(57)【要約】【解決手段】  ゼラチン加水分解物のゼラチンの溶液を７０〜１２５℃の温度でｐＨ３．５以下で少なくとも１５分間の期間インキュベートするステップと、ゼラチン加水分解物を回収するステップと、を含むエンドトキシン含量が減少しているゼラチン加水分解物の調製方法が記載されている。さらに、そのようにして得られるゼラチン加水分解物が記載されている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ゼラチン加水分解物のゼラチンの溶液を７０〜１２５℃の温度でｐＨ３．５以下で少なくとも１５分の期間インキュベートするステップと、
ｂ．ゼラチン加水分解物を回収するステップと、
を含むことを特徴とするエンドトキシン含量が減少しているゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項２】
前記温度が９０〜１００℃である請求項１に記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項３】
前記温度が９２〜９８℃、好ましくは９４〜９６℃である請求項１に記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項４】
前記ｐＨが２．７以下である請求項１〜３のいずれかに記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項５】
前記ｐＨが３．０以下、好ましくは２．５以下、好ましくは１．８〜２．２、最も好ましくは約２．０である請求項４に記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項６】
前記期間が３０分以上である請求項１〜５のいずれかに記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項７】
前記期間が１〜５時間、好ましくは１．５〜３時間、より好ましくは２〜２．５時間である請求項６に記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項８】
酵素処理ステップを含まない請求項１〜７のいずれかに記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項９】
ステップａにおいて、分子量が７０ｋＤａ超であるゼラチンの溶液をインキュベートする請求項１〜８のいずれかに記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項１０】
ステップｂにおけるゼラチン加水分解物の分子量が３０ｋＤａ以下、好ましくは２０ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、さらにより好ましくは５ｋＤａ以下である請求項１〜９のいずれかに記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項１１】
ステップｂにおけるゼラチン加水分解物のエンドトキシンレベルが２０ＥＵ／ｇゼラチン加水分解物以下、好ましくは１０ＥＵ／ｇ以下、より好ましくは５ＥＵ／ｇ以下、さらにより好ましくは２ＥＵ／ｇ以下、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ以下である請求項１〜１０のいずれかに記載のゼラチン加水分解物の調製方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のゼラチン加水分解物の調製方法によって得られるゼラチン加水分解物。
【請求項１３】
ａ．分子量が２０ｋＤａ以下、好ましくは１５ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、さらにより好ましくは５ｋＤａ以下であり、かつ
ｂ．エンドトキシンレベルが２０ＥＵ／ｇゼラチン加水分解物以下、好ましくは１０ＥＵ／ｇ以下、より好ましくは５ＥＵ／ｇ以下、さらにより好ましくは２ＥＵ／ｇ以下、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ以下である
請求項１２に記載のゼラチン加水分解物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポ多糖（ＬＰＳ）含量が低いゼラチン加水分解物の調製方法、およびリポ多糖含量が低いゼラチン加水分解物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゼラチンは、コラーゲンに由来する水溶性タンパク質の混合物である。ゼラチンは、例えばコラーゲンの部分的な加水分解によって得られ、酸またはアルカリ条件での皮膚、腱、靭帯、骨等の水性抽出によって得られるか、または酵素加水分解によって得られる。酸処理によって得られたゼラチンはタイプＡゼラチンと称される一方で、タイプＢゼラチンはアルカリによるプロセスから得られる。
【０００３】
ゼラチンは、均一なタンパク質分子を構成していないが、平均分子量が最大２００〜２５０ｋＤａである様々な長さのタンパク質分子を様々な量で含む。したがって、ゼラチンの分子量分布は、多くの場合、粘度およびブルーム値、またはゲル強度などの重大かつ重要な性質を担うか、または決定する重要なパラメータである。
【０００４】
ゼラチンは、室温で熱可塑性ゲルを形成し、熱水に溶解する。ゼラチンは、多様な産業、例えば食品、医薬品および化粧品用途で、とりわけ、例えばフルーツガムおよびゼラチンデザートのゲル化剤およびテクスチャライザーとして慣用されているのみならず、医療分野、例えば血漿置換およびゼラチンベースの移植の用途が見出されている。
【０００５】
分子量は、とりわけ、異なる抽出温度および条件により変動する。結果として、ブルームおよび粘度も変動する。温度は、ゼラチン調製、例えば、ゼラチンを食品、医薬、技術的および医療の用途に適用する前の精製条件における重要なパラメータであり、多くの場合、注意深いコントロールを必要とする。ゼラチンを使用することになる場合、ゲル化の特徴および粘度が重要である用途において、６０℃の温度が最大取り扱い温度として考えられるが、例えば５または１０〜３０または４５分の限定した期間であれば例えば６２℃または６５℃の最大温度が、ゲル化容量および／または粘度のいくらかの喪失が許容される状況下では許容され得る。
【０００６】
ゼラチンの分子量分布は、通常、サイズ排除ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）技術によって測定され、溶出した画分はＵＶ吸収によって検出され、測定したデータは適したソフトウェアによって評価される。当分野で既知のすべての技術について、例えば、Ｏｌｉｊｖｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２４３，４７６−４８２を参照されたい。平均分子量が２０ｋＤａ未満などの７０ｋＤａ未満である加水分解ゼラチンについて、同じ方法が使用できるが、ＴＳＫｇｅｌ２０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，日本）などの分離カラムを使用して、高い分解能を得るのが好ましい（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ  ２３（２００９）２００１−２００７）。
【０００７】
ゼラチンの粘度（動的粘度）は、通常、標準フローピペットを用いて６０℃でゼラチンの６．６７ｗ／ｗ％溶液のフロー時間を測定することによって測定される。ＧＭＥ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｄｉｂｌｅ  Ｇｅｌａｔｉｎ，ｖｅｒｓｉｏｎ  １０，２０１４（ＧＭＥ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）（「ＧＭＥ１０」とも称される），ｃｈａｐｔｅｒ  ２．４．２，ｐ．８１−８６を参照されたい。
【０００８】
６．６７ｗ／ｗ％ゼラチンゲルのゲル強度は、ＱＴＳ  ２５  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒｓ）またはＴｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＴＡ−ＸＴ２（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．，ロンドン，英国）などの標準装置（ＧＭＥ１０を参照）によって決定でき、ブルーム数（「ブルーム値」とも称される，ＧＭＥ１０を参照）で示される。
【０００９】
６５℃を超える温度、特に７０℃を超える温度で、ゼラチンの加水分解、すなわち、タンパク質分子のより小さいペプチドへの分解が生じ、ゲル強度が低くなるか、またはゲル化容量が喪失する。同じことが低いｐＨで生じる。したがって、いわゆる「加水分解ゼラチン」は、平均分子量が７０ｋＤａ以下、通常２０ｋＤａ以下、通常１００〜１５０００Ｄａであるペプチド分子へのゼラチンの加水分解から得られるペプチド調製物である。比較的小さい分子であることから、加水分解ゼラチンは、ゲル化の性質を有さず、すなわち、０℃で６時間保たれた際にゲルを形成できない（薬局方定義）。加水分解ゼラチンは、例えば、局所クリームのテクスチャー調整剤および保湿剤として使用され、グリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリン含量が高いことから、栄養製品にも使用され、健康効果を伴い、生物医学用途により多く使用されている。コラーゲンが最初にゼラチンに加水分解され、その後さらに非ゲル化加水分解物に加水分解されることから、加水分解ゼラチンは「加水分解コラーゲン」とも呼ばれる。ゼラチン加水分解物は、通常、ゼラチンの酵素加水分解によって調製される。
【００１０】
生物医学目的で使用できる、すなわちエンドトキシン含量が低いゼラチン加水分解物の必要性が増している。ゼラチン調製プロセスにおいて、原料は、多くの場合細菌によって汚染されており、結果として、一般的なゼラチン調製物はリポ多糖（ＬＰＳ）を含み得る。
【００１１】
リポ多糖は、グラム陰性細菌の外膜で見られ、潜在的な毒素である。また、リポ多糖は細菌によって分泌されないが、膜構造の一部であることから、ＬＰＳは「エンドトキシン」としても既知である。したがって、リポ多糖は、細菌細胞の死亡および溶解後に主に放出される。
【００１２】
ＬＰＳは、可変の多糖鎖と、脂質部分である脂質Ａとからなる。ＬＰＳ分子のサイズは約１０ｋＤａであるが、ＬＰＳは、水媒体中で、分子量が最大１０００ｋＤａである大きな凝集体（「ミセル」とも称される）を形成する。
【００１３】
ＬＰＳは、多くの哺乳類にとって有毒であり、動物宿主は、熱、頻脈、臓器不全および死亡などの広範囲の非特異的な病態生理反応を患う。
【００１４】
特定のＬＰＳ含量は、ゼラチン加水分解物の多くの用途で許容可能であるが、特定の用途、特に注射剤、ワクチンおよび非経口薬などの薬では、エンドトキシンレベルは、好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは１０ＥＵ／ｇ、さらにより好ましくは６．５ＥＵ／ｇ未満、または４ＥＵ／ｇ未満であるべきである。例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、心臓血管系および／またはリンパ系と接触する製品について、最大０．５ＥＵ／ｍｌまたは２０ＥＵ／デバイスを許容している。脳脊髄液と接触するデバイスについては、制限は０．０６ＥＵ／ｍｌまたは２．１５ＥＵ／デバイス（〜２ＥＵ／ｇゼラチン）である。眼球内環境と直接または間接的に接触するデバイスについては、さらにより低いエンドトキシンの制限が適用される。
【００１５】
リムルスアッセイ（ＬＡＬ）は、ＬＰＳのサブピコグラムまでの量を測定する当分野で周知のバイオアッセイである。リムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）は、カブトガニ、リムルス・ポリフェムス（Ｌｙｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）由来の血中細胞（変形細胞）の水性抽出物である。ＬＡＬは、細菌エンドトキシンまたはリポ多糖（ＬＰＳ）（グラム陰性細菌の膜成分）と反応する。この反応はＬＡＬ試験の基礎であり、ＬＡＬ試験は細菌エンドトキシンの検出および定量化に使用される。米国ＦＤＡ、ＵＳＰ２０１１、ｃｈａｐｔｅｒ＜８５＞が許容した、ＬＰＳレベルを定量化する推奨のＬＡＬ方法はｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ法（例えばＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＳＡ）である。他の許容された推奨の方法は、Ｈｙｇｌｏｓ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）のＥｎｄｏＺｙｍｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆａｃｔｏｒＣ法である。これらの方法の両方とも、類似のまたは同一の測定値をもたらし、同じ意味で使用できる。
【００１６】
国際公開第２００９／１５４４４０号には、１３，２００ＥＵ／ｇの最初のエンドトキシンレベルが１０２．１倍減少した、すなわち１０５ＥＵ／ｇの値に減少した、ゼラチン源からＬＰＳを除去する方法が記載されている。この減少は有意であるが、レベルは医療目的では依然として容認できないほど高い。国際公開第２００９／１５４４４０号によれば、３０ｗ／ｗ％水性ゼラチン溶液を、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で９０℃に、すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（６８〜６９℃）の曇り点を超える温度に加熱し、界面活性剤の溶解度の喪失および凝集を生じさせて、凝集した界面活性剤に加えて、吸着剤に結合したＬＰＳの両方を、精製したゼラチンを含む水相から遠心分離によって除去する３相抽出プロセスを行う。９０℃という温度であるため、ゼラチンの顕著な加水分解によって、初期のゼラチンの分子量が顕著に低下してしまい、粘度およびゲル強度などの機能性が本質的に喪失してしまう。ＷＯ２００９／１５４４４０の方法においては、界面活性剤を凝集させて、吸着剤に吸着したＬＰＳと共に凝集体を遠心分離によって除去できるようにするために、ゼラチンと、界面活性剤と、吸着剤と、ＬＰＳとを含む溶液の温度が界面活性剤の曇り点温度を超える条件に溶液がなることが重要である。
【００１７】
界面活性剤、吸着剤および長い時間と労力を要する遠心分離ステップを使用するが、加水分解物を医療用途で興味深いものとするエンドトキシンの低いレベルに到達しないことから、エンドトキシン含量がより低いゼラチン加水分解物の新しい調製方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【００１８】
この目的のために、本開示は、エンドトキシン含量が減少しているゼラチン加水分解物の調製方法を提供する。該方法は、
ａ．ゼラチン加水分解物のゼラチンの溶液を７０〜１２５℃の温度でｐＨ３．５以下で少なくとも１５分間の期間インキュベートするステップと、
ｂ．ゼラチン加水分解物を回収するステップと、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ゼラチン加水分解物のエンドトキシンレベルに対する温度およびｐＨの影響を示す図である。
【図２】ゼラチン加水分解物のエンドトキシンレベルに対する温度およびｐＨの影響を示す図である。
【図３】ゼラチン加水分解物のエンドトキシンレベルに対する温度およびｐＨの影響を示す図である。
【図４】ゼラチン加水分解物のエンドトキシンレベルに対する温度およびｐＨの影響を示す図である。
【図５】ゼラチン加水分解物のエンドトキシンレベルに対する温度およびｐＨの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
「エンドトキシン含量が減少している」とは、ステップｂのゼラチン加水分解物のエンドトキシンレベルが、開始材料、すなわちステップａで処理する前のゼラチンまたはゼラチン加水分解物のものより顕著に低いことを意味するものとする。レベルは、好ましくは少なくとも１０分の１、より好ましくは少なくとも１００分の１、より好ましくは少なくとも５００分の１またはさらに好ましくは７００分の１、より好ましくは１０００分の１または５，０００分の１、または１０，０００分の１である。実施例で見られるように、１５，０００分の１のレベルを達成できる。
【００２１】
温度は７０〜１２５℃であり、当然ながら、１００℃を超える温度では、加熱が圧力下で行われる。したがって、温度は、好ましくは８０℃〜１００℃、より好ましくは９０〜１００℃である。
【００２２】
ｐＨは３．５以下であり、期間は好ましくは少なくとも１５分である。温度が高くなるほどインキュベーション期間を短くすることができることは当業者に明らかである。インキュベーション期間は、想定されたエンドトキシン含量に達する一方で、分子量分布および平均分子量のような想定された性質のゼラチン加水分解物を提供するように選択される。当業者であれば、必要とされる低いエンドトキシン含量を有する想定された加水分解物に到達するように、温度、ｐＨおよび時間のパラメータを容易に調整するものである。
【００２３】
実施例で示され、当業者によって容易に理解されるように、温度が高いほど、ｐＨ低下を少なくすることができるか、かつ／または期間を短くすることができ、逆もまた同様に、すなわち、ｐＨが低くなるほど、温度を低くすることができるか、かつ／または期間を短くすることができる。上記を考慮すると、温度は好ましくは９２〜９８℃、より好ましくは９４〜９６℃である一方で、ｐＨは好ましくは３．０以下、より好ましくは２．７以下、より好ましくは２．５以下、さらにより好ましくは１．８〜２．２、最も好ましくは約２．０である。「約」は、ｐＨが、２．０の値辺りで、０．５以下ずつ、すなわち１．５〜２．５、または好ましくは１．７〜２．３、さらにより好ましくは１．９〜２．１で変動し得ることを意味するものとする。しかしながら、例えば２．５以下の好ましいより低いｐＨ範囲では、７０℃〜８０℃の温度が、さらに加熱する必要がなく魅力的なＬＰＳ除去をもたらすことが理解される。さらに、ＬＰＳ含量をさらに低下させるには加熱が望ましいものであり得る。他方で、例えば９０℃以上のより高い好ましい温度範囲では、ｐＨは、例えば３〜３．５の値を有する記載の通りの上限において選択され得る。さらに、ＬＰＳ含量をさらに低下させるには、ｐＨを低下させるのが望ましいものであり得る。
【００２４】
期間は、好ましくは３０分以上である。その期間で、ゼラチンがそのような高い温度で加水分解し、エンドトキシンレベルが魅力的に低くなる。期間は１〜５時間、好ましくは１．５〜３時間、より好ましくは２〜２．５時間である。
【００２５】
非常に魅力的な実施形態では、方法は酵素処理ステップを含まない。存在しているゼラチン加水分解物の調製方法では、多くの場合、酵素が使用され、それは不活性化される必要があり、そのような酵素などのいずれの外来のタンパク質材料も免疫応答を引き起こし得ることから、加水分解物の後の精製も要し得る。異常な過酷な温度およびｐＨ条件を用いることによって、酵素の関与を必要とせずに加水分解が行われるのが見られた。それ故に、生成物は好ましくは酵素を含まない。
【００２６】
方法はゼラチン加水分解物から始めるが、分子量が７０ｋＤａ超であるゼラチン溶液をステップａにおいてインキュベートするのが好ましい。方法条件がゼラチンの加水分解力を有することから、先のステップでゼラチンを加水分解する必要がない。
【００２７】
ステップｂのゼラチン加水分解物は、好ましくは分子量が３０ｋＤａ以下、好ましくは２０ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、さらにより好ましくは５ｋＤａ以下、または４ｋＤａ以下である。上述したように、ゼラチン加水分解物はゲル化力を有さない。
【００２８】
ステップｂのゼラチン加水分解物は、好ましくはエンドトキシンレベルが２０ＥＵ／ｇゼラチン加水分解物以下、好ましくは１０ＥＵ／ｇ以下、より好ましくは５ＥＵ／ｇ以下、さらにより好ましくは２ＥＵ／ｇ以下、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ以下である。そのような値は、１０，０００〜１５，０００ＥＵ／ｇゼラチン以上を有するゼラチン開始材料を用いて得ることができる。
【００２９】
さらに、先の請求項のいずれかの方法によって得られるゼラチン加水分解物について説明する。そのようなゼラチン加水分解物は、好ましくは分子量が２０ｋＤａ以下、好ましくは１５ｋＤａ以下であり、かつエンドトキシンレベルが２０ＥＵ／ｇゼラチン加水分解物以下、好ましくは１０ＥＵ／ｇ以下、より好ましくは５ＥＵ／ｇ以下、さらにより好ましくは２ＥＵ／ｇ以下、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ以下（特に上記のＬＡＬ方法に従って測定）である。
【００３０】
本開示を以下の実施例および図面によってさらに例証する。
【実施例】
【００３１】
実施例１
ゼラチン加水分解物のエンドトキシンレベルに対する温度およびｐＨの影響
温度を６０℃−７０℃−８０℃−９０℃−９５℃に変動させ、
ｐＨ値を２−２．５−３−「５」（変化していない）に変動させ、
加水分解を最大３時間実施した。
【００３２】
使用したゼラチンは、＃１４０Ｐ１１７１６２Ｂ１、ブタ皮膚ゼラチンタイプＡ、Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ，ヘント，ベルギー（高いブルーム、分子量（ＭＷ）１５０ｋＤａ、エンドトキシン含量〜１４０００ＥＵ／ｇ）である。
【００３３】
加水分解の温度／ｐＨ値ごとに、２０ｇのゼラチンを、５５℃で少なくとも３０分間加熱することによって１８０ｇの水に溶解して、２００ｇの１０％ゼラチン溶液を調製した。ゼラチン濃度がより低いか、またはより高い溶液も調製できる。
【００３４】
１０ｇの試料を採取し、これらを、正確な加水分解温度の水浴中に、溶液がこの温度（±３℃）に達するまで置いた。
【００３５】
ｐＨ分析には、５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を使用し、ｐＨあたりの酸の必要量は滴定曲線を用いて決定した。
【００３６】
採取した試料を０．１時間−０．５時間−１時間−１．５時間−２時間−３時間インキュベートした。
【００３７】
表１にて概説されるように、想定されたインキュベーションの終了時に、滴定曲線を用いて試料のｐＨが４．９になるように１０Ｍ  ＮａＯＨを混合し、エンドトキシンレベルを測定するまで、試料を−２０℃の冷凍機内で保持した。
表１：ＮａＯＨ添加の滴定値
【表１】
2021504463.tif 000003
【００３８】
エンドトキシンレベルの測定のために、４０℃の水浴で試料を解凍した。
【００３９】
分子量を上記Ｚｈａｎｇに記載の方法に従って測定し、表２および表３に示す。
表２：９５℃、異なるｐＨでの分子量
【表２】
2021504463.tif 000004
表３：ｐＨ２．０、異なる温度での分子量
【表３】
2021504463.tif 000005
【００４０】
ｐＨ３、４、および５で、オートクレーブ中１２１℃の温度で２０分間、同じ実験を実施した。
【００４１】
結果を以下の表３および図１〜４に示す。
表３：ｐＨ５での比較実施例
【表４】
2021504463.tif 000006
【００４２】
ｐＨ５では、有意なエンドトキシン除去が見られなかった。図１も参照されたい。
表４：ｐＨ２でのエンドトキシンレベル
【表５】
2021504463.tif 000007
【００４３】
図２も参照すると、９０℃および９５℃に加えて１２１℃で、魅力的な値の低いエンドトキシンレベルが得られることが分かる。
表５：ｐＨ３でのエンドトキシンレベル
【表６】
2021504463.tif 000008
【００４４】
図３も参照すると、ｐＨ３および９５℃などの９０℃超の温度で、想定されたエンドトキシンレベルが再度見られた。
表６：ｐＨ２．５、温度９５℃でのエンドトキシンレベル
【表７】
2021504463.tif 000009
【００４５】
表６から（データは図４にも示されている）、ゼラチンが４０００Ｄａ未満の分子量に加水分解されている一方で、エンドトキシンレベルは、１時間のインキュベーション時間後に１０ＥＵ／ｇ未満であることが分かる。
【００４６】
１２１℃、ｐＨ値２、３および５、２０分のインキュベーション期間での上記データに加えて、ｐＨ４での測定も行ったところ、１６４ＥＵ／ｇの値が得られた。データを図５に要約する。図５は、３のｐＨ値での魅力的な結果を示す。
【００４７】
同様の結果がタイプＢゼラチンで得られた。
【図１】
2021504463.tif 000010
【図２】
2021504463.tif 000011
【図３】
2021504463.tif 000012
【図４】
2021504463.tif 000013
【図５】
2021504463.tif 000014
【国際調査報告】
2021504463.tif 000015
2021504463.tif 000016