(57)【要約】本発明は、感染を含む微生物叢の増殖を低減するための方法及び組成物を提供し、治療用組成物、感染の治療方法、及び追加のかかる組成物を同定する方法を含む。【選択図】図１
2021506341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的グラム陰性細菌を死滅させることができる実質的に単離されたキメラバクテリオシン構築物であって、
ａ）受容体媒介性トランスロケーションドメイン、ここで、該受容体媒介性トランスロケーションドメインは、所望によりバクテリオシンのトランスロケーションセグメント（ＴＳ）に対して７０％以上のマッチング、及び／又はバクテリオシンの受容体結合セグメント（ＲＢＳ）に対して７０％以上のマッチングを含む；及び
ｂ）前記受容体媒介性トランスロケーションセグメントに作動可能に連結されると前記標的細菌を死滅させることができるカーゴドメイン、を含み、
前記キメラバクテリオシン構築物は、
ｉ）前記標的細菌が前記キメラバクテリオシン構築物と接触したときに、前記標的細菌を死滅させることができ、かつ
ｉｉ）天然のＳ型ピオシンとは異なる配列を含む、実質的に単離されたキメラバクテリオシン構築物。
【請求項２】
別の抗微生物剤、抗生物質、又は他の治療的介入と組み合わせて使用される、請求項１に記載のキメラバクテリオシン構築物。
【請求項３】
ａ）１つのセグメントの７０％のマッチングは８０％以上である、
ｂ）ＴＳ及びＲＢＳは両方とも単一のバクテリオシンに由来する、
ｃ）標的は混合細菌培養物である、
ｄ）標的は異なる種の細菌を含む、
ｅ）標的は異なる属の細菌を含む、
ｆ）死滅セグメントはバクテリオシンに由来する、
ｇ）死滅セグメントは相同バクテリオシンに由来する、
ｈ）死滅セグメントは異種バクテリオシンに由来する、又は
ｉ）異なる配列は精製タグを含む、
請求項１に記載のキメラバクテリオシン構築物。
【請求項４】
ａ）前記標的細菌は感受性Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属標的を含む、
ｂ）前記ＴＳ及び／又はＲＢＳはクレビシンに由来する、
ｃ）前記死滅セグメントはクレビシンに由来する、
ｄ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントは全て複数のクレビシンに由来する、
ｅ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントは全て単一のクレビシンに由来する、又は
ｆ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントのそれぞれは、異なるクレビシンに由来する、
請求項１に記載のキメラバクテリオシン構築物。
【請求項５】
請求項４に記載のキメラバクテリオシン構築物をコードする、単離された核酸。
【請求項６】
ａ）前記標的細菌は感受性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属標的を含む、
ｂ）前記ＴＳ及び／又はＲＢＳはＳ型ピオシンに由来する、
ｃ）前記死滅セグメントはＳ型ピオシンに由来する、
ｄ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントの全ては複数のＳ型ピオシンに由来する、
ｅ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントの全ては単一のＳ型ピオシンに由来する、又は
ｆ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントのそれぞれは、異なるＳ型ピオシンに由来する、
請求項１に記載のキメラバクテリオシン構築物。
【請求項７】
請求項６に記載のキメラバクテリオシン構築物をコードする、単離された核酸。
【請求項８】
ａ）前記標的細菌は感受性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属標的を含む、
ｂ）前記ＴＳ及び／又はＲＢＳは大腸菌ペスチシン（coli pesticin）に由来する、
ｃ）前記死滅セグメントは大腸菌ペスチシンに由来する、
ｄ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントの全ては複数の大腸菌ペスチシンに由来する、
ｅ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントの全ては単一の大腸菌ペスチシンに由来する、又は
ｆ）前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントのそれぞれは、異なる大腸菌ペスチシンに由来する、
請求項１に記載のキメラバクテリオシン構築物。
【請求項９】
請求項８に記載のキメラバクテリオシン構築物をコードする、単離された核酸。
【請求項１０】
バクテリオシン感受性を標的細菌に導入する方法であって、前記標的の外膜で発現されるバクテリオシン受容体を前記標的に導入する可動性要素（mobilizable element）を導入（transfer）することにより、前記バクテリオシン受容体を前記標的に導入する工程を含む方法。
【請求項１１】
前記受容体を発現している標的を前記バクテリオシンと接触させ、前記標的細菌の死滅をもたらす工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
標的グラム陰性細菌の外膜を横断してポリペプチドセグメントを送達することができる実質的に単離されたポリペプチドであって、
ａ）バクテリオシンのトランスロケーションセグメント（ＴＳ）に対して７０％以上のマッチングを含むセグメント、及び／又はバクテリオシンの受容体結合セグメント（ＲＢＳ）に対して７０％以上のマッチングを含むセグメント、及び
ｂ）前記トランスロケーションセグメント又は前記受容体結合セグメントに作動可能に連結された場合に前記標的細菌に送達されるためのカーゴポリペプチドセグメント、を含み、
前記単離されたポリペプチドは、前記標的細菌が前記ポリペプチドと接触した場合に、前記標的細菌の前記外膜を横断して前記カーゴポリペプチドを送達することができる、
実質的に単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
ａ）１つのセグメントの７０％のマッチングは８０％以上である、
ｂ）ＴＳ及びＲＢＳは両方とも単一のバクテリオシンに由来する、
ｃ）標的は混合細菌培養物である、
ｄ）標的は異なる種の細菌を含む、
ｅ）標的は異なる属の細菌を含む、
ｆ）カーゴポリペプチドはバクテリオシンに由来する、
ｇ）カーゴポリペプチドは相同バクテリオシンに由来する、
ｈ）カーゴポリペプチドは異種バクテリオシンに由来する、
ｉ）カーゴポリペプチドは標的細菌の生存率又は増殖を調節する、又は
ｊ）単離されたポリペプチドは精製タグを含む、
請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染を含む微生物叢の増殖を低減するための方法及び組成物を提供し、治療用でありうる抗菌組成物、感染の治療方法、及びさらなるかかる組成物を同定する方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
細菌は広範に分布し、生態学的に多様であり、生存のための独自のニッチ（適所）を見出す。細菌は土壌、粉塵、水などの環境全体に存在し、事実上すべての表面に存在する。多くは正常で有益な菌株であり、宿主との共生関係を提示する。他のものは有害であるか又は、利益と共に問題を引き起こす。
【０００３】
病原菌は、ヒト、他の動物、及び植物に感染症を引き起こし得る。一部の細菌は特定の宿主にのみ感染又は問題を引き起こし得るが、他の細菌はより広い宿主特異性を有し、多くの宿主において問題を引き起こし得る。細菌によって引き起こされる疾患は、細菌自体とほぼ同じ程度に多様であり、例えば、食中毒、う蝕、炭疽、一般的な感染性疾患、さらにはある種の形態のがんが挙げられる。
【０００４】
ある種の細菌は通常は無害であるが、適した機会に病原性となるか、異常な部位や状況における導入により問題となる。効果的な免疫系を欠いている人は最も脆弱であり、ある種の細菌は弱体化した宿主を用いて増殖し集団全体に分散する。
【０００５】
統計的には、感染性疾患は主要な医学的問題である。例えば、Ｗａｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ（２００３）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄを参照。米国では、毎年４万〜７万人が、院内（病院由来）感染により死亡している。
【０００６】
抗生物質は、過去半世紀にわたって臨床医学に革命をもたらしてきた。抗生現象が最初に発見されて以来、注目すべき治療領域であるこのクラスの作用機序及び開発は、大きな進歩を遂げてきた。例えば、Ｔｈｅｒｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｅｓｑｕｅ（２０００）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２４：２５１−６２、Ｄｕｒｇｅｓｓ（１９９９）Ｃｈｅｓｔ  １１５（３  Ｓｕｐｐｌ）：１９Ｓ−２３Ｓ、Ｍｅｄｅｉｒｏｓ（１９９７）Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２４（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１９−４５、Ｊｏｎｅｓ（１９９６）Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １００（６Ａ）：３Ｓ−１２Ｓ、Ｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｈａｉｔ（１９９３）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（１−３）：１７１−２１２、及びＬｉｕ（１９９２）Ｃｏｍｐｒ  Ｔｈｅｒ．  １８：３５−４２を参照。２００２年の全世界での抗生物質の売上高は約３２０億ドルであった。
【０００７】
とは言え、抗生物質耐性菌が広く見られるようになったことで、細菌適応に対する現在の抗菌治療の脆弱性が強調されている。例えば、Ｗａｌｓｈ（１９９２）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：  Ａｃｔｉｏｎｓ，  Ｏｒｉｇｉｎｓ，  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（１９９２）；  Ｃｕｎｈａ（１９９２）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｐｒｅｓｓ）、Ａｍｙｅｓ（２００３）Ｍａｇｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔｓ，  Ｌｏｓｔ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ：  Ｔｈｅ  Ｒｉｓｅ  ａｎｄ  Ｆａｌｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ）、Ａｘｅｌｓｅｎ（２００１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｆｏｒ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、及びＭａｉｎｏｕｓ  ａｎｄ  Ｐｏｍｅｒｏｙ（ｅｄｓ．  ２００１）Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）を参照。近年、非常に懸念される多重耐性プラスミドＮＤＭ−１の発見が報告されている（Ｋｕｍａｒａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １０：  ５９７−６０２；  ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｅａｒｌｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  ７  Ａｐｒｉｌ  ２０１１，  ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７３−３０９９（１１）７００５９−７）。
【０００８】
したがって、標的細菌、特に最も一般的にはグラム陰性である抗生物質耐性細菌の、増殖もしくは生存を減少させるか又は細菌病原性を制限するための、改善された方法に、大きな有用性が見出される。抗菌効果は、環境的、部分的、局所的、特にイン・ビボでのコロニー形成に適用可能である。本発明は、これら及び他の重要な課題に取り組むものである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、部分的には、天然に見出されるタンパク質でありうるバクテリオシンが、適した状況下で特定の宿主細菌を標的とするために利用され得る特定の特徴及び機能を有する、という認識に基づく。特に興味深いのは、グラム陰性細菌群の宿主細菌を標的とするものである。
【００１０】
本発明のある実施形態においては、天然配列のバクテリオシン、例えば、バクテリオシン又はその一部は、標的宿主を死滅させるか標識するために利用される所望の特性の組み合わせを有することが特定される。他の実施形態では、異種ドメインが組み合わされて所望の機能及び／又は特異性を提供する、特定のキメラバクテリオシン構築物が調製される。これらの実施形態では、ポリペプチドにおいて構成成分は、これらの所望の特性を同様に達成又は改善することができるものに置換され、例えば、バクテリオシンに見られる構成成分が代替されるか又は置換される。
【００１１】
グラム陰性細菌は、グラム陽性菌では見られない外膜に囲まれた薄いペプチドグリカンの細胞壁によって特徴付けられる。グラム陰性細菌の外膜は、外部から適用されたペプチドが細胞のペリプラズム空間及び細胞内区画にアクセスするのを防ぐ透過障壁として機能する。
【００１２】
本発明は、適切なカーゴドメインを所望の細胞区画に送達するために、標的菌株の膜障壁を選択的に認識して横断するバクテリオシン（天然に存在する配列を含む）又はキメラバクテリオシン構築物（本明細書では「受容体媒介性トランスロケーション」と称する）を使用する手段を提供する。所望の細胞区画に到達すると、カーゴドメインは意図した活性に影響を与える可能性があり、かかる活性は細胞を検出可能に標識することまたは死滅させることである場合がある。例えば、典型的に外膜が外部媒体からのムレイン分解活性へのアクセスを妨げている場合であれば、ムレイン分解酵素はグラム陰性細胞の薄いペプチドグリカン層を消化することができる。酵素的に活性なムレイン分解セグメント（断片）を、外膜を横断するムレイン分解セグメントの移動を提供する移動バクテリオシンセグメントに連結すると、ペプチドグリカン層へ接触する酵素活性が得られ、ペプチドグリカン層の分解につながる。ペプチドグリカン層の欠損は、細胞内膜を横断する大きな浸透圧により、細胞を破裂させる。あるいは、受容体媒介性移動バクテリオシンセグメントがカーゴドメインを細胞内に移動させることができる場合、多くの異なるメカニズムを使用して細胞機能を妨害することができる。細胞質に移動したヌクレアーゼ、毒素、毒性複合物、代謝ブロック、及びその他の破壊的なセグメントは、細胞の生存率及び健康に深刻な影響を与える可能性がある。例えば、細胞の検出を可能にして、生物内における分布を評価することができるように、検出可能な標識を導入することができる。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は、標的のグラム陰性細菌を死滅させることができる実質的に単離されたバクテリオシンポリペプチド（すなわち、バクテリオシン又はキメラバクテリオシン構築物）であって、ａ）受容体媒介性トランスロケーションドメイン、ここで、該受容体媒介性トランスロケーションドメインは、所望によりバクテリオシンのトランスロケーションセグメント（ＴＳ）に対して７０％以上のマッチング、及び／又はバクテリオシンの受容体結合セグメント（ＲＢＳ）に対して７０％以上のマッチングを含む；及び（ｂ）前記受容体媒介性トランスロケーションセグメントに作動可能に連結されると前記標的細菌を死滅させることができる死滅セグメント、を含み、前記バクテリオシンポリペプチドは、（ｉ）前記標的細菌が前記キメラバクテリオシン構築物と接触したときに、前記標的細菌を死滅させることができ、かつ（ｉｉ）天然のＳ型ピオシンとは異なる配列を含む、実質的に単離されたキメラバクテリオシン構築物を提供する。特定の実施形態では、前記バクテリオシンポリペプチドは、別の抗微生物剤、抗生物質、又は他の治療的介入と組み合わせて使用される。他の好ましい実施形態では、前記バクテリオシンポリペプチドは、１つのセグメントの７０％のマッチングは８０％以上である、ＴＳ及びＲＢＳは両方とも単一のバクテリオシンに由来する、標的は混合細菌培養物である、標的は異なる種の細菌を含む、標的は異なる属の細菌を含む、死滅セグメントはバクテリオシンに由来する、死滅セグメントは相同バクテリオシンに由来する、死滅セグメントは異種バクテリオシンに由来する、又は異なる配列は精製タグを含むバクテリオシンポリペプチドである。特に好ましい実施形態では、前記バクテリオシンポリペプチドは、前記標的細菌は感受性Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属標的を含む、前記ＴＳ及び／又はＲＢＳはクレビシンに由来する、前記死滅セグメントはクレビシンに由来する、前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントは全て複数のクレビシンに由来する、前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントは全て単一のクレビシンに由来する、又は前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントのそれぞれは、異なるクレビシンに由来する、本明細書に記載のキメラバクテリオシン構築物である。本発明はまた、本明細書に記載の組換えクレビシンをコードする単離核酸を提供する。他の特定の実施形態では、前記バクテリオシンポリペプチドは、前記標的細菌は感受性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属標的を含む、前記ＴＳ及び／又はＲＢＳはＳ型ピオシンに由来する、前記死滅セグメントはＳ型ピオシンに由来する、前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントの全ては複数のＳ型ピオシンに由来する、前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントの全ては単一のＳ型ピオシンに由来する、又は前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントのそれぞれは、異なるＳ型ピオシンに由来する、バクテリオシンポリペプチドであり得る。例えば、本明細書に記載されるように、高発現プラスミド又はベクター中にある、ピオシンポリペプチドをコードする単離核酸もまた提供される。さらなる特定の実施形態は、前記標的細菌は感受性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属標的を含む、前記ＴＳ及び／又はＲＢＳは大腸菌ペスチシンに由来する、前記死滅セグメントは大腸菌ペスチシンに由来する、前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントの全ては複数の大腸菌ペスチシンに由来する、前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントの全ては単一の大腸菌ペスチシンに由来する、又は前記ＴＳ、ＲＢＳ、及び死滅セグメントのそれぞれは、異なる大腸菌ペスチシンに由来する、本明細書に記載のバクテリオシンポリペプチドを提供する。本明細書に記載の組換えペスチシンポリペプチドをコードする単離核酸が提供される。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、バクテリオシン感受性を標的細菌に導入する方法であって、前記標的の外膜で発現されるバクテリオシン受容体を前記標的に導入する可動性要素（mobilizable element）を導入（transfer）することにより、前記バクテリオシン受容体を前記標的に導入する工程を含む方法を提供する。さらに、本明細書に記載されるように、前記受容体を発現している標的を前記バクテリオシンと接触させ、前記標的細菌の死滅をもたらす工程をさらに含む方法を提供する。
【００１５】
代替的な実施形態は、標的グラム陰性細菌の外膜を横断してポリペプチドセグメントを送達することができる実質的に単離されたバクテリオシンポリペプチドであって、（ａ）典型的には、バクテリオシンのトランスロケーションセグメント（ＴＳ）に対して７０％以上のマッチングを含むセグメント、及び／又はバクテリオシンの受容体結合セグメント（ＲＢＳ）に対して７０％以上のマッチングを含むセグメントを含む、受容体媒介性トランスロケーションセグメント、及び（ｂ）前記受容体媒介性トランスロケーションセグメントに作動可能に連結された場合に前記標的細菌に送達されるためのカーゴポリペプチドセグメント、を含み、前記単離されたポリペプチドは、前記標的細菌が前記ポリペプチドと接触した場合に、前記標的細菌の前記外膜を横断して前記カーゴポリペプチドを送達することができる、実質的に単離されたバクテリオシンポリペプチドを包含する。好ましい実施形態には、以下の単離されたポリペプチドが含まれる：１つのセグメントの７０％のマッチングは８０％以上である、ＴＳ及びＲＢＳは両方とも単一のバクテリオシンに由来する、標的は混合細菌培養物である、標的は異なる種の細菌を含む、標的は異なる属の細菌を含む、カーゴポリペプチドはバクテリオシンに由来する、カーゴポリペプチドは相同バクテリオシンに由来する、カーゴポリペプチドは異種バクテリオシンに由来する、カーゴポリペプチドは標的細菌の生存率又は増殖を調節する、又は単離されたポリペプチドは精製タグを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＬＢ及びＦＢＳにおけるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４に対するＰ６２８の抗菌活性を示す。
【図２Ａ】ＣＡ−ＭＨＢにおけるＰ６２８の活性を示す。
【図２Ｂ】ＦＣＳにおけるＰ６２８の活性を示す。
【図３】ＦＣＳにおけるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４に対するＰ６２８用量反応を示す。
【図４】ＦＣＳにおけるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  １３８８３に対するＰ６２８用量反応を示す。
【図５】５０％ＦＣＳにおけるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４に対するＦ６３６のＣＦＵ低下を示す。
【図６】構築物の物理地図を示す。
【図７】ＯＤ減少アッセイ（ＣＨＣｌ３処理ＰＡ０１）を示す。
【図８Ａ】ＰＡ０１（ＣＡＡ）におけるＳ５融合体のＣＦＵ低下アッセイを示す。
【図８Ｂ】ＣＦＵ低下アッセイ：ＣＡＡにおけるＰＡ０１に対するＰ６２６を示す。
【図８Ｃ】ＰＡ０１（５０％ＦＣＳ）におけるＳ５融合体のＣＦＵ低下アッセイを示す。
【図９Ａ】ＣＦＵ低下アッセイ：ＣＡＡ（４００μｇ／ｍＬ）におけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４に対するＰ６２８及びＰ６５２を示す。
【図９Ｂ】ＣＦＵ低下アッセイ：ＣＡＡ（２００μｇ／ｍＬ）におけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４に対するＰ６２８及びＰ６５２を示す。
【図１０Ａ】ＣＦＵ低下アッセイ：ＣＡＡ（１０μｇ／ｍＬ）におけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４に対するＰ６２８及びＰ６５２を示す。
【図１０Ｂ】ＣＦＵ低下アッセイ：ＣＡＡ（１０μｇ／ｍＬ）におけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ５６３に対するＰ６２８及びＰ６５２を示す。
【図１１】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１細胞に対するＰ５５８及びＰ５６７のＯＤ減少アッセイを示す。
【図１２】増殖速度論：ＥＲ２５６６（ＦｙｕＡ＋）に対するＰ５５８及びＰ５６７を示す。
【図１３】ＥＲ２５６６（ＦｙｕＡ＋）に対するＰ５５８及びＰ５６７のＣＦＵプレーティングを示す。
【図１４】増殖速度論：ＥＲ２５６６（ＦｙｕＡ＋）に対するＰ５５８及びＰ５６７を示す。
【図１５Ａ】５０％ＬＢ培地におけるＥＲ２５６６に対するＰ５５８活性を示す。
【図１５Ｂ】５０％ＦＣＳにおけるＥＲ２５６６に対するＰ５５８活性を示す。
【図１６】５０％ＬＢ及び５０％ＦＣＳにおけるＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するＰ５５８活性を示す。
【図１７】５０％ＬＢ及び５０％ＦＣＳにおけるＥ．ｃｏｌｉＳＬＣ−６に対するＰ５５８活性を示す。
【図１８Ａ】５０％ＬＢにおけるＥ．ｃｏｌｉ分離株（ＦｙｕＡ＋）に対するＰ５５８の活性を示す。
【図１８Ｂ】５０％ＦＣＳにおけるＥ．ｃｏｌｉ分離株（ＦｙｕＡ＋）に対するＰ５５８の活性を示す。
【図１９】５０％ＬＢにおけるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属分離株（ＦｙｕＡ＋）に対するＰ５５８の活性を示す。
【図２０】ＦｙｕＡ  ＢＤ融合体：ＯＤ低下（ＣＨＣｌ３処理ＰＡ０１）を示す。
【図２１】増殖速度論：ＥＲ２５６６（ＦｙｕＡ＋）に対するＦｙｕＡ  ＢＤ融合体を示す。
【図２２】ＥＲ２５６６／ＦｙｕＡ＋（５０％ＬＢ）におけるＦｙｕＡ  ＢＤ融合体の活性を示す。
【図２３】ＬＢ及びＦＣＳにおけるＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するＰ５８１の活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．序論
本発明は、受容体媒介性トランスロケーション機能（例えば、バクテリオシンに由来する）に、別の機能性カーゴドメイン、例えば、死滅ドメインを、バクテリオシン内におけるように連結させて、グラム陰性細菌標的を攻撃できる実体（entity）を達成する。本明細書に記載されるキメラ（及び関連する）「バクテリオシン」構築物は、ペプチドグリカン分解酵素活性であり得る標識機能又は死滅機能に、バクテリオシン由来の受容体媒介性トランスロケーション機能を、結合して組み合わせたものである。バクテリオシン由来の受容体媒介性トランスロケーション機能は、細菌の外膜受容体を認識し、典型的にはトランスロケーションの媒介に役立つタンパク質である、タンパク質セグメントにより達成される。通常、受容体認識機能は、その内部へのトランスロケーションを生じさせる標的細胞における選択性及び特異性を提供する。したがって、トランスロケーションは、「受容体に媒介される」プロセスとして特徴付けられる場合がある。多くの実施形態では、トランスロケーションには、２つの「機能」工程及びバクテリオシン内のドメイン、すなわち結合工程（受容体結合セグメント（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔ）又はＲＢＳが関与する）とトランスロケーション工程（トランスロケーションセグメント（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｓｅｇｍｅｎｔ）又はＴＳが関与する）とが含まれるが、この２つの工程は必ずしも物理的又は時間的に分離可能であるとは限らない。前記結合工程には、バクテリオシンのその同族受容体への結合のある程度の特異性が関与することが多く、ここで同族受容体は、バクテリオシン及びカーゴドメインを輸送又は反転させて脂質二重層膜を渡って移動させる構造形状をとる場合がある。
【００１８】
特定の実施形態では、前記受容体媒介性トランスロケーションは外膜を横断するだけであり、前記カーゴドメインは細菌宿主のペリプラズム空間にアクセス可能である。ペプチドグリカン（ムレイン）嚢は、ほとんどの細菌の細胞壁の重要な構造要素である。短いペプチドによって架橋されたグリカン鎖で作られた嚢は、細菌の細胞質膜を取り囲む閉じた袋状の構造を形成する。前記嚢は２５気圧の浸透圧まで耐える必要がある。前記嚢は柔軟であり、圧力下で可逆的な拡張を可能にし、それにより大きなタンパク質分子でも拡散を可能にする。例えば、Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＣＳＨ  Ｐｅｒｓｐ．  Ｂｉｏｌ．，  ２：ａ０００４１４、Ｖｏｌｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．  Ｒｅｖｓ  ３２：１４９−１６７、Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６１：１９１−２１４、及びＣｏｓｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂａｃｔ．  Ｒｅｖｓ．  ３８：８７−１１０を参照。
【００１９】
多くの抗生物質が標的細菌種のペプチドグリカン層に作用する。したがって、この構造は、細菌標的の生存において重要な要素である。ペプチドグリカンの攻撃は、標的の細菌宿主を死滅させるための合理的な戦略である。ペプチドグリカン層は通常約１層〜３層の厚さであるが、グラム陰性細菌の外膜は、外部から付加された酵素が基質に到達するのを防ぐ透過バリアとして機能する。
【００２０】
受容体媒介性トランスロケーションドメイン又はセグメントは、例えば、ムレイン分解活性を有するタンパク質が細菌の外膜を横断移動することを可能にする。例えば、受容体媒介性トランスロケーションセグメント自体が膜輸送イベントを媒介することにより、ムレイン分解活性が細菌の外膜の外側から内側に移動し、酵素とそのペプチドグリカン基質との接触が可能となる。受容体媒介性トランスロケーションセグメントは、外膜の内因性トランスロケーションシステムの利用において、分子をペリプラズム空間に持ち込むように前記システムに信号を伝達する耳標となるモチーフを提示する場合もある。いくつかの実施形態では、受容体媒介性トランスロケーションセグメントは、構築物ポリペプチドを外膜の受容体発現外葉へ方向づけ、ムレイン分解ポリペプチドは、外膜の外葉から内葉に反転し、それによりムレイン分解セグメントがペプチドグリカン基質に送達される。
【００２１】
ＩＩ．グラム陰性細菌
Ａ．外膜
グラム陰性細菌の細胞エンベロープは、内膜（ｉｎｎｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＩＭ））及び外膜（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＯＭ））の２つの膜で構成され、これらはペプチドグリカン層を含むペリプラズムによって分離されている。前記２つの膜の構造及び構成は全く異なる。ＩＭがリン脂質二重層であるのに対し、ＯＭは非対称の二重層であり、それぞれ内葉及び外葉においてリン脂質及びリポ多糖（ＬＰＳ）からなる。さらに、これらの膜は内在性膜タンパク質の構造についても異なる。内在性ＩＭタンパク質が通常、疎水性αヘリックスの形で膜にまたがっている一方で、内在性ＯＭタンパク質（ＯＭＰ）は通常、親水性の内部と外側を向いて膜脂質に面する疎水性残基とを有する円筒状のβバレルに折りたたまれた逆平行両親媒性βストランドを構成する（Ｋｏｅｂｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｂａｒｒｅｌｓ  ｉｎ  ａ  ｎｕｔｓｈｅｌｌ”  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７：２３９−５３）。両方の膜にはリポタンパク質も含まれており、Ｎ末端Ｎ−アシル−ジアシルグリセリルシステインを介して膜に固定されており、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、タンパク質部分は通常ペリプラズムに面している（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｔｏ  ｉｒｏｎ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ”  Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ７１：１２９−３６）。ＬＰＳ分子は、リピドＡ、コア多糖、Ｏ抗原繰り返し構造（O-antigen repeats）の３つの部分に分けることができる。リピドＡは、ＬＰＳの疎水性成分であり、外膜の外葉に位置する一方で、コア多糖及びＯ抗原繰り返し構造は細菌細胞の表面に表示される（Ｒａｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ”  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７６：２９５−３２９）。ＬＰＳの詳細な構造は細菌によって異なり、この変化は細菌の病原性に影響を与える可能性がある。例えば、Ｇａｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｒｅｅ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １４８：１−５及びＷｉｌｋｉｎｓｏｎ（１９９６）“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ−ｔｈｅｍｅｓ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ”  Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ３５：２８３−３４３を参照。
【００２２】
Ｂ．ペプチドグリカン層
ペプチドグリカン（ムレイン）は、ほとんど全ての細菌の細胞膜の外側にある細菌細胞壁の必須かつ特異的な成分である（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）、Ｐａｒｋ（１９９６）、Ｎａｎｎｉｎｇａ（１９９８）、Ｍｅｎｇｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘ  ＆  Ｌｅｍａｉｔｒｅ（２００５））。その主な機能は、内部浸透圧に耐えることによって細胞の完全性（integrity）を維持することである。細胞増殖中のペプチドグリカンの生合成又はその特異的分解の如何なる阻害も、細胞溶解をもたらす。ペプチドグリカンは、既定の細胞形状の維持にも寄与し、タンパク質（Ｄｒａｍｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）やテイコ酸（Ｎｅｕｈａｕｓ  ＆  Ｂａｄｄｉｌｅｙ，（２００３））などの他の細胞エンベロープ成分を固定するための足場として機能する。グラム陽性菌及びグラム陰性細菌の両方のペプチドグリカン構造は、Ｎ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）残基に結合したペプチドステム鎖によって架橋されるＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）とβ−（１−４）−Ｎ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）の二糖骨格繰り返し構造（repeating disaccharide backbones）を含む。グラム陰性細菌では、各ムラミン酸のカルボキシル基に結合したステムペプチドは通常、Ｌ−Ａｌａ−＿−Ｄ−Ｇｌｕ−（Ｌ）−メソジアミノピメリン酸（Ｄａｐ）−Ｄ−Ａｌａで構成されるが、ペプチドはしばしばＤ−Ａｌａを欠くか、又はより稀にはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａで終了する。ステムペプチドの約半分は、隣接するグリカン鎖間の架橋に関与する（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０））。
【００２３】
ムレイン分解ドメインは当技術分野において公知である。これらの中には、リゾチームタンパク質のクラスがある。例えば、Ｓａｌａｚａｒ  ａｎｄ  Ａｓｅｎｊｏ（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２９：９８５−９４を参照。ペプチドグリカン構造の分解は、少なくとも４つの状況で自然に起こる。１番目は、構造自体の生合成である。細菌細胞が増殖して分裂すると、必然的に構造が分解されることになる。例えば、Ｖｏｌｌｍｅｒ（２００８）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ３２：２８７−３０６、Ｓｃｈｅｕｒｗａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４０：５８６−９１、Ｋｅｅｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４：２７１−２７６、及びＢａｂａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：４６３９−４６４６を参照。細胞自体が以前に合成された構造を再配置又は変更する必要のある、さらなる状況がある。２番目では、真核生物の宿主が、感染除去に際して、例えばムタノリシン又はリゾチームを使用して、前記構造を分解する。例えばＣａｌｌｅｗａｅｒｔ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈｉｅｌｓ（２０１０）Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ３５：１２７−６０；  Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ７：７５−８２及びＬｉｃｈｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９０：１３１３−１３２２を参照。３番目の領域は、ファージが典型的にはエンドリシンを使用して複製ファージを放出して細菌宿主細胞を溶解する、ファージ複製である。例えば、Ｓｒｉｖｉｄｈｙａ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ（２００７）Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ３２：９７９−９０及びＬｏｅｓｓｎｅｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８：４８０−４８７を参照。これは、細胞の内側からのペプチドグリカン層の溶解である。４番目の状況は、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（国際公開第２００７／１３０６５５号）に記載されるように、ファージ感染にペプチドグリカンバリアの横断を要する場合である。これは、細胞の外側からのペプチドグリカン層の分解である。
【００２４】
これらの各メカニズムには、ペプチドグリカン構造を分解するいくつかの手段が含まれる。このように、ムレイン分解活性は、細菌の真核生物宿主のゲノム、細菌ゲノム自体、及び宿主として細菌を標的とするファージ（及び関連するプロファージ）に見られる。ムレイン分解ドメインは、これらのソースのいずれかとの相同性によって見出され得るものであり、インフォマティクスを使用して、それぞれの基準モチーフを有する候補遺伝子を特定できる。ムレイン分解活性は本発明に包含される死滅ドメインの１つのクラスであり、多くの例はこの例を使用して説明されるが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、他の多くの死滅セグメント又は毒性セグメントが置換され得る。
【００２５】
ペプチドグリカンの「分解活性」は、治療条件下でグラム陰性細菌病原体に対して使用するための非常に効果的な殺菌活性に変換可能であり、またムラミニダーゼ活性、グルコサミニダーゼ活性、アミダーゼ活性、又はエンドペプチダーゼ活性を含みうる。例示的なムレイン分解ドメインが同定され、キメラ構築物に組み込まれてペプチドグリカン基質に送達され、産生され、精製され、外膜を有する細菌宿主に対して殺菌活性を有することを確認することができる。かかる活性を含む組換え構築物は、抗菌組成物及び製剤としての有意な有利な特性を有する。
【００２６】
本発明の連結ポリペプチドの例は、例えば、ファージｐｈｉＫＭＶの近縁であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージＰ１３４由来のリゾチームドメインを含む、ムレイン分解断片を使用する。ｐｈｉＫＭＶのＯＲＦ３６に対応する、ファージＰ１３４のＯＲＦ３６は、外膜が除去されたグラム陰性細菌細胞を溶解する。外膜を取り除いた後、様々な異なるグラム陰性細菌に構築物を接触させると、細胞が破壊された。これらの結果は、種々のグラム陰性細菌種からのペプチドグリカンがムレイン分解活性の影響を受けやすいことを示している。
【００２７】
配列相同性検索により、ペプチドグリカン分解活性の代替ソースとして使用できる他の様々な類似ドメインが特定される。これらの活性を示すポリペプチドのサイズは小さいため、効率的な大規模産生が可能である。細菌標的における関連する細胞壁標的成分、例えば、ペプチドグリカンへの到達性（accessibility）が提示され、イン・ビボ投与時の薬理学的分布も同様である。
【００２８】
関連するムレイン分解活性は、リゾチーム様スーパーファミリーである溶解性トランスグリコシラーゼ（ＬＴ）やガチョウ卵白リゾチーム（ＧＥＷＬ）、並びに可溶性溶解性トランスグリコシラーゼ（ＳＬＴ）、ガチョウ卵白リゾチーム（ＧＥＷＬ）、鶏卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）、キチナーゼ、バクテリオファージラムダリゾチーム、エンドリシン、自己溶菌酵素、キトサナーゼなどを含むいくつかのメンバーを有するリゾチーム様（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＿ｌｉｋｅ）ドメインを含むスーパーファミリーＣｌ００４４２に見られ得る。これらのメンバーは全て、β−１，４−結合多糖類の加水分解に関与している。システインヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメインは、ファージエンドリシン及び細菌の自己溶菌酵素に含まれている。ＣＨＡＰドメインを含むタンパク質のほとんどは、ペプチドグリカン加水分解酵素として機能し、一般的にアミダーゼに関連している。Ｂａｔｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｗｌｉｎｇｓ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ５：２３４−２３７及びＰｒｉｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２０７９−２０８７を参照。またｃａｚｙ．ｏｒｇ．に掲載の「ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎＺＹｍｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ」についても参照。ＣＡＺＹデータベースは、グリコシド結合を分解、修飾、又は生成する酵素の構造的に関連する触媒及び炭水化物結合モジュール（又は機能性ドメイン）のファミリーを記述したものである。エンドペプチダーゼに関する他の情報源は、merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/clan_index?type=PにあるＷｅｂサイトのデータベースである。
【００２９】
類似の戦略を使用して、例えば、以下で説明する死滅機能に基づいて、ムレイン分解ドメインから他の死滅ドメインを同定して使用し得る。特定の機能性死滅ドメインを同定することが可能であり、類似又は相同の代替的置換を構築してもよい。
【００３０】
Ｃ．細胞膜
原核生物宿主の脂質二重層を分解するリパーゼ及び他の機能的活性は、細胞を死滅させることができる。標的のグラム陰性細胞を死滅させる付加的な毒性セグメント又は毒素セグメントは、細胞へのトランスロケーションのためにカーゴペプチドに結合したより小さな分子毒素であり得るように置換され得る。好ましくは、原核生物にのみ作用し、真核生物には影響を及ぼさないと考えられる活性は、効果上非常に選択的であり、標的にのみ作用するが、グラム陰性細菌に感染している宿主生物にはほとんど又は全く影響を及ぼさない。
【００３１】
Ｉ．バクテリオシンポリペプチド
Ａ．バクテリオシン
バクテリオシンは、細菌によって産生されるタンパク質抗生物質の多様なファミリーであり、同じ又は近縁の種のメンバーを死滅させるために自然に使用される。コリシンと呼ばれる、Ｅ．ｃｏｌｉによって産生されたバクテリオシンは、最初に同定されたものであり、よく研究されており、その多くが特徴解析されている。これまでに特徴解析されたコリシンのほとんど全ては、Ｎ末端トランスロケーションドメイン、受容体結合ドメイン、及びＣ末端死滅ドメインの３つのドメイン構成を示す。死滅ドメインは通常、ヌクレアーゼ又は膜損傷孔形成物（membrane damaging pore formers）のいずれかである。バクテリオシン産生細菌は、バクテリオシン発現株によって産生され死滅ドメインに化学量論的に結合することによって機能してその活性を阻害する免疫タンパク質によって、それ自体の作用から保護される。
【００３２】
本発明において有用なバクテリオシンポリペプチドの例を、それらのドメインの境界と共に、表１に示す。
【００３３】
【表１】
2021506341.tif 000003
【００３４】
2021506341.tif 000004
【００３５】
クレビシン：
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａによって産生されるバクテリオシンは、クレビシンと称される。クレビシンは、Ｅ．ｃｏｌｉから単離されたコリシンと同様のドメイン構造を有する。クレビシンＢ、クレビシンＣ、クレビシンＣＣＬ、及びクレビシンＤの４種類の異なるクレビシンが報告され、そのＤＮＡ配列が記述されている（Ｒｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）及びＣｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））。
【００３６】
Ｓ型ピオシン：
可溶性ピオシン又はＳ型ピオシンは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの、同種由来の細胞を死滅させることが可能な、プロテアーゼ感受性であり熱感受性であり染色体にコードされているバクテリオシンである。これらの抗微生物剤は、死滅機能を内包する大きなタンパク質と、前者の細胞毒性ドメインにしっかりと結合して維持される小さな免疫タンパク質とからなる二成分タンパク質複合体から分泌される。いくつかのタイプのＳ型ピオシンが記述され及び特徴解析されている：ピオシンＳ１、ピオシンＳ２、ピオシンＡＰ４１、ピオシンＳ３、ピオシンＳ４、及びピオシンＳ５。ピオシンＳａはピオシンＳ２と同一であることが判明した。標的細胞を死滅させるために、Ｓ型ピオシンは最初に細菌細胞の外膜にある特定の受容体に結合し、次にさらにトランスロケーションしてその阻害機能を発揮する。
【００３７】
ペスチシン：
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓのペスチシンは、Ｙ．  ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、及び特定のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を死滅させる毒素であり（Ｈｕ  ａｎｄ  Ｂｒｕｂａｋｅｒ（１９７４））、９．５ｋｂのプラスミドであるｐＹＰによってコードされている（Ｋｏｌ’ｔｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）、Ｆｅｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｕｂａｋｅｒ（１９８１））。ペスチシンはＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を示す（Ｆｅｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｕｂａｋｅｒ（１９７９））。ペスチシンは、エルシニア鉄キレート剤であるエルシニアバクチンの輸送に関与するＦｙｕＡ受容体を利用することができる（Ｈｅｅｓｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｒａｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｆｅｔｈｅｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５））。ペスチシンの発現はＳＯＳシステムによって制御されていると考えられており（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２））、ペスチシンの外膜を介しての輸送及び同族のＦｙｕＡ受容体との相互作用は、ＴｏｎＢ依存的である（Ｆｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１））。
【００３８】
Ｂ．カーゴドメイン
本発明のキメラ構築物を調製するために、バクテリオシン由来受容体媒介性トランスロケーションドメインは、所望の機能（例えば、標識又は死滅）を提供する異種カーゴドメインに連結される。例えば、死滅セグメントが含み得るセグメントは、完全な「ドメイン」より小さく（less than）、機能を保持するものの、標的細胞を死滅させる従来定義されてきた「ドメイン」とは異なるバリエーションを含み得る。ドメインは例えば、標的細胞を死滅させるように自然に機能するタンパク質であるバクテリオシンの成分であり得る。かかるドメインは、標的細胞を死滅させることができるか、これは前記細胞を死滅させることができる触媒活性であるか、又は死滅させるために正常な細胞活性を遮断又は妨害するように機能するいくつかの構造的特徴である、別のドメインで、置換又は代替することができる。さらに別の選択肢は、実際に毒性の化学物質又は構造を、受容体媒介性トランスロケーションドメインに作動可能に連結されている担体ペプチド又は他の化学結合に連結又は結合させることである。例としては、標的細胞に取り込まれ、細胞内の担体から放出される可能性があり、標的酵素又は基質の多くの異なるコピーに干渉する可能性のある化学量論性を有する、化学療法で標的毒素として使用されるものに類似した毒性複合物であり得る。死滅セグメントの例を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2021506341.tif 000005
【００４０】
大型バクテリオシン（＞６０ｋＤａ）は、感受性細菌の細胞質における核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）又は細胞膜成分のいずれかを標的とすることにより、産生生物の近縁の細菌を死滅させるタンパク質毒素である。バクテリオシンをコードする遺伝子は、産生生物のプラスミド又はゲノムのいずれかにあり、様々なバイオインフォマティクスツールを使用して全ゲノム配列を特定し得る。ＮＣＢＩゲノムデータベースなどのデータベースから利用できる全ゲノム情報をマイニングして、推定バクテリオシンを特定することができ、複数の配列アライメント及び配列同一性検索は、可能性のあるバクテリオシンの絞り込みに役立つであろう。例えば、ヒト、動物、植物、及び環境などの多様な生態学的ニッチに分布する５３の異なる細菌種からの隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ））を使用して、３０００を超えるヌクレアーゼバクテリオシンが特定された（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｕｓｉｎｇ  Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ．  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １３（７）：  ｅ１００５６５２）。ヌクレアーゼ及び細孔形成活性に加えて、バクテリオシンは、リパーゼ、酸化のデカプラー、活性化可能な変異原、転写／翻訳のブロッカー、アポトーシスの誘導因子、並びにｃｄｃ、エネルギー代謝、細胞壁及び細胞膜の生合成や維持などの重要な細胞機能の干渉因子であり得る。
【００４１】
バクテリオシンに由来するドメインを死滅させることに加えて、多くの供給源に由来する抗菌ペプチドを使用してもよい。表３に例を示す。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
2021506341.tif 000007
【００４４】
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【００４５】
2021506341.tif 000009
【００４６】
Ｃ．リンカー、その他の成分、免疫タンパク質
本発明のキメラ構築物の多くは、異なる成分を結合して単一のポリペプチドとするリンカーを有するであろう。あるいは、前記構築物は、しばしば単一のポリペプチドとして合成されるが切断されて二次構造又は三次構造によって構造的完全性を維持し得る、複数のポリペプチドを含み得る。
【００４７】
外膜を横断する移送速度は、いくつかの方法で測定できる。１つの方法は、ペリプラズム基質に到達する死滅セグメントの影響など、移送の結果を間接的に評価することである。測定の基準は、測定可能な細胞内容物の放出、基質放出、又は細胞溶解であり得る。細胞の死滅はペプチドグリカン消化の指標にもなり得る。
【００４８】
より直接的な方法は、例えば、検出可能な標識を使用して、ペリプラズム空間に移送された分子の数を追跡することである。特定の移送セグメントの移送効率は、移送されたパッセンジャーセグメント量を測定することによって評価されることがよくあると考えられる。検出可能な標識を使用して、ペリプラズムの空間条件（ＯＭの外側よりも酸化度が高い）と細胞外環境とを区別できる。Ｒａｊａｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１５：２６７−２７２を参照。
【００４９】
効率的な受容体媒介性トランスロケーションセグメントは、膜輸送セグメントがない場合と比較して、死滅セグメントによる標的宿主の死滅レベルの少なくとも３倍の増加、又は移送レベルの少なくとも３倍の増加をもたらすと考えられる。いくつかの実施形態では、受容体媒介性トランスロケーションセグメントは、膜輸送セグメントがない場合と比較して、死滅又は移送のレベルを少なくとも約５、７、１０、１５、２０、３０、５０、８０、１００、１５０、２５０倍又はそれ以上増加させると考えられる。アッセイは、通常、適用に応じて使用される可能性のある濃度に近い条件下で行われる。アッセイでは、典型的には、数分、例えば、約１、２、５、１０、１５、又は３０分〜１時間又は２時間の範囲内の時間にわたり移送を測定する。
【００５０】
ＩＩ．定義
「受容体媒介性トランスロケーションドメイン」（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ（ＲＭＴＤ））は、典型的にはバクテリオシン又は関連タンパク質に由来するドメインであり、グラム陰性外膜を横断する本発明のバクテリオシン及びキメラ構築物の受容体特異的トランスロケーションを提供するように機能する。通常、ドメイン構造は、境界を設定する際に二次タンパク質構造又は三次タンパク質構造を考慮する。同定されたセグメントは上記の通りである。変異誘発の様々な形態又は配列の必要なマッチングにおける可変性を試験する手段は、経験的に試験することができる。通常、ＲＭＴＤは、天然の配列に最適にアラインメントした場合、少なくとも約６０％のマッチングを示すが、アラインメントの領域全体に対して、例えば、約６５％、７０％、７５％、８０％のようなより高いマッチングを示すことが好ましく、好ましくは８５％、９０％、９５％又はそれ以上となることが好ましい。セグメントは通常、長さが少なくとも約６５％、７０％、７５％、好ましくは８０％、８５％、９０％又はそれ以上であり得る領域に渡って、ドメイン全体よりも、特に高いマッチング率を示す領域であると考えられる。セグメントマッチングは、アライメントのより短いセグメントに渡って選択されたより高いマッチング数となるであろう。
【００５１】
いくつかの実施形態では、受容体媒介性トランスロケーションドメイン（ＲＭＴＤ）は、２つの別個のセグメントを含み得る。１つ目は「受容体結合セグメント」（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｅｇｍｅｎｔ（ＲＢＳ））で、通常はバクテリオシン又は関連タンパク質に由来し、キメラ構築物と同族受容体との相互作用の選択性又は特異性を付与する。この相互作用は、構造及び標的間の初期の相互作用において重要であり、通常は選択性を提供して、トランスロケーションプロセスの経時的工程が起こることを可能とする。ＲＢＳは、前記ドメインの配列が請求の範囲を回避するために変更される（例えば、置換又は修飾によって）場合、機能の維持について試験することが可能である。天然配列へのマッチングは、典型的には、アラインメントの領域にわたって、例えば、天然配列の少なくとも約６５％、約７０％、７５％、８０％、好ましくは約８５％、９０％、９５％、又はそれ以上である。受容体結合セグメントは、短いセグメントよりも、特に高いマッチングの領域と考えられる。アラインメントの長さは、通常、任意のマッチング手段と組み合わせて、ドメインの長さの少なくとも約６５％、７０％、７５％、好ましくは８０％、８５％、９０％以上である。２つ目のセグメントは「トランスロケーションセグメント」（ＴＳ）であり、ＴＭＤ（膜貫通ドメイン）、トランスロケーションドメイン、移送セグメントなどの用語でも称され、作動可能に連結されたカーゴドメインの、グラム陰性細菌の外膜を横断する移送に、影響を与え得る。かかるドメインは、それ自体が膜を横断して付随するセグメントを移送させる能力を有するか、又は連結された触媒セグメントの輸送に影響を与える内因性のトランスロケーションシステムによって認識され得る。キメラポリペプチドは、膜を横断してインタクトなまま移送されるか、又はトランスロケーション中に修飾されてもよい。膜輸送ドメイン自体がさらに、内膜を損傷させ、この追加のメカニズムによって死滅させる能力を有してもよい。
【００５２】
「カーゴドメイン」は、通常、機能性タンパク質ドメインであり、ＲＭＴＤに作動可能に連結されて移送される。この「カーゴ」という記述は、ドメイン又はセグメントが受動的又は能動的であり得ることを強調している。特定の実施形態では、前記セグメントは、トランスロケーションに際して標的細胞の死滅をもたらす機能、例えば、死滅ドメイン又は死滅セグメントを有し得る。前記死滅機能（killing）は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ムレイン分解酵素、代謝かく乱物質、構造逆アセンブラ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｅｒ）、又は直接的若しくは間接的に毒性若しくは死滅に影響を及ぼし得る多くの能動的機能のように、触媒的、例えば酵素的であり得る。前記セグメント又はドメインは、例えば、ＧＦＰ又は様々な化学的に結合した実体の担体のような標識セグメントとして、受動的であり得る。したがって、カーゴドメインは、細胞区画に化学的に輸送され、そこから放出される毒性複合物の担体として使用されるポリペプチドであり得、これは化学量論的に作用し得る。抗生物質や抗微生物剤などの化学的添付物は、トランスロケーションプロセスによって適切な細胞区画に送達され、標的細胞内の適切な部位で放出されうる。
【００５３】
「作動可能に連結された」とは、要素の機能的連結を指す。したがって、第一のセグメント（例えば、トランスロケーションドメイン）の機能が、ムレイン分解又は他の機能（死滅）セグメント又はドメインなどのカーゴドメインをトランスロケーションするように作動するのであれば、２つの要素は作動可能に連結されている。
【００５４】
「死滅活性」は、標的細菌を死滅させるか、生存率又は増殖速度を低下させる酵素活性を含み得る。
【００５５】
細菌の「環境」は、イン・ビトロ又はイン・ビボ環境を含み得る。イン・ビトロ環境は、例えば、単離又は精製された細菌を保持する反応容器、滅菌される表面（例えば、公衆衛生施設で）、機器、動物の区画の表面、又は給水施設、浄化槽、若しくは下水道施設を含み得る。他のイン・ビトロ条件は、例えば、近接する多くの共生種又は相互作用種を含む、混合種集団を提供し得る。イン・ビボ環境は、標的細菌に感染した宿主生物であり得る。イン・ビボ環境は、膀胱、腎臓、肺、皮膚、心臓及び血管、胃、毛皮、腸、肝臓、脳又は脊髄などの器官、眼、耳、鼻、舌などの感覚器官、膵臓、脾臓、甲状腺などを含む。イン・ビボ環境は、歯茎、神経組織、リンパ組織、腺組織などの組織、例えば、血液、痰などの体液、カテーテル、チューブ、インプラント、及び身体に導入又は装着され、通常の使用では感染源となる可能性があるモニタリング装置又は治療装置を含む。環境には、魚、肉、又は植物材料などの食品の表面も含まれる。肉には、例えば、牛肉、豚肉、鶏肉、七面鳥、又は他の家禽が含まれる。植物材料には、野菜、果物、又は果物や野菜から作られたジュースが含まれる。あるいは衣類や住居が含まれる場合もある。いくつかの実施形態では、細菌感染食品と接触した表面は、ＶＡＭＥ構築物又はキメラを含む本発明のタンパク質で処理される。
【００５６】
組成物を環境に「導入すること」は、化合物又は組成物を適用又は投与すること、及び標的細菌が化合物又は組成物に曝露されるようにすることを含む。前記化合物又は組成物の導入は、それを産生又は放出する可能性がある生菌又は死菌によって影響を受ける可能性がある。
【００５７】
「細胞壁分解タンパク質」は、到達可能な細胞壁又はその成分に対して検出可能な、例えば、実質的な分解活性を有するタンパク質である。「ムレイン分解」活性は、分解活性の結果であり得る。細胞壁分解ドメインは、例えば、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）のファージの尾部基盤又はサイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）のファージの尾部の末端、及び他のファージビリオンムレイン分解ポリペプチドに由来し得る。
【００５８】
「ＧＭＰ条件」とは、例えば、米国政府の食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって定義されているように、適正製造基準（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を指す。同様の基準及び規制がヨーロッパ、日本、そしてほとんどの先進国で存在する。
【００５９】
上記の「実質的に純粋」の定義における「実質的に」という用語は、通常、タンパク質、核酸、又はその他の構造若しくはその他のクラスの分子において、約６０％以上、約７０％、約８０％以上、又はより好ましくは約９０％以上、さらに一層好ましくは約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、又は約９９％以上の純度を意味する。
【００６０】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたもの、並びに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基を有する化合物を指し、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸としての基本的な化学構造は保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の通常の化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００６１】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、又は「ペプチド」とは、ほとんど又は全てのモノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に結合されているポリマーを指し、あるいはポリペプチドと称される。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のいずれかを使用することができる。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、及びホモアルギニンも含まれる。遺伝子にコードされていないアミノ酸も本発明で使用することができる。さらに、適切な構造又は反応基を含むように修飾されたアミノ酸もまた、本発明において使用され得る。本発明で使用されるアミノ酸はＤ−異性体、Ｌ−異性体、又はそれらの混合物であり得る。Ｌ−異性体が通常は好ましい。さらに、他のペプチド模倣体もまた、本発明において有用である。一般的な考察については、Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．  Ｆ．，  ｉｎ  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．  １９８３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ．  ２６７を参照。
【００６２】
細胞に関して使用される場合の「組換え」という用語は、細胞が異種核酸を複製するか、又は異種核酸によってコードされるペプチド又はタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型では見られない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、修飾され、人工的手段により細胞に再導入された、細胞の天然型に見られる遺伝子を含むことができる。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく修飾された、細胞にとって内因性の核酸を含む細胞を包含する。かかる修飾には、遺伝子置換、部位特異的変異、及び関連技術によって得られる修飾が含まれる。特に、配列の融合は、例えば、所望の配列の上流に上流分泌カセットを組み込んで、分泌タンパク質産物を生成するように生成され得る。
【００６３】
「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」、「タンパク質複合物」などの用語は、元の又は天然の全長タンパク質又はその部分配列をコードするアミノ酸配列に加えて、その代わりに、それより少なく、及び／又はそれとは異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。本明細書に記載されるように、例えば、１つのエピトープタグ若しくは精製タグ、又は複数のエピトープタグ若しくは精製タグなど、１又は複数の追加のドメインを細胞壁ムレイン分解タンパク質に付加することができる。例えば、追加の（混合コロニー又はバイオフィルムの標的生物又は関連生物に対する）死滅活性、標的化機能を付加し得るか、又は、例えば、血管透過性又はバイオフィルムの完全性などの生理学的プロセスに影響を与える、追加のドメインが結合され得る。あるいは、ドメインを結合して、異なるポリペプチド間の物理的親和性をもたらし、多鎖ポリマー複合体を生成してもよい。
【００６４】
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は混合ポリマーを指し、他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知の類似体を包含する。他に示されない限り、又は文脈によって、特定の核酸配列は、その相補的配列を含む。
【００６５】
「組換え発現カセット」又は単に「発現カセット」は、かかる配列と適合する宿主における構造遺伝子の発現に影響を与えることができる核酸要素を用いて、組換え又は合成により生成される核酸構築物である。発現カセットは、典型的には、少なくともプロモーター及び／又は転写終結シグナルを含む。典型的には、組換え発現カセットは、転写される核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、及びプロモーターを含む。発現を引き起こす追加のファクターが含まれてもよい。特定の実施形態において、発現カセットはまた、宿主細胞が発現したタンパク質の分泌を指示するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シグナル、エンハンサー、及び遺伝子発現に影響を与える他の核酸配列も、発現カセットに含まれうる。特定の実施形態では、細胞壁上のムレイン分解活性を含むアミノ酸配列をコードする組換え発現カセットが、細菌宿主細胞中で発現される。
【００６６】
本明細書で使用される「異種配列」又は「異種核酸」は、特定の宿主細胞にとって外来の起源に由来するもの、又は、同じ起源に由来する場合は、その元の形態から修飾されたものである。異種配列の修飾は、例えば、ＤＮＡを制限酵素で処理して、プロモーターに作動可能に連結することができるＤＮＡ断片を生成することにより起こり得る。部位特異的変異誘発などの手法も、異種配列の修飾に有用である。
【００６７】
「単離（された）」という用語は、酵素の活性に干渉する成分を実質的又は本質的に含まない材料を指す。本発明の糖類、タンパク質、又は核酸について、「単離（された）」という用語は、その天然の状態で見られる材料に通常付随する成分を実質的又は本質的に含まない材料を指す。典型的には、本発明の単離された糖類、タンパク質、又は核酸は、純度決定のために銀染色ゲル又は他の方法でのバンド強度により測定した場合、約８０％以上の純度、通常は約９０％以上、又は約９５％以上の純度である。純度又は均一性は、当技術分野で周知のいくつかの手段によって示すことができる。例えば、サンプル中のタンパク質又は核酸は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離することができ、その後、前記タンパク質又は核酸は、染色によって視覚化されうる。特定の目的のために、タンパク質又は核酸の高分離能が望ましい場合があり、例えば、ＨＰＬＣ、質量分析、又は精製のための同様の手段を利用してもよい。
【００６８】
「同一（である）」又はパーセント「同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はタンパク質配列に係る文脈において、配列比較アルゴリズムの１つを使用するかまたは目視検査によって測定して一致が最大となる比較及びアラインメントを行った場合に、同一であるか又は特定の割合（パーセンテージ）で同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。ある同一性アラインメントでは、ギャップは許容されないが、他のアルゴリズムでは、ギャップは適切なペナルティ基準と共に許容される。
【００６９】
「実質的に同一」という語句は、２つの核酸又はタンパク質に係る文脈において、配列比較アルゴリズムの１つを使用するか又は目視検査により測定して、一致が最大となる比較及びアラインメントを行った場合に、適切なセグメントにわたって、少なくとも約６０％を超える核酸又はアミノ酸配列同一性、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約１３、１５、１７、２３、２７、３１、３５、４０、５０以上のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも約６０、７０、８０、又は１００残基の領域にわたって、及び最も好ましくは、少なくとも約１５０残基にわたって、又は参照配列の全長にわたって実質的に同一である配列に対応する配列の１又は複数の領域にわたって存在する。
【００７０】
配列比較では、通常、１つの配列が参照配列として機能し、テスト配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列と参照配列とをコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対するテスト配列の配列同一性を計算する。
【００７１】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２に記載の局所相同性によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３に記載の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４に記載の類似の方法の検索によって、これら及び関連するアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．（ウィスコンシン州マディソン）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は目視検査（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）によって、行うことができる。
【００７２】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）又は同様のソースから公開されている。
【００７３】
２つの核酸配列又はタンパク質が実質的に同一であるというさらなる指標は、以下に記載するように、第１の核酸によってコードされるタンパク質が第２の核酸によってコードされるタンパク質と免疫学的に交差反応することである。したがって、タンパク質は、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のタンパク質と実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載されるように、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００７４】
抗体に言及する場合、「タンパク質に特異的に結合する」又は「〜と特異的に免疫反応する」という語句は、タンパク質及び他の生物製剤（biologics）の異種集団の存在下におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された免疫測定法条件下では、指定された抗体は特定のタンパク質に優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には有意な量で結合しない。かかる条件下でのタンパク質への特異的結合には、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択された抗体が必要となる。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するには、様々な免疫測定法のフォーマットを使用しうる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法は、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用されている。特定の免疫反応性を決定するために使用可能な免疫測定法のフォーマット及び条件についての記述としては、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００７５】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に改変された変異」は、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は、ポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、アルギニンがコドンによって特定される各位置で、コドンは、コードするタンパク質を変えることなく、記載された対応する別のコドンに変えることができる。このような核酸変異は「サイレント変異」であり、「保存的に改変された変異」の一種である。タンパク質をコードする、本明細書に記載の各ポリヌクレオチド配列は、特に明記されている場合を除いて、可能なサイレント変異についても記載している。核酸の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＵＧＧを除く）を改変して、標準的な手法で機能的に同一の分子を生成できることを、当業者は認識するであろう。したがって、タンパク質をコードする核酸の各「サイレント変異」は、典型的には、記載された各配列において潜在的（implicit）である。
【００７６】
当業者は、タンパク質の機能に影響を与えることなく多くのアミノ酸をタンパク質中で互いに置換可能であることを認識している。例えば、保存的置換は、開示された細胞壁ムレイン分解タンパク質などのタンパク質の保存的に改変されたバリアントの基礎であり得る。保存的アミノ酸置換のリストは未だ完成されていない。以下の８つのグループにはそれぞれ、通常は互いに保存的に置換されているアミノ酸が含まれている：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓを参照）。
【００７７】
さらに、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸（典型的には、５％未満、より典型的には１％未満）を変化、付加、又は欠失させる個々の置換、欠失、又は付加が、その変化によりアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換される効果的に「保存的に改変された変異」であることを、認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提示する保存的置換表は、当技術分野で周知である。
【００７８】
当業者は、タンパク質、例えば、死滅セグメント又は細胞壁ムレイン分解タンパク質、及びタンパク質をコードする核酸の、多くの保存的変異が、本質的に同一の産物を生じることを、理解するであろう。例えば、遺伝暗号の縮重により、「サイレント置換」（例えば、コードされたタンパク質に変化をもたらさない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードする各核酸配列の暗黙の特徴である。本明細書に記載されるように、配列は、好ましくは、死滅セグメント、例えば、細胞壁ムレイン分解タンパク質を産生するために使用される特定の宿主細胞（例えば、酵母、ヒトなど）における発現のために最適化される。同様に、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸配列内の１又はいくつかのアミノ酸で、非常に類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換され、特定のアミノ酸配列又はアミノ酸をコードする特定の核酸配列と非常に類似していると容易に識別される。任意の特定の配列のかかる保存的に置換された変異は、本発明の特徴である。またＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照。さらに、コードされた配列中の単一のアミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を変化、付加、又は欠失させる個々の置換、欠失、又は追加も、通常は「保存的に改変された変異」である。
【００７９】
本発明の実施は、組換え核酸の構築、及び、宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞における、遺伝子の発現を含み得る。特定の宿主に最適化されたコドン使用法がしばしば適用される。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当技術分野で公知である。発現ベクターなどの組換え核酸の構築に適した多種多様なクローニング法及びイン・ビトロ増幅法は、当業者に周知である。多くのクローニング演習を介して当業者を方向付けるのに充分なこれらの技術の例及び指示は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，（１９９９  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に記載されている。組換えポリペプチドの発現に適した宿主細胞は当業者に公知であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞並びに昆虫（バキュロウイルス）、哺乳動物（ＣＨＯ細胞）、真菌細胞（例えば、酵母、Ｐｉｃｈｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、及びバクテリオファージ発現系を含む真核細胞が含まれる。
【００８０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、その他のＲＮＡポリメラーゼを介した技術など、イン・ビトロ増幅法を介して当業者を方向付けるのに充分なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）（米国特許第４，６８３，２０２号）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）、Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，  １９９０）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：  １１７３、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１８７４、Ｌｏｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ３５：１８２６、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：  ５６０、及びＢａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：  １１７に記載されている。イン・ビトロで増幅された核酸をクローニングする改善された方法はＷａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，４２６，０３９号）に記載されている。
【００８１】
ＩＩＩ．商業的用途
本明細書に記載のバクテリオシンポリペプチドの様々な用途は、直ちに認識され得る。前記タンパク質は、通常の使用で汚染される可能性のある物品の抗菌処理に使用できる。標的細菌が公衆衛生上の危険となる場所、表面、装置、又は環境は、本明細書に記載のバクテリオシンポリペプチドを使用して処理することができる。目的の場所としては、標的細菌を含む材料が存在する公衆衛生施設が挙げられる。これらの材料としては、廃棄物、例えば、液体、固体、又は気体が挙げられよう。キメラバクテリオシン構築物又はこれらのポリペプチドを発現及び放出する細胞で処理することによって、流出物から標的細菌を排除するために、本明細書に記載のキメラバクテリオシン構築物を水性廃棄物処理プラントに組み込むことができる。固形廃棄物サイトでは、これらのポリペプチドを導入して、標的宿主の発生の可能性を最小限に抑えることができる。
【００８２】
本明細書に記載のバクテリオシン組成物を使用して、食品調製領域及び設備を定期的に処理することができ、それによって標的細菌を効果的に排除する手段を提供する。汚染の影響を受ける医療及びその他の公共環境は、同様の手段を使用して、標的微生物の増殖及び拡散を最小限に抑えることができる。本方法は、例えば、集中治療室用の空気濾過システムを含む、標的細菌の除去が望まれる状況で使用することができる。
【００８３】
本明細書に記載のバクテリオシンポリペプチドは、タンパク質安定剤又は保存剤として、すなわち、標的細菌が不安定化剤である場合に、使用することができる。かかる組成物は、薬物の製剤の一部として、又は肉製品や他の食品の防腐剤として、使用することができる。いくつかの実施形態では、これらのキメラバクテリオシン構築物は、例えば、安定剤として、又は防腐剤配合物の成分として、水産食品に使用することができる。かかる用途は、防腐性を維持しなければならないが、従来の抗生物質を含むことができない材料に特に有用である。
【００８４】
代替用途には、獣医学的又は医学的な状況での使用が含まれる。特定の細菌の存在を決定するための手段、又は特定の標的を同定するための手段は、集団又は培養物に対する選択剤の効果を利用しうる。動物やペットの洗浄など、洗浄剤に静菌作用を含めることが望ましい場合がある。
【００８５】
本明細書に記載のバクテリオシンポリペプチドは、例えば、ヒト、哺乳動物、動物、及び植物の細菌感染を治療するために使用することができる。これらのポリペプチドは、対象に予防的に、又は対象が細菌感染している場合に投与することができる。また、本方法は、細菌の存在を低減させるために前記組成物が適用される、展示用動物（例えば、動物園又は上演）、コンパニオン動物（例えば、犬、猫、他のペット）、競走用動物（例えば、競馬）、又は家畜動物（例えば、乳牛及び肉牛、羊、山羊、豚、鶏、魚、エビ、ロブスターなど）に適用できる。これらのキメラバクテリオシン構築物は、死滅メカニズムが宿主細胞の複製に依存しないため、ゆっくりと複製する細菌によって引き起こされる感染を治療するために使用できる。例えば抗生物質など、現在の抗微生物剤の多くは、細菌の複製に対して最も有用である。例えば、これらのバクテリオシンポリペプチドは、約１〜７２時間、１〜４８時間、１〜２４時間、１〜１２時間、１〜６時間、１〜３時間、又は１〜２時間などの倍加時間で複製する細菌を標的とするために使用できる。
【００８６】
医学的に関連するグラム陰性球菌種は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びスピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅ）（性感染症を引き起こす）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（髄膜炎を引き起こす）、及びＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（呼吸器症状を引き起こす）を含む。関連するグラム陰性桿菌種は、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（呼吸器系の障害）、並びにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、及びＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（泌尿器系の障害）、並びにＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（胃腸の障害）、並びにスピロヘータ（性感染症）を含む。院内感染に関連するグラム陰性細菌は、例えば、病院施設の集中治療室で菌血症、二次性髄膜炎、及び人工呼吸器関連肺炎を引き起こすＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉを含む。
【００８７】
本発明で記載されるバクテリオシンポリペプチドを使用して標的化しうる関連細菌は、グラム陰性種であり、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ属、酢酸菌、ＷｏｌｂａｃｈｉａなどのＡｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱、シアノバクテリア、スピロヘータ、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌を含む。
【００８８】
特定の条件下で外膜を有する可能性がある（グラム染色でグラム可変パターンを示す）グラム可変生物も、本発明のバクテリオシンポリペプチドを使用して標的化することができる。グラム可変細菌には、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ａｒｔｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属が含まれ、これらは細胞分裂中の破損に特に敏感な細胞壁を有し、グラム陰性染色を示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの培養では、増殖中のペプチドグリカンの厚さの減少は、グラム染色陰性を示す細胞の数の増加と一致する。さらに、細菌培養の培養齢はグラム染色の結果に影響を与える可能性がある。
【００８９】
ＩＶ．投与
本明細書に記載のこれらのバクテリオシンポリペプチド及びキメラバクテリオシン構築物の投与経路及び投与量は、感染細菌株、感染の部位及び程度（例えば、局所又は全身）、並びに治療される対象によって変化する。投与経路には肺への送達のための経口、エアロゾル、又は他のデバイス、鼻腔スプレー、静脈内（ＩＶ）、筋肉内、腹腔内、髄腔内、眼内、膣内、直腸、局所、腰椎穿刺、髄腔内、脳及び／又は髄膜への直接適用が含まれるが、これらに限定されない。治療薬の送達のためのビヒクルとして使用できるエクシピエント（excipients）は、当業者には明らかであろう。例えば、ムレイン分解ポリペプチドは、凍結乾燥形態であり得、投与（例えば、ＩＶ静脈内注射による）前に溶解（再懸濁）され得る。投与量は、宿主感染における細菌あたり約０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、１００００個以上のキメラバクテリオシン構築物分子の範囲内であると考えられる。直列的に関連付けられているか、複数のサブユニットの形式（ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマーなど）であるか、又は１又は複数の他の実体（酵素や異なる特異性の断片など）と組み合わされていてもよい、タンパク質のサイズに応じて、用量は、約１００万〜約１０兆／ｋｇ／日、好ましくは約１兆／ｋｇ／日であり得、約１０６死滅単位／ｋｇ／日〜約１０１３死滅単位／ｋｇ／日であり得る。
【００９０】
死滅能力を評価する方法は、インタクトな複製ファージを評価するために当業者が使用する方法、例えば、プラーク形成単位又はｐｆｕと同様であり得るが、死滅単位は、死滅単位の滴定後の生存細菌数を決定することによってよりよく評価され得る。非複製ファージは細菌宿主の菌叢にプラークを形成しないと考えられるため、死滅の定量化は明確である。したがって、段階希釈法を使用して、標準のｐｆｕの代わりに「死滅」単位の量を評価できる。死滅組成物に曝露された細菌培養物の段階希釈を使用して、死滅単位を定量化することができる。総細菌数を生存可能なコロニー単位と比較することで、細菌の生存可能な画分及び死滅構築物に影響されやすい画分を確立できる。滞留活性（stasis activity）を評価するための他の手段は、天然又は負荷された細胞内内容物の放出、又は天然の細胞壁構造に対応する規定の又は調製された基質に対する酵素活性を含み得る。
【００９１】
治療剤は、典型的には、病原菌の除去が完了するまで投与される。本発明は、本発明の組成物の単回投与形態及び複数回投与形態、並びにかかる単回投与形態及び複数回投与形態の送達のための徐放手段を達成するための方法を企図する。広域スペクトルの製剤は、感染株の特異診断が決定される間でも使用できる。
【００９２】
肺又は他の粘膜表面へのエアロゾル投与に関して、前記治療組成物は、投与のために特別に設計されたエアロゾル製剤に組み込まれる。このようなエアロゾルの多くは当技術分野で公知であり、本発明は特定の製剤に限定されない。かかるエアロゾルの例は、噴霧剤がトリクロロモノフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、及びオレイン酸を含有する、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社製のＰｒｏｖｅｎｔｉｌ（商標）吸入器である。他の実施形態は、対象又は患者の鼻腔及び副鼻腔への投与のために設計された吸入器を含む。噴射剤成分及び乳化剤の濃度は、治療に使用されている特定の組成に基づいて、必要に応じて調整される。エアロゾル治療ごとに投与される酵素死滅単位数は、典型的には、約１０６〜１０１３死滅単位の範囲内、例えば、約１０１２死滅単位である。
【００９３】
典型的には、死滅は、宿主複製能力を少なくとも約３倍、例えば、１０倍、３０倍、１００倍、３００倍など、何桁も減少させると考えられる。死滅させずに宿主複製の速度を遅くすることも、治療的又は商業的に重要な価値がある場合がある。遺伝的不活性化効率は、約４、５、６、７、又は８以上の対数単位であり得る。
【００９４】
Ｖ．製剤
本発明はさらに、医薬的に許容されるエクシピエント（excipient）中に配置される本発明の少なくとも１つのバクテリオシンポリペプチドを含む医薬組成物を企図する。したがって、本発明の製剤及び医薬組成物は、細菌宿主に特異的な単離バクテリオシンポリペプチドを含む製剤、同一又は典型的な細菌宿主に影響を与える２、３、５、１０、又は２０以上の酵素の混合物、及び異なる細菌宿主又は同一細菌宿主の異なる細菌株に影響を与える２、３、５、１０、又は２０以上の酵素の混合物、例えば、複数のグラム陰性細菌種の増殖を一括して阻害するバクテリオシンポリペプチドのカクテル混合物を企図する。このようにして、本発明の組成物は、患者のニーズに合わせることができる。前記化合物又は組成物は、無菌又はほぼ無菌であり得る。
【００９５】
「治療有効用量」は、それに対して投与される静菌性（細菌増殖を低減する）又は殺菌性（細菌を死滅させる）の効果をもたらす用量である。正確な用量は、治療の目的に依拠し、当業者により公知技術を使用して確認可能であろう。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．  １−３），  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ、及びＰｉｃｋａｒ（１９９９）Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓを参照。当技術分野で公知のように、タンパク質分解、全身送達対局所送達、並びに年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び状態の重症度の調整が必要な場合があり、当業者により確認可能であろう。
【００９６】
様々な医薬的に許容されるエクシピエントが当技術分野で周知である。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容されるエクシピエント」は、組成物の活性成分と組み合わされた場合に、対象の免疫系と破壊的な反応を引き起こすことなく前記成分が生物活性を保持することを可能にする材料を含む。かかるエクシピエントには、安定剤、保存剤、塩もしくは糖の複合体（complexes）又は結晶などが含まれる。
【００９７】
例示的な医薬的担体には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳液が含まれる。リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳液などの乳液、及び様々な種類の湿潤剤などの標準的な医薬エクシピエントが例として挙げられるが、これらに限定されない。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、乳液又は懸濁液が含まれ、生理食塩水及び緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づいたものなど）などが含まれる。他の実施形態では、前記組成物は、徐放性粒子、ガラスビーズ、包帯、眼への挿入物、及び局所形態を含む固体マトリックスに組み込まれることが考えられる。
【００９８】
さらに、リポソーム送達用の製剤、及び糖結晶を含むマイクロカプセル化酵素を含む製剤が含まれる。かかるエクシピエントを含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４３，  １４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｌを参照）。タンパク質は、それらにしばしば由来する利点を達成するために、ＰＥＧ化に供されてもよい。例えば、Ｊｅｖｓｅｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  ５：１１３−１２８、Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｓ．  ６０：３−１２、Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ（２００８）Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  ２５：４０３−４７，  ＰＭＩＤ：  １９０６２６３３ｌ、及びＳｈａｕｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：３１２−３１３を参照。同様の安定化結果を達成するための代替手段が存在する。例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７：１１８６−１１９２を参照。
【００９９】
一般に、医薬組成物は、顆粒、錠剤、丸薬、カプセル（例えば、経口送達に適合）、坐剤、マイクロビーズ、マイクロスフェア、リポソーム、懸濁液、軟膏、ローションなどの様々な形態で調製することができる。経口及び局所使用に適した医薬品グレードの有機又は無機担体及び／又は希釈剤を使用して、治療活性化合物を含む組成物を構成することができる。当該技術分野で公知の希釈剤には、水性媒体、植物油脂及び動物油脂が含まれる。製剤は、安定剤、湿潤剤及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、又は適切なｐＨ値を確保するための緩衝液を組み込んでいてもよい。
【０１００】
前記医薬組成物は、前記バクテリオシンポリペプチドに加えて他の成分、例えば、複数の活性成分、例えば、２以上、３以上、５以上、又は１０以上の異なる酵素を含むことができ、これら異なる酵素は、同一、異なる、又は付随する細菌に対して特異的であり得る。例えば、前記医薬組成物は、複数（例えば、少なくとも２以上）の定義される（defined）死滅活性を有しうるものであり、ここで前記組成物における前記死滅活性のうち少なくとも２つは、異なる細菌宿主特異性又は異なる特異性を有する。このようにして、前記治療組成物は、異なる細菌の混合感染を治療するために適合させることができ、又は特定の施設環境でよく見られる様々なタイプの感染に対して有効であるように選択された組成物であり得る。選択された組み合わせは、例えば、感染に存在する、又は潜在的に存在する、複数の菌株を標的とするために、異なる特異性を有する様々な供給源に由来する異なる群の死滅実体（killing entities）を選択することにより生じ得る。上記のように、死滅活性は、バイオフィルム又はカプセル形成培養物に対する効力を提示する従来の抗微生物剤又は試薬などの他の薬剤と共に投与することができる。様々な材料が、例えば、Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｒｑｕｅｓ（２００９）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９１：３９３−４０３、Ｋｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｉｔｏｈ（２００２）Ａｐｐｌ．  ａｎｄ  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６９：２４９１−２４９７、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｇｅｉｄｅｒ（２０００）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９０：１２６３−１２６８、Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８５：５８３−５９０、及びＢａｒｔｅｌｌ  ａｎｄ  Ｏｒｒ（１９６９）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４：５８０−５８４に記載されている。いくつかの実施形態において、添加物（例えば、脂肪酸）又はバイオフィルム解重合酵素は、追加のドメインとしてキメラ構築物に添加されて、製剤中の追加の成分として、又は同時にもしくは順次、本明細書に記載のバクテリオシン死滅活性と組み合わせて、投与され得る。組み合わせは、選択した死滅活性を改善又は補完し得る。
【０１０１】
ＶＩ．方法論
本発明を実施するいくつかの態様は、周知の方法、一般的な臨床微生物学、バクテリオファージを取り扱うための一般的な方法、並びにバイオテクノロジーの一般的な基礎、原理、及び方法を含む。このような方法の参考文献を以下に示す。
【０１０２】
Ａ．一般的な臨床微生物学
一般的な微生物学は微生物の研究である。例えば、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．  ２００２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｃｌｏｓｅｓｔ  Ｒｅｌａｔｉｖｅｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｔｅ（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｔｌａｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｃａｎｎ（２００１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ  ｅｄ．），、Ｇａｒｒｉｔｙ（ｅｄ．  ２００５）Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（２  ｖｏｌ．  ２ｄ  ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ，、Ｓａｌｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔ（２００１）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：  Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（２ｄ  ｅｄ．）Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｔｉｅｒｎｏ（２００１）Ｔｈｅ  Ｓｅｃｒｅｔ  Ｌｉｆｅ  ｏｆ  Ｇｅｒｍｓ：  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｓｔａｒ、Ｂｌｏｃｋ（ｅｄ．  ２０００）Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（５ｔｈ  ｅｄ．）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌ．、Ｃｕｌｌｉｍｏｒｅ（２０００）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｔｌａｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｅｗｉｓ  Ｐｕｂ．、Ｍａｄｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（９ｔｈ  ｅｄ．）Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ、Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．  ２０００）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒ．、Ｔｏｒｔｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｃｅ（ＴＭ）Ｗｅｂｓｉｔｅ，  Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔｕｔｏｒｉａｌ  ＣＤ−ＲＯＭ，  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ＩＤ  ＣＤ−ＲＯＭ（７ｔｈ  ｅｄ．），  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｄｅｍａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．  １９９９）Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．）Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｆｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．  １９９９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．  １９９９）Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（７ｔｈ  ｅｄ．）Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｂｕｒｌａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．  １９９８）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ��ｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｆｏｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂａｉｌｅｙ  ＆  Ｓｃｏｔｔ’ｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１０ｔｈ  ｅｄ．）Ｍｏｓｂｙ、Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．  １９９８）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ（３ｄ  ｅｄ．）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｔｏｍｅｓ（１９９８）Ｔｈｅ  Ｇｏｓｐｅｌ  ｏｆ  Ｇｅｒｍｓ：  Ｍｅｎ，  Ｗｏｍｅｎ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ｉｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒ．、Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｐｎｅｓｓ（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ＩＳＢＮ：  １５５５８１１０２７、Ｋａｒｌｅｎ（１９９６）ＭＡＮ  ＡＮＤ  ＭＩＣＲＯＢＥＳ：  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｌａｇｕｅｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｔｉｍｅｓ  Ｔｏｕｃｈｓｔｏｎｅ  Ｂｏｏｋｓ、及びＢｅｒｇｅｙ（ｅｄ．  １９９４）Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（９ｔｈ  ｅｄ．）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照。最新版が利用できる場合がある。
【０１０３】
Ｂ．バクテリオファージを取り扱うための一般的な方法
バクテリオファージを取り扱うための一般的な方法は周知であり、例えば、Ｓｎｕｓｔａｄ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ（２００２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ａｉｔｋｅｎ（ｅｄｓ．  ２００２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ、Ｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌａｉｒ（ｅｄｓ．  ２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉ．  Ｐｕｂ．、Ａｄｏｌｆ（ｅｄ．  １９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｖｏｌ．  ６，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｄｏｌｆ（ｅｄ．  １９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｖｏｌ．  ７，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＨｏｂａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｔｔ（ｅｄｓ．  １９８８）Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｎｏ．  １３６）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照。
【０１０４】
Ｃ．バイオテクノロジーの一般的な基礎、原理、及び方法
バイオテクノロジーの一般的な基礎、原理、及び方法は、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（４ｔｈ  ｅｄ．）Ｇａｒｌａｎｄ、Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．  ２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．）Ｇａｒｌａｎｄ、Ｆｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．  １９９９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（３ｄ  ｅｄ．）Ｗｏｒｔｈ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０００）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（４ｔｈ  ｅｄ．）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ａｒｉａｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（７ｔｈ  ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｋｉｅｒｓｚｅｎｂａｕｍ（２００１）Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍｏｓｂｙ、Ｗｅａｖｅｒ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｂａｒｋｅｒ（１９９８）Ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ（１９９９）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２ｄ  ｅｄ．），  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３  ｖｏｌ．，  ３ｄ  ｅｄ．），  ＣＳＨ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ、及びＳｃｏｐｅｓ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（３ｄ  ｅｄ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇに記載されている。より新しい版が利用できる場合もある。
【０１０５】
Ｄ．部位特異的、ランダム、又はシャッフル突然変異誘発
本明細書で提供される構造的及び機能的説明に基づいて、相同体及び機能的バリアントを生成することができる。透過関数を有するセグメントは、構造的相同性によって見つけることができる。これらは、構造体のバリアントをスクリーニングするための開始点としても機能し得る。例えば、かかる構造体を変異誘発し、望ましい特性、例えば、より広い基質特異性を有するものをスクリーニングする。突然変異誘発の標準的な方法を使用してもよく、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｂｏａｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３：４９５−５０４、米国特許第６，５０６，６０２号、第６，５１８，０６５号、第６，５２１，４５３号、第６，５７９，６７８号を参照。
【０１０６】
Ｅ．スクリーニング
スクリーニング方法は、変異体又は新しい死滅セグメント候補を評価するために考案することができる。
【０１０７】
死滅活性スクリーニングでは、粗細菌培養、単離された基質成分、反応物調製物、合成基質、又は精製試薬を使用して、標的細胞上の基質部位の親和性及び数を決定できる。透過アッセイ（penetration assays）を組み込んで、標的菌株の外膜の完全性を評価することができ、菌叢阻害アッセイ、培養体の生存能試験、標的基質調製物又は他の基質に対する活性、又は成分の放出を評価することができる。例えば、細胞壁ムレイン分解機能アッセイでは、アミダーゼ活性は、可溶性Ｎ−アセチルヘキソースアミンの放出（例えば、改良モルガン−エルソン（Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ）反応）又はＤＮＦＢアッセイを使用した遊離アミノ基のアッセイによるエンドペプチダーゼ活性（ａｌａ−ｇｌｙエンドペプチダーゼのＬ−アラニン、ｇｌｙ−ｇｌｙエンドペプチダーゼのＬ−グリシン）により測定できる。これら３つのアッセイは全てＰｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２７６４−７６に基づく。Ｇｌｙ−ｇｌｙエンドペプチダーゼ活性は、Ｎ−アセチル化ヘキサグリシン（アセチル−Ｇｌｙ６）からの遊離アミノ基の放出としても測定可能である。Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１７：３２９−３３１を参照。
【０１０８】
リンカーを試験して、膜移動又は分解への影響を比較したり、活性断片の様々な配向の活性を比較したりすることができる。標的のパネル（panels of targets）（例えば、グラム陰性細菌、グラム陽性菌、マイコバクテリア、及び胞子）を、死滅セグメントを使用してスクリーニングし、標的のより広い又はより狭いスペクトルでどの断片が重要又は効率的かを決定できる。
【０１０９】
例えば、細胞壁分解活性を試験するための１つの方法は、ビリオンに関連するタンパク質を放出するために穏やかな界面活性剤又は変性剤でファージを処理することである。これらのタンパク質は、細菌細胞に対する壁分解又はムレイン分解活性についてさらに試験される。別の方法は、ファージ耐性宿主上での細胞壁分解活性又は外因性溶菌（ＬＯ）を決定することである。ファージ構造成分に関連する壁分解又はムレイン分解活性を評価する３番目の方法は、ザイモグラムアッセイを実施することであり、例えば、オートクレーブ処理した宿主細胞を組み込んだＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で精製ファージ調製物を電気泳動する。ゲル上のタンパク質はその場で再生され、その後、細胞壁成分に作用して、ゲルの残りの部分がメチレンブルー染料で青く染まると、透明な「ムレイン分解」ゾーンが生じる。例えば、Ｌｅｐｅｕｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６４：４１４２−４２８を参照。透明なゾーンが視覚化され、各ゾーンのタンパク質バンドが溶出される。タンパク質は、例えば、Ｎ末端配列決定又は質量分析によって同定することができる。次に、分解タンパク質をコードする配列を単離することができる。
【０１１０】
ＶＩＩ．バクテリオシンをコードする核酸の単離、成分ドメイン
本発明はさらに、死滅セグメント又は膜輸送タンパク質をコードする核酸を提供する。かかるポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載のバクテリオシン、及び上記のような他の死滅ドメインをコードし得る。
【０１１１】
死滅セグメントポリペプチドをコードする核酸は、本発明の核酸の実施形態に関連する。これらの核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム、又は部分配列（プローブ））は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）、又は自己配列複製システム（ＳＳＲ）などのイン・ビトロ法によってクローニング又は増幅され得る。合成方法論に加えて、多種多様なクローニング及びイン・ビトロ増幅方法論が当業者に周知である。多くのクローニング演習を介して当業者を方向付けるのに充分なこれらの技術の例及び指示は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９４  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、Ｃａｓｈｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＵＳ５０１７４７８、及びＣａｒｒ，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．０２４６８６４に記載されている。
【０１１２】
カーゴドメインをコードするＤＮＡは、例えば、制限酵素を用いて適切な配列をクローニング及び切断（restriction）することを含む、上記の適切な方法により調製され得る。所望の死滅セグメントをコードする核酸は、通常のクローニング法により単離され得る。例えば、受託番号ＹＰ＿０２４４８６である、細胞壁分解ポリペプチドの例示的なヌクレオチド配列を使用して、全核酸試料中の（例えば、サザンブロット又はノーザンブロット中の）死滅タンパク質又はセグメントをコードする遺伝子又はｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを設計してもよい。死滅タンパク質又はセグメントをコードする標的核酸が同定されたら、当業者に公知の標準的な方法に従って単離することができる。さらに、単離された核酸を制限酵素で切断して、完全長死滅ポリペプチドをコードする核酸、又は例えば、死滅ポリペプチドの触媒ドメインの少なくとも１つの部分配列をコードする複数の部分配列を含む、前記核酸の部分配列を作成してもよい。その後、死滅ポリペプチド又はその部分配列をコードするこれらの制限酵素断片を連結して、例えば、死滅ポリペプチドをコードする核酸を生成してもよい。
【０１１３】
同様の方法を使用して、断片間の適切なリンカーを生成してもよい。
【０１１４】
適切なポリペプチド又はその部分配列をコードする核酸は、発現された産物をアッセイすることによって特徴解析することができる。発現されたポリペプチドの物理的、化学的、又は免疫学的特性の検出に基づくアッセイを使用してもよい。例えば、本明細書に記載されるように、前記核酸によりコードされるポリペプチドの標的細菌細胞を死滅させる能力により、死滅セグメントポリペプチドを同定してもよい。
【０１１５】
また、所望のポリペプチド又はその部分配列をコードする核酸を化学的に合成してもよい。適切な方法には、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：  ９０−９９に記載のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：  １０９−１５１に記載のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．，  ２２：  １８５９−１８６２に記載のジエチルホスホロアミダイト、及び米国特許第４，４５８，０６６号に記載の固体支持法が含まれる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドが生成される。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、又は一本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る。ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に制限されることが多いが、より長い配列が、より短い配列のライゲーションによって得られ得ることを、当業者は認識している。
【０１１６】
所望のポリペプチド又はその部分配列をコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用してクローニングされ得る。したがって、例えば、前記核酸配列又は部分配列は、１つの制限酵素部位（例えば、ＮｄｅＩ）を含むセンスプライマー及び別の制限酵素部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含むアンチセンスプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅される。これにより、所望のポリペプチド又は部分配列をコードし、末端制限酵素部位を有する核酸が生成される。その後、この核酸は、第２の分子をコードし且つ適切な対応する制限酵素部位を有する核酸を含むベクターに、容易に連結され得る。適切なＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ又は他のソースで提供される配列情報を使用して、当業者によって決定され得る。適切な制限酵素部位はまた、カーゴポリペプチド又はそのポリペプチド部分配列をコードする核酸に、部位特異的変異誘発によって付加されてもよい。カーゴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は部分配列を含むプラスミドを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、標準的な方法に従って増幅及び／又は発現させるために適切なベクターに連結する。イン・ビトロ増幅法を介して当業者を方向付けるのに充分な手法の例は、Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ４，６８３，２０２、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９０）、Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，  １９９０）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：  ８１−９４、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：  １１７３、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，  １８７４、Ｌｏｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．，  ３５：  １８２６、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：  １０７７−１０８０、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：  ２９１−２９４、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：  ５６０、及びＢａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：  １１７に記載されている。
【０１１７】
カーゴポリペプチドをコードするいくつかの核酸は、同定済のポリペプチドの配列に基づくＰＣＲプライマーを使用して増幅することができる。
【０１１８】
例えば、特定の核酸から発現される組換えカーゴポリペプチドのその他の物理的特性を、公知の望ましいポリペプチドの特性と比較して、例えば細菌特異性、結合特異性、及び／又は触媒活性の決定因子であるカーゴタンパク質の、適切な配列又はドメインを同定する、別の方法を提供することができる。あるいは、カーゴポリペプチドをコードする核酸又は組換えカーゴポリペプチド遺伝子を変異させることが可能であり、カーゴポリペプチドとしての役割、又は特定の配列若しくはドメインの役割は、通常、変異していない、天然に存在する、又は制御カーゴポリペプチドによって高められる細菌の「機能」における変化を検出することによって確立される。本発明の死滅ポリペプチドの突然変異又は修飾は、例えば、ＰＣＲなどのポリペプチドをコードする核酸を操作する分子生物学技術により促進され得ることを当業者は認識するであろう。キメラ構築物と適合性のあるリンカー特徴を含む、他の突然変異誘発又は遺伝子シャッフリング技術が、本明細書に記載の機能性断片に適用され得る。
【０１１９】
新たに同定された死滅ポリペプチドの機能性ドメインは、該ポリペプチドを変異又は修飾し、本明細書に記載されるように、それらを受容体基質活性及び／又は触媒活性などの活性について試験する標準的な方法を使用することにより、同定することができる。様々な死滅タンパク質の機能性ドメインの配列を使用して、１又は複数の死滅ポリペプチドの機能性ドメインをコードするか又は組み合わせる核酸を構築してもよい。その後、これらの多活性ポリペプチド融合体を、所望の静菌又は溶菌活性について試験することができる。ポリペプチドを死滅させるための供給源の具体例としては、機能性ファージゲノムの不完全な残遺物を含むプロファージ配列、又はファージ様の遺伝子セグメントに由来する粒子を含むピオシン様構造、例えば、細菌のＤＮＡに残っている欠失又は変異のあるファージの遺伝子残遺物が挙げられる。
【０１２０】
死滅ポリペプチドをコードする核酸は、死滅ポリペプチドの公知の核酸又はアミノ酸配列とのアラインメント及び比較、例えばそれらの間の配列同一性の量を決定すること、により同定されてもよい。この情報を利用して、死滅ポリペプチド活性、例えば標的細菌又は結合特異性及び／又は分解活性を、付与又は調節するポリペプチドドメインを、目的のポリペプチド間の配列同一性の量に基づいて、同定及び選択してもよい。例えば、目的の死滅ポリペプチドとの配列同一性を有し且つ公知の活性に関連するドメインを用いて、該ドメイン及び他のドメインを含み且つ該ドメインに関連する活性（例えば、細菌又は結合特異性及び／又は死滅活性）を有するポリペプチドを、構築してもよい。同様の戦略は、適切なドメイン又はモチーフを単離することに適用してもよく、ドメイン間のスペーシングのためのリンカーに適用してもよい。
【０１２１】
ＶＩＩＩ．宿主細胞における所望のポリペプチドの発現
本明細書に記載のタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、及び酵母を含む、様々な宿主細胞で発現され得る。宿主細胞は、例えば、酵母細胞、細菌細胞、又は糸状菌細胞などの微生物であり得る。適切な宿主細胞の例には、例えば、とりわけＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属種（例えば、Ａ．  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属種、Ｅｒｗｉｎｉａ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種、Ｐｒｏｔｅｕｓ属種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｓｅｒｒａｔｉａ属種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属種、Ｒｈｉｚｏｂｉａ属種、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ属種、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種が含まれる。細胞はいくつかの属の任意のものであればよく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えば、Ｃ．  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．  ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃ．  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ、ａｎｄ  Ｃ．  ｈｕｍｉｃｏｌａ）、Ｐｉｃｈｉａ属（例えば、Ｐ．  ｆａｒｉｎｏｓａ  ａｎｄ  Ｐ．  ｏｈｍｅｒｉ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属（例えば、Ｔ．  ｃａｎｄｉｄａ、Ｔ．  ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｔ．  ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｔ．  ｆａｍａｔａ、ａｎｄ  Ｔ．  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｄ．  ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．  ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｄ．  ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．  ｈａｎｓｅｎｉｉ、ａｎｄ  Ｄ．  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｚ．  ｒｏｕｘｉｉ  ａｎｄ  Ｚ．  ｂａｉｌｉｉ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属（例えば、Ｈ．  ａｎｏｍａｌａ  ａｎｄ  Ｈ．  ｊａｄｉｎｉｉ）、及びＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｂ．  ｌａｍｂｉｃｕｓ  ａｎｄ  Ｂ．  ａｎｏｍａｌｕｓ）が含まれる。有用な細菌の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属が含まれるが、これらに限定されない。真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞もまた、産生のために使用され得る。
【０１２２】
前記キメラバクテリオシン構築物は、宿主細胞で発現されると、標的細菌の増殖成長を妨げる（prevent）か又は死滅させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバクテリオシン構築物は、グラム陰性細菌の増殖を減少させるために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌の増殖を減少させるために使用される。複数の死滅活性を含む融合タンパク質を含む、かかる断片を組み合わせた融合構築物を生成してもよい。
【０１２３】
典型的には、前記バクテリオシン又はキメラバクテリオシン構築物をコードするポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞において機能するプロモーターの制御下に置かれる。非常に多種多様なプロモーターが周知であり、特定の用途に応じて、本発明の発現ベクターで使用することができる。通常、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性化される細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位などの、他の発現制御配列を含んでもよい。これらの制御配列の１又は複数を含む構築物は、「発現カセット」と称される。したがって、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸、例えば、死滅断片を外膜移行断片と組み合わせる核酸が、所望の宿主細胞における発現のために組み込まれている、発現カセットを提供する。
【０１２４】
特定の宿主細胞での使用に適した発現制御配列は、その細胞で発現される遺伝子をクローニングすることにより得ることができる。一般に使用される原核生物の制御配列は、本明細書では転写開始用のプロモーターを含み、所望によりオペレーターと共にリボソーム結合部位配列を含むものと定義され、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモーターシステムなどの一般的に使用されるプロモーター（Ｃｈａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：  １０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：  ４０５７）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３）８０：２１−２５）、並びにラムダ由来ＰＬプロモーター及びＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：  １２８を含む。
【０１２５】
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の原核細胞におけるバクテリオシン又はキメラバクテリオシン構築物の発現のために、特定の原核生物産生種で機能するプロモーターが使用される。かかるプロモーターは、当該種からクローニングされた遺伝子から得られたものでもよく、又は異種プロモーターを使用してもよい。例えば、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉに加えてＢａｃｉｌｌｕｓでも機能する。
【０１２６】
リボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ（ＲＢＳ））は、本発明の発現カセットに含まれるのに好都合である。Ｅ．ｃｏｌｉにおける例示的なＲＢＳは、開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さが３〜９ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる（Ｓｈｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄａｌｇａｒｎｏ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４；  Ｓｔｅｉｔｚ，  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｅｄ．  Ｒ．Ｆ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ），  ｖｏｌ．  １，  ｐ．  ３４９，  １９７９，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ＮＹ）。
【０１２７】
酵母におけるタンパク質の発現のために好都合なプロモーターとしては、ＧＡＬ１−１０（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ（１９８４）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４：１４４０−１４４８）、ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：２６７４−２６８２）、ＰＨＯ５（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８２）６：６７５−６８０）、及びＭＦα（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｏｓｈｉｍａ（１９８２）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（ｅｄｓ．  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，  Ｊｏｎｅｓ，  ａｎｄ  Ｂｒｏａｃｈ）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  ｐｐ．  １８１−２０９）が挙げられる。Ｃｏｕｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ６１：２６５−２７５（１９８７）に記載されるように、酵母における使用に適した他のプロモーターとしてはＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターがある。糸状菌、例えば、菌類Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，９３５，３４９号）において、有用なプロモーターの例は、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４：  ２０９３  ２０９９（１９８５））及びｔｐｉＡプロモーターを含む。適切なターミネーターの例は、ＡＤＨ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０１２８】
本発明では、構成的プロモーター又は調節プロモーターのいずれかを使用することができる。融合タンパク質の発現が誘導される前に宿主細胞を高密度まで増殖させることができることから、調節プロモーターが有利であり得る。異種ポリペプチドの高レベル発現は、いくつかの状況で細胞増殖を遅らせる。誘導性プロモーターは、発現のレベルを、例えば、温度、ｐＨ、嫌気性又は好気性条件、光、転写因子及び化学物質などの環境又は発生要因によって変更可能な遺伝子の発現を指示するプロモーターである。このようなプロモーターは、本明細書では「誘導性」プロモーターと称され、所望のポリペプチドの発現のタイミングを制御することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌宿主細胞については、誘導性プロモーターは当業者に公知である。これらには、例えば、ｌａｃプロモーター、バクテリオファージラムダＰＬプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：  １６７；  ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：  ２１）、及びバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．；  Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：  １０７４−８）が含まれる。これらのプロモーター及びそれらの使用は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．で検討されている。
【０１２９】
ポリヌクレオチド構築物の構築は、通常、細菌で複製可能なベクターの使用を必要とする。細菌からプラスミドを精製するための多数のキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＥａｓｙＰｒｅｐＪ及びＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ、及びＱｉａｇｅｎのＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを参照）。次に、単離及び精製されたプラスミドをさらに操作して、他のプラスミドを生成し、細胞のトランスフェクションに使用できる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓでのクローニングも可能である。
【０１３０】
選択可能なマーカーがしばしば、本発明のポリヌクレオチドを発現するために使用される発現ベクターに組み込まれる。これらの遺伝子は、選択培養培地で増殖した形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要なポリペプチドなどの遺伝子産物をコードすることができる。多くの選択可能なマーカーは当業者に公知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。
【０１３１】
上記の成分の１又は複数を含む適切なベクターの構築には、上記で引用された参考文献に記載されているような標準的なライゲーション技術を使用する。単離プラスミド又はＤＮＡ断片は、必要なプラスミドを生成するために望ましい形で切断、調整、再連結される。構築されたプラスミドの正しい配列を確認するために、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化、及び／又は公知の方法による配列決定などの標準的な技術によって分析することができる。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当技術分野で公知である。組換え核酸の構築に適した多種多様なクローニング法及びイン・ビトロ増幅法は、当業者に周知である。
【０１３２】
本発明の発現ベクターを構築するための出発材料としての使用に適した様々な一般的なベクターは、当技術分野で公知である。細菌におけるクローニングの場合、一般的なベクターには、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）などのｐＢＲ３２２由来ベクター、およびラムダファージ由来ベクターが含まれる。酵母の場合、ベクターには、酵母統合プラスミド（例えば、ＹＩｐ５）、酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズプラスミド）、及びｐＧＰＤ−２が含まれる。哺乳動物細胞での発現は、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩ、及びｐ９１０２３を含む様々な一般的に入手可能なプラスミド、並びに溶菌ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及びバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウイルス）、及びレトロウイルスベクター（例えば、マウスレトロウイルス）を使用して達成できる。
【０１３３】
発現ベクターは、当業者に公知の標準的な方法を使用して、選択された宿主細胞に導入することができる。例えば、発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換により、Ｅ．ｃｏｌｉを含む原核細胞に、及びリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションにより真核細胞に導入してもよい。
【０１３４】
発現を増強するために翻訳カップリングを使用してもよい。かかる戦略では、プロモーターの下流に配置された翻訳システムに天然で存在する高度発現遺伝子に由来する短い上流オープンリーディングフレーム、及びいくつかのアミノ酸コドンの後に停止コドンが続くリボソーム結合部位を使用する。終止コドンの直前は２番目のリボソーム結合部位であり、終止コドンの後には翻訳開始の開始コドンがある。このシステムは、ＲＮＡの二次構造を溶解し、効率的な翻訳開始を可能にする。Ｓｑｕｉｒｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：  １６２９７−１６３０２を参照。
【０１３５】
本発明の様々なポリペプチドは、細胞内で発現され得るか、又は細胞から分泌され得る。細胞内発現はしばしば高収量をもたらす。必要に応じて、リフォールディング手順を実行して、可溶性の活性融合ポリペプチドの量を増やすことができる（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８００、Ｓｃｈｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：１５１を参照）。ポリペプチドがペリプラズム又は細胞外培地のいずれかに分泌される実施形態では、ＤＮＡ配列はしばしば切断可能なシグナルペプチド配列に連結される。シグナル配列は、細胞膜を通じての融合ポリペプチドの移行を指示する。プロモーター・シグナル配列ユニットを含むＥ．ｃｏｌｉでの使用に適したベクターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡプロモーターとシグナル配列とを有するｐＴＡ１５２９である（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：７２１２、Ｔａｌｍａｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３９８８、Ｔａｋａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６７０を参照）。別の実施形態においては、融合ポリペプチドは、例えば、精製、分泌、又は安定性を促進するために、プロテインＡ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の部分配列に融合される。例えば、触媒断片に基質を使用するアフィニティ法が適切な場合がある。
【０１３６】
本発明のバクテリオシンポリペプチドは、他のポリペプチドセグメント、例えば、バイオフィルム解重合酵素セグメントにさらに連結することも可能である。通常の原核生物の制御配列が転写及び翻訳を指示するので、このアプローチはしばしば高収率をもたらす。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｌａｃＺ融合は異種タンパク質の発現によく利用される。ｐＵＲ、ｐＥＸ、及びｐＭＲ１００シリーズなどの適切なベクターを簡単に入手できる。特定の用途では、精製後に融合ポリペプチドから外来配列を切断することが望ましい場合がある。これは、臭化シアン、プロテアーゼ、又は第Ｘａ因子による切断を含む、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって達成することができる（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６、Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：１０６、Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：８１０、Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：５６１を参照）。切断部位は、融合ポリペプチドの遺伝子内に所望の切断点において設計されうる。
【０１３７】
複数の転写カセットを単一の発現ベクターに配置することにより、又はクローニング戦略で使用される発現ベクターのそれぞれに異なる選択マーカーを利用することにより、複数の組換えポリペプチドを単一の宿主細胞で発現させてもよい。
【０１３８】
Ｎ末端の完全性を維持している組換えタンパク質をＥ．ｃｏｌｉから得るための適切なシステムは、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８−７０４により記載されている。このシステムでは、目的の遺伝子は、ペプチダーゼ切断部位を含む酵母ユビキチン遺伝子の最初の７６残基へのＣ末端融合体として生成される。２部分（two moieties）の接合部で切断することで、インタクトな真正Ｎ末端残基を有するタンパク質が生じる。
【０１３９】
ＩＸ．所望のポリペプチドの精製
本発明の方法においては、本明細書に記載の発現された細胞内ポリペプチド又は分泌ポリペプチドを含む粗細胞抽出物を使用することができる。
【０１４０】
前記バクテリオシンポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野の標準的な手順に従って精製することも可能である（一般的には、Ｒ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９８２），  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １８２：  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照）。分解セグメントは、少なくとも、安定性の観点から選択されたファージタンパク質に由来するため、精製には汚染物質の変性を伴い得る。実質的に純粋な組成物は、典型的には約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８〜９９％又はそれ以上均一である。精製ポリペプチドはまた、例えば、抗体選択のための免疫原として使用されてもよく、これらの抗体は、免疫選択精製方法において使用されてもよい。
【０１４１】
本発明のポリペプチドの精製を容易にするために、それらをコードする核酸は、親和性結合試薬が利用可能なエピトープ又は「タグ」、例えば、精製タグのコード配列を含むこともできる。適切なエピトープの例には、ｍｙｃレポーター遺伝子及びＶ−５レポーター遺伝子が含まれる。これらのエピトープを有する融合ポリペプチドの組換え産生に有用な発現ベクターは市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ及びｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓは、哺乳類細胞での発現に適している）。本発明のポリペプチドにタグを付着させるのに適した追加の発現ベクター、及び対応する検出システムは、当業者に公知であり、いくつかは市販されている（例えば、ＦＬＡＧ、Ｋｏｄａｋ社、ニューヨーク州ロチェスター）。適切なタグの別の例は、金属キレート親和性リガンドに結合可能なポリヒスチジン配列である。通常、隣接する６つのヒスチジンが使用されるが、６つより多くても少なくても使用可能である。ポリヒスチジンタグの結合部分として機能する適切な金属キレート親和性リガンドには、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）が含まれる（Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｊ．Ｋ．  Ｓｅｔｌｏｗ，  Ｅｄ．，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ、Ｑｉａｇｅｎ社（カリフォルニア州サンタクララ）から市販されている）。精製タグには、マルトース結合ドメイン及びデンプン結合ドメインも含まれる。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に公知である。
【０１４２】
タグとしての使用に適した他のハプテンは当業者に公知であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン）に記載されている。例えば、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン、バルビツール酸塩（例えば、米国特許第５，４１４，０８５号を参照）、及びいくつかの種類のフルオロフォアは、これらの化合物の誘導体と同様に、ハプテンとして有用である。ハプテンやその他の部分をタンパク質やその他の分子に連結するためのキットが市販されている。例えば、ハプテンがチオールを含む場合、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性リンカーを使用して、捕捉試薬上に存在するリジン残基にタグを付けることができる。
【０１４３】
当業者は、バクテリオシンポリペプチドの触媒ドメイン又は機能性ドメインに、それらの生物学的活性を低下させることなく、特定の修飾を行うことができることを認識するであろう。いくつかの修飾を行って、融合ポリペプチドへの触媒ドメインのクローニング、発現、又は組み込みを容易にしてもよい。かかる修飾は当業者に周知であり、例えば、触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端におけるコドンの付加が含まれ、これは例えば、開始部位を提供するためにアミノ末端に追加されたメチオニン、又は好都合に配置された制限酵素部位、終止コドン、若しくは精製配列を作成するためのどちらかの末端に配置された追加のアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）である。
【０１４４】
本発明の以下の検討は、例示及び説明を目的としており、本明細書に開示される１又は複数の形態に本発明を限定することを意図するものではない。本発明の記載は、１又は複数の実施形態並びに特定の変形及び修正の説明を含んでいるが、他の変形及び修正は、例えば、本開示を理解した後に当業者の技術及び知識の範囲内であり得るように、本発明の範囲内である。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ番号、及びウェブサイトは、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。教科書の最新版には、より最近の方法論が含まれる可能性がある。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ型バクテリオシン：クレビシン
クレビシンは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種によって産生される高分子量（＞３０ｋＤａ）バクテリオシンである。他のバクテリオシンと同様に、クレビシンも３つのドメインを有するモジュール型タンパク質である。クレビシンＢ、クレビシンＣ、クレビシンＣＣＬ、クレビシンＤなどのクレビシンが配列決定され、それらのいくつかはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ菌株の疫学的タイピングに使用することが提案されたが、その抗菌特性についてはほとんど知られていない。
【０１４６】
Ｐ６２８（野生型クレビシンＣＣＬ）：
クレビシンＣＣＬは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅが産生するバクテリオシンであるクロアシン（Ｃｌｏａｃｉｎ）ＤＦ１３と同一である。クロアシンＤＦ１３は、トランスロケーションにＴｏｌ−ＡＢＱＲ経路を利用し、細胞表面受容体としてＬｕｔＡを用いる。クレビシンの受容体は、鉄の存在によって調節されると予想される。細菌はシデロフォアを使用して環境から鉄を浚い取り、これらのシデロフォアは細胞表面に発現している受容体を利用して細胞内へ入る。
【０１４７】
ＤＦ１３及びクレビシンＣＣＬがほぼ同一であることは、Ｔｏｌ経路及びＬｕｔＡ受容体がこれらの種間で共有されていることを示唆している。クレビシンＣＣＬは、ｒＲＮＡの特異的分解を伴うヌクレアーゼであると予想される。ＬｕｔＡは多くの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）の細胞表面受容体として分布しているので、クレビシンＣＣＬは死滅範囲が広い可能性がある。クレビシンの受容体は、鉄の存在によって調節されると予想される。細菌は受容体を使用してシデロフォアを放出することにより環境から鉄を浚い取り、これらのシデロフォアは細胞表面に発現している受容体を利用して細胞内へ入る。
【０１４８】
公開されているＤＮＡ配列（ＡＦ１９０８５７．１）に基づいて、ＧａｎｇａＧｅｎの細菌コレクションのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種からクレビシンＣＣＬを単離し、異種発現のための免疫遺伝子とともにＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローニングした。
【０１４９】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ株におけるクレビシンＣＣＬ免疫遺伝子のスクリーニング：
プライマーは、データベースから入手可能な配列を使用して、クレビシンＣＣＬの存在をスクリーニングするように設計した。免疫遺伝子は小さい産物であり、常にクレビシンと関連しているため、免疫遺伝子ＰＣＲを実施した。いくつかのＫｌｂｅｓｉｅｌｌａ属種臨床分離株をコロニーＰＣＲでスクリーニングした。試験した１９分離株のうち、４菌株は免疫遺伝子が陽性であり、これら４菌株はクレビシンＣＣＬ遺伝子を保有していると予想される。結果を表４に示す。Ｂ２０９２株は、クローニング用のＣＣＬ遺伝子を単離するために使用した。
【０１５０】
【表４】
2021506341.tif 000010
【０１５１】
クレビシンＣＣＬのクローニング及び発現：
クレビシンＣＣＬをコードする遺伝子をその免疫遺伝子と共にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ株Ｂ２０９２からＰＣＲ増幅し、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位でＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ２６ｂにクローニングし、アフィニティタグなしのネイティブな形態で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングし、プラスミドＤＮＡを陽性クローンから単離し、挿入断片の存在を制限消化分析により確認した。
【０１５２】
試験した６つのクローンのうち５つが、約１．９ｋｂのクローン化挿入断片を放出した。クローンの配列を確認し、試験タンパク質の発現を行った。
【０１５３】
タンパク質発現：
試験タンパク質の発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で４時間誘導することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６で実施した。融合タンパク質の予想サイズは約６０ｋＤａである。４時間のＩＰＴＧ誘導の後、細胞をペレット化し、ｐＨ７の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解した。細胞の可溶性及び不溶性画分を、１００００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により分離した。上清及びペレットを１２％アクリルアミドゲルで分析した。
【０１５４】
クローン１、クローン３、及びクローン４は目的のタンパク質を発現し、可溶性の形態でのみ存在する。クローン１を、ｐＧＤＣ  ６２８と命名した。
【０１５５】
Ｐ６２８の精製：
Ｐ６２８はアフィニティタグなしで発現されたため、従来のイオン交換クロマトグラフィーで精製した。簡潔には、超音波処理した上清画分を陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックス（ＵＮＯ  Ｑ）に通し、フロースルーを収集した。次に、収集したフロースルーを陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックス（ＵＮＯ  Ｓ）にロードした。タンパク質に結合したマトリックスを洗浄し、ＮａＣｌ含有バッファーの濃度を上げてタンパク質を溶出した。１００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ、及び１Ｍの各濃度のＮａＣｌによる段階的勾配溶出を行い、試料を１２％アクリルアミドゲルで分析した。
【０１５６】
陽イオン交換マトリックスに結合したＰ６２８は、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出された。これらの画分を、ｐＨ７．０の２０ｍＭ  ＳＰＢに対してそれぞれ一晩透析を行い、ＮａＣｌを除去した。タンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍＬ及び１．３ｍｇ／ｍＬのブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイで推定した。
【０１５７】
精製Ｐ６２８の活性：
精製Ｐ６２８の抗菌活性を、ａ）菌叢阻害アッセイ、ｂ）ＣＦＵ低下アッセイ、ｃ）ＭＩＣアッセイの３つのアッセイで測定した。
【０１５８】
ａ）菌叢阻害アッセイ：
菌叢阻害アッセイは、試験タンパク質の抗菌活性を測定するための簡単な定性的アッセイである。このアッセイでは、試験分離株を使用して細菌叢をＬＢ寒天プレート上で作成し、規定の濃度の試験タンパク質を菌叢上に置き、風乾し、３７℃で１６〜１８時間インキュベートする。陽性結果では、明瞭な菌叢阻害区域が呈される。
【０１５９】
細胞表面受容体ＬｕｔＡは腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）に存在するので、Ｐ６２８はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種分離株及びＥ．ｃｏｌｉ分離株の各菌叢で試験した。Ｐ６２８を、６９株のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種臨床分離株及び４１株のＥ．ｃｏｌｉ臨床分離株で試験した。２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ（２０μｇ）Ｐ６２８を、ＬＢ寒天上で作成した臨床分離株の菌叢上に置いた。プレートを３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。
【０１６０】
Ｐ６２８は、試験した全分離株の７０％に対応する８５株のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ分離株及び試験した分離株の１５％に対応する６株のＥ．ｃｏｌｉ分離株において阻害区域を呈した。菌叢の溶解区域は変動的であり、非常に明確な溶解区域（３＋と評価）、中程度の溶解区域（２＋と評価）、混濁した溶解区域（１＋と評価）となった。パーセンテージを下記の表５に示す。
【０１６１】
【表５】
2021506341.tif 000011
【０１６２】
Ｐ６２８は、試験したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種の７６％で溶解を示し、これが強力なタンパク質である可能性を示唆している。ＬｕｔＡ受容体はＥ．ｃｏｌｉにも分布しているが、Ｐ６２８に感受性であったのは試験したＥ．ｃｏｌｉ株の２８％のみである。
【０１６３】
ｂ）ＣＦＵ低下アッセイ：
Ｐ６２８の抗菌活性を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）臨床分離株Ｂ２０９４に対して、ＬＢ培地及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）の両方で試験した。簡潔には、約１０６細胞／ｍＬのＢ２０９４を、ＬＢ又はＦＢＳに再懸濁し、２００μＬの容量でｐＨ７．０の２０ｍＭ  ＳＰＢ中の１００μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬの各濃度のＰ６２８で処理した。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、残存する生存細胞数をＬＢプレートに希釈プレーティングして測定し、３７℃で１８時間インキュベートした。
【０１６４】
Ｐ６２８は、ＬＢ及びＦＢＳの両方でＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを死滅させた。しかしながら、ＦＢＳでの活性はより優れており、ＦＢＳでは約４ｌｏｇの細胞の死滅、ＬＢ培地では１ｌｏｇの細胞の死滅が得られた。結果を図１に示す。
【０１６５】
Ｐ６２８は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ臨床株Ｂ２０９４に対して強力な抗菌活性を有し、血清中で活性である。
【０１６６】
ｃ）追加株を用いたＣＦＵ低下アッセイ：
追加株を用いたＣＦＵ低下アッセイを、増殖培地及びＦＢＳで行った。本アッセイでは、２つの追加Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ臨床分離株であるＢ２０６４及びＢ２０６５で、Ｐ６２８の抗菌活性を試験した。これらの菌株を、カチオン調整ミューラーヒントン培地（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ）（ＣＡ−ＭＨＢ培地）中、５０％ＦＢＳ中、又は７５％ＦＢＳ中で、２００μｇ／ｍＬのＰ６２８で処理した。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、残存する生存細胞数をＬＢプレートに希釈プレーティングして測定し、３７℃で１８時間インキュベートした。
【０１６７】
Ｐ６２８は、試験した分離株のＣＡ−ＭＨＢ及びＦＢＳの両方において活性があり、両方の培地で少なくとも２ｌｏｇの細胞の死滅を達成した（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【０１６８】
Ｐ６２８は、試験されたＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ臨床分離株に対して強力な抗菌活性を示す。
【０１６９】
ｄ）ＭＩＣ：
最小発育阻止濃度（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ））は、ＣＡ−ＭＨＢ、カザミノ酸培地（ＣＡＡ）、及びＦＢＳ中で、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株２０９４に対して、改変ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地微量希釈手順を使用して決定した。マイクロタイタープレートに１０点のＭＩＣを２連に設定し、８７５μｇ／ｍＬから開始して２倍に希釈した。各ウェルに５×１０５細胞の試験分離株を接種した。マイクロタイタープレートを３５℃で１８〜２０時間インキュベートした。本アッセイの終了点では、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）色素の添加後にウェルが無色であり、インキュベート終了時に増殖が完全に阻害されていたことが確認された。
【０１７０】
Ｂ２０９４株では、ＣＡ−ＭＨＢにおいて１００μｇ／ｍＬ、ＣＡＡにおいて１４μｇ／ｍＬ、及びＦＢＳにおいて２１９μｇ／ｍＬで、ＭＩＣが得られた。
【０１７１】
ＣＡＡ及びＦＢＳを使用すると、より良いＭＩＣが得られた。これは、Ｐ６２８が鉄の豊富な条件でよりよく機能することを示している。
【０１７２】
ｅ）さらなる臨床分離株に対するＭＩＣ：
いくつかの抗生物質に耐性を有する、さらなる１６株の臨床株を、ＣＡＭＨＢ及びＦＢＳの両方において、ＭＩＣによって、Ｐ６２８に対する感受性を試験した。結果を表６に示す。
【０１７３】
【表６】
2021506341.tif 000012
【０１７４】
2021506341.tif 000013
【０１７５】
薬剤耐性Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ臨床分離株はＰ６２８に対して感受性である。
【０１７６】
ｆ）Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するＰ６２８の用量反応：
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）におけるＰ６２８の用量反応は、ＣＦＵ低下アッセイを使用して２つのＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株で評価した。簡潔には、タンパク質の濃度を変えて５０％ＦＣＳ中で約１０６個の細胞を３７℃で２時間インキュベートし、ＬＢプレートにプレーティングすることで残存する生存細胞数を数えた。実験は２連に設定し、結果は２連の平均としてプロットした。
【０１７７】
患者から単離されたＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ臨床分離株Ｂ２０９４に対して用量反応を行った。１００μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの濃度範囲のＰ６２８を使用した。結果を図３に示す。
【０１７８】
１μｇ／ｍＬで示された効果は静的であったが、１０μｇ／ｍＬのＰ６２８では３ｌｏｇの細胞の死滅が達成された。この菌株では、死滅は１０μｇ／ｍＬで飽和しているようであり、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬでも同様の死滅が達成された。
【０１７９】
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  １３８８３は、抗生物質をテストするための品質管理株であり、Ｐ６２８に高い感受性を示す。１００μｇ／ｍＬ〜０．２５μｇ／ｍＬのＰ６２８濃度を使用した。結果を図４に示す。
【０１８０】
ＡＴＣＣ  １３８８３では用量依存的な死滅が達成され、０．２５μｇ／ｍＬで約１ｌｏｇの細胞の死滅が達成された。１０μｇ／ｍＬのＰ６２８で５ｌｏｇを超える細胞の死滅が達成された。
【０１８１】
実施例２：Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺感染症の好中球減少症マウスモデルにおけるＰ６２８のイン・ビボ有効性の評価
本研究では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺感染症モデルの標準的な好中球減少症マウスモデルを使用した（Ｗ．  Ａ．  Ｃｒａｉｇ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒ．  Ａｎｄｅｓ．  ２００８．  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｆｔｏｂｉｐｒｏｌｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｔｈｉｇｈ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５２，［１０］３４９２−３４９６）。
【０１８２】
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスは、シクロホスファミドの投与により好中球減少症とされた。これらの免疫不全マウスに、１０６ＣＦＵのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株（ＡＴＣＣ  １３８８３）を鼻腔内投与した。感染後２時間で、１つの動物群を２７ｍｇ／ｋｇのＰ６２８で静脈内経路（ＩＶ）を介して処置し、別の群を５０μＬあたり０．２７ｍｇのＰ６２８で鼻腔内経路を介して処置し、さらに別の群を１０ｍｇ／ｋｇのシプロフロキサシンで経口経路により処置した。Ｐ６２８（ＩＶ）処置群及びシプロフロキサシン処置群では、投与計画は１２時間毎に１回３日間であり、Ｐ６２８経鼻腔処置群の投与計画は１日１回最大３日間であった。感染制御下の全ての動物は、７２時間以内に肺感染症を発症する。Ｐ６２８の鼻腔内投与による動物の処置は動物を致死的な肺感染症から完全に防護し、１００％の防護を与えたが、Ｐ６２８（ＩＶ）処置群では１個体のみ死亡して８３％の防護となった。経口シプロフロキサシンによる処置も、マウスを致命的な感染症から完全に防護した。結果を表７に示す。
【０１８３】
【表７】
2021506341.tif 000014
【０１８４】
鼻腔内経路及び静脈内経路の両方を介して投与されたＰ６２８は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが誘発する致死的な肺感染症からマウスを防護した。Ｐ６２８は本動物モデルで効果を有する。
【０１８５】
実施例３：Ｐ６３６：クレビシンＣＣＬ  ＴＤ  ＲＤ−クレビシンＢ  ＫＤ
序論：
バクテリオシンは、細菌によって産生されるタンパク質抗生物質の多様なファミリーであり、同じ種又は近縁種のメンバーを死滅させる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種由来のバクテリオシン（クレビシン）の報告はわずかであり、それらのいずれも特徴解析されておらず、その抗菌特性については何ら知られていない。クレビシンは、何十年にもわたってＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種を分類する目的で使用されてきたが、イン・ビトロ又はイン・ビボでの抗菌特性に関しては特徴解析されていない。
【０１８６】
これらのタンパク質は、受容体に結合して、クレビシンの死滅ドメインがＤＮＡｓｅ／ＲＮａｓｅ活性によって殺菌効果を発揮するペリプラズム又は細胞質に移行することにより、非常に特異的な方法で抗菌活性を発揮する。クレビシンのドメイン構成は、トランスロケーションドメイン、受容体結合ドメイン、及び死滅ドメインからなる。特定の菌株で死滅が見られない理由は、受容体の欠如又は免疫タンパク質の存在によるものである。それゆえ、クレビシンの死滅ドメインを免疫タンパク質によって中和され得ない同様のドメインで置き換えることにより、宿主範囲を拡大することが可能であることが期待される。
【０１８７】
クレビシンＣＣＬにはＲＮａｓｅ活性があり、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種によって産生される。クレビシンＣＣＬはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ由来のバクテリオシンであるクロアシンＤＦ１３に対して９９％超の配列相同性を有する。クレビシンＢはＤＮａｓｅ活性を有し、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種によって産生される。戦略としては、免疫の問題を克服するために、クレビシンＣＣＬの死滅ドメインをクレビシンＢの死滅ドメインで置き換えることで、このキメラ分子により抗菌性の宿主範囲を拡大することであった。
【０１８８】
クレビシンＣＣＬ（トランスロケーションドメイン−受容体結合ドメイン）−クレビシンＢ（死滅ドメイン）の生成：クローニング戦略：
クレビシンＣＣＬトランスロケーションドメイン（ＴＤ）−受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をＰＣＲ増幅し、クレビシンＢ免疫タンパク質（この免疫タンパク質は転写的にのみ融合され、融合タンパク質の発現に不可欠である）と共にクレビシンＢ死滅ドメイン（ＫＤ）のＰＣＲ増幅産物に対してオーバーラップエクステンションＰＣＲにより融合した。得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ−ＸｈｏＩとしてｐＥＴ２６ｂにクローニングした。
【０１８９】
クローンの配列を確認し、ｐＧＤＣ  ６３６、クレビシンＣＣＬ（トランスロケーションドメイン−受容体結合ドメイン）−クレビシンＢ（死滅ドメイン）としてラベルした。
【０１９０】
タンパク質発現研究：
ＯＤ６０００．８で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で４時間誘導することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６においてタンパク質を発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【０１９１】
前記タンパク質が可溶性であるかどうかを判断するために、細胞ペレットを超音波処理し、上清とペレットを遠心分離で分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。上清画分に前記タンパク質が観察された。
【０１９２】
誘導されたタンパク質細胞ペレットを緩衝液に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解し、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離により上清とペレットを分離した。リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を使用した陰イオン交換クロマトグラフィー（ｕｎｏ  Ｑ）で可溶性画分からタンパク質精製を行い、汚染タンパク質をマトリックス上に保持して目的のタンパク質を通過させ、その後リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で陽イオン交換クロマトグラフィー（ｕｎｏ  Ｓ）を行い、塩化ナトリウムで溶出した。前記タンパク質は均一性約９０％まで精製された。
【０１９３】
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ２０９４に対するＰ６３６の殺菌活性：
Ｐ６３６の抗菌活性は、ＣＦＵ低下アッセイを使用して試験した。２００μｇ／ｍＬとしてＣａｓアミノ酸（ＣＡＡ）培地及び５０％ＦＣＳ中で約１０６細胞を３７℃で２時間インキュベートし、残存する生存細胞数を数えた。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。結果を図５に示す。Ｐ６３６はＣＡＡで活性があり、４ｌｏｇの低下を示したが、５０％ではｃｆｕの大幅な低下は見られなかった。
【０１９４】
Ｐ６３６の細胞結合活性：
細胞結合アッセイを行い、Ｐ６３６のＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅへの結合能を決定した。１５０ｍＭ生理食塩水を含む１０ｍＭ  ＳＰＢ中のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４の細胞（１０８細胞）を１０μｇのＰ６３６タンパク質と３７℃で３０分間インキュベートし、バイアルを１０，０００ｒｐｍで遠心分離して細胞をペレット化し、細胞ペレットを緩衝液で洗浄した。上清及びペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。細胞を含まないタンパク質のみを対照として維持した。上清にＰ６３６が観察され、これは前記タンパク質がアッセイ緩衝液に可溶であることを示す。さらに、上清にＰ６３６が観察され、これは前記タンパク質が試験した条件下で細胞に結合しなかったことを示す。
【０１９５】
実施例４：Ｓ５ピオシン−リゾチームキメラ融合体
序論：
バクテリオシンは、近縁の細菌を死滅させるために細菌によって生成されるタンパク質性分子である。例えば、コリシン、ピオシン、ペスチシンなど、いくつかのバクテリオシンが公知である。ピオシンは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種の７０％以上が産生するバクテリオシンである。高分子量のピオシンはＲ型及びＦ型のピオシンであり、低分子量のピオシンはＳ型のピオシンである。Ｓ型ピオシンの侵入の特異性は、細胞表面に存在する受容体によって決定される。これらの受容体は、鉄の取込みのために細胞によって利用され、鉄シデロフォア（ｉｒｏｎ−ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ）受容体と称される。Ｓ型ピオシンのドメイン構成は、受容体結合ドメイン（ＲＤ）、トランスロケーションドメイン（ＴＤ）、及び死滅ドメイン（ＫＤ）である。
【０１９６】
Ｓ型ピオシン及びＳ型ピオシン−リゾチームキメラ融合体のクローニング：
Ｓ型ピオシン、並びに、Ｓ型ピオシントランスロケーションドメイン及びリゾチームドメイン（ペプチドグリカン分解ドメイン）とを有する結合ドメインの融合体は、ｐＥＴ２６ｂプラスミドにクローニングすることにより得られ、配列が確認された。リゾチームドメインのソースは以下に由来する。
ａ．Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａファージＰ１３４由来ＧＰ３６  ＣＤ
ｂ．Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓファージＰｈｉ２９由来Ｐｈｉ２９リゾチーム
ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉファージＢＰ７由来ＢＰ７ｅリゾチーム
【０１９７】
構築物の物理地図を図６に示す。
【０１９８】
タンパク質精製：
ＯＤ６０００．８で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で４時間誘導することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６においてタンパク質を発現させた。誘導済細胞のペレットを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解し、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離により上清とペレットを分離した。Ｐ６２４、Ｐ６２５、Ｐ６２６、及びＰ６５２の各タンパク質は、２段階イオン交換クロマトグラフィーを用いて可溶性画分から精製した。簡潔には、清澄化された細胞溶解物を、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑマトリックス（Ｂｉｏｒａｄ社）を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに通し、目的のタンパク質を含むフロースルーを収集した。次に、フロースルーを、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓマトリックス（Ｂｉｏｒａｄ社）を使用して陽イオン交換クロマトグラフィーに通し、結合したタンパク質をＮａＣｌの段階的勾配で溶出した。目的のタンパク質は、Ｐ６２４、Ｐ６２５、Ｐ６２６、及びＰ６５２の場合、３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。タンパク質は、Ｐ６２４、Ｐ６２６、及びＰ６５２の場合は２０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して、Ｐ６２５の場合は２０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）に対して透析した。
【０１９９】
Ｈｉｓタグ付きタンパク質のＰ６２３及びＰ６３８は、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーで精製し、３００ｍＭイミダゾールで溶出し、Ｐ６３８の場合は２０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して、Ｐ６２３の場合は２０ｍＭＳＰＢ（ｐＨ７．０）に対して透析した。全てのタンパク質は均一性約８０％まで精製された。
【０２００】
ＯＤ減少アッセイ：
全てのリゾチームドメイン（ＧＰ３６  ＣＤ、Ｐｈｉ２９リゾチーム、及びＢＰ７ｅリゾチーム）の触媒活性は、クロロホルム処理したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１細胞を基質として使用して、濁度低減ＯＤ減少アッセイによって測定した。本アッセイでは、５０μｇ／ｍＬの精製タンパク質を使用した。ＯＤ減少アッセイによる活性タンパク質も、融合タンパク質におけるリゾチームドメインの正しいフォールディングを示唆すると考えられる。３つのリゾチームドメインは全て触媒的に活性であった。結果を図７に示す。
【０２０１】
菌叢阻害アッセイ：
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５の菌叢を、０．８のＯＤ６００までＬＢ培地でコロニーを成長させることによって作成した。菌叢はＬＢ寒天プレート上で作成した。融合タンパク質を、下記の濃度でスポットした。Ｐ６２６は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１上のＣＡＡ寒天にスポットし、Ｐ６５２は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＤＳＭＺ  ５００７１上のＬＢ寒天上にスポットした。Ｐ６２３：２０μｇ、Ｐ６２４：３８μｇ、Ｐ６２５：３２μｇ、Ｐ６２６：６０μｇ、Ｐ６３８：１２μｇ、Ｐ６５２：３０μｇ。阻害区域は、Ｐ６２５を除くすべての被験タンパク質で観察された。
【０２０２】
殺菌活性：
Ｓ５ピオシン並びにキメラ融合体Ｐ６２３、Ｐ６２４、Ｐ６２５、Ｐ６２６、Ｐ６３８、及びＰ６５２の抗菌活性を、ＣＦＵ低下アッセイを使用して、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１に対して試験した。簡潔には、２００μｇ／ｍＬとしてＣＡＡ培地及び５０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で約１０６細胞を３７℃で２時間インキュベートし、適切な希釈物をＬＢ寒天プレート上にプレーティングすることで残存する生存細胞数を数えた。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。リゾチーム（Ｐ２００、Ｐ１９８、及びＰ５０１）をそれぞれ陰性対照として使用した。結果を図８Ａ〜図８Ｃに示す。Ｐ６２３及びＰ６２４（Ｓ５ピオシン−ＧＰ３６融合体）は、ＣＡＡのＰＡ０１で殺菌活性を示していた。５０％ＦＣＳのＰＡ０１に殺菌作用を有するタンパク質は認められなかった。
【０２０３】
実施例５：混合感染（Ｋ．  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を標的とするクレビシン及びピオシンの使用
序論：
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、尿路、気道、及び熱傷の感染時に異物と共存可能な２つのバイオフィルム形成生物である（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））。
【０２０４】
バクテリオシンは、近縁の細菌を死滅させるために細菌によって天然で生成されるタンパク質性分子である。いくつかのバクテリオシン、例えば、クレビシン、ピオシン、コリシン、ペスチシンなどが公知である。
【０２０５】
クレビシンは、何十年にもわたってＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種を分類する目的で使用されてきたが、イン・ビトロ又はイン・ビボでの抗菌特性に関しては特徴解析されていない。
【０２０６】
ピオシンは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種の７０％以上が産生するバクテリオシンである。高分子量のピオシンはＲ型及びＦ型のピオシンであり、低分子量のピオシンはＳ型のピオシンである。Ｓ型ピオシンの侵入の特異性は、細胞表面に存在する受容体によって決定される。
【０２０７】
クレビシンＣＣＬ及びＳ５ピオシンのクローニング
クレビシンＣＣＬ遺伝子は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムからその免疫遺伝子とともにＰＣＲ増幅され、ｐＥＴ２６ｂプラスミドにクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６で発現され、従来のクロマトグラフィー（陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィー）で精製された。構築物の配列を確認し、ｐＧＤＣ  ６２８としてラベルした（命名した）。
【０２０８】
Ｓ５型ピオシンは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのゲノムからその免疫遺伝子とともにＰＣＲ増幅され、ｐＥＴ２６ｂプラスミドにクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６で発現され、従来のクロマトグラフィー（陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィー）で精製された。構築物を配列確認し、ｐＧＤＣ  ６５２と命名した。
【０２０９】
菌叢阻害アッセイ：
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５の菌叢をＬＢ寒天プレート上に作成した。２５μｇの濃度の両方のタンパク質をＣＡＡ寒天プレートにスポットした。Ｐ６２８及びＰ６５２の組み合わせは、混合培養において菌叢の阻害を示した。
【０２１０】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４に対するＰ６２８及びＰ６５２の殺菌活性
Ｐ６２８及びＰ６５２の抗菌活性は、ＣＦＵ低下アッセイを使用して試験した。２００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬとして、約１０６細胞のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５（約１×１０６）及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｂ２０９４（約１×１０６）をＣＡＡ培地に混合し、３７℃で２時間インキュベートし、残存する生存細胞数を数えた。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。Ｐ６２８及びＰ６５２の組み合わせは、混合培養において４００μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬで殺菌活性を示す。
【０２１１】
混合培養を用いた用量依存的な研究を行ない、細胞を死滅させるのに必要なＰ６２８及びＰ６５２の最小量を少なくとも３桁で決定した。結果を図１０Ａに示す。Ｐ６２８及びＰ６５２の組み合わせは、ＣＡＡ及びＦＣＳの両方で混合培養において１０μｇ／ｍＬで殺菌活性を示す。
【０２１２】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ５６３に対するＰ６２８及びＰ６５２の殺菌活性
Ｐ６２８及びＰ６５２の抗菌活性は、ＣＦＵ低下アッセイを使用して試験した。約１０６細胞のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＫＧＮ  １６６５（約１×１０６）及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ５６３（約１×１０６）をＣＡＡ培地に混合し、タンパク質をそれぞれ又は組み合わせて１０μｇ／ｍＬで混合し、３７℃で２時間インキュベートし、残存する生存細胞数を数えた。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。結果を図１０Ｂに示す。Ｐ６２８及びＰ６５２の組み合わせは、混合培養において１０μｇ／ｍＬで殺菌活性を示す。
【０２１３】
実施例６：Ｆｙｕ  Ａ結合ドメイン−リゾチームドメインの融合
序論：
細菌は、鉄の取込みのために細胞表面の受容体を介して鉄を利用する。取込みは、シデロフォアと呼ばれる分子によって媒介される。シデロフォアは遊離鉄に結合し、受容体を介して入り、その後、鉄がシデロフォアから放出されて利用される。
【０２１４】
ペスチシンは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓによって産生されるバクテリオシンであり、ペスチシン取り込みの受容体は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及びＥ．ｃｏｌｉの特定の病原性株に存在する鉄取込み受容体ＦｙｕＡである。ペスチシンは、Ｆｙｕ  Ａ結合ドメイン（ＦｙｕＡ  ＢＤ）及びペプチドグリカン分解ドメイン（ＰＧＤ）を含む。Ｌｕｋａｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｌｙｓｉｎ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０９：９８５７−６２。著者らは、ＰＧＤドメインを、その天然のリゾチームドメインと構造的に類似したＴ４リゾチームに由来する異種リゾチームドメインで置き換えたものが、細菌細胞に侵入し死滅させることができることを示した。
【０２１５】
Ｆｙｕ  Ａ結合ドメイン−Ｔ４リゾチーム及びＦｙｕ  Ａ結合ドメイン−Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａファージＰ１３４ビリオン関連リゾチームＧＰ３６の生成（クローニング戦略）：
Ｆｙｕ  Ａ結合ドメインを、ｐＥＴ２６ｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位としてＴ４リゾチームと融合して、合成構築物とした。Ｆｙｕ  Ａ結合ドメインを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ２６ｂのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａファージＰ１３４ビリオン関連リゾチームＧＰ３６にクローニング部位ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで融合した。クローンの配列を確認し、ｐＧＤＣ  ５５８（Ｆｙｕ  Ａ  ＢＤ−Ｔ４リゾチーム融合体）及びｐＧＤＣ  ５６７（Ｆｙｕ  Ａ  ＢＤ−ＧＰ３６融合体）と命名した。
【０２１６】
タンパク質発現研究：
試験タンパク質の発現は、ＯＤ６０００．８で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で４時間誘導することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６で実施した。誘導済細胞をペレット化し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解した。次に溶解物を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してペレット化し、上清及びペレットを別々に収集して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。タンパク質発現は、細胞の可溶性画分において、アクリルアミドゲル上で、Ｐ５５８の場合は約３７ｋＤａ、Ｐ５６７の場合は約４２ｋＤａで観察された。
【０２１７】
タンパク質の精製：
ＯＤ６０００．８で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で４時間誘導することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６においてタンパク質を発現させた。誘導済細胞のペレットを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解し、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離により上清とペレットを分離した。タンパク質は、２段階イオン交換クロマトグラフィーを用いて可溶性画分から精製した。簡潔には、清澄化された細胞溶解物を、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑマトリックス（Ｂｉｏｒａｄ社）を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに通し、目的のタンパク質を含むフロースルーを収集した。次に、フロースルーを、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓマトリックス（Ｂｉｏｒａｄ社）を使用して陽イオン交換クロマトグラフィーに通し、結合したタンパク質をＮａＣｌの段階的勾配で溶出した。目的のタンパク質は、５００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。タンパク質を２０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）＋３００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。
【０２１８】
ＯＤ減少アッセイ：
前記融合タンパク質におけるＴ４リゾチーム及びＧＰ３６リゾチームの触媒活性を、濁度低減ＯＤ減少アッセイにより、クロロホルム処理したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１細胞を基質として用いて測定した。本アッセイでは、５０μｇ／ｍＬの精製タンパク質を使用した。ＯＤ減少アッセイによる活性タンパク質も、融合タンパク質におけるリゾチームドメインの正しいリフォールディングを示すと考えられる。結果を図１１に示す。精製タンパク質Ｐ５５８及びＰ５６７は、触媒的に活性であった。
【０２１９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６におけるＦｙｕＡ受容体のクローニング及び発現：
ＦｙｕＡ  ＢＤ融合体は細菌への侵入にＦｙｕＡ受容体を利用する。Ｅ．ｃｏｌｉの実験室株はこの受容体を持たないため、これらのタンパク質に感受性ではない。しかし、前記受容体が実験室Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドから異種発現できた場合、その菌株は融合タンパク質に感受性となりうる。この目的のために、前記ＦｙｕＡ受容体をＥ．ｃｏｌｉ臨床分離株から単離し、受容体のペリプラズム局在化のためのＰｅｌＢシグナル配列融合タグとして発現させるためにＮｃｏＩ−ＸｈｏＩとしてｐＥＴ２６ｂにクローニングした。
【０２２０】
タンパク質発現研究：
試験タンパク質の発現は、０．８のＯＤ６００で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で４時間誘導することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６で実施した。予想されたサイズのタンパク質が、誘導細胞で観察された。クローンの配列を確認し、ｐＧＤＣ  ５７１と命名した。
【０２２１】
ＦｙｕＡを発現するＥＲ２５６６／ｐＧＤＣ５７１に対してのＰ５５８及びＰ５６７の試験：
ｐＧＤＣ５７１及びｐＥＴ２６ｂでＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６を形質転換し、得られたコロニーをＯＤ６００が０．８になるまで増殖させ、菌叢をＬＢプレート上で作成した。５０μｇのＰ５５８及びＰ５６７を、ＥＲ２５６６／ｐＧＤＣ  ５７１＋及びＥＲ２５６６  ｐＥＴ２６ｂ（対照）にスポットした。Ｐ５５８及びＰ５６７で観察された菌叢の阻害は、これらのタンパク質がＦｙｕＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉ株で活性であることを示している。
【０２２２】
ＦｙｕＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉに対するＰ５５８及びＰ５６７の効果：
Ｐ５５８及びＰ５６７の抗菌活性は、ＣＦＵ低下アッセイを使用して、ＦｙｕＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉに対して試験した。ＬＢ培地中の約１０７細胞のＥＲ２５６６／ｐＧＤＣ  ５７１を、３０μｇ／ｍＬ又は３００μｇ／ｍＬのＰ５５８、及び３００μｇ／ｍＬのＰ５６７で処理し、３７℃で２時間及び４時間インキュベートし、残存する生存細胞数を数えた。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。結果を図１２に示す。３００μｇ／ｍＬのＰ５５８で４時間まで静的効果が観察された。
【０２２３】
それぞれの時点での細胞の生存率は、適切な希釈物をＬＢプレートにプレーティングし、これらのプレートを３７℃で１６〜１８時間インキュベートすることによって決定した。結果を図１３に示す。Ｐ５５８（３００μｇ／ｍＬ）で静菌効果が観察され、細胞数は４時間後も一定のままであった。
【０２２４】
上記のようなＦｙｕＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉに対するＰ５５８及びＰ５６７の効果は、３００μｇ／ｍＬ及び１３５０μｇ／ｍＬ（Ｐ５５８の場合）及び１２５０μｇ／ｍＬ（Ｐ５６７の場合）の各タンパク質濃度で示された。対照として、ベクター対照（ＥＲ２５６６／ｐＥＴ２６ｂ）を有するＥＲ２５６６も、同じ濃度のＰ５５８及びＰ５６７で処理した。結果を図１４に示す。Ｐ５５８は、ＦｙｕＡ受容体を発現するＥＲ２５６６細胞の増殖を阻害し、対照では増殖阻害は観察されなかった（ＥＲ２５６６／ｐＥＴ２６ｂ）。
【０２２５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６／ＦｙｕＡ＋に対するＰ５５８の活性：
ＦｙｕＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉに対するＰ５５８の抗菌活性を、ＣＦＵ低下アッセイを使用して試験した。簡潔には、５０％ＬＢ培地及び５０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中の約１０７細胞のＥＲ２５６６／ＦｙｕＡを３００μｇ／ｍＬのＰ５５８で処理し、３７℃で２時間及び４時間インキュベートし、残存する生存細胞数を数えることにより細胞の死滅を決定した。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。結果を図１５Ａ及び図１５Ｂに示す。
【０２２６】
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するＰ５５８の活性：
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するＰ５５８の抗菌活性は、ＣＦＵ低下アッセイを使用して試験した。簡潔には、５０％ＬＢ培地及び５０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中の約１０７細胞のＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを３００μｇ／ｍＬのＰ５５８で処理し、３７℃で２時間及び４時間インキュベートし、残存する生存細胞数を数えることにより細胞の死滅を決定した。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。結果を図１６に示す。Ｐ５５８は５０％ＬＢ培地及び５０％ＦＣＳの両方でＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して静的効果を示した。
【０２２７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＬＣ−６に対するＰ５５８の活性：
尿路感染症（ＵＴＩ）分離株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＳＬＣ−６に対するＰ５５８の抗菌活性は、ＣＦＵ低下アッセイを使用して試験した。ＵＴＩ分離株は、ＦｙｕＡ遺伝子を保有し、尿路で受容体を発現することから、細菌のコロニー形成や生存を助長すると考えられる。簡潔には、３００μｇ／ｍＬとして、５０％ＬＢ培地及び５０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で約１０７細胞を３７℃で２時間及び４時間インキュベートし、残存する生存細胞数を数えた。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。結果を図１７に示す。Ｐ５５８は５０％ＬＢ培地及び５０％ＦＣＳの両方でＥ．ｃｏｌｉ  ＳＬＣ−６に対して静的効果を示した。
【０２２８】
ＦｙｕＡ遺伝子ＰＣＲ陽性のＥ．ｃｏｌｉ  ＵＴＩ分離株に対するＰ５５８の活性：
尿から単離したＥ．ｃｏｌｉ臨床株について、ｆｙｕＡ遺伝子の存在するものをＰＣＲでスクリーニングした。Ｐ５５８活性測定用の試験菌株として採用された陽性菌は少数であった。アッセイ条件：５０％ＬＢ培地及び５０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、反応液量：２ｍｌ。所要時間：３７℃、２００ｒｐｍで２時間及び４時間。試験菌株：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６／ＦｙｕＡ、Ｂ５０３１、Ｂ５１１３（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵＴＩ分離株）。結果を図１８Ａ及び図１８Ｂに示す。Ｐ５５８は５０％ＬＢ及び５０％ＦＣＳにおいてＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ５０３１に対して静的効果を示した。
【０２２９】
ｆｙｕＡ遺伝子ＰＣＲ陽性のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ臨床分離株に対するＰ５５８の活性（ＦｙｕＡ＋）
尿から単離したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ臨床株について、ｆｙｕＡ遺伝子の存在するものをＰＣＲでスクリーニングした。Ｐ５５８活性測定用の試験菌株として採用された陽性菌は少数であった。アッセイ条件：５０％ＬＢ培地及び５０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、反応液量：２ｍｌ。所要時間：３７℃、２００ｒｐｍで２時間及び４時間。試験菌株：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６／ＦｙｕＡ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種Ｂ２１０３、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種Ｂ２０９６（ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａはＰＣＲでＦｙｕＡ＋陽性）。結果を図１９に示す。Ｐ５５８は５０％ＬＢにおいてＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ２１０３に対して静的効果を示した。
【０２３０】
ＬＢ（５０％）及びＦＣＳ（５０％）におけるＰ５５８のＭＩＣ：
ＭＩＣアッセイを、ＣＬＳＩ法により、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６／ＦｙｕＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６／ｐＥＴ２６ｂ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、及びＥ．ｃｏｌｉ  ＳＬＣ−６に対して、Ｐ５５８を用いて５０％ＬＢ及び５０％ＦＣＳにおいて実施した。ＭＩＣは、６時間と１８時間の両方の時点で観察した。結果を表８及び表９に示す。Ｐ５５８は６時間でのみＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６（ＦｙｕＡ）で非常に低いＭＩＣを示したが、試験した他の菌株ではＭＩＣは認められなかった。
【０２３１】
【表８】
2021506341.tif 000015
【０２３２】
【表９】
2021506341.tif 000016
【０２３３】
他のＦｙｕＡ  ＢＤ融合体：
ＦｙｕＡ結合ドメインとペプチドグリカン分解ドメインとの融合体を、ｐＥＴ２６ｂプラスミドにクローニングすることにより生成し、配列を確認した。
ａ．ＦｙｕＡ  ＢＤ−Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓファージＰｈｉ２９由来Ｐｈｉ２９リゾチーム
ｂ．ＦｙｕＡ  ＢＤ−Ｅ．ｃｏｌｉファージＢＰ７由来ＢＰ７ｅリゾチーム
ｃ．ＦｙｕＡ  ＢＤ−Ｐ．ｓｙｒｉｎｇｉａｅファージＰｈｉ６由来Ｐｈｉ６  Ｐ５溶解酵素
ｄ．ＦｙｕＡ  ＢＤ−ＧＳリンカー−ＧＰ３６  ＣＤ
【０２３４】
タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーで均一性９０％まで精製された。
【０２３５】
ＯＤ減少アッセイ：
ＦｙｕＡ融合体の触媒活性を、ＯＤ減少アッセイにより、クロロホルム処理したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞を基質として用いて決定した。本アッセイでは、５０μｇ／ｍＬの精製タンパク質を使用した。ＯＤ減少アッセイによる活性タンパク質も、リゾチームの正しいリフォールディングを示すと考えられる。結果を図２０に示す。精製されたタンパク質Ｐ５８１、Ｐ５８３、及びＰ５８０は、触媒的に活性であることが、得られたＯＤ減少によって観察された。Ｐ５７８は活性ではなく、触媒ドメインが機能していないことを示していた。
【０２３６】
ＦｙｕＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉに対するＦｙｕＡ  ＢＤ融合体の効果：
ＦｙｕＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉに対する前記融合タンパク質の抗菌活性を、ＣＦＵ低下アッセイを使用して試験した。簡潔には、５０％ＬＢ培地中の約１０７細胞のＥＲ２５６６／ＦｙｕＡを３００μｇ／ｍＬのＰ５５８で処理し、３７℃で２時間及び４時間インキュベートし、残存する生存細胞数を数えることにより細胞の死滅を決定した。実験は２連に設定し、結果は２連の平均として表にした。結果を図２１に示す。Ｐ５５８及びＰ５８１は、ＦｙｕＡ受容体を発現するＥＲ２５６６細胞の増殖を阻害した。他のタンパク質では阻害は観察されなかった。
【０２３７】
それぞれの時点での細胞の生存率は、適切な希釈物をＬＢプレートにプレーティングし、これらのプレートを３７℃で１６〜１８時間インキュベートすることによって決定した。結果を図２２に示す。５０％ＬＢ培地では、Ｐ５５８は約１ｌｏｇの低下、Ｐ５８１は約２ｌｏｇの低下を示した。
【０２３８】
菌叢阻害アッセイ：
ｆｙｕＡ構築物ｐＧＤＣ５７１でＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６を形質転換し、得られたコロニーをＯＤ６００が０．８になるまでＬＢ培地で増殖させ、菌叢をＬＢ寒天プレート上で作成した。融合タンパク質を、ＥＲ２５６６／ｐＧＤＣ  ５７１及びＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにスポットした。ＦｙｕＡ発現ＥＲ２５６６及びＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して、Ｐ５８１で明確な阻害区域が観察された。
【０２３９】
ＬＢ及びＦＣＳにおけるＵＴＩ臨床株（ＦｙｕＡ＋）に対するＰ５８１の活性：
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ５５０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ５５０３、及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ５５０４。アッセイ条件：５０％ＬＢ培地及び５０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）。反応液量：２ｍｌ。所要時間：３７℃、２００ｒｐｍで２時間及び４時間。細胞：１０５ＣＦＵ／ｍＬ。タンパク質：３００μｇ／ｍＬ。インキュベート：３７℃、２００ｒｐｍ、２時間、４時間。結果を図２３に示す。Ｐ５８１は、ＬＢ及びＦＣＳの両方でＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して活性であった。
【０２４０】
実施例７：選択されたバクテリオシン受容体の、標的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌への移行
ＦｙｕＡ受容体をコードする遺伝子は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノム（受託番号：Ｚ３５１０７．１）から、Ｅ．ｃｏｌｉシグナル配列（例えば、ｐｅｌＢ）を含むプライマーを使用してＰＣＲ増幅される。宿主範囲の広い接合性プラスミド（例えば、ｐＬＭ２）がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２から単離され、上記のＰＣＲ産物が適切な制限部位でクローン化され、エレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉ実験室株が形質転換され、ＰＣＲにより組換えクローンがスクリーニングされる。目的の遺伝子を含むコロニーが「ドナー」細菌である。５ｍｌのドナー細胞及びレシピエント細胞（ＦｙｕＡ受容体を発現させる必要があるＥ．ｃｏｌｉ）をＯＤ６０００．５〜０．７まで増殖させる。１００μＬのドナー培養物及びレシピエント培養物を混合し（対照：ドナー細胞及びレシピエント細胞のみを１００μＬ）、遠心分離して０．８５％生理食塩水で細胞を２回洗浄する。ペレットを２０μＬの生理食塩水に再懸濁し、よく乾燥したＬＢ寒天ペトリ皿にスポットする。前記プレートを乾燥させ、３０℃で一晩インキュベートした後、培養物を５００μＬの生理食塩水中に掻き取り、ボルテックスして交配対（mating pairs）を破壊する。懸濁液を、それぞれの選択プレート、例えば、二重抗生物質プレート上で様々な適切な希釈物を平板培養する。適切なコロニーは、通常、接合性プラスミドの存在をＰＣＲで確認することで接合が確認される。接合子コロニーは、ＬＢ培地でＯＤ６００が０．８になるまで増殖させる。培養物をＯＤ６００が０．２になるように希釈し、ＬＢ寒天プレートに広げて平板培養し、乾燥させる。タンパク質Ｐ５５８（ＦｙｕＡ結合ドメイン−Ｔ４リゾチーム）融合体を菌叢にスポットし（１０μｇ）、３７℃で１７時間平板培養する。クリアランスとして見られる阻害区域は、ＦｙｕＡ受容体の発現による細菌の感受性を示す。レシピエント細菌の対照培養物にもＰ５５８をスポットする。
【０２４１】
実施例８：ＡＭＰと融合したバクテリオシンの構築
バクテリオシンをコードする遺伝子は、ｐＥＴプラスミドなどのＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローニングされ、組換えバクテリオシンの発現が確認される。ＡＭＰをコードするＤＮＡ配列は、バクテリオシンの５’末端又は３’末端にＰＣＲに基づく方法でクローニングされ、融合遺伝子が得られる。上記の表に記載されている種々のＡＭＰ配列は、様々なバクテリオシンと融合される。これらの融合遺伝子は細菌発現ベクターにクローニングされ、ＤＮＡ配列が確認される。あるいは、ＡＭＰをコードするＤＮＡ配列は、適切な制限酵素認識部位を有するオリゴとして合成され、バクテリオシン遺伝子を既に含むプラスミドにクローニングされる。
【０２４２】
タンパク質の発現、精製、及びリフォールディング：
全てのＤＮＡ配列が確認されたキメラバクテリオシンは、適切な実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株で発現される。例えば、プラスミドを担持するＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６は、例えば、ＯＤ６００が約０．８〜１．０に達するまで３７℃で増殖され、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加することによりタンパク質発現が誘導され、かかる誘導は、例えば、３７℃で４時間行われる。４時間のＩＰＴＧ誘導後、細胞を回収し、タンパク質発現をアクリルアミドゲルで確認する。試験組換えキメラバクテリオシンの発現が確認されたら、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより、精製する。細胞の可溶性画分で発現されるタンパク質は、例えば天然の精製条件を使用して、精製され、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ（ＩＢ））として発現されるタンパク質は、ＩＢを変性するための尿素又は塩酸グアニジンのいずれかを使用する変性条件下で精製される。変性タンパク質のリフォールディングは、例えば変性剤を除去することにより行われ、これは例えば適切な緩衝液に対して４℃で１６〜１８時間透析することにより行われる。リフォールディング後、精製されリフォールディングしたタンパク質の均一性を、アクリルアミドゲルで分析し、タンパク質濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイで測定する。
【０２４３】
殺菌アッセイ：
ａ）バッファー及び緩衝生理食塩水におけるＣＦＵ低下アッセイ：
対数増殖期中期（ＯＤ６００が約０．６）になるまで、例えばＬＢ培地で、増殖したグラム陰性細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有又は非含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）又は２０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）などの適切なバッファーで１００倍に希釈し、最終密度を約１０６ＣＦＵ／ｍＬとする。１００μＬの細胞を、種々の濃度（例えば、５０〜２００μｇ／ｍＬ）の精製された試験タンパク質で処理する。反応混合物の最終容量は、例えば、適切な緩衝液で２００μＬに調整される。前記反応混合物を、例えば、３７℃で２時間インキュベートし、ＬＢプレート上に適切な希釈物をプレーティングし、その後３７℃で一晩インキュベートすることにより、残存する生存細胞数を数える。抗菌活性は、未処理の細胞の初期数を残存細胞数により対数単位で割り、棒グラフとしてデータをプロットすることで計算する。
【０２４４】
ｂ）増殖培地におけるＣＦＵ低下アッセイ：
対数増殖期中期（ＯＤ６００が約０．６）になるまで、例えばＬＢ培地で、増殖したグラム陰性細胞を、ＬＢ培地又はＣＡ−ＭＨＢ培地で１００倍に希釈し、最終密度を約１０６ＣＦＵ／ｍＬとする。１００μＬの細胞を、種々の濃度（例えば、５０〜２００μｇ／ｍＬ）の精製された試験タンパク質で処理する。反応混合物の最終容量は、例えば、適切な緩衝液で２００μＬに調整される。前記反応混合物を、例えば、３７℃で２時間インキュベートし、ＬＢプレート上に適切な希釈物をプレーティングし、その後３７℃で一晩インキュベートすることにより、残存する生存細胞数を数える。抗菌活性は、未処理の細胞の初期数を残存細胞数により対数単位で割り、棒グラフとしてデータをプロットすることで計算する。
【０２４５】
ｃ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）におけるＣＦＵ低下アッセイ：
対数増殖期中期（ＯＤ６００が約０．６）になるまで、例えば、ＬＢ培地で、増殖したグラム陰性細胞を、ＦＢＳで１００倍に希釈し、最終密度を約１０６ＣＦＵ／ｍＬとする。１００μＬの細胞を、種々の濃度（例えば、１００〜４００μｇ／ｍＬ）の精製された試験タンパク質で処理する。反応混合物の最終容量は、例えば、ＣＡ−ＭＨＢ培地で２００μＬに調整される。前記反応混合物を、例えば、３７℃で２時間インキュベートし、ＬＢプレート上に適切な希釈物をプレーティングし、その後３７℃で一晩インキュベートすることにより、残存する生存細胞数を数える。抗菌活性は、未処理の細胞の初期数を残存細胞数により対数単位で割り、棒グラフとしてデータをプロットすることで計算する。
【０２４６】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定：
ＭＩＣは、例えば、カチオン調整ミューラーヒントン培地（ＣＡ−ＭＨＢ培地）又は５０％ＦＢＳ中で、グラム陰性細胞に対して、改変ＣＬＳＩ培地微量希釈手  順を使用して決定する。マイクロタイタープレートに１０点のＭＩＣを、２倍希釈の２連で設定する。９６ウェルポリスチレンプレートのウェルを、例えば、３７℃で１時間、０．５％ＢＳＡでコーティングし、各ウェルに、例えば、５×１０５細胞／ｍＬのグラム陰性細菌を接種する。試験タンパク質を含まない増殖の陽性対照をアッセイに含める。マイクロタイタープレートを、例えば、３５℃で１８〜２０時間インキュベートする。ＭＩＣは、インキュベーション終了時において細菌増殖を完全に阻害する最小濃度として定義される。例えば、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）色素の添加後にウェルが無色であることで測定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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