯＯＨ、ＡｌＰＯ４等）又はスクアレン乳剤（すなわち、スクアレンＡＳ０３、ＭＦ５９等）等のアジュバントの含有の結果である。アジュバントは、しばしばワクチン製剤の重要な成分である［３〜５］が、アジュバントの存在は、例えば、アジュバント粒子によって導入される濁度によって、一般に使用されるタンパク質定量法に対する著しい干渉を生じる可能性がある。アルミニウム塩を含むワクチン製剤内に存在する抗原を分析するための多くの方法が公開されているが、そのような方法は、製剤の濁度のために試験の前に抗原脱離を必要とする［６〜８］。文献に記載される脱離プロシージャは、むしろ複雑でかつ時間がかかり、変動性のある回復及び問題のある再現性を伴う［９，１０］。フローサイトメトリー［１１］、化学発光窒素検出（chemiluminescent nitrogen detection）［１２］、マイクロケルダール（micro-Kjeldalh）［１３］、及びオルトフタルアルデヒドアッセイ（o-phthalaldehyde assay）［９］等の、アジュバント化ワクチン内の抗原の定量について報告された他の方法は懸濁液に直接適用することができる。それでも、これらの方法は、大抵は破壊的であり、また特定の抗体又は特別な試薬を必要とし、したがって、これらの方法は、高速ターンアラウンド又はインラインプロセスモニタリングに適さない。現在のところ、アジュバント化ワクチン製剤のパーセント吸着をインラインで測定する方法も存在しない。
【０００３】
ワクチン製剤内のアジュバント化抗原の濃度を正確にかつ再現性よく決定するための新しい非破壊法が必要とされることが明らかである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、アジュバント化抗原を含むワクチン製剤内の抗原の濃度を正確にかつ再現性よく決定することに関連する問題を克服するために設計された新規な方法に関する。本明細書で述べる方法は、評価中のワクチン製剤内のアジュバント化抗原の試料における濁度の干渉等の問題を克服する。本明細書で述べる方法は、抗原がアジュバントによって製剤化される場合に、タンパク質の固有蛍光（ＩＦ：intrinsic fluorescence）を測定し、定量することができるという、本発明者らによる発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書で報告されるように、或る特定の芳香族アミノ酸を含むタンパク質の固有蛍光は、アジュバントからのタンパク質の脱離についての必要性なしで、ほとんどの混合物、更にはアルミニウム塩アジュバントを含む混合物中のタンパク質濃度を測定するために使用することができる。この発見は、固有蛍光を使用した、選択された化合物の製剤の正確な測定に拡張されており、製剤は、選択された化合物のアジュバント化複合体を含み、選択された化合物は、少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含む。
【０００６】
本発明は、幾つかの実施の形態及びその特定の態様を含むが、それに限定されないものとして、以下の節において簡潔に要約される。
【０００７】
したがって、第１の実施の形態において、本発明は、選択された化合物の濃度を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法に関する。この実施の形態において、方法は、
（ａ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物について蛍光強度値を得ることであって、選択された化合物は少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含み、組成物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、組成物についての蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定されることと、
（ｂ）（ａ）にて得られた蛍光強度値を、選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料の蛍光強度値を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、選択された化合物の濃度を選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定することと、
を含む。
【０００８】
この実施の形態の或る特定の態様において、（ｂ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成され、較正試料内の代表的化合物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、較正試料のそれぞれについて３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される。
【０００９】
この実施の形態の或る特定の態様において、（ｂ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも５つの較正試料を使用して作成される。
【００１０】
この実施の形態の或る特定の態様において、（ｂ）の較正曲線は、
（ａ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含むの組成物内で選択された化合物の疑わしい濃度の約５０％、７５％、１００％、１２５％、及び１５０％を示す濃度を有する代表的化合物の少なくとも５つの較正試料を調製すること、
（ｂ）（ａ）の各較正試料を、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長を使用して励起すること、
（ｃ）（ｂ）の各試料の放出スペクトルを、各較正試料について最大蛍光強度を生成する３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長を使用して決定すること、
（ｄ）最大蛍光強度を生成した（ｃ）の波長における蛍光強度の値を、較正試料内の代表的化合物の濃度に対してプロットすることであって、それにより、代表的化合物の較正曲線を作成する、プロットすること、
によって作成される。
【００１１】
この実施の形態の或る特定の態様において、種々の方法は２８０ｎｍから２９０ｎｍの間の励起波長を使用して実施され、放出スペクトルは３２０ｎｍから３６０ｎｍの間の波長で決定される。
【００１２】
第２の実施の形態において、本発明は、選択された化合物のパーセント（％）吸着を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法に関する。この実施の形態において、方法は、
（ａ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物の２つの試験試料を得ることであって、選択された化合物は少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含み、第１の試験試料内でアジュバント化複合体は実質的に溶液内にあり、第２の試験試料内でアジュバント化複合体は実質的に溶液から分離して沈殿することと、
（ｂ）（ｉ）第１の試験試料について蛍光強度値を得ることであって、第１の試験試料は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、第１の試験試料についての蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される、得ること、及び、（ｉｉ）蛍光強度値を、選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、第１の試験試料内で選択された化合物の濃度を決定する、比較することによって、第１の試験試料内で選択された化合物の濃度を決定することと、
（ｃ）（ｉ）第２の試験試料の上澄みについて蛍光強度値を得ることであって、第２の試験試料の上澄みは２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、第２の試験試料の上澄みについての蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される、得ること、及び、（ｉｉ）蛍光強度値を、選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、第２の試験試料内で選択された化合物の濃度を決定する、比較することによって、第２の試験試料の上澄み内で選択された化合物の濃度を決定することと、
（ｄ）（ｃ）にて決定された濃度を（ｂ）にて決定された濃度で割ることによってパーセント（％）吸着を計算することであって、それにより、選択された化合物のパーセント（％）吸着を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定することと、
を含む。
【００１３】
この実施の形態の或る特定の態様において、（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成され、較正試料内の代表的化合物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、較正試料のそれぞれについて３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される。
【００１４】
この実施の形態の或る特定の態様において、（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも５つの較正試料を使用して作成される。
【００１５】
この実施の形態の或る特定の態様において、（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、
（ａ）第２の試験試料内で実質的に溶液から分離して沈殿したアジュバント化複合体の疑わしい濃度の約５０％、７５％、１００％、１２５％、及び１５０％を示す濃度を有する代表的化合物の少なくとも５つの較正試料を調製すること、
（ｂ）（ａ）の各較正試料を、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長を使用して励起すること、
（ｃ）（ｂ）の各試料の放出スペクトルを、各較正試料について最大蛍光強度を生成する３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長を使用して決定すること、
（ｄ）最大蛍光強度を生成した（ｃ）の波長における蛍光強度の値を、較正試料内の代表的化合物の濃度に対してプロットすることであって、それにより、代表的化合物の較正曲線を作成する、プロットすること、
によって作成される。
【００１６】
この実施の形態の或る特定の態様において、種々の方法は２８０ｎｍから２９０ｎｍの間の励起波長を使用して実施され、放出スペクトルは３２０ｎｍから３６０ｎｍの間の波長で決定される。
【００１７】
この実施の形態の或る特定の態様において、（ｂ）及び（ｃ）の較正曲線は同じ較正曲線である。
【００１８】
第３の実施の形態において、本発明は、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物を製造する方法に関する。この実施の形態において、方法は、選択された化合物の濃度を、本出願において規定される方法（例えば、上記で要約され、以下で詳細に述べられる第１の実施の形態の方法）を使用して、選択された化合物のアジュバント化複合体のバッチにて決定するステップを含み、選択された化合物のアジュバント化複合体のバッチを組み込んだ組成物を製剤化することは、決定の結果に基づいて進められる。
【００１９】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、選択された化合物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖タンパク質複合体（polysaccharide-protein conjugate）、ウィルス様粒子（virus-like particle）、又はウィルス懸濁液とすることができるが、それに限定されない。１つの態様において、選択された化合物はタンパク質である。
【００２０】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、芳香族アミノ酸は、トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニンの１つ以上とすることができるが、それに限定されない。
【００２１】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、選択された化合物は、限定はしないが、アルミニウム塩、乳剤、ペプチド、核酸、及び上記化合物の組み合わせから選択される１つ以上のアジュバントによってアジュバント化される。１つの態様において、アジュバントはＡｌＯＯＨ及びＡｌＰＯ４等のアルミニウム塩である。
【００２２】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、アジュバントは、２８０ｎｍから２９０ｎｍの間の波長範囲内の光で励起されると、２９０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲内で２０％未満の蛍光を示す。
【００２３】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、選択された化合物の固有蛍光が決定される。１つの態様において、選択された化合物の固有蛍光は、付加された蛍光プローブ又はマーカーの非存在下で決定される。別の態様において、蛍光強度値は、選択された化合物に結合した蛍光プローブを介して得られる。
【００２４】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、選択された化合物は、約３２０ｎｍから３６０ｎｍの間の最大放出を有する。
【００２５】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、代表的化合物は、選択された化合物と同一である又は選択された化合物と異なるものとすることができる。例えば、代表的化合物は、ペプチド又はタンパク質であるとき、選択された化合物に対して少なくとも９０％の配列同一性を有することができる。
【００２６】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、代表的化合物は代表的化合物のアジュバント化複合体である。アジュバントは、選択された化合物のアジュバント化複合体の生産において使用されるものと同じアジュバント又は異なるアジュバントとすることができる。
【００２７】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、蛍光強度値は、光度計を介して、フローセルに取り付けられた蛍光プローブによって得られる。
【００２８】
本発明の関連する実施の形態及び態様において、方法は、インライン、オンライン、又はオフラインで実施される。
【００２９】
本発明の第４、第５、及び第６の実施の形態は、本発明の第１、第２、及び第３の実施の形態の方法を実施するために実装することができるシステムに関する。
【００３０】
これらの実施の形態の或る特定の態様において、システムは、プログラムを記憶する非一時的メモリを有するコンピューターを含み、プログラムは、実行されると、本発明の方法の一部の又は全ての特徴を実施する。
【００３１】
これらの実施の形態の或る特定の態様において、非一時的メモリは、半導体メモリ、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク、又は他の電子若しくは光メモリデバイス等のコンピューター可読媒体とすることができる。さらに、プログラムは、本発明の方法の一部の又は全ての特徴を実施するようにコンピューターに指令するための、実行可能命令又は１つ以上のアルゴリズムを含むコンピュータープログラムである。
【００３２】
これらの実施の形態の或る特定の態様において、コンピューターは、本発明の方法の一部の又は全ての特徴を実施するために実装される、汎用プロセッサ、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、専用プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、再構成可能プロセッサ、集積回路（ＩＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、又は大規模集積回路（ＬＳＩ）として実装することができるコントローラーを含む。
【００３３】
これらの実施の形態の或る特定の態様において、システムは、選択された化合物の濃度を、選択された化合物のアジュバント化複合体（adjuvanted complex）を含む組成物にて決定し、選択された化合物のパーセント（％）吸着を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する。
【００３４】
これらの実施の形態の或る特定の態様において、システムは、（ｉ）搬送手段と、（ｉｉ）蛍光強度値決定手段とを含む。
【００３５】
これらの実施の形態の或る特定の態様において、搬送手段、例えば、チューブは、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物又は試験試料を蛍光強度値決定手段に搬送する。さらに、蛍光強度値決定手段は、組成物の蛍光強度値を決定する。幾つかの態様において、蛍光強度値決定手段は、フローセルに取り付けられた蛍光プローブであり、フローセルを通して、組成物又は試験試料が搬送手段によって流れる。蛍光プローブは、蛍光強度値を決定するための光度計と通信状態にあることができる。
【００３６】
これらの実施の形態の或る特定の態様において、コンピューターは、蛍光強度値を受信し、これらの値を較正曲線と比較し、それにより、選択された化合物の濃度を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する。
【００３７】
これらの実施の形態の或る特定の態様において、コンピューターは、蛍光強度値を受信し、これらの値を較正曲線と比較し、それにより、選択された化合物のパーセント（％）吸着を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する。
【００３８】
上記は、以下の本発明の詳細な説明をよりよく理解することができるように本発明の特徴及び技術的な利点を幅広く概説した。本発明の追加の特徴及び利点が本明細書に記載され、本発明の特許請求の範囲の主題をなす。本明細書に開示される任意の概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実施するため他の構造を修飾又は設計するための基礎として容易に利用可能であることが当業者に理解される。また、かかる等価な構築物は、添付の特許請求の範囲に述べられる本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことが当業者によって明確に理解されなければならない。本発明の構成及び操作方法の両方について、本発明の特性と考えられる新規な特徴は、更なる目的及び利点とともに、添付の図面と組み合せて考慮される場合に以下の記載からより良く理解されるであろう。しかしながら、あらゆる記載、図面、実施例等が解説及び説明の目的に対してのみ提供され、本発明の限定を定義することは何ら意図されないことが明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬアルミニウム塩アジュバントの非存在下又は存在下での、１００μｇ／ｍＬにおけるＦＨＡ（Ａ）、ＰＲＮ（Ｂ）、及びＦＩＭ（Ｃ）の蛍光スペクトルである。
【図２】単独の抗原又はアジュバントに吸着した抗原の経時的な蛍光強度であり、２０分の期間にわたる２分間隔での、１００μｇ／ｍＬ  ＦＨＡ、並びに、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ  ＡｌＯＯＨ及びＡｌＰＯ４の存在下でのＦＨＡの３３０ｎｍ（２８０ｎｍ励起）における蛍光強度である（ｎ＝２）。エラーバーは平均からの標準偏差を示す。
【図３】ＦＨＡ（Ａ）、ＰＲＮ（Ｂ）、ＦＩＭ（Ｃ）の較正曲線であり、単独の抗原及びＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４の０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬに吸着した抗原の製剤を示す。２８０ｎｍで励起されると、蛍光強度（３３７ｎｍにおけるＦＨＡ、３３７ｎｍにおけるＰＲＮ、及び３１０ｎｍにおけるＦＩＭ）は濃度に対してプロットされた（ｎ＝２）。エラーバーは平均からの標準偏差を示す。
【図４】低、中、高アジュバント濃度で作成された較正曲線であり、０．３２（低）、０．６６（中）、及び１．３２（高）ｍｇ  Ａｌ／ｍL  Ａｌ塩においてＡｌＯＯＨに吸着したＦＨＡ（Ａ）及びＡｌＰＯ４に吸着したＦＨＡ（Ｂ）を示す（ｎ＝２）。エラーバーは平均からの標準偏差を示す。
【図５】較正曲線に対する緩衝液及びｐＨの影響を示す図である。０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ  ＡｌＯＯＨに吸着したＰＲＮの較正曲線は、異なる緩衝液組成及びｐＨによって作られた。７．４のｐＨにおける３つの異なる緩衝液（ＴＢＳ、ＰＢＳ、及びＨＥＰＥＳ）についての個々の較正曲線（Ａ）、及び、３つの異なるｐＨ（６、７．４、及び９）における緩衝液についての個々の較正曲線（Ｂ）が示される。
【図６】アジュバントの存在下でのタンパク質濃度のインライン決定、及び、固有蛍光分光法による抗原％吸着のアットライン決定（at-line determination）についての概念図を示す。
【図７】ＦＨＡ、及び、ＴＢＳ内の０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ  ＡｌＯＯＨに吸着したＦＨＡについてのインライン標準曲線である。
【図８】本発明のシステムの第１の例示的な実施形態による、ワクチン製剤内のタンパク質の濃度を測定するシステムの概略図である。
【図９】本発明のシステムの第２の実施形態による、ワクチン製剤内のタンパク質の濃度を測定するシステムの概略図である。
【図１０】本発明のシステムの第３の例示的な実施形態による、ワクチン製剤内のタンパク質の濃度を測定するシステムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
Ｉ．定義
本明細書中で使用される場合、数量を特定していないもの（"a" or "an"）は１つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、数量を特定していない単語（the words "a" or "an"）は、「を含む（comprising）」という単語とともに使用される場合に１つ又は２つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「別の」は少なくとも２つ目又はそれ以上を意味する場合がある。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は複数のものを含み、複数形の用語は単数のものを含む。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「約」は、明示されているか否かを問わず、例えば整数、分数及びパーセンテージを含む数値を指す。「約」という用語は一般に、当業者が列挙した値と同等である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と考え得る数値の範囲（例えば、列挙した値の±５％〜１０％）を指す。場合によっては、「約」という用語は、最も近い有効数字まで四捨五入した数値を含み得る。
【００４２】
ＩＩ．本発明
本発明は、包括的に、溶液内の化合物の濃度を定量するための、タンパク質等の化合物の固有蛍光の使用に関する。蛍光強度とタンパク質濃度との間の線形関係を使用することによって、未知濃度の溶液の蛍光強度を、アッセイし、既知量のタンパク質の蛍光強度に基づいて作成された較正曲線と比較することができる。
【００４３】
タンパク質は、芳香族アミノ酸の存在によって固有蛍光を示すという点でバイオ分子の中でも特徴的である。ほとんどのタンパク質は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ）等の芳香族アミノ酸を含む。ＵＶ領域（Ｐｈｅの場合、約２５０ｎｍ；Ｔｙｒの場合、約２７５ｎｍ；Ｔｒｐの場合、約２９０ｎｍ）で励起されると、これらの芳香族アミノ酸は、３１０ｎｍから３６０ｎｍの範囲内の最大放出を有する放出スペクトルを生じることができる［１４］。放出スペクトルの強度は、溶液内で利用可能な芳香族アミノ酸の数に比例し、したがって、検査される溶液内のタンパク質の濃度に比例する。タンパク質内で見出される３つの蛍光アミノ酸の中で、選択されたタンパク質の固有蛍光に対するＰｈｅの寄与は、量子収量が低いため無視できる。Ｔｒｐ及びＴｙｒは同様の量子収量を持つが、Ｔｒｐのインドール基が、タンパク質における、２８０ｎｍ近傍のＵＶ吸光及び３５０ｎｍ近傍の蛍光放出の主要源であると報告されている［１５］。Ｔｙｒの蛍光特性は比較的劣るが、その固有蛍光の分析は、Ｔｒｐを欠くタンパク質の分析のための有用なツールであることが示されている［１６］。
【００４４】
本明細書で論じるように、溶液内のタンパク質濃度を測定するための固有蛍光の使用を、タンパク質に加えて複数の成分を含む複雑な溶液の正確な測定に適用することができることが発見された。この発見は、アジュバント等の更なる成分を含むワクチン製剤内のタンパク質抗原の定量に関連する困難さを本発明者らが克服することを可能にした。アジュバント化タンパク質を含むワクチン製剤は、そのような製剤が概して濁っているため、しばしば、アッセイすることが難しい。そのような製剤内のタンパク質抗原の正確な測定は、通常、時間がかかりかつ破壊的なプロセスであるタンパク質脱離ステップを必要としてきた。本発明の方法は、ワクチン製剤内のタンパク質抗原の正確な測定を達成するためにタンパク質脱離ステップを含まない。本明細書で示すように、芳香族アミノ酸を含むタンパク質の固有蛍光は、脱離についての必要性なしで、ほとんどの混合物、更にアルミニウム塩アジュバントを含む混合物中のタンパク質濃度を測定するために使用することができる。
【００４５】
上記で簡潔に要約したように、本発明は、タンパク質等の選択された化合物の濃度を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法を含む。そのような方法は、概して、（ｉ）組成物の固有蛍光を測定することと、（ｉｉ）測定された蛍光強度値を、選択された化合物を表す化合物の既知の濃度を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、組成物内の選択された化合物の濃度を決定することとを含む。認識されるように、本発明は、（ｉ）組成物の固有蛍光を測定するステップ、及び、（ｉｉ）測定された蛍光強度値を較正曲線と比較するステップに基づく更なる方法も包含する。
【００４６】
本発明の方法は、脱離ステップを明示的に排除する。すなわち、本発明の方法は、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物内で、選択された化合物からアジュバントを分離するステップを排除することによって実施することができる。本発明の方法は、外因性の蛍光プローブ又はマーカーの非存在下で実施することもできる。本発明の方法は、選択された化合物のアジュバント化複合体の破壊及び／又は選択された化合物の破壊をもたらすアッセイ条件の非存在下で更に実施することができる。
【００４７】
本明細書で使用するように、用語「選択された化合物（selected compound）」は、本発明の方法において分析されている化合物を指す。選択された化合物は、概して、少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含む化合物、例えば、少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であることになる。しかしながら、１つの代替法において、選択された化合物は、少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含む化合物、例えば、少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含むタンパク質（例えば、抗体又はそのフラグメント）に結合している、芳香族アミノ酸を欠くタンパク質に又はそれによって結合している化合物とすることができる。更なる代替法において、選択された化合物は、蛍光プローブ又はマーカーに又はそれによって結合しているものとすることができる。
【００４８】
こうして、また、本明細書で使用するように、選択された化合物は、（ｉ）少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖タンパク質複合体、ウィルス様粒子、若しくはウィルス懸濁液、又は、（ｉｉ）少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含まないが、（ａ）少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖タンパク質複合体、ウィルス様粒子、若しくはウィルス懸濁液、若しくは、（ｂ）蛍光プローブ若しくはマーカーに若しくはそれによって結合している、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖タンパク質複合体、ウィルス様粒子、又はウィルス懸濁液のうちの１つ以上である。１つの態様において、選択された化合物は、少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含むタンパク質である。
【００４９】
本発明の選択された化合物の芳香族アミノ酸の数は、選択された化合物の同一性に応じて変動することになる。したがって、本発明の選択された化合物は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い数の芳香族アミノ酸を含むことができる。
【００５０】
本明細書で使用するように、用語「芳香族アミノ酸（aromatic amino acid）」は、アミノ酸トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、チロキシン、５−ヒドロキシトリプトファン、及びＬ−ＤＯＰＡを指す。１つの態様において、芳香族アミノ酸は、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）からなる下位群によって規定することができる。
【００５１】
選択された化合物が蛍光プローブ又はマーカーに又はそれによって結合している状況において、蛍光プローブ又はマーカーは、蛍光プローブ又はマーカーに又はそれによって結合している、選択された化合物のアジュバント化複合体の文脈で、検出し、測定することができる蛍光を生じる任意の蛍光プローブ又はマーカーとすることができる。
【００５２】
選択された化合物は、単独で又は本明細書で提供される他の記述に加えて、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の励起波長に曝露されると、３００ｎｍから５００ｎｍの間の最大放出を有するものとして特徴付けることもできる。幾つかの選択された化合物の場合、最大放出は、約３００ｎｍから４５０ｎｍの間、３００ｎｍから４００ｎｍの間、３００ｎｍから３８０ｎｍの間、３００ｎｍから３７０ｎｍの間、３００ｎｍから３６０ｎｍの間、３００ｎｍから３４０ｎｍの間、３２０ｎｍから４００ｎｍの間、３２０ｎｍから３８０ｎｍの間、又は３２０ｎｍから３６０ｎｍの間にある。
【００５３】
本明細書で使用するように、用語「代表的化合物（representative compound）」は、本明細書で規定される較正曲線の作成において使用される化合物を指す。較正曲線を、実施される方法においてアッセイされる選択された化合物を含む較正試料を使用して構成することができることが明らかになる。こうした状況下で、代表的化合物は、選択された化合物と同一である。しかしながら、較正曲線を、選択された化合物と同様であるだけである化合物を含む較正試料を使用して構成することができることも理解されるべきである。例えば、タンパク質が、選択された化合物としてアッセイされるとき、非同一配列を有するタンパク質は、較正曲線の構成において代表的化合物として使用することができる。代表的化合物が、選択された化合物と同一でないとき、代表的化合物は、通常、選択されたタンパク質と（数と同一性の両方で）同じ芳香族アミノ酸の補体を含むことになるが、これは、より少数の又はより多数の芳香族アミノ酸又は異なる芳香族アミノ酸を代表的化合物が有する場合、変動する可能性もある。代表的化合物は、選択された化合物がペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であるとき、選択された化合物に対して少なくとも８０％の配列同一性、又は、選択された化合物に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有することになる。
【００５４】
本発明の方法において使用されると、代表的化合物は、代表的化合物のアジュバント化複合体又は代表的化合物の非アジュバント化バージョンとすることができる。代表的化合物は、アジュバント化されると、選択された化合物のアジュバント化複合体の生産で使用されるものと同じアジュバント又は異なるアジュバントによってアジュバント化することができる。
【００５５】
本明細書で使用するように、用語「アジュバント（adjuvant）」は、ワクチン生産の分野におけるその通常のかつ慣用的な意味を有する、例えば、抗原に対する被験体の免疫反応を増強させる薬剤又は免疫薬等の物質である。アジュバントは、被験体において誘起される抗原に対する免疫反応を増強させるためにワクチン製剤にしばしば含まれ、したがって、被験体に投与される異物の量を最小にする。アジュバントは、抗原のためのデポー剤（depot）として役立つことができ、経時的に免疫系に対する抗原の緩徐でかつ一定の提示を可能にする。他のアジュバントは、抗原によって誘起される免疫反応と連携して被験体において発現する免疫反応に関わり合い、増幅するように働く。
【００５６】
本発明の方法で使用するための適したアジュバントは、アルミニウム塩、スクアレン乳剤、ペプチド、核酸、鉱油、合成及び天然リン脂質、及びその組み合わせ等の無機化合物を含む。方法で使用するための例示的なアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（オキシ水酸化アルミニウム又はＡｌＯＯＨとも呼ばれる）、リン酸アルミニウム（例えば、ＡｌＰＯ４）、アモルファスアルミニウムヒドロキシホスフェート硫酸塩（amorphous aluminum hydroxyphosphate sulfate）、及び水酸化リン酸カルシウムを含む。方法で使用するための例示的な乳剤は、スクアレンＡＦ０３乳剤、ＭＦ５９（商標）、ＡＳＯ３、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）を含む。方法で使用するための例示的なペプチドは、ペプチド・オリゴヌクレオチド微粒子複合体（peptide-oligonucleotide particulate complex）（例えば、ＩＣ３１）を含む。方法で使用するための例示的な核酸は、ＯＤＮ１ａ、ＣｐＧ１０１８を含む。
【００５７】
本発明の１つの態様において、適したアジュバントは、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長範囲内の光で励起されると、２９０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲内の検出不能な固有蛍光を示すアジュバントであることになる。代替的に、適したアジュバントは、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長範囲内の光で励起されると、２９０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲内の固有蛍光を示すアジュバントであることになり、その固有蛍光は、アジュバントと複合体を形成した選択された化合物の固有蛍光の２０％未満、好ましくは、アジュバントと複合体を形成した選択された化合物の固有蛍光の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満である。幾つかの態様において、励起波長は２８０ｎｍから２９０ｎｍの間である。
【００５８】
本発明の方法は、選択された化合物が、１つのタイプのアジュバントと、又は、同じ組成物において２つ、３つ、４つ、又はそれより多い数のタイプのアジュバントと複合体を形成する、組成物を使用して実施することができる。
【００５９】
本明細書で使用するように、用語「組成物（composition）」は、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む任意の組成物とすることができる。非制限的な例は、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４と複合体を形成したペプチド等のアジュバント化抗原を含むワクチン製剤を含む。
【００６０】
本発明の方法に目を向けると、また、上記で述べたように、第１の実施形態において、本発明は、タンパク質等の選択された化合物の濃度を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法として規定することができる。そのような方法は、概して、（ｉ）組成物の固有蛍光を測定することと、（ｉｉ）測定された蛍光強度値を、選択された化合物を表す化合物の既知の濃度を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、組成物にて選択された化合物の濃度を決定することとを含む。
【００６１】
一例としては、この実施形態によって包含される方法は、選択された化合物の濃度を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法であって、
（ａ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物について蛍光強度値を得ることであって、選択された化合物は少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含み、組成物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、組成物についての蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定されることと、
（ｂ）（ａ）にて得られた蛍光強度値を、選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む較正試料の蛍光値を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、選択された化合物の濃度を選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定することと、
を含む、方法として記載することができる。
【００６２】
この実施形態の或る特定の態様において、（ｂ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い数の較正試料を使用して作成される。例えば、（ｂ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成することができ、較正試料内の代表的化合物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、較正試料のそれぞれについて３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される。
【００６３】
この実施形態の或る特定の態様において、（ｂ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも５つの較正試料を使用して作成され、較正試料内の代表的化合物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、較正試料のそれぞれについて３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される。
【００６４】
較正曲線を作成するために使用される較正試料内の代表的化合物の濃度は、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度及び曲線を作成するために使用される試料の数に応じて変動することになる。しかしながら、較正試料は、概して、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度より低い濃度を有する少なくとも１つの試料、及び、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度より高い濃度を有する少なくとも１つの試料を含むことになる。幾つかの態様において、較正試料は、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度より低い濃度を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれより多い数の試料、及び、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度より高い濃度を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれより多い数の試料を含む。選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度より低い濃度を有する較正試料は、概して、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度の約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％の値を含む、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度の約２０％から１００％の間にあることになる。選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度より高い濃度を有する較正試料は、概して、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度の約１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、及び２００％の値を含む、選択された化合物の既知の又は疑わしい濃度の約１００％から２００％の間にあることになる。
【００６５】
この実施形態の或る態様において、（ｂ）の較正曲線は、
（ａ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物内で選択された化合物の疑わしい濃度の約５０％、７５％、１００％、１２５％、及び１５０％を示す濃度を有する代表的化合物の少なくとも５つの較正試料を調製すること、
（ｂ）（ａ）の各較正試料を、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長を使用して励起すること、
（ｃ）（ｂ）の各試料の放出スペクトルを、各較正試料について最大蛍光強度を生成する３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長を使用して決定すること、
（ｄ）最大蛍光強度を生成した（ｃ）の波長における蛍光強度の値を、較正試料内の代表的化合物の濃度に対してプロットすることであって、それにより、代表的化合物の較正曲線を作成する、プロットすること、
によって作成される。
【００６６】
本発明の方法で使用される較正曲線は、限定はしないが、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Microsoft）、ＪＭＰ（SAS）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software）、ＭＡＴＬＡＢ（商標）（MathWorks）、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ＰＸ２（Custom Sensors）等のコンピュータソフトウェア、及び、方眼紙（手作業による図面作成）等の任意の関連する手段を使用して作成することができる。較正曲線当てはめモデルのタイプは、同様に変動し、限定はしないが、代表的化合物及び関心の濃度範囲の、線形、多項式、対数、指数関数、べき乗、及びシグモイド型回帰を含むことができる。
【００６７】
本明細書で使用するように、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物内の、選択された化合物の「疑わしい濃度（suspected concentration）」は、組成物内の選択された化合物の濃度に関する推定又は根拠のある推測（educated guess）に過ぎない。関連する較正曲線を作成するため、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物について得られる蛍光強度値が、曲線を作成するために使用される最低値と最高値との間のどこかでその曲線上に乗ることになる、曲線を作成することが求められる。選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物の蛍光強度値が事前にわかっていないため、値がどのようなものになる場合があるかを推定又は推測し、その後、推定値より大きい濃度と小さい濃度の両方を有する代表的化合物の試料を使用して較正曲線を作成しなければならない。
【００６８】
組成物内のアジュバント化化合物の濃度を正確に測定するための手段は、組成物の特性に関する更なる情報を得ることを可能にする更なるステップと組み合わすことができる。例えば、第２の実施形態において、本発明は、選択された化合物のパーセント（％）吸着を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法を含む。こうして、例えば、アジュバントと複合体を形成したワクチン製剤内で抗原のパーセントを決定することができる。そのような方法は、概して、（ｉ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物の２つの試料を得ることであって、第１の試料内でアジュバント化複合体は実質的に溶液内にあり、第２の試料内でアジュバント化複合体は実質的に溶液から分離して沈殿することと、（ｉｉ）第１の試料の固有蛍光を測定することと、（ｉｉｉ）測定された蛍光強度値を、選択された化合物を表す化合物の既知の濃度を使用して作成された較正曲線と比較することであって、第１の試験試料内で、選択された化合物の濃度を決定することと、（ｉｖ）第２の試料の固有蛍光を測定することと、（ｖ）測定された蛍光強度値を、較正曲線と比較することであって、第２の試験試料内で、選択された化合物の濃度を決定することと、（ｖｉ）第２の試料について決定された濃度を第１の試料について決定された濃度で割ることによってパーセント（％）吸着を計算することであって、それにより、組成物内で、選択された化合物のパーセント（％）吸着を決定することとを含む。
【００６９】
一例としては、この実施形態によって包含される方法は、選択された化合物のパーセント（％）吸着を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法であって、
（ａ）選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物の２つの試験試料を得ることであって、選択された化合物は少なくとも１つの芳香族アミノ酸を含み、第１の試験試料内でアジュバント化複合体は実質的に溶液内にあり、第２の試験試料内でアジュバント化複合体は実質的に溶液から分離して沈殿することと、
（ｂ）（ｉ）第１の試験試料について蛍光強度値を得ることであって、第１の試験試料は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、第１の試験試料についての蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される、得ること、及び、（ｉｉ）蛍光強度値を、選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む較正試料を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、第１の試験試料内で選択された化合物の濃度を決定する、比較することによって、第１の試験試料内で選択された化合物の濃度を決定することと、
（ｃ）（ｉ）第２の試験試料の上澄みについて蛍光強度値を得ることであって、第２の試験試料の上澄みは２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、第２の試験試料の上澄みについての蛍光強度値を得るため３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される、得ること、及び、（ｉｉ）蛍光強度値を、選択された化合物を表す代表的化合物の異なる既知の濃度を含む較正試料を使用して作成された較正曲線と比較することであって、それにより、第２の試験試料内で選択された化合物の濃度を決定する、比較することによって、第２の試験試料の上澄み内で選択された化合物の濃度を決定することと、
（ｄ）（ｃ）にて決定された濃度を（ｂ）にて決定された濃度で割ることによってパーセント（％）吸着を計算することであって、それにより、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物内で選択された化合物のパーセント（％）吸着を決定することと、
を含む、方法として記載することができる。
【００７０】
この実施形態の或る特定の態様において、（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれより多い数の較正試料を使用して作成される。例えば、（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも３つの較正試料を使用して作成することができ、較正試料内の代表的化合物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、較正試料のそれぞれについて３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される。
【００７１】
この実施形態の或る特定の態様において、（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、代表的化合物の異なる既知の濃度を含む少なくとも５つの較正試料を使用して作成され、較正試料内の代表的化合物は２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長で励起され、放出スペクトルは、較正試料のそれぞれについて３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される。
【００７２】
この実施形態の或る特定の態様において、（ｂ）及び／又は（ｃ）の較正曲線は、
（ａ）第２の試験試料内で実質的に溶液から分離して沈殿したアジュバント化複合体の疑わしい濃度の約５０％、７５％、１００％、１２５％、及び１５０％を示す濃度を有する代表的化合物の少なくとも５つの較正試料を調製すること、
（ｂ）（ａ）の各較正試料を、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の波長を使用して励起すること、
（ｃ）（ｂ）の各試料の放出スペクトルを、各較正試料について最大蛍光強度を生成する３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長を使用して決定すること、
（ｄ）最大蛍光強度を生成した（ｃ）の波長における蛍光強度の値を、較正試料内の代表的化合物の濃度に対してプロットすることであって、それにより、代表的化合物の較正曲線を作成する、プロットすること、
によって作成される。
【００７３】
（ｂ）及び（ｃ）の較正曲線を同じ較正曲線とすることができること、又は、異なる構成曲線を作成することができることが認識されることになる。
【００７４】
さらに、アジュバント化複合体が実質的に溶液から分離して沈殿した後に第２の試験試料の上澄み（supernatant）に残留するアジュバントの存在を考慮する較正曲線を作成することができる。沈殿後の上澄みの残留アジュバントによってもたらされる蛍光オフセットを決定するため、製剤の２つのセットを、それぞれの代表的化合物について調製することができる。製剤の１つのセットはアジュバントなしで作られ、他のセットは、沈殿すると、上澄みに残留すると予想される代表的化合物の濃度を持つように作られる。本発明の較正曲線は、オフセット値を考慮するために改定することができる。
【００７５】
選択された化合物のパーセント（％）吸着を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定するこれらの方法において、２つの試験試料がアッセイされる。第１の試験試料内でアジュバント化複合体は実質的に溶液内にある。第２の試験試料内でアジュバント化複合体は実質的に溶液から分離して沈殿し、上澄みがアッセイされる。溶液に出入りするアジュバント化複合体の量が、アッセイに関連する特定の状況に応じて変動することになることが理解されることになる。実際には、アッセイの目的が異なる組成物についてパーセント（％）吸着を得ることであるため、アッセイに関連する特定の状況は、広く変動すると予想される。したがって、用語「実質的に溶液内にある（substantially in solution）」及び「実質的に溶液から分離して沈殿する（substantially settled out of solution）」の規定は、必然的に幅広い。しかしながら、用語は、第１の試験試料内のアジュバント化複合体の量と第２の試験試料の上澄み内のアジュバント化複合体の量との間の少なくとも約１０％の差に基づいて規定することができる。本発明の他の適した態様において、第１の試験試料内のアジュバント化複合体の量と第２の試験試料内の量との間に、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれより大きい％の差が存在する。代替的に、用語は、試験試料内のアジュバント化複合体の絶対量に基づいて規定することができる。こうして、本明細書で使用するように、用語「実質的に溶液内にある」は、アジュバント化複合体の少なくとも５１％が試料の溶液内にあることを意味することもできる。他の適した態様において、アジュバント化複合体の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれより大きい％が試料の溶液内にある。同様に、本明細書で使用するように、用語「実質的に溶液から分離して沈殿する」は、アジュバント化複合体の少なくとも５１％が試料の溶液から分離して沈殿することを意味することもできる。他の適した態様において、アジュバント化複合体の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれより大きい％が試料の溶液から分離して沈殿する。更なる代替法において、第１の試験試料は、混合され、かつ、混合の１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、７０秒、８０秒、９０秒、１００秒、１１０秒又は１２０秒以内に励起波長を受けるアジュバント化複合体の溶液として規定することができる。第２の試験試料は、混合され、試料の上澄みが励起波長を受ける前に、少なくとも１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、又はそれより長い時間の間、静止したままであることが許容されるアジュバント化複合体の溶液として規定することができる。
【００７６】
本発明の方法のそれぞれにおいて使用される励起波長が、他の因子の中でもとりわけ、選択された化合物の同一性、代表的化合物の同一性、及びアジュバントの同一性等の因子に応じて変動することになることが認識されることになる。しかしながら、Ｐｈｅが約２５０ｎｍの波長で蛍光を発し、Ｔｙｒが約２７５ｎｍの波長で蛍光を発し、Ｔｒｐが約２９０ｎｍの波長で蛍光を発するため、本発明の方法は、概して、２５０ｎｍから３００ｎｍの間の励起波長を使用して実施されることになる。他の適した範囲は、約２５０ｎｍから２９０ｎｍの間、２５０ｎｍから２８０ｎｍの間、２５０ｎｍから２７０ｎｍの間、２５０ｎｍから２６０ｎｍの間、２６０ｎｍから３００ｎｍの間、２６０ｎｍから２９０ｎｍの間、２６０ｎｍから２８０ｎｍの間、２６０ｎｍから２７０ｎｍの間、２７０ｎｍから３００ｎｍの間、２７０ｎｍから２９０ｎｍの間、２７０ｎｍから２８０ｎｍの間、２８０ｎｍから３００ｎｍの間、２８０ｎｍから２９０ｎｍの間、２９０ｎｍから３００ｎｍの間を含む。
【００７７】
本発明の方法のそれぞれを実施するときに決定される放出スペクトルが、同じ因子、すなわち、他の因子の中でもとりわけ、選択された化合物の同一性、代表的化合物の同一性、及びアジュバントの同一性に応じて変動することになることも認識されることになる。しかしながら、本発明の方法は、概して、放出スペクトルが３００ｎｍから５００ｎｍの間の波長で決定される場合に実施されることになる。他の適した範囲は、約３００ｎｍから４８０ｎｍの間、３００ｎｍから４６０ｎｍの間、３００ｎｍから４４０ｎｍの間、３００ｎｍから４２０ｎｍの間、３００ｎｍから４００ｎｍの間、３２０ｎｍから４８０ｎｍの間、３２０ｎｍから４６０ｎｍの間、３２０ｎｍから４４０ｎｍの間、３２０ｎｍから４２０ｎｍの間、３２０ｎｍから４００ｎｍの間、３４０ｎｍから４８０ｎｍの間、３４０ｎｍから４６０ｎｍの間、３４０ｎｍから４４０ｎｍの間、３４０ｎｍから４２０ｎｍの間、３４０ｎｍから４００ｎｍの間、３６０ｎｍから４８０ｎｍの間、３６０ｎｍから４６０ｎｍの間、３６０ｎｍから４４０ｎｍの間、３６０ｎｍから４２０ｎｍの間、３６０ｎｍから４００ｎｍの間、３８０ｎｍから４８０ｎｍの間、３８０ｎｍから４６０ｎｍの間、３８０ｎｍから４４０ｎｍの間、３８０ｎｍから４２０ｎｍの間、３８０ｎｍから４００ｎｍの間、３００ｎｍから４００ｎｍの間、３００ｎｍから３８０ｎｍの間、３００ｎｍから３６０ｎｍの間、３００ｎｍから３４０ｎｍの間、３００ｎｍから３２０ｎｍの間、３２０ｎｍから４００ｎｍの間、３２０ｎｍから３８０ｎｍの間、３２０ｎｍから３６０ｎｍの間、３２０ｎｍから３４０ｎｍの間、３４０ｎｍから４００ｎｍの間、３４０ｎｍから３８０ｎｍの間、３４０ｎｍから３６０ｎｍの間、３６０ｎｍから４００ｎｍの間、３６０ｎｍから３８０ｎｍの間、及び３８０ｎｍから４００ｎｍの間を含む。
【００７８】
本発明の方法は、光の所望の励起波長を生成し、本明細書で規定されるパラメーター内で結果として得られる放出スペクトルを検出することができる任意の関連する機器を使用して実施することができる。許容可能な機器は、光度計、蛍光光度計、分光光度計を含む。
【００７９】
本発明の方法は、較正試料から得られる測定値から較正曲線を生成するための任意の手段を使用して実施することができる。このような手段は、例えば、グラフ用紙及びペンシルを使用する手によるもの、及び、コンピュータープログラムの使用等の電子手段を含む。
【００８０】
同様に、本発明の方法は、蛍光強度値を較正曲線と比較するための任意の手段を使用して実施することができる。このような手段は、例えば、較正曲線上に蛍光強度値をプロットするためにグラフ用紙及びペンシルを使用する手によるもの、及び、コンピュータープログラムの使用等の電子手段を含む。
【００８１】
本発明の方法は、種々の状況において実施することができる。例えば、方法は、ワクチン製剤の小バッチが、実験動物に注入するために調製されるとき等、実験室環境で行われる小規模運用において実施することができる。試料を、個々のバッチから取り外し、本明細書で規定する方法を使用して試験することができる。方法は、ワクチン製剤の商用グレードバッチが販売のために生産されるときの工業環境において等、大規模運用において実施することもできる。この場合も、試料を、個々のバッチから取り外し、本明細書で規定する方法を使用して試験することができる。そのような条件下で、方法は、「オフラインで（off-line）」実施される、すなわち、試料は、例えば、ベンチトップ蛍光光度計を使用して実験室環境で、抗原濃度又は％吸収について試験される。
【００８２】
方法は、「インラインで（in-line）」又は「オンラインで（on-line）」実施することもでき、蛍光プローブは、フローセルに結合されて（フローセルは、次に、光度計に接続される）、タンパク質濃度のリアルタイムモニタリングを可能にする。方法は、光度計に接続された蛍光プローブを使用し、プローブを試料に直接接触するように設置して（例えば、プローブを試料に浸すことによって）「インラインで」実施することもできる。図６は、オンライン設定を使用して抗原濃度又は％吸収を決定するときに本発明の方法を使用する例を提供する。そのようなインライン及びオンライン分析は、プロセス分析技術（ＰＡＴ：Process Analytical Technology）アプリケーションのために重要である。ＰＡＴは、最終製品品質を確保することを目標として、未処理材料及び製造過程の（in-process）材料並びにプロセスの重要品質（critical quality）及び性能特性の時宜を得た（すなわち、処理中の）測定を通して、製造を設計し、分析し、制御するシステムとして米国ＦＤＡによって考えられている［２７］。
【００８３】
本発明の関連する実施形態及び態様において、蛍光値は、蛍光プローブによって、光度計によってこうして得られる。蛍光プローブは、フローセルに取り付けることができる。適した蛍光プローブは、当業者に知られており、例えば、Custom Sensorsによるオートクレーブ可能前面蛍光プローブ（Autoclaveable Front Surface Fluorescence Probe）、Ｐａｒｔ♯：3383-001-305-010-2000-101-101を含むことになる。適したフローセルは、当業者に知られており、例えば、種々の経路長においてオートサンプラー及びシッパーシステムとともに使用するためのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）フローセル及びPendoTECHによる使い捨て蛍光フローセル（プロトタイプ）、Ｐａｒｔ♯：1161362-210を含むことになる。
【００８４】
例として、選択された化合物の濃度を、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物にて決定する方法は、フローセルに取り付けられた蛍光プローブを使用して光度計によって行うことができる（図６）。蛍光プローブは、アジュバントの非存在下で、選択された化合物又は代表的化合物を含む較正試料を使用して最初に較正され、較正曲線が作成される。その後、アジュバント化製剤の試料が、フローセル内に流され、蛍光について測定される。得られる蛍光強度値は、較正曲線と比較され、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物内での選択された化合物の濃度が決定される。
【００８５】
更なる例として、アジュバントへの選択された化合物の％吸着を測定する方法も、フローセルに取り付けられた蛍光プローブを使用して光度計によって実施することができる（図１０）。蛍光プローブは、アジュバントの非存在下で、選択された化合物又は代表的化合物を含む較正試料を使用して最初に較正される。その後、アジュバント化製剤の試料が、フローセル内に流され、（アジュバント化複合体が実質的に溶液内にある第１の試験試料として）蛍光について測定され、試料は、その後、静止することで、アジュバント化複合体がフローセルから分離して沈殿され、試料は、（アジュバント化複合体が実質的に溶液から分離して沈殿する第２の試験試料の上澄みとして）非アジュバント化された選択された化合物の蛍光について再び測定される。上澄みを測定する代替のアプローチは、フィルターを使用することでアジュバント化複合体を除去し、試料は、（アジュバント化複合体が実質的に溶液から分離して沈殿する第２の試験試料の上澄みとして）非アジュバント化された選択された化合物の蛍光について再び測定される（図６）。２つの測定値を用いた計算が実施され、選択された化合物の％吸着がこうして測定される。
【００８６】
本発明は、第３の実施形態で述べることもできる。この実施形態において、本発明は、選択された化合物のアジュバント化複合体を含む組成物を製造する方法に関する。方法は、選択された化合物の濃度を、（本明細書で詳細に述べる第１の実施形態の方法等の）本出願で規定される方法を使用して、選択された化合物のアジュバント化複合体のバッチにて決定するステップを含み、選択された化合物のアジュバント化複合体のバッチを組み込んだ組成物を製剤化することは、決定の結果に基づいて進められる。
【００８７】
本発明は、本明細書で規定される本発明の方法のそれぞれを実施するために実装することができるシステムも包含する。
【００８８】
図８に示すシステム２０は、導管２２を含み、導管２２を通して、タンパク質を含むワクチン製剤が、内部にワクチン製剤を有するコンテナー２４から流れ、コンテナー２４に戻ることができる。
【００８９】
コンテナー２４は、出口２６及び入口２８を有し、そこを通ってそれぞれ導管２２の対向する入口端３０及び出口端３２が延在する。入口端３０は、コンテナー２４内でコンテナー下部の近くの撹拌子３４に隣接して位置する。コンテナー下部は撹拌プレート３６上に位置する。出口端３２は、コンテナー２４内でコンテナーの上部に隣接して位置する。導管２２は、柔軟なチューブ又はシリコンチューブを含むことができる。
【００９０】
導管２２は、入口端３０と出口端３２との間で導管２２内に直列に配置された蛍光強度センサー３８及びポンプ４０とループを形成し、ポンプ４０はセンサー３８の下流にある。
【００９１】
こうして、コンテナー２４の内部、センサー３８、及びポンプ４０は、流体連通している。センサー３８は、好ましくは、プローブを有する蛍光フローセルであり、プローブは、ワクチン製剤内のタンパク質の蛍光を測定し、その後、その蛍光を示す電気信号を生成し出す。
【００９２】
コンピューター４２は、ＰＸ２測光送信機デバイス４４を介してセンサー３８に電気接続されて、センサー３８から蛍光測定信号を受信する。コンピューターは、プログラムを記憶する非一時的メモリを含み、プログラムは、導管内のワクチン製剤内のタンパク質の蛍光値を示す信号を、コンピューターにおいて前もって作成され記憶された較正曲線と比較する。コンピューターは、その後、信号と較正曲線の比較から、ワクチン製剤内のタンパク質の濃度を示す出力を提供する。
【００９３】
図９の第２の例示的な実施形態は、図８の第１の例示的な実施形態の同じ特徴を識別するために同じ符号を使用する。図８の実施形態と図９の実施形態との主要な差は、図９の実施形態における導管２２のオープンループ、センサー３８に対するポンプ４０の上流への位置付け、２つのコンテナーの使用である。導管２２は、吸収した原薬（drug substance）を内部に有する供給コンテナー４６内に開口するその入口端３０を有する。原薬又はその上澄みは、センサー３８から上流に位置するポンプ４０によってコンテナー４６から導管２２に引き込まれ、センサー３８に達し、センサー３８を通過する。センサー３８から、原薬は、導管２２内で搬送され、出口端３２を出て、最終バルク製品を収容する貯蔵コンテナー４８に入る。
【００９４】
図１０の第３の実施形態は、図８の配置構成と同様の配置構成を有し、同様の符号が同じ部品を識別する。差は、コンテナー２４が一般的にブランクボックスとして示されていることである。
【実施例】
【００９５】
ＩＩＩ．実施例
１Ａ．材料
フィラメンタスヘマグルチニン（ＦＨＡ：Filamentous haemagglutinin）、分子量（ＭＷ）＝２２０ｋＤａ、パータクチン（ＰＲＮ）、ＭＷ＝６０．３ｋＤａ、フィムブリエ（ＦＩＭ）、タイプ２、ＭＷ＝１９．２ｋＤａ、及びタイプ３、ＭＷ＝１７．２ｋＤａが、Sanofi Pasteur（カナダ、トロント）によって製造され提供された。ＦＨＡは１１のトリプトファン及び２８のチロシンアミノ酸を有し、ＰＲＮは８つのトリプトファン及び６つのチロシンを有し、ＦＩＭタイプ２はトリプトファンを持たず、８つのチロシンを有し、ＦＩＭタイプ３はトリプトファンを持たず、７つのチロシンを有する。
【００９６】
ＦＨＡ、ＰＲＮ、及びＦＩＭの両方のタイプのバッチを、それぞれ９７３．４μｇ／ｍＬ〜１２００．９μｇ／ｍＬ、１４７．７μｇ／ｍＬ〜２４１．９μｇ／ｍＬ、及び２４２．０μｇ／ｍＬ〜４０２．０μｇ／ｍＬに及ぶ濃度で調製した。ＡｌＯＯＨアジュバントは、Brenntag Biosector（デンマーク、フレズレクソン）によって１０．２ｍｇＡｌ／ｍＬで供給された。ＡｌＰＯ４アジュバントは、Sanofi Pasteur（カナダ、トロント）によって４．１ｍｇ  Ａｌ／ｍＬで調製した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６）、１００ｍＭ重炭酸塩（ｐＨ９）、及び０．５Ｍリン酸塩（ｐＨ７．４）を有する緩衝液１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、Sigma-Aldrich（米国、ミズーリ州、セントルイス、Sigma-Aldrich）によって供給された試薬によって自主製作した。ＨＥＰＥＳは、Life Technologiesによって１Ｍ濃縮溶液で供給され、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水によって１０ｍＭに希釈し、ｐＨを、１Ｍ  ＨＣｌを使用して調整した。
【００９７】
１Ｂ．製剤の調製
全ての製剤は、適用可能な量のタンパク質に適切な量のアジュバントを添加し、その後、指定された緩衝液を最終希釈液として使用することによって調製した。製剤は、その後、Ａｄａｍｓ（商標）ニューテーターミキサー（Nutator Mixer）（Becton Dickinson、米国、ニュージャージ州）上で、室温で３０分間混合することで、アジュバントへの抗原吸着を可能にした。
【００９８】
述べない限り、標準曲線及び試験試料のために使用される緩衝液はＴＢＳであった。しかしながら、他の緩衝液（ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、及び重炭酸塩）は、較正曲線に対する緩衝液及びｐＨ条件の影響を試験するために使用した。パーセント吸着の影響を試験するため、異なる濃度（０ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭ、及び８０ｍＭ）のリン酸塩を、ＴＢＳ内の製剤に添加した。
【００９９】
較正曲線正確度に対するアジュバントの存在及びアッセイ間変動性の影響を評価するために調製されたＦＨＡを含む試験試料は、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４を含む製剤についての０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのアジュバント濃度とともに、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び２００μｇ／ｍＬの抗原濃度で調製した。沈降の影響を評価するために作製されたＦＨＡを含む試験試料は、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４を含む製剤についての０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのアジュバント濃度とともに、１００μｇ／ｍＬの抗原濃度で調製した。
【０１００】
較正曲線正確度に対するアジュバントの存在、緩衝液、及びｐＨの影響を評価するために作製されたＰＲＮを含む試験試料は、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４を含む製剤について０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのアジュバント濃度とともに、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬの抗原濃度で調製した。
【０１０１】
較正曲線正確度に対するアジュバントの存在の影響を評価するために調製されたＦＩＭを含む試験試料は、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４を含む製剤について０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのアジュバント濃度とともに、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び２００μｇ／ｍＬの抗原濃度で調製した。
【０１０２】
１Ｃ．蛍光測定
全ての製剤の蛍光測定は、Ｃｈｉｒａｓｃａｎ  Ｐｌｕｓ分光光度計（Applied Photophysics、英国、サリー）を使用して収集した。試料は、２８０ｎｍの励起波長で励起され、放出スペクトルは、８００Ｖの一定の光電子増倍管設定及び２０℃の設定温度を使用して、２９０ｎｍ〜４００ｎｍの間で、１ｎｍ増分でかつ１ポイント当たり０．５秒の測定時間で収集した。最大放出ピークが見出されると、スペクトル収集は、最大放出ピークから±２０ｎｍに設定した。標準的な１０ｍｍ石英キュベットを、製剤を測定するために使用した。読み値（reading）は、最適結果のために混合直後に採取した。
【０１０３】
１Ｄ．沈降研究
ＦＨＡ試料は、１０回インバージョンを繰り返すことによって混合し、３３０ｎｍにおける蛍光強度を、２０分間、２分間隔で収集した。３３０ｎｍにおける蛍光強度は、２つの値（duplicate）間で平均した。
【０１０４】
１Ｅ．較正曲線
アジュバントの影響を評価するために作成されたＦＨＡ較正曲線は、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４を含む製剤について、０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、及び７５０μｇ／ｍＬの抗原濃度並びに０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのアジュバント濃度の試料によって作成した。アジュバント濃度の影響を評価するために作成されたＦＨＡ較正曲線は、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び２００μｇ／ｍＬの抗原濃度、並びに、０．３３ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ、及び１．３２ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４濃度の試料によって作成した。
【０１０５】
アジュバントの影響を評価するために作成されたＰＲＮ較正曲線は、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４を含む製剤について、０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬの抗原濃度並びに０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのアジュバント濃度の試料によって作成した。緩衝液組成及びｐＨの影響を評価するために作成されたＰＲＮ較正曲線は、０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬの抗原濃度、並びに、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨ濃度の試料によって作成した。
【０１０６】
アジュバントの影響を評価するために作成されたＦＩＭ較正曲線は、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４を含む製剤について、０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び３００μｇ／ｍＬの抗原濃度並びに０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのアジュバント濃度の試料によって作成した。
【０１０７】
最大強度に達する波長を選択し、このポイントにおける蛍光を、２つの値間で平均され、その濃度に対してプロットした。アジュバント及びアジュバント濃度の影響を評価するために生成される較正曲線の場合、蛍光強度を２つの値間で平均した。全ての他の較正曲線の場合、レプリケート（replicate：反復値）は得られなかった。検出限界（ＬＯＤ：limit of detection）及び定量限界（ＬＯＱ：limit of quantification）は、以下のように、医薬品規制調和国際会議（International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use）（ＩＣＨ）指針［１７］を使用して計算した。
ＬＯＤ＝３．３σ／Ｓ
ＬＯＱ＝１０σ／Ｓ
σ＝ブランクの標準偏差
Ｓ＝線形回帰曲線の傾斜
線形性限界（ＬＯＬ：limit of linearity）は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００（GraphPad Software、米国、カルフォルニア州、ラホヤ）を使用して、線形回帰のＲ２が０．９８０以上であるとともに、線形性からの逸脱についてのラン検定がｐ値＞０．０５を生じるまで、較正曲線から、抗原の最高濃度から始まるデータポイントを除去することによって確立した。
【０１０８】
線形回帰傾斜の統計的比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００（GraphPad Software、米国、カルフォルニア州、ラホヤ）を使用して、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）によって実施した。傾斜は、単なる偶然で計算された１より大きい検定統計量（test statistic）Ｆを得る確率（ｐ値）が、０．０５以下と評価された場合、統計的に異なると考えられた。
【０１０９】
１Ｆ．アッセイ間変動性
アッセイ間変動性は、ＦＨＡ−ＡｌＯＯＨ製剤の１０の分取された較正曲線に対して、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨに吸着されたＦＨＡの低（１０μｇ／ｍＬ）、中（５０μｇ／ｍＬ）、及び高（１００μｇ／ｍＬ）濃度で調製された試験試料の１０の分取物を測定することによって調査した。
【０１１０】
１Ｇ．パーセント吸着
パーセント吸着は、パーセント吸着レベルの差を生じさせるため、０ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭ、及び８０ｍＭリン酸塩が存在する状態で、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨに吸着された５０μｇ／ｍＬのＰＲＮによって試験した。全製剤の蛍光を、１０分間の１４０００ｒｐｍでの遠心分離後に、上澄みの蛍光とともに収集した。製剤及び上澄みの濃度を、それらのそれぞれの標準曲線を使用して逆算した。
【０１１１】
１Ｈ．マイクロケルダール（micro-Kjeldalh）との比較
未知の抗原濃度の試料は、マイクロケルダール法［１８］と固有蛍光（ＩＦ）法の両方によって測定した。ＩＦ法の場合、アジュバントなしの試料をＴＢＳ内で希釈し、ＡｌＰＯ４を含む試料を、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＰＯ４を含むＴＢＳ内で希釈し、ついには、それぞれの較正曲線範囲内の濃度値が得られた。全ての希釈液を、それらのそれぞれの標準曲線の線形回帰を使用して逆算した。逆算された濃度は、マイクロケルダールの結果と比較した。
【０１１２】
２Ａ．タンパク質抗原の蛍光スペクトルに対するアルミニウム塩アジュバントの影響
アルミニウム塩アジュバントの存在下でタンパク質濃度を検出するＩＦ法の実現可能性を調査するため、１００μｇ／ｍＬのＦＨＡ、ＰＲＮ、及びＦＩＭの製剤が、ＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４の存在下で、２８０ｎｍで励起され、２９０ｎｍ〜４００ｎｍのその全放出スペクトルを、正方形１０ｍｍキュベットにおいて即座に収集した（図１）。アルミニウム塩の非存在下で、ＦＨＡ及びＰＲＮはともに、３３０ｎｍの近くに最大を有する幅広でかつ十分に検出可能なピークを示した（図１Ａ、１Ｂ）。一方、ＦＩＭは、３１０ｎｍの近くに最大蛍光強度を有するより幅狭のピークを示した（図１Ｃ）。ＦＩＭにおいて検出されたより低い放出波長は、その構造におけるトリプトファンの欠如に起因しており、チロシンが蛍光スペクトルに対する主要な一因になる［１９］。アルミニウム塩の添加は、最大放出波長に著しく影響を及ぼさなかった。しかしながら、蛍光強度は、製剤で使用されるアジュバントのタイプに応じて影響を受けた。蛍光強度の著しい増加が、ＡｌＰＯ４を含む試料について観察されたが、ＡｌＯＯＨの存在は、調査中のタンパク質の蛍光スペクトルに特に影響を及ぼさなかった（図１）。
【０１１３】
これらの結果は、ワクチンにおいて一般に使用されるアジュバント濃度におけるアルミニウム塩の存在が、タンパク質の蛍光特性に干渉せず、アルミニウム塩アジュバント化ワクチン内のタンパク質の検出にこの方法が相応しいことを示す。
【０１１４】
２Ｂ．沈降の影響
アルミニウム塩アジュバントの懸濁液は、経時的に沈降することが知られている［２０］。ＩＦに対する沈降の影響を調査するため、単独の又は０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４に吸着した１００μｇ／ｍＬ  ＦＨＡを含む製剤の蛍光強度を、全体で２０分間、２分間隔で測定した。抗原ＦＨＡは、中性ｐＨでＡｌＯＯＨとＡｌＰＯ４の両方に高い程度に結合することが分かっているため選択された［２１］。予想されるように、ＦＨＡの蛍光強度は、経時的な変化を単独で示さなかった。一方、蛍光強度の減少は、両方のアルミニウム塩について見られた（図２）。アルミニウムアジュバントが沈殿するにつれて、アジュバントに結合したタンパク質は、励起ビームの下に引き下ろされ、それが、蛍光強度の減少の観察をもたらした（図２）。しかしながら、蛍光強度が乱されなかった時間は、アジュバントに応じて変動した。ＡｌＰＯ４に吸着したタンパク質は、約１０分後に沈殿することが見出された。一方、ＡｌＯＯＨにおいて、沈殿は、約１６分後に起こり始めた（図２）。これは、おそらく、アルミニウム塩の粒子サイズ、形状、密度、及びゼータ電位の大きさによって大きく影響を受ける可能性がある沈降速度の差による。沈降の影響に対処するため、全ての更なる蛍光測定は、キュベット内で試料を混合してから２分以内に得られた。
【０１１５】
２Ｃ．較正曲線
検出が、アジュバントの存在下で可能であると証明されると、タンパク質濃度に対する蛍光の線形応答の調査を行った。較正曲線は、１μｇ／ｍＬから関心のタンパク質バッチについて考えられる最高濃度の間で、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨ又はＡｌＰＯ４内の又はＴＢＳ（対照）内のＦＨＡ、ＰＲＮ、及びＦＩＭについて生成した。線形回帰の傾斜を、ＡＮＣＯＶＡを使用して比較した。
【０１１６】
線形トレンドは、０．９９３より大きい相関係数（Ｒ２）を持って、単独の抗原とアルミニウム塩アジュバントに吸着された抗原の両方において明瞭に検出することができる（図３）（表１）。
【０１１７】
【表１】
2021518559.tif 000003
【０１１８】
ほとんどの部分について、アジュバントの添加は、特にＦＨＡ及びＰＲＮについて、Ｒ２値のわずかな減少を実際にもたらした。それは、十中八九、アジュバントマトリクスに固有のより大きい複雑さによってもたらされる変動性の増加による。標準曲線における試料ごとのアジュバント粒子サイズ分布及び／又は濃度の変化は、変動性を増加させ、相関係数に悪い影響を及ぼすことになる。
【０１１９】
検出限界（ＬＯＤ）及び定量限界（ＬＯＱ）は、ブランクの標準偏差に基づくＩＣＨ指針を使用して決定された（表１）［１７］。ＰＲＮ製剤は、全体として、最低のＬＯＤ及びＬＯＱを有し、ＦＩＭ及びＦＨＡがそれに続くことが見出された。これは、ＦＨＡと比較して、ＰＲＮ内の蛍光分子Ｔｒｐのより高いモル濃度に関連付けられ得る。同一のｗ／ｖ濃度下で、ＰＲＮ試料が、ＦＨＡに比べてＴｒｐの約２．６倍高いモル濃度をもたらすことが推定される。
【０１２０】
製剤に対するＡｌＰＯ４の添加は、全ての抗原についての較正曲線傾斜における有意の増加（ｐ値＜０．０００１）をもたらし、感度の増加を示した（図３）。製剤に対するＡｌＯＯＨの添加もまた、較正曲線傾斜に対して、全ての事例でＡｌＰＯ４と同じ程度ではないが、統計的に有意の影響を及ぼした。ＦＨＡ製剤におけるＡｌＯＯＨの含有は、傾斜を増加させ（ｐ値＝０．００２）、感度の改善も示唆した。ＰＲＮ及びＦＩＭ製剤内のＡｌＯＯＨの存在は、傾斜を減少させ（それぞれ、ｐ値＝０．０００７及びｐ値＜０．０００１）、感度の降下を示した。したがって、較正曲線感度が、考察中の抗原−アジュバントの組み合わせに特有であることが確立された。
【０１２１】
線形性限界（ＬＯＬ）は、線形性からの逸脱についてのラン検定についてＲ２≧０．９８０とｐ値＞０．０５の両方を生じた抗原の最高濃度として計算され、これは、抗原依存性があることが見出された（表１）。ＩＦアッセイは、試験される製剤について許容できる程度に正確であった。ＦＩＭ製剤は、試験試料の最高の総合パーセント回復を生じ、ＦＨＡ及びＰＲＮがそれに続いた（表２）。パーセント回復及び試験試料濃度又は特定のアルミニウム塩の存在に関する明らかなトレンドは存在しなかった。
【０１２２】
【表２】
2021518559.tif 000004
【０１２３】
２Ｄ．アッセイ間変動性
低（１０μｇ／ｍＬ）、中（５０μｇ／ｍＬ）、及び高（１００μｇ／ｍＬ）タンパク質濃度の、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨに吸着されたＦＨＡの製剤を、アッセイ間変動性を調査するために使用した。低、中、高濃度試料についての変動係数（ＣＶ）は、実施された全部で１０の実験について、それぞれ、７．４％、１．５％、及び０．６％であり、ＩＦアッセイの高い再現性を示した（表３）。
【０１２４】
【表３】
2021518559.tif 000005
【０１２５】
２Ｅ．アジュバント濃度の影響
アジュバント濃度の影響を調査するため、ＦＨＡについての較正曲線を、低（０．３３ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ）、中（０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ）、及び高（１．３２ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ）アジュバント濃度で作成し、ＡＮＣＯＶＡを使用して比較した。
【０１２６】
較正曲線の傾斜は、アジュバントの濃度に応じて著しく変化し、感度の変化を示した（図４）。０．３３ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨの場合、較正曲線は、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ及び１．３２ｍｇ  Ａｌ／ｍＬの製剤に比べて、有意に低い傾斜を有した（両方についてｐ値＜０．０００１）が、０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬの傾斜と１．３２ｍｇ  Ａｌ／ｍＬの傾斜との間に有意の差は存在しなかった（ｐ値＝０．６）（図４Ａ）。ＡｌＰＯ４の場合、０．３３ｍｇ  Ａｌ／ｍＬから０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬへのアジュバント濃度の増加は、較正曲線の傾斜を有意に増加させた（ｐ値＜０．０００１）。しかしながら、１．３２ｍｇ  Ａｌ／ｍＬへの更なる増加は、傾斜の減少を生じたが、０．３３ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ曲線の傾斜より依然として有意に急峻である（ｐ値＝０．０１）（図４Ｂ）。Ｒ２値は、ＡｌＯＯＨ濃度を増加させることによって改善するのが見られた（０．９８９から０．９９９に）。しかしながら、ＡｌＰＯ４の濃度を増加させる場合、逆のことが得られた（０．９９２から０．９８０に）。これは、ＡｌＰＯ４含量の増加が、飽和点の近くで蛍光を増強し、曲線の線形性を乱すことを示唆している可能性がある。対照的に、ＡｌＯＯＨ濃度の増加は、依然として蛍光飽和を下回りながら、金属増強蛍光（ＭＥＦ：metal enhanced fluorescence）を提供するのにちょうど十分であり得る。
【０１２７】
２Ｆ．緩衝液種及びｐＨの影響
緩衝液組成及びｐＨの影響は、種々の緩衝液種及びｐＨで製剤化された０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨ内のＰＲＮの較正曲線を作成することによって調査し、ＡＮＣＯＶＡを使用して比較した。
【０１２８】
異なる緩衝液種が中性ｐＨで比較されたとき（図５Ａ）、有意の差は傾斜に観察されなかった（ｐ値＝０．２）。しかしながら、ｐＨを変更することは、ＰＲＮ−ＡｌＯＯＨ製剤についての較正曲線の傾斜に有意の変化をもたらした（ｐ値＝０．０４）（図５Ｂ）。これらの結果は、抗原濃度の正確な決定を確保するために、較正曲線が試験試料の緩衝液ｐＨに適合すべきであることを示唆する。正確度が最も重要である場合、緩衝液条件及びｐＨが試験試料及び較正曲線について同一であることが推奨される。正確度を効率又は制約のためにレバレッジすることができる、試料容積制限又は高スループットニーズ（すなわち、緩衝液組成、ｐＨ及びイオン強度のスクリーニング）等の或る特定の状況下で、単一緩衝液条件の較正曲線を利用すること（又は、複数の緩衝液条件をプールすること）は、オプションとすることができる。
【０１２９】
２Ｇ．パーセント吸着
抗原吸着のパーセントは、ワクチンの製剤開発中に所望のレベルに調整される必要がある重要なパラメーターである［２２］。ＰＲＮ−ＡｌＯＯＨ製剤が、アルミニウム塩アジュバントに対する抗原のパーセント吸着を決定するＩＦ法の有用性を調査するためのモデルとして使用された。異なるレベルの吸着を得るため、ＡｌＯＯＨを、異なる量のリン酸イオンで前処理した。リン酸イオンの濃度が０ｍＭから８０ｍＭまで増加したとき、非結合ＰＲＮの濃度の有意の増加が、ＩＦアッセイによって検出され（表４）、６７％から７．６％への吸着のパーセントの減少になった。全抗原濃度の小さい減少が、リン酸塩によって処理された試料において検出され、それは、ＩＦによるＰＲＮの定量に対する、ＰＲＮ吸着の程度又はリン酸塩濃度の或る程度の影響を示唆することができる。
【０１３０】
【表４】
2021518559.tif 000006
【０１３１】
２Ｈ．マイクロケルダールとの比較
ＩＦ法は、マイクロケルダール技法と比較された。この基本的な分析技法は、有機窒素の定量を通してタンパク質濃度を決定し、アジュバント化試料と非アジュバント化試料の両方に適用することができる。未知の抗原濃度の試料（アジュバント化と非アジュバント化の両方）を、マイクロケルダール及びＩＦによって測定した。ＦＨＡ、ＰＲＮ、ＦＨＡ−ＡｌＰＯ４、及びＰＲＮ−ＡｌＰＯ４についてのバッチにわたるパーセント差は、それぞれ、０．０％〜１６．０％、２．７％〜７．１％、９．０％〜１４．１％、及び３．２％〜６．６％であった（表５）。アジュバント製剤と非アジュバント化製剤の両方についての結果は、マイクロケルダール法とＩＦ法の間で非常に良好な一致を示した（表５）。
【０１３２】
【表５】
2021518559.tif 000007
【０１３３】
２Ｉ．インライン法：蛍光フローセルの概念実証−パートＡ
概念実証（ＰＯＣ：proof of concept）研究は、使い捨てフローセルに取り付けられた蛍光プローブを組み込んだプロトタイプシステムの機能及び正確度を実証するために行った。そのようなインライン蛍光測定は、処理ライン内でフローセルを積分することによって実施し、したがって、オフラインサンプリングについての必要性を回避した。フローセルは、環境光の干渉を回避するため、ブラックボックス内に配置した。ソース及びリターンからなる光ファイバーケーブルは、光度計とフローセルを接続した。２８０ｎｍの波長を有する光源は、光学窓を通して試料内の電子を励起するために使用した。放出した光子は、光源と同じ角度で位置決めされた後方散乱光検出器によって検出した。吸収フィルター（emission filter）を検出器の前に設置することで、３３７ｎｍのみを有する光子が通過し、光の望ましくない任意の波長を遮断することを可能にした。
【０１３４】
蛍光の強度は、フルオロフォア（芳香族アミノ酸）の量に比例し、したがって、タンパク質の濃度に比例する。この理論に基づいて、タンパク質濃度は、関心のタンパク質の較正曲線に基づいて定量することができる。ＦＨＡは、ＰＯＣ研究のためのモデル抗原として使用した。較正曲線を、アジュバント化ＦＨＡ及び非アジュバント化ＦＨＡについて生成した。既知のＦＨＡ濃度の試料を、方法の事前の正確度及び精度（precision）を決定するために試験した。
【０１３５】
ＦＨＡ濃度と蛍光信号との間の相関は、単独のＦＨＡと、ＴＢＳ内で０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨに吸着したＦＨＡの両方について線形応答Ｒ２＞０．９９を示した（図７）。
【０１３６】
インライン法は、たとえフローセルの種々のバッチを使用するときでも、単独のＦＨＡと、ＴＢＳ内で０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨに吸着したＦＨＡの両方について高い再現性−１８．４％未満の変動係数を示した（表６）。
【０１３７】
【表６】
2021518559.tif 000008
【０１３８】
インライン法は、単独のＦＨＡと、ＴＢＳ内で０．６６ｍｇ  Ａｌ／ｍＬのＡｌＯＯＨに吸着したＦＨＡの両方について高い正確度−９４％を超える正確度を示した（表７）。
【０１３９】
【表７】
2021518559.tif 000009
【０１４０】
２Ｊ．インライン法：蛍光フローセルの概念実証−パートＢ
更なる概念実証（ＰＯＣ）研究は、使い捨てフローセルに取り付けられた蛍光プローブを組み込んだプロトタイプシステムの機能及び正確度を更に調査するために行った。
【０１４１】
ＰＲＮ（＋／−ＡｌＰＯ４）及びＡ０５、骨髄炎菌血清群Ｂ抗原（＋／−ＡｌＰＯ４）を別個の実験において利用した。ＰＲＮは１９のチロシン及び１３のトリプトファンを有する。Ａ０５は１０のフェニルアラニン及び５のチロシンを有する。ＡｌＰＯ４は、蛍光を発する共役電子を欠いているため、アジュバントに吸着するタンパク質は、固有蛍光によって測定することもできるが、アジュバント粒子及びＡｌの光散乱は、そのイオン形態によって測定の正確度に影響を及ぼす場合がある。
【０１４２】
各タンパク質組成について、タンパク質濃度及び％吸着を、蛍光フローセルを使用して計算した（図８の場合と同様に）。この研究で使用され収集される励起波長及び放出波長は、それぞれ、２８０ｎｍ及び３３７ｎｍであった。等間隔に配置された５つの濃度を有する試料が、標準曲線を構成するために選択された（表８）。標準曲線の正確度は、その後、較正範囲内の別の５つの製剤に対して検証した。
【０１４３】
【表８】
2021518559.tif 000010
【０１４４】
試験されるタンパク質のそれぞれは、非アジュバント化及び／又はＡｌＰＯ４アジュバント化のいずれでも、タンパク質濃度を決定するときに優れた線形関係（Ｒ２＞０．９８）を示した。本技法は、これらの抗原について吸着した原薬の稼働範囲（operating range）（表８）を定量することができた（データは示さず）。他の抗原と違って、Ａ０５は、タンパク質の蛍光強度に最も寄与するアミノ酸であるトリプトファンを欠いている。それでも、インライン法は、Ａ０５が試験されたときに、標準曲線において優れた線形結果を生じることができた。したがって、内因性の弱い蛍光強度にもかかわらず、Ａ０５等のチロシン及びフェニルアラニンベース抗原も、フローセルによる固有蛍光測定に適する。
【０１４５】
ＡｌＰＯ４のパーセント（％）吸着は、アジュバント粒子がフローセルから分離して沈殿した後、インラインで決定された。これにより、蛍光プローブが上澄みの蛍光だけを測定することが可能になる。沈殿プロセスを支援し、詰まりを回避するため、試料を、最初の２０分の沈降後に１秒間、チューブを通して短時間で圧送し、それに続いて、全体で４５分の継続時間になるように、更なる２５分の沈殿が設けられる。パーセント（％）吸着は、濃度に変換された、測定された上澄み蛍光、及び、理論的な吸着した試料濃度に基づいて計算した。これらの条件下で、フローセルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結果と比較して、オフセット及び補正係数によって補正された、完全に吸着したＡ０５及び部分的吸着したＡ０５についての同等の結果を生じることができた。補正係数及びオフセットは、抗原バッチの差、貯蔵条件、及び濾過状態に応じて同様に変動する場合がある。
【０１４６】
ＩＶ．コメント
アルミニウム塩アジュバントの存在下でのタンパク質濃度の決定は、アジュバントの内因性の微粒子特性（particulate nature）及びアジュバント粒子に対するしばしば非常に強い抗原吸着によって、複雑なタスクである。濁度由来の干渉を回避するため、アルミニウム塩アジュバント化ワクチン内のタンパク質の定量のための固有蛍光（ＩＦ）の使用が検討された。本明細書で、タンパク質からのＩＦを、より一般的に使用される２つのアルミニウム塩アジュバントの存在下で検出することができ、そのＩＦが線形応答を生じることができることが証明される。その結果は、ＩＦアッセイが、ほとんどのワクチンで使用される濃度範囲内でタンパク質抗原を十分に定量するのに、非常に正確で、再現性があり、感度があることを示す。
【０１４７】
ワクチン内のタンパク質濃度の決定のために通常使用される伝統的な方法と比較すると、多くの利点がＩＦ法について明らかである。古典的な方法と対照的に、ＩＦアッセイは、非常に単純で、非破壊的で、必要とされるアッセイ開発が最小限である。この文脈で、ＩＦ法は、バイオ医薬製品（biopharmaceutical product）及びワクチン内の全タンパク質を決定するために広く使用される方法であるマイクロケルダール法と同等の結果を生じることが示された［１３，２３］。ＩＦ法の別の利点は、ＩＦ法が、脱離、分離、又は化学反応についての必要性なしで、ワクチン試料に直接適用できることである。ＩＦの非破壊的かつ非侵襲的特性は、おそらく、アッセイの最も重要な特徴であり、それらの特徴は、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールの実装のために、また、設計による品質（ＱｂＤ：Quality by Design）アプローチを支持するために極めて重要である［２４，２５］。ＰＡＴ概念は、実際には、品質特性をリアルタイムにモニターすることによってプロセスを理解することを目指す［２５］。したがって、過剰処理及びリジェクトの数も低減しながら、試験効率及び一貫性を高めるためにインライン／オンラインで適用できる非破壊的定量法についての必要性が存在する。ＩＦ法は、インライン蛍光光度計を使用したワクチン製造中に抗原濃度の製造過程のモニタリングのために適合することができる［２６］。
【０１４８】
本明細書において、一般的に使用されるアルミニウム塩アジュバントを含むワクチン内のタンパク質濃度を決定するための、直接的で、非破壊的で、単純で、安価な蛍光法アッセイが述べられる。方法は、ほとんどのワクチン内で見出されるタンパク質濃度範囲内で高い正確度、感度、及び再現性を示した。この技法の適用は、アルミニウムアジュバントを含むワクチン内のタンパク質濃度の決定に限定されず、なぜならば、この技法が、カチオン性ペプチド−ＣｐＧ、スクアレン乳剤、サポニン、リポソーム等のような他のタイプのアジュバント系によって製剤化されたタンパク質の定量について大きな将来性を有するからである。
【０１４９】
本発明はその或る特定の実施形態を参照して記載されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修飾を行い得ることを理解する。添付の特許請求の範囲は、記載される具体的な実施形態に限定されない。
【０１５０】
参考資料
本明細書で言及される全ての特許及び出版物は、本発明の属する技術分野の当業者の技術水準の指標である。各々の引用される特許及び出版物はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。以下の参考資料は、全て本出願で引用されている。
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【図１】
2021518559.tif 000011
【図２】
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【図３】
2021518559.tif 000013
【図４】
2021518559.tif 000014
【図５】
2021518559.tif 000015
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021518559.tif 000019
【図１０】
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【国際調査報告】
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