(57)【要約】  本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来のナノ小胞およびその用途に関し、本発明者らは、正常ヒトに比べて胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病患者の臨床サンプルで前記小胞が有意に減少しており、前記菌株から分離した小胞を投与したとき、大腸菌由来の小胞のような病原性小胞による炎症メディエーターの分泌を顕著に抑制することを実験的に確認したところ、本発明によるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞は、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、および／またはパーキンソン病の診断方法、および前記疾患に対する予防、改善または治療用組成物を開発するための目的で有用に用いられるものと期待される。【選択図】図１４ｂ
2021510300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病の診断のための情報提供方法：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病と判定する段階。
【請求項２】
前記段階（ａ）で、サンプルは、便、血液、または尿であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項３】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記小胞は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）から自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項７】
前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項６に記載の食品組成物。
【請求項８】
前記小胞は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）から自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項６に記載の食品組成物。
【請求項９】
下記の段階を含む胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病の診断方法：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病と判定する段階。
【請求項１０】
前記段階（ａ）で、サンプルは、便、血液、または尿であることを特徴とする、請求項９に記載の診断方法。
【請求項１１】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療方法。
【請求項１２】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞の、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来のナノ小胞およびその用途に関し、より具体的に、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイに由来するナノ小胞を用いた胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病などの診断方法、および前記小胞を含む前記疾患に対する予防、改善または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀に入ってから、過去には伝染病と認識された急性感染性疾患の重要性が減る一方、ヒトとマイクロバイオームとの不調和により発生する免疫機能の異常を伴った慢性炎症性疾患が生活の質とヒト寿命を決定する主な疾患となり疾患パターンが変わった。２１世紀の難治性慢性炎症性疾患として、癌、心血管疾患、慢性肺疾患、代謝疾患、および神経精神疾患がヒトの寿命と生活の質を決定する主な疾患として国民保健に大きな問題となっている。
【０００３】
人体に共生する微生物は１００兆に至り、ヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を越えることが知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた生息地に存在する真正細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含んだ微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言う。
【０００４】
人体に共生する細菌及び周辺環境に存在する細菌は、他の細胞への遺伝子、低分子化合物、タンパク質などの情報を交換するためにナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子が通過できない物理的な防御膜を形成する。粘膜に共生する細菌の場合には粘膜を通過できないが、細菌由来の小胞は、サイズが１００ナノメートル以下であるので、比較的自由に粘膜を通じて上皮細胞を通過した後に人体に吸収される。局所的に分泌された細菌由来の小胞は、粘膜の上皮細胞あるいは皮膚角質細胞を通じて吸収されて局所炎症反応を誘導するだけでなく、人体に吸収されて各臓器に分布する。そして、吸収された臓器で免疫及び炎症反応を調節する。例えば、大腸菌（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような病原性グラム陰性菌に由来する小胞は、気道を通じて吸入されて肺気腫を誘発して慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）を誘導する。腸を通じて吸収された場合には、局所的に大腸炎を起こす。血管内では、血管内皮細胞炎症反応を通じて全身的な炎症反応及び血液凝固を促進させる。また、インシュリンが作用する筋肉細胞などに吸収されてインシュリン抵抗性と糖尿病を誘発する。一方、有益な細菌に由来する小胞は、病原性小胞による免疫機能の異常を調節して疾病を調節することができる。
【０００５】
細菌に由来する小胞などの因子に対する免疫反応は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、以下、ＩＬ）−１７サイトカインの分泌を特徴とするＴｈ１７免疫反応が発生する。これは、細菌由来の小胞に曝露されると、ＩＬ−６が分泌され、これがＴｈ１７免疫反応を誘導する。Ｔｈ１７免疫反応による炎症は、好中球浸潤を特徴とし、炎症が発生する過程でマクロファージ、好中球などのような炎症細胞から分泌される腫瘍怪死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ、以下、ＴＮＦ−α）が疾病の発生に重要な役割を担う。
【０００６】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ヒトの大腸に共生するグラム陽性細菌であって、食物繊維を発酵して酪酸のような短鎖脂肪酸を生産する細菌と知られている。前記細菌が減少しているとき、クローン病、肥満、喘息、およびうつ病と関連があると報告された。しかしながら、まだフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイが細胞外に小胞を分泌するという事実が報告されておらず、特に癌または心血管−脳疾患などのような難治性疾患の診断および治療に応用した事例は報告されたことがない。
【０００７】
これより、本発明では、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が、正常ヒトに比べて胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病患者の臨床サンプルで有意に減少していることを確認して、疾患を診断することができることを確認した。また、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイから小胞を分離し特性を分析した結果、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病などの疾患に対する予防または治療用組成物として用いられることを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、前記のような従来の問題点を解決するために、鋭意研究した結果、メタゲノム分析を通して正常ヒトに比べて胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病患者由来のサンプルでフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の含量が有意に減少していることを確認した。また、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ菌から小胞を分離してマクロファージに処理したとき、病原性小胞によるＩＬ−６およびＴＮＦ−ａｌｐｈａの分泌を顕著に抑制することを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【０００９】
これより、本発明は、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病の診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を有効成分として含む胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防、改善、または治療用組成物を提供することを他の目的とする。
【００１１】
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病と判定する段階。
【００１３】
また、本発明は、下記の段階を含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病の診断方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病と判定する段階。
【００１４】
本発明の一具現例において、前記段階（ａ）でのサンプルは、便、血液、または尿でありうる。
【００１５】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｂ）でのプライマーペアは、配列番号１および配列番号２のプライマーでありうる。
【００１６】
また、本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療用途を提供する。
【００２０】
本発明の一具現例において、前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍのものでありうる。
【００２１】
本発明の他の具現例において、前記小胞は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイから自然的または人工的に分泌されるものでありうる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明者らは、腸内細菌である場合には、体内に吸収されないが、細菌由来の小胞である場合には、上皮細胞を介して体内に吸収されて、全身的に分布し、腎臓、肝臓、肺を介して体外に排泄されることを確認し、患者の便、血液、または尿に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を通して胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病患者の便、血液、または尿に存在するフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が、正常ヒトに比べて有意に減少していることを確認した。また、腸内に共生するフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイを分離して、これを体外で培養して小胞を分離し、体外で炎症細胞に投与したとき、病原性小胞による炎症メディエーターの分泌を有意に抑制することを観察したところ、本発明によるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞は、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病に対する診断方法、および前記疾患に対する食品または薬物などの予防、改善または治療用組成物に有用に用いられるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１ａ】図１ａは、マウスに細菌と細菌由来の小胞（ＥＶ）を経口投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、経口投与した後１２時間目に、血液、腎臓、肝、および様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した結果である。
【図２】図２は、胃癌患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図３】図３は、大腸癌患者および正常ヒトの便に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図４】図４は、肝臓癌患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図５】図５は、すい臓癌患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図６】図６は、胆管癌患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図７】図７は、卵巣癌患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図８】図８は、膀胱癌患者および正常ヒトの血液存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図９】図９は、リンパ腫患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図１０】図１０は、心筋梗塞患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図１１】図１１は、心房細動患者および正常ヒトの血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図１２】図１２は、パーキンソン病患者および正常ヒトの尿に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を比較した結果である。
【図１３】図１３ａおよび図１３ｂは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の炎症誘導効果を評価するために、様々な濃度のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞をマクロファージに処理して、炎症メディエーターの分泌を病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）処理した場合と比較した結果であり、図１３ａは、ＩＬ−６の分泌を比較したものであり、図１３ｂは、ＴＮＦ−αの分泌を比較した結果である。
【図１４】図１４ａおよび図１４ｂは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の抗炎症および免疫調節効果を評価するために、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）の処理前にフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を前処理して、大腸菌小胞による炎症メディエーターの分泌に及ぼす影響を評価した結果であって、図１４ａは、ＩＬ−６の分泌を比較したものであり、図１４ｂは、ＴＮＦ−αの分泌を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞およびその用途に関する。
【００２５】
本発明者らは、メタゲノム分析を通して正常ヒトに比べて胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病患者由来のサンプルでフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の含量が顕著に減少していることを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【００２６】
これより、本発明は、下記の段階を含む胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病と判定する段階。
【００２７】
本発明において使用される用語「診断」とは、広い意味では、患者の病の実態をすべての面にわたって判断することを意味する。判断の内容は、病名、病因、病型、軽重、病床の詳細な様態、合併症の有無、および予後などである。本発明において診断は、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、および／またはパーキンソン病などの発病の有無および疾患のレベルなどを判断することである。
【００２８】
本発明において使用される用語「ナノ小胞（Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）」あるいは「小胞（Ｖｅｓｉｃｌｅ）」とは、多様な細菌から分泌されるナノサイズの膜からなる構造物を意味する。グラム陰性菌（ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の小胞、または外膜小胞（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＯＭＶｓ）は、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）だけでなく、毒性タンパク質および細菌ＤＮＡとＲＮＡも有しており、グラム陽性菌（ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の小胞は、タンパク質と核酸の他にも、細菌の細胞壁構成成分であるペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）とリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）も有している。本発明において、ナノ小胞あるいは小胞は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイから自然的に分泌されるかまたは人工的に生産されるものであって、球形の形態であり、１０〜２００ｎｍの平均直径を有している。
【００２９】
本発明で用いられる用語「メタゲノム」とは、「群遺伝子」とも言い、土壌、動物の腸など孤立した地域内の全てのウイルス、細菌、カビなどを含む遺伝子の総和を意味するものであり、主に培養されない微生物を分析するために配列分析器を用いて一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝子の概念として用いられる。特に、メタゲノムは、一種のゲノム、遺伝子を言うものでなく、１つの環境単位の全ての種の遺伝子であって、一種の混合遺伝子を言う。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で１つの種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から生じた用語である。技術的には、迅速な配列分析法を用いて種に関係なく全てのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、１つの環境内での全ての種を同定し、相互作用、代謝作用を解明する技法の対象である。
【００３０】
本発明において、前記患者由来のサンプルは、便、血液、または尿でありうるが、これに制限されるものではない。
【００３１】
本発明の他の様態として、本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３２】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００３３】
本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による食品または薬物組成物の投与により胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、および／またはパーキンソン病などを抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【００３４】
本発明において使用される用語「治療」とは、本発明による食品または薬物組成物の投与により胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、および／またはパーキンソン病などに対する症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００３５】
本発明において使用される用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。
【００３６】
前記小胞は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイを含む培養液を遠心分離、超高速遠心分離、高圧処理、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解、化学物質処理、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、およびキャピラリー電気泳動よりなる群から選ばれる１つ以上の方法を用いて分離することができる。また、不純物の除去のための洗浄、収得された小胞の濃縮などの過程をさらに含むことができる。
【００３７】
本発明の実施例では、細菌および細菌由来の小胞をマウス経口で投与して細菌および小胞の体内吸収、分布、および排泄様相を評価して、細菌である場合には、腸粘膜を介して吸収されないのに対し、小胞は、投与５分以内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝臓などを介して排泄されることを確認した（実施例１参照）。
【００３８】
本発明の一実施例では、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病患者と、年齢と性別をマッチングした正常ヒトの便、血液、または尿から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム分析を実施した。その結果、正常ヒトのサンプルに比べて、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病患者の臨床サンプルでフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（実施例３〜１３参照）。
【００３９】
本発明の他の実施例では、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイを培養して、これから分泌された小胞が免疫調節および抗炎症効果を示すかを評価したが、多様な濃度のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞でマクロファージを処理した後、炎症疾患の原因因子である大腸菌由来の小胞を処理して炎症メディエーターの分泌を評価した結果、大腸菌由来の小胞によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌をフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が効率的に抑制することを確認した（実施例１５参照）。
【００４０】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、または錠剤に製剤化することができる。適合な薬学的に許容される担体および製剤化については、レミントンの文献に開示されている方法を用いて各成分によって好適に製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、または経口摂取剤などに製剤化することができる。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。
【００４２】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含んだ要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による組成物は、個別治療剤で投与されるか他の治療剤と併用して投与され得、従来の治療剤とは順次または同時に投与され得、単一または多重投与され得る。上記した要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【００４３】
具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変わることができ、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１〜１５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇを毎日または隔日投与するか、１日１〜３回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することができるのであって、前記投与量はいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
本発明の食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。本発明による食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加するか、他の食品または食品成分と共に使用され得、通常の方法によって適切に使用され得る。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって適宜決定され得る。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかしながら、健康および衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取である場合には、前記量は、前記範囲以下であってもよい。
【００４５】
本発明の食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有すること以外に他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、単糖、例えば、ブドウ糖、果糖など；二糖類、例えばマルトース、スクロースなど；および多糖類、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を好適に用いることができる。前記天然炭水化物の割合は、当業者の選択によって適切に決定され得る。
【００４６】
上記のほか、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて用いることができる。このような添加剤の割合も、当業者によって適宜選択され得る。
【００４７】
以下、本発明の理解を助けるための好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
［実施例１．腸内細菌および細菌由来の小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析］
腸内細菌と細菌由来の小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来の小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウスの全体イメージを観察した結果、図１ａに示されたように、細菌である場合には、全身的に吸収されなかったが、細菌由来の小胞である場合には、投与５分後に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱で蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった（図１ａ参照）。
【００４９】
腸内細菌と腸内細菌由来の小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来の小胞を上記の方法のように投与した後、投与１２時間後に便、血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉を採取した。採取した組織で蛍光を観察した結果、図１ｂに示されたように、細菌由来の小胞が、便、血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉、腎臓に分布したが、細菌は、吸収されないことが分かった（図１ｂ参照）。
【００５０】
［実施例２．臨床サンプルで細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
便、血液、尿などの臨床サンプルをまず１０ｍｌのチューブに入れ、遠心分離法（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈めて上澄み液のみを新しい１０ｍｌのチューブに移した。０．２２μｍのフィルタを用いて細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ  ５０ｋＤ）に移し、１５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さい物質は捨てて１０ｍｌまで濃縮させた。さらに、０．２２μｍのフィルタ（ｆｉｌｔｅｒ）を用いてバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を用いて上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かした。
【００５１】
上記方法で分離した小胞１００μｌを１００℃でボイルして内部のＤＮＡを脂質の外に出るようにし、その後、氷に５分間冷ました後、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離して上澄み液のみを集めて、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来のＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）でＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来の遺伝子が存在することを確認した。
【００５２】
【表１】
2021510300.tif 000003
【００５３】
前記方法で抽出したＤＮＡを前記の１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマーを用いて増幅した後にシーケンシングを行い（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）、その結果をＳｔａｎｄａｒｄ  Ｆｌｏｗｇｒａｍ  Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルに出力し、ＧＳ  ＦＬＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ  ｃａｌｌ  ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ  ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）分析のためには、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシーケンス類似度によってクラスタリングを行い、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科(ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シーケンス類似度を基準にクラスタリングし、各ＯＴＵの門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、 科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ  ＲＮＡシーケンスデータベース（１０８，４５３シーケンス）を用いて属レベルで９７％以上のシーケンス類似度を有する細菌をプロファイリングした（ＱＩＩＭＥ）。
【００５４】
［実施例３．胃癌患者の血液内細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法で胃癌患者６６人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１９８人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて胃癌患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２および図２参照）。
【００５５】
【表２】
2021510300.tif 000004
【００５６】
［実施例４．大腸癌患者の便細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法で大腸癌患者２９人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト３５８人の便を対象として、便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの便に比べて大腸癌患者の便でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表３および図３参照）。
【００５７】
【表３】
2021510300.tif 000005
【００５８】
［実施例５．肝臓癌患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法で肝臓癌患者８６人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト３３１人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて肝臓癌患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表４および図４参照）。
【００５９】
【表４】
2021510300.tif 000006
【００６０】
［実施例６．すい臓癌患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法ですい臓癌患者１７６人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２７１人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べてすい臓癌患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表５および図５参照）。
【００６１】
【表５】
2021510300.tif 000007
【００６２】
［実施例７．胆管癌患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法で胆管癌患者７９人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２５９人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて胆管癌患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表６および図６参照）。
【００６３】
【表６】
2021510300.tif 000008
【００６４】
［実施例８．卵巣癌患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法で卵巣癌患者１３７人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１３９人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて卵巣癌患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表７および図７参照）。
【００６５】
【表７】
2021510300.tif 000009
【００６６】
［実施例９．膀胱癌患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法で膀胱癌患者９１人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１７６人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて膀胱癌患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表８および図８参照）。
【００６７】
【表８】
2021510300.tif 000010
【００６８】
［実施例１０．リンパ腫患者の尿細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法でリンパ腫患者６３人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト５３人の血液に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べてリンパ腫患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表９および図９参照）。
【００６９】
【表９】
2021510300.tif 000011
【００７０】
［実施例１１．心筋梗塞患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法で心筋梗塞患者５７人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１６３人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて心筋梗塞患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１０および図１０参照）。
【００７１】
【表１０】
2021510300.tif 000012
【００７２】
［実施例１２．心房細動患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法で心房細動患者３４人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト６２人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて心房細動患者の血液でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１１および図１１参照）。
【００７３】
【表１１】
2021510300.tif 000013
【００７４】
［実施例１３．パーキンソン病患者の尿細菌由来の小胞のメタゲノム分析］
実施例２の方法でパーキンソン病患者３９人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト７６人の尿を対象として、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べてパーキンソン病患者の尿でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１２および図１２参照）。
【００７５】
【表１２】
2021510300.tif 000014
【００７６】
［実施例１４．フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞分離および炎症誘導効果］
前記実施例の結果に基づいて、便からフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイを分離して培養した後、小胞を分離した。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ菌株を３７℃嫌気性チャンバで吸光度（ＯＤ６００）が１．０〜１．５になるまでＢＨＩ（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地で培養した後、サブカルチャー（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅ）した。以後、菌株が含まれていない培地の上澄み液を回収して１０，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルタに濾過した後、濾過した上澄み液を１００ｋＤａ  ｈｏｌｌｏｗフィルタメンブレインでＱｕｉｘＳｔａｎｄ  ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を用いて限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を通じて２００ｍｌの体積に濃縮した。以後、濃縮した上澄み液をさらに０．２２μｍのフィルタで濾過し、濾過された上澄み液を１５０，０００ｇ、４℃で３時間の間超遠心分離した後、ペレットをＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で懸濁した。次に、１０％、４０％、および５０％オプティプレップ溶液（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  ＡＳ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて密度勾配遠心分離を行い、低密度溶液の製造のためにオプティプレップ溶液をＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に希釈して用いた。２００，０００ｇ、４℃条件で２時間の間遠心分離を行った後、上層から１ｍｌの同じボリュームで分画された各溶液を１５０，０００ｇ、４℃条件で３時間の間さらに超遠心分離を実施した。以後、ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）アッセイを用いてタンパク質を定量し、得られた小胞に対して実験を実施した。
【００７７】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が、炎症細胞で炎症メディエーターの分泌に対する影響を確認するために、マウスマクロファージ株であるＲａｗ  ２６４．７細胞にフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、炎症メディエーター（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）の分泌量を測定した。より具体的に、Ｒａｗ  ２６４．７細胞を１×１０５個ずつ２４−ｗｅｌｌ細胞培養プレートに分注した後、２４時間の間ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）完全培地で培養した。以後、培養の上層液を１．５ｍｌチューブに集めて、３０００ｇで５分間遠心分離して、上層液を集めて４℃に保管しておいた後、ＥＬＩＳＡ分析を進めた。
【００７８】
その結果、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞（ＦＰＮ  ＥＶ）を前処理した場合、大腸菌由来の小胞によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌に比べて炎症メディエーターの分泌が顕著に低いことを確認した（図１３ａおよび図１３ｂ参照）。
【００７９】
［実施例１５．フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞の抗炎症効果］
前記実施例の結果に基づいて、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が、炎症細胞で病原性小胞による炎症メディエーターの分泌に対する抗炎症効果を確認するために、マウスマクロファージ株であるＲａｗ  ２６４．７細胞にフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、炎症疾患病原性小胞である大腸菌由来の小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）を処理して、炎症メディエーター（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）の分泌量を測定した。より具体的に、Ｒａｗ  ２６４．７細胞を１×１０５個ずつ２４−ｗｅｌｌ細胞培養プレートに分注した後、２４時間の間ＤＭＥＭ完全培地で培養した。以後、培養の上層液を１．５ｍｌのチューブに集めて、３０００ｇで５分間遠心分離して、上層液を集めて４℃に保管しておいた後、ＥＬＩＳＡ分析を進めた。
【００８０】
その結果、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞（ＦＰＮ  ＥＶ）を前処理した場合、大腸菌由来の小胞によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌が顕著に抑制されることを確認した（図１４ａおよび図１４ｂ参照）。これは、大腸菌由来の小胞のような病原性原因因子により誘導される炎症の発生をフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞が効率的に抑制することができることを意味する。
【００８１】
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明によるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ由来の小胞は、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、またはパーキンソン病に対する診断方法、および前記疾患に対する食品または薬品などの予防、改善または治療用組成物として用いられるので、関連医薬品産業および食品産業に有用に活用され得るものと期待される。
【図１ａ】
2021510300.tif 000015
【図１ｂ】
2021510300.tif 000016
【図２】
2021510300.tif 000017
【図３】
2021510300.tif 000018
【図４】
2021510300.tif 000019
【図５】
2021510300.tif 000020
【図６】
2021510300.tif 000021
【図７】
2021510300.tif 000022
【図８】
2021510300.tif 000023
【図９】
2021510300.tif 000024
【図１０】
2021510300.tif 000025
【図１１】
2021510300.tif 000026
【図１２】
2021510300.tif 000027
【図１３ａ】
2021510300.tif 000028
【図１３ｂ】
2021510300.tif 000029
【図１４ａ】
2021510300.tif 000030
【図１４ｂ】
2021510300.tif 000031
【配列表】
2021510300000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月1日(2020.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の診断のための情報提供方法：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患と判定する段階。
【請求項２】
前記段階（ａ）で、サンプルは、便、血液、または尿であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項３】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記小胞は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）から自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項３又は４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項７】
前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項６に記載の食品組成物。
【請求項８】
前記小胞は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）から自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項６又は７に記載の食品組成物。
【請求項９】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）由来の小胞の、胃癌、大腸癌、肝臓癌、すい臓癌、胆管癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫、心筋梗塞、心房細動、およびパーキンソン病よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患の予防または治療用薬剤の製造のための使用。
【国際調査報告】
2021510300.tif 000032
2021510300.tif 000033
2021510300.tif 000034
2021510300.tif 000035
2021510300.tif 000036
2021510300.tif 000037