(57)【要約】本出願は、疾患関連タンパク質に結合するステープルペプチドを、小分子デグロン例えばデグロンとしてのセレブロンまたはＶＨＬ結合小分子、またはポリペプチド配列デグロン例えばデグロンとしてのＣｏｐ１結合Ｔｒｉｂペプチドと組み合わせることによって；またはステープルペプチドデグロンを、ペプチド例えばステープルペプチド、または疾患関連タンパク質に結合する小分子と組み合わせることによってタンパク質分解誘発部分として作用するステープルペプチドデグロンキメラを記載する。本出願はまた、ステープルペプチドデグロンキメラを使用することによる内因性タンパク質の標的分解の方法であって、増殖性障害または他の状態の処置において利用し得ることによって疾患の原因、または疾患関連タンパク質が消失し、治療利益を有し得るる方法に関する。本出願はまた本出願の化合物およびその中間体を作製するための方法を提供する。
2021506814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２の部分に結合している第１の部分を含むキメラであって、
前記第１の部分が、分解の標的とされる第１のタンパク質に結合し；
前記第２の部分が、第２のタンパク質に結合し、前記第２のタンパク質がタンパク質分解誘導薬である、キメラ。
【請求項２】
前記第１の部分および第２の部分が、互いに共有結合している、請求項１に記載のキメラ。
【請求項３】
前記第１の部分および前記第２の部分が、リンカーを介して互いに結合している、請求項１に記載のキメラ。
【請求項４】
前記第１のタンパク質が、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質である、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項５】
前記分解の標的とされる第１のタンパク質が、キラータンパク質、細胞に損傷を与えるタンパク質、神経変性の原因となるタンパク質、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、ＣＣＲ５、細菌性タンパク質、またはウイルス性タンパク質である、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項６】
前記第１の部分が、前記分解の標的とされる第１のタンパク質に結合する第１のステープルペプチドを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項７】
前記第１のステープルペプチドが、Ｂｃｌ−２ホモロジー３（ＢＨ３）ドメインポリペプチドを含まない、請求項６に記載のキメラ。
【請求項８】
前記第１のステープルペプチドが、（ａ）ＭＣＬ−１由来のＢｃｌ−２ホモロジー３ドメイン、（ｂ）ＢＣＬ２ドメインのＭＣＬ−１安定化アルファヘリックス、または（ｃ）ＭＣＬ−１ＳＡＨＢＤを含まない、請求項６に記載のキメラ。
【請求項９】
前記第２の部分が、前記第１の部分のＮ末端に結合している、請求項６から８のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１０】
前記第２の部分が、前記第１の部分のＣ末端に結合している、請求項６から８のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１１】
前記第２の部分が、前記第１の部分の内部アミノ酸位置に結合している、請求項６から８のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１２】
前記第１の部分が、分解の標的とされる前記第１のタンパク質に結合する小分子を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１３】
前記第２の部分が、前記タンパク質分解誘導薬に結合するペプチドデグロンを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１４】
前記第２の部分が、前記タンパク質分解誘導薬に結合する第２のステープルペプチドを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１５】
前記第２の部分が、前記タンパク質分解誘導薬に結合する小分子を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１６】
前記第２の部分が、前記タンパク質分解誘導薬に結合する第２のステープルペプチドを含み、前記第１の部分が、前記第２の部分のＮ末端に結合している、請求項１から８のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１７】
前記第２の部分が、前記タンパク質分解誘導薬に結合する第２のステープルペプチドを含み、前記第１の部分が前記第２の部分のＣ末端に結合している、請求項１から８のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１８】
前記第２の部分が、前記タンパク質分解誘導薬に結合する第２のステープルペプチドを含み、前記第１の部分が、前記第２の部分の内部アミノ酸位置に結合している、請求項１から８のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項１９】
前記タンパク質分解誘導薬が、分解の標的とされる前記第１のタンパク質を分解する、請求項１から１８のいずれか一項に記載のキメラ。
【請求項２０】
病理学的ペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とする対象において処置する方法であって、治療有効量の請求項１から１９のいずれか一項に記載のキメラを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２１】
ステープルペプチドと、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドとを含むキメラポリペプチドであって、前記ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含み、前記改変型が、前記天然結合コンセンサス配列内に少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む、キメラポリペプチド。
【請求項２２】
Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである前記ＷＤ４０リピートタンパク質が、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択される、請求項２１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２３】
前記天然結合コンセンサス配列が、配列番号２５、３１〜４６、および６５〜１０５からなる群から選択される配列である、請求項２１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２４】
前記天然結合配列が配列番号２５である、請求項２１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２５】
前記天然結合コンセンサス配列が配列番号４６である、請求項２１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドが、少なくとも１個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２７】
前記ペプチドが、少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２８】
前記ペプチドが、少なくとも１個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２９】
前記ペプチドが、１から６個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号２５の４位（Ｖ）および５位（Ｐ）が置換されていない、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号２５の１位（Ｄ）、２位（Ｑ）、３位（Ｉ）、および６位（Ｅ）のうちの１個または複数が置換されている、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３２】
前記ペプチドが、１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号２５に記載のアミノ酸配列の７位（Ｙ）が欠失している、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３４】
前記ペプチドが、１から６個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドが、配列番号２６から３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３６】
前記ペプチドが、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３７】
前記ペプチドが、４から３０個のアミノ酸長である、請求項２４から３６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３８】
前記ペプチドが、
１ｎＭから３００ｎＭ；
１０ｎＭから３００ｎＭ；
１００ｎＭから３００ｎＭ；または
２００ｎＭから３００ｎＭ
の結合親和性でＣｏｐ１に結合する、請求項２４および２５から３７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３９】
前記ステープルペプチドが、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、または細胞表面タンパク質を標的とする、請求項２４から３８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４０】
前記ステープルペプチドが、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質を標的とする、請求項２４から３８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４１】
前記ステープルペプチドが、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または神経変性の原因となる細胞に損傷を与えるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）を標的とする、請求項２４から３８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４２】
前記ステープルペプチドが、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質を標的とする、請求項２４から２８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４３】
前記ステープルペプチドが細菌性タンパク質を標的とする、請求項２４から２８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４４】
前記ステープルペプチドがウイルス性タンパク質を標的とする、請求項２４から３８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４５】
構造的に不規則な領域を含む第１のタンパク質の改変タンパク質であって、構造的に不規則な領域が、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドを含む点で前記第１のタンパク質と異なり、前記ペプチドが、天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含み、前記改変型が、前記天然結合コンセンサス配列内に少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む、改変タンパク質。
【請求項４６】
Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである前記ＷＤ４０リピートタンパク質が、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択される、請求項４５に記載の改変タンパク質。
【請求項４７】
前記天然結合配列または前記天然結合コンセンサス配列が、配列番号２５、３１〜４６、および６５〜１０５からなる群から選択される配列である、請求項４５に記載の改変タンパク質。
【請求項４８】
前記天然結合配列が配列番号２５である、請求項４５に記載の改変タンパク質。
【請求項４９】
前記天然結合コンセンサス配列が配列番号４６である、請求項４５に記載の改変タンパク質。
【請求項５０】
前記ペプチドが、少なくとも１個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の改変タンパク質。
【請求項５１】
前記ペプチドが、少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の改変タンパク質。
【請求項５２】
前記ペプチドが、少なくとも１個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の改変タンパク質。
【請求項５３】
前記ペプチドが、１から６個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の改変タンパク質。
【請求項５４】
配列番号２５の４位（Ｖ）および５位（Ｐ）が置換されていない、請求項４８に記載の改変タンパク質。
【請求項５５】
配列番号２５の１位（Ｄ）、２位（Ｑ）、３位（Ｉ）、および６位（Ｅ）のうちの１個または複数が置換されている、請求項４８に記載の改変タンパク質。
【請求項５６】
前記ペプチドが、１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の改変タンパク質。
【請求項５７】
配列番号２５に記載のアミノ酸配列の７位（Ｙ）が欠失している、請求項４８に記載の改変タンパク質。
【請求項５８】
１から６個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のペプチド。
【請求項５９】
配列番号２６から３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載のペプチド。
【請求項６０】
配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載のペプチド。
【請求項６１】
４から１０個のアミノ酸長である、請求項４５から６０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６２】
１ｎＭから３００ｎＭ；
１０ｎＭから３００ｎＭ；
１００ｎＭから３００ｎＭ；または
２００ｎＭから３００ｎＭ
の結合親和性でＣｏｐ１に結合する、請求項４８、または５０から６１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６３】
病理学的ペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とする対象において処置する方法であって、治療有効量の請求項２１から４４のいずれか一項に記載のキメラ融合ポリペプチドを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項６４】
タンパク質を標的とするステープルペプチドおよびサリドマイドデグロン部分を含む、ペプチド小分子融合物。
【請求項６５】
前記サリドマイド部分が、前記タンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端にコンジュゲートしている、請求項６４に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項６６】
前記サリドマイド部分が、前記タンパク質を標的とするステープルペプチドのＣ末端にコンジュゲートしている、請求項６４に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項６７】
前記サリドマイド部分が、前記タンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端とＣ末端との間のペプチド配列に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる、請求項６４に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項６８】
前記ステープルペプチドが、疾患の原因となるタンパク質を標的とする、請求項６４から６７のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項６９】
前記ステープルペプチドが、細胞内タンパク質、受容体タンパク質、または細胞外タンパク質を標的とする、請求項６４から６７のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項７０】
前記ステープルペプチドが、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または神経変性（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）の原因となる細胞に損傷を与えるタンパク質を標的とする、請求項６４から６７のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項７１】
前記細胞内タンパク質、受容体タンパク質、または細胞外タンパク質が、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ｂ−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択される、請求項６９に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項７２】
前記ステープルペプチドが細菌性タンパク質を標的とする、請求項６４から６７のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項７３】
前記ステープルペプチドがウイルス性タンパク質を標的とする、請求項６４から６７のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項７４】
前記サリドマイド部分が、以下に示す構造を含む、請求項６４から７３のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【化１７】
2021506814.tif 000023
【請求項７５】
前記サリドマイド部分が、以下に示す構造を含む、請求項６４および６７から７３のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【化１８】
2021506814.tif 000024
【請求項７６】
前記サリドマイド部分が、以下に示す構造を含む、請求項６８から７３のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【化１９】
2021506814.tif 000025
【請求項７７】
病理学的ペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とする対象において処置する方法であって、治療有効量の請求項６４から７６のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項７８】
タンパク質を標的とするステープルペプチドおよびフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）デグロン部分を含む、ペプチド小分子融合物。
【請求項７９】
前記ＶＨＬデグロン部分が、前記タンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端にコンジュゲートしている、請求項７８に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項８０】
前記ＶＨＬデグロン部分が以下の構造を含む、請求項７９に記載のペプチド小分子融合物。
【化２０】
2021506814.tif 000026
【請求項８１】
前記ＶＨＬデグロン部分が、前記タンパク質を標的とするステープルペプチドのＣ末端にコンジュゲートしている、請求項７８に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項８２】
前記ＶＨＬデグロン部分が以下の構造を含む、請求項８１に記載のペプチド小分子。
【化２１】
2021506814.tif 000027
【請求項８３】
前記サリドマイド部分が、前記タンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端とＣ末端との間のペプチド配列に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる、請求項７８に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項８４】
前記ステープルペプチドが、疾患の原因となるタンパク質を標的とする、請求項７８から８３のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項８５】
前記ステープルペプチドが、細胞内タンパク質、受容体タンパク質、または細胞外タンパク質を標的とする、請求項７８から８３のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項８６】
前記ステープルペプチドが、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）、または神経変性（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）の原因となる細胞に損傷を与えるタンパク質を標的とする、請求項７８から８４のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項８７】
前記細胞内タンパク質、受容体タンパク質、または細胞外タンパク質が、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ｂ−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択される、請求項８５に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項８８】
前記ステープルペプチドが細菌性タンパク質を標的とする、請求項７８から８３のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項８９】
前記ステープルペプチドがウイルス性タンパク質を標的とする、請求項７８から８３のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物。
【請求項９０】
病理学的ペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とする対象において処置する方法であって、治療有効量の請求項７８から８９のいずれか一項に記載のペプチド小分子融合物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項９１】
構成的光形態形成１（Ｃｏｐ１）タンパク質に結合するペプチドであって、アミノ酸配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）の改変型を含み、前記改変型が、配列番号２５中に少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含むが、前記改変型が単一のアミノ酸置換からなる場合、前記アミノ酸置換は、配列番号２５の１から７位のうちのいずれか１つのＡまたはＲに対しても、配列番号２５の４位のＶに対しても行われていない、ペプチド。
【請求項９２】
少なくとも１個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項９３】
少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項９４】
少なくとも１個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項９５】
１から６個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項９６】
配列番号２５の４位（Ｖ）および／または５位（Ｐ）が置換されていない、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項９７】
配列番号２５の１位（Ｄ）、２位（Ｑ）、３位（Ｉ）、および６位（Ｅ）のうちの１個または複数が置換されている、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項９８】
１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項９９】
配列番号２５に記載のアミノ酸配列の７位（Ｙ）が欠失している、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項１００】
１から６個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項１０１】
配列番号２６から３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項１０２】
配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項９１に記載のペプチド。
【請求項１０３】
４から１０個のアミノ酸長である、請求項９１から１０２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０４】
１ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する、請求項９１から１０２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０５】
１０ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する、請求項９１から１０２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０６】
１００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する、請求項９１から１０２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０７】
２００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する、請求項９１から１０２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０８】
タンパク質を標的とするステープルペプチドおよび請求項９１から１０７のいずれか一項に記載のペプチドを含む、キメラ融合ポリペプチド。
【請求項１０９】
前記ステープルペプチドが、細胞内タンパク質または細胞表面受容体を標的とする、請求項１０８に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１１０】
前記ステープルペプチドが、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質を標的とする、請求項１０８に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１１１】
前記ステープルペプチドが、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または神経変性の原因となる細胞に損傷を与えるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）を標的とする、請求項１０８に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１１２】
前記細胞内タンパク質または細胞表面受容体が、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択される、請求項１０９に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１１３】
前記ステープルペプチドが細菌性タンパク質を標的とする、請求項１０８に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１１４】
前記ステープルペプチドがウイルス性タンパク質を標的とする、請求項１０８に記載のキメラ融合ポリペプチド。
【請求項１１５】
病理学的ペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とする対象において処置する方法であって、請求項１０８から１１４のいずれか一項に記載の治療有効量の前記キメラ融合ポリペプチドを前記対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮出願第６２／５９９，６０８号に基づく優先権を主張し、この仮出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、タンパク質を標的とする部分（ステープルペプチドまたは分子部分によって）およびタンパク質分解誘発部分（別のステープルペプチドまたは分子部分によって）の組合せとして働く、ステープルペプチドデグロンキメラと称される安定化ペプチドおよび小分子キメラ化合物に関する。キメラは、（ｉ）小分子デグロン（例えば、デグロンとしての、セレブロンまたはＶＨＬ結合小分子）、（ｉｉ）ポリペプチド配列デグロン、（ｉｉｉ）デグロンとしてのステープルペプチド、または（ｉｖ）タンパク質を標的とする化合物としての小分子（デグロンとしての役割を果たすステープルペプチドを含む）のいずれかに融合したステープルペプチドを含み、本開示は、これらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
デグロンは、その分解において主要な役割を果たすタンパク質の一部である。デグロンは、タンパク質配列のどこにでも位置することができる、通常短いアミノ酸配列である（Cho  et  al.,  Genes  &  Development,  24  (5):  438-442  (2010)；Fortmann  et  al.,  Journal  of  Molecular  Biology,  427  (17):  2748-2756  (2015)；Dohmen  et  al.,  Science,  263(5151):1273-1276  (1994)；Varshavsky,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences,  93  (22):12142-12149  (1996)）。実際、一部のタンパク質は、複数のデグロンを有する。デグロンは、原核細胞と真核細胞の両方で識別されている。いくつかのタイプのデグロンが存在するが、これらのグループ内での変異性が高いという事実にもかかわらず、デグロンは、タンパク質分解速度の調節においてこれらが関与することに関して全てが類似している。分解にはユビキチンが関与する場合があるか、または分解はユビキチン非依存性の場合がある。ユビキチン依存性であるデグロンは、同種のユビキチンＥ３リガーゼによって認識される特定の配列を含む。
【０００４】
ユビキチンプロテアソーム経路（ＵＰＰ）は、主要なレギュレータータンパク質を調節し、ミスフォールドまたは異常タンパク質を分解する主要な経路である。特定のタンパク質基質へのユビキチンの共有結合は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの作用を介して達成される。例えば、セレブロン（ＣＲＢＮ）は、損傷を受けたＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）と相互作用し、Ｃｕｌｌｉｎ４（ＣＵＬ４Ａ）とともにＥ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成し、その後、基質受容体として機能し、ＣＲＢＮによって認識されるタンパク質をユビキチン化し、プロテアソームによって分解することができるようにする。ＣＲＢＮは、サリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）と結合することも識別されている。そのような結合は、多発性骨髄腫を処置するために使用するレナリドミドなどのＩＭｉＤの催奇形性機序と、また細胞毒性と関連している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cho  et  al.,  Genes  &  Development,  24  (5):  438-442  (2010)
【非特許文献２】Fortmann  et  al.,  Journal  of  Molecular  Biology,  427  (17):  2748-2756  (2015)
【非特許文献３】Dohmen  et  al.,  Science,  263(5151):1273-1276  (1994)
【非特許文献４】Varshavsky,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences,  93  (22):12142-12149  (1996)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本開示は、目的の任意のタンパク質を標的とするために使用することができる二官能性安定化ペプチド−小分子（例えば、サリドマイドデグロン）コンジュゲート、安定化ペプチド−ペプチド（例えば、一次デグロン配列）コンジュゲート、安定化ペプチド−安定化ペプチド（例えば一次デグロン配列）コンジュゲート、および小分子−安定化ペプチド（例えば一次デグロン配列）コンジュゲート（これらのコンジュゲートは、「キメラ」とも称される）の合成および特性評価に関する。例えば、これらのコンジュゲートは、疾患に関与するまたはその原因となるタンパク質を標的とするため有用である。標的とするタンパク質は、ウイルス、細菌、動物、またはヒト起源であってもよい。ある特定の場合では、コンジュゲートは、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質を標的とするために有用である。そのような安定化ペプチドコンジュゲートは、そのような病理学的タンパク質によって引き起こされる疾患を処置するために有用である。大きくかつ通常新薬の開発につなげることができないタンパク質相互作用表面を標的とするステープルペプチドの能力は、デグロンの機能性と連動して、小分子の範囲を超えてデグロン技術の有用性を拡大し、ステープルペプチドの生物活性を強化することができる。
【０００７】
第１の態様では、本開示は、タンパク質を標的とするステープルペプチドおよび小分子デグロン部分（例えば、サリドマイド部分またはフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）部分）を含むペプチド−小分子融合物を特徴とする。
【０００８】
一部の実施形態では、小分子デグロン（例えば、サリドマイド部分またはＶＨＬ部分）は、タンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端にコンジュゲートしている。一部の場合では、小分子デグロン（例えば、サリドマイド部分またはＶＨＬ部分）は、タンパク質を標的とするステープルペプチドのＣ末端にコンジュゲートしている。ある特定の場合では、小分子デグロン（例えば、サリドマイド部分またはＶＨＬ部分）は、タンパク質を標的とするステープルペプチドのＮ末端とＣ末端との間のペプチド配列中に挿入された非天然アミノ酸内に含まれる。一部の場合では、ステープルペプチドは、疾患の原因となるタンパク質に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは細胞内タンパク質に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは細胞外タンパク質に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは細胞表面タンパク質（例えば、受容体）に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ヘモグロビン（鎌状細胞）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ｂ−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドは細菌性タンパク質に結合する。一部の場合では、ステープルペプチドはウイルス性タンパク質に結合する。ある特定の場合では、サリドマイド部分は、以下に示す構造を含む。
【化１】
2021506814.tif 000003
一部の場合では、サリドマイド部分は、安定化ペプチドのＮ末端においてコンジュゲートする場合、以下に示す構造を含む。
【化２】
2021506814.tif 000004
一部の場合では、サリドマイド部分は、安定化ペプチドのＣ末端においてコンジュゲートする場合、以下に示す構造を含む。
【化３】
2021506814.tif 000005
【０００９】
一部の場合では、ＶＨＬ部分は以下の構造を含む。
【化４】
2021506814.tif 000006
【００１０】
一部の場合では、ＶＨＬ部分は以下の構造を含む。
【化５】
2021506814.tif 000007
【００１１】
第２の態様では、本開示は、病理学的ペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とするヒト対象において処置する方法を特徴とする。方法は、本明細書において記載する治療有効量のペプチド小分子融合物をヒト対象に投与することを含む。
【００１２】
第３の態様では、本開示は、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドデグロンであって、ＷＤ４０リピートタンパク質がＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるペプチドデグロンを特徴とする。ペプチドは、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含む。改変型は、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合コンセンサス配列内に少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む。ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含む例示的なペプチドは、配列番号２６〜３０および１０６〜１１８として提供される。１つの例示の例では、本開示は、構成的光形態形成１（Ｃｏｐ１）タンパク質に結合するペプチドを提供する。ペプチドは、アミノ酸配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）の改変型を含む。改変型は、配列番号２５中に少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む。改変型が単一のアミノ酸置換からなる場合、アミノ酸置換は、配列番号２５の１から７位のうちのいずれか１つのＡまたはＲに対しても、配列番号２５の４位のＶに対しても行われていない。
【００１３】
一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、ペプチドは、１から６個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、配列番号２５の４位（Ｖ）および／または５位（Ｐ）は置換されていない。一部の場合では、配列番号２５の１位（Ｄ）、２位（Ｑ）、３位（Ｉ）、および６位（Ｅ）の１個または複数は置換されている。一部の場合では、ペプチドは、１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、配列番号２５に記載のアミノ酸配列の７位（Ｙ）は欠失している。一部の場合では、ペプチドは、１から６個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、配列番号２６から３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一例では、ペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、４から１０個のアミノ酸長である。
【００１５】
一部の場合では、ペプチドは、１ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。一部の場合では、ペプチドは、１ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。一部の場合では、ペプチドは、１０ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。一部の場合では、ペプチドは、１００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。一部の場合では、ペプチドは、２００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。一部の場合では、ペプチドは、２００ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。
【００１６】
第４の態様では、本開示は、タンパク質を標的とするステープルペプチドおよびＴｒｉｂ１ペプチドデグロンまたはそのバリアントを含むキメラ融合ポリペプチドに関する。
【００１７】
一部の実施形態では、ステープルペプチドは細胞内タンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは細胞外タンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは細胞表面タンパク質（例えば、受容体）に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは細菌性タンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドはウイルス性タンパク質に結合する。
【００１８】
第５の態様では、本開示は、ステープルペプチドと、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドとを含むキメラポリペプチドであって、ＷＤ４０リピートタンパク質がＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである、キメラポリペプチドを特徴とする。ペプチドは、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合配列または天然結合コンセンサス配列の改変型を含む。改変型は、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するアミノ酸配列の天然結合コンセンサス配列内に少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質は、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、天然結合配列または天然結合コンセンサス配列は、配列番号２５、３１〜４６、および６５〜１０５からなる群から選択される配列である。一部の場合では、天然結合コンセンサス配列は配列番号２５である。他の場合では、天然結合コンセンサス配列は配列番号４６である。
【００２１】
一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、ペプチドは、１から６個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、配列番号２５の４位（Ｖ）および／または５位（Ｐ）は置換されていない。一部の場合では、配列番号２５の１位（Ｄ）、２位（Ｑ）、３位（Ｉ）、および６位（Ｅ）のうちの１個または複数は置換されている。一部の場合では、ペプチドは、１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、配列番号２５に記載のアミノ酸配列の７位（Ｙ）は欠失している。一部の場合では、ペプチドは、１から６個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、配列番号２６から３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一例では、ペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ペプチドは４から３０個のアミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドは４から２０個のアミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドは４から１５個のアミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドは５から２０個のアミノ酸長である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、１ｎＭから３００ｎＭ；１０ｎＭから３００ｎＭ；１００ｎＭから３００ｎＭ；または２００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、１ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、２００ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。
【００２４】
一部の実施形態では、ステープルペプチドは細胞内タンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは細胞外タンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは細胞表面タンパク質（例えば、受容体）に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ（ヘモグロビン鎌状細胞）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドは細菌性タンパク質に結合する。一部の実施形態では、ステープルペプチドはウイルス性タンパク質に結合する。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、神経変性の原因となるタンパク質凝集体（例えば、ベータ−アミロイド）を標的とする。
【００２５】
第６の態様では、本開示は、構造的に不規則な領域を含む第１のタンパク質の改変タンパク質を特徴とする。改変タンパク質は、構造的に不規則な領域が、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドを含む点で第１のタンパク質と異なる。ペプチドは、天然結合コンセンサス配列の改変型を含み、改変型は、天然結合コンセンサス配列内に少なくとも１個のアミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸欠失、少なくとも１個のアミノ酸挿入、またはこれらの任意の組合せを含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質は、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択される。一部の場合では、天然結合コンセンサス配列は、配列番号２５、３１〜４６、および６５〜１０５からなる群から選択される配列である。一部の場合では、天然結合コンセンサス配列は配列番号２５である。一部の場合では、天然結合コンセンサス配列は配列番号４６である。
【００２７】
一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、ペプチドは、１から６個のアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、配列番号２５の４位（Ｖ）および／または５位（Ｐ）は置換されていない。一部の場合では、配列番号２５の１位（Ｄ）、２位（Ｑ）、３位（Ｉ）、および６位（Ｅ）のうちの１個または複数は置換されている。一部の場合では、ペプチドは、１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の場合では、配列番号２５に記載のアミノ酸配列の７位（Ｙ）は欠失している。一部の場合では、ペプチドは、１から６個のアミノ酸置換および少なくとも１個のアミノ酸欠失を有することを除いて、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ペプチドは、配列番号２６から３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一例では、ペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ペプチドは４から１０個のアミノ酸長である。
【００２９】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、１ｎＭから３００ｎＭ；１０ｎＭから３００ｎＭ；１００ｎＭから３００ｎＭ；または２００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、１ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、２００ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＣｏｐ１に結合する。
【００３０】
第７の態様では、本開示は、病理学的ペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とするヒト対象において処置する方法を特徴とする。方法は、本明細書において記載する治療有効量のキメラ融合ポリペプチドをヒト対象に投与することを含む。
【００３１】
第８の態様では、本開示は、配列番号１０６から１１８からなる群から選択されるペプチドデグロンを特徴とする。
【００３２】
一部の実施形態では、これらのペプチドは安定化ペプチドに連結している。
【００３３】
第９の態様では、本開示は、配列番号１１９から１２６からなる群から選択される安定化ペプチド−ペプチドデグロンキメラを提供する。
【００３４】
上記全ての態様のある特定の実施形態では、安定化ペプチド−デグロンキメラは、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＢＣＬＷ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＡＸ、ＭＤＭ２、またはＭＤＭＸのうちのいずれか１個または複数の分解を標的とするために使用する。
【００３５】
第１０の態様では、本開示は、第１の安定化ペプチドおよび第２の安定化ペプチドの２個の安定化ペプチドを含み、第１の安定化ペプチドが、分解されることになる標的タンパク質である第１のタンパク質に結合し、第２の安定化ペプチドが、分解誘導タンパク質（degrader  protein）である第２のタンパク質に結合する、安定化ペプチド−安定化ペプチドデグロンキメラを提供する。ある特定の実施形態では、第１の安定化ペプチドは、分解の標的である疾患に関連するタンパク質に結合し、第２の安定化ペプチドは、分解誘導タンパク質、例えばＥ３リガーゼ（例えばＭＤＭ２）に結合する。
【００３６】
一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞外タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞表面タンパク質（例えば、受容体）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ（ヘモグロビン鎌状細胞）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細菌性タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質はウイルス性タンパク質である。ある特定の場合では、第１のタンパク質は、神経変性の原因となるタンパク質凝集体（例えば、ベータ−アミロイド）である。
【００３７】
ある特定の実施形態では、第１の安定化ペプチドは、配列番号１〜２４、および１３４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。
【００３８】
ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、分解誘導タンパク質、例えばＥ３ユビキチンリガーゼ、またはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼである。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、Ｅ３リガーゼ（例えば、ＭＤＭ２）またはＥ３リガーゼと複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭ２に結合するＭＤＭＸに結合する。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＩＮＧ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｍｄｍ２−ＭｄｍＸ、ＴＲＩＭ５α、ｃ−ＣＢＬ、ｃＩＡＰ、ＲＮＦ４、ＢＩＲＣ７、ＩＤＯＬ、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１、ＲＩＮＧ１Ｂ−Ｂｍｉ１、Ｅ４Ｂ、ＣＨＩＰ、Ｐｒｐ１９）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＨＥＣＴ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｓｍｕｒｆ１、Ｓｍｕｒｆ２、Ｉｔｃｈ、Ｅ６ＡＰ）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＢＲ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｐａｒｋｉｎ、Ｐａｒｃ、ＲＮＦ１４４（Ａ／Ｂ）、ＨＯＩＰ、ＨＨＡＲＩ）である。例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例に関しては、Morreale  and  Walden,  Cell  165,  2016  DOI  http:/dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.03.003を参照されたい。
【００３９】
ある特定の実施形態では、キメラの第２の安定化ペプチド部分は、配列番号１３４に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。
【００４０】
第１１の態様では、本開示は、小分子および安定化ペプチドを含む小分子−安定化ペプチドデグロンキメラであって、小分子が、分解されることになる標的タンパク質である第１のタンパク質に結合し、安定化ペプチドが、第２のタンパク質である分解誘導タンパク質に結合する、小分子−安定化ペプチドデグロンキメラを提供する。ある特定の実施形態では、安定化ペプチドは、Ｅ３リガーゼ（例えばＭＤＭ２）のような分解誘導タンパク質、または分解誘導タンパク質複合体、例えばＭＤＭ２／ＭＤＭＸ複合体に結合し、動員する（recruit）。
【００４１】
一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞外タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞表面タンパク質（例えば、受容体）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ（ヘモグロビン鎌状細胞）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細菌性タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質はウイルス性タンパク質である。ある特定の場合では、第１のタンパク質は、タンパク質凝集体（例えば、ベータ−アミロイド）である。
【００４２】
ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、分解誘導タンパク質、例えばＥ３ユビキチンリガーゼ、またはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼである。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、Ｅ３リガーゼ（例えば、ＭＤＭ２）またはＥ３リガーゼと複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭ２に結合するＭＤＭＸに結合する。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＩＮＧ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｍｄｍ２−ＭｄｍＸ、ＴＲＩＭ５α、ｃ−ＣＢＬ、ｃＩＡＰ、ＲＮＦ４、ＢＩＲＣ７、ＩＤＯＬ、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１、ＲＩＮＧ１Ｂ−Ｂｍｉ１、Ｅ４Ｂ、ＣＨＩＰ、Ｐｒｐ１９）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＨＥＣＴ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｓｍｕｒｆ１、Ｓｍｕｒｆ２、Ｉｔｃｈ、Ｅ６ＡＰ）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＢＲ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｐａｒｋｉｎ、Ｐａｒｃ、ＲＮＦ１４４（Ａ／Ｂ）、ＨＯＩＰ、ＨＨＡＲＩ）である。例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例に関しては、Morreale  and  Walden,  Cell  165,  2016  DOI  http:/dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.03.003を参照されたい。
【００４３】
第１２の態様では、本開示は、第２の部分に結合している第１の部分を含むキメラであって、第１の部分が、分解の標的とされる第１のタンパク質に結合し、第２の部分が、第２のタンパク質に結合し、第２のタンパク質がタンパク質分解誘導薬である、キメラを提供する。
【００４４】
ある特定の態様では、第１の部分および第２の部分は、互いに共有結合している。ある特定の態様では、第１の部分および第２の部分は、リンカーを介して互いに結合している。
【００４５】
一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞外タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞表面タンパク質（例えば、受容体）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ（ヘモグロビン鎌状細胞）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細菌性タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質はウイルス性タンパク質である。ある特定の場合では、第１のタンパク質は、タンパク質凝集体（例えば、ベータ−アミロイド）である。
【００４６】
ある特定の場合では、第１の部分は、分解の標的とされる第１のタンパク質に結合する第１のステープルペプチドを含む。ある特定の場合では、第１の部分は、分解の標的とされる第１のタンパク質に結合する小分子を含む。ある特定の場合では、第２の部分は、第２のタンパク質、例えばタンパク質分解誘導薬に結合する第２のステープルペプチドを含む。ある特定の場合では、第２の部分は、第２のタンパク質、例えばタンパク質分解誘導薬に結合する小分子を含む。ある特定の場合では、第２の部分は、タンパク質分解誘導薬に結合するペプチドデグロンを含む。ある特定の場合では、第１の部分は、第１のタンパク質に結合する第１のステープルペプチドを含み、第２の部分は、第２のタンパク質に結合する第２のステープルペプチドを含む。ある特定の場合では、第１の部分は、第１のタンパク質に結合する第１のステープルペプチドを含み、第２の部分は、第２のタンパク質に結合する小分子を含む。ある特定の場合では、第１の部分は、第１のタンパク質に結合する第１のステープルペプチドを含み、第２の部分は、タンパク質分解誘導薬に結合するペプチドデグロンを含む。ある特定の場合では、第１の部分は、第１のタンパク質に結合する小分子を含み、第２の部分は、第２のタンパク質に結合するステープルペプチドを含む。
【００４７】
第１の部分がステープルペプチドである、ある特定の場合では、ステープルペプチドは、Ｂｃｌ−２ホモロジー３（ＢＨ３）ドメインポリペプチドを含まない。第１の部分がステープルペプチドである、ある特定の場合では、ステープルペプチドは、（ａ）ＭＣＬ−１由来のＢｃｌ−２ホモロジー３ドメイン、（ｂ）ＢＣＬ２ドメインのＭＣＬ−１安定化アルファヘリックス、または（ｃ）ＭＣＬ−１ＳＡＨＢＤも含まない。
【００４８】
第１の部分がステープルペプチドである、ある特定の場合では、第２の部分は、第１の部分のＮ末端に結合している。第１の部分がステープルペプチドである、ある特定の場合では、第２の部分は、第１の部分のＣ末端に結合している。第１の部分が第１のステープルペプチドである、ある特定の場合では、第２の部分は、第１の部分の内部アミノ酸位置に結合している。
【００４９】
第２の部分がステープルペプチドである、ある特定の場合では、第１の部分は、第２の部分のＮ末端に結合している。第２の部分がステープルペプチドである、ある特定の場合では、第１の部分は、第２の部分のＣ末端に結合している。第２の部分がステープルペプチドである、ある特定の場合では、第１の部分は、第２の部分の内部アミノ酸位置に結合している。
【００５０】
一部の態様では、タンパク質分解誘導薬は、分解の標的とされる第１のタンパク質を分解する。
【００５１】
第１３の態様では、本開示は、病理学的ペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる疾患または障害を、それを必要とする対象において処置する方法であって、本明細書において記載する治療有効量のキメラを対象に投与することを含む方法を提供する。
【００５２】
特に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載するものと同様のまたは同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を以下に記載する。本明細書において記載する全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本出願がコントロールすることになる。材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００５３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、代表的な一連のステープルペプチド配列に関するペプチド配列およびデグロンタイプ／位置を提供する。１列目のアミノ酸配列には、配列番号１〜２４が割り当てられている。表記されているとおり、＃＝Ｎ末端ＡｃまたはデグロンＡｈｘ；表記されているとおり、％＝Ｃ末端Ｌｙｓ（ｉｖｄｄｅ）またはＬｙｓ（デグロン）；Ｘ＝Ｓ−ペンテニルアラニン；８＝Ｒ−オクテニルアラニン；Ｂ＝ノルロイシン；＊（アミノ酸配列内の）＝シクロブチルアラニン（ｉｖｄｄｅ＝１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル）
【図２】図２は、図１に示すステープルペプチドデグロンを得るために、樹脂結合第１級アミンにカップリングされたカルボキシデグロンサリドマイド部分を示す。
【図３】図３は、ペプチドへの側鎖コンジュゲートリシン連結であるＣ末端デグロン含有部分を示す。
【図４】図４は、ペプチドへのアミノヘキサン酸連結であるＮ末端デグロン含有部分を示す。
【図５】図５は、酸またはアミンにカップリングするために使用するジアミノブタン酸（「ＤＡＢ」）の構造ならびにＴＨＡＬおよびＶＨＬリガンドに関する化学構造を示す。
【図６】図６は、さまざまなリンカー（Ｇｌｙ、βＡｌａ、およびリンカー１〜８）の構造を示す。
【図７】図７は、それによってジアミノブタン酸がステープルペプチドに組み込まれ、小分子デグロンに結合されており、さまざまな組成および長さのリンカーが導入され、小分子またはペプチドデグロン（ＴＨＡＬ、ＴＲＩＢ、またはＶＨＬ）からステープルペプチドが分離されている、一連のステープルペプチドデグロンキメラを示す。図７で図示するステープルペプチド配列は、ＩＷＩＡ％ＥＬＲＸＩＧＤＸＦＮＡＹＹＡＲＲ（配列番号１２７）、ＩＷＩＡＱＥＬＲＸＩＧＤＸＦＮ％ＹＹＡＲＲ（配列番号１２８）、ＬＴＦ８％ＹＷＡＱＬＸＳＡＡ（配列番号１２９）、ＬＴＦ８ＥＹＷＡＱＬＸ％ＡＡ（配列番号１３０）；および％ＴＦ８ＥＹＷＡＱＬＸＳＡＡ（配列番号１３１）であり、％は図で示され、８は（Ｒ）−２−（７−オクテニル）アラニンであり、Ｘは（Ｓ）−２−（４−ペンテニル）アラニンである。
【図８】図８は、競合的蛍光偏光アッセイによってモニターした場合の、組換えセレブロンへの結合を保持するための、サリドマイドデグロンに連結したステープルペプチドから構成されるステープルペプチドデグロンキメラの能力を示す。レナリドミドは、実験のための陽性対照としての役割を果たす。配列：＃ＱＬＴＡＡＲＬＫＸＬＧＤＸＬＨＱＲＴＢＷＲ％（配列番号１１）；＃ＡＥＬＥＶＥＳＡＴＱＬＲＸＦＧＤＸＬＮＦＲＱＫＬＬ％（配列番号１２）；および＃ＲＲＦＦＧＩＸＬＴＮＸＬＫＴＥＥＧＮ％（配列番号３）（ここで、Ｘは（Ｓ）−２−（４−ペンテニル）アラニンであり、＃および％は図に記載するとおりである）。「Ｎ末端Ａｃ」＝Ｎ末端アセチル化；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）＝Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル−Ｌ−リシン；「Ｌｙｓ−デグロン」＝図３で図示する構造；「Ｎ末端デグロンＡｈｘ」＝図４で図示する構造。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｉは、ステープルペプチドデグロンキメラは細胞に侵入し、ｄＢＥＴ６と競合してセレブロンと相互作用し、誘発されるＧＦＰ−ＢＲＤ４分解を阻害できることを示す。配列：＃ＲＲＦＦＧＩＸＬＴＮＸＬＫＴＥＥＧＮ％（配列番号３）；＃ＦＳＳＮＲＸＫＩＬＸＲＴＱＩＬＮＱＥＷＫＱＲＲＩＱＰＶ％（配列番号２）；＃ＮＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＬＲＸＢＳＤＸＦＶＤＳＦＫＫ％（配列番号１０）；＃ＬＳＱＥＱＬＥＨＲＥＲＳＬＸＴＬＲＸＩＱＲＢＬＦ％（配列番号５）；および＃ＮＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＬＲＸＢＤＤＸＦＶＤＳＦＫＫ％（配列番号９）（ここで、Ｘは（Ｓ）−２−（４−ペンテニル）アラニンであり、＃および％は、図に記載するとおりである）。「Ｎ末端Ａｃ」＝Ｎ末端アセチル化；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）＝Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル−Ｌ−リシン；「Ｌｙｓ−デグロン」＝図３で図示する構造；「“Ｎ末端デグロンＡｈｘ」＝図４で図示する構造。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｉは、ステープルペプチドデグロンキメラは細胞に侵入し、ｄＢＥＴ６と競合してセレブロンと相互作用し、誘発されるＧＦＰ−ＢＲＤ４分解を阻害できることを示す。配列：＃ＲＲＦＦＧＩＸＬＴＮＸＬＫＴＥＥＧＮ％（配列番号３）；＃ＦＳＳＮＲＸＫＩＬＸＲＴＱＩＬＮＱＥＷＫＱＲＲＩＱＰＶ％（配列番号２）；＃ＮＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＬＲＸＢＳＤＸＦＶＤＳＦＫＫ％（配列番号１０）；＃ＬＳＱＥＱＬＥＨＲＥＲＳＬＸＴＬＲＸＩＱＲＢＬＦ％（配列番号５）；および＃ＮＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＬＲＸＢＤＤＸＦＶＤＳＦＫＫ％（配列番号９）（ここで、Ｘは（Ｓ）−２−（４−ペンテニル）アラニンであり、＃および％は、図に記載するとおりである）。「Ｎ末端Ａｃ」＝Ｎ末端アセチル化；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）＝Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル−Ｌ−リシン；「Ｌｙｓ−デグロン」＝図３で図示する構造；「“Ｎ末端デグロンＡｈｘ」＝図４で図示する構造。
【図１０】図１０は、ＢＩＭ−Ｃ末端デグロンは、Ａ３７５Ｐ黒色腫細胞系に１０μＭの濃度で添加した場合に、ＭＣＬ−１の分解を誘発することを示す。ＢＩＭ−Ｃ末端デグロンは＃ＩＷＩＡＱＥＬＲＸＩＧＤＸＦＮＡＹＹＡＲＲ％（配列番号１３４；＃＝Ｎ末端Ａｃ；％＝Ｌｙｓ−デグロン（Ｌｙｓ−デグロンの構造に関しては図３を参照のこと））である。
【図１１】図１１は、抗ＭＤＭ２ウエスタン分析によって評価した場合、ＭＤＭ２／ＭＤＭＸを標的とするステープルペプチド（「ＡＴＳＰ」）およびサリドマイドデグロン部分から構成されるステープルペプチドデグロン（１μＭ）キメラのパネルで処置されたＳＪＳＡ−１細胞は、ＡＴＳＰ−７０４１単独で処置された細胞と比較して、がん細胞においてＭＤＭ２レベルが低いことが実証されることを示す。アクチンは負荷対照を表す。配列：ＬＴＦ８ＥＹＷＡＱＬＸ％ＡＡ（配列番号１３０）およびＬＴＦ８ＥＹＷＡＱ＃ＸＳＡＡ（配列番号６）。リンカー１、２、３、および５は図６で図示するとおりである。
【図１２】図１２は、ＳＪＳＡ−１細胞を、ＭＤＭ２／ＭＤＭＸを標的とするステープルペプチド（「ＡＴＳＰ」）、異なるリンカー、およびサリドマイドデグロンから構成されるステープルペプチドデグロンキメラのパネルで処置すると、最も強力な細胞毒性活性を示す「５−Ｌ５」（ＬＴＦ８ＥＹＷＡＱＬＸ％ＡＡ（配列番号１３０）（ここで％はＤＡＢ／リンカー５／ＴＨＡＬである）で、がん細胞の細胞生存率が可変的に低下することを示す（左）。異なるリンカーを有するある特定の組成物は、細胞活性を示さない（右）。リンカー１〜５は図５で図示するとおりである。
【図１３】図１３は、Ｔｒｉｂ１由来の配列を有するＭＤＭ２ｐ６０アイソフォームの遺伝子改変が、２９３Ｔ細胞におけるＭｙｃ標識ＭＤＭ２ｐ６０キメラ構築物の発現を使用してＣｏｐ１−介在性分解をどのようにもたらすかを示す。ＭＤＭ２内の天然ペプチド配列ＧＦＤＶＰＤ（配列番号２６）は、表記される配列（レーン３：配列番号２７；レーン４：配列番号２８；レーン５：配列番号２９；およびレーン６：配列番号３０）によって置き換えられる。天然配列を突然変異体配列ＤＱＩＶＰＤ（配列番号３０）で置き換えると、Ｃｏｐ１タンパク質によるｐ６０キメラタンパク質の破壊が生じる。下部パネル：Ｃｏｐ１負荷対照。
【図１４】図１４は、２９３Ｔ細胞からの共免疫沈降によって評価した場合の、Ｍｙｃ標識ＭＤＭ２ｐ６０突然変異体構築物のＣｏｐ１に対する結合を示す。配列：ＧＦＤＶＰＤ（配列番号２６）；ＧＦＤＡＡＤ（配列番号２７）；ＧＮＤＶＰＤ（配列番号２８）；ＰＱＴＶＰＤ（配列番号２９）；およびＤＱＩＶＰＤ（配列番号３０）。
【図１５】図１５は、標的とされるＴｒｉｂ−デグロン介在性タンパク質分解の活性を評価するために作製されたＳＡＨ＋Ｔｒｉｂペプチド配列を提供する。ステープルペプチドキメラ配列には、配列番号１１９〜１２６が割り当てられる。
【図１６】図１６は、ＴＲＩＢ配列をモデルとしたペプチドデグロンおよびアミンまたは酸にカップリングさせるためにその中に組み込まれた適切な部分の構造を示す。
【図１７】図１７は、抗ＭＤＭ２ウエスタン分析によって評価した場合、ＳＪＳＡ−１またはＳＪＳＡ−Ｘ細胞を、ＭＤＭ２／ＭＤＭＸを標的とするステープルペプチド（例えばＡＴＳＰ−７０４１様ステープルｐ５３ペプチド）およびＴＲＩＢデグロン部分から構成されるステープルペプチドデグロンキメラのパネル（２０μＭ）で処置すると、ＡＴＳＰ−７０４１単独（１μＭ）で処置されたものと比較して、がん細胞におけるＭＤＭ２レベルが明らかに可変的に減少したことを示す。アクチンは負荷対照を表す。配列：ＬＴＦ８ＥＹＷＡＱ＃ＸＳＡＡ（配列番号６）およびＬＴＦ８％ＹＷＡＱＬＸＳＡＡ（配列番号１２９）。
【図１８】図１８は、ＳＪＳＡ−１またはＳＪＳＡ−Ｘ細胞を、ＭＤＭ２／ＭＤＭＸを標的とするステープルペプチド（例えばＡＴＳＰ−７０４１様ステープルｐ５３ペプチド）およびＴＲＩＢデグロンから構成されるステープルペプチドデグロンキメラのパネルで処置すると、がん細胞の細胞生存率が可変的に低下することを示す。配列：ＬＴＦ８％ＹＷＡＱＬＸＳＡＡ（配列番号１２９）。
【図１９】図１９は、抗ＭＤＭ２ウエスタン分析によって評価した場合、ＳＪＳＡ−１またはＳＪＳＡ−Ｘ細胞を、ＭＤＭ２／ＭＤＭＸを標的とするステープルペプチド（例えばＡＴＳＰ−７０４１様ステープルｐ５３ペプチド）およびＶＨＬデグロン部分から構成されるステープルペプチドデグロンキメラのパネル（１μＭ）で処置すると、ＡＴＳＰ−７０４１単独で処置されたものと比較して、がん細胞におけるＭＤＭ２レベルが明らかに可変的に減少したことを示す。アクチンは負荷対照を表す。配列：ＬＴＦ８ＥＹＷＡＱ＃ＸＳＡＡ（配列番号６）およびＬＴＦ８ＥＹＷＡＱＬＸ％ＡＡ（配列番号１３０）。
【図２０】図２０は、ＳＪＳＡ−１またはＳＪＳＡ−Ｘ細胞を、ＭＤＭ２／ＭＤＭＸを標的とするステープルペプチド（例えばＡＴＳＰ−７０４１様ステープルｐ５３ペプチド）およびＶＨＬデグロンから構成されるステープルペプチドデグロンキメラのパネルで処置すると、がん細胞の細胞生存率が可変的に低下することを示す。配列：％ＴＦ８ＥＹＷＡＱＬＸＳＡＡ（配列番号１３１）およびＬＴＦ８ＥＹＷＡＱＬＸ％ＡＡ（配列番号１３０）。
【図２１】図２１は、１個のステープルペプチドおよびもう１個のステープルペプチドを含む例示的なステープルペプチドデグロンキメラの構造を示す。１個のステープルペプチドは、目的のタンパク質（例えば、目的の疾患に関連するタンパク質）を標的とし、もう１個のステープルペプチドは分解誘導タンパク質（例えば、ステープルペプチドＡＴＳＰ−７０４１（配列番号６、ＭＤＭ２に結合するため）に結合する。同じステープルペプチドの２個のコピーを含むステープルペプチドデグロンキメラの例も図示しており、ステープルペプチドは、分解誘導タンパク質である目的のタンパク質（例えば、目的の疾患に関連するタンパク質）を標的とし、ステープルペプチドデグロンキメラが標的タンパク質に結合した際に、タンパク質の二量化および自己分解が結果として誘発され得るようにする。図示する各例では、２個のステープルペプチドは、可変長のリンカーによって連結されている（例えば、例示的なリンカーに関しては図６を参照のこと）。左カラム（上部から下部まで）：配列番号１〜５、１３２、７〜１０、１３３、および１２。右列：配列番号１３４。
【図２２】図２２は、Ｅ１、Ｅ２、および組換えＭＤＭ２を含むユビキチン化マシナリーを、組換えＭＣＬ−１、ならびにＭＤＭ２およびＭＣＬ−１に結合するステープルペプチドデグロンキメラとインキュベートすると、ＭＤＭ２によるＭＣＬ−１（アミノ酸１〜３２７）のユビキチン化が誘発されることを示す。
【図２３】図２３は、ステープルペプチドデグロンキメラの構造を示す。ステープルペプチド（ＡＴＳＰ−７０４１（ＬＴＦ８ＥＹＷＡＱ＃ＸＳＡＡ（配列番号６））は、分解誘導タンパク質（ＭＤＭ２）に結合し、それを動員するために組み込まれ、小分子（ＪＱ１）は、疾患に関連するタンパク質（ＢＲＤ４）に結合するために含まれる。
【図２４】図２４は、Ｅ１、Ｅ２、およびＭＤＭ２を含むユビキチン化マシナリーを、組換えＢＲＤ４種（例えば、アミノ酸３４２〜４６０；アミノ酸４９〜１７０）、およびＭＤＭ２（例えば、ステープルｐ５３ペプチドＡＴＳＰ−７０４１）およびＢＲＤ４（例えば小分子ＪＱ１）に結合し、リンカーが２個のベータ−アラニンアミノ酸から構成されたステープルペプチドデグロンキメラとインキュベートすると、ＭＤＭ２による２つの異なる領域におけるＢＲＤ４のユビキチン化を誘発できることを示す。
【図２５】図２５は、Ｕ２ＯＳ細胞を、ＭＤＭ２に結合するためのステープルペプチド、および図２３で示すような２個のベータ−アラニンアミノ酸から構成されるリンカーを有し、ＢＲＤ４に結合するための小分子、例えばＪＱ１を組み込むステープルペプチドデグロンキメラで処置すると、天然ＢＲＤ４の時間依存的分解が生じることを示す。アクチンは負荷対照を表す。
【図２６】図２６の上部パネルは、ペプチド中に挿入するためのさまざまな種類のステープルを生成するために使用する、自然界には存在しない例示的なアミノ酸の化学構造を示す。図２６の中央パネルは、さまざまな長さのステープルを有するペプチドを示す。図２６の下部パネルは、ペプチド配列に沿ったステープルウォーク（staple  walk）を示す。
【図２７】図２７は、さまざまな種類のダブルおよびトリプルステープル化戦略、ならびにステープルペプチドを生成するための例示的なステープルウォークの代表的なものを示す概略図である。
【図２８】図２８は、ステープルペプチドを生成するためのさまざまな長さの分岐状ダブルステープル部分を使用した例示的なステープルウォークを示す概略図である。
【図２９】図２９は、ステープルペプチドを生成するために用いる例示的な化学変更を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
詳細な説明
本開示は、疾患に関連するタンパク質を標的とする安定化ペプチドを、例として「デグロン」としてもしくはより一般的には代替の小分子デグロンとして、セレブロン結合小分子サリドマイドと、または安定化ポリペプチド配列「デグロン」を含むポリペプチド配列「デグロン」と組み合わせることによって、タンパク質分解を誘発する部分として作用する安定化ペプチドデグロンキメラを特徴とする。安定化ペプチドデグロンキメラは、分解誘導タンパク質と結合し、それを動員する安定化ペプチドを、疾患に関連するタンパク質を標的とするために組み込まれる小分子またはペプチドと組み合わせることも含む。以前は小分子にアクセスできなかった、広範囲の細胞内タンパク質を効果的に標的とするための安定化ペプチドの能力を、結合タンパク質を分解する分解誘導薬タンパク質を動員できる小分子またはペプチドデグロン部分と組み合わせることによって、または分解誘導タンパク質と効果的に結合し、それを動員する安定化ペプチドを、疾患に関連するタンパク質を標的とする小分子またはペプチドと組み合わせることによって、この新規のクラスのステープルペプチドデグロンキメラは、ステープルペプチドの生物活性の潜在力および広がりが拡大する。本開示はまた、ステープルペプチドデグロンキメラを使用することによって内因性タンパク質の標的とされる分解を行うための方法であって、疾患に関連するタンパク質の存在によって引き起こされる障害（例えば、増殖性障害）の処置において利用することができる方法に関する。本出願はまた、本出願の化合物およびその中間体を作製するための方法を提供する。
【００５６】
安定化ペプチド
ペプチドヘリックスは、多くの重要な生物学的プロセス（例えば、アポトーシス）を調節する鍵となるタンパク質−タンパク質相互作用の重要なメディエーターであるが、そのようなヘリックスが、タンパク質の範囲内でその背景を無視して解釈され、単離して調製された場合、それは折りたたまれず、ランダムコイルコンフォメーションをとる場合があり、生物活性において劇的な減少につながり、したがって治療的潜在力が低下する。この問題を回避するために、構造的に安定化したペプチドを用いることができる。一部の場合では、構造的に安定化したペプチドは、内部（分子内）架橋（またはステープル）によって接合した少なくとも２個の改変アミノ酸を含む。本明細書において記載する安定化ペプチドは、ステープルペプチド、ステッチペプチド、複数のステッチを含むペプチド、複数のステープルを含むペプチド、またはステープルおよびステッチのミックスを含むペプチド、ならびに他の化学的戦略によって構造的に強化されたペプチドを含む（例えば、Balaram  P.  Cur.  Opin.  Struct.  Biol.  1992;2:845；Kemp  DS,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  1996;118:4240；Orner  BP,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2001;123:5382；Chin  JW,  et  al.,  Int.  Ed.  2001;40:3806；Chapman  RN,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2004;126:12252；Horne  WS,  et  al.,  Chem.,  Int.  Ed.  2008;47:2853；Madden  et  al.,  Chem  Commun  (Camb).  2009  Oct  7;  (37):  5588-5590；Lau  et  al.,  Chem.  Soc.  Rev.,  2015,44:91-102；および  Gunnoo  et  al.,  Org.  Biomol.  Chem.,  2016,14:8002-8013を参照されたく、これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５７】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ペプチドをステープル化することによって安定化することができる（例えば、Walensky,  J.  Med.  Chem.,  57:6275-6288  (2014)を参照されたく、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ペプチドは、その天然二次構造を維持する点で「安定化」されている。例えば、ステープル化は、α−ヘリックス二次構造を有する傾向があるポリペプチドが、その天然α−ヘリックスコンフォメーションを維持することを可能にする。この二次構造は、タンパク質の分解的切断および熱に対するポリペプチドの抵抗性を増加させ、標的への結合親和性、疎水性、および細胞透過性も増加させる場合がある。したがって、本明細書において記載するステープル（架橋）ポリペプチドは、対応する非ステープル（非架橋）ポリペプチドと比較して改善された生物活性を有する。
【００５８】
「ペプチドのステープル化」は、合成方法論から作り出された用語であり、ポリペプチド鎖に存在する２個のオレフィン含有側鎖（例えば、架橋可能な側鎖）が、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有接合し（例えば、「一緒にステープル化され」）、架橋環を形成している（例えば、Blackwell  et  al.,  J.  Org.  Chem.,  66:  5291-5302,  2001；Angew  et  al.,  Chem.  Int.  Ed.  37:3281,  1994を参照のこと）。「ペプチドのステープル化」という用語は、本明細書で使用される場合、そのような反応を促進し、単一の「ステープル」ポリペプチドを提供する任意の数の反応条件および／または触媒を使用した、ポリペプチド鎖に存在する場合がある２個の（例えば、少なくとも一対の）二重結合含有側鎖、三重結合含有側鎖、または二重結合含有および三重結合含有側鎖の接合を含む。「マルチプライ（multiply）ステープル」ポリペプチドという用語は、１個を超える個々のステープルを含み、２個、３個、またはそれを超えるさまざまな間隔の独立したステープルを含んでいてもよいポリペプチドを指す。さらに「ペプチドのステッチ化」という用語は、本明細書で使用される場合、２個のステープルが、例えば共通の残基に連結している「ステッチ」（例えば、直列のまたはマルチプライステープル）ポリペプチドを提供する、単一のポリペプチド鎖における複数のかつ直列の「ステープル化」事象を指す。ペプチドのステッチ化は、例えば、ＷＯ２００８／１２１７６７およびＷＯ２０１０／０６８６８４で開示されており、これら両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の場合では、ステープルは、本明細書で使用される場合、不飽和結合を保持することができるかまたは減少させることができる。
【００５９】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、炭化水素のステープル化によって安定化することができる。ある特定の場合では、ステープルペプチドは、少なくとも２個（例えば、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は、２個、３個、または６個のアミノ酸で隔てられ、置換されたアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である。多数の公知の非天然のまたは自然界には存在しないアミノ酸が存在し、これらのうちのいずれかは、ステープルペプチドに含まれる場合がある。自然界には存在しないアミノ酸の一部の例は、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ−アミノ酪酸、ベータ−シアノアラニン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−２−フェニル−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、４−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、４−ピペリジル酢酸、４−アミノ−ｌ−メチルピロール−２−カルボン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２−アミノヘプタン二酸、４−（アミノメチル）安息香酸、４−アミノ安息香酸、オルト−、メタ−およびパラ−置換フェニルアラニン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５；−ＣＦ３；−ＣＮ；−ハロ；−ＮＯ２；ＣＨ３で置換された）、二置換フェニルアラニン、置換チロシン（例えば、−Ｃ＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５；−ＣＦ３；−ＣＮ；−ハロ；−ＮＯ２；ＣＨ３でさらに置換された）、ならびにスタチンである。さらに、アミノ酸は、ヒドロキシル化、リン酸化、スルホン化、アシル化、またはグリコシル化されたアミノ酸残基を含むように誘導体化することができる。
【００６０】
炭化水素ステープルポリペプチドは、２個の非天然アミノ酸間に１個または複数のテザー（連結）を含み、このテザーは、ポリペプチドのα−ヘリックス二次構造を顕著に強化する。一般的に、テザーは、１つまたは２つの螺旋ターン（すなわち、約３．４または約７個のアミノ酸）の長さにわたって伸長する。したがって、ｉおよびｉ＋３個目；ｉおよびｉ＋４個目；またはｉおよびｉ＋７個目に位置するアミノ酸は、化学的修飾および架橋に関して理想的な候補である。したがって、例えば、ペプチドが、配列．．．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有する場合、Ｘ１とＸ４との間、またはＸ１とＸ５との間、またはＸ１とＸ８との間の架橋がそのペプチドの有用な炭化水素のステープル化形態であり、Ｘ２とＸ５との間、またはＸ２とＸ６との間、またはＸ２とＸ９との間などの架橋も同様である。複数の架橋（例えば、２、３、４個、またはそれを超える）の使用も検討される。複数の架橋の使用は、ペプチドの安定化および最適化において非常に効果的であり、特にペプチド長の増加を伴う。したがって、本開示は、配列をさらに安定化させるためか、またはより長いポリペプチド伸長の構造安定化、タンパク質分解抵抗性、酸安定性、熱安定性、細胞透過性、および／または生物活性の強化を促進するために、ポリペプチド配列内に１個を超える架橋の組込みを包含する。炭化水素ステープルポリペプチドの作製および使用に関する追加の説明は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１７２２８５号、同第２０１０／０２８６０５７号、および同第２００５／０２５０６８０号で見出すことができ、これら全ての内容は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋３個目の残基にある場合、Ｒ−プロペニルアラニンおよびＳ−ペンテニルアラニン；またはＲ−ペンテニルアラニンおよびＳ−ペンテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋４個目の残基にある場合、Ｓ−ペンテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、ステープルが、ｉおよびｉ＋７個目の残基にある場合、Ｓ−ペンテニルアラニンおよびＲ−オクテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。一部の場合では、ペプチドがステッチ化されている場合、「ステッチ」に関与するペプチドのアミノ酸は、ビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−ペンテニルアラニン、およびＲ−オクテニルアラニン；またはビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−オクテニルアラニン、およびＲ−オクテニルアラニンで置換されている。
【００６２】
ステープルまたはステッチ位置は、ステープルウォークにおいてさまざまなステープル位置を試験することによって変更することができる。
【００６３】
図２６（上部）は、さまざまな架橋化合物を生成するために使用することができる非天然アミノ酸の例示的な化学構造を示す。図２６（中央）は、ｉ位残基とｉ＋３位残基との間；ｉ位残基とｉ＋４位残基との間；およびｉ位残基とｉ＋７位残基との間に炭化水素架橋を有するペプチドを示す。図２６（下部）は、ペプチド配列に沿ったステープルウォークを示す。図２７は、ダブルおよびトリプルステープル化戦略を含むさまざまなペプチド配列、ならびに例示的なステープルウォークを示す。図２８は、さまざまな長さの分岐状ステッチ部分を使用した例示的なステープルウォークを示す。
【００６４】
一態様では、安定化ポリペプチドは式（Ｉ）
【化６】
2021506814.tif 000008
（式中、
各Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４］ｎであり；これらはそれぞれ０〜６個のＲ５で置換されており；
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、または放射性同位体であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６であるか、または
【化７】
2021506814.tif 000009
であり、
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、または治療剤であり；
ｎは１〜４の整数であり；
ｘは２〜１０の整数であり；
各ｙは、独立して、０〜１００の整数であり；
ｚは、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数であり；
各Ｘａａは、独立してアミノ酸である）を有する。
【００６５】
テザーは、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分（例えば、Ｃ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルキル、Ｃ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルケニル、またはＣ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルキニル）を含んでいてもよい。テザーされたアミノ酸は、アルファ二置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ３またはメチル）とすることができる。
【００６６】
一部の場合では、ｘは２、３、または６である。一部の場合では、各ｙは、独立して、１から１５または３から１５の整数である。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはメチルである。例えば、Ｒ１およびＲ２は、両方ともメチルとすることができる。一部の場合では、Ｒ３はアルキル（例えば、Ｃ８アルキル）であり、ｘは３である。一部の場合では、Ｒ３はＣ１１アルキルであり、ｘは６である。一部の場合では、Ｒ３はアルケニル（例えば、Ｃ８アルケニル）であり、ｘは３である。一部の場合では、ｘは６であり、Ｒ３はＣ１１アルケニルである。一部の場合では、Ｒ３は、直鎖状アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一部の場合では、Ｒ３は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００６７】
別の態様では、２個のアルファ、アルファ二置換立体中心は、両方ともＲ立体配置もしくはＳ立体配置（例えば、ｉ、ｉ＋４個目の架橋）であるか、または一方の立体中心はＲであり、もう一方はＳ（例えば、ｉ、ｉ＋７個目の架橋）である。したがって、式Ｉ
【化８】
2021506814.tif 000010
として図示する場合、例えば、ｘが３のとき、Ｃ’およびＣ”二置換立体中心は、両方ともＲ立体配置とすることができるか、または両方ともＳ立体配置とすることができる。ｘが６である場合、Ｃ’二置換立体中心はＲ立体配置であり、Ｃ”二置換立体中心はＳ立体配置である。Ｒ３二重結合は、ＥまたはＺ立体化学配置とすることができる。
【００６８】
一部の場合では、Ｒ３は、［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４］ｎであり；Ｒ４は、直鎖状アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。
【００６９】
一部の実施形態では、本開示は、２個、３個、または６個のアミノ酸で隔てられた２個のアミノ酸の側鎖が内部ステープルで置き換えられた；３個のアミノ酸の側鎖が内部ステッチで置き換えられた；４個のアミノ酸の側鎖が２個の内部ステープルで置き換えられた、または５個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルおよび内部ステッチの組合せで置き換えられた、内部架橋された（「ステープル化された」または「ステッチ化された」）ペプチドを特徴とする。ステープル化された／ステッチ化されたペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のアミノ酸長とすることができる。
【００７０】
ある特定の場合では、安定化ペプチドは、細胞内タンパク質のペプチドである。ある特定の場合では、安定化ペプチドは、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質のペプチドである。ある特定の場合では、安定化ペプチドは、細菌性タンパク質のペプチドである。ある特定の場合では、安定化ペプチドは、ヒトタンパク質のペプチドである。ある特定の場合では、安定化ペプチドは、発がんタンパク質のペプチドである。発がんタンパク質の非限定的な例としては、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５がある。
【００７１】
ステープルペプチドの非限定的な例を以下に挙げる：
【化９−１】
2021506814.tif 000011
【化９−２】
2021506814.tif 000012
（ここで、８＝Ｒ−オクテニルアラニン；Ｂ＝ノルロイシン；＃＝シクロブチルアラニン；Ｘ＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、一部の場合では、Ｘ１およびＸ２は同じ（例えば、Ｓ−ペネテニルアラニンである）。
【００７２】
ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号１から２４および１３４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなる。ある特定の実施形態では、本開示は、ステープル／ステッチの位置が異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の実施形態では、本開示は、これらのペプチドのアルファ−ヘリックスの非相互作用面上に１から７（例えば、１、２、３、４、５、６、７）個のアミノ酸置換を有する上記で開示した配列とは異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の場合では、置換は保守的である。他の場合では、置換は非保守的である。ある特定の実施形態では、本開示は、これらのペプチドのアルファ−ヘリックスの相互作用面上に１から５（例えば、１、２、３、４、５）個のアミノ酸置換を有する上記で開示した配列とは異なる点で、上記で開示されるペプチドとは異なる安定化ペプチドを特徴とする。ある特定の場合では、置換は保守的である。ステープルペプチドに対する例示的な変形／改変のタイプを図２９に示す。
【００７３】
ある特定の実施形態では、ステープルペプチドは、Ｂｃｌ−２ホモロジー３（ＢＨ３）ドメインポリペプチドではない（例えば、ＭＣＬ−１由来のＢＨ３ドメインでもなく、ＢＣＬ２ドメインのＭＣＬ−１安定化アルファヘリックス（ＳＡＨＢ）でもなく、ＭＣＬ−１ＳＡＨＢＤでもない）。
【００７４】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチド（例えば、ステープルペプチド）は、分解誘導タンパク質、例えばユビキチンＥ３リガーゼＭＤＭ２に直接的に結合し、それを動員させる。例えば、Ｅ３リガーゼＭＤＭ２は、当技術分野において公知のステープルｐ５３ペプチドによって強力に結合することができ、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の場合では、ペプチドデグロンは、分解誘導タンパク質、例えばＭＤＭＸとユビキチンＥ３リガーゼＭＤＭ２との間の複合体を含む複合体に直接的に結合し、それを動員させる安定化またはステープルペプチドである。本例では、ステープルｐ５３ペプチドはＭＤＭＸに強力に結合し、ＭＤＭＸ／ＭＤＭ２複合体を動員することができ、ＭＤＭ２が分解誘導タンパク質を動員できるようになる。
【００７５】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチドは、分解誘導タンパク質、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターに直接的にまたは間接的に結合する。ある特定の実施形態では、安定化ペプチドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに直接的にまたは間接的に結合する。一部の実施形態では、安定化ペプチドは、Ｅ３リガーゼ（例えば、ＭＤＭ２）またはＥ３リガーゼと複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭ２に結合するＭＤＭＸに、直接的にまたは間接的に結合する。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＩＮＧ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｍｄｍ２−ＭｄｍＸ、ＴＲＩＭ５α、ｃ−ＣＢＬ、ｃＩＡＰ、ＲＮＦ４、ＢＩＲＣ７、ＩＤＯＬ、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１、ＲＩＮＧ１Ｂ−Ｂｍｉ１、Ｅ４Ｂ、ＣＨＩＰ、Ｐｒｐ１９）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＨＥＣＴ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｓｍｕｒｆ１、Ｓｍｕｒｆ２、Ｉｔｃｈ、Ｅ６ＡＰ）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＢＲ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｐａｒｋｉｎ、Ｐａｒｃ、ＲＮＦ１４４（Ａ／Ｂ）、ＨＯＩＰ、ＨＨＡＲＩ）である。例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例に関しては、Morreale  and  Walden,  Cell  165,  2016  DOI  http:/dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.03.003を参照されたい。
【００７６】
本明細書において記載するキメラ融合物において用いることができる他の安定化ペプチドの非限定的な例は、米国特許第９，８３４，５８１号；同第９，８２２，１６５号；同第９，６９５，２２４号；同第９，６１７，３０９号；同第９，５７９，３９５号；同第９，５５６，２２９号；同第９，５５６，２２７号；同第９，５２７，８９６号；同第９，５２２，９４７号；同第９，５１７，２５２号；同第９，５０５，８１６号；同第９，５０５，８０４号；同第９，５０５，８０１号；同第９，４９３，５１０号；同第９，４６４，１２５号；同第９，４８５，２０２号；同第９，４５８，１８９号；同第９，４１６，１６２号；同第９，４０８，８８５号；同第９，３４６，８６８号；同第９，２９６，８０５号；同第９，２２７，９９５号；同第９，１７５，０４７号；同第９，１７５，０４５号；同第９，１６３，３３０号；同第９，０９６，６８４号；同第９，０７９，９７０号；同第８，９５７，０２６号；同第８，９３７，１５４号；同第８，９３３，１０９号；同第８，９２７，５００号；同第８，８８９，６３２号；同第８，５９２，３７７号；同第８，５８６，７０７号；同第８，３２４，１５３号；および米国特許出願公開第２０１７０２４７４２３号；同第２０１７０２４０６０４号；同第２０１７０２１２１２５号；同第２０１７０１６５３２０号；同第２０１７００６６７４７号；同第２０１７００１５７１６号；同第２０１６０３７６３３６号；および同第２０１６０２４４４９４号において提供され、これら全ての内容はその全体が参照により本明細書（特に安定化（例えば、ステープルまたはステッチ）ペプチドの開示）に組み込まれる。
【００７７】
炭化水素テザーは一般的であるが、他のテザーも本明細書において記載する安定化ペプチドにおいて用いることができる。例えば、テザーは、１個または複数のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、またはアミド、またはトリアゾール部分を含んでいてもよい。一部の場合では、天然に存在するアミノ酸側鎖を、テザー中に組み込むことができる。例えば、テザーは、官能基、例えばセリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リシン中の第１級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸中の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミン中のアミドとカップリングすることができる。したがって、２個の天然に存在しないアミノ酸をカップリングすることによって作製されるテザーを使用するのではなく、天然に存在するアミノ酸を使用してテザーを生成することが可能である。天然に存在するアミノ酸とともに単一の天然に存在しないアミノ酸を使用することも可能である。トリアゾール含有（例えば、１，４トリアゾールまたは１，５トリアゾール）架橋を使用することができる（例えば、Kawamoto  et  al.  2012  Journal  of  Medicinal  Chemistry  55:1137；ＷＯ２０１０／０６０１１２を参照のこと）。更に、異なるタイプのステープル化を行う他の方法は当技術分野において周知であり、それを用いることができる（例えば、ラクタムステープル化：Shepherd  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  127:2974-2983  (2005)；ＵＶ付加環化ステープル化：Madden  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.,  21:1472-1475  (2011)；ジスルフィドステープル化：Jackson  et  al.,  Am.  Chem.  Soc.,113:9391-9392  (1991)；オキシムステープル化：Haney  et  al.,  Chem.  Commun.,  47:10915-10917  (2011)；チオエーテルステープル化：Brunel  and  Dawson,  Chem.  Commun.,  552-2554  (2005)；光スイッチ（Photoswitchable）ステープル化：J.  R.  Kumita  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.,  97:3803-3808  (2000)；ダブルクリックステープル化：Lau  et  al.,  Chem.  Sci.,  5:1804-1809  (2014)；ビス−ラクタムステープル化：J.  C.  Phelan  et  al.,,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  119:455-460  (1997)；およびビス−アリール化ステープル化：A.  M.  Spokoyny  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  135:5946-5949  (2013)を参照のこと）。
【００７８】
テザーの長さが変わる場合がある点が更に想定される。例えば、二次性アルファ−ヘリックス構造に対して比較的高度の拘束を与えることが望ましい場合、長さが短いテザーを使用することができるが、一部の場合では、二次性アルファ−ヘリックス構造に対して拘束は低いことが望ましく、したがって長いテザーが望まれる場合がある。
【００７９】
さらに、主にアルファヘリックスの片面上にあるテザーを与えるために、アミノ酸ｉからｉ＋３個目、ｉからｉ＋４個目、およびｉからｉ＋７個目までのテザー全長は共通であるが、テザーは、アミノ酸の数の任意の組合せに及ぶように合成することができ、複数のテザーを導入するように組み合わせて使用することもできる。
【００８０】
一部の場合では、本明細書において記載する炭化水素テザー（すなわち、架橋）は、更に操作することができる。一例では、（例えば、ルテニウム触媒による閉環メタセシス（ＲＣＭ）を使用して合成されるような）炭化水素アルケニルテザーの二重結合を酸化し、（例えば、エポキシ化、アミノヒドロキシル化またはジヒドロキシル化を介して）、以下の化合物のうちの１つを提供することができる。
【化１０】
2021506814.tif 000013
【００８１】
エポキシド部分か、または遊離ヒドロキシル部分のうちの１つのいずれかは、さらに官能基化することができる。例えば、エポキシドは、例えば、治療剤に結合するために使用することができる追加の官能性を与える求核試薬で処置することができる。あるいはそのような誘導体化は、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端の合成操作によってまたはアミノ酸側鎖を介して達成することができる。他の薬剤、例えばポリペプチドが細胞中に侵入するのを促進する薬剤を、官能基化テザーに結合させることができる。
【００８２】
一部の場合では、アルファ二置換アミノ酸は、アルファヘリックス二次構造の安定性を改善するためにポリペプチドにおいて使用する。しかし、アルファ二置換アミノ酸は必須ではなく、（例えば、テザーされたアミノ酸において）モノ−アルファ置換基を使用した場合も想定される。
【００８３】
ステープルポリペプチドは、薬物、毒素、ポリエチレングリコール誘導体；第２のポリペプチド；炭水化物などを含んでいてもよい。ポリマーまたは他の薬剤がステープルポリペプチドに連結している場合、組成物は実質的に均質であることが望ましい場合がある。
【００８４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子が付加すると、ポリペプチドの薬物動態および薬力学特性が改善される場合がある。例えば、ＰＥＧ化を行うと、腎クリアランスを低下させることができ、より安定な血漿濃度をもたらす場合がある。ＰＥＧは水溶性ポリマーであり、
式：ＸＯ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
（式中、ｎは２から１０，０００であり、Ｘは、Ｈまたは末端改変、例えばＣ１〜４アルキルであり；Ｙは、ポリペプチドのアミン基（これらに限定されないが、リシンのイプシロンアミン、またはＮ末端を含む）への、アミド、カルバメートまたは尿素連結である）としてポリペプチドへ連結しているとして表すことができる。Ｙはまた、チオール基（これらに限定されないがシステインのチオール基を含む）へのマレイミド連結であってもよい。ＰＥＧをポリペプチドに直接的にまたは間接的に連結するための他の方法は、当業者であれば公知である。ＰＥＧは、直鎖状または分岐状とすることができる。さまざまな官能基化誘導体を含むＰＥＧのさまざまな形態が市販されている。
【００８５】
分解可能な連結を骨格において有するＰＥＧを使用することができる。例えば、ＰＥＧは、加水分解するための対象であるエステル連結を用いて調製することができる。分解可能なＰＥＧ連結を有するコンジュゲートは、ＷＯ９９／３４８３３、ＷＯ９９／１４２５９、およびＵ．Ｓ．６，３４８，５５８に記載されている。
【００８６】
ある特定の実施形態では、高分子ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、中間体リンカーを介して本明細書において記載する薬剤に結合している。ある特定の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１から２０個のアミノ酸で構成されており（made  up  of）、アミノ酸は、２０種類の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のうちの一部は、当業者であれば十分に理解しているようにグリコシル化されていてもよい。他の実施形態では、１から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。他の実施形態では、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のない大部分のアミノ酸で構成されている。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、アルキルリンカー、例えば−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝２〜２０）を使用することができる。これらのアルキルリンカーは、任意の立体障害のない基、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等でさらに置換されていてもよい。米国特許第５，４４６，０９０号では、二官能性ＰＥＧリンカー、および各ＰＥＧリンカー末端でペプチドを有するコンジュゲートの形成におけるその使用が記載されている。
【００８７】
一部の実施形態では、安定化ペプチドも、例えば、細胞取込みをさらに促進するために、またはｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増加させるために改変してもよい。例えば、ペプチド模倣大員環をアシル化またはＰＥＧ化すると、細胞取込みが促進され、バイオアベイラビリティが増加し、血液循環が増加し、薬物動態が変化し、免疫原性が減少しおよび／または必要とされる投与頻度が減少する。
【００８８】
一部の実施形態では、本明細書において開示されるステープルペプチドは、（例えば、非ステープルペプチドと比較して）細胞膜を貫通するための強化された能力を有する。
【００８９】
本明細書において記載する安定化ペプチドを合成する方法は当技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用する場合がある。さまざまなステップを、代替の配列または順序で行い、所望の化合物を得てもよいことは理解されるであろう。本明細書において記載する化合物の合成において有用である合成化学的変換および官能基を保護する方法論（保護および脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えば、R.  Larock,  Comprehensive  Organic  Transformations,  VCH  Publishers  (1989)；T.W.  Greene  and  P.G.M.  Wuts,  Protective  Groups  in  Organic  Synthesis,  3d.  Ed.,  John  Wiley  and  Sons  (1999)；L.  Fieser  and  M.  Fieser,  Fieser  and  Fieser's  Reagents  for  Organic  Synthesis,  John  Wiley  and  Sons  (1994)；およびL.  Paquette,  ed.,  Encyclopedia  of  Reagents  for  Organic  Synthesis,  John  Wiley  and  Sons  (1995)、ならびにこれらのその後の版に記載されているものを含む。
【００９０】
安定化ペプチドは、当業者であれば周知の化学的合成方法によって作製することができる。例えば、Fields  et  al.,  Chapter  3  in  Synthetic  Peptides:  A  User's  Guide,  ed.  Grant,  W.  H.  Freeman  &  Co.,  New  York,  N.Y.,  1992,  p.  77を参照されたい。したがって、ペプチドは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａまたは４３１において、側鎖が保護されたアミノ酸を使用してｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学作用で保護されたα−ＮＨ２を用いた固相合成の自動化Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を使用して合成することができる。
【００９１】
本明細書において記載するペプチドを作製する一様式は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用することである。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子を用い、酸に不安定な結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合させる。この樹脂は、合成のために使用する溶媒に不溶性であり、過剰な試薬および副生成物を洗い流すのを比較的単純にかつ迅速にする。Ｎ末端は、酸において安定なＦｍｏｃ基で保護されるが、塩基によって取り外し可能である。任意の側鎖官能基は、塩基で安定であり、酸に不安定な基で保護される。
【００９２】
長いペプチドは、ネイティブケミカルライゲーションを使用して個々の合成ペプチドを連接させることによって作製してもよい。あるいは、長い合成ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。そのような技術は、詳細なプロトコール含む周知の標準的なマニュアルとして提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳し、好ましくは遺伝子が発現される生物に最適なコドンを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的には必要に応じてペプチドおよび任意の調節性エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製する。合成遺伝子を、好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞中にトランスフェクトする。次いで、ペプチドを、選択された発現系および宿主に適切な好適な状態下で発現させる。ペプチドは精製し、標準的な方法によって特徴付ける。
【００９３】
ペプチドは、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈから入手可能なハイスループットマルチチャンネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用したハイスループット組合せ様式で作製することができる。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を高めるために、レトロインベルソ結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメチレン結合（Ｓ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランス−オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換トランス−オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ）またはＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である）；およびフルオロケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ３である）で置き換えることができる。
【００９４】
ポリペプチドは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によってさらに改変することができる。上記で示すように、ペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０直鎖状または分岐状アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびこれらの組合せにコンジュゲートすることができる。さまざまな長さのオレフィン側鎖を含むα、α−二置換非天然アミノ酸は、公知の方法で合成することができる（Williams  et  al.  J.  Am.  Chem.  Soc.,  113:9276,  1991；Schafmeister  et  al.,  J.  Am.  Chem  Soc.,  122:5891,  2000；およびBird  et  al.,  Methods  Enzymol.,  446:369,  2008；Bird  et  al,  Current  Protocols  in  Chemical  Biology,  2011）。ペプチドに関しては、ｉ＋７個目のステープルに連結したｉ個目を使用する（ヘリックス２回転が安定化される）場合、ａ）１個のＳ５アミノ酸および１個のＲ８を使用するか、またはｂ）１個のＳ８アミノ酸および１個のＲ５アミノ酸を使用する。Ｒ８は、出発キラル助剤がＲ−アルキル−立体異性体をもたらすことを除いて、同様の経路を使用して合成する。また、８−ヨードオクテンを５−ヨードペンテンの代わりに使用する。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂上での固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して固体支持体上で合成する（例えば、ＷＯ２０１０／１４８３３５を参照のこと）。
【００９５】
Ｆｍｏｃ−保護されたα−アミノ酸（オレフィンアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｓ５−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓ８−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｒ５−ＯＨ以外）、２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、およびＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡは、例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびピペリジンは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。オレフィンアミノ酸合成は、当技術分野において報告されている（Williams  et  al.,  Org.  Synth.,  80:31,  2003）。
【００９６】
本明細書において開示されるステープル化され、精製されたペプチドを得る（例えば、合成する）のに好適な方法もやはり、当技術分野において公知である（例えば、Bird  et.  al.,  Methods  in  Enzymol.,  446:369-386  (2008)；Bird  et  al,  Current  Protocols  in  Chemical  Biology,  2011；Walensky  et  al.,  Science,  305:1466-1470  (2004)；Schafmeister  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  122:5891-5892  (2000)；２０１０年３月１８日に出願された米国特許出願公開第１２／５２５，１２３号；および２０１０年５月２５日に登録された米国特許第７，７２３，４６８号を参照されたく、これらそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９７】
一部の実施形態では、ペプチドは、非ステープルペプチド混入物質を実質的に含まないか、または単離されている。ペプチドを精製するための方法としては、例えば、固相支持体上でのペプチド合成がある。環化後、固相支持体は、単離し、溶媒溶液、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物中に懸濁してもよい。ＤＭＳＯ／ジクロロメタンまたはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、約３０％、４０％、５０％または６０％のＤＭＳＯを含んでいてもよい。特定の実施形態では、５０％／５０％ＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液を使用する。溶液は、１、６、１２または２４時間インキュベートしてもよく、その後、樹脂は、例えばジクロロメタンまたはＮＭＰで洗浄してもよい。一実施形態では、樹脂はＮＭＰで洗浄する。振盪および溶液中への不活性ガスのバブリングを行ってもよい。
【００９８】
本発明の安定化（例えば、ステープル）ポリペプチドの特性は、例えば、以下に記載する方法を使用してアッセイすることができる。
【００９９】
α−らせん度を判定するためのアッセイ：化合物を、水溶液中に（例えばｐＨ７の５ｍＭリン酸カリウム溶液または蒸留Ｈ２Ｏ中で２５〜５０μＭの濃度に）溶解する。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０、Ａｖｉｖ）で標準的な測定パラメーター（例えば温度、２０℃；波長、１９０〜２６０ｎｍ；ステップ分解、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；アキュムレーション（accumulations）、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；光路長、０．１ｃｍ）を使用して得る。各ペプチドのα−ヘリックス含有量は、残基平均楕円率を、モデルヘリックスのデカペプチドに関する報告値で除算することによって算出する（Yang  et  al.,  Methods  Enzymol.  130:208  (1986)）。
【０１００】
融解温度（Ｔｍ）を判定するためのアッセイ：架橋または非改変の鋳型ペプチドを、蒸留Ｈ２Ｏまたは他の緩衝液または溶媒中に（例えば、５０μＭの最終濃度で）溶解し、Ｔｍを、温度範囲（例えば４から９５℃）にわたる楕円率における変化を標準的なパラメーター（例えば波長２２２ｎｍ；ステップ分解、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；アキュムレーション、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；温度上昇速度：１℃／分；光路長、０．１ｃｍ）を使用した分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０、Ａｖｉｖ）で測定することによって判定する。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼ抵抗性アッセイ
ペプチド骨格のアミド結合は、プロテアーゼによる加水分解に対する影響を受けやすく、その結果、ペプチド化合物はｉｎ  ｖｉｖｏでの急速な分解に対して脆弱になる。しかし、典型的には、ペプチドヘリックスが形成されると、アミド骨格が埋まり、および／またはねじれ、および／または遮蔽され、その結果、タンパク質の分解的切断が阻止されるかまたは実質的に遅れる。本発明のペプチド模倣大員環は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素タンパク質（例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン）分解を行い、分解速度における任意の変化に関して匹敵する非架橋またはその代わりとなるステープルポリペプチドと比較して評価してもよい。例えば、ペプチド模倣大員環および匹敵する非架橋ポリペプチドは、トリプシンアガロースとインキュベートし、遠心分離によってさまざまな時点において反応をクエンチし、その後、ＨＰＬＣ注入し、２８０ｎｍにおける紫外線吸収によって残留基質を定量化する。簡潔には、ペプチド模倣大員環およびペプチド模倣前駆体（５ｍｃｇ）をトリプシンアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｓ／Ｅ〜１２５）と０、１０、２０、９０、および１８０分間インキュベートする。反応を卓上遠心分離によって高速でクエンチし、単離された上澄み中の残りの基質を、ＨＰＬＣをベースとした２８０ｎｍにおけるピーク検出によって定量化する。タンパク質分解反応は一次反応を示し、速度定数ｋは時間に対するｌｎ［Ｓ］のプロットから判定される。
【０１０２】
ペプチド模倣大員環および／または匹敵する非架橋ポリペプチドは、新鮮なマウス、ラットおよび／またはヒト血清（例えば１〜２ｍＬ）と、３７℃で、例えば、０、１、２、４、８、および２４時間それぞれインキュベートしてもよい。異なる濃度の大員環試料は、血清を用いた連続希釈によって調製してもよい。完全なままの化合物のレベルを判定するために、以下の手順を使用してもよい：例えば、２ｍｌの遠心分離管に血清１００μＬを移すことによって試料を抽出し、続いて５０％ギ酸１０μＬおよびアセトニトリル５００μＬを添加し、１４，０００ＲＰＭ、４＋／−２℃で１０分間遠心分離する。次いで上澄みを新鮮な２ｍｌの管に移し、Ｎ２下、１０ｐｓｉ未満、３７℃のＴｕｒｂｏｖａｐで蒸発させる。試料を、５０：５０アセトニトリル：水の１００μＬ中で再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行う。ｅｘ  ｖｉｖｏ安定性を試験するための同様のまたは類似の手順は公知であり、血清中の大員環の安定性を判定するために使用してもよい。
【０１０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏプロテアーゼ抵抗性アッセイ：鍵となるペプチドをステープル化する利点は、プロテアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抵抗性が、ｉｎ  ｖｉｖｏで明らかに改善された薬物動態へ変換されることである。
【０１０４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ：ペプチド模倣大員環およびペプチド模倣薬前駆体のアクセプタータンパク質に対する結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を使用することができる。ＦＰＡ技術によって、偏光および蛍光トレーサーを使用した分子配向および移動性が測定される。偏光で励起された場合、見かけの分子量が大きい分子（例えば、大きいタンパク質に結合するＦＩＴＣ標識ペプチド）に結合している蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）は、小さい分子（例えば、溶液中で遊離しているＦＩＴＣ−標識ペプチド）結合している蛍光トレーサーと比較してその回転速度が低いために、高レベルの偏光蛍光を放出する。
【０１０５】
細胞分析
培養細胞（例えば、がん細胞）を、ステープルペプチド−デグロンキメラで処置し、標的とするタンパク質レベルをウエスタン分析によって経時的にモニターする。キメラペプチドの標的とならない陰性対照タンパク質を、標的とされる分解特異性の実証として同様にモニターする。特異的標的に応じて、アポトーシス誘導などの表現型の結果は、生存率、アネキシンＶ結合、カスパーゼ３／７活性化、およびミトコンドリアシトクロムｃ放出アッセイの組合せによって評価する。
【０１０６】
ペプチドデグロン
本開示は、ユビキチンＥ３リガーゼに対する基質アダプターであるタンパク質に結合するペプチドデグロンを特徴とする。一部の場合では、デグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ−４０タンパク質に結合する。デグロンは、浅い溝にあるユビキチンＥ３リガーゼの基質認識ドメインに結合し、Ｎ−またはＣ末端のいずれかにおける同化（すなわち、ステープルペプチド配列のコンジュゲート）に対して耐性がある。ユビキチンＥ３リガーゼに対する例示的な基質アダプターとしては、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、およびＦＺＲ１がある。Ｅ３リガーゼを含むＷＤ４０は、Ｅ３リガーゼの大半を含むが、そのようなＥ３リガーゼの基質アダプターであるタンパク質に結合する他のタイプのＥ３リガーゼおよびデグロンが存在し、これらも本開示に包含される。
【０１０７】
ある特定の場合では、ペプチドデグロンは、Ｔｒｉｂ１タンパク質配列：ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）またはそのバリアントに基づく。
【表１】
2021506814.tif 000014
【０１０８】
本開示のデグロンとしては、配列番号２５のバリアントがあり、バリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換；１個または複数の欠失（例えば、１、２、３個）；１個または複数の挿入（例えば、１、２、３個）；またはこれらの任意の２つまたはそれを超える組合せを含む。一部の場合では、配列番号２５のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）の置換を有する。ある特定の場合では、これらの置換のうちの１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７個）は、配列番号２５の１から６位のうちのいずれにおいてもＡ、Ｒに対するものではない。ある特定の場合では、これらの置換は、Ｉに対する配列番号２５における４位でのＶの置換を含まない。一部の場合では、配列番号２５のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３個）の欠失を有する。一部の場合では、配列番号２５のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３個）の挿入を有する。一部の場合では、配列番号２５のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）の置換および１個または複数（例えば、１、２、３個）の欠失を有する。一部の場合では、配列番号２５のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）の置換および１個または複数の挿入（例えば、１、２、３個）を有する。一部の場合では、配列番号２５のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３個）の欠失および１個または複数（例えば、１、２、３個）の挿入を有する。一部の場合では、配列番号２５のバリアントは、配列番号２５内に１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、２個、または１個のアミノ酸置換を有する。ある特定の場合では、配列番号２５の４位（Ｖ）および／または５位（Ｐ）は置換されていない。一部の場合では、配列番号２５の１位（Ｄ）、２位（Ｑ）、３位（Ｉ）、および６位（Ｅ）のうちの１個または複数が置換されている。一部の実施形態では、ペプチドデグロンは、１から７位のうちのいずれか１つがアラニンで置換されていないことを除いて、配列番号２５を含む。一部の実施形態では、ペプチドデグロンは、１から７位のうちのいずれか１つがアルギニンで置換されていないことを除いて、配列番号２５を含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドデグロンは、４位がイソロイシンで置換されていないことを除いて、配列番号２５を含む。一部の場合では、配列番号２５のバリアントは、１個の欠失を有する。欠失は、配列番号２５のＣ末端またはＮ末端にあってもよい。
【０１０９】
一部の場合では、ペプチドデグロンは、Ｆ−ボックス／ＷＤリピート含有タンパク質７（F-box/WD  repeat-containing  protein  7）（ＦＢＸＷ７）タンパク質に結合するペプチドである。一実施形態では、ペプチドデグロンは、アミノ酸配列ホスホ−Ｓｅｒ／ホスホ−ＴｈｒＰＸＸＥ／ホスホ−Ｓｅｒ／ホスホ−Ｔｈｒ（ｐＳ／ｐＴ−Ｐ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｅ／ｐＳ／ｐＴ）（配列番号４６）を含む（ここで、ＸａおよびＸｂは、独立して任意のアミノ酸である）。一部の場合ではＸａ＝Ｐである。一部の場合では、Ｘｂ＝Ｖ、Ｌ、またはＱである。他の場合では、Ｘａ＝ＰおよびＸｂ＝Ｖ、Ｌ、またはＱである。ある特定の実施形態では、ペプチドデグロンは配列番号４６のバリアントである。そのようなバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４個）のアミノ酸置換；１個または複数の欠失（例えば、１、２、３個）；１個または複数の挿入（例えば、１、２、３個）；またはこれらの任意の２つまたはそれを超える組合せを有する点で、配列番号４６とは異なるペプチドを含む。一部の場合では、配列番号４６のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４個）の置換を有する。一部の場合では、配列番号４６のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３個）の欠失を有する。一部の場合では、配列番号４６のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３個）の挿入を有する。一部の場合では、配列番号４６のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４個）の置換および１個または複数（例えば、１、２、３個）の欠失を有する。一部の場合では、配列番号４６のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４個）の置換および１個または複数の挿入（例えば、１、２、３個）を有する。一部の場合では、配列番号４６のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３個）の欠失および１個または複数（例えば、１、２、３個）の挿入を有する。一部の場合では、配列番号４６のバリアントは、配列番号４６内に１から５個、１から４個、１から３個、２個、または１個のアミノ酸置換を有する。ある特定の場合では、２位（Ｐ）は置換されていない。ある特定の場合では、１位はｐＳであり、２位はＰである。ある特定の場合では、１位はｐＳであり、２位はＰであり、５位はＥである。ある特定の場合では、１位はｐＳであり、２位はＰであり、５位はｐＳである。ある特定の場合では、１位はｐＳであり、２位はＰであり、５位はｐＴである。ある特定の場合では、１位はｐＴであり、２位はＰであり、５位はＥである。ある特定の場合では、１位はｐＴであり、２位はＰであり、５位はｐＳである。ある特定の場合では、１位はｐＴであり、２位はＰであり、５位はｐＴである。
【０１１０】
ある特定の場合では、ペプチドデグロンは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列に基づいている。一部の場合ではペプチドデグロンは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列のバリアント（例えば、置換、欠失、または挿入バリアント）である。Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドの天然結合コンセンサス配列の非限定的な例を以下に示す（配列には、上から下へ、配列番号６５から９２が割り当てられている）
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１１１】
†モチーフパターンは以下の命名法を使用する：「．」は任意のアミノ酸タイプを指定し、「［Ｘ］」はその位置において許可されるアミノ酸タイプ（複数可）を指定し、パターンの最初における「＾Ｘ」は、配列がアミノ酸タイプＸで開始することを指定し、「［＾Ｘ］」は、その位置がタイプＸ以外のアミノ酸を有することができることを示し、次のように指定される数「Ｘ｛ｘ，ｙ｝」のｘおよびｙは、その位置において必要な「Ｘ」アミノ酸タイプの最小および最大数を指定する。「＄」記号は、タンパク質鎖のＣ末端を示す。翻訳後に改変（例えば、リン酸化およびプロリンヒドロキシル化）されることが公知である第１級デグロン内の保存残基の位置を太字で示す。
【０１１２】
当技術分野において公知の任意の他のペプチドデグロンも本発明において用いることができる。例えば、Meszaros  et  al.,  Sci.  Signal.,  10(470):eaak9982  (2017)；Guharoy  et  al.,  Nature  Communications,  7:10239,  doi:10.1038/ncomms10239  (2016)；米国特許第９，７８３，５７５号；同第９，２９７，０１７号；および同第９，１１５，１８４号を参照されたく、これら全ては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
ある特定の場合では、ペプチドデグロンは、以下に挙げられるペプチドまたはそのバリアントのアミノ酸配列を有する：
ＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３１）−Ｅ３リガーゼ：ＭＤＭ２；
ＳＶＥＱＴＰＫＫ（配列番号３２）−Ｅ３リガーゼ：ＳＫＰ２−ＣＫＳ１；
ＤＳＧＩＨＳ（配列番号３２）−Ｅ３リガーゼ：β−ＴｒＣＰ１；
ＬＬＰＴＰＰＬＳ（配列番号３３）−Ｅ３リガーゼ：ＦＢＸＷ７；
ＡＳＳＳＳ（配列番号３４）−Ｅ３リガーゼ：ＳＰＯＰ；
ＬＡＰＡＡＧＤＴＩＩＳＬＤＦ（配列番号３５）−Ｅ３リガーゼ：ＶＨＬ；
ＰＦＬＴＰＳＰＥ（配列番号３６）−Ｅ３リガーゼ：ＦＢＸＷ７；
ＰＰＰＹ（配列番号３７）−Ｅ３リガーゼ：ＩＴＣＨ；
ＤＥＥＴＧＥ（配列番号３８）−Ｅ３リガーゼ：ＫＥＡＰ１；
ＱＤＩＤＬＧＶ（配列番号３９）−Ｅ３リガーゼ：ＫＥＡＰ１；
ＬＬＱＰＮＮＹＱＦＣ（配列番号４０）−Ｅ３リガーゼ：ＣＢＬ；
ＤＹＲ−Ｅ３リガーゼ：ＣＢＬ；
ＲＡＶＥＮＱＹＳＦＹ（配列番号４１）−Ｅ３リガーゼ：ＣＢＬ；
ＱＫＥＮＳ（配列番号４２）−Ｅ３リガーゼ：ＣＤＨ１；
ＦＤＩＹＭＤ（配列番号４３）−Ｅ３リガーゼ：ＣＤＣ２０／ＣＤＨ１；
ＰＲＴＡＬＧＤＩＧ（配列番号４４）−Ｅ３リガーゼ：ＣＤＣ２０／ＣＤＨ１；
ＤＫＥＮＧ（配列番号４５）−Ｅ３リガーゼ：ＰＴＴＧ１；
ＨＲＫＨＬＱＥＩＰ（配列番号９３）−Ｅ３リガーゼ：ＡＰＣ／Ｃ；
ＳＫＥＮＶ（配列番号９４）−Ｅ３リガーゼ：ＡＰＣ／Ｃ；
ＴＲＩＲ（配列番号９５）−Ｅ３リガーゼ：ＡＰＣ／Ｃ；
ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号９６）−Ｅ３リガーゼ：ＣＯＰ１；
ＴＳＭＴＤＦＹＨＳＫＲＲＬ（配列番号９７）−Ｅ３リガーゼ：ＤＣＡＦ２；
ＳＰＥＴＧＥ（配列番号９８）−Ｅ３リガーゼ：ＫＥＡＰ１；
ＥＰＥＥＰＥＡＤＱＨ（配列番号９９）−Ｅ３リガーゼ：ＫＬＨＬ３；
ＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号１００）−Ｅ３リガーゼ：ＶＨＬ；
ＬＴＰＰＱＳ（配列番号１０１）−Ｅ３リガーゼ：ＦＢＸＷ７；
ＳＶＥＱＴＰＲＫ（配列番号１０２）−Ｅ３リガーゼ：ＳＫＰ２／ＣＫＳ１；
ＤＳＧＮＹＳ（配列番号１０３）−Ｅ３リガーゼ：ベータ−ＴｒＣＰ１；
ＫＰＡＡＶＶＡＰＩ（配列番号１０４）−Ｅ３リガーゼ：Ｓｉａｈ；または
ＡＤＳＳＴ（配列番号１０５）−Ｅ３リガーゼ：ＳＰＯＰ
【０１１４】
上記ペプチド（すなわち、配列番号３１〜４５および９３〜１０５）のバリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換；１個または複数の欠失（例えば、１、２、３）；１個または複数の挿入（例えば、１、２、３個）；またはこれらの任意の２つまたはそれを超える組合せを有するペプチドを含む。適切なＥ３リガーゼと相互作用するバリアントが選択される。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、その適切なＥ３リガーゼと１ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、適切なＥ３リガーゼと１０ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、適切なＥ３リガーゼと５０ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、適切なＥ３リガーゼと１００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、適切なＥ３リガーゼと２００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、２００ｎＭから２５０ｎＭの結合親和性で適切なＥ３リガーゼと結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、適切なＥ３リガーゼと１ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、適切なＥ３リガーゼと２００ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性で結合する。
【０１１５】
非限定的な例示的バリアントを以下に示す：
ＦＢＸＷ７  Ｅ３リガーゼに関しては：ＬＴＰＰＡＳ（配列番号１０６）、ＬＴＰＰＳＳ（配列番号１０７）、ＬＳＰＰＰＳ（配列番号１０８）、ＬＳＰＰＡＳ（配列番号１０９）、ＬＳＰＰＬＳ（配列番号１１０）；
β−ＴｒＣＰ１  Ｅ３リガーゼに関しては：ＤＳＧＩＩＳ（配列番号１１１）、ＤＳＧＮＹＴ（配列番号１１２）、ＤＳＧＩＤＴ（配列番号１１３）、ＤＳＧＩＥＴ（配列番号１１４）、ＤＳＧＶＤＴＳ（配列番号１１５）；および
ＤＣＡＦ２  Ｅ３リガーゼに関しては：ＴＳＭＴＤＦＹＨＳＫＲＲＩ（配列番号１１６）、ＴＳＭＴＤＦＹＨＳＫＲＫＬ（配列番号１１７）、ＴＳＭＴＤＦＹＨＳＫＲＲＳ（配列番号１１８）
【０１１６】
ある特定の場合では、ペプチドデグロンは、４から２０個のアミノ酸長（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個）である。
【０１１７】
ある特定の場合では、ペプチドデグロンは、配列番号２６から３０のうちのいずれか１つに記載のペプチドのアミノ酸配列を有する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、配列番号２６から３０のうちのいずれか１つに記載のペプチドのバリアントであるアミノ酸配列を有する。ある特定の場合では、ペプチドデグロンは、配列番号３１から４５のうちのいずれか１つに記載のペプチドのアミノ酸配列を有する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、配列番号３１から４５のうちのいずれか１つに記載のペプチドのバリアントであるアミノ酸配列を有する。ある特定の場合では、ペプチドデグロンは、配列番号６５から１１８のうちのいずれか１つに記載のペプチドのアミノ酸配列を有する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、配列番号６５から１１８のうちのいずれか１つに記載のペプチドのバリアントであるアミノ酸配列を有する。バリアントは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換；１個または複数の欠失（例えば、１、２、３）；１個または複数の挿入（例えば、１、２、３個）；またはこれらの任意の２つまたはそれを超える組合せを有するペプチドデグロンを含む。
【０１１８】
上述のペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対するその適切な基質アダプターに結合する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対する基質アダプターに、１ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対する基質アダプターに、１０ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対する基質アダプターに、５０ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対する基質アダプターに、１００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対する基質アダプターに、２００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対する基質アダプターに、２００ｎＭから２５０ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対する基質アダプターに、１ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性で結合する。一部の場合では、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼ（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に対する基質アダプターに、２００ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性で結合する。
【０１１９】
本開示は、タンパク質デグロンを選択する方法も特徴とする。そのような選択されたタンパク質デグロンを、本開示のキメラ構築物において用いることができる。方法は、ユビキチンＥ３リガーゼに対する基質アダプターを、天然に存在するペプチドデグロンのバリアントと接触させ、所望の親和性を有する基質アダプターに結合するデグロンを選択することを伴う。例えば、方法は、Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターであるＷＤ４０リピートタンパク質を、ＷＤ４０リピートタンパク質（例えば、Ｃｏｐ１、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８）に結合する天然結合コンセンサス配列のアミノ酸配列のバリアントと接触させ、ＷＤ４０リピートタンパク質に結合するペプチドを選択することを含む。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、１ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、１０ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、５０ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、１００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、２００ｎＭから３００ｎＭの結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、２００ｎＭから２５０ｎＭの結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、１ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、２００ｎＭから１０００ｎＭの結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、１ｎＭ未満（例えば、約０．０１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．５ｎＭ）の結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。一部の場合では、選択されるペプチドデグロンは、３００ｎＭを超える（例えば、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、約１０００ｎＭの）結合親和性でＷＤ４０リピートタンパク質に結合する。
【０１２０】
ある特定の場合では、分解の標的となることが望まれるタンパク質は、直接的に改変される。タンパク質は、構造的に不規則な領域を含む領域に関して検討される。構造的に不規則な領域は、ＩＵＰｒｅｄ：ｉｕｐｒｅｄ．ｅｎｚｉｍ．ｈｕによって算出され、０．４未満またはそれに等しい障害スコアを有するものである。タンパク質は、上述のペプチドデグロン配列またはそのバリアントを含むように、構造的に不規則な領域において改変される。一部の場合では、構造的に不規則な領域は、タンパク質のＮまたはＣ末端にある。一部の場合では構造的に不規則な領域は、タンパク質のＮ末端とＣ末端との間である。ペプチドデグロン配列は、構造的に不規則な領域へ挿入することができる。他のケースでは、ペプチドデグロン配列は、タンパク質の構造的に不規則な領域においてアミノ酸配列を置き換えるように置換する。そのような置換は、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９改変によって作製することができる。
【０１２１】
小分子デグロン
本開示は、本明細書において記載するキメラにおいて利用することができる小分子デグロンを特徴とする。一実施形態では、デグロンは、以下に示す構造を有するサリドマイドに基づいている。
【化１１】
2021506814.tif 000017
【０１２２】
ある特定の場合では、小分子デグロンが安定化ペプチドのＮ末端においてコンジュゲートしている場合、以下に示す構造を有する。
【化１２】
2021506814.tif 000018
【０１２３】
ある特定の場合では、小分子デグロンが安定化ペプチドのＣ末端においてコンジュゲートしている場合、以下に示す構造を有する。
【化１３】
2021506814.tif 000019
【０１２４】
ある特定の場合では、本明細書において用いる小分子デグロンは、フォンヒッペルリンダウ（「ＶＨＬ」）タンパク質に結合し、以下に示す（酸残基へのカップリングに適合する）構造を有するリガンドに基づいている。
【化１４】
2021506814.tif 000020
【０１２５】
ある特定の場合では、小分子ＶＨＬデグロンがアミンにコンジュゲートする場合、以下に示すカルボキシレートアナログを用いる。
【化１５】
2021506814.tif 000021
【０１２６】
当技術分野において公知の任意の小分子デグロンは、本明細書において記載するキメラにおいて用いることができる。ある特定の場合では、本明細書において用いる小分子デグロンは、米国特許第９，６９４，０８４号；同第９，７５０，８１６号；同第９，７７０，５１２号；同第９，８２１，０６８号；同第９，７８３，５７５号；同第９，７６５，０１９号；同第９，６３２，０８９号；および同第９，５００，６５３号に記載の任意のデグロンであり、これら全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
安定化ペプチドおよびデグロンのキメラ
本開示は、デグロン（例えば、小分子デグロン、一次配列デグロン、および安定化（例えば、ステープル）ペプチドデグロン）を含む安定化ペプチドの（例えば、ステープル、ステッチ）キメラを提供する。以前は小分子にアクセスできなかったそのようなキメラは、小分子（例えば、セレブロン結合分子）、または結合タンパク質の標的とされる分解が可能な他の小分子またはペプチドデグロン部分とともに、広範囲のタンパク質を効果的に標的とすることができる。同様に、分解誘導タンパク質に結合し、動員することができる安定化ペプチドデグロンは、広範囲のタンパク質に結合し、疾患に関連するタンパク質を分解する小分子と組み合わせることができる。ステープルペプチドデグロンキメラのこれらの新規のクラスは、ステープルペプチドの生物活性の潜在力および広がりを拡大する。１個を超える（例えば、２、３、４個、またはそれを超える）安定化ペプチドおよび１個のデグロン（例えば、１個の小分子デグロン、１個の一次配列デグロン、または１個の安定化（例えば、ステープル）ペプチドデグロン）を含むキメラも本明細書において包含する。１個を超える（例えば、２、３、４個、またはそれを超える）デグロン（例えば、１個を超える小分子デグロン、１個を超える一次配列デグロン、または１個を超える安定化（例えば、ステープル）ペプチドデグロン）および１個の安定化ペプチドを含むキメラも本明細書において包含する。１個を超える（例えば、２、３、４個、またはそれを超える）安定化ペプチドおよび１個を超える（例えば、２、３、４個、またはそれを超える）デグロン（例えば、１個を超える小分子デグロン、１個を超える一次配列デグロン、または１個を超える安定化（例えば、ステープル）ペプチドデグロン）を含むキメラも本明細書において包含する。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、キメラのステープルペプチドは、Ｂｃｌ−２ホモロジー３（ＢＨ３）ドメインポリペプチドではない（例えば、ＭＣＬ−１由来のＢＨ３ドメインでもなく、ＢＣＬ２ドメインのＭＣＬ−１安定化アルファヘリックス（ＳＡＨＢ）でもなく、ＭＣＬ−１ＳＡＨＢＤでもない）。
【０１２９】
安定化ペプチド−ペプチドデグロンキメラ
安定化ペプチド−ペプチドデグロンキメラを本明細書において提供する。これらのキメラは、安定化ペプチドおよびペプチドデグロンから構成され、安定化ペプチドは、分解の標的とされるタンパク質である第１のタンパク質に結合し、ペプチドデグロンは、ユビキチンＥ３リガーゼに対する基質アダプターである第２のタンパク質に直接的にまたは間接的に結合する。したがって、ある特定の実施形態では、上述の安定化（例えば、ステープル、ステッチ）ペプチドは、上述のペプチドデグロンに連結している。例示的なキメラを、図７、１５、１７、および１８に示す。
【０１３０】
安定化ペプチドは、目的の任意のリンカー（例えば、ペプチドリンカー、合成化合物リンカー）によってデグロンに連結していてもよい。ペプチドデグロンを安定化ペプチドに連結し、本明細書において記載するキメラを形成するために使用することができるリンカーの非限定的な例を以下に記載し、サブセットを図６で図示する。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号１〜２４および１３４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。一部の実施形態では、ペプチドデグロンは、配列番号２５〜４６、６５〜１１８のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の場合では、ペプチドデグロンは安定化ペプチドのＮ末端に結合している。他の場合では、ペプチドデグロンは安定化ペプチドのＣ末端に結合している。一部の場合では、１個または複数のデグロンは、安定化ペプチドのＮ末端とＣ末端の両方に結合している。一部の場合では、デグロンは、安定化ペプチドの内部アミノ酸位置（すなわち、安定化ペプチドにおける、ＮまたはＣ末端を除く任意のアミノ酸位置、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９位など）に結合している。一部の場合では、１個を超える（例えば、２または３個の）デグロンは、安定化ペプチドに結合している。１個を超える（例えば、２または３個の）デグロンが安定化ペプチドに結合している一部の場合では、１個のデグロンは、安定化ペプチドの末端に結合していてもよく、１個のデグロンは、安定化ペプチドの内部位置に結合していてもよい。１個を超える（例えば、２または３個の）デグロンが安定化ペプチドに結合している一部の場合では、１個のデグロンは、安定化ペプチドの各末端に結合していてもよい。１個を超える（例えば、２または３個の）デグロンが安定化ペプチドに結合している一部の場合では、１個を超える各デグロンが安定化ペプチドの内部位置に結合している。図７は、デグロンが内部アミノ酸位置において安定化ペプチドに結合している例示的なキメラを示す。
【０１３２】
ある特定の場合では、安定化ペプチド−ペプチドデグロンキメラは、配列番号１１９〜１２６のうちの１つのアミノ酸配列を有する。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−ペプチドデグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドおよび１個のペプチドデグロンを含む。ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−ペプチドデグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）ペプチドデグロンおよび１個の安定化ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−ペプチドデグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドおよび１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）ペプチドデグロンを含む。
【０１３４】
図７、１５、１７、および１８で挙げる各キメラ構築物は本開示に包含される。図７、１５、１７、および１８で挙げる各キメラ構築物のバリアントは本開示に包含される。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、キメラは、以下の実施例の項に記載のキメラである。例えば、安定化ペプチド−ペプチドデグロンキメラの非限定的な例に関しては、以下の実施例６を参照されたい。
【０１３６】
安定化ペプチド−小分子デグロンキメラ
安定化ペプチド−小分子デグロンキメラを本明細書において提供する。これらのキメラは、安定化ペプチドおよび小分子デグロンから構成され、安定化ペプチドは、分解の標的である第１のタンパク質に結合し、小分子デグロンは、分解誘導タンパク質である第２のタンパク質に結合する。したがって、ある特定の実施形態では、上述の安定化（例えば、ステープル、ステッチ）ペプチドは、上述の小分子デグロンに連結している。安定化ペプチドは、目的の任意のリンカー（例えば、合成化合物リンカー）によってデグロンに連結していてもよい。例示的なキメラを、図１、７、８、９、１１、１２、１９、および２０に示す。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、第１のタンパク質は、第２のタンパク質またはリガンドまたは第２のタンパク質の受容体による分解の標的である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞外タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞表面タンパク質（例えば、受容体）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ（ヘモグロビン鎌状細胞）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細菌性タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質はウイルス性タンパク質である。ある特定の場合では、第１のタンパク質は、神経変性の原因となるタンパク質凝集体（例えば、ベータ−アミロイド）である。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号１〜２４、および１３４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチドは、リンカーを介して小分子デグロンに結合している。安定化ペプチドおよび小分子が互いに結合し、本明細書において記載するキメラを形成するために使用することができるリンカーの非限定的な例を以下に記載し、サブセットを図６に図示する。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチドは、小分子ペプチドに間接的に結合している。
【０１４１】
ある特定の場合では、小分子デグロンは安定化ペプチドのＮ末端に結合している。他の場合では、小分子デグロンは安定化ペプチドのＣ末端に結合している。一部の場合では、１個または複数のデグロンは安定化ペプチドのＮ末端とＣ末端の両方に結合している。一部の場合では、デグロンは安定化ペプチドの内部アミノ酸位置（すなわち、安定化ペプチドにおける、ＮまたはＣ末端を除く任意のアミノ酸位置、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９位など）に結合している。一部の場合では、１個を超える（例えば、２または３個の）デグロンは安定化ペプチドに結合している。１個を超える（例えば、２または３個の）デグロンが安定化ペプチドに結合している一部の場合では、１個のデグロンは、安定化ペプチドの末端に結合していてもよく、１個のデグロンは、安定化ペプチドの内部位置に結合していてもよい。１個を超える（例えば、２または３個の）デグロンが安定化ペプチドに結合している一部の場合では、１個のデグロンは、安定化ペプチドの各末端に結合していてもよい。１個を超える（例えば、２または３個の）デグロンが安定化ペプチドに結合している一部の場合では、１個を超える各デグロンは、安定化ペプチドの内部位置に結合している。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、分解誘導タンパク質、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼである。Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例としては、ＶＨＬ、ＣＯＰ１、およびＭＤＭ２がある。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択されるタンパク質に結合するタンパク質である。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２またはＭＤＭ２と複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭＸに結合する。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、分解誘導タンパク質、例えばＥ３ユビキチンリガーゼ、またはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼである。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、Ｅ３リガーゼ（例えば、ＭＤＭ２）またはＥ３リガーゼと複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭ２に結合するＭＤＭＸに結合する。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＩＮＧ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｍｄｍ２−ＭｄｍＸ、ＴＲＩＭ５α、ｃ−ＣＢＬ、ｃＩＡＰ、ＲＮＦ４、ＢＩＲＣ７、ＩＤＯＬ、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１、ＲＩＮＧ１Ｂ−Ｂｍｉ１、Ｅ４Ｂ、ＣＨＩＰ、Ｐｒｐ１９）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＨＥＣＴ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｓｍｕｒｆ１、Ｓｍｕｒｆ２、Ｉｔｃｈ、Ｅ６ＡＰ）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＢＲ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｐａｒｋｉｎ、Ｐａｒｃ、ＲＮＦ１４４（Ａ／Ｂ）、ＨＯＩＰ、ＨＨＡＲＩ）である。例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例に関しては、Morreale  and  Walden,  Cell  165,  2016  DOI  http:/dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.03.003を参照されたい。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、小分子デグロンは、サリドマイドに基づいている（例えば、上記構造を参照のこと）。ある特定の実施形態では、小分子デグロンは、フォンヒッペルリンダウタンパク質に結合するリガンドに基づいている（例えば、上記構造を参照のこと）。ある特定の実施形態では、小分子デグロンは、当技術分野において公知の任意のデグロンである。ある特定の実施形態では、本明細書において用いる小分子デグロンは、米国特許第９，６９４，０８４号；同第９，７５０，８１６号；同第９，７７０，５１２号；同第９，８２１，０６８号；同第９，７８３，５７５号；同第９，７６５，０１９号；同第９，６３２，０８９号；および同第９，５００，６５３号に記載の任意のデグロンであり、これら全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１４５】
ステープルペプチド−小分子デグロンキメラの非限定的な例を以下に示す：
【化１６】
2021506814.tif 000022
ここで、８＝Ｒ−オクテニルアラニン；Ｂ＝ノルロイシン；＃＝シクロブチルアラニン；Ｘ＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、一部の場合では、Ｘ１およびＸ２は同じ（例えば、Ｓ−ペネテニルアラニン）であり、＾＝サリドマイド−アミノヘキサン酸（thalidomide-aminohexanoic）、＆＝Ｌｙｓ−イプシロン−アミノ−サリドマイド、％＝Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、またはＡ１１、ここで、Ａ１＝ＤＡＢ−サリドマイド、Ａ２＝ＤＡＢ−Ｇｌｙ−Ｔｈａｌ、Ａ３＝ＤＡＢ−βＡｌａ−Ｔｈａｌ、Ａ４＝ＤＡＢ−リンカー１−Ｔｈａｌ、Ａ５＝ＤＡＢ−リンカー２−Ｔｈａｌ、Ａ６＝ＤＡＢ−リンカー３−Ｔｈａｌ、Ａ７＝ＤＡＢ−リンカー４−Ｔｈａｌ、Ａ８＝ＤＡＢ−リンカー５−Ｔｈａｌ、Ａ９＝ＤＡＢ−リンカー６−Ｔｈａｌ、Ａ１０＝ＤＡＢ−リンカー７−Ｔｈａｌ、およびＡ１１＝ＤＡＢ−リンカー８−Ｔｈａｌ；＄＝Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、またはＢ６、ここで、Ｂ１＝ＤＡＢ−ＴＲＩＢカルボキシレート、Ｂ２＝ＤＡＢ−Ｇｌｙ−ＴＲＩＢカルボキシレート、Ｂ３＝ＤＡＢ−βＡｌａ−ＴＲＩＢカルボキシレート、Ｂ４＝ＤＡＢ−リンカー３−ＴＲＩＢカルボキシレート、Ｂ５＝ＤＡＢ−リンカー５−ＴＲＩＢカルボキシレート、およびＢ６＝ＤＡＢ−リンカー７−ＴＲＩＢカルボキシレート；＠＝Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６、ここで、Ｃ１＝ＤＡＢ−ＶＨＬカルボキシレート、Ｃ２＝ＤＡＢ−Ｇｌｙ−ＶＨＬカルボキシレート、Ｃ３＝ＤＡＢ−βＡｌａ−ＶＨＬカルボキシレート、Ｃ４＝ＤＡＢ−リンカー３−ＶＨＬカルボキシレート、Ｃ５＝ＤＡＢ−リンカー５−ＶＨＬカルボキシレート、およびＣ６＝ＤＡＢ−リンカー７−ＶＨＬカルボキシレートであり、
ここで、リンカー１−リンカー８を図６で図示する。一部の実施形態では、サリドマイド−アミノヘキサン酸（＾）またはＬｙｓ−イプシロン−アミノ−サリドマイド（＆）は、リンカーを介してステープルペプチドに連結している。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−小分子デグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドおよび１個の小分子デグロンを含む。ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−小分子デグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）小分子デグロンおよび１個の安定化ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−小分子デグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドおよび１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）小分子デグロンを含む。
【０１４７】
上記で挙げたキメラ構築物およびこれらのバリアントはそれぞれ、本開示に包含される。図１、７、８、９、１１、１２、１９、および２０で挙げるキメラ構築物はそれぞれ、本開示に包含される。図１、７、８、９、１１、１２、１９、および２０で挙げるキメラ構築物のバリアントはそれぞれ、本開示に包含される。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、キメラは、以下の実施例の項に記載のキメラである。例えば、安定化ペプチド−小分子デグロンキメラの非限定的な例に関する以下の実施例２、３、４、および７を参照されたい。
【０１４９】
安定化ペプチド−安定化ペプチドデグロンキメラ
安定化ペプチド−安定化ペプチドデグロンキメラを、本明細書において提供する。これらのキメラは、第１の安定化ペプチドおよび第２の安定化ペプチドの２個の安定化ペプチドから構成され、第１の安定化ペプチドが、分解されることになる標的タンパク質である第１のタンパク質に結合し、第２の安定化ペプチドが、分解誘導タンパク質である第２のタンパク質に結合する。したがって、ある特定の実施形態では、上述の第１の安定化（例えば、ステープル、ステッチ）ペプチドは、上述の第２の安定化（例えば、ステープル、ステッチ）ペプチドに連結している。第１および第２の安定化ペプチドは、直接的にまたは間接的に連結していてもよい。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、第１のタンパク質は、第２のタンパク質または第２のタンパク質のリガンドもしくは受容体によって分解されることになる標的タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞外タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞表面タンパク質（例えば、受容体）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ（ヘモグロビン鎌状細胞）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細菌性タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質はウイルス性タンパク質である。ある特定の場合では、第１のタンパク質は、神経変性の原因となるタンパク質凝集体（例えば、ベータ−アミロイド）である。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、第１の安定化ペプチドは、配列番号１〜２４、および１３４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、第１の安定化ペプチドは、リンカーを介して第２の安定化ペプチドに結合している。第１のおよび第２の安定化ペプチドが互いに結合し、本明細書において記載するキメラを形成するために使用することができるリンカーの非限定的な例を以下に記載し、サブセットを図６で図示する。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、第１の安定化ペプチドは、第２の安定化ペプチドに間接的に結合している。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は分解誘導タンパク質、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼである。Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例としては、ＶＨＬ、ＣＯＰ１、およびＭＤＭ２がある。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択されるタンパク質に結合するタンパク質である。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２またはＭＤＭ２と複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭＸに結合する。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、分解誘導タンパク質、例えばＥ３ユビキチンリガーゼ、またはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼである。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、Ｅ３リガーゼ（例えば、ＭＤＭ２）またはＥ３リガーゼと複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭ２に結合するＭＤＭＸに結合する。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＩＮＧ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｍｄｍ２−ＭｄｍＸ、ＴＲＩＭ５α、ｃ−ＣＢＬ、ｃＩＡＰ、ＲＮＦ４、ＢＩＲＣ７、ＩＤＯＬ、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１、ＲＩＮＧ１Ｂ−Ｂｍｉ１、Ｅ４Ｂ、ＣＨＩＰ、Ｐｒｐ１９）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＨＥＣＴ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｓｍｕｒｆ１、Ｓｍｕｒｆ２、Ｉｔｃｈ、Ｅ６ＡＰ）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＢＲ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｐａｒｋｉｎ、Ｐａｒｃ、ＲＮＦ１４４（Ａ／Ｂ）、ＨＯＩＰ、ＨＨＡＲＩ）である。例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例に関しては、Morreale  and  Walden,  Cell  165,  2016  DOI  http:/dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.03.003を参照されたい。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号１３４に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、米国特許第８，８８９，６３２号、同第９，４５８，２０２号、同第９，５０５，８０４号、同第９，５２７，８９６号、同第９，９５７，２９９号、同第１０，０３０，０４９号、および同第１０，０５９，７４１号、ＷＯ１９９８／００１４６７およびＷＯ２０１７／１６５６１７、および米国特許出願公開第２０１４／００１８３０２Ａ１号に記載の安定化ペプチドであり、これらの出願はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１５８】
ある特定の場合では、第１の安定化ペプチドは、第２の安定化ペプチドのＮ末端に結合している。他の場合では、第１の安定化ペプチドは、第２の安定化ペプチドのＣ末端に結合している。一部の場合では、第１の安定化ペプチドは、第２の安定化ペプチドの内部アミノ酸位置（すなわち、安定化ペプチドにおける、ＮまたはＣ末端を除く任意のアミノ酸位置、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９位など）に結合している。ある特定の場合では、第２の安定化ペプチドは、第１の安定化ペプチドのＮ末端に結合している。他の場合では、第２の安定化ペプチドは、第１の安定化ペプチドのＣ末端に結合している。一部の場合では、第２の安定化ペプチドは、第１の安定化ペプチドの内部アミノ酸位置（すなわち、安定化ペプチドにおける、ＮまたはＣ末端を除く任意のアミノ酸位置、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９位など）に結合している。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−安定化ペプチドデグロンキメラは、分解されることになる１個または複数のタンパク質に結合する１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドおよび分解誘導タンパク質に結合する１個の安定化ペプチドデグロンを含む。ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−安定化ペプチドデグロンキメラは、１個または複数の分解誘導タンパク質に結合する１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドデグロンおよび分解されることになるタンパク質に結合する１個の安定化ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、安定化ペプチド−安定化ペプチドデグロンキメラは、分解されることになる１個または複数のタンパク質に結合する１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドおよび１個または複数の分解誘導タンパク質に結合する１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドデグロンを含む。
【０１６０】
図２１で挙げる各キメラ構築物は本開示に包含される。図２１で挙げる各キメラ構築物のバリアントは本開示に包含される。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、キメラは、以下の実施例の項に記載のキメラである。例えば、安定化ペプチド−安定化ペプチドデグロンキメラの非限定的な例に関する以下の実施例８を参照されたい。
【０１６２】
小分子−安定化ペプチドデグロンキメラ
小分子−安定化ペプチドデグロンキメラを本明細書において提供する。これらのキメラは、小分子および安定化ペプチドから構成され、小分子が、分解されることになる標的タンパク質である第１のタンパク質に結合し、安定化ペプチドが、分解誘導タンパク質である第２のタンパク質に結合する。したがって、ある特定の実施形態では、小分子は、上述の安定化（例えば、ステープル、ステッチ）ペプチドに連結している。小分子および安定化ペプチドは、直接的にまたは間接的に連結していてもよい。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、第１のタンパク質は、第２のタンパク質または第２のタンパク質のリガンドもしくは受容体によって分解されることになる標的タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞外タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細胞表面タンパク質（例えば、受容体）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、疾患の原因となるか、または疾患に関連するタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、キラータンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ）または細胞に損傷を与えるかもしくは神経変性の原因となるタンパク質（例えば、ＩｇＧ、ベータ−アミロイド、タウ、α−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＨｂＳ（ヘモグロビン鎌状細胞）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＵＳ、ＧＦＡＰ）である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は、ＢＣＬ２、ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、β−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合物、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質は細菌性タンパク質である。一部の実施形態では、第１のタンパク質はウイルス性タンパク質である。ある特定の場合では、第１のタンパク質は、神経変性の原因となるタンパク質凝集体（例えば、ベータ−アミロイド）である。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、小分子は、キメラの一部を形成する場合、その標的と相互作用するためのキメラのステープルペプチドの能力に干渉することなく、タンパク質に結合することができる任意の薬物または化学的化合物である。（キメラのその背景において）その標的と相互作用するための（キメラの）ステープルペプチドの能力に対する薬物のまたは化学的化合物の干渉を評価するためのアッセイおよび方法、例えば免疫蛍光法および共免疫沈降法は、当技術分野において公知である。ある特定の実施形態では、小分子は図２３で図示する化合物である。ある特定の実施形態では、小分子はキナーゼ阻害剤である。ある特定の実施形態では、小分子はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、小分子は、リンカーを介して安定化ペプチドに結合している。小分子および安定化ペプチドが互いに結合し、本明細書において記載するキメラを形成するために使用することができるリンカーの非限定的な例を以下に記載し、サブセットを図６で図示する。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、小分子は、安定化ペプチドに間接的に結合している。
【０１６７】
ある特定の場合では、小分子は安定化ペプチドのＮ末端に結合している。他の場合では、小分子は安定化ペプチドのＣ末端に結合している。一部の場合では、小分子は安定化ペプチドの内部アミノ酸位置（すなわち、安定化ペプチドにおける、ＮまたはＣ末端を除く任意のアミノ酸位置、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９位など）に結合している。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、分解誘導タンパク質、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼである。Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例としては、ＶＨＬ、ＣＯＰ１、およびＭＤＭ２がある。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２、ＳＫＰ２−ＣＫＳ１、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ２、ＦＢＸＷ４、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＳＰＯＰ、ＶＨＬ、ＩＴＣＨ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４２、ＣＯＰ１、ＴＲＡＦ７、ＲＦＷＤ３、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＳＩＡＨ１、ＴＲＰＣ４ＡＣ、ＤＥＴ１、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＨＥＲＣ１、ＤＤＢ２、ＣＳＡ、ＣＢＬ、ＣＤＣ２０、およびＦＺＲ１からなる群から選択されるタンパク質に結合するタンパク質である。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、ＭＤＭ２またはＭＤＭ２と複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭＸに結合する。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、第２のタンパク質は、分解誘導タンパク質、例えばＥ３ユビキチンリガーゼ、またはＥ３ユビキチンリガーゼに対する基質アダプターである。ある特定の実施形態では、第２のタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼである。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、Ｅ３リガーゼ（例えば、ＭＤＭ２）またはＥ３リガーゼと複合体を形成するタンパク質、例えばＭＤＭ２に結合するＭＤＭＸに結合する。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＩＮＧ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｍｄｍ２−ＭｄｍＸ、ＴＲＩＭ５α、ｃ−ＣＢＬ、ｃＩＡＰ、ＲＮＦ４、ＢＩＲＣ７、ＩＤＯＬ、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１、ＲＩＮＧ１Ｂ−Ｂｍｉ１、Ｅ４Ｂ、ＣＨＩＰ、Ｐｒｐ１９）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＨＥＣＴ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｓｍｕｒｆ１、Ｓｍｕｒｆ２、Ｉｔｃｈ、Ｅ６ＡＰ）である。ある特定の実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＢＲ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｐａｒｋｉｎ、Ｐａｒｃ、ＲＮＦ１４４（Ａ／Ｂ）、ＨＯＩＰ、ＨＨＡＲＩ）である。例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼの非限定的な例に関しては、Morreale  and  Walden,  Cell  165,  2016  DOI  http:/dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.03.003を参照されたい。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、安定化ペプチドは、配列番号１３４に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。ある特定の実施形態では、第２の安定化ペプチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有する。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、小分子−安定化ペプチドデグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドデグロンおよび１個の小分子を含む。ある特定の実施形態では、小分子−安定化ペプチドデグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）小分子および１個の安定化ペプチドデグロンを含む。ある特定の実施形態では、小分子−安定化ペプチドデグロンキメラは、１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）安定化ペプチドデグロンおよび１個または複数の（例えば、２、３、４個の、またはそれを超える）小分子を含む。
【０１７２】
図２３で図示するキメラ構築物は、本開示に包含される。図２３で図示するキメラ構築物のバリアントは、本開示に包含される。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、キメラは、以下の実施例の項に記載のキメラである。例えば、小分子−安定化ペプチドデグロンキメラの非限定的な例に関しては以下の実施例９を参照されたい。
【０１７４】
リンカー
上述の構築物において使用することができるリンカーに関しては、特に制限はない。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸、例えばアミノプロピオン酸、アミノブタン酸、アミノペンタン酸、またはアミノヘキサン酸である。一部の実施形態では、リンカーは、オリゴエチレングリコール、すなわち、ＮＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｘ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨである。一部の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の実施形態では、約１から３０個の残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸）を含む任意の（any  arbitrary）単一鎖ペプチドをリンカーとして使用することができる。他の実施形態では、リンカーは、１０から２０、１０から３０、１０から４０、１０から５０、１０から６０、１０から７０、１０から８０、１０から９０、１０から１００、１０から１４４、または１０から１５０個のアミノ酸長である。ある特定の場合では、リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基のみを含む。そのようなペプチドリンカーの例としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ；ＧｌｙＳｅｒ；ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ；ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号４７）；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号４８）；ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号４９）；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号５０）；ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号５１）；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号５２）；ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号５３）；ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号５４）；（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（配列番号４９）ｎ（ここで、ｎは１またはそれよりも多い整数である）；および（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ）ｎ（配列番号５０）ｎ（ここで、ｎは１またはそれよりも多い整数である）がある。一部の場合では、リンカーは、セリン残基が別のアミノ酸で置き換えられていることを除いて、配列番号４のアミノ酸配列を有する。一部の場合では、リンカーは、リンカーの各コピーにおけるセリン残基が別のアミノ酸で置き換えられていることを除いて、配列番号４のアミノ酸配列の複数のコピー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０コピー）を有する。
【０１７５】
他の実施形態では、リンカーペプチドは、（従来のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーペプチドリピートのジャンクションにおいて生じる）アミノ酸配列ＧＳＧが存在しないように改変される。例えば、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＸＸ）ｎＧＧＧＧＳ（配列番号５５）およびＧＧＧＧＳ（ＸＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５６）（ここで、Ｘは、配列へ挿入することができ、配列ＧＳＧを含むポリペプチドはもたらさない任意のアミノ酸であり、ｎは０から４である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーペプチドの配列は、（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳ（ここで、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＳであり、ｎは０から４である）（配列番号５７）である。別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳ（ここで、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＱであり、ｎは０から４である）（配列番号５８）である。別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳ（ここで、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＡであり、ｎは０から４である）（配列番号５９）である。更に別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は、ＧＧＧＧＳ（ＸＧＧＧＳ）ｎ（ここで、ＸはＰであり、ｎは０から４である）（配列番号６０）である。一実施形態では、本発明のリンカーペプチドは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＡ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）を含むか、またはそれからなる。別の実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＱ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号６２）を含むかまたはそれからなる。更に別の実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列（ＧＧＧＰＳ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号６３）を含むかまたはそれからなる。さらなる実施形態では、リンカーペプチドは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（ＰＧＧＧＳ）２（配列番号６４）を含むかまたはそれからなる。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、リンカーは、合成化合物リンカー（化学的架橋剤）である。市場で入手可能な架橋剤の例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、およびビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）がある。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、リンカーは、図６で図示するリンカーである。
【０１７８】
安定化ペプチドデグロンキメラを合成する方法
ステープルペプチド−小分子デグロンキメラの合成
炭化水素−ステープルペプチドは、以前に報告された方法（Bird  et  al.,  Methods  Enzymol.,  446:369-86  (2008);  Bird  et  al.,  Curr.  Protoc.  Chem.  Biol.,  3(3):99-117  (2011)）を、以下の変更および追加の詳細とともに使用して合成し、精製し、定量化することができる。ペプチドは、所望の配列が完了するまで、確立された方法（すなわち、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、ＨＡＴＵカップリング試薬）を使用して合成する。次いでペプチドを、Ｇｒｕｂｂｓ触媒（第一世代）を使用してステープル化し、ピペリジンを使用してＮ末端を脱保護する。多原子リンカー、例えばベータアラニンまたはアミノヘキサン酸を組み込む。次いでサリドマイド−ＣＯＯＨを、ＨＣＴＵを使用してカップリングする。イミド結合は求核試薬に対して特に感受性があるため、ピペリジンまたはヒドラジンは組込み後に使用しない。次いでペプチドを、ＴＦＡを用いて１時間切断し、ＬＣＭＳで精製する。
【０１７９】
ステープルペプチド−ペプチドデグロンキメラの合成
キメラのステープルペプチド部分は、上記のとおりに合成し、続いて完全に保護されたペプチドデグロンをカップリングしてもよい。完全に保護されたデグロンペプチドは、グリコール酸無水物のペプチドＮ末端との反応である最終合成ステップと同時に、弱酸開裂性樹脂、例えばＳｉｅｂｅｒアミド樹脂上で合成することができる。１％ＴＦＡで切断後、保護されたペプチドをエーテル中で沈殿させ、酢酸／水中に溶解し、凍結乾燥する。次いで、完全に保護されたデグロンペプチドをカップリング試薬および塩基と混合し、樹脂結合ステープルペプチドＮ末端と２時間反応させ、続いてＴＦＡで切断し、精製し、ステープルペプチド−ペプチドデグロンを得る。
【０１８０】
ステープルペプチド−ステープルペプチドデグロンキメラの合成
第１のステープルペプチド部分を、上述の確立された方法を使用して合成し、続いてリンカー部分、例えばベータアラニンまたはアミノヘキサン酸を組み込んでもよい。次いで第２のステープルペプチドキメラの半分を、第１のステープルペプチド部分に関する同じプロトコールを使用して合成し、次いでキメラ全体を、Ｇｒｕｂｂｓ触媒（第一世代）を使用してステープル化し、続いてＮ末端をアセチル化してもよい。次いでキメラを、ＴＦＡを用いて１時間切断し、ＬＣＭＳで精製する。
【０１８１】
小分子−ステープルペプチドデグロンキメラの合成
キメラのステープルペプチド部分は、上述の確立された方法を使用して合成してもよく、続いてペプチドを、Ｇｒｕｂｂｓ触媒（第一世代）を使用してステープル化し、ピペリジンを用いてＮ末端を脱保護し、多原子リンカー、例えばベータアラニンまたはアミノヘキサン酸を組み込む。小分子のステープルペプチドへのカップリングは上述のように行うことができる。
【０１８２】
本発明の安定化（例えば、ステープル）ペプチドデグロンキメラの特性および機能的活性は、例えば、以下に記載する方法を使用してアッセイすることができる。
【０１８３】
ステープルペプチドデグロンキメラのタンパク質標的への結合
競合的蛍光偏光アッセイを行い、（１）キメラのステープルペプチド（または分子）部分の、そのタンパク質標的に対する結合親和性を保持するための能力および（２）デグロン構成成分（分子またはペプチドでも）の、そのタンパク質標的に対する結合親和性を保持するための能力をモニターする。ステープルペプチドおよび分子デグロンに関する例示的な蛍光偏光法としては、Pitter  et  al  Methods  Enzymol  446:  387-408  (2008)およびNowak  et  al.  Nat  Chem  Biol  14:706-714  (2018)がある。ＧＦＰ−標識された標的タンパク質基質（例えばＧＦＰ−ＢＲＤ４）を使用したｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏでの分解アッセイを同様に使用し、完全なままの細胞を貫通するステープルペプチドデグロンキメラの能力を確認し、陽性対照分子デグロンキメラ（例えばｄＢＥＴ６）と競合させ、誘発される分解を阻害させる。そのような競合的細胞分解アッセイのための例示的な方法は、Nowak  et  al.  Nat  Chem  Biol  14:706-714  (2018)で見出すことができる。
【０１８４】
ステープルペプチドデグロンキメラによって誘発される、組換えタンパク質標的のユビキチン化のモニタリング
タンパク質標的のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのユビキチン化をモニターするために、市販のＭｄｍ２／ＨＤＭ２ユビキチンリガーゼキット（Ｋ−２００Ｂ）を用いてもよい。簡潔には、キメラ（１０μＭ）、組換え完全長ＭＤＭ２（ＧＳＴ標識、１μＭ）、Ｅ１酵素（ＵＢＥ１、５０ｎＭ）、Ｅ２酵素（ＵＢＥ２Ｄ３、１μＭ）、ユビキチン（１００μＭ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）および組換え標的タンパク質（１００ｎＭ）を、反応緩衝液中で１．５ｍＬのマイクロチューブにおいて組み合わせる。混合物を３７℃で６時間インキュベートする。その後、標準的なウエスタンブロット技術を使用して、反応混合物２０μＬをアッセイし、それによって標的タンパク質に対して生成された抗体を使用し、ユビキチン化によって上昇したバンドシフトを可視化する。
【０１８５】
ステープルペプチドデグロンキメラによって誘発される、ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏでの天然タンパク質分解のモニタリング
細胞内タンパク質分解に関してアッセイするために、がん細胞（例えば、ＳＪＳＡ−１、ＳＪＳＡ−Ｘ、Ｕ２ＯＳ）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）を含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）培養培地（ＣＭ）中で、３７℃で湿度制御されたＣＯ２平衡化インキュベーターにおいて継代する。処置の前日に、細胞を継代し、１００，０００細胞／ｍＬの密度で６ウェルプレート中に播種する。２４時間後、細胞を、ステープルペプチドデグロンキメラ（例えば、１０μＭ）で０、２、４および６時間処置し、その後、これらを採取し、溶解する。次いで細胞溶解物を、標的タンパク質に対して生成された抗体を使用し、標準的なウエスタンブロット技術を使用してアッセイし、タンパク質レベルおよび負荷対照に対するアクチン抗体を評価する。
【０１８６】
ステープルペプチドデグロンキメラによって誘発される標的タンパク質分解のがん細胞生存率に対する影響のモニタリング
両方のタンパク質標的への結合を保持し、細胞取込みを達成し、それらのｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏでの二重標的にアクセスし、標的タンパク質の分解を誘発することができるステープルペプチドデグロンキメラを、確立された細胞生存率ならびにＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏおよびカスパーゼ３／７活性化アッセイを含むアポトーシスアッセイを使用して報告とおりに行い（例えば、Labelle  et  al,  J  Clin  Invest  122:2018-31  (2012)；Wachter  et  al,  Oncogene,  36:2184-2190  (2017)；Guerra  et  al,  Cell  Reports  24:3393-3403  (2018)）、がん細胞に対するそれらの細胞毒性効果に関して評価する。例えば、それらのタンパク質標的、および／または標的タンパク質を発現しない細胞系、および／または目的の分解誘導タンパク質に結合する（engages）ことができない点突然変異体ペプチドを使用して、作用特異性の対照研究（specificity  of  action  controls  studies）を行った。
【０１８７】
処置方法
本明細書において開示されるキメラは、安定化ペプチドまたは小分子が結合する疾患に関連するタンパク質の分解を促進することができる。ある特定の場合では、分解されるタンパク質は、ＢＡＸまたはＢＡＫのようなキラータンパク質である（これは、例えば、脳卒中、神経変性疾患、および心臓発作における低酸素症などのストレス中の細胞保護剤として有用である）。ある特定の場合では、分解されるタンパク質は、骨髄腫におけるＩｇ、アルツハイマー疾患におけるアミロイド、疾患をもたらす他のタンパク質沈着物のような細胞に損傷を与えるタンパク質である。ある特定の場合では、分解されるタンパク質は、ＢＣＬ２、／ＢＣＬＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ、ＰＵＭＡ、ＳＯＳＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ｂ−カテニン、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ、ＡＫＴ、ＢＲＣＡ１／２、ＥＷＳ−ＦＬＩ、ＭＬＬ融合物、受容体チロシンキナーゼ、ＨＯＸホモログ、ＪＵＮ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７、オーロラキナーゼ、ＭＩＴＦ、Ｗｎｔ１、ＰＤ−１、ＢＣＲ、およびＣＣＲ５からなる群から選択されるタンパク質である。ある特定の場合では、分解されるタンパク質はアミロイドベータ（アルツハイマー疾患）、タウタンパク質（アルツハイマー疾患）、アルファ−シヌクレイン（アルツハイマー疾患）、ＴＤＰ−４３（前頭側頭葉変性症）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＡＬＳ）、Ｎｏｔｃｈ３（ＣＡＤＡＳＩＬ）、ＦＵＳ（肉腫、ＡＬＳ）、アミロイドＡ、Ｉｇ重鎖および軽鎖、ならびにＧＦＡＰ（アレキサンダー疾患）からなる群から選択されるタンパク質である。
【０１８８】
本開示は、がん、自己免疫疾患、または炎症性疾患を予防および／または処置するための、本明細書において記載する安定化ペプチドまたはキメラのうちのいずれかを使用する方法を特徴とする。「処置する」または「処置すること」という用語は、本明細書で使用される場合、そのために対象が患う疾患または状態を軽減、阻害、または回復することを指す。
【０１８９】
本明細書において記載するペプチドまたはキメラは、がんを呈するヒト対象の処置に有用であり得る。本明細書において記載するペプチドまたはキメラは、黒色腫、白血病、リンパ腫、または他の血液悪性腫瘍または固形腫瘍を呈するヒト対象の処置にも有用であり得る。ある特定の場合では、固形腫瘍は、黒色腫、乳がんまたは肺がんである。一部の実施形態では、本明細書において記載するペプチドまたはキメラは、自己免疫疾患または細胞過剰疾患の特徴を示す他の炎症性状態を呈するヒト対象の処置に有用であり得る。ある特定の場合では、自己免疫疾患は、自己免疫結腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、血管炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、またはシェーグレン疾患である。一部の場合では、炎症性疾患、喘息、乾癬、炎症性結腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、または血管炎である。
【０１９０】
内因性タンパク質（例えば、ＭＤＭ２のような発がんタンパク質）がデグロンを含むように改変する場合、任意の遺伝子編集技術を使用することができる（例えば、米国特許第９，８４０，７１３号；同第９，８４０，７０２号；同第９，８４０，６９９号；同第９，８３４，７９１号；同第９，８２２，３７２号；同第９，８１６，０８０号；同第９，７９０，４９０号；同第９，７８３，４９０号；同第９，７７１，６０１号；同第９，７５８，７７５号；同第９，７３８，９０８号；同第９，６１６，０９０号；同第９，５７４，２１１号を参照されたく、これら全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする）。新たに導入されたデグロンの存在は、タンパク質の分解につながるはずである。
【０１９１】
一般的に、方法は、対象を選択し、有効量の１個または複数の本明細書におけるペプチドを、例えば、医薬組成物でまたはそれとして対象に投与し、必要に応じて反復投与して、がん、例えば、黒色腫またはリンパ腫を予防するかまたは処置することを含み、経口で、静脈内でまたは局所的に投与してもよい。対象は、例えば対象が、ステープルペプチドが標的とするタンパク質（例えば、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１）を発現するがんを有することの判定に基づいて処置するために選択してもよい。
【０１９２】
任意の特定の患者に関する特異的投薬量および処置レジメンは、さまざまな因子に左右されることになり、その因子としては、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患に対する患者の傾向、状態または症状、ならびに処置する医師の判断がある。
【０１９３】
有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬として投与してもよい。治療有効量の治療化合物（すなわち、有効投薬量）は、選択される治療化合物に依存する。組成物は、１日当たり１回または複数回から１週当たり１回または複数回、投与することができ、隔日で１回を含む。当業者であれば、これらに限定されないが、疾患または障害の重症度、治療歴、対象の全身的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むある特定の因子が、対象を効果的に処置するために必須の投薬量およびタイミングに影響を与える場合があることは理解するであろう。更に、本明細書において記載する治療有効量の治療化合物を用いた対象の処置は、単回の処置または一連の処置を含んでいてもよい。例えば、有効量を、少なくとも一回投与してもよい。
【０１９４】
医薬組成物
本明細書において記載する１個または複数の安定化ペプチドまたはキメラのうちのいずれかは、医薬組成物としてまたはそれにおいて使用するために製剤化することができる。そのような組成物は、任意の経路、例えば食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された任意の経路を介した対象への投与のために、製剤化するかまたは適応させることができる。例示的な方法は、ＦＤＡのＣＤＥＲ  Ｄａｔａ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｍａｎｕａｌ第００４版（fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmにおいて利用可能である）に記載されている。例えば、組成物は、吸入（例えば、経口および／または経鼻吸入（例えば、ネブライザーまたは噴霧剤を介した））、注射（例えば、静脈内、動脈内、サブダーマル（subdermally）、腹腔内、筋肉内、および／または皮下（subcutaneously））による投与用に；および／または経口投与、経粘膜投与、および／または局所投与（局所（例えば、経鼻）用スプレー剤および／または液剤を含む）用に製剤化または適応させることができる。
【０１９５】
一部の場合では、医薬組成物は、有効量の１個または複数の安定化ペプチドを含んでいてもよい。「有効量」および「処置に有効な」という用語は、本明細書で使用される場合、意図する効果または生理学的アウトカムをもたらすためのその投与（例えば、感染症の処置）の背景内で有効な期間（急性または慢性投与および周期的または連続的投与を含む）で利用される、本明細書において記載する１個または複数の化合物または医薬組成物の量または濃度を指す。
【０１９６】
本発明の医薬組成物は、１個または複数のペプチド、ならびに任意の薬学的に許容される担体および／またはビヒクルを含んでいてもよい。一部の場合では、医薬品は、疾患または疾患の症状のモジュレートを達成するために有効な量で１個または複数の追加の治療剤を更に含んでいてもよい。
【０１９７】
「薬学的に許容される担体またはアジュバント」という用語は、本発明の化合物とともに患者に投与してもよく、その薬理学的活性を破壊せず、治療量の化合物を送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性である担体またはアジュバントを指す。
【０１９８】
本発明の医薬組成物において使用してもよい薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとしては、これらに限定されるものではないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達系（ＳＥＤＤＳ）、例えばｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート、医薬品投薬形態において使用する界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）または他の同様の高分子送達マトリックス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂がある。シクロデキストリン、例えばα−、β−、およびγ−シクロデキストリンも、本明細書において記載する製剤の化合物の送達を強化するために有利に使用してもよい。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含んでいてもよい。一部の場合では、製剤のｐＨは、製剤化化合物またはその送達形態の安定性を強化するための薬学的に許容される酸、塩基または緩衝剤を用いて調整してもよい。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変部内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
【０２００】
医薬組成物は、吸入および／または経鼻投与のための液剤または散剤の形態であってもよい。そのような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）および懸濁化剤を使用して、当技術分野において公知の技術に従って製剤化してもよい。注射可能な滅菌調製物はまた、非毒性非経口で許容される希釈剤または溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として注射用滅菌液剤または懸濁剤としてもよい。用いてもよい許容されるビヒクルおよび溶媒のうちの１つは、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌、固定油を、溶媒または懸濁媒体として慣例的に用いる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無菌固定油を用いてもよい。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注射可能な調製物において有用であり、天然の薬学的に許容される油、例えば特にそのポリオキシエチル化型のオリーブ油またはヒマシ油も同様である。これらの油性液剤または懸濁剤には、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース、または薬学的に許容される投薬形態の製剤、例えばエマルションおよび／もしくは懸濁剤において通常使用する同様の分散剤も含まれる場合がある。他の通常使用する界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）またはＳｐａｎおよび／または薬学的に許容される固形剤、液剤、もしくは他の投薬形態の製造において通常使用する他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ促進剤も、製剤の目的で使用してもよい。
【０２０１】
医薬組成物は、任意の経口で許容される投薬形態で、経口で投与することができ、その投薬形態としては、これらに限定されないが、カプセル剤、錠剤、エマルション剤および水性懸濁剤、分散剤および液剤がある。経口使用のための錠剤の場合、通常使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチがある。滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムも通常添加される。カプセル剤形態での経口投与に関しては、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチがある。水性懸濁剤および／またはエマルション剤が経口で投与される場合、活性成分は、乳化剤および／または懸濁化剤と組み合わせて油性相中に懸濁するかまたは溶解してもよい。必要に応じて、ある特定の甘味料および／または香味料および／または着色剤を添加してもよい。
【０２０２】
あるいはまたは更に、医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、医薬品製剤の技術分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野において公知の他の可溶化または分散剤を用いて、生理食塩水中の液剤として調製してもよい。
【０２０３】
一部の場合では、本明細書において開示される１個または複数のペプチドは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。そのようなコンジュゲート組成物は、一価または多価であってもよい。例えば、コンジュゲート組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートしている本明細書において開示される１個のペプチドを含んでいてもよい。あるいは、コンジュゲート組成物は、担体にコンジュゲートしている２個またはそれを超える本明細書において開示されるペプチドを含んでいてもよい。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、２個の実体が互いに「コンジュゲート」している場合、これらは直接的または間接的な共有または非共有相互作用によって連結している。ある特定の実施形態では、会合は共有性である。他の実施形態では、会合は非共有性である。非共有相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、静電的相互作用などがある。間接的共有相互作用は、２個の実体が共有的に連結されている場合、必要に応じてリンカー基を介する。
【０２０５】
担体タンパク質は、対象における免疫原性を増加させるかまたは強化する任意のタンパク質を含んでいてもよい。例示的な担体タンパク質は、当技術分野において記載されている（例えば、Fattom  et  al.,  Infect.  Immun.,  58:2309-2312,  1990；Devi  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:7175-7179,  1991；Li  et  al.,  Infect.  Immun.  57:3823-3827,  1989;Szu  et  al.,  Infect.  Immun.  59:4555-4561,1991；Szu  et  al.,  J.  Exp.  Med.  166:1510-1524,  1987；およびSzu  et  al.,  Infect.  Immun.  62:4440-4444,  1994を参照のこと）。高分子担体は、１個または複数の第１級および／または第２級アミノ基、アジド基、またはカルボキシル基を含む天然または合成材料であってもよい。担体は、水溶性であってもよい。
【実施例】
【０２０６】
以下の例は、特許請求する発明を更に例示するために提供され、発明の範囲を限定するものとして判断されるべきではない。特定の材料が言及されている範囲で、それは例示を目的とするにすぎず、本発明を限定することを意図しない。当業者であれば、発明の能力を行使することなくかつ発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を発展させることができる。
【０２０７】
（実施例１）
ステープルペプチドデグロンキメラの合成。
本発明者らは、（ｉ）ステープルペプチド−小分子デグロンキメラ、（ｉｉ）ステープルペプチド−ペプチドデグロンキメラ、（ｉｉｉ）ステープルペプチド−ステープルペプチドデグロンキメラ、および（ｉｖ）小分子−ステープルペプチドデグロンキメラを含む一連のクラスのステープルペプチドデグロンキメラを生成した。これらのクラスのステープルペプチドデグロンキメラをそれぞれ製造するための方法を、以下に記載する。図２６〜２９によって、これらのキメラのステープルペプチド部分をデザインする際のアプローチの多様性が実証される。キメラの例示的な構成成分を、図１〜７、１５〜１６、２１、２３で図示する。
【０２０８】
ステープルペプチド−小分子デグロンキメラの合成
炭化水素−ステープルペプチドは、以前に報告された方法（Bird  et  al.,  Methods  Enzymol.,  446:369-86  (2008)；Bird  et  al.,  Curr.  Protoc.  Chem.  Biol.,  3(3):99-117  (2011)）を、以下の変更および追加の詳細とともに使用して合成し、精製し、定量化した。ペプチドは、所望の配列が完了するまで、確立された方法（すなわち、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、ＨＡＴＵカップリング試薬）を使用して合成した。次いでペプチドを、Ｇｒｕｂｂｓ触媒（第一世代）を使用してステープル化し、ピペリジンを使用してＮ末端を脱保護した。多原子リンカー、例えばベータアラニンまたはアミノヘキサン酸を組み込んだ（図６のリンカーも参照のこと）。次いでサリドマイド−ＣＯＯＨを、ＨＣＴＵを使用してカップリングした。イミド結合は求核試薬に対して特に感受性があり、したがって、ピペリジンまたはヒドラジンは組込み後に使用しなかった。次いでペプチドを、ＴＦＡを用いて１時間切断し、ＬＣＭＳで精製した。
【０２０９】
ステープルペプチド−ペプチドデグロンキメラの合成
ステープルペプチド−ペプチドデグロンキメラのステープルペプチド部分を上記のとおりに（すなわち、ステープルペプチド−小分子デグロンの合成に関するとおりに）合成した。次いでステープルペプチドを、完全に保護されたペプチドデグロンにカップリングした。完全に保護されたデグロンペプチドを、グリコール酸無水物のデグロンペプチドＮ末端との反応である最終合成ステップと同時に、弱酸開裂性樹脂、特に、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上で合成した。１％ＴＦＡで切断後、保護されたデグロンペプチドをエーテル中で沈殿させ、酢酸／水中に溶解し、凍結乾燥した。次いで、完全に保護されたデグロンペプチドをカップリング試薬および塩基と混合し、樹脂結合ステープルペプチドＮ末端と２時間反応させ、続いてＴＦＡで切断し、精製し、ステープルペプチド−ペプチドデグロンを得た。
【０２１０】
ステープルペプチド−ステープルペプチドデグロンキメラの合成
ステープルペプチド−ステープルペプチドデグロンキメラの第１のステープルペプチドを、上述の確立された方法を使用して（すなわち、ステープルペプチド−小分子デグロンの合成に関するとおりに）合成した。次いでリンカー部分、例えばベータアラニンまたはアミノヘキサン酸を第１のステープルペプチド中に組み込んだ。第２のキメラのステープルペプチドを、第１のキメラのステープルペプチドと同じプロトコールを使用して合成した。次に、キメラ全体（すなわち、両方のステープルペプチド）を、Ｇｒｕｂｂｓ触媒（第一世代）を使用してステープル化し、続いてＮ末端をアセチル化した。次いでキメラを、ＴＦＡを用いて１時間切断し、ＬＣＭＳで精製した。
【０２１１】
小分子−ステープルペプチドデグロンキメラの合成
小分子−ステープルペプチドデグロンキメラのステープルペプチド部分を、上述の確立された方法を使用して（すなわち、ステープルペプチド−小分子デグロンの合成に関するとおりに）合成し、続いてペプチドを、Ｇｒｕｂｂｓ触媒（第一世代）を使用してステープル化し、ピペリジンを用いてＮ末端を脱保護し、多原子リンカー、例えばベータアラニンまたはアミノヘキサン酸を組み込んだ。
【０２１２】
小分子としてＪＱ１を含む小分子−ステープルペプチドデグロンキメラを生成した。ＪＱ１のカルボキシル基（L.  Anders  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  32,  92-96  (2014)）は、化学的置換を許容することができるため、樹脂を、ＪＱ１−酸（１１．３ｍｇ、０．０２８１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびＤＭＦ（０．２８ｍｌ、０．１Ｍ）中に溶解したＮ−（４−アミノブチル）−２−（（２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イル）オキシ）アセトアミドトリフルオロアセテート（１４．５ｍｇ、０．０２８１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）と室温でインキュベートした。ＤＩＰＥＡ（１４．７マイクロリットル、０．０８４３ｍｍｏｌ、３ｅｑ）およびＨＡＴＵ（１０．７ｍｇ、０．０２８１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を添加し、続いて窒素下で２０時間反応を行った。次いで小分子−ステープルペプチドデグロンキメラを、ＴＦＡを用いて１時間切断し、ＬＣＭＳで精製した。
【０２１３】
（実施例２）
ステープルペプチドデグロンキメラは、標的タンパク質結合親和性を保持し、細胞取込みを達成し、その天然標的にｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏでアクセスすることができる。
例示的な蛍光偏光（ＦＰ）結合アッセイ（Nat  Chem  Biol.  2018  Jul;  14(7):  706-714を参照のこと）を行い、ステープルペプチド、リンカー、およびサリドマイド部分を組み込む一連のステープルペプチドデグロンキメラが、競合的ＦＰによってモニターしたとおりにセレブロンへの結合を可変的に保持することができることを実証した（図８）。ＧＦＰ−ＢＲＤ４（例示的な標的タンパク質）の発現、ならびにセレブロンおよびＢＲＤ４を結合させ、ＢＲＤ４分解を誘導する小分子タンパク質分解標的化キメラ（「ＰＲＯＴＡＣ」）であるｄＢＥＴ６の投与を伴う細胞アッセイを使用することによって、ステープルペプチド−サリドマイドキメラが細胞に侵入し、セレブロン結合に対してｄＢＥＴ６と競合し、その結果ＧＦＰ−ＢＲＤ４を回復させることができる点を更に実証した（図９）。これらのデータによって、ステープルペプチドデグロンキメラは、標的タンパク質相互作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで保持することができ、細胞にアクセスし、ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏでの天然タンパク質分解誘導薬に結合することが実証された。
【０２１４】
（実施例３）
ステープルＢＩＭ  ＢＨ３ペプチドヘリックス−サリドマイドデグロンキメラによって標的とされる抗アポトーシスＢＣＬ−２ファミリータンパク質の分解。
プロアポトーシスＢＩＭ  ＢＨ３ドメインをモデルにし、デグロン（例えば、Ｌｙｓ−デグロン、図２〜４）が組み込まれたステープルペプチドヘリックス−デグロンキメラペプチド（図１）を、がん細胞の生存率および化学療法抵抗性を促進するＭＣＬ−１などの抗アポトーシスＢＣＬ−２ファミリータンパク質を発現するＡ３７５Ｐ黒色腫細胞に適用した。化合物を１０μＭで処置し、続いて細胞ＭＣＬ−１レベルを、溶解物のウエスタンブロットによってモニタリングすると、ＭＣＬ−１タンパク質において時間依存性の減少が、早くても２時間の時点で示された（図１０）。重要なことには、アクチンタンパク質レベルに対するウエスタンブロット対照は減少を示さなかった。これらのデータによって、デグロン部分が誘導体化されたＢＩＭ  ＢＨ３ヘリックスによってＭＣＬ−１を標的とすると、処置時間内にがん細胞におけるＭＣＬ−１タンパク質のレベルを減少させることができたことが実証される。
【０２１５】
（実施例４）
ステープルｐ５３ペプチドヘリックス−サリドマイドデグロンキメラによって標的とされるＭＤＭ２がんタンパク質（Oncoprotein）の分解。
ｐ５３のトランス活性化ドメインヘリックス（ＡＴＳＰ−７０４１）をモデルにし、サリドマイドデグロンにカップリングされたステープルペプチドデグロンキメラを、培養がん細胞（ＳＪＳＡ−１、ＳＪＳＡ−Ｘ）に適用し、ＭＤＭ２タンパク質レベルをウエスタンブロットでモニターし、ＡＴＳＰ−７０４１単独で処置された細胞中のものと比較した。実験を繰り返し、細胞生存率をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイによって測定した。データによって、ＭＤＭ２レベルが、ＡＴＳＰ−７０４１単独で処置された細胞と比較して、ＡＴＳＰ−７０４１にカップリングされたサリドマイドデグロンで処置された細胞において低下したことが実証される（図１１）。更に、各ステープルペプチドデグロンキメラは、がん細胞生存率を用量応答様式で低下させた（図１２）。リンカーの組成物は、生物活性の有（図１２、左）無（図１２、右）に影響を与えた。
【０２１６】
（実施例５）
Ｃｏｐ１介在性タンパク質分解
一次デグロンは、同種のユビキチンＥ３リガーゼによって認識可能な特定の配列パターンを含むペプチドモチーフとして定義される。一次デグロンは、構造的に不規則なタンパク質領域内の通常短い直鎖状モチーフである（Guharoy,  M.  et  al.,  Nat  Commun.,  7:10239,  doi:10.1038/ncomms10239  (2016)）。Ｅ３リガーゼＣｏｐ１によって認識されるタンパク質Ｔｒｉｂ１からの一次デグロン配列は、アミノ酸配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）である。タンパク質Ｔｒｉｂ１の背景において、配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）は、Ｃｏｐ１にＴｒｉｂ１を結合させ、Ｔｒｉｂ１が基質アダプターとして機能し、Ｔｒｉｂ１に結合したタンパク質が分解の標的となるようにする（Uljon,  S.  et  al.,  Structure,  doi:10.1016/j.str.2016.03.002  (2016)）。配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）のＣｏｐ１に対する報告された結合親和性は２５０±４０ｎＭである。
【０２１７】
本発明者らは、Ｃｏｐ１に対する結合親和性を保持する配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）、およびその誘導体は、細胞タンパク質のＣｏｐ１介在性分解をもたらすポータブルデグロン配列として使用されて、以下に記載するような治療利益をもたらすことができることを見出した。
（１）直接的な遺伝子改変：構造的に不規則な領域における天然タンパク質残基を、配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）の誘導体で置き換えると、キメラタンパク質がＣｏｐ１によって分解される場合がある。例えば、Ｃｏｐ１発現ヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞において外因的に発現される場合、タンパク質ＨＤＭ２のｐ６０アイソフォームのＣ末端配列ＧＦＤＶＰＤ（配列番号２６）をＴｒｉｂ１由来配列ＤＱＩＶＰＤ（配列番号３０）で置き換えると、突然変異体タンパク質のＣｏｐ１介在性分解が生じる（図１３）。２９３Ｔ細胞における共免疫沈降研究によって、特定のデグロン配列組込み時の分解（図１３）と、Ｃｏｐ１と対応するＭｙｃ標識ＭＤＭ２  ｐ６０突然変異体構築物（例えば、ＤＱＩＶＰＤ（配列番号３０））との間の直接的な結合との間の相関が実証される（図１４）。
（２）ペプチドリガンド標的化：配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）の誘導体の、タンパク質を標的とするステープルペプチドへのコンジュゲートは、Ｃｏｐ１介在性分解のためのステープルペプチドの結合パートナーを標的とすることができる。これらのコンジュゲートの設計は、小分子サリドマイドがペプチド配列ＤＱＩＶＰＥＹ（配列番号２５）の誘導体で置き換えられており、コンジュゲートがペプチドリンカーを介して達成されることを除いて、図１で概要が示されるものと同じである（図１５）。
【０２１８】
（実施例６）
ステープルｐ５３ペプチドヘリックス−Ｔｒｉｂデグロンキメラによって標的とされるＭＤＭ２がんタンパク質の分解。
Ｃｏｐ１に結合するＴｒｉｂからの配列をモデルにしたペプチドデグロンにカップリングされたｐ５３のトランス活性化ドメインヘリックス（ＡＴＳＰ−７０４１）をモデルにしたステープルペプチドデグロンキメラを、培養がん細胞（ＳＪＳＡ−１、ＳＪＳＡ−Ｘ）に適用し、ＭＤＭ２タンパク質レベルを、ウエスタンブロットでモニターし、ＡＴＳＰ−７０４１単独で処置された細胞中のものと比較した。実験を繰り返し、細胞生存率をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイによって測定した。データによって、ＡＴＳＰ−７０４１単独で処置された細胞と比較して、ＡＴＳＰ−７０４１にカップリングされたＴｒｉｂデグロンで処置された細胞においてＭＤＭ２レベルが低下したことが実証される（図１７）。更に、各ステープルペプチドデグロンキメラは、がん細胞生存率を用量応答様式で低下させた（図１８）。
【０２１９】
（実施例７）
ステープルｐ５３ペプチドヘリックス−ＶＨＬデグロンキメラによって標的とされるＭＤＭ２がんタンパク質の分解。
ＶＨＬに結合する小分子デグロンにカップリングされたｐ５３のトランス活性化ドメインヘリックス（ＡＴＳＰ−７０４１）をモデルにしたステープルペプチドデグロンキメラを、培養がん細胞（ＳＪＳＡ−１、ＳＪＳＡ−Ｘ）に適用し、ＭＤＭ２タンパク質レベルを、ウエスタンブロットでモニターし、ＡＴＳＰ−７０４１単独で処置された細胞中のものと比較した。実験を繰り返し、細胞生存率をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイによって測定した。データによって、ＭＤＭ２レベルが、ＡＴＳＰ−７０４１単独で処置された細胞中のものと比較して、ＡＴＳＰ−７０４１にカップリングされたＶＨＬデグロンで処置された細胞において低下したことが実証される（図１９）。更に、各ステープルペプチドデグロンキメラは、がん細胞生存率を用量応答様式で低下させた（図２０）。
【０２２０】
（実施例８）
選択的ステープルＢＨ３ペプチドヘリックス−ステープルｐ５３ペプチドデグロンキメラによって標的とされるＭＣＬ−１がんタンパク質の分解。
ＭＣＬ−１を選択的に標的とするＭＣＬ−１ＢＨ３ヘリックスをモデルにしたステープルペプチドデグロンキメラ（図２１）、ｐ５３のトランス活性化ドメインヘリックスをモデルにしたステープルペプチドデグロンにカップリングし、ＭＤＭ２をＭＣＬ−１に動員し、非標準的なＭＤＭ２介在性ユビキチン化を誘発し、ＭＣＬ−１を分解することを目的とした。（以下に記載する）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのユビキチン化アッセイを使用して、ステープルペプチドデグロンキメラを、組換えＭＣＬ−１、組換えＭＤＭ２、Ｅ１酵素、Ｅ２酵素（ＵＢＥ２Ｄ３）およびＡＴＰに添加すると、ＭＣＬ−１のユビキチン化が誘発されることを観察した（図２２）。これらの結果によって、ＭＤＭ２を、ステープルペプチドデグロンキメラの存在下のみでＭＣＬ−１に完全に動員することに成功し、ユビキチン化マシナリーによってユビキチンがＭＣＬ−１に移動したことが示される。
【０２２１】
（実施例９）
選択的小分子ＢＲＤ４阻害剤−ステープルｐ５３ペプチドデグロンキメラによって標的とされるＢＲＤ４がんタンパク質の分解。
ＢＲＤ４を強力に標的とする小分子を、ｐ５３のトランス活性化ドメインヘリックスをモデルにしたステープルペプチドデグロンにカップリングし（図２３）、ＭＤＭ２をＢＲＤ４に動員し、非標準的なＭＤＭ２介在性ユビキチン化を誘発し、ＢＲＤ４を分解することを目的とした。上述と同様の様式で（実施例８を参照のこと）、誘発した組換えＭＣＬ−１タンパク質のユビキチン化を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを利用し、本発明者らのステープルペプチドデグロンキメラが、ＭＤＭ２をユビキチン化組換えＢＲＤ４タンパク質に動員することができるかどうか試験を行った（例えば、一部：アミノ酸３４２〜４６０またはアミノ酸４９〜１７０）。ステープルペプチドデグロンキメラを添加すると、各組換えＢＲＤ４タンパク質の上方シフトを誘発し、ＭＤＭ２によるユビキチンの標的ＢＲＤ４タンパク質への移動を示した（図２４）。がん細胞における天然ＢＲＤ４レベルへの効果を評価するために、Ｕ２ＯＳがん細胞系を、１０μＭ投薬量の本発明者らのステープルペプチドデグロンキメラで処置すると、経時的な（例えば、０から６時間）のＢＲＤ４タンパク質レベルにおける漸減によって反映されるように天然ＢＲＤ４の時間応答性分解が観察された（図２５）。これらのデータによって、本発明者らのステープルペプチドデグロンキメラは、ＭＤＭ２を効果的に転用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＲＤ４のユビキチン化を行い、天然ＢＲＤ４の分解をｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏで誘発できることが示される。
【０２２２】
材料および方法
ステープルペプチドデグロンキメラによって誘発される、組換えタンパク質標的のユビキチン化のモニタリング
タンパク質標的のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのユビキチン化をモニターするために、市販のＭｄｍ２／ＨＤＭ２ユビキチンリガーゼキット（Ｋ−２００Ｂ）を用いた。簡潔には、キメラ（１０μＭ）、組換え完全長ＭＤＭ２（ＧＳＴ標識、１μＭ）、Ｅ１酵素（ＵＢＥ１、５０ｎＭ）、Ｅ２酵素（ＵＢＥ２Ｄ３、１μＭ）、ユビキチン（１００μＭ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）および組換え標的タンパク質（１００ｎＭ）を、反応緩衝液中で１．５ｍＬのマイクロチューブにおいて合わせた。混合物を３７℃で６時間インキュベートした。その後、標準的なウエスタンブロット技術を使用して、反応混合物２０μＬをアッセイし、それによって標的タンパク質に対して生成された抗体を使用し、ユビキチン化によって上昇したバンドシフトを可視化した。
【０２２３】
ステープルペプチドデグロンキメラによって誘発されるｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏでの天然タンパク質分解のモニタリング。
細胞内タンパク質分解に関してアッセイするために、がん細胞（例えばＳＪＳＡ−１、ＳＪＳＡ−Ｘ、Ｕ２ＯＳ）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）を含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）培養培地（ＣＭ）中で、３７℃で湿度制御されたＣＯ２平衡化インキュベーターにおいて継代した。処置の前日に、細胞を継代し、６ウェルプレート中に１００，０００細胞／ｍＬの密度で播種した。２４時間後、細胞を、ステープルペプチドデグロンキメラ（例えば、１０μＭ）で０、２、４および６時間処置し、その後、これらを採取し、溶解した。次いで細胞溶解物を、標的タンパク質に対して生成された抗体を使用し、標準的なウエスタンブロット技術を使用してアッセイし、タンパク質レベルおよび負荷対照に関するアクチン抗体を評価した。
【０２２４】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに併記してきたが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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