(57)【要約】  酵素的制限およびリアルタイムＰＣＲを使用して、癌関連の変異を検出するための方法およびキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、癌変異部位を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物のシグナル強度間の比を計算するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で計算された前記比を予め定義された閾値比と比較することによって、前記ＤＮＡサンプル中の前記癌関連変異を検出するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが腫瘍組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡが血漿に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対照遺伝子座が、前記制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠く遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡが天然ＤＮＡであり、前記制限遺伝子座が天然の制限遺伝子座であり、前記制限エンドヌクレアーゼがメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼであり、その認識配列が前記癌変異部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌関連変異が、ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｅ７４７〜Ａ７５０）、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換、Ｐ５３  Ｈ１７９置換、Ｐ５３  Ｇ１５４置換、Ｐ５３  Ｒ２８２置換、Ｐ５３  Ｒ２４８置換、Ｐ５３  Ｒ２４９置換およびＢＲＡＦ  Ｖ６００置換、からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭｓｅＩ（ＥＧＦＲエクソン１９欠失）、ＭｓｃＩ（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換）、ＦａｔＩ（Ｐ５３  Ｈ１７９置換）、ＭｓｐＩ（Ｐ５３  Ｇ１５４置換、Ｐ５３  Ｒ２８２置換、Ｐ５３  Ｒ２４８置換）、ＨａｅＩＩＩ（Ｐ５３  Ｒ２４９置換）およびＴｓｐＲＩ（ＢＲＡＦ  Ｖ６００置換）、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記癌変異部位が制限エンドヌクレアーゼの認識配列内に天然に見出されず、前記ＤＮＡがＰＣＲ産物であり、前記制限遺伝子座が前記ＰＣＲによって前記ＤＮＡに人工的に導入された制限遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記癌関連変異が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換およびＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＢｔｓＩＮ（ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換）およびＡｌｕＩ（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌関連変異が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換であり、前記制限エンドヌクレアーゼが、ＢｔｓＩＮである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前対照遺伝子座が、配列番号４に示される遺伝子座である、請求項１１に記載の方法：
ＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣ。
【請求項１３】
前記癌関連変異が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換、ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｅ７４７〜Ａ７５０）、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換、Ｐ５３  Ｈ１７９置換、Ｐ５３  Ｇ１５４置換、Ｐ５３  Ｒ２８２置換、Ｐ５３  Ｒ２４８置換、Ｐ５３  Ｒ２４９置換およびＢＲＡＦ  Ｖ６００置換、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）が、リアルタイムＰＣＲを使用して実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物の検出を補助するための蛍光プローブを添加することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物の前記シグナル強度間の比の前記計算は、各遺伝子座の定量化サイクル（Ｃｑ）を決定し、２（Ｃｑ対照遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）を計算することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象が癌関連変異について陽性であると同定するための方法であって、
（ａ）前記対象からのＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、癌変異部位を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物のシグナル強度間の比を計算するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で計算された前記比を予め定義された閾値比と比較することによって、前記対象が前記癌関連変異について陽性であると同定するステップと、を含む、方法。
【請求項１８】
ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのキットであって、
ＤＮＡサンプルを消化するための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
前記制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、癌変異部位を含む少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、
増幅後の前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、前記ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令するコンピュータソフトウェアを記憶するコンピュータ可読媒体と、を含む、キット。
【請求項１９】
前記コンピュータソフトウェアが、前記コンピュータプロセッサに、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の増幅後にそれらのシグナル強度を決定するステップ、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記シグナル強度の間の比を計算するステップ、前記計算された比を予め定義された閾値比と比較するステップ、および、前記比較に基づいて前記ＤＮＡサンプルが前記癌関連変異について陽性であるかどうかを出力するステップ、を実行するように命令する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記少なくとも１つの対照遺伝子座の増幅産物を検出するための複数のポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのシステムであって、
ＤＮＡサンプルを消化するための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
前記制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、癌変異部位を含む少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、
増幅後の前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、前記ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令するコンピュータ可読媒体に記憶されたコンピュータソフトウェアと、を含む、システム。
【請求項２２】
前記コンピュータソフトウェアが、前記コンピュータプロセッサに、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の増幅後にそれらのシグナル強度を決定するステップ、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記シグナル強度間の比を計算するステップ、前記計算された比を予め定義された閾値比と比較するステップ、および、前記比較に基づいて前記ＤＮＡサンプルが前記癌関連変異について陽性であるかどうかを出力するステップ、を実行するように命令する、請求項２１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素的制限（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）およびリアルタイムＰＣＲを使用したＤＮＡサンプルにおける癌関連変異の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、様々な細胞分子をコードする遺伝子の変化に関連している。癌変異の範囲は、タイプ、数、機能的影響の点で多様である。例としては、単一塩基の変化、欠失、および選択的スプライシングまたは転座が含まれる。特定の変異は１つ以上のタイプの癌に関連付けられており、変異遺伝子産物は癌の生物学的特性と関連している。
【０００３】
腫瘍ＤＮＡの変異プロファイルは、診断、予後、治療方針の決定など、患者管理にとって重要である。しかしながら、臨床サンプルでは通常、大量の正常遺伝子内に少量の変異腫瘍遺伝子しか含まれていないため、臨床環境での癌関連変異の検出は課題である。血漿サンプル中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を分析する場合、癌関連変異の検出は特に困難である。したがって、高感度でさらに特異的なアッセイが必要である。
【０００４】
現在、ほとんどの遺伝的変異体の臨床試験は、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サンガージデオキシシーケンシング、パイロシーケンシング、多重連結依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、質量分析（ＭＳ）などの技術を使用して行われる。大規模並列シーケンシングとも呼ばれる、新しい次世代シーケンシング（ＮＧＳ）テクノロジが登場している。ＮＧＳを使用すると、多数の配列の増幅とシーケンシングを同時に実行することが可能になる。しかしながら、この技術は現在、高価であり、日常的な臨床試験には複雑である。
【０００５】
Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９９）は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、１４（５）：４３９−４８において、遍在する制限酵素部位での変異を検出するための制限部位変異アッセイと命名された方法論の概要を提供している。簡単に言えば、遍在する制限酵素部位でのＤＮＡ変異によって、制限酵素が特定のＤＮＡ標的配列を認識する能力が失われる。したがって、野生型ＤＮＡは制限酵素によって認識および切断されるが、制限酵素部位に変異を含むＤＮＡは制限酵素によって認識されず、消化されずに残り、その後のＰＣＲ増幅の基質となる。ＰＣＲ増幅産物をゲル電気泳動に供して、酵素耐性バンド、すなわち、変異の存在を検出する。
【０００６】
Ｊｅｎｋｉｎｓら（２００２）は、Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．８９（１）：８−２０において、癌の進行の原因となる遺伝的変化の分析に制限酵素を使用する方法を概説している。
【０００７】
Ｗａｒｄら（１９９８）は、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，１５３（２）：３７３−３７９において、ＢｓｔＮＩ制限酵素とＴａｑポリメラーゼを同時に作用させて、野生型産物の形成を阻害しながら、変異型Ｋ−ｒａｓの増幅を可能にする、エンリッチドＰＣＲの戦略を報告している。この制限エンドヌクレアーゼを介した選択的ＰＣＲアッセイは、ＢｓｔＮＩと共に３セットのプライマーを反応ミックスで使用し、増幅産物をゲル電気泳動で分析する。
【０００８】
Ａｓａｎｏら（２００６）は、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４３：１２（１），４３−４８において、ＥＧＦＲエクソン１９および２１での変異のための、ならびに非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の患者の生検、胸水および外科的に切除された組織による検体を含む臨床サンプル中のＥＧＦＲ変異を検出するための、ＰＣＲに基づくアッセイの開発を報告している。
【０００９】
Ｚｈａｏら（２０１３）は、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１３２、２８５８−２８６６において、ＰＣＲを制限エンドヌクレアーゼ消化と組み合わせて（リアルタイム消化ＰＣＲ、またはＲＴＤ−ＰＣＲと呼ばれる）、一段階の反応チューブで、少数の細胞から体細胞変異を検出する方法を報告している。ＰＣＲ混合物には、ＰＣＲプログラム中に、野生型対立遺伝子を消化する耐熱性制限酵素が含まれており、変異対立遺伝子の選択的な増幅を可能にする。
【００１０】
ＷＯ２０１３／１８１２７６は、複数の核酸分子中のまれな核酸分子の変異を検出するための組成物および方法を開示している。また、ドロップレットデジタルＰＣＲを使用して核酸分子のサイズを決定する方法も開示している。
【００１１】
これまでに記載された方法には、あるものは手間がかかって高価であり、他のものは感度および／または特異性が不十分であり、ならびに定量データを欠くまたは定量データを提供するための複雑な処理や較正を必要とする、欠点がある。
【００１２】
操作が簡単で、費用対効果が高く、高い特異性と感度を特徴とする、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するための改善された方法およびキットが必要である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、一部の態様によれば、変異ＤＮＡが無傷のままでの野生型ＤＮＡの選択的な消化と、その後のＰＣＲ増幅および増幅産物の分析に基づく、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出する方法を提供する。ＰＣＲ増幅には、２つの遺伝子座の同時増幅が含まれ、一方は、変異が存在する場合は無傷のまま残り、もう一方は、試験条件下で常に無傷のまま残り、対照として機能する。開示された方法は、これらの遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比を計算すること、および計算された比に基づいて癌関連変異を検出することを含み、非常に正確な変異検出をもたらす。ＤＮＡサンプルは、腫瘍組織または血漿サンプルに由来する場合がある。さらに、対象が癌関連変異について陽性であるかどうかを決定するための方法が提供される。
【００１４】
特に、本明細書に開示する方法は、制限酵素部位内の癌関連変異を検出する。非変異（野生型）ＤＮＡは、制限酵素部位を含み、制限酵素によって認識される。したがって、非変異ＤＮＡは、制限酵素に接触すると切断される。変異ＤＮＡでは、制限酵素部位が変化するため、変異ＤＮＡは、制限酵素に認識されない。変異ＤＮＡは、制限酵素と接触すると無傷のまま残り、その後のＰＣＲ増幅の基質を提供する。その後の変異位置を含む制限酵素部位を有する遺伝子座（「制限遺伝子座」）のＰＣＲ増幅では、変異ＤＮＡのみが増幅され、変異の存在が決定可能になる。高い特異性を達成するために、特定の閾値を超える変異レベルのみが臨床的に有意であると見なされる。したがって、ＤＮＡサンプルが特定の変異について陽性であると見なされるかどうかを決定するための定量的な手段を用意することが重要である。本発明は、制限酵素の認識配列を含まない対照遺伝子座の同時増幅、ならびに制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比の計算によって、この必要性に有利に対処する。変異レベルが異なると、制限遺伝子座と対照遺伝子座の間のシグナル比に違いが生じ、より高いシグナル比は、より高い変異レベルに対応する。一部の実施形態によれば、閾値シグナル比が決定され、それを超えると、所与のＤＮＡサンプルは、特定の癌関連変異について陽性であると同定される。
【００１５】
したがって、本発明は、癌関連変異の存在を検出するための、簡単で信頼できる手段を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、癌変異位置（変異部位）は、制限酵素の認識配列内に（すなわち、天然ＤＮＡ内に）天然に見出される。他の実施形態では、癌変異部位は、制限酵素の認識配列内に天然に見出されない。これらの実施形態によれば、本明細書に開示する方法によって変異を検出するために、認識配列が、ＰＣＲによって人工的に導入される。これらの実施形態によれば、消化およびさらなる分析に供されるＤＮＡサンプルは、人工的に導入された制限遺伝子座を含むＰＣＲ産物である。追加の実施形態では、癌変異部位は、特定の制限酵素の認識配列内に天然に見出されるが、本発明の方法での使用には異なる制限酵素が望ましい。目的の制限酵素の認識配列は、ＰＣＲによって人工的に導入され得、これらの実施形態によれば、消化およびさらなる分析に供されるＤＮＡサンプルは、人工的に導入された制限遺伝子座を含むＰＣＲ産物である。
【００１７】
天然ＤＮＡおよび天然の制限遺伝子座の場合、好適な遺伝子座は、メチル化非感受性の制限酵素の遺伝子座を含むため、メチル化の存在によってＤＮＡの消化が偏ることがない。
【００１８】
したがって、一態様によれば、本発明は、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、癌変異部位を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比を計算するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で計算された比を予め定義された閾値比と比較することによって、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するステップとを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、計算された比が予め定義された閾値比を超えると、癌関連変異が検出される。
【００２０】
別の態様によれば、本発明は、対象が癌関連変異について陽性であると同定するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）対象からのＤＮＡサンプルをメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、癌変異部位を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比を計算するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で計算された比を予め定義された閾値比と比較することによって、対象が癌関連変異について陽性であると同定するステップとを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、計算された比が予め定義された閾値比を超える場合、対象が癌関連変異について陽性であると同定される。
【００２２】
一部の実施形態では、ＤＮＡは、腫瘍組織に由来する。
【００２３】
一部の実施形態では、ＤＮＡは、血漿に由来する。
【００２４】
一部の実施形態では、対照遺伝子座は、当該制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠く遺伝子座である。
【００２５】
一部の実施形態では、ＤＮＡは、天然ＤＮＡであり、制限遺伝子座は、天然の制限遺伝子座であり、制限エンドヌクレアーゼは、その認識配列が癌変異部位を含むメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼである。
【００２６】
一部の実施形態では、癌変異は、その部位がメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列内に自然に見つかり、ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｅ７４７〜Ａ７５０）、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換、Ｐ５３  Ｈ１７９置換、Ｐ５３  Ｇ１５４置換、Ｐ５３  Ｒ２８２置換、Ｐ５３  Ｒ２４８置換、Ｐ５３  Ｒ２４９置換およびＢＲＡＦ  Ｖ６００置換、からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２７】
一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ＭｓｅＩ（ＥＧＦＲエクソン１９欠失）、ＭｓｃＩ（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換）、ＦａｔＩ（Ｐ５３  Ｈ１７９置換）、ＭｓｐＩ（Ｐ５３  Ｇ１５４置換、Ｐ５３  Ｒ２８２置換、Ｐ５３  Ｒ２４８置換）、ＨａｅＩＩＩ（Ｐ５３  Ｒ２４９置換）およびＴｓｐＲＩ（ＢＲＡＦ  Ｖ６００置換）、からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２８】
他の実施形態では、癌変異部位は、制限エンドヌクレアーゼの認識配列内に天然に見出されない。これらの実施形態によれば、ＤＮＡは、ＰＣＲ産物であり、制限遺伝子座は、当該ＰＣＲによってＤＮＡに人工的に導入された制限遺伝子座である。
【００２９】
一部の実施形態では、癌変異は、その部位が制限エンドヌクレアーゼの認識配列内に天然に見出されず、ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換およびＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換からなる群から選択される。一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ＢｔｓＩＮ（ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換）およびＡｌｕＩ（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換）からなる群から選択される。
【００３０】
一部の特定の実施形態では、癌変異は、その部位が制限エンドヌクレアーゼの認識配列内に天然に見出されず、ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換であり、制限エンドヌクレアーゼは、ＢｔｓＩＮである。一部の実施形態では、対照遺伝子座は、配列番号４に示される遺伝子座である。
【００３１】
一部の実施形態では、癌関連変異は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換、ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｅ７４７〜Ａ７５０）、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換、Ｐ５３  Ｈ１７９置換、Ｐ５３  Ｇ１５４置換、Ｐ５３  Ｒ２８２置換、Ｐ５３  Ｒ２４８置換、Ｐ５３  Ｒ２４９置換およびＢＲＡＦ  Ｖ６００置換、からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３２】
一部の実施形態では、その方法のステップ（ｂ）は、リアルタイムＰＣＲを使用して実行される。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）がリアルタイムＰＣＲを使用して実行される場合、その方法は、制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物の検出を補助するための蛍光プローブを添加することをさらに含む。
【００３３】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、リアルタイムＰＣＲを使用して実行され、当該制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比の当該計算は、各遺伝子座の定量化サイクル（Ｃｑ）を決定して、２（Ｃｑ対照軌跡−Ｃｑ制限遺伝子座）を計算すること、を含む。
【００３４】
さらなる態様によれば、本発明は、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのキットを提供し、このキットは、
ＤＮＡサンプルを消化するための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、癌変異部位を含む少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、
増幅後の制限遺伝子座および対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令するコンピュータソフトウェアを記憶するコンピュータ可読媒体と、を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、コンピュータソフトウェアは、コンピュータプロセッサに、制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅後にそれらのシグナル強度を決定するステップ、制限遺伝子座および対照遺伝子座のシグナル強度間の比を計算するステップ、計算された比を予め定義された閾値比と比較するステップ、および、その比較に基づいてＤＮＡサンプルが癌関連変異について陽性であるかどうかを出力するステップ、を実行するように命令する。
【００３６】
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の増幅産物を検出するための複数のポリヌクレオチドプローブをさらに含む。
【００３７】
さらなる態様によれば、本発明は、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのシステムを提供し、このシステムは、
ＤＮＡサンプルを消化するための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、癌変異部位を含む少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、
増幅後の制限遺伝子座および対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令するコンピュータ可読媒体に記憶されたコンピュータソフトウェアと、を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、コンピュータソフトウェアは、コンピュータプロセッサに、制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅後にそれらのシグナル強度を決定するステップ、制限遺伝子座および対照遺伝子座のシグナル強度間の比を計算するステップ、計算された比を予め定義された閾値比と比較するステップ、および、その比較に基づいてＤＮＡサンプルが癌関連変異について陽性であるかどうかを出力するステップ、を実行するように命令する。
【００３９】
本発明の、これらのおよびさらなる態様および特徴は、以下の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ−１Ｄ】ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異部位を含むＢｓｔＮＩの制限遺伝子座、および対照遺伝子座の例示的な定量的ＰＣＲプロットであり、癌性肺組織由来のＤＮＡサンプルのＧ１２Ｖ変異（図１Ａ）、Ｇ１２Ａ変異（図１Ｂ）またはＧ１２変異なし（図１Ｃ）、および正常な肺組織由来のＤＮＡサンプル（Ｇ１２変異なし）（図１Ｄ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、酵素的制限およびリアルタイムＰＣＲを使用する、ＤＮＡサンプルにおける変異、特に癌関連変異の検出に関する。本発明は、制限酵素によるＤＮＡの消化後、試験されたＤＮＡサンプルから同時増幅された変異部位（例えば、癌変異部位）を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル強度の比を計算することを含む。シグナル強度の比に基づいて、試験されたサンプルは、変異（例えば、癌関連変異）について陽性または陰性として同定される。
【００４２】
シグナル強度の比は、同じ反応混合物中の同じＤＮＡテンプレートから増幅された遺伝子座間で（つまり、同じ反応条件下で）計算される。これにより、本明細書に開示する方法が、テンプレートＤＮＡ濃度の変化、ＰＣＲ条件、および阻害剤の存在などの様々な「ノイズ」的な要因に対して非感受性となる。
【００４３】
有利には、一部の実施形態によれば、本発明の方法は、ＰＣＲ産物を分離することおよび／またはシーケンシングすることなく行われる。本発明の方法は、変異を、高い特異性および感度で、簡便に検出する。
【００４４】
さらに、本発明は、癌関連変異の同定のための単純な手段を提供し、これは、癌診断のための既存の方法に容易に統合することができ、同時に疾患の診断および情報、例えば、好適な治療法を選択することや疾患の予後を決定することを支援し得る情報、を提供する。より具体的には、本発明の方法は、肺癌診断に関する本発明の出願人の同時係属出願書に記載の方法、および膀胱癌診断に関する同出願人の同時係属出願書に記載の方法、などの癌診断方法に統合されてもよい。本明細書に開示された方法は、選択されたゲノム遺伝子座におけるＤＮＡメチル化の変化に基づいて癌を同定することを含む。それらの方法は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを使用して試験された対象からのＤＮＡサンプルを消化すること、癌と正常なＤＮＡとの間の示差的にメチル化された少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座とを同時増幅すること、ならびに制限および対照遺伝子座のシグナル強度の比を計算すること、を含む。計算された比を参照比と比較することによって、癌の同定が行われる。有利には、本発明の方法は、ＤＮＡ消化とその後の増幅、シグナル強度の決定、および比の計算、の同様のステップに基づくもので、これらの診断方法と並行して簡単に行うことができ、変異状態に関する診断および情報を提供する。例えば、本発明による肺癌関連変異の検出は、肺癌を診断する前述の方法と並行して行ってもよく、試験された対象が肺癌を有するかどうか、および対象が、対象に特定の治療を受け入れやすくするおよび／または対象の予後に影響を与える、１つ以上の変異を有するかどうか、の情報を提供し得る。
【００４５】
一部の実施形態では、本明細書では、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）ＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得ること、（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、癌変異部位を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成すること、（ｃ）制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比を計算すること、および（ｄ）計算された比が予め定義された閾値比を上回るかまたは下回るかを決定し、それによってＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出すること、を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書において、ＤＮＡサンプル中の変異プロファイルを生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）ＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得ること、（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、癌変異部位を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成すること、および（ｃ）制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比を計算すること、を含む。一部の実施形態では、本方法は、計算された比が予め定義された閾値比を上回るかまたは下回るかを決定することをさらに含み、それによって、ＤＮＡサンプルにおける変異プロファイルを生成する。
【００４７】
一部の実施形態では、本方法は、制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比に基づいて、変異を検出することを含む。
【００４８】
一部の実施形態では、本方法は、制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比を計算することによって、変異が存在するかどうかを検出すること、および予め定義された閾値比を上回るシグナル比を検出することを含む。
【００４９】
生体サンプルの収集と処理
分析されるＤＮＡは、腫瘍組織（固形腫瘍）に由来してもよい。分析されるＤＮＡは、血漿サンプルに由来してもよい。
【００５０】
「〜からのＤＮＡ」、「〜由来のＤＮＡ」、「〜起源のＤＮＡ」などの用語は、腫瘍サンプルまたは血液（血漿）サンプルなどの生体サンプルから得られたＤＮＡを指す。これらの用語は、天然ＤＮＡ、すなわち、生体サンプル中に見出されるＤＮＡ、および人工的に導入された制限遺伝子座を含むＰＣＲ産物などの天然ＤＮＡから生成されたＰＣＲ産物をも包含する。
【００５１】
腫瘍および／または血漿サンプルは、従来の方法を使用して対象から収集され得る。
【００５２】
本明細書で使用される「対象」という用語は、「個体」と互換的であり、典型的にはヒト対象を指す。対象は、癌患者であるか、または特定の変異に関連する癌を有する疑いがある場合がある。一部の実施形態では、対象は、例えば、家族歴に基づいて、特定の変異に関連する癌を発症するリスクがあり得る。
【００５３】
ＤＮＡは、当該技術分野において既知の方法に従って、生体サンプルから抽出されてもよい。
【００５４】
一部の実施形態では、癌関連変異は、メチル化非感受性制限酵素の制限遺伝子座内で自然に見つかる場合、生体サンプルから得られた天然ＤＮＡを変異状態の分析に使用することができる。
【００５５】
他の実施形態では、人工制限遺伝子座が導入される場合、変異状態の分析の前に、生体サンプルから得られた天然ＤＮＡをＰＣＲに供して制限遺伝子座を導入する。特に、ミスマッチのプライマーを使用する癌変異部位を含む遺伝子座のＰＣＲ増幅は、人工制限遺伝子座を導入するために行われる。以下に模範的な手順を例示する。
【００５６】
ＤＮＡ消化
本発明の方法によれば、生体サンプル由来のＤＮＡまたは生体サンプル由来のＤＮＡから生成されたＰＣＲ産物は、制限エンドヌクレアーゼによる消化に適用される。
【００５７】
一部の実施形態では、生体サンプルから抽出される、またはＰＣＲによって生成されるＤＮＡ全体が、消化ステップで使用される。一部の実施形態では、ＤＮＡは、消化に供される前に定量化されない。他の実施形態では、ＤＮＡは、その消化の前に定量化される。
【００５８】
本明細書で「制限酵素」と互換的に使用される「制限エンドヌクレアーゼ」は、制限部位として知られる、特定の認識ヌクレオチド配列で、またはその近くでＤＮＡを切断する酵素を指す。
【００５９】
「メチル化非感受性」または「メチル化非依存性」制限エンドヌクレアーゼは、その活性がメチル化の存在に影響されない、または依存しない、制限エンドヌクレアーゼである。言い換えれば、メチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼは、制限部位を、そのメチル化状態とは無関係に切断する。
【００６０】
本発明の方法によって使用される制限エンドヌクレアーゼの選択は、検出される癌関連変異の位置またはその近くのヌクレオチド配列に依存する。一部の実施形態では、変異位置がメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列内で天然に見出される場合、このメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。消化は、生体サンプル由来の天然ＤＮＡに対して行うことができる。
【００６１】
他の実施形態では、例えば、変異位置がメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列内にない場合、制限エンドヌクレアーゼは、高温で機能する能力などの技術的基準に基づいて選択され、適切な認識配列は、ミスマッチプライマーを使用してＰＣＲによって導入され得る。制限酵素は、メチル化依存性制限酵素以外であることが好ましい。消化は、人工的に導入された認識配列を含むＰＣＲ産物に対して行われる。
【００６２】
ゲノム遺伝子座の増幅
本明細書で使用される用語「ゲノム遺伝子座」または「遺伝子座」は、互換的であり、染色体上の特定の位置にあるＤＮＡ配列を指す。特定の位置は、分子の位置、つまり、染色体上の開始および終末の塩基対の数によって同定され得る。特定のゲノム位置にあるＤＮＡ配列のバリアントは、対立遺伝子と呼ばれる。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体の同一部位に位置する。遺伝子座には、遺伝子配列ならびに他の遺伝要素（例えば、遺伝子間配列）が含まれる。
【００６３】
「制限遺伝子座」は、本明細書では、本方法で使用される制限酵素の認識配列を含む遺伝子座を説明するために使用される。
【００６４】
「癌変異部位を含む制限遺伝子座」は、特定のタイプの癌において変異しやすいことが知られている位置を含む制限遺伝子座を示す。癌変異部位は、本方法で使用される制限酵素の認識配列内に位置する。ＤＮＡ変異の結果として、特定のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたタンパク質、あるいは１つ以上のアミノ酸が欠失したタンパク質などの変異タンパク質が生成される。
【００６５】
用語「癌関連変異」は、１つ以上のタイプの癌に関連する変異タンパク質をもたらすＤＮＡ変異を示す。変異は、典型的に、タンパク質の名前、変化したアミノ酸、およびタンパク質鎖内でのその位置（アミノ酸番号）で示される。置換についても、また、置換されたアミノ酸が典型的に示される。癌関連変異の例としては、次のものが挙げられる。
−ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換：例えば、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２ＳおよびＧ１２Ｖは、肺癌、膵癌、膀胱癌、結腸直腸癌などの癌に関連する（例えば、Ｐｒｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７２（１０）：２４５７−２４６７で概説）。
−ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｅ７４７〜Ａ７５０欠失）：肺癌、主に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの癌に関連する（例えば、Ｌｏｖｌｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，ＥＧＦＲ  Ｅｘｏｎ  １９  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｍｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ（Ｕｐｄａｔｅｄ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，２０１５で概説）。
−ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換：例えば、Ｌ８５８Ｒは、肺癌、主に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの癌に関連する（例えば、Ｌｏｖｌｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，ＥＧＦＲ  ｃ．２５７３Ｔ＞Ｇ（Ｌ８５８Ｒ）  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｍｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ（Ｕｐｄａｔｅｄ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，２０１５で概説）。
−Ｐ５３  Ｈ１７９置換：例えば、Ｈ１７９Ｒ、Ｈ１７９ＬおよびＨ１７９Ｙは、乳癌、卵巣癌、肺癌などの癌に関連する（例えば、ＣＯＳＭＩＣ−ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）（Ｆｏｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（Ｄ１）：Ｄ７７７−Ｄ７８３で概説）。
−Ｐ５３  Ｇ１５４置換：例えば、Ｇ１５４ＶおよびＧ１５４Ｓは、肺癌、食道癌、肝臓癌などの癌に関連する（ＣＯＳＭＩＣ同文献を参照）。
−Ｐ５３  Ｒ２８２置換：例えば、Ｒ２８２ＷおよびＲ２８２Ｇは、腸癌、食道癌、乳癌などの癌に関連する（ＣＯＳＭＩＣ同文献を参照）。
−Ｐ５３  Ｒ２４８置換：例えば、Ｒ２４８Ｑは、結腸直腸癌、乳癌、食道癌、ＣＮＳ癌などの癌、およびリンパ腫に関連する（ＣＯＳＭＩＣ同文献を参照）。
−Ｐ５３  Ｒ２４９置換：例えば、Ｒ２４９Ｓは、肝癌、肺癌、乳癌などの癌に関連する（ＣＯＳＭＩＣ同文献を参照）。
−ＢＲＡＦ  Ｖ６００置換：例えば、Ｖ６００Ｅは、甲状腺癌や皮膚癌などの癌に関連する（ＣＯＳＭＩＣ同文献を参照）。
【００６６】
本明細書で使用される「非変異ＤＮＡ」および「野生型ＤＮＡ」という用語は、癌変異部位でのヌクレオチドの同一性を指し、「非変異」および「野生型」は、インビボで適切な野生型タンパク質の翻訳をもたらすヌクレオチドの存在を示す。
【００６７】
用語「変異ＤＮＡ」は、癌変異部位でのヌクレオチドの同一性を指し、それが癌に関連する非野生型ヌクレオチドを含むことを示す。
【００６８】
「対照遺伝子座」および「内部参照遺伝子座」は、互換的であり、遺伝子座を説明するために本明細書で使用され、消化ステップで適用される制限酵素によるその消化は、変異の存在または不在に依存しない。典型的には、対照遺伝子座は、消化ステップで適用される制限酵素の認識配列を欠く遺伝子座である。有利には、対照遺伝子座は、内部遺伝子座、すなわち、分析されたＤＮＡサンプル内の遺伝子座であり、したがって、外部／追加の対照サンプルの必要性を排除する。
【００６９】
変異について陽性の組織では、変異について陰性の組織と比較して、より多くの細胞がこの位置に変異を含む。制限酵素は、その認識配列に変異部位が含まれると、非変異ＤＮＡにおいてのみ、その認識配列を切断する。したがって、変異を含むＤＮＡ分子の割合がより高いＤＮＡサンプルでは、非変異ＤＮＡの割合がより高いＤＮＡサンプルと比較して、消化される程度がより低くなる。消化効率の違いにより、その後の増幅および定量化ステップにおいて、異なる増幅パターンが確立され、変異について陽性のＤＮＡと、変異について陰性のＤＮＡを、識別可能にする。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「増幅」とは、目的とする１つ以上の特定の核酸標的のコピー数の増加を指す。増幅は、典型的に、当該技術分野で既知の、ＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ（通常、Ｔａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、プライマーおよびプローブ（必要に応じて）を補充した好適なバッファーを含み得るＰＣＲ反応混合物の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。
【００７１】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、あるいはそれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。また、「オリゴヌクレオチド」という用語が本明細書で使用され、典型的には、１００塩基までの長さの、ヌクレオチドのポリマー形態を含む。
【００７２】
「増幅産物」は、増幅反応において生成および蓄積される特定の標的配列の核酸分子を集合的に指す。この用語は、一般に、所定の増幅プライマーのセットを使用して、ＰＣＲによって生成された核酸分子を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「プライマー」は、標的配列にアニーリング（ハイブリダイズ）することができ、それによって好適な条件下でＤＮＡ合成の開始点として役立ち得る二本鎖領域を生成するオリゴヌクレオチドを定義する。用語「プライマー対」は、本明細書では、いくつかのタイプの増幅プロセスの１つ、好ましくはＰＣＲによって、選択された核酸配列を増幅する際に一緒に使用されるように選択されるオリゴヌクレオチドの対を指す。当該技術分野で一般に既知であるように、プライマーは、選択された条件下で相補的配列に結合するように設計することができる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「ミスマッチプライマー」は、その対応する標的ポリヌクレオチドに部分的にハイブリダイズするプライマーを定義する。ミスマッチプライマーは、相補的部分と非相補的部分を含む。ミスマッチプライマーの非相補的部分は、その３’末端に位置し、標的ポリヌクレオチドに存在する目的のヌクレオチドとハイブリダイズすることができず、典型的には、１ヌクレオチド長である。典型的には、ミスマッチプライマーの相補的部分は、標的ポリヌクレオチドに完全に相補的である。相補的部分は、任意の適切な長さであり得る。一部の実施形態では、相補的部分は、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０を超えるヌクレオチド長である。
【００７５】
プライマーは、特定のアッセイ形式および特定の必要性に応じて、任意の好適な長さであり得る。一部の実施形態では、プライマーは、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド長を含み得る。プライマーは、選択された核酸増幅システムに特に好適なように適合させることができる。当該技術分野で一般に既知であるように、オリゴヌクレオチドプライマーは、それらの標的配列とのそのハイブリダイゼーションの融点を考慮することによって設計することができる。
【００７６】
一部の実施形態では、制限および対照遺伝子座は、各遺伝子座を特異的に増幅するために、当該技術分野で既知のように設計されたリバースおよびフォワードプライマーのペアを使用して、同じＤＮＡサンプル（消化サンプル）から増幅され得る。
【００７７】
一部の実施形態では、プライマーは、７５〜２２５塩基長の増幅産物を生成するように設計され得る。
【００７８】
本明細書に開示する方法は、同じ反応混合物中の複数の標的配列（制限遺伝子座および対照遺伝子座）の同時的な増幅（多重増幅または同時増幅として知られているプロセス）を含む。このプロセスでは、２つのプライマー対を同時に使用する必要がある。当該技術分野で既知であるように、プライマーは、増幅中に同じアニーリング温度で機能することができるように設計することができる。一部の実施形態では、類似の融解温度（Ｔｍ）を有するプライマーが、本明細書に開示する方法で使用される。プールで使用されるプライマーについて、約３〜５℃のＴｍ変動は許容可能と見なされる。
【００７９】
一部の実施形態では、ゲノム遺伝子座の増幅は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）としても知られるリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して実施されてもよく、増幅産物の増幅および検出が同時に行われる。
【００８０】
一部の実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅産物の検出は、ポリヌクレオチドプローブ、典型的には、蛍光標識されたポリヌクレオチドプローブ、を使用して達成され得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドプローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」は、互換的であり、目的の遺伝子座の核酸配列内の、例えば、制限遺伝子座または対照遺伝子座の配列内の、特定のサブ配列に相補的である標識されたポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、検出は、レポーター分子とクエンチャー分子の組み合わせに基づくＴａｑＭａｎアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用することによって達成される。そのようなアッセイでは、ポリヌクレオチドプローブは、それらの５’末端に結合された蛍光部分（フルオロフォア）および３’末端に結合されたクエンチャーを有する。ＰＣＲ増幅中、ポリヌクレオチドプローブは、テンプレート上のそれらの標的シーケンスに選択的にハイブリダイズし、ポリメラーゼがテンプレートを複製するときに、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性によりポリヌクレオチドプローブも切断する。ポリヌクレオチドプローブが無傷の場合、クエンチャーと蛍光部分が非常に近接しているため、通常、バックグラウンドの蛍光レベルが低くなる。ポリヌクレオチドプローブが切断されると、クエンチャーは、蛍光部分から分離され、蛍光強度が増加する。蛍光シグナルは、増幅産物の量と相関し、すなわち、シグナルは、増幅産物が蓄積するにつれて増加する。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「選択的にハイブリダイズする」（ならびに「選択的ハイブリダイゼーション」、「特異的にハイブリダイズする」、および「特異的ハイブリダイゼーション」）は、ストリンジェントな条件下で、核酸分子（プライマーまたはプローブなど）が、特定の相補的ヌクレオチド配列に優先的に結合、二重化、またはハイブリダイズすることを指す。用語「ストリンジェントな条件」は、核酸分子がその標的配列に優先的にハイブリダイズし、他の非標的配列により低い程度でハイブリダイズするかまたは全くハイブリダイズしない、条件を指す。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、核酸ハイブリダイゼーションの文脈において、配列依存的であり、当該技術分野で既知であるように、異なる条件下で異なる。
【００８３】
ポリヌクレオチドプローブは、長さが異なっていてもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、１５〜３０塩基を含み得る。追加の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、２５〜３０塩基を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、２０〜３０塩基、例えば、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基を含み得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８４】
ポリヌクレオチドプローブは、テンプレートのいずれかの鎖に結合するように設計され得る。追加の考慮事項としては、ポリヌクレオチドプローブのＴｍが挙げられ、プライマーのものと適合性であることが好ましい。プライマーおよびプローブを設計するために、コンピュータソフトウェアを使用してもよい。
【００８５】
上述の通り、本明細書に開示する方法は、同じ反応混合物中の複数の標的配列の同時増幅を含む。並行して増幅される複数の標的配列を識別するために、異なる蛍光色で標識されたポリヌクレオチドプローブを使用してもよい。
【００８６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、当該技術分野で既知であるように、フルオロフォア／クエンチャー対を形成し、例としては、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ−ＢＨＱ１、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ−ＢＨＱ１、ＡＴＴＯ５５０−ＢＨＱ２およびＲＯＸ−ＢＨＱ２が挙げられる。
【００８７】
一部の実施形態では、色素の組み合わせは、選択するＲＴ−ＰＣＲサーモサイクラーに適合し得る。
【００８８】
一部の実施形態では、蛍光は各ＰＣＲサイクルの間でモニターされてもよく、サイクル数の関数として、プローブからの蛍光シグナルの変化を示す増幅プロットを提供する。
【００８９】
ＲＴ−ＰＣＲの文脈では、次の用語が使用される。
「定量化サイクル（ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ）」（「Ｃｑ」）は、蛍光が、ソフトウェアによって自動的に、またはユーザーによって手動で設定された閾値を超えて増加するサイクル数を指す。一部の実施形態では、閾値は、すべての遺伝子座について一定であってもよく、増幅および検出を行う前に、事前に設定されてもよい。他の実施形態では、閾値は、増幅サイクル中にこの遺伝子座について検出された最大蛍光レベルに基づいて、実行後、各遺伝子座について別々に定義されてもよい。
【００９０】
「閾値」とは、Ｃｑ決定用に使用される蛍光の値を指す。一部の実施形態では、閾値は、ベースライン蛍光を超える値および／またはバックグラウンドノイズを超える値であり得、増幅プロットの対数増幅期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）内であり得る。
【００９１】
「ベースライン」とは、蛍光の変化がほとんどない、または全くないＰＣＲの初期サイクルを指す。
【００９２】
コンピュータソフトウェアを使用して、増幅プロットを分析し、ベースライン、閾値、Ｃｑを決定することができる。
【００９３】
制限酵素による消化後、ＤＮＡ分子が消化から保護されるため、癌の変異部位が変異している遺伝子座が高効率で増幅される。検出可能な増幅産物は、比較的小さい（低い）増幅サイクル数で示されるため、結果として、Ｃｑ値が比較的低くなる。逆に、癌変異部位が変異していない遺伝子座は、消化ステップ中により大幅に切断され、したがって、増幅および定量化ステップで、より高いＣｑ値が得られる（つまり、比較的多く増幅サイクル後に検出可能になる増幅産物を示す）。
【００９４】
代替の実施形態では、増幅産物の増幅および検出は、蛍光標識されたプライマーを使用する従来のＰＣＲ、その後の増幅産物のキャピラリー電気泳動、によって行うことができる。一部の実施形態では、増幅後、増幅産物は、キャピラリー電気泳動によって分離され、蛍光シグナルが定量化される。一部の実施形態では、サイズ（ｂｐ）または注入からの時間の関数として蛍光シグナルの変化をプロットする電気泳動図を生成することができ、電気泳動図の各ピークは単一の遺伝子座の増幅産物に対応する。ピークの高さ（例えば、「相対蛍光単位」、ｒＦＵを使用して与えられる）は、増幅された遺伝子座からのシグナルの強度を表す場合がある。コンピュータソフトウェアを使用して、ピークを検出し、増幅産物がキャピラリー電気泳動装置で実行された遺伝子座のセットの蛍光強度（ピーク高）を計算し、続いてシグナル強度間の比を計算することができる。
【００９５】
癌変異部位が変異している制限酵素で消化されたＤＮＡサンプルは、電気泳動図で比較的強いシグナル（より高いピーク）を生成する。逆に、癌変異部位が変異していない遺伝子座では、電気泳動図で比較的弱いシグナル（より低いピーク）が生成される。
【００９６】
一部の実施形態では、プライマーの蛍光標識は、フルオレセイン、ＦＡＭ、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＶＩＣおよびＲＯＸのうちのいずれか１つを含む。
【００９７】
シグナル比
本明細書で使用される「比」または「シグナル比」という用語は、単一のＤＮＡサンプル中の（同じ反応混合物中の）一対のゲノム遺伝子座の同時増幅、特に、制限遺伝子座および対照遺伝子座の同時増幅、から得られるシグナルの強度間の比を指す。
【００９８】
本明細書で使用される「シグナル強度」という用語は、遺伝子座の無傷なコピーの初期量に対応する遺伝子座特異的増幅産物の量を反映する尺度を指す。ただし、シグナル強度は、増幅産物／無傷な遺伝子座の実際の量を示さない場合があり、増幅産物／無傷な遺伝子座の絶対量の計算を全く含まない場合がある。したがって、増幅産物のシグナルの比を計算する場合、実際のＤＮＡ濃度自体を計算する必要がないため、標準曲線や参照ＤＮＡを必要としない。
【００９９】
いくつかの例示的な実施形態では、増幅産物の増幅および検出は、ＲＴ−ＰＣＲによって行われ、特定の遺伝子座のシグナル強度が、この遺伝子座について計算されたＣｑによって表される。この場合のシグナル比は、次の計算で表される：２（対照遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）。
【０１００】
一部の実施形態では、増幅がないか、または増幅が非常に少ない場合、Ｃｑは「無限大」と決定される。一部の実施形態では、そのような場合、式の数値（対照遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）は、（−１４）に設定され、シグナル比は、１：１６３８４に設定される。追加の実施形態では、そのような場合、シグナル比は、１：１６０００に設定される。
【０１０１】
追加の例示的な実施形態では、増幅産物の検出は、キャピラリー電気泳動によって行われ、特定の遺伝子座のシグナル強度が、その対応するピークの相対蛍光単位（ｒｆｕ）の数である。シグナル比は、制限遺伝子座のピークの高さを、対照遺伝子座のピークの高さで割ることによって計算される。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＤＮＡサンプル中の制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比を計算することは、（ｉ）制限遺伝子座の増幅産物のシグナル強度を決定すること、（ｉｉ）対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度を決定すること、および（ｉｉｉ）２つのシグナル強度間の比を計算すること、を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＤＮＡサンプル中の制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比を計算することは、各遺伝子座のＣｑを決定して、対照遺伝子座のＣｑと制限遺伝子座のＣｑとの差を計算することを含む。一部の実施形態では、計算は、以下の式を適用することをさらに含む：２＾（対照遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）。
【０１０４】
一部の実施形態では、増幅産物のシグナル強度間の比を計算するために、コンピュータソフトウェアを使用することができる。
【０１０５】
変異状態の決定
本明細書に開示される方法は、その変異状態、すなわち、特定の癌関連変異について陽性であるか陰性であるかを決定するために、所与のＤＮＡサンプルについて計算されたシグナル比を評価することに基づく。
【０１０６】
一部の実施形態では、試験されたサンプルで計算された比は、参照比と比較される。一部の実施形態では、計算された比は、閾値比と比較される。一部の実施形態では、計算されたシグナル比は、計算されたシグナル比が予め定義された閾値比を上回るかまたは下回る場合、ＤＮＡが変異について陽性であることを示す。
【０１０７】
「閾値比」または「カットオフ比」は、変異陰性サンプルの集団を、変異陽性サンプルの集団から区別するシグナル比を指す。
【０１０８】
一部の実施形態では、閾値を下回るより低い比は、非変異サンプル、例えば、正常な個体のサンプル（健康、すなわち、癌に罹患していない）からのものであり、一方、閾値を上回るより高い比は、変異サンプル、例えば、変異について陽性である癌患者からのものである。
【０１０９】
一部の実施形態では、閾値比を決定することは、他の方法によって決定されるように、変異陽性または変異陰性のいずれかの既知の変異状態を有する対象（または生体サンプル）の大集団における特定の対の制限および対照遺伝子座の間のシグナル比を測定することを含む。この大きなサンプルセットでシグナル比を分析した後、閾値が設定され、偽陽性のケースを最小限に抑え、所望のレベルの特異性を得る。好ましくは、閾値は、９５％を超える特異性が得られるように設定される。
【０１１０】
上述の通り、シグナル比は、例えば、キャピラリー電気泳動後にピークを測定すること、またはＲＴ−ＰＣＲ後にＣｑを計算することを含む、様々な方法によって決定されることができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、本発明の方法は、閾値比を提供することを含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、閾値は、統計的に有意な値である。多くの場合、統計的有意性は、２つ以上の集団を比較して、信頼区間（ＣＩ）および／またはｐ値を決めることによって決定される。一部の実施形態では、統計的に有意な値は、約９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％の信頼区間（ＣＩ）を指し、一方、好ましいｐ値は、約０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１未満、または０．０００１未満である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、閾値のｐ値は、最大で０．０５である。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、測定可能な値を指す場合、指定された値から＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％、さらにより好ましくは＋／−１％、さらにより好ましくは＋／−０．１％の変動を包含する。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書に開示する方法の感度は、少なくとも約７５％であり得る。一部の実施形態では、本方法の感度は、少なくとも約８０％であり得る。一部の実施形態では、本方法の感度は、少なくとも約８５％であり得る。一部の実施形態では、本方法の感度は、少なくとも約９０％であり得る。
【０１１５】
一部の実施形態では、本明細書で使用される診断アッセイの「感度」は、検査で陽性の変異サンプルの割合（「真の陽性」の割合）を指す。したがって、アッセイによって検出されなかった変異個体は、「偽陰性」である。変異しておらず、アッセイで検査陰性のサンプルは、「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１から偽陽性率を差し引いたものであり、「偽陽性」率は、突然変異がない検査で陽性のものの割合として定義される。特定の診断方法では、状態の確定診断が提供されない場合があるものの、その方法が診断に役立つ肯定的な指標を提供するのであれば、それで十分である。
【０１１６】
一部の実施形態では、本明細書に開示する方法の特異性は、少なくとも約６５％であり得る。一部の実施形態では、本方法の特異性は、少なくとも約７０％であり得る。一部の実施形態では、本方法の特異性は、少なくとも約７５％であり得る。一部の実施形態では、本方法の特異性は、少なくとも約８０％であり得る。
【０１１７】
キットとシステム
一部の実施形態では、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのキットが提供される。一部の実施形態では、ＤＮＡサンプル中の癌関連突然変異を検出するためのシステムが提供される。
【０１１８】
一部の実施形態では、キットおよびシステムは、本発明の方法によれば、癌関連変異を検出するためのものである。
【０１１９】
一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡサンプルを消化するための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ、および制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、癌変異部位を含む少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対を含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、キットはさらに、増幅後の制限遺伝子座および対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令する、コンピュータソフトウェアを記憶するコンピュータ可読媒体を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、システムは、ＤＮＡサンプルを消化するための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、癌変異部位を含む少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、増幅後の制限遺伝子座および対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようコンピュータプロセッサに命令するコンピュータ可読媒体に記憶されたコンピュータソフトウェアと、を含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、本発明によるコンピュータソフトウェアは、それらの同時増幅後の、各制限遺伝子座および各対照遺伝子座のシグナル強度を決定するステップ、各制限遺伝子座とそれに対応する対照遺伝子座のシグナル強度間の比を計算するステップ、計算された比を予め定義された閾値比と比較するステップ、およびその比較に基づいて、ＤＮＡサンプルが癌関連変異について陽性であるかどうかを出力するステップ、を実行するようにコンピュータプロセッサに命令する。一部の実施形態では、キットまたはシステムは、単一の癌関連変異の存在を検出するための、制限および対照遺伝子座の単一の対の増幅のためのプライマーを含む。他の実施形態では、キットまたはシステムは、複数の癌関連変異の存在を検出するための、複数の制限遺伝子座および対応する対照遺伝子座を増幅するためのプライマーを含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、コンピュータソフトウェアは、リアルタイムＰＣＲの実行の入力パラメータまたは生データとして受け取る。一部の実施形態では、コンピュータソフトウェアは、リアルタイムＰＣＲの実行を分析して、シグナル強度およびシグナル比を決定するようにコンピュータプロセッサに命令する。
【０１２４】
コンピュータソフトウェアは、非一時的コンピュータ可読媒体に記憶されたプロセッサ実行可能命令を含む。コンピュータソフトウェアはまた、記憶されたデータを含み得る。コンピュータ可読媒体は、コンパクトディスク（ＣＤ）、磁気記憶装置、光学記憶装置、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、または任意の他の有形媒体などの有形コンピュータ可読媒体である。
【０１２５】
一部の実施形態では、キットは、制限酵素、制限遺伝子座および対照遺伝子座を増幅するためのプライマーの対、制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物を検出する手段、癌関連変異の決定を行うための取扱説明書、を含む。一部の実施形態では、取扱説明書は、電子取扱説明書であってもよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、取扱説明書は、閾値シグナル比を提供してもよく、それを上回ると、サンプルが変異陽性であると決定される。他の実施形態では、取扱説明書は、閾値シグナル比を提供することができ、それを下回ると、サンプルが変異陽性であると決定される。
【０１２７】
一部の実施形態では、取扱説明書は、上に記載の方法ステップを実行するための指示を含み得る。
【０１２８】
一部の実施形態では、取扱説明書は、シグナル比と変異状態との間の相関を指導する指示を含み得る。
【０１２９】
一部の実施形態では、取扱説明書は、シグナル比を計算するための指示を提供することができる。
【０１３０】
一部の実施形態では、キットは、メチル化非感受性エンドヌクレアーゼを含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、キットは、コンピュータソフトウェアをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、コンピュータソフトウェアは、シグナル強度およびシグナル比のうちの少なくとも１つを計算するコンピュータソフトウェアであり得る。
【０１３２】
一部の実施形態では、キットは、制限遺伝子座および対照遺伝子座に相補的な蛍光ポリヌクレオチドプローブを含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の制限遺伝子座および対照遺伝子座に相補的なプライマー対、および制限遺伝子座および対照遺伝子座内の部分配列に相補的な蛍光ポリヌクレオチドプローブを含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、キットは、人工的な制限遺伝子座をＤＮＡサンプルに導入するためのミスマッチプライマーを含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つのヌクレオチドプライマー対で満たされた１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、本発明のキットに含まれる各ヌクレオチドプライマー対は、制限遺伝子座または対照遺伝子座内の部分配列に相補的なプライマーを含んでもよく、当該各ヌクレオチドプライマー対は、制限または対照遺伝子座を含むゲノムの断片を選択的に増幅するように設計される。
【０１３６】
一部の実施形態では、キットは、上に記載の遺伝子座の組み合わせを選択的に増幅するためのプライマー対を含み得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、キットは、キット中のプライマーを使用して増幅された遺伝子座の増幅産物を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み得る。各オリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子座内の部分配列に相補的であり得、それにハイブリダイズすることが可能であり得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光標識され得る。
【０１３８】
一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡ消化、遺伝子座増幅、およびＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチド混合物などの増幅産物の検出に必要な少なくとも１つの追加の成分をさらに含み得る。
【０１３９】
一部の実施形態では、キットは、消化および増幅のための好適な反応バッファー、ならびに変異検出を行うための書面のプロトコールをさらに含み得る。書面のプロトコールは、ＤＮＡ消化パラメータ、ＰＣＲサイクリングパラメータ、シグナル比分析、およびシグナル比閾値を含むが、これらに限定されず、本明細書に開示されたステップのいずれかを実行するための指示を含んでもよい。
【０１４０】
一部の実施形態では、キットは、組織または血漿からのＤＮＡ抽出のための材料をさらに含む。
【０１４１】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより十分に示すために提示される。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。
【実施例】
【０１４２】
実施例１−固形組織由来のＤＮＡにおける変異検出
肺癌腫瘍組織サンプル（ｎ＝７２、腺癌、扁平上皮癌および小細胞癌を含む）および正常な肺組織サンプル（ｎ＝２５）は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異について、サンガーシーケンシングによって、および本発明によるリアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲと組み合わせた酵素的制限によって試験された。
【０１４３】
ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットを使用して、ＤＮＡを組織サンプルから抽出した。Ｇ１２コドン周辺のＫＲＡＳの天然ＤＮＡ配列には、制限部位が含まれないため、ＢｓｔＮＩ制限部位を導入する１０サイクルの分析前ＰＣＲを実行し、次のプライマーを使用して、配列を修飾した。
フォワード  ５’−ＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧ（配列番号１）
リバース  ５’−ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴ（配列番号２）
分析前ＰＣＲのＤＮＡ量は４ｎｇであった。
【０１４４】
ＢｓｔＮＩ制限部位の導入の前と後のＧ１２コドン周辺の配列は、次の通りである（制限部位を導入するように変更されたヌクレオチドは太字で示し、導入された制限部位は下線を引く）。
2021510294.tif 000002
2021510294.tif 000003
【０１４５】
改変された配列はＢｓｔＮＩによって認識され、酵素との接触により大幅に切断されると予想される。斜体でマークされた１つ以上のヌクレオチドＧを変化する変異が存在する場合、その遺伝子座は、もはやＢｓｔＮＩによって認識されなくなり、切断されない。
【０１４６】
ＢｓｔＮＩ部位の導入後、各ＤＮＡサンプルを、ＢｓｔＮＩによる消化に供した。消化反応（総容積５０マイクロリットル）には、消化バッファーで希釈した（１：１００）ＰＣＲ産物とＢｓｔＮＩが４０マイクロリットル含まれた。６０℃で２時間、消化を行った。
【０１４７】
消化されたＤＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｇ１２コドンを含む制限遺伝子座、およびＢｓｔＮＩの認識配列を含まず、この酵素でＤＮＡサンプルを消化したときに無傷のまま残る対照遺伝子座を増幅した。
【０１４８】
制限遺伝子座の配列（Ｇ１２コドンを太字で示す）：
2021510294.tif 000004
【０１４９】
制限遺伝子座は、第１２染色体の位置２５２８９４８５〜２５２８９５７７に対応する。
【０１５０】
対照遺伝子座の配列：
ＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＴＡＡＡＴ  ＴＴＴＴＧＧＣＡＴＴ  ＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣ  ＴＴＧＧＡＧＡＣ（配列番号４）。
【０１５１】
対照遺伝子座は、第７染色体の位置１２１３８０８４４〜１２１３８０９２１に対応する。
【０１５２】
増幅反応（総容積２５マイクロリットル）には、１０マイクロリットルの消化ＤＮＡ、０．２μＭのプライマー、ｄＮＴＰ、および反応バッファーが含まれた。増幅中の増幅産物の検出を可能にするため、各遺伝子座に対して、蛍光標識ポリヌクレオチドプローブを反応に添加した（ＦＡＭおよびＪＯＥ標識、それぞれ制限および対照遺伝子座に対して）。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ  ７５００  ＦａｓｔＤｘ装置で、次のＰＣＲプログラムを使用して実行した：９５℃、１０分−＞４５Ｘ（９５℃、１５秒−＞６０℃、１分）。
【０１５３】
図１Ａ〜１Ｄは、例示的な定量的ＰＣＲプロットを示し、サイクル数の関数としてのプローブからの蛍光シグナルの変化を示す。これらの図は、Ｇ１２Ｖ変異（図１Ａ）、Ｇ１２Ａ変異（図１Ｂ）またはＧ１２変異なし（図１Ｃ）を有する癌性肺組織由来のＤＮＡサンプル、および正常な肺組織由来のＤＮＡサンプル（Ｇ１２変異なし）（図１Ｄ）での制限および対照遺伝子座のＰＣＲプロットを示す。
【０１５４】
変異が存在するサンプルでは、制限遺伝子座がもはやＢｓｔＩＮによって認識されなくなったため、酵素で消化したときにほとんど無傷のまま残り、制限遺伝子座が高効率で増幅された。それは、対照遺伝子座（全く切断されなかった）とほぼ同じサイクルで、またはそれより１〜３サイクル遅れて上昇した。
【０１５５】
Ｇ１２（癌性または正常）に変異がないサンプルでは、制限遺伝子座がＢｓｔＮＩによって大幅に切断され、増幅がほとんど見られなかった（図１Ｃおよび図１Ｄ）。
【０１５６】
各サンプルについて、制限遺伝子座のシグナル強度と対照遺伝子座のシグナル強度との間の比を以下のように計算した：制限遺伝子座および対照遺伝子座について定量化サイクル（Ｃｑ）を決定した。Ｃｑ値を、次の式に用いた。
２（対照遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）
【０１５７】
この計算から得られた数値は、制限遺伝子座および対照遺伝子座の間のシグナル比を表す。
【０１５８】
図１Ａでは、対照遺伝子座のＣｑは２８．３であり、制限遺伝子座のＣｑは２７．８であり、したがってシグナル比は１：０．７である。このシグナル比は、設定された閾値（１：５００、以下でさらに詳しく説明する）よりも有意に高く、サンプル中にＫＲＡＳ  Ｇ１２変異が存在することを示す。
【０１５９】
図１Ｂでは、対照遺伝子座のＣｑは２８．５であり、制限遺伝子座のＣｑは３１．３であり、したがってシグナル比は１：６．９である。このシグナル比も、閾値よりも有意に高く、サンプル中にＫＲＡＳ  Ｇ１２変異が存在することを示す。
【０１６０】
図１Ｃ−対照遺伝子座のＣｑは２７．７である。制限遺伝子座は、最小蛍光閾値を超えないため、Ｃｑは計算することができず、「無限大」として決定される。このような場合、シグナル比の数値は１：１６０００に設定され、閾値（１：５００）より有意に低い。図１Ｄは、同様のケースを表し、対照遺伝子座のＣｑが２８であり、制限遺伝子座のＣｑが「無限大」である。したがって、シグナル比が１：１６０００である。どちらのサンプルも、ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異について陰性であると判定される。
【０１６１】
結果：
サンガーシーケンシング：正常な肺組織サンプルにおいて、ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異は同定されなかった。肺癌腫瘍組織サンプルの１９％に、ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異があることがわかった。
【０１６２】
酵素的制限およびＲＴ−ＰＣＲアッセイ：制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル比が１：５００よりも高い（例えば１：２００）ことで、Ｇ１２変異の存在が示されるように、１：５００のシグナル比の閾値を設定した。９５％を上回る特異性を得るために、正常な肺および肺腫瘍組織の主要セットの分析後、シグナル比の閾値を１：５００に設定した。各サンプルについて計算されたシグナル比データに基づいて、シーケンシングによってＫＲＡＳ  Ｇ１２変異を有することが判明したすべての肺癌腫瘍組織サンプルも、Ｇ１２変異を伴っていると同定された。正常な肺組織では、ＫＲＡＳ  Ｇ１２変異は同定されなかった。
【０１６３】
実施例２−血漿由来のＤＮＡにおける変異検出
対照患者（肺癌を含まない）からの１０５の血漿サンプルおよび肺癌患者からの９９の血漿サンプルを、上記の実施例１に記載のようにＫＲＡＳ  Ｇ１２変異について試験した。
【０１６４】
血漿由来ＤＮＡのシグナル比の閾値を１：１０００に設定し、制限遺伝子座および対照遺伝子座の間のシグナル比が１：１０００（例えば、１：２００）を超えると、Ｇ１２変異の存在が示されようにした。
【０１６５】
健常者の血漿サンプルからのＤＮＡがＫＲＡＳ  Ｇ１２突然変異を含まないと仮定して、健康な（肺癌を有さない）および肺癌の患者から血漿サンプルの一次セットを試験した後、偽陽性のケースを最小化するために（９５％を超える特異性を得るため）、シグナル比の閾値を１：１０００とした。
【０１６６】
肺癌血漿の６％が、Ｇ１２変異陽性として同定された。
【０１６７】
対照血漿の１％は、Ｇ１２変異陽性として同定され、ケースの１％が偽陽性であることを示す。
【０１６８】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することによって、過度の実験なしに、および一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な用途に容易に修正および／または適合することができ、したがって、そのような適合および修正は、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内で理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではないことを理解されたい。開示された様々な化学構造および機能を実行するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく、多様な代替形態をとることができる。
【図１Ａ】
2021510294.tif 000005
【図１Ｂ】
2021510294.tif 000006
【図１Ｃ】
2021510294.tif 000007
【図１Ｄ】
2021510294.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月20日(2019.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡサンプルをメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、癌変異部位を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物のシグナル強度間の比を計算するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で計算された前記比を予め定義された閾値比と比較することによって、前記ＤＮＡサンプル中の前記癌関連変異を検出するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが腫瘍組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡが血漿に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対照遺伝子座が、前記メチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠く遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡが天然ＤＮＡであり、前記制限遺伝子座が天然の制限遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌関連変異が、ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｅ７４７〜Ａ７５０）、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換、Ｐ５３  Ｈ１７９置換、Ｐ５３  Ｇ１５４置換、Ｐ５３  Ｒ２８２置換、Ｐ５３  Ｒ２４８置換、Ｐ５３  Ｒ２４９置換およびＢＲＡＦ  Ｖ６００置換、からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記メチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼが、ＭｓｅＩ（ＥＧＦＲエクソン１９欠失）、ＭｓｃＩ（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換）、ＦａｔＩ（Ｐ５３  Ｈ１７９置換）、ＭｓｐＩ（Ｐ５３  Ｇ１５４置換、Ｐ５３  Ｒ２８２置換、Ｐ５３  Ｒ２４８置換）、ＨａｅＩＩＩ（Ｐ５３  Ｒ２４９置換）およびＴｓｐＲＩ（ＢＲＡＦ  Ｖ６００置換）、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの人工的に導入された制限遺伝子座を含むＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡサンプルを、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ以外の制限エンドヌクレアーゼによる消化に供して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、癌変異部位を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物のシグナル強度間の比を計算するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で計算された前記比を予め定義された閾値比と比較することによって、前記ＤＮＡサンプル中の前記癌関連変異を検出するステップと、を含み、
前記癌変異部位が制限エンドヌクレアーゼの認識配列内に天然に見出されず、前記ＤＮＡがＰＣＲ産物であり、前記制限遺伝子座が前記ＰＣＲによって前記ＤＮＡに人工的に導入された制限遺伝子座である、方法。
【請求項９】
前記癌関連変異が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換およびＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＢｔｓＩＮ（ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換）およびＡｌｕＩ（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８置換）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌関連変異が、ＫＲＡＳ  Ｇ１２置換であり、前記制限エンドヌクレアーゼが、ＢｔｓＩＮである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前対照遺伝子座が、配列番号４に示される遺伝子座である、請求項１１に記載の方法：
ＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣ。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が、リアルタイムＰＣＲを使用して実行される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物の検出を補助するための蛍光プローブを添加することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物の前記シグナル強度間の比の前記計算は、各遺伝子座の定量化サイクル（Ｃｑ）を決定し、２（Ｃｑ対照遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）を計算することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのキットであって、
ＤＮＡサンプルを消化するための少なくとも１つのメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼと、
前記メチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、癌変異部位を含む少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、
増幅後の前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、前記ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令するコンピュータソフトウェアを記憶するコンピュータ可読媒体と、を含む、キット。
【請求項１７】
ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのキットであって、
前記癌変異部位を含む人工的に導入された制限遺伝子座を含むＰＣＲ産物を生成するための、癌変異部位を含む遺伝子座のＰＣＲ増幅のための少なくとも一対のミスマッチプライマーと、
前記人工的に導入された制限遺伝子座を含む前記ＰＣＲ産物を消化するための、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ以外の少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
前記制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、前記癌変異部位を含む前記制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、
増幅後の前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、前記ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令するコンピュータソフトウェアを記憶するコンピュータ可読媒体と、を含む、キット。
【請求項１８】
前記コンピュータソフトウェアが、前記コンピュータプロセッサに、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の増幅後にそれらのシグナル強度を決定するステップ、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記シグナル強度間の比を計算するステップ、前記計算された比を予め定義された閾値比と比較するステップ、および、前記比較に基づいて前記ＤＮＡサンプルが前記癌関連変異について陽性であるかどうかを出力するステップ、を実行するように命令する、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記少なくとも１つの対照遺伝子座の増幅産物を検出するための複数のポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項２０】
ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのシステムであって、
ＤＮＡサンプルを消化するための少なくとも１つのメチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼと、
前記メチル化非感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、癌変異部位を含む少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、
増幅後の前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、前記ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令するコンピュータ可読媒体に記憶されたコンピュータソフトウェアと、を含む、システム。
【請求項２１】
ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するためのシステムであって、
前記癌変異部位を含む人工的に導入された制限遺伝子座を含むＰＣＲ産物を生成するための、癌変異部位を含む遺伝子座のＰＣＲ増幅のための少なくとも一対のミスマッチプライマーと、
前記人工的に導入された制限遺伝子座を含む前記ＰＣＲ産物を消化するための、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ以外の少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと、
前記制限エンドヌクレアーゼによる消化後の、前記癌変異部位を含む前記制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、
増幅後の前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座のシグナル強度の比と予め定義された閾値比との比較に基づいて、前記ＤＮＡサンプル中の癌関連変異を検出するようにコンピュータプロセッサに命令するコンピュータ可読媒体に記憶されたコンピュータソフトウェアと、を含む、システム。
【請求項２２】
前記コンピュータソフトウェアが、前記コンピュータプロセッサに、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の増幅後にそれらのシグナル強度を決定するステップ、前記制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記シグナル強度間の比を計算するステップ、前記計算された比を予め定義された閾値比と比較するステップ、および、前記比較に基づいて前記ＤＮＡサンプルが前記癌関連変異について陽性であるかどうかを出力するステップ、を実行するように命令する、請求項２０および２１に記載のシステム。
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月7日(2020.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021510294000001.app
【国際調査報告】
2021510294.tif 000009
2021510294.tif 000010
2021510294.tif 000011
2021510294.tif 000012
2021510294.tif 000013