(57)【要約】  本発明は、CD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 EpsilonおよびCD3 zetaうちの1つまたは複数がノックアウトされると共に、HSV-TK遺伝子が導入されるユニバーサルCAR-T細胞を公開する。本発明は、さらに、上記のCAR-T細胞の調製方法、該CAR-T細胞含有製剤および該CAR-T細胞の使用に関する。  【選択図】図４
2021528080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CAR-T細胞は、CD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 EpsilonおよびCD3 zetaうちの1つまたは複数がノックアウトされる
ことを特徴とする、ユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項２】
前記CAR-T細胞は、HSV-TK遺伝子が導入される
ことを特徴とする、請求項1に記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項３】
正しい遺伝子ノックアウト方法を利用して、CAR-T細胞におけるCD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 EpsilonおよびCD3 zetaうちの1つまたは複数をノックアウトするステップを含む
ことを特徴とする、請求項1または2に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項４】
さらに、T細胞にHSV-TK遺伝子を修飾するステップを含む
ことを特徴とする、請求項3に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項５】
遺伝子ノックアウト方法によるユニバーサルCAR-T細胞調製は、具体的に、
ステップ1：レンチウイルスベクター作製およびウイルス産生
CD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 Epsilon、CD3 zetaに対するsgRNAを、pLenti-CrisprV2にクローンするよう設計すると共に、レンチウイルスパッケージングプラスミドと同時形質移入後予定時間に、上清を採取してろ過し、遠心によってウイルスを濃縮することによって、plenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスが得られ、
ステップ2：CD3陰性CAR-T細胞調製
ヒトPBMCを、分離精製後、適切な刺激条件を持つ培養プレートに播種して、予定時間培養後、CARウイルスおよびステップ1で産生したplenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスを感染させ、適切な刺激条件で細胞を増幅させることにより得られる細胞からCD3陽性細胞を除去することによって、CD3陰性CAR-T細胞が得られることを含む
ことを特徴とする、請求項3に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項６】
分離精製されたヒトPBMCを培養する刺激条件は、anti-hCD3およびanti-hCD28であり、細胞を増幅させる刺激条件は、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激することである
ことを特徴とする、請求項5に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項７】
前記ステップ1において、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REVを有し、遠心は、ベックマン超遠心機およびSW28スウィングロータが用いられる
ことを特徴とする、請求項5に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項８】
前記ヒトPBMCは、臍帯血中のPBMCである
ことを特徴とする、請求項5または6に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項９】
請求項1または2に記載のユニバーサルCAR-T細胞を含む製剤。
【請求項１０】
腫瘍を治療または予防するための医薬品の調製における請求項1または2に記載のユニバーサルCAR-T細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞免疫治療技術の分野に関し、特に、ユニバーサルCAR-T細胞およびその調製方法ならびに使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的治療手段による腫瘍治療は、常に展開医療における免疫学の重要な応用方向である。各種のオミックス（ゲノミクス、プロテオミクス等）の発展につれて、腫瘍細胞の突然変異による免疫原性が広く認められ、腫瘍免疫治療の理論的根拠になっている。同時に、腫瘍免疫学研究そのもの積み重ねにつれて、腫瘍免疫治療が昨今、大きな進歩を遂げ、一連の新しい免疫治療手段が徐々に臨床にむかっている。現在の腫瘍免疫学の研究は、腫瘍免疫治療におけるT細胞殺傷の中心的な役割を打ち立て、また、キメラ抗原受容体T細胞（CAR-T細胞）は、抗体の標的認識およびT細胞の腫瘍殺傷機能に合わせて、産生された腫瘍殺傷細胞を人工的に修飾する。
【０００３】
キメラ抗原受容体T細胞という概念は、最初の1989年に、Gross、WaksとEshharにより、TNPを認識する抗体をT細胞上で発現させることにより、抗原特異的な非MHC拘束性T細胞の活性化およびエフェクトの増強を果たすと共に、腫瘍治療におけるCAR-T技術の使用の概念を提案したものである。この原理に基づき、腫瘍特異的抗体をT細胞に埋め込むことにより、T細胞に新しい腫瘍死滅能力を与える。その後、CAR-T技術は、抗腫瘍臨床試験に導入されたが、CAR-T細胞が早期の段階においてその細胞内シグナル伝達ドメインに第１シグナルしか含まなく、また、選ばれる腫瘍タイプが固形腫瘍であるため、最終的に臨床結果がともに理想的とは言い難しいものである。2008年、Fred Hutchison腫瘍研究所などの機関によるB細胞リンパ腫に対するCAR-T療法が行われた治療結果が理想的ではないとしても、この臨床試験のポイントは、CD20発現B細胞を標的とするCAR-T治療が比較的に安全であると証することにある。そして、2010年に、NCIによって、CD19に対するCAR-Tによって患者のリンパ腫が抑制されると共に、正常なB細胞も除去され、血清Igが明らかに低減することによって、B細胞由来リンパ腫に対するCAR-T治療の効果を理論的および実際にサポートするB細胞リンパ腫治療の成功症例が1つ報じられている。2011年に、米国ペンシルベニア大学のCarl June博士のチームは、CD19を特異的に認識するCAR-Tを、B細胞由来慢性リンパ性白血病の治療に用いて、しかも、「治癒」という治療効果を示し、そして、再発・難治性急性リンパ性白血病に対して臨床試験を行って、良好な治療効果も取得した。このような画期的な進歩およびその他の免疫調節手段の発展を遂げたため、Science誌は、腫瘍免疫治療に2013年科学技術飛躍的進歩の第1位を授与した。このような成功は、世界各国において影響が広範囲に及んで、各国もCAR-Tに基づく科学的研究および腫瘍治療臨床試験を多く開始している。
【０００４】
CARの構造は、細胞外抗原認識ドメイン、細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域および細胞内シグナル伝達ドメインより構成される。細胞外抗原認識ドメインは、通常、単一鎖抗体からなり、腫瘍細胞膜表面分子を特異的に認識可能であり、ある腫瘍特異抗原リガンドまたは受容体などでもありうる。細胞外ヒンジ領域は、抗原認識ドメインと膜貫通領域を離間する一定の空間構造であって、細胞外抗原認識ドメインが抗原を認識する前後に正しい構造を維持しながら細胞内シグナルを伝達するように、適切な空間位置を与えることを目的とする。膜貫通領域は、膜表面におけるCAR分子の局在化を保証するためのドメインである。細胞内シグナル伝達ドメインは、CARシグナル伝達を媒介する重要な部分であって、通常、1つまたはいくつかの第１シグナル（TCRとMHC-I-peptide複合体認識）と第2シグナル（共刺激受容体と共刺激リガンド認識）の組み合わせである。１代目のCARは、ただ第１シグナルを含み、2代目のCARは、1つの第１シグナルと1つの第2シグナルを含み、3代目のCARは、1つの第１シグナルと2つの第2シグナルドメインを含む。CAR-Tは、B細胞由来白血病治療に大きく成功したとしても、その比較的に高い再発率や、固形腫瘍に対する低い有効性が、現在の重要な課題になっている。したがって、新世代の高薬理活性CAR-Tの発展は、現在臨床に必要なものになっている。現在、3代目のCAR-Tのほか、さらに、CAR-Tの機能を向上させるように、さらに他の新しいCAR-T設計対策があり、すなわち、2代目のCAR-Tを元にCARと個別の新しい調節分子が導入される。
【０００５】
患者自身の血液細胞から調製されるB細胞表面標的分子CD19、CD20に対するCAR-Tは、B細胞白血病治療における使用が比較的成熟したが、全体の流れが複雑で、時間がかかり、かつ、例えば病状が深刻化し、細胞品質がかなり悪化するか、または、エイズ合併リンパ腫のいくつかの特別な患者が、自己免疫細胞をCAR-Tを調製するT細胞由来として不都合である。CAR-Tは、B細胞由来白血病の治療に大きく成功したが、その全体の治療に時間がかかり、また、患者が自己細胞欠陥によってCAR-T細胞を効果的に産生することができないことがあるような患者の多様性があり、これらによってCAR-Tの使用範囲が制限されるため、このような課題がユニバーサルのCAR-Tの発展により大きく解消される。
【０００６】
現在、臨床に用いられるユニバーサルCAR-Tの計画は、ともにCRISPR/Cas9またはTALEN遺伝子編集手段で、TCRをノックアウトすることによってGVHDを回避するが、他のGVHDを効果的に回避可能なユニバーサルCAR-Tの調製方法が報じられなく、かつ、CAR-Tによるスイッチ閉鎖との併用も報じられない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、従来の技術の欠陥を克服し、CD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 Epsilon、CD3 zetaをノックアウトすることにより、GVHDを回避する効果をもたらすと共に、HSV-TK遺伝子を導入し、副作用が出現する場合、臨床で既存のガンシクロビルで治療することによって、CAR-T細胞を除去するユニバーサルCAR-T細胞を提供することを目的とする。
【０００８】
前述した目的を達成するために、本発明は、以下の請求項を利用する。
【０００９】
本発明は、1つ目の目的がCD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 EpsilonおよびCD3 zetaうちの1つまたは複数がノックアウトされるユニバーサルCAR-T細胞を提供する。
【００１０】
さらに、前述したCAR-T細胞を最適化するために、本発明に用いられる技術的手段は、さらに、以下が含まれている。
【００１１】
さらに、上記のCAR-T細胞は、HSV-TK遺伝子が導入される。
【００１２】
さらに、上記の細胞内シグナル伝達ドメインは、さらに、CD3zeta、CD28、CD137、4-1BB、ICOS、OX40、IL-12、41BBL、IL7R、IL2Rのうち少なくとも1つを含む。
【００１３】
さらに、上記の細胞外抗原認識ドメインは、anti-CD19抗体、anti-CD20抗体、EGFR抗体、HER2抗体、EGFRVIII抗体を含む単一鎖抗体、または、NKG2Dを含む腫瘍特異抗原リガンドまたは受容体である。
【００１４】
さらに、上記の細胞外ヒンジ領域は、CD8aまたはIgGの一定の領域から選ばれ、上記の膜貫通領域は、CD8a、CD28、CD137またはCD3の1つから選ばれる。
【００１５】
本発明は、2つ目の目的は、正しい遺伝子ノックアウト方法を利用して、CAR-T細胞におけるCD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 EpsilonおよびCD3 zetaうちの1つまたは複数をノックアウトするステップを含むユニバーサルCAR-T細胞の調製方法を提供する。
【００１６】
さらに、前述したユニバーサルCAR-T細胞の調製方法を最適化するために、本発明に用いられる技術的手段は、さらに、以下が含まれている。
【００１７】
さらに、上記の調製方法は、さらに、T細胞に対してHSV-TK遺伝子を修飾するステップを含み、該ステップが、当該技術分野における従来の技術的手段により実施される。
【００１８】
さらに、上記の遺伝子ノックアウト方法は、当該技術分野における適切な方法のいずれかであり、より好ましくは、CRISPR/Cas9ノックアウト方法である。
【００１９】
さらに、遺伝子ノックアウト方法によるユニバーサルCAR-T細胞の調製は、具体的に、以下のステップを含む。
【００２０】
ステップ1：レンチウイルスベクター作製およびウイルス産生
CD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 Epsilon、CD3 zetaうちの1つまたは複数に対するsgRNAを、pLenti-CrisprV2にクローンするよう設計すると共に、レンチウイルスパッケージングプラスミドと同時形質移入後予定時間に、上清を採取してろ過し、遠心によってウイルスを濃縮することによって、plenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスが得られ、
ステップ2：CD3陰性CAR-T細胞調製
ヒトPBMCを、分離精製後、適切な刺激条件を持つ培養プレートに播種して予定時間培養後、CARウイルスおよびステップ1で産生したplenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスを感染させ、適切な刺激条件で細胞を増幅させることにより得られる細胞からCD3陽性細胞を除去することによって、CD3陰性CAR-T細胞が得られる。
【００２１】
さらに、上記のステップ1の具体なステップは、crispr.mit.eduによりCD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 Epsilon、CD3 zetaに対するsgRNAを、pLenti-CrisprV2にクローンするよう設計し；正しくシークエンシングされたクローンされたエンドトキシンフリーの大量抽出物を、レンチウイルスパッケージングプラスミドと293Xで、同時形質移入後48と72時間に、上清を採取して0.45μMでろ過後、25000RPMの遠心でウイルスを2時間濃縮することによって、plenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスが得られることを含む。
【００２２】
さらに、分離精製されたヒトPBMCを培養する刺激条件は、anti-hCD3およびanti-hCD28であり、細胞を増幅させる刺激条件は、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激することである。
【００２３】
さらに、上記のステップ2の具体なステップは、ヒトPBMCをStemcell T細胞分離キット（陰性選択）を介して精製後、anti-hCD3とanti-hCD28により被覆された96ウエル培養プレートに播種後2日に、MOI=10-20でCARウイルスおよびステップ1で産生したplenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスを感染後1日に、液を交換して細胞培養を続け、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激することにより得られる細胞から、Stemcell T細胞陽性選択キットによりCD3陽性細胞を除去することによって、CD3陰性20BBZ CAR-T細胞が得られることを含む。
【００２４】
さらに、上記のステップ1において、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REVより構成され、遠心は、ベックマン超遠心機およびSW28スウィングロータが用いられる。
【００２５】
さらに、上記のヒトPBMCは、臍帯血または成人末梢血由来単核細胞である。
【００２６】
本発明の3つ目の目的は、前述したCAR-T細胞または前述した方法で調製されるCAR-T細胞を有する製剤を提供し、さらに、上記の製剤は、薬学的に許容可能な希釈剤または賦形剤をさらに含む。
【００２７】
本発明の4つ目の目的は、腫瘍を治療または予防するための医薬品の調製における前述したCAR-T細胞または前述した方法で調製されるCAR-T細胞の使用を提供する。
【００２８】
さらに、上記の腫瘍は、リンパ腫、腎腫瘍、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、肝臓腫瘍、胸腺腫、肺芽細胞腫、膵芽腫、血管腫などを含むがこれに限定されない固形腫瘍および非固形腫瘍を含む。
【００２９】
本発明は、以下、従来の技術よりも有用の効果を有する。
【００３０】
本発明は、臍帯血のPBMCを利用して、初めてCRISPR/Cas9でCD3（CD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 Epsilon、CD3 zeta）をノックアウトすることによりGVHDを回避する効果をもたらし、ユニバーサルCAR-Tを作成し、CAR-T治療の操作性および適用範囲を向上させると共に、HSV-TKを導入し、さらに、ユニバーサルCAR-Tの安全性を高める。
【００３１】
本発明に記載のユニバーサルCAR-Tは、移植片対宿主病（GVHD）が小さく、増幅CAR-T治療の便利性を大きく増加する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図1は、本発明の一実施例に用いられる20BBZ CAR分子の構造模式図である。
【００３３】
図2は、本発明の一実施例におけるCD3陰性20BBZ CAR-T細胞表現型分析の結果模式図である。
【００３４】
図3は、本発明の一実施例におけるガンシクロビルによるCD3陰性20BBZ CAR-T細胞生存している調節の模式図である。
【００３５】
図4は、本発明の一実施例におけるCD3陰性20BBZ CAR-T細胞および対照CAR-T細胞の腫瘍殺傷能の模式図である。
【００３６】
図5は、本発明の一実施例におけるCD3陰性20BBZ CAR-T細胞および対照CAR-T細胞のインビボ生存性の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
CD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 EpsilonおよびCD3 zetaがノックアウトされると共に、HSV-TK遺伝子が導入されるユニバーサルCAR-T細胞である。本発明は、さらに、前述したCAR-T細胞の調製方法、該CAR-T細胞含有製剤および該CAR-T細胞の使用に関する。
【００３８】
以下、図面と実施例に合わせて、本発明の具体な実施形態をさらに説明する。以下、実施例は、本発明の請求項をより詳しく説明するに過ぎなく、本発明の請求の範囲を限定するものではない。
【００３９】
実施例1-CD3陰性20BBZ CAR-T細胞の調製
本実施例に記載のCD3陰性20BBZ CAR-T細胞の調製は、以下のステップを含む。
【００４０】
1.レンチウイルスベクターpLenti-CrisprV2-sgRNA作成およびウイルス産生
crispr.mit.eduによりCD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 Epsilon、CD3 zetaに対するsgRNAを、pLenti-CrisprV2にクローンするよう設計し；正しくシークエンシングされたクローンされたエンドトキシンフリーの大量抽出物を、レンチウイルスパッケージングプラスミド（VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REV）と293Xで、同時形質移入後48と72時間に、上清を採取して、0.45μMでろ過後、ベックマン超遠心機およびSW28スウィングロータを利用して、25000RPMの遠心でウイルスを2時間濃縮することによって、plenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスが得られ、次のCAR-T細胞の産生に用いられる。
【００４１】
2.CD3陰性20BBZ CAR-T細胞の調製
ヒトPBMCを、Stemcell T細胞分離キット（陰性選択）を介して精製後、anti-hCD3とanti-hCD28により被覆された96ウエル培養プレートに播種後2日に、MOI=10-20で20BBZ（その構造が図1に示されるように、用いられる抗体細胞外抗原認識ドメインがanti-CD20抗体である）とplenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスを感染後1日に、液を交換して細胞培養を続け、6日ごとに人工抗原提示細胞またはanti-hCD3/28で刺激することにより得られる細胞から、Stemcell T細胞陽性選択キットによりCD3陽性細胞を除去することによって、CD3陰性20BBZ CAR-T細胞（CD3- U-CAR-T、U-CAR-T細胞と単に称される）が得られ、次の実験および表現型分析表示に用いられ、その結果が図2に示される。図面のように、得られるU-CAR-T細胞がCAR陽性とCD3陰性であることが分かっている。
【００４２】
実施例2-ガンシクロビルによるU-CAR-T細胞生存している調節
実施例1におけるステップ2で得られるU-CAR-T細胞および対照CAR-Tを、96ウエルプレートに播種して、示されるような濃度のガンシクロビルを加えた後48時間に、生存しているCAR-Tの数を比較したところ、その結果が図3に示される。図面のように、ガンシクロビルは、U-CAR-Tの生存を調節することができ、U-CAR-Tが副作用を起こした条件でインビボにおけるU-CAR-Tを速やかに排除し、安全性を高めることができる。
【００４３】
実施例3-U-CAR-Tと対照CAR-Tの腫瘍殺傷能の比較
実施例1におけるステップ2で得られるU-CAR-Tと対照CAR-T細胞を、96ウエルプレートに播種して、CAR-T：腫瘍細胞が1:1の割合でRaji腫瘍細胞を加えた後24、48時間に、腫瘍細胞の生存割合を比較したところ、その結果が図4に示される。図面のように、U-CAR-Tが対照CAR-Tと類似の腫瘍殺傷能を有する。
【００４４】
実施例4-U-CAR-Tと対照CAR-Tのインビボ生存性の比較
106 Raji腫瘍細胞を、B-NDGマウスに静脈内に播種後6日に、107 U-CAR-Tと対照CAR-T治療を施し、マウスの生存率を観察したところ、その結果が図5に示される。図面のように、U-CAR-Tと対照CAR-Tがともにマウスの生存時間を延ばした。
【００４５】
前述した実施例から、本発明におけるCD3をノックアウトすることによって作成されるユニバーサルCAR-Tは、その移植片対宿主病（GVHD）が小さく、増幅CAR-T治療の便利性を大きく増加すると共に、HSV-TKが導入され、ガンシクロビルの調節によってインビボにおけるU-CAR-Tを速やかに排除し、さらにユニバーサルCAR-Tの安全性を高めることがわかる。
【００４６】
以上、本発明に係る具体的な実施例は、詳しく説明されたが、例として、本発明を限定することではない。当該技術分野における当業者にとって、本発明に対して等価な改変および置換のいずれも本発明の範囲に属する。そのため、本発明の要旨を逸脱しない範囲における種々の等価な変更、改変等が、本発明の範囲に該当するものになるであろう。
【図１】
2021528080.tif 000003
【図２】
2021528080.tif 000004
【図３】
2021528080.tif 000005
【図４】
2021528080.tif 000006
【図５】
2021528080.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月15日(2021.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CAR-T細胞は、CD3Delta、CD3Gamma、CD3 Epsilon及びCD3 zetaのうちの1つ又は複数がノックアウトされる
ことを特徴とする、ユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項２】
前記CAR-T細胞は、HSV-TK遺伝子が導入される
ことを特徴とする、請求項1に記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項３】
前記Car-T細胞が細胞内シグナル伝達ドメインを含有し、該細胞内シグナル伝達ドメインは、更に、CD3zeta、CD28、CD137、ICOS、OX40、IL-12、CD28、IL7R、又はIL2Rの少なくとも1つを含する
ことを特徴とする、請求項1に記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項４】
前記のユニバーサルCAR-T細胞が細胞外抗原認識ドメインを有含し、該細胞外ドメインは、一本鎖抗体または腫瘍特異的抗原のリガンド若しくは受容体である
ことを特徴とする、請求項１に記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項５】
前記一本鎖抗体が、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗EGFR抗体、抗HER2抗体、抗EGFRVIII抗体を含むことを特徴とする
請求項４に記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項６】
前記腫瘍特異的抗原のリガンドまたは受容体が、NKG2Dを含む
ことを特徴とする、請求項4に記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項７】
前記のユニバーサルCAR-T細胞が細胞外ヒンジ領域を含有し、該細胞外ヒンジ領域は、CD8aまたはIgGから選択される領域である
ことを特徴とする、請求項１に記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項８】
前記のユニバーサルCAR-T細胞が膜貫通ドメインを含有し、該膜貫通ドメインは、CD8a、CD28、CD137、又はCD3から選択される領域である
ことを特徴とする、請求項１に記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【請求項９】
正しい遺伝子ノックアウト方法を利用して、CAR-T細胞におけるCD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 Epsilon及びCD3 zetaうちの1つ又は複数をノックアウトする工程を含む
ことを特徴とする、請求項1〜８の何れか１つに記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項１０】
さらに、T細胞にHSV-TK遺伝子を修飾する工程を含む
ことを特徴とする、請求項９に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項１１】
請求項９に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調整方法であって、前記ユニバーサルCAR-T細胞が、以下の工程を含む遺伝子ノックアウト方法により調製される事を特徴とする方法：
工程1：レンチウイルスベクター作製及びウイルス産生
CD3 Delta、CD3 Gamma、CD3 Epsilon、CD3 zetaに対するsgRNAを、pLenti-CrisprV2にクローンするよう設計すると共に、レンチウイルスパッケージングプラスミドで同時形質移入後の予定時間に、上清を採取してろ過し、遠心によってウイルスを濃縮することによって、plenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスが得る工程、
工程2：CD3陰性CAR-T細胞調製
ヒトPBMCを、分離精製後、適切な刺激条件を持つ培養プレートに播種して、予定時間培養後、CARウイルス及び工程1で産生したplenti-CRISPRV2-sgRNAウイルスを感染させ、適切な刺激条件で細胞を増幅させることにより得られる細胞からCD3陽性細胞を除去することによって、CD3陰性CAR-T細胞が得る工程。
【請求項１２】
分離精製されたヒトPBMCを培養する刺激条件は、anti-hCD3及びanti-hCD28であり、細胞を増幅させる刺激条件は、6日ごとに人工抗原提示細胞又はanti-hCD3/28で刺激することである
ことを特徴とする、請求項１１に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項１３】
前記工程1において、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、VSV-g、pMD Gag/Pol、RSV-REVを有し、遠心は、ベックマン超遠心機及びSW28スウィングロータが用いられる
ことを特徴とする、請求項１１に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項１４】
前記ヒトPBMCは、臍帯血中のPBMCである
ことを特徴とする、請求項１１又は１２に記載のユニバーサルCAR-T細胞の調製方法。
【請求項１５】
請求項1〜８の何れか１つに記載のユニバーサルCAR-T細胞を含む製剤。
【請求項１６】
腫瘍を治療又は予防するために使用される請求項1〜８の何れか１つに記載のユニバーサルCAR-T細胞。
【国際調査報告】
2021528080.tif 000008
2021528080.tif 000009
2021528080.tif 000010
2021528080.tif 000011