(57)【要約】  本発明は、がんの治療に使用するための方法及び組成物を提供し、これは有利には腫瘍微小環境の標的化によって達成されうる。本発明は腫瘍微小環境を標的とするキメラ抗原ん受容体（ＣＡＲ）を提供する。一態様では、本発明は（ａ）第一抗原に結合する第一抗原結合ドメインと第二抗原に結合する第二抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと；（ｂ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥを発現するように操作された免疫細胞を特徴とする。他の態様では、本発明は免疫細胞を含む薬学的組成物を特徴とする。他の態様では、本発明は治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、免疫細胞を投与することを含む方法を特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一抗原に結合する第一抗原結合ドメインと第二抗原に結合する第二抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと；
（ｂ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥ、
を発現するように操作された免疫細胞。
【請求項２】
ＣＡＲポリペプチドが、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項３】
ＣＡＲポリペプチドが、一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項４】
第一及び第二抗原が神経膠芽腫抗原である、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項５】
第一及び第二抗原が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ−１３Ｒα２）、エフリンＡ型受容体１（ＥｐｈＡ１）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン、ムチン１，細胞表面関連（ＭＵＣ１）、又はムチン１６，細胞表面関連（ＭＵＣ１６）から独立して選択される、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項６】
第一抗原結合ドメイン及び／又は第二抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合断片を含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項７】
抗体の抗原結合断片が、単一ドメイン抗体又は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項６に記載の免疫細胞。
【請求項８】
第一抗原結合ドメイン及び／又は第二抗原結合ドメインが、第一及び／又は第二抗原のリガンドを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項９】
細胞外ドメインが、第一抗原結合ドメインと第二抗原結合ドメインの間にリンカーを含まない、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項１０】
第一抗原結合ドメインがリンカーによって第二抗原結合ドメインに連結されている、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項１１】
リンカーが、配列番号：１０２、１０７、１０８、１０９、又は１１０のリンカーと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１０に記載の免疫細胞。
【請求項１２】
膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項２に記載の免疫細胞。
【請求項１３】
ヒンジ／膜貫通ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項１２に記載の免疫細胞。
【請求項１４】
膜貫通ドメインが、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、もしくは１０４のアミノ酸配列、又は配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、もしくは１０４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項１２に記載の免疫細胞。
【請求項１５】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２に記載の免疫細胞。
【請求項１６】
細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、もしくは１０６のアミノ酸配列、又は配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、もしくは１０６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５に記載の免疫細胞。
【請求項１７】
共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む、請求項３に記載の免疫細胞。
【請求項１８】
共刺激ドメインが、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、もしくは１０５のアミノ酸配列、又は配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、もしくは１０５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
【請求項１９】
第一抗原結合ドメインがＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項２０】
第二抗原結合ドメインがＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項２１】
ＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインが、抗ＩＬ−１３Ｒα２ｓｃＦｖ又はＩＬ−１３Ｒα２のリガンドを含む、請求項１９に記載の免疫細胞。
【請求項２２】
ＩＬ−１３Ｒα２のリガンドが、ＩＬ−１３又はＩＬ−１３ゼータカイン、又はその抗原結合断片を含む、請求項２１に記載の免疫細胞。
【請求項２３】
ＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインが、配列番号：１０１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の免疫細胞。
【請求項２４】
ＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインが、配列番号：１０１のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の免疫細胞。
【請求項２５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインが、抗体の抗原結合断片を含む、請求項２０に記載の免疫細胞。
【請求項２６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインが抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖを含む、請求項２０に記載の免疫細胞。
【請求項２７】
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖが、配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び／又は配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項２６に記載の免疫細胞。
【請求項２８】
ＶＨが配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬが配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の免疫細胞。
【請求項２９】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインが、配列番号：１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の免疫細胞。
【請求項３０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインが、配列番号：１０３のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の免疫細胞。
【請求項３１】
ＣＡＲポリペプチドが、配列番号：１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項３２】
ＣＡＲポリペプチドが、配列番号：１００のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の免疫細胞。
【請求項３３】
（ｉ）配列番号：１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；
（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥ
を発現するように操作された免疫細胞。
【請求項３４】
（ｉ）配列番号：１００のアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；
（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥ
を発現するように操作された免疫細胞。
【請求項３５】
標的抗原が、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、ＨＥＲ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６の一つから選択される神経膠芽腫関連抗原である、請求項１、３３、又は３４に記載の免疫細胞。
【請求項３６】
Ｔ細胞抗原がＣＤ３である、請求項１、３３、又は３４に記載の免疫細胞。
【請求項３７】
標的抗原がＥＧＦＲであり、Ｔ細胞抗原がＣＤ３である、請求項１、３３、又は３４に記載の免疫細胞。
【請求項３８】
ＢｉＴＥが、配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１、３３、又は３４に記載の免疫細胞。
【請求項３９】
ＢｉＴＥが、配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の免疫細胞。
【請求項４０】
免疫細胞がＴ又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１、３３、又は３４に記載の免疫細胞。
【請求項４１】
免疫細胞がヒト細胞である、請求項１、３３、又は３４に記載の免疫細胞。
【請求項４２】
請求項１、３３、又は３４に記載のＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４３】
ポリヌクレオチドが、ＣＡＲポリペプチドコード配列とＢｉＴＥコード配列を含み、ＣＡＲポリペプチドコード配列とＢｉＴＥコード配列が、リボソームスキッピング部分により分離されている、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
ＣＡＲポリペプチド及び／又はＢｉＴＥが構成的プロモーター下で発現される、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
構成的プロモーターが伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターを含む、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
ＣＡＲポリペプチド及び／又はＢｉＴＥが誘導性プロモーター下で発現される、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
誘導性プロモーターが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＣＡＲシグナル伝達により誘導可能である、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
誘導性プロモーターが、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントを含む、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
ＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥがそれぞれ構成的プロモーター下で発現される、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
ＣＡＲポリペプチドが構成的プロモーター下で発現され、ＢｉＴＥが誘導性プロモーター下で発現される、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
自殺遺伝子を更に含む、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５２】
一又は複数のシグナル配列をコードする配列を更に含む、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５３】
請求項４２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５４】
ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
請求項１、３３、又は３４に記載の免疫細胞を含む薬学的組成物。
【請求項５６】
請求項１、３３、又は３４に記載の免疫細胞、又はその薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象のがんを治療する方法。
【請求項５７】
がんが、神経膠芽腫、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫であり、場合によってはがんが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、ＨＥＲ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６からなる群の一又は複数を発現することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
神経膠芽腫が、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、メソテリン、及びＥｐｈＡ１からなる群の一又は複数を発現する細胞を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
神経膠芽腫が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した細胞を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
（ｉ）ＥＧＦＲ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、配列番号：１１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；
（ｉｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＧＡＲＰカメリド
を発現するように操作された免疫細胞。
【請求項６１】
（ｉ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、配列番号：１１５又は１１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；
（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＥＧＦＲとＣＤ３に結合するＢｉＴＥ
を発現するように操作された免疫細胞。
【請求項６２】
請求項６０に記載のＣＡＲポリペプチドと抗ＧＡＲＰカメリドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６３】
請求項６１に記載のＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６４】
自殺遺伝子を更に含む、請求項６２又は６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
一又は複数のシグナル配列をコードする配列を更に含む、請求項６２又は６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
請求項６２又は６３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６７】
ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項６６に記載のベクター。
【請求項６８】
請求項６０又は６１に記載の免疫細胞を含む薬学的組成物。
【請求項６９】
対象のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した神経膠芽腫を治療する方法であって、（ｉ）細胞外ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作された免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、場合によっては、請求項１、３３、３４、６０、及び６１の何れか一項に記載の免疫細胞から選択される、方法。
【請求項７０】
対象の腫瘍微小環境における免疫抑制を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、場合によっては、請求項１、３３、３４、６０、及び６１の何れか一項に記載の免疫細胞から選択される、方法。
【請求項７１】
対象の腫瘍微小環境におけるＴ細胞消耗を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、場合によっては、請求項１、３３、３４、６０、及び６１の何れか一項に記載の免疫細胞から選択される、方法。
【請求項７２】
対象の異種抗原発現を有するがんを治療する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、場合によっては、請求項１、３３、３４、６０、及び６１の何れか一項に記載の免疫細胞から選択される、方法。
【請求項７３】
がんが、神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
がんが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６からなる群の一又は複数を発現する細胞を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
異種核酸分子を含むＣＡＲ Ｔ細胞であって、異種核酸分子が、
（ａ）細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチドと；
（ｂ）治療剤をコードする第二ポリヌクレオチド
を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項７６】
治療剤が抗体試薬を含む、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項７７】
抗体試薬が単鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含む、請求項７６に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項７８】
抗体試薬が二重特異性抗体試薬を含む、請求項７６に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項７９】
二重特異性抗体試薬がＢｉＴＥを含む、請求項７８に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８０】
単一ドメイン抗体がカメリド抗体を含む、請求項７７に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８１】
治療剤がサイトカインを含む、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８２】
ＣＡＲ及び治療剤が別個のＣＡＲ及び治療剤分子として生成される、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８３】
ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチドと治療剤をコードする第二ポリヌクレオチドとの間にリボソームスキッピング部分を含む、請求項８２に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８４】
リボソームスキッピング部分が２Ａペプチドを含む、請求項８３に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８５】
２ＡペプチドがＰ２Ａ又はＴ２Ａを含む、請求項８４に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８６】
ＣＡＲと治療剤がそれぞれ構成的に発現される、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８７】
ＣＡＲと治療剤の発現がＥＦ１αプロモーターによって駆動される、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８８】
治療剤が、Ｔ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達により場合によっては誘導可能である誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項８９】
誘導性プロモーターがＮＦＡＴプロモーターを含む、請求項８８に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９０】
ＣＡＲが構成的プロモーターの制御下で発現され、治療剤が、Ｔ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達により場合によっては誘導可能である誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９１】
ＣＡＲが一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９２】
ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、又はリガンドを含む、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９３】
膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９４】
ヒンジ／膜貫通ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項９３に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９５】
ＣＡＲの膜貫通ドメインが、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、及び１０４、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９６】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９７】
細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、及び１０６、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９８】
共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む、請求項９１に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項９９】
共刺激ドメインが、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、及び１０５、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項９１に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項１００】
ＣＡＲ抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に結合する、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項１０１】
カメリド抗体が、腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に結合する、請求項８０に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項１０２】
ＢｉＴＥが、（ｉ）腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原と、（ｉｉ）Ｔ細胞抗原に結合する、請求項７９に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項１０３】
腫瘍関連抗原が固形腫瘍関連抗原である、請求項１００から１０２の何れか一項に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項１０４】
腫瘍関連抗原が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６を含み、場合によってはＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤は、配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５１、５５、５７、６３、６５、１０３、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含む、請求項１０３に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項１０５】
Ｔｒｅｇ関連抗原が、反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）からなる群から選択され、場合によってはＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤は、配列番号：３、９、１５、２５、７１、７７、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含む、請求項１００から１０２の何れか一項に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
【請求項１０６】
細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み；抗原結合ドメインがＴｒｅｇ関連抗原に結合する、ＣＡＲポリペプチド。
【請求項１０７】
Ｔｒｅｇ関連抗原が、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５、及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択される、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１０８】
ＣＡＲが、一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１０９】
Ｔｒｅｇ関連抗原がＧＡＲＰ又はＬＡＰである、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１０】
ＣＡＲの抗原結合ドメインが、
（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８１のアミノ酸配列、又は配列番号：８１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：８２のアミノ酸配列、又は配列番号：８２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：８３のアミノ酸配列、又は配列番号：８３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの、及び／又は
（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：８４のアミノ酸配列、又は配列番号：８４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：８５のアミノ酸配列、又は配列番号：８５の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：８６のアミノ酸配列、又は配列番号：８６の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの
を含む、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１１】
ＶＨが、配列番号：８７のアミノ酸配列、又は配列番号：８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬが、配列番号：８８のアミノ酸配列、又は配列番号：８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１０に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１２】
ＣＡＲの抗原結合ドメインが、
（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８９のアミノ酸配列、又は配列番号：８９の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：９０のアミノ酸配列、又は配列番号：９０の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：９１のアミノ酸配列、又は配列番号：９１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの、及び／又は
（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：９２のアミノ酸配列、又は配列番号：９２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：９３のアミノ酸配列、又は配列番号：９３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：９４のアミノ酸配列、又は配列番号：９４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの
を含む、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１３】
ＶＨが、配列番号：９５のアミノ酸配列、又は配列番号：９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬが、配列番号：９６のアミノ酸配列、又は配列番号：９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１２に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１４】
ＶＨがＶＬのＮ末端にある、請求項１１０又は１１２に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１５】
ＶＬがＶＨのＮ末端にある、請求項１１０又は１１２に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１６】
ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号：３、９、１５、２５、７１、７７、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含んでいてもよい、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１７】
膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１８】
ヒンジ／膜貫通ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項１１７に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１１９】
ＣＡＲの膜貫通ドメインが、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、及び１０４、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１２０】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１２１】
細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、及び１０６、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１２２】
共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む、請求項１０８に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１２３】
共刺激ドメインが、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、及び１０５、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項１０８に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１２４】
配列番号：２６、配列番号：３５、配列番号：４４、配列番号：５３、配列番号：６１、配列番号：１９、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１３、配列番号：６９、配列番号：７５、及び配列番号：１００の何れか一のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチド。
【請求項１２５】
配列番号：２６、配列番号：３５、配列番号：４４、配列番号：５３、配列番号：６１、配列番号：１９、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１３、配列番号：６９、配列番号：７５、及び配列番号：１００の何れか一のアミノ酸配列を含む、請求項１２４に記載のＣＡＲポリペプチド。
【請求項１２６】
請求項７５又は１０６に記載の、（ｉ）ＣＡＲポリペプチド、又は（ｉｉ）ＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１２７】
自殺遺伝子を更に含む、請求項１２６に記載の核酸分子。
【請求項１２８】
シグナル配列をコードする配列を更に含む、請求項１２６に記載の核酸分子。
【請求項１２９】
請求項１２６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３０】
ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１２９に記載のベクター。
【請求項１３１】
請求項７５又は１０６に記載の、ＣＡＲポリペプチドを含むポリペプチド、又はＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質。
【請求項１３２】
請求項１０６に記載のＣＡＲポリペプチドを含む免疫細胞。
【請求項１３３】
免疫細胞がＴ又はＮＫ細胞である、請求項１３２に記載の免疫細胞。
【請求項１３４】
免疫細胞がヒト細胞である、請求項１３２に記載の免疫細胞。
【請求項１３５】
請求項７５又は１０６に記載の一又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞、核酸分子、ＣＡＲポリペプチド、ポリタンパク質、又は免疫細胞を含む薬学的組成物。
【請求項１３６】
がんを有する患者を治療する方法であって、請求項１３５に記載の薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項１３７】
腫瘍微小環境を標的とすることにより、全身毒性が低減される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
がんが、一又は複数の固形腫瘍の存在によって特徴付けられる、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
がんが腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇにより特徴付けられる、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４０】
がんが神経膠芽腫である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４１】
がんを有する患者を治療する方法であって、腫瘍毒性抗体又はサイトカインを分泌するように遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞産物を患者に投与することを含み、がん毒性を腫瘍微小環境に局所的に向けることにより、全身毒性が低減される、方法。
【請求項１４２】
ＣＡＲ Ｔ細胞が遺伝子改変されて、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＩＬ−１５、ＣＳＦ１Ｒ、又はＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６に対する抗体、あるいは二重特異性抗体が腫瘍微小環境に送達される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
二重特異性抗体が、ＥＧＦＲ及びＣＤ３に対するＢｉＴＥである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
患者の組織又は器官に治療剤を送達して疾患又は病状を治療する方法であって、治療用抗体、毒素、又は薬剤を分泌するように遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞を前記患者に投与することを含み、治療用抗体、毒素、又は薬剤が、それ自体では、組織又は器官に侵入又は浸透することができない、方法。
【請求項１４５】
組織又は器官が神経系にある、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
神経系が中枢神経系である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
中枢神経系が脳である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
疾患又は病状ががんである、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４９】
がんが、神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
治療用抗体が抗ＥＧＦＲ又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩである、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５１】
対象のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した神経膠芽腫を治療する方法であって、（ｉ）細胞外ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞である、方法。
【請求項１５２】
対象の腫瘍微小環境における免疫抑制を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞である、方法。
【請求項１５３】
対象の腫瘍微小環境におけるＴ細胞消耗を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞である、方法。
【請求項１５４】
対象の異種抗原発現を有するがんを治療する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、請求項７５に記載のＣＡＲ Ｔ細胞である、方法。
【請求項１５５】
がんが神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
がんが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６の一又は複数を発現する細胞を含む、請求項１５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
この出願は、内容の全体が出典明示によりここに援用される、２０１８年２月１２日出願の米国仮出願第６２／６２９５９３号；２０１８年４月１６日出願の米国仮出願第６２／６５８３０７号；２０１８年４月１６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２７７８３号；及び２０１８年１０月１７日出願の米国仮出願第６２／７４６８９５号の優先権を主張する。
【０００２】
［技術分野］
ここに記載される技術は免疫療法に関する。
【０００３】
［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が出典明示によりここに援用される配列表を含む。２０１９年２月１２日に作成したＡＳＣＩＩコピーは、５１２９５−０１３ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿２．１２．１９＿ＳＴ２５との名称が付され、１９０８１９バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、選択された標的抗原、ほとんどの場合、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原を発現する標的細胞に細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する経路を提供する。ＣＡＲは、抗原結合ドメインが、由来の標的抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインに置き換えられたＴ細胞受容体の適応体である。例えばＴ細胞（「ＣＡＲ Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ−Ｔ」）上に発現されたＣＡＲによる標的細胞の表面上の標的抗原のエンゲージは、標的細胞の死滅を促進する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、腫瘍微小環境を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００６】
一態様では、本発明は、一般に、（ａ）第一抗原に結合する第一抗原結合ドメインと第二抗原に結合する第二抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと；（ｂ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥを発現するように操作された免疫細胞を特徴とする。
【０００７】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲポリペプチドは膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施態様では、ＣＡＲポリペプチドは一又は複数の共刺激ドメインを更に含む。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。
【０００８】
幾つかの実施態様では、第一及び第二抗原は神経膠芽腫抗原である。更なる実施態様では、第一及び第二抗原は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ−１３Ｒα２）、エフリンＡ型受容体１（ＥｐｈＡ１）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン、ムチン１，細胞表面関連（ＭＵＣ１）、又はムチン１６，細胞表面関連（ＭＵＣ１６）から独立して選択される。
【０００９】
幾つかの実施態様では、第一抗原結合ドメイン及び／又は第二抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合断片、例えば単一ドメイン抗体又は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。他の実施態様では、第一抗原結合ドメイン及び／又は第二抗原結合ドメインは、第一及び／又は第二抗原のリガンドを含む。
【００１０】
更なる実施態様では、細胞外ドメインは、第一抗原結合ドメインと第二抗原結合ドメインとの間にリンカーを含まない。他の実施態様では、第一抗原結合ドメインは、リンカーによって第二抗原結合ドメインに連結され、例えば、リンカーは、配列番号：１０２、１０７、１０８、１０９、又は１１０のアミノ酸配列を含み、又は配列番号：１０２、１０７、１０８、１０９、又は１１０のリンカーと少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸を含む。
【００１１】
幾つかの実施態様では、膜貫通ドメインはヒンジ／膜貫通ドメインを含む。幾つかの実施態様では、ヒンジ／膜貫通ドメインは、免疫グロブリン様タンパク質（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む。特定の実施態様では、膜貫通ドメインは、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、又は１０４のアミノ酸配列、あるいは配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、又は１０４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通ドメインを含む。
【００１２】
幾つかの実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、又は１０６のアミノ酸配列、あるいは配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、又は１０６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１３】
更なる実施態様では、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む。幾つかの実施態様では、共刺激ドメインは、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、又は１０５のアミノ酸配列、あるいは配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、又は１０５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む。
【００１４】
幾つかの実施態様では、第一抗原結合ドメインはＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインを含む。幾つかの実施態様では、第二抗原結合ドメインはＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含む。
【００１５】
幾つかの実施態様では、ＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインは、抗ＩＬ−１３Ｒα２ｓｃＦｖ又はＩＬ−１３Ｒα２のリガンドを含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ−１３Ｒα２のリガンドは、ＩＬ−１３又はＩＬ−１３ゼータカイン、又はその抗原結合断片を含む。更なる実施態様では、ＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインは、配列番号：１０１のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１０１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【００１６】
更なる実施態様では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、抗体の抗原結合断片を含み、例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖを含む。幾つかの実施態様では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖは、配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又は配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施態様では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、配列番号：１０３のアミノ酸配列、又は配列番号：１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号：１００のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号：１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号：１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥを発現するように操作された免疫細胞を特徴とする。
【００１９】
別の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号：１００のアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥを発現するように操作された免疫細胞を特徴とする。
【００２０】
先の態様の何れかの幾つかの実施態様では、標的抗原は、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、ＨＥＲ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６の一つから選択される神経膠芽腫関連抗原である。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。特定の実施態様では、標的抗原はＥＧＦＲであり、Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【００２１】
先の態様の何れかの幾つかの実施態様では、ＢｉＴＥは、配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【００２２】
先の態様の何れかの幾つかの実施態様では、免疫細胞は、Ｔ又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。幾つかの実施態様では、免疫細胞はヒト細胞である。
【００２３】
別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一のＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥをコードするポリヌクレオチドを特徴とする。
【００２４】
幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、ＣＡＲポリペプチドコード配列とＢｉＴＥコード配列を含み、ＣＡＲポリペプチドコード配列とＢｉＴＥコード配列は、リボソームスキッピング部分によって分離されている。幾つかの実施態様では、ＣＡＲポリペプチド及び／又はＢｉＴＥは、構成的プロモーター、例えば伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター下で発現される。他の実施態様では、ＣＡＲポリペプチド及び／又はＢｉＴＥは、誘導性プロモーター下で発現され、例えば、誘導性プロモーターはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＣＡＲシグナル伝達、例えば活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントにより誘導可能である。所定の実施態様では、ＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥは、それぞれ構成的プロモーター下で発現される。他の実施態様では、ＣＡＲポリペプチドは構成的プロモーター下で発現され、ＢｉＴＥは誘導性プロモーター下で発現される。更なる実施態様では、ポリヌクレオチドは自殺遺伝子を更に含む。なおも更なる実施態様では、ポリヌクレオチドは、一又は複数のシグナル配列をコードする配列を含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、一般に、先の態様のポリヌクレオチドを含むベクターを特徴とする。幾つかの実施態様では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００２６】
別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一の免疫細胞、ポリヌクレオチド、又はベクターを含む薬学的組成物を特徴とする。
【００２７】
別の態様では、本発明は、一般に、治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、先の態様の何れか一の免疫細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、又は薬学的組成物を対象に投与することを含む方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、がんは神経膠芽腫、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫であり、場合によっては、がんはＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、ＨＥＲ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６からなる群の一又は複数を発現するものを含む。幾つかの実施態様では、神経膠芽腫は、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、メソテリン、及びＥｐｈＡ１からなる群の一又は複数を発現する細胞を含む。更なる実施態様では、神経膠芽腫は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した細胞を含む。
【００２８】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ＥＧＦＲ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、配列番号：１１７のアミノ酸配列、又は配列番号：１１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列、又は配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む抗ＧＡＲＰカメリドを発現するように操作された免疫細胞を特徴とする。
【００２９】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、配列番号：１１５又は１１６のアミノ酸配列、又は配列番号：１１５又は１１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列、又は配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、ＥＧＦＲとＣＤ３に結合するＢｉＴＥを発現するように操作された免疫細胞を特徴とする。
【００３０】
別の態様では、本発明は、先の態様のＣＡＲポリペプチドと抗ＧＡＲＰカメリドをコードするポリヌクレオチドを特徴とする。
別の態様では、本発明は、先の態様のＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥを特徴とする。
先のポリヌクレオチドの幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは自殺遺伝子を更に含む。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、一又は複数のシグナル配列をコードする配列を更に含む。
【００３１】
別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一のポリヌクレオチドを含むベクターを特徴とする。幾つかの実施態様では、ベクターはレンチウイルスベクターである。  別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一の免疫細胞、ポリヌクレオチド、又はベクターを含む薬学的組成物を特徴とする。
【００３２】
別の態様では、本発明は、対象におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した神経膠芽腫を治療する方法であって、（ｉ）細胞外ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作された免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、先の態様の何れか一の免疫細胞から場合によっては選択される方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、対象の腫瘍微小環境における免疫抑制を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、先の態様の何れか一の免疫細胞から場合によっては選択される方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。
【００３４】
別の態様では、本発明は、対象の腫瘍微小環境におけるＴ細胞消耗を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、先の態様の何れか一の免疫細胞から場合によっては選択される方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。
【００３５】
別の態様では、本発明は、対象のがんを治療する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、先の態様の何れか一の免疫細胞から場合によっては選択される方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。幾つかの実施態様では、がんは神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である。幾つかの実施態様では、がんは、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６からなる群の一又は複数を発現する細胞を含む。幾つかの実施態様では、がんは異種抗原を発現する。そのようながんの例は、（例えば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＨＥＲ２、及び／又はＥｐｈＡ１を発現する）神経膠芽腫である。
【００３６】
別の態様では、本発明は、一般に、異種核酸分子を含むＣＡＲ Ｔ細胞であって、異種核酸分子が、（ａ）細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチドと；（ｂ）治療剤をコードする第二ポリヌクレオチドを含むＣＡＲ Ｔ細胞を特徴とする。
【００３７】
幾つかの実施態様では、治療剤は、抗体試薬、例えば、単鎖抗体又は単一ドメイン抗体（例えば、カメリド抗体）を含む。更なる実施態様では、抗体試薬は、二重特異性抗体試薬、例えば、ＢｉＴＥを含む。更に他の実施態様では、治療剤はサイトカインを含む。
【００３８】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲ及び治療剤は別個のＣＡＲ及び治療剤分子として生成される。幾つかの実施態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチドと治療剤をコードする第二ポリヌクレオチドの間にリボソームスキッピング部分を含む。幾つかの実施態様では、リボソームスキッピング部分は２Ａペプチド、例えばＰ２Ａ又はＴ２Ａを含む。
【００３９】
更なる実施態様では、ＣＡＲと治療剤は、それぞれ構成的に発現される。幾つかの実施態様では、ＣＡＲと治療剤の発現はＥＦ１αプロモーターによって駆動される。他の実施態様では、治療剤は、Ｔ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達により場合によっては誘導可能な誘導性プロモーターの制御下で発現され、例えば誘導性プロモーターはＮＦＡＴプロモーターを含む。また更なる実施態様では、ＣＡＲは構成的プロモーターの制御下で発現され、治療剤はＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達により場合によっては誘導可能な誘導性プロモーターの制御下で発現される。
【００４０】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲは一又は複数の共刺激ドメインを更に含む。幾つかの実施態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、又はリガンドを含む。
【００４１】
幾つかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒンジ／膜貫通ドメイン、例えば、免疫グロブリン様タンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む。幾つかの実施態様では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含み、これは場合によっては、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、及び１０４、又はそれらのバリアントの何れか一の配列、あるいは配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、及び１０４の何れか一と少なくとも９０％の配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含む。
【００４２】
更なる実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、１０６、又はそれらのバリアントの何れか一の配列、あるいは配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、及び１０６の何れか一と少なくとも９０％の配列同一性（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００４３】
また更なる実施態様では、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む。特定の実施態様では、共刺激ドメインは、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、及び１０５、又はそれらのバリアントの何れか一の配列、あるいは配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、及び１０５の何れか一と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性）を有する配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
【００４４】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に結合する。幾つかの実施態様では、カメリド抗体は腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に結合する。幾つかの実施態様では、ＢｉＴＥは、（ｉ）腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原と（ｉｉ）Ｔ細胞抗原に結合する。
【００４５】
所定の実施態様では、腫瘍関連抗原は、固形腫瘍関連抗原、例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６である。場合によっては、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤は、配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５１、５５、５７、６３、６５、１０３、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列、あるいは配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５１、５５、５７、６３、６５、又は１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含む。
【００４６】
更なる実施態様では、Ｔｒｅｇ関連抗原は、反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）からなる群から選択される。場合によっては、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤は、配列番号：３、９、１５、２５、７１、７７、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列、あるいは配列番号：３、９、１５、２５、７１、又は７７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含む。
【００４７】
別の態様では、本発明は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み；抗原結合ドメインがＴｒｅｇ関連抗原に結合する、ＣＡＲポリペプチドを特徴とする。幾つかの実施態様では、Ｔｒｅｇ関連抗原は、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５、及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。
幾つかの実施態様では、ＣＡＲは一又は複数の共刺激ドメインを更に含む。
所定の実施態様では、Ｔｒｅｇ関連抗原はＧＡＲＰ又はＬＡＰである。
【００４８】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８１のアミノ酸配列、又は配列番号：８１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：８２のアミノ酸配列、又は配列番号：８２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：８３のアミノ酸配列、又は配列番号：８３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの、及び／又は（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：８４のアミノ酸配列、又は配列番号：８４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：８５のアミノ酸配列、又は配列番号：８５の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：８６のアミノ酸配列、又は配列番号：８６の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むものを含む。幾つかの実施態様では、ＶＨは、配列番号：８７のアミノ酸配列、又は配列番号：８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、及び／又はＶＬは、配列番号：８８のアミノ酸配列、又は配列番号：８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【００４９】
他の実施態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８９のアミノ酸配列、又は配列番号：８９の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：９０のアミノ酸配列、又は配列番号：９０の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：９１のアミノ酸配列、又は配列番号：９１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの、及び／又は（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：９２のアミノ酸配列、又は配列番号：９２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：９３のアミノ酸配列、又は配列番号：９３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：９４のアミノ酸配列、又は配列番号：９４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むものを含む。幾つかの実施態様では、ＶＨは、配列番号：９５のアミノ酸配列、又は配列番号：９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、及び／又はＶＬは、配列番号：９６のアミノ酸配列、又は配列番号：９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【００５０】
幾つかの実施態様では、ＶＨはＶＬのＮ末端である。他の実施態様では、ＶＬはＶＨのＮ末端である。
【００５１】
更なる実施態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号：３、９、１５、２５、７１、７７、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列、あるいは配列番号：３、９、１５、２５、７１、及び７７の何れか一のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含んでいてもよい、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む。
【００５２】
幾つかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒンジ／膜貫通ドメイン、例えば、免疫グロブリン様タンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む。幾つかの実施態様では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、１０４、又はそれらのバリアントの何れか一の配列、あるいは配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、及び１０４の何れか一のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含んでいてもよい、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む。
【００５３】
また更なる実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。所定の実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、及び１０６、又はそれらのバリアントの何れか一の配列、あるいは配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、及び１０６の何れか一のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００５４】
幾つかの実施態様では、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む。所定の実施態様では、共刺激ドメインは、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、及び１０５、又はそれらのバリアントの何れか一の配列、あるいは配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、及び１０５の何れか一のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
【００５５】
別の態様では、本発明は、配列番号：２６、配列番号：３５、配列番号：４４、配列番号：５３、配列番号：６１、配列番号：１９、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１３、配列番号：６９、配列番号：７５、及び配列番号：１００の何れか一のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：２６、配列番号：３５、配列番号：４４、配列番号：５３、配列番号：６１、配列番号：１９、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１３、配列番号：６９、配列番号：７５、及び配列番号：１００の何れか一のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、ＣＡＲポリペプチドを特徴とする。
【００５６】
別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一の、（ｉ）ＣＡＲポリペプチド、又は（ｉｉ）ＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質をコードする核酸分子を特徴とする。幾つかの実施態様では、核酸分子は自殺遺伝子を更に含む。幾つかの実施態様では、核酸分子はシグナル配列をコードする配列を更に含む。
【００５７】
別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一の核酸分子を含むベクターを特徴とする。幾つかの実施態様では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
更に別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一の、ＣＡＲポリペプチドを含むポリペプチド、又はＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質を特徴とする。
【００５８】
更に別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一のＣＡＲポリペプチド、核酸分子、ベクター、及び／又はポリペプチドを含む免疫細胞を特徴とする。幾つかの実施態様では、免疫細胞はＴ又はＮＫ細胞である。幾つかの実施態様では、免疫細胞はヒト細胞である。
【００５９】
別の態様では、本発明は、一般に、先の態様の何れか一の一又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞、核酸分子、ＣＡＲポリペプチド、ポリタンパク質、又は免疫細胞を含む薬学的組成物を特徴とする。
更に別の態様では、本発明は、一般に、がんを有する患者を治療する方法であって、先の態様の何れか一の薬学的組成物を患者に投与することを含む方法を特徴とする。
【００６０】
幾つかの実施態様では、全身毒性は、腫瘍微小環境を標的とすることによって低減される。幾つかの実施態様では、がんは一又は複数の固形腫瘍の存在によって特徴付けられる。更なる実施態様では、がんは、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇによって特徴付けられる。所定の実施態様では、がんは神経膠芽腫である。
【００６１】
別の態様では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法であって、腫瘍毒性抗体又はサイトカインを分泌するように遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞産物を患者に投与することを含み、がん毒性を腫瘍微小環境に局所的に向けることによって、全身毒性が低減される方法を特徴とする。
【００６２】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＩＬ−１５、ＣＳＦ１Ｒ、又はＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６に対する抗体、又は二重特異性抗体を腫瘍微小環境に送達するように遺伝子改変される。所定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＥＧＦＲとＣＤ３に対するＢｉＴＥである。
【００６３】
別の態様では、本発明は、疾患又は病状を治療するために患者の組織又は器官に治療剤を送達する方法であって、治療用抗体、毒素、又は薬剤を分泌するように遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞を前記患者に投与することを含み、治療用抗体、毒素、又は薬剤は、それ自体では、組織又は器官に侵入又は浸透することができない、方法を特徴とする。
【００６４】
幾つかの実施態様では、組織又は器官が神経系、例えば中枢神経系、例えば脳にある。幾つかの実施態様では、疾患又は病状は、がん、例えば神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である。幾つかの実施態様では、治療用抗体は抗ＥＧＦＲ又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩである。
【００６５】
別の態様では、本発明は、対象におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した神経膠芽腫を治療する方法であって、（ｉ）細胞外ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては先の態様の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞から選択される、方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。
【００６６】
別の態様では、本発明は、対象の腫瘍微小環境における免疫抑制を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、先の態様の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞から選択される、方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。
【００６７】
更なる態様では、本発明は、対象の腫瘍微小環境におけるＴ細胞消耗を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的を含むＣＡＲポリペプチド結合ドメインと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては先の態様の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞から選択される、方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。
【００６８】
更に別の態様では、本発明は、対象のがんを治療する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては先の態様の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞から選択される、方法を特徴とする。幾つかの実施態様では、ＣＡＲは膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数の共刺激ドメインを含む。幾つかの実施態様では、がんは、神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である。幾つかの実施態様では、がんは、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６の一又は複数を発現する細胞を含む。幾つかの実施態様では、がんは異種抗原を発現する。そのようながんの例は、神経膠芽腫（例えば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＨＥＲ２、及び／又はＥｐｈＡ１を発現する）である。
【００６９】
［定義］
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において使用される幾つかの用語及び語句の意味を以下に示す。特に明記されていない限り、又は文脈から暗示されている場合を除き、次の用語及び語句には、以下に示す意味が含まれる。定義は特定の実施態様を説明するのを助けるために提供しており、技術的範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、請求項記載の技術を限定することは意図していない。特に定義されていない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、この技術が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有している。当該分野における用語の使用法とここに提供したその定義との間に明らかな矛盾がある場合、明細書において提供される定義が優先するものとする。
【００７０】
免疫学及び分子生物学における一般的な用語の定義は、それぞれの内容が全て、出典明示により全体としてここに援用される、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19版, Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S. Porter等(編), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)；及びRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann, Elsevier, 2006；Janeway’s Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (編), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)；Lewin’s Genes XI, Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green及びJoseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis等, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (編) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (編), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (編), John Wiley and Sons, Inc., 2005；及びCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (編) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見出すことができる。
【００７１】
「減少する」、「低減した」、「低減」又は「阻害する」という用語は、ここでは全て、統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。幾つかの実施態様では、「低減する」、「低減」、又は「減少する」、「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の治療又は薬剤がない場合）と比較して少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上の減少を含みうる。ここで使用される場合、「低減」又は「阻害」は、参照レベルと比較した、完全な阻害又は低減を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較して１００％の阻害である。適用可能な場合、減少は、好ましくは、所与の疾患のない個体の正常範囲内として受け入れられるレベルまで下がりうる。
【００７２】
「増加した」、「増加する」、「増強する」、又は「活性化する」という用語は、ここでは全て、統計的に有意な量の増加を意味するために使用される。幾つかの実施態様では、「増加した」、「増加する」、「増強する」、又は「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又はそれ以上で１００％の増加を含む増加、あるいは参照レベルと比較して１０〜１００％の間の任意の増加、あるいは少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍の増加、あるいは参照レベルと比較して２倍と１０倍以上の間の任意の増加を意味しうる。マーカー又は症状の文脈では、「増加」はそのようなレベルの統計的に有意な増加である。
【００７３】
ここで使用される場合、「対象」はヒト又は動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜、又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが含まれる。げっ歯類には、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが含まれる。家畜及び狩猟動物には、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼い猫、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、及び魚、例えば、マス、ナマズ及びサケが含まれる。幾つかの実施態様では、対象は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「個体」、「患者」、及び「対象」という用語は、ここでは互換的に使用される。
【００７４】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシでありうるが、これらの例には限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、有利には、がんなどの疾患の動物モデルを表す対象として使用されうる。対象は雄でも雌でもよい。
【００７５】
対象は、治療を必要とする状態（例えば、なかでも神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、又は他のタイプのがん）又はそのような状態に関連した一又は複数の合併症と以前に診断されたか、又はそれに罹患しもしくはそれを有していると判定され、場合によっては、その病気又はその病気に関連する一又は複数の合併症に対して治療を既に受けているものでありうる。あるいは、対象はまたそのような病気又は関連する合併症を有していると過去には診断されたことがないものでありうる。例えば、対象は、その病気又はその病気に関連する一又は複数の合併症に対する一又は複数の危険因子を示すものあるいは危険因子を示さない対象でありうる。
【００７６】
特定の病気の治療を「必要とする対象」は、その病気を有し、その病気を有していると診断され、又はその病気を発症するリスクがある対象でありうる。
【００７７】
「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができず、疾患が改善されない場合、動物の健康が悪化し続ける、動物、例えばヒトの健康状態である。対照的に、動物の「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、動物の健康状態が、障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。治療せずに放置しても、障害によって必ずしも動物の健康状態が更に低下するわけではない。
【００７８】
ここで使用される場合、「腫瘍抗原」及び「がん抗原」という用語は、がん細胞によって差次的に発現され、それによってがん細胞を標的とするために利用できる抗原を意味するために互換的に使用される。がん抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を潜在的に刺激することができる抗原である。これらの抗原の幾つかは、必ずしも発現されているわけではないが、正常細胞によってコードされている。これらの抗原は、正常細胞では通常サイレントである（すなわち発現されない）もの、分化の所定の段階でのみ発現されるもの、及び胚性及び胎児性抗原などの一過性に発現されるものとして特徴付けることができる。他のがん抗原は、がん遺伝子（例えば、活性化ｒａｓがん遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、変異体ｐ５３）、及び内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質など、変異細胞遺伝子によってコードされている。更に他のがん抗原は、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスで運ばれるものなど、ウイルス遺伝子によってコードされうる。多くの腫瘍抗原が、複数の固形腫瘍の点から定義されている：免疫によって定義されたＭＡＧＥ１、２、３；ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、ムチン（すなわち、ＭＵＣ−１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、及び前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）。加えて、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、エプスタインバー（ＥＢＶ）、及びヒトパピローマ（ＨＰＶ）によってコードされる幾つかなどのウイルスタンパク質は、それぞれ肝細胞癌、リンパ腫、及び子宮頸がんの発症において重要であることが示されている。腫瘍抗原の例は以下に提供され、例えば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、インターロイキン１３受容体サブユニットα−２（ＩＬ１３Ｒａ２）などを含む。
【００７９】
ここで使用される場合、「Ｔｒｅｇ抗原」又は「Ｔｒｅｇ関連抗原」は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞によって発現される抗原を意味するために互換的に使用される。これらの抗原は、場合によっては、本発明の細胞及び方法によって標的とされうる。Ｔｒｅｇ抗原の例は以下に提供され、例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５、及びＣＴＬＡ−４を含む。
【００８０】
ここで使用される場合、「キメラ」という用語は、少なくとも二種以上の異なるポリヌクレオチド分子の部分の融合産物を意味する。一実施態様では、「キメラ」という用語は、既知のエレメント又は他のポリヌクレオチド分子の操作を通して産生される遺伝子発現エレメントを意味する。
【００８１】
「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」、「ＢｉＴＥ抗体コンストラクト」、又は「ＢｉＴＥ」は、それぞれがタンデムに連結された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むポリペプチドを意味する。場合によっては、ｓｃＦｖは、リンカー（例えば、グリシンリッチリンカー）によって連結される。ＢｉＴＥの一つのｓｃＦｖがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、ＣＤ３εサブユニット）に結合し、もう一つが標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に結合する。
【００８２】
幾つかの実施態様では、「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されているＴ細胞の状態を意味しうる。幾つかの実施態様では、活性化は誘導されたサイトカイン産生を意味しうる。他の実施態様では、活性化は、検出可能なエフェクター機能を意味しうる。ここで使用される「活性化されたＴ細胞」は、少なくとも、増殖性Ｔ細胞である。
【００８３】
ここで使用される場合、「特異的結合」及び「特異的に結合する」という用語は、第一のエンティティが第二の標的エンティティに、それが非標的である第三のエンティティに結合するよりも大きい特異性及び親和性で結合する、二つの分子、化合物、細胞及び／又は粒子間の物理的相互作用を意味する。幾つかの実施態様では、特異的結合は、同じ条件下で第三の非標的エンティティに対する親和性よりも少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上大きい、第二の標的エンティティに対する第一のエンティティの親和性を意味しうる。所与の標的に特異的な試薬は、利用されているアッセイの条件下でその標的に対して特異的な結合を示すものである。非限定的な例には、同族結合パートナー（例えば、Ｔ細胞上に存在する刺激及び／又は共刺激分子）タンパク質を認識して結合する抗体又はリガンドが含まれる。
【００８４】
ここで使用される「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、人工ＡＰＣなど）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（ここでは「刺激分子」又は「共刺激分子」と呼ばれる）と特異的に結合することができ、それにより、限定されないが増殖、活性化、免疫応答の開始などを含むＴ細胞による一次応答を媒介するリガンドを意味する。刺激リガンドは当該技術分野でよく知られており、とりわけ、ペプチドを含むＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【００８５】
ここで使用される「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【００８６】
ここで使用される「共刺激リガンド」という用語は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えばペプチドを含むＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、限定されないが増殖、活性化、分化などを含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供するＡＰＣ上の分子を含む。共刺激リガンドには、限定されないが、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、誘導性ＣＯＳｔｉｍｕｌａｔｏｒｙリガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌ様受容体に結合するアゴニスト又は抗体及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが含まれうる。共刺激リガンドにはまた、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３などのＴ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが含まれうる。
【００８７】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを意味する。共刺激分子には、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３が含まれる。
【００８８】
一実施態様では、ここで使用される「操作された」という用語及びその文法的等価語は、核酸、例えば、生物のゲノム内の核酸の一又は複数のヒトデザインの変化を意味しうる。別の実施態様では、操作されたとは、遺伝子の変化、付加、及び／又は欠失を意味しうる。「操作された細胞」は、遺伝子を付加、欠失及び／又は変化させた細胞を意味しうる。ここで使用される「細胞」又は「操作された細胞」という用語及びそれらの文法的等価語は、ヒト又は非ヒト動物由来の細胞を意味しうる。
【００８９】
ここで使用される場合、「作用可能に連結された」という用語は、プロモーターなどの第一ポリヌクレオチド分子が、目的の遺伝子などの第二の転写可能なポリヌクレオチド分子に連結され、そこで、ポリヌクレオチド分子が、第一ポリヌクレオチド分子が第二ポリヌクレオチド分子の機能に影響を与えるように配されていることを指す。二つのポリヌクレオチド分子は、単一の近接ポリヌクレオチド分子の一部であってもなくてもよく、隣接してもしていなくてもよい。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが細胞内の目的の遺伝子の転写を調節し又は媒介するならば、目的の遺伝子に作用可能に連結されている。
【００９０】
ここに記載される様々な実施態様では、記載された特定のポリペプチドの何れかのバリアント（天然に生じるか又は別のバリアント）、対立遺伝子、ホモログ、保存的に修飾されたバリアント、及び／又は保存的置換バリアントが包含されることが更に考えられる。アミノ酸配列に関し、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸又は僅かな割合のアミノ酸を変化させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列における個々の置換、欠失、又は付加は、その変化が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保持する、「保存的修飾バリアント」であることを認識する。そのような保存的修飾バリアントは、開示と一致する多形バリアント、種間ホモログ、及び対立遺伝子に加えられ、それらを排除しない。
【００９１】
所与のアミノ酸は、類似の生理化学的特性を持つ残基で置き換えることができ、例えば、ある脂肪族残基を別の脂肪族残基で（例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａを互いに）置換し、又はある極性残基を別の極性残基で（例えばＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、又はＧｌｎとＡｓｎの間で）置換することができる。他のそのような保存的置換、例えば類似の疎水性特性を有する領域全体の置換はよく知られている。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、ここに記載されるアッセイの何れか一で試験して、所望の活性、例えば、リガンド媒介性受容体活性及び天然又は参照ポリペプチドの特異性が保持されることを確認できる。
【００９２】
アミノ酸は、側鎖の性質の類似性に従ってグループ化できる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然に生じる残基は、共通の側鎖の性質に基づいてグループに分類できる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。特定の保存的置換には、例えば、ＡｌａをＧｌｙ又はＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎへ又はＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａへ又はＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎへ又はＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕへ又はＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅへ又はＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇへ、Ｇｌｎへ、又はＧｌｕへ；ＭｅｔをＬｅｕへ、Ｔｙｒへ又はＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔへ、Ｌｅｕへ又はＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｙｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへ；及び／又はＰｈｅをＶａｌへ、Ｉｌｅへ又はＬｅｕへの置換が含まれる。
【００９３】
幾つかの実施態様では、ここに記載されるポリペプチド（又はそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、ここに記載されるアミノ酸配列の一つの機能的断片でありうる。ここで使用される場合、「機能的断片」とは、当該技術分野において知られ又はここに後述されるアッセイに従って野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持するペプチドの断片又はセグメントである。機能的断片は、ここに開示される配列の保存的置換を含みうる。
【００９４】
幾つかの実施態様では、ここに記載されるポリペプチドは、ここに記載されるポリペプチド又は分子のバリアントでありうる。幾つかの実施態様では、バリアントは保存的修飾バリアントである。保存的置換バリアントは、例えば、天然ヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。ここで言及される「バリアント」は、天然又は参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、一又は複数の欠失、挿入、又は置換のために天然又は参照ポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然又は参照ＤＮＡ配列と比較した場合、ヌクレオチドの一又は複数の付加、欠失、又は置換を含むが、非バリアントポリペプチドの活性を保持するバリアントタンパク質又はその断片をコードする配列を包含する。多種多様なＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発アプローチが当該技術分野において知られており、当業者によって適用されうる。
【００９５】
バリアントアミノ酸又はＤＮＡ配列は、天然又は参照配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上、同一でありうる。天然配列と変異配列の間の相同性の度合い（同一性パーセント）は、例えば、ワールドワイドウェブでこの目的に一般的に用いられている自由に利用できるコンピュータープログラムを（例えば、ＢＬＡＳＴｐ又はＢＬＡＳＴｎをデフォルト設定で）使用して二つの配列を比較することによって決定できる。
【００９６】
天然アミノ酸配列の変更は、当業者に知られている多くの技術の何れかによって達成することができる。変異は、例えば、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位が隣接する変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーション後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を有するアナログをコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発手順を用いて、必要とされる置換、欠失、又は挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更されたヌクレオチド配列を提供することができる。そのような変更を行うための技法は十分に確立されており、例えば、出典明示によりその全体がここに援用される、Walder等 (Gene 42:133, 1986)；Bauer等 (Gene 37:73, 1985)；Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smith等 (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；及び米国特許第４５１８５８４号及び第４７３７４６２号に開示されたものが含まれる。ポリペプチドの適切な立体構造の維持に関与していないシステイン残基をまた、一般にセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をポリペプチドに加えて、その安定性を改善し又はオリゴマー化を促進することができる。
【００９７】
ここで使用される場合、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのポリマーを示すために、ここでは「核酸」と互換的に使用される。典型的には、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合された、ＤＮＡ又はＲＮＡに天然に見出されるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）で構成される。しかしながら、この用語は、天然に生じる核酸に見出されるか否かにかかわらず、化学的又は生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを含むヌクレオシド又はヌクレオシドアナログを含む分子を包含し、そのような分子が所定の用途に好ましい場合がある。この出願がポリヌクレオチドに言及する場合、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方と、何れの場合にも一本鎖及び二本鎖形態（及び各一本鎖分子の相補体）が提供されることが理解される。ここで使用される「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド物質自体及び／又は特定の核酸を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、塩基の略語として使用される一連の文字）を指しうる。ここに提示されるポリヌクレオチド配列は、他に示されない限り、５’から３’の方向で提示される。
【００９８】
ここで使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを意味する。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、ここでは互換的に使用される。ペプチドは、比較的短いポリペプチドであり、典型的には約２〜６０アミノ酸長である。ここで使用されるポリペプチドは、典型的には、タンパク質に最も一般的に見出される２０のＬ−アミノ酸などのアミノ酸を含む。しかしながら、当該技術分野において知られている他のアミノ酸及び／又はアミノ酸アナログを使用することができる。ポリペプチド内のアミノ酸の一又は複数が、例えば、炭水化物基、リン酸基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカー、官能基などの化学物質を加えることによって修飾されうる。非ポリペプチド部分が共有的又は非共有的に結合したポリペプチドは、依然として「ポリペプチド」と考えられる。例示的な修飾には、グリコシル化及びパルミトイル化が含まれる。ポリペプチドは、天然源から精製され、組換えＤＮＡ技術を使用して産生され、又は一般的な固相ペプチド合成などの化学的手段によって合成等されうる。ここで使用される「ポリペプチド配列」又は「アミノ酸配列」という用語は、ポリペプチド物質自体及び／又はポリペプチドを生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、アミノ酸名の略語として使用される一連の文字又は３文字コード）を指す場合がある。ここに提示されるポリペプチド配列は、他に示されない限り、Ｎ末端からＣ末端の方向で提示される。
【００９９】
幾つかの実施態様では、ここに記載されるポリペプチド（例えば、ＣＡＲポリペプチド）をコードする核酸は、ベクターによって含められる。ここに記載される態様の幾つかでは、ここに記載される所与のポリペプチドをコードする核酸配列又はその任意のモジュールが、ベクターに作用可能に連結される。ここで使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達又は異なる宿主細胞間の移動のためにデザインされた核酸コンストラクトを意味する。ここで使用される場合、ベクターは、ウイルス性又は非ウイルス性でありうる。「ベクター」という用語は、適切な調節エレメントと会合されると複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝要素を包含する。ベクターには、限定されないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどが含まれうる。
【０１００】
ここで使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを意味する。発現される配列は、必ずしもではないが、細胞にとって異種性であることが多い。発現ベクターは追加のエレメントを含み得、例えば、発現ベクターは二種の複製系を有し得、それにより、二種の生物において、例えばヒト細胞において発現のため、また原核生物宿主においてクローニング及び増幅のために、維持されることが可能になる。「発現」という用語は、適用可能であれば、限定されないが、例えば、転写、転写物プロセシング、翻訳及びタンパク質フォールディング、修飾及びプロセシングを含む、ＲＮＡ及びタンパク質の産生と、適切にはタンパク質の分泌に関与する細胞内プロセスを意味する。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作用可能に連結された場合にインビトロ又はインビボでＲＮＡに転写（ＤＮＡ）される核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、並びに個々のコード化セグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【０１０１】
ここで使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも一のエレメントを含み、ウイルスベクター粒子にパッケージされる能力を有する核酸ベクターコンストラクトを意味する。ウイルスベクターは、非必須のウイルス遺伝子の代わりに、ここに記載のポリペプチドをコードする核酸を含みうる。ベクター及び／又は粒子は、インビトロ又はインビボの何れかで核酸を細胞に移入する目的のために利用されうる。ウイルスベクターの多くの形態が当該分野において知られている。
【０１０２】
「組換えベクター」とは、インビボで発現することができる異種核酸配列又は「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。ここに記載のベクターは、幾つかの実施態様では、他の適切な組成物及び治療法と組み合わせることができることを理解されたい。幾つかの実施態様では、ベクターはエピソームである。適切なエピソームベクターの使用は、対象において目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持する手段を提供し、それによって染色体への組み込みの潜在的な影響を排除する。
【０１０３】
ここで使用される場合、「シグナルペプチド」又は「シグナル配列」は、新生タンパク質を小胞体に方向付けるのに役立つ、新規合成タンパク質のＮ末端のペプチドを意味する。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドはＣＤ８又はＩｇκシグナルペプチドである。
【０１０４】
ここで使用される場合、「治療する（treat）」、「治療」、「治療する（treating）」、又は「回復」という用語は、目的が、疾患又は障害、例えば神経膠芽腫、神経膠腫、急性リンパ芽球性白血病又は他のがん、疾患、又は障害に関連する病気の進行又は重症度を逆転させ、緩和し、回復させ、阻害し、減速させ、又は停止させることである治療的処置を意味する。「治療する（treating）」という用語は、病気、疾患又は障害の少なくとも一つの副作用又は症状を低減させ又は緩和させることを含む。一又は複数の症状又は臨床マーカーが減少した場合、治療は一般に「効果的」である。あるいは、疾患の進行が減少し又は停止した場合、治療は「効果的」である。すなわち、「治療」には、症状又はマーカーの改善だけでなく、治療を行わない場合に予想されうる症状と比較して、症状の進行又は悪化の停止又は少なくとも緩徐化も含まれる。有益な又は望ましい臨床結果には、限定されないが、一又は複数の症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しないこと）、疾患進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の回復又は緩和、病状、寛解（部分又は完全）、及び／又は死亡率の低下が、検出可能であろうと検出不可能であろうと、含まれる。疾患の「治療」という用語はまた疾患の症状又は副作用からの緩和をもたらすこと（対症的治療を含む）を含む。
【０１０５】
ここで使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、例えば、製薬業界で一般的に使用される担体と組み合わせた活性剤を意味する。「薬学的に許容される」という語句は、ここでは、健全な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題や合併症を伴わないで、妥当な効果／リスク比に見合って、人間や動物の組織と接触して使用されるのに適した化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を指すために用いられる。態様の何れかの幾つかの実施態様では、薬学的に許容される担体は、水以外の担体でありうる。態様の何れかの幾つかの実施態様では、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、及び／又は軟膏でありうる。態様の何れかの幾つかの実施態様では、薬学的に許容される担体は、人工又は操作された担体、例えば、活性成分がその中では天然に生じることが見出されない担体でありうる。
【０１０６】
ここで使用される場合、「投与する」という用語は、所望の部位への薬剤の少なくとも部分的な送達をもたらす方法又は経路による、ここに開示される治療又は薬学的組成物の対象への配置を意味する。ここに開示される薬剤を含む薬学的組成物は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与されうる。
【０１０７】
「統計的に有意」又は「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に２標準偏差（２ＳＤ）以上の差を意味する。
【０１０８】
実施例以外において、又は他に示されない限り、ここで使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。パーセントに関連して使用される「約」という用語は、±１％を意味しうる。
【０１０９】
ここで使用される場合、「含む」という用語は、提示された定まった要素に加えて、他の要素もまた存在できることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【０１１０】
「からなる」という用語は、実施態様のその説明において記載されていない任意の構成要素が除外される、ここに記載の組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指す。
【０１１１】
ここで使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施態様に必要とされる構成要素を指す。この用語は、技術のその実施態様の基本的かつ新規又は機能的特性に実質的に影響を与えない追加の要素の存在を許容する。
【０１１２】
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形の用語は、文脈が明らかに他の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「又は」という語は、文脈が明確に別のことを示していない限り、「及び」を含むことが意図される。ここに記載されているものと類似し又は同等の方法及び材料をこの開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料は以下に説明する。「例えば（e.g.）」という略語は、ラテン語の例えば（exempli gratia）に由来し、非限定的な例を示すためにここでは使用される。従って、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば（for example）」という用語と同義である。
【０１１３】
態様の何れかの幾つかの実施態様では、ここに記載の開示は、人間のクローン化方法、人や動物に対して何ら実質的な医学的利点をもたらさないでそれらに苦痛を引き起こす可能性が高い、人間の生殖細胞系列の遺伝的アイデンティティを変更する方法、産業又は商業目的でのヒト胚の使用、又は動物の遺伝的アイデンティティを変更する方法、及びそのような方法から生じる動物には関係しない。
【０１１４】
他の用語は、以下に述べるように、技術の様々な態様及び実施態様の説明中で定義される。
【０１１５】
本発明は幾つかの利点を提供する。例えば、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、がん治療のための治療剤を送達するために使用できる。一例では、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、他の毒性抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ４又は抗ＣＤ２５（例えば、ダクリズマブ））又は他の分子（例えば、サイトカイン）を腫瘍微小環境に送達するために使用でき、有利には、それらは、周囲の腫瘍浸潤リンパ球の活性化を可能にし、チェックポイント遮断をもたらし、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させうる。本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は更にＴｒｅｇ細胞の標的化を容易にするためにＴｒｅｇ抗原に対して向けられうる。更に、本発明の所定のＣＡＲ Ｔ細胞を使用して、これらの分子が到達できない身体の領域（例えば、脳を含む中枢神経系）に遺伝的にコードされた分子（例えば、抗体又はサイトカイン）を送達することができる。一例では、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするＣＡＲ Ｔ細胞を使用して脳腫瘍を標的とすることができ、抗体（例えば、セツキシマブなどのＥＧＦＲに対する抗体；以下をまた参照のこと）を腫瘍に送達することができる。従って、本発明は、腫瘍微小環境における遺伝的にコードされたＴｒｅｇのターゲティングを提供する。加えて、本発明は、所定の組織に到達できない抗体の遺伝的にコードされた送達を提供し、抗腫瘍標的の特異性を広げることによりＴ細胞療法の有効性を増強することができる。従って、本発明は、がんの遺伝子改変Ｔ細胞療法を提供する。
【０１１６】
本発明の他の特徴及び利点は、次の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞によるヒト神経膠腫標的細胞株Ｕ８７ｖＩＩＩの死滅を、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ：Ｕ８７ｖＩＩＩ標的細胞比の関数として示しているグラフである。非形質導入細胞を、陰性対照として標的細胞と共にインキュベートした。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ヒト神経膠腫の皮下モデルにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍（Ｕ８７ｖＩＩＩ）の位置を示している一連の生物発光画像である。図２Ａは、非形質導入細胞で処理されたマウスを陰性対照として示す。図２Ｂは、生着後４日目にＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで処置されたマウス（上段）と、２１日目までに治療が成功したマウス（下段）を示す。
【図３−４】図３Ａ及び３Ｂは、ヒト神経膠腫の頭蓋内モデルにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍（Ｕ８７ｖＩＩＩ）の位置を示す一連のＸ線オーバーレイである。図３Ａは、５日目（Ｄ５；上段）及びＤ１１（下段）の陰性対照として、非形質導入（ＵＴＤ）細胞で処置されたマウスを示している。図３Ｂは、生着後２日目のＤ５（上段）及びＤ１１（下段）でのＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで処置されたマウスを示す。図４Ａ及び４Ｂは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩの注入後５日での一患者における腫瘍組織の免疫組織化学的検査を示す顕微鏡写真である。図４Ａは、ＣＤ３について染色されたＴ細胞を示す。図４Ｂは、ＣＤ２５＋細胞を示す。ＣＤ２５は、活性化又は制御性Ｔ細胞のマーカーであるＩＬ−２受容体アルファ鎖である。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、インビトロでのヒト神経膠腫細胞との１８時間のコインキュベーション後のＣＡＲ Ｔ細胞抗腫瘍活性のＴｒｅｇ抑制を定性的に証明する蛍光顕微鏡写真である。図５Ａは、神経膠腫細胞に対するＣＡＲＴ非特異的細胞の相対濃度を示す。図５Ｂは、培養物中におけるＴｒｅｇのない神経膠腫細胞に対するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の相対濃度を示す。図５Ｃは、培養物中に含まれるＴｒｅｇを含む神経膠腫細胞に対するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の相対濃度を示す。図５Ｄは、時間（最大４８時間）の関数としての神経膠腫細胞生存率の尺度として緑色対象のコンフルエンスの定量的読み出しを示すグラフである。上の線は図５Ａに示す結果（神経膠腫細胞増殖）を表し、下の線は図５Ｂに示す結果（神経膠腫細胞の死滅）を表し、中央の線は図５Ｃに示す結果（ＣＡＲＴ死滅に対する神経膠腫細胞の耐性）を表す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、対照Ｔ細胞（図６Ａ）、非活性化Ｔｒｅｇ（図６Ｂ）、及び活性化Ｔｒｅｇ（図６Ｃ）におけるＬＡＰ（ｘ軸）及びＧＡＲＰ（ｙ軸）の発現を示すフローサイトメトリープロットである。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−のロイコパックから選別し、ＩＬ−２の存在下で７日間ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで増殖させた。１日目に、それらを、ＧＦＰを発現するように形質導入した。７日目にビーズを取り除いた後、増殖したＴｒｅｇを４日間休ませてから凍結させた。解凍後、Ｔｒｅｇを、ＬＡＰ及びＧＡＲＰ発現のために、一晩の休止（非活性化）後又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８による一晩の活性化後に染色した。同じドナー由来の非形質導入Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）を発現の対照として使用した（図６Ａ）。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ＬＡＰ（図７Ａ）及びＧＡＲＰ（図７Ｂ）の発現を示す図６Ａ〜６Ｃに示される結果に対応するフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔｒｅｇ関連抗原を標的とするためのＣＡＲコンストラクトの概略図である。図８Ａは、その軽鎖（Ｌ）と重鎖（Ｈ）がそれぞれ５’から３’方向に配置された抗ＬＡＰ ｓｃＦｖを有するＬＡＰ標的化ＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ）を示している。図８Ｂは、その重鎖（Ｈ）と軽鎖（Ｌ）がそれぞれ５’から３’の方向に配置された抗ＬＡＰ ｓｃＦｖを有するＬＡＰ標的化ＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ）を示している。図８Ｃは、抗ＧＡＲＰカメリド抗体結合ドメインを有するＧＡＲＰ標的化ＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ）を示している。図８Ｄは、抗ＧＡＲＰカメリド抗体を有するＥＧＦＲ標的化ＣＡＲコンストラクトを示している。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、ＣＡＲ Ｔ細胞対標的Ｔｒｅｇ細胞比の関数として標的Ｔｒｅｇ死滅を示すグラフである。ＴｒｅｇｓにＧＦＰを形質導入し、ＧＦＰ発現をモニタリングすることで細胞傷害性を定量した。図９Ａは活性化Ｔｒｅｇの死滅を示し、図９Ｂは非活性化Ｔｒｅｇの死滅を示す。ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌは、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈと比較して、非活性化Ｔｒｅｇの死滅化により効果的であった。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、１：１のＣＡＲ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ比での様々な抗Ｔｒｅｇ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ、又は非形質導入対照細胞）による４日間の標的Ｔｒｅｇ死滅を示すグラフである。図１０Ａ及び１０Ｂは、二種の異なるドナーで行われた同じ実験からの結果を示す。
【図１１】３日間の共培養後の、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ Ｔ細胞によるＣＡＲ Ｔ細胞対標的Ｔｒｅｇ細胞比の関数としての標的Ｔｒｅｇ死滅を示すグラフである。図１１Ａ及び１１Ｂは、フローサイトメトリーによって測定された、共培養物中に残っている標的細胞の数を示す。破線は、ＣＡＲ細胞を含んでいない対照試料中の標的細胞の数を示している。図１１Ａは、標的細胞として非活性化Ｔｒｅｇを示し、図１１Ｂは、標的細胞として活性化Ｔｒｅｇを示す。図１１Ｃ及び１１Ｄは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現によって測定される細胞傷害性パーセントを示す。図１１Ｃは、標的細胞として非活性化Ｔｒｅｇを示し、図１１Ｄは、標的細胞として活性化Ｔｒｅｇを示す。図１１Ａ〜１１Ｄのそれぞれにおいて、円形は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、矩形は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈを表し、三角形は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、ＨＵＴ７８細胞によるＧＡＲＰ（図１２Ａ）及びＬＡＰ（図１２Ｂ）の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、３日間の共培養後のＬＡＰ標的化ＣＡＲ Ｔ細胞によるＣＡＲ Ｔ細胞対標的細胞比の関数として標的ＨＵＴ７８細胞の死滅を示すグラフである。図１３Ａは、フローサイトメトリーにより測定された、３日後に培養物中に残っている標的細胞の数を示す。破線は、ＣＡＲ細胞を含んでいない対照試料中の標的細胞の数を示す。図１３Ｂは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現によって測定される細胞傷害性パーセントを示す。円形はＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、矩形はＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈを表し、三角形は非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＳｅＡｘ細胞によるＧＡＲＰ（図１４Ａ）及びＬＡＰ（図１４Ｂ）の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現によって測定された、共培養の２４時間（図１５Ａ）及び４８時間（図１５Ｂ）後のＧＡＲＰ及びＬＡＰ標的ＣＡＲ Ｔ細胞によるＣＡＲ Ｔ細胞対標的細胞比の関数として標的ＳｅＡｘ細胞の死滅を示すグラフである。矩形はＣＡＲＴ−ＧＡＲＰを表し、上向きの三角形はＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、下向きの三角形はＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ細胞を表し、菱形は非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ Ｔ細胞の培養から得られた上清のタンパク質成分の存在を示すウエスタンブロットの写真である。図１６Ａ及び１６Ｂは、分子量参照ラダーを含む完全なゲルを示している。図１６Ｃは、図１６Ｂに示されるゲルの下部領域のより長い露出であり、カメリド抗体の存在を示している１０〜１５ｋＤのバンドが矢印で特定されている。
【図１７】図１７は、ＣＡＲとＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）の概略図である。
【図１８】図１８は、セツキシマブに由来する抗ＥＧＦＲドメインとブリナツモマブに由来する抗ＣＤ３ドメインを有するＢｉＴＥの概略図である。
【図１９】図１９は、レーン２にＢｉＴＥの存在を確認するウエスタンブロット実験を示す一連の写真である。
【図２０−２１】図２０Ａ及び２０Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＨＥＫ２９３細胞によって発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞によって発現されたＥＧＦＲ（図２０Ａ）及びジャーカット細胞によって発現されたＣＤ３（図２０Ｂ）との結合を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。図２１Ａ及び２１Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＳｕｐＴ１細胞により発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞（図２１Ａ）により発現されたＥＧＦＲ及びＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）発現ＳｕｐＴ１細胞（図２１Ｂ）により発現されたＣＤ３への結合を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図２２−２３】図２２Ａ及び２２Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＮＤ４細胞により発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞により発現されたＥＧＦＲ（図２２Ａ）及びＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）発現ＮＤ４細胞（図２２Ｂ）により発現されたＣＤ３への結合を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。図２３は、エフェクター（非形質導入ＮＤ４）の標的（Ｕ８７ｖＩＩＩ）細胞比の関数として、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞により分泌されたＢｉＴＥと共にインキュベートされたＮＤ４細胞によるＵ８７ｖＩＩＩ細胞の死滅を示すグラフである。矩形は上清がＢｉＴＥを含んでいた実験群を表し、円形はＢｉＴＥを含んでいない陰性対照を表す。
【図２４−２５】図２４は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＣＡＲを、ＮＦＡＴプロモーターの制御下でＧＦＰを、コードする例示的な核酸分子の図である。図２５Ａ及び２５Ｂは、図２４のコンストラクトが形質導入された細胞によるＧＦＰ発現を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。赤のヒストグラムは、未刺激細胞におけるＧＦＰ発現を示し；青のヒストグラムは、ＰＭＡとイオノマイシンで刺激された細胞でのＧＦＰ発現を示し；オレンジのヒストグラムは、ＰＥＰｖＩＩＩでコートされた細胞でのＧＦＰ発現を示している。
【図２６】図２６Ａは、ＣＡＲと構成的に発現されるＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＧＦＰ−ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）の概略図である。図２６Ｂは、ＣＡＲと構成的に発現されるＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＧＦＰ−ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＣＤ１９−ＣＤ３）の概略図である。
【図２７】図２７Ａは、ＣＡＲと誘導的に発現されるＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＢｉＴＥ−（ＣＤ１９−ＣＤ３）−ＣＡＲ−ＥＧＦＲの概略図である。図２７Ｂは、ＣＡＲと誘導的に発現されるＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＢｉＴＥ−（ＣＤ１９−ＣＤ３）−ＣＡＲ−ＥＧＦＲの概略図である。
【図２８】図２８は、ＣＡＲ−ＢｉＴＥ細胞とＥＧＦＲ（ビオチン−ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ）の結合の共焦点顕微鏡写真を示している。形質導入された細胞は赤色である（ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子のため）。
【図２９Ａ】図２９Ａ及び２９Ｂは、ＣＡＲ−ＢｉＴＥの抗腫瘍活性を示す一連のグラフである。図２９Ａは、標的Ｕ８７神経膠腫細胞の存在下でＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲからＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αが産生されたことを示している。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、Ｕ８７細胞に対するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ媒介性特異的溶解を示し、４０時間の共培養後にほぼ１００％の溶解に達する。
【図２９Ｃ−Ｄ】図２９Ｃは、ＣＡＲ．ＢｉＴＥ Ｔ細胞を、ＵＴＤを有する上部ウェルに播種し、標的腫瘍を下部に播種するＡＣＥＡトランスウェル（孔径：１ミクロン）実験の概略図である。図２９Ｄは、ＣＡＲ．ＢｉＴＥを含むトランスウェルがＵ８７の選択的溶解をもたらしたが、ＵＴＤ又はＣＡＲ．ＢｉＴＥ対照を含むインサートを有するウェルではもたらさなかったことを示すグラフである。
【図３０−３１】図３０Ａは、頭蓋内Ｕ２５１に対するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ抗腫瘍活性のインビボ評価の概略図である。腫瘍は、−１日目に定位的補助下で生着させた後、１×１０６個のＣＡＲ形質導入細胞を対側側脳室への養子移入を行った。図３０Ｂは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲで処置されたマウスにおけるＣＡＲ−ＢｉＴＥのインビボ有効性を示す。ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲは、２１日目までに頭蓋内腫瘍のほぼ完全な根絶を示した。図３１は、神経膠芽腫及び中枢神経系（ＣＮＳ）の正常組織におけるＥＧＦＲ発現を示す。組織マイクロアレイは幾つかの正常な健康なヒトＣＮＳ組織（上段）と膠芽腫検体（下段）にわたる免疫組織化学によるＥＧＦＲ発現を示している。各検体に関する詳細は、表２に見出すことができる。
【図３２Ａ−Ｄ】図３２Ａは、Ｕ８７神経膠腫細胞（５×１０４）の異種集団（３０％ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性、７０％野生型）がＮＳＧマウスの脇腹に生着された実験デザインを示す。図３２Ｂは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍の増殖の経時的な生物発光分析を示す。図３２Ｃは、ＵＴＤ単独対ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで処置されたマウス（ｎ＝５マウス）における全腫瘍成長のノギス測定値を示す。図３２Ｄは、ＵＴＤ細胞又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（スケールバー＝５０μｍ）で処置したマウスから採取した腫瘍上のＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及び免疫組織化学（ＩＨＣ）を示している。
【図３２Ｅ】図３２Ｅは、異種性のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を示す。
【図３３Ａ】図３３Ａは、ＥＧＦＲとＣＤ１９を標的とする二種のＢｉＴＥ分泌抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲコンストラクトの導入遺伝子の概略図を示す。
【図３３Ｂ−Ｅ】図３３Ｂは形質導入効率を示す。全てのコンストラクトは、３人の正常ドナーからの初代ヒトＴ細胞の効率的な形質導入を証明した（平均±ＳＥＭ）。図３３Ｃは、各ＢｉＴＥについての全体的ｓｃＦｖ配向を示し、これは、可動性グリシン−セリンリンカーによって架橋された軽鎖−重鎖−重鎖−軽鎖である。図３３Ｄは、ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ及びＢｉＴＥ−ＣＤ１９の概略図を示す。図３３Ｅは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲが形質導入されたＨＥＫ２９８Ｔ細胞の上清中のＢｉＴＥのウエスタンブロット分析を示している。
【図３３Ｆ】図３３Ｆは、それぞれの標的を発現するＫ５６２細胞へのＢｉＴＥの結合の二次Ｈｉｓタグ検出を実証するフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９、及びＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞からの非濃縮上清を、形質導入の１０日後に、ＣＤ１９又はＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞と共にインキュベートした。
【図３３Ｇ−Ｈ】図３３Ｇは、初代ヒトＴ細胞上のＣＤ３へのＢｉＴＥ結合を示すフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。データは、次に対応する抗Ｈｉｓタグ抗体で染色された培養物を反映している：ＵＴＤ単独、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９細胞、又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞と共に培養されたＵＴＤ。それぞれの培養物からの濃縮上清（〜１０００倍）で染色されたＵＴＤを示す。図３３Ｈは、上清中のＢｉＴＥ濃度が経時的に増加することを示している。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲで形質導入されたＴ細胞を、０、７、及び１４日にＨｉｓタグＥＬＩＳＡ分析用に収集した上清と共に培養した。アッセイを三通り実施した（平均±ＳＥＭが示される；独立ｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５）。
【図３４Ａ−Ｂ】図３４Ａは、フローサイトメトリーによる未染色細胞と比較した、Ｕ８７及びＵ２５１細胞株におけるＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を示す。図３４Ｂは、非形質導入（ＵＴＤ）又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲで形質導入され、１：１のＥ：Ｔで１８時間Ｕ８７又はＵ２５１神経膠腫細胞株と共培養されたジャーカットレポーターＴ細胞を示している。活性化は、相対発光によって反映される。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、１：１のＥ：ＴでＵ８７又はＵ２５１と一晩共培養した場合の初代ヒトＵＴＤ、ＣＡＲ Ｔ、及びＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞によるサイトカイン産生を示している。
【図３５】図３５は、ＥＧＦＲ発現腫瘍に対するＣＡＲＴ．ＢｉＴＥの抗腫瘍特異的溶解を示している。１８時間後の示されたＥ：Ｔ比での生物発光ベースアッセイによるＵ８７に対するＵＴＤ細胞又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞の細胞傷害性。
【図３６Ａ】図３６Ａ及び３６Ｂは、３：１（Ｈｉ）及び１：１（Ｌｏ）のＥ：ＴでのＵ８７及びＵ２５１に対するＵＴＤ及びＣＡＲ Ｔ細胞のインピーダンスに基づく細胞傷害性アッセイを示す（図３６Ａ）。
【図３６Ｂ】経時的にＵＴＤに正規化された溶解パーセントとしても表される（図３６Ｂ）。データは１５分ごとに得られた読み取り値で記録した。
【図３６Ｃ】図３６Ｃは、ＧＢＭ細胞株におけるＥＧＦＲ発現とＣＡＲ Ｔ細胞による特異的溶解パーセントとの間の相関を示す。Ｕ２５１及びＵ８７によるＥＧＦＲ発現の定量化は、フローサイトメトリーによって決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてプロットした。特異的溶解パーセントは、インピーダンスベースの死滅アッセイによって測定した。エフェクター細胞を標的細胞と共に１：１のＥ：Ｔで２４時間インキュベートした。細胞傷害性は、ＵＴＤ対照と共にインキュベートした標的と比較した、細胞指数の減少によって反映させた。
【図３７Ａ−Ｃ】図３７Ａは、フローサイトメトリーによる、ＰＤＸニューロスフェア株、ＢＴ７４上のＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ発現の特徴付けを示す。陽性のイベント（灰色）を、アイソタイプ染色（黒色）に対してゲーティングした。図３７Ｂは、ＵＴＤ、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲの何れかが形質導入され、１：１のＥ：ＴでＢＴ７４と共培養されたレポーターＴ細胞を示している。図３７Ｃは、ｅＧＦＰが３：１のＥ：Ｔで二組で形質導入されたＢＴ７４に対する細胞傷害性の評価を示している。緑の全画像面積（μｍ２）を、ＢＴ７４の生存率のプロキシとして記録した。
【図３７Ｄ】図３７Ｄは、４日の過程にわたる図３７Ｃからのニューロスフェアの代表的な画像を示す（スケールバー＝１００μｍ）。
【図３８Ａ】図３８Ａは、５×１０３のＵ８７ｖＩＩＩ細胞をＮＳＧマウスの脳に同所性に生着させ、静脈内（ＩＶ）又は脳室内（ＩＶＴ）ＣＡＲ Ｔ細胞（１×１０６個の形質導入細胞）で処置した実験デザインの概略図を示している。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、ＵＴＤ細胞での処置と比較した、送達経路によってグループ分けされた、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩによって処置されたマウスの生存プロットを示す（ｎ＝１群当たり５匹）。
【図３９】図３９Ａは、ＣＢＧ−ＧＦＰが形質導入された５×１０５個のＢＴ７４細胞をＮＳＧマウスの頭蓋内（ＩＣ）に生着させ、生着後７日目にＵＴＤ細胞、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９細胞、又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞（１×１０６個の形質導入細胞）の脳室内（ＩＶＴ）注入で処置した実験デザインの概略図を示す。図３９Ｂは、経時的な腫瘍増殖を示す；データは、対応するレジメンで処置された３匹の連続したマウスを表す。図３９Ｃは、経時的にディスプレイされた１群当たりの平均生物発光値を示す（平均＋ＳＤが示されている）。
【図４０Ａ−Ｄ】図４０Ａは、Ｕ２５１細胞（２×１０４）をＮＳＧマウスに同所性に生着させ、生着後５日目に脳室内（ＩＶＴ）の非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩｖ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９細胞、又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞で処置したものを示している。図４０Ｂは、経時的なＵ２５１腫瘍増殖の生物発光画像を示す（ｎ＝５マウス）。図４０Ｃは腫瘍増殖を、個々のマウスについて（左パネル）と平均値（右パネル）として示している（平均±ＳＤが示されている；独立ｔ検定、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。図４０Ｄは実験デザインを示す。ヒト皮膚をＮＳＧマウスの背部に生着させ、６週間治癒させた。次に、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９、又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞を尾静脈から静脈内投与（ＩＶ）した。移植片は切除と病理組織学的分析の前に最大２週間観察した。
【図４０Ｅ−Ｇ】図４０Ｅは、静脈内ＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞で処置したマウスのホルマリン固定パラフィン包埋皮膚検体において末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）によって識別されたＣＤ３（Ｔ細胞）及びアポトーシス細胞のヘマトキシリン対比染色及び免疫組織化学（ＩＨＣ）を示している（スケールバー＝１００μｍ）。図４０Ｆ及び４０Ｇは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９、又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲで処置したマウスの皮膚移植片における浸潤ＣＤ３＋細胞（図４０Ｆ）及びＴＵＮＥＬ＋細胞（図４０Ｇ）の定量化を示す。細胞数を、４０倍の倍率で１０の連続する高倍率視野（ＨＰＦ）で記録した。実験を繰り返した。バーは平均値、ｎ＝１０を表す（独立ｔ検定、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図４１Ａ−Ｂ】図４１Ａは、Ｔ細胞へのＢｉＴＥの結合を示す共焦点顕微鏡写真を示す。ＣＡＲ形質導入はｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞として示されている。ＥＧＦＲ特異性はビオチン化ＥＧＦＲに結合する能力によって決定され、重複領域も存在する（スケールバー＝１０μｍ）。図４１Ｂは、図４１Ａに示されたパネルの概略図を示す；ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ（上段）、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９（中段）、及びＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ（下段）。
【図４１Ｃ】図４１Ｃは、ＥＧＦＲ発現腫瘍Ｕ８７との共培養後の、ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ陽性）並びにバイスタンダーＴ細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ陰性）上のＣＤ２５及びＣＤ６９発現を示している。
【図４１Ｄ−Ｅ】図４１Ｄは、バイスタンダーレポーターＴ細胞活性化を示している。ＵＴＤ、ＣＡＲ Ｔ細胞、及びＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞を、レポーターＴ細胞及びＥＧＦＲ発現腫瘍細胞と一晩共培養し、その後バイスタンダー活性化を相対発光によって測定した。図４１Ｅは、Ｕ８７に対するＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞培養増殖を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞を標的細胞と共培養し、形質導入細胞、非形質導入バイスタンダー細胞、及びＵ８７を明らかにした。
【図４１Ｆ−Ｈ】図４１Ｆは、ビーズをカウントすることによる、図４１Ｅに示された培養物からのバイスタンダー細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。図４１Ｇは、バイスタンダーサイトカイン分泌及びＵ８７に対する細胞傷害性を評価するために使用されるトランズウェルシステムの概略図を示す。非形質導入の、又はＣＡＲＴ．ＢｉＴＥコンストラクトが形質導入されたジャーカットＴ細胞を上部ウェルで培養し、初代ヒトＵＴＤ細胞及びＵ８７標的を下部ウェルに配した。図４１Ｈは、標的と共培養され、上部ウェルからの上清に曝露されたときのバイスタンダーＵＴＤ細胞によるサイトカイン産生を示す。
【図４１Ｉ−４２】図４１Ｉは、図４１Ｇに示されたトランズウェルシステムを使用して、Ｕ８７及びＵ８７−ＣＤ１９に対するバイスタンダー細胞の活性を測定するインピーダンスベースの細胞傷害性アッセイを示している。図４２は、トランズウェルシステムを使用して、Ｕ８７に対するバイスタンダーＴｒｅｇの活性を測定する生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを示している。ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲの何れかが形質導入されたＴ細胞を上部ウェルで培養し、選別した初代ヒトＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ／−）及びＵ８７標的を下部ウェルに配した。
【図４３Ａ−Ｄ】図４３Ａは、Ｕ８７神経膠腫細胞（５×１０３）の異種性集団（１０％ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性、９０％野生型）がＮＳＧマウスの脳内に同所性に生着させた実験デザインの概略図を示している。Ｕ８７細胞とＵ８７ｖＩＩＩ細胞の両方をＣＢＧ−ｌｕｃで修飾して、頭蓋内腫瘍の全量を生物発光イメージングで視覚化できるようにした。マウスを、生着後２日目に、非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９細胞、又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞で脳室内処置した。図４３Ｂは、経時的な混合腫瘍増殖の生物発光分析を示す（ｎ＝５）。図４３Ｃは、平均値として示される腫瘍増殖を示す（平均±ＳＤが示される；独立ｔ検定、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。図４３Ｄは、選別されたＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞の純度を示している。セルソーティング前後の代表的なフローサイトメトリーデータを示している。
【図４３Ｅ−Ｆ】４３Ｅ及び４３Ｆは、１８時間にわたる示されたＥ：Ｔ比での、Ｕ８７、Ｕ８７−ＣＤ１９（図４１Ｅ）、又はＵ８７ｖＩＩＩ（図４１Ｆ）に対するＵＴＤ、選別ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞、又は選別ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞の生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを示す。
【図４３Ｇ】図４３Ｇは、選別された形質導入細胞の増殖アッセイを示す。エフェクター細胞を、照射されたＵ８７、Ｕ８７ｖＩＩＩ、又はＵ８７−ＣＤ１９を使用して刺激した（矢印）。次に、ＵＴＤ細胞、選別されたＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞、及び選別されたＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞を、ＣＡＲ単独（ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９とＵ８７ｖＩＩＩ）、ＢｉＴＥ単独（ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９とＵ８７−ＣＤ１９）、又はＣＡＲとＢｉＴＥ（ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲとＵ８７ｖＩＩＩ）によって刺激した。アッセイは三通り実施した（平均±ＳＥＭが示されている；独立ｔ検定、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図４３Ｈ−Ｉ】図４３Ｈは、３週間の刺激後の図４１Ｇに概説されたＴ細胞の表現型を示す。細胞は、次のようにＴ細胞表現型に従ってフローサイトメトリーによってグループ化した：ナイーブ（ＴＮ）ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−、セントラルメモリー（ＴＣＭ）ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、エフェクターメモリー（ＴＥＭ）ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ＋、及びエフェクター（ＴＥ）ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ−。円グラフは、ＢｉＴＥのみ、ＣＡＲのみ、又はＣＡＲとＢｉＴＥによって刺激されたＣＡＲ Ｔ細胞の表現型を示している。図４３Ｉは、ＢｉＴＥのみ、ＣＡＲのみ、又はＣＡＲとＢｉＴＥによる１２日間の刺激後の消耗マーカー（ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３）を示している。
【図４４Ａ−Ｃ】図４４Ａ〜４４Ｃは、二種の異なる抗原を標的とするタンデムＣＡＲを含む、例示的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す一連の概略図である。図４４Ａは、ＥＦ１αプロモーター、ＩＬ−１３受容体アルファ２リガンド（例えばＩＬ−１３ゼータカイン、抗ＩＬ−１３Ｒａ２単鎖可変断片又は単一ドメイン抗体）、４−１ＢＢ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、Ｔ２Ａペプチド配列、及びレポーター遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）を含む、例示的な抗ＩＬ−１３Ｒα２ＣＡＲコンストラクトの概略図を示す。図４４Ｂは、ＥＦ１αプロモーター、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、Ｔ２Ａペプチド配列、及びレポーター遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）を含む、例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲコンストラクトの概略図を示す。図４４Ｃは、ＥＦ１αプロモーター、ＩＬ−１３リガンド（ＩＬ−１３ゼータカイン）、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、Ｔ２Ａペプチド配列、及びレポーター遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）を含む、例示的なタンデム抗ＩＬ−１３Ｒα２／抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲコンストラクトの概略図を示す。
【図４４Ｄ】図４４Ｄは、ｍＣｈｅｒｒｙなしの図４３Ａ〜４３Ｃのコンストラクトの概略図を示す。
【図４５】図４５Ａは、Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞及びＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するように形質導入されたＵ８７細胞（Ｕ８７ｖＩＩＩ）におけるＩＬ−１３Ｒα２の発現を評価するためのフローサイトメトリー分析の結果を示す一連のグラフである。図４５Ｂは、神経膠芽腫細胞の異種性集団（１：１の比率のＵ８７細胞：Ｕ８７ｖＩＩＩ細胞）を対照の非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）又は図４４Ａ〜４４Ｃの示されたＣＡＲコンストラクトが形質導入されたＴ細胞と共にインキュベートした、細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。ｙ軸は特異的溶解パーセントを示し、ｘ軸はエフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）比を示す。
【詳細な説明】
【０１１８】
本発明は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（「ＣＡＲ Ｔ細胞」）ベースの治療への改善されたアプローチを提供する。一般に、改善は、抗腫瘍療法におけるターゲティングの様々な態様、例えば腫瘍微小環境のターゲティングに関する。
【０１１９】
例えば、ここに記載されているのは、免疫細胞、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）のような、ＣＡＲを発現し、並びに治療剤を分泌するように操作されたＴ細胞である。ＢｉＴＥを分泌するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ここではＣＡＲＴ．ＢｉＴＥと呼ばれる。ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ戦略では、全身組織での望ましくない活性のリスクを低減しながら、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）における腫瘍に対する治療剤の局所領域送達を可能にする。そのようなＣＡＲＴ．ＢｉＴＥコンストラクトは、とりわけ、ここに記載されているように、神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫などのがんの治療に有用である。
【０１２０】
加えて、以下に更に説明するように、我々は、（例えば、腫瘍微小環境における）腫瘍に対する対象の免疫応答の抑制において役割を果たす制御性Ｔ細胞（ここでは「Ｔｒｅｇ」とも呼ばれる）が、ＣＡＲ Ｔ細胞で標的化されうることを実証した。従って、本発明は、ＣＡＲがＴｒｅｇ抗原又はマーカー（例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＴＬＡ４、又はＣＤ２５；以下もまた参照のこと）に対して向けられているＣＡＲ Ｔ細胞を提供する。他の例では、本発明は、一又は複数のＴｒｅｇ抗原又はマーカー（例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＴＬＡ４、又はＣＤ２５；以下もまた参照のこと）に対する抗体（例えば、単鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、カメリド抗体）、又は二重特異性抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー））を分泌するＣＡＲ Ｔ細胞を提供する。Ｔｒｅｇを標的とすることに加えて、本発明は、他の治療剤（例えば、抗体及び関連分子）を腫瘍に送達するためのＣＡＲ Ｔ細胞及び関連方法を提供する。一例では、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的なＣＡＲを有するＣＡＲ Ｔ細胞を使用して、脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）を標的化する。このようなＣＡＲ Ｔ細胞は、これらの腫瘍に抗体試薬（例えば、単鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、カメリド抗体）、又は二重特異性抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー））などの治療剤を送達するためにも使用されうる。これらの方法は、抗体が通常は通過しない血液脳関門にもかかわらず、それらが実際に脳への抗体投与を容易にするので、特に有利である。これらのアプローチ、並びに関連する方法及び組成物が、次の通りに、更に説明される。
【０１２１】
［キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）］
ここに記載の技術は、免疫療法で使用するための改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。次では、ＣＡＲと様々な改善を検討する。
【０１２２】
ここで使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲｓ」という用語は、リガンド又は抗原特異性をＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞又はその組み合わせ）に移植する操作されたＴ細胞受容体を意味する。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としてもまた知られている。
【０１２３】
ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体分子の膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含むコンストラクトに、Ｔ細胞応答の標的となる細胞の表面に発現される標的、例えばポリペプチドに特異的に結合するキメラ細胞外標的結合ドメインを配する。一実施態様では、キメラ細胞外標的結合ドメインは、Ｔ細胞応答の標的となる細胞上に発現される抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの特性は、当該技術分野において知られ、ここに開示されるように変化しうるが、キメラ標的／抗原結合ドメインは、キメラ標的／抗原結合ドメインが標的細胞の表面上の標的／抗原に結合する場合、受容体をシグナル伝達活性化に対して感受性にする。
【０１２４】
細胞内シグナル伝達ドメインに関し、いわゆる「第一世代」ＣＡＲには、抗原結合時にＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナルのみを提供するものが含まれる。いわゆる「第二世代」ＣＡＲには、共刺激（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ１３７）と活性化（ＣＤ３ζ）ドメインの両方を提供するものが含まれ、いわゆる「第三世代」ＣＡＲには、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）ドメインと活性化ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を提供するものが含まれる。様々な実施態様では、ＣＡＲは、標的／抗原に対して高い親和性又は結合活性を有するように選択され−例えば、抗体由来の標的又は抗原結合ドメインは、天然に生じるＴ細胞受容体よりも一般に標的抗原に対して高い親和性及び／又は結合活性を有する。この特性は、抗体に対して選択できる高い特異性と相まって、ＣＡＲ Ｔ細胞による高度の特異的なＴ細胞ターゲティングを提供する。
【０１２５】
ここで使用される場合、「ＣＡＲ Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ−Ｔ」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味する。Ｔ細胞で発現されると、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性と反応性を、ＭＨＣ非拘束の形で選択された標的に向けてリダイレクトし、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用する能力を有する。ＭＨＣ非拘束の抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングとは独立して抗原を認識する能力を与え、腫瘍エスケープの主要機序を迂回する。
【０１２６】
ここで使用される場合、「細胞外標的結合ドメイン」という用語は、標的への結合を促進するのに十分な、細胞の外側に見出されるポリペプチドを意味する。細胞外標的結合ドメインは、その結合パートナー、すなわち標的に特異的に結合する。非限定的な例として、細胞外標的結合ドメインは、抗体又は抗体試薬の抗原結合ドメイン、又は同族結合パートナータンパク質を認識して結合するリガンドを含みうる。この文脈において、リガンドは、タンパク質及び／又は受容体の一部に特異的に結合する分子である。ここに記載される方法及び組成物において有用なリガンドの同族結合パートナーは、一般に、細胞の表面に見出されうる。リガンド：同族パートナー結合は、リガンドを持つ受容体の変化をもたらし、又は生理学的応答、例えば、シグナル伝達経路の活性化を活性化しうる。一実施態様では、リガンドはゲノムに対して非天然でありうる。場合によっては、リガンドは、少なくとも二種にわたって保存された機能を有する。
【０１２７】
［抗体試薬］
様々な実施態様では、ここに記載のＣＡＲは、細胞外標的結合ドメインとして抗体試薬又はその抗原結合ドメインを含む。
【０１２８】
ここで使用される場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも一の免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを意味する。抗体試薬は、抗体又は抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含みうる。態様の何れかの幾つかの実施態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含みうる。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（ここではＶＨと略される）と、軽（Ｌ）鎖可変領域（ここではＶＬと略される）を含みうる。別の例では、抗体は、二つの重（Ｈ）鎖可変領域と二つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ及びｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、及びドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（例えば、de Wildt等, Eur. J. Immunol. 26(3):629-639, 1996を参照のこと；これは出典明示によりその全体がここに援用される））並びに完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ（並びにそれらのサブタイプと組み合わせ）の構造的特徴を有しうる。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）及び霊長類化抗体を含む、任意の供給源由来でありうる。抗体にはまたミディボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含まれる。完全ヒト抗体結合ドメインは、例えば、当業者に知られた方法を使用して、ファージディスプレイライブラリーから選択することができる。更に、抗体試薬には、カメリド抗体などの単一ドメイン抗体が含まれる。
【０１２９】
ＶＨ及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれるより保存された領域が散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性領域に更に分割されうる。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Kabat, E. A.等 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242，及びChothia等, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987を参照のこと；これらのそれぞれは、出典明示によりその全体がここに援用される）。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて次の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０１３０】
一実施態様では、抗体又は抗体試薬はヒト抗体又は抗体試薬ではない（すなわち、抗体又は抗体試薬はマウスである）が、ヒト化されている。「ヒト化抗体又は抗体試薬」とは、タンパク質配列レベルで修飾されて、ヒトにおいて天然に産生される抗体又は抗体試薬バリアントとのその類似性を高める非ヒト抗体又は抗体試薬を意味する。抗体をヒト化する一つのアプローチは、マウス又は他の非ヒトＣＤＲをヒト抗体フレームワークに移植することを採用している。
【０１３１】
一実施態様では、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインは、可動性リンカーペプチドを介して、抗体、一般的にはモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬドメインを融合することにより作製される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含むか、又は本質的にそれからなる。様々な実施態様では、ｓｃＦｖは、膜貫通ドメイン及びＴ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載されるような操作された細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。別の実施態様では、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインはカメリド抗体を含む。
【０１３２】
抗体結合ドメイン及びそれらを選択しクローニングする方法は、当業者によく知られている。幾つかの実施態様では、抗体試薬は、抗ＧＡＲＰ抗体試薬であり、配列番号：３又は２５の配列を含むか、あるいは配列番号：３又は２５の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。更なる実施態様では、抗体試薬は、抗ＧＡＲＰ抗体試薬であり、配列番号：８１、８２、８３、８４、８５、及び／又は８６の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、あるいは配列番号：８１、８２、８３、８４、８５、及び／又は８６の少なくとも１、２、又は３のアミノ酸置換を持つＣＤＲ配列を含む。更なる実施態様では、抗ＧＡＲＰ抗体試薬は、配列番号：８７及び８８の可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）を含むか、あるいは配列番号：８７及び８８の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む。ＶＨはＶＬのＮ末端に配置されうるか、又はＶＬはＶＨのＮ末端に配置されうる。更なる実施態様では、抗ＧＡＲＰ抗体試薬は、配列番号：７１又は７７の配列を含むか、あるいは配列番号：７１又は７７の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。
【０１３３】
他の実施態様では、抗体試薬は、抗ＬＡＰ抗体試薬であり、配列番号：８９、９０、９１、９２、９３、及び／又は９４の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、あるいは配列番号：８９、９０、９１、９２、９３、及び／又は９４の少なくとも１、２、又は３のアミノ酸置換を持つＣＤＲ配列を含む。更なる実施態様では、抗ＬＡＰ抗体試薬は、配列番号：９５及び９６のＶＨ及び／又はＶＬを含むか、あるいは配列番号：８７及び８８の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む。ＶＨはＶＬのＮ末端に配置されうるか、又はＶＬはＶＨのＮ末端に配置されうる。更なる実施態様では、抗体試薬は抗ＬＡＰ抗体試薬であり、配列番号：９又は１５の配列を含むか、あるいは配列番号：９又は１５の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。他の実施態様では、抗体試薬は、抗ＥＧＦＲ又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体試薬であり、配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５５、５７、６５、又は１０３の配列を含むか、あるいは配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５５、５７、６５、又は１０３の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。
【０１３４】
特定の実施態様では、抗体試薬は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖである。例えば、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖは、配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列を含み；又は配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列に対応するＶＨを含む。更なる実施態様では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦＶは、配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列を含み；又は配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列に対応するＶＬを含む。幾つかの実施態様では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖは、配列番号：２７、３６、４５、５７、６５、又は１０３の配列に対応し；配列番号：２７、３６、４５、５７、６５、又は１０３の配列を含み、あるいは配列番号：２７、３６、４５、５７、６５、又は１０３の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖを含む細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを含む免疫細胞は、以下に記載されるように抗ＥＧＦＲ ＢｉＴＥを分泌しうる。
【０１３５】
他の実施態様では、抗体試薬は、抗ＣＤ１９抗体試薬であり、配列番号：５１又は６３の配列を含むか、あるいは配列番号：５１又は６３の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。
【０１３６】
更に他の実施態様では、抗体試薬は、抗ＣＤ３抗体試薬であり、配列番号：３４、４３、５２、５６、又は６４の配列を含むか、あるいは配列番号：３４、４３、５２、５６、又は６４の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。様々な例では、抗体試薬は、Ｃ２２５、３Ｃ１０、セツキシマブ、及び２１７３から選択されうる。ここに記載されている任意の抗体試薬は、ＣＡＲの抗原結合ドメインとして、又は治療剤として有用でありうる。
【０１３７】
一実施態様では、ここに記載の技術において有用なＣＡＲは、少なくとも二つの抗原特異的標的領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。そのような実施態様では、二つ以上の抗原特異的標的化領域は、少なくとも二つの異なる抗原を標的とし、タンデムに配置され、リンカー配列によって分離されうる。別の実施態様では、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。二重特異性ＣＡＲは二つの異なる抗原に特異的である。
【０１３８】
例えば、二重特異性ＣＡＲは、ＩＬ−１３Ｒα２とＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするタンデムＣＡＲでありうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ−１３Ｒα２結合配列は、抗ＩＬ−１３Ｒα２抗体試薬、例えばｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体（例えばカメリド）を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ−１３Ｒα２結合配列は、ＩＬ−１３Ｒα２リガンド又はその抗原結合断片、例えば、ＩＬ−１３又はＩＬ−１３ゼータカインを含みうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ−１３ゼータカインは、配列番号：１０１の配列に対応し、又は配列番号：１０１の配列を含み、又は配列番号：１０１の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施態様では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合部位は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖを含みうる。幾つかの実施態様では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖは、配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、配列番号：１１１又は１１３の配列に対応するＶＨを含む。幾つかの実施態様では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖは、配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、配列番号：１１２又は１１４の配列に対応するＶＬを含む。ＶＨはＶＬのＮ末端に配置され得、又はＶＬはＶＨのＮ末端に配置されうる。幾つかの実施態様では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖは、配列番号：２７、３６、４５、５７、６５、又は１０３の配列に対応するか、又は配列番号：２７、３６、４５、５７、６５又は１０３の配列を含み、あるいは配列番号：２７、３６、４５、５７、６５又は１０３の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。ＩＬ−１３Ｒα２結合配列は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合配列のＮ末端に配置され得、又はＥＧＦＲｖＩＩＩ結合配列はＩＬ−１３Ｒα２のＮ末端に配置されうる。ＩＬ−１３Ｒα２結合配列とＥＧＦＲｖＩＩＩ結合配列は、場合によっては、例えば配列番号：１０２のリンカー、並びにここに記載されているか又は当該技術分野で知られている任意の他のリンカーを介して連結されうる。
【０１３９】
［標的／抗原］
任意の細胞表面部分がＣＡＲによって標的化されうる。しばしば、標的は、Ｔ細胞応答に対して標的とすることを望む細胞上で差次的に又は優先的に発現されうる細胞表面ポリペプチドである。Ｔｒｅｇを標的とするためには、抗体試薬は、例えば反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、及びＬＡＧ−３を標的とすることができる。腫瘍又はがん細胞を標的とするために、抗体ドメインは、ここに記載されるように、例えば、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩを標的化されうる。腫瘍に特異的な腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原を標的とするには、非腫瘍細胞又は組織への付随的損傷を回避又は少なくとも制限しながら、腫瘍細胞を標的にする手段を提供しうる。追加の腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、又は他の目的の抗原の非限定的な例には、ＣＤ１９、ＣＤ３７、ＢＣＭＡ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７））；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６０８；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１８３．２及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１９２．２））、ＣＥＡ、未熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＭＵＣ１、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＩＬ−１５、ＩＬ１３Ｒａ２、及びＣＳＦ１Ｒが含まれる。
【０１４０】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲの標的／抗原はＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６である。他の実施態様では、ＣＡＲの標的／抗原は、ＬＡＰ又はＧＡＲＰである。更なる実施態様では、ＣＡＲは、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６の二つに結合する二重特異性ＣＡＲである。
【０１４１】
［ヒンジ及び膜貫通ドメイン］
ここに記載される各ＣＡＲは、細胞外標的結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合する膜貫通ドメイン、例えば、ヒンジ／膜貫通ドメインを含む。
【０１４２】
ＣＡＲの結合ドメインの後には場合によっては一又は複数の「ヒンジドメイン」が続き、これが、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離れて位置させて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合及び活性化を可能にする役割を果たす。ＣＡＲは、場合によっては結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に一又は複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、又は組換え源の何れかに由来しうる。ヒンジドメインは、天然に生じる免疫グロブリンヒンジ領域又は改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含みうる。ここに記載のＣＡＲでの使用に適した例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α）、ＣＤ４、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これらはこれら分子からの野生型ヒンジ領域でありうるか又は改変されうる。幾つかの実施態様では、ヒンジ領域は、免疫グロブリン様タンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）、ＣＤ２８、又はＣＤ８のヒンジ領域に由来する。一実施態様では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０１４３】
ここで使用される場合、「膜貫通ドメイン」（ＴＭドメイン）とは、細胞外結合部分を、場合によってはヒンジドメインを介して、細胞内部分（例えば、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン）に融合させ、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の原形質膜に固定させるＣＡＲの部分を指す。膜貫通ドメインは、細胞の原形質膜を通過するＣＡＲの一般的に疎水性の領域である。ＴＭドメインは、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質又は他の膜貫通タンパク質）、人工疎水性配列、又はそれらの組み合わせの膜貫通領域又はその断片でありうる。特定の例がここに提供され、実施例において使用されるが、他の膜貫通ドメインは当業者には明らかであり、技術の代替の実施態様に関連して使用されうる。選択された膜貫通領域又はその断片は、ＣＡＲの意図された機能を妨害しないことが好ましい。タンパク質又はポリペプチドの膜貫通ドメインに関連して使用される場合、「その断片」は、タンパク質を細胞表面に固定し又は付着させるのに十分な膜貫通ドメインの一部を意味する。
【０１４４】
幾つかの例では、ここに記載のＣＡＲの膜貫通ドメイン又はその断片は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Tactile）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。
【０１４５】
ここで使用される場合、「ヒンジ／膜貫通ドメイン」とは、ヒンジドメインと膜貫通ドメインの両方を含むドメインを意味する。例えば、ヒンジ／膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ７、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインに由来しうる。一実施態様では、ＣＡＲ又はその断片のヒンジ／膜貫通ドメインは、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通ドメイン（例えば、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、１０４、又はそれらのバリアントの何れか一）に由来するか、又はそれを含む。
【０１４６】
ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞表面に優先的に見出される抗原である。ＣＤ８は免疫系内の細胞間相互作用を媒介し、Ｔ細胞の共受容体として作用する。ＣＤ８は、アルファ（ＣＤ８α又はＣＤ８ａ）及びベータ（ＣＤ８β又はＣＤ８ｂ）鎖からなる。ＣＤ８ａ配列は、多くの種、例えば、ヒトＣＤ８ａ（ＮＣＢＩ遺伝子番号：９２５）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３９３４５．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００００２．１２）に対して知られている。ＣＤ８は、天然に生じるバリアント、分子、及びその対立遺伝子を含む、ヒトＣＤ８を意味しうる。態様の何れかの幾つかの実施態様において、例えば、獣医学的用途では、ＣＤ８は、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどのＣＤ８を意味しうる。ヒトＣＤ８のホモログ及び／又はオルソログは、例えばＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＣＤ８配列に類似する配列について所与の種の利用可能な配列データを検索することにより、当業者によってそのような種について容易に同定される。
【０１４７】
幾つかの実施態様では、ＣＤ８ヒンジと膜貫通配列は、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、又は１０４のアミノ酸配列に対応し；あるいは配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、又は１０４の配列を含み；あるいは配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、又は１０４の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を持つ配列を含む。
【０１４８】
［共刺激ドメイン］
ここに記載の各ＣＡＲは、場合によっては、一又は複数の共刺激分子の細胞内ドメイン又は共刺激ドメインを含む。ここで使用される場合、「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを意味する。共刺激分子は、抗原に結合するとＴリンパ球の効率的な活性化と機能に必要とされる第二のシグナルを提供する抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。共刺激ドメインは、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ４０の共刺激ドメインでありうる。一例では、４−１ＢＢ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を使用することができる（例えば、以下及び配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、１０５、又はそれらのバリアントを参照）。そのような共刺激分子の追加の例示的な例には、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が含まれる。一実施態様では、細胞内ドメインは、４−１ＢＢの細胞内ドメインである。４−１ＢＢ（ＣＤ１３７；ＴＮＦＲＳ９）は、活性化によって誘導される共刺激分子であり、免疫応答の重要な調節因子である。
【０１４９】
４−１ＢＢは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである、ＣＤ１３７としても知られる膜受容体タンパク質である。４−１ＢＢは活性化Ｔリンパ球に発現される。４−１ＢＢ配列は、多くの種に対して知られており、例えば、ＴＮＦＲＳＦ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号：３６０４）及びｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１５６１．５）としても知られている例えばヒト４−１ＢＢである。４−１ＢＢは、天然に生じるバリアント、分子、及びそれらの対立遺伝子を含む、ヒト４−１ＢＢを指しうる。態様の何れかの幾つかの実施態様において、例えば、獣医学的用途では、４−１ＢＢは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の４−１ＢＢを指しうる。ヒト４−１ＢＢのホモログ及び／又はオルソログは、例えばＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照４−１ＢＢ配列に類似する配列について所与の種の利用可能な配列データを検索することにより、当業者によってそのような種について容易に同定される。
【０１５０】
幾つかの実施態様では、細胞内ドメインは４−１ＢＢの細胞内ドメインである。一実施態様では、４−１ＢＢ細胞内ドメインは、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、又は１０５から選択されるアミノ酸配列に対応し；あるいは配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、又は１０５から選択された配列を含み；あるいは配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、又は１０５から選択される配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を含む。
【０１５１】
［細胞内シグナル伝達ドメイン］
ここに記載されるＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への効果的なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば活性化、サイトカイン産生、増殖及び細胞傷害性活性、例えばＣＡＲに結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出、又は細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合後に誘発される他の細胞応答を誘発することに関与するＣＡＲポリペプチドの部分を意味する。様々な例では、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来する（例えば、以下を参照）。当該技術において特に有用である免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインの更なる非限定的な例には、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ｑ、ＣＤ３δ、ＣＤ３η、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。
【０１５２】
ＣＤ３は、適切な共刺激（例えば、共刺激分子の結合）と同時にエンゲージされると、Ｔリンパ球活性化を促進するＴ細胞共受容体である。ＣＤ３複合体は４つの異なる鎖からなり；哺乳動物ＣＤ３は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖からなる。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られている分子及びＣＤ３ζと会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。完全ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ、ＣＤ３ζ、及び完全ＣＤ３複合体を含む。
【０１５３】
何れかの態様の幾つかの実施態様では、ここに記載のＣＡＲポリペプチドは、例えばＩＴＡＭ変異ＣＤ３ζ、ＣＤ３η、又はＣＤ３θなどのＣＤ３ζのバリアントを含む、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）由来の免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。何れかの態様の幾つかの実施態様では、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭ（ＩＴＡＭ３）の３つのモチーフを含む。何れかの態様の幾つかの実施態様では、ＣＤ３ζのＩＴＡＭの３つのモチーフは変異しておらず、従って、天然又は野生型の配列を含む。幾つかの実施態様では、ＣＤ３ζ配列は、ここに提供された配列に記載されているＣＤ３ζの配列、例えば、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、１０６、又はそれらのバリアントの一つのＣＤ３ζ配列を含む。
【０１５４】
例えば、ここに記載されるＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施態様では、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、又は１０６から選択されるアミノ酸配列に対応し；あるいは配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、又は１０６から選択された配列を含み；あるいは配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、又は１０６から選択される配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を持つ配列を含む。
【０１５５】
ここに記載される個々のＣＡＲ及び他のコンストラクト成分は、当業者によって決定されうるように、互いに一緒に使用され得、ここに記載される様々なコンストラクトに入れ替えられうる。これらの成分のそれぞれは、ここに記載された対応する配列の何れか、又はそれらのバリアントを含みうるか、又はそれらからなりうる。
【０１５６】
ＣＡＲ及びＣＡＲ Ｔ細胞のより詳細な説明は、Maus等, Blood 123:2624-2635, 2014；Reardon等, Neuro-Oncology 16:1441-1458, 2014；Hoyos等, Haematologica 97:1622, 2012；Byrd等, J. Clin. Oncol. 32:3039-3047, 2014；Maher等, Cancer Res 69:4559-4562, 2009；及びTamada等, Clin. Cancer Res. 18:6436-6445, 2012に見出すことができ；これらの各々は、その全体が出典明示によりここに援用される。
【０１５７】
幾つかの実施態様では、ここに記載されるＣＡＲポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、細胞外ドメインを有するか、又は分泌される任意のタンパク質に由来しうる。ここに記載されるＣＡＲポリペプチドは、当該技術分野で知られている任意のシグナルペプチドを含みうる。幾つかの実施態様では、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ８シグナルペプチド、例えば、配列番号：２、８、１４、２０、７０、又は７６のアミノ酸配列に対応し、あるいは配列番号：２、８、１４、２０、７０、又は７６のアミノ酸配列を含み、あるいは配列番号：２、８、１４、２０、７０、又は７６の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＤ８シグナルペプチドを含む。
【０１５８】
更なる実施態様では、ここに記載のＣＡＲポリペプチドは、ここに記載のシグナルペプチドの一つ、例えば配列番号：２、８、１４、２０、７０、又は７６のＣＤ８シグナルペプチド又は配列番号：３２、４１、５０、５４、又は６２のＩｇκシグナルペプチドを場合によっては除外しうる。
【０１５９】
一実施態様では、ＣＡＲは、リンカードメインを更に含む。ここで使用される場合、「リンカードメイン」とは、ここに記載のＣＡＲのドメイン／領域の何れかを互いに連結する、約２から１００アミノ酸長のオリゴ又はポリペプチド領域を意味する。幾つかの実施態様では、リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に移動できるように、グリシン及びセリンなどの可動性残基を含むか、又はそれらから構成されうる。本発明に有用なリンカー配列は、２から１００アミノ酸長、５から５０アミノ酸長、１０から１５アミノ酸長、１５から２０アミノ酸長、又は１８から２０アミノ酸長であり得、当該分野で知られている任意の適切なリンカーを含む。例えば、本発明に有用なリンカー配列は、限定されないが、グリシン／セリンリンカー、例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号：１０７）及びＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）リンカー、例えば（Ｇ４Ｓ）３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１０８））及び（Ｇ４Ｓ）４（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１０２））；その内容がその全体において出典明示によりここに援用されるWhitlow等, Protein Eng. 6(8):989-95, 1993によって記載されているＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号：１０９）のリンカー配列；その内容がその全体において出典明示によりここに援用されるAndris-Widhopf等, Cold Spring Harb. Protoc. 2011(9), 2011によって記載されているＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：１１０）のリンカー配列；並びにその内容がその全体において出典明示によりここに援用されるSblattero等, Nat. Biotechnol. 18(1):75-80, 2000によって記載されている、例えば、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ組換え部位を含むコード化配列又はエピトープタグのような、機能性が追加されたリンカー配列を含む。二つの隣接ドメインが互いに立体的に干渉しないようにすることが望ましい場合は、より長いリンカーが使用されうる。
【０１６０】
更に、リンカーは、切断可能又は切断不可能でありうる。切断可能なリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｐ２Ａ及びＴ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はそれらの機能的等価物及びそれらの組み合わせが含まれる。例えば、Ｐ２Ａリンカー配列は、配列番号：３１、４０、又は４９のアミノ酸配列に対応しうる。様々な例では、ここに記載されている配列を持つリンカー又はそのバリアントが使用される。特定の位置のコンストラクトにおける特定のリンカーの表示は、そのリンカーのみがそこで使用できることを意味しないことを理解されたい。むしろ、当業者により決定されうるように、異なるリンカー配列（例えば、Ｐ２Ａ及びＴ２Ａ）は、（例えば、本発明のコンストラクトの文脈において）互いに交換されうる。一実施態様では、リンカー領域は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスに由来するＴ２Ａである。この技術において使用されうるリンカーの非限定的な例には、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、及びＢｍＩＦＶ２Ａが含まれる。これらのようなリンカーは、以下に記載されるもののようなポリタンパク質の文脈で使用することができる。例えば、それらは、ポリタンパク質のＣＡＲ成分をポリタンパク質の治療剤（例えば、抗体、例えばｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、カメリド抗体）、又は二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ））成分から分離するために使用されうる（下記参照）。
【０１６１】
幾つかの実施態様では、ここに記載されるＣＡＲは、場合によっては、例えば、非侵襲的画像化（例えば、陽電子放射断層撮影ＰＥＴスキャン）を可能にするために、レポーター分子を更に含む。レポーター分子を含む二重特異性ＣＡＲでは、第一細胞外結合ドメインと第二細胞外結合ドメインは、異なる又は同じレポーター分子を含みうる。二重特異性ＣＡＲ Ｔ細胞では、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲは異なる又は同じレポーター分子を発現しうる。別の実施態様では、ここに記載されるＣＡＲは、単独で又は基質もしくは化学物質（例えば、９−［４−［１８Ｆ］フルオロ−３］−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン（［１８Ｆ］ＦＨＢＧ））と組み合わせて画像化されうるレポーター分子（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ））を更に含む。別の実施態様では、ここに記載されるＣＡＲは、非侵襲的技術（例えば、６４Ｃｕ２＋で機能化された金ナノ粒子（ＧＮＰ））を使用して容易に画像化できるナノ粒子を更に含む。非侵襲的イメージングのためのＣＡＲ Ｔ細胞の標識は、例えば、出典明示によりその全体がここに援用されるBhatnagar等, Integr. Biol. (Camb). 5(1):231-238, 2013、及びKeu等, Sci. Transl. Med. 18; 9(373), 2017に概説されている。
【０１６２】
ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙは、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）上で発現されたＣＡＲを画像化するために有用な蛍光タグとしてここで実証される。当該技術分野で知られている本質的に如何なる蛍光タンパク質も、この目的のための蛍光タグとして使用することができることが期待される。臨床応用では、ＣＡＲに蛍光タグや蛍光タンパク質を含める必要はない。従って、ここに提供される特定のコンストラクトのそれぞれの例では、コンストラクト中に存在する任意のマーカーを除去することができる。本発明は、マーカーを伴うか又は伴わないコンストラクトを含む。従って、特定のコンストラクトがここで参照される場合、マーカー又はタグ（例えば、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号：９７）のヒスチジンタグなどのヒスチジンタグを含む）の有無にかかわらず、本発明に含まれると考えることができる。
【０１６３】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲポリペプチド配列は、場合によってはここに記載のＣＤ８シグナルペプチドを除外する、配列番号：１、７、１３、６９、７５、１００、１１５、１１６、又は１１７から選択される配列、又は配列番号：２１−２４、２７−３０、３６−３９、４５−４８、５７−６０、６５−６８、７１−７４、７７−８０、又は１０１−１０６の組合せに対応し、これらを含み、又はこれらの配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上の配列同一性を持つ配列を含む。当業者によって決定されうるように、これらのＣＡＲの様々な機能的に類似し又は均等の成分は、互いに、並びに当該技術分野において知られ又はここに列挙された他の類似の又は機能的に均等の成分と、交換又は置換されうる。
【０１６４】
［ＣＡＲ Ｔ細胞によって送達される治療剤］
上記のように、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、場合によっては、治療剤、例えば、抗体試薬又は他の治療分子、例えばサイトカインを腫瘍（すなわち、腫瘍微小環境）に送達するために使用されうる。様々な実施態様では、治療剤は、ＣＡＲと同じ核酸分子によってコードされ、従って、ＣＡＲと治療剤、例えば、抗体試薬又はサイトカインの両方を発現するように、細胞（例えば、Ｔ細胞）の形質導入を促進する。そのような例では、治療剤（例えば、抗体試薬又はサイトカイン）は、例えば、切断可能なリンカー配列（例えば、２Ａリンカー、例えば、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａ；上記参照）によってＣＡＲ（及び場合によっては他のタンパク質、例えばマーカー）から分離されるように発現されうる。治療剤（例えば、抗体試薬又はサイトカイン）は、ＣＡＲと同じプロモーターの制御下で（例えば、ＥＦ１αプロモーターにより）発現させることができ、構成的に発現させることができる。他の例では、治療剤（例えば、抗体試薬又はサイトカイン）は、誘導性プロモーター、例えば、Ｔ細胞活性化時に発現されるプロモーター（例えば、ＮＦＡＴプロモーター）の制御下で発現される。そのような誘導性プロモーターは、例えば、Ｔ細胞活性化時にのみ、よって、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞が、そこでの抗体産生の限定が有利でありうる腫瘍微小環境内にある場合にのみ、抗体が発現されることを確実にするために使用されうる。当該技術分野において理解されているように、ＣＡＲコード配列は、本発明内の様々なベクターデザインにおいて治療剤（例えば、抗体試薬又はサイトカイン）コード配列に対して５’又は３’でありうる。幾つかの実施態様では、治療薬はＩｇκシグナルペプチド、例えば、配列番号：３２、４１、５０、５４、又は６２のアミノ酸配列に対応するか、又は配列番号：３２、４１、５０、５４、又は６２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号：３２、４１、５０、５４、６２、又は６２の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩｇκシグナルペプチドを含む。
【０１６５】
様々な例では、治療剤は抗体試薬である。（例えば、ＣＡＲと同じ核酸分子から）ＣＡＲ Ｔ細胞内で発現される抗体試薬は、ここに記載される、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（例えば、カメリド）でありうる。単鎖抗体の場合、軽鎖（Ｌ）と重鎖（Ｈ）はＬ−Ｈ又はＨ−Ｌの順（Ｎ末端からＣ末端）であり得、場合によってはリンカー（例えば、グリシン系リンカー）によって互いに分離されうる。更なる例では、抗体試薬は、例えば、以下に記載される二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む二重特異性抗体である。
【０１６６】
抗体試薬は、例えば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＩＬ−１５、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＳＦ１Ｒなどの腫瘍抗原を標的としうる。例えば、抗体試薬は、抗ＥＧＦＲ又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体試薬であり、配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５５、５７、又は６５の配列を含むか、あるいは配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５５、５７、又は６５の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。別の例では、抗体試薬は、抗ＣＤ１９抗体試薬であり、配列番号：５１又は６３の配列を含むか、あるいは配列番号：５１又は６３の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。別の例では、抗体試薬は、抗ＣＤ３抗体試薬であり、配列番号：３４、４３、５２、５６、又は６４の配列を含むか、あるいは配列番号：３４、４３、５２、５６、又は６４の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。様々な他の例では、抗体試薬は、Ｃ２２５、３Ｃ１０、セツキシマブ、又は２１７３、又はその抗原結合断片を含みうる。
【０１６７】
他の例では、抗体試薬は、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰなどのＴｒｅｇ抗原を標的としうる。例えば、抗体試薬は、抗ＧＡＲＰ抗体試薬であり、配列番号：３又は２５の配列を含むか、あるいは配列番号：３又は２５の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。更なる実施態様では、抗体試薬は、抗ＧＡＲＰ抗体試薬であり、配列番号：８１、８２、８３、８４、８５、及び／又は８６の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、あるいは配列番号：８１、８２、８３、８４、８５、及び／又は８６の少なくとも１、２、又は３のアミノ酸置換を持つＣＤＲ配列を含む。更なる実施態様では、抗ＧＡＲＰ抗体試薬は、配列番号：８７及び８８のＶＨ及び／又はＶＬを含むか、あるいは配列番号：８７及び８８の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む。ＶＨはＶＬのＮ末端に位置され得、又はＶＬはＶＨのＮ末端に位置されうる。更なる実施態様では、抗ＧＡＲＰ抗体試薬は、配列番号：７１又は７７の配列を含むか、あるいは配列番号：７１又は７７の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。別の例では、抗体試薬は、抗ＬＡＰ抗体試薬であり、配列番号：８９、９０、９１、９２、９３、及び／又は９４の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、あるいは配列番号：８９、９０、９１、９２、９３、及び／又は９４の少なくとも１、２、又は３のアミノ酸置換を持つＣＤＲ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗ＬＡＰ抗体試薬は、配列番号：９５及び９６のＶＨ及び／又はＶＬを含むか、あるいは配列番号：８７及び８８の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む。ＶＨはＶＬのＮ末端に位置され得、又はＶＬはＶＨのＮ末端に位置されうる。更なる実施態様では、抗体試薬は、抗ＬＡＰ抗体試薬であり、配列番号：９又は１５の配列を含むか、あるいは配列番号：９又は１５の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。更なる例において、抗体試薬は、ダクリズマブ又はその抗原結合断片を含みうる。
【０１６８】
抗体試薬は、ここに記載され、又は当該技術分野において知られている任意の他の抗原を標的とすることもまたできる。ここに記載されるように、抗体試薬を任意選択的に送達することに加えて、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、限定されないが、サイトカイン及び毒素を含む他の治療剤を送達するために使用されうる。
【０１６９】
［二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）］
幾つかの実施態様では、ここに記載されるＣＡＲ Ｔ細胞によって送達される治療剤は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。そのような分子は、Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ３に結合することにより）並びに標的抗原、例えば、腫瘍抗原に結合することにより、Ｔ細胞を標的としうる。例示的な腫瘍抗原には、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６が含まれる（上記もまた参照）。ＢｉＴＥは、例えば腫瘍微小環境におけるＴ細胞応答を増強するために使用できる。ＢｉＴＥの二成分は、場合によってはここに記載されるリンカー（例えば、グリシン系リンカー）によって互いに分離され得、何れかの方向で、例えば、抗標的抗原成分に抗ＣＤ３成分のＮ末端が、又はその逆で、また連結されうる。ＢｉＴＥの抗ＣＤ３成分又は抗標的抗原成分は、ここに記載される抗体試薬の何れかを含みうる。
【０１７０】
ＣＡＲ Ｔ細胞が分泌するＢｉＴＥは、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞自体を刺激するか、腫瘍に対して非特異的バイスタンダーＴ細胞をリダイレクトすることによりパラクリン様式で作用し、従ってＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法の抗腫瘍効果を増強する。ＣＡＲ Ｔ細胞が媒介するＢｉＴＥ分泌は、ＢｉＴＥ分泌を腫瘍微小環境に方向付けることにより、全身組織における望ましくないＢｉＴＥ活性のリスクを低減させうる。例示的なＢｉＴＥコンストラクトを以下に提供する；しかし、ここに記載のもの以外のＢｉＴＥもまた本発明に対して有用でありうる。
【０１７１】
ここに記載の本発明に有用な例示的なＢｉＴＥには、例えば、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖと抗ＣＤ３ｓｃＦｖを含む抗ＥＧＦＲ ＢｉＴＥ（ここではＢｉＴＥ−ＥＧＦＲとも呼ばれる）が含まれる。抗ＥＧＦＲｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ配向、又はＶＬ−ＶＨ配向で配置されうる。特定の実施態様では、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖは、配列番号：３３、４２、又は５５のアミノ酸配列に対応するか、あるいは配列番号：３３、４２、又は５５のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：３３、４２、又は５５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７２】
別の例示的なＢｉＴＥは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ｓｃＦｖを含む抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（ここではＢｉＴＥ−ＣＤ１９とも呼ばれる）である。抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ配向、又はＶＬ−ＶＨ配向で配置されうる。所定の実施態様では、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、配列番号：５１又は６３のアミノ酸配列に対応するか、あるいは配列番号：５１又は６３のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：５１又は６３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７３】
幾つかの実施態様では、ここに記載されているＢｉＴＥの何れかの抗ＣＤ３ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ方向に又はＶＬ−ＶＨ方向に配置され得、場合によっては配列番号：３４、４３、５２、５６、又は６４のアミノ酸配列に対応し得、あるいは配列番号：３４、４３、５２、５６、又は６４のアミノ酸配列を含み、あるいは配列番号：３４、４３、５２、５６、又は６４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７４】
ここに記載の抗ＥＧＦＲ ＢｉＴＥは、配列番号：９８のアミノ酸配列に対応するか、あるいは配列番号：９８のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：９８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ここに記載の抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥは、配列番号：９９のアミノ酸配列に対応するか、あるいは配列番号：９９のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：９９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
場合によっては、ＢｉＴＥは、ここに記載されるシグナルペプチド、例えばＩｇκシグナルペプチド、例えば、配列番号：３２、４１、５０、５４、又は６２のアミノ酸配列に対応するか、又は配列番号：３２、４１、５０、５４、又は６２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号：３２、４１、５０、５４、又は６２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩｇκシグナルペプチドを含みうる。
【０１７６】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲと治療剤薬を含むポリタンパク質及び／又はポリタンパク質をコードする核酸を含む。所定の実施態様では、ＣＡＲと治療剤を含むポリタンパク質配列は、配列番号：１９、２６、３５、４４、５３、及び６１から選択される配列に対応し、又はその配列を含み、又はその配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を持つ配列を含む。
【０１７７】
ここに記載された、ＣＡＲと関連するコンストラクト（又はそのバリアント）の他の成分、例えばＩｇκシグナル配列（例えば、配列番号：３２、４１、５０、５４、６２、又はそれらのバリアント）、ＣＤ８シグナル配列（例えば、配列番号：２、８、１４、２０、７０、７６、又はそれらのバリアント）、及び関連する配列は、当業者に明らかなように、本発明のコンストラクトを作製する際に使用するために選択されうる。
【０１７８】
［ＣＡＲをコードする核酸］
ここに記載される（ｉ）（例えば、配列番号：１、７、１３、６９、７５、又は１００の）ＣＡＲポリペプチド又は（ｉｉ）（例えば、配列番号：１９、２６、３５、４４、５３、又は６１の）ＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質をコードする核酸コンストラクト及びベクターがまた提供される。様々な例では、本発明は、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞において発現される複数のタンパク質の別個のコード配列をそれぞれ含むコンストラクトを提供する。これらの別個のコード配列は、ここに記載されるように、切断可能なリンカー配列によって互いに分離されうる。例えば、ウイルス２Ａタンパク質（例えば、Ｔ２Ａ及びＰ２Ａ）をコードする配列は、別個の遺伝子間に配置され得、転写されると、生成されたポリタンパク質の切断を指示しうる。上記のように、本発明のコンストラクト及びベクターは、配列の多くの異なる組み合わせの何れかを含みうる。例えば、本発明のコンストラクト又はベクターは、ここに記載の一つのＣＡＲをコードする配列を、場合によってはここに記載される治療剤（例えば、抗体試薬（例えば、単鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、カメリド）、又は二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ））又はサイトカイン）と組合せて、含みうる。
【０１７９】
ここに記載のＣＡＲ Ｔ細胞におけるタンパク質の効率的な発現は、タンパク質をコードする核酸のｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又は遺伝子産物を検出する標準的なアッセイを使用して評価することができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織化学を使用することができる。ここに記載されるタンパク質は、構成的に発現されるか、又は誘導的に発現されうる。幾つかの例では、タンパク質は組換え核酸配列によってコードされる。例えば、本発明は、ＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチド配列（ここで、ＣＡＲは、例えば、腫瘍抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に結合する抗原結合配列を含む細胞外ドメインを含む）と、場合によっては、治療剤（例えば、抗体試薬（例えば、単鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、カメリド）、又は二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ））又はサイトカイン）をコードする第二ポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【０１８０】
幾つかの実施態様では、第一ポリヌクレオチド配列と第二ポリヌクレオチド配列はそれぞれプロモーターに作用可能に連結される。幾つかの実施態様では、第一ポリヌクレオチド配列は第一プロモーターに作用可能に連結され、第二ポリヌクレオチド配列は第二プロモーターに作用可能に連結される。プロモーターは、構成的に発現されるプロモーター（例えば、ＥＦ１αプロモーター）又は誘導的に発現されるプロモーター（例えば、ＮＦＡＴプロモーター）でありうる。
【０１８１】
幾つかの実施態様では、ＣＡＲと治療剤の発現は、同じプロモーター、例えば構成的に発現されるプロモーター（例えばＥＦ１αプロモーター）によって駆動される。他の実施態様では、ＣＡＲと治療剤の発現は、異なるプロモーターによって駆動される。例えば、ＣＡＲの発現は、構成的に発現されるプロモーター（例えば、ＥＦ１αプロモーター）により駆動されうる一方、治療剤の発現は、誘導的に発現されるプロモーター（例えば、ＮＦＡＴプロモーター）により駆動されうる。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、治療剤をコードするポリヌクレオチド配列の上流に位置され得、又は治療剤をコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列の上流に位置されうる。
【０１８２】
更に、本発明のポリヌクレオチドは、自殺遺伝子の発現を含みうる。これは、投与された細胞の外部の薬物媒介制御を促進するためになされうる。例えば、自殺遺伝子を使用することにより、例えば、有害事象の場合に、改変された細胞を患者から枯渇させることができる。一例では、ＦＫ５０６結合ドメインが、カスパーゼ９プロアポトーシス分子に融合される。このように操作されたＴ細胞は、免疫抑制薬タクロリムスに対して感受性になる。自殺遺伝子の他の例は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ＣＤ２０、チミジル酸キナーゼ、切断型前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、切断型低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、切断型ＣＤ１９、及び改変Ｆａｓであり、これらは特定の分子（例えば、ＴＫ＋細胞に対するガンシクロビル）又は抗体又は抗体−薬物コンジュゲートの投与による条件付きアブレーションでトリガーされうる。
【０１８３】
本発明のＣＡＲ Ｔ細胞における発現のためのタンパク質をコードする配列を含むコンストラクトは、ベクター内に含まれうる。様々な例では、ベクターはレトロウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスは、目的の遺伝子又はキメラ遺伝子をコードする核酸配列を送達するための簡便なプラットフォームを提供する。選択された核酸配列は、当該技術分野において知られている技術を使用して、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージされうる。ついで、組換えウイルスは単離され、例えば、インビトロ又はエクスビボで細胞に送達されうる。レトロウイルス系は当該技術分野においてよく知られており、その全体が出典明示によりここに援用される、例えば、米国特許第５２１９７４０号；Kurth及びBannert (2010) “Retroviruses: Molecular Biology, Genomics and Pathogenesis" Calster Academic Press (ISBN:978-1-90455-55-4)；並びにHu及びPathak Pharmacological Reviews 2000 52:493-512に記載されている。効率的なＤＮＡ送達のためのレンチウイルス系システムは、ＯｒｉＧｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入できる。様々な実施態様では、タンパク質は、当該技術分野において知られているベクター及び方法を使用して、タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターのトランスフェクション又はエレクトロポレーションによってＴ細胞において発現される。幾つかの実施態様では、ベクターはウイルスベクター又は非ウイルスベクターである。幾つかの実施態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターである。
【０１８４】
本発明はまた、ＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチド配列（ここで、ＣＡＲは、例えば、腫瘍抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に特異的に結合する配列を含む細胞外ドメインを含む）と、場合によっては、治療剤をコードする第二ポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。所定の実施態様では、治療剤が抗体試薬（例えば、単鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、カメリド）、又は二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ））である場合、抗体試薬は、腫瘍抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に特異的に結合する。
【０１８５】
［細胞と治療法］
ここに記載される技術の一態様は、（場合によっては、別の治療剤（例えば、抗体試薬（例えば、ｓｃＦｖ、カメリド抗体、又はＢｉＴＥ）又はサイトカイン）と共に）ここに記載されるＣＡＲポリペプチドの何れかを含む哺乳動物細胞；又は（場合によっては、別の治療剤（例えば、抗体試薬（例えば、ｓｃＦｖ、カメリド抗体、又はサイトカイン）と共に）ここに記載のＣＡＲポリペプチドの何れかをコードする核酸に関する。一実施態様では、哺乳動物細胞は、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、ここに記載のＣＡＲの何れか、又はサイトカイン、あるいはそのような抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、ここに記載のＣＡＲの何れか、又はサイトカインをコードする核酸を含む。哺乳動物細胞又は組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ又はネコ由来でありうるが、任意の他の哺乳動物細胞が使用されうる。何れかの態様の好ましい実施態様では、哺乳動物細胞はヒトである。
【０１８６】
何れかの態様の幾つかの実施態様では、哺乳動物細胞は免疫細胞である。ここで使用される場合、「免疫細胞」は、免疫応答においてある役割を果たす細胞を意味する。免疫細胞は造血起源であり、リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄系細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。幾つかの実施態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；及び骨髄系細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球である。一実施態様では、免疫細胞はＴ細胞である。
【０１８７】
他の実施態様では、免疫細胞は、がん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患を有するか、又は有すると診断された個体から得られる。
【０１８８】
表面抗原分類（ＣＤ）分子は、白血球上に存在する細胞表面マーカーである。白血球が分化し、成熟すると、そのＣＤプロファイルが変化する。白血球ががん細胞（すなわち、リンパ腫）になる場合、そのＣＤプロファイルは疾患の診断に重要である。所定のタイプのがんの治療と予後は、がん細胞のＣＤプロファイルの決定に依存している。「Ｘ」がＣＤマーカーである「ＣＤＸ＋」は、ＣＤマーカーががん細胞中に存在していることを示し、「ＣＤＸ−」は、マーカーが存在していないことを示す。当業者は、標準的な技術を使用して、例えば、免疫蛍光を使用して、ＣＤ分子に結合した市販の抗体を検出することにより、がん細胞上に存在するＣＤ分子を評価することができる。
【０１８９】
幾つかの実施態様では、ここに記載されているＣＡＲＴ．ＢｉＴＥなどのＣＡＲを含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、がん、例えばリンパ腫、骨髄腫、又は固形腫瘍、例えば神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、又は膵臓がんを治療するために使用できる。幾つかの実施態様では、ここに記載されるＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ、例えばＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した神経膠芽腫を治療するために使用することができる。
【０１９０】
更なる実施態様では、ここに記載のＣＡＲＴ．ＢｉＴＥなどのＣＡＲを含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用して、腫瘍微小環境における、例えば、Ｔｒｅｇによる免疫抑制を防止し又は低減することができる。更に、そのようなＣＡＲＴ．ＢｉＴＥは、腫瘍微小環境におけるＴ細胞消耗を防止し又は軽減するのに有用である。
【０１９１】
ここに記載のＣＡＲＴ．ＢｉＴＥなどのＣＡＲを含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）はまた異種抗原発現を有するがんを治療するために使用することができる。例えば、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥコンストラクトのＣＡＲ成分は、がんによって発現される一つの抗原に結合する細胞外標的結合ドメインを含み得、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥコンストラクトのＢｉＴＥ成分は、Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に加えてがんによって発現される第二抗原に結合しうる。
【０１９２】
ここで使用される「がん」は、その独特の形質、正常な細胞制御の喪失が未制御の成長、分化の欠如、局所組織浸潤、及び転移をもたらす細胞の過剰増殖を意味しうる。例示的ながんには、神経膠芽腫、前立腺がん、神経膠腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、又は固形腫瘍、例えば肺がん及び膵臓がんが含まれるが、これらに限定されない。白血病の非限定的な例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。一実施態様では、がんはＡＬＬ又はＣＬＬである。リンパ腫の非限定的な例には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、及びＴ細胞リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を含む末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ））が含まれる。一実施態様では、がんはＤＬＢＣＬ又は濾胞性リンパ腫である。固形腫瘍の非限定的な例には、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、癌腫、軟骨肉腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、内胚葉洞腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、生殖細胞腫瘍（固形腫瘍）、骨及び軟部組織の巨細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、メラノーマ、腎腫、神経芽細胞腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫（ＮＲＳＴＳ）、骨肉腫、傍脊柱肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、及びウィルムス腫瘍が含まれる。固形腫瘍は、骨、筋肉、又は臓器に見出され得、肉腫又は癌腫でありうる。ここに記載の技術の何れかの態様を使用して、本出願に列挙されていないがんを含む全てのタイプのがんを治療することができると考えられる。ここで使用される場合、「腫瘍」という用語は、例えば、悪性タイプ又は良性タイプの細胞又は組織の異常増殖を意味する。
【０１９３】
ここで使用される場合、「自己免疫疾患又は障害」は、免疫系が異質細胞と正常細胞とを区別できないことによって特徴付けられる。これにより、プログラム細胞死のために正常細胞を標的とする免疫システムが生まれる。自己免疫疾患又は障害の非限定的な例には、炎症性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、ＳＬＥ、及び血管炎、アレルギー性炎症、例えばアレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、及び接触過敏症が含まれる。限定されると解釈されるべきではないが、自己免疫関連疾患又は障害の他の例には、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病（甲状腺機能亢進症）、橋本甲状腺炎（甲状腺機能低下症）、セリアック病、クローン病及び潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群、原発性胆管硬化症／肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）、乾癬、自己免疫性アディソン病、強直性脊椎炎、急性播種性脳脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、オード（Ord）甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、イヌにおける多発性関節炎、ライター症候群、高安動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症及び線維筋痛症（ＦＭ）が含まれる。
【０１９４】
一実施態様では、哺乳動物細胞は、免疫系の異常に低い活性をもたらす免疫系障害、又は外来物質（例えば、ウイルス又は細菌細胞）と戦う能力を妨げる免疫不全障害を有する患者から得られる。
【０１９５】
形質細胞は、感染との闘いに必要とされる抗体を産生し放出するように機能するＢリンパ球から生成される白血球である。ここで使用される場合、「形質細胞障害又は疾患」は、形質細胞の異常な増殖によって特徴付けられる。異常な形質細胞は、正常な形質細胞を「締め出す」ことができ、ウイルス又は細菌細胞などの異物と戦う能力が低下する。形質細胞障害の非限定的な例には、アミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、及び形質細胞骨髄腫が含まれる。
【０１９６】
哺乳動物細胞、例えば、Ｔ細胞は、ここに記載のＣＡＲポリペプチド（ここに記載の抗体試薬又はサイトカインに切断可能に連結されるＣＡＲポリペプチドを含む）の何れか；あるいはここに記載のＣＡＲポリペプチドの何れかを（及び場合によっては遺伝的にコードされた抗体試薬又はサイトカインをまた）コードする核酸を含むように操作されうる。Ｔ細胞は、当該分野において知られている標準的な技術を使用して、対象から得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ドナー又は患者から採取した末梢血から単離されうる。Ｔ細胞は哺乳動物から単離されうる。好ましくは、Ｔ細胞はヒトから単離される。
【０１９７】
何れかの態様の幾つかの実施態様では、（場合によってはここに記載の抗体試薬又はサイトカインと共に）ここに記載のＣＡＲポリペプチドはレンチウイルスベクターから発現される。レンチウイルスベクターは、感染標準技術を使用して細胞内でＣＡＲポリペプチドを（及び場合によっては抗体試薬又はサイトカインをまた）発現させるために使用される。
【０１９８】
レンチウイルスなどのレトロウイルスは、目的の遺伝子又はキメラ遺伝子をコードする核酸配列を送達するための簡便なプラットフォームを提供する。選択された核酸配列は、当該技術分野において知られている技術を使用してベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージ化されうる。次に、組換えウイルスを単離して、例えば、インビトロ又はエクスビボで細胞に送達することができる。レトロウイルス系は当該技術分野においてよく知られており、例えば、それぞれ出典明示によりその全体がここに援用される、米国特許第５２１９７４０号；Kurth及びBannert (2010) “Retroviruses: Molecular Biology, Genomics and Pathogenesis” Calster Academic Press (ISBN:978-1-90455-55-4)；及びHu等, Pharmacological Reviews 52:493-512, 2000に記載されいている。効率的なＤＮＡ送達のためのレンチウイルス系は、ＯｒｉＧｅｎｅ（Rockville, MD）から購入できる。幾つかの実施態様では、ここに記載されているＣＡＲの何れかのＣＡＲポリペプチド（及び場合によっては抗体試薬又はサイトカイン）は、ＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターのトランスフェクション又はエレクトロポレーションによって哺乳動物細胞で発現される。トランスフェクション又はエレクトロポレーション法は、当該技術分野において知られている。
【０１９９】
ここに記載のポリペプチドの何れかのＣＡＲポリペプチド（及び場合によっては抗体試薬又はサイトカイン）の効率的な発現は、ＣＡＲ（及び場合によっては抗体試薬又はサイトカイン）をコードする核酸のｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又は遺伝子産物を検出する標準アッセイ、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織化学的検査を使用してアッセイされうる。
【０２００】
幾つかの実施態様では、ここに記載されているＣＡＲポリペプチド（及び場合によっては抗体試薬又はサイトカイン）は、構成的に表現される。他の実施態様では、ＣＡＲポリペプチドは構成的に発現され、任意選択的な抗体試薬又はサイトカインは誘導的に発現される。幾つかの実施態様では、ここに記載されているＣＡＲポリペプチド（及び場合によっては抗体試薬又はサイトカイン）は、組換え核酸配列によってコードされる。
【０２０１】
ここに記載の技術の一態様は、それを必要とする対象におけるがん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患を治療する方法に関し、その方法は、Ｔ細胞表面上にここに記載のＣＡＲポリペプチドの何れか（及び場合によっては抗体試薬又はサイトカイン）を含むようにＴ細胞を操作することと；操作されたＴ細胞を対象に投与することを含む。がんの場合、その方法は、診断されたがんを治療するため、がんの再発を予防するため、又はアジュバント又はネオアジュバントの設定での使用のためのものでありうる。
【０２０２】
ここに記載の技術の一態様は、それを必要とする対象におけるがん、形質細胞障害、又は自己免疫疾患を治療する方法に関し、その方法は、ここに記載のＣＡＲポリペプチド（及び場合によっては抗体試薬又はサイトカイン）の何れかを含む哺乳動物細胞の何れかの細胞を投与することを含む。
【０２０３】
態様の何れかの幾つかの実施態様では、操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、対象への投与の前に刺激され及び／又は活性化される。
【０２０４】
［投与］
幾つかの実施態様では、ここに記載の方法は、がん、形質細胞疾患又は障害、又は自己免疫疾患又は障害を有しているか又は有していると診断された対象を、ここに記載のＣＡＲポリペプチド（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）の何れか、あるいはここに記載のＣＡＲポリペプチド（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）の何れかをコードする核酸を含む哺乳動物細胞で治療することに関する。ここに記載のＣＡＲ Ｔ細胞は、ここに記載のＣＡＲポリペプチド（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）の何れか、又はここに記載のＣＡＲポリペプチド（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）の何れかをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を含む。ここで使用される場合、「病状」とは、がん、形質細胞疾患又は障害、又は自己免疫疾患又は障害を意味する。病状を有する対象は、病状を診断する本方法を使用して医師によって特定されうる。これらの病状を特徴付け、診断を助ける、病状の症状及び／又は合併症は、当該技術分野においてよく知られており、限定されないが、疲労、持続性感染、及び持続性出血が含まれる。例えば、病状の診断に役立ちうる試験には、限定されないが、血液検査及び骨髄検査があり、所与の病状に対して当該分野で知られている。病状の家族歴、又は病状の危険因子への曝露は、対象がその病状を持っている可能性が高いかどうかを判断したり、病状の診断を下したりするのにも役立ちうる。
【０２０５】
ここに記載の組成物は、病状を有するか、又は病状を有すると診断された対象に投与されうる。幾つかの実施態様では、ここに記載される方法は、病状の症状を緩和するために、ここに記載される活性化ＣＡＲ Ｔ細胞の有効量を対象に投与することを含む。ここで使用される場合、「病状の症状を緩和する」とは、任意の病状又は病状に関連する症状を寛解させることである。同等の未処置対照と比較して、そのような減少は、任意の標準技法で測定して、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上である。ここに記載の組成物を対象に投与するための様々な手段は、当業者に知られている。一実施態様では、ここに記載の組成物は、全身的又は局所的に投与される。好ましい実施態様では、ここに記載の組成物は静脈内投与される。別の実施態様では、ここに記載の組成物は、腫瘍の部位に投与される。
【０２０６】
ここで使用される「有効量」という用語は、疾患又は障害の少なくとも一又は複数の症状を緩和するのに必要な活性化ＣＡＲ Ｔ細胞の量を意味し、所望の効果をもたらすのに十分な量の細胞調製物又は組成物に関する。従って、「治療的有効量」という用語は、典型的な対象に投与されると、特定の病状に抗する効果をもたらすのに十分な活性化ＣＡＲ Ｔ細胞の量を意味する。ここで使用される有効量は、様々な状況では、疾患の症状の進行を遅らせ、疾患の症状の経過を変え（例えば、限定されないが、症状の進行を遅らせ）、又は病状の症状を逆転させるのに十分な量もまた含みうる。従って、正確な「有効量」を指定することは一般に現実的ではない。しかしながら、如何なる場合においても、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して当業者によって決定されうる。
【０２０７】
有効量、毒性、及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準的な製薬手順によって評価されうる。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて変動しうる。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物及び方法が好ましい。治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定できる。また、用量は、細胞培養又は適切な動物モデルにおいて決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する活性化ＣＡＲ Ｔ細胞の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するために、動物モデルで定式化されうる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイ、例えば、とりわけ骨髄検査のためのアッセイによって、モニターされうる。投薬量は医師によって決定され、観察された治療効果に合わせて必要に応じて調整されうる。
【０２０８】
本技術の一態様では、ここに記載の技術は、ここに記載の活性化ＣＡＲ Ｔ細胞と、場合によっては薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。最小限の薬学的組成物の活性成分は、ここに記載される活性化ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。幾つかの実施態様では、薬学的組成物の有効成分は、ここに記載される活性化ＣＡＲ Ｔ細胞から本質的になる。幾つかの実施態様では、薬学的組成物の有効成分は、ここに記載される活性化ＣＡＲ Ｔ細胞からなる。細胞ベースの治療製剤のための薬学的に許容される担体には、生理食塩水及び水性緩衝液、リンゲル液、並びに血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬが含まれる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等のような用語は、ここでは互換的に使用される。
【０２０９】
幾つかの実施態様では、ここに記載される活性化ＣＡＲ Ｔ細胞を含む薬学的組成物は、非経口剤形でありうる。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する患者の自然防御を回避するので、ＣＡＲ Ｔ細胞自体以外の成分は、好ましくは、無菌であるか、又は患者への投与前に無菌化できる。非経口剤形の例には、注射用の溶液、注射用の薬学的に許容されるビヒクルに溶解又は懸濁される乾燥生成物、注射用の懸濁液、及び乳濁液が含まれるが、これらに限定されない。これらの何れも、投与前に活性化ＣＡＲ Ｔ細胞調製物に加えることができる。
【０２１０】
開示されている活性化ＣＡＲ Ｔ細胞の非経口剤形を提供するために使用されうる適切なビヒクルは当業者によく知られている。例には、非限定的に、生理食塩水；グルコース溶液；限定されないが、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液を含む水性ビヒクル；限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールなどの水混和性ビヒクル；並びに限定されないが、コーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルなどの非水性ビヒクルが含まれる。
【０２１１】
［投薬量］
ここで使用される「単位剤形」という用語は、適切な一回の投与のための投薬量を意味する。例として、単位剤形は、例えばシリンジ又は静脈内点滴バッグなどの送達デバイスに配されたある量の治療薬でありうる。一実施態様では、単位剤形は単回投与で投与される。別の実施態様では、一を超える単位剤形が同時に投与されうる。
【０２１２】
幾つかの実施態様では、ここに記載される活性化ＣＡＲ Ｔ細胞は単剤療法として投与され、すなわち、病状に対する他の治療は対象に同時的には施されない。
【０２１３】
ここに記載のＴ細胞を含む薬学的組成物は、一般に、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、場合によっては１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与でき、それらの範囲内の全ての整数値を含む。必要に応じて、Ｔ細胞組成物はこれらの投薬量で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般的に知られている注入技術を使用することによって投与することができる（例えば、Rosenberg等, New Eng. J. Med. 319:1676, 1988を参照）。
【０２１４】
所定の態様では、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与し、その後血液を再採取（又はアフェレーシスを実施）し、ここに記載のようにそこからＴ細胞を活性化し、患者にこれらの活性化及び増殖Ｔ細胞を再注入することが望ましい場合がある。この方法は、数週間ごとに複数回実行されうる。所定の態様では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化されうる。所定の態様では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又は１００ｃｃの採血から活性化される。
【０２１５】
投与方法は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は注入を含みうる。ここに記載の組成物は、経動脈的に、腫瘍内に、結節内に、又は髄内に患者に投与されうる。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注入されうる。一実施態様では、ここに記載の組成物は、体腔又は体液（例えば、腹水、胸膜液、腹腔液、又は脳脊髄液）中に投与される。
【０２１６】
特定の例示的な態様では、対象は白血球除去輸血を受けてもよく、白血球がエクスビボで収集され、濃縮され、又は除去されて、目的の細胞、例えばＴ細胞を選択及び／又は単離する。これらのＴ細胞分離株は、人工ＡＰＣ、例えば、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３ ＣＤＲを発現するａＡＰＣとの接触によって増殖され、本技術の一又は複数のＣＡＲコンストラクトが導入されうるように処理され、それによってＣＡＲ Ｔ細胞が作製される。それを必要とする対象は、その後、高用量化学療法による標準治療を受け、その後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。移植後又は移植と同時に、対象は増殖ＣＡＲ Ｔ細胞の注入を受けることができる。一実施態様では、増殖細胞は、手術の前又は後に投与される。
【０２１７】
幾つかの実施態様では、リンパ球枯渇は、ここに記載される一又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞を投与する前に対象で実施される。そのような実施態様では、リンパ球枯渇は、メルファラン、サイトキサン、シクロホスファミド、及びフルダラビンの一又は複数を投与することを含みうる。
【０２１８】
患者に投与される上記の治療薬の投薬量は、治療される病状の正確な性質及び治療のレシピエントによって変化するであろう。ヒトへの投与のための投薬量のスケーリングは、当該技術分野で認められている実務に従って実施されうる。
【０２１９】
幾つかの実施態様では、単一の治療レジメンが必要とされる。他の場合には、一又は複数回のその後の用量又は治療レジメンの投与が実施されうる。例えば、隔週で３か月間治療した後、治療を月に１回、６か月間又は１年以上繰り返すことができる。幾つかの実施態様では、初回治療後に追加の治療は施されない。
【０２２０】
ここに記載される組成物の投薬量は、医師によって決定され、必要に応じて、観察された治療の効果に適合するように調整されうる。治療の期間と頻度に関して、熟練した臨床医は、治療がいつ治療効果をもたらすかを判断し、更に細胞を投与するか、治療を中止するか、治療を再開するか、又は治療レジメンに対してその他の変更を行うかを決定するために、対象を監視するのが一般的である。投薬量は、サイトカイン放出症候群などの有害な副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、病状、及び性別によって異なり、当業者が決定することができる。投薬量はまた何らかの合併症が発生した場合には、個々の医師によって調整されうる。
【０２２１】
［併用療法］
ここに記載の活性化ＣＡＲ Ｔ細胞は、場合によっては、当業者により適切であると決定されうるように、互いに、また他の既知の薬剤及び療法と組み合わせて、使用されうる。一例では、異なるＴｒｅｇマーカー（例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰなど）を標的とする二種以上のＣＡＲ Ｔ細胞を組み合わせて投与することができる。別の例では、異なるがん抗原を標的とする二種以上のＣＡＲ Ｔ細胞が組み合わせて投与される。更なる例では、Ｔｒｅｇマーカー（例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰなど）を標的とする一又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞と、一又は複数の腫瘍抗原を標的とする一又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞とが組み合わせて投与される。
【０２２２】
ここで使用される「組み合わせて」投与されるとは、対象の疾患の苦痛の過程中に二種（又はそれ以上）の異なる治療剤が対象に送達されることを意味する。例えば、二種以上の治療剤は対象が障害を持つと診断された後に送達され、障害が治癒され又は排除される前、又は治療が他の理由で中止される前に送達される。幾つかの実施態様では、一回の治療の送達は二回目の送達が開始された時点でまだなされており、投与に関して重複がある。これは、ここではしばしば「同時」又は「同時的送達」と呼ばれる。他の実施態様では、一種の治療剤の送達が、他の種の治療剤の送達が始まる前に終了する。何れかの場合の幾つかの実施態様では、治療は、併用投与のため、より効果的である。例えば、第二の治療剤は、第一の治療剤がない場合に投与された場合に見られるよりも、より効果的で、例えば、第二の治療剤を少なくしても同等の効果が見られ、又は第二の治療剤が症状を大きく低減し、あるいは第一の治療剤と類似の状況が見られる。幾つかの実施態様では、送達は、症状又は障害に関連する他のパラメーターの減少が、他の治療剤がない場合に一種の治療剤で観察されるであろうものよりも大きいようなものである。二種の治療剤の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、又は相加的よりも大きい場合がある。送達は、送達された第一の治療剤の効果が、第二の治療剤が送達されたときに依然として検出可能であるようなものでありうる。ここに記載の活性化ＣＡＲ Ｔ細胞と少なくとも一種の追加の治療剤は、同時に、同じ又は別々の組成物で、又は逐次的に投与されうる。逐次投与の場合、ここに記載のＣＡＲ発現細胞を最初に投与することができ、追加の薬剤を二回目に投与することができ、又は投与の順序を逆にすることができる。ＣＡＲ Ｔ療法及び／又は他の治療剤、手順又はモダリティは、活動性障害の期間中、又は寛解期間もしくは活動性の低い疾患の期間中に施されうる。ＣＡＲ Ｔ療法は、別の治療の前に、治療と同時に、治療後に、又は障害の寛解中に施されうる。
【０２２３】
組み合わせて投与される場合、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞と追加の薬剤（例えば、第二又は第三の薬剤）、又は全てが、例えば単剤療法として、個々に使用される各薬剤の量又は投薬量より多いか、少ないか又は同じである量又は用量で投与されうる。所定の実施態様では、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞、追加の薬剤（例えば、第二又は第三の薬剤）、又は全ての投与される量又は投薬量は、個々に使用される各薬剤の量又は投薬量より少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％である）。他の実施態様では、所望の効果（例えば、がんの治療）をもたらす、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞、追加の薬剤（例えば、第二又は第三の薬剤）、又は全ての量又は投薬量は、同じ治療効果を達成するために個々に必要とされる各薬剤の量又は投薬量よりも少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％少ない）。更なる実施態様では、ここに記載の活性化ＣＡＲ Ｔ細胞は、外科手術、化学療法、放射線、ｍＴＯＲ経路阻害剤、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６、抗体、又は他の免疫除去剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体又は他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、又はペプチドワクチン、例えばIzumoto等, J. Neurosurg. 108:963- 971, 2008に記載されたものと組み合わせた治療レジメンにおいて使用されうる。
【０２２４】
一実施態様では、ここに記載の活性化ＣＡＲ Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用されうる。例示的なチェックポイント阻害剤には、抗ＰＤ−１阻害剤（ニボルマブ、ＭＫ−３４７５、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４）、抗ＣＴＬＡ４阻害剤（イピリムマブ及びトレメリムマブ）、抗ＰＤＬ１阻害剤（アテゾリズマブ、アベロマブ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＥＤＩ４７３６、及びＭＰＤＬ３２８０Ａ）、及び抗ＴＩＭ３阻害剤が含まれる。
【０２２５】
一実施態様では、ここに記載の活性化ＣＡＲ Ｔ細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用されうる。例示的な化学療法剤には、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソームドキソルビシン））、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツザマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗剤（例えば、葉酸拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシン又はボルテゾミブ）、免疫調節剤、例えばサリドマイド又はサリドマイド誘導体（例えば、レナリドマイド）が含まれる。併用療法における使用が考えられる一般的な化学療法剤には、アナストロゾール（アリミデックス（登録商標））、ビカルタミド（カソデックス（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（ブレノキサン（Blenoxane）（登録商標））、ブスルファン（ミレラン（登録商標））、ブスルファン注射剤（ブスルフェクス（登録商標））、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（ロイケラン（登録商標））、シスプラチン（プラチノール（Platinol）（登録商標））、クラドリビン（ロイスタチン（登録商標））、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）又はネオサール（Neosar）（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（サイトサール−Ｕ）、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメガン）、塩酸ダウノルビシン（セルビジン（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）、ルベックス（登録商標））、エトポシド（ベペシド（登録商標））、リン酸フルダラビン（フルダラ（登録商標））、５−フルオロウラシル（アドルシル（登録商標）、エフデックス（登録商標））、フルタミド（ユーレキシン（Eulexin）（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア（登録商標））、イダルビシン（イダマイシン）、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（カンプトサール（Camptosar）（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（アルケラン（登録商標））、６−メルカプトプリン（プリネトール（Purinethol）（登録商標））、メトトレキサート（フォーレックス（Folex）（登録商標））、ミトキサントロン（ノバントロン（登録��標））、マイロターグ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラント（ギリアデル（登録商標））を含むポリフェプロサン２０、クエン酸タモキシフェン（ノルバデックス（登録商標））、テニポシド（ブモン（Vumon）（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（チラゾン（Tirazone）（登録商標））、注射用トポテカン塩酸塩（ハイカムチン（登録商標））、ビンブラスチン（ベルバン（Velban）（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、及びビノレルビン（ナベルビン（登録商標））が含まれる。例示的なアルキル化剤には、限定されないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア及びトリアゼン）；ウラシルマスタード（アミノウラシルマスタード（登録商標）、クロレタミナシル（登録商標）、デメチルドパン（登録商標）、デスメチルドパン（登録商標）、ヘマンタミン（登録商標）、ノルドパン（登録商標）、ウラシルナイトロジェンマスタード（登録商標）、ウラシルロスト（Uracillost）（登録商標）、ウラシルモスターザ（Uracilmostaza）（登録商標）、ウラムスチン（Uramustin）（登録商標）、ウラムスチン（Uramustine）（登録商標））、クロルメチン（マスタージェン（Mustargen）（登録商標））、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）、ネオサール（登録商標）、クラフェン（Clafen）（登録商標）、エンドキサン（登録商標）、プロシトックス（Procytox）（登録商標）、RevimmuneTM）、イホスファミド（ミトキサーナ（Mitoxana）（登録商標）、メルファラン（アルケラン（登録商標））、クロラムブシル（リューケラン（登録商標））、ピポブロマン（ＡｍｅｄｅｌＲ）、ピポブロマン（アメデル（Amedel）（登録商標）、ベルサイト（Vercyte）（登録商標））、トリエチレンメラミン（へメル（Hemel）（登録商標）、ヘキサレン（登録商標）、ヘキサスタット（Hexastat）（登録商標））、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド（テモダール（登録商標））、チオテパ（チオプレックス（Thioplex）（登録商標））、ブスルファン（ブシルベックス（Busilvex）（登録商標）、ミレラン（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（ザノサー（登録商標））、及びダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））が含まれる。追加の例示的なアルキル化剤には、限定されないが、オキサリプラチン（エロキサチン（Eloxatin）（登録商標）；テモゾロミド（テモダール（Temodar）（登録商標）及びテモダール（Temodal）（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄ、コスメゲン（登録商標）としても知られている）；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、及びフェニルアラニンマスタード、アルケラン（登録商標）としても知られている）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヘキサレン（登録商標）としても知られている）；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（トレアンダ（登録商標））；ブスルファン（ブスルフェックス（登録商標）及びミレラン（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標）としても知られている）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、プラチノール（登録商標）及びプラチノール（登録商標）−ＡＱとしても知られている）；クロラムブシル（リューケラン（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）及びネオサール（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣ及びイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）としても知られている）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヘキサレン（登録商標）としても知られている）；イフォスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドヌムスチン；プロカルバジン（マチュレーン（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン及び塩酸メクロレタミン、マスタージェン（登録商標）としても知られている）；ストレプトゾシン（ザノサー（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ及びＴＳＰＡ、チオプレックス（登録商標）としても知られている）；シクロホスファミド（エンドキサン（登録商標）、シトキサン（登録商標）、ネオサール（登録商標）、プロシトックス（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；及びベンダムスチンＨＣ１（トレアンダ（登録商標））が含まれる。例示的なｍＴＯＲ阻害剤には、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス（正式には、ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０６４３８３に記載されている、デフェロリムス（deferolimus）、（ｌＲ，２Ｒ，４５）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９５，１２５，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３５，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０５，３２５，３５Ｒ）−ｌ，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−ｌｌ，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４’９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート）；エベロリムス（アフィニトール（登録商標）又はＲＡＤＯＯｌ）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、シロリムス（登録商標））；シマピモド（simapimod（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；エムシロリムス、（５−｛２，４−ビス［（３５，）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−（ｉ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｉｒａｗ５，−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ＪＪピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；及びＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−ａ−アスパルチルＬ−セリン−，内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）、及びＸＬ７６５が含まれる。例示的な免疫調節剤には、例え���、アフツズマブ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）から入手可能）、ペグフィルグラスチム（ニューラスタ（Neulasta）（登録商標））；レナリドミド（ＣＣ−５０１３、レブラミド（登録商標））；サリドマイド（サロミド（Thalomid）（登録商標））、アクチミド（ＣＣ４０４７）；及びＩＲＸ−２（インターロイキン１、インターロイキン２、及びインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、ＣＡＳ９５１２０９−７１−５、 IRX Therapeuticsから入手可能）が含まれる。例示的なアントラサイクリンには、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）及びルベックス（登録商標））；ブレオマイシン（レノキサン（登録商標））；ダウノルビシン（塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシン、及び塩酸ルビドマイシン、セルビジン（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、ノバントロン（Novantrone）（登録商標））；エピルビシン（エレンスTM）；イダルビシン（イダマイシン（登録商標）、イダマイシンＰＦＳＲ）；マイトマイシンＣ（ムタマイシン（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；及びデスアセチルラビドマイシンが含まれる。例示的なビンカアルカロイドには、例えば、酒石酸ビノレルビン（ナベルビン（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、及びビンデシン（エルディシン（登録商標））；ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチン及びＶＬＢ、アルカバンＡＱＲ及びベルバン（登録商標）としても知られている）；及びビノレルビン（ナベルビン（登録商標））が含まれる。例示的なプロテオソーム阻害剤には、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７、（５）−４−メチル−Ｎ−（（５）−ｌ−（（（５）−４−メチル−１−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（５，）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタナミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＴ００５２）；クエン酸イキサゾミブ（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１
８７７０）；及びＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（ＩＩＳ’）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−１−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンアミド（ＯＮＸ−０９１２）が含まれる。
【０２２６】
当業者であれば、使用する化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning; Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18版; Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chapters 28-29 in Abeloff’s Clinical Oncology, 2013 Elsevier；及びFischer D. S. (編): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4版 St. Louis, Mosby-Year Book, 2003を参照のこと）。
【０２２７】
一実施態様では、ここに記載の活性化ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＩＴＲを標的とし、及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子のレベル及び／又は活性を低下させる分子、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子、ｍＴＯＲ阻害剤、ＧＩＴＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、非受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、及び／又はＢＴＫ阻害剤と組み合わせて対象に投与される。
【０２２８】
［有効性］
例えば、ここに記載される病状の治療における、又はここに記載される応答（例えば、がん細胞の減少）を誘導する、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性は、熟練した臨床医により決定されうる。しかし、治療は、ここに記載の方法による治療後に、ここに記載の病状の徴候又は症状の一又は複数が有益な形で変更され、他の臨床的に受け入れられる症状が改善され、寛解さえされ、又は所望の応答が、例えば少なくとも１０％まで誘導されるならば、その用語がここで使用されているような「有効な治療」と考えられる。有効性は、例えば、ここに記載の方法によって治療される病状のマーカー、指標、症状、及び／又は発生率あるいは任意の他の適切な測定可能なパラメーターを測定することによって評価することができる。ここに記載の方法による治療は、病状のマーカー又は症状のレベルを、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％以上低下させることができる。
【０２２９】
有効性は、入院によって評価される個体の悪化がないこと、又は医療介入の必要性（すなわち、疾患の進行の停止）によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、及び／又はここに記載されている。
【０２３０】
治療は、個体又は動物（幾つかの非限定的な例はヒト又は動物を含む）における疾患の任意の治療を含み、（１）疾患の阻害、例えば症状（例えば、痛み又は炎症）の悪化の防止；又は（２）症状の重症度の緩和、例えば症状の後退を生じさせることを含む。疾患の治療のための有効量とは、それを必要とする対象に投与された場合、その疾患に対して、その用語についてここで定義されるような、有効な治療をもたらすのに十分な量を意味する。薬剤の有効性は、病状又は望ましい応答の物理的指標を評価することによって決定されうる。そのようなパラメーターの何れか一、又はパラメーターの任意の組み合わせを測定することにより、投与及び／又は治療の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。所与のアプローチの有効性は、ここに記載されている病状の動物モデルにおいて評価することができる。実験動物モデルを使用する場合、マーカーの統計的に有意な変化が観察されると、治療の有効性が証明される。
【０２３１】
この出願を通して引用される、参照文献、発行済み特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む、全ての特許及びその他の刊行物は、例えば、ここに記載される技術に関連して使用されるかもしれないそのような刊行物に記載された方法論を説明し開示する目的で、出典明示によりここに明示的に援用される。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。この点に関し如何なるものも、発明者等が先の技術の理由で又は任意の他の理由のためにそのような開示に先行する権利がないことの自認と解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する提示は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関して何ら自認を構成するものではない。
【０２３２】
本開示の実施態様の説明は、網羅的であること又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施態様及び実施例を例示目的でここで説明するが、関連分野の当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な均等の変形が可能である。例えば、方法の工程又は機能が所与の順序で提示されているが、代替の実施態様では、異なる順序で機能を実行してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。ここで提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。ここで説明される様々な実施態様は、更なる実施態様を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参考文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示のまた更なる実施態様を提供するように変更することができる。更に、生物学的機能の均等性の考慮により、種類又は量において生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造に幾らかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような変更は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０２３３】
前述の実施態様の何れかの特定の要素は、他の実施態様の要素と組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示の所定の実施態様に関連する利点をこれら実施態様の文脈において説明したが、他の実施態様もまたそのような利点を示し得、全ての実施態様が本開示の範囲内に入るために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
【０２３４】
ここに記載される技術は、決して更なる限定であると解釈されるべきではない、次の実施例によって更に例証される。
【実施例】
【０２３５】
次は、本発明の方法と組成物の実施例である。上に与えられた一般的な説明に鑑みると、様々な他の実施態様が実施されてもよいことが理解される。
【０２３６】
実施例１：腫瘍微小環境を改変し、ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を増強する毒性薬物のＣＡＲ Ｔ細胞媒介性分泌
ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、毒性抗体を腫瘍微小環境に送達等するために使用できる。この実施例では、Ｔ細胞は、腫瘍微小環境の抑制性免疫細胞環境を改変することを目的として、抗体又はサイトカインを分泌するように遺伝子改変される。
【０２３７】
具体的には、異種性に発現される抗原に向けられたＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境において周囲の腫瘍浸潤リンパ球の活性化を可能にすることにより、その有効性を高めることができる。特定の非限定的な例には、次のものが含まれる：
（１）遺伝的にコードされた抗ＣＴＬＡ４ ＣＡＲ−Ｔ細胞媒介性分泌。抗ＣＴＬＡ４チェックポイント阻害は、全身性に送達されると毒性を引き起こしうる。しかし、抗ＣＴＬＡ４の局所的分泌はチェックポイント阻害をもたらし、腫瘍微小環境において制御性Ｔ細胞を枯渇させることが期待される。
（２）局所腫瘍微小環境においてＴｒｅｇを枯渇させる、遺伝的にコードされた抗ＣＤ２５（例えば、ダクリズマブ）。ＣＡＲ Ｔ細胞は、不適な環境と血液脳関門にもかかわらず、腫瘍に移動することが示されている。新しいＴ細胞移民もまた腫瘍に浸潤するが、これらはチェックポイントとＴｒｅｇの活性化によって阻害されると仮定されている。抗ＣＤ２５の局所性分泌は、Ｔｒｅｇを枯渇させると予想される。しかし、薬理学的に投与されるダクリズマブは、全身性に投与されると毒性である。
（３）遺伝的にコードされた抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）。安全であるが異種性に発現する抗原（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に向けられたＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原が異種性に発現される場合、腫瘍を完全には排除しない。しかしながら、他の抗原は、腫瘍微小環境において高レベルで発現されうる（例えば、ＥＧＦＲ）。ＥＧＦＲは脳内では脳腫瘍でのみ発現されるが、多くの他の上皮組織においても発現され、このことが、それをＣＡＲ Ｔ細胞の安全でない標的としている。しかしながら、ＥＧＦＲｖＩＩＩに向けられたＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞が移動する腫瘍微小環境における組織のみが高レベルの抗ＥＧＦＲに曝露されるように、抗ＥＧＦＲを分泌するようにデザインされうる。抗ＥＧＦＲの場合、頭頸部がんや結腸がんなどの他のがんにおいて全身性に使用されることに鑑みると、抗体はそれほど毒性がないと予想される。しかし、ＣＮＳには浸透しないため、脳腫瘍には効果がない。ＣＮＳに向けられたＣＡＲ Ｔ細胞の形態の遺伝的にコードされた抗ＥＧＦＲは、ＣＮＳ及び脳腫瘍、例えば神経膠芽腫への抗ＥＧＦＲの局所送達のための媒体としてＴ細胞を使用する能力を有している。
【０２３８】
従って、提供されるのは、二つの異なる形式の腫瘍微小環境における遺伝的にコードされたＴｒｅｇの枯渇である。加えて、所定の組織に入ることができない抗体の遺伝的にコードされた送達であり、抗腫瘍標的の特異性を広げることによりＴ細胞療法の有効性を増強できる。従って、がんに対する遺伝子改変Ｔ細胞療法が記載される。
【０２３９】
実施例２：操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は神経膠芽腫における腫瘍の異種性及び免疫抑制を克服する
［材料及び方法］
匿名化された健康なドナーから得られた白血球アフェレーシス産物のＴ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８をビーズ対細胞比３：１で用いて刺激し、完全ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。刺激とレンチウイルス形質導入の１０日後、細胞を凍結させ、機能アッセイで使用するために保存した。ＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞を死滅させる能力を、２０時間のルシフェラーゼベースアッセイにおいて試験した。Ｔｒｅｇ抑制を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞分析によって可視化した。
【０２４０】
インビボ実験では、腫瘍細胞を対数増殖期に収集し、洗浄し、５０マイクロリットルのハミルトンシリンジに入れた。定位フレームを使用して、ブレグマの右２ｍｍ、頭蓋骨表面の４ｍｍ下の冠状縫合に針を位置させた。処置では、マウスにＣＡＲ Ｔ細胞（マウス１匹当たり１×１０６個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞）を尾静脈から一回注入した。
【０２４１】
［結果］
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞はインビトロで抗腫瘍活性を媒介する。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲをデザインして合成し、これをインビトロでの初期試験で使用した。このＣＡＲのインビトロでの特徴付けは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲがヒト神経膠腫Ｕ８７ｖＩＩＩ細胞株に対して有意かつ特異的な細胞傷害性を媒介することを証明している（図１；ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、Ｕ８７ｖＩＩＩヒト神経膠腫細胞株に対して細胞傷害性を強力かつ特異的に媒介する）。この効果は、ヒトＧＢＭ異種移植片の皮下モデルにおいて観察され、そこでは、樹立された巨大腫瘍でさえもＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩに応答した（図２Ａ及び２Ｂ；ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ヒト神経膠腫の皮下モデルにおいてＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を治療する）。マウスを生着後４日目にＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで治療し（上段）、２１日目までに治療に成功した（下段）。非形質導入細胞であるＵＴＤが陰性対照となる）。
【０２４２】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞は脳内のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍に対して抗腫瘍活性を媒介する。
頭蓋内ヒト神経膠腫のマウスモデルにおいて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍の増殖を遅らせ、生存期間を延長した（図３Ａ及び３Ｂ；ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ヒト神経膠腫の頭蓋内モデルにおいてＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍（Ｕ８７ｖＩＩＩ）の増殖を遅くする。マウスは、生着後２日目にＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで治療した）。腫瘍の増殖は抑制されたが、その効果は、皮下腫瘍に対して観察された効果ほど顕著ではなかった。脳腫瘍患者に対するＣＡＲ Ｔ細胞の移動に対する一つの重要な障壁は、よく特徴付けられた抑制性Ｔｒｅｇの浸潤であった。
【０２４３】
ＣＡＲ Ｔ細胞活性は制御性Ｔ細胞によって抑制される。
ＣＡＲ Ｔ細胞と標的神経膠腫細胞株を用いた共培養実験において、制御性Ｔ細胞の存在がＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ抗腫瘍活性を抑制することが認められた。図５Ａ〜５Ｄは、インビトロでのヒト神経膠腫細胞との１８時間の共培養後のＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性のＴｒｅｇ抑制を定性的に（図５Ａ〜５Ｃ）及び定量的（図５Ｄ）に証明している。図６Ａ〜６Ｃは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−のｌｅｕｋｏｐａｋから選別され、ＩＬ−２の存在下で７日間ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで増殖させたＴｒｅｇを示す。１日目に、ＧＦＰを発現するようにそれらに形質導入した。７日目にビーズを取り除いた後、増殖したＴｒｅｇを、凍結前に４日間休ませた。解凍後、Ｔｒｅｇを、ＬＡＰ及びＧＡＲＰ発現のために、一晩の休止（非活性化）又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８による一晩の活性化後に染色した。同じドナー由来の非形質導入Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）を、発現の対照として使用した。
【０２４４】
抗ＬＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞はインビトロで制御性Ｔ細胞を死滅させる。
図９Ａ及び９Ｂに示されるように、ＣＡＲ Ｔ細胞を、同じドナーから増殖された単離Ｔｒｅｇと共培養し、ＧＦＰを発現するように形質導入した。Ｔｒｅｇを抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で一晩活性化させ、死滅アッセイ前に一晩休ませた。ウェル当たり６２５００個のＴｒｅｇを蒔いた。ＣＡＲを、上のグラフ中に表示されたＴｒｅｇに対する比率で添加した。細胞を３００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で３日間培養した。フローを３日目に実行したところ、各ウェルから３００００のイベントがあった。細胞傷害性パーセントを、Ｔｒｅｇと共に行った非形質導入Ｔ細胞培養と比較して、失われたＧＦＰ＋細胞のパーセントとして計算した。
これらのデータに基づいて、Ｔｒｅｇ上に見出された表面マーカーを標的とする新規のＣＡＲコンストラクトを開発した。これらのＣＡＲ Ｔ細胞の全体的なデザインを図８Ａ〜８Ｄに示す。
【０２４５】
結論
最終的な目標は、ヒトＧＢＭの前臨床マウスモデルにおいてＣＡＲ Ｔ細胞療法をデザインし、試験し、改善することである。ＣＡＲ Ｔ細胞が、樹立された巨大腫瘍に対してさえもインビボで特異的かつ強力な効果を確かに媒介できることが、ここで証明された。加えて、制御性Ｔ細胞がこれらの免疫応答の抑制に重要な役割を果たす場合があることが示されている。Ｔｒｅｇを標的とする新しい技法が、抗腫瘍効果を増強するために局所免疫環境を調節する方法を提供する可能性がある。
【０２４６】
実施例３  ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的としたＣＡＲ Ｔ細胞
部分的にはＥＧＦＲｖＩＩＩは健康な組織には一般に存在せず、腫瘍組織で特異的に発現されるため、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合部分を含むＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞）は、細胞溶解性細胞を腫瘍微小環境に対して特異的に標的化するための有望な細胞療法となる。この実施例において、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を二種の動物モデルにおいてインビトロ及びインビボで試験した。
【０２４７】
匿名化された健康なドナーから得られた白血球アフェレーシス産物のＴ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８）をビーズ対細胞比３：１で用いて刺激し、完全ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。刺激とレンチウイルス形質導入の１０日後、細胞を凍結させ、機能アッセイで使用するために保存した。
【０２４８】
図１に示される２０時間のルシフェラーゼベースアッセイにおいて、非形質導入対照細胞と比較して、腫瘍細胞を優先的に死滅させるＣＡＲ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の能力を特徴付けるために、インビトロで初期試験を実施した。神経膠腫細胞株Ｕ８７ｖＩＩＩを標的細胞として使用した。インビトロでの特徴付けにより、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞がＵ８７ｖＩＩＩ細胞に対して有意かつ特異的な細胞傷害性を媒介することが証明されている（図１）。
【０２４９】
インビボ実験では、Ｕ８７ｖＩＩＩ腫瘍細胞を対数増殖期に収集し、洗浄し、ヒト神経膠芽腫の異種移植モデル（図２Ａ及び２Ｂ）において皮下に、又はヒト神経膠腫のモデル（図３Ａ及び３Ｂ）において頭蓋内に、マウスに投与した。頭蓋内投与の場合、５０マイクロリットルのハミルトンシリンジの針を、定位フレームを使用してブレグマの右２ｍｍ、頭蓋骨表面の４ｍｍ下の冠状縫合に位置させた。処置では、マウスにＣＡＲ Ｔ細胞（マウス１匹当たり１×１０６個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞）を尾静脈から一回注入した。
【０２５０】
インビトロで観察された強力な抗腫瘍効果は、ヒト神経膠芽腫のインビボ皮下異種移植モデルに反映された（図２Ａ及び２Ｂ）。このモデルでは、樹立されたかさ高い腫瘍（上の行）がＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩに反応しした（図２Ｂ）一方で、非形質導入細胞は腫瘍の増殖を妨げなかった（図２Ａ）。頭蓋内ヒト神経膠腫のマウスモデルでは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍の増殖を遅らせ、非形質導入細胞（図３Ａ）と比較して長い生存期間となった（図３Ｂ）。腫瘍増殖は抑制されたが、その効果は皮下腫瘍に対して観察された効果ほど顕著ではなかった。
【０２５１】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞での処置後にヒト患者の腫瘍組織において観察された（図４Ａ及び４Ｂ）。脳浸潤性ＴｒｅｇがＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の抑制に機能的な役割を果たしているかどうかを判定するために、インビトロＴｒｅｇ抑制アッセイを実施し、そこでＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞と神経膠腫細胞をＴｒｅｇの存在下で１８時間インキュベートした。結果は、図５Ａ〜５Ｃに示されるように、ＩｎｃｙＣｙｔｅ生細胞分析によって得た。非特異的ＣＡＲ細胞は神経膠腫細胞の増殖を可能にしたが（図５Ａ及び５Ｄ、上の線）、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞は神経膠腫細胞を死滅させた（図５Ｂ及び５Ｄ、下の線）。しかしながら、共培養におけるＴｒｅｇの添加は、標的神経膠腫細胞を死滅させるＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の能力を有意に低減させた（図５Ｃ及び５Ｄ、中央の線）。
【０２５２】
実施例４  Ｔｒｅｇ関連抗原を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞のデザインと特徴付け
図６Ａ〜６Ｃ、７Ａ、及び７Ｂは、ＬＡＰ及びＧＡＲＰがヒト末梢血細胞上のＴｒｅｇ関連マーカーとして同定された実験の結果を示す。特に、エクスビボで活性化されなかったヒトＴｒｅｇのうち、およそ２７％がＬＡＰを発現し、およそ４％がＬＡＰとＧＡＲＰに対して二重陽性であった（図６Ｂ）。抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、及びＩＬ−２を使用してエクスビボで活性化すると、およそ３０％がＬＡＰを発現し、ＬＡＰ／ＧＡＲＰ二重陽性Ｔｒｅｇの数が１２．３％に増加した（図６Ｃ）。
【０２５３】
次に、ＬＡＰとＧＡＲＰを標的とするＣＡＲをコードするＣＡＲコンストラクトをデザインした。これらのコンストラクトの概略図を図８Ａ〜８Ｄに示す。Ｔｒｅｇ標的コンストラクトは、二種のＬＡＰ標的ＣＡＲ（各抗ＬＡＰｓｃＦｖの重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖配置に逆転があるＣＡＲ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ（図８Ａ）とＣＡＲ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ（図８Ｂ））、ＧＡＲＰ標的ＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲ−ＧＡＲＰ；図８Ｃ）、及び更に抗ＧＡＲＰカメリド抗体をコードするＥＧＦＲ標的ＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ；図８Ｄ）を含む。各コンストラクトの形質導入効率は、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の割合を測定することによりフローサイトメトリーを使用して評価し、以下に提供している。
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【０２５４】
抗ＬＡＰ ＣＡＲＴ細胞を試験するために、ＣＡＲ Ｔ細胞を、同じドナーから増やした単離Ｔｒｅｇと共培養し、ＴｒｅｇマーカーとしてＧＦＰを発現するように形質導入した。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を用いてＴｒｅｇを一晩活性化させ（図９Ｂ）、又は死滅アッセイ前に一晩静置した（図９Ａ）。ウェル当たり６２５００Ｔｒｅｇを蒔いた。ＣＡＲをＴｒｅｇに、示された比率で添加した。培養物を３００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で３日間インキュベートした。ウェル当たり３００００のイベントを収集することによってフローサイトメトリーを３日目に実施した。細胞傷害性パーセントを、Ｔｒｅｇを用いた非形質導入Ｔ細胞培養物と比較したＧＦＰ陽性細胞の減少パーセントとして算定した。ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌは、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈと比較して、非活性Ｔｒｅｇを死滅させるのにより効果的であった。ついで、ＬＡＰ標的ＣＡＲ Ｔ細胞をＧＡＲＰ標的ＣＡＲＴ細胞と、１：１のＣＡＲ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ比で二種のドナーにわたって４日間、類似のＴｒｅｇ死滅アッセイにおいて、比較した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。図１１Ａと１１Ｂは、非形質導入対照と比較した、ＬＡＰ標的ＣＡＲ Ｔ細胞による非活性化及び活性化Ｔｒｅｇ死滅を、ＣＡＲ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞比の関数として３日間の共培養の終わりに残っている標的Ｔｒｅｇの数によって特徴付けている。図１１Ｃ及び１１Ｄは、同じドナーからの類似のデータを示し、細胞傷害性はルシフェラーゼ発現により測定している。
【０２５５】
ＬＡＰ標的及びＧＡＲＰ標的ＣＡＲ Ｔ細胞の機能に対する抗原発現の影響を更に特徴付けるために、不死化細胞株をＬＡＰ及びＧＡＲＰ抗原の発現についてスクリーニングし、各ＣＡＲ Ｔ細胞による細胞傷害性効果を評価した。最初に、ＩＬ−２を発現する皮膚ヒトＣＤ４Ｔ細胞リンパ球由来細胞株であるＨＵＴ７８細胞をＧＡＲＰ及びＬＡＰについて染色し（それぞれ図１２Ａ及び１２Ｂ）、ＨＵＴ７８細胞によるＬＡＰ発現を確認した。次に、ＨＡＲＴ７８細胞に対するＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ及びＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ細胞媒介性細胞傷害性を細胞傷害性アッセイによって測定した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。次に、ＩＬ−２依存性ヒトセザリー症候群由来細胞であるＳｅＡｘをＧＡＲＰ及びＬＡＰについて染色し（それぞれ図１４Ａ及び１４Ｂ）、両方の抗原の発現を確認した。ＳｅＡｘ細胞を、ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ細胞、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ細胞、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ細胞、及び非形質導入細胞と共培養し、２４時間（図１５Ａ）及び４８時間（図１５Ｂ）でＣＡＲ Ｔ細胞媒介死滅を定量した。各ＣＡＲ Ｔは、２４時間で優れたＳｅＡｘ標的細胞死滅を示し、４８時間でより顕著な効果を示した。ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ及びＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌは、４８時間までにＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ細胞よりも高い効率で標的ＳｅＡｘ細胞を死滅させた。
【０２５６】
次に、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ細胞による抗ＧＡＲＰカメリド抗体の分泌をウエスタンブロットによって特徴付けた（図１６Ａ〜１６Ｃ）。還元及び非還元条件で処理したＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ細胞を含む培養物から上清を収集し、非還元サンプルを含むレーンにおいて１０から１５ｋＤのバンドの存在が観察され（図１６Ｃ）、カメリド抗体の存在を確認した。
【０２５７】
実施例５  ＢｉＴＥ分泌ＣＡＲ Ｔ細胞のデザインと特徴付け
（例えば、Ｔｒｅｇによる免疫調節を克服するために）腫瘍微小環境内のＣＡＲ Ｔ細胞活性の有効性を高めるためのここで提供される別の機序は、ＢｉＴＥなどの免疫調節抗体を分泌するＣＡＲ Ｔ細胞によるものである。理論に縛られることを望まないが、本発明者等は、ＣＡＲをまたコードするコンストラクトからの免疫調節抗体（例えば、ＢｉＴＥ）の発現が抗腫瘍効果を更に増幅しうることを発見した。
【０２５８】
図１７に概略的に示される一つの例示的な核酸コンストラクトであるＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）は、ＢｉＴＥをコードするポリヌクレオチドに作用可能に５’で連結されたＣＡＲコード化ポリヌクレオチドを含む。ＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍の微小環境に方向付ける、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する腫瘍抗原結合ドメインを特徴とする。図１８に示すように、ＢｉＴＥは一方のドメインでＥＧＦＲに結合し、もう一方のドメインでＣＤ３に結合し、これが、（ａ）宿主ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍細胞への結合活性を更に亢進させ又は（ｂ）隣接する（例えば、内因性の）Ｔ細胞を腫瘍に対して備えさせうる。ＣＡＲが細胞表面を標的としている一方、ＢｉＴＥには切断可能なリンカーＰ２Ａ及びＴ２Ａが隣接しており、ＢｉＴＥの別個の分泌が可能になる。（例えば、ＣＤ１９を標的とするＢｉＴＥをコードする）他の例示的なＢｉＴＥコード化ＣＡＲコンストラクトを図２６Ａ及び２６Ｂに示す。
【０２５９】
ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）細胞によるＢｉＴＥ分泌は、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＳｕｐＴ１細胞を含む培養物から上清を単離し、ＯＤ４５０に基づいて上清中のＢｉＴＥの濃度を計算し、ウエスタンブロット分析を実施することにより確認した。上清中のＢｉＴＥの濃度は０．６０４ｎｇ／ｍＬであった。ウエスタンブロット実験の結果を図１９に示す。レーン２の約５０〜６０ｋＤにバンドが観察され、これは、上清中にＢｉＴＥ分子が存在することを示している。
【０２６０】
次に、ＢｉＴＥ分子の結合をフローサイトメトリーによって評価した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を形質導入し、分泌されたＢｉＴＥを含む上清を収集し、Ｋ５６２細胞（図２０Ａ）及びジャーカット細胞（図２０Ｂ）と共にインキュベートした。図２０Ａに示すように、ＢｉＴＥは、ＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞に結合し、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞には結合せず、ＢｉＴＥのＥＧＦＲ結合ドメインの機能が確認された。図２０Ｂに示すように、ＣＤ３を発現するジャーカット細胞は、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清とのインキュベーション後に、非形質導入ＨＥＫ２９３Ｔからの上清とのインキュベーション後のＢｉＴＥに対する染色と比較して、ＢｉＴＥに対してより強い染色を示しており、ＢｉＴＥもまた機能的にＣＤ３に結合することを示している。
【０２６１】
ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）の形質導入宿主としてＳｕｐＴ１細胞を使用して、同様の実験を行なった。図２１Ａは、ＢｉＴＥが、ＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞に結合し、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞に結合しなかったことを示しており、形質導入されたＳｕｐＴ１細胞によって発現されるＢｉＴＥのＥＧＦＲ結合ドメインの機能が確認される。宿主ＳｕｐＴ１細胞の表面に発現されたＣＤ３にＢｉＴＥが結合したことを確認するために、形質導入されたＳｕｐＴ１細胞をＢｉＴＥについて染色した。図２１Ｂに示される結果から、形質導入されたＳｕｐＴ１細胞がＢｉＴＥに対して陽性に染色されることが確認された。ＮＤ４細胞をまた、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）による形質導入時に機能的ＢｉＴＥを分泌する能力について評価した。図２２Ａは、形質導入されたＮＤ４細胞によって分泌されたＢｉＴＥが、ＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞に結合し、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞に結合しなかったことを示している。図２２Ｂに示すように、ＢｉＴＥは、それらが分泌された形質導入ＮＤ４細胞で発現されたＣＤ３に結合した。
【０２６２】
次に、形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞から分泌されたＢｉＴＥの能力をインビトロで特徴付けた。ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から分泌されたＢｉＴＥを含む上清を、様々な比率の非形質導入ＮＤ４細胞とＵ８７ｖＩＩＩ標的細胞の共培養物と共にインキュベートした。図２３に示すように、ＮＤ４細胞は、ＢｉＴＥと共にインキュベートされた場合、用量依存的に、ＮＤ４発現ＣＤ３とＵ８７ｖＩＩＩ発現ＥＧＦＲの両方に、ＮＤ４細胞による死滅を誘導するのに十分な程度にＢｉＴＥが結合していたことを示している。
【０２６３】
Ｔ細胞活性化時にＢｉＴＥの誘導性発現を可能にするために、ＮＦＡＴプロモーターを含むコンストラクトをデザインし合成した。図２４に示すように、ＮＦＡＴプロモーターはＧＦＰをコードするポリヌクレオチドの前にあり、コンストラクトは、構成的プロモーターであるＥＦ１αによって駆動される下流のＣＡＲコード化ポリヌクレオチドを更に含む。ＧＦＰの誘導性発現を確認するために、ＧＦＰ発現を、ＰＭＡ／イオノマイシンによるＴＣＲ刺激に応じてＦＡＣＳによって評価した。図２５Ａ及び２５Ｂに示すように、刺激がＧＦＰの発現をトリガーした。この誘導性発現は、ＰＥＰｖＩＩＩとのインキュベーションにより阻害された。ＣＡＲをコードする誘導性ＢｉＴＥコンストラクトは、図２７Ａ及び２７Ｂに示すように、ＮＦＡＴプロモーターなどの誘導性プロモーターの下流にＢｉＴＥを位置させることによってデザインされる。
【０２６４】
実施例６  神経膠芽腫のためのＣＡＲ Ｔ細胞
共焦点顕微鏡を使用して、ＥＧＦＲを標的としたＢｉＴＥが上清中に放出され、ＣＤ３（エフェクターアーム）を介して形質導入（ｍｃｈｅｒｒｙ＋）及びバイスタンダー非形質導入（ｍｃｈｅｒｒｙ−）Ｔ細胞の両方に結合することを実証した。この実験では、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ形質導入細胞（ｍｃｈｅｒｒｙ＋）がビオチン化標的抗原に効果的に結合した（緑色、図２８、上段）；対照的に、非特異的ＢｉＴＥを分泌するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩは結合しなかった（図２８、中段）。ＣＡＲ．ＢｉＴＥの培養物ではＢｉＴＥがクラスターで結合した（赤／緑の共局在）が、培養物中のバイスタンダー非形質導入Ｔ細胞（ｍｃｈｅｒｒｙ−）もまたビオチン化抗原に結合した（図２８、下段）。
【０２６５】
次に、抗原刺激に応答するサイトカイン産生を分析した。ＥＧＦＲを発現するがＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しないヒト悪性神経膠腫細胞株であるＵ８７を用いたインビトロ刺激後に、異なるＣＡＲコンストラクトによるＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生のパターンを比較した。これは、ＢｉＴＥリダイレクトＴ細胞によって媒介されるＥＧＦＲ特異的サイトカイン産生を証明した（図２９）。この知見は、ＣＡＲ．ＢｉＴＥがインビトロでＵ８７に対する強力かつ特異的な抗腫瘍効果を媒介することができたＡＣＥＡ機器で実施された細胞傷害性アッセイと一致していた（図２９）。ＡＣＥＡトランズウェル実験では、これは主にバイスタンダー非形質導入Ｔ細胞のリダイレクトによるものであることが実証された（図２９Ｃ及び２９Ｄ）。ＥＧＦＲを発現するがＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しない頭蓋内神経膠腫（Ｕ２５１）のインビボモデルを使用すると（図３０Ａ）、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲの脳室内投与は、免疫不全マウスの脳に生着させた腫瘍に対してまた有効であることが判明した（図３０Ｂ）。
【０２６６】
この実験では、生物学的抗腫瘍効果を有する操作されたＢｉＴＥを分泌するＣＡＲ Ｔ細胞が首尾よく産生された。我々の知る限りでは、これが実証されたのはこれが初めてである。
【０２６７】
実施例７  材料と方法
［研究デザイン］
この研究の全体的な目的は、ＣＡＲとＢｉＴＥの両方のＴ細胞リダイレクト技術を組み合わせようとする新しい治療法の概念実証を提供することであった。ＣＡＲデザインと統合されたＣＡＲＴ．ＢｉＴＥコンストラクトの両方を、幾つかの腫瘍モデル、技法、及びアプローチを使用して試験した。これらは、三種の同所性脳腫瘍並びに毒性評価を助ける生着したヒト皮膚を含む五種の異なる異種モデルを用いた。腫瘍成長はキャリパーと生物発光イメージングによって測定し、細胞傷害性の三通りの異なるインビトロアッセイを使用した。
各実験は、様々な正常なヒトドナー由来のＴ細胞を用いて複数回実施した。
【０２６８】
［マウスと細胞株］
ＮＳＧマウスはジャクソン研究所から購入し、ＭＧＨがん研究センターで無菌条件下で飼育した。全ての実験は、施設内動物管理及び使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。ヒト神経膠腫細胞株Ｕ８７及びＵ２５１、並びに野生型の親Ｋ５６２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から取得し、供給者が概説する条件下に維持した。幾つかの場合、細胞は、レンチウイルス形質導入によってＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、又はＣＤ１９を発現するように操作した。示されている場合、細胞株を形質導入して、コメツキムシ緑（ＣＢＧ）ルシフェラーゼ又は高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を発現させ、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａでソートして、形質導入細胞のクローン集団を得た。患者由来のニューロスフェア培養物ＢＴ７４は、Ｓａｎｔｏｓｈ Ｋｅｓａｒｉ博士からの親切な贈り物であり、以前に記載されているように（Pandita等, Genes Chromosomes Cancer. 39:29-36, 2004）無血清ＥＦ２０培地で維持した。
【０２６９】
［ＣＡＲの構築］
二種の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥコンストラクトと三種の追加のＣＡＲコンストラクト（抗ＥＧＦＲ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及び抗ＣＤ１９）を合成し、ヒトＥＦ−１αプロモーターの制御下で第三世代レンチウイルスプラスミド骨格中にクローン化した。全てのＣＡＲ及びＣＡＲＴ．ＢｉＴＥコンストラクトは、細胞内４−１ＢＢ共刺激及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインとタンデムでＣＤ８膜貫通ドメインを含んでいた。ＢｉＴＥは、両方の配列にはＩｇκシグナルペプチドとポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）エレメントが隣接している野生型ＥＧＦＲとＣＤ１９に対してデザインした。リボソームスキップ部位を適切な位置に組み込んだ。全てのコンストラクトは、形質導入効率の評価を助けるために、蛍光レポーターであるｍＣｈｅｒｒｙをコードする導入遺伝子をまた含んでいた。
【０２７０】
［ＣＡＲ Ｔ細胞産生］
ヒトＴ細胞を、ＩＮＤ免除プロトコルの下でＭＧＨ血液バンクから購入した匿名のヒト正常ドナー白血球除去産物（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から精製した。細胞に、様々な第二世代のＣＡＲ Ｔ細胞コンストラクトに対応するレンチウイルスを形質導入した。簡潔に言えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して０日目にバルクのヒトＴ細胞を活性化し、１０％のＦＢＳと２０ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２を補填したＧｌｕｔａＭＡＸ及びＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞のレンチウイルス形質導入を１日目に実施し、特に明記しない限り、細胞は１０日目まで増殖することを許容し、その後、機能アッセイ前に液体窒素中での貯蔵に移した。全ての機能アッセイにおいて、ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞を、非形質導入であるが同じドナーと増殖からの培養及び活性化Ｔ細胞を使用して、形質導入効率について正規化した。所定の実験では、ＣＡＲ Ｔ細胞をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａでソートし、１０日目に形質導入されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性Ｔ細胞の純粋な集団を得た。
【０２７１】
［Ｔ細胞活性化と機能アッセイ］
ジャーカット（ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼ）レポーター細胞（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）に、２４時間の間、１：１のＥ：Ｔ比で腫瘍標的と共培養する前に、異なるＣＡＲコンストラクトを形質導入した。バイスタンダージャーカット活性化を、２４時間、１：１：１のＪ：Ｅ：Ｔ比の非形質導入ジャーカットレポーター細胞（Ｊ）並びに付随する一次ヒトＴ細胞及び腫瘍標的の共培養物で同様に評価した。次にルシフェラーゼ活性を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２ルミネセンスマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して評価した。腫瘍標的と共培養されたレスポンダー細胞からの無細胞上清をまた、製造元の指示に従ってＬｕｍｉｎｅｘアレイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ，ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ）を使用してサイトカイン発現について分析した。活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９を評価した実験では、ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞を、Ｅ：Ｔが１：１の照射Ｕ８７と共にインキュベートした。細胞を７２時間共培養し、ついでフローサイトメトリー分析に供した。ソートした形質導入細胞の増殖アッセイでは、エフェクターを１０日間増やし、ついでｍＣｈｅｒｒｙ陽性イベントでソートした。次に、照射されたＵ８７、Ｕ８７ｖＩＩＩ、又はＵ８７−ＣＤ１９を使用して細胞を刺激した。次に、ＵＴＤ、ソートされたＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞、及びソートされたＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞を、ＣＡＲ単独（ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９及びＵ８７ｖＩＩＩ）、ＢｉＴＥ単独（ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９及びＵ８７−ＣＤ１９）、又はＣＡＲとＢｉＴＥ（ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ及びＵ８７ｖＩＩＩ）で刺激した。エフェクター及び標的細胞を、１：１のＥ：Ｔで蒔いた。細胞を７日毎に計数し、７日間隔で刺激を加えて再び蒔いた。
【０２７２】
［細胞傷害性アッセイ］
単一時点の細胞傷害性アッセイでは、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ルシフェラーゼ発現腫瘍標的と共に、示されたＥ：Ｔ比で１８時間インキュベートした。その後、残存するルシフェラーゼ活性をＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２ルミネセンスマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）で測定した。特異的溶解パーセントは次式で計算した：％＝（（標的細胞単独のＲＬＵ−全ＲＬＵ）／（標的細胞単独のＲＬＵ））×１００。接着細胞株に対するリアルタイム細胞傷害性アッセイでは、細胞指数を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＳＰ機器（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した細胞インピーダンスの測定値として記録した。特異的溶解パーセントは、次式を使用して計算した：％＝（（ＵＴＤの細胞指数−ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞指数）／ＵＴＤの細胞指数）×１００。ＡＣＥＡ機器を使用するトランズウェル細胞傷害性アッセイでは、ＣＡＲコンストラクトを形質導入したジャーカットレポーター細胞を、０．４μｍのトランズウェルインサート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の上部ウェルで培養した。非形質導入Ｔ細胞を、示されたＥ：Ｔ比で腫瘍標的と共に下部ウェルで共培養した。時折、ＡＣＥＡ機器の故障によるあるウェルからの誤った読み取りが検閲されたが、データの解釈には影響しなかった。ニューロスフェアに対する試験では、細胞傷害性を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓによって記録された緑色の総平均面積で測定した。ニューロスフェアの形成を促進するエフェクターを添加する３日前にニューロスフェアを蒔いた。エフェクター細胞を３：１のＥ：Ｔで添加し、経時的にモニターし、ウェル当たり４画像を１０分毎に得た。
【０２７３】
［ＢｉＴＥの精製と定量］
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にそれぞれのＣＡＲコンストラクトを形質導入し、コンフルエンスになるまで培養した。細胞からの上清を収集し、ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に４℃において２４〜４８時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。ついで、上清・樹脂混合物をＮｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、２５ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。ついで、Ｈｉｓタグタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ溶出バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、２５０ｍＭのイミダゾール）で溶出させた。溶出後、製造元の指示に従ってＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセットフロートブイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、タンパク質をＰＢＳにバッファー交換した。示されている場合、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、タンパク質の更なる濃縮を実施した。無細胞、ＢｉＴＥ含有溶液のタンパク質濃度を、ＨｉｓタグＥＬＩＳＡ検出キット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して決定した。簡潔に述べると、ＢｉＴＥ産生細胞を２×１０５細胞／ｍＬで播種した。細胞を２週間増殖させ、上清を収集し、断続的に分析した。示されている場合、サンプルを、ＵＴＤのみを含むウェルから得られた平均値に正規化した。
【０２７４】
［ウエスタンブロッティング］
タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、製造元のプロトコルに従ってＮｏｖｅｘ ｉＢｌｏｔ２ニトロセルローストランスファースタック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｉＢｌｏｔ２ゲルトランスファーデバイス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してニトロセルロース膜に移した。簡潔に言えば、膜をＴＢＳＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中の５％の脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）からなるブロッキングバッファーで１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで１回洗浄し、抗Ｈｉｓタグ抗体（１：２５００、クローン３Ｄ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４℃において一晩プローブした。膜をＴＢＳＴで５分間３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に１時間インキュベートした。次に、膜をＴＢＳＴでそれぞれ５分間３回洗浄し、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で現像した。
【０２７５】
［フローサイトメトリーと免疫組織化学］
それぞれの抗原を標的とする次の抗体クローンを、示されている場合、フローサイトメトリー分析に使用した：ＥＧＦＲ（ＡＹ１３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｌ８Ａ４、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｈｉｓタグ（４Ｅ３Ｄ１０Ｈ２／Ｅ３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）、ＣＤ２５（２Ａ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６９（ＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＣＲ７（３Ｄ１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＤ−１（ＥＨ１２２８７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＩＭ−３（Ｆ３８−２Ｅ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＬＡＧ−３（３ＤＳ２２３Ｈ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。所定の実験では、精製したＢｉＴＥ、又は可溶性ＢｉＴＥを含む上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体での二次染色前に標的細胞と共にインキュベートした。一般に、細胞は室温において暗所で１５分間染色し、分析前に２％のＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。ライブとデッドの分離を確立するためにＤＡＰＩを添加した。免疫組織化学用の抗体クローンには次のものを含めた：ＥＤＴＡベースの抗原回収後に、それぞれ１：２００及び１：５０に希釈した、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｄ６Ｔ２Ｑ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＥＧＦＲ（Ｄ３８Ｂ１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。ホルマリン固定パラフィン包埋検体は、実験から単離するか、市販の組織マイクロアレイ（ＧＬ８０５ｃ、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ、ＢＮＣ１７０１１ａ、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ）の形で購入した。
【０２７６】
［顕微鏡イメージング］
Ｔ細胞の共焦点顕微鏡観察を、ＭＧＨがんセンター分子病理学共焦点コアのＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０倒立共焦点顕微鏡で実施し、Ｆｉｊｉ Ｉｓ Ｊｕｓｔ ＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。簡潔に言えば、活性化させ１０日間増殖させた形質導入Ｔ細胞を、濃度１μｇ／ｍＬでビオチン化ヒトＥＧＦＲ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で４０分間染色し、ついで顕微鏡分析の前に氷上で１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に１５分間インキュベートした。それ以外の場合は、細胞培養を、ＥＶＯＳ細胞イメージングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してまた視覚化させた。増殖を評価する実験においては、ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞を、１：１のＥ：ＴでｅＧＦＰを発現する照射Ｕ８７と１週間共培養した。
【０２７７】
［動物モデル］
腫瘍細胞を対数増殖期に回収し、ＰＢＳで２回洗浄した後、２５ゲージ針が取付けられた５０μＬのシリンジに入れた。定位フレームの補助下で、腫瘍細胞をブレグマの右側２ｍｍ、冠状縫合の頭蓋骨表面から４ｍｍの深さに生着させた。腫瘍細胞の数は、細胞培養に応じて変化させた。側腹部腫瘍又はヒト皮膚毒性のマウスモデルでは、エフェクター細胞を１００μＬの容量で尾静脈注入により全身注入した。脳室内に送達される場合、細胞はブレグマの左２ｍｍ、前０．３ｍｍに深さ３ｍｍで注入した。エフェクター細胞集団は、全ての実験に対して注入当たり１×１０６細胞を含むように正規化した。ついで、腹腔内基質注射後、Ａｍｉ ＨＴ光学イメージングシステム（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して生物発光により、腫瘍の進行を長軸方向に評価した。毒性研究では、匿名化された過剰のヒト皮膚を、インフォームドコンセントと施設内審査委員会による承認の下で、腹壁形成術中に健康なドナーから得た。およそ１ｃｍ×１ｃｍの皮膚サンプルをＮＳＧマウスの背に縫合し、少なくとも６週間治癒させた。生着した皮膚を、切除と組織学的分析の前に、最大２週間毎日モニターした。
【０２７８】
［統計的方法］
全ての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０ｃソフトウェアで実施した。データは、図の説明文に示しているように、検定によって決定された統計的有意差と共に平均±標準偏差（ＳＤ）又は平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。
【０２７９】
実施例８  神経膠芽腫（ＧＢＭ）のＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＣＡＲ Ｔ細胞とＣＡＲＴ．ＢｉＴＥのデザイン
神経膠芽腫（ＧＢＭ）は最も一般的な悪性脳腫瘍であり、また最も致命的である。ＧＢＭの現在の治療法には、外科的切除、放射線療法、及びテモゾロミド化学療法が含まれるが、これらは徐々のベネフィットのみを提供し、全身毒性と正常脳への損傷によって制限される（Imperato等, Annals of Neurology 28:818-822, 1990）。２０１７年に、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞が、Ｂ細胞性悪性疾患について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認され、それ以来、血液がんの治療に革命を起こした（Mullard等, Nat. Rev. Drug. Discov. 16:699, 2017）。ＧＢＭの最近の臨床試験では、幾つかの異なるＣＡＲが記載されており（O’Rourke等, Sci. Transl. Med. 9, 2017；Ahmed等, JAMA Oncol. 3:1094-1101, 2017；Brown等, N. Engl. J. Med. 375:2561-2569, 2016）、末梢注入されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は脳腫瘍に限局し、少なくとも一例では、頭蓋内投与されたＣＡＲ Ｔ細胞が後期の多巣性の大きい疾患の退縮を媒介した（上掲のBrown等）。しかし、ＧＢＭに対する臨床反応は、大部分はこれらの腫瘍内での異種性抗原発現と、単一の標的に向けられたＣＡＲ Ｔ細胞による治療後の抗原エスケープの出現のため、一貫しておらず又は持続性がない。
【０２８０】
ＧＢＭのおよそ３０％がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現し（Wikstrand等, Cancer Res. 57:4130-4140, 1997）、８０％以上がＥＧＦＲを発現する（Verhaak等, Cancer Cell 17:98-110, 2010）。ＧＢＭにおいてＥＧＦＲｖＩＩＩ変異が失われると、野生型ＥＧＦＲの増幅が維持される（O’Rourke等, Sci. Transl. Med. 9, 2017；Felsberg等, Clin. Cancer Res. 23:6846-6855, 2017）。ＥＧＦＲの発現は皮膚、肺、及び腸などの正常組織にも見出されるが、健康なヒト中枢神経系（ＣＮＳ）組織の８０のコアサンプルの分析においては、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（Uhlen等 Mol. Cell Proteomics 4:1920-1932, 2005）からの公開されている臓器特異的データと一致して、ＥＧＦＲは検出されなかった（図３１、表２）。この好ましい発現パターンを、この戦略を使用してＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原喪失のＧＢＭモデルの有効性を安全に増強できるという仮説を立てて、野生型ＥＧＦＲに対してＢｉＴＥを分泌するＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ）を作製することにより、利用した。
【０２８１】
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【０２８２】
異種移植片モデルにおいてＧＢＭ異種性と再発時の抗原エスケープの出現を再現するために、異種性ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を伴う腫瘍をＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスの側腹部に生着させた（図３２Ａ）。マウスを、非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで生着後２日目に尾静脈から静脈内（ＩＶ）処置した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞にコメツキムシ緑ルシフェラーゼ（ＣＢＧ−ｌｕｃ）を形質導入し、生物発光イメージングによる腫瘍進行のリアルタイム評価を可能にした。ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞をひとたび排除すると、側腹部生着により腫瘍増殖の同時のノギス測定が可能になった。この実験では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞のみにルシフェラーゼが形質導入されたため、イメージングシグナルはこの細胞集団でのみ検出される。静脈内（ＩＶ）非形質導入（ＵＴＤ）Ｔ細胞で処置されたマウスはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍の増殖を示したが、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞で処置されたマウスは、一部のマウスでは生物発光シグナルの抑止に反映される、様々な度合いの腫瘍増殖を示した（図３２Ｂ）。それにもかかわらず、これらのマウスでは、触知できる測定可能な腫瘍が進行した（図３２Ｃ）。採取した腫瘍の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析は、臨床試験の結果（上掲のO’Rourke等）と一致していた；すなわち、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩでの処置後のＥＧＦＲｖＩＩＩの喪失とＥＧＦＲ発現の維持を同時に伴う再発性の生存腫瘍（図３２Ｄ）。このようにして、複数抗原の標的化の理論的利点と、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで治療された患者のＧＢＭにおいて観察された細胞浸潤物の主要成分である（上掲のO’Rourke等）バイスタンダーＴ細胞を動員し活性化する能力をまた有している（Choi等, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110:270-275, 2013）ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥの概念が開発された（図３２Ｅ）。従来のＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍のみを標的としているが、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞はＥＧＦＲｖＩＩＩ陰性腫瘍を標的とするという追加の能力を有している。加えて、分泌されたＢｉＴＥは、残存腫瘍細胞に対してバイスタンダーＴ細胞をまたリダイレクトしうる。
【０２８３】
実施例９  異種性腫瘍のためのＣＡＲＴ．ＢｉＴＥの産生
どちらも、４−１ＢＢとＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ骨格に基づく、二種のＣＡＲＴ．ＢｉＴＥコンストラクトを産生した（図３３Ａ）。ＢｉＴＥは、野生型ＥＧＦＲ又はＣＤ１９に対してデザインしたが、後者は、モデル抗原全体での我々の知見を一般化するための陰性対照と概念実証の両方となる。ＢｉＴＥの配列の前にはＩｇκシグナルペプチドがあり、その後にポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）エレメントが続き、分泌産物の検出と精製に役立つ。ＢｉＴＥを分泌しなかった対照ＣＡＲは、同じ４−１ＢＢ及びＣＤ３ζ骨格並びにＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、及びＣＤ１９を標的とする単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）から構成した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーター遺伝子を、形質導入効率の評価を容易にするために全てのベクターに含めた。初代ヒトＴ細胞へのＣＡＲＴ．ＢｉＴＥベクターの効率的な遺伝子導入は、レンチウイルスベクターで達成した（図３３Ｂ）。
【０２８４】
ＢｉＴＥ ｃＤＮＡは、過去に記載された一般的な型に従って作製し（Choi等, Expert Opin. Biol. Ther. 11:843-853, 2011）、可動性グリシン−セリンリンカーによって架橋され、タンデムに翻訳された２つのｓｃＦｖを含めた（図３３Ｃ及び３３Ｄ）。従来通り、ＢｉＴＥの一アームは、ＣＤ３に結合することでＴ細胞にエンゲージし活性化するようにデザインされる一方、反対側の標的結合アームは腫瘍抗原に向けられている。各ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥベクターが形質導入されたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞の上清は、およそ５５ｋＤａの予想分子量でのウエスタンブロットによって証明されるように、ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲとＢｉＴＥ−ＣＤ１９の両方の成功裏の翻訳と分泌を実証した（図３３Ｅ）。レーンに１０μｇのタンパク質をロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗Ｈｉｓタグ抗体でのブロッティングに供した。分泌されたＢｉＴＥ産物はまた形質導入された初代ヒトＴ細胞からも成功裏に単離した；これらの培養物からの上清は、適切な同族抗原を発現するＫ５６２標的細胞に結合した。ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９及びＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞から単離されたＢｉＴＥは、それぞれＥＧＦＲ及びＣＤ１９を発現するＫ５６２に結合しなかったため、これは抗原特異的であることが確認された（図３３Ｆ）。予想通り、分泌されたＢｉＴＥは、その抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメインを介してＴ細胞に結合する能力をまた示した（図３３Ｇ）。ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞からの上清が濃縮されると検出が増強され、これはブリナツモマブなどの同じ抗ＣＤ３ ｓｃＦｖクローンを用いるＢｉＴＥと一致する知見である（Fajardo等, Cancer Res. 77:2052-2063）。
【０２８５】
次に、ヒトＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞によって産生されたＢｉＴＥの量は、競合ＥＬＩＳＡベースのイムノアッセイを使用して概算した。ＵＴＤ細胞は検出可能な分泌型Ｈｉｓタグタンパク質を産生しなかったが、可溶性ＢｉＴＥはＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞の上清において容易に測定され（５×１０５）、全ＢｉＴＥ濃度はおよそ１０ｐｇ／ｄの速度で経時的に増加した（図３３Ｈ）。臨床試験のための推定標的用量にスケーリングすると（例えば、およそ５×１０８の形質導入細胞）（上掲のO’Rourke等）、これは推定速度１０ｎｇ／ｄでＢｉＴＥ分泌を生じたことになる。重要なことに、ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲはカニクイザルにおいて毒性の試験がなされており、７０ｋｇの患者に対しておよそ８００μｇ／ｄの用量当量で安全であった（Lutterbuese等, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 107:12065-12610, 2010）；これは、ヒトにおいてＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞の全身注入から生じる予想ＢｉＴＥ分泌よりも５桁大きいと計算される。
【０２８６】
ＣＡＲ Ｔ細胞とＢｉＴＥを用いた免疫療法は、血液悪性腫瘍の患者に強力な抗腫瘍応答をもたらすが、ＧＢＭのような固形腫瘍では限られた成功しか収めていない。本研究では、ＣＡＲをＢｉＴＥと戦略的に組み合わせて、単一の遺伝子改変Ｔ細胞産物とするアプローチを開発した。このプラットフォームを使用して、抗原エスケープ、免疫抑制、Ｔ細胞消耗を含む、固形腫瘍の効果的な免疫療法に対する重要な障壁に対処できることが実証された。
【０２８７】
実施例１０  ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原喪失の設定におけるＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ機能
ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞を、ＢｉＴＥの翻訳と分泌の両方を行うように操作できることを実証したので、抗腫瘍免疫応答の媒介におけるＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞の機能的能力を次に決定した。最初に、候補コンストラクトを形質導入したジャーカットレポーターＴ細胞を産生し、インビトロでよく特徴付けられたＥＧＦＲｖＩＩＩ陰性、ＥＧＦＲ陽性神経膠腫細胞株に対する選択的活性化について評価した（図３４Ａ）。特に明記しない限り、全てのアッセイは三通り実施した（平均値±ＳＥＭが示される；独立ｔ検定、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。ＢｉＴＥのみの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを介して又はＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを通してオフターゲットの活性化を制御するために、我々は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９が形質導入された細胞を使用した。実際、Ｔ細胞の活性化は、ＢｉＴＥ−ＣＤ１９を分泌するＵＴＤ細胞又はＣＡＲ Ｔ細胞の何れかを含むウェルでは検出されなかった。対照的に、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲが形質導入されたＴ細胞は、ＧＢＭに対して有意で選択的な活性化を示した（図３４Ｂ）。初代ヒトＴ細胞を使用する類似の実験において、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞は、ＢｉＴＥ依存性で、ＥＧＦＲ特異的な形で神経膠腫細胞と培養すると、Ｔｈ１炎症性サイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを産生することがまた見出された（図３４Ｃ）。
【０２８８】
次に、抗原特異的な細胞傷害性応答を誘発するＣＡＲＴ．ＢｉＴＥの能力を試験した。標準の生物発光細胞傷害性アッセイを使用して、我々は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞がＥＧＦＲ陽性神経膠腫に対して高度に細胞傷害性でかつ特異的であることを証明した（図３５）。これらの結果は、リアルタイム評価をキャプチャするマイクロエレクトロニクスと経時的な細胞生存率の動態を統合するインピーダンスベースのプラットフォームを使用して再現した。これらのアッセイにおいては、標的ＥＧＦＲ陽性神経膠腫細胞株をエフェクターＴ細胞と共にインキュベートし、細胞指数（生存率）で表されるインピーダンスを縦軸方向に記録した。不可知論的ＣＡＲＴ対照（例えば、ＣＡＲＴ−ＣＤ１９、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及びＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９）又はＵＴＤと共培養されたウェルは全て類似の生存率動態を示したが、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞は、複数の神経膠腫細胞株に対して様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞生存率の急速な減少を媒介することが分かった（図３６Ａ）。幾つかの時点で細胞傷害性パーセントとして示した場合、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞は、陽性対照ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲと比較した場合でさえも、ＧＢＭ細胞に対して有意により効果的であった（図３６Ｂ）。より高度のＥＧＦＲ発現を伴う標的は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ又はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲの何れかが形質導入されたＴ細胞によってより効率的に溶解されたため、この効果は腫瘍細胞上のＥＧＦＲ発現の程度と相関していた（図３６Ｃ）。
【０２８９】
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）は、ＧＢＭにおけるトランスレーショナルリサーチの最近の焦点であり、脳腫瘍の遺伝的複雑性と特徴的な生物学的特徴を入念に再現していると考えられている。重要なことに、ＧＢＭ ＰＤＸは、生理学的に関連するＥＧＦＲコピー数と増幅レベルを維持することが特に示されている。１１を超える樹立されたＧＢＭ ＰＤＸニューロスフェアの研究において（Pandita等, Genes Chromosomes Cancer 39:29-36, 2004）、一腫瘍のみが増幅されたＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を含んでいた。その天然の二重抗原発現を考慮すると、このモデル（つまり、ＢＴ７４、以前はＧＢＭ６）がＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ評価の理想的なプラットフォームになると推論した。ＢＴ７４が確実にＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの両方の異種性発現を実証したことを確認した（図３７Ａ）。この異種性を強調して、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９が形質導入されたジャーカットレポーターＴ細胞を、培養中のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞のＣＡＲ媒介性認識と一致して−ＣＡＲ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲが形質導入されたものよりも有意に低い程度ではあるが−ＢＴ７４の存在下で活性化させた（図３７Ｂ）。
【０２９０】
ＰＤＸニューロスフェアは非付着性であり、よってインピーダンスに基づく生存率の測定が適用できないため、抗腫瘍細胞傷害性は生細胞の画像ベースの分析によって評価した。この系を使用して、経時的なＢＴ７４に対するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞の有意な抗腫瘍活性を実証した（図３７Ｃ）。このプラットフォームにより、ニューロスフェア自体の形態学的評価も可能になり、ＢｉＴＥ−ＣＤ１９又はＵＴＤ対照を分泌するものと比較して、ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲを分泌するＣＡＲ Ｔ細胞を含むウェルにおける選択的抗腫瘍効果を再び実証した（図３７Ｄ）。これらの観察を踏まえて、免疫不全マウスにおける同所性ＰＤＸに対するＣＡＲＴ．ＢｉＴＥの活性を評価するためにパイロット実験をデザインした。報告されている文献と一致して（Brown等, N. Engl. J. Med. 375:2561-2569, 2016；Priceman等, Clin. Cancer Res. 24:95-105, 2018；Choi等, J. Clin. Neurosci. 21:189-190, 2014）、ＣＡＲ Ｔ細胞の局所的な脳室内送達が、脳内の腫瘍を治療する場合に実現可能で安全で、全身送達よりも優れていることが見出された（図３８Ａ及び３８Ｂ）。インビボでＢＴ７４に対して試験した場合、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲの脳室内投与により、７日樹立脳内ＰＤＸの持続的な退縮が引き起こされた（図３９Ａ〜３９Ｃ）。ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９細胞で処置されたマウスもまた最終的に治療効果を示したが、これは実験の過程で後に生じ、振り返ってみると、ＢＴ７４がインビボで経時的に継代された場合にＥＧＦＲｖＩＩＩをアップレギュレートする能力を有しているかもしれないという報告と一致していた（Pandita等, Genes Chromosomes Cancer 39:29-36, 2004）。
【０２９１】
実施例１１  ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥはマウスのＥＧＦＲｖＩＩＩ陰性腫瘍に対して有効で安全である
ＢＴ７４でのＥＧＦＲｖＩＩＩの発現がマウスで変動することが判明したことから、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲのインビボでの有効性が、その同種抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩのＣＡＲ認識に依存性であったかどうか、又はＣＡＲエンゲージメントの非存在下で分泌されたＢｉＴＥがインビボで測定可能な抗腫瘍応答を検出するのに十分であったかを次に決定した。これを試験するために、ヒト神経膠腫細胞（Ｕ２５１）をＮＳＧマウスに同所性に生着させ、処置を進めた（図４０Ａ）。Ｕ２５１は、そのＥＧＦＲｖＩＩＩ発現の欠如とＥＧＦＲの比較的低い表面発現（図３６Ｃ）、並びにインビトロでのＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞による細胞死に対するより大きな耐性を考慮すると、有効性を試験する最も厳しい神経膠腫モデルの一つと考えられる（図３６Ａ及び３６Ｂ）。更に、他の細胞株と比較して、Ｕ２５１は、マウスに生着されたときのヒトＧＢＭの顕著な病理生物学的特徴を最も密接に反映するその能力について特に引用されている（Radaelli等 Histol. Histopathol. 24:879-891, 2009）。この異種移植モデルを使用して、我々は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞を注入した後、５日樹立神経膠腫の持続性のある退縮を証明した（図４０Ｂ及び４０Ｃ）。逆に、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＢｉＴＥ−ＣＤ１９を発現する細胞で処置されたマウスは、ＵＴＤ対照を受けたマウスに匹敵する進行性の腫瘍量を示した。
【０２９２】
分泌されたＢｉＴＥ−ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩが存在しない場合でも、ＧＢＭに対する抗腫瘍効果を媒介するのに必要かつ十分であったため、一つの潜在的な懸念は、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥが、野生型ＥＧＦＲを発現する正常なヒト組織において有意な標的上、腫瘍外の毒性をまた生じるかもしれないことである。しかし、形質導入されたＴ細胞からのＢｉＴＥ分泌が非常に低レベルであることを考えると（図３３Ｈ）、分泌されたＢｉＴＥによるＥＧＦＲの局所的標的化は、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲ Ｔ細胞による直接の免疫療法的標的化などの代替アプローチと比較して改善された安全性プロファイルをもたらす可能性があると仮定した。これを試験するために、内因性レベルでＥＧＦＲを発現するヒト組織に対する免疫応答のインビボ評価を可能にする、以前に公開された皮膚移植片毒性モデル（Johnson等, Sci. Transl. Med. 7:275ra222, 2015）を使用した。皮膚移植は、視覚化と分析のための採取の容易性のため、また皮膚反応がＥＧＦＲを標的とする幾つかのＦＤＡ承認治療法の主要な副作用であることから（Agero等, J. Am. Acad. Dermatol. 55:657-670, 2006）、選択した。
【０２９３】
ヒト皮膚をＮＳＧマウスの背に移植し、ＣＡＲ Ｔ細胞療法による処置の前に完全に治癒させた（図４０Ｄ）。セツキシマブの可変鎖に基づくＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ細胞は、皮膚毒性を誘導するための陽性対照となり、皮膚移植実験（上掲のJohnson等）及び臨床試験（上掲のO’Rourke等）において安全であることが以前に示されたが、ＣＤ１９ ＢｉＴＥを分泌するように改変されたＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＣＡＲ Ｔ細胞を陰性対照として使用した。全てのＴ細胞は、体循環へのＣＡＲ Ｔ細胞及び分泌ＢｉＴＥの薬物動態分布に起因するかもしれない毒性の感度を高めるために、頭蓋内ではなく静脈内に送達した。注入後最大２週間で皮膚サンプルを採取し、組織学的検査に供した。ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲで処置されたマウスは、その皮膚移植の真皮と表皮中に強いリンパ球浸潤を示した。ＩＨＣによる分析により、皮膚移植片対宿主病と一致して、強いＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤と、ケラチノサイトアポトーシスとＴＵＮＥＬ＋細胞の隣接領域が明らかになった（図４０Ｅ）。逆に、これらの兆候は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞で処置されたマウスでは見られず、１０の連続する高倍率視野で定量化した場合、対照と有意差はなかった（図４０Ｆ及び４０Ｇ）。これらの結果は、低レベルのＢｉＴＥを分泌するようにデザインされたＣＡＲに対して治療ウィンドウがあり、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞が全身投与された場合でも、健康な組織の抗原を標的とすることが安全である可能性を示唆している。
【０２９４】
実施例１２  ＣＡＲ Ｔ細胞によって分泌されるＢｉＴＥはバイスタンダーエフェクター活性を動員する
患者において、ＧＢＭ腫瘍にはベースラインで内因性Ｔ細胞が不定に浸潤し、これらの細胞の存在が、好ましい臨床転帰を予測することが示されている（Lohr等, Clin. Cancer Res. 17:4296-4308, 2011）。同様に、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を投与された患者の臨床試験では、腫瘍母地内の強力なバイスタンダーＴ細胞浸潤が実証された（上掲のO’Rourke等）。しかし、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）はしばしば腫瘍アゴニスト特異性を有し、がんとは全く無関係の広範なエピトープを認識する場合があることもまた示されている（Simoni等 Nature 557:575-579, 2018）。従って、これらの未修飾の内因性Ｔ細胞は、腫瘍特異的細胞傷害性キラーにリダイレクトされる可能性のある未開発のリソースである可能性がある（図３２Ｅ）。
【０２９５】
機構的には、分泌されたＢｉＴＥが、導入遺伝子を発現するように改変された細胞のみを動員していたのか、対照的に、研究と臨床使用の両方に対して全てのＣＡＲ Ｔ細胞調製物中に偶発的に存在しているバイスタンダーＴ細胞コンパートメントを主としてリダイレクトしていたのか、不明のままであった（図３３Ｂ）。分泌されたＢｉＴＥとバイスタンダーＴ細胞間の相互作用を具体的に特徴付けるために、共焦点顕微鏡を最初に使用して、培養物中のＣＡＲ Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞の両方におけるＥＧＦＲ特異的ＢｉＴＥの分布を視覚化した。以前のように、形質導入細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質の発現によって同定した（図３３Ａ）。加えて、ビオチン化されたＥＧＦＲを、この場合ＣＡＲの形態の膜貫通タンパク質として、又はＣＤ３のその結合部位の反対側のＢｉＴＥの未結合アームとして発現される、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖの高感度検出に使用した。特に明記しない限り、全てのアッセイは三通り実施した（平均値±ＳＥＭが示される；独立ｔ検定、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。予想通り、陽性対照ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ細胞は遊離ＥＧＦＲ抗原に成功裏に結合したことが見出された（図４１Ａ及び４１Ｂ；上段）。逆に、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９が形質導入された陰性対照Ｔ細胞は、そのＣＡＲ又は分泌されたＢｉＴＥ成分を通じてＥＧＦＲに対する特異性の兆候を示さなかった（図４１Ａ及び４１Ｂ；中段）。しかし、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲが形質導入された培養物では、形質導入されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞だけでなく、バイスタンダーの、ｍＣｈｅｒｒｙ陰性の、非形質導入細胞の表面にもクラスターで結合したＥＧＦＲ特異的ＢｉＴＥの証拠が見出された（図４１Ａ及び４１Ｂ；下段）。
【０２９６】
次に、分泌されたＢｉＴＥが腫瘍細胞に対するパラクリン免疫応答を増強する能力を、特にバイスタンダーコンパートメントから評価した。ＧＢＭと初代ヒトＴ細胞の共培養物にフローサイトメトリー分析を使用して、ＣＤ２５及びＣＤ６９の早期誘導によって示されるように、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲのみがｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞の活性化を媒介したことが見出された（図４１Ｃ）。予想通り、活性化はＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ細胞を含む共培養でも観察されたが、これはｍＣｈｅｒｒｙ陽性集団に限定され、これらの培養におけるバイスタンダー細胞は変化しなかった。バイスタンダーＴ細胞が非形質導入ジャーカットレポーターＴ細胞に置き換えられた追加の実験では、再びＢｉＴＥ−ＥＧＦＲを分泌するヒトＣＡＲ Ｔ細胞の存在下でのみ、抗原特異的活性化が実証された（図４１Ｄ）。重要なことに、アッセイ前は、標準的なＣＡＲ Ｔ細胞増殖中に典型的なように、これらのレポーター細胞は、ＢｉＴＥ分子が活発に産生されている条件下では培養されていない；従って、バイスタンダー活性化は、アッセイ中に分泌されたＢｉＴＥに特に起因する可能性がある。
【０２９７】
また評価されたのは、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥがバイスタンダーＴ細胞の機能的活性を誘発しうる度合いであり、これは、増殖、サイトカイン分泌、抗腫瘍細胞傷害性などのパラメーターによって測定した。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性のＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ細胞が培養中にその標的抗原に遭遇すると無差別に増殖したのに対し、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲが形質導入された培養物中における有意な割合の増殖が、バイスタンダーＴ細胞コンパートメント内で観察されたことが分かった（図４１Ｅ及び４１Ｆ）。最後に、可溶性ＢｉＴＥがチャンバー間を自由に通過できるようにしながら、遺伝子改変細胞とＵＴＤエフェクターの間に物理的障害を提供する、０．４μｍのトランズウェルシステムを使用した（図４１Ｇ）。この戦略により、非特異的ＣＡＲ Ｔ細胞と培養中の腫瘍との間の直接的な細胞間相互作用又は予期しない活動に関連する変数が排除された。このシステムを使用して、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞によって産生されたＢｉＴＥがトランズウェル膜を横切って成功裏に移動し、ＧＢＭの存在下でＴｈ１サイトカイン産生と未改変Ｔ細胞からの抗原特異的細胞傷害性を媒介することが分かった（図４１Ｈ及び４１Ｉ）。この効果は、結果がＣＤ１９を発現する標的細胞の設定においてＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＣＤ１９で再現されたという点でも一般化できた。特に、抗腫瘍細胞傷害性は、ＵＴＤエフェクター細胞が高純度のフローサイトメトリー細胞選別制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に置き換えられた場合にも観察された（図４２）。この知見は、ＢｉＴＥがＴｒｅｇさえグランザイム−パーフォリン経路を介して抗腫瘍性細胞傷害性キラーに変換する能力を有していることを示す以前の研究と一致している（Choi等, Cancer Immunol. Res. 1:163, 2013）。ＴｒｅｇはＧＢＭ患者における非常に抑制的な細胞集団であり、実際にはＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで処置された患者のＴＩＬにおいて過剰提示されていた（上掲のO’Rourke等）。従って、これらの知見は、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥが抗腫瘍免疫を増強し、Ｔ細胞拒絶からの腫瘍エスケープを緩和しうる追加の機序を強調している。
【０２９８】
実施例１３  ＣＡＲとＢｉＴＥによる同時リダイレクトにより、好ましいＴ細胞分化と表現型が生じる
細胞の僅か１０％においてＥＧＦＲｖＩＩＩを発現している異種性の脳腫瘍モデルにおいて、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ細胞を注入すると、全てのマウスにおいて完全かつ永続的な応答が得られた（図４３Ａ〜４３Ｃ）。この設定では、ＣＡＲＴ．ＢｉＴＥ細胞は、そのＣＡＲと分泌された結合ＢｉＴＥの両方によって活性化される可能性がある。ＣＡＲとＢｉＴＥによる同時活性化の効果を理解するために、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、９７．５％を超える純度で幾つかのＣＡＲ Ｔ細胞培養物の形質導入されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性亜集団を単離した（図４３Ｄ）。この工程は、後続の分析におけるＣＡＲ陰性バイスタンダー細胞の寄与を大部分において除外するために実施した。このアプローチを使用して、ＣＡＲを発現するように形質導入されたＴ細胞は、ＢｉＴＥ媒介性の細胞傷害性を通じて標的腫瘍細胞を効率的に溶解する能力を維持していることが実証された（図４３Ｅ）。これは、それぞれＥＧＦＲ及びＣＤ１９を発現する対応する標的腫瘍株に対して試験した場合、ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ及びＢｉＴＥ−ＣＤ１９の両方に当てはまった。加えて、ＣＡＲとＢｉＴＥの両方を介してリダイレクトされたＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩとＥＧＦＲの両方を発現するＵ８７ｖＩＩＩに対するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ．ＢｉＴＥ−ＥＧＦＲ）は、ＣＡＲ単独と比較して同等の細胞傷害性活性を示した（図４３Ｆ）。これらのデータは、ＣＡＲとＢｉＴＥが必ずしもプラットフォーム間で競合、逆効果、又は免疫優勢を生じることなく一緒にシグナル伝達できるかもしれないことの初期の証拠をもたらした。
【０２９９】
ＣＡＲ形質導入細胞の文脈におけるＢｉＴＥ活性を更に特徴付けるために、刺激の各態様をまた、Ｔ細胞増殖を開始し維持するその能力について比較した。特に、ＢｉＴＥはＣＤ３刺激によるＴ細胞の活性化に限定されているが、ＣＡＲ Ｔ細胞は、細胞内ＣＤ３ζとこの場合の４−１ＢＢなどの強力な共刺激ドメインの両方を発現するように操作されている。従って、デザイン上、ＣＡＲは、ヘッドトゥーヘッドで測定したときに所定の機能パラメーターを測定するアッセイにおいて、ＢｉＴＥよりも優れているかもしれないと推測した。実際、照射された標的細胞による連続的な抗原刺激後、ＢｉＴＥ刺激を受けた選別された形質導入細胞の増殖はおよそ１２日後にプラトーになったが、ＣＡＲによる反復抗原刺激は１か月以上対数増殖を維持した（図４３Ｇ）。興味深いことに、ＣＡＲとＢｉＴＥを介して同時に活性化すると、ＢｉＴＥ単独で観察された増殖欠陥はほぼ完全に排除された。
【０３００】
Ｔ細胞は様々な分化状態にあり、それぞれが独自の機能的能力を備えている。臨床研究では、ＢｉＴＥは高分化型エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の増殖を選択的に促進することが示されている（Bargou等, Science 321:974-977, 2008）；しかし、ＣＡＲＴの優れた結果は、低分化の幹細胞メモリー（ＴＳＣＭ）又は中央メモリー（ＴＣＭ）サブタイプを使用して達成されている（Sadelain等, Nature 545:423-431, 2017）。これらの低分化表現型は、亢進された増殖と持続、自己複製の能力、及びより短い寿命のＴＥＭを産生する能力に関連している。従って、各モダリティによる連続的な抗原刺激中に増殖で観察された差異（図４３Ｇ）もまた別個のＴ細胞分化パターンをもたらすかもしれないと仮定した。実際、我々のデータ並びに以前の研究と一致して、ＢｉＴＥ単独で長期の刺激を受けているＣＡＲ Ｔ細胞はＴＥＭ細胞を優先的に濃縮し、ＣＡＲ単独又はＢｉＴＥを含むＣＡＲの何れかによって活性化されたものは、低分化のＴＣＭコンパートメントを濃縮するように見えた（図４３Ｈ）。最後に、一般的な低応答性、限られた増殖能力、及び重度の障害のあるエフェクター機能を特徴とする状態であるＴ細胞の消耗を示す表面マーカーを特徴付けた。ＢｉＴＥ単独による刺激は、消耗したＴ細胞に関連する幾つかの免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３及びＬＡＧ−３）の発現を上方制御することが見出された；しかし、ＣＡＲとＢｉＴＥを組み合わせると、Ｔ細胞枯渇への極性化が逆転した（図４３Ｉ）。これらの知見は、ＣＡＲ Ｔ細胞における消耗の軽減に対する特に４−１ＢＢを介しての共刺激の好ましい効果を実証する以前の研究（Long等, Nat. Med. 21:581-590, 2015）を実証しており、これらの利点は他の抗原に対するＢｉＴＥとの併用療法に拡張されるかもしれないことをまた示唆している。我々の知見は、競合する技術であると典型的には考えられるＣＡＲとＢｉＴＥが、如何にして互いに補完するように使用できるかについての新しい洞察を明らかにする。
【０３０１】
実施例１４  タンデムキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と分泌型ＢｉＴＥの組み合わせで複数の抗原を標的とするように遺伝子改変させた免疫細胞
異種性標的抗原発現と標的抗原を欠く腫瘍の増殖は、ＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用する免疫療法に対するがんの応答性を制限する可能性がある。例えば、神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びエフリンを含む、効果的な抗腫瘍免疫の標的とされうる表面抗原を発現することが知られている極めて予後不良のがんである。しかし、これまでに、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＩＬ−１３Ｒα２などの単一抗原に対するＣＡＲ Ｔ細胞へのＧＢＭの応答は、部分的には抗原エスケープのために、限られている。
【０３０２】
この問題に対処するために、二以上の抗原結合ドメイン（例えば、二以上の単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）領域、二以上のリガンド、又は一又は複数のｓｃＦｖと一又は複数のリガンドの組み合わせ）から構成される第二世代ＣＡＲをデザインした。そのようなＣＡＲは、二以上の異なる抗原、例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩとＩＬ−１３Ｒα２にエンゲージすることによって活性化される能力を有する。このアプローチを通じて達成可能な応答の幅を更に広げ、抗原エスケープを介して腫瘍進行から保護するために、免疫細胞を追加の抗原、例えば、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２を標的とする二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ）をまた分泌するように免疫細胞を操作することにより、免疫細胞の追加の特異性又は標的を提供することができる。
【０３０３】
ＩＬ−１３Ｒα２とＥＧＦＲｖＩＩＩに対して向けられたタンデムＣＡＲコンストラクトを、何れかの単一抗原に対して向けられた２つの対照ＣＡＲと共にデザインした（図４４Ａ〜４４Ｃ）。タンデムＣＡＲ（コンストラクト１２）は、ＥＦ１αプロモーター、ＩＬ−１３リガンド（ＩＬ−１３ゼータカイン）、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ζドメイン、Ｔ２Ａペプチド配列、及びレポーター遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）を含む。コンストラクトは、例えば、Ｔ２Ａペプチド又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、ＢｉＴＥ（例えば、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２を標的とするＢｉＴＥ）を更にコードするポリシストロニックベクターでありうる。そのようなポリシストロニックベクターは、例えば、実施例８に記載された方法に従って及び／又は実施例５及び１０に記載されたコンストラクトと同様にしてデザインできる。他の例では、コンストラクト１２のようなタンデムＣＡＲコンストラクトを形質導入したＣＡＲ−Ｔ細胞には、ＢｉＴＥの発現のために別々のベクターを形質導入することができる。
【０３０４】
異種性神経膠芽腫のインビトロモデルを、Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞とＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するように形質導入されたＵ８７細胞（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を使用して開発した。フローサイトメトリーで評価して、ＩＬ１３Ｒα２の発現を、Ｕ８７及びＵ８７ｖＩＩＩ神経膠芽腫の両方で確認した（図４５Ａ）。次に、非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）、抗ＩＬ−１３Ｒα２ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞、又はタンデム抗ＩＬ−１３Ｒα２／抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイを実施した。図４５Ｂに示されるように、各ＣＡＲ Ｔ細胞集団は、標的細胞集団（１：１の比率のＵ８７及びＵ８７ｖＩＩＩ神経膠芽腫細胞）の細胞傷害性を誘導し、１０：１と３：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で単一抗原を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、特異的溶解において、タンデム型抗ＩＬ−１３Ｒα２／抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞が最も高い効果を示した。
【０３０５】
要約すると、我々は、追加の抗原、例えばＥＧＦＲ又はＨＥＲ２を標的とする二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ）を分泌するように操作できる、二種以上の別個の抗原、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩとＩＬ−１３Ｒα２を標的とするタンデムＣＡＲを開発した。この技法は、他の表面腫瘍抗原、例えば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６などを標的とする他のタンデムＣＡＲ又はＢｉＴＥに拡張できる。例えば、タンデムＣＡＲは、ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＳＭＡとＰＳＣＡ；ＣＤ１９とＣＤ７９ｂ；ＣＤ７９ｂとＣＤ３７；ＣＤ１９とＣＤ３７；ＥｐｈＡ１とＨｅｒ２；ＥｐｈＡ１とメソテリン；Ｈｅｒ２とメソテリン、ＭＵＣ１とＭＵＣ１６；並びに前述の腫瘍抗原の他の組み合わせを標的とするようにデザインできる。
【０３０６】
実施例１５  配列情報
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：１のアミノ酸１−２１；配列番号：２）；抗ＧＡＲＰカメリド（配列番号：１のアミノ酸２２−１２８；配列番号：３）；ＣＤ８ヒンジ／ＴＭドメイン（配列番号：１のアミノ酸１２９−１９７；配列番号：４）；４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：１のアミノ酸１９８−２３９；配列番号：５）；及びＣＤ３ζ（配列番号：１のアミノ酸２４０−３５１；配列番号：６）を含む、抗ＧＡＲＰ ＣＡＲ−コンストラクト１：ＣＤ８シグナル配列−抗ＧＡＲＰ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号：１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＮＩＬＩＹＧＡＳＲＬＫＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＴＬＴＩＳＧＬＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＹＡＳＶＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：１）
【０３０７】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：１のアミノ酸１−２１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号：２）
【０３０８】
抗ＧＡＲＰカメリド（配列番号：１のアミノ酸２２−１２８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＮＩＬＩＹＧＡＳＲＬＫＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＴＬＴＩＳＧＬＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＹＡＳＶＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫ（配列番号：３）
【０３０９】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭドメイン（配列番号：１のアミノ酸１２９−１９７）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：４）
【０３１０】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：１のアミノ酸１９８−２３９）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：５）
【０３１１】
ＣＤ３ζ（配列番号：１のアミノ酸２４０−３５１）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：６）
【０３１２】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：７のアミノ酸１−２１；配列番号：８）、抗ＬＡＰｓｃＦｖ（Ｈ−Ｌ）（配列番号：７のアミノ酸２２−３０７；配列番号：９）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭドメイン（配列番号：７のアミノ酸３０８−３７６；配列番号：１０）、４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：７のアミノ酸３７７−４１８；配列番号：１１）、及びＣＤ３ζ（配列番号：７のアミノ酸４１９−５３０；配列番号：１２）を含む、抗ＬＡＰ ＣＡＲ（Ｈ−Ｌ）−コンストラクト２：ＣＤ８シグナル配列−抗ＬＡＰ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号：７）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＭＫＬＷＬＮＷＩＦＬＶＴＬＬＮＤＩＱＣＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳＷＶＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＦＩＲＮＫＰＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＶＬＲＡＥＤＳＡＴＹＹＣＡＲＹＴＧＧＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＭＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＬＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＡＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＤＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：７）
【０３１３】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：７のアミノ酸１−２１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号：８）
【０３１４】
抗ＬＡＰｓｃＦｖ（Ｈ−Ｌ）（配列番号：７のアミノ酸２２−３０７）
ＭＫＬＷＬＮＷＩＦＬＶＴＬＬＮＤＩＱＣＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳＷＶＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＦＩＲＮＫＰＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＶＬＲＡＥＤＳＡＴＹＹＣＡＲＹＴＧＧＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＭＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＬＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＡＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＤＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：９）
【０３１５】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭドメイン（配列番号：７のアミノ酸３０８−３７６）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：１０）
【０３１６】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：７のアミノ酸３７７−４１８）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：１１）
【０３１７】
ＣＤ３ζ（配列番号：７のアミノ酸４１９−５３０）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：１２）
【０３１８】
ＣＤ８シグナル（配列番号：１３のアミノ酸１−２１；配列番号：１４）、抗ＬＡＰｓｃＦｖ（Ｌ−Ｈ）（配列番号：１３のアミノ酸２２−３０７；配列番号：１５）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：１３のアミノ酸３０８−３７６；配列番号：１６）、４−１Ｂ ＩＣＤ（配列番号：１３のアミノ酸３７７−４１８；配列番号：１７）、及びＣＤ３ζ（配列番号：１３のアミノ酸４１９−５３０；配列番号：１８）を含む、抗ＬＡＰ ＣＡＲ（Ｌ−Ｈ）−コンストラクト３：ＣＤ８シグナル配列−抗ＬＡＰ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号：１３）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＭＭＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＬＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＡＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＤＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＫＬＷＬＮＷＩＦＬＶＴＬＬＮＤＩＱＣＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳＷＶＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＦＩＲＮＫＰＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＶＬＲＡＥＤＳＡＴＹＹＣＡＲＹＴＧＧＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：１３）
【０３１９】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：１３のアミノ酸１−２１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号：１４）
【０３２０】
抗ＬＡＰｓｃＦｖ（Ｌ−Ｈ）（配列番号：１３のアミノ酸２２−３０７）
ＭＭＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＬＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＡＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＤＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＫＬＷＬＮＷＩＦＬＶＴＬＬＮＤＩＱＣＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳＷＶＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＦＩＲＮＫＰＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＶＬＲＡＥＤＳＡＴＹＹＣＡＲＹＴＧＧＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号：１５）
【０３２１】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：１３のアミノ酸３０８−３７６）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：１６）
【０３２２】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：１３のアミノ酸３７７−４１８）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：１７）
【０３２３】
ＣＤ３ζ（配列番号：１３のアミノ酸４１９−５３０）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：１８）
【０３２４】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：１９のアミノ酸１−２１；配列番号：２０）、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ（配列番号：１９のアミノ酸２２−２６７；配列番号：２１）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：１９のアミノ酸２６８−３３６；配列番号：２２）、４−１ＢＢ（配列番号：１９のアミノ酸３３７−３７８；配列番号：２３）、ＣＤ３ζ（配列番号：１９のアミノ酸３７９−４９０；配列番号：２４）、２Ａ開裂配列（配列番号：１９のアミノ酸４９４−５１５；配列番号：３１）、Ｉｇκリーダー（配列番号：１９のアミノ酸５１９−５３９；配列番号：３２）、及び抗ＧＡＲＰカメリド（配列番号：１９のアミノ酸５４０−６４６；配列番号：２５）を含む、抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ分泌抗ＧＡＲＰカメリド−コンストラクト４：ＣＤ８シグナル配列−抗ＥＧＦＲ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−抗ＧＡＲＰカメリド（配列番号：１９）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＰＧＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲＴＡＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＮＩＬＩＹＧＡＳＲＬＫＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＴＬＴＩＳＧＬＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＹＡＳＶＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＨＨＨＨＨＨＳＧ（配列番号：１９）
【０３２５】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：１９のアミノ酸１−２１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号：２０）
【０３２６】
抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ（配列番号：１９のアミノ酸２２−２６７）
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：２１）
【０３２７】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：１９のアミノ酸２６８−３３６）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：２２）
【０３２８】
４−１ＢＢ（配列番号：１９のアミノ酸３３７−３７８）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：２３）
【０３２９】
ＣＤ３ζ（配列番号：１９のアミノ酸３７９−４９０）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：２４）
【０３３０】
２Ａ開裂配列（配列番号：１９のアミノ酸４９４−５１５；配列番号：３１）
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：３１）
【０３３１】
Ｉｇκシグナル配列（配列番号：１９のアミノ酸５１９−５３９；配列番号：３２）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号：３２）
【０３３２】
抗ＧＡＲＰカメリド（配列番号：１９のアミノ酸５４０−６４６；配列番号：２５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＮＩＬＩＹＧＡＳＲＬＫＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＴＬＴＩＳＧＬＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＹＡＳＶＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫ（配列番号：２５）
【０３３３】
３Ｃ１０ｓｃＦｖ（配列番号：２６のアミノ酸１−２４３；配列番号：２７）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：２６のアミノ酸２４４−３１２；配列番号：２８）、４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：２６のアミノ酸３１３−３５４；配列番号：２９）、ＣＤ３ζ（配列番号：２６のアミノ酸３５５−４６６；配列番号：３０）、Ｐ２Ａ（配列番号：２６のアミノ酸４６７−４８８；配列番号：３１）、Ｉｇκシグナル配列（配列番号：２６のアミノ酸４９１−５１１；配列番号：３２）、セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号：２６のアミノ酸５１２−７５２；配列番号：３３）、ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：２６のアミノ酸７５８−１０００；配列番号：３４）を含む、コンストラクト５−３Ｃ１０（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ ＩＣＤ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−Ｉｇκシグナル配列−セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）ｓｃＦｖ−ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ−タグ（配列番号：２６）
ＥＩＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＫＱＲＴＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＴＳＳＮＴＶＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＰＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＭＤＶＶＭＴＱＳＰＬＴＬＳＶＡＩＧＱＳＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＰＲＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号：２６）
【０３３４】
３Ｃ１０（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ（配列番号：２６のアミノ酸１−２４３）
ＥＩＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＫＱＲＴＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＴＳＳＮＴＶＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＰＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＭＤＶＶＭＴＱＳＰＬＴＬＳＶＡＩＧＱＳＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：２７）
【０３３５】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：２６のアミノ酸２４４−３１２）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：２８）
【０３３６】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：２６のアミノ酸３１３−３５４）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：２９）
【０３３７】
ＣＤ３ζ（配列番号：２６のアミノ酸３５５−４６６）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：３０）
【０３３８】
Ｐ２Ａ（配列番号：２６のアミノ酸４６７−４８８）
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：３１）
【０３３９】
Ｉｇκシグナル配列（配列番号：２６のアミノ酸４９１−５１１）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号：３２）
【０３４０】
セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）ｓｃＦｖ（配列番号：２６のアミノ酸５１２−７５２）
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号：３３）
【０３４１】
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：２６のアミノ酸７５８−１０００）
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：３４）
【０３４２】
２１７３ｓｃＦｖ（配列番号：３５のアミノ酸１−２４６；配列番号：３６）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：３５のアミノ酸２４７−３１５；配列番号：３７）、４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：３６のアミノ酸３１６−３５７；配列番号：３８）、ＣＤ３ζ（配列番号：３５のアミノ酸３５８−４６９；配列番号：３９）、Ｐ２Ａ（配列番号：３５のアミノ酸４７０−４９１；配列番号：４０）、Ｉｇκシグナル配列（配列番号：３５のアミノ酸４９４−５１４；配列番号：４１）、セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号：３５のアミノ酸５１５−７５５；配列番号：４２）、及びＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：３５のアミノ酸７６１−１００３；配列番号：４３）を含む、コンストラクト６−２１７３（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ ＩＣＤ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−Ｉｇκシグナル配列−セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）ｓｃＦｖ−ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ−タグ（配列番号：３５）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＰＲＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号：３５）
【０３４３】
２１７３（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ（配列番号：３５のアミノ酸１−２４６）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：３６）
【０３４４】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：３５のアミノ酸２４７−３１５）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：３７）
【０３４５】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：３５のアミノ酸３１６−３５７）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：３８）
【０３４６】
ＣＤ３ζ（配列番号：３５のアミノ酸３５８−４６９）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：３９）
【０３４７】
Ｐ２Ａ（配列番号：３５のアミノ酸４７０−４９１）
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：４０）
【０３４８】
Ｉｇκシグナル配列（配列番号：３５のアミノ酸４９４−５１４）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号：４１）
【０３４９】
セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）ｓｃＦｖ（配列番号：３５のアミノ酸５１５−７５５）
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号：４２）
【０３５０】
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：３５のアミノ酸７６１−１００３）
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：４３）
【０３５１】
２１７３ｓｃＦｖ（配列番号：４４のアミノ酸１−２４６；配列番号：４５）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：４４のアミノ酸２４７−３１５；配列番号：４６）、４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：４４のアミノ酸３１６−３５７；配列番号：４７）、ＣＤ３ζ（配列番号：４４のアミノ酸３５８−４６９；配列番号：４８）、Ｐ２Ａ（配列番号：４４のアミノ酸４７０−４９１；配列番号：４９）、Ｉｇκシグナル配列（配列番号：４４のアミノ酸４９４−５１４；配列番号：５０）、ＣＤ１９ｓｃＦｖ（配列番号：４４のアミノ酸５１５−７６４；配列番号：５１）、ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：４４のアミノ酸７７０−１０１２；配列番号：５２）を含む、コンストラクト７−２１７３（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ ＩＣＤ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−Ｉｇκシグナル配列−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ−タグ（配列番号：４４）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＰＲＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＥＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号：４４）
【０３５２】
２１７３（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ（配列番号：４４のアミノ酸１−２４６）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：４５）
【０３５３】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：４４のアミノ酸２４７−３１５）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：４６）
【０３５４】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：４４のアミノ酸３１６−３５７）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：４７）
【０３５５】
ＣＤ３ζ（配列番号：４４のアミノ酸３５８−４６９）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：４８）
【０３５６】
Ｐ２Ａ（配列番号：４４のアミノ酸４７０−４９１）
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：４９）
【０３５７】
Ｉｇκシグナル配列（配列番号：４４のアミノ酸４９４−５１４）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号：５０）
【０３５８】
抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（配列番号：４４のアミノ酸５１５−７６４）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＥＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号：５１）
【０３５９】
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：４４のアミノ酸７７０−１０１２）
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：５２）
【０３６０】
Ｉｇκシグナル配列（配列番号：５３のアミノ酸１−２１；配列番号：５４）、セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号：５３のアミノ酸２２−２６２；配列番号：５５）、ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：５３のアミノ酸２６８−５１０；配列番号：５６）、２１７３ｓｃＦｖ（配列番号：５３のアミノ酸５１７−７６２；配列番号：５７）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：５３のアミノ酸７６３−８３１；配列番号：５８）、４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：５３のアミノ酸８３２−８７３；配列番号：５９）、ＣＤ３ζ（配列番号：５３のアミノ酸８７４−９８５；配列番号：６０）を含む、コンストラクト８−（ＮＦＡＴ応答エレメント）−Ｉｇκシグナル配列−セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）ｓｃＦｖ−ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｈｉｓタグ−（ＥＦ１ａプロモーター）−２１７３（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ ＩＣＤ−ＣＤ３ζ（配列番号：５３）
（ＮＦＡＴ応答エレメント）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ
（ＥＦ１ａプロモーター）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：５３）
（注：上記の二つのポリペプチドは便宜上単一の配列識別子で示しているが、ＣＡＲ及びＢｉＴＥ成分は、二つの別個のプロモーターのため、別個に作製できることを理解すべきである；上記を参照のこと）
【０３６１】
Ｉｇκシグナル配列（配列番号：５３のアミノ酸１−２１）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号：５４）
【０３６２】
セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）ｓｃＦｖ（配列番号：５３のアミノ酸２２−２６２）
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号：５５）
【０３６３】
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：５３のアミノ酸２６８−５１０）
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：５６）
【０３６４】
２１７３（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ（配列番号：５３のアミノ酸５１７−７６２）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：５７）
【０３６５】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：５３のアミノ酸７６３−８３１）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：５８）
【０３６６】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：５３のアミノ酸８３２−８７３）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：５９）
【０３６７】
ＣＤ３ζ（配列番号：５３のアミノ酸８７４−９８５）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：６０）
【０３６８】
（ＮＦＡＴ応答エレメント）、Ｉｇκシグナル配列（配列番号：６１のアミノ酸１−２１；配列番号：６２）、ＣＤ１９ｓｃＦｖ（配列番号：６１のアミノ酸２２−２７１；配列番号：６３）、ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：６１のアミノ酸２７７−５１９；配列番号：６４）、２１７３ｓｃＦｖ（配列番号：６１のアミノ酸５２６−７７１；配列番号：６５）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：６１のアミノ酸７７２−８４０；配列番号：６６）、４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：６１のアミノ酸８４１−８８２；配列番号：６７）、ＣＤ３ζ（配列番号：６１のアミノ酸８８３−９９４；配列番号：６８）を含む、コンストラクト９−（ＮＦＡＴ応答エレメント）−ＩｇＫシグナル配列−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｈｉｓタグ−（ＥＦ１ａプロモーター）−２１７３（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ ＩＣＤ−ＣＤ３ζ（配列番号：６１）
（ＮＦＡＴ応答エレメント）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＥＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ
（ＥＦ１ａプロモーター）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：６１）
（注：上記の二つのポリペプチドは便宜上単一の配列識別子で示しているが、ＣＡＲ及びＢｉＴＥ成分は、二つの別個のプロモーターのため、別個に作製できることを理解すべきである；上記を参照のこと）
【０３６９】
Ｉｇκシグナル配列（配列番号：６１のアミノ酸１−２１）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ（配列番号：６２）
【０３７０】
抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（配列番号：６１のアミノ酸２２−２７１）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＥＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号：６３）
【０３７１】
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（配列番号：６１のアミノ酸２７７−５１９）
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号：６４）
【０３７２】
２１７３（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ｓｃＦｖ（配列番号：６１のアミノ酸５２６−７７１）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：６５）
【０３７３】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：６１のアミノ酸７７２−８４０）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：６６）
【０３７４】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：６１のアミノ酸８４１−８８２）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：６７）
【０３７５】
ＣＤ３ζ（配列番号：６１のアミノ酸８８３−９９４）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：６８）
【０３７６】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：６９のアミノ酸１−２１；配列番号：７０）、抗ＧＡＲＰｓｃＦｖ（Ｈ−Ｌ）（配列番号：６９のアミノ酸２２−２７４；配列番号：７１）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：６９のアミノ酸２７５−３４３；配列番号：７２）、４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：６９のアミノ酸３４４−３８５；配列番号：７３）、ＣＤ３ζ（配列番号：６９のアミノ酸３８６−４９７；配列番号：７４）を含む、コンストラクト１０−ＣＤ８シグナル配列−抗ＧＡＲＰｓｃＦｖ（Ｈ−Ｌ）−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ ＩＣＤ−ＣＤ３ζ（配列番号：６９）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＶＱＬＶＱＰＧＡＥＬＲＮＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＲＦＴＳＹＹＩＤＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＤＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＦＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＶＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＮＩＬＩＹＧＡＳＲＬＫＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＴＬＴＩＳＧＬＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＹＡＳＶＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：６９）
【０３７７】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：６９のアミノ酸１−２１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号：７０）
【０３７８】
抗ＧＡＲＰｓｃＦｖ（Ｈ−Ｌ）（配列番号：６９のアミノ酸２２−２７４）
ＥＶＱＬＶＱＰＧＡＥＬＲＮＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＲＦＴＳＹＹＩＤＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＤＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＦＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＶＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＮＩＬＩＹＧＡＳＲＬＫＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＴＬＴＩＳＧＬＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＹＡＳＶＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫ（配列番号：７１）
【０３７９】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：６９のアミノ酸２７５−３４３）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：７２）
【０３８０】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：６９のアミノ酸３４４−３８５）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：７３）
【０３８１】
ＣＤ３ζ（配列番号：６９のアミノ酸３８６−４９７）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：７４）
【０３８２】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：７５のアミノ酸１−２１；配列番号：７６）、抗ＧＡＲＰｓｃＦｖ（Ｌ−Ｈ）（配列番号：７５のアミノ酸２２−２７４；配列番号：７７）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：７５のアミノ酸２７５−３４３；配列番号：７８）、４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：７５のアミノ酸３４４−３８５；配列番号：７９）、ＣＤ３ζ（配列番号：７５のアミノ酸３８６−４９７；配列番号：８０）を含む、コンストラクト１１−ＣＤ８シグナル配列−抗ＧＡＲＰｓｃＦｖ（Ｌ−Ｈ）−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ ＩＣＤ−ＣＤ３ζ（配列番号：７５）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＮＩＬＩＹＧＡＳＲＬＫＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＴＬＴＩＳＧＬＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＹＡＳＶＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＰＧＡＥＬＲＮＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＲＦＴＳＹＹＩＤＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＤＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＦＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＶＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：７５）
【０３８３】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号：７５のアミノ酸１−２１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号：７６）
【０３８４】
抗ＧＡＲＰｓｃＦｖ（Ｌ−Ｈ）（配列番号：７５のアミノ酸２２−２７４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＮＩＬＩＹＧＡＳＲＬＫＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＴＬＴＩＳＧＬＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＹＡＳＶＰＶＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＰＧＡＥＬＲＮＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＲＦＴＳＹＹＩＤＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＤＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＦＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＶＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号：７７）
【０３８５】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：７５のアミノ酸２７５−３４３）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：７８）
【０３８６】
４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：７５のアミノ酸３４４−３８５）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：７９）
【０３８７】
ＣＤ３ζ（配列番号：７５のアミノ酸３８６−４９７）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：８０）
【０３８８】
2021512635.tif 000007
2021512635.tif 000008
【０３８９】
ＩＬ−１３ゼータカイン（配列番号：１０１（配列番号：１００のアミノ酸１−１１２））；リンカー（配列番号：１０２（配列番号：１００のアミノ酸１１３−１３２））；ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ（配列番号：１０３（配列番号：１００のアミノ酸１３３−３７８））；ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：１０４（配列番号：１００のアミノ酸３７９−４４７））；４−１ＢＢ ＩＣＤ（配列番号：１０５（配列番号：１００のアミノ酸４４８−４８９））；及びＣＤ３ζ（配列番号：１０６（配列番号：１００のアミノ酸４９０−６０１））を含む、コンストラクト１２（タンデムＣＡＲ）−ＩＬ−１３ゼータカイン−リンカー−ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ ＩＣＤ−ＣＤ３ζ（配列番号：１００）
ＧＰＶＰＰＳＴＡＬＲＹＬＩＥＥＬＶＮＩＴＱＮＱＫＡＰＬＣＮＧＳＭＶＷＳＩＮＬＴＡＧＭＹＣＡＡＬＥＳＬＩＮＶＳＧＣＳＡＩＥＫＴＱＲＭＬＳＧＦＣＰＨＫＶＳＡＧＱＦＳＳＬＨＶＲＤＴＫＩＥＶＡＱＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＲＦＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：１００）
【０３９０】
ＩＬ−１３ゼータカイン（配列番号：１００のアミノ酸１−１１２）
ＧＰＶＰＰＳＴＡＬＲＹＬＩＥＥＬＶＮＩＴＱＮＱＫＡＰＬＣＮＧＳＭＶＷＳＩＮＬＴＡＧＭＹＣＡＡＬＥＳＬＩＮＶＳＧＣＳＡＩＥＫＴＱＲＭＬＳＧＦＣＰＨＫＶＳＡＧＱＦＳＳＬＨＶＲＤＴＫＩＥＶＡＱＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＲＦＮ（配列番号：１０１）
【０３９１】
リンカー（配列番号：１００のアミノ酸１１３−１３２）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１０２）
【０３９２】
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ（配列番号：１００のアミノ酸１３３−３７８）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＮＩＥＤＹＹＩＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＥＮＤＥＴＫＹＧＰＩＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＴＳＩＮＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＦＲＧＧＶＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＧＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：１０３）
【０３９３】
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号：１００のアミノ酸３７９−４４７）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：１０４）
【０３９４】
４−１ＢＢＩＣＤ（配列番号：１００のアミノ酸４４８−４８９）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号：１０５）
【０３９５】
ＣＤ３ζ（配列番号：１００のアミノ酸４９０−６０１）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号：１０６）
【０３９６】
ここに記載の更なる配列は次の通りである：
2021512635.tif 000009
【０３９７】
ここに記載した技術の幾つかの実施態様は、番号を付した次のパラグラフの何れかに従って定義されうる：
１．  （ａ）第一抗原に結合する第一抗原結合ドメインと第二抗原に結合する第二抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと；
（ｂ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥ
を発現するように操作された免疫細胞。
２．  ＣＡＲポリペプチドが、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ１の免疫細胞。
３．  ＣＡＲポリペプチドが一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、パラグラフ１又は２の免疫細胞。
４．  第一及び第二抗原が神経膠芽腫抗原である、パラグラフ１〜３の何れか一の免疫細胞。
５．  第一及び第二抗原が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ−１３Ｒα２）、エフリンＡ型受容体１（ＥｐｈＡ１）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン、ムチン１，細胞表面関連（ＭＵＣ１）、又はムチン１６，細胞表面関連（ＭＵＣ１６）から独立して選択される、パラグラフ１〜４の何れか一の免疫細胞。
６．  第一抗原結合ドメイン及び／又は第二抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合断片を含む、パラグラフ１〜５の何れか一の免疫細胞。
７．  抗体の抗原結合断片が、単一ドメイン抗体又は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、パラグラフ６の免疫細胞。
８．  第一抗原結合ドメイン及び／又は第二抗原結合ドメインが、第一及び／又は第二抗原のリガンドを含む、パラグラフ１〜７の何れか一の免疫細胞。
９．  細胞外ドメインが、第一抗原結合ドメインと第二抗原結合ドメインとの間にリンカーを含まない、パラグラフ１〜８の何れか一の免疫細胞。
１０．  第一抗原結合ドメインが、リンカーによって第二抗原結合ドメインに連結されている、パラグラフ１〜８の何れか一の免疫細胞。
１１．  リンカーが、配列番号：１０２、１０７、１０８、１０９、又は１１０のリンカーと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸を含む、パラグラフ１０の免疫細胞。
１２．  膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ２〜１１の何れか一の免疫細胞。
１３．  ヒンジ／膜貫通ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ１２の免疫細胞。
１４．  膜貫通ドメインが、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、又は１０４のアミノ酸配列、あるいは配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、又は１０４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ１２又は１３の免疫細胞。
１５．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ２〜１４の何れか一の免疫細胞。
１６．  細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、又は１０６のアミノ酸配列、あるいは配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、又は１０６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ１５の免疫細胞。
１７．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む、パラグラフ３〜１６の何れか一の免疫細胞。
１８．  共刺激ドメインが、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、又は１０５のアミノ酸配列、あるいは配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、又は１０５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む、パラグラフ１７の免疫細胞。
１９．  第一抗原結合ドメインがＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインを含む、パラグラフ１〜１８の何れか一の免疫細胞。
２０．  第二抗原結合ドメインがＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含む、パラグラフ１〜１９の何れか一の免疫細胞。
２１．  ＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインが、抗ＩＬ−１３Ｒα２ｓｃＦｖ又はＩＬ−１３Ｒα２のリガンドを含む、パラグラフ１９又は２０の免疫細胞。
２２．  ＩＬ−１３Ｒα２のリガンドが、ＩＬ−１３又はＩＬ−１３ゼータカイン、又はその抗原結合断片を含む、パラグラフ２１の免疫細胞。
２３．  ＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインが、配列番号：１０１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ１９〜２２の何れか一の免疫細胞。
２４．  ＩＬ−１３Ｒα２結合ドメインが配列番号：１０１のアミノ酸配列を含む、パラグラフ２３の免疫細胞。
２５．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインが抗体の抗原結合断片を含む、パラグラフ２０〜２４の何れか一の免疫細胞。
２６．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインが抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖを含む、パラグラフ２０〜２５の何れか一の免疫細胞。
２７．  抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖが、配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、パラグラフ２６の免疫細胞。
２８．  ＶＨが、配列番号：１１１又は１１３のアミノ酸配列を含み、及び／又はＶＬが、配列番号：１１２又は１１４のアミノ酸配列を含む、パラグラフ２７の免疫細胞。
２９．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインが、配列番号：１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ２０〜２８の何れか一の免疫細胞。
３０．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインが配列番号：１０３のアミノ酸配列を含む、パラグラフ２９の免疫細胞。
３１．  ＣＡＲポリペプチドが、配列番号：１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ１〜３０の何れか一の免疫細胞。
３２．  ＣＡＲポリペプチドが配列番号：１００のアミノ酸配列を含む、パラグラフ３１の免疫細胞。
３３．  （ｉ）配列番号：１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；
（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥ
を発現するように操作された免疫細胞。
３４．  （ｉ）配列番号：１００のアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；
（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、標的抗原とＴ細胞抗原に結合するＢｉＴＥ
を発現するように操作された免疫細胞。
３５．  標的抗原が、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、ＨＥＲ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６の一つから選択される神経膠芽腫関連抗原である、パラグラフ１〜３４の何れか一の免疫細胞。
３６．  Ｔ細胞抗原がＣＤ３である、パラグラフ１〜３５の何れか一の免疫細胞。
３７．  標的抗原がＥＧＦＲであり、Ｔ細胞抗原がＣＤ３である、パラグラフ１〜３６の何れか一の免疫細胞。
３８．  ＢｉＴＥが、配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ１〜３７の何れか一の免疫細胞。
３９．  ＢｉＴＥが配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列を含む、パラグラフ３８の免疫細胞。
４０．  免疫細胞がＴ又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、パラグラフ１〜３９の何れか一の免疫細胞。
４１．  免疫細胞がヒト細胞である、パラグラフ１〜４０の何れか一の免疫細胞。
４２．  パラグラフ１〜４１の何れか一のＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥをコードするポリヌクレオチド。
４３．  ポリヌクレオチドが、ＣＡＲポリペプチドコード配列とＢｉＴＥコード配列を含み、ＣＡＲポリペプチドコード配列とＢｉＴＥコード配列が、リボソームスキッピング部分によって分離されている、パラグラフ４２のポリヌクレオチド。
４４．  ＣＡＲポリペプチド及び／又はＢｉＴＥが構成的プロモーター下で発現される、パラグラフ４２又は４３のポリヌクレオチド。
４５．  構成的プロモーターが伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターを含む、パラグラフ４４のポリヌクレオチド。
４６．  ＣＡＲポリペプチド及び／又はＢｉＴＥが誘導性プロモーター下で発現される、パラグラフ４２又は４３のポリヌクレオチド。
４７．  誘導性プロモーターが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＣＡＲシグナル伝達によって誘導可能である、パラグラフ４６のポリヌクレオチド。
４８．  誘導性プロモーターが活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントを含む、パラグラフ４７のポリヌクレオチド。
４９．  ＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥが、それぞれ構成的プロモーター下で発現される、パラグラフ４２又は４３のポリヌクレオチド。
５０．  ＣＡＲポリペプチドが構成的プロモーター下で発現され、ＢｉＴＥが誘導性プロモーター下で発現される、パラグラフ４２又は４３のポリヌクレオチド。
５１．  自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ４２から５０の何れか一のポリヌクレオチド。
５２．  一又は複数のシグナル配列をコードする配列を更に含む、パラグラフ４２〜５１の何れか一のポリヌクレオチド。
５３．  パラグラフ４２〜５２の何れか一のポリヌクレオチドを含むベクター。
５４．  ベクターがレンチウイルスベクターである、パラグラフ５３のベクター。
５５．  パラグラフ１〜４１の何れか一の免疫細胞、パラグラフ４２〜５２の何れか一のポリヌクレオチド、又はパラグラフ５３又は５４のベクターを含む薬学的組成物。
５６．  治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、パラグラフ１〜４１の何れか一の免疫細胞、パラグラフ４２〜５２の何れか一のポリヌクレオチド、パラグラフ５３又は５４のベクター、又はパラグラフ５５の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
５７．  がんが、神経膠芽腫、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫であり、場合によっては、がんが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、ＨＥＲ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６からなる群の一又は複数を発現することを含む、パラグラフ５６の方法。
５８．  神経膠芽腫が、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、メソテリン、及びＥｐｈＡ１からなる群の一又は複数を発現する細胞を含む、パラグラフ５７の方法。
５９．  神経膠芽腫が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した細胞を含む、パラグラフ５７又は５８の方法。
６０．  （ｉ）ＥＧＦＲ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、配列番号：１１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；
（ｉｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＧＡＲＰカメリド
を発現するように操作された免疫細胞。
６１．  （ｉ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、配列番号：１１５又は１１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドと；
（ｉｉ）ＢｉＴＥであって、配列番号：９８又は９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＥＧＦＲとＣＤ３に結合するＢｉＴＥ
を発現するように操作された免疫細胞。
６２．  パラグラフ６０のＣＡＲポリペプチドと抗ＧＡＲＰカメリドをコードするポリヌクレオチド。
６３．  パラグラフ６１のＣＡＲポリペプチドとＢｉＴＥをコードするポリヌクレオチド。
６４．  自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ６２又は６３のポリヌクレオチド。
６５．  一又は複数のシグナル配列をコードする配列を更に含む、パラグラフ６２〜６４の何れか一のポリヌクレオチド。
６６．  パラグラフ６２〜６５の何れか一のポリヌクレオチドを含むベクター。
６７．  ベクターがレンチウイルスベクターである、パラグラフ６６のベクター。
６８．  パラグラフ６０又は６１の免疫細胞、パラグラフ６２〜６５の何れか一のポリヌクレオチド、又はパラグラフ６６又は６７のベクターを含む薬学的組成物。
６９．  対象におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した神経膠芽腫を治療する方法であって、（ｉ）細胞外ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作された免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、パラグラフ１〜４１及び６１の何れか一の免疫細胞から場合によっては選択される、方法。
７０．  対象の腫瘍微小環境における免疫抑制を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、パラグラフ１〜４１、６０、及び６１の何れか一の免疫細胞から場合によっては選択される、方法。
７１．  対象の腫瘍微小環境におけるＴ細胞消耗を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、パラグラフ１〜４１、６０、及び６１の何れか一の免疫細胞から場合によっては選択される、方法。
７２．  対象における異種抗原発現を有するがんを治療する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを含む免疫細胞を対象に投与することを含み、免疫細胞が、パラグラフ１〜４１、６０、及び６１の何れか一の免疫細胞から場合によっては選択される、方法。
７３．  がんが、神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である、パラグラフ７２の方法。
７４．  がんが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６からなる群の一又は複数を発現する細胞を含む、パラグラフ７２又は７３の方法。
７５．  異種核酸分子を含むＣＡＲ Ｔ細胞であって、異種核酸分子が、
（ａ）細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチドと；
（ｂ）治療剤をコードする第二ポリヌクレオチド
を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞。
７６．  治療剤が抗体試薬を含む、パラグラフ７５のＣＡＲ Ｔ細胞。
７７．  抗体試薬が単鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含む、パラグラフ７６のＣＡＲ Ｔ細胞。
７８．  抗体試薬が二重特異性抗体試薬を含む、パラグラフ７６のＣＡＲ Ｔ細胞。
７９．  二重特異性抗体試薬がＢｉＴＥを含む、パラグラフ７８のＣＡＲ Ｔ細胞。
８０．  単一ドメイン抗体がカメリド抗体を含む、パラグラフ７７のＣＡＲ Ｔ細胞。
８１．  治療剤がサイトカインを含む、パラグラフ７５のＣＡＲ Ｔ細胞。
８２．  ＣＡＲ及び治療剤が別個のＣＡＲ及び治療剤分子として生成される、パラグラフ７５〜８１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８３．  ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチドと治療剤をコードする第二ポリヌクレオチドとの間にリボソームスキッピング部分を含む、パラグラフ８２のＣＡＲ Ｔ細胞。
８４．  リボソームスキッピング部分が２Ａペプチドを含む、パラグラフ８３のＣＡＲ Ｔ細胞。
８５．  ２ＡペプチドがＰ２Ａ又はＴ２Ａを含む、パラグラフ８４のＣＡＲ Ｔ細胞。
８６．  ＣＡＲと治療剤がそれぞれ構成的に発現される、パラグラフ７５〜８５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８７．  ＣＡＲと治療剤の発現がＥＦ１αプロモーターによって駆動される、パラグラフ７５〜８６の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８８．  治療剤が、Ｔ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達によって場合によっては誘導可能な誘導性プロモーターの制御下で発現される、パラグラフ７５〜８５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８９．  誘導性プロモーターがＮＦＡＴプロモーターを含む、パラグラフ８８のＣＡＲ Ｔ細胞。
９０．  ＣＡＲが構成的プロモーターの制御下で発現され、治療剤が、Ｔ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達によって場合によっては誘導可能な誘導性プロモーターの制御下で発現される、パラグラフ７５〜８９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９１．  ＣＡＲが一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、パラグラフ７５〜９０の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９２．  ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、又はリガンドを含む、パラグラフ７５〜９１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９３．  膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ７５〜９２の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９４．  ヒンジ／膜貫通ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ９３のＣＡＲ Ｔ細胞。
９５．  ＣＡＲの膜貫通ドメインが、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、及び１０４、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ７５〜９４の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９６．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ７５〜９５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９７．  細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、及び１０６、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ７５〜９６の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９８．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む、パラグラフ９１〜９７の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９９．  共刺激ドメインが、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、及び１０５、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、パラグラフ９１〜９８の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１００．  ＣＡＲ抗原結合ドメインが腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に結合する、パラグラフ７５〜９９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１０１．  カメリド抗体が、腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原に結合する、パラグラフ８０のＣＡＲ Ｔ細胞。
１０２．  ＢｉＴＥが、（ｉ）腫瘍関連抗原又はＴｒｅｇ関連抗原と、（ｉｉ）Ｔ細胞抗原に結合する、パラグラフ７９のＣＡＲ Ｔ細胞。
１０３．  腫瘍関連抗原が固形腫瘍関連抗原である、パラグラフ１００〜１０２の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１０４．  腫瘍関連抗原が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６を含み、場合によってはＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤が、配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５１、５５、５７、６３、６５、１０３、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含む、パラグラフ１０３のＣＡＲ Ｔ細胞。
１０５．  Ｔｒｅｇ関連抗原が、反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）からなる群から選択され、場合によってはＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤が、配列番号：３、９、１５、２５、７１、７７、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含む、パラグラフ１００〜１０２の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１０６．  細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み；抗原結合ドメインがＴｒｅｇ関連抗原に結合する、ＣＡＲポリペプチド。
１０７．  Ｔｒｅｇ関連抗原が、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５、及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択される、パラグラフ１０６のＣＡＲポリペプチド。
１０８．  ＣＡＲが一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、パラグラフ１０６又は１０７のＣＡＲポリペプチド。
１０９．  Ｔｒｅｇ関連抗原がＧＡＲＰ又はＬＡＰである、パラグラフ１０６〜１０８の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１１０．  ＣＡＲの抗原結合ドメインが、
（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８１のアミノ酸配列、又は配列番号：８１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：８２のアミノ酸配列、又は配列番号：８２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：８３のアミノ酸配列、又は配列番号：８３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの、及び／又は
（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：８４のアミノ酸配列、又は配列番号：８４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：８５のアミノ酸配列、又は配列番号：８５の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：８６のアミノ酸配列、又は配列番号：８６の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの
を含む、パラグラフ１０６〜１０９の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１１１．  ＶＨが、配列番号：８７のアミノ酸配列、又は配列番号：８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又はＶＬが、配列番号：８８のアミノ酸配列、又は配列番号：８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ１１０のＣＡＲポリペプチド。
１１２．  ＣＡＲの抗原結合ドメインが、
（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８９のアミノ酸配列、又は配列番号：８９の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：９０のアミノ酸配列、又は配列番号：９０の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：９１のアミノ酸配列、又は配列番号：９１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの、及び／又は
（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：９２のアミノ酸配列、又は配列番号：９２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：９３のアミノ酸配列、又は配列番号：９３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：９４のアミノ酸配列、又は配列番号：９４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの
を含む、パラグラフ１０６〜１０９の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１１３．  ＶＨが、配列番号：９５のアミノ酸配列、又は配列番号：９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又はＶＬが、配列番号：９６のアミノ酸配列、又は配列番号：９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ１１２のＣＡＲポリペプチド。
１１４．  ＶＨがＶＬのＮ末端にある、パラグラフ１１０〜１１３の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１１５．  ＶＬがＶＨのＮ末端にある、パラグラフ１１０〜１１３の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１１６．  ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号：３、９、１５、２５、７１、７７、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含んでいてもよい、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む、パラグラフ１０６〜１１５の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１１７．  膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ１０６〜１１６の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１１８．  ヒンジ／膜貫通ドメインが、免疫グロブリン様タンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ８、又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ１１７のＣＡＲポリペプチド。
１１９．  ＣＡＲの膜貫通ドメインが、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、及び１０４、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ１０６〜１１８の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１２０．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３η、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ１０６〜１１９の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１２１．  細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、８０、及び１０６、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ１０６〜１２０の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１２２．  共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む、パラグラフ１０８〜１２１の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１２３．  共刺激ドメインが、配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、７９、及び１０５、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、パラグラフ１０８〜１２２の何れか一のＣＡＲポリペプチド。
１２４．  配列番号：２６、配列番号：３５、配列番号：４４、配列番号：５３、配列番号：６１、配列番号：１９、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１３、配列番号：６９、配列番号：７５、及び配列番号：１００の何れか一のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチド。
１２５．  配列番号：２６、配列番号：３５、配列番号：４４、配列番号：５３、配列番号：６１、配列番号：１９、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１３、配列番号：６９、配列番号：７５、及び配列番号：１００の何れか一のアミノ酸配列を含む、パラグラフ１２４のＣＡＲポリペプチド。
１２６．  パラグラフ７５〜１２５の何れか一の、（ｉ）ＣＡＲポリペプチド、又は（ｉｉ）ＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質をコードする核酸分子。
１２７．  自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ１２６の核酸分子。
１２８．  シグナル配列をコードする配列を更に含む、パラグラフ１２６又は１２７の核酸分子。
１２９．  パラグラフ１２６〜１２８の何れか一の核酸分子を含むベクター。
１３０．  ベクターがレンチウイルスベクターである、パラグラフ１２９のベクター。
１３１．  パラグラフ７５〜１２５の何れか一の、ＣＡＲポリペプチドを含むポリペプチド、又はＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質。
１３２．  パラグラフ１０６〜１２５の何れか一のＣＡＲポリペプチド、パラグラフ１２６〜１２８の何れか一の核酸分子、パラグラフ１２９又は１３０のベクター、及び／又はパラグラフ１３１のポリペプチドを含む免疫細胞。
１３３．  免疫細胞がＴ又はＮＫ細胞である、パラグラフ１３２の免疫細胞。
１３４．  免疫細胞がヒト細胞である、パラグラフ１３２又は１３３の免疫細胞。
１３５．  パラグラフ７５〜１３４の何れか一の一又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞、核酸分子、ＣＡＲポリペプチド、ポリタンパク質、又は免疫細胞を含む薬学的組成物。
１３６．  がんを有する患者を治療する方法であって、パラグラフ１３５の薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法。
１３７．  腫瘍微小環境を標的とすることにより、全身毒性が低減される、パラグラフ１３６の方法。
１３８．  がんが、一又は複数の固形腫瘍の存在によって特徴付けられる、パラグラフ１３６又は１３７の方法。
１３９．  がんが腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇにより特徴付けられる、パラグラフ１３６〜１３８の何れか一の方法。
１４０．  がんが神経膠芽腫である、パラグラフ１３６〜１３９の何れか一の方法。
１４１．  がんを有する患者を治療する方法であって、腫瘍毒性抗体又はサイトカインを分泌するように遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞産物を患者に投与することを含み、がん毒性を腫瘍微小環境に局所的に向けることにより、全身毒性が低減される、方法。
１４２．  ＣＡＲ Ｔ細胞が遺伝子改変されて、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＩＬ−１５、ＣＳＦ１Ｒ、又はＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、又はＭＵＣ１６に対する抗体、あるいは二重特異性抗体が腫瘍微小環境に送達される、パラグラフ１４１の方法。
１４３．  二重特異性抗体が、ＥＧＦＲ及びＣＤ３に対するＢｉＴＥである、パラグラフ１４２の方法。
１４４．  疾患又は病状を治療するために患者の組織又は器官に治療剤を送達する方法であって、治療用抗体、毒素、又は薬剤を分泌するように遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞を前記患者に投与することを含み、治療用抗体、毒素、又は薬剤は、それ自体では、組織又は器官に侵入又は浸透することができない、方法。
１４５．  組織又は器官が神経系にある、パラグラフ１４４の方法。
１４６．  神経系が中枢神経系である、パラグラフ１４５の方法。
１４７．  中枢神経系が脳である、パラグラフ１４６の方法。
１４８．  疾患又は病状ががんである、パラグラフ１４４〜１４７の何れか一の方法。
１４９．  がんが、神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である、パラグラフ１４８の方法。
１５０．  治療用抗体が抗ＥＧＦＲ又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩである、パラグラフ１４４〜１４９の何れか一の方法。
１５１．  対象のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が低下した神経膠芽腫を治療する方法であって、（ｉ）細胞外ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、パラグラフ７５〜１０５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞から選択される、方法。
１５２．  対象の腫瘍微小環境における免疫抑制を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、パラグラフ７５〜１０５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞から選択される、方法。
１５３．  対象の腫瘍微小環境におけるＴ細胞消耗を防止又は低減する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ここで、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、パラグラフ７５〜１０５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞から選択される、方法。
１５４．  対象の異種抗原発現を有するがんを治療する方法であって、（ｉ）細胞外標的結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドと；（ｉｉ）ＢｉＴＥを発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞が、場合によっては、パラグラフ７５〜１０５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞から選択される、方法。
１５５．  がんが、神経膠芽腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫、又は骨髄腫である、パラグラフ１５４の方法。
１５６．  がんが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＥｐｈＡ１、Ｈｅｒ２、メソテリン、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６の一又は複数を発現する細胞を含む、パラグラフ１５４又は１５５の方法。
【０３９８】
ここに記載した技術の更に他の実施態様は、追加の番号を付した次のパラグラフの何れかに従って定義されうる：
１．  異種核酸分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であって、異種核酸分子が、
（ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする第一ポリヌクレオチドと；
（ｂ）治療剤をコードする第二ポリヌクレオチド
を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞。
２．  治療剤が抗体試薬を含む、パラグラフ１のＣＡＲ Ｔ細胞。
３．  抗体試薬が、単鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含む、パラグラフ２のＣＡＲ Ｔ細胞。
４．  抗体試薬が、二重特異性抗体試薬を含む、パラグラフ２又は３のＣＡＲ Ｔ細胞。
５．  二重特異性抗体試薬が、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む、パラグラフ４のＣＡＲ Ｔ細胞。
６．  単一ドメイン抗体がカメリド抗体を含む、パラグラフ３のＣＡＲ Ｔ細胞。
７．  治療剤がサイトカインを含む、パラグラフ１のＣＡＲ Ｔ細胞。
８．  ＣＡＲと治療剤が、切断されて別個のＣＡＲ及び治療剤分子を生成するポリタンパク質の形態で生成される、パラグラフ１〜７の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９．  ポリタンパク質が、ＣＡＲと治療剤との間に切断可能な部分を含む、パラグラフ８のＣＡＲ Ｔ細胞。
１０．  切断可能な部分が２Ａペプチドを含む、パラグラフ９のＣＡＲ Ｔ細胞。
１１．  ２ＡペプチドがＰ２Ａ又はＴ２Ａを含む、パラグラフ１０のＣＡＲ Ｔ細胞。
１２．  ＣＡＲと治療剤が、それぞれ構成的に発現される、パラグラフ１〜１１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１３．  ＣＡＲと治療剤の発現が、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターによって駆動される、パラグラフ１〜１２の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１４．  治療剤が、場合によってはＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達により誘導可能な誘導性プロモーターの制御下で発現される、パラグラフ１〜１１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１５．  誘導性プロモーターがＮＦＡＴプロモーターを含む、パラグラフ１４のＣＡＲ Ｔ細胞。
１６．  ＣＡＲが構成的プロモーターの制御下で発現され、治療剤が、場合によってはＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達により誘導可能な誘導性プロモーターの制御下で発現される、パラグラフ１〜１１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１７．  ＣＡＲが一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、パラグラフ１〜１６の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１８．  ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、又はリガンドを含む、パラグラフ１〜１７の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
１９．  ＣＡＲの膜貫通ドメインが、配列番号：４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８、６６、７２、７８、及び１０４、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ１〜１８の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
２０．  細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号：６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８、７４、及び８０、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ１〜１９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
２１．  配列番号：５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７、７３、及び７９、又はそれらのバリアントの何れか一の配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、パラグラフ１〜２０の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
２２．  ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤が、治療剤が抗体試薬を含む場合、腫瘍関連抗原に結合する、パラグラフ１〜２１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
２３．  ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤が結合する腫瘍関連抗原が、固形腫瘍関連抗原である、パラグラフ２２のＣＡＲ Ｔ細胞。
２４．  ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤が結合する腫瘍関連抗原が、上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、又はＩＬ−１３受容体アルファ２（ＩＬ−１３Ｒα２）、を含み、場合によってはＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤が、配列番号：２１、２７、３３、３６、４２、４５、５１、５５、５７、６３、６５、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含む、パラグラフ２２又は２３のＣＡＲ Ｔ細胞。
２５．  ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤は、治療剤が抗体試薬を含む場合、Ｔｒｅｇ関連抗原に結合する、パラグラフ１〜２１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
２６．  ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤が結合するＴｒｅｇ関連抗原が、反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）からなる群から選択され、場合によってはＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療剤が、配列番号：３、９、１５、２５、７１、７７、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含む、パラグラフ２５のＣＡＲ Ｔ細胞。
２７．  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＣＡＲ Ｔ細胞であって、ＣＡＲが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み；かつ抗原結合ドメインがＴｒｅｇ関連抗原に結合する、ＣＡＲ Ｔ細胞。
２８．  Ｔｒｅｇ関連抗原が、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５、及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択される、パラグラフ２７のＣＡＲ Ｔ細胞。
２９．  ＣＡＲが一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、パラグラフ２７又は２８のＣＡＲ Ｔ細胞。
３０．  Ｔｒｅｇ関連抗原がＧＡＲＰである、パラグラフ２７〜２９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
３１．  ＣＡＲの抗原結合ドメインが、
（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８１のアミノ酸配列、又は配列番号：８１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：８２のアミノ酸配列、又は配列番号：８２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：８３のアミノ酸配列、又は配列番号：８３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むものと、
（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：８４のアミノ酸配列、又は配列番号：８４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：８５のアミノ酸配列、又は配列番号：８５の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：８６のアミノ酸配列、又は配列番号：８６の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの
を含む、パラグラフ２７〜３０の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
３２．  ＶＨが、配列番号：８７のアミノ酸配列、又は配列番号：８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号：８８のアミノ酸配列、又は配列番号：８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ３１のＣＡＲ Ｔ細胞。
３３．  ＶＨがＶＬのＮ末端である、パラグラフ３１又は３２のＣＡＲ Ｔ細胞。
３４．  ＶＬがＶＨのＮ末端である、パラグラフ３１又は３２のＣＡＲ Ｔ細胞。
３５．  ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号：３、９、１５、２５、７１、７７、及びそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含んでいてもよい、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む、パラグラフ２７〜３４の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
３６．  配列番号：２６、配列番号：３５、配列番号：４４、配列番号：５３、配列番号：６１、配列番号：１９、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１３、配列番号：６９、及び配列番号：７５の何れか一のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸分子を含むＣＡＲ Ｔ細胞。
３７．  配列番号：２６、配列番号：３５、配列番号：４４、配列番号：５３、配列番号：６１、配列番号：１９、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１３、配列番号：６９、及び配列番号：７５の何れか一のアミノ酸配列をコードする異種核酸分子を含む、パラグラフ３６のＣＡＲ Ｔ細胞。
３８．  パラグラフ１〜３７の何れか一の、（ｉ）ＣＡＲポリペプチド、又は（ｉｉ）ＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質をコードする核酸分子。
３９．  パラグラフ１〜３７の何れか一の、ＣＡＲポリペプチドを含むポリペプチド、又はＣＡＲポリペプチドと治療剤を含むポリタンパク質。
４０．  パラグラフ１〜３９の何れか一の、一又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞、核酸分子、ＣＡＲポリペプチド、又はポリタンパク質を含む薬学的組成物。
４１．  がんを有する患者を治療する方法であって、パラグラフ１〜３７の何れか一の一又は複数のＣＡＲ Ｔ細胞を含む薬学的組成物又はパラグラフ４０の薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法。
４２．  腫瘍微小環境を標的とすることにより、全身毒性が低減される、パラグラフ４１の方法。
４３．  がんが一又は複数の固形腫瘍の存在により特徴付けられる、パラグラフ４１又は４２の方法。
４４．  がんが腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇにより特徴付けられる、パラグラフ４１〜４３の何れか一の方法。
４５．  がんが神経膠芽腫である、パラグラフ４１〜４４の何れか一の方法。
４６．  がんを有する患者を治療する方法であって、腫瘍毒性抗体又はサイトカインを分泌するように遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞産物を患者に投与することを含み、がん毒性を腫瘍微小環境に向けることによって、全身毒性が低減される、方法。
４７．  ＣＡＲ Ｔ細胞が遺伝子改変されて、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＩＬ１５、ＣＳＦ１Ｒ、又はＥＧＦＲに対する抗体、又は二重特異性抗体を腫瘍微小環境に送達する、パラグラフ４６の方法。
４８．  二重特異性抗体がＥＧＦＲとＣＤ３に対するものである、パラグラフ４７の方法。
４９．  患者の組織又は器官に治療剤を送達して疾患又は病状を治療する方法であって、治療用抗体、毒素、又は薬剤を分泌するように遺伝子改変されたＣＡＲ Ｔ細胞を前記患者に投与することを含み、治療用抗体、毒素、又は薬剤が、それ自体では、組織又は器官に侵入又は浸透することができない、方法。
５０．  組織又は器官が神経系にある、パラグラフ４９の方法。
５１．  神経系が中枢神経系である、パラグラフ５０の方法。
５２．  中枢神経系が脳である、パラグラフ５１の方法。
５３．  疾患又は病状が神経膠芽腫である、パラグラフ４９〜５２の何れか一の方法。
５４．  治療用抗体が、抗ＥＧＦＲ又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩである、パラグラフ４９〜５３の方法。
５５．  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＣＡＲ Ｔ細胞であって、ＣＡＲが細胞外ＧＡＲＰ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＧＡＲＰ結合ドメインが、
（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８１のアミノ酸配列、又は配列番号：８１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：８２のアミノ酸配列、又は配列番号：８２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：８３のアミノ酸配列、又は配列番号：８３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むものと、
（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：８４のアミノ酸配列、又は配列番号：８４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：８５のアミノ酸配列、又は配列番号：８５の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：８６のアミノ酸配列、又は配列番号：８６の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの
を含むＣＡＲ Ｔ細胞。
５６．  ＶＨが、配列番号：８７のアミノ酸配列、又は配列番号：８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号：８８のアミノ酸配列、又は配列番号：８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ５５のＣＡＲ Ｔ細胞。
５７．  ＶＨがＶＬのＮ末端である、パラグラフ５５又は５６のＣＡＲ Ｔ細胞。
５８．  ＶＬがＶＨのＮ末端である、パラグラフ５５又は５６のＣＡＲ Ｔ細胞。
５９．  ＧＡＲＰ結合ドメインが、配列番号：７１又は７７のアミノ酸配列、又は配列番号：７１又は７７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、パラグラフ５５〜５８の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
６０．  ＣＡＲが一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、パラグラフ５５〜５９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
６１．  ＣＡＲの膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ５５〜６０の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
６２．  ヒンジ／膜貫通ドメインが、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ７、又はＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ６１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
６３．  ヒンジ／膜貫通ドメインが、配列番号：７２又は７８のＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ６２のＣＡＲ Ｔ細胞。
６４．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ５５〜６３の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
６５．  細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号：７４又は８０のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ６４のＣＡＲ Ｔ細胞。
６６．  共刺激ドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ、ＣＤ８３、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ１５０、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＣＤ２７０、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、又はＺＡＰ７０の共刺激ドメインを含む、パラグラフ５５〜６５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
６７．  共刺激ドメインが配列番号：７３又は７９の４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、パラグラフ６６のＣＡＲ Ｔ細胞。
６８．  ポリヌクレオチドが、配列番号：６９又は７５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードするか、又はポリヌクレオチドが、配列番号：７１〜７４又は７７〜８０のアミノ酸配列の組み合わせと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする、パラグラフ５５〜６７の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
６９．  ポリヌクレオチドが、配列番号：６９又は７５のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードするか、又はポリヌクレオチドが、配列番号：７１〜７４又は７７〜８０のアミノ酸配列の組み合わせを含むＣＡＲをコードする、パラグラフ６８のＣＡＲ Ｔ細胞。
７０．  パラグラフ５５〜６９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞を含む薬学的組成物。
７１．  がんを有する患者を治療する方法であって、パラグラフ５５〜６９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞、又はパラグラフ７０の薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法。
７２．  腫瘍微小環境を標的とすることにより、全身毒性が低減される、パラグラフ７１の方法。
７３．  がんが一又は複数の固形腫瘍の存在によって特徴付けられる、パラグラフ７１又は７２の方法。
７４．  がんが、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇによって特徴付けられる、パラグラフ７１〜７３の何れか一の方法。
７５．  がんが神経膠芽腫である、パラグラフ７１〜７４の何れか一の方法。
７６．  異種核酸分子が自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ１〜２６の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
７７．  ポリヌクレオチドが自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ２７〜３５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
７８．  異種核酸分子が自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ３６又は３７のＣＡＲ Ｔ細胞。
７９．  自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ３８の核酸分子。
８０．  ポリヌクレオチドが自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ５５〜６９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８１．  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＣＡＲ Ｔ細胞であって、ＣＡＲが細胞外ＬＡＰ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＬＡＰ結合ドメインが、
（ａ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号：８９のアミノ酸配列、又は配列番号：８９の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号：９０のアミノ酸配列、又は配列番号：９０の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号：９１のアミノ酸配列、又は配列番号：９１の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むものと、
（ｂ）３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号：９２のアミノ酸配列、又は配列番号：９２の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号：９３のアミノ酸配列、又は配列番号：９３の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含み；かつＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号：９４のアミノ酸配列、又は配列番号：９４の１、２、又は３以下のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を含むもの
を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞。
８２．  ＶＨが、配列番号：９５を含まず、及び／又はＶＬが、配列番号：９６を含まない、パラグラフ８１のＣＡＲ Ｔ細胞。
８３．  ＬＡＰ結合ドメインが配列番号：９又は１５を含まない、パラグラフ８１又は８２のＣＡＲ Ｔ細胞。
８４．  ポリヌクレオチドが、配列番号：７又は１３のＣＡＲをコードしない、パラグラフ８１〜８３の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８５．  ＣＡＲが、配列番号：９〜１２又は１５〜１８の組み合わせのアミノ酸配列を含まない、パラグラフ８１〜８４の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８６．  ＣＡＲが一又は複数の共刺激ドメインを更に含む、パラグラフ８１〜８５の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８７．  ＣＡＲの膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ８１〜８６の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
８８．  ヒンジ／膜貫通ドメインが、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ７、又はＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ８７のＣＡＲ Ｔ細胞。
８９．  細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ８１〜８８の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９０． 共刺激ドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ、ＣＤ８３、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ１５０、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＣＤ２７０、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、又はＺＡＰ７０の共刺激ドメインを含む、パラグラフ８１〜８９の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９１．  ポリヌクレオチドが自殺遺伝子を更に含む、パラグラフ８１〜９０の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞。
９２．  パラグラフ８１〜９１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞を含む医薬品。
９３．  がんを有する患者を治療する方法であって、パラグラフ８１〜９１の何れか一のＣＡＲ Ｔ細胞、又はパラグラフ９２の薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法。
９４．  腫瘍微小環境を標的とすることにより、全身毒性が低減される、パラグラフ９３の方法。
９５．  がんが、一又は複数の固形腫瘍の存在によって特徴付けられる、パラグラフ９３又は９４の方法。
９６．  がんが、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇによって特徴付けられる、パラグラフ９３〜９５の何れか一の方法。
９７．  がんが神経膠芽腫である、パラグラフ９３〜９６の何れか一の方法。
【０３９９】
次の特許請求の範囲は、代表的なものに過ぎず、開示された発明の範囲を限定するものではない。少なくとも一態様において、特許請求の範囲の通りに請求する。
【図１】
2021512635.tif 000010
【図２】
2021512635.tif 000011
【図３−４】
2021512635.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021512635.tif 000018
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−２１】
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【図２２−２３】
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【図２４−２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ−Ｄ】
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【図３０−３１】
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【図３２Ａ−Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ−Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ−Ｈ】
2021512635.tif 000043
【図３４Ａ−Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
2021512635.tif 000048
【図３６Ｃ】
2021512635.tif 000049
【図３７Ａ−Ｃ】
2021512635.tif 000050
【図３７Ｄ】
2021512635.tif 000051
【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
2021512635.tif 000054
【図４０Ａ−Ｄ】
2021512635.tif 000055
【図４０Ｅ−Ｇ】
2021512635.tif 000056
【図４１Ａ−Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ−Ｅ】
2021512635.tif 000059
【図４１Ｆ−Ｈ】
2021512635.tif 000060
【図４１Ｉ−４２】
2021512635.tif 000061
【図４３Ａ−Ｄ】
2021512635.tif 000062
【図４３Ｅ−Ｆ】
2021512635.tif 000063
【図４３Ｇ】
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【図４３Ｈ−Ｉ】
2021512635.tif 000065
【図４４Ａ−Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５】
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【配列表】
2021512635000001.app
【国際調査報告】
2021512635.tif 000069
2021512635.tif 000070
2021512635.tif 000071
2021512635.tif 000072
2021512635.tif 000073
2021512635.tif 000074
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