(57)【要約】  本発明は、乳児用栄養製剤の分野に関し、具体的には、牛乳アレルギー（ＣＭＡ）を発症するリスクがある乳児用の、牛乳タンパク質をベースとする低アレルゲン性栄養組成物を生成する方法に関する。この方法は、（ｉ）水性媒体中に１種又は複数種の牛乳タンパク質を含む出発組成物を酵素処理にかけることにより得られる、乳タンパク質の部分的加水分解物を準備する工程、（ｉｉ）この部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する工程、（ｉｉｉ）この清浄化された部分的加水分解物を任意選択的に濃縮する工程、並びに（ｉｖ）この（濃縮された）清浄化された部分的加水分解物を、ＣＭＡを発症するリスクがある乳児用の栄養組成物へと製剤化する工程を含む。
2021510502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛乳アレルギー（ＣＭＡ）を発症するリスクがある乳児用の低アレルゲン性栄養組成物を生成する方法であって、
（ｉ）水性媒体中に１種又は複数種の牛乳タンパク質を含む出発組成物を酵素処理にかけることにより得られる、乳タンパク質の部分的加水分解物を準備する工程、
（ｉｉ）前記部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する工程、
（ｉｉｉ）前記清浄化された部分的加水分解物を任意選択的に濃縮する工程、
並びに
（ｉｖ）前記（濃縮された）清浄化された部分的加水分解物を、ＣＭＡを発症するリスクがある乳児用の栄養組成物へと製剤化する工程
を含み、
前記清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、前記部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含むか、又は
前記清浄化する工程（ｉｉ）は、前記部分的加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィー、及び清浄化された部分的加水分解物を含む前記ろ液を回収することを含む、
方法。
【請求項２】
前記清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤの範囲の、好ましくは１０〜５０ｋＤａの範囲の、より好ましくは１０〜２０ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、前記部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含む前記ろ液を回収することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記部分的加水分解物は、ホエイタンパク質、酸ホエイタンパク質、スイートホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質単離物、脱塩ホエイ粉末、及びカゼイン塩からなる群から選択される１種又は複数種の牛乳タンパク質から得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記部分的タンパク質加水分解物は、部分的ホエイタンパク質加水分解物を含むか、又は部分的ホエイタンパク質加水分解物であり、前記部分的タンパク質加水分解物は、部分的ベータ−ラクトグロブリン加水分解物及び／若しくは部分的アルファ−ラクトアルブミン加水分解物を含むか、又は部分的ベータ−ラクトグロブリン加水分解物及び／若しくは部分的アルファ−ラクトアルブミン加水分解物であり、前記部分的タンパク質加水分解物は、部分的カゼイン加水分解物を含むか、又は部分的カゼイン加水分解物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記部分的加水分解物は、加水分解度（ＤＨ）が約５〜２０％の範囲であり、好ましくは６〜１８％の範囲であり、より好ましくは７〜１１％の範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記部分的加水分解物は、少なくとも１０重量％の、サイズが５ｋＤａ以上であるペプチドと、少なくとも１５重量％の、サイズが１〜５ｋＤａの範囲のペプチドとを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記部分的タンパク質加水分解物中の前記ペプチドの前記サイズ分布は、部分的タンパク質加水分解物中に存在するペプチドの乾燥重量を基準として、４０〜６０％  ＜１ｋＤａ、１０〜１４％  １〜＜２ｋＤａ、８〜１６％  ２〜＜５ｋＤａ、３〜７％  ５〜＜１０ｋＤａ、及び８〜１２％  ＞１０ｋＤａである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１０〜５０ｋＤａの範囲の、好ましくは１０〜２０ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜の使用を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ろ過は、精密ろ過（ＭＦ）、限外ろ過（ＵＦ）、炭素ろ過、又はポリッシュろ過を含み、好ましくは限外ろ過を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記清浄化された部分的加水分解物を濃縮する工程（ｉｉｉ）を含み、好ましくは、工程（ｉｉｉ）は噴霧乾燥を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉｖ）は、前記濃縮された、清浄化された部分的加水分解物と、炭水化物の供給源、脂質及び通常のビタミンの供給源、微量元素、並びにミネラルとを組み合わせることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｖ）は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）、特に２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）及び／又は６’−シアリルラクトース、並びにＴＧＦβからなる群から選択される少なくとも１種の成分を含めることを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得られる、乳児用の低アレルゲン性栄養組成物。
【請求項１４】
遺伝的にかかりやすい及び／又はＣＭＡを発症する家族歴を有する乳児又は幼児への投与での使用のための、請求項１３に記載の低アレルゲン性栄養組成物。
【請求項１５】
乳タンパク質の部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する方法であって、
（ｉ）水性媒体中に１種又は複数種の牛乳タンパク質を含む出発組成物を酵素処理にかけることにより得られる、前記乳タンパク質の部分的加水分解物を準備する工程、
並びに
（ｉｉ）前記部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する工程、
並びに
（ｉｉｉ）前記清浄化された部分的加水分解物を任意選択的に濃縮する工程
を含み、
前記清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、前記部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含むか、又は
前記清浄化する工程（ｉｉ）は、前記部分的加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィー、及び清浄化された部分的加水分解物を含む前記ろ液を回収することを含む
方法。
【請求項１６】
前記清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤの範囲の、好ましくは１０〜５０ｋＤａの範囲の、より好ましくは１０〜２０ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、前記部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の方法により得られる、乳タンパク質の部分的加水分解物。
【請求項１８】
遺伝的にかかりやすい及び／又はＣＭＡを発症する家族歴を有する乳児又は幼児への投与での使用のための、請求項１７に記載の乳タンパク質の部分的加水分解物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳児用栄養製剤の分野に関する。より具体的には、本発明は、牛乳アレルギー（ＣＭＡ）を発症するリスクがある乳児用の、牛乳タンパク質をベースとする低アレルゲン性栄養組成物を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの乳児用調製乳は、牛乳由来のタンパク質をベースとする。しかしながら、牛乳タンパク質は、０．１％〜８％の範囲と推定される少数の人において、アレルギー性症状を引き起こすことが知られている。
【０００３】
牛乳アレルギー（ＣＭＡ）の推定有病率は０．２５％〜４．９％であり、成人と比べて小児で高い。ＣＭＡは、１種又は複数種の乳タンパク質に対する免疫学的反応に起因する。この免疫学的根拠により、ＣＭＡは、乳糖不耐症等の牛乳タンパク質に対する他の有害反応と区別される。ＣＭＡは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）介在型であるか又は非ＩｇＥ介在型である場合があり、且つアトピー体質の発現である場合があり、且つ更なる食物アレルギーを伴う場合がある。（地域的な食事摂取に依存する）他の食物に対する反応が、ＣＭＡと併せて起こる場合がある。非ＩｇＥ介在障害は通常、Ｔ細胞（又は好酸球）を伴い、胃腸症状を主に呈し、且つ多重食物アレルギーを発症する可能性が低い。ＩｇＥ介在機序及び非ＩｇＥ介在機序は、アトピー性皮膚炎及び好酸球性消化管障害（ＥＧＩＤ）の発病において役割を果たす場合がある。一般的なアレルゲン性反応として、下痢、嘔吐、腸障害、呼吸障害、皮膚炎、過敏性、不穏、及び食欲不振が挙げられる。ベータ−ラクトグロブリン（ヒト乳中には存在しない）は、乳過敏症の最も多い原因である。
【０００４】
タンパク質加水分解により、牛乳タンパク質ベースの調製乳のアレルゲン性の可能性を低減し得る。実際には、加水分解されたタンパク質は、牛乳タンパク質に対するアレルギーと診断された乳児用の又はアレルギーリスク群に属すると確認された乳児用の調製乳に不可欠である。加水分解プロセスの最中に、タンパク質上のアレルギーを引き起こす領域（エピトープ）が、破壊されるか、又は最小限にまで減少する。動物実験により、部分的化加水分解物がインタクトなタンパク質に対する経口耐性を誘発し得ることが示されている。経口耐性とは、経口投与されたアレルゲンに対する免疫系の非積極的反応のことである。経口耐性が欠乏すると食物アレルギーが生じ、このことは、経口耐性が生後数ヶ月での重要なプロセスであることを意味する。
【０００５】
乳児用栄養での使用のための２種の乳タンパク質加水分解物カテゴリーが存在する。広範囲加水分解物では、ほぼ全てのエピトープが破壊されており、その結果、ＣＭＡに罹患していることが分かっている乳児で使用され得る。対象的に、部分的タンパク質加水分解物は、最小数のエピトープを依然として含む。部分的加水分解物は概して、非アレルギー性の乳児（例えば、ＣＭＡを発症し易い乳児）でのアレルギーの予防及び快適さに理想的であると考えられている。ヒト乳の組成を理想的に満たすためには、乳児用調製乳中の牛乳タンパク質は、適切な比率でホエイタンパク質とカゼインとの両方を含むべきである。インタクトな乳タンパク質をベースとする製品の多くは、望ましいホエイタンパク質対カゼイン比を満たすが、市販されている部分的加水分解調製乳の大部分は、１００％ホエイタンパク質をベースとする。
【０００６】
部分的ホエイタンパク質加水分解物の調製のためのプロセスは、当該技術分野で公知であり、酵素及び／又は残留タンパク質を除去するために多段階の加水分解及びこの加水分解後の物理的分離を一般に伴う。ほとんどのプロセスはまた、加水分解の最中に定期的なｐＨ調節も伴う。
【０００７】
Ｂｏｙｌｅ他による刊行物（ＢＭＪ  ２０１６；３５２：ｉ９７４）は、加水分解調製乳がアレルギー性疾患又は自己免疫疾患のリスクの低減に有効であるかどうか疑問を投げかけた。１９，０００例を超える参加者を含む、加水分解調製乳の３７の介入試験に関する系統的な概説及びメタアナリシスに基づいて、部分的に又は広範囲に加水分解された調製乳が、アレルギー性転帰又は自己免疫転帰の既存のリスクが高い乳児で、これらの転帰のリスクを低減するという全体的に一貫した証拠は存在しないと結論付けられた。注目すべきことに、著者らは、部分的加水分解調製乳が湿疹のリスクを低減させ得ることを米国食品医薬品局により承認された栄養機能表示を支持する証拠も、加水分解調製乳が牛乳に対してアレルギーを引き起こす可能性があるというＣｏｃｈｒａｎｅの概説の結論を支持する証拠も存在しなかったと結論付けている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在市販されている部分的乳タンパク質加水分解物の機能性をよりよく理解する目的で、本発明者らは、免疫原性及び／又はアレルゲン性を引き起こす潜在的成分の存在を解読することに着手した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、いくつかの従来の部分的加水分解物は、ＤＣ、マクロファージ、Ｔリンパ球、及びＢ細胞上で高度に発現されるＡＧＥ（最終糖化産物）のレセプターであるＲＡＧＥに結合し得るタンパク質性凝集体、並びに肥満細胞及び好塩基球を含むことを観察した。Ｔｅｏｄｏｒｏｗｉｃｚ他（２０１６）及びＳｍｉｔｈ他（２０１７）で論じられているように、食事性ＡＧＥによるＲＡＧＥ活性化は、（処理された）食物タンパク質のアレルゲン性効果及び免疫原性効果の媒介に関与することが知られている。
【００１０】
加えて、インビトロの好塩基球アッセイを使用して、部分的乳加水分解物は、アレルギー性メディエータの開口分泌をもたらすプロセスである脱顆粒を誘発することが分かった。注目すべきことに、この部分的加水分解物からの高分子量（糖化）凝集体の除去により、ＲＡＧＥ結合及び好塩基球性顆粒球の脱顆粒の両方が有意に減少した。
【００１１】
これにより、本発明者らは、ＣＭＡを発症するリスクがある乳児の栄養成分としての使用のための、改善された部分的乳タンパク質加水分解物を生成した。用語「し易い」及び「リスクがある」は、本明細書で使用される場合、別途明記されていない限り、ある特定の状態又は疾患に対する耐性がほとんどないこと（例えば、この状態若しくは疾患に遺伝的に罹りやすいこと、この状態若しくは疾患の家族歴を有すること、及び／又はこの状態若しくは疾患の症状を有すること）を意味する。例えば、少なくとも１人の近親者がアレルギーを罹患している乳児は、ＣＭＡを発症するリスクがある。さらに、そのようなアレルゲン性が低減された乳児用調製乳は、アレルギーの臨床症状につながる可能性がある感作を遅延させ得るか又は予防し得るという点で、予防的利点を有すると見なされる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一実施形態では、本発明は、牛乳アレルギー（ＣＭＡ）を発症するリスクがある乳児用の低アレルゲン性栄養組成物を生成する方法であって、
（ｉ）水性媒体中に１種又は複数種の牛乳タンパク質を含む出発組成物を酵素処理にかけることにより得られる、乳タンパク質の部分的加水分解物を準備する工程、
（ｉｉ）この部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する工程、
（ｉｉｉ）この清浄化された部分的加水分解物を任意選択的に濃縮する工程、
並びに
（ｉｖ）この（濃縮された）清浄化された部分的加水分解物を、ＣＭＡを発症するリスクがある乳児用の栄養組成物へと製剤化する工程
を含む方法を提供する。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は、牛乳アレルギー（ＣＭＡ）を発症するリスクがある乳児用の低アレルゲン性栄養組成物を生成する方法であって、
（ｉ）水性媒体中に１種又は複数種の牛乳タンパク質を含む出発組成物を酵素処理にかけることにより得られる、乳タンパク質の部分的加水分解物を準備する工程、
（ｉｉ）この部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する工程、
（ｉｉｉ）この清浄化された部分的加水分解物を任意選択的に濃縮する工程、
並びに
（ｉｖ）この（濃縮された）清浄化された部分的加水分解物を、ＣＭＡを発症するリスクがある乳児用の栄養組成物へと製剤化する工程
を含み、
清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、この部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む、
方法を提供する。
【００１４】
別の特定の実施形態では、本発明は、牛乳アレルギー（ＣＭＡ）を発症するリスクがある乳児用の低アレルゲン性栄養組成物を生成する方法であって、
（ｉ）水性媒体中に１種又は複数種の牛乳タンパク質を含む出発組成物を酵素処理にかけることにより得られる、乳タンパク質の部分的加水分解物を準備する工程、
（ｉｉ）この部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する工程、
（ｉｉｉ）この清浄化された部分的加水分解物を任意選択的に濃縮する工程、
並びに
（ｉｖ）この（濃縮された）清浄化された部分的加水分解物を、ＣＭＡを発症するリスクがある乳児用の栄養組成物へと製剤化する工程
を含み、
清浄化する工程（ｉｉ）は、この部分的加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィー、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む、
方法を提供する。
【００１５】
好ましい実施形態では、清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む。この実施形態では、この膜は、１０〜５０ｋＤａの範囲の、より好ましくは１０〜２０ｋＤａの範囲の分子量カットオフを有することがさらに好ましい。
【００１６】
一実施形態では、部分的加水分解物は、ホエイタンパク質、酸ホエイタンパク質、スイートホエイタンパク質（ｓｗｅｅｔ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質単離物、脱塩ホエイ粉末、及びカゼイン塩からなる群から選択される１種又は複数種の牛乳タンパク質から得られる。例えば、この部分的タンパク質加水分解物は、部分的ホエイタンパク質加水分解物を含むか、又は部分的ホエイタンパク質加水分解物であり、この部分的タンパク質加水分解物は、部分的ベータ−ラクトグロブリン加水分解物及び／若しくは部分的アルファ−ラクトアルブミン加水分解物を含むか、又は部分的ベータ−ラクトグロブリン加水分解物及び／若しくは部分的アルファ−ラクトアルブミン加水分解物であり、又はこの部分的タンパク質加水分解物は、部分的カゼイン加水分解物を含むか、又は部分的カゼイン加水分解物である。
【００１７】
ホエイタンパク質の供給源は、酸ホエイであってもよいし、スイートホエイであってもよいし、ホエイタンパク質単離物であってもよいし、これらの混合物であってもよい。一実施形態では、このタンパク質源は、ホエイタンパク質単離物又は改質スイートホエイをベースとする。スイートホエイは、チーズ製造の容易に入手可能な副産物であり、牛乳をベースとする乳児用調製乳の製造で使用されることが多い。しかしながら、スイートホエイは、トレオニンに不必要に富み且つトリプトファンに乏しい成分であるカゼイノ−グリコ−マクロペプチド（ＣＧＭＰ）を含む。スイートホエイからのＣＧＭＰの除去により、トレオニン含有量がヒト乳のトレオニン含有量に近いタンパク質画分が得られる。スイートホエイからＣＧＭＰを除去するプロセスは、欧州特許第８８０９０２号明細書で説明されている。タンパク質源として改質スイートホエイ又はホエイタンパク質単離物を使用する場合には、このタンパク質の０．１〜３重量％の量で遊離ヒスチジンを補充してもよい。
【００１８】
特定の態様では、部分的加水分解物はホエイタンパク質濃縮物から得られる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、語句「部分的加水分解物」は、ＣＭＡに罹患している乳児用の栄養成分として当該技術分野で既知の広範囲に加水分解されたタンパク質加水分解物と区別すべきである加水分解物を指す。一実施形態では、この部分的加水分解物は加水分解度（ＤＨ）が約５〜２０％の範囲であり、ＤＨは、当該技術分野で既知の方法により（例えばホルマール滴定（ｆｏｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）又はＡＮ／ＴＮにより）決定される。好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＤＨが６〜１８％であり、より好ましくは８〜１５％である部分的加水分解物を使用する。特定の態様では、この部分的加水分解物はＷＰＣから得られ、ＤＨが５〜１４％の範囲であり、好ましくは７〜１１％の範囲である。
【００２０】
牛乳タンパク質を、当該技術分野で既知の任意の適切な方法で加水分解し得る。典型的には、酵素処理は、ｐＨ６〜８及び４５〜６０℃の範囲の温度での、２．５〜２４時間の期間にわたる、１種又は複数種の乳タンパク質を含む出発組成物の１種又は複数種のエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼへの曝露を含む。
【００２１】
次いで、例えば、この出発物質（それ自体、又は溶液若しくは懸濁液等の適切な形態）を、少なくとも１種のエンドプロテイナーゼ及び少なくとも１種のエキソプロテイナーゼの組み合わせで処理し、ここで、前記酵素混合物を０．１〜５％の量で添加する。一実施形態では、この出発物質は、１０〜２０重量％の範囲のタンパク質含有量で水性媒体中に１種又は複数種の乳タンパク質を含む組成物である。エンドプロテイナーゼ及びエキソプロテイナーゼを（例えば、２つ以上の別々の加水分解工程で）順次使用し得るか、又は（例えば、任意選択的に、任意の残余の酵素を使用する１つ又は複数の更なる加水分解工程と組み合わせて、単一の加水分解工程において適切な混合物として）同時に使用し得る。好ましくは、この加水分解は、使用する全ての酵素の組み合わせを使用する単一の加水分解工程を含む。
【００２２】
一実施形態では、エンドプロテイナーゼ及びエキソプロテイナーゼとして、セリンプロテアーゼの適切な混合物（例えば、酵素アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）及びトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎｅ）を（少なくとも）含む酵素混合物）を使用する。前記酵素混合物での使用に適した別の酵素は、フレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）である。一実施形態では、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）、フレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）、及びトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎｅ）の混合物を使用する。
【００２３】
適切な酵素（例えば、エンドプロテイナーゼ及びエキソプロテイナーゼの混合物）を使用して、出発物質を、４時間未満にわたり、好ましくは１．５〜３時間にわたり、約４５〜６０℃の温度で、好ましくは５０〜５８℃の温度で、加水分解し得る。この加水分解の最中に、ｐＨを６．４〜８の範囲で概して保持し、好ましくは、例えば６．８〜７．８の範囲で本質的に一定に保持する。
【００２４】
実質的にラクトースを含まない出発物質としてホエイ画分を使用する場合には、加水分解及びその後の熱処理の最中に、このタンパク質が受けるリシン遮断（ｌｙｓｉｎｅ  ｂｌｏｃｋａｇｅ）がはるかに少ないことを見出し得る。これにより、リシン遮断の程度を総リシンの約１５重量％からリシンの約１０重量％未満（例えば、タンパク質源の栄養の質を大幅に改善する約７重量％のリシン遮断）に減少させることが可能となる。
【００２５】
本発明の一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１０重量％の、サイズが５ｋＤａ以上であるペプチドと、少なくとも１５重量％の、サイズが１〜５ｋＤａの範囲のペプチドとを含む部分的牛乳タンパク質加水分解物を準備することを含む。
【００２６】
例えば、部分的タンパク質加水分解物中のペプチドのサイズ分布は、部分的タンパク質加水分解物中に存在するペプチドの乾燥重量を基準として、４０〜６０％  ＜１ｋＤａ、１０〜１４％  １〜＜２ｋＤａ、８〜１６％  ２〜＜５ｋＤａ、３〜７％  ５〜＜１０ｋＤａ、及び８〜１２％  ＞１０ｋＤａである。
【００２７】
本発明の方法は、部分的牛乳タンパク質加水分解物を、おそらく最終糖化産物（ＡＧＥ）の存在に起因して最終糖化産物（ＡＧＥ）のレセプターであるＲＡＧＥに結合し得る（即ち、ＲＡＧＥ結合特性を有する）及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の不要な成分（凝集体）から清浄化し、それにより、この加水分解物のアレルゲン性／免疫原性の可能性を低減することを含むことを特徴とする。
【００２８】
一態様では、ＲＡＧＥ結合活性を有する１種又は複数種の成分（凝集体）を除去する。ＲＡＧＥ結合成分の存在（又は非存在）を、当該技術分野で既知の方法を使用して決定し得、例えば、ヒトＥＬＩＳＡにおいて最終糖化産物の可溶性レセプター（ｓＲＡＧＥ）を使用して決定し得る。ｓＲＡＧＥ試験キットがＢｉｏＶｅｎｄｏｒから販売されている。
【００２９】
加えて、又は或いは、ＡＧＥの存在及び／又は除去を、当該技術分野で既知の方法により検出し得る。例えば、Ｎ−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）を、ｏ−フタルアルデヒドプレカラム誘導体化を伴うＨＰＬＣ／ＦＬＤ法を使用して、ＡＧＥのマーカーとして分析し得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．３０  ｎｏ．１  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ６７３．８）。
【００３０】
或いは、又は加えて、好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分（凝集体）（例えば、ＲＢＬを使用する既知のインビトロアッセイを使用して照明されている）を除去する。さらに別の実施形態では、ＲＡＧＥ結合成分（凝集体）及び好塩基球脱顆粒誘発能力を有する成分を除去する。
【００３１】
一実施形態では、清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む。１０〜５０ｋＤの範囲の、好ましくは１０〜２０ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用して、良好な結果が得られる。好ましい実施形態では、清浄化する工程（ｉｉ）は、１０ｋＤａの分子カットオフを有する膜を使用する、部分的加水分解物のろ過を含む。
【００３２】
当業者は、本発明に従って任意のタイプのろ過技術を使用して１種又は複数種の不要な成分を除去し得ることを認識するだろう。例えば、本明細書で提供される方法は、精密ろ過（ＭＦ）、限外ろ過（ＵＦ）、炭素ろ過、又はポリッシュろ過（ｐｏｌｉｓｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を伴い得る。限外ろ過を使用して、非常に良好な結果を得ることができる。
【００３３】
ろ過の後、清浄化された部分的加水分解物を、当該技術分野で既知の方法により（例えば、噴霧乾燥等の熱処理により）高乾燥固体分へと濃縮し得る。
【００３４】
清浄化する工程（ｉｉ）で他の技術を使用してもよいことを当業者は認識するだろう。別の実施形態では、清浄化する工程（ｉｉ）は、部分的加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィー、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む。この実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより、分子量が１００ｋＤａ以上である成分が除去される。清浄化された部分的加水分解物を、当該技術分野で既知の方法により（例えば、噴霧乾燥等の熱処理により）高乾燥固体分へと濃縮し得る。
【００３５】
本明細書で開示されている方法の工程（ｉｖ）では、（濃縮された）清浄化された部分的牛乳タンパク質加水分解産物を、ＣＭＡを発症するリスクがある乳児用の栄養組成物へと製剤化する。この（濃縮された）清浄化された部分的牛乳タンパク質加水分解産物は概して、更なる分画又は精製を行なうことなく、最終的な栄養製品中で「それ自体」が使用される。
【００３６】
好ましくは、この（濃縮された）清浄化された部分的牛乳タンパク質加水分解産物を、低アレルゲン性の乳児用調製乳へと製剤化し、より好ましくは、生後４ヶ月超の乳児による使用のための乳児用調製乳へと製剤化する。
【００３７】
そのため、本発明はまた、本明細書で開示されている方法により得られる、乳児用の低アレルゲン性栄養組成物も提供する。より具体的には、本発明は、生後１年間の乳児による特定の栄養学的使用を目的とし、且つ１９９１年５月１４日のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９１／３２１／ＥＥＣで定義されているように、このカテゴリーの人の栄養要求量をそれ自体で満たすことを目的とする、「低アレルゲン性の乳児用調製乳」とも本明細書で称される低アレルゲン性栄養組成物を提供する。用語「乳児用調製乳」には、スターター乳児用調製乳及びフォローオン調製乳（ｆｏｌｌｏｗ−ｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａ）が含まれる。用語「スターター乳児用調製乳」は、生後４ヶ月〜６ヶ月の乳児による特定の栄養学的使用を目的とする食品を意味する。用語「フォローオン調製乳」は、生後４ヶ月〜６ヶ月（最大１２ヶ月）の乳児による特定の栄養学的使用を目的とし、且つこのカテゴリーの人の連続的に多様化した食事の主要な液体要素を構成することを目的とする食品を意味する。
【００３８】
本発明の乳児用調製乳は、すぐに摂取される調製乳１００ｍｌ当たり、部分的に加水分解されたホエイタンパク質１．０〜２．０グラムを含み得、より好ましくは１．５〜１．９ｇ／１００ｍｌを含み得る。
【００３９】
本発明に係る乳児用調製乳は、炭水化物源を含んでもよい。炭水化物の好ましい供給源はラクトースであるが、乳児用調製乳中で従来見出される任意の炭水化物源（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトデキストリン、デンプン、及びこれらの混合物）を使用してもよい。好ましくは、炭水化物源は、この調製乳の総エネルギーの３５〜６５％に寄与する。
【００４０】
この乳児用調製乳は一般に、脂質の供給源を含む。この場合、この脂質源は、乳児用調製乳での使用に適している任意の脂質又は脂肪であり得る。好ましい脂肪源として、乳脂肪、ベニバナ油、卵黄脂質、キャノーラ油、オリーブ油、ヤシ油、パーム核油、大豆油、魚油、パームオレイン酸（ｐａｌｍ  ｏｌｅｉｃ）、高オレイン酸ヒマワリ油及び高オレイン酸ベニバナ油、並びに長鎖多価不飽和脂肪酸を含む微生物発酵油が挙げられる。一実施形態では、無水乳脂肪が使用される。この脂質源はまた、これらの油に由来する画分（例えば、パームオレイン、中鎖トリグリセリド、及び脂肪酸のエステル、例えば、アラキドン酸、リノール酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ドコサヘキサエオン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リノレン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸、並びに同類のもの）の形態であってもよい。事前に形成されたアラキドン酸及びドコサヘキサエン酸を多量に含む油（魚油又は微生物油）の少量を添加してもよい。この脂質源は、好ましくは、ｎ−６脂肪酸対ｎ−３脂肪酸の比率が約５：１〜約１５：１であり、例えば約８：１〜約１０：１である。ある実施形態では、この乳児用調製乳は、エネルギー密度が６００ｋｃａｌ／Ｌ〜７８０ｋｃａｌ／Ｌであり、好ましくは６３０ｋｃａｌ／Ｌ〜７００ｋｃａｌ／Ｌである。合計で、脂質含有量は、好ましくは、この調製乳の総エネルギーの３０〜５５％に寄与するものである。
【００４１】
特定の態様では、本乳児用調製乳は、トリアシルグリセロールにエステル結合したパルミチン酸を含む油混合物を含み、例えば、トリアシルグリセロールのｓｎ−２位でエステル結合したパルミチン酸は、総パルミチン酸の２０重量％〜６０重量％の量であり、トリアシルグリセロールのｓｎ−１／ｓｎ−３位でエステル結合したパルミチン酸は、総パルミチン酸の４０重量％〜８０重量％の量である。
【００４２】
本乳児用調製乳はまた、毎日の食事で及び栄養学的に有意な量で必須であると理解されている全てのビタミン及びミネラルも含んでもよい。ある特定のビタミン及びミネラルに関しては、最低限の必要量が確立されている。この乳児用調製乳中に任意選択的に存在するミネラル、ビタミン、及び他の栄養素の例として、下記が挙げられる：ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、葉酸、イノシトール、ナイアシン、ビオチン、パントテン酸、コリン、カルシウム、リン、ヨウ素、鉄、マグネシウム、銅、亜鉛、マンガン、塩化物、カリウム、ナトリウム、セレン、クロム、モリブデン、タウリン、及びＬ−カルニチン。ミネラルは通常、塩の形態で添加される。具体的なミネラル及び他のビタミンの存在及び量は、対象とする乳児集団に応じて変わるだろう。
【００４３】
具体的な態様では、本発明に係る方法は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）、特に２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）及び／又は６’−シアリルラクトース、並びにＴＧＦ−βからなる群から選択される少なくとも１種の成分を含めることを含む。
【００４４】
一実施形態では、本乳児用調製乳は、少なくともガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む。
【００４５】
別の実施形態では、本乳児用調製乳は、少なくともヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を含み、好ましくは、シアリルラクトース、フコシルラクトース、ジ−シアリル化オリゴ糖、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオース（ＬＮＦＰ）異性体、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース（ＬＮＤＦＨ）異性体、フコシルラクト−Ｎ−ヘキサオース（Ｆ−ＬＮＨ）異性体、ジフコシルラクト−Ｎ−ヘキサオース（ＤＦ−ＬＮＨ）異性体、及びトリフコシルラクト−Ｎ−ヘキサオース（ＴＦ−ＬＮＨ）異性体からなる群から選択されるＨＭＯを含む（国際公開第２０１３／０２５１０４Ａ１号パンフレットも参照されたい）。このシアリルラクトースは牛乳に由来してもよい。特に好ましい実施形態では、この調製乳は、２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）及び／又は６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）を含む。
【００４６】
本発明の乳児用調製乳は、すぐに摂取される乳児用調製乳１００ｍｌ当たりＴＧＦ−β  ５０〜１０００ナノグラムを含み得、より好ましくは１００ｍｌ当たり５０〜５００ナノグラムを含み得、最も好ましくは１００ｍｌ当たり２００〜３００ナノグラムを含み得る。好ましくは、本発明の乳児用調製乳は、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の両方を含み、より好ましくは１：５〜１：５０の比率で含む。
【００４７】
例えば欧州特許第１２１８４１０Ｂ１号明細書で説明されているように、この調製乳に、ＴＧＦ−βを、当該技術分野で既知の方法により乳から単離されたポリペプチド成長因子の形態で添加し得る。或いは、好ましい場合には組換えＴＧＦ−βを使用し得る。
【００４８】
必要な場合には、本乳児用調製乳は、乳化剤及び安定剤（例えば、大豆レシチン、モノグリセリド及びジグリセリドのクエン酸エステル、並びに同類のもの）を含んでもよい。この乳児用調製乳は、有益な効果を有し得る他の物質（例えば、ラクトフェリン、ヌクレオチド、ヌクレオシド、及び同類のもの）を任意選択的に含んでもよい。
【００４９】
本発明の別の態様では、本発明は、乳タンパク質の部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する方法であって
（ｉ）水性媒体中に１種又は複数種の牛乳タンパク質を含む出発組成物を酵素処理にかけることにより得られる、この乳タンパク質の部分的加水分解物を準備する工程、
並びに
（ｉｉ）この部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する工程、
並びに
（ｉｉｉ）この清浄化された部分的加水分解物を任意選択的に濃縮する工程
を含み、
清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、この部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含むか、又は
清浄化する工程（ｉｉ）は、この部分的加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィー、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む
方法に関する。
【００５０】
好ましい実施形態では、清浄化する工程（ｉｉ）は、１０〜１００ｋＤａの範囲の分子カットオフを有する膜を使用する、この部分的加水分解物のろ過、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む。この実施形態では、この膜は、１０〜５０ｋＤａの範囲の、より好ましくは１０〜２０ｋＤａの範囲の分子量カットオフを有することがさらに好ましい。別の実施形態では、清浄化する工程（ｉｉ）は、この部分的加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィー、及び清浄化された部分的加水分解物を含むろ液を回収することを含む。この実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより、１００ｋＤａ以上の分子量を有する成分が除去される。
【００５１】
用語「部分的加水分解物」を、上記でより詳細に説明している。部分的加水分解物及びその好ましい実施形態を、上記でより詳細に説明している。この好ましい実施形態はまた、本発明に係る、乳タンパク質の部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する方法にも適用される。
【００５２】
本発明は、さらに、本発明に係る、乳タンパク質の部分的加水分解物を、ＲＡＧＥ結合し得る及び／又は好塩基球脱顆粒誘発能力を有する１種又は複数種の成分から清浄化する方法により得られる、乳タンパク質の部分的加水分解物に関する。
【００５３】
本発明はまた、遺伝的にかかりやすい及び／又はＣＭＡを発症する家族歴を有する乳児又は幼児への投与での使用のための、本発明に係る乳タンパク質の部分的加水分解物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】遠心フィルタユニットによる乳タンパク質加水分解物Ｓ１００、Ｓ３７５、Ｓ８ｘ、及びＳ６−５０の分画後の様々なＭＷ画分の相対的な寄与を示す。データは、得られた画分のタンパク質濃度及び体積に基づく。
【図２】ＳＥＣによるホエイタンパク質加水分解物画分の分析を示す。ホエイタンパク質加水分解物（Ｓ８ｘ）を、フィルタユニットで分画し、続いてＳＥＣにより画分を分析した。ｘ軸：フィルタユニットによる分画によって得られた画分；ｙ軸：ＳＥＣの結果。データを１００％に正規化している。
【図３】加水分解物Ｓ８Ｘ（パネルＡ）及びＳ１００（パネルＢ）の様々な画分に対するｓＲＡＧＥ阻害アッセイを示す。ホエイ由来のタンパク質試料をＭｉｌｌｉＱに溶解させ、分画し、ｓＲＡＧＥアッセイにかけた。結果は３重の平均である。有意水準を、総液体に対して又は互いに対して付与している。ＣＭＬ：カルボキシ−メチルリシン。Ｇ９０：陽性コントロール。ＯＶＡ：陰性コントロール（卵白アルブミン）。結果をＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）で分析し、続いてＴｕｋｅｙ事後検定を行なった。全ての分析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０３）で行なった。データを、平均＋標準偏差で示す。全ての場合において、有意水準を星で示す、＊：ｐ≦０．０５、＊＊：ｐ≦０．０１；＊＊＊：≦０．００１。
【図４】ＲＢＬからのβ−ヘキソサミニダーゼ放出を示す。ＲＢＬを、２４時間にわたり、ＩｇＧが枯渇した６０倍希釈ヒト血清と共にインキュベートし、続いて洗浄し、１時間にわたり加水分解物Ｓ８ｘの様々な画分と共にインキュベートした。全ての値から、（ＡＣＢ中での）自発的放出を差し引いている。絶対放出値を、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）の放出を基準にして標準化している。ＷＰＣに関して有意水準を示す。タンパク質濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで決定する；ＡＣＢ：抗原チャレンジ緩衝液。結果をＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）で分析し、続いてＴｕｋｅｙ事後検定を行なった。全ての分析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０３）で行なった。データを、平均＋標準偏差で示す。全ての場合において、有意水準を星で示す、＊：ｐ≦０．０５、＊＊：ｐ≦０．０１；＊＊＊：≦０．００１。
【実施例】
【００５５】
実施例１：部分的乳タンパク質加水分解物のサイズ分離
この実施例は、部分的乳タンパク質加水分解物の様々なサイズの画分への分画を示す。
【００５６】
下記の加水分解物を使用した：
Ｓ８ｘ、Ｓ６−５０、及びＳ３７５は、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）から得られ且つ加水分解度が約９．２％である、噴霧乾燥された部分的加水分解物である。
Ｓ１００は、ＷＰＣから得られ且つ加水分解度が約１５％である、噴霧乾燥された広範囲加水分解物である。  
【００５７】
サイズ分画
４種の異なる部分的乳タンパク質加水分解物を、５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度にてＭｉｌｌｉＱに溶解させた。振盪下での１５分にわたる溶解後、これらの試料を遠心分離した（２０００ｇ、１０分、２０℃）。その後、試料を１５分にわたり４℃でインキュベートし、分離した水層及び脂肪層の形成を可能にした。水層を注意深く取り出し、脂肪層を廃棄した。残余のペレットを、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ／尿素（０．０５Ｍ／６Ｍ）、又は追加のジチオエリトリトール（ＤＴＥ、５ｍｇ／ｍＬ）を含むＴｒｉｓ／尿素（０．０５Ｍ／６Ｍ）のいずれかの固定量に溶解させた。得られた画分のタンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐシステム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２８０ｎｍでの吸収測定により決定した。
【００５８】
試料から得られた水層中のタンパク質を、遠心フィルタユニットを使用して、このタンパク質のサイズに基づいて分離した。フィルタの洗浄後、溶解したタンパク質６０ｍｇを、１０ｋＤａの分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にロードした。試料を、ＲＴにて３３６３ｇで１０分にわたり遠心分離した。保持液を再懸濁させ、この遠心分離工程を繰り返した。各遠心分離工程後に、透過液のタンパク質濃度を調節した。透過液中のタンパク質濃度が検出されなくなるまで、このプロセスを繰り返した。両方の画分（保持液及び透過液）を回収し、分画処理を続けた。
【００５９】
３ｋＤａの分子量カットオフを有するフィルタユニットによる分画を、１０ｋＤａフィルタを通過するタンパク質画分に対して、上記で説明したように実施した。１０ｋＤａフィルタを通過しない画分を、１００ｋＤａフィルタによる分画にかけた。試料Ｓ１００は、１００ｋＤａフィルタによる分画にかけなかった。１０ｋＤａフィルタによる分画に使用されるタンパク質の固定量とは対照的に、３ｋＤａフィルタ及び１００ｋＤａフィルタではタンパク質の可変量を使用した。関連する画分をプールし、更なる使用まで−２０℃で保存した。
【００６０】
分画した加水分解物のＨＰＬＣ分析
分画した試料の様々な画分を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析にかけた。粒径が１．７μｍであり孔径が２００ÅであるＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣタンパク質カラムを使用した。ＰＢＳ（１００ｍＭ、ｐＨ６．８＋１５０ｍＭのＮａＣｌ）による均一濃度流（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ  ｆｌｏｗ）（０．３ｍＬ／分）を適用した。試料１０μＬを注入し、２１４ｎｍでのＵＶ吸光度によりタンパク質を検出した。
【００６１】
ＵＶ−ＶＩＳ及び蛍光測定
実験用の乳加水分解物を、吸光度及び蛍光の測定にかけた。試料を、ＭｉｌｌｉＱでタンパク質５．０又は２．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。試料を、９６ウェルプレートのウェルにピペットで入れた（低結合、１００μＬ／ウェル）。２９４ｎｍ及び４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６２】
並行実験では、試料を、白色の９６ウェルプレートのウェルにピペットで入れた。最適な励起波長及び発光波長を決定した後、試料の蛍光を、３５０ｎｍで励起させて４４０ｎｍで評価した。
【００６３】
乳タンパク質加水分解物の任意のサイズへの依存性を研究するために、試料を、下記のカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔを使用して分画した：１０ｋＤａ、３ｋＤａ、及び１００ｋＤａ。様々な画分の寄与を図１に示す。加水分解物Ｓ１００は、大部分が、小さい（＜３ｋＤａ）のペプチド及びタンパク質からなる。対照的に、加水分解物Ｓ３７５、Ｓ８ｘ、及びＳ６−５０は、より大きなタンパク質の相当量も含み、特に３〜１０ｋＤのサイズだけでなく、＞１００ｋＤａのサイズのものも含む。Ｓ３７５、Ｓ８ｘ、及びＳ６−５０は同様の供給源に由来することから、これらの試料の間の類似性が予想される。分画の精度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＤ）で調節し、結果を図２に示す。ＳＥＣ分析により、タンパク質の大部分が、フィルタユニット分画により正確に分類されていることが明らかとなった。このことは、全ての試験した試料に関する全てのサイズクラス（＜３ｋＤａ、３〜１０ｋＤａ、及び＞１０ｋＤａ）に適用される。３ｋＤａフィルタを通過する全てのタンパク質の内、最大３０％は分子量が３〜１０ｋＤａであり、そのため、フィルタユニット分析により誤って分類される。３〜１０ｋＤａの画分及び＞１０ｋＤａの画分も、より小さいサイズのタンパク質の存在を２０％まで（３〜１０ｋＤａの画分）及び３０％まで（＞１０ｋＤａの画分）示す。まとめると、データは、フィルタユニット遠心分離によるタンパク質分画の方法は、約７０％〜８５％の精度で乳加水分解物の分画を可能にすることを示す。  
【００６４】
実施例２：部分的乳タンパク質加水分解物は、ｓＲＡＧＥに結合する凝集体を含む。
ｓＲＡＧＥ阻害アッセイ
Ｌｉｕ他（Ｌｉｕ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｏｄ  Ｆｕｎｃｔ．２０１６  Ｊａｎ；７（１）：２３９−４９；Ｌｉｕ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ａｕｇ  ２４；６４（３３）：６４７７−８６）により以前に説明されているように、様々な乳タンパク質加水分解物のｓＲＡＧＥ結合能力を、競合アッセイにより評価した。
【００６５】
簡潔に説明すると、高タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）を、４℃及び１００μＬ／ウェルにて、糖化大豆タンパク質抽出物（２０μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングした。コーティング緩衝液として、２００ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）を使用した。ｓＲＡＧＥ（可溶性の最終糖化産物特異的レセプター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生、Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ）を０．１Ｍの酢酸（ｐＨ４．０）に溶解させ、ＡＧＥ結合タンパク質として使用した。試料画分を、１．５％のＢＳＡ及び０．０２５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで最初に希釈した。得られた濃縮物を連続的に希釈し、ｓＲＡＧＥ（１．２５μｇ／ｍＬ）と共にプレインキュベートし、３７℃でインキュベートした。４５分のインキュベーション後、タンパク質−ｓＲＡＧＥ混合物２００μＬを、コーティングされたプレートに移し、１時間にわたりＰＢＳ中の３％のＢＳＡでブロックし、その後洗浄した。１時間のインキュベーション後、３７℃で、タンパク質−ｓＲＡＧＥ混合物を廃棄してウェルをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄した。このウェルに抗ｓＲＡＧＥ抗体（モノクローナルマウスＩｇＧ、０．５μｇ／ｍＬ）に添加し（０．５μｇ／ｍＬ、８０μＬ）、このプレートを、室温で振盪しつつ３０分にわたりインキュベートした。洗浄後、検出抗体（ポリクローナルヤギ抗マウス、ＨＲＰ結合、０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、室温で３０分にわたりインキュベートした。最終洗浄後、３分にわたりＴＭＢ（８０μＬ／ウェル）でインキュベートした。２％のＨＣｌ  １００μＬの添加により、着色反応を停止させた。６２０ｎｍを基準として、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。結果を、陽性コントロールＧ９０（５０μｇ／ｍＬ）を基準とする阻害％として表す。陰性コントロールとして、卵白アルブミン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用した。
【００６６】
このシステムでは、ＲＡＧＥ結合凝集体の添加により、糖化大豆とｓＲＡＧＥとの相互作用を阻害し得、阻害％として表される。
【００６７】
例示的な加水分解物Ｓ８ｘ及びＳ１００（実施例１を参照されたい）の分画試料を、糖化大豆タンパク質へのｓＲＡＧＥの結合の阻害に関して試験した。結果を図３に示す。分画されていない部分的加水分解物はｓＲＡＧＥ結合を有意に阻害するが、＜１００ｋＤａのタンパク質をフィルタで除いた全ての画分は、この阻害にほとんど寄与しないことが分かった。対照的に、＞１００ｋＤａ画分は、分離されていない加水分解物による阻害と同様の阻害を示す。任意のタンパク質画分＞１０ｋＤａを含まない加水分解物Ｓ１００は、ｓＲＡＧＥ結合を阻害し得なかった（図３Ｂ）。
【００６８】
実施例３：乳タンパク質加水分解物中に存在する凝集体による好塩基球性顆粒球の脱顆粒の誘発
乳アレルギー患者からのヒト血清
乳アレルギー患者からのヒト血清を、Ｒｉｊｎｓｔａｔｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ａｒｎｈｅｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。３例の異なる患者の等量をプールした。それぞれの患者に関して、特異的ＩｇＥレベルを決定した。決定した値を表１に示す。
【００６９】
【表１】
2021510502.tif 000003
【００７０】
ＩｇＧ除去
スピン遠心分離により、ヒト血清からＩｇＧを除去した。プロトコルに従って、アガロースに結合したプロテインＧを平衡化して、１５ｍＬ採取管に入れた。ヒト血清を結合緩衝液で２倍に希釈し、カラム中のアガロース樹脂上にロードし、１０分にわたりインキュベートした。その後、このカラムを遠心分離し（１０００ｇ、１分）、フロースルーを保管した。このカラムに追加の結合緩衝液を添加し、続いて遠心分離することにより、このカラムを３回洗浄した。タンパク質濃度に基づいて、関連する洗浄画分をプールした。溶出緩衝液を添加することにより、このカラムから、結合したＩｇＧを溶出させ、その後に廃棄した。
【００７１】
ＲＢＬアッセイ
ヒトＩｇＥレセプター（ＦｃＥＲＩ）のアルファサブユニットがトランスフェクトされたラット好塩基球白血病（Ｒａｔ  Ｂａｓｏｐｈｉｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＲＢＬ）細胞を用いて、様々な乳加水分解物画分の脱顆粒誘発能力を評価した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて、５％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン、１％のストレプトマイシン、及び１％のグルタミンを含むＭＥＭ中で増殖させた。細胞をＭＥＭで洗浄し、フラスコの底から掻き取った。細胞を、遠心分離（４００ｇ、５分、ＲＴ）及びＭＥＭへの再懸濁により、ＭＥＭで２回洗浄した。その後、細胞を、ＭＥＭ＋１％のグルタミン中に７．５×１０４／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。
【００７２】
細胞がウェルの底に付着すると、この細胞に、牛乳アレルギー患者由来のヒト血清を添加した。ＩｇＧの除去後の３例の患者由来のプールした血清を使用した（乳特異的ＩｇＥの平均：１３２ｋＵ／Ｌ、表１を参照されたい）。典型的には、ＭＥＭによる４０倍及び６０倍の希釈を細胞に適用した。陽性コントロールの場合には、細胞を、ＭＥＭ中のＩｇＥ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。３７℃での２４時間のインキュベーション後、細胞を、Ｔｙｒｏｄｅの洗浄緩衝液（Ｈ２Ｏに溶解した、１３７ｍＭのＮａＣｌ，２．６９ｍＭのＫＣｌ、０．４１５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．４９２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．７２ｍＭのＣａＣｌ２、１０．１ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．２８０ｍＭのグルコース、及びＢＳＡ  １ｇ／Ｌ）７５μＬで緩やかに３回洗浄した。この洗浄工程を完了した後、この細胞に、抗ＩｇＥ（１．０〜３２μｇ／ｍＬ）又は希釈した乳加水分解物試料のいずれかを、各ウェルに１００μＬで添加した。この工程では、抗ＩｇＥ及び乳加水分解物の両方を、抗原チャレンジ緩衝液（５０％のＨ２Ｏ及び５０％のＤ２Ｏに溶解した、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２，６９ｍＭのＫＣｌ、０．４１５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．４９２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．７２ｍＭのＣａＣｌ２、１０．１ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．２８０ｍＭのグルコース、及びＢＳＡ  １ｇ／Ｌ）に溶解させた。
【００７３】
５０分間のインキュベーション後、全放出のための陽性コントロールとして機能する細胞に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＰＢＳ中に１％）１００μＬを添加した。１時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、３７℃で１時間にわたり、細胞の上清６０μＬを、基質溶液（ｐＨ４．５（０．４Ｍのクエン酸で調整した）でＨ２Ｏに溶解した、１２６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４中の３．８０ｍＭのｐ−ニトロ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）５０μＬと共にインキュベートした。グリシン（０．２Ｍ、ｐＨ１０．７）１００μＬの添加により、反応を停止させた。６２０ｎｍを基準値として、４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００７４】
ＲＢＬ細胞からのβ−ヘキソサミニダーゼ放出を、分画した加水分解物と共に細胞をインキュベートした後に評価した。全ての実験において、陽性基準としてホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）を使用した。
結果を図４に示す。例示的な加水分解物Ｓ８ｘの画分のそれぞれは、分子量が＞１００ｋＤａである画分を除いて、ＷＰＣと比べて有意に少ないＲＢＬ放出を誘発した。この画分は最大のＲＢＬ放出を示しており、ＷＰＣにより誘発された放出に対する５４％減少に等しい。対照的に、分子量がより低い画分は、より低いβ−ヘキソサミニダーゼ放出を引き起こし、分子量が＜３ｋＤａであるタンパク質を含む画分の場合のＷＰＣの１４％まで低下した。ペレット由来の不溶性タンパク質は、ＲＢＬ放出にほとんど寄与しなかった。
【００７５】
実施例４：低アレルゲン性（ＨＡ）乳児用調製乳の製造。
部分的加水分解物の調製
ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）又はカゼインを含む乳タンパク質を、５０〜６０℃で、１０〜１５％（重量／重量）の最終タンパク質濃度まで水に溶解させる。このタンパク質溶液のｐＨを、４５％の水酸化カリウム（ＫＯＨ）又は水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨ６〜８に調整する。このタンパク質溶液に、１：５０〜１：５００の酵素／基質（Ｅ／Ｓ）比でエンドペプチダーゼ（アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ））及びエキソペプチダーゼ（フレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ））を添加することにより、このタンパク質の加水分解を開始させる。この反応混合物を、４〜２４時間にわたり５０〜６０℃で保持する。この酵素反応を、この反応混合物を９０℃まで加熱することにより停止させ、その後、この混合物を少なくとも１０分にわたり９０℃で保持する。加熱後、この混合物を１０℃まで冷却する。
【００７６】
部分的加水分解物の清浄化
部分的加水分解物を、１００ｋＤａの分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、１０℃にて膜でろ過する（１０分、３３６３ｇ、ＲＴ）。保持液を水に再懸濁させ、透過液中において２８０ｎｍで検出されるタンパク質がなくなるまで遠心分離工程を繰り返す。清浄化された加水分解物を含む透過液画分をプールし、更なる下流の処理にかける。
【００７７】
清浄化された部分的加水分解物の濃縮
清浄化された加水分解物を、６０ｍｂａｒの真空圧を適用して３０℃にて回転膜蒸発を使用して、４０〜６０％の乾物含量まで濃縮する。濃縮された加水分解物を、２００℃の入口温度及び８０℃の出口温度を適用して、Ｂｕｅｃｈｉベンチトップ噴霧ドライヤ（Ｂｕｅｃｈｉ  ｂｅｎｃｈ−ｔｏｐ  ｓｐｒａｙ  ｄｒｉｅｒ）を使用して噴霧乾燥させる。
【００７８】
清浄化された部分的加水分解物の乳児用調製乳への製剤化
清浄化されて乾燥された部分的加水分解物を、表２に示す最終濃度まで、生後０〜６ヶ月用の乳児用調製乳へと製剤化する。味が良好な乳児用調製乳は、清浄化されたホエイ又はカゼインタンパク質加水分解物６〜１６重量％、脂肪成分１８〜２９重量％、炭水化物含有量＜６０重量％、プレバイオティクス成分３〜８重量％を（製品１００ｇ当たり）含む。ミネラル、微量元素、及びビタミンのような更なる成分を、法律で推奨される量で組み入れる。
【００７９】
表２は、レディ・トゥ・ドリンク１００ｍＬ当たりの、乳児の免疫系をサポートするか又は増強するための本発明に係る例示的な栄養調製乳（ＨＡ乳児用調製乳）（例えば、０〜６ヶ月の年齢群用の乳児用調製乳）の組成を示す。
【００８０】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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