(57)【要約】  VHHキメラ抗原受容体（VCAR）と、本開示のVCARをコードするVCARトランスポゾンと、本開示のVCARを発現するように改変された細胞のほか、養子細胞療法のためにそれらを製造する方法と利用する方法が開示されている。
2021507703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）抗原認識領域を含むエクトドメイン、ここで、該抗原認識領域は少なくとも1つのVHを含む；
（b）膜貫通ドメイン；及び
（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメイン；
を含むキメラ抗原受容体（CAR）。
【請求項２】
前記VHは、組換え又はキメラ配列を含むか又はそれからなる、請求項1に記載のCAR。
【請求項３】
前記VHは、ヒト又はヒト化配列を含むか又はそれからなる、請求項1に記載のCAR。
【請求項４】
前記VHは、天然に存在しない、請求項3に記載のCAR。
【請求項５】
前記VHは、天然に存在する抗体又はその断片ではない、請求項3又は4に記載のCAR。
【請求項６】
（a）のエクトドメインはシグナルペプチドを更に含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項７】
（a）のエクトドメインは、前記抗原認識領域と前記膜貫通ドメインの間にヒンジを更に含む、請求項1又は6に記載のCAR。
【請求項８】
前記シグナルペプチドは、ヒトCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB又はGM-CSFRシグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項6又は7に記載のCAR。
【請求項９】
前記シグナルペプチドは、ヒトCD8αシグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項6又は7に記載のCAR。
【請求項１０】
前記シグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号18012）を含むアミノ酸配列を含む、請求項9に記載のCAR。
【請求項１１】
前記シグナルペプチドは、atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca（配列番号18013）を含む核酸配列によってコードされる、請求項9又は10に記載のCAR。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインは、ヒトCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB又はGM-CSFR膜貫通ドメインをコードする配列を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインは、ヒトCD8α膜貫通ドメインをコードする配列を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項１４】
前記膜貫通ドメインは、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号18014）を含むアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のCAR。
【請求項１５】
前記膜貫通ドメインは、atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc（配列番号18015）を含む核酸配列によってコードされる、請求項13又は14に記載のCAR。
【請求項１６】
前記エンドドメインは、ヒトCD3ζエンドドメインを含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項１７】
前記少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒト4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40細胞内セグメント、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項１８】
前記少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトCD28及び／又は4-1BB共刺激ドメインを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項１９】
前記CD3ゼータ共刺激ドメインは、RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号18016）を含むアミノ酸配列を含む、請求項17又は18に記載のCAR。
【請求項２０】
前記CD3ゼータ共刺激ドメインは、cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg（配列番号18017）を含む核酸配列によってコードされる、請求項19に記載のCAR。
【請求項２１】
前記4-1BB共刺激ドメインは、KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号18018）を含むアミノ酸配列を含む、請求項17又は18に記載のCAR。
【請求項２２】
前記4-1BB共刺激ドメインは、aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg（配列番号18019）を含む核酸配列によってコードされる、請求項21に記載のCAR。
【請求項２３】
前記4-1BB共刺激ドメインは、前記膜貫通ドメインと前記CD28共刺激ドメインの間に位置する、請求項18〜22のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項２４】
前記ヒンジは、ヒトCD8α、IgG4、及び／又はCD4配列に由来する配列を含む、請求項6〜23のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項２５】
前記ヒンジは、ヒトCD8α配列に由来する配列を含む、請求項6〜23のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項２６】
前記ヒンジは、TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号18020）を含むアミノ酸配列を含む、請求項24又は25に記載のCAR。
【請求項２７】
前記ヒンジは、actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac（配列番号18021）を含む核酸配列によってコードされる、請求項26に記載のCAR。
【請求項２８】
前記少なくとも1つのVCARは、抗原に特異的に結合することが可能である、請求項1〜27のいずれか1項に記載のCAR。
【請求項２９】
前記VCARは、10-9 M以下、10-10 M以下、10-11 M以下、10-12 M以下、10-13 M以下、10-14 M以下、及び10-15 M以下のKDから選択される少なくとも1つの親和性をもって抗原に結合する、請求項28に記載のCAR。
【請求項３０】
前記KDは表面プラズモン共鳴によって決定される、請求項29に記載のCAR。
【請求項３１】
請求項1〜30のいずれか1項に記載のCAR及び少なくとも1つの医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３２】
請求項1〜31のいずれか1項に記載のCARを含むトランスポゾン。
【請求項３３】
前記トランスポゾンは選択遺伝子を更に含む、請求項32に記載のトランスポゾン。
【請求項３４】
前記選択遺伝子は細胞生存可能性および生存能力に必須な遺伝子産物をコードする、請求項33に記載のトランスポゾン。
【請求項３５】
選択的細胞培養条件にチャレンジされた場合、前記選択遺伝子は細胞生存可能性および生存能力に必須な遺伝子産物をコードする、請求項33に記載のトランスポゾン。
【請求項３６】
前記選択的細胞培養条件が細胞生存可能性又は生存能力に有害な化合物を含み、かつ前記遺伝子産物がその化合物に対する耐性を与えるものである、請求項35に記載のトランスポゾン。
【請求項３７】
前記選択遺伝子は、neo、DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ），TYMS（チミジル酸シンセターゼ）、MGMT（O（6）-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ）、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ALDH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1）、FRANCF、RAD51C（RAD51パラログC）、GCS（グルコシルセラミドシンターゼ）、NKX2．2（NK2ホメオボックス2）又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項33に記載のトランスポゾン。
【請求項３８】
前記トランスポゾンは、以下を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含む：
（a）リガンド結合領域、
（b）リンカー、及び
（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチド、
ここで、前記誘導性カスパーゼポリペプチドは、非ヒト配列を含まない、
請求項32〜37のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項３９】
前記非ヒト配列は制限部位である、請求項38に記載のトランスポゾン。
【請求項４０】
前記リガンド結合領域誘導性カスパーゼポリペプチドは、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含む、請求項37又は39に記載のトランスポゾン。
【請求項４１】
前記FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記配列の36位において修飾を含む、請求項40に記載のトランスポゾン。
【請求項４２】
前記修飾は、36位におけるフェニルアラニン（F）の代わりにバリン（V）を置換するもの（F36V）である、請求項41に記載のトランスポゾン。
【請求項４３】
前記FKBP12ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18022）を含むアミノ酸配列によってコードされる、請求項40〜42のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項４４】
前記FKBP12ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT  GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18023）を含む核酸配列によってコードされる、請求項43に記載のトランスポゾン。
【請求項４５】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリンカー領域は、GGGGS（配列番号18024）を含むアミノ酸によってコードされる、請求項38〜44のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項４６】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリンカー領域は、GGAGGAGGAGGATCC（配列番号18025）を含む核酸配列によってコードされる、請求項45に記載のトランスポゾン。
【請求項４７】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、前記配列の87位においてアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされる、請求項38〜46のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項４８】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、前記配列の282位においてアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされる、請求項38〜47のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項４９】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18026）を含むアミノ酸によってコードされる、請求項38〜48のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項５０】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされる、請求項49に記載のトランスポゾン。
【請求項５１】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18028）を含むアミノ酸配列によってコードされる、請求項38〜50のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項５２】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされる、請求項51に記載のトランスポゾン。
【請求項５３】
前記トランスポゾンは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含む、請求項32〜52のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項５４】
前記トランスポゾンは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含み、1つの自己切断ペプチドは前記CARと選択遺伝子の間に位置する、請求項33〜52のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項５５】
前記トランスポゾンは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含み、1つの自己切断ペプチドは前記CARと前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの間に位置する、請求項38〜54のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項５６】
前記トランスポゾンは少なくとも2つの自己切断ペプチドを含み、1つ目の自己切断ペプチドは誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドは、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのの下流に位置する、請求項38〜55のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項５７】
前記トランスポゾンは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含み、1つ目の自己切断ペプチドはCARの上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドは、CARの下流に位置する、請求項32〜56のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項５８】
前記少なくとも1つの自己切断ペプチドは、T2Aペプチド、GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、又はGSG-P2Aペプチドを含む、請求項53〜57のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項５９】
前記T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列を含む、請求項58に記載のトランスポゾン。
【請求項６０】
前記GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列を含む、請求項58に記載のトランスポゾン。
【請求項６１】
前記E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列を含む、請求項58に記載のトランスポゾン。
【請求項６２】
前記GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列を含む．
【請求項６３】
前記F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列を含む、請求項58に記載のトランスポゾン。
【請求項６４】
前記GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列を含む、請求項58に記載のトランスポゾン。
【請求項６５】
前記P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列を含む、請求項58に記載のトランスポゾン。
【請求項６６】
前記GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列を含む、請求項58に記載のトランスポゾン。
【請求項６７】
前記トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである、請求項32〜66のいずれか1項に記載のトランスポゾン。
【請求項６８】
請求項32〜67のいずれか1項に記載のトランスポゾンを含む組成物。．
【請求項６９】
トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドを更に含む、請求項68に記載の組成物。
【請求項７０】
前記トランスポザーゼ酵素をコードする配列はmRNA配列である、請求項69に記載の組成物。
【請求項７１】
前記トランスポザーゼはpiggyBacトランスポザーゼである、請求項68〜70のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記piggyBacトランスポザーゼは、配列番号14487を含むアミノ酸配列を含む、請求項71に記載の組成物。
【請求項７３】
前記piggyBacトランスポザーゼは超活性バリアントであり、該超活性バリアントは、配列番号14487の30、165、282及び538位の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項71又は72に記載の組成物。
【請求項７４】
配列番号14487の30位における前記アミノ酸置換は、イソロイシン（I）の代わりにバリン（V）を置換するもの（I30V）である、請求項73に記載の組成物。
【請求項７５】
配列番号14487の165位における前記アミノ酸置換は、グリシン（G）の代わりにセリン（S）を置換するもの（G165S）である、請求項73に記載の組成物。
【請求項７６】
配列番号14487の282位における前記アミノ酸置換は、メチオニン（M）の代わりにバリン（V）を置換するもの（M282V）である、請求項73に記載の組成物。
【請求項７７】
配列番号14487の538位における前記アミノ酸置換は、アスパラギン（N）の代わりにリシン（K）を置換するもの（N538K）である、請求項73に記載の組成物。
【請求項７８】
前記トランスポザーゼは、Super piggyBac（SPB）トランスポザーゼである、請求項71〜77のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記Super piggyBac（SPB）トランスポザーゼは、配列番号14484を含むアミノ酸配列を含む、請求項78に記載の組成物。
【請求項８０】
請求項1〜30のいずれか1項に記載のCARを含むベクター。
【請求項８１】
前記ベクターはウイルスベクターである、請求項80に記載のベクター。
【請求項８２】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又はそれらの任意の組み合わせから単離された又は由来する配列を含む、請求項81に記載のベクター。
【請求項８３】
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスから単離された又は由来する配列を含む、請求項81又は82に記載のベクター。
【請求項８４】
前記ウイルスベクターは組み換えベクターである、請求項81〜83のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項８５】
前記ベクターは、ナノ粒子ベクターである、請求項80に記載のベクター。
【請求項８６】
前記ナノ粒子ベクターは、核酸、アミノ酸、ポリマー、ミセル、脂質、有機分子、無機分子又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項85に記載のベクター。
【請求項８７】
前記ベクターは選択遺伝子を更に含む、請求項80〜86のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項８８】
前記選択遺伝子は細胞生存可能性および生存能力に必須な遺伝子産物をコードする、請求項87に記載のベクター。
【請求項８９】
選択的細胞培養条件にチャレンジされた場合、前記選択遺伝子は細胞生存可能性および生存能力に必須な遺伝子産物をコードする、請求項87に記載のベクター。
【請求項９０】
前記選択的細胞培養条件が細胞生存可能性又は生存能力に有害な化合物を含み、かつ前記遺伝子産物がその化合物に対する耐性を与えるものである、請求項89に記載のベクター。
【請求項９１】
前記選択遺伝子は、neo、DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ），TYMS（チミジル酸シンセターゼ）、MGMT（O（6）-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ）、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ALDH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1）、FRANCF、RAD51C（RAD51パラログC）、GCS（グルコシルセラミドシンターゼ）、NKX2．2（NK2ホメオボックス2）又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項87〜90のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項９２】
前記ベクターは、以下を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含む：
（a）リガンド結合領域、
（b）リンカー、及び
（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチド、
ここで、前記誘導性カスパーゼポリペプチドは、非ヒト配列を含まない、
請求項80〜91のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項９３】
前記非ヒト配列は制限部位である、請求項92に記載のベクター。
【請求項９４】
前記リガンド結合領域誘導性カスパーゼポリペプチドは、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含む、請求項92又は93に記載のベクター。
【請求項９５】
前記FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記配列の36位において修飾を含む、請求項94に記載のベクター。
【請求項９６】
前記修飾は、36位におけるフェニルアラニン（F）の代わりにバリン（V）を置換するもの（F36V）である、請求項95に記載のベクター。
【請求項９７】
前記FKBP12ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18022）を含むアミノ酸配列によってコードされる、請求項94〜96のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項９８】
前記FKBP12ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT  GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18023）を含む核酸配列によってコードされる、請求項97に記載のベクター。
【請求項９９】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリンカー領域は、GGGGS（配列番号18024）を含むアミノ酸によってコードされる、請求項92〜98のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１００】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリンカー領域は、GGAGGAGGAGGATCC（配列番号18025）を含む核酸配列によってコードされる、請求項99に記載のベクター。
【請求項１０１】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、前記配列の87位においてアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされる、請求項92〜100のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１０２】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの切断型カスパーゼ9ポリペプチド前記配列の282位においてアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされる、請求項92〜101のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１０３】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18026）を含むアミノ酸によってコードされる、請求項92〜102のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１０４】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされる、請求項103に記載のベクター。
【請求項１０５】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS (配列番号18028）を含むアミノ酸配列によってコードされる、請求項92〜104のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１０６】
前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされる、請求項105に記載のベクター。
【請求項１０７】
前記ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含む、請求項80〜106のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１０８】
前記ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含み、1つの自己切断ペプチドは前記CARと前記選択遺伝子の間に位置する、請求項80〜106のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１０９】
前記トランスポゾンは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含み、1つの自己切断ペプチドは前記CARと前記誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの間に位置する、請求項92〜108のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１１０】
前記トランスポゾンは少なくとも2つの自己切断ペプチドを含み、1つ目の自己切断ペプチドは誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドは、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのの下流に位置する、請求項92〜109のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１１１】
前記ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含み、1つ目の自己切断ペプチドはCARの上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドは、CARの下流に位置しする、請求項80〜110のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１１２】
前記少なくとも1つの自己切断ペプチドは、T2Aペプチド、GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、又はGSG-P2Aペプチドを含む、請求項107〜111のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項１１３】
前記T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列を含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１１４】
前記GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列を含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１１５】
前記E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列を含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１１６】
前記GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列を含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１１７】
前記F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列を含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１１８】
前記GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列を含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１１９】
前記P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列を含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１２０】
前記GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列を含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１２１】
請求項80〜120のいずれか1項に記載のベクターを含む組成物。
【請求項１２２】
請求項1〜30のいずれか1項に記載のCARを含む細胞。
【請求項１２３】
請求項32〜79のいずれか1項に記載のトランスポゾン又はトランスポザーゼを含む細胞。
【請求項１２４】
請求項80〜120のいずれか1項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１２５】
前記細胞は細胞表面上にCARを発現する、請求項122〜124のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１２６】
前記細胞は免疫細胞である、請求項122〜125のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１２７】
前記免疫細胞は、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラー（NK）様細胞、造血前駆細胞、末梢血（PB）由来T細胞または臍帯血（UCB）由来T細胞である、請求項126に記載の細胞。
【請求項１２８】
前記ナチュラルキラー（NK）様細胞はサイトカイン誘導キラー（CIK）細胞である、請求項126に記載の細胞。
【請求項１２９】
前記免疫細胞はT細胞である、請求項126に記載の細胞。
【請求項１３０】
前記T細胞は記憶幹T細胞（TSCM）である、請求項129に記載の細胞。
【請求項１３１】
前記TSCMは1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、請求項130に記載の細胞。
【請求項１３２】
前記細胞表面マーカーはCD62L及びCD45RAを含む、請求項131に記載の細胞。
【請求項１３３】
前記細胞表面マーカーはCD45RA、CD95、IL-2Rβ、CR7、及びCD62Lを含む、請求項131に記載の細胞。
【請求項１３４】
前記細胞表面マーカーはCD62L、CD45RA、CD28、CCR7、CD127、CD45RO、CD95、CD95及びIL-2Rβを含む、請求項131に記載の細胞。
【請求項１３５】
前記細胞は人工抗原提示細胞である、請求項122〜125のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１３６】
前記細胞は腫瘍細胞である、請求項122〜125のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１３７】
前記細胞は自己由来である、請求項112〜136のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１３８】
前記細胞は同種他家由来である、請求項112〜136のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１３９】
請求項122〜138のいずれか1項に記載の細胞を含む組成物。
【請求項１４０】
複数の細胞を含む組成物であって、前記複数には請求項122〜138のいずれか1項に記載の細胞の少なくとも1つが含まれる組成物。
【請求項１４１】
複数の細胞を含む組成物であって、前記複数には請求項122〜138のいずれか1項に記載の細胞の少なくとも1つが含まれる組成物。
【請求項１４２】
前記複数は、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％又はその数値の間のいずれかの割合の請求項122〜138のいずれか1項に記載の細胞が含まれる、請求項141に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記複数の細胞のそれぞれの細胞が請求項122〜138のいずれか1項に記載の細胞である、請求項141に記載の組成物。
【請求項１４４】
細胞の表面にキメラ抗原受容体（CAR）を発現させる方法であって、
（a）細胞集団を、その細胞集団内の少なくとも1つの細胞の細胞膜を通してCARを導入させるのに十分な条件下で、請求項1〜30のいずれか1項に記載のCARまたは該CARをコードする配列を含む組成物に接触させることにより、改変された細胞集団を生成すること；
（b）CARの組み込みに適した条件下で、該改変された細胞集団を培養すること；
（c）細胞表面でCARを発現する改変細胞集団から少なくとも1つの細胞を増殖および／または選択すること；
を含む、方法。
【請求項１４５】
前記細胞集団は白血球を含む、請求項144に記載の方法。
【請求項１４６】
前記細胞集団はCD4＋及びCD8＋白血球を最適化された比率で含む、請求項145に記載の方法。
【請求項１４７】
前記CD4＋とCD8＋白血球の最適化された比率はin vivoで天然に生じない、請求項146に記載の方法。
【請求項１４８】
トランスポゾン又はベクターはCARまたはをコードする配列を含む、請求項144に記載の方法。
【請求項１４９】
請求項38〜73のいずれか1項に記載のトランスポゾンはCARまたはをコードする配列を含む、請求項144に記載の方法。
【請求項１５０】
前記トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンを含む、請求項148又は149に記載の方法。
【請求項１５１】
トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドを含む組成物を更に含む、請求項150に記載の方法。
【請求項１５２】
前記トランスポザーゼ酵素をコードする配列はmRNA配列である、請求項151に記載の方法。
【請求項１５３】
前記トランスポザーゼはpiggyBacトランスポザーゼである、請求項151又は152に記載の方法。
【請求項１５４】
前記piggyBacトランスポザーゼは、配列番号14487を含むアミノ酸配列を含む、請求項153に記載の方法。
【請求項１５５】
前記piggyBacトランスポザーゼは超活性バリアントであり、該超活性バリアントは、配列番号14487の30、165、282及び538位の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項153又は154に記載の方法。
【請求項１５６】
配列番号14487の30位における前記アミノ酸置換は、イソロイシン（I）の代わりにバリン（V）を置換するもの（I30V）である、請求項155に記載の方法。
【請求項１５７】
配列番号14487の165位における前記アミノ酸置換は、グリシン（G）の代わりにセリン（S）を置換するもの（G165S）である、請求項155に記載の方法。
【請求項１５８】
配列番号14487の282位における前記アミノ酸置換は、メチオニン（M）の代わりにバリン（V）を置換するもの（M282V）である、請求項155に記載の方法。
【請求項１５９】
配列番号14487の538位における前記アミノ酸置換  は、アスパラギン（N）の代わりにリシン（K）を置換するもの（N538K）である、請求項155に記載の方法。
【請求項１６０】
前記トランスポザーゼは、Super piggyBac（SPB）トランスポザーゼである、請求項153〜159のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記Super piggyBac（SPB）トランスポザーゼは、配列番号14484を含むアミノ酸配列を含む、請求項160に記載の方法。
【請求項１６２】
請求項80〜120のいずれか1項に記載のベクターはCARまたはをコードする配列を含む、請求項144に記載の方法。
【請求項１６３】
前記細胞集団内の少なくとも1つの細胞の細胞膜を通してCARを導入させるのに十分な条件は、ヌクレオフェクションを含む、請求項144、148、149、または162に記載の方法。
【請求項１６４】
（b）の細胞集団内の少なくとも1つの細胞の細胞膜を通してCARを導入させるのに十分な条件は、特定の電圧での1つまたは複数の電気パルス、バッファ、および1つまたは複数の補助因子の適用の少なくとも1つを含む、請求項144〜162のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記バッファが、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトT細胞ヌクレオフェクションバッファまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項164に記載の方法。
【請求項１６６】
前記1つまたは複数の補助因子が、
（a）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン又はそれらの任意の組み合わせ；
（b）塩、ミネラル、代謝産物又はそれらの任意の組み合わせ；
（c）細胞培地；
（d）細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、またはそれらの組み合わせ；及び
（e）1つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬；
を含む、請求項164又は165に記載の方法。
【請求項１６７】
前記組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン又はそれらの任意の組み合わせは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ／IL-1F1、IL-1ベータ／IL-1F2、IL-12 p70、IL-12／IL-35 p35、IL-13、IL-17／IL-17A、IL-17A／Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18／IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32ベータ、IL-32ガンマ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE／TNFSF11／RANK L又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項166に記載の方法。
【請求項１６８】
前記塩、ミネラル、代謝産物又はそれらの任意の組み合わせは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS／FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca（NO3）2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン5、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項166に記載の方法。
【請求項１６９】
前記細胞培地が、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTSOpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項166に記載の方法。
【請求項１７０】
前記細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、またはそれらの組み合わせが、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、Caspase1 Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）、TWS119、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMKの阻害剤又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項166に記載の方法。
【請求項１７１】
前記1つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬が、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含むまたは含まない純正中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項166に記載の方法。
【請求項１７２】
前記CARまたはCARをコードする配列の組み込みに適した条件は、バッファおよび1つまたは複数の補助因子の少なくとも1つを含む、請求項144〜162のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記バッファが、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトT細胞ヌクレオフェクションバッファまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項172に記載の方法。
【請求項１７４】
前記1つまたは複数の補助因子が、
（a）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン又はそれらの任意の組み合わせ；
（b）塩、ミネラル、代謝産物又はそれらの任意の組み合わせ；
（c）細胞培地；
（d）細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、またはそれらの組み合わせ；及び
（e）1つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬；
を含む、請求項172又は173に記載の方法。
【請求項１７５】
前記組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン又はそれらの任意の組み合わせは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ／IL-1F1、IL-1ベータ／IL-1F2、IL-12 p70、IL-12／IL-35 p35、IL-13、IL-17／IL-17A、IL-17A／Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18／IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32ベータ、IL-32ガンマ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE／TNFSF11／RANK L又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項174に記載の方法。
【請求項１７６】
前記塩、ミネラル、代謝産物又はそれらの任意の組み合わせは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS／FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca（NO3）2、Tris／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン5、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項174に記載の方法。
【請求項１７７】
前記細胞培地が、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTSOpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項174に記載の方法。
【請求項１７８】
前記細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、またはそれらの組み合わせが、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、Caspase1 Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）、TWS119、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMKの阻害剤又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項174に記載の方法。
【請求項１７９】
前記1つまたは複数の核酸を修飾または安定化する試薬が、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含むまたは含まない純正中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項164に記載の方法。
【請求項１８０】
（d）の増殖と選択が連続して行われる、請求項144〜179のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８１】
増殖が選択の前に行われる、請求項180に記載の方法。
【請求項１８２】
増殖と選択の後に行われる、請求項180に記載の方法。
【請求項１８３】
増殖の後に更なる選択が行われる、請求項182に記載の方法。
【請求項１８４】
（d）の増殖と選択が同時に行われる、請求項144〜179のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８５】
増殖が、前記改変された細胞集団の少なくとも1つの細胞を抗原と接触させて、CARを介して少なくとも1つの細胞を刺激することを含む、請求項144〜184のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記抗原が基質の表面上に提示される、請求項185に記載の方法。
【請求項１８７】
前記基質が単数又は複数のビーズである、請求項186に記載の方法。
【請求項１８８】
前記ビーズまたは複数のビーズが改変された細胞集団から増殖後に分離される、請求項187に記載の方法。
【請求項１８９】
前記抗原が細胞の表面に提示される、請求項185に記載の方法。
【請求項１９０】
前記抗原が人工抗原提示細胞の表面に提示される、請求項189に記載の方法。
【請求項１９１】
前記トランスポゾンまたはベクターは選択遺伝子を含み、前記選択ステップは、前記改変された細胞集団の少なくとも1つの細胞を、選択遺伝子が耐性を付与する化合物と接触させることを含み、それにより、選択遺伝子を発現する細胞を選択から生存したものとして同定し、選択遺伝子を発現できない細胞は選択ステップから生存できないとして同定する、請求項144〜190のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記増殖および選択ステップが、端点を含めて10〜14日の期間にわたって進行する、請求項144〜191のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９３】
請求項144〜192のいずれか一項に記載の増殖および選択された細胞集団を含む組成物。
【請求項１９４】
請求項31、68〜79、121、133または183のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、CARが腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項１９５】
前記腫瘍細胞は悪性腫瘍細胞である、請求項184に記載の方法。
【請求項１９６】
前記細胞または細胞集団が自己由来である、請求項133または179に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項184又は185に記載の方法。
【請求項１９７】
前記細胞または細胞集団が同種他家由来である、請求項133または179に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項184又は185に記載の方法。
【請求項１９８】
請求項31、68〜79、121、143、または193のいずれか1項に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の自己免疫状態を治療する方法であって、CARが特異的に対象の自己免疫細胞上の抗原に結合する、方法。
【請求項１９９】
前記自己免疫細胞が、対象の標的細胞上の自己抗原に特異的に結合するリンパ球である、請求項198に記載の方法。
【請求項２００】
前記自己免疫細胞がBリンパ球である、請求項198又は199に記載の方法。
【請求項２０１】
前記自己免疫細胞がTリンパ球である、請求項198又は199に記載の方法。
【請求項２０２】
前記細胞又は細胞集団は自己由来である、請求項133又は179に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項198〜201のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記細胞又は細胞集団は同種他家由来である、請求項143又は189に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項198〜201のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０４】
請求項31、68-79、121、143又は193のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における感染を治療または予防する方法であって、CARが感染因子を含む細胞、感染因子が伝染している細胞、または感染因子に曝露された細胞上の抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項２０５】
前記感染因子は、細菌、ウイルス、酵母または微生物である、請求項204に記載の方法。
【請求項２０６】
前記感染因子は、感染、免疫不全状態、炎症状態、および増殖性障害の1つまたは複数を誘発する可能性がある、請求項204又は205に記載の方法。
【請求項２０７】
前記感染は、結核、小脳症、神経変性又はマラリアを引き起こす、請求項206に記載の方法。
【請求項２０８】
前記感染は対象の胎児の小脳症を引き起こす、請求項206又は207に記載の方法。
【請求項２０９】
前記感染因子はウイルスであり、該ウイルスはジカウイルスである、請求項208に記載の方法。
【請求項２１０】
前記免疫不全状態は後天性免疫不全症候群（AIDS）である、請求項206に記載の方法。
【請求項２１１】
前記増殖性障害は癌である、請求項206に記載の方法。
【請求項２１２】
前記癌は子宮頸癌であり、前記感染因子はヒトパピローマウイルス（HPV）である、請求項211に記載の方法。
【請求項２１３】
前記細胞または細胞集団が自己由来である、請求項143または189に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項204〜212のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１４】
前記細胞または細胞集団が同種他家由来である、請求項143または189に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項204〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１５】
請求項31、68〜79、121、143、または193のいずれか1項に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象のマスト細胞疾患を治療する方法であって、CARが特異的に対象のマスト細胞上の抗原に結合する、方法。
【請求項２１６】
前記マスト細胞疾患は、マスト細胞の過剰増殖に関連する疾患である、請求項215に記載の方法。
【請求項２１７】
前記マスト細胞疾患は肥満細胞症である、請求項216に記載の方法。
【請求項２１８】
前記マスト細胞疾患は、マスト細胞の異常活性に関連する疾患である、請求項217に記載の方法。
【請求項２１９】
前記マスト細胞疾患は、マスト細胞活性化症候群（MCAS）、アレルギー性疾患、喘息または炎症性疾患である、請求項218に記載の方法。
【請求項２２０】
前記細胞または細胞集団が自己由来である、請求項143または189に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項215〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２１】
前記細胞又は細胞集団は同種他家由来である、請求項143又は189に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項215〜219のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２２】
請求項31、68〜79、121、143、または193のいずれか1項に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の変性疾患を治療する方法であって、CARが特異的に対象の有害細胞または老化細胞上の抗原に結合する、方法。
【請求項２２３】
前記変性疾患は、神経変性障害、代謝障害、血管障害または老化である、請求項222に記載の方法。
【請求項２２４】
前記変性疾患は神経変性障害であり、前記有害細胞または老化細胞は、幹細胞、免疫細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである、請求項222又は223に記載の方法。
【請求項２２５】
前記変性疾患は代謝障害であり、前記有害細胞または老化細胞は、幹細胞、体細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである、請求項222又は223に記載の方法。
【請求項２２６】
前記変性疾患は血管障害であり、前記有害細胞または老化細胞は、幹細胞、体細胞、免疫細胞、内皮細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである、請求項222又は223に記載の方法。
【請求項２２７】
前記変性疾患は老化であり、前記有害細胞または老化細胞は、卵母細胞、精子、幹細胞、体細胞、免疫細胞、内皮細胞、ニューロン、グリアまたはミクログリアである、請求項222又は223に記載の方法。
【請求項２２８】
前記細胞又は細胞集団は自己由来である、請求項133又は179に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項222〜227のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２９】
前記細胞又は細胞集団は同種他家由来である、請求項143又は189に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項222〜227のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３０】
請求項32〜67のいずれか1項に記載のトランスポゾンを含む細胞を含む組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における細胞療法を改変する方法であって、前記細胞を誘導剤と接触させることにより該細胞内でアポトーシスを選択的に誘導することができる、方法。
【請求項２３１】
請求項80〜120のいずれか1項に記載のベクターを含む細胞を含む組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における細胞療法を改変する方法であって、前記細胞を誘導剤と接触させることにより該細胞内でアポトーシスを選択的に誘導することができる、方法。
【請求項２３２】
前記細胞は自己由来である、請求項230又は231に記載の方法。
【請求項２３３】
前記細胞は同種他家由来である、請求項230又は231に記載の方法。
【請求項２３４】
前記細胞療法は養子細胞療法である、請求項230〜233のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３５】
前記改変が細胞療法の終了である、請求項230〜234のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３６】
前記改変が前記細胞療法において提供される細胞の一部の枯渇である、請求項230〜234のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３７】
前記誘導剤の阻害剤を投与し前記て細胞療法の改変を阻害し、それにより該細胞療法の機能および／または効力を回復させるステップをさらに含む、請求項230〜236のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2017年12月20日に出願された仮出願USSN第62/608,571号と、2017年12月21日に出願された仮出願USSN第62/608,894号の恩恵を主張するものであり、そのそれぞれの内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本開示は分子生物学に向けられたものであり、より具体的には、キメラ抗原受容体と、1つまたは複数のVCARを含有するトランスポゾンのほか、それを製造する方法と利用する方法に向けられている。
【０００３】
参照による配列リストの組み込み
「POTH-034_001WO_SeqListing_ST25_R.txt」という名称のファイルは2018年12月19日に作成されたものであり、サイズが54.4 MBであって、その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００４】
伝統的な抗体配列又はその断片を用いずに免疫細胞の特異性を方向づける方法の必要性が本分野で長い間感じられてきたが、その必要性は満たされていない。本開示により、優れたキメラ抗原受容体が提供される。
【発明の概要】
【０００５】
本開示により、（a）抗原認識領域を含むエクトドメイン、ここで抗原認識領域は少なくとも1つの単一ドメイン抗体を含む；（b）膜貫通ドメイン；及び（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）が提供される。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト配列又はヒト化配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、天然に存在しない配列を含んでいる。単一ドメイン抗体は、組換え配列又はキメラ配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、VHH、又はVHHをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、VH、又はVHをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、本開示のVH、又は本開示のVHをコードする配列を含んでいる。
【０００６】
本開示により、（a）抗原認識領域を含むエクトドメイン、ここで抗原認識領域は少なくとも1つのVHHを含む；（b）膜貫通ドメイン；及び（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）が提供される。本開示の全体を通じ、VHHを含むCARをVCARと呼ぶ。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、二重特異性VCAR又はタンデムVCARを生成させるため2つのVHHを含むことができる。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、三重特異性VCARを生成させるため3つのVHHを含むことができる。
【０００７】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、エクトドメインはシグナルペプチドを更に含むことができる。その代わりに、又はそれに加えて、いくつかの実施態様では、エクトドメインは抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジを更に含むことができる。いくつかの実施態様では、エクトドメインはシグナルペプチドを更に含むことができる。その代わりに、又はそれに加えて、いくつかの実施態様では、エクトドメインは抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジを更に含むことができる。
【０００８】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamnwvrqapgkglewvagiigsggstyyadsvkgrfsisrdnskntldlqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-A；配列番号18000）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいはVHHは、核酸配列：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcagctacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccggaatcatcggcagcggcggcagcacatattacgccgattctgtgaagggccgcttcagcatcagccgggacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgagagccgaggataccgccgtgtactactgcgtgaaggattggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-A；配列番号18001）を含むか、この核酸配列からなる。
【０００９】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggsltlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsgiigsgattyyadsvkgrftisrdnskntlnlqmnslraedtaiyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-B；配列番号18002）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいはVHHは、核酸配列：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgacactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttgaatgggtgtccggcatcattggctctggcgccaccacctactacgccgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgaacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccatctactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-B；配列番号18003）を含むか、この核酸配列からなる。
【００１０】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgeslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsgivggggtsyyadsvrgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-C；配列番号18004）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいはVHHは、核酸配列：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcagcctggcgaatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttgaatgggtgtccggaatcgttggcggcggaggcacaagctactacgccgattctgtgcggggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-C；配列番号18005）を含むか、この核酸配列からなる。
【００１１】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamtwirqapgkglewvsgitgdggstfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-D；配列番号18006）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいはVHHは、核酸配列：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaattacgccatgacctggatcagacaggcccctggcaaaggcctggaatgggtgtccggaattacaggcgacggcggcagcaccttttacgccgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-D；配列番号18007）を含むか、この核酸配列からなる。
【００１２】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglaqpggslrlscaasgftfssyamnwirqapgkglewvsgisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-E；配列番号18008）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいはVHHは、核酸配列：
atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccgaggtgcagctgctggagtccggaggaggcctggcccagcctggcggcagcctgaggctgtcctgcgccgcctctggcttcacctttagctcctacgccatgaactggatcagacaggcccctggcaagggcctggagtgggtgtccggcatctccggctctggaggctctacatactatgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcagagataactccaagaataccgtgtacctccagatgaactctctgcgggccgaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagaggggccagggcaccctggtgacagtgtctagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccggcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggcaggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-E；配列番号18009）を含むか、この核酸配列からなる。
【００１３】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgrslrlscaasgftftnyamnwvrqapgkglewvsgisggggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-F；配列番号18010）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいはVHHは、核酸配列：
atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccgaggtgcagctgctggagtctggaggaggcctggtgcagcccggccggtccctgagactgtcttgcgccgccagcggcttcacctttacaaactacgccatgaattgggtgcggcaggcccctggcaagggcctggagtgggtgtctggcatcagcggaggaggaggcagcacctactatgcagactccgtgaagggcaggttcaccatctcccgcgataactctaagaatacactgtacctccagatgaacagcctgagggcagaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagaggggacagggcaccctggtgaccgtgagcagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccggcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggcaggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-F；配列番号18011）を含むか、この核酸配列からなる。
【００１４】
本開示により、（a）抗原認識領域を含むエクトドメイン、ここで、抗原認識領域は少なくとも1つのVHを含む；（b）膜貫通ドメイン；及び（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）が提供される。本開示の全体を通じ、VHを含むCARをVCARと呼ぶ。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、二重特異性VCAR又はタンデムVCARを生成させるため2つのVHHを含むことができる。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、三重特異性VCARを生成させるため3つのVHHを含むことができる。いくつかの実施態様では、エクトドメインは、シグナルペプチドを更に含むことができる。その代わりに、又はそれに加えて、いくつかの実施態様では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジを更に含むことができる。いくつかの実施態様では、エクトドメインは、シグナルペプチドを更に含むことができる。その代わりに、又はそれに加えて、いくつかの実施態様では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジを更に含むことができる。
【００１５】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、抗原認識領域を含むエクトドメイン（ここで、抗原認識領域は少なくとも1つのVHを含んでいる）を含むVCARを含め、VHは、ヒト配列又はヒト化配列を含んでいる。
【００１６】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、抗原認識領域を含むエクトドメイン（ここで、抗原認識領域は少なくとも1つのVHを含んでいる）を含むVCARを含め、VHは天然に存在しない配列を含んでいる。
【００１７】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、抗原認識領域を含むエクトドメイン（ここで、抗原認識領域は少なくとも1つのVHを含んでいる）を含むVCARを含め、VHは天然に存在しない。
【００１８】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、抗原認識領域を含むエクトドメイン（ここで、抗原認識領域は少なくとも1つのVHを含んでいる）を含むVCARを含め、VHは、組換え配列又はキメラ配列を含んでいる。
【００１９】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、抗原認識領域を含むエクトドメイン（ここで、抗原認識領域は少なくとも1つのVHを含んでいる）を含むVCARを含め、VHは、インビトロでのアフィニティ選択と組換えの手続きによって生成される。
【００２０】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamnwvrqapgkglewvagiigsggstyyadsvkgrfsisrdnskntldlqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-A；配列番号18000）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
あるいはVHは、核酸配列：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcagctacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccggaatcatcggcagcggcggcagcacatattacgccgattctgtgaagggccgcttcagcatcagccgggacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgagagccgaggataccgccgtgtactactgcgtgaaggattggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-A；配列番号18001）を含むか、この核酸配列からなる。
【００２１】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggsltlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsgiigsgattyyadsvkgrftisrdnskntlnlqmnslraedtaiyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-B；配列番号18002）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
あるいはVHは、核酸配列：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgacactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttgaatgggtgtccggcatcattggctctggcgccaccacctactacgccgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgaacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccatctactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-B；配列番号18003）を含むか、この核酸配列からなる。
【００２２】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgeslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsgivggggtsyyadsvrgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-C；配列番号18004）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
あるいはVHは、核酸配列：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcagcctggcgaatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttgaatgggtgtccggaatcgttggcggcggaggcacaagctactacgccgattctgtgcggggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-C；配列番号18005）を含むか、この核酸配列からなる。
【００２３】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamtwirqapgkglewvsgitgdggstfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-D；配列番号18006）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
あるいはVHは、核酸配列：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaattacgccatgacctggatcagacaggcccctggcaaaggcctggaatgggtgtccggaattacaggcgacggcggcagcaccttttacgccgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-D；配列番号18007）を含むか、この核酸配列からなる。
【００２４】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglaqpggslrlscaasgftfssyamnwirqapgkglewvsgisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-E；配列番号18008）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
あるいはVHは、核酸配列：
atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccgaggtgcagctgctggagtccggaggaggcctggcccagcctggcggcagcctgaggctgtcctgcgccgcctctggcttcacctttagctcctacgccatgaactggatcagacaggcccctggcaagggcctggagtgggtgtccggcatctccggctctggaggctctacatactatgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcagagataactccaagaataccgtgtacctccagatgaactctctgcgggccgaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagaggggccagggcaccctggtgacagtgtctagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccggcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggcaggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-E；配列番号18009）を含むか、この核酸配列からなる。
【００２５】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VHは、アミノ酸配列：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgrslrlscaasgftftnyamnwvrqapgkglewvsgisggggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（VH-F；配列番号18010）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
あるいはVHは、核酸配列：
atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccgaggtgcagctgctggagtctggaggaggcctggtgcagcccggccggtccctgagactgtcttgcgccgccagcggcttcacctttacaaactacgccatgaattgggtgcggcaggcccctggcaagggcctggagtgggtgtctggcatcagcggaggaggaggcagcacctactatgcagactccgtgaagggcaggttcaccatctcccgcgataactctaagaatacactgtacctccagatgaacagcctgagggcagaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagaggggacagggcaccctggtgaccgtgagcagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccggcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggcaggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（VH-F；配列番号18011）を含むか、この核酸配列からなる。
【００２６】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、単一ドメイン抗体、VHH、VH、又はそれらの組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体、VHH、又はVHは、組換え配列及び／又はキメラ配列を含むか、これら配列からなる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体、VHH、又はVHは、ヒト配列及び／又はヒト化配列を含むか、これら配列からなる。
【００２７】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは単一ドメイン抗体を含んでいる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、VHH抗体又はVH抗体である。いくつかの実施態様では、VH抗体はUniDab抗体である。いくつかの実施態様では、VH抗体は、天然に存在するモノクローナル抗体の断片ではない。
【００２８】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、ヒトのCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB、又はGM-CSFRシグナルペプチドをコードする配列を含むことができる。本開示のVCARのいくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、ヒトCD8αシグナルペプチドをコードする配列を含むことができる。ヒトCD8αシグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号18012）を含むアミノ酸配列を含むことができる。ヒトCD8αシグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号18012）を含むアミノ酸配列、又はMALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号18012）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。ヒトCD8αシグナルペプチドは、atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca（配列番号18013）を含む核酸配列によってコードすることができる。
【００２９】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒトのCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB、又はGM-CSFR 膜貫通ドメインをコードする配列を含むことができる。本開示のVCARのいくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α膜貫通ドメインをコードする配列を含むことができる。CD8α膜貫通ドメインは、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号18014）を含むアミノ酸配列、又はIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号18014）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。CD8α膜貫通ドメインは、atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactg
c（配列番号18015）を含む核酸配列によってコードすることができる。
【００３０】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、エンドドメインは、ヒトCD3ζエンドドメインを含むことができる。
【００３１】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトの4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、 OX-40細胞内セグメントのいずれか、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のVCARのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、CD28及び／又は4-1BB共刺激ドメインを含むことができる。CD3ゼータ共刺激ドメインは、
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号18016）を含むアミノ酸配列、又は
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号18016）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。CD3ゼータ共刺激ドメインは、
cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg（配列番号18017）を含む核酸配列によってコードすることができる。4-1BB共刺激ドメインは、
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号18018）を含むアミノ酸配列、又はKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号18018）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。4-1BB共刺激ドメインは、
aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg（配列番号18019）を含む核酸配列によってコードすることができる。4-1BB共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとCD28共刺激ドメインの間に位置することができる。
【００３２】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、ヒンジは、ヒトのCD8α、IgG4、及び／又はCD4配列に由来する配列を含むことができる。本開示のVCARのいくつかの実施態様では、ヒンジは、ヒトCD8α配列に由来する配列を含むことができる。ヒンジは、
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号18020）を含むヒトCD8αアミノ酸配列、又はTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDF
ACD（配列番号18020）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。ヒトCD8αヒンジアミノ酸配列は、
actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac（配列番号18021）を含む核酸配列によってコードすることができる。
【００３３】
本開示のVHH及び／又はVCARは、10-9 M以下、10-10 M以下、10-11 M以下、10-12 M以下、10-13 M以下、10-14 M以下、及び10-15 M以下のKDから選択される少なくとも1つの親和性をもって抗原と結合することができる。KDは、表面プラズモン共鳴によって求めることができる。
【００３４】
本開示により、抗BCMA VCARが提供される。本開示により、本開示のVCARと、医薬的に許容される少なくとも1つの基剤を含む組成物が提供される。
【００３５】
本開示により、本開示のVCARを含むトランスポゾンが提供される。
【００３６】
本開示のトランスポゾンは、トランスポゾンを発現する細胞を同定、富化、及び／又は単離するための選択遺伝子を含むことができる。代表的な選択遺伝子は、細胞生存可能性（viability）及び生存能力（survival）に必須な任意の遺伝子産物（例えば転写産物、タンパク質、酵素）をコードしている。代表的な選択遺伝子は、その選択遺伝子によってコードされる遺伝子産物が不在であるときに細胞が感受性である（又は細胞にとって致死的である可能性がある）薬チャレンジに対する耐性を付与するのに必須な任意の遺伝子産物（例えば転写産物、タンパク質、酵素）をコードしている。代表的な選択遺伝子は、その選択遺伝子が不在のときに細胞生存可能性及び／又は生存能力に必須な1つまたは複数の栄養素が欠けた細胞培地の中での生存可能性及び／又は生存能力に必須な任意の遺伝子産物（例えば転写産物、タンパク質、酵素）をコードしている。代表的な選択遺伝子の非限定的な例に含まれるのは、neo（ネオマイシンに対する耐性を与える）、DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードしていてメトトレキサートに対する耐性を与える）、TYMS（チミジル酸シンテターゼをコードしている）、MGMT（O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼをコードしている）、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ALDH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1をコードしている）、FRANCF、RAD51C（RAD51パラログCをコードしている）、GCS（グルコシルセラミドシンターゼをコードしている）、NKX2.2（NK2ホメオボックス2をコードしている）である。
【００３７】
本開示のトランスポゾンは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）アポトーシス促進ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、多量体リガンド結合領域を含むことができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、「iC9安全スイッチ」と呼ぶこともできる。いくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の36位に修飾を含むことができる。修飾として、36位のフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）が可能である。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18022）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18023）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域に対して特異的な誘導剤は、36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。誘導剤には、AP20187及び／又はAP1903が含まれる（両方とも合成薬）。
【００３８】
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リンカー領域は、GGGGS（配列番号18024）を含むアミノ酸、又はGGAGGAGGAGGATCC（配列番号18025）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含んでいない。
【００３９】
本開示の切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。その代わりに、又はそれに加えて、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18026）を含むアミノ酸、又は
TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされている。
【００４０】
切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含む本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのいくつかの実施態様では、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18028）を含むアミノ酸配列、又は
ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされている。
【００４１】
本開示のトランスポゾンは、例えば本開示の1つまたは複数のVHH又はVCARと本開示の選択遺伝子の間に位置する少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。本開示のトランスポゾンは、例えば本開示の1つまたは複数のVHH又はVCARと本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの間に位置する少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。本開示のトランスポゾンは少なくとも2つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つ目の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの上流又はすぐ上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの下流又はすぐ下流に位置する。
【００４２】
少なくとも1つの自己切断ペプチドは、例えばT2Aペプチド、GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、又はGSG-P2Aペプチドを含むことができる。T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列、又はEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列、又はGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号18032）を含む核酸配列を含むことができる。E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列、又はQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列、又はGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列、又はVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列、又はGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列、又はATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列、又はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。
【００４３】
本開示のトランスポゾンは、1つ目と2つ目の自己切断ペプチドを含むことができ、1つ目の自己切断ペプチドは、例えば本開示の1つまたは複数のVHH又はVCARの上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドは、例えば本開示の1つまたは複数のVHH又はVCARの下流に位置する。1つ目及び／又は2つ目の自己切断ペプチドは、例えばT2Aペプチド、 GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、又はGSG-P2Aペプチドを含むことができる。T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列、又はEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列、又はGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号18032）を含む核酸配列を含むことができる。E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列、又はQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列、又はGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列、又はVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列、又はGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列、又はATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列、又はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。
【００４４】
本開示により、本開示のトランスポゾンを含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、トランスポゾン酵素をコードする配列を含むプラスミドを更に含むことができる。トランスポゾン酵素をコードする配列としてmRNA配列が可能である。
【００４５】
本開示のトランスポゾンは、piggyBacトランスポゾンを含むことができる。この方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾンは、2つのシス調節インシュレータエレメントが隣接したキメラ抗原受容体をコードする配列を有するプラスミドDNAトランスポゾンである。いくつかの実施態様では、トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである。本開示のトランスポゾン酵素は、piggyBacトランスポザーゼ、又はそれと適合性のある酵素を含むことができる。いくつかの実施態様、特にトランスポザーゼがpiggyBacトランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼは、piggyBacトランスポザーゼ又はスーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼである。いくつかの実施態様、特にトランスポザーゼがスーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼである実施態様では、トランスポザーゼをコードする配列はmRNA配列である。
【００４６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることが可能である。
【００４７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、このトランスポザーゼ酵素は、配列：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）の30位、165位、282位、又は538位の1つまたは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。
【００４８】
いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、又は538位の1つまたは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、又は538位の3つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、及び538位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の30位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の165位のアミノ酸置換は、グリシン（G）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の282位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の538位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からリシン（K）への置換である。
【００４９】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、スーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、本開示のスーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素は、30位のアミノ酸置換がイソロイシン（I）からバリン（V）への置換であり、165位のアミノ酸置換がグリシン（G）からセリン（S）への置換であり、282位の置換がメチオニン（M）からバリン（V）への置換であり、538位のアミノ酸置換がアスパラギン（N）からリシン（K）への置換である配列番号14487のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることが可能である。いくつかの実施態様では、スーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）と少なくとも70％、80％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることが可能である。
【００５０】
本開示により、本開示のVCARを含むベクターが提供される。いくつかの実施態様では、ベクターはウイルスベクターである。ベクターとして組換えベクターが可能である。
【００５１】
本開示のウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はそれらの任意の組み合わせから単離された配列か、それらに由来する配列を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離された配列、又はAAVに由来する配列を含むことができる。ウイルスベクターは、組換えAAV（rAAV）を含むことができる。本開示の代表的なアデノ随伴ウイルスと組換えアデノ随伴ウイルスは、本開示のVHH又はVCARをコードする配列の隣にシスで位置する2つ又はそれよりも多い逆方向末端反復（ITR）を含んでいる。本開示の代表的なアデノ随伴ウイルスと組換えアデノ随伴ウイルスの非限定的な例に含まれるのは、あらゆる血清型（例えばAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、及びAAV9）である。本開示の代表的なアデノ随伴ウイルスと組換えアデノ随伴ウイルスの非限定的な例に含まれるのは、自己相補的AAV（scAAV）と、1つの血清型のゲノムとそれとは別の血清型のカプシドを含むAAVハイブリッド（例えばAAV2/5、AAV-DJ、及びAAV-DJ8）である。本開示の代表的なアデノ随伴ウイルスと組換えアデノ随伴ウイルスの非限定的な例に含まれるのは、rAAV-LK03である。
【００５２】
本開示のウイルスベクターは選択遺伝子を含むことができる。選択遺伝子は、細胞の生存可能性と生存能力に必須な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的な細胞培地条件によってチャレンジされるとき、細胞の生存可能性と生存能力に必須な遺伝子産物をコードすることができる。選択的な細胞培地条件は、細胞の生存可能性又は生存能力にとって有害な化合物を含んでいる可能性があり、遺伝子産物がその化合物に対する耐性を与える。本開示の代表的な選択遺伝子の非限定的な例に含めることができるのは、neo（ネオマイシンに対する耐性を与える）、DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードしていてメトトレキサートに対する耐性を与える）、TYMS（チミジル酸シンテターゼをコードしている）、MGMT（O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼをコードしている）、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ALDH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1をコードしている）、FRANCF、RAD51C（RAD51パラログCをコードしている）、GCS（グルコシルセラミドシンターゼをコードしている）、NKX2.2（NK2ホメオボックス2をコードしている）、又はそれらの任意の組み合わせである。
【００５３】
本開示のウイルスベクターは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）アポトーシス促進ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域として、多量体リガンド結合領域が可能である。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、「iC9安全スイッチ」と呼ぶこともできる。いくつかの実施態様では、本開示のウイルスベクターは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のウイルスベクターは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のウイルスベクターは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の36位に修飾を含むことができる。修飾として、36位のフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）が可能である。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18022）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAG
GGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18023）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域に対して特異的な誘導剤は、36位にフェニルアラニン（F）の代わりにバリン（V）（F36V）を有するFK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。誘導剤には、AP20187及び／又はAP1903が含まれる（両方とも合成薬である）。
【００５４】
本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リンカー領域は、GGGGS（配列番号18024）を含むアミノ酸、又はGGAGGAGGAGGATCC（配列番号18025）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含まない。
【００５５】
本開示の切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。その代わりに、又はそれに加えて、本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18026）を含むアミノ酸配列、又は
TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされている。
【００５６】
切断カスパーゼ9ポリペプチドを含む誘導性アポローシス促進ポリペプチドのいくつかの実施態様では、誘導性アポローシス促進ポリペプチドは、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18028）を含むアミノ酸配列、又は
ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされている。
【００５７】
本開示のウイルスベクターは、少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、ベクターは、少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つの自己切断ペプチドはCARと選択遺伝子の間に位置している。いくつかの実施態様では、ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つ目の自己切断ペプチドがCARの上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドはCARの下流に位置している。本開示のウイルスベクターは、例えば本開示のVCAR、VCAR、又はVCARの1つまたは複数と本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの間に位置する少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。本開示のウイルスベクターは少なくとも2つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つ目の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの上流又はすぐ上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの下流又はすぐ下流に位置する。自己切断ペプチドは、例えばT2Aペプチド、 GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、又はGSG-P2Aペプチドを含むことができる。T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列、又はEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列、又はGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号18032）を含む核酸配列を含むことができる。E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列、又はQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列、又はGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列、又はVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列、又はGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列、又はATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列、又はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。
【００５８】
本開示により、本開示のVCARを含むベクターが提供される。いくつかの実施態様では、ベクターはナノ粒子である。本開示の代表的なナノ粒子ベクターの非限定的な例に含まれるのは、核酸（例えばRNA、DNA、合成ヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせ）、アミノ酸（L-アミノ酸、D-アミノ酸、合成アミノ酸、改変されたアミノ酸、又はそれらの任意の組み合わせ）、ポリマー（例えばポリマーソーム）、ミセル、脂質（例えばリポソーム）、有機分子（例えば炭素原子、炭素シート、炭素ファイバー、炭素チューブ）、無機分子（例えばリン酸カルシウム、又は金）、又はそれらの任意の組み合わせである。ナノ粒子ベクターは細胞膜を通じて受動的又は能動的に輸送することができる。
【００５９】
本開示のナノ粒子ベクターは選択遺伝子を含むことができる。選択遺伝子は、細胞の生存可能性と生存能力に必須な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的な細胞培地条件によってチャレンジされるとき、細胞の生存可能性と生存能力に必須な遺伝子産物をコードすることができる。選択的な細胞培地条件は、細胞の生存可能性又は生存能力にとって有害な化合物を含んでいる可能性があり、遺伝子産物がその化合物に対する耐性を与える。本開示の代表的な選択遺伝子の非限定的な例に含めることができるのは、neo（ネオマイシンに対する耐性を与える）、DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードしていてメトトレキサートに対する耐性を与える）、TYMS（チミジル酸シンテターゼをコードしている）、MGMT（O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼをコードしている）、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ALDH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1をコードしている）、FRANCF、RAD51C（RAD51パラログCをコードしている）、GCS（グルコシルセラミドシンターゼをコードしている）、NKX2.2（NK2ホメオボックス2をコードしている）、又はそれらの任意の組み合わせである。
【００６０】
本開示のナノ粒子ベクターは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）アポトーシス促進ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域として、多量体リガンド結合領域が可能である。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、「iC9安全スイッチ」と呼ぶこともできる。いくつかの実施態様では、本開示のナノ粒子ベクターは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のナノ粒子ベクターは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のナノ粒子ベクターは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の36位に修飾を含むことができる。修飾として、36位のフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）が可能である。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18022）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18023）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域に対して特異的な誘導剤は、36位にフェニルアラニン（F）の代わりにバリン（V）（F36V）を有するFK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。誘導剤には、AP20187及び／又はAP1903が含まれる（両方とも合成薬である）。
【００６１】
本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リンカー領域は、GGGGS（配列番号18024）を含むアミノ酸、又はGGAGGAGGAGGATCC（配列番号18025）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含んでいない。
【００６２】
本開示の切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。その代わりに、又はそれに加えて、本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18026）を含むアミノ酸配列、又は
TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされている。
【００６３】
切断カスパーゼ9ポリペプチドを含む誘導性アポローシス促進ポリペプチドのいくつかの実施態様では、誘導性アポローシス促進ポリペプチドは、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18028）を含むアミノ酸配列、又は
ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされている。
【００６４】
本開示のナノ粒子ベクターは、少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つの自己切断ペプチドは、VCARとナノ粒子の間に位置する。いくつかの実施態様では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つ目の自己切断ペプチドはVCARの上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドはVCARの下流に位置する。いくつかの実施態様では、ナノ粒子ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つ目の自己切断ペプチドはVCARとナノ粒子の間に位置し、2つ目の自己切断ペプチドはVCARの下流に位置する。いくつかの実施態様では、ナノ粒子ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つ目の自己切断ペプチドはVCARとナノ粒子の間に位置し、2つ目の自己切断ペプチドはVCARの下流の例えばVCARと選択遺伝子の間に位置する。
【００６５】
本開示のナノ粒子ベクターは、例えば本開示の1つまたは複数のVHH又はVCARと本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの間に位置する少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。本開示のナノ粒子ベクターは少なくとも2つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つ目の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチドの上流又はすぐ上流に位置し、2つ目の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチドの下流又はすぐ下流に位置する。自己切断ペプチドは、例えばT2Aペプチド、GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、又はGSG-P2Aペプチドを含むことができる。T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列、又はEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18030）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列、又はGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18031）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号18032）を含む核酸配列を含むことができる。E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列、又はQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18033）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列、又はGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列、又はVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列、又はGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列、又はATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列、又はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18038）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％一致する配列を含むことができる。
【００６６】
本開示により、本開示のベクターを含む組成物が提供される。
【００６７】
本開示により、本開示のVCARを含む細胞が提供される。本開示により、本開示のトランスポゾンを含む細胞が提供される。いくつかの実施態様では、本開示のVCAR、トランスポゾン、又はベクターを含む細胞は、細胞表面にVCARを発現することができる。細胞として任意のタイプの細胞が可能である。細胞は免疫細胞であることが好ましい。免疫細胞として、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラー（NK）様細胞、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞、造血前駆細胞、末梢血（PB）由来T細胞、又は臍帯血（UCB）由来T細胞が可能である。免疫細胞はT細胞であることが好ましい。T細胞として、初期記憶細胞、幹様T細胞、TSCM様細胞、TSCM、又はTCMが可能である。T細胞としてTSCMが可能である。細胞として人工抗原提示細胞が可能であり、場合によってはこれを、本開示の改変された免疫細胞又はT細胞の刺激と増殖に用いることができる。細胞として腫瘍細胞が可能であり、場合によってはこれを、人工抗原提示細胞又は改変抗原提示細胞として用いることができる。
【００６８】
養子療法で使用できる本開示の改変された細胞として、自己由来又は同種他家由来のものが可能である。
【００６９】
本開示により、細胞表面にVCARを発現させる方法として、（a）細胞集団を取得し；（b）その細胞集団を、その細胞集団内の少なくとも1つの細胞の細胞膜を通してCARを導入するのに十分な条件下で、本開示のVCAR、又はVCARをコードする配列を含む組成物に接触させることにより、改変された細胞集団を生成させ；（c）トランスポゾンの組み込みに適した条件下で、その改変された細胞集団を培養し；（d）細胞表面でCARを発現する改変された細胞集団から少なくとも1つの細胞を増殖させる、及び／又は選択することを含む方法が提供される。
【００７０】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、細胞集団は、白血球、及び／又はCD4+白血球＋CD8+白血球を含むことができる。細胞集団は、CD4+白血球とCD8+白血球を最適な比率で含むことができる。CD4+白血球とCD8+白血球の最適な比率がインビボで天然に生じることはない。細胞集団は腫瘍細胞を含むことができる。
【００７１】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾン又はベクターは、VCAR 、又はVCARをコードする配列を含んでいる。
【００７２】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、VCARをコードする配列を、細胞集団内の少なくとも1つの細胞の細胞膜を通して導入するのに十分な条件は、ヌクレオフェクションを含んでいる。
【００７３】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、VCARをコードする配列を、細胞集団内の少なくとも1つの細胞の細胞膜を通して導入するのに十分な条件は、特定の電圧での1つまたは複数の電気パルス、バッファ、及び1つまたは複数の補助因子の適用の少なくとも1つを含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトT細胞ヌクレオフェクションバッファ、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施態様では、1つまたは複数の補助因子は、（a）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はそれらの任意の組み合わせ；（b）塩、ミネラル、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせ；（c）細胞培地；（d）細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、又はそれらの組み合わせ；（e）1つまたは複数の核酸を修飾又は安定化する試薬を含むことができる。組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はそれらの任意の組み合わせは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ／IL-1F1、IL-1ベータ／IL-1F2、IL-12 p70、IL-12／IL-35 p35、IL-13、IL-17／IL-17A、IL-17A／Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18／IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32ベータ、IL-32ガンマ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE／TNFSF11／RANK L、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。塩、ミネラル、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS／FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、Tris／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン5、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞培地は、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、又はそれらの組み合わせは、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。1つまたは複数の核酸���修飾又は安定化させる試薬は、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含む又は含まない純正中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素、又はそれらの任意の組み合わせを含んでいる。
【００７４】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、本開示のVCAR、又はVCARをコードする配列の組み込みに適した条件は、バッファと1つまたは複数の補助因子の少なくとも1つを含んでいる。いくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾン又はベクターは、本開示のVCAR、又はVCARをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトT細胞ヌクレオフェクションバッファ、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施態様では、1つまたは複数の補助因子は、（a）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はそれらの任意の組み合わせ；（b）塩、ミネラル、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせ；（c）細胞培地；（d）細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、又はそれらの組み合わせ；（e）1つまたは複数の核酸を修飾又は安定化する試薬を含むことができる。組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はそれらの任意の組み合わせは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ／IL-1F1、IL-1ベータ／IL-1F2、IL-12 p70、IL-12／IL-35 p35、IL-13、IL-17／IL-17A、IL-17A／Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18／IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32ベータ、IL-32ガンマ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE／TNFSF11／RANKL、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。塩、ミネラル、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS／FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、Tris／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン5、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞培地は、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、又はそれらの組み合わせは、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、又はそれらの任意の組み合わせを含むことが��きる。1つまたは複数の核酸を修飾又は安定化する試薬は、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含む又は含まない純正中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素、又はそれらの任意の組み合わせを含んでいる。
【００７５】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、増殖ステップと選択ステップは連続して行われる。増殖は選択の前に行うことができる。増殖は選択の後に行うことができ、場合によっては更なる（すなわち第2の）選択を増殖の後に行うことができる。
【００７６】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、増殖ステップと選択ステップを同時に行うことができる。
【００７７】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、増殖は、改変された細胞集団の少なくとも1つの細胞を抗原と接触させ、VCARを介してその少なくとも1つの細胞を刺激することにより、増殖された細胞集団を生成させることを含むことができる。抗原は、基質の表面に提示することができる。基質は任意の形を持つことができ、その非限定的な例に含まれるのは、表面、ウエル、1つまたは複数のビーズ、及びマトリックスである。基質は、常磁性成分又は磁性成分を更に含むことができる。VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、抗原は基質の表面に提示することができ、基質は磁性ビーズであり、改変されて増殖された細胞集団から磁石を用いて磁性ビーズを除去又は分離することができる。抗原は、細胞又は人工抗原提示細胞の表面に提示することができる。本開示の人工抗原提示細胞の非限定的な例に含まれるのは、腫瘍細胞と幹細胞である。
【００７８】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾン又はベクターは選択遺伝子を含み、選択ステップは、改変された細胞集団の少なくとも1つの細胞を、選択遺伝子が耐性を与える化合物と接触させることにより、選択遺伝子を発現する細胞を選択から生存したものとして同定し、選択遺伝子を発現できない細胞は選択ステップから生存できないとして同定する。
【００７９】
VCARを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、発現ステップ及び／又は選択ステップは、10〜14日（端点を含む）の期間にわたって進行することができる。
【００８０】
本開示により、本開示の方法の改変され、増殖され、選択された細胞集団を含む組成物が提供される。
【００８１】
本開示により、癌の治療を必要とする対象でがんを治療する方法として、その対象に本開示の組成物を投与することを含む方法が提供され、VCARが腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、腫瘍細胞として悪性腫瘍細胞が可能である。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として自己由来のものが可能である。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として同種他家由来のものが可能である。
【００８２】
本開示により、自己免疫状態の治療を必要とする対象で自己免疫状態を治療する方法として、その対象に本開示の組成物を投与することを含む方法が提供され、VCARが対象の自己免疫細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、自己免疫細胞として、対象の標的細胞上の自己抗原に特異的に結合するリンパ球が可能である。いくつかの実施態様では、自己免疫細胞としてBリンパ球（すなわちB細胞）が可能である。いくつかの実施態様では、自己免疫細胞としてTリンパ球（すなわちT細胞）が可能である。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として自己由来のものが可能である。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として同種他家由来のものが可能である。
【００８３】
本開示により、感染症の治療を必要とする対象で感染症を治療する方法として、その対象に本開示の組成物を投与することを含む方法が提供され、VCARが、感染因子を含む細胞上の抗原、又は感染因子が伝染する細胞上の抗原、又は感染因子に曝露された細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、感染因子が伝染する細胞は、空気による感染因子の伝染（例えば感染因子が空気によって運ばれるか吸入される）又は液体による感染因子の伝染（例えば感染因子が水性流体又は体液の中で運ばれる）が可能である。宿主細胞に感染を引き起こす感染因子として、細菌、ウイルス、酵母、又は微生物が可能である。感染因子は、細胞又は細胞の宿主生物（対象）の中で、代表的な状態として、ウイルス感染、免疫不全状態、炎症状態、増殖性障害を引き起こす可能性があるが、状態がそれらに限定されることはない。いくつかの実施態様では、感染によって結核、小脳症、神経変性、またはマラリアが起こる。いくつかの実施態様では、感染によって対象の胎児で小脳症が起こる。感染によって対象の胎児で小脳症が起こる実施態様を含むいくつかの実施態様では、感染因子はウイルスであり、そのウイルスはジカウイルスである。いくつかの実施態様では、免疫不全状態は後天性免疫不全症候群（AIDS）である。いくつかの実施態様では、増殖性障害は癌である。いくつかの実施態様では、癌は子宮頸がんであり、感染因子はヒトパピローマウイルス（HPV）である。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として自己由来のものが可能である。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として同種他家由来のものが可能である。
【００８４】
本開示により、マスト細胞疾患の治療を必要とする対象でマスト細胞疾患を治療する方法として、その対象に本開示の組成物を投与することを含む方法が提供され、VCARがマスト細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、VCARは対象のマスト細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、マスト細胞疾患の非限定的な例に含めることができるのは、マスト細胞の過剰増殖と関係する障害、異常な活性を有するマスト細胞に関係する障害、及びマスト細胞の異常な数とマスト細胞の異常な活性の両方に関係する障害である。マスト細胞の過剰増殖と関係する代表的な障害の非限定的な例に含まれるのは、肥満細胞症、皮膚肥満細胞症（例えば色素性蕁麻疹又は斑状丘疹状皮膚肥満細胞症）、全身性肥満細胞症（マスト細胞白血病を含む）、及び局在したマスト細胞増殖である。異常な活性を有するマスト細胞に関係する障害の非限定的な例に含まれるのは、マスト細胞活性化症候群（MCAS）又はマスト細胞活性化障害（MCAD）、アレルギー性疾患（アナフィラキシーを含む）、喘息、炎症性疾患（例えば関節組織の自己免疫関連性炎症、関節リウマチなどを含む）、又はそれらの任意の組み合わせである。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として自己由来のものが可能である。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として同種他家由来のものが可能である。本開示により、変性疾患の治療を必要とする対象の変性疾患を治療する方法として、その対象に本開示の組成物を投与することを含む方法が提供され、VCARが、有害細胞上の抗原、又は老化細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、変性疾患の非限定的な例に含めることができるのは、神経変性障害、代謝障害、血管障害、加齢である。代表的な神経変性障害の非限定的な例に含まれるのは、ニューロン、グリア細胞、又はミクログリアの1つまたは複数の機能又は効力の喪失に関係する障害である。代表的な神経変性障害の非限定的な例に含まれるのは、ニューロン、グリア細胞、ミクログリアの1つまたは複数の機能を妨げたり、これらの効力を低下させたりするシグナル伝達分子、タンパク質、又はプリオンの1つまたは複数の蓄積に関係する障害である。代表的な代謝障害の非限定的な例に含まれるのは、ミトコンドリア障害、電子輸送鎖の中断、細胞でのATP産生の中断、ニューロン、グリア細胞、ミクログリアの1つまたは複数の機能喪失又は効力低下に関係する障害である。代表的な代謝障害の非限定的な例に含まれるのは、循環する血流の喪失、又はニューロン、グリア細胞、又はミクログリアへの血流の減少に関係する障害（例えば脳卒中）；ニューロン、グリア細胞、又はミクログリアにおける（例えば細胞内でフリーラジカルを放出するのに十分な）一過性の、又は恒常的な低酸素状態に関係する障害；対象が睡眠状態にある間にニューロン、グリア細胞、又はミクログリアの廃棄産物の除去効力が低下するのに十分なほど、その睡眠状態の間に、循環するCNSが喪失したり、ニューロン、グリア細胞、又はミクログリアへのCNS流が減少したりすることに関係する障害である。代表的な加齢障害の非限定的な例に含まれるのは、ニューロン、グリア細胞、又はミクログリアの1つまたは複数の染色体上での短縮されたテロメアの増加又は短縮されたテロメアに関係する障害；ニューロン、グリア細胞、又はミクログリアにおけるテロメアの機能喪失又は効力低下に関係する障害；ニューロン、グリア細胞、又はミクログリアにおけるDNA修復機構の機能喪失又は効力低下に関係する障害である。いくつかの実施態様では、有害細胞又は老化細胞は、その有害細胞又は老化細胞を含むネットワーク内の別の細胞の機能を妨げたり効力を低下させたりするため、その有害細胞又は老化細胞を標的とした除去により、ネットワークの機能を向上又は回復させたり、効力を向上させたりする。いくつかの実施態様では、有害細胞又は老化細胞は、第2の細胞の機能又は効力を変化させる可能性があるため、その有害細胞又は老化細胞を標的とした除去により、第2の細胞の変換を阻止する。いくつかの実施態様では、変性疾患は神経変性障害であり、有害細胞又は老化細胞は、幹細胞、免疫細胞、ニューロン、グリア、又はミクログリアである。いくつかの実施態様では、変性疾患は代謝性障害であり、有害細胞又は老化細胞は、幹細胞、体細胞、ニューロン、グリア、又はミクログリアである。いくつかの実施態様では、変性疾患は血管障害であり、有害細胞又は老化細胞は、幹細胞、体細胞、免疫細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア、又はミクログリアである。いくつかの実施態様では、変性疾患は老化であり、有害細胞又は老化細胞は、卵母細胞、精子、幹細胞、体細胞、免疫細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア、又はミクログリアである。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として自己由来のものが可能である。本開示の改変された細胞又は細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞又は細胞集団として同種他家由来のものが可能である。
【００８５】
本開示により、細胞療法を必要とする対象で細胞療法を改変する方法として、その対象に、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む組成物のトランスポゾン又はベクターを含む細胞を含む組成物を投与することを含んでいて、細胞を誘導剤と接触させることによってアポトーシスを細胞内で選択的に誘導することのできる方法が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は自己由来である。いくつかの実施態様では、細胞は同種他家由来である。この方法のいくつかの実施態様では、細胞療法は養子細胞療法である。この方法のいくつかの実施態様では、細胞療法の改変は、その細胞療法の終了を含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、細胞療法の改変は、その細胞療法で提供される細胞の一部を枯渇させることを含んでいる。いくつかの実施態様では、この方法は、誘導剤の阻害剤を投与して細胞療法の改変を抑制することにより、細胞療法の機能及び／又は効力を回復させるステップを更に含んでいる。
【００８６】
本開示の細胞療法を改変する方法を利用して、例えば回復の徴候、又は疾患重症度／進行の低下の徴候、疾患寛解／終結の徴候、及び／又は有害事象の発生に反応して治療を終結又は減衰させることができる。疾患の徴候又は症状が再び現れたり、重症度及び／又は有害事象の増加が明確になることがあれば、誘導剤を抑制することによって本開示の細胞療法を再開することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図1は、本開示のVCARに関して体重変化と治療後の日数の関係を示すグラフである。
【００８８】
【図２】図2は、本開示のVCARに関して腫瘍負荷と治療後の日数の関係を示すグラフである。
【００８９】
【図３】図3は、本開示のVCARに関して生存率と治療後の日数の関係を示すグラフである。
【００９０】
【図４】図4は、VH-A（三角形）、無関係のCAR（正方形）、又は腫瘍なし／CAR-Tなし（円）で治療した後の日数と生物発光シグナルの関係を示す腫瘍負荷のプロットである。
【００９１】
【図５】図5は、VH-B（三角形）、無関係のCAR（正方形）、又は腫瘍なし／CAR-Tなし（円）で治療した後の日数と生物発光シグナルの関係を示す腫瘍負荷のプロットである。
【００９２】
【図６】図6は、VH-C（三角形）、無関係のCAR（正方形）、又は腫瘍なし／CAR-Tなし（円）で治療した後の日数と生物発光シグナルの関係を示す腫瘍負荷のプロットである。
【００９３】
【図７】図7は、VH-D（三角形）、無関係のCAR（正方形）、又は腫瘍なし／CAR-Tなし（円）で治療した後の日数と生物発光シグナルの関係を示す腫瘍負荷のプロットである。
【００９４】
【図８】図8は、VH-E（三角形）、無関係のCAR（正方形）、又は腫瘍なし／CAR-Tなし（円）で治療した後の日数と生物発光シグナルの関係を示す腫瘍負荷のプロットである。
【００９５】
【図９】図9は、VH-F（三角形）、無関係のCAR（正方形）、又は腫瘍なし／CAR-Tなし（円）で治療した後の日数と生物発光シグナルの関係を示す腫瘍負荷のプロットである。
【００９６】
【図１０Ａ】図10Aは、本開示の代表的なVHに関するフレームのコンセンサス配列とCDR配列を示す表である。
【００９７】
【図１０Ｂ】図10Bは、本開示の代表的なVHのアラインメントである。上から下に、配列は、フレームワークVH-B（配列番号18050）、VH-D（配列番号18051）、VH-A（配列番号18052）、VH-E（配列番号18053）、VH-F（配列番号18054）、 VH-C（配列番号18055）のコンセンサス配列に対応する。
【００９８】
【図１１】図11は、武装T細胞上のチェックポイントシグナル伝達タンパク質のノックアウト効率を示す棒グラフである。初代ヒトT細胞は、正常な健康なドナーから単離されたとき、典型的には休止状態にある。Cas-CLOVERを用いてチェックポイント受容体であるPD-1、TGFβR2、LAG-3、TIM-3、及びCTLA-4をノックアウトした。ノックアウト率をy軸に示してある。遺伝子編集の結果として、フローサイトメトリーによって測定すると、細胞表面でのタンパク質の発現が30〜70％失われた。
【００９９】
【図１２】図12は、野生型受容体、ヌル受容体、及びスイッチ受容体の模式図と、それら受容体が初代T細胞において抑制性又は刺激性の細胞内シグナル伝達に及ぼす効果である。T細胞上に内在性発現した野生型抑制性受容体がそのT細胞の内在性リガンドに結合すると抑制性シグナルが伝達される。その抑制性シグナルは、一部がT細胞エフェクタ機能を低下させる。しかしチェックポイント受容体タンパク質（PD1（上図）又はTGFβRII（下図））の細胞内ドメイン（ICD）の変異（変異ヌル）又は欠失（切断型ヌル）は、コグネイトリガンドが結合するとき、そのシグナル伝達能力を低下又は消失させる。したがって、改変されたT細胞の表面で、操作された変異型ヌル受容体又は切断型ヌル受容体が発現すると、遊離した内在性リガンドの結合に関して内在性発現した野生型受容体と競合し、内在性発現した野生型受容体による抑制性シグナルの送達が効果的に低下又は消失する。具体的には、変異型ヌル受容体又は切断型ヌル受容体によるあらゆる結合は、内在性リガンドが野生型受容体と結合するのを阻止し、改変されたT細胞に有効に送達されるチェックポイントシグナル伝達の全体レベルを低下させることで、改変されたT細胞のチェックポイント抑制と機能疲弊を減らす、又は阻止する。スイッチ受容体は、野生型ICDを共刺激性分子（D3z、CD28、4-1BBなど）又は異なる抑制性分子（CTLA4、PD1、Lag3など）からのICDと置き換えることによって生成する。前者の場合には、改変されたスイッチ受容体が内在性リガンドに結合すると、正のシグナルがT細胞に送達されることで、改変されたT細胞の刺激増強を助け、標的腫瘍細胞の殺傷を増強できる可能性がある。後者の場合には、改変されたスイッチ受容体が内在性リガンドに結合すると、負のシグナルがT細胞に送達されることで、改変されたT細胞の刺激が消失し、標的腫瘍細胞の殺傷が減少する可能性がある。シグナルペプチド（紫色の矢印）、細胞外ドメイン（ECD）（明るい緑色）、膜貫通ドメイン（黄色）、細胞内シグナル伝達ドメイン（ICD）（オレンジ色）、置換ICD（緑色）が、受容体のダイヤグラムに表示されている。「*」は変異したICDを示す。「+」はチェックポイントシグナルの存在を示す。「-」はチェックポイントシグナルの不在を示す。
【０１００】
【図１３】図13は、PD1ヌル受容体とTGFβRIIヌル受容体の設計を示す模式図である。PD1（上図）とTGFβRII（下図）に関して切断型ヌル受容体のシグナルペプチドドメイン（SP）、膜貫通ドメイン（TM）、及び細胞外ドメイン（ECD）が示されている。上の4つの分子の第1は野生型PD-1受容体であり、野生型PD-1 SPとTMをコードしている。PD1ヌル受容体に関しては、PD-1 野生型SPドメイン又はTMドメイン（緑色；明るい緑色）をヒトT細胞 CD8a受容体（赤色）のSPドメイン又はTMドメインで置換することが示されている。第2の分子は、CD8a SPと天然PD-1 TMをコードしており、第3の分子は、野生型PD-1 SPと代替CD8a TMをコードしており、第4の分子は、代替CD8a のSPとTMの両方をコードしている。同様に、TGFβRIIのヌル受容体に関しては、野生型TGFβRII SP（ピンク色）をヒトT細胞CD8a受容体のSPドメイン（赤色）で置換する。コンストラクトの名称と、各コンストラクトタンパク質のアミノ酸の長さ（aa）がダイヤグラムの左側に掲載されている。
【０１０１】
【図１４】図14は、フローサイトメトリーによって求めた初代ヒトT細胞の表面でのPD1とTGFβRIIのヌル受容体の発現を示す一連のヒストグラムである。図13からの6つの切断型ヌルコンストラクトそれぞれを初代ヒトT細胞の表面で発現させた。T細胞は、抗体PD1（上；青色のヒストグラム）、又は抗TGFβRII（下；青色のヒストグラム）、又はアイソタイプ対照、又は二次だけ（灰色のヒストグラム）で染色した。PD-1又はTGFβRIIの発現に関して陽性に染色される細胞をゲートし（ゲートの上に頻度を示す）、平均蛍光強度（MFI）値を各陽性ヒストグラムの上方に示してある。ヌル受容体コンストラクトの名称が各プロットの上方に示されている。両方のヌル受容体遺伝子戦略で、野生型SPを代替CD8aで置き換えるとうまく発現した。02.8aSP-PD-1と02.8aSP-TGFβRIIは、T細胞の表面における発現が最高レベルになった。02.8aSP-PD-1ヌル受容体はMFIが43,680を示し、これは内在性T細胞PD-1の発現の177倍であり、野生型PD-1ヌル受容体の2.8倍である。02.8aSP-TGFβRIIヌル受容体はMFIが13,809を示し、これは内在性T細胞TGFβRIIの発現の102倍であり、野生型TGFβRIIヌル受容体の1.8倍である。PD1とTGFβRIIの両方に関して野生型SPを代替CD8a SPで置き換えると、ヌル受容体又はスイッチ受容体の表面発現が増大する。これは、内在性リガンドが結合したときにチェックポイント抑制又は共刺激をそれぞれ最大化するのに役立つ。
【０１０２】
【図１５Ａ】図15A〜図15Bは、T細胞の中で発現させるためのNF-κB誘導性ベクターを示す一対の模式図である。2つのT細胞活性化NF-κB誘導性ベクターを開発した。一方は、順方向（A）の遺伝子発現系（GES）を持ち、他方は相補的な方向（B）であり、両方とも構成的EF1aプロモータの前にある。これらベクターは、T2A配列によって隔てられたCAR分子とDHFR選択遺伝子の発現も直接指示する。条件的NF-κB誘導系と、EF1aに指示される遺伝子の両方が、電気穿孔（EP）を利用してT細胞の中に恒久的に挿入することのできるPiggyBacトランスポゾンの一部である。そのT細胞は、ゲノムの中に組み込まれると、膜表面でCARを、細胞内でDHFRを構成的に発現させるのに対し、NF-κB誘導性遺伝子であるGFPの発現は、T細胞が活性化されたときだけ、最高レベルで発現することになる。
【図１５Ｂ】図15A〜図15Bは、T細胞の中で発現させるためのNF-κB誘導性ベクターを示す一対の模式図である。2つのT細胞活性化NF-κB誘導性ベクターを開発した。一方は、順方向（A）の遺伝子発現系（GES）を持ち、他方は相補的な方向（B）であり、両方とも構成的EF1aプロモータの前にある。これらベクターは、T2A配列によって隔てられたCAR分子とDHFR選択遺伝子の発現も直接指示する。条件的NF-κB誘導系と、EF1aに指示される遺伝子の両方が、電気穿孔（EP）を利用してT細胞の中に恒久的に挿入することのできるPiggyBacトランスポゾンの一部である。そのT細胞は、ゲノムの中に組み込まれると、膜表面でCARを、細胞内でDHFRを構成的に発現させるのに対し、NF-κB誘導性遺伝子であるGFPの発現は、T細胞が活性化されたときだけ、最高レベルで発現することになる。
【０１０３】
【図１６】図16は、活性化されたT細胞におけるGFPのNF-κB誘導性発現を示す一対のグラフである。順方向（pNFκB-GFP順）又は逆方向（pNFκB-GFP逆）でGFPの発現を駆動するNF-κB誘導性発現系の不在（GESなし対照）下又は存在下にて、EF1aプロモータの制御下で抗BCMA CARとDHFR突然変異タンパク質遺伝子を発現するpiggyBacベクターをT細胞にヌクレオフェクトした。細胞がほぼ完全に休止する（19日目）まで、細胞をメトトレキサート選択の存在下で培養し、GFPの発現を5日目と19日目に評価した。5日目、すべてのT細胞が増殖しており、強いNF-κB活性のために高レベルのGFPを生じさせるNF-κB誘導性発現カセットを有する細胞で強く刺激した。GESなし対照細胞は、検出可能なレベルのGFPを発現しなかった。19日目までにGES T細胞はほぼ完全に休止しており、GFPの発現は5日目よりも有意に少なかった（約1/8のMFI）。というのもNF-κB活性がより低いからである。GFPの発現は19日目にまだ観察される。それは、GFPタンパク質の半減期が長いこと（約30時間）、又は例えばTCR、CAR、サイトカイン受容体、又は増殖因子受容体シグナルを通じたNF-κB活性の基礎レベルが原因である可能性がある。
【０１０４】
【図１７】図17は、GFPのNF-κB誘導性発現が、BCMA+腫瘍細胞の存在下で抗BCMA CARを媒介として活性化されることを示す一連のグラフである。T細胞には、改変されていない（モックT細胞）か、順方向（pNFκB-GFP順）又は逆方向（pNFκB-GFP逆）でGFPの発現を駆動するNF-κB誘導性発現系の不在下（GESなし対照）又は存在下で、EF1プロモータの制御下で抗BCMA CARとDHFR突然変異タンパク質遺伝子を発現するpiggyBacベクターをヌクレオフェクトした。すべての細胞を、細胞がほぼ完全に休止するまで、メトトレキサート選択あり、又はなし（モックT細胞）で22日間培養した。次に細胞を、BCMA-（K562）、BMCA+（RPMI 8226）、又は陽性対照である抗CD3抗CD28活性化試薬（CD3／28刺激）の不在下（刺激なし）又は存在下で3日間刺激した。GFPの発現は、GESなし対照又はモックT細胞を用いたあらゆる条件下で検出できなかった。しかしpNFκB-GFP順転移細胞とpNFκB-GFP逆転移細胞は、BCMA-K562細胞とともに培養したとき、刺激なし対照を超えるGFP発現をほとんど示さなかったが、その両方とも、BCMA+腫瘍細胞の存在下、又は陽性対照条件下では遺伝子発現の劇的な上方調節を示した。BCMA+腫瘍細胞とともに培養したpNFκB-GFP順転移細胞とpNFκB-GFP逆転移細胞の間でGFP発現の差はほとんど観察されなかった。
【０１０５】
【図１８−１】図18は、誘導性遺伝子の発現レベルを、抗BCMA CARTyrinの後に選択遺伝子（その両方ともヒトEF1プロモータの制御下にある）をコードするpiggyBacベクターがプロモータT細胞にヌクレオフェクトされる前の反応エレメントの数によって調節できることを実証する一連のグラフである。更に、ベクターは、切断型CD19タンパク質（dCD19）の発現を駆動する条件的NF-κB誘導性遺伝子発現系を追加してコードしていて、0から5個まで変化する数のNFκB反応エレメント（RE）を含み、GESはない（GESなし）か、電気穿孔パルスを受けるがpiggyBac核酸（モック）は受けなかった。データは、逆（反対）方向／向きのGESだけについて示してある。すべての細胞は、18日間培養し、メトトレキサート添加を利用したpiggyBac改変T細胞に関する選択を含んでいた。次に、抗CD3抗CD28ビーズ活性化試薬を用いて細胞を3日間刺激し、dCD19の表面発現をFACSによって0日目、3日目、18日目に評価し、データを、FACSヒストグラム、及び標的タンパク質染色のMFIとして示した。表面でのdCD19発現は、GESをコードするベクターを転移されたすべてのT細胞で0日目に低レベルで検出された。刺激後3日目、dCD19発現の劇的な上方調節が、GESを発現しているすべてのT細胞で観察され、REの数がより多いT細胞では、表面発現の倍数増加がより大きかった。したがって表面でのdCD19の発現は、GESにコードされているREの数に直接比例していた。GESを含まないT細胞（GESなし、モック対照）の表面ではdCD19がまったく検出されなかった。
【図１８−２】図18は、誘導性遺伝子の発現レベルを、抗BCMA CARTyrinの後に選択遺伝子（その両方ともヒトEF1プロモータの制御下にある）をコードするpiggyBacベクターがプロモータT細胞にヌクレオフェクトされる前の反応エレメントの数によって調節できることを実証する一連のグラフである。更に、ベクターは、切断型CD19タンパク質（dCD19）の発現を駆動する条件的NF-κB誘導性遺伝子発現系を追加してコードしていて、0から5個まで変化する数のNFκB反応エレメント（RE）を含み、GESはない（GESなし）か、電気穿孔パルスを受けるがpiggyBac核酸（モック）は受けなかった。データは、逆（反対）方向／向きのGESだけについて示してある。すべての細胞は、18日間培養し、メトトレキサート添加を利用したpiggyBac改変T細胞に関する選択を含んでいた。次に、抗CD3抗CD28ビーズ活性化試薬を用いて細胞を3日間刺激し、dCD19の表面発現をFACSによって0日目、3日目、18日目に評価し、データを、FACSヒストグラム、及び標的タンパク質染色のMFIとして示した。表面でのdCD19発現は、GESをコードするベクターを転移されたすべてのT細胞で0日目に低レベルで検出された。刺激後3日目、dCD19発現の劇的な上方調節が、GESを発現しているすべてのT細胞で観察され、REの数がより多いT細胞では、表面発現の倍数増加がより大きかった。したがって表面でのdCD19の発現は、GESにコードされているREの数に直接比例していた。GESを含まないT細胞（GESなし、モック対照）の表面ではdCD19がまったく検出されなかった。
【図１８−３】図18は、誘導性遺伝子の発現レベルを、抗BCMA CARTyrinの後に選択遺伝子（その両方ともヒトEF1プロモータの制御下にある）をコードするpiggyBacベクターがプロモータT細胞にヌクレオフェクトされる前の反応エレメントの数によって調節できることを実証する一連のグラフである。更に、ベクターは、切断型CD19タンパク質（dCD19）の発現を駆動する条件的NF-κB誘導性遺伝子発現系を追加してコードしていて、0から5個まで変化する数のNFκB反応エレメント（RE）を含み、GESはない（GESなし）か、電気穿孔パルスを受けるがpiggyBac核酸（モック）は受けなかった。データは、逆（反対）方向／向きのGESだけについて示してある。すべての細胞は、18日間培養し、メトトレキサート添加を利用したpiggyBac改変T細胞に関する選択を含んでいた。次に、抗CD3抗CD28ビーズ活性化試薬を用いて細胞を3日間刺激し、dCD19の表面発現をFACSによって0日目、3日目、18日目に評価し、データを、FACSヒストグラム、及び標的タンパク質染色のMFIとして示した。表面でのdCD19発現は、GESをコードするベクターを転移されたすべてのT細胞で0日目に低レベルで検出された。刺激後3日目、dCD19発現の劇的な上方調節が、GESを発現しているすべてのT細胞で観察され、REの数がより多いT細胞では、表面発現の倍数増加がより大きかった。したがって表面でのdCD19の発現は、GESにコードされているREの数に直接比例していた。GESを含まないT細胞（GESなし、モック対照）の表面ではdCD19がまったく検出されなかった。
【０１０６】
【図１９】図19は、Csy4-T2A-Clo051-G4Sリンカー-dCas9コンストラクトマップ（実施態様2）の模式図である。
【０１０７】
【図２０】図20は、pRT1-Clo051-dCas9二重NLSコンストラクトマップ（実施態様1）の模式図である。
【０１０８】
【図２１】図21は、本開示のCas-Clover融合タンパク質の実施態様1（図20に示されているpRT1-Clo051-dCas9二重NLS）又は実施態様2（図19に示されているCsy4-T2A-Clo051-G4Sリンカー-dCas9）について、汎T細胞のB2M（左）又はJurcat細胞のT細胞受容体のα鎖（右）の発現をノックアウトする効率を比較した一対のグラフである。右側のグラフでは、融合タンパク質は、示されているように10μg又は20μgで提供される。
【０１０９】
【図２２】図22は、実施態様1（図20に示されているpRT1-Clo051-dCas9二重NLS）と実施態様2（図19に示されているCsy4-T2A-Clo051-G4Sリンカー-dCas9）の存在下におけるmRNAのゲル電気泳動分析の写真である。示されているように、両方ともmRNA発現をノックダウンするのに有効である。
【０１１０】
【図２３】図23は、UniRat（商標）ヒト重鎖抗体産生プラットフォームのダイヤグラムである。
【０１１１】
【図２４】図24は、免疫化の後にUniRat（商標）によって生成される重鎖抗体の完全な抗原特異的なレパートリーを同定するために用いられる、免疫化、B細胞単離、mRNA精製、次世代シークエンシング（NGS）、バイオインフォマティクス分析、ハイスループットベクターアセンブリ、及びハイスループットの発現とスクリーニングのパイプラインのダイヤグラムである。独自の遺伝子アセンブリ法により、抗体レパートリー配列情報を、多彩な機能に関してスクリーニングすることのできる完全ヒト重鎖抗体の大きなコレクションに変換する。
【０１１２】
【図２５】図25は、一対のヒートマップであり、次世代シークエンシング（NGS）分析が増殖されたVH配列系譜をどのようにして明らかにするかを示している。ヒートマップの中の赤（高）又は青（低）の程度は、免疫化によって増殖したVH配列ファミリーを示している。高ランクのいくつかのVH配列は、単一の動物に特有である。高ランクの他のVH配列は、2つ以上の動物に出現するが、これは、これら配列ファミリーの収束選択を示唆している。
【０１１３】
【図２６】図26は、一連のフローサイトメトリーのプロットであり、P-PSMA-101を発現していてTSCM／TCMの混合物を含むCAR-T集団が、固形腫瘍を攻撃するCAR+ TCM、TEM、Teffを生じさせることを示している。固形腫瘍を除去した後、CAR-T+ TSCMの集団が持続する。CARTyrinで実証したが、ここに示すこの原理は、本開示のVCAR+ TSCM集団とVCAR+ TCM集団に適用される。具体的には、NSGマウスに皮下注射（SC）されるルシフェラーゼ発現LNCaP細胞系（LNCaP.luc）を用いたマウス異種移植片モデルを使用し、「ストレス」用量（4×106）の全CAR-T細胞でのCAR（P-PSMA5-101とP-PSMA8-101）のインビボ抗腫瘍効力を評価した。これらのインビボ研究では、Poseida製造法を用いたP-PSMA5-101プラスミド又はP-PSMA8-101プラスミドのPB送達を利用してすべてのCAR-T細胞を生成させた。マウスの腋の下LNCaPを注入し、腫瘍が確立したとき（キャリパー測定により100〜300 mm3）に治療した。PSMA5 CARとPSMA8 CARの間に生じる可能性のあるあらゆる効力の差を引き出すため、マウスを、「ストレス」用量（4×106）のP-PSMA-101を静脈内注射することによって治療した。抗腫瘍活性を、生存率、血液中でのCD8+ T細胞の増殖と検出、キャリパー測定による腫瘍体積評価、及びLNCaP腫瘍の生物発光によって評価した。ストレス用量のP-PSMA5-101とP-PSMA8-101は、NSGマウス内の確立されたSC LNCaP.luc固形腫瘍に関してT細胞（CARなし）対照マウスと比べて抗腫瘍効力と生存率を有意に増強することが実証された。具体的には、T細胞（CARなし）対照マウスでは生存率がゼロであり、P-BCMA-101治療群では生存率が25％であり、P-PSMA5-101治療群では生存率が75％であり、「ストレス」用量のP-PSMA8-101で治療したマウスでは生存率が100％であった。末梢血ではP-PSMA5-101とP-PSMA8-101が増殖し、分化したエフェクタCARTyrin+ T細胞を生じさせるとともに、腫瘍負荷がキャリパーと生物発光イメージングの検出限界未満に低下した。次にこれらの細胞を収縮させると、末梢血の中でまだ持続していた。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
本開示により、少なくとも1つのVHH（VCAR）を含むキメラ抗原受容体（CAR）が提供される。本開示のキメラ抗原受容体は、2つ以上のVHHを含むことができる。例えば二重特異性VCARは、2つの異なる抗原に特異的に結合する2つのVHHを含むことができる。
【０１１５】
本開示のVHHタンパク質は抗原に特異的に結合する。1つの抗原に特異的に結合する1つまたは複数のVHHを含む本開示のキメラ抗原受容体は、細胞（例えば細胞傷害性免疫細胞）の特異性を特定の抗原に向けるのに用いることができる。
【０１１６】
本開示により、単一ドメイン抗体を含む抗原認識領域を含むキメラ抗原受容体（CAR）が提供される（VCAR）。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体はVHH抗体である。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体はVH抗体である。
【０１１７】
本開示のキメラ抗原受容体は、ヒトのCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB、又はGM-CSFRを含むことができる。本開示のヒンジ／スペーサドメインは、ヒトのCD8α、IgG4、及び／又はCD4のヒンジ／スペーサ／ストークを含むことができる。本開示の細胞内ドメインすなわちエンドドメインは、ヒトCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができ、ヒトの4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40細胞内セグメント、又はそれらの任意の組み合わせを更に含むことができる。代表的な膜貫通ドメインの非限定的な例に含まれるのは、ヒトのCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB、またはGM-CSFR膜貫通ドメインである。
【０１１８】
本開示により、本開示のVCARを導入することによって1つまたは複数の抗原に対して特異的にされた、遺伝子改変細胞（例えばT細胞、NK細胞、造血前駆細胞、末梢血（PB）由来T細胞（G-CSFによって動員される末梢血からのT細胞が含まれる）、臍帯血（UCB）由来T細胞）が提供される。本開示の細胞は、本開示のVCARをコードするトランスポゾンと、本開示のトランスポザーゼをコードする配列（本開示のトランスポザーゼをコードする配列はmRNA配列であることが好ましい）を含むプラスミドの電子輸送によって改変することができる。
本開示のVH
【０１１９】
本開示により、単一ドメイン抗体を含むキメラ抗原受容体（CAR）が提供される（VCAR）。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体はVHを含んでいる。いくつかの実施態様では、VHはヒト配列から単離されるか、ヒト配列に由来する。いくつかの実施態様では、VHは、ヒトCDR配列及び／又はヒトフレームワーク配列と、非ヒト配列又はヒト化配列（例えばラットFcドメイン）を含んでいる。いくつかの実施態様では、VHは完全ヒト化VHである。いくつかの実施態様では、VHは、天然に存在する抗体でも、天然に存在する抗体の断片でもない。いくつかの実施態様では、VHはモノクローナル抗体の断片ではない。いくつかの実施態様では、VHはUniRat（商標）（TeneoBio社）を用いて全面的に操作されている。
【０１２０】
いくつかの実施態様では、VHは、UniRat（商標）（TeneoBio社）システムと「NGSに基づく発見」を利用して全面的に操作されてVHを生成させる。この方法を用いると、特異的VHは天然には存在せず、全面的に操作されたシステムを用いて生成される。VHは、宿主（例えばマウス、ラット、ヒト）から直接単離されるか細胞又は細胞系（ハイブリドーマ）から直接単離された天然に存在するモノクローナル抗体（mAb）に由来しない。これらVHをその後その細胞系からクローニングすることはなかった。その代わりに、UniRat（商標）系を、ラットFcドメインを持つヒト可変領域（VHドメイン）を含む導入遺伝子として用い、VH配列を全面的に操作したため、このVH配列は軽鎖のないヒト／ラットキメラであり、標準的なmAb形式とは異なる。天然のラット遺伝子をノックアウトしたため、ラットの中で発現した抗体だけが、ラットFcに連結されたVHドメインを有する導入遺伝子に由来する（UniAb）。これらが、UniRatの中で発現する限定されたAbである。次世代シークエンシング（NGS）とバイオインフォマティクスを利用し、免疫後にUniRat（商標）によって生成させた重鎖抗体の完全抗原特異的レパートリーを同定する。その後、独自の遺伝子アセンブリ法を利用し、抗体レパートリー配列情報を、さまざまな機能に関してインビトロでスクリーニングすることのできる完全ヒト重鎖抗体の大きなコレクションに変換する。いくつかの実施態様では、完全ヒト化VHは、ヒトVHドメインをヒトFcsとインビトロで融合させ（て、天然に存在しない組換えVH抗体を生成させ）ることによって生成する。いくつかの実施態様では、VHは全面的にヒト化されているが、インビボで軽鎖のないヒト／ラットキメラ（ヒトVH、ラットFc）として発現する。インビボで軽鎖のないヒト／ラットキメラ（ヒトVH、ラットFc）として発現する全面的にヒト化されたVHは、（150 kDaではなく）約80 kDaである。
【０１２１】
本開示のVCARは、本開示の少なくとも1つのVHを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のVHを改変してFcドメイン又はその一部を除去することができる。いくつかの実施態様では、本開示のVHのフレームワーク配列を改変して例えば発現を改善すること、免疫原性を低下させること、又は機能を改善することができる。
本開示の代表的なVCAR
【０１２２】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、
VH-A：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamnwvrqapgkglewvagiigsggstyyadsvkgrfsisrdnskntldlqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号18000）のアミノ酸配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致するアミノ酸配列の少なくとも1つを含んでいる。
【０１２３】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARのアミノ酸配列は、VH-A：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcagctacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccggaatcatcggcagcggcggcagcacatattacgccgattctgtgaagggccgcttcagcatcagccgggacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgagagccgaggataccgccgtgtactactgcgtgaaggattggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（配列番号18001）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致する配列を含むヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１２４】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、
VH-B：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggsltlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsgiigsgattyyadsvkgrftisrdnskntlnlqmnslraedtaiyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号18002）のアミノ酸配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致するアミノ酸配列の少なくとも1つを含んでいる。
【０１２５】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARのアミノ酸配列は、
VH-B：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgacactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttgaatgggtgtccggcatcattggctctggcgccaccacctactacgccgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgaacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccatctactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（配列番号18003）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致する配列を含むヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１２６】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、
VH-C：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgeslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsgivggggtsyyadsvrgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号18004）のアミノ酸配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致するアミノ酸配列の少なくとも1つを含んでいる。
【０１２７】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARのアミノ酸配列は、
VH-C：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcagcctggcgaatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttgaatgggtgtccggaatcgttggcggcggaggcacaagctactacgccgattctgtgcggggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（配列番号18005）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致する配列を含むヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１２８】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、
VH-D：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamtwirqapgkglewvsgitgdggstfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号18006）のアミノ酸配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致するアミノ酸配列の少なくとも1つを含んでいる。
【０１２９】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARのアミノ酸配列は、
VH-D：
atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagttcagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcaattacgccatgacctggatcagacaggcccctggcaaaggcctggaatgggtgtccggaattacaggcgacggcggcagcaccttttacgccgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagaggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccagctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcggagctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacatgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（配列番号18007）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致する配列を含むヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１３０】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、
VH-E：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglaqpggslrlscaasgftfssyamnwirqapgkglewvsgisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号18008）のアミノ酸配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致するアミノ酸配列の少なくとも1つを含んでいる。
【０１３１】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARのアミノ酸配列は、
VH-E：
atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccgaggtgcagctgctggagtccggaggaggcctggcccagcctggcggcagcctgaggctgtcctgcgccgcctctggcttcacctttagctcctacgccatgaactggatcagacaggcccctggcaagggcctggagtgggtgtccggcatctccggctctggaggctctacatactatgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcagagataactccaagaataccgtgtacctccagatgaactctctgcgggccgaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagaggggccagggcaccctggtgacagtgtctagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccggcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggcaggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（配列番号18009）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致する配列を含むヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１３２】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、
VH-F：
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgrslrlscaasgftftnyamnwvrqapgkglewvsgisggggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号18010）のアミノ酸配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致するアミノ酸配列の少なくとも1つを含んでいる。
【０１３３】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARのアミノ酸配列は、
VH-F：
atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccgaggtgcagctgctggagtctggaggaggcctggtgcagcccggccggtccctgagactgtcttgcgccgccagcggcttcacctttacaaactacgccatgaattgggtgcggcaggcccctggcaagggcctggagtgggtgtctggcatcagcggaggaggaggcagcacctactatgcagactccgtgaagggcaggttcaccatctcccgcgataactctaagaatacactgtacctccagatgaacagcctgagggcagaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagaggggacagggcaccctggtgaccgtgagcagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccggcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggcaggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga（配列番号18011）のヌクレオチド配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％が一致する配列を含むヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１３４】
本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、VH-A、VH-B、VH-C、VH-D、VH-E、又はVH-Fをコードする配列を含んでいる。本開示のVCARのいくつかの実施態様では、VCARは、VH-A、VH-B、VH-C、VH-D、VH-E、またはVH-Fをコードする2つの配列を含んでいる。
免疫細胞と免疫前駆細胞
【０１３５】
いくつかの実施態様では、本開示の免疫細胞は、リンパ球前駆細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、Tリンパ球（T細胞）、幹記憶T細胞（TSCM細胞）、セントラル記憶細胞（TCM）、幹細胞様細胞、Bリンパ球（B細胞）、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、血小板、赤血球、赤血球細胞（RBC）、巨核球、または破骨細胞を含んでいる。
【０１３６】
いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、1つまたは複数のタイプの細胞に分化することのできる任意の細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、自己複製して免疫細胞になることのできる多能性幹細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、造血幹細胞（HSC）又はその子孫を含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、免疫細胞になることのできる前駆細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、造血前駆細胞（HPC）を含んでいる。
造血幹細胞（HSC）
【０１３７】
造血幹細胞（HSC）は、多能性の自己複製細胞である。リンパ球系列と骨髄細胞系列から分化したあらゆる血液細胞はHSCから生じる。HSCは成体の骨髄、末梢血、動員された末梢血、腹膜透析排液、及び臍帯血に見いだすことができる。
【０１３８】
本開示のHSCとして、初代幹細胞又は培養された幹細胞から単離されたもの、又はそれら幹細胞に由来するものが可能である。本開示のHSCは、胚性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、生体幹細胞、又は人工多能性幹細胞（iPSC）から単離すること、又はそれら細胞に由来することができる。
【０１３９】
本開示の免疫前駆細胞は、HSC、又はHSC子孫細胞を含むことができる。本開示の代表的なHSC子孫細胞の非限定的な例に含まれるのは、多能性幹細胞、リンパ球前駆細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、Tリンパ球（T細胞）、Bリンパ球（B細胞）、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、及びマクロファージである。
【０１４０】
本開示の方法によって生成したHSCは、成体幹細胞から単離されるか成体幹細胞から導出されている間、そして単一の細胞系列にコミットしている間、胚性幹細胞の特徴を共有している「原始的な」幹細胞の特徴を保持することができる。例えば本開示の方法によって生成した「原始的な」HSCは、分化後にその「幹性」を保持していて分化しない。その結果、養子細胞療法として、本開示の方法によって生成した「原始的な」HSCは、その数を補充するだけでなく、インビボで増殖もする。本開示の方法によって生成した「原始的な」HSCは、単一用量として投与されたときに治療に有効である可能性がある。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCはCD34+である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCはCD34+とCD38-である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+、CD38-、及びCD90+である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+、CD38-、CD90+、及びCD45RA-である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-、及びCD49f+である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-、及びCD49f+である。
【０１４１】
本開示のいくつかの実施態様では、原始的HSC、HSC、及び／又はHSC子孫細胞を本開示の方法に従って改変して外来配列（例えばキメラ抗原受容体又は治療用タンパク質）を発現させることができる。本開示のいくつかの実施態様では、改変された原始的HSC、改変されたHSC、及び／又は改変されたHSC子孫細胞を更に分化させて改変された免疫細胞を生成させることができる。改変された免疫細胞の非限定的な例に含まれるのは、本開示の改変されたT細胞、改変されたナチュラルキラー細胞、及び／又は改変されたB細胞である。
T細胞
【０１４２】
本開示の改変されたT細胞として、改変された造血幹細胞と前駆細胞（HSPC）、又は改変されたHSCに由来するものが可能である。
【０１４３】
伝統的な生物製剤及び化学療法剤とは異なり、本開示の改変されたT細胞は、抗原を認識すると迅速に複製する能力を有することにより、治療を繰り返す必要性を回避できる可能性がある。それを実現するため、いくつかの実施態様では、本開示の改変されたT細胞は、初期応答を駆動するだけでなく、患者の体内で、可能性のある再発を阻止する生存可能な記憶T細胞の安定な集団として生き残りもする。あるいはいくつかの実施態様では、望む場合には、本開示の改変されたT細胞は患者の体内で生き残らない。
【０１４４】
抗原とは独立な（持続性）シグナル伝達を通じてT細胞の疲弊を引き起こすことのない抗原受容体分子と、初期記憶T細胞（特に幹細胞記憶T細胞（TSCM）又は幹細胞様T細胞）を含む改変されたT細胞産物の開発に集中的に取り組まれてきた。本開示の幹細胞様の改変されたT細胞は、セントラル記憶（TCM）T細胞又はTCM様細胞、エフェクタ記憶T細胞（TEM）、及びエフェクタT細胞（TE）を誘導するための自己複製と多能性に関して最大の能力を示すことで、腫瘍根絶と改変されたT細胞の長期移植がよりよくなされる。ナイーブT細胞（TN）＞TSCM＞TCM＞TEM＞TE＞TTEという分化の直線的経路が、これら細胞を生成させるのに責任がある可能性がある。そうなっていることで、TNはTSCMを直接生成させる親前駆細胞であり、それが今度はTCMを直接生成させ、以下同様である。本開示のT細胞の組成物は、TSCM細胞又はTCM細胞が最も豊富である各親T細胞サブセットの1つまたは複数を含むことができる（例えばTSCM＞TCM＞TEM＞TE＞TTE）。
【０１４５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞前駆体が分化して初期記憶T細胞、幹細胞様T細胞、ナイーブT細胞（TN）、TSCM、TCM、TEM、TE、又はTTEになる、又はなることができる。いくつかの実施態様では、免疫細胞前駆体は、本開示の原始的なHSC、HSC、又はHSC子孫細胞である。
【０１４６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞は、初期記憶T細胞、幹細胞様T細胞、ナイーブT細胞（TN）、TSCM、TCM、TEM、TE、又はTTEである。
【０１４７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞は初期記憶T細胞である。
【０１４８】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞は幹細胞様T細胞である。
【０１４９】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞はTSCMである。
【０１５０】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞はTCMである。
【０１５１】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法はT細胞を改変する、及び／又は方法は、複数の改変されたT細胞を生成させ、それら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が、初期記憶T細胞の1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、複数の改変された初期記憶T細胞は、少なくとも1つの改変された幹細胞様T細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の改変された初期記憶T細胞は、少なくとも1つの改変されたTSCMを含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の改変された初期記憶T細胞は、少なくとも1つの改変されたTCMを含んでいる。
【０１５２】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法はT細胞を改変する、及び／又は方法は、複数の改変されたT細胞を生成させ、それた複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が、幹細胞様T細胞の1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、複数の改変された幹細胞様T細胞は、少なくとも1つの改変されたTSCMを含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の改変された幹細胞様T細胞は、少なくとも1つの改変されたTCMを含んでいる。
【０１５３】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法はT細胞を改変する、及び／又は方法は、複数の改変されたT細胞を生成させ、それら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が、幹記憶T細胞（TSCM）の1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD62LとCD45RAを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD62L、CD45RA、CD28、CCR7、CD127、CD45RO、CD95、CD95、及びIL-2Rβの1つまたは複数を含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD45RA、CD95、IL-2Rβ、CCR7、及びCD62Lの1つまたは複数を含んでいる。
【０１５４】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法はT細胞を改変する、及び／又は方法は、複数の改変されたT細胞を生成させ、それら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が、セントラル記憶T細胞（TCM）の1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD45RO、CD95、IL-2Rβ、CCR7、及びCD62Lの1つまたは複数を含んでいる。
【０１５５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法はT細胞を改変する、及び／又は方法は、複数の改変されたT細胞を生成させ、それら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が、ナイーブT細胞（TN）の1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD45RA、CCR7、及びCD62Lの1つまたは複数を含んでいる。
【０１５６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法はT細胞を改変する、及び／又は方法は、複数の改変されたT細胞を生成させ、それら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が、エフェクタT細胞（改変されたTEFF）の1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD45RA、CD95、及びIL-2Rβの1つまたは複数を含んでいる。
【０１５７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法はT細胞を改変する、及び／又は方法は、複数の改変されたT細胞を生成させ、それら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が、幹細胞様T細胞、幹記憶T細胞（TSCM）、またはセントラル記憶T細胞（TCM）の1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。
【０１５８】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、バッファは、免疫細胞又はその前駆体を含んでいる。バッファは、免疫細胞又はその前駆体（T細胞が含まれる）の細胞生存率のレベル及び／又は幹様表現型を維持、又は増強する。いくつかの実施態様では、バッファは、バッファは、ヌクレオフェクション前の初代ヒトT細胞の細胞生存率のレベル及び／又は幹様表現型を維持、又は増強する。いくつかの実施態様では、バッファは、ヌクレオフェクションの間の初代ヒトT細胞の細胞生存率のレベル及び／又は幹細胞様表現型を維持、又は増強する。いくつかの実施態様では、バッファは、バッファは、ヌクレオフェクション後の初代ヒトT細胞の細胞生存率のレベル及び／又は幹様表現型を維持、又は増強する。いくつかの実施態様では、バッファは、KCl、MgCl2、ClNa、グルコース、及びCa(NO3)2の1つまたは複数を任意の絶対量又は相対量又は濃度で含んでおり、場合によってはバッファは、HEPES、Tris/HCl、及びリン酸バッファからなるグループから選択されたサプリメントを更に含んでいる。。いくつかの実施態様では、バッファは、5 mM KCl、15 mM MgCl2、90 mM ClNa、10 mMグルコース、及び0.4 mM Ca(NO3)2を含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、5 mM KCl、15 mM MgCl2、90 mM ClNa、10 mMグルコース、及び0.4 mM Ca(NO3)2に加え、20 mM HEPESと75 mM Tris／HClを含むサプリメントを含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、5 mM KCl、15 mM MgCl2、90 mM ClNa、10 mMグルコース、0.4 mM Ca(NO3)2に加え、pH 7.2の40 mM Na2HPO4／NaH2PO4を含むサプリメントを含んでいる。いくつかの実施態様では、初代T細胞を含む組成物は、100μlのバッファと、5×106〜25×106個の細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、組成物は、導入ステップの間、バッファ又は他の媒体1ミリリットル当たりで拡張された比率の250×106個の初代T細胞を含んでいる。
【０１５９】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、本開示の免疫細胞（本開示のT細胞を含む）とT細胞増殖組成物を接触させることを含んでいる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼを本開示の免疫細胞に導入するステップは、免疫細胞とT細胞増殖組成物を接触させることを更に含むことができる。方法の導入ステップが電気穿孔ステップ又はヌクレオフェクションステップを含む実施態様を含むいくつかの実施態様では、電気穿孔ステップ又はヌクレオフェクションステップは、本開示のT細胞増殖組成物と接触している免疫細胞を用いて実施することができる。
【０１６０】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、リン；オクタン酸、パルミチン酸、リノレン酸、及びオレイン酸の1つまたは複数；ステロール；及びアルカンを含む、これらから主になる、又はこれらからなる。
【０１６１】
本開示の改変されたT細胞を生成させる方法のいくつかの実施態様では、増殖サプリメントは、1つまたは複数のサイトカインを含んでいる。その1つまたは複数のサイトカインは、任意のサイトカインを含むことができ、その非限定的な例に含まれるのは、リンホカインである。代表的なリンホカインの非限定的な例に含まれるのは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-15（IL-15）、インターロイキン-21（IL-21）、顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子（GM-CSF）、及びインターフェロン-γ（INFγ）である。1つまたは複数のサイトカインは、IL-2を含むことができる。
【０１６２】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、及び増殖サプリメントを含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロール、及びアルカンの1つまたは複数を更に含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、及びステロールの1つまたは複数を更に含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、0.9 mg/kg〜90 mg/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸；0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸；0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸；0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸；及び0.1 mg/kg〜10 mg/kg（端点を含む）の濃度のステロールを更に含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約9 mg/kgの濃度のオクタン酸、約2 mg/kgの濃度のパルミチン酸、約2 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2 mg/kgの濃度のオレイン酸、及び約1 mg/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を更に含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、6.4マイクロモル/kg〜640 マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、0.7マイクロモル/kg〜70マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸、0.75マイクロモル/kg〜75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、0.75マイクロモル/kg〜75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸、及び0.25マイクロモル/kg〜25マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のステロールを更に含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約64マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、約7マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.5マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、及び約2.5マイクロモル/kgの濃度のステロールを更に含んでいる。
【０１６３】
いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、複数の増殖された改変T細胞を生成させるため、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、及び増殖サプリメントの1つまたは複数を含んでいて、その複数の改変T細胞の少なくとも2％が、初期記憶T細胞、幹細胞様T細胞、幹記憶T細胞（TSCM）、及び／又はセントラル記憶T細胞（TCM）の1つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロール、及びアルカンの1つまたは複数を含んでいるか、更に含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、及びステロール（例えばコレステロール）の1つまたは複数を含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、0.9 mg/kg〜90 mg/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸、0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸、0.1 mg/kg〜10 mg/kg（端点を含む）の濃度のステロールの1つまたは複数を含んでいる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約9 mg/kgの濃度のオクタン酸、約2 mg/kgの濃度のパルミチン酸、約2 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2 mg/kgの濃度のオレイン酸、及び約1 mg/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を含んでいる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、9.19 mg/kgの濃度のオクタン酸、1.86 mg/kgの濃度のパルミチン酸、2.12 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2.13 mg/kgの濃度のオレイン酸、及び1.01 mg/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を含んでいる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、9.19 mg/kgの濃度のオクタン酸、1.86 mg/kgの濃度のパルミチン酸、2.12 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2.13 mg/kgの濃度のオレイン酸、及び1.01 mg/kgの濃度のステロールを含んでいる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、6.4マイクロモル/kg〜640 マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、0.7マイクロモル/kg〜70マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸、0.75マイクロモル/kg〜75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、0.75マイクロモル/kg〜75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸、及び0.25マイクロモル/kg〜25マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のステロールの1つまたは複数を含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約64マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、及び約2.5マイクロモル/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約63.75マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7.27マイクロモル/kgの濃度��パルミチン酸、約7.57マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.56マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、及び約2.61マイクロモル/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約63.75マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7.27マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.57マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.56マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、及び約2.61マイクロモル/kgの濃度のステロールを含んでいる。
【０１６４】
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、及び増殖サプリメントの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、又はそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、リン、オクタン脂肪酸、パルミチン脂肪酸、リノレン脂肪酸、及びオレイン酸の1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、培地は、例えばイスコーブ改変ダルベッコ培地（（IMDM）；ThermoFisher Scientific社でカタログ番号12440053として入手できる）に見いだすことのできるよりも10倍多い量のリンを含んでいる。
【０１６５】
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、イスコーブのMDM、及び増殖サプリメントのうちの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、又はそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、以下の原子、すなわちホウ素、ナトリウム、マグネット、リン、カリウム、及びカルシウムという元素の1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、対応する平均濃度で存在する以下の元素、すなわち3.7 mg/lのホウ素、3000 mg/のナトリウム、18 mg/lのマグネット、29 mg/lのリン、15 mg/lのカリウム、及び4 mg/lのカルシウムの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。
【０１６６】
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、及び増殖サプリメントの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、又はそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の成分の1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる：オクタン酸（CAS番号124-07-2）、ニコチンアミド（CAS No. 98-92-0）、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）（CAS番号126-86-3）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）（CAS番号6938-94-9）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド（CAS番号3622-84-2）、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル（CAS番号84-69-5）、パルミチン酸（CAS番号57-10-3）、リノレン酸（CAS番号60-33-3）、オレイン酸（CAS番号112-80-1）、ステアリン酸ヒドラジド（CAS番号4130-54-5）、オレアミド（CAS番号3322-62-1）、ステロール（例えばコレステロール）（CAS番号57-88-5）、及びアルカン（例えばノナデカン）（CAS番号629-92-5）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の成分の1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる：オクタン酸（CAS番号124-07-2）、ニコチンアミド（CAS番号98-92-0）、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）（CAS番号126-86-3）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）（CAS番号6938-94-9）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド（CAS番号3622-84-2）、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル（CAS番号84-69-5）、パルミチン酸（CAS番号57-10-3）、リノレン酸（CAS番号60-33-3）、オレイン酸（CAS番号112-80-1）、ステアリン酸ヒドラジド（CAS番号4130-54-5）、オレアミド（CAS番号3322-62-1）、ステロール（例えばコレステロール）（CAS番号57-88-5）、アルカン（例えばノナデカン）（CAS番号629-92-5）、及びフェノールレッド（CAS番号143-74-8）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の成分の1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる：オクタン酸（CAS番号124-07-2）、ニコチンアミド（CAS番号98-92-0）、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）（CAS番号126-86-3）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）（CAS番号6938-94-9）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド（CAS番号3622-84-2）、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル（CAS番号84-69-5）、パルミチン酸（CAS番号57-10-3）、リノレン酸（CAS番号60-33-3）、オレイン酸（CAS番号112-80-1）、ステアリン酸ヒドラジド（CAS番号4130-54-5）、オレアミド（CAS番号3322-62-1）、フェノールレッド（CAS番号143-74-8）、及びラノリンアルコール。
【０１６７】
いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、及び増殖サプリメントの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、又はそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、以下のイオン、すなわちナトリウム。アンモニウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、硫酸塩、及びリン酸塩の1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。
【０１６８】
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、及び増殖サプリメントの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、又はそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の遊離アミノ酸の1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる：ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、プロリン、システイン、リシン、チロシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、及びトリプトファン。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の遊離アミノ酸の1つまたは複数を対応する平均モル％で含む培地と交換可能に用いることができる：ヒスチジン（約1％）、アスパラギン（約0.5％）、セリン（約1.5％）、グルタミン（約67％）、アルギニン（約1.5％）、グリシン（約1.5％）、アスパラギン酸（約1％）、グルタミン酸（約2％）、トレオニン（約2％）、アラニン（約1％）、プロリン（約1.5％）、システイン（約1.5％）、リシン（約3％）、チロシン（約1.5％）、メチオニン（約1％）、バリン（約3.5％）、イソロイシン（約3％）、ロイシン（約3.5％）、フェニルアラニン（約1.5％）、トリプトファン（約0.5％）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の遊離アミノ酸の1つまたは複数を対応する平均モル％で含む培地と交換可能に用いることができる：ヒスチジン（約0.78％）、アスパラギン（約0.4％）、セリン（約1.6％）、グルタミン（約67.01％）、アルギニン（約1.67％）、グリシン（約1.72％）、アスパラギン酸（約1.00％）、グルタミン酸（約1.93％）、トレオニン（約2.38％）、アラニン（約1.11％）、プロリン（約1.49％）、システイン（約1.65％）、リシン（約2.84％）、チロシン（約1.62％）、メチオニン（約0.85％）、バリン（約3.45％）、イソロイシン（約3.14％）、ロイシン（約3.3％）、フェニルアラニン（約1.64％）、トリプトファン（約0.37％）。
【０１６９】
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、イスコーブのMDM、及び増殖サプリメントの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、又はそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、リン、オクタン脂肪酸、パルミチン脂肪酸、リノレン脂肪酸、及びオレイン酸の1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、培地は、例えばイスコーブの改変ダルベッコ培地（IMDM）（ThermoFisher Scientific社からカタログ番号12440053として入手できる）に見られるよりも10倍多い量のリンを含んでいる。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、オクタン酸、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、及びステロール（例えばコレステロール）の1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、0.9 mg/kg〜90 mg/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸、0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、0.2 mg/kg〜20 mg/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸、及び0.1 mg/kg〜10 mg/kg（端点を含む）の濃度のステロールの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、約9 mg/kgの濃度のオクタン酸、約2 mg/kgの濃度のパルミチン酸、約2 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2 mg/kgの濃度のオレイン酸、及び約1 mg/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、9.19 mg/kgの濃度のオクタン酸、1.86 mg/kgの濃度のパルミチン酸、2.12 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2.13 mg/kgの濃度のオレイン酸、及び1.01 mg/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、9.19 mg/kgの濃度のオクタン酸、1.86 mg/kgの濃度のパルミチン酸、2.12 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2.13 mg/kgの濃度のオレイン酸、及び1.01 mg/kgの濃度のステロールを含む培地と交換可能に用いることができる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、6.4マイクロモル/kg〜640 マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸；0.7マイクロモル/kg〜70マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸；0.75マイクロモル/kg〜75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸；0.75マイクロモル/kg〜75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸；及び0.25マイクロモル/kg〜25マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のステロールの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、約64マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、及び約2.5マイクロモル/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。
【０１７１】
いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、約63.75マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7.27マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.57マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.56マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、及び約2.61マイクロモル/kgの濃度のステロールの1つまたは複数を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」又は「T細胞増殖組成物」という用語は、約63.75マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7.27マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.57マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.56マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、及び約2.61マイクロモル/kgの濃度のステロールの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。
【０１７２】
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、TSCM及び／又はTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、方法は、改変されたT細胞とP13K-Akt-mTOR経路の阻害剤を接触させることを含んでいる。本開示の改変されたT細胞（本開示の改変された幹細胞様T細胞、TSCM及び／又はTCMが含まれる）は、手続きの方法の中の任意のステップで、PI3K経路の構成要素の1つまたは複数の阻害剤を含む増殖培地とともに培養すること、増殖させること、保管すること、又は組み合わせることができる。PI3K経路の構成要素の代表的な阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、GSK3βの阻害剤（例えばTWS119（GSK 3B阻害剤XIIとしても知られる；化学式C18H14N4O2を持つCAS番号601514-19-6）である。PI3K経路の構成要素の代表的な阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、bb007（BLUEBIRDBIO（商標））である。PI3K経路の構成要素の追加の代表的な阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、アロステリックAkt阻害剤VIII（Akti-1/2とも呼ばれ、化合物番号 10196499を持つ）、ATP競合性阻害剤（プロテインキナーゼ B（Akt）のATP結合ポケットを標的とするオルソステリック阻害剤）、イソキノリン-5-スルホンアミド（H-8、H-89、及びNL-71-101）、アゼパン誘導体（(-)-バラノールに由来する一連の構造）、アミノフラザン（GSK690693）、複素環（7-アザインドール、6-フェニルプリン誘導体、ピロロ[2,3-d]ピリミジン誘導体、CCT128930、3-アミノピロリジン、アニリノトリアゾール誘導体、スピロインドリン誘導体、AZD5363、イパタセルチブ（GDC-0068、RG7440）、A-674563、及びA-443654）、フェニルピラゾール誘導体（AT7867とAT13148）、チオフェンカルボキサミド誘導体（アフレセルチブ（GSK2110183）、2-ピリミジル-5-アミドチオフェン誘導体（DC120）、ウプロセルチブ（GSK2141795））、アロステリック阻害剤（オルソステリック阻害剤よりも優れていて、より大きな特異性、副作用の減少、より少ない毒性を提供する）、2,3-ジフェニルキノキサリン類似体（2,3-ジフェニルキノキサリン誘導体、トリアゾロ[3,4-f][1,6]ナフチリジン-3(2H)-オン誘導体（MK-2206））、アルキルリン脂質（エデルホシン (1-O-オクタデシル-2-O-メチル-rac-グリセロ-3-ホスホコリン、ET-18-OCH3）、イルモホシン（BM 41.440）、ミルテホシン（ヘキサデシルホスホコリン、HePC）、ペリホシン（D-21266）、エルシルホスホコリン（ErPC）、エルホシン（ErPC3、エルシルホスホホモコリン）、インドール-3-カルビノール類似体（インドール-3-カルビノール、3-クロロアセチルインドール、ジインドリルメタン、6-メトキシ-5,7-ジヒドロインドロ[2,3-b]カルバゾール-2,10-ジカルボン酸ジエチル（SR13668）、OSU-A9）、スルホンアミド誘導体（PH-316とPHT-427）、チオウレア誘導体（PIT-1、PIT-2、DM-PIT-1、N-[(1-メチル-1H-ピラゾル-4-イル)カルボニル]-N'-(3-ブロモフェニルブロモフェニル)-チオウレア）、プリン誘導体（トリシリビン（TCN、NSC 154020）、トリシリビン一リン酸活性類似体（TCN-P）、4-アミノ-ピリド[2,3-d]ピリミジン誘導体API-1、3-フェニル-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン誘導体、ARQ 092）、BAY 1125976、3-メチル-キサンチン、キノリン-4-カルボキサミドと2-[4-(シクロヘキサ-1,3-ジエン-1-イル)-1H-ピラゾル-3-イル]フェノール、3-オキソ-ティルカル（tirucallic）酸、3α-と3β-アセトキシ-ティルカル酸、アセトキシ-ティルカル酸、不可逆的阻害剤（抗生物質、ラクトキノマイシン、フレ��リシンB、カラフンギン、メデルマイシン、Boc-Phe-ビニルケトン、4-ヒドロキシノネナール（4-HNE）、1,6-ナフチリジノン誘導体、及びイミダゾ-1,2-ピリジン誘導体）である。
【０１７３】
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、TSCM及び／又はTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、方法は、改変されたT細胞とT細胞エフェクタ分化の阻害剤を接触させることを含んでいる。T細胞エフェクタ分化の代表的な阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、BET阻害剤（例えばJQ1というヒエノトリアゾロジアゼピン）及び／又はタンパク質のBETファミリー（例えばBRD2、BRD3、BRD4、BRDT）の阻害剤である。
【０１７４】
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、TSCM及び／又はTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、方法は、改変されたT細胞と、核-細胞質アセチル-CoAを減少させる薬剤を接触させることを含んでいる。核-細胞質アセチル-CoAを減少させる薬剤の非限定的な例に含まれるのは、2-ヒドロキシ-クエン酸塩（2-HC）と、Acss1の発現を増大させる薬剤である。
【０１７５】
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、TSCM及び／又はTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、方法は、改変されたT細胞と、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）を含む組成物を接触させることを含んでいる。いくつかの実施態様では、HDAC阻害剤を含む組成物は、バルプロ酸、フェニル酪酸ナトリウム（NaPB）、又はそれらの組み合わせを含むか、それらからなる。いくつかの実施態様では、HDAC阻害剤を含む組成物は、バルプロ酸を含むか、バルプロ酸からなる。いくつかの実施態様では、HDAC阻害剤を含む組成物は、フェニル酪酸ナトリウム（NaPB）を含むか、NaPBからなる。
【０１７６】
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、TSCM及び／又はTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、1つまたは複数のサイトカインを含むことができる。その1つまたは複数のサイトカインは、任意のサイトカインを含むことができ、その非限定的な例に含まれるのはリンホカインである。代表的なリンホカインの非限定的な例に含まれるのは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-15（IL-15）、インターロイキン-21（IL-21）、顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子（GM-CSF）、及びインターフェロン-γ（INFγ）である。1つまたは複数のサイトカインは、IL-2を含むことができる。
【０１７７】
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、TSCM及び／又はTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、1つまたは複数のアクチベータ複合体を含むことができる。アクチベータ複合体の代表例と非限定的な例は、CD3、CD28、CD2の1つまたは複数に結合する単量体、二量体、三量体、四量体の抗体複合体を含むことができる。いくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、又は組換え抗体、又はキメラ抗体を含むアクチベータ複合体を含むか、それらアクチベータ複合体からなる。いくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、CD3とCD28に結合するアクチベータ複合体を含むか、そのアクチベータ複合体からなる。いくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、CD3、CD28、CD2に結合するアクチベータ複合体を含むか、そのアクチベータ複合体からなる。
ナチュラルキラー（NK）細胞
【０１７８】
いくつかの実施態様では、本開示の改変された免疫細胞又は免疫前駆細胞はナチュラルキラー（NK）細胞である。いくつかの実施態様では、NK細胞は、リンパ前駆細胞から分化する細胞傷害性リンパ球である。
【０１７９】
本開示の改変されたNK細胞は、改変された造血幹細胞と、前駆細胞（HSPC）又は改変されたHSCに由来するものが可能である。
【０１８０】
いくつかの実施態様では、非活性化NK細胞は、（CD14/CD19/CD56+細胞を含む）CD3枯渇白血球除去に由来する
【０１８１】
いくつかの実施態様では、NK細胞は、Lonza 4Dヌクレオフェクタ又はBTX ECM 830（500V、700マイクロ秒のパルス長、0.2 mmの電極ギャップ、1パルス）を用いて電気穿孔される。すべてのLonza 4Dヌクレオフェクタプログラムが、本開示の方法の範囲に入るとして考慮される。
【０１８２】
いくつかの実施態様では、電気穿孔ごとにキュベット内の100μlのP3バッファの中で5×106個の細胞を電気穿孔した。しかし体積当たりの細胞のこの比率は、市場の製造方法のスケールに拡張することができる。
【０１８３】
いくつかの実施態様では、NK細胞は、追加の細胞系とともに培養することによって刺激した。いくつかの実施態様では、追加の細胞系は、人工抗原提示細胞（aAPC）を含んでいる。いくつかの実施態様では、刺激は、電気穿孔の後の1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、又は7日目になされる。いくつかの実施態様では、刺激は、電気穿孔の後の2日目になされる。
【０１８４】
いくつかの実施態様では、NK細胞はCD56を発現する。
B細胞
【０１８５】
いくつかの実施態様では、本開示の改変された免疫細胞又は免疫前駆細胞はB細胞である。B細胞は、細胞表面にB細胞受容体を発現するリンパ球タイプである。B細胞受容体は特定の抗原に結合する。
【０１８６】
本開示の改変されたB細胞は、改変された造血幹細胞と、前駆細胞（HSPC）又は改変されたHSCに由来するものが可能である。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、HSPCは本開示の方法を利用して改変された後、ヒトIL-3、Flt3L、TPO、SCF、及びG-CSFの存在下で、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、又は少なくとも7日間にわたってB細胞への分化を開始する。いくつかの実施態様では、HSPCは本開示の方法を利用して改変された後、ヒトIL-3、Flt3L、TPO、SCF、及びG-CSFの存在下で5日間にわたってB細胞への分化を開始する。
【０１８８】
いくつかの実施態様では、プライミングの後、改変されたHPSC細胞は、フィーダ細胞の層に移されて2週間ごとに供給されるとともに、週に1回、新鮮なフィーダ層に移される。いくつかの実施態様では、フィーダ細胞はMS-5フィーダ細胞である。
【０１８９】
いくつかの実施態様では、改変されたHPSC細胞をMS-5フィーダ細胞とともに少なくとも7日間、14日間、21日間、28日間、30日間、33日間、35日間、42日間、又は48日間にわたって培養する。いくつかの実施態様では、改変されたHPSC細胞をMS-5フィーダ細胞とともに33日間にわたって培養した。
転移系
【０１９０】
本開示の代表的なトランスポゾン／トランスポザーゼ系の非限定的な例に含まれるのは、piggyBacトランスポゾンとpiggyBacトランスポザーゼ、piggyBac様トランスポゾンとpiggyBac様トランスポザーゼ、眠れる美女トランスポゾンと眠れる美女トランスポザーゼ、HelraiserトランスポゾンとHelraiserトランスポザーゼ、及びTol2トランスポゾンとTol2トランスポザーゼである。
【０１９１】
piggyBacトランスポザーゼは、トランスポゾンの両端にあるトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ITR）を認識し、それらITRの間にある内容をTTAA染色体部位の中に移動させる。piggyBacトランスポゾン系は、それらITRの間に含めることのできる興味ある遺伝子に関するペイロードの制限がない。いくつかの実施態様では、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼは、piggyBacトランスポザーゼ又はスーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、特にトランスポゾンがスーパーpiggyBac（SPB）トランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼをコードする配列はmRNA配列である。
【０１９２】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素はPiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０１９３】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）の30位、165位、282位、又は538位の1つまたは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。
【０１９４】
いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、又は538位の1つまたは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、又は538位の3つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、及び538位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の30位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の165位のアミノ酸置換は、グリシン（G）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の282位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の538位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からリシン（K）への置換である。
【０１９５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素はスーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、本開示のスーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素は、30位のアミノ酸置換がイソロイシン（I）からバリン（V）への置換であり、165位のアミノ酸置換がグリシン（G）からセリン（S）への置換であり、282位の置換がメチオニン（M）からバリン（V）への置換であり、538位のアミノ酸置換がアスパラギン（N）からリシン（K）への置換である配列番号14487のアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなることが可能である。いくつかの実施態様では、スーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０１９６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はスーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487又は配列番号14484の3位、46位、82位、103位、119位、125位、177位、180位、185位、187位、200位、207位、209位、226位、235位、240位、241位、243位、258位、296位、298位、311位、315位、319位、327位、328位、340位、421位、436位、456位、470位、486位、503位、552位、570位、及び591位の1つまたは複数にアミノ酸置換を更に含むことができる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はスーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487又は配列番号14484の46位、119位、125位、177位、180位、185位、187位、200位、207位、209位、226位、235位、240位、241位、243位、296位、298位、311位、315位、319位、327位、328位、340位、421位、436位、456位、470位、485位、503位、552位、及び570位の1つまたは複数にアミノ酸置換を更に含むことができる。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の3位のアミノ酸置換は、セリン（S）からアスパラギン（N）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の46位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の46位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からトレオニン（T）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の82位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の103位のアミノ酸置換は、セリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の119位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の125位のアミノ酸置換は、システイン（C）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の125位のアミノ酸置換は、システイン（C）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の177位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の177位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からヒスチジン（H）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の185位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の187位のアミノ酸置換は、アラニン（A���からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の200位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の207位のアミノ酸置換は、バリン（V）プロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の209位のアミノ酸置換は、バリン（V）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の226位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の235位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からアルギニン（R）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の240位のアミノ酸置換は、バリン（V）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の241位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の243位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の258位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からチロシン（Y）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の311位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の311位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からバリンへの置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の315位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の319位のアミノ酸置換は、トレオニン（T）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の327位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からアルギニン（R）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の328位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の340位のアミノ酸置換は、システイン（C）からグリシン（G）への置換である。いくつ���の実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の340位のアミノ酸置換は、システイン（C）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の421位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（D）からヒスチジン（H）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の436位のアミノ酸置換は、バリン（V）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の456位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からチロシン（Y）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の470位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の485位のアミノ酸置換は、セリン（S）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の503位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の503位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の552位のアミノ酸置換は、バリン（V）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の570位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からトレオニン（T）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の591位のアミノ酸置換は、グルタミン（Q）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の591位のアミノ酸置換は、グルタミン（Q）からアルギニン（R）への置換である。
【０１９７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、又はスーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を更に含むことが、配列番号14487又は配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、及び570位の1つまたは複数において可能である。本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、又はスーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を更に含むことが、配列番号14487又は配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、及び570位の2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又はそれよりも多い位置において可能である。本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、又はスーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を更に含むことが、配列番号14487又は配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、及び570位において可能である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の103位のアミノ酸置換は、セリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の194位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の372位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の375位のアミノ酸置換は、リシン（K）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の450位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の509位のアミノ酸置換は、セリン（S）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の570位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素が配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を含むことができる実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487又は配列番号14484の372位、375位、及び450位にアミノ酸置換を更に含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を、配列番号14487の372位にアルギニン（R）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の375位にリシン（K）からアラニン（A）への置換を含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を、配列番号14487の372位にアルギニン（R）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の375位にリシン（K）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の450位にアスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換を含むことができる。
【０１９８】
眠れる美女トランスポゾンを、ITRを認識する眠れる美女トランスポザーゼによって標的ゲノムの中に転移させ、それらITRの間にある内容をTA染色体部位の中に移動させる。さまざまな実施態様では、SBトランスポゾンを媒介とする遺伝子輸送、又は多数の同様のトランスポゾンの任意のものを用いた遺伝子輸送を、本開示の組成物と方法で利用することができる。
【０１９９】
いくつかの実施態様では、特にトランスポゾンが眠れる美女トランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼは、眠れる美女トランスポザーゼ、又は高活性な眠れる美女トランスポザーゼ（SB100X）である。
【０２００】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、眠れる美女トランスポザーゼ酵素は、
1 MGKSKEISQD LRKKIVDLHK SGSSLGAISK RLKVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGR
61 RRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGRSARKK
121 PLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFWRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVWR KKGEACKPKN
181 TIPTVKHGGG SIMLWGCFAA GGTGALHKID GIMRKENYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKWV
241 FQMDNDPKHT SKVVAKWLKD NKVKVLEWPS QSPDLNPIEN LWAELKKRVR ARRPTNLTQL
301 HQLCQEEWAK IHPTYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY（配列番号14485）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致するアミノ酸配列を含んでいる。
【０２０１】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、高活性な眠れる美女（SB100X）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGKSKEISQD LRKRIVDLHK SGSSLGAISK RLAVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGR
61 RRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGHSARKK
121 PLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFWRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVWR KKGEACKPKN
181 TIPTVKHGGG SIMLWGCFAA GGTGALHKID GIMDAVQYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKWV
241 FQHDNDPKHT SKVVAKWLKD NKVKVLEWPS QSPDLNPIEN LWAELKKRVR ARRPTNLTQL
301 HQLCQEEWAK IHPNYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY（配列番号14486）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致するアミノ酸配列を含んでいる。
【０２０２】
Helraiserトランスポゾンは、ヘリトロントランスポザーゼによって転移される。ヘリトロントランスポザーゼは、Helraiserトランスポゾン（コウモリのゲノムに由来し、約3000万年〜3600万年前に活性であった古いエレメント）を動員する。本開示の代表的なHelraiserトランスポゾンの一例はHelibat1であり、これは、
1 TCCTATATAA TAAAAGAGAA ACATGCAAAT TGACCATCCC TCCGCTACGC TCAAGCCACG 
61 CCCACCAGCC AATCAGAAGT GACTATGCAA ATTAACCCAA CAAAGATGGC AGTTAAATTT 
121 GCATACGCAG GTGTCAAGCG CCCCAGGAGG CAACGGCGGC CGCGGGCTCC CAGGACCTTC 
181 GCTGGCCCCG GGAGGCGAGG CCGGCCGCGC CTAGCCACAC CCGCGGGCTC CCGGGACCTT 
241 CGCCAGCAGA GAGCAGAGCG GGAGAGCGGG CGGAGAGCGG GAGGTTTGGA GGACTTGGCA 
301 GAGCAGGAGG CCGCTGGACA TAGAGCAGAG CGAGAGAGAG GGTGGCTTGG AGGGCGTGGC 
361 TCCCTCTGTC ACCCCAGCTT CCTCATCACA GCTGTGGAAA CTGACAGCAG GGAGGAGGAA 
421 GTCCCACCCC CACAGAATCA GCCAGAATCA GCCGTTGGTC AGACAGCTCT CAGCGGCCTG 
481 ACAGCCAGGA CTCTCATTCA CCTGCATCTC AGACCGTGAC AGTAGAGAGG TGGGACTATG 
541 TCTAAAGAAC AACTGTTGAT ACAACGTAGC TCTGCAGCCG AAAGATGCCG GCGTTATCGA 
601 CAGAAAATGT CTGCAGAGCA ACGTGCGTCT GATCTTGAAA GAAGGCGGCG CCTGCAACAG 
661 AATGTATCTG AAGAGCAGCT ACTGGAAAAA CGTCGCTCTG AAGCCGAAAA ACAGCGGCGT 
721 CATCGACAGA AAATGTCTAA AGACCAACGT GCCTTTGAAG TTGAAAGAAG GCGGTGGCGA 
781 CGACAGAATA TGTCTAGAGA ACAGTCATCA ACAAGTACTA CCAATACCGG TAGGAACTGC 
841 CTTCTCAGCA AAAATGGAGT ACATGAGGAT GCAATTCTCG AACATAGTTG TGGTGGAATG 
901 ACTGTTCGAT GTGAATTTTG CCTATCACTA AATTTCTCTG ATGAAAAACC ATCCGATGGG 
961 AAATTTACTC GATGTTGTAG CAAAGGGAAA GTCTGTCCAA ATGATATACA TTTTCCAGAT 
1021 TACCCGGCAT ATTTAAAAAG ATTAATGACA AACGAAGATT CTGACAGTAA AAATTTCATG 
1081 GAAAATATTC GTTCCATAAA TAGTTCTTTT GCTTTTGCTT CCATGGGTGC AAATATTGCA 
1141 TCGCCATCAG GATATGGGCC ATACTGTTTT AGAATACACG GACAAGTTTA TCACCGTACT 
1201 GGAACTTTAC ATCCTTCGGA TGGTGTTTCT CGGAAGTTTG CTCAACTCTA TATTTTGGAT 
1261 ACAGCCGAAG CTACAAGTAA AAGATTAGCA ATGCCAGAAA ACCAGGGCTG CTCAGAAAGA 
1321 CTCATGATCA ACATCAACAA CCTCATGCAT GAAATAAATG AATTAACAAA ATCGTACAAG 
1381 ATGCTACATG AGGTAGAAAA GGAAGCCCAA TCTGAAGCAG CAGCAAAAGG TATTGCTCCC 
1441 ACAGAAGTAA CAATGGCGAT TAAATACGAT CGTAACAGTG ACCCAGGTAG ATATAATTCT 
1501 CCCCGTGTAA CCGAGGTTGC TGTCATATTC AGAAACGAAG ATGGAGAACC TCCTTTTGAA 
1561 AGGGACTTGC TCATTCATTG TAAACCAGAT CCCAATAATC CAAATGCCAC TAAAATGAAA 
1621 CAAATCAGTA TCCTGTTTCC TACATTAGAT GCAATGACAT ATCCTATTCT TTTTCCACAT 
1681 GGTGAAAAAG GCTGGGGAAC AGATATTGCA TTAAGACTCA GAGACAACAG TGTAATCGAC 
1741 AATAATACTA GACAAAATGT AAGGACACGA GTCACACAAA TGCAGTATTA TGGATTTCAT 
1801 CTCTCTGTGC GGGACACGTT CAATCCTATT TTAAATGCAG GAAAATTAAC TCAACAGTTT 
1861 ATTGTGGATT CATATTCAAA AATGGAGGCC AATCGGATAA ATTTCATCAA AGCAAACCAA 
1921 TCTAAGTTGA GAGTTGAAAA ATATAGTGGT TTGATGGATT ATCTCAAATC TAGATCTGAA 
1981 AATGACAATG TGCCGATTGG TAAAATGATA ATACTTCCAT CATCTTTTGA GGGTAGTCCC 
2041 AGAAATATGC AGCAGCGATA TCAGGATGCT ATGGCAATTG TAACGAAGTA TGGCAAGCCC 
2101 GATTTATTCA TAACCATGAC ATGCAACCCC AAATGGGCAG ATATTACAAA CAATTTACAA 
2161 CGCTGGCAAA AAGTTGAAAA CAGACCTGAC TTGGTAGCCA GAGTTTTTAA TATTAAGCTG 
2221 AATGCTCTTT TAAATGATAT ATGTAAATTC CATTTATTTG GCAAAGTAAT AGCTAAAATT 
2281 CATGTCATTG AATTTCAGAA ACGCGGACTG CCTCACGCTC ACATATTATT GATATTAGAT 
2341 AGTGAGTCCA AATTACGTTC AGAAGATGAC ATTGACCGTA TAGTTAAGGC AGAAATTCCA 
2401 GATGAAGACC AGTGTCCTCG ACTTTTTCAA ATTGTAAAAT CAAATATGGT ACATGGACCA 
2461 TGTGGAATAC AAAATCCAAA TAGTCCATGT ATGGAAAATG GAAAATGTTC AAAGGGATAT 
2521 CCAAAAGAAT TTCAAAATGC GACCATTGGA AATATTGATG GATATCCCAA ATACAAACGA 
2581 AGATCTGGTA GCACCATGTC TATTGGAAAT AAAGTTGTCG ATAACACTTG GATTGTCCCT 
2641 TATAACCCGT ATTTGTGCCT TAAATATAAC TGTCATATAA ATGTTGAAGT CTGTGCATCA 
2701 ATTAAAAGTG TCAAATATTT ATTTAAATAC ATCTATAAAG GGCACGATTG TGCAAATATT 
2761 CAAATTTCTG AAAAAAATAT TATCAATCAT GACGAAGTAC AGGACTTCAT TGACTCCAGG 
2821 TATGTGAGCG CTCCTGAGGC TGTTTGGAGA CTTTTTGCAA TGCGAATGCA TGACCAATCT 
2881 CATGCAATCA CAAGATTAGC TATTCATTTG CCAAATGATC AGAATTTGTA TTTTCATACC 
2941 GATGATTTTG CTGAAGTTTT AGATAGGGCT AAAAGGCATA ACTCGACTTT GATGGCTTGG 
3001 TTCTTATTGA ATAGAGAAGA TTCTGATGCA CGTAATTATT ATTATTGGGA GATTCCACAG 
3061 CATTATGTGT TTAATAATTC TTTGTGGACA AAACGCCGAA AGGGTGGGAA TAAAGTATTA 
3121 GGTAGACTGT TCACTGTGAG CTTTAGAGAA CCAGAACGAT ATTACCTTAG ACTTTTGCTT 
3181 CTGCATGTAA AAGGTGCGAT AAGTTTTGAG GATCTGCGAA CTGTAGGAGG TGTAACTTAT 
3241 GATACATTTC ATGAAGCTGC TAAACACCGA GGATTATTAC TTGATGACAC TATCTGGAAA 
3301 GATACGATTG ACGATGCAAT CATCCTTAAT ATGCCCAAAC AACTACGGCA ACTTTTTGCA 
3361 TATATATGTG TGTTTGGATG TCCTTCTGCT GCAGACAAAT TATGGGATGA GAATAAATCT 
3421 CATTTTATTG AAGATTTCTG TTGGAAATTA CACCGAAGAG AAGGTGCCTG TGTGAACTGT 
3481 GAAATGCATG CCCTTAACGA AATTCAGGAG GTATTCACAT TGCATGGAAT GAAATGTTCA 
3541 CATTTCAAAC TTCCGGACTA TCCTTTATTA ATGAATGCAA ATACATGTGA TCAATTGTAC 
3601 GAGCAACAAC AGGCAGAGGT TTTGATAAAT TCTCTGAATG ATGAACAGTT GGCAGCCTTT 
3661 CAGACTATAA CTTCAGCCAT CGAAGATCAA ACTGTACACC CCAAATGCTT TTTCTTGGAT 
3721 GGTCCAGGTG GTAGTGGAAA AACATATCTG TATAAAGTTT TAACACATTA TATTAGAGGT 
3781 CGTGGTGGTA CTGTTTTACC CACAGCATCT ACAGGAATTG CTGCAAATTT ACTTCTTGGT 
3841 GGAAGAACCT TTCATTCCCA ATATAAATTA CCAATTCCAT TAAATGAAAC TTCAATTTCT 
3901 AGACTCGATA TAAAGAGTGA AGTTGCTAAA ACCATTAAAA AGGCCCAACT TCTCATTATT 
3961 GATGAATGCA CCATGGCATC CAGTCATGCT ATAAACGCCA TAGATAGATT ACTAAGAGAA 
4021 ATTATGAATT TGAATGTTGC ATTTGGTGGG AAAGTTCTCC TTCTCGGAGG GGATTTTCGA 
4081 CAATGTCTCA GTATTGTACC ACATGCTATG CGATCGGCCA TAGTACAAAC GAGTTTAAAG 
4141 TACTGTAATG TTTGGGGATG TTTCAGAAAG TTGTCTCTTA AAACAAATAT GAGATCAGAG 
4201 GATTCTGCTT ATAGTGAATG GTTAGTAAAA CTTGGAGATG GCAAACTTGA TAGCAGTTTT 
4261 CATTTAGGAA TGGATATTAT TGAAATCCCC CATGAAATGA TTTGTAACGG ATCTATTATT 
4321 GAAGCTACCT TTGGAAATAG TATATCTATA GATAATATTA AAAATATATC TAAACGTGCA 
4381 ATTCTTTGTC CAAAAAATGA GCATGTTCAA AAATTAAATG AAGAAATTTT GGATATACTT 
4441 GATGGAGATT TTCACACATA TTTGAGTGAT GATTCCATTG ATTCAACAGA TGATGCTGAA 
4501 AAGGAAAATT TTCCCATCGA ATTTCTTAAT AGTATTACTC CTTCGGGAAT GCCGTGTCAT 
4561 AAATTAAAAT TGAAAGTGGG TGCAATCATC ATGCTATTGA GAAATCTTAA TAGTAAATGG 
4621 GGTCTTTGTA ATGGTACTAG ATTTATTATC AAAAGATTAC GACCTAACAT TATCGAAGCT 
4681 GAAGTATTAA CAGGATCTGC AGAGGGAGAG GTTGTTCTGA TTCCAAGAAT TGATTTGTCC 
4741 CCATCTGACA CTGGCCTCCC ATTTAAATTA ATTCGAAGAC AGTTTCCCGT GATGCCAGCA 
4801 TTTGCGATGA CTATTAATAA ATCACAAGGA CAAACTCTAG ACAGAGTAGG AATATTCCTA 
4861 CCTGAACCCG TTTTCGCACA TGGTCAGTTA TATGTTGCTT TCTCTCGAGT TCGAAGAGCA 
4921 TGTGACGTTA AAGTTAAAGT TGTAAATACT TCATCACAAG GGAAATTAGT CAAGCACTCT 
4981 GAAAGTGTTT TTACTCTTAA TGTGGTATAC AGGGAGATAT TAGAATAAGT TTAATCACTT 
5041 TATCAGTCAT TGTTTGCATC AATGTTGTTT TTATATCATG TTTTTGTTGT TTTTATATCA 
5101 TGTCTTTGTT GTTGTTATAT CATGTTGTTA TTGTTTATTT ATTAATAAAT TTATGTATTA 
5161 TTTTCATATA CATTTTACTC ATTTCCTTTC ATCTCTCACA CTTCTATTAT AGAGAAAGGG 
5221 CAAATAGCAA TATTAAAATA TTTCCTCTAA TTAATTCCCT TTCAATGTGC ACGAATTTCG 
5281 TGCACCGGGC CACTAG（配列番号17006）を含む核酸配列を含んでいる。
【０２０３】
ヘリトロントランスポザーゼは、他のトランスポザーゼとは異なってRNアーゼ-H様触媒ドメインを含んでいないが、その代わりに、複製開始ドメイン（Rep）とDNAヘリカーゼドメインからなるRepHelモチーフを含んでいる。Repドメインは、ヌクレアーゼのHUHスーパーファミリーのヌクレアーゼドメインである。
【０２０４】
本開示の代表的なヘリトロントランスポザーゼの一例は、
1 MSKEQLLIQR SSAAERCRRY RQKMSAEQRA SDLERRRRLQ QNVSEEQLLE KRRSEAEKQR 
61 RHRQKMSKDQ RAFEVERRRW RRQNMSREQS STSTTNTGRN CLLSKNGVHE DAILEHSCGG 
121 MTVRCEFCLS LNFSDEKPSD GKFTRCCSKG KVCPNDIHFP DYPAYLKRLM TNEDSDSKNF 
181 MENIRSINSS FAFASMGANI ASPSGYGPYC FRIHGQVYHR TGTLHPSDGV SRKFAQLYIL 
241 DTAEATSKRL AMPENQGCSE RLMININNLM HEINELTKSY KMLHEVEKEA QSEAAAKGIA 
301 PTEVTMAIKY DRNSDPGRYN SPRVTEVAVI FRNEDGEPPF ERDLLIHCKP DPNNPNATKM 
361 KQISILFPTL DAMTYPILFP HGEKGWGTDI ALRLRDNSVI DNNTRQNVRT RVTQMQYYGF 
421 HLSVRDTFNP ILNAGKLTQQ FIVDSYSKME ANRINFIKAN QSKLRVEKYS GLMDYLKSRS 
481 ENDNVPIGKM IILPSSFEGS PRNMQQRYQD AMAIVTKYGK PDLFITMTCN PKWADITNNL 
541 QRWQKVENRP DLVARVFNIK LNALLNDICK FHLFGKVIAK IHVIEFQKRG LPHAHILLIL 
601 DSESKLRSED DIDRIVKAEI PDEDQCPRLF QIVKSNMVHG PCGIQNPNSP CMENGKCSKG 
661 YPKEFQNATI GNIDGYPKYK RRSGSTMSIG NKVVDNTWIV PYNPYLCLKY NCHINVEVCA 
721 SIKSVKYLFK YIYKGHDCAN IQISEKNIIN HDEVQDFIDS RYVSAPEAVW RLFAMRMHDQ 
781 SHAITRLAIH LPNDQNLYFH TDDFAEVLDR AKRHNSTLMA WFLLNREDSD ARNYYYWEIP 
841 QHYVFNNSLW TKRRKGGNKV LGRLFTVSFR EPERYYLRLL LLHVKGAISF EDLRTVGGVT 
901 YDTFHEAAKH RGLLLDDTIW KDTIDDAIIL NMPKQLRQLF AYICVFGCPS AADKLWDENK 
961 SHFIEDFCWK LHRREGACVN CEMHALNEIQ EVFTLHGMKC SHFKLPDYPL LMNANTCDQL 
1021 YEQQQAEVLI NSLNDEQLAA FQTITSAIED QTVHPKCFFL DGPGGSGKTY LYKVLTHYIR 
1081 GRGGTVLPTA STGIAANLLL GGRTFHSQYK LPIPLNETSI SRLDIKSEVA KTIKKAQLLI 
1141 IDECTMASSH AINAIDRLLR EIMNLNVAFG GKVLLLGGDF RQCLSIVPHA MRSAIVQTSL 
1201 KYCNVWGCFR KLSLKTNMRS EDSAYSEWLV KLGDGKLDSS FHLGMDIIEI PHEMICNGSI 
1261 IEATFGNSIS IDNIKNISKR AILCPKNEHV QKLNEEILDI LDGDFHTYLS DDSIDSTDDA 
1321 EKENFPIEFL NSITPSGMPC HKLKLKVGAI IMLLRNLNSK WGLCNGTRFI IKRLRPNIIE 
1381 AEVLTGSAEG EVVLIPRIDL SPSDTGLPFK LIRRQFPVMP AFAMTINKSQ GQTLDRVGIF 
1441 LPEPVFAHGQ LYVAFSRVRR ACDVKVKVVN TSSQGKLVKH SESVFTLNVV YREILE（配列番号14501）を含むアミノ酸配列を含んでいる。
【０２０５】
ヘリトロン転移では、トランスポゾンの3'末端に近いヘアピンがターミネータとして機能する。しかしこのヘアピンはトランスポザーゼが迂回することができ、その結果として隣接している配列の形質導入が起こる。それに加え、Helraiser転移により、共有結合によって閉じた円形中間体が生成する。更に、ヘリトロン転移は標的部位のデュープリケーションが欠けている可能性がある。Helraiser配列では、トランスポザーゼに、LTS（5'末端配列）とRTS（3'末端配列）と名づけられた左と右の末端配列が隣接している。これら配列は、保存された5’-TC/CTAG-3’モチーフで終わっている。ヘアピン終結構造を形成する能力を持つ19 bpの回文配列がRTSの11ヌクレオチド上流に位置しており、配列GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG（配列番号14500）からなる。
【０２０６】
Tol2トランスポゾンは、メダカのゲノムから単離すること、又はメダカのゲノムに由来することができ、hATファミリーのトランスポゾンに似ている可能性がある。本開示の代表的なTol2トランスポゾンは、約4.7キロ塩基を含む配列によってコードされており、Tol2トランスポザーゼをコードする遺伝子を含んでいる。この遺伝子は4つのエキソンを含んでいる。本開示の代表的なTol2トランスポザーゼの一例は、以下の
1 MEEVCDSSAA ASSTVQNQPQ DQEHPWPYLR EFFSLSGVNK DSFKMKCVLC LPLNKEISAF 
61 KSSPSNLRKH IERMHPNYLK NYSKLTAQKR KIGTSTHASS SKQLKVDSVF PVKHVSPVTV 
121 NKAILRYIIQ GLHPFSTVDL PSFKELISTL QPGISVITRP TLRSKIAEAA LIMKQKVTAA 
181 MSEVEWIATT TDCWTARRKS FIGVTAHWIN PGSLERHSAA LACKRLMGSH TFEVLASAMN 
241 DIHSEYEIRD KVVCTTTDSG SNFMKAFRVF GVENNDIETE ARRCESDDTD SEGCGEGSDG 
301 VEFQDASRVL DQDDGFEFQL PKHQKCACHL LNLVSSVDAQ KALSNEHYKK LYRSVFGKCQ 
361 ALWNKSSRSA LAAEAVESES RLQLLRPNQT RWNSTFMAVD RILQICKEAG EGALRNICTS 
421 LEVPMFNPAE MLFLTEWANT MRPVAKVLDI LQAETNTQLG WLLPSVHQLS LKLQRLHHSL 
481 RYCDPLVDAL QQGIQTRFKH MFEDPEIIAA AILLPKFRTS WTNDETIIKR GMDYIRVHLE 
541 PLDHKKELAN SSSDDEDFFA SLKPTTHEAS KELDGYLACV SDTRESLLTF PAICSLSIKT 
601 NTPLPASAAC ERLFSTAGLL FSPKRARLDT NNFENQLLLK LNLRFYNFE（配列番号14502）を含むアミノ酸配列を含んでいる。
【０２０７】
本開示の代表的なTol2トランスポゾンの一例は、逆方向反復亜末端配列とTol2トランスポザーゼを含め、以下の
1 CAGAGGTGTA AAGTACTTGA GTAATTTTAC TTGATTACTG TACTTAAGTA TTATTTTTGG 
61 GGATTTTTAC TTTACTTGAG TACAATTAAA AATCAATACT TTTACTTTTA CTTAATTACA 
121 TTTTTTTAGA AAAAAAAGTA CTTTTTACTC CTTACAATTT TATTTACAGT CAAAAAGTAC 
181 TTATTTTTTG GAGATCACTT CATTCTATTT TCCCTTGCTA TTACCAAACC AATTGAATTG 
241 CGCTGATGCC CAGTTTAATT TAAATGTTAT TTATTCTGCC TATGAAAATC GTTTTCACAT 
301 TATATGAAAT TGGTCAGACA TGTTCATTGG TCCTTTGGAA GTGACGTCAT GTCACATCTA 
361 TTACCACAAT GCACAGCACC TTGACCTGGA AATTAGGGAA ATTATAACAG TCAATCAGTG 
421 GAAGAAAATG GAGGAAGTAT GTGATTCATC AGCAGCTGCG AGCAGCACAG TCCAAAATCA 
481 GCCACAGGAT CAAGAGCACC CGTGGCCGTA TCTTCGCGAA TTCTTTTCTT TAAGTGGTGT 
541 AAATAAAGAT TCATTCAAGA TGAAATGTGT CCTCTGTCTC CCGCTTAATA AAGAAATATC 
601 GGCCTTCAAA AGTTCGCCAT CAAACCTAAG GAAGCATATT GAGGTAAGTA CATTAAGTAT 
661 TTTGTTTTAC TGATAGTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGGTG TGCATGTTTT 
721 GACGTTGATG GCGCGCCTTT TATATGTGTA GTAGGCCTAT TTTCACTAAT GCATGCGATT 
781 GACAATATAA GGCTCACGTA ATAAAATGCT AAAATGCATT TGTAATTGGT AACGTTAGGT 
841 CCACGGGAAA TTTGGCGCCT ATTGCAGCTT TGAATAATCA TTATCATTCC GTGCTCTCAT 
901 TGTGTTTGAA TTCATGCAAA ACACAAGAAA ACCAAGCGAG AAATTTTTTT CCAAACATGT 
961 TGTATTGTCA AAACGGTAAC ACTTTACAAT GAGGTTGATT AGTTCATGTA TTAACTAACA 
1021 TTAAATAACC ATGAGCAATA CATTTGTTAC TGTATCTGTT AATCTTTGTT AACGTTAGTT 
1081 AATAGAAATA CAGATGTTCA TTGTTTGTTC ATGTTAGTTC ACAGTGCATT AACTAATGTT 
1141 AACAAGATAT AAAGTATTAG TAAATGTTGA AATTAACATG TATACGTGCA GTTCATTATT 
1201 AGTTCATGTT AACTAATGTA GTTAACTAAC GAACCTTATT GTAAAAGTGT TACCATCAAA 
1261 ACTAATGTAA TGAAATCAAT TCACCCTGTC ATGTCAGCCT TACAGTCCTG TGTTTTTGTC 
1321 AATATAATCA GAAATAAAAT TAATGTTTGA TTGTCACTAA ATGCTACTGT ATTTCTAAAA 
1381 TCAACAAGTA TTTAACATTA TAAAGTGTGC AATTGGCTGC AAATGTCAGT TTTATTAAAG 
1441 GGTTAGTTCA CCCAAAAATG AAAATAATGT CATTAATGAC TCGCCCTCAT GTCGTTCCAA 
1501 GCCCGTAAGA CCTCCGTTCA TCTTCAGAAC ACAGTTTAAG ATATTTTAGA TTTAGTCCGA 
1561 GAGCTTTCTG TGCCTCCATT GAGAATGTAT GTACGGTATA CTGTCCATGT CCAGAAAGGT 
1621 AATAAAAACA TCAAAGTAGT CCATGTGACA TCAGTGGGTT AGTTAGAATT TTTTGAAGCA 
1681 TCGAATACAT TTTGGTCCAA AAATAACAAA ACCTACGACT TTATTCGGCA TTGTATTCTC 
1741 TTCCGGGTCT GTTGTCAATC CGCGTTCACG ACTTCGCAGT GACGCTACAA TGCTGAATAA 
1801 AGTCGTAGGT TTTGTTATTT TTGGACCAAA ATGTATTTTC GATGCTTCAA ATAATTCTAC 
1861 CTAACCCACT GATGTCACAT GGACTACTTT GATGTTTTTA TTACCTTTCT GGACATGGAC 
1921 AGTATACCGT ACATACATTT TCAGTGGAGG GACAGAAAGC TCTCGGACTA AATCTAAAAT 
1981 ATCTTAAACT GTGTTCCGAA GATGAACGGA GGTGTTACGG GCTTGGAACG ACATGAGGGT 
2041 GAGTCATTAA TGACATCTTT TCATTTTTGG GTGAACTAAC CCTTTAATGC TGTAATCAGA 
2101 GAGTGTATGT GTAATTGTTA CATTTATTGC ATACAATATA AATATTTATT TGTTGTTTTT 
2161 ACAGAGAATG CACCCAAATT ACCTCAAAAA CTACTCTAAA TTGACAGCAC AGAAGAGAAA 
2221 GATCGGGACC TCCACCCATG CTTCCAGCAG TAAGCAACTG AAAGTTGACT CAGTTTTCCC 
2281 AGTCAAACAT GTGTCTCCAG TCACTGTGAA CAAAGCTATA TTAAGGTACA TCATTCAAGG 
2341 ACTTCATCCT TTCAGCACTG TTGATCTGCC ATCATTTAAA GAGCTGATTA GTACACTGCA 
2401 GCCTGGCATT TCTGTCATTA CAAGGCCTAC TTTACGCTCC AAGATAGCTG AAGCTGCTCT 
2461 GATCATGAAA CAGAAAGTGA CTGCTGCCAT GAGTGAAGTT GAATGGATTG CAACCACAAC 
2521 GGATTGTTGG ACTGCACGTA GAAAGTCATT CATTGGTGTA ACTGCTCACT GGATCAACCC 
2581 TGGAAGTCTT GAAAGACATT CCGCTGCACT TGCCTGCAAA AGATTAATGG GCTCTCATAC 
2641 TTTTGAGGTA CTGGCCAGTG CCATGAATGA TATCCACTCA GAGTATGAAA TACGTGACAA 
2701 GGTTGTTTGC ACAACCACAG ACAGTGGTTC CAACTTTATG AAGGCTTTCA GAGTTTTTGG 
2761 TGTGGAAAAC AATGATATCG AGACTGAGGC AAGAAGGTGT GAAAGTGATG ACACTGATTC 
2821 TGAAGGCTGT GGTGAGGGAA GTGATGGTGT GGAATTCCAA GATGCCTCAC GAGTCCTGGA 
2881 CCAAGACGAT GGCTTCGAAT TCCAGCTACC AAAACATCAA AAGTGTGCCT GTCACTTACT 
2941 TAACCTAGTC TCAAGCGTTG ATGCCCAAAA AGCTCTCTCA AATGAACACT ACAAGAAACT 
3001 CTACAGATCT GTCTTTGGCA AATGCCAAGC TTTATGGAAT AAAAGCAGCC GATCGGCTCT 
3061 AGCAGCTGAA GCTGTTGAAT CAGAAAGCCG GCTTCAGCTT TTAAGGCCAA ACCAAACGCG 
3121 GTGGAATTCA ACTTTTATGG CTGTTGACAG AATTCTTCAA ATTTGCAAAG AAGCAGGAGA 
3181 AGGCGCACTT CGGAATATAT GCACCTCTCT TGAGGTTCCA ATGTAAGTGT TTTTCCCCTC 
3241 TATCGATGTA AACAAATGTG GGTTGTTTTT GTTTAATACT CTTTGATTAT GCTGATTTCT 
3301 CCTGTAGGTT TAATCCAGCA GAAATGCTGT TCTTGACAGA GTGGGCCAAC ACAATGCGTC 
3361 CAGTTGCAAA AGTACTCGAC ATCTTGCAAG CGGAAACGAA TACACAGCTG GGGTGGCTGC 
3421 TGCCTAGTGT CCATCAGTTA AGCTTGAAAC TTCAGCGACT CCACCATTCT CTCAGGTACT 
3481 GTGACCCACT TGTGGATGCC CTACAACAAG GAATCCAAAC ACGATTCAAG CATATGTTTG 
3541 AAGATCCTGA GATCATAGCA GCTGCCATCC TTCTCCCTAA ATTTCGGACC TCTTGGACAA 
3601 ATGATGAAAC CATCATAAAA CGAGGTAAAT GAATGCAAGC AACATACACT TGACGAATTC 
3661 TAATCTGGGC AACCTTTGAG CCATACCAAA ATTATTCTTT TATTTATTTA TTTTTGCACT 
3721 TTTTAGGAAT GTTATATCCC ATCTTTGGCT GTGATCTCAA TATGAATATT GATGTAAAGT 
3781 ATTCTTGCAG CAGGTTGTAG TTATCCCTCA GTGTTTCTTG AAACCAAACT CATATGTATC 
3841 ATATGTGGTT TGGAAATGCA GTTAGATTTT ATGCTAAAAT AAGGGATTTG CATGATTTTA 
3901 GATGTAGATG ACTGCACGTA AATGTAGTTA ATGACAAAAT CCATAAAATT TGTTCCCAGT 
3961 CAGAAGCCCC TCAACCAAAC TTTTCTTTGT GTCTGCTCAC TGTGCTTGTA GGCATGGACT 
4021 ACATCAGAGT GCATCTGGAG CCTTTGGACC ACAAGAAGGA ATTGGCCAAC AGTTCATCTG 
4081 ATGATGAAGA TTTTTTCGCT TCTTTGAAAC CGACAACACA TGAAGCCAGC AAAGAGTTGG 
4141 ATGGATATCT GGCCTGTGTT TCAGACACCA GGGAGTCTCT GCTCACGTTT CCTGCTATTT 
4201 GCAGCCTCTC TATCAAGACT AATACACCTC TTCCCGCATC GGCTGCCTGT GAGAGGCTTT 
4261 TCAGCACTGC AGGATTGCTT TTCAGCCCCA AAAGAGCTAG GCTTGACACT AACAATTTTG 
4321 AGAATCAGCT TCTACTGAAG TTAAATCTGA GGTTTTACAA CTTTGAGTAG CGTGTACTGG 
4381 CATTAGATTG TCTGTCTTAT AGTTTGATAA TTAAATACAA ACAGTTCTAA AGCAGGATAA 
4441 AACCTTGTAT GCATTTCATT TAATGTTTTT TGAGATTAAA AGCTTAAACA AGAATCTCTA 
4501 GTTTTCTTTC TTGCTTTTAC TTTTACTTCC TTAATACTCA AGTACAATTT TAATGGAGTA 
4561 CTTTTTTACT TTTACTCAAG TAAGATTCTA GCCAGATACT TTTACTTTTA ATTGAGTAAA 
4621 ATTTTCCCTA AGTACTTGTA CTTTCACTTG AGTAAAATTT TTGAGTACTT TTTACACCTC 
4681 TG（配列番号17007）を含む核酸配列によってコードされている。
【０２０８】
本開示の代表的なトランスポゾン／トランスポザーゼ系の非限定的な例に含まれるのは、piggyBacトランスポゾンとpiggyBac トランスポザーゼ、及びpiggyBac様トランスポゾンとpiggyBac様トランスポザーゼである。
【０２０９】
piggyBacトランスポザーゼとpiggyBac様トランスポザーゼは、トランスポゾンの両端にあるトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ITR）を認識し、それらITR相互の間にある内容をTTAA染色体部位又はTTAT染色体部位の中に移動させる。piggyBacトランスポゾン系又はpiggyBac様トランスポゾン系は、それらITRの間に含まれる可能性のある興味ある遺伝子に関するペイロードの制限がない。
【０２１０】
いくつかの実施態様では、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼは、piggyBacトランスポザーゼ、スーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、特にトランスポザーゼがpiggyBacトランスポザーゼ、スーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼである実施態様では、トランスポザーゼをコードする配列はmRNA配列である。
【０２１１】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。
【０２１２】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０２１３】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）の30位、165位、282位、又は538位の1つまたは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。
【０２１４】
いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、又は538位の2つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、又は538位の3つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、及び538位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるpiggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の30位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の165位のアミノ酸置換は、グリシン（G）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の282位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の538位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からリシン（K）への置換である。
【０２１５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、スーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、本開示のスーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列において30位のアミノ酸置換がイソロイシン（I）からバリン（V）への置換であり、165位のアミノ酸置換がグリシン（G）からセリン（S）への置換であり、282位のアミノ酸置換がメチオニン（M）からバリン（V）への置換であり、538位のアミノ酸置換がアスパラギン（N）からリシン（K）への置換であるアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなることができる。いくつかの実施態様では、スーパーpiggyBac（SPB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０２１６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素、スーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素、又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487又は配列番号14484の3位、46位、82位、103位、119位、125位、177位、180位、185位、187位、200位、207位、209位、226位、235位、240位、241位、243位、258位、296位、298位、311位、315位、319位、327位、328位、340位、421位、436位、456位、470位、486位、503位、552位、570位、及び591位の1つまたは複数にアミノ酸置換を更に含むことができる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素、スーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素、又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487又は配列番号14484の46位、119位、125位、177位、180位、185位、187位、200位、207位、209位、226位、235位、240位、241位、243位、296位、298位、311位、315位、319位、327位、328位、340位、421位、436位、456位、470位、485位、503位、552位、及び570位の1つまたは複数にアミノ酸置換を更に含むことができる。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の3位のアミノ酸置換は、セリン（S）からアスパラギン（N）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の46位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の46位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からトレオニン（T）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の82位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の103位のアミノ酸置換は、セリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の119位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の125位のアミノ酸置換は、システイン（C）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の125位のアミノ酸置換は、システイン（C）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の177位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の177位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からヒスチジン（H）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の185位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では��配列番号14487又は配列番号14484の187位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の200位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の207位のアミノ酸置換は、バリン（V）プロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の209位のアミノ酸置換は、バリン（V）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の226位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の235位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からアルギニン（R）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の240位のアミノ酸置換は、バリン（V）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の241位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の243位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の258位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からチロシン（Y）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の311位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の311位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からバリンへの置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の315位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の319位のアミノ酸置換は、トレオニン（T）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の327位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からアルギニン（R）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の328位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の340位のアミノ��置換は、システイン（C）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の340位のアミノ酸置換は、システイン（C）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の421位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（D）からヒスチジン（H）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の436位のアミノ酸置換は、バリン（V）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の456位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からチロシン（Y）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の470位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の485位のアミノ酸置換は、セリン（S）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の503位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の503位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の552位のアミノ酸置換は、バリン（V）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の570位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からトレオニン（T）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の591位のアミノ酸置換は、グルタミン（Q）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の591位のアミノ酸置換は、グルタミン（Q）からアルギニン（R）への置換である。
【０２１７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、又はスーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を更に含むことが、配列番号14487又は配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、及び570位の1つまたは複数において可能である。本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、又はスーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を更に含むことが、配列番号14487又は配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、及び570位の2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又はそれよりも多い位置において可能である。本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、165位、282位及び／又は538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、又はスーパーpiggyBacトランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を更に含むことが、配列番号14487又は配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、及び570位において可能である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の103位のアミノ酸置換は、セリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の194位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の372位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の375位のアミノ酸置換は、リシン（K）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の450位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の509位のアミノ酸置換は、セリン（S）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487又は配列番号14484の570位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素が配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を含むことができる実施態様を含め、piggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487又は配列番号14484の372位、375位、及び450位にアミノ酸置換を更に含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を、配列番号14487の372位にアルギニン（R）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の375位にリシン（K）からアラニン（A）への置換を含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）��らバリン（V）への置換を、配列番号14487の372位にアルギニン（R）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の375位にリシン（K）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の450位にアスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換を含むことができる。
【０２１８】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、昆虫に由来する。いくつかの実施態様では、昆虫は、Trichoplusia ni（イラクサギンウワバ）（GenBank登録番号AAA87375；配列番号16796）、Argyrogramma agnata（ミツモンキンウワバ）（GenBank登録番号GU477713；配列番号14534、配列番号16797）、Anopheles gambiae（ハマダラカ）（GenBank登録番号XP_312615（配列番号16798）； GenBank登録番号XP_320414（配列番号16799）；GenBank登録番号XP_310729（配列番号16800））、Aphis gossypii（ワタアブラムシ）（GenBank登録番号GU329918；配列番号16801、配列番号16802）、Acyrthosiphon pisum（エンドウヒゲナガアブラムシ）（GenBank登録番号XP_001948139；配列番号16803）、Agrotis ipsilon（タマナヤガ）（GenBank登録番号GU477714；配列番号14537、配列番号16804）、Bombyx mori（カイコ）（GenBank登録番号BAD11135；配列番号14505）、Chilo suppressalis（ニカメイガ）（GenBank登録番号JX294476；配列番号16805、配列番号16806）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）（GenBank登録番号AAL39784；配列番号16807）、Helicoverpa armigera（オオタバコガ）（GenBank登録番号ABS18391；配列番号14525）、Heliothis virescens（ニセアメリカタバコガ）（GenBank登録番号ABD76335；配列番号16808）、Macdunnoughia crassisigna（オオキクギンウワバ）（GenBank登録番号EU287451；配列番号16809、配列番号16810）、Pectinophora gossypiella（ワタアカミムシ）（GenBank登録番号GU270322；配列番号14530、配列番号16811）、Tribolium castaneum（コクヌストモドキ）（GenBank登録番号XP_001814566；配列番号16812）、Ctenoplusia agnata（ミツモンキンウワバ）（Argyrogramma agnataとも呼ばれる）、Messour bouvieri（アリ）、Megachile rotundata（モンキヌゲハキリバチ）、Bombus impatiens（マルハナバチ）、Mamestra brassicae（ヨトウガ）、Mayetiola destructor（ヘシアンバエ）、又はApis mellifera（セイヨウミツバチ）である。
【０２１９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、昆虫に由来する。いくつかの実施態様では、昆虫はTrichoplusia ni（AAA87375）である。
【０２２０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、昆虫に由来する。いくつかの実施態様では、昆虫はBombyx mori（BAD11135）である。
【０２２１】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、甲殻類から単離されるか、甲殻類に由来する。いくつかの実施態様では、甲殻類はDaphnia pulicaria（オオビワミジンコ）（AAM76342、配列番号16813）である。
【０２２２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、脊椎動物から単離されるか、脊椎動物に由来する。いくつかの実施態様では、脊椎動物は、Xenopus tropicalis（ネッタイツメガエル）（GenBank登録番号BAF82026；配列番号14518）、Homo sapiens（ホモ・サピエンス）（GenBank登録番号NP_689808；配列番号16814）、Mus musculus（マウス）（GenBank登録番号NP_741958；配列番号16815）、Macaca fascicularis（カニクイザル）（GenBank登録番号AB179012；配列番号16816、配列番号16817）、Rattus norvegicus（ラット）（GenBank登録番号XP_220453；配列番号16818）、又はMyotis lucifugus（トビイロホオヒゲコウモリ）である。
【０２２３】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、尾索類から単離されるか、尾索類に由来する。いくつかの実施態様では、尾索類はCiona intestinalis（カタユウレイボヤ）（GenBank登録番号XP_002123602；配列番号16819）である。
【０２２４】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、染色体部位内の配列5’-TTAT-3’である（TTAT標的配列）。
【０２２５】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、染色体部位内の配列5’-TTAA-3’である（TTAA標的配列）。
【０２２６】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac 様トランスポゾンの標的配列は、5’-CTAA-3’、5’-TTAG-3’、5’-ATAA-3’、5’-TCAA-3’、5’AGTT-3’、5’-ATTA-3’、5’-GTTA-3’、5’-TTGA-3’、5’-TTTA-3’、5’-TTAC-3’、5’-ACTA-3’、5’-AGGG-3’、5’-CTAG-3’、5’-TGAA-3’、5’-AGGT-3’、5’-ATCA-3’、5’-CTCC-3’、5’-TAAA-3’、5’-TCTC-3’、5’TGAA-3’、5’-AAAT-3’、5’-AATC-3’、5’-ACAA-3’、5’-ACAT-3’、5’-ACTC-3’、5’-AGTG-3’、5’-ATAG-3’、5’-CAAA-3’、5’-CACA-3’、5’-CATA-3’、5’-CCAG-3’、5’-CCCA-3’、5’-CGTA-3’、5’-GTCC-3’、5’-TAAG-3’、5’-TCTA-3’、5’-TGAG-3’、5’-TGTT-3’、5’-TTCA-3’5’-TTCT-3’、及び5’-TTTT-3’を含むか、これら配列からなる。
【０２２７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac 様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac 様トランスポザーゼ酵素は、Bombyx moriから単離されるか、Bombyx moriに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac 様トランスポザーゼ酵素は、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FDVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELSANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRANKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KHSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSSL（配列番号14504）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０２２８】
piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はPiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSSL（配列番号14505）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０２２９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼが核局在シグナルに融合される。いくつかの実施態様では、核局在シグナルに融合したpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 atggcaccca aaaagaaacg taaagtgatg gacattgaaa gacaggaaga aagaatcagg 
61 gcgatgctcg aagaagaact gagcgactac tccgacgaat cgtcatcaga ggatgaaacc 
121 gaccactgta gcgagcatga ggttaactac gacaccgagg aggagagaat cgactctgtg 
181 gatgtgccct ccaactcacg ccaagaagag gccaatgcaa ttatcgcaaa cgaatcggac 
241 agcgatccag acgatgatct gccactgtcc ctcgtgcgcc agcgggccag cgcttcgaga 
301 caagtgtcag gtccattcta cacttcgaag gacggcacta agtggtacaa gaattgccag 
361 cgacctaacg tcagactccg ctccgagaat atcgtgaccg aacaggctca ggtcaagaat 
421 atcgcccgcg acgcctcgac tgagtacgag tgttggaata tcttcgtgac ttcggacatg 
481 ctgcaagaaa ttctgacgca caccaacagc tcgattaggc atcgccagac caagactgca 
541 gcggagaact catcggccga aacctccttc tatatgcaag agactactct gtgcgaactg 
601 aaggcgctga ttgcactgct gtacttggcc ggcctcatca aatcaaatag gcagagcctc 
661 aaagatctct ggagaacgga tggaactgga gtggatatct ttcggacgac tatgagcttg 
721 cagcggttcc agtttctgca aaacaatatc agattcgacg acaagtccac ccgggacgaa 
781 aggaaacaga ctgacaacat ggctgcgttc cggtcaatat tcgatcagtt tgtgcagtgc 
841 tgccaaaacg cttatagccc atcggaattc ctgaccatcg acgaaatgct tctctccttc 
901 cgggggcgct gcctgttccg agtgtacatc ccgaacaagc cggctaaata cggaatcaaa 
961 atcctggccc tggtggacgc caagaatttc tacgtcgtga atctcgaagt gtacgcagga 
1021 aagcaaccgt cgggaccgta cgctgtttcg aaccgcccgt ttgaagtcgt cgagcggctt 
1081 attcagccgg tggccagatc ccaccgcaat gttaccttcg acaattggtt caccggctac 
1141 gagctgatgc ttcaccttct gaacgagtac cggctcacta gcgtggggac tgtcaggaag 
1201 aacaagcggc agatcccaga atccttcatc cgcaccgacc gccagcctaa ctcgtccgtg 
1261 ttcggatttc aaaaggatat cacgcttgtc tcgtacgccc ccaagaaaaa caaggtcgtg 
1321 gtcgtgatga gcaccatgca tcacgacaac agcatcgacg agtcaaccgg agaaaagcaa 
1381 aagcccgaga tgatcacctt ctacaattca actaaggccg gcgtcgacgt cgtggatgaa 
1441 ctgtgcgcga actataacgt gtcccggaac tctaagcggt ggcctatgac tctcttctac 
1501 ggagtgctga atatggccgc aatcaacgcg tgcatcatct accgcaccaa caagaacgtg 
1561 accatcaagc gcaccgagtt catcagatcg ctgggtttga gcatgatcta cgagcacctc 
1621 cattcacgga acaagaagaa gaatatccct acttacctga ggcagcgtat cgagaagcag 
1681 ttgggagaac caagcccgcg ccacgtgaac gtgccggggc gctacgtgcg gtgccaagat 
1741 tgcccgtaca aaaaggaccg caaaaccaaa agatcgtgta acgcgtgcgc caaacctatc 
1801 tgcatggagc atgccaaatt tctgtgtgaa aattgtgctg aactcgattc ctccctg（配列番号14629）を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２３０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは高活性である。高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、その出所となる天然に存在するバリアントよりも活性なトランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、Bombyx moriから単離されるか、Bombyx moriに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、配列14505の高活性なバリアントである。いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQMSGPHYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSASTS 
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSHL（配列番号14576）と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
【０２３１】
いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは配列番号14576を含んでいる。いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVHNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YEVMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAHLDS（配列番号14630）の配列を含んでいる。
【０２３２】
いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSASTS 
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIAM QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSSL（配列番号14631）の配列を含んでいる。
【０２３３】
いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKTQIPENF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELQANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSSL（配列番号14632）の配列を含んでいる。
【０２３４】
いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSSL（配列番号14633）の配列を含んでいる。
【０２３５】
いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN DYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSSRHV NVKGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSSL（配列番号14634）の配列を含んでいる。
【０２３６】
いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、配列14505のトランスポザーゼよりも活性である。いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、配列14505と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致する。
【０２３７】
いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、（配列番号14505と比べて）92、93、96、97、165、178、189、196、200、201、211、215、235、238、246、253、258、261、263、271、303、321、324、330、373、389、399、402、403、404、448、473、484、507、523、527、528、543、549、550、557、601、605、607、609、610、又はそれらの組み合わせの位置にアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、Q92A、V93L、V93M、P96G、F97H、F97C、H165E、H165W、E178S、E178H、C189P、A196G、L200I、A201Q、L211A、W215Y、G219S、Q235Y、Q235G、Q238L、K246I、K253V、M258V、F261L、S263K、C271S、N303R、F321W、F321D、V324K、V324H、A330V、L373C、L373V、V389L、S399N、R402K、T403L、D404Q、D404S、D404M、N441R、G448W、E449A、V469T、C473Q、R484K T507C、G523A、I527M、Y528K Y543I、E549A、K550M、P557S、E601V、E605H、E605W、D607H、S609H、L610I、又はそれらの任意の組み合わせのアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、Q92A、V93L、V93M、P96G、F97H、F97C、H165E、H165W、E178S、E178H、C189P、A196G、L200I、A201Q、L211A、W215Y、G219S、Q235Y、Q235G、Q238L、K246I、K253V、M258V、F261L、S263K、C271S、N303R、F321W、F321D、V324K、V324H、A330V、L373C、L373V、V389L、S399N、R402K、T403L、D404Q、D404S、D404M、N441R、G448W、E449A、V469T、C473Q、R484K T507C、G523A、I527M、Y528K Y543I、E549A、K550M、P557S、E601V、E605H、E605W、D607H、S609H、及びL610Iのアミノ酸置換を含んでいる。
【０２３８】
いくつかの実施態様では、高活性piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の1つまたは複数の置換を含んでおり、野生型アミノ酸によるその1つまたは複数のアミノ酸置換は、（配列番号14505と比べて）E4X、A12X、M13X、L14X、E15X、D20X、E24X、S25X、S26X、S27X、D32X、H33X、E36X、E44X、E45X、E46X、I48X、D49X、R58X、A62X、N63X、A64X、I65X、I66X、N68X、E69X、D71X、S72X、D76X、P79X、R84X、Q85X、A87X、S88X、Q92X、V93X、S94X、G95X、P96X、F97X、Y98X、T99X、I145X、S149X、D150X、L152X、E154X、T157X、N160X、S161X、S162X、H165X、R166X、T168X、K169X、T170X、A171X、E173X、S175X、S176X、E178X、T179X、M183X、Q184X、T186X、T187X、L188X、C189X、L194X、I195X、A196X、L198X、L200X、A201X、L203X、I204X、K205X、A206X、N207X、Q209X、S210X、L211X、K212X、D213X、L214X、W215X、R216X、T217X、G219X、V222X、D223X、I224X、T227X、M229X、Q235X、L237X、Q238X、N239X、N240X、P302X、N303X、P305X、A306X、K307X、Y308X、I310X、K311X、I312X、L313X、A314X、L315X、V316X,D317X、A318X、K319X、N320X、F321X、Y322X、V323X、V324X、L326X、E327X、V328X、A330X、Q333X、P334X、S335X、G336X、P337X、A339X、V340X、S341X、N342X、R343X、P344X、F345X、E346X、V347X、E349X、I352X、Q353X、V355X、A356X、R357X、N361X、D365X、W367X、T369X、G370X、L373X、M374X、L375X、H376X、N379X、E380X、R382X、V386X、V389X、N392X、R394X、Q395X、S399X、F400X、I401X、R402XT403X、D404X、R405X、Q406X、P407X、N408X、S409X、S410X、V411X、F412X、F414X、Q415X、I418X、T419X、L420X、N428XV432X、M434X、D440X、N441X、S442X、I443X、D444X、E445X、G448X、E449X、Q451X、K452X、M455X、I456X、T457X、F458X、S461X、A464X、V466X、Q468X、V469X、E471X、L472X、C473X、A474X、K483X、W485X、T488X、L489X、Y491X、G492X、V493X、M496X、I499X、C502X、I503X、T507X、K509X、N510X、V511X、T512X、I513X、R515X、E517X、S521X、G523X、L524X、S525X、I527X、Y528X、E529X、H532X、S533X、N535X、K536X、K537X、N539X、I540X、T542X、Y543X、Q546X、E549X、K550X、Q551X、G553X、E554X、P555X、S556X、P557X、R558X、H559X、V560X、N561X、V562X、P563X、G564X、R565X、Y566X、V567X、Q570X、D571X、P573X、Y574X、K576X、K581X、S583X、A586X、A588X、E594X、F598X、L599X、E601X、N602X、C603X、A604X、E605X、L606X、D607X、S608X、S609X、又はL610Xの置換を含んでいる。高活性なアミノ酸置換のリストは、アメリカ合衆国特許第10,041,077号に見いだすことができる（その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
【０２３９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、組み込みが不足している。いくつかの実施態様では、組み込みが不足したpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、対応するトランスポゾンを切除できるが、切除されたトランスポゾンを対応する野生型トランスポザーゼよりも低頻度で組み込むトランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、配列番号14505の組み込み不足バリアントである。
【０２４０】
いくつかの実施態様では、切除能力のある組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の1つまたは複数の置換を含んでおり、野生型アミノ酸によるその1つまたは複数のアミノ酸置換は、（配列番号14505と比べて）R9X、A12X、M13X、D20X、Y21K、D23X、E24X、S25X、S26X、S27X、E28X、E30X、D32X、H33X、E36X、H37X、A39X、Y41X、D42X、T43X、E44X、E45X、E46X、R47X、D49X、S50X、S55X、A62X、N63X、A64X、I66X、A67X、N68X、E69X、D70X、D71X、S72X、D73X、P74X、D75X、D76X、D77X、I78X、S81X,V83X、R84X、Q85X、A87X、S88X、A89X,S90X,R91X、 Q92X、V93X、S94X、G95X、P96X、F97X、Y98X、T99X、W012X、G103X、Y107X、K108X、L117X、I122X、Q128X、I312X、D135X、S137X、E139X、Y140X、 I145X、S149X、D150X、Q153X、E154X、T157X、S161X、S162X、R164X、H165X、R166X、Q167X、T168X、K169X、T170X、A171X、A172X、 E173X、R174X、S175X、S176X、A177X、E178X、T179X、S180X,Y182X、Q184X、E185X、T187X、L188X、C189X、L194X、I195X、A196X、L198X、L200X、A201X、L203X、I204X、K205X、N207X、Q209X、L211X、D213X、L214X、W215X、R216X、T217X、G219X、T220X、V222X、D223X、I224X、T227X、T228X、F234X、Q235X、L237X、Q238X、N239X、N240X、N303X、K304X、I310X、I312X、L313X、A314X、L315X、V316X,D317X、A318X、K319X、N320X、F321X、Y322X、V323X、V324X、N325X、L326X、E327X、V328X、A330X、G331X、K332X、Q333X、S335X、P337X、P344X、F345X、E349X、H359X、N361X、V362X、D365X、F368X、Y371X、E372X、L373X、H376X、E380X、R382X、R382X、V386X、G387X、T388X、V389X、K391X、N392X、R394X、Q395X、E398X、S399X、F400X、I401X、R402XT403X、D404X、R405X、Q406X、P407X、N408X、S409X、S410X、Q415X,K416X、A424X、K426X、N428X、V430X、V432X、V433X、M434X、D436X、D440X、N441X、S442X、I443X、D444X、E445X、S446X、T447X、G448X、E449X、K450X、Q451X、E454X、M455X、I456X、T457X、F458X、S461X、A464X、V466X、Q468X、V469X、C473X、A474X、N475X、N477X、K483X、R484X、P486X、T488X、L489X、G492X、V493X、M496X、I499X、I503X、Y505X、T507X、N510X、V511X、T512X、I513X、K514X、T516X、E517X、S521X、G523X、L524X、S525X、I527X、Y528X、L531X、H532X、S533X、N535X、I540X、T542X、Y543X、R545X、Q546X、E549X、L552X、G553X、E554X、P555X、S556X、P557X、R558X、H559X、V560X、N561X、V562X、P563X、G564X、V567X、Q570X、D571X、P573X、Y574X、K575X、K576X、N585X、A586X、M593X、K596X、E601X、N602X、A604X、E605X、L606X、D607X、S608X、S609X、又はL610Xの置換を含んでいる。組み込み不足アミノ酸置換のリストは、アメリカ合衆国特許第10,041,077号に見いだすことができる（その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
【０２４１】
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRKDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN 
241 IRFDDISTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKKWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMMYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPVPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSSL（配列番号14606）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYL AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFYFLQNN 
241 IRFDDKSTLD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NYPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 VNCAELDSSL（配列番号14607）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE 
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE 
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS 
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRKDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN 
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY 
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN DYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR 
361 NVTFDNWFTG YECMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL 
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR 
481 NSKKWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIKEH LHSRNKKKNI 
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC 
601 ENCAELDSSL（配列番号14608）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のトランスポザーゼは、配列番号14608と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
【０２４２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Bombyx moriから単離されるか、Bombyx moriに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac 様トランスポゾンは、
1 ttatcccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta 
61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc 
121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc 
181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt 
241 tttccgatta ttaatttcaa ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt 
301 ttatgattta ctgtatcggt tgtctttcgt tcctttagtt gagttttttt ttattatttt 
361 cagtttttga tcaaa（配列番号14506）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct 
61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt 
121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa 
181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta 
241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa 
301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc 
361 cgggttat（配列番号14507）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttatcccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta 
61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc 
121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc 
181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcat（配列番号14508）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBac（PB）トランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 taaataataa taatttcata attaaaaact tctttcattg aatgccatta aataaaccat 
61 tattttacaa aataagatca acataattga gtaaataata ataagaacaa tattatagta 
121 caacaaaata tgggtatgtc ataccctgcc acattcttga tgtaactttt tttcacctca 
181 tgctcgccgg gttat（配列番号14509）の配列を含んでいる。
【０２４３】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506に対応する5'配列と、配列番号14507に対応する3'配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの一端は、配列番号14506と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致し、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの他端は、配列番号14507と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506と、配列番号14507又は配列番号14509を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14508と、配列番号14507又は配列番号14509を含んでいる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン末端と3'トランスポゾン末端は、その端部で、5'-TTAT-3'標的挿入部位に隣接したCCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）（その2つの末端において向きが逆転している）という16 bpの反復配列を共有している。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン末端は、5'-TTATCCCGGCGAGCATGAGG-3'（配列番号14511）を含む配列で始まり、3'トランスポゾン末端は、この配列の逆転相補配列5'-CCTCATGCTCGCCGGGTTAT-3'（配列番号14512）を含む配列で終わっている。
【０２４４】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506又は配列番号14508の少なくとも14個、16個、18個、20個、30個、又は40個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14507又は配列番号14509の少なくとも14個、16個、18個、20個、30個、又は40個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506又は配列番号14508と少なくとも90％一致する1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14507又は配列番号14509と少なくとも90％一致する1つの端部を含んでいる。
【０２４５】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaacccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta 
61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc 
121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc 
181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt 
241 tttccgatta ttaatttcaa ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt 
301 ttatgattta ctgtatcggt tgtctttcgt tcctttagtt gagttttttt ttattatttt 
361 cagtttttga tcaaa（配列番号14515）の配列を含んでいる。
【０２４６】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct 
61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt 
121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa 
181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataatt cattatttta 
241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa 
301 atatgggtat gtcataccct tttttttttt tttttttttt ttttttcggg tagagggccg 
361 aacctcctac gaggtccccg cgcaaaaggg gcgcgcgggg tatgtgagac tcaacgatct 
421 gcatggtgtt gtgagcagac cgcgggccca aggattttag agcccaccca ctaaacgact 
481 cctctgcact cttacacccg acgtccgatc ccctccgagg tcagaacccg gatgaggtag 
541 gggggctacc gcggtcaaca ctacaaccag acggcgcggc tcaccccaag gacgcccagc 
601 cgacggagcc ttcgaggcga atcgaaggct ctgaaacgtc ggccgtctcg gtacggcagc 
661 ccgtcgggcc gcccagacgg tgccgctggt gtcccggaat accccgctgg accagaacca 
721 gcctgccggg tcgggacgcg atacaccgtc gaccggtcgc tctaatcact ccacggcagc 
781 gcgctagagt gctggta（配列番号14516）の配列を含んでいる。
【０２４７】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
CCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14510というITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、TTATCCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14511）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14511からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、CCTCATGCTCGCCGGGTTAT（配列番号14512）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14512からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14511からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部と、配列番号14512からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14511と配列番号14512を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14513）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、CCTCATGCTCGCCGGGTTAA（配列番号14514）の配列を含んでいる。
【０２４８】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506と配列番号14507を含む端部か、その一方又は両方のバリアントで配列番号14506又は配列番号14507と少なくとも90％一致する配列を持つものを含む端部を持つことができ、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504又は配列番号14505の配列か、配列番号14504又は配列番号14505と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致する配列を有する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、一対の逆方向反復の間に挿入された異種ポリヌクレオチドを含んでいて、そのトランスポゾンは、配列番号14504又は配列番号14505と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼによる転移が可能である。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは2つのトランスポゾン端部を含んでいて、そのそれぞれは、その2つのトランスポゾン端部の中に配列番号14510を逆向きに含んでいる。いくつかの実施態様では、それぞれの逆方向末端反復（ITR）は、配列番号14510と少なくとも90％一致している。
【０２４９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼにより、標的核酸内の配列5'-TTAT-3'の位置に挿入することができる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの1つの端部は、配列番号14506からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含み、トランスポゾンの他方の端部は、配列番号14507からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの1つの端部は、配列番号14506からの少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも22個、少なくとも25個、少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14507からの少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも22個、少なくとも25個、少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含んでいる。
【０２５０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506と配列番号14507に対応するトランスポゾン端部（それぞれの端部がITRを含む）を含み、5'-TTAT3'に対応する標的配列を有する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、トランスポザーゼをコードする配列（例えば配列番号14505）も含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506に対応する1つのトランスポゾン端部と、配列番号14516に対応する第2のトランスポゾン端部を含んでいる。配列番号14516は配列番号14507と非常によく似ているが、ITRの少し前に大きな挿入部を有する。2つのトランスポゾン端部のためのITR配列は同じ（両方とも14510と同じ）だが、異なる標的配列を有する。すなわち第2のトランスポゾンは、5'-TTAA-3'に対応する標的配列を有するため、ITR配列が変化しないことが、標的配列特異性を変化させるのに必要であることの証拠を提供する。piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼ（配列番号14504）は、5'-TTAA-3'標的部位と関係していて、5'-TTAT-3'関連トランスポザーゼ（配列番号14505）とは4つのアミノ酸（D322Y、S473C、A507T、H582R）だけが異なっている。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼ（配列番号14504）は、5'-TTAA-3'標的部位と関係していて、5'-TTAT-3'に関連するpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼ（配列番号14505）よりも5'-TTAT-3'末端を有するトランスポゾンに対する活性が小さい。いくつかの実施態様では、5'-TTAA-3'標的部位を有するpiggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、5'-TTAA-3'標的部位を5'-TTAT-3'標的部位で置換することにより、5'-TTAT-3'標的部位を有するpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼに変換することができる。このようなトランスポゾンを、5'-TTAT-3'標的配列を認識するpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼ（配列番号14504など）とともに、又は元々は5'-TTAA-3'トランスポゾンと関係していたトランスポザーゼのバリアントとともに用いることができる。いくつかの実施態様では、5'-TTAA-3' piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼと5'-TTAT-3' piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼの間の大きな類似性は、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼのアミノ酸配列のごく少数の変化が標的配列特異性を変化させることを実証している。いくつかの実施態様では、任意のpiggyBacトランスポゾン-トランスポザーゼ遺伝子輸送系又はpiggyBac様トランスポゾン-トランスポザーゼ遺伝子輸送系の改変は、変異をトランスポザーゼの中に導入するための低レベルの突然変異誘発の結果であり、その遺伝子輸送系の中の5'-TTAA-3'標的配列が5'-TTAT-3'標的配列で置換され、ITRは同じままであり、トランスポザーゼは元のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼ、又はそのバリアントである。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン-トランスポザーゼ輸送系又はpiggyBac様トランスポゾン-トランスポザーゼ輸送系は、5'-TTAT-3'活性なpiggyBacトランスポゾン-トランスポザーゼ遺伝子輸送系又はpiggyBac様トランスポゾン-トランスポザーゼ遺伝子輸送系を改変し、その中の5'-TTAT-3'標的配列を5'-TTAA-3'標的配列で置換し、ITRは同じままにし、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは元のトランスポザーゼ又はそのバリアントにすることによって形成できる。
【０２５１】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Bombyx moriから単離されるか、Bombyx moriに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac 様トランスポゾンは、
1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt 
61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga 
121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac 
181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta t（配列番号14577）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttaagaaaa agattaataa ataataataa tttcataatt aaaaacttct ttcattgaat 
61 gccattaaat aaaccattat tttacaaaat aagatcaaca taattgagta aataataata 
121 agaacaatat tatagtacaa caaaatatgg gtatgtcata ccctgccaca ttcttgatgt 
181 aacttttttt cacctcatgc tcgccggg（配列番号14578）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、配列番号14577からの少なくとも16個の連続した塩基と、配列番号14578からの少なくとも16個の連続した塩基と、CCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）と少なくとも87％一致する逆方向末端反復を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt 
61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga 
121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac 
181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc 
241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat 
301 gatttactgt atcggttgtc tttcgttcct ttagttgagt ttttttttat tattttcagt 
361 ttttgatcaa a（配列番号14595）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct 
61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt 
121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa 
181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta 
241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa 
301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc 
361 cggg（配列番号14596）の配列を含んでいる。
【０２５２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14595と配列番号14596を含んでいて、配列番号14505のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼによって転移される。いくつかの実施態様では、配列番号14595と配列番号14596のITRは5'-TTAA-3'配列に隣接していない。いくつかの実施態様では、配列番号14595と配列番号14596のITRは5'-TTAT-3'配列に隣接している。
【０２５３】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt 
61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga 
121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac 
181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc 
241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat 
301 g（配列番号14597）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta ttttataaaa ttttcgtctg 
61 acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc gggaggggat agtggcgtga 
121 tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc aaacctgttt cgggtatgtt 
181 ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt tttccgatta ttaatttcaa 
241 ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt ttatg（配列番号14598）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta ttttataaaa ttttcgtctg 
61 acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc gggaggggat agtggcgtga 
121 tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc aaacctgttt cgggtatgtt 
181 ataccctgcc tcattgttga cgtat（配列番号14599）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの5'末端は、配列番号14577、配列番号14595、又は配列番号14597〜14599の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの5'末端の前に5'標的配列がある。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct 
61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt 
121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa 
181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta 
241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa 
301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc 
361 cggg（配列番号14600）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttaagaaaa agattaataa ataataataa tttcataatt aaaaacttct ttcattgaat 
61 gccattaaat aaaccattat tttacaaaat aagatcaaca taattgagta aataataata 
121 agaacaatat tatagtacaa caaaatatgg gtatgtcata ccctgccaca ttcttgatgt 
181 aacttttttt ca（配列番号14601）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt 
61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga 
121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac 
181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc 
241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat 
301 gatttactgt atcggttgtc tttcgttcct ttagttgagt ttttttttat tattttcagt 
361 ttttgatcaa a（配列番号14602）の配列を含んでいる。
【０２５４】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの3'末端は、配列番号14578、配列番号14596、又は配列番号14600〜14601の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの3'末端の後に3'標的配列が続く。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、配列番号14505のトランスポザーゼによって転移される。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの5'末端と3'末端は、標的配列に隣接している反対方向の配列番号14510の16 bpの反復配列を共有している。いくつかの実施態様では、トランスポゾンの5'末端は配列番号14510で始まり、トランスポゾンの3'末端は配列番号14510の逆相補的配列である5’- CCTCATGCTCGCCGGG-3’（配列番号14603）で終わる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14510又は配列番号14603と少なくとも93％、少なくとも87％、少なくとも81％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致するITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、標的配列と、その後に続く配列番号88、105、又は107から選択された配列を含むトランスポゾンの5'末端と、配列番号14578又は106を含むトランスポゾンの3'末端と、その後に続く標的配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14577と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致する配列を含む1つの端部と、配列番号14578と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致する配列を含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14577からの少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも18個、又は少なくとも20個の連続した塩基を含み、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14578からの少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも18個、又は少なくとも20個の連続した塩基を含んでいる。
【０２５５】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、2つのトランスポゾン端部を含んでおり、それぞれのトランスポゾン端部は、配列番号14510と少なくとも81％、少なくとも87％、少なくとも93％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致する配列を、それら2つのトランスポゾン端部の中に逆向きに含んでいる。1つの端部は、配列番号14599からの少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも18個、又は少なくとも20個の連続した塩基を更に含むことができ、他方の端部は、配列番号14601からの少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも18個、又は少なくとも20個の連続した塩基を更に含むことができる。piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14505のトランスポザーゼによって転移することができ、このトランスポザーゼは場合によっては核局在シグナルに融合させることができる。
【０２５６】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14595と配列番号14596を含み、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504又は配列番号14505を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14597と配列番号14596を含み、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504又は配列番号14505を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14595と配列番号14578を含み、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504又は配列番号14505を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14602と配列番号14600を含み、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504又は配列番号14505を含んでいる。
【０２５７】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、ATGAGGCAGGGTAT（配列番号14614）、ATACCCTGCCTCAT（配列番号14615）、GGCAGGGTAT（配列番号14616）、ATACCCTGCC（配列番号14617）、TAAAATTTTA（配列番号14618）、ATTTTATAAAAT（配列番号14619）、TCATACCCTG（配列番号14620）、及びTAAATAATAATAA（配列番号14621）から選択された1、2、3、4、5、6、又は7つの配列を含む5'末端を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14617、配列番号14620、及び配列番号14621から選択された1、2、又は3つの配列を含む3'末端を含んでいる。
【０２５８】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Xenopus tropicalisから単離されるか、Xenopus tropicalisに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY（配列番号14517）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０２５９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517の高活性バリアントである。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517の組み込み不足バリアントである。piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMAPSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWNTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPDHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLR FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT 
361 PACGTINRTR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT SAWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMLP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY（配列番号14518）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０２６０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、Xenopus tropicalisから単離されるか、Xenopus tropicalisに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPD SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14572）と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
【０２６１】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼである。高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、その出所である天然に存在するバリアントよりも活性なトランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517のトランスポザーゼよりも活性である。いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPD SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14572）の配列を含んでいる。
【０２６２】
いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14624）の配列を含んでいる。
【０２６３】
いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLKIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY（配列番号14625）の配列を含んでいる。
【０２６４】
いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EQTSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRKPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14627）の配列を含んでいる。
【０２６５】
いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14628）の配列を含んでいる。
【０２６６】
いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号16820）の配列を含んでいる。
【０２６７】
いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、（配列番号14517と比べて）アミノ酸6、7、16、19、20、21、22、23、24、26、28、31、34、67、73、76、77、88、91、141、145、146、148、150、157、162、179、182、189、192、193、196、198、200、210、212、218、248、263、270、294、297、308、310、333、336、354、357、358、359、377、423、426、428、438、447、450、462、469、472、498、502、517、520、523、533、534、576、577、582、583、587から選択された位置にアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、（配列番号14517と比べて）Y6C、S7G、M16S、S19G、S20Q、S20G、S20D、E21D、E22Q、F23T、F23P、S24Y、S26V、S28Q、V31K、A34E、L67A、G73H、A76V、D77N、P88A、N91D、Yl41Q、Y141A、N145E、N145V、P146T、P146V、P146K、P148T、P148H、Y150G、Y150S、Y150C、H157Y、A162C、A179K、L182I、L182V、T189G、L192H、S193N、S193K、V196I、S198G、T200W、L210H、F212N、N218E、A248N、L263M、Q270L、S294T、T297M、S308R、L310R、L333M、Q336M、A354H、C357V、L358F、D359N、L377I、V 423H、P426K、K428R、S438A、T447G、T447A、L450V、A462H、A462Q、I469V、I472L、Q498M、L502V、E5171、P520D、P520G、N523S、I533E、D534A、F576R、F576E、K577I、I582R、Y583F、L587Y、又はL587W、又はそれらの任意の組み合わせのアミノ酸置換を含んでおり、その中には、これら変異の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はすべてが含まれる。
【０２６８】
いくつかの実施態様では、高活性のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の1つまたは複数の置換を含んでおり、野生型アミノ酸によるその1つまたは複数の置換は、（配列番号14517と比べて）A2X、K3X、R4X、F5X、Y6X、S7X、A11X、A13X、C15X、M16X、A17X、S18X、S19X、S20X、E21X、E22X、F23X、S24X、G25X、26X、D27X、S28X、E29X、E42X、E43X、S44X、C46X、S47X、S48X、S49X、T50X、V51X、S52X、A53X、L54X、E55X、E56X、P57X、M58X、E59X、E62X、D63X、V64X、D65X、D66X、L67X、E68X、D69X、Q70X、E71X、A72X、G73X、D74X、R75X、A76X、D77X、A78X、A79X、A80X、G81X、G82X、E83X、P84X、A85X、W86X、G87X、P88X、P89X、C90X、N91X、F92X、P93X、E95X、I96X、P97X、P98X、F99X、T100X、T101X、P103X、G104X、V105X、K106X、V107X、D108X、T109X、N111X、P114X、I115X、N116X、F117X、F118X、Q119X、M122X、T123X、E124X、A125X、I126X、L127X、Q128X、D129X、M130X、L132X、Y133X、V126X、Y127X、A138X、E139X、Q140X、Y141X、L142X、Q144X、N145X、P146X、L147X、P148X、Y150X、A151X、A155X、H157X、P158X 、I161X、A162X、V168X、T171X、L172X、A173X、M174X、I177X、A179X、L182X、D187X、T188X、T189X、T190X、L192X、S193X、I194X、P195X、V196X、S198X、A199X、T200X、S202X、L208X、L209X、L210X、R211X、F212X、F215X、N217X、N218X、A219X、T220X、A221X、V222X、P224X、D225X、Q226X、P227X、H229X、R231X、H233X、L235X、P237X、I239X、D240X、L242X、S243X、E244X、R244X、F246X、A247X、A248X、V249X、Y250X、T251X、P252X、C253X、Q254X、I256X、C257X、I258X、D259X、E260X、S261X、L262X、L263X、L264X、F265X、K266X、G267X、R268X、L269X、Q270X、F271X、R272X、Q273X、Y274X、I275X、P276X、S277X、K278X、R279X、A280X、R281X、Y282X、G283X、I284X、K285X、F286X、Y287X、K288X、L289X、C290X、E291X、S292X、S293X、S294X、G295X、Y296X、T297X、S298X、Y299X、F300X、E304X、L310X、P313X、G314X、P316X、P317X、D318X、L319X、T320X、V321X、K324X、E328X、I330X、S331X、P332X、L333X、L334X、G335X、Q336X、F338X、L340X、D343X、N344X、F345X、Y346X、S347X、L351X、F352X、A354X、L355X、Y356X、C357X、L358X、D359X、T360X、R422X、Y423X、G424X、P426X、K428X、N429X、K430X、P431X、L432X、S434X、K435X、E436X、S438X、K439X、Y440X、G443X、R446X、T447X、L450X、Q451X、N455X、T460X、R461X、A462X、K465X、V467X、G468X、I469X、Y470X、L471X、I472X、M474X、A475X、L476X、R477X、S479X、Y480X、V482X、Y483X、K484X、A485X、A486X、V487X、P488X、P490X、K491X、S493X、Y494X、Y495X、K496X、Y497T、Q498X、L499X、Q500X、I501X、L502X、P503X、A504X、L505X、L506X、F507X、G508X、G509X、V510X、E511X、E512X、Q513X、T514X、V515X、E517X、M518X、P519X、P520X、S521X、D522X、N523X、V524X、A525X、L527X、I528X、K530X、H531X、F532X、I533X、D534X、T535X、L536X、T539X、P540X、Q546X、K550X、R553X、K554X、R555X、G556X、I557X、R558X、R559X、D560X、T561X、Y564X、P566X、K567X、P569X、R570X、N571X、L574X、C575X、F576X、K577X、P578X、F580X、E581X、I582X、Y583X、T585X、Q586X、L587X、H588X、又はY589Xの置換を含んでいる。高活性アミノ酸置換のリストは、アメリカ合衆国特許第10,041,077号に見いだすことができる（その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
【０２６９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、組み込み不足である。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、対応するトランスポゾンを切除できるが、その切除されたトランスポゾンを対応する天然に存在するトランスポザーゼよりも低頻度で組み込むトランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517の組み込み不足バリアントである。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517と比べて不足している。
【０２７０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、切除に関して活性だが、組み込みが不足している。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRVDAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL KFLHFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR（配列番号14605）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
【０２７１】
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLNIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLEFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY（配列番号14604）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
【０２７２】
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNVLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNDAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLTERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR（配列番号14611）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
【０２７３】
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14611を含んでいる。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAP GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR（配列番号14612）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
【０２７４】
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14612を含んでいる。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV 
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL 
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN 
181 SLESYWDTTT VLNIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLEFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID 
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF 
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT 
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE 
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY 
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP 
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR（配列番号14613）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
【０２７５】
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14613を含んでいる。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼはアミノ酸置換を含んでおり、218位のAsnが（配列番号14517と比べて）Glu又はAspで置換されている（N218D 又はN218E）。
【０２７６】
いくつかの実施態様では、切除能力のある組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の1つまたは複数の置換を含んでおり、野生型アミノ酸によるその1つまたは複数の置換は、（配列番号14517と比べて）A2X、K3X、R4X、F5X、Y6X、S7X、A8X、E9X、E10X、A11X、A12X、A13X、H14X、C15X、M16X、A17X、S18X、S19X、S20X、E21X、E22X、F23X、S24X、G25X、26X、D27X、S28X、E29X、V31X、P32X、P33X、A34X、S35X、E36X、S37X、D38X、S39X、S40X、T41X、E42X、E43X、S44X、W45X、C46X、S47X、S48X、S49X、T50X、V51X、S52X、A53X、L54X、E55X、E56X、P57X、M58X、E59X、V60X、M122X、T123X、E124X、A125X、L127X、Q128X、D129X、L132X、Y133X、V126X、Y127X、E139X、Q140X、Y141X、L142X、T143X、Q144X、N145X、P146X、L147X、P148X、R149X、Y150X、A151X、H154X、H157X、P158X、T159X、D160X、I161X、A162X、E163X、M164X、K165X、R166X、F167X、V168X、G169X、L170X、T171X、L172X、A173X、M174X、G175X、L176X、I177X、K178X、A179X、N180X、S181X、L182X、S184X、Y185X、D187X、T188X、T189X、T190X、V191X、L192X、S193X、I194X、P195X、V196X、F197X、S198X、A199X、T200X、M201X、S202X、R203X、N204X、R205X、Y206X、Q207X、L208X、L209X、L210X、R211X、F212X、L213X、H241X、F215X、N216X、N217X、N218X、A219X、T220X、A221X、V222X、P223X、P224X、D225X、Q226X、P227X、G228X、H229X、D230X、R231X、H233X、K234X、L235X、R236X、L238X、I239X、D240X、L242X、S243X、E244X、R244X、F246X、A247X、A248X、V249X、Y250X、T251X、P252X、C253X、Q254X、N255X、I256X、C257X、I258X、D259X、E260X、S261X、L262X、L263X、L264X、F265X、K266X、G267X、R268X、L269X、Q270X、F271X、R272X、Q273X、Y274X、I275X、P276X、S277X、K278X、R279X、A280X、R281X、Y282X、G283X、I284X、K285X、F286X、Y287X、K288X、L289X、C290X、E291X、S292X、S293X、S294X、G295X、Y296X、T297X、S298X、Y299X、F300X、I302X、E304X、G305X,K306X、D307X、S308X、K309X、 L310X、D311X、P312X、P313X、G314X、C315X、P316X、P317X、D318X、L319X、T320X、V321X、S322X、G323X、K324X、I325X、V326X、W327X、E328X、L329X、I330X、S331X、P332X、L333X、L334X、G335X、Q336X、F338X、H339X、L340X、V342X、N344X、F345X、Y346X、S347X、S348X、I349X、L351X、T353X、A354X、Y356X、C357X、L358X、D359X、T360X、P361X、A362X、C363X、G364X、I366X、N367X、R368X、D369X、K371X、G372X、L373X、R375X、A376X、L377X、L378X、D379X、K380X、K381X、L382X、N383X、R384XG385X、T387X、Y388X、A389X、L390X、K392X、N393X、E394X、A397X、K399X、F400X、F401X、D402X、N405X、L406X、L409X、R422X、Y423X、G424X、E425X、P426X、K428X、N429X、K430X、P431X、L432X、S434X、K435X、E436X、S438X、K439X、Y440X、G442X、G443X、V444X、R446X、T447X、L450X、Q451X、H452X、N455X、T457X、R458X、T460X、R461X、A462X、Y464X、K465X、V467X、G468X、I469X、L471X、I472X、Q473X、M474X、L476X、R477X、N478X、S479X、Y480X、V482X、Y483X、K484X、A485X、A486X、V487X、P488X、G489X、P490X、K491X、L492X、S493X、Y494X、Y495X、K496X、Q498X、L499X、Q500X、I501X、L502X、P503X、A504X、L505X、L506X、F507X、G508X、G509X、V510X、E511X、E512X、Q513X、T514X、V515X、E517X、M518X、P519X、P520X、S521X、D522X、N523X、V524X、A525X、L527X、I528X、G529X、K530X、F532X、I533X、D534X、T535X、L536X、P537X、P538X、T539X、P540X、G541X、F542X、Q543X、R544X、P545X、Q546X、K547X、G548X、C549X、K550X、V551X、C552X、R553X、K554X、R555X、G556X、I557X、R558X、R559X、D560X、T561X、R562X、Y563X、Y564X、C565X、P566X、K567X、C568X、P569X、R570X、N571X、P572X、G573X、L574X、C575X、F576X、K577X、P578X、C579X、F580X、E581X、I582X、Y583X、H584X、T585X、Q586X、L587X、H588X、又はY589Xの置換を含んでいる。切除能力のある組み込み不足のアミノ酸置換のリストは、アメリカ合衆国特許第10,041,077号に見いだすことができる（その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
【０２７７】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは核局在シグナルに融合される。いくつかの実施態様では、配列番号14517又は配列番号14518が核局在シグナルに融合される。いくつかの実施態様では、核局在シグナルに融合されるpiggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼのアミノ酸置換は、
1 atggcaccca aaaagaaacg taaagtgatg gccaaaagat tttacagcgc cgaagaagca 
61 gcagcacatt gcatggcatc gtcatccgaa gaattctcgg ggagcgattc cgaatatgtc 
121 ccaccggcct cggaaagcga ttcgagcact gaggagtcgt ggtgttcctc ctcaactgtc 
181 tcggctcttg aggagccgat ggaagtggat gaggatgtgg acgacttgga ggaccaggaa 
241 gccggagaca gggccgacgc tgccgcggga ggggagccgg cgtggggacc tccatgcaat 
301 tttcctcccg aaatcccacc gttcactact gtgccgggag tgaaggtcga cacgtccaac 
361 ttcgaaccga tcaatttctt tcaactcttc atgactgaag cgatcctgca agatatggtg 
421 ctctacacta atgtgtacgc cgagcagtac ctgactcaaa acccgctgcc tcgctacgcg 
481 agagcgcatg cgtggcaccc gaccgatatc gcggagatga agcggttcgt gggactgacc 
541 ctcgcaatgg gcctgatcaa ggccaacagc ctcgagtcat actgggatac cacgactgtg 
601 cttagcattc cggtgttctc cgctaccatg tcccgtaacc gctaccaact cctgctgcgg 
661 ttcctccact tcaacaacaa tgcgaccgct gtgccacctg accagccagg acacgacaga 
721 ctccacaagc tgcggccatt gatcgactcg ctgagcgagc gattcgccgc ggtgtacacc 
781 ccttgccaaa acatttgcat cgacgagtcg cttctgctgt ttaaaggccg gcttcagttc 
841 cgccagtaca tcccatcgaa gcgcgctcgc tatggtatca aattctacaa actctgcgag 
901 tcgtccagcg gctacacgtc atacttcttg atctacgagg ggaaggactc taagctggac 
961 ccaccggggt gtccaccgga tcttactgtc tccggaaaaa tcgtgtggga actcatctca 
1021 cctctcctcg gacaaggctt tcatctctac gtcgacaatt tctactcatc gatccctctg 
1081 ttcaccgccc tctactgcct ggatactcca gcctgtggga ccattaacag aaaccggaag 
1141 ggtctgccga gagcactgct ggataagaag ttgaacaggg gagagactta cgcgctgaga 
1201 aagaacgaac tcctcgccat caaattcttc gacaagaaaa atgtgtttat gctcacctcc 
1261 atccacgacg aatccgtcat ccgggagcag cgcgtgggca ggccgccgaa aaacaagccg 
1321 ctgtgctcta aggaatactc caagtacatg gggggtgtcg accggaccga tcagctgcag 
1381 cattactaca acgccactag aaagacccgg gcctggtaca agaaagtcgg catctacctg 
1441 atccaaatgg cactgaggaa ttcgtatatt gtctacaagg ctgccgttcc gggcccgaaa 
1501 ctgtcatact acaagtacca gcttcaaatc ctgccggcgc tgctgttcgg tggagtggaa 
1561 gaacagactg tgcccgagat gccgccatcc gacaacgtgg cccggttgat cggaaagcac 
1621 ttcattgata ccctgcctcc gacgcctgga aagcagcggc cacagaaggg atgcaaagtt 
1681 tgccgcaagc gcggaatacg gcgcgatacc cgctactatt gcccgaagtg cccccgcaat 
1741 cccggactgt gtttcaagcc ctgttttgaa atctaccaca cccagttgca ttac（配列番号14626）を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２７８】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Xenopus tropicalisから単離されるか、Xenopus tropicalisに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaacctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg 
61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg 
121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg 
181 ctgtc（配列番号14519）の配列を含んでいる。
【０２７９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa 
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg 
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa 
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa gggttaa（配列番号14520）の配列を含んでいる。
【０２８０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14519と配列番号14520を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaacccttt gcctgccaat cacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg 
61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg 
121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg 
181 ctgtc（配列番号14521）の配列を含んでいる。
【０２８１】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa 
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg 
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa 
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttggg acaaatcggc tggcagtgaa agggttaa（配列番号14522）の配列を含んでいる。
【０２８２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaacctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg 
61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaattctt ctctctgcag cggcagcatg 
121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg 
181 ctgtc（配列番号14523）の配列を含んでいる。
【０２８３】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14520と、配列番号14519、配列番号14521、又は配列番号14523を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14522と、配列番号14519、配列番号14521、又は配列番号14523を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14519、配列番号14521、又は配列番号14523からの少なくとも14個、16個、18個、20個、30個、又は40個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14520又は配列番号14522からの少なくとも14個、16個、18個、20個、30個、又は40個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14519、配列番号14521、又は配列番号14523と少なくとも90％一致する1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14520又は配列番号14522と少なくとも90％一致する1つの端部を含んでいる。一実施態様では、1つのトランスポゾン端部は配列番号14519と少なくとも90％一致し、他方のトランスポゾン端部は配列番号14520と少なくとも90％一致している。
【０２８４】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCTTTTTACTGCCA（配列番号14524）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCCTTTGCCTGCCA（配列番号14526）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCYTTTTACTGCCA（配列番号14527）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、TGGCAGTAAAAGGGTTAA（配列番号14529）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、TGGCAGTGAAAGGGTTAA（配列番号14531）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCYTTTKMCTGCCA（配列番号14533）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの1つの端部は、配列番号14524、配列番号14526、及び配列番号14527から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBac（PB）トランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの1つの端部は、配列番号14529と配列番号14531から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンのそれぞれの逆方向末端反復は、CCYTTTKMCTGCCA（配列番号14563）というITR配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBac（PB）トランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの各端部は、配列番号14563を逆向きに含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの1つのITRは、配列番号14524、配列番号14526、及び配列番号14527から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの1つのITRは、配列番号14529と配列番号14531から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、2つのトランスポゾン端部の中に配列番号14533を逆向きに含んでいる。
【０２８５】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14519と配列番号14520を含むか、その一方又は両方のバリアントで、配列番号14519又は配列番号14520と少なくとも90％一致するものを含む端部を持つことができ、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517、又は配列番号14517又は配列番号14518と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合が一致するバリアントの配列を有する。いくつかの実施態様では、1つのpiggyBacトランスポゾン端部又はpiggyBac様トランスポゾン端部は、配列番号14519、配列番号14521、又は配列番号14523からの少なくとも14個の連続したヌクレオチドを含んでおり、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14520又は配列番号14522からの少なくとも14個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14519、配列番号14521、配列番号14523いずれかからの少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも22個、少なくとも25個、少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14520又は配列番号14522からの少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも22個、少なくとも25個、少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含んでいる。
【０２８６】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14519に対応する5'配列と、配列番号14520に対応する3'配列を有する1つのトランスポゾン端部を認識する。それは、1つのDNA分子からのトランスポゾンの切除を、そのDNAを、1つのトランスポゾンの5'末端にある5'TTAA-3'配列から第2のトランスポゾン末端の3'末端の5'-TTAA-3'まで（これらの間に位置する任意の相同なDNAが含まれる）切断することによって実現し、切除されたその配列を第2のDNA分子に挿入することになる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部と3'トランスポゾン端部の切断型改変バージョンは、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼによって転移させることのできるトランスポゾンの一部としても機能するであろう。例えば5'トランスポゾン端部は、配列番号14521又は配列番号14523に対応する配列で置き換えることができ、3'トランスポゾン端部は、配列番号14522に対応するより短い配列で置き換えることができる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部と3'トランスポゾン端部は、その端部で、5'-TTAA-3'挿入部位（この配列は2つの端部の中で逆向きである）を含む18 bpのほぼ完全な反復配列（5'-TTAACCYTTTKMCTGCCA：配列番号14533）を共有している。すなわち配列番号14519と配列番号14523では、5'トランスポゾン端部は配列5'-TTAACCTTTTTACTGCCA-3'（配列番号14524）で始まり、配列番号14521では、5'トランスポゾン端部は配列5'-TTAACCCTTTGCCTGCCA-3'（配列番号14526）で始まり；この配列のほぼ逆相補的配列を有する3'トランスポゾン端部は、配列番号14520では5' TGGCAGTAAAAGGGTTAA-3'（配列番号14529）で終わり、配列番号14522では5'-TGGCAGTGAAAGGGTTAA-3'（配列番号14531）で終わる。本発明の一実施態様は、2つのトランスポゾン端部（それぞれが、2つのトランスポゾン端部の中に配列番号14533を逆向きに含む）の間に挿入された異種ポリヌクレオチドを含むトランスポゾンである。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14524、配列番号14526、及び配列番号14527から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14529と配列番号14531から選択された配列を含んでいる。
【０２８７】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Xenopus tropicalisから単離されるか、Xenopus tropicalisに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa 
61 cgacgcgtcc catacgtt（配列番号14573）の配列を含んでいる。
【０２８８】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctgggtaaa ctaaaagtcc cctcgaggaa aggcccctaa agtgaaacag tgcaaaacgt 
61 tcaaaaactg tctggcaata caagttccac tttgggacaa atcggctggc agtgaaaggg（配列番号14574）の配列を含んでいる。
【０２８９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14573又は配列番号14574からの少なくとも16個の連続した塩基と、CCYTTTBMCTGCCA（配列番号14575）という逆方向末端配列を含んでいる。
【０２９０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa 
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc 
121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt 
181 c（配列番号14579）の配列を含んでいる。
【０２９１】
piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、いくつかの実施態様では、
1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa 
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta attcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc 
121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt 
181 c（配列番号14580）の配列を含んでいる。
【０２９２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa 
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc 
121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt 
181 c（配列番号14581）の配列を含んでいる。
【０２９３】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa 
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc 
121 gccgctgcag agag（配列番号14582）の配列を含んでいる。
【０２９４】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa 
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtctt（配列番号14583）の配列を含んでいる。
【０２９５】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa 
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtctt（配列番号14584）の配列を含んでいる。
【０２９６】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttatcctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg 
61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg 
121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg 
181 ctgtc（配列番号14585）の配列を含んでいる。
【０２９７】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa 
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg 
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa 
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttggg acaaatcggc tggcagtgaa aggg（配列番号14586）の配列を含んでいる。
【０２９８】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14573と配列番号14579〜14585から選択された5'トランスポゾン端部配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部配列の前に5'標的配列がある。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa 
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg 
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa 
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa ggg（配列番号14587）の配列を含んでいる。
【０２９９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa 
61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact 
121 ttgaccaaaa cggctggcag taaaaggg（配列番号14588）の配列を含んでいる。
【０３００】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa 
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg 
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa 
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa gggttat（配列番号14589）の配列を含んでいる。
【０３０１】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa 
61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact 
121 ttgggacaaa tcggctggca gtgaaaggg（配列番号14590）の配列を含んでいる。
【０３０２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14574と配列番号14587〜14590から選択された3'トランスポゾン端部配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、3'トランスポゾン端部配列の後に3'標的配列がある。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部と3'トランスポゾン端部は、標的配列に隣接したそれら2つの端部の中に、14反復配列（配列番号14575）を逆向きで共有している。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、標的配列と、配列番号14582〜14584と14573から選択された配列を含む5'標的配列と、配列番号14588〜14590と14574から選択された配列を含む3'トランスポゾン端部と、その後の3'標的配列を含んでいる。
【０３０３】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの5'トランスポゾン端部は、
1 atcacgcatg ggatacgtcg tggcagtaaa agggcttaaa tgccaacgac gcgtcccata 
61 cgtt（配列番号14591）とITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部は、
1 atgacgcatg ggatacgtcg tggcagtaaa agggcttaaa tgccaacgac gcgtcccata 
61 cgttgttggc attttaagtc tt（配列番号14592）とITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンの3'トランスポゾン端部は、
1 cctgggtaaa ctaaaagtcc cctcgaggaa aggcccctaa agtgaaacag tgcaaaacgt 
61 tcaaaaactg tctggcaata caagttccac tttgggacaa atcggc（配列番号14593）とITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、3'トランスポゾン端部は、
1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa 
61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact 
121 ttgaccaaaa cggc（配列番号14594）とITRを含んでいる。
【０３０４】
いくつかの実施態様では、一方のトランスポゾン端部は、配列番号14573と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、又はこれらの間の任意の割合が一致する配列を含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14574と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、又はこれらの間の任意の割合が一致する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、一方のトランスポゾン端部は、配列番号14573からの少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも18個、少なくとも20個、又は少なくとも25個の連続したヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14574からの少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも18個、少なくとも20個、又は少なくとも25個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、一方のトランスポゾン端部は、配列番号14591からの少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも18個、少なくとも20個、又は少なくとも25個の連続したヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14593からの少なくとも14個、少なくとも16個、少なくとも18個、少なくとも20個、又は少なくとも25個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、各トランスポゾン端部は、配列番号14575を逆向きに含んでいる。
【０３０５】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14573、配列番号14579、配列番号14581、配列番号14582、配列番号14583、及び配列番号14588から選択された配列と、配列番号14587、配列番号14588、配列番号14589、及び配列番号14586から選択された配列を含み、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517又は配列番号14518を含んでいる。
【０３０６】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、標的配列に隣接したCCCTTTGCCTGCCA（配列番号14622）というITR（5’ITR）とTGGCAGTGAAAGGG（配列番号14623）というITR（3’ITR）を含んでいる。
【０３０７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Helicoverpa armigeraから単離されるか、Helicoverpa armigeraに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MASRQRLNHD EIATILENDD DYSPLDSESE KEDCVVEDDV WSDNEDAIVD FVEDTSAQED 
61 PDNNIASRES PNLEVTSLTS HRIITLPQRS IRGKNNHVWS TTKGRTTGRT SAINIIRTNR 
121 GPTRMCRNIV DPLLCFQLFI TDEIIHEIVK WTNVEIIVKR QNLKDISASY RDTNTMEIWA 
181 LVGILTLTAV MKDNHLSTDE LFDATFSGTR YVSVMSRERF EFLIRCIRMD DKTLRPTLRS 
241 DDAFLPVRKI WEIFINQCRQ NHVPGSNLTV DEQLLGFRGR CPFRMYIPNK PDKYGIKFPM 
301 MCAAATKYMI DAIPYLGKST KTNGLPLGEF YVKDLTKTVH GTNRNITCDN WFTSIPLAKN 
361 MLQAPYNLTI VGTIRSNKRE MPEEIKNSRS RPVGSSMFCF DGPLTLVSYK PKPSKMVFLL 
421 SSCDENAVIN ESNGKPDMIL FYNQTKGGVD SFDQMCKSMS ANRKTNRWPM AVFYGMLNMA 
481 FVNSYIIYCH NKINKQEKPI SRKEFMKKLS IQLTTPWMQE RLQAPTLKRT LRDNITNVLK 
541 NVVPASSENI SNEPEPKKRR YCGVCSYKKR RMTKAQCCKC KKAICGEHNI DVCQDCI（配列番号14525）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３０８】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Helicoverpa armigeraから単離されるか、Helicoverpa armigeraに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtaaatt tgacgtatac cgcggcgaaa tatctctgtc 
61 tctttcatgt ttaccgtcgg atcgccgcta acttctgaac caactcagta gccattggga 
121 cctcgcagga cacagttgcg tcatctcggt aagtgccgcc attttgttgt actctctatt 
181 acaacacacg tcacgtcacg tcgttgcacg tcattttgac gtataattgg gctttgtgta 
241 acttttgaat ttgtttcaaa ttttttatgt ttgtgattta tttgagttaa tcgtattgtt 
301 tcgttacatt tttcatataa taataatatt ttcaggttga gtacaaa（配列番号14570）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agactgtttt tttctaagag acttctaaaa tattattacg agttgattta attttatgaa 
61 aacatttaaa actagttgat tttttttata attacataat tttaagaaaa agtgttagag 
121 gcttgatttt tttgttgatt ttttctaaga tttgattaaa gtgccataat agtattaata 
181 aagagtattt tttaacttaa aatgtatttt atttattaat taaaacttca attatgataa 
241 ctcatgcaaa aatatagttc attaacagaa aaaaatagga aaactttgaa gttttgtttt 
301 tacacgtcat ttttacgtat gattgggctt tatagctagt taaatatgat tgggcttcta 
361 gggttaa（配列番号14528）の配列を含んでいる。
【０３０９】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Pectinophora gossypiellaから単離されるか、Pectinophora gossypiellaに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MDLRKQDEKI RQWLEQDIEE DSKGESDNSS SETEDIVEME VHKNTSSESE VSSESDYEPV 
61 CPSKRQRTQI IESEESDNSE SIRPSRRQTS RVIDSDETDE DVMSSTPQNI PRNPNVIQPS 
121 SRFLYGKNKH KWSSAAKPSS VRTSRRNIIH FIPGPKERAR EVSEPIDIFS LFISEDMLQQ 
181 VVTFTNAEML IRKNKYKTET FTVSPTNLEE IRALLGLLFN AAAMKSNHLP TRMLFNTHRS 
241 GTIFKACMSA ERLNFLIKCL RFDDKLTRNV RQRDDRFAPI RDLWQALISN FQKWYTPGSY 
301 ITVDEQLVGF RGRCSFRMYI PNKPNKYGIK LVMAADVNSK YIVNAIPYLG KGTDPQNQPL 
361 ATFFIKEITS TLHGTNRNIT MDNWFTSVPL ANELLMAPYN LTLVGTLRSN KREIPEKLKN 
421 SKSRAIGTSM FCYDGDKTLV SYKAKSNKVV FILSTIHDQP DINQETGKPE MIHFYNSTKG 
481 AVDTVDQMCS SISTNRKTQR WPLCVFYNML NLSIINAYVV YVYNNVRNNK KPMSRRDFVI 
541 KLGDQLMEPW LRQRLQTVTL RRDIKVMIQD ILGESSDLEA PVPSVSNVRK IYYLCPSKAR 
601 RMTKHRCIKC KQAICGPHNI DICSRCIE（配列番号14530）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３１０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Pectinophora gossypiellaから単離されるか、Pectinophora gossypiellaに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag ataactaaac attcgtccgc tcgacgacgc gctatgccgc gaaattgaag 
61 tttacctatt attccgcgtc ccccgccccc gccgcttttt ctagcttcct gatttgcaaa 
121 atagtgcatc gcgtgacacg ctcgaggtca cacgacaatt aggtcgaaag ttacaggaat 
181 ttcgtcgtcc gctcgacgaa agtttagtaa ttacgtaagt ttggcaaagg taagtgaatg 
241 aagtattttt ttataattat tttttaattc tttatagtga taacgtaagg tttatttaaa 
301 tttattactt ttatagttat ttagccaatt gttataaatt ccttgttatt gctgaaaaat 
361 ttgcctgttt tagtcaaaat ttattaactt ttcgatcgtt ttttag（配列番号14532）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttcactaag taattttgtt cctatttagt agataagtaa cacataatta ttgtgatatt 
61 caaaacttaa gaggtttaat aaataataat aaaaaaaaaa tggtttttat ttcgtagtct 
121 gctcgacgaa tgtttagtta ttacgtaacc gtgaatatag tttagtagtc tagggttaa（配列番号14571）の配列を含んでいる。
【０３１１】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Ctenoplusia agnataから単離されるか、Ctenoplusia agnataに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MASRQHLYQD EIAAILENED DYSPHDTDSE MEDCVTQDDV RSDVEDEMVD NIGNGTSPAS 
61 RHEDPETPDP SSEASNLEVT LSSHRIIILP QRSIREKNNH IWSTTKGQSS GRTAAINIVR 
121 TNRGPTRMCR NIVDPLLCFQ LFIKEEIVEE IVKWTNVEMV QKRVNLKDIS ASYRDTNEME 
181 IWAIISMLTL SAVMKDNHLS TDELFNVSYG TRYVSVMSRE RFEFLLRLLR MGDKLLRPNL 
241 RQEDAFTPVR KIWEIFINQC RLNYVPGTNL TVDEQLLGFR GRCPFRMYIP NKPDKYGIKF 
301 PMVCDAATKY MVDAIPYLGK STKTQGLPLG EFYVKELTQT VHGTNRNVTC DNWFTSVPLA 
361 KSLLNSPYNL TLVGTIRSNK REIPEEVKNS RSRQVGSSMF CFDGPLTLVS YKPKPSKMVF 
421 LLSSCNEDAV VNQSNGKPDM ILFYNQTKGG VDSFDQMCSS MSTNRKTNRW PMAVFYGMLN 
481 MAFVNSYIIY CHNMLAKKEK PLSRKDFMKK LSTDLTTPSM QKRLEAPTLK RSLRDNITNV 
541 LKIVPQAAID TSFDEPEPKK RRYCGFCSYK KKRMTKTQCF KCKKPVCGEH NIDVCQDCI（配列番号14534）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３１２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Ctenoplusia agnataから単離されるか、Ctenoplusia agnataに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtcattc tgacgtgtat gtcgccgaaa atactctgtc 
61 tctttctcct gcacgatcgg attgccgcga acgctcgatt caacccagtt ggcgccgaga 
121 tctattggag gactgcggcg ttgattcggt aagtcccgcc attttgtcat agtaacagta 
181 ttgcacgtca gcttgacgta tatttgggct ttgtgttatt tttgtaaatt ttcaacgtta 
241 gtttattatt gcatcttttt gttacattac tggtttattt gcatgtatta ctcaaatatt 
301 atttttattt tagcgtagaa aataca（配列番号14535）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agactgtttt ttttgtattt gcattatata ttatattcta aagttgattt aattctaaga 
61 aaaacattaa aataagtttc tttttgtaaa atttaattaa ttataagaaa aagtttaagt 
121 tgatctcatt ttttataaaa atttgcaatg tttccaaagt tattattgta aaagaataaa 
181 taaaagtaaa ctgagtttta attgatgttt tattatatca ttatactata tattacttaa 
241 ataaaacaat aactgaatgt atttctaaaa ggaatcacta gaaaatatag tgatcaaaaa 
301 tttacacgtc atttttgcgt atgattgggc tttataggtt ctaaaaatat gattgggcct 
361 ctagggttaa（配列番号14536）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTAGAAGCCCAATC（配列番号14564）というITR配列を含んでいる。
【０３１３】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Agrotis ipsilonから単離されるか、Agrotis ipsilonに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MESRQRLNQD EIATILENDD DYSPLDSDSE AEDRVVEDDV WSDNEDAMID YVEDTSRQED 
61 PDNNIASQES ANLEVTSLTS HRIISLPQRS ICGKNNHVWS TTKGRTTGRT SAINIIRTNR 
121 GPTRMCRNIV DPLLCFQLFI TDEIIHEIVK WTNVEMIVKR QNLIDISASY RDTNTMEMWA 
181 LVGILTLTAV MKDNHLSTDE LFDATFSGTR YVSVMSRERF EFLIRCMRMD DKTLRPTLRS 
241 DDAFIPVRKL WEIFINQCRL NYVPGGNLTV DEQLLGFRGR CPFRMYIPNK PDKYGIRFPM 
301 MCDAATKYMI DAIPYLGKST KTNGLPLGEF YVKELTKTVH GTNRNVTCDN WFTSIPLAKN 
361 MLQAPYNLTI VGTIRSNKRE IPEEIKNSRS RPVGSSMFCF DGPLTLVSYK PKPSRMVFLL 
421 SSCDENAVIN ESNGKPDMIL FYNQTKGGVD SFDQMCKSMS ANRKTNRWPM AVFYGMLNMA 
481 FVNSYIIYCH NKINKQKKPI NRKEFMKNLS TDLTTPWMQE RLKAPTLKRT LRDNITNVLK 
541 NVVPPSPANN SEEPGPKKRS YCGFCSYKKR RMTKTQFYKC KKAICGEHNI DVCQDCV（配列番号14537）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３１４】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Agrotis ipsilonから単離されるか、Agrotis ipsilonに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtaaatt tgacgtatac cgcggcgaaa tatatctgtc 
61 tctttcacgt ttaccgtcgg attcccgcta acttcggaac caactcagta gccattgaga 
121 actcccagga cacagttgcg tcatctcggt aagtgccgcc attttgttgt aatagacagg 
181 ttgcacgtca ttttgacgta taattgggct ttgtgtaact tttgaaatta tttataattt 
241 ttattgatgt gatttatttg agttaatcgt attgtttcgt tacatttttc atatgatatt 
301 aatattttca gattgaatat aaa（配列番号14538）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agactgtttt ttttaaaagg cttataaagt attactattg cgtgatttaa ttttataaaa 
61 atatttaaaa ccagttgatt tttttaataa ttacctaatt ttaagaaaaa atgttagaag 
121 cttgatattt ttgttgattt ttttctaaga tttgattaaa aggccataat tgtattaata 
181 aagagtattt ttaacttcaa atttatttta tttattaatt aaaacttcaa ttatgataat 
241 acatgcaaaa atatagttca tcaacagaaa aatataggaa aactctaata gttttatttt 
301 tacacgtcat ttttacgtat gattgggctt tatagctagt caaatatgat tgggcttcta 
361 gggttaa（配列番号14539）の配列を含んでいる。
【０３１５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Megachile rotundataから単離されるか、Megachile rotundataに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MNGKDSLGEF YLDDLSDCLD CRSASSTDDE SDSSNIAIRK RCPIPLIYSD SEDEDMNNNV 
61 EDNNHFVKES NRYHYQIVEK YKITSKTKKW KDVTVTEMKK FLGLIILMGQ VKKDVLYDYW 
121 STDPSIETPF FSKVMSRNRF LQIMQSWHFY NNNDISPNSH RLVKIQPVID YFKEKFNNVY 
181 KSDQQLSLDE CLIPWRGRLS IKTYNPAKIT KYGILVRVLS EARTGYVSNF CVYAADGKKI 
241 EETVLSVIGP YKNMWHHVYQ DNYYNSVNIA KIFLKNKLRV CGTIRKNRSL PQILQTVKLS 
301 RGQHQFLRNG HTLLEVWNNG KRNVNMISTI HSAQMAESRN RSRTSDCPIQ KPISIIDYNK 
361 YMKGVDRADQ YLSYYSIFRK TKKWTKRVVM FFINCALFNS FKVYTTLNGQ KITYKNFLHK 
421 AALSLIEDCG TEEQGTDLPN SEPTTTRTTS RVDHPGRLEN FGKHKLVNIV TSGQCKKPLR 
481 QCRVCASKKK LSRTGFACKY CNVPLHKGDC FERYHSLKKY（配列番号14540）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３１６】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Megachile rotundataから単離されるか、Megachile rotundataに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaataatg cccactctag atgaacttaa cactttaccg accggccgtc gattattcga 
61 cgtttgctcc ccagcgctta ccgaccggcc atcgattatt cgacgtttgc ttcccagcgc 
121 ttaccgaccg gtcatcgact tttgatcttt ccgttagatt tggttaggtc agattgacaa 
181 gtagcaagca tttcgcattc tttattcaaa taatcggtgc ttttttctaa gctttagccc 
241 ttagaa（配列番号14541）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 acaacttctt ttttcaacaa atattgttat atggattatt tatttattta tttatttatg 
61 gtatatttta tgtttattta tttatggtta ttatggtata ttttatgtaa ataataaact 
121 gaaaacgatt gtaatagatg aaataaatat tgttttaaca ctaatataat taaagtaaaa 
181 gattttaata aatttcgtta ccctacaata acacgaagcg tacaatttta ccagagttta 
241 ttaa（配列番号14542）の配列を含んでいる。
【０３１７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Bombus impatiensから単離されるか、Bombus impatiensに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MNEKNGIGEF YLDDLSDCPD SYSRSNSGDE SDGSDTIIRK RGSVLPPRYS DSEDDEINNV 
61 EDNANNVENN DDIWSTNDEA IILEPFEGSP GLKIMPSSAE SVTDNVNLFF GDDFFEHLVR 
121 ESNRYHYQVM EKYKIPSKAK KWTDITVPEM KKFLGLIVLM GQIKKDVLYD YWSTDPSIET 
181 PFFSQVMSRN RFVQIMQSWH FCNNDNIPHD SHRLAKIQPV IDYFRRKFND VYKPCQQLSL 
241 DESIIPWRGR LSIKTYNPAK ITKYGILVRV LSEAVTGYVC NFDVYAADGK KLEDTAVIEP 
301 YKNIWHQIYQ DNYYNSVKMA RILLKNKVRV CGTIRKNRGL PRSLKTIQLS RGQYEFRRNH 
361 QILLEVWNNG RRNVNMISTI HSAQLMESRS KSKRSDVPIQ KPNSIIDYNK YMKGVDRADQ 
421 YLAYYSIFRK TKKWTKRVVM FFINCALFNS FRVYTILNGK NITYKNFLHK VAVSWIEDGE 
481 TNCTEQDDNL PNSEPTRRAP RLDHPGRLSN YGKHKLINIV TSGRSLKPQR QCRVCAVQKK 
541 RSRTCFVCKF CNVPLHKGDC FERYHTLKKY（配列番号14543）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３１８】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Bombus impatiensから単離されるか、Bombus impatiensに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaatttttt aacattttac cgaccgatag ccgattaatc gggtttttgc cgctgacgct 
61 taccgaccga taacctatta atcggctttt tgtcgtcgaa gcttaccaac ctatagccta 
121 cctatagtta atcggttgcc atggcgataa acaatctttc tcattatatg agcagtaatt 
181 tgttatttag tactaaggta ccttgctcag ttgcgtcagt tgcgttgctt tgtaagctcc 
241 cacagtttta taccaattcg aaaaacttac cgttcgcg（配列番号14544）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 actatttcac atttgaacta aaaaccgttg taatagataa aataaatata atttagtatt 
61 aatattatgg aaacaaaaga ttttattcaa tttaattatc ctatagtaac aaaaagcggc 
121 caattttatc tgagcatacg aaaagcacag atactcccgc ccgacagtct aaaccgaaac 
181 agagccggcg ccagggagaa tctgcgcctg agcagccggt cggacgtgcg tttgctgttg 
241 aaccgctagt ggtcagtaaa ccagaaccag tcagtaagcc agtaactgat cagttaacta 
301 gattgtatag ttcaaattga acttaatcta gtttttaagc gtttgaatgt tgtctaactt 
361 cgttatatat tatattcttt ttaa（配列番号14545）の配列を含んでいる。
【０３１９】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Mamestra brassicaeから単離されるか、Mamestra brassicaeに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MFSFVPNKEQ TRTVLIFCFH LKTTAAESHR PLVEAFGEQV PTVKTCERWF QRFKSGDFDV 
61 DDKEHGKPPK RYEDAELQAL LDEDDAQTQK QLAEQLEVSQ QAVSNRLREG GKIQKVGRWV 
121 PHELNERQRE RRKNTCEILL SRYKRKSFLH RIVTGEEKWI FFVNPKRKKS YVDPGQPATS 
181 TARPNRFGKK TRLCVWWDQS GVIYYELLKP GETVNTARYQ QQLINLNRAL QRKRPEYQKR 
241 QHRVIFLHDN APSHTARAVR DTLETLNWEV LPHAAYSPDL APSDYHLFAS MGHALAEQRF 
301 DSYESVEEWL DEWFAAKDDE FYWRGIHKLP ERWDNCVASD GKYFE（配列番号14546）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３２０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Mamestra brassicaeから単離されるか、Mamestra brassicaeに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttattgggtt gcccaaaaag taattgcgga tttttcatat acctgtcttt taaacgtaca 
61 tagggatcga actcagtaaa actttgacct tgtgaaataa caaacttgac tgtccaacca 
121 ccatagtttg gcgcgaattg agcgtcataa ttgttttgac tttttgcagt caac（配列番号14547）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 atgatttttt ctttttaaac caattttaat tagttaattg atataaaaat ccgcaattac 
61 tttttgggca acccaataa（配列番号14548）の配列を含んでいる。
【０３２１】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Mayetiola destructorから単離されるか、Mayetiola destructorに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MENFENWRKR RHLREVLLGH FFAKKTAAES HRLLVEVYGE HALAKTQCFE WFQRFKSGDF 
61 DTEDKERPGQ PKKFEDEELE ALLDEDCCQT QEELAKSLGV TQQAISKRLK AAGYIQKQGN 
121 WVPHELKPRD VERRFCMSEM LLQRHKKKSF LSRIITGDEK WIHYDNSKRK KSYVKRGGRA 
181 KSTPKSNLHG AKVMLCIWWD QRGVLYYELL EPGQTITGDL YRTQLIRLKQ ALAEKRPEYA 
241 KRHGAVIFHH DNARPHVALP VKNYLENSGW EVLPHPPYSP DLAPSDYHLF RSMQNDLAGK 
301 RFTSEQGIRK WLDSFLAAKP AKFFEKGIHE LSERWEKVIA SDGQYFE（配列番号14549）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３２２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Mayetiola destructorから単離されるか、Mayetiola destructorに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 taagacttcc aaaatttcca cccgaacttt accttccccg cgcattatgt ctctcttttc 
61 accctctgat ccctggtatt gttgtcgagc acgatttata ttgggtgtac aacttaaaaa 
121 ccggaattgg acgctagatg tccacactaa cgaatagtgt aaaagcacaa atttcatata 
181 tacgtcattt tgaaggtaca tttgacagct atcaaaatca gtcaataaaa ctattctatc 
241 tgtgtgcatc atattttttt attaact（配列番号14550）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tgcattcatt cattttgtta tcgaaataaa gcattaattt tcactaaaaa attccggttt 
61 ttaagttgta cacccaatat catccttagt gacaattttc aaatggcttt cccattgagc 
121 tgaaaccgtg gctctagtaa gaaaaacgcc caacccgtca tcatatgcct tttttttctc 
181 aacatccg（配列番号14551）の配列を含んでいる。
【０３２３】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Apis melliferaから単離されるか、Apis melliferaに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MENQKEHYRH ILLFYFRKGK NASQAHKKLC AVYGDEALKE RQCQNWFDKF RSGDFSLKDE 
61 KRSGRPVEVD DDLIKAIIDS DRHSTTREIA EKLHVSHTCI ENHLKQLGYV QKLDTWVPHE 
121 LKEKHLTQRI NSCDLLKKRN ENDPFLKRLI TGDEKWVVYN NIKRKRSWSR PREPAQTTSK 
181 AGIHRKKVLL SVWWDYKGIV YFELLPPNRT INSVVYIEQL TKLNNAVEEK RPELTNRKGV 
241 VFHHDNARPH TSLVTRQKLL ELGWDVLPHP PYSPDLAPSD YFLFRSLQNS LNGKNFNNDD 
301 DIKSYLIQFF ANKNQKFYER GIMMLPERWQ KVIDQNGQHI TE（配列番号14552）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３２４】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Apis melliferaから単離されるか、Apis melliferaに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttgggttggc aactaagtaa ttgcggattt cactcataga tggcttcagt tgaattttta 
61 ggtttgctgg cgtagtccaa atgtaaaaca cattttgtta tttgatagtt ggcaattcag 
121 ctgtcaatca gtaaaaaaag ttttttgatc ggttgcgtag ttttcgtttg gcgttcgttg 
181 aaaa（配列番号14553）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agttatttag ttccatgaaa aaattgtctt tgattttcta aaaaaaatcc gcaattactt 
61 agttgccaat ccaa（配列番号14554）の配列を含んでいる。
【０３２５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Messor bouvieriから単離されるか、Messor bouvieriに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MSSFVPENVH LRHALLFLFH QKKRAAESHR LLVETYGEHA PTIRTCETWF RQFKCGDFNV 
61 QDKERPGRPK TFEDAELQEL LDEDSTQTQK QLAEKLNVSR VAICERLQAM GKIQKMGRWV 
121 PHELNDRQME NRKIVSEMLL QRYERKSFLH RIVTGDEKWI YFENPKRKKS WLSPGEAGPS 
181 TARPNRFGRK TMLCVWWDQI GVVYYELLKP GETVNTDRYR QQMINLNCAL IEKRPQYAQR 
241 HDKVILQHDN APSHTAKPVK EMLKSLGWEV LSHPPYSPDL APSDYHLFAS MGHALAEQHF 
301 ADFEEVKKWL DEWFSSKEKL FFWNGIHKLS ERWTKCIESN GQYFE（配列番号14555）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３２６】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Messor bouvieriから単離されるか、Messor bouvieriに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agtcagaaat gacacctcga tcgacgacta atcgacgtct aatcgacgtc gattttatgt 
61 caacatgtta ccaggtgtgt cggtaattcc tttccggttt ttccggcaga tgtcactagc 
121 cataagtatg aaatgttatg atttgataca tatgtcattt tattctactg acattaacct 
181 taaaactaca caagttacgt tccgccaaaa taacagcgtt atagatttat aattttttga 
241 aa（配列番号14556）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ataaatttga actatccatt ctaagtaacg tgttttcttt aacgaaaaaa ccggaaaaga 
61 attaccgaca ctcctggtat gtcaacatgt tattttcgac attgaatcgc gtcgattcga 
121 agtcgatcga ggtgtcattt ctgact（配列番号14557）の配列を含んでいる。
【０３２７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Trichoplusia niから単離されるか、Trichoplusia niに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素又はpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG 
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG 
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF 
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV 
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD 
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ 
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC 
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN 
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV 
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14558）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、又はこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むこと、又はそのアミノ酸配列からなることができる。
【０３２８】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Trichoplusia niから単離されるか、Trichoplusia niに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 
61 tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 
121 gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 
181 gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 
241 ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 
301 tgttatagat atc（配列番号14559）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat 
61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat 
121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt 
181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg gttaa（配列番号14560）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ccctagaaag atagtctgcg taaaattgac gcatgcattc ttgaaatatt gctctctctt 
61 tctaaatagc gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg cttggagctc 
121 ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata acgaccgcgt 
181 gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact catacgataa 
241 ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata ttttcttgtt 
301 atagatatc（配列番号14561）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat 
61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat 
121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt 
181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg g（配列番号14562）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tctaaatagc gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg cttggagctc 
61 ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata acgaccgcgt 
121 gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact catacgataa 
181 ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata ttttcttgtt 
241 atagatatc（配列番号14609）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat 
61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat 
121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt 
181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg g（配列番号14610）の配列を含んでいる。
【０３２９】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14561と配列番号14562を含み、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14558を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14609と配列番号14610を含み、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14558を含んでいる。
【０３３０】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Aphis gossypiiから単離されるか、Aphis gossypiiに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、CCTTCCAGCGGGCGCGC（配列番号14565）というITR配列を含んでいる。
【０３３１】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Chilo suppressalisから単離されるか、Chilo suppressalisに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、CCCAGATTAGCCT（配列番号14566）というITR配列を含んでいる。
【０３３２】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Heliothis virescensから単離されるか、Heliothis virescensに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTTAATTACTCGCG（配列番号14567）というITR配列を含んでいる。
【０３３３】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Pectinophora gossypiellaから単離されるか、Pectinophora gossypiellaに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTAGATAACTAAAC（配列番号14568）というITR配列を含んでいる。
【０３３４】
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、Anopheles stephensiから単離されるか、Anopheles stephensiに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン又はpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTAGAAAGATA（配列番号14569）というITR配列を含んでいる。
転移に基づかない遺伝子改変法
【０３３５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、本開示の改変されたHSC又は改変されたHSC子孫細胞は、導入遺伝子を本開示のHSC又はHSC子孫細胞に導入することによって生成させることができる。導入ステップは、非転移送達系を通じて核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトを送達することを含むことができる。
【０３３６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入は、局所的送達、吸着、吸収、電気穿孔、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクション、又はナノ粒子を媒介とした送達の1つまたは複数を含んでいる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入は、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、FuGENEトランスフェクション、デンドリマーを媒介としたトランスフェクションを含んでいる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、機械的送達による、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入は、細胞スクイージング、細胞ボンバードメント、遺伝子銃技術のいずれかを含んでいる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、ナノ粒子を媒介としたトランスフェクションによる、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入は、リポソーム送達、ミセルによる送達、ポリマロソームによる送達を含んでいる。
【０３３７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入は、非ウイルスベクターを含んでいる。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターは、プラスミドDNA、直線状二本鎖DNA（dsDNA）、直線状一本鎖DNA（ssDNA）、DoggyBone（商標）DNA、ナノプラスミド、ミニサークルDNA、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）、DDNA オリゴヌクレオチド、一本鎖mRNA（ssRNA）、及び二本鎖mRNA（dsRNA）を含んでいる。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターは、本開示のトランスポゾンを含んでいる。
【０３３８】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入は、ウイルスベクターを含んでいる。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、非組み込み非染色体ベクターである。代表的な非組み込み非染色体ベクターの非限定的な例に含まれるのは、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、及びヘルペスウイルスである。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは組み込み染色体ベクターである。組み込み染色体ベクターの非限定的な例に含まれるのは、アデノ随伴ベクター（AAV）、レンチウイルス、及びガンマ-レトロウイルスである。
【０３３９】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入は、ベクターの組み合わせを含んでいる。ベクターの組み合わせの代表的な非限定的例に含まれるのは、ウイルスベクターと非ウイルスベクター、複数の非ウイルスベクター、又は複数のウイルスベクターである。ベクターの組み合わせの代表的だが非限定的ではない例に含まれるのは、DNA由来のベクターとRNA由来のベクター、RNAと逆転写酵素の組み合わせ、トランスポゾンとトランスポザーゼの組み合わせ、非ウイルスベクターとエンドヌクレアーゼの組み合わせ、及びウイルスベクターとエンドヌクレアーゼの組み合わせである。
【０３４０】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入を含むゲノム改変により、核酸配列が安定に組み込まれるか、核酸配列が一過性に組み込まれるか、核酸配列の部位特異的組み込みが生じるか、核酸配列の偏向した組み込みが生じる。いくつかの実施態様では、核酸配列は導入遺伝子である。
【０３４１】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、エクスビボ、インビボ、インビトロ、又はインサイチュでのHSC又はHSC子孫細胞への核酸配列及び／又はゲノム編集コンストラクトの導入を含むゲノム改変により、核酸配列が安定に組み込まれる。いくつかの実施態様では、安定な染色体組み込みは、ランダムな組み込み、部位特異的組み込み、又は偏向した組み込みが可能である。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みは、支援なしの組み込み、又は支援された組み込みが可能である。いくつかの実施態様では、支援された部位特異的組み込みは、部位指向性ヌクレアーゼを用いた共送達である。いくつかの実施態様では、部位指向性ヌクレアーゼは、ゲノム組み込みの部位の上流領域及び下流領域とある割合が相同な5'ヌクレオチド配列延長部と3'ヌクレオチド配列延長部を有する導入遺伝子を含んでいる。いくつかの実施態様では、相同なヌクレオチド延長部を有する導入遺伝子により、相同組換えによるゲノム組み込み、マイクロホモロジー媒介末端結合、又は非相同的末端結合が可能になる。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みは、セーフハーバー部位で起こる。ゲノムのセーフハーバー部位は、新たな遺伝材料の組み込みを調節し、新たに挿入される遺伝エレメントが信頼性よく機能する（例えば治療に有効な発現レベルで発現する）とともに、宿主生物にリスクを起こす有害な変化を宿主のゲノムに引き起こさないことが保証されるようにすることができる。ゲノムの潜在的なセーフハーバーの非限定的な例に含まれるのは、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン配列、アデノ随伴ウイルス部位1（AAVS1）、第19染色体上でAAVウイルスの組み込みが自然に起こる部位、ケモカイン（C-Cモチーフ）受容体5（CCR5）遺伝子の部位、及びマウスRosa26遺伝子座のヒトオルソログの部位である。
【０３４２】
いくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現を妨げる部位に起こる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の発現阻止は、イントロン、エキソン、プロモータ、遺伝エレメント、エンハンサ、サプレッサ、開始コドン、終止コドン、及び反応エレメントの位置での部位特異的組み込みによって起こる。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みの標的となる代表的な標的遺伝子の非限定的な例に含まれるのは、TRAC、TRAB、PDI、任意の免疫抑制遺伝子、及びアロ拒絶に関与する遺伝子である。
【０３４３】
いくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現が増大する部位で起こる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の発現増大は、イントロン、エキソン、プロモータ、遺伝エレメント、エンハンサ、サプレッサ、開始コドン、終止コドン、及び反応エレメントの位置での部位特異的組み込みによって起こる。
【０３４４】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、酵素を用いて宿主ゲノムに鎖の切断を作り出し、導入遺伝子の送達又は組み込みを容易にすることができる。いくつかの実施態様では、酵素が一本鎖の切断を作り出す。いくつかの実施態様では、切断を誘導する酵素の非限定的な例に含まれるのは、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、CRISPR-Cas9、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Cas-CLOVER（商標）、及びCpf1である。いくつかの実施態様では、切断を誘導する酵素は、DNAにコードされて、mRNAにコードされて、タンパク質として、ガイドRNA（gRNA）との核タンパク質複合体として、細胞に送達することができる。
【０３４５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスによって制御される。いくつかの実施態様では、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスは、選択されたレンチベクターによって制御される。いくつかの実施態様では、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスは、選択されたガンマ-レトロウイルスベクターによって制御される。
【０３４６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込み部位は、不安定な染色体挿入である。いくつかの実施態様では、組み込まれた導入遺伝子は、沈黙した状態、除去された状態、切除された状態、又は更に改変された状態になることができる。
【０３４７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な組み込みである。いくつかの実施態様では、不安定な組み込みとして、一過性の非染色体組み込み、準安定な非染色体組み込み、準持続的な非染色体挿入、又は不安定な染色体挿入が可能である。いくつかの実施態様では、一過性の非染色体挿入として、染色体外挿入、又は細胞質挿入が可能である。
【０３４８】
いくつかの実施態様では、導入遺伝子が一過性の非染色体挿入によって染色体に組み込まれることはないため、改変された遺伝材料が細胞分裂の間に複製されることはない。
【０３４９】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の準安定な、又は持続的な非染色体組み込みである。いくつかの実施態様では、DNAベクターは、分裂している細胞の核における自律的複製を可能にする非ウイルスベクターをエピソーマル保持のための核マトリックスタンパク質に結合する足場／マトリックス付着領域（S-MAR）モジュールをコードしている。
【０３５０】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な染色体組み込みである。いくつかの実施態様では、組み込まれた導入遺伝子は、沈黙した状態、除去された状態、切除された状態、又は更に改変された状態になることができる。
【０３５１】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子の挿入によるゲノムの改変は、相同組換え（HR）、マイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）、非相同末端結合（NHEJ）、トランスポザーゼ酵素媒介修飾、インテグラーゼ酵素媒介修飾、エンドヌクレアーゼ酵素媒介修飾、又は組換え酵素媒介修飾による宿主細胞指向性二本鎖切断修復（相同組換え修復）を通じて起こることができる。いくつかの実施態様では、導入遺伝子挿入によるゲノムの修飾は、CRISPR-Cas9、TALEN、ZFN、Cas-CLOVER、及びCpf1を通じて起こることができる。
【０３５２】
新たなヌクレアーゼ／核酸、又は存在しているヌクレアーゼ／核酸が関与する遺伝子編集系では、挿入ツール（例えばDNA鋳型ベクター、転移可能エレメント（トランスポゾン又はレトロトランスポゾン））を切断酵素（例えばヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ）に加えて細胞に送達せねばならない。リコンビナーゼのためのそのような挿入ツールの例に含まれるのはDNAベクターである。他の遺伝子編集系は、インテグラーゼを挿入ベクターとともに送達すること、トランスポザーゼをトランスポゾン／レトロトランスポゾンとともに送達すること、などを必要とする。いくつかの実施態様では、切断酵素として使用できるリコンビナーゼの一例は、CREリコンビナーゼである。さまざまな実施態様では、挿入ツールで使用できるインテグラーゼの例に含まれるのは、多数のウイルスのうちの任意のウイルスから取られたウイルスに基づく酵素であり、その非限定的な例に含まれるのは、AAV、ガンマ-レトロウイルス、及びレンチウイルスである。挿入ツールで使用できるトランスポゾン／レトロトランスポゾンの非限定的な例に含まれるのは、piggyBacトランスポゾン、眠れる美女トランスポゾン、及びL1レトロトランスポゾンである。
【０３５３】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子はインビボに送達される。本開示の方法のいくつかの実施態様では、インビボ導入遺伝子送達は、局所的送達、吸着、吸収、電気穿孔、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクション、又はナノ粒子を媒介とした送達によって実行できる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、インビボ導入遺伝子送達は、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、FuGENEトランスフェクション、及びデンドリマーを媒介としたトランスフェクションによって実行できる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、インビボ機械的導入遺伝子送達は、細胞スクイージング、細胞ボンバードメント、及び遺伝子銃によって実行できる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、インビボのナノ粒子を媒介とした導入遺伝子送達は、リポソーム送達、ミセルによる送達、及びポリマロソームによって起こることができる。さまざまな実施態様では、切断酵素として使用できるヌクレアーゼの非限定的な例に含まれるのは、Cas9、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼである。
【０３５４】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、非ウイルスベクターを導入遺伝子の送達に使用する。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターは核酸である。いくつかの実施態様では、核酸非ウイルスベクターは、プラスミドDNA、直線状二本鎖DNA（dsDNA）、直線状一本鎖DNA（ssDNA）、DoggyBone（商標）DNA、ナノプラスミド、ミニサークルDNA、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）、DDNA オリゴヌクレオチド、一本鎖mRNA（ssRNA）、及び二本鎖mRNA（dsRNA）である。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターはトランスポゾンである。いくつかの実施態様では、トランスポゾンはpiggyBacである。
【０３５５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子の送達は、ウイルスベクターを通じて実行できる。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、非組み込み非染色体ベクターである。非組み込み非染色体ベクターには、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、ヘルペスウイルスを含めることができる。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、組み込み染色体ベクターである。組み込み染色体ベクターには、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レンチウイルス、及びガンマ-レトロウイルスを含めることができる。
【０３５６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子の送達は、ベクターの組み合わせによって実行できる。ベクターの組み合わせの代表的だが非限定的ではない例に含めることができるのは、ウイルスベクター＋非ウイルスベクター、2つ以上の非ウイルスベクター、又は2つ以上のウイルスベクターである。ベクターの組み合わせの代表的だが非限定的ではない例に含めることができるのは、DNA由来のベクター＋RNA由来のベクター、RNA＋逆転写酵素、トランスポゾン＋トランスポザーゼ、非ウイルスベクター＋エンドヌクレアーゼ、及びウイルスベクター＋エンドヌクレアーゼである。
【０３５７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変として、導入遺伝子の安定な組み込み、導入遺伝子の一過性の組み込み、導入遺伝子の部位特異的組み込み、又は導入遺伝子の偏向した組み込みが可能である。
【０３５８】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変として、導入遺伝子の安定な染色体組み込みが可能である。いくつかの実施態様では、安定な染色体組み込みは、ランダムな組み込み、部位特異的組み込み、又は偏向した組み込みが可能である。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みは、支援なしの組み込み、又は支援された組み込みが可能である。いくつかの実施態様では、支援された部位特異的組み込みは、部位指向性ヌクレアーゼを用いた共送達である。いくつかの実施態様では、部位指向性ヌクレアーゼは、ゲノム組み込みの部位の上流領域及び下流領域とある割合が相同な5'ヌクレオチド配列延長部と3'ヌクレオチド配列延長部を有する導入遺伝子を含んでいる。いくつかの実施態様では、相同なヌクレオチド延長部を有する導入遺伝子により、相同組換えによるゲノム組み込み、マイクロホモロジー媒介末端結合、又は非相同的末端結合が可能になる。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みは、セーフハーバー部位で起こる。ゲノムのセーフハーバー部位は、新たな遺伝材料の組み込みを調節し、新たに挿入される遺伝エレメントが信頼性よく機能する（例えば治療に有効な発現レベルで発現する）とともに、宿主生物にリスクを起こす有害な変化を宿主のゲノムに引き起こさないことが保証されるようにすることができる。ゲノムの潜在的なセーフハーバーの非限定的な例に含まれるのは、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン配列、アデノ随伴ウイルス部位1（AAVS1）、第19染色体上でAAVウイルスの組み込みが自然に起こる部位、ケモカイン（C-Cモチーフ）受容体5（CCR5）遺伝子の部位、及びマウスRosa26遺伝子座のヒトオルソログの部位である。
【０３５９】
いくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現を妨げる部位に起こる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の発現阻止は、イントロン、エキソン、プロモータ、遺伝エレメント、エンハンサ、サプレッサ、開始コドン、終止コドン、及び反応エレメントの位置での部位特異的組み込みによって起こる。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みの標的となる代表的な標的遺伝子の非限定的な例に含まれるのは、TRAC、TRAB、PDI、任意の免疫抑制遺伝子、及びアロ拒絶に関与する遺伝子である。
【０３６０】
いくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現が増大する部位で起こる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の発現増大は、イントロン、エキソン、プロモータ、遺伝エレメント、エンハンサ、サプレッサ、開始コドン、終止コドン、及び反応エレメントの位置での部位特異的組み込みによって起こる。
【０３６１】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、酵素を用いて宿主ゲノムに鎖の切断を作り出し、導入遺伝子の送達又は組み込みを容易にすることができる。いくつかの実施態様では、酵素が一本鎖の切断を作り出す。いくつかの実施態様では、切断を誘導する酵素の非限定的な例に含まれるのは、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、CRISPR-Cas9、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Cas-CLOVER（商標）、及びCpf1である。いくつかの実施態様では、切断を誘導する酵素は、DNAにコードされて、mRNAにコードされて、タンパク質として、ガイドRNA（gRNA）との核タンパク質複合体として、細胞に送達することができる。
【０３６２】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスによって制御される。いくつかの実施態様では、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスは、選択されたレンチベクターによって制御される。いくつかの実施態様では、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスは、選択されたγ-レトロウイルスベクターによって制御される。
【０３６３】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込み部位は、不安定な染色体挿入である。いくつかの実施態様では、組み込まれた導入遺伝子は、沈黙した状態、除去された状態、切除された状態、又は更に改変された状態になることができる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な組み込みである。いくつかの実施態様では、不安定な組み込みとして、一過性の非染色体組み込み、準安定な非染色体組み込み、準持続的な非染色体挿入、又は不安定な染色体挿入が可能である。いくつかの実施態様では、一過性の非染色体挿入として、染色体外挿入、又は細胞質挿入が可能である。いくつかの実施態様では、導入遺伝子が一過性の非染色体挿入によって染色体に組み込まれることはなく、改変された遺伝材料が細胞分裂の間に複製されることはない。
【０３６４】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の準安定な非染色体組み込み又は準持続的な非染色体組み込みである。いくつかの実施態様では、DNAベクターは、分裂している細胞の核における自律的複製を可能にする非ウイルスベクターのエピソーマル保持のための核マトリックスタンパク質に結合する足場／マトリックス付着領域（S-MAR）モジュールをコードしている。
【０３６５】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な染色体組み込みである。いくつかの実施態様では、組み込まれた導入遺伝子は、沈黙した状態、除去された状態、切除された状態、又は更に改変された状態になることができる。
【０３６６】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子によるゲノムの改変は、相同組換え（HR）、マイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）、非相同末端結合（NHEJ）、トランスポザーゼ酵素媒介修飾、インテグラーゼ酵素媒介修飾、エンドヌクレアーゼ酵素媒介修飾、又は組換え酵素媒介修飾による宿主細胞指向性二本鎖切断修復（相同組換え修復）を通じて起こることができる。いくつかの実施態様では、導入遺伝子挿入によるゲノムの修飾は、CRISPR-Cas9、TALEN、ZFN、Cas-CLOVER、及びCpf1を通じて起こることができる。
【０３６７】
本開示の方法のいくつかの実施態様では、インビボ又はエクスビボのゲノム改変を有する細胞として、生殖系細胞又は体細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変された細胞として、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、ラット細胞、マウス細胞、イヌ細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変された細胞は、分化した状態、未分化の状態、又は不死化状態が可能である。いくつかの実施態様では、改変された未分化の細胞として幹細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変された細胞は、分化した状態、未分化の状態、又は不死化状態が可能である。いくつかの実施態様では、改変された未分化の細胞として、人工多能性幹細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変された細胞として、T細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、巨核球、又は破骨細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変された細胞は、その細胞が休止している間に、活性化された状態で、休止中に、間期に、前期に、中期に、後期に、又は終期に改変することができる。いくつかの実施態様では、改変された細胞として、新鮮なもの、低温保管されたもの、バルクのもの、下位集団に分類されたもの、全血からのもの、白血球除去からのもの、又は不死化された細胞系からのものが可能である。
VCARの作製と生成
【０３６８】
本開示の少なくとも1つのVHHタンパク質又はVCARは、本分野で周知のように、場合によっては細胞系、混合された細胞系、不死化された細胞、又は不死化された細胞のクローン集団によって生成させることができる。例えばAusubel他編『Current Protocols in Molecular Biology』、John Wiley & Sons, Inc.社、ニューヨーク、ニューヨーク州（1987年〜2001年）；Sambrook他、『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』、第2版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989年）；HarlowとLane、『Antibodies, a Laboratory Manual』、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989年）；Colligan他編『Current Protocols in Immunology』、John Wiley & Sons, Inc.社、ニューヨーク（1994年〜2001年）；Colligan他、『Current Protocols in Protein Science』、John Wiley & Sons社、ニューヨーク、ニューヨーク州（1997年〜2001年）を参照されたい。
【０３６９】
本分野で知られているように、VHHタンパク質からのアミノ酸を変化させ、付加し、及び／又は欠失させて、免疫原性を低下させることや、結合親和性、オン-レート、オフ-レート、アビディティ、特異性、半減期、安定性、可溶性、又は適切な他の任意の特徴を低下させること、増強すること、又は変化させることができる。
【０３７０】
場合によっては、VHHタンパク質を操作し、抗原に対する高親和性と他の好ましい生物学的特性を保持することができる。この目標を達成するため、VHHタンパク質を場合によっては調製することが、親配列と操作された配列の三次元モデルを用いて親配列と概念的な操作された産物を分析するプロセスにより可能である。三次元モデルは当業者に一般に利用可能であって馴染みがある。選択された候補配列の確実そうな三次元配座構造を図解表示し、可能な免疫原性を測定できるコンピュータプログラムを利用できる（例えばモンロヴィアのXencor, Inc.社のImmunofilterプログラム）。これらの表示を検討することで、候補配列が機能する際の残基の確実と思われる役割を分析すること、すなわち候補VHHタンパク質が対応する抗原に結合する能力に影響を与える残基を分析することができる。このようにして、親配列と参照配列から残基を選択して組み合わせ、望む特徴（標的抗原に対する親和性など）を実現することができる。その代わりに、又はそれに加えて、上記の手続き、他の適切な操作方法を利用することができる。
VHHタンパク質のスクリーニング
【０３７１】
似たタンパク質又は断片への特異的結合に関するVHHのスクリーニングは、例えばヌクレオチド提示（DNA提示又はRNA提示）ライブラリ又はペプチド提示ライブラリを用いて簡単に実現することができる。この方法は、ペプチドの大きなコレクションをスクリーニングして望む機能又は構造を持つ個々のメンバーを探すことを含んでいる。表示されるヌクレオチド配列又はペプチド配列は、長さを3〜5000個以上のヌクレオチド又はアミノ酸にすること、頻繁には長さを5〜100個のアミノ酸にすること、しばしば長さを8〜25個のアミノ酸にすることができる。ペプチドライブラリを生成させるための直接的な化学合成法に加え、いくつかの組換えDNA法がこれまでに記載されている。1つのタイプは、ペプチド配列をバクテリオファージ又は細胞の表面に提示することを含んでいる。それぞれのバクテリオファージ又は細胞は、個々の表示されるペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。本開示のVHHタンパク質は、広い範囲の親和性（KD）でヒト又は他の哺乳動物のタンパク質に結合することができる。好ましい一実施態様では、本発明の少なくとも1つのVHHが場合によっては標的タンパク質に大きな親和性で結合することができ、例えばKDは約10-7 M以下であり、その非限定的な例は、0.1〜9.9（又はその中の任意の範囲又は値）×10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、又はその中の任意の範囲又は値である。親和性は、当業者が実践しているように、表面プラズモン共鳴又はKinexa法によって求められる。
【０３７２】
抗原に対するVHH又はVCARの親和性又はアビディティは、適切な任意の方法を利用して実験的に求めることができる。（例えば『Fundamental Immunology』、Paul, W. E.編、Raven Press社：ニューヨーク、ニューヨーク州（1984年）の中のBerzofsky他、「Antibody-Antigen Interactions」；Kuby, Janis、『Immunology』、W.H. Freeman and Company社：ニューヨーク、ニューヨーク州（1992年）を参照されたい）。特定のVHH-抗原相互作用又はVCAR-抗原相互作用の親和性の測定値は、異なる条件（例えば塩濃度、pH）で測定された場合には異なる可能性がある。したがって親和性と他の抗原結合パラメータ（例えばKD、Kon、Koff）の測定は、VHH又はVCARと抗原の標準化された溶液と、標準化されたバッファ（本明細書に記載されているバッファなど）を用いてなされることが好ましい。
【０３７３】
本開示のVHH又はVCARを用いて競合アッセイを実施し、どのタンパク質、抗体、及び他のアンタゴニストが標的タンパク質への結合に関して本発明のVHH又はVCARと競合するか、及び／又はエピトープ領域を共有するかを明らかにすることができる。当業者によく知られているこれらアッセイは、タンパク質上の限られた数の結合部位に関するアンタゴニスト又はリガンドの相互間での競合を評価する。競合の前又は後にタンパク質及び／又は抗体を固定化又は不溶化し、標的タンパク質に結合したサンプルを結合しなかったサンプルから、例えばデカント操作（タンパク質／抗体はあらかじめ不溶化されていた）又は遠心分離（タンパク質／抗体は競合反応の後に沈殿した）によって分離する。また、競合的結合は、標的タンパク質へのVHH又はVCARの結合又は結合の不在によって機能が代わるかどうか（例えばVCAR分子が例えば標識の酵素活性を抑制又は強化するかどうか）によって明らかにすることができる。本分野で周知のように、ELISAとそれ以外の機能的アッセイを利用することができる。
核酸分子
【０３７４】
VHHタンパク質又はVCARをコードする本開示の核酸分子は、RNAの形態（例えばmRNA、hnRNA、tRNA、又は他の任意の形態）又はDNAの形態（その非限定的な例に、クローニングによって得られた、又は合成で生成された、又はそれらの任意の組み合わせによるcDNA及びゲノムDNAが含まれる）が可能である。DNAとして、三本鎖、二本鎖、一本鎖、又はその任意の酌み交わせが可能である。DNA又はRNAの少なくとも1本の鎖の任意の部分が、コード鎖（センス鎖としても知られる）になること、又は非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）になることができる。
【０３７５】
本開示の単離された核酸分子は、場合によっては1つまたは複数のイントロンを有するオープンリーディングフレーム（ORF）（例えば少なくとも1つのVCARの少なくとも1つの特定の部分だが、それに限定されない）を含む核酸分子；VCARのコード配列を含む核酸分子；及び上記のヌクレオチド配列とは実質的に異なるが、遺伝暗号の縮重が原因で本明細書に記載のVCAR及び／又は本分野で知られているVCARを相変わらずコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むことができる。もちろん、遺伝暗号は本分野で周知である。したがって当業者にとって、本発明の特定のVCARをコードするそのような縮重核酸バリアントを生成させることは定型作業であると考えられる。例えばAusbel他、上記文献を参照されたい。そのような核酸バリアントは、本発明に含まれる。
【０３７６】
本明細書に示されているように、VCARをコードする核酸を含む本開示の核酸分子の非限定的な例に含まれるのは、それ自体がVHH断片のアミノ酸配列をコードする核酸；VCAR全体又はその一部のコード配列；VHH、断片又は一部のコード配列と、追加配列（例えば少なくとも1つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列）であって、上記の追加コード配列（例えば少なくとも1つのイントロン）と、追加の非コード配列（その非限定的な例に含まれるのは非コード5'配列と非コード3'配列であり、その例は、転写、mRNAプロセシングにおいて役割を果たす、転写されるが翻訳されない配列であり、スプライシングシグナルとポリアデニル化シグナル（例えばリボソームの結合とmRNAの安定性）が含まれる）を持つもの、又は持たないもの；追加アミノ酸（追加機能を提供するアミノ酸など）をコードする追加コード配列である。したがってVCARをコードする配列をマーカー配列（VHHの断片又は部分を含む融合したVCARの精製を容易にするペプチドをコードする配列など）に融合させることができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【０３７７】
本開示により、選択的ハイブリダイゼーション条件で本明細書に開示されているポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸が提供される。したがってこの実施態様のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸の単離、検出、及び／又は定量に使用できる。例えば本発明のポリヌクレオチドを用いて寄託されたライブラリの中の部分クローン又は完全長クローンを同定すること、単離すること、又は増幅することができる。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒト又は哺乳動物の核酸ライブラリから単離されるか、ヒト又は哺乳動物の核酸ライブラリからのcDNAと相補的なゲノム配列又はcDNA配列である。
【０３７８】
好ましいのは、cDNAライブラリが完全長配列の少なくとも80％を含んでいることであり、完全長配列の少なくとも85％又は90％が好ましく、完全長配列の少なくとも95％がより好ましい。cDNAライブラリを規格化して稀な配列の表示を増やすことができる。相補的配列と比べて配列一致度が低い配列を用いる低い厳しさ、又は中程度の厳しさのハイブリダイゼーション条件が典型的に利用されるが、それに限定されない。一致度がより大きい配列では場合によっては中程度と高い厳しさの条件を利用することができる。低い厳しさの条件は、配列一致が約70％の配列の選択的なハイブリダイゼーションを可能にするため、オルソログ配列又はパラログ配列の同定に用いることができる。
【０３７９】
場合によっては、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるVCARの少なくとも一部をコードすることになろう。本発明のポリヌクレオチドには、本発明のVCARをコードするポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズさせるのに使用できる核酸配列が包含される。例えばAusubel、上記文献；Colligan、上記文献を参照されたい（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
核酸の構成
【０３８０】
本開示の単離された核酸は、本分野で周知のように、（a）組換え法、（b）合成技術、（c）精製技術、及び／又は（d）それらの組み合わせを利用して作製することができる。
【０３８１】
核酸は、好都合なことに本発明のポリヌクレオチドに加えて複数の配列を含むことができる。例えば1つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸の中に挿入してポリヌクレオチドを単離しやすくすることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して本開示の翻訳されたポリヌクレオチドを単離しやすくすることができる。例えばヘキサ-ヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。本開示の核酸（コード配列は除外する）は、場合によっては、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプタ、又はリンカーである。
【０３８２】
追加配列をそのようなクローニング及び／又は発現のための配列に付加し、クローニング及び／又は発現におけるその機能を最適化すること、ポリヌクレオチドを単離しやすくすること、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプタ、及びリンカーの使用は、本分野で周知である。（例えばAusbel、上記文献；又はSambrook、上記文献を参照されたい）。
核酸を構成するための組換え法
【０３８３】
本開示の単離された核酸組成物（例えばRNA、cDNA、ゲノムDNA、又はそれらの任意の組み合わせ）は、当業者に知られている任意の数のクローニング法を利用して生物学的供給源から得ることができる。いくつかの実施態様では、厳しい条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いてcDNAライブラリ又はゲノムDNAライブラリの中の望む配列を同定する。RNAの単離と、cDNA及びゲノムライブラリの構成は当業者に周知である。（例えばAusbel、上記文献；又はSambrook、上記文献を参照されたい）。
核酸をスクリーニングする方法と単離する方法
【０３８４】
cDNAライブラリ又はゲノムライブラリは、本開示のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを用いてスクリーニングすることができる。プローブをゲノムDNA配列又はcDNA配列とハイブリダイズさせるのに使用し、同じ生物又は異なる生物の中の相同な遺伝子を単離することができる。当業者は、アッセイでハイブリダイゼーションのさまざまな程度の厳しさを利用できること；及びハイブリダイゼーション又は洗浄媒体を厳しくでることを知っているであろう。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど、二本鎖の形成が起こるためのプローブと標的の間の相補性の程度は大きくなるはずである。厳しさの程度は、温度、イオン強度、pH、及び部分的変性溶媒（ホルムアミドなど）の存在の1つまたは複数によって制御することができる。例えばハイブリダイゼーションの厳しさは、例えばホルムアミドの濃度を0％〜50％の範囲内で操作することを通じて反応溶液の極性を変化させることによってうまく変化する。検出可能な結合に必要とされる相補性（配列一致）の程度は、ハイブリダイゼーション媒体及び／又は洗浄媒体の厳しさに応じて変化するであろう。相補性の程度は、最適には100％、又は70〜100％、又はその間の任意の範囲又は値になろう。しかしプローブとプライマーの中のわずかな配列変化は、ハイブリダイゼーション媒体及び／又は洗浄媒体の厳しさを低下させることによって補償できることを理解すべきである。
【０３８５】
RNA又はDNAの増幅法は本分野で周知であり、本明細書に提示されている教示とガイドに基づき、特別な実験なしに本開示に従って利用することができる。
【０３８６】
DNA又はRNAを増幅する公知の方法の非限定的な例に含まれるのは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とそれに関連する増幅法（例えばMullisらに付与されたアメリカ合衆国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号；Taborらに付与されたアメリカ合衆国特許第4,795,699号、第4,921,794 号；Innisに付与されたアメリカ合衆国特許第5,142,033号；Wilsonらに付与されたアメリカ合衆国特許第5,122,464号；Innisに付与されたアメリカ合衆国特許第5,091,310号；Gyllenstenらに付与されたアメリカ合衆国特許第5,066,584号；Gelfandらに付与されたアメリカ合衆国特許第4,889,818号；Silverらに付与されたアメリカ合衆国特許第4,994,370号；Biswasに付与されたアメリカ合衆国特許第4,766,067号；Ringoldに付与されたアメリカ合衆国特許第4,656,134号を参照されたい）と、二本鎖DNA合成のための鋳型として標的配列に対するアンチセンスRNAを用いるRNA媒介増幅（MalekらにNASBAの商号で付与されたアメリカ合衆国特許第5,130,238号）であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。（例えばAusubel、上記文献；又はSambrook、上記文献を参照されたい）。
【０３８７】
例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用して本開示のポリヌクレオチドとそれに関連する遺伝子の配列をゲノムDNAライブラリ又はcDNAライブラリから直接増幅することができる。PCRと他のインビトロ増幅法は、例えば発現されることになるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするのにも有用である可能性、又はサンプル中の望むmRNAの存在を検出するためのプローブ、核酸シークエンシングのためのプローブ、又は他の目的のためのプローブとして用いる核酸を作製するのにも有用である可能性がある。当業者をインビトロ増幅法に精通した状態にするのに十分な技術の例は、Berger、上記文献、Sambrook、上記文献、Ausubel、上記文献のほか、Mullis他、アメリカ合衆国特許第4,683,202号（1987年）； Innis他編、『PCR Protocols A Guide to Methods and Applications』、Academic Press Inc.社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州（1990年）に見いだされる。ゲノムPCR増幅のための市販のキットが本分野で知られている。例えばAdvantage-GC Genomic PCR Kit（Clontech社）を参照されたい。それに加えて、例えばT4遺伝子32タンパク質（Boehringer Mannheim社）を用いて長いPCR産物の収率を改善することができる。
核酸を構成するための合成法
【０３８８】
本開示の単離された核酸は、公知の方法によって直接的な化学合成により調製することもできる（例えばAusbel他、上記文献を参照されたい）。化学合成によって一般に一本鎖オリゴヌクレオチドが生成し、その一本鎖を鋳型として使用して、その一本鎖を、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、又はDNAポリメラーゼを用いた重合によって二本鎖DNAに変換することができる。当業者は、DNAの化学合成が約100個以上の塩基からなる配列に限定されることはなく、より長い配列をより短い配列の連結によって取得できることを認識しているであろう。
組換え発現カセット
【０３８９】
本開示により、本開示の核酸を含む組換え発現カセットが更に提供される。本開示の核酸配列（例えば本開示のVCARをコードするcDNA又はゲノム配列）を用いて組換えカセットを構成し、少なくとも1つの望む宿主細胞に導入することができる。組換え発現カセットは、典型的には、予定する宿主細胞の中でポリヌクレオチドの転写を指示することになる転写開始調節配列に機能可能に連結された本開示のポリヌクレオチドを含むことになろう。異種プロモータと非異種（すなわち内在性）プロモータの両方を用いて本開示の核酸の発現を指示することができる。
【０３９０】
いくつかの実施態様では、プロモータ、エンハンサ、又は他のエレメントとして機能する単離された核酸を非異種形態の本開示のポリヌクレオチドの適切な位置（上流、下流、又はイントロンの中）に導入し、本開示のポリヌクレオチドの発現を上方調節又は下方調節することができる。例えば内在性プロモータは、変異、欠失、及び／又は置換によってインビボ又はインビトロで変化する可能性がある。
ナノトランスポゾン
【０３９１】
本開示により、（a）第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、及びITR内配列を含んでいてトランスポゾンインサートをコードする配列；（b）1〜450個のヌクレオチド（端点を含む）を有する複製起点をコードする配列と、1〜200個のヌクレオチド（端点を含む）を有する選択マーカーをコードする配列を含んでいて骨格をコードする配列；及び（c）ITR間配列を含むナノトランスポゾンが提供される。いくつかの実施態様では、（c）のITR間配列（b）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、（a）のITR内配列は、（b）の配列を含んでいる。
【０３９２】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、骨格をコードする配列は、1〜600個（端点を含む）のヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、骨格をコードする配列は、1〜50個の ヌクレオチド、50〜100個のヌクレオチド、100〜150個のヌクレオチド、150〜200個のヌクレオチド200〜250個のヌクレオチド、250〜300個のヌクレオチド、300〜350個のヌクレオチド、350〜400個のヌクレオチド、400〜450個のヌクレオチド、450〜500個のヌクレオチド、500〜550個のヌクレオチド、又は550〜600個のヌクレオチドからなる（それぞれの範囲は端点を含む）。
【０３９３】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR間配列は、1〜1000個（端点を含む）のヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ITR間配列は、1〜50個のヌクレオチド、50〜100個のヌクレオチド、100〜150個のヌクレオチド150〜200個のヌクレオチド、200〜250個のヌクレオチド250〜300個のヌクレオチド、300〜350個のヌクレオチド、350〜400個のヌクレオチド、400〜450個のヌクレオチド、450〜500個のヌクレオチド、500〜550個のヌクレオチド、550〜600個のヌクレオチド、600〜650個のヌクレオチド、650〜700個のヌクレオチド、700〜750個のヌクレオチド、750〜800個のヌクレオチド、800〜850個のヌクレオチド、850〜900個のヌクレオチド、900〜950個のヌクレオチド、又は950〜1000個のヌクレオチドからなる（それぞれの範囲は端点を含む）。
【０３９４】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、本開示の短いナノトランスポゾン（SNT）を含め、ITR間配列は、1〜200個（端点を含む）のヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ITR間配列は、1〜10個のヌクレオチド、10〜20個のヌクレオチド、20〜30個のヌクレオチド、30〜40個のヌクレオチド、40〜50個のヌクレオチド、50〜60個のヌクレオチド、60〜70個のヌクレオチド、70〜80個のヌクレオチド、80〜90個のヌクレオチド、又は90〜100個のヌクレオチドからなる（それぞれの範囲は端点を含む）。
【０３９５】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、1〜200個（端点を含む）のヌクレオチドを有する選択マーカーは、スクロース選択マーカーをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、スクロース選択マーカーをコードする配列は、RNA-OUT配列をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、RNA-OUT配列をコードする配列は、137塩基対（bp）からなる。いくつかの実施態様では、1〜200個（端点を含む）のヌクレオチドを有する選択マーカーは、蛍光マーカーをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、1〜200個（端点を含む）のヌクレオチドを有する選択マーカーは、細胞表面マーカーをコードする配列を含んでいる。
【０３９６】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、1〜450個（端点を含む）のヌクレオチドを有する複製起点をコードする配列は、ミニ複製起点をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、1〜450個（端点を含む）のヌクレオチドを有する複製起点をコードする配列は、R6K複製起点をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、R6K複製起点は、R6Kガンマ複製起点を含んでいる。いくつかの実施態様では、R6K複製起点は、R6Kミニ複製起点を含んでいる。いくつかの実施態様では、R6K複製起点は、R6Kガンマミニ複製起点を含んでいる。いくつかの実施態様では、R6Kガンマミニ複製起点は、281塩基対（bp）を含むか、281 bpからなる。
【０３９７】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、骨格をコードする配列は、組換え部位、切除部位、連結部位、又はそれらの組み合わせを含んでいない。いくつかの実施態様では、ナノトランスポゾンも、骨格をコードする配列も、組換えイベント、切除イベント、連結イベント、又はそれらの組み合わせの産物を含んでいない。いくつかの実施態様では、ナノトランスポゾンも、骨格をコードする配列も、組換え部位、切除部位、連結部位、又はそれらの組み合わせに由来しない。
【０３９８】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、組換え部位は、組換えイベントから得られる配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、組換え部位は、組換えイベントの産物である配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、組換えイベントは、リコンビナーゼの活性（例えばリコンビナーゼ部位）を含んでいる。
【０３９９】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、骨格をコードする配列は、外来DNAをコードする配列を更に含んでいない。
【０４００】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR間配列は、組換え部位、切除部位、連結部位、又はそれらの組み合わせを含んでいない。いくつかの実施態様では、ITR間配列は、組換えイベント、切除イベント、連結イベント、又はそれらの組み合わせの産物を含んでいない。いくつかの実施態様では、ITR間配列は、組換えイベント、切除イベント、連結イベント、又はそれらの組み合わせに由来しない。
【０４０１】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR間配列は、外来DNAをコードする配列を含んでいる。
【０４０２】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、インシュレータをコードする少なくとも1つの配列と、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【０４０３】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、インシュレータをコードする第1の配列、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列、及びインシュレータをコードする第2の配列を含んでいる。
【０４０４】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、インシュレータをコードする第1の配列、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列、ポリアデノシン（ポリA）配列、及びインシュレータをコードする第2の配列を含んでいる。
【０４０５】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、インシュレータをコードする第1の配列、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列、少なくとも1つの外来性配列、ポリアデノシン（ポリA）配列、及びインシュレータをコードする第2の配列を含んでいる。
【０４０６】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列は、ヒト細胞の中で外来性配列を発現することができる。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列は、構成的プロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列は、誘導性プロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ITR内配列は、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできる第1のプロモータをコードする第1の配列と、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできる第2のプロモータをコードする第2の配列を含んでいて、第1のプロモータは構成的プロモータであり、第2のプロモータは誘導性プロモータであり、第1のプロモータをコードする第1の配列と第2のプロモータをコードする第2の配列は、反対方向を向いている。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列は、細胞のタイプ又は組織のタイプに特異的なプロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現することのできるプロモータをコードする配列は、EF1aプロモータをコードする配列、CMVプロモータをコードする配列、MNDプロモータをコードする配列、SV40プロモータをコードする配列、PGK1プロモータをコードする配列、Ubcプロモータをコードする配列、CAGプロモータをコードする配列、H1プロモータをコードする配列、又はU6プロモータをコードする配列を含んでいる。
【０４０７】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ポリアデノシン（ポリA）配列は、ウイルスポリA配列から単離されるか、ウイルスポリA配列に由来する。いくつかの実施態様では、ポリアデノシン（ポリA）配列は、（SV40）ポリA配列から単離されるか、（SV40）ポリA配列に由来する。
【０４０８】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、誘導性カスパーゼポリペプチドは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含んでいない。いくつかの実施態様では、誘導性カスパーゼポリペプチドは、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含んでいない。
【０４０９】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域のアミノ酸配列は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドは、配列の36位に修飾を含んでいる。いくつかの実施態様では、修飾は、36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号14635）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号14636）を含む核酸配列によってコードされている。
【０４１０】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、リンカー領域は、GGGGS（配列番号14637）を含むアミノ酸、又はGGAGGAGGAGGATCC（配列番号14638）を含む核酸によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含んでいない。
【０４１１】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号14639）を含むアミノ酸によってコードされている。いくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、
GGATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号14640）を含む核酸配列によってコードされている。
【０４１２】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号14641）を含むアミノ酸によってコードされている。いくつかの実施態様では、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、
ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号14642）を含む核酸配列によってコードされている。
【０４１３】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、外来性配列は、選択マーカーをコードする配列を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーをコードする配列は、検出可能なマーカーをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、検出可能なマーカーは、蛍光マーカー又は細胞表面マーカーを含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーをコードする配列は、分裂している細胞の中で活性であり分裂していない細胞の中では活性でないタンパク質をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーをコードする配列は、代謝マーカーをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーをコードする配列は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）突然変異タンパク質酵素をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異タンパク質酵素は、
1 MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL 
61 VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL 
121 TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP 
181 EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号17012）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異タンパク質酵素は、
atggtcgggtctctgaattgtatcgtcgccgtgagtcagaacatgggcattgggaagaatggcgatttcccatggccacctctgcgcaacgagtcccgatactttcagcggatgacaactacctcctctgtggaagggaaacagaatctggtcatcatgggaaagaaaacttggttcagcattccagagaagaaccggcccctgaaaggcagaatcaatctggtgctgtcccgagaactgaaggagccaccacagggagctcactttctgagccggtccctggacgatgcactgaagctgacagaacagcctgagctggccaacaaagtcgatatggtgtggatcgtcgggggaagttcagtgtataaggaggccatgaatcaccccggccatctgaaactgttcgtcacacggatcatgcaggactttgagagcgatactttctttcctgaaattgacctggagaagtacaaactgctgcccgaatatcctggcgtgctgtccgatgtccaggaagagaaaggcatcaaatacaagttcgaggtctatgagaagaatgac（配列番号17095）を含む核酸配列を含むか、この核酸配列からなる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異タンパク質酵素のアミノ酸配列は、80位、113位、又は153位の1つまたは複数に変異を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異タンパク質酵素のアミノ酸配列は、80位におけるフェニルアラニン（F）又はロイシン（L）の置換、113位におけるロイシン（L）又はバリン（V）の置換、153位におけるバリン（V）又はアスパラギン酸（D）の置換の1つまたは複数を含んでいる。
【０４１４】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様、及び／又は外来性配列が選択マーカーをコードする配列を含む実施態様を含め、外来性配列は、天然に存在しない抗原受容体をコードする配列、及び／又は治療用ポリペプチドをコードする配列を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない抗原受容体は、T細胞受容体（TCR）を含んでいる。いくつかの実施態様では、TCRをコードする配列は、対応する野生型配列と比べて挿入、欠失、置換、逆転、転移、又はフレームシフトの1つまたは複数を含んでいる。いくつかの実施態様では、TCRをコードする配列は、キメラ配列又は組換え配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない抗原受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）を含んでいる。いくつかの実施態様では、CARは、（a）抗原認識領域を含むエクトドメイン、（b）膜貫通ドメイン、及び（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、CARの（a）のエクトドメインは、シグナルペプチドを更に含んでいる。いくつかの実施態様では、CARの（a）のエクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジを更に含んでいる。いくつかの実施態様では、エンドドメインは、ヒトCD3ζエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトの4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40細胞内セグメント、又はそれらの任意の組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトのCD28及び／又は4-1BB共刺激ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、scFv、VHH、VH、及びCentyrinの1つまたは複数を含んでいる。
【０４１５】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様、及び／又は外来性配列が選択マーカーをコードする配列を含む実施態様を含め、外来性配列は、トランスポザーゼをコードする配列を更に含んでいる。
【０４１６】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、選択マーカーをコードする配列、外来性配列、誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列、及び自己切断ペプチドをコードする少なくとも1つの配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、自己切断ペプチドをコードする少なくとも1つの配列は、（a）選択マーカーをコードする配列と外来性配列の間、（b）選択マーカーをコードする配列と誘導性カスパーゼポリペプチドの間、及び（c）外来性配列と誘導性カスパーゼポリペプチドの間の1つまたは複数に位置する。いくつかの実施態様では、自己切断ペプチドをコードする第1の配列は、選択マーカーをコードする配列と外来性配列の間に位置し、自己切断ペプチドをコードする第2の配列は、外来性配列と誘導性カスパーゼポリペプチドの間に位置する。
【０４１７】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、及び外来性配列の1つまたは複数を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBacトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBac様トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、TTAA認識配列、TTAT認識配列、又はTTAX認識配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、TTAA認識配列、TTAT認識配列、又はTTAX認識配列と、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼから単離されるか、これらトランスポザーゼに由来する配列と少なくとも50％一致する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、少なくとも2つのヌクレオチド（nt）、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、又は20 ntを含んでいる。
【０４１８】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、及び外来性配列の1つまたは複数を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列、又はCCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列と少なくとも70％一致する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17097）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列を含むとともに、
CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17097）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列を含むとともに、
CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATG（配列番号17098）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列を含むとともに、
TTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTA（配列番号17099）の配列を含んでいる。
【０４１９】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、及び外来性配列の1つまたは複数を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBacトランスポザーゼ又はpiggyBac様トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG 
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG 
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF 
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV 
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD 
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ 
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC 
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN 
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV 
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）のアミノ酸配列と少なくとも20％一致するアミノ酸配列を持つpiggyBacトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG 
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG 
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF 
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV 
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD 
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ 
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC 
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN 
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV 
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）のアミノ酸配列を持つpiggyBacトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）のアミノ酸配列と少なくとも20％一致するアミノ酸配列を持つpiggyBacトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）のアミノ酸配列を持つpiggyBacトランスポザーゼによって認識される。
【０４２０】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、及び外来性配列の1つまたは複数を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、眠れる美女トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、眠れる美女トランスポザーゼは、高活性な眠れる美女トランスポザーゼ（SB100X）である。
【０４２１】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、及び外来性配列の1つまたは複数を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、Helitronトランスポザーゼによって認識される。
【０４２２】
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、及び外来性配列の1つまたは複数を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、又は第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、Tol2トランスポザーゼによって認識される。
【０４２３】
本開示により、本開示のナノトランスポゾンを含む細胞が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、トランスポザーゼ組成物を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ組成物は、ナノトランスポゾンの第1のITR又は第2のITRを認識することのできるトランスポザーゼ、又はそのトランスポザーゼをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ組成物は、そのトランスポザーゼをコードする配列を含むナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞は、外来性配列を含む第1のナノトランスポゾンと、トランスポザーゼをコードする第2のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞は同種他家由来細胞である。
【０４２４】
本開示により、本開示のナノトランスポゾンを含む組成物が提供される。
【０４２５】
本開示により、本開示の細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞は更に改変されない。いくつかの実施態様では、細胞は同種他家由来である。
【０４２６】
本開示により、本開示の細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞は更に改変されない。いくつかの実施態様では、細胞は自己由来である。
【０４２７】
本開示により、本開示の複数の細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、複数の細胞の少なくとも1つの細胞は、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の細胞の一部は、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、その部分は、複数の細胞の少なくとも1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、又はその数値の間のいずれかの割合を含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の細胞のそれぞれの細胞は、開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の細胞は、本開示の改変された細胞を含んでいない。いくつかの実施態様では、複数の細胞の少なくとも1つの細胞は、更に改変されない。いくつかの実施態様では、複数の細胞のどれも更に改変されない。いくつかの実施態様では、複数の細胞は同種他家由来である。いくつかの実施態様では、同種他家由来の複数の細胞は、本開示の方法に従って生成される。いくつかの実施態様では、複数の細胞は自己由来である。いくつかの実施態様では、自己由来の複数の細胞は、本開示の方法に従って生成される。
【０４２８】
本開示により、（a）本開示のナノトランスポゾン；（b）誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列；（c）T細胞受容体（TCR）をコードする内在性配列の修飾を含んでいて、その修飾によってTCRの発現又は活性のレベルが低下するか消失する改変された細胞が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、（d）HLAクラスI組織適合性抗原、アルファ鎖E（HLA-E）を含む天然に存在しない配列と、（e）ベータ-2-ミクログロブリン（B2M）をコードする内在性配列の修飾を更に含んでいて、その修飾によって主要組織適合性複合体（MHC）クラスI（MHC-I）の発現又は活性のレベルが低下するか消失する。
【０４２９】
本開示により、（a）本開示のナノトランスポゾン；（b）誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列；（c）HLAクラスI組織適合性抗原、アルファ鎖E（HLA-E）を含む天然に存在しない配列、及び（e）ベータ-2-ミクログロブリン（B2M）をコードする内在性配列の修飾を含んでいて、その修飾によって主要組織適合性複合体（MHC）クラスI（MHC-I）の発現又は活性のレベルが低下するか消失する改変された細胞が提供される。
【０４３０】
本開示の改変された細胞のいくつかの実施態様では、HLA-Eを含む天然に存在しない配列は、B2Mシグナルペプチドをコードする配列を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、HLA-Eを含む天然に存在しない配列はリンカーを更に含んでいて、そのリンカーは、B2Mシグナルペプチドをコードする配列とHLA-Eをコードする配列の間に位置する。いくつかの実施態様では、HLA-Eを含む天然に存在しない配列は、ペプチドをコードする配列と、B2Mシグナルペプチドをコードする配列を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、HLA-Eを含む天然に存在しない配列は、B2Mシグナルペプチドをコードする配列とペプチドをコードする配列の間に位置する第1のリンカーと、B2Mシグナルペプチドをコードする配列とHLA-Eをコードする配列の間に位置する第2のリンカーを含んでいる。
【０４３１】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。
【０４３２】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞はヒト細胞である。
【０４３３】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は幹細胞である。
【０４３４】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、分化した細胞である。
【０４３５】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は体細胞である。
【０４３６】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、免疫細胞又は免疫細胞前駆体である。いくつかの実施態様では、免疫細胞は、リンパ球前駆細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞、Tリンパ球（T細胞）、Bリンパ球（B細胞）、又は抗原提示細胞（APC）である。いくつかの実施態様では、免疫細胞は、T細胞、初期記憶T細胞、幹細胞様T細胞、幹記憶T細胞（Tscm）、又はセントラル記憶T細胞（Tcm）である。いくつかの実施態様では、免疫細胞前駆体は、造血幹細胞（HSC）である。いくつかの実施態様では、細胞は抗原提示細胞（APC）である。
【０４３７】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、遺伝子編集組成物を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、DNA結合ドメインをコードする配列と、ヌクレアーゼタンパク質又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列、又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列、又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、DNA配列、RNA配列、又はそれらの組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインは、CRISPR／Casタンパク質、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、及びエンドヌクレアーゼの1つまたは複数を含んでいる。いくつかの実施態様では、CRISPR／Casタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Cas（dCas）タンパク質を含んでいる。
【０４３８】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、遺伝子編集組成物を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、DNA結合ドメインをコードする配列と、ヌクレアーゼタンパク質又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼタンパク質又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、ヌクレアーゼ不活性化Cas（dCas）タンパク質と、エンドヌクレアーゼを含んでいる。いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼは、Clo51ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、融合タンパク質を含んでいる。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Cas（dCas）タンパク質と、Clo51ヌクレアーゼ又はClo51ヌクレアーゼドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、ガイド配列を更に含んでいる。いくつかの実施態様では、ガイド配列はRNA配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、アミノ酸配列：
MAPKKKRKVEGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKYGGGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSPKKKRKVSS（配列番号17013）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいは融合タンパク質は、配列：
1 atggcaccaa agaagaaaag aaaagtggag ggcatcaagt caaacatcag cctgctgaaa 
61 gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg 
121 gccttcgaca gcaagcagaa tagactgttt gagatgaaag tgctggaact gctggtcaac 
181 gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac 
241 agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc 
301 tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat 
361 agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa 
421 tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga 
481 ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc 
541 gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac 
601 aattctgagt ttatcctgaa gtatggaggc gggggaagcg ataagaaata ctccatcgga 
661 ctggccattg gcaccaattc cgtgggctgg gctgtcatca cagacgagta caaggtgcca 
721 agcaagaagt tcaaggtcct ggggaacacc gatcgccaca gtatcaagaa aaatctgatt 
781 ggagccctgc tgttcgactc aggcgagact gctgaagcaa cccgactgaa gcggactgct 
841 aggcgccgat atacccggag aaaaaatcgg atctgctacc tgcaggaaat tttcagcaac 
901 gagatggcca aggtggacga tagtttcttt caccgcctgg aggaatcatt cctggtggag 
961 gaagataaga aacacgagcg gcatcccatc tttggcaaca ttgtggacga agtcgcttat 
1021 cacgagaagt accctactat ctatcatctg aggaagaaac tggtggactc caccgataag 
1081 gcagacctgc gcctgatcta tctggccctg gctcacatga tcaagttccg ggggcatttt 
1141 ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg 
1201 gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca 
1261 aaggccatcc tgagcgccag actgtccaaa tctaggcgcc tggaaaacct gatcgctcag 
1321 ctgccaggag agaagaaaaa cggcctgttt gggaatctga ttgcactgtc cctgggcctg 
1381 acacccaact tcaagtctaa ttttgatctg gccgaggacg ctaagctgca gctgtccaaa 
1441 gacacttatg acgatgacct ggataacctg ctggctcaga tcggcgatca gtacgcagac 
1501 ctgttcctgg ccgctaagaa tctgagtgac gccatcctgc tgtcagatat tctgcgcgtg 
1561 aacacagaga ttactaaggc cccactgagt gcttcaatga tcaaaagata tgacgagcac 
1621 catcaggatc tgaccctgct gaaggctctg gtgaggcagc agctgcccga gaaatacaag 
1681 gaaatcttct ttgatcagag caagaatgga tacgccggct atattgacgg cggggcttcc 
1741 caggaggagt tctacaagtt catcaagccc attctggaaa agatggacgg caccgaggaa 
1801 ctgctggtga agctgaatcg ggaggacctg ctgagaaaac agaggacatt tgataacgga 
1861 agcatccctc accagattca tctgggcgaa ctgcacgcca tcctgcgacg gcaggaggac 
1921 ttctacccat ttctgaagga taaccgcgag aaaatcgaaa agatcctgac cttcagaatc 
1981 ccctactatg tggggcctct ggcacgggga aatagtagat ttgcctggat gacaagaaag 
2041 tcagaggaaa ctatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tcgataaagg cgctagcgca 
2101 cagtccttca ttgaaaggat gacaaatttt gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctg 
2161 cccaaacaca gcctgctgta cgaatatttc acagtgtata acgagctgac taaagtgaag 
2221 tacgtcaccg aagggatgcg caagcccgca ttcctgtccg gagagcagaa gaaagccatc 
2281 gtggacctgc tgtttaagac aaatcggaaa gtgactgtca aacagctgaa ggaagactat 
2341 ttcaagaaaa ttgagtgttt cgattcagtg gaaatcagcg gcgtcgagga caggtttaac 
2401 gcctccctgg ggacctacca cgatctgctg aagatcatca aggataagga cttcctggac 
2461 aacgaggaaa atgaggacat cctggaggac attgtgctga cactgactct gtttgaggat 
2521 cgcgaaatga tcgaggaacg actgaagact tatgcccatc tgttcgatga caaagtgatg 
2581 aagcagctga aaagaaggcg ctacaccgga tggggacgcc tgagccgaaa actgatcaat 
2641 gggattagag acaagcagag cggaaaaact atcctggact ttctgaagtc cgatggcttc 
2701 gccaacagga acttcatgca gctgattcac gatgactctc tgaccttcaa ggaggacatc 
2761 cagaaagcac aggtgtctgg ccagggggac agtctgcacg agcatatcgc aaacctggcc 
2821 ggcagccccg ccatcaagaa agggattctg cagaccgtga aggtggtgga cgaactggtc 
2881 aaggtcatgg gacgacacaa acctgagaac atcgtgattg agatggcccg cgaaaatcag 
2941 acaactcaga agggccagaa aaacagtcga gaacggatga agagaatcga ggaaggcatc 
3001 aaggagctgg ggtcacagat cctgaaggag catcctgtgg aaaacactca gctgcagaat 
3061 gagaaactgt atctgtacta tctgcagaat ggacgggata tgtacgtgga ccaggagctg 
3121 gatattaaca gactgagtga ttatgacgtg gatgccatcg tccctcagag cttcctgaag 
3181 gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc aggtccgaca agaaccgcgg caaatcagat 
3241 aatgtgccaa gcgaggaagt ggtcaagaaa atgaagaact actggaggca gctgctgaat 
3301 gccaagctga tcacacagcg gaaatttgat aacctgacta aggcagaaag aggaggcctg 
3361 tctgagctgg acaaggccgg cttcatcaag cggcagctgg tggagacaag acagatcact 
3421 aagcacgtcg ctcagattct ggatagcaga atgaacacaa agtacgatga aaacgacaag 
3481 ctgatcaggg aggtgaaagt cattactctg aaatccaagc tggtgtctga ctttagaaag 
3541 gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac 
3601 ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc 
3661 gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa 
3721 attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc 
3781 gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag 
3841 acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc 
3901 atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag 
3961 agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc 
4021 aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag 
4081 gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt 
4141 atggaacgca gctccttcga gaagaatcct atcgattttc tggaagccaa gggctataaa 
4201 gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac 
4261 ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg 
4321 ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc 
4381 cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag 
4441 atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat 
4501 aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat 
4561 atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac 
4621 accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc 
4681 caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat 
4741 gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa（配列番号17014）：を含むかこの配列からなる核酸を含むか、この核酸からなる。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、アミノ酸配列：
1 MPKKKRKVEG IKSNISLLKD ELRGQISHIS HEYLSLIDLA FDSKQNRLFE MKVLELLVNE 
61 YGFKGRHLGG SRKPDGIVYS TTLEDNFGII VDTKAYSEGY SLPISQADEM ERYVRENSNR 
121 DEEVNPNKWW ENFSEEVKKY YFVFISGSFK GKFEEQLRRL SMTTGVNGSA VNVVNLLLGA 
181 EKIRSGEMTI EELERAMFNN SEFILKYGGG GSDKKYSIGL AIGTNSVGWA VITDEYKVPS 
241 KKFKVLGNTD RHSIKKNLIG ALLFDSGETA EATRLKRTAR RRYTRRKNRI CYLQEIFSNE 
301 MAKVDDSFFH RLEESFLVEE DKKHERHPIF GNIVDEVAYH EKYPTIYHLR KKLVDSTDKA 
361 DLRLIYLALA HMIKFRGHFL IEGDLNPDNS DVDKLFIQLV QTYNQLFEEN PINASGVDAK 
421 AILSARLSKS RRLENLIAQL PGEKKNGLFG NLIALSLGLT PNFKSNFDLA EDAKLQLSKD 
481 TYDDDLDNLL AQIGDQYADL FLAAKNLSDA ILLSDILRVN TEITKAPLSA SMIKRYDEHH 
541 QDLTLLKALV RQQLPEKYKE IFFDQSKNGY AGYIDGGASQ EEFYKFIKPI LEKMDGTEEL 
601 LVKLNREDLL RKQRTFDNGS IPHQIHLGEL HAILRRQEDF YPFLKDNREK IEKILTFRIP 
661 YYVGPLARGN SRFAWMTRKS EETITPWNFE EVVDKGASAQ SFIERMTNFD KNLPNEKVLP 
721 KHSLLYEYFT VYNELTKVKY VTEGMRKPAF LSGEQKKAIV DLLFKTNRKV TVKQLKEDYF 
781 KKIECFDSVE ISGVEDRFNA SLGTYHDLLK IIKDKDFLDN EENEDILEDI VLTLTLFEDR 
841 EMIEERLKTY AHLFDDKVMK QLKRRRYTGW GRLSRKLING IRDKQSGKTI LDFLKSDGFA 
901 NRNFMQLIHD DSLTFKEDIQ KAQVSGQGDS LHEHIANLAG SPAIKKGILQ TVKVVDELVK 
961 VMGRHKPENI VIEMARENQT TQKGQKNSRE RMKRIEEGIK ELGSQILKEH PVENTQLQNE 
1021 KLYLYYLQNG RDMYVDQELD INRLSDYDVD AIVPQSFLKD DSIDNKVLTR SDKNRGKSDN 
1081 VPSEEVVKKM KNYWRQLLNA KLITQRKFDN LTKAERGGLS ELDKAGFIKR QLVETRQITK 
1141 HVAQILDSRM NTKYDENDKL IREVKVITLK SKLVSDFRKD FQFYKVREIN NYHHAHDAYL 
1201 NAVVGTALIK KYPKLESEFV YGDYKVYDVR KMIAKSEQEI GKATAKYFFY SNIMNFFKTE 
1261 ITLANGEIRK RPLIETNGET GEIVWDKGRD FATVRKVLSM PQVNIVKKTE VQTGGFSKES 
1321 ILPKRNSDKL IARKKDWDPK KYGGFDSPTV AYSVLVVAKV EKGKSKKLKS VKELLGITIM 
1381 ERSSFEKNPI DFLEAKGYKE VKKDLIIKLP KYSLFELENG RKRMLASAGE LQKGNELALP 
1441 SKYVNFLYLA SHYEKLKGSP EDNEQKQLFV EQHKHYLDEI IEQISEFSKR VILADANLDK 
1501 VLSAYNKHRD KPIREQAENI IHLFTLTNLG APAAFKYFDT TIDRKRYTST KEVLDATLIH 
1561 QSITGLYETR IDLSQLGGDG SPKKKRKV（配列番号17058）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいは融合タンパク質は、配列：
1 atgcctaaga agaagcggaa ggtggaaggc atcaaaagca acatctccct cctgaaagac 
61 gaactccggg ggcagattag ccacattagt cacgaatacc tctccctcat cgacctggct 
121 ttcgatagca agcagaacag gctctttgag atgaaagtgc tggaactgct cgtcaatgag 
181 tacgggttca agggtcgaca cctcggcgga tctaggaaac cagacggcat cgtgtatagt 
241 accacactgg aagacaactt tgggatcatt gtggatacca aggcatactc tgagggttat 
301 agtctgccca tttcacaggc cgacgagatg gaacggtacg tgcgcgagaa ctcaaataga 
361 gatgaggaag tcaaccctaa caagtggtgg gagaacttct ctgaggaagt gaagaaatac 
421 tacttcgtct ttatcagcgg gtccttcaag ggtaaatttg aggaacagct caggagactg 
481 agcatgacta ccggcgtgaa tggcagcgcc gtcaacgtgg tcaatctgct cctgggcgct 
541 gaaaagattc ggagcggaga gatgaccatc gaagagctgg agagggcaat gtttaataat 
601 agcgagttta tcctgaaata cggtggcggt ggatccgata aaaagtattc tattggttta 
661 gccatcggca ctaattccgt tggatgggct gtcataaccg atgaatacaa agtaccttca 
721 aagaaattta aggtgttggg gaacacagac cgtcattcga ttaaaaagaa tcttatcggt 
781 gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca gaggcgactc gcctgaaacg aaccgctcgg 
841 agaaggtata cacgtcgcaa gaaccgaata tgttacttac aagaaatttt tagcaatgag 
901 atggccaaag ttgacgattc tttctttcac cgtttggaag agtccttcct tgtcgaagag 
961 gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt ggaaacatag tagatgaggt ggcatatcat 
1021 gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga aaaaagctag ttgactcaac tgataaagcg 
1081 gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc catatgataa agttccgtgg gcactttctc 
1141 attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg gatgtcgaca aactgttcat ccagttagta 
1201 caaacctata atcagttgtt tgaagagaac cctataaatg caagtggcgt ggatgcgaag 
1261 gctattctta gcgcccgcct ctctaaatcc cgacggctag aaaacctgat cgcacaatta 
1321 cccggagaga agaaaaatgg gttgttcggt aaccttatag cgctctcact aggcctgaca 
1381 ccaaatttta agtcgaactt cgacttagct gaagatgcca aattgcagct tagtaaggac 
1441 acgtacgatg acgatctcga caatctactg gcacaaattg gagatcagta tgcggactta 
1501 tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca atcctcctat ctgacatact gagagttaat 
1561 actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct tcaatgatca aaaggtacga tgaacatcac 
1621 caagacttga cacttctcaa ggccctagtc cgtcagcaac tgcctgagaa atataaggaa 
1681 atattctttg atcagtcgaa aaacgggtac gcaggttata ttgacggcgg agcgagtcaa 
1741 gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg 
1801 cttgtaaaac tcaatcgcga agatctactg cgaaagcagc ggactttcga caacggtagc 
1861 attccacatc aaatccactt aggcgaattg catgctatac ttagaaggca ggaggatttt 
1921 tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct 
1981 tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc 
2041 gaagaaacga ttactccatg gaattttgag gaagttgtcg ataaaggtgc gtcagctcaa 
2101 tcgttcatcg agaggatgac caactttgac aagaatttac cgaacgaaaa agtattgcct 
2161 aagcacagtt tactttacga gtatttcaca gtgtacaatg aactcacgaa agttaagtat 
2221 gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt ctaagcggag aacagaagaa agcaatagta 
2281 gatctgttat tcaagaccaa ccgcaaagtg acagttaagc aattgaaaga ggactacttt 
2341 aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag atctccgggg tagaagatcg atttaatgcg 
2401 tcacttggta cgtatcatga cctcctaaag ataattaaag ataaggactt cctggataac 
2461 gaagagaatg aagatatctt agaagatata gtgttgactc ttaccctctt tgaagatcgg 
2521 gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac gctcacctgt tcgacgataa ggttatgaaa 
2581 cagttaaaga ggcgtcgcta tacgggctgg ggacgattgt cgcggaaact tatcaacggg 
2641 ataagagaca agcaaagtgg taaaactatt ctcgattttc taaagagcga cggcttcgcc 
2701 aataggaact ttatgcagct gatccatgat gactctttaa ccttcaaaga ggatatacaa 
2761 aaggcacagg tttccggaca aggggactca ttgcacgaac atattgcgaa tcttgctggt 
2821 tcgccagcca tcaaaaaggg catactccag acagtcaaag tagtggatga gctagttaag 
2881 gtcatgggac gtcacaaacc ggaaaacatt gtaatcgaga tggcacgcga aaatcaaacg 
2941 actcagaagg ggcaaaaaaa cagtcgagag cggatgaaga gaatagaaga gggtattaaa 
3001 gaactgggca gccagatctt aaaggagcat cctgtggaaa atacccaatt gcagaacgag 
3061 aaactttacc tctattacct acaaaatgga agggacatgt atgttgatca ggaactggac 
3121 ataaaccgtt tatctgatta cgacgtcgat gccattgtac cccaatcctt tttgaaggac 
3181 gattcaatcg acaataaagt gcttacacgc tcggataaga accgagggaa aagtgacaat 
3241 gttccaagcg aggaagtcgt aaagaaaatg aagaactatt ggcggcagct cctaaatgcg 
3301 aaactgataa cgcaaagaaa gttcgataac ttaactaaag ctgagagggg tggcttgtct 
3361 gaacttgaca aggccggatt tattaaacgt cagctcgtgg aaacccgcca aatcacaaag 
3421 catgttgcac agatactaga ttcccgaatg aatacgaaat acgacgagaa cgataagctg 
3481 attcgggaag tcaaagtaat cactttaaag tcaaaattgg tgtcggactt cagaaaggat 
3541 tttcaattct ataaagttag ggagataaat aactaccacc atgcgcacga cgcttatctt 
3601 aatgccgtcg tagggaccgc actcattaag aaatacccga agctagaaag tgagtttgtg 
3661 tatggtgatt acaaagttta tgacgtccgt aagatgatcg cgaaaagcga acaggagata 
3721 ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat tctaacatta tgaatttctt taagacggaa 
3781 atcactctgg caaacggaga gatacgcaaa cgacctttaa ttgaaaccaa tggggagaca 
3841 ggtgaaatcg tatgggataa gggccgggac ttcgcgacgg tgagaaaagt tttgtccatg 
3901 ccccaagtca acatagtaaa gaaaactgag gtgcagaccg gagggttttc aaaggaatcg 
3961 attcttccaa aaaggaatag tgataagctc atcgctcgta aaaaggactg ggacccgaaa 
4021 aagtacggtg gcttcgatag ccctacagtt gcctattctg tcctagtagt ggcaaaagtt 
4081 gagaagggaa aatccaagaa actgaagtca gtcaaagaat tattggggat aacgattatg 
4141 gagcgctcgt cttttgaaaa gaaccccatc gacttccttg aggcgaaagg ttacaaggaa 
4201 gtaaaaaagg atctcataat taaactacca aagtatagtc tgtttgagtt agaaaatggc 
4261 cgaaaacgga tgttggctag cgccggagag cttcaaaagg ggaacgaact cgcactaccg 
4321 tctaaatacg tgaatttcct gtatttagcg tcccattacg agaagttgaa aggttcacct 
4381 gaagataacg aacagaagca actttttgtt gagcagcaca aacattatct cgacgaaatc 
4441 atagagcaaa tttcggaatt cagtaagaga gtcatcctag ctgatgccaa tctggacaaa 
4501 gtattaagcg catacaacaa gcacagggat aaacccatac gtgagcaggc ggaaaatatt 
4561 atccatttgt ttactcttac caacctcggc gctccagccg cattcaagta ttttgacaca 
4621 acgatagatc gcaaacgata cacttctacc aaggaggtgc tagacgcgac actgattcac 
4681 caatccatca cgggattata tgaaactcgg atagatttgt cacagcttgg gggtgacgga 
4741 tcccccaaga agaagaggaa agtctga（配列番号17059）を含むかこの配列からなる核酸を含むか、この核酸からなる。
【０４３９】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、ナノトランスポゾンは、ガイド配列と、融合タンパク質をコードしていて不活性化Cas9（dCas9）をコードする配列とClo51ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む配列を含む遺伝子編集組成物を含んでいる。
【０４４０】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、遺伝子編集組成物を一過性に発現する。
【０４４１】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞はT細胞であり、ガイドRNAは、内在性TCRをコードする標的配列と相補的な配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ガイドRNAは、B2Mポリペプチドをコードする標的配列と相補的な配列を含んでいる。
【０４４２】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、ガイドRNAは、ゲノムDNA配列のセーフハーバー部位の中の標的配列と相補的な配列を含んでいる。
【０４４３】
本開示の細胞、改変されていない細胞、及び改変された細胞のいくつかの実施態様では、Clo051ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインは、標的配列の中に一本鎖又は二本鎖の切断を誘導する。いくつかの実施態様では、ドナー配列、ドナープラスミド、又はドナーナノトランスポゾンITR内配列は、一本鎖又は二本鎖の切断位置、及び／又は標的配列内の細胞修復の位置に組み込まれる。
【０４４４】
本開示により、本開示の改変された細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、医薬的に許容される基剤を更に含んでいる。
【０４４５】
本開示により、本開示による複数の改変された細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、医薬的に許容される基剤を更に含んでいる。
【０４４６】
本開示により、疾患又は障害の治療に用いるための本開示の組成物が提供される。
【０４４７】
本開示により、疾患又は障害の治療に用いるための組成物の利用が提供される。
【０４４８】
本開示により、疾患又は障害を治療する方法として、それを必要とする対象に治療に有効な量の本開示の組成物を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、対象は、組成物の投与後に移植片対宿主（GvH）及び／又は宿主対移植片（HvG）を発症しない。いくつかの実施態様では、投与は全身投与である。いくつかの実施態様では、組成物は静脈内経路によって投与される。いくつかの実施態様では、組成物は静脈内注射又は静脈内輸液によって投与される。
【０４４９】
本開示により、疾患又は障害を治療する方法として、それを必要とする対象に治療に有効な量の本開示の組成物を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、対象は、組成物の投与後に移植片対宿主（GvH）及び／又は宿主対移植片（HvG）を発症しない。いくつかの実施態様では、投与は局所投与である。いくつかの実施態様では、組成物は、腫瘍内経路、脊椎内経路、脳室内経路、眼内経路、又は骨内経路によって投与される。いくつかの実施態様では、組成物は、腫瘍内への注射か輸液、脊椎内への注射か輸液、脳室内への注射か輸液、眼内への注射か輸液、又は骨内への注射か輸液によって投与される。
【０４５０】
疾患又は障害を治療する本開示の方法のいくつかの実施態様では、治療に有効な用量は一回量であり、組成物の同種他家由来の細胞が十分な時間にわたって定着及び／又は持続して疾患又は障害を治療する。いくつかの実施態様では、一回量は、同時に製造される少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、又はその数値の間の任意の数の用量の1つである。
【０４５１】
疾患又は障害を治療する本開示の方法のいくつかの実施態様では、治療に有効な用量は一回量であり、組成物の自己由来の細胞が十分な時間にわたって定着及び／又は持続して疾患又は障害を治療する。いくつかの実施態様では、一回量は、同時に製造される少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、又はその数値の間の任意の数の用量の1つである。
【０４５２】
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、同種他家由来の細胞は幹細胞である。いくつかの実施態様では、同種他家由来の細胞は幹細胞に由来する。代表的な幹細胞の非限定的な例に含まれるのは、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（iPS）、複能性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞（HSC）である。
【０４５３】
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、同種他家由来の細胞は分化した体細胞である。
【０４５４】
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、同種他家由来の細胞は免疫細胞である。いくつかの実施態様では、同種他家由来の細胞はTリンパ球（T細胞）である。いくつかの実施態様では、同種他家由来の細胞は、天然に存在するT細胞受容体（TCR）の1つまたは複数の構成要素を発現しないT細胞である。いくつかの実施態様では、同種他家由来の細胞は、天然に存在しない抗原受容体を発現するT細胞である。その代わりに、又はそれに加えて、いくつかの実施態様では、同種他家由来の細胞は、天然に存在しないキメラ刺激受容体（CSR）を発現するT細胞である。いくつかの実施態様では、天然に存在しないCSRは、スイッチ受容体を含むか、スイッチ受容体からなる。いくつかの実施態様では、スイッチ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、スイッチ受容体の細胞外ドメインはTCR共刺激分子に結合してシグナルを同種他家由来の細胞の細胞内空間に伝達し、その空間でTCRシグナル伝達又はTCR共刺激シグナル伝達が再現される。
キメラ刺激受容体（CSR）
【０４５５】
どの患者に投与しても「普遍的に」安全な養子細胞組成物は、同種他家性が有意に低下しているか消失している必要がある。
【０４５６】
その目的に向かい、本開示の同種他家由来の細胞を改変し、T細胞受容体（TCR）及び／又は主要組織適合性複合体（MHC）の1つのクラスの発現又は機能を停止させる。TCRは移植片対宿主（GvH）反応を媒介するのに対し、MHCは宿主対移植片（HvG）反応を媒介する。好ましい実施態様では、TCRのあらゆる発現及び／又は機能が本開示の同種他家由来の細胞において消失し、対象に死を引き起こす可能性のあるT細胞を媒介としたGvHが阻止される。したがって特に好ましい実施態様では、本開示により、純粋なTCR陰性同種他家由来T細胞組成物（例えば組成物の各細胞が、検出不能か存在しないくらいの低レベルで発現する）が提供される。
【０４５７】
好ましい実施態様では、MHCクラスI（MHC-I、特にHLA-A、HLA-B、HLA-C）の発現及び／又は機能が本開示の同種他家由来の細胞において消失してHvGが阻止され、その帰結として対象内の本開示の同種他家由来の細胞の移植が改善される。本開示の同種他家由来の細胞の移植が改善される結果として細胞がより長く持続し、したがって対象の治療ウインドウがより広くなる。具体的には、本開示の同種他家由来の細胞では、MHC-I、ベータ-2-ミクログロブリン（B2M）の構造エレメントの発現及び／又は機能が、本開示の同種他家由来の細胞で低下するか消失する。
【０４５８】
本開示の同種他家由来の細胞を生成させる上記の戦略はさらなるチャレンジを誘導する。T細胞においてT細胞受容体（TCR）をノックアウト（KO）すると、TCR複合体の一部であるCD3-ゼータ（CD3z又はCD3ζ）の発現が失われる。TCR-KO T細胞の中のCD3ζの喪失により、標準的な刺激／活性化試薬（その非限定的な例にアゴニスト抗CD3 mAbが含まれる）を用いてこれらの細胞を最適に活性化して増殖させる能力が劇的に低下する。TCR複合体の任意の1つの構成要素の発現又は機能が中断されるとき、その複合体の全構成要素（その中には、TCR-アルファ（TCRα）、TCR-ベータ（TCRβ）、CD3-ガンマ（CD3γ）、CD3-イプシロン（CD3ε）、CD3-デルタ（CD3δ）、及びCD3-ゼータ（CD3ζ）が含まれる）が失われる。CD3εとCD3ζの両方とも、T細胞の活性化と増殖に必要とされる。アゴニスト抗CD3 mAbは、典型的にはCD3εを認識し、おそらくは複合体内の別のタンパク質も認識し、そのことによって今度はCD3ζにシグナルを伝達する。CD3ζは、最適な活性化と増幅のためのT細胞活性化の一次刺激（とともに二次強刺激シグナル）を提供する。通常の条件では、完全なT細胞活性化は、TCRの関与と、免疫反応を促進する1つまたは複数の共刺激受容体（例えばCD28、CD2、4-1BBLなど）の組み合わせによる二次シグナルに依存する。しかしTCRが存在していないときには、標準的な活性化／刺激試薬（アゴニスト抗CD3 mAbが含まれる）を用いて刺激すると、T細胞の増殖がは大きく低下する。実際、T細胞の増殖は、標準的な活性化／刺激試薬（アゴニスト抗CD3 mAbが含まれる）を用いて刺激すると、増殖の正常レベルのほんの20〜40％へと低下する。
【０４５９】
本開示により、標準的な活性化／刺激試薬（アゴニスト抗CD3 mAbが含まれる）を用いて刺激したとき、内在性TCR（と、その帰結として内在性CD3ζ）の不在下でCD3z一次刺激を同種他家由来T細胞に送達するキメラ刺激受容体（CSR）が提供される。
【０４６０】
内在性TCRの不在下では、本開示のキメラ刺激受容体（CSR）がCD3ζ刺激を提供して、同種他家由来T細胞の活性化と増殖を増強する。言い換えると、内在性TCRの不在下では、本開示のキメラ刺激受容体（CSR）が、同種他家由来の細胞を、内在性TCRを発現する同種他家由来ではないT細胞と比べて活性化に基づく不利から救出する。いくつかの実施態様では、本開示のCSRは、細胞外にアゴニストmAbエピトープを、細胞内にCD3ζ刺激ドメインを含んでいて、機能的には、表面での抗CD28又は抗CD2の結合イベントを、CSRを発現するように改変された同種他家由来T細胞におけるCD3zシグナル伝達イベントに変換する。いくつかの実施態様では、CSRは、野生型のCD28タンパク質又はCD2タンパク質と、CD3z細胞内刺激ドメインを含んでいて、CD28z CSRとCD2z CSRをそれぞれ生成させる。好ましい実施態様では、CD28z CSR及び／又はCD2z CSRは、天然に存在しない抗原受容体及び／又は治療用タンパク質を更に発現する。好ましい実施態様では、天然に存在しない抗原受容体はキメラ抗原受容体である。
【０４６１】
本明細書に提示されているデータは、本開示のCSRを含む／発現する本開示の改変された同種他家由来の細胞が、もはや内在性TCRを発現しない同種他家由来T細胞の増殖を、本開示のCSRを含まない／発現しない細胞と比べて改善又は救出することを実証している。
内在性TCRノックアウト
【０４６２】
本開示の遺伝子編集組成物は、dCas9-Clo051を含むRNAにガイドされた融合タンパク質を含め、本開示の同種他家由来の細胞の内在性T細胞受容体を標的とし、その発現を低下又は消失させるのに用いることができる。好ましい実施態様では、本開示の遺伝子編集組成物は、本開示の同種他家由来の細胞の内在性T細胞受容体をコードする遺伝子、遺伝子の一部、又は遺伝子の調節エレメント（プロモータなど）を標的とし、欠失させる。
【０４６３】
TCR-アルファ（TCR-α）を標的として除去するためのガイドRNA（gRNA）鋳型を生成させるプライマー（T7プロモータ、ゲノム標的配列、及びgRNA足場が含まれる）の非限定的な例が表10に示されている。
【０４６４】
【化１】
2021507703.tif 000003
【０４６５】
TCR-ベータ（TCR-β）を標的として欠失させるためのガイドRNA（gRNA）鋳型を生成させるプライマーの非限定的な例が表11に示されている。
【０４６６】
【化２】
2021507703.tif 000004
【０４６７】
ベータ-2-ミクログロブリン（β2M）を標的として欠失させるためのガイドRNA（gRNA）鋳型を生成させるプライマーの非限定的な例が表12に示されている。
【０４６８】
【化３】
2021507703.tif 000005
内在MHCノックアウト
【０４６９】
本開示の遺伝子編集組成物は、非限定的な例としてのdCas9-Clo051を含むRNAにガイドされた融合タンパク質を含め、本開示の同種他家由来の細胞の内在性MHCI、MHCII、又はMHCアクチベータを標的とし、その発現を低下又は消失させるのに用いることができる。好ましい実施態様では、本開示の遺伝子編集組成物は、本開示の同種他家由来の細胞の内在性のMHCIアクチベータ、MHCIIアクチベータ、又はMHCアクチベータの1つまたは複数の構成要素をコードする遺伝子、遺伝子の一部、又は遺伝子の調節エレメント（プロモータなど）を標的とし、それを欠失させる。
【０４７０】
MHCアクチベータを標的として欠失させるためのガイドRNA（gRNA）鋳型を生成させるプライマーの非限定的な例が表13と表14に示されている。
【０４７１】
【化４】
2021507703.tif 000006
【０４７２】
【化５−１】
2021507703.tif 000007
【化５−２】
2021507703.tif 000008
【化５−３】
2021507703.tif 000009
操作されたHLA-E組成物
【０４７３】
MHCIノックアウト（KO）は細胞をT細胞による殺傷に対して抵抗性にするが、細胞を、ナチュラルキラー（NK）細胞を媒介とする細胞傷害性に対して感受性にもする（「失われた自己仮説」）（図23参照）。NKの拒絶により、治療設定（例えば同種他家由来（アロ）CAR-T療法）におけるこれらKO細胞のインビボ効力及び／又は持続性が低下するであろうという仮説を考える。アロCAR-T細胞の表面にMHCIを保持することが、それらの細胞を宿主T細胞による殺傷に対して感受性にすると考えられることが、古典的な混合リンパ球反応（MLR）実験で観察された。一人のT細胞の10％までが外来MHCに対して特異的であり、それらT細胞が外来細胞と外来組織の拒絶を媒介すると推定される。MHCI（特にHLA-A、HLA-B、及びHLA-C）を標的としたKOはB2Mを標的としたKOによって実現でき、その結果として追加HLA分子（HLA-Eが含まれる）が失われる。例えばHLA-Eの喪失により、「失われた自己仮説」が理由で、KO細胞は、NK細胞を媒介とした細胞傷害性に対してより感受性になる。失われる自己細胞に対するNK細胞を媒介とした細胞傷害性は、感染した細胞の表面にあるMHCを下方調節し、適応免疫系の細胞による検出と殺傷を回避する病原体に対する防御機構である。
【０４７４】
本開示では、アロ（MHCI陰性）T細胞（CAR-T細胞が含まれる）を操作してNK細胞を媒介とした細胞傷害性に対してより抵抗性にするための2つの戦略を考える。いくつかの実施態様では、NK殺傷を減少させる、又は阻止する分子（一本鎖HLA-Eなど）をコードする配列が、同種他家由来の細胞に導入又は送達される。その代わりに、又はそれに加えて、本開示の遺伝子編集法は、いくつかの内在性HLA分子（内在性HLA-Eなど）を保持している。例えば第1のアプローチは、B2M KO T細胞への一本鎖(sc)HLA-EのpiggyBac（PB）送達を含んでいる。
【０４７５】
第2のアプローチは、遺伝子編集組成物を、HLA-A、HLA-B、及びHLA-Cは選択するが、例えばMHCI KO細胞に関するナチュラルキラー細胞を媒介とした細胞傷害性から保護するHLA-E又は他の分子は選択しないガイドRNAとともに利用する。
【０４７６】
ナチュラルキラー（NK）細胞を媒介とする細胞傷害性から保護するHLA-Eの代替分子又は追加分子の非限定的な例に含まれるのは、インターフェロン-アルファ／ベータ受容体1（IFNAR1）、ヒトIFNAR1、インターフェロン-アルファ／ベータ受容体2（IFNAR2）、ヒトIFNAR2、HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4、HLA-G5、HLA-G6、HLA-G7、ヒト癌胎児性抗原関連細胞接着分子1（CEACAM1）、ウイルスヘマグルチニン、CD48、LLT1（C型レクチンドメインファミリー2メンバー（CLC2D）としても知られる）、ULBP2、ULBP3、及びsMICA、又はこれらのバリアントである。
【０４７７】
本開示のIFNAR1タンパク質の代表的な一例は、
MMVVLLGATTLVLVAVAPWVLSAAAGGKNLKSPQKVEVDIIDDNFILRWNRSDESVGNVT
FSFDYQKTGMDNWIKLSGCQNITSTKCNFSSLKLNVYEEIKLRIRAEKENTSSWYEVDSF
TPFRKAQIGPPEVHLEAEDKAIVIHISPGTKDSVMWALDGLSFTYSLVIWKNSSGVEERI
ENIYSRHKIYKLSPETTYCLKVKAALLTSWKIGVYSPVHCIKTTVENELPPPENIEVSVQ
NQNYVLKWDYTYANMTFQVQWLHAFLKRNPGNHLYKWKQIPDCENVKTTQCVFPQNVFQK
GIYLLRVQASDGNNTSFWSEEIKFDTEIQAFLLPPVFNIRSLSDSFHIYIGAPKQSGNTP
VIQDYPLIYEIIFWENTSNAERKIIEKKTDVTVPNLKPLTVYCVKARAHTMDEKLNKSSV
FSDAVCEKTKPGNTSKIWLIVGICIALFALPFVIYAAKVFLRCINYVFFPSLKPSSSIDE
YFSEQPLKNLLLSTSEEQIEKCFIIENISTIATVEETNQTDEDHKKYSSQTSQDSGNYSN
EDESESKTSEELQQDFV（配列番号17017）のアミノ酸配列（シグナルペプチド、細胞外、TM、細胞質）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４７８】
本開示のIFNAR2タンパク質の代表的な一例は、
MLLSQNAFIFRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELKNHS
IVPTHYTLLYTIMSKPEDLKVVKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGFSGNTTLF
SCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEEELQFDLSLVIEEQSEGIVKK
HKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTLLPPGQESESAE
SAKIGGIITVFLIALVLTSTIVTLKWIGYICLRNSLPKVLNFHNFLAWPFPNLPPLEAMD
MVEVIYINRKKKVWDYNYDDESDSDTEAAPRTSGGGYTMHGLTVRPLGQASATSTESQLI
DPESEEEPDLPEVDVELPTMPKDSPQQLELLSGPCERRKSPLQDPFPEEDYSSTEGSGGR
ITFNVDLNSVFLRVLDDEDSDDLEAPLMLSSHLEEMVDPEDPDNVQSNHLLASGEGTQPT
FPSPSSEGLWSEDAPSDQSDTSESDVDLGDGYIMR（配列番号17018）のアミノ酸配列（シグナルペプチド、細胞外、TM、細胞質）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４７９】
本開示のHLA-G1タンパク質の代表的な一例は、
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD（配列番号17019）のアミノ酸配列（アルファ鎖1、アルファ鎖2、アルファ鎖3）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８０】
本開示のHLA-G2タンパク質の代表的な一例は、
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD（配列番号17020）のアミノ酸配列（アルファ鎖1、アルファ鎖2、アルファ鎖3）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８１】
本開示のHLA-G3タンパク質の代表的な一例は、
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEAKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD（配列番号17021）のアミノ酸配列（アルファ鎖1、アルファ鎖2、アルファ鎖3）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８２】
本開示のHLA-G4タンパク質の代表的な一例は、
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRAKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD（配列番号17022）のアミノ酸配列（アルファ鎖1、アルファ鎖2、アルファ鎖3）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８３】
本開示のHLA-G5タンパク質の代表的な一例は、
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL（配列番号17023）のアミノ酸配列（アルファ鎖1、アルファ鎖2、アルファ鎖3、イントロン4）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８４】
本開示のHLA-G5タンパク質の代表的な一例は、
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL（配列番号17024）のアミノ酸配列（アルファ鎖1、アルファ鎖2、アルファ鎖3、イントロン4）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８５】
本開示のHLA-G5タンパク質の代表的な一例は、
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASE（配列番号17025）のアミノ酸配列（アルファ鎖1、アルファ鎖2、アルファ鎖3、イントロン2）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８６】
本開示のCEACAM1タンパク質の代表的な一例は、
MGHLSAPLHRVRVPWQGLLLTASLLTFWNPPTTAQLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQ
QLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFY
TLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWI
NNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTP
TISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCH
ANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWF
FKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALP
QENGLSPGAIAGIVIGVVALVALIAVALACFLHFGKTGRASDQRDLTEHKPSVSNHTQDH
SNDPPNKMNEVTYSTLNFEAQQPTQPTSASPSLTATEIIYSEVKKQ（配列番号17026）のアミノ酸配列（細胞外、TM、細胞質）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８７】
本開示のウイルスヘマグルチニンタンパク質の代表的な一例は、
MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCL
LKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELRE
QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKS
YVNNKEKEVLVLWGVHHPPNIGNQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQE
GRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQG
AINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGM
VDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRM
ENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGC
FEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSL
VLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号17027）のアミノ酸配列（HAforInfluenzaAvirus（A/NewCaledonia/20/1999（(H1N1）；TM）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８８】
本開示のCD48タンパク質の代表的な一例は、
MCSRGWDSCLALELLLLPLSLLVTSIQGHLVHMTVVSGSNVTLNISESLP
ENYKQLTWFYTFDQKIVEWDSRKSKYFESKFKGRVRLDPQSGALYISKVQ
KEDNSTYIMRVLKKTGNEQEWKIKLQVLDPVPKPVIKIEKIEDMDDNCYL
KLSCVIPGESVNYTWYGDKRPFPKELQNSVLETTLMPHNYSRCYTCQVSN
SVSSKNGTVCLSPPCTLARSFGVEWIASWLVVTVPTILGLLLT（配列番号17028）のアミノ酸配列（シグナルペプチド、鎖、成熟した形態では除去されるプロペプチド）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４８９】
本開示のLLT1タンパク質の代表的な一例は、
MHDSNNVEKDITPSELPANPGCLHSKEHSIKATLIWRLFFLIMFLTIIVCGMVAALSAIR
ANCHQEPSVCLQAACPESWIGFQRKCFYFSDDTKNWTSSQRFCDSQDADLAQVESFQELN
FLLRYKGPSDHWIGLSREQGQPWKWINGTEWTRQFPILGAGECAYLNDKGASSARHYTER
KWICSKSDIHV（配列番号17029）のアミノ酸配列（細胞質、TM、細胞外）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９０】
本開示のULBP2タンパク質の代表的な一例は、
1 maaaaatkil lclpllllls gwsragradp hslcyditvi pkfrpgprwc avqgqvdekt
61 flhydcgnkt vtpvsplgkk lnvttawkaq npvlrevvdi lteqlrdiql enytpkeplt
121 lqarmsceqk aeghssgswq fsfdgqifll fdsekrmwtt vhpgarkmke kwendkvvam
181 sfhyfsmgdc igwledflmg mdstlepsag aplamssgtt qlratattli lcclliilpc
241 filpgi（配列番号17030）のアミノ酸配列（NKG2Dリガンドとしても知られる；Genbank登録番号AAQ89028）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９１】
本開示のULBP3タンパク質の代表的な一例は、
1 maaaaspail prlailpyll fdwsgtgrad ahslwynfti ihlprhgqqw cevqsqvdqk
61 nflsydcgsd kvlsmghlee qlyatdawgk qlemlrevgq rlrleladte ledftpsgpl
121 tlqvrmscec eadgyirgsw qfsfdgrkfl lfdsnnrkwt vvhagarrmk ekwekdsglt
181 tffkmvsmrd ckswlrdflm hrkkrlepta pptmapglaq pkaiattlsp wsfliilcfi
241 lpgi（配列番号17031）のアミノ酸配列（NKG2Dリガンドとしても知られる；Genbank登録番号NP_078794）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９２】
本開示のsMICAタンパク質の代表的な一例は、
1 mglgpvflll agifpfappg aaaephslry nltvlswdgs vqsgfltevh ldgqpflrcd
61 rqkcrakpqg qwaedvlgnk twdretrdlt gngkdlrmtl ahikdqkegl hslqeirvce
121 ihednstrss qhfyydgelf lsqnletkew tmpqssraqt lamnvrnflk edamktkthy
181 hamhadclqe lrrylksgvv lrrtvppmvn vtrseasegn itvtcrasgf ypwnitlswr      241 qdgvslshdt qqwgdvlpdg ngtyqtwvat ricqgeeqrf tcymehsgnh sthpvpsgkv
301 lvlqshwqtf hvsavaaaai fviiifyvrc ckkktsaaeg pelvslqvld qhpvgtsdhr
361 datqlgfqpl msdlgstgst ega（配列番号17032）のアミノ酸配列（シグナルペプチド、細胞外ドメインの部分、TMと細胞質ドメイン）（Genbank登録番号Q29983）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９３】
本開示のsMICAタンパク質の代表的な一例は、
1 mglgpvflll agifpfappg aaaephslry nltvlswdgs vqsgfltevh ldgqpflrcd
61 rqkcrakpqg qwaedvlgnk twdretrdlt gngkdlrmtl ahikdqkegl hslqeirvce
121 ihednstrss qhfyydgelf lsqnletkew tmpqssraqt lamnvrnflk edamktkthy
181 hamhadclqe lrrylksgvv lrrtvppmvn vtrseasegn itvtcrasgf ypwnitlswr
241 qdgvslshdt qqwgdvlpdg ngtyqtwvat ricqgeeqrf tcymehsgnh sthpvpsgkv
301 lvlqshwqtf hvsavaaaai fviiifyvrc ckkktsaaeg pelvslqvld qhpvgtsdhr
361 datqlgfqpl msdlgstgst ega（配列番号17033）のアミノ酸配列（アルファ-1、アルファ-2、アルファ-3）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９４】
本開示のsMICAタンパク質の代表的な一例は、
MGGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASM   ephslry nltvlswdgs vqsgfltevh ldgqpflrcd
61 rqkcrakpqg qwaedvlgnk twdretrdlt gngkdlrmtl ahikdqkegl hslqeirvce
121 ihednstrss qhfyydgelf lsqnletkew tmpqssraqt l                 thy
181 hamhadclqe lrrylksgvv lrrtvppmvn vtrseasegn itvtcrasgf ypwnitlswr
241 qdgvslshdt qqwgdvlpdg ngtyqtwvat ricqgeeqrf tcymehsgnh sthpvpsgkv
301 lvlqshw（配列番号17034）のアミノ酸配列（シグナルペプチド；アルファ-1、アルファ-2、アルファ-3）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９５】
本開示のsMICAタンパク質の代表的な一例は、
MGGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKLDLRMTLAHIKLDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYNGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVDVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHW（配列番号17035）のアミノ酸配列（シグナルペプチド）を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９６】
本開示のbGBE三量体（270Gと484S）タンパク質の代表的な一例は、
MSRSVALAVLALLSLSGLEAVMAPRTLILGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL*（配列番号16972）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９７】
本開示のbGBE三量体（270Gと484S）タンパク質の代表的な一例は、
atgtctcgcagcgtggccctggccgtgctggccctgctgtccctgtctggcctggaggccgtgatggccccccggaccctgatcctgggaggaggaggcagcggcggaggaggctccggaggcggcggctctatccagcgcacacctaagatccaggtgtattctcggcacccagccgagaacggcaagagcaacttcctgaattgctacgtgagcggctttcacccttccgacatcgaggtggatctgctgaagaatggcgagagaatcgagaaggtggagcactccgacctgagcttctccaaggattggtctttttatctgctgtactataccgagtttacccctacagagaaggacgagtacgcctgtcgcgtgaaccacgtgacactgtcccagccaaagatcgtgaagtgggaccgggatatgggcggcggcggctctggcggcggcggcagcggcggcggcggctccggaggaggcggctctggcagccactccctgaagtatttccacacctctgtgagccggccaggcagaggagagccacggttcatctctgtgggctacgtggacgatacacagttcgtgaggtttgacaatgatgccgccagcccaagaatggtgcctagggccccatggatggagcaggagggcagcgagtattgggacagggagacccggagcgccagagacacagcacagattttccgggtgaacctgagaaccctgaggggctactataatcagtccgaggccggctctcacacactccagtggatgcacggatgcgagctgggaccagatggccgcttcctgcggggctacgagcagtttgcctatgacggcaaggattacctgaccctgaacgaggacctgagatcctggaccgccgtggatacagccgcccagatcagcgagcagaagtccaatgacgcatctgaggcagagcaccagagggcatatctggaggatacctgcgtggagtggctgcacaagtacctggagaagggcaaggagacactgctgcacctggagccccctaagacccacgtgacacaccacccaatcagcgaccacgaggccaccctgaggtgttgggcactgggcttctatcccgccgagatcaccctgacatggcagcaggacggagagggacacacccaggatacagagctggtggagaccaggcccgccggcgatggcacatttcagaagtgggccgccgtggtggtgccttccggagaggagcagagatacacctgtcacgtgcagcacgagggactgccagagccagtgaccctgaggtggaagcctgccagccagcccacaatccctatcgtgggaatcatcgcaggcctggtgctgctgggctctgtggtgagcggagcagtggtggccgccgtgatctggcggaagaagagcagcggaggcaagggaggctcctactccaaggcagagtggagcgactccgcccagggctctgagagccactccctgtga（配列番号16973）の核酸配列を含むか、この核酸配列からなる。
【０４９８】
本開示のbGBE三量体（270Rと484S）タンパク質の代表的な一例は、
MSRSVALAVLALLSLSGLEAVMAPRTLILGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDRRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL*（配列番号16974）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０４９９】
本開示のbGBE三量体（270Rと484S）タンパク質の代表的な一例は、
atgtctcgcagcgtggccctggccgtgctggccctgctgtccctgtctggcctggaggccgtgatggccccccggaccctgatcctgggaggaggaggcagcggcggaggaggctccggaggcggcggctctatccagcgcacacctaagatccaggtgtattctcggcacccagccgagaacggcaagagcaacttcctgaattgctacgtgagcggctttcacccttccgacatcgaggtggatctgctgaagaatggcgagagaatcgagaaggtggagcactccgacctgagcttctccaaggattggtctttttatctgctgtactataccgagtttacccctacagagaaggacgagtacgcctgtcgcgtgaaccacgtgacactgtcccagccaaagatcgtgaagtgggaccgggatatgggcggcggcggctctggcggcggcggcagcggcggcggcggctccggaggaggcggctctggcagccactccctgaagtatttccacacctctgtgagccggccaggcagaggagagccacggttcatctctgtgggctacgtggacgatacacagttcgtgaggtttgacaatgatgccgccagcccaagaatggtgcctagggccccatggatggagcaggagggcagcgagtattgggacagggagacccggagcgccagagacacagcacagattttccgggtgaacctgagaaccctgaggggctactataatcagtccgaggccggctctcacacactccagtggatgcacggatgcgagctgggaccagatcgccgcttcctgcggggctacgagcagtttgcctatgacggcaaggattacctgaccctgaacgaggacctgagatcctggaccgccgtggatacagccgcccagatcagcgagcagaagtccaatgacgcatctgaggcagagcaccagagggcatatctggaggatacctgcgtggagtggctgcacaagtacctggagaagggcaaggagacactgctgcacctggagccccctaagacccacgtgacacaccacccaatcagcgaccacgaggccaccctgaggtgttgggcactgggcttctatcccgccgagatcaccctgacatggcagcaggacggagagggacacacccaggatacagagctggtggagaccaggcccgccggcgatggcacatttcagaagtgggccgccgtggtggtgccttccggagaggagcagagatacacctgtcacgtgcagcacgagggactgccagagccagtgaccctgaggtggaagcctgccagccagcccacaatccctatcgtgggaatcatcgcaggcctggtgctgctgggctctgtggtgagcggagcagtggtggccgccgtgatctggcggaagaagagcagcggaggcaagggaggctcctactccaaggcagagtggagcgactccgcccagggctctgagagccactccctgtga（配列番号16975）の核酸配列を含むか、この核酸配列からなる。
【０５００】
本開示のgBE二量体（RとS）タンパク質の代表的な一例は、
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEV
DLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDR
DMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDN
DAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWM
HGCELGPDRRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRA
YLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQ
QDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPAS
QPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL（配列番号16976）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０５０１】
本開示のgBE二量体（RとS）タンパク質の代表的な一例は、
ATGAGCAGATCTGTGGCCCTGGCTGTTCTGGCTCTGCTGTCTCTGTCTGGCCTGGAAGCCATCCAGCGGACCCCTAAGATCCAGGTGTACAGCAGACACCCCGCCGAGAACGGCAAGAGCAACTTCCTGAACTGCTACGTGTCCGGCTTTCACCCCAGCGACATTGAGGTGGACCTGCTGAAGAACGGCGAGCGGATCGAGAAGGTGGAACACAGCGATCTGAGCTTCAGCAAGGACTGGTCCTTCTACCTGCTGTACTACACCGAGTTCACCCCTACCGAGAAGGACGAGTACGCCTGCAGAGTGAACCACGTGACACTGAGCCAGCCTAAGATCGTGAAGTGGGACAGAGATATGGGCGGAGGCGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGGCGGTGGTGGTTCTGGATCTCACAGCCTGAAGTACTTTCACACCTCCGTGTCCAGACCTGGCAGAGGCGAGCCTAGATTCATCAGCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTCAGATTCGACAACGACGCCGCCTCTCCTCGGATGGTTCCTAGAGCACCCTGGATGGAACAAGAGGGCAGCGAGTACTGGGATCGCGAGACAAGAAGCGCCAGAGACACAGCCCAGATCTTCCGCGTGAACCTGAGAACCCTGCGGGGCTACTACAATCAGTCTGAGGCCGGCTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGATGTGAACTGGGCCCCGACAGACGGTTCCTGAGAGGCTATGAGCAGTTCGCCTACGACGGCAAGGACTACCTGACACTGAACGAGGACCTGAGAAGCTGGACCGCCGTGGATACAGCCGCTCAGATCAGCGAGCAGAAGTCTAACGACGCCAGCGAGGCCGAACACCAGAGAGCCTATCTGGAAGATACCTGCGTGGAATGGCTGCACAAGTACCTGGAAAAGGGCAAAGAGACACTGCTGCACCTGGAACCTCCAAAGACACATGTGACCCACCATCCTATCAGCGACCACGAGGCCACACTGAGATGTTGGGCCCTGGGCTTTTACCCTGCCGAGATCACACTGACATGGCAGCAGGATGGCGAGGGCCACACACAGGATACAGAGCTGGTGGAAACAAGACCTGCCGGCGACGGCACCTTCCAGAAATGGGCTGCTGTGGTTGTGCCCAGCGGCGAGGAACAGAGATACACCTGTCACGTGCAGCACGAGGGACTGCCTGAACCTGTGACTCTGAGATGGAAGCCTGCCAGCCAGCCAACAATCCCCATCGTGGGAATCATTGCCGGCCTGGTGCTGCTGGGATCTGTGGTTTCTGGTGCTGTGGTGGCCGCCGTGATTTGGAGAAAGAAGTCCTCTGGCGGCAAAGGCGGCTCCTACTCTAAGGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACAGCCTGTAGATAA（配列番号16977）の核酸配列を含むか、この核酸配列からなる。
【０５０２】
本開示のgBE二量体（GとS）タンパク質の代表的な一例は、
DLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDR
DMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDN
DAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWM
HGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRA
YLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQ
QDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPAS
QPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL（配列番号16978）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０５０３】
本開示のgBE二量体（GとS）タンパク質の代表的な一例は、
ATGAGCAGATCTGTGGCCCTGGCTGTTCTGGCTCTGCTGTCTCTGTCTGGCCTGGAAGCCATCCAGCGGACCCCTAAGATCCAGGTGTACAGCAGACACCCCGCCGAGAACGGCAAGAGCAACTTCCTGAACTGCTACGTGTCCGGCTTTCACCCCAGCGACATTGAGGTGGACCTGCTGAAGAACGGCGAGCGGATCGAGAAGGTGGAACACAGCGATCTGAGCTTCAGCAAGGACTGGTCCTTCTACCTGCTGTACTACACCGAGTTCACCCCTACCGAGAAGGACGAGTACGCCTGCAGAGTGAACCACGTGACACTGAGCCAGCCTAAGATCGTGAAGTGGGACAGAGATATGGGCGGAGGCGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGGCGGTGGTGGTTCTGGATCTCACAGCCTGAAGTACTTTCACACCTCCGTGTCCAGACCTGGCAGAGGCGAGCCTAGATTCATCAGCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTCAGATTCGACAACGACGCCGCCTCTCCTCGGATGGTTCCTAGAGCACCCTGGATGGAACAAGAGGGCAGCGAGTACTGGGATCGCGAGACAAGAAGCGCCAGAGACACAGCCCAGATCTTCCGCGTGAACCTGAGAACCCTGCGGGGCTACTACAATCAGTCTGAGGCCGGCTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGATGTGAACTGGGCCCCGACAGACAGTTCCTGAGAGGCTATGAGCAGTTCGCCTACGACGGCAAGGACTACCTGACACTGAACGAGGACCTGAGAAGCTGGACCGCCGTGGATACAGCCGCTCAGATCAGCGAGCAGAAGTCTAACGACGCCAGCGAGGCCGAACACCAGAGAGCCTATCTGGAAGATACCTGCGTGGAATGGCTGCACAAGTACCTGGAAAAGGGCAAAGAGACACTGCTGCACCTGGAACCTCCAAAGACACATGTGACCCACCATCCTATCAGCGACCACGAGGCCACACTGAGATGTTGGGCCCTGGGCTTTTACCCTGCCGAGATCACACTGACATGGCAGCAGGATGGCGAGGGCCACACACAGGATACAGAGCTGGTGGAAACAAGACCTGCCGGCGACGGCACCTTCCAGAAATGGGCTGCTGTGGTTGTGCCCAGCGGCGAGGAACAGAGATACACCTGTCACGTGCAGCACGAGGGACTGCCTGAACCTGTGACTCTGAGATGGAAGCCTGCCAGCCAGCCAACAATCCCCATCGTGGGAATCATTGCCGGCCTGGTGCTGCTGGGATCTGTGGTTTCTGGTGCTGTGGTGGCCGCCGTGATTTGGAGAAAGAAGTCCTCTGGCGGCAAAGGCGGCTCCTACTCTAAGGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACAGCCTGTAGATAA（配列番号16979）の核酸配列を含むか、この核酸配列からなる。
【０５０４】
本開示のWT HLA-E単量体（RとS）タンパク質の代表的な一例は、
MSRSVALAVLALLSLSGLEAGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRF
DNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQ
WMHGCELGPDRRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQ
RAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLT
WQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKP
ASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHS
L（配列番号16980）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０５０５】
本開示のWT HLA-E単量体（RとS）タンパク質の代表的な一例は、
ATGAGCAGATCTGTGGCCCTGGCTGTTCTGGCTCTGCTGTCTCTGTCTGGACTGGAAGCCGGCAGCCACAGCCTGAAGTACTTTCACACCAGCGTGTCCAGACCTGGCAGAGGCGAGCCTAGATTCATCAGCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTCAGATTCGACAACGACGCCGCCTCTCCTCGGATGGTTCCTAGAGCACCCTGGATGGAACAAGAGGGCAGCGAGTACTGGGACAGAGAGACAAGAAGCGCCAGAGACACAGCCCAGATCTTCAGAGTGAACCTGCGGACCCTGCGGGGCTACTACAATCAGTCTGAAGCCGGCTCTCACACCCTGCAGTGGATGCACGGATGTGAACTGGGCCCCGACAGAAGATTCCTGAGAGGCTACGAGCAGTTCGCCTACGACGGCAAGGACTACCTGACACTGAACGAGGACCTGAGAAGCTGGACCGCCGTGGATACAGCCGCTCAGATCAGCGAGCAGAAGTCTAACGACGCCTCTGAGGCCGAACACCAGAGAGCCTACCTGGAAGATACCTGCGTGGAATGGCTGCACAAGTACCTGGAAAAGGGCAAAGAGACACTGCTGCACCTGGAACCTCCAAAGACACACGTGACCCACCATCCTATCAGCGACCACGAGGCCACACTGAGATGTTGGGCCCTGGGCTTTTACCCCGCCGAGATCACACTGACATGGCAGCAGGATGGCGAGGGCCACACACAGGATACAGAGCTGGTGGAAACAAGACCTGCCGGCGACGGCACCTTCCAGAAATGGGCTGCTGTGGTGGTTCCCAGCGGCGAGGAACAGAGATACACCTGTCACGTGCAGCACGAGGGACTGCCTGAACCTGTGACACTGAGGTGGAAGCCTGCCAGCCAGCCTACAATCCCCATCGTGGGAATCATTGCCGGCCTGGTGCTGCTGGGATCTGTGGTTTCTGGTGCAGTGGTGGCCGCCGTGATCTGGCGGAAAAAAAGCTCAGGCGGCAAAGGCGGCTCCTACTCCAAAGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACTCTCTGTAGATAA（配列番号16981）の核酸配列を含むか、この核酸配列からなる。
【０５０６】
本開示のWT HLA-E単量体（GとS）タンパク質の代表的な一例は、
MSRSVALAVLALLSLSGLEAGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRF
DNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQ
WMHGCELGPDGRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQ
RAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLT
WQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKP
ASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHS
L（配列番号16982）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。
【０５０７】
本開示のWT HLA-E単量体（GとS）タンパク質の代表的な一例は、
ATGAGCAGATCTGTGGCCCTGGCTGTTCTGGCTCTGCTGTCTCTGTCTGGACTGGAAGCCGGCAGCCACAGCCTGAAGTACTTTCACACCAGCGTGTCCAGACCTGGCAGAGGCGAGCCTAGATTCATCAGCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTCAGATTCGACAACGACGCCGCCTCTCCTCGGATGGTTCCTAGAGCACCCTGGATGGAACAAGAGGGCAGCGAGTACTGGGACAGAGAGACAAGAAGCGCCAGAGACACAGCCCAGATCTTCAGAGTGAACCTGCGGACCCTGCGGGGCTACTACAATCAGTCTGAAGCCGGCTCTCACACCCTGCAGTGGATGCACGGATGTGAACTGGGCCCCGACGGAAGATTCCTGAGAGGCTACGAGCAGTTCGCCTACGACGGCAAGGACTACCTGACACTGAACGAGGACCTGAGAAGCTGGACCGCCGTGGATACAGCCGCTCAGATCAGCGAGCAGAAGTCTAACGACGCCTCTGAGGCCGAACACCAGAGAGCCTACCTGGAAGATACCTGCGTGGAATGGCTGCACAAGTACCTGGAAAAGGGCAAAGAGACACTGCTGCACCTGGAACCTCCAAAGACACACGTGACCCACCATCCTATCAGCGACCACGAGGCCACACTGAGATGTTGGGCCCTGGGCTTTTACCCCGCCGAGATCACACTGACATGGCAGCAGGATGGCGAGGGCCACACACAGGATACAGAGCTGGTGGAAACAAGACCTGCCGGCGACGGCACCTTCCAGAAATGGGCTGCTGTGGTGGTTCCCAGCGGCGAGGAACAGAGATACACCTGTCACGTGCAGCACGAGGGACTGCCTGAACCTGTGACACTGAGGTGGAAGCCTGCCAGCCAGCCTACAATCCCCATCGTGGGAATCATTGCCGGCCTGGTGCTGCTGGGATCTGTGGTTTCTGGTGCAGTGGTGGCCGCCGTGATCTGGCGGAAAAAAAGCTCAGGCGGCAAAGGCGGCTCCTACTCCAAAGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACTCTCTGTAGATAA（配列番号16983）の核酸配列を含むか、この核酸配列からなる。
【０５０８】
ベクターと宿主細胞
【０５０９】
本開示は、本分野でよく知られているように、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び組換え技術による少なくとも1つのVHH又はVCARの作製にも関する。Sambrook他、上記文献；Ausbel他、上記文献を参照されたい（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
【０５１０】
例えばPB-EF1aベクターを使用することができる。このベクターは、以下のヌクレオチド配列：
tgtacatagattaaccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttatcgaatacctgcagcccgggggatgcagagggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaagttgactgtgcctttcgatcgaaccatggacagttagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgagaattctaatacgactcactatagggtgtgctgtctcatcattttggcaaagattggccaccaagcttgtcctgcaggagggtcgacgcctctagacgggcggccgctccggatccacgggtaccgatcacatatgcctttaattaaacactagttctatagtgtcacctaaattccctttagtgagggttaatggccgtaggccgccagaattgggtccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttcggactctaggacctgcgcatgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgttttccccgtatccccccaggtgtctgcaggctcaaagagcagcgagaagcgttcagaggaaagcgatcccgtgccaccttccccgtgcccgggctgtccccgcacgctgccggctcggggatgcggggggagcgccggaccggagcggagccccgggcggctcgctgctgccccctagcgggggagggacgtaattacatccctgggggctttgggggggggctgtccctctcaccgcggtggagctccagcttttgttcgaattggggccccccctcgagggtatcgatgatatctataacaagaaaatatatatataataagttatcacgtaagtagaacatgaaataacaatataattatcgtatgagttaaatcttaaaagtcacgtaaaagataatcatgcgtcattttgactcacgcggtcgttatagttcaaaatcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcctcacgggagctccaagcggcgactgagatgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgctatttagaaagagagagcaatatttcaagaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctagggttaatctagctagccttaagggcgcctattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagtcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcataatattattgaagcatttatcagggttcgtctcgtcccggtctcctcccaatgcatgtcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataata（配列番号17502）を含んでいる。
【０５１１】
ポリヌクレオチドは、宿主の中で増殖させるため、選択マーカーを含むベクターに場合によっては接合することができる。一般に、プラスミドベクターが、沈殿物（リン酸カルシウム沈殿物など）の中、又は帯電した脂質との複合体の中に導入される。ベクターがウイルスである場合には、適切な包装用細胞系を用いてインビトロで包装した後、宿主細胞に形質導入することができる。
【０５１２】
DNAインサートは、適切なプロモータに機能可能に連結させねばならない。発現コンストラクトは更に、転写開始部位と転写終結部位を含み、転写された領域内に翻訳のためのリボソーム結合部位を含むことになろう。コンストラクトが発現する成熟転写産物のコード部分は、頭部の翻訳開始コドンと、翻訳されるmRNAの末端に適切に位置する終止コドン（例えばUAA、UGA、UAGのいずれか）を含むことが好ましかろう。哺乳動物細胞又は真核細胞での発現にはUAAとUAGが好ましい。
【０５１３】
発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含んでいることが好ましいであろうが、それはオプションである。そのようなマーカーの非限定的な例に含まれるのは、例えば真核細胞培養のための耐性遺伝子であるアンピシリン、ゼオシン（Sh bla遺伝子）、ピューロマイシン（pac遺伝子）、ハイグロマイシンB（hygB遺伝子）、G418／ゲネチシン（neo遺伝子）、ミコフェノール酸、又はグルタミンシンターゼ（GS、アメリカ合衆国特許第5,122,464号；第5,770,359号；第5,827,739号）、ブラスチシジン（bsd遺伝子）のほか、大腸菌やそれ以外の細菌、又は原核生物の中で培養するための耐性遺伝子であるアンピシリン、ゼオシン（Sh bla遺伝子）、ピューロマイシン（pac遺伝子）、ハイグロマイシンB（hygB遺伝子）、G418／ゲネチシン（neo遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミクシンB、又はテトラサイクリンである（上記の特許は全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。上記の宿主細胞のための適切な培地と条件が本分野で知られている。適切なベクターは当業者にはただちに明らかであろう。宿主細胞へのベクターコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストランを媒介としたトランスフェクション、カチオン性脂質を媒介としたトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、又は他の公知の方法によって実行することができる。このような方法は例えば、Sambrook、上記文献、第1章〜第4章；Ausbel、上記文献、第1章、第9章、第13章、第15章、第16章に記載されている。
【０５１４】
発現ベクターは、本開示の組成物と方法によって改変された細胞を単離するため少なくとも1つの選択細胞表面マーカーを含んでいることが好ましいであろうが、それはオプションである。本開示の選択細胞表面マーカーは、表面タンパク質、糖タンパク質、又は1つの細胞か細胞のサブセットを別の規定された細胞のサブセットから識別する一群のタンパク質を含んでいる。選択細胞表面マーカーは、本開示の組成物又は方法によって改変された細胞を、本開示の組成物又は方法によって改変されていない細胞から識別することが好ましい。そのような細胞表面マーカーの非限定的な例に含まれるのは「分化のクラスター」タンパク質又は「分類決定」タンパク質（「CD」と略記されることがしばしばある）であり、例えばCD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52の切断形態又は完全長形態、又はそれらの任意の組み合わせである。細胞表面マーカーは、自殺遺伝子マーカーRQR8（Philip B他、Blood. 2014年8月21日；第124巻(8)：1277〜1287ページ）を更に含んでいる。 
【０５１５】
発現ベクターは、本開示の組成物又は方法によって改変された細胞を単離するための少なくとも1つの選択薬剤耐性マーカーを含んでいることが好ましいであろうが、それはオプションである。本開示の選択薬剤耐性マーカーは、野生型又は変異体のNeo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０５１６】
本開示の少なくとも1つのVHH又はVCARは、改変された形態（融合タンパク質など）で発現させることができ、分泌シグナルだけでなく、追加異種機能領域も含むことができる。例えば追加アミノ酸（特に帯電したアミノ酸）の領域をVHH又はVCARのN末端に付加し、精製の間、又はその後の処理と保管の間の宿主細胞の中での安定性と持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を本開示のVHH又はVCARに付加して精製を容易にすることができる。そのような領域は、VHH又はVCAR、又はその少なくとも1つの断片を最終的に調製する前に除去することができる。そのような方法は多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、その例は、Sambrook、上記文献、第17.29章〜第17.42章と第18.1章〜第18.74章；Ausbel、上記文献、第16章、第17章、第18章である。
【０５１７】
当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸を発現させるのに利用できる多数の発現系を知っている。あるいは本開示の核酸は、本開示のVHH又はVCARをコードする内在性DNAを含む宿主細胞の中で（操作によって）オンにすることによって宿主細胞の中で発現させることができる。そのような方法は本分野で周知であり、例えばアメリカ合衆国特許第5,580,734号、第5,641,670号、第5,733,746号、第5,733,761号に記載されている（参照によって全体が本明細書に組み込まれている）。
【０５１８】
VHH又はVCAR、その特定の部分、又はそのバリアントの生成に役立つ細胞培養物の具体例は、本分野で知られているように、細菌細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、複数の単層細胞の形態であることがしばしばあろうが、哺乳動物細胞の懸濁液又はバイオリアクターも使用することができる。完全なグリコシル化タンパク質を発現することのできる多数の適切な宿主細胞系が本分野で開発されており、その中に含まれるのは、COS-1（例えばATCC CRL 1650）、COS-7（例えばATCC CRL-1651）、HEK293、BHK21（例えばATCC CRL-10）、CHO（例えばATCC CRL 1610）、及びBSC-1（例えばATCC CRL-26）という細胞系、Cos-7細胞、CHO細胞、hep G2細胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293細胞、HeLa細胞などであり、例えばAmerican Type Culture Collection、マナサス、ヴァージニア州（www.atcc.org）から容易に入手できる。好ましい宿主細胞に含まれるのは、リンパ球起源（骨髄腫細胞とリンパ腫細胞など）の細胞である。特に好ましい宿主細胞は、P3X63Ag8.653細胞（ATCC登録番号CRL-1580）とSP2/0-Ag14細胞（ATCC登録番号CRL-1851）である。特に好ましい一実施態様では、組換え細胞は、P3X63Ab8.653又はSP2/0-Ag14である。
【０５１９】
これら細胞の増殖ベクターには、以下の発現制御配列、すなわち複製起点；プロモータ（例えば後期又は初期のSV40プロモータ、CMVプロモータ（アメリカ合衆国特許第5,168,062号；第5,385,839号）、HSV tkプロモータ、pgk（ホスホグリセル酸キナーゼ）プロモータ、EF-1アルファプロモータ（アメリカ合衆国特許第5,266,491号）、少なくとも1つのヒトプロモータ）；エンハンサ；及び／又はプロセシング情報部位（リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えばSV40大型T AgポリA付加部位）、転写終止配列など）の1つまたは複数を含めることができるが、これらに限定されない。例えばAusbel他、上記文献；Sambrook他、上記文献を参照されたい。本発明の核酸又はタンパク質の生成に役立つ他の細胞は、知られている、及び／又は例えば細胞系とハイブリドーマのAmerican Type Culture Collection Catalogue（www.atcc.org）からか、他の既知又は市販の供給源から入手可能である。
【０５２０】
真核生物宿主細胞を用いるとき、ポリアデニル化配列又は転写終止配列は、典型的にはベクターの中に組み込まれる。終止配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写産物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の一例は、SV40からのVP1イントロンである（Sprague他、J. Virol. 第45巻： 773〜781ページ（1983年））。それに加え、本分野で知られているように、宿主細胞の中で複製を制御するための遺伝子配列をベクターに組み込むことができる。
VH、VHH、又はVCARの精製
【０５２１】
VHHタンパク質又はVCARは、組換え細胞培養物から周知の方法によって回収して精製することができる。方法の非限定的な例に含まれるのは、プロテインA精製、硫酸アンモニウム沈降又はエタノール沈降、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィ又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィである。高性能液体クロマトグラフィ（「HPLC」）も精製に使用することができる。例えばColligan、『Current Protocols in Immunology』または『Current Protocols in Protein Science』、John Wiley & Sons社、ニューヨーク、ニューヨーク州、（1997〜2001年）の第1章、第4章、第6章、第8章、第9章、第10章を参照されたい（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
【０５２２】
本開示のVH、VHH、及び／又はVCARは、原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば大腸菌、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳動物の細胞が含まれる）から精製された産物、化学合成手続きの産物、組換え技術によって生成された産物を含んでいる。組換え産生で用いる宿主に応じ、本開示のVCARはグリコシル化すること、又は非グリコシル化することができる。そのような方法は多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている（例えばSambrook、上記文献、セクション17.37〜17.42；Ausbel、上記文献、第10章、第12章、第13章、第16章、第18章、第20章、Coligan、『Protein Science』、第12章〜第14章；これらすべての全体が、参照によって本明細書に組み込まれている）。
アミノ酸コード
【０５２３】
本開示のVCARを構成するアミノ酸は略記されることがしばしばある。アミノ酸の指定は、本分野でよく理解されているように、アミノ酸をその一文字コード、三文字コード、名称、又は3つのヌクレオチドコドンによって指定することによって示すことができる（Alberts, B.他、『Molecular Biology of The Cell』、第3版、Garland Publishing, Inc.社、ニューヨーク、1994年を参照されたい）。本開示のVCARは、本明細書に具体的に記載されているように、自発的な、又は変異、及び／又は人手による操作からの1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含むことができる。本開示のVCARの中にあって機能にとって必須のアミノ酸は、本分野で知られている方法（例えば部位指定突然変異誘発、又はアラニン走査突然変異誘発）によって同定することができる（例えばAusubel、上記文献、第8章、第15章；CunninghamとWells、Science 第244巻：1081〜1085ページ（1989年））。後者の手続きによって単一のアラニン変異が分子内のすべての残基に導入される。得られる変異分子はその後、生物活性（例えば少なくとも1つの中和活性だが、それに限定されない）を試験される。VCARの結合にとって決定的に重要な部位も構造分析（例えば結晶化、核磁気共鳴、又は光親和性ラベリング）によって同定することができる（Smith他、J. Mol. Biol. 第224巻：899〜904ページ（1992年）とde Vos他、Science第255巻：306〜312ページ（1992年））。
【０５２４】
当業者であればわかるように、本発明は、本開示の少なくとも1つの生物活性なVCARを含んでいる。生物活性なVCARは、天然（非合成）の内在性VCAR又は関連した既知のVCARの少なくとも20％、30％、又は40％、好ましくは少なくとも50％、60％、又は70％、最も好ましくは少なくとも80％、90％、又は95％〜99％の特異的活性を有する。酵素活性と基質特異性を調べて定量的に測定する方法は、当業者に周知である。
【０５２５】
別の1つの側面では、本開示は、有機部分の共有結合によって改変された本明細書に記載のVHHタンパク質と断片に関する。そのような改変により、薬物動態特性が改善された（例えばインビボ血清半減期が増加した）VCAR断片を生成させることができる。有機部分として、直線状の、又は分岐した親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基が可能である。特別な実施態様では、親水性ポリマー基は、約800〜約120,000ダルトンの分子量を持つことができ、ポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール（PPG））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、又はポリビニルピロリドンが可能であり、脂肪酸又は脂肪酸エステル基は、約8〜約40個の炭素原子を含むことができる。
【０５２６】
本開示の改変されたVHHタンパク質と断片は、抗体に直接又は間接に共有結合する1つまたは複数の有機部分を含むことができる。本開示のVHHタンパク質又は断片に結合する各有機部分として、独立に、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基が可能である。本明細書では、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸とジカルボン酸を包含する。本明細書で用いられている「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンの中よりも水の中に多く溶ける有機ポリマーを意味する。例えばポリリシンは、オクタンの中よりも水の中に多く溶ける。したがってポリリシンの共有結合によって改変されたVHHタンパク質が本開示に包含される。本開示のVCARを改変するのに適した親水性ポリマーは直線状であること、又は分岐していることが可能であり、その中に含まれるのは、例えばポリアルカングリコール（例えばPEG、モノメトキシ-ポリエチレングリコール（mPEG）、PPGなど）、炭水化物（例えばデキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンである。本開示のVCARを改変する親水性ポリマーは、独立した分子として約800〜約150,000ダルトンの分子量を有することが好ましい。例えばPEG5000とPEG20,000を用いることができる（数字は、ダルトンで表わしたポリマーの平均分子量である）。親水性ポリマー基は、1つ〜約6つのアルキル基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸基又は脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、適切な方法を用いて調製することができる。例えばアミン基を含むポリマーを脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートにカップルさせ、（例えばN,N-カルボニルジイミダゾールを用いて活性化された）活性化されたカルボキシレートをポリマー上のヒドロキシル基にカップルさせることができる。
【０５２７】
本開示のVHHタンパク質を改変するのに適した脂肪酸と脂肪酸エステルは、飽和させること、又は1つまたは複数の不飽和単位を含むことができる。本開示のVCARを改変するのに適した脂肪酸に含まれるのは、例えばn-ドデカノアート（C12、ラウリン酸塩）、n-テトラデカノアート（C14、ミリスチン酸塩）、n-オクタデカノアート（C18、ステアリン酸塩）、n-エイコサノアート（C20、アラキドン酸塩）、n-ドコサノアート（C22、ベヘン酸塩）、n-トリアコンタノアート（C30）、n-テトラコンタノアート（C40）、シス-Δ9-オクタデカノアート（C18、オレイン酸塩）、全シス-Δ5,8,11,14-エイコサテトラエノアート（C20、アラキドン酸塩）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などである。適切な脂肪酸エステルに含まれるのは、直線状の、又は分岐した低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルである。低級アルキル基は、1〜約12個、好ましくは1〜約6個の炭素原子を含むことができる。
【０５２８】
改変されたVHHタンパク質と断片は、適切な方法を利用して（例えば1つまたは複数の改変剤との反応によって）調製することができる。「改変剤」は、本明細書では、活性化基を含む適切な有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を意味する。「活性化基」は、適切な条件下で第2の化学基と反応することにより、改変剤と第2の化学基の間に共有結合を形成する化学的部分又は官能基である。例えばアミン反応性活性化基に含まれるのは、求電子基であるトシラート、メシラート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（NHS）などである。チオールと反応することのできる活性化基に含まれるのは、例えばマレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、5-チオール-2-ニトロ安息香酸チオール（TNB-チオール）などである。アルデヒド官能基をアミン含有分子又はヒドラジド含有分子にカップルさせることと、アジド基を3価リン基と反応させてホスホラミデート連結又はホスホリミド連結を形成することができる。活性化基を分子の中に導入する適切な方法は本分野で知られている（例えばHermanson, G. T.、『Bioconjugate Techniques』、Academic Press社：サン・ディエゴ、カリフォルニア州（1996年）を参照されたい）。活性化基は、有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接結合させること、又はリンカー部分（例えば2価のC1-C12基であり、その中の1つまたは複数の炭素原子はヘテロ原子（酸素、窒素、又はイオウ）で置換することができる）を介して結合させることができる。適切なリンカー部分に含まれるのは、例えばテトラエチレングリコール、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2) 2-NH-、及び-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-である。リンカー部分を含む改変剤は、例えばモノ-Boc-アルキルジアミン（例えばモノ-Boc-エチレンジアミン、モノ-Boc-ジアミノヘキサン）を1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）の存在下で脂肪酸と反応させ、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートの間にアミド結合を形成することによって製造することができる。Boc保護基をトリフルオロ酢酸（TFA）で処理することによって産物から除去し、第一級アミンを露出させて別のカルボキシレートとカップスさせること、又はBoc保護基を無水マレイン酸と反応させ、得られた産物を環化して脂肪酸の活性化されたマレイミド誘導体を生成させることができる。（例えばThompson他、WO 92/16221を参照されたい；その教示全体が、参照によって本明細書に組み込まれている）。
【０５２９】
本開示の改変されたVHHタンパク質と断片は、VHHタンパク質又は断片を改変剤と反応させることによって生成させることができる。例えばアミン反応性改変剤（例えばPEGのNHSエステル）を用いることによって有機部分を非部位特異的なやり方でVHHタンパク質に結合させることができる。本開示のVHHタンパク質の特定の部位に結合する改変されたVHHタンパク質と断片は、適切な方法（例えば、逆タンパク質分解（Fisch他、Bioconjugate Chem.、第3巻：147〜153ページ（1992年）；Werlen他、Bioconjugate Chem.、第5巻：411〜417ページ（1994年）；Kumaran他、Protein Sci. 第6巻(10)：2233〜2241ページ（1997年）； Itoh他、Bioorg. Chem.、第24巻(1)：59〜68ページ（1996年）； Capellas他、Biotechnol. Bioeng.、第56巻(4)：456〜463ページ（1997年））と、Hermanson, G. T.、『Bioconjugate Techniques』、Academic Press社：サン・ディエゴ、カリフォルニア州（1996年）に記載されている方法）を利用して調製することができる。
治療活性成分を更に含むVHタンパク質組成物又はVHHタンパク質組成物
【０５３０】
本開示のVHHタンパク質又はVCAR化合物、組成物、又は組み合わせは、適切な任意の助剤（その非限定的な例は、希釈剤、結合剤、安定剤、バッファ、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなど）の少なくとも1つを更に含むことができる。医薬的に許容される助剤が好ましい。そのような減菌溶液と、その調製方法の非限定的な例は本分野で周知であり、Gennaro編、『Remington's Pharmaceutical Sciences』、第18版、Mack Publishing Co.社（イーストン、ペンシルヴェニア州）1990年などがあるが、それに限定されない。医薬的に許容される基剤は、本分野で周知のように、又は本明細書に記載されているように、VHHタンパク質又はVCAR、断片、又はバリアント組成物の投与様式、溶解性、及び／又は安定性に適したものを定型的に選択することができる。
【０５３１】
本発明の組成物で有用な医薬用の賦形剤と添加剤の非限定的な例に含まれるのは、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物（例えば糖であり、その中には単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖が含まれる；アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖などの誘導体化された糖；多糖又は糖ポリマー）であり、それが単独で、又は組み合わされて存在することができ、単独で、又は組み合わせで1〜99.99％の重量又は体積を占めている。代表的なタンパク質賦形剤に含まれるのは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミン（HSA）、組換えヒトアルブミン（rHA）など）、ゼラチン、カゼインなどである。代表的なアミノ酸／タンパク質構成成分は緩衝能力においても機能することができ、その中に含まれるのは、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルタムなどである。好ましい1つのアミノ酸はグリシンである。
【０５３２】
本発明で用いるのに適した炭水化物賦形剤に含まれるのは、例えば単糖（フルクトース、マルトース、ガラクトース、D-マンノース、ソルボースなど）；二糖（ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど）；多糖（ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど）；アルジトール（マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなど）である。本発明で用いるのに適した好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、及びラフィノースである。
【０５３３】
VHタンパク質、VHHタンパク質、又はVCAR組成物は、バッファ又はpH調整剤も含むことができる。典型的には、バッファは、有機酸又は有機塩基から調製される塩である。代表的なバッファに含まれるのは、有機酸塩（例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、フタル酸の塩）；Tris、トロメタミンヒドロクロリド、又はリン酸塩バッファである。本組成物で用いるのが好ましいバッファは、有機酸塩（クエン酸塩など）である。
【０５３４】
それに加えて、本開示のVHタンパク質、VHHタンパク質、又はVCAR組成物に含めることができるのはポリマー賦形剤／添加剤であり、例えばポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば 2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、香味剤、抗微生物剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば「TWEEN 20」、「TWEEN 80」などのポリソルベート）、脂質（例えばリン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えばコレステロール）、キレート剤（例えばEDTA）がある。
【０５３５】
本発明によるVHタンパク質、VHHタンパク質、VCAR、部分、又はバリアント組成物で用いるのに適したこれらの医薬用の賦形剤及び／又は添加剤と、追加の既知の賦形剤及び／又は添加剤は本分野で知られており、例えば『Remington: The Science & Practice of Pharmacy』、第19版、Williams & Williams社（1995年）、と、『Physician's Desk Reference』、第52版、Medical Economics社、モントヴェール、ニュージャージー州（1998年）に掲載されている（その開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。好ましい基剤材料又は賦形剤材料は、炭水化物（例えば糖とアルジオール）とバッファ（例えばクエン酸塩）又は重合剤である。代表的な1つの基剤分子はムコ多糖であるヒアルロン酸であり、これは動脈内送達に有用である可能性がある。
白血球除去産物からのT細胞単離
【０５３６】
白血球除去産物又は血液は、臨床施設で閉鎖系と標準的な方法（例えばCOBEスペクトル・アフェレーシス・システム）を利用して対象から回収することができる。産物は病院又は施設の標準的な白血球除去手続きに従って白血球除去回収バッグの中に回収することが好ましい。例えば本開示の方法の好ましい実施態様では、追加の抗凝固剤又は血液添加剤（ヘパリンなど）が、白血球除去の間に通常使用される量を超えては含まれていない。
【０５３７】
あるいは（Biosafe Sepax 2（閉鎖式／自動化）を使用して）白血球細胞（WBC）／末梢血単核細胞（PBMC）を、又は（CliniMACS（登録商標）Prodigy（閉鎖式／自動化）を使用して）T細胞を、全血から直接単離することができる。しかし何人かの対象（例えば癌と診断された対象、及び／又は癌の治療を受けている対象）では、WBC／PBMCの収量は、全血から単離されるときには白血球除去によって単離されるときよりも有意に少ない可能性がある。
【０５３８】
本開示の任意の対象に対して白血球除去手続き及び／又は直接的細胞単離手続きのどちらを利用してもよい。
【０５３９】
白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物は、臨床プロトコルでの利用を承認した標準的な病院の制度的採血手続きに従い、絶縁された容器の中に包装するとともに、制御された室温（+19℃〜+25℃）に維持すべきである。白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物は、冷却してはならない。
【０５４０】
白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物の細胞濃度は、輸送中に1 ml当たり0.2×109細胞を超えてはならない。白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物を強く混合することは避けるべきである。
【０５４１】
白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物を（例えば一晩）保管せねばならない場合には、（上と同じ）制御された室温に維持すべきである。保管中、白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物の濃度は、1 ml当たり0.2×109細胞を決して超えてはならない。
【０５４２】
好ましくは、白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物は、自家血漿の中に保管すべきである。いくつかの実施態様では、白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物の細胞濃度が1 ml当たり0.2×109細胞よりも大きい場合には、産物を自家血漿で希釈すべきである。
【０５４３】
好ましくは、白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物は、標識と分離の手続きを開始するとき、24時間よりも前のものであってはならない。白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物は、細胞に標識するため、閉鎖システム及び／又は自動化システムを利用して処理すること、及び／又は調製することができる。
【０５４４】
自動化システムは、追加のバフィーコート単離を、おそらくは細胞産物（例えば白血球除去産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物）のフィコレーション（ficolation）及び／又は洗浄によって実施することができる。
【０５４５】
閉鎖システム及び／又は自動システムを利用して（例えば白血球電気泳動産物、血液、WBC／PBMC組成物、及び／又はT細胞組成物から）T細胞を単離するための細胞を調製してその細胞に標識することができる。
【０５４６】
WBC／PBMCには直接ヌクレオフェクトすることができる（それがより簡単であり、追加ステップが節約される）が、本開示の方法は、ヌクレオフェクションの前に最初にT細胞を単離することを含むことができる。より容易な戦略であるPBMCへの直接的なヌクレオフェクションは、VCARシグナル伝達を通じて媒介されるVCAR+細胞の選択的な増殖を必要とするため、そのこと自体が、T細胞を機能的に消耗させることによって産物のインビボ効力を直接低下させる劣った増殖法であることを証明している。産物は、T細胞、NK細胞、NKT細胞、単球、又はそれらの任意の組み合わせを含むVCAR+細胞の異種組成物である可能があり、そのことで産物内の変動性が患者ごとに大きくなり、投与とCRS管理がより難しくなる。T細胞は腫瘍の抑制と殺傷における一次エフェクタであると考えられているため、自己由来の産物を作製するためのT細胞単離によって他のより異種な組成物よりも顕著な利点が得られる可能性がある。
【０５４７】
T細胞は、標識した細胞の富化、又は標識した細胞の枯渇により、1ステップ標識手続きでは直接的に、又は2ステップ標識手続きでは間接的に単離することができる。本開示のいくつかの富化戦略によれば、T細胞はCell Collection Bagに回収し、標識されていない細胞（非標的細胞）はNegative Fraction Bagに回収することができる。本開示の富化戦略とは異なり、標識されていない細胞（標的細胞）はCell Collection Bagに回収し、標識された細胞（非標的細胞）はNegative Fraction Bag又はNon-Target Cell Bagにそれぞれ回収する。選択試薬の非限定的な例に含まれるのは、抗体で被覆されたビーズである。抗体で被覆されたビーズは、改変ステップ及び／又は増殖ステップの前に除去すること、又は改変ステップ及び／又は増殖ステップの前に細胞上に保持することができる。細胞マーカーの以下の非限定的な例の1つまたは複数を用いてT細胞を単離することができる：CD3、CD4、CD8、CD25、抗ビオチン、CD1c、CD3／CD19、CD3／CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-ガンマ、TCRアルファ／ベータ、又はそれらの任意の組み合わせ。T細胞を単離する方法は、細胞マーカーの以下の非限定的な例の1つまたは複数に特異的に結合する、及び／又は検出可能に標識する1つまたは複数の試薬を含むことができる：CD3、CD4、CD8、CD25、抗ビオチン、CD1c、CD3／CD19、CD3／CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-ガンマ、TCRアルファ／ベータ、又はそれらの任意の組み合わせ。これら試薬は「適正製造基準」（「GMP」）グレードであってもなくてもよい。試薬の非限定的な例に含めることができるのは、Thermo DynaBeads 産物とMiltenyi CliniMACS産物である。本開示のT細胞を単離する方法は、標識ステップ及び／又は単離ステップの多数回の繰り返しを含むことができる。本開示のT細胞を単離する方法の任意の時点で望まない細胞及び／又は望まない細胞タイプを、その望まない細胞及び／又は望まない細胞タイプを陽性選択又は陰性選択することにより、本開示のT細胞産物組成物から枯渇させることができる。本開示のT細胞産物組成物は、CD4、CD8、及び／又は別のT細胞マーカーを発現することのできる追加の細胞タイプを含むことができる。
【０５４８】
T細胞のヌクレオフェクションに関する本開示の方法は、例えばWBC／PBMCの集団又は組成物の中のT細胞にヌクレオフェクトする方法により、T細胞単離のステップをなくすことができ、この方法は、ヌクレオフェクションの後に、単離ステップ、又はTCRシグナル伝達を通じた選択的増殖ステップを含んでいる。
【０５４９】
いくつかの細胞集団は、T細胞の富化及び／又はソーティングの前又は後の陽性選択又は陰性選択によって枯渇させることができる。細胞産物組成物から枯渇させることのできる細胞組成物の例に含めることができるのは、骨髄細胞、CD25+ 調節性T細胞（T Reg）、樹状細胞、マクロファージ、赤血球細胞、マスト細胞、ガンマ-デルタT細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラー（NK）様細胞（例えばサイトカイン誘導キラー（CIK）細胞）、誘導ナチュラルキラー（iNK）T細胞、NK T細胞、B細胞、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０５５０】
本開示のT細胞産物組成物は、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含むことができる。CD4+ T細胞とCD8+ T細胞は、単離又は選択の手続き中に別々の回収バッグの中に単離することができる。CD4+ T細胞とCD8+ T細胞は、特定の比率で、別々に更に処理すること、又は再構成（同じ組成にする組み合わせ）の後に処理することができる。
【０５５１】
CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を再構成することのできる具体的な比率は、T細胞産物組成物の増殖のために利用する増殖技術のタイプと効力、細胞培地、及び／又は増殖条件に依存する。可能なCD4+：CD8+比の非限定的な例に含まれるのは、50％：50％、60％：40％、40％：60％、75％：25％、及び25％：75％である。
【０５５２】
CD8+ T細胞は、腫瘍細胞を殺傷する強い能力を示すのに対し、CD4+ T細胞は、CD8+ T細胞の増殖能力と機能をサポートする必要のある多くのサイトカインを提供する。正常なドナーから単離されたT細胞はCD4+が優勢であるため、T細胞産物組成物は、CD4+：CD8+比をインビトロで人工的に調節し、そうでない場合にインビボで存在すると考えられるCD8+ T細胞に対するCD4+ T細胞の比率を改善する。最適な比率を自己由来T細胞産物組成物のエクスビボ増殖で利用することもできる。T細胞産物組成物のCD4+：CD8+比を人工的に調節しているため、本開示の産物組成物は顕著に異なっている可能性があり、T細胞のどの内在性集団よりも顕著に大きい利点を提供することに注意することが重要である。
【０５５３】
T細胞を単離する好ましい方法は、無垢な汎T細胞を生成させるための陰性選択戦略を含むことができる。これは、得られるT細胞組成物が、これまで操作されたことがなくて内在性の多様性／比率であるT細胞を含むことを意味する。
【０５５４】
陽性選択又は陰性選択に使用できる試薬の非限定的な例に含まれるのは、磁性細胞分離ビーズである。磁性細胞分離ビーズは、本開示のT細胞単離法の中の次のステップを実行する前に、CD4+ T細胞の選択された集団、CD8+ T細胞の選択された集団、又はCD4+ T細胞とCD8 + T細胞両方の混合集団から除去しても、又は枯渇させてもよいし、除去しなくても、又は枯渇させなくてもよい。
【０５５５】
T細胞組成物とT細胞産物組成物を調製し、低温保存すること、標準的なT細胞培地の中で保管すること、及び／又は遺伝子改変することができる。
【０５５６】
T細胞組成物、T細胞産物組成物、刺激されていないT細胞組成物、休止しているT細胞組成物、又はその任意の部分は、ヒト細胞を大きな回収率、生存率、表現型、及び／又は機能的能力で保管して回収するために最適化された標準的な低温保存法を利用して低温保存することができる。市場で利用できる低温保存媒体及び／又はプロトコルを利用することができる。本開示の低温保存法は、凍結に関連する毒性を低下させる無DMSO低温保存剤（例えばCryoSOfree（商標）無DMSO低温保存媒体）を含むことができる。
【０５５７】
T細胞組成物、T細胞産物組成物、刺激されていないT細胞組成物、休止しているT細胞組成物、又はそれらの任意の部分は、培養培地の中に保管することができる。本開示のT細胞培養培地は、細胞の保管、細胞の遺伝子改変、細胞の表現型、及び／又は細胞の増殖に関して最適化することができる。本開示のT細胞培養培地は、1つまたは複数の抗生物質を含むことができる。細胞培地の中に抗生物質を含めると、ヌクレオフェクションを通じた遺伝子改変の後にトランスフェクション効率及び／又は細胞収率が低下する可能性があるため、特定の抗生物質（又はそれらの組み合わせ）とそれぞれの濃度を変化させ、ヌクレオフェクションを通じた遺伝子改変の後に最適なトランスフェクション効率及び／又は細胞収率になるようにすることができる、。
【０５５８】
本開示のT細胞培地は血清を含むことができ、更に、最適な細胞な細胞が得られるように血清の組成と濃度を変えることができる。ヒトAB血清は、T細胞の培養に関してFBS／FCSよりも好ましい。なぜなら本開示のT細胞培養培地での使用を考えるとしても、FBS／FCSは異物タンパク質を導入する可能性があるからである。血清は、培養中のT細胞組成物を投与する予定の対象の血液から単離できるため、本開示のT細胞培地は自己由来血清を含むことができる。無血清培地又は血清代替物も本開示のT細胞培地で使用することができる。本開示のT細胞培地と方法のいくつかの実施態様では、無血清培地又は血清代替物は、培地に異種血清を補充することと比べて利点を提供することができ、その利点の非限定的な例に含まれるのは、増殖技術を適用したとき、より大きな生存率を持つ、より大きな効率でヌクレオフェクトする、ヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す、より望ましい細胞表現型を示す、及び／又はより大きい／より速い増殖を示すより健康な細胞である。
【０５５９】
T細胞培地は市販の細胞増殖培地を含むことができる。代表的な市販の細胞増殖培地の非限定的な例に含まれるのは、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０５６０】
T細胞組成物、T細胞産物組成物、非刺激T細胞組成物、休止しているT細胞組成物、又はそれらの任意の部分を調製して遺伝子を改変することができる。T細胞組成物、T細胞産物組成物、非刺激T細胞組成物、休止しているT細胞組成物、又はそれらの任意の部分を遺伝子改変のために調製する操作は、細胞洗浄、及び／又は望むヌクレオフェクションバッファの中への再懸濁を含むことができる。ヌクレオフェクションによる遺伝子改変のため、低温保存されたT細胞組成物を解凍して調製することができる。低温保存された細胞の解凍と調製を最適化し、増殖技術を適用したとき、より大きな生存率を持つ、より大きな効率でヌクレオフェクトする、ヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す、より望ましい細胞表現型を示す、及び／又はより大きい／より速い増殖を示す細胞が生成するようにできる。解凍及び／又は調製プロセスで例えばGrifols Albutein（25％ヒトアルブミン）を用いることができる。
自己由来T細胞産物組成物の遺伝子改変
【０５６１】
T細胞組成物、T細胞産物組成物、非刺激T細胞組成物、休止しているT細胞組成物、又はそれらの任意の部分は、例えば電気穿孔などのヌクレオフェクション戦略を利用して遺伝子を改変することができる。ヌクレオフェクトされる細胞の総数、ヌクレオフェクション反応の全体積、サンプルを調製する正確なタイミングを最適化し、増殖技術を適用したとき、より大きな生存率を持つ、より大きな効率でヌクレオフェクトする、ヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す、より望ましい細胞表現型を示す、及び／又はより大きい／より速い増殖を示す細胞が生成するようにできる。
【０５６２】
ヌクレオフェクション及び／又は電気穿孔は、例えばLonza Amaxa、MaxCyte PulseAgile、Harvard Apparatus BTX、及び／又はInvitrogen Neonを利用して実現することができる。非金属電極系（プラスチックポリマー電極が含まれるが、それに限定されない）がヌクレオフェクションには好ましい可能性がある。
【０５６３】
T細胞組成物、T細胞産物組成物、非刺激T細胞組成物、休止しているT細胞組成物、又はそれらの任意の部分は、ヌクレオフェクションによる遺伝子改変の前にヌクレオフェクションバッファの中に再懸濁させることができる。本開示のヌクレオフェクションバッファは、市販のヌクレオフェクションバッファを含んでいる。本開示のヌクレオフェクションバッファを最適化し、増殖技術を適用したとき、より大きな生存率を持つ、より大きな効率でヌクレオフェクトする、ヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す、より望ましい細胞表現型を示す、及び／又はより大きい／より速い増殖を示す細胞が生成するようにできる。本開示のヌクレオフェクションバッファの非限定的な例に含まれるのは、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトT細胞ヌクレオフェクションバッファ、及びそれらの任意の組み合わせである。本開示のヌクレオフェクションバッファは、増殖技術を適用したとき、より大きな生存率を持つ、より大きな効率でヌクレオフェクトする、ヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す、より望ましい細胞表現型を示す、及び／又はより大きい／より速い増殖を示す細胞が生成するよう、1つまたは複数の補助因子を含むことができる。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的なサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンの非限定的な例に含まれるのは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ／IL-1F1、IL-1ベータ／IL-1F2、IL-12 p70、IL-12／IL-35 p35、IL-13、IL-17／IL-17A、IL-17A／Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18／IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE／TNFSF11／RANKL、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、塩、ミネラル、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせである。代表的な塩、ミネラル、代謝産物の非限定的な例に含まれるのは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS／FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、Tris／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン5、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地などの培地、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の���限定的な例に含まれるのは、細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路の阻害剤、及びそれらの組み合わせである。阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、1つまたは複数の核酸を修飾して、又は安定化させて細胞送達を増強する試薬、核送達又は核輸送を増強する試薬、核への核酸の容易な輸送を増強する試薬、染色体外核酸の分解を増強する試薬、及び／又はDNAを媒介とした毒性を低下させる試薬である。1つまたは複数の核酸を修飾する、又は安定化させる代表的な試薬の非限定的な例に含まれるのは、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含む又は含まない純正中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素、及びそれらの任意の組み合わせである。
【０５６４】
転移試薬を、トランスポゾンとトランスポザーゼを含め、（場合によっては、ヌクレオフェクション反応用のバイアル又はキュベットに収容された）ヌクレオフェクションバッファに細胞を添加する前、添加するのと同時に、又は添加した後に、本開示のヌクレオフェクション反応物に添加することができる。本開示のトランスポゾンは、プラスミドDNA、直線状プラスミドDNA、PCR産物、DOGGYBONE（商標）DNA、mRNA鋳型、一本鎖又は二本鎖のDNA、タンパク質-核酸の組み合わせ、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のトランスポゾンは、1つまたは複数のTTAA部位、1つまたは複数の逆方向末端反復（ITR）、1つまたは複数の長い末端反復（LTR）、1つまたは複数のインシュレータ、1つまたは複数のプロモータ、1つまたは複数の完全長遺伝子又は切断型遺伝子、1つまたは複数のポリAシグナル、1つまたは複数の自己切断2Aペプチド切断部位、1つまたは複数の内部リボソーム侵入部位（IRES）、1つまたは複数のエンハンサ、1つまたは複数の調節因子、1つまたは複数の複製起点、及びそれらの任意の組み合わせをコードする1つまたは複数の配列を含むことができる。
【０５６５】
本開示のトランスポゾンは、1つまたは複数の完全長遺伝子又は切断型遺伝子をコードする1つまたは複数の配列を含むことができる。本開示のトランスポゾンによって導入される完全長遺伝子及び／又は切断型遺伝子は、シグナルペプチド、VCAR、一本鎖可変断片（scFv）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、キメラ抗原受容体（CAR）、VCAR、キメラT細胞受容体（CAR-T又はVCAR-T）、受容体、リガンド、サイトカイン、薬剤耐性遺伝子、腫瘍抗原、アロ抗原又は自己抗原、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、蛍光タンパク質、突然変異タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせの1つまたは複数をコードすることができる。
【０５６６】
本開示のトランスポゾンは、水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培地、本開示の補助因子、又はそれらの任意の組み合わせの中で調製することができる。
【０５６７】
本開示のトランスポゾンは、臨床での安全性及び／又は製造しやすさが最適化されるように設計することができる。非限定的な一例として、本開示のトランスポゾンは、不要な配列又は領域を除去すること、及び／又は非抗生物質選択マーカーを含めることにより、臨床での安全性及び／又は製造しやすさが最適化されるように設計することができる。本開示のトランスポゾンは、GMPグレードであってもなくてもよい。
【０５６８】
本開示のトランスポザーゼ酵素は、プラスミドDNA、mRNA、タンパク質、タンパク質-核酸の組み合わせ、又はそれらの任意の組み合わせの1つまたは複数の配列によってコードすることができる。
【０５６９】
本開示のトランスポザーゼ酵素は、水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培地、本開示の補助因子、又はそれらの任意の組み合わせの中で調製することができる。本開示のトランスポザーゼ酵素、又はそれらをコード又は送達する配列／コンストラクトは、GMPグレードであってもなくてもよい。
【０５７０】
本開示のトランスポゾンとトランスポザーゼ酵素は、任意の手段によって細胞に送達することができる。
【０５７１】
本開示の組成物と方法は、プラスミドDNA（pDNA）による細胞への本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼ酵素の送達を含んでいるが、送達のためにプラスミドを使用することで、トランスポゾン及び／又はトランスポザーゼを細胞の染色体DNAに組み込むことが可能になり、トランスポザーゼの連続した発現につながる可能性がある。したがって本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼ酵素は、染色体に組み込まれるあらゆる可能性を除去するため、mRNA又はタンパク質として細胞に送達することができる。
【０５７２】
本開示のトランスポゾンとトランスポザーゼは、そのトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼをヌクレオフェクション反応物の中に導入する前に、単独で、又は別の1つのトランスポゾン又はトランスポザーゼと組み合わせてあらかじめインキュベートすることができる。それぞれのトランスポゾンとトランスポザーゼの絶対量のほか、相対量（トランスポザーゼに対するトランスポゾンの比率）を最適化することができる。
【０５７３】
ヌクレオフェクション反応物を場合によってはバイアル又はキュベットの中で調製した後、その反応物をヌクレオフェクタ装置にロードし、製造者のプロトコルに従って電気パルスを送達するために活性化することができる。本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼ（又は本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポザーゼをコードする配列）を細胞に送達するのに用いる電気パルスの条件を最適化し、増殖技術を適用したとき、増強された生存率、より大きな効率でのヌクレオフェクション、ヌクレオフェクション後のより大きな生存率、望ましい細胞表現型、及び／又はより大きい／より速い増殖を示す細胞が生成するようにできる。Amaxaヌクレオフェクタ技術を利用するときには、Amaxa 2Bヌクレオフェクタ又はAmaxa 4Dヌクレオフェクタのためのさまざまなヌクレオフェクションプログラムのそれぞれが考慮される。
【０５７４】
本開示のヌクレオフェクション反応の後、細胞を細胞培地にそっと添加することができる。例えばT細胞がヌクレオフェクション反応をするとき、T細胞をT細胞培地に添加することができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、任意の1つまたは複数の市販の培地を含むことができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地を（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含めて）最適化し、増殖技術を適用したとき、より大きな生存率を持つ、より大きなヌクレオフェクション効率を持つ、ヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す、より望ましい細胞表現型を示す、及び／又はより大きい／より速い増殖を示す細胞が生成するようにできる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地、及びそれらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、増殖技術を適用したとき、生存率、ヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後の生存率、細胞表現型、及び／又はより大きい／速い増殖を増強するため、本開示の1つまたは複数の補助因子を含むことができる。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的なサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンの非限定的な例に含まれるのは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ／IL-1F1、IL-1ベータ／IL-1F2、IL-12 p70、IL-12／IL-35 p35、IL-13、IL-17／IL-17A、IL-17A／Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18／IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE／TNFSF11／RANKL、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、塩、ミネラル、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせである。代表的な塩、ミネラル、代謝産物の非限定的な例に含まれるのは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS／FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、Tris／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン5、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地などの培地、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、及びそれらの組み合わせである。阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、及びそれらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、1つまたは複数の核酸を修飾して、又は安定化させて細胞送達を増強する試薬、核送達又は核輸送を増強する試薬、核への核酸の容易な輸送を増強する試薬、染色体外核酸の分解を増強する試薬、及び／又はDNAを媒介とした毒性を低下させる試薬である。1つまたは複数の核酸を修飾する、又は安定化させる代表的な試薬の非限定的な例に含まれるのは、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含む又は含まない純正中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素、及びそれらの任意の組み合わせである。
【０５７５】
本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、室温で、又は例えば32℃〜37℃（端点を含む）にあらかじめ温めて使用することができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、細胞の生存率及び／又は本開示のトランスポゾン又はその一部の発現を維持又は増強する任意の温度にあらかじめ温めることができる。
【０５７６】
本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、組織培養用のフラスコ又は皿、G-Rexフラスコ、Bioreactor又は細胞培養バッグ、又は他の標準的な任意の容器の中に収容することができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、静かな状態に維持すること、又は撹乱すること（例えば揺すること、かき混ぜること、振盪すること）ができる。
【０５７７】
ヌクレオフェクション後細胞培地は、遺伝子改変された細胞を含むことができる。ヌクレオフェクション後細胞培地は、遺伝子改変されたT細胞を含むことができる。本開示の遺伝子改変されたT細胞は、規定された期間そのままにすること、又は増殖のため例えばT Cell Expander技術の適用によって刺激することができる。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子改変された細胞は、規定された期間そのままにすること、又は増殖のため例えばT Cell Expander技術の適用によってただちに刺激することができる。本開示の遺伝子改変された細胞を、馴化するのに十分な時間、転移が起きるのに十分な時間、及び／又は陽性又は陰性の選択に十分な時間にわたって放置し、その結果として、増殖技術を適用したとき、増強された生存率、より大きなヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより大きな生存率、望ましい細胞表現型、及び／又はより大きい／より速い増殖となるようにすることができる。本開示の遺伝子改変された細胞は、例えば1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、又はそれよりも長い時間にわたって放置することができる。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子改変された細胞は、例えば一晩放置することができる。いくつかの側面では、一晩は約12時間である。本開示の遺伝子改変された細胞は、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、又はそれよりも多い日数にわたって放置することができる。
【０５７８】
本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション反応の後、かつエクスパンダー（expander）技術を適用する前に選択することができる。遺伝子改変された細胞の最適な選択のため、細胞をヌクレオフェクション後細胞培地の中に少なくとも2〜14日間放置し、改変された細胞の同定（例えば改変されていない細胞から改変された細胞を識別すること）を容易にする。
【０５７９】
本開示のトランスポゾンのヌクレオフェクションが成功すると、早ければヌクレオフェクションの24時間後に本開示のCAR／VCARと選択マーカーを改変されたT細胞の中で検出できる可能性がある。トランスポゾンの染色体外発現が理由で、選択マーカーだけの発現では改変されていない細胞（トランスポゾンがうまく組み込まれなかった細胞）から改変された細胞（トランスポゾンがうまく組み込まれた細胞）を識別することはできない。トランスポゾンが染色体外発現することで選択マーカーによる改変された細胞の検出が不明瞭になるときには、ヌクレオフェクトされた細胞（改変された細胞と改変されていない細胞の両方）を、細胞が発現を終了すること、又はあらゆる染色体外トランスポゾンの発現を失うことが可能になる期間にわたって放置することができる。この延長された放置期間の後は、改変された細胞だけが選択マーカーの発現に関して陽性のままであるはずである。この延長された放置期間の長さは、各ヌクレオフェクション反応と選択プロセスに関して最適化することができる。トランスポゾンが染色体外発現することで選択マーカーによる改変された細胞の検出が不明瞭になるときには、選択は、この延長された放置期間なしで実施できるが、追加選択ステップをあとの時点（例えば増殖段階の間又は後）に含めることができる。
【０５８０】
本開示の遺伝子改変された細胞の選択は、任意の手段によって実施することができる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、本開示の遺伝子改変された細胞の選択は、特定の選択マーカーを発現している細胞を単離することによって実現できる。本開示の選択マーカーは、トランスポゾン内の1つまたは複数の配列によってコードすることができる。本開示の選択マーカーは、成功した転移の結果として、（すなわちトランスポゾン内の1つまたは複数の配列によってコードされない）改変された細胞が発現することができる。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション後細胞培地の有害な化合物に対する耐性を与える選択マーカーを含んでいる。有害な化合物は、例えば改変された細胞に選択マーカーによって与えられる耐性が存在しない場合に細胞死に至る可能性のある抗生物質又は薬を含むことができる。代表的な選択マーカーの非限定的な例に含まれるのは、以下の遺伝子：neo、DHFR、TYMS、ALDH、MDR1、MGMT、FANCF、RAD51C、GCS、NKX2.2の1つまたは複数の野生型（WT）形態又は変異形態である。代表的な選択マーカーの非限定的な例に含まれるのは、表面で発現する選択マーカー、又は表面で発現するタグであり、そのそれぞれを、Abで被覆した磁性ビーズ技術又はカラム選択によって標的とすることができる。タンパク質の精製で使用されるような切断可能なタグを本開示の選択マーカーに付加し、効率的なカラム選択、洗浄、及び溶離を実施することができる。いくつかの実施態様では、本開示の選択マーカーは、改変された細胞（改変されたT細胞が含まれる）によって内在的に発現されることはないため、改変された細胞の（例えばセルソーティング技術による）物理的単離において有用である可能性がある。改変された細胞が内在的に発現することのない本開示の代表的な選択マーカーの非限定的な例に含まれるのは、CD271、CD19、CD52、CD34、RQR8、CD22、CD20、CD33の完全長形態、変異形態、又は切断形態、及びそれらの任意の組み合わせである。
【０５８１】
本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション反応の後に選択的に増殖させることができる。いくつかの実施態様では、VCARを含む改変された細胞は、VCAR刺激によって選択的に増殖させることができる。VCARを含む改変された細胞は、標的で覆われた試薬（例えば標的を発現している腫瘍系又は正常な細胞系、又は標的に覆われているエクスパンダービーズ）と接触させることによって刺激することができる。その代わりに、VCARを含む改変された細胞は、照射された腫瘍細胞、照射された同種他家由来の正常な細胞、照射された自己由来のPBMCと接触させることによって刺激できる。例えば細胞産物組成物を対象に直接投与できるとき、本開示の細胞産物組成物が刺激に用いる標的発現細胞でできるだけ汚染されないようにするため、刺激は、VCAR標的タンパク質で被覆されたエクスパンダービーズを用いて実施することができる。VCARを含む改変されたT細胞をVCARで刺激することによる選択的増殖を最適化し、改変されたT細胞が機能的に消耗するのを回避することができる。
【０５８２】
本開示の選択された遺伝子改変細胞は、低温保存すること、規定された期間放置すること、又はCell Expander技術の適用によって増殖を刺激することができる。本開示の選択された遺伝子改変細胞は、低温保存すること、規定された期間放置すること、又はCell Expander技術の適用によって増殖をただちに刺激することができる。選択された遺伝子改変細胞がT細胞であるときには、T Cell Expander技術を適用することによってそのT細胞を刺激して増殖させることができる。本開示の選択された遺伝子改変細胞は、例えば1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、又はそれよりも長い時間にわたって放置することができる。いくつかの実施態様では、本開示の選択された遺伝子改変細胞は、例えば一晩放置することができる。いくつかの側面では、一晩は約12時間である。本開示の選択された遺伝子改変細胞は、例えば1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、又はそれよりも多い日数にわたって放置することができる。本開示の選択された遺伝子改変細胞は、細胞内に任意の期間放置し、増強された生存率、より大きなヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより大きな生存率、望ましい細胞表現型、及び／又は増殖技術を適用したときのより大きい／より速い増殖となる細胞にすることができる。
【０５８３】
選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）は、任意の標準的な低温保存法を利用して低温保存することができる。この方法は、ヒト細胞を大きな回収率、生存率、表現型、及び／又は機能的能力で保管及び／又は回収するために最適化することができる。本開示の低温保存法は、市販の低温保存媒体及び／又はプロトコルを含むことができる。
【０５８４】
選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）の転移効率は任意の手段によって評価することができる。例えばエクスパンダー技術を適用する前に、選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）によるトランスポゾンの発現を蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって測定することができる。選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）の転移効率の測定は、トランスポゾン（例えばVCAR）を発現している選択された細胞の割合を求めることを含むことができる。その代わりに、又はそれに加えて、T細胞の純度、トランスポゾン発現（例えばCAR発現）の平均蛍光強度（MFI）、（トランスポゾンの中に送達される）VCARが、VCARリガンドを発現している標的細胞の脱顆粒化及び／又は殺傷を媒介する能力、及び／又は選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）の表現型を任意の手段によって評価することができる。
【０５８５】
本開示の細胞産物組成物は、所定の放出基準に合致するとき、対象に投与するために放出することができる。代表的な放出基準の非限定的な例に含まれるのは、細胞表面にVCARを検出可能なレベルで発現している改変された、選択された、及び／又は増殖された特定の割合のT細胞である。
自己由来のT細胞産物組成物の遺伝子改変
【０５８６】
本開示の遺伝子改変された細胞（選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）は、エクスパンダー技術を利用して増殖させることができる。本開示のエクスパンダー技術は、市販のエクスパンダー技術を含むことができる。本開示の代表的なエクスパンダー技術は、本開示の遺伝子改変された細胞を、TCRを通じて刺激することを含んでいる。本開示の遺伝子改変された細胞を刺激するあらゆる手段が考えられるが、本開示の遺伝子改変されたT細胞を、TCRを通じて刺激することが好ましい方法であり、優れたレベルの殺傷能力を持つ産物が生成する。
【０５８７】
本開示の遺伝子改変された細胞を、TCRを通じて刺激するため、Thermo Expander DynaBeadsを、ビーズとT細胞の比を3：1にして使用することができる。エクスパンダービーズが生物分解性でない場合には、ビーズをエクスパンダー組成物から除去することができる。例えばビーズは約5日後にエクスパンダー組成物から除去することができる。本開示の遺伝子改変された細胞を、TCRを通じて刺激するため、StemCell Technologies社のImmunoCult Human CD3/CD28又はCD3/CD28/CD2 T細胞活性化試薬を用いることができる。可溶性四量体抗体複合体はある期間の後に分解するため、プロセスから除去する必要がないと考えられるという理由で、この技術がより好ましい可能性がある。
【０５８８】
人工抗原提示細胞（APC）を操作して標的抗原を同時に発現させ、本開示の細胞又はT細胞を、本開示のTCR及び／又はVCARを通じて刺激することができる。人工APCは、腫瘍細胞系（例えば不死化された骨髄性白血病系K562が含まれる）を含むこと、又は腫瘍細胞系に由来することができ、操作して多数の共刺激分子又は共刺激技術（CD28、4-1BBL、CD64、mbIL-21、mbIL-15、CAR標的分子など）を同時に発現させることができる。本開示の人工APCを共刺激分子と組み合わせるとき、条件を最適化して望ましくない表現型と機能的能力、すなわち最終的に分化したエフェクタT細胞の発達又は出現を阻止することができる。
【０５８９】
照射されたPBMC（自己又はアロ）は、いくつかの標的抗原（CD19など）を発現することができ、本開示の細胞又はT細胞を、本開示のTCR及び／又はVCARを通じて刺激するのに用いることができる。その代わりに、又はそれに加えて、照射された腫瘍細胞は、いくつかの標的抗原を発現することができ、本開示の細胞又はT細胞を、本開示のTCR及び／又はVCARを通じて刺激するのに用いることができる。
【０５９０】
プレートに結合した、及び／又は可溶性の抗CD3、抗CD2、及び／又は抗CD28の刺激を用い、本開示の細胞又はT細胞を、本開示のTCR及び／又はVCARを通じて刺激することができる。
【０５９１】
抗原で被覆したビーズは標的タンパク質を提示することができるため、本開示の細胞又はT細胞を、本開示のTCR及び／又はVCARを通じて刺激するのに用いることができる。その代わりに、又はそれに加えて、VCAR標的タンパク質で被覆したエクスパンダービーズを用い、本開示の細胞又はT細胞を、本開示のTCR及び／又はVCARを通じて刺激することができる。
【０５９２】
増殖法を適用し、本開示の細胞又はT細胞を、TCR及び／又はVCARを通じてと、遺伝子改変されたT細胞の表面に発現したCD2、CD3、CD28、4-1BB、及び／又は他のマーカーを通じて刺激する。
【０５９３】
増殖技術は、ヌクレオフェクションの直後からヌクレオフェクションの約24時間後まで本開示の細胞に適用することができる。さまざまな細胞培地を増殖手続きの間に使用できるが、本開示の望ましいT細胞増殖培地は、例えばより大きな生存率、細胞表現型、全増殖、又はインビボ持続性、移植、及び／又はCARを媒介とした殺傷に関するより大きな能力を持った細胞を生成させることができる。本開示の細胞培地を最適化し、本開示の遺伝子改変された細胞の増殖、表現型、機能を改善／増強することができる。増殖されたT細胞の好ましい表現型に含めることができるのは、幹記憶T細胞、セントラル記憶T細胞、及びエフェクタ記憶T細胞である。Expander Dynabeadsは、臨床における優れた性能につながる可能性があるセントラル記憶T細胞を主に生成させることができる。
【０５９４】
本開示の代表的なT細胞増殖培地は、部分的に、又は全体が、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のT細胞増殖培地は、1つまたは複数の補助因子を更に含むことができる。本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子は、生存率、細胞表現型、全増殖を増強するか、インビボ持続性、移植、及び／又はVCARを媒介とした殺傷の能力を増強する。本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子の非限定的な例に含まれるのは、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、及び／又はインターロイキン、例えば、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ／IL-1F1、IL-1ベータ／IL-1F2、IL-12 p70、IL-12／IL-35 p35、IL-13、IL-17／IL-17A、IL-17A／Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18／IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32ベータ、IL-32ガンマ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE／TNFSF11／RANKL、又はそれらの任意の組み合わせである。本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子の非限定的な例に含まれるのは、塩、ミネラル、及び／又は代謝産物、例えばHEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS／FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、Tris／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン5、又はそれらの任意の組み合わせである。本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子の非限定的な例に含まれるのは、細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、及び／又は1つまたは複数のアポトーシス経路の阻害剤、例えばTLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０５９５】
本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子の非限定的な例に含まれるのは、1つまたは複数の核酸を修飾して、又は安定化させて細胞送達を増強する試薬、核送達又は核輸送を増強する試薬、核への核酸の容易な輸送を増強する試薬、染色体外核酸の分解を増強する試薬、及び／又はDNAを媒介とした毒性を低下させる試薬、例えばpH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含む又は含まない純正中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０５９６】
本開示の遺伝子改変された細胞は、増殖プロセスの間に、選択を可能にする薬又は化合物を用いて選択することができる。例えばいくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンが、遺伝子改変された細胞に、細胞培地に添加された薬に対する耐性を与える選択マーカーをコードできるとき、選択は、増殖プロセスの間に起こることができ、選択が起こるには約1〜14日間の培養が必要とされる可能性がある。本開示のトランスポゾンによってコードされる選択マーカーとして使用できる薬剤耐性遺伝子の非限定的な例に含まれるのは、遺伝子Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2、又はそれらの任意の組み合わせの野生型（WT）形態又は変異形態である。選択マーカーが耐性を与えることのできる培養培地に添加することのできる対応する薬又は化合物の非限定的な例に含まれるのは、G418、ピューロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、メトトレキサート、メファラン、テモゾロミド、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ベンダムスチン、フルダラビン、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、ベセヌム（カルムスチン）、BiCNU（カルムスチン）、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カルムブリス（カルムスチン）、カルムスチン、クラフェン（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロホスファミド）、ダラツムマブ、ダルザレックス（ダラツムマブ）、ドキシル（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、塩酸ドキソルビシンリポソーム、ドックス-SL（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エロツズマブ、エムプリシティ（エロツズマブ）、エバセット（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、ファリーダック（パノビノスタット）、クエン酸イクサゾミブ、キプロリス（カルフィルゾミブ）、レナリドマイド、リポドックス（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、モゾビル（プレリキサホル）、ネオサル（シクロホスファミド）、ニンラロ（クエン酸イクサゾミブ）、パミドロン酸二ナトリウム、パノビノスタット、プレリキサホル、ポマリドマイド、ポマリスト（ポマリドマイド）、レブリミド（レナリドマイド）、シノビル（サリドマイド）、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ゾレドロン酸、ゾメタ（ゾレドロン酸）、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０５９７】
本開示のT細胞増殖プロセスは、WAVE Bioreactorの中の細胞培養バッグの中、G-Rexフラスコの中、又は他の適切な任意の容器及び／又は反応器の中で起こることができる。
【０５９８】
本開示の細胞培養物又はT細胞培養物は、安定な状態、揺らした状態、かき混ぜた状態、又は振盪させた状態に維持することができる。
【０５９９】
本開示の細胞又はT細胞の増殖プロセスは、いくつかの条件を最適化することができ、条件の非限定的な例に含まれるのは、培養時間、細胞の濃度、T細胞培地の添加／除去のスケジュール、細胞のサイズ、全細胞数、細胞表現型、細胞集団の純度、増殖している細胞集団の中の遺伝子改変された細胞の割合、サプリメントの使用と組成、エクスパンダー技術の適用／除去、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０６００】
本開示の細胞又はT細胞の増殖プロセスは、得られる増殖した細胞集団が形成される前のあらかじめ決めた端点まで継続することができる。例えば本開示の細胞又はT細胞の増殖プロセスは、あらかじめ決めた時間にわたって継続すること、すなわち少なくとも2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、12時間、14時間、16時間、18時間、20時間、22時間、24時間；少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間；少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間；少なくとも1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間；又は少なくとも1年間にわたって継続することができる。本開示の細胞又はT細胞の増殖プロセスは、得られる培養物があらかじめ決めた全細胞密度、すなわち体積（μl、ml、L）当たり1個、10個、100個、1000個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、1010個の細胞、又はその数値の間のいずれかの密度に到達するまで継続することができる。本開示の細胞又はT細胞の増殖プロセスは、得られる培養物の遺伝子改変された細胞が、本開示のトランスポゾンのあらかじめ決めた発現レベル、すなわち発現の閾値レベル（得られた遺伝子改変された細胞が臨床で有効であることを示す発現の最低レベル、最高レベル、又は平均レベル）の1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、又はその数値の間のいずれかの割合を示すまで継続することができる。本開示の細胞又はT細胞の増殖プロセスは、得られる培養物の遺伝子改変された細胞の割合と改変されていない細胞の割合が、あらかじめ決めた閾値、すなわち少なくとも1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、2：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1に到達するまで継続することができる。
放出させるための遺伝子改変された自己由来T細胞の分析
【０６０１】
遺伝子改変された細胞の割合は、本開示の増殖プロセスの間又は後に評価することができる。本開示の改変された細胞によるトランスポゾンの細胞発現は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって測定することができる。例えばFACSを利用して本開示のVCARを発現する細胞又はT細胞の割合を求めることができる。その代わりに、又はそれに加えて、遺伝子改変された細胞又はT細胞の純度、本開示の遺伝子改変された細胞又はT細胞が発現するVCARの平均蛍光強度（MFI）、VVCARが、VCARリガンドを発現している標的細胞の脱顆粒化及び／又は殺傷を媒介する能力、及び／又はVCAR+ T細胞の表現型を評価することができる。
【０６０２】
対象に投与するための本開示の組成物は、組成物が、医薬産物としての製剤、及び／又は対象への投与に関して安全かつ効果的であることを示す1つまたは複数の「放出基準」を満たしている必要がある可能性がある。放出基準には、本開示の組成物（例えば本開示のT細胞産物）が、その細胞表面に検出可能なレベルの本開示のVCARを発現している特定の割合のT細胞を含むという条件を含めることができる。
【０６０３】
増殖プロセスは、具体的な基準（例えば細胞が所定の総数に到達する、特定の集団の記憶細胞に到達する、特定のサイズの集団に到達する）が満たされるまで継続すべきである。
【０６０４】
いくつかの基準が、増殖プロセスを終わらせるべき時点を通知する。例えば細胞が300 fLの細胞サイズに達すると、製剤化、再活性化、又は低温保存すべきである（そうしないと、この閾値を超えたサイズに達した細胞は死に始める可能性がある）。細胞の集団が300 fL未満の平均細胞サイズに達した直後に低温保存すると、解凍して培養したときに細胞の回収率がよりよい可能性がある。なぜなら細胞は、低温保存の前にまだ完全な休止状態には到達していなかったからである（完全休止のサイズは約180 fL）。増殖の前に本開示のT細胞は約180 fLの細胞サイズを持っている可能性があるが、増殖の3日後にはその4倍超の細胞サイズである約900 fLに達する可能性がある。次の6〜12日間をかけてT細胞の集団は細胞サイズがゆっくりと減少し、180 fLで完全に休止する。
【０６０５】
製剤のための細胞集団を調製する方法は、非限定的な例として、細胞集団の細胞を濃縮するステップ、細胞を洗浄するステップ、及び／又は特定の表面発現マーカーに対する薬剤耐性又は磁性ビーズソーティングを通じて細胞を更に選択するステップを含むことができる。製剤のための細胞集団を調製する方法は、最終産物の安全性と純度を保証するためのソーティングステップを更に含むことができる。例えば患者からの腫瘍細胞を用いて本開示の遺伝子改変された細胞を刺激した場合、又は製剤のために調製中の本開示の遺伝子改変された細胞を刺激するのに腫瘍細胞が遺伝子改変されている場合、患者からの腫瘍細胞が最終産物にまったく含まれないことが極めて重要である。
細胞産物の輸液及び／又は輸液のための低温保存
【０６０６】
本開示の医薬製剤は、輸液、低温保存、及び／又は保管のためバッグの中に供給することができる。
【０６０７】
本開示の医薬製剤は、標準的なプロトコルと、場合によっては輸液可能な低温保存媒体を用いて低温保存することができる。例えば無DMSO低温保存媒体（例えばCryoSOfree（商標）無DMSO低温保存媒体）を用いて凍結関連毒性を減らすことができる。本開示の低温保存された医薬製剤は、患者に後日輸液するために保管することができる。有効な治療は、本開示の医薬製剤の多数回投与を必要とする可能性があるため、医薬製剤は、凍結保管できるが個々の用量を解凍するために分離されているあらかじめアリコート化された「用量」に包装することができる。
【０６０８】
本開示の医薬製剤は室温で保管することができる。有効な治療は、本開示の医薬製剤の多数回投与を必要とする可能性があるため、医薬製剤は、凍結保管できるが個々の用量を解凍するために分離されているあらかじめアリコート化された「用量」に包装することができる。
【０６０９】
本開示の医薬製剤は、のちの増殖及び／又は選択のためにアーカイブ化することができる。それは例えば、病状の寛解と再発の後の将来のある日に投与する必要がある可能性のある同種他家療法の場合に同じ患者への追加用量を生成させるためである。
製剤
【０６１０】
上に指摘したように、本開示により、安定な製剤（生理食塩水又は選択された塩を含むリン酸塩バッファを含んでいることが好ましい）、保存剤を含む保存された溶液と製剤、医薬又は獣医学で用いるのに適した多用途の保存された製剤が提供され、それら製剤は、医薬的に許容される製剤の中に少なくとも1つのVCARを含んでいる。保存された製剤は、水性希釈剤の中に、少なくとも1つの既知の保存剤を含んでいるか、場合によっては少なくとも1つのフェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば六水和物）、アルキルパラベン（メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンなど）、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、チメロサール、ポリマー、又はその混合物からなるグループから選択された保存剤を含んでいる。本分野で知られている適切な任意の濃度又は混合物（例えば約0.0015％、又はその中の任意の範囲、値、又は一部）を用いることができる。非限定的な例に含まれるのは、保存剤なし、約0.1〜2％のm-クレゾール（例えば0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％）、約0.1〜3％のベンジルアルコール（例えば0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％）、約0.001〜0.5％のチメロサール（例えば0.005、0.01％）、約0.001〜2.0％のフェノール（例えば0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％）、0.0005〜1.0％のアルキルパラベン（例えば0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％）などである。
【０６１１】
上に指摘したように、本発明により、製造品として、包装材料と、場合によっては水性希釈剤の中に少なくとも1つのVCARと処方されたバッファ及び／又は保存剤を含む溶液を収容した少なくとも1つのバイアルを含む製品が提供される。包装材料は、そのような溶液を1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、9時間、12時間、18時間、20時間、24時間、30時間、36時間、40時間、48時間、54時間、60時間、66時間、72時間、又はそれよりも長い期間にわたって保持できることを示すラベルを含んでいる。本発明は、製造品として、包装材料、凍結乾燥させた少なくとも1つのVCARを収容した第1のバイアル、及び処方されたバッファ又は保存剤の水性希釈剤を収容した第2のバイアルを含む製品を更に含んでいる。ここに包装材料は、少なくとも1つのVCARを水性希釈剤の中で再構成して溶液を形成すると、この溶液を24時間又はそれよりも長い期間にわたって保持できることを患者に教えるラベルを含んでいる。
【０６１２】
本発明に従って用いられる少なくとも1つのVCARは、組換え手段によって哺乳動物細胞又はトランスジェニック調製物から生成させること、又は本明細書に記載されているか本分野で知られている他の生物学的供給源から精製することができる。
【０６１３】
本発明の産物中の少なくとも1つのVCARの範囲は、湿／乾系の中にある場合に再構成されたときに約1.0μg/ml〜約1000 mg/mlの濃度を生じさせる量を含んでいるが、より低い濃度とより高い濃度が可能であり、その範囲は、想定する送達ビヒクルに依存する（例えば溶液製剤は、経皮パッチ、肺法、経粘膜法、浸透圧法、又はマイクロポンプ法とは異なる）。
【０６１４】
水性希釈剤は、医薬的に許容される保存剤を場合によっては更に含んでいることが好ましい。好ましい保存剤に含まれるのは、フェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、チメロサール、又はそれらの混合物からなるグループから選択されたものである。製剤の中で用いられる保存剤の濃度は、抗菌効果を生じさせるのに十分な濃度である。そのような濃度は選択される保存剤に依存しており、当業者によって容易に求められる。
【０６１５】
他の賦形剤（例えば等張剤、バッファ、抗酸化剤、及び保存増強剤）を場合によっては希釈剤に添加することができ、そうすることが好ましい可能性がある。等張剤（グリセリンなど）が、既知の濃度で一般に使用される。生理学的に容認されるバッファを添加してpH制御を改善することが好ましい。製剤は広い範囲のpH（例えばpH約4〜pH約10）をカバーできるが、好ましい範囲はpH約5〜pH約9であり、最も好ましい範囲は約6.0〜約8.0である。本発明の製剤は、約6.8〜約7.8のpHを持つことが好ましい。好ましいバッファはリン酸塩バッファを含み、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特にリン酸塩緩衝化生理食塩水（PBS）を含んでいる。
【０６１６】
他の添加剤、例えば医薬的に許容される溶解剤（Tween 20（ポリオキシエチレン（20）モノラウリン酸ソルビタン）、Tween 40（ポリオキシエチレン（20）モノパルミチン酸ソルビタン）、Tween 80（ポリオキシエチレン（20）モノオレイン酸ソルビタン）、Pluronic F68（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）及びPEG（ポリエチレングリコール）など）、又は非イオン性表面活性剤（ポリソルベート20又は80、又はポロキサマー184又は188、Pluronic（登録商標）ポリオール、他のブロックコポリマー）、及びキレート剤（例えばEDTAとEGTA）を場合によっては製剤又は組成物に添加して凝集を減らすことができる。これら添加剤は、ポンプ又はプラスチック製容器を用いて製剤を投与する場合に特に有用である。医薬的に許容される界面活性剤が存在していると、タンパク質が凝集する傾向が緩和される。
【０６１７】
本発明の製剤は、少なくとも1つのVCARと、フェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、チメロサール、又はそれらの混合物からなるグループから選択された保存剤を、水性希釈剤の中で混合することを含むプロセスによって調製することができる。水性希釈剤の中での少なくとも1つのVCARと保存剤の混合は、従来の溶解手続きと混合手続きを利用して実施される。適切な製剤を調製するため、例えば緩衝化溶液の中の測定された量の少なくとも1つのVCARを、緩衝化溶液の中の望む保存剤と、そのタンパク質と保存剤を望む濃度で提供するのに十分な量で組み合わせる。当業者であればこのプロセスのバリエーションを知っているであろう。例えば構成成分を添加する順番、追加添加剤を用いるかどうか、製剤を調製するpHと温度が、投与で利用する濃度と手段のために最適化することのできる全因子である。
【０６１８】
本発明の製剤は、透明な溶液として、又は二重バイアルとして患者に提供することができる。二重バイアルは、再構成される凍結乾燥された少なくとも1つのVCARのバイアルと、水、保存剤、及び／又は賦形剤（リン酸塩バッファ及び／又は生理食塩水と、選択された塩が好ましい）を水性希釈剤の中に含む第2のバイアルを含んでいる。単一バイアル、又は再構成を必要とする二重バイアルは多数回再利用することができ、患者治療の単回サイクル又は多数回サイクルにとって十分である可能性があるため、現在利用できるよりも便利な治療計画を提供することができる。
【０６１９】
本発明の製造品は、直後から24時間又はそれよりも長い範囲の期間にわたる投与に有用である。したがって本発明の製造品は、患者に大きな利点を提供する。本発明の製剤は、場合によっては約2℃〜約40℃の温度で安全に保管することと、タンパク質の生物活性を延長された期間にわたって保持することができるため、包装ラベルに、この溶液を6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、72時間、96時間、又はそれよりも長時間の期間にわたって保持及び／又は使用できることを示すことができる。保存された希釈剤を用いる場合には、そのようなラベルは、1〜12ヶ月間、半年間、1年半の間、及び／又は2年間までの使用を含むことができる。
【０６２０】
本発明の少なくとも1つのVCARの溶液は、少なくとも1つのVCARを水性希釈剤の中で混合することを含む方法によって調製することができる。混合は、従来の溶解手続きと混合手続きを利用して実施される。適切な希釈剤を調製するため、例えば緩衝化溶液の中の測定された量の少なくとも1つのVCARを、緩衝化溶液の中の望む保存剤と、そのタンパク質と保存剤を望む濃度で提供するのに十分な量で組み合わせる。当業者であればこのプロセスのバリエーションを知っているであろう。例えば構成成分を添加する順番、追加添加剤を用いるかどうか、製剤を調製するpHと温度が、投与で利用する濃度と手段のために最適化することのできる全因子である。
【０６２１】
本発明の産物は、透明な溶液として、又は二重バイアルとして患者に提供することができる。二重バイアルは、再構成される凍結乾燥された少なくとも1つのVCARのバイアルと、水性希釈剤を含む第2のバイアルを含んでいる。単一バイアル、又は再構成を必要とする二重バイアルは多数回再利用することができ、患者治療の単回サイクル又は多数回サイクルにとって十分である可能性があるため、現在利用できるよりも便利な治療計画を提供することができる。
【０６２２】
本発明の産物は、薬局、クリニック、又は他のそのような機関と施設に、透明な溶液を提供することによって、又は再構成される凍結乾燥された少なくとも1つのVCARのバイアルと、水性希釈剤を含む第2のバイアルを含む二重バイアルを提供することによって、患者に間接的に提供することができる。この場合の透明な溶液は、1リットルまでにすること、又はより一層大きなサイズにすることができるため、大きなリザーバが提供され、そのリザーバから、少なくとも1つのVCARの溶液のより小さな部分を、より小さなバイアルに移すために1回又は多数回回収することと、薬局又はクリニックが顧客及び／又は患者に提供することができる。
【０６２３】
単一バイアル系を含む公知の装置に含まれるのは、溶液を送達するためのペン型注入装置、例えばBecton Dickinson社（フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、www.bectondickenson.com）、Disetronic社（ブルクドルフ、スイス国、www.disetronic.com； Bioject社、ポートランド、オレゴン州（www.bioject.com）； National Medical Products, Weston Medical社（ピーターバラ、連合王国、www.weston-medical.com）、Medi-Ject Corp社（ミネアポリス、ミネソタ州、 www.mediject.com）によって製造又は開発された例えばBD Pens、BD Autojector（登録商標）、Humaject（登録商標）、NovoPen（登録商標）、B-D（登録商標）Pen、AutoPen（登録商標）、OptiPen（登録商標）、GenotropinPen（登録商標）、Genotronorm Pen（登録商標）、Humatro Pen（登録商標）、Reco-Pen（登録商標）、Roferon Pen（登録商標）、Biojector（登録商標）、Iject（登録商標）、J-tip Needle-Free Injector（登録商標）、Intraject（登録商標）、Medi-Ject（登録商標）、及び同様の適切な装置である。二重バイアル系を含む公知の装置に含まれるのは、再構成された溶液を送達するため、凍結乾燥された薬を送達用カートリッジの中で再構成するためのペン型注入装置（例えばHumatroPen（登録商標））である。適切な他の装置の例に含まれるのは、あらかじめ充填された注射器、自己注入器、針なし注入器、針なし静脈内輸液セットである。
【０６２４】
本発明の産物は、包装材料を含んでいる。包装材料は、規制当局が要求する情報に加え、その産物を使用できる条件を提供する。本発明の包装材料は、二重バイアル湿／乾製品に関しては、少なくとも1つのVCARを水性希釈剤の中で再構成して溶液を形成し、その溶液を2〜24時間又はそれよりも長い期間にわたって使用するという指示を患者に提供する。単一バイアルの溶液製品に関しては、ラベルは、そのような溶液を2〜24時間又はそれよりも長い期間にわたって使用できることを示す。本発明の産物は、ヒトの医薬製品で使用するのに有用である。
【０６２５】
本発明の製剤は、少なくとも1つのVCARと、選択されたバッファ（好ましくは、生理食塩水又は選択された塩を含むリン酸塩バッファ）を混合することを含む方法によって調製することができる。水性希釈剤の中での少なくとも1つのVCARと保存剤の混合は、従来の溶解手続きと混合手続きを利用して実施される。適切な製剤を調製するため、例えば緩衝化溶液の中の測定された量の少なくとも1つのVCARを、緩衝化溶液の中の望む保存剤と、そのタンパク質と保存剤を望む濃度で提供するのに十分な量で組み合わせる。当業者であればこのプロセスのバリエーションを知っているであろう。例えば構成成分を添加する順番、追加添加剤を用いるかどうか、製剤を調製するpHと温度が、投与で利用する濃度と手段のために最適化することのできる全因子である。
【０６２６】
本発明の安定な製剤又は保存された製剤は、透明な溶液として、又は二重バイアルとして患者に提供することができる。二重バイアルは、再構成される凍結乾燥された少なくとも1つのVCARのバイアルと、保存剤又はバッファと賦形剤を水性希釈剤の中に含む第2のバイアルを含んでいる。単一バイアル、又は再構成を必要とする二重バイアルは多数回再利用することができ、患者治療の単回サイクル又は多数回サイクルにとって十分である可能性があるため、現在利用できるよりも便利な治療計画を提供することができる。
【０６２７】
VCARを安定化させる他の製剤又は方法により、VCARを含む凍結乾燥粉末の透明な溶液以外のものになる可能性がある。不透明な溶液の中には粒子状懸濁液を含む製剤があり、その粒子は、さまざまなサイズの構造になったVCARを含む組成物であり、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェア、又はリポソームなどのさまざまな名称で知られる。活性剤を含んでいてこのように比較的一様で本質的に球形である粒子製剤は、アメリカ合衆国特許第4,589,330号に教示されているように、活性剤とポリマーを含む水相と非水相を接触させた後、非水相を蒸発させて水相からの粒子同士を合体させることによって形成できる。多孔性マイクロ粒子は、アメリカ合衆国特許第4,818,542号に教示されているように、連続溶媒の中に分散された活性剤とポリマーを含む第1の相を使用し、凍結乾燥又は希釈-抽出-沈殿によってその溶媒を懸濁液から除去することによって調製できる。このような調製物にとって好ましいポリマーは、天然又は合成のコポリマー又はポリマーであり、ゼラチン寒天、デンプン、アラビノガラクタン、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド-L(-)ラクチドポリ(イプシロン-カプロラクトン、ポリ(イプシロン-カプロラクトン-CO-乳酸）、ポリ(イプシロン-カプロラクトン-CO-グリコール酸）、ポリ(β-ヒドロキシ酪酸)、ポリエチレンオキシド、ポリエチレン、ポリ(アルキル-2-シアノアクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリアミド、ポリ(アミノ酸)、ポリ (2-ヒドロキシエチル DL-アスパルタミド)、ポリ(エステルウレア)、ポリ (L-フェニルアラニン／エチレングリコール／1,6-ジイソシアナトヘキサン)、及びポリ(メチルメタクリレート) からなるグループから選択される。特に好ましいポリマーは、ポリエステル、例えばポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコシド-L(-)ラクチドポリ(イプシロン-カプロラクトン、ポリ(イプシロン-カプロラクトン-CO-乳酸)、及びポリ (イプシロン-カプロラクトン-CO-グリコール酸である。ポリマー及び／又は活性剤を溶かすのに有用な溶媒に含まれるのは、水、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ベンゼン、又はヘキサフルオロアセトンセスキ水和物である。活性成分を含む相を、第2の相を用いて分散させる方法は、第1の相に強制的にノズルの中のオフィリスを通過させて液滴形成に影響を及ぼすことを含んでいる。
【０６２８】
乾燥粉末製剤は、凍結乾燥以外の方法から得ること、例えばスプレー乾燥によって、又は蒸発による溶媒抽出によって、又は結晶組成物を沈殿させた後に水性溶媒又は非水性溶媒を除去する1つまたは複数のステップによって得ることができる。スプレー乾燥させたVCAR調製物の調製は、アメリカ合衆国特許第6,019,968号に教示されている。VCARに基づく乾燥粉末組成物は、スプレー乾燥溶液により、又は溶媒中のVCARのスラリーと場合によっては賦形剤により、呼吸可能な乾燥粉末を提供する条件下で生成させることができる。溶媒は極性化合物（水、エタノールなど）を含むことができ、それは容易に乾燥させることができる。VCARの安定性は、酸素の不在下（例えば窒素ブランケット下）でスプレー乾燥手続きを実施することによって、又は乾燥ガスとして窒素を用いることによって増強することができる。別の比較的乾燥した製剤は、WO 9916419に教示されているように、複数の孔開き微小構造が、典型的にはヒドロフルオロアルカン推進剤を含む分散媒体に分散された分散液である。安定化された分散液は、定量吸入器を用いて患者の肺に投与することができる。スプレー乾燥された薬を市販用に製造するのに役立つ装置は、Buchi Ltd.社又はNiro Corp.社によって製造されている。
【０６２９】
本明細書に記載されている安定な製剤か溶液、又は保存された製剤か溶液の中の少なくとも1つのVCARは、本分野で周知のように、本発明に従い、多彩な送達法（SC注射又はIM注射；経皮、肺、経粘膜、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当業者が評価する他の手段が含まれる）を通じて患者に投与することができる。
治療への応用
【０６３０】
本発明により、本分野で知られているか本明細書に記載されている細胞、組織、臓器、動物、又は患者の疾患を、本発明の少なくとも1つのVCARを用いて（例えばその細胞、組織、臓器、動物、又は患者に治療に有効な量のVCARを投与するか、その細胞、組織、臓器、動物、又は患者を治療に有効な量のVCARと接触させて）調節又は治療する方法も提供される。本発明により、細胞、組織、臓器、動物、又は患者の疾患（悪性疾患が含まれるが、それに限定されることはない）を調節又は治療する方法も提供される。
【０６３１】
本発明により、細胞、組織、臓器、動物、又は患者の少なくとも1つの悪性疾患を調節又は治療する方法も提供される。悪性疾患の非限定的な例に含まれるのは、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性リンパ性白血病、B細胞、T細胞、又はFAB ALL、急性骨髄性白血病（AML）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（MDS）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、大腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球症、腫瘍随伴症候群／悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、固形腫瘍、膀胱がん、乳がん、大腸がん、子宮内膜がん、頭部がん、首部がん、遺伝性非ポリポーシスがん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞癌、精巣がん、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、がん関連骨再吸収、がん関連骨疼痛などの少なくとも1つである。
【０６３２】
本発明のどの方法も、少なくとも1つのVCARを含む有効量の組成物又は医薬組成物を、そのような調節、処置、又は治療を必要とする細胞、組織、臓器、動物、又は患者に投与することを含んでいる。このような方法は、場合によってはそのような疾患又は障害を治療するための共投与又は併用療法を更に含むことができ、それよりも前に、それと同時に、及び／又はそれよりも後に、少なくとも1つのVCAR、その特定の一部、又はそのバリアントの投与は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、及び放射性医薬品の少なくとも1つから選択された少なくとも1つを投与することを更に含んでいる。適切な用量は本分野で周知である。例えばWells他編、『Pharmacotherapy Handbook』、第2版、Appleton and Lange社、スタンフォード、コネチカット州（2000年）； 『PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000』、豪華版、Tarascon Publishing社、ロマ・リンダ、カリフォルニア州（2000年）；『Nursing 2001 Handbook of Drugs』、第21版、Springhouse Corp.社、スプリングハウス、ペンシルヴェニア州、2001年；『Health Professional's Drug Guide 2001』、Shannon、Wilson、Stang編、Prentice-Hall, Inc社、アッパー・サドル・リヴァー、ニュージャージー州を参照されたい（各参考文献は、参照によって全体が本明細書に組み込まれている）。
【０６３３】
好ましい用量は、場合によっては約0.1〜99及び／又は100〜500 mg/kg/投与、又はその間の任意の範囲、値、又は一部を含むことができ、単回投与又は多数回投与ごとに約0.1〜5000μg/ml、又はその間の任意の範囲、値、又は一部という血清濃度が実現される。本発明のVCARの好ましい用量範囲は、患者の体重1 kg当たり約1 mgから約3 mg、約6 mg、又は約12 mgまでである。
【０６３４】
あるいは投与される用量は、わかっている因子（個々の薬剤の薬物動態特性、その投与様式と経路；レシピエントの年齢、健康、及び体重；症状の性質と程度、同時に実施している治療の種類、治療の頻度、望む効果）に依存して変化する可能性がある。通常は活性成分の用量として、体重1キログラム当たり約0.1〜100ミリグラムが可能である。通常は投与ごとに、又は持続放出の形態で、1キログラム当たり0.1〜50ミリグラム、好ましくは0.1〜10ミリグラムが、望む効果を得るのに有効である。
【０６３５】
非限定的な一例として、ヒト又は動物の治療は、本発明の少なくとも1つのVCARの一回用量又は定期用量として、単回用量、輸液用量、又は反復用量を用い、1日当たり約0.1〜100 mg/kg又はその間の任意の範囲、値、又は一部を、1〜40日目の少なくとも1つの日に、あるいはその代わりに、又はそれに加えて、1〜52週の少なくとも1つの週に、あるいはその代わりに、又はそれに加えて、1〜20年の少なくとも1つの年に、又はそれらの任意の組み合わせに提供することができる。
【０６３６】
内部投与に適した剤形（組成物）は、一般に、ユニット又は容器ごとに約0.001ミリグラム〜約500ミリグラムの活性成分を含んでいる。これら医薬組成物では、活性成分は通常、組成物の全重量を基準にして約0.5〜99.999重量％の量で存在することになる。
【０６３７】
非経口投与するため、VCARは、溶液、懸濁液、乳液、粒子、粉末、又は凍結乾燥された粉末として、医薬的に許容される非経口ビヒクルと組み合わせて、又はそれとは別々に製剤化することができる。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び約1〜10％ヒト血清アルブミンである。リポソームと非水性ビヒクル（不揮発性油など）も使用することができる。ビヒクル又は凍結乾燥された粉末は、等張性を維持する添加剤（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）と化学的安定性を維持する添加剤（例えばバッファと保存剤）を含むことができる。製剤は、公知の技術又は適切な技術によって殺菌される。
【０６３８】
適切な医薬基剤は、この分野の標準的な参考書である『Remington's Pharmaceutical Sciences』、A. Osolの最新版に記載されている。
代替投与
【０６３９】
多くの知られている様式と開発された様式を本発明に従って利用して医薬的に有効な量の本発明の少なくとも1つのVCARを投与することができる。以下の説明では肺投与を利用するが、他の投与様式を本発明に従って利用して適切な結果を得ることができる。本発明のVCARは、多彩な装置と方法の任意のものを利用し、吸入によって、又は本明細書に記載されているか本分野で知られている他の様式によって、基剤の中で、溶液、乳液、コロイド、又は懸濁液として、又は乾燥粉末として送達することができる。
非経口製剤と投与
【０６４０】
非経口投与のための製剤は、一般的な賦形剤として、殺菌した水又は生理食塩水、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコールなど）、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含むことができる。注射用の水性又は油性の懸濁液は、公知の方法に従って適切な乳化剤又は湿潤剤と懸濁剤を用いることによって調製できる。注射用の薬剤として、非毒性、非経口投与可能な希釈剤（水溶液、殺菌注射溶液、又は溶媒中の懸濁液）が可能である。使用可能なビヒクル又は溶媒として、水、リンゲル溶液、等張生理食塩水などが許容される。通常の溶媒又は懸濁溶媒として、殺菌不揮発性油を使用できる。これらの目的のため、任意の種類の不揮発性油と脂肪酸を使用でき、その中には天然又は合成又は半合成の脂肪油又は脂肪酸、天然又は合成又は半合成のモノグリセリド、又はジグリセリド、又はトリグリセリドが含まれる。非経口投与は本分野で知られており、その非限定的な例に含まれるのは、通常の注入手段、アメリカ合衆国特許第5,851,198号に記載されているガス圧針なし注入装置、及びアメリカ合衆国特許第5,839,446号に記載されているレーザー穿孔装置である（全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
代替送達
【０６４１】
本発明は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内（intracavitary）、腔内（intracelial）、脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、又は経皮手段による少なくとも1つのVCARの投与に更に関する。少なくとも1つのVCAR組成物は、非経口投与（皮下、筋肉内、又は静脈内）又は他の任意の投与で使用するためには、特に溶液又は懸濁液の形態で調製することができ；膣又は直腸への投与で使用するためには特に半固体の形態（非限定的な例としてクリーム、座薬など）で調製することができ；口腔又は舌下に投与するためには、非限定的な例として錠剤又はカプセルの形態で調製することができ；鼻腔内投与するためには、非限定的な例として粉末、点鼻薬、又はエアロゾル、又はいくつかの薬剤の形態で調製することができ；経皮投与するためには、非限定的な例としてゲル、軟膏、ローション、懸濁液、又はパッチ送達システムの形態で調製することができ、パッチ送達システムでは、皮膚構造を変えるか、経皮パッチ内の薬の濃度を大きくするための化学的エンハンサ（ジメチルスルホキシドなど）（『Drug Permeation Enhancement』、Hsieh, D. S.編の中のJunginger他、59〜90ページ (Marcel Dekker, Inc.社、ニューヨーク1994年；その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）又はタンパク質とペプチドを含む製剤を皮膚に適用することを可能にする酸化剤（WO 98/53847）を用いるか、一過性の輸送経路を作り出すため（電気穿孔など）、又は皮膚を通過する帯電した薬の移動度を大きくするため電場を印加する（イオン導入など）か超音波を適用する（超音波導入など）（アメリカ合衆国特許第4,309,989号と第4,767,402号）（上記の刊行物と特許は、全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
肺／鼻投与
【０６４２】
肺投与のためには、少なくとも1つのVCAR組成物を、肺の下気道又は副鼻腔に到達するのに効果的な粒子サイズで供給することが好ましい。本発明によれば、少なくとも1つのVCARを、吸入による治療剤投与用に本分野で知られている多彩な吸入装置又は鼻装置のうちの任意の装置によって送達することができる。患者の副鼻腔又は肺胞の中にエアロゾル化された製剤を堆積させることのできるこれらの装置には、定量吸入装置、噴霧器、乾燥粉末生成装置、スプレー装置などが含まれる。VCARの肺投与又は鼻投与に適した他の装置も本分野で知られている。そのようなすべての装置が、投与に適した製剤を利用して、エアロゾルになったVCARを供給することができる。そのようなエアロゾルは、溶液（水溶液と非水溶液の両方）又は固体粒子を含むことができる。
【０６４３】
Ventolin定量吸入装置などの定量吸入装置は、典型的には推進ガスを使用しており、吸入中に作動させる必要がある（例えばWO 94/16970、WO 98/35888を参照されたい）。乾燥粉末吸入装置（例えばInhale Therapeutics社によって市販されているTurbuhaler（商標（Astra社）、Rotahaler（登録商標）（Glaxo社）、Diskus（登録商標）（Glaxo社）、Spiros（商標）inhaler（Dura社）という装置、及びSpinhaler（登録商標）粉末吸入装置（Fisons社）は、呼吸で作動させる混合粉末を利用している（アメリカ合衆国特許第4,668,218号 Astra社、EP 237507 Astra社、WO 97/25086 Glaxo社、WO 94/08552 Dura社、アメリカ合衆国特許第5,458,135号 Inhale社、WO 94/06498 Fisons社；全体が、参照によって本明細書に組み込まれている）。噴霧器（例えばAERx（商標）Aradigm、Ultravent（登録商標）噴霧器（Mallinckrodt社）、Acorn II（登録商標）噴霧器（Marquest Medical Products社）（アメリカ合衆国特許第5,404,871号 Aradigm社、WO 97/22376）（上記の参考文献は、全体が参照によって本明細書に組み込まれている）は、溶液からエアロゾルを生成させるが、定量吸入装置、乾燥粉末吸入装置などは、小粒子エアロゾルを生成させる。市販されている吸入装置のこれら具体例は、本発明を実施するのに適した具体的な装置の代表であり、本発明の範囲を限定することは想定していない。
【０６４４】
少なくとも1つのVCARを含む組成物を乾燥粉末吸入装置又はスプレー装置によって供給することが好ましい。本発明の少なくとも1つのVCARを投与するための吸入装置にはいくつかの望ましい特徴がある。例えば吸入装置による送達は、信頼性があり、再現性があり、正確であるという利点がある。吸入装置は、吸入性が優れているようにするため場合によっては小さな乾燥粒子（例えば約10μm未満、好ましくは約1〜5μm）を送達することができる。
スプレーとしてのVCAR組成物の投与
【０６４５】
VCAR組成物を含むスプレーは、少なくとも1つのVCARの懸濁液又は溶液を圧力下で強制的にノズルを通過させることによって生成させることができる。ノズルのサイズと配置、印加圧力、及び液体供給速度を選択し、望む出力と粒子サイズを実現することができる。エレクトロスプレーは、例えばキャピラリ又はノズルからの供給に関係する電場によって生成させることができる。スプレーによって送達される少なくとも1つのVCAR組成物の粒子は、粒子サイズが約10μm未満、好ましくは約1μm〜約5μmの範囲、最も好ましくは約2μm〜約3μmであることが有利である。
【０６４６】
スプレーで使用するのに適した少なくとも1つのVCAR組成物の製剤は、典型的には水溶液の中にVCAR組成物を、溶液1 ml当たり少なくとも1つのVCAR組成物を約0.1 mg〜約100 mgの濃度（すなわちmg/g）、又はその間の任意の範囲、値、又は部分で含んでいる。製剤は、賦形剤、バッファ、等張剤、保存剤、界面活性剤、及び亜鉛などの薬剤を含むことができ、好ましくは亜鉛を含んでいる。製剤は、VCAR組成物を安定化させるための賦形剤又は薬剤（例えばバッファ、還元剤、バルクのタンパク質、又は炭水化物）も含むことができる。VCAR組成物を製剤化するのに有用なバルクのタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが含まれる。VCAR組成物を製剤化するのに有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが含まれる。VCAR組成物製剤は界面活性剤も含むことができる。界面活性剤は、エアロゾルを形成する際に、表面によってVCAR組成物の凝集が誘導されるのを溶液の霧化が引き起こすことを減らす、又は阻止することができる。従来からあるさまざまな界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコール、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなど）を使用できる。量は、一般に、製剤の重量の0.001〜14％の範囲になろう。本発明の目的のための特に好ましい界面活性剤は、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート80、ポリソルベート20などである。タンパク質（例えばVCAR、又は特定の部分又はバリアント）の製剤のための本分野で知られている追加の薬剤も製剤の中に含めることができる。
噴霧器によるVCAR組成物の投与
【０６４７】
本発明のVCAR組成物は噴霧器（例えばジェット噴霧器又は超音波噴霧器）によって投与することができる。典型的には、ジェット噴霧器では、圧縮空気源を用いて高速の空気ジェットを作り出してオリフィスを通過させる。ガスがノズルを超えて膨脹するにつれて低圧領域が作り出され、それが、液体リザーバに接続された毛細管を通じてVCAR組成物の溶液を引き付ける。毛細管からの液体流は、毛細管から出るときに剪断されて不安定なフィラメントと液滴になり、エアロゾルを生成させる。ある範囲の構成、流速、及びバッフルのタイプを用いて所与の噴霧器から望む性能特性を実現することができる。超音波噴霧器では、高周波数の電気エネルギーを利用し、典型的には圧電トランスデューサを用いて振動機械エネルギーを生み出す。このエネルギーは、直接に、又はカップリング流体を通じてVCAR組成物の製剤に伝えられ、VCAR組成物を含むエアロゾルを生み出す。噴霧器によって送達されるVCAR組成物の粒子は、粒子サイズが約10μm未満、好ましくは約1μm〜約5μmの範囲、最も好ましくは約2μm〜約3μmであることが有利であることが有利である。
【０６４８】
ジェット噴霧器であれ超音波噴霧器であれ、噴霧器で用いるのに適した少なくとも1つのVCARの製剤は、典型的には、溶液1 ml当たり約0.1 mg〜約100 mgの少なくとも1つのVCAR を含んでいる。製剤は、賦形剤、バッファ、等張剤、保存剤、界面活性剤、及び亜鉛などの薬剤を含むことができ、好ましくは亜鉛を含んでいる。製剤は、少なくとも1つのVCAR組成物を安定化させるための賦形剤又は薬剤（例えばバッファ、還元剤、バルクのタンパク質、又は炭水化物）も含むことができる。少なくとも1つのVCAR組成物を製剤化するのに有用なバルクのタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが含まれる。少なくとも1つのVCAR組成物を製剤化するのに有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが含まれる。少なくとも1つのVCAR組成物製剤は界面活性剤も含むことができる。界面活性剤は、エアロゾルを形成する際に、表面によって少なくとも1つのVCAR組成物の凝集が誘導されるのを溶液の霧化が引き起こすことを減らす、又は阻止することができる。従来からあるさまざまな界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコール、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなど）を使用できる。量は、一般に、製剤の重量の0.001〜4％の範囲になろう。本発明の目的のための特に好ましい界面活性剤は、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート80、ポリソルベート20などである。タンパク質（例えばVCAR）の製剤のための本分野で知られている追加の薬剤も製剤の中に含めることができる。
定量吸入装置によるVCAR組成物の投与
【０６４９】
定量吸入装置（MDI）では、推進剤、少なくとも1つのVCAR、及び任意の賦形剤又は他の添加剤が、液化された圧縮ガスを含む混合物としてキャニスターの中に収容される。計量弁を作動させると混合物がエアロゾルとして放出される。エアロゾルは、サイズ範囲が約10μm未満、好ましくは約1μm〜約5μmの範囲、最も好ましくは約2μm〜約3μmの粒子を含んでいることが好ましい。エアロゾルの望む粒子サイズは、当業者に知られているさまざまな方法（ジェット-ミリング、スプレー乾燥、臨界点凝集など）によって生成させたVCAR組成物の製剤を用いることによって得られる。好ましい定量吸入器には、3M社又はGlaxo社によって製造されて、ヒドロフルオロカーボン推進剤を使用しているものが含まれる。定量吸入装置で用いるための少なくとも1つのVCARの製剤は、一般に、細かく分割した粉末を、少なくとも1つのVCARを非水性媒体の中の懸濁液として含むことになろう（例えば界面活性剤の助けを借りて推進剤の中に懸濁させる）。推進剤として、この目的で用いられる従来からある任意の材料が可能であり、その例は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、又はヒドロカーボンであり、その中に含まれるのは、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び1,1,1,2-テトラフルオロエタン、HFA-134a（ヒドロフルオロアルカン-134a）、HFA-227（ヒドロフルオロアルカン-227）などである。推進剤はヒドロクロロフルオロカーボンであることが好ましい。界面活性剤は、推進剤の中の懸濁液としての少なくとも1つのVCARを安定化させること、活性剤を化学的分解から保護することなどを目的として選択することができる。適切な界面活性剤に含まれるのは、トリオレイン酸ソルビタン、ダイズレクチン、オレイン酸などである。いくつかの場合には、エタノールなどの溶媒を用いた溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の製剤の分野で知られている追加の薬剤も製剤に含めることができる。当業者は、本明細書に記載されていない装置を通じた少なくとも1つのVCAR組成物の肺投与によって本発明の方法を実現できることがわかるであろう。
経口製剤と投与
【０６５０】
経口投与のための製剤は、腸壁の透過性を人工的に増大させるためのアジュバント（例えばレソルシノールと非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルとn-ヘキサデシルポリエチレンエーテル））との同時投与のほか、酵素分解を抑制するための酵素阻害剤（例えば膵臓トリプシン阻害剤、フルオロリン酸ジイソプロピル（DFF）、及びトラシロール）との同時投与に依存している。親水性の薬剤（タンパク質及びVCARと、経口、口腔、粘膜、鼻腔、肺、膣膜貫通、又は直腸に投与することを想定した少なくとも2つの界面活性剤の組み合わせが含まれる）を送達するための製剤が、アメリカ合衆国特許第6,309,663号に教示されている。経口投与のための固体型剤形の活性構成化合物は、少なくとも1つの添加剤（スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成のポリマー、及びグリセリドが含まれる）と混合することができる。これらの剤形は、他のタイプの添加剤、例えば不活性な希釈剤、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウムなど）、パラベン、保存剤（ソルビン酸など）、アスコルビン酸、アルファ-トコフェロール、抗酸化剤（システインなど）、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、風味剤、香味剤なども含むことができる。
【０６５１】
錠剤とピルを更に処理して腸溶コーティング調製物にすることができる。経口投与のための液体調製物は、医学的利用を許容できる乳剤、シロップ、エリキシル、懸濁液、及び溶液調製物を含んでいる。これら調製物は、この分野で通常使用されている不活性な希釈剤（例えば水）を含むことができる。リポソームも、インスリンとヘパリンの薬送達系として記載されている（アメリカ合衆国特許第4,239,754号）。より最近になり、混合されたアミノ酸の人工ポリマー（プロテイノイド）からなるマイクロスフェアが医薬を送達するのに用いられている（アメリカ合衆国特許第4,925,673号）。更に、アメリカ合衆国特許第5,879,681号と第5,871,753号に記載されていて生物活性のある薬剤の経口送達に用いられる担体化合物が本分野で知られている。
粘膜製剤と投与
【０６５２】
マイクロカプセルを提供する1つまたは複数の生体適合性ポリマー賦形剤又はコポリマー賦形剤（好ましくは生物分解性のポリマー又はコポリマー）の中に封止された生物活性剤を経口投与するための製剤は、得られるマイクロカプセルが適切なサイズであることが理由で、薬剤が胃腸管を通過したことに起因する有効性喪失なしに動物の集合リンパ小節（別名「パイエル板」又は「GALT」として知られる）に到達して取り込まれる。同様の集合リンパ小節を気管支（BALT）と大腸に見いだすことができる。上記の組織は、一般に、粘膜関連リンパ組織（MALT）と呼ばれる。粘膜表面を通じた吸収のため、少なくとも1つのVCARを投与する組成物と方法は、複数のサブミクロン粒子、粘膜接着性巨大分子、生物活性ペプチド、及び水性連続相（乳剤粒子が粘膜に接着するのを実現することによって粘膜表面を通過する吸収を促進する）を含む乳剤を含んでいる（アメリカ合衆国特許第5,514,670号）。本発明の乳剤を適用するのに適した粘膜表面には、角膜、結膜、口腔、舌下、鼻腔、膣、肺、胃、腸、及び直腸という投与経路が含まれる。膣又は直腸に投与するための製剤（例えば座薬）は、賦形剤（例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバターなど）を含むことができる。鼻腔内投与のための製剤は、固体であって賦形剤として例えばラクトースを含むこと、又は点鼻薬の水溶液又は油性溶液が可能である。口腔投与のためには、賦形剤は、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、あらかじめゼラチン化したデンプンなどを含んでいる（アメリカ合衆国特許第5,849,695号）。
経皮製剤と投与
【０６５３】
経皮投与のため、少なくとも1つのVCARは送達装置（例えばリポソーム又はポリマーナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、又はマイクロスフェア（特に断わらない限り、まとめてマイクロ粒子と呼ぶ））の中に封止される。多数の適切な装置が知られており、その中に含まれるのは、合成ポリマー製のマイクロ粒子（例えばポリヒドロキシ酸（ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）とそのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、及びポリホスファゼン、及び天然ポリマー（例えばコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミンと他のタンパク質、アルギン酸塩と他の多糖、及びそれらの組み合わせ）である（アメリカ合衆国特許第5,814,599号）。
延長された投与と製剤
【０６５４】
本発明の化合物を対象に延長された期間（例えば単回投与から1週間〜1年間の期間）にわたって送達することが望ましい可能性がある。ゆっくりとした放出、留置、又はインプラントのためのさまざまな剤形を利用することができる。例えば剤形は、体液への溶解度が小さい化合物の医薬的に許容される非毒性の塩、例えば（a）ポリ塩基酸（リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノスルホン酸又はナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸など）との酸添加塩；（b）多価金属カチオン（亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなど）との塩、又はN,N'-ジベンジル-エチレンジアミン又はエチレンジアミンから形成される有機カチオンとの塩；又は（c）（a）と（b）の組み合わせ（例えば亜鉛タンニン酸塩）を含むことができる。それに加え、本発明の化合物、又は好ましくは比較的不溶性の塩（例えばすぐ上に記載した塩）は、ゲル（例えばモノステアリン酸アルミニウムゲル）の中で例えば注射に適したゴマ油を用いて製剤化することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩などである。ゆっくり放出される別のタイプの注射用留置製剤は、ゆっくりと分解する非毒性で非抗原性のポリマー（例えばアメリカ合衆国特許第3,773,919号に記載されているポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマー）の中に封止するため、分散された化合物又は塩を含むことになろう。化合物、又は好ましくは比較的不溶性の塩（例えばすぐ上に記載した塩）は、特に動物で使用するため、コレステロールマトリックスsilasticペレットの中で製剤化することもできる。ゆっくりと放出される追加の留置製剤又はインプラント製剤（例えば気体リポソーム又は液体リポソーム）が文献で知られている（アメリカ合衆国特許第5,770,222 号と、『Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems』、J. R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.社、ニューヨーク、1978年）。
養子細胞療法としての改変された細胞の輸液
【０６５５】
本開示により、必要とする対象に投与するため選択及び／又は増殖された、本発明の1つまたは複数のCAR及び／又はVCARを発現する改変された細胞が提供される。本開示の改変された細胞を製剤化し、任意の温度（室温と体温が含まれる）で保管することができる。本開示の改変された細胞を製剤化して低温保存し、あとで解凍することができる。本開示の改変された細胞を医薬的に許容される基剤の中で製剤化し、殺菌包装から対象に直接投与することができる。本開示の改変された細胞を、細胞の生存率及び／又はCAR／VCAR発現レベルのインジケータとともに医薬的に許容される基剤の中で製剤化し、最低レベルの細胞機能とCAR／VCAR発現を保証することができる。本開示の改変された細胞を、1つまたは複数の試薬とともに、規定された密度の医薬的に許容される基剤の中で製剤化し、さらなる増殖を抑制すること、及び／又は細胞死を阻止することができる。
誘導性アポトーシス促進ポリペプチド
【０６５６】
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、既存の誘導性ポリペプチドよりも優れている。なぜなら本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、免疫原性がはるかに少ないからである。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは組換えポリペプチドであるため、天然に存在しないが、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを生成させるために組換えられた配列は、宿主であるヒト免疫系が「非自己」と認識する可能性のある非ヒト配列を含んでおらず、その帰結として、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、その誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む細胞、又はその誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むかその誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む細胞を含む組成物を受ける対象に免疫反応を誘導することがない。
【０６５７】
本開示により、リガンド結合領域、リンカー、及びアポトーシス促進ペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドが提供される。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。いくつかの実施態様では、アポトーシス促進ペプチドは、カスパーゼポリペプチドである。いくつかの実施態様では、カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ9ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、カスパーゼ9ポリペプチドは、切断型カスパーゼ9ポリペプチドである。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドとして、天然に存在しないものが可能である。
【０６５８】
本開示のカスパーゼポリペプチドの非限定的な例に含まれるのは、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、カスパーゼ11、カスパーゼ12、及びカスパーゼ14である。本開示のカスパーゼポリペプチドの非限定的な例に含まれるのは、アポトーシスに関連するカスパーゼポリペプチドであり、その中には、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、及びカスパーゼ10が含まれる。本開示のカスパーゼポリペプチドの非限定的な例に含まれるのは、アポトーシスを開始するカスパーゼポリペプチドであり、その中には、カスパーゼ2、カスパーゼ8、カスパーゼ9、及びカスパーゼ10が含まれる。本開示のカスパーゼポリペプチドの非限定的な例に含まれるのは、アポトーシスを実行するカスパーゼポリペプチドであり、その中には、カスパーゼ3、カスパーゼ6、及びカスパーゼ7が含まれる。
【０６５９】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型のアミノ酸配列又は核酸配列と比べて1つまたは複数の修飾を有するアミノ酸配列又は核酸配列によってコードすることができる。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、コドンを最適化することができる。本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸配列及び／又は核酸配列に対する1つまたは複数の修飾は、野生型のアミノ酸配列又は核酸配列と比べて本開示のカスパーゼポリペプチドの相互作用、架橋、交差活性化、又は活性化を増大させる可能性がある。その代わりに、又はそれに加えて、本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸配列及び／又は核酸配列に対する1つまたは複数の修飾は、野生型のアミノ酸配列又は核酸配列と比べて本開示のカスパーゼポリペプチドの免疫原性を低下させる可能性がある。
【０６６０】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型カスパーゼポリペプチドと比べて切断されている可能性がある。例えばカスパーゼポリペプチドを切断してカスパーゼの活性化とリクルートのドメイン（CARD）をコードする配列を除去することで、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む細胞内でアポトーシスを開始することに加えて局所的炎症反応を活性化する可能性をなくすか最少にすることができる。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列をスプライスし、野生型カスパーゼポリペプチドとは異なる本開示のカスパーゼポリペプチドのバリアントアミノ酸配列を形成することができる。本開示のカスパーゼポリペプチドは、組換え配列及び／又はキメラ配列によってコードすることができる。本開示の組換え及び／又はキメラのカスパーゼポリペプチドは、1つまたは複数の異なるカスパーゼポリペプチドからの配列を含むことができる。その代わりに、又はそれに加えて、本開示の組換え及び／又はキメラのカスパーゼポリペプチドは、1つまたは複数の種からの配列（例えばヒト配列と非ヒト配列）を含むことができる。本開示のカスパーゼポリペプチドとして、天然に存在しないものが可能である。
【０６６１】
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域は、本開示の第1の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドと本開示の第2の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの二量体化を容易にするか促進する任意のポリペプチド配列を含むことができ、その二量体化によってアポトーシス促進ポリペプチドの架橋と細胞内でのアポトーシスの開始が活性化、又は誘導される。
【０６６２】
リガンド結合（「二量体化」）領域は、内在性リガンド又は天然に存在しないリガンド（すなわち誘導剤）（例えば天然に存在しない合成リガンド）を用いた誘導を可能にするであろう任意のポリペプチド又はその機能ドメインを含むことができる。リガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの性質とリガンド（すなわち誘導剤）の選択に応じて細胞膜の内部にあっても外部にあってもよい。多彩なリガンド結合ポリペプチドとその機能ドメインが、受容体を含めて知られている。本開示のリガンド結合領域は、受容体からの1つまたは複数の配列を含むことができる。特に興味深いのは、リガンド（例えば小さな有機リガンド）が知られているか、リガンドを容易に生成させることのできるリガンド結合領域である。これらのリガンド結合領域又は受容体の非限定的な例に含まれるのは、FKBP、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体などのほか、「天然に存在しない」受容体（抗体、特に重鎖又は軽鎖のサブユニットから得ることができる）、その変異した配列、確率的な手続きやコンビナトリアル合成などによって得られるランダムなアミノ酸配列である。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、及びテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなるグループから選択される。
【０６６３】
1つまたは複数の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、内在性ドメイン又はその切断型活性部分として、少なくとも約50個のアミノ酸かつ約350個未満のアミノ酸が可能であり、通常は200個未満のアミノ酸である。結合領域は、例えば小さな（ウイルスベクターに効率的にトランスフェクトできるように25 kDa未満の）単量体で非免疫原性であるものが可能であり、二量体化のための構成にできる、合成可能で細胞透過性で非毒性のリガンドを有する。
【０６６４】
1つまたは複数の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの設計と、適切なリガンド（すなわち誘導剤）の利用可能性に応じ、細胞内又は細胞外に存在することが可能である。疎水性リガンドに関しては、結合領域は膜のどちら側に存在していてもよいが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドに関しては、リガンドを結合に利用できる形態で内部化するための輸送システムが存在しないのであれば、結合領域は通常は細胞膜の外側に存在することになろう。細胞内受容体に関しては、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、又はその誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むトランスポゾン又はベクターは、シグナルペプチドと、受容体ドメイン配列の膜貫通ドメイン5'又は3'をコードすること、又は受容体ドメイン配列の脂質付着シグナル配列5'をコードすることができる。受容体ドメインがシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間にある場合には、受容体ドメインは細胞外に存在することになろう。
【０６６５】
抗体と抗体サブユニット（例えば重鎖又は軽鎖、特に断片、より特定するなら、可変領域の全体又は一部、又は高親和性結合を生じさせる重鎖と軽鎖の融合体）は、本開示のリガンド結合領域として使用することができる。考慮する抗体に含まれるのは、異所的に発現するヒト産物（例えば免疫反応を開始させず、一般に末梢（すなわちCNS／脳領域以外）では発現しないと考えられる細胞外ドメイン）である。このような例の非限定的な例に含まれるのは、低親和性神経増殖因子受容体（LNGFR）と、胚性表面タンパク質（すなわち癌胎児性抗原）である。更に、生理学的に許容できるハプテン分子に対する抗体を調製することができ、個々の抗体サブユニットを結合親和性に関してスクリーニングする。サブユニットをコードするcDNAは、単離し、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の突然変異誘発などによって改変して、リガンドにとって適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このようにして、生理学的に許容できるほぼすべてのハプテン化合物をリガンドとして用いてリガンドのためのエピトープを提供することができる。抗体ユニットの代わりに内在性受容体を用いることができる。そのとき結合領域又は結合ドメインは既知であり、結合のための有用なリガンド又は既知のリガンドが存在している。
【０６６６】
受容体を多量体化するため、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域／受容体ドメインのためのリガンドを多量体化することが、リガンドが少なくとも2つの結合部位を持ち、各結合部位がリガンド受容体領域に結合できる（すなわち第1の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域に結合できる第1の結合部位を有するリガンドと、第2の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域に結合できる第2の結合部位を有するリガンド；ここで第1と第2の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域は、同じであるか異なっている）という意味で可能である。したがって本明細書では、「多量体リガンド結合領域」という用語は、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域であって、多量体リガンドに結合するものを意味する。本開示の多量体リガンドは、二量体リガンドを含んでいる。本開示の二量体リガンドは、リガンド受容体ドメインに結合できる2つの結合部位を持つことができる。いくつかの実施態様では、本開示の多量体リガンドは、小さな合成有機分子の二量体、又はより高次のオリゴマーであり、通常はほぼ四量体を超えることはなく、個々の分子は典型的には少なくとも約150 Daかつ約5 kDa未満であり、通常は約3 kDa未満である。多彩な合成リガンドと受容体のペアを用いることができる。例えば内在性受容体が関与する実施態様では、二量体FK506をFKBP12受容体とともに使用でき、二量体化したシクロスポリンAをシクロフィリン受容体とともに使用でき、二量体化したエストロゲンをエストロゲン受容体とともに、二量体化したグルココルチコイドをグルココルチコイド受容体とともに、二量体化したテトラサイクリンをテトラサイクリン受容体とともに、二量体化したビタミンDをビタミンD受容体ととともに使用できるなどである。あるいはより高次のリガンド（例えば三量体）を用いることができる。天然に存在しない受容体（例えば抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、可撓性リンカーによって隔てられたタンデム式の重鎖と軽鎖の可変領域からなる一本鎖抗体、又は改変された受容体、及びその変異した配列など）が関与する実施態様に関しては、多彩な化合物の任意のものを用いることができる。本開示の多量体リガンドを含むユニットの重要な1つの特徴は、各結合部位が受容体に大きな親和性で結合できること、好ましくはそれらを化学的に二量体化できることである。また、リガンドの疎水性／親水性をバランスさせて、それらリガンドが機能的なレベルで血清に溶け、しかもたいていの用途では形質膜を通過して拡散できるようにする方法を利用できる。
【０６６７】
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの活性化は、例えば誘導剤を媒介とした化学的誘導二量体化（CID）を通じて条件的に制御されたタンパク質又はポリペプチドを生成させることによって実現することができる。本開示のアポトーシス促進ポリペプチドは、不安定な二量体化剤の分解、又は単量体競合阻害剤の投与が理由で、誘導性であるだけでなく、これらポリペプチドの誘導が可逆的でもある。
【０６６８】
いくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFKBP12ポリペプチドを含んでいる。リガンド結合領域が36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFKBP12ポリペプチドを含むいくつかの実施態様では、誘導剤は、AP1903という合成薬（CASインデックス名：2-ピペリジンカルボン酸、1-[(2S)-1-オキソ-2-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ブチル]-, 1,2-エタンジイルビス[イミノ (2-オキソ-2,1-エタンジイル)オキシ-3,1-フェニレン[(1R)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)プロピリデン]]エステル、 [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS登録番号：195514-63-7；分子式：C78H98N4O20；分子量：1411.65））を含むことができる。リガンド結合領域が36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFKBP12ポリペプチドを含むいくつかの実施態様では、誘導剤は、AP20187（CAS登録番号：195514-80-8、分子式：C82H107N5O20）を含むことができる。いくつかの実施態様では、誘導剤はAP20187類似体（例えばAP1510）である。本明細書では、誘導剤AP20187、AP1903、AP1510は、交換可能に用いることができる。
【０６６９】
AP1903 APIは、Alphora Research Inc.社によって製造されており、注射用のAP1903薬製品はFormatech Inc.社によって製造されている。それは、非イオン性可溶剤Solutol HS 15の25％溶液（250 mg/ml、BASF社）の中のAP1903の5 mg/ml溶液として製剤化されている。室温ではこの製剤は、透明なわずかに黄色い溶液である。冷却するとこの製剤は可逆的な転移を起こし、ミルク状の溶液になる。この相転移は、再度室温まで温めると逆転する。充填体積は、3 mlのガラス製バイアルに2.33 mlである（1つのバイアルにつき合計で注射用の約10 mgのAP1903）。AP1903の投与が必要であると判断されると、患者には、非DEHP非エチレンオキシド殺菌輸液セットを使用して、例えば単一固定用量の注射用AP1903（0.4 mg/kg）を2時間かけて静脈内輸液によって投与することができる。AP1903の用量は、すべての患者について個別に計算され、体重が10％以上変動する場合を除いて再計算されることはない。計算された用量は、100 mlの通常の0.9％生理食塩水の中で希釈された後に輸液される。AP1903に関する以前の第I相試験では、24人の健康なボランティアが、単一用量の注射用AP1903を0.01、0.05、0.1、0.5、及び1.0 mg/kgの用量レベルで2時間かけて静脈内に輸液する治療を受けた。最初の輸液期間の後、血中濃度は急速分布相を示し、血漿レベルは、投与してから0.5時間後、2時間後、及び10時間後に、最大濃度が約18％、7％、及び1％にそれぞれ低下した。注射用AP1903は安全であってあらゆる用量レベルでよく忍容されることが示されるとともに、好ましい薬物動態プロファイルであることが実証された。Iuliucci J D他、J Clin Pharmacol. 第41巻：870〜879ページ、2001年。
【０６７０】
使用した固定用量の注射用AP1903は、例えば0.4 mg/kgを2時間かけて静脈内に輸液することができる。インビトロで細胞の有効なシグナル伝達に必要なAP1903の量は、10〜100 nM（1600 Da MW）である。これは、16〜160μg/l、又は約0.016〜1.6μg/kg（1.6〜160μg/kg）に等しい。1 mg/kgまでの用量が、上記のAP1903の第I相試験ではよく忍容された。したがって0.4 mg/kgは、治療細胞と組み合わせた第I相試験でのAP1903の安全かつ有効な用量である可能性がある。
【０６７１】
本開示のリガンド結合領域をコードするアミノ酸及び／又は核酸配列は、野生型アミノ酸配列又は核酸配列と比べて1つまたは複数の修飾を持つ配列を含むことができる。例えば本開示のリガンド結合領域をコードするアミノ酸及び／又は核酸配列として、コドンが最適化された配列が可能である。1つまたは複数の修飾は、本開示のリガンド結合領域に関してリガンド（例えば誘導剤）の結合親和性を野生型ポリペプチドと比べて大きくする可能性がある。その代わりに、又はそれに加えて、1つまたは複数の修飾は、本開示のリガンド結合領域の免疫原性を野生型ポリペプチドと比べて低下させる可能性がある。本開示のリガンド結合領域及び／又は本開示の誘導剤として、天然に存在しないものが可能である。
【０６７２】
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、リガンド結合領域、リンカー、及びアポトーシス促進ペプチドを含むが、非ヒト配列は含んでいない。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。リンカーは、リガンド結合領域が二量体化したときにアポトーシス促進ポリペプチドの相互作用、架橋、交差活性化、又は活性化を可能にする任意の有機材料又は無機材料を含むことができ、アポトーシス促進ポリペプチドのその相互作用又は活性化によって細胞内でアポトーシスが開始される。いくつかの実施態様では、リンカーはポリペプチドである。いくつかの実施態様では、リンカーは、G／Sリッチアミノ酸配列を含むポリペプチドである（「GS」リンカー）。いくつかの実施態様では、リンカーは、アミノ酸配列GGGGS（配列番号18024）を含むポリペプチドである。好ましい実施態様では、リンカーはポリペプチドであり、そのポリペプチドをコードする核酸は、制限エンドヌクレアーゼのための制限部位を含んでいない。本開示のリンカーとして、天然に存在しないものが可能である。
【０６７３】
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを細胞内で発現させることが、その細胞内で本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの発現を開始及び／又は調節することのできる任意のプロモータの転写調節のもとで可能である。「プロモータ」という用語は、本明細書では、遺伝子を転写するためRNAポリメラーゼが最初に結合する部位として機能するプロモータを意味する。例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、哺乳動物細胞の中で本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの発現の開始及び／又は調節が可能な任意のプロモータ（天然のプロモータ、内在性プロモータ、外来性プロモータ、及び異種プロモータが含まれるが、これらに限定されない）の転写調節下にて、哺乳動物細胞の中で発現させることができる。好ましい哺乳動物細胞にはヒト細胞が含まれる。したがって本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、ヒト細胞の中で本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの発現の開始及び／又は調節が可能な任意のプロモータ（ヒトプロモータ又はウイルスプロモータが含まれるが、これらに限定されない）の転写調節下にて、ヒト細胞の中で発現させることができる。ヒト細胞の中で発現させるための代表的なプロモータの非限定的な例に含まれるのは、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）極初期遺伝子プロモータ、SV40初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復、β-アクチンプロモータ、ラットインスリンプロモータ、及びグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモータであり、そのそれぞれを用いて本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを高レベルに発現させることができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの発現を実現するのに本分野で周知の他のウイルスプロモータ又は哺乳動物細胞プロモータ又は細菌ファージプロモータを用いることも考えられるが、発現レベルが細胞内でアポトーシスを開始させるのに十分であることが条件である。周知の特性を有するプロモータを用いることにより、トランスフェクション又は形質転換の後の興味あるタンパク質の発現のレベルとパターンを最適化することができる。
【０６７４】
特定の生理学的シグナル又は合成シグナルに反応して調節されるプロモータを選択することにより、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの誘導的発現が可能になる。エクジソン系（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）はそのような1つの系である。この系は、哺乳動物細胞の中で興味ある遺伝子の調節された発現が可能になるように設計されている。それは、導入遺伝子の基礎発現レベルは実質的にないが、200倍を超える誘導性を可能にする厳しく調節される発現機構からなる。この系は、ショウジョウバエのヘテロダイマーエクジソン受容体に基づいており、エクジソン又は類似体（ムリステロンAなど）が受容体に結合するとき、受容体がプロモータを活性化して下流の導入遺伝子の発現をオンにすることで、高レベルのmRNA転写産物が達成される。この系では、ヘテロダイマー受容体の両方の単量体が1つのベクターから構成的に発現される一方で、興味ある遺伝子の発現を駆動するエクジソン反応性プロモータは別のプラスミド上にある。したがってこのタイプの系を操作して興味あるベクターに入れることは有用である可能性がある。有用である可能性のある別の誘導可能な系は、Tet-Off（商標）系又はTet-On（商標）系（Clontech社、パロ・アルト、カリフォルニア州）であり、そもそもはGossenとBujard (GossenとBujard、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻：5547〜5551ページ、1992年；Gossen他、Science、第268巻：1766〜1769ページ、1995年）によって開発された。この系も、テトラサイクリン又はテトラサイクリン誘導体（ドキシサイクリンなど）に反応して調節される高レベルの遺伝子発現を可能にする。Tet-On（商標）系では、ドキシサイクリンの存在下で遺伝子発現がオンにされるのに対し、Tet-Off（商標）系では、ドキシサイクリンの不在下で遺伝子発現がオンにされる。これらの系は、大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンに由来する2つの調節エレメント、すなわち（テトラサイクリンリプレッサが結合する）テトラサイクリンオペレータ配列とテトラサイクリンリプレッサ配列に基づいている。興味ある遺伝子は、プラスミドでテトラサイクリン反応性エレメントを内部に有するプロモータの背後にクローニングされる。第2のプラスミドは、テトラサイクリンに制御されるトランスアクチベータと呼ばれる調節エレメントを含んでいる。これは、Tet-Off（商標）系では、単純ヘルペスウイルスからのVP16ドメインと、野生型テトラサイクリンリプレッサで構成されている。したがってドキシサイクリンの不在下では、転写が構成的にオンにされる。Tet-On（商標）系では、テトラサイクリンリプレッサは野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下で転写が活性化される。遺伝子療法ベクターを作製するため、Tet-Off（商標）系を用いることにより、産生細胞がテトラサイクリン又はドキシサイクリンの存在下で増殖できて、潜在的に毒性の導入遺伝子の発現を阻止できるが、ベクターが患者に導入されたときには遺伝子発現が構成的にオンになるようにすることができる。
【０６７５】
いくつかの場合には、遺伝子療法ベクターの中の導入遺伝子の発現を調節することが望ましい。望む発現レベルに応じ、例えば活性の強度がさまざまな異なるウイルスベクターを使用する。哺乳動物の細胞では、強い転写活性化を提供するのにCMV極初期プロモータがしばしば用いられる。CMVプロモータは、Donnelly, J. J.他、1997年、Annu. Rev. Immunol. 第15巻：617〜648ページに概説されている。効力がより小さいCMVプロモータの改変バージョンも、導入遺伝子の低下した発現レベルが望まれるときには使用されてきた。造血細胞の中で導入遺伝子を発現させることが望ましいとき、レトロウイルスプロモータ（MLV又はMMTVからのLTRなど）がしばしば用いられる。望む効果に応じて用いられる他のウイルスプロモータに含まれるのは、SV40、RSV LTR、HIV-1 LTRとHIV-2 LTR、アデノウイルスプロモータ（E1A領域、E2A領域、又はMLP領域からのプロモータなど）、AAV LTR、HSV-TK、及びトリ肉腫ウイルスである。
【０６７６】
別の例では、プロモータは、発達的に調節されるものと、特定の分化した細胞の中で活性であるものを選択することができる。したがって、例えばプロモータは多能性幹細胞の中では活性でなくてもよいが、例えばその多能性幹細胞が分化してより成熟した細胞になると、そのプロモータは活性化される可能性がある。
【０６７７】
同様に、組織特異的プロモータを用いて特定の組織又は細胞の中で転写を実行し、標的とされない組織に対する潜在的な毒性又は望ましくない効果を減らす。これらプロモータにより、より強いプロモータ（CMVプロモータなど）と比べて発現が低下する可能性があるが、より制限された発現と免疫原性になる可能性もある（Bojak, A.他、2002年、Vaccine 第20巻：1975〜1979ページ； Cazeaux, N.他、2002年、Vaccine 第20巻：3322〜3331ページ）。例えば組織特異的プロモータ（PSA関連プロモータ又は前立腺特異的腺性カリクレイン、又は筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子など）を適切な場所で用いることができる。
【０６７８】
組織特異的又は分化特異的なプロモータの非限定的な例に含まれるのは、B29（B細胞）； CD14（単球細胞）； CD43（白血球と血小板）； CD45（造血細胞）； CD68（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ-1（膵臓腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化している細胞、治癒中の組織）； Flt-1（内皮細胞）；GFAP（アストロサイト）である。
【０６７９】
いくつかの徴候では、遺伝子療法ベクターを投与した後に転写を特定の回数活性化させることが望ましい。これは、ホルモン又はサイトカインを調節できるプロモータによってなされる。使用できるサイトカイン反応性プロモータと炎症性タンパク質反応性プロモータに含まれるのは、KキニノーゲンとTキニノーゲン（Kageyama他（1987年）J. Biol. Chem.、第262巻、2345〜2351ページ）、c-fos、TNF-アルファ、C反応性タンパク質（Arcone他（1988年）Nucl. Acids Res.、第16巻(8)、3195〜3207ページ）、ハプトグロビン（Oliviero他（1987年）EMBO J.、第6巻、1905〜1912ページ）、血清アミロイドA2、C／EBPアルファ、IL-1、IL-6（PoliとCortese、（1989年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA、第86巻、8202〜8206ページ）、補体C3（Wilson他（1990年）Mol. Cell. Biol.、6181〜6191ページ）、IL-8、アルファ-1酸性糖タンパク質（ProwseとBaumann、（1988年）Mol. Cell. Biol.、第8巻、42〜51ページ）、アルファ-1アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Zechner他、Mol. Cell. Biol.、2394〜2401ページ、1988年）、アンジオテンシノーゲン（Ron他（1991年）Mol. Cell. Biol.、2887〜2895ページ）、フィブリノーゲン、c-jun（ホルボールエステル、TNF-アルファ、UV照射、レチノイン酸、及び過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（エステルとレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属とグルココルチコイドによって誘導可能）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン-1、及びEGFによって誘導可能）、アルファ-2マクログロブリン、及びアルファ-1抗キモトリプシンである。他のプロモータに含まれるのは、例えば、SV40、MMTV、ヒト免疫不全ウイルス（MV）、モロニーウイルス、ALV、エプスタイン-バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、及びクレアチンである。
【０６８０】
上記のどのプロモータも、単独で、又は別のプロモータとの組み合わせで、望む作用に応じて有用である可能性があることが予想される。プロモータと他の調節エレメントは、望む細胞又は組織の中で機能するように選択される。それに加え、プロモータのこのリストは網羅的であるとか限定的であると見なしてはならず、他のプロモータが、本明細書に開示されているプロモータ及び方法と組み合わせて使用される。
武装化T細胞「ノックダウン」戦略
【０６８１】
本開示のT細胞の遺伝子を改変してその治療能力を増強することができる。その代わりに、又はそれに加えて、本開示のT細胞を改変して免疫学的チェックポイント及び／又は代謝的チェックポイントに対する感受性を低下させることができる。このタイプの改変によって本開示のT細胞を「武装化」する。改変後のT細胞を、本明細書では「武装化」T細胞と呼ぶことができる。本開示の武装化T細胞は、例えば免疫抑制性腫瘍微小環境内において、例えばT細胞に送達される特定のチェックポイントシグナルを阻止及び／又は希釈すること（すなわちチェックポイント抑制）によって生成させることができる。
【０６８２】
いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、T細胞、NK細胞、造血前駆細胞、末梢血（PB）由来T細胞（G-CSF動員末梢血から単離されたT細胞、又はG-CSF動員末梢血に由来するT細胞が含まれる）、又は臍帯血（UCB）由来T細胞に由来する。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、本開示の1つまたは複数のキメラリガンド受容体（単一ドメイン抗体を含むCLR）／キメラ抗原受容体（足場タンパク質、抗体、ScFv、又は抗体模倣体を含むCAR）、CARTyrin（Cenyrinを含むCAR）、及び／又はVCAR（ラクダVHH又は単一ドメインVHを含むCAR）を含んでいる。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、（a）リガンド結合領域、（b）リンカー、及び（c）切断型カスパーゼ9を含む誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含んでいて、この誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは非ヒト配列を含んでいない。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位である。いくつかの実施態様では、誘導性カスパーゼポリペプチドのリガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列の36位に修飾を含んでいる。いくつかの実施態様では、修飾は、36位におけるフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換である（F36V）。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、外来性配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、外来性配列は、治療用タンパク質をコードする配列を含んでいる。代表的な治療用タンパク質として、核タンパク質、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞表面結合タンパク質、又は分泌タンパク質が可能である。武装化T細胞によって発現される代表的な治療用タンパク質は、武装化T細胞の活性を変化させること、又は第2の細胞の活性を変化させることができる。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、選択遺伝子、又は選択マーカーを含んでいる。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、合成遺伝子発現カセット（本明細書では、誘導性導入遺伝子コンストラクトとも呼ばれる）を含んでいる。
【０６８３】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して抑制性チェックポイントシグナルの受容体をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を沈黙又は低下させ、本開示の武装T細胞を生成させる。代表的な抑制性チェックポイントシグナルの非限定的な例に含まれるのは、本開示のCAR-T細胞上のPD-1受容体に結合するPD-L1リガンド、又はCAR-T細胞上のTGFβRII受容体に結合するTGFβサイトカインである。抑制性チェックポイントシグナルの受容体は、T細胞の表面で、又はT細胞の細胞質内で発現する。抑制性チェックポイントシグナルの受容体をコードする遺伝子の発現を沈黙又は低下させると、本開示の武装化T細胞の表面又は細胞質内の抑制性チェックポイント受容体のタンパク質発現が失われる。したがって抑制性チェックポイント受容体をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現が沈黙又は低下した本開示の武装化T細胞は、チェックポイントシグナルに対して抵抗性、非受容性、又は非感受性である。抑制性チェックポイントシグナルに対する武装化T細胞の抵抗性又は低下した感受性は、これら抑制性チェックポイントシグナルの存在下における武装化T細胞の治療能力を増強する。抑制性チェックポイントシグナルの非限定的な例に含まれるのは、表1に掲載されている例である。本開示の武装化T細胞において沈黙させることのできる代表的な抑制性チェックポイントシグナルの非限定的な例に含まれるのは、PD-1とTGFβRIIである。
【０６８４】
【化６−１】
2021507703.tif 000010
【化６−２】
2021507703.tif 000011
【化６−３】
2021507703.tif 000012
【０６８５】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変してチェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内タンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を沈黙又は低下させ、本開示の武装T細胞を生成させる。本開示のT細胞の活性は、チェックポイントシグナル伝達経路に関与する任意の細胞内シグナル伝達タンパク質を標的とすることによって増強することができ、そのことによって1つ又は複数のチェックポイント経路へのチェックポイント抑制又はチェックポイント干渉が実現される。チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内シグナル伝達タンパク質の非限定的な例に含まれるのは、表2に提示されている代表的な細胞内シグナル伝達タンパク質である。
【０６８６】
【化７】
2021507703.tif 000013
【０６８７】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して治療の効力を妨げる転写因子をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を沈黙又は低下させ、本開示の武装T細胞を生成させる。武装T細胞の活性は、治療の効力を妨げる転写因子の発現を沈黙又は低下させる（又は機能を抑える）ことによって増強すること、又は変化させることができる。改変して発現を沈黙又は低下させる、又はその機能を抑えることのできる代表的な転写因子の非限定的な例は表3に提示されている代表的な転写因子である。例えばFOXP3遺伝子の発現を本開示の武装T細胞の中で沈黙又は低下させ、T調節性CAR-T細胞（CAR-Treg細胞）（その発現又は活性が治療の効力を低下させる可能性がある）の形成を阻止する、又は低下させることができる。
【０６８８】
【化８−１】
2021507703.tif 000014
【化８−２】
2021507703.tif 000015
【化８−３】
2021507703.tif 000016
【化８−４】
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【化８−５】
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【化８−６】
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【化８−７】
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【化８−８】
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【化８−９】
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【化８−１０】
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【化８−１１】
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【化８−１２】
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【化８−１３】
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【化８−１４】
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【化８−１５】
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【化８−１６】
2021507703.tif 000029
【化８−１７】
2021507703.tif 000030
【化８−１８】
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【化８−１９】
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【化８−２０】
2021507703.tif 000033
【化８−２１】
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【化８−２２】
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【化８−２３】
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【化８−２４】
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【化８−２５】
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【化８−２６】
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【化８−２７】
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【化８−２８】
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【化８−２９】
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【化８−３０】
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【化８−３１】
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【化８−３２】
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【化８−３３】
2021507703.tif 000046
【化８−３４】
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【化８−３５】
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【化８−３６】
2021507703.tif 000049
【化８−３７】
2021507703.tif 000050
【化８−３８】
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【化８−３９】
2021507703.tif 000052
【０６８９】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して細胞死又は細胞アポトーシスの受容体をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を沈黙又は低下させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。死受容体とその内在性リガンドが相互作用するとアポトーシスが開始される。細胞死及び／又は細胞アポトーシスの受容体及び／又はリガンドの発現、活性、又は相互作用を阻害すると、本開示の武装化T細胞が死シグナルをより受けにくくなり、その帰結として本開示の武装化T細胞が腫瘍環境においてより効果的になる。本開示の武装化T細胞で改変することのできる細胞死受容体の一例はFas（CD95）である。本開示の代表的な細胞死及び／又は細胞アポトーシスの受容体とリガンドの非限定的な例に含まれるのは、表4に提示されている代表的な受容体とリガンドである。
【０６９０】
【化９】
2021507703.tif 000053
【０６９１】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して代謝感知タンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を沈黙又は低下させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。本開示の武装化T細胞によって免疫抑制性腫瘍微小環境の代謝的感知が阻害されることで（酸素、pH、グルコース、及び他の分子のレベルによって特徴づけられる）、T細胞機能の保持が延長され、その帰結として1つの武装化T細胞が殺す腫瘍細胞がより多くなる。例えばHIF1aとVHLは、低酸素環境にある間、T細胞が機能する上である役割を果たす。本開示の武装化T細胞は、HIF1a又はVHLをコードする 1つまたは複数の遺伝子の発現を沈黙又は低下させた可能性がある。代謝感知に関与する遺伝子とタンパク質の非限定的な例に含まれるのは、表5に提示されている代表的な遺伝子とタンパク質である。
【０６９２】
【化１０−１】
2021507703.tif 000054
【化１０−２】
2021507703.tif 000055
【０６９３】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して癌療法（モノクローナル抗体が含まれる）に対する感受性を与えるタンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を沈黙又は低下させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。したがって本開示の武装化T細胞は機能することができ、癌療法（例えば化学療法、モノクローナル抗体療法、又は別の抗腫瘍治療）の存在下で優れた機能又は効力を実証する可能性がある。癌療法に対する感受性を与えるのに関与するタンパク質の非限定的な例に含まれるのは、表6に提示されている代表的なタンパク質である。
【０６９４】
【化１１】
2021507703.tif 000056
【０６９５】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して増殖促進因子をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を沈黙又は低下させ、武装化T細胞を生成させる。がん遺伝子の発現を沈黙又は低下させると、本開示の武装化T細胞の増殖が有利になる可能性がある。例えばCAR-T製造プロセスの間にTET2遺伝子の発現を沈黙又は低下させる（例えば発現の阻害）と、増殖能力が欠けた非武装化CAR-Tと比べて増殖とその後の腫瘍根絶の能力が顕著な武装化CAR-Tが生成する。この戦略は安全スイッチ（例えば本開示のiC9安全スイッチ）と組み合わせることが可能であり、そうすることで、対象からの有害反応、又は武装化CAR-Tの制御されない増殖が発生した場合に武装化CAR-Tを標的とした破壊が可能になる。代表的な増殖促進因子の非限定的な例に含まれるのは、表7に提示されている因子である。
【０６９６】
【化１２】
2021507703.tif 000057
武装化T細胞「ヌル又はスイッチ受容体」戦略
【０６９７】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して改変された／キメラチェックポイント受容体を発現させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。
【０６９８】
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含んでいる。本開示のヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体として、改変された／キメラ受容体／タンパク質が可能である。本開示のヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを発現させるために切断することができる。その代わりに、又はそれに加えて、本開示のヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメイン内にあって有効なシグナル伝達にとって決定的な、又は必要な1つまたは複数のアミノ酸位置で変異させることができる。本開示のヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体の切断又は変異により、受容体がチェックポイントシグナルを細胞又は細胞内に運ぶ能力又は伝達する能力が失われる可能性がある。
【０６９９】
例えば腫瘍細胞の表面に発現するPD-L1受容体からの免疫抑制性チェックポイントシグナルの希釈又は阻止は、改変された／キメラPD-1ヌル受容体を本開示の武装化T細胞の表面に発現させることによって実現できる。そうすることで改変された／キメラPD-1ヌル受容体は、武装化T細胞の表面にやはり発現している内在性（改変されていない）PD-1受容体と効果的に競合し、武装化T細胞の内在性PD-1受容体を通じて免疫抑制チェックポイントシグナルの伝達を低下させる、又は抑制する。この代表的な実施態様では、腫瘍細胞の表面に発現するPD-L1への結合に関して2つの異なる受容体の間で競合することで、有効なチェックポイントシグナル伝達のレベルが低下又は減少し、そのことによってPD-1ヌル受容体を発現する武装化T細胞の治療能力が増強される。
【０７００】
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、膜貫通受容体であるヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含んでいる。
【０７０１】
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、膜に関連した、又は膜に結合した受容体／タンパク質であるヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含んでいる。
【０７０２】
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、細胞内受容体／タンパク質であるヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含んでいる。
【０７０３】
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、細胞内受容体／タンパク質であるヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含んでいる。本開示の代表的なヌル細胞内受容体／タンパク質、デコイ細胞内受容体／タンパク質、又はドミナントネガティブ細胞内受容体／タンパク質の非限定的な例に含まれるのは、抑制性チェックポイントシグナル（例えば表1と表2に提示されているもの）、転写因子（例えば表3に提示されているもの）、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死又はアポトーシスの受容体／リガンド（例えば表4に提示されているもの）、代謝感知分子（例えば表5に提示されているもの）、癌療法に対する感受性を与えるタンパク質（例えば表6に提示されているもの）、及びがん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子（例えば表7に提示されているもの）の下流のシグナル伝達成分である。本開示の代表的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、及びケモカイン受容体の非限定的な例に含まれるのは、表8に提示されているサイトカイン及びサイトカイン受容体と、ケモカイン及びケモカイン受容体である。
【０７０４】
【化１３−１】
2021507703.tif 000058
【化１３−２】
2021507703.tif 000059
【化１３−３】
2021507703.tif 000060
【化１３−４】
2021507703.tif 000061
【化１３−５】
2021507703.tif 000062
【０７０５】
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、スイッチ受容体を含んでいる。代表的なスイッチ受容体は、本開示の改変された／キメラ受容体／タンパク質を含むことができ、天然又は野生型の細胞内シグナル伝達ドメインが、そのタンパク質にとって天然ではない、及び／又は野生型ドメインではない異なる細胞内シグナル伝達ドメインに切り換えられる、又は置き換えられる。例えば抑制性シグナル伝達ドメインを刺激性シグナル伝達ドメインで置き換えると、免疫抑制性シグナルが免疫刺激性シグナルに切り換わると考えられる。あるいは抑制性シグナル伝達ドメインを異なる抑制性ドメインで置き換えると、抑制性シグナル伝達のレベルを低下又は上昇させることができる。スイッチ受容体の発現又は過剰発現により、免疫抑制性腫瘍微小環境内で発現しているコグネイトチェックポイント受容体への結合に関する内在性野生型チェックポイント受容体（スイッチ受容体ではない）との競合を通じてコグネイトチェックポイントシグナルの希釈及び／又は阻止が起こる可能性がある。本開示の武装化T細胞は、本開示のスイッチ受容体をコードする配列を含むことができるため、本開示の1つまたは複数のスイッチ受容体の発現につながり、その帰結として本開示の武装化T細胞の活性が変化する。本開示の武装化T細胞は、本開示のチェックポイント受容体、転写因子、サイトカイン受容体、死受容体、代謝感知分子、癌療法、がん遺伝子、及び／又は腫瘍抑制タンパク質又は遺伝子の下流で細胞内発現しているタンパク質を標的とする本開示のスイッチ受容体を発現することができる。
【０７０６】
本開示の代表的なスイッチ受容体は、抑制性チェックポイントシグナル（例えば表1と表2に提示されているもの）、転写因子（例えば表3に提示されているもの）、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死又はアポトーシスの受容体／リガンド（例えば表4に提示されているもの）、代謝感知分子（例えば表5に提示されているもの）、癌療法に対する感受性を与えるタンパク質（例えば表6に提示されているもの）、及びがん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子（例えば表7に提示されているもの）の下流のシグナル伝達成分を非限定的な例として含むタンパク質を含むこと、又はこれらタンパク質に由来することが可能である。本開示の代表的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、及びケモカイン受容体の非限定的な例に含まれるのは、表8に提示されているサイトカイン及びサイトカイン受容体と、ケモカイン及びケモカイン受容体である。
武装化T細胞 - 条件的遺伝子発現系
【０７０７】
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して条件的遺伝子発現を媒介するキメラリガンド受容体（CLR）又はキメラ抗原受容体（CAR）を発現させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。武装化T細胞の核におけるCLR／CARと条件的遺伝子発現系の組み合わせが、コグネイトリガンドがCLRに結合するか、コグネイト抗原がCARに結合すると条件的に活性化される合成遺伝子発現系を構成する。この系は、例えばリガンド又は抗原が結合する部位において、腫瘍環境において、又は腫瘍環境内において合成遺伝子の発現を低下させる、又は制限することにより、改変されたT細胞の治療能力を「武装化する」又は増強するのを助けることができる。
外来性受容体
【０７０８】
いくつかの実施態様では、武装化T細胞は、（a）誘導性プロモータをコードする配列と導入遺伝子をコードする配列を含む誘導性導入遺伝子コンストラクト、及び（b）構成的プロモータをコードする配列と外来性受容体（CLR、CARなど）をコードする配列を含む受容体コンストラクトを含む組成物を含んでおり、（a）のコンストラクトと（b）のコンストラクトが細胞のゲノム配列に組み込まれると外来性受容体が発現し、その外来性受容体は、リガンド又は抗原が結合すると、誘導性導入遺伝子（a）の発現を調節する誘導性プロモータを直接又は間接に標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子の発現を変化させる。
【０７０９】
本開示の合成遺伝子発現系のいくつかの実施態様では、組成物は、遺伝子の発現を低下させることによって遺伝子の発現を変化させる。いくつかの実施態様では、組成物は、遺伝子の発現を一過性に（例えばリガンドが外来性受容体に結合している間）変化させることによって遺伝子の発現を変化させる。いくつかの実施態様では、組成物は、遺伝子の発現を急に変化させる（例えばリガンドが外来性受容体に可逆的に結合する）。いくつかの実施態様では、組成物は、遺伝子の発現を慢性的に変化させる（例えばリガンドが外来性受容体に不可逆的に結合する）。
【０７１０】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、細胞のゲノム配列に対して内在性である受容体を含んでいる。代表的な受容体の非限定的な例に含まれるのは、細胞内受容体、細胞表面受容体、膜貫通受容体、リガンド依存性イオンチャネル、及びGタンパク質共役受容体である。
【０７１１】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、合成受容体、改変された受容体、組換え受容体、変異受容体、又はキメラ受容体である。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、T細胞受容体（TCR）から単離された、又はTCRに由来する1つまたは複数の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、足場タンパク質から単離された、又は足場タンパク質に由来する1つまたは複数の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体が膜貫通ドメインを含まない実施態様を含め、天然に存在しない受容体は、第2の膜貫通受容体、膜結合受容体、及び／又は細胞内受容体と相互作用し、天然に存在しない受容体と接触した後に細胞内シグナルを伝達する。
【０７１２】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、合成受容体、改変された受容体、組換え受容体、変異受容体、又はキメラ受容体である。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、T細胞受容体（TCR）から単離された、又はTCRに由来する1つまたは複数の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、足場タンパク質から単離された、又は足場タンパク質に由来する1つまたは複数の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、膜貫通ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用する。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体はキメラリガンド受容体（CLR）である。いくつかの実施態様では、CLRはキメラ抗原受容体（CAR）である。
【０７１３】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、CLRは、キメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの実施態様では、キメラリガンド受容体は、（a）リガンド認識領域を含むエクトドメイン（ここで、リガンド認識領域は少なくとも1つの足場タンパク質を含む）；（b）膜貫通ドメイン；及び（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、（a）のエクトドメインは、シグナルペプチドを更に含んでいる。いくつかの実施態様では、エクトドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジを更に含んでいる。
【０７１４】
本開示のCLR／CARのいくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、ヒトのCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB、又はGM-CSFRシグナルペプチドをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、ヒトCD8αシグナルペプチドをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号17503）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、
atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca（配列番号17504）を含む核酸配列によってコードされている。
【０７１５】
本開示のCLR／CARのいくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒトのCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB、又はGM-CSFR膜貫通ドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α膜貫通ドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号17505）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、
atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc（配列番号17506）を含む核酸配列によってコードされている。
【０７１６】
本開示のCLR／CARのいくつかの実施態様では、エンドドメインは、ヒトCD3ζエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトの4-1BB、CD28、CD3ζ、CD40、ICOS、MyD88、OX-40細胞内セグメント、又はそれらの任意の組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトCD3ζ共刺激ドメイン及び／又は4-1BB共刺激ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、CD3ζ共刺激ドメインは、
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号17507）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、CD3ζ共刺激ドメインは、
cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg（配列番号17508）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、4-1BB共刺激ドメインは、KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号17509）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、4-1BB共刺激ドメインは、
aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg（配列番号17510）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、4-1BB共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとCD3ζ共刺激ドメインの間に位置する。
本開示のCLR／CARのいくつかの実施態様では、ヒンジは、ヒトのCD8α、IgG4、及び／又はCD4配列に由来する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヒンジは、ヒトCD8α配列に由来する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヒンジは、
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号17511）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヒンジは、
actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac（配列番号17512）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、ヒンジは、
ACCACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCCACACCCGCCCCTACCATCGCGAGTCAGCCCCTGAGTCTGAGACCTGAGGCCTGCAGGCCAGCTGCAGGAGGAGCTGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC（配列番号17513）によってコードされている。
【０７１７】
いくつかの実施態様では、少なくとも1つの足場タンパク質はリガンドに特異的に結合する。
【０７１８】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、CLRは、キメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの実施態様では、キメラリガンド受容体は、（a）リガンド認識領域を含むエクトドメイン（ここで、リガンド認識領域は少なくとも1つの足場タンパク質を含む）；（b）膜貫通ドメイン；及び（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、その少なくとも1つの足場タンパク質は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、抗体模倣体、又はCentyrin（本明細書ではCARTyrinと呼ぶ）を含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド認識領域は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、抗体模倣体、及びCentyrinの1つまたは複数を含んでいる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、VHH又はVH（本明細書ではVCARと呼ぶ）を含むか、VHH又はVHからなる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト相補性決定領域（CDR）を含むVHH又はVHを含むか、そのVHH又はVHからなる。いくつかの実施態様では、VHは、組換えタンパク質又はキメラタンパク質である。いくつかの実施態様では、VHは、組換えヒトタンパク質又はキメラヒトタンパク質である。いくつかの実施態様では、抗体模倣体は、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、DARPin、Fynomer、クニッツドメインペプチド、又はモノボディを含むか、これらからなる。いくつかの実施態様では、Centyrinは、少なくとも1つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインのコンセンサス配列を含むか、そのコンセンサス配列からなる。
【０７１９】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、CLRは、キメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの実施態様では、キメラリガンド受容体は、（a）リガンド認識領域を含むエクトドメイン（ここで、リガンド認識領域は少なくとも1つの足場タンパク質を含む）；（b）膜貫通ドメイン；及び（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、Centyrinは、少なくとも1つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインのコンセンサス配列を含むか、そのコンセンサス配列からなる。いくつかの実施態様では、その少なくとも1つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインは、ヒトタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、そのヒトタンパク質は、テネイシンCである。いくつかの実施態様では、コンセンサス配列は、
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号17514）を含んでいる。いくつかの実施態様では、コンセンサス配列は、
MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号17515）を含んでいる。いくつかの実施態様では、コンセンサス配列は、1つまたは複数の位置における修飾を、（a）コンセンサス配列の13〜16位にアミノ酸残基TEDS（配列番号17516）を含むか、そのアミノ酸残基からなるA-Bループの中；（b）コンセンサス配列の22〜28位にアミノ酸残基TAPDAAF（配列番号17517）を含むか、そのアミノ酸残基からなるB-Cループの中；（c）コンセンサス配列の38〜43位にアミノ酸残基SEKVGE（配列番号17518）を含むか、そのアミノ酸残基からなるC-Dループの中；（d）コンセンサス配列の51〜54位にアミノ酸残基GSER（配列番号17519）を含むか、そのアミノ酸残基からなるD-Eループの中；（e）コンセンサス配列の60〜64位にアミノ酸残基GLKPG（配列番号17520）を含むか、そのアミノ酸残基からなるE-Fループの中；（f）コンセンサス配列の75〜81位にアミノ酸残基KGGHRSN（配列番号17521）を含むか、そのアミノ酸残基からなるF-Gループの中；又は（g）（a）〜（f）の任意の組み合わせの中に有する。いくつかの実施態様では、Centyrinは、少なくとも5つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインからなるコンセンサス配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、Centyrinは、少なくとも10個のフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインからなるコンセンサス配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、Centyrinは、少なくとも15個のフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインからなるコンセンサス配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、足場は、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、10-12M以下、10-13M以下、10-14M以下、及び10-15M以下のKDで抗原に結合する。いくつかの実施態様では、KDは表面プラズモン共鳴によって求められる。
誘導性プロモータ
【０７２０】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（a）の誘導性プロモータをコードする配列は、NFκBプロモータをコードする配列を含んでいる。本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（a）の誘導性プロモータをコードする配列は、インターフェロン（IFN）プロモータをコードする配列、又はインターロイキン-2プロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、インターフェロン（IFN）プロモータは、IFNγプロモータである。本開示の組成物のいくつかの実施態様では、誘導性プロモータは、サイトカイン又はケモカインのプロモータから単離されるか、そのプロモータに由来する。いくつかの実施態様では、サイトカイン又はケモカインに含まれるのは、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A／F、IL21、IL22、IL23、トランスフォーミング増殖因子ベータ（TGFβ）、コロニー刺激因子2（GM-CSF）、インターフェロン-ガンマ（IFNγ）、腫瘍壊死因子（TNFα）、LTα、パーフォリン、グランザイムC（Gzmc）、グランザイムB（Gzmb）、C-Cモチーフケモカインリガンド5（CCL5）、C-Cモチーフケモカインリガンド4（Ccl4）、C-Cモチーフケモカインリガンド3（Ccl3）、X-Cモチーフケモカインリガンド1（Xcl1）、及びLIFインターロイキン6ファミリーサイトカイン（Lif）である。
【０７２１】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、誘導性プロモータは、細胞の分化、活性化、疲弊、機能に関与する表面タンパク質を含む遺伝子のプロモータから単離されるか、そのプロモータに由来する。いくつかの実施態様では、遺伝子に、CD69、CD71、CTLA4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM-3、GITR、MHCII、COX-2、FASL、及び4-1BBが含まれる。
【０７２２】
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、誘導性プロモータは、CDの代謝と分化に関与する遺伝子のプロモータから単離されるか、そのプロモータに由来する。本開示の組成物のいくつかの実施態様では、誘導性プロモータは、Nr4a1、Nr4a3、Tnfrsf9（4-1BB）、Sema7a、Zfp36l2、Gadd45b、Dusp5、Dusp6、及びNeto2から単離されるか、これらに由来する。
誘導性導入遺伝子
【０７２３】
いくつかの実施態様では、誘導性導入遺伝子コンストラクトは、抑制性チェックポイントシグナル（例えば表1と表2に提示されているもの）、転写因子（例えば表3に提示されているもの）、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死またはアポトーシスの受容体／リガンド（例えば表4に提示されているもの）、代謝感知分子（例えば表5に提示されているもの）、癌療法に対する感受性を与えるタンパク質（例えば表6または表9に提示されているもの）、及びがん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（例えば表7に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素を含むか、それらの発現を駆動する。本開示の代表的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、及びケモカイン受容体の非限定的な例に含まれるのは、表8に提示されているサイトカイン及びサイトカイン受容体と、ケモカイン及びケモカイン受容体である。
【０７２４】
【化１４−１】
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【化１４−２】
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【化１４−３】
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【化１４−４】
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【化１４−５】
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【化１４−６】
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【化１４−７】
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【化１４−８】
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【化１４−９】
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【化１４−１０】
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【化１４−１９】
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【化１４−３８】
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【化１４−３９】
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【化１４−４０】
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【化１４−４１】
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【化１４−４２】
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【化１４−４３】
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【化１４−４４】
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【化１４−４５】
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【化１４−４６】
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【化１４−４７】
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【化１４−４８】
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【化１４−４９】
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【化１４−５０】
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【化１４−５１】
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【化１４−５２】
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【化１４−５３】
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【化１４−５４】
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【化１４−５５】
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【化１４−５６】
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【化１４−５７】
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【化１４−５８】
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【化１４−５９】
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【化１４−６０】
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【化１４−６１】
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【化１４−６２】
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【化１４−６３】
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【化１４−６４】
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【化１４−６５】
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【化１４−６６】
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【化１４−６７】
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【化１４−６８】
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【化１４−６９】
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【化１４−７０】
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【化１４−７１】
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【化１４−７２】
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【化１４−７３】
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【化１４−７４】
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【化１４−７５】
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【化１４−７６】
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【化１４−７７】
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【化１４−７８】
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【化１４−７９】
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【化１４−８０】
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【化１４−８１】
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【化１４−８２】
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【化１４−８３】
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【化１４−８４】
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【化１４−８５】
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【化１４−８６】
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【化１４−８７】
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【化１４−８８】
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【化１４−８９】
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【化１４−９０】
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【化１４−９１】
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【化１４−９２】
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【化１４−９３】
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【化１４−９４】
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【化１４−９５】
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【化１４−９６】
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【化１４−９７】
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【化１４−９８】
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【化１４−９９】
2021507703.tif 000161
【化１４−１００】
2021507703.tif 000162
Cas-Clover
【０７２５】
本開示により、ガイドRNAと、融合タンパク質、又はその融合タンパク質をコードする配列を含む組成物が提供される。ただしその融合タンパク質は、dCas9と、Clo51エンドヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインを含んでいる。
小さなCas9（SaCas9）
【０７２６】
本開示により、エフェクタに機能可能に連結された小さなCas9（SaCas9）を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、本開示により、DNA局在成分とエフェクタ分子（ここで、エフェクタは、小さなCas9（SaCas9）を含む）を含む、主にそれらからなる、又はそれらからなる融合タンパク質が提供される。いくつかの実施態様では、本開示の小さなCas9コンストラクトは、IIS型エンドヌクレアーゼを含むエフェクタを含んでいる。
【０７２７】
活性な触媒部位を有する黄色ブドウ球菌Cas9のアミノ酸配列。
1    mkrnyilgld igitsvgygi idyetrdvid agvrlfkean vennegrrsk rgarrlkrrr
61   rhriqrvkkl lfdynlltdh selsginpye arvkglsqkl seeefsaall hlakrrgvhn
121  vneveedtgn elstkeqisr nskaleekyv aelqlerlkk dgevrgsinr fktsdyvkea
181  kqllkvqkay hqldqsfidt yidlletrrt yyegpgegsp fgwkdikewy emlmghctyf
241  peelrsvkya ynadlynaln dlnnlvitrd enekleyyek fqiienvfkq kkkptlkqia
301  keilvneedi kgyrvtstgk peftnlkvyh dikditarke iienaelldq iakiltiyqs
361  sediqeeltn lnseltqeei eqisnlkgyt gthnlslkai nlildelwht ndnqiaifnr
421  lklvpkkvdl sqqkeipttl vddfilspvv krsfiqsikv inaiikkygl pndiiielar
481  eknskdaqkm inemqkrnrq tnerieeiir ttgkenakyl iekiklhdmq egkclyslea
541  ipledllnnp fnyevdhiip rsvsfdnsfn nkvlvkqeen skkgnrtpfq ylsssdskis
601  yetfkkhiln lakgkgrisk tkkeylleer dinrfsvqkd finrnlvdtr yatrglmnll
661  rsyfrvnnld vkvksinggf tsflrrkwkf kkernkgykh haedaliian adfifkewkk
721  ldkakkvmen qmfeekqaes mpeieteqey keifitphqi khikdfkdyk yshrvdkkpn
781  relindtlys trkddkgntl ivnnlnglyd kdndklkkli nkspekllmy hhdpqtyqkl
841  klimeqygde knplykyyee tgnyltkysk kdngpvikki kyygnklnah lditddypns
901  rnkvvklslk pyrfdvyldn gvykfvtvkn ldvikkenyy evnskcyeea kklkkisnqa
961  efiasfynnd likingelyr vigvnndlln rievnmidit yreylenmnd krppriikti
1021 asktqsikky stdilgnlye vkskkhpqii kkg（配列番号18040）。
不活性化された小さなCas9（dSaCas9）
【０７２８】
本開示により、エフェクタに機能可能に連結された不活性化された小さなCas9（dSaCas9）を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、本開示により、DNA局在成分とエフェクタ分子（ここで、エフェクタは、不活性化された小さなCas9（dSaCas9）を含む）を含む、主にそれらからなる、又はそれらからなる融合タンパク質が提供される。いくつかの実施態様では、本開示の不活性化された小さなCas9（dSaCas9）コンストラクトは、IIS型エンドヌクレアーゼを含むエフェクタを含むことができる。
【０７２９】
dSaCas9配列：D10A変異とN580A変異（太字、大文字、及び下線）が触媒部位を不活性化する。
1    mkrnyilglA igitsvgygi idyetrdvid agvrlfkean vennegrrsk rgarrlkrrr
61   rhriqrvkkl lfdynlltdh selsginpye arvkglsqkl seeefsaall hlakrrgvhn
121  vneveedtgn elstkeqisr nskaleekyv aelqlerlkk dgevrgsinr fktsdyvkea
181  kqllkvqkay hqldqsfidt yidlletrrt yyegpgegsp fgwkdikewy emlmghctyf
241  peelrsvkya ynadlynaln dlnnlvitrd enekleyyek fqiienvfkq kkkptlkqia
301  keilvneedi kgyrvtstgk peftnlkvyh dikditarke iienaelldq iakiltiyqs
361  sediqeeltn lnseltqeei eqisnlkgyt gthnlslkai nlildelwht ndnqiaifnr
421  lklvpkkvdl sqqkeipttl vddfilspvv krsfiqsikv inaiikkygl pndiiielar
481  eknskdaqkm inemqkrnrq tnerieeiir ttgkenakyl iekiklhdmq egkclyslea
541  ipledllnnp fnyevdhiip rsvsfdnsfn nkvlvkqeeA skkgnrtpfq ylsssdskis
601  yetfkkhiln lakgkgrisk tkkeylleer dinrfsvqkd finrnlvdtr yatrglmnll
661  rsyfrvnnld vkvksinggf tsflrrkwkf kkernkgykh haedaliian adfifkewkk
721  ldkakkvmen qmfeekqaes mpeieteqey keifitphqi khikdfkdyk yshrvdkkpn
781  relindtlys trkddkgntl ivnnlnglyd kdndklkkli nkspekllmy hhdpqtyqkl
841  klimeqygde knplykyyee tgnyltkysk kdngpvikki kyygnklnah lditddypns
901  rnkvvklslk pyrfdvyldn gvykfvtvkn ldvikkenyy evnskcyeea kklkkisnqa
961  efiasfynnd likingelyr vigvnndlln rievnmidit yreylenmnd krppriikti
1021 asktqsikky stdilgnlye vkskkhpqii kkg（配列番号18041）。
不活性化されたCas9（dCas9）
【０７３０】
本開示により、不活性化されたCas9（dCas9）に機能可能に連結された組成物が提供される。いくつかの実施態様では、本開示により、DNA局在成分とエフェクタ分子（ここで、エフェクタは、不活性化されたCas9（dCas9）を含む）を含む、主にそれらからなる、又はそれらからなる融合タンパク質が提供される。いくつかの実施態様では、本開示の不活性化されたCas9（dCas9）コンストラクトは、IIS型エンドヌクレアーゼを含むエフェクタを含むことができる。
【０７３１】
いくつかの実施態様では、本開示のdCas9は、化膿性ブドウ球菌から単離された、又は化膿性ブドウ球菌に由来するdCas9を含んでいる。いくつかの実施態様では、dCas9は、dCas9のアミノ酸配列の10位と840位に触媒部位を不活性化する置換を有するdCas9を含んでいる。いくつかの実施態様では、これら置換はD10AとH840Aである。いくつかの実施態様では、dCas9のアミノ酸配列は、
1  XDKKYSIGLA IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE 
61 ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG 
121 NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD 
181 VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN 
241 LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI 
301 LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA 
361 GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH 
421 AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE 
481 VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL 
541 SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI 
601 IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG 
661 RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL 
721 HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER 
781 MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVDA 
841 IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEVVKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL 
901 TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS 
961 KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK 
1021 MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF 
1081 ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA 
1141 YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK 
1201 YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE 
1261 QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA 
1321 PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGD（配列番号18042）の配列を含んでいる。
【０７３２】
いくつかの実施態様では、dCas9のアミノ酸配列は、
1  MDKKYSIGLA IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE 
61 ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG 
121 NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD 
181 VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN 
241 LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI 
301 LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA 
361 GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH 
421 AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE 
481 VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL 
541 SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI 
601 IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG 
661 RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL 
721 HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER 
781 MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVDA 
841 IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEVVKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL 
901 TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS 
961 KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK 
1021 MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF 
1081 ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA 
1141 YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK 
1201 YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE 
1261 QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA 
1321 PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGD（配列番号18043）の配列を含んでいる。
Clo051エンドヌクレアーゼ
【０７３３】
1つの代表的なClo051ヌクレアーゼドメインは、
EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKY（配列番号18044）を含むこと、主にそれからなること、又はそれからなることができる。
Cas-Clover融合タンパク質
【０７３４】
いくつかの実施態様では、1つの代表的なdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様1）は、
MAPKKKRKVEGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKYGGGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSPKKKRKVSS（配列番号18045）のアミノ酸配列（Clo051配列に下線、リンカーは太字イタリック、dCas9配列（化膿性ブドウ球菌）はイタリック）を含むこと、主にそれからなること、又はそれからなることができる。
【０７３５】
いくつかの実施態様では、1つの代表的なdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様1）は、
1 atggcaccaa agaagaaaag aaaagtggag ggcatcaagt caaacatcag cctgctgaaa 
61 gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg 
121 gccttcgaca gcaagcagaa tagactgttt gagatgaaag tgctggaact gctggtcaac 
181 gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac 
241 agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc 
301 tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat 
361 agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa 
421 tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga 
481 ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc 
541 gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac 
601 aattctgagt ttatcctgaa gtatggaggc gggggaagcg ataagaaata ctccatcgga 
661 ctggccattg gcaccaattc cgtgggctgg gctgtcatca cagacgagta caaggtgcca 
721 agcaagaagt tcaaggtcct ggggaacacc gatcgccaca gtatcaagaa aaatctgatt 
781 ggagccctgc tgttcgactc aggcgagact gctgaagcaa cccgactgaa gcggactgct 
841 aggcgccgat atacccggag aaaaaatcgg atctgctacc tgcaggaaat tttcagcaac 
901 gagatggcca aggtggacga tagtttcttt caccgcctgg aggaatcatt cctggtggag 
961 gaagataaga aacacgagcg gcatcccatc tttggcaaca ttgtggacga agtcgcttat 
1021 cacgagaagt accctactat ctatcatctg aggaagaaac tggtggactc caccgataag 
1081 gcagacctgc gcctgatcta tctggccctg gctcacatga tcaagttccg ggggcatttt 
1141 ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg 
1201 gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca 
1261 aaggccatcc tgagcgccag actgtccaaa tctaggcgcc tggaaaacct gatcgctcag 
1321 ctgccaggag agaagaaaaa cggcctgttt gggaatctga ttgcactgtc cctgggcctg 
1381 acacccaact tcaagtctaa ttttgatctg gccgaggacg ctaagctgca gctgtccaaa 
1441 gacacttatg acgatgacct ggataacctg ctggctcaga tcggcgatca gtacgcagac 
1501 ctgttcctgg ccgctaagaa tctgagtgac gccatcctgc tgtcagatat tctgcgcgtg 
1561 aacacagaga ttactaaggc cccactgagt gcttcaatga tcaaaagata tgacgagcac 
1621 catcaggatc tgaccctgct gaaggctctg gtgaggcagc agctgcccga gaaatacaag 
1681 gaaatcttct ttgatcagag caagaatgga tacgccggct atattgacgg cggggcttcc 
1741 caggaggagt tctacaagtt catcaagccc attctggaaa agatggacgg caccgaggaa 
1801 ctgctggtga agctgaatcg ggaggacctg ctgagaaaac agaggacatt tgataacgga 
1861 agcatccctc accagattca tctgggcgaa ctgcacgcca tcctgcgacg gcaggaggac 
1921 ttctacccat ttctgaagga taaccgcgag aaaatcgaaa agatcctgac cttcagaatc 
1981 ccctactatg tggggcctct ggcacgggga aatagtagat ttgcctggat gacaagaaag 
2041 tcagaggaaa ctatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tcgataaagg cgctagcgca 
2101 cagtccttca ttgaaaggat gacaaatttt gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctg 
2161 cccaaacaca gcctgctgta cgaatatttc acagtgtata acgagctgac taaagtgaag 
2221 tacgtcaccg aagggatgcg caagcccgca ttcctgtccg gagagcagaa gaaagccatc 
2281 gtggacctgc tgtttaagac aaatcggaaa gtgactgtca aacagctgaa ggaagactat 
2341 ttcaagaaaa ttgagtgttt cgattcagtg gaaatcagcg gcgtcgagga caggtttaac 
2401 gcctccctgg ggacctacca cgatctgctg aagatcatca aggataagga cttcctggac 
2461 aacgaggaaa atgaggacat cctggaggac attgtgctga cactgactct gtttgaggat 
2521 cgcgaaatga tcgaggaacg actgaagact tatgcccatc tgttcgatga caaagtgatg 
2581 aagcagctga aaagaaggcg ctacaccgga tggggacgcc tgagccgaaa actgatcaat 
2641 gggattagag acaagcagag cggaaaaact atcctggact ttctgaagtc cgatggcttc 
2701 gccaacagga acttcatgca gctgattcac gatgactctc tgaccttcaa ggaggacatc 
2761 cagaaagcac aggtgtctgg ccagggggac agtctgcacg agcatatcgc aaacctggcc 
2821 ggcagccccg ccatcaagaa agggattctg cagaccgtga aggtggtgga cgaactggtc 
2881 aaggtcatgg gacgacacaa acctgagaac atcgtgattg agatggcccg cgaaaatcag 
2941 acaactcaga agggccagaa aaacagtcga gaacggatga agagaatcga ggaaggcatc 
3001 aaggagctgg ggtcacagat cctgaaggag catcctgtgg aaaacactca gctgcagaat 
3061 gagaaactgt atctgtacta tctgcagaat ggacgggata tgtacgtgga ccaggagctg 
3121 gatattaaca gactgagtga ttatgacgtg gatgccatcg tccctcagag cttcctgaag 
3181 gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc aggtccgaca agaaccgcgg caaatcagat 
3241 aatgtgccaa gcgaggaagt ggtcaagaaa atgaagaact actggaggca gctgctgaat 
3301 gccaagctga tcacacagcg gaaatttgat aacctgacta aggcagaaag aggaggcctg 
3361 tctgagctgg acaaggccgg cttcatcaag cggcagctgg tggagacaag acagatcact 
3421 aagcacgtcg ctcagattct ggatagcaga atgaacacaa agtacgatga aaacgacaag 
3481 ctgatcaggg aggtgaaagt cattactctg aaatccaagc tggtgtctga ctttagaaag 
3541 gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac 
3601 ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc 
3661 gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa 
3721 attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc 
3781 gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag 
3841 acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc 
3901 atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag 
3961 agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc 
4021 aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag 
4081 gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt 
4141 atggaacgca gctccttcga gaagaatcct atcgattttc tggaagccaa gggctataaa 
4201 gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac 
4261 ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg 
4321 ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc 
4381 cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag 
4441 atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat 
4501 aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat 
4561 atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac 
4621 accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc 
4681 caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat 
4741 gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa（配列番号18046）の核酸配列（化膿性ブドウ球菌に由来するdCas9配列）を含むこと、主にそれからなること、又はそれからなることができる。
【０７３６】
いくつかの実施態様では、本開示のdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様1）をコードする核酸配列は、DNAを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様1）をコードする核酸配列は、RNAを含むことができる。
【０７３７】
いくつかの実施態様では、1つの代表的なdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様2）は、
1 MPKKKRKVEG IKSNISLLKD ELRGQISHIS HEYLSLIDLA FDSKQNRLFE 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