(57)【要約】本開示は、抗原をアジュバントにカップリンするための組成物および方法、免疫原性組成物、ならびにワクチンに関する。本発明の方法は、免疫応答を増加させるため、またはがんもしくは感染性疾患を処置するために使用することができる。本明細書において実施例に記載するように、本開示の抗原−アジュバント複合体の投与は、２０倍を上回る胚中心応答の予想外の増強、６３倍の抗体価の増加、および骨髄中での長寿命の形質細胞の増加をもたらした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分に、必要に応じて少なくとも１つのリンカーを介して、カップリングした抗原反応性部分に共有結合で連結された抗原、および
（ｂ）金属水酸化物アジュバント
を含む、抗原−アジュバント複合体であって、
前記抗原が、前記多価アジュバント反応性部分の前記ヒドロキシル置換基を介して前記金属水酸化物アジュバントにコンジュゲートし、それにより、抗原−アジュバント複合体が形成される、抗原−アジュバント複合体。
【請求項２】
前記抗原反応性部分が、スルフヒドリル反応性部分を含む、請求項１に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項３】
前記スルフヒドリル反応性部分がマレイミドである、請求項１から２のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項４】
前記多価アジュバント反応性部分が、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項５】
前記ヒドロキシル置換基が、フッ化物基、クエン酸基、リン酸基、炭酸基および硫酸基からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項６】
前記ヒドロキシル置換基がリン酸基である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項７】
前記ヒドロキシル置換基が、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項８】
前記リン酸化アミノ酸残基が、リン酸化セリン、リン酸化チロシンおよびリン酸化スレオニンから選択される、請求項７に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項９】
前記リン酸化アミノ酸残基がリン酸化セリンである、請求項８に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１０】
前記金属水酸化物アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム、水酸化鉄、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛および水酸化ジルコニウムから選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１１】
ミョウバンとコンジュゲートした抗原を含む抗原−アジュバント複合体であって、前記抗原が、２〜１２個のリン酸化セリン残基を含む少なくとも１つのリンカーを含み、前記抗原が、前記リン酸化セリン残基を介してミョウバンとコンジュゲートする、抗原−アジュバント複合体。
【請求項１２】
前記抗原が、２〜８個のリン酸化セリンを含む少なくとも１つのリンカーを含む、請求項１１に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１３】
前記抗原が、２〜４個のリン酸化セリンを含む少なくとも１つのリンカーを含む、請求項１１に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１４】
前記抗原が、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物抗原および真菌抗原から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１５】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項１４に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１６】
前記ウイルス抗原がＨＩＶ抗原である、請求項１５に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１７】
前記ウイルス抗原が操作されたＨＩＶ抗原である、請求項１６に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１８】
前記操作されたＨＩＶ抗原が、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはその断片である、請求項１７に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体、および必要に応じて追加のアジュバントを含む免疫原性組成物。
【請求項２０】
投与部位で、対象における抗原の保持を増加させるための方法であって、請求項１９に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記抗原が、少なくとも１週間にわたって注射部位で持続する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原が、少なくとも３週間にわたって注射部位で持続する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象の流入領域リンパ節への抗原の継続的な放出のための方法であって、請求項１９に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
前記抗原−アジュバント複合体が、多価粒子凝集体を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記凝集体が、ナノ粒子またはナノ結晶を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏで、免疫細胞による前記抗原−アジュバント複合体の取り込みをもたらす、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞が抗原特異的Ｂ細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原に対する免疫応答が増強される、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫応答が、抗体価の増加によって増強される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体価が、コンジュゲートしていない抗原−アジュバント組成物の投与と比較して、少なくとも２０倍増強される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫応答が、中和抗体価の増加によって増強される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫応答が、抗体分泌Ｂ細胞の数の増加によって増強される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｂ細胞が骨髄形質細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗体分泌Ｂ細胞の数が、コンジュゲートしていない抗原−アジュバント組成物の投与と比較して、少なくとも１６倍増強される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｂ細胞が胚中心Ｂ細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
２〜１２個のリン酸化セリン残基を含む少なくとも１つのリンカーを介してミョウバンとコンジュゲートした、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはその断片を含む、抗原−アジュバント複合体。
【請求項３７】
前記ＨＩＶエンベロープタンパク質またはその断片が、２〜１０個のリン酸化セリン残基、２〜６個のリン酸化セリン残基、または２〜４個のリン酸化セリン残基を含む少なくとも１つのリンカーを介してミョウバンとコンジュゲートする、請求項３６に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項３８】
前記抗原またはＨＩＶエンベロープタンパク質もしくはその断片が、前記抗原またはＨＩＶエンベロープタンパク質もしくはその断片の部位特異的コンジュゲーションによって、アジュバント表面に固定化され、抗原エピトープを免疫細胞に選択的に提示する、請求項１から１８または３６から３７のいずれか一項に記載の抗原−アジュバント複合体。
【請求項３９】
対象における免疫応答の特異性を方向付ける方法であって、請求項３８に記載の抗原−アジュバント複合体を含む免疫原性組成物を前記対象に投与することを含み、前記抗原の１つまたは複数のエピトープが、多価アジュバント反応性部分を介した前記アジュバント表面への前記抗原の部位特異的コンジュゲーションによってマスクされる、方法。
【請求項４０】
前記免疫応答が、１つまたは複数の防御中和抗体を誘発する抗原におけるエピトープに対して方向付けられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＨＩＶエンベロープ三量体ベースの前記エピトープが、ミョウバン粒子上のＨＩＶ三量体の部位特異的コンジュゲーションによってマスクされ、非中和抗体の誘発から離れて免疫応答を方向付ける、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）抗原反応性部分、
（ｂ）２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分、および
（ｃ）必要に応じてリンカー
を含む、抗原−アジュバントカップリング試薬であって、
前記抗原反応性部分が、必要に応じて前記リンカーによって、前記多価アジュバント反応性部分に作動可能に連結され、前記抗原反応性部分が抗原上に存在する反応性基に共有結合し、前記多価アジュバント反応性部分が、アジュバント中に存在する２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル基と相互作用し、それにより前記抗原が前記アジュバントにカップリングする、抗原−アジュバントカップリング試薬。
【請求項４３】
前記抗原反応性部分が、スルフヒドリル反応性部分を含む、請求項４２に記載の試薬。
【請求項４４】
前記スルフヒドリル反応性部分がマレイミドである、請求項４３に記載の試薬。
【請求項４５】
前記反応性基がスルフヒドリル基である、請求項４２〜４４に記載の試薬。
【請求項４６】
前記多価アジュバント反応性部分が、３〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１７、１５〜１８、１６〜２０個またはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む、請求項４２から４５に記載の試薬。
【請求項４７】
前記多価アジュバント反応性部分が、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む、請求項４２から４６に記載の試薬。
【請求項４８】
前記多価アジュバント反応性部分が、約３〜１０、約３〜１５、または約３〜２０個のヒドロキシル置換基を含む、請求項４２から４７に記載の試薬。
【請求項４９】
前記多価アジュバント反応性部分が、３個のヒドロキシル置換基を含む、請求項４２から４８に記載の試薬。
【請求項５０】
前記多価アジュバント反応性部分が、４個のヒドロキシル置換基を含む、請求項４２から４８に記載の試薬。
【請求項５１】
前記多価アジュバント反応性部分が、５個のヒドロキシル置換基を含む、請求項４２から４８に記載の試薬。
【請求項５２】
前記ヒドロキシル置換基が、フッ化物基、クエン酸基、リン酸基、炭酸基および硫酸基からなる群から選択される、請求項４２から５１に記載の試薬。
【請求項５３】
前記ヒドロキシル置換基がリン酸基である、請求項５２に記載の試薬。
【請求項５４】
前記ヒドロキシル置換基がリン酸化アミノ酸残基を含む、請求項５３に記載の試薬。
【請求項５５】
前記リン酸化アミノ酸残基が、リン酸化セリン、リン酸化チロシンおよびリン酸化スレオニンから選択される、請求項５４に記載の試薬。
【請求項５６】
前記リン酸化アミノ酸残基がリン酸化セリンである、請求項５５に記載の試薬。
【請求項５７】
前記試薬がリンカーを含む、請求項４２から５６に記載の試薬。
【請求項５８】
前記リンカーがポリエチレングリコールである、請求項５７に記載の試薬。
【請求項５９】
前記アジュバントが金属水酸化物アジュバントである、請求項４２から５８に記載の試薬。
【請求項６０】
前記金属水酸化物アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム、水酸化鉄、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛および水酸化ジルコニウムから選択される、請求項５９に記載の試薬。
【請求項６１】
（ａ）請求項４２から６０のいずれか一項に記載の試薬、
（ｂ）抗原、および
（ｃ）必要に応じて金属水酸化物アジュバント
を含む免疫原性組成物であって、
前記試薬が前記抗原に共有結合で連結され、前記抗原が、存在する場合、前記試薬を介して前記金属水酸化物アジュバントにカップリングし、それにより抗原−アジュバント複合体が形成される、免疫原性組成物。
【請求項６２】
前記抗原が、前記試薬を介して前記金属水酸化物アジュバントの表面に吸着され、それにより抗原−アジュバント複合体が形成される、請求項６１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムである、請求項６１および６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
前記抗原が、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物抗原および真菌抗原から選択される、請求項６１から６３に記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６６】
前記ウイルス抗原がＨＩＶ抗原である、請求項６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項６７】
前記ＨＩＶ抗原が、ｇｐ１２０またはｇｐ１４０である、請求項６６に記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
前記ウイルス抗原が操作されたＨＩＶ抗原である、請求項６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
前記操作されたＨＩＶ抗原がｅＯＤである、請求項６８に記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
前記操作されたＨＩＶ抗原がＳＯＳＩＰである、請求項６８に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
前記抗原が、前記アジュバントの表面に対して配向され、前記抗原の配向が、免疫系による１つまたは複数のエピトープの認識をブロックまたは阻害する、請求項６１から７０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
請求項６１から７１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項７３】
投与部位で、対象における抗原の保持を増加させるための方法であって、請求項７２に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項７４】
対象の流入領域リンパ節への抗原の継続的な放出のための方法であって、請求項７２に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項７５】
それを必要とする対象におけるがんまたは感染性疾患を処置するための方法であって、請求項７２に記載のワクチンを投与し、それにより前記対象を処置することを含む、方法。
【請求項７６】
対象における免疫応答を増加させるための方法であって、請求項７２に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項７７】
先行する請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を作成する方法であって、反応性基を含む抗原をコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供すること、前記抗原が発現する条件下で前記宿主細胞を維持すること、前記抗原を得ること、前記試薬が前記抗原に共有結合で連結する条件下で、前記抗原を前記試薬と接触させること、前記試薬に共有結合で連結された前記抗原を得ること、必要に応じて前記抗原をアジュバントにカップリングまたは吸着させること、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の資金援助
本発明は、国立衛生研究所によって付与された、助成金番号Ｒ０１  ＡＩ１２５０６８およびＵＭＩ  ＡＩ１００６６３の政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６２／６０７，６９１号の利益を主張する。その全内容は、参照により、本明細書に組み込まれる
【背景技術】
【０００３】
背景
ワクチン接種は、ワクチン中に存在する抗原に対する免疫応答を誘導することを意図する医学的処置である。ワクチンは、過去１世紀にわたって何百万人もの命を救い、加えて、以前は世界中で高レベルの病的状態および死亡率を引き起こしていた多くの感染性疾患の根絶に近づけ、減少させている。
【０００４】
現在のワクチンの活性を制限する１つの要因は、宿主中での抗原の不十分な保持であり、これは、免疫応答がプライムされるリンパ節への標的化の不足、および疾患に対して防御するための抗原に対する不十分な応答をもたらす。抗原の免疫原性を促進する戦略の中には、ワクチン抗原を微粒子状にするもの、ワクチン抗原を重合または乳化するもの、ワクチン抗原をカプセル化する方法、宿主の免疫応答を増加させる方法、およびワクチン抗原を抗原提示細胞に標的化する方法がある（Ｎｏｓｓａｌ，  １９９９，  Ｉｎ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  Ｐａｕｌ  （Ｅｄ．），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．；Ｖｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｌｌ，  １９９５，  Ｉｎ：  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ  （Ｅｄｓ．），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  Ｎ．Ｙ．  ｐ．  １４１）。これらの戦略の中で、ワクチンにおけるアジュバントの使用は周知である。当技術分野において周知の従来のアジュバントは、本質的に多様である。
【０００５】
アジュバントの使用は、毒性または注射部位での局所的な炎症などの有害事象の危険性にもつながる。このような有害な反応を制限するために、免疫原性組成物またはワクチン中の界面活性剤および他の成分が低減されることがあるが、この低減は、その結果として、ワクチンの有効性の減少をもたらすことがある。したがって、有効な免疫応答のために抗原への十分な曝露を提供する新規なワクチン組成物についての必要性、ならびにワクチンの安全性および安定性を増加させる組成物についての必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｏｓｓａｌ，  １９９９，  Ｉｎ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  Ｐａｕｌ  （Ｅｄ．），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．
【非特許文献２】Ｖｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｌｌ，  １９９５，  Ｉｎ：  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ  （Ｅｄｓ．），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  Ｎ．Ｙ．  ｐ．  １４１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本開示は、少なくとも部分的に、抗原と水酸化アルミニウム（ミョウバン）との間の相互作用の部位特異的な操作によって、抗原に対する免疫応答が増強されたという驚くべき発見に基づく。したがって、本開示は、目的の抗原に対する増強された体液性免疫を誘発するための免疫原性組成物を提供し、それによって改善されたワクチンを提供する。一態様では、本開示は、（ａ）２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分に、必要に応じて少なくとも１つのリンカーを介して、カップリングした抗原反応性部分に共有結合で連結された抗原、および（ｂ）金属水酸化物アジュバント（例えば、ミョウバン）を含む、抗原−アジュバント複合体であって、抗原が、多価アジュバント反応性部分のヒドロキシル置換基を介して金属水酸化物アジュバントにコンジュゲートし、それにより、抗原−アジュバント複合体が形成される、抗原−アジュバント複合体を提供する。一部の態様では、抗原は、１つまたは複数のリン酸化セリン（ＰＳ）残基などの１つまたは複数のリン酸化アミノ酸残基を介して、金属水酸化物アジュバント（例えば、ミョウバン）にコンジュゲートする。
【０００８】
したがって、一部の態様では、本開示は、対象における抗原に対する免疫応答を増加させる方法であって、抗原が、１つまたは複数のＰＳ残基を介して、金属水酸化物アジュバント（例えば、ミョウバン）との部位特異的結合および／または緊密な結合を提供するために改変される、方法を提供する。一部の態様では、本開示は、ミョウバンの表面とのリガンド交換反応を受けて、ミョウバンなどの金属水酸化物アジュバントにおける部位特異的な様式および／または表面に配向される様式で抗原をアンカリングする、多価ＰＳペプチド−ポリマーの親和性リンカーの部位特異的導入による、金属水酸化物アジュバント（例えば、ミョウバン）との緊密な結合を提供するために改変された抗原を含む、方法および組成物を提供する。このような連結の結果として、未改変の抗原は数日以内に注射部位から排出されるが、ＰＳと連結した抗原−アジュバント複合体は、３週間にわたって注射部位で持続することを発見した。本開示の抗原−アジュバント複合体は、抗原のアジュバントへの非特異的吸着に依存する以前のアプローチに対して、利点を提供する。ミョウバン粒子への抗原のランダム架橋はまた、免疫応答における予測不可能な効果、およびミョウバン自身が数週間にわたって注射部位で保持されるという事実にもかかわらず、ミョウバン粒子からの抗原の迅速な脱着をもたらす。
【０００９】
理論によって拘束されることは決してないが、本開示の抗原−アジュバント複合体は２つの方法で抗原の免疫原性に影響を与え得ると考えられる。第１に、ＰＳ連結を介したミョウバンとのそれらの緊密な結合により、本開示の抗原−アジュバント複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでミョウバン粒子により輸送され、それによってｉｎ  ｖｉｖｏでのワクチンのクリアランスの動態を、免疫化から数日〜約３週間後まで延長する。第２に、リンパ節に到着した抗原は、Ｂ細胞が内部移行するように、ミョウバン粒子に依然として結合し、ミョウバンナノ粒子上に存在する固定化された抗原の多価アレイによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで刺激される。ミョウバンは、一般に、注射部位に残るデポーとして主に作用すると考えられ、食細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでミョウバン粒子を内部移行する能力があることが公知である。本開示は、免疫化後、本開示の抗原−アジュバント複合体が、粒子状の形態で、全組織および単一細胞レベルで、リンパ節中で検出可能であることを実証する。抗原をディスプレイするミョウバン粒子の取り込みは、増強されたＢ細胞受容体架橋を超える、Ｂ細胞応答についての複数の意味を有しており、この抗原獲得の様式は、遊離タンパク質およびミョウバンを含むワクチン組成物の取り込みと比較して、獲得される抗原の量を増加させることになる。このように、応答するＢ細胞は、濾胞ヘルパーＴ細胞からの助けを受けるためのより高い能力があり、細胞内シグナル伝達の増強を示し得る。したがって、本開示は、リンパ節におけるワクチンの蓄積の動態を変化させることによって、および免疫細胞への抗原提示における変更によって、免疫応答の複数の面を増強する、組成物および方法を提供する。別の態様では、本開示は、アジュバントへの未改変の抗原の吸着よりも遅くｉｎ  ｖｉｖｏで排出される、抗原−アジュバント複合体を提供する。理論によって拘束されないが、緊密に結合した抗原−アジュバント複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ細胞によって提示および獲得され得る多価粒子を形成すると考えられる。
【００１０】
本明細書において実施例に記載するように、本開示の抗原−アジュバント複合体の投与は、２０倍を上回る胚中心応答の予想外の増強、６３倍の抗体価の増加、および骨髄中での長寿命の形質細胞の増加をもたらした。
【００１１】
１つまたは複数のＰＳ残基などの１つまたは複数のリン酸化アミノ酸残基を介した、ミョウバンに対する抗原（例えば、ＨＩＶ抗原）の部位特異的コンジュゲーションが、ミョウバン粒子上の中和エピトープの配向およびディスプレイをもたらし、それによって中和エピトープに対する抗原特異的免疫応答を増強することも発見した。この発見は、したがって、ウイルス侵入受容体に対する十分な防御または広域中和免疫を誘発するという課題を克服するための戦略を提供する。現在のワクチンアプローチの問題は、それらが、ｅｎｖタンパク質の非天然表面を露出させる可溶性形態のｅｎｖタンパク質抗原を含有することである。非限定的な例として、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体ベースは、防御免疫または中和免疫を誘発するための無関係な標的である。可溶性のｅｎｖタンパク質ワクチン組成物による免疫化の際に、免疫優性のベース志向性抗体応答は、防御中和抗体の誘導を妨げる。本開示の抗原−アジュバント複合体は、抗原上のミョウバン結合ＰＳ改変の部位特異的導入によって、この課題を克服するための方法を提供する。方向付けられた抗原の配向により、中和エピトープが免疫細胞に曝露されることが確実となり、それによって、抗原上の非中和免疫優性表面をマスクしながら、広域中和抗体を誘発するための戦略を提供する。
【００１２】
加えて、ミョウバン粒子上のＨＩＶ三量体の配向されたアンカリングは、三量体の免疫原性ベースをブロックすることによって、体液性応答の免疫優性パターンを変更させた。このように、本開示は、サブユニットワクチンに対する体液性免疫の複数の面を増強するための普遍的に適用可能な戦略を提供する。
【００１３】
したがって、一態様では、本開示は、抗原および金属水酸化物アジュバントを含む抗原−アジュバント複合体を提供する。抗原は、２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分に、必要に応じて少なくとも１つのリンカーを介して、カップリングした抗原反応性部分に共有結合で連結される。抗原−アジュバント複合体は、多価アジュバント反応性部分のヒドロキシル置換基が金属水酸化物アジュバントにコンジュゲートされるときに形成される。
【００１４】
別の態様では、抗原−アジュバント複合体で構成される抗原反応性部分は、スルフヒドリル反応性部分である。別の態様では、抗原−アジュバント複合体のスルフヒドリル反応性部分はマレイミドである。別の態様では、抗原−アジュバント複合体の多価アジュバント反応性部分は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む。別の態様では、多価抗原のヒドロキシル置換基は、フッ化物基、クエン酸基、リン酸基、炭酸基および硫酸基からなる群から選択される。別の実施形態では、ヒドロキシル置換基はリン酸基である。別の実施形態では、ヒドロキシル置換基は、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸残基を含む。さらに別の実施形態では、リン酸化アミノ酸残基は、リン酸化セリン、リン酸化チロシンまたはリン酸化スレオニンである。
【００１５】
別の態様では、抗原−アジュバント複合体は、２つまたはそれよりも多くのリン酸化セリンを含む多価アジュバント反応性部分に、少なくとも１つのリンカーによってカップリングした抗原反応性部分に共有結合で連結された抗原を含み、その上で、抗原−アジュバント複合体は、多価アジュバント反応性部分のリン酸化セリン残基を介して金属水酸化物アジュバントにコンジュゲートされた抗原によって形成される。
【００１６】
さらに別の実施形態では、抗原−アジュバント複合体を形成する金属水酸化物アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム、水酸化鉄、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛または水酸化ジルコニウムである。
【００１７】
さらに別の実施形態では、抗原−アジュバント複合体は、２〜１２個のリン酸化セリン残基を含む少なくとも１つのリンカーを有する抗原を含み、抗原は、ミョウバンとのリン酸化セリン残基を通してミョウバンとコンジュゲートする。さらに別の実施形態では、抗原は、ミョウバンとコンジュゲートした２〜８個のリン酸化セリンを含む少なくとも１つのリンカーを含む。別の実施形態では、抗原は、ミョウバンとコンジュゲートした２〜４個のリン酸化セリンを含む少なくとも１つのリンカーを含む。
【００１８】
別の態様では、抗原−アジュバント複合体を形成する抗原は、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物抗原または真菌抗原から選択される。
【００１９】
別の態様では、抗原はウイルス抗原である。さらに別の実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ抗原、操作されたＨＩＶ抗原、もしくは操作されたＨＩＶエンベロープタンパク質、またはこれらの断片である。
【００２０】
別の態様では、本開示は、開示の抗原−アジュバント複合体および追加のアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。
【００２１】
別の態様では、本開示は、コンジュゲートした抗原−アジュバント複合体を含有する免疫原性組成物を対象に投与することにより、投与部位で、抗原の保持を増加させるための方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態では、コンジュゲートした抗原−アジュバント複合体の抗原は、少なくとも１週間にわたって注射部位で持続する。別の実施形態では、抗原は、少なくとも３週間にわたって注射部位で持続する。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示のコンジュゲートした抗原−アジュバント複合体を含む免疫原性組成物を対象に投与することによる、対象の流入領域リンパ節への抗原の継続的な放出を確実にする方法を提供する。
【００２４】
本開示の別の態様では、抗原−アジュバント複合体は、多価粒子凝集体を形成する。さらに別の態様では、多価粒子凝集体は、ナノ粒子またはナノ結晶である。
【００２５】
さらに別の態様では、抗原−アジュバント複合体の投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、免疫細胞による抗原−アジュバント複合体の取り込みをもたらす。
【００２６】
別の実施形態では、抗原−アジュバント複合体を取り込む免疫細胞は、抗原特異的Ｂ細胞である。本開示の別の態様では、抗原−アジュバント複合体の投与は、抗原に対する免疫応答の増強をもたらす。別の態様では、免疫応答は、抗体価の増加によって増強される。別の実施形態では、抗体価は、コンジュゲートしていない抗原−アジュバント組成物の投与からの抗体価と比較して、少なくとも２０倍増強される。さらに別の実施形態では、免疫応答の増強は、中和抗体価の増加によって測定される。本発明の別の態様では、抗原−アジュバント複合体の投与は、抗体分泌Ｂ細胞の数の増加によって測定される免疫応答の増強をもたらす。別の態様では、数が増加するＢ細胞は、骨髄形質細胞である。別の実施形態では、コンジュゲートした抗原−アジュバント複合体の投与は、コンジュゲートしていない抗原−アジュバント組成物の投与からの抗体分泌Ｂ細胞の数と比較して、抗体分泌Ｂ細胞の数の１６倍の増加をもたらす。別の実施形態では、コンジュゲートした抗原−アジュバント複合体の投与は、抗原特異的胚中心Ｂ細胞の数の増加をもたらす。
【００２７】
別の実施形態では、抗原−アジュバント複合体は、２〜１２個のリン酸化セリン残基を含む少なくとも１つのリンカーを介してミョウバンとコンジュゲートした、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはその断片を含む。別の態様では、ＨＩＶエンベロープ抗原−アジュバント複合体は、２〜１０個のリン酸化セリン残基、２〜６個のリン酸化セリン残基、または２〜４個のリン酸化セリン残基を含む少なくとも１つのリンカーを介してミョウバンとコンジュゲートする。さらに別の態様では、ＨＩＶエンベロープ抗原−アジュバント複合体は、部位特異的コンジュゲーションによってアジュバント表面に固定化されたＨＩＶエンベロープタンパク質を含み、この固定化は、ＨＩＶエンベロープのエピトープを免疫細胞に選択的に提示することが可能である。
【００２８】
別の態様では、本開示は、抗原−アジュバント複合体を含む免疫原性組成物を対象に投与することによって、対象における免疫応答の特異性を方向付ける方法であって、抗原の１つまたは複数のエピトープが、多価アジュバント反応性部分上のヒドロキシル置換基を介したアジュバント表面への抗原の部位特異的コンジュゲーションによってマスクされる、方法を提供する。
【００２９】
別の実施形態では、マスクされたエピトープを有する抗原−アジュバント複合体の投与は、抗原上のマスクされていないエピトープに対して方向付けられた免疫応答をもたらし、１つまたは複数の防御中和抗体を誘発する。さらに別の実施形態では、ＨＩＶエンベロープ三量体ベースが、ミョウバン粒子上のＨＩＶ三量体の部位特異的コンジュゲーションによってマスクされる抗原−アジュバント複合体の投与は、非中和抗体の誘発から離れて免疫応答の方向付けをもたらす。
【００３０】
本開示は、アジュバントへの抗原の吸着のために有用な試薬であって、試薬が複数のヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分を提供する、試薬も提供する。加えて、本開示は、少なくとも部分的に、多価アジュバント反応性部分を介してアジュバントに吸着した抗原を含む免疫原性組成物を、抗原の免疫原性を増強するために使用することができるという発見に基づく。
【００３１】
したがって、一態様では、本開示は、抗原−アジュバントカップリング試薬であって、抗原−アジュバントカップリング試薬が、抗原反応性部分、２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分、および必要に応じて少なくとも１つのリンカーを含み、抗原反応性部分が、必要に応じて少なくとも１つのリンカーによって、多価アジュバント反応性部分に作動可能に連結され、抗原反応性部分が抗原上に存在する反応性基に共有結合し、多価アジュバント反応性部分が、アジュバント中に存在する２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル基と相互作用し、それにより抗原がアジュバントにカップリングする、抗原−アジュバントカップリング試薬を提供する。
【００３２】
一部の実施形態では、抗原反応性部分は、スルフヒドリル反応性部分を含む。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性部分はマレイミドである。
【００３３】
一部の実施形態では、反応性基はスルフヒドリル基である。
【００３４】
一部の実施形態では、多価アジュバント反応性部分は、３〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１７、１５〜１８、１６〜２０個またはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む。一部の実施形態では、多価アジュバント反応性部分は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む。一部の実施形態では、多価アジュバント反応性部分は、約３〜１０、約３〜１５、または約３〜２０個のヒドロキシル置換基を含む。一部の実施形態では、多価アジュバント反応性部分は、３個のヒドロキシル置換基を含む。一部の実施形態では、多価アジュバント反応性部分は、４個のヒドロキシル置換基を含む。一部の実施形態では、多価アジュバント反応性部分は、５個のヒドロキシル置換基を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、ヒドロキシル置換基は、フッ化物基、クエン酸基、リン酸基、炭酸基および硫酸基からなる群から選択される。一部の実施形態では、ヒドロキシル置換基はリン酸基である。一部の実施形態では、ヒドロキシル置換基は、リン酸化アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、リン酸化アミノ酸残基は、リン酸化セリン、リン酸化チロシンおよびリン酸化スレオニンから選択される。一部の実施形態では、リン酸化アミノ酸残基は、リン酸化セリンである。
【００３６】
一部の実施形態では、抗原−アジュバントカップリング試薬は少なくとも１つのリンカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカーはポリエチレングリコールである。
【００３７】
一部の実施形態では、アジュバントは金属水酸化物アジュバントである。一部の実施形態では、金属水酸化物アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム、水酸化鉄、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛および水酸化ジルコニウムから選択される。
【００３８】
別の態様では、本開示は、抗原−アジュバントカップリング試薬、抗原、および必要に応じて金属水酸化物アジュバントを含む免疫原性組成物であって、試薬が抗原に共有結合で連結され、抗原が、存在する場合、試薬を介して金属水酸化物アジュバントにカップリングし、それにより抗原−アジュバント複合体が形成される、免疫原性組成物を提供する。一部の実施形態では、抗原は、試薬を介して金属水酸化物アジュバントの表面に吸着され、それにより抗原−アジュバント複合体が形成される。一部の実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムである。
【００３９】
一部の実施形態では、抗原は、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物抗原および真菌抗原から選択される。一部の実施形態では、抗原はウイルス抗原である。一部の実施形態では、ウイルス抗原はＨＩＶ抗原である。一部の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ｇｐ１２０またはｇｐ１４０である。一部の実施形態では、ウイルス抗原は操作されたＨＩＶ抗原である。一部の実施形態では、操作されたＨＩＶ抗原はｅＯＤである。一部の実施形態では、操作されたＨＩＶ抗原はＳＯＳＩＰである。
【００４０】
一部の実施形態では、抗原は、アジュバントの表面に対して配向され、抗原の配向は、免疫系による１つまたは複数のエピトープの認識をブロックまたは阻害する。一部の実施形態では、アジュバントに対する抗原の配向は、広域中和抗体価を増加させる。
【００４１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫原性組成物、および必要に応じて第２のアジュバントまたは追加のアジュバントを含むワクチンを提供する。
【００４２】
一部の態様では、本開示の抗原−アジュバント複合体は、粒子状形態で送達される。本開示の複合体および方法は、多様なサブユニットワクチンに幅広く適用可能であり、粒子状のワクチン製剤を提供する。現在の戦略は、Ｂ細胞受容体架橋を増強するために、多価のサブミクロンの粒子状形態で抗原を製剤化することである。しかしながら、ワクチン候補の粒子状製剤は、多くの場合、それぞれの抗原について特別に設計されなければならない、ウイルス様粒子の形態をとる。したがって、本開示は、多価の粒子状形態に抗原−アジュバント複合体を製剤化する、改善された組成物および方法を提供する。別の態様では、本開示は、サブミクロンの多価粒子状ワクチンを得るための方法を提供する。
【００４３】
別の態様では、本開示は、免疫細胞に提示され、免疫細胞によって内部移行する、ＰＳ連結を介して結合した抗原−アジュバント複合体を含む多価粒子状ワクチンを提供する。一部の実施形態では、抗原−アジュバント複合体は、ナノ粒子またはナノ結晶である、多価粒子凝集体を含む。
【００４４】
別の態様では、本開示は、投与部位で、対象における抗原の保持を増加させるための方法であって、本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、本開示は、対象の流入領域リンパ節への抗原の継続的な放出のための方法であって、本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、抗原−アジュバントは、多価粒子凝集体としてＢ細胞に提示される。別の実施形態では、投与部位における抗原−アジュバントの保持は、数週間にわたって持続する。別の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるがんまたは感染性疾患を処置するための方法であって、本明細書に記載のワクチンを投与し、それにより対象を処置することを含む、方法を提供する。別の態様では、本開示は、対象における免疫応答を増加させるための方法であって、本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、本開示は、対象における抗原特異的抗体分泌Ｂ細胞を増加させるための方法であって、本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、本開示は、骨髄形質細胞を増加させるための方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、胚中心Ｂ細胞を増加させるための方法を提供する。
【００４５】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の抗原をコードする核酸分子を提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載の抗原をコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載の抗原をコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００４６】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫原性組成物を作成する方法であって、抗原をコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供すること、抗原が発現する条件下で宿主細胞を維持すること、抗原を得ること、試薬が抗原に共有結合で連結する条件下で、抗原を抗原−アジュバントカップリング試薬と接触させること、試薬に共有結合で連結した抗原を得ること、必要に応じて抗原をアジュバントにカップリングまたは吸着させること、を含む方法を提供する。
【００４７】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を伴うこの特許または特許出願公開の写しは、申請および必要な料金の支払により、特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１Ａは、リン酸化セリンを含むマレイミド−リン酸化セリンカップリング試薬の化学構造を表す概略図、および溶媒に曝露された遊離スルフヒドリル基（−ＳＨ）を含むタンパク質抗原の概略図である。図１Ｂは、マレイミド部分が、チオエーテル連結を介してタンパク質抗原を構成するチオール基と共有結合で連結された、マレイミド−リン酸化セリンカップリング試薬の化学構造を表す概略図である。図１Ｃは、ミョウバンとカップリングまたは吸着させるときの、カップリング試薬−抗原コンジュゲートの結合および配向を一般に表す概略図である。図１Ｄは、２８０ｎｍでのタンパク質のＵＶ吸光度によって決定されたタンパク質濃度の関数として、ミョウバン上のモデルタンパク質であるチトクロムｃの吸着を示す線グラフである。
【００４９】
【図２】図２Ａは、４つのリン酸化セリン、または３つのセリンおよび１つのリン酸化セリンのいずれかと連結されたアジド官能基を含む、同等のペプチド長のペプチドリンカーの描写である。図２Ｂは、ミョウバンに結合したタンパク質の蛍光分光法を表す線グラフである。ペプチドリンカーは、タンパク質あたりの総リンカーの範囲で、銅フリーのクリック化学によって、ＤＢＣＯ改変フィコエリトリン（ＰＥ）にカップリングした。ＰＳ／ＳｅｒコンジュゲートＰＥ（５μｇ／ｍＬ）を、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（５０μｇ／ｍＬ）と３０分間混合し、続いて、２４時間、１０％のマウス血清を含有する培地を添加した。このインキュベーション後にミョウバンに結合したタンパク質を、蛍光分光法によって評価した（ｎ＝３試料／群）。
【００５０】
【図３】図３は、未改変またはＰＳコンジュゲート蛍光ｅＯＤタンパク質（１０μｇ／ｍＬ）を、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（１００μｇ／ｍＬ）と３０分間混合し、次いで、２４時間、１０％のマウス血清を含有するＰＢＳ中でインキュベートした後、ミョウバンに結合したままのタンパク質を測定する、蛍光分光法を示す棒グラフである。
【００５１】
【図４】図４は、リン酸化セリンを含む多価カップリング試薬とベースでコンジュゲートしたＳＯＳＩＰ三量体を表す概略図である。
【００５２】
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡによって決定された、２４時間後に血清の存在中でミョウバンから放出されたＳＯＳＩＰ抗原の割合を示す棒グラフである。
【００５３】
【図６】図６Ａは、遊離抗原の潜在的放出ｖｓ注射部位での抗原ディスプレイミョウバン粒子の放出の概略図である。図６Ｂは、ミョウバン（１０μｇ／ｍＬ）の存在中または非存在中でのｅＯＤ（５０ｎＭ）とのインキュベーション後、約５０秒でのｇｌＶＲＣ０１発現ヒトＢ細胞における蛍光レポーターによるカルシウムシグナル伝達の測定の線グラフである。図６Ｃは、蛍光Ｓｅｒ４−ｅＯＤ（５０ｎＭ）およびフルオロフォアタグ化ミョウバンと１時間インキュベートされ、次いで、共焦点顕微鏡によって撮像された、ｇｌＶＲＣ０１発現Ｂ細胞の蛍光画像である（スケールバー＝１０μｍ）。図６Ｄは、蛍光ＰＳ８−ｅＯＤ（５０ｎＭ）およびフルオロフォアタグ化ミョウバンと１時間インキュベートされ、次いで、共焦点顕微鏡によって撮像された、ｇｌＶＲＣ０１発現Ｂ細胞の蛍光画像である（スケールバー＝１０μｍ）。図６Ｅは、ミョウバンおよびＰＳ８−ｅＯＤとの１時間のインキュベーション後のＲａｍｏｓ  Ｂ細胞のＴＥＭ切片を示す画像である（スケールバー２００ｎｍ）。
【００５４】
【図７】図７Ａは、ＩＶＩＳによって決定された、アジュバントに吸収された蛍光標識化ｅＯＤ抗原による注射後のマウスの疑似着色画像である。フルオロフォア標識化ｅＯＤまたはＰＳ４−ｅＯＤ（１０μｇタンパク質）を、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ミョウバン、１００μｇ）またはリン酸アルミニウムアジュバント（ａｌｕｍＰ、１００μｇ）のいずれかと混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４匹／群）に皮下注射し、続いて、注射部位で蛍光の縦軸方向の全動物ＩＶＩＳイメージングを行った。図７Ｂは、ＩＶＩＳによって決定され、正規化された総放射輝度として表される、ミョウバン（Ａｌ−ＯＨ３）またはリン酸アルミニウム（Ａｌ−Ｐ）のいずれかのアジュバントに吸収された蛍光標識化ｅＯＤ抗原注射後の２４日間のマウスからの蛍光シグナルを示す線グラフである。
【００５５】
【図８】図８Ａは、２５日にわたって測定された総蛍光曲線下面積を示す棒グラフである。２〜８個のＰＳ残基を含有するリンカーとコンジュゲートしたフルオロフォア標識化ｅＯＤタンパク質を、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射し、続いて、図７Ａにおけるように、経時的に注射部位のＩＶＩＳイメージングを行った（ｎ＝４匹／群）。一元配置分散分析、続くチューキーの事後検定による、＊＊＊、ｐ＜０．００１。図８Ｂは、図７Ａにおけるように、ＰＳ４−ｅＯＤ／ミョウバンを注射されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３匹／群）からの代表的な組織学切片を示す画像である。マウスを注射の８日後に屠殺し、免疫化部位を、モリン染色による組織学によって分析して、ミョウバンを検出した。ＰＳ４−ｅＯＤを受けた動物からの注射部位の代表的な横断面を示す。モリンが紫、ｅＯＤ−ＡＦ６４７がシアン、および明視野が灰色（スケールバー：１ｍｍ）。
【００５６】
図８Ｃは、図７Ａにおけるように、ｅＯＤ／ミョウバンを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスからの代表的な組織学切片を示す画像である。ｅＯＤを受けた動物からの注射部位の代表的な横断面を示す。モリンが紫、ｅＯＤ−ＡＦ６４７がシアン、および明視野が灰色（スケールバー：１ｍｍ）。
【００５７】
【図９】図９Ａは、銅フリーのクリック化学によって合成されたＩＲ６８０−ＰＳ４コンジュゲートの構造を示す図である。図９Ｂは、ＩＲ６８０−ＰＳ４コンジュゲートを、単独またはミョウバンとともにのいずれかで３０分間インキュベートし、次いで１０％のマウス血清を添加し、溶液を３７℃で７２時間インキュベートした後の上清の蛍光の棒グラフである。データは、ミョウバンに結合したままの任意の色素を除去するための遠心分離後の上清の蛍光測定を表す。他の色素（Ｃｙ３−ＤＢＣＯおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−ＤＢＣＯ）を同じ方法でコンジュゲートした。
【００５８】
【図１０】図１０Ａは、一連の時点で切除されたｄＬＮ中で測定された総蛍光を示す線グラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝５／群）を、５０μｇのＩＲ６８０標識化ミョウバンと混合させた、５μｇのＩＲ８００色素標識化Ｓｅｒ４−ｅＯＤで免疫化した。図１０Ｂは、一連の時点で切除されたｄＬＮ中で測定された総蛍光を示す線グラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝５／群）を、５０μｇのＩＲ６８０標識化ミョウバンと混合させた、５μｇのＩＲ８００色素標識化ＰＳ８−ｅＯＤで免疫化した。図１０Ｃは、ナイーブマウス、および皮下に免疫化されたマウスの鼠径リンパ節中のアルミニウムのＩＣＰ−ＭＳ測定を反映する棒グラフである。測定は、免疫化から３日後および８日後に採取したリンパ節から取得した。
【００５９】
【図１１】図１１Ａは、養子移植実験のタイムラインを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５〜６／群）は、１×１０６のＧＦＰ＋ＣＴＶ＋ＶＲＣ０１ｇＨＬＢ細胞を用いて養子移植され、次いで、１００μｇのミョウバンと一緒に、５μｇのＡＦ６４７標識化Ｓｅｒ４−ｅＯＤ５またはＰＳ８−ｅＯＤ５で腹腔内に免疫化した。図１１Ｂは、ＡＦ６４７標識化ｅＯＤ−ＧＴ５の取り込みを示す脾臓からのＶＲＣ０１ｇＨＬＢ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。点線は、免疫化されていない対照のバックグラウンドシグナルを表す。図１１Ｃは、ＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞におけるｅＯＤ−ＡＦ６４７蛍光の定量化を反映する線グラフである。図１１Ｄは、ＣＤ８６発現によって評価されたＶＲＣ０ｇＨＬ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。図１１Ｅは、ＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞のｅＯＤ−ＡＦ６４７蛍光強度を反映する棒グラフである。２つの独立した実験からのプールされた結果（または代表的なデータ）。図１１Ｆは、ＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞のミョウバン−ＡＦ４８８蛍光強度を反映する棒グラフである。２つの独立した実験からのプールされた結果（または代表的なデータ）。
【００６０】
【図１２】図１２Ａは、１０μｇのＡＦ６４７標識化ＰＳ８−ｅＯＤ−ＧＴ８および１００μｇのＣｙ３−ＰＳ４標識化ミョウバンで腹腔内に免疫化されたマウスからの脾臓切片の蛍光分析を示す画像である（左スケールバー＝１ｍｍ、中央および右スケールバー＝１００μｍ）。図１２Ｂは、１０μｇのＡＦ６４７標識化Ｓｅｒ４−ｅＯＤ−ＧＴ８および１００μｇのＣｙ３−ＰＳ４標識化ミョウバンで腹腔内に免疫化されたマウスからの脾臓切片の蛍光分析を示す画像である（左スケールバー＝１ｍｍ、中央および右スケールバー＝１００μｍ）。図１２Ｃは、１×１０６のＣＴＶ＋ＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞を用いて養子移植され、５μｇのＡＦ６４７標識化Ｓｅｒ４−ｅＯＤ−ＧＴ８またはＰＳ８−ｅＯＤ−ＧＴ８、および１００μｇのミョウバンで免疫化された、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４〜８／群）からのＣＤ８６発現の線グラフである。図１２Ｄは、１×１０６のＣＴＶ＋ＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞を用いて養子移植され、５μｇのＡＦ６４７標識化Ｓｅｒ４−ｅＯＤ−ＧＴ８またはＰＳ８−ｅＯＤ−ＧＴ８、および１００μｇのミョウバンで免疫化された、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４〜８／群）からの分割されたＣＴＶｌｏＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞の線グラフである。
【００６１】
【図１３】図１３Ａは、１０μｇのＡＦ６４７標識化ＰＳ８−ｅＯＤ−ＧＴ８とミョウバンによる腹腔内の免疫化から２日後の脾臓Ｂ細胞のＴＥＭ切片を示す画像である。ＧＦＰ＋ＡＦ６４７＋ＶＲＣ０１ｇＨＬＢ細胞を、脾臓から選別し、固定し、染色し、ＴＥＭイメージングのために切片にした（スケールバー２００ｎｍ）。実験および分析された細胞の状態番号。図１３Ｂは、１０μｇのＡＦ６４７標識化ＰＳ８−ｅＯＤ−ＧＴ８とミョウバンによる腹腔内の免疫化から２日後の脾臓Ｂ細胞のＴＥＭ切片を示す画像である。ＧＦＰ−ＡＦ６４７−内因性Ｂ細胞を、脾臓から選別し、固定し、染色し、ＴＥＭイメージングのために切片にした（スケールバー２００ｎｍ）。
【００６２】
【図１４】図１４Ａは、ＥＬＩＳＡによって決定された、ＳＯＳＩＰ抗原単独または４つのリン酸化セリンを含むカップリング試薬とコンジュゲートしたＳＯＳＩＰ抗原（ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４）を用いて吸収されたミョウバンによる、０日目の初回の注射および２１日目の２回目の注射から６３日後のマウスにおける抗ＳＯＳＩＰ抗体価を示すグラフである。図１４Ｂは、ＥＬＩＳＡによって決定された、経時的な、ＳＯＳＩＰ抗原単独または４つのリン酸化セリンを含むカップリング試薬とコンジュゲートしたＳＯＳＩＰ抗原（ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４）を用いて吸収されたミョウバンによる、０日目および２１日目の注射後のマウスにおける抗ＳＯＳＩＰ抗体価を示す線グラフである。
【００６３】
【図１５】図１５Ａは、ＩＶＩＳによって決定された、追加のアジュバント（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標））と組み合わされたアジュバント（ミョウバン）に吸収された蛍光標識化ＳＯＳＩＰ抗原による注射後のマウスの疑似着色画像である。図１５Ｂは、ＩＶＩＳによって決定され、正規化された総放射輝度として表される、アジュバントに吸収された蛍光標識化ＳＯＳＩＰ抗原の注射後２５日間のマウスからの蛍光シグナルを示す線グラフである。図１５Ｃは、ＥＬＩＳＡによって決定された、経時的な、示された通りのＳＯＳＩＰ抗原単独または４つのリン酸化セリンを含むカップリング試薬とコンジュゲートしたＳＯＳＩＰ抗原（ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４）、または追加のアジュバント（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標））と組み合わされたＳＯＳＩＰ抗原を用いて吸収されたミョウバンによる、単回の初回の注射から５６日後のマウスにおける抗ＳＯＳＩＰ抗体価を示すグラフである。
【００６４】
【図１６】図１６は、ＥＬＩＳＡによって決定された、リン酸化セリンなし（ｅＯＤ−ＰＳ０）、１つのリン酸化セリン（ＯＤ−ＰＳ１）、２つのリン酸化セリン（ｅＯＤ−ＰＳ２）および４つのリン酸化セリン（ｅＯＤ−ＰＳ４）を含むカップリング試薬とコンジュゲートしたｅＯＤ抗原とカップリングしたミョウバン（Ａｌ−ＯＨ３）による注射から４週間後のマウスにおける抗ｅＯＤ抗体価を示すグラフである。
【００６５】
【図１７】図１７は、５μｇのｅＯＤ（ＰＳ改変あり、またはなし）と混合された５０μｇのミョウバンで免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）からの血清ＩｇＧ力価のドットプロットを示す図であり、血清ＩｇＧ力価を、６週目にＥＬＩＳＡによって分析した。
【００６６】
【図１８−１】図１８Ａは、５μｇのｅＯＤ（ＰＳリンカーあり、またはなし）、５０μｇのミョウバンおよび５μｇのサポニンアジュバントで免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）からの経時的に分析されたＩｇＧ価を示す図である。図１８Ｂは、５０μｇのミョウバンおよび５μｇのｅＯＤで皮下または筋肉内経路によって免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）からの６週目に採取された血清ＩｇＧ力価を示す図である。図１８Ｃは、図１８Ａにおけるように免疫化の３か月後の代表的なＥＬＩＳＰＯＴウェルおよび棒グラフであり、骨髄からのｅＯＤ特異的抗体分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴによってアッセイした。図１８Ｄは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）が５μｇのｅＯＤおよび５０μｇのミョウバンで皮下経路によって免疫化された９日後におけるｄＬＮの胚中心応答のフローサイトメトリー分析を示す図である。代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図１８Ｅは、平均ＧＣ  Ｂ細胞の頻度の棒グラフである。図１８Ｆは、ＡＦ６４７標識化ｅＯＤと結合したＧＣ  Ｂ細胞の代表的なヒストグラムである。図１８Ｇは、ＡＦ６４７標識化ｅＯＤと結合したＧＣ  Ｂ細胞の頻度を反映する棒グラフである。一元配置分散分析、続くチューキーの事後検定による、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図１８−２】図１８Ａは、５μｇのｅＯＤ（ＰＳリンカーあり、またはなし）、５０μｇのミョウバンおよび５μｇのサポニンアジュバントで免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）からの経時的に分析されたＩｇＧ価を示す図である。図１８Ｂは、５０μｇのミョウバンおよび５μｇのｅＯＤで皮下または筋肉内経路によって免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）からの６週目に採取された血清ＩｇＧ力価を示す図である。図１８Ｃは、図１８Ａにおけるように免疫化の３か月後の代表的なＥＬＩＳＰＯＴウェルおよび棒グラフであり、骨髄からのｅＯＤ特異的抗体分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴによってアッセイした。図１８Ｄは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）が５μｇのｅＯＤおよび５０μｇのミョウバンで皮下経路によって免疫化された９日後におけるｄＬＮの胚中心応答のフローサイトメトリー分析を示す図である。代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図１８Ｅは、平均ＧＣ  Ｂ細胞の頻度の棒グラフである。図１８Ｆは、ＡＦ６４７標識化ｅＯＤと結合したＧＣ  Ｂ細胞の代表的なヒストグラムである。図１８Ｇは、ＡＦ６４７標識化ｅＯＤと結合したＧＣ  Ｂ細胞の頻度を反映する棒グラフである。一元配置分散分析、続くチューキーの事後検定による、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【００６７】
【図１９】図１９Ａは、５０μｇのミョウバンと混合された５μｇのＳＯＳＩＰ（ＰＳ改変あり、またはなし）で０日目および２１日目に免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）から経時的に採取された血清ＩｇＧ力価を示す図である。二元配置分散分析、続くボンフェローニ事後検定による、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。図１９Ｂは、図１９Ａに記載のようにして免疫化された個々のマウスからの６３日目の力価を示す図である。スチューデントのｔ検定による、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。図１９Ｃは、５０μｇのミョウバンおよび５μｇのサポニンアジュバントと混合された、５μｇのＳＯＳＩＰまたは５μｇのＳＯＳＩＰ−ＰＳ４で免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群、２つの独立した免疫化からプール）から経時的に採取された血清ＩｇＧ力価を示す図である。二元配置分散分析、続くボンフェローニ事後検定による、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。図１９Ｄは、図１９Ｃに記載のようにして免疫化された個々のマウスからの６週目の力価を示す図である。スチューデントのｔ検定による、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。図１９Ｅは、図１９Ｃに記載のようにして免疫化された個々のマウスからの３か月目の抗体分泌細胞の骨髄ＥＬＩＳＰＯＴ分析からの例示的なＥＬＩＳＰＯＴウェルを示す図である。図１９Ｆは、それぞれの免疫化群からの個々および平均の三量体特異的なＩｇＧ産生細胞を示す図である。スチューデントのｔ検定による、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【００６８】
【図２０】図２０Ａは、ＳＯＳＩＰベース結合抗体１２Ｎの存在中および非存在中で、免疫化されたマウス血清からのＳＯＳＩＰ特異的ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ曲線からの吸光度値を示す線グラフである。ＳＯＳＩＰでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、ｘ軸に示された希釈で、免疫化されたマウスからの血清の添加の前に１２Ｎ抗体とインキュベートした。血清を、０日目および２８日目に、ミョウバン、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）、およびＳＯＳＩＰ抗体単独または４つのリン酸化セリンを含むカップリング試薬とコンジュゲートしたＳＯＳＩＰ抗体（ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４）のいずれかの免疫化を受けた７２日目のマウスから取得した。図２０Ｂは、１２Ｎ抗体の添加後に残ったＥＬＩＳＡシグナルのパーセンテージを記載する棒グラフである。ＥＬＩＳＡシグナルのパーセンテージは、１２Ｎ抗体による図１９ＡにおけるＥＬＩＳＡシグナルからの曲線下面積（ＡＵＣ）の１２Ｎの非存在中でのＡＵＣに対する比を表す（＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する）。
【００６９】
【図２１】図２１Ａは、ＶＲＣ０１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されたＳＯＳＩＰ三量体（１）、ＶＲＣ０１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されたＳＯＳＩＰ−ＰＳ４（２）、またはミョウバンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されたＳＯＳＩＰ−ＰＳ４（３）の抗原性分析の図である。０．１μｇ／ｍＬで添加された示されたモノクローナル抗体の結合についての生のＥＬＩＳＡ吸光度を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、０日目および２１日目に、５０μｇのミョウバンと混合された２μｇのＳＯＳＩＰまたはＳＯＳＩＰ−ＰＳ４で免疫化された。図２１Ｂは、２０μｇの競合ベース結合モノクローナルＡｂの存在中または非存在中で評価された６３日間のＳＯＳＩＰ特異的ＩｇＧの生のＥＬＩＳＡの希釈曲線である。図２１Ｃは、ベースブロッキングＡｂの存在中でのＥＬＩＳＡシグナルの曲線下面積の棒グラフである（ベースブロッキングＡｂの非存在中でＡＵＣに対して正規化）。図２１Ｄは、６３日目にＥＬＩＳＡによって評価されたＨｉｓタグ特異的ＩｇＧ力価のドットプロット分析を示す図である。スチューデントのｔ検定による、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。図２１Ｅは、６３日目にＥＬＩＳＡによって評価されたＳＯＳＩＰ  ｇｐ１２０特異的ＩｇＧ力価のドットプロット分析を示す図である。スチューデントのｔ検定による、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
発明の詳細な説明
本開示は、目的の抗原に対する増強された体液性免疫を誘発するための免疫原性組成物を提供し、それによって改善されたワクチンを提供する。一態様では、本開示は、（ａ）２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分に、必要に応じて少なくとも１つのリンカーを介して、カップリングした抗原反応性部分に共有結合で連結された抗原、および（ｂ）金属水酸化物アジュバント（例えば、ミョウバン）を含む、抗原−アジュバント複合体であって、抗原が、多価アジュバント反応性部分のヒドロキシル置換基を介して金属水酸化物アジュバントにコンジュゲートし、それにより、抗原−アジュバント複合体が形成される、抗原−アジュバント複合体を提供する。一部の態様では、抗原は、１つまたは複数のリン酸化セリン（ＰＳ）残基などの１つまたは複数のリン酸化アミノ酸残基を介して、金属水酸化物アジュバント（例えば、ミョウバン）にコンジュゲートする。
定義
【００７１】
特許請求の範囲および明細書において使用する用語は、他に明記されない限り、下記に説明するように定義される。
【００７２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数形を含むことに留意すべきである。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数の存在を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。用語が使用される文脈を与えられた当業者にとって明確ではない用語が使用される場合、「約」は、特定の値の最大でプラス１０％またはマイナス１０％までを意味する。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、特異的抗原と組み合わされて使用される場合に、抗原特異的免疫応答を増大および／または方向付けするために働く任意の物質を指す。ワクチン抗原と組み合わされる場合、アジュバントは、ワクチン抗原単独によって誘導される応答と比較して、ワクチン抗原に対する免疫応答を増加させる。アジュバントは、免疫学的機構を駆動し、ワクチン抗原に対する出力免疫応答を形作るのを助ける。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「アジュバント−抗原複合体」という用語は、抗原−アジュバントカップリング試薬と共有結合で連結された抗原を指すために使用され、カップリング試薬に連結された抗原は、リガンド交換によって金属水酸化物アジュバントに吸着して、複合体を形成する。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「マスクする」という用語は、アジュバント表面に抗原を固定化することによって影響を受けるブロッキングを指す。一部の実施形態では、抗原のアジュバントに対する部位特異的なコンジュゲーションの間に、ＰＳリンカーが抗原上の定義された残基に付加され、、ミョウバン粒子に対する抗原の配向を制御する。そのため、ミョウバン粒子表面と並置で位置するエピトープは、ミョウバンに対するそれらの近接性によって覆い隠される。したがって、マスクされたエピトープは、免疫系にディスプレイされず、免疫応答を誘発しないと予想される。
【００７７】
エピトープがマスクされるか否かを決定するための方法は、当業者に公知である。例えば、このような方法としては、限定されるものではないが、目的のエピトープに結合する抗体を用いる競合ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどのプラズモン共鳴アッセイで免疫レジメンから得られる血清を試験すること、または野生型抗原との結合と比較して目的のエピトープを欠く変異抗原への試料の結合を評価することが挙げられる。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「ナノ結晶」という用語は、１００ｎｍ未満の寸法のサブミクロンの結晶性粒子を指す。一部の実施形態では、ナノ結晶が凝集体を形成する場合、凝集体のサイズは、１００ｎｍを超える場合がある。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、１００ｎｍ未満の寸法のサブミクロンの粒子を指す。一部の実施形態では、ナノ粒子が凝集体を形成する場合、凝集体のサイズは、１００ｎｍを超える場合がある。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「凝集体」という用語は、電子顕微鏡法によって決定可能であるような、非アモルファスの粒子のクラスターまたはコレクションを指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「アラニンスキャニング」という用語は、所与のタンパク質またはポリペプチドの安定性または機能（例えば、結合親和性）に対する特定の野生型残基の寄与を決定するために使用される技術を指す。この技術は、ポリペプチド中の野生型残基に対するアラニン残基の置換、続いてアラニン置換誘導体または変異体ポリペプチドの安定性または機能（例えば、結合親和性）の評価、および野生型ポリペプチドとの比較を含む。ポリペプチド中の野生型残基に対してアラニンを置換する技術は、当技術分野において公知である。
【００８２】
「改善する」という用語は、疾患状態、例えば、がんの処置における任意の治療的に有益な結果を指し、それらの予防法、重症度もしくは進行の緩和、寛解、または治癒を含む。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに後で修飾されるこれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−リン酸化セリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基化学構造を有する化合物、すなわち、水素に結合した炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する、化学物質を指す。
【００８４】
アミノ酸は、一般に公知の３文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字の記号のいずれかによって、本明細書において言及することができる。同様に、ヌクレオチドは、一般に許容される１文字のコードによって言及することができる。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列（開始ポリペプチドのアミノ酸配列）中の少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の、第２の異なる「置き換え」アミノ酸残基での置き換えを指す。「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つの追加のアミノ酸の組み込みを指す。挿入は、通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、より大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３〜約５個、またはさらに最大で約１０、１５もしくは２０個のアミノ酸残基の挿入を行うこともできる。挿入される残基は、上記に開示のように、天然に存在していてもよく、または天然に存在していなくてもよい。「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、本明細書に開示の天然ポリペプチドの生物活性を、部分的または完全に、ブロック、阻害または中和する、任意の分子を指す。好適なアンタゴニスト分子としては、詳細には、アンタゴニスト抗体もしくは抗体断片、天然ポリペプチドの断片もしくはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子などが挙げられる。一部の実施形態では、アンタゴニストの存在中における阻害は、用量依存的な様式で観察される。一部の実施形態では、測定されるシグナル（例えば、生物活性）は、比較可能な条件下で陰性対照を用いて測定されたシグナルよりも、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低い。また、本開示の方法における使用に好適なアンタゴニストを特定する方法も本明細書に開示する。例えば、これらの方法としては、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ（Ｃ）システム、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの結合アッセイが挙げられる。これらのアッセイは、目的のポリペプチド（例えば、受容体またはリガンド）に結合するアンタゴニストの能力を決定し、したがって、ポリペプチドの活性を、阻害、中和またはブロックするアンタゴニストの能力を示す。ポリペプチドまたはアゴニストの機能を阻害するアンタゴニストの能力などのアンタゴニストの有効性は、機能性アッセイを使用して決定することもできる。例えば、機能性アッセイは、ポリペプチドを候補のアンタゴニスト分子と接触させること、およびポリペプチドに通常関連する１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。アンタゴニストの効力は、通常、そのＩＣ５０値（アゴニストの応答の５０％を阻害するために必要な濃度）によって定義される。ＩＣ５０値が低いほど、アンタゴニストの効力が高く、最大の生物学的応答を阻害するために必要な濃度が低い。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含む全抗体を指す。全抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む、異なる抗体のアイソタイプを含む。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体は、様々な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒまたはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラットおよびマウスなどの哺乳動物のいずれかで作成され得るか、またはいずれかに由来し得る。抗体は、精製抗体または組換え抗体であり得る。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「抗原性製剤」または「抗原性組成物」または「免疫原性組成物」という用語は、脊椎動物、特に哺乳動物に投与されると、免疫応答を誘導する調製物を指す。
【００８９】
「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、その表面上でＭＨＣと複合体化した外来抗原をディスプレイする細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこの複合体を認識する。ＡＰＣの例としては、限定されるものではないが、樹状細胞（ＤＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球（ＴＨＰ−１など）、Ｂリンパ芽球様細胞（Ｃ１Ｒ．Ａ２、１５１８Ｂ−ＬＣＬなど）、および単球由来樹状細胞（ＤＣ）が挙げられる。一部のＡＰＣは、食作用によって、または受容体媒介性エンドサイトーシスによってのいずれかで、抗原を内部移行する。
【００９０】
「抗原提示」という用語は、ＡＰＣが抗原を捕捉し、例えばＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩコンジュゲートの成分として、Ｔ細胞によるそれらの認識を可能にするプロセスを指す。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「抗原反応性部分」という用語は、触媒または刺激（例えば、光）との接触によって、自発的または活性化後のいずれかで、直接反応することによって標的にする反応性基または官能基を含む化学部分を指し、共有結合での連結をもたらすための、抗原を含むポリペプチドの利用可能な反応性基もしくは官能基、または抗原を含むポリペプチドに付着したペンダント（例えば、オリゴ糖）を含む反応性基もしくは官能基である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「がん特異的免疫応答」という用語は、腫瘍、がん細胞またはがん抗原の存在によって誘導される免疫応答を指す。ある特定の実施形態では、この応答は、がん抗原特異的リンパ球の増殖を含む。ある特定の実施形態では、この応答は、抗体およびＴ細胞受容体の発現および上方調節、ならびにリンホカイン、ケモカインおよびサイトカインの形成および放出を含む。自然免疫系および獲得免疫系の両方が相互作用して、腫瘍、がん細胞またはがん抗原に対する抗原応答を惹起する。ある特定の実施形態では、がん特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答である。
【００９３】
「癌腫」という用語は、当技術分野で認識されており、呼吸器系癌、消化器系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌および黒色腫を含む、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。本明細書に記載の抗ＣＤ１３７抗体および腫瘍抗原標的化抗体は、腎臓癌または黒色腫を含む、任意の種類のがんを有する患者、これらを有すると疑われる患者、または、これらの発生についての高い危険性を有し得る患者を処置するために使用することができる。例示的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。この用語は、癌性および肉腫性の組織で構成される悪性腫瘍を含む、癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織に由来する癌腫、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「競合」という用語は、同じエピトープへの結合について競合する抗原結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン、抗体またはその抗原結合断片）の文脈で使用される場合、アッセイ（例えば、競合的結合アッセイ、交差ブロッキングアッセイ）によって決定される抗原結合タンパク質の間の相互作用を指し、試験抗原結合タンパク質（例えば、試験抗体）は、共通の抗原に対する参照の抗原結合タンパク質（例えば、参照抗体）の特異的結合を阻害する（例えば、低減またはブロックする）。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「架橋」という用語は、共有結合が形成される反応を含む２つまたはそれよりも多くの分子を化学的に接合または連結するプロセスを指す。
【００９６】
指定されたポリペプチドまたはタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその部分と本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、部分は、少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３０〜５０個のアミノ酸からなるか、または部分は、そうでなければ、配列中においてその起源を有するとして、当業者には特定可能である。別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発のポリペプチドに対して１つまたは複数の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換されたか、または１つもしくは複数のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失を有する、１つまたは複数のアミノ酸残基を有し得る。
【００９７】
ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含むことができる。このようなバリアントは、必ずしも出発分子と１００％未満の配列同一性または類似性を有するわけではない。ある特定の実施形態では、バリアントは、例えば、バリアント分子の長さにわたって、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、より好ましくは、約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、最も好ましくは約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列の同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。
【００９８】
ある特定の実施形態では、出発のポリペプチド配列とそれらに由来する配列との間に１つのアミノ酸の相違が存在する。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するための配列の整列およびギャップの導入後に、出発のアミノ酸残基と同一（すなわち同じ残基）である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２に記述される配列から選択されるアミノ酸配列からなるか、これらから本質的になるか、またはこれらを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２に記述される配列から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２に記述される配列から選択される連続したアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の連続したアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００または５００個（またはこれらの数字内の任意の整数）の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。
【００９９】
ある特定の実施形態では、本開示の抗原は、ヌクレオチド配列によってコードされる。本発明のヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子治療、タンパク質発現および精製、変異導入、それを必要とする宿主のＤＮＡワクチン接種、例えば受動免疫のための抗体生成、ＰＣＲ、プライマーおよびプローブ生成などを含む、いくつかの適用のために有用であり得る。
【０１００】
本明細書に開示される方法における使用に好適な抗原が、天然配列の所望の活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在する配列または天然配列から順番に変化するように変更し得ることも当業者によって理解されると予想される。例えば、保存的置換もしくは「非必須」アミノ酸残基での変化をもたらす、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換を行ってもよい。変異は、部位特異的変異生成およびＰＣＲ媒介性変異生成などの標準的な技術によって導入されてもよい。
【０１０１】
本明細書に開示される方法における使用に好適な抗原は、１つまたは複数のアミノ酸残基での、例えば、必須アミノ酸残基または非必須アミノ酸残基での、保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。このように、結合ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置き換えられる。ある特定の実施形態では、一連のアミノ酸は、側鎖ファミリーのメンバーの順序および／または組成において異なる構造的に類似した一連で置き換えることができる。あるいは、ある特定の実施形態では、変異は、飽和変異生成などによって、コード配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに導入されてもよく、得られる変異体は、本発明の結合ポリペプチドに組み込むことができ、所望の標的に結合するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、抗原「交差提示」という用語は、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を介したＴ細胞への外因性タンパク質抗原の提示を指す。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「有効用量」または「有効投薬量」という用語は、所望の効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。「治療有効用量」という用語は、疾患に既に罹患している患者における疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に抑止するために十分な量として定義される。この使用に有効な量は、処置される障害の重症度、および患者自身の免疫系の一般的状態に依存すると予想される。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン、抗体または抗原結合性断片）が特異的に結合する抗原の決定基または部位を指す。タンパク質抗原のエピトープは、「直線状エピトープ」および「立体構造エピトープ」に区別することができる。本明細書で使用される場合、「直線状エピトープ」という用語は、連結されたアミノ酸の連続する線状配列から形成されるエピトープを指す。タンパク質抗原の直線状エピトープは、典型的には、化学変性剤（例えば、酸、塩基、溶媒、架橋試薬、カオトロピック剤、ジスルフィド結合低減剤）または物理的変性剤（例えば、熱、放射線または機械的剪断もしくは応力）に曝露される際に保持される。一部の実施形態では、エピトープは、非直線状であり、中断エピトープとも称される。本明細書で使用される場合、「立体構造エピトープ」という用語は、ポリペプチドの三次フォールディングによって並置された連続しないアミノ酸から形成されるエピトープを指す。立体構造エピトープは、典型的には、変性剤による処置の際に失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的な立体構造中に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。一般に、特定の標的分子に対して特異的な抗体またはその抗原結合断片は、タンパク質および／または巨大分子の複合体混合物内の標的分子に対する特異的エピトープを優先的に認識し、結合する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「エピトープマッピング」という用語は、その標的タンパク質抗原に対する、抗体またはその抗原結合断片の結合部位またはエピトープを特定するプロセスまたは方法を指す。エピトープマッピング方法および技術を本明細書において提供する。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列の可変領域および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的変異生成によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）を含むことができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：  ８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，  （１９９４）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ＆  Ｈｕｓｚａｒ，  （１９９５）  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ  ＆  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  （１９９５）  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７６４：５３６−５４６を参照のこと）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体（すなわち、ヒト化抗体）は含まない。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「異種抗体」という用語は、抗体などを産生するトランスジェニック非ヒト生物体に関して定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物からなるのではない生物体において見られるものに相当するアミノ酸配列またはコードする核酸配列を有する抗体を指し、一般にトランスジェニック非ヒト動物の種以外の由来である。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル置換部分」または「ヒドロキシルを置き換える部分」は、金属水酸化物アジュバントを含む表面ヒドロキシル基に対する置換に有効である化学部分または化学基を指す。
【０１０９】
「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を増強する」という用語は、互換可能に使用され、特定の抗原に対する免疫応答（すなわち、受動または適応）の刺激を指す。ＣＤＣまたはＡＤＣＣを誘導することに関して使用される「誘導する」という用語は、特定の直接の細胞死滅機構の刺激を指す。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、（例えば、細胞に言及する）「成長を阻害する」という用語は、細胞の成長の任意の測定可能な減少、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％までの細胞の成長の阻害を含むことを意図する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「予防を必要とする」、「処置を必要とする」または「それを必要とする」対象は、適切な医師（例えば、ヒトの場合においては、医師、看護師、または診療看護師、非ヒト哺乳動物の場合においては、獣医師）の判断によって、所与の処置（ワクチンを含む組成物による処置など）から合理的な利益を受けるであろうものを指す。
【０１１２】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、生物体（例えば、動物、植物または微生物）内よりむしろ、人工的な環境、例えば、試験管または反応容器において、細胞培養において、ペトリ皿においてなどで生じるプロセスを指す。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生体中で生じるプロセスを指す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する。しかしながら、エピトープに特異的に結合する単離抗体は、異なる種由来の目的の他のタンパク質または抗原に対する交差反応性を有する場合がある。しかしながら、抗体は、本明細書に記載の特異的結合アッセイにおける目的の抗原への特異的結合をディスプレイし続ける。加えて、単離抗体は、典型的には、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」または「ＫＤ」という用語は、抗体と抗原との間の結合反応の平衡解離定数を指す。ＫＤの値は、抗体の解離速度定数（ｋｄ）の抗体の結合速度定数（ｋａ）に対する比の数値表示である。ＫＤの値は、抗原に対する抗体の結合親和性に逆相関する。ＫＤ値が小さくなると、その抗原に対する抗体の親和性が高くなる。親和性は、そのリガンドに対する単一分子の結合の強さであり、典型的には、二分子相互作用を評価し、その強さを順序付けるために使用される平衡解離定数（ＫＤ）によって測定および報告される。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「ｋｄ」または「ｋｄ」（あるいは「ｋｏｆｆ」または「ｋｏｆｆ」）という用語は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する解離速度定数を指すことを意図する。ｋｄの値は、１秒あたりに減衰または解離する複合体の割合の数値表示であり、ｓｅｃ−１の単位で表される。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ｋａ」または「ｋａ」（あるいは「ｋｏｎ」または「ｋｏｎ」）という用語は、抗体の抗原との会合についての結合速度定数を指すことを意図する。ｋａの値は、抗体および抗原の１モル濃度（１Ｍ）溶液中で１秒あたりに形成される抗体／抗原複合体の数の数値表示であり、Ｍ−１ｓｅｃ−１の単位で表される。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合した」または「融合」という用語は、互換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むあらゆる手段によって、２つまたはそれよりも多くのエレメント、基、成分、ドメインまたは部分を一緒に接合することを指す。関連して、本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つまたはそれよりも多くのエレメント、基、成分、ドメインまたは部分を接合する化学基またはドメインを指す。化学的コンジュゲーションの方法（例えば、異種二官能性架橋剤を使用する）は、当技術分野において公知である。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」は、血管系を介した、その意図される標的組織もしくは部位への組成物または薬剤の輸送に依存しない送達を指す。例えば、組成物は、組成物もしくは薬剤の注射もしくはインプラントによって、または組成物もしくは薬剤を含有するデバイスの注射もしくはインプラントによって送達されてもよい。標的組織または部位の近辺への局所投与の後、組成物もしくは薬剤、または１つもしくは複数のその成分は、意図される標的組織または部位に拡散し得る。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「多価アジュバント反応性部分」という用語は、複数のヒドロキシル置換基を含む反応性部位を指し、それぞれのヒドロキシル置換基は、金属水酸化物アジュバントの表面ヒドロキシル基を置換するために有効であり、それによって、多価の形式でアジュバントに結合する。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、特定のエピトープについて単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および必要に応じた定常領域を有する、抗体を指す。一部の実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、対象物に適用される「天然に存在する」という用語は、対象物を天然で見出すことができるという事実を指す。例えば、天然源から単離することができ、実験室においてヒトによって意図的に改変されていない、生物体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「ネオ抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞における変異、または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、対応する野生型の親抗原から区別される、少なくとも１つの変更を有する抗原を指す。ネオ抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含むことができる。変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位の変更、ゲノム再配置もしくは遺伝子融合、またはネオ抗原のオープンリーディングフレームを与える任意のゲノムもしくは発現の代替を含むことができる。変異は、スプライスバリアントを含むこともできる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常なリン酸化を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、プロテアソームを生じるスプライス抗原を含むこともできる。Ｌｉｅｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｌａｒｇｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｒｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１６  Ｏｃｔ  ２１；  ３５４  （６３１０）：  ３５４−３５８を参照のこと。一部の実施形態では、ネオ抗原が、対象の腫瘍細胞または組織中に存在するが、対象の対応する正常細胞または組織中には存在しない、「腫瘍ネオ抗原」である。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態で、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。他の指示がない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮退コドン置換）、ならびに相補配列および明示的に示された配列も暗黙的に包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生じることによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１，  １９９１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８，  １９８５；およびＣａｓｓｏｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２；  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８，  １９９４）。アルギニンおよびロイシンについては、第２の塩基での修飾は、保存的でもあり得る。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換可能に使用される。
【０１２４】
本明細書において使用されるポリヌクレオチドは、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成され得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成され得る。ポリヌクレオチドは、安定性または他の理由のために修飾された１つもしくは複数の修飾塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ主鎖を含有することもできる。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどのまれな塩基が挙げられる。様々な修飾を、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態を包含する。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、第１のエレメントおよび第２のエレメントが機能的関係に置かれるような、第１のエレメントの第２のエレメントに対する連結を指す。例えば、第１の反応性部分または反応性基が第２の反応性部分または反応性基に「作動可能に連結される」場合、第１および第２の部分の機能または反応性は連結される。例えば、核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、核酸は「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、これが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列に関して、作動可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり、必要により２つのタンパク質のコード領域を接合する場合、連続的で、リーディングフレーム内であることを意味する。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「パラトープ」、また「抗原結合部位」という用語は、可変重鎖および軽鎖内に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含む、抗原上のエピトープを認識および結合する、抗体の部分またはその抗原結合断片を指す。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」、「非経口的に投与された」および他の文法的に同等の語句は、通常、注射による、腸以外の投与および局所投与の方式を指し、限定されないが、静脈内、経鼻、眼内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、大脳内、頭蓋内、頸動脈内および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受ける、ヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【０１２９】
「同一性パーセント」という用語は、２つまたはそれよりも多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈において、以下に記載の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して、または目視検査によって測定された最大の一致について比較および整列させた場合に、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定されたパーセンテージを有する２つまたはそれよりも多くの配列またはサブ配列を指す。適用に応じて、「同一性パーセント」は、比較される配列の領域全体にわたって、例えば、機能的ドメイン全体にわたって、存在することができ、あるいは比較される２つの配列の全長全体にわたって存在することができる。配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューターに入力され、必要により、サブ配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列（単数または複数）についての配列同一性パーセントを計算する。
【０１３０】
比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）の類似性法についてのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューター化されたインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施することができる（一般には、以下のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。
【０１３１】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センターのウェブサイトを通じて公開されている。
【０１３２】
本明細書において一般に使用される場合、「薬学的に許容される」とは、医学的判断であると思われる範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的な利益／危険性の比に釣り合う他の問題もしくは合併症がなく、ヒトおよび動物の組織、器官および／または体液と接触する使用に好適である、これらの化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを指し、これらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含むことができる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６６：１−１９を参照のこと）。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、互換可能に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸に対応する人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、状態に関して使用される場合、組成物を受けていない対象に対して、対象における病状の症状の発症の頻度を低減し、または病状の開始を遅らせる組成物の投与を指す。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載のタンパク質（抗体または断片）のいずれかに適用される「精製された」または「単離された」という用語は、天然に付随する成分（例えば、タンパク質、または他の天然に存在する生物学的分子または有機分子）、例えば、タンパク質を発現する原核生物における他のタンパク質、脂質および核酸から、分離または精製されたポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドは、試料中の総タンパク質の少なくとも６０重量％（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７または９９重量％）を構成する場合に精製される。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことを意図する。このような用語は、特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すことも意図することが理解されるべきである。ある特定の改変が、変異または環境的影響のいずれかに起因する後続の世代において生じる場合があるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、本発明の方法および組成物は、免疫障害を有する対象を処置するために使用することができる。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【０１３９】
核酸について、「実質的相同性」という用語は、２つの核酸、またはその指定配列が、最適に整列および比較される場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失と、少なくとも約８０％のヌクレオチド、通常少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％のヌクレオチドと同一であることを示す。あるいは、実質的相同性は、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合に、存在する。
【０１４０】
２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、非限定的な下記の例に記載するような数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【０１４１】
２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップの重み、および１、２、３、４、５または６の長さの重みを使用して、決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．  Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｍｉｌｌｅｒ  （ＣＡＢＩＯＳ，  ４：１１−１７  （１９８９））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０の重みの残基テーブル、ギャップ長のペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （４８）：４４４−４５３  （１９７０））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップの重みおよび１、２、３、４、５または６の長さの重さを使用して、決定することができる。
【０１４２】
本開示の核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を特定するために、公開データベースに対して検索を行う「クエリ配列」として、さらに使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。比較目的のためにギャップがある整列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されている通り、利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【０１４３】
核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製された形態、もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知の他の技術を含む、標準的な技術により、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質から精製された場合、「単離される」または「実質的に純粋な状態である」。Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７）を参照のこと。
【０１４４】
本開示の核酸組成物は、多くの場合、天然配列（修飾制限部位などを除く）であるが、ｃＤＮＡ、ゲノムまたはこれらの混合物のいずれかから、遺伝子配列を提供する標準的な技術に従って、変異させることができる。コード配列について、これらの変異は、所望によりアミノ酸配列に影響を与え得る。特に、本明細書に記載の、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび他のそのような配列に対して実質的に相同のＤＮＡ配列、またはこれらに由来するＤＮＡ配列が企図される（ここで「由来する」とは、配列が別の配列と同一であるか、または改変されることを示す）。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」は、（ｉ）腫瘍特異的抗原、（ｉｉ）腫瘍関連抗原、（ｉｉｉ）腫瘍特異的抗原を発現する細胞、（ｉｖ）腫瘍関連抗原を発現する細胞、（ｖ）腫瘍上の胚抗原、（ｖｉ）自己腫瘍細胞、（ｖｉｉ）腫瘍特異的膜抗原、（ｖｉｉｉ）腫瘍関連膜抗原、（ｉｘ）増殖因子受容体、（ｘ）増殖因子リガンド、（ｘｉ）ネオ抗原、および（ｘｉｉ）がんまたは腫瘍に関連する、任意の他の種類の抗原または抗原提示細胞もしくは材料を指す。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」という用語は、全く発現しないか、または低レベルでのみ発現され得る非腫瘍細胞よりも、腫瘍細胞においてより高いレベルで一般に発現する、タンパク質などの免疫原性分子を指す。一部の実施形態では、腫瘍を持つ宿主の免疫系によって認識される腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原と称される。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ほとんどの腫瘍によって幅広く発現される場合、普遍的な腫瘍抗原である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、分化抗原、変異抗原、過剰発現細胞抗原またはウイルス抗原である。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「腫瘍特異的抗原」または「ＴＳＡ」という用語は、腫瘍細胞に固有の、タンパク質などの免疫原性分子を指す。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞においてもっぱら発現する。
【０１４８】
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の治療的または予防的方策を指す。「処置」の方法は、障害または再発した障害の１つもしくは複数の症状を予防、治癒、遅延、その重症度を低減、もしくは改善するために、またはそのような処置がない場合に予想される生存を超える対象の生存を延長するために、そのような処置を必要とする対象、例えば、特定の抗原に対する免疫応答を増強する必要がある対象、または最終的にそのような障害がもたらされ得る対象への本開示のヒト抗体の投与を利用する。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」とは、アジュバントと組み合わされた、本明細書に記載の免疫原性組成物を含有する製剤を指し、これは、脊椎動物に投与することができる形態であり、感染症もしくは疾患を予防および／もしくは改善するため、ならびに／または感染症もしくは疾患の少なくとも１つの症状を低減するため、ならびに／または合成ナノ粒子の別の用量の有効性を増強するために、免疫を誘導するために十分な防御免疫応答を誘導する。典型的には、ワクチンは、本明細書に記載の組成物が懸濁または溶解される、従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本明細書に記載の組成物は、感染症または疾患を、予防、改善、またはそうでなければ処置するために使用される。宿主への導入の際に、ワクチンは、限定されないが、抗体および／もしくはサイトカインの産生、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞および／もしくは他の細胞応答の活性化を含む免疫応答を引き起こす。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「防御」免疫応答は、疾患または感染症を予防または改善する、細胞媒介性および／または体液（抗体）媒介性の免疫応答を指す。防御体液性免疫応答または体液性免疫は、多くの場合、抗原上の特異的エピトープを認識する広域中和抗体の誘導を含む。ワクチン接種による防御体液性免疫の誘発のために、Ｂ細胞は、活性化され、胚中心に進入しなければならず、そこでは、Ｂ細胞が増殖し、抗原の認識を増強する方向にそれらの抗体遺伝子を変異させる。次いで、これらの細胞の一部は、恒常的に抗体を分泌する長寿命の形質細胞、または病原体への再曝露の際に応答の呼び戻しに関与する記憶Ｂ細胞のいずれかに分化するはずである。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図する。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントにライゲートされ得る円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自己複製する能力がある（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに統合され得、それにより宿主ゲノムとともに複製される。また、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結している遺伝子の発現を指示する能力がある。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術における発現ベクターの有用性は、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、互換可能に使用される場合がある。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０１５２】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、この開示が関係する当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。好ましい方法および材料を、以下に記載するが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および物質は、現在開示されている方法および組成物の実施または試験において使用することもできる。本明細書において列挙されるすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
抗原反応性部分
【０１５３】
本開示によって提供される一部の実施形態では、抗原反応性部分は、アミン反応性基、カルボキシル−アミン反応性基、スルフヒドリル反応性基、アルデヒドまたはカルボニル反応性基、ヒドロキシル反応性基、アジド反応性基、および光反応性基からなる群から選択される反応性基または官能基を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、抗原反応性部分はアミン反応性基を含む。アミン反応性基の非限定的な例としては、イソチオシアネート、イソシアネート、スルホニルクロリド、アルデヒド、カルボジイミド、アシルアジド、無水物、フルオロベンゼン、カーボネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、イミドエステル、エポキシドおよびフルオロフェニルエステルが挙げられる。一部の実施形態では、抗原反応性部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、スルホ−ＮＨＳエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびヒドロキシメチルホスフィンからなる群から選択されるアミン反応性基を含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、抗原反応性部分は、カルボジイミドを含むカルボキシル−アミン反応性基を含む。一部の実施形態では、カルボジイミドはＥＤＣである。他の実施形態では、カルボジイミドはＤＣＣである。
【０１５６】
一部の実施形態では、抗原反応性部分はスルフヒドリル反応性基を含む。スルフヒドリル反応性基の非限定的な例としては、マレイミド、ハロアセチル（ブロモまたはヨード）、ピリジルジスルフィド、チオスルホネートおよびビニルスルホンが挙げられる。一部の実施形態では、抗原反応性部分は、マレイミドを含むスルフヒドリル反応性基を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、抗原反応性部分は、アルデヒドまたはカルボニル反応性基を含む。アルデヒドまたはカルボニル反応性基の例としては、限定されるものではないが、ヒドラジドおよびアルコキシアミンが挙げられる。
【０１５８】
一部の実施形態では、抗原反応性部分はヒドロキシル反応性基を含む。ヒドロキシル反応性基の非限定的な例はイソシアネートである。
【０１５９】
一部の実施形態では、抗原反応性部分はアジド反応性基を含む。アジド反応性基の非限定的な例はホスフィンである。
【０１６０】
一部の実施形態では、抗原反応性部分は光反応性基を含む。光反応性基の例としては、限定されるものではないが、フェニルアジド、オルト−ヒドロキシフェニルアジド、メタ−ヒドロキシフェニルアジド、テトラフルオロフェニルアジド、オルト−ニトロフェニルアジド、メタ−ニトロフェニルアジド、ジアジリン、アジド−メチルクマリンおよびプソラレンが挙げられる。
【０１６１】
一部の実施形態では、抗原反応性部分は、第１級アミン基（−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、スルフヒドリル基（−ＳＨ）、カルボニル基（−ＣＨＯ）、アジド基（−Ｎ３）から選択される反応性基または官能基を標的にし、これらと反応する。
【０１６２】
本開示によって提供される一部の実施形態では、抗原反応性部分は、ポリペプチドがフォールディングされた状態で維持される条件（例えば、生理学的条件）下で、目的のポリペプチドを含む１つまたは複数の反応性基または官能基と反応し得る。一部の実施形態では、抗原反応性部分は、抗原のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＡｒｇのアミノ酸残基の側鎖基などの、抗原の１つまたは複数の反応性基または官能基と反応する。抗原反応性部分は、アミノ反応性、チオール反応性、ヒドロキシル反応性、イミダゾリル反応性またはグアニジニル反応性であってもよい。抗原反応性部分に好適なさらなる例示的な反応性基または官能基、およびこれを使用する方法は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１３に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
リンカー
【０１６３】
一部の実施形態では、抗原−アジュバントカップリング試薬はリンカーを含む。一部の実施形態では、抗原−アジュバントカップリング試薬は、複数のリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ポリペプチドリンカー、エチレングリコールリンカーまたはオリゴヌクレオチドリンカーである。ある特定の態様では、抗原がアジュバントとカップリングして抗原−アジュバント複合体を形成するリンカーを利用することが望ましい。一部の実施形態では、抗原は、本明細書に記載のリンカーのいずれかと連結またはタグ化されたリン酸化セリン残基を介して、アジュバントとカップリングする。本明細書で使用される場合、リン酸化セリン残基を含むリンカーは、本明細書において「リン酸化セリンリンカー」（ＰＳリンカー）と称される。一部の実施形態では、ＰＳリンカーは、リン酸化セリン残基を含有するポリペプチドリンカーを含む。別の実施形態では、ＰＳリンカーは、１〜１２個の連続したＰＳ残基に続いて、短いポリ（エチレングリコール）スペーサーおよびＮ末端のマレイミド官能基を含む。別の実施形態では、ＰＳリンカーのＮ末端のマレイミド官能基は、抗原上のチオール基へのチオエーテル連結を介して共有結合される。
【０１６４】
さらに別の実施形態では、複数のＰＳリンカーは、アジド官能基を介して抗原タンパク質にコンジュゲートし、ＤＢＣＯ改変抗原とカップリングする。本発明のリンカーは、例えば、抗原が、アジュバントに対して相対的に位置して、抗原の適切なフォールディングおよび形成を確実にする、または特定のエピトープをブロックもしくは露出させることを確実にするために利用し得る。好ましくは、本発明に適合するリンカーは、比較的非免疫原性であり、結合タンパク質（例えば、抗体）のモノマーサブユニットの間の任意の非共有結合性の会合を阻害しない。例示的なリンカードメインは、米国特許第６，６６０，８４３号に開示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
一部の実施形態では、リンカーは、非切断性リンカーまたは切断性リンカーであり得る。非切断性リンカーは、アミド結合またはリン酸結合を含んでいてもよく、切断性リンカーは、ジスルフィド結合、酸切断性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合、または酵素切断性結合を含んでいてもよい。
ポリペプチドリンカー
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示によって提供される抗原−アジュバントカップリング試薬は、任意の抗原反応性部分を、本明細書に記載の２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む任意の多価アジュバント反応性部分と接合させるためのポリペプチドリンカーを含む。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、スルフヒドリル反応性部分を含む抗原反応性部分を、２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分と共有結合で連結させるために使用することができ、ここで、ヒドロキシル置換基はリン酸基を含む。
【０１６７】
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは合成である。本明細書で使用される場合、ポリペプチドリンカーに関する「合成」という用語は、アミノ酸の線状配列において反応性部分と連結されるアミノ酸配列（天然に存在していてもよく、または天然に存在していなくてもよい）を含むペプチド（またはポリペプチド）を含む。例えば、ポリペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変された形態（例えば、付加、置換または欠失などの変異を含む）であるか、第１のアミノ酸配列（天然に存在していてもよく、または天然に存在していなくてもよい）を含む、天然に存在しないポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１６８】
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含むか、またはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーからなる。本明細書で使用される場合、「Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは正の整数（例えば、１、２、３、４または５）である）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１である。ある特定の実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２である。ある特定の実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。ある特定の実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。ある特定の実施形態では、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５である。ある特定の実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーの２つの他の配列（例えば、本明細書に記載のポリペプチドリンカー配列のいずれか）の間に挿入され得る。他の実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーの別の配列（例えば、本明細書に記載のポリペプチドリンカー配列のいずれか）の一端または両端に付着される。さらに他の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーに順に組み込まれる。
【０１６９】
本明細書に記載の抗原−アジュバントカップリング試薬のいずれかにおける使用に好適な他のリンカーは、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，５２５，４９１号に開示されたセリンリッチリンカー、Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２００１；１４：５２９−３２に開示されたヘリックス形成ペプチドリンカー（例えば、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５））、およびＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ２０１１；８：４５７−６５に開示された安定なリンカー、すなわちジペプチドリンカーのＬＥ、トロンビン感受性ジスルフィドシクロペプチドリンカー、およびアルファヘリックス形成リンカーＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥである。
【０１７０】
他の例示的なリンカーとしては、ＧＳリンカー（すなわち、（ＧＳ）ｎ）、ＧＧＳＧリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧ）ｎ）、ＧＳＡＴリンカー、ＳＥＧリンカーおよびＧＧＳリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ）が挙げられ、ここで、ｎは正の整数（例えば、１、２、３、４または５）である。抗原−アジュバントカップリング試薬における使用のための他の好適なリンカーは、Ｌｉｎｋｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｉｂｉ．ｖｕ．ｎｌ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｌｉｎｋｅｒｄｂｗｗｗ）などの公開されているデータベースを使用して見出すことができる。Ｌｉｎｋｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅは、新規融合タンパク質において潜在的なリンカーとして機能する多機能酵素におけるドメイン間リンカーのデータベースである（例えば、Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００２；１５：８７１−９を参照のこと）。
【０１７１】
これらの例示的なポリペプチドリンカーのバリアント形態は、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失がポリペプチドリンカーに導入されるように、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失を、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列に導入することによって作出することができることが理解されると予想される。変異は、部位特異的変異生成およびＰＣＲ媒介性変異生成などの標準的な技術によって導入されてもよい。
【０１７２】
本発明のポリペプチドリンカーは、少なくとも１アミノ酸長であり、様々な長さであり得る。一実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１〜約５０アミノ酸長である。この文脈で使用される場合、「約」という用語は、＋／−２個のアミノ酸残基を示す。リンカーの長さは正の整数でなくてはならないので、約１〜約５０アミノ酸長の長さは、１から４８〜５２のアミノ酸長の長さを意味する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１〜５アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約５〜１０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１０〜２０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１５〜約５０アミノ酸長である。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約２０〜約４５アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１５〜約２５アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０もしくは６１、またはそれよりも長いアミノ酸長である。
【０１７４】
ポリペプチドリンカーは、当技術分野において公知の技術を使用して、ポリペプチド配列に導入することができる。改変は、ＤＮＡ配列分析によって確認することができる。プラスミドＤＮＡは、産生されるポリペプチドの安定な産生のために宿主細胞を形質転換するために使用することができる。
エチレングリコールリンカー
【０１７５】
一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のエチレングリコール（ＥＧ）単位、より好ましくは、２またはそれよりも多くのＥＧ単位（すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーからなる。ポリエチレングリコールまたはＰＥＧは、繰り返されるエチレングリコール単位で構成される化学物質を指す。例示的な「ＰＥＧリンカー」は、式：Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（式中、ｎは正の整数（例えば、１、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００）である）の化合物を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカーはＰＥＧ１０００である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカーはＰＥＧ２０００である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカーはＰＥＧ３０００である。
【０１７６】
一部の実施形態では、本開示によって提供される抗原−アジュバントカップリング試薬は、任意の抗原反応性部分を、本明細書に記載の２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む任意の多価アジュバント反応性部分と接合させるための任意のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーは、スルフヒドリル反応性部分を含む抗原反応性部分を、２つまたはそれよりも多くのヒドロキシル置換基を含む多価アジュバント反応性部分と共有結合で連結させるために使用することができ、ここで、ヒドロキシル置換基はリン酸基を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、抗原−アジュバントカップリング試薬を含むエチレングリコール（ＥＧ）単位の正確な数は、約１〜約１００の間、約２０〜約８０の間、約３０〜約７０の間、約４０〜約６０の間のＥＧ単位の範囲であり得る。一部の実施形態では、エチレングリコールリンカーは、約４５〜５５の間のＥＧ単位を有する。例えば、一実施形態では、エチレングリコールリンカーは４５ＥＧ単位を有する。例えば、一実施形態では、エチレングリコールリンカーは４８ＥＧ単位を有する。
オリゴヌクレオチドリンカー
【０１７８】
一部の実施形態では、リンカーはオリゴヌクレオチドである。リンカーは、任意の配列を有することができ、例えば、オリゴヌクレオチドの配列は、ランダム配列、またはその分子もしくは生化学的特性のために特異的に選択された配列であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、連続したアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはこれらのアナログの１つまたは複数の系列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、連続したアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはこれらのアナログの１つの系列からなる。
【０１７９】
一実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のグアニン、例えば、１〜１０個の間のグアニンである。一部の実施形態では、ＡＢＰコンジュゲート中のリンカーは、０、１または２つのグアニンを含むことができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートのサブユニット間の連結を含む。
ヒドロキシル置換基
【０１８０】
本開示は、脊椎動物への抗原の投与から生じる免疫応答を増強することを指向する新規な組成物および方法を提供する。本開示によれば、免疫応答は、免疫系へのその提示が応答を高める形態で、抗原を投与することによって増強される。例えば、抗原の持続時間の変化は、リンパ節、または例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞による内部移行の促進に利用可能である。本発明は、静電気および他の二次的力のみによってアジュバント粒子に吸着された抗原が、皮下または筋肉内の場所へのワクチンの送達後に、高い程度で吸着されたままではない、リガンド交換によってアジュバント粒子に吸着された抗原が、送達後に高い程度で吸着されたままである、および送達後にアジュバント粒子に吸着されたままの抗原が、注射部位でより容易に保持され、高い抗抗原抗体価を誘導する、という発見に起因する。
【０１８１】
カップリング試薬を含む多価アジュバント反応性部分は、金属水酸化物アジュバント粒子（例えば、ミョウバン）の表面ヒドロキシル基を置換するために有効な少なくとも２つのヒドロキシル置換基（例えば、リン酸基）を提供し、それにより抗原をアジュバントにカップリングまたは吸着させる。
【０１８２】
このような組成物は、本明細書において「抗原−アジュバント複合体」と称される。この置換は、リガンド交換機構によって生じ、置換は、抗原および金属水酸化物アジュバントを含む内球表面複合体の形成をもたらし、それによって抗原は、アジュバント粒子に強く吸着される。本明細書で使用される場合、「リガンド交換」という用語は、別のリガンド、この場合において、ヒドロキシル置換基を含む抗原による表面ヒドロキシルの置換または交換として定義される。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「金属水酸化物アジュバント」という用語は、金属に結合した少なくとも１つのヒドロキシル基を含む物質を指すために使用され、これは、ヒドロキシル置換部分を有する抗原を吸着する能力があり、脊椎動物に送達されると免疫応答の誘発において抗原を補助する能力がある。金属水酸化物アジュバントはまた、ヒトおよび非ヒトに生体適合性のものが選択される。本発明による好ましい金属水酸化物アジュバントまたは使用は、アルミニウム含有アジュバントである。「アルミニウム含有アジュバント」という用語は、アルミニウムに結合した少なくとも１つのヒドロキシル基を含む物質として定義される。アルミニウム含有アジュバントの例は、水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントである。
【０１８４】
関連分野の当業者は、「水酸化アルミニウムアジュバント」という用語が、結晶性のオキシ水酸化アルミニウム化合物を特定するために、この分野において使用されることを理解すると予想される。水酸化アルミニウムアジュバントは、アルミニウムに共有結合で結合した、ヒドロキシル基のみを表面に有する。「リン酸アルミニウムアジュバント」という用語は、アモルファスのヒドロキシリン酸アルミニウムを特定するためにこの分野において使用される。リン酸アルミニウムアジュバントは、アルミニウムに共有結合で結合した、リン酸基およびヒドロキシル基を表面に有する。アルミニウム含有アジュバントは、最も一般的に使用されるワクチンアジュバントであり、水酸化アルミニウムアジュバントは、米国でヒトのためにＦＤＡが認可したワクチンにおいて現在使用されている唯一のアジュバントであるが、本発明の原理は、アルミニウム含有アジュバント以外の金属水酸化物アジュバントに同様に適用可能である。さらなる代替の金属水酸化物アジュバントの非限定的な例として、本発明は、水酸化鉄アジュバントおよびリン酸カルシウムアジュバントが本発明による使用に好適であることを企図する。
【０１８５】
本発明はまた、改変された、ヒドロキシル置き換え抗原を送達するためのワクチン製剤において、例えば、改変アルミニウム含有アジュバントなどの改変金属水酸化物アジュバントの使用も企図する。本明細書で使用される場合、「改変金属水酸化物アジュバント」という用語は、リガンド交換のために利用可能な表面ヒドロキシル基の数を低減するように、表面ヒドロキシル基の一部が置き換えまたは改変されている金属水酸化物アジュバントを指すために使用される。本発明による金属水酸化物アジュバントを改変する１つの例示的な様式は、表面ヒドロキシル基のリン酸置換の発生を引き起こす（本明細書において、表面ヒドロキシル基のいくつかをリン酸化するとも称する）ために十分な時間、アジュバントをリン酸含有溶液と接触させることによる。例えば、水酸化アルミニウムアジュバントがリン酸イオンに曝露されると、リン酸イオンは、表面ヒドロキシルにとって代わり、表面アルミニウムを有する内球表面複合体（共有結合）を形成し、それにより水酸化アルミニウムアジュバントの表面構造が改変される。リン酸アルミニウムアジュバントの表面ヒドロキシル基は、同様の様式でリン酸化することができる。
【０１８６】
金属水酸化物アジュバントは、リガンド交換のために利用可能なアジュバント粒子の表面上のヒドロキシル基の密度を変更するために、記載のようにして改変することができる。あるいは、または加えて、この様式における金属水酸化物アジュバントの改変は、他の理由にとって望ましい場合がある。例えば、本開示は、したがって、アジュバント粒子の表面上のヒドロキシル基の密度の改変が、免疫原性組成物の吸着またはカップリングの程度を改変することを企図する。
【０１８７】
ヒドロキシル置換基の非限定的な例としては、フッ化物基、クエン酸基、リン酸基、硫酸基および炭酸基が挙げられる。アルミニウムは、リガンド交換反応において表面ヒドロキシルと置き換わることができるリン酸イオンに対して高親和性を有する。一部の実施形態では、抗原−アジュバントカップリング試薬を含むヒドロキシル置換基は、リン酸基である。アルミニウムは、フッ素に対してさらに高い親和性を有する。別の実施形態では、抗原−アジュバントカップリング試薬を含むヒドロキシル置換基は、フッ素基である。
【０１８８】
抗原は、ヒドロキシル置換部分を含まない抗原を提供することによって、および抗原−アジュバントカップリング試薬の抗原への共有結合での連結を介して、ここで抗原がリガンド交換による金属水酸化物アジュバントに吸着する部分を介して、１つまたは複数のヒドロキシル置き換え部分を付加することにより抗原を改変することによって、アジュバントを吸着させるため、アジュバントの吸着を増加させるため、またはアジュバントからの放出を減少させるために改変することができる。ポリペプチド抗原を改変するために特に十分に好適なこの改変を達成するための１つの様式は、アミノ酸を、反応性部分（例えば、システイン、−ＳＨ）を提供する抗原に含めることによる、および抗原−アジュバントカップリング試薬を有する反応性部分を含む改変された抗原をさらに接触させることによる。
【０１８９】
一部の実施形態では、本開示によって提供される抗原は、抗原−アジュバントカップリング試薬と反応する抗原の能力を作出するまたは増加させる目的のために、抗原の天然形態に存在しない１つまたは複数のアミノ酸（例えば、システイン）を含むように改変される。一部の実施形態では、本開示は、アジュバントの表面に対して、抗原を配向する抗原の部位特異的改変を企図する。このように、抗原上の選択的に提示されるエピトープは、無関係のエピトープをマスクしながら、アジュバント表面と並置で配向される。
【０１９０】
一部の実施形態では、本開示は、その天然形態中の１つまたは複数のヒドロキシル置換部分を含む抗原が、リガンド交換吸着の速度を増加させるか、または金属水酸化物アジュバントへの抗原の吸着の強度を増加させるために、本発明により改変することができることを企図する。
抗原
【０１９１】
本明細書に記載の免疫原性組成物への包含のために好適な抗原は、任意の病原体（例えば、細菌病原体、ウイルス病原体、真菌病原体、原生動物病原体、単細胞または多細胞性寄生生物病原体）、アレルゲン、または腫瘍に由来し得る。一部の実施形態では、抗原は、ウイルスに由来する。好適な抗原を含む例示的なウイルスとしては、限定されるものではないが、例えば、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ）、伝染性軟属腫ウイルス、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ライノウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、アレナウイルス（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルスまたはラッサウイルス）、ノロウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、フィロウイルス（例えば、エボラウイルスまたはマールブルグウイルス（ｍａｒｂｕｇ  ｖｉｒｕｓ））、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、モルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス）、ルビウイルス（例えば、風疹ウイルス）、ウシウイルス性下痢症ウイルスが挙げられる。例えば、抗原は、ＣＭＶ糖タンパク質のｇＨもしくはｇＬ；パルボウイルス；ＨＩＶ糖タンパク質のｇｐ１２０もしくはｇｐ１４０、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ、ｐｏｌ；またはＲＳＶ−Ｆ抗原であり得る。一部の実施形態では、抗原はウイルス抗原である。一部の実施形態では、ウイルス抗原は、ｇｐ１２０またはｇｐ１４０を含むＨＩＶ抗原である。一部では、操作されたＨＩＶ抗原は、ｇｐ１２０の操作されたバリアント（操作された外側ドメイン、ｅＯＤ）である。一部の実施形態では、操作されたＨＩＶ抗原は、ｇｐ１４０の操作されたバリアント（ＳＯＳＩＰ）である。ｅＯＤおよび／またはＳＯＳＩＰのさらなる説明は、国際公開第２０１６０５７０４号Ａ３、米国特許出願公開第２０１６０１８５８２５号Ａ１、Ｇｅｏｒｇｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８９（１０）：５３１８−５３２９によって提供されており、これらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
一部の実施形態では、抗原は、寄生生物に由来する。一部の実施形態では、抗原は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅまたはＰ．ｏｖａｌｅなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属内からの種に由来する。したがって、免疫原性組成物は、マラリアに対する免疫化のためのワクチンの調製のために使用され得る。
【０１９３】
一部の実施形態では、抗原は、細菌病原体に由来する。例示的な細菌病原体としては、例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓを含むＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ；Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ；Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプＢ、分類不能Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉを含むＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ；Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとしても公知のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを含むＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐｐ；Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを含むＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ；エンテロトキシン性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸管出血性（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒａｇｉｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ；Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａを含むＶｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉを含むＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ；Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含むＹｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉおよびＣ．ｃｏｌｉを含むＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ；Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．；Ｈ  ｐｙｌｏｒｉを含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．；Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍを含むＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．；Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを含むＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．；Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅを含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ、Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉを含むＢｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．；Ｅ．ｅｑｕｉを含むＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．およびヒト顆粒球エーリキア病原体；Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉを含むＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ；Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉを含むＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．；Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓを含むＬｅｐｔｓｉｒａ  ｓｐｐ．；Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを含むＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．が挙げられる。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、抗原は、真菌病原体に由来する。例示的な真菌病原体としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉが挙げられる。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、抗原は、原生動物病原体に由来する。例示的な原生動物病原体としては、例えば、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉおよびＳｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓが挙げられる。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、抗原は、多細胞性の寄生生物病原体に由来する。例示的な多細胞性の寄生生物病原体としては、例えば、吸虫類（吸虫）、条虫類（条虫）、線形動物（線虫）および節足動物が挙げられる。
【０１９７】
一部の実施形態では、抗原は、花粉アレルゲン（樹木、草本、雑草および草類の花粉アレルゲン）、昆虫またはクモアレルゲン（吸入抗原、唾液および毒アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリおよび小昆虫アレルゲン、ハチ毒アレルゲン）；動物の毛およびふけアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなど由来）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）などのアレルゲンに由来する。樹木、草類および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、分類学上の、Ｆａｇａｌｅｓ目、Ｏｌｅａｌｅｓ目、Ｐｉｎａｌｅｓ目ならびに限定されないがカバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、スズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含むｐｌａｔａｎａｃｅａｅ目、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｃｔｙｌｉｓ属、Ｈｏｌｃｕｓ属、Ｐｈａｌａｒｉｓ属、Ｓｅｃａｌｅ属およびＳｏｒｇｈｕｍ属の草類を含むＰｏａｌｅｓ目、Ａｍｂｒｏｓｉａ属、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属およびＰａｒｉｅｔａｒｉａ属の草本を含むＡｓｔｅｒａｌｅｓ目ならびにＵｒｔｉｃａｌｅｓ目が起源のものである。他の重要な吸入アレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属およびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のチリダニ類、コナダニ、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ、ゴキブリ、小昆虫およびノミ、例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓに由来するもの、ならびにネコ、イヌおよびウマなどの哺乳動物に由来するもの、例えば、ハチ（Ａｐｉｄａｅ）、カリバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含む分類学上のＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目に由来するものなどの刺咬昆虫が起源のものなどを含む毒アレルゲンである。
【０１９８】
一部の実施形態では、抗原は、（ａ）がん−精巣抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６およびＭＡＧＥ−１２（これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる）；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍、例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がんに関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんに関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんに関連する）、ＣＩＡ  ０２０５（例えば、膀胱がんに関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、ベータカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ  ０２０５、ＣＤＣ−２７およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現した抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、種々の白血病に関連する）、炭酸脱水酵素（例えば、腎臓がんに関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんに関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんに関連する）、マンマグロビン、アルファ−フェトプロテイン（例えば、肝がんに関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんに関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんに関連する）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞癌に関連する）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんに関連する）、ならびに癌胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および結腸直腸がんなどの胃腸管のがんに関連する）；（ｄ）共通抗原、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫に関連する）；（ｅ）前立腺関連抗原、例えば、前立腺がんに関連する、例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２；（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫に関連する）から選択される腫瘍抗原に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍免疫原性としては、限定されるものではないが、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６およびＥ７を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。
【０１９９】
一部の実施形態では、抗原は、アジュバントの表面に対して配向され、抗原の配向は、免疫系による１つまたは複数のエピトープの認識をブロックまたは阻害する。
アジュバント
【０２００】
アルミニウム塩（「ミョウバン」；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）および「アジュバントシステム０４」（ＡＳ０４）は、米国において市販されているワクチン中で使用されている２つのアジュバントである。ミョウバンは、ヒトワクチン接種において最も一般的に使用されるアジュバントである。追加のアジュバントは、ヨーロッパにおける使用のために承認されており、多くの他のものが臨床試験で試験されている。アジュバントの非限定的な例としては、トレハロース−６，６’−ジミコール酸（ＴＤＭ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、プルロニック（登録商標）ブロックコポリマー、ミョウバン溶液、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ（登録商標）（ポリホスファゼン）；リン酸アルミニウムゲル；藻類由来グルカン；アルガムリン；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）；高タンパク質吸着水酸化アルミニウムゲル；低粘度水酸化アルミニウムゲル；ＡＦまたはＳＰＴ（スクアラン（５％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％）、プルロニック（登録商標）Ｌ１２１（１．２５％）、リン酸緩衝食塩水のエマルジョン、ｐＨ７．４）；ＡＶＲＩＤＩＮＥ（商標）（プロパンジアミン）；ＢＡＹ  Ｒ１００５（商標）（（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシル−ドデカノイル−アミドヒドロアセテート）；ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（商標）（１−アルファ，２Ｓ−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３）；リン酸カルシウムゲル；ＣＡＰ（商標）（リン酸カルシウムナノ粒子）；コレラホロ毒素、コレラ毒素−Ａ１−タンパク質−Ａ−Ｄ−断片融合タンパク質、コレラ毒素のサブユニットＢ；ＣＲＬ１００５（ブロックコポリマーＰ１２０５）；サイトカイン含有リポソーム；ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）；ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＯＣ／ミョウバン複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）；フロイント完全アジュバント；フロイント不完全アジュバント；ガンマイヌリン；ゲルブアジュバント（ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド（ＤＤＡ）、ｉｉｉ）亜鉛−Ｌ−プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）の混合物；ＧＭ−ＣＳＦ）；ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）；イミキモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−４，５−ｃ）キノリン−４−アミン）；ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミテート）；ＤＲＶ（脱水−再水和ベシクルから調製されたイムノリポソーム）；インターフェロン−ガンマ；インターロイキン−１ベータ；インターロイキン−２；インターロイキン−７；インターロイキン−１２；ＩＳＣＯＭＳ（商標）；ＩＳＣＯＰＲＥＰ７．０．３．（商標）；リポソーム；ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ（商標）（７−アリ���−８−オキソグアノシン）；ＬＴ経口アジュバント（Ｅ．ｃｏｌｉの不安定なエンテロトキシン−プロトキシン）；任意の組成物のマイクロスフェアおよび微粒子；ＭＦ５９（商標）（スクアレン−水エマルジョン）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１（商標）（精製不完全フロイントアジュバント）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０（商標）（代謝可能油のアジュバント）；ＭＰＬ（商標）（３−Ｑ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ）；ＭＴＰ−ＰＥおよびＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ））−エチルアミド、一ナトリウム塩）；ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ＧＣｎ−ＯＣＨ３）；ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）およびＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−ｉｓｏＣｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）；ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼ−ガラクトースオキシダーゼ）；任意の組成物のナノスフェアまたはナノ粒子；ＮＩＳＶ（非イオン性界面活性剤ベシクル）；ＰＬＥＵＲＡＮ（商標）（β−グルカン）；ＰＬＧＡ、ＰＧＡおよびＰＬＡ（乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー；マイクロスフェア／ナノスフェア）；ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）  Ｌ１２１；ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）；ＰＯＤＤＳ（商標）（プロテノイドマイクロスフェア）；ポリエチレンカルバメート誘導体；ポリ−ｒＡ：ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体）；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）；タンパク質コクリエート（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ．）；ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（ＱＳ−２１）；Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）；Ｓ−２８４６３（４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）；ＳＡＦ−１（商標）（「Ｓｙｎｔｅｘアジュバント製剤」）；センダイプロテオリポソームおよびセンダイ含有脂質マトリックス；Ｓｐａｎ−８５（ソルビタントリオレエート）；Ｓｐｅｃｏｌ（Ｍａｒｃｏｌ５２、Ｓｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８５のエマルジョン）；スクアレンまたはＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサンおよび２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）；ステアロイルチロシン（オクタデシルチロシン塩酸塩）；Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）；スレオニル（Ｔｈｅｒｏｎｙｌ）−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ（商標）または［ｔｈｒ  １］−ＭＤＰ；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン）；Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰまたはウイルス様粒子）；Ｗａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウムに吸着されたリピドＡを含有するリポソーム）、およびＰａｍ３Ｃｙｓ、特にアル���ニウム塩、例えば、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌを含むリポペプチド；ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＩＦＡ、ＭＦ５９、Ｐｒｏｖａｘ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを含むエマルジョン；Ｏｐｔｉｖａｘ（ＣＲＬ１００５）、Ｌ１２１、Ｐｏｌｏａｘｍｅｒ４０１０などを含むコポリマー；Ｓｔｅａｌｔｈを含むリポソーム、ＢＩＯＲＡＬを含むコクレート；ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）、ＩＳＣＯＭを含む植物由来アジュバント；Ｔｏｍａｔｉｎｅを含む同時刺激に好適なアジュバント、ＰＬＧ、ＰＭＭ、イヌリンを含むバイオポリマー；Ｒｏｍｕｒｔｉｄｅ、ＤＥＴＯＸ、ＭＰＬ、ＣＷＳ、マンノース、ＣｐＧ核酸配列、ＣｐＧ７９０９を含む微生物由来アジュバント、ヒトＴＬＲ１〜１０のリガンド、マウスＴＬＲ１〜１３のリガンド、ＩＳＳ−１０１８、ＩＣ３１、イミダゾキノリン、アンプリゲン、Ｒｉｂｉ５２９、ＩＭＯｘｉｎｅ、ＩＲＩＶ、ＶＬＰ、コレラ毒素、熱不安定毒素、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、フラゲリン、ＧＰＩアンカー、ＬＮＦＰＩＩＩ／Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、抗菌ペプチド、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＲＳＶ融合タンパク質、ｃｄｉＧＭＰ；ならびにＣＧＲＰニューロペプチドを含むアンタゴニストとして好適なアジュバントが挙げられる。
【０２０１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフまたはポリ（Ｉ：Ｃ）を含むもの）は、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２１４，８０６号；米国特許第６，２１８，３７１号；米国特許第６，２３９，１１６号；米国特許第６，３３９，０６８号；米国特許第６，４０６，７０５号；および米国特許第６，４２９，１９９号を参照のこと）。例示的なアジュバントはまた、共刺激分子などの生物学的分子（「生物学的アジュバント」）を含み得る。例示的な生物学的アジュバントとしては、ＳＴＩＮＧ、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌおよび４１ＢＢＬが挙げられる。アジュバントは、開示の組成物と組み合わせて使用することができる。
抗原−アジュバント複合体および免疫原性組成物
【０２０２】
本明細書に記載の抗原−アジュバントカップリング試薬、抗原、必要に応じてリンカー、およびアジュバントは、抗原−アジュバント複合体および免疫原性組成物における使用のため、またはワクチンの成分として好適である。本明細書に開示の免疫原性組成物は、抗原−アジュバント複合体、必要に応じてリンカー、第２のアジュバントまたはこれらの組み合わせを含み得る。本明細書に記載のいずれかの免疫原性組成物は、ワクチンと称される場合がある。組み合わせて対象に投与される場合、抗原−アジュバント複合体および第２のアジュバントは、別々の医薬組成物で投与することができ、またはそれらは同じ医薬組成物で一緒に投与することができる。
【０２０３】
本明細書に開示の方法における使用に好適な免疫原性組成物は、単独で、または１つもしくは複数の追加のアジュバントとの組み合わせで投与される、抗原−アジュバント複合体を含み得る。抗原−アジュバント複合体を含むアジュバント、および／または１つもしくは複数の追加もしくは第２のアジュバントは、本明細書に記載のいずれかのアジュバントであり得る。アジュバントとしては、例えば、限定されないが、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；ＱＳ２１（ＨＰＬＣ画分で２１番目のピークで溶出する糖脂質；Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）などのＱ．ｓａｐｏｎａｒｉａ樹木の樹皮由来の精製サポニン；ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）、Ｆｌｔ３リガンド、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ伸長因子（精製Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａタンパク質；Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）、ＩＳＣＯＭＳ（混合サポニン、脂質および抗原を保持することができる孔を有するウイルスサイズの粒子形態を含有する免疫刺激複合体；ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＳＢ−ＡＳ４（ミョウバンおよびＭＰＬを含有するＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍアジュバントシステム＃４；ＳＢＢ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ＣＲＬ１００５（これらはポリオキシエチレンの鎖に隣接する疎水性ポリオキシプロピレンの直鎖を含有する、Ｖａｘｃｅｌ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ．）などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ（例えば、ＩＭＳ１３１２、可溶性免疫刺激剤のＳｅｐｐｉｃと組み合わせた水系ナノ粒子）が挙げられ得る。
【０２０４】
免疫原性組成物中の抗原−アジュバント複合体は、ナノ粒子またはナノ結晶を含む粒子凝集体を含んでいてもよい。
【０２０５】
免疫原性組成物を含む１つまたは複数のアジュバントは、例えば、限定されないが、上記で議論したものなどのＴＬＲリガンドも含み得る。ＴＬＲ３を通して作用するアジュバントとしては、限定されないが、二本鎖ＲＮＡが挙げられる。ＴＬＲ４を通して作用するアジュバントとしては、限定されないが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ；Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ならびにムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）およびスレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）；ＯＭ−１７４（リピドＡに関するグルコサミンジサッカリド；ＯＭ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ、Ｍｅｙｒｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などのリポ多糖の誘導体が挙げられる。ＴＬＲ５を通して作用するアジュバントとしては、限定されないが、フラジェリンが挙げられる。ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を通して作用するアジュバントとしては、一本鎖ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）、イミダゾキノリンアミン（例えば、イミキモド（Ｒ−８３７）、レシキモド（Ｒ−８４８））などの合成低分子化合物が挙げられる。ＴＬＲ９を通して作用するアジュバントとしては、ウイルスもしくは細菌起源のＤＮＡ、またはＣｐＧ  ＯＤＮなどの合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が挙げられる。別のアジュバントのクラスは、ホスホロチオエートヌクレオチドアナログなどの分子を含有するホスホロチオエート、およびホスホロチオエート主鎖連結を含有する核酸である。
【０２０６】
免疫原性組成物を含む１つまたは複数のアジュバントはまた、例えば、限定されないが、油エマルジョン（例えば、フロイントアジュバント）；サポニン製剤；ビロソームおよびウイルス様粒子；細菌および微生物誘導体；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；ＡＤＰ−リボシル化毒素および解毒誘導体；ミョウバン；ＢＣＧ；ミネラル含有組成物（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などの無機塩など）；バイオ接着剤および／または粘膜接着剤；微粒子；リポソーム；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤；ポリホスファゼン；ムラミルペプチド；イミダゾキノロン化合物；ならびに表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を含んでいてもよい。
【０２０７】
免疫原性組成物を含む１つまたは複数のアジュバントはまた、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などの免疫調節剤を含んでいてもよい。
抗原−アジュバント複合体および免疫原性組成物を作成する方法
【０２０８】
一態様では、本開示は、ワクチン製剤における使用のための抗原−アジュバント複合体および免疫原性組成物を提供する。本開示によって提供される抗原は、本開示によって提供される抗原−アジュバントカップリング試薬との共有結合での連結に適した反応性基を含むように改変もしくは操作されていてもよく、またはそのような反応性基を含むように合成される。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の免疫原性組成物を作成する方法であって、本明細書に記載の反応性基を含む抗原の核酸配列を含む宿主細胞を提供すること、抗原が発現する条件下で宿主細胞を維持すること、抗原を得ること、試薬が抗原に共有結合で連結する条件下で、抗原を本明細書に記載の抗原−アジュバントカップリング試薬と接触させること、試薬に共有結合で連結した抗原を得ること、必要に応じて抗原をアジュバントにカップリングまたは吸着させること、を含む方法を提供する。
【０２０９】
一部の実施形態では、抗原−アジュバントカップリング試薬は、固相ペプチド合成を使用して調製される。固相ペプチド合成は、アミノ酸残基を固体支持体上に固定化されたペプチドに添加する公知のプロセスである。固相ペプチド合成のさらなる説明は、Ｓｔａｗｉｋｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ  （２００２）  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ＣＨＡＰＴＥＲ：Ｕｎｉｔ−１８．１およびＢｅｈｒｅｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  ２２（１）：４−２７に見られ、この両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
一部の実施形態では、抗原としての使用のための本明細書に記載のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を使用して形質転換された宿主細胞中で合成される。それを行うために、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。このようなＤＮＡ分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ポリペプチドをコードする配列を、好適な制限酵素を使用してＤＮＡから切除することができる。あるいは、ＤＮＡ分子を、ホスホルアミデート法などの化学的合成技術を使用して合成することができる。また、これらの技術の組み合わせを使用することができる。一部の実施形態では、抗原は、反応性基（例えば、溶媒に曝露されるシステイン）を含む天然に存在しないアミノ酸を含むように操作される。天然に存在しないアミノ酸を含めるために抗原を操作する方法としては、限定されるものではないが、部位特異的変異および遺伝子合成が挙げられる。遺伝子操作する他の方法は、一般に、当業者に公知である。
【０２１１】
ポリペプチドを作成する方法はまた、適切な宿主中でペプチドを発現する能力があるベクターも含む。ベクターは、適切な発現制御配列に作動可能に連結されたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子がベクターに挿入される前または後のいずれかでこの作動可能な連結に影響を与える方法は、周知である。発現制御配列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソームヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。
【０２１２】
そこにＤＮＡ分子を有する得られたベクターは、適切な宿主に形質転換させるために使用される。この形質転換は、当技術分野において周知の方法を使用して行うことができる。
【０２１３】
任意の多数の利用可能な周知の宿主細胞は、本明細書に開示される方法における使用に好適であり得る。特定の宿主の選択は、当技術分野によって認識されているいくつかの要因に依存する。これらの要因としては、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物学的安全性およびコストが挙げられる。これらの要因のバランスは、すべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効でなくてもよいという理解に襲われるはずである。これらの一般的なガイドライン内で、有用な微生物宿主としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｐ．）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、および他の真菌、昆虫、植物、哺乳動物（ヒトを含む）の培養細胞、または当技術分野において公知の他の宿主が挙げられる。
【０２１４】
次に、形質転換された宿主は、培養および精製される。宿主細胞は、所望の化合物を発現するような、従来の発酵条件下で培養され得る。このような発酵条件は、当技術分野において周知である。最後に、ペプチドは、当技術分野において周知の方法によって、培養物から精製される。
【０２１５】
化合物は、合成法によって作成されてもよい。例えば、固相合成技術を使用し得る。好適な技術は、当技術分野において周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９７３），  Ｃｈｅｍ．  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｐｐ．  ３３５−６１  （Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９６３），  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：  ２１４９；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  １０：  ３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  （１９６９），  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６），  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （３ｒｄ  ｅｄ．）  ２：  １０５−２５３；およびＥｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６），  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （３ｒｄ  ｅｄ．）  ２：  ２５７−５２７に記載されているものが挙げられる。固相合成は、小ペプチドを作成する最もコスト効率がよい方法であるので、個々のペプチドを作成する好ましい技術である。誘導体化ペプチドを含有する化合物、または非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技術によって合成し得る。
【０２１６】
分子の発現／合成の他の方法は、一般に、当業者に公知である。
【０２１７】
上に記載の核酸分子は、例えば、ベクターで形質導入された細胞中で、それらの発現を指示する能力があるベクター内に含有され得る。したがって、ポリペプチド変異体に加えて、変異体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターおよびこれらのベクターをトランスフェクトした細胞は、ある特定の実施形態内である。
【０２１８】
使用に好適なベクターとしては、細菌における使用のためのＴ７系ベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ５６：  １２５，  １９８７を参照のこと）、哺乳動物細胞における使用のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：３５２１，  １９８８）、および昆虫細胞における使用のためのバキュロウイルス由来ベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．製の発現ベクターｐＢａｃＰＡＫＳ）が挙げられる。このようなベクターにおいて目的のポリペプチドをコードする核酸挿入物は、例えば発現を行おうとする細胞型に基づいて選択されたプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、Ｔ７プロモーターは細菌において使用することができ、ポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において使用することができ、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターは哺乳動物細胞において使用することができる。また、高等真核生物の場合において、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターが幅広く利用可能である。これらのプロモーターは、身体内の所与の組織または細胞型において核酸分子の発現を指示するそれらの能力に対して名付けられる。当業者は、核酸の発現を指示するために使用することができる非常に多くのプロモーターおよび他の調節エレメントをを十分に承知している。
【０２１９】
挿入された核酸分子の転写を容易にする配列に加えて、ベクターは、複製開始点および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含有することができる。例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏｒ）遺伝子は、それを発現する細胞にＧ４１８耐性を付与し、、トランスフェクトされた細胞の表現型選択を可能にする。当業者は、所与の調節エレメントまたは選択マーカーが、特定の実験の文脈における使用に好適であるか否かを容易に決定することができる。
【０２２０】
使用に好適なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ならびにウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ  （Ｅｄ．），  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【０２２１】
ポリペプチド変異体をコードする核酸分子を含有および発現する原核細胞または真核細胞も、使用に好適である。細胞は、トランスフェクトされた細胞、すなわち、核酸分子、例えば、変異体ポリペプチドをコードする核酸分子が、組換えＤＮＡ技術によって導入された細胞である。このような細胞の子孫も、本明細書に開示される方法における使用に好適であると考えられる。
【０２２２】
発現系の正確な成分は重要ではない。例えば、ポリペプチド変異体は、細菌のＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主、または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞またはＨｅＬａ細胞）などの真核生物宿主において、産生され得る。これらの細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）を含む多くの供給源から利用可能である。発現系の選択において、成分が互いに適合性であることのみが重要である。技術者または当業者は、このような決定を行うことが可能である。さらにまた、発現系の選択において指針が必要である場合、当業者は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９３）およびＰｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８５  Ｓｕｐｐｌ．  １９８７）を参考にしてもよい。
【０２２３】
発現したポリペプチドは、日常的な生化学的手順を使用して発現系から精製することができ、本明細書に記載されるように、例えば、脂質とコンジュゲートして使用することができる。
【０２２４】
一部の実施形態では、本明細書に開示の免疫原性組成物はワクチンを含む。当業者に理解されるように、金属水酸化物アジュバント粒子は、リガンド交換のために利用可能な非常に多くの表面ヒドロキシル基を含む。本開示は、ワクチン製剤中のそれぞれの金属水酸化物粒子が、本発明による複数の抗原と複数の表面複合体結合を形成する能力があり、、例えば樹状細胞などの抗原提示細胞による粒子の内部移行の際の免疫応答を高めるために有効である、より強力な抗原粒子を提供することを企図する。金属水酸化物アジュバント−抗原複合体は、金属水酸化物アジュバント、およびヒドロキシル置換部分を含む抗原を提供すること、ならびにリガンド交換を達成するために適切な条件下でアジュバントを抗原に接触させることによって、容易に作成される。次いで、金属水酸化物アジュバント−抗原複合体は、医薬ワクチンを調製するために有利に使用することができる。上記で議論したように、本発明の金属水酸化物アジュバント／抗原複合体は、アジュバント粒子あたり多数の抗原を有するように調製することができる。一実施形態では、金属水酸化物アジュバント抗原複合体は、約１：１〜約１：１０またはそれよりも大きい、抗原の（金属水酸化物アジュバントの）金属に対するモル比を有し得る。
【０２２５】
加えて、実施例に記載するように、多価抗原−アジュバントカップリング試薬を介して金属水酸化物アジュバントと複合体化された抗原は、注射部位で保持され、非複合体化抗原または一価抗原−アジュバントカップリング試薬を含む複合体化抗原と比べて、より高い抗抗原抗体価を提供する。したがって、本発明のワクチン製剤は、当技術分野においてこれまでに公知のワクチンよりも、より少ない抗原分子およびより少ないアジュバント粒子で、免疫応答を有効に高めるために調製することができると期待される。
【０２２６】
ワクチンを製剤化するために、適切な量の金属水酸化物アジュバント−抗原複合体を、例えば、希釈剤および賦形剤などの１つまたは複数の追加成分と組み合わせることができる。本発明のワクチン製剤に含めることができる希釈剤の一例は、ｐＨ緩衝剤である。使用することができる緩衝剤の例は、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムの組み合わせである。他の例としては、これらの緩衝剤のカリウム塩、または酢酸ナトリウムおよび酢酸のミックスが挙げられる。リン酸緩衝剤が本発明のワクチンに関連して使用される場合、緩衝剤が金属水酸化物アジュバントにおいて有する効果について認識および考慮に入れることが重要である。特に、リン酸緩衝剤の使用は、アジュバントの表面ヒドロキシル基のリン酸化をもたらし、それによりアジュバントのリガンド交換吸着特性に影響を及ぼす可能性がある。このように、アジュバントの前処理を含む本発明のプロトコールにおいて、前処理が、リン酸緩衝液中にアジュバントを入れることによって達成することができること、および達成された改変の程度が、緩衝剤中のリン酸塩の濃度に依存することが理解される。他方で、アジュバントの前処理を含まないプロトコールにおいて、すなわち、最大のリガンド交換機能性、およびしたがって最大のヒドロキシル利用性が望まれる場合、アジュバントは、リガンド交換吸着の前に、金属水酸化物アジュバントの表面上の利用可能なヒドロキシル基の数を著しく低減する、リン酸緩衝剤または任意の他の組成物と接触させるべきではない。当然ながら、リガンド交換による抗原吸着後のリン酸緩衝剤の使用が生じ、さらに他のリン酸含有組成物によるアジュバントの後処理は、一部の場合では、例えば、抗原／金属水酸化物アジュバント複合体の等電特性を変更させることが望まれる場合がある。
医薬組成物および投与方式
【０２２７】
一部の実施形態では、本開示によって提供される免疫原性組成物を含む医薬組成物が投与される。一部の実施形態では、免疫原性組成物および第２のアジュバントまたは追加のアジュバントを含む医薬組成物は、一緒に（同時にまたは連続して）投与される。一部の実施形態では、免疫原性組成物および第２のアジュバントまたは追加のアジュバントを含む医薬組成物は、別々に投与される。
【０２２８】
一部の実施形態では、本開示は、免疫原性組成物を、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとともに含む、医薬組成物を提供する。
【０２２９】
一部の実施形態では、許容される製剤材料は、好ましくは、利用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。ある特定の実施形態では、製剤材料（単数または複数）は、皮下および／または静脈内投与用である。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、ｐＨ、オスモル濃度、粘度、澄明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、組成物の吸着または浸透を、改変、維持または防止するための製剤材料を含有することができる。一部の実施形態では、好適な製剤材料としては、限定されるものではないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリスＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；フィラー；単糖；二糖；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；等張化増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール  ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬アジュバントが挙げられる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９９５））。ある特定の実施形態では、製剤は、ＰＢＳ；２０ｍＭのＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭのＮａＣｌ；および／または１０ｍＭのＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％のスクロースを含む。一部の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達の形式および所望の投薬量に応じて、当業者によって決定される。例えば、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと。一部の実施形態では、このような組成物は、免疫原性組成物の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出の速度およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を与え得る。
【０２３０】
一部の実施形態では、医薬組成物中の一次ビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、一部の実施形態では、好適なビヒクルまたは担体は、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料で場合により補充される、注射用水、生理的食塩水または人工脳脊髄液であり得る。一部の実施形態では、生理食塩水は、等張のリン酸緩衝食塩水を含む。ある特定の実施形態では、中性の緩衝食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。一部の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝剤、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これは、ソルビトールまたはこれらの好適な代替物をさらに含むことができる。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、必要に応じた製剤薬剤（上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と所望の程度の純度を有する選択された組成物を混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、保管のために調製することができる。さらに、一部の実施形態では、免疫原性組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０２３１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口的な送達のために選択することができる。一部の実施形態では、組成物は、経口などの、吸入のため、または消化管を通る送達のために選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技量内である。
【０２３２】
一部の実施形態では、製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。一部の実施形態では、緩衝剤は、生理学的ｐＨで、またはこれよりわずかに低いｐＨで、典型的には、約５〜約８のｐＨ範囲内で組成物を維持するために使用される。
【０２３３】
一部の実施形態では、非経口投与が企図される場合、治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に免疫原性組成物を含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。一部の実施形態では、非経口注射のためのビヒクルは、免疫原性組成物が無菌の等張溶液として製剤化され、適切に保存される、無菌の蒸留水である。一部の実施形態では、調製物は、次いで、デポー注射を介して送達することができる生成物の徐放性または持続放出性を提供することができる、薬剤、例えば、注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームを伴う所望の分子の製剤を含むことができる。一部の実施形態では、ヒアルロン酸も使用することができ、循環中の持続時間を促進する効果を有し得る。一部の実施形態では、インプラント可能な薬物送達デバイスを、所望の分子を導入するために使用することができる。
【０２３４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、吸入のための乾燥粉末として製剤化することができる。一部の実施形態では、免疫原性組成物を含む吸入溶液は、エアゾール送達のために噴射剤を用いて製剤化することができる。一部の実施形態では、溶液は霧状にすることができる。肺投与は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されており、これは、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載している。
【０２３５】
一部の実施形態では、製剤が経口で投与することができることを企図する。一部の実施形態では、この形式で投与される免疫原性組成物は、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の配合に従来使用されるこれらの担体あり、または担体なしで、製剤化することができる。一部の実施形態では、カプセル剤は、生物学的利用率を最大化し、前全身性分解を最少化する場合、胃腸管中のポイントで製剤の活性部分を放出するように設計することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の薬剤が、免疫原性組成物の吸収を促進するために含まれ得る。ある特定の実施形態では、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤および結合剤も利用することができる。
【０２３６】
一部の実施形態では、医薬組成物は、錠剤の製造に好適である非毒性賦形剤との混合物中に、有効量の免疫原性組成物を含むことができる。一部の実施形態では、滅菌水または別の適切なビヒクルに錠剤を溶解することによって、溶液を単位用量形態で調製することができる。一部の実施形態では、好適な賦形剤としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤が挙げられる。
【０２３７】
持続放出性または徐放性の送達製剤中に免疫原性組成物を含む製剤を含む、追加の医薬組成物は、当業者に明らかである。一部の実施形態では、様々な他の持続放出性または徐放性の送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズ、およびデポー注射剤を製剤化するための技術も当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の徐放を記載しているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照のこと。一部の実施形態では、持続放出調製物は、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態で、半透過性ポリマーマトリックスを含むことができる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ０５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ２２：５４７−５５６  （１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  １５：  １６７−２７７  （１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．，  １２：９８−  １０５  （１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を含むことができる。一部の実施形態では、持続放出組成物は、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含むことができる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２：３６８８−３６９２  （１９８５）；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６およびＥＰ１４３，９４９を参照のこと。
【０２３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏの投与のために使用される医薬組成物は、典型的には無菌である。一部の実施形態では、これは、無菌濾過膜を通す濾過によって達成され得る。ある特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかで実施することができる。一部の実施形態では、非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中で、保管することができる。一部の実施形態では、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグ、または皮下注入針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。
【０２３９】
一部の実施形態では、医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水された粉末もしくは凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中で保管することができる。一部の実施形態では、このような製剤は、使用準備済の形態で、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで、保管することができる。
【０２４０】
一部の実施形態では、キットが、単一用量投与単位を生成するために提供される。一部の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器、および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有することができる。一部の実施形態では、単一およびマルチチャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびライオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
【０２４１】
一部の実施形態では、治療的に利用される免疫原性組成物を含む有効量の医薬組成物は、例えば、治療の背景および目的に依存する。このため、当業者であれば、ある特定の実施形態による処置に適切な投薬量のレベルは、部分的に、送達される分子、免疫原性組成物を使用するための指示、投与の経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面または器官のサイズ）および／または状態（年齢および全体的な健康）に応じて変わることを理解すると予想される。一部の実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るために投薬量をタイターし、投与の経路を改変することができる。
【０２４２】
一部の実施形態では、投薬の頻度は、使用される製剤中の免疫原性組成物の薬物動態パラメーターを考慮に入れる。一部の実施形態では、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。一部の実施形態では、したがって、組成物は、単一用量として、または経時的に２もしくはそれよりも多くの用量（同じ量の所望の分子を含有していてもよく、含有していなくてもよい）として、あるいはインプラントデバイスまたはカテーテルを介した持続注入として、投与することができる。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって日常的に行われ、当業者によって日常的に行われるタスクの範囲内である。一部の実施形態では、適切な投薬量は、適切な用量反応データの使用により確かめることができる。
【０２４３】
一部の実施形態では、医薬組成物の投与の経路は、公知の方法に従って、例えば、経口、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内の経路による注射によって；持続放出システムによって、またはインプラントデバイスによってである。ある特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって継続的に、またはインプラントデバイスによって、投与することができる。ある特定の実施形態では、併用療法の個々の要素は、異なる経路によって投与されてもよい。
【０２４４】
一部の実施形態では、組成物は、所望の分子が吸収またはカプセル化された、膜、スポンジまたは別の適切な材料のインプラントを介して、局所的に投与することができる。一部の実施形態では、インプラントデバイスが使用される場合、デバイスは、任意の好適な組織または器官に埋め込まれ得、所望の分子の送達は、拡散、時効型ボーラスまたは継続投与を介してであり得る。一部の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏの様式で免疫原性組成物を含む医薬組成物を使用することが望ましくあり得る。このような例において、患者から除去された細胞、組織および／または器官は、免疫原性組成物を含む医薬組成物に曝露され、その後、続けて、細胞、組織および／または器官が患者に戻して移植される。
【０２４５】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ポリペプチドを発現および分泌させるために、本明細書に記載のものなどの方法を使用して、遺伝子操作されたある特定の細胞を移植することによって送達することができる。一部の実施形態では、このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、自己、異種または異種間であり得る。一部の実施形態では、細胞は不死化され得る。一部の実施形態では、免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するためにカプセル化することができる。一部の実施形態では、カプセル化材料は、典型的には、タンパク質産物（単数または複数）の放出を可能にするが、患者の免疫系によるか、または周囲の組織からの他の有害な要因による細胞の破壊を防止する、生体適合性の、半透過性のポリマー封入体または膜である。
使用の方法
【０２４６】
一部の態様では、本開示は、ワクチンが、本開示により提供される免疫原性組成物により、抗原−アジュバントカップリング試薬に共有結合で連結する能力がある反応性基を含むか、またはこのような反応性基を含むように、改変、操作もしくは合成された任意の抗原を使用して、調製することができることを企図する。
【０２４７】
一部の実施形態では、本開示は、投与部位で、対象における抗原の保持を増加させるための方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物を含むワクチンを投与することを含む、方法を提供する。
【０２４８】
対象における抗原の保持を決定するための方法は、当業者に公知である。例えば、一部の実施形態では、投与部位での抗原の保持は、標識化抗原による免疫化後、全身ＩＶＩＳスキャニングを使用して、評価される。他の実施形態では、投与部位での抗原の保持は、免疫組織化学的染色、または経時的な注射部位の組織試料の電子顕微鏡研究によって、検証される。
【０２４９】
一部の実施形態では、本開示は、対象の流入領域リンパ節への抗原の継続的な放出のための方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物を含むワクチンを投与することを含む、方法を提供する。抗原の放出を評価するための方法は、当業者に公知である。例えば、一部の実施形態では、抗原−アジュバント複合体がリンパ節で保持され、免疫応答を刺激するために継続的に放出されているかどうかを、免疫化後の様々な時に採取されたｄＬＮ生検の免疫組織化学的染色が決定する。
【０２５０】
免疫系の組織学の標準的な方法は記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ  （ｅｄ．）  （１９８６）  Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；Ｈｉａｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ，  Ｐａ．；Ｌｏｕｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：  Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【０２５１】
一部の実施形態では、本開示は、対象における免疫応答を増加させるための方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物を含むワクチンを投与することを含む、方法を提供する。宿主への導入の際に、ワクチンは免疫応答を引き起こす。「免疫応答」は、自然免疫または適応免疫の活性化または効率を、誘導、増加または永続させる応答を指す。免疫応答は、限定されないが、抗体および／もしくはサイトカインの産生、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞および／もしくは他の細胞応答の活性化を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、感染因子にその後に曝露される対象において耐性を付与する予防的ワクチンもしくは免疫原性組成物の一部として、または治療ワクチンの一部として投与され、これは、感染因子または新生物に感染した対象におけるウイルス抗原などの既存の抗原に対する対象の免疫応答を開始または増強するために使用することができる。
【０２５３】
予防的または治療的な免疫応答の所望の結果は、処置される疾患もしくは状態により、または当技術分野において周知の原理により、変動し得る。例えば、感染因子に対する免疫応答は、感染因子のコロニー形成および複製を完全に防止することができ、「無菌免疫」および任意の疾患の症状の非存在に影響を及ぼす。しかしながら、感染因子に対するワクチンは、症状の数、重症度または期間を低減する場合、症状を有する集団内の個体の数を低減する場合、または感染因子の伝染を低減する場合、有効であると考えることができる。同様に、がん、アレルゲンまたは感染因子に対する免疫応答は、疾患を完全に処置することができ、症状を緩和することができ、または疾患に対する全体的な治療介入における１つの面であり得る。
【０２５４】
対象における抗体応答を分析するための方法は、当業者に公知である。例えば、一部の実施形態では、免疫応答の増加は、抗原特異的抗体価を決定するＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。
【０２５５】
一部の実施形態では、本開示は、対象における広域中和抗体を増加させるための方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物を含むワクチンを投与することを含む、方法を提供する。中和抗体を測定するための方法は、当業者に公知である。一部の実施形態では、中和抗体の誘発は、中和アッセイにおいて測定される。
【０２５６】
中和抗体を特定および測定するための方法は、当業者に公知である。例えば、ＨＩＶワクチンの分野において、中和抗体は、試験された野生分離株の大部分を中和する能力を有する。大多数では、代表的な多様な野生分離株のコレクションにおいて、抗体は、試験された株の少なくとも５０％、好ましくは、試験された株の少なくとも７５％を中和する能力があることを意味する。この文脈において、「中和する」とは、記載の抗体濃度で、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏのウイルス感染性アッセイにおいてＨＩＶ感染力価を低減する効果を意味する。
【０２５７】
中和抗体は、ワクチンの防御有効性の指標であるが、ウイルスの致死下または致命的な負荷からの直接的な防御は、ワクチンの有効性を明確に実証する。例示的な動物モデル系において、細菌またはウイルス負荷が実施され、対象は、必要に応じて１回よりも多く、免疫化され、ワクチンに対する免疫応答が発生した後に負荷される。中和の誘発は、負荷された対象における病的状態または死亡率の測定によって定量化され得る。
【０２５８】
一部の実施形態では、免疫原性組成物の投与は、免疫された対象における改善されたＢ記憶細胞応答を誘導する。改善されたＢ記憶細胞応答は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの分化の刺激によって測定される、抗原の遭遇の際に抗体分泌形質細胞に分化する能力がある末梢血Ｂリンパ球の頻度の増加を意味することを意図する。一部の実施形態では、本開示は、抗体分泌Ｂ細胞の数を増加させるための方法を提供する。一部の実施形態では、抗体分泌Ｂ細胞は、骨髄形質細胞または胚中心Ｂ細胞である。一部の実施形態では、抗体分泌Ｂ細胞の数を測定するための方法としては、限定されるものではないが、抗原特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、および免疫後の様々な時点で採取された形質細胞または胚中心Ｂ細胞のフローサイトメトリー研究が挙げられる。
【０２５９】
蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  Ｎ．Ｊ．；Ｇｉｖａｎ  （２００１）  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．；  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  Ｎ．Ｊ．；Ｓｈａｐｉｒｏ  （２００３）  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  Ｎ．Ｊ．を参照のこと）。例えば、診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチドならびに抗体を含む、核酸を改変するために好適な蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （２００３）  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇ．；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （２００３）  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ．）。
がんおよびがん免疫療法
【０２６０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンは、異常なアポトーシスまたは分化プロセスに関連する障害（例えば、細胞増殖性障害（例えば、過剰増殖障害）またはがんなどの細胞の分化障害）を処置するために有用である。本発明の方法による処置に適したがんの非限定的な例を以下に記載する。
【０２６１】
細胞増殖性障害および／または分化障害の例としては、がん（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血性新生物障害、例えば、白血病）が挙げられる。転移性腫瘍は、限定されないが、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓の腫瘍を含む、多数の原発性腫瘍の種類から生じ得る。したがって、免疫原性組成物またはワクチンを含む本明細書において使用される組成物は、がんを有する患者に投与することができる。
【０２６２】
本明細書で使用される場合、本発明者らは、自律的成長（すなわち、迅速に増殖する細胞の成長によって特徴付けられる異常な状態または状況）のための能力を有する細胞を指すために、「がん」（または「がん性」）、「過剰増殖性」および「新生物」という用語を使用し得る。過剰増殖性および新生物の疾患状態は、病状として分類することができ（すなわち、疾患状態を特徴付けるか、または構成する）、またはこれらは、非病状として分類することができる（すなわち、疾患状態に関連しないが、正常からの逸脱として）。これらの用語は、病理組織学的な種類または侵襲性の段階に関わらず、すべての種類のがん性の成長または腫瘍形成プロセス、転移性組織、または悪性に形質転換された細胞、組織もしくは器官を含むことを意味する。「病理学的過剰増殖性」細胞は、悪性の腫瘍成長によって特徴付けられる疾患状態において生じる。非病理学的過剰増殖性細胞の例としては、創傷の修復に関連する細胞の増殖が挙げられる。
【０２６３】
「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ組織、消化器官、および泌尿生殖器に影響を与えるものを含む様々な器官系の悪性腫瘍、ならびに大多数の結腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸のがんおよび食道のがんなどの悪性腫瘍を含むと一般に考えられる腺癌を指すために使用される。
【０２６４】
「癌腫」という用語は、当技術分野で認識されており、呼吸器系癌、消化器系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌および黒色腫を含む、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。免疫原性組成物は、腎臓癌もしくは黒色腫を含む、任意の種類のがん、または任意のウイルス性疾患を有する患者、これらを有すると疑われる患者、またはこれらの発生についての高い危険性を有し得る患者を処置するために使用することができる。例示的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。この用語は、癌性および肉腫性の組織で構成される悪性腫瘍を含む、癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織に由来する癌腫、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。
【０２６５】
増殖性障害の追加の例としては、造血性新生物障害が挙げられる。本明細書で使用される場合、「造血性新生物障害」という用語は、例えば、骨髄系列、リンパ系列もしくは赤血球系列から生じる、造血起源の過形成性／新生物細胞、またはこれらの前駆細胞を含む疾患を含む。好ましくは、疾患は、低分化の急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じる。追加の例示的な骨髄障害としては、限定されるものではないが、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられ（Ｖａｉｃｋｕｓ，  Ｌ．  （１９９１）  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．  １１：２６７−９７に概説されている）；リンパ系悪性疾患としては、限定されるものではないが、Ｂ系列ＡＬＬおよびＴ系列ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられる。悪性リンパ腫の追加の形態としては、限定されるものではないが、非ホジキンリンパ腫およびそのバリアント、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリードシュテルンベルク病が挙げられる。
【０２６６】
腫瘍成長およびサイズを低減させるために十分な免疫原性組成物もしくはワクチンの量、または治療有効量は、選択される特定の組成物またはワクチンに応じて変動するだけでなく、投与経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態に応じても変動し、最終的には患者の医師または薬剤師の裁量であることが、当業者に理解されると予想される。本方法において使用される化合物を与える時間の長さは、個体ごとに変動する。
【０２６７】
一部の実施形態では、本開示は、腫瘍のサイズを低減もしくは減少させる方法、またはそれを必要とする対象における腫瘍成長を阻害する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象における抗腫瘍応答を誘導するための方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２６８】
一部の実施形態では、本開示は、免疫応答を刺激するための方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、免疫応答は体液性免疫応答である。一部の実施形態では、免疫応答は抗腫瘍免疫応答である。
【０２６９】
本明細書における処置への言及が、予防的ならびに指摘されたがんおよび症状の処置に拡大されることは、当業者に理解されると予想される。
感染性疾患
【０２７０】
一部の実施形態では、本明細書に開示の免疫原性組成物またはワクチンは、急性または慢性の感染性疾患を処置するために有用である。したがって、一部の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、限定されるものではないが、免疫不全（例えば、ＨＩＶ）、パピローマ（例えば、ＨＰＶ）、ヘルペス（例えば、ＨＳＶ）、脳炎、インフルエンザ（例えば、ヒトインフルエンザウイルスＡ型）および風邪（例えば、ヒトライノウイルス）ウイルス感染症を含む、局所性または全身性ウイルス感染症の処置のために投与される。一部の実施形態では、免疫原性組成物を含む医薬製剤は、ヘルペス病変もしくは帯状疱疹などのウイルス性の皮膚疾患、または性器疣贅を処置するために局所投与される。一部の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、限定されないが、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、風邪、または脳炎を含む全身性ウイルス疾患を処置するために投与される。
【０２７１】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象におけるウイルス感染症を低減する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、がんを有する対象における抗ウイルス応答を誘導するための方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２７２】
本明細書における処置への言及が、予防的ならびに指摘された感染症および症状の処置に拡大されることは、当業者に理解されると予想される。
キット
【０２７３】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチン、および使用説明書を含むキットを提供する。キットは、適切な容器中に、免疫原性組成物またはワクチン、１つまたは複数の対照、ならびに様々な緩衝剤、試薬、酵素および当技術分野において周知の他の標準的な有効成分を含み得る。一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。したがって、一部の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチン、およびアジュバントは同じバイアル中にある。一部の実施形態では、免疫原性組成物、および１つまたは複数のアジュバントは、別々のバイアル中にある。
【０２７４】
容器は、免疫原性組成物またはワクチンを中に入れることができ、一部の場合では好適に分割することができる、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含むことができる。追加の成分が提供される場合、キットは、この化合物を中に入れることができる追加の容器を含むことができる。キットは、免疫原性組成物またはワクチン、および任意の他の試薬の容器を商業販売のために密に閉じ込めて収容するための手段を含むこともできる。このような容器は、所望のバイアルを保持する、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。容器および／またはキットは、使用説明書および／または注意書きを有するラベルを含むことができる。
【０２７５】
一部の実施形態では、本開示は、免疫原性組成物、必要に応じて薬学的に許容される担体を含むワクチンを含む容器、および対象におけるがんの進行を処置するため、または遅延させるためのワクチンの投与のための説明書を含む添付文書を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、アジュバント、および対象におけるがんの進行を処置するため、または遅延させるためのアジュバントの投与のための説明書をさらに含む。
【０２７６】
一部の実施形態では、本開示は、免疫原性組成物、必要に応じて薬学的に許容される担体を含むワクチンを含む容器、ならびに対象における感染症の進行を処置するため、または遅延させるための、単独、またはアジュバントおよび必要に応じて薬学的に許容される担体と組み合わせた医薬の投与のための説明書を含む添付文書を含むキットを提供する。
【０２７７】
本開示を、以下の実施例によってさらに説明し、これは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通じて引用されるすべての図ならびにすべての参照文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０２７８】
本開示を、その具体的な実施形態を参照して記載してきたが、本開示の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物に置き換えることができることが当業者に理解されるべきである。加えて、多くの改変は、特定の状況、材料、組成物の内容、プロセス、プロセスの１つまたは複数のステップを、本開示の目的、精神および範囲に適合させるために行ってもよい。すべてのこのような改変は、本開示の範囲内であることが意図される。下記は、本発明を行うための具体的な実施形態の例である。この例は、例示の目的のみのために供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【０２７９】
本発明の実施は、他の指示がない限り、当技術分野のスキル内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を利用する。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）；Ａ．Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）  Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  （ｌ９９２）を参照のこと。
材料および方法
抗体および試薬
【０２８０】
脾臓の組織学切片のために、組織を、Ｂ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３５（クローン８Ｃ１２、ＢＤ）、Ｋｉ６７（クローンＳｏｌＡ１５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）について染色した。Ｂ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＧＬ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３（クローン１７Ａ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＣＤ３８（クローン９０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、胚中心染色のために使用した。ＥＬＩＳＡのために、抗マウスヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用した。養子移植モデルにおけるＶＲＣ０１ｇＨＬ  Ｂ細胞の染色のために、細胞をＣＣＲ７  ＰＥ（４Ｂ１２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８６  ＢＶ６０５（ＧＬ−１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびストレプトアビジンＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。ペプチドカップリング試薬は、特に断りのない限り、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）から購入した。水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ−Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）およびリン酸アルミニウム（ＡｄｊｕＰｈｏｓ）アジュバントは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。
リン酸化セリンペプチド合成
【０２８１】
ペプチドを固相ペプチド合成によって手作業で合成した。低ロードＴｅｎｔａｇｅｌ  Ｒｉｎｋアミド樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、０．２ｍｅｑ／ｇ）をすべてのペプチドの合成のために使用した。ペプチドカップリングを、４当量のＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨと３．９５当量のＨＡＴＵ（ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム）を使用して、２５℃で２時間行った。リン酸化セリン残基、以下「ＰＳ」を、ＤＭＦ中の５％ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）を使用して脱保護したが、すべての他の残基をＤＭＦ中の２０％ピペリジン中で脱保護した。ダブルカップリングを、３回を超える任意のＰＳモノマーの付加のために、行った。６単位のＦｍｏｃ保護オリゴエチレングリコールリンカー（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、反応性リンカーとＰＳ残基との間のスペーサーとしての役割を果たすＰＳモノマーの添加後に添加した。タンパク質と反応するＰＳリンカーのために、マレオイル−β−アラニン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を、ペプチドのＮ末端にカップリングした。ペプチドを、９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％のＨ２Ｏおよび２．５％のトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）中で、２５℃で２．５時間切断した。氷冷したジエチルエーテル中での沈殿後、ペプチドを乾燥させ、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝剤（ｐＨ７）に再懸濁させ、アセトニトリルのグラジエント中の０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝剤を使用して、Ｃ１８カラムのＨＰＬＣによって精製した。ペプチドの質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。
ＰＳリンカーのタンパク質抗原へのカップリング
【０２８２】
抗原を、チオール−マレイミド反応を使用して、ＰＳリンカーで改変した。１ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳの溶液中、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質抗原を、１０当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で１５分間還元し、次いで、ＴＣＥＰを、Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター（１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、遠心濾過によって除去した。次いで、抗原をマレイミド−ＰＳコンジュゲートと反応させた。ｅＯＤおよびチトクロムｃとのカップリングのために、１ｍｇ／ｍＬの抗原を、ＰＢＳ中、２モル当量のマレイミド−ＰＳと４℃で終夜反応させた。ＳＯＳＩＰ三量体との反応のために、２０モル当量のマレイミド−ＰＳリンカーを、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬのＳＯＳＩＰに添加して、利用可能なチオールとの完全な反応を確実にした。次いで、タンパク質を、遠心濾過機（１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、未反応のペプチドリンカーから分離した。反応を、最初に、分光学的ハンドル（マレイミド−ジベンゾシクロオクチンリンカー）を含有する類似リンカーとのパラレル反応を使用して監視し、リン酸化セリンの抗原へのカップリングを、マラカイトグリーンアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して確認した。マラカイトグリーンアッセイは、既知濃度の元のＰＳリンカーを使用して調製された、生成された標準曲線を使用して、定量化した。標識化タンパク質を、ＮＨＳ−ＡＦ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＮＨＳ−ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して、６当量のフルオロフォアと５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝剤中のｅＯＤまたはＳＯＳＩＰ（１ｍｇ／ｍＬ）の２時間の反応によって、調製し、遠心濾過（１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して精製した。フィコエリトリン（ＰＥ）−ＰＳコンジュゲートを、ＮＨＳ−ＤＢＣＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）ヘテロ二官能性架橋剤をホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．０）中のＰＥと、リンカーのタンパク質に対する様々なモル比（２、４、８、１６および３２当量）で、室温で４時間反応させることによって調製した。未反応のリンカーを遠心濾過によって除去し、次いで、ＤＢＣＯ改変ＰＥ（１ｍｇ／ｍＬ）を、４℃で終夜の、ＰＢＳ中での２モル当量のアジド−ＰＳ４またはアジド−Ｓｅｒ３ＰＳ１との２つの反応に分けた。次いで、未反応のＰＳリンカーを遠心濾過によって除去した。
ＨＩＶ  ｅＯＤおよびＳＯＳＩＰ抗原
【０２８３】
ワクチン抗原のＰＳ改変を評価するために、ペプチドタグカップリングのための遊離Ｎ末端システイン残基の部位特異的導入を有するＨＩＶエンベロープｇｐ１２０抗原のｅＯＤ−ＧＴ８を生成した。ｅＯＤ−ＧＴ８（または「ｅＯＤ」）は、ＶＲＣ０１クラス抗体として公知のＣＤ４結合部位特異的な広域中和抗体（ｂｎＡｂ）の重要なセットに対して進化する能力があるヒトＢ細胞の初回プライミングを惹起するように設計された、２１．５ｋＤａの生殖細胞系列の標的化ｇｐ１２０の操作された外側ドメイン抗原である。Ｓｏｋ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３，  １５５７−１５６０；Ｊａｒｄｉｎｅ，  Ｊ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４９，  １５６−１６１；Ｊａｒｄｉｎｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，  ７１１−７１６。ｅＯＤのアミノ酸配列は、配列番号１に表される。
【化１】
2021506851.tif 000002
【０２８４】
ｅＯＤ抗原に加えて、ＳＯＳＩＰと称される安定化されたｇｐ１４０  ＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体を、それぞれのプロトマーのＣ末端でＰＳリンカーにより改変した。システイン改変ＳＯＳＩＰのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
【化２】
2021506851.tif 000003
ワクチン抗原の合成およびＰＳリンカーのコンジュゲーション
【０２８５】
ｅＯＤ  ｇｐ１２０およびＳＯＳＩＰ三量体抗原を、以前に記載されているようにして合成した。Ｊａｒｄｉｎｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，  ７１１−７１６；Ｋｕｌｐ，  Ｄ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ８，  １６５５。簡潔には、Ｎ末端のシステインを有するｅＯＤをＨＥＫ細胞中で発現させ、ニッケルアフィニティーカラム、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。簡潔には、三量体遺伝子を合成し、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔによってｐＨＬｓｅｃにクローニングし、次いで、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド上のヒトフューリンを、三量体のフューリンＤＮＡに対する比が２：１で、２９３フェクチンを使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に共トランスフェクトした。三量体の上清を、トランスフェクションの５日後に遠心分離によって収集し、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するアフィニティークロマトグラフィー、続いてＰＢＳ中、０．５ｍｌ／分の流速でのＳ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。三量体の分子量を、ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ  ＩＩおよびＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ装置（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ＳＥＣマルチアングル光散乱（ＳＥＣＭＡＬＳ）によって確認した。
抗原−ミョウバンの結合および放出
【０２８６】
ミョウバンの結合実験を、蛍光標識化タンパク質またはＥＬＩＳＡのいずれかを使用して行った。１０：１のミョウバン：タンパク質の重量比を、特に断りのない限り、すべての結合実験および免疫化のために使用した。結合アッセイのために、タンパク質抗原を、最初に、Ａｌ−Ｈｙｄｒｏｇｅｌと、ＰＢＳ中、２５℃で３０分間インキュベートして結合させ、次いで、マウス血清を１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で添加した。タンパク質、ミョウバンおよび血清の混合物を、３７℃で２４時間インキュベートし、溶液を、１０Ｋ×ｇで１０分間遠心分離して、ミョウバンをペレット化した。次いで、上清中の未結合タンパク質の濃度を、蛍光またはＥＬＩＳＡによって測定した。蛍光測定は、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏ吸光度／蛍光プレートリーダーを使用して行った。蛍光強度を、ミョウバンを欠くが同じ処理を行った試料の総蛍光に対して正規化した。ＥＬＩＳＡ測定のために、９６ウェルのＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、ＶＲＣ０１抗体でコーティングし、１％のＢＳＡでブロッキングし、抗原の連続希釈を、２μｇ／ｍＬの最大濃度でプレートに添加した。次いで、抗原を、抗ＨｉｓタグＨＲＰ（１：５０００希釈）を使用して検出し、洗浄し、ＴＭＢ基質を用いて展開した。次いで、抗原の量を、吸光度値を既知濃度の対照抗原と比較することによって、定量化した。
ミョウバン−抗原コンジュゲートとのＢ細胞相互作用
【０２８７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を、Ｄａｎｉｅｌ  Ｌｉｎｇｗｏｏｄ教授（Ｒａｇｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＭＧＨ、ＭＩＴおよびＨａｒｖａｒｄ）によって親切に提供された、ｇｌ−ＶＲＣ０１を発現するＲａｍｏｓ  Ｂ細胞を使用して行った。カルシウム流出の測定を、カルシウムの存在中、無血清ＲＰＭＩ中で、３７℃で３０分間、１０ｕＭのＦｌｏｕ−４色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でロードされた細胞を使用して、行った。Ｂ細胞を１回洗浄し、活性化の前に３７℃に加熱した。抗原およびミョウバンを、１０％のＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩに懸濁させた後、Ｂ細胞に添加した。ベースラインの蛍光を、１μｇ／ｍＬのｅＯＤの濃度での抗原の添加の前に、１分間測定した。ミョウバンを、１０μｇ／ｍＬでＢ細胞に添加した。Ｆｌｕｏ−４の蛍光放射を、抗原の添加前のベースライン値に対して正規化した。共焦点およびＴＥＭイメージング実験のために、ｇｌ−ＶＲＣ０１を発現するＲａｍｏｓ  Ｂ細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中、３７℃で１時間、ｅＯＤ／ミョウバン製剤とともにインキュベートした。共焦点イメージングのために、細胞を、次いで、ＰＢＳ中、１％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、洗浄し、ＤＡＰＩおよびファロイジンで染色し、ガラススライド上に置き、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｘ７１倒立顕微鏡を使用して撮像した。ＴＥＭ分析のための試料を、３％のパラホルムアルデヒド、２％のグルタメート、５％のスクロースを有する０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）中で固定し、ペレット化し、ベロナール−アセテート緩衝剤中の１％のＯｓＯ４中で後固定した。細胞を、ベロナール−アセテート緩衝剤（ｐＨ６．０）中の０．５％の酢酸ウラニルで終夜、一括染色し、次いで、脱水し、Ｅｍｂｅｄ−８１２樹脂に包埋した。切片を、５０ｎｍの厚さ設定で、Ｄｉａｔｏｍｅダイヤモンドナイフを用いて、Ｌｅｉｃａ  ＥＭ  ＵＣ７ウルトラミクロトームにおいて切断し、２％の酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。切片を、８０ＫＶで、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  ｓｐｉｒｉｔを使用して調べ、ＡＭＴ  ｃｃｄカメラで撮影した。
【０２８８】
養子移植実験のために、Ｂ細胞を、製造者のプロトコールに従って、ホモ接合性ＶＲＣ０１ｇＨＬ  ＢＣＲノックインマウスの脾臓から、抗マウスＣＤ４３（Ｌｙ−４８）ＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、精製した。一部の実験では、精製Ｂ細胞は、その後、０．１％のＢＳＡ−ＤＰＢＳ中の５μＭのＣｅｌｌ−ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で、３７℃で９．５分間標識した。１０６のｅＯＤ特異的Ｂ細胞を、免疫化の１〜３日前に、レシピエントマウスに後眼窩に注射した。
動物および免疫化
【０２８９】
マウスの実験および取り扱いは、ＩＡＣＵＣに承認されたプロトコールに従い、連邦、州および地域のガイドラインに従って、実施した。６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。イメージング実験のために、ＡＦ６４７で標識された１０μｇのｅＯＤを、剪毛した尾部に、１００μＬのＰＢＳ中の１００μｇのミョウバンを皮下注射した。ｅＯＤおよびＳＯＳＩＰによる免疫原性実験は、特に断りのない限り、１００μＬのＰＢＳ中の５０μｇのミョウバンと混合させた５μｇの抗原の免疫製剤を使用した。一部の製剤では、サポニン含有ナノ粒子を、１０μｇ／ｍＬのコレステロールの濃度で注射した。特に断りのない限り、免疫応答を、単回一次免疫化後に測定する。血清を、ＥＬＩＳＡ測定のために、隔週で、後眼窩の放血によって採取した。
全マウスイメージングおよびリンパ節輸送
【０２９０】
ＡＦ６４７で標識された抗原のシグナルを、注射部位で、経時的に、ＩＶＩＳ蛍光イメージングシステムを使用して測定した。総放射輝度を、０日目の注射３０分後に測定された最初のＩＶＩＳシグナルに対して正規化した。リンパ節における抗原の蓄積をＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ蛍光撮像装置を使用して測定した。これらの実験のために、ミョウバン（５０μｇ）を、０．５ｎｍｏｌのＰＳ４−６８０および５μｇのＩＲ８００色素で標識されたｅＯＤの混合物の添加によって標識した。ミョウバン／ｅＯＤ試料を、２５℃で３０分間混合し、次いで、ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に皮下注射した。鼠径リンパ節を、様々な時点で切除し、全組織蛍光を、７００ｎｍおよび８００ｎｍの波長で、ＬＩＣＯＲイメージングシステムによって測定した。値を積分した蛍光強度で表す。組織学実験のために、マウスを、１０μｇのＡＦ６４７標識化抗原および１００μｇのミョウバンによる皮下または腹腔内注射によって免疫化した。
抗体価のＥＬＩＳＡ分析
【０２９１】
抗ｅＯＤ力価を測定するＥＬＩＳＡのために、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、未改変の単量体ｅＯＤ（１μｇ／ｍＬ）で直接コーティングし、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングした。ＳＯＳＩＰのＥＬＩＳＡのために、プレートをＳＴ−ＩＩ抗体（２μｇ／ｍＬ）でコーティングし、次いで、ＳＴ−ＩＩタグを含有するＳＯＳＩＰを、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡによるブロッキングの後にプレートに添加した。ＳＯＳＩＰ  ｇｐ１２０に対する応答を、ウサギ抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、続いてブロッキングし、次いで、Ｈｉｓタグ化ＳＯＳＩＰ  ｇｐ１２０抗原（２μｇ／ｍＬ）を添加することによって、測定した。血清の連続希釈物をブロッキングしたプレートに２５℃で２時間添加し、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ中で洗浄し、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＢｉｏＲａｄ）とともにインキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを、ＴＭＢ基質を用いて展開し、４５０ｎｍでの吸光度値を測定した。ベースのブロッキングＥＬＩＳＡを、ヒトＶＲＣ０１（２μｇ／ｍＬ）でコーティングしたプレートを使用し、続いてＰＢＳ中の１％のＢＳＡによるブロッキングステップ、次いでＳＯＳＩＰ（２μｇ／ｍＬ）を２５℃で２時間添加することによって、行った。三量体のベースを目立たなくするために、２０μｇ／ｍＬのベース結合抗体を、血清希釈物の添加の前に３０分間添加した。血清希釈物を、ベース結合抗体が残ったままのウェルに直接添加し、吸光度値を、ベース結合抗体の代わりにＰＢＳ中の１％のＢＳＡとともにインキュベートされたウェルと比較した。Ｈｉｓタグ特異的抗体を、ストレプトアビジン（２μｇ／ｍＬ）中でコーティングされたプレートを使用し、続いてビオチン−Ｈ６ペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を添加して、測定した。力価を、０．１ＯＤの吸光度カットオフ、およびそれぞれＳＯＳＩＰおよびｅＯＤの免疫化について０．３ＯＤで、決定した。
サポニンアジュバント合成
【０２９２】
自己集合するコレステロール、リン脂質およびＱｕｉｌｌａｊａ（Ｑｕｉｌ−Ａ）サポニンで構成されるＩＳＣＯＭ様ナノ粒子を、以前に記載されたようにして４５、いくつかの免疫化のために調製した。すべての合成を、滅菌試薬を用いて、滅菌状態下で行った。簡潔には、１０ｍｇのそれぞれのコレステロール（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  ７０００００）およびＤＰＰＣ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  ８５０３５５）を、別々に、２０％のＭＥＧＡ−１０（Ｓｉｇｍａ  Ｄ６２７７）洗浄剤に、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解し、５０ｍｇのＱｕｉｌ−Ａサポニン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ｖａｃ−ｑｕｉｌ）を、ＭＱ  Ｈ２Ｏに、１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解した。次に、ＤＰＰＣ溶液をコレステロールに添加し、続いて、Ｑｕｉｌ−Ａサポニンを素早く連続して添加し、容積を、ＰＢＳを用いて、１ｍｇ／ｍｌのコレステロールおよび２％のＭＥＧＡ−１０の最終濃度にした。溶液を、２５℃で終夜平衡化し、続いて、１０ｋのＭＷＣＯ膜を使用して、ＰＢＳに対する５日の透析を行った。次いで、アジュバント溶液を、０．２μｍのＳｕｐｏｒシリンジフィルターを使用して滅菌濾過し、５０ｋのＭＷＣＯ  ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを使用して濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲサイズ排除カラムを使用するＦＰＬＣによってさらに精製した。それぞれのアジュバントのバッチを、最終的に、陰性染色のＴＥＭおよびＤＬＳによって特徴付けて、均一な形態およびサイズを確認し、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓｔａｅアッセイ（Ｌｏｎｚａ  ＱＣＬ−１０００）によって低エンドトキシンについて検証した。最終アジュバント濃度を、コレステロール定量化（Ｓｉｇｍａ  ＭＡＫ０４３）によって決定した。
ＥＬＩＳＰＯＴおよび胚中心分析
【０２９３】
骨髄ＥＬＩＳＰＯＴを、特に断りのない限り、製造者の使用説明書（ＭａｂＴｅｃｈ）に従って、免疫化から３か月後に行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、抗マウスＩｇＧ抗体でコーティングし、分離した骨髄細胞を、完全ＲＰＭＩ中、３７℃で４時間、プレートに添加した（それぞれ、抗原特異的応答または総ＩｇＧ応答のために、ウェルあたり５００ｋまたは１００ｋ細胞）。プレートの洗浄後、抗原特異的応答を、２５℃で２時間のビオチン化抗原（１μｇ／ｍＬ）、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰの添加によって測定した。それぞれのマウスから分離された骨髄細胞を三反復で測定した。胚中心応答の測定のために、マウスを免疫化から９日後に屠殺にし、リンパ節を機械的に消化し、７０ｕｍのフィルターを通過させた。次いで、細胞を、ＣＤ３ｅ、Ｂ２２０、ＣＤ３８およびＧＬ−７、ならびにＡＦ６４７標識化ｅＯＤの６０量体ナノ粒子に対する抗体で染色した（Ｊａｒｄｉｎｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，  ７１１−７１６）。ｅＯＤ特異的Ｂ細胞を特定するために、フローサイトメトリー分析を、ＢＤ  Ｃａｎｔｏを使用して行った。
注射部位、リンパ節および脾臓の免疫組織化学的検査
【０２９４】
マウスを、１０μｇのＡＦ６４７標識化抗原および１００μｇのミョウバンによる皮下または腹腔内注射によって免疫化した。組織学切片を、４％のパラホルムアルデヒドによって終夜固定された、注射部位からの皮膚、脾臓またはリンパ節組織を使用して、洗浄し、３ｗｔ％の低融点アガロースに３７℃で包埋し、次いで放冷し、１５分間氷上で固化して、調製した。１００〜２００ｕｍの切片を、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１０００Ｓ）を使用して、氷冷したＰＢＳに懸濁させ、次いで、１０％のヤギ血清、０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００および０．０５％のアジ化ナトリウムを含有するブロッキング溶液に３７℃で終夜、移した後、免疫染色して、調製した。注射部位の切片のために、薄片を、エタノール中の０．５％の酢酸中のモリン（１ｕＭ）の溶液中で染色した。リンパ節および脾臓の切片のために、組織を、Ｂ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３５（クローン８Ｃ１２、ＢＤ）、Ｋｉ６７（クローンＳｏｌＡ１５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＰＳ４−Ｃｙ３（１：２００希釈、１ｕＭ）について染色した。抗体を、１：１００の希釈で、ブロッキング緩衝剤中、３７℃で終夜使用し、続いて、０．０５％のＴｗｅｅｎのＰＢＳで洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ褐色防止封入剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにガラススライド上に置いた。次いで、イメージを、１０倍または２５倍の水対物レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＳＰ８レーザースキャニング共焦点顕微鏡を使用して取得した。次いで、イメージをＦｉｊｉソフトウェアで処理した。
リンパ節中のアルミニウムのＩＣＰ−ＭＳ
【０２９５】
誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）測定を、ｅＯＤまたはＰＳ４−ｅＯＤと混合した２００μｇのミョウバンの免疫を使用して行った。鼠径リンパ節を、指示された時点で切除し、硝酸に溶解し、Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ  ＵｌｔｒａＷａｖｅマイクロ波消化システム中で、２００℃で２０分間消化し、２％硝酸水に希釈し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ７９００  ＩＣＰ−ＭＳによって分析した。１μｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍＬのアルミニウムの標準曲線を使用して、すべての試料についてロジウムの内部標準と併せて、試料を定量化した。
ミョウバンに結合した三量体の抗原性
【０２９６】
ミョウバンに結合したＳＯＳＩＰ三量体の抗原性を、改変サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコールを使用して測定した。ＰＳ４リンカーで改変された無関係のタンパク質（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来チトクロムｃ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最初に、ＥＬＩＳＡプレートに終夜コーティングした。次いで、１００μｇ／ｍＬでミョウバンをプレートに添加して、チトクロムｃ上に存在する露出したＰＳ残基に結合させた。対照ウェルを、２μｇ／ｍＬのマウスＶＲＣ０１でコーティングした。プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄し、次いで、ＳＯＳＩＰ−ＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を含有する１％のＢＳＡの溶液とともに２５℃で２時間インキュベートした。広域中和抗体またはベース特異的抗体を１００ｎｇ／ｍＬで添加し、二次Ａｂ−ＨＲＰコンジュゲートを用いて検出し、続いて、ＴＭＢ基質中で展開した。
（実施例１）
多価抗原−アジュバントカップリング試薬を介したタンパク質抗原のミョウバンへの吸着
【０２９７】
ミョウバン粒子の表面でのリン酸基とヒドロキシルとの間のリガンド交換によってミョウバンへの結合を媒介する短ペプチド／ポリマーリンカーを設計した。１〜１２個の連続したリン酸化セリン（ＰＳ）、続いて短いポリ（エチレングリコール）スペーサーおよびＮ末端マレイミド官能基で構成されたペプチドを、固相合成によって調製した。
【０２９８】
図１Ａは、リン酸化セリンリンカーを含むマレイミド−リン酸化セリンカップリング試薬の化学構造、および溶媒に曝露された遊離スルフヒドリル基（−ＳＨ）を含むタンパク質抗原の概略図を示す。図１Ｂは、マレイミド部分が、チオエーテル連結を介してタンパク質抗原を構成するチオール基と共有結合で連結された、マレイミド−リン酸化セリンカップリング試薬の化学構造を示す。最後のカップリング試薬−抗原コンジュゲートを、緩衝食塩水中でミョウバンと混合し、それによって、抗原を、リン酸化セリンを含むリン酸基と、ミョウバンの表面上に存在する表面ヒドロキシル基との間のリガンド交換を介して、ミョウバンにカップリングまたは吸着させた。図１Ｃは、ミョウバンとカップリングまたは吸着させるときの、カップリング試薬−抗原コンジュゲートの結合および配向を一般に示す。
【０２９９】
一価ｖｓ多価のカップリング試薬とコンジュゲートしたタンパク質抗原のミョウバンへの吸着を評価するために、モデルタンパク質（酵母のチトクロムｃ）のミョウバンへの吸着を決定した。図１Ｄは、タンパク質濃度の関数として、ミョウバン上のチトクロムｃの吸着を示す。チトクロムｃタンパク質を、カップリング試薬上のマレイミドをタンパク質上の溶媒に曝露したシステインと反応させることによって、リン酸化セリン残基の数（ｎ）を変動させたカップリング試薬で官能化した。チトクロムｃの官能化の程度は、すべてのカップリング試薬について同等であった（データは示さない）。ミョウバンに結合したタンパク質の量を、遠心分離によってミョウバンおよび結合したタンパク質を除去し、上清中の未結合のタンパク質を測定することによって、決定した。次いで、結合したタンパク質の量を、未結合のタンパク質の量から減算したタンパク質の総量であると仮定した。図１Ｄに示されるように、ミョウバンアジュバントへのチトクロムの結合は、リン酸化セリン残基の数の増加とともに増加する。これらのデータは、２つまたは４つのリン酸化セリンを含む多価カップリング試薬にコンジュゲートしたタンパク質が、１つのリン酸化セリンを含む一価カップリング試薬よりもより高い程度でミョウバンに結合することを実証する。
【０３００】
ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＰＳアンカータンパク質は、間質液中に存在する血清タンパク質または有機リン酸イオンによって、ミョウバン表面から変位された。安定な結合の達成におけるＰＳの価数の役割を評価するために、２４０ＫＤａの蛍光タンパク質フィコエリトリン（ＰＥ）を、２〜２０個のリンカーで改変し、そのそれぞれは、図２Ａの１つまたは４つのＰＳ残基のいずれかを含有していた。色素−ＰＳ４コンジュゲートを使用するイメージング実験を、アジド−ＰＳ４とＤＢＣＯフルオロフォアとの間のＣｕフリーのクリック反応、続いてＨＰＬＣ精製によって調製した。アジド−ＰＳ４およびアジド−Ｓｅｒ３−ＰＳ１ペプチドを、ペプチドのリン酸化セリン部分について上に記載と同じ方法を使用して調製した。オリゴエチレングリコールリンカーは、これらのリンカーについて含まれていなかった。ペプチドのＮ末端で、Ｆｍｏｃ−５−アジドペンタン酸（Ａｎａｓｐｅｃ）を、マレオイル−β−アラニンの場所で使用し、ペプチドを、２０％のピぺリジン中で脱保護した後、ＴＦＡ中で切断した。ＰＳ１またはＰＳ４で改変されたＰＥを３０分間ミョウバンと混合して、結合させ、続いて、１０％の血清を含有する緩衝剤中で２４時間インキュベートし、この２つのステップのプロセスの後にミョウバンに結合したタンパク質を、蛍光分光法によって測定した。図２Ｂに示されるように、未改変ＰＥは、ミョウバン上でほとんど保持されなかったが、ＰＳリンカーは、大部分のタンパク質がミョウバンと結合するように促進し、タンパク質あたり２〜４個のＰＳ４リンカーのみが、単一のＰＳ残基を有する１０〜２０個のリンカーと同じレベルの結合を達成するために必要であったことを示した。このように、非常に大きなタンパク質でさえ、いくつかの多価ＰＳリンカーによる改変は、血清の存在中でミョウバンへの安定な結合を促進する。
【０３０１】
次の実験では、ｅＯＤ抗原を、１〜８個のリン酸化セリンを含有する単一ペプチドリンカー、またはセリン残基を含有する対照リンカーとカップリングさせ、ミョウバンへの結合を評価した。緩衝剤中で、添加されたｅＯＤの９０％は、ペプチドリンカーの組成に関わらず、３０分以内にミョウバンに吸着された（データは示さない）。しかしながら、ｅＯＤが吸着されたミョウバンを１０％の血清中で２４時間インキュベートすると、未改変または対照のセリン改変ｅＯＤの約２％のみが結合したままであったが、ＰＳ改変抗原は、ＰＳの価数の増加とともにミョウバン上の保持が増加し、親和性リンカー中で４つまたはそれよりも多くのリン酸化セリンに対する約７５％の保持で頭打ちになったことを示した（図３）。このように、ミョウバンへの免疫原の結合は、多価ＰＳリンカーの導入によって、容易に調整することができた。
【０３０２】
別のＨＩＶ抗原のＳＯＳＩＰを、図４において説明されるように、３つのＰＳリンカーがそれぞれの三量体のベースでコンジュゲートするそれぞれのプロモーターのＣ末端で、遊離システインを用いて改変した。操作されたＨＩＶ抗原のｅＯＤおよびＳＯＳＩＰへのカップリング試薬の共有結合を行った。図５は、２４時間後に１０％の血清の存在中でミョウバンから放出されたＳＯＳＩＰ抗原の割合を示す。タンパク質濃度を、既知濃度のタンパク質標準に対して、ＥＬＩＳＡによって測定した。これらのデータは、血清への曝露後に、多価カップリング試薬を介してミョウバンにカップリングしたタンパク質抗原が、タンパク質抗原単独または一価カップリング試薬を介してミョウバンにカップリングしたタンパク質抗原よりも高い程度でミョウバン上に保持されることを実証する。
（実施例２）
抗原特異的Ｂ細胞は、ミョウバン／ＰＳ抗原ナノ粒子を飲み込み、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性の増強を示す。
【０３０３】
ミョウバンは、一体化した固体ではないが、水酸化アルミニウムナノ結晶の繊維状の凝集体で作られている。Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｍｉｃｒｏｎ  ４３，  １９２−２００。免疫原とミョウバン粒子との間の緊密な結合の状況において、経時的なリンパ節への抗原の送達は、注射部位でのミョウバン表面からの遊離抗原のゆっくりとした放出によって、または水酸化アルミニウムのナノ結晶もしくはナノ結晶凝集体に依然として結合している抗原が、図６Ａに示されるように、リンパ節に輸送され得るかのいずれかによって媒介される。後者のシナリオが優位であった場合、これは、（１）Ｂ細胞が、多価粒子状抗原によって強く誘発される、（２）ミョウバン粒子が、抗原特異的Ｂ細胞に対する直接のアジュバント活性を発揮する可能性がある、および（３）粒子表面からの抗原の提示は、体液性応答のエピトープ特異性に影響を与え得るので、免疫応答について複数の意味を有することになる。
【０３０４】
ミョウバン／ＰＳ−ｅＯＤコンジュゲートｖｓミョウバン／ｅＯＤによる抗原特異的Ｂ細胞の刺激のｉｎ  ｖｉｔｒｏの影響を最初に評価した。ヒトにおけるｅＯＤ免疫原の所望の標的であるＢ細胞の代表である、生殖細胞系列と推測されるＶＲＣ０１  ＩｇＭ（ｇｌＶＲＣ０１）を発現するヒトＲａｍｏｓ  Ｂ細胞を、ｅＯＤ単独、ミョウバンと混合されたｅＯＤ、またはミョウバンと混合されたＰＳ−ｅＯＤによって、細胞培養中に刺激した。Ｂ細胞中のカルシウムシグナル伝達を、蛍光レポーター色素のＦｌｕｏ−４によって追跡した。ｅＯＤがｇｌＶＲＣ０１受容体による強いシグナル伝達のために多量体化されなければならないという以前の報告２２と一致して、遊離の単量体ｅＯＤは、図６Ｂに示されるように、ミョウバンと混合されたｅＯＤのように、ベースラインに近い応答を誘発した。対照的に、ミョウバン／ＰＳ−ｅＯＤによって刺激されたＢ細胞は、リン酸化セリンの価数の増加とともに、カルシウムシグナル伝達が着実に増加することを示した（図６Ｂ）。共焦点顕微鏡によって、ミョウバンおよびｅＯＤとともに１時間インキュベートされたＢ細胞は、ミョウバン粒子と結合していることが観察されたが、わずかなｅＯＤの取り込み、またはｅＯＤの取り込みがないことを示した（図６Ｃ）。しかしながら、Ｂ細胞をミョウバン／ＰＳ８−ｅＯＤとともにインキュベートすると、ミョウバン粒子は、コロニー化したｅＯＤに引き付けられた（図６Ｄ）。ＴＥＭイメージングによるこれらの細胞のより高い解像度の可視化は、図６Ｅに示されるように、ナノスケールのミョウバン凝集体が、ＰＳ−ｅＯＤがミョウバンに結合するときに、Ｂ細胞によって内部移行したことを明らかにした。これらの結果は、ＰＳ連結を介してミョウバンに結合するときに、ｅＯＤが、Ｂ細胞によって内部移行する多価粒子状ワクチンとして挙動し得ることを示唆する。
（実施例３）
多価抗原−アジュバントカップリング試薬を介してミョウバンにカップリングした抗原は、投与部位で保持され、抗抗原ＩｇＧ力価を増強する。
【０３０５】
ミョウバンへのＰＳ媒介性結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原のクリアランスを示す。ミョウバンは、注射部位で数週間にわたって保持されるが（Ｆｌａｒｅｎｄ，  Ｒ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５，  １３１４−１３１８）、ミョウバンとともに投与された抗原のクリアランスは、多くの場合、より速い。Ｇｕｐｔａ，  Ｒ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １４，  １４１２−１４１６；Ｎｏｅ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８，  ３５８８−３５９４。
【０３０６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのカップリング試薬の効果を試験するために、マウスに、４つのリン酸化セリンを含む多価カップリング試薬（以下「ＰＳ４」）の存在中および非存在中で、ミョウバンとともにインキュベートされたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化ｅＯＤ抗原を投与した。対照として、ｅＯＤ抗原およびＰＳ４を、ＰＳ４に結合しない代替のアルミニウム系アジュバントであるＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓとともにインキュベートした。蛍光抗原−アジュバント製剤を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾根部に皮下注射し、ｉｎ  ｖｉｖｏのイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用して監視した。図７Ａは、それぞれ、０日目（注射の日）および３日後に、（１）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７とコンジュゲートしたｅＯＤを伴うＡｌ−Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（ミョウバン；Ａｌ−ＯＨ３）、（２）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７とコンジュゲートしたｅＯＤ−ＰＳ４を伴うＡｌ−Ｈｙｄｒｏｇｅｌ、（３）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７とコンジュゲートしたｅＯＤ−ＰＳ４を伴うＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ａｌ−Ｐ）が注射されたマウス、および（４）注射なしのマウスの疑似着色ＩＶＩＳ画像を示す。マウスからの蛍光シグナルは、注射後２４日間続き、時間の関数として、ＩＶＩＳによって決定された正規化された蛍光シグナルを図７Ｂに示す。
【０３０７】
未改変のｅＯＤは３日以内に注射部位から排出されるが、ＰＳ４−ｅＯＤは３週間にわたって持続し、抗原シグナルは、約９日の半減期で減衰した（図７Ｂ）。追加の対照として、ＰＳリンカーとのリガンド交換結合を受けることが不可能なミョウバンの代替の臨床製剤であるリン酸アルミニウム（ａｌｕｍＰ）と混合されたＰＳ４−ｅＯＤを注射した。ＰＳ４−ｅＯＤは、この図７Ａ、７Ｂの場合において、ｅＯＤと同じ速度で排出された。ＰＳリンカーの価数を変動させると、最大抗原持続性は、図８Ａに示されるように、４つまたはそれよりも多くのＰＳ残基で観察された。標識ミョウバンに対してモリン色素を使用して染色された、注射８日後の注射部位でのミョウバンの小結節の組織学は（Ｄｅ  Ｂｏｎｉ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７４）  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０，  ３１−３７）、図８Ｂに示されるようにＰＳ８−ｅＯＤはミョウバンとコロニー化したが、未改変のｅＯＤは検出不可能であった（図８Ｃ）ことを示した。
【０３０８】
これらの結果は、ＰＳ−抗原が、ミョウバンに吸着された未改変抗原よりもはるかにゆっくりと、ｉｎ  ｖｉｖｏで排出されることを実証する。ミョウバンとカップリングしたｅＯＤ−ＰＳ４抗原は、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ａｌ−Ｐ）と組み合わせて投与されたｅＯＤ−ＰＳ４抗原、またはミョウバン（Ａｌ−ＯＨ３）と組み合わせて投与されたｅＯＤ抗原よりも高い程度で、投与部位で保持される。これらの結果は、保持の延長によるｅＯＤ−ＰＳ４抗原への流入領域リンパ節の曝露の延長が、ｅＯＤ抗原に対する免疫応答を増強するであろうことを示す。
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｖｏでのミョウバンおよびＰＳ−抗原の一緒の輸送、および流入領域ＬＮにおける蓄積
【０３０９】
次の実験では、投与後の抗原−アジュバント複合体のｉｎ  ｖｉｖｏの伸展を次に評価した。図９Ａに示される赤外色素（ＩＲ６８０）−ＰＳ４コンジュゲートを合成して、抗原およびミョウバンを同時に追跡した。ＩＲ６８０−ＰＳ４は、非常に緊密にミョウバンに結合し、図９Ｂに示されるように、血清中での７２時間のインキュベーション後に、ミョウバンから最小の検出可能な色素を放出した。ミョウバンを、当量のＰＳ８−ｅＯＤ（ＩＲ８００色素で標識化）およびＩＲ６８０−ＰＳ４、または対照として色素標識化Ｓｅｒ４−ｅＯＤおよびＩＲ６８０−ＰＳ４と混合した。流入領域リンパ節（ｄＬＮ）におけるそれぞれのトレーサーの総蓄積を、連続的な時点で動物から切除した全リンパ節のＩＲイメージングによって測定した。ＬＮ中のＳｅｒ４−ｅＯＤレベルは、２４でピークに達し、その後迅速に減衰するが、ミョウバントレーサーはゆっくりと蓄積した（図１０Ａ）。対照的に、ＰＳ８−ｅＯＤおよびミョウバンは、図１０Ｂに示されるように、ｄＬＮにおけるゆっくりとした蓄積のパターンのマッチングを示した。ミョウバン粒子が実際にｄＬＮに輸送されたことを確認するために、ｄＬＮ中のアルミニウムレベルを、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって直接定量化した。図１０Ｃに示されるように、アルミニウムは、ミョウバン／ＰＳ８−ｅＯＤ、およびミョウバン／Ｓｅｒ４−ｅＯＤの免疫化の両方について、ｄＬＮ中においてすぐに検出された。
（実施例５）
抗原特異的Ｂ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでミョウバン粒子に結合したＰＳ抗原を獲得する。
【０３１０】
次の実験では、ｅＯＤ特異的Ｂ細胞の追跡が可能なｉｎ  ｖｉｖｏの養子移植モデルを利用して、ＰＳ抗原で官能化されたミョウバン粒子が、どのようにして多価の形態でＢ細胞に抗原を送達するかを検出した。Ａｂｂｏｔｔ，  Ｒ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１８）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４８，  １３３−１４６。ｇｌＶＲＣ０１  ＢＣＲ（ＶＲＣ０１ｇＨＬ）を発現するマウスＢ細胞を、野生型マウスに養子移植して、規定の抗原特異的Ｂ細胞の前駆体の頻度を確立し（同上）、続いてｅＯＤ／ミョウバンの組み合わせで腹腔内にワクチン接種した（図１１Ａ）。ＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞はＧＦＰを発現し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識した。マウスに標識化Ｓｅｒ−ｅＯＤまたはＰＳ−ｅＯＤおよびミョウバンを注射すると、図１１Ｂ、１１Ｃに示されるように、両群のＶＲＣ０１ｇＨＬ  Ｂ細胞は、免疫化から１日後に抗原を獲得したが、ｅＯＤの取り込みは、ＰＳ−ｅＯＤ／ミョウバン群において、２日目で上昇が継続した。ｅＯＤおよびミョウバンの両方が蛍光標識された場合（ＡＦ４８８−ＰＳ４で標識されたミョウバン）、ＶＲＣ０１ｇＨＬＢ細胞は、２日目にリン酸化セリンが連結された抗原およびミョウバンの同時取り込みを示し、Ｓｅｒ−ｅＯＤ／ミョウバンで免疫化されたマウスにおいて抗原特異的細胞によって取り込まれたｅＯＤまたはミョウバンのいずれかの低レベルとは対照的である（図１１Ｄ〜１１Ｆ）。
【０３１１】
色素標識化ミョウバンおよびｅＯＤによる腹腔内免疫化から２日後に切片化した脾臓の組織学は、Ｂ細胞の小胞の周囲でミョウバンおよびＰＳ８−ｅＯＤのコロニー化を示したが、対照群では、ミョウバンのみ、およびわずかなＳｅｒ４−ｅＯＤが観察され、またはＳｅｒ４−ｅＯＤは観察されなかった（図１２Ａ、１２Ｂ）。ミョウバン／Ｓｅｒ−ｅＯＤで免疫化された動物中の抗原特異的Ｂ細胞は、活性化マーカーのＣＤ８６の上方調節を示さず、細胞分裂の徴候も示さなかったが、ＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞の頑強な活性化および分裂は、図１２Ｃおよび１２Ｄに示されるように、ミョウバン／ＰＳ８−ｅＯＤ免疫化群において観察された。ｅＯＤは、ＶＲＣ０１ｇＨＬ細胞に高い親和性で結合するように操作されているので（Ｊａｒｄｉｎｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，  ７１１−７１６）、この実験を、ＶＲＣ０１ｇＨＬＢＣＲに対する生理学的な（ＫＤ約０．５μＭ）親和性を有するｅＯＤ免疫原の代替の形態である、ＰＳまたはＳｅｒ改変ｅＯＤ−ＧＴ５によって養子移植されたマウスを免疫化することによって、繰り返した。結果は、質的に同様であった（データは示さない）。
【０３１２】
抗原特異的Ｂ細胞が、ミョウバン粒子に結合した抗原を取り込んでいるかを決定するために、動物を、蛍光ＰＳ−ｅＯＤと混合されたミョウバンで免疫化した。免疫化から２日後に、脾臓を収集した。脾臓の細胞懸濁液を得て、ｅＯＤ＋抗原特異的Ｂ細胞または対照の内因性Ｂ細胞について選別し、次いで、固定し、ＴＥＭイメージングのために切片化した。図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を獲得したＶＲＣ０１ｇＨＬＢ細胞は、エンドソームの区画におけるミョウバン粒子凝集体の迅速な検出可能な蓄積を有していたが（カウントされた１２０細胞切片の５３％）、内因性Ｂ細胞は、ミョウバンの取り込みを示さなかった（カウントされた４３細胞切片の０％）。これらの結果は、ミョウバンへの緊密な結合を操作することによって、ＰＳ改変抗原が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ細胞にミョウバン結合形態で送達されることを実証する。
（実施例６）
多価抗原−アジュバントカップリング試薬を介してミョウバンにカップリングした抗原、および追加のアジュバントとの共投与は、投与部位で保持され、抗抗原ＩｇＧ力価を増強する。
【０３１３】
多価カップリング試薬を含む抗原−アジュバント複合体の保持と抗体応答との間の関係をさらに特徴付けるために、マウスに、５０μｇのミョウバンと組み合わせた２μｇのＳＯＳＩＰ、または５０μｇのミョウバンとカップリングした２μｇのＳＯＳＩＰ−ＰＳ４を、０日目および２１日目に投与した。図４は、リン酸化セリンを含む多価カップリング試薬とコンジュゲートしたＳＯＳＩＰ三量体の概略図を示す。図１４Ａに示されるように、抗ＳＯＳＩＰ抗体価の顕著な増加が、プライムから６３日後に観察された。さらに、図１４Ｂに示されるように、抗ＳＯＳＩＰ抗体価におけるこの増加は、長期間にわたって持続した。総合すると、これらのデータは、多価カップリング試薬を介してミョウバンにカップリングした抗原の保持が、ミョウバンと組み合わせて投与されたカップリングしていない抗原と比べて、体液性免疫応答の顕著な増強を誘導することを実証する。
【０３１４】
投与部位の保持、およびミョウバンとカップリングした抗原による抗抗原ＩｇＧ力価の増強が、追加のアジュバントの共投与によってさらに増強され得るかを決定するために、マウスを、５０μｇのａｌ−ｈｙｄｒｏｇｅｌ（ミョウバン）、５μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（追加のアジュバント）、および５μｇの蛍光標識化ＳＯＳＩＰまたは蛍光標識化ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４のいずれかで、尾根部の皮下組織に免疫化した。ＳＯＳＩＰをフルオロフォアＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識した。図１５Ａは、０日目（注射の日）ならびに１日後、６日後および１０日後に、示すように、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）、Ａｌ−Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（ミョウバン；Ａｌ−ＯＨ３）、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７とコンジュゲートしたＳＯＳＩＰの組み合わせ（ＳＯＳＩＰ）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）、Ａｌ−Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（ミョウバン；Ａｌ−ＯＨ３）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７とコンジュゲートしたＳＯＳＩＰ−ＰＳ４の組み合わせ（ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４）が、注射されたか、または注射されていない（ナイーブ）、マウスの疑似着色ＩＶＩＳ画像を示す。マウスからの蛍光シグナルは、注射後２０日間続き、時間の関数として、ＩＶＩＳによって決定された正規化された蛍光シグナルを図１５Ｂに示す。これらのデータは、ミョウバンとカップリングしたＳＯＳＩＰ−ＰＳ４抗原およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）との共投与が、ミョウバンおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）との組み合わせで投与されたＳＯＳＩＰ抗原よりも高い程度で、投与部位で保持されることを実証する。図１４Ａ〜１４Ｂに示す結果と一致して、これらの結果は、持続の増加によるＳＯＳＩＰ−ＰＳ４抗原への曝露の延長が、ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４抗原に対する免疫応答を増強するであろうことを示す。マウスの注射部位での蛍光の定量化は、リン酸化セリンリンカーを含有するＳＯＳＩＰの保持の延長を示す。
【０３１５】
多価カップリング試薬を含む抗原−アジュバント複合体の保持と抗体応答との間の関係をさらに特徴付けるために、マウスに、５０μｇのミョウバンと組み合わせた５μｇのＳＯＳＩＰ、または５０μｇのミョウバンとカップリングした５μｇのＳＯＳＩＰ−ＰＳ４を投与した。図１５Ｃに示すように、「＋ｉｓｃｏ」と標識されたマウスは、免疫応答を改善する追加のアジュバントの５μｇのｉｓｃｏｍａｔｒｉｘも受けた。図１４Ａおよび１４Ｂに記載の抗原の投与と対照的に、マウスは単回の免疫化を受けた。追加のアジュバントからの免疫応答の改善と組み合わされたミョウバンとカップリングしたＳＯＳＩＰ−ＰＳ４抗原の保持の延長は、図１５Ｃに示されるように、抗ＳＯＳＩＰ  ＩｇＧ力価の顕著な増強を示した（ＳＯＳＩＰ−Ｐ４＋ｉｓｃｏ）。このミョウバン、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）およびミョウバン結合抗原の免疫化の組み合わせは、二次免疫（追加免疫）のための必要性も潜在的にとり除く。
（実施例７）
ミョウバン／ＰＳ−ｅＯＤ免疫化は、体液性免疫応答の複数の面を増強する。
【０３１６】
投与部位での抗原の保持が体液性免疫応答の増強と相関するかを決定するために、コンジュゲートしていない（ｅＯＤ−ＰＳ０）、または１つのリン酸化セリン（ＯＤ−ＰＳ１）抗原、２つのリン酸化セリン（ｅＯＤ−ＰＳ２）抗原、および４つのリン酸化セリン（ｅＯＤ−ＰＳ４）抗原を含むカップリング試薬とコンジュゲートした、ｅＯＤ抗原（２μｇ）とカップリングした５０μｇのミョウバンを注射されたマウスにおける抗ｅＯＤ抗体価を、抗原の注射から４週間後に決定した。図１６に示されるように、抗ｅＯＤ抗体価は、ｅＯＤ−ＰＳ０およびｅＯＤ−ＰＳ１とカップリングしたミョウバンと比べて、ｅＯＤ−ＰＳ２またはｅＯＤ−ＰＳ４とカップリングしたミョウバンを投与されたマウスにおいて顕著に増加した。これらの結果は、抗原保持と抗体応答との間の相関があることを確認する。
【０３１７】
免疫応答に対するＰＳ抗原免疫化の影響を、図１７および１８Ａ〜１８Ｇにおいて特徴付けた。ミョウバン／Ｓｅｒ４−ｅＯＤまたはミョウバン／ＰＳ−ｅＯＤによるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、親和性リンカー中のリン酸化セリンの数の増加とともに、血清ＩｇＧ力価が増加する明確な傾向を明らかにし；ＰＳ４−ｅＯＤは、Ｓｅｒ４−ｅＯＤ抗原と比較して６３倍高い血清ＩｇＧ力価を誘発した（図１７）。次の実験は、ミョウバン／ＰＳ抗原への応答が、マウス、非ヒト霊長類およびヒトにおける体液性免疫を非常に強力に促進するＩＳＣＯＭ様サポニンナノ粒子アジュバントと一緒の抗原およびミョウバンの共投与によってさらに増幅され得るかを試験した（Ｐａｕｔｈｎｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４６，  １０７３−１０８８；  Ｄｒａｎｅ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ６，  ７６１−７７２）。サポニンナノ粒子は、ミョウバンへのＰＳ抗原結合を妨げない（データは示さない）。耐久性のＩｇＧの誘発と組み合わせるサポニンおよびミョウバンアジュバントによる共免疫化は、ミョウバン単独よりもおよそ１０倍強く応答する（図１８Ａ対図１７）。ＰＳ８リンカーは、図１８Ａに示されるように、ＰＳ４リンカーをわずかに上回って力価を増加させ、リン酸化セリン抗原の免疫化は、図１８Ｂに示されるように、ワクチンが皮下または筋肉内に投与されたかに関わらず、有効であった。重要なことは、リン酸化セリンリンカー自体に対する測定可能な抗体応答は検出されなかった（示さない）。長期間にわたって検出された安定した高レベルの血清抗体と一致して、単回のミョウバン／ＰＳ抗原の免疫化から３か月後の骨髄形質細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析は、対照のＳｅｒ４−ｅＯＤと比較して、ＰＳ４−ｅＯＤ免疫化による免疫化により誘発された１６倍の抗原特異的形質細胞を示した（図１８Ｃ）。
【０３１８】
体液性応答の親和性成熟は胚中心で起こり、そこでは、Ｂ細胞は、それらの免疫グロブリン遺伝子を周期的に変異させて、より高い親和性の結合因子を発達させ；したがって、胚中心（ＧＣ）応答を促進するための戦略は、ＨＩＶワクチンに関して大きな関心がもたれている（Ｈａｖｅｎａｒ−Ｄａｕｇｈｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２７５，  ４９−６１）。ＧＣ  Ｂ細胞は、ミョウバン／Ｓｅｒ−ｅＯＤ免疫化後にバックグラウンドを上回って幅広く検出可能であったが、ミョウバン／ＰＳ−ｅＯＤは、頑強な胚中心応答をプライムした（図１８Ｄ、１８Ｅ）。さらに、ｅＯＤ結合ＧＣ  Ｂ細胞のパーセンテージは、図１８Ｆ、１８Ｇに示されるように、ＰＳ抗原免疫化への応答において、約２％〜約４５％、大幅に増加した。全体として、これらの結果は、緊密なミョウバンの結合のために操作された免疫原によるワクチン接種が、体液性免疫応答において、早期のイベントおよび後期のイベントの両方を促進することを示す。
（実施例８）
ミョウバン／ＰＳ−ＳＯＳＩＰ免疫化は、Ｅｎｖ三量体への体液性応答を増強する。
【０３１９】
ＳＯＳＩＰエンベロープ三量体への全体液性応答に対するＰＳ媒介ミョウバン結合の影響を評価した。ミョウバンと混合したＳＯＳＩＰ三量体によるマウスのプライムおよび単回の追加免疫は、弱い三量体特異的ＩｇＧ応答を誘発したが、図１９Ａ、１９Ｂに示されるように、同じレジメンで投与されたＳＯＳＩＰ−ＰＳ４は、追加免疫から７日後までに、約２０倍高い力価をもたらした。サポニンアジュバントと一緒のミョウバンの共投与は、ＳＯＳＩＰ三量体が、単回の免疫化後に測定可能なＩｇＧ応答を刺激することを可能にするが、ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４とのミョウバン／サポニンのワクチン接種は、図１９Ｃ、１９Ｄに示されるように、長期間にわたって維持された実質的により高い三量体特異的力価を誘発した。ｅＯＤ抗原による知見と同様に、免疫化から３か月後に三量体特異的ＩｇＧ抗体を分泌する骨髄形質細胞の顕著な増加が、図１９Ｅ、１９Ｆに示されるように、観察された。
（実施例９）
配向された部位特異的固定化は、ミョウバンと結合したＰＳ−Ｅｎｖ三量体のベースをブロックし、エピトープのマスクが可能である。
【０３２０】
ＰＳ改変が、ミョウバン粒子に依然として結合しているＢ細胞への抗原の送達を促進するという発見は、Ｂ細胞応答を形作るための追加戦略を広げ、それによって、ミョウバン粒子表面と並置で配向される望ましくない部位で抗原を固定化することにより、望ましくないエピトープがマスクされる。ＨＩＶ感染症の動物モデルにおいて、ＨＩＶ三量体ベースのベースに対する抗体応答は、免疫優性であるが、ウイルスの中和について無関係である（Ｈａｖｅｎａｒ−Ｄａｕｇｈｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２７５，  ４９−６１）。三量体ベースに対する抗体応答を最小化させるための試みにおいて、ＳＯＳＩＰを、図４において説明されるように、３つのＰＳリンカーがそれぞれの三量体のベースでコンジュゲートするそれぞれのプロモーターのＣ末端で、遊離システインにより改変した。
【０３２１】
ＳＯＳＩＰ−ＰＳ三量体は、図５Ｂに示されるように、未改変のＳＯＳＩＰと比較して、血清の曝露後に、ミョウバンにおける保持の増加を示した。
【０３２２】
タンパク質抗原のどの部分が、免疫された血清からの抗体によって結合されるかをさらに特徴付けるために、競合ＥＬＩＳＡを、タンパク質抗原の既知の位置に結合する高親和性の抗体を使用して行った。ベース特異的抗体の１２Ｎを使用して、ＳＯＳＩＰのベース領域を目立たなくし、血清抗体を、ＳＯＳＩＰのその部分への結合からブロックした。血清を、５０μｇのミョウバンと組み合わせた２μｇのＳＯＳＩＰ、または５０μｇのミョウバンとカップリングした２μｇのＳＯＳＩＰ−ＰＳ４からなる、一次（０日目）および二次（２８日目）免疫化から７２日後にマウスから採取した。吸光度値は、図２０Ａに示されるように、免疫化の両方の種類に対して、競合ベース特異的抗体１２Ｎの存在中で測定されたＥＬＩＳＡシグナルの減少を示した。しかしながら、ＥＬＩＳＡの曲線下面積によって測定されたシグナルの相対的減少は、図２０Ｂに示されるように、ミョウバンにカップリングしたＳＯＳＩＰ−ＰＳ４について顕著に少なかった。
【０３２３】
ＳＯＳＩＰおよびＳＯＳＩＰ−ＰＳは、遊離三量体がＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されると、ｂＮＡｂおよび非中和ベース特異的ｍＡｂの両方によって、同等に認識された（図２１Ａの群１および２）。しかしながら、ベース改変ＳＯＳＩＰ−ＰＳがＥＬＩＳＡプレートにコーティングされたミョウバンに結合すると、三量体のベースに対する非中和抗体は最小の結合を示したが、図２１Ａに示されるように、三量体表面上の様々な中和部位を認識するｂＮＡｂは結合したままであった。
【０３２４】
ｅＯＤで得られた結果と同様に、ミョウバンを有する蛍光ＳＯＳＩＰの投与後のＩＶＩＳイメージングは、図１５Ａ、１５Ｂに示されるように、未改変ＳＯＳＩＰの迅速なクリアランスだが、免疫化部位からのＰＳ４−ＳＯＳＩＰのゆっくりとした減衰を明らかにした。免疫化後、ＥＬＩＳＡ分析を、ベース結合ｍＡｂの存在中または非存在中で、プレートに結合したＳＯＳＩＰと結合するＩｇＧを評価することによって行った。ミョウバン／ＳＯＳＩＰで免疫化されたマウスからの血清は、中程度のＳＯＳＩＰ特異的ＩｇＧ応答を示し、結合は、ベース特異的モノクローナル抗体の添加によって大幅にブロックされた（図２１Ｂ）。対照的に、ミョウバン／ＳＯＳＩＰ−ＰＳ４で免疫化されたマウスにおけるＩｇＧ応答は、図２１Ｂ、２１Ｃに示されるように、より強かったが、ベース特異的Ａｂの添加によってほんのわずか低減された。さらにまた、動物がＳＯＳＩＰ−ＰＳ４で免疫化され、三量体のｇｐ１２０の部分への応答が増加した場合、ミョウバン／ＳＯＳＩＰ−ｐＳ４免疫化は、三量体のベースに位置するＨｉｓタグへの応答の顕著な減少をもたらした（図２１Ｄ、２１Ｅ）。
【０３２５】
これらのデータは、ミョウバンへのＳＯＳＩＰの部位特異的カップリングが、カップリングしていないＳＯＳＩＰ抗原と比較した場合に、ベースから離れて、タンパク質の他の部分に向かわせる免疫の注意を方向付けることを実証する。抗原の部分のこの制御されたマスクは、ミョウバン表面への直接的な抗原の部位特異的コンジュゲーションの結果である。これらの結果は、したがって、ＰＳリンカーを有する免疫原の方向付けられた配向が、免疫応答の特異性を変更することができることを示唆する。
均等物
【０３２６】
当業者は、日常的な実験だけを使用して、本明細書に記載の具体的な実施形態の多くの均等物を認識することとなり、または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【図１】
2021506851.tif 000004
【図２】
2021506851.tif 000005
【図３】
2021506851.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021506851.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
2021506851.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
2021506851.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2021506851.tif 000019
【図１７】
2021506851.tif 000020
【図１８−１】
2021506851.tif 000021
【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2021506851.tif 000025
【配列表】
2021506851000001.app
【国際調査報告】
2021506851.tif 000026
2021506851.tif 000027
2021506851.tif 000028