(57)【要約】  本発明は、類似運動神経と類似感覚神経とを含む差異性組織工学神経を開示し、前記類似運動神経と類似感覚神経とはそれぞれ類似運動神経の神経上管と神経上管内の類似運動神経線維及び類似感覚神経の神経上管と神経上管内の類似感覚神経線維を含み、類似運動神経と類似感覚神経の神経上管の表面又は孔隙内に、それぞれ運動神経由来と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞が含まれ、類似運動神経と類似感覚神経線維の表面又は孔隙内に、それぞれ経シナプスシグナル分子ニューロリギン−１とニューロリギン−２とが含まれる。本発明は、選択的にニューロリギン−１を使用して運動ニューロンを特異的に促進してシナプスしてリモデリングし、ニューロリギン−２を使用して感覚ニューロンを特異的にシナプスしてリモデリングして、運動神経細胞と感覚神経細胞の修復効率を向上させている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
差異性組織工学神経において、類似運動神経と類似感覚神経とを含み、
前記類似運動神経は、類似運動神経の神経上管と神経上管内の類似運動神経線維を含み、前記類似運動神経の神経上管の表面又は孔隙内に、運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞が含まれており、前記類似運動神経線維の表面又は孔隙内に、経シナプスシグナル分子ニューロリギン−１が含まれており、
前記類似感覚神経は、類似感覚神経の神経上管と神経上管内の類似感覚神経線維を含み、前記類似感覚神経の神経上管の表面又は孔隙内に、感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞が含まれており、前記類似感覚神経線維表面又は孔隙内に、経シナプスシグナル分子ニューロリギン−２が含まれていることを特徴とする、差異性組織工学神経。
【請求項２】
前記運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：１〜５であることを特徴とする、請求項１に記載の差異性組織工学神経。
【請求項３】
前記運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：３であることを特徴とする、請求項２に記載の差異性組織工学神経。
【請求項４】
ニューロリギン−１とニューロリギン−２との質量比が１：１であることを特徴とする、請求項１に記載の差異性組織工学神経。
【請求項５】
前記類似運動神経線維及び／又は類似感覚神経線維表面又は孔隙内に、経シナプスシグナル分子ニューレキシン−１βがさらに含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の差異性組織工学神経。
【請求項６】
前記類似運動神経線維におけるニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：０．０１〜１０であり、前記類似感覚神経線維におけるニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：０．０１〜１０であることを特徴とする、請求項５に記載の差異性組織工学神経。
【請求項７】
前記類似運動神経線維におけるニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であり、前記類似感覚神経線維におけるニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であることを特徴とする、請求項６に記載の差異性組織工学神経。
【請求項８】
前記経シナプスシグナル分子ニューロリギン−１、ニューロリギン−２及びニューレキシン−１βは、微小球内に包埋されていることを特徴とする、請求項５に記載の差異性組織工学神経。
【請求項９】
前記類似運動神経と類似感覚神経は、平坦状、Ｙ字状、樹木状、櫛歯状のうちの一種又は複数種の形状の多分岐状をなすように配置されていることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の差異性組織工学神経。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組織工学神経の末梢神経欠損修復への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生医学分野に関し、具体的には運動神経と感覚神経を差異的に制御して修復できる差異性組織工学神経に関する。
【背景技術】
【０００２】
末梢神経損傷は、臨床でよく見られる疾患であり、社会経済の発展及び人口高齢化、意外事故による急性外傷と慢性退行性疾患による末梢神経障害は、大幅に上昇する傾向がある。末梢神経損傷は、患者の相応部位の運動と感覚機能の損傷を招き、損傷後の機能の回復状況は、主に再生神経軸索が特定の運動と感覚経路に対する正確な選択性により成長する。臨床において、神経修復は主に断端で無張力の直接縫合、自体あるいは異体の神経移植、及び組織工学神経移植片などの方式がある。断端直接縫合は、あまり深刻でない局部創傷のみに適用し、自体あるいは異体の神経移植の実際操作において多くの不便と弊害があるため、現在、末梢神経修復の主な研究方向は、適切な組織工学神経の構築を探求することである。
【０００３】
正常な生理状態で、末梢神経系の運動・感覚神経線維は、対応する神経周膜内で一定の方向性で規則的に成長している。一方、神経損傷後、損傷部位に単純な材料で作られたカテーテルを架橋すると、運動神経線維や感覚神経線維の再生方式が無規則で混乱し、神経線維の誤接続率が存在する。そして、後期の神経線維が最終的に支配する標的器官を見つけても、神経再生の速度に大きな影響を与えるようになっている。より深刻なのは、遠端の神経線維末梢の効果器が長期にわたって神経支配を失ったため、機能を完全に回復することができなくなり、例えば標的筋の萎縮過程が不可逆的である。したがって、再生の初期段階で適切に介入し、運動神経線維と感覚神経線維の正確かつ規則的な成長を促すことで、末梢神経再生の速度と効率を高めることができる。
【０００４】
中国の特許文献１に、バイオプリンティング技術に基づいて調製された組織工学神経移植片が開示されており、前記組織工学神経移植片は、神経上管と管内のナノ線維骨格とを含み、前記神経上管の直径が１〜９ｍｍであり、壁厚が０．５〜１ｍｍであり、前記管内のナノ線維骨格の直径が０．１ｍｍであり、骨格の本数が５〜３０本であり、骨格は管内に均一に分配され、骨格の内部あるいは表面と神経上管の内外表面は、栄養因子及び／あるいは細胞を被覆している。中国の特許文献２に、カテーテルと管内の線維骨格を含む懸糸線維骨格を持つ組織工学神経移植片が開示されている。各本の線維骨格は線維の長さ方向に沿っていくつかの懸糸が設けられてカテーテル内壁に繋がれ、線維骨格は懸糸によってカテーテル内に吊り下げられていることを特徴とする。これらの研究は、神経細胞成長の「橋梁」としてナノ線維を用いたバイオプリンティング技術を利用し、神経細胞が線維骨格に沿って配向的に成長することを保証している。しかし、実際の末梢神経修復過程において、運動神経と感覚神経をよく区別できず、神経線維の誤接続が問題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０２９０８２０７号公報
【特許文献２】中国特許出願公開第１０４６２３７３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、末梢神経の独特な解剖構造に基づいて設計され、運動神経と感覚神経を差異的に制御して修復できる差異性組織工学神経を構築する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の具体的な技術方案は、以下の通りである。
【０００８】
差異性組織工学神経であって、類似運動神経と類似感覚神経とを含み、
前記類似運動神経は、類似運動神経の神経上管と神経上管内の類似運動神経線維を含み、前記類似運動神経の神経上管の表面又は孔隙内に、運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞が含まれており、前記類似運動神経線維の表面又は孔隙内に、経シナプスシグナル分子ニューロリギン（Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）−１が含まれており、
前記類似感覚神経は、類似感覚神経の神経上管と神経上管内の類似感覚神経線維を含み、前記類似感覚神経の神経上管の表面又は孔隙内に、感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞が含まれており、前記類似感覚神経線維表面又は孔隙内に、経シナプスシグナル分子ニューロリギン（Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）−２が含まれている。
【０００９】
本発明の研究から明らかなことは、ニューロリギン−１は、運動ニューロンを特異的に促進してシナプスしてリモデリングすることができ、ニューロリギン−２は、感覚ニューロンを特異的に促進してシナプスしてリモデリングすることができ、両者をそれぞれ運動神経と感覚神経の再生に応用すると非常に良好な神経修復効果が得られる。
【００１０】
好ましくは、前記運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：１〜５である。本発明の類似運動神経線維と類似感覚神経線維における神経細胞の再生速度の一致を保証するために、運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：３であることがより好ましい。
【００１１】
１つの好ましい方案として、ニューロリギン−１とニューロリギン−２との質量比が１：１である。
【００１２】
好ましくは、本発明に係る前記類似運動神経線維及び／又は類似感覚神経線維に経シナプスシグナル分子ニューレキシン（Ｎｅｕｒｅｘｉｎ）−１βをさらに含み、類似運動神経線維におけるニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：０．０１〜１０であることが好ましく、１：５であることがより好ましい。前記類似感覚神経線維におけるニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：０．０１〜１０であることが好ましく、１：５であることがより好ましい。
【００１３】
本発明に係る差異性組織工学神経は、従来技術に開示された技術で調製することができ、例えば、鋳型、凍結乾燥成形、静電紡糸技術、三次元バイオプリンティング技術などであり、三次元バイオプリンティング技術が好ましい。
【００１４】
本発明は、バイオプリンティング技術を採用することができ、運動神経、感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞、経シナプスシグナル分子ニューロリギン−１、ニューロリギン−２、ニューレキシン−１β（あるいは経シナプスシグナル分子を含有した微小球を調製する）及び運動神経線維と感覚神経線維材料を原料としてプリントを行ってもよく、運動神経、感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞、経シナプスシグナル分子ニューロリギン−１、ニューロリギン−２、ニューレキシン−１β（あるいは経シナプスシグナル分子を含有した微小球を調製する）を、それぞれ神経線維の対応する位置にプリントし、塗布あるいは受動的に吸着してもよい。
【００１５】
本発明の１つの好ましい方案として、経シナプスシグナル分子ニューロリギン−１、ニューロリギン−２及びニューレキシン−１βを微小球（徐放性微小球が好ましい）に包埋させ、安定性を向上し、生物活性及び組織工学神経における粘着性を保証することができる。
【００１６】
１つの好ましい方案として、ＰＬＧＡ微小球を採用し、調製方法は以下の通りである。
【００１７】
ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ，乳酸：エタノールのモル比が５３：４７、分子量［ＭＷ］２５ｋＤａ）。ＰＬＧＡ微小球は、水／油／水の多重エマルジョン法により調製した。１００ｍｇのＰＬＧＡを１ｍＬのジクロロメタンに溶解し、続いて３ｍＬの７％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液に乳化し、１分間超音波処理して第１段階の乳液を作製した。続いて、上記溶液を５０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液（２％のイソプロピルアルコール含有）に加え、再び３分間超音波処理により、第２段階の乳液を形成した。室温で、前記第２段階の乳液をゆっくり１晩撹拌し、残存するジクロロメタンはきれいに揮発した。１３，０００ｒｐｍ、５分間、４℃の遠心沈殿によってＰＬＧＡ微小球を得た。ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄し、ｄｄＨ２Ｏを０．４ｍＬ加えて再懸濁して予備とした。
【００１８】
本発明に係る類似運動神経と類似感覚神経は神経カテーテル構造であり、神経上管と管内の類似運動神経線維と類似感覚神経線維を含み、神経上管の直径が１〜９ｍｍ、壁厚が０．５〜１ｍｍであることが好ましく、前記類似運動神経線維と類似感覚神経線維の直径が０．０１〜０．１ｍｍ、数が５〜３０本である。
【００１９】
本発明に係る差異性組織工学神経は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、絹フィブロインのうちの一種又はそのうちの何種類から選択される分解可能な重合体材料から製造されている。
【００２０】
本発明の１つの好ましい方案として、前記類似運動神経と類似感覚神経は、平坦状、Ｙ字状、樹木状、櫛歯状のうちの一種又は複数種の形状の多分岐状をなすように配置されている。空間的に運動神経と感覚神経の相対的な分離をよりよく保証することができ、架橋の正確性を高めることができる。固定成形の形状を有するように、さらにスリーブ、懸糸、骨格などの方式を使用して類似運動神経と類似感覚神経の相対位置を設計して配置してもよい。
【００２１】
本発明の他の目的は、本発明に係る組織工学神経の末梢神経欠損修復への使用を提供することである。
【００２２】
本発明の利点は以下の通りである。
【００２３】
本発明は、異なるニューロリギンが運動神経細胞と感覚神経細胞に対する作用が異なることを初めて発見し、選択的にニューロリギン−１を使用して運動ニューロンを特異的に促進してシナプスしてリモデリングし、ニューロリギン−２を使用して感覚ニューロンを特異的に促進してシナプスしてリモデリングして、運動神経細胞と感覚神経細胞の修復効率を向上させている。
【００２４】
本発明は、さらに研究したところ、ニューロリギン−１とニューロリギン−２が運動神経細胞と感覚神経細胞の修復速度を促進して、本発明に係る組織工学神経における運動神経と感覚神経の再生速度を一致させて、末梢神経の再生速度を向上させている。
【００２５】
本発明は、組織工学の研究方法を運用し、末梢神経損傷の局部に運動・感覚ニューロン軸索に適応して特異的に成長したシナプス関連タンパク質を模擬して徐々に放出し、シュワン細胞と線維芽細胞から構成される３Ｄ運動感覚の微小環境を結合し、解剖構造／局部微小環境の二重生体模倣の組織工学神経を構築して、末梢神経の再生速度と効率の向上に有利となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】免疫細胞化学染色でニューロリギン−１とニューロリギン−２がそれぞれ運動・感覚ニューロンに作用してシナプス形成に影響を与えることを示し、図１Ａは、ニューロリギン−１とニューロリギン−２がそれぞれ運動ニューロンと感覚ニューロンに作用し、免疫細胞化学染色によるシナプス関連タンパク質シナプトフィジン（Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）とＰＳＤ−９５の分布及び表現状況を観察し、図１Ｂは、ニューロリギン−１とニューロリギン−２が、それぞれ運動ニューロンと感覚ニューロンに作用して、シナプス前膜タンパク質シナプトフィジンとシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５のシナプス面積が全神経突起の面積に占める百分率の棒グラフである（＊＊ｖｓ．ニューロリギン−１  運動ニューロン中；＃＃ｖｓ．ニューロリギン−２  感覚ニューロン中，Ｐ＜０．０１）。
【図２】免疫細胞化学染色でニューレキシン−１βとニューロリギンが、剤量と関連する協同作用を有することを示し、図２Ａは、ニューレキシン−１β及びニューレキシン−１βが、それぞれニューロリギン−１及びニューロリギン−２と運動ニューロン及び感覚ニューロンに共同作用し、免疫細胞化学染色によるシナプス関連タンパク質シナプトフィジンとＰＳＤ−９５の分布及び表現状況を観察し、図２Ｂは、ニューレキシン−１β及びニューレキシン−１βが、それぞれニューロリギン−１及びニューロリギン−２と運動ニューロン及び感覚ニューロンに共同作用し、シナプス前膜タンパク質シナプトフィジンとシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５のシナプス面積が全神経突起の面積に占める百分率の棒グラフである（＊＊ｖｓ．ニューロリギン−１  ２００ｎｇ／ｍＬ＋ニューレキシン−１β  １μｇ／ｍＬ  運動ニューロン中；＃＃ｖｓ．ニューロリギン−２  ２００ｎｇ／ｍＬ＋ニューレキシン−１β  １μｇ／ｍＬ  感覚ニューロン中，Ｐ＜０．０１）。
【図３】本発明に係る差異性組織工学神経の模式図である。
【図４】本発明の実施例４の坐骨神経損傷モデルの術後１２週、各実験チームの運動機能回復状況を電気生理学的に検査し、図４Ａは、各実験チームＣＭＡＰの代表図であり、図４Ｂは、各実験チームＣＭＡＰが自家移植片（Ａｕｔｏｇｒａｆｔ）に占める百分率の統計結果である（ｎ＝６，＊ｖｓ．ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ，Ｐ＜０．０５；＊＊ｖｓ．ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ，Ｐ＜０．０１）。
【図５】本発明の実施例４の坐骨神経損傷モデルの術後１２週、各実験チームの痛覚検査による感覚機能の回復状況であり、図５Ａは、各実験チームの機械的疼痛を検査した結果であり（ｎ＝６，＊ｖｓ．ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ，Ｐ＜０．０５）、図５Ｂは、各実験チームの熱過敏性疼痛を検査した結果である（ｎ＝６，＊ｖｓ．ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ，Ｐ＜０．０５；＊＊ｖｓ．ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ，Ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、実施例にて本発明の具体的なステップを説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
本発明に使用される用語は、他に指示がない限り、通常当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００２９】
以下、具体的実施例とデータを参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。なお、該実施例は本発明を説明するために過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００３０】
以下の実施例では、詳細に記載されていない様々なプロセス及び方法は本技術分野で周知の常法である。
【実施例】
【００３１】
以下、具体的実施例により本発明をさらに説明する。
【００３２】
実施例１  ニューロリギン−１とニューロリギン−２の運動ニューロンと感覚ニューロンシナプスの促進作用への考察
【００３３】
（１）運動ニューロンの培養：妊娠１５ｄ〜１６ｄのＳＤラットを解剖鏡下で脊髄腹側被膜、後根神経節及び血管を除去し、ラットの腹側脊髄を慎重に分離し、氷冷解剖液のシャーレに置いた。０．５ｃｍ３の大きさの組織塊にマイクロシザーズよりせん断した後、１５ｍＬの遠心管に移した。０．２５％のパンクレアチンと２００Ｕ／ｍｌのＤＮＡ酵素を加え、３７℃で３０分消化した後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加えて消化を中止し、１０００ｒ／分で５分間遠心分離し、上清を捨てた。５ｍＬの「オプティプレップ（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）」分離液を加え、３０００ｒ／分の密度勾配で１５分間遠心分離した後、遠心管内の液体を３層に分け、中間層は脊髄運動ニューロンを含む。１５ｍＬの遠心管に中間層を慎重に吸引し、３ｍＬの培地を加え、１０００ｒ／分で５分間遠心分離し、上清を捨てて細胞片を除去した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加えて細胞を再懸濁し、封止されていない６ウェルプレートに細胞懸濁液を加え、１ｈ示差接着し、未付着細胞を集めて遠心させ、「ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ」完全培地（９７％「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ」＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕＭＡＸ）を加えて細胞を再懸濁した。細胞懸濁液を１×１０５／ｍＬで予めポリリジンで被覆した２４ウェルプレートに播種した。１２ｈに液体の交換を１回し、その後３ｄごとに半分の量で液体の交換をした。
【００３４】
（２）感覚ニューロンの培養：妊娠１７ｄ〜１８ｄのＳＤラットを氷上に置き、解剖鏡下で脊柱管を切開し、脊髄を摘出し、Ｌ４−６後根神経節を慎重に摘出し、後根神経節の外膜を極力除去して、神経根を整えた。後根神経節を０．２５％パンクレアチンと０．５ｇ／Ｌコラゲナーゼ中に入れ、３７℃で３０分間消化した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加えて消化を中止し、１０００ｒ／分で５分間遠心分離し、上清を捨てた。「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ」完全培地（９７％「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ」＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕＭＡＸ）を加えて細胞を再懸濁した。細胞懸濁液を１×１０５／ｍＬで予めポリリジンで被覆した２４ウェルプレートに播種した。培養３日目に、２０ｍｇ／Ｌの５−フルオロウラシルを加えて増殖の非神経細胞を抑制し、４８ｈ保持した後に「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ」完全培地に交換し、その後３ｄごとに半分の量で液体の交換をした。
【００３５】
運動ニューロンと感覚ニューロンをそれぞれ１０ｄ体外培養した後、それぞれ２組に分け、ニューロリギン−１（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）とニューロリギン−２（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）を加えて継続して２４ｈ培養した。０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。室温で、４％のパラホルムで１０分間固定し、室温でブロッキング液により１ｈ密封し、マウス抗シナプトフィジンポリクローナル抗体（濃度が１：６００）及びウサギ抗−ＰＳＤ−９５ポリクローナル抗体（濃度が１：８００）を加えて４℃で一晩置いた（実験で第１抗体を加えない陰性対照とした）。０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄した。ＴＲＩＴＣ  ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（濃度が１：２００）、ＦＩＴＣ  ｄｏｎｋｅｙ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（濃度が１：２００）を加えて室温で２ｈインキュベートした。０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。Ｈｏｅｃｈｓｔ（５μｇ／ｍｌ）核対比染色した。マウンティングメディウムを載せた後、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＥＩＣＡ−ＳＰ２，Ｇｅｒｍａｎｙ）下で観察した。
【００３６】
免疫細胞化学染色の結果は図１に示す通りであり、図１Ａは、ニューロリギン−１（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）とニューロリギン−２（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）が、それぞれ運動ニューロンと感覚ニューロンに作用し、免疫細胞化学染色によるシナプス関連タンパク質シナプトフィジンとＰＳＤ−９５の分布及び表現状況を観察し、図１Ｂは、ニューロリギン−１とニューロリギン−が、それぞれ運動ニューロンと感覚ニューロンに作用し、シナプス前膜タンパク質シナプトフィジンとシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５のシナプス面積が全神経突起の面積に占める百分率の棒グラフである。結果が示すように、ニューロリギン−１が運動ニューロンに作用した後、シナプス前膜タンパク質シナプトフィジン（緑色）とシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５（赤色）のシナプス面積が全神経突起の面積の７５％以上を占め、ニューロリギン−１が感覚ニューロンに作用した後、シナプス前膜タンパク質シナプトフィジン（緑色）とシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５（赤色）のシナプス面積が全神経突起の面積の３３％を占めており、ニューロリギン−１が運動ニューロンのシナプス形成のみに特異的な促進作用をすることを提示した。
【００３７】
ニューロリギン−２が感覚ニューロンに作用した後、シナプス前膜タンパク質シナプトフィジン（緑色）とシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５（赤色）のシナプス面積が全神経突起の面積の６８％以上を占め、ニューロリギン−２が運動ニューロンに作用した後、シナプス前膜タンパク質シナプトフィジン（緑色）とシナプスタンパク質蛋白ＰＳＤ−９５（赤色）のシナプス面積が全神経突起の面積の２５％を占めており、ニューロリギン−２が感覚ニューロンシナプス形成のみに特異的な促進作用をすることを提示した。
【００３８】
実施例２  ニューレキシン−１βとニューロリギン−１、ニューロリギン−２の併用によるシナプス形成への促進作用の考察
【００３９】
運動ニューロンと感覚ニューロンをそれぞれ１０ｄ体外培養した後、以下のように組を分け、それぞれ運動ニューロンと感覚ニューロン培地にニューレキシン−１βとニューロリギン−１、ニューロリギン−２を加えた。
【００４０】
運動ニューロン群：
（１）ニューレキシン−１β（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）＋ニューロリギン−１（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）、
（２）ニューレキシン−１β（最終濃度１μｇ／ｍＬ）＋ニューロリギン−１（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）、
（３）ニューレキシン−１β（最終濃度１μｇ／ｍＬ）。
感覚ニューロン群：
（４）ニューレキシン−１β（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）＋ニューロリギン−２（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）、
（５）ニューレキシン−１β（最終濃度１μｇ／ｍＬ）＋ニューロリギン−２（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）、
（６）ニューレキシン−１β（最終濃度１μｇ／ｍＬ）。
【００４１】
２４ｈ継続して培養した。免疫細胞化学染色の結果は図２に示す通りであり、図２Ａは、異なる濃度のニューレキシン−１β（最終濃度１μｇ／ｍＬ）が単独作用するか、又はニューレキシン−１β（最終濃度１μｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ／ｍＬ）がそれぞれニューロリギン−１（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）及びニューロリギン−２（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）と運動ニューロン及び感覚ニューロンに共同作用し、免疫細胞化学染色によるシナプス関連タンパク質シナプトフィジンとＰＳＤ−９５の分布及び表現状況を観察し、図２Ｂは、異なる濃度のニューレキシン−１βが単独作用するか、又はそれぞれニューロリギン−１及びニューロリギン−２と運動ニューロン及び感覚ニューロンに共同作用し、シナプス前膜タンパク質シナプトフィジンとシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５のシナプス面積が全神経突起の面積に占める百分率の棒グラフである。結果が示すように、（ニューロリギン−１とニューレキシン−１β質量比が１：１の時、運動ニューロンのシナプス前膜タンパク質シナプトフィジン（緑色）とシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５（赤色）に対するシナプス面積が全神経突起の面積の３３％を占め、ニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５の時、運動ニューロンのシナプス前膜蛋白Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（緑色）とシナプス後膜蛋白ＰＳＤ−９５（赤色）に対するシナプス面積が全神経突起の面積の９０％を占める。最終濃度１μｇ／ｍＬのニューレキシン−１βは、運動ニューロンのシナプス前膜タンパク質シナプトフィジン（緑色）とシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５（赤色）に対するシナプス面積が全神経突起の面積の２６％を占める。
【００４２】
ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：１の時、感覚ニューロンのシナプス前膜タンパク質シナプトフィジン（緑色）とシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５（赤色）に対するシナプス面積が全神経突起の面積の３８％を占め、ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５の時、感覚ニューロンのシナプス前膜蛋白Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（緑色）とシナプス後膜蛋白ＰＳＤ−９５（赤色）に対するシナプス面積が全神経突起の面積の８５％を占める。最終濃度１μｇ／ｍＬのニューレキシン−１βは、感覚ニューロンのシナプス前膜タンパク質シナプトフィジン（緑色）とシナプス後膜タンパク質ＰＳＤ−９５（赤色）に対するシナプス面積が全神経突起の面積の２３％を占める。
【００４３】
結果が示すように、ニューレキシン−１βとニューロリギン−１、ニューロリギン−２を併用するとシナプス形成に促進作用を有し、特にニューロリギン−１／ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５の時、シナプス形成を促進する協同作用を最適に発揮できる。
【００４４】
実施例３  本発明に係る差異性組織工学神経の構築
【００４５】
１．ニューロリギン−１、ニューロリギン−２とニューレキシン−１βリコンビナントタンパク質含有徐放性微小球の調製
【００４６】
ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ，乳酸：エタノールのモル比が５３：４７、分子量［ＭＷ］２５ｋＤａ）。ＰＬＧＡ微小球は、水／油／水の多重エマルジョン法により調製した。１００ｍｇのＰＬＧＡを１ｍＬのジクロロメタンに溶解し、続いて３ｍＬの７％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液に乳化し、１分間超音波処理して第１段階の乳液を作製した。続いて、上記溶液を５０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液（２％のイソプロピルアルコール含有）に加え、再び３分間超音波処理により、第２段階の乳液を形成した。室温で、前記第２段階の乳液をゆっくり１晩撹拌し、残存するジクロロメタンをきれいに揮発した。１３，０００ｒｐｍ、５分、４℃の遠心沈殿によってＰＬＧＡ微小球を得た。ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄し、ｄｄＨ２Ｏを０．４ｍＬ加えて再懸濁して予備とした。
【００４７】
調製された０．４ｍＬのＰＬＧＡ微小球水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とポリエーテルイミド（ＰＥＩ，Ｍｗ１／４分子量２５ｋＤａ）をｄｄＨ２Ｏに共溶解させ、得られた溶液をＰＬＧＡ微小球溶液に異なる窒素／リン比で加え、少し渦を加えた。ＰＥＩ修飾のＰＬＧＡ微小球溶液を得て、室温で２０ｍｉｎインキュベートした。１３，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心させ、沈殿した後ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄し、０．４ｍＬのｄｄＨ２Ｏで再懸濁した。１ｍＬＰＥＩ修飾のＰＬＧＡ微小球水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ１０μＬ  ２００ｎｇ／ｍＬ−１μｇ／ｍＬのニューロリギン−１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒａｔ  ＮＬＧＮ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＮＬＧＮ１−３９９５Ｒ）、２００ｎｇ／ｍＬ−１μｇ／ｍＬ  ニューロリギン−２（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒａｔ  ＮＬＧＮ２  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＮＬＧＮ２−３９９６Ｒ）と２００ｎｇ／ｍＬ−５μｇ／ｍＬ  ニューレキシン−１β（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒａｔ  Ｎｅｕｒｅｘｉｎ−１−ｂｅｔａ，Ｃｕｓａｂｉｏ，Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｑ６３３７３）のリコンビナントタンパク質溶液と混合し、室温で９０ｍｉｎインキュベートし、それぞれニューロリギン−１、ニューロリギン−２とニューレキシン−１βリコンビナントタンパク質ＰＥＩ修飾のＰＬＧＡ徐放性微小球を形成した。
【００４８】
２．「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  ａｆｆｅｒｅｎｔ  ｎｅｒｖｅ  ｆｉｂｒｅｓ  ａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔａｇｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，１０；８（１）：１１９９０．ｄｏｉ：１０．１０３８）、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｒｖｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９，Ｊａｎ  ９；１２：１０１６．ｄｏｉ：１０．３３８９）、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌｓ」（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ  Ｌｅｔｔ．，２０１２，５２１（１）：５７〜６１）を参照して、ラットの運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞を調製した。
【００４９】
３．３Ｄバイオプリンティングによる差異性組織工学神経の構築
【００５０】
３．１．徐放性微小球含有絹フィブロイン繊維の調製
カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）蚕糸を通常に０．０５ＭのＮａ２ＣＯ３水溶液で２回沸騰させ、３０分ごとに蚕糸のセリシンを十分に除去し、脱イオン水で十分に洗浄し、室温で乾燥させた後、絹繊維ＳＦが得られ、絹繊維の直径が１０〜３０μｍで、高温高圧滅菌後に予備とした。
【００５１】
天然、無毒、相溶性良好のゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）を生物架橋剤とし、ニューロリギン−１、ニューロリギン−２とニューレキシン−１βリコンビナントタンパク質含有徐放性微小球を絹フィブロイン繊維に固定させ、ニューロリギン−１、ニューロリギン−２とニューレキシン−１βリコンビナントタンパク質含有徐放性微小球の絹フィブロイン繊維を得た（徐放性微小球の使用量を調整することで神経線維上のニューロリギン−１、ニューロリギン−２とニューレキシン−１βの比率を制御して経シナプスシグナル分子の含有量が同じな微小球を調製することができる）。但し、架橋剤のゲニピンは両官能基によって、それぞれ絹フィブロイン及びＰＬＧＡ側鎖とアミノ作用し、ＰＥＩ修飾のＰＬＧＡ徐放微小球を絹フィブロイン繊維に固定する。
【００５２】
３．２  絹フィブロイン／ゼラチン溶液をキャリアとし、運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞を複合し、３Ｄプリンティング用の機能性バイオインクを調製した。ラットの坐骨神経骨格のデジタルプリント指示をインクジェット式３Ｄバイオプリンターに出力し、機能性バイオインクで構造／微小環境の二重生体模倣の組織工学神経移植片をプリントした。
【００５３】
（１）絹フィブロイン溶液を調製する。蚕糸を８０℃の水浴で電磁撹拌してモル比がＣａＣｌ２：Ｈ２Ｏ：Ｃ２Ｈ５ＯＨ＝１：８：２の三元溶液中に完全に溶解する。絹フィブロイン溶液を４０℃のＬｉＢｒ水溶液に２ｈ溶解し、透析袋外の脱イオン水の電気伝導率が基本的に変わらなくなるまで、透析袋に置いて脱イオン水によって連続的に３ｄ透析し、質量分率が４％の絹フィブロイン溶液を得た。
【００５４】
（２）ゼラチン溶液を調製する。１５ｇのゼラチン材料を量り、撹拌しながらゆっくりと１００ｇのＨ２Ｏ中に加え、充分に膨潤した後８０℃程度に加熱して加速溶解し、３ｈ保温して均質な高分子溶液を得、高圧蒸気で滅菌した後に予備とした。
【００５５】
（３）絹／ゼラチン溶液と細胞培養液の混合液を調製する。第３代まで培養したシュワン細胞と線維芽細胞を０．２５％のトリプシンで消化した後、１５ｍＬの遠心管に収集し、１０００ｒ／分で５分間遠心分離し、上清液を捨て、体積比１：１００で細胞濃度が５×１０５〜５×１０６細胞／ｍＬの細胞培養液を絹／ゼラチン溶液に移して、運動神経由来の細胞を均一に撹拌して第１混合液Ａを形成し、感覚由来の細胞を均一に第２混合液Ｂを形成した。
【００５６】
（４）それぞれ第１混合液Ａと第２混合液Ｂをプリンターの２つの異なる注射器にセットし、プリンターの運転手順を設定する。マイクロポンプで機能性バイオインクを制御して、安定流量が１８０μｌ／ｍｉｎであり、プリンターノズルの直径が２００μｍであり、細胞が自由に通過できて詰まることがなく、過給機のパルス周波数が１５ｖであり、細胞活力に影響しない。プリンターヘッドのＸＹ軸方向の移動速度が１〜５０ｍｍ／ｓである。プリンターヘッドのＺ軸方向の移動速度が１００〜５００μｍである。プリンターヘッドのＸＹ軸方向のプリント終了後と、Ｚ軸方向のプリント開始前との時間間隔を２分内に制御した。
【００５７】
（５）シャーレの表面で細胞と絹／ゼラチン溶液の混合液を順にプリントした。環境温度が２０℃、相対湿度が６５％であり、架橋成形時間が５〜１０ｍｉｎであり、管径が１〜９ｍｍ、壁厚が０．５〜１ｍｍである。
【００５８】
（６）それぞれニューロリギン−１とニューレキシン−１β組換えタンパク質含有徐放性微小球の絹フィブロイン懸糸を３Ｄプリンティングの類似運動神経の神経上管内に固定させ、ニューロリギン−２とニューレキシン−１β組換えタンパク質含有徐放性微小球の絹フィブロイン懸糸を３Ｄプリンティングの類似感覚神経の神経上管内に固定して、Ｙ字状カテーテルを形成し、図３に示すように、組合構築により差異性組織工学神経を得た。
【００５９】
実施例４  本発明に係る差異性組織工学神経の神経損傷修復への応用
【００６０】
１．坐骨神経損傷モデルを調製する。
【００６１】
ＳＰＦクラスの雄ＳＤラットを５組にランダムに分けた（ｎ＝６）：
【００６２】
（１）運動・感覚混合群（Ｍｉｘｅｄ）、類似運動神経と類似感覚神経線維を従来の円柱形状の生物材料を骨格とする神経カテーテル内に混合し、特に類似運動神経と類似感覚神経を区別しない。ここで、類似運動神経と類似感覚神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：３であり、類似運動神経線維ニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であり、類似感覚神経線維ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５である。細胞数と因子比率はいずれも最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）と同じであるが、特に類似運動神経と類似感覚神経を区別することなく、従来のカテーテル内に混合した。
【００６３】
（２）運動・感覚特異組織工学神経群（ＴＥＮＧ）、実施例３の方法で調製されたＹ字状の骨格で類似運動神経と類似感覚神経を区別し、かつ類似運動神経と類似感覚神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：１であり、類似運動神経線維ニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であり、類似感覚神経線維ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５である。
【００６４】
（３）最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）、実施例３の方法で調製されたＹ字状の骨格で類似運動神経と類似感覚神経を区別し、かつ類似運動神経と類似感覚神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：３であり、類似運動神経線維ニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であり、類似感覚神経線維ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５である。
【００６５】
（４）単純材料群（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）は、陰性対照群である。すなわち、骨格材料の絹／ゼラチンを使用して構築された神経外のカテーテルであり、材料に混合された相応する支持細胞がなく、内部が中空であり、徐放性微小球又は細胞因子がない。
【００６６】
（５）自家移植片（Ａｕｔｏｇｒａｆｔ）は、陽性対照群である。すなわち切除した１０ｍｍの坐骨神経を、長軸を中心に元の位置で水平方向に反転させた後、断端縫合した。
【００６７】
従来の手術により、ラット坐骨神経１０ｍｍ破損モデルを調製した。
【００６８】
２．術後運動機能回復の評価
【００６９】
電気生理学による複合筋活動電位の機能検査（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ，ＣＭＡＰｓ）
【００７０】
術後１２ｗ、室温でラットに電気生理検査を行う。ラットの体重を量り、麻酔薬混合物（ラットは体重１００グラムあたり０．２〜０．３ｍＬ）を腹腔内注射し、麻酔が成功した後、坐骨神経を暴露し、ガラス分離針で坐骨神経を慎重に分離し、記録電極を腓腹筋の筋腹に刺し、干渉電極をラットの膝での皮膚表面に置き、順に刺激電極をけがした近、遠位坐骨神経幹に置き、神経を刺激し、複合筋活動電位（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ，ＣＭＡＰｓ）を記録した。ＣＭＡＰｓ振幅、潜伏期間を測定した。同じ方法で、正常側のＣＭＡＰｓ振幅と潜伏期間を記録した。ＣＭＡＰｓの神経線維が支配した標的筋の神経線維と比例している。
【００７１】
電気生理学で複合筋活動電位を検査し、結果は図４に示す通りであり、図４Ａは、各チーム坐骨神経１０ｍｍ損傷を修復した術後１２週であり、ラット腓腹筋複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を記録した代表図であり、図４Ｂは、複合筋活動電位振幅であり、各チームが陽性対照の自家移植片（Ａｕｔｏｇｒａｆｔ）に占める百分率の棒グラフである。結果が示すように最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）と陽性対照の自家移植片（Ａｕｔｏｇｒａｆｔ）に顕著な差異がなく、単純材料群（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）と運動・感覚混合群（Ｍｉｘｅｄ）より顕著に優れており、Ｐ＜０．０１であり、運動・感覚特異組織工学神経群（ＴＥＮＧ）群よりも顕著に優れていた。
【００７２】
結果が提示したのは、通常の生理状況では、運動神経線維の回復速度が感覚神経線維より明らかに速いため、臨床上によく見られる運動機能は回復、改善されたが、感覚機能の回復は遅れる現象である。最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）において、感覚神経線維のシュワン細胞と線維芽細胞の支持細胞としての比率を高めることで、類似感覚神経と類似運動神経細胞中の支持細胞の比率が３：１の時、効果が最適であることを実証した。
【００７３】
３．術後感覚機能回復の評価
【００７４】
術後１２週目に疼痛挙動の検査を行う。すべての動物挙動実験は「二重盲」の実験設計案を採用する。
【００７５】
（１）機械痛覚異常実験は、Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ電子痛覚装置（アメリカＳｔｏｅｌｔｉｎｇ社）ｕｐ−ｄｏｗｎ法で５０％の足を縮める閾値を推定する。有機透明なガラス箱を金属篩網に置き、マウスが有機ガラス箱に３０分間適応した後、フォン  フレイ（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ）繊維糸でマウスの後肢足底中部を垂直に刺激し、１〜２ｓ持続し、マウスが足を上げるか又は足を舐める行為を陽性反応と見なし、そうでない場合を陰性反応と見なす。
【００７６】
機械的疼痛の検査結果は図５Ａに示す通りで、結果は術後１２週間の機械的痛覚の検査結果を示し、自家移植片（Ａｕｔｏｇｒａｆｔ）はベースライン（ｂａｓｅ  ｌｉｎｅ，正常値は１．０に設定）辺りに近づくまで回復し、最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）と陽性対照の自家移植片（Ａｕｔｏｇｒａｆｔ）に顕著な差異がなく、単純材料群（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）と運動・感覚混合群（Ｍｉｘｅｄ）及び運動・感覚特異組織工学神経群（ＴＥＮＧ）より顕著に優れていた。結果が示すように、最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）の機械的疼痛の回復は、感覚・運動特異組織工学神経群（ＴＥＮＧ）より顕著に優れており、類似感覚神経と類似運動神経細胞中の支持細胞の比率が３：１の時、効果が最適であることを実証した。
【００７７】
（２）熱痛覚過敏の実験でマウスを底が３ｍｍの厚ガラス板の不透明な有機ガラス箱（１３ｃｍ×１４ｃｍ×９ｃｍ）中に入れ、３０分間適応させ、マウスの毛づくろいと探査活動が基本的に消えた後、ハーグスリーブ（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）法にしたがって熱輻射で刺激して、マウスの足底のガラス板密着部分を照射した。照射が開始してからマウスが足を上げるまでの時間を記録し、カット時間が２０ｓである。平均値を計算し、すなわち逃避潜伏期間（ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｌａｔｅｎｃｙ）である。
【００７８】
熱過敏性疼痛の検査結果は図５Ｂに示す通りで、結果は術後１２週間の熱過敏性痛覚の検査結果を示し、自家移植片（Ａｕｔｏｇｒａｆｔ）がベースライン（ｂａｓｅ  ｌｉｎｅ，正常値は１．０に設定）に近づくまで回復し、数値が０．８５であり、最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）の数値が０．８７であり、陽性対照の自家移植片（Ａｕｔｏｇｒａｆｔ）と顕著な差異がなく、いずれも単純材料群（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）と運動・感覚混合群（Ｍｉｘｅｄ）及び運動・感覚特異組織工学神経群（ＴＥＮＧ）より顕著に優れていた。結果が示すように、最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）の熱過敏性疼痛の回復は、運動・感覚特異組織工学神経群（ＴＥＮＧ）より顕著に優れており、類似感覚神経と類似運動神経細胞中の支持細胞の比率が３：１の時、効果が最適であることをさらに実証した。
【図１】
2021528206.tif 000002
【図２】
2021528206.tif 000003
【図３】
2021528206.tif 000004
【図４】
2021528206.tif 000005
【図５】
2021528206.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月19日(2021.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
差異性組織工学神経において、類似運動神経と類似感覚神経とを含み、
前記類似運動神経は、類似運動神経の神経上管と神経上管内の類似運動神経線維を含み、前記類似運動神経の神経上管の表面又は孔隙内に、運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞が含まれており、前記類似運動神経線維の表面又は孔隙内に、経シナプスシグナル分子ニューロリギン−１が含まれており、
前記類似感覚神経は、類似感覚神経の神経上管と神経上管内の類似感覚神経線維を含み、前記類似感覚神経の神経上管の表面又は孔隙内に、感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞が含まれており、前記類似感覚神経線維表面又は孔隙内に、経シナプスシグナル分子ニューロリギン−２が含まれていることを特徴とする、差異性組織工学神経。
【請求項２】
前記運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数の比が１：１〜５であることを特徴とする、請求項１に記載の差異性組織工学神経。
【請求項３】
前記運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数の比が１：３であることを特徴とする、請求項２に記載の差異性組織工学神経。
【請求項４】
ニューロリギン−１とニューロリギン−２との質量比が１：１であることを特徴とする、請求項１に記載の差異性組織工学神経。
【請求項５】
前記類似運動神経線維及び／又は類似感覚神経線維表面又は孔隙内に、経シナプスシグナル分子ニューレキシン−１βがさらに含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の差異性組織工学神経。
【請求項６】
前記類似運動神経線維におけるニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：０．０１〜１０であり、前記類似感覚神経線維におけるニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：０．０１〜１０であることを特徴とする、請求項５に記載の差異性組織工学神経。
【請求項７】
前記類似運動神経線維におけるニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であり、前記類似感覚神経線維におけるニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であることを特徴とする、請求項６に記載の差異性組織工学神経。
【請求項８】
前記経シナプスシグナル分子ニューロリギン−１、ニューロリギン−２及びニューレキシン−１βは、微小球内に包埋されていることを特徴とする、請求項５に記載の差異性組織工学神経。
【請求項９】
前記類似運動神経と類似感覚神経は、平坦状、Ｙ字状、樹木状、櫛歯状のうちの一種又は複数種の形状の多分岐状をなすように配置されていることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の差異性組織工学神経。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組織工学神経の末梢神経欠損修復への使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
好ましくは、前記運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：１〜５である。本発明の類似運動神経線維と類似感覚神経線維における神経細胞の再生速度の一致を保証するために、運動神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数と感覚神経由来のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：３であることがより好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の他の目的は、本発明に係る組織工学神経の末梢神経欠損修復材料の調製への使用を提供することである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
（３）絹／ゼラチン溶液と細胞培養液の混合液を調製する。第３代まで培養したシュワン細胞と線維芽細胞を０．２５％のトリプシンで消化した後、１５ｍＬの遠心管に収集し、１０００ｒ／分で５分間遠心分離し、上清液を捨て、体積比１：１００で細胞濃度が５×１０５〜５×１０６細胞／ｍＬの細胞培養液を絹／ゼラチン溶液に移して、運動神経由来の細胞を均一に撹拌して第１混合液Ａを形成し、感覚神経由来の細胞を均一に第２混合液Ｂを形成した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
（１）運動・感覚混合群（Ｍｉｘｅｄ）、類似運動神経と類似感覚神経線維を従来の円柱形状の生物材料を骨格とする神経カテーテル内に混合し、特に類似運動神経と類似感覚神経を区別しない。ここで、類似運動神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数と類似感覚神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：３であり、類似運動神経線維ニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であり、類似感覚神経線維ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５である。細胞数と因子比率はいずれも最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）と同じであるが、特に類似運動神経と類似感覚神経を区別することなく、従来のカテーテル内に混合した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（２）運動・感覚特異組織工学神経群（ＴＥＮＧ）、実施例３の方法で調製されたＹ字状の骨格で類似運動神経と類似感覚神経を区別し、かつ類似運動神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数と類似感覚神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：１であり、類似運動神経線維ニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であり、類似感覚神経線維ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
（３）最適化の運動・感覚特異組織工学神経群（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＴＥＮＧ）、実施例３の方法で調製されたＹ字状の骨格で類似運動神経と類似感覚神経を区別し、かつ類似運動神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数と類似感覚神経のシュワン細胞及び／又は線維芽細胞の数との比が１：３であり、類似運動神経線維ニューロリギン−１とニューレキシン−１βとの質量比が１：５であり、類似感覚神経線維ニューロリギン−２とニューレキシン−１βとの質量比が１：５である。
【国際調査報告】
2021528206.tif 000007
2021528206.tif 000008
2021528206.tif 000009
2021528206.tif 000010
2021528206.tif 000011
2021528206.tif 000012
2021528206.tif 000013
2021528206.tif 000014