(57)【要約】  開示されるのは、リンパ球−活性化遺伝子３(ＬＡＧ−３)抗体医薬組成物およびその使用である。医薬組成物は酢酸緩衝液またはヒスチジン塩緩衝液中にＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。医薬組成物はまた糖類、非イオン性界面活性剤および他の添加物も含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントおよび緩衝液を含む医薬組成物であって、ここで緩衝液が酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項２】
酢酸緩衝液が酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液から選択され、ヒスチジン緩衝液がヒスチジン−塩酸緩衝液およびヒスチジン−酢酸緩衝液からなる群から選択され、クエン酸緩衝液がクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液であり、コハク酸緩衝液がコハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液であり、好ましくは、緩衝液がヒスチジン−塩酸緩衝液または酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度が１mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは４０mg／ml〜６０mg／ml、より好ましくは５０mg／mlである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
緩衝液が約５.０〜６.５、好ましくは約５.０〜６.０のｐＨを有する、請求項１〜３の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
緩衝液の濃度が５mM〜３０mM、好ましくは１０mM〜３０mMである、請求項１〜４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
さらにアジュバントを含み、該アジュバントが糖類および界面活性剤からなる群から選択される１以上である、請求項１〜５の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
糖類が二糖、好ましくはトレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール、より好ましくはスクロースである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
スクロースの濃度が３０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは６０mg／ml〜９０mg／ml、より好ましくは７５mg／mlである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
界面活性剤がポリソルベートであり、ここで、ポリソルベートがポリソルベート８０およびポリソルベート２０からなる群から選択される、好ましくはポリソルベート８０である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
界面活性剤の濃度が０.０２mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは０.２mg／ml〜０.６mg／ml、より好ましくは０.３mg／ml〜０.５mg／mlである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
次のｉ)またはii)に示す成分を含む、請求項１〜１０の何れかに記載の医薬組成物：
ｉ)(ａ)１mg／ml〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５mM〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.０２mg／ml〜０.８mg／ml  ポリソルベート８０；または
ii)(ａ)１mg／ml〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５mM〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｄ)０.０５mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０、
好ましくは(ｅ)４０mg／ml〜８０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｆ)１０mM〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.２〜５.８、(ｇ)７０mg／ml〜８０mg／ml  スクロースおよび(ｈ)０.４mg／ml〜０.５mg／ml  ポリソルベート８０
を含む；または
(ｅ)４５mg／ml〜６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｆ)１０mM〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.５〜６.０、(ｇ)６０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｈ)０.２mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０
を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
ヒト化ＬＡＧ−３抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５の何れかに示すとおりであるかまたは該配列が配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５と少なくとも８５％配列同一性を有する；および
軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の何れかに示すとおりであるかまたは該配列が配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８と少なくとも８５％配列同一性を有する、
請求項１〜１１の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
(ａ)１〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５mM〜３０mM  酢酸−酢酸緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.０２mg／ml〜０.８mg／ml  ポリソルベート８０；
好ましくは：
(ｅ)４０mg／ml〜８０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｆ)１０mM〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.２〜５.８、(ｇ)７０mg／ml〜８０mg／mlのスクロースおよび(ｈ)０.４mg／ml〜０.５mg／ml  ポリソルベート８０；
より好ましくは：
(ｉ)  約５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｊ)１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.５、(ｋ)約７５mg／ml  スクロースおよび(ｌ)約０.４mg／ml  ポリソルベート８０
を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヒト化ＬＡＧ−３抗体が次に示す重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせ：
１)配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
２)配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
３)配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
４)配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
５)配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
６)配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
７)配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
８)配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
９)配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
１０)配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
１１)配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
１２)配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
１３)配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
１４)配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
１５)配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；および
１６)配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域
を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒト化ＬＡＧ−３抗体が重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み、ここで、重鎖定常領域は好ましくは配列番号３８に示され、軽鎖定常領域が好ましくは配列番号３９に示される、請求項１２〜１４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ヒト化ＬＡＧ−３抗体の重鎖アミノ酸配列が配列番号４０に示すとおりであるかまたは該配列が配列番号４０と少なくとも９５％配列同一性を有し、軽鎖アミノ酸配列が配列番号４１に示すとおりであるかまたは該配列が配列番号４１と少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ヒト化ＬＡＧ−３抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３の何れかに示すとおりであるかまたは該配列が配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３と少なくとも８５％配列同一性を有する；および
軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７の何れかに示すとおりであるかまたは該配列が配列番号３０、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７と少なくとも８５％配列同一性を有する、請求項１〜１１の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
(ａ)１mg／ml〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５mM〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｄ)０.０５mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０
を含む；好ましくは
(ｅ)４５mg／ml〜６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｆ)約１０mM〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.５〜６.０、(ｇ)６０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｈ)０.２mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０
を含む；より好ましくは：
(ｉ)約５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｊ)１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約６.０、(ｋ)約７５mg／ml  スクロース、(ｌ)約０.３mg／ml  ポリソルベート８０
を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ヒト化ＬＡＧ−３抗体が次に示す重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせ：
１)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
２)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
３)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
４)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
５)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
６)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
７)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
８)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
９)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
１０)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
１１)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
１２)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
１３)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
１４)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
１５)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
１６)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
１７)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
１８)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
１９)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；および
２０)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域
を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ヒト化ＬＡＧ−３抗体が重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み、ここで、重鎖定常領域が好ましくは配列番号３８に示され、軽鎖定常領域が好ましくは配列番号３９に示される、請求項１７〜１９の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ヒト化ＬＡＧ−３抗体の重鎖アミノ酸配列が配列番号４２に示すとおりであるかまたは該配列が配列番号４２と少なくとも９５％配列同一性を有するおよび軽鎖アミノ酸配列が配列番号４３に示すとおりであるかまたは該配列が配列番号４３と少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントと緩衝液を混合することを含み、ここで、該緩衝液が酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ヒスチジン−塩酸緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液、好ましくは酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液またはヒスチジン−塩酸緩衝液からなる群から選択される、請求項１〜２１の何れかに記載の医薬組成物を製造する方法。
【請求項２３】
請求項１〜２１の何れかに記載の医薬組成物を凍結乾燥する工程を含む、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む凍結乾燥製剤を製造する方法。
【請求項２４】
凍結乾燥が前凍結、一次乾燥および二次乾燥の工程を順次含む、請求項２３に記載のＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤またはその抗原結合フラグメントを製造する方法。
【請求項２５】
一次乾燥が−５℃〜−２０℃、好ましくは−１０℃の温度で実施される、請求項２４に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む凍結乾燥製剤を製造する方法。
【請求項２６】
請求項２３〜２５の何れかに記載の方法により製造された、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む凍結乾燥製剤。
【請求項２７】
凍結乾燥製剤が請求項１〜２１の何れかに記載の医薬組成物を得るために再構成され得ることを特徴とする、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む凍結乾燥製剤。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の凍結乾燥製剤を再構成する工程を含み、ここで、再構成のための溶媒が好ましくは注射用水である、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む再構成溶液を製造する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法により製造される、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、再構成溶液。
【請求項３０】
次の成分：
ｉ)(ａ)４０mg／ml〜８０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０mM〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.２〜５.８、(ｃ)７０mg／ml〜８０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.４mg／ml〜０.５mg／ml  ポリソルベート８０；または
ii)(ａ)４５mg／ml〜６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０mM〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.５〜６.０、(ｃ)６０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｄ)０.２mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０
を含む、請求項２９に記載のＬＡＧ−３抗体または抗原結合フラグメントを含む、再構成溶液。
【請求項３１】
医薬として使用するための、請求項１〜２１の何れかに記載の医薬組成物または請求項２６または２７に記載の凍結乾燥製剤または請求項２９または３０に記載の再構成溶液。
【請求項３２】
ＬＡＧ−３と関連する疾患または状態の処置用医薬の製造のための請求項１〜２１の何れかに記載の医薬組成物または請求項２６または２７に記載の凍結乾燥製剤または請求項２９または３０に記載の再構成溶液の使用であって、ここで、該疾患または状態が病原性Ｔ細胞が関与する疾患または状態、好ましくは癌であり、該癌が卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、腸癌、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌ならびに骨髄腫、慢性および急性白血病を含む血液系腫瘍からなる群から選択される、使用。
【請求項３３】
治療有効量の請求項１〜２１の何れかに記載の医薬組成物または請求項２６または２７に記載の凍結乾燥製剤または請求項２９または３０に記載の再構成溶液を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＬＡＧ−３と関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、ここで、疾患または状態が病原性Ｔ細胞が関与する疾患または状態、好ましくは癌であり、該癌が卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、腸癌、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌ならびに骨髄腫、慢性および急性白血病を含む血液系腫瘍からなる群から選択される、方法。
【請求項３４】
請求項１〜２１の何れかに記載の医薬組成物または請求項２６または２７に記載の凍結乾燥製剤または請求項２９または３０に記載の再構成溶液を含む容器を含む、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は医薬製剤の分野に属し、特に、本発明は、ＬＡＧ−３抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物および医薬としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リンパ球活性化遺伝子−３はＬＡＧ−３またはＣＤ２１５としても知られ、免疫細胞の種々の機能および生存サイクルを負に制御できる免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。研究により、ＬＡＧ−３がウイルス感染、自己免疫性疾患および腫瘍誘導免疫系機能不全に重要な役割を有することが示されている。ＬＡＧ−３の機能に影響することは、これら疾患の進展中の免疫機能不全状態を改善し、その疾病の予後を改善する。
【０００３】
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとして、ＬＡＧ−３は細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインの３領域からなる。Triebel et al., in 1990 (J Exp Med, 1990, 171 (5): 1393-405)により最初に発見された成熟ＬＡＧ−３分子は、４７０アミノ酸からなり、相対的分子量は７０kDaである。研究者らは、ＬＡＧ−３が、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１と同様、負の共刺激分子であり、その活性化がリンパ球の機能を負に制御できることを発見した。構造的に、ＬＡＧ−３はＣＤ４と密接に関係するが、その機能はＣＤ４のものと逆である。具体的に、ＬＡＧ−３分子はＣＤ４分子と高い類似性を有し、両者ともＭＨＣ−II(主要組織適合遺伝子複合体)クラス分子に結合できる。しかしながら、ＬＡＧ−３のＭＨＣ−II分子への結合親和力はＣＤ４のものより高い。故に、ＬＡＧ−３はＣＤ４＋Ｔリンパ球により誘導されるＴＣＲ活性化を妨害し、Ｔリンパ球の活性化を阻害する(Curr Opin Immunol, 2009, 21(2):179-86; Eur J Immunol, 2003, 33 (4): 970-9)。インビトロ研究で、ＬＡＧ−３はＴリンパ球の抗原誘発増殖を阻害できることが示されている。ＬＡＧ−３遮断は、Ｔリンパ球の活性化および増殖を改善し、１型Ｔヘルパー細胞(Ｔｈ１)により分泌されるサイトカインを改善する。Huang et al.は、ＬＡＧ−３のレベルが活性化ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞表面で顕著に増加しており、ＬＡＧ−３がＣＤ４＋Ｔｒｅｇが最大免疫抑制性効果の発揮を可能にする必須条件であったことを示している(Immunity, 2004, 21 (4): 503-13)。さらに、抗ＬＡＧ−３抗体はまたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球のホメオスタシスを維持し、ＬＡＧ−３遮断は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の殺腫瘍細胞能を顕著に増加させる(J Clin Invest, 2007, 117 (11): 3383-92)。疾患におけるいくつかの研究で、ＬＡＧ−３が疾患の発症および進行制御に重要な役割を有することも判明している。Gandhi et al.は、ヒトリンパ腫組織のＴリンパ球におけるＬＡＧ−３発現レベルがＴリンパ球機能不全と相関し、ＬＡＧ−３＋Ｔリンパ球のクリアランスが、リンパ球による腫瘍細胞排除の能力を顕著に増加できることを確認した(Blood, 2006, 108 (7): 2280-9)。この結果は、ＬＡＧ−３が免疫細胞表面の重要な阻害性分子であり、Ｔリンパ球に顕著な負の制御効果を有することを示す。
【０００４】
ＬＡＧ−３は主にＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、Ｔｒｅｇ細胞およびＤＣ細胞で発現される(Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5744-9. Eur J Immunol, 2005, 35 (7): 2081-8; J Immunol, 2009, 182 (4): 1885-91)。ＬＡＧ−３は、免疫抑制性分子のクラスであり、ＴＣＲの共受容体を構成する要素の一つである。それは、Ｔリンパ球により誘導されるＴＣＲ活性化を阻害し、Ｔリンパ球活性化に負の制御性の役割を有する。ある疾患において、ＬＡＧ−３の発現が増加し、対応する免疫抑制が観察された。Gandhi et al.は、ＬＡＧ−３がホジキンリンパ腫を有する患者の血液および腫瘍組織からのリンパ球で高度に発現され、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能が腫瘍組織で明らかに障害され、ＬＡＧ−３陽性Ｔ細胞が除かれたら、抗腫瘍機能が回復し、サイトカイン分泌が増加したことを発見した。著者らは、ＬＡＧ−３発現が特定のＴ細胞による免疫機能の抑制と関係し、ＬＡＧ−３分子機能阻害が、Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強でき、よって、ＬＡＧ−３分子が腫瘍免疫療法の潜在的標的であり得ると考えた(血液, 2006, 108 (7): 2280-9)。
【０００５】
現在、ＢＭＳおよびNovartisなどのいくつかの多国籍製薬企業が、Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増大し、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激により患者自身の腫瘍に対する免疫応答を最大化し、さらに腫瘍細胞を致死させる目的を達成する、ＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体の研究を続けている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、抗体薬物は、その大きな分子量、複雑な構造、分解され易すさ、重合化し易さまたは好ましくない化学修飾のために、不安定である。抗体薬物の安定な製剤の研究は、抗体を投与に適するようにするため、貯蔵およびその後の使用までの安定性を維持するために特に重要である。
【０００７】
多数の企業がＬＡＧ３抗体およびその製剤を現在開発しているが(例えば、ＷＯ２０１８２０４３７４、ＷＯ２０１００１９５７０、ＷＯ２０１４００８２１８、ＷＯ９５３０７５０、ＷＯ２００４０７８９２８、ＷＯ２００８１３２６０１、ＷＯ２０１４１４０１８０、ＷＯ２０１５１３８９２０など)、新規ＬＡＧ−３抗体製剤に絞った研究はほとんどない。投与により適するＬＡＧ−３を含む医薬組成物(製剤)を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明は、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントおよび緩衝液を含む医薬組成物を提供し、該緩衝液は酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液からなる群から選択される。
【０００９】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれる酢酸緩衝液は酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸カリウム緩衝液、酢酸−ヒスチジン塩緩衝液、酢酸−酢酸カルシウム緩衝液および酢酸−酢酸マグネシウム緩衝液から選択され、好ましくは酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液である。
【００１０】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれるヒスチジン緩衝液はヒスチジン−塩酸緩衝液、ヒスチジン−酢酸緩衝液、ヒスチジン−リン酸緩衝液、ヒスチジン−硫酸緩衝液から選択され、好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液である。
【００１１】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれるクエン酸緩衝液はクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液であり、コハク酸緩衝液はコハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液である。
【００１２】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度は約１mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約１０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約２０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約７０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約８０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約１０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約２０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約７０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約１０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約２０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約１０mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約２０mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約１０mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは約２０mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは約１０mg／ml〜４０mg／ml、好ましくは約２０mg／ml〜４０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜４０mg／ml、好ましくは約１０mg／ml〜３０mg／ml、好ましくは約２０mg／ml〜３０mg／mlである。非限定的例として、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度は約４０mg／ml、４１mg／ml、４２mg／ml、４３mg／ml、４４mg／ml、４５mg／ml、４６mg／ml、４７mg／ml、４８mg／ml、４９mg／ml、５０mg／ml、５１mg／ml、５２mg／ml、５３mg／ml、５４mg／ml、５５mg／ml、５６mg／ml、５７mg／ml、５８mg／ml、５９mg／mlまたは６０mg／ml、最も好ましくは５０mg／mlである。
【００１３】
別の実施態様において、緩衝液の濃度は約５mM〜３０mM、好ましくは約１０mM〜３０mM、好ましくは約１５mM〜３０mM、好ましくは約２０mM〜３０mM、好ましくは約２５mM〜３０mM、好ましくは約５mM〜２５mM、好ましくは約１０mM〜２５mM、好ましくは約１５mM〜２５mM、好ましくは約２０mM〜２５mM、好ましくは約５mM〜２０mM、好ましくは約１０mM〜１５mMであり、非限定的例として、緩衝液の濃度は約１０mM、１２mM、１４mM、１６mM、１８mM、２０mM、２２mM、２４mM、２６mM、２８mMまたは３０mM、最も好ましくは１０mMである。
【００１４】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれる緩衝液のｐＨ値は約５.０〜７.５、好ましくは約５.５〜７.５、好ましくは約６.０〜７.５、好ましくは約６.５〜７.５、好ましくは約７.０〜７.５、好ましくは約５.０〜７.０、好ましくは約５.５〜７.０、好ましくは約６.０〜７.０、好ましくは約６.５〜７.０、好ましくは約５.０〜６.５、好ましくは約５.５〜６.５、好ましくは約６.０〜６.５、好ましくは約５.０〜６.０、好ましくは約５.５〜６.０、好ましくは約５.０〜５.５である。非限定的例として、緩衝液のｐＨ値はあるいは約５.０、５.１、５.２、５.３、５.４、５.５、５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、より好ましくは約５.５〜６.０、なおさらに好ましくは５.５または６.０である。
【００１５】
さらに、別の実施態様において、医薬組成物は、糖類および界面活性剤の１以上から選択されるアジュバントをさらに含む。
【００１６】
別の実施態様において、糖類は二糖、好ましくはトレハロース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール、より好ましくはスクロースである。別の実施態様において、医薬組成物に含まれる糖類の濃度は、約３０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜９０mg／ml、３５mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約５５mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約６５mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約７０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約７５mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約８０mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約８５mg／ml〜９０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約５５mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約６５mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約７０mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約７５mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約８０mg／ml〜８５mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約５５mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約６５mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約７０mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約７５mg／ml〜８０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約５５mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約６５mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約７０mg／ml〜７５mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約５５mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約６５mg／ml〜７０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜６５mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜６５mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜６５mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜６５mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜６５mg／ml、好ましくは約５５mg／ml〜６５mg／ml、好ましくは約６０mg／ml〜６５mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約５５mg／ml〜６０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜５５mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜５５mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜５５mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜５５mg／ml、好ましくは約５０mg／ml〜５５mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは約４５mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜４５mg／ml、好ましくは約３５mg／ml〜４５mg／ml、好ましくは約４０mg／ml〜４５mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜４０mg���ml、好ましくは約３５mg／ml〜４０mg／ml、好ましくは約３０mg／ml〜３５mg／mlであり、非限定的例として、医薬組成物に含まれる糖類の濃度は約６０mg／ml、６５mg／ml、７０mg／ml、７５mg／ml、８０mg／ml、８５mg／mlまたは９０mg／ml、より好ましくは約７０mg／ml〜８０mg／ml、最も好ましくは７５mg／mlである。
【００１７】
別の実施態様において、医薬組成物界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリヒドロキシル炭化水素、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ラウリルスルホン酸ナトリウム、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタイン、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシン、ステアリル−サルコシン、リノレイル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−ベタイン、コカアミドプロピル−ベタイン、リノールアミドプロピル−ベタイン、ミリストアミドプロピル−ベタイン、パルミトイルプロピル−ベタイン、イソステアロアミドプロピル−ベタイン、ミリストアミドプロピル−ジメチルアミン、パルミトイルプロピル−ジメチルアミン、イソステアロアミドプロピル−ジメチルアミン、ナトリウムメチルココアシル、ナトリウムメチルオレイルタウリン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンおよびプロピレングリコールのコポリマーなどからなる群から選択され得る。好ましい界面活性剤はポリソルベート８０またはポリソルベート２０、より好ましくはポリソルベート８０である。
【００１８】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれる界面活性剤の濃度は、約０.０２mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは約０.１mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは約０.２mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは約０.３mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは約０.４mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは約０.５mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは約０.６mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは約０.７mg／ml〜０.８mg／ml、好ましくは約０.０２mg／ml〜０.７mg／ml、好ましくは約０.１mg／ml〜０.７mg／ml、好ましくは約０.２mg／ml〜０.７mg／ml、好ましくは約０.３mg／ml〜０.７mg／ml、好ましくは約０.４mg／ml〜０.７mg／ml、好ましくは約０.５mg／ml〜０.７mg／ml、好ましくは約０.６mg／ml〜０.７mg／ml、好ましくは約０.０２mg／ml〜０.６mg／ml、好ましくは約０.１mg／ml〜０.６mg／ml、好ましくは約０.２mg／ml〜０.６mg／ml、好ましくは約０.３mg／ml〜０.６mg／ml、好ましくは約０.４mg／ml〜０.６mg／ml、好ましくは約０.５mg／ml〜０.６mg／ml、好ましくは約０.０２mg／ml〜０.５mg／ml、好ましくは約０.１mg／ml〜０.５mg／ml、好ましくは約０.２mg／ml〜０.５mg／ml、好ましくは約０.３mg／ml〜０.５mg／ml、好ましくは約０.４mg／ml〜０.５mg／ml、好ましくは約０.０２mg／ml〜０.４mg／ml、好ましくは約０.１mg／ml〜０.４mg／ml、好ましくは約０.２mg／ml〜０.４mg／ml、好ましくは約０.３mg／ml〜０.４mg／ml、好ましくは約０.０２mg／ml〜０.３mg／ml、好ましくは約０.１mg／ml〜０.３mg／ml、好ましくは約０.２mg／ml〜０.３mg／ml、好ましくは約０.０２mg／ml〜０.２mg／ml、好ましくは約０.１mg／ml〜０.２mg／ml、好ましくは約０.０２mg／ml〜０.１mg／mlである。非限定的例として、医薬組成物に含まれる界面活性剤の濃度は約０.２mg／ml、０.２５mg／ml、０.３mg／ml、０.３５mg／ml、０.４mg／ml、０.４５mg／mlまたは０.５mg／ml、より好ましくは約０.３mg／ml〜０.５mg／mlである。
【００１９】
ある実施態様において、医薬組成物は下記ｉ)またはii)の成分を含む。
ｉ)(ａ)１mg／ml〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５mM〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.０２mg／ml〜０.８mg／ml  ポリソルベート８０；好ましくは、医薬組成物は：
(ｅ)４０mg／ml〜８０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｆ)１０mM〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.２〜５.８、(ｇ)７０mg／ml〜８０mg／ml  スクロースおよび(ｈ)０.４mg／ml〜０.５mg／ml  ポリソルベート８０を含む；または
ii)(ａ)１mg／ml〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５mM〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｄ)０.０５mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０を含む；好ましくは、医薬組成物は；
(ｅ)４５mg／ml〜６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｆ)１０mM〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.５〜６.０、(ｇ)６０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースおよび(ｈ)０.２mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００２０】
ある実施態様において、医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に示す重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；およびそれぞれ配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に示す軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。
【００２１】
別の実施態様において、医薬組成物は：
(ａ)１mg／ml〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５mM〜３０mM酢酸緩衝液、好ましくはｐＨは５.０〜６.５、(ｃ)３０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.０２mg／ml〜０.８mg／ml  ポリソルベート８０
を含む。
【００２２】
別の実施態様において、医薬組成物は：
(ａ)４０mg／ml〜８０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０mM〜３０mM酢酸緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.０、(ｃ)６０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.１mg／ml〜０.５mg／ml  ポリソルベート８０
を含む。
【００２３】
別の実施態様において、医薬組成物は：
(ａ)５０mg／ml〜６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０mM〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液およびｐＨは約５.２〜５.８、(ｃ)７０mg〜８０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.４mg／ml〜０.５mg／ml  ポリソルベート８０
を含む。
【００２４】
別の実施態様において、医薬組成物は：
(ａ)約５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.５、(ｃ)約７５mg／ml  スクロースおよび(ｄ)約０.４mg／ml  ポリソルベート８０
を含む。
【００２５】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体またはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメント、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００２６】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるマウスＬＡＧ−３抗体は、配列番号５に示す重鎖可変領域および配列番号６に示す軽鎖可変領域を含む。
【００２７】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるヒト化ＬＡＧ−３抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５の何れかに示すとおりであるかまたはそれと少なくとも８５％配列同一性を有する；そして
軽鎖可変領域は配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の何れかに示すとおりであるかまたはそれと少なくとも８５％配列同一性を有する。
【００２８】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有し、ＬＡＧ−３抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５に示す重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【００２９】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３ヒト化抗体は、次に示す群から選択される重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせを含む：
１)配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
２)配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
３)配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
４)配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
５)配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
６)配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
７)配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
８)配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
９)配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
１０)配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
１１)配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
１２)配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
１３)配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
１４)配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
１５)配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；および
１６)配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域。
【００３０】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるヒト化ＬＡＧ−３抗体は重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み、ここで、重鎖定常領域は好ましくは配列番号３８に示され、軽鎖定常領域は好ましくは配列番号３９に示される。
【００３１】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるヒト化ＬＡＧ−３抗体の重鎖は配列番号４０に記載されるまたは配列番号４０と少なくとも９５％配列同一性を有し、軽鎖は配列番号４１に記載されるまたは配列番号４１と少なくとも９５％配列同一性を有する。
【００３２】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体の重鎖は、配列番号４０に示す重鎖アミノ酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有し、ＬＡＧ−３抗体の軽鎖アミノ酸配列は配列番号４１に示す抗体軽鎖と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【００３３】
ある実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３および１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５を含む。
【００３４】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３および１０mM  コハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０を含む。
【００３５】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３および１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.０を含む。
【００３６】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０mM  コハク酸−コハク酸ナトリウム、ｐＨ６.０および０.１mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００３７】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０mM  コハク酸−コハク酸ナトリウム、ｐＨ６.０および７０mg／ml  スクロースを含む。
【００３８】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、６０mg／ml  スクロースおよび０.４mg／mL  ポリソルベート８０を含む。
【００３９】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０mM  ヒスチジン−酢酸、ｐＨ６.０、６０mg／ml  スクロースおよび０.４mg／mL  ポリソルベート８０を含む。
【００４０】
ある実施態様において、医薬組成物は１mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０〜３０mM  ヒスチジン−酢酸、ｐＨ５.５、７５mg／ml  スクロースおよび０.２mg／mL  ポリソルベート８０を含む。
【００４１】
さらに別の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム、ｐＨ５.２〜５.８、７５mg／ml  スクロースおよび０.２mg／mL  ポリソルベート８０を含む。
【００４２】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、６０mg／ml  スクロースおよび０.４mg／mL  ポリソルベート８０を含む。
【００４３】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０−６０mg／ml  ＬＡ−Ｇ３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、３０〜９０mg／ml  スクロースおよび０.４〜０.５mg／mL  ポリソルベート８０を含む。
【００４４】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、７５mg／ml  スクロースおよび０.４mg／mL  ポリソルベート８０を含む。
【００４５】
他の実施態様において、医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントはそれぞれ配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；およびそれぞれ配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。
【００４６】
別の実施態様において、医薬組成物は：
(ａ)１mg／ml〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５mM〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０mg／ml〜９０mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｄ)０.０５mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０
を含む。
【００４７】
別の実施態様において、医薬組成物は：
(ａ)４５mg／ml〜６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)約１０mM〜３０mMのヒスチジン−塩酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.０、(ｃ)６０mg〜９０mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｄ)０.２mg／ml〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０
を含む。
【００４８】
別の実施態様において、医薬組成物は：
(ａ)約５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.０、(ｃ)約７５mg／ml  スクロースまたはトレハロースおよび(ｄ)約０.３mg／ml  ポリソルベート８０
を含む。
【００４９】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントはマウス抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはヒト化抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
【００５０】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるマウスＬＡＧ−３抗体は、配列番号７に示す重鎖可変領域および配列番号８に示す軽鎖可変領域を含む。
【００５１】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるヒト化ＬＡＧ−３抗体は：
配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３の一つまたはそれと少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される重鎖可変領域配列および配列番号３０、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７の一つまたはそれと少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される軽鎖可変領域配列
を含む。
【００５２】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体の軽鎖可変領域は配列番号３０、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有し、ＬＡＧ−３抗体の重鎖可変領域は配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３に示す重鎖可変領域と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【００５３】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるヒト化ＬＡＧ−３抗体は、次に示す群から選択される重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせを含む：
１)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
２)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
３)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
４)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
５)配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
６)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
７)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
８)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
９)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
１０)配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
１１)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
１２)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
１３)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
１４)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
１５)配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
１６)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
１７)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
１８)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
１９)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；および
２０)配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域。
【００５４】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるキメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖は、さらにヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来の重鎖定常領域またはそのバリアントを含み、好ましくはヒトＩｇＧ４由来の重鎖定常領域またはそのバリアントを含み、最も好ましくは配列番号３８に示す重鎖定常領域からなり；そしてキメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖はヒトκ、λ鎖由来の軽鎖定常領域またはそのバリアントを含み、好ましくは配列番号３９に示す軽鎖定常領域からなる。
【００５５】
別の実施態様において、上記医薬組成物に含まれるヒト化ＬＡＧ−３抗体の重鎖は配列番号４２に示すまたはそれと少なくとも９５％配列同一性を有し、軽鎖は配列番号４３に示すまたはそれと少なくとも９５％配列同一性を有する。
【００５６】
別の実施態様において、医薬組成物に含まれるＬＡＧ−３抗体の重鎖は、配列番号４２に示す重鎖アミノ酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有し、ＬＡＧ−３抗体の軽鎖アミノ酸配列は配列番号４３に示す抗体軽鎖と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【００５７】
ある実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡ−Ｇ３抗体Ｈｕ３０３−００５および１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.０を含む。
【００５８】
ある実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５および１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ５.０を含む。
【００５９】
ある実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５および１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.５を含む。
【００６０】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５および１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５を含む。
【００６１】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５、７５mg／ml  スクロースおよび０.２mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００６２】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５、７５mg／ml  トレハロースおよび０.２mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００６３】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５および０.４mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００６４】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.０、７５mg／ml  スクロースおよび０.４mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００６５】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.５、７５mg／ml  スクロースおよび０.４mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００６６】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ５.５、７５mg／ml  スクロースおよび０.４mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００６７】
ある実施態様において、医薬組成物は４５−６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ５.５、７５mg／ml  スクロースおよび０.２−０.６mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００６８】
さらに他の実施態様において、医薬組成物は約５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、約１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、約ｐＨ６.０、約７５mg／ml  スクロースおよび約０.３mg／ml  ポリソルベート８０を含む。
【００６９】
本発明はまた、ＬＡＧ−３抗体または抗原結合フラグメントと薬学的に許容される添加物を混合することを含む、ＬＡＧ−３抗体を含む医薬組成物の製造方法も提供する。
【００７０】
本発明はまた上記医薬組成物を凍結乾燥する工程を含む、ＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。
【００７１】
ＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤を製造する方法の別の実施態様において、凍結乾燥は、前凍結、一次乾燥および二次乾燥の工程を含む。
【００７２】
ＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤を製造する方法の別の実施態様において、一次乾燥は、−５℃乃至−２０℃、好ましくは−１０℃の温度で実施される。
【００７３】
本発明はまた、ＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤の前記製造方法により製造されたＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤を提供する。
【００７４】
ある実施態様において、凍結乾燥製剤は、その安定性を２〜８℃で少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月または少なくとも２４か月維持する。ある実施態様において、凍結乾燥製剤は、その安定性を４０℃で少なくとも７日、少なくとも１４日または少なくとも２８日維持する。
【００７５】
本発明はまた、上記凍結乾燥方法により製造したＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤を提供する。
【００７６】
本発明はまた、凍結乾燥製剤が上記医薬組成物を得るために再構成され得ることを特徴とする、ＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤を提供する。
【００７７】
本発明はまた、上記凍結乾燥製剤を再構成する工程を含む、ＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤から再構成された溶液を調製する方法であって、ここで、再構成のための溶媒が、注射用水、生理食塩水またはグルコース溶液から選択されるが、これらに限定されない方法を提供する。
【００７８】
本発明はまた、ＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤から再構成溶液を調製する方法により製造される、ＬＡＧ−３抗体を含む凍結乾燥製剤から得られる再構成溶液を提供する。
【００７９】
本発明はまたＬＡＧ−３抗体を含む再構成溶液も提供し、これは、次の成分をさらに含む：
(ａ)１〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０〜９０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.０２〜０.８mg／ml  ポリソルベート８０。
【００８０】
本発明はまたＬＡＧ−３抗体を含む再構成溶液も提供し、これは、次の成分をさらに含む：
(ａ)４０〜８０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.２〜５.８、(ｃ)７０〜８０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.４〜０.５mg／ml  ポリソルベート８０。
【００８１】
本発明はまたＬＡＧ−３抗体を含む再構成溶液も提供し、これは、次の成分をさらに含む：
(ａ)５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨは約５.５、(ｃ)７５mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.４mg／ml  ポリソルベート８０。
【００８２】
(ａ)１〜９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)５〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.０〜６.５、(ｃ)３０〜９０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.０５〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０。
【００８３】
本発明はまたＬＡＧ−３抗体を含む再構成溶液も提供し、これは、次の成分をさらに含む：
(ａ)４５〜６０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０〜３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約５.５〜６.０、(ｃ)６０〜８０mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.２〜０.６mg／ml  ポリソルベート８０。
【００８４】
本発明はまたＬＡＧ−３抗体を含む再構成溶液も提供し、これは、次の成分をさらに含む：
(ａ)５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、(ｂ)１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨは約６.０、(ｃ)７５mg／ml  スクロースおよび(ｄ)０.３mg／ml  ポリソルベート８０。
【００８５】
本発明は、さらにここに記載する安定な医薬組成物の何れかを含む容器を含む、製品またはキットを提供する。ある実施態様において、バイアルは中性硼珪酸ガラス製の注射用バイアルである。
【００８６】
本発明の上記医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液は、医薬として使用され得る。
【００８７】
本発明はまた、ＬＡＧ−３と関連する疾患または状態の処置用医薬の製造のための上記医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液の使用であって、ここで、疾患または状態は病原性Ｔ細胞が関与する疾患または状態、好ましくは癌である使用を提供する。癌は、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、腸癌、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌ならびに骨髄腫および慢性および急性白血病を含む血液系腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
本発明はまた処置を必要とする対象に治療有効量の上記医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液を投与することを含む、ＬＡＧ−３と関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、ここで、疾患または状態は病原性Ｔ細胞が関与する疾患または状態、好ましくは癌である、方法を提供する。癌は、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、腸癌、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌ならびに骨髄腫および慢性および急性白血病を含む血液系腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明はまた、上記医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液を含む容器を含む製品を提供する。
【００９０】
当業者に周知のとおり、本明細書に記載する種々の実施態様の特性の一つ、一部またはすべてを、組み合わせて、本発明のさらなる実施態様を形成できる本発明の。上記実施態様および組み合わせにより得られる他の実施態様を、次の詳細な記載によりさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ヒト化抗ＬＡＧ−３抗体は、ＳＥＢにより活性化されたＴリンパ球からのＩＬ−２サイトカイン分泌を増強する。結果は、ヒト化ＬＡＧ−３抗体候補、Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５が活性化Ｔリンパ球からのサイトカインＩＬ−２の分泌を異なる程度で増強でき、薬物濃度に対して用量−効果依存性を示す。
【００９２】
【図２】Ｕ−８７ＭＧ腫瘍担持マウスにおける腫瘍体積に対するヒト化抗ＬＡＧ−３抗体の効果。結果は、投与１４日目、ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３  ６mpkおよびＨｕ３０３−００５  ６mpkは腫瘍阻害に一定効果を有し、腫瘍阻害率はそれぞれ２７.２５％(ｐ＜０.０５)および３４.９４％(ｐ＜０.０１)であり、対照群と比較して有意差があった(ｐ＜０.００１対ｈＩＧｇ)ことを示す。
【００９３】
【図３】４０℃で抗体Ｈｕ２２９−０１３のＣＥ純度を示す傾向図。
【００９４】
【図４】４０℃で抗体Ｈｕ２２９−０１３のＩＥＣ中性ピークを示す傾向図。
【００９５】
【図５】４０℃で抗体Ｈｕ３０３−００５の非還元ＣＥを示す傾向図。
【００９６】
【図６】４０℃で抗体Ｈｕ３０３−００５のｉＣＥ主ピークを示す傾向図。
【００９７】
【図７】Ｈｕ３０３−００５の振盪ＳＥＣ結果を示す傾向図。
【００９８】
【図８】０℃での抗体Ｈｕ３０３−００５のＩＥＣと４０℃でのそのＩＥＣの差値を示すフィッティング結果。
【００９９】
【図９】０℃での抗体Ｈｕ３０３−００５のＣＥ純度と４０℃でのそのＣＥ純度の差値を示す。
【０１００】
【図１０】２５℃および４０℃での抗体Ｈｕ３０３−００５製剤のｉＣＥ／ＣＥ／ＤＬＳを示すフィッティング結果。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
用語
本発明がより容易に理解されるように、ある技術的および科学的用語を下に具体的に定義する。本明細書で異なって特別に定義されない限り、ここで使用するその他のすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１０２】
「緩衝液」は、その共役酸−塩基成分によりｐＨ変化に耐性である、緩衝液をいう。適切な範囲にｐＨを制御する緩衝液の例は、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グリシルグリシンおよび他の有機酸緩衝液を含む。
【０１０３】
「ヒスチジン緩衝液」は、ヒスチジンイオンを含む緩衝液をいう。ヒスチジン緩衝液の例は、ヒスチジン−塩酸緩衝液、ヒスチジン−酢酸緩衝液、ヒスチジン−リン酸緩衝液、ヒスチジン−硫酸緩衝液など、好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液を含む。ヒスチジン−塩酸緩衝液はヒスチジンと塩酸またはヒスチジンと塩酸ヒスチジンにより製造される。
【０１０４】
「クエン酸緩衝液」は、クエン酸イオンを含む緩衝液をいう。クエン酸緩衝液の例は、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸カリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸カルシウム緩衝液、クエン酸−クエン酸マグネシウム緩衝液などを含む。好ましいクエン酸緩衝液はクエン酸−クエン酸ナトリウムである。
【０１０５】
「コハク酸緩衝液」は、コハク酸イオンを含む緩衝液をいう。コハク酸緩衝液の例は、コハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−コハク酸カリウム緩衝液、コハク酸−コハク酸カルシウム緩衝液などを含む。好ましいコハク酸緩衝液はコハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液である。
【０１０６】
「リン酸緩衝液」は、リン酸イオンを含む緩衝液をいう。リン酸緩衝液の例は、リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液およびリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素カリウム緩衝液などを含む。好ましいリン酸緩衝液はリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液である。
【０１０７】
「酢酸緩衝液」は、酢酸イオンを含む緩衝液をいう。酢酸緩衝液の例は、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸−ヒスチジン緩衝液、酢酸−酢酸カリウム緩衝液、酢酸−酢酸カルシウム緩衝液、酢酸−酢酸マグネシウム緩衝液などを含む。好ましい酢酸緩衝液は酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液である。
【０１０８】
「Ｔｒｉｓ緩衝液」は、Ｔｒｉｓ塩基、Trizma、Trisamine、ＴＨＡＭ、トロメタミンおよびトロメタモールとしても知られるトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを含む、緩衝溶液をいう。Ｔｒｉｓ緩衝液の有効な緩衝範囲はｐＨ７.０〜９.２であり、Ｔｒｉｓ塩基水溶液のｐＨは約１０.５である。一般に、該ｐＨを有する緩衝液を得るために、ｐＨを所望の値に調節するために塩酸が加えられる。
【０１０９】
本発明の「糖類」は、慣用の組成物(ＣＨ２Ｏ)ｎおよびその誘導体を含み、単糖、二糖、三糖類、多糖、糖類アルコール、還元糖類、非還元糖類などを含む。グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセロール、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、シリトール、ソルビトール、マンニトール、メリジオース、メレジトース、メリトリオース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルトース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソ−マルトースなどからなる群から選択され得る。好ましくは、糖類は非還元二糖、より好ましくはスクロースである。
【０１１０】
「粘性修飾剤」は、製剤の粘性を調節するために加えられる、慣用の医薬物質である。ここでいう粘性修飾剤は、主に無機塩およびアミノ酸塩をいい、ここで、無機塩は好ましくは塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよび酢酸カルシウムからなる群から選択され、アミノ酸塩は好ましくは塩酸アルギニン、塩酸ヒスチジン、塩酸グリシンおよび酢酸ヒスチジンなどからなる群から選択される。
【０１１１】
「医薬組成物」は、１以上のここに記載する化合物またはその生理学／薬学的に許容される塩またはそのプロドラッグおよび他の化学成分を含む混合物をいい、ここで、他の化学成分は、例えば、生理学／薬学的に許容される担体および添加物である。医薬組成物の目的は、生物への投与を補助し、それは活性成分の吸収を促進し、それにより生物学的活性を発揮する。ここで使用する「医薬組成物」および「製剤」は、相互排他的ではない。
【０１１２】
本発明において、溶液形態の医薬組成物について、特に断らない限り、それに含まる溶媒は水である。
【０１１３】
「凍結乾燥製剤」は、液体形態または溶液形態の医薬組成物または製剤の減圧凍結乾燥により得られる製剤または医薬組成物をいう。
【０１１４】
本発明の凍結乾燥は、前凍結、一次乾燥および二次乾燥を含む。前凍結の目的は、結晶性固体を得るための製品の凍結である。前凍結の温度および速度は、二つの重要なプロセスパラメータである。本発明において、前凍結の温度は−４５℃として設定され、前凍結の速度は１℃／分として設定される。一次乾燥は主乾燥としても知られ、凍結乾燥の主段階である。目的は、製品の形を維持し、製品への損傷を最少化しながら、製品から氷を除くことである。一次凍結の温度および減圧程度が適切でないならば、製品の崩壊が起こる。高温および高減圧は、凍結乾燥の効率を上げるが、同時に製品が崩壊する危険性を高める。本発明の一次乾燥の温度は当分野で慣用の温度、例えば、−３０℃〜０℃であってよい。二次乾燥は分析乾燥としても知られ、最終減圧(０.０１mbar)および昇温(２０〜４０℃)により製品から結合水を除去するための二次工程である。大部分の生物学的製品が温度感受性であるため、二次乾燥の温度は、温度範囲の低い方であるように、すなわち２５℃であるように選択される。凍結乾燥の時間は、冷凍機、凍結乾燥製剤の用量および凍結乾燥剤の容器による。凍結乾燥時間の調整方法は当業者に周知である。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「約」は、当業者により決定される特定の値の許容される誤差範囲内である値であり、これは、一部、数値がどのように測定または決定されるか(すなわち、測定系の限界)に依存する。例えば、「約」は、当分野の各実施で、１または１を超える標準偏差を示し得る。あるいは、「約」または「実質的に含む」は、最大２０％の範囲をいう。例えば、約５.５のｐＨはｐＨ５.５±１.１を意味する。さらに、特に生物学的系または過程について、本用語は、数値の最大一桁または最大５倍をいい得る。特定の値が本明細書および特許請求の範囲で記載されるとき、特に断らない限り、「約」または「実質的に含む」の意味は、その特定の数値について許容される誤差範囲内であると推定すべきである。
【０１１６】
本発明の医薬組成物は、安定な効果を達成でき、抗体は、貯蔵後その物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を実質的に維持でき、好ましくは、医薬組成物は貯蔵後、その物理的安定性、化学的安定性および生物学的活性を実質的に維持する。貯蔵寿命は、一般に医薬組成物の予測される貯蔵寿命に基づき選択される。現在では、一定期間、一定温度で貯蔵した後の安定性を計測できる、タンパク質の安定性を調べる多数の分析方法がある。
【０１１７】
安定な抗体医薬製剤は、次の条件で、顕著な変化が観察されないものである：冷蔵温度(２〜８℃)で少なくとも３か月、好ましくは６か月、より好ましくは１年およびさらにより好ましくは最大２年貯蔵。さらに、安定な液体製剤は、例えば、２５℃の温度で１か月、３か月および６か月の期間または４０℃で１か月貯蔵後、所望の特徴を発揮する、液体製剤を含む。一般に、安定性について許容される基準は次のとおりである：一般に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより評価して、約５％を超えない、好ましくは約５％を超えない抗体モノマーが分解される。医薬抗体製剤は、目視で無色または透明ないし僅かに乳白光性白色である。製剤の濃度、ｐＨおよび浸透圧は±５％を超えて変わらない。一般に、約５％を超えない、好ましくは約５％を超えない短縮物が観察される。一般に、約５％を超えない、好ましくは約５％を超えない凝集が形成される。
【０１１８】
抗体は、色および／または透明性の目視でまたはＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)および動的光散乱(ＤＬＳ)により測定して、凝集、沈殿および／または変性の顕著な増加が示されなければ医薬製剤中で「その物理的安定性を維持する」。タンパク質高次構造変化は、蛍光スペクトロスコピー(タンパク質三次構造を決定する)およびＦＴＩＲスペクトロスコピー(タンパク質二次構造を決定する)により評価され得る。
【０１１９】
抗体は、顕著な化学的改変を示さないならば、医薬製剤で「その化学的安定性を保持する」と考えられる。化学的安定性は、タンパク質の化学的に改変された形態の検出および定量により評価され得る。タンパク質の化学構造をしばしば変える分解過程は、加水分解または短縮化(サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの方法により評価)、酸化(質量分析またはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせたペプチドマッピングなどの方法により評価)、脱アミド化(イオン交換クロマトグラフィー、毛管等電点電気泳動、ペプチドマッピング、イソアスパラギン酸測定などの方法により評価)および異性化(イソアスパラギン酸含量測定、ペプチドマッピングなどの方法により評価)を含む。
【０１２０】
抗体は、ある時点での抗体の生物学的活性が、医薬製剤を調製した時点で示された生物学的活性の予定された範囲内であるならば、医薬製剤で「その生物学的活性を保持する」と考えられる。抗体の生物学的活性は、例えば、抗原結合アッセイにより決定され得る。
【０１２１】
用語「ＬＡＧ−３」は、リンパ球活性化遺伝子−３をいう。用語「ＬＡＧ−３」は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。用語「ヒトＬＡＧ−３」は、Uniprot No. P18627のヒトＬＡＧ−３の完全アミノ酸配列などのヒトＬＡＧ−３の配列をいう。ＬＡＧ−３はまた、例えば、ＣＤ２１５として、当分野で知られる。ヒトＬＡＧ−３配列はUniprot No. P18627のヒトＬＡＧ−３と異なってよく、例えば、ヒトＬＡＧ−３は、保存的変異または非保存領域での変異を有し、Uniprot No. P18627のヒトＬＡＧ−３と実質的に同一の生物学的機能を有する。例えば、ヒトＬＡＧ−３の生物学的機能は、ＬＡＧ−３の細胞外ドメインにおけるエピトープを有する点にあり、当該エピトープはここに開示する抗体と特異的に結合するものであり、あるいはヒトＬＡＧ−３の生物学的機能は、ＭＨＣクラスII分子に結合する点にある。
【０１２２】
特定のヒトＬＡＧ−３配列は、一般にUniprot No. P18627のヒトＬＡＧ−３と少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を有し、他の種(例えば、マウス)からのＬＡＧ−３アミノ酸配列と比較して、ヒトアミノ酸配列であるとして同定されるアミノ酸残基を有する。ある場合、ヒトＬＡＧ−３は、Uniprot No. P18627のＬＡＧ−３と少なくとも８５％または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性であるアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ヒトＬＡＧ−３配列は、Uniprot No. P18627のＬＡＧ−３配列と１０以下のアミノ酸差異を示す。ある実施態様において、ヒトＬＡＧ−３は、Uniprot No. P18627のヒトＬＡＧ−３配列と５以下または４、３、２または１以下のアミノ酸差異を示し得る。パーセント同一性は、ここに記載するとおり決定され得る。
【０１２３】
ここで使用するアミノ酸残基の三文字表記および一文字表記はJ. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968)に記載されている。
【０１２４】
本発明で使用する「抗体」は、２つの同一重鎖と２つの同一軽鎖間の鎖間ジスルフィド結合により一体に接続されたテトラ−ペプチド鎖構造である、免疫グロブリンをいう。
【０１２５】
本発明において、本発明の抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスκ、λ鎖またはそのバリアントを含む軽鎖定常領域をさらに含み得る。
【０１２６】
本発明において、本発明の抗体重鎖は、ヒトまたはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントを含む重鎖定常領域をさらに含み得る。
【０１２７】
抗体重鎖および軽鎖のＮ末端に隣接する約１５アミノ酸配列は高度に可変であり、可変領域(Ｆｖ領域)として知られ、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は比較的安定であり、定常領域として知られる。可変領域は、３つの超可変領域(ＨＶＲ)および４つの比較的保存されたフレームワーク領域(ＦＲ)を含む。抗体の特異亭を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域(ＣＤＲ)としても知られる。各軽鎖可変領域(ＬＣＶＲ)および各重鎖可変領域(ＨＣＶＲ)は３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて次の順番である：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称され、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称する。
【０１２８】
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体を含む。
【０１２９】
本発明における用語「マウス抗体」は、本分野での知識および技術により製造されるＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体をいう。この方法においては、試験対象にＬＡＧ−３抗原を注射し、次いで所望の配列または機能的性質を有する抗体を発現するハイブリドーマが分離される。
【０１３０】
用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域により形成される抗体であり、キメラ抗体は、マウス抗体により誘導される免疫応答を軽減できる。キメラ抗体を構築するために、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを構築し、次いで可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマ細胞からクローン化する。その後、ヒト抗体の定常領域遺伝子が、所望によりクローン化される。マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子とライゲートしてキメラ遺伝子を形成し、これをヒトベクターに挿入でき、最後にキメラ抗体分子は、真核生物または原核生物の生産系で発現される。本発明の好ましい実施態様において、ＬＡＧ−３キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。ＬＡＧ−３キメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。
【０１３１】
用語「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ移植抗体としても知られ、マウスＣＤＲ配列のヒト抗体の可変領域フレームワークへの移植により産生された抗体、すなわち、種々のタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列から製造される抗体をいう。ヒト化抗体は、多くのマウスタンパク質成分を担持するキメラ抗体により誘発される強い抗体応答の欠点を克服する。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列をカバーする公開されたＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から得られ得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース(ウェルのwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseから入手可能)に見ることができ、Kabat, E A, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edに見ることもできる。免疫原性と同時の活性の減少を避けるために、ヒト抗体の可変領域のフレームワーク配列は、活性を維持するために最小の逆変異または戻し変異に付される。本発明のヒト化抗体はまた、ファージディスプレイによりＣＤＲ親和性成熟が実施される、ヒト化抗体も含む。
【０１３２】
本発明における用語「抗ＬＡＧ−３抗体」、「抗ＬＡＧ−３」、「ＬＡＧ−３抗体」および「ＬＡＧ−３に結合する抗体」は、抗体がＬＡＧ−３を標的とする診断剤および／または治療剤として使用できるように、十分な親和性でＬＡＧ−３と結合できる抗体をいう。
【０１３３】
本発明における用語「ＬＡＧ−３に結合」は、ヒトＬＡＧ−３と相互作用可能であることをいう。
【０１３４】
用語「特異的に結合」は、競合的ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)アッセイまたはＫＩＮＥＸＡ(登録商標)アッセイなどの当分野で利用可能な技術により決定される。例えば、本用語はまた本発明の抗体の抗原結合ドメインが、多くの抗原に担持される特定のエピトープに特異的である場合にも適用される。このような場合、抗原結合ドメインを担持する抗体は、このようなエピトープを担持する多様な抗原に特異的に結合する。
【０１３５】
用語「競合的結合」は、本発明の抗体が認識するのと同じヒトＬＡＧ−３細胞外領域エピトープ(抗原決定基とも称する)またはその一部を認識し、該抗原に結合する抗体抗原をいう。本発明のモノクローナル抗体が認識するのと同じエピトープに結合する抗体は、本発明のモノクローナル抗体により認識されるヒトＬＡＧ−３のアミノ酸配列を認識し、結合する抗体をいう。
【０１３６】
用語「ＫＤ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数をいう。一般に、本発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置で表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)技術を使用して決定して、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低い解離平衡定数(ＫＤ)でＬＡＧ−３に結合する。
【０１３７】
本発明において記載する「抗原結合フラグメント」は、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ(ａｂ’)２フラグメントならびにヒトＬＡＧ−３に結合するｓｃＦｖフラグメントおよび抗ＬＡＧ−３抗体ＶＨおよびＶＬにより形成されるヒトＬＡＧ−３に結合できる他のフラグメントを含み、それは、配列番号９、１０、１１、１５、１６、１７および１２、１３、１４、１８、１９および２０からなる群から選択される、本明細書に記載の抗体の１以上のＣＤＲ領域を含む。Ｆｖフラグメントは、定常領域を伴わずに重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、全抗原結合部位を有する最小抗体フラグメントである。一般に、Ｆｖ抗体は、ＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、抗原結合に必要な構造を形成できる。また、異なるリンカーを使用して、ポリペプチド鎖を形成するように２つの抗体の可変領域を連結でき、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)と称される。
【０１３８】
用語「エピトープ」は、１以上の抗体により認識および結合され得る、抗原に位置する部位をいう。
【０１３９】
「保存的修飾」または「保存的置き換えまたは置換」は、タンパク質のアミノ酸の、しばしばタンパク質の生物学的活性を変えることなく変更できる、類似特徴(例えば荷電、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖高次構造および硬直性など)を有する他のアミノ酸への置換をいう。本分野の当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域の一アミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変えないことを認識する(例えば、Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)参照)。さらに、構造的にまたは機能的に類似するアミノ酸への置換は、生物学的活性を妨害する可能性が低い。
【０１４０】
「アミノ酸同一性」は、２タンパク質間または２ポリペプチド間の配列類似性をいう。比較する２配列の両者におけるある位置が同じアミノ酸残基で占拠されていたら、例えば、２ポリペプチドの各々におけるある位置が同一アミノ酸残基で占拠されたいたら、これら分子は、その位置で同一である。パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性の決定に適するアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２.０アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-45およびAltschul et al., (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、National Center of Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/)で一般に入手可能である。
【０１４１】
抗体および抗原結合フラグメントを製造および精製する方法は当分野で周知であり、例えば、Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15に見ることができる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、１以上のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)の非ヒト由来ＣＤＲ領域への導入により遺伝子改変される。ヒトＦＲ生殖系列配列は、ＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖系列遺伝子データベースと比較することにより、およびウェブサイトhttp://imgt.cines.frImMunoGeneTics(IMGT)からまたはThe Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351からＭＯＥソフトウェアを使用して、得ることができる。
【０１４２】
本発明の改変抗体または抗原結合フラグメントは、慣用法により製造および精製され得る。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローン化し、ＧＳ発現ベクターに組み換えることができる。次いで、組み換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトされ得る。より推奨される当分野で周知の組み換え方法として、哺乳動物発現系は、一般にＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端で、抗体のグリコシル化をもたらすであろう。安定なクローンを、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する抗体の発現により得ることができる。陽性クローンを、バイオリアクターでの抗体産生のために無血清培養培地で拡大できる。抗体が分泌されている培養培地を、慣用技術により精製し得る。例えば、精製は、調整緩衝液で平衡化されているプロテインＡまたはＧセファロースＦＦカラムで好都合に実施され得る。カラムを洗浄して、非特異的に結合する成分を除去し得る。結合抗体をｐＨ勾配により溶出し、抗体フラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出し、次いで回収する。抗体を、一般的技術を使用して、濾過および濃縮できる。可溶性混合物および多量体も、分子篩またはイオン交換を含む一般的技術により効率的に除去できる。得られた生産物を、直ぐに、例えば−７０℃で凍結してよくまたは凍結乾燥してよい。
【０１４３】
「投与」および「処置」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器または生物学的流体に適応されるとき、外因性医薬、治療剤、診断剤または組成物と動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器または生物学的溶液との接触をいう。「投与」および「処置」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究および実験方法をいい得る。細胞の処置は、薬剤と細胞の接触、ならびに薬剤と溶液との接触を含み、ここで、該溶液は細胞と接触している。「投与」および「処置」はまた、例えば、細胞の、薬剤、診断、結合化合物または他の細胞による、インビトロおよびエクスビボ処置も意味する。「処置」は、ヒト、動物または研究対象に適用されるならば、治療処置、予防または防止手段、研究および診断適用をいう。
【０１４４】
「処置」は、本発明の結合化合物の何れかを含む組成物などの治療剤の、該薬剤が治療剤活性を有することが知られる１以上の疾患症状を有する患者への内的または外的投与を含む。一般に、治療剤は、処置患者または集団における１以上の疾患症状の軽減に有効な量で、そのような症状の何らかの臨床的に測定可能な程度までの退行または進行阻止を誘発するように、投与される。何らかの特定の疾患症状の軽減に有効な治療剤の量(「治療有効量」とも称される)は、疾患状態、患者の年齢および体重、健康状態、行動、患者の食習慣、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物組み合わせ等々および薬物が患者で所望の応答を発揮する能力などの因子により変わり得る。疾患症状が軽減されているか否かは、医師または他の熟練した医療従事者が、その症状の重症度または進行状態を評価するのに一般に使用する何らかの臨床的測定により評価される。本発明の実施態様(例えば、処置方法または製造品)は、目的の各疾患症状の軽減に有効でないこともあり得るが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーのＵ検定、クラスカル・ウォリス検定(Ｈ検定)、ヨンクヒール・タプストラ検定およびウィルコクソン検定の同分野で知られる何らかの統計学的検定により決定して、統計学的に有意な数の患者で、目的の標的疾患症状を軽減する。
【０１４５】
「有効量」は、医学的状態の症状または徴候の回復または予防に十分な量も意味する。有効量はまた、診断を可能とするまたは容易にするのに十分な量も意味する。特定の患者または獣医対象の有効量は、処置する状態、患者の一般的健康状態、投与経路および用量ならびに副作用の重症度などの因子により変わり得る。有効量は、顕著な副作用または毒性効果を避ける、最大用量または投与プロトコールであり得る。
【０１４６】
「Ｔｍ値」は、タンパク質の熱変性温度、すなわち、タンパク質の半分が折りたたみが解除され、タンパク質の空間的構造が破壊される温度をいう。それ故に、Ｔｍ値が高いほど、タンパク質の熱安定性は高い。
【０１４７】
発明の詳細な記載
本発明は、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、酢酸緩衝液またはヒスチジン塩、スクロースおよびポリソルベート８０を含む安定な医薬組成物(製剤)を提供し、医薬組成物(製剤)は投与により適する。
【実施例】
【０１４８】
本発明を次の実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明目的でのみ提供し、本発明の範囲を制限する意図はない。
【０１４９】
本発明の実施例において、特定の条件が記載されていないならば、実験は、一般に慣用の条件下でまたは物質または製品の製造業者により提案される条件下で実施される。試薬の供給源が具体的に記載されていないとき、試薬は市販されている常用試薬である。
【０１５０】
実施例１. ＬＡＧ−３抗原および抗体の製造
１. タンパク質設計および発現
UniProtリンパ球活性化遺伝子３タンパク質(ヒトＬＡＧ−３、UniProt: P18627)をここでＬＡＧ−３の鋳型として使用し、抗原および検出に使用するタンパク質のアミノ酸配列を設計し、所望によりＬＡＧ−３タンパク質に種々の標識を融合させ、次いでｐＨｒベクター(社内製造)またはｐＴＴ５ベクター(Biovector, Cat#: 102762)またはｐ標的ベクター(Promega, A1410)と融合させた。本発明の抗原タンパク質および検出タンパク質は２９３細胞で一過性に発現されまたはＣＨＯ−Ｓで安定に発現され、精製され、得られた。次のＬＡＧ−３抗原を、特に断らない限り、ヒトＬＡＧ−３という。
【０１５１】
Ｆｌａｇ標識を伴うＬＡＧ−３細胞外ドメイン：マウスの免疫化に使用、ＬＡＧ−３−Ｆｌａｇ。
【化１】
2021506922.tif 000002
配列番号１
注：下線部分はシグナルペプチドを表し、斜体部分はＦｌａｇ標識配列を表す。
【０１５２】
完全長のＬＡＧ−３：マウスの免疫化および検出のため、ＬＡＧ−３過発現細胞株の構築に使用
【化２】
2021506922.tif 000003
配列番号２
【化３】
2021506922.tif 000004
【０１５３】
ＬＡＧ−３細胞外領域とｈＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質：検出用ＬＡＧ−３−Ｆｃ
【化４】
2021506922.tif 000005
配列番号３
注：下線部分はシグナルペプチドを表し、二重下線部分はリンカーを表し、斜体部分はＦｃを表す。
【０１５４】
ＬＡＧ−３細胞外領域とｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃの融合タンパク質：検出のためのＬＡＧ−３−ｍＦｃ
【化５】
2021506922.tif 000006
配列番号４
注：下線部分はシグナルペプチドを表し、二重下線部分はリンカーを表し、斜体部分はｍＦｃを表す。
【０１５５】
２. ＬＡＧ−３関連組み換えタンパク質、ならびにハイブリドーマ抗体および組み換え抗体の精製
１). Ｆｌａｇ標識を伴うＬＡＧ−３−Ｆｌａｇ組み換えタンパク質の精製工程
サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、適切な体積に濃縮した。ｆｌａｇ親和性カラムを.５×ＰＢＳで平衡化し、２〜５カラム体積で洗浄した。細胞により発現された上清を、不純物の除去後カラムに載せた。カラムを、Ａ２８０読み取り値がベースラインまで減少するまで０.５×ＰＢＳで洗浄した。カラムをＰＢＳで洗浄して、不純タンパク質を洗い流し、次いで標的タンパク質を回収した。標的タンパク質を１００mM  グリシン、ｐＨ３.０で溶出し、インビトロでのさらなる活性化および精製のために集めた。
【０１５６】
２). ハイブリドーマ、組み換え抗体およびＦｃ融合タンパク質の精製
細胞により発現された上清を高速で遠心分離して不純物を除去し、ハイブリドーマ発現上清をプロテインＧカラムで精製し、組み換え抗体およびＦｃ融合タンパク質発現上清をプロテインＡカラムで精製した。カラムを、Ａ２８０読み取り値がベースラインまで減少するまでＰＢＳで洗浄した。標的タンパク質を１００mM  酢酸(ｐＨ３.０)で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０で中和した。溶出サンプルを適切に濃縮し、ＰＢＳで平衡化されたゲルクロマトグラフィーSuperdex200(ＧＥ)を使用してさらに精製し、凝縮物を表すピークを除き、サンプルを集め、使用のために等分した。
【０１５７】
実施例２. 抗ヒトＬＡＧ−３ハイブリドーマモノクローナル抗体の製造
１. 免疫化
抗ヒトＬＡＧ−３モノクローナル抗体をマウスの免疫化により製造した。実験ＳＪＬ白色マウス、雌、６週齢(Beijing Charles River Lab Animal Technology Co., Ltd., animal production license number: SCXK (Beijing) 2012-0001)。飼育環境：ＳＰＦレベル。マウス購入後、動物を、１２／１２時間明／暗サイクル、温度２０〜２５℃および湿度４０〜６０％で１週間研究室に維持した。本環境に順化したマウスを、次のスキームにより免疫化した。免疫抗原は、Ｆｌａｇ標識を有するＬＡＧ−３の細胞外領域(配列番号１)であった。
【０１５８】
スキームＡ：マウスをTiterMax(登録商標)Gold Adjuvant(Sigma Cat No: T2684)およびThermo Imject(登録商標)Alum(Thremo Cat No: 77161)で交差免疫した。抗原対アジュバント(TiterMax(登録商標)Gold Adjuvant)比は１：１であり、抗原対アジュバント(Thermo Imject(登録商標)Alum)比は３：１であり、５０μg／マウス(最初の免疫化)および２５μg／マウス(ブースター免疫化)であった。抗原乳化後、マウスに０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目および４２日目に接種した。０日目、マウスに、数か所、５０μg／マウスで乳化抗原を皮下(ｓ.ｃ.)注射した。７日目、マウスに、２５μg／マウスで腹腔内(ｉ.ｐ.)注射した。１４日目、２８日目、３５日目および４２日目、抗原の背面または腹腔内注射を、背面の塊および腹部の腫脹状態により選択した。血液サンプルを２１日目、３５日目、４９日目に集め、マウス血清の抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。７回免疫化後、プラットフォームである傾向のあった高血清抗体力価を有するマウスを脾臓細胞融合のために選択した。ブースター免疫化を、脾臓細胞融合３日前、食塩水で製剤した抗原溶液の５０μg／マウスのｉ.ｐ.注射により、実施した。
【０１５９】
スキームＢ：マウスをQuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)で免疫化した。抗原対アジュバント比は、１：１であり、２５μg／マウス１回(最初の免疫化／ブースター免疫化)であった。抗原およびアジュバントを迅速に混合し、０日目、２１日目および３５日目の接種に使用した。０日目、マウスに抗原を後部腓腹筋(ｉ.ｍ.)に、２５μg／マウスで注射し、２１日目および３５日目、注射を同じ方法で、２５μg／マウスで繰り返した(三回目の免疫化を実施するか否かは、抗体力価による)。血液サンプルを２８日目および４２日目にアルメタ。マウス血清の抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。プラットフォームである傾向のあった高血清抗体力価を有するマウスを脾臓細胞融合のために選択した。ブースター免疫化を、脾臓細胞融合３日前、食塩水で製剤した抗原溶液の５０μg／マウスのｉ.ｐ.注射により、実施した。
【０１６０】
２. 脾臓細胞融合
ハイブリドーマ細胞を、最適化ＰＥＧ介在融合方法を使用することにより、脾臓リンパ球と骨髄腫Ｓｐ２／０細胞(ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＲＬ−８２８７ＴＭ)を融合して得た。得た融合ハイブリドーマ細胞を、完全培地(２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩ含有ＤＭＥＭ培地)に０.５〜１×１０６／ml密度で再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに、１００μl／ウェルで播種した。３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーション後、１００μl／ウェルのＨＡＴ完全培地を補い、３〜４日間培養を維持して針様クローンを形成させた。上清を除去し、２００μl／ウェルのＨＴ完全培地(２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地)を加え、５％ＣＯ２、３７℃で３日間培養し、次いでＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。
【０１６１】
３. ハイブリドーマ細胞スクリーニング
ハイブリドーマ培養上清を、ハイブリドーマ細胞の増殖密度により結合ＥＬＩＳＡで検出した。細胞遮断実験を、結合ＥＬＩＳＡにより検出された陽性ウェルの細胞上清で実施した。結合および遮断実験両者で陽性であった細胞を増殖させ、直ぐに凍結保存し、細胞を、単一細胞クローンが得られるまで２〜３回サブクローン化した。
各サブクローニング方法の後、細胞をＬＡＧ−３結合ＥＬＩＳＡおよび細胞遮断アッセイに付した。ハイブリドーマクローンが上記スクリーニング実験により得られ、抗体をさらに無血清細胞培養方法により調製し、次いで試験実施例において使用するために精製実施例により精製した。
【０１６２】
４. 陽性ハイブリドーマクローンのシーケンシング
陽性ハイブリドーマの配列のクローニング方法は次の通りであった：対数増殖期のハイブリドーマ細胞を集め、製造業者の指示によりＴｒｉｚｏｌ(Invitrogen Cat No. 15596-018)でＲＮＡを抽出し、次いでPrimeScriptTM Reverse Transcriptaseキット(Takara, Cat No. 2680A)で逆転写を実施した。逆転写により得たｃＤＮＡを、マウスIg-Primer Set(Novagen, TB326 Rev.B 0503)を使用するＰＣＲにより増幅し、シーケンシングを、シーケンシング業者により実施した。ハイブリドーマクローンｍＡｂ２２９のＤＮＡ配列に対応する重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、それぞれ配列番号５、６および配列番号７、８に示す。
【０１６３】
ｍＡｂ２２９−ＶＨ
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号５
ｍＡｂ２２９−ＶＬ
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWITPWTFGGGTKLEIK
配列番号６
ｍＡｂ３０３−ＶＨ
EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTLTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTAYNQKFKGKATLTVDKSSNTAYMEINSLTSEDSAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGTGTTVTVSS
配列番号７
ｍＡｂ３０３−ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASLGERVILTCRASQDIGSRLNWLQQGPDGTFKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDFSLTISSLESEDFVDYYCLQLASSPPTFGGGTKLEIK
配列番号８。
【０１６４】
【表１】
2021506922.tif 000007
【０１６５】
得られた陽性クローンを、ヒトＬＡＧ−３への結合についてＥＬＩＳＡアッセイ(タンパク質結合活性のＥＣ５０値の結果は表２に示す)、ヒトＬＡＧ−３過発現ＣＨＯ−ｓ細胞への結合についてＥＬＩＳＡアッセイ(タンパク質結合活性のＥＣ５０値の結果は表２に示す)およびＬＡＧ−３抗原とＤａｕｄｉ細胞の結合の遮断についてのアッセイ(遮断活性のＥＣ５０値の結果は表２に示す)およびヒトＬＡＧ−３タンパク質に対する親和性についてのアッセイ(結果は表３に示す)に付す。
【０１６６】
【表２】
2021506922.tif 000008
【０１６７】
【表３】
2021506922.tif 000009
【０１６８】
表２に示す結果は、ＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３両者が、ヒトＬＡＧ−３タンパク質への優れた結合活性を示したことを示す。ＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３はまたヒトＬＡＧ−３タンパク質のＣＨＯ−Ｓ細胞過発現完全長に優れた結合活性も示した。ＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３両者は、ヒトＬＡＧ−３抗原とＤａｕｄｉ細胞の結合を顕著に遮断した。
表３に示す結果は、本発明のＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に対する強い結合活性および親和性を示したことを示す。
【０１６９】
実施例３. マウス抗ヒトＬＡＧ−３ハイブリドーマモノクローナル抗体ｍＡｂ２２９のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子データベースのＭＯＥソフトウェアに対するアラインメントを介して、ｍＡｂ２２９に対する高相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子を鋳型として選択し、マウス抗体由来ＣＤＲを、対応するヒト源鋳型に移植して、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４順で可変領域配列を形成させた。アミノ酸残基を同定し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによりアノテートした。
【０１７０】
１. ハイブリドーマクローンｍＡｂ２２９のヒト化のためのフレームワーク選択
マウス抗体ｍＡｂ２２９のヒト化のための軽鎖鋳型はＩＧＫＶ１−３９*０１およびｈｊｋ４.１であり、ヒト化のための重鎖鋳型はＩＧＨＶ７−４−１*０１およびｈｊｈ６.１であり、ヒト化可変領域の配列は次のとおりである：
Ｈｕ２２９ＶＨ−ＣＤＲ移植片
【化６】
2021506922.tif 000010
配列番号２１
【化７】
2021506922.tif 000011
配列番号２２
注：順番はＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４であり、斜体配列はＦＲ配列を表し、下線配列はＣＤＲ配列を表す。
【０１７１】
２. ハイブリドーマクローンｍＡｂ２２９のための鋳型選択および復帰変異設計、下記表４参照：
【表４】
2021506922.tif 000012
注：例えば、Ｉ４８Ｖは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる４８位でのＩからＶへの復帰変異を意味する。移植は、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖系列ＦＲ配列にインプラントされたことを示す。
【０１７２】
【表５】
2021506922.tif 000013
注：この表は、種々の変異の種々の配列組み合わせを示す。例えば、Ｈｕ２２９−００５は、２配列変異(軽鎖ＨｕｍＡｂ２２９＿ＶＬ.１Ａおよび重鎖ＨｕｍＡｂ２２９＿ＶＨ.１)がヒト化マウス抗体Ｈｕ２２９−００５に存在し、残りを同じ方法で説明し得ることを示す。
【０１７３】
ヒト化抗体ｍＡｂ２２９の配列は次のとおりである：
Hu229VH.1(Hu229VH-CDR移植片と同一)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS
配列番号２１
Ｈｕ２２９ＶＨ.１Ａ
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVRQAPGQGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS
配列番号２３
Ｈｕ２２９ＶＨ.１Ｂ
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGQGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYYCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS
配列番号２４
Ｈｕ２２９ＶＨ.１Ｃ
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGQGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS
配列番号２５
Ｈｕ２２９ＶＬ.１(Ｈｕ２２９ＶＬ−ＣＤＲ移植片と同一)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK
配列番号２２
Ｈｕ２２９ＶＬ.１Ａ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK
配列番号２６
Ｈｕ２２９ＶＬ.１Ｂ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK
配列番号２７
Ｈｕ２２９ＶＬ.１Ｃ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK
配列番号２８
【０１７４】
実施例４. マウス抗ヒトＬＡＧ−３ハイブリドーマモノクローナル抗体ｍＡｂ３０３のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子データベースのＭＯＥソフトウェアに対するアラインメントを介して、ｍＡｂ３０３に対する高相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子を鋳型として選択し、マウス抗体由来ＣＤＲを、対応するヒト源鋳型に移植して、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４順で可変領域配列を形成させた。アミノ酸残基を同定し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによりアノテートした。
【０１７５】
１. ハイブリドーマクローンｍＡｂ３０３のヒト化のためのフレームワーク選択
マウス抗体ｍＡｂ３０３のヒト化のための軽鎖鋳型はＩＧＫＶ１−３９*０１およびｈｊｋ４.１であり、ヒト化のための重鎖鋳型はＩＧＨＶ１−３*０１およびｈｊｈ６.１であり、ヒト化可変領域の配列は次のとおりである：
Ｈｕ３０３ＶＨ−ＣＤＲ移植片
【化８】
2021506922.tif 000014
配列番号２９
Ｈｕ３０３ＶＬ−ＣＤＲ移植片
【化９】
2021506922.tif 000015
配列番号３０
注：順番はＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４であり、斜体配列はＦＲ配列を表し、下線配列はＣＤＲ配列を表す。
【０１７６】
２. ハイブリドーマクローンｍＡｂ３０３の鋳型選択および復帰変異設計、下記表６参照：
【表６】
2021506922.tif 000016
注：例えば、Ｌ４６Ｒは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる４６位でのＬからＲへの復帰変異を意味する。移植は、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖系列ＦＲ配列にインプラントされたことを示す。
【０１７７】
種々の変異の配列組み合わせは次のとおりである：
【表７】
2021506922.tif 000017
注：この表は、種々の変異の種々の配列組み合わせを示す。例えば、Ｈｕ３０３−００５、２配列変異(軽鎖ＨｕｍＡｂ３０３＿ＶＬ.１Ａおよび重鎖ＨｕｍＡｂ３０３＿ＶＨ.１)がヒト化マウス抗体Ｈｕ３０３−００５に存在し、残りを同じ方法で説明し得ることを示す。
【０１７８】
ヒト化抗体ｍＡｂ３０３の配列は次のとおりである：
Ｈｕ３０３＿ＶＨ.１(Ｈｕ３０３ＶＨ−ＣＤＲ移植片と同一)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWMGVINPYNGDTAYNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSS
配列番号２９
Ｈｕ３０３＿ＶＨ.１Ａ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWMGVINPYNGDTAYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSS
配列番号３１
Ｈｕ３０３＿ＶＨ.１Ｂ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYYMNWVRQAPGQRLEWMGVINPYNGDTAYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSS
配列番号３２
Ｈｕ３０３＿ＶＨ.１Ｃ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYYMNWVRQAPGQRLEWIGVINPYNGDTAYNQKFKGRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSS
配列番号３３
Ｈｕ３０３＿ＶＬ.１(Ｈｕ３０３ＶＬ−ＣＤＲ移植片と同一)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKLLIYATSTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK
配列番号３０
Ｈｕ３０３＿ＶＬ.１Ａ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSTLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK
配列番号３４
Ｈｕ３０３＿ＶＬ.１Ｂ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK
配列番号３５
Ｈｕ３０３＿ＶＬ.１Ｃ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGKAFKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK
配列番号３６
Ｈｕ３０３＿ＶＬ.１Ｄ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSRLNWLQQKPGGAFKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK
配列番号３７
【０１７９】
実施例５. ヒト化抗体の組み換えおよび製造
抗体を、各可変領域と組み合わせたヒト重鎖ＩｇＧ４／軽鎖カッパ由来定常領域で構築し、ＩｇＧ４抗体の安定性を高めるために、ＦｃにＳ２２８Ｐ変異を行った。当分野で知られる他の変異も、その性能を高めるために使用し得る。
【０１８０】
重鎖定常領域：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号３８
軽鎖定常領域：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号３９
Ｈｕ２２９−０１３の重鎖アミノ酸配列：
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGQGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYYCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号４０
Ｈｕ２２９−０１３の軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号４１
Ｈｕ３０３−００５の重鎖アミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWMGVINPYNGDTAYNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号４２
Ｈｕ３０３−００５の軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSTLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号４３
【０１８１】
１. 組み換え抗体の分子クローニング
可変領域コード遺伝子の配列を、ハイブリドーマスクリーニングから得た陽性抗体分子のシーケンシングにより得た。プライマーを得られた配列に従い設計し、シーケンシング遺伝子を鋳型として使用し、種々の抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲにより構築し、次いで相同組み換えにより発現ベクターｐＨｒ(シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ４／ｈカッパ定常領域(ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ)フラグメントと共に)に再構成して、完全長組み換え抗体のための発現プラスミドＶＨ−ＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＬ−ＣＬ−ｐＨｒを構築した。
【０１８２】
２. ヒト化抗体の分子クローニング
設計ヒト化抗体配列をコドン最適化に付し、ヒトコドン優先を有するコード配列を産生した。プライマーを設計し、抗体の種々のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲにより構築し、相同組み換えにより発現ベクターｐＨｒ(シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ４／ｈカッパ定常領域(ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ)フラグメントと共に)で再構成して、完全長ヒト化抗体のための発現プラスミドＶＨ−ＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＬ−ＣＬ−ｐＨｒを構築した。
【０１８３】
３. 組み換、ヒト化抗体の発現および精製
抗体軽鎖および重鎖の別々の発現のためのプラスミドを、１：１.２比でＨＥＫ２９３Ｅ細胞に共トランスフェクトした。発現上清を６日後に集め、不純物を高速遠心分離により除去し、次いでプロテインＡカラムにより精製した。カラムを、Ａ２８０読み取り値がベースラインまで減少するまでＰＢＳで洗浄した。標的タンパク質を酸性溶出緩衝液、ｐＨ３.０〜ｐＨ３.５で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０〜９.０で中和した。溶離剤を適切に濃縮し、ＰＢＳで平衡化されたゲルクロマトグラフィーSuperdex200(ＧＥ)を使用してさらに精製した。凝縮物を表すピークを除き、単一ピークを集め、使用のために等分した。
本発明の抗体の性能および利益を、下記生化学的試験法により検証した。
【０１８４】
実施例６. ＬＡＧ−３抗体のヒトＬＡＧ−３タンパク質への結合についてのＥＬＩＳＡアッセイ
抗ＬＡＧ−３抗体のヒトＬＡＧ−３タンパク質への結合能をＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。ＦｃまたはｍＦｃ標識を有するＬＡＧ−３融合タンパク質を、マイクロタイタープレートに被覆した抗Ｆｃまたは抗ｍＦｃ抗体への結合により９６ウェルマイクロタイタープレートに固定し、抗体添加後のシグナル強度を、抗体のＬＡＧ−３への結合活性の決定に使用し、具体的実験法は次のとおりである。
ヤギ抗ヒトＦｃ抗体(Jackson Immuno Research, Cat No. 109-005-008)またはヤギ抗マウスＦｃ抗体(Sigma, Cat No. M3534-1ML)を、ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液(Sigma, Cat No. P4417-100TAB)で２μg／ml濃度に希釈し、９６ウェルプレートに５０μl／ウェルの体積で加え、次いで、プレートをインキュベーターで３７℃で２時間インキュベートした。液体廃棄後、プレートをＰＢＳ中５％スキムミルク(Bright Dairy、脱脂粉乳)を含む２００μl／ウェルの遮断溶液で遮断し、インキュベーターで３７℃で２.５時間または一夜、４℃で(１６〜１８時間)インキュベートした。遮断後、遮断溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液(０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＨ７.４  ＰＢＳ)で５回洗浄した。ＬＡＧ−３−Ｆｃ融合タンパク質(配列番号３、社内製造)またはＬＡＧ−３−ｍＦｃ融合タンパク質(配列番号４、社内製造)をサンプル希釈剤(１％ＢＳＡ含有ＰＨ７.４  ＰＢＳ)で１μg／mlに希釈し、各ウェルに、５０μl／ウェルで加えた。次いでプレートをインキュベーターで３７℃で１時間または一夜、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、プレートの反応溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、次いでサンプル希釈剤で希釈されている５０μl／ウェルの種々の濃度の試験抗体(ハイブリドーマ精製抗体またはヒト化抗体)と共に加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、インキュベーション後ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＨＲＰで標識し、サンプル希釈剤で希釈した１００μl／ウェルのヤギ抗マウス(Jackson Immuno Research, Cat No. 115-035-003)またはヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003)と共に加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄後、５０μl／ウェルのＴＭＢ色素原基質(ＫPL, Cat No. 52-00-03)を各ウェルに加え、室温で５〜１５分インキュベートし、各ウェルに５０μl／ウェル１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応停止させた。４５０nm波長のＯＤ値をＮＯＶＯＳｔａｒマイクロプレートリーダーで読み、次いでＬＡＧ−３抗体のヒトＬＡＧ−３への結合のＥＣ５０値を計算した。結果は表８に示す。データは、本発明のスクリーニング方法により得た全ヒト化抗体が、ヒトＬＡＧ−３タンパク質への優れた結合活性を示したことを示した。
【０１８５】
【表８】
2021506922.tif 000018
【０１８６】
実施例７. ＬＡＧ−３抗体とヒトＬＡＧ−３過発現ＣＨＯ−Ｓ細胞の結合アッセイ
抗ＬＡＧ−３抗体のＬＡＧ−３タンパク質過発現ＣＨＯ−Ｓ細胞への結合能を結合アッセイにより検出した。完全長ＬＡＧ−３プラスミド(社内製造、配列番号２)をエレクトロポレーションによりＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトし、ＬＡＧ−３の発現レベルを、負荷下の２週間のスクリーニング後検出した。ＬＡＧ−３過発現細胞を９６ウェルプレートの底に固定し、抗体添加後のシグナル強度を、抗体のＬＡＧ−３への結合活性の決定に使用し過発現ＣＨＯ−Ｓ細胞、具体的実験法は次のとおりである。
１００μl／ウェルの細胞を、４×１０５／mlの密度で９６ウェルプレートに播種し、一夜インキュベートした。上清を廃棄し、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、４％ＰＦＡ(１００μl／ウェル)で半時間、室温で固定し、次いでプレートをＰＢＳで３回洗浄した。液体廃棄後、プレートを、ＰＢＳで希釈した５％スキムミルク(Bright Dairy、脱脂粉乳)を含む２００μl／ウェルの遮断溶液で遮断し、３７℃で２.５時間インキュベートした。遮断後、遮断溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液(０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＨ７.４  ＰＢＳ)で５回洗浄し、サンプル希釈剤で希釈されている５０μl／ウェルの種々の濃度の試験抗体(ハイブリドーマ精製抗体またはヒト化抗体)と共に加え、次いでインキュベーターで、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをインキュベート後５回ＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰで標識し、サンプル希釈剤で希釈した１００μl／ウェルのヤギ抗マウス(Jackson Immuno Research, Cat No. 115-035-003)またはヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003)と共に加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄後、５０μlのＴＭＢ色素原基質(KPL, Cat No. 52-00-03)を各ウェルに加え、室温で５〜１５分インキュベートし、反各ウェルに５０μl  １Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応停止させた。４５０nm波長のＯＤ値をＮＯＶＯＳｔａｒマイクロプレートリーダーで読み、次いでＬＡＧ−３抗体のＬＡＧ−３過発現ＣＨＯ−Ｓ細胞への結合のＥＣ５０値を計算した。
【０１８７】
実施例８. ＬＡＧ−３抗原のＤａｕｄｉ細胞への結合遮断における抗ＬＡＧ−３抗体のアッセイ
Ｄａｕｄｉ細胞(ヒト白血病細胞、Chinese Academy of Sciencesの細胞銀行から購入)を、３×１０５／ウェル密度で９６ウェルプレートに播種した。１０００rpmで遠心分離後、上清を廃棄し、次いでプレートを４％ＰＦＡで３０分間、室温で固定した。プレートを、固定溶液排気後ＰＢＳで４回洗浄し、プレートをＰＢＳで希釈した５％スキムミルク(Bright Dairy、脱脂粉乳)を含む２００μl／ウェルの遮断溶液で遮断し、３７℃で２.５時間インキュベートした。遮断後、遮断溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液(０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０含有ｐＨ７.４  ＰＢＳ)で５回洗浄し、ビオチン標識(ビオチン標識キット、Dojindo Chemical, Cat No. LK03)ＬＡＧ−３−Ｆｃ融合タンパク質(社内製造、配列番号３)および試験抗体の勾配濃度の５０μl／ウェル混合物と共に加え(ここで、ビオチン標識ＬＡＧ−３−Ｆｃ融合タンパク質は、サンプル希釈剤(１％ＢＳＡ含有ＰＨ７.４  ＰＢＳ)で最終濃度０.４μg／mlに希釈されている)、１時間前混合され、次いでプレートを３７℃で１時間インキュベートした。反応溶液を廃棄し、プレートをインキュベート後５回ＰＢＳＴで洗浄し、サンプル希釈剤で希釈した５０μl／ウェルのＨＲＰ標識ストレプトアビジン(Sigma,Cat No. S2438)を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄後、５０μl／ウェルのＴＭＢ色素原基質(ＫＰＬ、Cat No. 52-00-03)を各ウェルに加え、室温で５〜１５分インキュベートし、反各ウェルに５０μl  １Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応停止させた。４５０nm波長のＯＤ値をＮＯＶＯＳｔａｒマイクロプレートリーダーで読み、次いで抗原のＤａｕｄｉ細胞への結合遮断におけるＬＡＧ−３抗体の活性を計算した。結果は表９に示す。データは、本発明のスクリーニング方法により得た全ヒト化抗体が、ヒトＬＡＧ−３抗原のＤａｕｄｉ細胞への結合を顕著に遮断したことを示す。
【０１８８】
【表９】
2021506922.tif 000019
【０１８９】
実施例９. ＬＡＧ−３抗体の親和性についてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
１. マウス抗捕捉用抗体をマウス抗捕捉用キット(Cat. #BR-1008-38, GE)の指示に従う方法によりＣＭ５バイオチップ(Cat. # BR-1000-12, GE)に共有結合させ、試験抗体を親和性により捕捉させた。次いで、ＬＡＧ−３−Ｆｌａｇ抗原(社内製造、配列番号１)をバイオチップ表面を流し、反応シグナルをＢｉａｃｏｒｅ装置を使用してリアルタイムで検出して、結合および解離曲線を得て、親和性の値をフィッティングにより得た(上記表２参照)。実験で解離の各サイクルが完了した後、バイオチップを洗浄し、マウス抗捕捉用キットに備えられた再生溶液で再生した。結果は、ＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３がヒトＬＡＧ−３タンパク質に優れた結合活性および親和性を示すことを示す。
【０１９０】
２. ヒト抗捕捉用抗体をヒト抗捕捉用キット(Cat. # BR-1008-39, GE)の指示に従う方法によりＣＭ５バイオチップ(Cat. # BR-1000-12, GE)に共有結合させ、試験抗体を親和性により捕捉させた。次いで、ＬＡＧ−３−Ｆｌａｇ抗原(社内製造、配列番号１)をバイオチップ表面を流し、反応シグナルをＢｉａｃｏｒｅ装置を使用してリアルタイムで検出して、結合および解離曲線を得て、親和性の値をフィッティングにより得た(下記表１０参照)。実験で解離の各サイクルが完了した後、バイオチップを洗浄し、ヒト抗捕捉用キットに備えられた再生溶液で再生した。結果は、本発明のスクリーニング方法により得た抗体がヒトＬＡＧ−３タンパク質への優れた結合活性および親和性を示したことを示す。
【０１９１】
【表１０】
2021506922.tif 000020
【０１９２】
実施例１０. ＰＢＭＣ−Ｔリンパ球の活性化
Ｔリンパ球の活性化におけるＬＡＧ−３抗体の効果を試験するために、ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を採取し、精製した。ＩＬ−２サイトカインの分泌レベルを、インビトロでブドウ球菌腸毒素Ｂ(ＳＥＢ)のスーパー抗原で７２時間刺激後測定した。実験方法を下に簡潔に記載する。
新たに単離し、精製したＰＢＭＣを、９６ウェル細胞培養プレートに約１×１０５／ウェルの細胞密度で播種し、１００ng／ml  ＳＥＢスーパー抗原刺激を加、勾配希釈抗体サンプル(培地で希釈)またはブランク対照としての培地を同時に加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、細胞培養上清を回収した。培養上清中の分泌ＩＬ−２レベルを、ＥＬＩＳＡ(ＢＤ、CAT # 550611)により測定した。詳細な方法は、製造業者のマニュアルに示されている。
結果を図１に示した。ヒト化ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５両者は、活性化Ｔリンパ球により分泌されるサイトカインＩＬ−２レベルを種々の程度で増加でき、薬物濃度に用量−効果依存性がある。
【０１９３】
実施例１１. ＬＡＧ−３抗体による皮下接種Ｕ−８７ＭＧ腫瘍の阻害
この試験において、Ｕ−８７ＭＧ腫瘍担持マウスの腫瘍体積に対するヒト化抗ＬＡＧ−３抗体の効果を測定した。
１００μlのヒト神経膠腫Ｕ８７ＭＧ細胞(３.５×１０６細胞)を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス(Changzhou Cavion Experimental Animal Co., Ltd.から購入)の右肋骨に皮下摂取した。腫瘍が１０〜１４日後に４０mm３まで増殖したら、体重または腫瘍体積が大きすぎるまたは小さすぎるものを除くマウスを、腫瘍体積(グループ分けおよび投与は表１１に示す)により、各群８マウス(Ｄ０)でアイソタイプマッチｈＩｇＧの対照群、ヒト化ＬＡＧ−３候補抗体Ｈｕ２２９−０１３群およびヒト化ＬＡＧ−３候補抗体Ｈｕ３０３−００５群の３群に無作為化した。ＣＤ３抗体で刺激されたＰＢＭＣを腫瘍組織に５×１０５細胞／６０μlで注射し、試験抗体の注射をｉ.ｐ.注射で、週３回、計６回で開始した。マウスの腫瘍体積を週２回測定し、データを記録した。腫瘍体積(Ｖ)を：
腫瘍体積(ＴＶ)＝１／２×Ｌ長×Ｌ短２
として計算した。
各群の腫瘍体積を平均±標準誤差(平均±ＳＥＭ)で表し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアでプロットし、二元配置ＡＮＯＶＡ統計解析により分析し、腫瘍阻害率を次の式により計算した：
腫瘍増殖率(Ｔ／Ｃ％)＝(Ｔ−Ｔ０／Ｃ−Ｃ０)×１００％
腫瘍阻害率％ＴＧＩ＝１−Ｔ／Ｃ％
結果を表１１および図２に示した。ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３  ６mpkおよびＨｕ３０３−００５  ６mpk両者は、投与後１４日間一定の抗腫瘍効果を有し、腫瘍阻害率はそれぞれ２７.２５％(ｐ＜０.０５)および３４.９４％(ｐ＜０.０１)であった。対照群と比較して、有意差があった(ｐ＜０.００１対ｈＩＧｇ)。
【０１９４】
【表１１】
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注：Ｄ０：最初の投与；二元配置ＡＮＯＶＡで*  ｐ＜０.０５、**  ｐ＜０.０１、***  ｐ＜０.００１対ｈＩＧｇ。
【０１９５】
実施例１２. マウスにおけるヒト化抗ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５のＰＫアッセイ
１８匹のＩＣＲ雄マウス、体重１８〜２２ｇを、Sippr-BK Lab Animal Co., Ltd.から購入した。飼育期間中、マウスは水および餌を自由に利用し、マウスを１２／１２時間明／暗サイクル制御、温度１６〜２６℃および相対湿度４０〜７０％の実験室環境に３日以上適応させた。ＩＣＲマウスを番号付けし、実験１日前に各群３マウスで、種々の群に無作為に分けた。実験の日、２群のマウスに、ヒト化候補抗体(Ｈｕ２２９−０１３)をそれぞれ３mg／kgおよび１０mg／kgの用量で静脈内注射した；他の２群のマウスに、ヒト化候補抗体(Ｈｕ３０３−００５)をそれぞれ３mg／kgおよび１０mg／kgの用量で静脈内注射した。静脈注射の体積は２０ml／kgである。
血液サンプルを投与１５分、８時間、１日、２日、４日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日および３５日後の時点で採取した。各時点約０.１mlの全血を、抗凝固剤不含遠沈管に採り、４℃で３０分間置き、次いで１０００ｇで１５分間遠心分離した。上清をＥＰチューブにピペットで移し、−８０℃で貯蔵した。
【０１９６】
薬物の血清濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、Ｔ１／２および他の主パラメータをＷｉｎｎｏｌｉｎソフトウェアで計算した。主薬物動態パラメータを表１２に示す。
【表１２】
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ヒト化ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５のマウスへのインビボ暴露は類似し、３mg／kgおよび１０mg／kg用量のこれら２抗体の暴露量およびピーク濃度は用量増加と直線的に比例し、直線的薬物動態特徴を示した。
【０１９７】
抗体医薬組成物(製剤)の製剤方法の例
工程１：ＬＡＧ−３抗体を含む製剤の原液を０.２２μm  ＰＶＤＦフィルターを通し、濾液を無菌試験のためにサンプリングし、濾液を取得した。
工程２：充填体積を５.３mlに調節し、濾液を６mlストッパー付きバイアルに充填し、充填方法の開始時、中途および終了時にそれぞれサンプリングして、体積差異を検出した。
工程３：キャッピング機を使用してアルミニウムキャップで施蓋した。
工程４：不正確な充填など何らかの不備がないかを確認するため目視を実施した。ラベルを印刷し、バイアルに貼った。紙トレイ用ラベルを印刷し、紙トレイを折り畳み、バイアルを紙トレイに入れ、紙トレイにラベルを貼った。
【０１９８】
抗体医薬組成物の製剤方法例
工程１：Ｈｕ３０３−００５を含む製剤の原液を０.２２μm  ＰＶＤＦフィルターを通し、濾液を無菌試験のためにサンプリングし、濾液を取得した。
工程２：充填体積を５.３mlに調節し、濾液を２０ml  バイアルに充填し、プラグをバイアルに半分押し込み、原液を凍結乾燥し、ゴム栓でバイアルを密封した。
工程３：キャッピング機を使用してアルミニウムキャップで施蓋した。
工程４：凍結中の崩壊など何らかの不備がないかを確認するため目視検査を実施した。ラベルを印刷し、バイアルに貼った。紙トレイ用ラベルを印刷し、紙トレイを折り畳み、バイアルを紙トレイに入れ、紙トレイにラベルを貼付した。
【０１９９】
実施例１３. ＬＡＧ−３抗体製剤のための緩衝系スクリーニング
ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３またはＨｕ３０３−００５製剤を、一連の１０mM緩衝液、ｐＨ５.０〜７.５で、タンパク質濃度５０mg／mLで調製し、各製剤を濾過し、ストッパー付きバイアルに入れ、バイアルに施蓋し、密封した。サンプルを、４０℃高温などの過酷分解試験に付し、振盪し、見かけ、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)、非還元ドレシル硫酸ナトリウム(ＣＥ−ＳＤＳ)キャピラリー電気泳動およびイオン交換クロマトグラフィー(ＩＥＣ)または画像化キャピラリー等電点電気泳動(ｉＣＩＥＦ)により評価した。結果を表１３−１および表１３−２に示し、統計分析の結果を図３〜図６に示す。
【０２００】
【表１３−１】
2021506922.tif 000023
【表１３−２】
2021506922.tif 000024
【表１３−３】
2021506922.tif 000025
【表１３−４】
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注：０.０１mg／ml  ポリソルベート８０を加えて振盪Ｄ１２サンプルを調製し、他のサンプルはポリソルベート８０を含まなかった；Ｄは日数を示す。
【０２０１】
【表１３−５】
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【表１３−６】
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注：Ｄは日数を示す；Ｎ／Ａは実施せず。
【０２０２】
結果は次のことを示した。
(１)抗体Ｈｕ２２９−０１３は酢酸−酢酸ナトリウム(ＡＡ)系で最良の見かけを有し、コハク酸−コハク酸ナトリウム(ＳＡ)およびヒスチジン−塩酸(Ｈｉｓ−ＨＣｌ)系が続いた。４０℃ＣＥで、ＩＥＣ純度は酢酸−酢酸ナトリウム(ＡＡ)、ｐＨ５.５、コハク酸−コハク酸ナトリウム(ＳＡ)、ｐＨ６.０、クエン酸−クエン酸ナトリウム(ＣＡ)、ｐＨ６.０、ヒスチジン−塩酸(Ｈｉｓ)、ｐＨ６.０系で高かった。見かけおよびＣＥ、ＩＥＣ結果を考慮して、ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３はＡＡ(ｐＨ５.５)、ＳＡ(ｐＨ６.０)、Ｈｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ６.０)系で比較的安定であった(図３および図４参照)。
【０２０３】
(２)抗体Ｈｕ３０３−００５の振盪見かけデータは、ｐＨが低いほど見かけが良好であり、緩衝系ヒスチジン−塩酸(Ｈｉｓ−ＨＣｌ)および酢酸−酢酸ナトリウム(ＡＡ)が優れたことを示した。ＣＥ−ＳＤＳ(非還元)およびｉＣＩＥＦは４０℃の加速条件下で顕著な分解を示し、一方ＣＥ−ＳＤＳデータはｐＨ６.０が優れ、緩衝系酢酸−酢酸ナトリウム、ヒスチジン−塩酸(Ｈｉｓ−ＨＣｌ)およびリン酸系が優れたことを示した。ｉＣＥデータは、中性ピークの減少がｐＨ高いほど少ないことを示した(図５および図６参照)。全体的考察後、好ましい緩衝系は１０mM  Ｈｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６.０である。
【０２０４】
実施例１４. スＬＡＧ−３抗体製剤のアジュバントクリーニング
(１)ＬＡＧ−３  Ｈｕ２２９−０１３製剤を、１０mM  コハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０で、タンパク質濃度５０mg／mLで、下に示す種々の濃度の界面活性剤および糖類と共に調製した。結果を表１４−１に示した。
１)  ０.１mg／mL  ポリソルベート２０(ＰＳ２０)
２)  ０.１mg／mL  ポリソルベート８０(ＰＳ８０)
３)  ７０mg／mL  スクロース
４)  ７０mg／mL  トレハロース
５)  ５０mg／mL  マンニトール
６)  ５０mg／mL  ソルビトール
【０２０５】
(２)抗体Ｈｕ３０３−００５製剤を１０mM  酢酸(ナトリウム)、ｐＨ５.５で、抗体濃度５０mg／mLで、下に示す種々の濃度の界面活性剤および糖類と共に調製した。結果を図７および表１４−２に示した。
１)  ７５mg／mL  スクロース＋０.２mg／mL  ＰＳ８０
２)  ７５mg／mL  トレハロース＋０.２mg／mL  ＰＳ８０
３)  ０.０５mg／mL  ポリソルベート２０(ＰＳ２０)
４)  ０.０５mg／mL  ポリソルベート８０(ＰＳ８０)
５)  ０.２mg／mL  ＰＳ２０
６)  ０.２mg／mL  ＰＳ８０
７)  ０.４mg／mL  ＰＳ２０
８)  ０.４mg／mL  ＰＳ８０
【０２０６】
各製剤を濾過し、ストッパー付きバイアルに加え、バイアルを蓋し、密封した。サンプルを、４０℃高温、反復凍結−融解、振盪などの過酷分解試験に付した。結果を表１４および図７に示した
【０２０７】
【表１４−１】
2021506922.tif 000029
注：Ｄは日数を示す。
【０２０８】
【表１４−２】
2021506922.tif 000030
注：Ｄは日数を示す。
【０２０９】
結果は次のことを示した。
(１)ＰＳ８０振盪群の抗体Ｈｕ２２９−０１３製剤の見かけはＰＳ２０振盪群のものより優れた；１回凍結および融解後、数粒子がスクロース群に出現し、多数の粒子がトレハロース群に出現した；他の群間で差異はなかった；それ故に、アジュバントは好ましくはポリソルベート８０およびスクロースであった。
【０２１０】
(２)抗体Ｈｕ３０３−００５製剤の見かけはトレハロース群でわずかに良かったが、ＳＥＣ結果はスクロース群が僅かに良いことを示した；全体として、スクロース群とトレハロース群に明白な差異はなかった。見かけおよびＳＥＣデータは、ＰＳ８０がＰＳ２０より優れ、図７に示すとおり、ポリソルベート含量増加が見かけおよびＳＥＣ安定性を顕著に改善できることを示す。それ故に、ＰＳ８０が好ましく、ＰＳ濃度は０.２mg／mlより高濃度とすべきである。
【０２１１】
実施例１５. ＬＡＧ−３抗体の安定性評価
(１)ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３製剤を、下に示す種々の緩衝液で、タンパク質濃度５０mg／mLで、６０mg／ml  スクロースおよび０.４mg／mL  ポリソルベート８０を含んで調製した：
１)  １０mM  酢酸−酢酸ナトリウム(ＡＡ)ｐＨ５.５；
２)  １０mM  ヒスチジン−酢酸(Ｈｉｓ−ＡＡ)ｐＨ６.０；
３)  １０mM  ヒスチジン−塩酸(Ｈｉｓ−ＨＣｌ)ｐＨ６.０；
４)  １０mM  コハク酸−コハク酸ナトリウム(ＳＡ)ｐＨ６.０。
【０２１２】
(２)Ｈｕ３０３−００５製剤、下に示す種々の緩衝液で、タンパク質含量５０mg／mLで、７５mg／ml  スクロースおよび０.４mg／mL  ＰＳ８０を含んで調製した：
１)  １０mM  酢酸−酢酸ナトリウム(ＡＡ)ｐＨ５.５
２)  １０mM  ヒスチジン−塩酸(Ｈｉｓ−ＨＣｌ)ｐＨ６.０
３)  １０mM  ヒスチジン−塩酸(Ｈｉｓ−ＨＣｌ)ｐＨ６.５。
【０２１３】
各製剤を濾過し、ストッパー付きバイアルに充填し、バイアルを施蓋し、密封した。調製サンプルを２５℃または４℃において、安定性を観察した。検出項目は見かけ、ＳＥＣ、ＩＥＣまたはｉＣＥ、ＣＥ−ＳＤＳ(非還元)であった。
【０２１４】
【表１５−１】
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注：Ｍ３.５は３.５か月を意味する
【０２１５】
【表１５−２】
2021506922.tif 000032
注：Ｍは月数を示し、Ｎ／Ａは実施せず。
【０２１６】
結果は次のことを示した。
(１)ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３は１０mM  ＡＡ  ｐＨ５.５、１０mM  Ｈｉｓ−ＡＡ  ｐＨ６.０系でより安定である。
【０２１７】
(２)４℃で３か月置いた後、抗体Ｈｕ３０３−００５のＣＥはＨｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ６.５)群でわずかに減少し、抗体のｉＣＥはＡＡ  ｐＨ５.５およびＨｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６.５群でわずかに代わり、抗体はＨｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ６.０)で最も安定であった。
【０２１８】
実施例１６. ＬＡＧ−３抗体製剤の最適化
緩衝液のタイプ、ｐＨおよびイオン強度をさらに最適化するために、抗体Ｈｕ２２９−０１３の濃度を５０mg／mlに設定し、ＤＯＥ実験をＪＭＰソフトウェアで設計した。一連の製剤をＲＳＭモデルを使用して得た。ＩＥＣ、ＣＥ(非還元)およびマイクロ流体イメージング(ＭＦＩ)を、過酷分解法の評価指標として使用した。結果を最小二乗法により統計解析した。ＤＯＥパラメータを表１６に示した。試験製剤および結果を表１７および表１８に示した。
【０２１９】
【表１６】
2021506922.tif 000033
【０２２０】
【表１７】
2021506922.tif 000034
【０２２１】
【表１８】
2021506922.tif 000035
注：Ｍ１は１か月を意味し、Ｄは日数を意味する。
【０２２２】
過酷分解で得たデータをフィッティングに付し、結果はＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３が１０〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム(ＡＡ)緩衝液またはヒスチジン−酢酸緩衝液(Ｈｉｓ−ＡＡ)系、ｐＨ５.２〜５.８で良好な安定性を示すことを示した。好ましくは、緩衝系は１０〜３０mM  酢酸−酢酸ナトリウム(ＡＡ)、ｐＨ５.５である。
【０２２３】
実施例１７. ＬＡＧ−３抗体製剤の安定性試験
ＬＡＧ−３  Ｈｕ２２９−０１３製剤を、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウムｐＨ５.５緩衝液で、タンパク質濃度６０mg／mLで、６０mg／ml  スクロースおよび０.４mg／mL  ポリソルベート８０を含んで調製した。
製剤を濾過し、ストッパー付きバイアルに加え、バイアルを蓋し、密封した。調製サンプルを４℃に置いて、安定性を観察した。検出項目は見かけ、ＳＥＣ、ＩＥＣ、ＣＥ−ＳＤＳ(非還元)を含む。
【０２２４】
【表１９】
2021506922.tif 000036
結果は、Ｈｕ２２９−０１３製剤が４℃で９か月間その安定性を保持することを示した。
【０２２５】
実施例１８. ＬＡＧ−３抗体製剤の最適化
(１)Ｈｕ２２９−０１３製剤に含まれる成分の最適化
タンパク質、スクロースおよびポリソルベート８０の濃度をさらに最適化するために、緩衝液を１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５に設定した。ＤＯＥ実験設計をＪＭＰソフトウェアを使用して実施した。一連の製剤をＲＳＭモデルを使用して得て、ＩＥＣおよびＣＥ(非還元)を、過酷分解法の評価指標として使用した。結果を最小二乗法により統計解析した。ＤＯＥパラメータを表２０に示した。試験結果を表２１に示した。統計解析結果を図８、図９および表２１に示した。
【０２２６】
【表２０】
2021506922.tif 000037
【０２２７】
【表２１】
2021506922.tif 000038
【０２２８】
種々の過酷分解から得たデータをフィッティングに付し、結果は次のとおりであった。
Ｄ０でのＩＥＣ値および４０℃でのＩＣＥ値の差値をフィッティングに付した。Ｒ２＞０.９８、Ｐ＜０.０６、モデルを検証し、結果を図８に示した。Ｄ０でのＣＥ純度値とおよび４０℃でのＣＥ純度値の差値をフィッティングに付した。Ｒ２＞０.９９、Ｐ＜０.０５、モデルを検証し、結果を図９に示した。４０℃ＩＥＣのフィッティング結果はより好ましい製剤が４０〜６０mg／mlタンパク質濃度、３０〜９０mg／ml  糖類濃度および０.４〜０.５mg／ml  ＰＳ８０濃度であることを示し、４０℃ＣＥのフィッティング結果はより好ましい製剤が５０〜８０mg／mlタンパク質濃度、３０〜９０mg／ml  糖類濃度および０.１〜０.５mg／ml  ＰＳ８０濃度であることを示した。それ故に、最も好ましい範囲は５０〜６０mg／mlタンパク質濃度、３０〜９０mg／ml  スクロース濃度および０.４〜０.５mg／ml  ＰＳ８０濃度である。
【０２２９】
(２)Ｈｕ３０３−００５抗体製剤に含まれる成分の最適化
スクロース濃度を７５mg／mlに設定し、ＤＯＥ実験を１０mM  Ｈｉｓ緩の衝液ｐＨ値で設計し、タンパク質濃度およびポリソルベート濃度を変数として使用した。ＲＳＭモデルを使用して一連の製剤を得た。製剤を表２２に示した。ｉＣＩＥＦ、ＣＥ(非還元)およびＤＬＳを、過酷分解法の評価指標として使用した。結果を最小二乗法により統計解析した。結果を表２３および図１０に示した。
【０２３０】
【表２２】
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【０２３１】
【表２３】
2021506922.tif 000040
過酷分解から得たデータをフィッティングに付し、２５℃および４０℃でのｉＣＩＥＦ／ＣＥ／ＤＬＳデータもフィッティングに付し、モデルを検証した。結果を図１０に示した。
【０２３２】
結果は、高温条件下、ｐＨ上昇は粒子径および中性ピーク増加となる。ｉＣＩＥＦの変化速度は、温度が下がると減速する。ＣＥデータはｐＨ６.０で最も優れた。先の実験結果と組み合わせて(１０mM  Ｈｉｓ  ｐＨ６.０でより安定)、最も好ましいｐＨは６.０と決定し、４０℃で得られたＣＥデータは、４５〜６０mg／mlのタンパク質濃度がより好ましいことを示し、故に、最も好ましくは、濃度は５０mg／mlであり、他の実験における種々の条件下のタンパク質安定性に対するポリソルベート濃度の効果を示す結果およびポリソルベート濃度のスクリーニング結果(０.２mg／mlを超える濃度がより好ましかった)と組み合わせて、ＰＳ８０濃度を０.３mg／mと設定し、このおよび他の実施例におけるＨｕ３０３−００５抗体液体製剤で、ｉＣＩＥＦは高温条件で有意な分解を示し、凍結乾燥製剤として製剤すべきと結論付けた。凍結乾燥製剤の良好な成形性および適当な浸透圧を確実にするために、スクロース濃度は７５mg／mlであると設定した。
【０２３３】
実施例１９. ＬＡＧ−３抗体製剤の凍結乾燥
Ｈｕ３０３−００５の凍結乾燥製剤を、１０mM  ヒスチジン−塩酸、ｐＨ５.５または６.０で、タンパク質含量５０mg／mlで、７５mg／ml  スクロースおよび０.４mg／ml  ＰＳ８０を含んで調製した。凍結乾燥方法は次のとおりであった。
【表２４】
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【０２３４】
サンプルを４℃および２５℃において、安定性を観察した。サンプルを種々の時点で採り、適切な量の注射用水で再構成した。結果を表２５および表２６に示した。結果は、４℃でＭ３長期貯蔵中２５℃で加速試験の間Ｈｕ３０３−００５製剤の種々の指標に顕著な変化はなく、安定性が良好であったことを示す。
【表２５】
2021506922.tif 000042
【０２３５】
【表２６】
2021506922.tif 000043
【０２３６】
同時に、凍結乾燥抗体Ｈｕ２２９−０１３の再構成溶液の安定性を決定した。ＬＡＧ−３抗体製剤を１０mM  酢酸−酢酸ナトリウムｐＨ５.５で、タンパク質濃度５０mg／mlで、７５mg／ml  スクロースおよび０.４mg／ml  ポリソルベート８０を含んで調製した。抗体を２mL  バイアル、１.１mL／バイアルに入れ、凍結乾燥箱に入れ、凍結乾燥した。安定性を観察するため、凍結乾燥前後のサンプルを比較した。結果は、凍結乾燥前後で抗体Ｈｕ２２９−０１３の品質に変化はなく、凍結乾燥製剤が貯蔵中、良好な安定性を有したことを示す。
【０２３７】
実施例２０. 凍結乾燥方法でのパラメータ最適化
５０mg／ml抗体Ｈｕ３０３−００５、１０mM  ヒスチジン−塩酸、ｐＨ６.０、７５mg／ml  スクロースおよび０.４mg／ml  ＰＳ８０を含む製剤を調製し、凍結乾燥した。Ｈｕ３０３−００５崩壊が起きた温度は、凍結乾燥顕微鏡で測定して、約−１９℃であった。一次乾燥温度は凍結乾燥方法の重要なパラメータである。それ故に、一次乾燥方法中の棚温度を注意深く最適化した。凍結乾燥パラメータを表２７に示した。結果を表２８に示した。各温度での凍結乾燥粉末の見かけは要件を満たした。しかしながら、−５℃で再構成後数粒子が見かけ試験で出現した。それ故に、一次乾燥のための棚温度を−１０℃と設定した。
【０２３８】
【表２７】
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【０２３９】
【表２８】
2021506922.tif 000045
【０２４０】
最終凍結乾燥は次のとおりであった。
【表２９】
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*  一次乾燥および二次乾燥時間は特定のバッチおよび昇圧試験による。
【０２４１】
実施例２１. 他の代替製剤
本発明はまた次のものからなる群から選択される何れかを含む、次音安定な医薬製剤も提供する。
(１)９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、８０mg／ml  スクロース、０.４mg／ml  ポリソルベート８０、１５mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５；
(２)９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、８０mg／ml  スクロース、０.４mg／ml  ポリソルベート８０、１５mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５；
(３)９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、５０mg／ml  スクロース、０.４mg／ml  ポリソルベート８０、２５mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５；
(４)７０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、５０mg／ml  スクロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５；
(５)７０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、８０mg／ml  スクロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、１５mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.２；
(６)４０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、７５mg／ml  スクロース、０.４mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０；
(７)５５mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、７５mg／ml  スクロース、０.４mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.７；
(８)３０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、７０mg／ml  スクロース、０.５mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.５；
(９)２０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、７０mg／ml  スクロース、０.２mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.４；
(５)１５mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、８５mg／ml  スクロース、０.１mg／ml  ポリソルベート８０、２５mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.６；
(１１)５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、８５mg／ml  スクロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、２５mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.８；
(１２)５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、７５mg／ml  スクロース、０.４mg／ml  ポリソルベート８０、２５mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.０；
(１３)５５mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、９０mg／ml  スクロース、０.４mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.３；
(１４)５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３、９０mg／ml  スクロース、０.４mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.０；
(１５)９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、７５mg／ml  スクロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.０；
(１６)９０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、７５mg／ml  スクロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ５.５；
(１７)７５mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、７５mg／ml  スクロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、３０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ５.０；
(１８)１mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、７５mg／ml  スクロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、５mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.０；
(１９)７０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、３０mg／ml  スクロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、５mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.０；
(２０)５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、６０mg／ml  トレハロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.０；
(２１)５０mg／ml  ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ３０３−００５、９０mg／ml  トレハロース、０.３mg／ml  ポリソルベート８０、１０mM  ヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６.０。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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