(57)【要約】間葉系細胞凝集体およびヒドロゲルを含む組成物が提供される。組成物はさらに薬物または成長因子を含むことができる。間葉系細胞凝集体は、結合組織細胞、あるいはコラーゲンおよびグリコサミノグリカンなどの結合組織細胞外マトリックスを生成することができる前駆細胞を含んでいてよい。結合組織欠損、軟骨損傷、および軟骨劣化を処置する方法も提供される。
2021517121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）間葉系細胞凝集体（ＣＭＢ）；および
ｂ）ヒドロゲル；
を含む組成物。
【請求項２】
ｃ）１つまたは複数の薬物または成長因子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ポリマーマイクロスフェアをさらに含み、１つまたは複数の薬物または成長因子がポリマーマイクロスフェアに封入されている、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーマイクロスフェアが、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、またはＰＬＧＡとＰＬＡの組合せを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＣＭＢが、結合組織細胞と軟骨細胞、腱細胞、靱帯細胞または半月板細胞を形成することができる前駆細胞とから選択される細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＣＭＢが、軟骨、腱、靭帯または半月板から分離された細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が、軟骨細胞、腱細胞、腱芽細胞、線維細胞または線維芽細胞である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＣＭＢが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）、臍帯血幹細胞（ＵＢ−ＭＳＣ）、神経堤幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、および初代軟骨細胞から選択される幹細胞を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞が、同種供給源または自家供給源に由来する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞が、抗免疫原性および／または免疫抑制性である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＣＭＢが、約−１℃未満の温度で少なくとも１日凍結保存される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＣＭＢが、０℃〜３０℃の間の温度で少なくとも１日低温保存される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＣＭＢ中の細胞が、その細胞表面上に実質的または検出可能な量のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６を発現しない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ヒドロゲルが、フィブリン糊、多血小板血漿（ＰＲＰ）、Ｉ型コラーゲン、キトサン、ゼラチン、ポリエチレングリコールジアクリレート、ヒアルロン酸、ならびにフィブリン糊、ＰＲＰ、Ｉ型コラーゲン、キトサン、ゼラチン、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびヒアルロン酸の任意の組合せから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記成長因子がＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記成長因子が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬからなる群より選択される形態形成タンパク質である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１７】
インスリン、トランスフェリン、ヒト血清アルブミン、プロリン、ウシ血清アルブミン、セレン酸、リノール酸、デキサメタゾン、およびアスコルビン酸のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＣＭＢが、単細胞を含む懸濁液中にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＣＭＢはサイズが均一または不均一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が注射可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物を結合組織または結合組織の周囲の領域に投与することを含む、患者における結合組織欠損を治療する方法。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物を軟骨または軟骨の周囲の領域に投与することを含む、患者における軟骨劣化を予防する、または軟骨損傷、軟骨変性疾患もしくは軟骨障害を処置する方法。
【請求項２３】
前記軟骨が関節軟骨である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記軟骨が非関節軟骨である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記軟骨が、鼻軟骨、耳介軟骨、気管気管支軟骨、肋軟骨、半月板および椎間板からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に１〜２０％（ｗ／ｗ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む組織を形成するのに有効である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）のコラーゲンを含む組織を形成するのに有効である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に少なくとも１００ｋＰａのヤング率および最大０．８の摩擦係数を有する軟骨を形成するのに有効である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に軟骨を形成するのに有効であり、その軟骨は、前記部位またはその周囲の任意の隣接する軟骨および軟骨下骨組織と癒合する、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨組織を形成する方法。
【請求項３１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物を、断裂もしくは破裂した結合組織に、または断裂もしくは破裂した結合組織の周囲の領域に投与することを含む、患者における断裂または破裂した結合組織を処置する方法。
【請求項３２】
前記結合組織が、靭帯、腱または半月板である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は２０１８年３月６日出願の米国仮出願第６２／６３９，３２２号の優先権を主張し、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
軟骨損傷は毎年約１００万人のアメリカ人に影響を及ぼし、結果として５０万件を超える軟骨関連処置が行われる（非特許文献１）［１］。軟骨損傷を処置する現在の方法には、デブリードマン（壊死組織切除）およびマイクロフラクチャー法（非特許文献２）［２］、骨髄刺激法、自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）（非特許文献３）［３］、マトリックス誘導性自家軟骨細胞移植（ＭＡＣＩ）（非特許文献４）［４］、モザイクプラスティ法（非特許文献５）［５］、自家骨軟骨移植および骨軟骨同種移植（非特許文献６〜８）［６−８］が含まれる。毎年少なくとも３５万件の膝関節置換術が行われ、軟骨病変が＞６０％の症例に存在する（非特許文献９）［９］。そのような処置の数は、人口増加、長寿、および診断ツールの進歩により増加すると予測される。
【０００３】
軟骨病変はしばしば他の関節損傷と関連し、関節変性および変形性関節症（ＯＡ）に進行する可能性がある（非特許文献１０）［１０］。ＯＡはアメリカ人の約２０％に影響を及ぼし、ＯＡ患者の１０％は活動制限がある。ＯＡの年間コストは、１３００億ドルを超えると推定される。世界保健機関は、ＯＡを無病寿命および障害に対する影響に関して４番目の条件としてランク付けしたが、一方、疾病管理予防センターは、関節炎が米国における障害の最大の原因であると決定した（非特許文献１１）［１１］。変形性関節症は、外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）として若い人にも影響を及ぼす（非特許文献１２）［１２］。ＰＴＯＡは、股および膝の症候性関節炎の１２％の原因となり、関連するコストは年間３０億ドルを超えると推定される。ＰＴＯＡおよびその他の一般的な軟骨損傷は現役軍人に特に影響を与え、民間人と比べてすべての一般的な軟骨損傷の発生率が約１０倍である。例として、ＡＣＬおよび半月板損傷はそれぞれ、毎年１０００人の兵士のうち３．６５人および〜６．５人に影響を与える。民間人の対応する割合は、１０００人中〜０．３４および〜０．４５である（非特許文献１３）［１３］。軍人および若者におけるＰＴＯＡおよび軟骨損傷を処置する大きなニーズがある。
【０００４】
骨軟骨欠損を処置するための最も一般的な手順は、マイクロフラクチャー法、モザイクプラスティ法、同種または自家骨軟骨移植、ＡＣＩ、そして最近ではＭＡＣＩである。すべての手法には、サイズ制限、患者の年齢、および周囲の軟骨の質により影響されるいくつかの欠点がある。欠点には、生体力学的特性の低下、長い回復期間、二重の手術、およびドナー組織の必要性が含まれる。成功率は低い傾向があり、術後１〜５年で失敗するリスクが高い。
【０００５】
自家移植および同種移植が軟骨損傷の処置に使用されている。自家移植は、直径３ｃｍまでの病変に有効であることが示されており、アスリートの間でも良好ないし極めて優れた結果が報告されている（非特許文献１４）［１４］。同種骨軟骨移植はこれまで戦闘兵士に利用されており、彼らが軍の職務に戻ることを可能にする［１５］。しかしながら、同種骨軟骨移植は、民間人に比べた場合に、現役軍人で成功率が低いことが証明されている。遡及的検討では、現役集団の膝での同種骨軟骨移植の有効性を分析し、処置後に患者が元の状態に戻る能力に焦点を当てた（非特許文献１６）［１６］。膝の大きな病変に対するこの手術方法は、民間の患者の間では良好な成功率であったが、特に肉体的に過酷な軍事的職務についている場合には、負傷した兵士が現役に留まることを保証できなかった。同種骨軟骨移植によって処置された多くの患者は、以前の職務で現役を続けることができなかった。軍に代替案がほとんどない軍人のために、改善された移植療法が必要とされている。また、プロやアマチュアのアスリート、消防士、および警察官などの比較的身体的にアクティブなライフスタイルを送る人々のためにも改善された移植療法が必要とされている。
【０００６】
移植用の軟骨の調製にはまだ改善が必要である。軟骨は、強い臨床的必要性と、この組織の無血管性および低い細胞密度の両方のせいで、長い間、組織工学の分野の主な焦点であった。軟骨組織工学は、主に天然の軟骨から抽出された初代軟骨細胞を利用することによって進歩してきた。これらの極めて活性であるが表現型的に安定しかつ成熟した細胞は、軟骨基質を生成することができる。単純な培養システムでさえ、数ミリメートルの厚さの初代軟骨細胞から生存可能な軟骨組織構築物を作成することができる。また、動的流動環境のバイオリアクターでの培養は、親軟骨と同様の生化学的組成および機械的剛性を備えた軟骨をもたらした。軟骨組織工学では、幼若ウシ軟骨細胞を足場材料と組み合わせて使用して、天然組織の機械的特性に近い機械的特性を持つ軟骨を作成している。しかしながら、これらの方法は、入手可能性が限られ、また成体軟骨細胞から機能的な軟骨を作成する能力が限られている。
【０００７】
軟骨損傷に加えて、結合組織損傷も永続的な臨床課題である。米国では、損傷した腱、靭帯および関節包が、毎年報告されている３２００万の筋骨格損傷の４５％を占めている。さらに、スポーツへの参加の増加および人口の高齢化により、これらの発生率は上昇している。結合組織は修復が難しいことで有名である。現在の治療戦略には、しばしば膝蓋骨腱などの骨付き膝蓋腱自家移植片を用いた外科的再建が含まれる。この多組織組成物は、宿主組織への固着および癒合（integration）を改善する。しかしながら、これらの自家移植片は元の組織を十分に模倣しておらず、損傷前の組織機能、複雑な生化学的特性、および腱付着部構造を修復できない。その結果、自家移植手法は失敗率が高く再置換術を必要とし、患者の生活の質を損なう。
【０００８】
前駆幹細胞は、軟骨および結合組織を形成する可能性を有する。幹細胞から軟骨および結合組織を作成する多くの試みが、天然形態および機能を有する軟骨を完全に再生することを目的として検討されてきた。間葉系幹細胞（非特許文献１９）［１９］または軟骨細胞（ＮｅｏｃａｒｔやＭＡＣＩなど）から開始してｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨様組織を成長させることができる。しかしながら、これら製品の使用には、投与のために侵襲的手術が必要である。関節鏡視下手術などの低侵襲手術で軟骨および結合組織を再生することを目指した製品、または容易に入手可能な既製の製品で成功したものはまだない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【特許文献１】Riboh, J.C., et al., Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc., 2016.
【特許文献２】Goyal, D., et al., Arthroscopy, 2013. 29(9): p. 1579-88.
【特許文献３】Brittberg, M., et al., Clin. Orthop., 1996(326): p. 270-83.
【特許文献４】Jacobi, M., et al., Sports Med Arthrosc. Rehabil. Ther. Technol., 2011. 3(1): p. 10.
【特許文献５】Hangody, L., et al., Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc., 1997. 5(4): p. 262-7.
【特許文献６】O’Driscoll, S.W., et al., J. Bone Joint Surg. Am., 1986. 68(7): p. 1017-35.
【特許文献７】Bobic, V., The Journal of Regenerative Medicine, 2000. 1(4): p. 37-41.
【特許文献８】McNickle, A.G., et al., Sports Med. Arthrosc. Rev., 2008. 16(4): p. 196-201.
【特許文献９】Bobic, V., Medscape Orthopaedics & Sports Medicine eJournal, 2000. 4(1).
【特許文献１０】Bos, P.K., et al., Open Access Surgery, 2010. 3: p. 109-122.
【特許文献１１】Rivera, J.C., et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg., 2012. 20(1): p. S64-69.
【特許文献１２】Anderson, D.D., et al., J. Orthop. Res, 2011. 29(6): p. 802-809.
【特許文献１３】Olson, S., et al., Pathogenesis, Diagnosis and Management. 2015: Springer.
【特許文献１４】Hangody, L., et al., Cartilage Repair, 2008. 39(1): p. 32-39.
【特許文献１５】Eichinger, J.K., et al., Cartilage, 2011. 2(3): p. 307-311.
【特許文献１６】Scully, W.F., et al., Military Medicine, 2011. 176(10): p. 1196-1201.
【特許文献１７】Lima, E.G., et al., Biorheology, 2004. 41(3-4): p. 577-90.
【特許文献１８】Hu, J.C., et al., Tissue Eng., 2006. 12(4): p. 969-79.
【特許文献１９】Bhumiratana, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2014. 111(19): p. 6940-5.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記に鑑みて、天然様組織を再生することにより軟骨欠損および／または骨軟骨欠損を処置するための製品の改善された組成物を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書では、外傷、組織変性、外傷後変形性関節症、関節炎などの様々な原因により生じた、多領域の軟骨、半月板組織、靭帯、腱および筋肉の欠損（軟骨／骨軟骨欠損など）、断裂または破裂（tear or rupture）の治療法として使用される、軟骨、腱、および靭帯などの骨格組織および結合組織を再生するための改善された組成物および方法を記載する。
【００１２】
本明細書に記載される組成物および方法は、関節または非関節の軟骨欠損、腱欠損および靭帯欠損などの、結合組織欠損の処置への新規かつ改善されたアプローチを含む。利点には次のものが含まれる：（１）多種多様な欠損のサイズおよび形状への埋め込みを可能にする注射可能なプラットフォーム；（２）使いやすさおよび欠損の正確な充填；（３）軟骨形成、腱形成、組織形成を受けて、耐久的機能に重要な天然組織様の構造を形成することができる前駆細胞；（４）生体力学的特性（圧縮弾性率、摩擦係数、引張強度、および剪断強度）を有する天然様組織に細胞が発生する能力；（５）宿主組織とのシームレスで機械的に適格な界面の形成を可能にする、細胞から生成された間葉系細胞凝集体のｉｎ  ｖｉｖｏ成熟化；および（６）外傷性軟骨および結合組織損傷のオンデマンド処置に容易に利用できる既製（off-the shelf）の細胞ベースの組織製品。細胞は、培養の間中、および注射または埋め込み（implantation）の前後に生存可能である。宿主への組織癒合が促進される。臨床結果の改善および回復時間の短縮に加えて、繰り返しの手術および組織の異常を回避することができる。
【００１３】
一態様では、間葉系細胞凝集体（condensed mesenchymal cell body）（ＣＭＢ）およびヒドロゲルを含む組成物が提供される。ＣＭＢは、軟骨形成を受けることができる細胞から生成することができる。あるいは、ＣＭＢは、結合組織を形成する細胞から生成することができる。結合組織は、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸またはエラスチンを含み得る。コラーゲンには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＶＩＩＩ型、ＩＸ型、Ｘ型またはＸＩ型コラーゲンが含まれ得る。プロテオグリカンには、グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸、またはコンドロイチン硫酸が含まれ得る。ＣＭＢは、様々な種類の細胞外マトリックス（または細胞外基質）（ＥＣＭ）を含む組織へと発生することができる。ＥＣＭは、例えば、コラーゲン、グリコサミノグリカン、エラスチン、フィブロネクチン、および／またはラミニンを含み得る。組成物は、どの結合タイプが生成されているかに応じて、任意選択で１つまたは複数の薬物または成長因子を含むことができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリマーマイクロスフェアをさらに含み、１つまたは複数の成長因子がポリマーマイクロスフェアに封入される。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロスフェアは、乳酸・グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolic acid)）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、またはＰＬＧＡとＰＬＡの組合せを含む。一部の実施形態では、ＣＭＢは、結合組織細胞；および軟骨細胞、腱細胞、靱帯細胞または半月板細胞を形成することができる前駆細胞；から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＢは、軟骨、腱、靭帯、または半月板から分離された細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、腱細胞、腱芽細胞、線維細胞または線維芽細胞である。一部の実施形態では、ＣＭＢは、軟骨細胞；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）から選択される前駆細胞；あるいは軟骨、腱、靭帯および半月板などの天然組織から抽出される細胞（腱細胞、腱芽細胞、線維細胞、線維芽細胞が含まれるがこれらに限定されない）である。いくつかの実施形態では、ＣＭＢは幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）、臍帯血幹細胞（ＵＢ−ＭＳＣ）、神経堤幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、初代軟骨細胞、および神経堤幹細胞から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、細胞または幹細胞（例えば、ＭＳＣ、ＡＤＳＣ、ＢＭＳＣ、またはＵＢ−ＭＳＣ）は、同種供給源または自家供給源に由来する。いくつかの実施形態では、細胞または幹細胞（例えば、ＭＳＣ、ＡＤＳＣ、ＢＭＳＣ、またはＵＢ−ＭＳＣ）は、抗免疫原性（anti-immunogenic）および／または免疫抑制性である（例えば、Gimble, J.M. et al., "Adipose-Derived Stromal/Stem Cells: A Primer” Organogenesis, 2013, 9(1):3-10を参照）。いくつかの実施形態では、ＣＭＢおよび／または細胞は、約−８０℃または約−８０℃未満の温度で少なくとも約１日間凍結保存または保管される。いくつかの実施形態では、ＣＭＢおよび／または細胞は、約−１９６℃または約−１９６℃未満の温度で少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日間、約５日、約６日、または約１週間、凍結保存または保管される。いくつかの実施形態では、ＣＭＢおよび／または細胞は、−１℃〜−２５℃の間、または約−１℃未満の氷点下温度で、少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約１週間、凍結保存または保管される。いくつかの実施形態では、ＣＭＢは、約−２０℃、−２０℃、または約−２０℃未満で、少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約１週間、保管される。一部の実施形態では、ＣＭＢは、約−１０℃、−１０℃、または約−１０℃未満で、少なくとも１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約１週間、保管される。いくつかの実施形態では、ＣＭＢおよび／または細胞は、１℃〜３０℃の間または約３０℃未満の温度で、少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約１週間、低温保存または保管される。いくつかの実施形態では、ＣＭＢは、約４℃、４℃、または約４℃未満で、少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約１週間、保管される。いくつかの実施形態では、ＣＭＢは、約２５℃、２５℃、または約２５℃未満で、少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約１週間、保管される。
【００１６】
一部の実施形態では、ＣＭＢ中の細胞は、細胞表面上に実質的または検出可能な量のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６を発現しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＢ中の細胞は、イムノアッセイ、例えばフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＰＯＴ、定量ＰＣＲ、および混合リンパ球反応アッセイのうちの１つまたは複数を含むアッセイによると、細胞表面上に実質的または検出可能な量のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６を発現しない。
【００１７】
一部の実施形態では、ＣＭＢ中の細胞は、実質的な量のＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、またはＣＤ１４６を細胞表面上に発現する。一部の実施形態では、ＣＭＢ中の細胞は、細胞表面上に検出可能な量のＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、またはＣＤ１４６を発現する。いくつかの実施形態では、ＣＭＢ中の細胞は、イムノアッセイ、例えばフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＰＯＴ、定量ＰＣＲ、および混合リンパ球反応アッセイのうちの１つまたは複数を含むアッセイによると、細胞表面上に実質的な量のＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、またはＣＤ１４６を発現しない。いくつかの実施形態では、ＣＭＢ中の細胞は、イムノアッセイ、例えばフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＰＯＴ、定量ＰＣＲ、および混合リンパ球反応アッセイのうちの１つまたは複数を含むアッセイによると、細胞表面上に検出可能な量のＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、またはＣＤ１４６を発現しない。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、フィブリン糊、多血小板血漿（ＰＲＰ）、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、キトサン、ゼラチン、ポリエチレングリコールジアクリレート、ヒアルロン酸；ならびにフィブリン糊、ＰＲＰ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、キトサン、ゼラチン、ポリエチレングリコールジアクリレートおよびヒアルロン酸の任意の組合せ；から選択される。いくつかの実施形態では、成長因子は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーから選択され、そのメンバーには、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８が含まれる。一部の実施形態では、成長因子は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８が含まれるＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー、および相乗的に作用することが示されているそれらの任意の組合せから選択される（Choi, S. et al., Int. J. Oral. Sci., 2013, 5(1):7-13, and Hildner, F. et al., J. Biomed. Mater. Res. A, 2010, 94(3):978-87）。
【００１９】
いくつかの実施形態では、成長因子は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、成長因子は、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、ＣＴＧＦ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬからなる群より選択される形態形成タンパク質である。いくつかの実施形態では、組成物は、インスリン、トランスフェリン、ヒト血清アルブミン、プロリン、ウシ血清アルブミン、セレン酸、リノール酸、デキサメタゾン、およびアスコルビン酸のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＣＭＢの細胞は懸濁液中にある。
【００２１】
一部の実施形態では、ＣＭＢは、少なくとも１，０００個の細胞から作成される。いくつかの実施形態では、ＣＭＢは、少なくとも５，０００細胞、少なくとも１０，０００細胞、少なくとも１５，０００細胞、少なくとも２０，０００細胞、少なくとも２５，０００細胞、少なくとも３０，０００細胞、少なくとも４０，０００細胞、少なくとも５０，０００細胞、少なくとも６０，０００細胞、少なくとも７０，０００細胞、少なくとも８０，０００細胞、少なくとも９０，０００細胞、少なくとも１００，０００細胞、少なくとも１２５，０００細胞、少なくとも１５０，０００細胞、少なくとも１７５，０００細胞、少なくとも２００，０００細胞、少なくとも２２５，０００細胞、少なくとも２５０，０００細胞、少なくとも３００，０００細胞、少なくとも４００，０００細胞、または少なくとも５００，０００細胞から作成される。
【００２２】
一部の実施形態では、ＣＭＢはサイズが均一である。例えば、ＣＭＢは、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約８００μｍ、約１ｍｍ、約１．２ｍｍ、約１．４ｍｍ、約１．６ｍｍ、約１．８ｍｍ、約２．０ｍｍ、約２．２ｍｍ、約２．４ｍｍ、約２．６ｍｍ、約２．８ｍｍ、または約３ｍｍの直径を有していてよい。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＣＭＢはサイズが様々である。ＣＭＢの直径は２００μｍ〜３．０ｍｍであり得る。ＣＭＢの直径は２００μｍ〜８００μｍであり得る。ＣＭＢの直径は４００μｍ〜１．０ｍｍであり得る。ＣＭＢの直径は６００μｍ〜１．２ｍｍであり得る。ＣＭＢの直径は８００μｍ〜１．６ｍｍであり得る。ＣＭＢの直径は１．０ｍｍ〜１．８ｍｍであり得る。ＣＭＢの直径は１．２ｍｍ〜２．０ｍｍであり得る。ＣＭＢの直径は１．４ｍｍ〜２．４ｍｍであり得る。ＣＭＢの直径は２．０ｍｍ〜３．０ｍｍであり得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組成物は注射可能である。
【００２５】
別の態様では、上記および本明細書に記載の任意の組成物を軟骨または軟骨の周囲の領域に投与することを含む、患者における軟骨欠損を処置する方法が提供される。
【００２６】
別の態様では、上記および本明細書に記載の組成物のいずれかを軟骨または軟骨の周囲の領域に投与することを含む、患者における軟骨劣化（cartilage degradation）を予防する、または軟骨損傷、軟骨変性疾患もしくは軟骨障害を処置する方法が提供される。
【００２７】
上記の方法のいくつかの実施形態では、軟骨は関節軟骨である。上記の方法のいくつかの実施形態では、軟骨は非関節軟骨である。いくつかの実施形態では、非関節軟骨は、鼻軟骨、耳介軟骨、気管気管支軟骨、肋軟骨、半月板および椎間板からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、この方法は、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に、１〜２０％（ｗ／ｗ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む軟骨組織を形成するのに有効である。いくつかの実施形態では、この方法は、０．５〜２０％（ｗ／ｗ）のコラーゲンを含む軟骨組織を形成するのに有効である。いくつかの実施形態では、この方法は、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に、少なくとも１．２％（ｗ／ｗ）、１．３％（ｗ／ｗ）、１．４％（ｗ／ｗ）、１．５％（ｗ／ｗ）、または１．６％（ｗ／ｗ）のコラーゲンを含む軟骨組織を形成するのに有効である。いくつかの実施形態では、この方法は、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位において、少なくとも１００ｋＰａのヤング率および最大０．８の摩擦係数を有する軟骨を形成するのに有効である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、この方法は、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に軟骨を形成するのに有効であり、軟骨は、その部位またはその部位の周囲の任意の隣接する軟骨および軟骨下骨組織と癒合する（integrated）。
【００２９】
いくつかの実施形態では、この方法は、組織の断裂または破裂、組織の変性、損傷、または変性障害の部位で天然組織を一緒に結合させるのに有効である。様々な実施形態において、腱、靭帯、半月板、筋肉などの組織は、軟骨、骨、筋肉、他の結合組織、または同じタイプの組織などの任意の隣接する組織と癒合する。
【００３０】
別の態様では、本明細書に記載の任意の組成物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨組織を形成する方法が提供される。
【００３１】
別の態様では、断裂または破裂した結合組織あるいは断裂または破裂した結合組織の周囲の領域に上記の組成物のいずれかを投与することを含む、患者における断裂または破裂した結合組織を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、結合組織は、靭帯、腱、または半月板である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＡＤＳＣを介した軟骨形成に対する凍結保存の影響を試験するためのプロトコルを示す。左の「細胞（２−Ｄ）」の下は、ＣＭＢの形成前にＡＤＳＣがどのように処理されるかを示す概略図である。「フレッシュ（Ｆｒｅｓｈ）」ＡＤＳＣは全く凍結保存されず、一方、「ＳＶＦクライオ（ＳＶＦ  Ｃｒｙｏ）」および「ｐ１クライオ（Ｐｌ  Ｃｒｙｏ）」ＡＤＳＣは、凍結保存されて液体窒素中で少なくとも１か月間保管される。「ｐ１クライオ」ＡＤＳＣは、凍結保存前に１回継代されるが、「ＳＶＦクライオ」ＡＤＳＣは、凍結保存前に継代されない。右の「ペレット（３−Ｄ）」の下には、マルチウェルプレートでのＣＭＢの形成と、それに続く試験サンプルでの別のラウンドの凍結保存の説明である。ＣＭＢを形成するために、新鮮な人間の脂肪吸引物から採取した間質血管細胞群（ＳＶＦ）をプレーティングおよび継代し、ＡＤＳＣを採取して軟骨形成培地に２５０，０００細胞／ｍＬで再懸濁するときにＰ０〜Ｐ１０であるようにする。続いて、９６ウェルのディープウェルプレートにウェルあたり１ｍＬの細胞懸濁液を分注し、３００ｇで５分間遠心分離する。遠心分離後、ＣＭＢを軟骨形成培地で維持する。
【図２】凍結保存されなかったサンプル（フレッシュ）、採取直後に凍結保存され、解凍して１〜４回継代されたサンプル（ＳＶＦクライオ）、および１回継代され、凍結保存され、解凍され、１〜４回継代されたＡＤＳＣ（Ｐ１クライオ）における、脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の継代数に対する集団倍加時間のグラフを示す。
【図３】ＡＤＳＣに対する凍結保存の影響を試験するためのプロトコルを示す。プロトコルは、ＣＭＢが凍結保存されないことを除いて図１と同様である。
【図４Ａ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰｌクライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。直径の試験結果を示す。
【図４Ｂ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰｌクライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。湿重量の試験結果を示す。
【図４Ｃ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰｌクライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。湿重量に対するＤＮＡの質量比の試験結果を示す。
【図４Ｄ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰｌクライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。湿重量に対するＧＡＧの質量比の試験結果を示す。
【図４Ｅ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰｌクライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。湿重量に対するコラーゲンの質量比の試験結果を示す。
【図４Ｆ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰｌクライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。培養中のフレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰｌクライオの各集団の外観を示す。図４Ｆのスケールバーは０．５ｍｍである。
【図５】ＡＤＳＣから調製した間葉系細胞凝集体（ＣＭＢ）のペレットに対する凍結保存の影響を試験するためのプロトコルを示す。
【図６Ａ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰ１クライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。直径の試験結果を示す。
【図６Ｂ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰ１クライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。湿重量の試験結果を示す。
【図６Ｃ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰ１クライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。湿重量に対するＤＮＡの質量比の試験結果を示す。
【図６Ｄ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰ１クライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。湿重量に対するＧＡＧの質量比の試験結果を示す。
【図６Ｅ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰ１クライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。湿重量に対するコラーゲンの質量比の試験結果を示す。
【図６Ｆ】フレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰ１クライオのＡＤＳＣ集団での様々なパラメーターの試験結果を示す。培養中のフレッシュ、ＳＶＦクライオおよびＰｌクライオの各集団の外観（図６Ｆ）を示す。
【図７Ａ】フローサイトメトリーにより軟骨形成ＣＭＢ上の様々な抗原をアッセイした結果を示す。陰性対照として使用したＩＳＯ抗体で陰性発現が認められ、一方、陽性対照として使用したＣＤ５９およびＣＤ９０では陽性発現が認められた。試験した免疫原性マーカーＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は陰性であった。
【図７Ｂ】生きているＡＤＳＣでの様々な抗原の発現レベルを示す。
【図８】シリコーン外植片欠損モデルでヒドロゲルとＣＭＢの組合せを試験する実験プロトコルを示す。
【図９Ａ】骨軟骨欠損モデルにおける空の欠損の写真である。
【図９Ｂ】コラーゲンゲル−ＣＭＢ充填欠損を示す写真である。
【図９Ｃ】欠損内に充填成分が保持されている、コラーゲンゲル−ＣＭＢ充填欠損の半断面を示す写真である。
【図１０Ａ】経時的な薬物放出を調べるための実験プロトコルを示す。
【図１０Ｂ】経時的な成長因子の観察された放出を示す。
【図１１Ａ】ＧＡＧ含有量が、負荷軟骨充填材および非負荷対照軟骨充填材の両方で類似していたことを示す。
【図１１Ｂ】湿重量に対して約５％のコラーゲンである非負荷対照と比較して、負荷により湿重量に対して１０％までコラーゲン含有量が改善されることを示す。
【図１２】軟骨充填製品の製造および送達プロセスの概略を示す。細胞、ヒドロゲル、および成長因子成分を個々に調製し、必要になるまで保管し、その後、欠損部位への注射のためにシリンジで混ぜ合わせる。
【図１３】ウシ軟骨外植片欠損へのフィブリンおよび様々なヒアルロン酸／コラーゲンヒドロゲル製剤の送達を示す。組成物は不透明度および保持力が異なる。
【図１４】ＣＭＢを含む１つのヒドロゲル組成物の外植片欠損への送達を示す。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養後、新しく形成された組織は天然の軟骨に癒合し、天然の軟骨に匹敵するグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの含有量を示した。
【図１５Ａ】多様なＣＭＢ、ヒドロゲルおよび成長因子を用いて作成した軟骨構築物を示す。組織は、５０，０００〜２５０，０００細胞／ＣＭＢの範囲の様々な細胞量を有する多様なＣＭＢから製造できる。
【図１５Ｂ】様々なＣＭＢサイズで作成した軟骨構築物の組織学的染色を示す。結果は、実験群間で同等のグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの含有量を示す。
【図１５Ｃ】様々なＣＭＢサイズで作成した軟骨構築物の定量的特性評価を示す。結果は、実験群間で同等の湿重量、ならびにＤＮＡ、ＧＡＧおよびコラーゲンの含有量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の様々な実施形態の原理および特徴の理解を容易にするために、様々な例示的な実施形態を以下に説明する。本発明の例示的な実施形態を詳細に説明するが、他の実施形態も企図されることを理解されたい。したがって、本発明の範囲が以下の説明または実施例に示される要素の構成および配置の詳細に限定されることは意図されていない。本発明は、他の実施形態も可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。また、例示的な実施形態を説明する際に、明確にするために特定の用語が使用される。
【００３４】
定義
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数への言及が含まれることに留意されたい。例えば、構成要素への言及は、複数の構成要素の組成物を含むことも意図されている。構成要素を含む組成物への言及は、指定されたものに加えて他の構成要素を含むことが意図されている。言い換えると、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、数量の制限を示すものではなく、言及される項目の「少なくとも１つ」の存在を示すものである。各用語は、当業者によって理解されるその最も広い意味を企図しており、同様の目的を達成するために同様に動作するすべての技術的同等物を含むことが意図されている。
【００３５】
本明細書では、範囲は、「約」、「およそ」または「実質的に」１つの特定の値からおよび／または「約」または「およそ」または「実質的に」別の特定の値までとして表現することができる。そのような範囲が示される場合、他の例示的な実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。さらに、「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行にしたがって、許容可能な標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所定の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、さらに好ましくは最大±１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は暗黙的であり、この文脈では、特定の値の許容誤差範囲内を意味する。
【００３６】
「含む」、「含有する」または「含まれる」とは、少なくとも指定された化合物、要素、粒子、または方法ステップが組成物または物品または方法に存在するが、他のそのような化合物、材料、粒子、方法ステップが指定されたものと同じ機能を有する場合でさえ、他の化合物、材料、粒子、方法ステップの存在を排除しないことを意味する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、用語「ヒドロゲル」および「足場（scaffold）」は、イオン性の水溶性多糖類、例えばセルロース（例えば、ＮａＣＳまたはＮａＣＰ）を含むポリマーのネットワークを含む、本明細書で教示および記載されるヒドロゲル組成物を意味することができるが、決してそれらに限定されない。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「コラーゲン」という用語は、結合組織の主成分として存在してそれに強度と柔軟性を与える細胞外の密接に関連するタンパク質ファミリーのいずれかを意味することができるが、決してこれらに限定されない。少なくとも１４のタイプが存在し、それぞれが共通の三重らせん形状を共有するがタイプ間で構成が多少異なるトロポコラーゲン単位で構成され、各タイプは異なる組織、段階、または機能に限局している。最も一般的なＩ型を含む一部のタイプでは、トロポコラーゲンのロッドが会合してフィブリルまたは線維を形成する；他のタイプでは、ロッドはフィブリル状（線維状）ではないが、線維性コラーゲンと関連しており、また他のタイプでは、非線維性で非周期的であるが構造化されたネットワークを形成する。軟骨は、軟骨細胞または軟骨細胞様細胞および細胞内物質、プロテオグリカン、および他のタンパク質を含むことができる。軟骨には、関節および非関節軟骨が含まれる。
【００３９】
「関節軟骨」は、硝子軟骨とも呼ばれ、無血管の非石灰化結合組織を指し、それは関節の骨の関節面を覆い、２つの対向する骨表面間の摩擦を低減する接合面として機能する。関節軟骨は、骨と骨との直接の接触なしに関節の動きを可能にする。軟骨表面は、肉眼では滑らかで真珠のように見え、高拡大倍率では細かく粒状である。関節軟骨は、ＩＩ型およびＩＸ型コラーゲンや様々な特徴付けられたプロテオグリカンの存在、ならびに軟骨内骨化に関連するＸ型コラーゲンの不在を伴う。
【００４０】
「非関節軟骨」は、関節表面を覆わない軟骨を指し、線維軟骨（関節間線維軟骨、線維軟骨円板、結合線維軟骨および関節周縁線維軟骨（circumferential fibrocartilage）を含む）および弾性軟骨が含まれる。線維軟骨では、微小多糖（micropolysaccharide）ネットワークが、突き出たコラーゲンの束と織り交ぜられており、軟骨細胞が硝子軟骨または関節軟骨におけるよりも広く散在している。関節間線維軟骨は、衝撃に曝されかつ頻繁な動きを受ける関節、例えば、膝の半月板に見られます。そのような関節の例には、顎関節、胸鎖関節、肩鎖関節、手首関節および膝関節が含まれるが、これらに限定されない。線維軟骨結合（Secondary cartilaginous joint）は、線維軟骨の円板によって形成される。
【００４１】
「細胞」という用語は、限定はされないが、その通常の生物学的意味を有することができ、完全な多細胞生物を指すわけではない。細胞は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのものであってよく、例えば、細胞培養物中にある、または例えば、鳥類、植物、ならびにヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、およびネコなどの哺乳動物を含む、多細胞生物に存在していてもよい。細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）または真核細胞（例えば、哺乳動物または植物細胞）であってよい。
【００４２】
「セルロース」という用語は、その通常の生物学的意味を有することができるが、決してそれに限定されない。セルロースは、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎの有機化合物であり、たとえば、数百〜１万超のβ（１→４）結合されたＤ−グルコース単位の直鎖からなる多糖類である。
【００４３】
「欠損（defect）」または「欠損部位」という用語は、軟骨、骨軟骨組織、半月板、靭帯、または腱の破壊を指す。欠損は、「空隙（void）」の構成をとることがあり、これは、例えば、ギャップ、空洞、穴、あるいは軟骨および／または骨軟骨組織、半月板、靭帯、または腱の構造的完全性の他の実質的な破壊などの、三次元欠損を意味すると理解される。欠損は、骨または靭帯への付着点からの軟骨の剥離であってもよい。ある実施形態では、欠損は、それが内因性または自発的修復が不可能であるようなものである。欠損は、事故、病気、および／または外科的処置の結果であってよい。例えば、軟骨欠損は、断裂した半月板組織の関節内でのずれなどの関節への外傷の結果であり得る。軟骨欠損は、変形性関節症などの変性関節疾患からも生じる場合がある。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「成長因子」には、細胞の成長、増殖、修復および細胞分化を刺激することができる物質が含まれ得る。成長因子は薬物であってよい。薬物には、合成物質および天然物質が含まれる。成長因子には、骨形態形成タンパク質、線維芽細胞成長因子および血管内皮成長因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ポリマー」という用語は、５つ以上のモノマーと呼ばれる同一の結合単位の化学結合によって形成される高分子を意味することができるが、これに限定されない。ほとんどの場合、モノマーの数は非常に多く、正確に知られていないことがよくある。合成ポリマーでは、この数は所定の範囲に制御できる。２、３、または４つのモノマーの組合せはそれぞれ、二量体、三量体、および四量体と呼ばれ、まとめてオリゴマーと呼ばれる。ポリマーは、無機（例えば、シロキサン、硫黄鎖、黒リン、ホウ素−窒素、シリコーン）であっても、また有機（炭素を含むことを意味する）であってもよい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ホモポリマー」という用語は、単一モノマーに由来する天然または合成ポリマーを意味することができるが、決してそれに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「多糖」という用語は、グルコースおよび／または関連分子（例えば、グルクロン酸、ガラクトース、ガラクトサミン、グルコサミン、アセチルグルコサミン）などの単糖（単糖類）が連結されたものから構成される長鎖天然または合成ポリマーを意味することができるが、決してこれらに限定されない。２つの単糖分子は、例えば、グルコースとフルクトースが結合してスクロースを生成する場合のように、グリコシド結合によって連結されて二糖を形成することができる。デンプン、グリコーゲン、セルロースまたはキチンなどのより複雑な多糖類は、グリコシド結合によって連結された多数の単糖類単位で構成される。
【００４８】
「修復」という用語は、欠損部位の空隙または構造的不連続を少なくとも部分的に充填するのに十分である新たな組織形成、ならびに欠損の周囲の関節軟骨、非関節軟骨、靭帯、および腱などの天然組織と新たに形成された組織との癒合を指す。しかしながら、修復は、完全な治癒のプロセス、または欠損をその欠損前の生理学的／構造的／機械的状態に回復させるのに１００％効果的な処置を意味するものではなく、あるいは必要としない。
【００４９】
「治療的有効量」という用語は、修復、再生、促進、加速、劣化防止、または軟骨組織の形成に有効な量を指す。
【００５０】
「患者」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含む動物を指す。
【００５１】
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容されるアジュバント」という用語は、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体と一緒に患者に投与することができる非毒性担体またはアジュバントを指し、その薬理学的活性を破壊せず、熟練した開業医の知識に基づき許容できない免疫反応（例えば、重度のアレルギーまたはアナフィラキシーショック）を引き起こさない。例には、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルションなどのエマルション、および様々なタイプの湿潤剤などの、標準的な医薬担体の任意のものが含まれるが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与のための例示的な希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水または通常の（０．９％）生理食塩水である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、損傷の領域に遊走する可能性があり、また複数の異なる細胞表現型への終末分化を受けることができる娘細胞を生成する可能性がある、自己再生する能力と共に高い増殖能を有する未分化細胞を意味することができるが、これに限定されない。これらの細胞は、様々な細胞型に分化することができ、したがって、目的の病変組織または損傷組織の再生または修復を促進することができる。「細胞分化」という用語は、細胞が細胞型を獲得するプロセスを指す。本明細書で使用される「前駆細胞（progenitor cell）」という用語は、軟骨細胞、骨細胞、および脂肪細胞を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の標的細胞型に分化する柔軟性を維持する任意の系統の分離可能な細胞を指す。前駆細胞は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）またはコロニー形成細胞（ＣＦＣ）と称される。前駆細胞の特定の系統は、限定はされないがＣＦＵ−Ｆ（線維芽細胞の）などの接尾辞により示される。前駆細胞は、幹細胞のように特定の種類の細胞に分化することができる可能性があるが、すでに幹細胞よりも特異的であり、その「標的」細胞に分化するように後押しまたは刺激される。一般に、幹細胞は無期限に複製できるが、前駆細胞は限られた回数しか分裂できない。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「骨前駆細胞」、「軟骨前駆細胞」、「骨軟骨前駆細胞」、「間葉系細胞」、「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」、または「骨髄間質細胞」は、１つまたはいくつかの系統の経路に沿って、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、および腱細胞に分化できるＣＦＵ−Ｆ細胞から分化する多能性幹細胞を指すために互換的に使用される。単一のＭＳＣが培地や周囲の環境に応じて軟骨細胞または骨芽細胞に分化する能力を示しているため、骨または軟骨に言及する場合、ＭＳＣは通常、骨軟骨形成細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞、または骨前駆細胞として知られている。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「軟骨細胞」という用語は、軟骨基質を産生および維持する軟骨に見られる細胞を意味することができるが、決してそれに限定されない。最小分化したものから最終分化したものまでについて、軟骨細胞系譜は、（ｉ）コロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）；（ｉｉ）間葉系幹細胞／骨髄間質細胞（ＭＳＣ）；または（ｉｉｉ）軟骨細胞である。「軟骨形成」という用語は、軟骨形成細胞または軟骨化能を有する細胞（chondrocompetent cell）からの新しい軟骨の形成を指す。
【００５５】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、動物またはヒトに適切に投与された場合に、有害作用、アレルギーまたは他の有害な反応を生じない実体および組成物を意味することができるが、決してこれらに限定されない。
【００５６】
「薬学的に許容される担体」または「薬理学的に許容される担体」という用語は、医薬投与と適合性がある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味することができるが、これらに限定されない。適切な担体は、当該分野における標準的な参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体または希釈剤の例には、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。補足的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【００５７】
一態様では、間葉系細胞凝集体（ＣＭＢ）およびヒドロゲルを含む組成物が提供される。組成物は、任意選択で１つまたは複数の成長因子を含むことができる。
【００５８】
一部の実施形態では、ＣＭＢは、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）、臍帯血由来間葉系幹細胞（ＵＭ−ＭＳＣ）、滑膜由来間葉系幹細胞幹（ＳＭＳＣ）などの、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。ＡＤＳＣなどの幹細胞は、豊富な脂肪組織から入手でき、軟骨分化（chondrogenic differentiation）についての細胞の能力を損なうことなく多数に拡大できるため、組織工学のための臨床的に関連する細胞源を提供する。臨床グレードの同種ＢＭＳＣは、クライオバンク（ｃｒｙｏｂａｎｋ）から入手し、スクリーニングして最も強い軟骨形成レベルを示す細胞を選択することができる。これらのＭＳＣは免疫原性ではないかまたは免疫原性が低い可能性がある。ＭＳＣは、自己複製および長期増殖の能力を有することに加えて、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、ニューロン、および上皮細胞などの多様な細胞タイプに分化できる可能性がある。
【００５９】
ＭＳＣは、当業者に知られている様々な方法によって分離することができる。例えば、米国特許第６，１５３，４３２号を参照されたい。ＡＤＳＣを調製するために使用される脂肪組織は、大網脂肪組織などの様々な脂肪組織部位に由来することができる。脂肪組織は、脂肪吸引によって入手または分離することができ、分離される例示的な量は１０〜３００ｍＬの範囲である。ＢＭＳＣを調製するために使用される骨髄組織は、腸骨稜などの様々な骨髄組織部位に由来することができる。骨髄組織は針吸引により得られ、典型的な量はドナーの体重１ｋｇあたり約２０ｍＬの範囲で分離される。
【００６０】
ＭＳＣは、成長因子、ホルモン、およびサイトカインを発現する遺伝子を含むように操作できる。例えば、ＡＤＳＣは、有益な遺伝子、サイトカインまたは成長因子を発現するように操作することができる。例えば、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）を発現するように遺伝子改変されたＡＤＳＣを、炎症が起こっている場所（例えば、関節炎の関節）に移植することができる。ＡＤＳＣは、有益な抗炎症性サイトカインを発現することに加えて、軟骨細胞になることができるため、移植は対象に二重の恩恵をもたらす。
【００６１】
ＭＳＣ含有組成物を用いて、変形性関節症（ＯＡ）の患者を処置することができる。ＯＡは、関節軟骨の変性、マトリックス（または基質）の喪失、フィブリル化、および亀裂の形成を特徴とする。ＯＡは、軟骨表面の完全な喪失をもたらす可能性がある。関節軟骨の唯一の細胞である軟骨細胞は、高分子成分（コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびヒアルロン酸）の分泌と細胞外マトリックスの代謝回転の調節とを介して、細胞外マトリックスの恒常的合成および分解を維持する。ＯＡでは、同化および修復物質と比較して破壊的および炎症誘発性メディエーターが過剰に生成され、関節軟骨の進行性破壊を引き起こす。
【００６２】
ＭＳＣは抗免疫原性である可能性がある。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは同種供給源に由来する。
【００６３】
同種細胞にはいくつかの利点がある。同種細胞は容易に入手できるドナー組織から分離できるため、既製の組成物を製造することができる。いくつかのドナー細胞ロット間で軟骨形成能を試験および比較することにより、最終製品の品質を向上させることができる。単一のバッチから多数の細胞およびいくつかの製品を作成できるため、ユニバーサルドナーからの細胞はコストおよびばらつきを低減する［２０］
【００６４】
拡大された未分化ＭＳＣはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない場合がある。軟骨形成を誘導されたＭＳＣ（成長因子ＴＧＦ−β３およびＢＭＰ−６の適用などによる）もＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない場合がある。ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しないものなどの同種起源由来のＭＳＣは、免疫反応を誘発することなくドナーに埋め込みすることができる。埋め込まれたＡＤＳＣが免疫反応を誘起しないことを確認するために、様々な動物試験を行うことができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、組成物、ＣＭＢおよびＭＳＣは、フローサイトメトリーおよび混合リンパ球反応アッセイによると、細胞表面上に実質的または検出可能な量のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６を発現しない。ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現を欠く細胞は、免疫特権のある細胞と見なすことができる
【００６６】
これらのマーカーを検出するために、解凍したＣＭＢをＩ型コラゲナーゼ中にて３７℃で１時間インキュベートすることにより、単細胞懸濁液に分離する［２１］。次に、ほぼ等容量の軟骨形成培地と細胞懸濁液で消化物を中和し、さらに２０Ｇ針を通して再懸濁させることにより分離させる。単細胞を、フローサイトメトリーの製造元のプロトコルに従って、表面マーカー特異的抗体およびＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで染色することができる。その後、フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーを実施することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＣＭＢは低温（hypothermically）保存される。いくつかの実施形態では、ＣＭＢは、室温または０℃〜１０℃の温度で低温保存される。一部の実施形態では、ＣＭＢは、例えば、約−２０℃の温度、約−８０℃の温度、または約−８０℃未満の温度で凍結保存される。様々な実施形態では、ＣＭＢは、少なくとも約１週間、低温保存または凍結保存される。低温保存または凍結保存されたＣＭＢは、低温保存または凍結保存されなかった対応する「フレッシュＣＭＢ」と同様の性能特性を示し得る。低温保存または凍結保存されたＣＭＢは、フレッシュＣＭＢ、または非低温保存または非凍結保存ＣＭＢに匹敵する細胞生存率（たとえば、ＯＲＦＬＯ  ＭｏｘｉＦｌｏおよびＭｏｘｉ  ＧＯ  ＩＩを使用したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイで試験できる）を示し得る。低温保存または凍結保存は、ＤＭＳＯ（たとえば、ＧｉｂｃｏのＳｙｎｔｈ−ａ−Ｆｒｅｅｚｅ（登録商標））などの安定剤を含む培地にＣＭＢを導入することによって行うことができる。ＣＭＢおよびＣＭＢを含む組成物の低温保存または凍結保存は、長期保存および既製品での使用のための特性を改善するために最適化され得る。
【００６８】
低温保存または凍結保存されたＣＭＢに対して様々な試験を実施することができる。低温保存または凍結保存されたＣＭＢを、軟骨形成培地（たとえば、アスコルビン酸、デキサメタゾン、ＩＴＳ＋プレミックス（Ｃｏｍｉｎｇ）、ＭＳＣサプリメント、ＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＢＭＰ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足したＳｔｅｍＰｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で培養して、軟骨形成の質の維持を評価することができる。次に、培養したＣＭＢを組織学的分析および免疫組織化学分析のために１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで固定してよく、あるいは、遺伝子発現分析のためにＴＲＩ試薬中に保管してもよい。固定後、サンプルをパラフィン包埋し、５μｍの切片に切り、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ＧＡＧについてアルシアンブルー、トリクローム、コラーゲンＩ、ＩＩ、Ｘ、およびルブリシン（Ａｂｅａｍ）で染色することができる。ＲＮＡは、ＴＲＩ試薬法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の指示に従ってサンプルから精製できる。
【００６９】
次の遺伝子の１つまたは複数の発現が評価され得る：アグリカン（ＡＣＡＮ）、Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、ＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）、Ｘ型コラーゲン（ＣＯＬ１０Ａ１）、Ｙ染色体性決定領域遺伝子（ＳＲＹ）−ｂｏｘ９（ＳＯＸ９）およびホメオボックスＡ２（ＨＯＸＡ２）間充織凝集転写因子（mesenchymal condensation transcriptional factor）、細胞接着カドヘリン２（ＣＤＨ２）、凝集細胞外マトリックスフィブロネクチン（ＦＮ１）、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、シンデカン３（ＳＤＣ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）、トロンボスポンジンモチーフ５を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆｓ−５）（ＡＤＡＭＴＳ５）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３）、および骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）。ＴａｑＭａｎプライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したリアルタイムＰＣＲを、遺伝子発現解析のために実施することができる。新鮮なＣＭＢと低温保存されたＣＭＢとの間での上記の遺伝子の発現の比較は、ハウスキーピング遺伝子を用いて行うことができ、そのようなハウスキーピング遺伝子には、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、Ｓ１８、Ｌ３７、ＥＦ１、ＥＦ２、およびアクチンが含まれるがこれらに限定されない。
【００７０】
ＣＭＢは、軟骨形成の前駆細胞構造である。ＣＭＢは、ＡＤＳＣなどのヒトＭＳＣを培養し、集合体を形成させることにより調製することができる。ＣＭＢは、例えば、培養の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後またはさらには９日後のいずれかに形成することができる。少なくとも６日間培養されたＣＭＢは、境界または界面を形成し、したがって「成熟ＣＭＢ」になることができる。ＣＭＢは、それが「成熟ＣＭＢ」または軟骨特異的ＣＭＢであることを示す次のマーカーの１つまたは複数を発現し得る：アグリカン（ＡＣＡＮ）、Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、ＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）、Ｘ型コラーゲン（ＣＯＬ１０Ａ１）、間充織凝集転写因子Ｙ染色体性決定領域遺伝子（ＳＲＹ）−ｂｏｘ９（ＳＯＸ９）、ホメオボックスＡ２（ＨＯＸＡ２）、細胞接着カドヘリン２（ＣＤＨ２）、凝集細胞外マトリックスフィブロネクチン（ＦＮ１）、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、シンデカン３（ＳＤＣ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）、トロンボスポンジンモチーフ５を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆｓ−５）（ＡＤＡＭＴＳ５）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３）、および骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）。未成熟ＣＭＢの融合は、ＣＭＢ、ヒドロゲルおよび１つまたは複数の成長因子を含む組成物中に存在する場合などに、既存の軟骨を修復するのに有効となり得る。
【００７１】
ヒドロゲルは、細胞外マトリックスの天然ゲル様媒体を模倣し得るポリマーネットワークまたは足場で構成され得る。ある実施形態では、天然のゲル様媒体は、コラーゲンまたは断片化されたコラーゲンまたはゼラチンである。ある実施形態では、天然ゲル様媒体はヒアルロン酸または修飾ヒアルロン酸である。ヒドロゲルは、親水性または水溶性多糖化合物を含むポリマーまたはミクロフィブリルのネットワークを含むことができる。ある実施形態では、可溶性多糖化合物は、水溶性セルロース化合物である。ある実施形態では、水溶性セルロース化合物は、アニオン性の水溶性セルロースである。
【００７２】
ヒドロゲルまたは足場は、実質的に不溶性の線維またはフィラメントのマトリックスまたはメッシュをさらに含むことができる。（「ヒドロゲル」および「足場」という用語は、本明細書では互換的に使用される。）ある実施形態では、ヒドロゲルは、イオン性の水溶性セルロース化合物およびポリイオン性多糖類（例えばキトサンなどのポリカチオン性多糖類）のポリマーネットワークを、ヒドロゲル内に繊維状またはフィラメント状メッシュまたはマトリックスを形成するのに十分な量で含む。ある実施形態では、ポリカチオン性多糖類はキトサンである。追加の実施形態では、含まれるキトサンの有効量は、ヒドロゲルの重量に対して約０．０１％〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００７３】
ヒドロゲルまたは足場は、例えば対イオン（アニオンまたはカチオン）または化学架橋剤などの、錯化剤または安定剤をさらに含んでもよい。錯化剤または安定化剤は、例えば疎水結合、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力または他の化学結合を介して、セルロースポリマーと相互作用または錯体形成することにより、ヒドロゲルに追加の生化学的および／または生体力学的安定性あるいはその両方を与える。ある実施形態では、ヒドロゲルまたは足場は、アニオン性セルロース化合物およびカチオンを含む。ある実施形態では、カチオンは、例えば、カルシウム、マグネシウム、マンガン、または鉄（ＩＩ）などの二価カチオンを含む。２０１７年９月８日に国際公開第２０１７／１５１６１９号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１９９５６号に記載されているように、様々な生体吸収性ポリマー、足場、およびそれらの構成要素を使用することができる。
【００７４】
追加の実施形態では、ヒドロゲルまたは足場は、イオン性の水溶性セルロース化合物および化学架橋剤を含む。多種多様な適切な化学架橋剤が当技術分野で知られている。例えば、本明細書に記載のヒドロゲルでの使用に適した架橋には、例えば、アミン、硫酸基、ヒドロキシル基、チオール基、ジアクリレート、グリコシド結合と反応するもの、例えば、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＰＤＡＤＭＡＣ）およびビスエポキシドなどが含まれる。ある実施形態では、架橋剤は、ジグリシジルエーテル、例えば、ジイソソルビドビスエポキシドである。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む。体内では、成体幹細胞は、特定の化学的およびトポロジー的に複雑な微小環境、またはニッチに局在化していることがよくある。軟骨の発生中の微小環境の特性を模倣することは、実行可能なアプローチとなり得る。軟骨の発生中、最も初期のイベントの１つは、前軟骨間葉系細胞の集合（aggregation）と、細胞間接着および細胞−マトリックス間接着の両方によって媒介される細胞間相互作用によって生じる凝集（condensation）である。軟骨の発生中にＧＡＧ、特にコンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸およびヘパリン硫酸が存在する。成長因子はこれらのＧＡＧに結合できる。
【００７６】
様々な実施形態において、ヒドロゲルは、組成物の質量の約１．０％〜約９５％を構成し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、１．０〜３．０％のヒドロゲル、２．０〜４．０％のヒドロゲル、３．０〜６．０％のヒドロゲル、４．０〜８．０％のヒドロゲル、５．０〜１０．０％のヒドロゲル、７．０〜１２．０％のヒドロゲル、１０．０〜１５．０％のヒドロゲル、１５〜２５％のヒドロゲル、２０〜３０％のヒドロゲル、２５〜４０％のヒドロゲル、３０〜４５％のヒドロゲル、３５〜５０％のヒドロゲル、４０〜５５％のヒドロゲル、または５０〜７０％のヒドロゲルを含む。
【００７７】
ヒドロゲルは、細胞が付着することができるタンパク質フィラメントからなるナノ繊維ネットワークまたはフレームワークによって支持され得る。可溶性栄養素は、ヒドロゲルを通って拡散できる。天然のＥＣＭでは、ヒドロゲルは圧縮応力を仲介する。水はＧＡＧに強く吸収され、それによってＧＡＧは圧力に対する抵抗力を軟骨に提供できる。ヒドロゲルの一貫性は、ＧＡＧにより構成されるプロテオグリカンによって維持される。また、ＧＡＧは成長因子を隔離する。ＧＡＧは、それらが含むヘキソサミン、ヘキソース、またはヘキスロン酸単位の種類において異なる（たとえば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクトース、ガラクトサミン、グルコサミン）。生理学的に重要な具体的なＧＡＧは、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびケラタン硫酸である。
【００７８】
ヒドロゲルまたは足場は、少なくとも２つの材料を含んでいてよい。ある実施形態では、材料は、例えば２つの水溶性セルロース化合物などの多糖類である。ある実施形態では、材料はコラーゲンまたはコラーゲンベースのマトリックスである。ある実施形態では、材料はコラーゲンおよびヒアルロン酸を含む。ある実施形態では、化合物は、例えばイオン的または化学的相互作用によって、本明細書に記載されるように架橋される。
【００７９】
成長因子には、細胞の成長、増殖、修復および細胞分化を刺激することができる天然に存在する物質が含まれる。通常、成長因子はタンパク質または小分子、例えばステロイドホルモンであり、それは標的細胞内／上の特定の受容体に結合する。成長因子は、様々な細胞プロセスの調節に重要であり、典型的には、細胞間のシグナル伝達分子として機能する。成長因子には、例えば骨形成タンパク質が含まれるが、線維芽細胞成長因子および血管内皮成長因子は血管分化（血管新生）を刺激する。
【００８０】
本明細書に教示および記載の実施形態のいずれかで使用できる例示的な成長因子には、オートクリン運動性因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびその他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、および／またはウシ胎仔成長ホルモン（ＦＢＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
いくつかの実施形態では、成長因子は形態形成タンパク質である。形態形成タンパク質には、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバー、特にＢＭＰ−６が含まれる。このファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質のサブクラスである。成長因子として使用され得る例示的な形態形成タンパク質には、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、およびＮＥＵＲＡＬが含まれる。
【００８２】
成長因子（または薬物）は、ＣＭＢ中のＡＤＳＣの軟骨細胞への分化をｉｎ  ｓｉｔｕで誘導することができる。いくつかの実施形態では、成長因子は、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−６、またはＴＧＦ−β３とＢＭＰ−６の組合せである。ＴＧＦ−β３とＢＭＰ−６を組み合わせる場合、それらは、１：５、１：４、１：３、１：２．５、１：２、１：１．５、１：１．２５、１：１、１．２５：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、あるいは１：５〜１：３、１：４〜１：２．５、１：３〜１：２、１：２．５〜１：１．５、１：２〜１：１．２５、１：１．５〜１：１、１：１．２５〜１．２５：１、１：１〜１．５：１、１．２５：１〜２：１、１．５：１〜２．５：１、２：１〜３：１、２．５：１〜４：１、または３：１〜５：１の質量比（ＴＧＦ−β３：ＢＭＰ−６）で存在し得る。マイクロスフェアが組成物中に存在し、ＴＧＦ−β３とＢＭＰ−６を組み合わせる場合、それらは、１：５、１：４、１：３、１：２．５、１：２、１：１．５、１：１．２５、１：１、１．２５：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、あるいは１：５〜１：３、１：４〜１：２．５、１：３〜１：２、１：２．５〜１：１．５、１：２〜１：１．２５、１：１．５〜１：１、１：１．２５〜１．２５：１、１：１〜１．５：１、１．２５：１〜２：１、１．５：１〜２．５：１、２：１〜３：１、２．５：１〜４：１、または３：１〜５：１の質量比（ＴＧＦ−β３：ＢＭＰ−６）で存在し得る。
【００８３】
一実施形態では、ＴＧＦ−β３がヒドロゲルまたは足場マトリックスに含まれ得る。ＴＧＦ−β３は、ｉｎ  ｖｉｖｏで発生中の軟骨形成中に検出され得る。このような固定化は、以前に報告されたプロトコルを使用して検出できる。たとえば、ＢＳＡ−ＰＢＳ中の様々な濃度のＴＧＦ−β３を、４℃で一晩、架橋ＮａＣＳフィルムに添加する。ウェルをＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、マウス抗ヒトＴＧＦ−β３抗体（Ａｂｅａｍ，Ｉｎｃ．）、続いてＦＩＴＣとコンジュゲートさせた二次抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して免疫蛍光染色を行う。次に、蛍光プレートリーダー（ＦＬＸ８００，Ｂｉｏｔｅｋ，Ｉｎｃ．）を使用して蛍光強度を検出し、ＴＧＦ−β３の量と相関させる。
【００８４】
様々な実施形態において、成長因子は、組成物１ｃｃあたり約１０〜約１００００ｎｇで含まれる。一部の実施形態では、組成物は、組成物１ｃｃあたり、１〜１５ｎｇの成長因子、１０〜１００ｎｇの成長因子、２０〜２００ｎｇの成長因子、５０〜５００ｎｇの成長因子、１００〜１０００ｎｇの成長因子、２００〜２０００ｎｇの成長因子、５００〜３０００ｎｇの成長因子、１０００〜４０００ｎｇの成長因子、２０００〜５０００ｎｇの成長因子、３０００〜６０００ｎｇの成長因子、４０００〜７０００ｎｇの成長因子、または５０００〜８０００ｎｇの成長因子、６０００〜１００００ｎｇ成長因子を含む。
【００８５】
組成物中に存在する成長因子は、組成物が注射される関節または他の部位において、ＣＭＢの軟骨細胞への分化をもたらすことができる。組成物中に存在する成長因子は、ＣＭＢにシグナルを送り、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはコラーゲンまたはヒアルロン酸を生成することができる。組成物中に存在する成長因子は、ヒドロゲルおよびＣＭＢとともに、間充織凝集の生理学的発生過程を有利に提供することができ、それは埋め込み後に軟骨を形成して隣接する組織と癒合する。成長因子の量および放出速度は、そのような発生過程（development process）を提供するために最適化され得る。成長因子を隔離してゆっくりと放出する材料を使用して、ＣＭＢが発生過程で成長因子に長時間曝されるようにすることができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリマーマイクロスフェアをさらに含み、１つまたは複数の成長因子がポリマーマイクロスフェアに封入される。いくつかの実施形態では、ポリマーマイクロスフェアは、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含む。ポリマーマイクロスフェアは、成長因子が数日または数週間にわたってｉｎ  ｓｉｔｕでＭＳＣの軟骨分化を誘導するのに有効であるように、成長因子の制御放出を提供することができる。理論に縛られることを望まないが、ＰＬＧＡなどのポリマーマイクロスフェアを含むヒドロゲルは、ヒドロゲル単独よりも優れた長期成長因子放出を提供することができる。ＰＬＧＡベースのマイクロスフェアは、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ６、ＴＧＦ−β３などの成長因子の制御放出を９０日間ものあいだ持続することができる。実質的に一定の様式でのそのような制御放出は、骨軟骨修復のための高密度で機能的な細胞層の形成を可能にすることができる。
【００８７】
加えて、ＰＬＧＡおよび他のポリマーマイクロスフェアは、凍結乾燥可能でかつ保存可能であり、それにより、組成物を既製品で使用することを可能にすることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、組成物は、フィブリン、ラミニン、ポリ−Ｄ−リジンおよび／またはポリ−Ｌ−リジンなどの安定剤をさらに含む。フィブリンはトロンビンとフィブリノーゲンから形成されるため、これらの成分が別々に存在していて後で混ぜ合わせてもよい。例えば、軟骨の修復が必要な関節または他の部位に組成物が注射される直前に、トロンビンとフィブリノーゲンを混ぜ合わせてもよい。ラミニン（ＬＮ）は高分子量の接着性糖タンパク質である。ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−リジンは、非生物学的供給源からそれらを調製できるので有利である。組成物が、ＣＭＢ、ヒドロゲルおよび成長因子を注射部位に保持するのに適したゲル様の粘稠度を有するように、安定剤の量を変化させることができる。
【００８９】
様々な実施形態において、組成物は、ＣＭＢとヒドロゲルを混合することによって調製される。１つまたは複数の薬物を組成物に加えることができる。１つまたは複数の成長因子を組成物に添加することができる。ＣＭＢおよびヒドロゲルを含む組成物は、少なくとも５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、２か月、３か月、４か月、６か月、１年、３年、５年、または１０年間でさえ、凍結保存されて液体窒素中で保管され得る。調製中、組成物は機械的負荷の下で混合に供されてもよい。機械的負荷は、例えば、手作業で、攪拌によって、動荷重（dynamic loading）によって、または静水圧によって加えることができる。
【００９０】
様々な実施形態において、対象または患者に投与される場合、ヒドロゲルまたは足場は、組織の成長、再生、および／または修復を支持、促進、および／または増強するのに有効である。
【００９１】
本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、および／またはアジュバントと一緒に投与することができる。組成物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、化学化合物、薬物、抗体等、またはそれらの組合せなどの、少なくとも１つの追加の生物学的活性物質および／または治療剤と組み合わせることができる。例えば、ヒドロゲルまたは足場組成物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、化学化合物、薬物、抗体等、またはそれらの組合せなどの、少なくとも１つの追加の生物学的活性物質および／または治療剤を含んでいてよい。
【００９２】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合された活性物質を含み得る。そのような賦形剤には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアゴムが含まれる。例示的な賦形剤には、分散剤または湿潤剤、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例えばポリオキシエチレンステアレート）も含まれる。例示的な賦形剤はまた、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから生じた部分エステルとの縮合物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から部分エステルとの縮合物（例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート）も含まれる。
【００９３】
水性懸濁液はまた、例えばエチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つまたは複数の防腐剤、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香味料、およびスクロースまたはサッカリンなどの１つまたは複数の甘味料を含むこともできる。
【００９４】
注射用途に適した医薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末を含むことができる。注射用製剤は、防腐剤が添加された、例えばアンプルまたは多回投与容器などの単位剤形で提供されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液として形成されてよく、また懸濁剤、安定剤、および／または分散剤を含んでいてよい。
【００９５】
静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。組成物は、無菌で、かつ容易な注射針通過性が存在する程度に流動性であり得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングによって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成できる。等張剤、例えば、糖；マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール；および塩化ナトリウムを組成物に含めることができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【００９６】
バイオリアクターを使用して組成物を調製してもよく、例示的なバイオリアクターは、２０１０年９月１０日に国際公開第２０１０／１０２０５９号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０２６１２０号、および２０１４年１０月２３日に国際公開第２０１４／１７２５７５号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／０３４５５９号に記載されている。製造中、同種ドナー細胞を使用してＣＭＢを作成することができ、ＣＭＢはその後、埋め込みに最適な時点で低温保存または凍結保存される。同様に、成長因子を注入した微粒子を、それらをドナー細胞の大きな同種プールから作成されたＣＭＢと共に出荷に容易に利用できるように、製造および凍結乾燥して、既製品での使用（off-the-shelf use）を可能にすることができる。
【００９７】
様々な実施形態において、組成物またはその任意の成分を、患者への投与前に、または品質管理手順の一部として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験してもよい。組成物は、試験前に低温保存または凍結保存されていてもよい。試験の１つの方法は、組成物またはその中のＣＭＢの軟骨形成特性をアッセイすることである。該当する場合、組成物のＣＭＢを解凍し、軟骨形成培地（chondrogenic medium）で培養してよい。例えば、解凍後、ＣＭＢを軟骨分化培地（chondrogenic differentiation media）（ＣＤＭ）で１日以上培養し、移植前にヒドロゲルと混ぜ合わせてよい。細胞の生存率、組織学的検査、および遺伝子発現の１つまたは複数のアッセイを行うことができる。具体的なアッセイは実施例１に記載されている。例えば、培養したＣＭＢを固定および染色することができる。組織学的分析では、ヘマトキシリン、エオシン、アルシアンブルー、トリクロームなどの様々な染色を使用することができる。遺伝子発現については、リアルタイムＰＣＲを実施して、アグリカン、コラーゲン、ＳＯＸ９、ＨＯＸＡ２、カドヘリン２、フィブロネクチン、テネイシンＣ、シンデカン３、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、トロンボスポンジンモチーフ５を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆｓ）（ＡＤＡＭＴＳ）、トランスフォーミング成長因子ベータ、および骨形成タンパク質の発現を評価することができる。そのような試験を行って、組成物を処方、低温保存または凍結保存および／または保管する方法を最適化または改善することができる。
【００９８】
組成物を免疫原性について試験することができる。ＣＭＢ中に存在するＭＳＣ上の免疫原性マーカーを、フローサイトメトリーなどにより試験することができる。例示的なマーカーには、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６が含まれるが、これらに限定されない。そのような試験の例は実施例１に記載されている。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨欠損を修復する効果について組成物を試験することができる。軟骨欠損は、動物ベースの軟骨外植片において作成するか、あるいはシリコーンゴムリングなどの人工材料を使用してシミュレートすることができる。あるいは、結合組織欠損を作成してもよい。次に、組成物を欠損に押し込み、軟骨形成培地で培養する。任意選択で、軟骨細胞の発生を促進するため、あるいはさもなければ膝または肩などのｉｎ  ｖｉｖｏの状態をシミュレートするために、機械的力を組成物に加える。後で機械的強度を決定するために組成物を試験する（圧縮ヤング率を測定することにより）。さらに、機械的力が、例えば動荷重によって提供される場合、上記および実施例２に記載される組織学的検査を行って、軟骨細胞の発生に対する機械的力の影響を評価することができる。
【０１００】
別の態様では、上記および本明細書に記載の任意の組成物を軟骨または軟骨の周囲の領域に投与することを含む、患者における軟骨欠損を処置する方法が提供される。組成物は欠損部位に注射することができる。例えば、膝の半月板に組成物を注射してよい。あるいは、膝の半月板の近くの部位に軟骨を注射してもよい。また、組成物を滑液に注射してよく、あるいは滑液と接触させてよい。
【０１０１】
別の態様では、上記および本明細書に記載の組成物のいずれかを軟骨または軟骨の周囲の領域に投与することを含む、患者における軟骨劣化を予防する、あるいは軟骨の損傷または変性疾患または障害を処置する方法が提供される。組成物は、軟骨の病変または欠損に埋め込まれ、固定されてもよい。軟骨の病変および欠損は、様々な形状、サイズ、および場所で起こり得るため、組成物は、治療される患者の軟骨の特定の軟骨欠損または病変に適合するのに十分な形状およびサイズに成形され得る。例えば、組成物は、シートまたはマトリックスとして成形され得る。シートまたはマトリックスの厚さは、０．５〜１０ｍｍ、１〜１．５ｍｍ、１．５〜３ｍｍ、２．５〜４ｍｍ、３．５〜５ｍｍ、４〜６ｍｍ、５〜７ｍｍ、６〜８ｍｍ、または８〜１０ｍｍであってよい。厚さは、シートまたはマトリックス全体にわたり異なっていてよい。インプラントを軟骨欠損に確保するために、必要に応じて追加のマトリックス、メッシュ、およびその他の成分を使用してよい。
【０１０２】
別の態様では、上記および本明細書に記載の組成物のいずれかを結合組織または結合組織の周囲の領域に投与することを含む、患者における結合組織の劣化を予防する、あるいは結合組織の損傷または変性疾患または障害を処置する方法が提供される。組成物は、結合組織の病変または欠損に埋め込まれ、固定されてもよい。結合組織の病変および欠損は様々な形状、サイズ、場所で起こり得るため、組成物は、治療される患者の結合組織の特定の結合組織の欠損または病変に適合するのに十分な形状およびサイズに成形され得る。例えば、組成物は、シートまたはマトリックスとして成形され得る。シートまたはマトリックスの厚さは、０．５〜１０ｍｍ、１〜１．５ｍｍ、１．５〜３ｍｍ、２．５〜４ｍｍ、３．５〜５ｍｍ、４〜６ｍｍ、５〜７ｍｍ、６〜８ｍｍ、または８〜１０ｍｍであってよい。厚さは、シートまたはマトリックス全体にわたり異なっていてよい。インプラントを結合組織の欠損に確保するために、必要に応じて追加のマトリックス、メッシュ、およびその他の成分を使用してよい。
【０１０３】
上記の方法のいくつかの実施形態において、結合組織は、半月板、靭帯または腱である。上記の方法のいくつかの実施形態では、軟骨は、関節軟骨および非関節軟骨から選択される。いくつかの実施形態では、非関節軟骨は、半月板および椎間板からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、この方法は、結合組織欠損、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に、１〜２０％（ｗ／ｗ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む組織を形成するのに有効である。組織は、１．０〜５．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、３．０〜６．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、４．０〜８．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、５．０〜１０．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、６．０〜１１．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、７．０〜１２．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、８．０〜１３．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、９．０〜１４．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、１０．０〜１５．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、１１．０〜１６．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、１２．０〜１７．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、１３．０〜１８．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、１４．０〜１９．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧ、または１５．０〜２０．０％（ｗ／ｗ）のＧＡＧを含んでいてよい。いくつかの実施形態では、方法は、結合組織欠損、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に、０．５〜２０％（ｗ／ｗ）のコラーゲンを含む組織を形成するのに有効である。組織は、０．５〜５．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、１．０〜５．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、２．０〜７．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、３．０〜８．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、４．０〜９．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、５．０〜１０．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、６．０〜１１．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、７．０〜１２．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、８．０〜１３．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、９．０〜１４．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、１０．０〜１５．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、１０．０〜１５．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、１２．０〜１７．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、１４．０〜１９．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲン、または１５．０〜２０．０％（ｗ／ｗ）のコラーゲンを含んでいてよい。組織は、少なくとも１．２％（ｗ／ｗ）、１．３％（ｗ／ｗ）、１．４％（ｗ／ｗ）、または１．６％（ｗ／ｗ）のコラーゲンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、方法は、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に、少なくとも１％（ｗ／ｗ）のＧＡＧを含む組織を形成するのに有効である。いくつかの実施形態では、方法は、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に、少なくとも１００ｋＰａのヤング率および最大０．８の摩擦係数を有する軟骨を形成するのに有効である。ヤング率は、少なくとも２０ｋＰａ、２５ｋＰａ、３０ｋＰａ、４０ｋＰａ、５０ｋＰａ、７５ｋＰａ、１００ｋＰａ、１２５ｋＰａ、１５０ｋＰａ、１７５ｋＰａ、２００ｋＰａ、少なくとも３００ｋＰａ、少なくとも４００ｋＰａ、少なくとも５００ｋＰａ、少なくとも６００ｋＰａ、少なくとも７００ｋＰａ、少なくとも８００ｋＰａ、少なくとも９００ｋＰａ、少なくとも９５０ｋＰａ、少なくとも１０００ｋＰａ、少なくとも１１００ｋＰａ、少なくとも１２００ｋＰａ、または少なくとも１３００ｋＰａであってよい。摩擦係数は、０．８、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４０、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３０、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、または０．２３未満であってよい。    
【０１０４】
いくつかの実施形態では、方法は、軟骨欠損、軟骨劣化、軟骨損傷、軟骨変性疾患または軟骨障害の部位に軟骨を形成するのに有効である。いくつかの実施形態では、軟骨は、その部位またはその部位の周囲の任意の隣接する軟骨および軟骨下骨組織と癒合する。
【実施例】
【０１０５】
本発明はまた、以下の実施例によって説明および実証される。しかしながら、明細書中のいずれかでのこれらおよび他の例の使用は、単なる例示であり、本発明または例示された用語の範囲および意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、ここに記載された特定の好ましい実施形態に限定されない。実際、本明細書を読むと、本発明の多くの修正および変更が当業者には明らかであり、そのような変更は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語およびそれらの特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲によってのみ限定されるべきである。
【０１０６】
実施例１：凍結保存された同種ＣＭＢの軟骨形成特性を示す
初期継代の拡大された脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）をＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣから得て、抗原性について徹底的に試験する。ＧＭＰグレードの成分を使用して細胞を拡大および継代する。４回目の継代後、ＡＤＳＣを軟骨形成培地に導入し、そこでＣＭＢが形成される。
【０１０７】
ＣＭＢが形成されると、それらをすぐにＳｙｎｔｈ−ａ−ｆｒｅｅｚｅ（Ｇｉｂｃｏ）培地中において−１℃／分の速度で−８０℃に温度を下げ、−８０℃で少なくとも３日間おいた後に液体窒素に移すことによって凍結保存する。１〜５週間の凍結保存後、３７℃の水浴で３７℃にすばやく再加温することにより、凍結したＣＭＢを解凍する。細胞生存率は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはトリパンブルー色素排除試験を使用して測定する。免疫組織化学分析および遺伝子発現分析は、解凍したＣＭＢで得られた結果を凍結保存されなかったＣＭＢと比較することにより、解凍したＣＭＢで実施する。
【０１０８】
さらに、凍結保存されたＣＭＢを、軟骨形成培地、すなわち、アスコルビン酸、デキサメタゾン、ＩＴＳ＋プレミックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＭＳＣサプリメント、ＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＢＭＰ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足したＳｔｅｍＰｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養して、軟骨形成の質の維持を評価する。簡単に説明すると、培養したＣＭＢを、組織学的分析および免疫組織化学分析のために１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン中に固定するか、あるいは遺伝子発現分析のためにＴＲＩｚｏｌ中に保存する。固定後、サンプルをパラフィン包埋し、５μｍの切片に切り、ヘマトキシリンおよりエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ＧＡＧについてアルシアンブルー、トリクローム、間充織凝集転写因子Ｙ染色体性決定領域遺伝子（ＳＲＹ）−ｂｏｘ９（ＳＯＸ９）、コラーゲンＩ、ＩＩ、Ｘ、およびルブリシン（Ａｂｅａｍ）で染色する。ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の指示に従ってサンプルから精製する。ＴａｑＭａｎプライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してリアルタイムＰＣＲを実施して、次の遺伝子の発現を評価する：アグリカン（ＡＣＡＮ）、Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、ＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）、Ｘ型コラーゲン（ＣＯＬ１０Ａ１）、間充織凝集転写因子Ｙ染色体性決定領域遺伝子（ＳＲＹ）−ｂｏｘ９（ＳＯＸ９）およびホメオボックスＡ２（ＨＯＸＡ２）、細胞接着カドヘリン２（ＣＤＨ２）、凝集細胞外マトリックスフィブロネクチン（ＦＮ１）、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、シンデカン３（ＳＤＣ３）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）、トロンボスポンジンモチーフ５を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆｓ−５）（ＡＤＡＭＴＳ５）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３）、および骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をハウスキーピング遺伝子として使用する。
【０１０９】
ＣＭＢ形成後の同種ＡＤＳＣの抗原性をより理解するために、凍結保存サンプルをフローサイトメトリーで分析して、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６表面マーカーレベルを検出する。前述のマーカーの発現を欠く細胞は免疫特権があると考えられる［２２］。簡単に説明すると、ＣＭＢをＩ型コラゲナーゼ中において３７℃で１時間インキュベートしてペレットを壊すことにより、解凍したＣＭＢを単細胞懸濁液に解離させる。消化物を等容量の軟骨形成培地で中和する。細胞懸濁液を、２０Ｇの針を通して再懸濁させることによりさらに解離させる。単細胞を、Ｏｎ−Ｃｈｉｐ染色（Ａｇｉｌｅｎｔ）の製造元のプロトコルに従って、表面マーカー特異的抗体およびＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで染色する。フローサイトメトリーは、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター、または別のフローサイトメーターを使用して行う。
【０１１０】
ＣＭＢの製造方法は、（ｉ）新鮮な（またはフレッシュ）生成物と対比して凍結保存／解凍されたＣＭＢの匹敵する性能、（ｉｉ）間充織体（mesenchymal body）へのＡＤＳＣの均一な癒合および融合（均一なグリコサミノグリカン構造、低テネイシン沈着）、および（ｉｉｉ）ＣＭＢ形成後の細胞上の免疫原性表面マーカーの不在；を達成するために必要に応じて最適化される。
【０１１１】
実施例２：ヒドロゲル中の同種ＣＭＢの投与のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨欠損モデルを充填するＣＭＢ／ヒドロゲルの実現可能性および有効性を、凍結保存されたＣＭＢおよび作りたてのＣＭＢを使用して試験する。生存不能なウシ軟骨外植片（直径５ｍｍおよび高さ５ｍｍ）において、直径３ｍｍの全層軟骨欠損を作成する。ＣＭＢを、様々なヒドロゲルビヒクルを用いて欠損に挿入する。各ビヒクルは、Ｉ型コラーゲン、ヒアルロン酸、およびフィブリンの１つまたは複数を含み、ビヒクルの比較分析を行って最適なヒドロゲル組成を決定する。次に、ヒドロゲルビヒクルを欠損に押し込む（図４）。構築物を、上記のように、ＴＧＦ−β３およびＢＭＰ−６を含む軟骨形成培地で最大５週間培養し、分析する。組織学的、生化学的および機械的分析を行う［１９］。ＤＮＡ、ＧＡＧ、およびヒドロキシプロリン（コラーゲン）の含有量も測定する。
【０１１２】
簡単に説明すると、軟骨および軟骨下領域を、下にある骨の表面に沿って分離し、湿重量を測定する。サンプルを消化し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用してＤＮＡ含有量を測定する。抽出物の硫酸化ＧＡＧ（ｓ−ＧＡＧ）の含有量を、標準物質としてコンドロイチン−６−硫酸を用いる１，９−ジメチルメチレンブルー色素の比色分析を使用して決定する。１：７．６４のヒドロキシプロリンとコラーゲンの質量比、または総コラーゲン含有量の約１３．５％がヒドロキシプロリンであることを使用して、ヒドロキシプロリンの含有量に基づき、酸加水分解を用いてコラーゲンの量を評価する。
【０１１３】
次に、軟骨の圧縮ヤング率を一軸圧縮試験によって測定する。構築物を圧縮することにより応力−ひずみ曲線（すなわち、０．０１％ひずみ／秒、１５０μｍまでの変形、３，０００秒間まで）を作成し、圧縮荷重を測定する。ヤング率は、応力−ひずみ曲線の線形勾配から計算する。また、垂直抗力、摩擦力、軸変形、および軟骨とガラスとの間の摩擦係数を、一軸圧縮構成で測定する。次に、プッシュアウト試験を使用して、融合したＣＭＢと天然の軟骨マトリックスとの間の癒合強度（integration strength）を試験する。
【０１１４】
インプラントの耐荷重能力（load bearing capabilities）を定量化して、周囲の軟骨および基礎となる骨との癒合に対する荷重負荷の影響を判断し、時間の経過に伴う「破損」パラメーターを調べる。動荷重は、１０〜１５％の表面間変形（surface-to-surface deformation）を使用して、１Ｈｚで最大４時間／日、５〜７日／週で実施する。上記で概説したように、得られる組織の細胞外マトリックスの組成および分布（生化学的および組織学学的分析による）ならびに機能特性（一軸圧縮試験による）に対する動荷重の影響を評価する。
【０１１５】
ヒドロゲル中のＣＭＢの調製および投与の方法は、機械的刺激での得られる組織の機械的および生化学的特性の有意な改善、特に（ｉ）欠損を充填するための密性軟骨組織（３〜６％ｗ／ｗのＧＡＧおよび＞５％ｗ／ｗのコラーゲンを含む）の形成；（ｉｉ）生理学的機械特性（ヤング率＞８００ｋＰａ、摩擦係数＜０．３）、および（ｉｉｉ）開発製品と隣接する軟骨および軟骨下骨組織との癒合；を達成するために、必要に応じて最適化される。
【０１１６】
実施例３：ＰＬＧＡマイクロスフェアを送達プラットフォームとして使用する成長因子（ＴＧＦ−β３およびＢＭＰ６）の長期放出およびＣＭＢ軟骨形成
骨軟骨移植片からの成長因子の長期放出を持続させるために、制御放出技術を組み込んで試験する。試験サンプルでは、マイクロスフェアを使用して、軟骨形成を誘導および増強する成長因子を送達する。対照サンプルでは、マイクロスフェアを使用しない。
【０１１７】
マイクロスフェアは、生体適合性、注射可能性、およびカスタマイズ可能な放出プロファイルのための実行可能なタンパク質送達ビヒクルとして使用されているＰＬＧＡベースのポリマーで作られる。成長因子（ＧＦ）の制御放出プロファイルが最適化されるが、そのようなプロファイルは、選択したＧＦの生化学的特性を含む多くの因子に依存する。
【０１１８】
ＰＬＧＡマイクロスフェアは、公開されているプロトコルに基づいて、油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルション法を使用して作成する。簡単に説明すると、ＰＬＧＡ（５０：５０の乳酸とグリコール酸の比率）とＧＦの水溶液とをジクロロメタン中に混合する。混合物をホモジナイズして油中水型エマルションを形成し、これをポリビニルアルコール（ＰＶＡ）に添加してダブルエマルションを形成する。長時間攪拌した後、内容物を遠心分離して上清を除去する。次に、マイクロスフェアペレットを洗浄し、凍結乾燥する。
【０１１９】
走査型電子顕微鏡を用いて、様々なマイクロスフェア群のサイズ分布および形態学的特性に基づきそれらを特徴付けすることにより、製造したマイクロスフェアの品質を評価する。均一なＧＦ放出を最適化するために、最も均一な粒子サイズおよび明確な個々の球状形態を示すマイクロスフェアを選択する。様々なマイクロスフェアのＧＦ放出を、公開されているプロトコルに従って分析する。簡単に説明すると、１０ｍｇのマイクロスフェアをマイクロ遠心チューブ内でＰＢＳに懸濁させる。ＧＦカーゴ（cargo）を最適化するために、調製したマイクロスフェアに、ＢＭＰ６とＴＧＦ−β３の様々な組合せ（５ｍｇ：５ｍｇ、３ｍｇ：７ｍｇ、７ｍｇ：３ｍｇ）を装填する。３０分、１時間、５時間、１日、３日、７日、およびその後は７日ごとにＧＦ放出を調べる。すべての時点で、上清を回収し、等量の新しいＰＢＳをマイクロスフェアに添加する。この手順を、サンプルにペレットがなくなるまで繰り返し、それはマイクロスフェアの完全な分解と成長因子の放出を示す。収集した上澄みに対してＥＬＩＳＡを実施し、成長因子放出の濃度を経時的に測定する。マイクロスフェアは、ＣＭＢ軟骨形成に最適な濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）で長期間のＧＦ放出を持続できるように選択される。
【０１２０】
保管寿命の長いポリマーマイクロスフェアを調製するために条件を最適化する。製造したマイクロスフェアの保管寿命を４℃および２５℃（室温）の両方で試験し、様々な保管時間でＧＦ放出プロファイルを評価する。ＧＦマイクロスフェアを４℃および２５℃で１日、７日、１４日、および２１日間保管し、ＧＦ放出プロファイルを評価して、４℃および２５℃での保管の許容範囲を決定する。
【０１２１】
成長因子（ＧＦ）を注入したマイクロスフェアをｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析し、それらが長期間のＧＦ放出を持続することができ、それによってＣＭＢの成熟化および軟骨形成を増強できるかどうかを判断する。この実験では、成分を混合し、コンポジットをカスタム金型に注入することによって、ヒドロゲル＋ＣＭＢ±ＧＦマイクロスフィアコンポジットを作成する。コンポジット構築物は、ＧＦを補足せずに（実施例１および２による）最適化培地で培養する。組織学的および生化学的アッセイを行って、コンポジット構築物でのＣＭＢの成熟化、軟骨形成、および骨軟骨ＥＣＭ沈着におけるＧＦ放出の役割を確認する。これらの構築物の馴化培地を、３０分、１時間、５時間、１日、３日、５日、７日、および７日ごとに収集して、ＥＬＩＳＡにより５週間にわたりＧＦ放出を調べる。コンポジット構築物（ヒドロゲル＋ＣＭＢ＋ＧＦマイクロスフェア）は、ＢＭＰ６およびＴＧＦ−β３を補足した培地で培養したヒドロゲル＋ＣＭＢ構築物に匹敵する程度のＣＭＢの成熟化および軟骨形成を示すことができる。
【０１２２】
実施例４：製品投与のモデルおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨欠損モデルにおける有効性
実施例１〜３のプロトコルを最適化し、適切な条件および成分を選択すると、ＣＭＢ、ヒドロゲル、およびＧＦ注入微粒子から作成した選択材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨欠損モデルで試験する。実施例１および２に記載のように、選択材料を外植片軟骨欠損モデルに注入し、機械的負荷の下で培養する。外植片は、外因性ＧＦの捕足なしの軟骨形成培地で最大５週間育てる。実施例１および２に概説するように、得られた組織を機能性について評価する。さらに、培地へのＧＦ放出を培地交換ごとに評価して、ＰＴＯＡの長期処置に対するこれらプラットフォームの有効性をさらに判断する。組織学的、生化学的および機械的分析も実施して、コンポジット構築物の生物学的および機械的特性を評価する。成功基準は、欠損部における軟骨組織の形成、ならびに隣接する軟骨および軟骨下骨への組織の癒合によって決定する。
【０１２３】
実施例５：軟骨形成に対する凍結保存の影響の試験
ＡＤＳＣを介した軟骨形成に対する凍結保存の影響を、図１に概説するように試験した。図１では、ＣＭＢ培養の２次元（２−Ｄ）または３次元（３−Ｄ）の段階で細胞を凍結保存した。２次元条件の場合、細胞を、（ｉ）凍結保存なしでＰ４まで継代する（フレッシュ）、（ｉｉ）間質血管画分（ＳＶＦ）を採取した直後に凍結保存し、解凍し、Ｐ４まで継代する（ＳＶＦクライオ）、または（ｉｉｉ）Ｐ１まで継代し、凍結保存し、解凍し、Ｐ４まで継代する（Ｐ１クライオ）のいずれかであった。３−Ｄ条件に関しては、ＣＭＢを、形成後維持して凍結保存しない（対照）、または培養３日後に凍結保存して凍結保存の１〜５週間後に解凍した。
【０１２４】
凍結したおよび対照の「フレッシュ」サンプルは、脂肪組織のサンプルを遠心分離して間質血管画分（ＳＶＦ）を分離することにより調製した。ＳＶＦをフラスコに移し、ＴｒｙｐＬＥ−Ｓｅｌｅｃｔで４回継代した。次に、サンプルを（ｉ）凍結保存を行わない対照サンプルと（ｉｉ）凍結サンプルに分け、凍結サンプルは実施例１に記載されているように凍結保存して、液体窒素中で１〜５週間保管した。次に、凍結保存したサンプルを解凍して、凍結サンプルを得た。その後、対照サンプルと試験サンプルの両方をさらにアッセイした。
【０１２５】
試験および対照「ＳＶＦクライオ」サンプルは、脂肪組織のサンプルを遠心分離して間質血管画分（ＳＶＦ）を分離することにより調製した。ＳＶＦを実施例１に記載されているように凍結保存し、液体窒素中で少なくとも１か月間保管した。次に、ＳＶＦを解凍してフラスコに移し、４回継代する。サンプルを対照サンプルと凍結サンプルに分け、凍結サンプルは実施例１に記載のように凍結保存した。サンプルを（ｉ）凍結保存を行わない対照サンプルと（ｉｉ）凍結サンプルに分け、凍結サンプルは実施例１に記載されているように凍結保存し、液体窒素中で１〜５週間保管した。次に、凍結保存したサンプルを解凍して、試験サンプルを得た。その後、対照サンプルと試験サンプルの両方をさらにアッセイした。
【０１２６】
試験および対照「ｐ１クライオ」サンプルは、脂肪組織のサンプルを遠心分離して間質血管画分（ＳＶＦ）を分離することにより調製した。ＳＶＦをフラスコに移し、１回継代した。継代したＳＶＦを、実施例１に記載されているように凍結保存し、液体窒素中で少なくとも１か月間保管した。次に、ＳＶＦを解凍し、フラスコに移して、４回継代した。サンプルを対照サンプルと凍結サンプルに分け、凍結サンプルは実施例１に記載のように凍結保存した。サンプルを（ｉ）凍結保存を行わない対照サンプルと（ｉｉ）凍結サンプルに分け、凍結サンプルは実施例１に記載のように凍結保存し、液体窒素中で１〜５週間保管した。次に、凍結保存したサンプルを解凍して、試験サンプルを得た。その後、対照サンプルと試験サンプルの両方をさらにアッセイした。
【０１２７】
次に、集団倍加時間に対するＡＤＳＣ凍結保存の影響をアッセイした。（ｉ）凍結保存なしでＰ４まで継代したＡＤＳＣ（フレッシュ）、（ｉｉ）間質血管画分（ＳＶＦ）を採取した直後に凍結保存し、解凍し、Ｐ４まで継代したＡＤＳＣ（ＳＶＦクライオ）、および（ｉｉｉ）Ｐ１まで継代し、凍結保存し、解凍し、Ｐ４まで継代したＡＤＳＣ（Ｐ１クライオ）の間で比較を行う。最後の凍結保存ステップの後に行った４回の継代のそれぞれでサンプルを採取し、集団倍加時間についてアッセイした。結果は図２に示されており、Ｙ軸は集団倍加時間であり、Ｘ軸は受けた継代数である。
【０１２８】
集団倍加時間（ＰＤＴ）の分析により、フレッシュＡＤＳＣとＰ１クライオＡＤＳＣが、継代とともにＰＤＴが増加する同様の傾向を示したことが明らかになった。ＳＶＦクライオＡＤＳＣの場合、ＰＤＴは継代とともに減少した。「フレッシュ」サンプルの場合、集団倍加時間は、約１．５日（１回継代）から４回継代すると約２日に増加した。対照的に、ＳＶＦを凍結保存および解凍した「ＳＶＦクライオ」サンプルの場合、集団倍加時間は、約２日（１回継代）から４回継代すると約１．５日に減少した。凍結保存および解凍する前にＳＶＦを１回継代する「ｐ１クライオ」サンプルの場合、集団倍加時間は約２．５日であり、継代が増えるとわずかに増加した。
【０１２９】
実施例６：軟骨形成に対するＡＤＳＣの凍結保存の影響の試験
細胞（フラスコ内の２Ｄ）に対する凍結保存の影響のさらなるアッセイを行った。対照「フレッシュ」、「ＳＶＦクライオ」、および「ｐ１クライオ」ＣＭＢを上記の方法で図３に示すように調製した。培養２８日後、「フレッシュ」、「ＳＶＦクライオ」、「ｐ１クライオ」の各サンプルのＣＭＢの直径を測定し、図４Ａに示した。フレッシュＣＭＢの直径は約１．９ｍｍであり、ＳＶＦクライオＣＭＢの直径は約１．７ｍｍであり、ＰｌクライオＣＭＢの直径は約１．６ｍｍである。
【０１３０】
培養２８日後に「フレッシュ」、「ＳＶＦクライオ」、「ｐ１クライオ」の各サンプルのＣＭＢの湿重量を測定し、図４Ｂに示した。フレッシュＣＭＢの湿重量は約４．０ｍｇである。ＳＶＦクライオＣＭＢの湿重量は約２．５ｍｇであり、ＰｌクライオＣＭＢの湿重量は約１．７ｍｇである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）
【０１３１】
培養２８日後に、「フレッシュ」、「ＳＶＦクライオ」、および「ｐ１クライオ」の各サンプルにおける湿重量に対するＤＮＡの質量比（ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量）を測定し、図４Ｃに示した。フレッシュＣＭＢの質量比は、約３７５ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量である。ＳＶＦクライオＣＭＢの質量比は、約８５ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量である。ＰｌクライオＣＭＢの質量比は、約１０５ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量である。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）
【０１３２】
培養２８日後に、「フレッシュ」、「ＳＶＦクライオ」、および「ｐ１クライオ」の各サンプルにおける湿重量に対するＧＡＧの質量比（ｗ／ｗ％）を測定し、図４Ｄに示した。フレッシュＣＭＢの質量比は約５．５ｗ／ｗ％である。ＳＶＦクライオＣＭＢの質量比は約２．０ｗ／ｗ％である。ＰｌクライオＣＭＢの質量比は約４．８ｗ／ｗ％である。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）
【０１３３】
培養２８日後に、「フレッシュ」、「ＳＶＦクライオ」、および「ｐ１クライオ」の各サンプルにおける湿重量に対するコラーゲンの質量比（ｗ／ｗ％）を測定し、図４Ｅに示した。フレッシュＣＭＢの質量比は約３．５ｗ／ｗ％である。ＳＶＦクライオＣＭＢの質量比は約５．２ｗ／ｗ％である。ＰｌクライオＣＭＢの質量比は約３．１ｗ／ｗ％である。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）
【０１３４】
培養２８日後の「フレッシュ」、「ＳＶＦクライオ」、「ｐ１クライオ」のＣＭＢのそれぞれの外観を図４Ｆに示す。スケールバーは０．５ｍｍである。
【０１３５】
３つの群のＡＤＳＣを使用してＣＭＢを作成し、軟骨分化培地（ＣＤＭ）で４週間成長させた場合、凍結保存により、得られたサンプルの直径、湿重量、およびＤＮＡが有意に減少した（ｐ＜０．０１）。凍結保存はまた、ＳＶＦクライオＣＭＢにおいて、ＧＡＧを有意に減少させ［軟骨形成のマーカー（ｐ＜０．０１）］、またコラーゲン含有量を有意に増加させる（ｐ＜０．０５）が、ＰｌクライオＣＭＢは、フレッシュＣＭＢと同様の特性を有していた。図４Ｆは、培養２８日後の典型的なＣＭＢの画像を示す。
【０１３６】
上記の結果は、１回の継代後に凍結保存されたＡＤＳＣ（「ｐ１クライオ」）が、既製の注射製品に適していることを示唆する。
【０１３７】
実施例７：軟骨形成に対するＣＭＢの凍結保存の影響の試験
ＣＭＢペレット（ウェル内の３Ｄ）に対する凍結保存の影響のさらなるアッセイを行った。
【０１３８】
対照の「フレッシュ」および「ｐ１クライオ」サンプルを図５に示すように調製した。脂肪組織のサンプルを遠心分離して、間質血管画分（ＳＶＦ）を分離した。「ｐ１クライオ」サンプルでは、ＳＶＦをフラスコに入れ、１回継代した後、実施例１に記載のように凍結保存し、液体窒素中に１〜５週間保管した。次に、凍結保存したサンプルを解凍し、４回継代した。「フレッシュ」サンプルでは、ＳＶＦをフラスコに入れ、４回継代した。
【０１３９】
次に、「フレッシュ」および「ｐ１クライオ」サンプルのそれぞれを、対照サンプルと凍結サンプルに分けた。凍結サンプルは、実施例１に記載のように凍結保存し、液体窒素中に少なくとも１週間保管した。次に、凍結サンプルを解凍し、マルチウェルプレートに移した。その後、対照サンプルおよび凍結サンプルの両方をさらにアッセイする。
【０１４０】
マルチウェルプレートでの３日間の培養（３Ｄ培養）の後でさらに２８日間の軟骨分化の後に、「フレッシュ−対照」、「ｐ１クライオ−対照」、「フレッシュ−凍結」、および「ｐ１クライオ−凍結」の各サンプルのＣＭＢの直径を測定し、結果を図６Ａに示した。フレッシュ−対照ＣＭＢの直径は約１．８７ｍｍであり、フレッシュ−凍結ＣＭＢの直径は約１．２０ｍｍであり、ｐ１クライオ−対照ＣＭＢの直径は約１．８２ｍｍであり、ｐ１クライオ−凍結ＣＭＢの直径は約１．４３ｍｍである。
【０１４１】
「フレッシュ−対照」、「ｐ１クライオ−対照」、「フレッシュ−凍結」および「ｐ１クライオ−凍結」の各サンプルの細胞の湿重量も測定し、結果を図６Ｂに示した。フレッシュ−対照ＣＭＢの湿重量は約３．１５ｍｇであり、フレッシュ−凍結ＣＭＢの湿重量は約１．７０ｍｇであり、ｐ１クライオ−対照ＣＭＢの湿重量は約２．３０ｍｇであり、ｐ１クライオ−凍結ＣＭＢの湿重量は約１．２０ｍｇである。
【０１４２】
「フレッシュ−対照」、「ｐ１クライオ−対照」、「フレッシュ−凍結」および「ｐ１クライオ−凍結」の各サンプルにおける湿重量に対するＤＮＡの質量比（ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量）を測定し、図６Ｃに示した。長期軟骨形成誘導の前は、ＣＭＢの湿重量に対するＤＮＡの質量比は、約２００〜５０００ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ  ＣＭＢである。５週間の軟骨形成誘導後、フレッシュ−対照ＣＭＢの湿重量に対するＤＮＡの質量比は約３６０ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量であり、フレッシュ−凍結ＣＭＢの質量比は約２３０ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量であり、ｐ１クライオ−対照ＣＭＢの質量比は約３４５ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量であり、Ｐ１クライオ−凍結ＣＭＢの質量比は約５５０ｎｇ  ＤＮＡ／ｍｇ湿重量である。
【０１４３】
「フレッシュ−対照」、「ｐ１クライオ−対照」、「フレッシュ−凍結」および「ｐ１クライオ−凍結」の各サンプルにおける湿重量に対するＧＡＧの質量比（ｗ／ｗ％）を測定し、図６Ｄに示した。フレッシュ−対照ＣＭＢの質量比は約５．７０（ｗ／ｗ％）であり、フレッシュ−凍結ＣＭＢの質量比は約６．５５（ｗ／ｗ％）であり、ｐ１クライオ−対照ＣＭＢの質量比は約４．４５（ｗ／ｗ％）であり、ｐ１クライオ−凍結ＣＭＢの質量比は約３．９０（ｗ／ｗ％）である。
【０１４４】
「フレッシュ−対照」、「ｐ１クライオ−対照」、「フレッシュ−凍結」および「ｐ１クライオ−凍結」の各サンプルにおける湿重量に対するコラーゲンの質量比（ｗ／ｗ％）を測定し、図６Ｅに示した。フレッシュ−対照ＣＭＢの質量比は約３．６５（ｗ／ｗ％）であり、フレッシュ−凍結ＣＭＢの質量比は約４．９５（ｗ／ｗ％）であり、ｐ１クライオ−対照ＣＭＢの質量比は約４．００（ｗ／ｗ％）であり、ｐ１クライオ−凍結ＣＭＢの質量比は約２．４０（ｗ／ｗ％）である。
【０１４５】
マルチウェルプレートでの３日間の培養（３−Ｄ培養）の後でさらに２８日間の軟骨分化の後の「フレッシュ−対照」、「ｐ１クライオ−対照」、「フレッシュ−凍結」および「ｐ１クライオ−凍結」のＣＭＢの外観を図６Ｆに示すおよび。
【０１４６】
直径（図６Ａ）は、対照ＣＭＢについて同様であり、ＣＭＢの凍結保存で直径が２５〜３０％減少する。これらの違いは、図６Ｆの目視検査データで確認できる。図６Ｂの湿重量データは、すべての群間で有意差を示し、ＡＤＳＣの凍結保存とＣＭＢの凍結保存の両方で有意な減少が見られる。
【０１４７】
ＤＮＡ（図６Ｃ）、ＧＡＧ（図６Ｄ）、およびコラーゲン（図６Ｅ）の含有量の生化学分析は、問題の境界に応じて異なる応答を示した。ＣＭＢのＤＮＡ含有量は、フレッシュ−対照、フレッシュ−凍結、Ｐｌクライオ−対照の群間で有意差はなかった。しかしながら、Ｐｌクライオ−凍結群は、他の群、特にフレッシュ−凍結と比較して、ＤＮＡ含有量が増加した。ＧＡＧ含有量は、フレッシュＣＭＢと比較して、ＰｌクライオＣＭＢで低かった。図６Ｄに示すように、これらの差異の一部は有意である。線維性コラーゲンの含有量は、対照群間では類似していたが、それぞれ対応の対照と比較して、フレッシュ−凍結群のコラーゲン含有量は増加し、Ｐｌクライオ−凍結群のコラーゲン含有量は減少した。
【０１４８】
実施例８：軟骨形成ＣＭＢのフローサイトメトリー分析
軟骨形成ＣＭＢの細胞表面マーカーの分析をフローサイトメトリーによって行った。ＩＳＯに対する抗体を陰性対照として使用し、ＣＤ５９およびＣＤ９０に対する抗体を陽性対照として使用した。ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０またはＣＤ８６の発現を試験した。また、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現も試験した。図７Ａにおいて、フローサイトメトリーの結果は、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現の陰性により、軟骨形成ＣＭＢの抗原性を示す。発現の陰性は、陰性対照として使用されるＩＳＯ抗体でも見られ、一方、陽性対照として使用されるＣＤ５９およびＣＤ９０では発現の陽性が見られた。
【０１４９】
図７Ｂは、表面マーカーの特徴の分析をフローサイトメトリーによって行った後の、生存するＡＤＳＣ上の様々な抗原の発現パーセントを示す。ＡＤＳＣは４人のドナーから採取した。ＣＤ３４およびＣＤ４５の発現が低く、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現が高い、典型的な間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のプロファイルが示された。さらに、凍結保存されたＣＭＢにおける抗原マーカーの検査は、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６の発現の欠如を示し、そのような細胞が免疫原性反応を誘起しない可能性が高いことを示す。
【０１５０】
実施例９：ヒドロゲルとＣＭＢとの組合せを試験するためのシリコーン欠損モデル
Ｉ型コラーゲン、ヒアルロン酸、およびＩ型コラーゲン：ヒアルロン酸塩（４：１、１：１、１：４の比率）を、ＣＭＢおよび成長因子微粒子のための送達ビヒクルとして検討する。我々のヒドロゲル送達ビヒクルならびにＣＭＢおよび微粒子のパラメーターの最適化のために、図８に示すように、外植片欠損モデルを模倣するシリコーンゴムリング法（内径５ｍｍ、厚さ２ｍｍ）を使用する。ヒドロゲルとＣＭＢをシリコーン欠損に添加する。湿重量、ＤＮＡ質量比、ＧＡＧ質量比、およびコラーゲン質量比のパラメーターを図８の表に示しており、すべてのゲル製剤が、ＣＭＢを送達するのに適した選択肢である。各ヒドロゲルの濃度およびゲル化時間の最適化をシリコーン欠損モデルで行う。（ｉ）コラーゲンおよび（ｉｉ）コラーゲン：ヒアルロン酸塩（１：１、４：１、１：４）を用いて送達されるＣＭＢを充填したシリコーン欠損モデルおよび軟骨欠損モデルの両方で追加の最適化を行い、どの条件が軟骨の表現型および周囲軟骨との癒合の最良の組合せを与えるかを決定する。
【０１５１】
シリコーン欠損モデルで最適化した後、骨軟骨欠損モデルを使用して試験を繰り返す。図９Ａは、骨軟骨欠損モデルにおける空の欠損の写真である。図９Ｂは、コラーゲンゲル−ＣＭＢを充填した欠損を示す写真である。図９Ｃは、欠損内に充填成分が保持されている、コラーゲンゲル−ＣＭＢ充填欠損の半断面を示す写真である。骨軟骨欠損モデルで上記のパラメーターの追加の最適化を行う。
【０１５２】
実施例１０：ヒドロゲルとＣＭＢの組合せを試験するためのシリコーン欠損モデル
薬物をＣＭＢ−ヒドロゲルの組合せに組み込んで、ｈＡＤＳＣ軟骨形成を誘導できるかどうかを試験した。薬物放出製剤は、薬物が軟骨分化培地に直接添加されるｈＡＤＳＣ軟骨形成を誘導するために以前に使用された薬物補充法と同等であるように設計された。平均１〜１０μｍのサイズを有する粒子に、０．０２％（ｗ／ｗ％）の薬物を装填した。８０ｍｇの薬物を含む微粒子を作製し、長期の薬物放出（最大３５日）を試験して、ｈＡＤＳＣ軟骨形成をうまく誘導するのに必要な最適な微粒子濃度を決定した。経時的な薬物放出を、図１０Ａに記載の実験プロトコルを使用してアッセイした。
【０１５３】
図１０Ｂは、経時的に観察された薬物の放出を示す。１０ｍｇの微粒子は、６日間にわたり、約１０ｐｇ／４８時間、または５ｐｇ／日の放出速度をもたらす。
【０１５４】
直径５ｍｍ／厚さ１ｍｍの移植片（２０μｌの移植片体積）で１０ｎｇ／ｍｌの成長因子濃度を維持するのに適した２０ｐｇ／日の放出速度を達成するには、４０ｍｇの微粒子を各移植片に装填する。
【０１５５】
実施例１１：ヒドロゲル、ＣＭＢおよび薬物を含む組成物からの軟骨の再生を試験するための軟骨外植片欠損モデル
２つの薬物、ＴＧＦ−β３とＢＭＰ−６を、ＣＭＢ−ヒドロゲルの組合せに添加し、それらがｅｘ  ｖｉｖｏモデルで軟骨欠損を充填するかどうか、および動的変形荷重（dynamic deformational loading）がＧＡＧおよびコラーゲンの含有量に影響を及ぼすかどうかを試験した。動的変形荷重（１％の風袋荷重、それに続く１Ｈｚでの１日３時間、週５〜７日の１０％の表面間変形［Ng et al., Cell Mol. Bioeng., Sep. 1, 2009, 2(3):386-394]）を用いてＡＤＳＣを刺激して、軟骨細胞に分化させ、またグリコサミノグリカン、軟骨オリゴマータンパク質（ＣＯＭＰ）、リンクタンパク質、ヒアルロン酸、およびコラーゲン（特に、ＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン）などの、軟骨分化誘導因子の産生を増加させた。動的変形荷重を負荷された軟骨充填材および対照軟骨充填材のＧＡＧ含有量およびコラーゲン含有量をアッセイした。結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。
【０１５６】
図１１Ａは、ＧＡＧ含有量が、負荷軟骨充填材または非負荷対照軟骨充填材の両方で類似していたことを示す。
【０１５７】
図１１Ｂは、荷重負荷により、湿重量に対して約５％のコラーゲンである非負荷対照と比較して、コラーゲン含有量が湿重量の１０％に改善されることを示す。
【０１５８】
実施例１２：様々なヒドロゲル組成物の送達を試験するための軟骨外植片欠損モデル
様々な組成および濃度のヒドロゲルを、全層軟骨外植片欠損モデルにおいて保持時間およびゲル化時間について試験した。試験したゲル成分には、フィブリンのみ、およびコラーゲン／ヒアルロン酸の様々な組合せが含まれていた。様々なヒドロゲル組成物を外植片の欠損部に送達し、硬化させ、その後にＰＢＳ中において３７℃で最大５日間攪拌することにより、ゲル保持能力を試験した。
【０１５９】
結果を図１３に示す。フィブリンのみおよび高ヒアルロン酸のヒドロゲル組成物は、高コラーゲン組成物サンプルと比較して、優れた保持力を示した。
【０１６０】
さらに、ＡＤＳＣから製造されたＣＭＢを含むヒドロゲル組成物を外植片の欠損に送達した。直径１０ｍｍ、厚さ１０ｍｍ（軟骨の厚さ１〜２ｍｍ）のウシ骨軟骨外植片を、骨格的に成熟したウシの膝から採取した。生検パンチを使用して、直径５ｍｍの全厚（骨に至るまで）の欠損を作成した。次に、これら欠損を、ＣＭＢとコラーゲン／ヒアルロン酸ヒドロゲルとの１：１体積の混合物で充填し、ＴＧＦ−β３およびＢＭＰ−６成長因子を含む培地で、負荷ありまたはなしで最大５週間培養した。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養後、新しく形成された組織は天然の軟骨に癒合し、天然の軟骨に匹敵するグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの含有量を示した。データを図１４に示す。
【０１６１】
実施例１３：ＣＭＢのサイズが軟骨構築物の質に及ぼす影響
軟骨構築物の質に対するＣＭＢのサイズの影響を評価した。５０Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの細胞からＣＭＢを作成した。次に、各ＣＭＢのサイズで構築物を作成し、４週間培養し、目視検査、組織学的検査、および定量評価のために採取した。目視検査は、すべての実験条件のサンプルが十分に融合したＣＭＢを示すことを明らかにした。データを図１５Ａに示す。さらに、構築物は不透明であり、それは軟骨様品質の指標である。図１５Ｂに示すように、Ｈ＆Ｅの組織学的染色が目視観察を追認し、すべての群で融合したＣＭＢを示した。軟骨形成マーカー、ＧＡＧおよびコラーゲンの組織学的染色は、実験条件間で同等の分化を示した。ＣＭＢのサイズが構築物の品質にどのように影響するかを特定するために、サンプルの湿重量、ＤＮＡ、ＧＡＧ、およびコラーゲンの定量も群間で比較した。データを図１５Ｃに示す。すべてのパラメーターについて、値は群間で比較的一貫していた。これらの結果は、５０Ｋ、１００Ｋ、および２５０ＫのＣＭＢのサイズが、すべて同等の軟骨品質をもたらし、軟骨充填材製品の製造の対象になり得ることを示す。
【参考文献】
【０１６２】
1. Riboh, J.C., et al., Comparative efficacy of cartilage repair procedures in the knee: a network meta-analysis. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc., 2016.
2. Goyal, D., et al., Evidence-based status of microfracture technique: a systematic review of level I and II studies. Arthroscopy, 2013. 29(9): p. 1579-88.
3. Brittberg, M., et al., Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop., 1996(326): p. 270-83.
4. Jacobi, M., et al., MACI - a new era? Sports Med Arthrosc. Rehabil. Ther. Technol., 2011. 3(1): p. 10.
5. Hangody, L., et al., Arthroscopic autogenous osteochondral mosaicplasty for the treatment of femoral condylar articular defects. A preliminary report. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc., 1997. 5(4): p. 262-7.
6. O’Driscoll, S.W., et al., The chondrogenic potential of free autogenous periosteal grafts for biological resurfacing of major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion. An experimental investigation in the rabbit. J. Bone Joint Surg. Am., 1986. 68(7): p. 1017-35.
7. Bobic, V., Current Status of the Articular Cartilage Repair. The Journal of Regenerative Medicine, 2000. 1(4): p. 37-41.
8. McNickle, A.G., et al., Overview of Existing Cartilage Repair Technology. Sports Med. Arthrosc. Rev., 2008. 16(4): p. 196-201.
9. Bobic, V., Tissue Repair Techniques of the Future: Options for Articular Cartilage Injury. Conference Report. Medscape Orthopaedics & Sports Medicine eJournal, 2000. 4(1).
10. Bos, P.K., et al., Articular cartilage repair and the evolving role of regenerative medicine. Open Access Surgery, 2010. 3: p. 109-122.
11. Rivera, J.C., et al., Posttraumatic Osteoarthritis Caused by Battlefield Injuries: The Primary Source of Disability in Warriors. J. Am. Acad. Orthop. Surg., 2012. 20(1): p. S64-69.
12. Anderson, D.D., et al., Post-traumatic osteoarthritis: improved understanding and opportunities for early intervention. J. Orthop. Res, 2011. 29(6): p. 802-809.
13. Olson, S., et al., Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. 2015: Springer.
14. Hangody, L., et al., Autologous osteochondral grafting - technique and long-term results. Cartilage Repair, 2008. 39(1): p. 32-39.
15. Eichinger, J.K., et al., Penetrating Blast Injury to the Knee of a United States Soldier Treated with Allograft Mosaicplasty. Cartilage, 2011. 2(3): p. 307-311.
16. Scully, W.F., et al., Allograft Osteochondral Transplantation in the Knee in the Active Duty Population. Military Medicine, 2011. 176(10): p. 1196-1201.
17. Lima, E.G., et al., Functional tissue engineering of chondral and osteochondral constructs. Biorheology, 2004. 41(3-4): p. 577-90.
18. Hu, J.C., et al., A self-assembling process in articular cartilage tissue engineering. Tissue Eng., 2006. 12(4): p. 969-79.
19. Bhumiratana, S., et al., Large, stratified, and mechanically functional human cartilage grown in vitro by mesenchymal condensation. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2014. 111(19): p. 6940-5. 
20. McIntosh, K.R., et al., Evolution and future prospects of adipose-derived immunomodulatory cell therapeutics. Expert Rev. Clin. Immunol., 2013. 9(2): p. 175-84.
21. Yodmuang, S., et al., Synergistic effects of hypoxia and morphogenetic factors on early chondrogenic commitment of human embryonic stem cells in embryoid body culture. Stem Cell Rev., 2015. 11(2): p. 228-41.
22. Ryan, J.M., et al., Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. J. Inflamm. (London), 2005. 2: p. 8.
【０１６３】
本発明は、本明細書に記載されるある実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が前述の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【０１６４】
本明細書で言及されるすべての特許、出願、出版物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021517121.tif 000003
【図２】
2021517121.tif 000004
【図３】
2021517121.tif 000005
【図４Ａ】
2021517121.tif 000006
【図４Ｂ】
2021517121.tif 000007
【図４Ｃ】
2021517121.tif 000008
【図４Ｄ】
2021517121.tif 000009
【図４Ｅ】
2021517121.tif 000010
【図４Ｆ】
2021517121.tif 000011
【図５】
2021517121.tif 000012
【図６Ａ】
2021517121.tif 000013
【図６Ｂ】
2021517121.tif 000014
【図６Ｃ】
2021517121.tif 000015
【図６Ｄ】
2021517121.tif 000016
【図６Ｅ】
2021517121.tif 000017
【図６Ｆ】
2021517121.tif 000018
【図７Ａ】
2021517121.tif 000019
【図７Ｂ】
2021517121.tif 000020
【図８】
2021517121.tif 000021
【図９Ａ】
2021517121.tif 000022
【図９Ｂ】
2021517121.tif 000023
【図９Ｃ】
2021517121.tif 000024
【図１０Ａ】
2021517121.tif 000025
【図１０Ｂ】
2021517121.tif 000026
【図１１Ａ】
2021517121.tif 000027
【図１１Ｂ】
2021517121.tif 000028
【図１２】
2021517121.tif 000029
【図１３】
2021517121.tif 000030
【図１４】
2021517121.tif 000031
【図１５Ａ】
2021517121.tif 000032
【図１５Ｂ】
2021517121.tif 000033
【図１５Ｃ】
2021517121.tif 000034
【国際調査報告】
2021517121.tif 000035
2021517121.tif 000036
2021517121.tif 000037