(57)【要約】本発明は、試料から非標的DNA混入を取り除く方法を目的とする。本発明は、子宮頚管試料からの胎児DNAの解析をさらに目的とする。2021513359.tif 000006
2021513359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞試料から標的核酸を単離する方法であって、
a）細胞核を遊離するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックス上で、細胞を、少なくとも一つの酵素を含むタンパク質カクテルと共にインキュベートする工程；
b）非標的核酸を除去するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスを洗浄する工程；
c）標的核酸を放出するために、核を溶解する工程；および
d）標的核酸を単離する工程
を含む、方法。
【請求項２】
標的核酸が、胎児核酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
非標的核酸が、母親核酸、ウイルス核酸、微生物核酸、無細胞DNA、またはこれらの組み合わせである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、ヒト細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、母親細胞および／または胎児細胞である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
試料が、子宮頚管試料である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
子宮頚管試料が、非標的核酸、母親細胞、および胎児細胞を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
試料が、約1〜10細胞、10〜25細胞、25〜50細胞、50〜100細胞、100〜250細胞、25〜500細胞、500〜750細胞、750〜1000細胞、1000〜2500細胞、または2500〜5000細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質カクテルが、細胞壁を消化するプロテイナーゼを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
プロテイナーゼが、ペプシンである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、非DNA結合条件下でタンパク質カクテルと共にインキュベートされる、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
核を溶解する工程が、細胞を溶解緩衝液と共にインキュベートすることを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
溶解緩衝液が、酵素的または非酵素的であってもよい、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
溶解緩衝液が、プロテイナーゼKおよび／またはトリプシンを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸が、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスに結合する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
標的核酸を単離する工程が、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスから核酸を溶出することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
単離された標的核酸における非標的核酸混入が、約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%未満、または約50%未満である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
DNAシーケンシング、PCR、または全ゲノム増幅による、単離された標的核酸の解析
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
子宮頚管試料から胎児核酸を解析する方法であって、
a）子宮頚管試料から胎児細胞を単離する工程；
b）細胞核を遊離するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックス上で、胎児細胞を、タンパク質カクテルと共インキュベートする工程；
c）非標的核酸を除去するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスを洗浄する工程；
d）胎児核酸を放出するために、核を溶解する工程；および
e）胎児核酸を単離する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
子宮頚管試料が、月経カップを使用して収集される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
子宮頚管試料が、母親細胞および胎児細胞を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
胎児細胞を単離する工程が、抗HLA抗体に胎児細胞を結合することを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
試料が、約1〜10細胞、10〜25細胞、25〜50細胞、50〜100細胞、100〜250細胞、25〜500細胞、500〜750細胞、750〜1000細胞、1000〜2500細胞、または2500〜5000細胞を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質カクテルが、細胞壁を消化するプロテイナーゼを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２５】
プロテイナーゼが、ペプシンである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
核を溶解する工程が、細胞を溶解緩衝液と共にインキュベートすることを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２７】
溶解緩衝液が、酵素的または非酵素的である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
溶解緩衝液が、プロテイナーゼKおよび／またはトリプシンを含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
放出された胎児核酸が、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスに結合する、請求項19に記載の方法。
【請求項３０】
胎児核酸を単離する工程が、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスから核酸を溶出することを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項３１】
胎児核酸における非標的核酸混入が、約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%未満、または約50%未満である、請求項19に記載の方法。
【請求項３２】
DNAシーケンシング、PCR、または全ゲノム増幅による、単離された胎児核酸の解析
をさらに含む、請求項19に記載の方法。
【請求項３３】
胎児核酸を解析することが、遺伝子異常もしくは遺伝子に基づいた疾患；遺伝子突然変異；または染色体異常を同定することを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項３４】
胎児核酸を解析することが、軟骨形成不全、ダウン症候群、21トリソミー、18トリソミー、13トリソミー、ターナー症候群、鎌状赤血球症、嚢胞性線維症、脆弱XD症候群、筋ジストロフィー、テイ-サックス病、二分脊椎、無脳症、サラセミア、多発性嚢胞腎、血友病A、ハンチントン病、または先天性副腎皮質過形成からなる群より選択される、遺伝子異常、遺伝子突然変異、もしくは染色体異常によって生じる疾患または状態を同定することを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
a）折り畳み可能な月経カップ；
b）貯蔵容器；および
c）輸送培地
を含む、子宮頚管試料の収集のためのキット。
【請求項３６】
月経カップが、膣管に挿入される、請求項35に記載のキット。
【請求項３７】
輸送培地が、少なくとも一つの細胞保存化学物質を含む、請求項35に記載のキット。
【請求項３８】
保存化学物質が、グリセロール、血清、ジメチルスルホキシド、メタノール、酢酸、細胞培養培地、乾燥剤、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項37に記載のキット。
【請求項３９】
細胞が、核酸の単離の間に表面に固定されないかまたは結合されない、請求項1または19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119（e）の下で、いずれも2018年1月8日に出願された米国特許出願番号62/614,691および62/614,692の優先権の恩典を主張する。先行出願の開示は、それら全体が本出願の開示において一部と見なされ、かつ参照により援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、標的核酸と非標的核酸とを含む子宮頚管試料からの標的核酸の単離のための方法およびキットに関し、より具体的には、胎児核酸の解析に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
背景情報
DNA単離は、分子生物学において確立された方法である。方法の間、細胞は、全体として溶解され、DNAはマトリックスに結合されるか、または有機および無機溶媒における差示的溶解性を使用して、クリーンなDNA試料において望まれないタンパク質およびその他の成分などの細胞物質を除去する。
【０００４】
一定の環境下では、外来DNAおよび／または望まれないDNA（たとえば、ウイルス/細菌/無細胞DNA）は、標的細胞と共に存在し得る。このDNAは、標的細胞集団に入り込んで、または接着して、PCR、シーケンシング、および全ゲノム増幅などのDNAに基づく下流の解析を妨げ得る。これは、解析される標的DNAが、混入するDNAの宿主および関心対象の細胞タイプの両方に存在する場合に、特に困難な問題である。この状況は、標的DNAが、正確に解析されるように一定量の総画分を有することを必要とする。この場合において、DNAが混入すると、標的DNAと競合し、およびシグナルをマスクし得るし、解析が困難なものから不可能なものになる。
【０００５】
核単離における以前の試みでは、産業において使用される自動化されたハイスループットなシステムがうまくいかないことが判明している。さらに、必要とされる再現性がない。
【０００６】
現在では、手動および高スループット適用の両方のために使用することができるDNAマトリックスアプローチに対して、核単離を使用して、関心対象の細胞における混入DNA（たとえば、核外DNA、母親DNA、微生物DNA、ウイルスDNA、または無細胞DNA）の効率的な除去を可能にする方法またはキットはない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、妊娠対象由来の子宮頚管試料から胎児細胞を単離することができるという独創性に富んだ発見に基づく。本発明は、標的核酸と非標的核酸とを含む子宮頚管試料からの標的核酸（すなわち、胎児核酸）の単離、およびその後の標的核酸の解析をさらに含む。
【０００８】
一つの態様において、本発明は、細胞核を遊離するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックス上で、試料由来の細胞を、少なくとも一つの酵素を含むタンパク質カクテルと共にインキュベートする工程；非標的核酸を除去するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスを洗浄する工程；標的核酸を放出するために、核を溶解する工程；および標的核酸を単離する工程によって、細胞を含む試料から標的核酸を単離する方法を提供する。一つの側面において、標的核酸は、胎児核酸であり、非標的核酸は、母親核酸、ウイルス核酸、微生物核酸、または無細胞DNAである。さらなる側面において、細胞は、ヒト細胞である。一定の側面において、細胞は、母親細胞および／または胎児細胞である。一つの側面において、試料は、子宮頚管試料であり、子宮頚管試料は、母親細胞および胎児細胞を含む。一定の側面において、試料は、約1〜10細胞、10〜25細胞、25〜50細胞、50〜100細胞、100〜250細胞、25〜500細胞、500〜750細胞、750〜1000細胞、1000〜2500細胞、または2500〜5000細胞を含む。一つの側面において、細胞は、表面（たとえば、膜またはマトリックス、DNA結合または非DNA結合のいずれか）に固定されない、または結合されない。さらなる側面において、子宮頚管試料は、月経カップを使用して収集される。さらなる側面において、タンパク質カクテルは、好ましくは細胞壁を消化するが核エンベロープは消化しないプロテイナーゼを含む。一定の側面において、タンパク質カクテルは、ペプシンを含み、および好ましくはDNaseを含まない。あまり制御されないが細胞の中および外にイオンが自由に流れることができないサンプリング条件（たとえば、生細胞）が選択される場合、その他の細胞物質から核を遊離するために低張溶液を使用することができるであろう。一つの側面において、細胞は、非結合条件下でタンパク質カクテルと共にインキュベートされる。もう一つの側面において、核を溶解する工程は、溶解緩衝液と共に細胞をインキュベートすることを含む。一定の側面において、溶解緩衝液は、酵素的または非酵素的溶解緩衝液である。一定の側面において、溶解緩衝液は、プロテイナーゼKおよび／またはトリプシンを含む。さらなる側面において、標的核酸は、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスに結合する。さらなる側面において、標的核酸を単離する工程は、DNA結合膜またはDNA結合から核酸を溶出させることを含む。一つの側面において、単離された標的核酸における非標的核酸混入は、約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%未満、または約50%未満である。さらなる側面において、単離された標的核酸は、DNAシーケンシング、PCR、または全ゲノム増幅によって解析される。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、子宮頚管試料から胎児細胞を単離する工程；細胞核を遊離するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックス上で、胎児細胞を、少なくとも一つの酵素を含むタンパク質カクテルと共にインキュベートする工程；非標的核酸を除去するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスを洗浄する工程；胎児核酸を放出するために、核を溶解する工程；および胎児核酸を単離する工程を含む、子宮頚管試料から胎児核酸を解析する方法を提供する。一つの側面において、子宮頚管試料は、月経カップを使用して収集される。もう一つの側面において、子宮頚管試料は、母親細胞および胎児細胞を含む。さらなる側面において、胎児細胞を単離する工程は、抗HLA抗体に対する胎児細胞の結合を含む。一定の側面において、試料は、約1〜10細胞、10〜25細胞、25〜50細胞、50〜100細胞、100〜250細胞、25〜500細胞、500〜750細胞、750〜1000細胞、1000〜2500細胞、または2500〜5000細胞を含む。一つの側面において、細胞は、表面（すなわち、膜またはマトリックス、DNA結合または非DNA結合のいずれか）に固定されない、または結合されない。さらなる側面において、タンパク質カクテルは、好ましくは細胞壁を消化するが核エンベロープは消化しないプロテイナーゼを含む。一定の側面において、タンパク質カクテルは、ペプシンを含み、および好ましくはDNaseを含まない。一つの側面において、核を溶解する工程は、溶解緩衝液と共に細胞をインキュベートすることを含む。一定の側面において、溶解緩衝液は、酵素的または非酵素的溶解緩衝液である。一定の側面において、溶解緩衝液は、プロテイナーゼKおよび／またはトリプシンを含む。もう一つの側面において、放出された胎児核酸は、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスに結合する。さらなる側面において、胎児核酸を単離する工程は、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスから核酸を溶出させることを含む。一定の側面において、胎児核酸における非標的核酸混入は、約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%未満、または約50%未満である。さらなる側面において、単離された胎児核酸は、DNAシーケンシング、PCR、または全ゲノム増幅によって解析される。一つの側面において、胎児核酸を解析することは、遺伝子異常または遺伝子に基づいた疾患；遺伝子突然変異；または染色体異常を同定することを含む。さらなる側面において、胎児核酸を解析することは、軟骨形成不全、ダウン症候群、21トリソミー、18トリソミー、13トリソミー、ターナー症候群、鎌状赤血球症、嚢胞性線維症、脆弱XD症候群、筋ジストロフィー、テイ-サックス病、二分脊椎、無脳症、サラセミア、多発性嚢胞腎、血友病A、ハンチントン病、または先天性副腎皮質過形成である、遺伝子異常、遺伝子突然変異、もしくは染色体異常によって生じる疾患または状態を同定することを含む。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、子宮頚管試料の収集のためのキットであって、折り畳み可能な月経カップ；貯蔵容器；および輸送培地を含む、キットを提供する。一つの側面において、月経カップは、膣管に挿入される。もう一つの側面において、月経カップは、たとえば約10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、60分、1時間未満、1〜2時間、1〜5時間、1〜10時間、1〜20時間、またはより長い時間の間、試料収集することができる時間および条件下で挿入される。さらなる側面において、輸送培地は、少なくとも一つの細胞保存化学物質を含む。さらなる側面において、保存化学物質は、グリセロール、血清、ジメチルスルホキシド、メタノール、酢酸、細胞培養培地、乾燥剤、またはこれらの組み合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図1A〜1Dは、核精製が胎児DNA品質を改善することを示すBAFプロットを示す。BAF頻度（B対立遺伝子頻度）プロットは、高度に変動する一塩基多型の遺伝子型の比較（核単離を伴うおよび伴わない、胎児細胞 対 胎児胎盤、胎児細胞 対 母親細胞）を示す。母親と胎児との間の遺伝的関係のため、クリーンなDNA単離物において遺伝子型の約50%が母親と共有され、これを図1Aに示してある。
【図１Ｂ】図1A〜1Dは、核精製が胎児DNA品質を改善することを示すBAFプロットを示す。BAF頻度（B対立遺伝子頻度）プロットは、高度に変動する一塩基多型の遺伝子型の比較（核単離を伴うおよび伴わない、胎児細胞 対 胎児胎盤、胎児細胞 対 母親細胞）を示す。胎盤は、子宮頚管検体から単離された胎児栄養芽細胞に類似し、したがって遺伝子型は類似するはずである（図1B）。
【図１Ｃ】図1A〜1Dは、核精製が胎児DNA品質を改善することを示すBAFプロットを示す。BAF頻度（B対立遺伝子頻度）プロットは、高度に変動する一塩基多型の遺伝子型の比較（核単離を伴うおよび伴わない、胎児細胞 対 胎児胎盤、胎児細胞 対 母親細胞）を示す。胎児試料に母親またはその他（たとえば、父親）DNAが混入している場合、BAFは、用量依存的な様式で母親（またはたとえば父親）遺伝子プロフィールへとシフトする。混入があまりに高い場合、胎児DNAは、母親遺伝子型と区別がつかなくなり得る（図1C）。
【図１Ｄ】図1A〜1Dは、核精製が胎児DNA品質を改善することを示すBAFプロットを示す。BAF頻度（B対立遺伝子頻度）プロットは、高度に変動する一塩基多型の遺伝子型の比較（核単離を伴うおよび伴わない、胎児細胞 対 胎児胎盤、胎児細胞 対 母親細胞）を示す。結果として、胎児試料は、胎盤DNAシグニチャーと異なるようにみえるだろう（図1D）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、妊娠対象由来の子宮頚管試料から胎児細胞を単離することができるという独創性に富んだ発見に基づく。本発明は、標的核酸と非標的核酸とを含む子宮頚管試料からの標的核酸（すなわち、胎児核酸）の単離、およびその後の標的核酸の解析をさらに含む。
【００１３】
本組成物および方法を記述する前に、本発明が、記述された特定の組成物、方法、および実験条件に限定されないこと、同様にこのような組成物、方法、および条件は変化してもよいことを理解すべきである。本明細書において使用される用語法は、詳細な態様のみを記述するためであり、本発明の範囲は、添付の請求の範囲においてのみに限定されるため、限定することは意図されないことが、また理解されるはずである。
【００１４】
この明細書および添付の請求の範囲に使用される文脈が別途明確に示さない限り、単数形「一つの（a）」、「一つの（an）」、および「該（the）」は、複数の言及を含む。したがって、たとえば、「該方法」の言及は、本明細書において記述されるタイプの一つまたは複数の方法および／または工程を含み、これは、この開示等を読むことにより当業者には明らかであろう。
【００１５】
用語「約」または「ほぼ」は、数値表示または数値範囲の前に使用されるとき（たとえば、（長さまたは圧力を定義するため）、近似値を示し、（+）または（-）5%、1%または0.1%まで変化してもよい。本明細書に提供される全ての数値範囲は、明示された開始数および最終数を含む。用語「実質的に」は、装置、物質、または組成物の大部分（すなわち、50%を上回る）または本質的に全てを示す。
【００１６】
この明細書において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により援用されるように具体的および個別に示されたのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【００１７】
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門的および科学的用語は、本発明が属する技術における当業者によって理解されるのと同じ意味を一般に有する。本明細書において記述したものに類似の、または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、改変およびバリエーションが本開示の精神および範囲内に包含されることが理解されよう。好ましい方法および材料をここに記述してある。
【００１８】
固体マトリックスでの核単離と標的核酸の単離との組み合わせを使用する、試料からの非標的核酸（すなわち、母親DNA）混入の除去のための方法およびキットを、本明細書において記述する。本明細書において記述した方法を使用する標的核酸（胎児DNA）の回収率は、＞80%、＞85%、＞90%、＞95%、＞96%、＞97%、もしくは＞98%、または＞99%である。本明細書において記述した方法およびキットは、1〜10細胞、10〜25細胞、25〜50細胞、50〜100細胞、100〜250細胞、250〜500細胞、500〜750細胞、750〜1000細胞、1000〜2500細胞、および2500〜5000細胞ほどの少ない細胞数で、市販の、ハイスループットな、自動化された方法のために適切な迅速なDNA単離を可能にする。本明細書において記述した方法およびキットは、非標的DNAの効率的な除去を提供することによって、シーケンシング、PCR、および全ゲノム増幅のための信頼できるDNA単離を可能にする。
【００１９】
一つの態様において、本発明は、細胞の試料から標的核酸を単離する方法であって、細胞核を遊離するかまたは放出するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックス上で、試料からの細胞を、少なくとも一つの酵素を含むタンパク質カクテルと共にインキュベートする工程；非標的核酸を除去するために、細胞を洗浄する工程；核酸を放出するために、核を溶解する工程；および標的核酸を単離する工程を含む、方法を提供する。一つの側面において、試料は、非標的核酸、母親細胞、および／または胎児細胞を含む。
【００２０】
生物学的試料には浮遊する核酸が混入し得るし、これが試料における細胞の特定の亜集団に焦点を当てる下流の適用の成功に影響を及ぼし得る。混入するDNA（すなわち、非標的DNA）の効率的な除去は、このような混入によって影響を受けるアッセイについて高い読み出しを得るために重要である。本明細書において記述した方法は、細胞を取り出すことと、酵素またはその他の相当する手段（低張溶液）を使用して全ての混入物を溶液中に導くことによる核単離とを組み合わせる。非結合条件下でDNA結合マトリックス上に核および混入物を添加することによって、核が精製される。混入物は、カラムを通して洗浄され、一方で核は、通過しないだろう。pHの単純な変化またはカオトロピック高塩溶液の使用は、核を溶解し、DNAを放出し、および効率的にそれを任意のDNA結合マトリックスに結合するだろう。これは、酵素的消化工程によって補助することができる。有機溶媒（エタノールおよびその他）を使用して、結合したDNAから塩およびタンパク質を効率的に取り除くことができる。DNAは、下流の適用と適合性である好適な任意の一般的な溶出緩衝液（たとえば、H2O、TRIS-HCL）を用いてカラムから簡単に溶出させることができる。DNA単離工程の間、細胞は、表面（すなわち、膜またはマトリックス、DNA結合または非DNA結合のいずれか）に固定されない、または結合されない。
【００２１】
本明細書に使用される用語「対象」は、本方法が行われる個体または患者をいう。一般に、対象は、ヒトであるが、当業者には明らかであるように、対象は、動物であってもよい。したがって、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、その他を含む）、および霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）、などの脊椎動物を含むその他の動物は、対象の定義内に含まれる。一つの側面において、対象は、ヒト女性である。もう一つの側面において、対象は妊娠している。妊娠対象は、少なくとも約5週、6週、7、週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、25週、30週、35週、または40週間の妊娠期間であってよい。
【００２２】
用語「核酸」および「核酸分子」は、本開示の全体にわたって交換可能に使用され得る。本用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド（DNA）、リボヌクレオチド重合体（RNA）、RNA/DNAハイブリッド、およびポリアミド核酸（PNA）をいい、および他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で機能することができる天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含するだろう。
【００２３】
本明細書に使用される、用語「標的核酸」は、その起源の細胞に基づいて抽出される関心対象の核酸をいう。一つの側面において、標的核酸は、胎児核酸である。
【００２４】
本明細書に使用される、用語「非標的核酸」は、生物学的試料に存在する望ましくないバックグラウンド核酸をいう。一つの側面において、非標的核酸は、宿主または宿主細胞由来である。もう一つの側面において、非標的核酸は、母親、ウイルス、もしくは微生物起源であるか、または無細胞DNAである。一つの側面において、細胞核を遊離するために使用されるタンパク質カクテルは、ペプシンを含む。もう一つの側面において、タンパク質カクテルは、DNAseを含まない。たとえば、細胞をPBSまたはその他などのpH7.5緩衝液中でインキュベートし、およびたとえば1N HClで、ペプシン活性を保証する最終濃度0.04Nその他に酸性化する。
【００２５】
あまり望ましくないが、細胞（たとえば、生細胞）の中および外にイオンが自由に流れることができないサンプリング条件が選択される場合、その他の細胞物質から核を遊離するために低張溶液を使用することができるであろう。例示的低張液：1.5mM MgCl2および10mM KC1を伴う10 mM HEPES、pH 7.9、並びにまたは溶液中に核を放出する任意のその他の緩衝液を使用することができる。特定の環境下では、等張緩衝液、たとえば、2mM MgCl2、3mM CaCl2、0.3M ショ糖を伴う10mM Tris HCl、pH 7.5の使用が望ましいかもしれない。
【００２６】
さらなる側面において、核は、核を溶解せず、かつ本工程においてその他の生物材料を取り除くことができる緩衝液で洗浄され、またはインキュベートされる。たとえば、膜またはマトリックスを使用して、洗浄緩衝液、たとえばPBS pH7.5がその他の生物材料を除去する間に核をトラップし得る。あまり望ましくないが、洗浄緩衝液から核を免疫除去するために、核エンベロープタンパク質に対して特異的な抗体を使用し得る。たとえば、抗ラミンA抗体を、複合体溶液からの核の単離を可能にする固相に結合することができる。
【００２７】
次いで、核は、プロテイナーゼ、たとえばプロテイナーゼKまたはトリプシンおよび緩衝液、たとえば溶解緩衝液、たとえばPBS pH 7.5または核溶解およびその後のDNA単離が可能な任意のその他のもので溶解される。さらなる側面において、溶解の後、放出された核酸は、膜またはマトリックスに結合する。一つの側面において、核酸は、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスからの溶出によって単離される。一定の側面において、溶解緩衝液は、非酵素的である。
【００２８】
本明細書において記述した方法は、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（たとえば、気管支肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節(athroscopic)）、生検試料、尿、排泄物、痰、唾液、鼻粘液、リンパ液、胆汁、涙、汗、乳房乳、乳液、胚性細胞、胎児細胞、または子宮頚管試料）などの生物学的試料からの核酸の抽出に関する。本明細書に使用される、用語「子宮頚管試料」は、子宮頚管から収集される細胞を包含する。一つの側面において、子宮頚管試料は、妊娠対象由来である。もう一つの側面において、子宮頚管試料は、非標的核酸、母親細胞、および／または胎児細胞を含む。
【００２９】
本明細書において記述した核単離のための方法は：細胞集団を単離する工程；消化カクテルが胎児の核以外の全ての細胞成分を除去し、および溶液中に外来DNAを放出するように、細胞集団を消化カクテルと共にインキュベートする工程；核がマトリックスを通過することができないように、生じる消化物を非DNA結合条件下でマトリックスに適用する工程；外来DNAおよびその他の細胞成分がマトリックスを通過するように、洗浄緩衝液をマトリックスに適用する工程；胎児核が溶解され、マトリックスがDNA結合状態にあり、かつ胎児DNAがマトリックスに結合するように、核溶解物およびDNA結合緩衝液をマトリックスに適用する工程；望まれない化学物質およびタンパク質を除去するように、洗浄緩衝液でマトリックスを洗浄する工程；並びに胎児DNAを溶出するように、緩衝液を使用する工程を含む。細胞は、月経カップを使用して単離しても、または収集してもよい。本発明については、単離された細胞は、標的DNA、すなわち胎児DNA単離の間に、表面に固定されない、または結合されない。表面は、膜またはマトリックス、DNA結合または非DNA結合のいずれかであることができる。
【００３０】
本明細書に使用される、用語「抽出」は、その他の核酸を含む生物学的または非生物学的試料からの核酸の部分的または完全な分離および単離をいう。本明細書に使用される用語「選択的」および「選択的に」は、分子サイズに基づいて、核酸分子の種の混合物であるかそれを含む組み合わせから、核酸分子の特定の種を抽出する能力をいう。
【００３１】
生物材料からの核酸の抽出は、細胞溶解、細胞ヌクレアーゼの不活性化、および細胞細片からの所望の核酸の分離を必要とする。一般的な溶解手順は、機械的破壊（たとえば、粉砕、低張溶解）、化学的処理（たとえば、洗浄剤溶解、カオトロピック剤、チオール還元）および酵素的消化（たとえば、プロテイナーゼK）を含む。生物学的試料は、最初に緩衝液、たとえば溶解緩衝液、カオトロピック剤（たとえば、塩）およびプロテイナーゼ、またはプロテアーゼの存在下において溶解してもよい。細胞膜破壊と細胞内ヌクレアーゼの不活性化とを組み合わせてもよい。たとえば、単一溶液は、細胞膜を可溶化するための洗浄剤と、細胞内酵素を不活性化するための強力なカオトロピック塩とを含んでいてもよい。細胞溶解およびヌクレアーゼ不活性化の後、細胞細片は、濾過または沈澱によって容易に除去し得る。
【００３２】
本方法は、DNAseを使用することなく不活性メッシュまたはマトリックス上で溶液中の細胞から遊離核を調製するために緩衝液または酵素を使用する。たとえば、1〜10,000標的細胞を酵素または低張溶液に曝露し、これにより細胞核の放出を生じさせる。酵素または低張溶液は、これらがマトリックスに添加される前に、または細胞がマトリックスの上にある間に細胞に適用されてもよい。いくつかの態様において、マトリックスは、DNAを結合することができるように構成される（たとえば、シリカマトリックス）。酵素は、核エンベロープではなく細胞壁を消化することが望ましい。このような酵素の例は、ペプシンである。続いて、リン酸緩衝食塩水またはその他の緩衝液で数回洗浄し、これはDNAをマトリックス親和性に誘導しないか、または標的細胞核を溶解し得る。
【００３３】
たとえば、DNAは、一定の化学的条件下でシリカなどの種々のマトリックスに結合することができる。生理的緩衝液（PBS、TRIS）は、マトリックスに対するDNAの結合も誘導せず、核も溶解せず、かつ望まれないDNAを効率的にカラム通過させる。これらの緩衝液のいくつかは、以下に示すように、結合したDNAをマトリックスから溶出させるために使用される。対照的に、たとえばカオトロープとして作用するグアニジウムHC1（GuHCl）は、核溶解、DNA放出、およびシリカマトリックスの活性化を生じてDNA分子に密接に結合する。たとえば、高塩濃度またはエタノールでの洗浄は、結合を破壊しないだろうし、および細胞性物質および塩を除去するために使用することができる。次いで、クリーンなDNAを、水緩衝液、TE緩衝液、水、およびマトリックスの結合能力を非DNA結合状態に逆転させてDNA溶出を生じるその他のもので溶出することができる。
【００３４】
結合マトリックスの容量を超えない溶解緩衝液（たとえば、Tris-HCl、EDTA、Triton X-100、NaCl、KClその他を含む）を、カオトロピック塩または精製目的のためにDNAマトリックス結合を可能にする任意のその他の化学物質と組み合わせてマトリックスに添加し、これにより核の溶解、並びにマトリックスに結合するDNAのそのDNA放出および活性化を生じる。DNA結合マトリックスは、有機溶媒ベースの洗浄緩衝液（たとえば、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ベンゼン、l-ブタノール、2-ブタノール、2-ブタノン、t-ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、1,2-ジクロロエタン、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、ダイグライム、DMA、DMF、DMSO、1,4-ジオキサン、エタノール、エチルアセテート、エチレングリコール、グリセリン、ヘプタン、HMPA、HMPT、ヘキサン、メタノール、MTBE、塩化メチレン、NMP、ニトロメタン、ペンタン、石油エーテル、1-プロパノール、2-プロパノール、ピリジン、THF、トルエン、トリエチルアミン、水、重水、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、その他）を使用して洗浄して、タンパク質混入物を除去してもよい。溶解後および膜の乾燥の後、DNAを非Tris EDTAまたは水などの非結合溶媒条件下でマトリックスから溶出する。溶解緩衝液は、酵素的または非酵素的溶解緩衝液であることができる。
【００３５】
本方法は、固体支持体-標的核酸複合体または周囲の溶液から、非核酸分子、たとえば塩を除去するための追加の洗浄工程を含んでいてもよい。次いで、アルコールベースの洗浄で非核酸分子を除去し、および標的核酸を小容量で低塩または無塩条件（TE緩衝液または水）下で溶出させ、さらなる濃縮を伴わずに即時使用のための準備がされる。もう一つの態様において、抽出は、tRNA、グリコーゲン、polyA RNA、デキストランブルー、直鎖状ポリアクリルアミド（LPA）などの担体、または核酸の回収を増加させる任意の材料の導入によって改善される。担体は、二次結合溶液または洗浄緩衝液に添加してもよい。
【００３６】
本明細書において記述した方法は、塩化セシウム勾配、勾配、スクロース勾配、グルコース勾配、遠心プロトコル、煮沸、Microcon100濾過、ChemagenウイルスDNA/RNA 1kキット、Qiagen精製システム、Qiagen MinEluteキット、HiSpeedPlasmidマキシキット、OlAfilterプラスミドキット、Promega DNA精製システム、MangeSil Paramagnetic Particleに基づいたシステム、Wizard SV技術、Wizard Genomic DNA精製キット、Amersham精製システム、Invitrogen Life Technologies Purification Systems, CONCERT精製システムおよびMo Bio Laboratories精製システムを含むが、限定されない、核酸の抽出、単離、または精製のための適切な任意の公知の技術と組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
一つの側面において、DNA結合膜またはDNA結合マトリックスは、低pHおよび高塩下でDNA分子を結合するシリカまたはその他のマトリックス材料である。典型的には、イオン強度を減少すること、および7.0を上回るpHにより、DNA溶出を生じるだろう。＜2ミクロンからのマトリックス孔径は、マトリックスに核が確実にトラップされるために好ましい。DNA結合膜またはDNA結合マトリックスは、それがDNAを吸着することができるような化学的および物理的な特性を有する任意の表面をいい得る。たとえば、荷電した表面の静電荷は、pH変化を介して調整することができ、これにより荷電された前記表面をより荷電させる、またはさせなくすることができる。適切な緩衝液では、pHおよび塩濃度が最適なときに、表面の静電荷を調節することができ、これにより負に荷電したDNAと負に荷電した表面との間の静電反発を減少させることができ、または負に荷電したDNAと正に荷電した表面との間の静電引力を増加させることができ；これが表面に対するDNAの吸着に好都合である。負に荷電したDNAを吸着することができる任意の材料は、この目的のために使用され得る。シリカは、DNA結合マトリックスを形成するために使用することができる適切な材料の非限定的な例である。核を保持する非DNA結合膜を代わりの態様において使用することができ、ここで、マトリックス孔径が大きすぎる場合に核を捕捉することができるであろう。
【００３８】
標的核酸の単離後、非標的核酸に対する標的核酸（すなわち、胎児DNA）の最終的な相対的割合は、少なくとも約5〜6%胎児DNA、約7〜8%胎児DNA、約9〜10%胎児DNA、約11〜12%胎児DNA、約13〜14%胎児DNA、約15〜16%胎児DNA、約16〜17%胎児DNA、約17〜18%胎児DNA、約18〜19%胎児DNA、約19〜20%胎児DNA、約20〜21%胎児DNA、約21〜22%胎児DNA、約22〜23%胎児DNA、約23〜24%胎児DNA、約24〜25%胎児DNA、約25〜35%胎児DNA、約35〜45%胎児DNA、約45〜55%胎児DNA、約55〜65%胎児DNA、約65〜75%胎児DNA、約75〜85%胎児DNA、約85〜90%胎児DNA、約90〜91%胎児DNA、約91〜92%胎児DNA、約92〜93%胎児DNA、約93〜94%胎児DNA、約94〜95%胎児DNA、約95〜96%胎児DNA、約96〜97%胎児DNA、約97〜98%胎児DNA、約98〜99%胎児DNA、または約99〜99.7%胎児DNAである。
【００３９】
精製後のDNA定量が、予想されるDNA量に一致しない場合、精製工程におけるDNAの喪失が想定され得る。この喪失を減少させるために、人工DNAまたはRNAを（下流の適用に応じて）マトリックスに結合する標的DNAおよびその回収を増大するために経験的に確立された量で使用してもよい。
【００４０】
もう一つの側面において、非標的核酸混入は、約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%未満、または約50%未満である。さらなる側面において、単離された標的核酸は、DNAシーケンシング、PCR、または全ゲノム増幅によって解析される。
【００４１】
胎児細胞は、免疫枯渇技術を使用して子宮頚管から単離することができる。一般に、胎児細胞は、母親細胞2000〜10,000に1つの比率で存在する。胎児細胞特異的抗体を使用することにより、胎児細胞は、母親細胞を排してほぼ純粋まで濃縮される。胎児細胞は、男の乳児に対するFISH解析によって示されるようにほぼ純粋であるが、胎児DNAの検出解析は、非標的（たとえば、試料に存在する母親DNA）の圧倒的量によってマスキングされ得るし、このことは、非標的DNAが、細胞外に、および／または胎児細胞に存在することを示している。
【００４２】
正確なDNA解析を可能にするためには、高品質DNA試料が必要とされる。標的DNAの量および混入の量は、全ゲノム増幅を伴うおよび伴わないシーケンシングおよびPCRなどの解析の成功に正比例する。標的細胞の細胞数がより低い場合、非標的DNA除去および標的DNA回収の頻度を増加することを必要とする。本明細書において記述したキットおよび方法を使用した後の結果は、試料中の標的細胞がわずか1〜25、25〜50、50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000、または2000〜5000の高純度（たとえば、＞50%、＞80%、＞85%、＞90%、＞85%、＞98%）を示す。
【００４３】
超音波検査、羊水穿刺、絨毛膜絨毛サンプリング（CVS）、母親血液における胎児血液細胞、母親血清アルファフェトプロテイン、母親血清ベータ-HCG、および母親血清エストリオールを含む、出生前診断のために利用できる多様な非侵襲的および侵襲的技術がある。しかし、非侵襲的な技術は特異的が低く、高特異性で高感受性な技術は、高度に侵襲的である。さらにまた、大部分の技術は、最も優れた有用性のために妊娠中の特定の時間の間にのみ適用することができる。
【００４４】
母親血漿における胎児DNA検出のために開発された最初のマーカーは、男の胎児に存在するY染色体であった。Y染色体マーカーの確固さは、本分野における多くの従事者によって再現されてきた。このアプローチは、胎児の性の決定のための高度に正確な方法を構成し、これは伴性疾患の出生前研究のために有用である。母親血漿DNA解析は、RhD陰性妊婦における胎児RhD血液型状態の非侵襲性出生前決定のためにも有用である。より最近では、母親血漿DNA解析は、胎児β-サラセミアメジャーの非侵襲的出生前排除のために有用なことが示されている。類似のアプローチは、HbE遺伝子の出生前検出のためにも使用されてきた。
【００４５】
母親血漿における胎児DNAのその他の遺伝的適用は、軟骨形成不全、筋緊張性ジストロフィー、嚢胞性線維症、ハンチントン疾患、および先天性副腎皮質過形成の検出を含む。このような適用の範囲は、今後数年にわたって増加するであろうことが期待される。
【００４６】
本明細書において記述した方法については、対象は妊娠しており、対象またはその胎児における疾患または生理的状態を評価する方法は、対象またはその胎児の検出、モニタリング、予後、または治療における助けとなる。より具体的には、本発明は、母親から得られた生物学的試料における胎児DNAを検出することによって胎児における異常を検出する方法を特徴とする。本発明に従った方法は、胎児DNAを母親DNAから区別することによって、母親試料における胎児DNAを検出するために提供する。このような方法を用いて、遺伝子異常または遺伝子に基づいた疾患を予測する胎児DNAが同定され得るし、これにより出生前診断のための方法を提供する。これらの方法は、核酸変化、突然変異またはその他の特徴（たとえば、メチル化状態）が疾患状態と関連する全ての妊娠関連状態に適用することができる。たとえば、配列解析を使用して一塩基多型（SNP）およびDNA突然変異（挿入および／または欠失など）を検出することができる。診断され得る例示的な疾患は、たとえば子癇前症、早期分娩、妊娠悪阻、子宮外妊娠、胎児染色体異数性（18トリソミー、21トリソミー、または13トリソミーなど）および子宮内成長遅滞を含む。
【００４７】
本明細書において記述した方法およびキットは、染色体異常（たとえば、ダウン症候群と関連する異数性または染色体異常）または先天性メンデル遺伝性障害に含まれるもの、並びにこれに関連した遺伝子マーカーの各々（たとえば、嚢胞性線維症または異常ヘモグロビン症などの単一遺伝子障害）を含む胎児の遺伝的形質の解析が可能である。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、子宮頚管試料から胎児核酸を解析する方法であって、子宮頚管試料から胎児細胞を単離する工程；細胞核を遊離する、または放出するために、DNA結合膜またはDNA結合マトリックス上で、胎児細胞を、酵素を含むタンパク質カクテルと共にインキュベートする工程；非標的核酸を除去するために、胎児核を洗浄する工程；胎児核酸を放出するために、核を溶解する工程；および胎児核酸を単離する工程を含む、方法を提供する。一つの側面において、子宮頚管試料は、月経カップを使用して収集される。さらなる側面において、子宮頚管試料は、非標的核酸、母親細胞、および／または胎児細胞を含む。さらなる側面において、タンパク質カクテルは、細胞壁を優先して消化しかつ核エンベロープを消化しないプロテイナーゼを含む。一定の側面において、核は、酵素的または非酵素的溶解緩衝液を使用して溶解される。溶解緩衝液は、プロテイナーゼKおよび／またはトリプシンを含んでいてもよい。
【００４９】
一般に、胎児細胞は、母親細胞において2000〜10,000に1つの比率で存在する。胎児細胞特異的抗体を使用することにとり、胎児細胞は、母親細胞を排してほぼ純粋まで濃縮される。本明細書において記述した方法において、胎児細胞は、細胞を抗HLA-Gに結合することによって単離される。HLA-G組織適合性抗原、クラスI、Gは、ヒト白血球抗原G（HLA-G）としても公知であり、ヒトにおいてHLA-G遺伝子によってコードされるタンパク質である。HLA-Gは、HLA非古典的クラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、重鎖および軽鎖からなるヘテロ二量体（ベータ-2ミクログロブリン）である。HLA-Gは、胎児細胞によって発現される。一つの側面において、胎児細胞は、抗HLA-G抗体でコーティングされたナノ粒子を使用して単離される。いくつかの態様において、胎児細胞は、フローサイトメトリー、免疫染色、顕微鏡法、ポリメラーゼ連鎖反応、シーケンシング、または当該技術分野において公知の任意のその他の方法によって解析される。
【００５０】
さらなる側面において、試料は、約1〜10細胞、10〜25細胞、25〜50細胞、50〜100細胞、100〜250細胞、25〜500細胞、500〜750細胞、750〜1000細胞、1000〜2500細胞、または2500〜5000細胞を含む。一つの側面において、細胞核を遊離するために使用されるタンパク質カクテルは、少なくとも一つの酵素を含み、これは、細胞壁を優先して消化しかつ核エンベロープを消化しない。このような酵素の例は、ペプシンである。さらなる側面において、タンパク質カクテルは、好ましくはDNAseを含まない。いくつかの側面において、核は、溶解緩衝液と共に細胞をインキュベートすることによって溶解される。溶解緩衝液は、酵素的または非酵素的であり得る。溶解緩衝液は、プロテイナーゼKおよび／またはトリプシンを含んでいてもよい。もう一つの側面において、放出された胎児核酸は、膜またはマトリックスに結合する。さらなる側面において、胎児核酸は、膜から核酸を溶出させることによって単離される。一つの側面において、非標的核酸混入は、約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%未満、または約50%未満である。
【００５１】
本明細書に使用される、用語「妊娠関連障害」は、妊婦、女性が身ごもっている胎児、または女性と胎児の両方に影響を及ぼし得る、任意の状態または疾患をいう。このような状態または疾患は、限られた期間の間、たとえば妊娠または分娩の間にその症候が表れてもよく、またはその出生後に胎児の全寿命で持続してもよい。妊娠関連障害のいくつかの例は、子宮外妊娠、子癇前症、早期分娩、および13トリソミー、18トリソミー、または21トリソミーなどの胎児染色体異常を含む。
【００５２】
用語「染色体異常」は、対象染色体の構造と正常な相同的染色体との間の偏位をいう。用語「正常」は、優勢を占める特定の種の健康な個体において見いだされる核型または横縞模様をいう。染色体異常は、数値的または構造的であり得るし、および異数性、倍数性、逆転、トリソミー、モノソミー、複製、欠失、染色体の部分の欠失、付加、染色体の部分の付加、挿入、染色体の断片、染色体の領域、染色体再構成、およびトランスロケーションを含むが、限定されない。染色体異常は、病態の存在と、または病態を発症する傾向と相関し得る。
【００５３】
遺伝子異常、遺伝子突然変異、および染色体異常により生じる胎児の疾患または状態の例は、軟骨形成不全、ダウン症候群、21トリソミー、18トリソミー、13トリソミー、ターナー症候群、鎌状赤血球症、嚢胞性線維症、脆弱XD症候群、筋ジストロフィー（たとえば、デュシェンヌ筋ジストロフィー）、テイ-サックス病、二分脊椎および無脳症などの神経管欠損、サラセミア、多発性嚢胞腎、血友病A、ハンチントン病、および先天性副腎皮質過形成を含む。
【００５４】
子宮頚管試料を収集するためのキットおよび方法が、本明細書に記述されている。本明細書において記述した方法は、月経カップなどの折り畳み可能なカップ、貯蔵容器、および輸送溶液を使用し、妊娠5〜20週の間に、子宮頚管を起源とする頚部細胞の安全な「在宅でのサンプリング」が可能である。本明細書において記述したキットは、ヘルスケア専門家および在宅での個人の両方によって、安全に使用され得る。
【００５５】
本明細書において記述した月経カップは、子宮頚管のすぐ下に女性によって置かれる漏斗形の再使用可能な装置である。カップは、快適さおよび細胞の最大収集を保証するように種々のサイズおよび形状で構成されていてもよい。カップは、妊娠が確認された後に子宮頚管の開口部下に配置される。また、カップは、たとえば妊娠を同定する、または確認する際に使用され得る細胞または試料を収集するために、妊娠が確認される前に子宮頚管の開口部下に配置することができる。カップは、少なくとも一つの胎児細胞がカップによって収集されるまでの間、子宮頚管の開口部に挿入される。たとえば、カップは、1時間、5時間、10時間、12時間、15時間、20時間、もしくは任意の範囲またはその間の副範囲まで、子宮頚管の開口部にて配置してもよい。カップは、パップスメアなどのその他の方法と比較して細胞を収集するための非侵襲的技術である点で有益である。
【００５６】
カップは慎重に取り出され、輸送およびその後の解析のために輸送培地で満たされるか、または輸送培地で満たされた貯蔵容器内に入れられる。たとえば、輸送培地は、一つまたは複数の細胞保存化学物質（たとえば、グリセロール、血清、ジメチルスルホキシド、メタノール、酢酸、細胞培養培地、乾燥剤、その他）を含んでいてもよい。
【００５７】
さらなる態様において、本発明は、折り畳み可能な月経カップ；貯蔵容器；および輸送培地を含む、子宮頚管試料の収集のためのキットを提供する。一つの側面において、月経カップは、膣管に挿入される。もう一つの側面において、月経カップは、試料収集が可能な時間および条件下で、たとえば約10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、60分、1時間未満、1〜2時間、1〜5時間、1〜10時間、1〜20時間、またはより長い時間、挿入される。さらなる側面において、輸送培地は、少なくとも一つの細胞保存化学物質を含む。一定の側面において、保存化学物質は、グリセロール、血清、ジメチルスルホキシド、メタノール、酢酸、細胞培養培地、および/または乾燥剤である。
【００５８】
以下の実施例は、本発明の態様をさらに例証するために提供されるが、本発明の範囲を限定することは意図されない。これらは、使用されるであろうものの典型ではあるが、当業者に公知のその他の手順、方法論、または技術が代替的に使用されてもよい。
【実施例】
【００５９】
実施例1
混合試料からの標的DNAの単離
1〜2,000個の女性細胞を、2〜10,000倍の男性標準DNAと共におよびそれなしで、培地にて1時間インキュベートした。10倍の固定液を添加して、標的細胞に固着するDNAを模倣した。細胞を収集し、計数し、タンパク質カクテルに曝露し、これにより核を遊離した。混合物をマトリックス（たとえば、カラム内のマトリックス）上に分注した。対照細胞は、核放出手順を伴わずに使用した。
【００６０】
カラムをマイクロ遠心機において8000×gにて10秒間回転させた。500マイクロリットルのリン酸緩衝食塩水をマトリックスに2回添加して、混入DNAを洗い流した。溶解結合緩衝液を添加して、核DNA放出およびマトリックス結合を開始した。細胞が50より少ない試料は、溶解緩衝液にスパイクしたキャリアRNAを受け、効率的な結合を確実にした。
【００６１】
エタノールベースの溶液でDNAを洗浄し、その後、10マイクロリットルのTRIS EDTA pH 8緩衝液を使用してDNAを溶出させる前に、マトリックスを乾燥した。
【００６２】
DNAを、RNAseH（総コピー数）および性決定領域Y（SRY）について定量的PCRを使用して定量化した。結果は、非標的DNAの＞90%の除去を示した。
【００６３】
実施例2
頚部試料収集
妊娠14週にて、ボランティアは、一晩12時間月経カップを使用して合計25,000,000細胞を提供した。約250個の胎児細胞を、胎児HLAGおよびbHCGについて免疫染色によって同定した。
【００６４】
実施例3
TRIC-子宮頚管検体からの胎児細胞単離プロトコル
抗HLA-Gが結合したナノ粒子の調製。手順の前日、ヤギ抗マウスIgGに結合した磁気ナノ粒子（Clemente and Assoc.）をマウスモノクローナル抗HLA-G抗体（BD）と共にインキュベートした。100μL無菌PBS、10μL抗体（0.5mg/mL）、および10μLナノ粒子を合わせて、冷却室において4℃にて揺動装置上で混合しながら一晩インキュベートした。翌日、最初に900μL無菌PBSを、次いで、全ての液体を除去する10分前に磁化粒子を添加することによって、結合していない抗体を除去した。200μLピペットマンの先端をチューブの反対の壁に置き、先端をチューブの底面へ移動しながら液体を吸い出した。粒子を1mL無菌PBSに再懸濁し、さらに2回洗浄し、最終的な再懸濁のために100μLを添加した。
【００６５】
最初の子宮頚管試料は、10mLのCytolyt溶液に入って到着した。プラスチックスパチュラを使用して、溶液に浮遊する細胞の凝集塊を分解し、可視物質がバイアルに残っている場合、細胞採取用ブラシから掻き出した。（任意：これに問題がある場合、過剰な粘液を分解するために混合しながら未希釈の酢酸500μLを添加する。）10μLの細胞懸濁液を血球計算器上に一定分量取り、細胞を計数し、出発材料における総細胞を計数した。
【００６６】
100μLの試料を取り出し、Shandon Cytospinを使用して顕微鏡スライド上で遠心した。Shandon EZ Megafunnel使い捨て試料チャンバを使用する。最初の細胞試料を抗HLA-Gマウスモノクローナル抗体（BD #557577）およびDABで染色した。細胞をヘマトキシリンで対比染色し、計数してHLA-G陽性細胞数の概算を得た（スライド上の合計×20=試料中の合計）。栄養芽細胞/総細胞の比を算出することができる（スライド上の合計HLA-G陽性細胞数×20/血球計数器計数から決定される合計細胞数）。比は、約1：2000であるはずである。
【００６７】
細胞を1200rpm（400×g）にて5分間ペレット化した（固定液を全て取り除く）。細胞ペレットを12〜13mL無菌PBSに再懸濁して14mLの最終容量にした。任意で、試料を、15mL遠心管に挿入した250μm組織濾過器を通過させて粘液および細胞凝集塊の大きな小片を取り除く。
【００６８】
頚部試料を細胞の遠心および14mL無菌PBSへの再懸濁により、2回洗浄した。
【００６９】
試料を1.4mLの無菌PBSに再懸濁した。抗HLA-Gコーティング磁気ナノ粒子（#1において調製した）の100μL全てを試料に添加して栄養芽細胞を単離し、試料を冷却室において4℃にて揺動装置上で一晩インキュベートした。
【００７０】
一晩のインキュベーション後、栄養芽細胞を磁石（DynaMag-Spin磁石; Life Technologies）上で4℃にて10分間分離した。結合していない母親細胞を、チューブの反対の壁に対してピペッティングすること、および先端をチューブの底面へ移動しながらゆっくり液体を吸い出すことによって取り除いた。栄養芽細胞を、磁石（ナノ粒子をピペッティングする前に各洗浄について10分間磁化させる）を使用して4℃にて1mL無菌PBSで3回洗浄した。結合していない細胞の最後の除去後、捕捉された細胞を4℃にて100μLの無菌PBSに再懸濁した。
【００７１】
単離された細胞懸濁液の少量の一定分量（10μL）を取り出し、単離された胎児細胞を計数して、回収された胎児細胞の総数を算出した。最初の洗浄液からの母親細胞を、血球計算器を使用して計数した。
【００７２】
細胞は、ビーズ上に固定されたDNAseで、またはなしで、栄養芽細胞を処理することによって、DNA単離のために調製した。
【００７３】
純度分析、タンパク質マーカー染色、およびFISH解析のために、スライドを調製した。およそ50〜100細胞をサイトスピンでそれぞれのスライド上で回転し、次いでスライドを1分間加熱する。***あるいは、スライドの中心に少量の液滴（約10〜40μL）中に40〜100+細胞を置き、乾燥するまで5〜10分間45℃までスライド暖熱装置上で加熱する。
【００７４】
細胞の純度は、抗βhCGで細胞を免疫蛍光標識することによって決定した。蛍光βhCG陽性細胞の数および合計細胞（DAPI標識した）を決定し、βhCG陽性細胞の%が85%を上回ることが見いだされた。
【００７５】
実施例4
胎児DNA単離
20×ペプシンを調製した（50ml 0.01N HC1中に0.22gのペプシン）。100μlの20×ペプシンを100μlのTRIC細胞（上記の通りに単離した）に添加し、Eppendorf ThermoMixer C（500rpm）で37℃にて11分間インキュベートした。
【００７６】
細胞をスピンカラム（DNeasy blood & tissue）に通し、600gにて30秒間遠心し、600gにて30秒間遠心することによって500μlのPBSで5×洗浄した。
【００７７】
200μlのPBS、20μl プロテイナーゼK、200μl AL溶解緩衝液（DNeasy blood & tissue）をカラムに添加して、56℃にてEppendorf ThermoMixer C（500rpm）にカラムを10分間置いた。
【００７８】
200μlのETOHを上記の混合物[PBS + プロテイナーゼK + AL緩衝液]に添加して、ピペットを上下することによって混合し、次いで6000gで1分間遠心した。
【００７９】
DNeasyミニスピンカラムを新たな2mL収集管に置き、500μL Buffer AW1を添加して、6000×g（8000rpm）にて1分間遠心分離した。フロースルーおよび収集管は廃棄した。
【００８０】
DNeasyミニスピンカラムを新たな2mL収集管に置き、500μL Buffer AW2を添加して、20,000×g（14,000rpm）にて3分間遠心分離してDNeasy膜を乾燥させた。フロースルーおよび収集管は廃棄した。
【００８１】
残留エタノールはその後の反応を妨げ得るので、DNeasyスピンカラムの膜を乾燥させることは重要である。この遠心工程は、残留エタノールが以下の溶出の間に持ち越されないことを確実にする。
【００８２】
DNeasyミニスピンカラムをクリーンな1.5または2mLのマイクロ遠心機チューブに置き、25μL Buffer AEをDNeasy膜上に直接ピペットで加え、室温で1分間インキュベートし、次いで6000×g（8000rpm）にて1分間遠心分離して溶出した。インキュベーションおよび遠心溶出工程を、最初の溶出から25μL Buffer AEを膜に添加することによって繰り返した。-20℃で保存する。全ての純度、得られたDNAの量、データは、混入が（いくらか）ある場合でも、分析可能なDNAが含まれることを示す（したがって、配列データは、助けにはなり得るが、決定的であるかどうかは不明）。より多くのデータをアプリケーションに入れるほど、より良くなる。今が可能な限り追加するときである。
【００８３】
実施例5
胎児細胞から単離したDNAの解析
外来/母親DNAが混入した子宮頚管検体から得た胎児細胞からのDNA単離。栄養芽細胞（260〜380細胞）を子宮頚管検体から単離し（試料A〜D）、90%を上回る純度であることが免疫組織化学（hCG陽性）によって決定された。胎児細胞を分割し、核単離を伴う/伴わない抽出によりDNAを処理した。DNAを単離し、Illumina Forenseq技術に類似の方法を使用する次世代シーケンシングによって解析した。高度に変動性のアイデンティティを有するSNPを使用して、参照DNAを用いて母親および胎児由来の特異的遺伝子シグネチャーを作製した。このデータを用いて、子宮頚管検体から単離された胎児細胞における胎児および母親DNA含量を決定した。核単離を伴わない胎児画分は、この試料のサブセットにおいて、11.5%以下の低い胎児画分および88.5〜90.5%の母親混入であった（表1）。核単離は、母親混入を2〜10%まで減少させ、90〜98%の高い胎児画分および純度であった（表1）。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
実施例6
胎児DNA試料中の母親DNA混入の解析
先に記述したように、外来/母親DNAが混入した子宮頚管検体から得た胎児細胞からの核単離後に、DNA単離を行った。栄養芽細胞は、免疫枯渇によって子宮頚管検体から最初に単離した（試料1〜30）。DNAは、Illumina Forenseq技術に類似の方法を使用する次世代シーケンシングよって単離して解析した。高度に変動性のアイデンティティを有するSNPを使用して、参照DNAを用いて母親および胎児由来の特異的遺伝子シグネチャーを作製した。このデータを使用して、子宮頚管検体から単離された胎児細胞における胎児および母親DNA含量を決定した。核単離は、母親混入を0.5〜16.7%まで減少させ、83.3〜99.5%の高い胎児画分および純度であった（表2）。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
実施例7
核単離を伴うおよび伴わない胎児DNAの解析
先に記述したように、外来/母親DNAが混入した子宮頚管検体から得た胎児細胞からの核単離後に、胎児DNA単離を行った。DNA単離前の核単離は、胎児DNA品質を改善した（図1および表3）。核単離との相関は、ほぼ1（0.98）に達した。核単離を伴わない場合、胎児試料は、母親DNAの除去がうまくいかないために母親と高度に相関した。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
本発明を上記の実施例にて記述したが、改変およびバリエーションが本発明の精神および範囲内に包含されることが理解されよう。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021513359.tif 000008
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【国際調査報告】
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