(57)【要約】  本発明は、患者の無細胞腫瘍核酸を連続的に採取して、血漿量当たりの突然変異の数の変化を決定することによる、がん患者において治療法に対する応答を予測する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）処置レジメン中の第１の時点で回収された患者の血漿サンプルを用意するステップ、
（ｂ）処置レジメン中の第２の時点で回収された患者の血漿サンプルを用意するステップ、
（ｃ）前記サンプルにおいて、表１または表２で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、
（ｄ）前記サンプルにおいて、サンプルの容積に対する、バイオマーカーにおいて検出された突然変異の数の比率（ＭＭＰＭ）を決定するステップ、
（ｅ）第２のサンプルにおけるＭＭＰＭが第１のサンプルにおけるよりも低ければ、患者は治療レジメンに対して応答したと判定するステップ、または
（ｆ）第２のサンプルにおけるＭＭＰＭが第１のサンプルにおけるよりも低くなければ、患者は治療レジメンに対して応答しなかったと判定するステップ
を含む、がん患者が治療レジメンに対して正に応答したか否かを判定するための方法。
【請求項２】
がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および結腸直腸がん（ＣＲＣ）の中から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療法に対する患者の応答が、無増悪生存期間（ＰＦＳ）の増大および全生存期間（ＯＳ）の増大から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療レジメンが、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ−ベバシズマブでの処置、ＦＯＬＦＯＸ−ベバシズマブでの処置、カペシタビン（ｃａｐｅｒｃｉｔａｂｉｎｅ）−ベバシズマブ、および化学放射線療法から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
処置レジメン中のさらなる時点で採取されるさらなる血漿を回収するステップ、および、その中のＭＭＰＭがそれより前の時点と比較して低下したか否か、またはその後の時点のＭＭＰＭよりも大きいか否かを判定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）処置レジメン中の第１の時点で回収された患者の血漿サンプルを用意するステップ、
（ｂ）処置レジメン中の第２の時点で回収された患者の血漿サンプルを用意するステップ、
（ｃ）前記サンプルにおいて、表１または表２で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、
（ｄ）前記サンプルにおいて、サンプルの容積に対する、バイオマーカーにおいて検出された突然変異の数の比率（ＭＭＰＭ）を決定するステップ、
（ｅ）第２のサンプルにおけるＭＭＰＭが第１のサンプルにおけるより低ければ、治療レジメンを継続するステップ、または
（ｆ）第２のサンプルにおけるＭＭＰＭが第１のサンプルにおけるより低くなければ、治療レジメンを変更するステップ
を含む、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および結腸直腸がん（ＣＲＣ）を処置する方法。
【請求項７】
治療レジメンを変更するステップが、治療法の用量の増大、１つまたは複数の治療剤の追加、および変更されていない治療レジメンと比較した際の治療期間の延長の１つまたは複数を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
がん患者が治療レジメンに対して正に応答したか否かについてのアルゴリズムを実装するように設計されたコンピュータシステムであって、アルゴリズムが、治療レジメン中の別々の時点で回収された少なくとも２人の患者の血液サンプルから得た１つまたは複数のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析し、アルゴリズムが、突然変異検出のステップ、エラー訂正のステップ、サンプル当たりの突然変異の数を計数し、サンプル容積に対するサンプル中の突然変異の数の比率（ＭＭＰＭ）を決定するステップ、ＭＭＰＭがその後の各時点で低下したか否かを判定するステップ、および、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していれば、患者が治療法に対して応答したと報告し、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していなければ、患者が治療法に対して応答しなかったと報告するステップ、から選択される１つまたは複数のステップを含む、コンピュータシステム。
【請求項９】
がん患者に対する治療法を選択するためのアルゴリズムを実装するように設計されたコンピュータシステムであって、アルゴリズムが、治療レジメン中の別々の時点で回収された少なくとも２人の患者の血液サンプルから得た１つまたは複数のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析し、アルゴリズムが、突然変異検出のステップ、エラー訂正のステップ、サンプル当たりの突然変異の数を計数し、サンプル容積に対するサンプル中の突然変異の数の比率（ＭＭＰＭ）を決定するステップ、ＭＭＰＭがその後の各時点で低下したか否かを判定するステップ、および、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していれば、同一の治療法の選択が提案されることを報告し、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していなければ、代替療法の選択が提案されることを報告するステップ、から選択される１つまたは複数のステップを含む、コンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、がん患者の核酸ベースの試験の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのタイプのがんにおいて化学放射線療法が常用されているが、多くの患者は、処置に対して応答が不良であるか、または不応である。現在の予後予測方法は、依然として、イメージングに限られている。ＣＴスキャンが処置の数カ月後に典型的には行われるが、これは、暫定的な代替療法が有益であったと思われる患者における、疾患の進行を検出するには遅すぎるおそれがある。ＣＴスキャンはまた、より小さな腫瘍を有する患者における疾病負荷を正確に評価するには解像度が十分ではない可能性がある。
【０００３】
血漿中の血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、疾病負荷を迅速かつ正確に推定するための代替的な方法であり、腫瘍のクローン性の評価における生検部位のバイアスを克服し得る。ｃｔＤＮＡは、血流に流れ出る、断片化された腫瘍由来ＤＮＡを指す。これまでの分析は、血漿中のｃｔＤＮＡレベルが疾患のモニタリングのためのツールとして使用され得、処置応答を評価し得、また、残った疾患および再発性の疾患ならびに処置の失敗をＣＴスキャンよりも迅速かつ正確に検出し得ることを示している。Ｄｉｅｈｌ  Ｆら（２００８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ＤＮＡ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｔｕｍｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．Ｓｅｐ、１４（９）：９８５〜９０。ｃｔＤＮＡの予後予測上の価値は、いくつかのタイプのがんの研究において実証されている。Ａｌｍｏｄｏｖａｒ  Ｋら（２０１８）Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｌａｐｓｅ．Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ．Ｊａｎ、１３（１）：１１２〜１２３；Ｔｉｅ  Ｊ．ら（２０１５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ａｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．２６：１７１５〜１７２２。しかし、定性的評価から、患者のケアをリアルタイムで導き得る定量的測定への移行が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、非侵襲的な方法によって治療法に対する応答を評価することによる、がん患者の治療法を評価し、導く方法である。本方法は、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）としても知られている無細胞腫瘍ＤＮＡに関連する新規なパラメータにおける変化を測定することを含む。新規なパラメータは、回収された血漿の量当たりの、例えば、血漿の容積当たりの突然変異ｃｔＤＮＡ分子の数である。
【０００５】
一実施形態において、本発明は、処置レジメン中の第１の時点で回収された患者の血漿サンプルを用意するステップ、処置レジメン中の第２の時点で回収された患者の血漿サンプルを用意するステップ、前記サンプルにおいて、表１または表２で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、前記サンプルにおいて、サンプルの容積に対する、バイオマーカーにおいて検出された突然変異の数の比率（ＭＭＰＭ）を決定するステップ、および、第２のサンプルにおけるＭＭＰＭが第１のサンプルにおけるよりも低ければ、患者は治療レジメンに対して応答したと判定するステップ、または第２のサンプルにおけるＭＭＰＭが第１のサンプルにおけるよりも低くなければ、患者は治療レジメンに対して応答しなかったと判定するステップを含む、がん患者が治療レジメンに対して正に応答したか否かを判定する方法である。がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および結腸直腸がん（ＣＲＣ）の中から選択し得る。治療法に対する患者の応答は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）の増大および全生存期間（ＯＳ）の増大から選択し得る。治療レジメンは、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ−ベバシズマブでの処置、ＦＯＬＦＯＸ−ベバシズマブでの処置、カペシタビン（ｃａｐｅｒｃｉｔａｂｉｎｅ）−ベバシズマブ、および化学放射線療法から選択し得る。一部の実施形態において、本方法は、処置レジメン中のさらなる時点で採取されるさらなる血漿を回収すること、および、その中のＭＭＰＭがそれより前の時点と比較して低下しているか否か、またはその後の時点のＭＭＰＭよりも大きいか否かを判定することをさらに含む。
【０００６】
一実施形態において、本発明は、処置レジメン中の第１の時点で回収された患者の血漿サンプルを用意するステップ、処置レジメン中の第２の時点で回収された患者の血漿サンプルを用意するステップ、前記サンプルにおいて、表１または表２で列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、前記サンプルにおいて、サンプルの容積に対する、バイオマーカーにおいて検出された突然変異の数の比率（ＭＭＰＭ）を決定するステップ、および、第２のサンプルにおけるＭＭＰＭが第１のサンプルにおけるより低ければ、治療レジメンを継続するステップ、または第２のサンプルにおけるＭＭＰＭが第１のサンプルにおけるより低くなければ、治療レジメンを変更するステップを含む、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および結腸直腸がん（ＣＲＣ）を処置する方法である。治療レジメンを変更するステップは、治療法の用量の増大、１つまたは複数の治療剤の追加、および変更されていない治療レジメンと比較した際の治療期間の延長の１つまたは複数を含み得る。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、がん患者が治療レジメンに対して正に応答したか否かについてのアルゴリズムを実装するように設計されたコンピュータシステムであって、アルゴリズムが、治療レジメン中の別々の時点で回収された少なくとも２人の患者の血液サンプルから得た１つまたは複数のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析し、アルゴリズムが、突然変異検出のステップ、エラー訂正のステップ、サンプル当たりの突然変異の数を計数し、サンプル容積に対するサンプル中の突然変異の数の比率（ＭＭＰＭ）を決定するステップ、ＭＭＰＭがその後の各時点で低下したか否かを判定するステップ、および、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していれば、患者が治療法に対して応答したと報告し、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していなければ、患者が治療法に対して応答しなかったと報告するステップ、から選択される１つまたは複数のステップを含む、コンピュータシステムである。
【０００８】
一実施形態において、本発明は、がん患者に対する治療法を選択するためのアルゴリズムを実装するように設計されたコンピュータシステムであって、アルゴリズムが、治療レジメン中の別々の時点で回収された少なくとも２人の患者の血液サンプルから得た１つまたは複数のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析し、アルゴリズムが、突然変異検出のステップ、エラー訂正のステップ、サンプル当たりの突然変異の数を計数し、サンプル容積に対するサンプル中の突然変異の数の比率（ＭＭＰＭ）を決定するステップ、ＭＭＰＭがその後の各時点で低下したか否かを判定するステップ、および、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していれば、同一の治療法の選択が提案されることを報告し、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していなければ、代替療法の選択が提案されることを報告するステップ、から選択される１つまたは複数のステップを含む、コンピュータシステムである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】測定されたＭＭＰＭが中央値を下回るｍＣＲＣ患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と、測定されたＭＭＰＭが中央値を上回るまたは中央値に等しいｍＣＲＣ患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）とを比較する、カプラン・マイヤーグラフである。
【図２】ＭＭＰＭ＜８のｍＣＲＣ患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と≧８のｍＣＲＣ患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）とを比較する、カプラン・マイヤーグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
以下の定義は限定的なものではなく、本開示の理解の助けとなるものにすぎない。
用語「ＰＦＳ」は、患者の無増悪生存の期間を説明するために、本明細書において使用される。
【００１１】
用語「ＯＳ」は、患者の全生存の期間を説明するために、本明細書において使用される。
用語「血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）」は、腫瘍に由来する、ヒトの血漿または血清で見られる無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の一部分を説明するために、本明細書において使用される。血中循環腫瘍ＤＮＡは、腫瘍の特徴である突然変異によって、非腫瘍ＤＮＡと区別される。
【００１２】
用語「バイオマーカー」は、生物学的または臨床的現象に関連する情報を含むヌクレオチド配列を説明するために、本明細書において使用される。例えば、情報は、ヌクレオチド配列の突然変異の状態の場合もある。バイオマーカーは、遺伝子（コード配列、調節配列、イントロン、もしくはスプライス部位を含む）または遺伝子間領域とし得る。臨床的現象は、患者のサンプルにおける悪性細胞、例えば腫瘍細胞の存在とし得る。
【００１３】
用語「ＷＧＳと表記される全ゲノムシーケンシング」は、細胞の、または１つもしくは複数の細胞が由来する元である生物の、ゲノム全体のシーケンシングを説明するために、本明細書において使用される。用語「ＷＥＳと表記される全エキソームシーケンシング」は、ゲノムの全ての遺伝子に存在する全てのエキソンのシーケンシングを説明するために、本明細書において使用される。ヒトまたは他の高等脊椎動物のゲノムに対するＷＧＳおよびＷＥＳの両方は、大量の配列情報を集め、保存することができる、大規模並列シーケンシング方法（次世代シーケンシング方法）を使用して行われる。
【００１４】
本発明は、腫瘍患者を処置する方法、腫瘍患者の処置をモニタリングする方法、および腫瘍患者の処置レジメンを修正または変更する方法を記載する。一部の実施形態において、腫瘍は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および結腸直腸がん（ＣＲＣ）から選択される。
【００１５】
腫瘍細胞は、腫瘍の発生および進行の間に体細胞突然変異を蓄積させることが知られている。腫瘍突然変異を評価する様々な方法が、診断および治療法選択に使用されている。例えば、患者から得た腫瘍サンプルにおける突然変異の数として定義される腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）は、固形転移性悪性腫瘍のアレイのための、化学療法およびがん免疫療法についての予測バイオマーカーである。ＴＭＢは、全エキソームシーケンシング（ＷＥＳ）によってまたはマルチメガベースパネルのシーケンシングによって測定されることが多い。最近の研究では、１．２メガベースのゲノムを含むパネルが突然変異について分析された。１８５、２３６、３１５、または４０５のがん関連遺伝子からのエキソン領域のハイブリダイゼーションキャプチャー、およびがんにおいて共通して再配列されている１９、２８、または３１の遺伝子からのイントロンの選択が、ホルマリン固定されパラフィン包埋された臨床的がん標本から抽出された≧５０ｎｇのＤＮＡに適用された。Ｃｈａｌｍｅｒｓら（２０１７）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １００，０００  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｕｒｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１７）９：３４；Ｇｏｏｄｍａｎら（２０１７）Ｔｕｍｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ａｓ  ａｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃａｎｃｅｒｓ，ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３５〜７１６３．ＭＣＴ−１７−０３８６；Ｍａｉａ，Ｍ．Ｃ．ら（２０１８）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｕｒｄｅｎ（ＴＭＢ）ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ｍＲＣＣ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３６、第６号＿補遺（２０１８年２月２０日）６６２〜６６２。最近、腫瘍に特徴的な突然変異を評価する、新たな、さらに実用的な、非侵襲的な方法が開発されており、「Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｒｄｅｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ」という発明の名称の、２０１８年５月３日に出願された米国仮出願第６２／６６６，３２９号において記載されている。ＷＧＳまたはＷＥＳなどの全ゲノム分析の代わりに、この新たな方法は、小さな標的シーケンシングパネルを利用して、がん患者の血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）において見られる突然変異を測定する。この方法は、例えば組織ベースのシーケンシングと比較してより大きなシーケンシング深度を採用し、そして、固形腫瘍において共通して突然変異している遺伝子を濃縮する、より小さな標的シーケンシングパネルを利用する。突然変異数は、わずか１９８キロベースの標的次世代シーケンシングパネルである、ＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）を使用して��価される。このパネルは、ヒトゲノムのごく一部のみを調べることによって、肺がんおよび結腸直腸がんにおいて検出しようとしている関連する突然変異の数を最大にするように設計された。より小さなゲノム部分がシーケンシングされ、サンプルは無細胞ＤＮＡしか含まないが、この方法は、腫瘍ＤＮＡ内に存在する突然変異を適切に評価することが示されている。
【００１６】
本発明は、同一の限定的なゲノムパネルアプローチを利用する。本発明は、処置レジメンの有効性が、腫瘍突然変異の変化を検出することによってモニタリングされる、腫瘍を有する患者を評価し、処置する方法である。この新規な方法は、経済的かつ非侵襲性である。さらに具体的には、治療レジメンの有効性は、血漿１ミリリットル当たりの突然変異分子（ＭＭＰＭ）という新規なパラメータの変化を検出することによってモニタリングされる。ＭＭＰＭは、検出された腫瘍突然変異の数を、試験対象の核酸が抽出された元である血漿の容積で割ったものである。当業者には、ＭＭＰＭを決定するためにサンプルを数ミリリットル単位で測定する必要がないことが理解されよう。サンプル量のあらゆる他の測定、例えば任意の単位で決定される質量または容積も、ＭＭＰＭの検出およびモニタリングに同様に適している。本発明はさらに、処置でのＭＭＰＭの変化の決定を含む。血液サンプルは、場合によって処置前の測定および１回または複数回のさらなる測定を含む、処置中の様々な時点で、患者から回収される。ＭＭＰＭ値は、異なる時点の間で比較される。本処置方法はさらに、ＭＭＰＭの低減が時点間で観察されれば処置レジメンを継続することを含む。本処置方法は、あるいは、ＭＭＰＭの低減が時点間で観察されなければ処置レジメンを変更するステップを含む。
【００１７】
一部の実施形態において、本発明は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって腫瘍特異的な体細胞突然変異を識別するためのバイオマーカーパネルを使用する。一部の実施形態において、本発明は、患者から得た血液サンプルまたは血液由来サンプルを利用する。サンプルは、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ）を含む無細胞ＤＮＡを含有する、血液の任意の画分、例えば血清または血漿を含み得る。一部の実施形態において、サンプルは、処置中の様々な時点で、例えば、化学療法レジメンまたは化学放射線療法レジメンの前、最中、および後に、連続的に採取される。患者からの血液サンプルは、例えば、２０１０年１月１９日に出願された米国特許出願第１２／６８９，３７０号、Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａにおいて記載されているような保存用媒質中への血液サンプルの回収を含む、無細胞ＤＮＡを保存する任意の適切な手段によって、回収され、保存される。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明は、遺伝子パネルまたは突然変異パネルまたは体細胞バリアントパネルを含む、バイオマーカーパネルを利用する。突然変異は、遺伝子のコード領域内で生じる場合、ナンセンス（ｏｎ−ｓｅｎｓｅ）突然変異、ミスセンス突然変異、およびフレームシフト突然変異に対応する、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、欠失および挿入（インデル）を含み得る。他のタイプの突然変異としては、遺伝子の融合および転座が含まれる。このようなパネルの選択、サイズ、および内容は、例えば、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ」という発明の名称の米国特許出願第１４／２０９，８０７号、米国特許出願第１４／７７４，５１８号、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４９８３８号において記載されている。一部の実施形態において、本発明は、パネル内のバイオマーカーの、例えば表１または表２で列挙する遺伝子の配列を決定することを含む。一部の実施形態において、遺伝子の配列全体が決定される。他の実施形態において、遺伝子のコード配列全体が決定される。他の実施形態において、がんにおいて突然変異生成されることが知られている遺伝子の一部分の配列のみが決定される。さらに他の実施形態において、バイオマーカーは、コード配列を伴わずに、調節配列、または機能未知であるが、ヒト腫瘍において一貫して突然変異することが知られている配列を伴っている。一部の実施形態において、遺伝子または他の配列の一部分は、それが同一のタイプの腫瘍または異なるタイプの腫瘍に罹患している複数の患者における突然変異の再発を特徴とするならば、パネルに含めるために選択される。パネルに含めるための他の基準は、上記の特許出願「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ」において開示されている。
【００１９】
本発明の文脈において、バイオマーカーの配列は、当技術分野において知られているあらゆる適切な方法を介して決定し得る。適切な方法は、非突然変異配列と同時発生する希少な突然変異配列を検出するための十分な精度、例えば感度および特異性を有する。一部の実施形態において、シーケンシング方法は、分子バーコード、エラーステレオタイピング、および、例えば上記の特許出願「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ」において記載されている他の化学的または計算的なエラー抑制方法の使用などの、エラー訂正ステップを含む。シーケンシング方法としては、アレイベースのシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ．）、エマルジョンベースのシーケンシング（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、光学測定ベースのシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌ．）、またはナノポアベースのシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｏｐｏｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、またはＲｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌ．）を含む、大規模並列シーケンシング方法を含み得る。
【００２０】
配列データは、突然変異を決定するために参照ゲノム配列と比較される。一部の実施形態において、参照配列は、規準的なヒトゲノムアセンブリ、例えばＨＧ３８である。参照ゲノムと比較しての核酸配列の変化が識別され、突然変異としてスコア付けされる。一部の実施形態において、１つまたは複数のフィルターが、スコア付けされる突然変異を選択するために適用される。一部の実施形態において、コード領域内の突然変異のみがスコア付けされる。一部の実施形態において、コード領域内の非同義突然変異のみがスコア付けされる。他の実施形態において、コード領域内の非同義突然変異および同義突然変異の両方がスコア付けされる。さらに他の実施形態において、頻度がより低い突然変異事象の検出を可能にするために、がんドライバー遺伝子における突然変異が、スコア付けから除外される。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明は、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無再発生存期間（ＲＦＳ）、再発までの総時間（ＴＴＲ）、および全生存期間（ＯＳ）のうちの１つまたは複数の期間を決定することによって、治療を受けている患者におけるがんの状態を評価するステップを含む。評価は、本明細書において記載されるように決定された、処置中のＭＭＰＭの変化に基づく。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明は、投与されている処置レジメンに対して良好に応答しているがん患者を識別するための方法を提供する。本発明はまた、投与されている処置レジメンに対して良好に応答していないがん患者を識別するための方法を提供する。具体的には、本発明は、処置中の２つ以上の時点で、患者から得た無細胞血液サンプルから核酸を単離するステップ、単離された核酸において、表１または表２に列挙するバイオマーカーのそれぞれの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、配列を参照配列と比較し、突然変異を識別するステップ、識別された突然変異の数と回収された血液または血漿の量（例えば容積）との比率としてＭＭＰＭを決定するステップ、および時点間でのＭＭＰＭの変化を決定するステップを含む、がん患者を処置する方法である。本方法はさらに、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していれば治療レジメンを継続し、ＭＭＰＭがその後の時点間で低下していなければ治療レジメンを変更することを含む。一部の実施形態において、転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）を含む結腸直腸がん（ＣＲＣ）のための治療レジメンは、同時に投与される（ｃＦＯＬＦＯＸＩＲＩ−ＢＥＶ）ベバシズマブ（ＢＥＶ）と５−フルオロウラシル／ロイコボリン／オキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）および５−フルオロウラシル／ロイコボリン／イリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）、またはカペシタビンとベバシズマブから選択される。一部の実施形態において、ｍＣＲＣのための進行療法は、選択されたベバシズマブおよびフルオロピリミジンベースの化学療法である。
【００２３】
本発明の一態様は、患者においてＭＭＰＭを検出するためのシステムを含む。このシステムは、プロセッサ、およびプロセッサに繋がれた非一時的なコンピュータ可読媒体を含み、この媒体は、処置中の２つ以上の時点で回収されたサンプルから得られた表１または表２のバイオマーカーについてのシーケンシングデータを分析するステップ、配列の比較および突然変異の検出、エラーの訂正を行うステップ、識別された突然変異の数と血漿の量（例えば容積）との比率としてＭＭＰＭを決定するステップ、ならびにＭＭＰＭがその後の時点間で低下したか否かを判定するステップを含む方法を行うための、プロセッサによって実行できるコードを含む。
【００２４】
一部の実施形態において、コンピュータ可読媒体は、１つまたは複数の記憶デバイスを含み得るが、患者におけるＭＭＰＭ測定のダイナミクスに応じた利用可能な治療法のリストを含むデータベースを含む。コンピュータ可読媒体はさらに、適切な治療法を列挙する報告を生成するための指示を有するプログラムコードを含む。システムは、デジタルデータを処理するためのプロセッサ、デジタルデータを格納するための、プロセッサに繋がれたメモリ、デジタルデータをインプットするための、プロセッサに繋がれたインプットデジタイザ、メモリに格納され、プロセッサによってアクセス可能な、プログラムコード、プロセッサに繋がれたディスプレイデバイス、ならびに、デジタルデータ、データネットワーキング、および１つまたは複数の情報データベースに由来する情報をディスプレイするためのメモリを含む、サーバなどの、様々な機能面を含み得る。データベースは、患者のデータ、患者のサンプルのデータ、前処置のデータを含む臨床データ、治療法および治療剤のリスト、患者のトラッキングデータ、およびそれに類するものを含み得る。
【００２５】
一部の実施形態において、本発明は、患者の組織および血液を分析してサンプルにおける腫瘍特異的な突然変異を識別および定量することができる、ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ分析キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）などのバイオマーカーパネルを利用する。ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ分析キット（ｅｘｐａｎｄｅｄパネル）におけるバイオマーカーパネルの組成を表１に示す。ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ分析キット（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅパネル）におけるバイオマーカーパネルの組成を表２に示す。
【００２６】
【表１】
2021513352.tif 000002
【００２７】
【表２−１】
2021513352.tif 000003
【００２８】
【表２−２】
2021513352.tif 000004
【００２９】
一部の実施形態において、表１に列挙する７７の遺伝子からなるパネルの一部のまたは全ての遺伝子が使用される。一部の実施形態において、表２に列挙する１９７の遺伝子からなるパネルの一部のまたは全ての遺伝子が使用される。突然変異（ＭＭＰＭ）の測定は、ＭＭＰＭの変化を評価するために、処置レジメン中の１つまたは複数の時点で行われる。一部の実施形態において、最初の測定は、処置レジメンの開始前に行われる。一部の実施形態において、最後の測定は、処置レジメンの完了後に行われる。一部の実施形態において、処置前のＭＭＰＭ測定は利用できず、ＭＭＰＭの変化を評価するために、突然変異（ＭＭＰＭ）の測定が、処置中のみ、場合によって処置後に行われる。
【実施例】
【００３０】
実施例１
ＭＭＰＭを使用して、肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者が治療法に対して応答したか否かを判定する。
【００３１】
血漿サンプルを、進行非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）腺がん患者のコホートから回収した。ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡキットのＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅパネル（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）を使用して、患者のサンプルにおける突然変異の数を評価した。患者の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を、ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡキットの製造者の指示に従って単離および分析した。処置後のＭＭＰＭ値を、ベースラインおよび／またはそれ以前の処置時点でのＭＭＰＭ値と比較した。ベースライン（ｂ０）では、本発明者らは、ｃｔＤＮＡのモニタリングを可能にするために、全ての患者においてバリアントを識別した。本発明者らは、第１の処置サイクルおよび第２の処置サイクルの後に採取した血漿をそれぞれｐ１およびｐ２と定義する。
【００３２】
ｐ２での８を下回る平均ＭＭＰＭまでの経時的な平均ＭＭＰＭの低減によって表されるｃｔＤＮＡレベルの連続的な低下（ｐ２＜ｐ１＜ｂ０）によって定義される、連続的レスポンダーアルゴリズムが適用された。その結果、１３／４３（３０％）の連続的レスポンダーが、ＰＦＳ（Ｐ＝０．０２８  ＨＲ  ０．４５；９５％ＣＩ  ０．２３〜０．９０）およびＯＳ（Ｐ＝０．００７４  ＨＲ  ０．３；９５％ＣＩ  ０．１２〜０．７７）によって示される、より良好な治療応答を伴っていた。連続的レスポンダーは、不良なレスポンダーと比べて１１．２５カ月の全生存期間利点中央値を示した。結果は、ＮＧＳによって測定された処置直後のｃｔＤＮＡレベルが、進行肺腺がん集団における化学放射線療法への応答に関連していたことを示す。
【００３３】
実施例２
ＭＭＰＭを使用して、肺がん（ＳＣＬＣ）患者が治療法に対して応答したか否かを判定する。
【００３４】
ドイツの肺がんマルチマーカーのプロスペクティブ観察研究から、本発明者らは、ＵＩＣＣ−ステージＩＩＩＢ／ＩＶの、最初の７２人の小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）の治療継続患者を選択し、血漿サンプルは、治療法の開始前、および第２のサイクルの化学療法の前、および第３のサイクルの前に入手可能であった。本発明者らは、治療開始後のｃｔＤＮＡのレベルの評価が処置効果および予後に関連すると仮定した。本発明者らは、１９７の遺伝子のＮＧＳアッセイである、ＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）を利用し、これによって、本発明者らは、縦断的ｃｔＤＮＡ分析を行うこと、および、全てのシーケンシングされたゲノム領域の全バリアントにわたりｃｔＤＮＡを定量する、血漿１ミリリットル当たりの突然変異分子（ＭＭＰＭ）を測定することが可能となった。全ての抽出されたｃｆＤＮＡサンプルを処理し、採血の日付順に並べた。ベースライン（ｂ０）で、本発明者らは、全ての（７２／７２）対象においてバリアントを識別して、ｃｔＤＮＡのモニタリングを可能にした。各対象からの連続リキッドバイオプシーを使用して、第１の処置サイクル後（ｐ１）の平均ＭＭＰＭおよび第２の処置サイクル後（ｐ２）の平均ＭＭＰＭを分析した。本発明者らは、ｐ２での１８を下回る平均ＭＭＰＭまでの経時的な平均ＭＭＰＭの低減によって表されるｃｔＤＮＡレベルの連続的な低下（ｐ２＜ｐ１＜ｂ０）によって定義される、連続的レスポンダーアルゴリズムを試験した。その結果、４７／７２の連続的レスポンダーが、より良好な治療応答、ＯＳ  ＨＲ＝２（Ｐ＝０．００９２％、ＣＩ  １．２〜３．４）を伴っていた。連続的レスポンダーは、不良なレスポンダーと比べて４．６カ月の生存期間利点中央値を示した。性別も、年齢も、ＥＣＯＧも、ステージも、モデルにおける応答の予測因子ではなかった。結果は、処置効果の早期の評価は、血漿中の突然変異分子数によって判定し得ることを示す。処置後のｃｔＤＮＡレベルの低下は、進行ＳＣＬＣにおけるより良好な予後と関連していた。
【００３５】
実施例３
ＭＭＰＭを使用する、転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）患者における疾患のモニタリング
患者の選択および処置
研究のために選択された患者は、これまでにｍＣＲＣの処置を受けていない、第２フェーズ試験の患者であった。２１日間のスクリーニング期間の後、患者を１：１：１で、ｃＦＯＬＦＯＸＩＲＩ−ＢＥＶ、ｓＦＯＬＦＯＸＩＲＩ−ＢＥＶ、またはＦＯＬＦＯＸ−ＢＥＶを２週間サイクルで投与する、４カ月間の処置導入フェーズにランダム化した。導入は、処置する医師の裁量で、最大でさらに２カ月間延長し得る。導入療法の後に、２週間ごとの５−フルオロウラシル、ロイコボリン、およびベバシズマブで、または３週間ごとのカペシタビンとベバシズマブとで、維持した。疾患が進行した後、患者に研究者の選択でベバシズマブおよびフルオロピリミジンベースの第二選択化学療法薬を投与することになっていた。処置は、進行、死亡、同意の取り消し、または許容できない毒性が現れるまで継続した。処置の有効性は、ランダム化前のスクリーニング期間の間、およびその後８週間ごとに、固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）ｖ１．１ごとに、施設試験責任者（ｓｉｔｅ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ）によって評価された。ＰＦＳを、ランダム化から、最初の疾患進行または何らかの原因による死亡の、より早く生じた方までの時間として計算した。事象を有さない患者は、その最後の腫瘍評価の時点で除外した。
【００３６】
バイオマーカー分析のための組織および血漿の回収
バイオマーカーについて評価可能な患者は、バイオマーカープログラムへの参加について任意選択の同意を与え、１つの組織サンプル、１つの導入前血漿サンプル、および１つの導入後血漿サンプルを有する患者と定義された。組織サンプルおよび導入前の血漿サンプルは分析可能でなければならず、また、互いに９０日以内の間隔で回収されなければならなかった。さらに、導入後の血漿サンプルは、最後の薬剤導入日から６０日以内に回収されなければならなかった。各患者についての保管されていたまたは新鮮なベースライン（サイクル１、１日目、処置前）腫瘍組織を回収した。バイオマーカー分析のための血漿は、ベースラインで、および導入フェーズの最後（サイクル８の最後、研究者の裁量によってサイクル１２まで延長が可能）で回収した。
【００３７】
腫瘍ＤＮＡおよび血漿ｃｔＤＮＡのバイオマーカーの評価
ｃｆＤＮＡを、ｃｏｂａｓ（登録商標）ｃｆＤＮＡサンプル調製キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）を使用して４ｍＬの血漿から抽出し、腫瘍ＤＮＡを、ｃｏｂａｓ（登録商標）ＤＮＡサンプル調製キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）を使用してホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織切片から単離した。ＤＮＡ収量を、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ）によって定量した。１から２０８ｎｇ（中央値５０ｎｇ）のｃｆＤＮＡを使用する、ＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡ  Ｅｘｐａｎｄｅｄキット（研究使用のみ；Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）を使用してのシーケンシングのために、ｃｆＤＮＡサンプルを調製した。ＤＮＡのシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００で行った。ｃｔＤＮＡのバリアントを、ＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡ分析ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）を使用して識別した。
【００３８】
ミリリットル当たりの突然変異分子（ＭＭＰＭ）の決定
所与の体細胞突然変異についての対立遺伝子頻度（ＡＦ）を、その突然変異を有する重複除去されたリードの数を、そのゲノム位置をカバーする重複除去されたリードの総数で割ったものとして計算した。所与の体細胞突然変異についてのＭＭＰＭを、そのバリアントのＡＦに、抽出された質量（ｎｇ）をかけ、血漿容積（ｍＬ）で割り、そして１ｎｇ当たり３３０の１倍体ヒトゲノム当量（ｈＧＥ）の係数によって調整することによって計算した。各血漿サンプルについての平均ＡＦまたは平均ＭＭＰＭを、対応（ｍａｔｃｈｅｄ）組織サンプルによって事前に定義された体細胞バリアント（単一ヌクレオチドバリアントおよびインデル）全体について計算した。分類指標についてのカットオフは、導入後の平均ＡＦ値および平均ＭＭＰＭ値の分布に基づいて決定した。複数のカットオフ値を試験した後、本発明者らは、８ＭＭ／ｍＬの平均ＭＭＰＭ値が良好な分子レスポンダーと不良な分子レスポンダーとの臨床的に有意な分離を示すことを見出した。
【００３９】
統計方法
カプラン・マイヤー方法およびログランク検定を使用して、中央値ＰＦＳおよびログランクｐ値を推定した。コックス比例ハザードモデルを使用して、ハザード比（ＨＲ）およびそれに伴う９５％ＣＩを推定した。
【００４０】
結果
バイオマーカーを評価可能な集団における５４人の患者のうち、６人の患者が、研究中に、根治目的の外科手術（すなわち、Ｒ０切除のアウトカムを伴う外科手術）を受けていた。中央値を追跡した期間は、バイオマーカーを評価可能な集団に含められた５４人の患者において、１９．３（範囲は６．７〜２８．０）カ月間であった。バイオマーカーを評価可能な集団（ｎ＝５４）におけるファーストライン導入療法後の中央値ＰＦＳは、残りのＳＴＥＡＭ集団（ｎ＝２２６）で見られる中央値ＰＦＳに類似していた（それぞれ１１．２カ月と１０．９カ月；ＨＲ  １．０９［９５％ＣＩ  ０．７７〜１．５４］、ログランクＰ＝０．６３６１）。
【００４１】
導入後の平均ＭＭＰＭ（ｍＭＭＰＭ）とＰＦＳとの関連
血漿中のｃｔＤＮＡレベルを推定する代替的な方法として、本発明者らは、新規なパラメータ、すなわち、単位血漿当たりのバリアント分子（ＭＭＰＭ）の絶対数を評価した。本発明者らは、ＭＭＰＭの変化とＰＦＳとの関連を判定した。導入後の平均ＭＭＰＭ（ｍＭＭＰＭ）レベルは、使用したカットオフにかかわらず（中央値、８ＭＭ／ｍＬ、または１０ＭＭ／ｍＬ）、ＰＦＳと逆に関連しており、このことは、ｍＭＭＰＭレベルがさらに、臨床的アウトカムを予測することを示唆している。≦中央値ｍＭＭＰＭの患者と、＞中央値ｍＭＭＰＭの患者とにおいて、中央値ＰＦＳはそれぞれ１７．７カ月と８．１カ月とであり、ＨＲは０．３９（９５％ＣＩ  ０．２０〜０．７５）（ログランクＰ＝０．００３４）であった（図１）。＜８ＭＭ／ｍＬの患者と、≧８ＭＭ／ｍＬの患者とにおいて、中央値ＰＦＳはそれぞれ１６．９カ月と７．４カ月とであり、ＨＲは０．２９（９５％ＣＩ  ０．１５〜０．５７、ログランクＰ＝０．０００１）であった（図２）。
【００４２】
ｍＡＦおよびｍＭＭＰＭは全体として互いに相関していたが、非常に高い（＞１００ｎｇ／ｍＬ）血漿ｃｆＤＮＡレベルを有していたこの分析における３人の患者は、低い導入後ｍＡＦレベル（０．２１％、０．３６％、および０．０３％）を有していたものの、中央値ｍＭＭＰＭよりも大きい値を有していた（それぞれ、２１１．６２、７９３．４３、１０．９３）。３人の患者のうち２人は、比較的短いＰＦＳ期間（６．７カ月間および７．５カ月間）を有していた。これらの外れ値のケースでは、ｍＡＦは疾病負荷が過小評価されている可能性があるため、ｍＭＭＰＭはｍＡＦよりも良好な予後バイオマーカーであった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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