(57)【要約】  本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質または組換えタンパク質、および炎症状態の予防または治療におけるその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項２】
タンパク質１ｍｇ当たり５０エンドトキシン単位未満、任意選択でタンパク質１ｍｇ当たり２５エンドトキシン単位未満、またはタンパク質１ｍｇ当たり２エンドトキシン単位未満の量でエンドトキシン不純物を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項３】
グリコシル化されていない、請求項１または請求項２に記載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に記載の核酸配列からなる、請求項４に記載の単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項７】
医薬または獣医学的医薬における使用のための、請求項１または請求項２に記載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項８】
炎症状態、任意選択でヒト対象における炎症状態の治療および／または予防における使用のための、請求項１または請求項２に定義される単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項９】
前記炎症状態の治療および／または予防が、著しい免疫抑制なしに達成される、請求項８に記載の使用のための、請求項８に記載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項１０】
前記炎症状態の治療および／または予防が、前記タンパク質の投与前の活性と比較して、Ｔリンパ球活性によって測定されたときに、著しい免疫抑制なしに達成される、請求項９に記載の使用のための、請求項８に記載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項１１】
前記炎症状態が、関節リウマチ；乾癬性関節炎；若年性特発性関節炎；強直性脊椎炎；臓器、皮膚、組織、血液、血清、血漿もしくは細胞の移植の拒絶；またはクローン病などの炎症性腸疾患から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用のための、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項１２】
前記炎症状態が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、または若年性特発性関節炎から選択される、請求項１０に記載の使用のための、請求項１１に記載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項１３】
骨代謝の調節不全、任意選択で骨粗鬆症、骨損失、骨吸収、パジェット病、骨癌、乳癌、または癌に関連する骨損失である疾患を治療または予防する際の使用のための、請求項１または請求項２に記載の単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項１４】
人工関節の緩みの防止における使用のための、請求項１または請求項２に定義される単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項１５】
前記使用が、１ｍｇ〜１ｇの用量として前記タンパク質を投与することを含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の使用のための、請求項８〜１４のいずれか一項に定義される単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項１６】
いずれか一項の先行する請求項に定義される前記単離されたタンパク質または組換えタンパク質と、
１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、または担体と
を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
ヒトにおける使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質もしくは組換えタンパク質、または請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
ｐＨ７．２〜７．６のリン酸緩衝生理食塩水を含む、請求項１６または請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
２．０〜５０．０ｍｇ／ｍＬの量で前記単離されたタンパク質または組換えタンパク質を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
約５．０ｍｇ／ｍＬの量で前記単離されたタンパク質または組換えタンパク質を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
静脈内投与に好適である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
患者において、いずれか一項の先行する請求項に定義される状態を治療および／または予防する方法であって、
それを必要とする患者に、有効量の、いずれか一項の先行する請求項に定義される単離されたタンパク質もしくは組換えタンパク質、または請求項１６〜２１のいずれか一項に定義される薬学的組成物
を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
患者が１つ以上の治療薬をさらに投与されるか、またはペプチドが１つ以上の治療薬と組み合わせて提供される、いずれか一項の先行する請求項に記載される単離されたタンパク質もしくは組換えタンパク質、使用のための単離されたタンパク質もしくは組換えタンパク質、薬学的組成物、または方法。
【請求項２４】
前記治療薬が、疾患修飾剤、鎮痛剤、抗炎症剤、免疫療法剤、抗生物質、抗体、およびステロイドから選択される、請求項２３に記載の単離されたタンパク質もしくは組換えタンパク質、使用のための単離されたタンパク質もしくは組換えタンパク質、薬学的組成物または方法。
【請求項２５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質を調製するための方法であって、
ａ）請求項６に定義される組換えベクターで微生物を形質転換することと、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載のタンパク質の産生をもたらす前記微生物を培養することと、
ｃ）前記微生物を溶解して前記タンパク質を放出することと、
ｄ）エンドトキシンを除去するために前記溶解物を界面活性剤で処理することと、
ｅ）固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用して前記タンパク質を単離および精製することであって、前記固定化金属がコバルトである、前記単離および精製することと、
ｆ）前記精製タンパク質をジアミノペプチダーゼ酵素と接触させることであって、前記ジアミノペプチダーゼが前記タンパク質のＮ末端からヒスチジンタグを切断する、前記接触させることと、
ｇ）前記切断されたタンパク質を前記ヒスチジンタグから分離することと
を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記微生物が細菌、任意選択で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
エンドトキシンを除去するために前記タンパク質を界面活性剤で処理する１つ以上のさらなる工程を含む、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質１ｍｇ当たり２５エンドトキシン単位未満、任意選択でタンパク質１ｍｇ当たり２エンドトキシン単位未満を有するタンパク質を産生するためのものである、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
工程ｇ）が、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用して行われ、前記固定化金属がコバルトである、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記界面活性剤が１，１，３，３−（テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコールである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上の濾過工程、精製工程、または濃縮工程をさらに含む、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
２つ以上の凍結融解工程を含まない、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物が、動物由来生成物を含まない培地中で培養される、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質を調製するための方法であって、非細菌宿主細胞の使用を含む、前記方法。
【請求項３５】
前記タンパク質が、酵母、昆虫、または真菌に由来する細胞を使用して産生される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質が哺乳動物細胞を使用して産生される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規タンパク質、その医学における使用、特に、炎症状態の予防または治療における使用、およびそのタンパク質の調製のためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）またはグルコース調節タンパク質７８（Ｇｒｐ７８）のように様々に知られているヒト分子シャペロンの抗炎症特性が報告されている（Ｃｏｒｒｉｇａｌｌ  ＶＭ，Ｂｏｄｍａｎ−Ｓｍｉｔｈ  ＭＤ，Ｂｒｕｎｓｔ  Ｍ，Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｈ，Ｐａｎａｙｉ  ＧＳ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢｉＰ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎｄ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：１１６７−１１７１（非特許文献１））。細菌で発現される組換えヒトタンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の既知の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）とは異なる。
【０００３】
ＢｉＰは、小胞体（ＥＲ）に存在する遍在性の内因性発現タンパク質であり、新生ポリペプチドの正しい折りたたみと、ＥＲストレス時に蓄積された誤って折りたたまれたタンパク質からの細胞の保護のための細胞内タンパク質として必要とされている。したがって、ＢｉＰはまた、ストレスタンパク質、および熱ショックタンパク質７０ファミリーのメンバーとしても定義される。細胞ストレスの間に上方制御されて、ＢｉＰは、細胞外マトリックスに発現および分泌されるため、無細胞ＢｉＰが関節リウマチ患者の滑液に分泌され得る（Ｃｏｒｒｉｇａｌｌ  ＶＭ  ｅｔ  ａｌ、上記）。
【０００４】
この天然（天然に存在する）ＢｉＰ（ｐ７８）をコードする遺伝子がクローニングされ、組換えヒトタンパク質が発現されている（ＷＯ２０００／２１９９５（特許文献１））。
【０００５】
ＷＯ２０００／２１９９５（特許文献１）は、ＢｉＰの新規タンパク質類似体（ＳＥＱ．１およびＳＥＱ．２）およびそれらの炎症性疾患の治療における有用性を開示している。
【０００６】
ＷＯ２００６／１１１７２０（特許文献２）は、骨損失および骨吸収の治療および予防のための同じ２つの類似体の使用を開示している。
【０００７】
ＷＯ２００２／０７２１３３（特許文献３）は、自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎、多発性硬化症、狼瘡、クローン病、肝炎、または移植臓器拒絶に関連する望ましくない免疫応答などの免疫媒介性疾患の治療を含む、望ましくない免疫応答の治療または予防のためのＢｉＰ、特にＷＯ２０００／２１９９５（特許文献１）からのＳＥＱ．１およびＳＥＱ．２の使用を開示している。
【０００８】
ＢｉＰ類似体（ＳＥＱ．１およびＳＥＱ．２）は、炎症の多くのインビトロおよびインビボ動物モデルにおける結果を示すが、診療所で何が起こり得るかを予測するためのこれらのモデルからの外挿は不確かであり、患者への投与に好適な純度および有効性を有するタンパク質の製造の課題が残っている。
【０００９】
ＢｉＰ類似体ＳＥＱ．１およびＳＥＱ．２（これからＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と称する）は、細菌細胞を使用して産生されるが、いくつかの理由からヒト投与のための臨床産物としては好適ではない。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の６×ヒスチジンタグ（アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質単離のために使用される）は、タンパク質の特性、物理的および機能的特性を変化させ得ることが報告されてきた。（Ｓａｎｔｉａｇｏ  ＦＷ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｈ１Ｎ１  ｗｈｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３０，Ｉｓｓｕｅ  ３１，２９  Ｊｕｎｅ  ２０１２，Ｐａｇｅｓ  ４６０６−４６１６（非特許文献２））一方、キレート化のために使用される金属イオンは、完全に除去されない場合、血流中に浸出し得る。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は臨床的には使用できない。
【００１０】
産生方法としての細菌細胞の使用は、形質転換された哺乳動物細胞を使用するよりも容易で安価であるが、グリコシル化されておらず、哺乳動物等価物と同じ折りたたみを有しない可能性があるタンパク質を生じるという問題を有する。さらに、細菌産物中のエンドトキシン負荷は依然として高いままであり、ヒトに投与された場合には、副作用を引き起こし得る。主に、そのコストにもかかわらず形質転換哺乳動物細胞タンパク質産生の人気の増加につながったのは、生成物からエンドトキシンを除去することの技術的難しさである。製造プロセス中にエンドトキシンを除去するための精製は、技術的に複雑で、高価で時間がかかる。さらに、生産および精製プロセスの拡張性が問題となり得る。
【００１１】
したがって、ヒト投与に好適であるが、拡張可能なプロセスを使用して容易に製造され、治療においても有効であるＢｉＰに基づく抗炎症特性および／または免疫調節特性を有する新規タンパク質の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２０００／２１９９５
【特許文献２】ＷＯ２００６／１１１７２０
【特許文献３】ＷＯ２００２／０７２１３３
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃｏｒｒｉｇａｌｌ  ＶＭ，Ｂｏｄｍａｎ−Ｓｍｉｔｈ  ＭＤ，Ｂｒｕｎｓｔ  Ｍ，Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｈ，Ｐａｎａｙｉ  ＧＳ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢｉＰ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎｄ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：１１６７−１１７１
【非特許文献２】Ｓａｎｔｉａｇｏ  ＦＷ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｈ１Ｎ１  ｗｈｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３０，Ｉｓｓｕｅ  ３１，２９  Ｊｕｎｅ  ２０１２，Ｐａｇｅｓ  ４６０６−４６１６
【発明の概要】
【００１４】
発明の記載
これらの必要性は、本発明の新規タンパク質によって対処される。
【００１５】
したがって、本発明の一態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質または組換えタンパク質を提供する。
【００１６】
本発明は、図４に示す結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の類似体に関する。天然ＢｉＰの予測アミノ酸配列は図１に提供され、公開されて利用可能なデータベースＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ内の受託番号Ｘ８７９４９の下で見出すことができる。天然ＢｉＰのヌクレオチド配列を図２に示す。天然アミノ酸配列は、ｎ末端に結合したシグナル配列
2021528100.tif 000002
を有する。アラニン残基の後でのシグナル配列の切断は、「ＥＥＥＤ．．．」から始まる成熟ポリペプチドを放出する。
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列は、Ｎ末端が「ＥＥＥＤ．．．」ではなく「ＲＡＥＥＥＤ．．．」配列で始まる点において、天然ＢｉＰの配列とは異なる。これには、天然シグナル配列の２つのｃ末端アミノ酸（アルギニンおよびアラニン）が含まれる。当業者には、ｎ末端にＲＡを含める理由はない − 天然型では、活性ポリペプチドはグルタミン酸残基で始まり、当業者が改変形態のＢｉＰを提供しようとしている場合、異なる位置でのシグナル配列の切断、および任意の数の変異、付加または欠失を提供することを含む、複数の選択肢があることが理解される。
【００１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に相当し、タンパク質のｎ末端にポリヒスチジン親和性タグ（以降はＨｉｓタグ）を有する（図３を参照されたい）。Ｈｉｓタグは、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製を容易にする。
【００１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３はまた、ＷＯ２０００／２１９９５に開示されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２からの重要な違いを有する。上述のように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ｃ末端にＨｉｓタグを有し、ｎ末端は「ＭＥＥＤ．．．」で始まる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相当するが、Ｈｉｓタグを伴わない。
【００２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のタンパク質は、ＷＯ２０００／２１９９５およびＷＯ２００６／１１１７２０に報告されているものとは異なる強力な抗炎症特性および免疫調節特性を有する。これらの重要な違いは、当業者には予想されない。これらの特性は、関連するインビトロ研究およびインビボ研究によって本明細書で実証される。さらに、本発明のタンパク質は、ヒトにおける使用のために安全である。
【００２１】
本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、ＷＯ２０００／２１９９５およびＷＯ２００６／１１１７２０のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１との間の鍵となる機能の違いは、以下の通りである：
１）末梢血単核細胞によるサイトカインＴＮＦαの産生は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の存在下で大きく減少する（実施例２を参照されたい）。
２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの下方調節を引き起こし、一方、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６発現の有意な喪失を示さなかった（実施例３を参照されたい）。
３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ヒトにおける使用のために好適であり、臨床試験においては、注入反応または重篤な有害薬物反応は認められなかった（実施例４参照）。対照的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ヒトへの投与のためには適していない。
４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、プラセボ群と比較して、ヒトにおけるＣＲＰ、ＶＥＧＦ、およびＩＬ−８の血清濃度の有意な低下を引き起こす。これは、疾患の炎症が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の投与によって有意に減少したことを示す（実施例４を参照されたい）。
５）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較して、調節性Ｔ細胞上のＣＤ３９発現の増加を引き起こし、診療所において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に応答する患者からの調節性Ｔ細胞上のＣＤ３９の発現の有意な増加が観察され、これは注入後１２週間維持された（実施例５を参照されたい）。
６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は破骨細胞分化および吸収活性を阻害する（実施例６を参照されたい）。
７）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とは異なり、全体的な免疫抑制効果を有しない。ツベルクリンＰＰＤに対するリコール抗原応答を低減する（実施例７を参照されたい）。
８）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、動物モデルにおける皮膚移植片の生存期間を延ばす（実施例８を参照されたい）。
【００２２】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において１つ以上の保存的置換を有する単離されたタンパク質または組換えタンパク質を含む。「保存的置換」は、アミノ酸残基が、例えば、類似の側鎖を有する別の生物学的に類似するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンでの置換は、保存的置換である。タンパク質機能に悪影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換を同定する方法は、当該技術分野で周知である。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明の単離されたＢｉＰタンパク質または組換えＢｉＰタンパク質は、タンパク質１ｍｇ当たり５０エンドトキシン単位（ＥＵ）未満の量でエンドトキシン不純物を含む。好ましい実施形態では、単離されたタンパク質または組換えタンパク質は、タンパク質１ｍｇ当たり２５エンドトキシン単位（ＥＵ）未満の量でエンドトキシン不純物を含む。好ましい実施形態では、単離されたタンパク質または組換えタンパク質は、タンパク質１ｍｇ当たり２エンドトキシン単位未満、最も好ましくはタンパク質１ｍｇ当たり１．５エンドトキシン単位未満の量でエンドトキシン不純物を含む。
【００２４】
エンドトキシンは、カブトガニ血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ：ＬＡＬ）試験を使用して検出し、グラム陰性細菌の外側膜から抽出された細菌性エンドトキシンを検出および定量する（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，ＵＫ）。エンドトキシン試験で使用されるＬＡＬ試薬の重要な構成要素は、カブトガニ、リムス・ポリフェムス（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血液細胞（アメボサイト）に由来する。ＬＡＬ試験は、米国薬局方における細菌エンドトキシン試験の章（第８５章）、ならびに欧州薬局方における同等の章（第２．６．１４章）および日本薬局方における同等の章（一般試験法、第４．０１）に記載されている。
【００２５】
本発明のタンパク質は、グリコシル化される天然タンパク質とは対照的に、グリコシル化されていないかまたは実質的にグリコシル化されていない。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質をコードする単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供する。
【００２７】
好ましくは、請求項３に記載の単離された核酸分子または組換え核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に記載の核酸配列からなる。
【００２８】
追加の態様は、上記に定義される核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００２９】
ベクターは、プロモーターおよび／またはオペレーター配列を含んでもよい。ベクターは、非哺乳動物配列、例えば、細菌または酵母由来の配列を含んでもよい。ベクターは、非哺乳動物プロモーターおよび／またはオペレーター配列、例えば、細菌または酵母プロモーターおよび／またはオペレーター配列を含んでもよい。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、医薬または獣医学的医薬における使用のための、上記に定義される単離されたタンパク質または組換えタンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、ヒト動物または非ヒト動物における使用のためであり得る。
【００３１】
なおさらなる態様では、本発明は、炎症状態の治療および／または予防における使用のための、上記に定義される単離されたタンパク質または組換えタンパク質を提供する。好ましくは、炎症状態の治療および／または予防は、著しい免疫抑制を伴うことなく達成される。一実施形態では、炎症状態の治療および／または予防は、タンパク質の投与前の活性と比較してＴリンパ球活性によって測定されたときに、著しい免疫抑制を伴うことなく達成される。一実施形態では、ツベルクリン精製タンパク質誘導体などのリコール抗原、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの有糸分裂促進因子、または抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズに対するＴ細胞増殖の有意な阻害は存在しない。
【００３２】
好ましい実施形態では、炎症状態は、関節リウマチ；乾癬性関節炎；若年性特発性関節炎；強直性脊椎炎；臓器、皮膚、組織、血液、血清、血漿もしくは細胞の移植の拒絶；またはクローン病などの炎症性腸疾患から選択される。
【００３３】
特に好ましい実施形態では、炎症状態は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、または若年性特発性関節炎から選択される。
【００３４】
一実施形態では、単離されたタンパク質または組換えタンパク質は、骨代謝の調節不全の疾患、例えば、骨粗鬆症、骨損失、骨吸収、パジェット病、乳癌、骨癌、または癌に関連する骨損失の治療または予防における使用のためである。転移性乳癌は、骨損失と関連することが知られている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｉｏｎａｌｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ−ｂｒｅａｓｔ−ｃａｎｃｅｒ）。
【００３５】
別の態様では、上記に定義される単離されたタンパク質または組換えタンパク質は、人工関節の緩みの防止に使用される。
【００３６】
上記に定義される使用のための上記に定義される単離されたタンパク質または組換えタンパク質の一実施形態では、使用は、タンパク質を１ｍｇ〜１ｇ、任意選択で１ｍｇ〜５００ｍｇ、任意選択で１ｍｇ〜５０ｍｇ、任意選択で１〜１５ｍｇの用量として投与することを含む。
【００３７】
用量は、１ｍｇ、５ｍｇ、または１５ｍｇであり得る。
【００３８】
タンパク質は、単回用量または複数回用量として投与することができる。
【００３９】
用量は、０．５〜３時間、任意選択で１〜２時間、好ましくは１時間の期間、単回静脈内注入として投与され得る。
【００４０】
好ましい実施形態では、１ｍｇ、または５ｍｇもしくは１５ｍｇの用量が、１時間の期間、患者に投与される。
【００４１】
代替の実施形態では、複数回用量を患者に投与してもよく、各用量の投与間隔は、少なくとも１時間、または少なくとも２時間、または少なくとも１日、または少なくとも１週間である。
【００４２】
数値範囲は、範囲を定義する数値を含み、本明細書で提供される任意の個々の値は、本明細書で提供される他の個々の値を含む範囲のエンドポイントとしての役割を果たすことができる。例えば、１、２、３、８、９、および１０などの値のセットは、１〜１０、１〜８、３〜９などの数値の範囲の開示でもある。同様に、開示される範囲は、範囲によって包含される各個々の値の開示である。例えば、記載される５〜１０の範囲は、５、６、７、８、９、および１０の開示でもある。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、いずれかの先行する請求項に定義される単離されたタンパク質または組換えタンパク質と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、または担体と、を含む薬学的組成物を提供する。１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、アジュバントまたは担体は特に限定されず、好適な賦形剤、アジュバントまたは担体は当業者には既知である。
【００４４】
任意の好適な投与経路を使用することができる。例えば、経口、局所、非経口、眼、直腸、膣、吸入、口腔、舌下、および鼻腔内の送達経路のいずれかが好適であり得る。
【００４５】
非経口投与のための薬学的組成物が好ましい場合がある。本発明のタンパク質および薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与され得るか、または注入技術によって投与され得る。静脈内投与が特に好ましい。
【００４６】
薬学的組成物は、生理食塩水などの薬学的に許容される担体を含むことができる。好適な薬学的組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、クエン酸）、サーファクタント（例えば、ポリソルベート）、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン、ポリオール、アミノ酸）、防腐剤（例えば、安息香酸ナトリウム）、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤のうちの１つ以上を含むことができる。
【００４７】
本発明の薬学的組成物は、血液と等張性である溶液を作製するために十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含有し得る無菌水溶液の形態であってもよい。必要に応じて、水溶液は適切に緩衝化される必要がある（好ましくは３〜９のｐＨ）。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技法によって容易に達成される。
【００４８】
非経口投与に適した薬剤および薬学的組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。薬剤および組成物は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中に提示されてもよく、使用の直前に、滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保管されてもよい。即時注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
【００４９】
好ましい実施形態では、薬学的組成物は、ｐＨ７．２〜７．６、最も好ましくはｐＨ７．４でリン酸緩衝生理食塩水を含む。一実施形態では、薬学的組成物は０．９％ｗ／ｖの生理食塩水を含む。
【００５０】
一実施形態では、薬学的組成物は、２．０〜５０．０ｍｇ／ｍＬの量で、任意選択で２．０〜１０．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約５．０ｍｇ／ｍＬの量で単離されたタンパク質または組換えタンパク質を含む。
【００５１】
典型的には、薬学的組成物は静脈内投与のために好適である。
【００５２】
さらなる態様では、本発明は、上記に定義される有効量の単離されたタンパク質もしくは組換えタンパク質または上記に定義される薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、患者において上記に定義される状態を治療および／または予防する方法を提供する。
【００５３】
「治療する」または「治療」または「治療すること」などの用語は、望ましくない生理学的状態、診断された病理学的状態、疾患、または障害の症状を治癒し、遅延させ、軽減し、および／またはその進行を停止させる治療的措置を指す。したがって、治療を必要としているものには、既に症状、疾患、または障害を患っているものが含まれる。ある特定の実施形態では、患者が、状態、疾患、または障害に関連する症状の全体的、部分的、または一過性の緩和または排除を示し、状態、疾患、または障害の程度の低下、状態、疾患、または障害の安定化（すなわち、悪化しない）を示し、状態、疾患、または障害の発症の遅延または進行の遅延を示し、部分的または完全寛解を含む状態、疾患、または障害の改善を示し、および／または治療を受けていない場合に予想される生存期間の延長を示す場合、対象は、状態、疾患、または障害に対して成功裏に「治療」される。
【００５４】
「予防する」または「予防」または「予防すること」は、標的とする病理学的状態、疾患、または障害の発症を回避および／または遅らせる予防または防止措置を指す。したがって、予防を必要とするものには、状態、疾患、または障害を有する傾向があるか、またはその影響を受けやすいものが含まれる。特定の実施形態では、患者が、本発明の方法を受けていない患者よりも一過性または永続的に、例えば、その状態、疾患、もしくは障害に関連する状態がより少ないかその重症度が低く、またはその状態、疾患、もしくは障害に関連する症状の発症がより遅い場合に、疾患、もしくは障害は成功裏に予防される。
【００５５】
一実施形態では、患者は、１つ以上の治療薬をさらに投与されるか、またはタンパク質が１つ以上の治療薬と組み合わせて提供されるときに投与される。好ましい実施形態では、治療薬は、疾患修飾剤、鎮痛剤、抗炎症剤、免疫療法剤、抗生物質、抗体、およびステロイドから選択される。特定の実施形態では、治療薬は、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）である。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載のアミノ酸からなる組換えタンパク質を調製するための方法を提供し、この方法は、
ａ）微生物を請求項６に定義される組換えベクターで形質転換することと、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載のタンパク質の産生をもたらす微生物を培養することと、
ｃ）微生物を溶解して上記タンパク質を放出することと、
ｄ）エンドトキシンを除去するために溶解物を界面活性剤で処理することと、
ｅ）固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用してタンパク質を単離および精製することであって、固定化金属はコバルトである、前記単離および精製することと、
ｆ）精製タンパク質をジアミノペプチダーゼ酵素と接触させることであって、ジアミノペプチダーゼが上記タンパク質のＮ末端からヒスチジンタグを切断する、前記接触させることと、
ｇ）切断されたタンパク質をヒスチジンタグから分離することと
を含む。
【００５７】
好ましくは細菌、最も好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００５８】
１つの好ましい実施形態では、微生物は、動物由来産物を含まないか、または実質的に含まない培地で培養される。
【００５９】
典型的には、この方法は、エンドトキシンを除去するためにタンパク質を界面活性剤で処理する１つ以上のさらなる工程を含む。界面活性剤は、１，１，３，３−（テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコールであり得る。代替として、タンパク質は、エンドトキシンを除去するためにアルギニンで処理され得る。
【００６０】
上記の方法は、好ましくは、タンパク質１ｍｇ当たり２５エンドトキシン単位未満、任意選択でタンパク質１ｍｇ当たり２エンドトキシン単位未満を有するタンパク質を産生するためのものである。界面活性剤またはアルギニンの添加により、エンドトキシンの除去が可能になる。
【００６１】
工程ｆ）は、ジアミノペプチダーゼ酵素の活性に好適な温度、好ましくは約３７℃で行われる。
【００６２】
典型的には、工程ｇ）は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用して実行され、固定化金属はコバルトである。切断されたＨｉｓタグは、カラムに結合し、精製されたタンパク質はカラムから溶出する。
【００６３】
好ましくは、本方法は、２つ以上の凍結融解工程を含まない。好ましくは、タンパク質は、この方法の任意の段階で凍結されない。この方法の工程間にタンパク質を保管する必要がある場合、タンパク質は２〜８℃の温度で保管される。
【００６４】
一実施形態では、本方法は、１つ以上の濾過、精製または濃縮工程をさらに含む。
【００６５】
一実施形態では、細胞は、特にフレンチプレスを使用する剪断によって溶解される。
【００６６】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、細菌以外の宿主細胞を使用して産生される。一実施形態では、本発明のタンパク質は、酵母、昆虫または真菌に由来する細胞を使用して産生される。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、哺乳動物細胞を使用して産生される。
【００６７】
ここで、以下の図面を参照して非限定的な例を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】天然ＢｉＰのアミノ酸配列を示す。ＢｉＰの一次構造は６６４アミノ酸から構成される。Ｎ’末端で、１８個のアミノ酸のリーダー配列（下線付き）は、翻訳後の変化の間に切断される。
【図２−１】天然ＢｉＰのヌクレオチド配列を示す。ＢｉＰ遺伝子は２．５キロ塩基である。
【図２−２】図２−１の説明を参照のこと。
【図３】精製中の切断の前にＮ末端にＨｉｓタグを含む本発明のタンパク質である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を示す。
【図４】本発明のタンパク質（Ｈｉｓタグを含まない）である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を示す。
【図５Ａ】天然ＢｉＰ遺伝子のクローニングに使用した組換えベクターｐＱＥ−２を示す。使用されるベクターの概略図は、ヒスチジンタグの部位および制限酵素の切断部位を示す。
【図５Ｂ】ベクターｐＱＥ−２のＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングされたＢｉＰ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を示す。
【図６−１】天然タンパク質のアミノ酸配列を有する本発明によるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図６−２】図６−１の説明を参照のこと。
【図７−１】ＷＯ００／２１９９５からのＳＥＱ１である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を示す。
【図７−２】図７−１の説明を参照のこと。
【図８−１】ＷＯ００／２１９９５からのＳＥＱ２である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を示す。
【図８−２】図８−１の説明を参照のこと。
【図９】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を示す。
【図１０】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって誘導されるサイトカイン産生の比較を示す。末梢血単核細胞を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（Ａ、Ｂ）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ）のいずれかの存在下で、示した濃度で２４時間培養した。４人の健常対照（黒色記号）および１人の関節リウマチ患者（白色記号）からのＰＢＭＣを使用した。２４時間で上清を収集し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびインターロイキン（ＩＬ）１０の産生を定量化した。ＥおよびＦは、ＣおよびＤと同じデータを示すが、５つの試料の同定が観察されることを可能にする個々のｙ軸スケールを有する。
【図１１】蛍光色素共役抗体、抗ＣＤ８０．フィコエリスリン、抗ＣＤ８６．フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはＨＬＡ−ＤＲ．ＦＩＴＣを使用するフローサイトメトリー分析の前に、単独で、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とともに２４時間培養した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する実験からのデータを示す。すべての場合において、ＰＢＭＣ試料をライブゲートしてＣＤ１４集団にのみアクセスした。ＰＢＭＣは、（Ａ）未処理；（ＢおよびＥ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の存在下で、または（Ｃ）および（Ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の存在下のいずれかで培養された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲのダウンレギュレーションも示した。対照的に、本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６発現の有意な喪失を示さなかった。
【図１２】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３についての第１のヒト臨床試験において患者から採取した血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルに対するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の効果を示す。３つの患者群、プラセボ、活性応答者（Ｒ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を受容したすべての患者が示される。注入後２週間および１２週間における注入前レベルからのＣＲＰ血清レベルの変化を、プラセボ群、応答群、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で処置されたすべての患者について測定した。１２週目に、ＣＲＰのレベルの有意な低下が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で処置された患者において認められた。＊この患者は、プロトコル違反であるメトトレキサート併用薬を中断した。
【図１３】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で処置された患者におけるバイオマーカーレベルの変化を示す。ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の血清濃度を、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ技術によって測定し、ならびに注入前血清濃度からの変化を、２週目および１２週目の各患者について計算した。（Ａ）ＶＥＧＦ濃度の変化、（Ｂ）ＩＬ−８濃度の変化。データは、プラセボ群（ｎ＝６）、応答者群（Ｒ）［ｎ＝８（２週間）および６（１２週間）］、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で処置した全患者群［ｎ＝１４（２週間）および１２（１２週間）］であり、これらは１２週間時点で試験に残った。濃度範囲（すべての患者）ＶＥＧＦ、４〜１９５ｐｇ／ｍｌ、およびＩＬ−８については０．７〜１９ｐｇ／ｍｌ。
【図１４】増加した調節性Ｔ細胞機能効率のマーカーであるＣＤ３９の上方調節発現を示す。ＲＡ患者からの末梢血単核細胞を、無刺激（白色バー）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（１０μｇ／ｍｌ）（網目状バー）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（１０μｇ／ｍｌ）（黒色バー）のいずれかで培養状態に準備した。２４時間後、４８時間または７２時間後、細胞を培養から取り出し、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ３９の蛍光色素結合体抗体のパネルで染色した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で細胞を分析した。結果は、以下についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）の結果として表される：（Ａ）複数のライブゲートを使用して、生きているＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋細胞にアクセスした後のＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ１２７ｌｏ細胞；（Ｂ）（Ａ）におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ集団によるＣＤ３９の発現。（Ｃ）ＰＢＭＣ（１０６／ｍＬ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（１０または０．１μｇ／ｍｌ）または本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（１０または０．１μｇ／ｍｌ）で、培養中９６時間前処理した。新鮮な自己移植ＣＦＳＥ染色Ｔ細胞に添加し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズで刺激した。前処理されたＴ細胞対応答者Ｔ細胞の比率は１：１０であった。３日後にＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して、ＣＦＳＥ  ＭＦＩの低減について細胞を分析した。Ｔ細胞がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とプレインキュベートされていた場合、応答の阻害は観察されなかったが、応答の最大３０％の低下が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３とプレインキュベートした細胞で観察された。（Ｄ）ＲＡＧＵＬＡ臨床試験では、プラセボおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３治療を受けた関節リウマチ患者、応答者（Ｒ）または非応答者（ＮＲ）からの全血サンプルを、１２週間にわたってＴｒｅｇ細胞（生きている、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ  ＣＤ１２７ｌｏ）上でのＣＤ３９の発現の変化について監視した。結果は、示される時点での、前注入からの細胞表面発現の変化％として発現される。単回注入後、ＣＤ３９＋発現を注入後少なくとも１２週間有意に上昇させた。
【図１５−１】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（２μｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下で４８時間培養したＭ−ＣＳＦ依存性ヒト破骨細胞前駆体によるＣＤ１１５／ｃ−Ｆｍｓ（Ａ）およびＲＡＮＫ（Ｂ）タンパク質レベルの発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。平均蛍光強度を示す代表的な試料：点線、未処理対照；濃い実線、ＲＡＮＫＬ活性化対照；薄い実線、ＲＡＮＫＬ活性化ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３処理細胞（ｎ＝４個）。（Ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（２μｇ／ｍｌ）を有するマウスＭ−ＣＳＦ依存性破骨細胞前駆体の４８時間処理後のｃ−ｆｍｓのｑＰＣＲ分析およびＲＡＮＫ発現。データは、特異的プライマーを使用し、β−アクチンに正規化した重複実験の平均値±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（２μｇ／ｍｌ、４８時間）の非存在下または存在下で培養した細胞において、示される時間、ＲＡＮＫＬ（１０ｎｇ／ｍｌ）に応答したヒト破骨細胞前駆体におけるｐＥＲＫおよびｐｐ３８の発現を示すウェスタンブロット分析。（Ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の非存在下または存在下で培養した成熟ヒト破骨細胞を含む培養物におけるＲＡＮＫＬ誘導ｐＥＲＫの発現（２μｇ／ｍｌ、４８時間）。（Ｆ）ＢｉＰ（２μｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下で処理した破骨細胞前駆体および成熟破骨細胞におけるＲＡＮＫＬ（１０ｎｇ／ｍｌ）に応答した転写因子ｃ−ＦｏｓおよびＮＦＡＴｃ１の発現を示すウェスタンブロット分析。示されるように、全ＥＲＫおよびｐ３８タンパク質、ならびにＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。＊ｐ＜０．０１。これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１が、ヒト破骨細胞前駆体におけるＣＤ１１５およびＲＡＮＫ細胞表面の発現ならびに下流シグナル伝達を下方制御することを実証する。
【図１５−２】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１６】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬ刺激後の破骨細胞前駆体およびＴＨＰ１単球におけるＮＦ−κＢ  ｐ６５およびｐ５２の核移行を阻害する。Ｍ−ＣＳＦ依存性（Ａ）ヒト破骨細胞前駆体、または（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（１０μｇ／ｍｌ）（Ａ、Ｂ）の非存在下（Ｃｏ）または存在下で１時間前処理し、次いで、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で１０分間刺激した。（Ｃ）前破骨細胞を、ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）ありまたはなしで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（１０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で４時間培養した。細胞を固定し、ＤＡＰＩ対比染色を用いてＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ａ、Ｂ）またはｐ５２（Ｃ）について染色した後、フローサイトメトリー、イメージングフローサイトメトリー、または共焦点顕微鏡検査のために処理した。各図のセクションの右側のパネルは、代表的な単一細胞におけるｐ６５およびｐ５２の核移行の共焦点画像を示し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３処理細胞における核移行の非存在を示す。＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３。
【図１７】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはプラセボを用いる処置後に、患者の免疫応答を、最大刺激である抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズ（３日間培養）（図１７Ａ）またはリコール抗原であるツベルクリンＰＰＤ（５日間培養）（図１７Ｂ）に対するＴ細胞応答を検出するために刺激されたＰＢＭＣ培養物を使用して測定した。活性化を、トリチウム化チミジンの最後の２４時間の培養の取り込みによって測定した。
【図１８】図１８Ａは、マウス皮膚移植実験のプロトコルおよび結果の概略図を示す。図１８Ｂは、Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒグラフにおける生存分析を示す。これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３が、移植片の５／６の生存期間を対照群の生存期間を超えて延長し、５０％の移植片が対照マウスの移植片よりも約３０％長く生存したことを実証する。
【図１９】第２の移植探索実験の概略図を示す。再び、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３投与により、修飾樹状細胞（ＤＣ）を与えられた動物と比較して、皮膚移植片の生存期間が長くなる。ＤＣ投与をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と混合することは有益ではなかった。
【図２０】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３有りまたは無しで培養したプロテーゼ周囲組織によるサイトカイン産生を示す。同様のサイズの小片を、人工関節の緩みの後、患者の完全なインフォームドコンセントを得て、再置換手術中に採取したプロテーゼ周囲組織から切り取った。組織は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の非存在下（対照）または存在下（２０μｇ／ｍｌ）のいずれかで２４〜７２時間培養した。サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αまたはインターロイキン（ＩＬ）１０を、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＢＤ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）によって定量化した。２つのグラフは、対照培養物およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の培養物におけるＴＮＦαが、４つの培養物すべてにおいてほとんど変化を示さず、ＩＬ−１０産生の増加があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６９】
実施例１：本発明のタンパク質の調製
ＢｉＰ遺伝子を修飾して、分子のＮ末端にＨｉｓタグを配置した。６ｘヒスチジンタグを、コバルトカラム上でのタンパク質のアフィニティー精製後にジアミノペプチダーゼによる酵素消化によって除去できるように配置した。ニッケルは、十分量が残存して調製物を汚染する場合、ニッケルがアレルギー反応を引き起こす可能性があるため、使用しなかった。温度変化と界面活性剤の組み合わせを使用して、エンドトキシンを効率的に除去した。
【００７０】
収率および精製
収率は、除去可能なＨｉｓタグシステムによってタンパク質の純度と同様に大幅に改善される。
【００７１】
（表１）細菌ペレットからのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
2021528100.tif 000003
【００７２】
（表２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の純度および収率
2021528100.tif 000004
【００７３】
比較実施例、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７
本発明のタンパク質の開発中に、分子はＣ’末端に正しいＫＤＥＬ配列を有し、タンパク質に付着した他のタグを有してはならないことが決定された。このタンパク質は、当業者に既知の標準的な組換え技法に従って調製された。しかし、タンパク質が少なすぎ、純度が低すぎて、生物活性のほぼすべてが失われていた。したがって、このタンパク質を使用することはできなかった。
【００７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、Ｈｉｓタグが除去されかつＫＤＥＬアミノ酸配列が回復されるが、ＷＯ００／２１９９５のＳＥＱ１からの他の変更はない、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＷＯ００／２１９９５のＳＥＱ１）に対応する。このタンパク質は精製が非常に困難であることが証明され、最終的なタンパク質純度は＜９０％であり、エンドトキシン負荷は臨床的用途のためには高すぎた。このことは、調製しやすく、安定し、生物学的活性を有し、かつヒトへの投与に好適である天然ＢｉＰの類似体を提供することが困難であることを実証する。
【００７５】
４つの試行バッチを調製して、純粋なタンパク質の収率、純度、およびエンドトキシン汚染の低減を試み、改善した。これは不可能であることが証明された。タンパク質の回収率は約１％であったが、エンドトキシンレベルは高いままであった。
【００７６】
実施例２
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のタンパク質によって誘導されるＴＮＦα産生の比較を図１０に示す。４人の健常対照（黒色記号）および１人の関節リウマチ患者（白色記号）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の存在下で２４時間培養した上清中で産生されたサイトカインを検出し、ＥＬＩＳＡによって定量化した。
【００７７】
ＰＢＭＣによるＴＮＦα産生は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の存在下で大きく減少する。さらに、本発明のタンパク質は、リウマチ性関節炎ＰＢＭＣによるＴＮＦαの産生を健常対照とは異なって増加させず、一方で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のタンパク質は、健常ＰＢＭＣよりも多い、ＲＡ  ＰＢＭＣによるＴＮＦα産生を誘導するように見える。
【００７８】
関節リウマチ（ＲＡ）の発病におけるＴＮＦαの臨床的意義は十分に確立されている（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ａｎ  ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍ，Ｍａｉｎｉ  ＳＲ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００８  Ｊｕｎ；２２３：７−１９を参照されたい）。したがって、ＴＮＦαを上方制御しないことは、本発明のタンパク質の重要なポジティブな特徴である。
【００７９】
実施例３
Ｔ細胞活性化を調節する分子間の相互作用は複雑であるが、関節リウマチは慢性炎症の疾患であるため、これらの分子およびこれらの分子の相対発現は重要である。ヒト白血球抗原−抗原Ｄ関連（ＨＬＡ−ＤＲ）は、一般に抗原提示細胞として知られる単球、マクロファージ、および樹状細胞によって構成的に発現される分子であり、それぞれがＣＤ４＋Ｔ細胞受容体に提示される準備ができた抗原ペプチドを保持する。しかし、完全なＴ細胞活性化のためには、２つのシグナルが必要とされ、１つは、ＨＬＡ−ＤＲ−Ｔ細胞受容体ライゲーションを介するものであり、同時的な第２のシグナルは、ＣＤ８６またはＣＤ８０ライゲーションを介したＣＤ２８を介するものである。第２のシグナルは、同じく抗原提示細胞によって発現される共刺激分子ＣＤ８６および／またはＣＤ８０（これは最初、ＣＤ４Ｔ細胞によって発現されるＣＤ２８に結合する）によって提供され、これは後で、ＣＴＬＡ−４が上方制御されている間に下方制御される。Ｔ細胞の活性化は、これらの分子の発現によって制御される。ＣＤ２８は、正の活性化シグナルを提供し、一方ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞に負のシグナルを提供する。ＣＴＬＡ−４もまたＣＤ８０およびＣＤ８６に、ＣＤ２８よりも高いアビディティで結合し、このことは、Ｔ細胞活性化を阻害する効果を有することから、慢性的または継続的なＴ細胞活性化を防止する。
【００８０】
これらの４つの分子の相互作用は、免疫応答を調節するために役立つ。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１がＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの下方制御も示したことは注目に値する。これは、ツベルクリンＰＰＤなどのリコール抗原に対するＢｉＰ処理ＰＢＭＣのインビトロ応答が減少したことによって例示されるようにＴ細胞活性化を減少させるように作用するだけでなく、長期的に臨床的に有益ではない普遍化された免疫抑制の可能性も表す（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｄａｎｄｅｌ，Ｈａｎｓ  Ｂｒｅｎｄａｎ  Ｌｅｈｍｋｕｈｌ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  Ｋｎｏｓａｌｌａ，Ｒｏｌａｎｄ  Ｈｅｔｚｅｒ，Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｏｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ’  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｖｏｌｕｍｅ  ２３，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｊｕｌｙ  ２０１０，Ｐａｇｅｓ  ９３−１０３）、図１１Ｄを参照されたい。対照的に、本発明によるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＨＬＡ−ＤＲ（図１１Ｅ）およびＣＤ８６発現の有意な喪失を引き起こさなかった。
【００８１】
図１１は、ＣＤ１４＋細胞上のフローサイトメトリー実験の結果を示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の存在下では（図１１Ｂ）、刺激なし細胞（図１１Ａ）と比較して、ＣＤ８０の発現の増加およびＣＤ８６の増加が存在する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の存在下では（図１１Ｃ）、刺激なし細胞と比較して、ＣＤ８０の発現が増加するが、ＣＤ８６は増加しない。
【００８２】
結論から言うと、これは２つの重要な関心点を明らかにする。まず、Ｔ細胞活性化の低減が炎症を低減するが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を用いて見られるように、免疫系の普遍的な抑制は、長期的に患者に有益ではなく、感染の増加などにつながる。第２に、本発明によるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、既にインビボモデルにおいて抗炎症効果を示している。これは、普遍化された免疫抑制効果を回避するＢｉＰ特異的活性を通じて慢性炎症を解消するための免疫系の調節を実証する。
【００８３】
実施例４：臨床データ
許容される療法で失敗した活性ＲＡ患者における無作為化プラセボ対照用量上昇二重盲検第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の結果は、本発明のタンパク質が安全であることを示した。さらに、バイオマーカー分析は、臨床的利益を伴うかなりの抗炎症活性を示した（Ｋｉｒｋｈａｍ  Ｂ，Ｃｈａａｂｏ  Ｋ，Ｈａｌｌ  Ｃ，Ｇａｒｒｏｏｄ  Ｔ，Ｍａｎｔ  Ｔ，Ａｌｌｅｎ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｔｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩＡ  ＲＡＧＵＬＡ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２０１６；５５：１９９３−２０００）を参照されたい。
【００８４】
１つ以上の疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）による治療に応答しなかった活性ＲＡを有する２４人の患者を、１、５、または１５ｍｇの用量で、プラセボ（２人の患者）または本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のタンパク質（６人の患者）を受けるようにランダムに割り当てられた、各々８人の患者の３つのグループに順次割り当てた。患者は１時間にわたって単一の静脈内注入を受け、一晩入院患者として観察された。患者を、安全性、有効性（ＤＡＳ２８−ＥＳＲ）、およびバイオマーカー解析についてのフォローアップ臨床および実験室評価を用いて、次の１２週間にわたってモニタリングした。
【００８５】
安全性
輸液反応または重篤な有害薬物反応は認められなかった。有害事象は、薬物関連毒性を有しないプラセボ群と活性群との間で均一に分布した。血液学的な、腎臓の、および代謝のパラメータは、薬物関連毒性を示さなかった。
【００８６】
有効性
疾患活動性スコア（ＤＡＳ２８）は、臨床試験および診療における使用のための動的評価ツールおよび治療応答尺度として開発されている。ＤＡＳ２８−ＥＳＲは、以下の疾患指標を使用する：軟関節数（２８関節）、腫脹関節数（２８関節）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、および１００ｍｍの視覚的類似スケールで患者が報告した一般的な健康状態（Ｐｒｅｖｏｏ，ＭＬ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９５；３８：４４−８を参照されたい）。
【００８７】
主な有効性エンドポイントは、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ応答であり、ＥＵＬＡＲ応答基準に従って、２．６未満のＤＡＳ２８−ＥＳＲとして定義される寛解を伴う良好、中等度、および非応答にグレード付けされた（Ｋｉｒｋｈａｍ  Ｂ，Ｃｈａａｂｏ  Ｋ，Ｈａｌｌ  Ｃ，Ｇａｒｒｏｏｄ  Ｔ，Ｍａｎｔ  Ｔ，Ａｌｌｅｎ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｔｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩＡ  ＲＡＧＵＬＡ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２０１６；５５：１９９３−２０００）。生物学的有効性エンドポイントは、ＣＲＰ（図１２）、ＩＬ−８およびＶＥＧＦ（図１３）の変化であった。以下のさらなる考察を参照されたい。これらは、関節リウマチの治療の臨床薬物試験における疾患活動性を監視するために一般的に使用される。
【００８８】
臨床的に、良好なＥＵＬＡＲ応答は、プラセボを受けた患者ではいなかったことと比較して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を受けた３名の患者において観察された持続的な低ＤＡＳ２８スコア（３〜１２週間）を有する、より高い用量のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で処置された患者においてはより一般的であったが、すべての治療群において良好なＤＡＳ２８−ＥＳＲ応答が達成された。
【００８９】
血清ＶＥＧＦおよびＩＬ−８濃度
図１３は、Ｌｕｍｉｎｅｘテクノロジー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）によって測定された２週間または１２週間における各患者の注入前ベースラインからの、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の存在下でのＶＥＧＦまたはＩＬ−８の血清レベルの変化を示す。この分析には、１２週間時点で試験に残っている患者のみが含まれた（図１３）。
【００９０】
ＣＲＰ、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の分析は、プラセボと比較して活性薬物を受ける対象を区別するのに有用であることが証明された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に応答した患者は、プラセボ群および非応答群と比較して、２週間でのＣＲＰの有意な減少を示した（注入前レベル、１２．７±１．７対注入後２週間レベル、７．１±２．１、ｐ＝０．０２）。血清ＶＥＧＦおよびＩＬ−８は、滑膜炎および単球浸潤の測定とそれぞれ良好に相関するため、臨床試験で使用される一般的なバイオマーカーである。これらのバイオマーカーのレベルの有意な変化は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を受容した患者群において起こった。さらに、バイオマーカーは、プラセボ患者の臨床的改善を支持しなかった。驚くべきことに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３応答群（それぞれ７１％および８３％の患者）と比較して、プラセボを受けた患者は、１２週目に、有意に少ない患者が血清ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の減少を示した（それぞれ１７および５０％）。興味深いことに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の非応答者群でさえ、血清濃度の低下（それぞれ６６％および８３％の患者）を示し、疾患の病理学的変化を示唆した。
【００９１】
要約すると、活性応答患者は、プラセボ群から有意に低い、ＣＲＰの血清濃度（注入前レベルと比較した注入の２週間後の血清濃度）（図１２）、ならびにＶＥＧＦおよびＩＬ−８の血清濃度（図１３）を示した。これは、疾患の炎症が注入前のレベルよりもかなり少ないことを示す。
【００９２】
実施例５：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、制御性Ｔ細胞上でＣＤ３９を上方制御する
ＲＡ患者からの末梢血単核細胞を、無刺激（白色バー）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（１０μｇ／ｍｌ）（網目状バー）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（１０μｇ／ｍｌ）（黒色バー、図１４）のいずれかで培養状態に準備した。
【００９３】
２４時間後、４８時間または７２時間後、細胞を培養から取り出し、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ３９の蛍光色素結合体抗体のパネルで染色した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で細胞を解析した。
【００９４】
図１４の結果は、以下についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される：
（Ａ）複数のライブゲートを使用して、生きている、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋細胞にアクセスした後のＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ１２７ｌｏ細胞、
（Ｂ）（Ａ）におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ集団上でのＣＤ３９の発現
（Ｃ）ＰＢＭＣ（１０６／ｍＬ）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（１０または０．１μｇ／ｍｌ）または本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（１０または０．１μｇ／ｍｌ）で、培養中９６時間前処理し、洗浄し、新鮮な自己ＣＦＳＥ染色（細胞質色素カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）Ｔ細胞に添加し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズで刺激した。前処理されたＴ細胞と応答者Ｔ細胞の比率は、１：１０であった。細胞を、３日後にＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ上のＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してＣＦＳＥ  ＭＦＩの低減について分析した。細胞が増殖するにつれて、各分裂によってＣＦＳＥ含有量が減少し、増殖しない細胞は高度に染色されたままである。
（Ｄ）臨床試験では、プラセボおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３治療を受けた関節リウマチ患者、応答者（Ｒ）または非応答者（ＮＲ）からの全血サンプルを、１２週間にわたって、Ｔｒｅｇ細胞（生きている、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ）でのＣＤ３９の発現の変化について監視した。結果は、示される時点での、前注入からの細胞表面発現の変化％として表現される。
【００９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３との間のインビトロ比較は、Ｔｒｅｇ数の実際の増加は低く、したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を用いた以前の研究を確認し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と直接比較した場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を用いたＴｒｅｇにおけるＣＤ３９の発現％にはより大きな差があることを示す。興味深いことは、７２時間において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の培養物からのＴｒｅｇ上のＣＤ３９発現は、対照細胞の発現よりも低いことである。診療所において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に応答する患者からのＴｒｅｇ細胞上のＣＤ３９の発現の有意な増加が観察され、これは注入後１２週間維持された。
【００９６】
実施例６：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は破骨細胞分化シグナル伝達経路を抑制する
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３による破骨細胞形成の阻害の根底にあるメカニズムを調査するために、破骨細胞分化に不可欠であることが知られている特定のサイトカインシグナル伝達および下流シグナル伝達経路を分析した。ヒト末梢血由来Ｍ−ＣＳＦ依存性破骨細胞前駆体における、それぞれＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの受容体であるＣＤ１１５／ｃ−ＦｍｓおよびＲＡＮＫのフローサイトメトリー解析により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３が、ＣＤ１１５の発現を６３±１６％下方制御した（阻害範囲、４３〜７９％）ことが明らかになった（図１５Ａ）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ＲＡＮＫタンパク質発現を５１±２９％同様に阻害した（阻害範囲、２２〜９０％）（図１５Ｂ）。ｑＰＣＲ分析は、ｃ−ｆｍｓおよびＲＡＮＫ  ＲＮＡの有意な減少を示したため、ｃ−ＦｍｓおよびＲＡＮＫ発現の阻害もまたｍＲＮＡレベルで観察された（図１５Ｃ）。受容体発現の減少が、破骨細胞増殖性サイトカインに対する応答性の低下をもたらしたかどうかに対処するために、本発明者らは、ＲＡＮＫＬ依存性ＭＡＰＫシグナル伝達に対するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の効果を分析した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を用いたヒトＰＢＭＣ由来破骨細胞前駆体の前処理は、未処理の細胞と比較して、ＲＡＮＫＬ誘導ＥＲＫおよびｐ３８リン酸化を著しく抑制した（図１５Ｄ）。同様の結果を、Ｍ−ＣＳＦ依存性マウス骨髄由来破骨細胞前駆体を使用して得た（データ示さず）。後期培養物におけるＲＡＮＫＬ応答性のさらなる検査も同様に、ＲＡＮＫＬ誘導性ｐＥＲＫレベルが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１処理後の成熟破骨細胞で富化された培養物においてもまた減衰したことを明らかにした（図１５Ｅ）。
【００９７】
次に、本発明者らは、破骨細胞の分化に不可欠であり、破骨細胞前駆体および単球におけるＲＡＮＫおよびＴＮＦαシグナル伝達の下流に位置する転写因子ｃ−ＦｏｓおよびＮＦＡＴｃ１の発現に対するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の効果を調べた。ヒト破骨細胞前駆体の、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とのプレインキュベーションは、ＲＡＮＫＬ処理後のｃ−Ｆｏｓタンパク質の活性化を大幅に低下させた（図１５Ｆ）。ＮＦＡＴｃ１、ｃ−Ｆｏｓ標的遺伝子のＲＡＮＫＬ刺激は、対照細胞溶解物と比較した場合に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で処理した破骨細胞前駆体において同様に遮断された（図１５Ｆ）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で処理した成熟破骨細胞はまた、ｃ−ＦｏｓおよびＮＦＡＴｃ１転写因子の両方の内因性発現の著しい減少を示した（図１５Ｆ）。
【００９８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、破骨細胞への単球の分化に必要なシグナル伝達経路を阻害するので、本発明者らは、炎症を駆動するが代替経路がＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬによって下流分化を駆動するために必要とされている転写因子のうちの１つであるＮＦ−ＫＢにＳＥＱ３が同様の効果を有するかどうかを調べた。
【００９９】
イメージングフローサイトメトリーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３処理が、破骨細胞前駆体におけるｐ６５  ＮＦ−κＢのＴＮＦα誘導性核移行を阻害することを実証した（図１６Ａ）。ＲＡＮＫＬ刺激に応答して同様の結果を得た（データ示さず）。ＲＡＮＫＬは非正規ＮＦ−κＢ経路を介して細胞を刺激するため、ＲＡＮＫＬ刺激後のｐ５２  ＮＦ−κＢの核移行を調査した。共焦点顕微鏡法および画像解析は、ＲＡＮＫＬが未処理の細胞におけるｐ５２の効率的な核移行を刺激したのに対して、これがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３前処理によって阻害されたことを示した（図１６Ｂ）。これらの結果は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３が、ＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬ処理後の単球および破骨細胞前駆体における正規および非正規のＮＦ−κＢシグナル伝達の両方をブロックすることを示唆する。
【０１００】
総合すると、これらのデータにより、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を用いた単球および破骨細胞前駆体の処理は、Ｍ−ＣＳＦ誘導シグナル伝達およびＲＡＮＫＬ誘導シグナル伝達ならびに必須の破骨細胞増殖転写因子ＮＦ−κＢ、ｃ−ＦｏｓおよびＮＦＡＴｃ１の活性化を低減することが実証され、それによって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３が破骨細胞の分化および吸収活性を阻害するメカニズムへの洞察が提供される。
【０１０１】
このデータは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を使用して、骨代謝の調節不全の疾患を治療することができるという証拠を提供する。
【０１０２】
実施例７
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはプラセボを用いる処置後、患者の免疫応答を、最大刺激である抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体コーティングビーズ（３日間培養）（図１７Ａ）またはリコール抗原であるツベルクリンＰＰＤ（５日間培養）（図１７Ｂ）に対するＴ細胞応答を検出するために刺激されたＰＢＭＣ培養物を使用して測定した。
【０１０３】
活性化を、培養の最後の２４時間にわたって細胞を増殖させることによってトリチウム化チミジンの取り込みによって測定した。データは、臨床試験の１２週間にわたって、有糸分裂促進因子またはリコール抗原に応答する変化を示さない。これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３が全体的な免疫抑制効果を有しないことを示し、これは、ツベルクリンＰＰＤに対するリコール抗原応答を低減するものとして既に公表されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とは異なる（Ｃｏｒｒｉｇａｌｌ  ＶＭ，Ｂｏｄｍａｎ−Ｓｍｉｔｈ  ＭＤ，Ｂｒｕｎｓｔ  Ｍ，Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｈ，Ｐａｎａｙｉ  ＧＳ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢｉＰ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎｄ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：１１６７−１１７１）。
【０１０４】
実施例８：移植；皮膚移植マウスモデル
図１８は、プロトコルおよびマウス皮膚移植実験の結果の概略図を示す。すべてのレシピエントマウスに、移植の８日前に、内因性樹状細胞を枯渇させるために抗ＣＤ８抗体を投与した。４つの群のそれぞれに６匹のマウスが存在した。移植の７日前、対照マウスはビヒクルのみを受けた。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（２０μｇ／マウス）を静脈内投与した。他の２つの群は、Ｈ２Ｋｂ一致マウスから未成熟または成熟形質細胞様樹状細胞を受けた。１週間後、Ｈ２Ｋｄミスマッチマウスの尾部からの皮膚の小片をレシピエントマウスの背部に移植した。
【０１０５】
Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒグラフによる移植片生存率分析は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３が、５／６の移植片の生存期間を対照群の生存期間を超えて延長し、５０％の移植片が対照マウスの移植片よりも約３０％長く生存したことを示す。
【０１０６】
提示されるデータは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３が、移植片生存を維持することが非常に困難であると評されるモデルである皮膚移植マウスモデルにおいて移植片生存を維持するのに有効であることを示す。
【０１０７】
第２の移植探索実験も実施した（図１９を参照されたい）。再び、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３投与により、修飾樹状細胞（ＤＣ）を与えられた動物と比較して、皮膚移植片の生存期間が長くなる。ＤＣ投与とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の混合は有益ではなかった。
【０１０８】
実施例９：人工関節の緩み
プロテーゼでは、人工関節の周囲に発達する組織、すなわちプロテーゼ周囲組織の緩みは、関節リウマチ中に炎症を起こす滑膜と非常に類似している。この組織は、人工関節の緩みを引き起こす可能性がある。人工関節置換のための再置換手術中にプロテーゼ周囲組織（ＰＰＴ）を収集した。組織を等量の小片に切断し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の存在下または非存在下で、２４ウェルプレート中の組織培養培地（１ｍｌ）中で一晩培養した。培養上清を２４時間から７２時間の間に収集し、ＴＮＦα（炎症促進性）、またはインターロイキン−１０（抗炎症性）サイトカインを、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＢＤ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）によって定量化した。
【０１０９】
図２０は、本発明のタンパク質がＴＮＦαの産生にほとんど影響を及ぼさなかったが、ＩＬ−１０が顕著に増加したことを示す。
【０１１０】
本発明者らによって提供されるデータは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３が有意な抗炎症作用を有することを実証する。これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を使用して、炎症性腸疾患、例えばクローン病を治療することができることを示す。
【０１１１】
実施例１０
表４および５は、本発明のタンパク質と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、天然ＢｉＰとの間の生理学的および機能的な違いを要約する。これは、本発明のタンパク質と、以前に公開された組換えＢｉＰ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、天然タンパク質との間の重要な相違点を明確に要約する。
【０１１２】
（表４）
2021528100.tif 000005
【０１１３】
（表５）
2021528100.tif 000006
ひよこコラーゲンモデルは、重度の関節炎を改善したｎ＝１；＊＊臨床試験におけるＤＡＳ２８の低減、ＣＩＡ＝コラーゲン誘発性関節炎
【図１】
2021528100.tif 000007
【図２−１】
2021528100.tif 000008
【図２−２】
2021528100.tif 000009
【図３】
2021528100.tif 000010
【図４】
2021528100.tif 000011
【図５Ａ】
2021528100.tif 000012
【図５Ｂ】
2021528100.tif 000013
【図６−１】
2021528100.tif 000014
【図６−２】
2021528100.tif 000015
【図７−１】
2021528100.tif 000016
【図７−２】
2021528100.tif 000017
【図８−１】
2021528100.tif 000018
【図８−２】
2021528100.tif 000019
【図９】
2021528100.tif 000020
【図１０】
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【図１１】
2021528100.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
2021528100.tif 000026
【図１５−２】
2021528100.tif 000027
【図１６】
2021528100.tif 000028
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月15日(2021.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021528100000001.app
【国際調査報告】
2021528100.tif 000033
2021528100.tif 000034
2021528100.tif 000035