(57)【要約】  提供されるのは、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に結合特異性を有する抗体またはその断片である。様々な例において、抗体またはその断片は、本明細書で開示されるＶＨおよびＶＬのＣＤＲ、またはそれらのバリアントを含む。自己免疫疾患および障害を治療するために抗体またはその断片を使用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域とを備え、
前記ＨＣＤＲ１は配列番号１２７のアミノ酸配列（ＲＹＷＭＳ）を含み、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号１２８（ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号１２９（ＥＩＮＰＥＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４０（ＥＩＮＰＥＡＳＳＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４３、（ＥＩＮＰＥＡＧＫＷＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４７（ＥＩＮＰＥＴＴＩＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４９（ＥＩＮＰＥＳＴＬＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５１（ＩＮＰＥＳＴＧＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５４（ＥＩＮＰＥＳＮＦＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５７（ＥＩＮＰＥＲＮＹＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３６９（ＥＩＮＰＥＡＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、または配列番号３７０（ＥＩＮＰＥＳＳＳＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）のアミノ酸配列を含み、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１３０（ＱＤＤＹＥＹＹＡＭＤＹ）、配列番号３４１（ＱＤＤＹＳＨＹＡＭＤＹ）、配列番号３４４（ＱＤＤＹＴＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３４５（ＱＤＤＹＬＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３４８（ＱＤＤＹＲＨＹＡＭＤＹ）、配列番号３５０（ＱＤＤＹＲＮＹＡＭＤＹ）、配列番号３５２（ＱＤＤＹＷＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３５５（ＱＤＤＹＳＶＹＡＭＤＹ）、配列番号３５８（ＱＤＤＹＤＫＹＡＭＤＹ）、配列番号３５９（ＱＤＤＹＥＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３６２（ＱＥＤＹＥＹＹＡＬＤＹ）、配列番号３６５（ＱＤＤＴＲＹＹＡＭＤＹ）、配列番号３６６（ＱＤＤＹＬＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３６７（ＱＤＤＹＥＴＹＴＭＤＹ）、配列番号３６８（ＱＤＤＹＬＴＹＴＭＤＹ）、配列番号３７１（ＱＤＤＹＳＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３７２（ＱＤＤＹＥＨＹＴＭＤＹ）、または配列番号３７３（ＱＤＤＹＳＨＹＴＭＤＹ）のアミノ酸配列を含み、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号１３１（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＡ）、配列番号３４２（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＳ）、配列番号３４６（ＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＤ）、配列番号３５３（ＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＳ）、配列番号３５６（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＴ）、配列番号３６０（ＫＶＳＱＤＶＮＴＧＶＡ）、または配列番号３６３（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＹ）のアミノ酸配列を含み、
前記ＬＣＤＲ２は配列番号１３２（ＳＡＳＹＲＹＴ）のアミノ酸配列を含み、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号１３３（ＱＱＹＹＳＴＰＬＴ）、配列番号３６１（ＱＱＹＷＳＴＰＬＴ）、または配列番号３６４（ＱＱＧＹＳＴＰＬＴ）のアミノ酸配列を含む、
抗体またはその断片。
【請求項２】
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、および前記ＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３６７、３６０、１３２、および１３３を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
前記重鎖可変領域は、配列番号１８１のアミノ酸配列、または配列番号１８１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１７９のアミノ酸配列、または配列番号１７９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
ヒト化されており、前記重鎖可変領域はＫａｂａｔナンバリングによる５Ｑ、４７Ｉ、４８Ｇ、および８５Ｖ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、または前記軽鎖可変領域はＫａｂａｔナンバリングによる突然変異７８Ｖを含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
前記重鎖可変領域は配列番号１８１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号１７９のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、および前記ＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３５９、３６０、１３２、および１３３を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
前記重鎖可変領域は、配列番号１７４のアミノ酸配列、または配列番号１７４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１７９のアミノ酸配列、または配列番号１７９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、および前記ＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３５９、３６０、１３２、および３６１を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
前記重鎖可変領域は、配列番号１７４のアミノ酸配列、または配列番号１７４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１７５のアミノ酸配列、または配列番号１７５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、および前記ＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、および１３３を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列、または配列番号１５６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１３８のアミノ酸配列、または配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体またはその断片。
【請求項１２】
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、および前記ＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、および１３３を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域は、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１３８のアミノ酸配列、または配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１４】
ヒト化されており、前記重鎖可変領域はＫａｂａｔナンバリングによる５Ｑ、４７Ｉ、４８Ｇ、および８５Ｖ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、または前記軽鎖可変領域はＫａｂａｔナンバリングによる突然変異７８Ｖを含む、請求項６から１３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１５】
ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域とを備え、
前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、および前記ＨＣＤＲ３の組は、表Ａもしくは表Ｂ、またはＣＤＲのうちの１つまたは複数において１個、２個、または３個のアミノ酸付加、欠失、および／または置換を有する、表Ａもしくは表Ｂに由来する前記ＣＤＲの組から選択され、
前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、および前記ＬＣＤＲ３の組は、表Ａもしくは表Ｂ、またはＣＤＲのうちの１つまたは複数において１個、２個、または３個のアミノ酸付加、欠失、および／または置換を有する、表Ａもしくは表Ｂに由来する前記ＣＤＲの組みから選択される、
抗体またはその断片。
【請求項１６】
ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片は、前記ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、Ｒ２４、およびＦ２５からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基に結合することができる、抗体またはその断片。
【請求項１７】
前記ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０およびＰ２２、Ｆ２０およびＲ２４、Ｆ２０およびＦ２５、Ｐ２２およびＲ２４、Ｐ２２およびＦ２５、またはＲ２４およびＦ２５に結合することができる、請求項１６に記載の抗体またはその断片。
【請求項１８】
前記ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、およびＲ２４；Ｆ２０、Ｐ２２、およびＦ２５；Ｆ２０、Ｒ２４およびＦ２５；またはＰ２２、Ｒ２４およびＦ２５に結合することができる、請求項１７に記載の抗体またはその断片。
【請求項１９】
前記ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、Ｒ２４、およびＦ２５に結合することができる、請求項１７に記載の抗体またはその断片。
【請求項２０】
さらに、カニクイザルＣＸＣＬ１３タンパク質に結合することができる、請求項１７に記載の抗体またはその断片。
【請求項２１】
二重特異性抗体であって、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する第１の抗原結合部分と、ヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）タンパク質に特異性を有する第２の抗原結合部分とを備え、前記第１の抗原結合部分は請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体断片を有する、二重特異性抗体。
【請求項２２】
２つの単鎖断片（ｓｃＦｖ）にまたは２つのＦａｂ断片に融合された完全な抗体を含む形式を有する、請求項２１に記載の二重特異性抗体。
【請求項２３】
前記第２の抗原結合部分はベリムマブの抗原結合断片を含む、請求項２１または２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または請求項２１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物、および医薬的に許容される担体。
【請求項２５】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または請求項２１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
【請求項２６】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または請求項２１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の１つまたは複数の鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
それを必要とする患者において免疫応答を抑制する、または自己免疫疾患もしくは障害を治療する方法であって、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または請求項２１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を前記患者に投与する段階を含む、方法。
【請求項２８】
それを必要とする患者において免疫応答を抑制する、または自己免疫疾患もしくは障害を治療するための薬剤の調製のための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または請求項２１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項２９】
自己免疫疾患または障害を治療するための、請求項２７に記載の方法または請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記自己免疫疾患または障害は、１型糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬／乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ループス）、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血、およびセリアック病からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法または請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記自己免疫疾患または障害はシェーグレン症候群である、請求項２７に記載の方法または請求項２８に記載の使用。
【請求項３２】
それを必要とする患者においてがんを治療する方法であって、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を前記患者に投与する段階を含む、方法。
【請求項３３】
それを必要とする患者においてがんを治療するための薬剤の調製のための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片の使用。
【請求項３４】
試料中のヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質の発現を検出する方法であって、前記試料を請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片に接触させる段階と、前記試料中のＣＸＣＬ１３の発現を示す結合を検出する段階とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）は、Ｂリンパ球走化性因子（ＢＬＣ）またはＢ細胞誘引性ケモカイン１（ＢＣＡ−１）としても公知であり、ヒトにおいてＣＸＣＬ１３遺伝子によってコードされるタンパク質リガンドである。ＣＸＣＬ１３は、ＣＸＣケモカインファミリに属する小さなケモカインである。その名称が示唆するように、このケモカインは、Ｂ−１サブセットとＢ−２サブセットに属するＢ細胞両方に対して選択的に走化性であり、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５と相互作用することによってその効果を引き出す。
【０００２】
ＣＸＣＬ１３およびその受容体ＣＸＣＲ５は、リンパ組織の濾胞内でのＢ細胞の組織化を制御し、ヒトの肝臓、脾臓、リンパ節、および腸で高度に発現される。ＣＸＣＬ１３のための遺伝子は、ヒト４番染色体上で、他のＣＸＣケモカインのクラスタ中に位置する。
【０００３】
Ｔリンパ球においては、ＣＸＣＬ１３の発現は、Ｔ細胞、特に、濾胞性ＢヘルパＴ細胞（またはＴＦＨ細胞）と呼ばれるＴ細胞のサブセットの胚中心起源を反映すると考えられている。しがって、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫におけるＣＸＣＬ１３の発現は、腫瘍Ｔ細胞の胚中心起源を反映すると考えられている。
【０００４】
ＣＸＣＬ１３媒介シグナル伝達経路を標的とする治療法への需要は、近年ますます明白となっている。そのような治療に対する作用機序としては、たとえば、結果として、Ｂ細胞および濾胞ＢヘルパＴ細胞の炎症組織への遊走ならびに胚中心形成に干渉し（たとえば、自己免疫疾患の場合）、かつがん細胞増殖および腫瘍疾患へ広がる能力を阻害する、ＣＸＣＬ１３とその受容体との相互作用の遮断が挙げられるであろう。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に結合特異性を有する抗体またはその断片、ならびにＣＸＣＬ１３およびＢＡＦＦおよびＩＦＮαＲＩなどの別の抗原に特異性を有する二重特異性抗体を提供する。これらの抗体および断片は、自己免疫疾患およびがんの治療において有用である。
【０００６】
本開示の一実施形態は、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する抗体またはその断片を提供し、ここで、抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域とを備え、ここで、ＨＣＤＲ１は配列番号１２７のアミノ酸配列（ＲＹＷＭＳ）を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１２８（ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号１２９（ＥＩＮＰＥＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４０（ＥＩＮＰＥＡＳＳＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４３、（ＥＩＮＰＥＡＧＫＷＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４７（ＥＩＮＰＥＴＴＩＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４９（ＥＩＮＰＥＳＴＬＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５１、（ＩＮＰＥＳＴＧＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５４（ＥＩＮＰＥＳＮＦＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５７（ＥＩＮＰＥＲＮＹＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３６９（ＥＩＮＰＥＡＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、または配列番号３７０（ＥＩＮＰＥＳＳＳＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１３０（ＱＤＤＹＥＹＹＡＭＤＹ）、配列番号３４１（ＱＤＤＹＳＨＹＡＭＤＹ）、配列番号３４４（ＱＤＤＹＴＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３４５（ＱＤＤＹＬＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３４８（ＱＤＤＹＲＨＹＡＭＤＹ）、配列番号３５０（ＱＤＤＹＲＮＹＡＭＤＹ）、配列番号３５２（ＱＤＤＹＷＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３５５（ＱＤＤＹＳＶＹＡＭＤＹ）、配列番号３５８（ＱＤＤＹＤＫＹＡＭＤＹ）、配列番号３５９（ＱＤＤＹＥＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３６２（ＱＥＤＹＥＹＹＡＬＤＹ）、配列番号３６５（ＱＤＤＴＲＹＹＡＭＤＹ）、配列番号３６６（ＱＤＤＹＬＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３６７（ＱＤＤＹＥＴＹＴＭＤＹ）、配列番号３６８（ＱＤＤＹＬＴＹＴＭＤＹ）、配列番号３７１（ＱＤＤＹＳＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３７２（ＱＤＤＹＥＨＹＴＭＤＹ）、または配列番号３７３（ＱＤＤＹＳＨＹＴＭＤＹ）のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１３１（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＡ）、配列番号３４２（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＳ）、配列番号３４６（ＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＤ）、配列番号３５３（ＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＳ）、配列番号３５６（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＴ）、配列番号３６０（ＫＶＳＱＤＶＮＴＧＶＡ）、または配列番号３６３（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＹ）のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１３２（ＳＡＳＹＲＹＴ）のアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３は、配列番号１３３（ＱＱＹＹＳＴＰＬＴ）、配列番号３６１（ＱＱＹＷＳＴＰＬＴ）、または配列番号３６４（ＱＱＧＹＳＴＰＬＴ）のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３６７、３６０、１３２、および１３３を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１８１のアミノ酸配列、または配列番号１８１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１７９のアミノ酸配列、または配列番号１７９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、抗体またはその断片はヒト化され、ここで、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔナンバリングによる５Ｑ、４７Ｉ、４８Ｇ、および８５Ｖ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、または軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔナンバリングによる突然変異７８Ｖを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は配列番号１８１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号１７９のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３５９、３６０、１３２、および１３３を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１７４のアミノ酸配列、または配列番号１７４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１７９のアミノ酸配列、または配列番号１７９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３５９、３６０、１３２、および３６１を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１７４のアミノ酸配列、または配列番号１７４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１７５のアミノ酸配列、または配列番号１７５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、および１３３を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列、または配列番号１５６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３８のアミノ酸配列、または配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、および１３３を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３８のアミノ酸配列、または配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、抗体またはその断片はヒト化され、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔナンバリングによる５Ｑ、４７Ｉ、４８Ｇ、および８５Ｖ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、または軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔナンバリングによる突然変異７８Ｖを含む。
【００１６】
さらに提供されるのは、一実施形態において、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する抗体またはその断片であり、ここで、抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、Ｒ２４、およびＦ２５からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基に結合することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０およびＰ２２、Ｆ２０およびＲ２４、Ｆ２０およびＦ２５、Ｐ２２およびＲ２４、Ｐ２２およびＦ２５、またはＲ２４およびＦ２５に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、およびＲ２４；Ｆ２０、Ｐ２２、およびＦ２５；Ｆ２０、Ｒ２４およびＦ２５；またはＰ２２、Ｒ２４およびＦ２５に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、Ｒ２４、およびＦ２５に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片はさらに、カニクイザルＣＸＣＬ１３タンパク質に結合することができる。
【００１８】
一実施形態において、提供されるのは二重特異性抗体であり、二重特異性抗体は、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する第１の抗原結合部分と、ヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）タンパク質に特異性を有する第２の抗原結合部分とを備え、ここで、第１の抗原結合部分は本開示の抗体断片を有する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの単鎖断片（ｓｃＦｖ）にまたは２つのＦａｂ断片に融合された完全な抗体を含む形式を有する。いくつかの実施形態において、第２の部分はベリムマブの抗原結合断片を含む。
【００１９】
方法および使用も提供される。一実施形態において、それを必要とする患者において免疫応答を抑制する、または自己免疫疾患もしくは障害を治療する方法が提供され、方法は、本開示の二重特異性抗体の抗体またはその断片を患者に投与する段階を含む。
【００２０】
一実施形態において、それを必要とする患者においてがんを治療する方法が提供され、方法は、抗体またはその断片を患者に投与する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞内のＣＸＣＬ１３誘発カルシウム流出の遮断において、４１５Ａ３Ｄ１を除く抗ＣＸＣＬ１３のキメラ抗体が強力な活性を有したことを示す。
【００２２】
【図２】抗ＣＸＣＬ１３抗体６４Ｃ１０Ｇ１、２１Ｈ１２Ｄ９、３２９Ｆ２Ｅ１、４１１Ａ１１Ｅ９、７１Ｆ４Ａ３、および１Ｈ３Ａ１１により、ＩＰ１シグナルを有効に用量依存的に遮断することができ、阻害効率は同様であったことを示す。
【００２３】
【図３】ＢａＦ３−ＣＸＣＲ５細胞遊走が、抗ＣＸＣＬ１３抗体によって用量依存的に阻害されたことを示す。
【００２４】
【図４】すべてのキメラ抗ＣＸＣＬ１３抗体により、滴定可能な様式で初代ヒト扁桃細胞の走化性が阻害されたことを示す。
【００２５】
【図５】インビボモデルを用いて、抗ＣＸＣＬ１３抗体６４Ｃ１０Ｇ１が、胚中心形成の阻害を意味する、抗原特異的な高親和性抗体の産生、クラススイッチの遮断において、強力な効力を有したことを示す。
【００２６】
【図６】４２４Ｈ７Ｆ２マウスモノクローナル抗体により、初代マウス脾細胞のマウスＣＸＣＬ１３への遊走を用量依存的に阻害することができたことを示す。
【００２７】
【図７】マウス抗ＣＸＣＬ１３抗体４２４Ｈ７Ｆ２が、二次リンパ器官における胚中心（ＧＣ）形成、およびナイーブＢ細胞によるアイソタイプクラススイッチ、および抗原特異的な高親和性抗体産生における、ＣＸＣＬ１３機能の阻害を媒介したことを示す。
【００２８】
【図８】ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質上のエピトープ残基の同定を示す。
【００２９】
【図９】翻訳後修飾を除去する突然変異を有するヒト化Ｆａｂの下流シグナルアッセイにおける試験結果を示す。
【００３０】
【図１０】６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２（Ｄ５３Ｅ、Ｄ１０７Ｅ）Ｆａｂおよび７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）（Ｄ５４Ｅ）Ｆａｂ両方により、ヒトＣＸＣＬ１３誘発初代ヒト扁桃細胞遊走を用量依存的に遮断することができたことを示す。
【００３１】
【図１１】翻訳後修飾を除去する突然変異を有するヒト化完全長ＩｇＧ１抗体の結合特性を示す。
【００３２】
【図１２】試験した抗体により、ＣＸＣＬ１３誘発ＩＰ１シグナル伝達が阻害されたことを示す。
【００３３】
【図１３】試験した親和性成熟抗体により、ＣＸＣＬ１３誘発ＩＰ１シグナル伝達が阻害されたことを示す。
【００３４】
【図１４】試験した抗体により、ＢａＦ３−ＣＸＣＲ５（ヒト）細胞のＣＸＣＬ１３への遊走が阻害されたことを示す。
【００３５】
【図１５】親和性成熟抗体により、用量依存的な様式で、ＣＸＣＬ１３によって誘発される初代ヒト扁桃細胞の走化性が阻害されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
用語「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」存在物は、その存在物の１つまたは複数を意味し、たとえば、「ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１つの抗体）」は、１つまたは複数の抗体を表すと理解されることに留意されるべきである。したがって、本明細書において、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つ」という用語は、交換可能に使用することができる。
【００３７】
本明細書で用いられるように、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識し、その抗原に結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体、および任意の抗原結合断片、またはその単鎖であり得る。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。そのようなものの例としては、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはそれらのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれの任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも１つの部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で用いられる「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、たとえばＦ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部である。構造に関わらず、抗体断片は、無傷の抗体によって認識されるものと同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、アプタマ、シュピーゲルマ（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、および二特異性抗体を含む。「抗体断片」という用語はまた、特異的な抗原に結合し複合体を形成することによって抗体のような働きをする、任意の合成された、または遺伝子操作されたタンパク質を含む。
【００３９】
「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様において、領域は、１０から約２５アミノ酸の短いリンカペプチドで接続されている。リンカは、柔軟性のためにグリシンが、可溶性のためにセリンまたはスレオニンが豊富であり得、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続し得るか、その逆も同様に接続し得る。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を維持する。ｓｃＦｖ分子は、当技術分野で公知であり、たとえば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書において説明されている。
【００４０】
抗体という用語は、生化学的に区別することができる、様々で広範なクラスのポリペプチドを包含する。当業者には、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）、およびそれらの中のいくつかのサブクラス（たとえば、γｌ〜γ４）に分類されることが理解されるであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥに決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特性付けられており、機能的な特殊化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾型は、本開示を考慮すると当業者には容易に認識可能であり、したがって、本開示の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスは、明らかに本開示の範囲内であり、以下の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンである２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。これらの４つの鎖は典型的に、ジスルフィド結合によって「Ｙ」形状に結合されており、ここで、軽鎖は重鎖とひとまとめになり、「Ｙ」の入口から始まり可変領域を通して伸びる。
【００４１】
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、バリアント、またはその誘導体としては、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＫドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生される断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、抗Ｉｄ抗体から本明細書で開示されるＬＩＧＨＴ抗体までを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリン分子または抗体分子は、任意の種類（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、およびＩｇＡ２）、または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
【００４２】
軽鎖は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）いずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合していてもよい。概して、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、軽鎖および重鎖は、互いに対して共有結合しており、２つの重鎖の「尾」部分は、共有結合であるジスルフィド結合または非共有結合によって互いに対して結合している。重鎖においては、アミノ酸配列は、Ｙ形状の二又の終端のＮ末端から各鎖の下部のＣ末端へ伸びている。
【００４３】
軽鎖および重鎖の両方は、構造的および機能的相同性の領域に分割されている。「定常」および「可変」という用語は、機能に関して用いられる。この関連で、軽鎖および重鎖部分両方の可変ドメイン（ＶＫ、ＶＨ）は、抗原認識および特異性を決定することが認識されるであろう。その反対に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＫ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、たとえば、分泌、経胎盤性移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにしたがって増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である。ＣＨ３ドメインおよびＣＫドメインはそれぞれ実際に、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４４】
上に示したように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することができる。換言すれば、抗体のＶＫドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、組み合わさって、３次元の抗原結合部位を画定する可変領域を形成する。この４次抗体構造は、Ｙの各アームの終端に存在している抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＫ鎖（すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３）のそれぞれ上の３つのＣＤＲによって画定されている。いくつかの事例、たとえば、ラクダ科動物種由来の、またはラクダ科動物免疫グロブリンに基づいて操作された、ある特定の免疫グロブリン分子において、完全免疫グロブリン分子は、軽鎖を有さず重鎖のみからなっていてもよい。たとえば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照されたい。
【００４５】
天然に存在する抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境においてその３次元配置をとる際、抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置付けられた、隣接しない短いアミノ酸配列である。抗原結合ドメインのアミノ酸の残りの部分は、「フレームワーク」領域と呼ばれ、分子間可変性をそれほど示さない。フレームワーク領域は、大部分はβシートコンフォメーションを採用し、ＣＤＲは、βシート構造に接続し、場合によってはβシート構造の部分を形成する、ループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によってＣＤＲを正しい配向に位置付けすることを可能にする足場を形成するように働く。位置付けされたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補的な表面を画定する。この相補的表面は、抗体のその同族エピトープに対する非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域それぞれを含むアミノ酸は、正確に定義されているため、任意の重鎖または軽鎖可変領域に関して、当業者によって容易に同定され得る（"Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，"Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたい）。
【００４６】
当技術分野内で用いられる、かつ／または許容される用語に２つ以上の定義がある場合、本明細書で用いられるその用語の定義は、すべてのそのような意味を含むことが意図されるが、その逆が明示的に述べられる場合はこの限りではない。具体的な例は、重鎖および軽鎖のポリペプチド両方の可変領域内に見られる隣接しない抗原結合部位を表す「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，"Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ"（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって説明されており、これらはその全体を参照により本明細書に引用される。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義は、互いに対して比較すると、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含んでいる。それにもかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すためにどちらの定義を適用しても、本明細書において定義され用いられる用語の範囲内であることが意図される。上記に引用した参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する、適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数は、ＣＤＲの配列および大きさに依存して異なる。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むのか、ルーチン的に決定することができる。
【００４７】
本明細書で開示される抗体は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物の起源由来であってもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域が軟骨魚類（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（たとえば、サメ由来）であってもよい。
【００４８】
本明細書で用いられる「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（たとえば、上部、中間、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片のうち少なくとも１つを含む。たとえば、本発明で用いる抗原結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとを有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖を備えてもよい。別の実施例において、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖を備える。さらに、本開示で用いる抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（たとえば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠いてもよい。上述したように、重鎖定常領域は天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾されてもよいことが当業者には理解されるであろう。
【００４９】
本明細書で開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。たとえば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。別の例において、重鎖定常領域は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、かつ部分的にＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、かつ部分的にＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
【００５０】
本明細書で用いられるように、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインのうち少なくとも１つを含む。
【００５１】
「軽鎖−重鎖対」は軽鎖と重鎖の集合を指し、これらは軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。
【００５２】
先に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および３次元配置は周知である。本明細書で用いられるように、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端の可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１の（多くはアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端である。
【００５３】
本明細書で用いられるように、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、従来のナンバリングスキームを用いて、たとえば、抗体の約残基２４４から残基３６０まで延在する重鎖分子の部分を含む（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；および残基２３１〜３４０、ＥＵナンバリングシステム；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，"Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ"（１９８３）を参照されたい）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと相接して対になっていないという点で独特である。むしろ、２つのＮ連結分岐炭水化物鎖が、無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで延在し、約１０８個の残基を含むことも文書で十分に立証されている。
【００５４】
本明細書で用いられるように、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５個の残基を含み、かつ柔軟性があり、したがって、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン：上部、中間、および下部のヒンジドメインにさらに分割することができる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：４０８３（１９９８））。
【００５５】
本明細書で用いられるように、「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子間で形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することができる、または第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域とＣＫ領域はジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いた２３９および２４２に対応する位置（位置２２６または２２９、ＥＵナンバリングシステム）での２つのジスルフィド結合によって連結される。
【００５６】
本明細書で用いられるように、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性の領域または部位が第１の種から得られるか、またはそれに由来し、定常領域（無傷であっても、部分的であっても、または本発明に従って修飾されていてもよい）が第２の種から得られる、任意の抗体を意味すると考えられる。特定の実施形態において、標的結合領域または部位は、非ヒト源（たとえばマウスまたは霊長類）由来となり、定常領域はヒトである。
【００５７】
「特異的に結合する」または「特異性を有する」によって、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合することを意味し、結合が、抗原結合ドメインとエピトープとのある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体は、ランダムな関連しないエピトープに結合するより容易に、抗体の抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するときに、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、それによってある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的な親和性を有するとみなすために、本明細書において用いられる。たとえば、抗体「Ａ」は、任意のエピトープに対して抗体「Ｂ」より高い特異性を有すると考えられてもよく、または抗体「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」に対して有するより高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われてもよい。
【００５８】
本明細書で用いられるように、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置および予防的または防止的処置の両方を指し、ここで、その目的は、がんの進行などの、望ましくない生理学的な変化または障害を阻止するかつ／または遅らせる（弱める）ことである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出可能であっても検出不可能であっても、症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の安定した（すなわち、悪化していない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の回復または緩和、および寛解（部分または完全）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合の予測生存期間と比較して生存期間を延長することも意味する。処置を必要とする人には、状態もしくは障害を既に有している人、および状態もしくは障害を有する傾向のある人、または状態もしくは障害を予防する必要がある人が含まれる。
【００５９】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によって、診断、予後、または治療が所望される任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、飼育動物、農場動物、動物園動物、競技動物、またはペットの動物、たとえば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが挙げられる。
【００６０】
本明細書で用いられるように、「治療を必要とする患者に」または「治療を必要とする対象」などの語句は、たとえば検出のため、診断手順のため、および／または治療のために使用される、本開示の抗体または組成物の投与から恩恵を受けるであろう哺乳動物対象などの対象を含む。
抗ＣＸＣＬ１３抗体
【００６１】
本開示は、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に結合特異性を有する二重特異性抗体および断片を含む抗体を提供する。実験例において実証されているように、ヒトＣＸＣＬ１３タンパク質に対して高い結合親和性を有する多数のマウス抗ヒトＣＸＣＬ１３抗体が得られた。それらのうちのいくつかは、カニクイザルおよびマウスのＣＸＣＬ１３タンパク質と交差反応することもできる。
【００６２】
マウス抗体クローンのうちの４つ、２１Ｈ１２Ｄ９、６４Ｃ１０Ｇ１、７１Ｆ４Ａ３、および４１１Ａ１１Ｅ９が、さらなるヒト化および特性付けのために選択された。ヒト化抗体は、ＣＸＣＬ１３タンパク質に対する高い結合活性を維持し、ＣＸＣＬ１３誘発カルシウム流出を阻害し、ＣＸＣＬ１３媒介ＩＰ１シグナル伝達を遮断し、ＣＸＣＬ１３由来細胞遊走を遮断し、抗ＫＬＨ特異的ＩｇＧの産生を阻害し、抹消血液中のＣＸＣＬ１３を中和し、かつ胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞産生、クラススイッチ、およびＧＣ形成を遮断した。インビボ試験において、抗体は、ＣＸＣＬ１３への初代脾細胞遊走を阻害し、ＧＣ細胞集団を減少させることができた。
【００６３】
興味深いことに、ヒトＣＸＣＬ１３およびカニクイザルＣＸＣＬ１３を交差結合（ｃｒｏｓｓ  ｂｉｎｄ）する抗体は、ＣＸＣＬ１３の同じエピトープに結合した。エピトープは、ヒトタンパク質上のアミノ酸残基Ｆ２０、Ｐ２２、Ｒ２４、およびＦ２５を含んだ。
【００６４】
本開示の一実施形態に従って、提供されるのは、実験例において調製された抗体のＣＤＲ領域を有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、抗体およびその断片である。ＣＤＲを下記の表Ａにまとめる。
表Ａ．マウス抗体のＣＤＲ配列
【表１】
2021513324.tif 000002
【表２】
2021513324.tif 000003
【表３】
2021513324.tif 000004
【表４】
2021513324.tif 000005
【表５】
2021513324.tif 000006
【表６】
2021513324.tif 000007
【表７】
2021513324.tif 000008
【表８】
2021513324.tif 000009
【表９】
2021513324.tif 000010
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、表Ａに示すＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の任意の組から選択され、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、表Ａに示すＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の任意の組から選択される。いくつかの実施形態において、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、例中の同じ抗体に由来するものから選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、上記のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のうち少なくとも１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つが、１つ、２つ、または３つのアミノ酸の付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせによって修飾される。
【００６７】
一実施形態において、抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその断片は、以下のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＤＹＹＭＮ（配列番号９７）、ＨＣＤＲ２：ＶＩＮＰＮＮＧＧＴＴＹＫＥＫＦＫＧ（配列番号９８）、ＨＣＤＲ３：ＤＤＹＤＡＧＹ（配列番号９９）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１００）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＨＲＹＴ（配列番号１０１）、およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＴＤＦＰＬＴ（配列番号１０２）を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化されているが、重鎖上にある以下の復帰突然変異：Ｋａｂａｔナンバリングによる１２Ｖ、２０Ｍ、４８Ｉ、６８Ａ、７０Ｌ、７２Ｖ、７７Ｇ、および１１２Ｌ、ならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数を有する。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化されているが、軽鎖上にある以下の復帰突然変異：Ｋａｂａｔナンバリングによる１３Ｔおよび７８Ｖ、ならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数を有する。
【００６９】
重鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号９５および１０３〜１０６が挙げられる。軽鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号９６および１０７〜１０９が挙げられる。
【００７０】
一実施形態において、抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその断片は、以下のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＳＹＡＭＳ（配列番号１１２）、ＨＣＤＲ２：ＴＩＳＤＧＧＳＤＡＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号Ｃ２）、ＨＣＤＲ３：ＤＹＹＧＳＧＹＥＤＳＰＭＤＹ（配列番号１１５）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＡ（配列番号１１７）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＴＬＱＰ（配列番号１１８）、およびＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＮＬＹＴ（配列番号１１９）を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化されているが、軽鎖上にある以下の復帰突然変異：Ｋａｂａｔナンバリングによる４９Ｈ、５８Ｉ、７１Ｙ、および８３Ｆならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数を有する。
【００７２】
重鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１１０および１２０が挙げられる。軽鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１１１および１２１〜１２４が挙げられる。
【００７３】
一実施形態において、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基のうち１つまたは複数は、翻訳後修飾を回避するために異なるアミノ酸で置換される。例の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその断片は、以下のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＳＹＡＭＳ（配列番号１１２）、ＨＣＤＲ２：ＴＩＳＥＧＧＳＤＡＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号１１４）、ＨＣＤＲ３：ＤＹＹＧＳＧＹＥＥＳＰＭＤＹ（配列番号１１６）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＡ（配列番号１１７）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＴＬＱＰ（配列番号１１８）、およびＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＮＬＹＴ（配列番号１１９）を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化されているが、軽鎖上にある以下の復帰突然変異：Ｋａｂａｔナンバリングによる４９Ｈ、５８Ｉ、７１Ｙ、および８３Ｆならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数を有する。
【００７５】
重鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１５７が挙げられる。軽鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１１１および１２１〜１２４、特に配列番号１２１が挙げられる。
【００７６】
一実施形態において、抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその断片は、以下のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＲＹＷＭＳ（配列番号１２７）、ＨＣＤＲ２：ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ（配列番号１２８）、ＨＣＤＲ３：ＱＤＤＹＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号１３０）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＡ（配列番号１３１）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１３２）、およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＹＳＴＰＬＴ（配列番号１３３）を含む。
【００７７】
一実施形態において、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基のうち１つまたは複数は、翻訳後修飾を回避するために異なるアミノ酸で置換される。例の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその断片は、以下のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＲＹＷＭＳ（配列番号１２７）、ＨＣＤＲ２：ＥＩＮＰＥＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ（配列番号１２９）、ＨＣＤＲ３：ＱＤＤＹＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号１３０）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＡ（配列番号１３１）、ＬＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１３２）、およびＬＣＤＲ３：ＱＱＹＹＳＴＰＬＴ（配列番号１３３）を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化されているが、重鎖上にある以下の復帰突然変異：Ｋａｂａｔナンバリングによる５Ｑ、４７Ｉ、４８Ｇおよび８５Ｖ、ならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数を有する。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化されているが、軽鎖上にある以下の復帰突然変異：Ｋａｂａｔナンバリングによる７８Ｖのうち１つまたは複数を有する。
【００７９】
重鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１２５および１３４〜１３７が挙げられる。軽鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１２６および１３８〜１３９が挙げられる。
【００８０】
ヒト化後、７１Ｆ４Ａ３抗体は、さらに親和性成熟の過程を経た。以下に、７１Ｆ４Ａ３の様々なバリアント由来のＣＤＲ配列を表Ｂに提供し、表Ｃにまとめる。
表Ｂ．７１Ｆ４Ａ３に由来する抗体およびそのＣＤＲ
【表１０】
2021513324.tif 000011
【表１１】
2021513324.tif 000012
【表１２】
2021513324.tif 000013
【表１３】
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【表１４】
2021513324.tif 000015
【表１５】
2021513324.tif 000016
表Ｃ．７１Ｆ４Ａ３に由来する抗体のＣＤＲのまとめ
【表１６】
2021513324.tif 000017
【表１７】
2021513324.tif 000018
【００８１】
一実施形態において、提供されるのは、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する抗体またはその断片であり、ここで、抗体またはその断片は、表Ｂまたは表Ｃに列挙されるＣＤＲ配列を含む。
【００８２】
一実施形態において、提供されるのは、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する抗体またはその断片であり、ここで、抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２，およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を備え、ここで、ＨＣＤＲ１は配列番号１２７のアミノ酸配列（ＲＹＷＭＳ）を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１２８（ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号１２９（ＥＩＮＰＥＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４０（ＥＩＮＰＥＡＳＳＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４３、（ＥＩＮＰＥＡＧＫＷＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４７（ＥＩＮＰＥＴＴＩＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３４９（ＥＩＮＰＥＳＴＬＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５１（ＩＮＰＥＳＴＧＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５４（ＥＩＮＰＥＳＮＦＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３５７（ＥＩＮＰＥＲＮＹＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、配列番号３６９（ＥＩＮＰＥＡＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）、または配列番号３７０（ＥＩＮＰＥＳＳＳＩＮＹＡＰＳＬＫＤ）のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１３０（ＱＤＤＹＥＹＹＡＭＤＹ）、配列番号３４１（ＱＤＤＹＳＨＹＡＭＤＹ）、配列番号３４４（ＱＤＤＹＴＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３４５（ＱＤＤＹＬＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３４８（ＱＤＤＹＲＨＹＡＭＤＹ）、配列番号３５０（ＱＤＤＹＲＮＹＡＭＤＹ）、配列番号３５２（ＱＤＤＹＷＴＹＡＭＤＹ）、配列番号３５５（ＱＤＤＹＳＶＹＡＭＤＹ）、配列番号３５８（ＱＤＤＹＤＫＹＡＭＤＹ）、配列番号３５９（ＱＤＤＹＥＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３６２（ＱＥＤＹＥＹＹＡＬＤＹ）、配列番号３６５（ＱＤＤＴＲＹＹＡＭＤＹ）、配列番号３６６（ＱＤＤＹＬＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３６７（ＱＤＤＹＥＴＹＴＭＤＹ）、配列番号３６８（ＱＤＤＹＬＴＹＴＭＤＹ）、配列番号３７１（ＱＤＤＹＳＹＹＴＭＤＹ）、配列番号３７２（ＱＤＤＹＥＨＹＴＭＤＹ）、または配列番号３７３（ＱＤＤＹＳＨＹＴＭＤＹ）のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１３１（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＡ）、配列番号３４２（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＳ）、配列番号３４６（ＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＤ）、配列番号３５３（ＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＳ）、配列番号３５６（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＴ）、配列番号３６０（ＫＶＳＱＤＶＮＴＧＶＡ）、または配列番号３６３（ＫＡＳＱＤＶＮＴＧＶＹ）のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１３２（ＳＡＳＹＲＹＴ）のアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３は、配列番号１３３（ＱＱＹＹＳＴＰＬＴ）、配列番号３６１（ＱＱＹＷＳＴＰＬＴ）、または配列番号３６４（ＱＱＧＹＳＴＰＬＴ）のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３６７、３６０、１３２、および１３３を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１８１のアミノ酸配列、または配列番号１８１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１７９のアミノ酸配列、または配列番号１７９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、抗体または断片はヒト化され、ここで、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔナンバリングによる５Ｑ、４７Ｉ、４８Ｇ、および８５Ｖ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含む、または軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔナンバリングによる突然変異７８Ｖを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は配列番号１８１のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号１７９のアミノ酸配列を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３５９、３６０、１３２、および１３３を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１７４のアミノ酸配列、または配列番号１７４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１７９のアミノ酸配列、または配列番号１７９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、３５９、３６０、１３２、および３６１を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１７４のアミノ酸配列、または配列番号１７４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１７５のアミノ酸配列、または配列番号１７５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、および１３３を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列、または配列番号１５６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３８のアミノ酸配列、または配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、および１３３を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３８のアミノ酸配列、または配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９０】
一実施形態において、抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその断片は、以下のＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＤＹＹＭＡ（配列番号１４２）、ＨＣＤＲ２：ＳＩＮＹＤＧＧＤＴＹＹＲＤＳＶＫＧ（配列番号１４３）、ＨＣＤＲ３：ＥＥＤＹＤＧＳＹＶＭＤＡ（配列番号１４４）、ＬＣＤＲ１：ＫＡＳＱＮＩＮＫＥＬＴ（配列番号１４５）、ＬＣＤＲ２：ＮＴＮＩＬＱＴ（配列番号１４６）、およびＬＣＤＲ３：ＬＱＱＳＳＬＹＴ（配列番号１４７）を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化されているが、重鎖上にある以下の復帰突然変異：Ｋａｂａｔナンバリングによる２４Ｖ、７０Ｖ、９８Ｔ、および１０５Ａ、ならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数を有する。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化されているが、軽鎖上にある以下の復帰突然変異：Ｋａｂａｔナンバリングによる５８Ｉ、７１Ｙ、および８７Ｆ、ならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数を有する。
【００９２】
重鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１４０および１４８〜１５１が挙げられる。軽鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１４１および１５２〜１５５が挙げられる。
【００９３】
ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＬ１３タンパク質両方に対して交差結合する抗体が、公知の抗ＣＸＣＬ１３抗体とは異なるエピトープを標的とすることは、興味深い発見であった。したがって、一実施形態において、提供されるのは、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質に特異性を有する抗体またはその断片であり、ここで、抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、Ｒ２４、およびＦ２５からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基に結合することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０およびＰ２２、Ｆ２０およびＲ２４、Ｆ２０およびＦ２５、Ｐ２２およびＲ２４、Ｐ２２およびＦ２５、またはＲ２４およびＦ２５に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、およびＲ２４；Ｆ２０、Ｐ２２、およびＦ２５；Ｆ２０、Ｒ２４およびＦ２５；またはＰ２２、Ｒ２４およびＦ２５に結合することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３タンパク質のＦ２０、Ｐ２２、Ｒ２４、およびＦ２５に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体またはその断片はさらに、カニクイザルＣＸＣＬ１３タンパク質に結合することができる。
【００９６】
本開示のＣＤＲ、重鎖可変領域、および軽鎖可変領域は、さらに修飾され得る。いくつかの実施形態において、修飾された重鎖可変領域または軽鎖可変領域は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を維持し、それでもなおＣＸＣＬ１３に結合可能である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、修飾とは、ＣＤＲのそれぞれに由来する１つ以下のホットスポット位置での置換である。いくつかの実施形態において、修飾とは、１つ、２つ、または３つのそのようなホットスポット位置での置換である。一実施形態において、修飾とは、ホットスポット位置のうちの１つでの置換である。そのような置換は、いくつかの実施形態において、保存的置換である。
【００９８】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは当技術分野で定義されており、それには、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、免疫グロブリンポリペプチドにおける非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリ由来の別のアミノ酸残基で置き換えられることが好ましい。別の実施形態において、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリメンバの順序および／または組成が異なる構造的に類似のストリングで置換えることができる。
【００９９】
保存的アミノ酸置換の非限定的な例を以下の表に示し、ここで、類似性スコアが０以上であれば、２つのアミノ酸間の保存的置換を表す。
アミノ酸類似性マトリックス
【表１８】
2021513324.tif 000019
保存的アミノ酸置換
【表１９】
2021513324.tif 000020
【０１００】
本明細書で開示される抗体は、抗体が由来した天然に存在する結合ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるように修飾されてもよいことも当業者には理解されるであろう。たとえば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は類似であってもよく、たとえば、出発配列に対してある特定のパーセントの同一性を有し、たとえば、出発配列に対して６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であってもよい。
【０１０１】
特定の実施形態において、抗体は、通常は抗体と関連付けられていないアミノ酸配列または１つまたは複数の部分を含む。例示的な修飾は、さらに詳細に以下で説明される。たとえば、本開示の抗体は、フレキシブルリンカ配列を含んでもよく、または機能性の部分（たとえば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または標識）を付加するように修飾されてもよい。
【０１０２】
本開示の抗体、バリアント、またはその誘導体は、すなわち、共有結合が、抗体がエピトープに結合することを阻止しないような、任意の種類の分子の抗体への共有結合によって、修飾された誘導体を含む。たとえば、限定する目的ではないが、たとえば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって、抗体を修飾することができる。多数の化学修飾のうち任意のものは、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない公知の手法によって実行されてもよい。さらに、抗体は１つまたは複数の非古典的アミノ酸であってもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬品、またはＰＥＧに共役していてもよい。
【０１０４】
抗体は、放射性標識、免疫調節物質、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤または診断用薬、薬剤もしくは毒素であってもよい細胞傷害性薬剤、超音波増強剤、非放射性標識、それらの組み合わせ、および当技術分野で公知のそのような他の薬剤などの検出可能な標識を含んでもよい治療剤に共役または融合していてもよい。
二機能性分子
【０１０５】
二重特異性抗体などの二機能性分子も提供される。一実施形態において、二機能性分子は、ＣＸＣＬ１３に対する第１の特異性、および第２の特異性を有する。第２の特異性は、一実施形態において、別のサイトカインまたは免疫細胞に対する。
【０１０６】
たとえば、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）は、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリメンバ１３Ｂとしても公知であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリに属するサイトカインである。このサイトカインは、受容体ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、およびＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ／ＢＡＦＦ−Ｒのためのリガンドである。このサイトカインは、Ｂ細胞系列の細胞において発現され、強力なＢ細胞活性化因子として働く。このサイトカインは、Ｂ細胞の増殖および分化において重要な役割を果たすことも示されている。抗ＢＡＦＦ特異性は、ベリムマブなどの抗ＢＡＦＦ抗体に由来し得る。
【０１０７】
別の例において、第２の特異性は、ＩＦＮαＲＩ（インターフェロン−アルファ／ベータ受容体アルファ鎖、またはＩＦＮＡＲ１）であり得る。Ｉ型ＩＦＮ、特にＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、自己免疫性および炎症性症候群の発症における役割のために注目されている。共通の受容体（ＩＦＮＡＲ）を介したシグナル伝達によって、これらの多面発現性サイトカインは、ＭＨＣおよび共刺激分子のアップレギュレーションならびに抗原提示細胞によるＢ細胞生存因子（ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ）の産生を含む、自然および適応免疫応答のほとんどすべての側面に影響を及ぼし、結果的に自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞の関与および拡大に達する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、貪食細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球、およびマスト細胞からなる群より選択される。標的とされ得る免疫細胞上の分子としては、たとえば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２８、およびＣＤ６４が挙げられる。他の例としては、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３としても公知である）、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても公知である）、ＴＩＭ３、ＯＸ−４０またはＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＥＶＭまたはＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知である）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）およびＣＤ４７が挙げられる。
【０１０９】
抗ＣＸＣＬ１３特異性はまた、腫瘍抗原への特異性と組み合わせることができる。「腫瘍抗原」は腫瘍細胞において産生される抗原物質である、すなわち、「腫瘍抗原」は宿主において免疫応答を引き起こす。腫瘍抗原は腫瘍細胞の同定において有用であり、がん治療での使用に関して有望な候補である。体内の正常なタンパク質は抗原性ではない。しかしながら、ある特定のタンパク質は、腫瘍発生中に産生される、または過剰発現され、したがって、体にとって「異質である」ようにみえる。このことは、免疫系から十分に隔絶された正常なタンパク質、正常には極めて少ない量で産生されるタンパク質、正常には発生のある特定の段階でのみ産生されるタンパク質、または突然変異のために構造が改変されたタンパク質を含む場合がある。
【０１１０】
腫瘍抗原の存在量は当技術分野で公知であり、新規腫瘍抗原は容易にスクリーニングによって同定することができる。腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、およびテネイシンが挙げられる。
【０１１１】
異なる形式の二重特異性抗体も提供される。いくつかの実施形態において、抗ＣＸＣＬ１３断片のそれぞれ、および第２の断片それぞれは独立して、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体から選択される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体はＦｃ断片をさらに含む。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法
【０１１２】
本開示はまた、本開示の抗体、バリアント、またはその誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上の、または別々のポリヌクレオチド分子上の、抗原結合ポリペプチド、バリアント、またはその誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域全体をコードしてもよい。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上の、または別々のポリヌクレオチド分子上の、抗原結合ポリペプチド、バリアント、またはその誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分をコードしてもよい。
【０１１３】
抗体を作製する方法は当技術分野で周知であり、本明細書で説明される。特定の実施形態において、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域および定常領域の両方は、完全にヒトである。完全にヒトである抗体は、当技術分野で説明され、本明細書で説明される手法を用いて作製することができる。たとえば、特異的抗原に対する完全にヒトである抗体は、抗原投与に応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、内因性遺伝子座は無効にされたトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作製するために用いられ得る例示的な手法は、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、同第６，４５８，５９２号明細書、同第６，４２０，１４０号明細書に記載されており、その全体を参照により引用される。
治療および診断法
【０１１４】
本明細書で説明されるように、本開示の抗体、バリアントまたは誘導体は、ある特定の治療および診断法において用いられてもよい。
【０１１５】
本開示はさらに、本明細書に記載される障害または状態のうち１つまたは複数を治療するために、動物、哺乳動物、およびヒトなどの患者に本開示の抗体を投与する段階を包含する抗体ベースの治療法を対象とする。本開示の治療用化合物としては、本開示の抗体（本明細書で説明されるバリアントおよびその誘導体を含む）、および本開示の抗体をコードする核酸またはポリヌクレオチド（本明細書で説明されるバリアントおよびその誘導体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
一実施形態により、それを必要とする患者において免疫応答を抑制する方法が提供される。方法は、本開示の抗体、断片、または二機能性分子を患者に投与する段階を含意する。いくつかの実施形態において、患者は、組織または臓器移植レシピエントである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害を治療する方法が提供される。自己免疫疾患または障害の非限定的な例としては、１型糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬／乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ループス）、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血、およびセリアック病が挙げられる。
【０１１８】
本開示の抗体は、がんを治療または阻害することができる。したがって、いくつかの実施形態において、提供されるのは、それを必要とする患者においてがんを治療するための方法である。方法は、一実施形態において、本開示の抗体の有効量を患者に投与する段階を含意する。がんの非限定的な例としては、膀胱癌、肝臓癌、大腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、黒色腫、前立腺癌、および甲状腺癌が挙げられる。
【０１１９】
細胞生存の増大に関連付けられる、本開示の抗体もしくはバリアント、またはその誘導体で治療されても、予防されても、診断されても、かつ／または予測されてもよい追加の疾患または状態としては、白血病（急性白血病（たとえば急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（たとえば慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（たとえばホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽腫などの肉腫および癌腫を含むがこれらに限定されない固形腫瘍などの、悪性腫瘍および関連する疾患の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
任意の特定の患者のための具体的な投与量および治療レジメンは、使用される特定の抗体、バリアントまたはその誘導体、患者の年齢、体重、総体的な健康、性別、および食習慣、ならびに投与時間、排出率、薬物の組み合わせ、および治療される特定の疾患の重症度を含む様々な因子に応じて決まる。医療介護者がそのような因子を判断することは、当技術分野の通常の技術の範囲内である。量も、治療される個々の患者、投与経路、製剤の種類、用いられる化合物の特性、疾患の重症度、および所望の効果に応じて決まる。使用量は、当技術分野で周知である薬理学的および薬物動態学的原理よって決定され得る。
【０１２１】
抗体、バリアント、またはその誘導体の投与の方法としては、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合ポリペプチドまたは組成物は、任意の簡便な経路、たとえば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の内層（たとえば、口腔粘膜、直腸粘膜、腸管粘膜など）を介した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的活性剤と一緒に投与されてもよい。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含有する医薬組成物は、経口的に、経直腸的に、非経口的に、大槽内に、腟内に、腹腔内に、局所的に（粉剤、軟膏剤、点滴剤、または経皮パッチによってのように）、頬側に、または経口もしくは鼻腔用噴霧剤として投与されてもよい。
【０１２２】
本明細書で用いられるように、「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下、皮下、および関節内注射および注入を含む投与の様式を指す。
【０１２３】
投与は、全身性または局所的であり得る。さらに、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適切な経路で中枢神経系へと本開示の抗体を導入することは望ましい場合があり、脳室内注射を、たとえばオマヤレザバなどのレザバに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易にしてもよい。経肺投与を、たとえば吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を有する製剤を使用することによって用いることもできる。
【０１２４】
本開示の抗原結合ポリペプチドまたは組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、限定する目的ではないが、たとえば、外科手術中の局所的注入、局所適用、たとえば外科手術後の創傷被覆材と併せて、注射によって、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、または留置用剤を用いて達成されてもよく、上記留置用剤は、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の物質であり、シラスティック膜などの膜、または繊維を含む。好ましくは、本開示の抗体を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収していかない材料を使用するように注意しなければならない。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、試料中のヒトケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）タンパク質の発現を検出する方法も提供され、方法は、試料を抗体またはその断片に接触させる段階と、試料中のＣＸＣＬ１３の発現を示す結合を検出する段階とを含む。
組成物
【０１２６】
本開示はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、抗体の有効量、および許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、第２の抗がん剤（たとえば、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。
【０１２７】
特定の実施形態において、「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されている、または動物およびより詳細にはヒトにおける使用に関して、米国薬局方もしくは一般に認知されている他の薬局方に収載されていることを意味する。さらに、「医薬的に許容される担体」は、一般に、任意の種類の、非毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、封入材料、または製剤補助剤である。
【０１２８】
「担体」という用語は、治療効果のあるものが共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒を指す。そのような医薬的担体は、水、および石油、動物、野菜または合成起源のものを含む油、たとえばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油などの、滅菌液であり得る。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水は好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液はまた、特に、注射用溶液のために、液体担体として用いることができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤、または酢酸塩、クエン酸塩、もしくはリン酸塩などのｐＨ緩衝剤を含有することができる。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧の調節のための剤も、想定される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤および担体を有する坐剤として処方することができる。経口製剤は、たとえば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適切な医薬的担体の例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されており、当文献は参照により本明細書に引用される。そのような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するために、好ましくは精製した形態で、好適な量の担体と一緒に、治療効果のある量の抗原結合ポリペプチドを含有する。製剤は、投与の様式に敵ったものであるべきである。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくは合成樹脂製の複数回用量バイアルに密封され得る。
【０１２９】
ある実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として慣例的手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張緩衝水溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位における痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。概して、成分は、たとえば、活性剤の量を示すアンプルまたは小袋などの密封された容器中の凍結乾燥した粉末または水を含まない濃縮物として、個別にまたは単位剤形中に混合されて供給される。組成物が注入によって投与されることになる場合、医薬品グレードの滅菌水または生理食塩水を含有する注入瓶を用いて分注することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合されていてもよいように、提供され得る。
【０１３０】
本開示の化合物は、中性または塩の形態として処方され得る。医薬的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンを有して形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンを有して形成されるものが挙げられる。
実施例
実施例１．ヒトＣＸＣＬ１３に対するマウスモノクローナル抗体の生成
【０１３１】
この実施例は、ハイブリドーマ技術を用いた抗ヒトＣＸＣＬ１３マウスモノクローナル抗体の生成を示す。
免疫化
【０１３２】
組換えヒトＣＸＣＬ１３タンパク質を、免疫原として使用し、抗ヒトＣＸＣＬ１３抗体を産生させた。第１に、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ、ＳＪＬマウスまたはウィスターラットを、５０μｇの免疫原で皮下的に（ｓ．ｃ．）免疫し、次に、隔週で、２５μｇの免疫原で腹腔内に（ｉ．ｐ．）またはｓ．ｃ．に免疫した。免疫応答を後眼窩出血によって監視した。血漿をＥＬＩＳＡ結合アッセイによってスクリーニングした。手短に言えば、ヒトＣＸＣＬ１３またはマウスＣＸＣＬ１３またはカニクイザルＣＸＣＬ１３を、一晩０．５μｇ／ｍｌでコーティングし、次に、５％ＢＳＡのＰＢＳによってブロッキングした。連続希釈した血清を、室温（ＲＴ）にて１時間、コーティングした抗原と共にインキュベートした。得られたプレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、ＲＴにて１時間、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰと共にインキュベートした。プレートをＴＭＢ基質で現像し、１ＮのＨＣｌで停止させ、分光光度計によってＯＤ４５０〜６３０ｎｍで分析した。高力価の抗ＣＸＣＬ１３免疫グロブリンを有するマウスを、融合およびさらなるスクリーニングのために選択した。屠殺および脾臓の除去の４日前に、マウスを２５μｇの抗原でｉ．ｐ．に追加免疫した。脾臓は融合に用いた。
融合およびハイブリドーマスクリーニング
【０１３３】
脾細胞をマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０細胞と電気融合させ、９６ウェル培養プレートに播種した。ハイブリドーマ上清を、抗ヒトＣＸＣＬ１３バインダに関してＥＬＩＳＡ結合アッセイによって試験した。正の結合クローンの上清を、細胞ベースの受容体遮断ＥＬＩＳＡアッセイによって、ヒトＣＸＣＬ１３の、そのリガンドＣＸＣＲ５への結合の遮断における機能に関してスクリーニングした。簡潔には、５×１０４個のＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞を、１００μｌの培養培地を有する９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＲＴにて１時間、１００μｌの２％ＰＦＡで固定した。ＲＴにて１時間、１％ＢＳＡのＰＢＳＴでブロッキングを行った。上清をＰＢＳで希釈し、ＲＴにて３０分間、等体積の０．３μｇ／ｍｌのヒトＣＸＣＬ１３と共にプレインキュベートした。次に、ＲＴにて３０分間、１００μｌの抗体抗原複合体を各細胞ウェルに移した。試料を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌの３μｇ／ｍｌのヒトＭａｂ５２６１抗体を各ウェルに加え、ヒトＣＸＣＬ１３を捕捉し、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを用いて、ヒトＣＸＣＬ１３を、それがＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞に結合したとき、間接的に検出した。二次抗体を１００μｌのＴＭＢによって明示し、１００μｌの１ＮのＨＣｌで停止した。４５０ｎＭで読み取りを行った。
【０１３４】
このアッセイにおいて強い遮断能力を示すクローンをサブクローニングのために選択した。１回サブクローンの上清を用いて、ＥＬＩＳＡベースのヒトＣＸＣＬ１３またはマウスＣＸＣＬ１３またはカニクイザルＣＸＣＬ１３の結合および受容体遮断能力を確認し、続いて配列決定を行い、さらに分析した。これらのスクリーニング後、ヒトＣＸＣＬ１３およびカニクイザルＣＸＣＬ１３に交差結合する１９個のクローン（３２９Ｆ２Ｅ１、３４８Ｂ１０Ｂ１、３６０Ａ３Ｄ４Ｅ３、４１４Ｄ１０Ｆ５、３３９Ａ９Ｅ７、３３９Ｈ３Ｅ２、３６７Ｆ１Ｃ２、２１Ｈ１２Ｄ９、４０８Ｅ３Ｆ３、４１５Ａ３Ｄ１Ｆ４、３４８Ｅ１２Ｆ１２、３６８Ｄ６Ｄ１０、１Ｈ３Ａ１１、３５５Ａ１Ｆ６、３５３Ｆ９Ｃ４、１９Ｈ７Ｅ１０、４１１Ａ１１Ｅ９、６４Ｃ１０Ｇ１、３９７Ｃ３Ｂ３）を同定し、ヒトＣＸＣＬ１３およびマウスＣＸＣＬ１３に交差結合する１４個のクローン（４０２Ｈ２Ｇ１２、４０９Ｇ９Ｃ２、４１０Ａ４Ｄ１０、４１４Ｇ３Ｆ４、４１６Ｃ９Ｈ８、４１８Ｄ３Ｈ６、４２３Ａ６Ｈ６、４２４Ｈ７Ｆ２、４２７Ｃ４Ｆ１１、４３０Ｄ９Ｂ３、４３２Ｃ１２Ｅ１、４４２Ｃ９Ｈ４、４４５Ａ６Ｇ７、５３７Ｃ８Ｄ７）を同定し、ヒトＣＸＣＬ１３にのみ結合する１３個のクローン（１１９Ｈ１０Ｄ６、３０Ｄ６Ｇ１、１５６Ｈ３Ｈ７、１６８Ａ２Ｄ４、１６８Ｄ６Ｆ２、１７５Ｅ３Ｂ１０、１７７Ｄ２Ｇ１０、１７８Ｂ２Ｅ８、１７８Ｅ２Ｂ３、１８１Ｂ１１Ｇ１２、１８４Ｈ１０Ｂ５、３４５Ｇ１Ｂ４、３９６Ａ５Ａ１）を同定した。
【０１３５】
それらの抗体を、プロテインＧカラムと結合させることによってハイブリドーマ上清から精製し、ＥＬＩＳＡ結合アッセイおよび細胞ベースの遮断ＥＬＩＳＡアッセイによって特性付けした。結合特性および遮断特性を表１に列挙し、すべてのクローンの配列を表２に列挙した。ｈｕＣＸＣＬ１３のみに結合する、またはｈｕＣＸＣＬ１３およびマウスＣＸＣＬ１３両方に結合する２７個のクローンは、完全に、または部分的に遮断する活性を示した。ヒトＣＸＣＬ１３およびカニクイザルＣＸＣＬ１３両方に結合される１１／２０個のクローンは、ヒトＣＸＣＲ５に対してヒトＣＸＣＬ１３を完全に遮断するように思われた。ｈｕＣＸＣＬ１３およびｃｙｎｏＣＸＣＬ１３両方に結合される１１個の遮断抗体を、さらなる特性付けのためにキメラヒトＩｇＧ１抗体として作製した。
表１．結合特性および遮断特性
【表２０】
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【表２１】
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Ｎ．Ｂ．＝結合なし、ＮＡ＝該当なし
表２．スクリーニングから選択される抗体の配列
【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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実施例２．細胞ベースの遮断アッセイにおける抗ＣＸＣＬ１３キメラ抗体の遮断特性
【０１３６】
この実施例では、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞に対する抗ＣＸＣＬ１３キメラ抗体の遮断を試験した。簡潔には、５×１０４個のＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞を、１００μｌの培養培地を有する９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＲＴにて１時間、１００μｌの２％ＰＦＡで固定した。ＲＴにて１時間、１％ＢＳＡのＰＢＳＴで試料をブロッキングした。抗体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで５０μｇ／ｍｌから３倍連続希釈し、ＲＴにて３０分間、等体積の０．３μｇ／ｍｌのヒトＣＸＣＬ１３と共にプレインキュベートした。ＲＴにて３０分間、１００μｌの抗体抗原複合体を各細胞ウェルに移した。試料を１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌの３μｇ／ｍｌのヒトＭａｂ５２６１抗体を各ウェルに加え、ヒトＣＸＣＬ１３を捕捉し、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを用いて、ヒトＣＸＣＬ１３を、それがＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞に結合したとき、間接的に検出した。
【０１３７】
二次抗体を１００μｌのＴＭＢによって明示し、１００μｌの１ＮのＨＣｌで停止した。次に、４５０ｎＭで読み取った。ＩＣ５０値を表３にまとめ、これは遮断特性のＩＣ５０を示した。すべてのクローンの中で、４１５Ａ３Ｄ１、６４Ｃ１０Ｇ１、１Ｈ３Ａ１１、４１４Ｄ１０Ｆ５、４１１Ａ１１Ｅ９、２１Ｈ１２Ｄ９、７１Ｆ４Ａ３、３２９Ｆ２Ｅ１は完全に遮断する活性を示し、４０８Ｅ３Ｆ３、１９Ｈ７Ｅ１０、３３９Ａ６Ｅ７は部分的な遮断であるように思われた。
表３．キメラ抗体の遮断特性
【表３４】
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実施例３．抗ＣＸＣＬ１３キメラ抗体の結合特性
【０１３８】
ＥＬＩＳＡベース結合アッセイヒトＣＸＣＬ１３を機能的に遮断した抗体を、ｈｕＣＸＣＬ１３およびｃｙｎｏＣＸＣＬ１３に対する結合に関してより完全に特性付けした。簡潔には、１００μｌのヒトＣＸＣＬ１３またはカニクイザルＣＸＣＬ１３を、一晩０．５μｇ／ｍｌでコーティングし、次に、２００μｌの５％ＢＳＡのＰＢＳによってブロッキングした。連続希釈した抗体をＲＴにて３０分間、コーティングした抗原と共にインキュベートした。得られたプレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、ＲＴにて３０分間、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰと共にインキュベートした。プレートを、１×ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ基質で現像し、１ＮのＨＣｌで反応を停止させ、分光光度計によってＯＤ４５０〜６３０ｎｍで分析した。ＥＣ５０値を表４に示す。
表４．キメラ抗体の結合特性
【表３５】
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【０１３９】
表面プラズモン共鳴によるｈｕＣＸＣＬ１３結合親和性Ｆａｂを作製するために４１１Ａ１１Ｅ９、４１５Ａ３Ｄ１、６４Ｃ１０Ｇ１、２１Ｈ１２Ｄ９、３２９Ｆ２Ｅ１、７１Ｆ４Ａ３を選択し、結合親和性を試験した。ｈｕＣＸＣＬ１３に対する抗体の結合をＢｉａｃｏｒｅ  ８Ｋによって検査した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４をラニング緩衝液とし、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０を再生緩衝液とした。ＣＸＣＬ１３タンパク質を、アミンカップリング法を用いてＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に固定した（固定レベル約３０ＲＵ）。連続濃度（０〜１６ｎＭ）のＦａｂを固定したＣＸＣＬ１３上に３０μｌ／分の流速で注入した。解離相は６００秒であった。結果を下記の表５に示す。
表５．Ｂｉａｃｏｒｅにより試験した親和性
【表３６】
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実施例４．シグナル伝達アッセイにおける抗ＣＸＣＬ１３キメラ抗体の遮断特性
【０１４０】
抗ＣＸＣＬ１３キメラ抗体によるＣＸＣＬ１３誘発カルシウム流出の阻害。その時のヒトＣＸＣＬ１３での処理により、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞における細胞内カルシウムの流動をシミュレーションした。連続希釈した抗ＣＸＣＬ１３抗体をアッセイに加えたとき、抗体は、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞におけるカルシウム流出産生を用量依存的に阻害した。結合親和性および細胞ベースの遮断の結果に基づいて、このカルシウム流出アッセイにおいて試験するために６４Ｃ１０Ｇ１、１Ｈ３Ａ１１、４１１Ａ１１Ｅ９、２１Ｈ１２Ｄ９、７１Ｆ４Ａ３、３２９Ｆ２Ｅ１、および４１５Ａ３Ｄ１を選んだ。
【０１４１】
培地にいれたＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞（１．５×１０４個／ウェル）を３８４ウェルアッセイプレートにコーティングした。翌日、連続希釈した抗ＣＸＣＬ１３抗体と共に、またはそれなしで、３７℃で３０分間アッセイ緩衝液（ＨＥＰＥＳ、２０ｎＭのＨＢＳＳ）中で０．７５μｇ／ｍｌのｒｈＣＸＣＬ１３と共に細胞をインキュベートした。カルシウム色素ワーキング緩衝液を調製し、細胞に加えた。次に、混合物を細胞に移し、ＦＬＩＰＲＴＥＲＡによって蛍光強度（ＦＩ）を得る。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ５．０）ソフトウェアによって統計解析を実施した。
【０１４２】
図１に示すように、ＣＸＣＬ１３によって誘発された正のカルシウム流出のＦＩ（破線）と比較して、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞におけるＣＸＣＬ１３誘発カルシウム流出の遮断において、４１５Ａ３Ｄ１を除き、抗ＣＸＣＬ１３のすべてのキメラ抗体が同様に強力な活性を有した。
【０１４３】
抗ＣＸＣＬ１３キメラ抗体によるＣＸＣＬ１３媒介ＩＰ１シグナル伝達の遮断。ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞上の、Ｇタンパク質共役受容体であるリガンドＣＸＣＲ５に結合されたＣＸＣＬ１３により、イノシトール一リン酸（ＩＰ１）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）カスケードの活性化によって誘発されるＩＰ３の安定的な下流代謝産物、の蓄積が誘発され得る。ＩＰ１キット（Ｃｉｓｂｉｏ社）を用いて、抗ＣＸＣＬ１３抗体の遮断効果を試験した。キットは、ＨＴＲＦ技術によって細胞におけるＩＰ１蓄積を測定することを意図した、競争力のあるイムノアッセイである。細胞によって産生される天然のＩＰ１は、抗ＩＰ１クリプテートに対する結合に関して、ｄ２標識したＩＰ１と競合した。ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞がＣＸＣＬ１３で刺激されると、ＩＰ１が細胞によって産生され、ｄ２標識されたＩＰ１と競合し、ＣＸＣＬ１３で処理しない場合と比較して、検出シグナルがダウンレギュレーションされることになる。
【０１４４】
０．２５μｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１３を、連続希釈した抗ＣＸＣＬ１３抗体と共に、またはそれなしで、刺激培地（５ｍＭのＬｉＣｌを含有するＦ１２培養培地（その機能はＩＰ１を蓄積することである））で、３８４ウェルアッセイプレート中でＲＴにて２０分間インキュベートした。５×１０４個の細胞を各ウェルに移した。細胞インキュベータ中で１時間、プレートをインキュベートする（３７℃、加湿下、５％ＣＯ２）。インキュベーション後、ＩＰ１−ｄ２および抗ＩＰ１クリプテートのワーキング混合溶液を各ウェルに加えた。プレートをシールしてＲＴにて１時間インキュベートした。最後に、シールを除去し、プレートをＨＴＲＦ適合性の読み取り装置上で読み取り、６６５ｎｍ／６１５ｎｍでの値を得た。
【０１４５】
図２に示すように、ＩｇＧ曲線はＣＸＣＬ１３によって誘発されたＩＰ１の産生を意味する。破線は、ＣＸＣＬ１３処理なしのＣＨＯ−Ｋ１−ＣＸＣＲ５細胞におけるＩＰ１の基底レベルを表す。すべての抗ＣＸＣＬ１３抗体６４Ｃ１０Ｇ１、２１Ｈ１２Ｄ９、３２９Ｆ２Ｅ１、４１１Ａ１１Ｅ９、７１Ｆ４Ａ３、および１Ｈ３Ａ１１により、ＩＰ１シグナルを有効に用量依存的に遮断することができ、阻害効率は同様であった。
実施例５．抗ＣＸＣＬ１３キメラ抗体によるＣＸＣＬ１３由来細胞遊走のインビトロ遮断
【０１４６】
ＣＸＣＬ１３へのＢａＦ３−ＣＸＣＲ５（ヒト）細胞遊走の遮断。ＣＸＣＬ１３がその受容体ＣＸＣＲ５に結合し、細胞遊走を引き起こし得ることは公知である。遊走アッセイにおいて抗ＣＸＣＬ１３抗体の阻害効力を評価するために、ヒトＣＸＣＲ５過剰発現細胞株、ＢａＦ３−ＣＸＣＲ５細胞、を用いた。
【０１４７】
５０ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１３の混合物を、連続希釈した抗ＣＸＣＬ１３抗体と共に、またはそれなしで、希釈培地（ゲイ平衡塩類溶液＋０．１％ＢＳＡ）で、９６ウェル培養プレート中でＲＴにて３０分間インキュベートした。次に、６８．５μｌ／ウェルの混合物を５μｍ孔サイズのトランズウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３３８７）の底部に移す。１００μｌ／ウェル（６．５×１０５個の細胞）のＢａＦ３−ＣＸＣＲ５細胞を上部のチャンバに加えた。さらに、背景シグナルを除去するために、底部のプレートに加えた走化性培地および上部チャンバに加えた細胞のみを有するウェル。インキュベータ中で３時間インキュベートした後、チャンバを解体してすべての体積をプレートの底部から９６ウェル培養プレートに移した。１０μｌ／ウェルのレサズリン（Ｒ＆Ｄ社）をアッセイプレートに加え、プレートをさらに１６〜２４時間インキュベータ中でインキュベートした。蛍光を５４４ｎｍおよび５９０ｎｍの波長で測定した。
【０１４８】
背景シグナルを除去し、ＧｒａｐｈＰａｄ（ｖ５．０）ソフトウェアを使用して滴定適合曲線を得た。図３において、破線はＣＸＣＬ１３誘発遊走のＦＩを表す。抗ＣＸＣＬ１３抗体６４Ｃ１０Ｇ１、２１Ｈ１２Ｄ９、３２９Ｆ２Ｅ１、４１１Ａ１１Ｅ９、７１Ｆ４Ａ３、および１Ｈ３Ａ１１をアッセイに加えたとき、ＦＩは用量依存的にダウンレギュレーションされ、これは、抗ＣＸＣＬ１３抗体によってＢａＦ３−ＣＸＣＲ５細胞遊走が用量依存的に阻害されたことを意味する。このＢａＦ３−ＣＸＣＲ５細胞遊走における試験した抗体の阻害効力は、比較に値する。
【０１４９】
ＣＸＣＬ１３への初代ヒト扁桃細胞遊走の阻害。抗ＣＸＣＬ１３抗体の遮断機能をさらに検討するために、初代ヒト扁桃細胞遊走アッセイを用いた。初代ヒト扁桃細胞遊走に対する上記の抗ＣＸＣＬ１３抗体の効果を試験した。
【０１５０】
ヒト扁桃組織を１ｍＬ注射器プランジャでつぶし、７０μｍ細胞ろ過器を通過させた。細胞を収集しＰＢＳで洗浄する。次に、フィコールによってリンパ球を得る。走化性培地（０．５％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０）でリンパ球を洗浄および再懸濁する。次に、０．５μｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１３を、連続濃度の抗体または対照ＩｇＧと共に、走化性培地中でＲＴにて３０分間インキュベートする。１５０μｌ／ウェルの混合物を５μｍ孔サイズの９６ウェルトランズウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３３８７）の底部に移し、５０μｌ／ウェルのヒト扁桃細胞（５×１０５個の細胞）を上部チャンバに加えた。さらに、背景シグナルを除去するために、底部のプレートに走化性培地を、および上部チャンバに細胞を加えただけのウェルを設計する。インキュベータ中で３時間インキュベートした後、チャンバを解体してフィルタを廃棄する。１．６７μｇ／ｍｌのカルセインＡＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を各ウェルに加え、インキュベータ中でさらに２０分間インキュベートする。蛍光を４８５ｎｍおよび５２０ｎｍの波長で測定する。
【０１５１】
背景蛍光強度（ＦＩ）を生データから消去し、ＧｒａｐｈＰａｄ（ｖ５．０）ソフトウェアによってヒストグラムを得る。図４に示すように、処理したＩｇＧと比較して、すべての抗ＣＸＣＬ１３抗体により、滴定可能な様式で初代ヒト扁桃細胞の走化性が阻害された。
実施例６．カニクイザルにおける抗ＣＸＣＬ１３抗体療法のインビボ有効性
【０１５２】
正常な免疫応答において、ＣＸＣＬ１３およびその受容体ＣＸＣＲ５は、Ｂ細胞のホーミングおよび胚中心形成に関与している。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のＴ細胞依存抗体応答（ＴＤＡＲ）で免疫したカニクイザルは、包括的な免疫応答モデルである。この免疫応答において、抗原特異的抗体産生（すなわち、ＩｇＭからＩｇＧへの特異的抗体応答）によって、ＢおよびＴリンパ球相互作用、クラススイッチ、および胚中心形成を評価することができる。
【０１５３】
カニクイザルを２群（サル３匹／群）にランダム化し、０日目に１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのＫＬＨで筋肉内注射によって免疫した。−１、４、９日目に３０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＸＣＬ１３キメラ抗体６４Ｃ１０Ｇ１を静脈内注入を介して交互の末梢血管に投与した。等体積の生理食塩水を対照群サルと同時に投与した。−４、−１、４、９、および１４日目に抗ＫＬＨ特異的ＩｇＧ／ＩｇＭの検出のために橈側皮静脈または大腿静脈から血清を採取した。サル抗ＫＬＨ  ＩｇＧおよびＩｇＭの血清レベルのためのＥＬＩＳＡを製造業者の取扱説明書（Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＫＬＨＭ−３−ＩＮＴおよびＫＬＨＧ−３−ＩＮＴ））に従って実施した。１４日目に、全血を採取し、フィコールによって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得る。フローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって、Ｂ細胞集団（ＣＤ２０＋、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）およびＣＸＣＲ５（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）のＢ細胞表面上の発現を分析する。データ取得および解析は、ＦｌｏｗＪｏを使用して行った。
【０１５４】
図５のＡに示すように、生理食塩水群において個々の相違はあるものの、抗ＣＸＣＬ１３抗体６４Ｃ１０Ｇ１処理により抗ＫＬＨ特異的ＩｇＧの産生を阻害し得ることを認めることができた。図５のＢにおいて、ＫＬＨ特異的なＩｇＭレベルもわずかに阻害された。図５のＣに示すように、抗体６４Ｃ１０Ｇ１が、末梢血において抗原ＣＸＣＬ１３を中和し、抹消でＢ細胞集団を低減させることが推測された。末梢血でのＣＸＣＬ１３の低減により、その受容体ＣＸＣＲ５の結合および内在化を減少させ、これはひいては、図５のＤにおいてＢ細胞表面上のＣＸＣＲ５の発現を増大させた。このインビボモデルの結果は、抗ＣＸＣＬ１３抗体６４Ｃ１０Ｇ１が、胚中心形成の阻害を意味する、ＧＣ  Ｂ細胞産生、クラススイッチ、抗原特異的な高親和性抗体の産生の遮断において、強力な効力を有することを示した。
実施例７．代理抗ＣＸＣＬ１３マウスモノクローナル抗体によるマウス脾細胞のＣＸＣＬ１３依存遊走の遮断
【０１５５】
マウスＣＸＣＬ１３に交差結合することができる代理抗ＣＸＣＬ１３抗体４２４Ｈ７Ｆ２を実施例１において述べたハイブリドーマスクリーニングから得た。遮断活性を検討するために、ｒｍＣＸＣＬ１３誘発初代マウス脾細胞遊走に対する４２４Ｈ７Ｆ２の効果を試験した。
【０１５６】
１０日目に、アジュバントを有するＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスを屠殺し、その脾臓を得た。脾臓を１ｍＬ注射器プランジャでつぶし、４０μｍ細胞ろ過器を通過させた。赤血球を溶解緩衝液で溶解した。細胞をろ過し、走化性培地で洗浄した。１μｇ／ｍｌのｒｍＣＸＣＬ１３（Ｒ＆Ｄ社）を、異なる濃度の抗ＣＸＣＬ１３抗体４２４Ｈ７Ｆまたは対照ＩｇＧと共に室温にて３０分間インキュベートした。次に、１５０μｌ／ウェルの混合物を０．５μｍトランズウェルプレートの底部に、５０μｌ／ウェルの脾細胞（１×１０７／ｍｌ）を上部チャンバに移した。細胞インキュベータ中で３時間、トランズウェルプレートをインキュベートする。最後に、フィルタを廃棄し、１．６７μｇ／ｍｌのカルセイン−ＡＭを各ウェルに加え、さらに２０分間インキュベートする。蛍光を４８５ｎｍおよび５２０ｎｍの波長で測定する。
【０１５７】
図６における結果のように、４２４Ｈ７Ｆ２マウスモノクローナル抗体により、初代マウス脾細胞のマウスＣＸＣＬ１３への遊走を用量依存的に阻害することができた。
実施例８．マウスＮＰ−ＣＧＧモデルにおける抗ＣＸＣＬ１３マウスモノクローナル抗体療法のインビボ有効性
【０１５８】
抗ＣＸＣＬ１３抗体が、二次リンパ器官における胚中心（ＧＣ）形成、およびナイーブＢ細胞によるアイソタイプクラススイッチにおいてＣＸＣＬ１３機能の阻害を媒介できるかを判定するために、０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスをＮＰ−ＣＧＧ（１００μｇ／マウス）で腹腔内注射によって免疫し、−１、２、５、８、１１日目に、腹腔内を介して３０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＸＣＬ１３抗体４２４Ｈ７Ｆ２またはＰＢＳを注入した。１４日目に、マウスを屠殺し、脾臓におけるフローサイトメトリによって胚中心Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＩｇＤ−ＧＬ７＋Ｆａｓ＋）の集団、クラススイッチ（Ｂ２２０＋ＩｇＤ−ＧＬ７＋ＩｇＭ−ＩｇＧ１＋）を、血清におけるＥＬＩＳＡによって高親和性ＮＰ特異的（ＮＰ５）ＩｇＧ１レベルを、および脾臓におけるＩＨＣ染色（ＩｇＤ−ＰＮＡ＋）によってＧＣ形成を分析する。
【０１５９】
対照群と比較して、マウス脾臓において処理された抗ＣＸＣＬ１３抗体４２４Ｈ７Ｆ２によってＧＣ  Ｂ細胞集団は著しく減少した（図７のＡ）。図７のＢにおいて、ＩｇＧ１＋Ｂ細胞集団は４２４Ｈ７Ｆ２処理マウスにおいて低減し、これはクラススイッチが抗ＣＸＣＬ１３抗体によって障害されることを示した。また、４２４Ｈ７Ｆ２処理マウスの血清中のＮＰ５特異的ＩｇＧ１抗体の低減により、抗原特異的ＩｇＧ１の親和性成熟が抗ＣＸＣＬ１３抗体によって遮断されることが示された（図７のＣ）。ＩＨＣの結果は、対照群と比べて、抗ＣＸＣＬ１３抗体４２４Ｈ７Ｆ２処理をしたマウスにおいてＧＣ形成が著しく障害されることを直接的に示した（図７のＤ）。すべての結果を結び付けると、インビボＣＸＣＬ１３機能は抗ＣＸＣＬ１３抗体４２４Ｈ７Ｆ２によって有効に遮断されることが明らかとなった。
実施例９．決定的な結合残基を明らかにするための抗ＣＸＣＬ１３抗体のエピトープマッピング
【０１６０】
エピトープ結合の結果は、カニクイザルに交差結合するすべての抗ＣＸＣＬ１３抗体が、６４Ｃ１０Ｇ１、２１Ｈ１２Ｄ９、３２９Ｆ２Ｅ１、４１１Ａ１１Ｅ９、７１Ｆ４Ａ３、および１Ｈ３Ａ１１を含む、同じエピトープを有することを示した。抗原ＣＸＣＬ１３に対する決定的な結合残基を同定するために、６４Ｃ１０Ｇ１を用いてエピトープマッピングを行った。さらに、スクリーニングのために、公開された特許（国際公開第２０１２／０３１０９９Ａ２号）における配列に従って対照の抗体を合成した。
【０１６１】
異なるＷＴ構築物、または各アミノ酸がアラニンへの変異体であり、全体で８７個のアミノ酸である６４Ｃ１０Ｇ１  Ｆａｂ変異構築物で、細胞をトランスフェクションした。次に、アラニン走査ライブラリにおける各変異クローンに対する試験Ｆａｂの結合を、高スループットフローサイトメトリによって２連で決定した。各点で、背景蛍光を生データから減算し、次いでＷＴ標的タンパク質とのＦａｂの反応性に正規化した。各変異クローンに関して、発現の関数として、平均結合値をプロットした（対照の反応性によって表される）。予備的な初代の決定的なクローン（赤円）を同定するために、対照Ａｂに結合するＷＴが＞７０％、かつ、試験Ｆａｂに結合するＷＴが＜２０％であるという閾値（破線）を適用した。
【０１６２】
図８のＡに示すように、右下角（赤円）の変異クローンは、設定された閾値を満たし、その突然変異は６４Ｃ１０Ｇ１  Ｆａｂに対する結合が負であるが、Ｆ２０、Ｐ２２、Ｒ２４、およびＦ２５（表６）を含む対照Ｆａｂに対する結合が正であり、これはこれらの残基が６４Ｃ１０Ｇ１  Ｆａｂ結合に関して決定的であることを示した。図８のＢに結晶構造の略図を描画し、この結晶構造上に６４Ｃ１０Ｇ１  Ｆａｂ結合に決定的な残基を可視化し、示した。
表６：６４Ｃ１０Ｇ１  Ｆａｂ結合に決定的な残基の同定
【表３７】
2021513324.tif 000038
実施例１０．マウスｍＡｂヒト化および親和性の決定
Ａ．２１Ｈ１２Ｄ９
【０１６３】
マウス抗体２１Ｈ１２Ｄ９可変領域遺伝子を用いてヒト化ＭＡｂを作製した。このプロセスの第１のステップにおいて、２１Ｈ１２Ｄ９のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列を入手可能なヒトＩｇ遺伝子配列データベースに対して比較し、総じて最も合致するヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を同定した。重鎖に関して、最も近いヒトの合致はＩＧＨＶ１−２＊０２遺伝子であった。軽鎖に関して、最も近いヒトの合致はＩＧＫＶ１−１２＊０１遺伝子であった。
【０１６４】
次に、ヒト化可変ドメイン配列を設計し、ここで、２１Ｈ１２Ｄ９  ＶＨのＣＤＲ１〜３の配列をＩＧＨＶ１−２＊０２遺伝子のフレームワーク配列に移植し、２１Ｈ１２Ｄ９軽鎖のＣＤＲ１〜３をＩＧＫＶ１−１２＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植した。そして次に、ヒトアクセプタｐｉｒ｜｜Ｓ４９５３０抗Ｓｍ抗体ＶＨ鎖（ＶＨ１／ＤＫ１またはＤＭ１／ＪＨ４ｂ）−ヒトをＣＤＲ移植のために選択し、ヒト化ＶＨ１を得た。ＡＩＴ３８６５３．１免疫グロブリンＧ重鎖可変領域、部分［ホモサピエンス］をＣＤＲ移植のために選択し、ヒト化ＶＬ１を得た。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えることが結合および／またはＣＤＲコンフォメーションに影響し得る任意のフレームワーク位置が存在するかを判定した。重鎖の場合、ヒトフレームワークにおけるＫ１２、Ｖ２０、Ｍ４８、Ｖ６８、Ｍ７０、Ｒ７２、Ｓ７７、およびＶ１１２（Ｋａｂａｔナンバリング）を同定し、マウスのそれらに対応するアミノ酸、すなわちＫ１２Ｖ、Ｖ２０Ｍ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｓ７７Ｇ、およびＶ１１２Ｌへの復帰突然変異に供した。軽鎖の場合、ヒトフレームワークにおけるＡ１３、Ｌ７８（Ｋａｂａｔナンバリング）を同定し、マウスのそれらに対応するアミノ酸、すなわちＡ１３Ｔ、Ｌ７８Ｖへの復帰突然変異に供した。
表７．２１Ｈ１２Ｄ９マウス抗体配列およびＣＤＲ
【表３８】
2021513324.tif 000039
【０１６５】
ヒト化配列を表８に列挙する：２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＨ１および２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＬ１は完全にヒト化された配列であり、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＨ２、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＨ３、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＨ４、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＬ２、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＬ３は異なる復帰突然変異を有する配列である。
表８．ヒト化配列
【表３９】
2021513324.tif 000040
Ｂ．６４Ｃ１０Ｇ１
【０１６６】
マウス抗体６４Ｃ１０Ｇ１可変領域遺伝子を用いてヒト化ＭＡｂを作製した。このプロセスの第１のステップにおいて、６４Ｃ１０Ｇ１のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列を入手可能なヒトＩｇ遺伝子配列データベースに対して比較し、総じて最も合致するヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を捜し出した。重鎖に関して、最も近いヒトの合致はＩＧＨＶ３−７＊０１遺伝子であった。軽鎖に関して、最も近いヒトの合致はＩＧＫＶ１−３３＊０１遺伝子であった。次に、ヒト化可変ドメイン配列を設計し、ここで、６４Ｃ１０Ｇ１  ＶＨのＣＤＲ１〜３の配列をＩＧＨＶ３−７＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植し、６４Ｃ１０Ｇ１軽鎖のＣＤＲ１〜３をＩＧＫＶ１−３３＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植した。そして次に、ヒトアクセプタＡＡＶ４８９５４．１：抗肺炎球菌抗体８Ｂ３免疫グロブリン重鎖可変領域、部分［ホモサピエンス］をＣＤＲ移植のために選択し、ヒト化ＶＨ１を得た。ＡＣＹ７８４１６．１：免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域、部分［ホモサピエンス］をＣＤＲ移植のために選択し、ヒト化ＶＬ１を得た。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えることが結合および／またはＣＤＲコンフォメーションに影響し得る任意のフレームワーク位置が存在するかを判定した。軽鎖の場合、ヒトフレームワークにおけるＹ４９、Ｖ５８、Ｆ７１、Ｉ８３（Ｋａｂａｔナンバリング）を同定し、マウスのそれらに対応するアミノ酸、すなわちＹ４９Ｈ、Ｖ５８Ｉ、Ｆ７１Ｙ、Ｉ８３Ｆへの復帰突然変異に供した。
表９．６４Ｃ１０Ｇ１マウス抗体配列およびＣＤＲ
【表４０】
2021513324.tif 000041
【０１６７】
ヒト化配列を表１０に列挙する：６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１および６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＬ１は完全にヒト化された配列であり、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＬ２、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＬ３は異なる復帰突然変異を有する配列である。
表１０．ヒト化配列
【表４１】
2021513324.tif 000042
Ｃ．７１Ｆ４Ａ３
【０１６８】
マウス抗体７１Ｆ４Ａ３可変領域遺伝子を用いてヒト化ＭＡｂを作製した。このプロセスの第１のステップにおいて、７１Ｆ４Ａ３のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列を入手可能なヒトＩｇ遺伝子配列データベースに対して比較し、総じて最も合致するヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を捜し出した。重鎖に関して、最も近いヒトの合致はＩＧＨＶ３−７＊０１遺伝子であった。軽鎖に関して、最も近いヒトの合致はＩＧＫＶ１−３３＊０１遺伝子であった。次に、ヒト化可変ドメイン配列を設計し、ここで、７１Ｆ４Ａ３  ＶＨのＣＤＲ１〜３の配列をＩＧＨＶ３−７＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植し、７１Ｆ４Ａ３軽鎖のＣＤＲ１〜３をＩＧＫＶ１−３３＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植した。そして次に、ヒトアクセプタＡＡＡ１８２８０．１：免疫グロブリン重鎖可変領域、部分［ホモサピエンス］をＣＤＲ移植のために選択し、ヒト化ＶＨ１を得た。ＡＣＹ７８４１６．１：免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域、部分［ホモサピエンス］をＣＤＲ移植のために選択し、ヒト化ＶＬ１を得た。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えることが結合および／またはＣＤＲコンフォメーションに影響し得る任意のフレームワーク位置が存在するかを判定した。重鎖の場合、ヒトフレームワークにおけるＥ５、Ｖ４７、Ａ４８、Ｌ８５（Ｋａｂａｔナンバリング）を同定し、マウスのそれらに対応するアミノ酸、すなわちＥ５Ｑ、Ｖ４７Ｉ、Ａ４８Ｇ、Ｌ８５Ｖへの復帰突然変異に供した。軽鎖の場合、ヒトフレームワークにおけるＬ７８（Ｋａｂａｔナンバリング）を同定し、マウスのそれらに対応するアミノ酸、すなわちＬ７８Ｖへの復帰突然変異に供した。
表１１．７１Ｆ４Ａ３マウス抗体配列およびＣＤＲ
【表４２】
2021513324.tif 000043
【０１６９】
ヒト化配列を表１２に列挙する：７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１および７１Ｆ４Ａ３−ＶＬ１は完全にヒト化された配列であり、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ２、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ３、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ４、７１Ｆ４Ａ３−ＶＬ２は異なる復帰突然変異を有する配列である。
表１２．ヒト化配列
【表４３】
2021513324.tif 000044
Ｄ．４１１Ａ１１Ｅ９
【０１７０】
マウス抗体４１１Ａ１１Ｅ９可変領域遺伝子を用いてヒト化ＭＡｂを作製した。このプロセスの第１のステップにおいて、４１１Ａ１１Ｅ９のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列を入手可能なヒトＩｇ遺伝子配列データベースに対して比較し、総じて最も合致するヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列を同定した。重鎖に関して、最も近いヒトの合致はＩＧＨＶ３−７＊０１遺伝子であった。軽鎖に関して、最も近いヒトの合致はＩＧＫＶ１−１７＊０１遺伝子であった。
【０１７１】
次に、ヒト化可変ドメイン配列を設計し、ここで、４１１Ａ１１Ｅ９  ＶＨのＣＤＲ１〜３の配列をＩＧＨＶ３−７＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植し、４１１Ａ１１Ｅ９軽鎖のＣＤＲ１〜３をＩＧＫＶ１−１７＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植した。そして次に、ヒトアクセプタＡＣＳ９６１７７．１免疫グロブリン重鎖可変領域、部分［ホモサピエンス］をＣＤＲ移植のために選択し、ヒト化ＶＨ１を得た。ＡＡＺ０９０５０．１：免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域、部分［ホモサピエンス］をＣＤＲ移植のために選択し、ヒト化ＶＬ１を得た。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えることが結合および／またはＣＤＲコンフォメーションに影響し得る任意のフレームワーク位置が存在するかを判定した。重鎖の場合、ヒトフレームワークにおけるＡ２４、Ｉ７０、Ｒ９８、Ｔ１０５（Ｋａｂａｔナンバリング）を同定し、マウスのそれらに対応するアミノ酸、すなわちＡ２４Ｖ、Ｉ７０Ｖ、Ｒ９８Ｔ、Ｔ１０５Ａへの復帰突然変異に供した。軽鎖の場合、ヒトフレームワークにおけるＶ５８、Ｆ７１、Ｙ８７（Ｋａｂａｔナンバリング）を同定し、マウスのそれらに対応するアミノ酸、すなわちＶ５８Ｉ、Ｆ７１Ｙ、Ｙ８７Ｆへの復帰突然変異に供した。
表１３．４１１Ａ１１Ｅ９マウス抗体配列およびＣＤＲ
【表４４】
2021513324.tif 000045
【０１７２】
ヒト化配列を表１４に列挙する：４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ１および４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＬ１は完全にヒト化された配列であり、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ２、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ３、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ４、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＬ２、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＬ３、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＬ４は異なる復帰突然変異を有する配列である。
表１４．ヒト化配列
【表４５】
2021513324.tif 000046
【０１７３】
ヒト化Ｆａｂとして、ヒト化ＶＨ遺伝子およびヒト化ＶＬ遺伝子を合成にて作製し、次にそれぞれを、ヒトガンマ１定常ドメインおよびヒトカッパ定常ドメインを含有するベクタにクローニングした。ヒト化したＶＨおよびＶＫを対にしてＦａｂを作製し、次に、さらなるオフレートランキング（ｏｆｆ−ｒａｔｅ  ｒａｎｋｉｎｇ）（表１５）および親和性試験のために精製した。
表１５．Ｂｉａｃｏｒｅによるオフレートランキング
【表４６】
2021513324.tif 000047
【表４７】
2021513324.tif 000048
【０１７４】
すべてのヒト化Ｆａｂ試料の中から、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ２ＶＬ１、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ２、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ３ＶＬ１、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ１ＶＬ４、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ３ＶＬ４、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ２ＶＬ４、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ３ＶＬ２、４１１Ａ１１Ｅ９−ＶＨ１ＶＬ２、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＨ１ＶＬ１、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＨ２ＶＬ２、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＨ３ＶＬ３、２１Ｈ１２Ｄ９−ＶＨ１ＶＬ２、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ３、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ４、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ１、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋによって親和性を試験するために選択した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４をラニング緩衝液とし、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０を再生緩衝液とした。ＣＸＣＬ１３タンパク質を、アミンカップリング法を用いてＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に固定した（固定レベル約２５０ＲＵ）。連続濃度（０〜２０ｎＭ）のＦａｂを固定したＣＸＣＬ１３上に３０μｌ／分の流速で注入した。解離相は６００秒あった。結果を下記の表１６に示す。
表１６．親和性決定の結果
【表４８】
2021513324.tif 000049
実施例１１．抗ＣＸＣＬ１３ヒト化Ｆａｂの結合特性および遮断特性
【０１７５】
この実施例により、ＣＸＣＬ１３タンパク質に対する、ヒト化抗ＣＸＣＬ１３抗体の細胞ベース遮断アッセイにおける結合特性および遮断特性を試験した。
【０１７６】
ヒト化Ｆａｂの結合および遮断活性を評価するために、７１Ｆ４Ａ３Ｈおよび６４Ｃ１０Ｇ１ＨをＥＬＩＳＡ結合試験および細胞ベースの遮断アッセイに供した。ＥＣ５０およびＩＣ５０を表１７にまとめ、これにより、ヒト化７１Ｆ４Ａ３、６４Ｃ１０Ｇ１に関する結合活性の効力がキメラ抗体のそれより良好であることが明示される。遮断活性の効力は、ヒト化７１Ｆ４Ａ３は、そのキメラ対応物と比較するとき、約２倍減少し、ヒト化６４Ｃ１０Ｇ１はそのキメラ対応物と比較されるとき、遮断効力を維持する。
表１７．ヒト化Ｆａｂに関する結合特性および遮断特性
【表４９】
2021513324.tif 000050
実施例１２．抗ＣＸＣＬ１３ヒト化ＰＴＭ除去Ｆａｂの機能特性
【０１７７】
ＣＸＣＬ１３誘発ＩＰ１シグナル伝達の遮断。関与する突然変異部位が多くなりすぎることを避けるために、かつＥＬＩＳＡ結合および細胞ベースの遮断の結果に基づいて、ＰＴＭ（翻訳後修飾）部位を除去するべく６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ３、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ２配列を選び、６４Ｃ１０Ｇ１の変異位置は、ＶＨにおけるＤ５３ＥおよびＤ１０７Ｅであり、７１Ｆ４Ａ３に関しては、変異位置はＶＨにおけるＤ５４Ｅであった、そしてさらに、先に述べたＩＰ１アッセイにおいて検証する。
【０１７８】
図９のＡに示すように、ヒト化６４Ｃ１０Ｇ１バリアントの遮断活性はキメラ抗体より低かったが、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２（Ｄ５３Ｅ、Ｄ１０７Ｅ）ＰＴＭ除去抗体では他のヒト化バリアントよりわずかに良好であった。図９のＢにおいて、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）（Ｄ５４Ｅ）阻害活性は、他のヒト化バリアントより良好であり、キメラ抗体に匹敵する。
【０１７９】
ヒトＣＸＣＬ１３への初代ヒト扁桃細胞遊走の遮断。ＩＰ１アッセイの結果に基づいて、初代ヒト扁桃細胞遊走アッセイでの６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２（Ｄ５３Ｅ、Ｄ１０７Ｅ）、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）、および７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）（Ｄ５４Ｅ）の効果を評価した。
【０１８０】
図１０において、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２（Ｄ５３Ｅ、Ｄ１０７Ｅ）および７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）（Ｄ５４Ｅ）両方により、ヒトＣＸＣＬ１３誘発の初代ヒト扁桃細胞遊走を用量依存的に遮断することができたことがわかった。また、阻害の能力は比較に値する。
実施例１３．ＰＴＭ除去した抗ＣＸＣＬ１３完全長ヒト化ＩｇＧの結合特性
【０１８１】
この実施例により、ｈｕＣＸＣＬ１３タンパク質およびｃｙｎｏＣＸＣＬ１３タンパク質に対するヒト化抗ＣＸＣＬ１３抗体の結合特性を試験した。
【０１８２】
ヒト化抗体結合活性を評価するために、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ２、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ３を、抗体の安定性を増大するためにＶＨにおいてＰＴＭ除去したヒトガンマ１およびヒトカッパ定常ドメインを含有するヒト化完全長ＩｇＧ１として合成にて作製した。７１Ｆ４Ａ３に関して、変異位置はＤ５４Ｅであり、６４Ｃ１０Ｇ１に関して、変異位置はＤ５３Ｅ、Ｄ１０７Ｅであった。ｈｕＣＸＣＬ１３およびｃｙｎｏＣＸＣＬ１３への交差結合を、ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって試験した。結果を図１１にまとめ、これにより、ヒト化７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）（Ｄ５４Ｅ）および７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ２（Ｄ５４Ｅ）に関するｈｕＣＸＣＬ１３およびｃｙｎｏＣＸＣＬ１３への結合の効力は、キメラ７１Ｆ４Ａ３に匹敵するが、ヒト化６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２（Ｄ５３Ｅ、Ｄ１０７Ｅ）および６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ３（Ｄ５３Ｅ、Ｄ１０７Ｅ）に関する結合効力は、そのキメラ対応物と比較するとき、著しく減少することが明示される。
実施例１４．ＰＴＭ除去した抗ＣＸＣＬ１３完全長ヒト化ＩｇＧの遮断効力
【０１８３】
ＣＸＣＬ１３誘発ＩＰ１シグナル伝達の遮断。これらのヒト化抗体の遮断効力を評価するために、７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）、６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２抗体をそれぞれ、Ｄ５４Ｅ（表１８）およびＤ５３Ｅ、Ｄ１０７Ｅ（表１８ａ）の変異位置を有するヒト化完全長ＩｇＧ１抗体として合成にて作製した。ヒトＣＸＣＬ１３によって誘発されるＩＰ１アッセイにおいて、遮断活性を評価した。
【０１８４】
結果を図１２にまとめ、これにより、ヒト化７１Ｆ４Ａ３−ＶＨ１ＶＬ１（Ｈｚ７１Ｆ４）および６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２によりＩＰシグナル伝達を有効に遮断できたことが明示される。また、両方の遮断効力は、キメラ７１Ｆ４Ａ３、６４Ｃ１０Ｇ１に匹敵した。
実施例１５．ヒト化抗体の親和性最適化
【０１８５】
ＣＤＲ領域またはフレームワーク領域内のある特定のアミノ酸残基を変えて、抗体の活性および／または安定性をさらに向上する、または維持し得ることが企図された。計算道具（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／にて入手可能）を用いて、バリアントを、その構造的、コンフォメーション的、および機能的な特性に関して２つの異なるアプローチで設計した。
【０１８６】
第１のアプローチにおいて、ＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３におけるホットスポットを標的とするために突然変異を選んだ。表１８に示すように、ＣＤＲにおけるホットスポットを同定した。通常、ＣＤＲ３は抗原結合に最も寄与し、抗原結合に関して重鎖は軽鎖より重要である。さらに、ＬＣＤＲ１は抗原結合に関して重要である。第１の試行において、ＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３におけるホットスポットにランダム突然変異を標的させた。ＣＤＲ中の保存されたアミノ酸および埋もれたアミノ酸をコードするホットスポットを排除する。ホットスポットを有する残りのＣＤＲ：ＨＣＤＲ２（３個のアミノ酸：５５Ｓ、５６Ｓ、５７Ｔ）、ＨＣＤＲ３（２個のアミノ酸：１０３Ｅ、１０４Ｙ）、ＬＣＤＲ１（３個のアミノ酸：３２Ｇ、３４Ａ、３６Ｙ）をランダムに変異させる。ファージライブラリの構築の終了後、抗原ＣＸＣＬ１３スクリーニングを行った。Ｋｏｎを向上することができた変異させたアミノ酸を表１９に列挙する。ヒトＣＸＣＬ１３に対してより大きいＫｏｎを有するリードクローンの配列を表２０に列挙する。これらの配列の抗体を生成し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００によって親和性試験を実施した。結果を下記の表２１に列挙する。
表１８．７１Ｆ４Ａ３（Ｄ５４Ｅを有する）のホットスポットにおける標的化突然変異
【表５０】
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表１８ａ．突然変異Ｄ５３ＥおよびＤ１０７Ｅを有する６４Ｃ１０Ｇ１−ＶＨ１ＶＬ２
【表５１】
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表１９．結合を向上するために有用な７１Ｆ４Ａ３における突然変異
【表５２】
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表２０．７１Ｆ４Ａ３のリードクローン
【表５３】
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【表５４】
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表２１．リードクローンに関するＫｏｎの結果
【表５５】
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【０１８７】
第２のアプローチにおいて、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ３、またはＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２に関するＣＤＲウォーキングによる飽和突然変異ライブラリ、およびＣＤＲ  Ｈ３またはＣＤＲ  Ｌ３に関する連続的に変異された３つのａａによる飽和突然変異ライブラリなどの、４つのサブライブラリを含む複数のライブラリによって突然変異を実行した。表２２に示すように、ａｂＹｓｉｓ３（ｈｔｔｐ：／／ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）によってＡｂＭ法に従って、ＣＤＲを同定した。ファージサブライブラリの構築の終了後、抗原ＣＸＣＬ１３スクリーニングを行った。Ｋｏｆｆを向上することができた変異させたアミノ酸を表２３に列挙する。ヒトＣＸＣＬ１３に対してより小さいＫｏｆｆを有するリードクローンの配列を表２４に列挙する。これらの配列の抗体を生成し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００によって親和性試験を実施した。結果を下記の表２５に列挙する。次に、抗体をさらに最適化するために、リードクローンを１つのａａによってそのヒト化対応物の１つのａａに復帰変異させた。配列を生成し、抗体のために合成した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００によって親和性を試験した。結果は、配列が表２６に示され、軽鎖のＹへの９２Ｗ復帰変異であり、７１Ｆ４−Ｂと名付けられている、００５−３−１８の復帰突然変異のうちの１つは、Ｈｚ７１Ｆ４および００５−３−１８と比較してＫｏｆｆ、ＫＤ（＜１ｎＭ）および遮断活性を著しく促進することを示し、データは表２７に列挙した。
表２２．７１Ｆ４Ａ３のＣＤＲ
【表５６】
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表２３．Ｋｏｆｆを向上するために有用な７１Ｆ４Ａ３における突然変異
【表５７】
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表２４．リードクローンの配列
【表５８】
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表２５．リードクローンに関するＫｏｆｆの結果
【表５９】
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表２６．リードクローンの配列
【表６０】
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表２７．７１Ｆ４−Ｂに関する親和性決定および遮断の結果
【表６１】
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【０１８８】
７１Ｆ４−Ｂをさらに最適化するために、結合（Ｋｏｎ）を向上するために有用な７１Ｆ４Ａ３における各突然変異を７１Ｆ４−Ｂに加え、配列を表２８に列挙した。これらの配列に従った抗体を生成し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００によって親和性試験を実施した。結果は、７１Ｆ４−Ｂと比較して、７１Ｆ４−Ｂ−Ｔ、７１Ｆ４−Ｂ−ＬＴ、７１Ｆ４−Ｂ−Ｈの親和性がほぼ１対数増大したことを示し、リードクローンの親和性を表２９に列挙した。
表２８．リードクローンの配列
【表６２】
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【表６３】
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表２９．親和性決定の結果
【表６４】
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実施例１６．シグナル伝達アッセイにおける抗ＣＸＣＬ１３親和性成熟抗体の遮断効力
【０１８９】
ＣＸＣＬ１３媒介ＩＰ１シグナル伝達の阻害。結合親和性の結果に基づいて、ＩＰ１シグナル伝達機能アッセイにおいて検討するために、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ−Ｔ、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ−Ｈ、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ−ＬＴを選択した。さらに、自家抗ＣＸＣＬ１３の遮断効力を、実施例９において言及した参照用の抗ＣＸＣＬ１３抗体Ｍａｂ５２６１と比較した。
【０１９０】
図１３に示すように、すべての７１Ｆ４Ａ３親和性成熟バリアントおよびＨｕ７１Ｆ４Ａ３は、ＣＸＣＬ１３によって誘発されるＩＰ１シグナルを用量依存的に阻害することができた。７１Ｆ４Ａ３の種々の親和性成熟バリアントの遮断効力はＨｚ７１Ｆ４Ａ３に匹敵し、７１Ｆ４Ａ３の親和性成熟バリアントの効力は参照用抗体より著しく良好であった。
実施例１７．細胞遊走アッセイにおける抗ＣＸＣＬ１３親和性成熟抗体の機能特性
【０１９１】
ＣＸＣＬ１３へのＢａＦ３−ＣＸＣＲ５（ヒト）細胞遊走の遮断。さらに、実施例５で言及したＢａＦ３−ＣＸＣＲ５細胞株遊走アッセイにおいて、これらの親和性成熟抗体および参照用抗体の活性を検証した。
【０１９２】
図１４に示すように、破線はＣＸＣＬ１３が遊走レベルを誘発したことを表した。抗ＣＸＣＬ１３抗体、Ｈｚ７１Ｆ４Ａ３、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ−Ｔ、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ−Ｈ、およびＭａｂ６２６１がこのアッセイ系に加えられたとき、ＢａＦ３−ＣＸＣＲ５細胞遊走は用量依存的に阻害された。７１Ｆ４Ａ３親和性成熟バリアントの阻害活性は、この細胞株遊走アッセイにおいてＨｚ７１Ｆ４Ａ３と類似であった。また、すべての親和性成熟７１Ｆ４Ａ３バリアントの阻害活性は参照用抗体Ｍａｂ５２６１より劇的に良好であった。
【０１９３】
ＣＸＣＬ１３への初代ヒト扁桃細胞遊走の阻害。さらに、初代ヒト扁桃細胞遊走アッセイにおいて抗ＣＸＣＬ１３親和性成熟抗体の遮断機能も検討した。
【０１９４】
図１５に示すように、ＩｇＧ処理した条件と比較すると、すべての７１Ｆ４Ａ３親和性成熟抗体７１Ｆ４Ａ３−Ｂ、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ−Ｔ、７１Ｆ４Ａ３−Ｂ−Ｈにより、用量依存的な様式で、ＣＸＣＬ１３によって誘発される初代ヒト扁桃細胞の走化性が阻害され得た。そして、７１Ｆ４Ａ３親和性成熟抗体の阻害活性は、この初代ヒトアッセイにおいてＨｚ７１Ｆ４Ａ３と匹敵した。
【０１９５】
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される、説明される特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、機能的に均等であるいかなる組成物または方法も本開示の範囲内にある。本開示の方法および組成物において、様々な修正および変形が、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく行われ得ることは、当業者に明らかとなろう。したがって、本開示は、本開示の修正および変形を包含することが意図され、ただし修正および変形が添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内にあることを条件とする。
【０１９６】
本明細書において言及されるすべての公報および出願特許は、各個別の公報または出願特許が具体的にかつ個別に参照により引用されることを示された場合と同じ程度に、本明細書において参照により引用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2021513324.tif 000076
【図１２】
2021513324.tif 000077
【図１３】
2021513324.tif 000078
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021513324.tif 000082
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