(57)【要約】  機能性核酸分子であって：  タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに  特定のステムループドメイン及び内部ループドメインを含む2次元構造を有する調節配列を含み、かつ翻訳増強能を示す、前記機能性核酸分子を開示する。【選択図】図２
2021512646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性核酸分子であって：
タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに
8〜12組の対合したヌクレオチドを有するステム及び5〜9個のヌクレオチドを含むループを含む第1のステムループドメイン（SL-1）を含む、2次元構造を有する調節配列、を含む、前記機能性核酸分子。
【請求項２】
機能性核酸分子であって：
タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに
配列番号：1と少なくとも50%一致する配列を有する第1のステムループドメイン（SL-1）を含む、2次元構造を有する調節配列、を含む、前記機能性核酸分子。
【請求項３】
前記第1のステムループドメイン（SL-1）が、配列番号：1と少なくとも75%一致する配列を有する、請求項2記載の機能性核酸分子。
【請求項４】
前記第1のステムループドメイン（SL-1）が、配列番号：1と少なくとも90%一致する配列を有する、請求項3記載の機能性核酸分子。
【請求項５】
前記第1のステムループドメイン（SL-1）のステムが、A型螺旋3次元構造を有する、請求項1〜4のいずれか1項記載の機能性核酸分子。
【請求項６】
前記調節配列の2次元構造が、第2のステムループドメイン（SL-2）及び第4の内部ループドメイン（IL-4）又は第4のステムループドメイン（SL-4）をさらに含み、ここで該第2のステムループドメイン（SL-2）は2〜4組の対合したヌクレオチドを有するステム及び6〜10個のヌクレオチドを含むループを含み、該第4の内部ループドメイン（IL-4）は14〜24個のヌクレオチドを含み、かつ該第4のステムループドメイン（SL-4）は3〜5組の対合したヌクレオチドを有するステム及び6〜10個のヌクレオチドを含むループを含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の機能性核酸分子。
【請求項７】
6〜14個のヌクレオチドを含む第3の内部ループドメイン（IL-3）をさらに含む、請求項6記載の機能性核酸分子。
【請求項８】
1〜3組の対合したヌクレオチドを有するステム及び3〜5個のヌクレオチドを含むループを含む第3のステムループドメイン（SL-3）をさらに含む、請求項7記載の機能性核酸分子。 
【請求項９】
6〜12個のヌクレオチドを含む第2の内部ループドメイン（IL-2）をさらに含む、請求項8記載の機能性核酸分子。
【請求項１０】
6〜12個のヌクレオチドを含む第1の内部ループドメイン（IL-1）をさらに含む、請求項9記載の機能性核酸分子。
【請求項１１】
前記調節配列が、配列番号：2と少なくとも50%一致する配列を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の機能性核酸分子。
【請求項１２】
機能性核酸分子であって：
タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに
配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：15、配列番号：7、配列番号：22、及び配列番号：23からなる群から選択される配列と少なくとも50%一致する配列を含む、調節配列、を含む、前記機能性核酸分子。
【請求項１３】
前記調節配列が、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：15、配列番号：7、配列番号：22、及び配列番号：23からなる群から選択される配列と少なくとも75%一致する配列を含む、請求項12記載の機能性核酸分子。
【請求項１４】
前記調節配列が、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：15、配列番号：7、配列番号：22、及び配列番号：23からなる群から選択される配列と少なくとも90%一致する配列を含む、請求項13記載の機能性核酸分子。
【請求項１５】
機能性核酸分子であって：
タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに
配列番号：7、配列番号：21、配列番号：17、配列番号：22、配列番号：65、配列番号：66、及び配列番号：67からなる群から選択される配列と少なくとも90%一致する配列を含む、調節配列、を含む、前記機能性核酸分子。
【請求項１６】
前記調節配列が、配列番号：7、配列番号：21、配列番号：17、配列番号：22、配列番号：65、配列番号：66、及び配列番号：67からなる群から選択される配列を含む、請求項15記載の機能性核酸分子。
【請求項１７】
機能性核酸分子であって：
タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに
配列番号：12と少なくとも90%一致する配列を含む、調節配列、を含む、前記機能性核酸分子。
【請求項１８】
前記調節配列が、配列番号：12を含む、請求項17記載の機能性核酸分子。
【請求項１９】
機能性核酸分子であって：
タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに
調節配列であって： 
【化１】
2021512646.tif 000011
と75%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの逆相補的RNAによって形成されたモチーフ；又は
【化２】
2021512646.tif 000012
と75%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの部分逆相補的RNAによって形成されたモチーフ；又は
【化３】
2021512646.tif 000013
と75%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの部分逆相補的RNAによって形成されたモチーフ、のうちの1以上を含む、前記調節配列、を含む、前記機能性核酸分子。
【請求項２０】
機能性核酸分子であって：
タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに
調節配列であって：
【化４】
2021512646.tif 000014
と90%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの逆相補的RNAによって形成されたモチーフ；又は
【化５】
2021512646.tif 000015
と90%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの部分逆相補的RNAによって形成されたモチーフ；又は
【化６】
2021512646.tif 000016
と90%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの部分逆相補的RNAによって形成されたモチーフ、のうちの1以上を含む、前記調節配列、を含む、前記機能性核酸分子。
【請求項２１】
前記調節配列が、少なくとも、
【化７】
2021512646.tif 000017
と90%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの逆相補的RNAによって形成されたモチーフを含む、請求項20記載の機能性核酸分子。
【請求項２２】
機能性核酸分子であって：
タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに
配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75、配列番号：76、及び配列番号：77からなる群から選択される配列と少なくとも90%一致する配列を含む、調節配列、を含む、前記機能性核酸分子。
【請求項２３】
前記調節配列が、配列番号：72と少なくとも90%一致する配列を含む、請求項22記載の機能性核酸分子。
【請求項２４】
前記調節配列が、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75、配列番号：76、及び配列番号：77からなる群から選択される配列を含む、請求項22記載の機能性核酸分子。
【請求項２５】
前記調節配列が、配列番号：72を含む、請求項24記載の機能性核酸分子。
【請求項２６】
前記分子が環状である、請求項1〜25のいずれか1項記載の機能性核酸分子。
【請求項２７】
請求項1〜26のいずれか1項記載の機能性核酸分子を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許出願は、その開示が参照により組み込まれている2018年2月5日に提出されたイタリア特許出願第102018000002411号を基礎とする優先権を主張する。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、機能性核酸分子であって、タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列；並びに特定のステムループドメイン及び内部ループドメインを含む2次元構造及び/又は特定の3次元構造を有する調節配列を含む、前記機能性核酸分子に関する。
【０００３】
（従来技術）
ENCODE及びFANTOMなどの大規模ゲノムプロジェクトにより、ゲノムの大部分が転写されているが、転写されたRNAの5%未満しかタンパク質をコードしていないことが示されている。実に、長鎖非コードRNA（lncRNA）及び転移因子（TE）は、主要な細胞転写産物であるようである。過去10年間のますます多くの研究により、lncRNAの機能が明らかにされている。概して、lncRNAは主に核及び細胞質において、さまざまなレパートリーの機構を通じた調節分子として作用することが明らかにされてきている。この進展にもかかわらず、機能的に検証された注釈付きのlncRNAは、ごく一部のみしかない。
【０００４】
最近、部分的に重複するタンパク質をコードするセンス鎖mRNAの翻訳を増加させる、新たな機能クラスのアンチセンス（AS）lncRNA が同定された。また、これらのRNAはタンパク質翻訳の上方調節を引き起こすSINEエレメントを含むアンチセンスRNAであるため、SINEUPとも呼ばれる。
【０００５】
ヒトUchl1/PARK5遺伝子のマウスオーソログに対するlncRNAアンチセンスであるアンチセンス（AS）Uchl1は、転写後レベルで作用してUchL1タンパク質の合成を増加させることが認められたため、SINEUPの代表的なメンバーとみなすことができる。AS Uchl1の活性は2つの機能性ドメインの組合わせに依存する：5’末端の重複領域は「結合ドメイン」と示され、Uchl1 mRNAに対するAS Uchl1の特異性を決定し；3’末端の非重複領域は埋込み型逆向きSINE B2エレメントを含み、「エフェクタードメイン」として作用し、結合した標的mRNAの翻訳の上方調節を誘発する。
【０００６】
30超のアンチセンスlncRNAが、部分的に重複するmRNAの翻訳の上方調節を促進する。結合ドメインを交換することで、選択した標的mRNAに向けてAS Uchl1活性を再方向付けすることができる。
【０００７】
これらの天然及び合成分子は翻訳を上方調節するためにSINE B2エレメントを必要とするためSINEUPと命名され、WO 2012/133947に開示されている。AS Uchl1はこの新たなクラスのlncRNAの代表的なメンバーとみなすことができ、ここで埋込み型転移因子はタンパク質の上方調節を達成する機能性RNAドメインとして利用される。
【０００８】
逆向きSINE B2エレメントは、十分に定義されたlncRNAドメインの一例である。進化研究により、SINEエレメントの1次配列はlncRNA一般と同様に、保存性に乏しいことが示されている。SINEエレメント中の部分的保存は、Aボックス及びBボックスにのみ観察される。これらは、非埋込み型SINEにおいてRNAポリメラーゼIIIの内部プロモーターとなる。興味深いことに、いくつかのSINE B2配列は天然及びキメラSINEUP中でエフェクタードメインとして作用することが示されているため、少なくともマウスSINE B2エレメントは配列同一性に乏しいにもかかわらず、機能的保存性を示している。また、ヒトのSINEエレメントも同定されており、SINEUPとして機能することが証明されている（Schein A.らの文献、Sci Rep. (2016), 6:33605）。
【０００９】
従って、埋込み型SINEのドメイン機能性は、配列ベースのモチーフではなく構造ベースのモチーフに存在するという仮説が立てられている。
【００１０】
RNA のフォールディングは、lncRNA及び埋込み型TEに機能的役割を提供すると仮定されている。RNA 配列はフォールディングして、1次ヌクレオチド配列のみがわかっている場合には予測困難な複雑な2次及び3次構造を形成することができる。lncRNAの2次構造モジュールを体系的に特定する計算方法はまだ不十分である。現在のアルゴリズムを用いると、分かっている塩基対の約50〜70%を正確に予測できる。最も重要なのは、2次構造予測モデルの精度が50〜70%という値であることは、モデルが正しい領域及び重大な不一致を示す領域が平均されることに起因することである。従って、RNAの機能について洞察を得るには、溶液中のRNA分子の実際の構造を測定する方法しかない。水がアクセス可能な残基の化学修飾に基づく方法（化学フットプリンティング）及び核酸の磁気特性に基づく方法（NMR）が利用可能である。より最近では、icSHAPEと命名された新たな生化学アプローチ（インビボでのクリック選択性29-ヒドロキシルアシル化及びプロファイリング実験）が開発され、このアプローチを用いると、4種の塩基全ての生細胞におけるRNA2次構造の全体像の観察が初めて可能となる。 
【００１１】
以上を考慮して、さらなる研究及び臨床的設定において、これらの分子を効果的かつ効率的に利用できるようにするために、特定の2次元又は3次元分子構造がlncRNAの機能に寄与するかどうかを特定することが求められている。特に、lncRNAは遺伝子機能の研究から工業用タンパク質の生産に至る幅広い研究活動に、及びハプロ不全の治療などのインビボ適用に、理想的なツールである。
【発明の概要】
【００１２】
（発明の概要）
本発明の目的は、タンパク質をコードする遺伝子と部分的に重複し、翻訳上方調節活性を有する機能性アンチセンスlncRNAに埋め込まれているマウスAS Uchl1由来逆向きSINE B2エレメント、他のマウスSINE、及び進化的に遠い種由来のSINEの2次及び3次構造を特定することである。これらの分子の2次及び3次構造のモチーフ及びそれらの適切な組合わせを同定することにより、翻訳上方調節機能が高められたSINEエレメントの設計が可能となる。
【００１３】
さらに、これらのモチーフ及びそれらの適切な組合わせを同定することで、より短い機能性配列を設計することが可能となる。実に、治療適用にはSINEUP RNAの送達は非常に重要な課題である。RNA分子は生体内では高度に不安定である。化学修飾及び/又は脂質ナノ粒子中への封入は、RNAの自然な不安定性を克服するために広く利用されている。しかしながら、これらの送達方法は、長鎖RNA分子については効率が低いことが証明されている。不連続かつ活性を示す構造エレメントのみを保持する逆向きSINE B2エフェクタードメインのより短いバリアントを設計することにより、「必須ではない」配列からエフェクタードメインを「取り出し」、活性を示す最短のSINEUP RNA分子を得る。
【００１４】
この目的は、請求項1又は2で定義する機能性核酸分子によって達成される。
【００１５】
本発明の他の目的は、請求項12、15、17、19、22で定義する機能性核酸分子及び請求項26で定義する組成物を提供することである。
【００１６】
（定義）
「ミニSINEUP」という用語は、結合ドメイン（標的mRNAに対して相補的な配列）、スペーサー配列（例示的事例において、21 ntスペーサー）、及びエフェクタードメインとしての任意のSINE又はSINE由来配列（Zucchelliらの文献、Front Cell Neurosci., 9: 174, 2015.）からなる核酸分子を意図する。
【００１７】
特に、「ミニSINEUP-GFP」という用語は、ミニSINEUPの結合ドメインがEGFP mRNAに対して相補的な配列となるように設計することを意図する（Zucchelliらの文献、Front Cell Neurosci., 9: 174, 2015.）。
【００１８】
「機能性核酸分子」は、一般的に核酸分子が対象とする標的mRNAの翻訳を増強できることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
（図面の簡単な説明）
【図１】実施例1に関する図1は、天然のAS Uchl 1由来の逆向きSINE B2配列の化学フットプリンティングを示す。
【図２】実施例2に関する図2は、天然のAS Uchl 1由来の逆向きSINE B2配列の2次構造を示す。
【図３】実施例3に関する図3は、逆向きSINE B2 RNAの末端欠失断片の溶液中における構造を示す。
【図４】実施例4に関する図4は、ウェスタンブロット及びqRT-PCRによる、第1のステムループドメイン（SL-1）がAS Uchl1の活性に寄与することを示す。
【図５】実施例5に関する図5は、ウェスタンブロット及びqRT-PCRによる、第1のステムループドメイン（SL-1）がUchl1-FLAGを過剰発現させたヒト肝細胞株におけるAS Uchl1核酸分子の翻訳上方調節に必要であることを示す。
【図６】実施例6に関する図6は、ウェスタンブロット及びqRT-PCRによる、第1のステムループドメイン（SL-1）がHEK 293T/17細胞中でGFP mRNA（SINEUP-GFP）と重複するアンチセンスlncRNAの翻訳上方調節活性に寄与することを示す。
【図７】実施例7に関する図7は、NMRによる、逆向きSINE B2断片(38 nt) の溶液中における構造の決定を示す。
【図８】実施例8に関する図8は、invSINEB2/38の2D NOESY NMRスペクトル（τm = 250 ms）の芳香族アノマー領域を示す。
【図９】実施例9に関する図9は、逆向きSINE B2 38nt断片の3D構造を適切に再構築するために使用するNMRシグナルの接続性マップを示す。
【図１０】実施例10に関する図10は、逆向きSINE B2エフェクタードメインのSL-1領域の高分解能3D構造を示す。
【図１１】実施例11に関する図11は、逆向きSINE B2上の欠失させた配列及び逆向きSINE B2の活性に対するこれらの欠失の効果を示す（ウェスタンブロット及びqRT-PCR）。
【図１２】実施例12に関する図12は、逆向きSINE B2上の突然変異させた配列及び逆向きSINE B2の活性に対するこれらの突然変異の効果を示す（ウェスタンブロット及びqRT-PCR）。
【図１３】実施例13に関する図13は、より短い型の逆向きSINE B2上の突然変異させた配列及び逆向きSINE B2の活性に対するこれらの突然変異の効果を示す。
【図１４】実施例14に関する図14は、異なるマウスAS lncRNA由来のSINE B2エレメントがミニSINEUP中のエフェクタードメインとして作用し、HEK293TにおいてGFPタンパク質の発現を上方調節することができることを示す（ウェスタンブロット）。
【図１５】実施例15に関する図15は、異なるマウスAS lncRNA由来のSINE B2エレメントのClustalWによる配列アラインメントを示す。
【図１６】実施例16に関する図16は、翻訳上方調節活性を有するアンチセンス機能性核酸分子中でエフェクタードメインとして作用する進化的に遠い種由来のSINE配列を示す（ウェスタンブロット及びqRT-PCR）。
【図１７】実施例17に関する図17は、進化的に遠い種由来のSINE配列のより強力な翻訳上方調節活性及びより複雑な構造の間の相関を示す。
【図１８】実施例18に関する図18は、進化的に遠い種由来のSINE配列の2D構造モチーフ解析を示す。
【図１９】実施例19に関する図19は、第1のステムループドメイン（SL-1）がHEK 293T/17細胞中でGFP mRNA（59-96 SL1 SINEUP-GFP）と重複するアンチセンスlncRNAの翻訳上方調節活性に十分であることを示す。
【図２０】実施例20に関する図20は、ウェスタンブロットによる、構造ベースのより短い型の逆向きSINE B2が、HEK 293T/17細胞中でのGFP mRNA（44-120 SINEUP-GFP）と重複するアンチセンスlncRNAの翻訳上方調節に十分であることを示す。
【図２１】実施例21に関する図21は、構造ベースのより短い型の逆向きSINE B2が、HEK 293T/17細胞中での内因のDJ-1 mRNA（44-120 SINEUP-DJ-1）と重複するアンチセンスlncRNAの翻訳上方調節に十分であることを示す。点突然変異を有する2つのバリアントの機能も試験した。
【図２２】図22は、SINEUP-icSHAPE実験の概略図を示す。
【図２３】図23は、HEK293T/17細胞中のミニSINEUP-GFPエフェクタードメインの2次（2D）構造、及びその内部のモチーフを示す。
【図２４】図24は、ExpaRNAを用いた（A）長鎖SINEUP-GFP中及び（B）ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2の2D構造の比較を示す。
【図２５】図25は、（A）長鎖SINEUP-GFP中及び（B）ミニSINEUP-GFP中のAS Uxt SINEB2-bの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図２６】図26は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)長鎖SINEUP-GFP中のAS Txnip SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図２７】図27は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)長鎖SINEUP-GFP中のAS Uxt SINEB2-bの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図２８】図28は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Uxt SINEB2-bの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図２９】図29は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のSINEB2/B3コンセンサス（逆相補的）の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３０】図30は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Nars2 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３１】図31は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Abhd11 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３２】図32は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Epb4.9 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３３】図33は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Wfdc5 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３４】図34は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Pgbd1 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３５】図35は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Gsk3β SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３６】図36は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Rhod SINEB2-Mm2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３７】図37は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Rhod SINEB2-B3Aの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３８】図38は、（a)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（b)ミニSINEUP-GFP中のAS E4f1 SINEB2-Mm2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図３９】図39は、（a)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（b)ミニSINEUP-GFP中のAS E4f1 SINEB2-Mm1tの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図４０】図40は、AS- Uchl1 SINEB2の構造力学を示す。
【図４１】図41は、AS- Uchl1 SINEB2の構造力学を示す。
【図４２】図42は、様々なED長の合成SINEUP及び構造モチーフの組合わせがどの程度GFPタンパク質の発現を上方調節するかを示す。
【図４３】図43は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（B)ミニSINEUP 071 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図４４】図44は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（B)ミニSINEUP 072 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図４５】図45は、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（B)ミニSINEUP 073 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図４６】図46は、（a)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（b)ミニSINEUP 074 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図４７】図47は、（a)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（b)ミニSINEUP 075 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。
【図４８】図48は、AS Uchl1由来SINE B2の構造断片がどの程度GFPタンパク質の発現を上方調節するかを示す。
【図４９】実施例48に関する図49は、SINEUP-DJ-1が環状RNAとして発現された場合に活性を示すことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明では特に、SINEUPの代表的なエフェクタードメインである、AS Uchl1に由来する逆向きSINE B2転移因子の2次及び3次構造を開示する。
【００２１】
欠失突然変異体を使用して、SINEUP活性に必要な構造エレメントを示す。
【００２２】
さらに、翻訳上方調節の機能を有するアンチセンスlncRNA由来のSINE B2の構造配列（天然のSINEUP）を、生細胞中で決定する。
【００２３】
また、構造機能関係をSINEUP活性の生化学的特性評価と、活性及び不活性のSINEのicSHAPEプロファイルに基づいて定義する（後者は示さない）。
【００２４】
SINE B2配列の構造ベースの活性モチーフを開示する。
【００２５】
また、1次配列が保存されておらず、かつ2次構造エレメントが既知の進化的に離れた種に由来するSINE配列の機能性エフェクタードメインの翻訳上方調節活性を開示する。
【００２６】
特に、機能実験では、第1のステムループドメイン（SL-1）とも呼ばれる短鎖末端ヘアピンループ構造が、部分的に重複する mRNAの翻訳を上方調節するSINEUPの能力の重要な構造決定因子であること、及びさらなる構造エレメントも活性の増強に重要であり、かつより活性が低いSINEとより活性が高いSINEが識別されることが示されている。 
【００２７】
RNA分子の1次配列が必ずしもあらかじめ定められた2次構造をもたらすわけではないこと、及び条件次第で分子の別のフォールディングが起こり得ることが証明されている。言い換えると、RNA分子の1次配列から得られる2次構造は、決して予め定められているのではなく、1次配列からただ予測可能であるだけである。
【００２８】
さらに、SINE配列のエフェクタードメインの、突然変異により2次構造が強化され、かつ/又は分子のサイズが制限されたいくつかのバリアントを提供する。これらのバリアントは、2次構造中の特に関連性が高く保存されたモチーフを同定し、かつ機能に必要とされる最小の構造並びにそのような構造を得るための最適な配列及び条件に到達するように、それらを組み合わせることにより、設計した。
【００２９】
実に、本発明の機能性核酸分子は、タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列、並びに8〜12組の対合したヌクレオチドを有するステム及び5〜9個のヌクレオチドを含むループを含む第1のステムループドメイン（SL-1）を含む、2次元構造を有する調節配列、を含む。調節配列は、タンパク質の翻訳増強能を有する。
【００３０】
本発明により、2次構造が保存されている限り、1次配列の塩基は大きく変化してよいことが示される。
【００３１】
標的結合配列は、標的mRNAに逆相補的な配列とのわずか約60%の類似性を有していればよい。実際、標的結合配列は、多数のミスマッチを示す場合でさえ、活性を保持し得る。実に、miRNAは、多数のミスマッチを有する場合でさえ、それらのセンス鎖mRNAパートナーに作用し得る。この概念は、WO 2012/133947で既に示されている。
【００３２】
標的結合配列及び調節配列は、好ましくはスペーサー/リンカー配列によって接続する。
【００３３】
好ましくは、第1のステムループドメイン（SL-1）のステムは、G/Cリッチとする。ここで「G/Cリッチ配列」とは、G及びCを50%超、並びに好ましくはG及びCを75%超有する配列をいうものとする。
【００３４】
好ましくは、第1のステムループドメイン（SL1）のループは、A/Uリッチとする。ここで「A/Uリッチ配列」とは、A及びUを50%超、並びに好ましくはA及びUを75%超有する配列をいうものとする。
【００３５】
第1のステムループドメイン（SL-1）のステムは、好ましくは10組の対合したヌクレオチドを有し、第1のステムループドメイン（SL-1）のループは、好ましくは7個のヌクレオチドを有する。
【００３６】
本発明の機能性核酸分子は、タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列、並びに配列番号：1と少なくとも50%一致する、好ましくは配列番号：1と少なくとも75%一致する、より好ましくは配列番号：1と少なくとも90%一致する、配列を有する第1のステムループドメイン（SL-1）を含む、2次元構造を有する調節配列、を含む。
【００３７】
例示されたAS Uchl1由来の逆向きSINE B2転移因子において、第1のステムループドメイン（SL-1）は配列番号：1、すなわち配列番号：5のヌクレオチド64-92を含む（後者は、AS Uchl1由来の逆向きSINE B2転移因子の完全配列である）。
【００３８】
好ましくは、第1のステムループドメイン（SL-1）のステムは、高分解能NMRで示されるように、A型螺旋3次元構造を有する。 
【００３９】
調節配列の2次元構造は、好ましくは第2のステムループドメイン（SL-2）及び第4の内部ループドメイン（IL-4）又は第4のステムループドメイン（SL-4）をさらに含み、ここで該第2のステムループドメイン（SL-2）は2〜4組の対合したヌクレオチドを有するステム及び6〜10個のヌクレオチドを含むループを含み、該第4の内部ループドメイン（IL-4）は14〜24個のヌクレオチドを含み、かつ該第4のステムループドメイン（SL-4）は3〜5組の対合したヌクレオチドを有するステム及び6〜10個のヌクレオチドを含むループを含む。
【００４０】
第2のステムループドメイン（SL-2）のステムは、好ましくはG/Cリッチとする。第2のステムループドメイン（SL-2）のループ及び/又は第4の内部ループドメインは、好ましくはA/Uリッチとする。
【００４１】
第2のステムループドメイン（SL-2）のステムは、好ましくは3組の対合したヌクレオチドを有し、第2のステムループドメイン（SL-2）のループは、好ましくは8個のヌクレオチドを有する。第4の内部ループドメイン（IL-4）は、好ましくは16〜22個のヌクレオチドを含む。
【００４２】
本発明の機能性核酸分子は、好ましくは配列番号：2と少なくとも50%一致する、好ましくは配列番号：2と少なくとも75%一致する、より好ましくは配列番号：2と少なくとも90%一致する、配列を含む2次元構造を有する調節配列を含む。
【００４３】
例示されたAS Uchl1由来の逆向きSINE B2転移因子において、調節配列は配列番号：2、すなわち配列番号：5のヌクレオチド52-112を含む。
【００４４】
調節配列の2次元構造は、好ましくは6〜14個のヌクレオチド、好ましくは7〜13個のヌクレオチドを含む第3の内部ループドメイン（IL-3）をさらに含む。
【００４５】
調節配列の2次元構造は、好ましくは1〜3組の対合したヌクレオチドを有するステム及び3〜5個のヌクレオチドを含むループを含む第3のステムループドメイン（SL-3）をさらに含む。
【００４６】
本発明の機能性核酸分子は、好ましくは配列番号：3と少なくとも50%一致する、好ましくは配列番号：3と少なくとも75%一致する、より好ましくは配列番号：3と少なくとも90%一致する、配列を含む2次元構造を有する調節配列を含む。
【００４７】
例示されたAS Uchl1由来の逆向きSINE B2転移因子において、調節配列は配列番号：3、すなわち配列番号：5のヌクレオチド36-133を含む。
【００４８】
調節配列の2次元構造は、好ましくは6〜12個のヌクレオチド、好ましくは7〜11個のヌクレオチドを含む第2の内部ループドメイン（IL-2）をさらに含む。第2の内部ループドメイン（IL-2）は、好ましくは非対称かつ/又はA/Uリッチとする。
【００４９】
本発明の機能性核酸分子は、好ましくは配列番号：4と少なくとも50%一致する、好ましくは配列番号：4と少なくとも75%一致する、より好ましくは配列番号：4と少なくとも90%一致する、配列を含む2次元構造を有する調節配列を含む。
【００５０】
例示されたAS Uchl1由来の逆向きSINE B2転移因子において、調節配列は配列番号：4、すなわち配列番号：5のヌクレオチド22-150を含む。
【００５１】
調節配列の2次元構造は、好ましくは6〜12個のヌクレオチド、好ましくは7〜11個のヌクレオチドを含む第1の内部ループドメイン（IL-1）をさらに含む。
【００５２】
本発明の機能性核酸分子は、好ましくは配列番号：5と少なくとも50%一致する、好ましくは配列番号：5と少なくとも75%一致する、より好ましくは配列番号：5と少なくとも90%一致する、配列を含む2次元構造を有する調節配列を含む。
【００５３】
例示されたAS Uchl1由来の逆向きSINE B2転移因子において、調節配列は配列番号：5を有する。
【００５４】
本発明の別の機能性核酸分子は、タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列、並びに配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：15、配列番号：7、配列番号：22、及び配列番号：23からなる群から選択される配列と少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、さらにより好ましくは少なくとも90%一致する配列を含む、調節配列、を含む。
【００５５】
icSHAPE解析により、先に開示したステム中の対合したヌクレオチドの数及び先に開示したループ中のヌクレオチドの数が、開示された範囲を超えて変化し得ることが示されている。
【００５６】
本発明の別の機能性核酸分子は、タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列、並びに配列番号：7、配列番号：21、配列番号：17、配列番号：22、配列番号：65、配列番号：66、及び配列番号：67からなる群から選択される配列と少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、さらにより好ましくは少なくとも90%一致する配列を含む、調節配列、を含む。 
【００５７】
調節配列は、好ましくは配列番号：7、配列番号：21、配列番号：17、配列番号：22、配列番号：65、配列番号：66、及び配列番号：67を含む。
【００５８】
別の実施態様において、機能性核酸は、配列番号：12と少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、さらにより好ましくは少なくとも90%一致する配列を含む調節配列を含み、さらにより好ましくは配列は、配列番号：12である。
【００５９】
本発明の別の機能性核酸分子は、タンパク質翻訳を増強させたい標的mRNA配列に逆相補的な配列を含む標的結合配列、並びに
【化１】
2021512646.tif 000003
と50%、好ましくは75%、さらにより好ましくは90%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの逆相補的RNAによって形成されたモチーフ、又は
【化２】
2021512646.tif 000004
と50%、好ましくは75%、さらにより好ましくは90%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの部分逆相補的RNAによって形成されたモチーフ、又は
【化３】
2021512646.tif 000005
と50%、好ましくは75%、さらにより好ましくは90%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの部分逆相補的RNAによって形成されたモチーフのうちの1以上を含む、調節配列、を含む。
【００６０】
さらにより好ましいモチーフは、それぞれ
【化４】
2021512646.tif 000006
及びハイブリダイズされたそれらの逆相補的RNAによって形成され、
【化５】
2021512646.tif 000007
及びハイブリダイズされたその部分逆相補的RNAによって形成され、かつ
【化６】
2021512646.tif 000008
及びハイブリダイズされたその部分逆相補的RNAによって形成される。
【００６１】
上記機能性核酸分子の調節配列は、好ましくは少なくとも
【化７】
2021512646.tif 000009
と90%一致するRNA配列及びハイブリダイズされたそれらの逆相補的RNAによって形成されたモチーフを含む。より好ましくは、モチーフは
【化８】
2021512646.tif 000010
である。
【００６２】
上記のモチーフの望ましい組合わせを、図24〜39、43〜47、及び48Bに示す。
【００６３】
より詳細には、上記機能性核酸分子は調節配列として、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75、配列番号：76、及び配列番号：77からなる群から選択される配列と少なくとも50%、好ましくは75%、さらにより好ましくは90%一致する配列を含む。さらにより好ましくは、配列は、配列番号：69、配列番号：70、配列番号：71、配列番号：72、配列番号：73、配列番号：74、配列番号：75、配列番号：76、及び配列番号：77を含む。これらの中で、好ましい配列は配列番号：72である。この配列は、完全長SINEUPエフェクタードメインのいくつかのモチーフを欠いているにもかかわらず、標的RNAの翻訳を増加させる能力を維持する最小機能性配列の一例である。
【００６４】
本発明の機能性核酸分子は、好ましくは環状分子である。このコンフォメーションは、細胞内で非常に分解しにくく、従って長時間活性を維持するよりずっと安定な分子をもたらす。
【００６５】
また、本発明は上記機能性核酸分子を含む組成物に関する。上記機能性核酸分子をウイルスベクター（AAV、レンチウイルスなど）及び非ウイルスベクター（ナノ粒子、脂質粒子など）によって送達することを可能とする任意の組成物も含める。
【００６６】
（実施例）
（実施例1） 
本実施例では、天然のAS Uchl1由来逆向きSINE B2配列中の各ヌクレオチドへの、化学物質(DMS及びCMCT)のアクセス可能性を示す。化学物質によるアクセス可能性は、分子の局所構造に厳密に依存する。
【００６７】
図1はinvSINEB2/183 RNAコンストラクトの化学フットプリンティングを示す。左パネルに、ヌクレオチド数を付した、C及びAの配列決定レーンを有する蛍光ゲルを示す。漸増DMS濃度で処理したinvSINEB2/183 RNAを陽性(+)及び陰性(-)対照とともに有するDMSレーン。右パネルに、ヌクレオチド数を付した、G及びUの配列決定レーンを有する蛍光ゲルを示す。漸増CMCT濃度で処理したinvSINEB2/183 RNAを陽性(+)及び陰性(-)対照とともに有するCMCTレーン。実験はTijerina P.らの文献(2007) Nature Protocols 2:2608-2623の記載の通りに実施した。
【００６８】
（実施例2）
本実施例では、機能的AS Uchl1の逆向きSINE B2エフェクタードメインの2次元構造を示す。構造をステムループ（SL1、SL2、及びSL3）、内部ループ（IL1、IL2、IL3、及びIL4）、及び介在ステム構造で組織する。構造は、実施例1のデータに基づいて作成する。
【００６９】
図２は、AS Uchl1の逆向きSINE B2エフェクタードメインの2次構造を示す。DMS反応性ヌクレオチドを灰色背景の丸の中の黒文字で、CMCT反応性ヌクレオチドを黒背景の丸の中の白文字で、それぞれ示す。内部ループ及びステムループを、それぞれILx及びSLxと標識する。非反応性ヌクレオチドにはただ丸を付す。灰色で網掛けされたセグメントは、DNAプライマーのハイブリダイゼーション部位に対応する。
【００７０】
（実施例3）
本実施例では、逆向きSINE B2配列のより短い断片が末端SL1構造を保持することを示す。
【００７１】
図3には、逆向きSINE B2 RNAの末端欠失断片の溶液中における構造を示す。図3Aは、AS Uchl1のinvSINEB2/183エフェクタードメインの2D構造を示す。末端を除去した領域を四角の中に示す。図3Bに、末端欠失断片の模式的構造を示す。ヌクレオチドの位置は、全長配列を基準にして示す。図3Cは、マウスAS Uchl1由来逆向きSINE B2のイミノプロトン領域を示す。イミノ1Hシグナルを、各末端欠失断片に帰属する。断片#1（配列番号：9）、#2（配列番号：8）、#3（配列番号：7）、及び#4（配列番号：6）のトラックを示す。SL1のステム構造は全ての断片で観察される。
【００７２】
（実施例4）
本実施例では、SL1が、翻訳を上方調節する機能性核酸分子（AS Uchl1）中の逆向SINE B2エフェクタードメインの活性に要求されることを示す。
【００７３】
マウス神経芽腫N2a細胞（ATCC Cat No. ATCC-CCL-131）に、AS Uchl1及びΔSL1突然変異体コンストラクトをトランスフェクションした。ΔSL1突然変異体コンストラクトでは、埋込み型逆向きSINE B2のヌクレオチド68-77が欠失している（配列番号：10）。ΔSL1突然変異体では、SL-1のステムループ構造が破壊されているが、全体の逆向きSINE B2アセンブリは保持される。対照細胞には空の対照プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、細胞を溶解し、タンパク質及びRNAレベルで処理した。ウェスタンブロットは、抗UCHL1抗体を用いて実施した（図4A）。β-アクチンをローディング対照として使用した。β-アクチンに対して正規化されたウェスタンブロット画像について空の対照試料を基準にして、誘導倍数を計算した。特異的プライマーを用いたqRT-PCRにより、Uchl1 mRNA（灰色のバー）及びAS Uchl1（白のバー）の発現をモニタリングした。データは平均±標準偏差を示す。データはN＝5の独立したレプリカを表す。図4Bは、N2a細胞における内因のUchl1 mRNAに対するAS Uchl1及びΔSL1の翻訳増強活性のグラフ表示を示す（N＝5）。* 、 p＝0.01；NS、有意ではない（p＞0.5）。実験はZucchelli S.らの文献(2015) Front Cell Neurosci. 9:174.の記載の通りに実施した。
【００７４】
（実施例5）
本実施例では、mRNAを過剰発現させたヒト肝細胞株におけるAS Uchl1核酸分子の翻訳上方調節機能にSL-1が要求されることを示す。実に、ヒトHepG2細胞（ATCC Cat No. ATCC-HB-8065）でUchl1-FLAGを過剰発現させて試験すると、 SL-1の欠失によりAS Uchl1の活性がなくなる。
【００７５】
ヒト肝細胞HepG2細胞株に、Uchl1-FLAGコンストラクトをAS Uchl1及びΔSL1突然変異体コンストラクトと組み合わせてトランスフェクションした。対照細胞には空の対照プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、細胞を溶解し、ウェスタンブロットによるタンパク質量のために処理した。抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロットを実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした（図5A）。β-アクチンをローディング対照として使用した。β-アクチンに対して正規化されたウェスタンブロット画像について空の対照試料を基準にして、誘導倍数を計算した。AS Uchl1翻訳エンハンサー活性は太字で強調する。上記の通り処理された細胞は、RNA定量のために処理した（図5B）。特異的プライマーを用いたqRT-PCRにより、Uchl1 mRNA（右）及びAS Uchl1（左）の発現をモニタリングした。データは平均±標準偏差を示す。 
【００７６】
（実施例6）
本実施例では、過剰発現させたmRNA（SINEUP-GFP）を標的とする合成機能性核酸分子の翻訳上方調節機能に SL-1 が要求されることを示す。また、StemDM突然変異体（ステムを不安定にする突然変異体）のエフェクタードメイン活性が低下しているが、なくなってはいないため、好ましくは追加の構造エレメントが要求される。
【００７７】
図6は、SL-1構造エレメントがHEK293T/17細胞（ATCC Cat No. ATCC-CRL-11268）におけるSINEUP-GFP活性に寄与することを示す。図6Aは、逆向きSINE B2エフェクタードメイン由来の末端ヘアピン構造（SL-1）の拡大画像である。ΔSL1突然変異体は、SINEUP-GFPのSINE B2エフェクタードメインにおける欠失により作製した。同様に、部位指定突然変異（G70A及びG73A、丸で囲む）をSINEUP-GFPに導入し、StemDM突然変異体（配列番号：11）を作製した。図6Bでは、HEK 293T/17細胞に、示されているように空ベクター（-）又はSINEUP-GFP全長（FL）、ΔSL1又はStemDM突然変異体と組み合わせて、eGFP発現プラスミドでトランスフェクションした。抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットを実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした。β-アクチンをローディング対照として使用した。β-アクチンに対して正規化されたウェスタンブロット画像について空の対照試料を基準にして、誘導倍数を計算した。SINEUP-GFP翻訳エンハンサー活性は赤で強調する。図6Cでは、図6Bにおけるように処理された細胞を使用してRNAを調製した。特異的プライマーを用いたqRT-PCRにより、GFP mRNA（灰色）及びSINEUP-GFP（黒）の発現をモニタリングした。データは平均±標準偏差を示す。 
【００７８】
（実施例7）
本実施例では、SL1構造領域（配列番号：12）をカバーする逆向きSINE B2断片（38ヌクレオチド）が、NMRにより決定された溶液中での単一構造をとることを示す。本実験では、NMRデータによりより短い断片(実施例1、2、及び3において他の技術により観察した)のSL-1の構造を検証する。 
【００７９】
図7Aは、0℃及び25℃で取得した5% 2H2O/95% H2O中での38 nt RNAの1H NMRスペクトルのイミノ及び芳香族領域を示す。イミノ1Hシグナルを帰属する。図7Bは、15N HSQC NMRスペクトルのイミノ領域を示す。25℃及び0℃で観察されるシグナルは、それぞれ濃灰色及び淡灰色とする。図7Cは、SINEB2/38コンストラクトの2次構造を示す。25℃及び0℃で観察可能なイミノシグナルを持つ塩基対を、それぞれ濃灰色及び淡灰色で網掛けする。実験はSybren S.らの文献(1998)Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 32:287-387.に記載の通りに実施した。
【００８０】
（実施例8）
本実施例では、NMRシグナルを2D NOESY NMRスペクトルに帰属して、逆向きSINE B2 38 nt断片の3D構造を適切に再構築し得ることを示す。
【００８１】
図8は、関連する共鳴の帰属を示す。invSINEB2/38の2D NOESY NMRスペクトル（τm = 250 ms）の芳香族アノマー領域。連続歩行（sequential walk）を黒線で示す。 
【００８２】
（実施例9）
本実施例では、逆向きSINE B2 38nt断片の3D構造を適切に再構築するために使用するNMRシグナルの接続性マップを示す。
【００８３】
図9は、NOE接続性の図を示す。invSINEB2/38分子の強い（太字）、中程度の（実線）、弱い（破線）NOE接続性の図。 
【００８４】
（実施例10）
本実施例では、逆向きSINE B2エフェクタードメインのSL-1領域の高分解能3D構造を示す。ヘアピンはA型螺旋ステムをとる。ループは、溶液中で動的特性を示す。
【００８５】
図10に、SL1の高分解能構造を示す。図10Aは29 ntヘアピン（配列番号：1）の最も低い10個のエネルギー構造の側面図を示し、図10Bはその上面図を示す。図10C及び10Dは、G77、U78、及びG79塩基の配向を含むループの代表的な構造である。
【００８６】
（実施例11）
本実施例では、さらなる構造エレメント（IL3-SL3領域、IL4、及び基部ステム構造）が、機能性核酸分子（特に、SINEUP-GFP）における逆向きSINE B2エフェクタードメイン活性に寄与することを示す。
【００８７】
図11Aは、逆向きSINE B2の2次構造に関して注釈が付けられたΔSL1（配列番号：10）、ΔpolII（配列番号：13）、及びΔBox（配列番号：14）欠損配列の模式的表示である。図11Bでは、HEK 293T/17細胞に、示されているように空ベクター（-）又はSINEUP-GFP全長（FL）、ΔSL1、ΔpolII、又はΔBox突然変異体と組み合わせて、eGFP発現プラスミドでトランスフェクションした。抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットを実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした。β-アクチンをローディング対照として使用した。β-アクチンに対して正規化されたウェスタンブロット画像について空の対照試料を基準にして、誘導倍数を計算した。SINEUP-GFP翻訳エンハンサー活性は太字で強調する。構造突然変異体の寄与は赤で示す。図11Cでは、図11Bにおけるように処理された細胞を使用してRNAを調製した。特異的プライマーを用いたqRT-PCRにより、GFP mRNA（灰色）及びSINEUP-GFP（黒）の発現をモニタリングした。データは平均±標準偏差を示す。 
【００８８】
（実施例12）
本実施例では、構造特徴（IL-4、SL-2、SL-1の基部に介在するステム構造）に基づいて新たな合成エフェクタードメイン配列を設計し得ることを示す。これらの配列を用いると、過剰発現させたmRNAについての機能性核酸分子における翻訳上方調節活性を増強することができる。1次ヌクレオチド配列は異なるが、構造は同じである配列を用いて、増強された活性を得る。
【００８９】
特に、逆向きSINE B2の構造ベースのバリアントは、SINEUP-GFPにおけるエフェクタードメインとしての翻訳上方調節活性の増加を示す。図 12A に、逆向きSINE B2の2次構造に注釈された構造ベースの突然変異の模式的表示を示す。丸：単一点突然変異；四角：構造エレメント（ステム及びループベース）の配列交換。図12Bでは、HEK 293T/17細胞に、空ベクター（-）又は陽性対照としてのSINEUP-GFP全長（FL）と組み合わせて、eGFP発現プラスミドでトランスフェクションした。示されているように、構造ベースの突然変異を有するSINEUP-GFPコンストラクトをトランスフェクションした。抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットを実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした。β-アクチンをローディング対照として使用した。図12Cは、Bにおける通りに実施したN＝9の実験におけるGFPタンパク質レベルの相対的増加（左パネル）及びGFP mRNAレベルが変化しないこと（右パネル）を示す。各SINEUP-GFP構造突然変異体（AS GFP）の発現をqRT-PCRによってモニタリングし、右パネルに含める。すべての突然変異体は同じレベルで発現させる。
【００９０】
（実施例13）
本実施例では、新たな合成エフェクタードメイン配列を、構造特徴（IL-4、SL-2、SL-1の基部に介在するステム構造）に基づいて設計して、過剰発現させたmRNAにつき機能性核酸分子の翻訳上方調節活性の増強を得ることができることを示す。1次ヌクレオチド配列は異なるが、構造は同じである配列を用いて、増強された活性を得る。
【００９１】
特に、逆向きSINE B2のより短い構造ベースのバリアントは、内因のmRNAを標的とする機能性核酸分子のエフェクタードメインとしての翻訳上方調節活性の増加を示す。
【００９２】
図13Aは、逆向きSINE B2の2次構造について注釈された構造ベースの突然変異の模式的表示である（27-142は配列番号：21に対応し、44-120は配列番号：7に対応し、 A45Gを有する44-120 は配列番号：22に対応し、 A51Cを有する44-120 は配列番号：23に対応する）。単一点突然変異を示す。図13Bは、エフェクタードメインが構造的特徴が改善された合成配列である、内因に発現されたmRNAを標的とした機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を示す。条件に応じて、配列番号：7のような別のフォールディングが発生し、より強くなる場合がある。
【００９３】
（実施例14）
本実施例では、天然のアンチセンス長鎖非コードRNA由来のSINE配列が、部分的に重複するmRNAの翻訳上方調節のための機能性核酸分子のエフェクタードメインであることを示す。
【００９４】
特に、異なるマウスAS lncRNA由来のSINE B2エレメントがミニSINEUP中のエフェクタードメインとして作用し、HEK 293T（Riken Brc Cat. No. RCB2202）においてGFPタンパク質の発現を上方調節することができる。
【００９５】
図14A は、ミニSINEUP-GFPにクローニングして、エフェクタードメインとしてのAS Uchl1由来の元の逆向きSINE B2配列を置き換えた天然機能性アンチセンスlncRNA由来のSINE B2配列を示す。GFP標的配列は、開始AUGコドンを基準として、-40/+4ヌクレオチドであった。配列は以下の順とする：配列番号：44、配列番号：47、配列番号：50〜配列番号：62。図14Bは、センス鎖EGFP及びミニSINEUP-GFPを用いた共トランスフェクション後（トランスフェクション後24時間）のHEK293T細胞におけるGFPタンパク質の誘導倍数を示す。ウェスタンブロット画像及び対応するGFPバンド強度（ACTB発現レベルに対し正規化）は、ImageJソフトウェアを使用して計算する。空のベクターは陰性対照として使用し、一方AS Uchl1（AS Uchl1 SINEB2を含むミニSINEUP）は陽性対照として使用する。試料ラベルは、SINEB2配列を単離する元となったAS lncRNAの名称を示す。4つのサブファミリーを代表するSINEB2配列（RepeatMaskerの注釈に基づく）、すなわちB3、B3A、Mm2、及びMm1tを試験した。SINEB2 エレメントは、特に明記されていない限り、B3サブファミリーから得た。AS Uchl1＋AS Uxt-bは、 AS Uchl1 SINEB2及びAS Uxtの第2のSINEB2をEDで組み合わせたものを意味する。3X は、SINEB2及びSINEB2/B3コンセンサスの3つの反復配列が、RepBaseデータベースから得たB3サブファミリーのコンセンサス配列であることを示す。n＝5；エラーバー ±SEM； **** P<0.00005； ***P<0.0005； ** P<0.005； * P<0.05； 両側スチューデントt-検定。
【００９６】
図14Cは、SINEUP-GFPでEDとして試験したSINEB2配列を示す。
【００９７】
図14Dは、抗GFP抗体及び抗ACTB抗体を用いたウェスタンブロット画像及びImageJソフトウェアを使用して計算した、対応するGFPバンドの強度（ACTB発現レベルに対し正規化）を示す。ACTB はローディング対照として使用する。ここで、AS Uchl1 SINEB2は、EGFPの開始コドン（+21 nt スペーサー配列）に関して-40/+32に設計されたBD、EDとしてのAS Uchl1 SINEB2、さらにAlu及びAS Uchl1由来の3’テールを含むSINEUP-GFPである。AS Txnip SINEB2及びAS Uxt-SINEB2は、AS Uchl1 SINEB2をそれぞれAS Txnip及びAS Uxt (SINEB2-b)由来のSINEB2エレメントに置き換えたことを除いて、同じ設計に従う。AS Uchl1_Δ5’-28ntは、AS Uchl1 SINEB2と同じであるが、BDがより短い（EGFP開始コドンに関して-40/+4）。direct＝順方向のSINEB2；Δ＝欠失、n＝3；エラーバー ±SEM ；** P < 0.005； * P < 0.05； 両側スチューデントt-検定。
【００９８】
（実施例15）
本実施例では、機能性核酸分子中の翻訳上方調節機能について活性を示すSINE配列が、配列一致率に乏しいことを示す。本実施例では、エフェクタードメイン機能の構造依存性を示唆する。
【００９９】
図15は、異なるマウスAS lncRNA由来のSINE B2エレメントのClustalWによる配列アラインメントを示す。SINEUP-GFP及びミニSINEUP-GFP（実施例14）中の翻訳上方調節機能のために選択されたマウスSINEB2配列を、MEGA5ソフトウェアのClustalWによってアライメントする。配列は以下の順とする：配列番号：44〜配列番号：49、及び配列番号：52〜配列番号：62。アラインメント中のギャップは「-」で示す。塩基は4 種類の異なる灰色の網掛けにより強調する。Aボックス及びBボックスを黒い四角で示す。アラインメントから、同じファミリーのSINEのメンバー内で配列の変化が示される。
【０１００】
（実施例16）
本実施例は、翻訳上方調節活性を有するアンチセンス機能性核酸分子中でエフェクタードメインとして作用する進化的に遠い種由来のSINE配列を示す。
【０１０１】
図16Aに示すように、進化的に遠い種由来のSINE配列及び定義された二次構造を有するSINE配列（Sun Fen-Jieらの文献、Trends in Genetics, 2011）を解析のために選択した。これらの配列は、アラインメント解析によって示す配列一致率に乏しい。配列表には、図16Aで示すDNA配列に対応するRNA配列を含める（配列番号：24〜配列番号：33）。また、配列表には逆向きRNA配列を含める（配列番号：34〜配列番号：43）。図16Bでは、HEK 293T/17細胞に、示されている通り、eGFP発現プラスミドを空ベクター（-）又は元の逆向きSINE配列（暗青色、B2）又は示されたエフェクタードメインによる交換突然変異体を含むSINEUP-GFPと組み合わせて、順方向及び逆方向にクローニングしたものをトランスフェクションした。GFPの自家蛍光は、CeligoS自動イメージングシステムを使用して記録した。データは、空ベクター（pCDNA3.1）をトランスフェクションした細胞（N＞7レプリカ）に対して正規化されたGFP蛍光の結果を示す。データは平均±標準偏差を示す。フレーム付きカラムは、SINEUPの活性がSINE B2陽性対照と比較して増強される条件を示す。図16Cに示すように、qRT-PCR解析より、タンパク質上方調節は、GFP mRNAレベルが安定している場合に起こることが示される（転写後）。Celigo Sによる測定後、RNAを抽出し、精製した。GFP mRNA及びSINEUP-GFP RNAは、特異的プライマーを用いたqRT-PCRにより解析した。N＝3、SINE B2は1に設定する。
【０１０２】
（実施例17）
本実施例では、進化的に遠い種由来のSINE配列のより強力な翻訳上方調節活性が、より複雑な2次構造（ステムループの組合わせ）と相関することを示す。
【０１０３】
図17Aでは、HEK 293T/17細胞に、eGFP発現プラスミドを空ベクター（-）又は元の逆向きSINE配列（SINE B2）又は示されたエフェクタードメインによる交換突然変異体を含むSINEUP-GFPと組み合わせたものをトランスフェクションした。抗GFP抗体を用いたウェスタンブロット解析を実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした。β-アクチンをローディング対照として使用した。図17Bでは、β-アクチン対照に対する正規化に基づき、GFPタンパク質量を画像解析によって計算した。N＝5レプリカからのデータを、平均±標準偏差として表す。統計解析は t-検定 を使用して実行した（p値を示す）。図17Cは、さまざまな種由来の最も活性の高いSINEを、それらの関連する構造とともに示す。SINEの全体構造を、線（ステム）及び丸（ヘアピンループ）で表す。最も活性の高いSINEは全て、保存された頂端部のステムループ構造を共有していることに留意されたい。実に、このステムループ構造は、進化的に遠い種のSINEの翻訳上方調節活性に重要なエレメントであることが示されている。
【０１０４】
（実施例18）
本実施例では、構造モチーフ（モチーフ1、IL-3/SL-3及びモチーフ2、SL-1）が機能性核酸分子のより強力なSINE配列間で共有されていることを示す。
【０１０５】
図18は、機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を有する、進化的に遠い種由来のSINE配列の2D構造モチーフ解析を示す。図18Aは、実施例2の逆向きSINE B2 RNAの2D構造を示す（配列番号：5）。図18Bは、RNA foldウェブサーバがデフォルト設定で決定したB2 コンセンサスSINE RNA （配列番号：30）の予測される2D構造を示す。図18Cは、酵素的プローブ法を用いた SmaI SINE RNA （配列番号：27）の2D構造を示す。LINE RTの推定認識領域を破線の四角で囲む（H Kawagoe-Takakiらの文献、Gene 365 (2006), 67-73)。図18Dは、逆向きSINE B2及びB2 SINEの2D構造からのステム構造体モチーフ1（中間ステム、IL-3、SL-3）を示す。モチーフ1構造は中央ループ構造の間にステムを形成する。図18Eは、逆向きSINE B2、B2 SINE、及びSmaI SINEの 2D構造由来のステム構造モチーフ2（SL-1）を示す。モチーフ2構造は、エッジループ構造の近くにステムを形成する。
【０１０６】
ここでも、図18A、18B、18Cの3つの構造は、保存された頂端部のステムループ構造を共有していることに留意されたい。
【０１０７】
（実施例19）
本実施例では、新たな合成エフェクタードメイン配列を、構造特徴（38 nt、ステムループ構造SL1）に基づいて設計できること、及びこれらが過剰発現させたmRNAとともに機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を有することを示す。1次ヌクレオチド配列は異なるが、構造は同じである配列につき、活性を得る。特に、逆向きSINE B2のより短い構造ベースのバリアントは、内因のmRNA（59-96 SL1 SINEUP-GFP）を標的とする機能性核酸分子のエフェクタードメインとしての翻訳上方調節活性を示す。図19Aは、SL1（59-96 nt、配列番号：12に対応する）を強調した、逆向きSINE B2の2次構造に注釈された構造ベースの突然変異の模式的表示である。図19Bでは、エフェクタードメインが構造的特徴が保存されたより短い合成配列である、内因に発現されたGFP mRNAを標的とした機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を示す(38 nt、SL1）。HEK 293T/17細胞は示されている通り、eGFP発現プラスミドを、空ベクター（-）又は1-183 SINEUP-GFP（配列番号：5を含む）、1-183 SINEUP-GFP ポリA（配列番号：63）及びSL1 59-96ポリA SINEUP-GFP （ 配列番号：64）と組み合わせたものでトランスフェクションした。抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットを実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした。β-アクチンをローディング対照として使用した。β-アクチンに対して正規化されたウェスタンブロット画像について空の対照試料を基準にして、誘導倍数を計算した。図19Cには、4つの独立した実験からのデータを示す。SL1 SINEUP-GFP翻訳エンハンサー活性を赤で示す。データは平均±標準偏差を示す。 
【０１０８】
本実験は、第1のステムループドメイン（SL-1）がHEK 293T/17細胞中でGFP mRNAと重複するアンチセンスlncRNA（59-96 SL1 SINEUP-GFP）の翻訳上方調節活性に十分であることを示す。
【０１０９】
（実施例20）
本実施例では、新たな合成エフェクタードメイン配列を、構造特徴（IL4、SL1、及びSL2を含み、配列番号：7に対応する、44-120 nt SINEUP）に基づいて設計できること、及びこれらが過剰発現させたmRNAについての機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を有することを示す。1次ヌクレオチド配列は異なるが、構造は同じである配列につき、活性を得る。特に、逆向きSINE B2のより短い構造ベースのバリアントは、内因のmRNAを標的とする機能性核酸分子のエフェクタードメインとしての翻訳上方調節活性を示す。さらに、 切断型逆向きSINE B2エレメント44-120を含むSINEUP中の突然変異U78Gは、同様の翻訳上方調節活性を維持するのに対し、三重突然変異GUG77-79CCCはその活性を大きく低下させ、ヌクレオチド77-79の機能的重要性が証明される。図20Aは、切断型逆向きSINE B2の2次構造について注釈された構造ベースの突然変異の、野生型及び突然変異配列を強調した模式的表示である（U78Gを有する44-120 は配列番号：65に対応し、 GUG77-79CCCを有する44-120 は配列番号：66に対応する）。図20Bでは、エフェクタードメインが77-79ヌクレオチド位置にwt又は突然変異型配列を含むより短い合成配列である、内因に発現されたGFP mRNAを標的とした機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を示す。HEK 293T/17細胞は、eGFP発現プラスミドを、空ベクター（-）又は44-120 SINEUP-GFP、U78Gを有する44-120 SINEUP-GFP、及びGUG77-79CCCを有する44-120 SINEUP-GFPと組み合わせたものでトランスフェクションした。抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットを実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした。β-アクチンをローディング対照として使用した。β-アクチンに対して正規化されたウェスタンブロット画像について空の対照試料を基準にして、誘導倍数を計算した。44-120 SINEUP-GFP活性は、全長の逆向きSINE B2配列を有するSINEUP-GFPの活性及びU78G突然変異を有する切断型44-120エフェクタードメインを有する44-120 SINEUP-GFPの双方と同程度であった。これに対し、GUG77-79CCCを有する44-120 SINEUP-GFPは、低い活性を示した。 
【０１１０】
本実験では、構造ベースのより短い型の逆向きSINE B2が、HEK 293T/17細胞中でのGFP mRNA（44-120 SINEUP-GFP）と重複するアンチセンスlncRNAの翻訳上方調節に十分であることを示す。また、逆向きSINE B2配列のヌクレオチド77-79が、翻訳を上方調節する能力に重要であることを示す。3つのコンストラクトは全て機能的であり、2次構造は77-79ループの3つのヌクレオチドを最適な方法で提示する。たとえこれら3つのヌクレオチドを改変しても、分子は機能を保持する。
【０１１１】
（実施例21）
本実施例では、新たな合成エフェクタードメイン配列を、構造特徴（IL4、SL1、及びSL2を含み、配列番号：7に対応する、44-120 nt SINEUP）に基づいて設計できること、及びこれらが内因に発現するmRNAについての機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を有することを示す。1次ヌクレオチド配列は異なるが、構造は同じである配列につき、活性を得る。特に、逆向きSINE B2のより短い構造ベースのバリアントは、内因のmRNAを標的とする機能性核酸分子のエフェクタードメインとして翻訳上方調節活性を示す。さらに、切断型逆向きSINE B2の2次構造について注釈された構造ベースの突然変異は翻訳活性化能力を増加させ得るのに対し（切断型逆向きSINE B2配列中に6つの点突然変異：A45G; U48C; U66G; U88C; U90C; U115Cを有し、44-120 SINEUP-DJ-1-Strongと称し、配列番号：67に対応する44-120 SINEUP-DJ-1バリアント）、切断型逆向きSINE B2の2次構造について注釈された他の構造ベースの突然変異は翻訳上方調節能力が変わらないか、又は低下するように維持され得る（切断型逆向きSINE B2配列中に5つの点突然変異：G49A; U66A; G68A; G116A; C119Aを有し、44-120 SINEUP-DJ-1-Weakと称し、配列番号：68に対応する44-120 SINEUP-DJ-1バリアント）。この2つのバリアントの設計の根拠は、44-120 SINEUPの構造に従い、dsRNAの2つのストレッチ（114-120について44-50、82-92について64-74）に5塩基対のミスマッチ（45-119、48-116、49-115、66-90、68-88）があることである。44-120 SINEUP Strongでは、突然変異体塩基対がG:C対を確立するように設計されている。44-120 SINEUP Weakでは、突然変異体塩基対がU:A対を確立するように設計されている。G:C対は、要因の中でも特に3対2水素結合の形成のためにより安定であるため、5つのG:C対を有する突然変異体44-120 SINEUPをStrongと表示し、一方で5つのU:A対を有する突然変異体44-120 SINEUPをweakと表示する。  
【０１１２】
図21Aは、切断型逆向きSINE B2 2次構造につき44-120 SINEUP-DJ-1-Strong及び44-120 SINEUP-DJ-1-Weakに対して注釈された構造ベースの突然変異の模式的表示である。突然変異の位置は矢印で示す。図21Bは、エフェクタードメインがより短い合成配列（44-120 SINEUP-DJ-1）又は6つの点突然変異（44-120 SINEUP-DJ-1-Strong）又は5つの点突然変異（44-120 SINEUP-DJ-1-Weak）により改変された同配列である、内因に発現するDJ-1 mRNAを標的とする機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を示す。HEK 293T/17細胞は、eGFP発現プラスミドを、空ベクター（-）又は44-120 SINEUP-DJ-1、44-120 SINEUP-DJ-1-Strong、及び44-120 SINEUP-DJ-1-Weakと組み合わせたものでトランスフェクションした。抗DJ-1抗体を用いたウェスタンブロットを実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした。β-アクチンをローディング対照として使用した。β-アクチンに対して正規化されたウェスタンブロット画像について空の対照試料を基準にして、誘導倍数を計算した。図21Cには、3つの独立した実験からのデータを示す。44-120 SINEUP-DJ-1の活性は44-120 SINEUP-DJ-1-Weakと同等である一方、44-120 SINEUP-DJ-1-Strongは統計的に有意に高かった。データは平均±標準偏差を意味する。
【０１１３】
本実験では、構造ベースのより短い型の逆向きSINE B2が、翻訳上方調節に十分であることを示す（44-120 SINEUP-DJ-1）。さらに、44-120 SINEUP-DJ-1-Strongは、44-120 SINEUP-DJ-1に対してより高い翻訳アクチベーター活性を呈する。44-120 SINEUP-DJ-1-Weakは、44-120 SINEUP-DJ-1と同程度又はそれ以下の翻訳上方調節活性を呈する。
【０１１４】
（実施例22）
図23Aは、ミニSINEUP-GFPにおけるAS Uchl1 SINEB2のicSHAPEデータにより導いた2次構造を示す。icSHAPE濃縮スコアデータは、ViennaRNAのRNAfoldツールのソフト制約として使用した。線形マッピング方法を使用して対形成率を導出し、Zarringhalamらの文献(2012)に記載された方法を選択して誘導偽エネルギーをフォールディングアルゴリズムに取り込んだ。2次構造を描画するために、fornaサーバを使用した。暗い点は icSHAPE濃縮スコア≧0.8 ；明るい点は濃縮スコア0.5〜0.8。濃縮スコアは0〜1のスケールでスケール化する。ここで1は、ヌクレオチドが非対合状態にある確率が高いことを示し、0は対合する傾向を示す。SINEB2のBボックス領域及びAボックス領域を線でマークする（それぞれ図の上の部分及び図の下の部分）。本研究で機能試験されたSINEB2の全ての配列及びicSHAPEにより誘導した2D構造を、2つのRNAに共通する正確一致配列構造モチーフを計算するExpaRNAツール（Heyne, S.らの文献、Bioinformatics, 2009, 25:2095-2102）を用いてこの構造及びAS Uchl1 SINEB2の配列とペアワイズに比較した。このように、続いて全てのペアワイズ比較から得た導出モチーフファイルをスクリーニングし、全ての比較における少なくとも2 merの長さの1又は複数のモチーフに存在するAS Uchl1 SINEB2の位置を抽出した。全てのSINEB2に共通する類似した配列及び構造モチーフの位置を、それらの対応するモチーフ番号とともに四角で示す。2 mer以上のモチーフを共通の領域を識別するために考慮し、かつSINEB2の配列は高度に可変性であるため、ほとんどの場合、部分一致のみが見いだされる。図23Bは、図23Aに示す共通の配列及び構造モチーフに照らして拡大したものを示す。モチーフ2及び3並びにモチーフ4、5、6、及び7は類似しており、それぞれ主にAGG及びUGGのトリヌクレオチドから構成されることに留意されたい。異なるモチーフ番号を、それらの配列及び近隣構造及びSINEB2上の位置に基づいて割り当てる。それらの配列組成が類似しているため、時に1つのクエリー配列のヒットが複数のモチーフと一致し、又は1つのモチーフがクエリー配列中で複数の位置と一致する。
【０１１５】
（実施例23）
図24では、ExpaRNAを用いた（A）SINEUP-GFP中及び（B）ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2の2D構造の比較を示す。異なる網掛け領域は、2つのRNA間の配列及び構造の対応する正確な一致を示す。AS Uchl1 SINEB2 2D構造及びミニSINEUP-GFPはほぼ同一であり、この構造が細胞内で高度に安定であり、優勢であることを示唆している。構造が異なる唯一の領域は、黒い四角でマークする。
【０１１６】
（実施例24）
図25では（A）SINEUP-GFP中及び（B）ミニSINEUP-GFP中のAS Uxt SINEB2-bの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。異なる網掛け領域は、2つのRNA間の配列及び構造の対応する正確な一致を示す。ここで全体的な構造は、SINEUP及びミニSINEUPの間でかなり異なるが、一部の領域は構造が保存されており（例えば、四角で囲んだ領域）、SINEUPの機能にとって非常に重要である可能性がある。
【０１１７】
（実施例25）
図26では、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)SINEUP-GFP中のAS Txnip SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。異なる網掛け領域は、2つのRNA間の正確な配列及び構造一致の特有のパターンに対応することを示す。全てのSINEB2に共通する類似した配列及び構造モチーフの位置を、それらそれぞれのモチーフ番号とともに四角で示す。それらの配列組成は類似しているため、一部の例では、モチーフ2及び3が重複し得る。このことはモチーフ4、5、6、及び7についてもいえる。
【０１１８】
（実施例26）
図27では、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)SINEUP-GFP中のAS Uxt SINEB2-bの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１１９】
（実施例27）
図28では、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2及び（B)ミニSINEUP-GFP中のAS Uxt SINEB2-bの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。異なる網掛け領域は、2つのRNA間の正確な配列及び構造一致の特有のパターンに対応することを示す。上記と同じことがいえる。
【０１２０】
（実施例28）
図29では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)SINEB2/B3コンセンサス（逆相補的）の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２１】
（実施例29）
図30では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)AS Nars2 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２２】
（実施例30）
図31では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)AS Abhd11 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２３】
（実施例31）
図32では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)AS Epb4.9 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２４】
（実施例32）
図33では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)AS Wfdc5 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２５】
（実施例33）
図34では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)AS Pgbd1 SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２６】
（実施例34）
図35では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)AS Gsk3β SINEB2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２７】
（実施例35）
図36では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)AS Rhod SINEB2-Mm2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２８】
（実施例36）
図37では、ミニSINEUP-GFP中の（A)AS Uchl1 SINEB2及び（B)AS Rhod SINEB2-B3Aの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１２９】
（実施例37）
図38では、ミニSINEUP-GFP中の（a)AS Uchl1 SINEB2及び（b)AS E4f1 SINEB2-Mm2の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１３０】
（実施例38）
図39では、ミニSINEUP-GFP中の（a)AS Uchl1 SINEB2及び（b)AS E4f1 SINEB2-Mm1tの2D構造のExpaRNA正確パターンマッチ及びモチーフ解析の結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１３１】
（実施例39）
図40では、AS-Uchl1 SINEB2の構造力学を示す。SINEB2 RNA構造をより小さな断片に分割する目的は、全長（FL）が大きすぎて現在のNMRの磁力を解析できないことである。1H NMR スペクトルのイミノプロトンシグナルを正しく帰属するには、構造を分割する必要がある。分割されたRNAは、FLと同様の構造を形成するべきである。TM、C、MC2の1H NMRスペクトルから、それが示唆される。さらに、これらの構造はNMR水性緩衝液中では、化学フットプリンティング測定に関して、異なる形態をとる(図2) 。生理的条件、例えば異なる細胞区画において、構造力学が生じ得る（Sunらの文献、bioRxiv 2018., https://doi.org/10.1101/399386）。 
【０１３２】
図40Aでは、RNA foldプログラムによるAS-Uchl1由来FL SINEB2及びその構造の一部のコンピュータ予測構造を示す。FLは3つの構造（TM、C、MC2）に分割された。
【０１３３】
図40Bでは、NMR 1Hスペクトルによる残基の帰属を示す。MC2、C、TM構造のほぼすべてのシグナルピークがFL構造に確認された。これらの結果は、MC2、C、及びTMが FL 構造と同じ構造を形成していることを示唆する。
【０１３４】
図40Cでは、核オーバーハウザー効果分光法（NOESY）（右）で5つのステム構造（左に点線の四角でマークしたステム）が帰属されたことを示す。 
【０１３５】
（実施例40）
図41では、AS-Uchl1 SINEB2の構造力学を示す。
【０１３６】
FL及びCのコンピュータ予測では両方とも、46-49及び58-61（（A)中の点線の丸）でステム構造を形成するが、これは図1及び図2の化学フットプリンティングによっては確認されなかった。さらに、50-57のループ及び18-123の一本鎖領域は、図1及び図2の化学フットプリンティングによっては確認されなかった。しかしながら、1H NMRスペクトル及びNOESYにより、46-49及び58-61でのステム構造（図40B及び40C）がコンピュータ予測構造と同じであることが確認された。46-49及び58-61のステム構造がループ50-57及び一本鎖領域18-123での任意の他の構造化されていない残基と関連するかどうかを、1H NMRスペクトルでA51＞C突然変異体RNA及びSINEB2 RNAの一部を使用することにより、解析した。言い換えれば、化学フットプリンティング測定の未決定の構造が同時に現れ、NMR緩衝液条件において、相互に関連しているかどうかを調べた。 
【０１３７】
本実施例では以下を示す： 
ａ） RNAfoldプログラムによるFL及びCドメイン(34-122)のコンピュータ予測構造。Cの構造は、FLの構造の未フォールド領域に分割された（118-123）。Cの構造の5つの残基（118-120）は、反対側の残基を含むステムを形成する。 
b） 3つの小RNA（34-120、34-121、34-122）及びFLの1H NMRスペクトル。34-120は45-49及び58-61（U61、G60、G49、U48、及びG59の縦線のピーク）のステムを示さなかったが、他の3つの構造（FL、34-121、及び34-122）はこれらのピークを示した。図41Bでは、118-123の未フォールドのループが 46-49及び58-61でのステムの形成に重要であったことを示す。図41Bはタンパク質合成が増加しているA51Cの1H NMR スペクトルを示している（図12）。A51＞C突然変異の結果として、U48及びG59（縦線）のピークで化学シフトが発生する。さらに、FLの未帰属の2つのピーク（U61及びU48の左の縦線）が消失した。これらのピークシフトは、A51での突然変異により、46-49でのステムの結合位置が変化し、タンパク質合成の機能が増加することを示唆する。全体として、50-57及び118-123のループ構造は、NMR緩衝液（20 mM MES (pH6.0)、50 mM NaCl、8% D2O、298K）の水性条件下での46-49及び58-61にあるステムの構造形成と相互作用する。図41は、SINEB2構造が厳密ではなく、一部の構造が動的であることを示唆する。A中の丸は、B中の丸に対応する。 
【０１３８】
（実施例41）
図42は、様々なED長の合成SINEUP及び構造モチーフの組合わせがどの程度GFPタンパク質の発現を上方調節するかを示す。
【０１３９】
センス鎖EGFP並びに(A) SINEUP (n＝3)、及び(B) ミニSINEUP(n＝4) を用いた共トランスフェクション後(トランスフェクション後24時間）、HEK293T/17細胞における平均的なGFPタンパク質の変化倍数。ウェスタンブロット画像及び対応するGFPバンド強度（ACTB発現レベルに対し正規化）は、ImageJソフトウェアを使用して計算する。空のベクターは陰性対照として使用し、一方AS Uchl1（AS Uchl1 SINEB2を含むSINEUP又はミニSINEUP）は陽性対照として使用する。SINEUP IDは、括弧内のEDの長さに従う。エラーバー±SD ； **** P＜0.00005 ； *** P＜0.0005 ； ** P＜0.005 ； * P＜0.05 ；両側スチューデントのt-検定。本実験で試験する（図23に記載のモチーフに基づく）構造モチーフの組合わせをコンストラクトの完全な特徴とともに以下に提供する。明確性を確保するため、配列番号はエフェクタードメインの配列のみを示す。これはSINEUP及び対応するミニSINEUPでも同じとする。
【０１４０】
SINEUP 071/ミニSINEUP 071 （206 nt）：5'末端から部分モチーフ1、部分モチーフ2及び3（重複）、完全モチーフ 6 、部分モチーフ 4及び7
SINEUP 071
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED （配列番号：69）＝SacII及びClaI の制限部位間；AS Uchl1、AS Uxt-b、及びAS Txnip SINEB2エレメント（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）のグローバル配列構造アラインメントに基づくコンセンサス2D構造に由来する206 nt長の配列。
SINEUP長＝1380 nt
ミニSINEUP 071
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+4 （+21 ntスペーサー）
ED = EcoRI及びHindIIIの制限部位間；（配列番号：69）
SINEUP長＝289 nt
SINEUP 072/ミニSINEUP 072 （206 nt）：5'末端から部分モチーフ2、完全モチーフ1、部分モチーフ4、完全モチーフ 7
SINEUP 072
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED （配列番号：70）＝SacII及びClaI の制限部位間；AS Uchl1、AS Uxt-b SINEB2エレメント（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）のグローバル配列構造アラインメントに基づくコンセンサス2D構造に由来する206 nt長の配列。
SINEUP長＝1380 nt
ミニSINEUP 072
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+4 （+21 ntスペーサー）
ED＝EcoRI及びHindIII制限部位間； 配列番号：70
SINEUP長＝289 nt
SINEUP 073/ミニSINEUP 073 （156 nt）：5'末端から完全モチーフ1、部分モチーフ2及び3（重複）、部分モチーフ4 、完全モチーフ6、部分7
SINEUP 073
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）  
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED （配列番号：71）＝SacII及びClaI の制限部位間；AS Uchl1及びAS Uxt-b SINEB2エレメント（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）のローカル配列構造アラインメントに基づくコンセンサス2D構造に由来する156 nt長の配列。
SINEUP長＝1330 nt
ミニSINEUP 073
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴：   BD＝-40/+4 （+21 ntスペーサー）
ED＝EcoRI及びHindIII制限部位間； 配列番号：71
SINEUP長＝239 nt
SINEUP 074/ミニSINEUP 074 （68 nt）：5'末端から部分1、7、6（重複）、部分2
SINEUP 074
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED （配列番号：72）＝SacII及びClaI の制限部位間；AS Uchl1、AS Uxt-b、及びAS Txnip SINEB2エレメント（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）のローカル配列構造アラインメントに基づくコンセンサス2D構造に由来する68 nt長の配列。
SINEUP長＝1242 nt
ミニSINEUP 074
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+4 （+21 ntスペーサー）
ED＝EcoRI及びHindIII制限部位間； 配列番号：72
SINEUP長＝151 nt
SINEUP 075/ミニSINEUP 075 （110 nt）：5'末端から完全1、2、3、及び6
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED（配列番号：73）＝SacII及びClaIの制限部位間；110 nt；Δ28-32、Δ42-60、Δ90-116、Δ131-135 AS Uchl1 SINEB2欠失突然変異体（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）
SINEUP長＝1284 nt
ミニSINEUP 075
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+4 （+21 ntスペーサー）
ED＝EcoRI及びHindIII制限部位間； 配列番号：73
SINEUP長＝193 nt
AS Uchl1及びAS Uchl1_Δ5’-28nt (167 nt)：陽性対照、7つのモチーフ全て
【０１４１】
本実験で試験する全てのモチーフの組合わせはGFPの発現を上方調節するが、陽性対照によって誘導されるタンパク質変化倍数を上回ることはできなかった。これは、異なるモチーフがSINEUP活性に組合わせ効果を及ぼすことを示唆している。実施例22で説明したように、ほとんどのモチーフは類似した配列組成を有しており、それにより任意の欠落しているモチーフが補償され、 SINEUP活性の最小レベルが保証されるのかもしれない。最適なSINEUPの効果は陽性対照（AS Uchl1 SINEB2）から明らかなように、7つのモチーフの全てをそれらそれぞれの順序にとることによって得られる。興味深いことに、SINEUP 074及びミニSINEUP 074はEDが短く、従ってモチーフを欠いているにもかかわらずGFPタンパク質の発現を増加させ、SINEUPの活性に要求される最小機能性配列の一例となっている。
【０１４２】
（実施例42）
図43では、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（B)ミニSINEUP 071 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。異なる網掛け領域は、2つのRNA間の正確な配列及び構造一致の特有のパターンに対応することを示す。全てのSINEB2に共通する類似した配列及び構造モチーフの位置を、それらそれぞれのモチーフ番号とともに四角で示す。それらの配列組成は類似しているため、一部の例では、モチーフ2及び3が重複し得る。このことはモチーフ4、5、6、及び7についてもいえる。
【０１４３】
（実施例43）
図44では、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（B)ミニSINEUP 072 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１４４】
（実施例44）
図45では、（A)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（B)ミニSINEUP 073 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１４５】
（実施例45）
図46では、（a)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（b)ミニSINEUP 074 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１４６】
（実施例46）
図47では、（a)ミニSINEUP-GFP中のAS Uchl1 SINEB2（icSHAPEで誘導）及び（b)ミニSINEUP 075 ED(RNAfoldで予測) の2D構造のExpaRNA正確パターンマッチの結果を示す。上記と同じことがいえる。
【０１４７】
（実施例47）
図48では、AS Uchl1由来SINE B2の構造断片がどの程度GFPタンパク質の発現を上方調節するかを示す。
【０１４８】
(A)センス鎖EGFP及びSINEUP(n＝2) を用いた共トランスフェクション後(トランスフェクション後24時間）、HEK293T/17細胞における平均的なGFPタンパク質の変化倍数。ウェスタンブロット画像及び対応するGFPバンド強度（ACTB発現レベルに対し正規化）は、ImageJソフトウェアを使用して計算する。空ベクターを陰性対照として使用する。 
【０１４９】
本実験における全ての構造断片はGFPの発現を上方調節するが、AS Uchl1 SINEB2によって誘導されるタンパク質変化倍数を上回ることはできなかった。これらの断片は、AS Uchl1 SINEB2の構造と同じ構造を形成する（図23）。
【０１５０】
これは、異なるモチーフを有する構造がSINEUP活性に組合わせ効果を及ぼすことを示唆している。図23で説明したように、ほとんどのモチーフは類似した配列組成を有しており、それにより任意の欠落しているモチーフが補償され、SINEUP活性の最小レベルが保証されるのかもしれない。最適なSINEUPの効果は陽性対照（AS Uchl1 SINEB2）から明らかなように、7つのモチーフの全てをそれらそれぞれの順序にとることによって得られる。 
【０１５１】
（B）このAS Uchl1 SINEB2の構造は、NMR分光法溶液中で別の構造として確認されている。AS Uchl1 SINEB2のより短い構造である他の断片は、形態を維持する。モチーフの組合わせは、新たな図23に対応する。
【０１５２】
（図23に記載のモチーフに基づく）構造モチーフの組合わせをコンストラクトの完全な特徴とともに以下に提供する。明確性を確保するため、配列番号はエフェクタードメインの配列のみを示す。
AS Uchl1 SINEB2：5'末端から完全モチーフ1、部分モチーフ2、完全モチーフ3、部分モチーフ5、完全モチーフ6、及び完全モチーフ７
24-150 （126 nt）: 5'末端から完全モチーフ3、部分モチーフ4、部分モチーフ5、完全モチーフ6、及び完全モチーフ７
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED （配列番号：74）＝SacII及びClaI の制限部位間；AS Uchl1 SINEB2エレメント（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）由来の126 nt長の配列。
SINEUP長＝1300 nt
C_34-122 （89 nt）：5末端から部分モチーフ4、5、及び完全モチーフ6、及び完全モチーフ７
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED （配列番号：75）＝SacII及びClaI の制限部位間；89 nt長の配列は、AS Uchl1 SINEB2エレメント（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）中に含む。
SINEUP長＝1263 nt
TM(72 nt)：5'末端から完全モチーフ1、完全モチーフ2、完全モチーフ3、完全モチーフ4、及び部分モチーフ6(重複)
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED （配列番号：76）＝SacII及びClaI の制限部位間；72 nt長の配列は、AS Uchl1 SINEB2エレメント（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）中に含む。
SINEUP長＝1246 nt
MC2 （ 94 nt）：5'末端から完全モチーフ3、完全モチーフ4、部分モチーフ5、及び完全モチーフ7。
レシピエントプラスミド： pcDNA3.1（-）
クローニング制限部位：XhoI-HindIII
特徴： BD＝-40/+32 （+21 ntスペーサー）
ED （配列番号：77）＝SacII及びClaI の制限部位間；AS Uchl1 SINEB2エレメント（＋Alu及びAS Uchl1由来の3’テール領域）由来の94 nt長の配列。
SINEUP長＝1268 nt
【０１５３】
（実施例48）
図49は、SINEUPが環状RNAとして発現された場合に活性を示すことを示す。環状SINEUP-DJ-1（circSINEUP-DJ-1）は、HEK 293T/17細胞における標的DJ-1 mRNAレベルを変化させることなく、結合ドメイン依存的な方法で、内因のDJ-1タンパク質レベルを増加させることができる。
【０１５４】
本実施例では、SINEUP配列は環状RNAとなり得ること、及びこれらが内因のmRNA への機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を有していることを示す。活性は、同じ1次ヌクレオチド配列を有するが、線状SINEUP-DJ-1の5'末端及び3'末端が共有結合により連結されたものについて得られる。図49Aは、逆向きSINE B2の標準配列及びDJ-1 mRNAに対する結合ドメインの両方を含む環状SINEUP-DJ-1 RNA (circSINEUP-DJ-1)の模式的表示である。図49Bは、SINEUPが環状形態をとる、内因に発現されたDJ-1mRNAを標的とした機能性核酸分子の翻訳上方調節活性を示す。HEK 293T/17細胞に空ベクター又は環状SINEUP-DJ-1及びDJ-1 mRNA に対するアンチセンス配列を欠いている環状SINEUP-DJ-1ΔBDをトランスフェクションした。抗DJ-1抗体を用いたウェスタンブロットを実施して、過剰発現させたタンパク質をモニタリングした。β-アクチンをローディング対照として使用した。β-アクチンに対して正規化されたウェスタンブロット画像について空の対照試料を基準にして、誘導倍数を計算した。図49Cは、環状SINEUP-DJ-1 RNA及びDJ-1 mRNAレベルを定量するためのリアルタイムqPCR解析を提示し、機構が転写後のものであることを証明する。
【０１５５】
（利点）
SINE B2の構造エレメントを同定することで、活性が増加し、ヒトにおける潜在的な有用性を有するSINEUPバリアントの選択及び設計のための構造誘導型戦略が可能となる。特に、より短いSINEUPのバリアントは、いくつかの理由、中でもインビボ送達及び安定性の理由から、有利である。
【図１】
2021512646.tif 000018
【図２】
2021512646.tif 000019
【図３Ａ−Ｂ】
2021512646.tif 000020
【図３Ｃ】
2021512646.tif 000021
【図４】
2021512646.tif 000022
【図５】
2021512646.tif 000023
【図６】
2021512646.tif 000024
【図７Ａ】
2021512646.tif 000025
【図７Ｂ】
2021512646.tif 000026
【図７Ｃ】
2021512646.tif 000027
【図８】
2021512646.tif 000028
【図９】
2021512646.tif 000029
【図１０Ａ】
2021512646.tif 000030
【図１０Ｂ】
2021512646.tif 000031
【図１０Ｃ】
2021512646.tif 000032
【図１０Ｄ】
2021512646.tif 000033
【図１１】
2021512646.tif 000034
【図１２Ａ−Ｂ】
2021512646.tif 000035
【図１２Ｃ】
2021512646.tif 000036
【図１３】
2021512646.tif 000037
【図１４Ａ−Ｂ】
2021512646.tif 000038
【図１４Ｃ−Ｄ】
2021512646.tif 000039
【図１５】
2021512646.tif 000040
【図１６Ａ】
2021512646.tif 000041
【図１６Ｂ−Ｃ】
2021512646.tif 000042
【図１７】
2021512646.tif 000043
【図１８】
2021512646.tif 000044
【図１９】
2021512646.tif 000045
【図２０】
2021512646.tif 000046
【図２１】
2021512646.tif 000047
【図２２】
2021512646.tif 000048
【図２３】
2021512646.tif 000049
【図２４】
2021512646.tif 000050
【図２５】
2021512646.tif 000051
【図２６】
2021512646.tif 000052
【図２７】
2021512646.tif 000053
【図２８】
2021512646.tif 000054
【図２９】
2021512646.tif 000055
【図３０】
2021512646.tif 000056
【図３１】
2021512646.tif 000057
【図３２】
2021512646.tif 000058
【図３３】
2021512646.tif 000059
【図３４】
2021512646.tif 000060
【図３５】
2021512646.tif 000061
【図３６】
2021512646.tif 000062
【図３７】
2021512646.tif 000063
【図３８】
2021512646.tif 000064
【図３９】
2021512646.tif 000065
【図４０Ａ−Ｂ】
2021512646.tif 000066
【図４０Ｃ】
2021512646.tif 000067
【図４１】
2021512646.tif 000068
【図４２】
2021512646.tif 000069
【図４３】
2021512646.tif 000070
【図４４】
2021512646.tif 000071
【図４５】
2021512646.tif 000072
【図４６】
2021512646.tif 000073
【図４７】
2021512646.tif 000074
【図４８Ａ】
2021512646.tif 000075
【図４８Ｂ】
2021512646.tif 000076
【図４９】
2021512646.tif 000077
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月27日(2020.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021512646000001.app
【国際調査報告】
2021512646.tif 000078
2021512646.tif 000079
2021512646.tif 000080
2021512646.tif 000081
2021512646.tif 000082
2021512646.tif 000083
2021512646.tif 000084