(57)【要約】  本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４分子に結合する抗ＣＴＬＡ−４抗体組成物、並びにがん免疫療法における使用及び他の免疫治療剤と比較して自己免疫副作用を低減するための前記組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性ｐＨにおいてＣＴＬＡ−４への結合が減少する抗ＣＴＬＡ−４抗体を生成する方法であって、前記抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のうち少なくとも一方における１又は複数のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域内又は近傍にあるチロシンをヒスチジンで置換することを含む、方法。
【請求項２】
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のうち少なくとも一方における１又は複数のチロシン残基がヒスチジンで置換されているトレメリムマブ又はイピリムマブのアミノ酸配列を含む、酸性ｐＨにおいてＣＴＬＡ−４への結合が減少する抗ＣＴＬＡ−４抗体バリアント。
【請求項３】
配列番号１、３、５、６、又は８に示される配列を含む重鎖及び配列番号２又は４に示される配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項４】
配列番号６に示される配列を含む重鎖及び配列番号２に示される配列を含む軽鎖を含む、請求項３に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項５】
配列番号１４〜１８のうち１つに示される配列を含む重鎖及び配列番号１０〜１２のうち１つに示される配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項６】
がん免疫治療を必要とする対象におけるがん免疫治療の方法であって、単独で、又は１又は複数の他の治療と組み合わせて、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７】
前記他の治療は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に結合する抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＰＤ−１抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対象のがんを処置する際に使用するための、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【請求項１０】
対象のがんを処置するための医薬の製造における、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍活性が向上し副作用が軽減した変異抗ＣＴＬＡ−４抗体、並びにかかる抗体を作製及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｍＡｂ））は、がんの免疫療法効果（ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ（ＣＩＴＥ））をもたらすが、重度の免疫療法関連の有害事象（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔ（ｉｒＡＥ））を引き起こす。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂｓはマウスモデル及び黒色腫患者でＣＩＴＥを示していた。抗ＰＤ−１  ｍＡｂであるニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）と抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂであるイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）との併用により、進行性黒色腫患者の客観的奏効率が大幅に増加した。進行性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）における当併用療法からも有望な結果が現出した。別の抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ））を第ＩＩ相臨床試験で抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂであるデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）と併用した場合、臨床的有用性の暫定的なエビデンスが得られた。
【０００３】
抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの単独又は併用による幅広い臨床使用に対する主要な障害となるのは、重篤な有害事象（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔ（ＳＡＥ））である。イピリムマブ（最初の臨床的抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ）の治験で観察されたＳＡＥは、免疫療法関連の有害事象（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔ（ｉｒＡＥ））の概念につながった。特に、イピリムマブ及びニボルマブ（抗ＰＤ−１）の併用療法では、５０％超の患者がグレード３及びグレード４のＳＡＥを発症した。ＮＳＣＬＣでは、イピリムマブ及びニボルマブの併用療法により高い奏効率が得られたが、グレード３及びグレード４のＳＡＥも高率で生じた。同様に、デュルバルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）及びトレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）の組み合わせは、ＮＳＣＬＣで臨床活性を示したが、おそらく容認できない毒性のせいで、グレード３及びグレード４のＳＡＥの発生率並びに患者の脱落率が高かった。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの高用量は単剤療法及び併用療法の両方でより良い臨床転帰と関連しているため、ｉｒＡＥは多くの患者が免疫療法を継続することを妨げるだけでなく、ＣＩＴＥの有効性も制限する。さらに、両方の抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂで脱落した患者の数が多かったことは、いくつかの臨床試験で臨床評価項目を満たすことができなかったためと考えられる。
【０００４】
より最近では、切除されたステージＩＩＩ及びステージＩＶの黒色腫に対するアジュバント（術後補助）療法としての抗ＰＤ−１  ｍＡｂであるニボルマブ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂであるイピリムマブの直接比較により、イピリムマブのＣＩＴＥは小さいがｉｒＡＥは大きく、ＣＴＬＡ−４−標的免疫療法の見通しにさらなる影を落としている。しかしながら、３年間生存したイピリムマブ投与患者は、１０年間の生存率ではさらなる低下を示さなかった。奏功が顕著に持続することは、特にｉｒＡＥを制御下に置くことができる場合、免疫療法のためにＣＴＬＡ−４を標的とすることの例外的な利点を強調するものである。
【０００５】
安全で効果的な抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの生成に関する基本的な問題は、ＣＩＴＥ及びｉｒＡＥが本質的に関連しているかどうかである。これまでのチェックポイント阻害の仮説は、リンパ系臓器でナイーブＴ細胞の活性化を促進するＢ７−ＣＴＬＡ−４相互作用の負のシグナルを遮断することにより、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂががん免疫を促進することを規定している。このモデルによれば、治療用抗体はＣＴＬＡ−４−Ｂ７相互作用を機能的に不活性化するアンタゴニストである。ＣＴＬＡ−４発現の遺伝的不活性化はマウス及びヒトにおける自己免疫疾患を引き起こすため、ｉｒＡＥはＣＩＴＥに必要な対価であると考えられている。一方我々は、抗マウスＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの治療効果には、Ｂ７−ＣＴＬＡ−４相互作用を阻害することよりも、特に腫瘍微小環境内において、抗体媒介によってＴｒｅｇを枯渇させること（antibody-mediated depletion of Treg）が必要であることを示した。抗体がＣＩＴＥの誘導のための生理学的条件下でＢ７−ＣＴＬＡ−４相互作用を阻害可能であるかどうかは無関係である。これらの研究は、ＣＴＬＡ−４発現の遺伝的不活性化を模倣することなく局所的なＴｒｅｇの枯渇を達成できれば、ＣＩＴＥがｉｒＡＥなしで達成できるという興味深い可能性を提起している。ヒト対立遺伝子に対してホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかであるマウスを使用して、ＣＩＴＥは単一対立遺伝子の関与（monoallelic engagement）のみを必要とする一方で、ｉｒＡＥは両対立遺伝子の関与（biallelic engagement）を必要とすることがわかった。これらのデータは、ｉｒＡＥがＣＴＬＡ−４機能への拮抗を必要とする一方で、ＣＩＴＥは抗体のアゴニスト活性に依存することを示唆する。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書において、抗ＣＴＬＡ−４抗体のアンタゴニスト活性を抑制すると共にそれらのＦｃ受容体アゴニスト活性を維持及び向上する方法が提供される。具体的に開示されるのは、抗体結合の酸性ｐＨに対する感受性を増加する方法であり、これにより抗ＣＴＬＡ−４抗体はＣＴＬＡ−４への結合の低下を示す。本明細書に記載される、抗ＣＴＬＡ−４抗体結合活性の低下などの変化は、特定の抗体組成物についての２つの異なるｐＨレベルの間の相対的な差異であり得る。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４への結合は、細胞内エンドソームコンパートメントを反映するｐＨで減少する。好ましい実施形態では、ＣＴＬＡ−４への結合は、中性ｐＨ（ｐＨ７．０）における結合と比較して、エンドソームｐＨ５．５において５０％超減少する。かかる減少は、ｐＨ７．０と比較して、リソソームｐＨ４．５では７５％超に達し得る。ｐＨ７．０で事前に形成された抗体−抗原複合体は、ｐＨ４．５〜６．０の酸性環境下で解離し得る。結合の減少は、同じ標準試料（standard）を使用した場合にｐＨ感受性がかなり低い参照抗体と比較してもよい。参照抗体は、イピリムマブ又はトレメリムマブなどの当技術分野で公知の抗体であってもよい。改変抗体との関連で、前記変化はまた、同じ標準試料を使用した場合にｐＨ感受性がかなり低くなり得る野生型抗体と比較してもよい。
【０００７】
別の態様では、本明細書において、抗腫瘍効果が改善されている及び／又は毒性が低減されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を同定する方法であって、プレートコーティングされたＣＴＬＡ−４と可溶性抗体との間の相互作用を、ｐＨ４．５〜７．０の範囲内の１又は複数のｐＨで試験又は測定すること、及び酸性ｐＨにおける結合の減少が観察されるｐＨ感受性が高い抗体（antibodies with increased pH sensitivity such that reduced binding is observed at acidic pH）を選択することを含む前記方法が提供される。一実施形態では、ｐＨは７．０及び５．５である。その他の場合は、ｐＨは７．０及び４．５であるか７．０、５．５、及び４．５である。
【０００８】
別の態様では、本明細書において、毒性が低減されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を、細胞表面ＣＴＬＡ−４のレベルに対するそれら抗体の効果によって同定する方法が提供される。好ましい実施形態では、前記抗体は、細胞内のＣＴＬＡ−４から解離し、ＣＴＬＡ−４が細胞表面に再循環（リサイクル）することを可能にし得るものであり、これは、細胞表面ＣＴＬＡ−４の減少が最小であるか又は減少しないことに基づいて決定することができる。
【０００９】
別の態様では、本明細書において、抗腫瘍効果を改善及び／又は毒性を低減するために、酸性ｐＨにおいてＣＴＬＡ−４への結合の減少が観察されるようにｐＨ感受性を高めることにより抗ＣＴＬＡ−４抗体を設計又は改変する方法が提供される。これらの特徴を示す抗ＣＴＬＡ−４抗体も提供される。一実施形態では、前記抗体は、イピリムマブ又はトレメリムマブなどの野生型抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域の１又は複数のＣＤＲ領域内又は近傍にある１又は複数のチロシン残基をヒスチジン残基で置換することにより設計され得る。酸性ｐＨにおけるＣＴＬＡ−４への結合が野生型抗体と比較して減少するように、抗ＣＴＬＡ−４抗体、トレメリムマブ、又はイピリムマブの変異バージョンを生成してもよい。
【００１０】
別の態様では、本明細書において、ＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して抗腫瘍効果が改善された抗体を同定する方法であって、増強されたＡＤＣＣ活性が抗腫瘍活性の読み取り（readout）として使用される前記方法が提供される。
【００１１】
本明細書において、抗腫瘍活性が増強されている及び／又は毒性が低減されている特定の抗ＣＴＬＡ−４抗体、その抗体フラグメント、及びその組成物（compositions of foregoing）も提供される。前記抗体は、配列番号１、３、５、６、又は８に示される配列を含む重鎖及び配列番号２又は４に示される配列を含む軽鎖を含み得る。前記抗体はまた、配列番号１４〜１８のうち１つに示される配列を含む重鎖及び配列番号１０〜１２のうち１つに示される配列を含む軽鎖を含み得る。
【００１２】
さらに、本明細書において、がん免疫療法又はがんの処置方法であって、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体組成物を、単独又は１又は複数の他の抗がん治療と組み合わせて使用する前記方法が提供される。一態様では、前記他の抗がん治療は免疫療法である。別の態様では、前記免疫療法は抗ＰＤ−１治療又は抗ＰＤ−Ｌ１治療である。前記免疫療法はニボルマブ、デュルバルマブ、又はペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）であってもよい。がんを処置するための医薬の製造における、本明細書に記載の抗体組成物の使用も提供される。前記がんを処置する方法は、本明細書に記載の組成物を、がん処置を必要とする対象に投与することを含み得る。前記対象はヒトであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜図１ＢはＴｒｅｍｅＩｇＧ１及びそのバリアントのｐＨ感受性を示す。ＥＬＩＳＡプレートにおいてＨｉｓ−ｈＣＴＬＡ−４（０．５μｇ／ｍＬ）をコーティングし、ｐＨ４．５〜７．０の範囲内でバッファーに１μｇ／ｍＬの異なる抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂを添加した。表示されるｐＨは、結合及び洗浄の条件を表す。ＣＴＬＡ−４に結合した抗体は、西洋ワサビペリオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して測定した。
【図２】図２はＴｒｅｍｅＩｇＧ１及びそのバリアントのｐＨ感受性結合解離を示す。図１と同様に、ｐＨ７．０においてプレート結合ＣＴＬＡ−４に結合した抗体の一群を除いては、その後、表示されるｐＨのバッファーでプレートが洗浄された。
【図３】図３は総ＣＴＬＡ−４レベルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果を示す。ヒトＣＴＬＡ−４  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を抗ＣＴＬＡ−４抗体と３７℃で４時間インキュベートし、細胞内のＣＴＬＡ−４の総量を総細胞溶解物のウエスタンブロットで測定した。ＣＴＬＡ−４のダウンレギュレーションは、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１及びｍＡｂ１５４によって引き起こされるが、他の抗体バリアントによってはわずかである。
【図４】図４はエンドサイトーシス後の生細胞においてＣＴＬＡ−４から解離した抗体のｐＨ感受性を示す。ｈＣＴＬＡ−４を発現する２９３Ｔ安定細胞株を、４℃で３０分間、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂで標識し、未結合の抗体を洗い流した後、細胞を３７℃で１時間へ移植した。抗体結合表面ＣＴＬＡ−４はプロテインＧビーズで捕捉され、抗ＣＴＬＡ−４抗体（Ｈ−１２６）：ｓｃ−９０９４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズバイオテクノロジー）社）を使用したウエスタンブロットで検出された。図４Ａは、４℃での抗体の結合を示した図である。図４Ｂは、３７℃でのインキュベーション後に残存する抗体のレベルを示した図である。改変抗体、特にＡＢ１５６及びＡＢ１５７は、ｍＡｂ１３９（ＴｒｅｍｅＩｇＧ１）又はｐＨ感受性の低い他のバリアントに較べると、３７℃での抗体誘導内部移行（antibody-induced Internalization）中にＣＴＬＡ−４から解離する。
【図５】図５は細胞表面ＣＴＬＡ−４に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果を示す。ヒトＣＴＬＡ−４発現ＣＨＯ細胞をＴｒｅｍｅＩｇＧ１及びその変異体で３７℃又は４℃で２時間処理した。未結合の抗体を洗い流した後、表面ＣＴＬＡ−４を抗ｈＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ａｌｅｘ４８８によって４℃で３０分間で検出し、フローサイトメトリーによって分析した。表示されるデータは、３７℃でインキュベートしたサンプルの４℃でインキュベートしたサンプルに対するＭＦＩの比率であり、平均が１．０と定義されているＨＬ１２の比率に対して正規化したものである。示されているデータは、３つの独立した実験からのもので、それぞれグループ毎に２つのサンプルを含む。
【図６】図６はＴｒｅｍｅＩｇＧ１及びそのｐＨ感受性バリアントのＡＤＣＣ活性を示す。示されているデータは、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現するレポーター細胞から放出された発光ユニットである。ヒトＣＴＬＡ−４分子を発現する２９３Ｔ細胞を標的細胞として使用している。
【図７】図７は、腫瘍微小環境でＴｒｅｇを枯渇させることにおいてＡｂ１５７が改善された活性を示すことを表す。ＭＣ３８担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウス（ｎ＝９）は、腫瘍接種後１４日目にＴｒｅｍｅＩｇＧ１（ＡＢ１３９）又はそのｐＨ感受性バリアントＡｂ１５７（３０μｇ／マウス）を腹腔内投与された。腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の選択的枯渇は、抗体処理後１６時間のＣＤ４  Ｔ細胞におけるＴｒｅｇ細胞の割合（％）で測定された。＊Ｐ＜０．０５。
【図８】図８Ａ〜図８ＥはＴｒｅｍｅＩｇＧ１及びそのｐＨ感受性バリアントの免疫療法効果を示す。図８Ａは実験の設計を示す。図８Ｂ〜図８Ｅは、ＩｇＧ−Ｆｃ（図８Ｂ）、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１（ＡＢ１３９；図８Ｃ）、ＡＢ１５６（図８Ｄ）、又はＡＢ１５７（図８Ｅ）のいずれかを投与されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。
【図９】抗ＰＤ−１との併用療法で使用した場合、ｐＨ感受性は抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体の安全性の向上に関連する。ＣＴＬＡ−４ｈ／ｈマウスは、生後１０、１３、１７、及び２０日目における１００μｇ／マウス／注射の用量のＴｒｅｍｅＩｇＧ１（ＡＢ１３９）、ＡＢ１５６、ＡＢ１５７、ＡＢ１５８、及びＡＢ１５９のうちいずれかの抗ＣＴＬＡ−４と抗ＰＤ−１との併用療法を受けた。安全性は、経時的生存率の観点から表される。Ｎ＝６。ＡＢ１５７対ＴｒｅｍｅＩｇＧ１はＰ＝０．０１であり、ＡＢ１５６対ＴｒｅｍｅＩｇＧ１はＰ＝０．０３である。
【図１０】図１０は、野生型抗体ＴｒｅｍｅＩｇＧ１と比較して、ｐＨ感受性バリアント抗ＣＴＬＡ−４抗体であるＡＢ１５７の安全性がより優れていることを示す独立した２つの実験のデータの生存率分析である。ＴｒｅｍｅＩｇＧ１（ＡＢ１３９）及びＡＢ１５７は、生後１０、１３、１７、及び２０日目に１００μｇ／マウス／注射の用量で投与された。安全性は、経時的生存率の観点から表される。データは独立した２つの実験の要約である。２つの処置群間で統計的に有意な差が観察された。ＡＢ１５７又はｈＩｇＧＦｃ対照＋抗ＰＤ−１の場合はＮ＝１５、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１＋抗ＰＤ−１の場合はＮ＝１６である。Ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．定義
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を指す。「可変領域」という用語は、抗体によって広く共有されるドメイン（抗体Ｆｃドメインなど）とは異なる免疫グロブリンのドメインを指す。可変領域は、その残基が抗原結合の能力を担う「超可変領域」を含む。超可変領域は、「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、典型的には軽鎖可変ドメインのおよそ２４〜３４番目（Ｌ１）、５０〜５６番目（Ｌ２）、及び８９〜９７番目（Ｌ３）の残基並びに重鎖可変ドメインのおよそ２７〜３５番目（Ｈ１）、５０〜６５番目（Ｈ２）、及び９５〜１０２番目（Ｈ３）の残基、参考文献４４）を含み、「超可変ループ」からのそれらの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの２６〜３２番目（Ｌ１）、５０〜５２番目（Ｌ２）、及び９１〜９６番目（Ｌ３）の残基並びに重鎖可変ドメインの２６〜３２番目（Ｈ１）、５３〜５５番目（Ｈ２）、及び９６〜１０１番目（Ｈ３）の残基）を含み得る。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、又は抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体及び抗抗Ｉｄ抗体を含む）。特に、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹなどの免疫グロブリン分子であってもよく、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、若しくはＩｇＡ２などのクラス又はサブクラスのものであってもよい。
【００１５】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び所望により抗体の「可変領域」抗原認識部位を含むフレームワーク残基抗体を含み、抗原を免疫特異的に結合する能力を示す、抗体の１又は複数の部分を指す。かかるフラグメントには、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、及びそれらの変異体、天然に存在するバリアント、並びに抗体の「可変領域」抗原認識部位及び異種タンパク質（例えば、毒素、異なる抗原の抗原認識部位、酵素、受容体、又は受容体リガンドなど）を含む融合タンパク質が含まれる。本明細書中で使用される場合、「フラグメント」という用語は、少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドをいう。
【００１６】
ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体は、ヒトにおけるインビボでの使用に特に好ましいが、マウス抗体又は他の種の抗体は、多くの用途（例えば、インビトロ検出アッセイ又はインサイチュ検出アッセイ、急性のインビボでの使用など）に有利に使用され得る。
【００１７】
「キメラ抗体（chimeric antibody）」は、抗体の異なる部分（different portions of the antibody）が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子であり、例えば非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などである。非ヒト種由来の１又は複数のＣＤＲとヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、例えばＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号、国際公開第９１／０９９６７号、並びに米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、及び第５，５８５，０８９号）、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又は表面再仕上げ（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号、欧州特許第５１９，５９６号、４６〜４８）、及びチェーンシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）などの当技術分野で公知の様々な技法を使用して製造可能であり、これら全ての内容は、参照により本明細書に援用される。
【００１８】
本明細書で記載される抗体はヒト化抗体であってよい。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト（通常はマウス又はラット）免疫グロブリンからの１又は複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５％〜９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。したがって、おそらくＣＤＲを除いて、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖免疫グロブリン及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、典型的なキメラ抗体は、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるなどのため、ヒト化抗体には包含されないであろう。ドナー抗体が「ヒト化（humanization）」のプロセスによって「“ヒト化”（humanized）」されたものとされるのは、得られるヒト化抗体がＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予想されるためである。ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、望ましい特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり得る。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＦＲ））残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾により、抗体の性能がさらに向上する場合がある。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み得、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を所望により含み得、これは、１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加（すなわち、変異）の導入によって変更された、ＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリンのものであり得る。
【００１９】
１．抗ＣＴＬＡ４抗体組成物
イピリムマブ及びトレメリムマブを含む、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に対する抗体は、唯一の免疫療法薬としても、又は抗ＰＤ−１抗体などの別の治療薬と組み合わせても、がん患者の生存率を高めることが示されている。しかしながら、その治療効果は、免疫関連の重大な有害作用と関連している。より優れた治療効果又は自己免疫副作用のさらなる減少を達成するために、新規な抗ＣＴＬＡ−４抗体を開発する大きな需要がある。本発明者らは、驚くべきことに、免疫療法に関連する重大な自己免疫副作用を低減しながらがん拒絶を誘導するために使用することができる抗ＣＴＬＡ−４抗体を見出した。
【００２０】
本明細書では、抗体及びその抗原結合フラグメント、並びに前述のものを含む組成物が提供される。前記組成物は医薬組成物であってもよい。前記抗体は抗ＣＴＬＡ−４抗体であってもよい。前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体であってもよい。前記抗体はまた、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性であり得る。前記抗体は検出可能に標識されていてもよく、共役毒素、薬剤、受容体、酵素、又は受容体リガンドを含んでいてもよい。
【００２１】
本明細書では、内因性濃度又はトランスフェクトした濃度で（at an endogenous or transfected concentration）生細胞の表面に発現され得る、ＣＴＬＡ−４、特にヒトＣＴＬＡ−４に免疫特異的に結合する抗体の抗原結合フラグメントも本明細書に提供される。抗原結合フラグメントはＣＴＬＡ−４に結合し得るものであり、生細胞はＴ細胞であり得る。
【００２２】
特定の実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｔｒｅｇ枯渇及びＦｃ受容体依存性腫瘍拒絶を効率的に誘発し得る。他の実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体は、細胞内酸性ｐＨ表示下においてＣＴＬＡ−４から解離し、ＣＴＬＡ−４が細胞表面に再循環（リサイクル）することを可能にし得る。
【００２３】
さらに、本明細書において、本明細書に記載の抗体の機能的特徴又は属性を組み込むことによる、新規抗ＣＴＬＡ−４抗体の設計、並びに既存の抗ＣＴＬＡ−４抗体の有効性又は毒性プロファイルを改善する方法が提供される。
【００２４】
前記抗体は、イピリムマブ又はトレメリムマブであり得る公知の抗ＣＴＬＡ−４抗体のアミノ酸配列の変異体を含み得る。野生型抗体配列と比較して、前記変異配列は、重鎖又は軽鎖の少なくとも一方における１又は複数のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域の近傍又は内部に、ヒスチジンによるチロシンの１又は複数の置換を含み得る。抗ＣＴＬＡ−４抗体は、配列番号１、３、５、６、及び８のうち１つに示される配列を含む重鎖、及び配列番号２〜４のうち１つに示される配列を含む軽鎖を含み得る。特に、前記重鎖は、配列番号６に示される配列を含み得、前記軽鎖は、配列番号２に示される配列を含み得る。前記重鎖はまた、配列番号１４〜１８のうち１つに示される配列を含み得、前記軽鎖は、配列番号１０〜１２のうち１つに示される配列を含み得る。
【００２５】
２．抗ＣＴＬＡ−４抗体組成物の有効性及び安全性を改善する方法
本明細書において、改善された抗腫瘍活性及び／又は安全性を示す抗体組成物を設計（変異導入又は改変）又は選択する方法が提供される。具体的には、酸性ｐＨにおける抗体結合の感受性を高めることが可能であり、これにより、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、より低いｐＨではＣＴＬＡ−４への結合の減少を示す。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４への結合は、エンドソームコンパートメントを反映するｐＨで減少する。好ましい実施形態では、ＣＴＬＡ−４への結合は、中性ｐＨ（ｐＨ７．０）での結合と比較して、ｐＨ５．５で減少する。ｐＨ５．５におけるかかる減少した結合は、中性ｐＨで観察されるＣＴＬＡ−４結合の５０％以上であり得る。結合などの、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体活性の減少又は増加などの変化は、参照抗体又は野生型抗体と比較してもよい。参照抗体は、イピリムマブ又はトレメリムマブなどの当技術分野で公知の抗体であってもよい。前記変化はまた、本明細書に記載の特定の抗体組成物の２つの異なるｐＨレベルの間で相対的であり得る。
【００２６】
プレートコーティングされたＣＴＬＡ−４と可溶性抗体との間の相互作用をｐＨ４．５〜７．０の範囲内で試験すること、及び酸性ｐＨで結合の減少が観察されるｐＨ感受性が高い抗体を選択することにより、抗腫瘍活性が改善され且つ／又は毒性が低減された抗ＣＴＬＡ−４抗体が同定され得る。
【００２７】
抗ＣＴＬＡ−４抗体は、細胞表面ＣＴＬＡ−４のレベルへの影響による毒性が低減された状態で同定され得る。好ましい実施形態では、前記抗体は、細胞内のＣＴＬＡ−４から解離し、ＣＴＬＡ−４が細胞表面に再循環することを可能にするものであり、これは、細胞表面ＣＴＬＡ−４の減少が最小であるか又は減少しないことや抗体の結合した表面ＣＴＬＡ−４の量の減少に基づいて決定することができる。
【００２８】
本明細書において、ＣＴＬＡ−４への結合の減少が酸性ｐＨで観察されるようにｐＨ感受性を高めることによって抗腫瘍効果を改善し且つ／又は毒性を低減するために抗ＣＴＬＡ−４抗体を設計又は改変する方法が提供される。一実施形態では、前記抗体は、抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域のＣＤＲ領域内又は近傍の１又は複数のチロシン残基をヒスチジン残基で置換することにより設計される。前記方法は、酸性ｐＨでＣＴＬＡ−４への結合の減少を示す抗ＣＴＬＡ−４抗体トレメリムマブ又はイピリムマブの変異体バージョンを作製することを含み得る。
【００２９】
ＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して抗腫瘍効果が改善されるように抗体を設計又は変更してもよく、ここでは増強されたＡＤＣＣ活性が抗腫瘍活性の読み取りとして使用される。好ましい実施形態では、抗腫瘍活性を増大させるために、ＣＴＬＡ−４標的化剤は、腫瘍微小環境においてＴｒｅｇを選択的に枯渇させるであろう。特定の実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂは、Ｆｃ媒介性Ｔｒｅｇ枯渇活性が増大している。Ｔｒｅｇの枯渇は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃ媒介性エフェクター機能によって発生し得る。Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、当技術分野で公知の任意の方法によって導入又は増強することができる。一例では、前記抗体は、他のアイソタイプと比較してエフェクター機能が向上したＩｇＧ１アイソタイプである。前記Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、Ｆｃドメインのアミノ酸配列の変異によってさらに増強することが可能である。例えば、３つの変異（Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、及びＫ３３４Ａ）をＦｃドメインのＣＨ領域に導入して、ＡＤＣＣ活性を高めることができる。ＡＤＣＣ媒介性活性に使用される抗体には、通常、ＡＤＣＣ活性を強化するために何らかの修飾が必要となる。前記抗体のＦｃ領域のオリゴ糖がフコース糖単位を持たないように抗体を改変してＦｃγＩＩＩａ受容体への結合を改善することを通常は含む、いくつかの利用可能な技術がある。抗体がアフコシル化されている場合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増加させる効果がある。例えば、ＢｉｏＷａ社のＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）テクノロジーは、ＦＵＴ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ細胞株を使用して、１００％アフコシル化抗体を生成するものである。ＦＵＴ８は、複合型オリゴ糖の１，６結合におけるＧＤＰ−フコースからＧｌｃＮＡｃへのフコースの転移を触媒する１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする、唯一の遺伝子である。ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ社は、ＭＡｂ上のフコシル化グリカンの産生が低レベルであるように改変されたＣＨＯ株を開発したが、ＦＵＴノックアウトによるものではない。ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ社のシステムは、細胞によって代謝され得ない糖ヌクレオチドへとデノボフコース合成経路をリダイレクトする細菌酵素を導入するものである。代替のアプローチとして、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社は、ＣＨＯ（及びおそらく他の）細胞株において産生するＭＡｂ上のフコシル化グリカンの産生が低レベルである独自のフィードシステムを所有する。Ｘｅｎｃｏｒ社は、腫瘍や他の病理細胞の免疫系の排除を改善するように設計したＸｍＡｂ  Ｆｃドメインテクノロジーを開発した。このＦｃドメインには２つのアミノ酸変化があり、ＦｃγＲＩＩＩａに対して４０倍の親和性が得られる。また、ＦｃγＲＩＩａとの親和性が高まり、異物を貪食して消化することで免疫における役割を果たすマクロファージなどの他のエフェクター細胞を動員する可能性がある。
【００３０】
３．治療方法
本明細書に記載の抗体組成物又は本明細書に記載の方法に基づき設計される抗体は、免疫応答を上方制御するために使用されてもよい。免疫系の上方調節は、がん及び慢性感染症の処置において特に望ましく、したがって、本明細書に記載の抗体組成物は、かかる障害の処置において有用性を有する。本明細書で使用される「がん」という用語は、細胞の異常な制御されない増殖から生じる新生物又は腫瘍を指す。「がん」には、白血病及びリンパ腫が明示的に含まれる。「がん」という用語は、遠位部位に転移する可能性を有する細胞が関与する疾患も指す。  
【００３１】
本明細書に記載の抗体組成物は、医薬の製造において使用され得る。前記組成物は、処置を必要とする対象に投与してもよい。前記対象はヒトであり得る。前記対象は、本明細書に記載の疾患又は状態の処置を必要としている場合がある。
【００３２】
したがって、本明細書に記載の方法及び組成物はまた、以下を含むがこれらに限定されない、様々ながん又は他の異常な増殖性疾患の処置又は予防において有用であり得る：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、及び皮膚のがんを含むがん腫；扁平上皮がんを含む；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病並びに前骨髄球性白血病を含む、骨髄系の造血性腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；黒色腫、セミノーマ（精上皮腫）、テラトカルシノーマ（胚性奇型腫）、神経芽細胞腫、神経膠腫を含む他の腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫を含む間葉系腫瘍；及び黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ（角化棘細胞腫）、セミノーマ、甲状腺濾胞がん、及びテラトカルシノーマ（奇形がん）を含む他の腫瘍。アポトーシスの異常によって引き起こされるがんもまた、本発明の方法及び組成物によって処置されると考えられる。そのようながんには、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴うがん腫、乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、家族性腺腫性ポリポーシスなどの前がん性病変、並びに骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、悪性腫瘍又は増殖異常性変化（化生及び異形成など）、又は過剰増殖性障害は、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、又は子宮における本発明の方法及び組成物によって処置又は予防される。他の特定の実施形態では、肉腫、黒色腫、又は白血病は、本発明の方法及び組成物によって処置又は予防される。
【００３３】
前記抗体組成物及びその抗原結合フラグメントは、現在の標準的及び実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、又は手術から選択され得るがこれらに限定されない別の抗腫瘍療法と共に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の分子は、がん、自己免疫疾患、感染症、又は中毒の治療又は予防のために当業者に公知の治療的又は予防的有効量の１又は複数の薬剤、治療用抗体、又は他の薬剤と組み合わせて投与され得る。かかる薬剤には、例えば、上記の生物学的応答修飾因子、細胞毒素、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、有糸分裂阻害剤、又は免疫療法剤のいずれかが含まれる。
【００３４】
前記抗体組成物及びその抗原結合フラグメントは、別の抗腫瘍免疫療法と共に使用されてもよい。かかる実施形態では、前記組成物は、免疫調節効果を増強するために、代替免疫調節経路（ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、４−１−ＢＢ、Ｂ７−Ｈ１、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、又はＬＡＧ３など）を妨害又は増強するか、又はサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＧＦ−β、ＩＦＮｇ、Ｆｌｔ３、ＢＬｙｓ）及びケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１）などのエフェクター分子の活性を調節する分子と組み合わせて投与される。特定の実施形態は、抗ＰＤ−１（ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）又はニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ））、抗Ｂ７−Ｈ１（アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）又はデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ））、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＭ４、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳ、又は抗４−１ＢＢと組み合わせて、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性抗体を含む。さらに別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、より広範な免疫応答を達成するために、ＩＤＯ阻害剤などの免疫応答の異なる段階又は側面を活性化する分子と組み合わせて投与される。より好ましい実施形態では、前記抗体組成物及びその抗原結合フラグメントは、自己免疫副作用を悪化させることなく、抗ＰＤ−１又は抗４−１ＢＢ抗体と組み合わされる。
【００３５】
本明細書に記載の組成物は、別の免疫刺激分子に結合する抗体に架橋された抗ＣＴＬＡ４抗体組成物を含む二重特異性抗体を含んでもよい。特定の実施形態は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体組成物を含む二重特異性抗体と、抗ＰＤ−１、抗Ｂ７−Ｈ１、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＭ４、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳ又は抗４−１ＢＢとを含む。かかる抗体は医薬として使用されてもよく、がんを処置するために使用されてもよい。
【００３６】
４．産生
本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体及びその抗原結合フラグメントは、真核生物発現系を使用して調製され得る。発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるベクターからの発現を伴い得る。前記抗体はまた、細胞ゲノムに組み込まれているベクター又はベクターの一部から抗体を発現する安定な細胞株から産生されてもよい。
【００３７】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体及びその抗原結合フラグメントは、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を使用して精製できる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチドが親和性マトリックス上に捕獲されることを可能にするアミノ酸配列を含む追加のドメインを含むように改変され得る。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ領域を含む本明細書に記載される抗体は、プロテインＡ又はプロテインＧカラムを使用して、細胞培養上清又は細胞質抽出物から単離され得る。さらに、抗体の精製を補助するために、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、又はＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ社）などのタグを使用することができる。そのようなタグは、カルボキシル基又はアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド配列内の任意の位置に挿入可能である。有用であり得る他の融合体としては、アルカリホスファターゼなどの、ポリペプチドの検出を補助する酵素が挙げられる。ポリペプチドの精製には免疫親和性クロマトグラフィーが使用されてもよい。
【００３８】
５．医薬組成物
本発明はさらに、いずれかの治療的有効量の前述の抗ＣＴＬＡ４抗体組成物又はその抗原結合フラグメント、及び生理学的に許容される担体又は添加剤（excipient）を含む医薬組成物に関する。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的に有効な量の抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合フラグメント及び医薬的に許容される担体を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府又は州政府の規制機関、又は動物、より具体的にはヒトでの使用のために米国薬局方又は他の一般に認められた薬局方によって承認されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、添加剤、又は媒体を指す。そのような医薬担体は、水や、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む油などの、無菌の液体であり得る。前記医薬組成物が静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。生理食塩水、デキストロース水溶液、及びグリセロール溶液も、特に注射剤のための液体担体として使用することができる。適切な医薬添加剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。前記組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤、例えばポロキサマー又はポリソルベート、又はｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。
【００４０】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又は分包などの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別々に又は混合して単位剤形で供給することができる。前記組成物が注入によって投与される場合、無菌の医薬品グレードの水又は生理食塩水を含む注入ボトルでそれを分注可能である。前記組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供されてもよい。
【００４１】
本発明の組成物は、中性又は塩の形態として製剤化され得る。医薬的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンで形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンで形成されたもの含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体組成物又はその抗原結合フラグメントは、特に室温での長期保存を可能にするために凍結乾燥のために製剤化することも可能である。凍結乾燥製剤は、皮下投与に特に有用である。
【００４３】
６．投与方法
本明細書に記載の組成物を投与する方法は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下）、硬膜外投与、及び経粘膜投与（例えば、鼻腔内及び経口経路）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の抗体は、筋肉内、静脈内、又は皮下に投与される。前記組成物は、例えば、注入又はボーラス注射、上皮又は粘膜皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によってなど、任意の簡便な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は全身的又は局所的であり得る。
【実施例】
【００４４】
実施例１
低ｐＨで結合活性を失うトレメリムマブバリアントの生成
ＣＴＬＡ−４の遺伝的不活性化は重度の自己炎症性リンパ増殖性疾患をもたらすため、本発明者らは、ＣＴＬＡ−４に拮抗する又はＣＴＬＡ−４の分解を引き起こす抗体はｉｒＡＥになりやすいことを認識した。多くの抗原−抗体複合体がリソソームに移動して分解され得るという事実を考慮して、本発明者らは、前記複合体がリソソームに到達する前にＣＴＬＡ−４への結合を失った抗体は解離し、抗原及び／又は抗体分子の再循環を可能にするであろうことを認識した。リソソームコンパートメントのｐＨが５．０未満であり得ることから、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲ領域の部位特異的変異誘発によって、低ｐＨにおいてＣＴＬＡ−４分子への結合を失うであろうトレメリムマブ及びイピリムマブのバリアントが生成された。ヒスチジンの側鎖はｐＫが５．９７であるため、ヒスチジン残基を組み込んだ抗体は、ｐＨ５．５〜６．０付近で電荷が変化しやすい。最大限の効果を得るために、トレメリムマブ及びイピリムマブの両方のＣＤＲ領域に変異を加えた。
【００４５】
野生型（ＷＴ）又は変異トレメリムマブ可変領域のいずれかの軽鎖及び重鎖を含む８つの抗体を生成した。Ｔｒｅｇ枯渇活性は腫瘍拒絶に重要であるため、トレメリムマブのヒトＩｇＧ２定常領域をＩｇＧ１の当該領域と置換した。よってその生成物はＴｒｅｍｅＩｇＧ１（ＡＢ１３９）と称され、変異抗体はＴｒｅｍｅＩｇＧ１Ｍ（ＡＢ１５４〜１５９）と称される。前記抗体の組成及び親和性を表１に示す。
【００４６】
【表１】
2021512884.tif 000002
【００４７】
同様のアプローチを用いて、イピリムマブの親重鎖（配列番号１３）及び親軽鎖（配列番号９）の変異体を生成した。これにより、配列番号１４〜１８を有する重鎖変異体及び配列番号９〜１２を有する軽鎖変異体を得た。配列番号１〜１８に示す配列は例示であり、ＣＤＲ領域内又は抗体の抗原結合部位近傍において追加的変異を同じ原理に基づいて生じさせることが可能である。
【００４８】
前記アプローチを検証するために、トレメリムマブ変異抗体の活性を評価した。ＣＤＲ領域へのヒスチジンの導入が抗体のｐＨ感度に影響を与えるかどうかを判断するために、その抗原であるポリヒスチジンタグ付きＣＴＬＡ−４に結合する抗体をｐＨ範囲内で測定した。生データを図１Ａに示す。正規化された結合を図１Ｂに示す。対照として、ＣＴＬＡ−４にｐＨ依存的に結合することが知られており、低／酸性ｐＨで結合が減少する、ＨＬ１２を使用した。これらのデータは、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１が試験した全てのｐＨでＣＴＬＡ−４に結合する一方で、全ての変異体が酸性ｐＨではｐＨ感受性の程度が様々であることを示した。とりわけ、Ａｂ１５４、Ａｂ１５８、及びＡｂ１５９は、ＨＬ１２よりも感受性が低く、一方でＡｂ１５６及びＡｂ１５７はより高いｐＨ感受性を示した。重要なことに、後期エンドソームで見られるｐＨ（ｐＨ５．５）では、ＨＬ１２、Ａｂ１５６、及びＡｂ１５７は中性ｐＨ（ｐＨ７．０）と比較して結合が５０％以下であったが、Ａｂ１５８及びＡｂ１５９は、中性ｐＨと比較して結合が７５％以上であった。さらに、Ａｂ１５８と比較した場合、Ａｂ１５９は高い親和性にもかかわらずやや高いｐＨ感受性を示したことを考えると、ｐＨ依存性は中性ｐＨにおける抗体親和性の低さによるものではない。同様に、Ａｂ１５７はより高い親和性とより高いｐＨ感受性とを示し、Ａｂ１５５はＣＴＬＡ−４に結合せず、本分析から除外した。
【００４９】
生理学的条件下において中性ｐＨ下で抗ＣＴＬＡ−４抗体がＣＴＬＡ−４に結合したため、また抗体−抗原複合体が次第に酸性の環境を通過するため、ｐＨ感受性及び解離は様々なｐＨで測定された。図２に示すように、酸性ｐＨ及び中性ｐＨでの結合及び洗浄によって識別されたｐＨ感受性抗体も、同様の順で、酸性ｐＨでＣＴＬＡ−４から解離される。
【００５０】
エンドソームの酸性ｐＨ内で抗原から抗体を分離するために、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１のＣＤＲにおいてチロシン（Ｙ）をヒスチジンに置換した。ヒスチジンは、ＣＤＲ３の連続する５つのＹ残基及びＣＤＲ２の連続する２つのＹ残基の数を変えて導入された。ＣＤＲ３において２つ又は３つの連続するＹをＨとする変異（Ａｂ１５７及びＡｂ１５６）を有するバリアントは、ＣＤＲ２における１つのＹからＨへの変異（Ａｂ１５８）又は２つのＹからＨへの変異（Ａｂ１５９）よりも高いｐＨ感受性を示す。Ａｂ１５６及びＡｂ１５７は、初期エンドソーム（ｐＨ６）でＣＴＬＡ−４の放出を開始し、後期エンドソームで見られるｐＨ（ｐＨ５．５）で示した結合は５０％以下であった。一方、Ａｂ１５８及びＡｂ１５９は、ｐＨ５．５で７５％以上の結合を示す。
【００５１】
Ｈｉｓ変異はまた、重鎖可変ＣＤＲ１（Ａｂ  １５４）におけるＳｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、及びＴｒｐ３６、又は軽鎖ＣＤＲ１（Ａｂ１５５）におけるＴｙｒ３２及びＡｓｐ３４の組み合わせ変異で導入された。他の抗体について同等の変異がｐＨ依存的抗原結合に必須であることが報告されているが、それらはＴｒｅｍｅＩｇＧ１の望ましいｐＨ感受性をもたらしてはいなかった：Ａｂ１５５がｐＨ５．５で示したＣＴＬＡ−４結合の損失はわずかであり、中性ｐＨではＡｂ１５５はＣＴＬＡ−４への測定可能な結合を示さなかった。前記データは、ＣＤＲのチロシンが豊富な領域で複数のチロシンをヒスチジンに置き換えることが、中性ｐＨ下における抗原への結合を維持しながらｐＨ感受性である抗体を取得する簡単な方法を提示するものであることを示唆する。
【００５２】
実施例２
細胞表面ＣＴＬＡ−４レベルを低下させない抗体の同定
総ＣＴＬＡ−４レベルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果を決定するために、トレメリムマブ抗体を、ヒトＣＴＬＡ−４  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と３７℃で４時間インキュベートした。細胞中のＣＴＬＡ−４の総量を、総細胞溶解物のウエスタンブロットによって決定した。図３に示すように、野生型（ＷＴ）ＴｒｅｍｅＩｇＧ１とそのバリアントＡｂ１５４ではＣＴＬＡ−４の大幅な低減が誘導された。他の変異抗体で誘導された低減は、非常に少なかった。
【００５３】
抗体のｐＨ感受性が生細胞でのＣＴＬＡ−４からの解離を引き起こすかどうかを判断するために、まず抗体を、ヒトＣＴＬＡ−４を安定して発現する２９３Ｔ細胞の２つの複製と４℃でインキュベートした。３０分後、アリコートを３７℃で１時間に切り替えた。次に、未結合の抗体を洗い流した。１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で溶解した後、プロテインＧビーズを使用して抗ＣＴＬＡ−４抗体をプルダウンし、ウエスタンブロットで検出した。図４Ａに示すように、同程度の量のＣＴＬＡ−４タンパク質が、４℃で抗体Ａｂ１３９、Ａｂ１５４、及びＡｂ１５６〜Ａｂ１５９に結合した。３７℃でインキュベートした後では、Ａｂ１３９（ＴｒｅｍｅＩｇＧ１）又はｐＨ感受性の低い他のバリアントと比較して、Ａｂ１５６及びＡｂ１５７に付随していたＣＴＬＡ−４は非常に少なかった（図４Ｂ）。対応して、細胞溶解物中の総ＣＴＬＡ−４の量は、Ｍａｂ１５６及び１５７処理細胞においてより高かった。これらのデータは、Ａｂ１５６及びＡｂ１５７が３７℃で細胞内に到達すると、ＣＴＬＡ−４から解離することを示唆している。
【００５４】
ＴｒｅｍｅＩｇＧ１又はそのバリアントの処理後の細胞表面ＣＴＬＡ−４レベルを直接評価する目的で、ＣＴＬＡ−４を安定して発現するＣＨＯ細胞を、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１（Ａｂ１３９）又は変異抗体Ａｂ１５４及びＡｂ１５６〜Ａｂ１５９と共に、４℃（ダウンレギュレーションなし）又は３７℃でインキュベートした。細胞表面抗体結合ＣＴＬＡ−４の量は、抗ヒトＣＴＬＡ−４試薬を使用して測定した。対照としてＨＬ１２及びイピリムマブを含めた。図５に示すように、３７℃でＴｒｅｍｅＩｇＧ１とプレインキュベーションすると、細胞表面ＣＴＬＡ−４が大幅に減少した。Ａｂ１５４及びイピリムマブで同様の減少が誘発された。注目すべきは、Ａｂ１５６及びＡｂ１５７は、非毒性のＨＬ１２と同様に、細胞表面ＣＴＬＡ−４を減少させなかった。Ａｂ１５８及びＡｂ１５９ではわずかな減少が誘導された。抗体による細胞表面ＣＴＬＡ−４の減少は、抗体のＣＴＬＡ−４分子への結合のｐＨ依存性と強く相関している（図１）。これらのデータは、ｐＨ感受性が細胞表面抗ＣＴＬＡ−４分子の抗体媒介減少（antibody-mediated reduction of cell surface anti-CTLA-4 molecules）の優れた指標であるという仮説と一致している。
【００５５】
実施例３
抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及びｐＨ感受性抗ＣＴＬＡ−４抗体の抗腫瘍活性の増加
近年、抗ＣＴＬＡ−４抗体のＡＤＣＣ活性が、インビボでのＴｒｅｇの枯渇及び腫瘍拒絶を与えるのに必要かつ十分であることが本発明者ら及びその他により証明された（１６−１８、２０）。したがって、抗ＣＴＬＡ−４抗体の潜在的抗腫瘍活性を、ＡＤＣＣ活性のインビトロレポーターアッセイを用いて評価することは、興味深いことである。図６に示すように、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１（Ａｂ１３９）は強力なＡＤＣＣ活性を示すが、ｐＨ感受性が最も高い２つの抗体は、特により高い抗体用量で、さらに高いＡＤＣＣ活性を示した。
【００５６】
ＡＤＣＣレポーターアッセイが腫瘍微小環境における選択的Ｔｒｅｇ枯渇を反映しているかどうかを確認した。ＭＣ３８腫瘍細胞を受けて１４日目の、平均直径７ｍｍの腫瘍を有するマウスに、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１及びＡｂ１５７を注射した。１６時間後、腫瘍を採取し、ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＴｒｅｇの割合（％）をフローサイトメトリーで測定した。図７に示すように、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１はこの初期の時点ではほとんど効果がなかったが、Ａｂ１５７はＴｒｅｇの有意な減少を引き起こした。
【００５７】
ｐＨ感受性抗体が腫瘍拒絶を引き起こすのに有効であるかどうかを試験するために、ＣＴＬＡ−４ｈ／ｈマウスにＭＣ３８腫瘍細胞を皮下注射した。７日後、腫瘍のサイズが直径約５ｍｍに達した時点で、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１とそのｐＨ感受性変異体であるＡｂ１５６及びＡｂ１５７を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの低用量でマウスを処置した。腫瘍の成長又は再発を、６．５週間観察した（図８Ａ）。図８Ｂ〜図８Ｅに示すように、３回の注射後、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１は８０％のマウスで完全な腫瘍拒絶を引き起こした。注目すべきことに、Ａｂ１５６及びＡｂ１５７によって１００％の拒絶が達成された。これらのデータは、ｐＨ感受性の増加が、おそらくはＡＤＣＣ活性の増加によって、抗ＣＴＬＡ−４抗体の抗腫瘍効果を改善することを示している。
【００５８】
実施例４
ｐＨ感受性ＴｒｅｍｅＩｇＧ１変異体は、親ＴｒｅｍｅＩｇＧ１抗体より毒性が低い
ＴｒｅｍｅＩｇＧ１バリアント抗体の毒性に対するｐＨ感受性の影響を試験するために、対照ＩｇＧ１Ｆｃ、抗ＰＤ−１＋対照ＩｇＧ１Ｆｃ、抗ＰＤ−１＋ＴｒｅｍｅＩｇＧ１、抗ＰＤ−１＋Ａｂ１５６、Ａｂ１５７、Ａｂ１５８、またはＡｂ１５９のいずれかを生後１０日目から１００μｇ／マウス／注射×４の用量で、１０日目、１３日目、１７日目、及び２０日目に投与したマウスを比較した。マウスを生存率について観察した。図９に示すように、対照ＩｇＧ１Ｆｃ又は対照ＩｇＧ１Ｆｃ＋抗ＰＤ−１を受けたマウスは観察期間を通じて死亡しなかったが、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１を受けたマウスは１個体を除いて全てが死亡した。対照的に、Ａｂ１５７を投与されたマウスは１個体を除いて全てが全期間生存した。ＴｒｅｍｅＩｇＧ１と比較すると、Ａｂ１５７では生存率の大幅な改善が観察された（Ｐ＝０．０１）。Ａｂ１５７を使用した場合にも、有意な改善が観察された（Ｐ＝０．０３）。Ａｂ１５８及びＡｂ１５９も、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１と比較してある程度より良い生存率を示したが、その差は統計的に有意なレベルには達しなかった。それにもかかわらず、ｐＨ感受性及び安全性の間には強い相関関係があるようである。１５個体のマウスを含む２つの実験のデータを組み合わせると、ＴｒｅｍｅＩｇＧ１を超えるＡｂ１５７での安全性の改善はさらに明確となる（図１０）。これらのデータは、ｐＨ感受性が抗ＣＴＬＡ−４抗体の安全性のための優れた代替マーカーであることを示している。
【００５９】
まとめると、酸性ｐＨでＣＴＬＡ−４への結合を保持する抗体は、ＣＴＬＡ−４に結合してリソソーム分解に向かわせることにより、細胞表面ＣＴＬＡ−４レベルの低下を引き起こすことが実証された。結果として、これらの抗体は機能的にアンタゴニストであり、ＣＴＬＡ−４機能を不活性化する。インビボでは、かかる抗体は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用すると高い毒性を示す。対照的に、より低いｐＨにおけるＣＴＬＡ−４への結合を失っている抗体は、ＣＴＬＡ−４が細胞表面にリサイクル可能となることによって細胞表面ＣＴＬＡ−４を減少させることができなかったため、アゴニストとして作用不可能である。注目すべきことに、これらの抗体は親和性が低いにもかかわらず、ＡＤＣＣ活性と腫瘍拒絶においてより有力であると思われる。これらのデータは、抗ＣＴＬＡ−４抗体の低ｐＨ感受性を増加させることを、毒性を軽減しながら腫瘍の治療効果を高めるための新たなアプローチとして示している。
【図１】
2021512884.tif 000003
【図２】
2021512884.tif 000004
【図３】
2021512884.tif 000005
【図４】
2021512884.tif 000006
【図５】
2021512884.tif 000007
【図６】
2021512884.tif 000008
【図７】
2021512884.tif 000009
【図８】
2021512884.tif 000010
【図９】
2021512884.tif 000011
【図１０】
2021512884.tif 000012
【配列表】
2021512884000001.app
【国際調査報告】
2021512884.tif 000013
2021512884.tif 000014
2021512884.tif 000015