(57)【要約】ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の種などのグラム陽性細菌のゲノムを改変するために首尾よく使用される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種を改変するための方法は、遺伝子欠失および／または挿入を生じさせる単一ヌクレオチド変化を含む。２つまたはそれよりも多くのゲノム改変をコードする１つまたは複数のドナーポリヌクレオチドのプラスミドベースの提示を使用する、改善された編集効率での複数の編集の導入のための方法もまた例示される。
2021512617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変するための方法であって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種を、第１のガイドＲＮＡを発現させるための配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のプラスミドで形質転換するステップと、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドを提供するステップであって、前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む、ステップと、前記第１のガイドＲＮＡを、前記宿主中で、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて発現させるステップとを含む、方法。
【請求項２】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変するための方法であって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種を、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現させるための配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のプラスミドで形質転換するステップと、第１のガイドＲＮＡを提供するステップと、前記宿主中で、前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドを、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドと併せて発現させるステップであって、前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む、ステップとを含む、方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、プラスミドベースの提示によって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のガイドＲＮＡが、プラスミドベースの提示によって提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、プラスミドベースの提示によって提供される、請求項１または３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のゲノムに組み込まれる、請求項１または３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のプラスミドが、ｐＣＡＳＥ１複製起点（配列番号１）およびｐＣＧ１複製起点（配列番号２）からなる群から選択される複製起点を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のプラスミドが、ｐＣＡＳＥ１複製起点を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のプラスミドが、ｐＣＧ１複製起点を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記第１のプラスミド上に提供される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、第２のプラスミド上に提供される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、直線状断片として提供される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のプラスミドが、前記第１のプロモーターに作動可能に連結した前記第１のガイドＲＮＡまたは１つもしくは複数の追加のガイドＲＮＡ、あるいは第２のプロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数の追加のガイドＲＮＡをさらにコードする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のプロモーターが構成的である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のプロモーターが誘導性である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のプロモーターが構成的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のプロモーターが誘導性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが誘導性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、示差的に誘導性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記第１のプラスミド上に提供され、前記第１のプラスミドが、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列（単数または複数）および右の相同性アーム配列（単数または複数）を有する１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含み、前記追加のドナーポリヌクレオチド（単数または複数）が各々、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む、請求項１４または１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記第２のプラスミド上に提供され、前記第２のプラスミドが、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列（単数または複数）および右の相同性アーム配列（単数または複数）を有する１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含み、前記追加のドナーポリヌクレオチド（単数または複数）が各々、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む、請求項１５または１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のプラスミドまたは前記第２のプラスミドが、前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの変異配列が、
ａ．単一ヌクレオチド挿入；
ｂ．２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入；
ｃ．１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入；
ｄ．単一ヌクレオチド欠失；
ｅ．２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失；
ｆ．１つまたは複数のコード配列の欠失；
ｇ．単一ヌクレオチドの置換；
ｈ．２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換；
ｉ．２つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および／または置換；ならびに
ｊ．それらの任意の組合せ
からなる群から選択される変異を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの変異配列が、ａ）〜ｊ）に従う複数の変異を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の変異が、同じドナーポリヌクレオチド配列上にコードされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの変異配列が、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはシード領域の変異を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主が、構成的または誘導性プロモーターに連結した配列を含み、前記配列が、前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のプラスミドが、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した配列を含み、前記配列が、前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼポリペプチドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記相同性アーム配列が、少なくとも２５塩基対、好ましくは少なくとも７５塩基対、より好ましくは少なくとも１５０、２００、２５０または３００塩基対、なおより好ましくは少なくとも３５０、４００、４５０、５００または２，０００塩基対である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１のプロモーターが、内在性、異種、合成、誘導性および構成的プロモーターからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のプロモーターがＰｃｇ２６１３である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１のガイドＲＮＡが、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ならびに少なくとも２０ヌクレオチドの第１のスペーサー配列を含み、前記第１のスペーサー配列が、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相補的である、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
２つまたはそれよりも多くの異なるガイドＲＮＡの発現を順次誘導するステップであって、それによって、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の２つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を導入する、ステップを含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記２つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの少なくとも１つが、非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換を含む；または前記２つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの２つもしくはそれよりも多くが各々、非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
２つまたはそれよりも多くの異なるガイドＲＮＡ／ドナーポリヌクレオチド対を、異なる誘導性プロモーターの制御下で順次発現させるステップであって、それによって、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の２つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を順次導入するステップを含み、一連の編集が、一連のガイドＲＮＡ／ドナーポリヌクレオチド対の各対の発現を連続的に誘導することによって導入される、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主において２つまたはそれよりも多くのドナーポリヌクレオチドを発現させるステップと、前記宿主中に既に存在する修復断片に対応するｇＲＮＡ（単数または複数）を順次提供するステップであって、それによって、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の２つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を順次導入する、ステップとを含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
２つまたはそれよりも多くの異なるガイドＲＮＡを同時に発現させるステップであって、それによって、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の２つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を導入する、ステップを含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のプラスミドが、対抗選択マーカーを含み、前記方法が、前記対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、前記第１のプラスミドの前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主をキュアリングする、ステップを含む、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のプラスミドの前記対抗選択マーカーが不利になるように選択する前記ステップが、前記宿主中で、前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて、前記第１のガイドＲＮＡを用いて前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変した後、かつ前記宿主中で、前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて、第２のガイドＲＮＡを用いて前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変する前に実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記２つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの少なくとも１つが、非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換を含み；または前記２つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの２つもしくはそれよりも多くが各々、非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換を含む、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記宿主において１つまたは複数の異種組換え系からタンパク質のセットを発現させるステップを含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ラムダレッド組換え系、Ｒｅｃ  ＥＴ組換え系からのタンパク質のセット、ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃ  ＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ、またはそれらの任意の組合せを発現させるステップを含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ａ．第１のガイドＲＮＡに作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のプラスミド；ならびに
ｂ．右の相同性アーム配列および左の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドであって、各相同性アーム配列が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノム中の標的配列に相同である、第１のドナーポリヌクレオチド
を含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主であって、
ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて前記第１のガイドＲＮＡを発現する、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主。
【請求項５１】
ａ．ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現させるための配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のプラスミド；および
ｂ．第１のガイドＲＮＡ
を含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主であって、
前記宿主が、前記宿主中で、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドと併せて、前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現し、前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主。
【請求項５２】
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主である、請求項５０または請求項５１に記載の宿主。
【請求項５３】
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４である、請求項５２に記載の宿主。
【請求項５４】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログからなる群から選択される、請求項５０から５３のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項５５】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項５０から５３のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項５６】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、プラスミドベースの提示によって提供される、請求項５０、５２から５５のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項５７】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のゲノムに組み込まれる、請求項５０、５２から５５のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項５８】
前記第１のプラスミドが、ｐＣＡＳＥ１複製起点およびｐＣＧ１複製起点からなる群から選択される複製起点を含む、請求項５０から５７のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項５９】
前記第１のプラスミドが、ｐＣＡＳＥ１複製起点を含む、請求項５８に記載の宿主。
【請求項６０】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記第１のプラスミド上に提供される、請求項５０から５９のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項６１】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、第２のプラスミド上に提供される、請求項５０から５９のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項６２】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、直線状核酸断片として提供される、請求項５０から５９のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項６３】
前記第１のプラスミドが、前記第１のプロモーターに作動可能に連結した前記第１のガイドＲＮＡまたは１つもしくは複数の追加のガイドＲＮＡ、あるいは１つまたは複数の追加のプロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数の追加のガイドＲＮＡをさらにコードする、請求項５０から６２のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項６４】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記第１のプラスミド上に提供され、前記第１のプラスミドが、１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６０または６３のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項６５】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、第２のプラスミド上に提供され、前記第２のプラスミドが、１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６１または６３のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項６６】
前記第１のドナーポリヌクレオチドが、
ａ）単一ヌクレオチド挿入；
ｂ）２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入；
ｃ）１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入；
ｄ）単一ヌクレオチド欠失；
ｅ）２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失；
ｆ）１つまたは複数のコード配列の欠失；
ｇ）単一ヌクレオチドの置換；
ｈ）２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換；
ｉ）２つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および／または置換；ならびに
ｊ）それらの任意の組合せ
からなる群から選択される変異を含む少なくとも１つの変異配列を含む、請求項５０から６５のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項６７】
前記宿主が、第２のドナーポリヌクレオチドを含み、前記第２のドナーポリヌクレオチドが、
ｋ）単一ヌクレオチド挿入；
ｌ）２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入；
ｍ）１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入；
ｎ）単一ヌクレオチド欠失；
ｏ）２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失；
ｐ）１つまたは複数のコード配列の欠失；
ｑ）単一ヌクレオチドの置換；
ｒ）２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換；
ｓ）２つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および／または置換；ならびに
ｔ）それらの任意の組合せ
からなる群から選択される変異を含む少なくとも１つの変異配列を含む、請求項６６に記載の宿主。
【請求項６８】
前記少なくとも１つの変異配列が、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはシード領域の変異を含む、請求項６６または６７に記載の宿主。
【請求項６９】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドが、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結したＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列から発現される、請求項５０から６８のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７０】
前記第１のプラスミドが、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列をさらに含む、請求項５０から６８のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７１】
前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種における発現のために最適化されたコード配列を含む、請求項７０に記載の宿主。
【請求項７２】
前記右および左の相同性アーム配列が、少なくとも２５塩基対、好ましくは少なくとも１５０、２００、２５０または３００塩基対、より好ましくは少なくとも３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００塩基対である、請求項５０から７１のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７３】
前記第１のプロモーターが、内在性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーター、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に対して異種のプロモーター、合成プロモーター、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターからなる群から選択される、請求項５０から７２のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７４】
前記第１のプロモーターがＰｃｇ２６１３である、請求項７３に記載の宿主。
【請求項７５】
前記第１のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、請求項５０から７４のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７６】
前記第１のガイドＲＮＡが、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、請求項５０から７４のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７７】
前記第１のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ならびに少なくとも２０ヌクレオチドの第１のスペーサー配列を含み、前記第１のスペーサー配列が、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相補的である、請求項５０から７４のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７８】
少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡ配列に作動可能に連結した少なくとも２つの異なる誘導性プロモーターを含む、請求項５０から７７のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７９】
前記第１のプラスミドが、対抗選択マーカーを含む、請求項５０から７８のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項８０】
前記宿主中に１つまたは複数の異種組換え系からのタンパク質のセットを含む、請求項５０から７９のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項８１】
ラムダレッド組換え系、Ｒｅｃ  ＥＴ組換え系からのタンパク質のセット、ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃ  ＥＴ組換え系からのタンパク質の任意の相同体、オルソログもしくはパラログ、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項５０から８０のいずれか一項に記載の宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１８年２月８日出願の米国仮出願第６２／６２８，１６６号および２０１８年７月２３日出願の米国仮出願第６２／７０１，９７９号の利益を主張し、その各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
連邦支援の研究または開発に関する陳述
本開示は、Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  Ａｇｅｎｃｙ（ＤＡＲＰＡ）によって授与された、契約書番号ＨＲ００１１−１５−９−００１４の下での政府支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
配列表の組込み
コンピューター読み取り可能な形態の配列表を含む、名称「ＺＹＭＲ＿０３８＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイルは、２０１９年２月６日に作成された。このファイルは、約１２．９ＫＢであり（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）、（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  ＥＦＳ−Ｗｅｂ提出システムを使用して）電子申請によって同時に提出され、その全体が参照により本出願に組み込まれている。
【０００４】
発明の分野
本開示は一般に、グラム陽性細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のゲノムを改変するためにＣＲＩＳＰＲ媒介性編集を使用する、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのガイド型遺伝子配列編集のために使用される系、方法および組成物に関する。本開示は、とりわけ、改善されたＤＮＡクローニング、オリゴヌクレオチドのアセンブリーおよび微生物の改善のために、ガイド型配列編集複合体を使用する方法を記載する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
ゲノムを改変し微生物を改善する能力は、過去数十年にわたって顕著に増加した。初期のアプローチには、機能的ノックアウトおよび小さい変更（例えば、一塩基多型即ちＳＮＰ）を典型的には生じる、ＵＶまたは化学的変異誘発およびトランスポゾンが関与していた（Ｋａｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；Ｐｅｒｕｔｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ｙａｏ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ，  ２００７）。インテグラーゼおよびリコンビナーゼが関与する部位特異的組込み技法は、遺伝子および経路の挿入を可能にしたが、ゲノム中の特定の既存の配列または「ランディングパッド」に制限された（Ｋｉｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１；Ｔｕｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【０００６】
ＳＮＰ、欠失および挿入を生じさせるために目的のゲノム領域を正確に操作するために相同組換え（ＨＲ）を利用する能力は、バイオテクノロジーのすべての領域（治療薬、新規化学物質の産生、代謝操作など）における大きな進歩を可能にした。初期のテクノロジーは、内在性宿主相同組換えマシナリーを利用することによって、またはウイルス組換えタンパク質を補充することによって、二本鎖ＤＮＡならびに一本鎖オリゴヌクレオチドドナーＤＮＡを宿主ゲノムに導入した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，  ２０００；ｖａｎ  Ｐｉｊｋｅｒｅｎ  ａｎｄ  Ｂｒｉｔｔｏｎ，  ２０１２；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。しかし、残念ながら、これらの方法は、低頻度の事象に依存し、導入されている変化について選択するための選択マーカーの使用を必要とし、この選択マーカーは次いで、複数の変異を組み込むために、操作の各ラウンドの前に除去される必要がある。
【０００７】
操作されている部位またはその近傍において二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することは、その部位における組換え事象の頻度を有意に増加させることができることが、続いて発見された。組換え能がある生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、例えば、二本鎖切断は、相同組換えマシナリーを誘導し、これが、続くＤＮＡ組込みの効率を増加させる（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，  ２００２）。これは、「ランディングパッド」にメガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩ）を事前に設置し、適切なホーミングエンドヌクレアーゼを発現させることによってＤＳＢを誘導し、導入されている変化に隣接する相同末端を有する適切なドナー核酸を供給することによって、最初に開拓された（Ｋｕｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ，  ２０１０）。後に、テクノロジーは、任意の所与のゲノム場所における二本鎖切断の生成を可能にすることによってプログラム可能なマーカーなし編集を可能にする、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合された結合ドメインである、ジンクフィンガーヌクレアーゼ即ちＺＦＮおよび転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ即ちＴＡＬＥＮ）に融合された結合ドメインを利用した（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【０００８】
さらに最近、新しいクラスのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、侵入してくるウイルスおよびプラスミドからの保護を提供するように一緒になって機能するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ゲノム遺伝子座およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質に依存する一部の細菌および古細菌において同定された。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、Ｃａｓ９タンパク質は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を一緒になって生成する２つのヌクレアーゼ活性部位が関与する機構による標的の認識および切断のために、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるデュアルガイドＲＮＡを使用する、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼとして機能する。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．は後に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として組み合わされ転写され得、ｓｇＲＮＡ内の短い２０ｎｔの「スペーサー」配列が、Ｃａｓ９タンパク質にそのＤＮＡ標的への指向性を付与することを示した（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。
【０００９】
機能的には、Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡを認識してそれと複合体化し、次いで、得られたリボ核タンパク質複合体は、スペーサー配列に対して相補的な配列（「プロトスペーサー」）とその後ろのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を求めてゲノムを探索する。１つのモデルの下では、標的配列への結合の際に、Ｃａｓ９は二本鎖切断を生成し、次いで、変化が、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）によって、または供給されたドナー核酸のＨＲによって、導入され得る。ＮＨＥＪは、短い挿入または欠失を生じ、これらは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）におけるフレームシフト変異によって機能的ノックアウトを生じさせる際に有用であり得る。対照的に、ＨＲは、適切に設計されたドナー核酸の組込みによって、ゲノム中により正確なシームレスの変化を導入するために利用され得る。
【００１０】
しかしながら、相同組換えのための限定的な内在性マシナリーを有するまたは内在性マシナリーを有さない宿主では、ゲノム中のＣａｓ９により標的化される二本鎖切断は、毒性および細胞死をしばしば生じ得る。これらの生物では、一本鎖ニックを誘導するための代替的ストラテジーが開発されたが、それは、これらの切断が致死性ではないからである。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍでは、野生型Ｃａｓ９タンパク質の発現は致死性であり、これは、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）による研究において、供給されたドナーＤＮＡとの増加したＨＲのための部位として次いで機能するゲノム中の一方のＤＮＡ鎖中にニックを生じさせるためのＣａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）の発現を介して回避された。遺伝子欠失を、この方法論に従って合理的な効率で得ることができたが、より大きい（例えば、＞１ｋｂの）挿入物の組込みには大きな制限があった。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、ＨＲのための限定的な内在性マシナリーを有し（Ｒｅｓｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ．  ２０１１；４８２：１−７；１−７；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ．  ２００３  Ｏｃｔ  ２３；３１７（１−２）：１４９−５５）、したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集に関して不確かな結果を有する、別の原核生物である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用を記載するいくつかの刊行物が現在存在している（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１７  Ｍａｙ  ４；８：１５１７９；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．  ２０１７  Ｊｕｌ；４２：１５７−１６７；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．；  ２０１７  Ｎｏｖ  １４；１６（１）：２０１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．  ２０１７  Ｎｏｖ  １６；１６（１）：２０５）。これらの刊行物は、いくつかの編集構成およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を試験している。しかし興味深いことに、これらの刊行物は、Ｃａｓ９の毒性、編集の有効性、試験した具体的な株ならびに試験したドナー構成に関して、その結論が大きく異なっている。さらに、特に多重遺伝子編集に関して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ技術は、複数の編集の同時導入に対してもっぱら焦点を当てているが、連続するポリヌクレオチド領域の非常に低い編集効率を達成したに過ぎない。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．は、それぞれｒｆｐ指向性およびｒｐｓＬ指向性のガイドＲＮＡを使用した、第１（ｒｆｐ）および第２（ｒｐｓＬ）の遺伝子座の同時編集を記載している。しかしながら、非常に低い編集効率が達成されたに過ぎず、連続する領域のみが各遺伝子座内で編集された。よって、より高い効率、１つまたは複数の遺伝子座内の非連続的な編集、および他の利点を提供する改善された多重遺伝子編集法を含む、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるゲノム編集のための改善されたＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼツールおよび方法が、依然必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒｅｓｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ．  ２０１１；４８２：１−７；１−７
【非特許文献２】Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ．  ２００３  Ｏｃｔ  ２３；３１７（１−２）：１４９−５５
【非特許文献３】Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１７  Ｍａｙ  ４；８：１５１７９
【非特許文献４】Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．  ２０１７  Ｊｕｌ；４２：１５７−１６７
【非特許文献５】Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．；  ２０１７  Ｎｏｖ  １４；１６（１）：２０１
【非特許文献６】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．  ２０１７  Ｎｏｖ  １６；１６（１）：２０５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明は、これらの満たされていない要求および不確実性に、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチド、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍを遺伝子改変するための首尾よい方法で対処し、ここで、このドナーポリヌクレオチドは、好ましくは、複製性プラスミド中にコードされる。特定の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのドナーポリヌクレオチドの、同時または順次的なプラスミドベースの提示を使用する、改善された編集効率での多重遺伝子改変のための方法が例示される。本発明のある特定の実施形態は、Ｃｏａｔｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４”，  Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２０１８  Ｎｏｖ  ２７  （ｄｏｉ：  １０．１００７／ｓ１０２９５−０１８−２１１２−７）に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００１３】
ある特定の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのゲノム改変をコードする１つまたは複数のドナーポリヌクレオチドのプラスミドベースの提示を使用する、改善された編集効率での複数の編集の導入のための方法が例示される。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド（単数または複数）（プラスミドベースの提示によって提供されるのであれ直線状断片として提供されるのであれ）は、２つまたはそれよりも多くのゲノム改変をコードし、このとき、２つもしくはそれよりも多くのゲノム改変のうちの少なくとも２つ、または２つもしくはそれよりも多くの改変のうちのすべては、例えば、非連続的であり、ゲノム中で互いに近傍にある。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にある改変は、１５０塩基対、１２５塩基対、１００塩基対、７５塩基対、７０塩基対、６５塩基対、６０塩基対、５５塩基対、５０塩基対、４５塩基対、４０塩基対、３５塩基対、３０塩基対、２５塩基対、２０塩基対または１０もしくは５塩基対以内、あるいは約１５０塩基対、１２５塩基対、１００塩基対、７５塩基対、７０塩基対、６５塩基対、６０塩基対、５５塩基対、５０塩基対、４５塩基対、４０塩基対、３５塩基対、３０塩基対、２５塩基対、２０塩基対または１０もしくは５塩基対以内にある。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にある改変は、ゲノム中で互いに、約１０〜約１００塩基対または約２５〜約７５塩基対の距離にある。
【００１４】
さらに、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用に関する最近の刊行物の多くは、ｐＢＬ１複製起点を有するプラスミドを利用している。本明細書に記載の研究の過程の間に、ｐＣＧ１およびｐＣＡＳＥ１プラスミドが、試験株ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４においてｐＢＬ１ベースのプラスミドよりも予期せぬことに優れていたことが決定された。理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、ｐＢＬ１ベースのプラスミドと比較した、ｐＣＧ１ベースのプラスミドおよびｐＣＡＳＥ１ベースのプラスミドの予期せぬことに改善された形質転換有効性が、他のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を含む広い範囲の商業的に適切なＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株に適用可能であると仮説を立てている。また、理論に束縛されることは望まないが、予期せぬことに改善された編集が、ｐＢＬ１ベースのプラスミドと比較して、ｐＣＧ１およびｐＣＡＳＥ１プラスミドを使用して得られた形質転換効率における予期せぬ増加に少なくとも一部起因するとさらに仮説が立てられる。したがって、１つまたは複数のドナーポリヌクレオチドのｐＣＧ１および／またはｐＣＡＳＥ１プラスミドコーディングを使用するドナー構成が挙げられるがこれらに限定されない、より有効なＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）編集系および可能なドナー構成の拡張されたツールボックスの構築もまた、本明細書に記載される。
【００１５】
一態様では、本発明は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変するための方法であって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を、第１のガイドＲＮＡを発現させるための配列に作動可能に連結した第１のプロモーター、例えば、誘導性または構成的プロモーターを含むプラスミドで形質転換するステップと、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドを提供するステップと、前記第１のガイドＲＮＡを、宿主中のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチドと併せて発現させるステップとを含む方法を提供する。一部の場合では、前記ドナーポリヌクレオチドは、プラスミド上にコードされる。
【００１６】
一態様では、本発明は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変するための方法であって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種を、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現させるための配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のプラスミドで形質転換するステップと、第１のガイドＲＮＡを提供するステップと、前記宿主中で、前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドを、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドと併せて発現させるステップであって、前記第１のドナーポリヌクレオチドが、前記左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む、ステップとを含む、方法を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。
【００１８】
一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、プラスミドベースの提示によって提供される。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、プラスミドベースの提示によって提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、プラスミドベースの提示によって提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のゲノムに組み込まれる。
【００１９】
一部の実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４である。
【００２０】
一部の実施形態では、第１のプラスミドは、ｐＣＡＳＥ１複製起点およびｐＣＧ１複製起点からなる群から選択される複製起点を含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、ｐＣＡＳＥ１複製起点を含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、ｐＣＧ１複製起点を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡと同じプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、異なる、例えば、第２または第３のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、線形の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ断片として提供される。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドを含むまたはコードするプラスミドまたは線形もしくは環状断片は、１つもしくは複数の、または２つもしくはそれよりも多くの追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含むまたはコードする。
【００２２】
一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、第１のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、第２のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、直線状断片として提供される。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、第１のプロモーターに作動可能に連結した第１のガイドＲＮＡまたは１つもしくは複数の追加のガイドＲＮＡ、あるいは第２のプロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数の追加のガイドＲＮＡをさらにコードする。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、構成的である。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、誘導性である。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、構成的である。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、誘導性である。一部の実施形態では、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、誘導性である。一部の実施形態では、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、示差的に誘導性である。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、第１のプラスミド上に提供され、第１のプラスミドは、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列（単数または複数）および右の相同性アーム配列（単数または複数）を有する１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含み、追加のドナーポリヌクレオチド（単数または複数）は各々、左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、第２のプラスミド上に提供され、第２のプラスミドは、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列（単数または複数）および右の相同性アーム配列（単数または複数）を有する１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含み、追加のドナーポリヌクレオチド（単数または複数）は各々、左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドまたは第２のプラスミドは、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする。
【００２３】
ある特定の実施形態では、前記第１のドナーポリヌクレオチドは、前記左の相同性アーム配列および前記右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む。少なくとも１つの変異配列は、有利には、単一ヌクレオチド挿入；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入；１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入；単一ヌクレオチド欠失；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失；１つまたは複数のコード配列の欠失；単一ヌクレオチドの置換；ならびに２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換からなる群から選択される変異を含み得る。具体的な実施形態では、少なくとも１つの変異配列は、Ｃａｓ９のＰＡＭまたはシード領域の変異を含む。ある特定の実施形態では、前記少なくとも１つの変異配列は、前の文に従う複数の変異を含む。ある特定の実施形態では、複数の変異は、同じドナーポリヌクレオチド配列上にコードされる。
【００２４】
一部の実施形態では、少なくとも１つの変異配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはシード領域の変異を含む。一部の実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主は、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列をさらに発現する。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した機能的なＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列をさらに含む。
【００２５】
一部の実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主は、構成的または誘導性プロモーターに連結した配列を含み、この配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した配列を含み、この配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼポリペプチドである。
【００２６】
一部の実施形態では、左および／または右の相同性アーム配列またはドナーポリヌクレオチドは、少なくとも２５塩基対、好ましくは少なくとも７５塩基対、より好ましくは少なくとも１５０、２００、２５０または３００塩基対、なおより好ましくは少なくとも３５０、４００、４５０、５００または２，０００塩基対である。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、内在性、異種、合成、誘導性および／または構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のプロモーターはＰｃｇ２６１３である。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ならびに少なくとも２０ヌクレオチドの第１のスペーサー配列を含み、第１のスペーサー配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相補的である。一部の実施形態では、方法は、２つまたはそれよりも多くの異なるガイドＲＮＡの発現を順次誘導するステップであって、それによって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の２つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を導入する、ステップを含む。一部の実施形態では、２つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの少なくとも１つは、非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換を含む；または２つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの２つもしくはそれよりも多くが各々、非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換を含む。一部の実施形態では、方法は、２つまたはそれよりも多くの異なるガイドＲＮＡ／ドナーポリヌクレオチド対を、異なる誘導性プロモーターの制御下で順次発現させるステップであって、それによって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の２つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を順次導入するステップを含み、一連の編集が、一連のガイドＲＮＡ／ドナーポリヌクレオチド対の各対の発現を連続的に誘導することによって導入される。一部の実施形態では、方法は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主において２つまたはそれよりも多くのドナーポリヌクレオチドを発現させるステップと、宿主中に既に存在する修復断片に対応するｇＲＮＡ（単数または複数）を順次提供するステップであって、それによって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の２つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を順次導入する、ステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、２つまたはそれよりも多くの異なるガイドＲＮＡを同時に発現させるステップであって、それによって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の２つまたはそれよりも多くの異なる遺伝子改変を導入する、ステップを含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドが、対抗選択マーカーを含み、方法は、対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、第１のプラスミドのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主をキュア��ングする、ステップを含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドの対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップは、宿主中で、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて、第１のガイドＲＮＡを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変した後、かつ宿主中で、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて、第２のガイドＲＮＡを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変する前に実施される。一部の実施形態では、２つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの少なくとも１つが、非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換を含み；または２つもしくはそれよりも多くの異なる遺伝子改変のうちの２つもしくはそれよりも多くが各々、非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換を含む。一部の実施形態では、方法は、宿主において１つまたは複数の異種組換え系からタンパク質のセットを発現させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、ラムダレッド組換え系、Ｒｅｃ  ＥＴ組換え系からのタンパク質のセット、ラムダレッド組換え系もしくはＲｅｃ  ＥＴ組換え系からのタンパク質の任意のホモログ、オルソログもしくはパラログ、またはそれらの任意の組合せを発現させるステップを含む。ある特定の実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主は、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、プラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列をさらに発現する。一部の場合では、Ｃａｓ９プロモーターは、ガイドＲＮＡに作動可能に連結した構成的または誘導性プロモーターと比較して、示差的に誘導性である。ある特定の実施形態では、前記第１のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列をさらに含む。
【００２７】
一部の実施形態では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列は、宿主ゲノムに組み込まれる。Ｃａｓ９を有する複製性プラスミドを形質転換するための以前の試みは、細胞に対するＣａｓ９遺伝子および／またはポリペプチドの毒性に潜在的に起因して、形質転換体をほとんど生じないこと、または低減された成長速度を示すことが報告されている（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．  ２０１７  Ｊｕｌ；４２：１５７−１６７；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．；  ２０１７  Ｎｏｖ  １４；１６（１）：２０１）。本明細書で初めて例示されるように、本発明者らは、機能的なＣａｓ９ポリペプチドが、宿主に対する毒性なしに、かつＣａｓ９自体の毒性を低減させる必要なしに、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノムに首尾よく組み込まれ得ることを決定した。一部の場合では、プラスミドによってコードされるものであれ、ゲノムに組み込まれた遺伝子によってコードされるものであれ、Ｃａｓ９ポリペプチドの毒性は、Ｃａｓ９ポリペプチドが、非誘導状態で発現されないまたは最小限に発現され、次いでゲノム編集を実施するために誘導状態で発現されるように、誘導性プロモーターを使用することによって低減される。一部の場合では、Ｃａｓ９プロモーターは、ガイドＲＮＡに作動可能に連結した誘導性プロモーターと比較して、示差的に誘導性である。
【００２８】
一部の実施形態では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列は、プラスミド中にある。一部の場合では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列は、第１のプラスミド中にある。一部の場合では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列は、第２のプラスミド中にある。一部の場合では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列は、ガイドＲＮＡコード配列、例えば、第１のガイドＲＮＡコード配列を含むプラスミド中にある。一部の場合では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列は、ドナーポリヌクレオチド、例えば、第１のドナーポリヌクレオチドを含むプラスミド中にある。一部の実施形態では、構成的または誘導性プロモーターに連結した機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列を含むプラスミドは、対抗選択マーカー（ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）をさらに含む。一部の場合では、Ｃａｓ９ポリペプチドコード配列を含むプラスミド中の前記対抗選択マーカーは、異なる（例えば、第１または第２の）プラスミド上の別の対抗選択マーカーと比較して、示差的に対抗選択され得る。一部の場合では、本方法は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の１回もしくは複数の、または２回のまたはより好ましくは順次的なゲノム編集を実施した後に、機能的なＣａｓ９ポリペプチドコード配列を含むプラスミドが不利になるように対抗選択するステップであって、それによって、Ｃａｓ９ポリペプチドコード配列のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主をキュアリングする、ステップを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、前記第１のプロモーターに作動可能に連結した第１のガイドＲＮＡまたは１つもしくは複数の追加のガイドＲＮＡ、あるいは第２のプロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数の追加のガイドＲＮＡをさらにコードする。一部の場合では、前記第１のプロモーターは、構成的である。一部の場合では、前記第１のプロモーターは、誘導性である。一部の場合では、第２のプロモーターは、構成的である。一部の場合では、第２のプロモーターは、誘導性である。一部の場合では、前記第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、誘導性である。一部の場合では、前記第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、示差的に誘導性である。一部の場合では、前記第１のガイドＲＮＡに作動可能に連結した前記第１のプロモーターが誘導され、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主のゲノムが改変され、次いで、第２のプロモーターが誘導され、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主の異なる遺伝子改変が行われる。一部の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は各々独立して、２５；５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対を含む、約２５；５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対を含む、少なくとも２５；５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対を含む、または少なくとも約２５；５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対を含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約２５塩基対と約２０００塩基対との間、約２５塩基対と約１０００塩基対との間、約２５塩基対と約６００塩基対との間、約２５塩基対と約５００塩基対との間、約２５塩基対と約２５０塩基対との間、約２５塩基対と約２００塩基対との間、約２５塩基対と約１００塩基対との間または約２５塩基対と約５０塩基対との間を含む。ある特定の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約１００塩基対と約２０００塩基対との間、約１００塩基対と約１０００塩基対との間、約１００塩基対と約６００塩基対との間、約１００塩基対と約５００塩基対との間、約１００塩基対と約２５０塩基対との間、約１００塩基対と約２００塩基対との間または約１００塩基対と約１５０塩基対との間を含む。ある特定の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約０塩基対と約２０００塩基対との間、約０塩基対と約１０００塩基対との間、約０塩基対と約６００塩基対との間、約０塩基対と約５００塩基対との間、約０塩基対と約２５０塩基対との間、約０塩基対と約２００塩基対との間、約０塩基対と約１００塩基対との間、約０塩基対と約５０塩基対との間または約０塩基対と約２５塩基対との間を含む。
【００３１】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡに作動可能に連結したプロモーターは、天然のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーターである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡに作動可能に連結したプロモーターは、宿主細胞に対して異種のプロモーターである。一般に、プロモーターは、そのプロモーターが、宿主細胞原産であれ、異なる生物由来であれ、合成であれ、作動可能に連結したガイドＲＮＡに対して異種である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡに作動可能に連結したプロモーターは、合成プロモーターである。天然の、異種のまたは合成のプロモーターは、構成的であり得る。あるいは、天然の、異種のまたは合成のプロモーターは、誘導性であり得る。ある特定の実施形態では、プロモーターは、Ｐｃｇ２６１３またはＰｃｇ０００７またはＰｃｇ００４７またはＰｃｇ１１３３またはＰＴｅｔ１またはＰＴｅｔ３またはＰＬａｃ１またはＰＬａｃ２またはＰＡｒａ１またはＰＴｒｃからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、プロモーターは、Ｐｃｇ２６１３である。ある特定の実施形態では、プロモーターは、任意の内在性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーター、異種生物由来の任意のプロモーター、任意の合成プロモーター、任意の誘導性プロモーターまたは任意の構成的プロモーターからなる群から選択される。
【００３２】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、対抗選択マーカーを含む第１のプラスミドによってコードされ、本方法は、対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、第１のプラスミドのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主をキュアリングする、ステップを含む。一部の場合では、第１のプラスミドの対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップは、前記宿主中で、Ｃａｓ９ポリペプチドと併せて、第１のガイドＲＮＡを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変した後、かつ前記宿主中で、Ｃａｓ９ポリペプチドと併せて、第２のガイドＲＮＡを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変する前に実施される。
【００３３】
別の態様では、Ｃａｓ９ポリペプチドと併せて、第１のプラスミドから発現される第１のガイドＲＮＡを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変するステップと、第１のプラスミド上に存在する対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、第１のプラスミドの宿主をキュアリングする、ステップと、Ｃａｓ９ポリペプチドと併せて、第２のプラスミドから発現される第１のガイドＲＮＡを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を遺伝子改変するステップと、第２のプラスミド上に存在する対抗選択マーカーが不利になるように選択するステップであって、それによって、第２のプラスミドの宿主をキュアリングする、ステップと、所望のゲノム編集を完了するまで、必要に応じて反復するステップとを含む、多重遺伝子編集の改善された方法が提供される。一部の場合では、第１および／または第２のプラスミドは、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを含む（例えば、このとき、第１および第２のプラスミドのドナーポリヌクレオチドは異なる）。本明細書で初めて確証的に実証されるように、この順次的なゲノム編集アプローチは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主における遺伝子編集効率を劇的に改善する。
【００３４】
別の態様では、本開示は、例えば、本明細書に開示のプロモーターの制御下に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集において使用されるガイドＲＮＡを配置することによって、グラム陽性細菌においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を改善する方法を提供する。
【００３５】
別の態様では、本開示は、ａ）第１のガイドＲＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む第１のプラスミド；ならびにｂ）右の相同性アーム配列および左の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドであって、各相同性アーム配列が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノム中の標的配列に相同である、第１のドナーポリヌクレオチドを含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主であって、前記宿主が、Ｃａｓ９ポリペプチドと併せて前記第１のガイドＲＮＡを発現する、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を提供する。一部の場合では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主である。一部の場合では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４である。
【００３６】
一部の実施形態では、第１のプラスミドは、ｐＣＡＳＥ１複製起点およびｐＣＧ１複製起点からなる群から選択される複製起点を含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、ｐＣＡＳＥ１複製起点を含む。一部の実施形態では、前記第１のドナーポリヌクレオチドは、前記第１のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、前記第１のドナーポリヌクレオチドは、第２のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、前記第１のドナーポリヌクレオチドは、直線状核酸断片として提供される。一部の実施形態では、前記第１のプラスミドは、前記第１のプロモーターに作動可能に連結した１つもしくは複数の追加のガイドＲＮＡ、または１つもしくは複数の追加のプロモーターに作動可能に連結した１つもしくは複数の追加のガイドＲＮＡをさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、第１のプラスミド上に提供され、前記第１のプラスミドは、１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、前記第１のドナーポリヌクレオチドは、第１のプラスミド上に提供され、１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドは、第２のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第１、第２、第３などのドナーポリヌクレオチドの各々は、単一ヌクレオチド挿入；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入；１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入；単一ヌクレオチド欠失；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失；１つまたは複数のコード配列の欠失；単一ヌクレオチドの置換；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換；およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される変異を含む少なくとも１つの変異配列を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、前記少なくとも１つの変異配列は、Ｃａｓ９のＰＡＭまたはシード領域の変異を含む。一部の場合では、少なくとも１つの変異配列は、Ｃａｓ９のＰＡＭの変異を含む。一部の場合では、少なくとも１つの変異配列は、Ｃａｓ９のシード領域の変異を含む。一部の場合では、少なくとも１つの変異配列は、Ｃａｓ９のシード領域の変異を含み、配列の少なくとも１つの変異は、Ｃａｓ９のＰＡＭの変異を含む。
【００３９】
一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９ポリペプチドは、プロモーターに作動可能に連結したＣａｓ９ポリペプチドコード配列から発現される。一部の場合では、Ｃａｓ９プロモーターは、構成的である。一部の実施形態では、構成的Ｃａｓ９プロモーターは、Ｐｃｇ２６１３またはＰｃｇ０００７またはＰｃｇ００４７またはＰｃｇ１１３３またはＰＴｒｃからなる群から選択される。一部の場合では、Ｃａｓ９プロモーターは、誘導性である。一部の実施形態では、誘導性Ｃａｓ９プロモーターは、ＰＴｅｔ１またはＰＴｅｔ３またはＰＬａｃ１またはＰＬａｃ２またはＰＡｒａ１からなる群から選択される。一部の場合では、Ｃａｓ９プロモーターは、ガイドＲＮＡに作動可能に連結した誘導性プロモーターおよび／またはドナーポリヌクレオチドに作動可能に連結した誘導性プロモーターと比較して、示差的に誘導性である。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９ポリペプチドコード配列は、プラスミド中にある。一部の実施形態では、前記第１のプラスミドは、プロモーターに作動可能に連結した前記Ｃａｓ９ポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記第２のプラスミドは、プロモーターに作動可能に連結した前記Ｃａｓ９ポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９ポリペプチドコード配列を含む前記プラスミドは、対抗選択マーカーを含む。一部の場合では、前記対抗選択マーカーは、異なる（例えば、第１または第２の）プラスミド上の別の対抗選択マーカーと比較して、示差的に対抗選択され得る。一部の実施形態では、プロモーターに作動可能に連結した前記Ｃａｓ９ポリペプチドコード配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主のゲノムに組み込まれる。一部の場合では、前記Ｃａｓ９ポリペプチドコード配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種における発現のために最適化されたコード配列を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、前記右および左の相同性アーム配列は、少なくとも２５塩基対、好ましくは少なくとも１５０、２００、２５０または３００塩基対、より好ましくは少なくとも３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００塩基対である。一部の実施形態では、前記第１、第２および／または追加のプロモーターは、Ｐｃｇ２６１３またはＰｃｇ０００７またはＰｃｇ００４７またはＰｃｇ１１３３またはＰＴｅｔ１またはＰＴｅｔ３またはＰＬａｃ１またはＰＬａｃ２またはＰＡｒａ１またはＰＴｒｃからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記第１、第２および／または追加のプロモーターは、内在性Ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーター、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に対して異種のプロモーター、合成プロモーター、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記第１および／または第２のプロモーターは、Ｐｃｇ２６１３である。一部の実施形態では、前記第１のプロモーターは、Ｐｃｇ２６１３である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ならびに少なくとも２０ヌクレオチドの第１のスペーサー配列を含み、前記第１のスペーサー配列は、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相補的である。一部の実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、宿主は、少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡ配列に作動可能に連結した少なくとも２つの異なる誘導性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、対抗選択マーカーを含む。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明は、第１のガイドＲＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む第１のプラスミド；ならびに右の相同性アーム配列および左の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドであって、各相同性アーム配列が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノム中の標的配列に相同である、第１のドナーポリヌクレオチドを含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主であって、前記宿主が、前記第１のガイドＲＮＡを、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドと併せて発現する、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現させるための配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第１のプラスミド；および第１のガイドＲＮＡを含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主であって、宿主が、宿主中で、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドと併せて、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドを発現し、第１のドナーポリヌクレオチドが、左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を提供する。一部の実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主である。一部の実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４である。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、プラスミドベースの提示によって提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、ｐＣＡＳＥ１複製起点およびｐＣＧ１複製起点からなる群から選択される複製起点を含む。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、ｐＣＡＳＥ１複製起点を含む。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、前記第１のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、第２のプラスミド上に提供される。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、直線状核酸断片として提供される。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、前記第１のプロモーターに作動可能に連結した第１のガイドＲＮＡまたは１つもしくは複数の追加のガイドＲＮＡ、あるいは１つまたは複数の追加のプロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数の追加のガイドＲＮＡをさらにコードする。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、前記第１のプラスミド上に提供され、前記第１のプラスミドは、１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、第２のプラスミド上に提供され、前記第２のプラスミドは、１つまたは複数の追加のドナーポリヌクレオチドをさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明は、ドナーポリヌクレオチドが、単一ヌクレオチド挿入；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入；１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入；単一ヌクレオチド欠失；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失；１つまたは複数のコード配列の欠失；単一ヌクレオチドの置換；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換；２つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および／または置換；ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される変異を含む少なくとも１つの変異配列を含む、本明細書に記載のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主を提供する。一部の実施形態では、宿主は、第２のドナーポリヌクレオチドを含み、第２のドナーポリヌクレオチドは、単一ヌクレオチド挿入；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入；１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入；単一ヌクレオチド欠失；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失；１つまたは複数のコード配列の欠失；単一ヌクレオチドの置換；２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドの置換；２つまたはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および／または置換；ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される変異を含む少なくとも１つの変異配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの変異配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはシード領域の変異を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結したＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列から発現される。一部の実施形態では、第１のプラスミドは、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結した前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドコード配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種における発現のために最適化されたコード配列を含む。一部の実施形態では、右および左の相同性アーム配列は、少なくとも２５塩基対、好ましくは少なくとも１５０、２００、２５０または３００塩基対、より好ましくは少なくとも３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００塩基対である。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、内在性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーター、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に対して異種のプロモーター、合成プロモーター、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のプロモーターはＰｃｇ２６１３である。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ならびに少なくとも２０ヌクレオチドの第１のスペーサー配列��含み、第１のスペーサー配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相補的である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム中の３つの遺伝子座（ｒｐｓＬ、ｃｇ３０３１およびｃｇ３４０４）を標的化するｓｇＲＮＡを含むプラスミドで形質転換されたＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのプレートの写真を示す。上のパネルは、ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの対照株を用いた結果を示す。下のパネルは、上の対照株におけるガイドプラスミドと同一のガイドプラスミドで形質転換されたＣａｓ９含有ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを示す。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ複合体の致死性は、形質転換体の数における大きな減少から明らかであり、ここで、ｓｇＲＮＡは、ゲノム中に存在する配列を標的化しており、よって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が活性でありｓｇＲＮＡ配列が機能的であることが示されている。
【００４５】
【図２】図２は、示されるような、Ｃａｓ９遺伝子を含むまたは欠如する株に形質転換されたｓｇＲＮＡコンストラクトから生じるコロニー計数を示す。５つの遺伝子座（ｃｇ０１６７、ｃｇ３０３１、ｃｇ３４０４、ｇｄｈＡまたはｒｐｓＬ）のうちの１つを標的化するｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを、２つの異なるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点（ｐＣＡＳＥ１、ｐＣＧ１）を使用して構築した。プラスミドは、ドナー断片を含まなかった。組み込まれたＣａｓ９を含むコンピテントなＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞（Ｃａｓ９  ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）、または野生型対照（ＷＴ  ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）を、ｓｇＲＮＡプラスミドで形質転換し、連続希釈を、選択的培地上で平板培養した。示されたコロニー計数は、２回の独立した形質転換についてのコロニー計数の平均である。ＷＴ対照株と比較して有意に低いコロニー計数が、Ｃａｓ９含有株において観察されたが、これは、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、試験したすべての遺伝子座について機能的であることを示している。
【００４６】
【図３】図３は、組み込まれたＣａｓ９を有するＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにＳＮＰを導入するために使用され得る例示的なｓｇＲＮＡおよびドナー構成の概略図である。Ａ．一実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点、ｓｇＲＮＡ、耐性マーカー、ならびに標的ＳＮＰに隣接する左（Ｌ）および右（Ｒ）の相同性アームを有するドナー断片を含むプラスミドが使用され得る。Ｂ．別の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点、ｓｇＲＮＡ、耐性マーカーを含むプラスミド、ならびに標的ＳＮＰに隣接する左（Ｌ）および右（Ｒ）の相同性アームを有するドナー断片を含む別のＰＣＲ産物が使用され得る。
【００４７】
【図４】図４は、組み込まれたＣａｓ９を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてノックアウトを生じさせるために使用され得る例示的なｓｇＲＮＡおよびドナー構成の概略図である。Ａ．一実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点、ｓｇＲＮＡ、耐性マーカー、ならびに左（Ｌ）および右（Ｒ）の相同性アームを有するドナー断片を含むプラスミドが使用され得る。Ｂ．別の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点、ｓｇＲＮＡおよび耐性マーカーを含むプラスミド；ならびに左（Ｌ）および右（Ｒ）の相同性アームを有するドナー断片を含む、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点を有さない別のプラスミドが使用され得る。Ｃ．別の実施形態では、左（Ｌ）および右（Ｒ）の相同性アームを有するドナー断片を含む別のＰＣＲ産物と共に、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点、ｓｇＲＮＡおよび耐性マーカーを含むプラスミド。
【００４８】
【図５】図５は、組み込まれたＣａｓ９を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて挿入を生じさせるために使用され得る例示的なｓｇＲＮＡおよびドナー構成の概略図である。Ａ．Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点、ｓｇＲＮＡ、耐性マーカー、ならびに挿入物に隣接する左（Ｌ）および右（Ｒ）の相同性アームを有するドナー断片を含むプラスミド。
【００４９】
【図６】図６は、ｒｐｓＬ遺伝子座において首尾よく組み込まれた３つのＳＮＰを有するコロニー、および未編集の野生型コロニーを示すカバレッジプロットを示す。コンピテントなＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞を、ｒｐｓＬ遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡをコードするプラスミドおよび３つの別々のＳＮＰをコードするドナー断片で形質転換した。１．ＰＡＭ領域を変異させ、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体によるさらなる認識を防止するＳＮＰ。２．ＰＡＭ領域中の変異から１０ｂｐの、プロトスペーサー認識配列のシード領域を変異させるＳＮＰ。３．ＰＡＭ部位から６５ｂｐの、ｒｐｓＬオープンリーディングフレーム中のＳＮＰ。ドナー断片上の相同性アームの外側にハイブリダイズするプライマーを使用して、スクリーニングされたコロニーからｒｐｓＬ領域を増幅した。タグメンテーションライブラリーを、このアンプリコンを用いて生成し、ハイスループットシーケンシングに供した。Ａ．エラーなしのｒｐｓＬドナー断片にアライメントさせた、３つすべてのＳＮＰを首尾よく組み込んだコロニーからのシーケンシング読み取り。Ｂ．ｒｐｓＬドナー断片にアライメントさせた、操作されたＳＮＰ部位の各々において配列の食い違いを示す、未編集のＷＴコロニーからのシーケンシング読み取り。Ｃ．３つの別々のＳＮＰをコードする例示的なｒｐｓＬドナー断片の概略図が示される。
【００５０】
【図７】図７は、本発明の実施形態に従うＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ編集の結果を示す。組み込まれたＣａｓ９遺伝子を含むＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞を、ｐＣＡＳＥ１起点を含むプラスミドで形質転換した。ｐＣＡＳＥ１プラスミドは、３つの遺伝子座のうちの１つを標的化するｓｇＲＮＡ、およびＰＡＭ遺伝子座をスクランブルするＳＮＰをコードするマッチするドナー断片をコードし、このＳＮＰには、１２５ｂｐの相同配列がいずれかの側に隣接した。コロニーを、ＰＣＲ増幅、タグメンテーションおよび次世代シーケンシングによってスクリーニングし、編集されたパーセントを、スクリーニングした総コロニーに対する配列確認された編集されたコロニーの総数を集計することによって計算した。
【００５１】
【図８】図８は、本発明の実施形態に従うＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ編集の結果を示す。ｐＣＡＳＥ１またはｐＣＧ１複製起点のいずれかを含むプラスミドを、３つの遺伝子座（ｃｇ０１６７、ｃｇ３４０４、ｒｐｓＬ）のうちの１つを標的化するｓｇＲＮＡ、および標的化された遺伝子座においてＳＮＰを導入するように設計したドナー断片をコードするように構築した。ドナー断片を、２５ｂｐから１２５ｂｐまでの範囲の、意図したＳＮＰのいずれかの側に隣接する相同性アームの長さで構築した。コロニーを、ＰＣＲ増幅、タグメンテーションおよび次世代シーケンシングによってスクリーニングし、編集されたパーセントを、スクリーニングした総コロニーに対する配列確認された編集されたコロニーの総数を集計することによって計算した。
【００５２】
【図９】図９は、本発明の実施形態に従うＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼゲノム編集の結果を示す。ｐＣＡＳＥ１またはｐＣＧ１複製起点のいずれかを含むプラスミドを、３つの遺伝子座（ｃｇ３０３１、ｃｇ３４０４、ｇｄｈＡ）のうちの１つを標的化するｓｇＲＮＡ、および標的遺伝子座において１００ｂｐの小さい挿入を導入するように設計したドナー断片をコードするように構築した。ドナー断片を、２５ｂｐから２０００ｂｐまでの範囲の、意図した挿入のいずれかの側に隣接する相同性アームの長さで構築した。コロニーを、ＰＣＲ増幅、タグメンテーションおよび次世代シーケンシングによってスクリーニングし、編集されたパーセントを、スクリーニングした総コロニーに対する配列確認された編集されたコロニーの総数を集計することによって計算した。
【００５３】
【図１０】図１０は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを用いてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム中に編集を生成するための例示的な構成の概略図表現である。この構成は、ｄｓＤＮＡドナー断片、およびｓｇＲＮＡをコードする別の複製性プラスミドと共に、ＲｅｃＥＴを発現する複製性ヘルパープラスミドを使用する。
【００５４】
【図１１】図１１は、ＰＣＲ増幅されたドナー断片および複製性プラスミド中にコードされるｓｇＲＮＡの送達によるＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ編集のコロニースクリーニング結果を示す。コロニーを、ＰＣＲを使用してスクリーニングし、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング分析を介して検証した。編集されたコロニーは、ｃｇ３０３１遺伝子座から７０２ｂｐを除去するノックアウトであった。各バーは、意図した編集について陽性とスクリーニングされたコロニーの平均パーセンテージを示し、点は、個々の形質転換事象からの編集されたコロニーのパーセントを示す。
【００５５】
【図１２】図１２は、プラスミドベースの系を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によってＳＮＰおよび小さい挿入物を作製するための、２つの異なるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点の有効性を実証するデータを示す。２セットの編集プラスミドを、３つの遺伝子座のうちの１つにおいてＳＮＰ（Ａ．およびＣ．）または１００ｂｐ挿入物（Ｂ．およびＤ．）のいずれかを導入するように構築した。プラスミドは、ｐＣＡＳＥ１またはｐＣＧ１複製起点のいずれかを含む。すべてのプラスミドは、標的遺伝子座に特異的なｓｇＲＮＡ、およびＳＮＰのいずれかの側の１２５ｂｐの相同性または挿入のいずれかの側の５００ｂｐの相同性のいずれかを含むドナー断片もまた含む。プラスミドを、Ｃａｓ９遺伝子の組み込まれた構成的に発現されるコピーを有するＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に形質転換し、最大で８個のコロニーを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によるスクリーニングのために選んだ。２つの生物学的再現を、各編集コンストラクトについて平均した。Ａ．標的遺伝子座およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点による、意図したＳＮＰ導入について陽性とスクリーニングされたコロニーのパーセンテージ。Ｂ．標的遺伝子座およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点による、意図した１００ｂｐ挿入について陽性とスクリーニングされたコロニーのパーセンテージ。Ｃ．およびＤ．ｐＣＡＳＥ１起点を使用した場合の挿入編集効率における統計的に有意な増加を実証する、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点による、小さい挿入編集のスチューデントｔ検定による平均の比較。
【００５６】
【図１３】図１３は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム遺伝子座ｃｇ３０３１からの７０２ｂｐの欠失およびガイドＲＮＡ設計パラメータの評価からの結果を示す。この実験では、ｃｇ３０３１遺伝子座中に７０２ｂｐ欠失を導入するように設計したドナー断片および欠失領域を標的化するｓｇＲＮＡを含むプラスミドを、Ｃａｓ９発現ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に導入した。Ｃａｓ９発現株へのプラスミドの形質転換後、コロニーを、ＰＣＲおよびＤＮＡ断片分析を使用して、ｃｇ３０３１遺伝子座からの７０２ｂｐ欠失の欠失の存在についてスクリーニングした。野生型ｃｇ３０３１遺伝子座は、１６４８ｂｐのバンドを生じるが、ｃｇ３０３１遺伝子座中に標的欠失を有するコロニーは、９４６ｂｐのバンドを生じる。ＰＣＲ断片分析データは、８つのコロニーのうちの６つにおいて、ｃｇ３０３１遺伝子座からの７０２ｂｐの欠失を示す。
【００５７】
【図１４】図１４は、５つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点について形質転換効率を比較するグラフである。菱形の中央の線は、集団平均を示し、菱形の外線は、９５％信頼区間である。予期せぬことに、ＣＡＳＥ１およびＣＧ１複製起点を含むプラスミド系は、ｐＢＬ１、ｐＣＣ１およびｐＮＧ２プラスミドと比較して、統計的に有意に高い（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒを介してＰ＜０．０５）形質転換効率を示した。
【００５８】
【図１５】図１５は、２つの遺伝子座ｃｇ３４０４およびｒｐｓＬにおける多重化編集を実証するカバレッジプロットを示す。これらのプロットは、ｙ軸上に読み取りの数を示し、ｘ軸上に染色体座標を示す。垂直マーカー（明るい色調）は、アライメントされた読み取りと参照配列との間の不一致を示す。変異体コロニーからの読み取りを野生型参照配列にマッピングした場合、これらの遺伝子座における編集を示す、ｃｇ３４０４遺伝子座における２つの不一致およびｒｐｓＬ遺伝子座における３つの不一致が存在する。編集のために標的化しなかった遺伝子座であるｃｇ０１６７遺伝子座では、不一致は存在しない。逆に、変異体コロニーからの読み取りをｃｇ０１６７、ｃｇ３４０４およびｒｐｓＬにマッピングした場合、読み取りは、ｃｇ３４０４およびｒｐｓＬにおいて（予測通り）完全にアライメントし、ｃｇ０１６７において（予測通り）変異と不一致である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
発明の詳細な説明
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
【００６０】
用語「ａ」または「ａｎ」は、そのエンティティの１つまたは複数を指し、すなわち、複数形の指示対象を指すことができる。したがって、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【００６１】
特に示さない限り、用語「約」は、示されたパラメータにおける±１０％の変動を指す。
【００６２】
用語「遺伝的に改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用され、本開示のＣＲＩＳＰＲ媒介性の方法によって遺伝的に改変された宿主細胞を指す。よって、この用語は、宿主Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞であって、それが由来した天然に存在するまたは微生物と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき）を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、宿主細胞を含む。この用語は、問題の特定の組換え微生物だけでなく、このような微生物の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
【００６３】
用語「遺伝子操作された（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、宿主Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞のゲノムの任意の操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）（例えば、核酸の挿入、欠失または置換による）を指すことができる。
【００６４】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で互換的に使用され、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これらは、修飾核酸、例えば、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含む。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および／またはこれらの発現に要求される調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「ホモログ」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用される。これらは、核酸断片であって、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の差が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的特性を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含することが理解される。これらの用語「相同の」または「ホモログ」または「オルソログ」または「実質的に同様の」または「実質的に対応する」は、１つの種、亜種、種類、栽培品種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、栽培品種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述し得る。
【００６７】
本開示の目的に関して、相同配列が比較される。「相同配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的に関連していると見なされ、考えられ、または知られている。機能的関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか１つにおいて示され得る。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、デフォルトパラメータを使用するＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）などを使用して決定することができる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の特性もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質改変」は、当技術分野で十分理解されるように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸改変、欠失および／または挿入を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特徴を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の適用に依存する。ハイブリダイゼーションプローブまたはガイドＲＮＡの標的化領域として有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドという短さであり得；一部の態様では、それは、１５、２０または２５ヌクレオチドであるか、または約１５、２０または２５ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、４アミノ酸より長いはずである。一部の場合では、全長ポリペプチドの機能を実行するポリペプチドの一部は、Ｎおよび／またはＣ末端から欠失された１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸を含む。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの元からあるエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。本明細書の方法における使用に適切な非限定的なプロモーター配列は、表１：ガイドＲＮＡ発現を駆動するための例示的なプロモーターにおいて以下に提供される。
【表１】
2021512617.tif 000003
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「内在性の」および「天然の」は、遺伝子またはプロモーターの天然に存在するコピーを指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「天然に存在する」は、天然に存在する源に由来する遺伝子を指す。一部の態様では、天然に存在する遺伝子は、源生物内のその内在性背景に位置するのであれ、「異種」背景に配置される場合であれ、異なる生物に導入される場合であれ、野生型（非導入遺伝子）遺伝子の遺伝子を指す。よって、本開示の目的のために、「天然に存在しない」遺伝子は、公知の天然の遺伝子とは異なる配列を有するように、変異されたもしくは他の方法で改変された、または合成された、遺伝子である。一部の態様では、改変は、タンパク質レベル（例えば、アミノ酸置換）であり得る。他の態様では、改変は、タンパク質配列に対するいずれの影響も伴わない、ＤＮＡレベル（例えば、コドン最適化）であり得る。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「異種の」は、特定の生物において天然には見出されないまたは特定の生物において特定の状況（例えば、ゲノムまたはプラスミド場所）では天然には見出されない、アミノ酸または核酸配列（例えば、遺伝子またはプロモーター）を指す。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの天然のプロモーターまたは他の核酸配列は、野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは作動可能に連結していない核酸配列に作動可能に連結した場合、または異種プラスミドもしくは異種核酸断片などにおいて非天然の形態で送達される場合、異種であり得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「外因性の」は、用語「異種の」と互換的に使用され、その天然源以外の何らかの源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非天然の源または場所由来であり、生物系に人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。内在性遺伝子の人工的に変異された改変体は、本開示の目的のために、「外因性」とみなされる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、語句「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。
【００７７】
当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を順調に形質転換、選択、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Ｊｏｎｅｓら（１９８５年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４巻：２４１１〜２４１８頁；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら（１９８９年）、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１８巻：７８〜８６頁）、よって、所望の発現レベルおよびパターンをディスプレイする系（ｌｉｎｅ）を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザンブロット分析、ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
【００７８】
用語「作動可能に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす連鎖配列（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を意味する。一部の態様では、本開示のプロモーター配列は、遺伝子の５’ＵＴＲまたはオープンリーディングフレームの直前に挿入される。他の態様では、本開示の作動可能に連結したプロモーター配列および遺伝子配列は、１つまたは複数のリンカーヌクレオチドによって分離される。
【００７９】
細胞は、外因性ＤＮＡ、例えば、組換え発現ベクターが細胞の内側に導入されている場合、そのようなＤＮＡによって、「遺伝子改変され」または「形質転換され」または「トランスフェクトされ」ている。外因性ＤＮＡの存在は、永続的または一過的な遺伝子変化を生じる。形質転換性ＤＮＡは、細胞のゲノム中に組み込まれ（共有結合的に連結され）ても組み込まれ（共有結合的に連結され）なくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換性ＤＮＡは、エピソームエレメント、例えば、プラスミド上に維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるように、形質転換性ＤＮＡが染色体に組み込まれた細胞である。この安定性は、形質転換性ＤＮＡを含む娘細胞の集団を含む細胞株またはクローンを樹立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞株」は、多世代にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定な成長が可能な初代細胞のクローンである。
【００８０】
「標的核酸」は、本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。用語「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在するのに十分な条件が提供された場合に、対象ガイド核酸の標的化セグメントが結合する標的核酸中に存在する核酸配列を指すために、本明細書で互換的に使用される。適切なハイブリダイゼーション条件は、細胞中に通常存在する生理的条件を含む。二本鎖標的核酸について、ガイド核酸に対して相補的でありそれとハイブリダイズする標的核酸の鎖は、「相補鎖」と呼ばれる；一方、「相補鎖」に対して相補的である（したがって、ガイド核酸に対して相補的でない）標的核酸の鎖は、「非相補鎖（ｎｏｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｔｒａｎｄ）」または「非相補鎖（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｔｒａｎｄ）」と呼ばれる。標的核酸が一本鎖標的核酸（例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ））である実施形態では、ガイド核酸は、一本鎖標的核酸に対して相補的でありそれとハイブリダイズする。
【００８１】
ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）に結合し、標的核酸内の特定の場所にこのポリペプチドを標的化する核酸分子は、本明細書で「ガイド核酸」と呼ばれる。ガイド核酸がＲＮＡ分子である場合、これは、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれ得る。ガイド核酸は、２つのセグメント、第１のセグメント（本明細書で「標的化セグメント」と呼ばれる）；および第２のセグメント（本明細書で「タンパク質結合性セグメント」と呼ばれる）を含む。「セグメント」は、分子のセグメント／セクション／領域、例えば、核酸分子中のヌクレオチドの連続したストレッチを意味する。セグメントは、セグメントが１つよりも多くの分子の領域を含み得るような、複合体の領域／セクションもまた意味し得る。例えば、一部の実施形態では、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメント（以下に記載される）は、１つの核酸分子（例えば、１つのＲＮＡ分子）であり、したがって、タンパク質結合性セグメントは、その１つの分子の領域を含む。他の実施形態では、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメント（以下に記載される）は、相補性の領域に沿ってハイブリダイズする２つの別々の分子を含む。例示的な非限定的な例として、２つの別々の分子を含むガイド核酸のタンパク質結合性セグメントは、（ｉ）１００塩基対長である第１の分子（例えば、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子）の塩基対４０〜７５；および（ｉｉ）５０塩基対長である第２の分子（例えば、ＲＮＡ分子）の塩基対１０〜２５を含み得る。「セグメント」の定義は、特定の文脈において具体的に他の定義がされない限り、総塩基対の具体的な数に限定されず、所与の核酸分子由来の塩基対の任意の特定の数に限定されず、複合体内の別々の分子の特定の数に限定されず、任意の総長さの核酸分子の領域を含み得、他の分子に対する相補性を有する領域を含んでも含まなくてもよい。
【００８２】
ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ）の第１のセグメント（標的化セグメント）は、標的核酸（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖など）内の特定の配列（標的部位）に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合性セグメント（または「タンパク質結合性配列」）は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチドと相互作用する。標的核酸の部位特異的結合および／または切断は、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）と標的核酸との間での塩基対合相補性によって決定される場所において生じ得る。
【００８３】
対象ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する、ヌクレオチドの２つの相補的ストレッチを含む。
【００８４】
ドナーポリヌクレオチドに連結した対象ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、対象のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成する（即ち、非共有結合的相互作用を介して結合する）。ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的核酸の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことによって、複合体に標的特異性を提供する。よって、複合体のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントとのその会合によって、部位特異的または「標的化された」活性を提供する。
【００８５】
一部の実施形態では、対象ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、２つの別々の核酸分子を含み、本明細書で「デュアルガイド核酸」と呼ばれる。一部の実施形態では、対象ガイド核酸は、単一の核酸分子（単一のポリヌクレオチド）であり、本明細書で「シングルガイド核酸」と呼ばれる。用語「ガイド核酸」は、包括的であり、デュアルガイド核酸およびシングルガイド核酸の両方を指し、用語「ガイドＲＮＡ」もまた包括的であり、デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）およびシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の両方を指す。
【００８６】
一部の実施形態では、ガイド核酸は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子である。そのような実施形態では、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントは、ＲＮＡであり、ＲＮＡ二重鎖を形成する。しかしながら、ガイド核酸の標的化セグメントは、ＤＮＡであり得る。よって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドガイド核酸がデュアルガイド核酸である場合、標的化セグメントはＤＮＡであり得、二重鎖形成性セグメントはＲＮＡであり得る。そのような実施形態では、「アクチベーター」分子の二重鎖形成性セグメントは、（例えば、標的化セグメントの二重鎖形成性セグメントとＲＮＡ二重鎖を形成するために）ＲＮＡであり得るが、二重鎖形成性セグメントの外側にある「アクチベーター」分子のヌクレオチドは、ＤＮＡであり得（この場合、アクチベーター分子がハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子である）、またはＲＮＡであり得る（この場合、アクチベーター分子がＲＮＡである）。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドガイド核酸がシングルガイド核酸である場合、標的化セグメントは、ＤＮＡであり得、二重鎖形成性セグメント（これは、タンパク質結合性セグメントを構成する）は、ＲＮＡであり得、標的化セグメントおよび二重鎖形成性セグメントの外側のヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
【００８７】
例示的なデュアルガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子および対応するトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を含む。ｃｒＲＮＡ分子は、ガイド核酸の標的化セグメント（一本鎖）およびガイド核酸のタンパク質結合性セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の一方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（「二重鎖形成性セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ガイド核酸のタンパク質結合性セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（二重鎖形成性セグメント）を含む。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ分子のヌクレオチドのストレッチは、ガイド核酸のタンパク質結合性ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するように、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子のヌクレオチドのストレッチに対して相補的でありそれとハイブリダイズする。ｃｒＲＮＡ様分子は、一本鎖標的化セグメントをさらに提供する。よって、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（対応する対として）は、デュアルガイド核酸を形成するようにハイブリダイズする。所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、それらのＲＮＡ分子が見出される種に特徴的である。
【００８８】
用語「プロトスペーサー」は、ｃｒＲＮＡガイド鎖によって標的化されるＤＮＡ配列を指す。一部の態様では、プロトスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のｃｒＲＮＡガイド配列とハイブリダイズする。
【００８９】
「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」配列は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）によって標的化されるＤＮＡ配列の直後の２〜６塩基対のＤＮＡ配列である。ＰＡＭ配列は、標的核酸の切断のために必要とされ、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の源に依存して変動する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭ配列はＮＧＧである。本開示の態様では、ＰＡＭ配列は、標的部位のさらなる切断が防止されるように、ドナーポリヌクレオチドによって変異される。
【００９０】
一部の例では、コンポーネント、例えば、核酸コンポーネント（例えば、ガイド核酸など）；タンパク質コンポーネント（例えば、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ポリペプチド、改変体のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、改変体Ｃａｓ９ポリペプチド）など）は、標識部分を含む。用語「標識」、「検出可能な標識」または「標識部分」は、本明細書で使用される場合、シグナル検出を提供する任意の部分を指し、アッセイの特定の性質に依存して広く変動し得る。目的の標識部分としては、直接的に検出可能な標識（例えば、蛍光標識）および間接的に検出可能な標識（間接的標識、例えば、結合対メンバー）の両方が挙げられる。蛍光標識は、任意の蛍光標識、例えば、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）標識など）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびそれらの任意の蛍光誘導体など）であり得る。
【００９１】
本方法における使用に適切な（直接的または間接的に）検出可能な標識部分としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段によって検出可能な任意の部分が挙げられる。例えば、適切な間接的標識としては、ストレプトアビジン（これ自体、直接的または間接的に標識され得る）が結合し得るビオチン（結合対メンバー）が含まれる。標識としては、以下もまた挙げられ得る：放射能標識（直接的標識）（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）；酵素（間接的標識）（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）；蛍光タンパク質（直接的標識）（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質およびそれらの任意の簡便な誘導体）；金属標識（直接的標識）；比色標識；結合対メンバーなど。「結合対メンバー」とは、第１の部分および第２の部分のうちの一方を意味し、この第１の部分および第２の部分は、互いに対して特異的な結合親和性を有する。適切な結合対としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエローおよびローダミン／抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリン。任意の結合対メンバーが、間接的に検出可能な標識部分としての使用に適切であり得る。
【００９２】
任意の所与のコンポーネント、またはコンポーネントの組合せは、非標識であってもよく、標識部分で検出可能に標識されてもよい。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのコンポーネントが標識される場合、これらは、互いに識別可能な標識部分で標識され得る。
【００９３】
分子および細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  （Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｉ．  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｇｏｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ２００３），  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  １−１１７などの標準的な教科書中に見出され得、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド
【００９４】
少なくとも５つの主要なＣＲＩＳＰＲ系の型（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型）および少なくとも１６個の別個のサブタイプが存在する（Ｍａｋａｒｏｖａ，  Ｋ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１５．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３，  ７２２−７３６）。ＣＲＩＳＰＲ系は、それらのエフェクタータンパク質に基づいても分類される。クラス１の系は、マルチサブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体を有し、一方で、クラス２の系では、エフェクター複合体のすべての機能が、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）によって実行される。実施例に記載されるように、本開示は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド、その改変体および／またはそのオルソログを有利に使用する。当業者は、本開示の態様が、Ｃａｓ９を含むものに加えて、他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｃｐｆ１）にも適用可能であることを理解する。したがって、適切なＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃｐｆ１およびＭＡＤ７、またはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログから選択され得る。
【００９５】
本発明における使用に適切なＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）としては、天然に存在するＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、細菌および／または古細菌細胞中に天然に存在する）、または以下で論じられる改変体Ｃａｓ９ポリペプチドが挙げられる。好ましい一実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である。特に好ましい実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、Ｃｏｂｂ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．  Ｂｉｏｌ．  ４，  ７２３−７２８  （２０１５）に記載されるように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのためにコドン最適化されている。
【００９６】
本明細書に詳述するように、天然に存在するＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、ガイド核酸に結合し、それによって、標的核酸内の特定の配列（標的部位）への指向性を付与され、標的核酸を切断する（例えば、ｄｓＤＮＡを切断して二本鎖切断を生じる、ｓｓＤＮＡを切断する、ｓｓＲＮＡを切断するなど）。したがって、適切なＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、２つの部分、ＲＮＡ結合部分および活性部分を含む。ＲＮＡ結合部分は、対象ガイド核酸と相互作用し、活性部分は、部位特異的酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡメチル化の活性、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ切断の活性、ヒストンアセチル化の活性、ヒストンメチル化の活性、ＲＮＡ改変の活性、ＲＮＡ結合の活性、ＲＮＡスプライシングの活性など）を示す。一部の実施形態では、活性部分は、野生型のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）の対応する活性部分と比較して低減されたヌクレアーゼ活性を示し得る。
【００９７】
タンパク質が対象ガイド核酸と相互作用するＲＮＡ結合部分を有するかどうかを決定するためのアッセイは、タンパク質と核酸との間の結合について試験する任意の簡便な結合アッセイであり得る。例示的な結合アッセイとしては、ガイド核酸およびＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）を標的核酸に添加することが関与する、結合アッセイ（例えば、ゲルシフトアッセイ）が挙げられる。
【００９８】
タンパク質が活性部分を有するかどうかを決定するため（例えば、ポリペプチドが標的核酸を切断するヌクレアーゼ活性を有するかどうかを決定するため）のアッセイは、核酸切断について試験する任意の簡便な核酸切断アッセイであり得る。例示的な切断アッセイとしては、これらに限定されないが、ガイド核酸およびＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）を標的核酸に添加すること、および標的核酸の切断が生じたかどうかを、任意の適切な分析技法、例えば、シーケンシングまたはＰＣＲ増幅を介して試験することが挙げられる。
【００９９】
本発明における使用に適切なＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）としては、改変体のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）が挙げられる。改変体のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、野生型のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸が異なる（例えば、欠失、挿入または置換を有する）アミノ酸配列を有し、ヌクレアーゼ活性の改変を生じる。
【０１００】
一部の実施形態では、改変体のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、標的核酸の相補鎖を切断することができるが、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断する能力は低減されている。例えば、改変体のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、ＲｕｖＣドメインの機能を低減させる変異（アミノ酸置換）を有し得る。非限定的な例として、一部の実施形態では、改変体Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｄ１０Ａ変異（例えば、配列番号３の核酸配列によってコードされるＣａｓ９ポリペプチドの１０位に対応するアミノ酸位置における、アスパラギン酸からアラニンへの変異）を有し、したがって、二本鎖標的核酸の相補鎖を切断することができるが、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断する能力が低減されている（よって、改変体Ｃａｓ９ポリペプチドが二本鎖標的核酸を切断する場合、二本鎖切断（ＤＳＢ）の代わりに一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じる）（例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１を参照されたい）。
【０１０１】
一部の実施形態では、改変体のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断することができるが、標的核酸の相補鎖を切断する能力が低減されている。例えば、改変体のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、ＨＮＨドメインの機能を低減させる変異（アミノ酸置換）を有し得る。非限定的な例として、一部の実施形態では、改変体Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｈ８４０Ａ変異（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの８４０位に対応するアミノ酸位置における、ヒスチジンからアラニンへの変異）を有し得、したがって、標的核酸の非相補鎖を切断することができるが、標的核酸の相補鎖を切断する能力が低減されている（よって、改変体Ｃａｓ９ポリペプチドが二本鎖標的核酸を切断する場合、ＤＳＢの代わりにＳＳＢを生じる）。
【０１０２】
他の実施形態では、本開示のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ペプチド）は、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１４  Ｆｅｂ；４２（４）：２５７７−９０；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ．  ２０１４  Ｆｅｂ  ２７；１５６（５）：９３５−４９；Ｊｉｎｅｋ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１２  ３３７：８１６−２１；Ｊｉｎｅｋ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１４  Ｍａｒ  １４；３４３（６１７６）；およびＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１７  Ｏｃｔ  １９；５５０（７６７６）：４０７−４１０に記載される機能的変異が挙げられるがこれらに限定されない、文献中に記載される変異のうちの１つまたは複数を含み得る；米国特許公開第２０１４／００６８７９７号；および同第２０１６／０１６８５９２号もまた参照されたい；ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１７／１５５７１７；ＷＯ２０１７／１４７０５６；ＷＯ２０１７／０６６１７５；ＷＯ２０１７／０４０３４８；ＷＯ２０１７／０３５４１６；ＷＯ２０１７／０１５１０１；ＷＯ２０１６／１８６９５３；およびＷＯ２０１６／１８６７４５もまた参照されたい；さらに、米国特許第８，６９７，３５９号；同第８，７７１，９４５号；同第８，７９５，９６５号；同第８，８６５，４０６号；同第８，８７１，４４５号；同第８，８８９，３５６号；同第８，８９５，３０８号；同第８，９０６，６１６号；同第８，９３２，８１４号；同第８，９４５，８３９号；同第８，９９３，２３３号；同第８，９９９，６４１号；同第９，８４０，７１３号；同第９，８４０，６９９号；および同第９，７７１，６００号を参照されたい。上述の特許および刊行物の各々は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれており、それらの目的としては、これらに限定されないが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ドナー核酸および／またはＣＲＩＳＰＲ系のコンポーネントを用いて、１つまたは複数の核酸を標的化、切断、編集、改変しまたはその発現をモジュレートするための方法および組成物が挙げられる。
【０１０３】
よって、一部の実施形態では、本明細書に開示の系および方法は、二本鎖ヌクレアーゼ活性を有する野生型のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）、一本鎖ニッカーゼとして作用するＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９改変体）、または改変されたヌクレアーゼ活性を有する他の変異体と使用され得る。したがって、本発明における使用に適切なＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、酵素的に活性なＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）であり得、例えば、標的核酸において一本鎖もしくは二本鎖切断を行うことができ、またはあるいは、野生型のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）と比較して低減された酵素活性を有し得る。
【０１０４】
ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）は、様々な適切なフォーマットで、細胞に、または細胞中に提供され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、プラスミドによってコードされる。プラスミドは、複製コンピテントであっても複製インコンピテントであってもよく、好ましくは、複製コンピテントである。プラスミドは、ガイドＲＮＡをコードするプラスミドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードするプラスミドと同じプラスミドであっても異なるプラスミドであってもよい。一部の場合では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、第１のプラスミドによってコードされ、ガイドＲＮＡは、第２のプラスミドによってコードされる。一部の場合では、ドナー断片は、第１のプラスミドによってコードされる。一部の場合では、ドナー断片は、第２のプラスミドによってコードされる。一部の場合では、ドナー断片は、第３のプラスミドによってコードされる。
【０１０５】
本発明のプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ適合性の複製起点を含み得る。一部の場合では、プラスミドは、ＣＧ１またはＣＡＳＥ１起点を含む。一部の場合では、プラスミドは、ｃｏｌＥ１、ｐ１５ａまたはＲ６ｋ起点を含む。一部の場合では、プラスミドは、ＣＧ１およびＣＡＳＥ１から選択される起点ならびにｃｏｌＥ１、ｐ１５ａおよびＲ６ｋから選択される起点を含む。
【０１０６】
本明細書に記載のように、一部の場合では、ドナー断片、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡのうちの１つまたは複数は、線形または環状の非プラスミド核酸断片中にコードされる。１つまたは複数の断片は、ゲノムに組み込まれ得る。よって、一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、編集される細胞のゲノムに組み込まれた核酸断片中にコードされ得る。一部の場合では、プラスミドまたは組み込まれた断片は、陰性選択のための配列（例えば、ｍａｚＦ、ｃｃｄＢ、ｇａｔａ−１、ｌａｃＹ、ｔｈｙＡ、ｐｈｅＳ、ｔｅｔＡＲ、ｒｐｓＬ、ｓａｃＢ、温度感受性複製起点など）および／またはＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼコード配列の除去のために後に活性化され得る、隣接する組換え配列、例えば、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などをさらに含む。
【０１０７】
ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、線形もしくは環状断片またはプラスミド）は、選択マーカーを含み得る。適切な選択マーカーとしては、これらに限定されないが、抗生物質耐性遺伝子、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子およびＫｍ（カナマイシン耐性遺伝子）、ｔｅｔＡ（テトラサイクリン耐性遺伝子）、Ｇ４１８（ネオマイシン耐性遺伝子）、ｖａｎ（バンコマイシン耐性遺伝子）、ｔｅｔ（テトラサイクリン耐性遺伝子）、アンピシリン（アンピシリン耐性遺伝子）、メチシリン（メチシリン耐性遺伝子）、ペニシリン（ペニシリン耐性遺伝子）、オキサシリン（オキサシリン耐性遺伝子）、エリスロマイシン（エリスロマイシン耐性遺伝子）、リネゾリド（リネゾリド耐性遺伝子）、ピューロマイシン（ピューロマイシン耐性遺伝子）またはハイグロマイシン（ハイグロマイシン耐性遺伝子）が挙げられる。
【０１０８】
一部の場合では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼコード核酸（例えば、線形もしくは環状断片またはプラスミド）中の選択マーカーは、ガイドＲＮＡおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする異なる核酸において使用されるものと同じ選択マーカーである。一部の場合では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼコードプラスミド中の選択マーカーは、ガイドＲＮＡおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする異なる核酸中の選択マーカーと比較して、異なる選択マーカーである。１つまたは複数の陽性および／または陰性選択マーカーの使用は、個々のＣＲＩＳＰＲコンポーネントについての特異的かつ示差的な選択を可能にすることができる。例えば、細胞は、細胞中に、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド、第１のガイドＲＮＡ、および必要に応じて第１のドナー断片を提供することによって編集され得；次いで、第２の編集が、第１のガイドＲＮＡおよびドナー断片の細胞をキュアリングすること；ならびに細胞中に第２のガイドＲＮＡおよび／またはドナー断片を提供することによって行われ得る。ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡおよび／またはドナー断片は、ＣＲＩＳＰＲコンポーネント（単数または複数）をコードする核酸を導入すること、１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲコンポーネントの核タンパク質複合体を導入すること、１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲコンポーネントの発現を誘導すること、またはそれらの組合せによって、細胞中に提供され得る。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、天然のプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、外因性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ配列は、合成プロモーターに作動可能に連結している。
ドナーポリヌクレオチド
【０１１０】
「ドナーポリヌクレオチド」または「修復断片」は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）によって誘導される切断部位において挿入される核酸配列を意味する。適切なドナーポリヌクレオチド配列は一般に、各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な左の相同性アーム配列および右の相同性アーム配列を含み、左および右の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列をさらに含む。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの変異配列を含み、この２つもしくはそれよりも多くの変異配列のうちの少なくとも２つもしくはすべてには、共に同じ左および右の相同性アーム配列が隣接し、またはこの２つもしくはそれよりも多くの変異配列のうちの少なくとも２つもしくはすべてには、異なる左および右の相同性アーム配列が隣接する。一般に、２つまたはそれよりも多くの変異配列が同じドナーポリヌクレオチド中にある場合、これらの変異配列は、互いに近傍にある標的ゲノム遺伝子座の変異である。典型的には、ドナーポリヌクレオチド上の２つまたはそれよりも多くの変異配列は、１５０塩基対、１２５塩基対、１００塩基対、７５塩基対、７０塩基対、６５塩基対、６０塩基対、５５塩基対、５０塩基対、４５塩基対、４０塩基対、３５塩基対、３０塩基対、２５塩基対、２０塩基対または１０もしくは５塩基対以内、あるいは約１５０塩基対、１２５塩基対、１００塩基対、７５塩基対、７０塩基対、６５塩基対、６０塩基対、５５塩基対、５０塩基対、４５塩基対、４０塩基対、３５塩基対、３０塩基対、２５塩基対、２０塩基対または１０もしくは５塩基対以内にあるゲノム改変をコードする。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にあるゲノム改変をコードする２つまたはそれよりも多くの変異配列は、ゲノム中で互いに、約１０〜約１００塩基対または約２５〜約７５塩基対の距離にある。
【０１１１】
本明細書で実証されるように、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の編集効率は、相同性アームの長さを増加させると、顕著に増加する。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右および左の相同性アーム配列は各々独立して、２５；４５、５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対を含む、約２５；４５、５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対を含む、少なくとも２５；４５、５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対を含む、または少なくとも約２５；４５、５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される左および右の相同性アーム配列は各々独立して、２５；５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対以下、または約２５；５０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２２５；２５０；２７５；３００；３２５；３５０；３７５；４００；４２５；４５０；４７５；５００；５２５；５５０；５７５；６００；６２５；６５０；６７５；７００；７２５；７５０；７７５；８００；８２５；８５０；８７５；９００；９２５；９５０；９７５；１，０００；１，０２５；１，０５０；１，０７５；１，１００；１，１２５；１，１５０；１，１７５；１，２００；１，２２５；１，２５０；１，２７５；１，３００；１，３２５；１，３５０；１，３７５；１，４００；１，４２５；１，４５０；１，４７５；１，５００；１；５２５；１，５５０；１，５７５；１，６００；１，６２５；１，６５０；１，６７５；１，７００；１，７２５；１，７５０；１，７７５；１，８００；１，８２５；１，８５０；１，８７５；１，９００；１，９２５；１，９５０；もしくは２，０００塩基対以下を含む。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約４５塩基対と約１２５塩基対との間、約２５塩基対と約２０００塩基対との間、約２５塩基対と約１０００塩基対との間、約２５塩基対と約６００塩基対との間、約２５塩基対と約５００塩基対との間、約２５塩基対と約２５０塩基対との間、約２５塩基対と約２００塩基対との間、約２５塩基対と約１００塩基対との間または約２５塩基対と約５０塩基対との間を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約１００塩基対と約２０００塩基対との間、約１００塩基対と約１０００塩基対との間、約１００塩基対と約６００塩基対との間、約１００塩基対と約５００塩基対との間、約１００塩基対と約２５０塩基対との間、約１００塩基対と約２００塩基対との間または約１００塩基対と約１５０塩基対との間を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右および左の相同性アーム配列は各々独立して、約０塩基対と約２０００塩基対との間、約０塩基対と約１０００塩基対との間、約０塩基対と約６００塩基対との間、約０塩基対と約５００塩基対との間、約０塩基対と約２５０塩基対との間、約０塩基対と約２００塩基対との間、約０塩基対と約１００塩基対との間、約０塩基対と約５０塩基対との間または約０塩基対と約２５塩基対との間を含む。
【０１１３】
一部の場合では、本明細書に記載のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される右の相同性アームは、０塩基対の長さを有するが、左の相同性アームは、２５、４５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０もしくは２０００塩基対の長さ、少なくとも２５、４５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０もしくは２０００塩基対の長さ、約２５、４５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０もしくは２０００塩基対の長さ、または少なくとも約２５、４５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０もしくは２０００塩基対の長さを有する。一部の場合では、本明細書に記載のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドと組み合わせて使用される左の相同性アームは、０塩基対の長さを有するが、右の相同性アームは、２５、４５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０もしくは２０００塩基対の長さ、少なくとも２５、４５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０もしくは２０００塩基対の長さ、約２５、４５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０もしくは２０００塩基対の長さ、または少なくとも約２５、４５、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０もしくは２０００塩基対の長さを有する。
【０１１４】
ドナーポリヌクレオチドは、典型的には、それが置き換えるゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナーポリヌクレオチドは一般に、相同組換え修復を支持するために十分な相同性が存在する限り、少なくとも１つの変異配列、例えば、ゲノム配列に関して、１つまたは複数の単一塩基変化、挿入、欠失、反転または再編成を含む。例示的な変異配列は、以下を含む：単一ヌクレオチド挿入；２つもしくはそれよりも多くのヌクレオチドの挿入；１つもしくは複数のタンパク質をコードする核酸配列の挿入；単一ヌクレオチド欠失；２つもしくはそれよりも多くのヌクレオチドの欠失；１つもしくは複数のコード配列の欠失；単一ヌクレオチドの置換；２つもしくはそれよりも多くのヌクレオチドの置換；２つもしくはそれよりも多くの非連続的な挿入、欠失および／もしくは置換；またはそれらの任意の組合せ。具体的な実施形態では、少なくとも１つの変異配列は、Ｃａｓ９のＰＡＭの変異を含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの非連続的な変異を有する変異配列を含む。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドのＰＡＭ領域（例えば、Ｃａｓ９のＰＡＭ領域）中の変異、必要に応じてまたは代替的に、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチドのシード領域（例えば、Ｃａｓ９のシード領域）中の変異、および少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、５０、６０、９０または１００ヌクレオチド離れた変異を含み得る。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にある非連続的な改変は、２００塩基対、１７５塩基対、１５０塩基対、１２５塩基対、１００塩基対、７５塩基対、７０塩基対、６５塩基対、６０塩基対、５５塩基対、５０塩基対、４５塩基対、４０塩基対、３５塩基対、３０塩基対、２５塩基対、２０塩基対もしくは１０塩基対もしくは５塩基対以内、または約２００塩基対、１７５塩基対、１５０塩基対、１２５塩基対、１００塩基対、７５塩基対、７０塩基対、６５塩基対、６０塩基対、５５塩基対、５０塩基対、４５塩基対、４０塩基対、３５塩基対、３０塩基対、２５塩基対、２０塩基対もしくは１０塩基対もしくは５塩基対以内にある。一部の場合では、ゲノム中で互いに近傍にある非連続的な改変は、ゲノム中で互いに、約１０〜約１００塩基対または約２５〜約７５塩基対の距離にある。
【０１１６】
一部の場合では、一方のドナーポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの非連続的な変異を含み、第２のまたは他方のドナーポリヌクレオチドは、異なる遺伝子座における変異を含む。一部の場合では、一方のドナーポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの非連続的な配列を含み、第２のまたは他方のドナーポリヌクレオチドは、異なる遺伝子座における２つまたはそれよりも多くの非連続的な変異を含む。
【０１１７】
変異配列は、ゲノム配列と比較して、ある特定の配列差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、切断部位におけるドナー配列の首尾よい挿入について評価するために使用され得、または、一部の実施形態では、他の目的のため（例えば、標的化されたゲノム遺伝子座における発現を示すため）に使用され得る。一部の実施形態では、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列差異は、アミノ酸配列を変化させず、またはサイレントなアミノ酸変化（即ち、タンパク質の構造にも機能にも影響を与えない変化）を起こす。あるいは、これらの配列差異は、マーカー配列の除去のために後に活性化され得る、隣接する組換え配列、例えば、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などを含み得る。
【０１１８】
ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡとして提供され得る。ドナーポリヌクレオチドの末端は、当業者に公知の方法によって、（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つもしくは複数のジデオキシヌクレオチド残基が、線形分子の３’末端に付加され得、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方もしくは両方の末端にライゲーションされ得る。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加の方法としては、これらに限定されないが、末端アミノ基（単数または複数）、リン酸基、メチル基の付加、ならびに改変されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの使用が挙げられる。
【０１１９】
一部の実施形態では、例えば、追加の配列、例えば、複製起点、１つもしくは複数のプロモーターおよび／または陽性もしくは陰性選択マーカーなど、あるいはそれらのうちの２つ、それらのうちの３つまたはそれらのうちのすべての組合せを有するプラスミドの一部として細胞に導入されるドナーポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、複製コンピテントなプラスミドの一部として提供される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、複製インコンピテントなプラスミドの一部として、細胞に導入される。あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として（例えば、線形または環状断片として）、リポソームもしくはポリマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入され得、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達され得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの組込みは、組換えタンパク質、例えば、ＲｅｃＥ／Ｔ、またはファージラムダ由来レッド（Ｒｅｄ）組換え系ラムダのエキソヌクレアーゼ、ベータ−タンパク質および／もしくはガンマ−タンパク質のうちの１つもしくは複数のコンポーネントの、同時または順次的な導入によって補助され得る（ＧＥＮＥＴＩＣＳ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １，  ２０１０  ｖｏｌ．  １８６  ｎｏ．  ３  ７９１−７９９を参照されたい）。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのドナー断片コード核酸は、選択的誘導のために、例えば、宿主細胞ゲノムの連続的編集のために、示差的に誘導性のプロモーターに作動可能に連結している。
【０１２２】
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、ドナーポリヌクレオチドのプラスミドベースの提示による多重化ゲノム編集が、以下に詳述される機構（１）、（２）、（３）、（４）または（５）のうちの１つまたは複数を介して進行し得ると仮説を立てている。
【０１２３】
機構（１）、単一のクロスオーバーループイン（ｌｏｏｐ−ｉｎ）と、その後のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）／ｓｇＲＮＡ媒介性の切断および修復。細胞内で、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）は、構成的に発現される。ｓｇＲＮＡ／修復断片コンストラクトの形質転換後、修復断片遺伝子座におけるループイン事象（即ち、２つの別々の組込み事象）が存在し、それによって、遺伝子座が重複する（即ち、１つの変異体コピー、１つの野生型コピー）。並行して、コンストラクト上のｓｇＲＮＡ（単数または複数）が発現され、フォールディングし、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）」は、野生型遺伝子座を認識し切断する。細胞は、生存するためにこの切断を修復しなくてはならない。ゲノムに既に組み込まれた変異体遺伝子座は、切断部位に隣接し、修復のための組換え鋳型として機能する。次いで、変異はゲノムＤＮＡ中で固定され、娘細胞まで存続する。
【０１２４】
機構（２）、二重クロスオーバーループイン／ループアウト（ｌｏｏｐ−ｏｕｔ）と、その後のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）／ｓｇＲＮＡ媒介性切断。細胞内で、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）は、構成的に発現される。ｓｇＲＮＡ／修復断片コンストラクトの形質転換後、修復断片遺伝子座におけるループイン事象（即ち、２つの別々の組込み事象）が存在し、それによって、遺伝子座が重複する（即ち、１つの変異体コピー、１つの野生型コピー）。ｓｇＲＮＡ／修復断片コンストラクトのループイン後、修復断片相同性アームによって媒介されるループアウト事象が存在する（理論上、細胞の約５０％は、野生型バージョンの遺伝子座にループアウトするはずであり、残りの５０％は、変異体バージョンの遺伝子座にループアウトする）。並行して、コンストラクト上のｓｇＲＮＡ（単数または複数）が発現され、フォールディングし、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）」は、野生型にループアウトした細胞を認識して切断し、それらを集団から取り除く。変異体遺伝子座を含む細胞は、「プライミングされたＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）」によって切断されない；次いで、変異はゲノムＤＮＡ中で固定され、娘細胞まで存続する。
【０１２５】
機構（３）、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）／ｓｇＲＮＡ媒介性切断と、その後のプラスミドドナーによる二重クロスオーバー修復。細胞内で、Ｃａｓ９は、構成的に発現される。ｓｇＲＮＡ／修復断片コンストラクトの形質転換後、コンストラクト上のｓｇＲＮＡ（単数または複数）が発現され、フォールディングし、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）」は、野生型遺伝子座を認識し切断する（即ち、染色体ＤＮＡ中の２つの二本鎖切断）。細胞は、生存するためにこれらの切断を修復しなくてはならない。ｓｇＲＮＡ／修復断片コンストラクトは、ＤＮＡ中の切断を直すための組換え鋳型として機能する（即ち、２つの二重クロスオーバー修復事象）。細胞は、二重クロスオーバー事象を実行し、切断を修復する。変異はゲノムＤＮＡ中で固定され、娘細胞まで存続する。
【０１２６】
機構（４）、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）／ｓｇＲＮＡ媒介性切断と、その後の二本鎖線形ドナーによる二重クロスオーバー修復：細胞内で、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）は、異種組換えタンパク質（例えば、ラムダレッド組換え系からのベータ、ガンマおよびエキソ、またはｒａｃプロファージからのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ）と共に構成的に発現される。ｓｇＲＮＡコンストラクトおよび線形二本鎖修復断片（単数または複数）の形質転換後、コンストラクト上のｓｇＲＮＡ（単数または複数）が発現され、フォールディングし、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたＣａｓ９」は、野生型遺伝子座を認識し切断する（即ち、染色体ＤＮＡ中の２つの二本鎖切断）。細胞は、生存するためにこれらの切断を修復しなくてはならない。修復断片は、異種組換えタンパク質によってプロセシングされ、染色体修復のための鋳型として使用される。変異はゲノムＤＮＡ中で固定され、娘細胞まで存続する。
【０１２７】
機構（５）、ＤＮＡ複製を介した一本鎖線形ドナーの導入と、その後の野生型遺伝子座のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）／ｓｇＲＮＡ媒介性切断。細胞内で、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）は、異種組換えタンパク質（例えば、ラムダレッド組換え系からのガンマまたはｒａｃプロファージからのＲｅｃＴ）と共に構成的に発現される。ｓｇＲＮＡコンストラクトおよび線形一本鎖修復断片（単数または複数）の形質転換後、線形一本鎖修復断片（単数または複数）が、ＤＮＡ複製の間に、岡崎フラグメント伸長を介してゲノムＤＮＡに組み込まれる。ｓｇＲＮＡ（単数または複数）が発現され、フォールディングし、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）に結合し、これにより、それを標的の認識および切断のためにプライミングする。この時点で、「プライミングされたＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）」は、野生型遺伝子座を認識して切断し（即ち、染色体ＤＮＡ中の２つの二本鎖切断）、変更された遺伝子座をインタクトなままにする。変異はゲノムＤＮＡ中で固定され、娘細胞まで存続する。
ガイドＲＮＡ
【０１２８】
ガイドＲＮＡは、以下として提供され得る：ガイドＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡ。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、追加の配列、例えば、複製起点、１つもしくは複数のプロモーターおよび／または陽性もしくは陰性選択マーカーなど、あるいはそれらのうちの２つ、それらのうちの３つまたはそれらのうちのすべての組合せを有するプラスミド中にコードされる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、複製コンピテントなプラスミドの一部として提供される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、複製インコンピテントなプラスミドの一部として提供される。あるいは、ガイドＲＮＡは、裸の核酸として（例えば、線形または環状断片として）、リポソームもしくはポリマーなどの薬剤と複合体化した核酸として提供され得、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達され得る。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのガイドＲＮＡコード核酸は、選択的誘導のために、例えば、宿主細胞ゲノムの連続的編集のために、示差的に誘導性のプロモーターに作動可能に連結している。示差的に誘導性のガイドＲＮＡは、同じまたは異なるプラスミドまたは核酸断片によってコードされ得る。
ＤＮＡ修復コンポーネント
【０１３０】
ある特定の実施形態では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、ドナーポリヌクレオチド、および異種ＤＮＡ修復経路のコンポーネントをコードする核酸によって宿主細胞ゲノムを編集するための方法が提供される。一部の場合では、本方法は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、ドナーポリヌクレオチド、および異種ＤＮＡ修復経路の２つまたはそれよりも多くのコンポーネントをコードする２つまたはそれよりも多くの核酸によって宿主細胞ゲノムを編集するステップを含む。一部の場合では、本方法は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、ドナーポリヌクレオチド、および異種ＤＮＡ修復経路の２つまたはそれよりも多くのコンポーネントをコードする核酸を含む。
【０１３１】
一部の場合では、修復経路は、ＲｅｃＡ／ＲｅｃＢＣＤ修復経路である。一部の場合では、修復経路は、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ修復経路である。一部の場合では、修復経路は、Ｒｅｄα／Ｒｅｄβ修復経路である。一部の場合では、修復経路は、ラムダ由来レッド組換え修復経路である。一部の場合では、本方法は、ＲｅｃＡおよび／またはＲｅｃＢＣＤの発現を含む。一部の場合では、本方法は、ＲｅｃＥおよび／またはＲｅｃＴの発現を含む。一部の場合では、本方法は、Ｒｅｄαおよび／またはＲｅｄβの発現を含む。一部の場合では、本方法は、ラムダ由来レッド組換え修復経路のベータ、ガンマおよび／またはエキソコンポーネントの発現を含む。異種ＤＮＡ修復経路のコンポーネントをコードする核酸は、第１、第２または他のプラスミド上にあり得る。一部の場合では、ｓｇＲＮＡ（単数または複数）は、第１のプラスミド上にコードされ、異種ＤＮＡ修復タンパク質（単数または複数）は、第２のプラスミド上にコードされる。
発現、精製および送達
【０１３２】
一態様では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）遺伝子編集複合体をコードするプラスミド、ベクター、コンストラクトおよび核酸配列を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチドの同時もしくは順次的な発現および／またはドナーポリヌクレオチドの提示を伴うまたは伴わない、ガイドＲＮＡの一過的な発現のためのプラスミドを提供する。一部の実施形態では、本発明のプラスミドおよびベクターは、ガイドＲＮＡをコードし、本開示のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドもまたコードする。他の態様では、操作された複合体の異なるコンポーネントは、１つまたは複数の別個のプラスミド中にコードされ得る。
【０１３３】
一部の実施形態では、本開示のプラスミドは、複数のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種を横断して使用され得る。一部の実施形態では、本開示のプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに特異的に合わせて調整される。一部の実施形態では、本開示のプラスミドは、一般にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ならびに／または特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、および／もしくはその特定の株、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４における発現のためにコドン最適化された配列（例えば、プロモーター、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ遺伝子）、複製起点など）であるまたはそれを含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、本開示のプラスミドおよびベクターは、目的の細胞において選択的に発現される。よって、一部の実施形態では、本出願は、異所的プロモーター、発生的に調節されるプロモーターおよび／または誘導性プロモーターの使用を企図する。一部の実施形態では、本開示は、ターミネーター配列の使用を提供する。
形質転換
【０１３５】
一部の実施形態では、本明細書は、本明細書に開示のプラスミドおよびベクターの形質転換の使用を提供する。当業者は、本明細書のプラスミドが、本明細書の他の部分に記載されるような任意の公知の系を介して細胞に形質転換され得ることを認識する。例えば、一部の態様では、本明細書は、電気穿孔による形質転換、化学的に誘導される形質転換（例えば、二価カチオン、例えば、Ｍｇ２＋の存在下での形質転換）、コンジュゲーション、微粒子銃、アグロバクテリウム形質転換、ナノスパイク形質転換およびウイルス形質転換（例えば、ファージ形質転換）を提供する。
【０１３６】
一部の実施形態では、本明細書のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ媒介性遺伝子移入を含む様々な技法のいずれかを使用して、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞に導入され得る。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔が挙げられる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６  ”Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９９  Ｏｃｔ；５２（４）：５４１−５）。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７：６９−７４  （１９９２）；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｏｌ．  １５３：１６３−１６８  （１９８３）；およびＢｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：１８２−１８７  （１９９１）を参照されたい。一部の実施形態では、形質転換された宿主細胞は、組換えＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主株と呼ばれる。
【０１３７】
一部の実施形態では、本明細書は、Ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎと題するＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４０１１４に記載されるような９６ウェルプレートロボット工学プラットフォームおよび液体ハンドリング機械を使用する、細胞のハイスループット形質転換を提供する。
【０１３８】
一部の実施形態では、外因性タンパク質（例えば、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチド）を細胞に導入するための方法が必要とされる。タンパク質／ＲＮＡ／ＤＮＡの直接的トランスフェクションまたはＤＮＡ形質転換とその後のＲＮＡおよびタンパク質の細胞内発現を含む、これを達成するための様々な方法が、以前に記載されている（例えば、Ｄｉｃａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１：４３３６−４３  （２０１３）；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １９５：３０３−３１１  （１９９７）；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｉｆｅ  ３：ｅ０４７６６  （２０１４）を参照されたい）。
【０１３９】
一部の実施形態では、本明細書は、上述した１つまたは複数の選択マーカーで形質転換された細胞をスクリーニングすることを提供する。そのような一実施形態では、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換された細胞は、有効量のカナマイシン抗生物質を含む培地上で平板培養される。カナマイシン添加培地上で視認できるコロニー形成単位は、ベクターカセットをそれらのゲノムに組み込んでいると推定される。所望の配列の挿入は、関連する挿入部位のＰＣＲ、制限酵素分析および／またはシーケンシングを介して確認することができる。
【０１４０】
当業者は、遺伝子発現のためのウイルスベクターまたはプラスミドが、本明細書に開示の配列および／または複合体を送達するために使用され得ることを容易に認識する。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、組換え発現のために核酸もしくは核タンパク質複合体をカプセル封入するために使用され得、または本明細書に開示の精製されたリボ核タンパク質複合体は、電気穿孔、細胞（単数または複数）をＶＬＰと接触させること、または注入を介して、細胞に提供および送達され得る。
キット
【０１４１】
一部の実施形態では、本開示は、上記方法および組成物において開示された要素のうちのいずれか１つまたは複数を含むキットを提供する。一部の態様では、キットは、ＣＲＩＳＰＲ／ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）系、およびキットを使用するための使用説明書を含む。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）系は、第１のガイドＲＮＡを発現させるための配列に作動可能に連結したプロモーター、ならびに各々がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ標的配列に相同な上流の相同性アーム配列および下流の相同性アーム配列を有する第１のドナーポリヌクレオチドであって、前記上流の相同性アーム配列および前記下流の相同性アーム配列が隣接した少なくとも１つの変異配列を含む、前記第１のドナーポリヌクレオチド、ならびに必要に応じて、宿主Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株にこれもまた直接組み込まれ得るＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチドを含む、プラスミドを含む。ドナーポリヌクレオチドおよび／またはＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチドは、ガイドＲＮＡと同じまたは別々のプラスミド上にコードされ得る。あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、線形または環状断片として提供され得る。
【０１４２】
要素は、個々にまたは組み合わせて提供され得、任意の適切な容器、例えば、バイアル、ボトル、管またはマルチウェルプレート（例えば、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルプレート）中に提供され得る。一部の態様では、キットは、１つまたは複数の言語、例えば、１つよりも多い言語での使用説明書を含む。
【０１４３】
一部の態様では、キットは、本明細書に記載の要素（例えば、精製されたＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）ポリペプチド）のうちの１つまたは複数を利用するプロセスにおける使用のための１つまたは複数の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器中に提供され得る。例えば、キットは、１つまたは複数の反応または保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態で、または使用前に１つもしくは複数の他のコンポーネントの添加を必要とする形態で（例えば、濃縮または凍結乾燥された形態で）提供され得る。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない任意の緩衝液であり得る。一部の態様では、緩衝液は、アルカリ性である。一部の態様では、緩衝液は、約７〜約１０のｐＨを有する。一部の態様では、キットは、ｃｒＲＮＡ配列および調節エレメントを作動可能に連結するために、ベクター中への挿入のためのｃｒＲＮＡ配列に対応する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。
【０１４４】
ここまで本発明を一般に記載してきたが、特記しない限り、例として提供され本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解される。
【０１４５】
本明細書で引用される各定期刊行物、特許および他の文書または参考文献は、その全体が参照により本出願に組み込まれている。
【実施例】
【０１４６】
（実施例１）
Ｃａｓ９は、機能的なガイドＲＮＡと併せて発現された場合、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて致死ＤＳＢを誘導することができる
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓへのコドンバイアスを有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９遺伝子（Ｃｏｂｂ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．  Ｂｉｏｌ．  ４，  ７２３−７２８  （２０１５））を合成し、Ｐｔｒｃプロモーターに連結し、Ｃａｓ９の発現のためにＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに組み込んだ。
【０１４７】
Ｃａｓ９活性を、Ｃａｓ９をｃｇ０４４３〜ｃｇ０４４４遺伝子座に組み込んだ株において試験した。修復が無効である場合、二本鎖切断（ＤＳＢ）は致死であるので、数個のエスケープ変異体以外にコロニーは形成しないと予測された（図１）。図１に示されるように、ガイドＲＮＡ発現を駆動するプロモーターとしてＰｃｇ２６１３を有するプラスミドの形質転換後、得られたＣａｓ９  ＤＳＢの致死効果が実証され、よって、Ｃａｓ９は、ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて機能的であった。図２は、機能性ｓｇＲＮＡの致死効果が、目的の様々な遺伝子座で一般化できることを実証している。
（実施例２）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集  −  ＳＮＰ導入
【０１４８】
使用するＣａｓ９およびガイドＲＮＡの機能性を首尾よく実証した後で、単一のプラスミド上に一緒にコードされる検証されたガイドＲＮＡおよび対応するドナーポリヌクレオチドを使用して、３つの試験遺伝子座においてＳＮＰを導入するためのプラスミドを設計した。ＳＮＰを導入するために使用した構成の概略図は、図３のパネルＡに示される。標的化されたＳＮＰは、ＰＡＭ領域を変更する各遺伝子座中の単一の変異であった。ＰＡＭ領域における標的ＳＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による改変されたゲノムの続く切断を防止する。これらの結果を、Ｃａｓ９を含みガイドＲＮＡのみを発現する株、ならびに組み込まれたＣａｓ９を有さないがＣａｓ９が組み込まれた株において使用されるのと同一のガイドＲＮＡおよびドナー断片を含むプラスミドを有するＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍと比較した。
【０１４９】
ガイドＲＮＡ／ドナーＤＮＡプラスミドによる形質転換からのコロニーを、コロニーＰＣＲおよびＮＧＳ配列分析を介して試験した。１つのＮＧＳカバレッジプロットの例は、図６に示される。３つの遺伝子座（ｒｐｓＬ、ｃｇ０１６７およびｃｇ３４０４）を、ＳＮＰ導入を試験するために選択した。ガイドＲＮＡ／ＰＡＭ部位変異を含むドナーＤＮＡプラスミドで形質転換されたコロニーのパーセントは、４４％（ｒｐｓＬ）、８７．５％（ｃｇ０１６７）および７５％（ｃｇ３４０４）であった（図７）。試験遺伝子座の範囲はゲノムにおよび、既知および未知の機能の様々な遺伝子を示し、これは、ゲノム編集のこの方法が、広い範囲の遺伝子標的に一般化可能であることを示している。
（実施例３）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集  −  遺伝子欠失
【０１５０】
ｃｇ３０３１遺伝子座からの７０２ｂｐの欠失を試験した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてｃｇ３０３１  ＯＲＦをノックアウトするためのストラテジーの概要は、図４のパネルＡに提供される。上記実施例と同様、Ｃａｓ９をゲノムに組み込んだ；ｃｇ３０３１  ＯＲＦに対する３４０ｂｐの左のアーム相同性および４００ｂｐの右アーム相同性ならびにガイドＲＮＡカセットを含むドナーポリヌクレオチドを、単一のプラスミド上で導入した。ｃｇ３０３１の７０２ｂｐ領域の除去は、図１３に示されるように、ＰＣＲによって検出可能であった。１６４８ｂｐのバンドは、野生型ゲノムを示す；一方で、９４６ｂｐのバンドは、改変されたゲノムを示す。形質転換後に生じたコロニーの分析により、８つのコロニーのうちの６つにおいて、ｃｇ３０３１遺伝子座からの７０２ｂｐの欠失の存在が実証された。
（実施例４）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集  −  小さい挿入
【０１５１】
ポリヌクレオチドを、図５に示されるように、３つの遺伝子座において１００ｂｐを挿入するように設計した。各挿入を、標的化されたプロトスペーサーの２０ｂｐを欠失させ、１００ｂｐの挿入で置き換えるように設計した。挿入を、３つの遺伝子座（ｇｄｈＡ、ｃｇ３０３１およびｃｇ３４０４）を標的化するように設計した。ドナー断片は、２５、５０、７５、１００、ならびに１２５、５００および２０００ｂｐの相同性アームの長さを含んだ。各ドナー断片を有するポリヌクレオチドを、組み込まれたＣａｓ９を有するＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに形質転換した。３つすべての遺伝子座が、挿入によって首尾よく編集された（図９）。５００ｂｐを有する相同性アームは、３つすべての試験遺伝子座において挿入を生じさせることができたが、より短い相同性のアームは、遺伝子座を横断して変動性を示した（図９）。
（実施例５）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集  −  複数の遺伝子座における複数の同じ場所に位置するＳＮＰの首尾よい同時導入
【０１５２】
標的ＳＮＰがＰＡＭ領域の外側の位置にある場合、または複数のＳＮＰが望ましい場合、複数の同じ場所に位置するＳＮＰが、同じドナー断片上に導入され得る。複数の同じ場所に位置するＳＮＰの同時導入を調査するために、ドナー断片を、ｃｇ０１６７およびｃｇ３４０４試験遺伝子座において２つの同時ＳＮＰを導入し、ｒｐｓＬ試験遺伝子座において３つの同時編集を導入するために設計した。ｃｇ０１６７を標的化するドナー断片は、ＰＡＭ領域をスクランブルする１つのＳＮＰおよびＰＡＭから１０ｂｐ離れた別のＳＮＰからなる。ｃｇ３４０４を標的化するドナー断片は、ＰＡＭ領域をスクランブルする１つのＳＮＰおよびＰＡＭから７０ｂｐ離れた別のＳＮＰを含む。ｒｐｓＬドナー断片は、ＰＡＭ領域をスクランブルする１つのＳＮＰ、プロトスペーサーのシード領域中の別のＳＮＰ（ＰＡＭの１０ｂｐ下流）、およびＰＡＭから６５ｂｐ離れた別のＳＮＰを含む。ＰＡＭおよびシード領域における標的ＳＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による改変されたゲノムのさらなる切断を防止する。編集されたおよび未編集のコロニーの配列分析からのカバレッジプロットは、図６に示され、ｒｐｓＬ遺伝子座における３つのＳＮＰの首尾よい共導入を実証している。複数のＳＮＰが、３つすべての遺伝子座において首尾よく導入された（図７）。
（実施例６）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集効率は、プラスミドにコードされるドナーポリヌクレオチド中の相同性アームの長さに依存して変動する
【０１５３】
標的化されたＳＮＰおよび挿入を、異なる長さの相同性アームを用いて３つの遺伝子座において試験した。ドナー断片は、２５、５０、７５、１００および１２５ｂｐの、左および右の対称な相同性アームの長さを含んだ。標的ＳＮＰを、３つの試験遺伝子座（ｃｇ０１６７、ｃｇ３４０４およびｒｐｓＬ）において生成したところ、より長い相同性アームは、編集されたコロニーのより高いパーセンテージを生じた（図８）。ＳＮＰ編集を、１つの遺伝子座（ｒｐｓＬ）における２５ｂｐの小ささの相同性アームを用いて実証した。挿入を、代替的セットの３つの遺伝子座（ｃｇ３０３１、ｃｇ３４０４およびｇｄｈＡ）においても試験した。より長い相同性アームは、編集されたコロニーのより高いパーセンテージを生じた（図９）。１つの遺伝子座（ｇｄｈＡ）において首尾よい挿入を生じた最も小さい相同性アームの長さは、７５ｂｐであった。
（実施例７）
形質転換効率は、複製起点に依存し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株においてユニークである
【０１５４】
５つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点のパネルを、プラスミドへと構築し、ＷＴ  ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに形質転換して、形質転換効率を試験した（図１４）。複製起点ｐＣＡＳＥ１およびｐＣＧ１は、高い数のコロニーおよび許容できる形質転換効率を生じた。起点ｐＢＬ１、ｐＣＣ１およびｐＮＧ２は、コロニーをほとんど生じず、無視できる形質転換効率を生じた。ｐＢＬ１、ｐＣＣ１およびｐＮＧ２と比較したｐＣＡＳＥ１およびｐＣＧ１の形質転換効率における差異は、統計的に有意である。これらの結果は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの一部の株における前者の複製起点の報告された使用とは対照的である。本明細書に示されるデータは、様々な複製起点が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの異なる工業的に適切な株において異なる形質転換効率を示すことを示唆している。起点ｐＣＡＳＥ１およびｐＣＧ１を、ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４における編集効率に対するプラスミド複製起点の影響を調査するさらなる研究へと進めた。首尾よい形質転換体は、この系における首尾よい編集の必要条件であるので、編集効率は、起点ｐＢＬ１、ｐＣＣ１およびｐＮＧ２について無視できると予測される。
（実施例８）
複製起点は、編集効率に影響を与える
【０１５５】
ポリヌクレオチドコピー数は、ガイドＲＮＡの発現レベルおよびドナー断片の送達に影響を与え得る。複製起点が編集効率に対して影響を有するかどうかを調査するために、２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ複製起点（ｐＣＡＳＥ１およびｐＣＧ１）を、標的遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡ、およびＳＮＰのいずれかの側の１２５ｂｐの相同性または挿入のいずれかの側の５００ｂｐの相同性を含むドナー断片を含むポリヌクレオチド中に含めた。プラスミドを、組み込まれた構成的に発現されるＣａｓ９遺伝子のコピーを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株に形質転換し、最大で８つのコロニーを、ＮＧＳによるスクリーニングのために選んだ。２つの生物学的再現を、各編集コンストラクトについて平均した。複製起点は、編集効率に対して有意な影響を有し、ｐＣＡＳＥ１は、ｐＣＧ１よりも有意に高い編集効率を示した（図１２）。
（実施例９）
ＰＣＲドナーポリヌクレオチドと併せたＲｅｃＥＴの発現は、所望の編集の首尾よい組込みを生じる
【０１５６】
編集を生成するために使用され得る構成は、複製性プラスミド上のガイドＲＮＡおよびＰＣＲ産物としてのドナー断片の送達を含む。これらのコンポーネントを、ＲｅｃＥＴに作動可能に連結した誘導性プロモーターを含むヘルパープラスミド（ｐＲｅｃＥＴ）を含む株バックグラウンドに形質転換した（図１０）。ＰＣＲ産物を、ｃｇ３４０４において２つのＳＮＰを生じさせるように設計した。ＰＣＲドナーおよびガイドＲＮＡプラスミドを、ＷＴ、組み込まれたＣａｓ９、ｐＲｅｃＥＴを含むＷＴ、およびｐＲｅｃＥＴを含む組み込まれたＣａｓ９に形質転換した。コロニーを、コロニーＰＣＲを介してスクリーニングし、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングして、ＳＮＰまたはノックアウトが首尾よく生じたかどうかを決定した。ＳＮＰおよびノックアウトは、組み込まれたＣａｓ９およびｐＲｅｃＥＴを有する株でのみ首尾よく生成された（図１１）。
（実施例１０）
プラスミドベースのドナーポリヌクレオチドを使用する、ｃｇ３４０４およびｒｐｓＬにおける多重化並行ＳＮＰ編集
【０１５７】
以前の報告は、複数のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９媒介性編集を並行して導入することが、非効率的なプロセスであることを示唆している。１つの実験（図１５）では、２つの対をなすｓｇＲＮＡおよびドナー断片を、組み込まれたＣａｓ９遺伝子を有する株に形質転換した単一のプラスミド上に含めた。スクリーニングしたコロニーのうち、この実験における２編集コンストラクトのうちの１つからのｒｐｓＬおよびｃｇ３４０４における同時編集が観察された（図１５中のＮＧＳ読み取りによって示される通り）。別の構成では、異なる誘導性プロモーターの制御下に複数のｓｇＲＮＡ／ドナー断片対を含む単一のプラスミドが、Ｃａｓ９発現株に形質転換され得る。次いで、一連の編集の各々が、一連のｓｇＲＮＡの各々の発現を連続的に誘導することによって導入され得る。なお別の構成では、親株は、複数の修復断片を含み対応するｇＲＮＡを含まないプラスミドで形質転換され得る。次いで、修復断片を含む形質転換体は、既に存在する修復断片に対応するｇＲＮＡ（単数または複数）を含むプラスミドで形質転換され得る。
（実施例１１）
反復ＣＲＩＳＰＲ編集による積み重ねゲノム編集
【０１５８】
以前の報告および本発明者らのデータは、複数の編集を導入することが非効率的であること］］、複数のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９媒介性編集を並行して導入することが、非効率的なプロセスであることを示唆している。
【０１５９】
１つの代替法は、複数の編集を順次組み込むことである。１つのそのような構成では、単一のｓｇＲＮＡ／ドナー断片対を有し、プラスミド除去のためのエレメントを含むプラスミドが、Ｃａｓ９発現株に導入され得る。形質転換および編集の後、プラスミドは除去され得、異なるｓｇＲＮＡ／ドナー断片対を含む第２のプラスミドが、第２の編集を導入するために形質転換され得る。次いで、コロニーは、すべての意図した編集の組込みを検証するためにアッセイされ得る。
＊  ＊  ＊
本開示は、好ましい実施形態を参照して記載されてきたが、様々な変化が行われ得、本開示の範囲から逸脱することなしに特定の状況に適合するように、等価物がその要素を置換し得ることが、当業者によって理解される。したがって、本開示は、本開示を実施するために企図されるベストモードとして開示された特定の実施形態に限定されないが、本開示は、添付の特許請求の範囲の範囲および精神に入るすべての実施形態を含むことを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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