(57)【要約】  疾患関連ナノボディを開発するための方法および関連する製品およびキットが提供される。疾患特異的タンパク質は、疾患の様々な側面に関連し、および、非疾患個体には存在しないかまたは極めて低い量で存在する、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、ドメイン、またはエピトープである。in vivo画像化アッセイ、疾患の検出、診断および処置、ならびに、疾患を有する患者における治療上の進行をモニタリングすること、において有用なこれらのＥＣＭタンパク質エピトープに特異的に結合できる高度に有効なナノボディが、本明細書で提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的であり、および、これに直接結合するナノボディを含む組成物であって、
病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織よりも、疾患組織において多い量で存在し、および、ナノボディは、活性剤に接合されている、前記組成物。
【請求項２】
活性剤が、ナノボディのＮ末端に連結されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
活性剤が、ナノボディのＣ末端に連結されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
活性剤が、画像化プローブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
画像化プローブが、フルオロフォア、免疫組織化学的トレーサー、ＰＥＴトレーサー、ＮＩＲプローブ、ＳＰＥＣＴ、磁気粒子画像化、および放射性同位体から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
活性剤が、標的化治療のために、薬物、毒素、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、サイトカイン、ＥＣＭリモデリング酵素、ＣＡＲ−Ｔ細胞および放射性同位体から選択される、または、選択的送達のためにナノボディと接合されたナノ粒子に組み込まれ得る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ナノボディが、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または他の方法によって測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性で、病的な状態のＥＣＭエピトープに特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
病的な状態のＥＣＭエピトープが、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインのエピトープである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
病的な状態のＥＣＭタンパク質は、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ナノボディが、配列番号１〜４で表される配列および元の配列に対して配列類似性を有するそれらの誘導体を含む、請求項１〜７のずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
配列番号１〜４で表される配列またはそのフラグメントを含むペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１２】
ペプチドが、活性剤に接合されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ペプチドが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントである、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
フラグメントが、ＣＤＲである、請求項１１、１２、または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
配列番号１〜４で表される配列またはそのフラグメントを含むナノボディ、および、薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１６】
ナノボディが、活性剤に接合されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ナノボディが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または他の抗体フラグメントに接合される、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物を、腫瘍に活性剤を送達するのに有効な量で、腫瘍または他の病状を有する対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
対象における病的な状態に特徴的な１以上のＥＣＭタンパク質の存在または非存在を決定すること、および、対象が疾患を有するかどうかを決定することを包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１以上のＥＣＭタンパク質の存在または非存在が、免疫組織化学によって決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
病的な状態に特徴的な１以上のＥＣＭタンパク質の存在または非存在を経時的に測定することによって、疾患の進行期への進行をトラッキングする方法である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
第一の時点および第二の時点において対象から単離された組織試料中の病的な状態に関連する１以上のＥＣＭタンパク質の存在または非存在を測定するための、および、第一の時点および第二の時点において、病的な状態に関連する１以上のＥＣＭタンパク質の存在または非存在における変化に基づいて、疾患の進行期への進行を決定するための方法である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
病的な状態が、がん、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、線維症、慢性炎症または創傷である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
がんが、転移性がんである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
病的な状態に関連するＥＣＭタンパク質が、第二の時点からの単離された組織試料において、より高いレベルで存在するとき、疾患は、進行期へ進行している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
病的な状態に関連するＥＣＭタンパク質が、第二の時点からの単離された組織試料において、より低いレベルで存在するとき、疾患は、あまり進行していない段階に退行している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
病的な状態に関連するＥＣＭタンパク質が、第二の時点からの単離された組織試料において、より高いレベルで存在するとき、転移性がんが進行している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
病的な状態に関連するＥＣＭタンパク質が、第二の時点からの単離された組織試料において、より低いレベルで存在するとき、がんは、あまり転移性でない段階に退行している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
ＥＣＭタンパク質が、ＥＣＭタンパク質に特異的に結合する１以上のナノボディを使用して検出される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
ＥＣＭタンパク質が、定量的ＥＬＩＳＡを使用して分析される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
ＥＣＭ特異的ナノボディの多様なライブラリを作製する方法であって、
ＥＣＭタンパク質の複合体混合物から構成されるＥＣＭ調製物で免疫化されたラクダ科動物から回収された血液からリンパ球を単離すること、
リンパ球ＲＮＡを抽出すること、および、
リンパ球ＲＮＡからのＭ１３ファージディスプレイをベースとしたナノボディライブラリを構築すること、
を含み、ここで、ライブラリは、ＥＣＭ特異的ナノボディの多様なライブラリである、前記方法。
【請求項３２】
ラクダ科動物が、アルパカである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ナノボディが、ライブラリから単離され、および、ＥＣＭエピトープへの結合をさらに最適化するために、in vitro親和性成熟のための足場として使用される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＥＣＭ調製物は、ヒトがん転移からのＥＣＭである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＥＣＭ調製物が、がん転移を有する複数のヒト患者からのＥＣＭである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
複数のベクターを含む核酸ベクターのライブラリであって、各ベクターは、ベクター内に別個のＤＮＡ配列を有し、各ＤＮＡ配列は、ベクター内の１以上の他のＤＮＡ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、および、ライブラリは、１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの多様性を有し、各ＤＮＡ配列は、ＥＣＭエピトープに結合する能力を有するナノボディをコードする、前記ライブラリ。
【請求項３７】
ＥＣＭタンパク質が、病的な状態のＥＣＭエピトープである、請求項３６に記載のライブラリ。
【請求項３８】
病的な状態のＥＣＭエピトープが、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡおよびＥＩＩＩＢドメインである、請求項３７に記載のライブラリ。
【請求項３９】
病的な状態のＥＣＭが、テネイシンＣまたはそのエピトープである、請求項３７に記載のライブラリ。
【請求項４０】
ナノボディが、配列番号１〜４の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３６または３７に記載のライブラリ。
【請求項４１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を、胚にナノボディを送達するのに有効な量で、胚を有する対象に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
ナノボディが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物または胎盤性薬物を胚に送達する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＥＣＭタンパク質が腫瘍部位において腫瘍化促進機能を有するのをナノボディがブロックするための有効量で、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を、腫瘍を有する対象に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を、腫瘍を有する対象に投与することを含む方法であって、ナノボディは、腫瘍に結合し、および、腫瘍の腫瘍周辺部を同定するための有効量で、検出可能な標識を含む、前記方法。
【請求項４５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を、腫瘍または他の病状を有する対象に投与することを含む方法であって、ナノボディは、腫瘍または他の疾患の部位にｓｉＲＮＡを送達するのに有効な量で、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含有するナノ粒子に連結されている、前記方法。
【請求項４６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を、腫瘍または他の病状を有する対象に投与することを含む方法であって、ナノボディは、腫瘍または他の疾患部位に活性剤を送達するのに有効な量で、活性剤に連結されている、前記方法。
【請求項４７】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を作製するための方法であって、
病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的であり、および、これに直接結合するナノボディを含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を作製すること、ここで、病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織よりも、疾患組織において、多い量で存在する、および、
対象の血液から取り出されたＴ細胞をトランスフェクトすること、
ＣＡＲ構築物を発現させて、ＣＡＲ  Ｔ細胞を産生するために、Ｔ細胞中に機能的ＣＡＲを産生すること、
を含む、前記方法。
【請求項４８】
病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的である、および、これに直接結合するナノボディから構成される外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を有するＴ細胞を含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）であって、病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織よりも、疾患組織で、多い量で存在する、前記キメラ抗原受容体Ｔ細胞。
【請求項４９】
病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的である、および、これに直接結合するナノボディから構成される外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有する、ＣＡＲをコードする核酸を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物であって、病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織よりも、疾患組織で、多い量で存在する、前記キメラ抗原受容体構築物。
【請求項５０】
ナノボディが、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または他の方法によって測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性で、病的な状態のＥＣＭエピトープと特異的に結合する、請求項４７、４８、または４９に記載の方法。
【請求項５１】
病的な状態のＥＣＭエピトープが、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインのエピトープである、請求項４７、４８、または４９に記載の方法。
【請求項５２】
病的な状態のＥＣＭタンパク質が、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである、請求項４７、４８、または４９に記載の方法。
【請求項５３】
ナノボディが、配列番号１〜４で表される配列および元の配列に対して配列類似性を有するそれらの誘導体を含む、請求項４７、４８、または４９に記載の方法。
【請求項５４】
ナノボディが、不定にスプライシングされたＥＣＭタンパク質内の病的な状態エキソンによって発現されるエピトープを標的化する、請求項４７、４８、または４９に記載の方法。
【請求項５５】
病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的である、および、これに直接結合する、配列番号１〜４で表される配列を含むペプチドまたはそのフラグメントから構成される外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および、内部ドメインを有する、ＣＡＲをコードする核酸を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物であって、病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織よりも、疾患組織において、多い量で存在する、キメラ抗原受容体構築物。
【請求項５６】
ペプチドが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントである、請求項５５に記載のＣＡＲ構築物。
【請求項５７】
フラグメントが、ＣＤＲである、請求項５５に記載のＣＡＲ構築物。
【請求項５８】
ペプチドが、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または他の方法によって測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性で、病的な状態のＥＣＭエピトープに特異的に結合する、請求項５５に記載のＣＡＴ構築物。
【請求項５９】
病的な状態のＥＣＭエピトープが、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインのエピトープである、請求項５５に記載のＣＡＲ構築物。
【請求項６０】
病的な状態のＥＣＭタンパク質が、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである、請求項５５に記載のＣＡＲ構築物。
【請求項６１】
ペプチドが、不定にスプライシングされたＥＣＭタンパク質内の病的な状態エキソンによって発現されるエピトープを標的化する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
固形腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を、固形腫瘍を有する対象を処置するのに有効な量で、固形腫瘍を有する対象に投与することを含み、
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的であり、および、これに直接結合する、配列番号１〜４で表される配列を含むナノボディペプチドまたはそのフラグメントから構成される外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有し、
病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織よりも、疾患組織において、多い量で存在する、前記方法。
【請求項６３】
ペプチドが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ペプチドが、ナノボディである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
フラグメントが、ＣＤＲである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
ペプチドが、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または他の方法によって測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性で、病的な状態のＥＣＭエピトープに特異的に結合する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
病的な状態のＥＣＭエピトープが、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインのエピトープである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
病的な状態のＥＣＭタンパク質が、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
ＣＡＲが、Ｔ細胞において発現される、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ＣＡＲが、ＮＫ細胞において発現される、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
対象における固形腫瘍へ免疫細胞を動員するための方法であって、
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）またはキメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ−ＮＫ細胞）を、固形腫瘍に免疫細胞を動員するのに有効な量で、固形腫瘍を有する対象に投与することを含み、
ＣＡＲＴまたはＣＡＲ−ＮＫ細胞は、病的な状態細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的であり、および、これに直接結合する、配列番号１〜４で表される配列を含むナノボディペプチドまたはそのフラグメントから構成される外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有し、
病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織よりも、疾患組織において、多い量で存在する、前記方法。
【請求項７２】
ペプチドが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ペプチドが、ナノボディである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
フラグメントが、ＣＤＲである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
ペプチドが、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または他の方法によって測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性で、病的な状態のＥＣＭエピトープに特異的に結合する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
病的な状態のＥＣＭエピトープが、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインのエピトープである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
ペプチドが、不定にスプライシングされたＥＣＭタンパク質内の病的な状態エキソンによって発現されるエピトープを標的化する、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許法§１１９の下で、２０１８年１月２５日に出願の米国仮出願第６２／６２１,８１１号の出願日の利益を主張し、その全体の内容は、本明細書に参照によって組み込まれる。
発明の分野
【０００２】
本発明は、いくつかの側面において、病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質に特異的なナノボディの生成および同定、および診断、予後、および治療の目的のためのかかるナノボディの使用、ならびに関連する試薬、製品、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
他のプロセスの中で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）およびＥＣＭタンパク質は、増殖、創傷治癒、細胞移動、および分化において重要な生理的役割を果たす。さらにその上、病的な状態で、ＥＣＭの組成は変化し、そして、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質におけるこれらの変化が、がんの進行および転移において、心血管疾患において、そして、線維症において有意な役割を果たすことができることを、従来の所見は指し示す。プロテオミクスの分野は、複雑な生理的システムにおけるタンパク質およびこれらのシステムにおけるそれらの役割の検討に、関わる。大きいデータセットは、ゲノムおよびプロテオミクス法を使用して発生されたが、しかし、疾患の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の役割を同定するその情報の使用は、限定された。これは、ＥＣＭが不溶性でありおよび架橋されており、そして、その組成が、ＥＣＭタンパク質に特異的に標的とされるプロテオミクスの最近の適用まで、決定するのが困難だったという理由である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、病状の画像化および標的化における使用のためのＥＣＭタンパク質へのナノ抗体（すなわち、アルパカからの単一ドメイン抗体）の開発、単離、および使用のための方法を網羅する。目的のＥＣＭエピトープは、がん、転移、および他の病状において、特異的に発現される。これらのナノボディは、様々な目的のために、たとえば、腫瘍、転移または他の疾患遺伝子座のＥＣＭを標的とするために、そして、以下：〔１〕画像化剤；〔２〕多様なタイプの治療剤；〔３〕免疫調節剤（改変されたＴ細胞を含む）を送達するためのナノボディの特異性を用いて、使用されてもよいし；または、〔４〕病状に影響を及ぼすためのナノボディそれ自体の機能特性を使用してもよい。
【０００５】
本発明は、腫瘍および転移の従来のプロテオミクス分析によって定義された、腫瘍に豊富なＥＣＭタンパク質および／またはドメイン（まとめると、ＥＣＭエピトープ）によりラクダ科の動物を免疫化することによってナノボディを産生するための方法に、関わる。これらの方法を用いて発生するライブラリは、転移および他の病的な状態を標的とする追加の腫瘍選択的抗ＥＣＭナノボディの発生のための他の腫瘍に増強されたＥＣＭエピトープに、抗ＥＣＭ抗体の再生可能な供給源を、提供する。
【０００６】
本開示の側面は、直接病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的であり、および直接結合するナノボディを備える組成物に関し、ここで、病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織中よりも病的な組織中により大量に存在し、そしてここで、該ナノボディは、１以上の活性剤に接合される。
【０００７】
いくつかの態様において、活性剤は、ナノボディのＮ末端に連結する。他の実施形態において、活性剤は、ナノボディのＣ末端に連結する。一態様において、活性剤は、画像化プローブである。いくつかの態様において、画像化プローブは、フルオロフォア、ＰＥＴトレーサー、ＳＰＥＣＴ、ＮＩＲ、磁性粒子画像化、または放射性同位体から選択される。他の態様において、活性剤は、標的治療のための薬物、毒素、サイトカイン、免疫モジュレーター、ＥＣＭリモデリング酵素、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ナノ粒子、ＣＡＲ−Ｔ細胞、または放射性同位体から選択される。
【０００８】
いくつかの態様において、一旦対象に投与されたナノボディは、疾患部位でのレベルが、体内の他の部分のそれよりかなり高いように、ナノボディ、および腫瘍または他の疾患遺伝子座領域中に付着したいずれかの活性剤を濃縮するのに十分な結合親和性を有する、病的な状態のＥＣＭタンパク質エピトープに、特異的に結合する。ナノボディの親和性は、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲（すなわち、例においてテストされた抗体の中で、ＮＪＢ２は、ＢＬＩにより〜４ｎＭの親和性を有し、そして、ＮＪＴ３、ＮＪＴ４、およびＮＪＴ６は、ＢＬＩに基づくｐＭ以下の親和性を有する）にあり、それは、この目的を達成するのに明白に十分であり、治療用の普通抗体（例として、リツキサン、ハーセプチン）の親和性と類似している。ナノボディの親和性は、実験的に決定されることができる。
【０００９】
いくつかの態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインにおけるエピトープである。他の態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである。一態様において、ナノボディは、配列番号１〜４に規定される配列、またはそれらの親和性または効力を改善するため、かかる配列へとほどこされた改変を備える。
【００１０】
本開示の他の側面は、配列番号１〜４に規定される配列の１つを備えるナノボディを備える組成物、または薬学的に許容し得る担体中に製剤化される、配列中に軽微な違いを有する誘導体に関する。いくつかの態様において、ナノボディは、活性剤に接合される。他の態様において、ナノボディは、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントまたは追加のエピトープの標的化を許すキメラ抗原受容体などの別のタンパク質中に、組み込まれるかまたはそれによって接合される。
本開示の別の側面は、活性剤を腫瘍／疾患部位に送達するために有効な量で、本明細書中に記載される組成物を、腫瘍または他の病状を有する対象に投与することを備える方法を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、該方法は、対象における病的な状態に特徴的な１以上のＥＣＭタンパク質またはエピトープの存在または非存在を決定し、および、該対象が、身体において疾患を有するかどうか、またはどこに有するかを決定することに関わる。かかる態様において、１以上のＥＣＭタンパク質またはエピトープの存在または非存在は、免疫−ＰＥＴ／ＣＴなどの、非侵襲的in vivo画像化モダリティーなどの、免疫組織化学または免疫蛍光法または他の画像化モダリティーによって、決定される。
【００１２】
別の態様において、該方法は、経時的に、病的な状態に特徴的な１以上のＥＣＭタンパク質またはエピトープの存在、量、または非存在を評価することによって、進行ステージまでの疾患の進行を追う、方法である。一態様において、該方法は、第１および第２の時点に、対象から単離された組織試料における病的な状態と関連した１以上のＥＣＭタンパク質またはエピトープの存在、量、または非存在を測定し、第１および第２の時点に、病的な状態と関連する１以上のＥＣＭエピトープの存在、量、または非存在における変化に基づいた、より高度なステージへの疾患の進行を、決定するための方法である。いくつかの態様において、病的な状態は、がん、アテローム硬化症、心筋梗塞、線維症、慢性炎症、または創傷である。一態様において、がんは、転移性がんである。
【００１３】
いくつかの態様において、病的な状態と関連するＥＣＭエピトープが、第２の時点から、単離された組織試料においてより高いレベルで存在する場合に、該疾患はより高度なステージに進行した。別の態様において、病的な状態と関連するＥＣＭエピトープが、第２の時点から、単離された組織試料においてより低いレベルで存在する場合に、該疾患はより低度なステージに、退行した。いくつかの態様において、病的な状態と関連するＥＣＭエピトープが、第２の時点から、単離された組織試料においてより高いレベルで存在する場合に、該がんは、転移性がんへと進行するか、または成長した。
他の態様において、病的な状態と関連するＥＣＭエピトープが、第２の時点から、単離された組織試料において低いレベルで存在する場合に、がんは、より低度の悪性状態に退行した。
【００１４】
いくつかの態様において、ＥＣＭエピトープは、ＥＣＭエピトープに特異的に結合する１以上のナノボディを使用して、検出される。一態様において、ＥＣＭタンパク質またはエピトープは、定量的ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを使用して、分析される。いくつかの態様において、ＥＣＭエピトープは、質量分析法および／またはクロマトグラフィー法を使用して、検出される。
【００１５】
本開示の別の側面は、ＥＣＭタンパク質およびそれらのエピトープに関して特異的なナノボディの多様なライブラリを発生させる方法を含み、ここで、ＥＣＭ調製物は、転移関連タンパク質中に豊富な、１以上のヒトがん転移からのＥＣＭである。かかるライブラリは、複合のＥＣＭが豊富な調製物によって免疫化されたラクダ科の動物から収集された血液からリンパ球を単離し、リンパ球ＲＮＡを抽出し、そしてリンパ球ＲＮＡからＭ１３ファージディスプレイに基づくナノボディライブラリを構築することによって、引き出され、ここで、該ライブラリは、必要に応じて、多数の特異的な抗ＥＣＭナノボディを単離することができる、多様なおよび再生可能なＥＣＭ特異的ナノボディのライブラリである。
【００１６】
いくつかの態様において、ラクダ科の動物は、アルパカである。別の態様において、ナノボディは、ライブラリから単離され、そしてＥＣＭエピトープに結合することをさらに最適化するために、in vitroの親和性成熟のための足場として使用される。
【００１７】
本開示のさらなる側面は、複数個のベクターを備え、それぞれのベクターが該ベクターの中で別個のDNA配列を有する、核酸ベクターのライブラリを提供し、ここで、それぞれのDNA配列は、該ベクターの中で１以上の他のDNA配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ここで、該ライブラリは、１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの多様性を有し、そしてここで、それぞれのDNA配列は、病状と関連するＥＣＭタンパク質エピトープに結合する能力を有するナノボディを、コードする。
いくつかの態様において、ＥＣＭエピトープは、病的な状態のＥＣＭエピトープである。
【００１８】
別の態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインである。他の態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである。一態様において、ナノボディは、配列番号１−４の配列と、少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を、備える。
【００１９】
いくつかの側面において、本開示は、病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに特異的であり、および直接結合するナノボディを備える外部ドメイン、膜貫通ドメインおよび内部ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構造物を発生させることに関わる、キメラ抗原受容体Ｔ−細胞（ＣＡＲＴ細胞）を発生させるための方法であり、ここで、該病的な状態のＥＣＭ（ＥＣＭ）エピトープは、正常な組織より病的な組織においてより大量に存在し、そして、対象の血液から取り出されたＴ細胞をトランスフェクトして、ＣＡＲ構築物を発現し、Ｔ細胞中で機能的なＣＡＲを産生し、ＣＡＲＴ細胞を産生する。
【００２０】
他の側面において、本開示は、病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに関して特異的であり、直接結合するナノボディを備える外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）を提供し、ここで、病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織より大量に病的な組織に存在する。
【００２１】
別の側面において、本開示は、病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに関して特異的であり、直接結合するナノボディを備える外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有するＣＡＲをコードする核酸を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を提供し、ここで、病的な状態のＥＣＭエピトープは、正常組織より大量に病的な組織に存在する。
【００２２】
いくつかの態様において、ナノボディは、Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）または他の方法で測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性を伴う、病的な状態のＥＣＭエピトープを、特異的に結合する。
【００２３】
いくつかの態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインにおけるエピトープである。他の態様において、病的な状態のＥＣＭタンパク質は、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである。
【００２４】
他の態様において、ナノボディは、配列番号１〜４に規定される配列、またはそれらの親和性または効力を改善するため、かかる配列へとほどこされた改変を備える。他の側面において、本開示は、病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに関して特異的であり、および直接結合する配列番号１〜４に規定される配列またはそれらのフラグメントを備えるペプチドから構成される外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有するＣＡＲをコードする核酸を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を、提供し、ここで、病的な状態のＥＣＭエピトープが、正常組織より大量に病的な組織に存在する。
いくつかの態様において、ペプチドは、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントである。別の態様において、フラグメントは、ＣＤＲである。
【００２５】
いくつかの態様において、ペプチドは、Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）または他の方法で測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性を伴う、病的な状態のＥＣＭエピトープを、特異的に結合する。いくつかの態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインにおけるエピトープである。他の態様において、病的な状態のＥＣＭタンパク質は、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである。別の態様において、ペプチドは、不定にスプライシングされたＥＣＭタンパク質内で、病的な状態のエキソンによって発現されるエピトープを、標的とする。
【００２６】
本開示のさらなる側面は、固形腫瘍を有する対象を処置するための有効量において、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を、固形腫瘍を有する対象に投与することを含む、固形腫瘍を有する対象を処置するための方法を提供し、ここで、該ＣＡＲ  Ｔ細胞が、病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに関して特異的であり、および直接結合する配列番号１〜４に規定される配列またはそれらのフラグメントを備えるナノボディペプチドから構成される外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を有するＴ細胞を備え、ここで、該病的な状態のＥＣＭエピトープが、正常組織よりより大量に病的な組織中に存在する。
【００２７】
いくつかの態様において、ペプチドは、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントである。いくつかの態様において、ペプチドは、ナノボディである。別の態様において、フラグメントは、ＣＤＲである。
【００２８】
いくつかの態様において、ペプチドは、Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）または他の方法で測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性を伴う、病的な状態のＥＣＭエピトープを、特異的に結合する。いくつかの態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインにおけるエピトープである。他の態様において、病的な状態のＥＣＭタンパク質は、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである。別の態様において、ペプチドは、不定にスプライシングされたＥＣＭタンパク質内で、病的な状態のエキソンによって発現されるエピトープを、標的とする。
いくつかの態様において、ＣＡＲは、Ｔ細胞において発現される。別の態様において、ＣＡＲは、ＮＫ細胞において発現される。
【００２９】
開示のさらなる側面は、固形腫瘍に免疫細胞を補充するための有効量において、固形腫瘍に有する対象にキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）またはキメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ−ＮＫ細胞）を投与することに関わる、対象における固形腫瘍に免疫細胞を補充するための方法を提供し、ここで、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ−ＮＫ細胞が、病的な状態の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）エピトープに関して特異的であり、および直接結合する配列番号１〜４に規定される配列またはそれらのフラグメントを備えるナノボディペプチドを備える外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を有するＴ細胞またはＮＫ細胞を備え、ここで、該病的な状態のＥＣＭエピトープが、正常組織よりより大量に病的な組織中に存在する。
いくつかの態様において、ペプチドは、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントである。
いくつかの態様において、ペプチドは、ナノボディである。別の態様において、フラグメントは、ＣＤＲである。
【００３０】
いくつかの態様において、ペプチドは、Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）または他の方法で測定される場合、ｎＭ〜ｐＭ以下の範囲の結合親和性を伴う、病的な状態のＥＣＭエピトープを、特異的に結合する。いくつかの態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインにおけるエピトープである。他の態様において、病的な状態のＥＣＭタンパク質は、テネイシンＣまたはテネイシンＣのエピトープである。別の態様において、ペプチドは、不定にスプライシングされたＥＣＭタンパク質内で、病的な状態のエキソンによって発現されるエピトープを、標的とする。
本発明は、以下の記載に規定されるかまたは図面に図示される構築物の詳細および構成要素の配置に、その適用において限定されない。本発明は、他の実施形態で、および種々の方法で実施されるかまたは実行されることができる。また、本明細書に使用される語法および専門用語は、記載の目的のためにあって、限定するとみなされるべきではない。本明細書における「含む」、「備える」、または「有する」、「含有する」、「関わる」及びそれらの変形の使用は、以降にリストされる項目及びその均等物並びに追加の項目を包含することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、２ラウンドのバイオ−パニングからそれぞれ単離された、αＥＩＩＩＢ  ＶＨＨ配列（図１Ａ）およびαＴＮＣ  ＶＨＨ配列（図１Ｂ）のＣｌｕｓｔａｌＷに基づくアライメントを示す。相補性決定領域、ＣＤＲ３、またはナノボディ中の他の場所の違いは、種々のナノボディの中で区別する。ＣＤＲは、相補性決定領域である。上から下へ、左から右へ、図１Ａにおいて、配列は、配列番号５、１、６、７、８、および９に対応する。上段から下段へ、左から右へ、図１Ｂにおいて、配列は、配列番号１０、１２、１１、１６、３、１３、１４、１７、１５、２、４に対応する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、２ラウンドのバイオ−パニングからそれぞれ単離された、αＥＩＩＩＢ  ＶＨＨ配列（図１Ａ）およびαＴＮＣ  ＶＨＨ配列（図１Ｂ）のＣｌｕｓｔａｌＷに基づくアライメントを示す。
【図２】図２は、ナノボディＮＪＢ２が、フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＩＩＩＢドメインのエピトープに特異的に結合することを、示す。ＮＪＢ２は、部位特異的にソータギングを介してビオチンで標識されて、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８によって検出された。右のパネルは、ＶＨＨ  ＮＪＢ２が、コントロール／野生型マウスに由来する大動脈内皮細胞のＥＣＭ中のＦＮのＥＩＩＩＢドメインのエピトープを、特異的に認識することを、示す。しかしながら、左のパネルに示されるように、ＮＪＢ２は、ＦＮのＥＩＩＩＡおよびＥＩＩＩＢドメインを欠いているマウス（ＡＢヌルマウス）に由来する内皮細胞のＥＣＭのＦＮを、認識しなかった。αＥＩＩＩＢの対照は、ＦＮのＥＩＩＩＢドメインのエピトープに特異的なマウスモノクローナルIgGで染色される細胞だった。陰性対照Ｃは、染色されない細胞だった。
【図３】図３は、ＶＨＨ  ＮＪＢ２が、腫瘍のＥＣＭを特異的に認識することを、示す。ＮＪＢ２は、部位特異的にソータギングを介してＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識され、マウスに導入されて、腫瘍のＥＣＭを標識した。画像は、解剖された腫瘍のex vivoでの２−光子顕微鏡を用いて取得され、種々のチャネルのオーバレイを示す。細胞（オリジナルの緑）は、丸い白体として現れ；該ＥＣＭ（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ染色された）は、フィブリルとして現れる。左のパネルは、画像化より１２０分先立ち、ＮＪＢ２−Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄの２０μｇを続いて注入されたＮＯＤ−ＳＣＩＤ  Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスにおいて増殖された、オルト局所的に移植されたＬＭ２−Ｚｓ−Ｇｒｅｅｎ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ腫瘍の画像を示す。右のパネルは、画像化より１２０分先立ち、ＮＪＢ２−Ｔｅｘａｓ ｒｅｄの２０μｇを注入されたＮＳＧマウスにおいて視覚化された、ＬＭ２−Ｚｓ−Ｇｒｅｅｎ−ルシフェラーゼ腫瘍の肺転移の画像を、示す。いずれの場合においても、ナノボディによって結合されたＥＣＭ繊維（矢印）は、腫瘍細胞を取り巻いて明確に見られることができる。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２が、ＬＭ２  ＴＮＢＣヒト細胞株に由来する同所性の原発腫瘍および肺転移を検出することを示す。ＶＨＨ−ＮＪＢ２は、ソータギングを使用して、部位特異的に６４Ｃｕで標識された。マウスは、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２の注入２ｈ後に画像化された。図４Ａは、対照のＮＳＧマウス（腫瘍でない）のＰＥＴ−ＣＴ画像を示す；ＰＥＴシグナルは、循環するナノボディのクリアランスにより、腎臓および膀胱において、検出された。
【図４Ｂ】図４Ｂは、同所性に（乳房脂肪体）ＬＭ２−ＴＮＢＣ細胞を注入された、ＮＳＧマウスを示す。標識は、腎臓、膀胱、および左下乳房脂肪体中の原発腫瘍において検出された。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＬＭ２−ＴＮＢＣ細胞を尾静脈（肺転移モデル）を介して注入された、ＮＳＧマウスを示す。ＰＥＴシグナルは、腎臓、膀胱、および肺中の転移において検出された。これらおよびすべてのこれに続くＰＥＴ／ＣＴ画像において、ＰＥＴシグナル（６４Ｃｕ共役ナノボディ）は、ＣＴ画像と同じ色のようにみえる；本来のカラーフォトで、そして、さらにいっそうそのように、３次元再構築の動画で、別個の画像は、明確に識別可能で、ＰＥＴ画像化から、極めて低いバックグラウンドシグナルを示す（腎臓および膀胱シグナルから離れて）。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２が、原発腫瘍、および肝臓、およびＬＭ２  ＴＮＢＣヒト乳癌細胞によって乳腺中に同所性に播種されたマウスのリンパ節への転移を検出することを示す。ＶＨＨ−ＮＪＢ２は、ソータギングを使用して、部位特異的に６４Ｃｕで標識された。６４Ｃｕ−ＮＪＢ２免疫ＰＥＴ／ＣＴ画像は、同じマウスの１８Ｆ−ＦＤＧ画像と比較された。ＬＭ２−ＺｓＧｒｅｅｎ−ルシフェラーゼＴＮＢＣ細胞に由来する同所性の（乳房脂肪体）腫瘍をもつＮＳＧマウスは、１８Ｆ−ＦＤＧ（図５Ａ）を、または、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２（図５Ｂ）を注入されて、注入２ｈ後に、ＰＥＴ／ＣＴによって画像化された。ＬＮ  Ｍｅｔｓ：リンパ節転移。Ｌｉｖｅｒ  Ｍｅｔｓ:肝臓 転移。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２が、原発腫瘍、および肝臓、およびＬＭ２  ＴＮＢＣヒト乳癌細胞によって乳腺中に同所性に播種されたマウスのリンパ節への転移を検出することを示す。
【図６】図６は、１８Ｆ−ＦＤＧ（図６Ａ、Ｃ）または６４Ｃｕ−ＮＪＢ２（図６Ｂ、Ｄ）によって画像化された、膵管腺癌すなわちＰＤＡＣ（上段）および膵上皮内腫瘍性病変すなわちＰａｎＩＮｓ（下段）を伴うマウスの、代表的なＰＥＴ−ＣＴ画像を示す。腎臓および膀胱のクリアランス臓器からのシグナルに加えて、ナノボディシグナルは、ＰＤＡＣ腫瘍（図６Ｂ）およびＰａｎＩＮｓ（図６Ｄ正面および側面図）からも見られた。
【図７Ａ】図７Ａは、対照のＢＡＬＢ／ｃマウス、および４Ｔ１トリプルネガティブ乳癌細胞に由来する原発腫瘍および肺転移を伴うマウスを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、対照のＣ５７Ｂｌ／６マウス、およびＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞に由来する皮下腫瘍または肺転移を伴うマウスを示す。代表的なＰＥＴ／ＣＴ画像は、原発腫瘍「Ｔ」、肺転移「ＬＭ」、腎臓「Ｋ」、および膀胱「Ｂ」からのＰＥＴシグナルを示す。
【図８】図８は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中へのブレオマイシンスルファートの０．０３５Ｕの単回気管内投与によって誘発される肺線維症を、示す。シャム（生理食塩水）およびブレオマイシン処置マウス（ブレオマイシン投与後７および１４日）は、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２  ＰＥＴ／ＣＴによって画像化された。ブレオマイシン処置の７日後およびブレオマイシン処置の１４日後の、シャム処置されたマウスの代表的なＰＥＴ／ＣＴ画像。線維性病変（矢印）は、ブレオマイシン投与後７および１４日のマウスにおいて目に見えた。
【図９】図９は、６、８、１０、１２および１３週齢での、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２  ＰＥＴ／ＣＴによって画像化されたＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス（ｎ＝７）の上体の、代表的なＰＥＴ／ＣＴ画像を示す。特発性乳房脂肪体腫瘍からのＰＥＴ／ＣＴシグナルは、１０週以降、目に見えた（矢印先端）。多数の乳房腫瘍の腫瘍の進行は、すべてのマウスにおいて明らかだった。上段のパネルは、最大強度プロジェクション（ＭＩＰ）を示し、そして、下段のパネルは、横断切片を示す。
【図１０】図１０は、多器官に由来する１０４人の患者からの生検試料（２生検／患者）による転移性組織アレイ上のビオチン化されたＮＪＢ２による免疫組織化学からの結果を、示す。図は、患者の４４％が、間質ＦＮ−ＥＩＩＩＢに関して陽性だった転移を有することを示す。これは、両方の生検が陽性だった（２９％）患者、および片方の生検が陽性だった者（１５％）を、含む。腫瘍不均一性が、小さい生検において完全には捕獲されないので、これは、陽性転移の数の過小評価である。表４は、原発腫瘍の供給源およびスコア化した転移の部位を、リストする。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、αＴＮＣナノボディＮＪＴ３、ＮＪＴ４、およびＮＪＴ６による、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＥＬＩＳＡプレートは、精製されたヒトＴＮＣタンパク質の３μｇ／ｍｌでコートされ、そして、ＶＨＨ  ＮＪＴ４（図６Ａ）およびＮＪＴ３およびＮＪＴ６（図６Ｂ）の濃度増大は、ＴＮＣへの結合および結合親和性の決定に関して、テストされた。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、αＴＮＣナノボディＮＪＴ３、ＮＪＴ４、およびＮＪＴ６による、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１２】図１２は、αＴＮＣナノボディＮＪＴ３、ＮＪＴ４、およびＮＪＴ６が、腫瘍ＥＣＭに特異的に結合することを示す。ＮＳＧマウスにおいて進展したＬＭ２−ＺｓＧｒｅｅｎ−ルシフェラーゼ細胞の肺転移の免疫組織化学は、ナノボディが、転移性ＥＣＭのＴＮＣを特異的に認識することを、明らかにした。
【図１３】図１３は、３つの異なる抗ＴＮＣ  ＶＨＨが、腫瘍ＥＣＭを特異的に認識することを示す。ＶＨＨは、部位特異的にソルターゼによって媒介されるタグ付けを介して、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄによって標識され、腫瘍を担持するマウスに注入された。画像は、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ２光子顕微鏡を用いて取得され、緑および赤チャネルのオーバレイを示す；腫瘍細胞（本来は緑）は、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識化ＥＣＭによって取り巻かれる（矢印）。画像化に１２０分先立って、指し示されたＴｅｘａｓ ｒｅｄ標識化ＶＨＨの２０μgを注入されたＮＳＧマウスに由来する同所性のＬＭ２−Ｚｓ−Ｇｒｅｅｎ−ルシフェラーゼ腫瘍の画像。
【図１４】図１４は、６４Ｃｕ−ＮＪＴ６抗テネイシンナノボディが、ＬＭ２  ＴＮＢＣヒト細胞株に由来する同所性の原発腫瘍および肺転移を検出することを示す：ＶＨＨ−ＮＪＴ６は、ソータギングを使用して６４Ｃｕで標識された。マウスは、同所性に（乳房脂肪体）ＬＭ２−ＺｓＧｒｅｅｎ−ルシフェラーゼＴＮＢＣ細胞を注入されたＮＳＧマウスの６４Ｃｕ−ＮＪＴ６（Ａ）ＰＥＴ−ＣＴ画像を、注入２ｈ後に画像化された。ＬＭ２−ＺｓＧｒｅｅｎ−ルシフェラーゼＴＮＢＣを尾静脈を介して注入された、左下の乳房脂肪体（Ｂ）ＮＳＧマウス（肺転移モデル）中の腎臓、膀胱、および原発腫瘍において検出された標識。腎臓、膀胱、および肺において検出されたシグナル（矢印で示された転移）。
【図１５Ａ】図１５Ａは、フィブロネクチン（Ｂ２）のＥＩＩＩＢドメインを認識し、Ｂ１６Ｆ１０細胞が皮下にＣ５７ＢＬ／６の免疫能力のあるマウスに移植され、未処置のままか（Ｎｏｎｅ）またはＣＡＲ−Ｔ細胞で４および１１日に処置されたあとの腫瘍サイズを、示す。抗−ＥＩＩＩＢ−ＦＮ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置された腫瘍は、著しく減弱した成長速度を示した。免疫不全ＲＡＧ２ノックアウトマウスにおいて執行された平行実験は、腫瘍成長のきわめて小さい抑制を示し、そして、宿主免疫細胞が、抑制に寄与することを指し示した。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、脈管構造（ＣＤ３１）および処置された腫瘍へのＴ細胞の著しく増強された動員を示す、未処置の腫瘍（Ｃ）またはＣＡＲ−Ｔ処置腫瘍の免疫組織化学；総Ｔ細胞（ＣＤ３）およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、Ｔ細胞浸潤の定量化は、ＣＡＲ−Ｔ細胞腫瘍中のＴ細胞数を大いに増強したことを、示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な記載
細胞によって分泌される細胞外分子を含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、細胞を取り巻くために、構造上および生化学的支持体を提供する。それは、創傷治癒、血管新生、および成長などの、生理的プロセスにおいて関わることに加えて、組織を相互に分離すること、細胞間通信を制御すること、生体力学的および生化学的支持体を細胞に提供して、成長因子を封鎖することを含む、様々な追加の目的にかなう。該ＥＣＭは、腫瘍浸潤および転移およびＥＣＭリモデリングに関連する他の疾患を含む、病態生理学的プロセスにも関わる。ＥＣＭの組成、剛性、および弾性は、遺伝子発現、細胞生存、増殖および分化、およびがん進行に関する衝撃につながることが、示された。
【００３３】
がんは、典型的に原発腫瘍の過剰な成長につながる１以上の突然変異の事象を経た、原発腫瘍のイニシエーションから進行する、複合の疾患である。原発腫瘍が、起源のその部位に限定されたままである限り、外科的にそれを切除することはしばしば可能であり、そして、それは、良性腫瘍としてしばしば称される。しかしながら、腫瘍細胞自体に固有の、そして、腫瘍細胞と相互作用する非腫瘍細胞（しばしば間質細胞と称される）の動員によっての両方のさらなる変化は、最終的に下層の組織への浸潤に結果としてなる、腫瘍の状態の進行につながる。かかる腫瘍は、それらが浸潤し、広がるのですべての腫瘍細胞の除去を確保することが困難であるので、浸潤性または悪性として称される。この問題は、転移のプロセスによって悪化され、そのなかで、腫瘍細胞が、原発腫瘍からはずれ、それから離れて移動し、最終的に脈管構造および／またはリンパ管に深く入りこんで、遠位部位で二次腫瘍または転移を播種し、広範囲にわたって体に広がる。
【００３４】
いくつかの転移が、外科的に取り除かれることができるにもかかわらず、それらは、頻繁に無数であり、小さくおよび検出するのが難しいかもしれず、手術によって取り除くのがそれゆえ不可能である。処置は、放射線治療または化学治療を次いで必要とし、そして、数十年の努力にもかかわらず、これらの方法は、効果がないままであり、そして、転移性がんは、がん死の９０％の原因である。それゆえ、転移の機構のより良好な理解、および転移を検出して根絶するため方法の開発のための緊急の必要性が、ある。
【００３５】
本明細書に記載の発明は、いくつかの側面において、数ある中で、腫瘍、線維性組織、およびアテロームなどの病的な組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に存在するタンパク質に特異的なナノボディを開発する方法を、含む。これらのタンパク質は、ＥＣＭリモデリングによって特徴づけられる腫瘍、転移部位、線維症、アテローム、炎症性障害、動脈瘤、および他の疾患において発現され、重要なことに、正常な成人ヒト組織からは、ほとんどない。たとえば、フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＩＩＩＢドメインのエピトープに、そして、テネイシンＣ（ＴＮＣ）（病的な組織のＥＣＭにおいて存在するが、正常な、健康な成人組織には存在しない）に高度に特異的なナノボディが、開発された。それゆえ、発生されたナノボディは、in vivoおよびin vitro画像診断（これに限定されないがＩＦ、ＩＨＣ、ＰＥＴ／ＣＴなど）のために、そして、疾患の広域スペクトラムにわたる多様な標的治療のために使用されてもよい。
【００３６】
本明細書に使用される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、ＥＣＭの一部であると認められるいずれかのタンパク質を、指す。ＥＣＭは、構造上の支持体および足場を細胞に提供する、後生動物有機体の基本的なおよび重要な構成要素である。ＥＣＭは、高度に架橋したタンパク質の複合の網目構造からなり、器官内で間質型として、そして、基底膜下層の上皮、脈管内皮、および一定の他の組織および細胞型（例として、ニューロン、筋）などを取り巻く特殊な型として、存在する。細胞は、膜貫通受容体を介してＥＣＭに付着し、それら膜貫通受容体の中で、インテグリンは、最も顕著である。これらの細胞−マトリックス相互作用は、増殖および生存、分化、遊走等々を制御している様々なシグナリング経路の刺激に、結果としてなる。ＥＣＭの組成およびＥＣＭ受容体のレパートリは、細胞の応答を決定する。ＥＣＭの生物物理学的な特性（変形性または剛性）も、これらの細胞の機能を調節することが、示された。コアのＥＣＭ構成要素（フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン等々）に加えて、ＥＣＭは、成長因子およびサイトカインのための、そして、細胞にシグナルを送るＥＣＭタンパク質と共同するＥＣＭ−リモデリング酵素のリザーバとして、役立つ。
【００３７】
とりわけ、がんおよび転移、例えば、フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＩＩＩＡおよび／またはＥＩＩＩＢドメインおよびテネイシンＣ（ＴＮＣ））などの病状においてそれらの増強された存在によって特徴づけられるＥＣＭタンパク質は、ナノボディを結合するための標的として、使用されてもよい。ＦＮおよびＴＮＣのＥＩＩＩＡおよびＥＩＩＩＢドメインが、腫瘍、転移部位、線維症、アテローム、炎症性障害、動脈瘤、および他の疾患などの病的な状態中において発現され、一方、健康な（発症していない）成人組織においては、ほとんど無かったことが分かった。それゆえ、ナノボディの開発は、これらの選択されたドメインにとって、病的な組織（そして、対象の病的な状態）を同定し、ならびに該領域に治療法または他の荷を送達するために、有用でありえる。他のＥＣＭタンパク質、またはそれらのエピトープは、腫瘍または転移において選択的に発現されるのが示され、そして、同様に、特異的なナノボディを使用して検出されることができた。
【００３８】
下の例に示すように、ＥＣＭタンパク質に対するナノボディライブラリが、発生され、スクリーニングされ、疾患特異的なＥＣＭエピトープ（例えば、ＮＪＢ２、ＮＪＴ３、ＮＪＴ４、およびＮＪＴ６）に対して新規および特異的なナノボディの発見に、結果としてなった。とりわけ、例として、ＮＪＢ２ナノボディは、フィブロネクチンのＥＩＩＩＢドメインのエピトープに特異的であり、そして、ＮＪＴ３、ＮＪＴ４、およびＮＪＴ６ナノボディは、ヒトテネイシンＣタンパク質に特異的である。腫瘍または転移において選択的に発現した、他の腫瘍および／または転移のＥＣＭタンパク質およびドメイン（まとめると、ＥＣＭエピトープとしてここに称される）は、同じプロテオミクス方法を使用して記載され、そして、それらは、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して検出されてもよく、モニターされてもよい。
【００３９】
本発明に従って使用される方法は、ＥＣＭの選択的濃縮、ゲノムにおいてコードされるＥＣＭタンパク質の完全な目録の生物情報科学定義、および質量分析の適用を組み合わせる技術の、きわめて最近の進歩を利用する。これらの方法は、組織の小さい試料からのいかなる組織も、ＥＣＭ補完の決定を可能にした。このアプローチは、一定のＥＣＭタンパク質、そして、ドメイン（ＥＣＭエピトープ）が、健康な組織においてよりも、高い濃度で病的な組織に存在することを、確認した。
【００４０】
病的な組織に選択的に存在するＥＣＭエピトープに特異的に結合するナノボディを回収するための方法は、本明細書に記載される。これらのナノボディの適用および活用に基づく数個の方法は、本明細書に記載される。患者試料からこれらのＥＣＭエピトープの存在を決定して、したがって対象が、特定の疾患および／または疾患の進行または退行を有するかどうかに関して証拠を提供するための方法も、提供される。対象の状態は、免疫組織化学、免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、タンパク質アレイ、免疫−ＰＥＴ／ＣＴなどの非侵襲的画像化方法および類似の方法を含む標準免疫学的な方法を使用して、活性剤に連結された特異的なナノボディを使用して、決定されることができる。かかる方法の使用は、診断、予後、およびモニタリングの情報を提供し、患者の看護および治療の改善された管理を許す。
【００４１】
疾患、例として原発腫瘍および／または転移の、場所、範囲、および進行を検出するための、病的な状態の細胞外マトリックスの範囲内で個々のＥＣＭエピトープに特異的に造影剤（例として、ＰＥＴ画像化またはその他の画像化モダリティの使用のための放射性核種、蛍光レポーター、または他の検出可能な試薬等々）などの活性剤を標的とするため方法も、発明の中に包含される。
【００４２】
病的な組織、例として、原発腫瘍および／または転移に対するかかる治療剤を濃縮し、したがって治療の指標を改善するために、個々のＥＣＭエピトープに特異的な治療剤（例として、放射性核種、化学療法剤、毒素、サイトカイン、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ナノ粒子、ＣＡＲ−Ｔ細胞等々）などの活性剤を標的とするための方法も、発明の側面である。治療剤の標的化は、上で記載の側面において定義されるＥＣＭエピトープに対して特異的なナノボディに付着することによって、達成されてもよい。
【００４３】
本発明は、下記のように、抱合体の形において任意にＥＣＭエピトープと相互作用することができる、ナノボディなどの結合ペプチドまたはポリペプチドも包含する。本発明の結合ペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは選択的やり方で、ＥＣＭエピトープに結合する。本明細書に使用される「ＥＣＭエピトープ」は、ナノボディまたはペプチドと相互作用する一部の病的な状態のＥＣＭを、指す。エピトープは、ＥＣＭタンパク質のドメイン、ＥＣＭタンパク質の一部のドメイン、特異的な翻訳後修飾を備えてもよいか、またはＥＣＭタンパク質の複数のドメインからの領域に関わってもよい。本明細書に使用されているように、用語「選択的結合」および「特異的な結合」は、非ＥＣＭタンパク質または他のＥＣＭ構成要素に対するより、特異的なＥＣＭタンパク質およびそれらのフラグメントに対してより大きな親和性によって結合するための結合ペプチドまたはポリペプチドの能力を指すための結合ペプチドまたはポリペプチドに関して、交換可能に使用される。すなわち、ＥＣＭエピトープに選択的に結合する結合ペプチドまたはポリペプチドは、それらが特定のＥＣＭエピトープに結合するのと同じ範囲で、そして、同じ親和性では、非ＥＣＭタンパク質に、または、他のＥＣＭタンパク質に結合しないだろう。いくつかの態様において、本発明の結合ペプチドまたはポリペプチドは、特異的なＥＣＭエピトープにもっぱら結合する。本明細書に使用されるように、特異的なＥＣＭエピトープに選択的に、または、特異的に結合する結合ペプチドまたはポリペプチドは、より小さい親和性（たとえあったとしても）によって、非ＥＣＭタンパク質または他の種々のＥＣＭタンパク質に結合する。より小さい親和性は、少なくとも１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満、を含んでもよい。
【００４４】
好ましくは、ＥＣＭ結合ペプチドまたはポリペプチドは、ナノボディである。本明細書に記載のナノボディは、がんなどの、病的な組織において特異的に発現されるＥＣＭエピトープに選択的で、正常な成人ヒト組織中にほとんど無いか、名目上の濃度で存在する。ナノボディは、in vivoの診断画像化および標的化送達に関して、他の抗体プラットホームと比較して有利な多数の重要な特性を、有する。抗体と比較して、ナノボディは、より小さく（おおよそ１５ｋＤａ）、糸球体ろ過のための腎臓のカットオフが、６０ｋＤａであるので、それは、より速いクリアランス速度を許す（De Vos et al., Expert Opin Biol Ther. 13(8): 1149-60 (2013))。ナノボディは、フルサイズの抗体と比較すると、より良好な組織浸透およびより短い循環半減期も有する。さらにその上、ナノボディは、ｓｃＦｖｓまたは人工足場と異なってin vivoで親和性が成熟し、それは、高機能（すなわち高親和性）結合剤の単離を許す。ナノボディは、酵素の触媒部位などの、抗原の表面上の溝と相互作用することに関して、ｓｃＦｖｓより好適でもある（Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomed. 8(6): 1013-26 (2013)）。
ラクダ科の動物の単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）が、高度な配列同一性をヒトＶＨと共有し、マウスにおける免疫原性応答を起動させることは見出されていない。
【００４５】
同じく、ヒトの有害な免疫原性応答は、現在の臨床試験において報告されてなかった。ナノボディは、プローブを画像化することなどの、ヒト化されることができて（Rashidian et al., PNAS, 112(19): 6146-6151 (2015)）、再生可能な供給源であり、そして、活性剤の添加後に、一般に安定である。安定な接合されたナノボディが、発生することができ、急速に、そして、再現的に精製されることができる。
【００４６】
いくつかの態様において、ナノボディは、すなわち、天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列の（そして、特に、フレームワーク配列の）１以上のアミノ酸残基アミノ酸配列を、ヒトからの従来の４鎖抗体からのＶＨドメインにおける対応する位置で生じる１以上のアミノ酸残基で置き換えることによって、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化された」アミノ酸配列を有する。ヒト化のための方法は、周知である。ヒト化ナノボディは、対応する天然に存在するＶＨＨドメインと比較して、低下された免疫原性などのいくつかの利点があってもよい。「ヒト化」は、天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を提供することによって、および次いで、新しいヌクレオチド配列が「ヒト化」ナノボディをコードするかかる方法においてヌクレオチド配列の１以上のコドンを変化させることによって、遂行されることができる。この核酸は、ナノボディを提供するために、次いで発現されることができる。あるいは、ヒト化ナノボディのアミノ酸配列は、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に基づいて、設計され、そして、ペプチド合成のための技法を使用して、デノボ合成されることができる。当業者は、ナノボディまたはこれをコードする核酸配列または核酸を提供するように、好適なやり方において、１以上の天然に存在するＶＨＨ配列（１以上のＦＲ配列またはＣＤＲ配列など）の１以上の部分、および／または、１以上の合成または半合成配列も、組み合わせてもよい。
【００４７】
いくつかの態様において、用語ナノボディは、本明細書に記載のナノボディの類似体、変異体、バリアント、アレル、ホモログ、およびオルトログを、指す。
一般に、かかる類似体において、１以上のアミノ酸残基は、本明細書に開示のナノボディと比較して、置き換えられ、削除され、および／または、付加されてもよかった。かかる置換、挿入、欠失または付加は、１以上のフレームワーク領域および／または1以上のＣＤＲ、および、特に、配列番号１〜４を含む本明細書に開示の配列のナノボディのＣＤＲの類似物において、なされてもよい。例示的なＣＤＲは、表３において提示される。
【００４８】
いくつかの態様において、ナノボディは、本明細書に提供のアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％９８％、または９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を、備える。いくつかの態様において、ナノボディのアミノ酸配列は、本明細書に提供されるアミノ酸配列を備える。
【００４９】
あるいは、本明細書に記載のナノボディは、本明細書に例示の抗体のうちの１つの、1以上のＣＤＲ領域において、最高５（例として、４、３、２、または１）のアミノ酸残基のバリエーションを備えてもよく、実質的に類似の親和性（例として、同じオーダーのＫＤ値を有する）を有する抗原の同じエピトープを結合する。一つの実施例において、アミノ酸残基のバリエーションは、保存的なアミノ酸残基置換である。本明細書に使用のように、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸置換が作られるタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変えないアミノ酸置換基を、指す。
【００５０】
本明細書に使用される場合、「類似体」は、各々またはいずれかのフレームワーク領域、および、各々またはいずれかの相補性決定領域が、ＢＬＡＳＴｐアライメントにおいて測定された場合に、参照配列における対応する領域と（すなわち、ＦＲ１類似体対ＦＲ１参照、ＣＤＲ１類似体対ＣＤＲ１参照、ＦＲ２類似体対ＦＲ２参照、ＣＤＲ２類似体対ＣＤＲ２参照、ＦＲ３類似体対ＦＲ３参照、ＣＤＲ３類似体対ＣＤＲ３参照、ＦＲ４類似体対ＦＲ４参照）、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、さらにいっそう好ましくは９５％の同一性を示す、配列である。
【００５１】
置換は、たとえば、保存的置換でもよく、および／または、アミノ酸残基は、別のＶＨＨドメインの同じ位置で天然に存在する別のアミノ酸残基と、置き換えられてもよい。欠失および／または置換は、翻訳後修飾の1以上の部位（１以上の部位１以上のグリコシル化部位など）が取り除かれるなどの方法で、または、官能基の付着のために1以上の部位を導入するように、例えば、部位特異的なペグ化を許すように設計されてもよい。
【００５２】
ナノボディのアミノ酸残基は、すなわち、タンパク質の主鎖に、または、側鎖に修飾されることができる。修飾は、ナノボディの中への、またはその上への、１以上の官能基、残基、または部分の導入を含む。官能基は、直接ナノボディに、または、間接的にリンカーまたはスペーサーを通して、連結されてもよい。半減期を増大させ、および／または、医薬タンパク質の免疫原性を低下させるための方法は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはそれらの誘導体など（メトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧなど）のポリマーを、付着させることに関わる。たとえば、ＰＥＧは、ナノボディにおいて天然に出現するか、または末端、または、ナノボディの中で、ナノボディに合成的に付加されるシステイン残基に、付着されてもよい。いくつかの態様において、ＰＥＧは、５０００より大きく１００，０００未満、または１０，０００より大きく２００，０００未満の分子量を、有する。他の修飾は、ナノボディを発現するために使用される宿主細胞に応じて、通常共翻訳および／または翻訳後の修飾の部分として、Ｎにリンクされたか、Ｏにリンクされたグリコシル化を含む。ナノボディは、かかるＶＨＨドメイン、例として、ファージライブラリのライブラリからの選択から、得られてもよい。ファージライブラリは、免疫化された動物のＢ細胞からの抗体ＶＨＨドメインを含有するポリヌクレオチドのライブラリを挿入することによって、作成されることができる。ファージミドライブラリの多様性は、追加の、所望の、分子特性およびそれらをコードするポリヌクレオチドを産生して、続いて確認するために、ライブラリのポリペプチドの特異性を増加させておよび／または変えるために、操作されることができる。ライブラリは、あらゆる位置および２０全てのアミノ酸の３２の種々のコドンのうちの１を導入することが可能であるので、多様性の高いレベルに関わる。かかるライブラリは、理論上は、残基の数ｎごとに３２ｎ増殖する。一定の位置の選択されたヌクレオチドの「縮退」を伴うオリゴヌクレオチドの合成は、その技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリは、典型的には１０９〜１０１０の「エントリ」を有する。
【００５３】
一般にナノボディライブラリを作成する方法は、すなわち病的な組織の調製物に対して免疫化されるための材料による、ラクダ科の動物（例として、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ビクーナ、ラマ等々）の免疫化に、関わる。たとえば、例部分に記載のように、アルパカは、ヒトがん患者からの特異的なＥＣＭ調製物によって免疫化されて、疾患と関連するＥＣＭタンパク質エピトープに特異的なアルパカ誘導ナノボディを、発生させてもよい。リンパ球は、血液試料から次いで単離されることができ、そして、リンパ球ＲＮＡは、次いでファージ提示に基づくナノボディライブラリを構築するために、たとえばＭ１３ファージを使用して、用いられることができる。ライブラリは、次いで疾患に関わるＥＣＭおよびＥＣＭ関連抗原の多様なセットに対する新規なナノボディのために、スクリーニングされることができる。該方法は、核酸が単離されることができる末梢血リンパ球を、収穫することに関わる。ＶＨドメイン配列が由来する核酸は、総ＲＮＡでもよく、または、より具体的に言うと宿主からとられた試料の中で細胞から単離されるメッセンジャーＲＮＡであってもよい。発現ベクターは、ライブラリ構築物のために使用されるいかなる好適なベクターでもあってもよく、そして、好ましくはファージ提示に基づく選択方法を使用する標的特異的な抗体フラグメントの選択を許すファージまたはファージミドベクターである。
【００５４】
これらのライブラリから単離された抗体配列は、次いで標的抗原への結合をさらに改善するために、in vitroでの親和性成熟のための足場として、使用されてもよい。使用される免疫原は、ヒトがん転移試料の病的なＥＣＭに直接由来するか、または免疫化のためのカクテルを調製するために個別に混合される、疾患部位に存在する一組のＥＣＭタンパク質である。ライブラリは、この病的なＥＣＭの多様な構成要素を結合するＶＨＨの配列を、含有する。ナノボディは、それらのＮ末端またはＣ末端で、種々の活性剤によって容易に部位特異的にタグ付けされることができ、画像化および／または治療の適用において、のそれらの使用を促進する。
【００５５】
本発明は、ハイスループットなやり方で、ＥＣＭエピトープに対してナノボディを発生させる方法を、包含する。非限定的な例として、方法は、病状と関連するＥＣＭタンパク質のエピトープに特異的に結合する、ナノボディなどのＥＣＭタンパク質結合剤を発生させることで提供され、そして好ましくは、（ｉ）病的な組織からのＥＣＭタンパク質試料によって動物を免疫化することによって、および（ｉｉ）病的な組織からのＥＣＭタンパク質のエピトープに特異的に結合するナノボディに関するスクリーニングによって、病的な組織から単離される。
【００５６】
いくつかの態様において、本明細書に記載のナノボディまたは他のペプチドは、対応する標的エピトープに、特異的に結合する。エピトープに「特異的に結合する」抗体などのナノボディまたはペプチドは、当該技術分野において十分理解されている用語である。分子は、それが、代替の標的によってより、特定の標的抗原によって、より長い期間におよび／またはより大きな親和性で、より頻繁に、より急速に、反応する場合、「特異的な結合」を呈すると言われる。ナノボディは、それが、他の物質に結合するより、より大きな親和性、結合力で、より容易におよび／またはより長い期間に結合する場合、標的抗原またはエピトープに、「特異的に結合する」。たとえば、抗原またはその中の抗原エピトープに特異的に（または優先的に）結合するナノボディは、それが、他の抗原または同じ抗原の中の他のエピトープに結合するより、より大きな親和性、結合力で、より容易におよび／またはより長い期間で、この標的抗原に結合するナノボディである。たとえば、第１の標的抗原に特異的に結合するナノボディが、第２の標的抗原に特異的に、または、優先的に結合してもよいかまたは結合しなくてもよいことも、この定義によってよく理解される。そのため、「特異的な結合」または「優先的な結合」が、（それが含むことができるにもかかわらず）独占的な結合を、必ずしも要求するというわけではない。いくつかの例において、標的抗原またはそれらのエピトープに「特異的に結合する」ナノボディは、他の抗原または同じ抗原の中の他のエピトープに、結合しなくてもよい。
【００５７】
いくつかの態様において、本明細書に記載のナノボディは、標的抗原またはそれらの抗原エピトープのための好適な結合親和性を、有する。本明細書に使用のように、「結合親和性」は、見かけの会合定数すなわちＫＡを、指す。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載のナノボディは、標的抗原または抗原エピトープに関して少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはそれより低い結合親和性（ＫＤ）を有してもよい。増大した結合親和性は、減少したＫＤに対応する。第２の抗原と比べた第1の抗原に関するナノボディのより高い親和性結合は、第２の抗原への結合に関するＫＡ（またはＫＤの数値）より、第1の抗原への結合に関するより高いＫＡ（またはよりＫＤのより小さい数値）によって、指し示されることができる。
【００５８】
かかるケースにおいて、ナノボディは、第２の抗原（例として、それらの第２の立体配座または模倣体における同じ第1のタンパク質；または第２のタンパク質）と比べて、第1の抗原（例として、それらの第1の立体配座または模倣体の第1のタンパク質）に関して特異性を有する。
【００５９】
たとえば、いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＥＣＭナノボディは、第２のＥＣＭエピトープへの結合親和性と比較して、第1のＥＣＭエピトープにより高い結合親和性（より高いＫＡまたはより小さいＫＤ）を、有する。
【００６０】
結合親和性の違い（例として、特異性または他の比較に関して）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７.５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０,０００、または１０５倍であることができる。
【００６１】
結合アフィニティー（または結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または（例として、蛍光アッセイを使用する）分光法を含む様々な方法によって、決定されることができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．００５％  （ｖ／ｖ）  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）においてある。これらの技法は、標的タンパク質濃度の関数として、結合した結合タンパク質の濃度を測定するために、用いられることができる。結合した結合タンパク質の濃度（［結合］）は、一般に、以下の等式によって、遊離標的タンパク質の濃度（［遊離］）に、関連付けられる：
［結合］＝［遊離］／（Ｋｄ＋［遊離］）
【００６２】
しかし、時々、それは、例として、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される親和性の定量的測定を得るのに十分で、ＫＡまたはＫＤと比例していて、したがって、より高い親和性が、例として、２倍より高いかどうかを決定することなどの比較のために、親和性の定性的な測定を得るために、または、例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおける、例として機能的なアッセイにおける活性によって、親和性の推論を得るために、使用されることができるので、ＫＡまたはＫＤの正確な決定を作成することは、必ずしも必要でない。
【００６３】
さらなるステップは、たとえば、そして、限定されずに、親和性成熟のステップ、所望のアミノ酸配列を発現しておよび／または修飾するステップ、所望された抗原（ＥＣＭエピトープ）に対する結合のためのおよび／または活性のためのスクリーニングのステップ、所望されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を決定するステップ、１以上のヒト化置換を導入するステップ、好適な多価および／または多特異的なフォーマットをフォーマットするステップ、特異的な所望の生物学的および／または生理的特性のためのスクリーニングのステップを、含んでもよい。
【００６４】
ＥＣＭリモデリングは、多数の疾患で典型的であり、そして、少なくともいくつかのＥＣＭ生物マーカーエピトープは、これらの疾患で共有される。下の例に記載のように、バイオパニングされるナノボディは、ＥＣＭリモデリングによって特徴づけられる広範な疾患に、それゆえ適用できる。
【００６５】
いくつかの態様における本発明に従う有用な結合試薬は、単離されたＶＨＨ抗体フラグメント、いわゆるナノボディである。本明細書に使用の「単離されたナノボディ」は、他の細胞の材料（例として、ナノボディを産生する細胞から分離された）から、または、本発明の診断または治療方法において、それらの使用を妨げる他の材料から、実質的に物理的に切り離されたポリペプチドを、指す。
【００６６】
とりわけ、ペプチドは、たとえば、医薬調製物を産生し、またはシークエンシングすることにおいて有用であるように、十分に純粋であり、それらの宿主細胞の他の生物学的構成成分が、十分に存在していない。本発明の単離されたナノボディは、医薬調製物中の薬学的に許容し得る担体と混ぜられてもよいので、それらは、該調製物のほんの小さい重量％を備えてもよい。ナノボディは、それにもかかわらず、生体系に関連してもよい物質から実質的に分離されたという点で、実質的に純粋である。
【００６７】
いくつかの態様において、本明細書に開示されるナノボディのＣＤＲまたは他の部分は、ナノボディ以外の構造に組み込まれる。例えば、本明細書に開示のナノボディの１以上のＣＤＲを備えるヒト化抗体またはそれらの類似体は、本発明に従って産生されても、使用されてもよい。したがって、ペプチドは、抗体でもよい。他の態様において、本明細書に記載のナノボディのペプチドは、他の分子に接合されて、例えば、送達を増強してもよい。ペプチドまたはナノボディは、いくつかの実施形態において、抗体に接合されてもよい。
【００６８】
本明細書の用語「抗体」は、それらが所望された生物活性を呈する限り、最も幅広い意味において使用され、無傷のモノクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、抗体フラグメント、およびｓｃＦｖなどの抗体様の分子を、具体的に網羅する。天然の抗体は、通常２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロテトラマーの糖タンパク質を、指す。それぞれの重および軽鎖は、鎖の間のジスルフィド架橋に規則的に間隔をあけた。それぞれの重鎖は、多数の定常ドメインがそれに続く可変ドメイン（ＶＨ）を、一端で有する。それぞれの軽鎖は、一端（ＶＬ）に可変ドメインおよびその他端に不変ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと一列に並べられ、そして、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと一列に並べられる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメインの間に接点を形成すると考えられている。
【００６９】
画像化プローブ（蛍光体、ＰＥＴトレーサー、放射性同位体等々）などの活性剤、サイトカイン、ＥＣＭリモデリング酵素、毒素、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ナノ粒子、ＣＡＲ−Ｔ細胞、薬物、または他の形態は、病的な部位に標的化された送達のためのナノボディに、きわめて容易に部位特異的に、付着されることができる。たとえば、ナノボディは、ソルターゼ媒介反応（「ソータギング」）を介してそれらのＮまたはＣ末端で部位特異的にタグ付けされてもよい（Guimaraes et al-Site-specific C-terminal and internal loop labeling of proteins using sortase-mediated reactions.）。この付着は、病的なＥＣＭエピトープへのナノボディに付着されるいずれかの荷の標的化送達を、大いに促進する。
【００７０】
この標的化されたアプローチは、それが、腫瘍および疾患ＥＣＭ中に選択的蓄積ができるようにするので、検出および／または処置の増大した特異性および感度ならびに背景およびオフターゲット毒性の軽減に結果としてなる、従来の全身治療に勝る無数の利点を与える。さらにその上、その一方で、他の標的治療は、標的とされたタンパク質のより広い発現に起因して、全身性の毒性によってしばしば曝露される（Hansel et al., Nat Rev Drug Discov, 9(4): 325-338 (2010)）；ＦＮのＥＩＩＩＢドメインおよび病的な部位におけるＴＮＣの（または他の腫瘍特異的ＥＣＭエピトープの）選択的遺伝子発現、およびそれらのそれぞれの標的タンパク質に対するナノボディの特異的な結合は、他の標的治療が直面する全身性の毒性を回避する。ナノボディはサイズにおいて小さく（おおよそ１５ｋＤａ）、それゆえ対象からも急速に消去され、全身性の影響の低下に結果としてなる。
【００７１】
他の標的治療、たとえば胸部および卵巣の癌に関するＨＥＲ２特異的なナノボディおよびリンパ球様腫瘍のためのリツキシマブとは異なり、本明細書に記載のナノボディは、それらが、もっぱら特異的ながん型に限定されずに、病的なＥＣＭと関連する抗原を認識するので、広く治療／標的化剤であることができる。加えて、本明細書に開示のナノボディのいくつかは、ＥＣＭリモデリングによって特徴づけられる他の病状において発現される標的抗原を、認識することができる。かかる病状は、アテローム、動脈瘤、および心筋梗塞、線維症、および炎症性障害などの、心血管障害を含むが、これに限定されるものではない。腫瘍細胞不均一性および腫瘍細胞のゲノム不安定性に起因して限定された有効性を有してもよかった、抗ＣＤ３０および抗ＣＤ２０などの、腫瘍細胞標的化治療と比較して、本明細書に記載のナノボディは、特異的なＥＣＭタンパク質エピトープ（それはより不均一でなくおよびより安定である）を標的とする。
【００７２】
腫瘍細胞標的化治療は、減少したか不均一な標的発現、受容体内部移行および薬物流出に起因して、有効性を欠いている。対照的に、ＥＣＭタンパク質は、がんの突然変異をめったに有さず、そして、該ＥＣＭは、豊富であり、およびアクセス可能である。提示された特定の例において、フィブロネクチンおよびテネイシンＣは、腫瘍ＥＣＭの主な構成成分である。本明細書および他の場所に記載のプロテオミクスデータを使用して、追加の腫瘍および／または転移特異的なＥＣＭタンパク質および関連するナノボディは、Ｍ１３ファージライブラリから同様に単離され、確認されることができる。
【００７３】
局所投与治療は、種々の欠点を被る：それらは、転移を処置することに効率的でなく、それは典型的には、多数で、広く分配される。しかしながら、ナノボディの全身性の投与は、体の全体にわたって、原発腫瘍および転移部位の両方を含む、すべての病的な組織にアクセスして、腫瘍および／または病的なＥＣＭに選択的に結合することを、それらに許す。
【００７４】
本明細書に使用のように、単離された組織試料は、医療技術に関連する当業者に周知の方法を使用して、体から取り出された組織生検、外科的に切除された腫瘍、または他のいずれかの腫瘍塊から得られた組織である。該組織は、病的なことが知られ、または、病的なことが疑われてもよく、たとえば、該組織は、がん性であることが知られ、または、がん性であると疑われてもよい。「がん性であると疑われる」という本明細書に使用の句は、医療技術の当業者によってがん性の細胞を含有すると考えられているがん組織試料を、意味する。生検から試料を得るための方法は、塊の粗分割、顕微解剖、レーザーに基づく顕微解剖、または他の公知技術の細胞分離方法を、含む。組織は、組織切片でもよい。
【００７５】
病的な組織生検材料における細胞型の多様性および使用される予測方法の感度の多様性のため、分析のために要求される試料サイズは、組織の５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、または５０ｍｇ以上でもよい。あるいは、それは、生検サイズの組織試料の部分または切片でもよい。適切な試料サイズは、細胞の組成および生検の条件に基づいて決定されてもよく、そして、この決定のための標準分取ステップ、および本発明における使用のためのタンパク質のこれに続く単離は、当業者に周知である。
【００７６】
あるいは、ＥＣＭタンパク質は、体において直接分析されてもよい。実例として、１以上または病的なＥＣＭタンパク質エピトープを認識することができる、ナノボディなどの１以上の結合ペプチドまたはポリペプチドは、直接対象に投与されてもよい。結合ペプチドまたはポリペプチドは、ＥＣＭの可視化によって支援するために、たとえば蛍光、ＮＩＲ、ルミネセンス、またはＰＥＴプローブで標識されてもよい。あるいは、他の結合ペプチドまたはポリペプチドは、ＥＣＭの可視化を提供するために、用いられてもよい。他の実施形態において、組織は、結合ペプチドまたはポリペプチドへ曝露の前の対象から、取り出されてもよい。
【００７７】
本発明は、対象の病的な状態の変化を調査するために、使用されてもよい。病的な状態は、対象中の生化学物質の過少または過剰産生、外来有機体、すなわち宿主に有毒である物質を産生する有機体による対象への浸潤、または対象の一部の異常な増殖によって引き起こされる対象中の、いずれかの生理的条件である。たとえば、病的な状態は、感染症、がん、転移、等々と関連する状態を含み、およびこれらの病状の多数は、ＥＣＭの過度の生成および変性に関連し、それは、本発明のナノボディによって、標的とされることができる。腫瘍の転移の状態における変化は、経時的におよび／または治療の介入に応答して調査されることができる。これらの方法を達成するために、組織試料は、種々の時間に、および／または薬物処置の有無にかかわらず、対象から単離されてもよい。種々の組織試料が、病的な状態のＥＣＭエピトープの存在のために、分析されることができる。次いで、2以上の試料間のＥＣＭエピトープ発現の違いが、評価されることができる。該違いは、存在する種々のタンパク質の評価を通して定性的に（例として、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって）、または、タンパク質発現の測定値レベルまたは近似のレベルによって定量的に（例として、ＥＬＩＳＡによって）、分析されることができる。あるいは、本発明の方法は、組織試料を取り出すことなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遂行されてもよい。
本発明の方法は、がん、転移、および他の病状において特異的に発現されるＥＣＭエピトープに高度に特異的なナノボディの由来、検証、および展開に関わる。
【００７８】
これらのユニークな、高度に有効な抗体は、病的な組織のアクセス可能な、行き渡った、安定な細胞外構成要素への画像化プローブ（蛍光、放射能、ＰＥＴ等々）および、医薬、毒素、抗体、免疫調節剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ナノ粒子、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むがこれに限らない他の剤の送達の、高度に選択的な手段（低い全身性の背景によって）を可能にするために、接合されたナノボディとして使用されてもよい。接合技法、造影剤、活性剤、これらのユニークな抗体を調製および画像化する方法は、当該技術分野において公知であり、そして、これらの摘要は、本明細書に含まれる。
【００７９】
組織試料中のタンパク質の存在または組織試料のタンパク質のレベルは、当該技術分野においていかなる公知の方法を使用して、評価されてもよい。かかる方法論は、周知である。臨床的および病理的評価において一般的に用いられる方法は、免疫組織化学または免疫蛍光法であり、それは、組織試料中の特定のタンパク質の存在またはタンパク質のセットの決定を、許す。免疫組織化学および免疫蛍光法の方法は、周知であり、広く実践される。タンパク質レベルの定量的評価がなされる場合に、タンパク質のレベルは、参照または閾値量によって、または、他の試料で見られる量によって、比較されてもよい。実例として、タンパク質の存在またはレベルが、原発腫瘍およびその転移または対応する正常な組織において測定される場合、それらは、腫瘍またはその転移の進行の相対的な評価を提供するために、比較されることができる。あるいは、該レベルは、腫瘍が通常タンパク質を発現する量が公知である（または、示される）量と、上であるか下であるか比較されてもよい。比較において使用される値は、参照または閾値レベルと称される。
【００８０】
限界値の特定の決定における実数値は、発現を決定するアッセイの状態などの、種々の腫瘍に関して、または、種々の状況の下で変化してもよい。しかしながら、当業者は、状況に基づいて正しい限界値を確認することが可能である。
たとえば、限界値は、類似の状況の下で正常な非がん性の組織を使用して、容易に発生されることができた。
【００８１】
参照試料は、診断評価がなされてもよい様々な生体試料のいずれかであることが、できる。参照試料の例は、対照集団または対照試料からの生体試料を、含む。参照試料は、試験試料と平行してテストするために供給される製造をとおして、発生してもよく、例として、参照試料が、診断キット中に供給されてもよい。適切な参照試料は、当業者に明白である。
【００８２】
他の態様において、試験試料中のタンパク質の発現レベルは、絶対値の参照レベルとの直接比較に基づいて、決定されてもよい。実例として、参照試料のタンパク質中の発現レベルより、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％以上高い。他の態様において、試験試料中のタンパク質の発現レベルは、参照試料中のタンパク質の発現レベルより、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％以上低い。
【００８３】
さらなる実施形態において、対象中の１以上のＥＣＭエピトープの発現レベルは、第1の時点に、そして、その後の第２の時点に決定される。１以上のＥＣＭエピトープの発現レベルは、さらなるこれに続く時間に、追加で測定されていてもよく、その結果、測定の総数は、３、４、５、６、７、８、９、１０以上でもよい。いかなる２つの測定の間の時間内の分離も、日の問題でもよく、または、それはより長くてもよい（例として、週、月、または年）。たとえば、得る試料間の時は、６ヵ月、８ヵ月、１０ヵ月、１年、１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、または５年である。対象中の第1の（またはより初期の）試料を得ることと、これに続くまたは連続した試料を得ることとの間の時は、変化する病状が起こるのに十分でありうる。疾患の進行または退行は、2以上の時点の間に単離された組織試料におけるＥＣＭエピトープ発現レベルを比較することによって、決定されてもよい。たとえば、連続した時点間の１以上のＥＣＭエピトープまたはそれらの発現レベルの存在または非存在における変化は、疾患の進行ステージなどの、疾患の進行を、指し示してもよい。とりわけ、後の時点にとられた試料中の１以上のＥＣＭエピトープのより高い発現レベルおよび／または存在は、疾患が、進行ステージに進行したことを、指し示してもよい。いくつかの場合において、疾患は、がんでもよく、そして、後の時点にとられる試料の病的な状態と関連するＥＣＭエピトープのより高い発現レベルまたはより広い分布は、転移性がんが進行したことを、指し示してもよい。反対に、第２の時点からの単離された組織試料が、第1の時点から単離された組織試料と比較して、病的な状態と関連するＥＣＭエピトープのより低い発現レベルを有する場合、疾患は、より進行していないステージに退行した。たとえば、連続したより低い発現レベル測定は、がんがより転移でない状態に退行したことを、指し示すことができた。
病的な状態は、がん、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、線維症または創傷などの、いかなる非生理的状態でもあってもよい。いくつかの場合において、がんは、転移性がんである。
【００８４】
タンパク質またはマーカーの存在／非存在またはレベルは、タンパク質分析、例として、直接物理測定（例えば、質量分析）、または結合アッセイ（例として、免疫組織化学、免疫アッセイ、凝集アッセイ、および免疫クロマトグラフィアッセイ）等々に関して、当業者に利用可能な多数の技法のいずれかを使用して、決定されてもよい。該方法は、化学反応、例として、光学吸光度における変化、蛍光における変化、ケミルミネッセンスまたは電気化学ルミネセンスの発生、反射率、屈折率または光散乱における変化、表面から検出可能な標識の蓄積または放出、酸化または還元または酸化還元種、電流または電位、磁場における変化、等々）から結果として起こるシグナルを測定することを、備えてもよい。好適な検出技法は、それらのフォトルミネセンス（例として、蛍光、時間分解蛍光、エバネッセント波蛍光、アップコンバートリン光体、多光子蛍光等々の測定を経る）、ケミルミネッセンス、電気化学ルミネセンス、光散乱、光学吸光度、放射活性、磁場、酵素活性（例として、光学吸光度または蛍光における変化を引き起こすかまたはケミルミネッセンスの発光を引き起こす酵素反応を通した酵素活性を測定することによる）を介する標識の測定を通した標識された結合ドメインの関与を測定することによって、結合事象を検出してもよい。あるいは、検出技法は、標識の使用、例として、塊測定に基づく技法（例として、表面音響波測定）、屈折率（例として、表面プラズモン共鳴測定）、またはアナライトの固有の発光を要求しないで使用されてもよい。
【００８５】
タンパク質エピトープレベルの測定ための結合アッセイは、固体相または均一なフォーマットを、使用してもよい。好適なアッセイ方法は、サンドイッチまたは競合結合測定を含む。サンドイッチ免役アッセイの例は、Ｇｒｕｂｂらに対する米国特許第４,１６８,１４６号およびＴｏｍらに対する米国特許第４,３６６,２４１号に記載され、その両方は、参照によって本明細書に組み込まれる。競争免疫アッセイの例は、Ｄｅｕｔｓｃｈらに対する米国特許第４,２３５,６０１号、Ｌｉｏｔｔａに対する米国特許第４,４４２,２０４号、およびＢｕｅｃｈｌｅｒらに対する米国特許第５,２０８,５３５号に開示されたものを含み、その全てが、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８６】
複数のＥＣＭエピトープは、多重化されたアッセイフォーマット、例として、ナノボディアレイの使用をとおして多重化、標識のスペクトル識別を使用する多重化、粒子に実行される結合アッセイのフローサイトメトリー解析による多重化を使用して、測定されてもよい。
【００８７】
試験試料中のタンパク質エピトープの検出は、ルーチンの方法に関わる。当業者は、周知の方法を使用して、タンパク質の存在または非存在を検出することができる。かかる方法は、多様な免疫アッセイを含む。一般に、免疫アッセイは、組織学的切片などの試料中のタンパク質に対する抗体または類似のプローブの結合、またはプラスチック表面などの固体相支持体に対する試料中のタンパク質の結合に、関わる。目的のタンパク質に選択的に結合する検出可能な抗体が、次いで加えられる。抗体の検出は、タンパク質の存在を指し示す。検出可能な抗体は、標識されたまたは標識されていない抗体でもよい。標識されていない抗体は、第２の、第１の抗体に特異的に結合する標識されていない抗体、または、第２の、標識されていないプロテインＡ、抗体とともに複合体となるタンパク質を使用して検出されることができる標識されていない抗体を使用して、検出されてもよい。様々な免役アッセイ手順は、Immunoassays for the 80's, A. Voller et al., Eds., University Park, 1981中に記載され、それは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８８】
ドットブロットおよびウエスタンブロットなどの単純な免疫アッセイは、試験試料によって接触される固体相支持体の使用に、関わる。試験試料中に存在するいかなるタンパク質も、固体相支持体を結合して、特異的な、検出可能な抗体調製物によって、検出されることができる。シグナルの強度は、例えばＥＬＩＳＡによって、定量的読み取りを得るために、測定されていることができる。他のより多くの複合体免疫アッセイは、その中で固体相支持体に結合された第1の抗タンパク質抗体が、試験試料によって接触されるところのタンパク質の検出のための、進んだアッセイを、含む。好適なインキュベーション期間の後、固体相支持体は、非結合タンパク質を取り除くために、洗浄される。第1の抗体によって認識されない一部の特異的なタンパク質に特異的である、第２の、別個の抗タンパク質抗体が、次いで加えられる。第２抗体は、好ましくは検出可能である。検出可能な抗体が、第1の抗体をとおして固体相支持体に結合された特異的なタンパク質と複合体となることができるようにするための第２のインキュベーション期間の後に、固体相支持体は、非結合の検出可能な抗体を取り除くために、二度目に洗浄される。あるいは、フォワードサンドイッチアッセイにおいて、第３の検出可能な抗体は、第２の抗体の結合し、システムに加えられる。他の型の免疫測定法は、同時およびリバースアッセイを含む。同時アッセイは、単一のインキュベーション・ステップに、関わり、ここで、固体相支持体に結合される第1の抗体、第２の、検出可能な抗体、および試験試料が、同時に加えられる。インキュベーションが完了されたあと、固体相支持体は、結合されていないタンパク質を取り除くために、洗浄される。固体支持体と関連する検出可能な抗体の存在は、それが、従来のアッセイにおけるように、次いで決定される。リバースアッセイは、インキュベーション期間の後の試験試料に対する検出可能な抗体の溶液の段階的添加、および、追加のインキュベーション期間の後の固体相支持体に結合される抗体の添加に関わる。固体相支持体は、従来の様式で洗われて、結合されていないタンパク質／抗体複合体、および反応していない検出可能な抗体を取り除く。
【００８９】
多数の方法が、抗体の検出および定量化に関して周知である。実例として、抗体は、該抗体を酵素に結合し、続いてキャプチャーＥＬＩＳＡなどの、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の抗体を使用することによって、検出可能に標識されることができる。酵素は、続いてその基質に暴露される場合に、基質と反応し、たとえば、分光光度的、蛍光定量的、または視覚的手段によって検出されることができる化学成分を発生させる。抗体を検出可能的に標識するために使用されることができる酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースホスファートイソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含むが、これに限定されるものではない。
【００９０】
本発明の方法は、検出可能標識を有するナノボディを使用する、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のための方法を、含む。実例として、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法は、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）画像化を、含んでもよい。ＰＥＴ画像化技術は、リアルタイムに分子レベルで、生理的プロセスの高品質可視化を、可能にする。ＰＥＴは、臨床的な診断法および薬剤開発において、それゆえ高度に有用である。ＰＥＴ技術における多数の技術的な改善は、トレーサー開発の分野において、生理学的および病態生理学的プロセスにおいて関わられる分子標的を視覚化する能力を伴う選択的分子プローブの、標識化戦略およびインテリジェント設計における両方の進展を含んで、開発されてきたが、しかしながら、いくつかの腫瘍および微小転移の検出は、課題を残している。本出願人は、本発明に従って開発されたユニークなナノボディを使用する免疫−ＰＥＴ／ＣＴが、本技術において予想外の改善を提供し、そして、ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴの従来の画像化モダリティーと比較して、著しく初期のステージがんおよび小さな転移の可視化を改善するということを、発見した。図４に示されるとおり、本発明のナノボディを用いて発生する画像は、かかる従来の方法より、著しく上質である。
【００９１】
検出可能な標識は、部分であり、そして、その存在は、直接、または、間接的に確認されることができる。一般に、標識の検出は、標識によってエネルギーの発光に関わる。標識は、特定の波長の光子または他の素粒子を発しておよび／または吸収するその能力によって、直接検出されることができる（例として、放射活性、発光、光学、または電子密度等々）。標識は、特定の波長の光をそれ自体発してもまたは吸収してもよい別の部分を結合し、補充し、場合によっては、切断するその能力によって、間接的に検出されることができる（例として、ＦＬＡＧエピトープなどのエピトープ標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素タグ等々）。間接的な検出の例は、目に見える製品に基質を切断する第1の酵素標識の、使用である。標識は、それがそれほど限定されないにもかかわらず、化学物質、ペプチド、または核酸分子本来の姿のものでもよい。標識は、ＰＥＴ同位体、シンチグラフィ、ＮＭＲ等々などの、画像化技法によって使用されることができる、いかなる公知の標識も含む。他の検出可能標識は、Ｐ３２またはＨ３などの放射性同位体、蛍光色素などのルミネセンスマーカー、光学または電子密度マーカー等々、または、ＦＬＡＧエピトープまたはＨＡエピトープなどのエピトープ、ビオチン、アビジン、およびホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素タグ、β−ガラクトシダーゼ、ならびにはナノ粒子等々を、含む。
【００９２】
標識は、その合成の間、または、それの後、試薬に結合されてもよい。当業者に公知の標識化という多くの種々の標識および方法が、ある。本発明において使用されることができる標識の型の例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド状金属、化学発光化合物、および生物発光化合物を含む。当業者は、ルーチンの実験法を使用して、本明細書に記載の試薬のためのその他の好適な標識を知るだろう、または、それを確認することが可能である。さらにその上、発明の試薬に対するこれらの標識のカップリングまたは接合は、当業者に共通の標準技法を使用して、遂行されることができる。治療剤は、単独で送達されることができ、そして様々な型のナノ粒子によって組み合わせてもでき、そして、これらは、疾患部位における濃縮を許すナノ粒子との接合によって、疾患特異的なＥＣＭに標的とされることができる。
【００９３】
より大きな感度に結果としてなってもよい別の標識化技法は、本明細書に記載の分子を低い分子量のハプテンにカップリングすることから成る。これらのハプテンは、次いで第2の反応によって特異的に変化させられることができる。たとえば、アビジンと反応するビオチン、またはジニトロフェニル、ピリドキサル、またはフルオレセインなどの特異的抗ハプテン抗体と反応することができるハプテンを使用するのが、一般的である。
【００９４】
ここで記載のナノボディなどの抗体またはそれらのフラグメントを含む結合ペプチドまたはポリペプチドの、検出可能な標識への接合は、とりわけ、診断検査法のかかる剤の使用を、促進する。検出可能標識の別のカテゴリは、たとえば磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）：Ｇｄ（ＤＯＴＡ）；核医学に関して：２０１Ｔｌ、ガンマ放出放射性核種９９ｍＴｃ；ポジトロン放射形断層撮影（ＰＥＴ）に関して：ポジトロン放出同位体、１８Ｆ−フッ化デオキシグルコース（１８ＦＤＧ）、１８Ｆ−フッ化物、銅６４、ガドジアミド、および２０３ＰｂなどのＰｂ（ＩＩ）の放射性同位体；１１１Ｉｎなどの、診断および画像化標識（ｉｎ  ｖｉｖｏ検出可能標識と一般に称される）を、含む。
【００９５】
本明細書に使用のように、「接合された」は、いかなる生理化学的な手段によっても互いに安定して結合される、２つの実体を、意味する。付着の本来の姿が、それが、実質的にはどちらの実体の有効性も損なわないようであることは、重要である。これらのパラメーターに注意して、当業者に公知のいかなる共有結合性または非共有的結合が、用いられてもよい。いくつかの態様において、共有結合が、好ましい。非共有の接合は、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ビオチンアビジンとビオチンストレプトアビジンとの複合体形成などの高親和性相互作用、および他の親和性相互作用を、含む。かかる付着の手段および方法は、当業者に周知である。
【００９６】
したがって、本発明は、本発明の方法に用いられる検出可能な標識などの、活性剤に任意に接合されていてもよいナノボディなどの、ＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドを、意図する。活性剤は、ナノボディのＮ末端またはＣ末端または内部アミノ酸に接合されてもよい。他の側面において、本発明は、活性剤に直接接合されたＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチド（例として、ナノボディ）を、意図する。活性剤が、ＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸（すなわち、Ｎ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、または内部アミノ酸）に直接連結される（例として、ペプチド結合を介して）場合、ＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドは、活性剤に直接接合される。あるいは、リンカーが、活性剤をＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドに接続するために使用される、または、２つの構成要素が、共通の担体分子への連結によって、互いに間接的に連結されてもよい場合、ＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドは、活性剤に間接的に接合されてもよい。
【００９７】
したがって、リンカー分子（「リンカー」）は、ＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドを別の分子（例として、多重−または二重特異的抗体における）に連結するために、任意に用いられてもよい。リンカーはペプチドでもよく、それは、１から複数のアミノ酸または非ペプチド分子から成る。本発明において有用なペプチドリンカー分子の例は、グリシンが豊かなペプチドリンカーを含み（例として、ＵＳ５，９０８，６２６を参照）、ここで、アミノ酸残基の半数より多くは、グリシンである。好ましくは、かかるグリシンが豊かなペプチドリンカーは、約２０またはより少ないアミノ酸から成る。ナノボディの特異的な利点は、ＶＨＨドメインナノボディをコードするクローニングされたＤＮＡ配列の単離、サブクローニング、および発現の間、短いペプチドタグが、他の実体にこれらのタグを介して安易な接合を遂行するソルターゼ酵素によって認識され、組み込まれるということである（Ｇｕｉｍａｒｅｓら）。
担体分子は、実例として、ＰＥＧまたはＴＥＧ分子を含んでもよい。ＰＥＧまたはＴＥＧ担体改変ペプチドは、ＰＥＧ化またはＴＥＧ化ペプチドとして、称されるだろう。
【００９８】
リンカー分子は、非ペプチドまたは部分ペプチド分子を、含んでもよい。実例として、ＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドは、グルタルアルデヒドまたはＥＤＣなどの周知の架橋分子を使用して、他の分子に連結されてもよい（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。二官能基架橋分子は、２つの別個の反応部位を所有する、リンカー分子である。たとえば、二官能基リンカー分子の反応部位の１つは、ペプチド上の官能基と反応して、共有結合を形成してもよく、そして他の反応部位は、別の分子上の官能基と反応して、共有結合を形成してもよい。
【００９９】
ホモ二官能基クロスリンカー分子は、化学的に同一である２つの反応部位を有する。ホモ二官能基クロスリンカー分子の例としては、グルタルアルデヒド；Ｎ，Ｎ'−ビス（３−マレイミド−プロピオニル−２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジオール（スルフヒドリル特異的なホモ二官能基クロスリンカー）；一定のＮ−スクシンイミドエステル、（例として、スクシンイミジルスベラート、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）、および可溶性のビススルホン酸およびそれらの塩を含むが、これに限定されない。
【０１００】
好ましくは、二官能基クロスリンカー分子は、ヘテロ二官能基リンカー分子であり、リンカーが、少なくとも２つの異なる反応部位を有し、それぞれが、ペプチドまたは他の分子に個別に連結されることができることを、意味する。かかるヘテロ二官能基リンカーの使用は、選択されたペプチド配列への、それぞれの各反応部位の化学的な分離および段階的添加（ベクトル性接合）を許す。本発明において有用なヘテロ二官能基リンカーは、限定されず、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ｍ−マレイミド−ベンゾイルスルホスクシンイミドエステル；γ−マレインイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；および、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートを、含む。
【０１０１】
本明細書に記載のＥＣＭタンパク質結合ペプチドはまたポリペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸残基は、遊離の末端のカルボン酸基の反応性をブロックまたは低減するために、例として、エステルの形成、ペプチド結合、および他の反応を妨げるために、改変されてもよい。かかるブロッキング基は、カルボン酸基のアミドを形成することを包含する。かかるブロッキングが望ましくない免疫反応を誘発せず、または、有意にＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドの特異的に機能する能力を変更しないという条件で、ポリペプチド中に存在し得る他のカルボン酸基はまた、ブロックされてもよい。
【０１０２】
ネイティブなまたは天然に存在するＥＣＭタンパク質結合ペプチドまたはポリペプチドの好適な生物学的に活性なバリアントは、その結合ペプチドまたはポリペプチドのフラグメント、類似体、および誘導体であり得る。「類似体」は、ネイティブなポリペプチドの類似体、または、ネイティブなポリペプチドのフラグメントの類似体のいずれかであり、類似体は、ネイティブなポリペプチド配列および１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する構造を含む。ＥＣＭタンパク質ナノボディまたは抗体フラグメントは、本明細書でナノボディまたは抗体の一部として称される、完全長未満のＥＣＭタンパク質結合ナノボディまたは抗体に同一であるか、または、少なくとも９０％相同である、ペプチドである。ナノボディまたは抗体の一部は、完全長ナノボディまたは抗体ポリペプチドを代表する。フラグメントは、もし、それが、ナノボディまたは抗体の少なくとも２個のアミノ酸（連続したまたは非連続した）を包含し、ＥＣＭタンパク質に結合する場合、完全長ナノボディまたは抗体を代表する。
【０１０３】
いくつかの態様において、部分は、ナイティブなナノボディまたは抗体の全体の９０％未満である。他の態様において、部分は、ネイティブなナノボディまたは抗体の全体の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満である。「誘導体」は、ナノボディまたは抗体の所望される生物活性が保持される限り、目的のポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、またはそれらの夫々の類似体の何れかの好適な改変（グリコシル化、リン酸化、ポリマー接合（ポリエチレングルコールとなど）、または、外来の部分の他の付加など）を意図する。ポリペプチドフラグメント、類似体、および誘導体を作成するための方法は、当該技術分野において一般に利用可能である。
【０１０４】
活性剤は、上に記載のとおりの、検出可能な標識であり得る。かかる化合物は、腫瘍細胞の検出および特徴づけのために、in vitroおよびin vivoで有用である。
結合ペプチドまたはポリペプチドは、抗がん薬物などの、薬物または治療薬(therapeutic)である活性剤に接合される。かかる化合物は、疾患および腫瘍を処置するために、治療用抱合体として使用され得る。
【０１０５】
治療用抱合体は、化学治療剤、毒素（例として、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント、または低分子毒素）、または、放射性同位体（すなわち、放射性抱合体）またはＣＡＲ−Ｔ細胞などの細胞傷害性薬物に接合された、本明細書に記載されたナノボディなどの結合ペプチドまたはポリペプチドを包含する。本発明の結合ペプチドまたはポリペプチドに接合され得る他の抗腫瘍剤は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載のＬＬ−Ｅ３３２８８複合体としてまとめて公知の薬剤ファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）を包含する。抱合体において使用され得る、酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)からの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca Americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ(momordica charantia)インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを包含する。
【０１０６】
細胞の選択的な破壊のために、抗体は、高度に放射性の原子を接合され得る。様々な放射性同位体は、放射性接合された抗体の産生に利用可能である。例は、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２ＰｂおよびＬｕの放射性同位体を包含する。抱合体は、検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子（例えば９９ｍＴｃまたは１２３Ｉ）、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識（１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９Ｆ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、ガドリニウム、マンガンまたは鉄など）を含み得る。
【０１０７】
放射性または他の標識は、公知の方法で、抱合体中に取り込まれ得る。例えば、結合ペプチドまたはポリペプチドは、生合成されてもよいし、例えば、水素のかわりにフッ素１９を包含する好適なアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成によって合成されてもよい。９９ｍＴｃまたは１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅおよび１１１Ｉｎなどの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム９０は、リジン残基を介して付着され得る。ヨードゲン法(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)は、ヨウ素１２３を取り込むために使用することができる。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)は、他の方法を詳細に記載する。
【０１０８】
他の側面において、細胞の選択的な破壊は、キメラ抗原受容体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞によって媒介され得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、本明細書に使用されるとき、えり抜きの抗原に対してそれらの特異性を再指向する(redirect)ようにキメラ受容体が導入されたＴ細胞を指す。かかる受容体は、細胞質シグナリングドメインと組み合わせて、ＭＨＣ制限と独立して抗原を認識する外部ドメインを含む。多くの異なるペプチドは、キメラ抗原受容体の外部ドメインとして、Ｔ細胞に導入され得る。例は、ナノボディ、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントを包含する。一態様において、ペプチドは、ナノボディである。
【０１０９】
一態様において、本開示は、ＣＡＲを発現するように改変された細胞（例として、Ｔ細胞）を提供し、ここで、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗腫瘍特性を示す。ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（例として、ＣＤ３ゼータ）の細胞内シグナリングドメインに融合された外部ドメインペプチドを含むように改変され得る。ＣＡＲは、Ｔ細胞中で発現される場合、抗原結合特異性に基づく抗原認識を再指向することができる。例示の抗原は、正常な組織よりも、疾患組織において、多くの量で存在する病的な状態のＥＣＭエピトープである。
【０１１０】
本発明は、何れかの抗原結合ペプチドを包含し、その同族抗原は、正常組織よりも疾患組織において、多い量で存在し、これは、その同族抗原に結合されると、腫瘍細胞が増速しないように、死滅が促進されるように腫瘍細胞に影響するか、または、患者中の腫瘍負荷が減少または除去されるように影響される。抗原結合ペプチドは、好ましくは、同時刺激性分子およびゼータ鎖の１以上からの細胞内ドメインと融合されている。いくつかの態様において、抗原結合ペプチドは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナリングドメイン、ＣＤ２８シグナリングドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１以上の細胞内ドメインと融合される。
【０１１１】
いくつかの態様において、抗原結合ペプチドは、ナノボディである。いくつかの態様において、ナノボディは、病的な状態のＥＣＭエピトープに特異的であり、および、これに直接結合する。一態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、フィブロネクチンのＥＩＩＩＡまたはＥＩＩＩＢドメインである。別の態様において、病的な状態のＥＣＭエピトープは、テネイシンＣまたはテネイシンのエピトープである。
【０１１２】
いくつかの側面において、本開示は、キメラ抗原受容体構築物を作製することによって、ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための方法を提供する。キメラ抗原受容体は、本明細書で使用されるときは、ペプチドの外部ドメイン、ヒンジおよび膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメイン（ヒト４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのものなど）を包含する、所望されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを指す。かかるベクターは、細胞に所望されるＣＡＲを導入することができる。
【０１１３】
いくつかの場合において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの側面において、ＣＡＲの外部ドメインは、ナノボディである。他の側面において、ＣＡＲの外部ドメインは、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、または抗体フラグメントである。いくつかの態様において、本発明のＣＡＲは、抗ＥＩＩＩＢナノボディ、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、本発明のＣＡＲは、配列番号１〜４で表される核酸配列を含む。
【０１１４】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、先天性免疫機能において役割を果たす末梢血リンパ球である。ＮＫ細胞は、健常細胞と、ウイルス感染細胞またはがん性細胞との間を区別することを担う、様々な活性化および阻害性受容体を発現する。Ｔ細胞とは違って、ＮＫ細胞は、抗原と独立したやり方で、標的細胞に対してそれらの細胞毒性効果を発揮する。結果として、ＮＫ細胞は、抗原プライミングを必要とせず、および、特定の抗原の非存在下で、強力な細胞傷害性を表示し得る。
【０１１５】
ＣＡＲは、ＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞に、ある抗原特異性を導入することができる。よって、本発明の組成物は、初代細胞および少なくとも１つのキメラ抗原受容体で改変された細胞株の両方である、ＮＫ細胞を含む医薬組成物を包含する。
【０１１６】
ある態様において、改変されたＮＫ細胞は、本明細書に記載のナノボディによって結合されるＥＣＭタンパク質について２５％を超えて陽性である複数の細胞を含む。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号１〜４のいずれか１つで表される配列に少なくとも８０％同一である標的化ドメインアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号１〜４のいずれか１つで表される配列に少なくとも９０％同一である標的化ドメインアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号１〜４のいずれか１つで表される配列に少なくとも９５％同一である標的化ドメインアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号１〜４のいずれか１つで表される配列に少なくとも９８％同一である標的化ドメインアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号１〜４のいずれか１つで表される配列と同一である標的化ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
好ましくは、ＥＣＭ特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、がんに関連するＥＣＭについてのそれらの親和性と比較して、ＥＣＭタンパク質に関連する正常（非悪性）組織のＥＣＭについて、より低い親和性を有する。このことが生じ得るのは、例えば、がん細胞が、正常細胞よりも高いレベルの特異的標的化ＥＣＭタンパク質に関連するからである、および／または、ＣＡＲの細胞外ドメインが、がん細胞に関連するＥＣＭの特定の形態についてより高い親和性、および／または、正常細胞に関連するＥＣＭの特定の形態についてより低い親和性、を有するからである。
【０１１８】
がんＥＣＭについてのＣＡＲ−ＴまたはＮＫ細胞のより高い親和性は、正常ＥＣＭについてのＣＡＲ−ＴまたはＮＫ細胞の親和性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％であることが好ましい。正常なＥＣＭについてのＣＡＲ−ＴまたはＮＫ細胞の親和性の減少は、がんＥＣＭについてのＣＡＲ−ＴまたはＮＫ細胞の親和性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％であることが好ましい。がんＥＣＭについてのＡＣＲ−ＴまたはＮＫ細胞の親和性の減少は、正常ＥＣＭについてのＣＡＲ−ＴまたはＮＫ細胞の親和性の、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍であることが好ましい。
【０１１９】
膜貫通ドメインは、細胞外ドメインおよび細胞内シグナルドメインを連結する。膜貫通ドメインの例は、これらに限定されないが、ＣＤ２８、ＣＤ３−イプシロン、ＣＤ８−アルファ、ＣＤ３、ＣＤ４、および４−１ＢＢを包含する。代替的に、人工ポリペプチドから構成される膜貫通ドメインは、使用され得る。
【０１２０】
細胞内シグナルドメインは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のエフェクター機能の発揮のために必要なシグナルを伝達する。より具体的に言うと、細胞外ドメインが標的ＥＣＭペプチドに結合すると、細胞内シグナルドメインは、細胞の活性化に必要なシグナルを伝達する。細胞内シグナルドメインは、実例として、ＴＣＲ複合体を通してシグナルを伝達するためのドメイン、および、同時刺激性シグナルを伝達するためのドメインを包含する。同時刺激性分子の例は、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１３４、ＯＸ−４０、およびＩＣＯＳを包含する。
【０１２１】
リーダー配列またはシグナルペプチドはまた、ＣＡＲ分泌を促進するために使用され得る。例えば、ＧＭ−ＣＳＦレセプターのリーダー配列が、使用され得る。加えて、構造は、好ましくは、スペーサードメインを通して一緒に連結された、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインから構成される。より具体的に言うと、好ましい態様に従うＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインを含有する。スペーサードメインは、ＣＡＲと標的ＥＣＭとの間の連結を促進するために使用される。
【０１２２】
改変されたＴ細胞またはＮＫ細胞は、二重特異的であってもよく、すなわち、二重特異的ＣＡＲまたは複数の異なるＣＡＲを発現してもよく、ここで、それらの親和性は、２つの別個のリガンド／抗原についてである。二重特異的ＣＡＲ−ＴまたはＮＫは、がん細胞上の潜在的な結合部位の数を増大させるためか、または、代替的に、ＴまたはＮＫ−ＣＡＲに特異的なリガンドを発現する他の免疫エフェクター細胞へ、がん細胞を局在化させるため、のいずれかのために使用され得る。がん治療における使用のために、二重特異的ＣＡＲは、標的腫瘍細胞または腫瘍ＥＣＭに、および、エフェクター細胞（例としてＴ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージ）に結合しても良い。本開示の改変されたＴ細胞またはＮＫ細胞は、同じＴ細胞またはＮＫ細胞によって発現される二重特異的ＣＡＲまたは複数のＣＡＲを含んでいてもよい。これは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、２つの異なる抗原を同時に標的化することを可能にする。
【０１２３】
抗体および細胞傷害性薬物の抱合体は、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジプイミデートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシニミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。
【０１２４】
例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)において記載されるように調製することができる。炭素１４標識した１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの接合のための例示のキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは、細胞における細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定なリンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィドを含有するリンカー（Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０１２５】
加えて、サイトカインおよび抗体サイトカイン抱合体は、治療的に使用することができる。ＥＣＭタンパク質に対する抗体は、がん性組織に対する免疫応答を強化することを包含する、数多の機能を有し得るサイトカインを送達するために使用され得る。サイトカインは、これらに限定されないが、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−β、ケモカイン、およびＩＦＮ−αを包含する。一態様において、ナノボディは、キメラ抗原受容体に組み込まれて、および次いで、Ｔ細胞の表面で発現されて（所謂ＣＡＲ−Ｔ細胞）、これらの細胞を疾患組織のＥＣＭへ標的化することができ、それにより、標的化される腫瘍細胞の近傍にそれらを濃縮させる。
【０１２６】
一側面において、本発明は、あるＥＣＭタンパク質エピトープの正常でない発現に関連する他の障害または疾患の処置のための方法を提供する。ＥＣＭエピトープの正常でない発現に関連する障害または疾患の例は、これらに限定されないが、がん、線維症、アテローム、炎症性障害、および動脈瘤を包含する。
【０１２７】
一側面において、本発明は、がんの処置のための方法を提供する。用語「腫瘍」、「がん」、「がん性組織」および「癌」は、本明細書で互換的に使用され、および各々は、身体器官および系の正常な機能に干渉する細胞の制御されていない増殖を指す。それらの本来の場所およびシードの欠かせない器官(seed vital organ)から転移するがんを包含するがんは、罹患器官の機能的な悪化を通して、対象の死亡を最終的に導き得る。がんは、癌、肉腫、および造血性がんを包含する、様々なカテゴリーに分類され得る。癌は、上皮細胞から生じる悪性がんであり、腺癌および扁平上皮細胞癌を包含する。
【０１２８】
本明細書に使用されるとき、対象は、ヒト、非ヒトの霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯類の動物である。すべての態様において、ヒト対象が好ましい。がんにおける予測的治療に関する本発明の側面において、対象は、がんを有すると疑われるか、または、癌を有すると診断されたかのいずれかのヒトである。がんを有すると疑われる対象を同定する方法は、身体的な調査、対象の家族の病歴、対象の病歴、生検、または数多の画像化技術（超音波検査、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴画像法、磁気共鳴分光法、またはポジトロン断層撮影など）を包含し得る。がんのための診断方法およびがん診断の臨床の描写は、医学分野の当業者に周知である。
【０１２９】
がん治療およびそれらの投薬量、投与のルートおよび推奨される用法は、当該技術分野において知られている。いくつかの態様において、本発明の治療用化合物は、１以上の追加の抗がん剤をさらに含む医薬組成物に製剤化される。
【０１３０】
本発明の活性剤は、対象を処置するのに有効な量で、対象に投与される。「有効（な）量」は、実例としては、所望される生物学的効果を実現するのに必要または充分な量である。実例として、有効量は、がん細胞成長または増殖を予防または阻害するのに充分な量であるか、または代替的に、がん細胞のアポトーシスを誘導するかまたは腫瘍退縮を誘導するのに充分な量である。いくつかの好ましい態様において、有効量は、転移性のがんの発生を低減するために有用な量である。
【０１３１】
対象の処置における、本発明の化合物の有効量は、使用する特定の化合物、化合物の送達の様式、およびそれが単独でまたは組み合わせて使用されるか、に依存して変化し得る。何れかの具体的な適用のための有効量もまた、対象におけるがんのタイプおよび／または程度、処置のために投与される具体的な化合物、対象のサイズ、または、障害の重症度などの因子に依存して変化し得る。
【０１３２】
当業者は、過度な実験を必要とすることなく、本発明の具体的な分子の有効量を経験的に決定することができる。本明細書に提供される教示と組み合わせて、様々な活性化合物の中で選択することにより、および、効能、相対的なバイオアベイラビリティ、患者の体重、副作用の重症度および好ましい投与様式などの因子を秤にかけることにより、それ自体においておよびそれ自体の実質的な毒性を引き起さず、および、さらに具体的な対象を処置するのに全面的に有効である、有効な予防的または治療的な処置計画を計画することができる。
【０１３３】
本発明のプロトコルの毒性および有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる（例として、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために）。毒性影響と治療効果との間の用量比率は、治療上の指標であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。大きい治療的な指標を示す、予防剤および／または治療剤が好ましい。毒性の副作用を示す、予防剤および／または治療剤は使用され得るが、未感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、それにより、副作用を最小化するために、罹患組織の部位にかかる薬剤を標的化する送達系を設計するように、注意しなければならない。
【０１３４】
細胞培養アッセイ、動物研究、およびヒト研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲の予防剤および／または治療剤を製剤化する際に使用され得る。かかる薬剤の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がない、ＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される剤形および利用される投与のルートに依存して、この範囲内で変化し得る。
【０１３５】
本発明の方法において使用される何れかの薬剤について、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養において決定される場合、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方され得る。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿におけるレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１３６】
本明細書に使用されるとき、用語「処置（する）」、「処置された」、または「処置する（こと）」は、障害に関して使用される場合、疾患の発症に対する対象の耐性を増大させる、または、換言すれば、対象が疾患を発症する可能性を減少させる、予防的処置、並びに、疾患と闘い、疾患が悪化するのを防ぎ、または、治療の非存在下と比較して疾患の進行を遅らせるための、対象が疾患を発症した後の処置を指す。
【０１３７】
本明細書に記載の診断用および治療用化合物は、他の治療剤と組み合わせて投与され得、および、かかる投与は、同時または逐次的である。他の治療剤が同時に投与される場合、これらは、同じまたは別々の製剤で投与され得るが、同時に投与される。化学療法剤を包含する他の治療剤の投与はまた、時間的に別々であってもよく、治療剤が、本明細書に記載の治療薬の投与の前または後のいずれかに、異なる時間で投与されることを意味する。これらの化合物の投与の間の時間の分離は、分の問題であってもよいし、それより長くても良い。本発明の治療薬と組み合わせて使用される場合、公知の治療薬の投与量は、副作用を避けるために、いくつかの場合において、低減され得る。
【０１３８】
よって、いくつかの場合において、本発明はまた、対象に別のがん処置（例として、放射線治療、化学治療または外科手術）を投与することを包含する。従来のがん治療の例は、オールトランス型レチノイン酸、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、アナストロゾール、アザシチジン、アザチオプリン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、三酸化ヒ素（トリセノックス）、ＢｉＣＮＵ  ブレオマイシン、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ＤＴＩＣ、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、エキセメスタン、エルロチニブ、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、ハーセプチン、ハイドレア、イホスファミド、イリノテカン、イダルビシン、イマチニブ、レトロゾール、ラパチニブ、ロイスタチン、６−ＭＰ、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、メクロレタミン、メゲストロール、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ナベルビン、ナイトロジェンマスタード、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペメトレキセド、リツキサン、６−ＴＧ、タキソール、トポテカン、タモキシフェン、タキソテール、テニポシド、チオグアニン、トレミフェン、トリメトレキサート、トラスツズマブ、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）、ＶＰ−１６、およびゼローダなどの薬剤を用いるがんの処置を包含する。
【０１３９】
本発明の分子の複数回用量もまた、企図される。いくつかの場合において、本発明の分子が、別の治療薬（実例として、化学治療剤）とともに投与される場合、治療投薬量以下の分子のいずれかまたは両方が使用され得る。「治療用量以下」は、本明細書に使用されるときは、他の薬剤の非存在下で投与される場合、対象において治療結果を生じるであろう投薬量未満である投薬量を指す。
【０１４０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体中に溶解または分散された、有効量の１以上の薬剤を含む。句「薬学的にまたは薬理学的に許容し得る」は、必要に応じて、動物（例えば、ヒトなど）に投与される場合、有害な、アレルギー性のまたは他の有害な反応を生じない、分子実態および組成物を指す。その上、動物（例として、ヒト）投与のために、調製は、ＦＤＡの生物学的標準事務局(Office of Biological Standard)によって要求される、無菌、発熱性、一般的な安全性および純度標準を満たさなければならないことが理解される。化合物は、ヒトへの投与に一般に好適である。この用語は、化合物または組成物が、ヒトへの投与に先立ち、化合物または組成物のさらなる操作が必要でないように、非毒性および充分に純粋であることを要求する。
【０１４１】
本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容し得る担体」は、当業者に公知であろう、ありとあらゆる溶媒、分散培地、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例として、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、それらの材料および組み合わせなどを包含する（例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences (1990)を参照のこと）。何れかの従来の担体が活性成分と非適合性である場合を除き、治療用組成物または医薬組成物におけるその使用が、企図される。化合物は、滅菌されていても、滅菌されていなくてもよい。
【０１４２】
本明細書に記載の化合物は、固体、液体またはエアロゾル形態で投与されるかに応じて、および、注射などの投与のルートのために滅菌する必要があるかに応じて、異なるタイプの担体を含んでいても良い。本発明は、静脈内に、皮内に、動脈内に、病巣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に(intraprostaticaly)、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、血管内に、粘膜に、心膜内に、臍部内に(intraumbilically)、眼内に、経口的に、局所的に、局部的に、吸入（例として、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続的な注入、細胞を直接標的化する局部の灌流バス(localized perfusion bathing target cells directly)、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物で（例として、リポソーム）、または当業者に公知であろう他の方法または上記のいずれかの組み合わせで投与され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences (1990)を参照のこと）。具体的な態様において、腹腔内注射が、企図される。
【０１４３】
いずれのケースにおいても、組成物は、１以上の構成要素の酸化を遅延させる様々な抗酸化剤を含み得る。加えて、微生物の作用の防止は、これらに限定されないが、パラベン（例として、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを包含する、様々な抗細菌剤および抗真菌剤などの防腐剤によってもたらされ得る。
【０１４４】
薬剤は、遊離塩基、中性または塩の形態で組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩、例として、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、または、例えば、塩化水素またはリン酸などの無機酸と形成されるもの、または酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸などの有機酸と形成されるものを包含する。遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【０１４５】
組成物が液体形態である態様において、担体は、これらに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等々）、脂質（例として、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせを含む、溶媒または分散媒であり得る。正しい流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、例えば、液体ポリオールまたは脂質などの担体中に分散させることによる必要な粒子サイズの維持によって、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって、または、かかる方法の組み合わせによって、維持することができる。多くの場合において、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせなどの等張剤を包含することが好ましい。
【０１４６】
本発明の化合物は、組織に直接投与され得る。直接組織投与は、直接的な注射によって達成され得る。化合物は、一回で投与されても良いし、または代替的に、これらは、複数の投与によって投与されても良い。複数回投与される場合、化合物は、異なるルートを介して投与されてもよい。例えば、初回（または最初の２，３回）投与は、後の投与が全身性である限り、罹患組織に直接行われ得る。
【０１４７】
本発明の製剤は、薬学的に許容し得る溶液で投与され、これは、慣用的に、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性のある担体、アジュバント、および任意に他の治療用成分を含有し得る。一般に、医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容し得る担体を含む。核酸、小分子、ペプチド、モノクローナル抗体、および抗体フラグメントについての、薬学的に許容し得る担体は、当業者に周知である。本明細書に使用されるとき、薬学的に許容し得る担体は、活性成分の生物活性の有効性に干渉しない、非毒性の材料を意味する。
【０１４８】
薬学的に許容し得る担体は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および当該技術分野において周知である他の材料を包含する。ペプチドのための、例示の薬学的に許容し得る担体は、とりわけ、米国特許第５，２１１，６５７号に記載されている。かかる調製物は、ルーチン的に、塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性のある担体、および任意に他の治療剤を含有し得る。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に許容し得るべきであるが、非薬学的に許容し得る塩は、便宜上、その薬学的に許容し得る塩を調製するために使用されてもよく、および、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的および薬学的に許容し得る塩は、これらに限定されないが、以下の酸から調製されるものを包含する：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。また、薬学的に許容し得る塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩（ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩など）として調製され得る。
【０１４９】
本発明の化合物は、錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒剤、軟膏、溶液、保管所(depositories)、吸入剤および注射剤、ならびに、経口、非経口または外科的投与のための通常の様式などの、固体、半固体、液体またはガス状形態で、調製物に製剤化され得る。本発明は、徐放性放出または制御放出のために設計されるものを包含する、移植片などの、局所投与のために製剤化される医薬組成物を包含する。
【０１５０】
経口投与のための好適な組成物は、カプセル剤、錠剤、トローチ剤などの不連続単位として提示されてもよく、各々は、活性剤の予め決められた量を含有する。他の組成物は、水性液体または非水性液体の懸濁液（シロップ剤、エリキシル剤またはエマルジョンなど）を包含する。
【０１５１】
経口投与のために、化合物は、活性化合物を、当該技術分野において周知である薬学的に許容し得る担体と組み合わせることによって、容易に製剤化され得る。かかる担体は、本発明の化合物を、処置される対象による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液等として製剤化することを可能にする。経口用途のための医薬調製物は、任意に得られた混合物を粉砕し、および、所望される場合、錠剤または糖衣錠コアを得るために、適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理し、固体賦形剤として得ることができる。
【０１５２】
好適な賦形剤は、とりわけ、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ガムトラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物を包含する。所望される場合、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天(agar)、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの、崩壊剤が添加されてもよい。任意に、経口製剤は、内部の酸条件を中和するための生理食塩水または緩衝液中に製剤化されてもよいし、何れの担体なしで投与されてもよい。
【０１５３】
糖衣錠コアは、適切なコーティングとともに提供される。このために、濃縮された糖溶液が使用され得、これは、任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素(Dyestuff)または色素(pigment)が、同定のため、または、異なる組み合わせの活性化合物用量を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１５４】
経口的に使用され得る医薬調製物は、ゼラチンから作製されるプッシュ−フィットカプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（グリセロールおよびソルビトールなど）から作製される軟性密封カプセルを包含する。プッシュ−フィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および、任意に、安定剤と混合して、活性成分を含有し得る。軟性カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの、好適な液体に熔解されても良いし、懸濁されても良い。加えて、安定剤が添加されても良い。経口投与のために製剤化されたマイクロスフェアもまた使用され得る。かかるマイクロスフェアは、当該技術分野において充分に定義されている。経口投与のための全ての製剤は、かかる投与のための好適な投薬量で存在すべきである。
頬側投与のために、組成物は、従来のやり方で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態を採用し得る。
【０１５５】
吸入による投与のために、本発明に従う使用のための化合物は、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾル噴霧提示の形態で、適切な噴霧剤、例として、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体を使用して、都合良く送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投薬量ユニットは、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。化合物およびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末塩基の粉末混合物を含有する、例として吸入器(inhaler)または吸入器(insufflator)における使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、製剤化され得る。エアロゾル送達系を調製するための技法は、当業者に周知である。一般に、かかる系は、活性剤の生物学的特性を有意に損なわない構成要素を利用すべきである（例えば、参照により援用されるSciarra and Cutie, "Aerosols," in Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp 1694-1712を参照のこと）。当業者は、過度な実験に頼ることなく、エアロゾルを産生するための様々なパラメータおよび条件を容易に決定することができる。
【０１５６】
化合物は、それらを全身的に送達することが所望される場合、例として、ボーラス注射による、注射によって、または連続的な注入によって、非経口投与のために製剤化され得る。注射のための製剤は、防腐剤を添加して、単位剤形、例として、アンプルでまたは複数用量容器で、提示され得る。組成物は、懸濁液、溶液、または油状もしくは性ビヒクル中のエマルジョンなどの形態を採用し得、および、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤化剤(formulatory agent)を含有し得る。
【０１５７】
非経口投与のための調製物は、滅菌された水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションを包含する。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性の担体は、水、アルコール／水性溶液、エマルションまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を包含する）を包含する。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、デキストロース添加リンゲル液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油を包含する。静脈内ビヒクルは、流体および栄養素補充薬(replenisher)、電解質補充薬 (デキストロース添加リンゲル液に基づくものなど)等を包含する。
【０１５８】
防腐剤および他の添加剤はまた、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等として存在し得る。低用量は、静脈内投与などの他の形態の投与から生じるだろう。対象における応答が、適用される初回用量において不充分である場合、高用量（または、異なる、より局在化した送達ルートによる、有効により高用量）が、患者の寛容性が許容する程度まで、使用され得る。一日あたりの複数回用量は、適切な全身性レベルの化合物を達成するために企図される。
【０１５９】
非生物分解性および生物分解性ポリマーのマトリックスが、本発明の薬剤の対象への送達のために使用され得る。生物分解性マトリックスが好ましい。かかるポリマーは、天然ポリマーであってもよいし、合成ポリマーであってもよい。合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、一般に、数時間〜１年またはそれ以上のオーダーで、放出が所望される時間の期間に基づいて選択される。典型的には、数時間と３〜１２ヶ月との間の範囲の期間にわたる放出が最も所望される。ポリマーは、任意には、その重量の約９０％まで水を吸収することができるヒドロゲルの形態であり、および、さらに任意には、多価イオンまたは他のポリマーで架橋されている。
【０１６０】
一態様において、本開示は、ＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を投与することによって、固形腫瘍を有する患者を処置する方法を提供する。別の態様において、本開示は、ＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を投与することによって、患者における固形腫瘍に免疫細胞を動員する方法を提供する。いくつかの場合において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、リンパ球注入を使用して投与することができる。好ましくは、自家リンパ球注入が、処置において使用される。自家ＰＢＭＣは、処置が必要な患者から回収され、および、Ｔ細胞は活性化され、および、本明細書に記載のおよび当該分野で公知の方法を使用して拡大され、および次いで、患者に注入して戻される。別の態様において、本開示は、サイトカインまたは免疫細胞を動員する他の結合剤にカップリングされた抗ＥＣＭナノボディを投与することによって、患者における固形腫瘍に、免疫細胞を動員する方法を提供する。
【０１６１】
本発明はまた、本発明の方法を達成するためにアセンブリされた、本明細書に記載の様々な試薬から作製されるキットを包含する。キットは、実例として、ＦＮおよび／またはＴＮＣのＥＩＩＩＢドメインなどの、１以上のＥＣＭタンパク質エピトープを検出するための１以上の試薬を包含し得る。キットはさらに、アッセイ希釈液、標準、対照、および／または検出可能標識を含み得る。アッセイ希釈液、標準および／または対照は、具体的な試料のために最適化されてもよい。結合ペプチドまたはポリペプチドは、実例として、ナノボディ、抗体、核酸、標識された二次薬剤を包含する。当業者は容易に、本発明の試薬が、当該技術分野で周知である確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込まれ得ることを理解するだろう。
【０１６２】
本明細書に使用されるとき、「促進された」は、がんの処置または特徴付けに関連する本発明の組成物と関連する、教育の方法を包含するビジネスを行う全ての方法、病院および他の臨床指示、医薬の販売を包含する医薬産業活動、および、何れかの形態の書面、口頭および電子コミュニケーションを包含する何れかの広告または他の宣伝活動を包含する。
「指示」は、促進の構成要素を定義し得、および、典型的には、本発明の組成物のパッケージングに関するまたはこれに関連する書面の指示を包含し得る。指示はまた、何れかの様式で提供されるいずれかの口頭または電子の指示を包含し得る。
【０１６３】
よって、本明細書に記載の薬剤は、いくつかの態様において、治療、診断または調査用途におけるそれらの使用を容易にするために、医薬または診断または調査キットにアセンブリされ得る。キットは、本発明の構成要素および使用のための指示を収容する１以上の容器を包含し得る。具体的に言うと、かかるキットは、意図される治療用途およびこれらの薬剤の適切な投与を記載する指示とともに、本明細書に記載の１以上の薬剤を包含し得る。ある態様において、キット中の薬剤は、具体的な適用および薬剤の投与の方法に好適な医薬製剤および投薬量であり得る。
【０１６４】
キットは、医師による本明細書に記載の方法の使用を容易にするように設計されてもよく、多数の形態をとり得る。キットの組成物の各々は、適用可能な場合、液体形態で（例として、溶液で）、または固体形態で（例として、乾燥粉末で）提供され得る。あるケースにおいて、組成物のいくつかは、キットとともに提供されてもよいし、されなくてもよく、例えば、好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加によって、構成可能または他に加工可能（例として、活性形態に）であり得る。本明細書に使用されるとき、「指示」は、指示の構成要素および／または促進を定義し得、および典型的には、本発明のパッケージングに関するまたはこれに関連する書面の指示を包含し得る。指示はまた、指示がキットに関連することを使用者が明確に理解する様式で、提供されるいずれかの口頭または電子指示を包含し得る（例えば、視聴覚（例として、ビデオテープ、ＤＶＤ等々）、インターネット、および／またはウェブベースのコミュニケーション等々）。書面の指示は、医薬または生物学的な製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって説明された形態で存在し得、この指示はまた、ヒト投与のための製造、使用または販売の政府機関による承認を反映し得る。
【０１６５】
キットは、１以上の容器中に、本明細書に記載の構成要素のいずれか１以上を含有し得る。例としては、一態様において、キットは、キットの１以上の構成要素を混合するための、および／または、試料を単離および混合し、および対象に適用するための指示を包含し得る。キットは、本明細書に記載の薬剤を収容する容器を包含し得る。薬剤は、滅菌して調製され、シリンジにパッケージングされ、および、凍結して輸送されてもよい。代替的には、それは、貯蔵のための、バイアルまたは他の容器中に収容されても良い。第二の容器は、滅菌調製された他の薬剤を有しても良い。代替的には、キットは、予め混合された活性剤を包含し、シリンジ、バイアル、管、または他の容器で輸送されてもよい。
【０１６６】
以下の例は、本発明の実施の特定の場合を説明するために提供されており、本発明の範囲を制限することは意図されない。当業者に明らかなように、本発明は、様々な組成物および方法において適用を見出す。
【実施例】
【０１６７】
例１：細胞外マトリックス濃縮およびＬＣ／ＭＳ
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を有する患者の肺および肝臓転移、ならびに、結腸直腸がんを有する患者からの肝臓転移を得た。これまでに記載される方法を使用して、試料を、これらの組織のＥＣＭについて濃縮した(Naba et al., Mol Cell Proteomics. 11:M111 014647 (2012))。ＥＣＭ調製物の一部を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供し、および残りを、確立された方法を使用するナノボディライブラリ生成のために、アルパカを免疫化するために使用した(Pardon et al., Nat Protoc. 9(3): 674-93 (2014))。
【０１６８】
例２：アルパカ免疫化
疾患組織の細胞外マトリックスは、正常組織のそれとは別個であることが知られており、およびしばしば、疾患部位に排他的にまたは選択的に存在するＥＣＭタンパク質およびＥＣＭタンパク質のエピトープを含有する（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって示されるように、および、免疫組織化学によって確認されるように）。がんのような疾患組織に関連するＥＣＭタンパク質エピトープに特異的なアルパカ由来のナノボディを開発するために、４匹の異なるアルパカを、以下を用いて免疫化した：（ａ）ＥＣＭタンパク質および疾患ＥＣＭに関連するタンパク質由来の合成ペプチドのカクテル；（ｂ）肝臓への結腸がん転移のヒト患者からのＥＣＭ調製物；（ｃ）肝臓へのトリプルネガティブ乳がん転移のヒト患者からのＥＣＭ調製物；および（ｄ）肺へのトリプルネガティブ乳がん転移のヒト患者からのＥＣＭ調製物。
【０１６９】
例３：ナノボディライブラリ構築
アルパカなどのラクダ科動物は、従来の免疫グロブリンを作製することに加えて、それらのＶＨＨ（重鎖のみの抗体の重鎖の可変領域）ドメインを通してそれらの抗原に結合する重鎖のみの抗体を作製する。組み換えＶＨＨドメインは、ナノボディと呼ばれており、これは、１５ｋＤａの単一タンパク質ドメインで、無傷の抗体の全体の特異性を含有する単一ドメイン抗体である。リンパ球は、免疫化されたアルパカから回収された血液から単離され、ＥＣＭ調製物でブーストされる。リンパ球ＲＮＡを抽出し、ＶＨＨドメインをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、Ｍ１３ファージディスプレイをベースとしたナノボディライブラリの構築のために使用した。４つのＭ１３ライブラリを、上記の細胞外マトリックスタンパク質調製物に対して作製した。ライブラリを、表１に示す。これらのライブラリは、１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの多様性を有していた。
【０１７０】
【表１】
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【０１７１】
例４：フィブロネクチンのＥＩＩＩＢドメインに対するナノボディの開発および適用
４．１  フィブロネクチンのＥＩＩＩＢドメインに対するナノボディのパニング
フィブロネクチン（ＦＮ）は、組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主要な構成要素を形成する、大きな多機能性糖タンパク質である(Hynes, Annu Rev Cell Biol. 1: 67-90 (1985;Hynes 1990)。ＦＮは、胚発生、創傷治癒、組織修復、線維症、心血管疾患、血管新生および腫瘍形成の間に、選択的スプライシングを経験する。この選択的スプライシングは、正常なＥＣＭではなく、疾患ＥＣＭにおいてＥＩＩＩＡおよびＥＩＩＩＢドメインの包含を生じる(White and Muro, JUBMB Life, 63(7): 538-46 (2011))。疾患ＥＣＭにおけるこれらのドメインの発現、および、正常組織および血漿からのこれらの非存在は、これらを、ナノボディをベースとした画像化および治療法についての有望な標的とする。
【０１７２】
ライブラリを使用して、確立されたファージディスプレーパニング方法を使用して、組み換え発現されたＦＮのＥＩＩＩＢドメインに特異的なナノボディをパニングした。ＣＤＲ３（相補性決定領域３）における配列多様性に基づいて、６つのユニークなクローンを、パニングから単離し、それらの配列を図１Ａおよび表２に示す。ＣＤＲは、表３に提示する。これらのクローンは、コードされるＶＨＨナノボディを発現するようにプロセシングされ、および、免疫ブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光および免疫組織化学を包含する様々なin vitroアッセイを使用して、ＥＩＩＩＢドメイン中のエピトープについてのそれらの特異性について試験した。図２は、ＥＩＩＩＢドメイン中のエピトープについてのクローンＮＪＢ２の特異性を示す。
【０１７３】
腫瘍および転移部位において発現されるＥＩＩＩＢへのＮＪＢ２の特異性および結合をさらに試験するために、２光子顕微鏡法を使用するex vivoの蛍光画像化を実施して、ＮＪＢ２が腫瘍ＥＣＭに特異的に局在化することを見出した（図３）。in vivo結合を、担腫瘍マウスに注射した６４Ｃｕ標識ＮＪＢ２を用いて免疫ＰＥＴ／ＣＴによってさらに試験した。ＮＪＢ２ナノボディは、高いシグナル対背景比率で腫瘍ＥＣＭに特異的に局在化した（図４Ａ〜４Ｃ）。腫瘍ＥＣＭへの結合の特異性および小さい転移を検出する感受性を比較するために、ＮＪＢ２免疫ＰＥＴ画像を、同じマウスの１８Ｆ−ＦＤＧ画像と比較した。ＮＪＢ２免疫ＰＥＴは、肝臓およびリンパ節への同所性転移（直径２〜４ｍｍ）を首尾良く検出でき（図５Ｂ）、これらのいずれも、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴにより明確に検出できなかった（図５Ａ）。この例およびこれに続く例および図面における腫瘍および転移は、これらの図面が由来する本来の着色画像および動画においてはるかに容易に観察されることに留意する。
【０１７４】
４．２：膵管腺癌の早期検出における６４Ｃｕ−ＮＪＢ２ナノボディ
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、明確に定義された新生物段階を通って発生しおよび、増大する線維増生および顕著なＥＣＭ沈着によって特徴付けられる。開始から転移性疾患へのＰＤＡＣの進行は、大体二十年かかり得、初期検出の幅広い機会が示唆される。我々は、初期検出およびＰＤＡＣ進行のトラッキングのためにＮＪＢ２が使用できるかどうかを試験することに興味があった。我々は、膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）（これは後にＰＤＡＣに進行する前駆病変である）を包含する異なる段階のＰＤＡＣ進行を再現するＰＤＡＣのＫＰＣマウスモデルを使用した。ＰＤＡＣ進行の間のＥＩＩＩＢの発現を試験するために、我々は、ＰａｎＩＮ病変の間質におけるＥＩＩＩＢ発現を観察し、正常の膵臓においてＥＩＩＩＢは観察されなかったが、ＰＤＡＣ間質において極めて強いＥＩＩＩＢ染色が検出された。これらの結果は、マウスにおけるＰＤＡＣ進行の間、ＥＩＩＩＢを含有するＦＮの増大する包含／発現を指し示す。
【０１７５】
さらにまた、ヒトＰＤＡＣ患者試料の組織切片に対するＮＪＢ２−ビオチンを用いるＩＨＣは、ナノボディがヒトＰＤＡＣ間質において発現されるＥＩＩＩＢに結合することを示した。in vivoで、ＮＪＢ２のＰＤＡＣ腫瘍への結合を試験するために、２〜８ヶ月齢のＫＰＣマウスに、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２を尾の静脈を介して注射し、および、２時間後にＰＥＴ／ＣＴで画像化した。６４Ｃｕ−ＮＪＢ２  ＰＥＴ／ＣＴを用いて画像化したＰＤＡＣを有するマウスにおいて、ナノボディは、大きい膵臓腫瘍に特異的に結合した（図６Ｂ）。６４Ｃｕ−ＮＪＢ２  ＰＥＴ／ＣＴを用いて画像化したＰａｎＩＮを有するマウスにおいて、別個のＰＥＴシグナルが、膵臓の領域において明らかであった（図６Ｄ）。これは、着色において、および、３Ｄ再構成ビデオにおいてはるかにより明確である画像の具体的な例である。同じマウスをまた、比較のために、１８Ｆ−ＦＤＧを用いて画像化した。大きい膵臓腫瘍が、１８Ｆ−ＦＤＧによって検出されたが（図６Ａ）、ＰａｎＩＮ病変は、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴ画像化を用いて明確に可視ではなかった（図６Ｃ）。よって、ＮＪＢ２は、ＰＤＡＣの非侵襲性早期検出およびスクリーニングのために、および、高い特異性および感受性を有するＰＤＡＣ進行モニタリングのために、使用することができる。
【０１７６】
４．３：６４Ｃｕ−ＮＪＢ２は、黒色腫およびトリプルネガティブ乳がんの同一遺伝子モデルにおいて、腫瘍および転移を検出する
我々は、次に、ＮＪＢ２ナノボディが乳がんおよび黒色腫の免疫適格性同一遺伝子モデルにおける腫瘍（ＢＡＬＢ／ｃにおける４Ｔ１）および転移（Ｃ５７ＢＬ／６におけるＢ１６Ｆ１０）を標的化および検出できるかどうか調査した。４Ｔ１腫瘍は、トリプルネガティブ乳がんのモデルであり、これは、肺、肝臓、およびリンパ節を包含する遠位部位へ自発的に転移することができる。同一遺伝子のｔ腫瘍または肺転移を保有するマウスをさらに、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２  ＰＥＴ／ＣＴで画像化し、これは、両方のモデルで高い特異性で、腫瘍および肺転移を検出した（図７Ａおよび７Ｂ、着色にて容易により可視化された）。
【０１７７】
４．４：６４Ｃｕ−ＮＪＢ２を用いる肺線維症の非侵襲性検出およびトラッキング
線維症は、ＥＣＭ含有フィブロネクチンの過度の沈着によって特徴付けられる。ＥＩＩＩＢ／ＥＩＩＩＡ含有ＦＮの発現は、正常組織において低い／非存在であるが、線維症の部位において高い。ブレオマイシンは、臨床上の肺線維症の多数の側面を模倣する実験的な肺線維症を誘導するために、幅広く使用されている。ブレオマイシン処理およびシャム処理のマウスを、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２免疫ＰＥＴ／ＣＴを用いて画像化した。ナノボディは、線維性肺の領域に結合し、ブレオマイシン処理後の７日目および１４日目の両方で肺における明確なシグナルを示す（図８）。我々は、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２が、優れた特異性および高いシグナル対ノイズ比で、非侵襲的に肺線維症を検出すると結論づける。
【０１７８】
４．５：６４Ｃｕ−ＮＪＢ２は、乳がんにおいて腫瘍進行を検出する
疾患進行の非侵襲性モニタリング（治療に応答する際のような）は、in vivo画像化の重要な用途である。６４Ｃｕ−ＮＪＢ２が本願において有用なツールであり得るかを査定するために、我々は、乳がん進行のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴモデル（これにおいて、マウスは、自発的な自発性(spontaneous autochthonous)腫瘍を発生する）を選択した。このモデルは、ヒト乳がん進行の多数の側面を再現する。腫瘍進行は、４つの別個の段階を介して生じる；過形成（４〜６週齢）、前悪性腺腫（８〜９週齢）、初期癌（８〜１２週齢の悪性移行）（これは次いで進行癌に進行する）。我々は、長期免疫ＰＥＴ／ＣＴ画像化を使用して、腫瘍進行をモニタリングした。ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ雌性（ｎ＝７）を、６週〜１３週、６４Ｃｕ−ＮＪＢ２  ＰＥＴ／ＣＴを用いて画像化した。乳房脂肪パット腫瘍からのＰＥＴシグナルを、１０週齢マウスで検出した。１０週から１３週に腫瘍成長が進行するにつれて、ＰＥＴシグナルは、全てのマウスにおいて複数の巨視的腫瘍小結節から観察された（図９）。免疫組織学に基づいて、このモデルは、試験された他の乳がんモデルと比較して、低いレベルのＥＩＩＩＢを発現する。よって、ＮＪＢ２は、低いレベルのＥＩＩＩＢを発現するマウスモデルにおいてさえも、腫瘍進行を標的化およびモニタリングするために使用することができる。
【０１７９】
４．６：ＦＮ−ＥＩＩＩＢは、複数のがんタイプに由来する転移において幅広く発現される
ナノボディが小さい転移を検出できること（これは、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴなどの従来の画像化を使用して技術的に困難なままである）を実証したので、我々は、ＮＪＢ２がどれだけ広く、転移の検出および標的化に使用され得るかを査定することを望んだ。複数の患者からの転移試料におけるＥＩＩＩＢの発現を調査するために、我々は、ＮＪＢ２−ビオチンを有する１０４人の患者に由来する様々な転移性部位からの試料の複数器官組織アレイを染色した。組織は、ＥＣＭにおけるＥＩＩＩＢシグナルについてスコア付し、および、我々は、ＮＪＢ２−ビオチンで染色した組織アレイにおいて、〜４４％の患者が、彼らの転移部位においてＦＮ−ＥＩＩＩＢを発現したことを見出した（図１０）。並行して、同様の結果が、モノクローナル抗ＥＩＩＩＢ抗体を用いて得られた（ＡＭ３、データは示さず）。複数器官（２１の別個の部位）へのこれらの転移は、数ある中でも直腸、膵臓、肺、卵巣、胃および甲状腺を包含する、１７の異なる原発性部位に由来した（表４）。ＥＩＩＩＢ陽性生検の中で、〜３２％が、転移部位においてリンパ節に転移した（表４）。複数の器官における転移部位でのＥＩＩＩＢの広い発現および複数のタイプの原発腫瘍からの由来はさらに、ＮＪＢ２をベースとして画像化および治療用途の潜在的な適用を広げる。
【０１８０】
【表４】
2021512071.tif 000004
【０１８１】
例５：ヒトテネイシンＣに対するナノボディについてのパニング
テネイシンＣ（ＴＮＣ）は、成人ヒト組織においてほとんど非存在の巨大なＥＣＭタンパク質である（腱および靱帯ならびにＣＮＳの脳室下帯における低レベルの発現を除く）(Giblin and Midwood, Cell Adh Migr. 9: 48-82 (2015))。しかしながら、このタンパク質は、炎症およびがんの部位などのＥＣＭリモデリングに関連する疾患組織において、特異的に再発現される。活性化間質／疾患関連ＥＣＭにおけるその制限された発現パターンは、ナノボディをベースとした画像化および治療的アプローチについての魅力的な標的とする(Giblin and Midwood, Cell Adh Migr. 9: 48-82 (2015);Gocheva et al, 2017))。
【０１８２】
表１に記載したライブラリＢおよびＣを、ヒトテネイシンＣに特異的なナノボディについてパニングするために使用した。１１のユニークなクローン（全体の配列多様性に基づく）を単離し、その中の８つが、ＣＤＲ３領域に基づいてユニークであり、その配列を図１Ｂおよび表２に示す。ＣＤＲは表３に提示する。これらのクローンを発現し、および、続いて、免疫ブロッティング、ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学を包含する様々なin vitroアッセイを使用して、テネイシンＣについてのそれらの特異性について試験した。図１１は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトテネイシンＣタンパク質に特異的な３つのナノボディ（ＮＪＴ３、ＮＪＴ４およびＮＪＴ６）を記載する。これらのナノボディは、腫瘍ＥＣＭにおいてテネイシンＣに特異的に結合することが見出された（図１２）。
【０１８３】
腫瘍において発現されるテネイシンＣへのＶＨＨの特異性および結合をさらに試験するために、ＮＪＴ３、ＮＪＴ４およびＮＪＴ６を、ソルターゼ媒介タギングを介して、テキサスレッドで部位特異的に標識した。２光子顕微鏡法を使用するex vivo蛍光画像化を実施し、および、テネイシンＣに対するＶＨＨは、腫瘍ＥＣＭに特異的に局在化することが見出された（図１３）。in vivo結合をさらに、担腫瘍ＮＧＳマウスに注射された６４Ｃｕ標識ＮＪＴ６を用いる免疫ＰＥＴ／ＣＴによって試験し、ＬＭ２  ＴＮＢＣ細胞に由来する転移を試験した。ＮＪＴ６ナノボディは、高いシグナル対背景比で、腫瘍および肺転移に具体的に局在化した（図１４Ａ，Ｂ）。
【０１８４】
例６：ナノボディをベースとしたＣＡＲ−Ｔ細胞は腫瘍成長を抑制し、および、Ｔ細胞を動員する
血液学的ながんを処置する際の成功にもかかわらず、固形腫瘍は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療によって容易に除去されない。固形腫瘍は一般に、高度に免疫抑制性の環境で発生し、および、腫瘍特異的抗原発現の欠如に主に起因して、標的化するのが困難であるが、他の因子も同様に寄与する。これらのマーカーを認識する単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）をベースとしたＣＡＲ−Ｔ細胞の使用は、がん細胞自体に対する腫瘍特異的標的の必要性を回避する。間質を通して腫瘍微小環境を標的化するＶＨＨをベースとしたＣＡＲ−Ｔ細胞、および、ＥＣＭマーカーは、同一遺伝子免疫適格性動物モデルにおける固形腫瘍に対して有効である。
【０１８５】
この研究で作製されたＶＨＨをベースとしたＣＡＲＴ細胞は、ｓｃＦｖをベースとしたＣＡＲ−Ｔ細胞の原則的な設計に従い、ここで、Ｔ細胞は、膜貫通ドメインおよびシグナリングドメインを有するキメラにおける認識モジュールをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入される。このケースにおいて、ＶＨＨは、認識モジュールとして、ｓｃＦｖを取り換えた。我々は、この分野において使用される標準的な方法によってＣＡＲ構築物を作製するために、フィブロネクチンのＥＩＩＩＢスプライシングバリアント（ＮＪＢ２）に特異的なＶＨＨを使用した。ＣＡＲ構築物をコードするマウス幹細胞ウイルス由来のレンチウイルスベクター主鎖を、形質転換効率を測定するためのＩＲＥＳ駆動蛍光マーカーカセットに加えて、腫瘍微小環境に特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞を産生するように、マウスＴ細胞がそれらの表面でＮＪＢ２  ＣＡＲを発現するように、マウスＴ細胞を形質導入するために使用した（以降、Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞）。
【０１８６】
Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞のＥＩＩＩＢへの結合特異性を確認した後、我々は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルを、Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞での処置が腫瘍成長を遅延させることを示すために使用した。マウスに、１ｘ１０５  Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下注射し、およびＢ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞注射（１×１０７〜１．５×１０７細胞）を、Ｂ１６Ｆ１０細胞注射の４日後および１１日後に与えた。腫瘍を、１６日目に収穫し、および、腫瘍サイズを測定し、腫瘍面積をグラフ化した。Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍成長を首尾良く遅延させた（図１５Ａ）。Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞処置をまた、免疫無防備状態のＲＡＧ−／−マウスのＢ１６モデルで試験し、処置の有効性における内在性適応免疫系の貢献を決定した。我々は、Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞の効率的な拡大にかかわらず、適応免疫を欠く担腫瘍マウスがＢ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理される場合、腫瘍成長における生存または遅延の有意な増加を観察しなかった。このことは、ＣＡＲ処置が、内在性適応免疫系と協力し、これらの免疫適格性腫瘍モデルにおいて有効性を示すことを指し示す（データは示さず）。これらの結果は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍ＥＣＭおよび血管新生(neovasculature)に選択的に標的化することは、腫瘍成長の抑制に極めて有効であり得ることを示す。我々は、完全に免疫適格性のマウスにおいて、腫瘍微小環境における標的に対してin vivoで有効なＣＡＲ−Ｔ細胞を産生するのにＶＨＨを提供できると、我々は結論づける。
【０１８７】
Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞処置の機構をより密接に分析するために、我々は、処置を経験する間に、切除された腫瘍に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を接種して、および、マウスを、Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理するかまたは左側を未処理のいずれかとした。処理群と対照群との間で腫瘍サイズの有意な差異が存在する１６日目に（図１５Ａ）、腫瘍を切除、固定し、およびＩＨＣに供した。次いで、腫瘍試料を、ＣＤ３１、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８について染色し、どのくらいの脈管構造および免疫細胞集団が、Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞処置によって影響されるのかを決定した。未処理腫瘍の構造は、健康的および無傷であるようにみえたが、処理された腫瘍は、崩壊の明確な兆候を示した。処置された試料は、対照と比較して、ＣＤ３１陽性脈管構造のレベルの減少を示した。Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＥＩＩＩＢ（これは、腫瘍間質中および新生血管上に発現される）に標的化されるので、処理された試料における壊死性質およびＣＤ３１発現の非存在が、おそらく予測される。
【０１８８】
全ての腫瘍全体を平均すると、Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理した腫瘍は、未処理の腫瘍と比較してＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８の染色の増加によって証明されるように、Ｔ細胞のレベルが上昇していた（図１５Ｂ）。浸潤したＴ細胞を、図１５Ｃにおいて定量した。合理的な解釈は、Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍に浸潤し、および、またおそらく、追加の免疫細胞を動員する。これらのデータはさらに、ＥＩＩＩＢ発現腫瘍に浸潤し、これを損傷するＢ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞の能力を実証する。腫瘍は、それらの間質および脈管構造によって送達される支持体および栄養素に依存し、および、これらの相互作用を損なうことによって、Ｂ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍成長を著しく遅延させる。
【０１８９】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１９０】
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１９１】
これらの例は、腫瘍および転移の先のプロテオミクス解析によって規定された腫瘍濃縮ＥＣＭタンパク質エピトープを標的化する腫瘍選択的抗ＥＣＭナノボディを単離するアプローチの有効性を実証する。作製されたライブラリは、他の腫瘍増強ＥＣＭエピトープに対する複数の他の抗ＥＣＭ抗体の再生可能な供給源であろう（アルパカを免疫化するために使用したＥＣＭ濃縮調製物は、質量分析によって分析されているので、我々は構成物質ＥＣＭ構成要素を知っていることに留意する）。
よって、本発明の態様のいくつかの側面を記載したので、様々な変更、改変および改善が当業者に容易に思い浮かぶことが理解されるべきである。かかる変更、改変、および改善は、本開示の一部であることが意図され、および、本発明の精神および範囲内であることが意図される。結果的に、上記の記載および図面は、一例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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