(57)【要約】本発明は、肝門脈−類洞循環に蓄積されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のクリアランスを高めるためのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素の肝臓特異的送達および／または発現、ならびにがんおよび神経変性を含む様々な疾患および状態の処置のためのそのような肝臓特異的送達および／または発現の使用に関する。
2021510539.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）カプシドタンパク質と、（ｉｉ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸とを含み、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクター。
【請求項２】
前記肝臓特異的プロモーターが、他の組織および器官と比較した肝臓での前記酵素の発現の実質的増加を媒介する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
（ｉ）カプシドタンパク質と、（ｉｉ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸とを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターであって、前記カプシドタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに肝臓へのベクターの効率的および／または優先的なターゲティングを媒介する、ｒＡＡＶ発現ベクター。
【請求項４】
前記カプシドタンパク質がＶＰ３である、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記カプシドタンパク質が、対応する野生型カプシドタンパク質と比較して、肝臓へのベクターの送達の効率および／または特異性を改善する１つまたは複数の変異を含む、請求項３または４に記載のベクター。
【請求項６】
肝臓へのベクターの送達の効率および／または特異性の改善により、他の組織および器官と比較した肝臓での前記酵素の発現の実質的増加をもたらす、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記ＤＮａｓｅ活性を有する酵素が、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅ  γ、ＤＮａｓｅ１Ｌ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ２、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、ＤＮａｓｅ  ＩＩα、ＤＮａｓｅ  ＩＩβ、カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ（ＣＡＤ）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、アセチルコリンエステラーゼ、またはそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
前記ＤＮａｓｅ活性を有する酵素が、ＤＮａｓｅ  Ｉまたはその変異体もしくは誘導体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
前記ＤＮａｓｅ活性を有する酵素が、ヒトＤＮａｓｅ  Ｉまたはその変異体もしくは誘導体である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記核酸が、配列番号３０または配列番号３１の配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、アクチン結合部位に１つまたは複数の変異を含む、請求項８または９に記載のベクター。
【請求項１２】
前記アクチン結合部位における１つまたは複数の変異が、Ｇｌｎ−９、Ｇｌｕ−１３、Ｔｈｒ−１４、Ｈｉｓ−４４、Ａｓｐ−５３、Ｔｙｒ−６５、Ｖａｌ−６６、Ｖａｌ−６７、Ｇｌｕ−６９、Ａｓｎ−７４、Ａｌａ−１１４、およびそれらの任意の組合せでの変異から選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記アクチン結合部位における変異の１つがＡｌａ−１１４での変異である、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、ＤＮａｓｅ活性を高める１つまたは複数の変異を含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の変異が、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｅ１３Ｋ、Ｔ１４Ｒ、Ｔ１４Ｋ、Ｈ４４Ｒ、Ｈ４４Ｋ、Ｎ７４Ｋ、Ａ１１４Ｆ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の変異が、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４Ｋ、およびＡ１１４Ｆ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１７】
前記ＤＮａｓｅ活性を高める変異の１つがＱ９Ｒである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ＤＮａｓｅ活性を高める変異の１つがＥ１３Ｒである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１９】
前記ＤＮａｓｅ活性を高める変異の１つがＮ７４Ｋである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項２０】
前記ＤＮａｓｅ活性を高める変異の１つがＡ１１４Ｆである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、配列番号５の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２２】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、配列番号５の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２３】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、配列番号５の配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、配列番号５の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２５】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、変異Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４Ｋ、およびＡ１１４Ｆを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２６】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が配列番号５の配列を含む、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２７】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、配列番号２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、配列番号２の配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３０】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、変異Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４Ｋ、およびＡ１１４Ｆを含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３１】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が配列番号２の配列を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３２】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が配列番号２または配列番号５の配列からなる、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３３】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、Ｈ４４Ｃ、Ｈ４４Ｎ、Ｌ４５Ｃ、Ｖ４８Ｃ、Ｇ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｄ５３Ｃ、Ｄ５３Ｒ、Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｙ、Ｄ５３Ａ、Ｎ５６Ｃ、Ｄ５８Ｓ、Ｄ５８Ｔ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｅ、Ｙ６５Ｒ、Ｙ６５Ｃ、Ｖ６６Ｎ、Ｖ６７Ｅ、Ｖ６７Ｋ、Ｖ６７Ｃ、Ｅ６９Ｒ、Ｅ６９Ｃ、Ａ１１４Ｃ、Ａ１１４Ｒ、Ｈ４４Ｎ：Ｔ４６Ｓ、Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｄ５３Ｒ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ４４Ａ：Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｈ４４Ａ：Ｙ６５Ａ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｓ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｔ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｓ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｔ、Ｖ６６Ｎ：Ｓ６８Ｔ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｓ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｔ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｓ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｔ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｓ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｔ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む、請求項８または請求項９に記載のベクター。
【請求項３４】
前記核酸が、配列番号４の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉをコードする、請求項８に記載のベクター。
【請求項３５】
前記核酸が、配列番号２３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
前記核酸が、配列番号２３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３７】
前記核酸が、配列番号２３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３８】
前記核酸が、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３９】
前記核酸が、配列番号１の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉをコードする、請求項８に記載のベクター。
【請求項４０】
前記核酸が、配列番号２２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４１】
前記核酸が、配列番号２２と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４２】
前記核酸が、配列番号２２と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４３】
前記核酸が、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４４】
前記核酸が、配列番号３２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項４５】
前記核酸が、配列番号３２と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項４６】
前記核酸が、配列番号３２と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項４７】
前記核酸が、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項４８】
前記核酸が、配列番号２４の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉをコードする、請求項８に記載のベクター。
【請求項４９】
前記核酸が、配列番号２９と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
前記核酸が、配列番号２９と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５１】
前記核酸が、配列番号２９と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５２】
前記核酸が、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５３】
前記核酸が、配列番号２６の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉをコードする、請求項８に記載のベクター。
【請求項５４】
前記核酸が、配列番号２８と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
前記核酸が、配列番号２８と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５６】
前記核酸が、配列番号２８と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５７】
前記核酸が、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５８】
前記核酸が、配列番号５の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉ変異体をコードする、請求項８に記載のベクター。
【請求項５９】
前記核酸が、配列番号２１と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載のベクター。
【請求項６０】
前記核酸が、配列番号２１と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載のベクター。
【請求項６１】
前記核酸が、配列番号２１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載のベクター。
【請求項６２】
前記核酸が、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載のベクター。
【請求項６３】
前記核酸が、配列番号２の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉ変異体をコードする、請求項８に記載のベクター。
【請求項６４】
前記核酸が、配列番号１９と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６５】
前記核酸が、配列番号１９と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６６】
前記核酸が、配列番号１９と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６７】
前記核酸が、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６８】
前記ＤＮａｓｅ活性を有する酵素が、（ｉｉ）アルブミンまたはＦｃまたはそれらの断片に連結された（ｉ）ＤＮａｓｅ酵素またはその断片を含む融合タンパク質である、請求項１〜６７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６９】
前記ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする配列が、分泌シグナル配列をコードする配列を含み、前記分泌シグナル配列は、肝臓でのベクターの発現の際に肝類洞系への酵素の効果的な分泌を媒介する、請求項１〜６８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７０】
前記分泌シグナル配列が、ＤＮａｓｅ  Ｉ分泌シグナル配列、ＩＬ２分泌シグナル配列、アルブミン分泌シグナル配列、β−グルクロニダーゼ分泌シグナル配列、アルカリプロテアーゼ分泌シグナル配列、およびフィブロネクチン分泌シグナル配列からなる群より選択される、請求項６９に記載のベクター。
【請求項７１】
前記分泌シグナル配列が、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）またはＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）を含む、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７２】
前記分泌シグナル配列が、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）またはＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）からなる、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７３】
前記分泌シグナル配列が、ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）の配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７４】
前記分泌シグナル配列をコードする配列が、配列番号２０と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７５】
前記分泌シグナル配列をコードする配列が、配列番号２０と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７６】
前記分泌シグナル配列をコードする配列が、配列番号２０と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７７】
前記分泌シグナル配列をコードする配列が、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７８】
前記分泌シグナル配列が、配列ＭＲＹＴＧＬＭＧＴＬＬＴＬＶＮＬＬＱＬＡＧＴ（配列番号２５）を含む、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７９】
前記分泌シグナル配列が、配列ＭＲＹＴＧＬＭＧＴＬＬＴＬＶＮＬＬＱＬＡＧＴ（配列番号２５）からなる、請求項７０に記載のベクター。
【請求項８０】
前記分泌シグナル配列が、ＭＲＹＴＧＬＭＧＴＬＬＴＬＶＮＬＬＱＬＡＧＴ（配列番号２５）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７０に記載のベクター。
【請求項８１】
前記分泌シグナル配列をコードする配列が、配列番号２７と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８２】
前記分泌シグナル配列をコードする配列が、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８３】
前記分泌シグナル配列をコードする配列が、配列番号２７と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８４】
前記分泌シグナル配列をコードする配列が、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８５】
前記プロモーターが、アルブミンプロモーター、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）プロモーター、ＨＢＶベーシックコアプロモーター（ＢＣＰ）、ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）プロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ホスホフェノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプロモーター（ＡＰＯＡ２）、トランスフェリンプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、α−フィブリノーゲンプロモーター、β−フィブリノーゲンプロモーター、α１−アンチキモトリプシンプロモーター、α２−ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質のプロモーター、α１−酸性糖タンパク質プロモーター、ＬＳＰ１プロモーター、セルピンペプチダーゼ阻害剤プロモーター、クレードＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）（ｈＡＡＴ）プロモーター、チトクロームＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １２２（ｍｉＲ−ｌ２２）プロモーター、肝臓特異的ＩＧＦ−ＩＩプロモーターＰ１、トランスサイレチン（ＭＴＴＲ）プロモーター、およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターからなる群より選択される、請求項１〜８４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８６】
前記プロモーターがアルブミンプロモーターである、請求項８５に記載のベクター。
【請求項８７】
前記アルブミンプロモーターが配列番号８の配列を含む、請求項８６に記載のベクター。
【請求項８８】
前記アルブミンプロモーターが配列番号８の配列からなる、請求項８７に記載のベクター。
【請求項８９】
前記プロモーターがα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターである、請求項８５に記載のベクター。
【請求項９０】
前記プロモーターがヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである、請求項８９に記載のベクター。
【請求項９１】
ｈＡＡＴプロモーターが、配列番号１５の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９０に記載のベクター。
【請求項９２】
ｈＡＡＴプロモーターが配列番号１５の配列を含む、請求項９１記載のベクター。
【請求項９３】
ｈＡＡＴプロモーターが配列番号１５の配列からなる、請求項９２に記載のベクター。
【請求項９４】
前記カプシドタンパク質における１つまたは複数の変異が、Ｓ２７９Ａ、Ｓ６７１Ａ、Ｋ１３７Ｒ、Ｔ２５２Ａ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項５〜９３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９５】
前記カプシドタンパク質における１つまたは複数の変異が変異Ｋ１３７Ｒを含む、請求項５〜９４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９６】
前記カプシドタンパク質が配列番号３４の配列を含む、請求項１〜９３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９７】
前記カプシドタンパク質が配列番号３４の配列からなる、請求項９６に記載のベクター。
【請求項９８】
前記ＡＡＶが、血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、およびＡｎｃ８０から選択される、請求項１〜９７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９９】
前記ＡＡＶが血清型８またはＡｎｃ８０に由来する、請求項９８に記載のベクター。
【請求項１００】
前記核酸が、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含み、前記ＩＴＲが、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列に隣接する、請求項１〜９９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０１】
前記核酸が、プロモーターの上流または下流に位置する１つまたは複数のエンハンサーをさらに含む、請求項１〜１００のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０２】
前記１つまたは複数のエンハンサーが、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサー、α−フェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ＬＳＰエンハンサー、α１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー、アルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１０１に記載のベクター。
【請求項１０３】
前記エンハンサーがアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーである、請求項１０２に記載のベクター。
【請求項１０４】
前記アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーが肝臓制御領域（ＨＣＲ）エンハンサーである、請求項１０３に記載のベクター。
【請求項１０５】
前記エンハンサーが、配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０３または１０４に記載のベクター。
【請求項１０６】
前記エンハンサーが配列番号１７の配列を含む、請求項１０５に記載のベクター。
【請求項１０７】
前記エンハンサーが配列番号１７の配列からなる、請求項１０６に記載のベクター。
【請求項１０８】
前記核酸が、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１〜１０７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０９】
前記核酸がコザック配列をさらに含む、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１０】
前記コザック配列が、配列５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３３）を含む、請求項１０９に記載のベクター。
【請求項１１１】
前記核酸が、配列番号３０と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０９に記載のベクター。
【請求項１１２】
前記核酸が、配列番号３０と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０９に記載のベクター。
【請求項１１３】
前記核酸が、配列番号３０と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０９に記載のベクター。
【請求項１１４】
前記核酸が、配列番号３０と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０９に記載のベクター。
【請求項１１５】
前記核酸が配列番号３０のヌクレオチド配列を含む、請求項１０９に記載のベクター。
【請求項１１６】
前記核酸が転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１〜１１５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１７】
前記転写後調節エレメントがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１１６に記載のベクター。
【請求項１１８】
ＷＰＲＥが機能性Ｘタンパク質をコードしない、請求項１１７に記載のベクター。
【請求項１１９】
前記転写後調節エレメントが、配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０９〜１１８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２０】
前記転写後調節エレメントが配列番号１６の配列を含む、請求項１１９に記載のベクター。
【請求項１２１】
前記転写後調節エレメントが配列番号１６の配列からなる、請求項１２０に記載のベクター。
【請求項１２２】
前記核酸が、配列番号１９の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜２２、３４〜７０、７５〜８５、８９〜１０７および１０９〜１１９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２３】
前記核酸が配列番号１９の配列を含む、請求項１２２に記載のベクター。
【請求項１２４】
前記核酸が配列番号１９の配列からなる、請求項１２３に記載のベクター。
【請求項１２５】
（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）アルブミンプロモーターまたはα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結された配列番号４の配列を含むデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクター。
【請求項１２６】
（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）アルブミンプロモーターまたはα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結された配列番号５の配列を含むデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクター。
【請求項１２７】
（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）アルブミンプロモーターまたはアンチトリプシンプロモーターに作動可能に連結された配列番号１の配列を含むデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクター。
【請求項１２８】
（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）アルブミンプロモーターまたはアンチトリプシンプロモーターに作動可能に連結された配列番号２の配列を含むデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクター。
【請求項１２９】
（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）配列番号３０のヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクター。
【請求項１３０】
（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）配列番号３１のヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクター。
【請求項１３１】
請求項１〜１２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、ならびに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３２】
デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素を、それを必要とする対象の肝臓に送達する方法であって、請求項１〜１３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１３１に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３３】
それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、前記疾患または状態は対象の肝門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の蓄積を伴い、該方法は、請求項１〜１２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１３１に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３４】
前記疾患が、がん、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、および遅延型過敏症反応からなる群より選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、請求項１〜１３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１３１に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３６】
前記がんが、門脈へと流れ出る器官、組織および／または構造を起源とするおよび／またはそれらに転移する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記がんが、がん性腹膜炎、リンパ腫、胃がん、結腸がん、腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、胆管のがん、胆嚢のがん、肉腫、および任意の起源の肝転移性疾患からなる群より選択される、請求項１３５または請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
転移を阻害するのに有効である、請求項１３５〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
それを必要とする対象における神経変性疾患を処置する方法であって、請求項１〜１３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１３１に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４０】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、軽度認知障害（ＭＣＩ）、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、および１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）から選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記神経変性疾患が、ＤＮＡの存在によるミスフォールドタンパク質の形成に関連する、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記ＤＮＡが、ヒトＤＮＡ、微生物ＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ、または細胞内ＤＮＡである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記神経変性疾患が、糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、痛風、メタボリックシンドローム、アミロイドーシス、喘息、またはプリオン病に続発する、請求項１３９〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
アミロイドーシスが、遺伝性脳出血を伴うアミロイドーシス、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、血液透析関連アミロイドーシス、フィンランド型遺伝性全身性アミロイドーシス、心房性アミロイドーシス、リゾチーム全身性アミロイドーシス、インスリン関連アミロイドーシス、またはフィブリノーゲンα鎖アミロイドーシスである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
それを必要とする対象における遅延型過敏反応を処置する方法であって、請求項１〜１３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１３１に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４６】
前記遅延型過敏症反応が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
それを必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、請求項１〜１３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１３１に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４８】
それを必要とする対象における化学療法または放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する方法であって、請求項１〜１３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項１３１に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４９】
前記化学療法に関連する１つまたは複数の副作用が、体重減少、骨髄毒性、血液生化学における異化変化、心毒性、消化管毒性、免疫の抑制、および好中球減少症からなる群より選択される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記化学療法が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗ガン性抗生物質、微小管標的薬、トポイソメラーゼ阻害剤、アルカロイド、および標的治療薬からなる群より選択される１つまたは複数の化合物の投与を含む、請求項１４８または請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記化学療法が、アントラサイクリン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エトポシド、タキサン、およびシクロホスファミドからなる群より選択される１つまたは複数の化合物の投与を含む、請求項１４８または請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
前記放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用が、体重減少、皮膚刺激、皮膚損傷、疲労、吐き気、嘔吐、線維症、腸損傷、記憶喪失、不妊症、および二次がんからなる群より選択される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５３】
前記放射線療法が、外照射療法または全身性放射性同位元素療法である、請求項１４８または請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ｒＡＡＶベクターまたはベクター組成物が、化学療法または放射線療法のサイクル中に投与される、請求項１４８〜１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ｒＡＡＶベクターまたはベクター組成物が、化学療法または放射線療法のサイクル後に投与される、請求項１４８〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ｒＡＡＶベクターまたはベクター組成物の投与が、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素の発現および対象の肝門脈−類洞循環へのその分泌をもたらす、請求項１３２〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ｒＡＡＶベクターまたはベクター組成物が、前記対象の門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルを低下させるのに十分な用量およびレジメンで投与される、請求項１３２〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記化学療法または放射線療法が、がん性腹膜炎、リンパ腫、胃がん、結腸がん、腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、胆管のがん、胆嚢のがん、肉腫、および任意の起源の肝転移性疾患からなる群より選択されるがんの処置に使用される、請求項１４８〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記対象がヒトである、請求項１３２〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素を、それを必要とする対象の肝臓に送達する方法であって、前記酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである、方法。
【請求項１６１】
デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素を、それを必要とする対象の肝臓に送達する方法であって、前記酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合に核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む、方法。
【請求項１６２】
それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、前記疾患または状態は、対象の肝門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の蓄積を伴い、該方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである、方法。
【請求項１６３】
それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法であって、前記疾患または状態は、対象の肝門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の蓄積を伴い、該方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターは、前記核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む、方法。
【請求項１６４】
前記疾患が、がん、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、および遅延型過敏症反応からなる群より選択される、請求項１６２または請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである、方法。
【請求項１６６】
それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターは、前記核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む、方法
【請求項１６７】
前記がんが、門脈へと流れ出る器官、組織および／または構造に由来するおよび／またそれらに転移する、請求項１６５または請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記発現ベクターは、前記対象の肝臓におけるＤＮａｓｅ酵素の合成をもたらし、前記がんは、門脈に流出する器官、組織および／または構造に由来するおよび／またはそれらに転移する、方法。
【請求項１６９】
前記がんが、がん性腹膜炎、リンパ腫、胃がん、結腸がん、腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、胆管のがん、胆嚢のがん、肉腫、および任意の起源の肝転移性疾患からなる群より選択される、請求項１６５〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
転移を阻害するのに有効である、請求項１６５〜１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
それを必要とする対象における神経変性疾患を処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである、方法。
【請求項１７２】
それを必要とする対象における神経変性疾患を処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターは、核酸を肝細胞に標的化できる１つまたは複数の分子を含む、方法。
【請求項１７３】
それを必要とする対象における神経変性疾患を処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記発現ベクターは、前記対象の肝臓におけるＤＮａｓｅ酵素の合成をもたらし、腸由来の微生物セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が前記患者の血液で検出可能である、方法。
【請求項１７４】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、軽度認知障害（ＭＣＩ）、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、または１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）である、請求項１７１〜１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記神経変性疾患が、糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、痛風、メタボリックシンドローム、アミロイドーシス、喘息、またはプリオン病に続発する、請求項１７１〜１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
アミロイドーシスが、遺伝性脳出血を伴うアミロイドーシス、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、血液透析関連アミロイドーシス、フィンランド型遺伝性全身性アミロイドーシス、心房性アミロイドーシス、リゾチーム全身性アミロイドーシス、インスリン関連アミロイドーシス、またはフィブリノーゲンα鎖アミロイドーシスである、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
それを必要とする対象における遅延型過敏反応を処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである、方法。
【請求項１７８】
それを必要とする対象における遅延型過敏反応を処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターは、前記核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む、方法。
【請求項１７９】
前記遅延型過敏症反応が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項１７７または請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
それを必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである、方法。
【請求項１８１】
それを必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターは、前記核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む、方法。
【請求項１８２】
それを必要とする対象における化学療法または放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである、方法。
【請求項１８３】
それを必要とする対象における化学療法または放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する方法であって、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターは、前記核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む、方法。
【請求項１８４】
前記化学療法に関連する１つまたは複数の副作用が、体重減少、骨髄毒性、血液生化学における異化変化、心毒性、消化管毒性、免疫の抑制、および好中球減少症からなる群より選択される、請求項１８２または請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記化学療法が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗ガン性抗生物質、微小管標的薬、トポイソメラーゼ阻害剤、アルカロイド、および標的治療薬からなる群より選択される１つまたは複数の化合物の投与を含む、請求項１８２〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記化学療法が、アントラサイクリン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エトポシド、タキサン、およびシクロホスファミドからなる群より選択される１つまたは複数の化合物の投与を含む、請求項１８２〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用が、体重減少、皮膚刺激、皮膚損傷、疲労、吐き気、嘔吐、線維症、腸損傷、記憶喪失、不妊、および二次がんからなる群より選択される、請求項１８２または請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８８】
前記放射線療法が外照射療法または全身性放射性同位元素療法である、請求項１８２〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記ベクターが化学療法または放射線療法のサイクル中に投与される、請求項１８２〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記ベクターが化学療法または放射線療法のサイクル後に投与される、請求項１８２〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記ベクターが、核酸を肝臓に標的化することができる１つまたは複数の分子をさらに含む、請求項１６０、１６２、１６４、１６５、１６７〜１７１、１７３、１７４、１７６、１７９、１８２、および１８４〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターである、請求項１６１、１６３、１６４、１６６〜１７０、１７２、１７３、１７７、１７８、１８０、および１８３〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記ベクターが、リポソームまたはナノ粒子にパッケージングされている、請求項１６０〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記ベクターが裸のＤＮＡとして使用される、請求項１６０〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９５】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１６０〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または肝臓指向性ウイルスベクターである、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
肝臓指向性ウイルスベクターがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ベクターである、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９９】
前記ＤＮａｓｅ活性を有する酵素が、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅ  γ、ＤＮａｓｅ１Ｌ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ２、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、ＤＮａｓｅ  ＩＩα、ＤＮａｓｅ  ＩＩβ、カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ（ＣＡＤ）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、アセチルコリンエステラーゼ、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、請求項１６０〜１９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２００】
前記ＤＮａｓｅが、ＤＮａｓｅ  Ｉまたはその変異体もしくは誘導体である、請求項１６０〜１９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記ＤＮａｓｅが、ヒトＤＮａｓｅ  Ｉまたはその変異体もしくは誘導体である、請求項１９３に記載の方法。
【請求項２０２】
ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、アクチン結合部位に１つまたは複数の変異を含む、請求項２００または請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記アクチン結合部位における１つまたは複数の変異が、Ｇｌｎ−９、Ｇｌｕ−１３、Ｔｈｒ−１４、Ｈｉｓ−４４、Ａｓｐ−５３、Ｔｙｒ−６５、Ｖａｌ−６６、Ｖａｌ−６７、Ｇｌｕ−６９、Ａｓｎ−７４、Ａｌａ−１１４、およびそれらの任意の組合せでの変異から選択される、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記アクチン結合部位における変異の１つがＡｌａ−１１４での変異である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、ＤＮａｓｅ活性を高める１つまたは複数の変異を含む、請求項２００〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０６】
前記１つまたは複数の変異が、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｅ１３Ｋ、Ｔ１４Ｒ、Ｔ１４Ｋ、Ｈ４４Ｒ、Ｈ４４Ｋ、Ｎ７４Ｋ、Ａ１１４Ｆ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記１つまたは複数の変異が、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４Ｋ、およびＡ１１４Ｆからなる群より選択される、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０８】
前記ＤＮａｓｅ活性を高める変異の１つがＱ９Ｒである、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０９】
前記ＤＮａｓｅ活性を高める変異の１つがＥ１３Ｒである、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２１０】
前記ＤＮａｓｅ活性を高める変異の１つがＮ７４Ｋである、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２１１】
前記ＤＮａｓｅ活性を高める変異の１つがＡ１１４Ｆである、請求項２０５に記載の方法。 
【請求項２１２】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が、Ｈ４４Ｃ、Ｈ４４Ｎ、Ｌ４５Ｃ、Ｖ４８Ｃ、Ｇ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｄ５３Ｃ、Ｄ５３Ｒ、Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｙ、Ｄ５３Ａ、Ｎ５６Ｃ、Ｄ５８Ｓ、Ｄ５８Ｔ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｅ、Ｙ６５Ｒ、Ｙ６５Ｃ、Ｖ６６Ｎ、Ｖ６７Ｅ、Ｖ６７Ｋ、Ｖ６７Ｃ、Ｅ６９Ｒ、Ｅ６９Ｃ、Ａ１１４Ｃ、Ａ１１４Ｒ、Ｈ４４Ｎ：Ｔ４６Ｓ、Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｄ５３Ｒ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ４４Ａ：Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｈ４４Ａ：Ｙ６５Ａ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｓ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｔ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｓ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｔ、Ｖ６６Ｎ：Ｓ６８Ｔ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｓ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｔ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｓ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｔ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｓ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｔ、およびそれらの任意の組合せなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２１３】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が長時間作用型のＤＮａｓｅである、請求項２００または請求項２０１に記載の方法。
【請求項２１４】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉが配列番号４の配列を含む、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉが配列番号１の配列を含む、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が配列番号５の配列を含む、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１７】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体が配列番号２の配列を含む、請求項２１６に記載の方法。
【請求項２１８】
前記ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする配列が分泌シグナル配列をコードする配列を含み、前記分泌シグナル配列は、対象にベクターを投与したときに、肝門脈−類洞循環への前記酵素の効果的な分泌を媒介する、請求項１６０〜２１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１９】
前記分泌シグナル配列が、ＤＮａｓｅ  Ｉ分泌シグナル配列、ＩＬ２分泌シグナル配列、アルブミン分泌シグナル配列、β−グルクロニダーゼ分泌シグナル配列、アルカリプロテアーゼ分泌シグナル配列、およびフィブロネクチン分泌シグナル配列からなる群より選択される、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
前記分泌シグナル配列が、ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、またはＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記分泌シグナル配列が、ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、またはＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記分泌シグナル配列が、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）またはＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）を含む、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２３】
前記分泌シグナル配列が、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）またはＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）からなる、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
前記肝臓特異的プロモーターが、他の組織および器官と比較した肝臓での前記酵素の発現の実質的増加を媒介する、請求項１６０、１６２、１６４、１６５、１６７〜１７１、１７３、１７４、１７６、１７９、１８２、および１８４〜２２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２５】
前記プロモーターが、アルブミンプロモーター、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）プロモーター、ＨＢＶベーシックコアプロモーター（ＢＣＰ）、ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）プロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ホスホフェノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプロモーター（ＡＰＯＡ２）、トランスフェリンプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、α−フィブリノーゲンプロモーター、β−フィブリノーゲンプロモーター、α１−アンチキモトリプシンプロモーター、α２−ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質のプロモーター、α１−酸性糖タンパク質プロモーター、ＬＳＰ１プロモーター、セルピンペプチダーゼ阻害剤プロモーター、クレードＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）（ｈＡＡＴ）プロモーター、チトクロームＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １２２（ｍｉＲ−ｌ２２）プロモーター、肝臓特異的ＩＧＦ−ＩＩプロモーターＰ１、トランスサイレチン（ＭＴＴＲ）プロモーター、およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターからなる群より選択される、請求項１６０〜２２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２６】
前記プロモーターがアルブミンプロモーターである、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
前記アルブミンプロモーターが配列番号８の配列を含む、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記アルブミンプロモーターが配列番号８の配列からなる、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記プロモーターがアンチトリプシンプロモーターである、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３０】
前記プロモーターがヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記ＡＡＴプロモーターが、配列番号１５の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３２】
前記ＡＡＴプロモーターが配列番号１５の配列を含む、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３３】
前記ＡＡＴプロモーターが配列番号１５の配列からなる、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３４】
前記核酸が、プロモーターの上流または下流に位置する１つまたは複数の肝臓制御領域（ＨＣＲ）ＡｐｏＥエンハンサーをさらに含む、請求項１６０〜２３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３５】
ＨＣＲ  ＡｐｏＥエンハンサーが、配列番号１７の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
ＨＣＲ  ＡｐｏＥエンハンサーが配列番号１７の配列を含む、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３７】
ＨＣＲ  ＡｐｏＥエンハンサーが配列番号１７の配列からなる、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３８】
前記核酸がコザック配列をさらに含む、請求項１６０〜２３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３９】
前記コザック配列が、配列５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３３）を含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４０】
前記核酸が転写後調節エレメントをさらに含み、該転写後調節エレメントが機能性Ｘタンパク質をコードしないウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１６０〜２３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４１】
前記核酸が、配列番号１９の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１６０〜２１９、２２４、２２５および２２９〜２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４２】
前記核酸が配列番号１９の配列を含む、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
前記核酸が配列番号１９の配列からなる、請求項２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
前記ベクターの投与が、前記酵素の発現および対象の肝門脈−類洞循環へのその分泌をもたらす、請求項１４８〜２４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４５】
前記対象の門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルを低下させるのに十分な用量およびレジメンで前記ベクターが投与される、請求項１４８〜２４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４６】
前記対象がヒトである、請求項１４８〜２４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４７】
正常な健康対象の血流中のｃｆＤＮＡのレベルと比較して、血流中のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルが上昇している対象を選択することをさらに含む、請求項１３９〜２４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４８】
デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１３９〜２４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４９】
前記ＤＮａｓｅが、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅ  γ、ＤＮａｓｅ１Ｌ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ２、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、ＤＮａｓｅ  ＩＩα、ＤＮａｓｅ  ＩＩβ、カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ（ＣＡＤ）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、アセチルコリンエステラーゼ、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
前記ＤＮａｓｅが、ＤＮａｓｅ  Ｉまたはその変異体もしくは誘導体である、請求項２４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、２０１８年１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６１７，８７９号に基づく優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年１月１０日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーの名前は２５２７３２．０００００３＿ＳＴ２５．ｔｘｔで、サイズは５２，１７７バイトである。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、肝門脈−類洞循環（hepatic porto-sinusoidal circulation）に蓄積されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のクリアランスを高めるためのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素の肝臓特異的送達および／または発現、ならびにがんおよび神経変性を含む様々な疾患および状態の処置のためのそのような肝臓特異的送達および／または発現の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
悪性腫瘍を有する患者は、健康な個体と比較して、血漿および血清中の循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルが上昇している（非特許文献１）。がん患者では、循環ｃｆＤＮＡは、死にかけている非腫瘍細胞、腫瘍細胞および好中球の両方に由来する。腫瘍は好中球に細胞外ＤＮＡトラップを放出させ、それはがん患者における血栓形成促進状態、悪液質および臓器不全の確立に寄与する（非特許文献２）。腫瘍由来のｃｆＤＮＡは、転移および化学療法耐性の発生に寄与する可能性がある（非特許文献３）。循環ｃｆＤＮＡの量は、腫瘍が進行するにつれて増加し（非特許文献４）、進行性疾患および転移性疾患の患者で最大レベルに達する（非特許文献５）。より多くの量の循環ｃｆＤＮＡは、患者の乏しい生存性に有意に相関することが示されている（非特許文献６）。
【０００５】
神経変性は、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造および／または機能の進行性の喪失を伴う別個の臨床病理学的状態である。神経変性につながる分子経路は非常に疾患特異的であり（例えば、アルツハイマー病患者の脳における異常に折りたたまれたアミロイドβおよびタウ（ｔａｕ）タンパク質の蓄積；パーキンソン病におけるα−シヌクレインの蓄積；ハンチントン病における変異ハンチンチンの蓄積；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるＴＤＰ−４３およびＦＵＳタンパク質凝集体の蓄積；老化におけるミトコンドリアＤＮＡ変異の蓄積とミトコンドリア分裂機構の破綻）、疾患進行の進行した段階で神経細胞死を引き起こす。動物モデルおよび細胞株での研究で示されているように、アポトーシスを含むプログラムされた細胞死は、疾患後期の神経変性の進行に重要な役割を果たすようである（非特許文献７）。
【０００６】
神経変性疾患の患者では、微生物起源のｃｆＤＮＡを含む循環ｃｆＤＮＡのレベルが上昇しており、それは、血液脳関門（ＢＢＢ）を介した移送、および直接的な神経損傷、脳内好中球ＤＮＡトラップの放出（非特許文献８）、および脳血栓性動脈症の誘発など、さまざまなメカニズムを通して神経変性の進行に大きく関与している（例えば、特許文献１を参照）。
【０００７】
本発明者らは以前に、高用量のＤＮａｓｅタンパク質の患者の循環への全身投与が、血中のｃｆＤＮＡレベルの上昇に関連する多くの疾患および状態の処置に有用となり得ることを示しており、それら疾患および状態には、がん（例えば、がん腫、肉腫、リンパ腫、黒色腫；例えば、特許文献２〜４を参照）、体細胞モザイクの発生（例えば、特許文献５を参照）、化学療法または放射線療法に関連する副作用（例えば、特許文献６を参照）、神経変性疾患（例えば、特許文献７を参照）、感染症（例えば、特許文献８および９を参照）、糖尿病（例えば、特許文献１０を参照）、アテローム性動脈硬化症（例えば、特許文献１０を参照）、脳卒中（例えば、特許文献１１を参照）、狭心症（例えば、特許文献１１を参照）、虚血（例えば、特許文献１１を参照）、腎障害（例えば、特許文献１２を参照）、例えば移植片対宿主病［ＧＶＨＤ］などの遅延型過敏症反応（例えば、特許文献１３を参照）、受胎能の低下（例えば、特許文献１４を参照）、年齢特異的な精子運動障害（例えば、特許文献１５を参照）、および老化（例えば、特許文献１６を参照）が含まれる。これらの特許および出願はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００８】
他の人達は後に同様の効果を示した（非特許文献９〜１２；Ｃｅｄｅｒｖａｌ，２０１５）。ＲｈＤＮａｓｅ  Ｉはまた、肺がんおよび肝がんの転移性疾患モデルにおいて、０．０２〜２．３ｍｇ／ｋｇで毎日投与した場合に、転移性疾患の発生を６０〜９０％抑制した（非特許文献１１）。Ｌｉ（非特許文献１２）は、ＤＮａｓｅ  Ｉを使用してマウスでＧＶＨＤを処置するのに成功したことを報告した。
【０００９】
ＤＮａｓｅタンパク質の全身投与は、循環ｃｆＤＮＡの量の増加に関連する疾患および状態の処置に有用であるように見えるが、臨床設定では、ＤＮａｓｅタンパク質での全身処置は限られた効果しか示さなかった（例えば、特許文献１７を参照）。したがって、血中のｃｆＤＮＡレベルの上昇に関連する疾患および状態（例えば、がん、体細胞モザイクの発生、化学療法または放射線療法に関連する副作用、神経変性疾患、感染症、遅延型過敏反応、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、虚血、脳卒中、狭心症、受胎能の低下、年齢特異的な精子運動障害、老化など）の処置の効果（有効性）を高めるために、循環ｃｆＤＮＡレベルを低下させるより効率的な方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１９０７８０号
【特許文献２】米国特許第７，６１２，０３２号明細書
【特許文献３】米国特許第８，７１０，０１２号明細書
【特許文献４】米国特許第９，２４８，１６６号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１７００５６４８２号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１７０１００４６３号明細書
【特許文献７】国際公開第２０１６／１９０７８０号
【特許文献８】米国特許第８，４３１，１２３号明細書
【特許文献９】米国特許第９，０７２，７３３号明細書
【特許文献１０】米国特許第８，３８８，９５１号明細書
【特許文献１１】米国特許第８，７９６，００４号明細書
【特許文献１２】米国特許第９，７７０，４９２号明細書
【特許文献１３】米国特許第８，５３５，６６３号明細書
【特許文献１４】米国特許第８，９１６，１５１号明細書
【特許文献１５】米国特許第８，８７１，２００号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１５０１１０７６９号明細書
【特許文献１７】国際公開第２０１４／０２０５６４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Fleischhacker M. et al., Biochim Biophys Acta, 2007, 1775(1): 181-232.
【非特許文献２】Demers, M. at al., PNAS, 2012, 109(32):13076-13081.
【非特許文献３】Garcia-Olmo D.C. andGarcia-Olmo, D.,Crit Rev Oncolog.,2013, 18:153-161.
【非特許文献４】Sawyers 2008 C.L., 2008, 452(7187):548-552.
【非特許文献５】Butt A.N. et al.. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2008, 1137: 236-242．
【非特許文献６】Schwarzenbach H. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 2008, 1137: 190-196.
【非特許文献７】Radi E., et al., J Alzheimers Dis. 2014; 42
【非特許文献８】Zenaro E, et al., Nat Rev Nephrol., 2015, Author manuscript.
【非特許文献９】Fushi, W. et al., Cancer Res., 2013, 73:4256-4266.
【非特許文献１０】Tohme, S. et al., Cancer Res., 2016 Mar 15, 76(6): 1367-1380.
【非特許文献１１】Patutina, O. et al., Biochimie., 2011 Apr, 93(4): 689-96.
【非特許文献１２】Dan Li, Biology of Blood and Marrow Transplantation, Volume 21, Issue 2, Page S339.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の発明の背景の欄で述べたように、血中のｃｆＤＮＡのレベルの上昇に関連する疾患および状態の処置の効果（有効性）を高めるために、循環ｃｆＤＮＡレベルを低下させるより効率的な方法が必要とされている。本発明は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素の肝臓特異的送達および／または発現のための方法および組成物を提供することにより、これらおよび他の必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本発明は、（ｉ）カプシドタンパク質と、（ｉｉ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸とを含み、前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターである組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターを提供する。一実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、他の組織および器官と比較した肝臓での酵素の発現の実質的増加を媒介する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、（ｉ）カプシドタンパク質と、（ｉｉ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸とを含み、前記カプシドタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに肝臓へのベクターの効率的および／または優先的なターゲティングを媒介する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターを提供する。一実施形態では、カプシドタンパク質はＶＰ３である。一実施形態において、カプシドタンパク質は、対応する野生型カプシドタンパク質と比較して、肝臓へのベクターの送達の効率および／または特異性を改善する１つまたは複数の変異を含む。特定の一実施形態では、肝臓へのベクターの送達の効率および／または特異性の改善が、他の組織および器官と比較した肝臓での酵素の発現の実質的増加をもたらす。
【００１５】
本発明のベクターで使用できるＤＮａｓｅ活性を有する酵素の非限定的な例には、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅ  γ、ＤＮａｓｅ１Ｌ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ２、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、ＤＮａｓｅ  ＩＩα、ＤＮａｓｅ  ＩＩβ、カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ（ＣＡＤ）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、アセチルコリンエステラーゼ、またはそれらの変異体または誘導体が含まれる。一実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素はＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒトＤＮａｓｅ  Ｉ）またはその変異体もしくは誘導体である。一実施形態では、核酸は、配列番号３０または配列番号３１の配列を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、アクチン結合部位（例えば、Ｇｌｎ−９、Ｇｌｕ−１３、Ｔｈｒ−１４、Ｈｉｓ−４４、Ａｓｐ−５３、Ｔｙｒ−６５、Ｖａｌ−６６、Ｖａｌ−６７、Ｇｌｕ−６９、Ａｓｎ−７４、Ａｌａ−１１４、およびそれらの任意の組合せ；分泌シグナル配列を欠く成熟タンパク質配列に関連して示された位置）に１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、アクチン結合部位における変異の１つは、Ａｌａ−１１４での変異である。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、ＤＮａｓｅ活性を高める１つまたは複数の変異（例えば、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｅ１３Ｋ、Ｔ１４Ｒ、Ｔ１４Ｋ、Ｈ４４Ｒ、Ｈ４４Ｋ、Ｎ７４Ｋ、Ａ１１４Ｆ、およびそれらの任意の組合せ；分泌シグナル配列を欠く成熟タンパク質配列に関して示された位置）を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４ＫおよびＡ１１４Ｆ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は変異Ｑ９Ｒを含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は変異Ｅ１３Ｒを含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、変異Ｎ７４Ｋを含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は変異Ａ１１４Ｆを含む。
【００１６】
一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、配列番号５の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、変異Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４Ｋ、およびＡ１１４Ｆを含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は配列番号５の配列を含む。
【００１７】
一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、配列番号２の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、変異Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４ＫおよびＡ１１４Ｆを含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は配列番号２の配列を含む。
【００１８】
一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、配列番号２または配列番号５の配列からなる。
【００１９】
一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、Ｈ４４Ｃ、Ｈ４４Ｎ、Ｌ４５Ｃ、Ｖ４８Ｃ、Ｇ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｄ５３Ｃ、Ｄ５３Ｒ、Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｙ、Ｄ５３Ａ、Ｎ５６Ｃ、Ｄ５８Ｓ、Ｄ５８Ｔ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｅ、Ｙ６５Ｒ、Ｙ６５Ｃ、Ｖ６６Ｎ、Ｖ６７Ｅ、Ｖ６７Ｋ、Ｖ６７Ｃ、Ｅ６９Ｒ、Ｅ６９Ｃ、Ａ１１４Ｃ、Ａ１１４Ｒ、Ｈ４４Ｎ：Ｔ４６Ｓ、Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｄ５３Ｒ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ４４Ａ：Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｈ４４Ａ：Ｙ６５Ａ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｓ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｔ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｓ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｔ、Ｖ６６Ｎ：Ｓ６８Ｔ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｓ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｔ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｓ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｔ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｓ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｔ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉをコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号２３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉをコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号２２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２２と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２２と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３２と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３２と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２４の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉ変異体をコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号２９と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２９と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２９と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２６の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉ変異体をコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号２８と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２８と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２８と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌク��オチド配列は、配列番号５の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉ変異体をコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号２１と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２１と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２の配列を含むＤＮａｓｅ  Ｉ変異体をコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号１９と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号１９と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号１９と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
一実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素は、（ｉｉ）アルブミンまたはＦｃポリペプチドまたはそれらの断片に連結された（ｉ）ＤＮａｓｅ酵素またはその断片を含む融合タンパク質である。一実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする配列は、分泌シグナル配列をコードする配列を含み、前記分泌シグナル配列は、肝臓でのベクターの発現の際に肝類洞系への酵素の効果的な分泌を媒介する。有用な分泌シグナル配列の非限定的な例には、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ分泌シグナル配列、ＩＬ２分泌シグナル配列、アルブミン分泌シグナル配列、β−グルクロニダーゼ分泌シグナル配列、アルカリプロテアーゼ分泌シグナル配列、およびフィブロネクチン分泌シグナル配列が含まれる。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）からなる。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）からなる。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列をコードする配列は、配列番号２０と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列をコードする配列は、配列番号２０と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列をコードする配列は、配列番号２０と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列をコードする配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＹＴＧＬＭＧＴＬＬＴＬＶＮＬＬＱＬＡＧＴ（配列番号２５）を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＹＴＧＬＭＧＴＬＬＴＬＶＮＬＬＱＬＡＧＴ（配列番号２５）からなる。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＹＴＧＬＭＧＴＬＬＴＬＶＮＬＬＱＬＡＧＴ（配列番号２５）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列をコードする配列は、配列番号２７と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列をコードする配列は、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列をコードする配列は、配列番号２７と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列をコードする配列は、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本発明のベクターで使用できるプロモーターの非限定的な例には、例えば、アルブミンプロモーター、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）プロモーター、ＨＢＶベーシックコアプロモーター（ＢＣＰ）、ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）プロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ホスホフェノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプロモーター（ＡＰＯＡ２）、トランスフェリンプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、α−フィブリノーゲンプロモーター、β−フィブリノーゲンプロモーター、α１−アンチキモトリプシンプロモーター、α２−ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質のプロモーター、α１−酸性糖タンパク質プロモーター、ＬＳＰ１プロモーター、セルピンペプチダーゼ阻害剤プロモーター、クレードＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）（ｈＡＡＴ）プロモーター、チトクロームＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １２２（ｍｉＲ−ｌ２２）プロモーター、肝臓特異的ＩＧＦ−ＩＩプロモーターＰ１、トランスサイレチン（ＭＴＴＲ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターが含まれる。
【００２３】
一実施形態では、プロモーターはアルブミンプロモーターである。特定の一実施形態では、アルブミンプロモーターは、配列番号８の配列を含む。特定の一実施形態では、アルブミンプロモーターは、配列番号８の配列からなる。Frain et al., Mol. Cell Biol., 1990, 10(3):991-999も参照されたい。
【００２４】
一実施形態では、プロモーターは、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである。特定の一実施形態では、アンチトリプシンプロモーターは、配列番号１５の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９%の同一性を有する配列を含む。特定の一実施形態では、ＡＡＴプロモーターは、配列番号１５の配列を含む。特定の一実施形態では、ＡＡＴプロモーターは、配列番号１５の配列からなる。
【００２５】
一実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｓ２７９Ａ、Ｓ６７１Ａ、Ｋ１３７Ｒ、Ｔ２５２Ａ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質における１つまたは複数の変異は、変異Ｋ１３７Ｒを含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号３の配列［Ａｎｃ８０］を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号３の配列［Ａｎｃ８０］からなる。一実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号９の配列［Ａｎｃ８０］を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号９の配列［Ａｎｃ８０］からなる。一実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号３４の配列［Ａｎｃ８０Ｌ６５］を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号３４の配列［Ａｎｃ８０Ｌ６５］からなる。一実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号３５の配列［Ａｎｃ８０Ｌ６５バリアント］を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号３５の配列［Ａｎｃ８０Ｌ６５バリアント］からなる。一実施形態において、カプシドタンパク質は、例えば、ＡＡＶ３Ｇ１、ＡＡＶＴ２０またはＡＡＶＴＲ１などの変異ＡＡＶ８カプシドタンパク質、あるいは国際公開第２０１７／１８０８５４号に開示されている別の変異カプシドタンパク質（例えば、アミノ酸２６３−２６７［例えば、２６３ＮＧＴＳＧ２６７−＞ＳＧＴＨ、または２６３ＮＧＴＳＧ２６７−＞ＳＤＴＨ］および／またはアミノ酸４５７−４５９［例えば、４５７ＴＡＮ４５９−＞ＳＲＰ］、および／またはアミノ酸４５５−４５９［例えば、４５５ＧＧＴＡＮ４５９−＞ＤＧＳＧＬ］および／またはアミノ酸５８３−５９７におけるＶＰ３変異を含む）である。
【００２６】
本発明のベクターで使用できるＡＡＶの非限定的な例には、例えば、血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３ＡおよびＡＡＶ３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、およびＡｎｃ８０が含まれる。特定の一実施形態では、ＡＡＶは、血清型８またはＡｎｃ８０に由来する。
【００２７】
一実施形態では、ＡＡＶベクターの核酸は、２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）をさらに含み、ＩＴＲはＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列に隣接する。
【００２８】
一実施形態では、ＡＡＶベクターの核酸は、プロモーターの上流または下流に位置する１つまたは複数のエンハンサーをさらに含む。一実施形態では、エンハンサーは、例えば、エンハンサー配列の３’末端がプロモーター配列の５’末端に直接融合されている場合など、プロモーターのすぐ上流に位置していてもよい。有用なエンハンサーの非限定的な例には、例えば、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサー（例えば、ＡｐｏＥ肝臓制御領域−１（ＨＣＲ−１）エンハンサーまたはＡｐｏＥ  ＨＣＲ−２エンハンサー）、α−フェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ＬＳＰエンハンサー、α１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー、アルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）、およびそれらの任意の組合せが含まれる。特定の一実施形態では、エンハンサーはＡｐｏＥエンハンサーである。特定の一実施形態では、エンハンサーは、プロモーターの上流に位置するＡｐｏＥエンハンサーである。特定の一実施形態では、エンハンサーは、プロモーターの５’末端に融合したＡｐｏＥエンハンサーである。特定の一実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサーは肝臓制御領域（ＨＣＲ）エンハンサーである。特定の一実施形態では、エンハンサーは、配列番号１７の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。特定の一実施形態では、エンハンサーは配列番号１７の配列を含む。特定の一実施形態では、エンハンサーは配列番号１７の配列からなる。
【００２９】
一実施形態では、ＡＡＶベクターの核酸は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【００３０】
一実施形態では、核酸は、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列をさらに含む。特定の一実施形態では、コザック配列は、５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３３）の配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３０と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３０と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３０と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３０と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
一実施形態では、核酸は、転写後調節エレメントをさらに含む。一実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。特定の一実施形態では、ＷＰＲＥは機能性Ｘタンパク質をコードしない。一実施形態では、転写後調節エレメントは、配列番号１６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。特定の一実施形態では、転写後調節エレメントは配列番号１６の配列を含む。特定の一実施形態では、転写後調節エレメントは配列番号１６の配列からなる。
【００３２】
一実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターの核酸は、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含む。特定の一実施形態では、核酸は配列番号１９の配列を含む。特定の一実施形態では、核酸は配列番号１９の配列からなる。特定の一実施形態では、核酸は、図１０に示されるマップを有する。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）アルブミンプロモーターまたはα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結された配列番号４の配列を含むデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターを提供する。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）アルブミンプロモーターまたはα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結された配列番号５の配列を含むデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターを提供する。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）アルブミンプロモーターまたはα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結された配列番号１の配列を含むデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターを提供する。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）アルブミンプロモーターまたはα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターに作動可能に連結された配列番号２の配列を含むデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターを提供する。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）配列番号３０のヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターを提供する。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３４の配列を含むカプシドタンパク質と、（ｉｉ）配列番号３１のヌクレオチド配列を含む核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）発現ベクターを提供する。
【００３９】
関連する態様では、本発明は、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれか、ならびに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物および剤形を提供する。
【００４０】
関連する態様において、本発明は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をそれを必要とする対象の肝臓に送達する方法を提供し、その方法は、上記のｒＡＡＶベクターまたは医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む。
【００４１】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における疾患または状態（例えば、がん、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、または遅延型過敏反応）を処置する方法を提供し、前記疾患または状態は対象の肝門脈−類洞循環（hepatic porto-sinusoidal circulation）におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の蓄積／上昇レベルを伴い、その方法は、治療有効量の上記のｒＡＡＶベクターまたは医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法を提供し、その方法は、対象に治療有効量の上記のｒＡＡＶベクターまたは医薬組成物のいずれかを投与することを含む。一実施形態では、がんは、門脈へと流れ出る器官、組織および／または構造を起源とするおよび／またはそれらに転移する。一実施形態では、この方法は、転移を阻害するのに有効である。本発明の方法により処置可能ながんの非限定的な例には、例えば、がん性腹膜炎（peritoneal carcinomatosis）、リンパ腫、胃がん、結腸がん（colon cancer）、腸がん（intestinal cancer）、結腸直腸がん（colorectal cancer）、膵臓がん、肝臓がん、胆管のがん、胆嚢のがん、肉腫、および任意の起源の肝転移性疾患が含まれる。
【００４３】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における神経変性疾患を処置する方法を提供し、その方法は、治療有効量の上記のｒＡＡＶベクターまたは医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む。本発明の方法により処置可能な神経変性疾患の非限定的な例には、例えば、アルツハイマー病、軽度認知障害（ＭＣＩ）、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、および１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）が含まれる。一実施形態では、神経変性疾患は、ＤＮＡの存在によるミスフォールドタンパク質の形成に関連する。特定の一実施形態では、ＤＮＡは、ヒトＤＮＡ、微生物ＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ、または細胞内ＤＮＡである。
【００４４】
一実施形態では、神経変性疾患は、糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、痛風、メタボリックシンドローム、アミロイドーシス、喘息、またはプリオン病に続発する。一実施形態では、アミロイドーシスは、遺伝性脳出血を伴うアミロイドーシス、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、血液透析関連アミロイドーシス、フィンランド型遺伝性全身性アミロイドーシス、心房性アミロイドーシス、リゾチーム全身性アミロイドーシス、インスリン関連アミロイドーシス、またはフィブリノーゲンα鎖アミロイドーシスである。
【００４５】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における遅延型過敏反応を処置する方法を提供し、その方法は、治療有効量の上記のｒＡＡＶベクターまたは医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む。一実施形態では、遅延型過敏症反応は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法を提供し、その方法は、治療有効量の上記のｒＡＡＶベクターまたは医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む。
【００４７】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における化学療法または放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する方法を提供し、その方法は、治療有効量の上記のｒＡＡＶベクターまたは医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む。一実施形態では、化学療法の１つまたは複数の副作用は、体重減少、骨髄毒性、血液生化学における異化変化、心毒性（例えば、心筋壊死）、消化管毒性、免疫の抑制、および好中球減少症からなる群より選択される。一実施形態では、化学療法は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗ガン性抗生物質、微小管標的薬、トポイソメラーゼ阻害剤、アルカロイド、および標的治療薬からなる群より選択される１つまたは複数の化合物の投与を含む。一実施形態では、化学療法は、アントラサイクリン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エトポシド、タキサン、およびシクロホスファミドからなる群より選択される１つまたは複数の化合物の投与を含む。一実施形態では、放射線療法の１つまたは複数の副作用は、体重減少、皮膚刺激、皮膚損傷、疲労、吐き気、嘔吐、線維症、腸損傷、記憶喪失、不妊症、および二次がんからなる群より選択される。一実施形態では、放射線療法は、外照射療法または全身性放射性同位元素療法である。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはベクター組成物は、化学療法または放射線療法のサイクル中に投与される。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはベクター組成物は、化学療法または放射線療法のサイクル後に投与される。一実施形態では、化学療法または放射線療法は、がん性腹膜炎、リンパ腫、胃がん、結腸がん、腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、胆管のがん、胆嚢のがん、肉腫、および任意の起源の肝転移性疾患からなる群より選択されるがんの処置に使用される。
【００４８】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態において、ｒＡＡＶベクターまたはベクター組成物の投与は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素の発現および対象の肝門脈−類洞循環へのその分泌をもたらす。
【００４９】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態において、ｒＡＡＶベクターまたはベクター組成物は、前記対象の門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルを低下させるのに十分な用量およびレジメンで投与される。
【００５０】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態において、対象はヒトである。
【００５１】
別の態様では、本発明は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をそれを必要とする対象の肝臓に送達する方法を提供し、その方法は、酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
【００５２】
さらなる態様では、本発明は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をそれを必要とする対象の肝臓に送達する方法を提供し、その方法は、酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合に核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む。
【００５３】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法を提供し、疾患または状態は、対象の肝門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の蓄積／上昇レベルを伴い、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。一実施形態では、疾患は、がん（肝臓転移性疾患を含む）、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、および遅延型過敏反応からなる群より選択される。
【００５４】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法を提供し、疾患または状態は、肝臓の門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の蓄積／上昇レベルを伴い、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、ベクターは、核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む。一実施形態では、疾患は、がん（肝臓転移性疾患を含む）、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症、および遅延型過敏反応からなる群より選択される。
【００５５】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。一実施形態では、がんは、門脈へと流れ出る器官、組織および／または構造に由来するおよび／またはそれらに転移する。
【００５６】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、ベクターは、核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む。一実施形態では、がんは、門脈へと流れ出る器官、組織および／または構造に由来するおよび／またはそれらに転移する。
【００５７】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記発現ベクターは、前記対象の肝臓におけるＤＮａｓｅ酵素の合成をもたらし、がんは、門脈へと流れ出る器官、組織および／または構造に由来するおよび／またはそれらに転移する。
【００５８】
がんを処置するための上記の方法のいずれかによって処置可能ながんの非限定的な例には、例えば、がん性腹膜炎、リンパ腫、胃がん、結腸がん、腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、胆管のがん、胆嚢のがん、肉腫、および任意の起源の肝転移性疾患が含まれる。
【００５９】
がんを処置するための上記の方法のいずれかの一態様において、その方法は転移を阻害するのに有効である。
【００６０】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における神経変性疾患を処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
【００６１】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象における神経変性疾患を処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、ベクターは核酸を肝細胞に標的化できる１つまたは複数の分子を含む。
【００６２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における神経変性疾患を処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記発現ベクターは、前記対象の肝臓におけるＤＮａｓｅ酵素の合成をもたらし、腸由来の微生物セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が前記患者の血液で検出可能である。
【００６３】
神経変性疾患を処置するための上記の方法のいずれかによって処置可能な神経変性疾患の非限定的な例には、例えば、アルツハイマー病、軽度認知障害（ＭＣＩ）、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、および１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）が含まれる。一実施形態では、神経変性疾患は、糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、痛風、メタボリックシンドローム、アミロイドーシス、喘息、またはプリオン病に続発する。一実施形態では、アミロイドーシスは、遺伝性脳出血を伴うアミロイドーシス、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、血液透析関連アミロイドーシス、フィンランド型遺伝性全身性アミロイドーシス、心房性アミロイドーシス、リゾチーム全身性アミロイドーシス、インスリン関連アミロイドーシス、またはフィブリノーゲンα鎖アミロイドーシスである。
【００６４】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における遅延型過敏反応を処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含むみ、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。一実施形態では、遅延型過敏症反応は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
【００６５】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における遅延型過敏反応を処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、ベクターは、核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む。一実施形態では、遅延型過敏症反応は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
【００６６】
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
【００６７】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、ベクターは、核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む。
【００６８】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における化学療法または放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする対象における化学療法または放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、ベクターは、核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子を含む。
【００７０】
化学療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する上記の方法のいずれかの一実施形態において、化学療法の１つまたは複数の副作用は、体重減少、骨髄毒性、血液生化学における異化変化、心毒性（例えば、心筋壊死）、消化管毒性、免疫の抑制、および好中球減少症からなる群より選択される。
【００７１】
化学療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する上記の方法のいずれかの一実施形態において、化学療法は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管標的薬、トポイソメラーゼ阻害剤、アルカロイド、および標的治療薬からなる群より選択される１つまたは複数の化合物の投与を含む。
【００７２】
化学療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する上記の方法のいずれかの一実施形態において、化学療法は、アントラサイクリン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エトポシド、タキサン、およびシクロホスファミドからなる群より選択される１つまたは複数の化合物の投与を含む。
【００７３】
放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する上記の方法のいずれかの一実施形態において、放射線療法の１つまたは複数の副作用は、体重減少、皮膚刺激、皮膚損傷、疲労、吐き気、嘔吐、線維症、腸損傷、記憶喪失、不妊症、および二次がんからなる群より選択される。
【００７４】
放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する上記の方法のいずれかの一実施形態において、放射線療法は外照射療法または全身性放射性同位元素療法である。
【００７５】
化学療法または放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する上記の方法のいずれかの一実施形態において、ベクターは化学療法または放射線療法のサイクル中に投与される。
【００７６】
化学療法または放射線療法に関連する１つまたは複数の副作用を予防または改善する上記の方法のいずれかの一実施形態において、ベクターは化学療法または放射線療法のサイクル後に投与される。
【００７７】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、ベクターは、核酸を肝臓細胞に標的化することができる１つまたは複数の分子をさらに含む。
【００７８】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
【００７９】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、ベクターはリポソームまたはナノ粒子にパッケージングされている（packaged）。
【００８０】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、ベクターは裸のＤＮＡとして使用される。
【００８１】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。有用なウイルスベクターの非限定的な例には、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、および肝臓指向性（hepatotropic）ウイルスベクター（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ベクター）が含まれる。
【００８２】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素は、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅ  γ、ＤＮａｓｅ１Ｌ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ２、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、ＤＮａｓｅ  ＩＩα、ＤＮａｓｅ  ＩＩβ、カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ（ＣＡＤ）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、アセチルコリンエステラーゼ、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される。一実施形態では、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒトＤＮａｓｅ  Ｉ）またはその変異体もしくは誘導体である。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、アクチン結合部位（例えば、Ｇｌｎ−９、Ｇｌｕ−１３、Ｔｈｒ−１４、Ｈｉｓ−４４、Ａｓｐ−５３、Ｔｙｒ−６５、Ｖａｌ−６６、Ｖａｌ−６７、Ｇｌｕ−６９、Ａｓｎ−７４、Ａｌａ−１１４、およびそれらの任意の組合せ；分泌シグナル配列を欠く成熟タンパク質配列に関して示された位置）に１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、アクチン結合部位の変異の１つは、Ａｌａ−１１４での変異である。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、ＤＮａｓｅ活性を高める１つまたは複数の変異（例えば、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｅ１３Ｋ、Ｔ１４Ｒ、Ｔ１４Ｋ、Ｈ４４Ｒ、Ｈ４４Ｋ、Ｎ７４Ｋ、Ａ１１４Ｆ、およびそれらの任意の組合せ；分泌シグナル配列を欠く成熟タンパク質配列に関して示された位置）を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４ＫおよびＡ１１４Ｆ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は変異Ｑ９Ｒを含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は変異Ｅ１３Ｒを含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、変異Ｎ７４Ｋを含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は変異Ａ１１４Ｆを含む。
【００８３】
一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、Ｈ４４Ｃ、Ｈ４４Ｎ、Ｌ４５Ｃ、Ｖ４８Ｃ、Ｇ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｄ５３Ｃ、Ｄ５３Ｒ、Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｙ、Ｄ５３Ａ、Ｎ５６Ｃ、Ｄ５８Ｓ、Ｄ５８Ｔ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｅ、Ｙ６５Ｒ、Ｙ６５Ｃ、Ｖ６６Ｎ、Ｖ６７Ｅ、Ｖ６７Ｋ、Ｖ６７Ｃ、Ｅ６９Ｒ、Ｅ６９Ｃ、Ａ１１４Ｃ、Ａ１１４Ｒ、Ｈ４４Ｎ：Ｔ４６Ｓ、Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｄ５３Ｒ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ４４Ａ：Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｈ４４Ａ：Ｙ６５Ａ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｓ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｔ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｓ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｔ、Ｖ６６Ｎ：Ｓ６８Ｔ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｓ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｔ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｓ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｔ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｓ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｔ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つまたは複数の変異を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は、長時間作用型のＤＮａｓｅである。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉは配列番号４の配列を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉは配列番号１の配列を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は配列番号５の配列を含む。一実施形態では、ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体は配列番号２の配列を含む。
【００８４】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする配列は分泌シグナル配列を含み、前記分泌シグナル配列は、対象にベクターを投与したときに、肝門脈−類洞循環への酵素の効果的な分泌を媒介する。一実施形態では、分泌シグナル配列は、ＤＮａｓｅ  Ｉ分泌シグナル配列、ＩＬ２分泌シグナル配列、アルブミン分泌シグナル配列、β−グルクロニダーゼ分泌シグナル配列、アルカリプロテアーゼ分泌シグナル配列、およびフィブロネクチン分泌シグナル配列からなる群より選択される。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）を含む。一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ（配列番号６）からなる。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）を含む。特定の一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）からなる。
【００８５】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、肝臓特異的プロモーターは、他の組織および器官と比較した肝臓での酵素の発現の実質的増加を媒介する。本発明の方法およびベクターにおいて有用な肝臓特異的プロモーターの非限定的な例には、例えば、アルブミンプロモーター、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）プロモーター、ＨＢＶベーシックコアプロモーター（ＢＣＰ）、ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）プロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ホスホフェノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプロモーター（ＡＰＯＡ２）、トランスフェリンプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、α−フィブリノーゲンプロモーター、β−フィブリノーゲンプロモーター、α１−アンチキモトリプシンプロモーター、α２−ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質のプロモーター、α１−酸性糖タンパク質プロモーター、ＬＳＰ１プロモーター、セルピンペプチダーゼ阻害剤プロモーター、クレードＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）（ｈＡＡＴ）プロモーター、チトクロームＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １２２（ｍｉＲ−ｌ２２）プロモーター、肝臓特異的ＩＧＦ−ＩＩプロモーターＰｌ、トランスサイレチン（ＭＴＴＲ）プロモーター、およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターが含まれる。一実施形態では、肝臓特異的プロモーターはアルブミンプロモーターである。特定の一実施形態では、アルブミンプロモーターは配列番号８の配列を含む。一実施形態では、アルブミンプロモーターは配列番号８の配列からなる。Frain et al., Mol. Cell Biol., 1990, 10(3):991-999も参照されたい。
【００８６】
特定の一実施形態では、肝臓特異的プロモーターはα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターである。特定の一実施形態では、アンチトリプシンプロモーターは、ヒトα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーターである。特定の一実施形態では、ＡＡＴプロモーターは配列番号１５の配列を含む。特定の一実施形態では、ＡＡＴプロモーターは配列番号１５の配列を含む。特定の一実施形態では、ＡＡＴプロモーターは配列番号１５の配列からなる。本発明の方法のいずれかの様々な実施形態において、ベクターはエンハンサーを含む。エンハンサーは、ＡｐｏＥ遺伝子（例えば、ヒトＡｐｏＥ遺伝子）に関連するＨＣＲ−１またはＨＣＲ−２などの肝臓制御領域エンハンサーであってより。特定の一実施形態では、エンハンサーは配列番号１７の配列を含む。特定の一実施形態では、エンハンサーは配列番号１７の配列からなる。
【００８７】
本発明の方法のいずれかの様々な実施形態において、ベクターは、ＤＮａｓｅコード配列の上流にコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む。コザック配列は、５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３３）の配列を有することができる。
【００８８】
本発明の方法のいずれかの様々な実施形態において、ベクターは、転写後調節エレメント、例えば、機能性Ｘタンパク質をコードしないＷＰＲＥを含む。特定の一実施形態では、転写後調節エレメントは配列番号１６の配列を含む。特定の一実施形態では、転写後調節エレメントは配列番号１６の配列からなる。
【００８９】
本発明の方法のいずれかの様々な実施形態において、ベクターは、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。特定の一実施形態では、核酸は配列番号１９の配列を含む。特定の一実施形態では、核酸は配列番号１９の配列からなる。特定の一実施形態では、核酸は、図１０に示されるマップを有する。
【００９０】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、ベクターの投与は、酵素の発現および対象の肝門脈−類洞循環へのその分泌をもたらす。
【００９１】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、ベクターは、前記対象の門脈−類洞循環におけるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルを低下させるのに十分な用量およびレジメンで投与される。
【００９２】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、対象はヒトである。
【００９３】
本発明のいずれかの方法の一実施形態において、その方法は、正常な健康対象の血流中のｃｆＤＮＡのレベルと比較して、血流中のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のレベルが上昇している対象を選択することをさらに含む。
【００９４】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅ  γ、ＤＮａｓｅ１Ｌ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ２、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（ＤＮａｓｅ  ＩＩαおよびＤＮａｓｅ  ＩＩβを含む）、カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ（ＣＡＤ）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、アセチルコリンエステラーゼ、およびそれらの変異体または誘導体）を対象に投与することをさらに含む。特定の一実施形態では、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅ  Ｉまたはその変異体もしくは誘導体である。
【００９５】
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の説明、特許請求の範囲および図面において当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】肝門脈により排出される（門脈へと流れ出る）器官および組織を示す。例えば、門脈は、食道の下部、胃、膵臓、胆嚢、脾臓、小腸、大腸、膀胱の上部、および肝臓からの血液を排出させる。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｉは静脈内ウシＤＮａｓｅ  Ｉで処置された進行性転移性疾患の９人の患者の患者サマリーおよび個々の血液電気泳動データを示す。（Ａ）直腸がん
【図２Ｂ】図２Ａの続き。（Ｂ）肺がん
【図２Ｃ】図２Ｂの続き。（Ｃ）肺がん
【図２Ｄ】図２Ｃの続き。（Ｄ）黒色腫
【図２Ｅ】図２Ｄの続き。（Ｅ）乳がん
【図２Ｆ】図２Ｅの続き。（Ｆ）腺がん
【図２Ｇ】図２Ｆの続き。（Ｇ）腎がん
【図２Ｈ】図２Ｇの続き。（Ｈ）直腸がん
【図２Ｉ】図２Ｈの続き。（Ｉ）乳がん
【図３】１５日目に得られた９９ｍＴｃ標識抗ＤＮＡ抗体の注射の１時間後の担腫瘍マウスのガンマ免疫シンチグラフィー画像を示し、左下部分の腫瘍ゾーン（ａ）よりも中央／右部分の肝臓ゾーン（ｂ）において実質的に高い放射活性が見られる。
【図４】実施例４に記載のように処置された表３に示される異なる群からの肝組織のＩＨＣ顕微鏡写真を示す。ゲムシタビンで処置したマウス（群７）の肝臓に大量のｃｆＤＮＡが見られた。ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８（アルブミンプロモーター下での発現のための肝臓細胞にＤＮａｓｅ  Ｉ遺伝子を標的化するＡＡＶ８ベクター）で処置したマウス（群２）の肝臓では、比較的少ないｃｆＤＮＡが見られた。
【図５Ａ】ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８ベクター、すなわち４６５８＿ｐＡＡＶ−ＡＦＰ−Ａｌｂ−ｈｕＤＮａｓｅＩ＿ｍｕｔのマップを示す。このベクターは、（ｉ）細菌での増殖のためのエレメント、すなわち、ＡｍｐＲマーカー、ｃｏｌＥ１、Ｆ１およびＭ１３複製起点、ならびに（ｉｉ）マウスアルブミン最小プロモーター、それぞれＡＡＶ８Ｌ−ＩＴＲおよびＲ−ＩＴＲと隣接するマウスα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）エンハンサーＩＩ（Ｌ−ＩＴＲと）およびｈＧＨポリＡ（ｐｏｌｙＡ）シグナル、Ｍ１３複製起点およびＦｌ複製起点に、作動可能に連結されたｈＤＮＡｓｅＩ＿ｍｕｔ配列（配列番号２；高活性（hyperactive）アクチン耐性ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体）を含む。
【図５Ｂ】Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ８  ＶＰ３タンパク質の配列アラインメントを示す（Zinn et al., Cell Rep., 2015, 12(67): 1056-1068から抜粋）。
【図５Ｃ】ヒトＤＮａｓｅ  ＩがＣＭＶプロモーターの制御下で発現されるヒトアデノウイルス５型（ｄＥ１／Ｅ３）に基づくＡＤＶ−２０７１８６ベクターのマップを示す。
【図６】腫瘍サイズを反映する生物発光データを示す。ｈＤＮａｓｅＩ＿ｍｕｔ（配列番号５；高活性アクチン耐性ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体）ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８で処置すると、同所性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍移植を受けたマウスと非同所性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍移植を受けたマウスの両方の腫瘍サイズが減少した。
【図７】肝臓の組織学データを示し、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８で処置した動物が、ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質よりもＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８発現ベクターで処置した場合に、炎症細胞密度がはるかに低く、壊死がなく、血管界面に求核物質がはるかに少ないことを示す。
【図８】組換えＤＮａｓｅ  Ｉ処置マウスと比較して、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８処置マウスの末梢リンパ節、腸間膜リンパ節およびパイエル板におけるドナー由来Ｔ細胞の総数、ドナー由来ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な減少を示す。
【図９】実施例７でＤＮａｓｅ  Ｉを送達するために使用したレンチウイルスベクターｐＬＶ２−ＩＬ２ｓｓ−ＤＮａｓｅＩ  ｍｕｔの制限地図を示す。そのベクターは、ＡｍｐＲマーカー、ならびにＦ１およびＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を含む。ベクターは、ＤＮＡｓｅ  Ｉの上流のＩＬ−２リーダー配列の上流にＥＦ−１ａプロモーターを含む。
【図１０Ａ】構築物ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー：ｈＡＡＴプロモーター＞ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー(correct leader)−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ、すなわちＡｐｏＥ−ＨＣＲエンハンサー：ｈＡＡＴプロモーター＞正しいリーダー配列（分泌配列）を有するヒトＤＮＡｓｅ  Ｉ高活性バリアント：機能性タンパク質Ｘをコードしないウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）の完全な配列を示す。
【図１０Ｂ】ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー：ｈＡＡＴプロモーター＞ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔのベクターマップを示す。
【図１０Ｃ】ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー：ｈＡＡＴプロモーター＞ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔのベクターマップを示す。
【図１１】ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー：ｈＡＡＴプロモーター＞ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔの調製に使用されるｐＡＡＶ−ＭＣＳプロモーターレス発現ベクターのマップを示す。
【図１２】精製されたＡｎｃ８０  ＶＲ−１８０１３ＡＤ  ＡＡＶベクターのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。６０、７２、および９０ｋＤａの３つのバンドが、約１：１：１０の比率で観察され、これはＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質に該当する。
【図１３Ａ】ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ｍｕｔ）およびＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＷＴ）ベクターが、肝細胞起源の細胞のみを効率的に形質導入させ、形質導入されたＧ２細胞からの生物学的に強化されたＤＮａｓｅ  Ｉ酵素または野生型ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の高収率発現および分泌を誘発するデータを示す。
【図１３Ｂ】ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ｍｕｔ）およびＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＷＴ）ベクターが、肝細胞起源の細胞のみを効率的に形質導入させ、形質導入されたＧ２細胞からの生物学的に強化されたＤＮａｓｅ  Ｉ酵素または野生型ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の高収率発現および分泌を誘発するデータを示す。
【図１４】Ｙ迷路行動試験の結果を示す。
【図１５】文脈的恐怖条件付け試験（contextual fear condition test）の結果を示す。
【図１６】３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと比較して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスにおいて、特に脳の皮質領域で、ミクログリアの活性化が有意に低減されたことを示す。
【図１７】３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと対比して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスの脳皮質領域におけるミクログリアの活性化の有意な減少を示すデータを示す。
【図１８−１】ＶＲ−１８０１３ＡＤでの処置により、３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと対比して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスにおいてアミロイド沈着が有意に減少することを示すデータを示す。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１９】ＶＲ−１８０１３ＡＤでの処置により、３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと対比して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスにおいて過剰リン酸化タウ沈着が有意に減少することを示す。
【図２０】ＶＲ−１８０１３ＡＤで処置した後の海馬領域におけるｐ−ｔａｕ（リン酸化タウ）の有意な減少を示すデータを示す。
【図２１】対照（ＰＢＳの単回ＩＶ注射）およびＶＲ−１８０１４ＡＤ（１．０×１０１１ＧＣ／マウス用量でのＶＲ−１８０１４ＡＤの単回ＩＶ注射）処置マウスの典型的な形態計測画像（morphometric image）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
本発明は、循環ｃｆＤＮＡレベルの上昇を特徴とする疾患および状態（例えば、腫瘍の成長および進行、自己免疫疾患および神経変性疾患、感染症など）の過程で、かなりの量のｃｆＤＮＡが、肝臓、主に内皮周囲腔（periendothelial space）およびディッセ腔に蓄積するという予想外の発見に基づく。大量の全身投与されたＤＮａｓｅタンパク質でさえ、肝臓のｃｆＤＮＡを消化するのに限られた効果しか示さない。このｃｆＤＮＡは、肝臓の貯蔵所から肝門脈、さらには全身の血液循環へと継続的に供給される。下記の実施例の欄に示すように、ＤＮａｓｅ  Ｉの肝臓でのトランスジェニック発現（例えば、ウイルス発現ベクターを使用）は、ＤＮａｓｅが肝臓の類洞腔に分泌される場合、肝臓および門脈−類洞循環に蓄積されたｃｆＤＮＡのほぼ完全なクリアランスをもたらす。このような肝臓でのＤＮａｓｅのトランスジェニック発現は、（特に、門脈により排出される器官および組織での腫瘍における）有意な抗腫瘍効果、抗ガン化学療法の毒性の低減、自己免疫疾患および神経変性疾患の進行の減速などにつながる。このような肝臓でのＤＮａｓｅのトランスジェニック発現は、ＤＮａｓｅが肝臓の類洞腔に分泌される場合、腫瘍が門脈系によって排出され、腫瘍成長領域で生成されたｃｆＤＮＡが門脈−類洞循環を「初回通過（first pass）」する場合にさらに多くの恩恵をもたらす。（図１は、門脈により排出される（門脈へと流れ出る）器官および系を示す。）同じことが、門脈−類洞循環を通るそれぞれの「初回通過」を有する全身血液循環に微生物のＤＮＡが入るリーキーガット（腸管壁浸漏）によって促進される神経変性状態および自己免疫状態にも当てはまる。
【００９８】
本発明は、ＤＮａｓｅを肝臓に送達するための様々なベクターを提供する。そのようなベクターの非限定的な具体的例には、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、肝臓指向性ウイルスベクター（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ベクター）、ナノ粒子（例えば、ホスホロアミダイトナノ粒子）、リポソーム（例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）などのカチオン性リポソーム）、ラクトフェリン、ポリＬ−リジン、ポリエチレンイミン、キトサンが含まれる。
【００９９】
ＤＮａｓｅ活性を有する酵素は、肝臓特異的プロモーターおよび／または別の肝臓特異的制御エレメント（例えば、エンハンサー）の制御下で発現させることができる。肝臓特異的プロモーターおよび制御エレメントの具体的な非限定例には、例えば、アルブミンプロモーター；ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター；ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）；アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域；アポリポタンパク質Ａ−ＩＩプロモーター（ＡＰＯＡ２）；セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）（ｈＡＡＴ）プロモーター；チトクロームＰ４５０ファミリー３、サブファミリーＡポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモーター；ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １２２（ＭＩＲ１２２）プロモーター；肝臓特異的ＩＧＦ−ＩＩプロモーターＰ１；マウストランスサイレチン（ＭＴＴＲ）プロモーター；およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターが含まれる。プロモーターはエンハンサーの上流でも下流でもよい。プロモーター配列は、エンハンサー配列に直接融合されてよい。
【０１００】
本発明の組成物および方法で使用できるＤＮａｓｅ活性を有する酵素の具体的な非限定例には、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅ  γ、ＤＮａｓｅ１Ｌ１、ＤＮａｓｅ１Ｌ２、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩα、ＤＮａｓｅ  ＩＩβ）、カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ（ＣＡＤ）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、アセチルコリンエステラーゼ、およびそれらの変異体または誘導体が含まれる。
【０１０１】
ＤＮａｓｅ活性を有する酵素がＤＮａｓｅ  Ｉである場合、アクチン結合を弱める様々な変異体を使用してもよい。変異させることができる野生型組換えヒトＤＮａｓｅ  Ｉ（配列番号４）の残基の具体的な非限定例には、例えば、Ｇｌｎ−９、Ｇｌｕ−１３、Ｔｈｒ−１４、Ｈｉｓ−４４、Ａｓｐ−５３、Ｔｙｒ−６５、Ｖａｌ−６６、Ｖａｌ−６７、Ｇｌｕ−６９、Ａｓｎ−７４、およびＡｌａ−１１４が含まれる。様々な実施形態において、Ａｌａ−１１４変異が使用される。例えば、配列番号５の配列を含むヒトＤＮａｓｅ  Ｉ高活性（hyperactive）変異体では、Ａｌａ−１１４残基が変異している。他のＤＮａｓｅの相補残基（complementary residue）も変異され得る。野生型ヒト組換えＤＮＡｓｅ  Ｉの変異の具体的な非限定例には、Ｈ４４Ｃ、Ｈ４４Ｎ、Ｌ４５Ｃ、Ｖ４８Ｃ、Ｇ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｄ５３Ｃ、Ｄ５３Ｒ、Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｙ、Ｄ５３Ａ、Ｎ５６Ｃ、Ｄ５８Ｓ、Ｄ５８Ｔ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｅ、Ｙ６５Ｒ、Ｙ６５Ｃ、Ｖ６６Ｎ、Ｖ６７Ｅ、Ｖ６７Ｋ、Ｖ６７Ｃ、Ｅ６９Ｒ、Ｅ６９Ｃ、Ａ１１４Ｃ、Ａ１１４Ｒ、Ｈ４４Ｎ：Ｔ４６Ｓ、Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｄ５３Ｒ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ４４Ａ：Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｈ４４Ａ：Ｙ６５Ａ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｓ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｔ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｓ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｔ、Ｖ６６Ｎ：Ｓ６８Ｔ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｓ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｔ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｓ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｔ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｓ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｔが含まれる。
【０１０２】
ＤＮａｓｅ活性を高めるために様々なＤＮａｓｅ変異体を使用することができる。野生型ヒト組換えＤＮＡｓｅ  Ｉの変異の具体的な非限定例には、例えば、Ｇｌｎ−９、Ｇｌｕ−１３、Ｔｈｒ−１４、Ｈｉｓ−４４、Ａｓｐ−５３、Ｔｙｒ−６５、Ｖａｌ−６６、Ｖａｌ−６７、Ｇｌｕ−６９、Ａｓｎ−７４、およびＡｌａ−１１４での変異が含まれる。野生型ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉの活性を高めるための変異の具体的な非限定例には、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｅ１３Ｋ、Ｔ１４Ｒ、Ｔ１４Ｋ、Ｈ４４Ｒ、Ｈ４４Ｋ、Ｎ７４Ｋ、およびＡ１１４Ｆが含まれる。例えば、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４ＫおよびＡ１１４Ｆの変異の組合せを使用してもよく、そのような組合せは、少なくとも、配列番号５の配列を含む高活性ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体に見られる。
【０１０３】
ＤＮａｓｅ発現にＡＡＶベクターを使用する場合、それらは任意の血清型に由来するものであってよく、例えば、血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０（例えば、米国特許第９，７９０，４７２号、国際公開第２０１７／１８０８５７号および国際公開第２０１７／１８０８６１号に開示されている）、ＡＡＶＬＫ０３（例えば、Wang et al., Mol. Ther., 2015, 23(12):1877-1887に開示されている）、ＡＡＶｈｕ３７（例えば、国際公開第２０１７１８０８５７号に開示されている）、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１（例えば、国際公開第２０１７１８０８５７号に開示されている）、またはＡｎｃ８０（Zinn et al., Cell Rep., 2015, 12(67): 1056-1068）に由来するものであってよい。
【０１０４】
肝臓特異的送達の効率および／または特異性を改善するために、カプシドタンパク質（例えば、ＶＰ３）に点突然変異を行うことができる。ＡＡＶ８  ＶＰ３カプシドタンパク質におけるそのような点突然変異の具体的な非限定例には、例えば、Ｓ２７９Ａ、Ｓ６７１Ａ、Ｋ１３７Ｒ、およびＴ２５２Ａ、ならびに国際公開第２０１７／１８０８５４号に開示されているＡＡＶ８カプシド突然変異（例えば、ＡＡＶ３Ｇ１、ＡＡＶＴ２０またはＡＡＶＴＲ１、アミノ酸２６３−２６７における［例えば、２６３ＮＧＴＳＧ２６７−＞ＳＧＴＨまたは２６３ＮＧＴＳＧ２６７−＞ＳＤＴＨ］および／またはアミノ酸４５７−４５９における［例えば、４５７ＴＡＮ４５９−＞ＳＲＰ］および／またはアミノ酸４５５−４５９における［例えば、４５５ＧＧＴＡＮ４５９−＞ＤＧＳＧＬ］および／またはアミノ酸５８３−５９７における、ＶＰ３突然変異）が含まれる。
【０１０５】
様々な様式で本発明のベクターおよび組成物を肝臓に標的化させることができる。肝臓への投与経路の具体的な非限定例には、肝臓内注射、静脈内注射、および動脈内注射が含まれる。
【０１０６】
配列
配列番号１−ヒトＤＮａｓｅ  Ｉ、野生型（ＷＴ）、前駆体；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２１４．２；分泌シグナル配列に下線を付す：
ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳＬＫＩＡＡＦＮＩＱＴＦＧＥＴＫＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩＶＱＩＬＳＲＹＤＩＡＬＶＱＥＶＲＤＳＨＬＴＡＶＧＫＬＬＤＮＬＮＱＤＡＰＤＴＹＨＹＶＶＳＥＰＬＧＲＮＳＹＫＥＲＹＬＦＶＹＲＰＤＱＶＳＡＶＤＳＹＹＹＤＤＧＣＥＰＣＧＮＤＴＦＮＲＥＰＡＩＶＲＦＦＳＲＦＴＥＶＲＥＦＡＩＶＰＬＨＡＡＰＧＤＡＶＡＥＩＤＡＬＹＤＶＹＬＤＶＱＥＫＷＧＬＥＤＶＭＬＭＧＤＦＮＡＧＣＳＹＶＲＰＳＱＷＳＳＩＲＬＷＴＳＰＴＦＱＷＬＩＰＤＳＡＤＴＴＡＴＰＴＨＣＡＹＤＲＩＶＶＡＧＭＬＬＲＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹＧＬＳＤＱＬＡＱＡＩＳＤＨＹＰＶＥＶＭＬＫ
【０１０７】
配列番号２−ヒトＤＮＡｓｅ  Ｉ変異体、前駆体；配列番号１と比較した変異残基を太字で記載し下線を付す。分泌シグナル配列に下線を付す：
ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳＬＫＩＡＡＦＮＩＲＴＦＧＲＴＫＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩＶＱＩＬＳＲＹＤＩＡＬＶＱＥＶＲＤＳＨＬＴＡＶＧＫＬＬＤＮＬＮＱＤＡＰＤＴＹＨＹＶＶＳＥＰＬＧＲＫＳＹＫＥＲＹＬＦＶＹＲＰＤＱＶＳＡＶＤＳＹＹＹＤＤＧＣＥＰＣＧＮＤＴＦＮＲＥＰＦＩＶＲＦＦＳＲＦＴＥＶＲＥＦＡＩＶＰＬＨＡＡＰＧＤＡＶＡＥＩＤＡＬＹＤＶＹＬＤＶＱＥＫＷＧＬＥＤＶＭＬＭＧＤＦＮＡＧＣＳＹＶＲＰＳＱＷＳＳＩＲＬＷＴＳＰＴＦＱＷＬＩＰＤＳＡＤＴＴＡＴＰＴＨＣＡＹＤＲＩＶＶＡＧＭＬＬＲＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹＧＬＳＤＱＬＡＱＡＩＳＤＨＹＰＶＥＶＭＬＫ
【０１０８】
配列番号３−Ａｎｃ８０  ＶＰ１カプシドタンパク質：
ＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＸ１ＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＮＴＭＸ２ＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＸ３ＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＸ４ＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＸ５ＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＳＧＴＡＧＮＲＸ６ＬＱＦＳＱＡＧＰＳＳＭＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＸ７ＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＳＮＶＤＬＤＮＶＭＩＴＸ８ＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＸ９ＹＧＴＶＡＴＮＬＱＳＸ１０ＮＴＡＰＡＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＸ１１ＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＴＴＦＳＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
Ｘ１＝ＫまたはＲ；Ｘ２＝ＡまたはＳ；Ｘ３＝ＡまたはＧ；Ｘ４＝ＲまたはＫ；Ｘ５＝ＥまたはＱ；Ｘ６＝ＴまたはＥ；Ｘ７＝ＡまたはＴ；Ｘ８＝ＳまたはＮ；Ｘ９＝ＱまたはＥ；Ｘ１０＝ＳまたはＡ；およびＸ１１＝ＮまたはＤ
【０１０９】
配列番号４−成熟野生型（ＷＴ）ヒトＤＮａｓｅ  Ｉ（分泌シグナル配列なし）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号４ＡＷＮ＿Ａ：
ＬＫＩＡＡＦＮＩＱＴＦＧＥＴＫＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩＶＱＩＬＳＲＹＤＩＡＬＶＱＥＶＲＤＳＨＬＴＡＶＧＫＬＬＤＮＬＮＱＤＡＰＤＴＹＨＹＶＶＳＥＰＬＧＲＮＳＹＫＥＲＹＬＦＶＹＲＰＤＱＶＳＡＶＤＳＹＹＹＤＤＧＣＥＰＣＧＮＤＴＦＮＲＥＰＡＩＶＲＦＦＳＲＦＴＥＶＲＥＦＡＩＶＰＬＨＡＡＰＧＤＡＶＡＥＩＤＡＬＹＤＶＹＬＤＶＱＥＫＷＧＬＥＤＶＭＬＭＧＤＦＮＡＧＣＳＹＶＲＰＳＱＷＳＳＩＲＬＷＴＳＰＴＦＱＷＬＩＰＤＳＡＤＴＴＡＴＰＴＨＣＡＹＤＲＩＶＶＡＧＭＬＬＲＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹＧＬＳＤＱＬＡＱＡＩＳＤＨＹＰＶＥＶＭＬＫ
【０１１０】
配列番号５−成熟ヒトＤＮＡｓｅ  Ｉ変異体（分泌シグナル配列なし）；配列番号４と比較した変異残基を太字で記載し下線を付す：
ＬＫＩＡＡＦＮＩＲＴＦＧＲＴＫＭＳＮＡＴＬＶＳＹＩＶＱＩＬＳＲＹＤＩＡＬＶＱＥＶＲＤＳＨＬＴＡＶＧＫＬＬＤＮＬＮＱＤＡＰＤＴＹＨＹＶＶＳＥＰＬＧＲＫＳＹＫＥＲＹＬＦＶＹＲＰＤＱＶＳＡＶＤＳＹＹＹＤＤＧＣＥＰＣＧＮＤＴＦＮＲＥＰＦＩＶＲＦＦＳＲＦＴＥＶＲＥＦＡＩＶＰＬＨＡＡＰＧＤＡＶＡＥＩＤＡＬＹＤＶＹＬＤＶＱＥＫＷＧＬＥＤＶＭＬＭＧＤＦＮＡＧＣＳＹＶＲＰＳＱＷＳＳＩＲＬＷＴＳＰＴＦＱＷＬＩＰＤＳＡＤＴＴＡＴＰＴＨＣＡＹＤＲＩＶＶＡＧＭＬＬＲＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹＧＬＳＤＱＬＡＱＡＩＳＤＨＹＰＶＥＶＭＬＫ
【０１１１】
配列番号６−ヒトＤＮａｓｅ  Ｉの分泌シグナル配列：
ＭＲＧＭＫＬＬＧＡＬＬＡＬＡＡＬＬＱＧＡＶＳ
【０１１２】
配列番号７−ＩＬ２の分泌シグナル配列：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ
【０１１３】
配列番号８−ヒトアルブミンプロモーター：
ＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＣＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＣＴＡＧＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＧＣＴＡＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＡＣＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＣ
【０１１４】
配列番号９−Ａｎｃ８０  ＶＰ１カプシドタンパク質：
ＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＸ１ＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＮＴＭＸ２ＡＧＧＧＡＰＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＸ３ＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＸ４ＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＸ５ＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＳＧＴＡＧＮＲＸ６ＬＱＦＳＱＡＧＰＳＳＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＸ７ＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＳＮＶＤＬＤＮＶＩＴＸ８ＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＸ９ＹＧＴＶＡＴＮＬＱＳＸ１０ＮＴＡＰＡＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＶＷＱＸ１１ＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＴＴＦＳＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
Ｘ１＝ＫまたはＲ；Ｘ２＝ＡまたはＳ；Ｘ３＝ＡまたはＧ；Ｘ４＝ＲまたはＫ；Ｘ５＝ＥまたはＱ；Ｘ６＝ＴまたはＥ；Ｘ７＝ＡまたはＴ；Ｘ８＝ＳまたはＮ；Ｘ９＝ＱまたはＥ；Ｘ１０＝ＳまたはＡ；およびＸ１１＝ＮまたはＤ
【０１１５】
配列番号１０−ヒトβグロビンプライマー：
ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ
【０１１６】
配列番号１１−フォワードＮＬＲＰ３プライマー：
ＧＴＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＴ
【０１１７】
配列番号１２−リバースＮＬＲＰ３プライマー：
ＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴ
【０１１８】
配列番号１３−フォワード１６Ｓユニバーサル細菌ＲＮＡ遺伝子プライマー：
ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ
【０１１９】
配列番号１４−リバース１６Ｓユニバーサル細菌ＲＮＡ遺伝子プライマー：
ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ
【０１２０】
配列番号１５−ヒトアンチトリプシンプロモーター配列：
ＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＡＡＧＴＧＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴ
【０１２１】
配列番号１６−機能性タンパク質Ｘをコードしないウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント：
ＡＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＴＣＧＧＡＣＴＡＧ
【０１２２】
配列番号１７−アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサー、肝臓制御領域（ＨＣＲ）：
ＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＧＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧ
【０１２３】
配列番号１８−配列番号５のヒトＤＮａｓｅ  Ｉ高活性バリアントをコードするポリヌクレオチド：
ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡ
【０１２４】
配列番号１９−配列番号２のヒトＤＮＡｓｅ  Ｉ変異体前駆体をコードするポリヌクレオチド（分泌シグナル配列に下線を付す）：
ＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡ
【０１２５】
配列番号２０−ヒトＤＮａｓｅ  Ｉの分泌シグナル配列（配列番号６）をコードするポリヌクレオチド：
ＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣ
【０１２６】
配列番号２１−配列番号５の成熟ヒトＤＮＡｓｅ  Ｉ変異体（分泌シグナル配列なし）をコードするポリヌクレオチド：
ＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡ
【０１２７】
配列番号２２−配列番号１のヒトＤＮａｓｅ  Ｉ、野生型（ＷＴ）、前駆体をコードするポリヌクレオチド：
ＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧ
【０１２８】
配列番号２３−配列番号４の成熟野生型（ＷＴ）ヒトＤＮａｓｅ  Ｉをコードするポリヌクレオチド：
ＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧ
【０１２９】
配列番号２４−ハツカネズミ（Mus musculus）野生型ＤＮａｓｅ  Ｉ、前駆体；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３４１９１．３；分泌シグナル配列に下線を付す：
ＭＲＹＴＧＬＭＧＴＬＬＴＬＶＮＬＬＱＬＡＧＴＬＲＩＡＡＦＮＩＲＴＦＧＥＴＫＭＳＮＡＴＬＳＶＹＦＶＫＩＬＳＲＹＤＩＡＶＩＱＥＶＲＤＳＨＬＶＡＶＧＫＬＬＤＥＬＮＲＤＫＰＤＴＹＲＹＶＶＳＥＰＬＧＲＫＳＹＫＥＱＹＬＦＶＹＲＰＤＱＶＳＩＬＤＳＹＱＹＤＤＧＣＥＰＣＧＮＤＴＦＳＲＥＰＡＩＶＫＦＦＳＰＹＴＥＶＱＥＦＡＩＶＰＬＨＡＡＰＴＥＡＶＳＥＩＤＡＬＹＤＶＹＬＤＶＷＱＫＷＧＬＥＤＩＭＦＭＧＤＦＮＡＧＣＳＹＶＴＳＳＱＷＳＳＩＲＬＲＴＳＰＩＦＱＷＬＩＰＤＳＡＤＴＴＶＴＳＴＨＣＡＹＤＲＩＶＶＡＧＡＬＬＱＡＡＶＶＰＮＳＡＶＰＦＤＦＱＡＥＹＧＬＳＮＱＬＡＥＡＩＳＤＨＹＰＶＥＶＴＬＲＫＩ
【０１３０】
配列番号２５−ハツカネズミ野生型ＤＮａｓｅ  Ｉの分泌シグナル配列
ＭＲＹＴＧＬＭＧＴＬＬＴＬＶＮＬＬＱＬＡＧＴ
【０１３１】
配列番号２６−成熟野生型（ＷＴ）ハツカネズミ野生型ＤＮａｓｅ  Ｉ
ＬＲＩＡＡＦＮＩＲＴＦＧＥＴＫＭＳＮＡＴＬＳＶＹＦＶＫＩＬＳＲＹＤＩＡＶＩＱＥＶＲＤＳＨＬＶＡＶＧＫＬＬＤＥＬＮＲＤＫＰＤＴＹＲＹＶＶＳＥＰＬＧＲＫＳＹＫＥＱＹＬＦＶＹＲＰＤＱＶＳＩＬＤＳＹＱＹＤＤＧＣＥＰＣＧＮＤＴＦＳＲＥＰＡＩＶＫＦＦＳＰＹＴＥＶＱＥＦＡＩＶＰＬＨＡＡＰＴＥＡＶＳＥＩＤＡＬＹＤＶＹＬＤＶＷＱＫＷＧＬＥＤＩＭＦＭＧＤＦＮＡＧＣＳＹＶＴＳＳＱＷＳＳＩＲＬＲＴＳＰＩＦＱＷＬＩＰＤＳＡＤＴＴＶＴＳＴＨＣＡＹＤＲＩＶＶＡＧＡＬＬＱＡＡＶＶＰＮＳＡＶＰＦＤＦＱＡＥＹＧＬＳＮＱＬＡＥＡＩＳＤＨＹＰＶＥＶＴＬＲＫＩ
【０１３２】
配列番号２７−ハツカネズミ野生型ＤＮａｓｅ  Ｉの分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチド
ＡＴＧＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＣＴＡＡＴＧＧＧＡＡＣＡＣＴＧＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＣＴ
【０１３３】
配列番号２８−成熟野生型（ＷＴ）ハツカネズミ野生型ＤＮａｓｅ  Ｉをコードするポリヌクレオチド
ＣＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣＴＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＴＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＴＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＡＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＧＴＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＧＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＧＡＡＴＡＣＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡ
【０１３４】
配列番号２９−ハツカネズミ野生型ＤＮａｓｅ  Ｉ、前駆体をコードするポリヌクレオチド
ＡＴＧＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＣＴＡＡＴＧＧＧＡＡＣＡＣＴＧＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣＴＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＧＴＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＴＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＡＣＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＧＴＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＧＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＧＡＡＴＡＣＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡ
【０１３５】
配列番号３０−ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１３ＡＤ）の完全配列
ＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＧＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＡＡＧＴＧＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＴＣＧＧＡＣＴＡＧ
（ＡＰＯＥ  ＨＣＲエンハンサー：塩基１−３２０；ヒトα１−アンチトリプシンプロモーター：塩基３２１−７１７；コザック配列：塩基７１８−７２６；天然の完全に正しいリーダー配列を持つヒトＤＮａｓｅＩ高活性バリアント：塩基７２７−１５７５；不活性化されたＷＰＲＥ  Ｘタンパク質：塩基１５７６−２２１２）
【０１３６】
配列番号３１−ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ野生型−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１４ＡＤ）の完全配列
ＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＧＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＡＡＧＴＧＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＴＣＧＧＡＣＴＡＧ
（ＡＰＯＥ  ＨＣＲエンハンサー：塩基１−３２０；ヒトα１−アンチトリプシンプロモーター：塩基３２１−７１７；コザック配列：塩基７１８−７２６；天然の完全に正しいリーダー配列を持つヒトＤＮａｓｅＩ野生型：塩基７２７−１５７５；不活性化されたＷＰＲＥ  Ｘタンパク質：塩基１５７６−２２１２）
【０１３７】
配列番号３２−停止コドンを有する配列番号１のヒトＤＮａｓｅ  Ｉ、野生型（ＷＴ）、前駆体をコードするポリヌクレオチド：
ＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡ
【０１３８】
配列番号３３−コザック配列
５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’
【０１３９】
配列番号３４−Ａｎｃ８０Ｌ６５  ＶＰ１カプシドタンパク質
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＮＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＫＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＳＧＴＡＧＮＲＴＬＱＦＳＱＡＧＰＳＳＭＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＴＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＳＮＶＤＬＤＮＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＥＹＧＴＶＡＴＮＬＱＳＡＮＴＡＰＡＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＴＴＦＳＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
【０１４０】
配列番号３５−変異Ａｎｃ８０Ｌ６５  ＶＰ１カプシドタンパク質
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＮＴＭＡＡＧＧＧＡＰＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＫＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＳＧＴＡＧＮＲＴＬＱＦＳＱＡＧＰＳＳＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＴＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＳＮＶＤＬＤＮＶＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＥＹＧＴＶＡＴＮＬＱＳＡＮＴＡＰＡＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＴＴＦＳＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
【０１４１】
定義
「デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素」という用語は、本明細書では、ＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合の加水分解切断が可能な酵素を指すために使用される。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、用語「デオキシリボヌクレアーゼ」および「ＤＮａｓｅ」は、ＤＮＡ骨格におけるホスホジエステル結合の加水分解切断を触媒する任意の酵素を指すために使用される。多種多様なデオキシリボヌクレアーゼが知られており、本発明の方法で使用することができる。本発明の方法において有用なＤＮａｓｅの非限定的な例には、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、組換えヒトＤＮａｓｅ  Ｉ（ｒｈＤＮａｓｅ  Ｉ）またはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅ  ガンマ（γ）、およびＤＮＡＳ１Ｌ２など）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−アルファ（α）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−ベータ（β））、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。また、本発明には、延長された半減期を有するＤＮａｓｅ酵素（例えば、アルブミンおよび／またはＦｃ融合物、あるいはアクチン結合部位の修飾によりアクチンへの結合から保護されている；例えば、Gibson et al., (1992) J. Immunol. Methods, 155, 249-256を参照）も包含される。ＤＮａｓｅ  Ｉのアクチン結合部位は、例えば、以下の残基において変異させることができる：組換えヒトＤＮａｓｅ  Ｉ（配列番号４）のＧｌｎ−９、Ｇｌｕ−１３、Ｔｈｒ−１４、Ｈｉｓ−４４、Ａｓｐ−５３、Ｔｙｒ−６５、Ｖａｌ−６６、Ｖａｌ−６７、Ｇｌｕ−６９、Ａｓｎ−７４、Ａｌａ−１１４。例えば、配列番号５の配列を含むヒトＤＮａｓｅ  Ｉ高活性バリアントでは、Ａｌａ−１１４残基が変異している。例示的な変異には、Ｈ４４Ｃ、Ｈ４４Ｎ、Ｌ４５Ｃ、Ｖ４８Ｃ、Ｇ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｄ５３Ｃ、Ｄ５３Ｒ、Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｙ、Ｄ５３Ａ、Ｎ５６Ｃ、Ｄ５８Ｓ、Ｄ５８Ｔ、Ｙ６５Ａ、Ｙ６５Ｅ、Ｙ６５Ｒ、Ｙ６５Ｃ、Ｖ６６Ｎ、Ｖ６７Ｅ、Ｖ６７Ｋ、Ｖ６７Ｃ、Ｅ６９Ｒ、Ｅ６９Ｃ、Ａ１１４Ｃ、Ｈ４４Ｎ：Ｔ４６Ｓ、Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｄ５３Ｒ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ４４Ａ：Ｄ５３Ｒ：Ｙ６５Ａ、Ｈ４４Ａ：Ｙ６５Ａ：Ｅ６９Ｒ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｓ、Ｈ６４Ｎ：Ｖ６６Ｔ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｓ、Ｙ６５Ｎ：Ｖ６７Ｔ、Ｖ６６Ｎ：Ｓ６８Ｔ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｓ、Ｖ６７Ｎ：Ｅ６９Ｔ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｓ、Ｓ６８Ｎ：Ｐ７０Ｔ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｓ、Ｓ９４Ｎ：Ｙ９６Ｔ（配列番号４の配列における）が含まれる。高められたＤＮａｓｅ  Ｉ活性を有するＤＮａｓｅ  Ｉの変異も包含される。そのような変異の非限定的な例は、例えば、組換えヒトＤＮａｓｅ  Ｉ（配列番号４）のＱ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｅ１３Ｋ、Ｔ１４Ｒ、Ｔ１４Ｋ、Ｈ４４Ｒ、Ｈ４４Ｋ、Ｎ７４Ｋ、およびＡ１１４Ｆである。例えば、Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４ＫおよびＡ１１４Ｆの変異の組合せが、配列番号５の配列を含む高活性ＤＮａｓｅ  Ｉに見られる。ＤＮａｓｅ  Ｉは、ピリミジンヌクレオチドに隣接するホスホジエステル結合で優先的にＤＮＡを切断し、３’位に遊離ヒドロキシル基を有する５’−リン酸末端ポリヌクレオチドを生成し、平均してテトラヌクレオチドを生成する。ＤＮａｓｅ  Ｉは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、およびクロマチンに作用する。
【０１４３】
「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、許容可能な標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所定の値の±２０％まで、±１０％まで、±５％まで、および±１％までの範囲を意味する場合がある。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の２倍以内など、１桁以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は暗黙的であり、この文脈では、特定の値の許容誤差範囲内を意味する。
【０１４４】
「細胞外ＤＮＡ」、「セルフリーＤＮＡ」、および「ｃｆＤＮＡ」という用語は互換的に使用され、患者の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、または腸で見られる細胞外ＤＮＡ（例えば、真核生物、古細菌または原核生物起源のもの）を指す。
【０１４５】
状況、障害または状態を「処置する（treat）」または「処置（treatment）」という用語には以下が含まれる：（１）状況、障害または状態に罹患しているかまたはその素因を有する可能性があるが、まだその状況、障害または状態の臨床症状または無症候性症状を経験または表示していない対象において進行している状況、障害または状態の少なくとも１つの臨床症状または無症候性症状の発生および／または出現の可能性を防止、遅延または低減すること；あるいは（２）状況、障害または状態を阻害すること、すなわち、疾患もしくはその再発、またはそれらの少なくとも１つの臨床症状もしくは無症候性症状の進行を阻止、低減または遅延させること；あるいは（３）疾患を緩和すること、すなわち、状況、障害もしくは状態またはそれらの臨床症状もしくは無症候性症状の少なくとも１つの後退を生じさせること。処置される対象に対する利益は、統計的に有意であるか、あるいは少なくとも患者または医師に知覚可能であるかのいずれかである。
【０１４６】
「個体」、「対象」、「動物」、「患者」、および「哺乳動物」という用語は互換的に使用され、哺乳動物を指し、それには、ヒト、獣医動物（例えば、猫、犬、牛、馬、羊、豚など）および疾患の実験動物モデル（例えば、マウス、ラット）が含まれる。
【０１４７】
用量または量に適用される「有効」という用語は、それを必要とする対象に投与したときに所望の活性をもたらすのに十分な化合物または医薬組成物の量を指す。有効成分の組合せが投与される場合、組合せの有効量は、個別に投与した場合に有効であった各成分の量を含んでも含まなくてもよいことに留意されたい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、処置される状態の重症度、使用される特定の薬物（単数または複数）、投与方法などに応じて、対象ごとに異なる。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、用量または量に適用される「治療的有効」という用語は、それを必要とする対象に投与したときに所望の活性をもたらすのに十分な化合物または医薬組成物の量を指す。有効成分の組合せ（例えば、ＤＮａｓｅと別の化合物の組合せ）が投与される場合、組合せの有効量は、個別に投与した場合に有効であった各成分の量を含んでも含まなくてもよいことに留意されたい。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、１つまたは複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置する核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、およびその他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定され、その他のＤＮＡ配列には、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を調節するために直接的または間接的に作用することが当業者に知られている任意のその他のヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の組織または細胞において優先的に活性であることができる。
【０１５０】
本明細書で使用される「肝臓特異的発現」という用語は、肝臓での、優勢なまたは排他的な発現、すなわち他の組織および器官におけるよりも実質的により大きな程度の発現を指す。
【０１５１】
「肝臓特異的プロモーター」という用語は、本明細書では、肝臓細胞（例えば、肝細胞）で優勢に（predominantly）または排他的に（exclusively）活性であり、他の組織および器官におけるよりも実質的に大きな程度、肝臓での転写を指示／開始するプロモーターを指すために使用される。この文脈において、「優勢に」という用語は、前記プロモーター駆動発現の少なくとも５０％、より典型的には前記プロモーター駆動発現の少なくとも９０％（例えば前記プロモーター発現の１００％）が肝臓細胞で生じることを意味する。非肝臓発現に対する肝臓発現の比率は、異なる肝臓特異的プロモーター間で変動し得る。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、特定の肝臓細胞の種類（例えば、肝細胞、クッパー細胞、内皮細胞など）での転写を優先的に指示／開始することができる。本発明の発現カセットにおいて有用ないくつかの肝臓特異的プロモーターは、少なくとも１つ、典型的にはいくつかの肝細胞核因子結合部位を含む。本発明の発現カセットにおいて有用な肝臓特異的プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。本発明の発現カセットにおいて有用な肝臓プロモーターのいくつかの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（Ａｌｂ）、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域プロモーター、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（ＡＰＯＡ２）プロモーター、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）（ｈＡＡＴ）プロモーター、チトクロームＰ４５０ファミリー３、サブファミリーＡポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １２２（ｍｉＲ−ｌ２２）プロモーター、肝臓特異的ＩＧＦ−ＩＩプロモーターＰｌ、マウストランスサイレチン（ＭＴＴＲ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、およびマウスプレアルブミン遺伝子プロモーターが含まれる。
【０１５２】
肝臓特異的プロモーターの非限定的な例には、例えば、アルブミンプロモーター（Ａｌｂ）、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域プロモーター、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（ＡＰＯＡ２）プロモーター、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）（ｈＡＡＴ）プロモーター、チトクロームＰ４５０ファミリー３、サブファミリーＡポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １２２（ｍｉＲ−ｌ２２）プロモーター、肝臓特異的ＩＧＦ−ＩＩプロモーターＰｌ、マウストランスサイレチン（ＭＴＴＲ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）プロモーター、ＨＢＶベーシックコアプロモーター（ＢＣＰ）およびＰｒｅＳ２プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと組み合わせたＡＡＴプロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ホスフェノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、トランスフェリンプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、α−フィブリノーゲンおよびβ−フィブリノーゲンプロモーター、α１−アンチキモトリプシンプロモーター、α２−ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質（例えば、Ｃｌｑ、Ｃｌｒ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、補体因子Ｉ、および因子Ｈ）のプロモーター、Ｃ３補体アクチベーターおよび［α］１−酸性糖タンパク質プロモーターが含まれる。追加の組織特異的プロモーターは、組織特異的プロモーターデータベース、ＴｉＰｒｏＤ （Nucleic Acids Research, J4:D104-D107 (2006)）でみつけることができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、例えば、肝臓ターゲティングがカプシドタンパク質によって媒介される場合、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする核酸を、効率的な全身発現を可能にするプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、鶏β−アクチンプロモーター（ＣＢＡ）、ＥＦ１ａプロモーター）に作動可能に連結させることができる。
【０１５４】
「門脈がん」という用語は、本明細書では、門脈へと流れ出る器官または組織に由来するまたはそれらに転移したがん（例えば、がん腫、肉腫、またはリンパ腫）を指すために使用される。そのような器官および組織の非限定的な例を図１に示し、例えば、肝臓、結腸、小腸および大腸、胃、脾臓、膵臓、および胆嚢が含まれる。
【０１５５】
「神経変性」という用語は、本明細書において、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造および／または機能の進行性の喪失を伴う別個の臨床病理学的状態を指すために使用される。神経変性は原発性（一次性）または続発性（二次性）であり得る。原発性神経変性を伴う疾患の非限定的な例には、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、プリオンが原因となる疾患、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、レビー小体型認知症、血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、ピック病、オリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、アルツハイマー型老年認知症、進行性核上性麻痺（Steel-Richardson-Olszewski）、大脳皮質基底核変性症、ハラーフォルデン−シュパッツ病（Hallervorden-Spatz disease）、進行性の家族性ミオクローヌスてんかん、線条体黒質変性症、捻転ジストニア（例えば、捻転けいれん；変形性筋ジストニア）、痙性斜頸およびその他のジスキネジー（dyskinesis）、家族性振戦、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群（Gilles de la Tourette syndrome）、小脳皮質変性症、脊髄小脳変性症（例えば、フリードライヒ運動失調症および関連疾患）、シャイ・ドレーガー（Shy-Drager）症候群、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺、腓骨筋萎縮症（シャルコー・マリー・トゥース病（Charcot- Marie-Tooth））、肥厚性間質性多発ニューロパチー（デジュリーヌ・ソッタス病（Dejerine-Sottas））、慢性進行性ニューロパチー、網膜の色素変性（網膜色素変性症）、および遺伝性視神経萎縮症（レーベル病）が含まれる。続発性神経変性は主に壊死によって引き起こされる。続発性神経変性をもたらし得る状態の非限定的な例には、新生物、浮腫、出血、脳卒中、外傷、免疫発作、低酸素症、中毒、代謝異常および感染による、ニューロンの破壊が含まれる。
【０１５６】
本発明の組成物に関連して使用される「薬学的に許容される」という語句は、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与したときに、生理学的に許容可能でありかつ典型的には有害反応を生じないそのような組成物の分子実態および他の成分を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている哺乳動物、より具体的にはヒトでの使用のための薬局方に掲載されていることを意味する。
【０１５７】
「細胞増殖抑制および／または細胞毒性化学療法」および「化学療法」という用語は本明細書で互換的に使用され、細胞増殖抑制剤および／または細胞毒性剤の投与を伴う治療を指す。
【０１５８】
「抗がん剤」および「抗がん化学療法剤」という用語は、がんを処置するために使用される任意の化合物を指すために本明細書で使用される。抗がん化学療法剤は当技術分野でよく知られている（例えば、Gilman A. G., et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Ed., Sec 12:1202-1263 (1990)を参照）。化学療法剤の具体例は、本明細書全体にわたって提供されている。
【０１５９】
本明細書で使用される「化学療法の副作用」という用語は、必ずしも予期されないわけではないが、化学療法の結果である望ましくない意図しない結果を指す。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「放射線療法」、「放射線治療」、および「ＲＴ」という用語は互換的に使用され、直接的にまたは病的細胞内にＤＮＡに損傷を与える荷電粒子を作成することにより悪性細胞のＤＮＡに損傷を与えるための、がん治療の一部としての電離放射線の医学的使用を指す。本発明に包含される一般的に使用されるタイプの放射線療法には、例えば、外照射療法（ＥＢＲＴまたはＸＲＴ）、小線源療法／密封線源放射線療法、および全身放射性同位体療法／非密封線源放射線療法が含まれる。
【０１６１】
本明細書で使用される「放射線療法の副作用」または「放射線治療の副作用」という用語は、必ずしも予期されないわけではないが、放射線療法の望ましくない意図しない結果を指す。どの副作用が発生するかは、治療対象の体の部位、１日あたりの照射量、総照射量、患者の全身病状、および同時に行われる他の処置によって異なり、例えば、皮膚の刺激または損傷、疲労、吐き気、嘔吐、線維症、腸損傷、記憶喪失、不妊症、または二次がんが含まれ得る。
【０１６２】
本明細書で使用される「異化状態」という用語は、化学療法または化学放射線療法の背景で起こり得る、急速な体重減少や脂肪および骨格筋量の減少を特徴とする状態を指す。関連する臨床事象には、例えば、免疫抑制、筋力低下、肺塞栓症の素因、血栓性静脈炎、およびストレス応答の変化が含まれる。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、用語「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」は、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列）を含む組換えウイルス構築物を指す。一部の実施形態では、ウイルスベクターは複製欠損である。いくつかの実施形態では、ウイルスの構造および非構造コード配列はウイルスベクターに存在せず、プラスミドなどのベクターによってトランスにウイルスベクター生成中に、または配列をパッケージング細胞株に安定に組み込むことによって提供される。ウイルスに応じて、ウイルスベクターをカプシド（例えば、ＡＡＶベクター）および／または脂質エンベロープ（例えば、レンチウイルスベクター）内にパッケージすることができる。
【０１６４】
本明細書で使用される「ポリアデニル化シグナル」という用語は、ｍＲＮＡの３’末端へのポリアデニンストレッチの付着を媒介する核酸配列に関する。本発明の発現構築物で使用できるポリアデニル化シグナルの非限定的な例には、例えば、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５  ＥＩｂポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ヒト変異成長ホルモンポリアデニル化シグナルなどが含まれる。
【０１６５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないことを指示しない限り、複数への言及を含む。
【０１６６】
本発明によれば、当技術分野の範囲内の従来の薬理学および分子生物学の技法を使用することができる。そのような技術は文献で完全に説明されている。とりわけ、例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (ここでは、「Sambrook et al., 1989」); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【０１６７】
ＤＮａｓｅ酵素の肝臓へのターゲティング
本発明者らは、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素の発現を肝臓に標的化（ターゲティング）することにより、循環全体、特に門脈−類洞循環からの疾患関連ｃｆＤＮＡのクリアランスの増強をもたらし得ることを予想外に見出した。下記の実施例の欄で実証するように、ｃｆＤＮＡは肝臓、特に内皮周囲腔およびディッセ腔に蓄積することができる。ＤＮａｓｅ活性を有する酵素の局所的発現によるｃｆＤＮＡのそのような貯蔵庫の分解は、循環中のｃｆＤＮＡの全体的なレベルを低下させることができる。
【０１６８】
本願明細書全体で説明するように、ＤＮａｓｅ導入遺伝子を担持するウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、またはアデノウイルスベクター）、リポソーム、ナノ粒子、または裸のＤＮＡを使用することにより、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素を肝細胞で効率的に発現させることができる。成人の肝臓は、心拍出量の４分の１近くを受け取り、毎分約１Ｌの血液をろ過し、いかなる場合にも血液量の１０〜１５％を占める。このような活発な循環により、高レベルのベクター粒子を急速に肝臓内に蓄積させることができる。ベクター粒子は、肝類洞に沿って有窓性内皮を通過して直接肝細胞に達する。そのような肝細胞は、ベクター粒子によってトランスフェクトされ、続いてＤＮａｓｅを産生することができる。産生されたＤＮａｓｅは、内皮周囲腔およびディッセ腔に分泌され、そこでｃｆＤＮＡの濃縮プールを効率的に分解することができる。
【０１６９】
本発明者らは、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素を発現させるための肝細胞のトランスフェクションが、血流中の高レベルのｃｆＤＮＡに関連する疾患および状態の実質的かつ驚くべき改善とともに、ｃｆＤＮＡの驚くほど大きな減少をもたらすことを見出した。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、肝臓におけるＤＮａｓｅ酵素の発現は、肝臓で優勢に発現される核酸発現カセットの使用によって達成される。いくつかの実施形態では、そのような発現カセットは、以下のエレメントの１つまたは複数を含むことができる：（ａ）肝臓遺伝子座制御エレメント；（ｂ）肝臓遺伝子座制御エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーター；（ｃ）肝臓プロモーターの３’側に位置するコード配列、前記コード配列は、例えばデオキシリボヌクレアーゼなどのポリペプチドをコードする；（ｄ）コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナル；および（ｅ）肝臓プロモーターの３’側でかつポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロン。エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、コード配列によりコードされるポリペプチドを発現するように作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、本発明の発現カセットは、少なくとも１００日間（例えば、少なくとも２００日間、少なくとも３００日間、少なくとも４００日間、または少なくとも５００日間）、肝臓細胞で治療量のポリペプチドの発現を導く。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＤＮａｓｅである。ＤＮａｓｅは、本明細書に記載されている任意のＤＮａｓｅ、例えばＤＮａｓｅ  Ｉであってよい。
【０１７１】
ポリアデニル化シグナルは、ＤＮａｓｅをコードする核酸に作動可能に連結され得る。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例には、例えば、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５  ＥＩｂポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ヒト変異成長ホルモンポリアデニル化シグナルなどが含まれる。
【０１７２】
別の態様において、本発明は、哺乳動物の肝臓で優勢に発現される核酸発現カセットを含むベクターを提供する。そのような発現カセットは、例えば、（ａ）肝臓遺伝子座制御エレメント；（ｂ）肝臓遺伝子座制御エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーター；（ｃ）肝臓プロモーターの３’側に位置するコード配列、前記コード配列は、例えばデオキシリボヌクレアーゼなどのポリペプチドをコードする；（ｄ）コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナル；および（ｅ）肝臓プロモーターの３’側でかつポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンを含むことができる。エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、コード配列によってコードされるポリペプチドを発現するように作動可能に連結される。本発明のいくつかのベクターはエピソームベクターであり、本発明のいくつかのベクターは、組み込み型ウイルスベクターなどの組み込み型ベクターである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）である。ＤＮａｓｅは、本明細書に記載されている任意のＤＮａｓｅ、例えばＤＮａｓｅ  Ｉであってよい。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、ｃｆＤＮＡのレベルの上昇に関連する疾患または状態を処置する方法を提供する。疾患または状態は、本明細書、あるいは米国特許第７，６１２，０３２号；同第８，３８８，９５１号；同第８，４３１，１２３号；同第８，５３５，６６３号；同第８，７１０，０１２号；同第８，７９６，００４号；同第８，８７１，２００号；同第８，９１６，１５１号；同第９，０７２，７３３号；同第９，２４８，１６６号；同第９，７７０，４９２号；米国特許出願公開第２０１７００５６４８２号、同第２０１７０１００４６３号、同第２０１５０１１０７６９号、および国際公開２０１６／１９０７８０号に記載されており、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、この方法は、（１）核酸発現カセットを含むベクターを対象の肝臓に導入するステップであって、前記発現カセットは、（ａ）肝臓特異的プロモーター；（ｂ）肝臓特異的プロモーターの３’側に位置するコード配列、前記コード配列は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする（例えば、本明細書に記載の任意のＤＮＡ）；（ｃ）コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナル；および任意選択で（ｄ）肝臓プロモーターの３’側でかつポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンを含み、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、コード配列によってコードされるポリペプチドを発現するように作動可能に連結されている、ステップ；および（２）肝臓で治療量の前記ポリペプチドを発現させるステップを含む。本発明のこの態様の方法のいくつかの実施形態では、治療量のポリペプチドは、少なくとも１００日間（例えば、少なくとも２００日間、少なくとも３００日間、少なくとも４００日間、および少なくとも５００日間）発現される。
【０１７４】
本発明のこの態様の核酸発現ベクターおよびカセットは、肝臓で優勢に発現され、例えば、コードされるポリペプチドの発現の少なくとも５０％が肝臓内で生じる。より典型的には、発現の少なくとも９０％が肝臓内で生じる。本発明のこの態様の発現ベクターおよびカセットのいくつかは、肝臓内で排他的に発現される。
【０１７５】
本発明の発現カセットに肝臓遺伝子座制御エレメントを組み込むことができ、それは、肝細胞における核酸分子の発現を増強することができ、発現カセットでのコピー数依存的で位置非依存的な発現をもたらす。本発明の発現カセットにおいて有用ないくつかの肝臓遺伝子座制御領域には、例えば、マトリックス付着領域および／または肝臓特異的エンハンサーエレメントが含まれる。
【０１７６】
プロモーターに加えて、発現カセットおよび／またはベクターは、１つまたは複数の追加の転写開始、終結、および／またはエンハンサー配列；ＲＮＡプロセシングシグナル（スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなど）；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’［配列番号３３］などのコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；およびコードされるポリペプチドの分泌を増強する配列を含んでいてよい。適切なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。適切なエンハンサーの例には、例えば、とりわけ、α−フェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）、セルピン１エンハンサーが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つまたは複数の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーを含む。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在させることができる。あるいは、エンハンサーの二重コピーは、１つまたは複数の配列によって分離されていてもよい。
【０１７７】
さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａイントロン、短縮型（truncated）キメライントロン（Ｔキメライントロン）、国際公開第２０１１／１２６８０８号に記載されているイントロン）をさらに含む。
【０１７８】
必要に応じて、１つまたは複数の配列が、ｍＲＮＡを安定化するために選択され得る。そのような配列の例は、改変ＷＰＲＥ配列であり、それはポリＡ配列の上流でかつコード配列の下流に組み込まれ得る（例えば、MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619を参照）。
【０１７９】
エンハンサーは、アポリポタンパク質ＥまたはＡｐｏＥに由来する約１５５ｂｐのＡｐｏＥエンハンサーエレメントであってよい。ＡｐｏＥは、リポタンパク質粒子の結合、内在化、異化を媒介するアポリポタンパク質であって、低密度リポタンパク質（ＡｐｏＢ／Ｅ）受容体および肝組織のＡｐｏＥ受容体のリガンドである。ＡｐｏＥ遺伝子に関連する遺伝子エンハンサーは、特に肝臓での核酸の転写を増加させることができる真核生物の制御エレメントである。
【０１８０】
エンハンサーは、ＡｐｏＥ遺伝子に関連する肝臓制御領域（例えば、ＨＣＲ−１またはＨＣＲ−２）からのエレメントを含んでいてよい。例えば、ＨＣＲ−１からの配列は、配列番号１７の配列に見られる。
【０１８１】
さらに別の実施形態では、発現カセットおよび／またはベクターは、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）をさらに含む。例示的な転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。例えば、ＷＰＲＥからの配列は、配列番号１６に示されている。ＷＰＲＥは、タンパク質（ＤＮａｓｅなど）の発現を増加させるのに効果的である。ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥにコードされる短縮型Ｘタンパク質の活性型を生成しないように改変することができる。そのような改変ＷＰＲＥの１つは、少なくとも配列番号１６の配列、およびＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー：ｈＡＡＴプロモーター＞ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（配列番号３０の塩基１５７６−２２１２；図１０Ａおよび図１０Ｂも参照）に提供される。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本発明のカセットは、コード配列によってコードされるポリペプチドの治療量の発現を、長期間、典型的には２００日超、ある場合には５００日超にわたり指示する。コード配列によってコードされるポリペプチドの発現は、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイのような抗体ベースのアッセイなど、当技術分野で認められている任意の手段によって測定することができる。再度、非限定的な例として、発現カセット内のコード配列によってコードされるポリペプチドの発現は、ポリペプチドの酵素的または生物学的活性を検出するバイオアッセイで測定することができる。
【０１８３】
肝臓細胞（例えば、肝細胞）に入ると、ベクターはエピソームのままであることができ（つまり、宿主細胞のゲノムに組み込まれない）、あるいは宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。エピソームベクターの非限定的な例には、アデノウイルスベクターが含まれ、宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターの例には、レトロウイルスベクターが含まれる。
【０１８４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、ＤＮＡがＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド）およびＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）などの１つまたは複数の脂質と会合しているリポソームの形で細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ＤＯＴＭＡを含有するカチオン性リポソームは、本発明の発現ベクターを肝臓に標的化するのに有効である。いくつかの実施形態では、ラクトフェリンおよび／またはポリＬ−リジンおよび／またはポリエチレンイミンおよび／またはキトサンを発現ベクターにコンジュゲートし、このコンジュゲートは、対象への直接導入後に肝臓に効果的に標的化される。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、リポソームは、肝臓の肝類洞を裏打ちする内皮層の開窓よりも小さい寸法を有する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ナノベクターにパッケージングされるか、またはナノベクターに封入される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ホスホロアミダイトナノ粒子にパッケージングされる。
【０１８８】
ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする本発明の核酸の標的細胞へのバイオアベイラビリティを高めるために様々なデバイスが開発されており、例えば、ＤＮＡを含むカテーテルまたは移植可能材料(G. D. Chapman et al., Circulation Res. 71:27-33 (1992)) 、および高圧下で液柱を標的組織に直接投射する無針ジェット注射装置(P. A. Furth et al., Anal Biochem. 20:365-368 (1992); (H. L. Vahlsing et al., J. Immunol. Meth. 175:11-22 (1994); (F. D. Ledley et al., Cell Biochem. 18A:226 (1994)) が含まれる。
【０１８９】
ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする本発明の核酸の肝臓ターゲティング送達への別のアプローチは分子コンジュゲートの使用であり、これは、核酸の細胞への特異的ターゲティングのために核酸結合剤が取り付けられているタンパク質または合成リガンドからなる(R. J. Cristiano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11548-52 (1993); B. A. Bunnell et al., Somat. Cell Mol. Genet. 18:559-69 (1992); M. Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094-98 (1992))。この遺伝子送達システムは、異なるリガンドの使用を通して多くの細胞型へのターゲティング送達が可能であることが示されている(R. J. Cristiano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11548-52 (1993))。例えば、リポフェクションおよびマラリアスポロゾイト周囲タンパク質が遺伝子の肝臓特異的送達に使用されてきた（Z. Ding et al., J. Biol. Chem. 270:3667-76 (1995)）。
【０１９０】
本発明の発現ベクターの好ましい投与経路は、肝臓内、静脈内、および動脈内投与である。しかしながら、例えば、経腸（例えば、経口）、筋肉内、腹腔内などの肝臓ターゲティングを可能にする他の投与経路も使用することができる。
【０１９１】
本発明の発現ベクターは、肝臓への直接注射、門脈注射または尾静脈注射などの当技術分野で認められている任意の手段によって、肝臓に直接導入することができる。
【０１９２】
本発明の発現ベクターは、（１）哺乳動物の動脈にアクセス部位を作成し、（２）ガイドワイヤーを動脈に導入し、（３）ガイドワイヤーに沿わせてシースを動脈に導入し、（４）シースを通してカテーテルを肝臓へと前進させ、（５）例えばｒＡＡＶビリオンなどの発現ベクターを、カテーテルを通して肝臓に注入し、（６）カテーテルおよびシースを動脈から取り除き、さらに（７）アクセス部位を修復することによって、送達することができる。カテーテルは、適切な静脈または動脈を通して標的器官に導入することができます。例えば、肝臓には、門脈または肝動脈のいずれかを介してアクセスすることができる。セルディンガー法などの当技術分野で知られている技法を使用して、適切な静脈または動脈にアクセスすることができる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるConahan et al., (1977) JAMA 237:446-447を参照されたい。静脈または動脈にアクセスする他の方法も知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９４４，６９５号を参照されたい。
【０１９３】
いくつかの他の実施形態では、肝臓に血液を送達する、または肝臓から血液を排出する血管の１つまたは複数を閉塞することが行われる。閉塞デバイスは、例えば、カテーテルの先端に取り付けられたバルーンであってよい。発現ベクターが無血的肝灌流法により送達されるように肝臓に出入りするすべての動脈および静脈を閉塞させ、それにより、正常な血流を肝臓から排除した後に肝臓を選択的に灌流させる。これは、肝動脈、門脈、肝上大静脈、右副腎静脈、および肝下大静脈をクランプして、全肝血行遮断を達成することによって成し遂げることができる。次に適切なゲージのカテーテルで門脈にカニューレを挿入し、肝下大静脈の前壁を切開し、吸引カニューレを大静脈に挿入して流出物を収集する。次に、肝臓灌流、好ましくはシングルパス灌流を、ポンプを使用して行う。流速は、肝臓１グラムあたり０．１ｍｌ／分〜肝臓１グラムあたり１０ｍｌ／分の範囲であってよい。肝臓１グラムあたり１ｍｌ／分の速度が好ましく、器官の十分な灌流を確保するために高めてもよい。灌流後、門脈と大静脈の切開を縫合し、肝臓の血行再建を行う。Cardoso, et al., Human Gene Therapy 4:411-418 at 412 (1993) 。
【０１９４】
他の実施形態では、発現ベクターは、肝動脈への注射によって肝臓に送達される。
【０１９５】
肝臓器官において、実質細胞には、肝細胞、クッパー細胞、ならびに胆道および細胆管を裏打ちする上皮細胞が含まれる。肝実質の主要な構成要素は、多面体の肝細胞（別名肝実質細胞）であり、少なくとも１つの側面が肝類洞に提示され、また側面が胆管に隣接している。実質細胞ではない肝細胞には、内皮細胞または線維芽細胞などの血管内の細胞が含まれる。
【０１９６】
肝臓において、肝静脈は通常、血液を肝臓から下大静脈に運び出すため、輸出血管である。また、肝臓では、門脈および肝動脈は、通常、肝臓に向かって血液を運ぶため、肝臓に対して輸入血管である。
【０１９７】
肝血管には、消化管やその他の内臓（脾臓、膵臓、胆嚢など）から肝臓へと血液を運ぶ門脈系が含まれる。別の肝血管は肝静脈である。肝静脈は、下大静脈または最終的に肝臓につながる別の血管を介して到達することもできる。針またはカテーテルを使用して、ポリヌクレオチドを血管系に注入することができる。注入は、切開および組織血管の可視化の後、直接観察下で行うことができる。あるいは、カテーテルを離れた場所に挿入し、それが標的組織と接続する血管系に留まるように通すこともできる。いくつかの実施形態では、大静脈への深部注入が行われる。別の実施形態では、注入は、無傷の皮膚を横断して、標的組織に供給または標的組織から排出する血管に入る針を使用することによって実行することができる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、送達は次のように行われる。肝臓および門脈を腹側正中切開により視覚化する。凝固を防ぐためのヘパリンを含むさまざまな溶液１ｍｌ中のベクター／リポソーム／裸のＤＮＡを、針を使用して約３０秒かけて門脈に注入する。
【０１９９】
ＤＮａｓｅ活性を有する酵素の肝臓送達、発現および分泌の効率は、例えば、免疫学的アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）などの酵素を認識する抗体を用いたアッセイ（米国、カリフォルニア州サンファンキャピストラーノのＮｉｃｈｏｌｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨＧＨ−ＴＧＥＳ１００Ｔキット））を使用して、血液（例えば、眼窩後静脈洞から得られた血液）中の酵素レベルを測定することにより決定することができる。実験動物モデルでは、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素の肝臓への送達、発現、分泌の効率は、例えば、頸椎脱臼によって動物を屠殺し、肝臓（平均重量１．５ｇ）を、２つの中葉（内側葉）、２つの外側左葉、外側右葉、および尾側葉＋外側右葉の小片で構成される６つのセクションに分ける。６つのセクションをそれぞれ、ホモジナイズバッファー中に個別に入れてよい。ホモジネートを遠心分離し、上清を外来遺伝子産物（すなわち、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素）について分析することができる。肝臓注射は、肝静脈の下大静脈への入口の近位と遠位の２か所でクランプされた下大静脈に向けることができる。具体的には、下流の下大静脈クランプを横隔膜と肝静脈の入口点との間に配置することができる。上流の下大静脈クランプは、腎静脈の入口点のすぐ上流に配置することができる。腎静脈などの他の器官の静脈がこの場所で下大静脈に入るため、注射液のすべてが肝臓に入るわけではない。下大静脈に逆行性注射を受ける一部の動物では、肝動脈、腸間膜動脈、および門脈をクランプ（閉塞）することができる。
【０２００】
アデノ随伴ウイルスベクターを含むパルボウイルスベクター
特定の実施形態では、本発明で使用されるベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのパルボウイルスベクターである。本明細書で使用される「パルボウイルス」という用語は、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む、パルボウイルス科を包含する。自律性パルボウイルスには、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、およびコントラウイルス属のメンバーが含まれる。自律性パルボウイルスには、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、鶏パルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、マスコビーダックパルボウイルス、Ｂ  １９ウイルス、およびその他の現在知られているかまたは後に発見される自律性パルボウイルスが含まれるが、これらに限定されない。他の自律性パルボウイルスは当業者に知られている。例えば、Bernard N. Fields et al., Virology, Vol. 2, Chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、パルボウイルスベクターは、ＡＡＶベクターなどの一本鎖パルボウイルスベクターである。ＡＡＶ（ディペンドウイルス属）は通常、ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、および６）もしくは霊長類（例えば、血清型１および４）、または他の温血動物（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジのＡＡＶ）に感染する。パルボウイルスおよびパルボウイルス科の他のメンバーに関するさらなる情報は、例えば、Kenneth I. Berns, “Parvoviridae: The Viruses and Their Replication,” Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)に提供されている。
【０２０２】
本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、血清型の組合せ（例えば、「シュードタイプ」ＡＡＶ）を含む任意のＡＡＶ血清型、あるいは様々なゲノム（例えば、一本鎖または自己相補的）に由来し得る。「血清型」は伝統的に、あるウイルスを別のウイルスと比較して抗体間に交差反応性がないことに基づいて決定される。そのような交差反応性の違いは、通常、カプシドタンパク質配列／抗原決定基の違いによるものである（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３配列の違いによる）。本発明のＡＡＶ発現ベクターを開発するために使用することができるＡＡＶ血清型の非限定的な例には、例えば、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０（例えば、米国特許第９，７９０，４７２号、国際公開第２０１７１８０８５７号および国際公開第２０１７／１８０８６１号に開示される）、ＡＡＶＬＫ０３（例えば、Wang et al., Mol. Ther., 2015, 23(12):1877-1887に開示される）、ＡＡＶｈｕ３７（例えば、国際公開第２０１７１８０８５７号に開示される）、ＡＡＶｒｈ６４Ｒｌ（例えば、国際公開第２０１７１８０８５７号に開示される）、Ａｎｃ８０（血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９の予測祖先に基づく；Zinn et al., Cell Rep., 2015, 12(67): 1056-1068を参照）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在知られている、または後で発見されるその他のＡＡＶが含まれる。例えば、Fields et al., Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。
【０２０３】
最近、多くの推定上の新規なＡＡＶ血清型およびクレードが同定された（例えば、Gao et al., (2004) J. Virology 78:6381-6388; Moris et al., (2004) Virology 33-:375-383を参照）。ＡＡＶおよび自律性パルボウイルスの様々な血清型のゲノム配列、ならびに末端反復、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られており、例えば、Srivistava et al., (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al., (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et a1, (1999) J. Virology 73:1309; Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al., (1996) Virology 221: 208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al., (2004) Virology 33-: 375-383; ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＡＦ０８５７１６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＮＣ００６１５２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｙ１８０６５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＮＣ００６２６０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＮＣ＿００６２６１；国際公開第００／２８０６１号、国際公開第９９／６１６０１号、国際公開第９８／１１２４４号；および米国特許第６，１５６，３０３号に開示され、それらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を教示すために、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
すべての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は非常に似ている。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直線状の１本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質と構造（ＶＰ）タンパク質のユニークなコーディングヌクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）はカプシドを形成する。末端の１４５ヌクレオチドは自己相補的であり、Ｔ型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖が形成されるように編成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして働く。哺乳動物細胞におけるｗｔＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（すなわちＲｅｐ７８とＲｅｐ５２）がそれぞれ、Ｐ５プロモーターとＰ１９プロモーターから発現され、両方のＲｅｐタンパク質がウイルスゲノムの複製に機能を有する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、少なくとも１つのパルボウイルスまたはＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）により隣接される１つまたは複数の目的ヌクレオチド配列を含む。このようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ  ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現しているパッケージ細胞で産生される場合、複製されおよびウイルス粒子にパッケージされる。本明細書で使用する「ＡＡＶ  Ｃａｐタンパク質」または「ＡＡＶ  カプシドタンパク質」という用語は、天然のＡＡＶ  Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の機能的活性の例には、カプシドの形成を誘導する、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進する、カプシドへのＡＡＶ  ＤＮＡのパッケージング（すなわち、カプシド形成）を促進する、細胞受容体に結合する、およびビリオンの宿主細胞への侵入を促進する能力が含まれる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、所望のタンパク質またはタンパク質バリアントを含むことができる。本明細書で使用される「バリアント」は、１つまたは複数のアミノ酸によって改変されたアミノ酸配列を指す。バリアントは、例えばロイシンのイソロイシンによる置換のような、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する「保存的」変化を有することができる。よりまれに、バリアントは、例えばグリシンのトリプトファンによる置換のような、「非保存的」変化を有する場合がある。類似の些細な変更には、アミノ酸の削除または挿入、あるいはその両方が含まれ得る。
【０２０７】
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスカプシドにパッケージングされる。ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質の配列は、特定のＡＡＶベクターの多数の特徴を規定する。例えば、カプシドタンパク質は、カプシドの構造および集合（assembly）、ＲｅｐやＡＡＰタンパク質などのＡＡＶ非構造タンパク質との相互作用、宿主の体液や細胞外マトリックスとの相互作用、血液からのウイルスのクリアランス、血管透過性、抗原性、中和抗体に対する反応性、組織／器官／細胞型指向性、細胞付着性および内在化の効率、細胞内輸送経路、ビリオンの脱殻率などに影響する。カプシドタンパク質（例えば、ＶＰ３）の配列を改変して、肝臓への送達を増強することができる。
【０２０８】
ＡＡＶ構築物は、上記のポリヌクレオチド配列をパッケージングする１つまたは複数のカプシドタンパク質（ＶＰ１および／またはＶＰ２、および／またはＶＰ３カプシドタンパク質、好ましくはＶＰ３カプシドタンパク質のみ）をコードする配列をさらに含むことができる。本発明の文脈で使用するためのカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０などの既知の４２血清型のいずれか、あるいは例えば、カプシドシャッフリング技術および／またはＡＡＶカプシドライブラリーの使用によって得られる新しく開発されたＡＡＶ様粒子から取得することができる。カプシドタンパク質配列のいくつかの非限定的な例については、例えば、米国特許第９，７９０，４７２号；同第９，６７７，０８９号；同第７，２８２，１９９号；国際公開第２０１５／０５４６５３号、国際公開第２０１７／１８０８５７号（ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１）、国際公開第２０１７／１８０８６１号（ＡＡＶｒｈ１０）、国際公開第２０１７／１８０８５４号（ＡＡＶ８変異体）、およびWang et al., Mol. Ther., 2015, 23(12):1877-1887（ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶＬＫ０３）を参照されたい。国際公開第００／２８００４号およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されるように、カプシドタンパク質をコードする配列がＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来する場合、そのＡＡＶ構築物は「ハイブリッド」パルボウイルスゲノムとして知られている（すなわち、ＡＡＶカプシドとＡＡＶ末端反復配列は異なるＡＡＶに由来する）。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、肝臓へのＡＡＶベクターの効率的なターゲティングを媒介する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、肝臓へのＡＡＶベクターの優先的ターゲティングを媒介する。一部のカプシドタンパク質（例えば、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３ＢのＶＰ３）は、天然において肝臓特異的である。本発明はまた、肝臓ターゲティングおよび／または肝臓特異性を増強するＡＡＶカプシド変異体の使用も包含する。ＡＡＶ８カプシド配列に対するそのような点突然変異の非限定的な例には、例えば、Ｓ２７９Ａ、Ｓ６７１Ａ、Ｋ１３７Ｒ、およびＴ２５２Ａ、ならびに国際公開第２０１７／１８０８５４号に開示されているＡＡＶ８カプシド突然変異（例えば、ＡＡＶ３Ｇ１、ＡＡＶＴ２０またはＡＡＶＴＲ１、アミノ酸２６３−２６７［例えば、２６３ＮＧＴＳＧ２６７−＞ＳＧＴＨまたは２６３ＮＧＴＳＧ２６７−＞ＳＤＴＨ］および／またはアミノ酸４５７−４５９［例えば、４５７ＴＡＮ４５９−＞ＳＲＰ］、および／またはアミノ酸４５５−４５９［例えば、４５５ＧＧＴＡＮ４５９−＞ＤＧＳＧＬ］および／またはアミノ酸５８３−５９７におけるＶＰ３突然変異）が含まれる。
【０２１０】
本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、例えばＤＮａｓｅ  ＩなどのＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする核酸を含む。様々な態様において、核酸はまた、コードされる酵素の発現および分泌を可能にする１つまたは複数の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列、分泌シグナル配列なども含むことができる。したがって、いくつかの実施形態では、核酸は、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター領域を含み、トランスフェクトされた細胞における目的タンパク質の発現を引き起こすまたは改善することができる。そのようなプロモーターは、例えば、肝臓におけるタンパク質の効率的かつ安定した産生を可能にするために、ユビキタス（遍在性）、細胞または組織特異的、強い、弱い、調節された、またはキメラなどであってよい。プロモーターは、コードされるタンパク質に対して同種であっても異種であってもよいが、一般に、記載の方法で使用されるプロモーターは、ヒト細胞において機能的である。制御されたプロモーターの例には、限定されないが、Ｔｅｔ  ｏｎ／ｏｆｆエレメント含有プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが含まれる。使用され得る他のプロモーターには、例えば肝臓に対して組織特異的であるプロモーターが含まれる。肝臓特異的プロモーターの非限定的な例には、例えば、アルブミンプロモーター（Ａｌｂ）、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、アポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域プロモーター、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ（ＡＰＯＡ２）プロモーター、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）（ｈＡＡＴ）プロモーター、チトクロームＰ４５０ファミリー３、サブファミリーＡポリペプチド４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １２２（ｍｉＲ−ｌ２２）プロモーター、肝臓特異的ＩＧＦ−ＩＩプロモーターＰｌ、マウストランスサイレチン（ＭＴＴＲ）プロモーター、およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターが含まれる。ユビキタス(遍在性)プロモーターの非限定的な例には、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびにホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＣＭＶＥ／ＣＡＧプロモーターシステム、およびβ−アクチンプロモーターなどの細胞プロモーターが含まれる。
【０２１１】
本発明のＡＡＶ構築物はまた、非解離可能(non-resolvable)な末端反復を含むことができる。本明細書で使用される表現「非解離可能な末端反復」は、末端反復の解離が実質的に低減される（例えば、解離可能な末端反復と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上）または排除されるように、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって認識および解離されない（すなわち、「ニック」を入れられない）末端反復に関する。そのような非解離可能な末端反復は、天然に存在する末端反復配列（その改変形態を含む）であってよく、例えば、ＡＡＶを含むパルボウイルスに由来することができ、または別のウイルスに由来してもよく、あるいはさらなる代替として、部分的または完全に合成であってもよい。非解離可能な末端反復は、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって認識されない非ＡＡＶウイルス配列であってよく、あるいはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって認識されなくなるように（例えば、挿入、置換、および／または欠失によって）改変されたＡＡＶ末端反復でもよい。さらに、非解離可能な末端反復は、ウイルスベクターを産生するために使用される条件下で非解離可能な任意の末端反復であってよい。さらに、ＡＡＶ末端反復を、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質による解離が実質的に低減または排除されるように改変することができる。非解離可能な末端反復は、ヘアピン構造を形成してＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によってニックを入れることができない任意の逆方向反復配列であってよい。
【０２１２】
逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、典型的にはＡＡＶベクター中に少なくとも２コピーで存在し、典型的にはＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットに隣接する。ＩＴＲは、典型的には、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の５’および３’末端にあるが、それらに隣接する必要はない。ＩＴＲは互いに同じでも異なっていてもよい。「末端反復」という用語は、ヘアピン構造を形成して逆方向末端反復として機能する任意のウイルス末端反復および／または部分または完全合成配列を含み、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載の「二重Ｄ配列」含まれる。「ＡＡＶ末端反復」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、Ａｎｃ８０、あるいは現在既知のまたは後で発見される任意の他のＡＡＶを含むがこれに限定されない任意のＡＡＶからのものであってよい。末端反復が、例えば複製、ニッキング、ウイルスのパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスのレスキューなどの目的機能を媒介する限り、ＡＡＶ末端反復は野生型配列を有する必要はない（例えば、野生型配列を、挿入、欠失、トランケーション、またはミスセンス変異によって改変することができる）。ベクター構築物は、１つまたは複数（例えば、２つ）のＡＡＶ末端反復を含むことができ、それらは同じであっても異なっていてもよい。さらに、１つまたは複数のＡＡＶ末端反復は、ＡＡＶカプシドと同じＡＡＶ血清型に由来しても、または異なっていてもよい。特定の実施形態では、ベクター構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、および／またはＡｎｃ８０末端反復を含む。
【０２１３】
パルボウイルスのＩＴＲヌクレオチド配列は、典型的にはパリンドローム（回文）配列であり、「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」領域とも呼ばれるほぼ相補的で対称的に配置された配列を含む。ＩＴＲは、複製起点、つまり複製において「シス」の役割を有する部位、すなわち、例えばパリンドロームおよびパリンドローム内部の特定配列を認識するＲｅｐ  ７８（またはＲｅｐ  ６８）などのトランス作用性複製タンパク質の認識部位として機能する。ＩＴＲ配列の対称性の１つの例外は、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。この領域は独特である（１つのＩＴＲ内に相補鎖がない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングは、Ａ領域とＤ領域の間の接合部で生じる。これは新しいＤＮＡ合成が始まる領域である。Ｄ領域は通常、パリンドローム配列の片側に位置し、核酸複製ステップに方向性を提供する。哺乳動物細胞で複製するパルボウイルスは、典型的には２つのＩＴＲ配列を有する。ただし、結合部位がＡ領域の両方の鎖にありかつＤ領域がパリンドローム配列のそれぞれの側に１つずつ対称的に配置されるように、ＩＴＲを操作することが可能である。二本鎖環状ＤＮＡテンプレート（プラスミドなど）上で、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８支援核酸複製が両方向に進行し、環状ベクターのパルボウイルス複製には単一のＩＴＲで十分である。したがって、１つのＩＴＲヌクレオチド配列を本発明の文脈において使用することができる。２つまたは別の偶数の通常のＩＴＲを使用できる。
【０２１４】
機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー、およびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、野生型の配列であってよく、あるいは野生型の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有していてよい。ＩＴＲ配列は、それが機能的である限り、例えばヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失または置換によって改変されてもよい。この文脈において、機能性とは、ゲノムのカプシド殻へのパッケージングを指示し、次いで形質導入される宿主細胞または標的細胞での発現を可能にする能力を指す。
【０２１５】
ＡＡＶベクターは、一本鎖または二本鎖（自己相補的）ＤＮＡを含むことができる。一本鎖核酸分子は、センスまたはアンチセンス鎖のいずれでもよく、これは両方が正反対で等しく遺伝子発現が可能なためである。ＡＡＶベクターは、例えば抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）をコードする遺伝子、あるいは当該技術分野で既知である化学的、酵素的もしくはその他の方法で検出可能および／または選択可能な産物（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）をコードする遺伝子など、マーカーまたはレポーター遺伝子をさらに含むことができる。
【０２１６】
ＡＡＶ発現ベクターは、形質導入された細胞からのＤＮａｓｅ活性を有するコードされた酵素の分泌を可能にする分泌シグナル配列を含み得る核酸を含むことができる。そのような分泌シグナル配列の非限定的な例には、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ分泌シグナル配列、ＩＬ２分泌シグナル配列、アルブミン分泌シグナル配列、β−グルクロニダーゼ分泌シグナル配列、アルカリプロテアーゼ分泌シグナル配列、およびフィブロネクチン分泌シグナル配列が含まれる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ８ベースまたはＡｎｃ８０ベースのベクターが発現ベクターとして使用される。ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０ベクターは、肝臓ターゲティングおよび発現に特に適している。例えば、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０の両方のベクターは、ＡＡＶ２ベクターと比較してより高い効率で肝細胞をトランスフェクトすることができる。ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０は、他のＡＡＶベクターの一部よりも少ない量の中和抗体を誘導する。
【０２１８】
ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチドを含むＡＡＶ８ベクターまたはＡｎｃ８０ベクターは、肝臓細胞をトランスフェクトしかつＤＮａｓｅ活性を有するコードされた酵素の効果的な産生ならびに内皮周囲腔およびディッセ腔でのその分泌を媒介するのに有効なＡＡＶ８またはＡｎｃ８０ベクターを用いて、肝臓内に（例えば、直接臓器注射を介して）または全身的に（例えば静脈内注射によって）、投与することができる。いくつかの実施形態では、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質（例えば、配列番号３または配列番号９の配列を含むＡｎｃ８０  ＶＰ１カプシドタンパク質、あるいは配列番号３４の配列を含むＡｎｃ８０Ｌ６５  ＶＰ１カプシドタンパク質、あるいは配列番号３５の配列を含むバリアントＡｎｃ８０Ｌ６５  ＶＰ１カプシドタンパク質）が、発現ベクターのヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ８カプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ８  ＶＰ１またはＡＡＶ８  ＶＰ３）が、発現ベクターのヌクレオチド配列によってコードされる。本発明のＡＡＶベクターの末梢投与は、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、および動脈内注射などの全身注射を含んでいてよい。
【０２１９】
本発明のＤＮａｓｅ酵素をコードするＡＡＶベクターの所望の用量は、例えば、病状、対象、治療スケジュールなどに応じて、当業者が容易に適合させることができる。いくつかの実施形態では、１回（用量）あたり１０５〜１０１４の組換えウイルス粒子が投与され、例えば、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、または１０８〜１０１４である。他の実施形態では、治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１、あるいはそれ以上の組換えウイルス粒子の力価を含むことができる。
【０２２０】
外因性ターゲティング配列が、主要なカプシドサブユニット（例えば、ＶＰ３）の一部または全部を置き換えまたは置換してもよい。さらなる代替として、２つ以上の外因性ターゲティング配列、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の配列を、ビリオンカプシドに導入してもよい。代替の実施形態では、マイナーカプシドサブユニット（例えば、ＶＰ１およびＶＰ２）内に挿入および置換を行ってもよい。ＡＡＶカプシドの場合、ＶＰ２またはＶＰ３で挿入または置換を行うことができる。
【０２２１】
天然ビリオンの指向性を、アミノ酸配列の挿入または置換によって低減または排除することができる。あるいは、外因性アミノ酸配列の挿入または置換により、ビリオンを特定の細胞型に標的化することができる。外因性ターゲティング配列は、ビリオンの指向性を変化させるタンパク質またはペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であってよい。特定の実施形態では、ターゲティングペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するか、あるいは完全にまたは部分的に合成されたものでもよい。例示的なペプチドおよびタンパク質にはリガンドが含まれ、肝臓細胞に存在する細胞表面受容体に結合する他のペプチドには、アポリポタンパク質ＥのＳｒ−Ｂ１受容体に結合できるリガンド、ガラクトースおよびラクトース特異的レクチン、低密度リポタンパク質受容体リガンド、アシアロ糖タンパク質（ガラクトース末端）リガンドなどが含まれる。
【０２２２】
あるいは、外因性ターゲティング配列は、抗体またはその抗原認識部分であってもよい。本明細書で使用される「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含むすべてのタイプの免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヒトを含む任意の起源の種であってよく、またはキメラ抗体であってもよい。また、「抗体」という用語には、当業者に知られている二重特異性または「架橋」抗体も含まれる。本発明の範囲内の抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｃ断片、ならびにＩｇＧ以外の抗体から得られる対応断片が含まれる。そのような断片は、既知の技術によって作成することができる。ビリオンカプシドに挿入される外因性アミノ酸配列は、ビリオンの精製または検出を容易にするものであってよい。例えば、外因性アミノ酸配列は、当業者に知られているように、ニッケルカラムでビリオンを精製するために有用なポリヒスチジン配列、または標準的な免疫精製技術によってビリオンを精製するために使用できる抗原ペプチドまたはタンパク質を含むことができる。あるいは、アミノ酸配列は、受容体リガンド、あるいはアフィニティー精製または当該技術分野で既知のその他の技術（例えば、異なるサイズ、密度、電荷、または等電点に基づく精製技術、イオン交換クロマトグラフィー、またはペプチドクロマトグラフィー）によって修飾ビリオンを精製するために使用できるその他のペプチドまたはタンパク質をコードしてもよい。
【０２２３】
あるいは、外因性ターゲティング配列は、抗体またはその抗原認識部分であってもよい。本明細書で使用される「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含むすべてのタイプの免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヒトを含む任意の起源の種であってよく、またはキメラ抗体であってもよい。また、「抗体」という用語には、当業者に知られている二重特異性または「架橋」抗体も含まれる。本発明の範囲内の抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｃ断片、ならびにＩｇＧ以外の抗体から得られる対応断片が含まれる。そのような断片は、既知の技術によって作成することができる。
【０２２４】
ビリオンカプシドに挿入される外因性アミノ酸配列は、ビリオンの精製または検出を容易にするものであってよい。本発明のこの態様によれば、外因性アミノ酸配列が改変パルボウイルスのビリオンも変化させる必要はない。例えば、外因性アミノ酸配列は、当業者に知られているように、ニッケルカラム上でビリオンを精製するために有用なポリヒスチジン配列、または標準的な免疫精製技術によってビリオンを精製するために使用できる抗原ペプチドまたはタンパク質を含むことができる。あるいは、アミノ酸配列は、受容体リガンド、あるいはアフィニティー精製または当該技術分野で既知のその他の技術（例えば、異なるサイズ、密度、電荷、または等電点に基づく精製技術、イオン交換クロマトグラフィー、またはペプチドクロマトグラフィー）によって修飾ビリオンを精製するために使用できるその他のペプチドまたはタンパク質をコードしてもよい。
【０２２５】
アデノウイルスベクター
アデノウイルスゲノムは、複数の重度にスプライシングされた転写物を含む３６Ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡである。ゲノムの両端には逆方向末端反復（ＩＴＲ）がある。遺伝子は初期（Ｅ１−Ｅ４）と後期（Ｌ１−Ｌ５）の転写産物に分けられる。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、２つの遺伝子：Ｅ１およびＥ３（ｄＥ１／Ｅ３）が欠失している。Ｅ１の欠失は、ウイルスベクターを複製欠損にする。Ｅ１は、アデノウイルスパッケージング細胞株（例えば、Ｔ２９３または９１１）によって供給され得る。Ｅ３は宿主免疫の回避に関与しており、ウイルス産生に必須ではない。Ｅ１およびＥ３の欠失は、＞８Ｋｂの導入遺伝子パッケージング容量をもたらす。いくつかの実施形態では、構築物は、導入遺伝子のアデノウイルスプラスミドへの相同組換えを促進するために左および右アームを含む。
【０２２７】
例えば、Ａｄ５に基づくアデノウイルスベクターのような、受け入れられているヒトアデノウイルスタイプのいずれかを使用することができる。Ａｄ５ベースのベクターは、コクサッキー・アデノウイルス受容体（Coxsackie-Adenovirus Receptor）（ＣＡＲ）を使用して細胞に入る。いくつかの実施形態では、ヒトアデノウイルス５型（ｄＥ１／Ｅ３）がベクターとして使用される。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子に置き換わるように操作される；その後、欠失遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において複製欠損ベクターを増殖させる。アデノウイルスベクターは、肝臓で見られる非分裂分化細胞などの非分裂分化細胞を含む、多様なタイプの組織にｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは大きな運搬容量を有する。臨床試験でのＡｄベクターの使用例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法に関連していた（terman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加の例には、Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)が含まれる。
【０２２８】
Ｂ型肝炎ウイルスベクターおよび他の肝臓指向性ベクター
いくつかの実施形態において、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素の肝臓特異的送達および発現は、天然において肝細胞を標的とするウイルスベクターの使用によって達成することができる。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）または他のヘパドナウイルス科のウイルスなどの肝臓指向性ウイルスに由来するベクターは、循環を介して投与し、野生型ウイルスと同じ受容体を使用して肝細胞を標的とすることができる。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、顕著な宿主および組織特異性を有する小さなエンベロープＤＮＡウイルスのファミリーであるヘパドナウイルス科のプロトタイプである（Ｇａｎｅｍ，１９９６）。ヘパドナウイルスは、ヒト（ＨＢＶ）、ウッドチャック（ＷＨＶ）、およびジリス（ＧＳＨＶ）などの哺乳類や、北京ダック（ＤＨＢＶ）およびアオサギ（ＨＨＢＶ）などの鳥類で発見されている。
【０２２９】
本発明の一実施形態では、ＨＢＶベクターは、ウイルスゲノム複製に必須のすべてのシス作用性エレメントを保持する。しかしながら、本発明は、マップ上の指定された位置に、２つの新規のシス作用性エレメント（すなわち、αエレメントおよびβエレメント）の位置を制限しない。一実施形態では、パッケージングサイズの制限を超えることなくより大きな挿入に適応するために、ベクター機能を損なうことなく新規のシス作用性エレメントの位置を変更することができると考えられる。
【０２３０】
この方法の一実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする配列が、ＨＢＶベクターのαエレメントとＤＲ２の間に挿入される。この方法の別の実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする配列が、ＨＢＶベクターの５’イプシロン（ε）構造とαエレメントとの間に挿入されることが企図される。
【０２３１】
裸のＤＮＡの送達
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする配列を含む発現ベクターは、裸のＤＮＡとして対象に投与される。そのような裸のＤＮＡは、例えば、遠位または近位の地点で肝臓血管に送達することができる。
【０２３２】
エンベロープウイルスベクター
本発明の様々な実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする核酸の肝臓送達のために、エンベロープウイルス粒子を使用することができる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルス粒子は、レトロウイルス科のウイルスに由来する。特定の一実施形態では、本明細書に記載のウイルス粒子はレトロウイルス粒子である。別の特定の実施形態では、本明細書に記載のウイルス粒子はレンチウイルス粒子である。レンチウイルスおよびレトロウイルスベクターは、他の遺伝子導入システムと比較して、さまざまな種類の細胞を形質導入する能力、導入された遺伝物質を標的宿主細胞のゲノムに安定して組み込む能力、形質導入された遺伝子を有意なレベルで発現する能力など、幅広い利点を提供する。ガンマレトロウイルス属、例えばマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来するベクターは、遺伝子治療の臨床試験で使用されている（Ross et al., Hum. Gen Ther. 7:1781-1790, 1996）。
【０２３４】
１つの特定の実施形態では、目的のヌクレオチドに関連する少なくとも１つのウイルスエレメントは、レトロウイルスエレメントである。別の特定の実施形態では、目的のヌクレオチドに関連する少なくとも１つのウイルスエレメントはレンチウイルスエレメントである。１つの特定の実施形態では、目的のヌクレオチドに関連する少なくとも１つのウイルスエレメントは、Ｐｓｉ（ψ）パッケージングシグナルである。
【０２３５】
１つの特定の実施形態では、レンチウイルス粒子は、ｇｐ１２０表面エンベロープタンパク質および／またはｇｐ４１膜貫通エンベロープタンパク質を含まない。別の特定の実施形態では、レンチウイルス粒子は、変異ｇｐ１２０表面エンベロープタンパク質および／または変異ｇｐ４１膜貫通エンベロープタンパク質を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウイルス粒子は複製欠損であり、それらが由来するウイルスの不完全なゲノムのみを含む。例えば、いくつかの実施形態では、レンチウイルスおよびレトロウイルス粒子は、ｇａｇ、ｅｎｖ、またはｐｏｌ遺伝子（ウイルス粒子のアセンブリに関与する可能性がある）の遺伝情報を含まず、これはレンチウイルスまたはレトロウイルスの複製の成功のための既知の最小必要要件である。これらの場合、ベクター粒子を組み立てるために必要なウイルスタンパク質の最小セットは、パッケージング細胞株によってトランスで提供される。特定の一実施形態では、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆ遺伝子は、ＨＩＶ−１に由来するレンチウイルス粒子に欠けており、トランスで提供されるか、あるいはフレームシフト突然変異の使用により不活性化される。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、レンチウイルスまたはレトロウイルス粒子に組み込まれた（ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする）ＲＮＡ分子は、ｐｓｉパッケージングシグナルおよびＬＴＲを含む。肝臓細胞でのＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために、そのような配列は通常、ユビキタスプロモーターの制御下に置かれ、ユビキタスプロモーターの非限定的な例には、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびにホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＣＭＶＥ／ＣＡＧプロモーターシステム、およびβ−アクチンプロモーターなどの細胞プロモーターが含まれる。
【０２３８】
レンチウイルスおよびレトロウイルス粒子のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、パッケージング細胞株によってトランスで提供されるｇａｇおよびｐｏｌがコードするタンパク質と一緒に、ベクター粒子に組み立てられ、それがその後で細胞に感染し、プロモーターの制御下でＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を逆転写し、前記遺伝情報を標的細胞のゲノムに組み込むか、またはエピソームのままでいる（組込み（integration）に必要な１つまたは複数の成分が破壊されている場合）。形質導入されたＲＮＡ分子にｇａｇおよびｐｏｌがコードするタンパク質の遺伝情報が存在しない場合、ベクター粒子は複製欠損であり、すなわち、そのベクター粒子の新世代は形質導入された細胞によって生成されないため、臨床応用における安全性が確保される。
【０２３９】
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のウイルスエレメントは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）成分、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）成分、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）成分し、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）成分、馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）成分、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）成分、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）成分、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）成分、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）成分、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）成分、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）成分、ネコ肉腫ウイルス成分、トリ細網内皮症ウイルス成分、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）成分、および／またはビスナ・マエディ（Ｖｉｓｎａ−Ｍａｅｄｉ）ウイルス（ＶＭＶ）成分をコードする。
【０２４０】
本明細書に記載されるウイルス粒子と共に、本明細書に記載されるのは、細胞を検出および／または単離するための方法である。いくつかの実施形態では、そのような方法は、例えば、選択化合物曝露または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を利用して標的細胞を選択できるようにする関心ヌクレオチド配列として、選択可能なマーカー（例えば、ネオマイシン耐性）および／またはレポーター（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）を含む、ウイルス粒子を使用する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来する。ＭＬＶをコードするレトロウイルスベクターは、ＰＩＮＣＯ（Grignani et al., 1998）またはｐＢａｂｅベクターシリーズ（Morgenstern and Land, 1990）など、当業者に広く利用可能である。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレンチウイルス粒子は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレンチウイルスに由来する。ＨＩＶおよび他の有用なウイルスをコードする適切なベクターは、当業者が容易に同定および／または調製することができる。
【０２４３】
特定の一実施形態では、トランスファーベクターは：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター配列；ＨＩＶ５’ＬＴＲのＲおよびＵ５配列；ＨＩＶ−１フラップ（ｆｌａｐ）シグナル；内部エンハンサー；内部プロモーター；目的のヌクレオチド配列；ウッドチャック肝炎ウイルス応答エレメント；ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列；エンハンサー配列が欠失されたＵ３エレメント；鶏β−グロブリンインシュレーター；および３’ＨＩＶ  ＬＴＲのＲおよびＵ５配列を含む。
【０２４４】
本発明はまた、天然のエンベロープに挿入または置換された異種ターゲティング配列または分子を含むエンベロープウイルスベクターも企図する。異種ターゲティング配列または分子は、肝臓への指向性の変化をもたらか、またはベクターの肝臓送達の効率を高めることができる。
【０２４５】
ＤＮａｓｅ酵素をコードする発現ベクターを投与するための方法およびレジメン
本発明の方法において、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする核酸を含む発現ベクターを、一度にまたは一連の処置にわたり；１日あたり１回または数回、患者に投与することができる。
【０２４６】
投与される発現ベクターの有効量は患者によって異なる。したがって、有効量は、組成物を投与する医師によって最良に決定され、適切な投薬量は、当業者が容易に決定することができる。ベクターによりコードされるＤＮａｓｅ活性を有する酵素の血液（血清、血漿）または組織レベルの分析および投与前の初期レベルとの比較により、投与量が低すぎるか、正しい範囲内であるか高すぎるかを決定することができる。初回およびその後の投与に適したレジメンも変動するが、初回投与および必要に応じてそれに続く後続投与が典型的である。その後の投与は、毎日、毎週、毎月、毎年、数年ごとなど、さまざまな間隔で投与してよい。
【０２４７】
ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする発現ベクターの用量は、処置する状態の種類、これらの副作用の重症度と経過、患者の病歴、担当医師の裁量、ならびに例えば化学療法または放射線療法などの以前の処置およびＤＮａｓｅタンパク質療法に対する反応に依存する。いくつかの実施形態では、発現ベクターの有効量は、０．５〜１００ｍｇ／Ｌまたは１０００〜２０００００Ｋｕｎｉｔｚ  ｕｎｉｔｓ（ＫＵ）／Ｌ、０．５〜５０ｍｇ／Ｌまたは１０００〜１０００００Ｋｕｎｉｔｚ  ｕｎｉｔ（ＫＵ）／Ｌ、１．５〜５０ｍｇ／Ｌまたは３０００〜１０００００ＫＵ／Ｌ、１０〜５０ｍｇ／Ｌまたは２００００〜１０００００ＫＵ／Ｌの肝門脈におけるＤＮａｓｅタンパク質レベルをもたらす量である。
【０２４８】
本発明の方法による、ＤＮａｓｅ酵素をコードする発現ベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたはウイルスベクター）、および／またはＤＮａｓｅ酵素の投与は、例えば、静脈内、動脈内および肝臓内投与を含む、任意の適切な経路によって行うことができる。
【０２４９】
がんの処置
一態様では、がんを患っている対象におけるがんを処置または改善するための方法が提供され、その方法は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  ＩなどのＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）をコードする発現ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１に示される配列（分泌シグナル配列を含む野生型前駆体配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号２に示される配列（分泌シグナル配列を含み、さらにアクチン媒介阻害を弱める突然変異も含む前駆体変異配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号４に示される配列（分泌シグナル配列を含まない野生型成熟配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号５に示される配列（分泌シグナル配列を含まず、アクチン媒介阻害を弱める突然変異を含む成熟変異配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、肝臓特異的プロモーターまたは肝臓特異的エンハンサーエレメントの制御下で発現される。
【０２５０】
本発明の発現ベクターの投与量および投与方法は、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍成長速度の減少、転移速度の減少、化学療法および／または放射線療法の治療効果の増強、寿命の延長、がんまたは処置に関連する体重減少の割合の減少、または体重増加の割合の増加のうちの１つまたは複数により、がんを処置するのに有効でなければならない。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする発現ベクターの投与は、同じ酵素のタンパク質としての投与（例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、腹腔内、経腸）と組み合わせる（併用する）ことができる。酵素は、例えば、ＤＮａｓｅ酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）のいずれかであってよい。
【０２５２】
本発明のベクターを使用する処置の方法は、広範囲のがんに罹患している対象に使用することができる。本発明は、「門脈がん」を処置するために特に有用であり、そのようながんには、門脈へと流れ出る器官、組織および構造（図１を参照）に由来するかまたはそれらに転移した任意のがん腫、肉腫、黒色腫、またはリンパ腫を含む。門脈がんの非限定的な例には、例えば、がん性腹膜炎、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、胃がん、結腸がん、腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、脾臓がん、胆管のがん、胆嚢のがん、門脈へと流れ出ている組織の肉腫（例えば、管肉腫（angiosarcoma）、内皮肉腫、血管肉腫（hemangiosarcoma）、平滑筋肉腫、その他の肉腫、およびそのような組織の上皮がん）、ならびに任意の起源の肝転移性疾患が含まれる。
【０２５３】
本発明の方法によって処置することができる他のがんの非限定的な例には、例えば、乳がん、前立腺がん、多発性骨髄腫、移行上皮がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））、腎がん、甲状腺がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病）、頭頸部がん、食道がん、直腸がん、卵巣がん、子宮体がん（uterine endometrial cancer）、膣がん、子宮頸がん、膀胱がん、神経芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、悪性黒色腫、扁平上皮がん、骨がん（原発性骨がん（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、アダマンチノーマ、巨細胞腫、および脊索腫）、ならびに二次（転移性）骨がんの両方を含む）、軟部組織肉腫、基底細胞がん、管肉腫、血管肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨原性肉腫（osteogenic sarcoma）、管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、精巣がん、子宮がん、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭状がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、気管支原性がん、絨毛がん、精上皮腫、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、上皮がん、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫、髄様がん、胸腺腫、肉腫などが含まれる。
【０２５４】
併用がん治療では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする発現ベクター、例えばＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを、化学療法剤（または放射線療法）の前、一緒に、または後に投与することができる。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、患者、例えばがんの素因のリスクが高い患者のがんを予防するために使用される。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、がんの素因の検出のための血液ベースのＤＮＡスクリーニング試験（例えば、液体生検）からの陽性結果の後にがんを予防するために使用される。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腫瘍感受性遺伝子の評価の後にがんを予防するために使用される。腫瘍感受性遺伝子の例には、ＡＢＬ１（ＡＢＬ）、ＡＢＬ２（ＡＢＬＬ、ＡＲＧ）、ＡＫＡＰ１３（ＨＴ３１、ＬＢＣ．ＢＲＸ）、ＡＲＡＦ１、ＡＲＨＧＥＦ５（ＴＩＭ）、ＡＴＦ１、ＡＸＬ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ（ＢＲＡＦ１、ＲＡＦＢ１）、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２（ＦＡＮＣＤ１）、ＢＲＩＰ１、ＣＢＬ（ＣＢＬ２）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＳＦ−１、ＦＭＳ、ＭＣＳＦ）、ＤＡＰＫ１（ＤＡＰＫ）、ＤＥＫ（Ｄ６Ｓ２３１Ｅ）、ＤＵＳＰ６（ＭＫＰ３、ＰＹＳＴ１）、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ１）、ＥＲＢＢ３（ＨＥＲ３）、ＥＲＧ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＷＳＲ１（ＥＷＳ、ＥＳ、ＰＮＥ）、ＦＥＳ（ＦＰＳ）、ＦＧＦ４（ＨＳＴＦ１、ＫＦＧＦ）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１０Ｐ（ＦＯＰ）、ＦＬＣＮ、ＦＯＳ（ｃ−ｆｏｓ）、ＦＲＡＰ１、ＦＵＳ（ＴＬＳ）、ＨＲＡＳ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２、ＴＫＲ１、ＮＥＵ）、ＨＧＦ（ＳＦ）、ＩＲＦ４（ＬＳＩＲＦ、ＭＵＭ１）、ＪＵＮＢ、ＫＩＴ（ＳＣＦＲ）、ＫＲＡＳ２（ＲＡＳＫ２）、ＬＣＫ、ＬＣＯ、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２、ＣＯＴ、ＥＳＴ）、ＭＣＦ２（ＤＢＬ）、ＭＤＭ２、ＭＥＴ（ＨＧＦＲ、ＲＣＣＰ２）、ＭＬＨタイプの遺伝子、ＭＭＤ、ＭＯＳ（ＭＳＶ）、ＭＲＡＳ（ＲＲＡＳ３）、ＭＳＨタイプの遺伝子、ＭＹＢ（ＡＭＶ）、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１（ＬＭＹＣ）、ＭＹＣＮ、ＮＣＯＡ４（ＥＬＥ１、ＡＲＡ７０、ＰＴＣ３）、ＮＦ１タイプの遺伝子、ＮＭＹＣ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１（ＴＲＫ、ＴＲＫＡ）、ＮＵＰ２１４（ＣＡＮ、Ｄ９Ｓ４６Ｅ）、ＯＶＣ、ＴＰ５３（Ｐ５３）、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ３（ＨＵＰ２）、ＳＴＡＴ１、ＰＤＧＦＢ（ＳＩＳ）、ＰＩＭ遺伝子、ＰＭＬ（ＭＹＬ）、ＰＭＳ（ＰＭＳＬ）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ（ＷＩＰ１）、ＰＴＥＮ（ＭＭＡＣ１）、ＰＶＴ１、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＲＢ１（ＲＢ）、ＲＥＴ、ＲＲＡＳ２（ＴＣ２１）、ＲＯＳ１（ＲＯＳ、ＭＣＦ３）、ＳＭＡＤタイプの遺伝子、ＳＭＡＲＣＢ１（ＳＮＦ５、ＩＮＩ１）、ＳＭＵＲＦ１、ＳＲＣ（ＡＶＳ）、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＴＤＧＦ１（ＣＲＧＦ）、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡ（ＥＲＢＡ、ＥＡＲ７など）、ＴＦＧ（ＴＲＫＴ３）、ＴＩＦ１（ＴＲＩＭ２４、ＴＩＦ１Ａ）、ＴＮＣ（ＴＮ、ＨＸＢ）、ＴＲＫ、ＴＵＳＣ３、ＵＳＰ６（ＴＲＥ２）、ＷＮＴ１（ＩＮＴ１）、ＷＴ１、およびＶＨＬが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５８】
感受性遺伝子は、次世代シーケンシング、全ゲノムシーケンシング、エクソームシーケンシング、ＥＬＩＳＡベースの方法、およびＰＣＲ増幅の１つまたは複数によって評価ですることができる。他の方法を使用して感受性遺伝子を評価することもできる。
【０２５９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置または改善する方法を提供し、その方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素をコードする核酸を含む発現ベクターを対象に投与することを含み、前記発現ベクターは、前記対象の肝臓におけるＤＮａｓｅ酵素の合成を提供する。一部の実施形態では、がんは、前記対象の血液中の微生物起源のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の総レベルまたは相対含有量の増加を伴う。いくつかの実施形態では、その方法は、微生物起源のｃｆＤＮＡのレベル、あるいは対象の血液中のｃｆＤＮＡの総レベルに対する微生物起源のｃｆＤＮＡの比率を検出することを含む。微生物起源のｃｆＤＮＡを検出する方法の非限定的な例には、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）および全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）が含まれる。いくつかの実施形態では、微生物起源のｃｆＤＮＡは、例えば、１６ＳリボソームＲＮＡ、１６ＳリボソームＤＮＡまたは遺伝子間スペーサー領域のＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを使用して検出することができる。いくつかの実施形態では、微生物起源のｃｆＤＮＡの総レベルまたは相対含有量を決定することは、対象の血液における微生物起源のｃｆＤＮＡレベル、またはｃｆＤＮＡの総レベルに対する微生物起源のｃｆＤＮＡの比率を、対照のレベルまたは比率（例えば、年齢をマッチさせたがんのない対象を使用して決定した所定の標準または対応するレベルまたは比率）と比較することを含む。
【０２６０】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、対象はヒトである。
【０２６１】
がん化学療法または放射線療法の毒性の改善
一態様では、本発明は、がんを患っており、化学療法を受けているか受けているとみなされる対象における細胞増殖抑制および／または細胞毒性化学療法に関連する毒性または状態を予防または改善する方法を提供し、その方法は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２など）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）をコードする発現ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１に示される配列（分泌シグナル配列を含む野生型前駆体配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号２に示される配列（分泌シグナル配列を含み、アクチン媒介阻害を弱める突然変異も含む前駆体変異配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号４に示される配列（分泌シグナル配列を含まない野生型成熟配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号５に示される配列（分泌シグナル配列を含まず、アクチン媒介阻害を弱める突然変異を含む成熟変異配列）を含む。いくつかの態様において、ＤＮａｓｅ酵素は、肝臓特異的プロモーターおよび／または肝臓特異的エンハンサーエレメントの制御下で発現される。
【０２６２】
発現ベクターの投与量および投与方法は、化学療法の少なくとも１つの副作用を改善するのに有効である。
【０２６３】
細胞増殖抑制および／または細胞毒性化学療法に関連する状態には、例えば、（ｉ）体重減少をもたらす異化状態、（ｉｉ）骨髄毒性および／または血液生化学における異化変化、（ｉｉｉ）心毒性（例えば、心筋壊死）、（ｉｖ）消化管毒性、（ｖ）免疫の抑制、（ｖｉ）好中球減少症、および（ｖｉｉ）体重減少が含まれ得る。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、がんは、患者の血液もしくは脳脊髄液（ＣＳＦ）または腸内のｃｆＤＮＡレベルの上昇に関連し、そのレベルは、対照レベル（例えば、年齢をマッチさせた健康な個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡのレベル、あるいは年齢をマッチさせた健康ないくつかの個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡの平均レベル）よりも高い。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、化学療法の副作用は、患者の血液もしくはＣＳＦ、腹水、または腸内のｃｆＤＮＡレベルの上昇に関連し、そのレベルは、対照レベル（例えば、化学療法を受けていない同様のがんプロファイルを持つ年齢をマッチさせた個体の血液または脳脊髄液または腸内のｃｆＤＮＡのレベル、あるいはがんを有しているが化学療法を受けていない年齢をマッチさせたいくつかの個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡの平均レベル）よりも高い。
【０２６６】
さらなる態様では、本発明は、がんを患っており、化学療法を受けているか受けているとみなされる対象における細胞増殖抑制および／または細胞毒性化学療法の効果（有効性）を高める方法を提供し、その方法は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２など）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）をコードする発現ベクター（例えば、Ａｎｃ８０もしくはＡＡＶ８  ＡＡＶベクター、またはレンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター）の治療有効量を対象に投与することを含む。発現ベクターの投与量および投与方法は、前記化学療法の少なくとも１つの副作用を予防または改善するため、および前記化学療法に関連する毒性を予防または改善するために有効である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）のいずれかも、例えば静脈内に投与される。
【０２６７】
本発明の発現ベクターは、広範囲の様々な化学療法剤の毒性を改善するおよび／または効果（有効性）を高めるために使用することができる。そのような薬剤の非限定的な例には、ピリミジン類似体（例えば、５−フルオロウラシル［５−ＦＵ］、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸拮抗薬および関連阻害剤（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））などの代謝拮抗物質；ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）などの天然物、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビン、エピジポドフィロフィトキシン（例えば、エトポイド、テニポシド）などの微小管破壊剤、ＤＮＡ損傷剤（例えば、アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、ネダプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、プラルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、ニムスチン、ラニムスチン、エストラムスチン、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホロアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））を含む、抗増殖剤／抗有糸分裂剤；抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、フレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えば、アクチノマイシンＤ）、ジノスタチンスチマラマー）；酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）；ネオカルジノスタチン；抗血小板剤；ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、イミダゾールカルボキサミド、メルファラン、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド塩酸塩、イホスファミド）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、カルボコン、トリエチレンチオホスファミド）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、イソプロスルファントシレート）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン（ＤＴＩＣ）などの抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤；エポキシド型化合物（例えば、ミトブロニトール）；葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）などの抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗剤；白金配位錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（例えば、エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール）；抗分泌剤（例えば、ブレベルジン）；免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）および成長因子阻害剤（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（例えば、トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（例えば、トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘発剤；クロマチン攪乱物質；ソブゾキサン；トレチノイン；ペントスタチン；フルタミド；ポルフィマーナトリウム；ファドロゾール；プロカルバジン；アセグラトン；放射免疫療法（ＲＩＴ）化合物（例えば、イブリツモマブチウキセタン、ヨウ素（１３１Ｉ）トシツモマブ）；標的放射性核種治療（ＴＲＴ）化合物（例えば、サマリウム１５３（１５３Ｓｍ）−ＥＤＴＭＰ、塩化ストロンチウム８９）が含まれる。
【０２６８】
本発明の方法に従って発現ベクターを投与することにより予防または改善することができる細胞増殖抑制および／または細胞毒性化学療法の副作用の非限定的な例には、例えば、骨髄毒性、好中球減少症、脊髄症（例えば、白血球減少症、顆粒球減少症、リンパ球減少症、血小板減少症、赤血球減少症）；血液障害（例えば、血漿フィブリノゲン減少症）；血液生化学における異化変化；胃腸障害（吐き気、嘔吐、食欲不振、体重減少、胃もたれ感、下痢、便秘、口内炎、食道炎）；肺機能不全（例えば、慢性肺炎、肺線維症、ＡＲＤＳ、ＡＬＳ、肺塞栓）；皮膚障害（例えば、角質化、皮膚肥厚(pachymenia)、色素沈着（chromatosis）、脱毛、発疹、爪の変化、がん性脱毛症）；神経系障害（例えば、知覚異常、鬱病、深部反射消失、神経麻痺、聴覚障害、錯話症、見当識障害、神経症状、小脳性運動失調症、眠気、昏睡、めまい、頻尿、頻回の便意）；内分泌障害（例えば、下垂体障害、副腎障害、高血糖、低血糖）；性器障害（例えば、性欲低下、精子減少症、女性化乳房、月経障害）；心血管障害（例えば、心筋壊死、心筋症、不整脈、低血圧、頻脈、心不全）；肝障害、膵臓障害、腎症、膀胱障害、高尿酸血症、免疫力の低下、および感染が含まれる。
【０２６９】
本発明の発現ベクターはまた、例えば、外照射療法（ＥＢＲＴまたはＸＲＴ）、小線源療法／密封線源放射線療法、および全身放射性同位体療法／非密封線源放射線療法を含む、様々なタイプの放射線療法の毒性を改善し、効果（有効性）を高めるために使用することができる。本発明の方法に従って発現ベクターを投与することにより予防または改善することができる放射線療法の副作用の非限定的な例には、例えば、皮膚の刺激または損傷、疲労、吐き気、嘔吐、線維症、腸損傷、記憶喪失、不妊、二次がんが含まれる。
【０２７０】
本発明の発現ベクターは、例えば、抗体（裸のモノクローナル抗体、コンジュゲートモノクローナル抗体、化学標識抗体、二重特異性モノクローナル抗体）、がんワクチン、免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４を標的とする薬物）、非特異的がん免疫療法およびアジュバント、ＣＡＲ−Ｔ療法を含む、がん免疫療法の効果（有効性）を高めるために使用することができる。
【０２７１】
神経変性の処置
一態様では、本発明は、神経変性を処置または改善する方法を提供する方法を提供する。「神経変性」という用語は、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造および／または機能の進行性の喪失を伴う別個の臨床病理学的状態を指すために本明細書で使用される。神経変性は原発性（一次性）または続発性（二次性）であり得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、神経変性は、患者の血液または脳脊髄液（ＣＳＦ）または腸内のｃｆＤＮＡ（例えば、微生物ＤＮＡまたはヒトＤＮＡ）のレベルの上昇に関連し、そのレベルは、対照レベル（例えば、年齢をマッチさせた健康な個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡのレベル、あるいは年齢をマッチさせた健康ないくつかの個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡの平均レベル）よりも高い。一実施形態では、神経変性は神経変性障害に関連する。包含される神経変性障害の非限定的な例には、例えば、アルツハイマー病（例えば、遅発性アルツハイマー病）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、プリオンが原因となる疾患、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、進行性核上性麻痺（Steel-Richardson-Olszewski）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、多発性硬化症、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、強直性脊椎炎、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症 (ケネディ病)、フリードライヒ運動失調症、小脳性運動失調症、脊髄小脳性変性症、レビー小体型認知症、血管性痴呆、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症、脊髄性筋萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、アルツハイマー型老年認知症、大脳皮質歯状核黒質変性症（corticodentatonigral degeneration）、ハラーフォルデン−シュパッツ病（Hallervorden-Spatz disease）、進行性の家族性ミオクローヌスてんかん、線条体黒質変性症、捻転ジストニア（例えば、捻転けいれん；変形性筋ジストニア）、痙攣性斜頸およびその他のジスキネジー、家族性振戦、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、小脳皮質変性症、脊髄小脳変性症（例えば、フリードライヒ運動失調症および関連疾患）、シャイ・ドレーガー症候群、原発性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺、腓骨筋萎縮症（シャルコー・マリー・トゥース病）、肥厚性間質性多発ニューロパチー（デジュリーヌ・ソッタス病（Dejerine-Sottas））、慢性進行性ニューロパチー、網膜の色素変性（網膜色素変性症）、および遺伝性視神経萎縮症（レーベル病）、壊死による続発性神経変性（例えば、新生物、浮腫、出血、脳卒中、外傷、免疫発作、低酸素症、中毒、代謝異常、および感染症による、ニューロンの破壊）、ならびに様々なタウオパチー（例えば、原発性年齢関連タウオパチー）／ＡＤと同様の神経原線維変化（ＮＦＴ）を有するがプラークのない神経原線維変化優位型老年期認知症、ＣＴＥ、リティコ−ボディグ病（Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ）、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎）が含まれる。いくつかの実施形態では、神経変性は、例えば、統合失調症または双極性障害、うつ病性障害、自閉症、自閉症スペクトラム障害、慢性疲労症候群、強迫性障害、全般性不安障害（ＧＡＤ）、大うつ病性障害（ＭＤＤ）、または社会性不安障害（ＳＡＤ）などの神経系機能障害に関連する。一部の実施形態では、神経変性障害は、アミロイドーシスに��って引き起こされるか、それに続発するか、または関連する。いくつかの実施形態では、神経変性障害は、タンパク質ミスフォールディングに関連する疾患である。いくつかの実施形態において、神経変性障害は、糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、痛風、メタボリックシンドローム、アミロイドーシス（例えば、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、血液透析関連アミロイドーシス、フィンランド型遺伝性全身性アミロイドーシス、心房性アミロイドーシス、リゾチーム全身性アミロイドーシス、インスリン関連アミロイドーシス、フィブリノーゲンα鎖アミロイドーシス）、喘息、またはプリオン病によって引き起こされるか、それに続発するか、または関連する。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、神経変性は、ＤＮＡ（例えば、ヒト、微生物、セルフリー、または細胞内）の存在によるミスフォールドタンパク質の形成によって引き起こされるか、それに続発するか、または関連する。いくつかの実施形態では、神経変性は、ＤＮＡ（例えば、ヒト、微生物、セルフリーまたは細胞内）の存在によるミスフォールドタンパク質の形成によって引き起こされる。
【０２７４】
いくつかの態様では、神経変性は、β−アミロイド、タウタンパク質、α−シヌクレイン、ＳＯＤ１、ＴＤＰ−４３、ＬＡＰＰ、ＡＤａｎ、ＡＢｒｉ、Ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ（ＦＵＳ）タンパク質、Ｎｏｔｃｈ３、グリア線維性酸性タンパク質、セイピン、トランスサイレチン、セルピン、アポリポタンパク質、アミロイドβペプチド、ラクトフェリン、ガレクチン（Galectin）−７、コルネオデスモシン(corneodesmosin)を含むがこれらに限定されないミスフォールドタンパク質の形成によって引き起こされるか、それに続発するか、または関連する。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して、疾患関連感受性遺伝子の存在または活性の評価の後、タンパク質ミスフォールディングに関連する神経変性疾患または別の疾患の発症を予防することができる。疾患関連感受性遺伝子の例には、ＡＤＡＲ１、ＭＤＡ５（ＩＦＩＨ１）、ＲＮＡｓｅＨサブユニット、ＳａｍＨＤ１、ＴＲＥＸ、ＴＢＫ１、オプチニューリン、Ｐ６２（セクエストソーム−１）、プログラニュリン、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ＶＣＰ、ＣＨＭＰ２Ｂ、プロフィリン−１、アミロイド−β、タウ、α−シヌクレイン、ＰＩＮＫ、Ｐａｒｋｉｎ、ＬＲＲＫ２、ＤＪ−１、ＧＢＡ、ＡＴＰＡ１３Ａ２、ＥＸＯＳＣＩＩＩ、ＴＳＥＮ２、ＴＢＣ１Ｄ２３、リスク因子アレル、ＴＲＥＭ２、ＡＰＯＥ、ＴＯＭＭ４０、ＩＬ−３３、グルコセレブロシダーゼ、アタキシン（Ａｔａｘｉｎ）−２、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＯＤ１、およびＦＵＳが含まれるが、これらに限定されない。感受性遺伝子は、次世代シーケンシング、全ゲノムシーケンシング、エクソームシーケンシング、ＥＬＩＳＡベースの方法、およびＰＣＲ増幅の１つまたは複数によって評価することができる。他の方法を使用して、感受性遺伝子を評価することもできる。
【０２７６】
上記の方法の一実施形態において、哺乳動物の生体液および組織におけるミスフォールドタンパク質の凝集体形成の予防または処置は、配列番号３０（ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ）または配列番号３１（ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ野生型−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ５６５３）の配列を含む発現ベクターを含めて、本明細書に記載の発現ベクターの使用により達成される。配列番号３０の配列において、塩基１−３２０はＡＰＯＥ  ＨＣＲエンハンサーに対応し、塩基３２１−７１７はヒトα１−アンチトリプシンプロモーターに対応し、塩基７１８−７２６はコザック配列に対応し、塩基７２７−１５７５は天然の完全な正しいリーダー配列を持つヒトＤＮａｓｅI高活性バリアントに対応し、塩基１５７６−２２１２は不活性化されたＷＰＲＥ  Ｘタンパク質に対応する。配列番号３１の配列において、塩基１−３２０はＡＰＯＥ  ＨＣＲエンハンサーに対応し、塩基３２１−７１７はヒトα１−アンチトリプシンプロモーターに対応し、塩基７１８−７２６はコザック配列に対応し、塩基７２７−１５７５は天然の完全な正しいリーダー配列を持つヒトＤＮａｓｅＩ野生型に対応し、塩基１５７６−２２１２は不活性化されたＷＰＲＥ  Ｘタンパク質に対応する。
【０２７７】
国際公開第２０１６／１９０７８０号に記載されているように、神経変性を患う患者の腸、血液およびＣＳＦからのｃｆＤＮＡは、神経細胞死およびアポトーシスを引き起こし、そのようなｃｆＤＮＡを破壊する組換えＤＮａｓｅタンパク質による処置はこれらの患者の神経系機能を改善する。以下の実施例の欄に示すように、ＤＮａｓｅの肝臓特異的発現のための本発明のベクターの使用は、ＤＮａｓｅタンパク質投与と比較して、さらなる治療の改善をもたらす。
【０２７８】
神経変性および神経炎症の治療効果の評価は、例えば、ＭＭＳＥ、ＰＡＮＳＳ、身体機能、および／または機能的タスクなどの認知機能低下の広く受け入れられている臨床診断基準に従って、当技術分野で既知の任意の方法を使用して行うことができる（例えば、Holmes et al., (1999) The British Journal of Psychiatry, 174(1), 45-50; Os et al., (2006) Acta Psychiatrica Scandinavica, 113(2), 91-95; O'Shea et al., (2002) Physical therapy, 82(9), 888-897; Rochester et al., Arch. Phys. Med. Rehabil. (2004) 85(10), 1578- 1585を参照されたい）。
【０２７９】
本発明のいくつかの実施形態では、神経変性は、腸内細菌の腸透過性およびトランスロケーションの増加、ならびに微生物ｃｆＤＮＡを含む微生物起源のＤＡＭＰによって引き起こされるかまたは悪化する。このようなｃｆＤＮＡは、神経炎症および様々な神経変性疾患を誘発する。消化管の微生物叢に由来するｃｆＤＮＡは、肝臓の門脈−類洞循環を「初回通過」する。ＮＬＲＰ３インフラマソームは神経炎症の発症の主要な原因と考えられている。例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソームは、脳、例えば脳皮質組織において著しいアップレギュレーションを受ける可能性がある。ＮＬＲＰ３インフラマソームシグナル伝達の異常な活性化は、幅広い神経疾患の病理に寄与することが実証されている（Ｓｏｎｇ，２０１７）。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、本発明は、神経変性を患っている対象の神経変性を処置する方法を提供し、その方法は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）をコードする発現ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む。発現ベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターまたはリポソームまたは裸のＤＮＡ）の投与量および投与方法は、そのような神経変性の１つまたは複数の症状または影響を処置するのに有効でなければならない。
【０２８１】
理論に拘束されるつもりはないが、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする核酸が本発明のベクターを使用して肝臓に送達された後、酵素は肝臓細胞によって産生され、内皮周囲腔およびディッセ腔に分泌され、酵素はそこに存在するｃｆＤＮＡの濃縮プールを効率的に分解する。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターの使用は、ＤＮａｓｅタンパク質（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）の投与（例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、腹腔内、または経腸投与）と組み合わせられる（併用される）。理論に拘束されるつもりはないが、本発明の発現ベクターを使用した肝臓細胞における上記のＤＮａｓｅの産生と組み合わせたＤＮａｓｅタンパク質の全身投与は、血流と、肝臓のそのようなｃｆＤＮＡの濃縮プールの両方で、ｃｆＤＮＡをより迅速に分解する。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする発現ベクターは、神経変性疾患または他の包含される神経系機能障害（例えば、双極性障害、片頭痛、統合失調症、てんかん）の処置に有用な他の処置と組み合わせて投与することができる。そのような追加の処置の非限定的な例には、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性化因子、サイクリン依存性プロテインキナーゼ５阻害剤、ニューロトロフィン模倣物、セマフォリン４Ｄブロッカー、ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ−１阻害剤、レボドパ、およびＮ−メチル−ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体阻害剤（例えば、メマンチン）が含まれる。
【０２８４】
遅延型過敏反応の処置
一態様では、本発明は、それを必要とする対象における遅延型過敏症反応（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））を処置する方法を提供し、その方法は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）をコードする発現ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１に示される配列（分泌シグナル配列を含む野生型前駆体配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号２に示される配列（分泌シグナル配列を含み、アクチン媒介阻害を弱める突然変異も含む前駆体変異配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号４に示される配列（分泌シグナル配列を含まない野生型成熟配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号５に示される配列（分泌シグナル配列を含まず、アクチン媒介阻害を弱める突然変異を含む成熟変異配列）を含む。いくつかの態様において、ＤＮａｓｅ酵素は、肝臓特異的プロモーターおよび／または肝臓特異的エンハンサーエレメントの制御下で発現される。
【０２８５】
理論に拘束されるつもりはないが、好中球の活性化により、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）とともに顆粒タンパク質が放出され、ＮＥＴとして知られる細胞外線維が形成される。補体はＮＥＴによって活性化される。補体の活性化は、遅延型過敏反応で観察される症状につながる可能性がある。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、遅延型過敏反応は、患者の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡのレベルの上昇に関連し、そのレベルは、対照レベル（例えば、年齢をマッチさせた健康な個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡのレベル、あるいは年齢をマッチさせた健康ないくつかの個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡの平均レベル）よりも高い。ＤＮａｓｅ活性を有する酵素をコードする発現ベクターの投与は、ＮＥＴ形成を阻害し、補体の活性化の低減をもたらすことができる。
【０２８７】
理論に拘束されるつもりはないが、上記の発現ベクターを使用した肝細胞におけるＤＮａｓｅの産生と組み合わせたＤＮａｓｅ酵素の全身投与は、血流と、肝臓のそのようなｃｆＤＮＡの濃縮プールの両方で、ｃｆＤＮＡをより迅速に分解する。
【０２８８】
ＤＮａｓｅ酵素をコードする発現ベクターは、遅延型過敏症反応を処置するのに有用な他の１つまたは複数の処置と組み合わせて投与することができ、そのような他の処置は、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ＡＴＧ、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、抗−インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体抗体、抗ＣＤ５特異的免疫毒素、汎Ｔ細胞リシンＡ鎖免疫毒素（ＸｏｍａＺｙｍｅ）、従来のステロイド療法への無関係のドナー由来のｅｘ  ｖｉｖｏ培養間葉細胞の追加、およびそれらの任意の組合せである。
【０２８９】
アテローム性動脈硬化症の処置
一態様では、それを必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置するための方法が提供され、その方法は、ＤＮａｓｅ活性を有する酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）をコードする発現ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号１に示される配列（分泌シグナル配列を含む野生型前駆体配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号２に示される配列（分泌シグナル配列を含み、アクチン媒介阻害を弱める突然変異も含む前駆体変異配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号４に示される配列（分泌シグナル配列を含まない野生型成熟配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素は、配列番号５に示される配列（分泌シグナル配列を含まず、アクチン媒介阻害を弱める突然変異を含む成熟変異配列）を含む。いくつかの態様において、ＤＮａｓｅ酵素は、肝臓特異的プロモーターおよび／または肝臓特異的エンハンサーエレメントの制御下で発現される。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、アテローム性動脈硬化症は、患者の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡレベルの上昇に関連し、そのレベルは、対照レベル（例えば、年齢をマッチさせた健康な個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡのレベル、あるいは年齢をマッチさせた健康ないくつかの個体の血液またはＣＳＦまたは腸内のｃｆＤＮＡの平均レベル）よりも高い。
【０２９１】
ＤＮａｓｅ酵素をコードする発現ベクター、例えばＡｎｃ８０または別のＡＡＶベクターあるいはレンチウイルスベクターは、任意選択で追加のＤＮａｓｅ酵素と共に投与することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ酵素（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉまたはウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ）、ＤＮａｓｅ  Ｉの類似体（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｘ、ＤＮａｓｅγ、またはＤＮＡＳ１Ｌ２）、ＤＮａｓｅ  ＩＩ（例えば、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−α、ＤＮａｓｅ  ＩＩ−β）、ホスホジエステラーゼＩ、ラクトフェリン、またはアセチルコリンエステラーゼ）のいずれかも、例えば静脈内に投与される。理論に拘束されるつもりはないが、上記の肝臓細胞でのＤＮａｓｅの産生と組み合わせたＤＮａｓｅ酵素の全身投与は、血流と、肝臓のそのようなｃｆＤＮＡの濃縮プールの両方で、ｃｆＤＮＡをより迅速に分解する。
【０２９２】
ＤＮａｓｅ酵素をコードする発現ベクターは、アテローム性動脈硬化症の処置に有用な他の処置と組み合わせて投与することもできる。
【０２９３】
医薬組成物、製剤および剤形
本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、例えば、液体溶液または懸濁液として、あるいは注射前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態として、任意の適切な形態で投与することができる。ベクターは、任意の適切かつ薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバント、希釈剤などを用いて製剤化することができる。例えば、注射の場合、適切な担体または希釈剤は、等張液、緩衝液、無菌で発熱物質を含まない水、または例えば無菌で発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水であってよい。発現ベクターは、医薬組成物および剤形に製剤化され得る。そのような医薬組成物および剤形は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体および／または賦形剤を使用して、任意の従来の方法で製剤化することができる。ベクター粒子は、例えば注射による投与用に製剤化され得る。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、以下に記載するように、利用可能な医薬組成物の多種多様な適切な製剤がある（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照）。
【０２９４】
製剤には、液体中の懸濁液または乳化液も含まれる。活性成分は、通常、薬学的に許容されかつ活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが含まれる。さらに、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の効果を高める他の試薬など、少量の補助物質を含んでいてよい。
【０２９５】
本発明の方法において使用される製剤は、好都合には単位剤形で提示され、当該分野で既知の方法によって調製され得る。担体材料と組み合わせて単一剤形を作成することができる活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変動するであろう。担体材料と組み合わせて単一剤形を作成することができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量である。
【０２９６】
非経口投与に適した医薬組成物は、１つまたは複数の追加の有効成分（例えばＤＮａｓｅタンパク質または別の活性化合物）を、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、あるいは使用直前に無菌の注射可能な溶液または分散液に再構成することができる無菌粉末と組み合わせて、さらに含むことができ、前記の無菌粉末は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含むことができる。本開示の医薬組成物で使用することができる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０２９７】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤も含むことができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって確実にすることができる。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることが望ましい場合もある。
【実施例】
【０２９８】
本発明はまた、以下の実施例によって説明および実証される。しかしながら、明細書のどこかでこれらおよび他の例を使用することは単なる例示であり、本発明または例示した用語の範囲および意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、ここに記載された特定の好ましい実施形態に限定されない。実際、本明細書を読むと、本発明の多くの修正および変更が当業者に明らかであり、そのような変更は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語およびそれら特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲によってのみ制限されるべきである。
【０２９９】
実施例１：腫瘍患者の循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を消化するＤＮａｓｅ酵素の限られた能力
Ｋｏｓｔｕｓｈｋｏ病院（ロシア、サンクトペテルブルク）の胸部外科に入院した進行性転移性疾患の患者９人に、３週間コースの２５００ＫＵ／ｍｇの比活性を有するウシ膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質による静脈内処置を施した（サムソン、ロシア）。処置は以下のスケジュールに従って進められた：第Ｉ週には、６回の３０分ＩＶ注入によって３００ｍｇを毎日投与した；第ＩＩ週には、６回の３０分のＩＶ注入により４５０ｍｇを毎日投与した；第ＩＩＩ週には、６回の３０分のＩＶ注入により６００ｍｇを毎日投与した。
【０３００】
最初のＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質注入の前、第ＩＩ週の終わり、および最後のＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質注入の直後に、循環ｃｆＤＮＡの電気泳動プロファイリングを各患者について行った。古典的なフェノール−クロロホルム法を使用して血漿からＤＮＡを単離した。血液ｃｆＤＮＡの電気泳動を１％アガロースゲルで行った。ＤＮＡを臭化エチジウムで可視化した。処置の効果は、最後のＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質注入の１週間後に、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づいてスパイラルＣＴスキャンを使用して評価した（例えば、２００９年１月に公開されたＲＥＣＩＳＴ  １．１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｒｒｅｃｉｓｔ．ｃｏｍを参照）。患者サマリーおよび個々の血液電気泳動データを図２Ａ〜２Ｉに示す。全体として、ＲＥＣＩＳＴの結果によると、固形腫瘍の径の減少はほとんどなかった（図２Ａ−２Ｈ）。ほとんどの患者で、第ＩＩＩ週の後もまだ循環中にｃｆＤＮＡがあった。
【０３０１】
ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の連続漸増高用量ＩＶ注入にもかかわらず、再発性直腸がん（ＰＶＩＩＩ）の１人の患者のみが、ゲル電気泳動で測定して、血漿からの循環ｃｆＤＮＡの完全なクリアランスを示した。患者ＰＶＩＩＩの病状は安定しており、ＲＥＣＩＳＴ基準による進行の証拠はなかった。ＲＥＣＩＳＴ基準に従って安定な疾患と認定された他の３人の患者（ＰＩＸ、ＰＶＩＩ、ＰＩ）は、ゲル電気泳動で測定して、血漿の循環ｃｆＤＮＡの増加がほとんどまたはまったくなかった。
【０３０２】
ＲＥＣＩＳＴ基準に従って進行性疾患患者と認定された５人の患者（ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶ、およびＰＶＩ）は、ゲル電気泳動で測定して、血漿からの循環ｃｆＤＮＡが大幅に増加した。また、９人中８人の患者（８８％）において、漸増高用量のＤＮａｓｅ酵素の３週間連続静脈内注入は、血漿からの循環ｃｆＤＮＡの治療的に有効なクリアランスをもたらすことはできなかった。
【０３０３】
実施例２：担腫瘍動物の肝臓におけるセルフリーＤＮＡの蓄積
約１２×１０６のＬＳ１７４Ｔヒト結腸がん細胞を、１２匹の８週齢雌ｎｕ／ｎｕマウス（ＩＢＣＨ  ＲＡＳ品種）のそれぞれの左側腹部に皮下接種した。マウスは以下のスケジュールに従って９９ｍＴｃ標識抗ＤＮＡ抗体の単回ＩＶ注射を受けた：３匹のマウスはＤ５に注射を受け、３匹のマウスはＤ１０に注射を受け、３匹のマウスはＤ１５に注射を受け、３匹のマウスはＤ２５に注射を受けた。注射の２時間後にマウスを屠殺し、組織および血液をガンマ計数のために採取した。
【０３０４】
ＡＣ−３０−１０  ＤＮＡ結合抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ）を次のように９９ｍＴｃで標識した：０．３Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．２）中の抗体の０．０２４ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．２５ｍｌの生理食塩水中の１ｍＣｉの９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸塩と混合し、さらに０．１Ｎ  ＨＣｌ中のＳｎＣｌ２二水和物の１０ｍｇ／ｍｌ溶液と混合した。室温で５分間インキュベーション後、１．９ｍｌの生理食塩水と８２５μｌのＩｇＭ溶液を添加した。単回注射用量は以下のように調製した：１６．６μＣｉ（３６８５２０００ＣＰＭ、約０．０４７μｇの９９ｍＴｃ−ＩｇＭ）の９９ｍＴｃ−ＩｇＭ溶液を３．３μｇの非標識ＩｇＭと混合し、生理食塩水で１００μＬ体積まで希釈した。オートガンマカウンターを使用して各組織におけるγシグナルを定量化した。測定はＣＭＰ単位で行われた。９９ｍＴｃ  ＩｇＭの濃度は、ガンマカウントデータ、組織重量、投与したＩｇＭ調製物の比放射能、および９９ｍＴｃの半減期に基づいて定量化した。
【０３０５】
放射能の組織分布を下の表１に示す。
【表１】
2021510539.tif 000003
【０３０６】
図３は、１５日目に得られた９９ｍＴｃ標識抗ＤＮＡ抗体の注射の１時間後の担腫瘍マウスのガンマ免疫シンチグラフィー画像を示す。画像の中央右部分の肝臓ゾーン（ｂ）は、画像の左下部分の腫瘍ゾーン（ａ）のシグナルよりも大きい放射性シグナルを生成した。したがって、肝臓が循環ｃｆＤＮＡの最も多い蓄積を示した。
【０３０７】
実施例３：腫瘍由来のｃｆＤＮＡの肝臓から血液への供給
６匹の６週齢雌ヌードマウス（ＩＢＣＨ  ＲＡＳ品種）に、２ｘ１０６のＭＣＦ−７細胞を左脇腹に皮下注射した。注射後２０日目に腫瘍を外科的に切除した。２５日目にすべてのマウスに麻酔をかけ、各マウスの門脈、肝動脈および肝静脈から５００μｌの血液サンプルを採取した。２０００ｇで１０分間遠心分離することにより、血漿を血球から分離した；上部の透明な血漿相を新しいチューブに移し、１４０００ｇで遠心分離した。上清を新しいＤＮＡ抽出用チューブに移した。製造元の指示に従ってＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、血漿サンプルからｃｆＤＮＡを抽出した。ヒトβグロビンプライマーＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ（配列番号１０）を用いるＲＴ−ＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５６  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、各サンプルにおいてセルフリーＤＮＡ中のヒトβグロビン配列を定量化した。異なる血管から採取した血漿中のヒトβグロビン配列のＣｔ値を以下の表２に示す：
【表２】
2021510539.tif 000004
【０３０８】
腫瘍は外科的に取り除かれたにもかかわらず、ヒト由来の循環ｃｆＤＮＡを含まない血漿は１匹のマウスのみであった。ＭＣＦ−７腫瘍は、皮下成長時に転移を起こさなかった。肝臓または肺に転移性結節がないことは、肉眼的および顕微鏡的検査によってさらに確認した。ヒト腫瘍異種移植に由来する循環ｃｆＤＮＡは、マウスの血液で検出可能であり、肝静脈で最も高い量が検出可能であった。これらの結果は、肝臓の類洞が循環ｃｆＤＮＡの貯蔵源（depot source）であることを支持する。
【０３０９】
実施例４：膵臓がんモデルにおけるＤＮａｓｅ  Ｉのトランスジェニック送達および組換えＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質の静脈内送達の効果
ＤＮａｓｅ  Ｉの肝臓特異的トランスジェニック発現のためのＡＡＶベクター（４６５８＿ｐＡＡＶ−ＡＦＰ−Ａｌｂ−ｈｕＤＮａｓｅＩ＿ｍｕｔ）は、Ｓｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）に特注して製造した。ベクターマップを図５Ａに示す。ＡＡＶベクターは、肝臓を効果的に標的とするＡＡＶ血清型８に基づく。ベクターは、配列番号２に示される配列を含み、この配列は、酵素をアクチン阻害に対してより低い感受性にしかつ触媒的により活性にするいくつかの変異を含む変異ヒトＤＮａｓｅ  Ｉ酵素をコードする。ＤＮａｓｅ  Ｉコード配列は、分泌シグナル配列をさらに含む。ＤＮａｓｅ  Ｉコード配列は、５’末端でｍＡＦＰ／Ａｌｂエンハンサー／プロモーターシステム（肝臓特異的マウスα−フェトプロテインエンハンサーおよび肝臓特異的マウスアルブミン最小プロモーター）に、そして３’末端でｈＧＨポリＡシグナルに作動可能に連結している。発現カセットには、ＡＡ８  Ｌ−ＩＴＲおよびＲ−ＩＴＲがさらに隣接している。
【０３１０】
ｈｕＤＮａｓｅＩ＿ｍｕｔ発現カセットをＡＡＶトランスファーベクターにクローニングし、トランスファーベクターとＡＡＶ８パッケージングプラスミドの同時トランスフェクションを介して２９３Ｔ細胞で生成した。ウイルス粒子を精製し、１×１０１３ＧＣ／ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳ中で凍結保存した。
【０３１１】
４６５８＿ｐＡＡＶ−ＡＦＰ−Ａｌｂ−ｈｕＤＮａｓｅＩ＿ｍｕｔと同じであるが、肝臓特異的ｍＡＦＰ／Ａｌｂエンハンサー／プロモーターシステムの代わりに肝臓非特異的ＣＭＶＥ／ＣＡＧプロモーター／エンハンサーシステムを有する対照ベクターも作成した。
【０３１２】
ヒト組換えＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質（ｒｈＤＮａｓｅＩ）は、Ｃａｔａｌｅｎｔ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）によって製造され、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の１０ｍｇ／ｍｌストック溶液で凍結保存した。
【０３１３】
５６匹の６〜８週齢で体重１８〜２２ｇの雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ＩＢＣＨ  ＲＡＮ）を実験で使用した。マウスは、各ケージ４匹ずつ、制御された温度と湿度で個々の換気ケージで飼育した。腫瘍成長のためにＢＤマトリゲルを補足した０．２ｍｌのＰＢＳ（１：１）中のＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓腫瘍細胞（１×１０７）を、各マウスの右側腹部に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約１７０ｍｍ３に達した腫瘍接種後１７日目に処置を開始した。各群は８匹の担腫瘍マウスで構成された。以下の表３に示す所定のレジメンに従って試験ベクターおよび組成物をマウスに投与した：
【表３】
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【０３１４】
腫瘍サイズは、週２回キャリパーを使用して２次元で測定し、体積は式：Ｖ＝０．５ａｘｂ２（式中、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である）を使用してｍｍ３で表した。日常的なモニタリングの際に、目視検査のみによって可動性、食餌および水の消費量、体重の増減（週２回測定）、目／毛のもつれ、およびその他の異常な影響など、正常行動に対する腫瘍成長および処置のあらゆる影響について動物を毎日チェックした。３５日目に試験を終了し、マウスをＣＯ２によって人道的に屠殺し、血液を中心静脈および肝静脈から採取した。肝臓組織も採取し、ホルマリンに浸して固定した。
【０３１５】
H. Goldstein, “A rapid direct fluorescent assay for cell-free DNA quantification in biological fluids”, Annals of Clinical Biochemistry, Vol 46, Issue 6, pp. 488-494に記載されている方法を使用して、血漿中の循環ｃｆＤＮＡを測定した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最初にジメチルスルホキシドで１：１０００に希釈し、次にリン酸緩衝生理食塩水で１：８に希釈した。血漿サンプル１０μｌを９６ウェルプレートに添加した。４０μｌの希釈したＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄを各ウェルに加え（最終希釈１：１０，０００）、９６ウェルフルオロメーターを用いて５３５ｎｍの発光波長と４８５ｎｍの励起波長で蛍光を測定した。
【０３１６】
血清ＤＮａｓｅ  Ｉ活性は、製造元のプロトコルに従ってＯＲＧ５９０（Ｏｒｇｅｎｔｅｃ）を使用して測定した。検出は、マイクロプレート光度計（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＦＣ）を使用して、補正波長６２０ｎｍを用いて４５０ｎｍで行った。肝臓組織のｃｆＤＮＡは、ＡＣ−３０−１０マウスＩｇＧ  ＤＮＡ結合抗体（Ｓｉｇｍａ）を一次抗体として使用し、Ｎｏｖｏｌｉｎｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、肝臓パラフィンスライドの免疫組織化学染色（ＩＨＣ）で定量化した。
【０３１７】
（表３のとおり）試験ベクターおよび組成物を投与されたＭＩＡ  ＰａＣａ−２異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの経時的な平均腫瘍体積を以下の表４に示す：
【表４】
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【０３１８】
（表３のとおり）試験ベクターおよび組成物を投与されたＭＩＡ  ＰａＣａ−２異種移植片を有する雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの各群における、３５日目に体重減少を有する動物の数を以下の表５に示す：
【表５】
2021510539.tif 000007
【０３１９】
血液中の循環ｃｆＤＮＡならびに中心静脈および肝静脈のＤＮａｓｅ  Ｉ酵素活性の定量の結果を以下の表６にまとめる：
【表６】
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【０３２０】
様々な群の肝臓組織のＩＨＣ顕微鏡写真を図４に示す。
【０３２１】
上記の表４〜６、および図４のデータは、化学療法と組み合わせたＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の肝臓特異的トランスジェニック発現が、抗腫瘍効果の点で有意に優れた結果をもたらしただけでなく、化学療法誘発性体重減少を完全に改善できたことを明確に示す。３つの漸増用量で１日２回投与された組換えＤＮａｓｅ  Ｉ酵素、ならびに肝臓に標的化されないＤＮａｓｅ  Ｉのトランスジェニック発現は、ＤＮａｓｅ  Ｉの肝臓特異的トランスジェニック発現よりも、抗腫瘍効果および化学療法誘発性毒性の改善が有意に少ないことを示した。肝臓特異的ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８ベクターで処置したマウスは、循環ｃｆＤＮＡの量が最も少なく、肝臓に残っているｃｆＤＮＡの量が最も少なく、また肝静脈のＤＮａｓｅ  Ｉ酵素活性が最も高かった。
【０３２２】
実施例５：膵臓がんの同所性および非同所性成長に対するＤＮａｓｅ  Ｉのトランスジェニック送達の効果
４つの実験群に分けられた１２匹の８週齢ＳＣＩＤマウス（ＩＢＣＨ  ＲＡＳ）を実験に使用した。６匹のマウスの右大腿骨に、１００μｌのマトリゲル中の４ｘ１０６のルシフェラーゼ発現ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓がん細胞を皮下投与した（非同所性モデル）。６匹のマウスの膵臓尾部に、１００μｌのマトリゲル中の４ｘ１０６のルシフェラーゼ発現ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓がん細胞を移植した（同所性モデル）。翌日、同所性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２移植の３匹のマウスは、１．００ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ用量でｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８ベクター４６５８＿ｐＡＡＶ−ＡＦＰ−Ａｌｂ−ｈｕＤＮａｓｅＩ＿ｍｕｔのＩＶ注射を受け、同所性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２移植の３匹のマウスはプラセボ（ＰＢＳ）注射を受けた。非同所性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２移植の３匹のマウスは、１．００ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ用量でＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８ベクターのＩＶ注射を受け、非同所性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２移植の３匹のマウスはプラセボ（ＰＢＳ）注射を受けた。４週間後、実験の最後に、ＡＭＩ−１０００イメージングシステムを使用して、生物発光イメージングによって腫瘍を評価した。生物発光データを以下の表７にまとめ、典型的な画像を図６に示す。
【表７】
2021510539.tif 000009
【０３２３】
従って、ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の肝臓へのトランスジェニック送達は、門脈によって排出される領域（すなわち膵臓）における同所性様式での腫瘍成長の発達を完全に阻止する。非同所性様式での同じ膵臓がんの異種移植の発達も、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８の注射によって有意に抑制されたが、腫瘍成長を完全になくすほどは抑制されなかった。
【０３２４】
実施例６：乳がんモデルにおける乳がんの成長に対するＤＮａｓｅ  Ｉ導入遺伝子の肝臓および肺送達の効果
ＡＤＶ−２０７１８６ベクターは、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）から購入した。ベクターマップを図５Ｃに示す。このベクターは、ヒトアデノウイルス５型（ｄＥ１／Ｅ３）（天然の肝臓指向性を持つ）に基づくものであり、分泌シグナル配列を含む野生型ヒトＤＮａｓｅ  Ｉコード配列（配列番号１）を含む。ＤＮａｓｅ  Ｉコード配列は、５’末端で肝臓非特異的ＣＭＶプロモーターに、そして３’末端でｈＧＨポリＡシグナルに作動可能に連結されている。発現カセットには、ＡＴＴ−Ｌ１およびＡＴＴ−Ｌ２がさらに隣接している。
【０３２５】
ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ雌マウスＩＢＣＨ  ＲＡＳ品種を研究に使用した。各マウスが少なくとも３ｍｍｘ５ｍｍの少なくとも３つの触知可能な腫瘍を成長させたとき（これは通常８週齢で生じた）、６匹のマウスに、マウスあたり０．２ｘ１０１１ＰＦＵのＡＤＶ−２０７１８６を静脈内注射し、６匹のマウスには、マウスあたり０．２ｘ１０１１ＰＦＵのＡＤＶ−２０７１８６を麻酔下で鼻腔内注射した。マウスを１４週齢で屠殺した。６匹のマウスを対照として使用した。腫瘍のサイズは、キャリパーを使用して２次元で測定し、体積は式：Ｖ＝０．５ａｘｂ２（式中、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である）を使用してｍｍ３で表した。ＴＧＩは、式：ＴＧＩ（％）＝［１−（Ｔｉ−Ｔ０）／（Ｖｉ−Ｖ０）］×１００（Ｔｉは所定日の処置群の平均腫瘍体積、Ｔ０は処置開始日の処置群の平均腫瘍体積、ＶｉはＴｉと同じ日のビヒクル対照群の平均腫瘍体積、Ｖ０は、処置開始日のビヒクル群の平均腫瘍体積である）を使用して、各群について計算した。試験の終了時に中心静脈から血液を採取した。実施例４に記載するように、循環ｃｆＤＮＡおよび血清ＤＮａｓｅ  Ｉ活性を測定した。データを以下の表８に報告する。
【表８】
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【０３２６】
血液中のＤＮａｓｅ酵素活性のレベルがほぼ同じであるにもかかわらず、ＤＮａｓｅ  Ｉ導入遺伝子の気管支肺胞系への送達と比較して、ＤＮａｓｅ  Ｉ導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを用いた肝臓ターゲティングは、優れた乳腫瘍成長阻害および血液からの循環ｃｆＤＮＡのクリアランスをもたらすことを示す。
【０３２７】
実施例７：微生物ｃｆＤＮＡのレベルおよび神経炎症のレベルに対する肝臓および筋肉でのアクチン耐性高活性ＤＮａｓｅ  Ｉのトランスジェニック発現の効果
胃腸内微生物叢の腸透過性およびトランスロケーションの増加、ならびに微生物ｃｆＤＮＡを含む微生物起源の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）は、神経炎症および神経変性疾患のスペクトルを引き起こす。胃腸内細菌叢に由来するｃｆＤＮＡは、門脈−類洞循環を通る「初回通過」を受ける。脳および肝臓の微生物ｃｆＤＮＡのレベル、ならびにバクテリオファージ誘発性リーキーガット症候群（腸管壁浸漏症候群）後のＣＳＦおよび脳における神経炎症のレベルに対する、高活性アクチン耐性ＤＮａｓｅ  Ｉ導入遺伝子の筋肉および肝臓送達の効果、および野生型ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質の注射の効果をさらに調査した。
【０３２８】
健康な成体の雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝２４；ｌ２週齢、２４０〜２８０ｇ）を、２２〜２５℃の温度および６０±５％の大気湿度で、ｌ２時間の明／暗サイクルの下、Ｐ３実験室の個々のケージで維持した。実験動物の管理と使用のためのガイドにしたがい、すべての動物は食餌と水に自由にアクセスできた。
【０３２９】
ＤＮａｓｅ  Ｉ分泌シグナル配列がＩＬ２分泌シグナル配列に置き換えられた高活性アクチン耐性ＤＮａｓｅ  Ｉ変異体（配列番号５）をコードするＤＮＡ分子を合成し（ＧｅｎｅＣｕｓｔ）、ＥＦ１ａプロモーター（肝臓特異的ではない）の制御下でｐＬＶ２レンチウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。得られた構築物はｐＬＶ２−ＩＬ２ｓｓ−ＤＮａｓｅＩ  ｍｕｔであり、図９に示されている。２９３Ｔレンチウイルスパッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ｐＬＶ２ベースのレンチウイルスベクターｐＬＶ２−ＩＬ２ｓｓ−ＤＮＡｓｅＩ  ｍｕｔをＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、５ｍｌの上清を回収した。０．４５μｍのポリエーテルスルホンメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、２０，０００ｇで３０分間遠心分離して、レンチウイルスを収集した。得られたペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。
【０３３０】
２４匹のラットにおいて、細菌叢病を誘発するように、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ブドウ球菌科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、およびレンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に対するバクテリオファージカクテルを用いてリーキーガット（腸管壁浸漏）を誘発した。カクテルには、Ｍｉｃｒｏｇｅｎ（モスクワ、ロシア）のサルモネラバクテリオファージカクテル［パラチフス菌（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ハイデンベルグ（Ｓ．ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、サルモネラ・ニューポート（Ｓ．ｎｅｗｐｏｒｔ）、サルモネラ・コレレスイス（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・オラニエンブルグ（Ｓ．ｏｒａｎｉｅｎｂｕｒｇ）、サルモネラ・インファンティス（Ｓ．ｉｎｆａｎｓ）、サルモネラ・ダブリン（Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・アナツム（Ｓ．ａｎａｔｕｍ）、およびサルモネラ・ニューランズ（Ｓ．ｎｅｗｌａｎｄｓ）を含有する］、ならびにＭｉｃｏｇｅｎのピオバクテリオファージ（Ｐｙｏｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）カクテル［７つの細菌種、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ヴルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に対するバクテリオファージを含有する］が含まれる。製造元の指示に従って、ファージ（１．５ｍＬ、１×１０６プラーク形成単位／ｍＬの各ファージカクテル）を飲料水に加え、１０日間経口投与した。ファージ処置の７日目に、ラットを次のように４つの群に無作為に分けた：６匹のラットは、２００μｌの容量の１．０ｘ１０１２ＬＶＰの肝臓内注射を受けた；６匹のラットは、２００μｌの容量の１．０ｘ１０１２ＬＶＰの大腿筋への注射を受けた；６匹のラットは、７日目と１２日目の間に５０ｍｇ／ｋｇで組換えＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質の静脈内注射を１日２回受けた。残りの６匹のラットは、未処置のリーキーガット対照とした。さらに６匹の健康なラットを健康対照として使用した。１２日目に、すべてのラットを屠殺し、血液のＤＮａｓｅ活性を測定するために血液サンプルを収集した。脳の剖検を収集して、ＮＬＲＰ３インフラマソーム発現分析および１６Ｓユニバーサル細菌ＲＮＡ遺伝子定量を行った。
【０３３１】
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、神経炎症の発症の主要な原因と考えられている。ＮＬＲＰ３インフラマソームシグナル伝達の異常な活性化は、幅広い神経疾患の病理に寄与することが実証されている（Ｓｏｎｇ，２０１７）。ＮＬＲＰ３の発現は、５０ｍｇの皮質組織サンプルの収集によって評価した。ＲＮＡは、ＳＶ総ＲＮＡ分離システム（SV total RNA isolation system）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。フォワードＮＬＲＰ３プライマーとして５’−ＧＴＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＴ−３’（配列番号１１）を使用しかつリバースＮＬＲＰ３プライマーとして５’−ＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１２）を使用する逆転写酵素−ＰＣＲに、プラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩワンステップＲＴ−ＰＣＲシステムを使用した。１６Ｓユニバーサル細菌ＲＮＡ遺伝子プライマー（フォワード：５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ−３’（配列番号１３）；リバース：５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ−３’（配列番号１４））を使用して、肝臓および脳における微生物起源のＤＮＡの存在を定量化した。遺伝子発現解析は、比較Ｃｔ法を使用して行った。
【０３３２】
血清ＤＮａｓｅ  Ｉ活性は、製造元のプロトコルに従ってＯＲＧ５９０（Ｏｒｇｅｎｔｅｃ）を使用して測定した。検出は、マイクロプレート光度計（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＦＣ）を使用して、補正波長６２０ｎｍを用いて４５０ｎｍで行った。結果を以下の表９にまとめる：
【表９】
2021510539.tif 000011
【０３３３】
データは、リーキーガットの誘発が、内因性血液ＤＮａｓｅ酵素活性の抑制、肝臓および脳皮質における微生物ｃｆＤＮＡの存在の有意な増加、および脳皮質組織におけるＮＬＲＰ３インフラマソーム成分の有意なアップレギュレーションにつながることを示す。中心血流で同等のＤＮａｓｅ酵素活性が維持されているにもかかわらず、同じ導入遺伝子の筋肉組織への送達やＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質の静脈内注射と比較して、高活性アクチン耐性ＤＮａｓｅ  Ｉレンチウイルス導入遺伝子の肝臓への送達は、肝臓および脳における微生物ｃｆＤＮＡの増加および脳インフラマソームの活性化をほぼ完全に防いだ。
【０３３４】
実施例８：ＧＶＨＤに対する高活性アクチン耐性ＤＮａｓｅ  Ｉのトランスジェニック送達および組換えＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質の静脈内送達の効果
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）からＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）へのＭＨＣクラスＩおよびＩＩの異種モデルを使用してＧＶＨＤを確立した。すべてのレシピエントは、骨髄移植（ＢＭＴ）時の年齢が２〜６か月の年齢をマッチさせた雌であった。骨髄細胞および脾細胞の単細胞懸濁液を注射用生理食塩水で調製した。ＢＭＴキメラを作成するために、レシピエントのＢＡＬＢ／ｃマウスに、１２００ｒａｄのＴＢＩ（１３７Ｃｓ線源）を２回の照射に分けて与えた。次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの細胞：５×１０６の骨髄細胞および１０ｘ１０６の脾細胞：をマウスに投与した。
【０３３５】
次の２つの処置を比較するために実験を設計した：野生型マウスＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質（５０ｍｇ／ｋｇ）を毎日；および肝臓特異的野生型マウスＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８ベクターを単回静脈内注射として。ＢＭＴと同じ日に開始し、レシピエントを、１日２回ＩＰ経路によりＤＮａｓｅ  Ｉで処置するか、または１．００ｘ１０１１ＧＣ／ｋｇ用量でのＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８の単回静脈内送達により処置した。組織病理学的分析のために、移植後１６日目にマウスを屠殺した。組織を１０％ホルマリンに入れ、パラフィンに包埋し、切片にしてヘマトキシリンとエオシンで染色した。ドナー由来の脾臓Ｔ細胞（ＳＰ）、末梢リンパ節（ＰＬＮ）、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）およびパイエル板（ＰＰ）を、移植後１６日目にレシピエントマウスから採取した。これらの組織から回収された細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＨ−２Ｄｂ抗体で染色した。ドナー由来のＴ細胞（Ｈ−２Ｄｂ＋）ならびにＣＤ４＋／Ｈ−２Ｄｂ＋およびＣＤ８＋／Ｈ−２Ｄｂ＋サブセットの数をＦＡＣＳで決定した。
【０３３６】
生存データを以下の表１０に示す：
【表１０】
2021510539.tif 000012
【０３３７】
ＤＮａｓｅ  Ｉ処置レシピエントマウスおよびＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８処置レシピエントマウスの肝臓の病理組織学のデータを図７に示す。左パネルは、ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質のみ（ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８ではなく）で処置した動物の門脈管のリンパ形質細胞の浸潤、胆管上皮細胞の部分的損失、肝細胞の巣状壊死の領域、および血管界面におけるかなりの量の求核物質を示す。右パネルは、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８で処置した動物の肝臓では、炎症細胞密度がはるかに低く、壊死がなく、血管界面における求核物質がはるかに少ないことを示す。
【０３３８】
ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質処置レシピエントマウスおよびＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８処置レシピエントマウスにおけるドナー由来のＴ細胞に関するデータを図８に示す。特に、図８は、ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質処置レシピエントと比較して、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８処置レシピエントにおいて、末梢リンパ節（ＰＬＮ）、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）およびパイエル板（ＰＰ）でのドナー由来Ｔ細胞の総数、ドナー由来ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が有意に減少したことを示す。
【０３３９】
結果は、ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の肝臓特異的トランスジェニック発現により、ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質処置と比較して、動物の生存率が倍増することを示す。このような生存率の向上は、ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質で処置したレシピエントと比較して、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８で処置したレシピエントのＰＬＮ、ＭＬＮおよびＰＰにおけるドナー由来Ｔ細胞の総数、ドナー由来ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な減少を伴っていた。肝臓において、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｍＡＦＰ／Ａｌｂ  ＡＡＶ８処置は、門脈管のリンパ形質細胞の浸潤の有意な減少、細胞損失の防止、および求核物質の血管界面からのクリアランスをもたらした。
【０３４０】
実施例９：ＡＡＶベクター：ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１３ＡＤ）のクローニング
ＡＡＶプロモーターレス発現ベクターｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プロモーターレスは、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  ｌａｂｓ（カタログ番号  ＶＰＫ−４１１；図１１）から得た。ＩＴＲの完全性を、ＳｍａＩ制限酵素消化を行った後でゲル精製を行い、予想される次のバンド：２６８１ｂｐ、６６６ｂｐ、および１１２ｂｐの存在を評価して確認した。予想される１１ｂｐバンドは見られない。予想されるバンドが存在する場合、プラスミドはＳＵＲＥ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または他の同様の細菌内で成長することにより増幅された。配列番号３０の配列（ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ）に５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を加えた。配列番号３０のポリヌクレオチド（５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する）を合成し、次いでＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ（ＮＥＢから入手可能）で消化した。２．２ｋｂのバンドをゲル抽出した。ｐＡＡＶ−ＭＣＳプロモーターレスベクターをＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦで消化し、得られた３．５ｋｂのバンドをゲル抽出した。消化されたベクターと配列番号３０のポリヌクレオチド（インサート）を、３：１のインサート対ベクターのモル比で、室温で１時間ライゲーションした。ライゲーションした構築物をＳＵＲＥエレクトロコンピテントセルに形質転換し、ＬＢ−寒天（Ａｍｐ）プレートにプレーティングした。コロニーを選択し、スクリーニングのためにミニプレップを準備した。最初に、ＩＴＲの完全性のためにＳｍａＩ消化を行って、予想される次のバンド：２６８１ｂｐ、１６５０ｂｐ、および１３１１ｂｐが存在するかどうかを確認した。次に、ＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ消化を行って、インサートが存在するかどうかを評価した。インサートが存在する場合、３４３５ｂｐおよび２２１８ｂｐのバンドが見られる。ＶＲ−１８０１３ＡＤベクターのマップを図１０Ｂに示す。
【０３４１】
ＳｍａＩ消化物、ならびにＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ消化物のそれぞれに予想されるバンドが存在する場合にクローンを選択した。選択したクローンについて、グリセロールストックを長期保存用に調製した。プラスミドを増幅させ、配列決定した。次に、正しい配列のプラスミドを含むクローンを培養し、エンドフリーのＧｉｇａｐｒｅｐ（ＡＬＴＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。精製されたプラスミドは、ＭＥＥによるＡＡＶカプシドへのパッケージングに適していた。
【０３４２】
実施例１０：ＡＡＶベクター：ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１４ＡＤ）のクローニング
ＡＡＶプロモーターレス発現ベクターｐＡＡＶ−ＭＣＳ−プロモーターレスはＣｅｌｌ  Ｂｉｏ  ｌａｂｓ（カタログ番号  ＶＰＫ−４１１；図１１）から得た。ＩＴＲの完全性を、ＳｍａＩ消化、およびゲル精製してプラスミドが予想される２６８１ｂｐ、６６６ｂｐ、および１１２ｂｐのバンドを生成するかどうかを評価して確認した。予想される１１ｂｐバンドは見られない。予想されるバンドが存在する場合、プラスミドはＳＵＲＥ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または他の同様の細菌内で成長することにより増幅された。配列番号３１の配列（ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ）に、５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を加えた。配列番号３１のポリヌクレオチド（５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する）を合成し、次いでＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ（ＮＥＢから入手可能）で消化した。２．２ｋｂのバンドをゲル抽出した。ｐＡＡＶ−ＭＣＳプロモーターレスベクターをＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦで消化し、得られた３．５ｋｂのバンドをゲル抽出した。消化されたベクターと配列番号３１のポリヌクレオチド（インサート）を、３：１のインサート対ベクターのモル比で、室温で１時間ライゲーションした。ライゲーションした構築物をＳＵＲＥエレクトロコンピテントセルに形質転換し、ＬＢ−寒天（Ａｍｐ）プレートにプレーティングした。コロニーを選択し、スクリーニングのためにミニプレップを準備した。最初に、ＩＴＲの完全性のためにＳｍａＩ消化を行って、予想される次のバンド：２６８１ｂｐ、１６５０ｂｐ、および１３１１ｂｐが存在するかどうかを確認した。次に、ＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ消化を行って、インサートが存在するかどうかを評価した。インサートが存在する場合、３４３５ｂｐおよび２２１８ｂｐのバンドが見られる。ＶＲ−１８０１４ＡＤベクターのマップを図１０Ｃに示す。
【０３４３】
Ｓｍａｌ消化物、ならびにＥｃｏＲＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ消化物のそれぞれに予想されるバンドが存在する場合にクローンを選択した。選択したクローンについて、グリセロールストックを長期保存用に調製した。プラスミドを増幅させ、配列決定した。次に、正しい配列のプラスミドを含むクローンを培養し、エンドフリーのＧｉｇａｐｒｅｐ（ＡＬＴＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。精製されたプラスミドは、ＭＥＥによるＡＡＶカプシドへのパッケージングに適していた。
【０３４４】
実施例１１：ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１３ＡＤ）およびＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ  ＡＡＶベクター（ＶＲ−１８０１４ＡＤ）の製造
ＶＲ−１８０１３ＡＤおよびＶＲ−１８０１４ＡＤ発現プラスミドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ  ０８８５４、ＵＳＡ）によって製造された。対応するｈＤＮＡｓｅ  Ｉ（高活性）ＶＲ−１８０１３ＡＤ  ＡＡＶベクターおよびｈＤＮＡｓｅＩ（野生型）ＶＲ−１８０１４ＡＤ  ＡＡＶベクターは、ＨＥＫ２９３細胞のコンフルエントに近い単層でのＡｎｃ８０Ｌ６５  ＡＡＶ  ｃｉｓ、ＡＡＶ  ｔｒａｎｓ、およびアデノウイルスヘルパープラスミドの大規模なポリエチレンイミントランスフェクションを使用し、さらに従来のプロトコルを使用して大規模なイオジキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配で精製して作成した。精製したＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１３ＡＤ；ＶＲ−１８０１３ＡＤの導入遺伝子カセットは、配列番号３０の配列を含んでいた；図１０Ｂのベクターマップを参照）およびＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１４ＡＤ（図１０Ｃに示すマップ；ベクターの導入遺伝子カセットは配列（配列番号３１）を有していた））ベクターを、３５ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．００１％ＰＦ６８を補足したＰＢＳ中に再構成し、それは１．０ｘ１０１３ＧＣ／ｍｌ（ＶＲ−１８０１４ＡＤ）および５．０ｘ１０１２ＧＣ／ｍｌ（ＶＲ−１８０１３ＡＤ）を含む。
【０３４５】
精製したＶＲ−１８０１３ＡＤ  ＡＡＶベクターをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、結果を図１２に示す。６０、７２、および９０ｋＤａの３つのバンドが、約１：１：１０の比率で観察され、これはＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３タンパク質に対応する。
【０３４６】
形質導入のために、ＶＲ−１８０１４ＡＤおよびＶＲ−１８０１３ＡＤを、組換えＶＲ−１８０１４ＡＤおよびＶＲ−１８０１３ＡＤ粒子の無菌で透明な無色の高度に精製された溶液として調製した。
【０３４７】
実施例１２：ＡＡＶベクター：ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１３ＡＤ）およびＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１４ＡＤ）の肝臓特異的形質導入
次の２つの遺伝子治療ベクター：ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  ＸｉｎａｃｔおよびＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型）−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ：の形質導入効率を試験した。これらの遺伝子治療ベクター候補を、ＨＥＰ  Ｇ２ヒトヘパトーマ由来細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）および内皮由来のＳＫ−ＨＥＰ１ヒト肝腺がん（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−５２）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【０３４８】
細胞を５×１０５細胞／ｍｌで４８ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ  Ａｄｖ、１０％ＦＢＳ培地で増殖させた。播種の２４時間後、ＭＯＩ  １０４ＧＣ／細胞、１０５ＧＣ／細胞および１０６ＧＣ／細胞、またはブランク対照を使用して、ＶＲ−１８０１３ＡＤまたはＶＲ−１８０１４ＡＤをウェルに加えた。各ウェルを三重で作成した。
【０３４９】
ＤＮａｓｅ活性は、蛍光色素およびクエンチャーで標識したヘアピンオリゴヌクレオチドを表す蛍光プローブ（Ｔｅｒｅｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１７；ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｐｎａｓ／１１４／１０／２５５０．ｆｕｌｌ．ｐｄｆ）を使用して分析した。蛍光の増加を、Ｖａｒｉｓｃａｎ  Ｆｌａｓｈプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して監視した。反応緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および０．３ｍＭ  ＣａＣｌ２）で培養培地を２０〜２００倍に希釈した。０．２５μＭ濃度の蛍光プローブを使用した。反応条件下での蛍光プローブの完全な加水分解により、アッセイ条件下で２８ＲＦＵの蛍光が得られた。バックグラウンドプローブの蛍光は０．３ＲＦＵ未満であった。ＤＮａｓｅ濃度の推定のための検量線は、純粋なＤＮａｓｅ  Ｉ  Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）「Ｄｏｒｎａｓｅ  ａｌｆａ」（Ｒｏｃｈｅ）の連続希釈を使用して得た。サンプルのＤＮａｓｅ濃度は、線形回帰を使用して推定した。データを図１３Ａおよび１３Ｂに示す。
【０３５０】
図１３Ａおよび１３Ｂのデータは、ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１３ＡＤ）およびＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（野生型−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１４ＡＤ）ベクターが、肝細胞由来の細胞のみを効率的に形質導入し、形質導入されたＧ２細胞からの生物学的に強化されたＤＮａｓｅ  Ｉ酵素または野生型ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の高収量の発現および分泌を引き起こすことを示す。ＤＮａｓｅ濃度の推定は、純粋なＤＮａｓｅ  Ｉ  Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）「Ｄｏｒｎａｓｅ  ａｌｆａ」（Ｒｏｃｈｅ）の連続希釈を使用して得られた。７２時間の観察期間中、ＶＲ−１８０１３ＡＤおよびＶＲ−１８０１４ＡＤの最高用量の１０６ＧＣ／細胞でさえ細胞死の兆候がなく、また形質導入された細胞と対照細胞との間に形態学的差異がないため、形質導入は細胞にとって安全であると思われる。
【０３５１】
実施例１３：アルツハイマー病の処置のためのＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ（ＶＲ−１８０１３ＡＤ）
ＶＲ−１８０１３ＡＤ（ＡｐｏＥＨＣＲエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーター−ｈＤＮａｓｅＩ（高活性）正リーダー−ＷＰＲＥ  Ｘｉｎａｃｔ）の単回ＩＶ注射の治療効果を、３つの変異ヒト導入遺伝子：プレセニリン（ＰＳ）１（Ｍ１４６Ｖ）、βＡＰＰ（スウェーデン型突然変異）およびタウ（Ｐ３０１Ｌ）を発現する３ｘＴｇ−ＡＤマウスで試験した。これらトランスジェニックマウスは、アミロイドとタウの両方の病状を発症する。
【０３５２】
学習および記憶障害に対するＶＲ−１８０１３ＡＤの効果は、次の行動試験を実施することによって評価した：１）Ｙ迷路交替試験、これは空間作業記憶を測定し、辺縁系および非辺縁系経路の完全性に依存する；および２）文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ）、これは海馬と扁桃体の機能に大きく依存するが、皮質にも依存する。
【０３５３】
この試験の目的は、免疫組織化学染色により、３ｘＴｇ−ＡＤでのアミロイド沈着およびタウのリン酸化に対するＶＲ−１８０１３ＡＤのＩＶ注射の効果を定量化することであった。タウの過剰リン酸化に対するＶＲ−１８０１３ＡＤの効果を、ＡＤ患者の最も初期のリン酸化タウのエピトープの１つであるｐＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５エピトープに特異的なＡＴ８  ｍＡｂ抗体を使用して３ｘＴｇ−ＡＤマウスで試験した。総タウも処置および非処置の３ｘＴｇ−ＡＤマウスで決定した。ミクログリアの過剰活性化は非常に有害な神経毒性効果を誘発する可能性がある；したがって、ミクログリア応答の減衰は、ＡＤの潜在的な治療アプローチとして提案されている。
【０３５４】
実験計画を以下の表１１に要約する：
【表１１】
2021510539.tif 000013
【０３５５】
０日目に、以下の群のマウスに処置を施した：（ａ）１３匹の６か月齢の野生型（ＷＴ）マウスにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射した；（ｂ）１５匹の６ヶ月齢の３ｘＴｇ−ＡＤマウスにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみを注射した；（ｃ）１０匹の６か月齢の３ｘＴｇ−ＡＤマウスにＶＲ−１８０１３ＡＤを１．０ｘ１０１１ＧＣ／マウス用量で注射した。データを以下のようにまとめる。図１４において、Ｙ迷路行動試験は、３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと対比して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスでわずかな改善を示す。図１５において、文脈的恐怖条件付け試験の結果は、３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと比較して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスでわずかな改善を示す。図１６のデータは、３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと比較して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスにおいて、特に脳の皮質領域で、ミクログリアの活性化が有意に低減されたことを示す。
【０３５６】
図１７のデータは、３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと対比して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスの皮質脳領域においてミクログリアの活性化が有意に低減されたことを示す。図１８のデータは、ＶＲ−１８０１３ＡＤで処置することにより、３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと対比して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスにおけるアミロイド沈着が有意に減少することを示す。図１９のデータは、ＶＲ−１８０１３ＡＤで処置することにより、３ｘＴｇ−ＡＤ対照マウスと対比して、ＶＲ−１８０１３ＡＤ処置３ｘＴｇ−ＡＤマウスにおいて過剰リン酸化タウ沈着が有意に減少することを示す。図２０の写真は、ＶＲ−１８０１３ＡＤで処置した後の海馬領域におけるｐ−ｔａｕ（リン酸化タウ）の有意な減少を示す。要約すると、ＶＲ−１８０１３ＡＤの単回ＩＶ注射は、アルツハイマー病のマウスモデルで有意な治療活性を示す。
【０３５７】
実施例１４：がん性腹膜炎の処置としてのＶＲ−１８０１４ＡＤ
ＩＢＣ  ＨＲＡＳ品種の１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（２０〜２２ｇ）を、２０〜２２℃の制御された温度で飼育した。１日目に、マウスに５×１０５のＣＴ２６  ＮＮＵ誘導未分化結腸がん細胞を含む２００μｌの細胞懸濁液を腹腔内注射した。腫瘍移植後６日目に、マウスを対照群（６匹のマウス、ＰＢＳの単回ＩＶ注射）または処置群（６匹のマウス、ＶＲ−１８０１４ＡＤの１．０ｘ１０１１ＧＣ／マウス用量での単回ＩＶ注射）に無作為に割り当てた。腫瘍細胞接種後１６日目にマウスを安楽死させた後、各群において腫瘍結節の形態計測評価および数の測定を行った。対照群のマウスは、マウスあたり１４〜２２個の腫瘍結節を有し、結節の一部が凝集塊を形成していた。対照的に、ＶＲ−１８０１４ＡＤ処置マウスは、凝集体形成の兆候がなく、より小さなサイズの２〜５個の結節しかなかった。対照およびＶＲ−１８０Ｌ４ＡＤ処置マウスの典型的な形態計測画像を図２１に示す。
【０３５８】
実施例１５：リーキーガット（腸管壁浸漏）を誘発したマウスから抽出したＣｆＤＮＡはタウ凝集を誘発し、肝臓特異的ＤＮａｓｅ遺伝子導入はｃｆＤＮＡがタウ凝集を誘発する能力を抑制する
凝集したタウタンパク質は、アルツハイマー病を含む２０以上の神経障害に関連している。実施例７に記載するように、１８匹のラットでリーキーガットを誘発した。試験ベクターおよび組成物を、以下の表１２に示す所定のレジメンに従ってラットに投与した：
【表１２】
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【０３５９】
ｃｆＤＮＡ抽出は次のように行った。末梢血サンプル（５ｍｌ）を心穿刺によりセルフリーＤＮＡ  ＢＣＴチューブに収集した。最初に４℃、８００ｇで１０分間遠心して血漿を細胞画分から分離した。血漿をさらに４℃、１３，０００ｇで１０分間遠心分離してペレット化し、残った細胞をすべて除去した後、ＤＮＡ抽出まで−８０℃で１ｍｌのアリコートで保存した。
【０３６０】
ｃｆＤＮＡ抽出には、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用した。
【０３６１】
タウ凝集に対するｃｆＤＮＡの評価を行った。全長ヒトタウ（４Ｒ２Ｎ）を使用した。アッセイでは、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中の２．５μＭヘパリンの存在下で、１ｍｇ／ｍｌのタウモノマーを含む溶液を、２５μｌの抽出されたｃｆＤＮＡの存在下で、２０℃で周期的に攪拌しながらインキュベートした（５００ｒｐｍでの１分間の振とう後、振とうせずに２９分間）。総サンプル量は２００μｌであった；溶液は５μＭのチオフラビンＴも含んでいた。ＴｈＴ蛍光（励起４３５ｎｍ、発光４８５ｎｍ）により凝集を経時的に追跡した。
【０３６２】
結果を以下の表１３にまとめる。３つの複製の平均とＳＥＭの両方を示す。
【表１３】
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【０３６３】
表１３のデータは、ＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の肝臓特異的トランスジェニック発現はリーキーガットの動物の血液から抽出されたｃｆＤＮＡがタウ凝集を促進する能力を有意に抑制するが、一方、組換えＤＮａｓｅＩ酵素の注射ならびにＤＮａｓｅ  Ｉ酵素の非肝臓特異的トランスジェニック発現の使用はあまり効果的でないことを明確に示す。
【参考文献】
【０３６４】
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【０３６５】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によってその範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０３６６】
本明細書で引用されるすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
2021510539.tif 000022
【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
2021510539.tif 000024
【図２Ｉ】
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【図３】
2021510539.tif 000026
【図４】
2021510539.tif 000027
【図５Ａ】
2021510539.tif 000028
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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