(57)【要約】【課題】マルチウェル電極基盤のバイオセンサーの提供。【解決手段】本発明は、マルチウェル電極基盤のバイオセンサーに関するもので、アンペロメトリー（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）法を用いて、インピーダンス測定方法を通じた従来のバイオセンサーに比べ小型化することができ、免疫測定方式を組み合わせることによって、ｆｇ／ｍｌ程度の感度を発揮して、血中の極めて微細な量で含まれている標的タンパク質を効果的に検出することができる。また、多数のウェルに異なるプローブを含むようにして、同時に様々な標的タンパク質を一度の過程を通じて検出することができる。【選択図】図１
2021518912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を収容するための１乃至複数個のウェルが形成されている電極と、
上記電極上に提供される第１プローブ及び上記第１プローブに特異的に結合するアダプタータンパク質と、
上記第１プローブに結合する標的物質に特異的に結合する第２プローブと、
上記第２プローブに特異的に結合する信号仲介分子
を含むことを特徴とする電気化学的バイオセンサー。
【請求項２】
上記電気化学的バイオセンサーは、アンペロメトリー（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）法により、試料内のターゲット物質の濃度を測定することを特徴とする請求項１に記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項３】
上記第１プローブは、ウェルの底部に露出された電極に固定されたアダプタータンパク質と特異的に結合することを特徴とする請求項１に記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項４】
上記電極は、自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；  ＳＡＭ）で表面が改質されたことを特徴とする請求項３に記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項５】
上記第２プローブは、タンパク質タグと結合され、
上記信号仲介分子は、上記タンパク質タグと特異的に結合するタンパク質と過酸化酵素が結合されることを特徴とする請求項１に記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項６】
上記タンパク質タグは、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、カルモジュリン（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、及びＳＢＰ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で構成された群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項５に記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項７】
上記標的物質は、タンパク質またはペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の電気化学的バイオセンサー。
【請求項８】
電気化学的バイオセンサーを利用して、試料内の標的物質を検出する方法として、
上記電気化学的バイオセンサーは、試料を収容するための１乃至複数個のナノウェルが形成されている電極、上記ナノウェルの底部に提供される第１プローブ、及び上記第１プローブに特異的に結合するアダプタータンパク質を含み、
上記の方法は、
ａ）上記電気化学的バイオセンサーに生物学的試料を入れて反応させる段階と、
ｂ）上記ナノウェルに標的物質をターゲットとする第２プローブを提供して反応させる段階と、
ｃ）上記ナノウェルに第２プローブに結合された標識物質をターゲットとする信号仲介分子を反応させる段階と、
ｄ）上記ｃ）段階での第２プローブと信号仲介分子との間の反応は、電解質が存在する状態で、酸化還元反応により発生する電流を測定する段階
を含む、電気化学的バイオセンサーを利用して、試料内の標的物質を検出する方法。
【請求項９】
上記電解質は、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）及びハイドロキノン（Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）のうち１種以上を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極微量の標的物質の検出において、感度が改善されたマルチウェル電極基盤のバイオセンサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、微細試料を利用した新薬開発のためのスクリーニングプロセス、病気の診断などの分野で、バイオセンサーが注目され、研究開発が活発に行われているのが実情である。特に、血液、尿、唾液などの試料溶液の中に存在する微細な量の標的物質の存在や濃度を、現場で迅速かつ正確に測定するための小型バイオセンサーの開発が多く行われており、生体特異的な結合、免疫センサーまたはＤＮＡセンサーなどがその例である。
【０００３】
タンパク質を測定するために、従来は、主にＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法を使用しており、これは抗体を支持体に固定化させて、上記抗体が固定化された表面に抗原タンパク質が混合されている試料溶液を一定時間反応させた後、上記の抗原タンパク質が結合された表面上に、抗原タンパク質と選択的に結合する感知用抗体を結合させた後、上記感知用抗体に酵素を結合させて、酵素が発色または蛍光特性を起こす反応物質を添加して、発色または蛍光反応が起きるようにすることにより、微量の抗原タンパク質を定量する方法である。ＥＬＩＳＡ法が現在まで、効果的に微量の抗原タンパク質を測定する方法として使用されているが、抗原タンパク質の分析範囲が少なく、一度に一つのタンパク質だけしか分析できないので、多量の試料（２００ｕｌ）を必要とし、ｐｇ／ｍｌレベルの濃度では、正確な測定が難しいという欠点が存在する。
【０００４】
そこで、最近ＥＬＩＳＡの原理を利用して、バイオセンサー及びバイオチップに適用する過程を通じて簡便に抗原の濃度を測定することができる方法等が開発されている。その例として、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス、電気化学センサーなどで測定する研究結果が存在する。このような方法は、試料内に存在する極微量の標的物質を簡便に検出することができるだけでなく、様々な種類の抗原を同時に検出できるという利点が存在する。しかし、上記の方法は、ＥＬＩＳＡ法に比べ感度が大幅に改善されていない結果となっており、極微量の標的物質を検出するために、感度が改善されたバイオセンサーの研究開発が必要な実情である。
【０００５】
併せて、有害物質吸入による肺損傷と、それから誘発される心血管の損傷を測定するためには、一般的にＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、ＩＦＮ−ｇａｍｍａなどのサイトカインを測定するものの、血液内で１０乃至４００ｐｇ／ｍｌの極めて低い濃度で存在し、センシングが難しいという問題があり、このような感度が改善されたバイオセンサーの研究開発が必要な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の一目的は、マルチウェルバイオセンサーを提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、上記バイオセンサーを利用して、試料内の標的物質を検出する方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、本発明に係る上記バイオセンサーの製造方法を提供することである。
【０００９】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に限定されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業界で通常の知識を有する者に明確に理解されるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
試料を収容するための１乃至複数個のウェル（ｎａｎｏｗｅｌｌ）が形成されている電極と、上記電極上に提供される第１プローブ及び上記第１プローブに特異的に結合するアダプタータンパク質と、上記第１プローブに結合する標的物質に特異的に結合する第２プローブと、上記第２プローブに特異的に結合する信号仲介分子を含むことを特徴とする電気化学的バイオセンサーを提供する。
【００１１】
また、本発明において、上記電気化学的バイオセンサーは、アンペロメトリー（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）法により、試料内のターゲット物質の濃度を測定するものであることができる。
【００１２】
また、本発明において、上記電極に結合されるアダプタータンパク質は、上記ウェル内に存在するように、電極に結合するものであることができる。
【００１３】
また、本発明において、上記第１プローブは、ウェルの底部に露出された電極に固定されたアダプタータンパク質と特異的に結合するものであることができる。
【００１４】
また、本発明において、上記電極は、自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；  ＳＡＭ）で改質されたものであることができる。
【００１５】
また、本発明において、上記第２プローブは、タンパク質タグと結合され、上記信号仲介分子は、過酸化酵素と結合されるものであることができる。
【００１６】
また、本発明において、上記信号仲介分子は、第２プローブのタンパク質タグと結合されるものであることができる。
【００１７】
また、本発明において、上記タンパク質タグは、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、カルモジュリン（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、及びＳＢＰ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で構成された群から選択される１種以上のものであることができる。
【００１８】
また、本発明において、上記標的物質は、タンパク質またはペプチドであることができる。
【００１９】
本発明の他の実施例は、電気化学的バイオセンサーを利用して、試料内の標的物質を検出する方法として、
上記電気化学的バイオセンサーは、試料を収容するための１乃至複数個のウェルが形成されている電極、上記ウェルの底部に提供される第１プローブ、及び上記第１プローブに特異的に結合するアダプタータンパク質を含み、
上記の方法は、
ａ）上記電気化学的バイオセンサーに個体から分離された生物学的試料を入れて反応させる段階と、
ｂ）上記ウェルに標的物質をターゲットとする第２プローブを提供して反応させる段階と、
ｃ）上記ウェルに第２プローブを標識する物質をターゲットとする信号仲介分子を反応させる段階と、
ｄ）上記ｃ）段階での第２プローブと信号仲介分子との間の反応は、電解質が存在する状態で、酸化還元反応により発生する電流を測定する段階を含む、電気化学的バイオセンサーを利用して、試料内の標的物質を検出する方法を提供する。
【００２０】
また、本発明において、上記ｄ）段階の電解質は、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）及びハイドロキノン（Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）のうち１種以上を含むことができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るバイオセンサーは、アンペロメトリー（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）法を利用し、インピーダンス測定方法を通じた従来のバイオセンサーに比べて小型化することができ、免疫測定方式を組み合わせることにより、ｆｇ／ｍｌの程度の感度を発揮して血中の極めて微細な量で含まれている標的タンパク質を非常に効果的に検出することができる。
【００２２】
また、多数のウェルにそれぞれ異なるプローブを含むようにして、同時に様々な標的タンパク質を一度の過程を通じて検出することができる。
【００２３】
併せて、特定電圧をかけて電流を測定する酸化還元方法を利用することで、分析時間が５秒以内と非常に短い。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態に係るバイオセンサーのナノサイズの直径を有するウェルの模式図を示したものである。
【図２】本発明の一実施形態に係るバイオセンサーの模式図を示したものである。
【図３】本発明の一実施形態に係るバイオセンサーの模式図を示したものである。
【図４】本発明の一実施形態に係るバイオセンサー製作及び検出過程を示したものである。
【図５】本発明の一実施形態に係るバイオセンサー及びＥＬＩＳＡを利用したＭＣＰ−１タンパク質の測定グラフを示したものである。
【図６】本発明の一実施形態に係るナノウェルバイオセンサー及び平面の電極を利用したＴＧＦ−ｂｅｔａの量を測定したグラフを示したものである。
【図７】本発明の一実施形態に係るナノウェルバイオセンサー（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）を利用して、様々なタンパク質１ｎｇ／ｍｌあたりに発生する電流を測定したグラフを示したものである。
【図８】本発明の一実施形態に係るナノウェルバイオセンサー（ＩＬ−６）を利用して、様々なタンパク質１ｎｇ／ｍｌあたりに発生する電流を測定したグラフを示したものである。
【図９】本発明の一実施形態に係るナノウェルバイオセンサー（ＭＣＰ−１）を利用して、様々なタンパク質１ｎｇ／ｍｌあたりに発生する電流を測定したグラフを示したものである。
【図１０】総ＩｇＥ（ｔｏｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ）をマーカーに、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで濃度別クロノアンペロメトリー（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）を実行したグラフを示したものである。
【図１１】総ＩｇＥの濃度による電流値を計算して作成された、ｐｇ乃至ｎｇの範囲で指数曲線を示す較正曲線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）を示したものである。
【図１２】対照群（未処理群）のマウスについて、時間によるＩｇＥレベルを、本発明のバイオセンサーを利用して測定した結果を示したものである。
【図１３】ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を感作させ、これを吸引させて喘息及び気道炎症を誘発した実験群で、サイトカインＩＬ−４の変化を、本発明のバイオセンサーを利用して、二日おきに測定した結果を示したものである。
【図１４】ＯＶＡを感作させ、これを吸引させて喘息と気道炎症を誘発した実験群でサイトカインＩｇＥの変化を、本発明のバイオセンサーを利用して、二日おきに測定した結果を示したものである。
【図１５】ナノウェルアレイ電極を有するバイオセンサーの製造過程を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、添付された図面を参照して、本発明の望ましい実施形態等を説明する。しかし、本発明の実施形態は、様々な形態に変形することができ、本発明の範囲が以下で説明する実施形態に限定されるものではない。また、本発明の実施形態は、当該技術分野で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供するものである。
【００２６】
本発明者らは、従来のＥＬＩＳＡ方式において、試料内に含まれている極微量の標的物質を検出するにあたり、さらに感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が高いバイオセンサーを開発しようと努力した結果、直径がマイクロまたはナノサイズの円筒形のウェルが形成されている電極を有するバイオセンサーが、タンパク質タグが結合された第２プローブ及び第２プローブに特異的に結合できる信号仲介分子を含む場合、試料内の標的物質の測定感度を著しく高めることができることを発見し、本発明を完成するに至った。
【００２７】
本発明において、一実施例として、バイオセンサーは、図１５での製造過程を通じて得られるナノウェルアレイ電極を有するバイオセンサーであることができる。一例として、ナノウェルは、現在知られている様々なナノウェル形成方法を適用することができ、例えば、シリコンウェハ基盤のナノウェル構造体をパターニングする技術などを適用することができる。
【００２８】
本発明は、試料を収容するための１乃至複数個のウェル（ｎａｎｏｗｅｌｌ）が形成されている電極と、上記電極上に提供される第１プローブ及び上記第１プローブに特異的に結合するアダプタータンパク質と、上記第１プローブに結合する標的物質に特異的に結合する第２プローブと、上記第２プローブに特異的に結合する信号仲介分子を含むことを特徴とする電気化学的バイオセンサーに関するものである。以下、本発明に係るバイオセンサーの各構成を図面をもとに詳細に説明する。
【００２９】
試料を収容するための１乃至複数個のウェルを含む電極（１００）：
【００３０】
電極配線に、標的物質を検出するために、試料内に発生される電子を検出する構成に該当する。
【００３１】
本発明において、上記電極は、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｐｔ及びＡｕのうち１種以上であることができ、望ましくはＡｕであるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
図２に示すように、また、本発明において、上記電極の表面は、第１プローブ及びアダプタータンパク質の結合を容易にするために、表面が改質されたもの（２００）であることができる。具体的には、上記表面の改質は、自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；  ＳＡＭ）で改質されたものであることができる。上記自己組織化単分子膜で電極の表面を改質する場合には、第１プローブ（４００）及びアダプタータンパク質（３００）の共有結合を安定的に誘導することにより、安定性、再現性、及び感度を顕著に高めることができる。
【００３３】
また、図１に示すように、本発明において、上記１乃至複数個のウェルは、マイクロ乃至はナノサイズの直径を有するウェル構造体であり、円筒形のウェルであることができる。このように、マイクロ乃至はナノサイズの直径を有する場合には、目的とする個体から分離された、またはその他の方法で得られる生物学的試料内に含まれている標的物質以外のアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）のような巨大分子タンパク質などを濾過する効果を発揮することができる。また、円筒形ウェルの形態を有する場合には、そうでない場合に比べて下記の式１による際、電子伝達の拡散を極大化して、極微量の試料を効率的に検出することができる。
【００３４】
【数１】
2021518912.tif 000003
【００３５】
望ましくは、上記ウェルのサイズは、５０乃至５００ｎｍの直径であることができ、２００乃至５００ｎｍの直径であることができ、例えば、３００乃至４００ｎｍの直径であることができるが、これらに限定されない。上記円筒形ウェルの直径が５０ｎｍ未満である場合は、抗体がウェル内に固定されにくく、直径が２００ｎｍ未満である場合には、内部に測定のための電子伝達の拡散が極大化できず、５００ｎｍ超過の場合には、標的物質以外の不要なタンパク質を充分にろ過することができない。
【００３６】
第１プローブ及びアダプタータンパク質：
【００３７】
アダプタータンパク質は、目的とする試料内に存在する標的物質（５００）を最初に捕獲する第１プローブ（４００）と電極との間の結合を容易にする構成に該当する。
【００３８】
本発明において、上記第１プローブ（４００）は、試料内に存在する標的物質に特異的に結合できる分子であればすべて含むことができ、具体的に標的物質に特異的に結合する抗体、タンパク質、その他の生体分子などであることができるが、これらに限定されない。
【００３９】
また、本発明において、上記アダプタータンパク質（３００）は、抗体、タンパク質などの第１プローブを固定化できるものであればすべて含むことができ、具体的にタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）等であるが、これに限定されない。このように、第１プローブが電極に直接結合されずにアダプタータンパク質に結合される場合、第１プローブと電極との間の固定効率を著しく増加させ、非特異的反応を抑えることができる。
【００４０】
ただし、本発明において、上記「標的物質（５００）」は、目的とする個体から分離された生物学的試料内に含まれている測定のためのペプチド又はタンパク質であることができる。
【００４１】
本発明において、上記の「ペプチド」は、ポリペプチドを含み、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質という用語は、アミノ酸残基の重合体を意味する。一つ以上のアミノ酸残基のような自然発生的なアミノ酸のみならず、自然発生のアミノ酸の重合体が人工化学的に合成されたアナログであるときも、本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
本発明の目的上、上記標的物質は、試料内の極微量含まれているタンパク質であるサイトカインタンパク質であることができ、望ましくは、上記サイトカインタンパク質は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、ＴＧＦ−アルファ（ａｌｐｈａ）、ＴＧＦ−ベータ（ｂｅｔａ）、インターロイキン−４、インターロイキン−６、ＭＣＰ−１、インターロイキン−１−ベータ（ｂｅｔａ）、インターロイキン−１７及びＩＦＮ−ガンマ（ｇａｍｍａ）などであることができる。
【００４３】
図３に示すように、本発明の一実施例は、上記第１プローブによって捕獲された標的物質に特異的に結合する第２プローブ及び第２プローブに特異的に結合する信号仲介分子をさらに含むバイオセンサーに関するものであることができる。
【００４４】
第２プローブ：
【００４５】
第１プローブによって捕獲される標的物質に特異的に結合する構成に該当する。
【００４６】
本発明において、上記第２プローブ（６０１）は、標的物質（５００）に特異的に結合できる分子であればすべて含むことができ、具体的にタンパク質、抗体などであるが、これらに限定されない。また、本発明で、上記第２プローブは、タンパク質タグ（６０２）が結合されたものであることができる、
【００４７】
本発明において、上記タンパク質タグは、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、カルモジュリン（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、及びＳＢＰ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で構成された群から選択される１種以上のものであることができ、望ましくは、ビオチンであるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
信号仲介分子：
【００４９】
第２プローブに特異的に結合して酸化還元反応を起こし、電流を発生させることで標的物質の存否を確認させる構成に該当する。
【００５０】
本発明において、上記信号仲介分子（７００）は、第２プローブに直接結合したり、第２プローブのタンパク質タグに特異的に結合したりするタンパク質（７０１）に、酸化還元反応を通じて電流を発生させる物質が結合された物質（７０２）であればすべて含むことができる。望ましくは、上記タンパク質タグがビオチンである場合、ビオチン１分子に１つの分子が結合できるストレプトアビジンに、過酸化酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された物質であることができる。このように、ビオチンと１：１で結合できるストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）に過酸化酵素が結合された信号仲介分子を含む場合、標的物質に結合されている第２プローブに特異的に結合することにより、標的物質に対する定量的測定において、感度及び正確度を顕著に高めることができる。
【００５１】
本発明の他の実施例では、
電気化学的バイオセンサーを利用して、試料内の標的物質を検出する方法として、上記電気化学的バイオセンサーは、基板上に、試料を収容するための１乃至複数個のウェルが形成されている電極、上記ウェルの底部に提供される第１プローブ、及び上記第１プローブに特異的に結合するアダプタータンパク質を含み、上記方法は、
ａ）上記電気化学的バイオセンサーに個体から分離された生物学的試料を入れて反応させる段階と、ｂ）上記ウェルに標的物質をターゲットにする第２プローブを提供して反応させる段階と、ｃ）上記ウェルに第２プローブに結合された標識物質をターゲットにする信号仲介分子を反応させる段階と、ｄ）上記ｃ）段階での第２プローブと信号仲介分子との間の反応は、電解質が存在する状態で、酸化還元反応により発生する電流を測定する段階を含む、電気化学的バイオセンサーを利用して、試料内の標的物質を検出する方法を提供する。
【００５２】
本発明において、上記「標的物質」は、目的とする個体から分離された生物学的試料内に含まれている測定のための蛋白質又はペプチドであることができる。本発明の目的上、上記標的物質は、試料内に極微量含まれているタンパク質であるサイトカインタンパク質であることができ、望ましくは、上記サイトカインタンパク質は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、ＴＧＦ−アルファ（ａｌｐｈａ）、ＴＧＦ−ベータ（ｂｅｔａ  ）、インターロイキン−４、インターロイキン−６、ＭＣＰ−１、インターロイキン−１−ベータ（ｂｅｔａ）、インターロイキン−１７及びＩＦＮ−ガンマ（ｇａｍｍａ）などであることができる。
【００５３】
本発明の上記「目的とする個体」とは、試料内の標的物質の存在または定量的数値を測定するための個体を意味する。また、本発明において、上記個体から得られた「生物学的試料」とは、本発明に係る上記標的物質に該当する遺伝子、タンパク質、および／またはマイクロＲＮＡなどが存在する組織、組織のライセート（ｌｙｓａｔｅ）、気管支肺胞洗浄液、細胞、血液、血清、血漿、唾液、喀痰、脳脊髄液、糞便又は尿といった試料などを含むが、このような測定しようとする標的物質が含まれている試料であれば、どのような種類でもすべて含まれる。
【００５４】
本発明の一実施例では、上記ｃ）段階で、第２プローブと信号仲介分子との間の反応は、電解質が存在する状態で、酸化還元反応により発生する電流を測定することができる。望ましくは、上記電解質は、（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）及びハイドロキノン（Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）のうち１種以上を含むことができ、さらに望ましくはＴＭＢであることができるが、これに制限されるものではない。このように、第２プローブと信号仲介分子との間の反応が、電解質が存在する状態で、酸化還元反応を通じて発生する電子により発生する電流を測定する場合、従来に使用されたインピーダンス測定方法と比較して交流電圧装置を追加することなく、センサーの簡素化が可能であり、測定限界度及び感度が著しく向上することにより、ｆｇ／ｍｌに該当する標的物質を検出することができる。
【００５５】
また、本発明において、上記ウェルに含まれる第１プローブは、ウェルごとに異なるプローブを含むようにして、同時に様々な標的物質を一度の過程を通じて検出することもできる。
【００５６】
また、別の観点から、本発明のもう一つの実施例では、電極の表面を改質する段階と、上記電極上に１乃至複数個のウェルを形成させる段階と、上記改質された電極にアダプタータンパク質及び第１プローブを結合する段階を含むバイオセンサーの製造方法を提供する。
【００５７】
本発明のバイオセンサーの製造方法において、上記電極、第１プローブ、アダプタータンパク質、第２プローブに関する内容は、上記バイオセンサーで記載したものと重複しており、以下、具体的な記載を省略する。
【実施例】
【００５８】
以下、具体的な実施例を通じて本発明をさらに具体的に説明する。下記の実施例は、本発明の理解を助けるための例示に過ぎず、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
【００５９】
［製造例］バイオセンサーの製造
【００６０】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６８，５８４−５８８，２０１３に記載されたナノウェル形成方法を参考にして、金の電極表面にレーザーを利用して、３００乃至４００ｎｍの直径を有する複数個のナノウェルをアレイ型に形成した（図１）。
【００６１】
具体的には、上記電極は、２ｘ４ｍｍのシリコンウェハ上にシリコン酸化膜をプラズマ化学気相蒸着法で形成して（１０ｎｍ）、電気がよく通る物質でバイオ親和性金属であるＡｕ層を電子ビーム蒸着法（ｅ−ｂｅａｍ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で５０ｎｍの厚さに形成した。このように生成されたゴールド層の上に微細ナノウェルを形成するために、半導体工程であるリソグラフィ方法を適用した。そのために、まず、第１感光層であるＰＲ（ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ）を１ｕｍで塗布して形成した。塗布層の厚さは、薄すぎると微細パターン形成が容易でなく、厚すぎると工程が終わって完全に削除されないため、エッチング選択比を考慮して、１００ｎｍの厚さに形成した。このようにＰＲ層を形成した後、電子ビームリソグラフィ（Ｅ−ｂｅａｍ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）工程を利用して、２００ｎｍの直径を有する丸い円構造の微細パターンを形成した。この時、ｅ−ｂｅａｍ  ｐｏｗｅｒの大きさによって円構造の直径のナノからマイクロサイズまでの調整が可能である。エッチング（ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）工程が終了した後に残ったＰＲ（日本ゼオン株式会社）及び絶縁層を除去するために形成された電極をアセトン（ＡＣＥＴＯＮ）に浸漬させた後、超音波を利用して除去した。このように生成された電極は、酸化防止のために、個々の真空包装をして恒温恒湿機に保管し、使用する直前に、純水（Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）で洗浄した後、使用した。
【００６２】
以降は、図４に示すように、金の電極に形成されたウェルの内部の表面を親水性化し、タンパク質等との共有結合を誘導するにあたって、安全性、再現性および敏感性を高めるために自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ＳＡＭ）改質をするために１１−ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを利用して１時間反応させた。その後、１Ｍエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）で１０分間反応して、反応が起こらない自己組織化単分子膜物質を除去した。このように得られた多数の改質された多数のウェルを有する金の電極に、アダプタータンパク質に該当するタンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）を抗体の固定化のために結合させた。その後、測定しようとする標的物質に特異的に結合する抗体である第１プローブを上記タンパク質Ａに１時間反応させて結合を誘導して電極を形成した。
【００６３】
また、標的物質と直接結合する第２プローブは、ビオチン化（Ｂｉｏｔｉｎｌｙａｔｉｏｎ）させて準備し、第２プローブに結合されたビオチンに結合する信号仲介分子は、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）にＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された物質を準備してから、バイオセンサーを利用した測定に使用した。
【００６４】
［実験例１と比較例１］バイオセンサーを利用した標的物質の測定及びＥＬＩＳＡ法との比較
【００６５】
第１プローブ及び第２プローブをＭＣＰ−１に特異的な抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社で購入）を利用して作ったバイオセンサーを用いた。
【００６６】
上記第１プローブのそれぞれを、ナノウェルにそれぞれ結合させた後、非特異的な結合を防止するためにＢＳＡ  １ｍｇ／ｍｌに３０分間反応させた。その後、それぞれの第１プローブの抗体に該当する抗原であるＭＣＰ−１タンパク質それぞれをウェルに入れ、３０分間反応させた。その後、上記ビオチン化された第２プローブと４５分間反応させ、ストレプトアビジンにＨＲＰが結合された信号仲介分子と１５分間反応させた。その後、電解質に該当するＴＭＢ溶液を入れた後、時間に応じた電流を測定し、その値を図５に示した。ただし、ＥＬＩＳＡ方式は、上記ＭＣＰ−１抗原及びそれに特異的な抗体を用いて公知の通常の方法によって測定した。
【００６７】
図５に示すように、本発明に係るバイオセンサーで測定した場合、測定限界値が１０−１７ｇ／ｍｌに該当し、１０−１７から１０−１１までの広い範囲の濃度を測定することができる反面、ＥＬＩＳＡ法の場合、測定限界値が１０−１２ｇ／ｍｌに該当し、１０−９ｇ／ｍｌの比較的短い範囲の濃度内で測定された。
【００６８】
上記の結果を通じて、本発明に係るバイオセンサーは、極めて微細な量（５ｕｌ以下のサンプル消耗量）のタンパク質を検出することができるだけでなく、広い範囲に該当する濃度まで測定できるという効果が存在することがわかる。
【００６９】
［比較例２］ナノウェル電極及び一般電極バイオセンサーの感度比較
【００７０】
本発明に係るウェルは、特にナノサイズの直径を有するウェルがある電極と、このようなウェルが存在しない電極で感度を比較した。
【００７１】
本発明に係るナノサイズの直径を有する上記製造例１のバイオセンサーと、一般的に使用することができるウェルが含まれていない平面の電極にプローブを固定させて測定するセンサーを利用して、ＴＧＦ−ｂｅｔａについて、上記の実験例１及び比較例１のように測定し、その結果を図６に示した。
【００７２】
図６に示すように、ナノサイズの直径を有する製造例１のバイオセンサーの場合、ＴＧＦ−ｂｅｔａのタンパク質の量が増加するほど、電流の差が比例して増加するのに対し、平面の電極では、１０−１５乃至１０−１３ｇ／ｍｌでは電流の差の変化が存在しなかった。
【００７３】
上記の結果を通じて、本発明に係るバイオセンサーは、平面の電極を有する場合に比べて、低い濃度を区別する感度が顕著に高くなることが分かる。
【００７４】
［比較例３］標的物質間の感度（特異性）の測定比較
【００７５】
本発明に係るバイオセンサーを利用して、選択的な抗原のみを特異的に探知する信号を確認した。
【００７６】
上記製造例１のバイオセンサーに、第１プローブをＴＧＦ−ｂｅｔａに特異的な抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社で購入）を使用し、対照群にＭＣＰ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−１  ｂｅｔａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＮＦ−ｇａｍｍａ及びＬｅｐｔｉｎ、ＢＳＡ及びバッファーを使用して、それぞれ１ｎｇ／ｍｌの濃度を処理した後、発生する電流を測定して図７に示した。
【００７７】
図７に示すように、他の抗原が約１０ｕＡの電流の強さを示すのに対し、ＴＧＦ−ｂｅｔａは１ｎｇ／ｍｌの場合、６５ｕＡの電流の強さを示した。
【００７８】
それだけでなく、他の特異的な抗体を電極にコーティングしたときにも、その抗体に特異的に結合するタンパク質のみが大きな電流強度の変化を見せることを確認した。このような方法で、図８に示すように、ＩＬ−６に特異的な抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社で購入）を使用して、ＭＣＰ−１、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、及びバッファーを使用して１ｎｇ／ｍｌで処理した結果、当該タンパク質、つまり、ＩＬ−６でのみ特異的に大きな電流強度の変化を見せることを確認した。
【００７９】
図９でも示すように、ＭＣＰ−１に特異的な抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社で購入）を使用して、ＩＬ−６、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、及びバッファーを使用して１ｎｇ／ｍｌで処理した結果、当該タンパク質、つまり、ＭＣＰ−１でのみ特異的に大きな電流強度の変化を見せることを確認した。
【００８０】
［実験例２］  較正曲線（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）作成
【００８１】
較正曲線（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）の作成に使用されたマーカーは、総ＩｇＥ  （ｔｏｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ）で、ＩｇＥは、炎症性損傷モデルでそのレベルが急激に増加することになる蛋白質である。まず、ＩｇＥの定量のためにＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで濃度別にクロノアンペロメトリー（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）を行い（図１０）、これにより、それぞれの濃度に応じた電流値を計算してｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅを完成した。その結果、ｐｇ乃至ｎｇの範囲で指数曲線（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｃｕｒｖｅ）にフィッティングされることを確認した（図１１）。
【００８２】
［比較例４］対照群（未処理群）及びＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）投与群でＩｇＥ又はＩＬ−４の測定比較
【００８３】
上記実験例２で完成されたｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ定量を基に、実際のマウスモデルから総ＩｇＥレベルを測定した。従来のＥＬＩＳＡ法の場合、約１００乃至２００μｌの多量の試料（例えば、血液）を必要とし、測定時に動物（マウス）を犠牲にせざるを得ず、持続的なモニタリングが不可能だったのに対し、本発明のバイオセンサーは、ｆｇ／ｍｌの程度の感度を発揮して、動物を犠牲にせずに収得した極少量の試料から目的のタンパク質を効果的に検出することができ、これにより、持続的なモニタリングも可能である。
【００８４】
まず、何の処理もしていない対照群のマウスに対し、本発明のバイオセンサー及び検出方法を利用して、ＩｇＥレベルを測定した結果、持続的なモニタリングにより、時間の経過によるＩｇＥ濃度に差がないことを確認した（図１２）。一方、実験群の場合、薬物点滴器にＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を感作させ、これを吸引させて喘息（ａｓｔｈｍａ）及び気道炎症を誘発し、これによって増加する代表的なサイトカインであるＩＬ−４及びＩｇＥの変化を二日おきに確認した。その結果、本発明のバイオセンサーは、時間の経過に応じてＩＬ−４及びＩｇＥ濃度の変化レベル及び経過を正確に確認することができ（図１３及び１４）、これは従来のＥＬＩＳＡ法と異なり、増加した感度による持続的モニタリングが可能であることを示す結果である。
【００８５】
以上、本発明の実施例について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、請求の範囲に記載された本発明の技術的思想を脱しない範囲内で、多様な修正及び変形が可能であることは、当技術分野の通常の知識を有する者には自明であるだろう。
【符号の説明】
【００８６】
１００：電極
２００：改質層
３００：アダプタータンパク質
４００：第１プローブ
５００：標的タンパク質
６００：タンパク質タグが結合された第２プローブ
６０１：第２プローブ
６０２：タンパク質タグ
７００：過酸化酵素が結合された信号仲介分子
７０１：タンパク質タグに特異的に結合するタンパク質
７０２：酸化還元反応を通じて電流を発生させることができる物質（例えば、過酸化酵素）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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