(57)【要約】  可溶性免疫受容体レベルを減少させることを含む、癌を処置し、免疫療法を改善する方法が提供される。膜免疫受容体に結合し、受容体のタンパク質分解切断を阻害する薬剤、および可溶性免疫受容体に結合し、受容体アゴニストでもアンタゴニストでもない薬剤もまた、これらの薬剤の生成方法と同様に提供される。【選択図】図１０Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置および／または予防を必要とする対象における癌を処置および／または予防する方法であって、前記対象における可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルを減少させることを含む方法。
【請求項２】
ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を必要とする対象におけるＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法であって、前記対象におけるｓＣＤ２８レベルを減少させることを含む方法。
【請求項３】
免疫療法を必要とする前記対象が、癌に罹患している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法に反応しないか、または反応が低い、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記減少が、前記対象の血液、末梢血、または腫瘍微小環境で生じる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記減少が、
ａ．前記対象に、ｓＣＤ２８に結合する薬剤を投与することであって、前記薬剤は、結合すると、前記ｓＣＤ２８を分解するか、または前記ｓＣＤ２８を分解の標的とする、投与すること；
ｂ．前記対象に阻害性核酸分子を投与することであって、前記分子は、ｓＣＤ２８をコードするｍＲＮＡに結合し、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）をコードするｍＲＮＡには結合しない、投与すること；
ｃ．前記対象に、ｍＣＤ２８に結合し、前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を投与すること；
ｄ．前記対象に、ヒトＣＤ２８のストーク領域を含む二量体ペプチドを投与すること；
ｅ．前記対象に、ｍＣＤ２８を切断することができるプロテアーゼを阻害する薬剤を投与すること、および
ｆ．前記対象から血液を採取し、前記血液中のｓＣＤ２８の量を減少させ、前記血液を前記対象に戻すことの少なくとも１つを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ストーク領域が、
ａ．アミノ酸配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）もしくはＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号３６）を含む；
ｂ．アミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）からなる、または
ｃ．（ａ）および（ｂ）の両方である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、ｍＣＤ２８を分解しない、またはｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を減少させない、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記減少前の前記対象の血液が、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、黒色腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌および結腸直腸癌から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、黒色腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、および結腸直腸癌から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象に別の免疫療法を施すことをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫療法が、
ａ．チェックポイント阻害剤；
ｂ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づく治療；および
ｃ．癌ワクチンから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、前記ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤。
【請求項１６】
前記薬剤が、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない、請求項１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記薬剤が、前記ｍＣＤ２８を分解することも、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を阻害することもない、請求項１５または１６に記載の薬剤。
【請求項１８】
ａ．抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発しない；
ｂ．ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４を含む；
ｃ．ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、もしくはその両方を減少させるように設計されたＦｃドメインを含む；
ｄ．Ｆｃドメインを欠乏している；
ｅ．Ｆａｂ断片である；
ｆ．一本鎖抗体である；
ｇ．単一ドメイン抗体である；
ｈ．小分子である；
ｉ．ｍＣＤ２８に特異的に結合するペプチドである；または
ｊ．それらの組み合わせである、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１９】
ＣＤ２８のストーク領域内に結合する、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記ストーク領域が、
ａ．アミノ酸配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）もしくはＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号３６）を含む；
ｂ．アミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）からなる；または
ｃ．（ａ）および（ｂ）の両方である、請求項１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断を阻害する、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのプロテアーゼが、少なくとも１つのメタロプロテアーゼである、請求項２１に記載の薬剤。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのメタロプロテアーゼが、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７から選択される、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２４】
前記薬剤が、抗体またはその抗原結合断片であり、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含み、
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号３０（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号３１（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３２（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号３３（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３４（ＡＴＳＤＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号３５（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２５】
ａ．配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖；および
ｂ．配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖の少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の薬剤。
【請求項２６】
可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）に結合し、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない薬剤。
【請求項２７】
膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合しない、請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２８】
前記薬剤が、抗体またはその抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびｓＣＤ２８への特異的結合を有するペプチドから選択される、請求項２６または２７に記載の薬剤。
【請求項２９】
生物におけるｓＣＤ２８への前記薬剤の結合が、
ａ．前記結合したｓＣＤ２８の分解；
ｂ．血液からのｓＣＤ２８の除去；および
ｃ．前記結合したｓＣＤ２８のリソソーム、エンドソーム、プロテアソームまたはそれらの組み合わせへの輸送の少なくとも１つをもたらす、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記ｓＣＤ２８のリガンドへの結合を阻害しない、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３１】
二量体ｓＣＤ２８、単量体ｓＣＤ２８または両方に結合する、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３２】
ｓＣＤ２８のＩｇＶドメインの外側に結合する、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記薬剤が、抗体またはその抗原結合断片であり、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含み、
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１２（ＧＹＴＬＴＮＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１３（ＮＴＹＴＧＫ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号１４（ＧＤＡＮＱＱＦＡＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１５（ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１６（ＲＡＮＲＬＶＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１７（ＬＱＹＤＥＦＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む；
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１８（ＧＹＴＦＴＳＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１９（ＹＰＧＤＧＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２０（ＮＹＲＹＳＳＦＧＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２２（ＷＡＳＴＲＥＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号２３（ＱＳＤＹＳＹＰＬＴ）に示されるアミノ酸配列を含む；または
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２４（ＧＹＴＦＴＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２５（ＮＰＮＹＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２６（ＳＳＰＹＹＤＳＮＨＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２７（ＳＡＲＳＳＩＮＹＭＨ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２８（ＤＴＳＫＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号２９（ＨＱＲＮＳＹＰＦＴ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３４】
ａ．配列番号４１、４５または４９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖；および
ｂ．配列番号４３、４７または５１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖の少なくとも１つを含む、請求項３３に記載の薬剤。
【請求項３５】
前記抗原結合断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶまたはｓｃＦＶ２断片からなる群から選択される、請求項３３または３４に記載の薬剤。
【請求項３６】
ヒト化されている、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３７】
前記薬剤が、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発しない、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３８】
請求項１５から２５のいずれか一項に記載の薬剤を生成するための方法であって、
ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得し、プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する前記薬剤の能力を試験し、前記プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する少なくとも１つの薬剤を選択すること；または
薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、前記核酸配列は、
ｉ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得すること；
ｉｉ．プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する前記薬剤の能力を試験すること；および
ｉｉｉ．前記プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する少なくとも１つの薬剤を選択すること
によって選択された薬剤のものである、培養することを含み、それによって請求項１５から２５のいずれか一項に記載の薬剤を生成する方法。
【請求項３９】
前記プロテアーゼが、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に特異的に結合する薬剤を取得することが、ＣＤ２８ストークドメインに特異的に結合する薬剤を取得することである、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２６から３７のいずれか一項に記載の薬剤を生成する方法であって、
ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得し、前記取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択すること；または
薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、前記核酸配列は、
ｉ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得すること；
ｉｉ．前記取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイすること；および  
ｉｉｉ．ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択すること
によって選択された薬剤のものである、培養することを含み、それによって請求項２６から３７のいずれか一項に記載の薬剤を生成する方法。
【請求項４３】
ａ．前記取得された薬剤のｍＣＤ２８への結合を試験し、ｍＣＤ２８に結合しない少なくとも１つの薬剤を選択すること；および
ｂ．取得された薬剤の癌患者からのｓＣＤ２８への結合を試験し、癌患者からの前記ｓＣＤ２８に結合する少なくとも１つの薬剤を選択することの少なくとも１つをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記薬剤を取得することが、
ａ．前記ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片で生物を免疫し、前記免疫された生物から抗体を収集すること；
ｂ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合するための薬剤のライブラリをスクリーニングし、結合する薬剤を選択することの少なくとも１つを含む、請求項３８または４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片が、二量体または単量体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物が、ウサギ、マウス、ラット、サメ、ラクダ科動物、ニワトリ、ヤギおよびファージから選択される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体を収集することが、
ａ．前記免疫された生物の脾臓からＢ細胞を抽出すること；
ｂ．前記抽出されたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成すること；および
ｃ．前記ハイブリドーマから抗体を収集することを含む、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記結合する薬剤を選択することが、前記選択された薬剤を配列決定すること、および前記配列から前記薬剤の組換え形態を生成することを含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４９】
請求項３８から４８のいずれか一項に記載の方法により生成される薬剤。
【請求項５０】
請求項１５から３７および４９のいずれか一項に記載の薬剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項５１】
癌の処置および／もしくは予防、またはＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を必要とする対象における癌を処置および／もしくは予防する、またはＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法であって、対象に請求項５０の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項５２】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法により処置される対象の適合性を決定する方法であって、前記対象から試料を取得すること、および前記試料中のｓＣＤ２８レベルを決定することを含み、５ｎｇ／ｍｌを超えるｓＣＤ２８レベルは、対象が請求項１から１２のいずれか一項に記載の処置の方法に適していることを示す方法。
【請求項５３】
請求項１５から３７および４９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの薬剤を含むキット。
【請求項５４】
ａ．抗ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１免疫療法；
ｂ．本発明の薬剤がＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法と共に使用するためのものであることを示すラベル；ならびに
ｃ．請求項１５から３７および４９のいずれか一項に記載の前記少なくとも１つの薬剤を検出するための二次検出分子の少なくとも１つをさらに含む、請求項５３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１５日の米国仮特許出願第６２／６４３，３３４号、２０１８年３月１５日の米国仮特許出願第６２／６４３，３５５号、および２０１８年１２月２日の米国仮特許出願第６２／７７４，２５４号の優先権の利益を主張し、その内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、免疫調節および免疫療法の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
適応免疫システムは、主に抗原特異的ヘルパーＣＤ４＋および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激を調整することにより、病原体および癌細胞に対する調節および保護において重要な役割を果たす。抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞の耐久性のある持続的な活性化には、ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＡＰＣ上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示されるペプチドとの関与、およびｉｉ）ＡＰＣによっても発現されるＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）リガンドに結合するＴ細胞上の共刺激性ＣＤ２８受容体が関連する。ＣＤ２８共刺激の生物学的影響は数多くあり、免疫エフェクター機能を達成するために必要なしきい値を下げることによるＴ細胞周期の制御、拡大、分化、およびＴＣＲ刺激の増幅が含まれる。
【０００４】
活性化共刺激分子ＣＤ２８とは対照的に、構造的相同体である細胞傷害性Ｔリンパ球関連４（ＣＴＬＡ−４）は、ＣＤ２８のトリガーによって駆動される膜発現を伴う抑制性共刺激受容体である。ＣＴＬＡ−４とＣＤ２８はどちらも、Ｉ型の膜貫通タンパク質である。それらの細胞外部分は、膜貫通領域に近接するＩｇＶドメインの外側に位置するシステイン残基によってホモ共有結合されている１つのＶセット免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｉｇ−Ｖ）ドメインで構成されている。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８は、類似しているものの、親和性および四次構造配置の点で異なる。ＣＴＬＡ−４は、Ｂ７分子との結合親和性がより高く、ＣＤ２８とは異なる二量体化モードを有し、共有リガンドとの化学量論的結合が異なることが判明した。ＣＤ２８は一価の結合化学量論を示し、ＣＴＬＡ−４は二価の様式で相互作用する。したがって、ＣＴＬＡ−４はＣＤ２８よりもはるかに高い親和性および結合力でＢ７分子に結合し、その結果、Ｔ細胞応答を下方調節し、抗原特異的寛容の開始に有利となる。
【０００５】
いくつかの共刺激分子はいくつかの生理学的形態を有することが示されている。膜結合型に加えて、ナイーブ免疫細胞で発現する可溶型も報告されており、Ｔ細胞生物学の複雑さが増している。ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）の可溶型は、選択的にスプライシングされた遺伝子産物に起因するとされている。スプライシングイベントの結果、フレームシフトが発生し、翻訳が停止する前に１３７位のグリシンの後に２つのグルタミン酸残基が追加される。最終生成物は膜貫通領域および細胞質領域全体を欠失しており、重要なことに、二量体ＣＤ２８のジスルフィド結合を媒介する１４１位のシステイン残基が欠失している（Ｍａｇｉｓｔｒｅｌｌｉ  Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９）。単量体ＣＤ２８可溶型の生物学的機能およびカウンター受容体結合が調査され（Ｈｅｂｂａｒ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４）、Ｔ細胞の増殖も阻害することが示された。それでも、二量体ｓＣＤ２８の場合、Ｂ７分子に結合することによりＴ細胞の機能を抑制するための調節的役割を有することが示唆されている（Ｓｕｎ，Ｚ．，Ｃｅｎｔｒ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４；Ｈｅｂｂａｒ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４）。驚くべきことに、自己免疫疾患患者の血清中のｓＣＤ２８分子数の増加が報告されている（Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｋ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２００５；Ｈａｍｚａｏｕｉ，Ｋ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２００５；Ｈｅｂｂａｒ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４；Ｓｕｎ，Ｚ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４）。ｓＣＤ２８の明確な源は議論の的となっている。自己免疫患者のＴ細胞の持続性炎症状態を反映するＴ細胞活性化のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して、Ｔ細胞活性化のプロセス中に代替の可溶型の転写が抑制され、ＣＤ２８の全長膜形態のみが明らかであり、一方培養中のｓＣＤ２８の量は増加することが示されている（Ｈｅｂｂａｒ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４）。この現象は、ＣＤ２８の膜形態の活発な脱落が血清中の可溶性分子の上昇の原因であるという提案につながったが、これはまだ証明されていない。Ｔ細胞活性化中の活発な脱落は、接着分子のタンパク質分解による持続的な活性化に対抗する調節メカニズムとして過去に説明されていた。
【０００６】
ＣＴＬＡ−４は初期Ｔ細胞応答の振幅を制限するが、別の阻害性受容体ＰＤ−１は末梢のＴ細胞機能を抑制する。ＰＤ−１の発現はＴ細胞の活性化中に上昇し、その既知のリガンドはＢ７ファミリーホモログ：Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）およびＢ７−Ｈ２（ＰＤ−Ｌ２）である。これらのホモログはＡＰＣおよび癌細胞に見られ、活性化されたＴ細胞を細胞アネルギーの状態にして、免疫応答を弱める。したがって、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸に対する標的療法は、さまざまな種類の癌で臨床活性を示している。最近の研究では、ＣＤ２８のシグナル伝達経路がＰＤ−１によって標的化および抑制されることが示され（Ｈｕｉ，Ｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７）、同時に、効果的なＰＤ−１療法を行うためには、無傷の活性なＣＤ２８／Ｂ７軸が不可欠であるこが示されている（Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ，Ａ．Ｏ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７）。
【０００７】
しかしながら、すべての患者がＰＤ−１に基づく免疫療法または一般的な免疫療法に応答するわけではなく、またしばしば再発する。したがって、患者の免疫細胞が癌を攻撃する能力を改善することができる方法および分子が大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、可溶性ＣＤ２８レベルを減少させることを含む、癌を処置し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法を提供する。膜ＣＤ２８に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤、および可溶性ＣＤ２８に結合し、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない薬剤もまた、これらの薬剤の生成方法と同様に提供される。
【０００９】
第１の態様によれば、癌の処置および／または予防を必要とする対象における癌を処置および／または予防する方法であって、対象における可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルを減少させることを含む方法が提供される。
【００１０】
ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を必要とする対象におけるＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法であって、対象におけるｓＣＤ２８レベルを減少させることを含む方法が提供される。
【００１１】
別の態様によれば、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）に結合し、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない薬剤が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、免疫療法を必要とする対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態によれば、対象は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法に反応しないか、または反応が低い。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、減少は、対象の血液、末梢血、または腫瘍微小環境で生じる。いくつかの実施形態によれば、減少させることは、
ａ．対象に、ｓＣＤ２８に結合する薬剤を投与することであって、薬剤は、結合すると、ｓＣＤ２８を分解するか、またはｓＣＤ２８を分解の標的とする、投与すること；
ｂ．対象に阻害性核酸分子を投与することであって、分子は、ｓＣＤ２８をコードするｍＲＮＡに結合し、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）をコードするｍＲＮＡには結合しない、投与すること；
ｃ．対象に、ｍＣＤ２８に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤を投与すること；
ｄ．対象に、ヒトＣＤ２８のストーク領域を含む二量体ペプチドを投与すること；
ｅ．対象に、ｍＣＤ２８を切断することができるプロテアーゼを阻害する薬剤を投与すること、および
ｆ．対象から血液を採取し、血液中のｓＣＤ２８の量を減少させ、血液を対象に戻すことの少なくとも１つを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、ストーク領域は、
ａ．アミノ酸配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）もしくはＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号３６）を含む；
ｂ．アミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）からなる、または
ｃ．（ａ）および（ｂ）の両方である。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、ｍＣＤ２８を分解しない、またはｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化を減少させない。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、減少する前の対象の血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、癌は、黒色腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌および結腸直腸癌から選択される。いくつかの実施形態によれば、癌は、黒色腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、および結腸直腸癌から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、対象に別の免疫療法を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、免疫療法は、
ａ．チェックポイント阻害剤；
ｂ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づく治療；および
ｃ．癌ワクチンから選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法である。
【００２０】
別の態様によれば、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤が提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない。いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ｍＣＤ２８を分解することも、ｍＣＤ２８媒介性免疫細胞活性化を阻害することもない。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、
ａ．抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発しない；
ｂ．ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４を含む；
ｃ．ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、もしくはその両方を減少させるように設計されたＦｃドメインを含む；
ｄ．Ｆｃドメインを欠乏している；
ｅ．Ｆａｂ断片である；
ｆ．一本鎖抗体である；
ｇ．単一ドメイン抗体である；
ｈ．小分子である；
ｉ．ｍＣＤ２８に特異的に結合するペプチドである；または
ｊ．それらの組み合わせである。
【００２３】
一部の実施形態によれば、薬剤は、ＣＤ２８のストーク領域内に結合する。いくつかの実施形態によれば、ストーク領域は、
ａ．アミノ酸配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）もしくはＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号３６）を含む；
ｂ．アミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）からなる；または
ｃ．（ａ）および（ｂ）の両方である。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断を阻害する。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのプロテアーゼは、少なくとも１つのメタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのメタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、抗体またはその抗原結合断片であり、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含み、
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号３０（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号３１（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３２（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号３３（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３４（ＡＴＳＤＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号３５（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、本発明の薬剤は、
ａ．配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖；および
ｂ．配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖の少なくとも１つを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合しない。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、抗体またはその抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびｓＣＤ２８への特異的結合を有するペプチドから選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、生物におけるｓＣＤ２８への薬剤の結合は、
ａ．結合したｓＣＤ２８の分解；
ｂ．血液からのｓＣＤ２８の除去；および
ｃ．結合したｓＣＤ２８のリソソーム、エンドソーム、プロテアソームまたはそれらの組み合わせへの輸送の少なくとも１つをもたらす。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ｓＣＤ２８のリガンドへの結合を阻害しない。いくつかの実施形態によれば、薬剤は、二量体のｓＣＤ２８、単量体のｓＣＤ２８または両方に結合する。いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ｓＣＤ２８のＩｇＶドメインの外側に結合する。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、抗体またはその抗原結合断片であり、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含み、
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１２（ＧＹＴＬＴＮＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１３（ＮＴＹＴＧＫ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号１４（ＧＤＡＮＱＱＦＡＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１５（ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１６（ＲＡＮＲＬＶＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１７（ＬＱＹＤＥＦＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む；
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１８（ＧＹＴＦＴＳＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１９（ＹＰＧＤＧＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２０（ＮＹＲＹＳＳＦＧＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２２（ＷＡＳＴＲＥＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号２３（ＱＳＤＹＳＹＰＬＴ）に示されるアミノ酸配列を含む；または
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２４（ＧＹＴＦＴＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２５（ＮＰＮＹＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２６（ＳＳＰＹＹＤＳＮＨＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２７（ＳＡＲＳＳＩＮＹＭＨ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２８（ＤＴＳＫＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号２９（ＨＱＲＮＳＹＰＦＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、本発明の薬剤は、
ａ．配列番号４１、４５または４９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖；および
ｂ．配列番号４３、４７または５１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖の少なくとも１つを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、抗原結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶまたはｓｃＦＶ２断片からなる群から選択される。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、ヒト化されている。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、薬剤は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発しない。
【００３６】
別の態様によれば、本発明の薬剤を生成するための方法であって、
ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得し、プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する薬剤の能力を試験し、プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する少なくとも１つの薬剤を選択すること；または
薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、核酸配列は、
ｉ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得すること；
ｉｉ．プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する薬剤の能力を試験すること；および
ｉｉｉ．プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する少なくとも１つの薬剤を選択すること
によって選択された薬剤のものである、培養することを含み、それによって本発明の薬剤を生成する方法が提供される。
【００３７】
別の態様によれば、本発明の薬剤を生成するための方法であって、
ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得し、取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択すること；または
薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、核酸配列は、
ｉ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得すること；
ｉｉ．前記取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイすること；および
ｉｉｉ．ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択すること
によって選択された薬剤のものである、培養することを含み、それによって本発明の薬剤を生成する方法が提供される。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７から選択される。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に特異的に結合する薬剤を取得することは、ＣＤ２８ストークドメインに特異的に結合する薬剤を取得することである。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、方法は、
ａ．取得された薬剤のｍＣＤ２８への結合を試験し、ｍＣＤ２８に結合しない少なくとも１つの薬剤を選択すること；および
ｂ．取得された薬剤の癌患者からのｓＣＤ２８への結合を試験し、癌患者からのｓＣＤ２８に結合する少なくとも１つの薬剤を選択することの少なくとも１つをさらに含む。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、薬剤を取得することが、
ａ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片で生物を免疫し、免疫された生物から抗体を収集すること；
ｂ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合するための薬剤のライブラリをスクリーニングし、結合する薬剤を選択することの少なくとも１つを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片は、二量体または単量体である。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、生物は、ウサギ、マウス、ラット、サメ、ラクダ科動物、ニワトリ、ヤギおよびファージから選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、抗体を収集することは、
ａ．免疫された生物の脾臓からＢ細胞を抽出すること；
ｂ．抽出されたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成すること；および
ｃ．ハイブリドーマから抗体を収集することを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、結合する薬剤を選択することは、選択された薬剤を配列決定すること、および配列から薬剤の組換え形態を生成することを含む。
【００４７】
別の態様によれば、本発明の方法により生成される薬剤が提供される。
【００４８】
別の態様によれば、本発明の薬剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物が提供される。
【００４９】
別の態様によれば、癌の処置および／もしくは予防、またはＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を必要とする対象における癌を処置および／もしくは予防する、またはＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法であって、対象に本発明の医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００５０】
別の態様によれば、本発明の方法により処置される対象の適合性を決定する方法であって、対象から試料を取得すること、および試料中のｓＣＤ２８レベルを決定することを含み、５ｎｇ／ｍｌを超えるｓＣＤ２８レベルは、対象が本発明の処置の方法に適していることを示す方法が提供される。
【００５１】
別の態様によれば、本発明の少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、本発明のキットは、
ａ．抗ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１免疫療法；
ｂ．本発明の薬剤がＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法と共に使用するためのものであることを示すラベル；ならびに
ｃ．請求項１５から３７および４９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの薬剤を検出するための二次検出分子の少なくとも１つをさらに含む。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示としてのみ与えられると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＰＢＭＣの刺激中に可溶性ＣＤ２８が生成され、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）の添加により中和される。ヒトＣＤ２８  ＥＬＩＳＡで定量化された、ＳＥＢ（０．５ｎｇ／ｍＬ、左側）またはＣＭＶペプチド（０．５μｇ／ｍＬ、右側）で刺激されたＰＢＭＣの培養物における可溶性ＣＤ２８の量の棒グラフ（上部パネル）である。プロテアーゼ阻害剤のカクテルを指示された濃度で加えた。全体的な健康およびエフェクター活性は、インターフェロンγの分泌によって検査された（下のパネル）。
【図２】ＰＨＡによるＴ細胞の刺激中に可溶性ＣＤ２８が生成され、プロテアーゼ阻害剤の添加により中和される。一定濃度のプロテアーゼ阻害剤カクテル（２μＭ）の存在下、増加濃度のＰＨＡ（１〜４μｇ／ｍＬ、上のグラフＰで刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞（左上）または単離されたＣＤ４  Ｔ細胞（右上）の棒グラフである。別のセットアップでは、ＰＨＡ濃度を固定してＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（１μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ、左下）またはヒトＣＤ４  Ｔ細胞（２μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ、右下）を刺激し、プロテアーゼ阻害剤カクテルの濃度を調整した（０．５〜２μＭ）。上清中のヒトＣＤ２８の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡで定量化された。
【図３Ａ−Ｂ】特定のＡＤＡＭ−１０およびＡＤＡＭ−１７阻害剤は、ＳＥＢによるヒトＰＢＭＣ活性化中に可溶性ＣＤ２８の蓄積を排除し、その生存能を妨げない。（３Ａ〜Ｂ）様々な濃度（０．０１〜１μＭ）の（３Ａ）ＡＤＡＭ−１０特異的阻害剤（ＧＩ２５４０２３Ｘ）および（３Ｂ）ＡＤＡＭ−１７特異的阻害剤（ＴＭＩ−１）の存在下での、ＳＥＢ（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激されたヒトＰＢＭＣの棒グラフである。異なる処理における細胞の生存能を、ＭＴＴアッセイを使用して評価した（上部パネル）。上清中のヒトＣＤ２８（下のパネル）の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡで定量化された。
【図４Ａ−Ｄ】ＰＢＭＣ刺激中に可溶性ＣＤ２８が生成される。（４Ａ）ＣＭＶを含まない（黒い棒）、またはＣＭＶペプチドを含む（暗い灰色の棒）同じドナーからのＣＤ３  Ｔ細胞と１：５の比率で混合された未成熟樹状細胞の棒グラフ。単独またはＣＭＶを使用した各細胞集団の制御は、薄い灰色の棒で表示される。上清中のヒトＣＤ２８の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡで定量化された。（４Ｂ〜Ｄ）（４Ｂ）ＣＭＶまたは（４Ｃ）ＳＥＢまたは（４Ｄ）ＡＤＡＭ−１０およびＡＤＡＭ−１７阻害剤の存在下でのＳＥＢで２４刺激され、次いで清浄な培養物に移されたヒトＰＢＭＣの棒グラフ。図４Ｄの測定値は、細胞を移してから１２０時間後である。
【図５】ＣＤ２８可溶性スプライス変異体は、活性化細胞で下方調節される。非刺激ＰＢＭＣ（レーン４）およびＣＤ４（レーン６）、刺激ＰＢＭＣ（レーン５）およびＣＤ４細胞（レーン７）でＰＣＲにより増幅されたヒトＣＤ２８のコード配列を示すゲルの写真である。増幅された断片を１％アガロースゲルでサイズ分離し、臭化エチジウムで可視化した。ＧＡＤＰＨ  ｃＤＮＡを対照として増幅した（下のパネル）。Ｓａｎｇｅｒ配列決定用に取得されたバンドは、Ｓ１（ＰＨＡ活性化ＣＤ４−６５０ｂｐ）およびＳ２（ナイーブＣＤ４−５５０ｂｐバンド）でマークされている。
【図６】可溶性ＣＤ２８は、エフェクターサイトカインの分泌を阻害する。組換えヒトＣＤ２８を含まない（黒い棒）、または指定濃度で含む（灰色の棒）ＣＭＶ（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激されたヒトＰＢＭＣの棒グラフである。ＣＭＶ刺激のないナイーブ試料は、薄い灰色の棒で示される。上清中のヒトＩＦＮガンマの濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化された。
【図７】可溶性ＣＤ２８は、ＩＬ−６サイトカイン分泌を増加させる。組換えヒトＣＤ２８を含まない（黒い棒）、または示された濃度で含む（灰色の棒）ＣＭＶ（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激したヒトＰＢＭＣの棒グラフである。ＣＭＶ刺激のないナイーブ試料は、薄い灰色の棒で示される。上清中のヒトＩＬ−６の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化された。
【図８Ａ−Ｅ】（８Ａ）示された濃度の組換えヒト可溶性ＣＤ２８（灰色の三角形）または組換えヒト可溶性ＣＴＬＡ−４（黒い円）の存在下、ＣＭＶ（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激されたヒトＰＢＭＣの線グラフである。上清中のヒトＩＬ−６、ＩＦＮγおよびＩＬ−４の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化された。上清中のヒトＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ（４０）およびＩＬ−１０の濃度は、Ｍａｇｐｉｘシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したマルチプレックス分析で定量化された。（８Ｂ）自己単球およびＣＤ３  ＭＬＲからのサイトカイン分泌の棒グラフ。ＣＭＶ刺激のないナイーブ試料は、薄い灰色の棒で示される。ＣＭＶ単独またはＩｇＧ対照を使用した場合は、黒い棒で示される。ｓＣＤ２８の濃度の増加は、濃い灰色のバーで示される。（８Ｃ）組換えヒト可溶性ＣＤ２８の存在下、ＳＥＢで刺激された（灰色の円）、または対照ＩｇＧ（灰色の三角形）で刺激されたヒトＰＢＭＣによるリンパ球のクラスタ形成の線グラフである。（８Ｄ）組換えヒトｓＣＤ２８あり、またはなしで処理された単球からのキヌレニンＥＬＩＳＡキットによって測定された培養物へのＩＤＯ分泌の棒グラフである。（８Ｅ）組換えヒトｓＣＤ２８あり、またはなしで処理された単球におけるＩＤＯの細胞内ＦＡＣＳの散布図である。
【図９Ａ−Ｃ】可溶性ＣＤ２８は、抗ＰＤ１処置を阻害する。（９Ａ）抗ＰＤ１（ＭＫ３４７５、５μｇ／ｍＬ、黒い棒）または組換えヒト可溶性ＣＤ２８（２および１０μｇ／ｍＬ、灰色の棒）または両方の組み合わせ（点付きの棒）の存在下で、ＳＥＢ（２００ｎｇ／ｍＬ、左側のグラフ）またはＣＭＶペプチド（０．５μｇ／ｍＬ、右側のグラフ）で３日間刺激されたヒトＰＢＭＣの棒グラフである。（９Ｂ）単球ＭＬＲ設定からのサイトカイン分泌の棒グラフである（ナイーブ−白い棒、ＣＭＶのみ−明るい灰色の棒、ｓＣＤ２８−黒い棒、ＭＫ−３４７５−暗い灰色、ｓＣＤ２８＋ＭＫ−３４７５−格子縞の棒）。上清中のヒトＩＦＮγ、ＴＧＦβおよびＩＬ−２の濃度は、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化された。（９Ｃ）対照およびｓＣＤ２８とのインキュベーション後の単球における表面ＰＤ−Ｌ１（左）およびＰＤ−Ｌ２（右）発現のヒストグラムである。
【図１０Ａ−Ｄ】がん患者における可溶性ＣＤ２８である。（１０Ａ）可溶性ヒトＣＤ２８の存在について調査された１０の癌の徴候および健康なドナーのそれぞれにおける２０の血漿試料を示すドットプロットである。可溶性ＣＤ２８の含有量が高い試料は、いくつかの希釈係数で繰り返し調査された。上清中のヒトＣＤ２８の濃度は、ヒト血漿試料からの読み取り値に対応するために内部で補正された標準化サンドイッチＥＬＩＳＡで定量化された。（１０Ｂ）本発明の抗体＃１および＃３、ならびに市販のＣＤ２８  ＥＬＩＳＡキットを使用した、２０の黒色腫患者試料からのｓＣＤ２８のＥＬＩＳＡ検出の棒グラフである。＊−測定量が１５０ｎｇ／ｍｌを超える。（１０Ｃ）ｓＣＤ２８、ＭＫ−３４７５およびその２つの組み合わせの存在下で、癌患者（肉腫患者−左上、腎臓癌患者−右上、および２つの異なる頭頸部癌患者−下）のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからサンドイッチＥＬＩＳＡで測定されたＩＮＦγ分泌の棒グラフである。（１０Ｄ）単独、ＩＬ−６との併用、単球との共培養または単球およびｓＣＤ２８との共培養における、癌細胞ＳＣＣ−２５の生存能および増殖の棒グラフである。
【図１１Ａ−Ｂ】（１１Ａ）一定のＣＤ８０−Ｆｃレベルおよび可溶性ＣＤ２８の滴定の存在下抗ＣＤ３で刺激された、単離ＣＤ３  Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌の棒グラフである。（１１Ｂ）一定のｓＣＤ２８レベルおよびＣＤ８０−Ｆｃ滴定の存在下、ＣＭＶで刺激された単離ＰＢＭＣである。
【図１２Ａ−Ｂ】（１２Ａ〜Ｂ）（１２Ａ）組換えマウスＣＤ２８の投与なしおよび（１２Ｂ）投与ありで抗ＰＤ−１抗体で処理された免疫適格マウスにおける接種されたＨ２２細胞の腫瘍体積の線グラフである。
【図１３Ａ−Ｃ】（１３Ａ）ＢＳＡ結合ＣＤ２８ストーク領域二量体ペプチド（右）および組換えヒトＣＤ２８タンパク質（左）へのクローンＭ９の段階希釈による抗原結合を示す線グラフである。抗原は、ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートに固定化された。クローンＭ９の一連の希釈を行い、結合した抗体の検出をロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰおよびＴＭＢによる発色で行った。（１３Ｂ）組換えヒトｓＣＤ２８（左）およびＳＥＢで活性化されたヒトＰＢＭＣから脱落したｓＣＤ２８（右）のＥＬＩＳＡ検出の棒グラフである。ＥＬＩＳＡでは、陽性対照として抗体＃３（２μｇ／ｍＬ、灰色の棒）、陰性対照として無関係な抗体Ｍ３９（１０μｇ／ｍＬ、濃い灰色の棒）、および抗切断抗体Ｍ９（１０μｇ／ｍＬ、黒色の棒）が使用された。組換えＣＤ２８または脱落したＣＤ２８の検出は、ＨＲＰ（０．５μｇ／ｍＬ）に結合したＥＬＩＳＡキット検出抗体を使用して行われた。（１３Ｃ）市販のＭＡＢ３４２、クローン３７４０７についての増加濃度の組換えヒトＣＤ２８−Ｆｃ、組換えヒトＣＤ２８ａ、組換えマウスＣＤ２８および二量体ヒトＣＤ２８ストーク領域ペプチドに対するＥＬＩＳＡアッセイの結果の線グラフである。
【図１４Ａ−Ｅ】（１４Ａ〜Ｂ）（１４Ａ）ＰＨＡで刺激されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、および（１４Ｂ）ＳＥＢで刺激されたヒトＰＢＭＣからの上清中のｓＣＤ２８レベルを示す棒グラフである。（１４Ｃ）抗体＃１および＃２ならびに市販のＣＤ２８．２についての増加濃度のヒトｓＣＤ２８に対するＥＬＩＳＡアッセイの結果の線グラフである。（１４Ｄ）抗体＃１、＃２、および＃３のそれぞれについての増加濃度のヒトｓＣＤ２８に対するＥＬＩＳＡアッセイの結果の線グラフである。（１４Ｅ）抗体＃１、＃２、および＃３のそれぞれについての増加濃度のマウスｓＣＤ２８に対するＥＬＩＳＡアッセイの結果の線グラフである。
【図１５Ａ−Ｉ】（１５Ａ〜Ｄ）ＣＤ８６単独（赤い線）、またはＣＤ８６ならびに（１５Ａ）ＣＤ２８．２、（１５Ｂ）抗体＃１、（１５Ｃ）抗体＃２、（１５Ｄ）抗体＃３および（１５Ｅ）ｍＩｇＧ対照（緑色の線）の添加後の、ｍＣＤ２８を発現する細胞へのＣＤ８６の結合を示すＦＡＣＳヒストグラムである。染色されていない細胞（黒い線）を示すために、二次抗体のみを添加した。（１５Ｆ〜Ｇ）（１５Ｆ）２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３、およびＣＤ２８．２（２．０μｇ／ｍＬ）または異なる希釈（０．１〜１０μｇ／ｍＬ、黒い棒）での抗体＃１〜３での処理後のＴ細胞、（１５Ｇ）ＳＥＢ刺激およびＣＤ２８．２（２．０μｇ／ｍＬ）または異なる希釈（０．１〜１０μｇ／ｍＬ、黒い棒）での抗体＃１〜３での処理後のＰＢＭＣ、ならびに（１５Ｈ）抗体＃１〜３の濃度を変化させた場合と変化させない場合のＣＤ８０−Ｆｃでの処理後のＴ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を示す棒グラフである。（１５Ｉ）ナイーブＣＤ３陽性Ｔ細胞への抗体＃１〜３の結合のヒストグラムである。
【図１６Ａ−Ｇ】（１６Ａ〜Ｂ）異なる量の（１６Ａ）抗体＃１および（１６Ｂ）抗体＃２に結合したビーズと混合した後の、癌患者の血液中に残っているｓＣＤ２８を示す棒グラフである。（１６Ｃ〜Ｇ）抗体＃１、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＯＳＬと結合したビーズと混合した後の、（１６Ｃ）結腸直腸癌患者、（１６Ｄ〜Ｅ）黒色腫患者、（１６Ｆ）卵巣癌患者、および（１６Ｇ）健康な患者からの血液中に残っているｓＣＤ２８を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、いくつかの実施形態において、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤、および可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）に結合し、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない薬剤を提供する。本発明はさらに、結合するとｓＣＤ２８を分解する、もしくはｓＣＤ２８の分解をもたらす、または循環、組織、および／または腫瘍微小環境（ＴＭＥ）からのそのクリアランスをもたらす薬剤を提供する。いくつかの場合には、薬剤はこれらのタスクの複数を実行することができる。また、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルを減少させることを含む、癌を処置し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を改善する方法も提供される。本発明の薬剤および方法は、多数の癌患者がその血流中のｓＣＤ２８レベルを上昇させているという驚くべき発見に基づいている。ｓＣＤ２８は、自己免疫疾患で時折過剰発現する既知の免疫モジュレーターである。しかしながら、これまで、非常に高いレベルが多種多様な癌で報告されたことはない。さらに、ｓＣＤ２８がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を阻害し得ることが予想外に発見された。したがって、対象の血流中のｓＣＤ２８の低減は、癌と戦う対象の能力および免疫療法の有効性に対するｓＣＤ２８の有害な影響の低減につながる。
【００５６】
本発明の抗切断分子は、二重の利点を有する。ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を遮断することにより、Ｔ細胞の細胞表面でＣＤ２８の量を高く維持する。これにより、迅速かつ効果的なＴ細胞の活性化が可能になり、これは、表面ＣＤ２８のレベルが切断により低下した場合に損なわれる。さらに、切断の低減は、対象の血流中のｓＣＤ２８の低減につながり、したがって、癌と戦う対象の能力および免疫療法の有効性に対するｓＣＤ２８の有害な影響の低減につながる。
【００５７】
ｓＣＤ２８の結合
第１の態様により、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）に結合し、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない薬剤が提供される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８は、哺乳動物のＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ２８は、アミノ酸配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１）を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、成熟ＣＤ２８は、シグナルペプチドを欠失し、配列：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２）を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、全長ヒトＣＤ２８をコードするＤＮＡコード配列は、配列：ＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡ（配列番号３）を含む。
【００６０】
本明細書で使用される場合、ｓＣＤ２８は、膜貫通ドメインを含まず、したがって膜に組み込むことができない任意のＣＤ２８断片または変異体を指す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４）を含む。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、膜結合されていない。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、溶液中にある。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、血液中のＣＤ２８である。いくつかの態様において、ｓＣＤ２８は、ＴＭＥ中のＣＤ２８である。いくつかの態様において、ｓＣＤ２８は、体液中のＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８のエクソン３を欠失している。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８のエクソン３をスプライシングする選択的スプライシングから生じるスプライス変異体である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）からの切断産物である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、短縮型ＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、全長ＣＤ２８の細胞質ドメインを欠失している。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、二量体ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、単量体ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、ＣＤ２８の選択的スプライシングから生じるスプライス変異体ではない。いくつかの態様において、選択的スプライシングは、ＣＤ２８のエクソン３をスプライシングする。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、アミノ酸配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＥＥ（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、シグナルペプチドを欠失し、配列：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＥＥ（配列番号６）を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ヒトｓＣＤ２８をコードするＤＮＡコード配列は、配列：ＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡ（配列番号７）を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８およびｍＣＤ２８に結合し、ｓＣＤ２８のみの分解またはクリアランスにつながる、またはそれを引き起こす。いくつかの実施形態において、薬剤は、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合しない。本明細書で使用される場合、ｍＣＤ２８は、膜貫通ドメインを含み、したがって膜に組み込むことができる任意のＣＤ２８を指す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４）を含む。いくつかの実施形態において、ｍＣＤ２８は、膜内にある。いくつかの実施形態において、ｍＣＤ２８は、ＥＲから通過し、ゴルジ体を通過して細胞の原形質膜に達した。いくつかの実施形態において、ｍＣＤ２８は、免疫細胞の原形質膜内にある。いくつかの実施形態において、ｍＣＤ２８は、Ｔ細胞の原形質膜内にある。
【００６３】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アンタゴニストではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８結合剤はまた、ｍＣＤ２８アゴニストでもある。
【００６４】
「アゴニスト」という用語は、一般に、受容体に結合し、受容体を完全にまたは部分的に活性化する分子、化合物または薬剤を指す。いくつかの実施形態において、アゴニストは、天然リガンドと同じ部位で結合する。いくつかの実施形態において、アゴニストは、天然リガンドの結合部位とは異なるアロステリック部位で結合する。「アンタゴニスト」という用語は、一般に、アゴニストと同じ部位または別の部位で受容体に結合し、受容体を活性化せず、天然リガンドによる受容体の活性化の妨害または遮断、および受容体アゴニストによる受容体の活性化の妨害または遮断の１つまたは複数を行う分子、化合物または薬剤を指す。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ｍＣＤ２８に結合するが、受容体を活性化しない、または受容体の活性化を遮断しない。いくつかの実施形態において、それらは、ＣＤ８６による活性化を遮断しない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ｍＣＤ２８に結合しない。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「直接アゴニスト／アンタゴニスト」は、受容体（ｍＣＤ２８）に結合し、結合することによってその分子によるシグナル伝達を増加／減少させる分子を指す。ｍＣＤ２８の場合、アゴニストは、ｍＣＤ２８に結合し、結合することによって細胞内のｍＣＤ２８シグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態において、アゴニストは、Ｔ細胞活性化を増加させる。いくつかの実施形態において、アゴニストは、Ｔ細胞増殖を増加させる。いくつかの実施形態において、アゴニストは、炎症誘発性サイトカイン分泌を増加させる。炎症誘発性サイトカインは、当技術分野で周知であり、活性化Ｔ細胞によって分泌されることが知られている。炎症誘発性サイトカインの例には、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１Ｂ、およびＩＬ−６が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、炎症誘発性サイトカインは、ＩＦＮγである。ｍＣＤ２８の場合、アンタゴニストは、ｍＣＤ２８に結合し、結合することによって細胞におけるｍＣＤ２８シグナル伝達を減少させる。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、Ｔ細胞活性化を減少させ、Ｔ細胞増殖を減少させ、および／または炎症誘発性サイトカイン分泌を減少させる。リガンドに接触する、阻害剤に接触する、共受容体に接触する、または受容体シグナル伝達を改変するために問題の受容体以外の分子に接触することによって受容体のシグナル伝達に影響を与える分子は、直接アゴニスト／アンタゴニストとは見なされない。いくつかの実施形態において、本発明の薬剤は、血清中のｓＣＤ２８と接触し、それにより細胞上のｍＣＤ２８を介したシグナル伝達の増加を可能にする。その結果、ｍＣＤ２８シグナル伝達は増加するが、ｍＣＤ２８への結合は受容体シグナル伝達を増加させないため、抗体はｍＣＤ２８アゴニストまたは直接アゴニストではない。
【００６６】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８のリガンド結合ドメインに結合しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、リガンド結合ドメインへのアクセスを遮蔽しない、または遮断しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８のＩｇＶドメインに結合しない、ドメインへのアクセスを遮蔽しない、または遮断しない。いくつかの実施形態において、ＩｇＶドメインは、リガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸２８〜１３７を含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、アミノ酸配列ＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧ（配列番号８）を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８のリガンドへの結合を阻害しない。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＯＳＬから選択される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８６である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８０である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８リガンドは、ＩＣＯＳＬである。いくつかの実施形態において、ＣＤ８６は、ＣＤ８６−Ｆｃである。いくつかの実施形態において、ＣＤ８０は、ＣＤ８０−Ｆｃである。
【００６７】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８のストーク領域に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８の膜近位領域に結合する。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）を含む。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号３６）を含む。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ｓＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体ｓＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ｓＣＤ２８、二量体ｓＣＤ２８または両方に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ＣＤ２８に結合するが、二量体ＣＤ２８には結合しない。機能的ｍＣＤ２８は二量体であるため、ＣＤ２８単量体のみの結合を使用して、薬剤がｍＣＤ２８に結合しないことを確実にすることができる。
【００６８】
薬剤の例には、抗体、抗体の抗原結合断片、ナノボディ、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、ペプチドおよびＤＡＲＰｉｎが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、ナノボディ、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、ペプチドおよびＤＡＲＰｉｎから選択される。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小分子、およびＣＤ２８に特異的に結合するペプチドから選択される。いくつかの実施形態において、薬剤は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ナノボディである。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＶＨＨ抗体である。本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」、「ナノボディ」および「ＶＨＨ抗体」という用語は同義であり、互換的に使用される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＣＤ２８への特異的結合を有する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８への特異的結合を有するペプチドである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、抗体、抗体の抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＶＨＨ抗体および抗体模倣物から選択される。本明細書で使用される場合、「抗体模倣物」という用語は、標的抗原に特異的に結合することができる有機化合物を指す。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、構造的に抗体に関連しない。抗体模倣物の例には、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、およびナノＣＬＡＭＰＳが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、ＤＡＲＰｉｎである。これらの薬剤はすべて当技術分野で周知であり、受容体とそれらのリガンドとの間の相互作用を遮断するのに有用であることが知られている。ｍＣＤ２８に結合できる小分子およびタンパク質は、切断部位を遮蔽し得る、またはプロテアーゼの障害をもたらす、もしくはそのアクセスを損ない得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体模倣物である。本明細書で使用される場合、「ＤＡＲＰｉｎ」という用語は、設計されたアンキリンリピートタンパク質を指す。ＤＡＲＰｉｎは、遺伝子操作された抗体模倣タンパク質であり、一般的にタンパク質標的に非常に特異的である。したがって、ＣＤ２８のＤＡＲＰｉｎは、薬剤の一例である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８に結合する薬剤は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８に対する抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８に対する抗体は、Ｆｃドメインを欠失している。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８に結合する薬剤は、Ｆｃドメインを欠失した抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８に結合する薬剤は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８に結合する薬剤は、ラクダ科動物、サメまたはナノボディである。いくつかの実施形態において、抗体または断片は、別のタンパク質またはタンパク質の断片に融合される。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質または断片は、特に血清中での半減期を増加させる。いくつかの実施形態において、半減期延長タンパク質は、ヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態において、薬剤は、半減期を向上させる修飾を生成する化学物質によって修飾される。いくつかの実施形態において、修飾はペグ化であり、化学物質はポリエチレングリコールである。当業者には、当技術分野で知られている任意の半減期延長タンパク質もしくは化学物質、または修飾を使用できることが理解される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、内部表面形状および抗原の抗原決定基の特徴に相補的な電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチドの群を指す。抗体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアを含む四量体形態を有し、各ペアは１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。抗体は、単独または他のアミノ酸配列との組み合わせた、オリゴクローナル、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ラクダ化、ＣＤＲグラフト、多特異性、二重特異性、触媒性、ヒト化、完全ヒト型、抗イディオタイプ、および可溶または結合型で標識できる抗体、ならびに、エピトープ結合断片、その変異体または誘導体を含む断片であってもよい。抗体は、いかなる種からのものであってもよい。抗体という用語には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディ）、およびジスルフィド結合可変領域（ｄｓＦｖ）を含むがそれらに限定されない結合断片も含まれる。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち抗原結合部位を含む分子が含まれる。抗体断片は、Ｆｃ領域またはその断片を含むがそれらに限定されない別の免疫グロブリンドメインに融合されてもよく、または融合されなくてもよい。当業者には、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）−Ｆｃ融合およびｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合を含むがそれらに限定されない他の融合産物が生成され得ることがさらに理解される。
【００７１】
免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４を含む。いくつかの態様において、抗体は、ＩｇＧ２を含む。いくつかの態様において、抗体は、ＩｇＧ４を含む。
【００７２】
自然に発生する抗体構造の基本単位は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質複合体であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成され、非共有結合およびジスルフィド結合の両方で結合されている。各重鎖および軽鎖には、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋もある。５つのヒト抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）が存在し、これらのクラス内のさまざまなサブクラスは、単一の抗体分子内の免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長および配列の違い等の構造の違いに基づいて認識される。抗体のクラスおよびサブクラスは、そのアイソタイプである。
【００７３】
重鎖および軽鎖のアミノ末端領域は、カルボキシ末端領域よりも配列が多様であり、したがって可変ドメインと呼ばれる。抗体構造のこの部分は、抗体の抗原結合特異性を付与する。重可変（ＶＨ）ドメインおよび軽可変（ＶＬ）ドメインは一緒に単一の抗原結合部位を形成し、したがって基本的な免疫グロブリン単位には２つの抗原結合部位がある。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１−６３（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２  ４５９２−４５９６）。
【００７４】
重鎖および軽鎖のカルボキシ末端部分は、定常ドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬを形成する。これらのドメインの多様性ははるかに低いが、動物種ごとに違いがあり、さらに同じ個体内でそれぞれ異なる機能を有するいくつかの異なる抗体のアイソタイプがある。
【００７５】
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」という用語は、本明細書で定義される超可変領域アミノ酸残基以外の、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは主に抗原のエピトープへの結合に関与する。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。
【００７６】
免疫グロブリン可変ドメインは、ＩＭＧＴ情報システム（ｗｗｗ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ−Ｑｕｅｓｔ）を使用して分析し、ＣＤＲを含む可変領域セグメントを特定することもできる。例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｊ６：Ｗ５０３−５０８（２００８）を参照されたい。
【００７７】
Ｃｈｏｔｈｉａらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超えて実験データに依存することなく、この「Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用すされる場合、「Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング」とは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ」（１９８９）に記載のナンバリングシステムを指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列がヒト抗体との類似性を高めるように改変されている非ヒト種由来の抗体を指す。ヒト化抗体は、ヒト抗体に類似する配列により囲まれた非ヒト抗体のＣＤＲをコードする組換えＤＮＡの生成により生成され得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト化は、本発明のＣＤＲをヒト抗体足場または骨格に挿入することを含む。ヒト化抗体は、当技術分野で周知であり、本発明のＣＤＲを保持するそれらを生成する任意の方法が使用され得る。
【００７９】
「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の生成中に生じ得る可能な変異体を除いて同一であり、および／または同じエピトープに結合し、そのような変異体は一般に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の調製方法によって生成されると解釈されるべきではない。本明細書で提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に説明されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００８０】
本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであってもよい。ｍＡｂを生成するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養され得る。高力価のｍＡｂがｉｎ  ｖｉｖｏ生成で得ることができ、個々のハイブリドーマからの細胞が、プリスチンでプライムされたＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射され、高濃度の所望のｍＡｂを含む腹水が生成される。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、そのような腹水から、または培養上清から精製することができる。
【００８１】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線形抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；片腕の抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、一本鎖抗体分子；抗体断片から形成された多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ、またはタンデム（ｄｉ、ｔｒｉ）−ｓｃＦｖ）；ならびにＢｉ特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が含まれる。
【００８２】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成され、それぞれ単一の抗原結合部位、および残留「Ｆｃ」断片を有し、その名前は容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するが抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が生成される。
【００８３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、しっかり共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。ＶＨ−ＶＬ二量体の３つの表面はこの構成である。総合的に、６つの超可変領域が、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００８４】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を保持するＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、間にヒンジシステインを持つＦａｂ’断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００８５】
脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２つの明確に区別できるタイプの１つに割り当てることができる。
【００８６】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに割り当てることができる。無傷抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、ａ、δ、ｅ、γ、μと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
【００８７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの考察については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
【００８８】
「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指す。同じ鎖の２つのドメイン間のペアリングを許可するには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアになり、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディの生成は当技術分野で知られており、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されている。
【００８９】
「多重特異性抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、特に、ポリエピトープ特異性を有する抗体を包含する。そのような多重特異性抗体には、ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合した２つ以上のＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合した２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三機能性抗体、共有結合または非共有結合した抗体断片等の抗体断片が含まれるが、それらに限定されない「ポリエピトープ特異性」は、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。
【００９０】
本発明のモノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して調製され得る。例には、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，ｐｇ．７７−９６  ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）に記載のもの等の様々な技術が含まれる。
【００９１】
抗体をインビボで産生する従来の方法に加えて、抗体は、ファージディスプレイ技術を使用してインビトロで生成され得る。そのような組換え抗体の生成は、従来の抗体生成と比較してはるかに速く、それらは膨大な数の抗原に対して生成され得る。さらに、従来の方法を使用する場合、多くの抗原は非免疫原性または非常に毒性があることが判明しているため、動物での抗体の生成には使用できない。さらに、組換え抗体の親和性成熟（すなわち、親和性および特異性の増加）は非常に単純で比較的速い。最後に、特定の抗原に対する多数の異なる抗体が、１回の選択手順で生成され得る。組換えモノクローナル抗体を生成するには、ディスプレイライブラリに基づくさまざまな方法を使用して、異なる抗原認識部位を有する抗体の大きなプールが生成され得る。そのようなライブラリはいくつかの方法で作製され得る：合成ＣＤＲ３領域を重鎖生殖細胞系列遺伝子のプールにクローニングすることで合成レパートリーを生成し、さまざまな特異性を有する組換え抗体断片が選択され得る大きな抗体レパートリーを生成することができる。ヒトのリンパ球プールを、抗体ライブラリ構築の出発材料として使用することができる。ヒトＩｇＭ抗体のナイーブレパートリーを構築し、したがって多様性の高いヒトライブラリを作成することが可能である。この方法は、さまざまな抗原に対する多数の抗体を選択するために広く成功裏に使用されている。バクテリオファージライブラリの構築および組換え抗体の選択のためのプロトコルは、周知の参考テキストであるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ  （Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２−２０００），Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １７．１に記載されている。
【００９２】
非ヒト抗体は、当技術分野で知られている任意の方法によってヒト化することができる。１つの方法では、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列に挿入される。次いで、抗体フレームワークにさらなる変更を導入して、親和性または免疫原性を調節することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、抗体およびその一部には、抗体、抗体の断片、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗原結合組換え断片および天然ナノボディが含まれる。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶまたはｓｃＦＶ２断片からなる群から選択される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体または抗原結合部分をコードする核酸配列を提供する。
【００９５】
例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖または重鎖等の免疫グロブリン分子鎖全体をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく、重鎖定常領域（ＣＨ）（典型的には３つの定常領域であるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む）；ならびに「ヒンジ」領域を含む。いくつかの状況では、定常領域の存在が望ましい。
【００９６】
ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドは、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＣＨＩ等の抗原結合抗体断片を含み、ＣＫまたはＣＬドメインは切除されている。ミニボディは従来の抗体よりも小さいため、臨床／診断における使用での組織浸透性が向上するはずであるが、２価であることから、ｄＡｂ等の１価抗体断片よりも高い結合親和性を保持するはずである。したがって、文脈により別段に示されない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体分子全体だけでなく、上記で議論したタイプの抗原結合抗体断片も包含する。コードされたポリペプチドに存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。したがって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に対して、合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換を含み得る。開示されたタンパク質生成物を構成する個々のアミノ酸の特性を考慮すると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
【００９７】
適切には、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、単離および／または精製され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」物質、組成物、実体、および／または物質、組成物もしくは実体の任意の組み合わせ、またはそれらの文法上の変形は、当業者によって「自然に発生している」と十分に理解されている、あるいは任意の時点で判定者または行政機関または司法機関によって「自然に発生している」と判断もしくは解釈される、または判断もしくは解釈され得る、物質、組成物、実体、および／または物質、組成物もしくは実体の任意の組み合わせのそれらの形態を明示的に除外するが、除外するだけの条件語である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、薬剤は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含む抗体またはその抗原結合部分であり、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１２（ＧＹＴＬＴＮＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１３（ＮＴＹＴＧＫ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号１４（ＧＤＡＮＱＱＦＡＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１５（ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１６（ＲＡＮＲＬＶＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１７（ＬＱＹＤＥＦＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、薬剤は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含む抗体またはその抗原結合部分であり、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１８（ＧＹＴＦＴＳＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１９（ＹＰＧＤＧＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２０（ＮＹＲＹＳＳＦＧＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２２（ＷＡＳＴＲＥＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号２３（ＱＳＤＹＳＹＰＬＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、薬剤は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含む抗体またはその抗原結合部分であり、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２４（ＧＹＴＦＴＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２５（ＮＰＮＹＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２６（ＳＳＰＹＹＤＳＮＨＦＤＹに示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２７（ＳＡＲＳＳＩＮＹＭＨ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２８（ＤＴＳＫＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号２９（ＨＱＲＮＳＹＰＦＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
別の態様により、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含む抗体またはその抗原抗原結合部分が提供され、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１２（ＧＹＴＬＴＮＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１３（ＮＴＹＴＧＫ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号１４（ＧＤＡＮＱＱＦＡＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１５（ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１６（ＲＡＮＲＬＶＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１７（ＬＱＹＤＥＦＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
別の態様により、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含む抗体またはその抗原結合部分が提供され、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１８（ＧＹＴＦＴＳＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１９（ＹＰＧＤＧＤ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２０（ＮＹＲＹＳＳＦＧＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２２（ＷＡＳＴＲＥＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号２３（ＱＳＤＹＳＹＰＬＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
別の態様により、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含む抗体またはその抗原結合部分が提供され、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２４（ＧＹＴＦＴＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２５（ＮＰＮＹＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２６（ＳＳＰＹＹＤＳＮＨＦＤＹに示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号２７（ＳＡＲＳＳＩＮＹＭＨ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２８（ＤＴＳＫＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号２９（ＨＱＲＮＳＹＰＦＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＫＰＴＹＶＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＤＡＮＱＱＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号４１）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖の可変領域は、配列番号４１を含む、および／またはそれからなる。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＫＰＴＹＶＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＤＡＮＱＱＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号４２）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号４２からなる。本出願で言及される抗体＃１は、配列決定され、配列番号４２からなる重鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの重鎖のＣＤＲは、配列番号１２〜１４である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＤＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号４３）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の可変領域は、配列番号４３を含む、および／またはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＤＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号４４）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号４４からなる。本出願で言及される抗体＃１は、配列決定され、配列番号４４からなる軽鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの軽鎖のＣＤＲは、配列番号１５〜１７である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＱＷＩＫＫＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＧＤＴＲＹＴＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＮＹＲＹＳＳＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号４５）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖の可変領域は、配列番号４５を含む、および／またはそれからなる。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＱＷＩＫＫＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＧＤＴＲＹＴＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＮＹＲＹＳＳＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＳＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＳＶＨＴＦＰＡＬＬＱＳＧＬＹＴＭＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＴＣＳＶＡＨＰＡＳＳＴＴＶＤＫＫＬＥＰＳＧＰＩＳＴＩＮＰＣＰＰＣＫＥＣＨＫＣＰＡＰＮＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＩＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＩＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号４６）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号４６からなる。本出願で言及される抗体＃２は、配列決定され、配列番号４６からなる軽鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの重鎖のＣＤＲは、配列番号１８〜２０である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＬＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＳＤＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号４７）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の可変領域は、配列番号４７を含む、および／またはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＬＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＳＤＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号４８）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号４８からなる。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号４８からなる。本出願で言及される抗体＃２は、配列決定され、配列番号４８からなる軽鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの軽鎖のＣＤＲは、配列番号２１〜２３である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＱＱＦＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＭＤＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＹＤＳＴＡＹＮＱＫＦＭＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＳＰＹＹＤＳＮＨＦＤＹＷＧＱＧＴＳＬＴＶＳＳ（配列番号４９）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖の可変領域は、配列番号４９を含む、および／またはそれからなる。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＱＱＦＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＭＤＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＹＤＳＴＡＹＮＱＫＦＭＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＳＰＹＹＤＳＮＨＦＤＹＷＧＱＧＴＳＬＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号５０）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号５０からなる。本出願で言及される抗体＃３は、配列決定され、配列番号５０からなる重鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの重鎖のＣＤＲは、配列番号２４〜２６である。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＲＳＳＩＮＹＭＨＷＦＱＱＫＰＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＮＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＲＮＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５１）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の可変領域は、配列番号５１を含む、および／またはそれからなる。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＲＳＳＩＮＹＭＨＷＦＱＱＫＰＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＮＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＲＮＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号５２）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号５２からなる。本出願で言及される抗体＃３は、配列決定され、配列番号５２からなる軽鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの軽鎖のＣＤＲは、配列番号２７〜２９である。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体および／または二量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合するが、ｍＣＤ２８には結合しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合するが、ｍＣＤ２８を架橋および／または活性化しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合するが、ＣＤ２８の単一分子のみに結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体および／または二量体ＣＤ２８に結合する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ２８抗体である。いくつかの実施形態において、抗体の標的抗原は、ＣＤ２８、ｓＣＤ２８、二量体ＣＤ２８および／または二量体ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、抗体の標的抗原は、ＣＤ２８、ｓＣＤ２８、単量体ＣＤ２８および／または単量体ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、抗体の標的抗原は、ＣＤ２８、ｓＣＤ２８、単量体ＣＤ２８、単量体ｓＣＤ２８、二量体ＣＤ２８および／または二量体ｓＣＤ２８である。いくつかの態様において、ｓＣＤ２８またはＣＤ２８は、単量体である。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８またはＣＤ２８は、二量体である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８またはｓＣＤ２８は、単量体または二量体である。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、抗可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）抗体である。「抗ＣＤ２８抗体」、「ＣＤ２８を認識する抗体」、または「ＣＤ２８に対する抗体」は、十分な親和性および特異性でＣＤ２８に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＤ２８またはｓＣＤ２８への増加した結合を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、膜のｍＣＤ２８と比較して、ｓＣＤ２８への増加した結合を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、市販のＣＤ２８抗体と比較して、ｓＣＤ２８への増加した結合を有する。いくつかの実施形態において、市販のＣＤ２８抗体は、ＣＤ２８．２である。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ２８またはｓＣＤ２８に対して特異的結合親和性を有する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「増加した結合親和性」および「より大きな結合親和性」という用語は、交換可能である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ｍＣＤ２８と比較して、ｓＣＤ２８に対するより大きな結合親和性を有する。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、１０％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、３０％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、５０％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、７５％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、１００％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、１５０％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、２５０％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、５００％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、１，０００％である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、１．５倍である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は２倍である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、５倍である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、１０倍である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、５０倍である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、１００倍である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、５００倍である。一実施形態において、本明細書で使用されるより大きな親和性は、１，０００倍である。
【０１１４】
「抗原」は、抗体形成を惹起し、抗体によって結合され得る分子または分子の一部である。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有し得る。上記の特定の反応は、抗原が非常に選択的な様式でその対応する抗体と反応し、他の抗原によって誘起される可能性のある他の多数の抗体とは反応しないことを示している。
【０１１５】
本発明による「抗原決定基」または「エピトープ」という用語は、特定の抗体と特異的に反応する抗原分子の領域を指す。当技術分野で知られている方法を適用し、エピトープに由来するペプチド配列を単独でまたは担体部分と組み合わせて使用して、動物を免疫し、追加のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成することができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、抗体は、重鎖のＮ３０４にＮ結合型グリコシル化を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片である。いくつかの実施形態において、抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆｃドメインを欠失している。いくつかの実施形態において、薬剤は、Ｆｃドメインを欠失した抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態において、薬剤は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ラクダ科動物、サメまたはナノボディである。いくつかの実施形態において、抗体または断片は、別のタンパク質またはタンパク質の断片に融合される。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質または断片は、特に血清中での半減期を増加させる。いくつかの実施形態において、半減期延長タンパク質は、ヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態において、薬剤は、半減期を向上させる修飾を生成する化学物質によって修飾される。いくつかの実施形態において、修飾はペグ化であり、化学物質はポリエチレングリコールである。当業者には、当技術分野で知られている任意の半減期延長タンパク質または化学物質、または修飾を使用できることが理解される。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８への薬剤の結合は、ｓＣＤ２８を分解する。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８への薬剤の結合は、ｓＣＤ２８の分解につながる、またはそれをもたらす。いくつかの実施形態において、分解は、結合が生物内にあるときに生じる。いくつかの実施形態において、分解は、結合が生物の血流中にある場合に生じる。いくつかの実施形態において、分解は、結合が生物のＴＭＥにあるときに生じる。いくつかの実施形態において、分解は、血液からのｓＣＤ２８の除去を含む。いくつかの実施形態において、分解は、結合したｓＣＤ２８のリソソーム、エンドソーム、プロテアソームまたはそれらの組み合わせへの輸送を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、生物におけるｓＣＤ２８への薬剤の結合は、血液からのｓＣＤ２８の除去をもたらす。いくつかの実施形態において、生物におけるｓＣＤ２８への薬剤の結合は、血液からのｓＣＤ２８の一掃をもたらす。いくつかの実施形態において、生物における薬剤のｓＣＤ２８への結合は、ＴＭＥからのｓＣＤ２８の除去をもたらす。いくつかの実施形態において、生物におけるｓＣＤ２８への薬剤の結合は、ＴＭＥからのｓＣＤ２８の一掃をもたらす。いくつかの実施形態において、生物におけるｓＣＤ２８への薬剤の結合は、血液、ＴＭＥまたは両方からのｓＣＤ２８の除去をもたらす。いくつかの実施形態において、生物におけるｓＣＤ２８への薬剤の結合は、血液、ＴＭＥまたは両方からのｓＣＤ２８の一掃をもたらす。いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８は、分解されないが、血液、ＴＭＥまたは両方から除去される。いくつかの実施形態において、結合したｓＣＤ２８は、免疫複合体である。
【０１２０】
結合した抗原を血流から取り除く多くの既知のメカニズムがある。これらには、補体媒介除去、単球およびマクロファージによる食作用、オプソニン化、タンパク質分解、受動拡散、および能動輸送が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、能動輸送は、赤血球によるものである。いくつかの実施形態において、結合した抗原は、食細胞に輸送される。いくつかの実施形態において、結合した抗原は、リソソームに輸送される。いくつかの実施形態において、結合した抗原は、リソソーム、エンドソーム、プロテアソーム、またはそれらの組み合わせに輸送される。結合したｓＣＤ２８複合体の除去を誘導し得る任意の薬剤が、本発明に使用され得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８レベルを少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７または９９％低減する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８レベルを健康な個体のレベルに低減する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８レベルを最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍｌに低減する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８の血中濃度を最大で５ｎｇ／ｍｌに低減する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８の血中濃度を最大で１０ｎｇ／ｍｌに低減する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８の血中濃度を最大で２０ｎｇ／ｍｌに低減する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８レベルを健康な個体のレベルに低減する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８レベルを１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍｌ未満に低減する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８レベルを５ｎｇ／ｍｌ未満に低減する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８レベルを１０ｎｇ／ｍｌ未満に低減する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８レベルを２０ｎｇ／ｍｌ未満に低減する。いくつかの実施形態において、低減または減少は、対象の血液、末梢血またはＴＭＥ中で生じる。いくつかの実施形態において、低減または減少は、血液中で生じる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定されるとおりである。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡである。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡは、標準化されたサンドイッチＥＬＩＳＡである。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡは、Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ  ＥＬＩＳＡである。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡはＢｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ  ＥＬＩＳＡキットＢＭＳ２９０である。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡは、本発明の薬剤を用いて行われる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、薬剤は、一掃抗体である。本明細書で使用される場合、「一掃抗体」という用語は、溶液から可溶性成分の量を減少させる任意の抗体またはその抗原結合断片を指す。いくつかの実施形態において、一掃抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発しない。いくつかの実施形態において、一掃抗体は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発しない。いくつかの実施形態において、一掃抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発しない。いくつかの実施形態において、一掃抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一掃抗体は、ＩｇＧ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一掃抗体は、ＩｇＧ４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一掃抗体は、抗体の結合によって媒介される細胞死を低減するように変異したＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、Ｆｃ受容体結合ドメインを突然変異させる。いくつかの実施形態において、抗体のＦｃドメインは、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは両方を減少させるように操作または突然変異される。Ｆｃ操作は当技術分野で周知であり、抗体媒介性細胞死滅を減少させることが知られている任意の変異またはアミノ酸変化を使用することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３を含まない。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発しない。いくつかの実施形態において、抗体は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発しない。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体の結合によって誘導されるＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはその両方を低減する突然変異を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはその両方をゼロにまで低減する。ＡＤＣＣおよびＣＤＣは十分に特徴付けられており、これらの細胞毒性経路の誘導を可能にする抗体配列は周知である。非限定的な例等の突然変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＩｇＧ２またはＩｇＧ４への突然変異がよく知られている。そのような突然変異はいずれも、本発明の抗体の骨格で使用され得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、抗体のＦｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはその両方を低減する突然変異を含む。いくつかの態様において、抗体は、低ｐＨでｓＣＤ２８からの抗体またはその抗原結合部分の解離を増加させる突然変異を含む。いくつかの実施形態において、低ｐＨは、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５、４．５、４、３．５または３以下のｐＨである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、低ｐＨは、ｐＨ６以下である。いくつかの実施形態において、低ｐＨは、ヒトエンドソームに見られるｐＨである。いくつかの実施形態において、低ｐＨは、ヒトリソソームで見られるｐＨである。いくつかの態様において、抗体は、低カルシウム濃度でのｓＣＤ２８からの抗体またはその抗原結合部分の解離を増加させる突然変異を含む。いくつかの実施形態において、低カルシウム濃度は、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０７、０．０５、０．０３、または０．０１ｍＭ以下のカルシウム濃度である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、低カルシウム濃度は、ヒトエンドソームに見られるカルシウム濃度である。いくつかの実施形態において、解離を増加させる突然変異は、ＣＤＲにおける突然変異である。いくつかの実施形態において、抗体は、エンドソームおよび／またはリソソームにおけるｓＣＤ２８からの抗体の解離を増加させる突然変異を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、突然変異は、ＦｃＲｎ結合領域にある。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＦｃγＲＩＩｂ結合領域にある。いくつかの実施形態において、突然変異は、Ｆｃ受容体への結合を増加させる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩｂである。いくつかの実施形態において、突然変異は、中性ｐＨで、および／または血清中でＦｃ受容体結合を増加させる。いくつかの実施形態において、突然変異は、低ｐＨでＦｃ受容体結合を増加させる。いくつかの実施形態において、突然変異は、重鎖のアミノ酸２７、重鎖のアミノ酸３１、軽鎖のアミノ酸３２、および軽鎖のアミノ酸５３のヒスチジンへの突然変異から選択される。いくつかの実施形態において、突然変異は、抗体およびその結合抗原の細胞への取り込みを増加させる。
【０１２７】
Ｆｃ受容体結合を増加させ、細胞への取り込みを増加させ、低ｐＨでの解離を増加させ、および／または一掃抗体を生成するのに有用である突然変異の例は、当技術分野で周知である。そのような例は、例えば、Ｓｃｈｒｏｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐＨ−ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｄｉｓｐｌａｙ，ｍＡｂｓ，２０１５；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ＦｃＲｎ，ｍＡｂｓ，２０１７；およびＩｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｗｅｅｐｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄａｌｉｔｙ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１６に見出すことができ、これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのような抗体を生成する方法およびそれらの有効性を試験する方法もまた、そこに記載されている。いくつかの実施形態において、突然変異は、ヒトＦｃドメインのものであり、ヒスチジン２６８からグルタミン、バリン３０９からロイシン、アラニン３３０からセリン、およびプロリン３３１からセリンへの突然変異から選択される。提供されたナンバリングはＩｇＧ１に対するものであるが、当業者により決定され得るような同等の突然変異が、他のＩｇＧでも作製され得る。さらに、そのような抗体の効力は、様々なｐＨの培地で結合／解離アッセイを行うことによって検査することができる。マウスやサル等のモデル生物での試験も可能であり、抗体の添加前後にｓＣＤ２８の血清レベルが測定される。任意選択で、ヒトｓＣＤ２８を発現する腫瘍を動物に異種移植して、血清ｓＣＤ２８を確実にしてもよい。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、抗体は、低ｐＨで抗原への結合を減少させるＣＤＲの突然変異を含む。いくつかの実施形態において、抗原は、ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、突然変異は、ヒスチジンへの突然変異である。いくつかの実施形態において、少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸がヒスチジンに突然変異している。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸がヒスチジンに突然変異している。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、ＣＤＲの外側のアミノ酸は、ヒスチジンに突然変異している。
【０１２９】
抗体の結合界面へのヒスチジン残基の組み込みは、ｐＨ依存性結合を操作するために使用され得ることが示されている。ｐＨ感受性結合の基礎は、細胞内微小環境、より具体的にはエンドソーム小胞、より好ましくは初期エンドソームを含む、様々な微小環境におけるｐＨ値の低下の結果としてのプロトン化に対するヒスチジンの感受性から生じる。結合界面におけるヒスチジンの側鎖のプロトン化は、静電相互作用を変化させ得る、または結合親和性のｐＨ依存性の違いにつながる構造変化を誘発し得る。
【０１３０】
抗原結合部位へのｐＨ感受性の組み込みは、抗原結合サイクルの数を増やすことができ、ｐＨ依存性抗体は、血漿ｐＨ（ｐＨ７．４）で同様の高いまたは低下した十分な親和性で抗原に結合し、低ｐＨで結合の低下を示して、酸性エンドソーム内のその抗原結合部位からの抗体のより速くかつ増加した解離をもたらし、それにより血漿への再循環および血漿からの抗原のクリアランスの増加を可能にする。
【０１３１】
ＣＤＲの各アミノ酸をヒスチジンに置き換え、ｐＨ依存性結合を評価するｈｉｓスキャニングは、当技術分野で知られている十分に確立された技術である。複数のヒスチジン突然変異を組み合わせて、相乗的に、または直線的に突然変異の効果を増加させることができる。ファージまたは酵母ディスプレイを使用するコンビナトリアルｈｉｓスキャニングライブラリ手法も当技術分野で周知である。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、抗体は、一掃抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、診断抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、治療用抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗癌抗体である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、薬剤は、非抗体タンパク質である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、非抗体ペプチドである。いくつかの実施形態において、非抗体タンパク質は、抗体模倣物である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、薬剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、薬剤は、合成結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、合成ペプチドは、非抗体足場に基づく。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体模倣物である。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ｋＤａ未満のモル質量を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸アプタマーである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、抗体は、癌の治療および／または予防を必要とする対象における癌の治療および／または予防に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、抗体は、免疫療法を必要とする対象における免疫療法の改善に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、免疫療法は、ＰＤ１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法である。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１免疫療法は、当技術分野で周知であり、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の遮断、ならびにＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１阻害剤が含まれる。いくつかの例には、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、ピジリズマブ、セミプリマブ、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂｅｖａｎｃｉｏ）、およびデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
ｍＣＤ２８の脱落の遮断
別の態様により、膜ＣＤ２８（ｍＣＤ２８）に結合し、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断を阻害する薬剤が提供される。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、タンパク質分解切断の阻害とは、ｍＣＤ２８のタンパク質分解切断の任意の低減を指す。いくつかの実施形態において、阻害は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の切断の低減である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の阻害は、免疫細胞上のｍＣＤ２８のレベルを維持する。いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の阻害は、免疫細胞上のｍＣＤ２８のレベルを増加させる。いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の阻害は、免疫刺激に適切なｍＣＤ２８のレベルを維持する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の低減は、少なくとも１つのプロテアーゼによる切断の低減である。いくつかの実施形態において、タンパク質分解切断の低減は、少なくとも１つのメタロプロテアーゼによる切断の低減である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはその両方である。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗体または断片は、別のタンパク質またはタンパク質の断片に融合される。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質または断片は、特に血清中での半減期を増加させる。いくつかの実施形態において、半減期延長タンパク質は、ヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態において、薬剤は、半減期を向上させる修飾を生成する化学物質によって修飾される。いくつかの実施形態において、修飾はペグ化であり、化学物質はポリエチレングリコールである。当業者には、当技術分野で知られている任意の半減期延長タンパク質または化学物質、または修飾を使用できることが理解される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体および／または二量体として結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合するが、ｍＣＤ２８を架橋および／または活性化しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体として結合するが、ＣＤ２８の単一分子のみに結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、二量体ＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、単量体および／または二量体ＣＤ２８に結合する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アンタゴニストではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８アゴニストでもアンタゴニストでもない。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８のリガンド結合ドメインに結合しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、リガンド結合ドメインへのアクセスを遮蔽しない、または遮断しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、切断部位に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、切断部位へのアクセスを遮蔽する、または遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、プロテアーゼの切断部位へのアクセスを遮断する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８のストーク領域に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８の膜近位領域に結合する。いくつかの実施形態において、切断部位は、ストーク領域内にある。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）を含む。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ（配列番号３６）を含む。いくつかの実施形態において、ストーク領域は、配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１０）を含む、またはそれからなる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、切断部位は、ロイシンの前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、バリンの前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、芳香族アミノ酸の前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、ロイシン、バリンおよび／または芳香族アミノ酸の前にある。いくつかの実施形態において、芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびヒスチジンから選択される。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号１のヒスチジン１３４、バリン１３５、ヒスチジン１３９、ロイシン１４０、ロイシン１４５、およびフェニルアラニン１４６のいずれか１つの前にある。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号１のヒスチジン１３４、バリン１３５、ヒスチジン１３９、ロイシン１４０、ロイシン１４５、またはフェニルアラニン１４６の前にある。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号１のロイシン１４５の前にある。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８の機能および／またはシグナル伝達を調節しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８を分解しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８分解につながらない、またはそれを促進しない。いくつかの実施形態において、シグナル伝達は、ｍＣＤ２８媒介免疫細胞活性化である。いくつかの実施形態において、薬剤は、免疫細胞の活性化を阻害しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８受容体の内部移行または再循環を誘発しない。Ｔ細胞の免疫活性化には、ｍＣＤ２８を介した共刺激が不可欠である。タンパク質分解切断により、ＣＤ２８の細胞外領域にあるリガンド結合ドメインが、膜に残っているタンパク質の膜貫通部分および細胞質部分から除去された。したがって、切断されたＣＤ２８はシグナル伝達することができず、Ｔ細胞の活性化に寄与し得ない。したがって、切断を遮断し、かつアンタゴニストでもある薬剤は、ｍＣＤ２８の活性化を可能にしない。同様に、切断を遮断するがアゴニストでもある薬剤は、異常なＴ細胞活性化、および潜在的に自己免疫応答を誘発する可能性がある。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗ＣＤ２８抗体ＭＡＢ３４２ではない。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗ＣＤ２８抗体クローン＃３７４０７ではない。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、薬剤は、免疫細胞上のｍＣＤ２８の表面レベルを低減しない。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８の表面レベルを５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、７、５、３、２または１％未満だけ低減する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、細胞への薬剤の結合は、細胞を死滅させない。いくつかの実施形態において、細胞への薬剤の結合は、細胞の死につながらない。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発しない。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体であり、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体の結合によって媒介される細胞死を低減するように突然変異したＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、Ｆｃ受容体結合ドメインを突然変異させる。いくつかの実施形態において、抗体のＦｃドメインは、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは両方を減少させるように操作または突然変異される。Ｆｃ操作は当技術分野で周知であり、抗体媒介性細胞死滅を減少させることが知られている任意の変異またはアミノ酸変化を使用することができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、薬剤は、非抗体タンパク質である。いくつかの実施形態において、薬剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、薬剤は、合成結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、合成ペプチドは、非抗体足場に基づく。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗体模倣物である。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０ｋＤａ未満のモル質量を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸アプタマーである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。抗体模倣物の例には、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、およびナノＣＬＡＭＰＳが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、ＤＡＲＰｉｎである。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、薬剤は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断を阻害する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、システインプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、スレオニンプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、セリン、システインまたはスレオニンプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、グルタミン酸プロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、システインおよびスレオニンプロテアーゼから選択される。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、アスパラギンペプチドリアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、シェダーゼである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、エキソペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、エンドペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、エキソペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼである。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、亜鉛触媒である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、コバルト触媒である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態において、メタロプロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはその両方である。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）を含み、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号３０（ＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号３１（ＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３２（ＩＨＷＰＹＹＦＤＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号３３（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３４（ＡＴＳＤＬＡＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号３５（ＱＱＷＳＳＨＰＰＴ）に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＤＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＬＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＤＮＴＹＹＡＧＴＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＦＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＨＷＰＹＹＦＤＳＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号５３）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖の可変領域は、配列番号５３を含む、および／またはそれからなる。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＧＡＣＣＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号５４）を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号５４からなる。本出願の抗切断抗体は、配列決定され、配列番号５４からなる重鎖を有することが判明した。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの重鎖のＣＤＲは、配列番号３０〜３２である。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＦＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＭＬＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＤＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＨＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＲ（配列番号５５）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖の可変領域は、配列番号５５を含む、および／またはそれからなる。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＣＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡ（配列番号５６）を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号５６からなる。本出願で言及される抗切断抗体は、配列決定され、配列番号５６からなる軽鎖を有することが見出された。Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定されたこの軽鎖のＣＤＲは、配列番号３３〜３５である。
【０１５１】
癌を処置／予防する方法
別の態様により、癌の処置および／または予防を必要とする対象における癌を治療および／または予防する方法であって、前記対象における可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）レベルを低下させることを含む方法が提供される。
【０１５２】
別の態様により、免疫療法を必要とする対象における免疫療法を改善する方法であって、前記対象におけるｓＣＤ２８レベルを減少させることを含む方法が提供される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、免疫療法は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法である。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法は、抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態において、療法は、ＰＤ−１チェックポイントの遮断を含む。いくつかの実施形態において、免疫療法は、同種、同系、または自己免疫細胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫療法を必要とする対象は、癌に罹患している。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態の「処置」または「処置すること」という用語は、その少なくとも１つの症状の緩和、その重症度の低減、またはその進行の阻害を包含する。処置は、疾患、障害、または状態が完全に治癒することを意味する必要はない。有効な処置であるためには、本明細書における有用な組成物は、疾患、障害、もしくは状態の重症度を軽減する、それに関連する症状の重症度を軽減する、または患者もしくは対象の生活の質の改善を提供するだけでよい。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、減少させることは、対象に少なくとも１つの本発明の薬剤を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与」等の用語は、健全な医療行為において、活性剤を含む組成物を、治療効果を提供するような様式で対象に送達する任意の方法を指す。本主題の一態様は、治療的有効量の本発明の薬剤の、それを必要とする患者への経口投与を提供する。他の適切な投与経路には、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内が含まれ得る。
【０１５６】
別の態様により、本発明の薬剤および治療上許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、投与することは、本発明の医薬組成物を投与することである。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「担体」、「賦形剤」、または「アジュバント」という用語は、活性薬剤ではない医薬組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、非毒性の不活性固体、半固体液体充填剤、希釈剤、封入材料、任意の種類の製剤補助剤、または単に生理食塩水等の無菌水性媒体を指す。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン等のデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体；粉末化トラガカント；麦芽、ゼラチン、タルク；カカオバターおよび坐剤ワックス等の賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油等の油；プロピレングリコール等のグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル、寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水、リンガー溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で使用される他の非毒性適合性物質である。本明細書において担体として役立ち得る物質のいくつかの非限定的な例には、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、粉末化トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、ポリオール、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リン酸緩衝液、カカオバター（坐剤基剤）、乳化剤、および他の医薬製剤で使用される他の非毒性の医薬適合性物質が含まれる。ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤および滑剤、ならびに着色剤、着香剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、および保存剤も存在し得る。本明細書で企図される組成物を製剤化するために、非毒性、不活性および有効な担体が使用され得る。これに関して、適切な薬学的に許容される担体、賦形剤、および希釈剤は当業者に周知であり、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｄａｖａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１）；ｔｈｅ  ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）；および「Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ」，Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  （ＦＤＡ）  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔに記載のものがあり、これらすべての内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本組成物において有用な薬学的に許容される賦形剤、担体および希釈剤の例には、蒸留水、生理食塩水、リンガ��溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、およびＤＭＳＯが含まれる。これらの追加の不活性成分、ならびに有効な製剤および投与手順は、当技術分野で周知であり、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ：  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（２００５）等の標準的な教本に記載されており、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物はまた、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放性粒子、および血清中のペプチドまたはポリペプチドの半減期を増加させる他のビヒクル等の人工的に作製された構造に含まれてもよい。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が含まれる。本明細書に記載のペプチドと共に使用するためのリポソームは、中性および負に荷電したリン脂質およびコレステロール等のステロールを一般に含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は一般に、リポソームのサイズおよび血液中での安定性等の考慮事項によって決定される。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにより考察されているように、リポソームを調製するための様々な方法が利用可能であり、また米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号を参照されたい。
【０１５８】
担体は、全体で、本明細書に提示される医薬組成物の約０．１重量％〜約９９．９９９９９重量％を構成し得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、減少させることは、ｓＣＤ２８をコードするｍＲＮＡに結合し、ｍＣＤ２８をコードするｍＲＮＡに結合しない阻害性核酸分子を投与することを含む。ｓＣＤ２８の１つの可能な源は、膜貫通ドメインを欠失したＣＤ２８の転写変異体の翻訳からである。そのような変異体は、ｍＲＮＡの翻訳を分解または阻害するために標的化され得る一意のｍＲＮＡ配列を有し得る。非限定的な例として、ｓＣＤ２８は、エクソン３（配列番号７）を欠失したｍＲＮＡスプライス変異体によって生成される。この変異体では、エクソン２およびエクソン４ジャンクションが、変異体に存在するが全長ＣＤ２８を欠失する唯一の配列である。いくつかの実施形態において、核酸分子は、少なくとも配列番号７のエクソン２およびエクソン４のジャンクションに結合する。いくつかの実施形態において、エクソン２および４のスプライスジャンクションは、配列ＡＡＡＧＧＴＧＡ（配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、エクソン２および４のスプライスジャンクションを含む、配列番号７の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０塩基に結合する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、分子は、ｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、分子は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、減少させることは、ｍＣＤ２８を切断することができるプロテアーゼを阻害する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７または両方を阻害する。プロテアーゼ阻害剤は、当技術分野で周知である。ＡＤＡＭ１７およびＡＤＡＭ１０を阻害するプロテアーゼ阻害剤の例には、ＴＡＰＩ−１、ＧＭ６００１、およびＧＩ２５４０２３Ｘが含まれるが、それらに限定されない。さらなる治療プロテアーゼ阻害剤は、国際特許出願ＷＯ２００４０９６１３９に開示されている。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、減少させることは、ＣＤ２８のストーク領域を含むペプチドまたはその断片を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、単量体である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、二量体である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、プロテアーゼの切断部位へのアクセスを阻害する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、切断部位を遮断する自己抗体の生成を誘導する。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｍＣＤ２８を分解しない、または分解につながらない。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを低下させない。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｍＣＤ２８媒介性免疫細胞活性化を減少させない。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象の免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを維持する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象の免疫細胞上のｍＣＤ２８レベルを増加させる。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、低減は、ｓＣＤ２８の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％の低減である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、低減は、血清ｓＣＤ２８の低減である。いくつかの実施形態において、低減は、ｓＣＤ２８の血中レベルの低減である。いくつかの実施形態において、低減は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるｓＣＤ２８レベルの低減である。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、対象の血液は、高レベルのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、減少する前の対象の血液は、高レベルのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、レベルは、健康な対象のレベルよりも上昇する。いくつかの実施形態において、対象のｓＣＤ２８レベルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％、健康な対象のレベルよりも上昇する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、レベルは、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍｌ血液を超えて上昇する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、レベルは、５ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態において、レベルは、１０ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態において、レベルは、２０ｎｇ／ｍｌを超えて上昇する。いくつかの実施形態において、対象の血液は、血液１ｍｌ当たり少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｇのｓＣＤ２８を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、減少前の対象の血液は、血液１ｍｌ当たり少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｇのｓＣＤ２８を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、対象の血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、対象の血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、対象の血液は、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、減少する前の対象の血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、減少する前の対象の血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態において、減少する前の対象の血液は、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌのｓＣＤ２８を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態において、癌は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法で処置され得る癌である。いくつかの実施形態において、対象は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法を受けている。いくつかの実施形態において、対象は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法に対する非応答者である。いくつかの実施形態において、対象は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法に対してナイーブである。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法と一緒に行われる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法の前に行われる。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、方法は、対象に別の免疫療法を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態において、別の免疫療法は、チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤である。いくつかの実施形態において、別の免疫療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づく免疫療法である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ−ＮＫである。いくつかの実施形態において、別の免疫療法は、癌ワクチンである。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ−Ｔ細胞」および「ＣＡＲ−ＮＫ細胞」という用語は、少なくとも１つの目的のタンパク質（例えば、エピジェネティック修飾剤での処理後に発現が増加した免疫原性タンパク質）に特異性を有し、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞）にグラフトされる操作された受容体を指す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞にグラフトされたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞にグラフトされたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球および調節性Ｔ細胞から選択される。
【０１６９】
ＣＡＲ−ＴおよびＣＡＲ−ＮＫ細胞ならびにそれらのベクターは、当技術分野で周知である。そのような細胞は、受容体が結合するタンパク質を標的とし、細胞毒性を示す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−ＴまたはＣＡＲ−ＮＫ細胞は、少なくとも１つのウイルスタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−ＴまたはＣＡＲ−ＮＫ細胞は、複数のウイルスタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−ＴまたはＣＡＲ−ＮＫ細胞は、エピジェネティック修飾剤との接触により発現が増加したウイルスタンパク質を標的とする。
【０１７０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の構築は、当技術分野で周知である。１つの非限定的な例では、ウイルスタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製することができ、その後、抗体をコードするベクターが構築される。ベクターはまた、共刺激シグナル領域を含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル領域は、既知のＴ細胞またはＮＫ細胞刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドの少なくとも１つから選択される。いくつかの実施形態において、ベクターはまた、ＣＤ３Ｚシグナル伝達ドメインも含む。次いで、このベクターは、例えばレンチウイルス感染によって、Ｔ細胞にトランスフェクトされる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、癌は、ｓＣＤ２８レベルが上昇した癌である。いくつかの実施形態において、癌は、高いｓＣＤ２８レベルを含む。いくつかの実施形態において、上昇した、および／または高いｓＣＤ２８レベルは、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ／ｍｌの、および／またはそれを超えるレベルである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、癌は、高いｓＣＤ２８レベルを含む。いくつかの実施形態において、上昇した、および／または高いｓＣＤ２８レベルは、健康な対象におけるレベルの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００％の、および／またはそれを超えるレベルである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌ではない。いくつかの実施形態において、癌は、黒色腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌および結腸直腸癌から選択される。いくつかの実施形態において、癌は、黒色腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、および結腸直腸癌から選択される。いくつかの実施形態において、癌は、黒色腫、頭頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌または結腸直腸癌である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態において、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。いくつかの実施形態において、減少させることは、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態において、減少させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。いくつかの実施形態において、減少させることは、対象から血液を除去し、除去された血液中のｓＣＤ２８レベルを減少させ、血液を対象に戻し、それにより対象におけるｓＣＤ２８を減少させることを含む。透析および血液洗浄の方法は周知である。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓＣＤ２８を一掃し、次いで血液を対象に戻すことによって行われてもよい。
【０１７３】
使用方法
別の態様により、試料中のｓＣＤ２８をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する方法であって、
ａ．ｓＣＤ２８を含む試料を提供すること；
ｂ．試料を本発明の薬剤と接触させること；および
ｃ．ｓＣＤ２８に結合した薬剤を検出すること；
を含み、それによって試料中のｓＣＤ２８を検出する方法が提供される。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、試料は、対象からのものである。いくつかの実施形態において、試料は、体液を含む。いくつかの実施形態において、試料は、組織を含む。いくつかの実施形態において、試料は、細胞を含む。いくつかの実施形態において、検出は、二次抗体によるものである。いくつかの実施形態において、検出は、薬剤に結合する標識分子である。いくつかの実施形態において、検出は、ＥＬＩＳＡによるものである。いくつかの実施形態において、検出は、免疫組織化学によるものである。いくつかの実施形態において、検出は、イムノブロットによるものである。いくつかの実施形態において、本発明の薬剤は、ｓＣＤ２８を検出するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明の薬剤は、ｍＣＤ２８を検出せずにｓＣＤ２８を検出するためのものである。
【０１７５】
別の態様により、本発明の治療方法によって処置される対象の適合性を決定する方法であって、対象からの試料を提供すること、および試料中のｓＣＤ２８レベルを決定することを含み、ｓＣＤ２８レベルの上昇は、対象が本発明の治療方法により処置されるのに適していることを示す方法が提供される。
【０１７６】
別の態様により、抗ＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１免疫療法によって、ならびに／またはＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６に基づく免疫療法によって処置される対象の適合性を決定する方法であって、対象からの試料を提供すること、および試料中のｓＣＤ２８レベルを決定することを含み、５ｎｇ／ｍｌを超えるｓＣＤ２８レベルは、対象が抗ＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１免疫療法またはＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６に基づく免疫療法により処置されるのに不適切であることを示す方法が提供される。
【０１７７】
別の態様により、抗ＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１免疫療法ならびに／またはＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６に基づく免疫療法を受けるのに適した不適切対象を作製する方法であって、不適切対象におけるｓＣＤ２８レベルを減少させ、それによってそれらを適切にすることを含む方法が提供される。
【０１７８】
別の態様により、対象におけるＣＤ８０および／またはＣＤ８６に基づく免疫療法を改善する方法であって、
ａ．対象のｓＣＤ２８レベルを測定すること；ならびに
ｂ．５ｎｇ／ｍｌを超えるｓＣＤ２８レベルを含む対象へのＣＤ８０および／またはＣＤ８６に基づく免疫療法の用量を増加させること
を含み、それによって、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に基づく免疫療法を改善する方法が提供される。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、方法は、本発明の方法を実行することによって、不適切対象を適切にすることをさらに含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、上昇したレベルは、健康な対象におけるレベル付近まで上昇する。いくつかの実施形態において、上昇したレベルは、所定の閾値のレベル付近まで上昇する。いくつかの実施形態において、上昇したレベルは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍｌを超えるｓＣＤ２８レベルである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｍｌを超えるｓＣＤ２８レベルは、対象が処置されるのに不適切であることを示す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、１０を超えるｓＣＤ２８レベルは、対象が処置されるのに不適切であることを示す。いくつかの実施形態において、２０を超えるｓＣＤ２８レベルは、対象が処置されるのに不適切であることを示す。
【０１８１】
ＣＤ８０およびＣＤ８６免疫療法は当技術分野で周知であり、免疫応答を刺激するためにＣＤ８０／ＣＤ８６および／またはその模倣体、誘導体もしくは模倣物を投与することを含む。ＣＤ８０−Ｆｃは、非限定的な例として、抗がん免疫療法薬として現在臨床試験中である。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、ｓＣＤ２８に結合した薬剤を検出することは、結合したｓＣＤ２８の量を決定することを含む。いくつかの実施形態において、結合したｓＣＤ２８の量を検出することは、体液中のｓＣＤ２８の量を決定することである。いくつかの実施形態において、方法は、本発明の医薬組成物で処置される対象の適合性を決定するためのものである。いくつかの実施形態において、所定の閾値を超えるｓＣＤ２８のレベルは、対象が本発明の組成物による処置に適していることを示す。いくつかの実施形態において、方法は、免疫療法に対する対象の適合性を決定するためのものである。いくつかの実施形態において、所定の閾値を下回るｓＣＤ２８のレベル、またはｓＣＤ２８の不在は、対象が免疫療法に適していることを示す。いくつかの実施形態において、所定の閾値を超えるｓＣＤ２８のレベルは、対象が免疫療法および本発明の組成物の併用に適していることを示す。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、癌を発症するリスクを有する。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、方法は、本発明の医薬組成物を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、検出されたｓＣＤ２８が所定の閾値を超える場合に、本発明の医薬組成物を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、対象に免疫療法を施すことをさらに含む。
【０１８５】
キット
別の態様により、本発明の少なくとも１つの薬剤、または本発明の医薬組成物を含むキットが提供される。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、キットは、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、本発明の薬剤がＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法薬と共に使用するためのものであることを示すラベルを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく治療薬が本発明の抗体または医薬組成物と共に使用するためのものであることを示すラベルを含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、キットは、本発明の薬剤を検出するための検出分子をさらに含む。いくつかの実施形態において、検出分子は、二次検出分子である。いくつかの実施形態において、検出分子は、薬剤に結合する。検出分子は当技術分野で周知であり、蛍光部分および分子、色素、ならびに二次抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【０１８８】
別の態様により、本発明の抗体または医薬組成物と共に使用するためのものであることを示すラベルを含む、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法剤を含むキットが提供される。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、癌の処置に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、診断キットである。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、それを必要とする対象におけるｓＣＤ２８の血清レベルを決定する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、対象は、癌に罹患している。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、本発明の薬剤または医薬組成物で処置される対象の適合性を決定する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、キットは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に基づく免疫療法で処置される対象の適合性を決定する際に使用するためのものである。
【０１９０】
薬剤生成の方法
別の態様により、本発明の薬剤を生成するための方法であって、
ａ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に特異的に結合する薬剤を取得すること；および
ｂ．プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する薬剤の能力を試験し、プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する少なくとも１つの薬剤を選択すること；
を含み、それによって本発明の薬剤を生成する方法が提供される。
【０１９１】
別の態様により、本発明の薬剤を生成するための方法がであって、
薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、核酸配列は、
ｉ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得すること；
ｉｉ．プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する薬剤の能力を試験すること；および
ｉｉｉ．プロテアーゼによるｍＣＤ２８の切断を遮断する少なくとも１つの薬剤を選択すること
によって選択された薬剤のものである、培養することを含み、それによって本発明の薬剤を生成する方法が提供される。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、薬剤は、抗切断剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、脱落防止剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、対象におけるｓＣＤ２８の脱落を減少させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｍＣＤ２８の切断を減少させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、対象におけるｍＣＤ２８の切断を減少させる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１７である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、またはその両方である。
【０１９４】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８の細胞外ドメイン」という用語は、膜貫通ドメインの前に来るＣＤ２８のＮ末端部分を指す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ｓＣＤ２８である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８ａである。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８ストークドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、ＣＤ２８のストークドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインは、配列ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号３７）を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインは、二量体である。いくつかの態様において、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインは、単量体である。いくつかの態様において、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインは、二量体または単量体である。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、「断片」は、より大きなタンパク質またはタンパク質ドメインの一部を構成する部分ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、断片は、少なくとも１０、２０、３０、４０または５０個のアミノ酸を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、断片は、最大で１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８の細胞外ドメインの断片に結合する薬剤を取得することは、ＣＤ２８ストークドメインに特異的に結合する薬剤を取得することである。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、方法は、取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、選択することは、ｍＣＤ２８シグナル伝達に拮抗しない少なくとも１つの薬剤を選択することである。癌の処置のためにＣＤ２８シグナル伝達を刺激することは有害ではないかもしれないが、シグナル伝達に拮抗することは逆効果であることは当業者によって理解されるであろう。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、切断を遮断する薬剤の能力を試験することは、以下に記載される方法による。いくつかの実施形態において、切断を遮断する薬剤の能力を試験することは、薬剤、プロテアーゼおよびＣＤ２８の細胞外ドメインまたは切断部位を含むその断片の混合を含む。いくつかの実施形態において、試験することは、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインを配列決定して、短縮および／または切断についてチェックすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、試験することは、切断によるサイズ変化を測定するのに十分な感度を有するゲル上で、ＣＤ２８またはその断片の細胞外ドメインを泳動することをさらに含む。いくつかの実施形態において、試験することは、薬剤およびプロテアーゼの存在下で、ｍＣＤ２８を発現する細胞からのｓＣＤ２８の生成を測定することをさらに含む。
【０１９８】
別の態様により、本発明の薬剤を生成するための方法であって、
ａ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得すること；および
ｂ．取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイし、ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択すること；
を含み、それによって本発明の薬剤を生成する方法が提供される。
【０１９９】
別の態様により、本発明の薬剤を生成するための方法であって、
薬剤をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を培養することであって、核酸配列は、
ｉ．ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合する薬剤を取得すること；
ｉｉ．取得された薬剤の存在下でｍＣＤ２８下流シグナル伝達をアッセイすること；および
ｉｉｉ．ｍＣＤ２８シグナル伝達を実質的に作動することも実質的に拮抗することもしない少なくとも１つの薬剤を選択すること
によって選択された薬剤のものである、培養することを福井、それによって本発明の薬剤を生成する方法が提供される。
【０２００】
いくつかの実施形態において、薬剤は、一掃剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、対象からｓＣＤ２８を除去するためのものである。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＣＤ２８に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、ｓＣＤ２８に特異的に結合する。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、方法は、宿主細胞から薬剤を単離および／または抽出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、宿主細胞の培養培地から薬剤を単離および／または抽出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、宿主細胞または宿主細胞の培養培地から薬剤を精製することをさらに含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、方法は、取得された薬剤のｍＣＤ２８への結合を試験し、ｍＣＤ２８に結合しない少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、取得された薬剤の対象からのｓＣＤ２８への結合を試験し、対象からのｓＣＤ２８に結合する少なくとも１つの薬剤を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、自己免疫患者である。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片で生物を免疫し、免疫された生物から抗体を収集することを含む。いくつかの実施形態において、生物は、マウスである。いくつかの実施形態において、生物は、ウサギ、マウス、ラット、サメ、ラクダ科動物、ニワトリ、ヤギおよびファージから選択される。いくつかの実施形態において、ラクダ科動物は、ラクダおよびラマから選択される。いくつかの実施形態において、収集することは、採血を含む。いくつかの実施形態において、収集することは、
ａ．免疫された生物の脾臓からＢ細胞を抽出すること；
ｂ．抽出されたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成すること；および
ｃ．ハイブリドーマから抗体を収集することを含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、ＣＤ２８細胞外ドメインまたはその断片に結合するための薬剤のライブラリをスクリーニングし、そのように結合する薬剤を選択することを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリは、ファージディスプレイライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、脾臓Ｂ細胞に由来する免疫化ライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、ＩｇＧライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、Ｆａｂライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、ＶＨＨ抗体のライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、単鎖、単一ドメインまたはナノボディのライブラリである。いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、薬剤を配列決定することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤を取得することは、薬剤の組換え形態を生成することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤を選択することは、薬剤を配列決定することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤を選択することは、薬剤の組換え形態を生成することを含む。いくつかの実施形態において、組換え形態は、薬剤の配列から生成される。いくつかの実施形態において、方法は、薬剤をヒト化することをさらに含む。
【０２０５】
細胞内で薬剤をコードする核酸分子を発現させることは、当業者に周知である。それは、多くの方法の中でも、トランスフェクション、ウイルス感染、または細胞のゲノムの直接変更によって実行することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子は、プラスミドまたはウイルスベクター等の発現ベクター中にある。ｐ１６−Ｉｎｋ４ａを含む発現ベクターの１つのそのような例は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能な哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ  ｐ１６  ＩＮＫ４Ａである。
【０２０６】
ベクター核酸配列は、一般に、少なくとも細胞内での増殖のための複製起点、および任意選択で、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデニン配列を含む。
【０２０７】
ベクターは、非ウイルス法またはウイルス法により送達されるＤＮＡプラスミドであってもよい。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターであってもよい。プロモーターは、哺乳動物細胞において活性であってもよい。プロモーターは、ウイルスプロモーターであってもよい。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、薬剤をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節エレメント（複数可）に連結されていることを意味することが意図される。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、ベクターは、エレクトロポレーション（例えば、Ｆｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５）に記載される通り）、熱ショック、ウイルスベクターによる感染、小さなビーズまたは粒子のマトリックス内、または表面上にある核酸による、小さな粒子による高速弾道侵入（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７．７０−７３（１９８７））等を含む標準的な方法によって細胞に導入される。
【０２１０】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼ、すなわちＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りにクラスタ化した一群の転写制御モジュールを指す。プロモーターは、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子またはリプレッサータンパク質の１つまたは複数の認識部位を含む、個別の機能モジュールで構成される。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ  ＩＩおよびＰｏｌ  ＩＩ）によって転写される。ＲＮＡＰ  ＩＩは、真核細胞に見られる酵素である。これは、ＤＮＡの転写を触媒して、ｍＲＮＡの前駆体ならびにほとんどのｓｎＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡを合成する。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）、およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、レトロウイルス等の真核生物ウイルスからの調節エレメントを含む発現ベクターが、本発明によって使用される。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。いくつかの実施形態において、ウシパピローマウイルスに由来するベクターにはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタインバーウイルスに由来するベクターにはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に効果的であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、水平感染および標的特異性等の利点を提供する組換えウイルスベクターが、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現に使用される。一実施形態において、水平感染は、例えばレトロウイルスのライフサイクルに固有であり、出芽して隣接細胞に感染する多くの子孫ビリオンを単一の感染細胞が生成するプロセスである。一実施形態において、その結果、その大部分が最初は元のウイルス粒子に感染していなかった広い領域が急速に感染するようになる。一実施形態において、水平方向に広がることができないウイルスベクターが生成される。一実施形態において、この特徴は、所望の目的が特定の遺伝子を局所化された数の標的細胞のみに導入することである場合に有用となり得る。
【０２１５】
本発明の発現ベクターを細胞に導入するために様々な方法が使用され得る。そのような方法は一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）およびＧｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に記載されており、例えば、安定したまたは一時的なトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。さらに、陽性−陰性選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【０２１６】
（ポリペプチドをコードする）挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む以外に、本発明の発現コンストラクトは、発現したポリペプチドの安定性、生成、精製、収量または活性を最適化するように操作された配列も含み得ることが理解される。
【０２１７】
別の態様により、本発明の方法によって生成された薬剤が提供される。
【０２１８】
別の態様により、本発明の方法によって生成された薬剤、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物が提供される。
【０２１９】
本明細書で使用される場合、値と組み合わせたときの「約」という用語は、参照値のプラスおよびマイナス１０％を指す。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ±１００ｎｍの長さを指す。
【０２２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別の意味が明示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「ポリペプチド」への言及は、１つまたは複数のポリペプチドおよび当業者に知られているその同等物への言及を含む。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草されてもよいことに留意されたい。したがって、この記述は、請求要素の引用、または「否定的な」制限の使用に関連して、「単独」、「唯一」等の排他的な用語を使用するための先行基準として機能することを意図する。
【０２２１】
「Ａ、Ｂ、およびＣ等のうちの少なくとも１つ」に類似した慣例が使用される事例では、概して、このような構造は、当業者が慣例を理解するであろうという意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、ならびにＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に等を有する系を含むがこれらに限定されないであろう）。明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替的な用語を提示する実質的にいかなる離接的な単語および／または句が、用語のうちの１つ、用語のうちのいずれか、またはいずれの用語も含む可能性を企図すると理解されるべきであることは当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。
【０２２２】
明確にするために別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできる、ことが理解される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態に関連して説明されている本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の適切な部分的組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素の全ての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、全てのそのような部分的組み合わせが本明細書で個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書において開示される。
【０２２３】
本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定することを意図しない、以下の実施例を検討すると、当業者には明らかになるであろう。追加的に、上記で説明されおよび以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求される、本発明の様々な実施形態および態様の各々は、以下の実施例において実験的裏付けが認められる。
【０２２４】
上で説明し、以下の特許請求の範囲で請求する本発明の様々な実施形態および態様に関して、以下の実施例において実験的裏付けが認められる。
【実施例】
【０２２５】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）  「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載の方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；  Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、これらはすべて参照により組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、本明細書全体に記載されている。
【０２２６】
材料および方法
抗体−市販のマウスモノクローナル抗ＣＤ２８クローン＃ＣＤ２８．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９０２）およびＦＩＴＣ結合（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９０６）。ヤギポリクローナル抗ＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＡＦ−３４２−ＰＢ）。ＦＩＴＣ結合抗ヒトＰＤ−Ｌ１（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５８０６５）。ＡＰＣ結合抗ヒトＰＤ−Ｌ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４５５０８）。ＰＥ結合抗ヒトＩＤＯ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＩＣ６０３０Ｐ）。ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５３２２）。ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７０９−６０５−１４９）。ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０３５−０７１）。抗ヒトＣＤ３クローンＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３０４）。抗ヒトＰＤ−１ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）。ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ４５０６）。
【０２２７】
アフィニティ精製を容易にするために、組換え可溶性ヒトＣＤ２８ａの生成−ＣＤ２８ａ  ｃＤＮＡを、６つのヒスチジン残基の前にｃ末端ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するｐＣＤＮＡ３・１ベクターにサブクローニングした。プラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、可溶性組換えＣＤ２８ａを固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で精製した。プールされた材料を、２番目のＩＭＡＣの後にＴＥＶプロテアーゼを使用してＨｉｓタグ切断に供し、ＨｉｓタグおよびＴＥＶプロテアーゼを削除した。
【０２２８】
ＥＬＩＳＡ−市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ヒトインターフェロン−γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０１０３）、ヒトインターロイキン２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３１８０２）、ヒトインターロイキン６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０５０２）、ヒトインターロイキン１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３０６０３）、ヒト腫瘍成長因子β１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３６７０８）、ヒトインターロイキンβ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４３７００４）およびヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＤＹ３４２）の量を定量した。細胞増殖および生存能（ＭＴＴアッセイ）は、製造元（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１４６５００７００１）の指示に従って行った。キヌレニン（ＩＤＯ活性）ＥＬＩＳＡキットは、製造元（ＩｍｍｕＳｍｏ  カタログ番号ＢＡ  Ｅ−２２００）の指示に従って行った。
【０２２９】
サイトカインマルチプレックス−いくつかのサイトカインの同時評価を、Ｍａｇｐｉｘシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でＰｒｏｃａｒｔａＰＬｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＰＸ−０７−ＭＸＸＧＰＹ２）を使用して行った。
【０２３０】
フローサイトメトリー−一般に、細胞はすべてのステップで氷上に保持された。染色する前に、５ｘ１０５細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中、５０μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ４５０６）で１５分間遮断した。製造元が推奨する濃度で抗体を使用し、３０分間暗所でインキュベートした。インキュベーションは、９６ウェルＵ底プレートで１００μＬの容量で行った。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、分析のために１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中のＦＡＣＳチューブに移した。Ｇａｌｌｉｏｓ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ＳｏｆｔｗａｒｅのＫａｌｕｚａを使用して、Ｇａｌｌｉｏｓ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞を分析した。
【０２３１】
細胞株およびヒト免疫細胞の単離−Ｊｕｒｋａｔ白血病性Ｔ細胞リンパ芽球細胞株クローンＥ６．１およびＳＣＣ−２５舌扁平上皮癌を、ＡＴＣＣから取得した。ＰＢＭＣは、標準的なリンパ球分離培地（ＭＢＰ、カタログ番号８５０４９４）を使用して健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。ＣＤ３細胞は、ＲｏｓｓｅｔｔｅＳＥＰ（商標）ヒトＴ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１５０６１）を使用して、陰性選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。ＣＤ４細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４  Ｔ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１９０５９）を使用して、陰性選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。単球は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒト単球濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１７９５２）を使用して、陰性選択法により健康なドナーの新鮮な血液試料から単離した。すべての細胞は、１０％ＨＩ−ＦＣＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ混合物を添加した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で成長させた。
【０２３２】
樹状細胞の分化−単球を、３日目および６日目にリフレッシュした成長因子を含むＲＰＭＩ培地で１×１０６／ｍＬの密度で培養した。未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を、５０ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４によって６日間誘導した。必要に応じて、１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳを４８時間添加することにより、ｉＤＣをさらに成熟樹状細胞に分化させた。生成された細胞集団を、関連するマーカーのＦＡＣＳ分析および特徴的なサイトカインの分泌の分析により、示された表現型について試験した。
【０２３３】
プロテアーゼ阻害剤−プロテアーゼ阻害剤を、各実験の開始時に示された濃度で添加した。１週間のアッセイでは、３日後に最終濃度でさらなる阻害剤を追加した。使用されたプロテアーゼ阻害剤は、ＴＡＰＩ−１（Ｃａｙｍａｎ、カタログ番号１８５０５）、ＧＭ６００１（サンタクルス、カタログ番号ＳＣ−２０３９７９）、ＴＭＩ−１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＺ０３３６）およびＧＩ２５４０２３Ｘ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＭＬ０７８９）である。プロテアーゼカクテルは、言及される場合、ＴＡＰＩ−１およびＧＭ６００１を等モル比で混合したものである。
【０２３４】
可溶性ＣＤ２８の生成のためのＣＤ４  Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株のＰＨＡ活性化−１×１０５のＪｕｒｋａｔ細胞またはＣＤ４  Ｔ細胞を、示された濃度のフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ８９０２）および様々なプロテアーゼ阻害剤と共に、さらに５日間（Ｊｕｒｋａｔ）または７日間（ＣＤ４  Ｔ細胞）インキュベートした。
【０２３５】
可溶性ＣＤ２８を生成するためのＰＢＭＣのＳＥＢまたはＣＭＶ活性化−４８ウェルプレートで、０．３×１０６のＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬ  ＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４８８１）で３７℃で５〜７日間、示された濃度の様々なプロテアーゼ阻害剤あり／なしで刺激した。代替として、９６ウェルプレートフォーマットアッセイにおいて、０．１×１０６のＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬ  ＳＥＢで刺激した。ＣＭＶ刺激では、９６ウェルプレートで、０．５×１０６のＰＢＭＣを、０．５μｇ／ｍＬ  ＣＭＶペプチベーター（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９３−４３５）により３７℃で２〜５日間、示された濃度の様々なプロテアーゼ阻害剤あり／なしで刺激した。連続脱落実験では、２４ウェルプレートでＰＢＭＣをＳＥＢまたはＣＭＶで２４時間刺激し、細胞を採取し、刺激剤なしのＲＰＭＩで３回洗浄し、９６ウェルプレートに再度播種した。試料は指示された時間に採取し、可溶性ＣＤ２８の検査まで凍結条件下に置いた。
【０２３６】
混合リンパ球反応−１×１０５の未成熟ＤＣを、５×１０５の単離された自己ＣＤ３  Ｔ細胞と６日間混合した。
【０２３７】
異所性組換えヒトＣＤ２８、ヒトＣＴＬＡ−４およびヒトＣＤ８０を使用したＳＥＢまたはＣＭＶ刺激アッセイ−ＣＭＶ刺激では、９６ウェルプレートで、０．５×１０６のＰＢＭＣ（健康または癌患者のドナーから）を、０．５μｇ／ｍＬ  ＣＭＶペプチベーター（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９３−４３５）３７℃で２〜５日間、指示された濃度の組換えヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４２−ＣＤ）、ヒトＣＴＬＡ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３４−ＣＴ）、ヒトＣＤ８０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１４０−Ｂ１）あり／なしで刺激した。ＳＥＢ設定では、１×１０５のＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４８８１）濃度で、示された濃度のｒｅｃ．ヒトＣＤ２８の存在下で７２時間培養した。指定されている場合、抗ＰＤ１またはヒトＩｇＧを５μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。
【０２３８】
自己単球ＣＤ３  ＭＬＲ−０．５×１０６のＴ細胞を同じＣＭＶ反応性ドナーからの０．５×１０５の単球と混合し、示された濃度の処置あり／なしで、３７℃で６日間０．５μｇ／ｍＬのＣＭＶペプチベーターで刺激しした。
【０２３９】
組換えヒトＣＤ２８による単球の刺激−１．５×１０６の単球を、１００〜１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２８５−ＩＦ）を含むＲＰＭＩ培地中で、示されている濃度の組換えヒトＣＤ２８の存在下で４８時間２４ウェルプレートに播種した。生成された細胞集団を、関連マーカー（ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）のＦＡＣＳ分析、および特徴的なサイトカイン（ＩＬ−６）の分泌の分析によって、示された表現型について試験した。
【０２４０】
ＯＫＴ３によるＴ細胞刺激−０．１×１０６の単離されたＣＤ３  Ｔ細胞（健康なドナーから）を、３７℃で４８〜７２時間、示された量の抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３で刺激した。記載されている場合、組換えヒトＣＤ８０−Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を可溶形態で添加した。ＣＤ２８に対する抗体または対照を、可溶形態で示された濃度で添加した。
【０２４１】
ＣＤ８６遮断ＦＡＣＳ−ヒトＣＤ２８で安定的にトランスフェクトされた０．５×１０６のＨＥＫ２９３細胞を５μｇ／ｍＬのＣＤ８６−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１４１−Ｂ２）と共に室温で３０分間、抗ＣＤ２８抗体（２０μｇ／ｍＬ）なしまたはありでインキュベートした。細胞を洗浄し、氷上で２０分間、１：５０００希釈でフルオロフォアに結合した抗ヒト重鎖および軽鎖抗体を使用した二次結合のために採取した。
【０２４２】
トランスウェルに基づくアッセイにおけるＳＣＣ−２５癌細胞株と単球との共培養−血清を含まない飢餓培地での４日間の指示された処理あり、またはなしで、４×１０４のＳＣＣ−２５細胞を２４ウェルプレートの底に播種し、１×１０５の単球を細胞培養インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＣＨＴ２４１１４８）上に播種した。
【０２４３】
ＣＤ２８  ｍＲＮＡ変異体の同定、クローニングおよび配列決定−ヒトＰＢＭＣを、３７℃で７日間、０．５ｎｇ／ｍＬ  ＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ４８８１）で刺激した。ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を、３７℃で７日間、フィトヘマグルチニン（２μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ８９０２）と共にインキュベートした。Ｑｉａｃｕｂｅ自動化システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）により全ＲＮＡを活性化およびナイーブ免疫細胞の細胞ペレットから抽出した。各試料から、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３７４９６６）を利用して５００ｎｇのＲＮＡをＲＴ反応に供した。ＲＴ反応の陰性対照は、ＲＮＡを含まないチューブと、逆転写酵素を含まない別のチューブであった。フォワードプライマー（ＣＤ２８Ｆ）５’−ＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣ−３’（配列番号３８）およびリバースプライマー（ＣＤ２８Ｒ）５’−ＴＣＡＧＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＣＧ−３’（配列番号３９）を使用して、１μＬのｃＤＮＡをＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに投入した。ＰＣＲ産物をゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して抽出した。示されている場合、ＣＤ２８Ｆプライマーを使用してサンガー配列決定を行った。
【０２４４】
癌患者の血漿中の可溶性ヒトＣＤ２８の検出−１０種類の癌の適応症および健康なドナーのそれぞれの２０の凍結血漿試料を、ＤｘＢｉｏｓａｍｐｌｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。血漿試料を１：２０に希釈し、ＥＬＩＳＡにより可溶性ヒトＣＤ２８について分析した。高ｓＣＤ２８の試料を適切な希釈で再度分析した。
【０２４５】
直接ＣＤ２８  ＥＩＡ−特に記載がない限り、Ｃｏｒｎｉｎｇの高結合プレートまたは同等のものをスクリーニングに使用した。各ウェルを、２００−３００ｎｇのヒトＣＤ２８−Ｉｇキメラ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３４２−ＣＤ）、マウスＣＤ２８−Ｉｇキメラ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号４８３−ＣＤ）またはＣＤ２８ストーク領域アミノ酸配列（Ｇｌｙ１３７−Ｐｒｏ１５２）で構成されるＢＳＡ結合二量体ペプチドでコーティングした。ＰＢＳ中の５％ミルクまたは１％カゼインを使用して、プレートを室温（ＲＴ）で１時間遮断した。ＰＢＳＴを使用してプレートを３回洗浄し、１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ  Ｆｃ特異的検出後、調査した抗体とインキュベートした。陽性対照は、マウス抗ヒトＣＤ２８クローン２８．２または免疫マウスからのマウス血清である。ハイブリドーマ上清培養物を希釈せずにスクリーニングした。
【０２４６】
癌患者の血漿からの可溶性ＣＤ２８の一掃のシミュレーション。抗体または組換えタンパク質を、製造元のプロトコルに記載されているようにトシル活性化磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＤＹ−１４２０３）にコーティングした。ビーズは、示された量の抗体を示すように採取し、癌患者の血漿試料と混合した。混合物をサーモミキサーで２時間、１０００ＲＰＭで３７℃でインキュベートし、続いてＤｙｎａＭａｇ磁石（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３２１Ｄ）を使用してビーズを除去し、ＣＤ２８特異的ＥＬＩＳＡを使用して試料を検査した。
【０２４７】
抗体配列決定。アミノ酸配列決定のために、抗体をＲａｐｉｄ  Ｎｏｖｏｒ社に提供した。配列決定は、標準的な方法を使用して行われたが、これには、簡潔には６つの酵素（ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、Ｌｙｓ  ＣおよびＡｓｐ  Ｎ）で酵素消化した後のＬＣ−ＭＳ分析が含まれる。消化は、ジスルフィド還元およびアルキル化を使用して行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｑ−ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を使用して行った。各抗体の重鎖と軽鎖の両方で、アミノ酸残基の１００％が少なくとも５つのペプチドスキャンでカバーされ、有意なサポート断片イオンが含まれていた。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａスキームを使用して決定した。
【０２４８】
実施例１：ヒトＣＤ２８は慢性刺激中にタンパク質分解性脱落を受ける
慢性的に刺激されたヒトＰＢＭＣの培養において、可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）がＥＬＩＳＡにより検出された（図１）。この現象は、刺激物質の性質である人工的（ＳＥＢ）または生理学的（ＣＭＶ）に関係なく明白であり、現象の堅牢性を示していた。ＴＡＰＩ−１およびＧＭ６００１（広範なＭＭＰおよびＡＤＡＭ１７阻害剤）での処理により、用量依存的にｓＣＤ２８の量が減少するため、可溶性ＣＤ２８の起源は膜形態の脱落に由来する（図１）。脱落したＣＤ２８の細胞源は、図２に見られるようにＴ細胞である。健康なドナーの末梢血からのＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株またはヒトＣＤ４  Ｔ細胞のＰＨＡによる慢性刺激により、用量依存的にｓＣＤ２８が生成される（図２、上図）。ＴＡＰＩ−１およびＧＭ６００１での処理により、各ＰＨＡ濃度（図２、上図）で、また固定ＰＨＡ濃度（図２、下のグラフ）で用量依存的に、ｓＣＤ２８の量が減少した。
【０２４９】
非常に特異的なＡＤＡＭ−１０阻害剤であるＧＩ２５４０２３Ｘによる処理は、活性化免疫細胞からのｓＣＤ２８放出のほぼ完全な阻害を、用量依存的にもたらした（図３Ａ、下のパネル）。ＡＤＡＭ−１７特異的阻害剤ＴＭＩ−１でも同様の結果が観察された（図３Ｂ、下のパネル）。免疫細胞の生存能をＭＴＴアッセイでモニタリングし、培養中の細胞の代謝活性を確認した。結果は、ＡＤＡＭ阻害剤を使用した場合と使用しない場合の処理に有意差がないことを示し、低いｓＣＤ２８レベルはプロテアーゼ活性の遮断が原因であり、プロテアーゼ阻害剤が原因の細胞死のアーチファクトではないことを示唆していた（図３Ａ−Ｂ、上のパネル）。
【０２５０】
ｓＣＤ２８の生成は、より生理学的なシステムでも検証した。最初に、単離された自己樹状細胞および抗原提示細胞によるＴ細胞の生理学的刺激を模倣するＣＤ４  Ｔ細胞が利用された。ｓＣＤ２８の上昇は、２つの細胞集団を混合すると明白になり、ＣＭＶを培養物に添加するとさらに顕著になった（図４Ａ）。これは、慢性刺激が行われると、ヒトＣＤ２８タンパク質がタンパク質分解脱落プロセスを経験することを示している。
【０２５１】
次に、ヒトＰＢＭＣをＣＭＶペプチド（図４Ｂ）またはＳＥＢ（図４Ｃ）で２４時間刺激した。その後、細胞を洗浄して刺激物質を除去し、刺激信号なしでさまざまな期間、再び播種した。その後、培地中のｓＣＤ２８の存在を検査した。ｓＣＤ２８の蓄積は、経時的に明確に見える。さらに、蓄積は、図４Ｄに見られるように、ＡＤＡＭ−１０およびＡＤＡＭ−１７の活性に依存する。ＳＥＢ刺激後、特定の阻害剤を異なる濃度で添加すると、１２０時間後に定量化されるｓＣＤ２８の量が減少した。ＣＤ２８の脱落はＴ細胞の一次活性化後に生じ、必ずしも一定または繰り返しの刺激を必要としないため、この研究は患者の血液中の多量の可溶性ＣＤ２８の存在を説明し得る。
【０２５２】
ｓＣＤ２８の起源がタンパク質分解性脱落に由来するという最後の証拠は、既知のＣＤ２８の選択的にスプライスされた変異体が活性化リンパ球で著しく下方調節されているという観察によって得られた（図５）。刺激されていない試料では４つのＣＤ２８  ｍＲＮＡ産物が検出され得たが、活性化された細胞では２つだけが明らかであった。最上部のバンドは、サンガー配列決定によって、翻訳時に膜結合される全長成熟ＣＤ２８に対応することが確認されたが、第２のバンド（黒い矢印、約５００ｂｐ）は、分泌された短縮タンパク質をもたらす選択的にスプライスされた産物であることが以前に示されている。ナイーブ配列からのこのバンドは、サンガー配列決定を使用して、エクソン３を欠失したスプライス変異体、したがって膜貫通ドメインであることが確認された。ＰＢＭＣおよびＴ細胞のＳＥＢまたはＰＨＡ刺激により、全長ＣＤ２８  ｍＲＮＡが優先的に発現し、それに伴いスプライスされた転写産物が抑制された（図５、レーン５および７）。これらの結果をまとめると、活性化Ｔ細胞からのｓＣＤ２８の起源はタンパク質分解性脱落であり、遺伝子レベルでの選択的スプライシングからではないことが示される。
【０２５３】
実施例２：可溶性ヒトＣＤ２８は免疫抑制活性を有する
図１に見られるように、プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用してｓＣＤ２８のレベルを低下させることは、分泌されたＩＦＮγのレベルによって明らかなようにＴ細胞活性化の上昇と直接相関しており、ｓＣＤ２８が免疫抑制機能を有することを示唆している。プロテアーゼ阻害剤カクテルの濃度を増加させると、細胞の培地でのｓＣＤ２８レベルの低下につながり、これらのｓＣＤ２８レベルの低下は、分泌されたＩＦＮγのレベルの増加に逆相関していた。ｓＣＤ２８による免疫抑制をさらに調査するために、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠失した組換えヒトＣＤ２８を、ＣＭＶで刺激されたヒトＰＢＭＣの培養液に追加した。これは、ＩＦＮγ分泌の用量依存的阻害をもたらした（図６）。この免疫抑制効果は、異なるヒトＰＢＭＣドナーで観察され、ｓＣＤ２８によって遮断されるこのシグナル伝達軸の堅牢性を裏付けている。
【０２５４】
並行して、インターロイキン−６分泌（図７および８Ａ）およびインターロイキン−１０（図８Ａ）の上昇が明らかであった。これらのサイトカインは、免疫エフェクター活性（ＩＬ−１０）の抑制、ならびにＳＴＡＴ−３シグナル伝達（ＩＬ−６）を介して癌の増殖および血管新生を補助し得る２型免疫応答への免疫系の歪みを示すと報告されている。さらに、可溶性ＣＴＬＡ−４（アバタセプトを模倣−自己免疫障害の登録された治療薬）との比較が行われ、サイトカイン分泌プロファイルに関して、免疫システムに対する全体的に同様の影響が明らかになった（図８Ａ）。
【０２５５】
次に、ヒトＰＢＭＣを、組換えヒトＣＤ２８の存在下または非存在下で、ＳＥＢ（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。ヒトＩｇＧを対照として使用した。免疫活性化の顕著な特徴であるリンパ球クラスタ化を、１２時間ごとに撮影した写真で、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３生細胞を用いて監視した。図８Ｃに見られるように、組換えヒトｓＣＤ２８が存在する場合、ＳＥＢは本質的にリンパ球に影響を及ぼさなかった。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ免疫応答の間に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が互いに、および他の細胞型とクラスタ化し、クラスタ化が休止リンパ球の抗原特異的活性化に不可欠であることは、十分に確立されている。可溶性ＣＤ２８は、ＳＥＢ免疫応答中にクラスタ形成の量およびサイズを減少させるようであり、これは、ＡＰＣによるＴ細胞特異的活性化の最初のステップを阻害することを意味する。
【０２５６】
単離された自己単球およびＣＤ３  Ｔ細胞を混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で共培養すると、同様の結果が観察された。混合細胞を、組換えヒトｓＣＤ２８の濃度を増加させて、または増加させずに、ＣＭＶペプチド（０．５μｇ／ｍＬ）で５日間刺激した。ここでも、ｓＣＤ２８は、ＩＦＮγ分泌を阻害すると同時に、ＩＬ−１Ｂ、ＴＧＦβおよびＩＬ−１０の分泌を増加させることが判明した（図８Ｂ）。
【０２５７】
ｓＣＤ２８は、単球に対して同様の免疫抑制効果を有していた。酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、必須アミノ酸であるトリプトファンを異化させるその能力により、免疫調節に関与している。それは、様々な免疫細胞および多くの癌細胞でも発現される。トリプトファンの不足はＴリンパ球の成熟および増殖を阻害するが、トリプトファン異化作用の最終産物であるキヌレニンは、様々な生理学的および病態生理学的状態で免疫寛容を促進する免疫抑制代謝産物としても知られている。ＩＤＯに対するｓＣＤ２８の効果を試験するために、分離されたヒト単球を、対照ヒトＩｇＧまたは組換えヒトＣＤ２８（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、ＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍＬ）で４８時間刺激した。インキュベーション後、単球はヒトＩＤＯで細胞内染色された（図８Ｅ）。細胞内染色を容易にするために、細胞を固定し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液キットで透過処理した。様々な処理の培養液を、ＩｍｍｕＳｍｏｌ固有キヌレニンＥＬＩＳＡキットを使用してＩＤＯ活性について評価した（図８Ｄ）。ｓＣＤ２８は、単球におけるＩＤＯ発現を強く増強した。
【０２５８】
さらに、驚くべきことに、ｓＣＤ２８は、抗ＰＤ１免疫療法の強力な阻害剤であることが判明した。ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブまたはＫｅｙｔｒｕｄａ、Ｍｅｒｃｋ）は、複数の癌の適応症における前例のない効能を備えた承認済みの薬剤である。ＰＭＢＣ培養物への添加により、炎症性サイトカイン分泌（ＩＦＮγおよびＩＬ−２）が増加したが、ｓＣＤ２８の存在により、この免疫活性化効果は完全に無効になった（図９Ａ）。
【０２５９】
ＭＬＲ設定でも同様の結果が観察された。ＭＬＲは、ｓＣＤ２８を使用した場合および使用しない場合、ならびに抗ＰＤ１抗体（ＭＫ３４７５、５μｇ／ｍＬ）を使用した場合および使用しない場合で、以前と同様に行った（図９Ｂ）。予想通り、ＭＫ−３４７５はＩＦＮγ分泌を増加させ、ＴＧＦβ分泌を減少させた。特に、ｓＣＤ２８の存在下では、ＭＫ−３４７５の効果は大幅に低減した。
【０２６０】
ｓＣＤ２８が抗ＰＤ−１療法のプロ活性化効果を阻害するメカニズムを解明するために、ｓＣＤ２８の存在下で免疫細胞上のＰＤ−１リガンドの発現を検査した。単離されたヒト単球を、対照ヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下でＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍＬ）または組換えヒトＣＤ２８（１０μｇ／ｍＬ）で４８時間刺激した。インキュベーション後、単球は、ＰＤ−Ｌ１（図９Ｃ、左）およびＰＤ−Ｌ２（図９Ｃ、右）で染色された。両方のリガンドは、ｓＣＤ２８で培養された単球上で上方調節されたが、これはｓＣＤ２８が抗ＰＤ−１免疫療法の効果を回避する１つの可能な方法を示唆している。
【０２６１】
実施例３：可溶性ヒトＣＤ２８は癌患者の血漿中に見られる
癌におけるｓＣＤ２８のレベルは、少数の乳癌患者でのみ示されており、健康な個人で観察されるレベルをわずかに上回っているだけであることが判明した（Ｉｓｉｔｍａｎｇｉｌ，Ｇ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ，２０１６）。著者らは、ｓＣＤ２８が乳癌のマーカーとして使用され得ることを示唆しているが、機能的な関係は示唆されていない。可溶性ＣＤ２８が実際に免疫系の癌回避を強化する可能性があることが分かった今、１０の異なる癌の適応症をカバーする２２０の試料および健康なドナーからの２０の試料の調査を行った。調査では、いくつかの癌で高いｓＣＤ２８レベルが見つかったが、このレベルは、健康な対照または乳癌患者で見られるレベルよりも桁違いに高い場合があった（図１０Ａ）。実際、一部の黒色腫、結腸直腸癌、卵巣癌、ＮＳＣＬＣ、および頭頸部癌患者に見られるｓＣＤ２８レベルと比較すると、乳癌患者のレベルは健康な個人と同等であるようである。この調査は、本発明の抗体＃１および＃３を使用して行った。そのような高いレベルは、本発明者らに知られているどの研究でも以前に報告されていなかったことは、驚くべきことであった。したがって、本発明の抗体（捕捉用の抗体＃３および検出用の抗体＃１）ならびにＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な市販のＣＤ２８キット（カタログ番号ＤＹ３４２）を使用して、２０の黒色腫患者試料をサンドイッチＥＬＩＳＡにより試験した。本発明の抗体は、試料の３つで非常に高レベルのｓＣＤ２８を検出し、別の１４ではより低レベルを検出したが、市販のキットは、試料のいずれでもｓＣＤ２８を検出しなかった（図１０Ｂ）。同様の結果は、乳癌に関するＩｓｉｔｍａｎｇｉｌらの研究で使用されていたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能な市販のＣＤ２８  ＥＬＩＳＡキットＢＭＳ２９０でも見出された。市販のキットではヒト細胞から脱落したｓＣＤ２８を検出できないことは、がん患者の高ｓＣＤ２８が今まで知られていない現象であった理由を説明し得る。
【０２６２】
癌におけるｓＣＤ２８の役割をさらに解明するために、ＰＢＭＣを異なる適応症を有する癌患者から分離した。細胞を、ＳＥＢ（５ｎｇ／ｍＬ）で３日間、単独で、ＭＫ−３４７５と共に、組換えヒトｓＣＤ２８と共に、または両方の分子の組み合わせと共に刺激した。ＭＫ−３４７５が存在する場合でも、ｓＣＤ２８の存在下では、すべてのドナーからの細胞の上清中のヒトＩＦＮγの濃度が大幅に低減された（図１０Ｃ）。確かに、ｓＣＤ２８により、ＭＫ−３４７５の効果は存在しなかった。
【０２６３】
次に、頭頸部がん細胞株ＳＣＣ−２５の細胞を、トランスウェルアッセイで単独で、または単球と共にインキュベートした。単独で成長させたＳＣＣ−２５細胞に陽性対照としてＩＬ−６を投与すると、ＭＴＴ（図１０Ｄ、上）で測定される、およびコンフルエンス％（図１０Ｄ、下）で測定される細胞増殖は実際に増加した。単球の存在下で癌細胞を成長させると増殖も増加したが、共培養にｓＣＤ２８が含まれる場合は、断然に最大の増加が観察された。このデータは、ｓＣＤ２８が前癌効果を有することをさらに裏付けている。
【０２６４】
実施例４：ｓＣＤ２８はＣＤ８０−Ｆｃの有効性を阻害する
ＣＤ８０は、ＣＤ８６と共にｍＣＤ２８の２つの主要なリガンドの１つである。Ｆｃ部分に融合したＣＤ８０の細胞外ドメインは、免疫刺激分子として使用されており、癌治療法として調査されている。ｓＣＤ２８がＣＤ８０−Ｆｃの有効性に及ぼす影響を検査するために、単離されたＣＤ３ヒトＴ細胞を、２μｇ／ｍＬの可溶性組換えヒトＣＤ８０−Ｆｃの存在下で、プレート結合抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、２μｇ／ｍＬ）で刺激した。予想通り、ＣＤ８０−Ｆｃは、ＩＦＮγ分泌を増加させた。しかしながら、ｓＣＤ２８の添加は、ＣＤ８０−Ｆｃの二次活性化効果を打ち消した（図１１Ａ）。同様に、単離されたＰＢＭＣをＣＭＶペプチドで３日間刺激し、次いでｓＣＤ２８と共にインキュベートした場合、期待される免疫応答を生成するためにＣＤ８０−Ｆｃの量を増やす必要があった（図１１Ｂ）。
【０２６５】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏでの癌に対するｓＣＤ２８の効果
マウスはｍＣＤ２８を切断しないため、マウスモデルではｓＣＤ２８の効果を簡単に検査することができない。最も近い選択肢は、組換えｓＣＤ２８をマウスに投与して、上昇したｓＣＤ２８レベルの状況を模倣することである。これを、Ｈ２２同系マウスモデルで調査した。Ｂａｌｂ／ｃ完全免疫適格マウスに、Ｈ２２肝細胞癌細胞の同種移植を施した。細胞は完全に免疫能のあるマウスでも成長し、抗ＰＤ−１療法の追加は腫瘍の成長をほぼ完全に止めた（図１２Ａ）。組換えヒトｓＣＤ２８を追加した場合、抗ＰＤ−１療法の効果は２匹のマウスでほぼ完全に無効となった（図１２Ｂ）。これは、一部の対象では、ｓＣＤ２８レベルの増加が癌の進行に非常に有害な影響を与える可能性があることを示唆している。
【０２６６】
実施例６：ｓＣＤ２８の免疫抑制効果（抗切断）を排除する抗体に基づく薬剤の特性決定
ヒトＣＤ２８がＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７によるタンパク質分解プロセスを受けるという発見は、タンパク質分解性脱落の潜在的感受性を示す候補領域のそのポリペプチド配列の検査を促した。研究により、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７がＰ１’位のロイシン、バリンおよび芳香族残基を好むことが示唆されている。ヒトＣＤ２８の最も魅力的な配列領域は、ヒスチジン１３４からプロリン１５２（配列番号１０：ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ）に及ぶストークセクションであり、球状ＩｇＶドメインを膜貫通領域に接続している。この領域は、合計３つのロイシンおよびバリン残基、ならびにフェニルアラニン残基を保持し、プロテアーゼのアクセスを妨げる可能性のある二次構造エレメントがないと予測される。特に、ストーク領域には、ＣＤ２８のホモ二量体化を促進するジスルフィド間結合を形成するシステイン１４１も含まれている。ＣＤ２８ストーク領域に特異的に結合する抗体または抗体断片を生成し、ＣＤ２８オリゴマーの構造および機能の低下を回避しながら脱落したＣＤ２８への異なるプロテアーゼのアクセスを潜在的に遮断する目的で、ＣＤ２８ストーク領域を模倣する二量体ペプチドでＣＤ１マウスを免疫した。免疫化に使用されたペプチド配列は、配列番号４０、ＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＫであり、ヒドラジド化学を使用してＫＬＨまたはＢＳＡ結合を可能にする遊離アミノ基を有するためにＣ末端リシンを追加した。結合は、ヒドラジド終端ＣＤ２８ペプチドとＳ−４ＦＢ修飾ＢＳＡとの間で行ったが、これにより、部位特異的結合のための遊離アルデヒドが生成される。ペプチドを非変性ゲルで泳動することにより二量体化を確認した。
【０２６７】
６匹のマウスをＢＳＡ結合ペプチドで免疫した。マウスの尾血血清を、標的抗原、組換えヒトＣＤ２８（ｒｈＣＤ２８）、およびＫＬＨ結合混合ペプチドへの結合について、ＥＬＩＳＡで慣例的にチェックした。
【０２６８】
ＥＬＩＳＡで抗原標的に結合するための初期クローンスクリーニングには、ハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用した。培養上清を一次抗体として使用して、ｒｈＣＤ２８に対する初期ＥＩＡで約２０００個のハイブリドーマを生成およびスクリーニングし、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）およびＴＭＢを用いて発色させた。２０クローンが得られ、そのすべてがＩｇＧ２ａ抗体であり、さらに精製およびアイソタイピングのために拡大した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、２０のＩｇＧすべてが組換え可溶性ＣＤ２８への様々なレベルの有意な結合を有することが確認されている（表１）。
【表１】
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【０２６９】
３つの最高結合クローンをすべて配列決定し、同じ抗体（以下、クローンＭ９と呼ばれる）であることが判明したため、この抗体を用いて実験を続けた。Ｍ９抗体の配列は上記に見出すことができる。抗体Ｍ９の段階希釈を使用して、組換えヒトｓＣＤ２８およびストーク領域ペプチドへの特異的結合を確認した（図１３Ａ）。興味深いことに、抗体は組換えヒトｓＣＤ２８を検出できたが、実際に免疫細胞から脱落したｓＣＤ２８は検出できなかった（図１３Ｂ）。これは、抗体が切断部位で結合し、それが結合するデアイソトープが切断形態では不完全であることを強く示唆している。抗体Ｍ９の存在下および非存在下でｒｈＣＤ２８をＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７と混合することにより、切断の直接阻害がチェックされる。得られるｒｈＣＤ２８ペプチドを質量分析によって配列決定され、切断が生じたかどうかが決定される。
【０２７０】
これらの結果は、ストーク領域の結合がｍＣＤ２８シグナル伝達に直接影響しない可能性があることを示唆している。しかしながら、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓのモノクローナル抗体ＭＡＢ３４２、クローン３７４０７がＣＤ２８のストーク領域に結合することが報告されている（国際特許出願ＷＯ２００４０９６１３９を参照されたい）。さらに、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓは、この抗体がＣＤ２８アゴニストであることを報告している（ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｈｕｍａｎ−ｃｄ２８−ｍａｂ−ｃｌｏｎｅ−３７４０７−３７４０７＿ｍａｂ３４２）。したがって、この抗体の結合を調査した。ＭＡＢ３４２は、組換えヒトＣＤ２８−Ｆｃおよび組換えヒトＣＤ２８ａ（ストーク領域配列を欠失した可溶性スプライス変異体）に結合するが、組換えマウスＣＤ２８には結合しないことが判明した（図１３Ｃ）。しかしながら、ヒトＣＤ２８ストークペプチドへの結合をアッセイした場合、結合は観察されず、この抗体が実際にＣＤ２８ストーク領域に結合しないことを強く示唆している（図１３Ｃ）。
【０２７１】
実施例７：ｓＣＤ２８の免疫抑制効果を排除する（一掃）抗体に基づく薬剤の特性決定
ｓＣＤ２８に強く結合する３つの抗体を取得し、ｓＣＤ２８レベルを下げるための一掃剤としてのそれらの潜在的有効性を調査した。３つの抗体の配列は、上記に示されている。
【０２７２】
３つの抗体がヒトｓＣＤ２８に結合する能力を確認するために、ヒトＣＤ３  Ｔ細胞をＰＨＡで刺激し、ｓＣＤ２８を本発明の２つの抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。抗体１を検出抗体として使用し、抗体２を捕捉抗体として使用した代表的な結果を、図１４Ａに示す。同様に、ヒトＰＢＭＣをＳＥＢで刺激すると、本発明の抗体は再びｓＣＤ２８を強く検出することができた（図１４Ｂ）。プロテアーゼ阻害剤ＴＡＰＩ、ＧＩ２５４０２３ＸおよびＴＭＩ−１を使用すると、より低いレベルのｓＣＤ２８が検出され、確かにｓＣＤ２８が検出されていることが確認される。
【０２７３】
抗体＃１および＃２を、ｍＣＤ２８に結合することが知られている対照の市販のＣＤ２８抗体ＣＤ２８．２と比較した。様々な濃度のｓＣＤ２８を使用し、各抗体（および陰性対照としてのｍＩｇＧ）を用いて直接ＥＬＩＳＡを行った（図１４Ｃ）。組換えヒトｓＣＤ２８タンパク質を、ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートに固定化し、結合をロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰによる結合抗体の検出およびＴＭＢによる発色で評価した。市販の抗体ＣＤ２８．２はｓＣＤ２８に結合したが、結合は貧弱で、入力を１０倍に増やしてもＯ．Ｄ．の増加はわずかであった。対照的に、抗体＃１および＃２はどちらも、はるかに強いｓＣＤ２８への結合を示し、抗体＃１は、ほぼ１０倍大きい検出を示し、抗体＃２は、検査した全範囲にわたって増加する抗体濃度と直線関係を示した。各抗体の直接ＥＬＩＳＡを、個別に図１４Ｄに示す。興味深いことに、抗体＃２はマウスＣＤ２８にも結合することができたが、抗体＃１および＃３は結合することができなかった（図１４Ｅ）。
【０２７４】
ＣＤ２８．２はＴ細胞の増殖およびサイトカイン分泌を刺激することが知られており、したがってｍＣＤ２８アゴニストとして作用する。実際に、ＣＤ８６のｍＣＤ２８への結合をＦＡＣＳで測定したところ、ＣＤ２８．２を追加するとＣＤ８６結合が大幅に減少し（図１５Ａ）、これはＣＤ２８．２がｍＣＤ２８のリガンド結合ドメインに結合またはそれを閉塞することを示している。対照的に、抗体＃１（図１５Ｂ）、抗体＃２（図１５Ｃ）、または抗体＃３（図１５Ｄ）はいずれも、ＣＤ８６のｍＣＤ２８への結合を遮断せず、実際に、両方の抗体はｍＩｇＧ対照（図１５Ｅ）に相当するようである。
【０２７５】
Ｔ細胞による炎症性サイトカイン分泌を代表するものとして、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を測定した。抗ＣＤ３刺激の存在下で、抗体ＣＤ２８．２はＴ細胞が活性化されたことを示す強力なＩＦＮγ分泌を誘導した。対照的に、抗体＃１、＃２、および＃３はすべて、様々な濃度でＩＦＮγ分泌に影響を与えなかった（図１５Ｆ）。したがって、ＣＤ２８．２はｍＣＤ２８アゴニストとして作用するが、抗体＃１〜３はアゴニスト様ではない。同様の結果は、ヒトＰＢＭＣがＳＥＢで刺激された場合にも見られた（図１５Ｇ）。
【０２７６】
同様に、ヒト単離Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激すると、ＣＤ８０−Ｆｃはアゴニストとして機能し、ＩＦＮγ分泌を増加させる。アンタゴニストの添加はＣＤ８０の効果を減少させるはずであるが、抗体＃１〜３を添加した場合、分泌の減少は観察されなかった（図１５Ｈ）。これは、抗体＃１〜３もアンタゴニスト様でないことを示している。
【０２７７】
最後に、抗体＃１〜３がｍＣＤ２８に結合する能力を検査した。ｓＣＤ２８抗体がｍＣＤ２８に結合しないことは、必須ではないが有利である。そのような抗体は、可溶性タンパク質の特異的検出に使用することができ、治療的に使用した場合、膜形態には影響を及ぼさないであろう。ナイーブ単離ＣＤ３  Ｔ細胞をＦＡＣで評価して、ｍＣＤ２８結合をアッセイした。細胞を抗体＃１〜３（２０μｇ／ｍＬの濃い灰色のヒストグラム）またはアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ、２０μｇ／ｍＬ、淡い灰色のヒストグラム）と共にインキュベートした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合ヤギ抗マウス二次抗体を用いて結合検出を行った。図１５Ｉに見られるように、抗体＃１のみがｍＣＤ２８と結合した。抗体＃２および＃３は、細胞表面上のＣＤ２８に結合しないため、ｓＣＤ２８に完全に特異的である。
【０２７８】
実施例８：抗体を使用して血漿からｓＣＤ２８を除去することができる
製造元のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、様々な量（０．１２５〜２μｇ）の抗体＃１および＃２をトシル活性化磁気ビーズに投入した。次いで、投入したビーズを癌患者からの血漿試料に加え、サーモミキサーで混合物を３７℃で２時間、１０００ＲＰＭでインキュベートした。ビーズを分離し、磁石を用いて血漿から取り出し、血清中に残っているｓＣＤ２８の量をＥＬＩＳＡで測定した。抗体＃１（図１６Ａ）および抗体＃２（図１６Ｂ）からの代表的な結果が示されているが、本発明の抗体が血漿からｓＣＤ２８を結合および除去することができたことを示している。
【０２７９】
抗体＃１を、様々な癌試料（黒色腫、結腸直腸癌および卵巣癌）でさらに試験し、ＣＤ２８の既知のリガンドである３つのＢ７分子と比較した。約１．５μｇの抗体＃１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＣＯＳＬをそれぞれトシル活性化磁気ビーズに投入し、ビーズを以前のように血漿と混合した。結腸直腸癌試料（図１６Ｃ）、２つの黒色腫試料（図１６Ｄ〜Ｅ）、卵巣癌試料（図１６Ｆ）および健康なドナーからの試料（図１６Ｇ）をすべて試験した。抗体＃１は、試験された他の３つの分子よりも優れており、すべての場合において、血漿中のｓＣＤ２８レベルを健康な試料で観察されたレベル以下に減少させることができた。実際に、抗体＃１は、黒色腫試料の１つを除いて（図１６Ｄ）すべての試料でｓＣＤ２８をほぼ検出不可能なレベルに減少させたが、この試料でも５０％を超える低減が観察された。
【０２８０】
本発明は、その特定の実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替物、改変物、および変形物が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に収まるこのような代替物、改変物、および変形物をすべて包含することが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
2021517152.tif 000032
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月4日(2020.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021517152000001.app
【国際調査報告】
2021517152.tif 000056
2021517152.tif 000057
2021517152.tif 000058
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