(57)【要約】  免疫関連ゲノムの遺伝子座を標的とするように設計された対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼリボ核タンパク質、および免疫関連ゲノムの遺伝子座を改変するための該リボ核タンパク質の使用方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞中の免疫関連ゲノムの遺伝子座の改変方法であって、免疫関連ゲノムの遺伝子座における標的配列とハイブリダイズするように設計された一対のガイドＲＮＡを含むClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（ＣＲＩＳＰＲ）ニッカーゼリボ核タンパク質（ＲＮＰｓ）を真核細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓによって作成された二本鎖の破壊の修復が該免疫関連ゲノムの遺伝子座の改変を引き起こすようにすることを含む、方法。
【請求項２】
対になったガイドＲＮＡｓの標的配列が免疫関連ゲノムの遺伝子座の対向鎖（opposite strand）上にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ガイドＲＮＡの対が、標的配列の１つに隣接した各protospacer adjacent motif（ＰＡＭ）配列が外向きになる（あるいは標的配列の遠位端に位置する）ように配置されている、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＰＡＭ配列間の距離が約３５塩基対ないし約１２０塩基対である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰがＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼまたはＣａｓ１３ａニッカーゼを含む、請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰがＣａｓ９ニッカーゼを含む、請求項１ないし５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
Ｃａｓ９ニッカーゼが、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ、ＦｎＣａｓ９ニッカーゼ、ＳａＣａｓ９ニッカーゼ、ＳｔＣａｓ９ニッカーゼ、ＳｐａＣａｓ９ニッカーゼ、ＣｊＣａｓ９ニッカーゼ、ＮｍＣａｓ９ニッカーゼまたはＮｃＣａｓ９ニッカーゼを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｃｓａ９ニッカーゼがＳｐＣａｓ９ニッカーゼ、ＦｎＣａｓ９ニッカーゼまたはＳａＣａｓ９ニッカーゼである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
Ｃａｓ９ニッカーゼがＣａｓ９−Ｄ１０ＡニッカーゼまたはＣａｓ９−Ｈ８４０Ａニッカーゼである、請求項６ないし８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
Ｃａｓ９ニッカーゼがＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼである、請求項６ないし８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過ドメイン、少なくとも１つのクロマチン破壊ドメイン、またはそれらの組み合わせ
を含む、請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼが少なくとも１つの核局在化シグナルを含む、請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比が約２：１ないし約１０：１である、請求項１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比が、０．５：１、１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、または１０：１である、請求項１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
真核細胞がヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞である、請求項１ないし１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
真核細胞が初代Ｔ細胞またはＴ細胞の集団である、請求項１ないし１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ガイドＲＮＡの対が、（ａ）配列番号：３１を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：３２を含むガイドＲＮＡ、（ｂ）配列番号：３３を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：３４を含むガイドＲＮＡ、（ｃ）配列番号：３３を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：３２を含むガイドＲＮＡ、（ｄ）配列番号：３９を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４０を含むガイドＲＮＡ、（ｅ）配列番号：４１を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４２を含むガイドＲＮＡ、（ｆ）配列番号：４３を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４４を含むガイドＲＮＡ、（ｇ）配列番号：４５を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４６を含むガイドＲＮＡ、（ｈ）配列番号：４７を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４８を含むガイドＲＮＡ、（ｉ）配列番号：４９を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：５０を含むガイドＲＮＡ、（ｊ）配列番号：５１を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：５２を含むガイドＲＮＡ、（ｋ）配列番号：５３を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：５４を含むガイドＲＮＡ、または（ｌ）配列番号：５５を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：５６を含むガイドＲＮＡから選択される、請求項１ないし１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による二本鎖破壊の修復が、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、またはそれらの組み合わせを生じさせ、免疫関連ゲノムの遺伝子座を不活性化させる、請求項１ないし１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
免疫関連ゲノムの遺伝子座に関連した少なくとも１つのヌクレオチドの変化を有するドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含み、相同性指向修復（ＨＤＲ）による二本鎖破壊の修復が、免疫関連ゲノムの遺伝子座中へのドナー配列の組み込みまたは交換を生じさせ、その結果該免疫関連ゲノムの遺伝子座の改変が生じる、請求項１ないし１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
免疫関連ゲノムの遺伝子座が、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ａ２ａＲ、ＡＡＶＳ１、ＡＣＴＢ、ＡＬＢ、Ｂ２Ｍ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ブチロフィリン、ＣＣＲ５、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＣＤ１６０、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９６（Tactile）、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＤＧＫ、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＧＫＧ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ、ＤＨＦＲ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＥＰ２／４受容体、Ａ２ＡＲを含むアデノシン受容体、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ４９Ｂ、ＨＨＬＡ２、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＩＶ−ＬＴＲ（long terminal repeat）、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−Ｉ、ＨＶＥＭ、ＨＶＥＭ、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＦＮ−アルファ／ベータ／ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲファミリー受容体、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＬＡＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＭＮＫ１／２、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ２Ｒ、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＧＥ２受容体、ＰＩＲ−Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＰＳＧＬ１、ＰＴＰＮ２、ＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ５、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＴＭＩＧＤ２、ＴＲＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＴＲＤ、ＴＲＧ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦＲ２、ＴＵＢＡ１、ＶＩＳＴＡ、ＶＬＡ１、またはＶＬＡ−６から選択される、上記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２１】
免疫関連ゲノムの遺伝子座が表Ａ：
【表Ａ】
2021518760.tif 000011
から選択される、上記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２２】
免疫関連ゲノムの遺伝子座がＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３またはＴＲＡＣである、上記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２３】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼおよび免疫関連ゲノムの遺伝子座を標的とするように設計された一対のガイドＲＮＡを含む組成物。
【請求項２４】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼがＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼまたはＣａｓ１３ａニッカーゼである、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼがＣａｓ９ニッカーゼである、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
Ｃａｓ９ニッカーゼが、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ、ＦｎＣａｓ９ニッカーゼ、ＳａＣａｓ９ニッカーゼ、ＳｔＣａｓ９ニッカーゼ、ＳｐａＣａｓ９ニッカーゼ、ＣｊＣａｓ９ニッカーゼ、ＮｍＣａｓ９ニッカーゼまたはＮｃＣａｓ９ニッカーゼを含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
Ｃｓａ９ニッカーゼがＳｐＣａｓ９ニッカーゼ、ＦｎＣａｓ９ニッカーゼまたはＳａＣａｓ９ニッカーゼである、請求項２４ないし２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
Ｃａｓ９ニッカーゼがＣａｓ９−Ｄ１０ＡニッカーゼまたはＣａｓ９−Ｈ８４０Ａニッカーゼである、請求項２４ないし２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
Ｃａｓ９ニッカーゼがＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼである、請求項２４ないし２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
ガイドＲＮＡの対が、（ａ）配列番号：３１を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：３２を含むガイドＲＮＡ、（ｂ）配列番号：３３を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：３４を含むガイドＲＮＡ、（ｃ）配列番号：３３を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：３２を含むガイドＲＮＡ、（ｄ）配列番号：３９を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４０を含むガイドＲＮＡ、（ｅ）配列番号：４１を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４２を含むガイドＲＮＡ、（ｆ）配列番号：４３を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４４を含むガイドＲＮＡ、（ｇ）配列番号：４５を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４６を含むガイドＲＮＡ、（ｈ）配列番号：４７を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：４８を含むガイドＲＮＡ、（ｉ）配列番号：４９を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：５０を含むガイドＲＮＡ、（ｊ）配列番号：５１を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：５２を含むガイドＲＮＡ、（ｋ）配列番号：５３を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：５４を含むガイドＲＮＡ、または（ｌ）配列番号：５５を含むガイドＲＮＡおよび配列番号：５６を含むガイドＲＮＡから選択される、請求項２３ないし２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
対象における癌の治療方法であって、請求項１ないし２２のいずれか１項記載の方法に従ってエクスビボにおいて真核細胞中の免疫関連ゲノムの遺伝子座を改変して、改変された真核細胞を該対象にデリバリーすることを含む、方法。
【請求項３２】
真核細胞がＴ細胞またはＴ細胞の集団である、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫関連ゲノムの遺伝子座（loci）を標的とするように設計された対になった（paired）ＣＲＩＳＰＲニッカーゼリボ核タンパク質、ならびにそれを用いて免疫関連ゲノムの遺伝子座を改変する方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年４月１３日出願の米国仮出願第６２／６５７４８８号に対して優先権を主張するものであり、参照によりその全体を本願明細書に一体化させる。
【０００３】
配列表に関して
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、参照によりその全体を本願明細書に一体化させる。２０１９年４月１０日に作成されたＡＳＣＩＩコピーはＰ１８＿０６１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１９６０７バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
免疫療法は、癌、感染および他の疾病に対して免疫系を闘わせる強力な治療選択肢である。伝統的な免疫療法は、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン等の物質を用いて免疫系および他の化合物を刺激または抑制することを特徴とするものである。近年、ゲノム編集を用いて細胞のＤＮＡを改変して、免疫療法に用いられるより良い機能を発揮する細胞が設計されている。ジンクフィンガークレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いて疾病と闘う細胞が設計されている。しかしながら、これらのゲノム標的化手法は、低い標的化頻度およびオフターゲット効果によって妨げられている。したがって、免疫関連ゲノムの遺伝子座における改善された、そしてより正確なゲノム編集が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の様々な態様の１つにおいて、真核細胞における免疫関連ゲノムの遺伝子座を改変する方法が提供される。該方法は、免疫関連ゲノムの遺伝子座における標的配列とハイブリダイズするように設計された一対のガイドＲＮＡを含むClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（ＣＲＩＳＰＲ）ニッカーゼリボ核タンパク質（ＲＮＰｓ）を真核細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓによって作成された二本鎖の破壊（break）の修復が該免疫関連ゲノムの遺伝子座の改変を引き起こすようにすることを含む。
【０００６】
本開示のもう１つの態様は、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼおよび免疫関連ゲノムの遺伝子座を標的化するように設計された一対のガイドＲＮＡを含む組成物に関する。
【０００７】
本開示のもう１つの態様は、対象中の癌の治療方法に関する。該方法は、本明細書記載の方法に従ってエクスビボ（ex vivo）において真核細胞の免疫関連ゲノムの遺伝子座を改変して、改変された真核細胞を調製し、改変された真核細胞を対象にデリバリーすることを含む。
【０００８】
他の目的および特徴は、以下においてある程度明らかであり、ある程度指摘される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、免疫関連ゲノムの遺伝子座を標的化するように設計されている対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼリボ核タンパク質、ならびに該対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを用いて免疫関連遺伝子座を改変する方法を提供する。本明細書に開示された組成物および方法を、標的化免疫療法、例えば癌の免疫療法に用いることができる。
【００１０】
（Ｉ）ＣＲＩＳＰＲニッカーゼリボ核タンパク質
本開示の１の態様は、免疫機能に関与しているゲノムの遺伝子座を標的とする対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼリボ核タンパク質を提供する。対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、対象とするゲノムの遺伝子座中の標的部位とハイブリダイズするように設計された少なくとも一対のオフセットガイドＲＮＡを含んでおり、その結果、コーディネートされたニッカーゼのニッキングは当該ゲノムの遺伝子座に二本鎖の破壊を生じさせ、そのことは、細胞のＤＮＡ修復プロセスにより修復された場合に、当該ゲノムの遺伝子座の改変を生じさせる。
【００１１】
（ａ）標的ゲノムの遺伝子座
一般的に、免疫関連ゲノムの遺伝子座を標的とするように、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを設計することができる。ゲノムの遺伝子座は、例えば、免疫細胞のエフェクター機能の喪失に関連したものであってもよく、有利には、免疫細胞活性化状態とは区別される、別個のまたはカップリングしていないものであり、あるいは免疫細胞活性化状態から独立したものである。あるいは、ゲノムの遺伝子座は、例えば、免疫細胞活性化に関連したものであってもよく、有利には、免疫細胞機能不全状態とは区別される、別個のまたはカップリングしていないものであり、あるいは免疫細胞機能不全状態から独立したものである。したがって、様々な具体例において、例えば、活性化遺伝子座をそのままにしておきながら機能不全遺伝子座を標的化してもよい。
【００１２】
他の具体例において、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ａ２ａＲ、ＡＡＶＳ１、ＡＣＴＢ、ＡＬＢ、Ｂ２Ｍ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ブチロフィリン、ＣＣＲ５、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＣＤ１６０、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９６（Tactile）、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＤＧＫ、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＧＫＧ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ、ＤＨＦＲ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＥＰ２／４受容体、Ａ２ＡＲを含むアデノシン受容体、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ４９Ｂ、ＨＨＬＡ２、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＩＶ−ＬＴＲ（long terminal repeat）、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−Ｉ、ＨＶＥＭ、ＨＶＥＭ、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＦＮ−アルファ／ベータ／ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲファミリー受容体、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＬＡＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＭＮＫ１／２、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ２Ｒ、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＧＥ２受容体、ＰＩＲ−Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＰＳＧＬ１、ＰＴＰＮ２、ＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ５、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＴＭＩＧＤ２、ＴＲＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＴＲＤ、ＴＲＧ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦＲ２、ＴＵＢＡ１、ＶＩＳＴＡ、ＶＬＡ１またはＶＬＡ−６から選択されるゲノムの遺伝子座を標的とするように、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを設計することができる。
【００１３】
いくつかの具体例において、表Ａに示す免疫関連ゲノムの遺伝子座を標的とするように、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを設計することができる。
【表Ａ】
2021518760.tif 000002
【００１４】
１の特別な具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、ＰＤ−１ゲノムの遺伝子座を標的とするように設計される。もう１つの特別な具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、ＣＴＬＡ４ゲノムの遺伝子座を標的とするように設計される。もう１つの特別な具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、ＴＩＭ−３ゲノムの遺伝子座を標的とするように設計される。もう１つの特別な具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、ＴＲＡＣゲノムの遺伝子座を標的とするように設計される。
【００１５】
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインの１つを不活性化することにより得られる。特別な具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから得ることができる。例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質であり得る。適切なＣａｓ９ヌクレアーゼは、Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、Francisella novicida Cas9（FnCas9）、Staphylococcus aureus（SaCas9）、Streptococcus thermophilus Cas9（StCas9）、Streptococcus pasteurianus（SpaCas9）、Campylobacter jejuni Cas9（CjCas9）、Neisseria meningitis Cas9（NmCas9）またはNeisseria cinerea Cas9（NcCas9）を包含する。他の具体例において、ニッカーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼのごときＶ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから得ることができる。適切なＣｐｆ１ヌクレアーゼは、Francisella novicida Cpf1（FnCpf1）、Acidaminococcus sp. Cpf1（AsCpf1）、またはLachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1（LbCpf1）を包含する。さらにもう１つの具体例において、ニッッカーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばLeptotrichia wadei Cas13a（LwaCas13a）またはLeptotrichia shahii Cas13a（LshCas13a）から得ることができる。
【００１６】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは２つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９フクレアーゼは、ガイドＲＮＡの相補鎖を開裂するＨＮＨドメイン、および非相補鎖を開裂するＲｕｖＣドメインを含み；Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインおよびＮＵＣドメインを含み；Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼは２つのＨＮＥＰＮドメインを含む。両方のヌクレアーゼドメインが機能的である場合、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは二本鎖の破壊を導入する。１またはそれ以上の変異および／または欠失によっていずれか一方のヌクレアーゼドメインを不活性化することができ、そのことにより二本鎖配列の一方の鎖において一本鎖破壊を導入する変異体を得ることができる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｖＣドメイン中の１つまたはそれ以上の変異（例えばＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａおよび／またはＤ９８６Ａ）は、ガイドＲＮＡ相補鎖にニックを入れるＨＮＨニッカーゼを生じさせ；Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＨＮＨドメイン中の１つまたはそれ以上の変異（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａおよび／またはＮ８６３Ａ）は、ガイドＲＮＡの非相補鎖にニックを入れるＲｕｖＣニッカーゼを生じさせる。同質的変異（comparable mutation）によってＣｐｆ１およびＣａｓ１３ａヌクレアーゼをニッカーゼに変換することができる。
【００１７】
特別な具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲニッカーゼまたはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲニッカーゼであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼがＩＩ型ニッカーゼである場合、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、ＳｐＣａｓ９、ＦｎＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、ＳｐａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９またはＮｃＣａｓ９のごときＣａｓ９ニッカーゼであり得る。もう１つの例として、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼがＶ型ニッカーゼである場合、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１のごときＣｐｆ１ニッカーゼであり得る。さらにもう１つの例として、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、ＬｗａＣａｓ１３ａまたはＬｓｈＣａｓ１３ａのごときＣａｓ１３ａニッカーゼであり得る。上の段落で説明したように、上記ＣＲＩＳＰＲニッカーゼが、ヌクレアーゼをニッカーゼに変換するための機能的に適切な変異を含むことが理解されるであろう。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼはＣａｓ９−Ｄ１０ＡニッカーゼまたはＣａｓ９−Ｈ８４０Ａニッカーゼであり得る。１の特別な具体例において、Ｃａｓ９ニッカーゼはＳｐＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼである。もう１つの特別な具体例において、Ｃａｓ９ニッカーゼはＳｐＣａｓ９−Ｈ８４０Ａニッカーゼである。
【００１８】
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメインおよび／または少なくとも１つのクロマチン破壊ドメイン（chromatin disrupting domain）をさらに含み得る。少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、および／または少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部の位置（ただしＣＲＩＳＰＲニッカーゼの機能に影響しない）に存在し得る。
【００１９】
核局在化シグナルの非限定的な例は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：１）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号：２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号：３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：４）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号：６）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号：７），ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号：８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号：９）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号：１０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号：１１）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号：１２）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号：１３）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号：１４）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号：１５）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号：１６）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号：１７）およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号：１８）を包含する。
【００２０】
適切な細胞透過ドメインの例は、限定するものではないが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：１９）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：２０）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：２１）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：２２）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：２３）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号：２４）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号：２５）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号：２６）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号：２７）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号：２８）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号：２９）およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を包含する。
【００２１】
マーカードメインは、蛍光タンパク質および精製またはエピトープタグを包含する。適切な蛍光タンパク質は、限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−２、タグＧＦＰ、ターボＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、Ｚｓグリーン１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、ビーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、Ｚｓイエロー１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍカラマル、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、Ａｍシアン１、ミドリイシ−シアン）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍプラム、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍチェリー、ｍＲＦＰ１、Ｄｓレッド−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−モノマー、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍサズベリー、ｍストロベリー、Ｊレッド）および橙色蛍光タンパク質（例えば、ｍオレンジ、ｍＫＯ、クサビラ−オレンジ、単量体クサビラ−オレンジ、ｍタンジェリン、ｔｄトマト）を包含する。適切な精製またはエピトープタグの非限定的な例は、６ｘＨｉｓ、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｍｙｃ等を包含する。ＣＲＩＳＰＲの検出または富化を容易ならしめる異種融合物の非限定的な例は、ストレプトアビジン（Kipriyanov et al., Human Antibodies, 1995, 6(3):93-101）、アビジン（Airenne et al., Biomolecular Engineering, 1999, 16(1-4):87-92）、単量体形態のアビジン（Laitinen et al., Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(6):4010-4014）、組換え産物生産の間にビオチン化を容易ならしめるペプチドタグ（Cull et al., Methods in Enzymology, 2000, 326:430-440）を包含する。
【００２２】
適切なクロマチンディスラプティングドメインの例は、高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質（例えば、ＨＭＧＢ、ＨＭＧＮタンパク質）に由来するヌクレオソーム相互作用ペプチド、ヒストンＨ１バリアント（例えば、ヒストンＨ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４、Ｈ１．５、Ｈ１．６、Ｈ１．７、Ｈ１．８、Ｈ１．９、およびＨ．１．１０の中央球状ドメイン）、あるいはクロマチンリモデリング複合体（例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦ、ＩＳＷＩ、ＣＨＤ、Ｍｉ−２／ＮｕＲＤ、ＩＮＯ８０、ＳＷＲ１、またはＲＳＣ複合体）のＤＮＡ結合ドメインを包含する。いくつかの例において、クロマチン破壊ドメインはＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＢ２ボックスＡドメイン、ＨＭＧＢ３ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１ペプチド、ＨＭＧＮ２ペプチド、ＨＭＧＮ３ペプチド、ＨＭＧＮ３ペプチド、ＨＭＧＮ４ペプチド、ＨＭＧＮ５ペプチド、またはヒトヒストンＨ１中央球状（central globular）ドメインペプチドであり得る。
【００２３】
少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、および／または少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインは、１つまたはそれ以上の化学結合（例えば共有結合）を介してＣＲＩＳ｀Ｒニッカーゼに直接結合され得る。あるいは、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、および／または少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインあるいは１つまたはそれ以上の異種ドメインは、１つまたはそれ以上のリンカーを介してＣＲＩＳＰＲニッカーゼに間接的に結合され得る。適切なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子（例えば、マレイミド誘導体、Ｎ−エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル等）、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）を包含する。リンカーは、限定するものではないが、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル等の１つまたはそれ以上のスペーシング基を包含し得る。リンカーは、中性であり得、あるいは正または負の電荷を有し得る。さらに、リンカーは開裂可能なものであり、その結果、ｐＨ、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素を包含する特定の条件下でリンカーを別の化学基に結合しているリンカーの共有結合が破壊または開裂されるものであり得る。いくつかの具体例において、リンカーはペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは、フレキシブルなアミノ酸リンカーまたは堅固なアミノ酸リンカーであり得る。適切なリンカーのさらなる例は当該技術分野においてよく知られており、リンカーを設計するためのプログラムは容易に入手できる（Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309-312）。
【００２４】
さらに別の具体例において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入によって、改善された標的特異性、改善された忠実度、変化したＰＡＭ特異性、減少したオフターゲット効果、および／または向上した安定性を有するように、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼを設計することができる。標的特異性を改善、忠実度を改善、および／またはオフターゲット効果を減少させる１つまたはそれ以上の変異の非限定的な例は、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａおよび／またはＤ１１３５Ｅ(ＳｐＣａｓ９の番号付けを参照)を包含する。
【００２５】
（ｃ）対になったガイドＲＮＡ
対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、対象とするゲノムの遺伝子座の対向鎖（opposite strand）上の標的配列にハイブリダイズするように設計された少なくとも一対のオフセットガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および（ｉｉ）実行（transacting）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、対象とするゲノムの遺伝子座中の標的配列（すなわちプロトスペーサー（protospacer））とハイブリダイズするように設計された５’末端のガイド配列を含む。標的配列は、ゲノムの残りの部分と比較した場合にユニークなものであり、プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif）（ＰＡＭ）に隣接している。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびＰＡＭ配列と相互作用する配列を含む。各ｃｒＲＮＡのガイド配列が異なっていても（すなわち配列特異的であっても）、一般的には、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、特定の細菌種由来のＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計されたガイドＲＮＡｓ中では同じである。
【００２６】
２つの個別のニッキング事象によって二本鎖破壊を生じるように十分に近接している標的配列にハイブリダイズするように、対になったガイドＲＮＡを設計する。標的領域は２つの標的配列および隣接したＰＡＭ配列を含む。ガイドＲＮＡの対は、ＰＡＭ配列が外側に向くように、あるいは標的領域の遠位端（distal end）に位置するように配置される（Ran et al., Cell, 2013, 154:1380-1389）。かかる配置は「ＰＡＭ−ｏｕｔ」配向と呼ばれる。２つのＰＡＭ配列間の距離は約３０塩基対（ｂｐ）ないし約１５０ｂｐ、約３５ｂｐないし約１２０ｂｐ、または約４０ｂｐないし８０ｂｐの範囲であり得る。様々な具体例において、２つのＰＡＭ配列間の距離は、約３５−４０ｂｐ、約４０−４５ｂｐ、約４５−５０ｂｐ、約５０−５５ｂｐ、約５５−６０ｂｐ、約６０−６５ｂｐ、約６５−７０ｂｐ、約７０−７５ｂｐ、約７５−８０ｂｐ、約８５−９０ｂｐ、約９０−９５ｂｐ、または約９５−１００ｂｐであり得る。
【００２７】
各ｃｒＲＮＡは、標的配列に相補的な５’ガイド配列を含む。一般的には、ｃｒＲＮＡガイド配列と標的配列の間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である。特定の具体例において、相補性は完全（すなわち１００％）である。様々な具体例において、ｃｒＲＮＡガイド配列の長さは、約１７ヌクレオチドないし約２７ヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの具体例において、ｃｒＲＮＡガイド配列は、１９、２０または２１ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は２０ヌクレオチドの長さであり得る。他の具体例において、ｃｒＲＮＡガイド配列は２２、２３または２４ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は２３ヌクレオチドの長さであり得る。１の具体例において、ｃｒＲＮＡガイド配列は、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３または配列番号：３４を含む。
【００２８】
標的配列はＰＡＭ配列に隣接している。異なる細菌種由来のＣＲＩＳＰＲタンパク質は異なるＰＡＭ配列を認識する。例えば、ＰＡＭ配列は、５’ＮＧＧ（ＳｐＣａｓ９，ＦｎＣＡｓ９）、５’−ＮＧＲＲＴ（ＳａＣａｓ９）、５’−ＮＮＡＧＡＡＷ（ＳｔＣａｓ９）、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ（ＮｍＣａｓ９）、５−ＮＮＮＮＲＹＡＣ（ＣｊＣａｓ９）および５’−ＴＴＴＶ（Ｃｐｆ１）を包含し、ここで、Ｎはいずれかのヌクレオチドであると定義され、ＲはＧまたはＡのいずれかであると定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかであると定義され、ＹはＣまたはＴのいずれかであると定義され、ＶはＡ、ＣＲＩＳＰＲまたはＧであると定義される。Ｃａｓ９  ＰＡＭｓは標的部位の３’に位置し、ｃｐｆ１  ＰＡＭは標的部位の５’に位置する。
【００２９】
各ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に相補的である３’末端における配列をさらに含み、その結果、ｃｒＲＮＡの３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端とハイブリダイズすることができる。ｃｒＲＮＡの３’配列の長さは、約６ないし約５０ヌクレオチド、約１５ないし約２５ヌクレオチドの範囲であり得る。様々な具体例において、ｃｒＲＮＡの３’配列は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの範囲の長さであり得る。
【００３０】
ｃｒＲＮＡの３’配列に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端における配列に加えて、各ｔｒａｃｒＲＮＡは、二次構造（例えば少なくとも１つのステムループ、ヘアピンループ等）を形成し得る３’リピート配列をさらに含み、該二次構造はＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用する。ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端における配列は一本鎖のままである。一般的には、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡに基づく。各ｔｒａｃｒＲＮＡは、約５０ヌクレオチドないし約３００ヌクレオチドの範囲の長さであり得る。様々な具体例において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約５０ないし９０ヌクレオチド、約９０ないし約１１０ヌクレオチド、約１１０ないし約１３０ヌクレオチド、約１３０ないし約１５０ヌクレオチド、約１５０ないし１７０ヌクレオチド、約１７０ないし約２００ヌクレオチド、約２００ないし約２５０ヌクレオチド、または約２５０ないし約３００ヌクレオチドの範囲の長さであり得る。
【００３１】
各ガイドＲＮＡは、２つの別個の分子、すなわちｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。あるいは、各ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡに結合している単一の分子であり得る。例えば、ループまたはステムループを用いてｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを結合させることができる。
【００３２】
ガイドＲＮＡを化学合成、酵素合成、あるいはこれらの組み合わせにより合成することができる。例えば、標準的なホスホロアミダイトに基づく固相合成法を用いてガイドＲＮＡを合成することができる。別法として、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、ファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター制御配列に作動可能に結合することによって、ガイドＲＮＡをインビトロで合成することができる。適切なファージプロモーター配列の例は、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター配列、またはそれらの変異体を包含する。いくつかの具体例において、ｃｒＲＮＡは化学合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡは酵素合成される。
【００３３】
各ガイドＲＮＡは標準的なリボヌクレオチドおよび／または修飾されたリボヌクレオチドを含み得る。いくつかの具体例において、ガイドＲＮＡは標準的なまたは修飾されたデオキシリボヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡが酵素合成される具体例において、一般的には、ガイドＲＮＡは標準的なリボヌクレオチドを含む。ガイドＲＮＡが化学合成される具体例において、ガイドＲＮＡは、標準的なまたは修飾されたリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。修飾されたリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、塩基修飾（例えば、シュードウリジン、２−チオウルジン、Ｎ６−メチルアデノシン等）および／または糖修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）等）を包含する。ガイドＲＮＡの骨格はまた、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、またはペプチド核酸を含むように修飾され得る。
【００３４】
他の具体例において、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含み得る。検出可能な標識は発蛍光団（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、オレゴングリーン、Alexa Fluor、ハロタグ、または適切な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等）、量子ドット、または金粒子であり得る。
【００３５】
（ｄ）特定の具体例
ある具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号３１を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号３２を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号３３を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号３４を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号３３を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号３２を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号３９を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号４０を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号４１を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号４２を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号４３を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号４４を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号４５を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号４６を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号４７を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号４８を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号４９を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号５０を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号５１を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号５２を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号５３を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号５４を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。他の具体例において、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは、（ｉ）配列番号５５を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）および（ｉｉ）配列番号５６を含むガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣａｓ９−Ｄ１０Ａ（＋ＮＬＳ）を含む。
【００３６】
（ＩＩ）キット
本開示のさらなる態様は、上のセクション（Ｉ）で説明した対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを含むキットを提供する。いくつかの具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、対になったガイドＲＮＡのそれぞれと複合体を形成し、即使用可能なＲＮＰｓとして提供され得る。他の具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼおよび対になったガイドＲＮＡのそれぞれが、エンドユーザーに別々に提供され、使用前に複合体化されてＲＮＰにされ得る。キットは、トランスフェクション試薬、細胞増殖培地、選択培地、反応バッファー等をさらに含み得る。いくつかの具体例において、キットは、対象とするゲノムの遺伝子座の遺伝子変換／修正のための１つまたはそれ以上のドナーポリヌクレオチドをさらに含み得る。一般的には、本発明により提供されるキットは、以下に説明する方法を実施するための説明書を含む。キットに含まれる説明書は包装材に付けられていてもよく、あるいは包装内に入れられていてもよい。典型的には説明書は手書きまたは印刷されたものであるが、そのようなものに限定されない。かかる説明書を保存し、それをエンドユーザーに届けることができる媒体はすべて本開示により企図される。かかる媒体は、限定するものではないが、電子的保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）等を包含する。本明細書の用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを包含し得る。
【００３７】
（ＩＩＩ）免疫関連ゲノムの遺伝子座の効率的な改変方法
本開示のもう１つの態様は、真核細胞におけるゲノムの遺伝子座を効率的に改変する方法に関する。該方法は、上のセクション（Ｉ）で説明した対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを細胞に導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは協働して標的ゲノムの遺伝子座に二本鎖破壊を導入し、その結果、細胞の二本鎖破壊の修復がゲノムの遺伝子座の改変をもたらす。
【００３８】
二本鎖破壊は非相同末端結合（nonhomologous end joining）（ＮＨＥＪ）によって修復され得、その結果、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入および／または少なくとも１つのヌクレオチドの欠失（すなわちインデル（indels））が生じ、ゲノムの遺伝子座が不活性化される。例えば、ゲノムの遺伝子座をノックダウン（すなわちモノアレル変異（monoallelic mutation））して、減少した量の遺伝子産物を得ることができ、あるいはゲノムの遺伝子座をノックアウト（すなわちバイアレル変異（biallelic mutation））して、遺伝子産物を生じさせないようにすることができる。
【００３９】
いくつかの具体例において、該方法は、対象とするゲノムの遺伝子座の標的領域と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの変化を有するドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含み、相同性指向修復（homology-directed repair）（ＨＤＲ）による二本鎖破壊の修復によってドナー配列の組み込みまたは交換が起こり、その結果、少なくとも１つのヌクレオチドの置換（例えば、遺伝子修正／変換）により対象となるゲノムの遺伝子座が改変される。
【００４０】
本明細書に「開示された方法は、ＣＲＩＳＰＲ成分をコードする核酸に対するものとしてＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを細胞に導入することを含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは即座に標的ゲノムの遺伝子座を開裂することができ、細胞はＣＲＩＳＰＲ成分を転写／翻訳する必要がない。外来タンパク質およびＲＮＡｓは迅速に分解される傾向があるので、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓは一時的な効果を有する。そのうえ、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼのデリバリーは、ＣＲＩＳＰＲ成分をコードする核酸が細胞に導入される場合に観察される長時間発現の問題（Kim et al., Genome Research, 2014, 24(6):1012-1019）を回避する。
【００４１】
一般的には、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓの使用は、高頻度のゲノム改変を生じさせる。実施例４にて詳述するように、ＴＩＤＥ／ＩＣＥアッセイ（Tracking of Indels by Decomposition/Inference of CRISPR Edits）を用いて評価したところ、ヒト初代Ｔ細胞において、対になったＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓを用いた場合、ＣＴＬＡ−４遺伝子座において２９％、ＴＩＭ−３遺伝子座において１１％、そしてＴＲＡＣ遺伝子座において１４％のインデル頻度を生じさせた。しばしば、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓの使用は、単一のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＲＮＰを用いる場合と比較して、ゲノム改変頻度の増加をもたらす。実施例１にて詳述するように、ＣＥＬ−１ヌクレーゼアッセイを用いて評価したところ、Ｋ５６２細胞において、対になったＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓは、ＰＤ−１遺伝子座において２１％の平均インデル頻度を生じさせたが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰは、ＰＤ−１遺伝子座において９．５％の平均インデル頻度を生じさせた。同様に、実施例２にて詳述するように、次世代シークエンスを用いて評価したところ、ヒト初代Ｔ細胞において、対になったＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓは、ＰＤ−１遺伝子座において５．６％の平均インデル頻度を生じさせたが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰは、ＰＤ−１遺伝子座において１．６％の平均インデル頻度を生じさせた。実施例４にて詳述するように、ＴＩＤＥ／ＩＣＥアッセイを用いて評価したところ、対になったＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓは、ＴＩＭ−３遺伝子座において１１％のインデル頻度を生じさせたが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰは、ＴＩＭ−３遺伝子座において４％のインデル頻度を生じさせた。
【００４２】
（ａ）細胞への導入
該方法は、対になったＣａｓ９ニッカーゼＲＮＡｓを細胞に導入することを含む。いくつかの具体例において、細胞にデリバリーする直前に、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼおよび対になったガイドＲＮＡのそれぞれを複合体化させてＲＮＰとすることができる。他の具体例において、細胞にデリバリーする前数陣、数日間、数週間または数ヶ月の間、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼおよび対になったガイドＲＮＡのそれぞれを複合体化させる（そして適切に保存する）ことができる。
【００４３】
一般的には、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、約０．１：１ないし約１００：１であり得る。したがって、例えば、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、０．２５：１、０．５：１、０．７５：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１．５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、または１００：１であり得る。いくつかの具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、約０．５：１ないし約５０：１である。いくつかの具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、約１：１ないし約７５：１である。いくつかの具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、約１：１ないし約２５：１である。いくつかの具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、約１：１ないし約１５：１である。いくつかの具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、約１：１ないし約１０：１である。いくつかの具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、約２：１ないし約１０：１である。他の具体例において、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼに対するガイドＲＮＡの対のモル比は、０．５：１、１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、または１０：１である。
【００４４】
様々な方法によりＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを細胞にデリバリーすることができる。いくつかの具体例において、適切なトランスフェクション法によってＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを細胞に導入することができる。例えば、エレクトロポレーションに基づくトランスフェクション法、すなわち、ヌクレオフェクションを用いてＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを導入することができる。ヌクレオフェクション法および器具は当該技術分野においてよく知られている。他の具体例において、細胞透過性ペプチドまたはそれらの誘導体（Erazo-Oliverase et al., Nature Methods, 2014, 11:861-867）のごときエンドソーム溶解剤の存在下においてインキュベーションすることにより、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを細胞に導入することができる。さらに他の具体例において、マイクロインジェクションによりＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを細胞に導入することができる。
【００４５】
一般的には、細胞増殖および／または維持に適した条件下で細胞が維持される。適切な細胞培養条件は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814；Moehle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060；Urnov et al., Nature, 2005, 435:646-651；およびLombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306に記載されている。当業者は、細胞培養方法が当該技術分野において知られ、細胞タイプに応じて変更されうることを理解している。特別な細胞タイプのための最良の方法を決定するために、すべての場合において常套的な最適化を用いてもよい。
【００４６】
（ｂ）任意の（optional）ドナーポリヌクレオチド
いくつかの具体例において、該方法は、対象とするゲノムの遺伝子座の標的領域と比較して少なくとも１つのヌクレオチド変化を有するドナー配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む。したがって、元のゲノム配列への組み込みまたは交換によって、改変されたゲノムの遺伝子座は少なくとも１つのヌクレオチド変化を有し、その結果、細胞は改変された遺伝子産物を生産する。
【００４７】
ドナー配列は、ゲノムの遺伝子座の標的領域と比較して少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。そのようなものとして、ドナー配列は、対象とするゲノムの遺伝子座中の標的配列と実質的な配列同一性を有する。標的領域の長さに応じて、ドナー配列は、標的領域の上流および下流に存在する配列と実質的に同じ配列を有する配列と隣接しうる。本明細書において、「実質的な配列同一性」というフレーズは、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列をいう。したがって、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列（および任意のフランキング配列）は、対象とするゲノムの遺伝子座に対して約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。特別な具体例において、任意のフランキング配列は、対象とするゲノムの遺伝子座中の対応配列に対して約９５％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００４８】
ドナー配列（および任意のフランキング配列）の長さを変更でき、そして変更されるであろう。例えば、ドナー配列（および任意のフランキング配列）は、約３０ヌクレオチドないし約１０００フクレオチドの長さの範囲であり得る。ある具体例において、ドナー配列（および任意のフランキング配列）は、約３０ヌクレオチドないし約１００フクレオチド、約１００ヌクレオチドないし約３００ヌクレオチド、または約３００ヌクレオチドないし約１００００ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。
【００４９】
ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、直鎖状または環状、そして／あるいはＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。いくつかの具体例において、ドナーポリヌクレオチドはベクター、例えばプラスミドベクターであり得る。他の具体例において、ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであり得る。
【００５０】
（ｃ）細胞タイプ
該方法は、対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓを真核細胞に導入することを含む。真核細胞はヒト細胞または動物細胞であり得る。大部分の具体例において、真核細胞は免疫細胞であり得る。適切な免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞）、Ｂ細胞（例えば、プロＢ−細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のごときリンパ球、好中球、単球／マクロファージ、顆粒球、マスト細胞、および樹状細胞を包含する。いくつかの具体例において、細胞は非免疫細胞であり得る。真核細胞は、初代細胞または細胞株の細胞であり得る。特別な具体例において、細胞はヒト初代Ｔ細胞であり得る。
【００５１】
（ＩＶ）応用
本明細書に開示された組成物および方法を、様々な治療、診断、工業および研究用途に使用し得る。いくつかの具体例において、本開示を用いて免疫腫瘍学、癌の免疫療法、免疫療法、免疫治療、免疫診断、または他の免疫に基づく処理を開発、試験、および／または実施することができる。例えば、特定のタイプの乳癌（例えば、ＥＲ−陽性、ＰＲ−陽性、トリプルネガティブ等）、前立腺癌、肺癌、皮膚癌等を標的とするように特別な組成物を設計することができる。
【００５２】
他の具体例において、本開示を用いて、細胞または動物中の対象とするゲノムの遺伝子座を改変して遺伝子の機能を設計および／または研究し、対象とする遺伝的またはエピジェネティックな状態を研究し、あるいは様々な疾病または疾患に関連する生化学的経路を研究することができる。例えば、疾病または疾患に関連した１つまたはそれ以上の核酸配列の発現が変化している疾病または疾患をモデルとした遺伝子導入動物を作成することができる。疾病モデルを用いて、動物に対する変異の効果を研究し、疾病の発症および／または進行を研究し、疾病に対する薬理活性物質の効果を研究し、そして／あるいは可能性のある遺伝子治療戦略の有効性を評価することができる。
【００５３】
他の具体例において、該組成物および方法を用いて、効率的かつコスト的に有効な機能的ゲノムのスクリーニング行うことができ、それを用いて、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子の機能を研究し、遺伝子発現の変化がいかにして生物学的プロセスに影響しうるのかを研究し、あるいは細胞の表現形に関連したゲノムの遺伝子座の突然変異誘発をサチュレーティング（saturating）またはディープスキャンニング（deep scanning）することができる。突然変異誘発のサチュレーティングまたはディープスキャンニングを用いて、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性、および疾病の逆転に必要な機能的エレメントの重要な最小限の特徴および個別の脆弱性を決定することができる。
【００５４】
（Ｖ）治療方法
もう１つの態様において、対象の治療方法、例えば、対象中の過剰増殖の症状または疾患（例えば、癌）、例えば固形腫瘍、軟組織腫瘍、または転移性病変を軽減または改善方法が提供される。該方法は、本明細書に記載の方法に従って典型的にはエクスビボにて細胞を改変し、改変された細胞を単独または他の薬剤または治療モダリティーと組み合わせて治療を要する対象にデリバリーまたは投与することを含む。
【００５５】
例えば、改変方法は、ヒトゲノム中の遺伝子座（タンパク質をコードしている遺伝子、コードしていない遺伝子、セーフハーバー部位）を標的として、特定の標的遺伝子（複数も可）をノックダウン、ノックアウト、またはノックインするためのものである。遺伝子を不活性化することにより、対象とする遺伝子が機能的なタンパク質またはＲＮＡ形態に発現されないようにすること（すなわちノックアウト）が意図される。別法として、対象とする遺伝子を改変して、その発現および／または機能性を低下（すなわちノックダウン）させてもよい。もう１つの別法として、外因性またはドナーの配列をゲノム配列中にコピーし、あるいは組み込んでもよい（すなわちノックインまたは組み込み）。例えば、疾病の治療を引き起こす小規模な内在性遺伝子領域の修正（例えば単一の核酸の変化あるいはいくつかの遺伝子の変化）あるいは合成コピーの導入による遺伝子全体の機能的置換によって、変異したあるいは不良の遺伝子の修正版を導入してもよい。引き起こされる核酸の鎖の破壊は、通常は、相同組み換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）といった明確なメカニズムによって修復される。しかしながら、ＮＨＥＪは、開裂部位においてしばしばＤＮＡ配列の変化を引き起こす不完全な修復プロセスである。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復は、小規模な挿入および欠失（インデル）をしばしば引き起こすものであり、特異的な遺伝子ノックアウトを作出するために用いることができる。当該技術分野においてよく知られた方法により、突然変異事象により誘発された開裂が起こっている細胞を同定および／または選択することができる。
【００５６】
本明細書に記載の癌治療は、組織病理学的タイプまたは侵襲性のステージに関係なく、すべてのタイプの癌性増殖または腫瘍発生プロセス、転移性組織または悪性形質転換細胞、組織もしくは器官を包含することを意味する。癌性疾患の例は、限定するものではないが、固形腫瘍、血液学的癌、軟組織腫瘍、および転移性病変を包含する。
【００５７】
固形腫瘍の例は、悪性腫瘍、例えば肉腫、ならびに肝臓、肺、乳房、リンパ、胃腸（例えば大腸）、尿生殖路（例えば腎臓、尿路上皮細胞）、前立腺および咽頭のごとき様々な器官システムの癌腫（腺癌および扁平上皮癌を含む）を包含する。腺癌は、大部分の大腸癌、直腸癌、腎細胞癌腫、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸の癌、および食道の癌のごとき悪性腫瘍を包含する。扁平上皮癌は、例えば、肺、食道、皮膚、頭頸部領域、口腔、肛門および頸部の悪性腫瘍を包含する。本開示の方法および組成物を用いて上記癌の転移性病変を治療または予防することもできる。
【００５８】
本明細書に開示された方法および組成物を用いて増殖を抑制することができる代表的な癌は、典型的に免疫療法に応答性の癌を包含する。治療される好ましい癌の非限定的な例は、リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、乳がん（例えば、転移性乳がん）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、例えばＩＶ期または再発非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ腺癌、またはＮＳＣＬＣ扁平上皮癌）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病）、皮膚癌（例えば、黒色腫（例えば、ステージＩＩＩまたはＩＶの黒色腫）またはメルケル細胞癌）、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、骨髄異形成症候群、膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、例えば、明細胞腎細胞癌、例えば、進行性または転移性明細胞腎細胞癌）および結腸癌を包含する。さらに、本明細書に開示された抗体分子を用いて難治性または再発性の悪性腫瘍を治療することができる。
【００５９】
治療することのできる他の癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門癌、胃食道、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、メルケル細胞癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌システムの癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄性白血病を含む慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球白血病、慢性リンパ性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、腎臓または尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発アスベストによって誘発されるもの（例、中皮腫）を含む癌、および前記癌の組み合わせを包含する。
【００６０】
１の具体例において、腫瘍または癌は、腺腫、血管肉腫、星細胞腫、上皮癌、生殖細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜肉腫、横紋筋肉腫、肉腫、および奇形腫から選択される。腫瘍は、末端黒子黒色腫、光線性角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管、カルチノイド、癌腫、癌肉腫、海綿状、胆管癌、軟骨肉腫、絨毛神経叢乳頭腫／癌、明細胞癌、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜腺癌、子宮内膜腺癌、上衣、類上皮、ユーイング肉腫、線維層板、限局性結節性過形成、ガストリノーマ、生殖細胞腫瘍、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫、肝細胞癌、インスリノーマ、上皮間腫瘍、上皮間扁平上皮腫瘍、浸潤性扁平上皮癌、大細胞癌、平滑筋肉腫、黒子型黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、中皮、転移性癌、粘表皮癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌結節性黒色腫、オート麦細胞癌、オリゴデンドロログ、骨肉腫、膵臓、乳頭状漿液性腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、小細胞癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮癌、中皮下、表在性黒色腫、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、ｖｉｐｏｍａ、高分化型癌、およびウィルム腫瘍から選択され得る。
【００６１】
したがって、本開示は、限定するものではないが、膀胱（加速性および転移性膀胱癌を含む）、乳房、結腸（結腸直腸癌を含む）、腎臓、肝臓、肺（小および非小細胞肺癌および肺腺癌を含む）、卵巣、前立腺、精巣、尿生殖路、リンパ系、直腸、喉頭、膵臓（外分泌膵臓癌を含む）、食道、胃、胆嚢、子宮頸部、甲状腺、および皮膚（扁平上皮癌を含む）の癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、およびバーケットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、および前骨髄球性白血病を含む骨髄系列の造血性腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫を含む間葉系腫瘍；黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアクタントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞癌、奇形癌などのその他の腫瘍を包含する様々な癌の治療方法を提供する。
【００６２】
例えば、本明細書に開示された方法および組成物にて治療されうる特定の白血病は、限定するものではないが、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血病性白血病、白血球性白血病、好塩基球性白血病、芽球細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、白血病皮膚、胚性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血球性白血病、血球芽球性白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ肉腫細胞白血病、マスト細胞白血病、巨核球性白血病、微小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄性単球性白血病、ネゲリ白血病、形質細胞性白血病、形質細胞性白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血病性白血病、および未分化細胞白血病を包含する。
【００６３】
本明細書に記載された組成物および方法にてリンパ腫を治療することもできる。一般的には、リンパ腫は、初めはリンパ組織に存在する細胞の腫瘍性形質転換である。リンパ腫は、免疫系の腫瘍であり、一般的には、Ｔ細胞関連およびＢ細胞関連の疾病の両方として存在する。リンパ腫のなかに２つの別個のグループ：非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびホジキンリンパ腫が存在する。とりわけ、骨髄、リンパ節、脾臓および循環細胞が関与し得る。治療プロトコルは、しばしば腫瘍細胞タイプに存在する抗原に対する抗体を用いて行われる患者からの骨髄の除去と腫瘍の除去、およびその後の保管（storage）を包含する。次いで、患者に毒性用量の放射線療法または化学療法を与え、その後、除去された骨髄を再注入して患者の造血系を再投入する。
【００６４】
本明細書に記載された組成物および方法にて治療することのできる他の血液学的悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、孤立性骨髄腫や多発性骨髄腫などの骨髄腫を包含する。多発性骨髄腫（形質細胞性骨髄腫とも呼ばれる）は骨格系に関連し、該系に散在する腫瘍性形質細胞の複数の腫瘍塊によって特徴づけられる。多発性骨髄腫は、リンパ節および皮膚のごとき他の部位にも広がり得る。孤立性骨髄腫は、多発性骨髄腫と同じ部位に発生する傾向のある孤立性の病変を包含する。
【００６５】
本明細書に記載された治療方法における使用を目的とした細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、またはリンパ球が分化しうる多能性幹細胞を包含する。所望のＣＡＲを発現するＴ細胞は、例えば、癌抗原と共刺激分子を同時発現しているγ線照射された活性化かつ拡大している細胞（gamma-irradiated activating and propagating cells (AaPC)）であってもよい。例えば、ＩＬ−２やＩＬ−２１のごとき可溶性因子の存在下にてＡＰＣ上で共培養することにより、処理加工されたＣＡＲ  Ｔ細胞を拡大してもよい。例えば、かかる拡大を行って、メモリーＣＡＲ＋Ｔ細胞（例えば、非酵素的デジタルアレイおよび／またはマルチパネルフローサイトメトリーによってアッセイされる）を得てもよい。このようにして、抗原担持腫瘍に対して特異的な細胞毒性を有するＣＡＲ  Ｔ細胞を得てもよい（所望により、インターフェロンγのごとき所望のケモカインの生成とともに）。例えばこの種類のＣＡＲ  Ｔ細胞を、例えば腫瘍異種移植を治療するための動物モデルにおいて用いてもよい。
【００６６】
上記のようなアプローチを適用して、例えば、選択された抗原に結合する受容体を認識する抗原を含む有効量の免疫応答性細胞を投与することによって、新生物のごとき疾病を有する対象治療方法および／またはその生存率を向上させる方法を提供してもよく、ここで該結合は免疫応答性細胞を活性化し、そのことにより疾病（新生物、病原体感染、自己免疫疾患、または同種移植反応のごとき）が治療される。
【００６７】
本開示に従って改変された細胞または細胞集団の投与を、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、インプラントまたは移植を包含するいずれかの都合の良いやり方で行ってもよい。患者に細胞または細胞集団を、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内またはリンパ内注射、または腹腔内投与してもよい。１の具体例において、本開示の改変された細胞は、好ましくは、静脈注射される。
【００６８】
１の具体例において、本明細書に記載された目的はいずれも、ＣＡＲ  Ｔ細胞を必要とする患者への投与前のＣＡＲ  Ｔ細胞における改変である。
【００６９】
細胞または細胞集団の投与は、体重１ｋｇあたり１０４〜１０９個、好ましくは体重１ｋｇあたり１０５〜１０６個の細胞からなり、それらの範囲内の細胞数のすべての整数値を包含する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与は、例えばシクロホスファミドを用いるリンパ枯渇を伴うまたは伴わない、例えば１０６ないし１０９個の細胞の投与を包含する。細胞または細胞集団を１回またはそれ以上の回数投与することができる。もう１つの具体例において、有効量の細胞は１回投与される。もう１つの具体例において、有効量の細胞は、一定期間において１回よりも多くと投与される。投与のタイミングは医師の管理の範囲内であり、患者の臨床的症状による。細胞または細胞集団を、血液銀行またはドナーのごときいずれのソースから得てもよい。個々のニーズが異なる一方で、特定の疾病または症状に対する特定の細胞タイプの有効量の最適範囲の決定は、当業者の技量の範囲内である。有効量は、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与量は、受容者の年齢、健康状態および体重、行っているのであれば同時に行っている治療の種類、治療の頻度および望まれる効果の性質に応じたものとなるであろう。
【００７０】
もう１つの具体例において、細胞または細胞を含む組成物の有効量が非経口的に投与される。投与は静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内に直接注射することにより行われ得る。
【００７１】
いくつかの具体例において、該方法は、１つまたはそれ以上の追加の薬剤の投与（例えば、併用療法）をさらに含み得る。例えば、１つまたはそれ以上の追加の薬剤を、化学療法剤、抗−血管新生剤および免疫抑制を減じる薬剤などとともに（本明細書に記載した治療の前、後または同時に）対象に投与してもよい。
【００７２】
治療剤は、例えば、化学療法剤または生物療法剤、放射線照射、あるいは免疫療法であり得る。特定の癌に適した治療的処置が与えられる。化学療法剤および生物療法剤の例は、限定するものではないが、ヒドロキシアンジオスタチンＫ１−３、ＤＬ−α−ジフルオロメチル−オルニチン、エンドスタチン、フマジリン、ゲニステイン、ミノサイクリン、スタウロスポリンおよびサリドマイドのごとき血管新生阻害剤；ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、スクロスホスファミド、シス−ジアミネプラチナム（ＩＩ）ジクロライド（シスプラチン）、メルファラン、ミトキサントロンおよびオキサリプラチンのごときＤＮＡインターカレーター／クロスリンカー；（±）−アメトプテリン（メトトレキセート）、３−アミノ−１，２，４−ベンゾトリアジン１，４−ジオキシド、アミノプテリン、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル、ガンシクロビル、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシンＣのごときＤＮＡ合成阻害剤；アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ホモハリントニンおよびイダルビシンのごときＤＮＡ−ＲＮＡ転写調節剤；Ｓ（＋）−カンプトテシン、クルクミン、（−）−デグエリン、５，６−ジヒドロベンジイミダゾール１−β−Ｄ−リボフラノシド、エトポシド、フォルメスタン、フォストリエシン、ヒスピジン、２−イミノ−１−イミダゾリジン酢酸（シクロクレアチン）、メビロニン、トリコスタチンＡ、チルホスチンＡＧ３４およびチルホスチンＡＧ８７９のごとき酵素阻害剤；５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−アザシチジン、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、４−ヒドロキシタモキシフェン、メラトニン、ミフェプリストン、ラロキシフェン、オールトランス−レチナール（ビタミンＡアルデヒド）、レチノイン酸オールトランス（ビタミンＡ酸）、９−シス−レチノイン酸、１３−シス−レチノイン酸、レチノール（ビタミンＡ）、タモキシフェンおよびトログリタゾンのごとき遺伝子調節剤；コルヒチン、ドデタキセル、ドラスタチン１５、ノコダゾール、パクリタキセル、ポドフィロトキシン、リゾキシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンオレルビン（ナベルビン）のごとき微小管阻害剤；ならびに１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、アピゲニン、ブレフェルジンＡ、シメチジン、ジクロロメチレン−ジホスホン酸、ロイプロリド（ロイプロレリン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ピフィスリン−α、ラパマイシン、性ホルモン結合グリブリン、タプシガルギンおよび尿トリプシンインヒビターフラグメント（ビクニン）のごとき未分類の治療剤を包含する。治療剤は、アルトレタミン、アミフォスチン、アスパラギナーゼ、カペクチタビン、クラドリビン、シサプリド、シタラビン、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドロナビノール、エポエチンアルファ、フィルグラスチム、フルダラビン、ゲムシタビン、グラニセトロン、イフォサミド、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトクロプ��ミド、ミトタン、オメプラゾール、オンダンセトロン、ピロカルピン、プロクロロペラジンまたは塩酸トポテカンであってもよい。
【００７３】
また、治療剤は、131I-トシツモマブ、90Y-イブリツモマブ  チウキセタン、ado-トラスツズマブ  エムタンシン(KadcylaＴＭ)、ado-トラスツズマブ  エムタンシン、アファチニブジマレイン酸塩(Gilotrif（登録商標）)、アレムツズマブ(Campath（登録商標）)、アキシチニブ(Inlyta（登録商標）)、ベバシズマブ(Avastin（登録商標）)、ボルテゾミブ(Velcade（登録商標）)、ボスチニブ(Bosulif（登録商標）)、ブレンツキシマブ  ベドチン(Adcetris（登録商標）)、カボザンチニブ(CometriqＴＭ)、カルフィルゾミブ(Kyprolis（登録商標）)、セリチニブ(LDK378/Zykadia)、セツキシマブ(Erbitux（登録商標）)、クリゾチニブ(Xalkori（登録商標）)、ダブラフェニブ(Tafinlar（登録商標）)、ダサチニブ(Sprycel（登録商標）)、デノスマブ(Xgeva（登録商標）)、エルロンチニブ(Tarceva（登録商標）)、エルロンチニブ(Tarceva（登録商標）)、ゲフィチニブ(Iressa（登録商標）)、イブリツモマブ  チウキセタン(Zevalin（登録商標）)、イブルチニブ(ImbruvicaＴＭ)、イデラリシブ(Zydelig（登録商標）)、イマチニブメシレート(Gleevec（登録商標）)、ラパチニブ(Tykerb（登録商標）)、ニロチニブ(Tasigna（登録商標）)、オビヌツズマブ(GazyvaＴＭ)、オファツムマブ(Arzerra（登録商標）)、パニツムマブ(Vectibix（登録商標）)、パゾパニブ(Votrient（登録商標）)、ペムブロリズマブ(Keytruda（登録商標）)、ペルツズマブ(PerjetaＴＭ)、ラムシルマブ(CyramzaＴＭ)、レゴラフェニブ(Stivarga（登録商標）)、リツキシマブ(Rituxan（登録商標）)、シルツキシマブ(SylvantＴＭ)、ソラフェニブ(Nexavar（登録商標）)、スニチニブ(Sutent（登録商標）)、トシツモマブおよび131I-トシツモマブ(Bexxar（登録商標）)、トラメチニブ(Mekinist（登録商標）)、トラスツズマブ(Herceptin（登録商標）)、バンデタニブ(Caprelsa（登録商標）)、ベムラフェニブ(Zelboraf（登録商標）)、およびビスモデギブ(ErivedgeＴＭ)のごときモノクローナル抗体であり得る。また、治療剤はネオアンチゲンであり得る。
【００７４】
治療剤は、インターフェロン（ＩＮＦｓ）、インターロイキン（ＩＬｓ）または造血成長因子のごときサイトカインであってもよい。例えば、治療剤は、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、アルデスロイキン、ＩＬ−２、エリスロポイエチン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）または顆粒球コロニー刺激因子であり得る。治療剤は、アビラテロンアセテート(Zytiga（登録商標）)、アリトレチノイン(Panretin（登録商標）)、アナストロゾール(Arimidex（登録商標）)、ベリノスタット(BeleodaqＴＭ)、ベキサロテン(Targretin（登録商標）)、カバジタキセル(Jevtana（登録商標）)、デニロイキン  ジフチトックス(Ontak（登録商標）)、エンザルタミド(Xtandi（登録商標）)、エベロリムス(Afinitor（登録商標）)、エキセメスタン(Aromasin（登録商標）)、フルベストラント(Faslodex（登録商標）)、レナリオミド(Revlimid（登録商標）)、レナリオミド(Revlimid（登録商標）)、レトロゾール(Femara（登録商標）)、ポマリドミド(Pomalyst（登録商標）)、プララトレキセート(Folotyn（登録商標）)、ラジウム２２３クロライド(Xofigo（登録商標）)、ロミデプシン(Istodax（登録商標）)、テムシロリムス(Torisel（登録商標）)、トレミフェン(Fareston（登録商標）)、トレチノイン(Vesanoid（登録商標）)、ボリノスタット(Zolinza（登録商標）)およびziv-アフリベルセプト(Zaltrap（登録商標）)のごとき標的化治療剤であってもよい。さらに、治療剤は、ＨＤＡＣ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデメチラーゼ阻害剤またはヒストンメチス化阻害剤のごときエピジェネティック標的化薬剤であってもよい。エピジェネティック薬剤は、アザシチジン(Vidaza)、デシタビン(Dacogen)、ロミデプシン(Istodax)、ルキソリチニブ(Jakafi)またはボリノスタット(Zolinza)であってもよい。
【００７５】
定義
特に定義しない限り、本明細書中のすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常に理解されている意味を有する。以下の文献は、本発明にて使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される以下の用語は、特に断らない限り、それらに起因する意味を有する。
【００７６】
本開示またはその好ましい具体例の要素を導入する場合、冠詞（a、an、theおよびsaid）は、１つまたはそれ以上の要素があることを意味することが意図される。用語「含む」、「有する」（comprising、includingおよびhaving）は包括的であることが意図され、挙げられた要素のほかにも付加的要素があってもよいことを意味することが意図される。
【００７７】
用語「約」は数値ｘに関して使用され、例えばｘ±５％を意味する。
【００７８】
本明細書において、用語「相補的な」または「相補性」は、特異的な水素結合を介する塩基対による二本鎖核酸の結合をいう。塩基対は、標準的なワトソン−クリック塩基対（例えば、相補配列３’−ＴＣＡＧ−５’と５’−ＡＧＴＣ−３’とのペア）であってもよい。塩基対はホーグステーン（Hoogsteen）または逆ホーグステーン水素結合であってもよい。相補性は、典型的には、二本鎖領域に関して測定されるものであり、したがって、例えばオーバーハングは除外される。二本鎖の２つの鎖間の相補性は部分的なものであってもよく、ある程度（例えば７０％）の塩基が相補的である場合にはパーセンテージ（例えば７０％）として表されてもよい。相補的でない塩基は「ミスマッチ」である。二本鎖領域中のすべての塩基が相補的である場合、相補性は完全（すなわち１００％）であってもよい。
【００７９】
本明細書で用いられる「遺伝子」は、遺伝子産物をコードする染色体領域（エクソンおよびイントロンを包含）ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべての染色体領域をいい、その場合、調節配列がコーディングおよび／または転写される配列に隣接しているかどうかは関係ない。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソームエントリー部位のごとき翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製開始点、マトリクスアタッチメント部位および遺伝子座制御領域を包含する。「ゲノムの遺伝子座」は、当該遺伝子配列を含む染色体上の位置をいう。
【００８０】
用語「ニッカーゼ」は、二本鎖核酸配列の一方の鎖を開裂する（すなわち、二本鎖配列にニックを入れる）酵素をいう。例えば、変異および／または欠失を用いて、ニッカーゼとして機能し、二本鎖配列の一方の鎖のみを開裂するように、二本鎖開裂活性を有するヌクレアーゼを改変することができる。
【００８１】
本明細書の用語「ヌクレアーゼ」は、二本鎖核酸配列の両方の鎖を開裂する酵素をいう。
【００８２】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖状または環状の立体配座の一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーをいう。本開示の目的からすると、これらの用語はポリマーの長さを限定するものと解してはならない。該用語は、天然ヌクレオチドの既知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分において修飾された（例えば、ホスホロチオネート骨格）ヌクレオチドを包含し得る。一般的には、特定のヌクレオチドのアナログは同じ塩基対形成特異性を有する。すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対を形成するであろう。
【００８３】
用語「ヌクレオチド」はデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう。ヌクレオチドは標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジンおよびウチジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチドアナログであってもよい。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基あるいは修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドをいう。ヌクレオチドアナログは、天然に存在するヌクレオチド（例えばイノシン、シュードウリジンなど）であってもよく、あるいは天然に存在しないヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分に対する修飾の非限定的な例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基およびチオール基の付加（または除去）ならびに塩基の炭素原子および窒素原子の他の原子での置換（例えば７−デアザプリン）を包含する。ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびモルホリノを包含する。
【００８４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいうために互換的に用いられる。
【００８５】
用語「対象」および「個体」は本明細書において互換的に用いられ、本発明の組成物にて治療（予防的処置を包含）が提供される動物、例えばヒトをいう。本明細書の用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物をいう。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシのごとき哺乳動物、およびニワトリ、両生類、は虫類などのごとき非哺乳動物を包含する。１の具体例において、対象は非ヒト哺乳動物である。もう１つの具体例において、対象はヒトである。もう１つの具体例において、対象は実験動物または疾患モデルとしての動物代用品（animal substitute）である。上記用語は特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、オスまたはメスにかかわらず、成体または新生対象ならびに胎児が包含される。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、ヤギおよびマウスを包含することが意図される。用語「対象」は遺伝子導入種を包含することが意図される。
【００８６】
用語「標的配列」および「標的部位」は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰが標的化される対象のゲノムの遺伝子座中の特定の配列をいうために互換的に用いられる。
【００８７】
核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を決定する方法は当該分野においてよく知られている。典型的には、かかる方法は、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、次いでこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを包含する。このやりかたで、ゲノム配列を決定し比較することもできる。一般的には、同一性は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。２つまたはそれ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらの同一性パーセントを決定することによって比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸またはアミノ酸にかかわらず、２つの並べられた配列間の正確な合致数を短い方の配列の長さで割って、１００を掛けた数である。核酸配列に関する近似のアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムにより提供される。Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって正規化されたスコアリングマトリクスを用いて、このアルゴリズムをアミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの代表的な実装は、Genetics Computer Group (Madison, Wis.)によって「BestFit」ユーティリティーアプリケーション中に提供されている。配列間の同一性または相同性パーセントを計算するための他の適切なプログラムは当該分野において広く知られており、例えば、もう１つのアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメーターと一緒に使用される。例えば、以下のデフォルトパラメーターを用いてＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを使用することができる：genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、GenBankのウェブサイト上に見いだすことができる。
【００８８】
本発明の範囲から逸脱することなく上で説明した細胞および方法において様々な変更を行うことができるので、上記説明および下記実施例に含まれるすべての内容は説明としてのものであって、限定することを意味するものではないことが意図される。
【００８９】
実施例
以下の実施例は、本開示の特定の態様を説明するものである。
【００９０】
実施例１．Ｋ５６２細胞におけるＰＤ−１に対するＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓの評価
細胞表面受容体であるプログラム細胞死（Programmed cell death）−１（ＰＤ−１またはＰＣＤ−１）を、癌の免疫療法のチェックポイントブロケード（blockade）の可能性のある標的とする。ＰＤ−１に対するＣＲＩＳＰＲ−ニッカーゼＲＮＰｓ用に対になったｃｒＲＮＡｓのセットを設計した（表１）。対になったｃｒＲＮＡｓをＰＡＭ−ｏｕｔ方向に配置した。
【表１】
2021518760.tif 000003
【００９１】
対になったｃｒＲＮＡ設計物＃１、＃２または＃３を含むＳｐＣａｓ９−Ｄ１０ＡニッカーゼＲＮＰｓを試験し、個々のｃｒＲＮＡｓ（ｃｒＲＮＡ−ａ、ｃｒＲＮＡ−ｂ、ｃｒＲＮＡ−ｃまたはｃｒＲＮＡ−ｄ）を含むＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓと比較した。ＲＮＰｓを得るために、Ｃａｓ９タンパク質（＋ＮＬＳ）、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡのそれぞれを、提供された懸濁溶液またはｐＨ７．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーに３０μＭとなるよう再懸濁した。次いで、それらをモル比５：５：１（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ９）にて１１μＬのミックスとしてアッセンブルし、使用直前に室温に５分間静置した。ニッカーゼＲＮＰｓに関しては、２つのＲＮＰｓを別個に得て、トランスフェクション直前に細胞に同時添加した。nucleofector system (Lonza)を用いて１００μＬのＫ５６２細胞（約３５０ｘ１０３個）にＲＮＰミックス全部を添加してトランスフェクションを行った。
【００９２】
DNA Extraction Solution (Epicentre)を用いてＫ５６２細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、標的部位を増幅した（フォワードＰＤ−１プライマー: 5’- GGACAACGCCACCTTCACCTGC, 配列番号：３５；リバースＰＤ−１プライマー: 5’- CTACGACCCTGGAGCTCCTGAT; 配列番号：３６）。Surveyor Mutation Detection Kit (IDT)を用いてＣＥＬ−１アッセイを行った。先ず、ＰＣＲアンプリコンを完全に変性させ、増幅後サーモサイクラーにてアニーリング工程を行ってヘテロ二本鎖を得て、次いで、ヌクレアーゼおよびエンハンサータンパク質を用いて４２℃で消化を行い、その後１０％ＴＢＥゲル（Thermofisher）にて電気泳動した。次いで、１０ｍｇ／ｍｌの臭化エチジウム２μＬを含む１００ｍｌの１ｘＴＢＥバッファー中でゲルを５分間染色し、その後１ｘＴＢＥバッファーで洗浄し、ＵＶルミノメーターにて可視化した。得られたバンドを、Image Jソフトウェアを用いて分析した。表２に結果を示す。
【表２】
2021518760.tif 000004
【００９３】
表２に示すように、Ｋ５６２細胞にてＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓを用いることによりゲノム編集の成功が達成された。驚くべきことに、ＰＤ−１に対するＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓのゲノム編集効率は、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓのそれよりもずっと高かった。例えば、ｃｒＲＮＡ−ａおよびｃｒＲＮＡ−ｂを含むＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓ設計物＃１は２２％のインデルを生じさせたが、ｃｒＲＮＡ−ａまたはｃｒＲＮＡ−ｂを含むＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓは、それぞれ１１％または１３％のインデルを生じさせた。
【００９４】
実施例２．初代Ｔ細胞におけるＰＤ−１に対するＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓの評価
ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓおよびＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓを実施例１で説明したようにして調製した。１０％ヒトＡＢ血清 (Sigma-Aldrich)、1x L-glutamine alternative (Gibco)、８ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２（Gibco)および５０μＭメルカプトエタノール(Sigma)を補充したＴ細胞拡大培地（Sigma-Aldrich）にてＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞（AllCells, LLC）を維持した。ヌクレオフェクション（nucleofection）の７日前にＴ細胞拡大ビーズ（すなわち、DYNABEADSＴＭ Human T-Expander CD3/CD28; Gibco）にて細胞を刺激した。１回のトランスフェクションあたりＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞（約５００ｘ１０３個）を用い、実施例１で説明したようにしてヌクレオフェクションシステムを用いてトランスフェクションを行った。Ｔ細胞拡大ビーズの存在下で細胞を培養した。
【００９５】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いることにより、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓおよびＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓの編集効率を測定した。ヌクレオフェクションから６日後に、Ｔａｑ反応混合物（JUMPSTARTＴＭ REDTAQ（登録商標） READYMIXＴＭ Reaction Mix; Sigma-Aldrich）およびゲノムの切断部位に隣接したプライマーを用いてＰＣＲを行った。パーシャルイルミナアダプター配列
NickFOR-ILLUMIPD1：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNGGACAACGCCACCTTCACCTG (配列番号：３７)
NickREV-ILLUMIPD1: GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNCTACGACCCTGGAGCTCCTGAT (配列番号：３８)
にてプライマーにタグを付した。
【００９６】
サーマルサイクリング条件は、９５℃５分の熱変性工程、次いで、９５℃３０秒、６７．７℃で３０秒のアニール、そして７０℃３０秒の伸長を３４サイクル含んでいた。増幅後、７０℃１０分の最終伸長を行い、４℃で冷却した。
【００９７】
制限されたサイクル数のＰＣＲを行って、増幅されたＰＣＲ生成物にインデックスを付した。全反応体積５０μＬは、上記Ｔａｑ反応ミックス２５μＬ、５μＬの増幅されたＰＣＲ生成物、１０μＬのＨ２Ｏ、および５μＬのNextera XT Index 1 (i7)およびIndex 2 (i5)オリゴ各５μＭを含んでいた。サーマルサイクリング条件は、９５℃３分の初期熱変性、次いで、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０秒を８サイクルからなっていた。最終伸長を７２℃で５分行い、反応物を４℃で冷却した。インデックスを付した試料とビーズを８：１にしたもの（２５μＬ）を用い、マグネチックＰＣＲ精製ビーズ（Corning）を用いてＰＣＲ精製を行った。２５μＬの１０ｍＭトリス中にＤＮＡを溶出した。
【００９８】
PicoGreen蛍光色素（Invitrogen）を用いてインデックスを付した試料の定量を行った。精製されたインデックスを付したＰＣＲ生成物を、１ｘＴＥにて１：１００に希釈した。PicoGreenを１ｘＴＥで１：２００に希釈した。希釈されたインデックスを付したＰＣＲ試料に等量の希釈されたPicoGreenを添加して、蛍光プレートリーダー中に最終１：１の希釈比とした。試料を４７５ｎｍで励起し、５３０ｎｍで読んだ。すべての試料を１ｘＴＥにて４ｎＭに正規化して、正規化された各試料６μＬを集めてプールした。
【００９９】
ライブラリー調製日にストックの１０Ｍ  ＮａＯＨをＨ２Ｏにて系列希釈して、０．１Ｍの最終濃度とした。ＤＮＡを変性させるために、５μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨおよび５μＬのプールされた４ｎＭのライブラリーを混合し、室温で５分間インキュベーションした。これに９９０μＬの冷イルミナＨＴ１バッファーを添加して、２０ｐＭのプールされ、変性されたライブラリーを得た。ＰｈｉＸ（２０ｐＭ）を融解し、３０μＬを新たなチューブに移し、２０ｐＭのライブラリー５７０μＬをＰｈｉＸに添加し、ライブラリー多様化、クラスターを得るための品質管理、シークエンシングおよびアラインメト用の５％のＰｈｉＸを得た。これを混合し、９６℃で２分間熱ショックを与え、その後即座に氷上に置いた。ライブラリーを含むＰｈｉＸ（６００μＬ）を300 cycle v2 Miseq reagent cartridgeのウェルに添加し、シークエンス反応を開始した。ラン（run）の後、.bamファイルを用いてＩＧＶソフトウェアにて分析を行った。結果を表３に示す。
【表３】
2021518760.tif 000005
【０１００】
ＮＧＳ分析により、初代Ｔ細胞におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓを用いるＰＤ−１に対するゲノム編集の成功が示された。ＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓ設計物＃１および＃２の両方が、どの単一ｃｒＲＮＡを有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓよりも初代Ｔ細胞に対して高いゲノム編集効率を示した。詳細には、設計物＃１の対になったＲＮＰｓ（ｃｒＲＮＡ−ａ＋ｒＲＮＡ−ｂ）を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼは１１．９％のインデルを生じさせた；その一方で、ｃｒＲＮＡ−ａまたはｃｒＲＮＡ−ｂを有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓは１．７％および２．４％のインデルを生じさせただけであった。
【０１０１】
実施例３．Ｋ５６２細胞におけるより多くの免疫に関連した標的に対するＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓの評価
細胞毒性Ｔリンパ球タンパク質４(CTLA4)、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３(TIM-3; Ａ型肝炎ウイスル細胞受容体２, HAVCR2とも呼ばれる)およびＴ細胞受容体アルファコンスタント(TRAC)は、癌の免疫療法における目立った標的またはゲノムの遺伝子座である。これらの標的に対するＣＲＩＳＰＲ−ニッカーゼＲＮＰｓのために対になったｇＲＮＡｓのセットを設計した（表４）。化学的に修飾された単一のｇＲＮＡs（single gRNAs）（安定化のための２’−Ｏ−メチルおよびホスホロチオエート結合を含むmod-sgRNAs）を用いた。対になったｍｏｄ−ｓｇＲＮＡをＰＡＭ−ｏｕｔ方向に配置した。
【０１０２】
表４．対になったｍｏｄ−ｓｇＲＮＡの設計
【表４−１】
2021518760.tif 000006
【表４−２】
2021518760.tif 000007
【表４−３】
2021518760.tif 000008
【０１０３】
モル比３：１（ｍｏｄ−ｓｇＲＮＡ:Ｃａｓ９タンパク質）でＲＮＰｓをアッセンブルした以外は、実施例１で説明したようにＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓを調製し、Ｋ５６２細胞中にデリバリーした。
【０１０４】
DNA Extraction Solution (Epicentre)を用いてＫ５６２細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、標的部位を増幅した（CTLA-4プライマー: フォワードＣＴＬＡ−４プライマー: 5’- CCCTTGTACTCCAGGAAATTCTCCA, 配列番号：５７、リバースＣＴＬＡ−４プライマー: 5’-ACTTGTGAGCTCATCCTGAAACCCA, 配列番号：５８、ＴＩＭ−３プライマー: フォワードＴＩＭ−３プライマー: 5’-TCATCCTCCAAACAGGACTGC, 配列番号：５９、リバースＴＩＭ−３プライマー: 5’-TGTCCACTCACCTGGTTTGAT, 配列番号６０、ＴＲＡＣプライマー: フォワードＴＲＡＣプライマー: 5’-TCAGGTTTCCTTGAGTGGCAG, 配列番号：６１, リバースＴＲＡＣプライマー: 5’-TGGCAATGGATAAGGCCGAG, 配列番号：６２）。
【０１０５】
ＴＩＤＥ／ＩＣＥ（Tracking of Indels by Decomposition / Inference of CRISPR Edits）アッセイを用いることによりＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓの編集効率を測定した。標的特異的ＰＣＲ精製物を用いるＧＥＮＥＷＩＺによりサンガートレースを得て、TIDE or ICE ウェブツール（http://tide.nki.nl or https://ice.synthego.com）を用いて分析した。デフォルトパラメーターを用いた。表５に結果を示す。
【表５】
2021518760.tif 000009
【０１０６】
表５に示すように、Ｋ５６２細胞においてＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓを用いるＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＴＲＡＣに対するゲノム編集の成功が得られた。例えば、それぞれ、ＣＴＬＡ−４ペア＃２を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓは１４％のインデルを生じさせ；ＴＩＭ３ペア＃３を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓは１８％のインデルを生じさせ；そしてＴＲＡＣペア＃２を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓは６％のインデルを生じさせた。
【０１０７】
実施例４．ヒト初代Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＴＲＡＣに対するＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓの評価
Ｋ５６２細胞中の各標的に対する最も高い編集効率を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓ（ＣＴＬＡ−４ペア＃２、ＴＩＭ−３ペア＃３およびＴＲＡＣペア＃２）を、ヒト初代Ｔ細胞にて試験するために選択した。実施例３に記載したようにＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓおよびＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓを調製し；実施例２に記載したようにＲＮＰｓをヒト初代Ｔ細胞にデリバリーした。実施例３に記載したようにＴＩＤＥ／ＩＣＥアッセイを用いることによりＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓおよびＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓの編集効率を測定した。結果を表６に示す。
【０１０８】
表６．デユアルＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓおよびＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓを用いるヒト初代Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＴＲＡＣに対するゲノム編集
【表６】
2021518760.tif 000010
【０１０９】
表６に示すように、ヒト初代Ｔ細胞におけるすべての標的に対してＳｐＣａｓ９ニッカーゼを用いるゲノム編集の成功が得られた。１つのターゲットであるＴＩＭ−３に対して、ニッカーゼＲＮＰｓは、初代Ｔ細胞においてＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰｓよりも高いゲノム編集効率を示した。特に、ＰＤ−１に対する化学的に修飾された単一の（single）ｇＲＮＡｓを有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼＲＮＰｓ（ペア＃２）は、ヒト初代Ｔ細胞において３４％のインデルを生じさせ、それは２パーツのｃｒ／ｔｒａｃＲＮＡを有するニッカーゼＲＮＰｓにより得られる値よりも有意に高かった（実施例２において、ＰＤ−１  ｃｒ／ｔｒａｃＲＮＡペア＃２を有するニッカーゼＲＮＰｓは５％未満のインデルしか生じさせなかった）。
【０１１０】
実施例５．対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼリボ核タンパク質を用いるドナーポリヌクレオチドの組み込み
真核細胞における標的化染色体の二本鎖の破壊（break）の特異性および頻度の両方を改善する対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓの能力は、外来ドナーポリヌクレオチドの組み込み頻度を増加させるのにも有利であろう。外来ドナーポリヌクレオチドにてヒト体細胞免疫細胞のゲノムを遺伝学的に改変する能力は、様々な疾病（とりわけ癌、感染症）に対する免疫応答を改善するための多くの新たな選択肢を生じさせる。
【０１１１】
外来ドナーポリヌクレオチドを対になったＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰｓとともに用いて、ＡＡＶＳ１遺伝子座（ヒト遺伝子ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ中）、ヒトＲｏｓａ２６遺伝子座、Ｈｉｐｐ１１（Ｈ１１）遺伝子座またはＣＣＲ５のごとき真核免疫細胞中のセーフハーバー部位に導入遺伝子をデリバリーすることができる。セーフハーバー部位は、外来遺伝子の挿入および発現が細胞の機能および健康に対して最小限のインパクトを有する部位であると定義される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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