(57)【要約】  本発明は、最適化されたＧＬＰ−１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１化合物活性比を有するＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子２１）化合物およびＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストを含む組合せ、医薬組成物および融合分子に関する。本発明はさらに、特に、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはアテローム性動脈硬化症の治療のための医薬としてのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子２１）化合物およびＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストを含む組合せであって、
該ＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１のＦＧＦ２１活性と同じまたは実質的に同じであるＦＧＦ２１活性を有し、以下：
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から９８〜１０１位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＥＩＲＰ（配列番号４４）による置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＶ（配列番号４５）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＮ（配列番号４６）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  上記に定義される１つまたはそれ以上の変異と共に、配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１８０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｅでの置換；および
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１に比べて、ＦＧＦ２１変異体の免疫原性を減少させるための１〜１０個のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＦＧＦ２１変異体であり、
該ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜５３１分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する、前記組合せ。
【請求項２】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜４８２分の１または９〜３１９分の１または９〜１２１分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、１８〜５０１分の１または１８〜４６９分の１または１８〜３１３分の１または１８〜１２３分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する、請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】
ＦＧＦ２１変異体は、天然ＦＧＦ２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項５】
ＦＧＦ２１変異体は、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項６】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、アミノ酸配列
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｘ１０−Ｓ−Ｘ１２−Ｑ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｅ−Ｅ−Ｘ１８−Ｖ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０（配列番号３７）
を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなり、
式中
Ｘ１０はＬまたはＫであり；
Ｘ１２はＫまたはＩであり；
Ｘ１４はＬまたはＭであり；
Ｘ１５はＥまたはＤであり；
Ｘ１８はＡまたはＲであり；
Ｘ２０はＲまたはＱであり；
Ｘ２１はＬまたはＥであり；
Ｘ２７はＬ、Ｅ、ＫまたはＶであり；
Ｘ２８はＡ、ＮまたはＫであり；
Ｘ２９はＴまたはＧであり；
Ｘ３０はＧまたはＲであり；
場合により、該アミノ酸配列は、そのＮ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、
場合により、該アミノ酸配列は、そのＣ末端に最大１２、１１または１０個のアミノ酸残基からなるペプチド延長を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項７】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、配列番号９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組合せ。
【請求項８】
Ｘ１４はＬであり、Ｘ２８はＡである、請求項６または７に記載の組合せ。
【請求項９】
薬学的に許容される担体および／または賦形剤と共に、ＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子２１）化合物およびＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストを含む医薬組成物であって、
該ＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１のＦＧＦ２１活性と同じまたは実質的に同じであるＦＧＦ２１活性を有し、以下：
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から９８〜１０１位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＥＩＲＰ（配列番号４４）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＶ（配列番号４５）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＮ（配列番号４６）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  上記に定義される１つまたはそれ以上の変異と共に、配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１８０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｅでの置換；および
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１に比べて、ＦＧＦ２１変異体の免疫原性を減少させるための１〜１０個のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＦＧＦ２１変異体であり、
該ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜５３１分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する、前記医薬組成物。
【請求項１０】
ＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子２１）化合物およびＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストを含む融合分子であって、
該ＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１のＦＧＦ２１活性と同じまたは実質的に同じであるＦＧＦ２１活性を有し、以下：
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から９８〜１０１位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＥＩＲＰ（配列番号４４）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＶ（配列番号４５）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＮ（配列番号４６）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  上記に定義される１つまたはそれ以上の変異と共に、配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１８０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｅでの置換；および
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１に比べて、ＦＧＦ２１変異体の免疫原性を減少させるための１〜１０個のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＦＧＦ２１変異体であり、
該ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜５３１分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する、前記融合分子。
【請求項１１】
融合分子は、異なる免疫グロブリンの部分的Ｆｃ領域／ドメインの組合せを含むハイブリッドＦｃドメインをさらに含む、請求項１０に記載の融合分子。
【請求項１２】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストおよび／またはＦＧＦ２１化合物は、請求項２〜８のいずれか１項に定義される、請求項９に記載の医薬組成物または請求項１０もしくは１１に記載の融合分子。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の融合分子をコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含有する、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組合せ、請求項９もしくは１２に記載の医薬組成物、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１３に記載の核酸分子または請求項１４に記載の宿主細胞を含む、キット。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組合せ、請求項９もしくは１２に記載の医薬組成物、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１３に記載の核酸分子または請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害の治療での使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組合せ、請求項９もしくは１２に記載の医薬組成物、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１３に記載の核酸分子または請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害の治療での使用のための医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組合せ、請求項９もしくは１２に記載の医薬組成物、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１３に記載の核酸分子または請求項１４に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１９】
肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害を治療する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組合せ、請求項９もしくは１２に記載の医薬組成物、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１３に記載の核酸分子または請求項１４に記載の宿主細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
糖尿病は１型糖尿病または２型糖尿病である、請求項１７に記載の使用のための、組合せ、医薬組成物、融合分子、核酸分子もしくは宿主細胞、請求項１８に記載の使用または請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適化されたＧＬＰ−１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１化合物活性比を有するＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子２１）化合物およびＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストを含む組合せ、医薬組成物および融合分子に関する。本発明はさらに、特に、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはアテローム性動脈硬化症の治療のための医薬としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）化合物、例えば、組換え産生されたＦＧＦ２１ポリペプチドの投与によって、体重、血中グルコースおよび血漿脂質の大幅な減少ならびに例えば、非特許文献１および非特許文献２に説明されているように、インスリン感度の改善がもたらされる。グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストは、例えば、非特許文献３および非特許文献４に示されるように、ヒトにおける効果的なグルコースおよび体重減少を提供する。ＦＧＦ２１投与の利益効果をＧＬＰ−１受容体アゴニストのグルコース減少効果と組合せることによって、驚くべきことに、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはアテローム性動脈硬化症のような疾患／障害のより包括的な治療を提供する相乗効果（例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと）がもたらされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０８９２０３Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２０１４／０３７３７３Ａ１
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇａｉｃｈら（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ１８（３）：３３３−３４０
【非特許文献２】Ｄｏｎｇら（２０１５）Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ８０（５）：１０５１−１０６３
【非特許文献３】Ａｓｔｒｕｐら（２０１２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３６（６）：８４３−８５４
【非特許文献４】Ｎａｕｃｋら（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ１５（３）：２０４−２１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
例えば、融合タンパク質の形態のＦＧＦ２１化合物とＧＬＰ−１Ｒアゴニストの組合せは、例えば、２型糖尿病を有する肥満の異常脂血症の患者に対して、太り過ぎにおける血糖コントロールを改善するために使用することができる。
【０００６】
注目すべきことに、ＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１（一次ＧＬＰ−１Ｒアゴニストとして）は、異なる血漿中濃度で薬理学的作用を発揮する。より詳細には、ＦＧＦ２１効果は、ＧＬＰ−１効果に比べて、より高い血漿レベルで作用し始める。さらに、より高いレベルで、ＧＬＰ−１は、例えば、吐き気および嘔吐といった有害作用を有することが知られている。まとめると、このことは、例えば、融合タンパク質の形態で、ＦＧＦ２１化合物およびＧＬＰ−１Ｒアゴニストの組合せを投与する場合、ＧＬＰ−１媒介性有害作用の潜在的なリスクを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、潜在的な有害作用（例えば、吐き気および嘔吐）を回避しながら、利益効果を達成するために、最適なＧＬＰ−１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１化合物活性比を決定することである。本発明のさらなる目的は、最適化されたＧＬＰ−１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１化合物活性比を有する対応する組合せ、医薬組成物および融合分子を提供することである。
【０００８】
一態様において、本発明は、ＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子２１）化合物およびＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストを含む組合せであって、ＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１のＦＧＦ２１活性と同じまたは実質的に同じであるＦＧＦ２１活性を有し、以下：
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から９８〜１０１位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＥＩＲＰ（配列番号４４）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＶ（配列番号４５）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＮ（配列番号４６）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  前述に定義される１つまたはそれ以上の変異と共に、配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１８０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｅでの置換；および
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１に比べて、ＦＧＦ２１変異体の免疫原性を減少させるための１〜１０個のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＦＧＦ２１変異体であり、
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜５３１分の１（または９．４４９〜５３１．０分の１）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する、組合せに関する。
【０００９】
一実施形態において、ＦＧＦ２１活性は、ＦＧＦ２１受容体の活性を指す。一実施形態において、この用語は、インビトロにおける活性を指す。一実施形態において、ＦＧＦ２１受容体の活性は、インビトロにおけるＦＧＦ２１化合物と接触したときのＦＧＦ２１受容体自己リン酸化を測定することによって決定される。一実施形態において、ＦＧＦ２１活性は、例えば、本質的に実施例３において説明されるように、Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用することによって決定される。
【００１０】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒ活性は、ＧＬＰ−１受容体の活性を指す。一実施形態において、この用語は、インビトロにおけるアゴニスト活性を指す。一実施形態において、ＧＬＰ−１受容体の活性は、インビトロにおけるアゴニストと接触したときのＧＬＰ−１受容体を安定的に発現する細胞のｃＡＭＰ反応を測定することによって決定される。一実施形態において、ＧＬＰ−１受容体の活性は、本質的に実施例４において説明されるように決定される。
【００１１】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜４８２分の１（または９．４４９〜４８２．３９６分の１）または９〜３１９分の１（または９．４４９〜３１９．３１１分の１）または９〜１２１分の１（または９．４４９〜１２１．１８９分の１）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００１２】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜３１９分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００１３】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも９．４分の１または少なくとも９．４５分の１または少なくとも９．５分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００１４】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも１０分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００１５】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、最大４８２．４分の１または最大４８２．３５分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００１６】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、最大４８２分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００１７】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、１０〜４８２分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００１８】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、１０〜３１９分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００１９】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９０〜１００分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００２０】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも１８分の１（または少なくとも１８．２６８分の１）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００２１】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、１８〜５０１分の１（または１８．２６８〜５００．６８６分の１）または１８〜４６９分の１（または１８．２６８〜４６８．６７９分の１）または１８〜３１３分の１（または１８．２６８〜３１３．２１４分の１）または１８〜１２３分の１（または１８．２６８〜１２３．４６６分の１）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００２２】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、１８〜３１３分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００２３】
前述の実施形態の１つにおいて、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、少なくとも１８．２分の１または少なくとも１８．３分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する。
【００２４】
一実施形態において、ＦＧＦ２１変異体は、天然ＦＧＦ２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２５】
一実施形態において、ＦＧＦ２１変異体は、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。
【００２６】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、アミノ酸配列
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｘ１０−Ｓ−Ｘ１２−Ｑ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｅ−Ｅ−Ｘ１８−Ｖ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０（配列番号３７）
を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなり、
式中
Ｘ１０はＬまたはＫであり；
Ｘ１２はＫまたはＩであり；
Ｘ１４はＬまたはＭであり；
Ｘ１５はＥまたはＤであり；
Ｘ１８はＡまたはＲであり；
Ｘ２０はＲまたはＱであり；
Ｘ２１はＬまたはＥであり；
Ｘ２７はＬ、Ｅ、ＫまたはＶであり；
Ｘ２８はＡ、ＮまたはＫであり；
Ｘ２９はＴまたはＧであり；
Ｘ３０はＧまたはＲであり；
場合により、アミノ酸配列は、そのＮ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、場合により、アミノ酸配列は、そのＣ末端に最大１２、１１または１０個のアミノ酸残基からなるペプチド延長を含む。
【００２７】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、配列番号９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。
【００２８】
一実施形態において、Ｘ１４はＬであり、Ｘ２８はＡである。
【００２９】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、配列番号９、１０、１２、１４、１６、１７、１９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤と共に、ＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子２１）化合物およびＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストを含む医薬組成物であって、ＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１のＦＧＦ２１活性と同じまたは実質的に同じであるＦＧＦ２１活性を有し、以下：
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から９８〜１０１位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＥＩＲＰ（配列番号４４）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＶ（配列番号４５）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＮ（配列番号４６）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  前述に定義される１つまたはそれ以上の変異と共に、配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１８０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｅでの置換；および
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１に比べて、ＦＧＦ２１変異体の免疫原性を減少させるための１〜１０個のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＦＧＦ２１変異体であり、
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜５３１分の１（または９．４４９〜５３１．０分の１）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する、医薬組成物に関する。
【００３１】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストおよび／またはＦＧＦ２１化合物は、前述のように定義される。
【００３２】
さらなる別の態様において、本発明は、ＦＧＦ２１（線維芽細胞増殖因子２１）化合物およびＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）アゴニストを含む融合分子であって、ＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１のＦＧＦ２１活性と同じまたは実質的に同じであるＦＧＦ２１活性を有し、以下：
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から９８〜１０１位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＥＩＲＰ（配列番号４４）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＶ（配列番号４５）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＮ（配列番号４６）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  前述に定義される１つまたはそれ以上の変異と共に、配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１８０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｅでの置換；および
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１に比べて、ＦＧＦ２１変異体の免疫原性を減少させるための１〜１０個のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＦＧＦ２１変異体であり、
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて、９〜５３１分の１（または９．４４９〜５３１．０分の１）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する、融合分子に関する。
【００３３】
一実施形態において、融合分子は、異なる免疫グロブリンの部分的Ｆｃ領域／ドメインの組合せを含むハイブリッドＦｃドメインをさらに含む。
【００３４】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストおよび／またはＦＧＦ２１化合物は、前述のように定義される。
【００３５】
別の態様において、本発明は、上記において定義される融合分子をコードする核酸分子に関する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、上記において定義される核酸分子を含有する宿主細胞に関する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、上記において定義される組合せ、上記において定義される医薬組成物、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子または上記において定義される宿主細胞を含むキットに関する。
【００３８】
別の態様において、本発明は、医薬としての使用のための、上記において定義される組合せ、上記において定義される医薬組成物、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子または上記において定義される宿主細胞に関する。
【００３９】
別の態様において、本発明は、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害の治療での使用のための、上記において定義される組合せ、上記において定義される医薬組成物、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子または上記において定義される宿主細胞に関する。
【００４０】
一実施形態において、疾患または障害は、糖尿病である。一実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病または２型糖尿病である。
【００４１】
別の態様において、本発明は、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害の治療での使用のための、医薬品の製造における上記において定義される組合せ、上記において定義される医薬組成物、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子または上記において定義される宿主細胞の使用に関する。
【００４２】
一実施形態において、疾患または障害は、糖尿病である。一実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病または２型糖尿病である。
【００４３】
別の態様において、本発明は、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖症、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患または障害を治療する方法であって、方法は、上記において定義される組合せ、上記において定義される医薬組成物、上記において定義される融合分子、上記において定義される核酸分子または上記において定義される宿主細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００４４】
一実施形態において、疾患または障害は、糖尿病である。一実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病または２型糖尿病である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＧＬＰ−１減衰率（１２か月のシミュレーション）に依存した有害作用（胃排出（ＧＥ）率）および薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬ、脂肪量）のＥＣ５０を示すグラフである：    ・  ９．４４９超のＧＬＰ−１減衰率（９に四捨五入することができる）について、ＧＬＰ−１媒介性胃腸有害作用（胃排出；ＧＥ率）のＥＣ５０は、薬力学的作用（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）のＥＣ５０よりも大きかった；    ・  ＦＧＦ２１−（脂質）およびＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、１２１．１８９であり、すなわち、１２１．１８９（１２１に四捨五入することができる）において、ＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）と平均ＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離において、薬力学的作用（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間で最大距離がある（図２を参照のこと）；    ・  薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、３１９．３１１であった（３１９に四捨五入することができる）；    ・  平均薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、４８２．３９６であった（図２を参照のこと；４８２に四捨五入することができる）；    ・  胃排出率の最大は５３１．０であった；（全て：縦線）。
【図２】ＧＬＰ−１減衰率（１２か月のシミュレーション）に依存した胃排出（ＧＥ）率および平均薬力学的作用（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬ、脂肪量）のＥＣ５０を示すグラフである：    ・  平均薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、４８２．３９６であった（右の縦線；４８２に四捨五入することができる）。    ・  ＦＧＦ２１−（脂質）およびＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、１２１．１８９であった（左の縦線；１２１に四捨五入することができる）。曲線「（最大ＧＥ率）／範囲」は、ＨｂＡ１ｃとＧＥ率との間の最大距離と、ＨｂＡ１ｃと平均ＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離との間の比を表す。「（最大ＧＥ率）／範囲」曲線の最小において（すなわち、１２１．１８９において）、ＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）とＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離において、薬力学的作用（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間で最大距離がある。
【図３】ＧＬＰ−１減衰率（３か月のシミュレーション）に依存した有害作用（胃排出（ＧＥ）率）および薬力学（ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬ、脂肪量）のＥＣ５０を示すグラフである：    ・  １８．２６８超のＧＬＰ−１減衰率（１８に四捨五入することができる）について、ＧＬＰ−１媒介性胃腸有害作用（胃排出；ＧＥ率）のＥＣ５０は、薬力学的作用（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）のＥＣ５０よりも大きかった；    ・  ＦＧＦ２１−（脂質）およびＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、１２３．４６６であり、すなわち、１２３．４６６（１２３に四捨五入することができる）において、ＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）と平均ＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離において、薬力学的作用（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間で最大距離がある（図４を参照のこと）；    ・  薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、３１３．２１４であった（３１３に四捨五入することができる）；    ・  平均薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、４６８．６７９であった（図４を参照のこと；４６９に四捨五入することができる）；    ・  胃排出率の最大は５００．６８６であった（５０１に四捨五入することができる）；（全て：縦線）。
【図４】ＧＬＰ−１減衰率（３か月のシミュレーション）に依存した胃排出（ＧＥ）率および平均薬力学的作用（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬ、脂肪量）のＥＣ５０を示すグラフである：    ・  平均薬力学（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、４６８．６７９であった（右の縦線；４６９に四捨五入することができる）；    ・  ＦＧＦ２１−（脂質）およびＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間の最大距離は、１２３．４６６であった（左の縦線；１２３に四捨五入することができる）。曲線「（最大ＧＥ率）／範囲」は、ＨｂＡ１ｃとＧＥ率との間の最大距離と、ＨｂＡ１ｃと平均ＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離との間の比を表す。「（最大ＧＥ率）／範囲」曲線の最小において（すなわち、１２３．４６６において）、ＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）とＦＧＦ２１媒介性作用（すなわち、脂肪量、非ＨＤＬ、脂肪酸、トリグリセリド）との間の最小距離において、薬力学的作用（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用（ＧＥ率）との間で最大距離がある。
【図５】Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎによって測定した、成熟ヒトＦＧＦ２１（配列番号２）による刺激後の、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびベータ−ｋｌｏｔｈｏを過剰発現するＣＨＯ細胞における（Ａ）ＦＧＦＲ自己リン酸化または（Ｂ）ＥＲＫ１／２−リン酸化の用量−応答曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明を以下において詳細に説明するが、本明細書において説明される特定の方法、プロトコール、および試薬は変わることがあるため、本発明はそれらに限定されるものではないことは理解されるべきである。本明細書において使用する専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないということも理解されるべきである。特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４７】
以下において、本発明のある特定の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態により列挙されるが、それらは、追加の実施形態を創出するためにあらゆる様式およびあらゆる数において組み合わせることができるということは理解されるべきである。様々に説明される実施例および好ましい実施形態は、明確に説明された実施形態のみに本発明を限定すると解釈すべきではない。この説明は、明確に説明される実施形態をいくつもの開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせる実施形態も、支持および包含すると理解されるべきである。さらに、本出願における全ての説明された要素のあらゆる順序および組合せは、文脈において明記されない限り、本出願の説明によって開示されるものと解釈すべきである。
【００４８】
本明細書において使用される用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｌｂｌ編，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載される通りに定義される。
【００４９】
本発明の実施は、そうでないと明記されない限り、当技術分野における文献において説明される、化学、生化学、細胞生理学、免疫学、遺伝子組換えＤＮＡ技術における従来の方法を用いるであろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。
【００５０】
以下の本明細書および特許請求の範囲全体を通して、文脈上必要とされない限り、言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、言明されたメンバー、整数、または工程の包含だけでなく、任意の他のメンバー、整数、もしくは工程、または、メンバー、整数、または工程の群の包含を含意するが、いくつかの実施形態では、そのような他のメンバー、整数、または工程、または、メンバー、整数、もしくは工程の群が除外される場合もある、すなわち、主題が、言明されたメンバー、整数、もしくは工程、またはメンバー、整数、または工程の群の包含からなることも理解されるべきである。本発明を説明する文脈において使用される用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに同様の指示語は（特に特許請求の範囲の文脈において）、本明細書において別段の指示がないか、または文脈において明確に否定されない限り、単数および複数の両方を網羅すると解釈されるできである。本明細書における値の範囲の列挙は、単にその範囲内に属する別々の各値を個別に言及するための簡単な方法として機能する。本明細書において別段の指示がない限り、個々の各値は、それらが本明細書において個別に列挙されるかのように、本明細書に組み入れられる。本明細書において説明される全ての方法は、そうでないことが本明細書において示されていない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、任意の適切な順序において実行することができる。本明細書において提供されるありとあらゆる実施例または例示言語（例えば、「例えば、〜など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に本発明をよりよく解説することを意図するものであり、そうでないことが主張されない限り、発明の範囲に制限を課すものではない。明細書におけるいかなる言語も、非請求要素を発明の実施に不可欠なものと指摘していると解釈すべきではない。
【００５１】
いくつかの文献が、本明細書の本文全体を通して引用されている。本明細書において引用された各文献（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書などを含む）は、上記および下記に関わらず、それらを参照することによりその全体を本明細書に組み入れる。本明細書のいかなる記載も、先行発明によるそのような開示に先行する権利がないことの承認として、解釈されるべきではない。
【００５２】
糖尿病の病態生理学との関連においてＧＬＰ−１受容体シグナル伝達およびＦＧＦ２１産生および作用の重要な要素を統合したシステム薬理学アプローチを使用することによって、発明者は、潜在的な有害作用（例えば、吐き気および嘔吐）を回避しながら、両方の活性剤（例えば、体重、脂質、血糖コントロールにおいて）の利益効果を達成するために、最適なＧＬＰ−１Ｒアゴニスト／ＦＧＦ２１化合物活性比を決定することに成功した。
【００５３】
用語「組合せ」は、本明細書において使用される場合、ＦＧＦ２１化合物およびＧＬＰ−１Ｒアゴニストを患者に別々に投与することによって、またはＦＧＦ２１化合物およびＧＬＰ−１Ｒアゴニストが存在する組合せ産物の形態、例えば、１つの医薬組成物または融合分子／タンパク質の形態でのいずれかによって、ＦＧＦ２１化合物およびＧＬＰ−１Ｒアゴニストを含む組合せを適用することができる手段を含むことを意味する。別々に投与される場合、投与は、同時にまたは逐次に、任意の順序において行うことができる。ＦＧＦ２１化合物およびＧＬＰ−１Ｒアゴニストの量ならびに関連する投与のタイミングは、所望の組合せ療法効果を達成するように選択される。組合せ物の投与は、同時に、（１）全ての医薬品有効成分を含む単一の医薬組成物において；または（２）医薬品有効成分の少なくとも１つをそれぞれが含む別々の医薬組成物においてであってもよい。あるいは、組合せ物は、ある治療薬剤が最初に投与され、二番目に他の薬剤が投与されるか、またはその逆において、連続して別々に投与してもよい。そのような連続投与は、時間的に近くであっても、または時間的に離れていてもよい。一実施形態において、組合せ物は、キット、例えば、本明細書において定義されるキットの形態で提供される。
【００５４】
用語「線維芽細胞増殖因子２１」または「ＦＧＦ２１」は、本明細書において使用される場合、当技術分野において公知の任意のＦＧＦ２１タンパク質を指し、特に、ヒトＦＧＦ２１を指す。一実施形態において、ヒトＦＧＦ２１は配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００５５】
用語「ＦＧＦ２１化合物」は、本明細書において使用される場合、概して、ＦＧＦ２１活性を有する化合物を指す。
【００５６】
一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物は、ペプチド化合物、すなわち、ペプチドまたはタンパク質である。
【００５７】
用語「ペプチド」は、本明細書において使用される場合、ペプチド結合によって共有結合的に連結された、例えば、２以上、または３以上、または４以上、または６以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１３以上、または１６以上、または２１以上のアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。ペプチドは、例えば、最大１００個のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」は、大きなペプチド、好ましくは、１００を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指す。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、互換的に使用される。
【００５８】
一実施形態においてＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異体であって、天然ＦＧＦ２１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００５９】
用語「天然ＦＧＦ２１」は、本明細書において使用される場合、天然に存在するＦＧＦ２１、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＦＧＦ２１を指す（「全長ヒト野生型ＦＧＦ２１」とも呼ばれる）。用語「天然ＦＧＦ２１」は、本明細書において使用される場合、成熟ＦＧＦ２１、すなわち、本来のシグナル配列（シグナルペプチドとも呼ばれる）を欠く天然に存在するＦＧＦ２１も含む。一実施形態において、天然ＦＧＦ２１は、配列番号１のアミノ酸１〜２８（Ｍ１〜Ａ２８）を欠く成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１であり、配列番号２によって表される。
【００６０】
２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間において同一であるアミノ酸の割合を示す。比較のための配列の最適化アラインメントは、手作業以外に、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２、４８２の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３の局所的相同性アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、２４４４の類似検索方法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、生成され得る。
【００６１】
ＦＧＦ２１変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基を天然ＦＧＦ２１（例えば、配列番号１または２）に対して欠失、付加および／または置換することに基づいてもよい。
【００６２】
このような、欠失、付加および／または置換は、天然ＦＧＦ２１（例えば、配列番号１または２）に比べて、変異体の安定性、例えば、タンパク質分解安定性および／または熱安定性などの増加に貢献することができる。これは、例えば、置換されたアミノ酸においてかまたはその近くでのプロテアーゼ切断の防止によって、または１つまたはそれ以上の追加のジスルフィド架橋の形成によって達成される。
【００６３】
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、本明細書において使用される場合、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、および天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸模倣物、それらの構造がそのような立体異性形態を許容する場合にはそれらのＤおよびＬ立体異性体の全てを指す。アミノ酸は、本明細書において、それらの名前もしくは一般的に知られるそれらの３文字記号のどちらかにおいて、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号によって呼ばれる。
【００６４】
アミノ酸に関連して使用される場合、用語「天然に存在する」は、慣習的な２０のアミノ酸（すなわち、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ））、ならびにセレノシステイン、ピロリシン（ＰＹＬ）、およびピロリン−カルボキシリシン（ＰＣＬ）を意味する。
【００６５】
用語「非天然アミノ酸」は、本明細書において使用される場合、自然にはコードされないかまたはどの有機体の遺伝子コードにも見出されないアミノ酸を意味することを指す。それらは、例えば、純粋に合成された化合物である場合がある。非天然アミノ酸の例としては、これらに限定されるわけではないが、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−アルギニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、およびチオプロリンが挙げられる。
【００６６】
用語「アミノ酸類似体」は、本明細書において使用される場合、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物を指す。アミノ酸類似体は、可逆的もしくは非可逆的に化学的に遮断されるか、またはそれらのＣ末端カルボキシ基、それらのＮ末端アミノ基、および／またはそれらの側鎖の官能基が化学的に修飾された、天然および非天然アミノ酸を含む。そのような類似体としては、これらに限定されるわけではないが、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホン、アスパラギン酸−（ベータメチルエステル）、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシン、およびメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。
【００６７】
用語「アミノ酸模倣物」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。
【００６８】
いくつかの実施形態において、変異体は、そのＮ末端に、少なくとも１つの追加のアミノ酸を含む。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、プロリンを除く天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣物から選択される。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｎ、およびＣからなる群から選択される。特定の実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、Ｇである。
【００６９】
本発明に使用するための適切なＦＧＦ２１変異体は、ＷＯ２０１６／１１４６３３Ａ１、ＷＯ２０１７／０９３４６５Ａ１、ＷＯ２０１７／０７４１１７Ａ１、ＷＯ２０１７／０７４１２３Ａ１およびＷＯ２０１８／０８８８３８Ａ１に記載され、それらを参照することにより本明細書に組み入れられる。
【００７０】
一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物は、配列番号３、４、５および６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＦＧＦ２１変異体である。
【００７１】
一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物は、以下：
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から９８〜１０１位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＥＩＲＰ（配列番号４４）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＶ（配列番号４５）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０〜１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸配列ＴＧＬＥＡＮ（配列番号４６）での置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１７４位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｎでの置換；
−  前述に定義される１つまたはそれ以上の変異と共に、配列番号２の天然ＦＧＦ２１のＮ末端から１８０位のアミノ酸残基の、アミノ酸Ｅでの置換；および
−  配列番号２の天然ＦＧＦ２１に比べて、ＦＧＦ２１変異体の免疫原性を減少させるための１〜１０個のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＦＧＦ２１変異体である。
【００７２】
所与のＦＧＦ２１変異体の免疫原性は、当技術分野で公知の従来の方法によって予測することができる。例えば、タンパク質の潜在的な免疫原性は、例えば、ｉＴｏｐｅ（商標）および／またはＴＣＥＤ（商標）方法を使用することによってスクリーニングすることができる。さらに、免疫原性を最小化するための変異は、当技術分野で公知の従来の方法によって設計することができる。例えば、潜在的な免疫原性を評価するために、免疫原性がＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）分析を実施することによって観察される場合、免疫原性を誘導するアミノ酸配列は、Ｔ細胞エピトープマッピングによって同定することができ、最小になった免疫原性を有する突然変異体は、インシリコの予測によって設計することができる。
【００７３】
一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物は、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００７４】
本発明の組合せ、医薬組成物および融合分子に含まれるＦＧＦ２１化合物は、天然ＦＧＦ２１（例えば、配列番号２）のＦＧＦ２１活性と同じまたは実質的に同じであるＦＧＦ２１活性を示す。一実施形態において、ＦＧＦ２１活性は、本明細書において定義される融合分子に含まれない（その成分ではない）場合、および／またはさらに改変されない場合（以下を参照のこと）、ＦＧＦ２１化合物のＦＧＦ２１活性を指す。
【００７５】
用語「実質的に同じ」は、本明細書において使用される場合、天然ＦＧＦ２１（例えば、配列番号２）のＦＧＦ２１活性の５０〜１５０％または６０〜１４０％または６５〜１３５％の範囲内にあるＦＧＦ２１活性を指す。
【００７６】
一実施形態において、用語「ＦＧＦ２１活性」（または「ＦＧＦ２１効力」）は、本明細書において使用される場合、ＦＧＦ２１受容体（ＦＧＦＲ、例えば、ＦＧＦＲ１ｃ）の活性を指す。一実施形態において、ＦＧＦ２１受容体は、ヒトＦＧＦ２１受容体である。一実施形態において、この用語は、インビトロにおける活性／効力を指す。別の実施形態において、この用語は、インビボにおける活性／効力を指す。一実施形態において、ＦＧＦ２１受容体の活性は、インビトロにおけるＦＧＦ２１化合物と接触したときのＦＧＦ２１受容体自己リン酸化を測定することによって決定される。一実施形態において、ＦＧＦ２１活性／効力は、Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用することによって決定される。一実施形態において、活性／効力は、ＥＣ５０値を決定することによって定量される。
【００７７】
用語「Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイ」は、本明細書において使用される場合、免疫細胞化学的アッセイ、より詳しくは、通常はマイクロプレート（例えば、９６ウェル形式または３８４ウェル形式）において実施される、定量的免疫蛍光アッセイを指す。それは、ウェスタンブロットの特異性を、ＥＬＩＳＡの再現性および処理能力と組み合わせるものである（例えば、Ａｇｕｉｌａｒ  Ｈ．Ｎ．ら（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（４）：ｅ９９６５を参照されたい）。適切なＩＣＷアッセイシステムは市販されている（例えば、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）。一実施形態において、抗ｐＦＧＦＲおよび／または抗ｐＥＲＫは、ＩＣＷアッセイにおいて使用される。一実施形態において、ｐＦＧＦＲ  ＩＣＷアッセイが実施される。一実施形態において、ＩＣＷアッセイは、本質的に実施例３において説明されるように実施される。一実施形態において、ＩＣＷアッセイは、本質的に実施例３において説明されるように実施される。
【００７８】
一実施形態において、天然ＦＧＦ２１のＦＧＦ２１活性と同じまたは実質的に同じであるＦＧＦ２１活性を有するＦＧＦ２１化合物は、ＦＧＦ２１受容体活性のＥＣ５０値に関して定義することができる。例えば、天然ＦＧＦ２１（例えば、配列番号２）のＦＧＦ２１活性の５０〜１５０％または６０〜１４０％または６５〜１３５％の範囲内にあるＦＧＦ２１活性を有するＦＧＦ２１化合物は、ｐＦＧＦＲ  ＩＣＷアッセイ、例えば、実施例３において本質的に説明されるように、それぞれ、２．４０〜７．２０ｎｍｏｌ／Ｌまたは２．８８〜６．７２ｎｍｏｌ／Ｌまたは３．１２〜６．４８ｎｍｏｌ／ＬのＥＣ５０を有するＦＧＦ２１受容体を活性化するＦＧＦ２１化合物として、本明細書において示すこともできる。一実施形態において、ＥＣ５０値は、ＥＣ５０±ＳＤとして与えられる。一実施形態において、ＳＤは、アッセイ依存性標準偏差である。一実施形態において、ＥＣ５０は、ｐＦＧＦＲ  ＩＣＷアッセイ、例えば、実施例３において本質的に説明されるように、それぞれ、２．４０±ＳＤ〜７．２０±ＳＤｎｍｏｌ／Ｌまたは２．８８±ＳＤ〜６．７２±ＳＤｎｍｏｌ／Ｌまたは３．１２±ＳＤ〜６．４８±ＳＤｎｍｏｌ／Ｌである。一実施形態において、ＳＤは１．８ｎｍｏｌ／Ｌである。
【００７９】
本発明により、例えば、以下にさらに説明されるように、ＦＧＦ２１化合物は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）または、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくは免疫グロブリンもしくはその変異体のＦｃ領域／ドメインのようなペプチド／ポリペプチドのような、別の実体／分子にさらに改変、例えば、融合／コンジュゲートすることができる。一実施形態において、本明細書に示されるＦＧＦ２１化合物のＦＧＦ２１活性は、このようなさらなる改変のないＦＧＦ２１化合物のＦＧＦ２１活性であり、本明細書では「純粋ＦＧＦ２１化合物」とも呼ばれる。
【００８０】
用語「融合した」は、本明細書において使用される場合、特に、例えば、遺伝子組換えＤＮＡ技術などによる、遺伝子融合を指す。（ポリ）ペプチド半減期延長モジュールのアミノ酸配列は、変異体のアミノ酸配列内の任意の位置に導入することができ、例えば、コードされたタンパク質構造内においてループ形状を取ってもよく、または、Ｎ末端もしくはＣ末端に融合させることもできる。
【００８１】
用語「にコンジュゲートさせる」は、本明細書において使用される場合、特に、結果として（ポリ）ペプチドと別の分子との間、例えば、変異体および半減期延長モジュールなどとの間において安定な共有結合を生じる、化学的および／または酵素的コンジュゲーションを指す。そのようなコンジュゲーションは、（ポリ）ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または特定の側鎖において、例えば、リジン、システイン、チロシン、または非天然アミノ酸残基において、生じてもよい。
【００８２】
用語「ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト」（省略して「ＧＬＰ−１ＲＡ」）は、本明細書において使用される場合、概して（一次ＧＬＰ−１Ｒアゴニストとして）ＧＬＰ−１のようなＧＬＰ−１受容体に結合するおよびＧＬＰ−１受容体を活性化する化合物を指す。
【００８３】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ペプチド化合物、すなわち、ペプチドまたはタンパク質である。別の実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、小分子、すなわち、９００Ｄａ未満の分子量を有する有機化合物である。
【００８４】
本発明の組合せ、医薬組成物および融合分子に含まれるＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、本明細書において定義される天然ＧＬＰ−１（７−３６）のものに比べて、減少したＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を示す。「ｘ分の１の」という表現における「ｘ」という値は、本明細書において使用される場合、「減衰率」または「減衰係数」として本明細書に示すことができる。一実施形態において、本明細書において定義される天然ＧＬＰ−１（７−３６）のものに比べて減少したＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが本明細書において定義される融合分子の成分である場合、示される。
【００８５】
用語「天然ＧＬＰ−１（７−３６）」は、本明細書において使用される場合、場合により、そのＣ末端にアミド基を含む配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。
【００８６】
一実施形態において、用語「ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性」（または「ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト効力」）は、本明細書において使用される場合、ＧＬＰ−１受容体の活性を指す。一実施形態において、この用語は、インビトロにおけるアゴニスト活性／効力を指す。別の実施形態において、この用語は、インビボにおけるアゴニスト活性／効力を指す。一実施形態において、ＧＬＰ−１受容体の活性は、インビトロにおけるアゴニストと接触したときのＧＬＰ−１受容体を安定的に発現する細胞のｃＡＭＰ反応を測定することによって決定される。一実施形態において、細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞株に由来する。一実施形態において、ＧＬＰ−１受容体は、ヒトＧＬＰ−１受容体である。一実施形態において、ＧＬＰ−１受容体の活性は、本質的に実施例４において説明されるように決定される。一実施形態において、活性／効力は、ＥＣ５０値を決定することによって定量される。
【００８７】
一実施形態において、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて減少したＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、例えば、表４に示されるように、ＧＬＰ−１受容体活性のＥＣ５０値に関して定義することができる。例えば、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に比べて９〜５３１分の１のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、６．９３〜４０８．８７ｐｍｏｌ／Ｌ等のＥＣ５０を有するＧＬＰ−１受容体を活性化するＧＬＰ−１Ｒアゴニストとして、本明細書に示すこともできる。一実施形態において、ＥＣ５０値は、上記において説明されるように決定される。一実施形態において、ＥＣ５０値は、ＥＣ５０±ＳＤとして与えられる。一実施形態において、ＳＤは、アッセイ依存性標準偏差である。
【００８８】
天然ＧＬＰ−１（７−３６）のものに比べて減少したＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有する適切なＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性、例えば、実施例４において、またはＸｉａｏら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４０（９）：２８６０−９またはＧａｕｌｔら（２０１３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８８（４９）：３５５８１−９１において説明されるようなアッセイ、例えば、サイトゾルｃＡＭＰのＧＬＰ−１Ｒアゴニスト誘導性産生、β細胞保存作用（アポトーシス）、またはグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）等において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性の決定について、本明細書において説明されるアッセイによって同定することができる。適切なＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、例えば、ランダムまたは部位特異的変異誘発または化学合成（例えば、実施例５を参照のこと）、および対照として天然ＧＬＰ−１（７−３６）を使用して、本明細書において説明されるＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性の事後決定によって、天然ＧＬＰ−１（７−３６）のような公知のペプチドＧＬＰ−１Ｒアゴニストの変異体を産生することによって、同定することができる。あるいは、適切なＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、対照として天然ＧＬＰ−１（７−３６）を使用して、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性に関して小分子ライブラリをスクリーニングすることによって、同定することができる。これらのアッセイの全ては、ハイスループットアッセイの形態で実施することができる。
【００８９】
公知のペプチドＧＬＰ−１Ｒアゴニスト（例えば、天然ＧＬＰ−１（７−３６））の変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基を公知のペプチドＧＬＰ−１Ｒアゴニストのアミノ酸配列に対して欠失、付加および／または置換することに基づいてもよい。
【００９０】
一実施形態において、変異体は、最大１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５個のアミノ酸残基の置換を含む。
【００９１】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の配列において、最大１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５個のアミノ酸残基の置換を含むＧＬＰ−１（７−３６）の変異体である。一実施形態において、置換は、Ａ８Ｇ、Ｖ１６Ｌ、Ｖ１６Ｋ、Ｓ１８Ｋ、Ｓ１８Ｉ、Ｙ１９Ｑ、Ｌ２０Ｍ、Ｅ２１Ｄ、Ｇ２２Ｅ、Ｑ２３Ｅ、Ａ２４Ｒ、Ａ２５Ｖ、Ｋ２６Ｒ、Ｋ２６Ｑ、Ｅ２７Ｌ、Ａ３０Ｅ、Ｖ３３Ｋ、Ｖ３３Ｌ、Ｖ３３Ｅ、Ｋ３４Ｎ、Ｋ３４Ａ、Ｇ３５ＴおよびＲ３６Ｇならびに／または表５（配列番号８〜２０の記述を参照のこと）に挙げられる置換を含むまたはそれからなる群から選択される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、変異体は、そのＮ末端に、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、プロリンを除く天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣物から選択される。一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、Ｇ、Ａ、Ｎ、およびＣからなる群から選択される。特定の実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、（単一の）Ｇである。
【００９３】
いくつかの実施形態において、変異体は、そのＣ末端にペプチド延長を含む。ペプチド延長は、例えば、最大１２、１１または１０個のアミノ酸残基からなってもよい。一実施形態において、ペプチド延長は、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３８）、ＰＶＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３９）、ＰＳＳＧＥＰＰＰＥＳ（配列番号４０）、ＰＳＳＧＥＰＰＰＥ（配列番号４１）、ＰＫＫＱＲＬＳ（配列番号４２）およびＰＫＫＩＲＹＳ（配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００９４】
一実施形態において、本明細書において定義される天然ＧＬＰ−１（７−３６）に比べて減少したＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、アミノ酸配列
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｘ１０−Ｓ−Ｘ１２−Ｑ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｅ−Ｅ−Ｘ１８−Ｖ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０（配列番号３７）を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなり、
式中
Ｘ１０は任意のアミノ酸、例えば、ＬまたはＫであり；
Ｘ１２は任意のアミノ酸、例えば、ＫまたはＩであり；
Ｘ１４は任意のアミノ酸、例えば、ＬまたはＭであり；
Ｘ１５は任意のアミノ酸、例えば、ＥまたはＤであり；
Ｘ１８は任意のアミノ酸、例えば、ＡまたはＲであり；
Ｘ２０は任意のアミノ酸、例えば、ＲまたはＱであり；
Ｘ２１は任意のアミノ酸、例えば、ＬまたはＥであり；
Ｘ２７は任意のアミノ酸、例えば、Ｌ、Ｅ、ＫまたはＶであり；
Ｘ２８は任意のアミノ酸、例えば、Ａ、ＮまたはＫであり；
Ｘ２９は任意のアミノ酸、例えば、ＴまたはＧであり；
Ｘ３０は任意のアミノ酸、例えば、ＧまたはＲであり；
場合により、アミノ酸配列は、そのＮ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、場合により、アミノ酸配列は、そのＣ末端に最大１２、１１または１０個のアミノ酸残基からなるペプチド延長を含む。
【００９５】
一実施形態において、Ｘ２７はＬ、ＥまたはＶであり、例えばＬである。一実施形態において、Ｘ２８はＡまたはＫであり、例えばＡである。
【００９６】
一実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、Ｇ、Ａ、Ｎ、およびＣからなる群から選択される。特定の実施形態において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基は、（単一の）Ｇである。
【００９７】
一実施形態において、ペプチド延長は、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３８）、ＰＶＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３９）、ＰＳＳＧＥＰＰＰＥＳ（配列番号４０）、ＰＳＳＧＥＰＰＰＥ（配列番号４１）、ＰＫＫＱＲＬＳ（配列番号４２）およびＰＫＫＩＲＹＳ（配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００９８】
Ｎ末端におけるＧの導入またはＸ１２＝Ｉのような本明細書において説明される改変は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性の適切な減少へと導く。
【００９９】
一実施形態において、本明細書において定義される天然ＧＬＰ−１（７−３６）のものに比べて減少したＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性を有するＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、配列番号９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。
【０１００】
一実施形態において、Ｘ１４はＬであり、Ｘ２８はＡである。
【０１０１】
一実施形態において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、配列番号９、１０、１２、１４、１６、１７、１９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。
【０１０２】
本発明において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、例えば、ＦＧＦ２１化合物に関連して、上記において説明されるように、さらに改変することができる。例えば、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、免疫グロブリンまたはその変異体のＦｃ領域／ドメイン、例えば、本明細書において説明される免疫グロブリンまたはその変異体のＦｃ領域／ドメインに融合することができる。
【０１０３】
本明細書による医薬組成物は、１種もしくはそれ以上の担体および／または賦形剤を含み、それら全ては、薬学的に許容されるものである。用語「薬学的に許容される」は、本明細書において使用される場合、好ましくは、該医薬組成物の活性剤の作用と相互作用しない材料の非毒性を意味する。
【０１０４】
用語「担体」は、適用を促進、増強、または可能にするために有効成分と組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、用語「担体」は、対象への投与にとって好適な、１種またはそれ以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤、または封入物質も含む。
【０１０５】
非経口投与のための可能な担体物質は、例えば、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、生理食塩水、静菌性生理食塩水（例えば、０．９％ベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン／ポリオキシ−プロピレンコポリマーである。
【０１０６】
用語「賦形剤」は、本明細書において使用される場合、有効成分ではないが医薬組成物中に存在していてもよい全ての物質、例えば、塩、結合剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール）、充填剤、潤滑剤、増粘剤、表面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤物質、香味剤、または着色剤などを含むことが意図される。
【０１０７】
薬学的に許容される塩を製造するために、薬学的に許容されない塩を使用してもよく、それらは本発明に含まれる。この種類の薬学的に許容される塩は、非限定的に以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから製造されるものを含む。薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などとして製造することもできる。塩は、イオン強度または張度を調節するために加えることができる。
【０１０８】
医薬組成物での使用のための好適な防腐剤としては、酸化防止剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、システイン、メチオニン、パラベン、チメロサール、フェノール、クレゾールおよびその混合物が挙げられる。
【０１０９】
医薬組成物での使用のための好適な緩衝物質としては、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、塩でのリン酸、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス、ＴＨＡＭ、トロメタモール）が挙げられる。
【０１１０】
本発明による医薬組成物は、好ましくは、滅菌である。医薬組成物は、一様な剤形において提供され、それ自体公知の様式において製造することができる。医薬組成物は、例えば、溶液剤または懸濁剤の形態であってもよい。
【０１１１】
医薬組成物は、適切な希釈剤によって再構成される、安定な凍結乾燥された製品として製剤化することもでき、場合により、上記において定義されるような１種またはそれ以上の賦形剤を含む。
【０１１２】
本発明による医薬組成物は、少なくとも１種の他の医薬品有効成分をさらに含んでもよい。
【０１１３】
用語「医薬品有効成分」（ＡＰＩ）は、本明細書において使用される場合、いくつらかの薬理効果を提供し、例えば、本明細書において定義される疾患または障害などの状態を治療または予防するために使用される、任意の薬学的に活性な化学的または生物学的化合物ならびにそれらの任意の薬学的に許容される塩およびそれらの任意の混合物を含む。例示的な薬学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、マレイン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、クエン酸、酒石酸、パモン酸、ラウリン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、ラウリル硫酸、ナフタリンスルホン酸、リノール酸、リノレン酸などが挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「医薬品有効成分」、「活性剤」、「有効成分」、「活性物質」、「治療的に活性な化合物」、および「薬物」は、同義語であることが意図され、すなわち、同一の意味を有する。
【０１１４】
本発明により、医薬品有効成分は、場合により、以下から選択される：
−  Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１４において言及される全ての薬物、例えば、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１４、ｃｈａｐｔｅｒ  １２において言及される全ての抗糖尿病薬、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１４、ｃｈａｐｔｅｒ  ０６において言及される全ての体重減量剤または食欲抑制剤、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１４、ｃｈａｐｔｅｒ  ５８において言及される全ての脂質低下剤、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１４  ｃｈａｐｔｅｒ  １７において言及される全ての抗高血圧症薬、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅにおいて言及される全ての腎臓保護薬（ｎｅｐｈｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）、またはＲｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１４ｃｈａｐｔｅｒ  ３６において言及される全ての利尿薬など；
−  インスリンおよびインスリン誘導体、例えば：インスリングラルギン（例えば、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標））、１００Ｕ／ｍＬ超に濃縮されたインスリングラルギン、例えば、２７０〜３３０Ｕ／ｍＬのインスリングラルギンまたは３００Ｕ／ｍＬのインスリングラルギン（ＥＰ２３８７９８９において開示される）、インスリングルリシン（例えば、Ａｐｉｄｒａ（登録商標））、インスリンデテミル（例えば、Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標））、インスリンリスプロ（例えば、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）、Ｌｉｐｒｏｌｏｇ（登録商標））、インスリンデグルデク（例えば、ＤｅｇｌｕｄｅｃＰｌｕｓ（登録商標）、ＩｄｅｇＬｉｒａ（ＮＮ９０６８））、インスリンアスパルトおよびアスパルト製剤（例えば、ＮｏｖｏＬｏｇ（登録商標））、基礎インスリンおよび類似体（例えば、ＬＹ２６０５５４１、ＬＹ２９６３０１６、ＮＮ１４３６）、ペグ化インスリンリスプロ（例えば、ＬＹ−２７５５８５）、長時間作用型インスリン（例えば、ＮＮ１４３６、Ｉｎｓｕｍｅｒａ（ＰＥ０１３９）、ＡＢ−１０１、ＡＢ−１０２、Ｓｅｎｓｕｌｉｎ  ＬＬＣ）、中間時間作用型インスリン（例えば、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｎ、Ｎｏｖｏｌｉｎ（登録商標）Ｎ）、速効性および短時間作用型インスリン（例えば、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ、Ｎｏｖｏｌｉｎ（登録商標）Ｒ、Ｌｉｎｊｅｔａ（登録商標）（ＶＩＡｊｅｃｔ（登録商標））、ＰＨ２０インスリン、ＮＮ１２１８、ＨｉｎｓＢｅｔ（登録商標））、予備混合インスリン、ＳｕｌｉＸｅｎ（登録商標）、ＮＮ１０４５、インスリン＋Ｓｙｍｌｉｎ（登録商標）、ＰＥ−０１３９、ＡＣＰ−００２ヒドロゲルインスリン、および経口、吸入可能、経皮、および口腔、または舌下インスリン（例えば、Ｅｘｕｂｅｒａ（登録商標）、Ｎａｓｕｌｉｎ（登録商標）、Ａｆｒｅｚｚａ（登録商標）、インスリントレゴピル（ｔｒｅｇｏｐｉｌ）、ＴＰＭ−０２インスリン、Ｃａｐｓｕｌｉｎ（登録商標）、Ｏｒａｌ−ｌｙｎ（登録商標）、Ｃｏｂａｌａｍｉｎ（登録商標）、経口インスリン、ＯＲＭＤ−０８０１、Ｏｓｈａｄｉ経口インスリン、ＮＮ１９５３、ＮＮ１９５４、ＮＮ１９５６、ＶＩＡｔａｂ（登録商標））。二官能性リンカーによってアルブミンまたは他のタンパク質に結合したこれらのインスリンの誘導体も好適である；
−  グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−１類似体、およびＧＬＰ−１受容体アゴニスト、例えば：ＧＬＰ−１（７〜３７）、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド、リキシセナチド（例えば、Ｌｙｘｕｍｉａ（登録商標））、エキセナチド（例えば、エキセンディン−４、ｒエキセンディン−４、Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）、Ｂｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標）、エキセナチドＮｅｘＰ）、エキセナチド−ＬＡＲ、リラグルチド（例えば、Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標））、セマグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド、デュラグルチド、アルブゴン、オキシントモジュリン、ゲニプロシド、ＡＣＰ−００３、ＣＪＣ−１１３１、ＣＪＣ−１１３４−ＰＣ、ＧＳＫ−２３７４６９７、ＰＢ−１０２３、ＴＴＰ−０５４、ラングレナチド（ＨＭ−１１２６０Ｃ）、ＣＭ−３、ＧＬＰ−１Ｅｌｉｇｅｎ、ＡＢ−２０１、ＯＲＭＤ−０９０１、ＮＮ９９２４、ＮＮ９９２６、ＮＮ９９２７、Ｎｏｄｅｘｅｎ、Ｖｉａｄｏｒ−ＧＬＰ−１、ＣＶＸ−０９６、ＺＹＯＧ−１、ＺＹＤ−１、ＺＰ−３０２２、ＣＡＭ−２０３６、ＤＡ−３０９１、ＤＡ−１５８６４、ＡＲＩ−２６５１、ＡＲＩ−２２５５、エキセナチド−ＸＴＥＮ（ＶＲＳ−８５９）、エキセナチド−ＸＴＥＮ＋グルカゴン−ＸＴＥＮ（ＶＲＳ−８５９＋ＡＭＸ−８０８）、およびポリマー結合ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１類似体；
−  二重ＧＬＰ−１／ＧＩＰアゴニスト（例えば、ＲＧ−７６９７（ＭＡＲ−７０１）、ＭＡＲ−７０９、ＢＨＭ０８１、ＢＨＭ０８９、ＢＨＭ０９８）；二重ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト（例えばＢＨＭ−０３４、ＯＡＰ−１８９（ＰＦ−０５２１２３８９、ＴＫＳ−１２２５）、ＴＴ−４０１／４０２、ＺＰ２９２９、ＬＡＰＳ−ＨＭＯＸＭ２５、ＭＯＤ−６０３０）；
−  二重ＧＬＰ−１／ガストリンアゴニスト（例えば、ＺＰ−３０２２）；
−  胃腸ペプチド、例えば、ペプチドＹＹ３−３６（ＰＹＹ３−３６）またはその類似体および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）またはその類似体；
−  グルカゴン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、グレリンアンタゴニストまたはインバースアゴニスト、キセニンおよびその類似体；
−  ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−４）阻害剤、例えば：アログリプチン（例えば、Ｎｅｓｉｎａ（登録商標）、Ｋａｚａｎｏ（登録商標））、リナグリプチン（例えば、Ｏｎｄｅｒｏ（登録商標）、Ｔｒａｊｅｎｔａ（登録商標）、Ｔｒａｄｊｅｎｔａ（登録商標）、Ｔｒａｙｅｎｔａ（登録商標））、サキサグリプチン（例えば、Ｏｎｇｌｙｚａ（登録商標）、Ｋｏｍｂｏｇｌｙｚｅ  ＸＲ（登録商標））、シタグリプチン（例えば、Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）、Ｘｅｌｅｖｉａ（登録商標）、Ｔｅｓａｖｅｌ（登録商標）、Ｊａｎｕｍｅｔ（登録商標）、Ｖｅｌｍｅｔｉａ（登録商標）、Ｊｕｖｉｓｙｎｃ（登録商標）、Ｊａｎｕｍｅｔ  ＸＲ（登録商標））、アナグリプチン、テネリグリプチン（例えば、Ｔｅｎｅｌｉａ（登録商標））、トレラグリプチン、ビルダグリプチン（例えば、Ｇａｌｖｕｓ（登録商標）、Ｇａｌｖｕｍｅｔ（登録商標））、ゲミグリプチン、オマリグリプチン、エボグリプチン、デュトグリプチン、ＤＡ−１２２９、ＭＫ−３１０２、ＫＭ−２２３、ＫＲＰ−１０４、ＰＢＬ−１４２７、ピノキサシンヒドロクロリド、およびＡｒｉ−２２４３；
−  ナトリウム依存性グルコーストランスポーター２（ＳＧＬＴ−２）阻害剤、例えば：カナグリフロジン、ダパグリフロジン、レモグリフロジン、エタボン酸レモグリフロジン、セルグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、ルセオグリフロジン、エルツグリフロジン、ＥＧＴ−０００１４４２、ＬＩＫ−０６６、ＳＢＭ−ＴＦＣ−０３９、およびＫＧＡ−３２３５（ＤＳＰ−３２３５）；
−  ＳＧＬＴ−２およびＳＧＬＴ−１の二重阻害剤（例えば、ＬＸ−４２１１、ＬＩＫ０６６）。
−  肥満防止薬、例えば、回腸型胆汁酸トランスポーター（ＩＢＡＴ）阻害剤（例えば、ＧＳＫ−１６１４２３５＋ＧＳＫ−２３３０６７２）と組み合わせたＳＧＬＴ−１阻害剤（例えばＬＸ−２７６１、ＫＧＡ−３２３５）またはＳＧＬＴ−１阻害剤；
−  ビグアニド（例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン）；
−  チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン）、グリタゾン類似体（例えば、ロベグリタゾン）；
−  ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ−）（アルファ、ガンマ、またはアルファ／ガンマ）アゴニストまたはモジュレーター（例えば、サログリタザル（例えば、Ｌｉｐａｇｌｙｎ（登録商標））、ＧＦＴ−５０５）、またはＰＰＡＲガンマ部分アゴニスト（例えば、Ｉｎｔ−１３１）；
−  スルホニル尿素（例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリメピリド、Ａｍａｒｙｌ（登録商標）、グリピザイド）およびメグリチニド（例えば、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド）；
−  アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール、ボグリボース）；
−  アミリンおよびアミリン類似体（例えば、プラムリンチド、Ｓｙｍｌｉｎ（登録商標））；
−  Ｇタンパク質結合受容体１１９（ＧＰＲ１１９）アゴニスト（例えば、ＧＳＫ−１２９２２６３、ＰＳＮ−８２１、ＭＢＸ−２９８２、ＡＰＤ−５９７、ＡＲＲＹ−９８１、ＺＹＧ−１９、ＤＳ−８５００、ＨＭ−４７０００、ＹＨ−Ｃｈｅｍ１）；
−  ＧＰＲ４０アゴニスト（例えば、ＴＵＧ−４２４、Ｐ−１７３６、Ｐ−１１１８７、ＪＴＴ−８５１、ＧＷ９５０８、ＣＮＸ−０１１−６７、ＡＭ−１６３８、ＡＭ−５２６２）；
−  ＧＰＲ１２０アゴニストおよびＧＰＲ１４２アゴニスト；
−  全身性または低吸収性ＴＧＲ５（ＧＰＢＡＲ１＝Ｇタンパク質結合胆汁酸受容体１）アゴニスト（例えば、ＩＮＴ−７７７、ＸＬ−４７５、ＳＢ７５６０５０）；
−  糖尿病免疫療法、例えば：経口Ｃ−Ｃケモカインレセプタータイプ２（ＣＣＲ−２）アンタゴニスト（例えば、ＣＣＸ−１４０、ＪＮＪ−４１４４３５３２）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１β）アンタゴニスト（例えばＡＣ−２０１）、または経口モノクローナル抗体（ＭｏＡ）（例えば、メタゾラミド、ＶＶＰ８０８、ＰＡＺ−３２０、Ｐ−１７３６、ＰＦ−０５１７５１５７、ＰＦ−０４９３７３１９）；
−  メタボリック症候群および糖尿病の治療のための抗炎症剤、例えば：核内因子カッパＢ阻害剤（例えば、Ｔｒｉｏｌｅｘ（登録商標））；
−  アデノシンモンリン酸−活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）刺激剤、例えば：Ｉｍｅｇｌｉｍｉｎ（ＰＸＬ−００８）、Ｄｅｂｉｏ−０９３０（ＭＴ−６３−７８）、Ｒ−１１８；
−  １１−ベータ−ヒドロキシステロイド脱水素酵素１（１１−ベータ−ＨＳＤ−１）の阻害剤（例えば、ＬＹ２５２３１９９、ＢＭＳ７７０７６７、ＲＧ−４９２９、ＢＭＳ８１６３３６、ＡＺＤ−８３２９、ＨＳＤ−０１６、ＢＩ−１３５５８５）；
−  グルコキナーゼの活性剤（例えば、ＰＦ−０４９９１５３２、ＴＴＰ−３９９（ＧＫ１−３９９）、ＧＫＭ−００１（ＡＤＶ−１００２４０１）、ＡＲＲＹ−４０３（ＡＭＧ−１５１）、ＴＡＫ−３２９、ＴＭＧ−１２３、ＺＹＧＫ１）；
−  ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の阻害剤（例えば、プラジガスタット（ＬＣＱ−９０８））、プロテインチロシンホスファターゼ１の阻害剤（例えば、トロズスクエミン）、グルコース−６−ホスファターゼの阻害剤、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼの阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼの阻害剤、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼの阻害剤、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼの阻害剤；
−  グルコーストランスポーター−４のモジュレーター、ソマトスタチン受容体３アゴニスト（例えば、ＭＫ−４２５６）；
−  １種またはそれ以上の脂質低下剤も組合せパートナーとして好適であり、例えば：
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイム−Ａ−レダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ）阻害剤、例えば、シンバスタチン（例えば、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）、Ｉｎｅｇｙ（登録商標）、Ｓｉｍｃｏｒ（登録商標））、アトルバスタチン（例えば、Ｓｏｒｔｉｓ（登録商標）、Ｃａｄｕｅｔ（登録商標））、ロスバスタチン（例えば、Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標））、プラバスタチン（例えば、Ｌｉｐｏｓｔａｔ（登録商標）、Ｓｅｌｉｐｒａｎ（登録商標））、フルバスタチン（例えば、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標））、ピタバスタチン（例えば、Ｌｉｖａｚｏ（登録商標）、Ｌｉｖａｌｏ（登録商標））、ロバスタチン（例えば、Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標）、Ａｄｖｉｃｏｒ（登録商標））、メバスタチン（例えば、Ｃｏｍｐａｃｔｉｎ（登録商標））、リバスタチン、セリバスタチン（Ｌｉｐｏｂａｙ（登録商標））、フィブレート、例えば、ベザフィブレート（例えば、Ｃｅｄｕｒ（登録商標）ｒｅｔａｒｄ）、シプロフィブレート（例えば、Ｈｙｐｅｒｌｉｐｅｎ（登録商標））、フェノフィブレート（例えば、Ａｎｔａｒａ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｎ（登録商標）、Ｌｉｐａｎｔｈｙｌ（登録商標））、ゲンフィブロジル（例えば、Ｌｏｐｉｄ（登録商標）、Ｇｅｖｉｌｏｎ（登録商標））、エトフィブレート、シンフィブレート、ロニフィブレート、クリノフィブレート、クロフィブリド、ニコチン酸およびその誘導体（例えば、ナイアシン、例えば、ナイアシンの徐放性製剤など）、ニコチン酸受容体１アゴニスト（例えば、ＧＳＫ−２５６０７３）、ＰＰＡＲ−デルタアゴニスト、アセチル−ＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤（例えば、アバシミベ）、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ、Ｅｚｅｔｒｏｌ（登録商標）、Ｚｅｔｉａ（登録商標）、Ｌｉｐｔｒｕｚｅｔ（登録商標）、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標）、Ｓ−５５６９７１）、胆汁酸結合物質（例えば、コレスチラミン、コレセベラム）、回腸胆汁酸トランスポート（ＩＢＡＴ）阻害剤（例えば、ＧＳＫ−２３３０６７２、ＬＵＭ−００２）、ミクロソーマールトリグリセリド移転タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤（例えば、ロミタピド（ＡＥＧＲ−７３３）、ＳＬｘ−４０９０、グラノタピド）、前駆タンパク質転換酵素ズブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）のモジュレーター（例えば、アリロクマブ（ＲＥＧＮ７２７／ＳＡＲ２３６５５３）、ＡＭＧ−１４５、ＬＧＴ−２０９、ＰＦ−０４９５０６１５、ＭＰＳＫ３１６９Ａ、ＬＹ３０１５０１４、ＡＬＤ−３０６、ＡＬＮ−ＰＣＳ、ＢＭＳ−９６２４７６、ＳＰＣ５００１、ＩＳＩＳ−３９４８１４、１Ｂ２０、ＬＧＴ−２１０、１Ｄ０５、ＢＭＳ−ＰＣＳＫ９Ｒｘ−２、ＳＸ−ＰＣＫ９、ＲＧ７６５２）、ＬＤＬ受容体アップレギュレーター、例えば、肝臓選択性甲状腺ホルモン受容体ベータアゴニス（例えば、エプロチローム（ＫＢ−２１１５）、ＭＢ０７８１１、ソベチロム（ＱＲＸ−４３１）、ＶＩＡ−３１９６、ＺＹＴ１）、ＨＤＬ−上昇化合物（ＨＤＬ−ｒａｉｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、例えば：コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤（例えば、アナセトラピブ（ＭＫ０８５９）、ダル���トラピブ、エバセトラピブ、ＪＴＴ−３０２、ＤＲＬ−１７８２２、ＴＡ−８９９５、Ｒ−１６５８、ＬＹ−２４８４５９５、ＤＳ−１４４２）、または二重ＣＥＴＰ／ＰＣＳＫ９阻害剤（例えばＫ−３１２）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ１）レギュレーター、脂質代謝モジュレーター（例えば、ＢＭＳ−８２３７７８、ＴＡＰ−３０１、ＤＲＬ−２１９９４、ＤＲＬ−２１９９５）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害剤（例えば、ダラプラディブ、Ｔｙｒｉｓａ（登録商標）、バレスプラジブ、リラプラジブ）、ＡｐｏＡ−Ｉエンハンサー（例えば、ＲＶＸ−２０８、ＣＥＲ−００１、ＭＤＣＯ−２１６、ＣＳＬ−１１２）、コレステロール合成阻害剤（例えば、ＥＴＣ−１００２）、脂質代謝モジュレーター（例えば、ＢＭＳ−８２３７７８、ＴＡＰ−３０１、ＤＲＬ−２１９９４、ＤＲＬ−２１９９５）、およびオメガ−３脂肪酸およびその誘導体（例えば、イコサペント酸エチル（ＡＭＲ１０１）、Ｅｐａｎｏｖａ（登録商標）、ＡＫＲ−０６３、ＮＫＰＬ−６６、ＰＲＣ−４０１６、ＣＡＴ−２００３）；
−  ブロモクリプチン（例えば、Ｃｙｃｌｏｓｅｔ（登録商標）、Ｐａｒｌｏｄｅｌ（登録商標））、フェンテルミンおよびフェンテルミン処方物または組合せ（例えば、Ａｄｉｐｅｘ−Ｐ、Ｉｏｎａｍｉｎ、Ｑｓｙｍｉａ（登録商標））、ベンズフェタミン（例えば、Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標））、ジエチルプロピオン（例えば、Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標））、フェンジメトラジン（例えば、Ａｄｉｐｏｓｔ（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ（登録商標））、ブプロピオンおよび組合せ（例えば、Ｚｙｂａｎ（登録商標）、Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ  ＸＬ（登録商標）、Ｃｏｎｔｒａｖｅ（登録商標）、Ｅｍｐａｔｉｃ（登録商標））、シブトラミン（例えば、Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標）、Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標））、トピラマート（例えば、Ｔｏｐａｍａｘ（登録商標））、ゾニサミド（例えば、Ｚｏｎｅｇｒａｎ（登録商標））、テソフェンシン、オピオイドアンタゴニスト、例えば、ナルトレキソン（例えば、Ｎａｌｔｒｅｘｉｎ（登録商標）、ナルトレキソン＋ブプロピオン）、カンナビノイド受容体１（ＣＢ１）アンタゴニスト（例えば、ＴＭ−３８８３７）、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ−１）アンタゴニスト（例えば、ＢＭＳ−８３０２１６、ＡＬＢ−１２７１５８（ａ））、ＭＣ４受容体アゴニストおよび部分的アゴニスト（例えば、ＡＺＤ−２８２０、ＲＭ−４９３）、ニューロペプチドＹ５（ＮＰＹ５）またはＮＰＹ２アンタゴニスト（例えば、ベルネペリト、Ｓ−２３４４６２）、ＮＰＹ４アゴニスト（例えば、ＰＰ−１４２０）、ベータ−３−アドレナリン受容体アゴニスト、レプチンまたはレプチン模倣物、５−ヒドロキシトリプタミン２ｃ（５ＨＴ２ｃ）受容体のアゴニスト（例えば、ロルカセリン、Ｂｅｌｖｉｑ（登録商標））、プラムリンチド／メトレレプチン、リパーゼ阻害剤、例えば、セチリスタット（例えば、Ｃａｍｅｔｏｒ（登録商標））、オルリスタット（例えば、Ｘｅｎｉｃａｌ（登録商標）、Ｃａｌｏｂａｌｉｎ（登録商標））、血管新生阻害剤（例えば、ＡＬＳ−Ｌ１０２３）、ベータヒスチジンおよびヒスタミンＨ３アンタゴニスト（例えば、ＨＰＰ−４０４）、ＡｇＲＰ（アグーチ関連タンパク質）阻害剤（例えば、ＴＴＰ−４３５）、セロトニン再取り込み阻害剤、例えば、フルオキセチン（例えば、Ｆｌｕｃｔｉｎｅ（登録商標））、ジュロキセチン（例えば、Ｃｙｍｂａｌｔａ（登録商標））、二重または三重モノアミン取り込み阻害剤（ドーパミン、ノルエピネフリン、およびセロトニン再取り込み）、例えば、セルトラリン（例えば、Ｚｏｌｏｆｔ（登録商標））、テソフェンシン、メチオニンアミノペプチダーゼ−２（ＭｅｔＡＰ２）阻害剤（例えば、ベロラニブ）、および線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）の産生に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＩＳＩＳ−ＦＧＦＲ４Ｒｘ）またはプロヒビチン標的指向性ペプチド−１（例えば、Ａｄｉｐｏｔｉｄｅ（登録商標））；
−  硝酸オキシド供与体、ＡＴ１アンタゴニストまたはアンジオテンシンＩＩ（ＡＴ２）受容体アンタゴニスト、例えば、テルミサルタン（例えば、Ｋｉｎｚａｌ（登録商標）、Ｍｉｃａｒｄｉｓ（登録商標））、カンデサルタン（例えば、Ａｔａｃａｎｄ（登録商標）、Ｂｌｏｐｒｅｓｓ（登録商標））、バルサルタ（例えば、Ｄｉｏｖａｎ（登録商標）、Ｃｏ−Ｄｉｏｖａｎ（登録商標））、ロサルタン（例えば、Ｃｏｓａａｒ（登録商標））、エプロサルタン（例えば、Ｔｅｖｅｔｅｎ（登録商標））、イルベサルタン（例えば、Ａｐｒｏｖｅｌ（登録商標）、ＣｏＡｐｒｏｖｅｌ（登録商標））、オルメサルタン（例えば、Ｖｏｔｕｍ（登録商標）、Ｏｌｍｅｔｅｃ（登録商標））、タソサルタン、アジルサルタン（例えば、Ｅｄａｒｂｉ（登録商標））、二重アンジオテンシン受容体遮断薬（二重ＡＲＢ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡＣＥ−２活性剤、レニン阻害剤、プロレニン阻害剤、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）阻害剤、エンドセリン受容体（ＥＴ１／ＥＴＡ）遮断薬、エンドセリンアンタゴニスト、利尿薬、アルドステロンアンタゴニスト、アルドステロンシンターゼ阻害剤、アルファ遮断薬、アルファ−２アドレナリン受容体のアンタゴニスト、ベータ遮断薬、混合アルファ／ベータ遮断薬、カルシウムアンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、カルシウムチャネル遮断薬ジルチアゼムの経鼻剤（例えば、ＣＰ−４０４）、二重ミネラルコルチコイド／ＣＣＢ、中枢作用性抗高血圧症薬、中性エンドペプチダーゼの阻害剤、アミノペプチダーゼＡ阻害剤、バソペプチド阻害剤、二重バソペプチド阻害剤、例えば、ネプリリシンＡＣＥ阻害剤またはネプリリシン−ＥＣＥ阻害剤、二重作用性ＡＴ受容体−ネプリリシン阻害剤、二重ＡＴ１／ＥＴＡアンタゴニスト、終末糖化産物（ＡＧＥ）分解剤、遺伝子組換えレナラーゼ、血圧ワクチン、例えば、抗ＲＡＡＳ（レニン−アンジオテンシン−アルドステロン−システム）ワクチン、ＡＴ１−またはＡＴ２−ワクチンなど、高血圧症ファーマコゲノミクスに基づく薬物、例えば、抗高血圧応答を有する遺伝的多型のモジュレーター、栓球凝集抑制因子、および他のものまたはそれらの組合せが好適である。
【０１１５】
用語「融合分子」は、一般的に、２つ以上の異なる分子（例えば、タンパク質および／またはペプチド）を連結、特に共有結合させ、結果として元の各分子に由来する機能特性を有する単一の分子を生じさせることよって作り出された分子を指す。タンパク質および／またはペプチドの場合、融合分子は、「融合タンパク質」と呼ばれる。融合分子は、遺伝子融合によって（例えば、遺伝子組換えＤＮＡ技術によって）、または化学的および／または酵素的コンジュゲーションによって生じさせることができる。２つ以上の異なる分子は、好適なリンカー分子、例えば、ペプチドリンカーまたは非ペプチドポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などによって連結させてもよい。
【０１１６】
一般的に、ペプチドリンカーは、柔軟性およびプロテアーゼ抵抗性を提供するように設計される。一実施形態において、ペプチドリンカーは、１〜３０、１〜２５または１〜２０個のアミノ酸残基の長さを有する。一実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、ペプチドリンカーは、グリシン−セリンリッチリンカーであり、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸は、それぞれ、グリシンまたはセリン残基である。一実施形態において、ペプチドリンカーは、そのＣ末端にアラニン残基を含む。別の実施形態において、アミノ酸は、グリシンおよびセリンから選択され、すなわち、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリンから排他的に構成される（グリシン−セリンリンカーとして呼ばれる）。一実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。ペプチドリンカーは、１つまたはそれ以上の特異的プロテアーゼ切断部位をさらに含み得る。
【０１１７】
一実施形態において、融合分子は、融合タンパク質である。本発明による融合タンパク質において、融合タンパク質の成分は、（Ｎ末端からＣ末端まで）Ａ−Ｂ−ＣまたはＣ−Ｂ−Ａの順序で整列することができ、ＡはＧＬＰ−１Ｒアゴニストであり、Ｂはリンカー分子であり、ＣはＦＧＦ２１化合物である。
【０１１８】
一実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＤ）またはその変異体のＦｃ領域／ドメインをさらに含む。一実施形態において、Ｆｃ領域／ドメインの変異体は、Ｆｃ領域／ドメインの野生型配列に比べて、最大５、４または３個の変異を含む。一実施形態において、該変異は、アミノ酸置換および欠失、例えば、ＮまたはＣ末端欠失からなる群から選択される。一実施形態において、ＩｇＧ４のＦｃ領域／ドメインの変異体（「ＩｇＧ４  Ｆｃ変異体」とも呼ばれる）は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。
【０１１９】
一実施形態において、Ｆｃ領域／ドメインの変異体は、ハイブリッドＦｃ領域／ドメインの変異体である。このようなハイブリッドＦｃ領域／ドメインは、例えば、ＷＯ２０１６／１１４６３３Ａ１、ＷＯ２０１７／０７４１１７Ａ１、ＷＯ２０１７／０７４１２３Ａ１およびＷＯ２０１８／０８８８３８Ａ１に記載され、それらを参照することにより本明細書に組み入れられる。一実施形態において、ハイブリッドＦｃ領域／ドメインは、異なる免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＤ）の部分的Ｆｃ領域／ドメインの組合せを含む。一実施形態において、ハイブリッドＦｃ領域／ドメインは、ＩｇＧ４およびＩｇＤの部分的Ｆｃ領域／ドメイン（「ＩｇＧ４／ＩｇＤハイブリッドＦｃ領域／ドメイン」とも呼ばれる）、好ましくはヒトＩｇＧ４およびＩｇＤを含む。一実施形態において、ハイブリッドＦｃ領域／ドメインは、ＩｇＤ  Ｆｃ領域／ドメインのヒンジ配列およびＣＨ２、ならびにＩｇＧ４  Ｆｃ領域／ドメインのＣＨ２およびＣＨ３配列の部分を含む。一実施形態において、ハイブリッドＦｃ領域／ドメインは、配列番号６５、６６、６７、６８、６９および７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。
【０１２０】
一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物およびＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、免疫グロブリンまたはその変異体のＦｃ領域／ドメインによって結合する。一実施形態において、ＦＧＦ２１化合物およびＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、Ｌ−Ｆｃ、Ｆｃ−Ｌ、Ｌ１−Ｆｃ−Ｌ２およびＦｃからなる群から選択される構造を含むリンカー分子によって結合し、Ｌ、Ｌ１およびＬ２は、本明細書において定義されるペプチドリンカーであり（Ｌ１およびＬ２は同じまたは異なる）、Ｆｃは、免疫グロブリンまたはその変異体のＦｃ領域／ドメインである。
【０１２１】
一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２５、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのようなアミノ酸配列からなる。
【０１２２】
本発明による融合タンパク質のさらなる特色は、例えば、ＷＯ２０１４／０３７３７３Ａ１およびＷＯ２０１７／０９３４６５Ａ１に記載され、それらを参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０１２３】
「核酸分子」は、本発明において、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸分子は、本発明において、一本鎖または二本鎖の、直鎖状であるかまたは共有結合により閉じて環を形成する分子の形態である。
【０１２４】
用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を含む分子、好ましくは、完全にまたは実質的にデオキシリボヌクレオチド残基で構成される分子に関する。「デオキシリボヌクレオチド」は、ベータ−Ｄ−リボフラノシル基の２’位においてヒドロキシル基を欠くヌクレオチドに関する。用語「ＤＮＡ」は、単離ＤＮＡ、例えば、部分的または完全に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および遺伝子組換えにより生じたＤＮＡを含み、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換、および／または改変によって天然に存在するＤＮＡとは異なる修飾ＤＮＡも含む。そのような改変は、ＤＮＡの末端または内部などへの、例えば、ＤＮＡの１つまたはそれ以上のヌクレオチドへの、非ヌクレオチド材料の追加を含み得る。ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドは、非標準的ヌクレオチド、例えば、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドなども含むことができる。これらの改変ＤＮＡは、類似体または天然に存在するＤＮＡの類似体と呼ぶことができる。用語「天然に存在する」は、ヌクレオチドと組み合わせて使用される場合、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）の塩基を指す。
【０１２５】
用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む分子、好ましくは、完全にまたは実質的に、リボヌクレオチド残基で構成された分子に関する。「リボヌクレオチド」は、ベータ−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。用語「ＲＮＡ」は、単離ＲＮＡ、例えば、部分的または完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および遺伝子組換えにより生じたＲＮＡを含み、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換、および／または改変によって、天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを含む。そのような改変は、ＲＮＡの末端または内部などへの、例えば、ＲＮＡの１つまたはそれ以上のヌクレオチドでの、非ヌクレオチド材料の追加を含み得る。ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドは、非標準的ヌクレオチド、例えば、天然に存在しないヌクレオチドもしくは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなども含むことができる。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。本発明によれば、「ＲＮＡ」は、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを指す。一実施形態において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、例えば、インビトロにおいて転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）または合成ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡの安定性（例えば、半減期）を増加させる１つまたはそれ以上の修飾によって、修飾することができる。そのような変更は、当業者に公知であり、そのようなものとして、例えば、５’−キャップまたは５’キャップ類似体が挙げられる。
【０１２６】
本発明による核酸分子は、ベクターに含有させる／含ませることができる。用語「ベクター」は、本明細書において使用される場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えば、ラムダファージなど、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターなど、または人工染色体ベクター、例えば、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などを含む、当業者に公知の全てのベクターを含む。前記ベクターは、発現ベクターおよびクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般的に、特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物）における、またはインビトロ発現系における、所望のコード配列と、作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要な適切なＤＮＡ配列とを含有する。クローニングベクターは、一般的に、ある特定の所望のＤＮＡ断片を設計および増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠き得る。
【０１２７】
あるいは、本発明による核酸分子は、ゲノム、例えば、宿主細胞のゲノム、に統合させてもよい。特定の核酸分子をゲノムに統合するための手段および方法は、当業者に公知である。
【０１２８】
用語「細胞」または「宿主細胞」は、好ましくは、完全細胞、すなわち、その正常な細胞内成分、例えば、酵素、細胞小器官、または遺伝物質などを放出していない、完全膜を有する細胞に関する。完全細胞は、好ましくは、生存細胞、すなわち、その正常な代謝機能を行うことができる生きた細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明において、外因性の核酸をトランスフェクトまたは形質転換することができる任意の細胞に関する。好ましくは、外因性の核酸をトランスフェクトまたは形質導入させ、レシピエントに移した細胞は、レシピエントにおいてその核酸を発現することができる。用語「細胞」は、原核細胞、例えば、細菌細胞など、および真核生物細胞、例えば、酵母細胞、真菌細胞、または哺乳動物細胞などを含む。好適な細菌細胞としては、グラム陰性細菌株、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の細菌株など、およびグラム陽性細菌株、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）などに由来する細胞が挙げられる。好適な真菌細胞としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポーラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒ）、およびアスペルギルス属  （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種に由来する細胞が挙げられる。好適な酵母細胞としては、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の種（例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））、およびハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種に由来する細胞が挙げられる。好適な哺乳動物細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３などが挙げられる。一実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞が使用される。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および異種タンパク質の発現のために当技術分野において使用される任意の他の細胞も、使用することができる。哺乳動物細胞は、養子移入にとって特に好ましく、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、および霊長類に由来する細胞である。これらの細胞は、多くの組織型から誘導することができ、初代細胞および細胞株、例えば、免疫系の細胞など、特に抗原提示細胞、例えば、樹枝状細胞およびＴ細胞など、幹細胞、例えば、造血幹細胞および間充織幹細胞など、ならびに他の細胞型を含む。抗原提示細胞は、その表面上の主要組織適合遺伝子複合体との関連において抗原を示す細胞である。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、この複合体を認識することができる。「細胞」または「宿主細胞」は、単離してもよく、または組織または有機体、特に「非人体」、の一部であってもよい。
【０１２９】
用語「非人体」は、本明細書において使用される場合、非ヒト霊長類または他の動物、特に哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、もしくはげっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどを含むことを意味する。
【０１３０】
本明細書において使用される場合、用語「部品のキット（簡潔に：キット）」は、１つまたはそれ以上の容器と、場合によりデータ媒体とを含む製品を指す。前記１つまたはそれ以上の容器は、上記において言及した薬剤（試薬）の１つまたはそれ以上で満たされる。キットには、例えば、希釈剤、緩衝剤、およびさらなる試薬を収容する追加の容器を含ませてもよい。前記データ媒体は、非電子的データ媒体、例えば、グラフィックデータ媒体、例えば、情報リーフレット、情報シート、バーコードもしくはアクセスコード、または電子的データ媒体、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップ、もしくは別の半導体ベースの電子的データ媒体である。アクセスコードは、データベース、例えば、インターネットデータベース、集中データベース、分散データベースなどへのアクセスの可能にする。前記データ媒体は、本発明の薬剤、例えば、組合せ、医薬組成物および融合分子ならびに本明細書において説明される核酸分子および宿主細胞のような関連の薬剤の使用のための取扱説明書を含んでもよい。
【０１３１】
本明細書において説明される薬剤および組成物は、任意の従来の経路、例えば、経口、経肺、吸入によって、または注射もしくは注入による非経口において投与することができる。一実施形態において、非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、または筋肉内において使用される。本明細書において説明される薬剤および組成物は、徐放性投与によって投与することもできる。
【０１３２】
非経口投与にとって好適な医薬組成物は、通常、活性物質の滅菌水性または非水性調製物を含み、これらは、好ましくは、レシピエントの血液に対して等張である。適合性の担体／溶媒／希釈剤の例は、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、生理食塩水、静菌性生理食塩水（例えば、０．９％ベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、およびハンクス液である。さらに、通常、滅菌の不揮発性油も、溶液または懸濁液媒体として使用することができる。
【０１３３】
本明細書において説明される薬剤および組成物は、通常、治療有効量において投与される。「治療有効量」は、好ましくは、許容できない副作用を引き起こすことなく、単独でまたはさらなる用量と一緒に、所望の治療反応または所望の治療効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を減速させること、および、特に疾患の進行を中断または逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望の反応は、前記疾患または状態の発生の遅延または発生の予防であってもよい。本明細書において説明される薬剤および組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重篤度、対象の個々のパラメータ、例えば、年齢、生理的条件、サイズ、および体重など、治療の持続期間、付随する療法のタイプ（存在する場合）、投与の特定の経路、ならびに同様の因子に依存するであろう。したがって、本明細書において説明される薬剤の投与される用量は、様々なそのようなパラメータに依存する。対象における反応が、初回用量において十分でない場合、より多い用量（または、別のより局所的経路の投与によって効果的に達成される、より多い用量）を使用することもできる。
【０１３４】
本発明により、用語「疾患または障害」は、任意の病理学的状態または不健康な状態、特に、肥満、太り過ぎ、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性網膜症、高血糖、異常脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはアテローム性動脈硬化症を指す。
【０１３５】
用語「肥満」は、健康に負の影響を有し得る程度にまで過剰な体脂肪が蓄積された医学的状態を指す。ヒト（成人）対象に関して、肥満は、３０ｋｇ／ｍ２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）（ＢＭＩ≧３０ｋｇ／ｍ２）として定義することができる。
【０１３６】
用語「太り過ぎ」は、体脂肪の量が、最適に健康である量を超えている医学的状態を指す。ヒト（成人）対象に関して、肥満は、２５ｋｇ／ｍ２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）（例えば、２５ｋｇ／ｍ２≦ＢＭＩ＜３０ｋｇ／ｍ２）として定義することができる。
【０１３７】
ＢＭＩは、成人において太り過ぎおよび肥満を分類するために一般的に使用される身長体重比の単純な指標である。それは、キログラムで表した人の体重をメートルで表したその人の身長の二乗で割ったものとして定義される（ｋｇ／ｍ２）。
【０１３８】
「メタボリック症候群」は、以下の医学的状態のうちの少なくとも３つのクラスタリングとして定義することができる：腹部（中心性）肥満（例えば、コーカソイドの男性の場合には胴回り≧９４ｃｍおよびコーカソイドの女性の場合は≧８０ｃｍ、他の群に関しては民族的特有の値を有すると定義）、高い血圧（例えば、１３０／８５ｍｍＨｇ以上）、高い空腹時血漿グルコース（例えば、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬ）、高い血清トリグリセリド（少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬＥ）、および低い高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル（例えば、男性の場合には４０ｍｇ／ｄＬ未満および女の場合は５０ｍｇ／ｄＬ未満）。
【０１３９】
「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」（単に「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」とも呼ばれる）は、インスリン産生、インスリン作用、またはその両方における欠陥から結果として生じる血中グルコースの高濃度によって特徴付けられる代謝病の群を指す。一実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、緩徐発症成人自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびに特定の遺伝的条件、薬物、栄養不良、感染症、および他の病気からの結果として生じる他のタイプの糖尿病からなる群から選択される。
【０１４０】
糖尿病の現在のＷＨＯ診断基準は以下の通りである：空腹時血漿グルコース≧７．０ｍｍｏｌ／ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）または２時間血漿グルコース≧１１．１ｍｍｏｌ／ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）。
【０１４１】
「１型糖尿病」（「インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）」または「若年性糖尿病」としても知られる）は、インスリンの完全な欠乏によって引き起こされる高い血中グルコース濃度によって特徴付けられる状態である。これは、体の免疫システムが、膵臓におけるインスリンを産生するベータ細胞を攻撃し、それらを破壊する場合に生じる。膵臓は、インスリンを少ししか、または全く産生しない。膵臓除去または膵疾患も、インスリンを産生するベータ細胞の欠乏を生じ得る。１型糖尿病は、糖尿病の症例の５％から１０％の間を占める。
【０１４２】
「２型糖尿病」（「インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）」または「成人発症型糖尿病」としても知られる）は、インスリンの可用性にかかわらない過剰なグルコース産生と、不十分なグルコースクリアランス（インスリン作用）の結果として過度に高いレベルのままにグルコースレベルが循環することによって特徴付けられる状態である。２型糖尿病は、糖尿病の全ての診断症例の約９０から９５％を占める。
【０１４３】
「妊娠性糖尿病」は、それ以前に糖尿病と診断されていない女性が、妊娠中（特に妊娠第三期）に高い血中グルコースレベルを示す状態である。妊娠性糖尿病は、調査された集団に応じて、妊娠の３〜１０％に影響する。
【０１４４】
「緩徐発症成人自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）」（「遅発性１型糖尿病」とも呼ばれる）は、成人において生じる、多くの場合において発症の経過がより遅い、１型糖尿病の形態である。
【０１４５】
「若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）」は、インスリン産生を妨害する常染色体優性遺伝子における変異によって引き起こされる、糖尿病の遺伝子型を指す。
【０１４６】
「糖尿病性網膜症」は、糖尿病患者に生じる代謝の乱れによって誘発される眼疾患であり、視力の進行性喪失へ導く。
【０１４７】
用語「高血糖」は、血液中の過剰な糖（グルコース）を指す。
【０１４８】
用語「異常脂血症」は、リポタンパク質の過剰産生（高脂肪血症）または欠乏（低脂血症）を含む、リポタンパク質代謝の障害を指す。異常脂血症は、血中の総コレステロール、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよび／もしくはトリグリセリド濃度の上昇、ならびに／または高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の減少によって明らかにされる。
【０１４９】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、肝細胞の炎症および変性を伴う、脂肪の蓄積（脂肪滴）によって特徴付けられる肝臓疾患である。一度罹患すると、この疾患は、肝臓機能が変化して肝不全へと進行し得る状態である、肝硬変の高リスクを伴う。その後、ＮＡＳＨは、多くの場合、肝臓がんへと進行する。
【０１５０】
「アテローム性動脈硬化症」は、動脈内腔の狭窄を引き起こして線維症および石灰化へと進行し得る、大動脈および中動脈の血管内膜におけるプラークと呼ばれる不規則に分布する脂質沈着によって特徴付けられる血管疾患である。病巣は、通常、限局性であり、ゆっくりと断続的に進行する。時折、血流障害を生じ、その結果として、閉塞に対して末梢側の組織死を引き起こす、プラークの破裂を生じる。血流の制限は、ほとんどの臨床徴候の主要因であり、これは、閉塞の分布および重篤度によって変わる。
【０１５１】
用語「医薬」は、本明細書において使用される場合、治療法において、すなわち、疾患および障害の治療において使用される、物質／組成物を指す。
【０１５２】
「治療」は、疾患または障害を予防または除去するため；対象の疾患および障害を停止または鈍化させるため；対象における新たな疾患または障害の発生を阻害または鈍化させるため；現在または以前に疾患または障害を有している対象における症状の頻度もしくは重篤度および／または再発を減少させるため；および／または、対象の寿命を延長、すなわち増加させるために、化合物もしくは組成物または化合物もしくは組成物の組合せを対象に投与することを意味する。
【０１５３】
特に、用語「疾患または障害を治療すること／治療」は、治癒、期間の短縮、改善、予防、進行または悪化の鈍化または阻害、または疾患もしくは障害もしくはそれらの症状の発症を予防または遅延させることを包含する。
【０１５４】
用語「対象」は、本明細書において、治療のための対象、特に罹患した対象（「患者」とも呼ばれる）、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、または他の動物、特に哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、またはげっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどを意味する。一実施形態において、対象／患者は、ヒトである。
【０１５５】
そこで、説明をするが、本発明の範囲を限定することは意図していない以下の実施例を参照することによって本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１５６】
システム薬理学モデリングによる最適なＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１活性比の決定
ヒトにおけるＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質の薬理学的効果への改善された機械論的洞察を使用して、最適なＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１効力比を特定した。機械論的システム薬理学モデルを開発し、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１のヒトにおけるグルコース、脂質およびエネルギー代謝に対する効果を説明した（Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓら（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｖ  ５（４）：２１６−２２０；Ｄｅａｃｏｎら（２０１１）Ｒｅｖ  Ｄｉａｂｅｔ  Ｓｔｕｄ  ８（３）：２９３−３０６；Ｋｉｍら（２００８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ６０（４）：４７０−５１２；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖら（２０１４）Ｍｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ３（３）：２２１−２２９）。
【０１５７】
このモデルは、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の効果について関連する経路を表した。血糖コントロール（すなわち、ＨｂＡ１ｃ、空腹時血漿グルコース、食後血糖値）、脂質パラメータ（すなわち、血漿トリグリセリド、脂肪酸、コレステロール）およびエネルギーバランス（すなわち、体重、食物摂取、エネルギー消費）を獲得して、模擬薬物治療（例えば、ＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質、リラグルチド、ＦＧＦ２１類似体ＬＹ２４０５３１９）に対する治療奏功を評価した。ＬＹ２４０５３１９については、Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖら（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ８（３）：ｅ５８５７５を参照されたい。
【０１５８】
このモデルは、ホルモンインスリン、グルカゴンおよびインクレチン（ＧＬＰ−１、ＧＩＰ）によって制御されるグルコースホメオスタシスの重要な態様を網羅した。血糖コントロールに関する主要モデルエンドポイントは、ＨｂＡ１ｃであった。ＨｂＡ１ｃは、先の数か月にわたる平均血漿グルコース濃度を推定するために使用された共通の臨床エンドポイントである。ＨｂＡ１ｃは、Ｎａｔｈａｎら（２００８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ３１（８）：１４７３−１４７８によって報告されたように、平均血漿グルコースとＨｂＡ１ｃとの間位の線形的相関を使用してモデルにおいて推定した。
【０１５９】
このモデルは、コレステロールの提示を含む基本的脂質代謝を扱うのに適したレベルで、トリグリセリドおよび脂肪酸代謝を組み入れた。ＨＤＬおよび非ＨＤＬ、すなわち、ＬＤＬ＋ＶＬＤＬコレステロールは、循環しているリポタンパク質である。脂質代謝の提示は、ＦＧＦ２１化合物の、脂質およびスタチンとの相互作用に与える影響をシミュレートすることを可能にした。ＦＧＦ２１化合物は、脂質濃度に著しい効果を有した（Ｇａｉｃｈら（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ１８（３）：３３３−３４０；Ｆｉｓｈｅｒら（２０１１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１５２（８）：２９９６−３００４）。
【０１６０】
このモデルにおける体重減少または体重増加は、体脂肪量の変化として測定した。脂肪量と体重との間に直接的な関係性があった（Ｂｒｏｙｌｅｓら（２０１１）Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ  １０５（８）：１２７２−１２７６）。食物摂取は、基礎および安静時代謝率に基づいた（Ａｍｉｒｋａｌａｌｉら（２００８）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ６２（７）：２８３−２９０）。エネルギー消費がカロリー摂取と等しい場合、体脂肪量は、一定を維持した。食物摂取に対する治療効果は、（Ｇｏｂｅｌら（２０１４）Ｏｂｅｓｉｔｙ（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ）２２（１０）：２１０５−２１０８）の式を使用して、モデルに実行した。
【０１６１】
食物は、炭水化物（グルコース等価物）、脂肪（脂肪酸等価物）およびタンパク質（アミノ酸等価物）であると考えた。全ての栄養が胃に入り、遅延ノードを通過し、その後、３区画の消化管に進んだ。消化管の設計は、食物消化および吸収を用いて（Ｂａｓｔｉａｎｅｌｌｉら（１９９６）Ｊ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ７４（８）：１８７３−１８８７；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（１９９７）Ｍｅｄ  Ｉｎｆｏｒｍ（Ｌｏｎｄ）２２（１）：３５−４５）によってなされた仕事に基づいた。
【０１６２】
栄養、ホルモン、薬物および疾患状態は、胃排出の遅延を生じさせる可能性がある。健康状態下で、胃排出率は、食事の量、そのエネルギー密度および胃における栄養量（Ａｃｈｏｕｒら（２００１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ５５（９）：７６９−７７２；Ｆｏｕｉｌｌｅｔら（２００９）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ２９７（６）：Ｒ１６９１−１７０５）に依存した。糖尿病を有する個体は、経口ブドウ糖負荷試験または食事試験（Ｂｈａｒｕｃｈａら（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｏｘｆ）７０（３）：４１５−４２０；Ｃｈａｎｇら（２０１２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ３５（１２）：２５９４−２５９６）で見られるグルコース吸収の遅延を有することが多かった。この遅延は胃排出の減速に起因した。胃と小腸との間の遅延をこのモデルに加えて、糖尿病対象における胃排出の遅延を説明した。薬物およびホルモン（ＧＬＰ−１）は、胃の迷走神経緊張に影響し得、これは機械的混合および／または蠕動を減少し、胃排出も遅延させる（Ｊｅｌｓｉｎｇら（２０１２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ  １４（６）：５３１−５３８；Ｌｉｔｔｌｅら（２００６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ９１（５）：１９１６−１９２３；Ｎａｕｃｋら（２０１１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０（５）：１５６１−１５６５；ｖａｎ  Ｃａｎら（２０１３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３８（６）：７８４−９３）。
【０１６３】
この調査の１つの目的は、ＧＬＰ−１関連有害作用、すなわち、吐き気および嘔吐（Ｌｅａｎら（２０１４）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３８（５）：６８９−６９７）を予防することであった。胃排出測定値は、胃排出率の低さに相関する吐き気および嘔吐といった有害事象の推定を提供した。したがって、モデルにおける胃有害事象についてのマーカーは、胃排出率の和であった。
【０１６４】
健常者および疾患の異なるステージの２型糖尿病患者を表す異なる仮想患者がモデルプラットフォームに実装された。さらに、仮想患者は、異なる程度の肥満および異常脂血症を網羅した。仮想患者は、疾患重症度の可変性ならびにクリニックにおいて観察された病態生理学的および表現型の可変性を表した。
【０１６５】
いくつかの治療薬、すなわち、ＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質、リラグルチド、ＦＧＦ２１類似体ＬＹ２４０５３１９、メトホルミン、アトルバスタチン、シタグリプチン、ヒトインスリンがモデルにおいて実施された。これらの治療薬は、シミュレーションにおいてオンオフ切り換えすることができた。仮想患者は、ＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質を投与される場合、メトホルミンおよびアトルバスタチンのバックグラウンドにあると想定された。
【０１６６】
仮想ＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質がこのモデルにおいて実施された。融合タンパク質は、ＦＧＦ２１アゴニスト活性とＧＬＰ−１アゴニスト活性の両方を含み、ＦＧＦ２１受容体アゴニストとＧＬＰ−１受容体アゴニストの両方と同じ効果を有した。仮想融合タンパク質の薬物動態特性は、デュラグルチドと同様であると想定した（Ｇｅｉｓｅｒら（２０１６）Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ５５（５）：６２５−３４）。
【０１６７】
多くのデータセットと比較することによってモデルを検証した。シミュレーション結果は、関連データおよび知識、例えば、Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎら（１９９７）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００（５）：１３０５−１３１９；Ｍｕｓｃｅｌｌｉら（２００８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５７（５）：１３４０−１３４８と定量的に一致した。モデルは、関連の定量的試験データ、例えば、Ａｓｃｈｎｅｒら（２００６）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ２９（１２）：２６３２−２６３７；Ｄａｌｌａ  Ｍａｎ、Ｃａｕｍｏら（２００５）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ２８９（５）：Ｅ９０９−９１４；Ｄａｌｌａ  Ｍａｎら（２００５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５４（１１）：３２６５−３２７３；Ｆｉａｌｌｏ−Ｓｃｈａｒｅｒ（２００５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ９０（６）：３３８７−３３９１；Ｈａｈｎら（２０１１）Ｔｈｅｏｒ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｄｅｌ８：１２；Ｈｅｒｍａｎら（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７８（６）：６７５−６８８；Ｈｅｒｍａｎら（２００６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ４６（８）：８７６−８８６およびＪ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ９１（１１）：４６１２−４６１９；Ｈｏｊｌｕｎｄら（２００１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２８０（１）：Ｅ５０−５８；Ｍｏｎａｕｎｉら（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９（６）：９２６−９３５；Ｎａｕｃｋら（２００９）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ３２（１）：８４−９０；Ｎａｕｃｋら（１９９３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ９１（１）：３０１−３０７；Ｎａｕｃｋら（２００４）Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ１２２（３）：２０９−２１７；Ｔｚａｍａｌｏｕｋａｓら（１９８９）Ｗｅｓｔ  Ｊ  Ｍｅｄ１５０（４）：４１５−４１９；Ｓｉｋａｒｉｓ（２００９）Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ３（３）：４２９−４３８；ＶｉｃｉｎｉおよびＣｏｂｅｌｌｉ（２００１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ２８０（１）：Ｅ１７９−１８６；Ｖｏｌｌｍｅｒら（２００８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５７（３）：６７８−６８７に適合した。
【０１６８】
ＦＧＦ２１類似体およびＧＬＰ−１受容体アゴニストを含む既存の治療薬が直接的比較についてモデルにおいて実施された。ＦＧＦ２１類似体の効果は臨床データ、例えば、Ｇａｉｃｈら２０１３で検証された。ＧＬＰ−１受容体アゴニストリラグルチドは、標的について直接的な競合相手であり、その実行を様々な臨床データ、例えば、Ｊａｃｏｂｓｅｎら（２００９）Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ６８（６）：８９８−９０５；Ｅｌｂｒｏｎｄら（２００２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ２５（８）：１３９８−１４０４；Ｃｈａｎｇら（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５２（７）：１７８６−１７９１；Ｋｏｌｔｅｒｍａｎら（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ８８（７）：３０８２−３０８９；Ｄｅｇｎら（２００４）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５３（５）：１１８７−１１９４；Ｋｏｌｔｅｒｍａｎら（２００５）Ａｍ  Ｊ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ  Ｐｈａｒｍ６２（２）：１７３−１８１；Ｖｉｌｓｂｏｌｌら（２００８）Ｄｉａｂｅｔ  Ｍｅｄ２５（２）：１５２−１５６；Ｂｕｓｅら（２００９）Ｌａｎｃｅｔ３７４（９６８３）：３９−４７；Ｊｅｌｓｉｎｇら（２０１２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ１４（６）：５３１−５３８；Ｈｅｒｍａｎｓｅｎら（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ１５（１１）：１０４０−１０４８；Ｓｕｚｕｋｉら（２０１３）Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ５２（１０）：１０２９−１０３４；ｖａｎ  Ｃａｎら（２０１３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３８（６）：７８４−９３；Ｚｉｎｍａｎら（２００９）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ３２（７）：１２２４−１２３０；Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓら（２００９）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ５２（１０）：２０４６−２０５５；Ｐｒａｔｌｅｙら（２０１１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ６５（４）：３９７−４０７；Ｎａｕｃｋら（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ１５（３）：２０４−２１２；Ｆｌｉｎｔら（２０１１）Ａｄｖ  Ｔｈｅｒ２８（３）：２１３−２２６；Ｋａｐｉｔｚａら（２０１１）Ａｄｖ  Ｔｈｅｒ２８（８）：６５０−６６０；Ａｓｔｒｕｐら（２０１２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）３６（６）：８４３−８５４と比較した。
【０１６９】
モデルプラットフォームは、活性比を変化させて、仮想ＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質の利益的および有害作用をシミュレートすることを可能にした。有効ＦＧＦ２１媒介性ＥＣ５０値には、Ｇａｉｃｈら（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ１８（３）：３３３−３４０に由来する定数を設定した。有効ＧＬＰ−１媒介性ＥＣ５０値は、内在ＧＬＰ−１（表１）に関して、１つ増加の２〜６００の因子によって減少した。
【０１７０】
【表１】
2021528422.tif 000002
【０１７１】
仮想融合タンパク質のそれぞれについて、関連の薬力学的エンドポイント、すなわち、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリド、脂肪酸、非ＨＤＬコレステロールおよび脂肪量について、暴露−奏功の関係をシミュレートした。ＧＬＰ−１媒介性有害事象についてのマーカーとして、胃排出率を使用した。平均的な肥満異常脂血症の２型糖尿病の仮想患者に対するＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質による５２週間の治療を幅の広い用量範囲でシミュレートした。５２週間の治療後、全ての関連の薬力学的エンドポイントが定常状態に到達することを予想した。各エンドポイントについて、最大半量効果濃度（ＥＣ５０値）を暴露−奏功曲線から決定した。ＥＣ５０値は、特に主にＧＬＰ−１媒介性エンドポイントであるＨｂＡ１ｃおよび胃排出率について、活性比で変化した。図１は、ＧＬＰ−１減衰率に依存するＥＣ５０値を記載する。ＧＬＰ−１減衰率の増加は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性の減少を示す。
【０１７２】
この手順は、関連の活性比を特定することを可能にし、有害作用が薬力学的作用に比べて、より高い血漿レベルで作用し始める。９より高いＧＬＰ−１減衰率について、ＧＬＰ−１媒介性消化管有害作用のＥＣ５０のほうが薬力学的作用のＥＣ５０より高かった。したがって、胃の有害作用は、薬力学的作用よりも高い血漿レベルで作用し始めた。ＧＬＰ−１媒介性消化管有害作用を回避しながら、全ての望ましい薬力学的作用を提供する用量を見つけることは可能である。したがって、１：１０以下の活性比は、関係しなかった。
【０１７３】
胃排出率についての最大ＥＣ５０値は、減衰率５３１で到達した。有害作用と平均薬力学的作用との間の最大距離は、減衰率４８２で到達した（図２）。したがって、１：４８２以上の活性比は、関係しなかった。薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用との間の最大距離は、３１９であった。ＦＧＦ２１−（脂質）およびＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用との間の最大距離は、１２１であった。
【０１７４】
１：１０〜１：４８２の間の効力比を有するＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質は、脂質特性、体重およびグルコース代謝を改善するのに最も有益であると予測され、胃排出反応に基づく著しい有害事象を発生する見込みはなかった。より低い効力比は、その予想される胃排出の強力な抑制および有害事象の潜在性に基づいて、良好な候補になりそうになかった。より高い効力比は、充分に効果的ではない可能性があり、したがって競合的ではなかった。
【０１７５】
さらに、平均的な肥満異常脂血症の２型糖尿病の仮想患者に対するＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質による１２週間の治療は、主にＧＬＰ−１媒介性パラメータＨｂＡ１ｃが１２週間の治療後に定常状態に臨床的に到達するため、幅の広い投与範囲でシミュレートしなかった。
【０１７６】
図３は、１２週間のシミュレーションについてのＧＬＰ−１減衰率に依存するＥＣ５０値を記載する。１８より高いＧＬＰ−１減衰率について、ＧＬＰ−１媒介性消化管有害作用のＥＣ５０のほうが薬力学的作用のＥＣ５０より高かった。胃排出率についての最大ＥＣ５０値は、減衰率５０１で到達した。有害作用と平均の薬力学的作用との間の最大距離は、減衰率４６９で到達した（図４）。薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用との間の最大距離は、３１３であった。ＦＧＦ２１−（脂質）およびＧＬＰ−１媒介性作用（ＨｂＡ１ｃ）の展開によって正規化された薬力学（ＨｂＡ１ｃ）の最大と有害作用との間の最大距離は、１２３であった。
【０１７７】
異なる活性比を有するＧＬＰ−１ＲＡ／ＦＧＦ２１融合タンパク質についての有害事象の効能および潜在能を記載のシステム薬理学アプローチによって調査した。おそらく計算された理想的な効力比を有する融合タンパク質が、同定され、胃排出反応に基づく著しく有害なＧＬＰ−１ＲＡ関連作用を発生しない可能性のある状態で、脂質特性、体重および血糖コントロールを改善するのに有益であると予測された。したがって、選択したモデルが知らせる効力比を有する化合物がリスク特性に対する良好な効能を提供することを予測した。
【実施例２】
【０１７８】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＬＰ１ＲＡ−ＦＧＦ２１融合タンパク質の発現
配列番号２のＦＧＦ２１タンパク質をＧＬＰ１ＲＡに直接融合するか、またはリンカー配列をＧＬＰ１ＲＡとＦＧＦ２１配列との間に挿入するかのいずれかであった。全ての構築物において、ＦＧＦ２１構築物は、ＧＬＰ１ＲＡ配列にＣ末端において融合した。リンカーを挿入した場合、ＧＬＰ１ＲＡは、リンカー配列にＮ末端において融合し、ＦＧＦ２１はリンカー配列にＣ末端において融合した。ＧＬＰ１ＲＡ−ＦＧＦ２１融合タンパク質のＤＮＡ配列を、Ｎ末端においてＩＬ２シグナル配列に融合させ、続いて、ヒスチジンリッチな配列（Ｈｉｓタグ）およびＴｅｖ切断部位に融合させた。ＧＬＰ１ＲＡ−ＦＧＦ２１融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって産生した。シグナル配列は、培養培地への所望の融合タンパク質の分泌に必要であった。固定化金属イオン親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を使用して、培養上清から所望の融合タンパク質を精製した。ＩＭＡＣカラムからの溶出後、場合により、Ｎ末端ＨｉｓタグをＴｅｖプロテアーゼの添加によって切断することができる。構築物のスクリーニングのために、ＧＬＰ１ＲＡ活性アッセイについて、Ｔｅｖプロテアーゼをインキュベーション培地に直接的に添加することによって、Ｈｉｓタグを切断した。Ｈｉｓタグを確実に完全切断するために、アッセイを開始する前のインキュベーション時間は、１０〜６０分であった。所望の範囲のＧＬＰ１ＲＡ活性を有する構築物を大規模に産生した。ＧＬＰ１ＲＡ−Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって産生した。所望の融合タンパク質は、完全Ｈｉｓタグ精製樹脂（Ｒｏｃｈｅ）を有するＩＭＡＣを使用して、培養上清物から精製した。Ｈｉｓタグ切断後、切断反応溶液をＩＭＡＣカラム（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｎ（Ｒｏｃｈｅ））上にわたり２回目の通過をさせ、（Ｈｉｓタグを有さない）フロースルー分画を収集した。これらの融合タンパク質をさらに、泳動用緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を用いたゲルろ過カラムを使用して精製した。所望の融合タンパク質を含有する分画を収集し、プールし、濃縮して、さらなる使用まで−８０℃で貯蔵した。
【実施例３】
【０１７９】
ＣＨＯ細胞におけるヒトＦＧＦ２１受容体の有効性についてのインビトロ細胞アッセイ（Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ）
成熟ヒトＦＧＦ２１（配列番号２）またはＦＧＦ２１変異体の細胞インビトロ有効性を、特異的な高感度のＩｎ−Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用して測定した。ＩＣＷアッセイは、通常、マイクロプレート形式において実施される、免疫細胞化学的アッセイである。Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（Ａｇｕｉｌａｒ  Ｈ．Ｎ．ら（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（４）：ｅ９９６５頁）を使用するＦＧＦ２１受容体自己リン酸化アッセイのために、ヒトベータ−Ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）と共にヒトＦＧＦＲ１ｃ（＝ＦＧＦ受容体１ｃアイソフォーム）を安定して発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ダルムシュタット、ドイツ）を使用した。ＭＰＡキナーゼＥＲＫ１／２の受容体自己リン酸化レベルまたは下流活性を決定するために、２×１０４細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに播種し、４８時間培養した。細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、ダルムシュタット、ドイツ）を伴う無血清培地ハムＦ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘによって３〜４時間、血清飢餓させた。続いて、細胞を、増加した濃度の、成熟ヒトＦＧＦ２１（配列番号２）のいずれかによって、３７℃で５時間処理した。インキュベーション後、培地を捨て、細胞を、３．７％の新たに調製したパラ−ホルムアルデヒドにおいて２０分間固定させた。２０分間、ＰＢＳ中で細胞に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を浸透させた。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファ（ＬＩＣＯＲ、バートホンブルク、ドイツ）により、室温で２時間、ブロッキングを実施した。一次抗体（抗ｐＦＧＦＲ  Ｔｙｒ６５３／６５４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、ドイツ）または抗ｐＥＲＫホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰキナーゼＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））を加えて、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。二次抗マウス８００ＣＷ抗体（ＬＩＣＯＲ、バートホンブルク、ドイツ）を、室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で再び洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ画像表示装置（ＬＩＣＯＲ、バートホンブルク、ドイツ）により、赤外色素シグナルを定量した。結果を、ＴＯ−ＰＲＯ３染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）によるＤＮＡの定量化によって正規化した。任意単位（ＡＵ）としてデータを得て、用量−応答曲線からＥＣ５０値を得て、それらを表２にまとめる。図５は、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＋ＫＬＢを過剰発現するＣＨＯ細胞によるＩＣＷの結果を示している。
【０１８０】
【表２】
2021528422.tif 000003
【実施例４】
【０１８１】
ヒトＧＬＰ−１受容体効能についてのインビトロ細胞アッセイ
ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体についての化合物のアゴニズムを、ヒトＧＬＰ−１受容体を安定的に発現するＨＥＫ−２９３細胞株においてｃＡＭＰ反応を測定する機能的アッセイによって決定した。
【０１８２】
細胞のｃＡＭＰ含有量は、ＨＴＲＦ（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）に基づいて、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｃｏｒｐ．のキット（カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＣ）を使用して決定した。製造するために、細胞は、Ｔ１７５培養フラスコに分割し、培地（ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ）においてコンフルエンス近くまで一晩培養した。培地はその後除去し、細胞をＰＢＳ欠失カルシウムおよびマグネシウムで洗浄し、続いて、アキュターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ａ６９６４）でプロテイナーゼ処理を行った。剥離した細胞を洗浄し、アッセイバッファ（１×ＨＢＳＳ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のＢＳＡ、２ｍＭのＩＢＭＸ）に再懸濁し、細胞密度を決定した。剥離した細胞は、その後、４×１０５細胞／ｍＬに希釈し、２５μＬのアリコートを９６ウェルプレートのウェルに分注した。測定のために、アッセイバッファにおける２５μＬの試験化合物をウェルに添加し、続いて、室温で３０分間インキュベーションした。溶解バッファ（キットの成分）に希釈したＨＴＲＦ試薬を添加した後、プレートを１時間インキュベートし、続いて、６６５／６２０ｎｍで蛍光比を測定した。アゴニストのインビトロ効力は、最大反応の５０％活性（ＥＣ５０）を引き起こした濃度を決定することによって定量した。結果を表３にまとめる。
【０１８３】
【表３】
2021528422.tif 000004
【０１８４】
【表４】
2021528422.tif 000005
【実施例５】
【０１８５】
ペプチド化合物の合成
融合タンパク質が組換え方法（実施例２を参照のこと）によって産生をした一方で、単離されたペプチドＧＬＰ−１Ｒアゴニストを、化学合成した。
【０１８６】
より詳細には、ペプチドは手動の合成手順によって合成した：
０．３ｇの乾燥ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器内に置いた。樹脂はＤＣＭ（１５ｍｌ）にて１時間、ＤＭＦ（１５ｍｌ）にて１時間膨張した。樹脂のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ＤＭＦ溶液で５分および１５分間、２回処理することによって脱保護した。樹脂をＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６時間）。固形支持体からＦｍｏｃが除去されたことを確認するために、Ｋａｉｓｅｒ試験（定量的方法）を使用した。乾燥ＤＭＦ中のＣ末端Ｆｍｏｃアミノ酸（樹脂負荷に対応する５等量の余剰）を脱保護された樹脂に添加し、次のＦｍｏｃアミノ酸のカップリングをＤＭＦ中のＤＩＣおよびＨＯＢＴの５等量の余剰で開始させた。反応混合物における各反応物の濃度は約０．４Ｍであった。混合物は、室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂をろ過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６時間）。カップリング完了時のペプチド樹脂アリコートのＫａｉｓｅｒ試験は陰性であった（樹脂に色がなかった）。第１のアミノ酸の付着後、無反応のアミノ基は、存在する場合、樹脂の中で、無水酢酸／ピリジン／ＤＣＭ（１：８：８）を使用して、２０分間キャップして、配列の任意の欠失を回避した。キャッピング後、ＤＣＭ／ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで樹脂を洗浄した（各６／６／６／６時間）。Ｃ末端のアミノ酸付着ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ＤＭＦ溶液で５分および１５分間、２回処理することによって脱保護した。樹脂をＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６時間）。Ｆｍｏｃ脱保護完了時のペプチド樹脂アリコートのＫａｉｓｅｒ試験は陽性であった。
【０１８７】
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上の標的配列における残りのアミノ酸は、ＤＭＦ中の樹脂負荷に対応する５等量の余剰を使用して、Ｆｍｏｃ  ＡＡ／ＤＩＣ／ＨＯＢｔ方法を使用して、順次結合させた。反応混合物における各反応物の濃度は約０．４Ｍであった。混合物は、室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂をろ過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６時間）。各カップリングステップおよびＦｍｏｃ脱保護ステップの後、Ｋａｉｓｅｒ試験を実施して、反応の完全性を確認した。
【０１８８】
線形配列の完成後、分枝点または修飾点として使用されるリジンのε−アミノ基は、ＤＭＦ中の２．５％のヒドラジン水和物を使用することによって、１５分間を２回、脱保護し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６時間）。ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ方法（樹脂負荷に対して、５等量の余剰）によるＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−ＯｔＢｕを使用して、グルタミン酸のγ−カルボキシル端をＬｙｓのε−アミノ基に付着させた。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂をろ過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６×３０ｍｌ）。グルタミン酸のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ＤＭＦ溶液で５分および１５分間（各２５ｍｌ）、２回処理することによって脱保護した。樹脂をＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６時間）。Ｆｍｏｃ脱保護完了時のペプチド樹脂アリコートのＫａｉｓｅｒ試験は陽性であった。
【０１８９】
側鎖分枝が１つ以上のγ−グルタミン酸も含む場合、ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ方法（樹脂負荷に対して、５等量の余剰）でγ−グルタミン酸の遊離アミノ基に付着させるために、第２のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−ＯｔＢｕを使用した。混合物を室温で２時間、ローターで回転させた。樹脂をろ過し、ＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６×３０ｍｌ）。γ−グルタミン酸のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ＤＭＦ溶液で５分および１５分間（２５ｍｌ）、２回処理することによって脱保護した。樹脂をＤＭＦ／ＤＣＭ／ＤＭＦで洗浄した（各６：６：６時間）。Ｆｍｏｃ脱保護完了時のペプチド樹脂アリコートのＫａｉｓｅｒ試験は陽性であった。
【０１９０】
樹脂からのペプチドの最終切断：
手動の合成によって合成したペプチジル樹脂をＤＣＭ（６×１０ｍｌ）、ＭｅＯＨ（６×１０ｍｌ）およびエーテル（６×１０ｍｌ）で洗浄し、減圧デシケーターで一晩乾燥させた。固体支持体からのペプチドの切断は、ペプチド−樹脂を試薬カクテル（８０％のＴＦＡ／５％のチオアニソール／５％のフェノール／２．５％のＥＤＴ／２．５％のＤＭＳ／５％のＤＣＭ）で、室温で３時間処理することによって達成した。切断混合物はろ過によって回収し、樹脂はＴＦＡ（２ｍｌ）およびＤＣＭ（２×５ｍｌ）で洗浄した。余剰ＴＦＡおよびＤＣＭを窒素下で少量に濃縮し、少量のＤＣＭ（５〜１０ｍｌ）を残留物に添加し、窒素下で蒸発させた。この工程を３〜４回繰り返して、揮発性不純物の多くを除去した。残留物を０℃に冷却し、無水エーテルを添加して、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離にかけ、上清エーテルを除去し、新鮮なエーテルをペプチドに添加し、再び遠心分離にかけた。粗試料は分取ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥した。ペプチドの同一性をＬＣＭＳによって確認した。
【０１９１】
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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