(57)【要約】本発明は、血友病の治療法に使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡを提供する。血友病を治療するための方法を必要とする患者の血友病を治療するための方法であって、本発明によるｓｉＲＮＡを含む分子を患者に投与することを含む方法、および血友病を予防または治療するための剤形であって、本発明によるｓｉＲＮＡを含む分子を含む剤形も、本発明の範囲内である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血友病の治療法に使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡは、１７〜２４個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の血友病の治療法で使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号００１または配列番号００２に逆相補的な配列により特徴付けられる、請求項１または２に記載の血友病の治療法で使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、配列番号０１４、配列番号０１５、配列番号０１６、配列番号０１７、および配列番号０１８を含む群から選択される配列に逆相補的な配列により特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の血友病の治療法で使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１〜１００、１０１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、３０１〜４００、４０１〜５００、５０１〜６００、６０１〜７００、７０１〜８００、８０１〜９００、９０１〜１０００、１００１〜１１００、１１０１〜１２００、１２０１〜１３００、１３０１〜１４００、１５０１〜１６００、１７０１〜１８００、１８０１〜１９００、１９０１〜２０００、２００１〜２１００、２１０１〜２２００、２２０１〜２３００、２３０１〜２４００、２５０１〜２６００、２７０１〜２８００、２８０１〜２９００、２９０１〜３０００、３００１〜３１００、３１０１〜３２００、３２０１〜３３００、３３０１〜３４００、３４０１〜３５００、または３５０１〜３５８０により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の血友病の治療法で使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号０１９（ｓｉＲＮＡ＿１）、配列番号０２０（ｓｉＲＮＡ＿２）、配列番号０２１（ｓｉＲＮＡ＿３）、配列番号０２２（ｓｉＲＮＡ＿４）、配列番号０２３（ｓｉＲＮＡ＿５）、配列番号０２４（ｓｉＲＮＡ＿６）、配列番号０２５（ｓｉＲＮＡ＿７）、配列番号０２６（ｓｉＲＮＡ＿８）、配列番号０２７（ｓｉＲＮＡ＿９）、配列番号０２８（ｓｉＲＮＡ＿１０）、配列番号０２９（ｓｉＲＮＡ＿１１）、配列番号０３０（ｓｉＲＮＡ＿１２）、配列番号０３１（ｓｉＲＮＡ＿１３）、配列番号０３２（ｓｉＲＮＡ＿１４）、配列番号０３３（ｓｉＲＮＡ＿１５）、配列番号０３４（ｓｉＲＮＡ＿１６）、配列番号０３５（ｓｉＲＮＡ＿１７）、配列番号０３６（ｓｉＲＮＡ＿１８）、配列番号０３７（ｓｉＲＮＡ＿１９）、配列番号０３８（ｓｉＲＮＡ＿２０）、配列番号０３９（ｓｉＲＮＡ＿２１）、配列番号０４０（ｓｉＲＮＡ＿２２）、配列番号０４１（ｓｉＲＮＡ＿２３）、配列番号０４２（ｓｉＲＮＡ＿２４）、配列番号０４３（ｓｉＲＮＡ＿２５）、配列番号０４４（ｓｉＲＮＡ＿２６）、配列番号０４５（ｓｉＲＮＡ＿２７）、配列番号０４６（ｓｉＲＮＡ＿２８）、配列番号０４７（ｓｉＲＮＡ＿２９）、配列番号０４８（ｓｉＲＮＡ＿３０）、配列番号０４９（ｓｉＲＮＡ＿３１）、配列番号０５０（ｓｉＲＮＡ＿３２）、配列番号０５１（ｓｉＲＮＡ＿３３）、配列番号０５２（ｓｉＲＮＡ＿３４）、配列番号０５３（ｓｉＲＮＡ＿３５）、配列番号０５４（ｓｉＲＮＡ＿３６）、配列番号０５５（ｓｉＲＮＡ＿３７）、配列番号０５６（ｓｉＲＮＡ＿３８）、配列番号０５７（ｓｉＲＮＡ＿３９）、配列番号０５８（ｓｉＲＮＡ＿４０）、配列番号０５９（ｓｉＲＮＡ＿４１）、配列番号０６０（ｓｉＲＮＡ＿４２）、配列番号０６１（ｓｉＲＮＡ＿４３）、配列番号０６２（ｓｉＲＮＡ＿４４）、配列番号０６３（ｓｉＲＮＡ＿４５）、配列番号０６４（ｓｉＲＮＡ＿４６）、配列番号０６５（ｓｉＲＮＡ＿４７）、配列番号０６６（ｓｉＲＮＡ＿４８）、配列番号０６７（ｓｉＲＮＡ＿４９）、および配列番号０６８（ｓｉＲＮＡ＿５０）を含む群から選択される配列を含むかまたはからなる配列により特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の血友病の治療法で使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡは、プロテインＳのイントロン配列に対して向けられている、請求項１または２に記載の血友病の治療法で使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
血友病Ａの治療法に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
血友病Ｂの治療法に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロテインＳに対するｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
血友病を治療するための方法を必要とする患者の、血友病を治療するための方法であって、前記患者に、請求項の１〜９のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡを含む分子を投与することを含む方法。
【請求項１１】
血友病を予防または治療するための剤形であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡを含む分子を含む剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＳに対して向けられるｓｉＲＮＡを使用した血友病の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａ（ＨＡ）および血友病Ｂ（ＨＢ）は、遺伝性Ｘ連鎖障害である。それらは、内因性凝固経路の必須成分であるコード化タンパク質の欠損に結び付く、それぞれ第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（Ｆ８）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）遺伝子（Ｆ９）の突然変異により引き起こされる（図１Ａ）。
【０００３】
重症血友病の患者は、関節血症などの筋骨格系内の特発性出血を患うことが多い。これは、治療しないでおくと若年年齢で身体障害をもたらす場合がある。
【０００４】
現行の血友病治療は、因子補充療法を含む。この療法は、生活の質（ＱｏＬ）を向上させるが、幾つかの欠点が残る。因子は、静脈内投与されるが、半減期が短いため反復して注入されなければならならず、これは、患者にとって非常に苦痛であり、感染および静脈損傷のリスクがある処置である。より重要なことには、因子補充療法下の患者は、阻害性同種抗体を発生させる場合がある。阻害物質は、補充療法の効果をなくし、安全で有効な標準治療への患者アクセスを制限し、患者の罹患および死亡リスクを増加させ易い。
【０００５】
新しい療法は、予防的注入の頻度を減少させ、したがって療法への順守およびＱｏＬを両方とも向上させることが可能な製品の開発に焦点を当てている。持続的なＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの他に、新規手法は、血友病の患者における凝固のリバランス戦略として、内因性凝固因子の産生に必要な遺伝子の補充、欠失因子の凝固機能を模倣する二重特異性抗体技術、および組織因子経路阻害物質（ＴＦＰＩ）または抗トロンビンなどの凝固阻害物質の標的化を含む。最近、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）特異的セルピンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトロンビン生成をレスキューし、血友病マウスモデルにおいて止血を回復させることが示された。
【０００６】
上記で言及した技術水準に基づき、本発明の目的は、血友病の新規治療を提供するための手段および方法を提供することである。この目的は、本明細書の請求項により達成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の第１の態様は、血友病の治療法に使用するためのプロテインＳに対するｓｉＲＮＡを提供する。
【０００８】
用語「血友病」は、本明細書の状況では、血餅を作る身体の能力が損なわれている状態に関する。血友病の遺伝的形態としては、遺伝的障害血友病Ａ、血友病Ｂ、および血友病Ｃが挙げられる。
【０００９】
プロテインＳは、本明細書の状況では、遺伝子ＰＲＯＳ１（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５６２７）によりコードされるヒト「ビタミンＫ依存性プロテインＳ」（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０７２２５）に関する。
【００１０】
ヒトプロテインＳには、２つの転写バリアントが存在する。転写バリアント２は、転写バリアント１と比較して、５’コード領域の選択的インフレームエクソンを欠如する。コード化アイソフォーム２は、アイソフォーム１よりも短い。転写バリアント２は配列番号００１により特徴付けられる。転写バリアント１は配列番号００２により特徴付けられる。
【００１１】
用語「ｓｉＲＮＡ（低分子／短鎖干渉ＲＮＡ）」は、本明細書の状況では、ＲＮＡ干渉と呼ばれるプロセスにおいて、ｓｉＲＮＡの配列に相補的な核酸配列を含む遺伝子の発現に干渉する（言い換えれば、発現を防止する）ことが可能なＲＮＡ分子に関する。用語「ｓｉＲＮＡ」は、一本鎖ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ｓｉＲＮＡを両方とも包含することが意図されている。ＳｉＲＮＡは、通常は、１７〜２４ｂｐの長さであることにより特徴付けられる。二本鎖ｓｉＲＮＡは、より長鎖の二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）に由来する。長鎖ｄｓＲＮＡは、エンド−リボヌクレアーゼ（ダイサーと呼ばれる）により切断されて、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。二本鎖ｓｉＲＮＡは、核タンパク質複合体（ＲＩＳＣと呼ばれる）で解かれて、一本鎖ｓｉＲＮＡが形成される。ＲＮＡ干渉は、ｓｉＲＮＡ分子が、相補的配列を有するｍＲＮＡ分子に結合することにより作用して、ｍＲＮＡ分子の分解をもたらすことが多い。ＲＮＡ干渉は、ｓｉＲＮＡ分子が、細胞の核内のｍＲＮＡ前躯体（未成熟の未スプライスｍＲＮＡ）のイントロン配列に結合し、ｍＲＮＡ前躯体の分解をもたらすことによっても可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、プロテインＳ（ＰＳ）の標的化が、凝固のリバランスにより血友病において止血を促進することができるか否かを調査した（図１Ｂ）。ＰＲＯＳ１遺伝子によりコードされるＰＳは、第Ｖａ因子（ＦＶａ）およびＦＶＩＩＩａの不活化におけるＡＰＣの、およびＦＸａの阻害におけるＴＦＰＩのコファクターとして作用する。この二重の役割により、ＰＳは、トロンビン生成の重要な制御因子となる。
【００１３】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１７〜２４個のヌクレオチドを含む。
【００１４】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１８〜２２個のヌクレオチドを含む。
【００１５】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１９個のヌクレオチドを含む。
【００１６】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００１７】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００２に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００１８】
ある実施形態では、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、配列番号０１４、配列番号０１５、配列番号０１６、配列番号０１７、および配列番号０１８を含む群から選択される配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００１９】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００３に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２０】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００４に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２１】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００５に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２２】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００６に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２３】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００７に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２４】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００８に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２５】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００９に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２６】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１０に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２７】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１１に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２８】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１２に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００２９】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１３に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３０】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１４に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３１】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１５に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３２】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１６に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３３】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１７に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３４】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１８に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３５】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、上記で画成される配列の任意の２つの連続配列を並置することにより形成される配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。非限定的な例では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１４および配列番号０１５を並置することにより形成される配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３６】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１４（エクソン１２）、配列番号０１１（エクソン９）、配列番号００６（エクソン４）、配列番号０１２（エクソン１０）、および配列番号０１３（エクソン１１）で構成される群から選択される配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３７】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１〜１００、１０１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、３０１〜４００、４０１〜５００、５０１〜６００、６０１〜７００、７０１〜８００、８０１〜９００、９０１〜１０００、１００１〜１１００、１１０１〜１２００、１２０１〜１３００、１３０１〜１４００、１５０１〜１６００、１７０１〜１８００、１８０１〜１９００、１９０１〜２０００、２００１〜２１００、２１０１〜２２００、２２０１〜２３００、２３０１〜２４００、２５０１〜２６００、２７０１〜２８００、２８０１〜２９００、２９０１〜３０００、３００１〜３１００、３１０１〜３２００、３２０１〜３３００、３３０１〜３４００、３４０１〜３５００、または３５０１〜３５８０により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３８】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１〜１００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００３９】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１０１〜２００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４０】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２０１〜３００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４１】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド３０１〜４００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４２】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド４０１〜５００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４３】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド５０１〜６００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４４】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド６０１〜７００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４５】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド７０１〜８００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４６】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド８０１〜９００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４７】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド９０１〜１０００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４８】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１００１〜１１００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００４９】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１１００〜１２００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５０】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１２０１〜１３００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５１】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１３０１〜１４００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５２】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１４０１〜１５００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５３】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１５０１〜１６００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５４】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１６０１〜１７００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５５】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１７０１〜１８００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５６】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１８０１〜１９００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５７】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド１９０１〜２０００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５８】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２００１〜２１００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００５９】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２１００〜２２００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６０】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２２０１〜２３００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６１】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２３０１〜２４００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６２】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２４０１〜２５００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６３】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２５０１〜２６００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６４】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２６０１〜２７００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６５】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２７０１〜２８００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６６】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２８０１〜２９００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６７】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド２９０１〜３０００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６８】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド３００１〜３１００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００６９】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド３１００〜３２００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００７０】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド３２０１〜３３００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００７１】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド３３０１〜３４００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００７２】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド３４０１〜３５００により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００７３】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１のヌクレオチド３５０１〜３５８０により特徴付けられる配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００７４】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、上記で画成される配列の任意の２つの連続配列を並置することにより形成される配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。非限定的な例では、ｓｉＲＮＡは、配列番号００１の１５０１〜１６００および配列番号００１の１５０１〜１６００を並置することにより形成される配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００７５】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、プロテインＳのイントロン配列に対して向けられる。
【００７６】
ある実施形態では、配列番号０１４（エクソン１２）、配列番号０１１（エクソン９）、配列番号００６（エクソン４）、配列番号０１２（エクソン１０）、および配列番号０１３（エクソン１１）で構成される群から選択される配列に逆相補的な配列により特徴付けられる。
【００７７】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号０１９（ｓｉＲＮＡ＿１）、配列番号０２０（ｓｉＲＮＡ＿２）、配列番号０２１（ｓｉＲＮＡ＿３）、配列番号０２２（ｓｉＲＮＡ＿４）、配列番号０２３（ｓｉＲＮＡ＿５）、配列番号０２４（ｓｉＲＮＡ＿６）、配列番号０２５（ｓｉＲＮＡ＿７）、配列番号０２６（ｓｉＲＮＡ＿８）、配列番号０２７（ｓｉＲＮＡ＿９）、配列番号０２８（ｓｉＲＮＡ＿１０）、配列番号０２９（ｓｉＲＮＡ＿１１）、配列番号０３０（ｓｉＲＮＡ＿１２）、配列番号０３１（ｓｉＲＮＡ＿１３）、配列番号０３２（ｓｉＲＮＡ＿１４）、配列番号０３３（ｓｉＲＮＡ＿１５）、配列番号０３４（ｓｉＲＮＡ＿１６）、配列番号０３５（ｓｉＲＮＡ＿１７）、配列番号０３６（ｓｉＲＮＡ＿１８）、配列番号０３７（ｓｉＲＮＡ＿１９）、配列番号０３８（ｓｉＲＮＡ＿２０）、配列番号０３９（ｓｉＲＮＡ＿２１）、配列番号０４０（ｓｉＲＮＡ＿２２）、配列番号０４１（ｓｉＲＮＡ＿２３）、配列番号０４２（ｓｉＲＮＡ＿２４）、配列番号０４３（ｓｉＲＮＡ＿２５）、配列番号０４４（ｓｉＲＮＡ＿２６）、配列番号０４５（ｓｉＲＮＡ＿２７）、配列番号０４６（ｓｉＲＮＡ＿２８）、配列番号０４７（ｓｉＲＮＡ＿２９）、配列番号０４８（ｓｉＲＮＡ＿３０）、配列番号０４９（ｓｉＲＮＡ＿３１）、配列番号０５０（ｓｉＲＮＡ＿３２）、配列番号０５１（ｓｉＲＮＡ＿３３）、配列番号０５２（ｓｉＲＮＡ＿３４）、配列番号０５３（ｓｉＲＮＡ＿３５）、配列番号０５４（ｓｉＲＮＡ＿３６）、配列番号０５５（ｓｉＲＮＡ＿３７）、配列番号０５６（ｓｉＲＮＡ＿３８）、配列番号０５７（ｓｉＲＮＡ＿３９）、配列番号０５８（ｓｉＲＮＡ＿４０）、配列番号０５９（ｓｉＲＮＡ＿４１）、配列番号０６０（ｓｉＲＮＡ＿４２）、配列番号０６１（ｓｉＲＮＡ＿４３）、配列番号０６２（ｓｉＲＮＡ＿４４）、配列番号０６３（ｓｉＲＮＡ＿４５）、配列番号０６４（ｓｉＲＮＡ＿４６）、配列番号０６５（ｓｉＲＮＡ＿４７）、配列番号０６６（ｓｉＲＮＡ＿４８）、配列番号０６７（ｓｉＲＮＡ＿４９）、および配列番号０６８（ｓｉＲＮＡ＿５０）を含む群から選択される配列を含むかまたはからなる配列により特徴付けられる。
【００７８】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、血友病Ａの治療法で使用するために提供される。
【００７９】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、血友病Ｂの治療法で使用するために提供される。
【００８０】
同様に、血友病を治療するための方法を必要とする患者の血友病を治療するための方法であって、本発明によるｓｉＲＮＡを含む分子を患者に投与することを含む方法は、本発明の範囲内にある。
【００８１】
同様に、血友病を予防または治療するための剤形であって、本発明によるｓｉＲＮＡを含む分子を含む剤形が提供される。
【００８２】
本明細書の状況では、表現「本発明によるｓｉＲＮＡを含む分子」は、本発明によるｓｉＲＮＡ、および本発明によるｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉経路により哺乳動物細胞内でそれから生成され得る分子、特にｄｓＲＮＡ分子を意味する。
【００８３】
「ヌクレオチド」は、本発明の状況では、核酸または核酸類似体構造単位、塩基対合に基づいてＲＮＡオリゴマーとの選択的ハイブリッドを形成することが可能なオリゴマーである。用語「ヌクレオチド」は、この状況では、古典的リボヌクレオチド構造単位であるアデノシン、グアノシン、ウリジン（およびリボシルチミン）、シチジン、古典的デオキシリボヌクレオチドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、およびデオキシシチジンを含む。それは、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｏａｔｅ）、２’Ｏ−メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；グリシンのアルファ炭素に付着されている核酸塩基と、ペプチド連結により連結されているＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位）、またはロックド核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ、４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡ構造単位）などの核酸の類似体をさらに含む。ハイブリダイズ配列は、上記のヌクレオチドのいずれかまたはそれらの混合物で構成されてもよい。
【００８４】
ある実施形態では、本発明によるｓｉＲＮＡのハイブリダイズ配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個のヌクレオチドを含む。
【００８５】
ある実施形態では、ハイブリダイズ配列は、配列番号００１または配列番号００２の逆相補的配列と少なくとも９５％同一であり、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ある実施形態では、ハイブリダイズ配列は、デオキシヌクレオチド、ホスホチオエートデオキシヌクレオチド、ＬＮＡおよび／もしくはＰＮＡヌクレオチド、またはそれらの混合物を含む。
【００８６】
本明細書の状況では、「配列同一性」および「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、２つのアラインされた配列を比較することにより決定される値を指す。比較のために配列をアラインメントするための方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁（１９７０年）のグローバルアラインメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性探索法により、またはこれらに限定されないが、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含む、こうしたアルゴリズムのコンピューター実装により実施することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公的に利用可能である。
【００８７】
アミノ酸配列比較の１つの例は、初期設定：閾値期待値：１０；ワードサイズ：３；クエリー範囲の最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：イグジスタンス１１、エクステンション１；組成調整：条件付き組成スコアマトリックス調整を使用したＢＬＡＳＴＰアルゴリズムである。核酸配列比較の１つのそのような例は、初期設定：閾値期待値：１０；ワードサイズ：２８；クエリー範囲の最大一致：０；マッチ／ミスマッチスコア：１．〜２；ギャップコスト：線形を使用したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである。別様の記載がない限り、本明細書中で提供される配列同一性値は、上記で特定されている初期設定パラメーターをそれぞれタンパク質および核酸の比較に使用したＢＬＡＳＴプログラムパッケージ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））を使用して得られる値を指す。
【００８８】
一部の実施形態では、ハイブリダイズ配列は、リボヌクレオチド、ホスホチオエート、および／または２’−Ｏ−メチル−修飾ホスホチオエートリボヌクレオチドを含む。
【００８９】
一部の実施形態では、ハイブリダイズ配列は、デオキシヌクレオチド、ホスホチオエートデオキシヌクレオチド、ホスホチオエートリボヌクレオチド、および／または２’−Ｏ−メチル−修飾ホスホチオエートリボヌクレオチドを含む。
【００９０】
単一の分離可能な特徴の選択肢が「実施形態」として本明細書に提示されている場合はいずれも、そのような選択肢を自由に組み合わせて、本明細書で開示されている本発明の個別の実施形態を形成することができることが理解されるべきである。
【００９１】
本発明は、以下の例および図面により更に説明される。さらなる実施形態および利点をそれらから導き出すことができる。こうした例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定しないことが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１（ａ）】Ｘ−ａｓｅ活性の喪失は、Ｐｒｏｓ１−／−マウスをレスキューすることを示す図である。Ａ、血友病状態におけるトロンビン生成の概略モデル。主な凝固複合体の１つは、内因性テナーゼ（Ｘ−ａｓｅ）複合体である。Ｘ−ａｓｅは、プロテアーゼとしての活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）、コファクターとしての活性化ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）、および基質としての第Ｘ因子（ＦＸ）を含む。傷害部位での組織因子（ＴＦ）の生成または発露は、外因性経路を介した凝固開始の初期事象であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは利用可能な活性ＴＦの量が限定的であり、活性化ＦＸ（ＦＸａ）と複合体化するとＴＦ／活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）複合体を阻害するＴＦＰＩが存在するため、内因性経路Ｘ−ａｓｅが重要である。したがって、持続的なトロンビン生成は、ＦＩＸおよびＦＶＩＩＩの両方の活性化に依存する。ＦＶＩＩＩは、ＦＸａおよびトロンビンの両方により、ＦＶＩＩａおよび活性化第ＸＩ因子（ＦＸＩａ）の両方により活性化され、後者の因子はトロンビンにより以前に活性化されているため、このプロセスは増幅される。結果的に、ＦＸａおよびトロンビンが形成されると共に、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ活性化の漸増が生じる。
【図１（ｂ）】Ｂ、Ｐｒｏｓ１を標的とすることにより、重度血友病ＡおよびＢでのトロンビン生成を増強するための実験手法。
【図１（ｃ）】Ｃ〜Ｄ、Ｐｒｏｓ１欠損を有するおよび有しない血友病成体マウスのＤＩＣ血液学的パラメーターのマウスモデル検証および評価：Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−（Ｃ）、ならびにＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−成体マウス（Ｄ）（ｎ＝５／群）におけるＰＳ（抗原性）、ＦＶＩＩＩ（凝固活性）、またはＦＩＸ（凝固活性）の血漿レベル；血友病Ａ群では血小板（ｎ＝７／群）、フィブリノゲン（ｎ＝８／群）、ＰＴ（ｎ＝６／群）、およびＴＡＴ（ｎ＝６／群）（ｃ）；ならびに血友病Ｂ群では血小板（ｎ＝５／群）、フィブリノゲン（ｎ＝４／群）、ＰＴ（ｎ＝４／群）、およびＴＡＴ（ｎ＝４／群）（Ｄ）。
【図１（ｄ）】Ｃ〜Ｄ、Ｐｒｏｓ１欠損を有するおよび有しない血友病成体マウスのＤＩＣ血液学的パラメーターのマウスモデル検証および評価：Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−（Ｃ）、ならびにＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−成体マウス（Ｄ）（ｎ＝５／群）におけるＰＳ（抗原性）、ＦＶＩＩＩ（凝固活性）、またはＦＩＸ（凝固活性）の血漿レベル；血友病Ａ群では血小板（ｎ＝７／群）、フィブリノゲン（ｎ＝８／群）、ＰＴ（ｎ＝６／群）、およびＴＡＴ（ｎ＝６／群）（ｃ）；ならびに血友病Ｂ群では血小板（ｎ＝５／群）、フィブリノゲン（ｎ＝４／群）、ＰＴ（ｎ＝４／群）、およびＴＡＴ（ｎ＝４／群）（Ｄ）。
【図１（ｅ）】Ｅ〜Ｆ、２Ｕ／ｇの組換えＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））注入剤の単回静脈内注射の２４時間後のＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスに由来する肺の微視的画像（Ｅ）、および肺切片におけるフィブリン塊の対応する微視的評価（Ｆ）。
【図１（ｆ）】Ｇ、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−における組換えＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））投与：Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−に０．３Ｕ／ｇのＡｄｖａｔｅ（登録商標）ｉ．ｖ．を５回注射した２４時間後のフィブリノゲンおよびＴＡＴの血漿レベル（注射時点：カテーテル挿入の１時間前、ならびにカテーテル挿入の１時間、４時間、８時間、および１６時間後）（ｎ＝３）（Ｇ、白色柱および黒色柱）および単回ｉ．ｖ．注射２４時間後（ｎ＝３）（Ｇ、斜線柱）、ならびにＡｄｖａｔｅ（登録商標）の０．３Ｕ／ｇ反復ｉ．ｖ．注射の２４時間後の（Ｈ）および０．３Ｕ／ｇ  Ａｄｖａｔｅ（登録商標）ｉ．ｖ．の単回ｉ．ｖ．後（i）のＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−の肺切片および肝臓切片におけるフィブリン塊の検出を可能にする代表的な免疫組織化学。データはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；ｎｓ、有意ではない；＊、Ｐ＜０．０５  ＊＊；Ｐ＜０．００５として表されている。
【図１（ｇ）】Ｇ、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−における組換えＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））投与：Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−に０．３Ｕ／ｇのＡｄｖａｔｅ（登録商標）ｉ．ｖ．を５回注射した２４時間後のフィブリノゲンおよびＴＡＴの血漿レベル（注射時点：カテーテル挿入の１時間前、ならびにカテーテル挿入の１時間、４時間、８時間、および１６時間後）（ｎ＝３）（Ｇ、白色柱および黒色柱）および単回ｉ．ｖ．注射２４時間後（ｎ＝３）（Ｇ、斜線柱）、ならびにＡｄｖａｔｅ（登録商標）の０．３Ｕ／ｇ反復ｉ．ｖ．注射の２４時間後の（Ｈ）および０．３Ｕ／ｇ  Ａｄｖａｔｅ（登録商標）ｉ．ｖ．の単回ｉ．ｖ．後（i）のＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−の肺切片および肝臓切片におけるフィブリン塊の検出を可能にする代表的な免疫組織化学。データはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；ｎｓ、有意ではない；＊、Ｐ＜０．０５  ＊＊；Ｐ＜０．００５として表されている。
【図２（ａ）】血栓症のマウスモデルを示す図である。Ａ〜Ｃ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスのＴＦ誘導性静脈血栓塞栓症（ｎ＝１０／遺伝子型）。麻酔したマウスに、異なる用量の組換えＴＦ（イノビン）を下大静脈から静脈内注射した：Ａでは１／２希釈（約４．３ｎＭ  ＴＦ）およびＢ〜Ｃでは１／４希釈（約２．１ｎＭ  ＴＦ）。（Ａ）では、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスの１つの群は、低分子量ヘパリン（エノキサパリン  ６０μｇ／ｇ  ｓ．ｃ．）の注射を受けた。少なくとも２分続いた呼吸停止が発症するまでの時間を記録した。実験は２０分で中止した。カプラン−マイヤー生存曲線（Ａ〜Ｂ）。Ｃ、呼吸停止発症の２分後にまたは２０分間の観察期間の完了時に肺を切除し、フィブリン塊を調査した（不溶性フィブリンの免疫染色、ｍＡｂクローン１０２−１０）。
【図２（ｂ）】血栓症のマウスモデルを示す図である。Ａ〜Ｃ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスのＴＦ誘導性静脈血栓塞栓症（ｎ＝１０／遺伝子型）。麻酔したマウスに、異なる用量の組換えＴＦ（イノビン）を下大静脈から静脈内注射した：Ａでは１／２希釈（約４．３ｎＭ  ＴＦ）およびＢ〜Ｃでは１／４希釈（約２．１ｎＭ  ＴＦ）。（Ａ）では、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスの１つの群は、低分子量ヘパリン（エノキサパリン  ６０μｇ／ｇ  ｓ．ｃ．）の注射を受けた。少なくとも２分続いた呼吸停止が発症するまでの時間を記録した。実験は２０分で中止した。カプラン−マイヤー生存曲線（Ａ〜Ｂ）。Ｃ、呼吸停止発症の２分後にまたは２０分間の観察期間の完了時に肺を切除し、フィブリン塊を調査した（不溶性フィブリンの免疫染色、ｍＡｂクローン１０２−１０）。
【図２（ｃ）】血栓症のマウスモデルを示す図である。Ａ〜Ｃ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスのＴＦ誘導性静脈血栓塞栓症（ｎ＝１０／遺伝子型）。麻酔したマウスに、異なる用量の組換えＴＦ（イノビン）を下大静脈から静脈内注射した：Ａでは１／２希釈（約４．３ｎＭ  ＴＦ）およびＢ〜Ｃでは１／４希釈（約２．１ｎＭ  ＴＦ）。（Ａ）では、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスの１つの群は、低分子量ヘパリン（エノキサパリン  ６０μｇ／ｇ  ｓ．ｃ．）の注射を受けた。少なくとも２分続いた呼吸停止が発症するまでの時間を記録した。実験は２０分で中止した。カプラン−マイヤー生存曲線（Ａ〜Ｂ）。Ｃ、呼吸停止発症の２分後にまたは２０分間の観察期間の完了時に肺を切除し、フィブリン塊を調査した（不溶性フィブリンの免疫染色、ｍＡｂクローン１０２−１０）。
【図２（ｄ）】Ｄ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスにおける、生体顕微鏡法により記録されたＦｅＣｌ３傷害性腸間膜動脈の血栓形成、代表的な実験（ｎ＝３／遺伝子型）。Ｄ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスにおける、生体顕微鏡法により記録されたＦｅＣｌ３傷害性腸間膜動脈の血栓形成、代表的な実験（ｎ＝３／遺伝子型）。
【図３】尾部出血モデルを示す図である。３０分間（Ａ）および１０分間（Ｂ）の２ｍｍ（Ａ）および４ｍｍ（Ｂ）尾部離断後に、血液を新しい生理食塩水のチューブに収集した；その後、合計血液喪失（μｌ）を測定した。Ｆ８＋／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウス（白色柱）は、対照としての役目を果たした（Ａでは全群がｎ＝５、Ａでは全群がｎ＝６）。Ｃ、抗ヒトＰＳ抗体は、４ｍｍ離断後に尾部出血を変更した。
【図４（ａ）】急性関節血症モデルを示す図である。Ａ、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−、およびＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスにおける、傷害の７２時間後および傷害前の膝直径間の差異。
【図４（ｂ）】Ｂ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスにおける、７２時間後の代表的な非傷害肢および傷害肢の膝関節内腔の微視的評価（不溶性フィブリンのマッソン３色染色および免疫染色）。
【図４（ｃ）】Ｃ、特異的ｓｉＲＮＡを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍＰＳサイレンシング：ｍＰＳ  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡの単回ｉ．ｐ．注入で処置されたＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスにおける、傷害７２時間後の関節直径の評価。Ｄ、ｍＰＳ  ｓｉＲＮＡまたはＣｔｒｌ  ｓｉＲＮＡで以前に処置されたＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスにおける、７２時間後の代表的な傷害肢の膝関節内腔の微視的評価（マッソン３色染色）。測定は、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示されている。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５；＊＊＊、Ｐ＜０．０００５；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図５（ａ）】ＰＳおよびＴＦＰＩは両方ともマウス滑膜で発現されることを示す図である。Ａ、Ｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡまたはｍＰＳ−ｓｉＲＮＡで以前に処置されたＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスに由来する傷害膝の膝関節内腔におけるＰＳおよびＴＦＰＩの免疫染色。矢印頭は滑膜組織を指し、矢印は血管構造を指す。すべてＰＳおよびＴＦＰＩの両方に陽性。上段の図のボックス（縮尺バー：２００μｍ）は、下段パネルで拡大されている領域を示す（縮尺バー：５０μｍ）。Ｂ、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスに由来する非傷害膝の膝関節内腔におけるＴＦＰＩの免疫染色。
【図５（ｂ）】Ｃ〜Ｅ、抗ＰＳ抗体（ｃ）および抗ＴＦＰＩ抗体（ｄ）を使用した、一次マウス線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）培養に由来する順化培地のウエスタンブロット分析。無血小板血漿（ＰＦＰ）、血小板に由来するタンパク質ライセート（ＰＬＴ）、マウスＰＳ（ｍＰＳ）を陽性対照として使用した（ｃ）。脱グリコシル化ＴＦＰＩおよび完全グリコシル化ＴＦＰＩの分子量を比較することにより決定したＴＦＰＩアイソフォーム発現。マウス胎盤を、ＴＦＰＩαの陽性対照として使用した。
【図５（ｃ）】Ｅ〜Ｆ、抗ＰＳ抗体（ｆ）および抗ＴＦＰＩ抗体（ｅ）を使用した、トロンビン（Ｔｈｒ、＋）または媒体（−）の存在下で培養した２４時間後にＦＬＳから単離した全タンパク質ライセートのウエスタンブロット分析。ヒト組換えＴＦＰＩ全長を、ＴＦＰＩαの陽性対照として使用した（ｈｒＴＦＰＩ）。ブロットは、３つの独立実験を示すものである。
【図６（ａ）】ヒト滑膜中のＰＳおよびＴＦＰＩを示す図である。Ａ、ＰＳおよびＴＦＰＩは、要求時にまたは骨関節炎時（ＯＡ）に、ＨＡ患者（要求時および予防時）、ＨＢ患者の滑膜組織で発現される。矢印頭は滑膜内層を指し、矢印は下内層の血管構造を指す。すべてＰＳおよびＴＦＰＩの両方に陽性。縮尺バー：５０μｍ。
【図６（ｂ）】Ｂ、抗ＴＦＰＩ抗体を使用した、脱グリコシル前後の健康な個体およびＯＡ患者に由来する一次ヒトＦＬＳ（ｈＦＬＳ）培養の順化培地のウエスタンブロット分析。ヒト血小板ライセート（ｈＰＬＴ）を、ＴＦＰＩαの陽性対照として使用した。ブロットは、３つの独立実験を示すものである。
【図７（ａ）】ＴＦＰＩ依存性ＰＳ活性を示すＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスに由来するＰＲＰにおける、血友病Ａにおけるトロンビン生成およびフィブリンネットワーク、ＴＦ（１ｐＭ）誘導性トロンビン生成を示す図である。
【図７（ｂ）】Ｂ、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスに由来するＰＲＰおよびＰＦＰにおけるＡＰＣ依存性ＰＳ活性。
【図７（ｃ）】Ｃ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−フィブリン構造の、ならびにＦ９＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−フィブリン構造の代表的な走査型電子顕微鏡画像。
【図７（ｄ）】Ｄ〜Ｇ、高力価の阻害物質を有しない（Ｄ、Ｆ）および有する（Ｅ、Ｇ）重度ＨＡ患者（ＦＶＩＩＩ＜１％）に由来するＰＦＰ（Ｄ〜Ｅ）およびＰＲＰ（Ｆ〜Ｇ）における低ＴＦ濃度（１ｐＭ）が引き金となって起きるトロンビン生成。測定は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊＊、Ｐ＜０．００５；＊＊＊、Ｐ＜０．０００５。
【図７（ｅ）】Ｄ〜Ｇ、高力価の阻害物質を有しない（Ｄ、Ｆ）および有する（Ｅ、Ｇ）重度ＨＡ患者（ＦＶＩＩＩ＜１％）に由来するＰＦＰ（Ｄ〜Ｅ）およびＰＲＰ（Ｆ〜Ｇ）における低ＴＦ濃度（１ｐＭ）が引き金となって起きるトロンビン生成。測定は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊＊、Ｐ＜０．００５；＊＊＊、Ｐ＜０．０００５。
【図７（ｆ）】Ｄ〜Ｇ、高力価の阻害物質を有しない（Ｄ、Ｆ）および有する（Ｅ、Ｇ）重度ＨＡ患者（ＦＶＩＩＩ＜１％）に由来するＰＦＰ（Ｄ〜Ｅ）およびＰＲＰ（Ｆ〜Ｇ）における低ＴＦ濃度（１ｐＭ）が引き金となって起きるトロンビン生成。測定は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊＊、Ｐ＜０．００５；＊＊＊、Ｐ＜０．０００５。
【図７（ｇ）】Ｄ〜Ｇ、高力価の阻害物質を有しない（Ｄ、Ｆ）および有する（Ｅ、Ｇ）重度ＨＡ患者（ＦＶＩＩＩ＜１％）に由来するＰＦＰ（Ｄ〜Ｅ）およびＰＲＰ（Ｆ〜Ｇ）における低ＴＦ濃度（１ｐＭ）が引き金となって起きるトロンビン生成。測定は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊＊、Ｐ＜０．００５；＊＊＊、Ｐ＜０．０００５。
【図８】遺伝子型決定手法を示す図である。Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−（ａ〜ｃ）およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−（ｄ〜ｆ）マウスを交配することにより得られた遺伝子型。ａ、Ｐｒｏｓ１対立遺伝子を、マルチプレックスＰＣＲにより増幅した。その後ＰＣＲ産物を電気泳動にかけた。ｗｔバンドは、Ｓａｌｌｅｒら、２００９年によると、ヌルバンド（５７１ｂｐ）と比較してより低い分子量（２３４ｂｐ）を有する。ｂ、マルチプレックスＰＣＲを設定して、ゲノムＤＮＡに由来するＦ８対立遺伝子のｗｔバンド（６２０ｂｐ）およびヌルバンド（４２０ｂｐ）を増幅した。ｃ、（ａ）と同じ試料でのＦ８対立遺伝子増幅のＰＣＲ産物（ヌルバンド：４２０ｂｐ）。ｄ、Ｐｒｏｓ１対立遺伝子を、マルチプレックスＰＣＲにより増幅した。その後ＰＣＲ産物を電気泳動にかけた。ｗｔバンドは、Ｓａｌｌｅｒら、２００９年によると、ヌルバンド（５７１ｂｐ）と比較してより低い分子量（２３４ｂｐ）を有する。ｅ、マルチプレックスＰＣＲを設定して、ゲノムＤＮＡに由来するＦ９対立遺伝子のｗｔバンド（３２０ｂｐ）およびヌルバンド（５５０ｂｐ）を増幅した。ｆ、（ｄ）と同じ試料でのＦ９対立遺伝子増幅のＰＣＲ産物（ヌルバンド：５５０ｂｐ）。
【図９】生理学的状態における組織学的検査を示す図である。Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスならびにＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−の肝臓切片、肺切片、腎臓切片、脳切片における不溶性フィブリンの免疫染色。縮尺バー：１００μｍ。
【図１０（ａ）】Ｐｒｏｓ１の遺伝的喪失は、血友病Ｂを有するマウスの関節血症を防止することを示す図である。Ａ、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−、およびＦ９＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスにおける、傷害の７２時間後および傷害前の膝直径間の差異。
【図１０（ｂ）】Ｂ、Ｆ９＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスにおける、７２時間後の代表的な非傷害肢および傷害肢の膝関節内腔の微視的評価（不溶性フィブリンのマッソン３色染色および免疫染色、ｍＡｂクローン１０２−１０）。縮尺バー：５００μｍ。測定は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊＊＊、Ｐ＜０．０００５。
【図１１（ａ）】フィブリンネットワーク密度および線維分岐の定量化を示す図である。ａ〜ｂ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスのフィブリンネットワーク。ｃ〜ｄ、Ｆ９＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−のフィブリンネットワーク。フィブリンネットワーク密度の定量化（ａおよびｃ）。線維分岐の定量化（ｂおよびｄ）。測定は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊＊＊、Ｐ＜０．０００５。
【図１１（ｂ）】フィブリンネットワーク密度および線維分岐の定量化を示す図である。ａ〜ｂ、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスのフィブリンネットワーク。ｃ〜ｄ、Ｆ９＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−のフィブリンネットワーク。フィブリンネットワーク密度の定量化（ａおよびｃ）。線維分岐の定量化（ｂおよびｄ）。測定は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。＊＊＊、Ｐ＜０．０００５。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
実施例
実施例１：Ｘ−ａｓｅ活性の喪失はＰｒｏｓ１−／−マウスをレスキューする
Ｆ８−／−雄と交配させたＰｒｏｓ１＋／−雌は、２５％のＦ８＋／−Ｐｒｏｓ１＋／−子孫をもたらした。Ｆ８−／−雄と交配させたＦ８＋／−Ｐｒｏｓ１＋／−雌は、２５％のＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−子孫をもたらした（図８Ａ〜８Ｃ）。同様の観察が、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−マウスでなされた（図８Ｄ〜８Ｆ）。予想通り、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスは、それぞれＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ血漿活性を示さなかった。ＰＳは、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウス血漿では検出されなかった（図１Ｃ〜１Ｄ）。報告されているように、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−のＰＳレベルは、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスよりも約５０〜６０％低かった（図１Ｃ〜１Ｄ）。
【００９４】
Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−繁殖対に由来する２９５匹の子犬のうち、７２匹（２４％）はＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋であり、１６４匹（５６％）はＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−であり、５９匹（２０％）はＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−だった（χ２＝４．８、Ｐ＝０．０９）。したがって、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスは、予想通りのメンデル比で存在した。対照的に、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−繁殖対に由来する２１９匹の子犬のうち、５６匹（２６％）はＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋であり、１３２匹（６０％）はＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−であり、３１匹（１４％）はＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−だった（χ２＝１４．９５、Ｐ＝０．００１）。これは、Ｆ９＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスの交配の産仔数と比較した産仔数の減少と一致するＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスの遺伝比歪みと矛盾しない（５．２±０．７対９．８±１．８、ｎ＝４交配／３ｔ世代にわたって、Ｐ＝０．０４６）。
【００９５】
Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスは、完全に正常であると思われた。それらの生存能を、それぞれ２０か月（ｎ＝４）および１６か月（ｎ＝２）までモニターしたところ、それぞれＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスと比較していかなる差異も示さなかった。
【００９６】
マウスにおける完全なＰｒｏｓ１欠損は、消費性凝固障害に結び付くため１５、本発明者らは、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスがＤＩＣを発症したか否かを評価した。ＤＩＣパラメーターは、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウス（図１Ｃ）、ならびにＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウス（図１Ｄ）では同等だった。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、ＦＶＩＩＩが存在しなかったため、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋（６９±２秒）、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−（６８±３秒）、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−（６３±３秒）マウス（平均±ｓ．ｅ．ｍ、１群当たりｎ＝６、Ｐ＝０．３）では等しく長期化した。同等のデータが、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスで得られた。さらに、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスの脳、肺、肝臓、および腎臓には、血栓症またはフィブリン沈着は見出されなかった（図９）。
【００９７】
このように、Ｘ−ａｓｅ活性の喪失は、完全Ｐｒｏｓ１欠損の胚致死性をレスキューする。しかしながら、このレスキューは、部分的なものに過ぎず、ＦＩＸ活性が喪失した。考え得る説明は、重度ＨＢが、重度ＨＡと比較してより低い重症状態であると考えられることである。結果的に、Ｐｒｏｓ１−／−マウスにおけるＦ９破壊は、Ｆ８破壊よりも凝固のリバランスがあまり効率的ではなかった。
【００９８】
ＦＶＩＩＩ注入による内因性Ｘ−ａｓｅ活性の回復が、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスのＤＩＣ、血栓症、および電撃性紫斑病を誘導するか否かを探究するため、本発明者らは、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）を静脈内投与した。ｒＦＶＩＩＩ注射後に死亡したマウスはなかった。多数の血管における血栓および肺における出血が、過剰用量のｒＦＶＩＩＩを単回注射した２４時間後にＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスで見出された（図１Ｅ〜１Ｆ）。通常用量のｒＦＶＩＩＩを反復投与した２４時間後、凝固分析は、顕性ＤＩＣと同等の非凝固性プロトロンビン時間（ＰＴ）（非表示）、低フィブリノゲンレベル、および高トロンビン−抗トロンビン（ＴＡＴ）レベルを示した（図１Ｇ）。対照的に、通常用量のｒＦＶＩＩＩをＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスに単回注射した後のフィブリノゲンレベルおよびＴＡＴのレベルは、未処置Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスのレベルと同等だった（図１Ｇ）。多数の血栓が肺および肝臓で視認可能だったが（図１Ｈ〜１Ｉ）、これらのマウスはいずれも、電撃性紫斑病を発症しなかった。
【００９９】
実施例２：Ｘ−ａｓｅ活性の喪失は、Ｐｒｏｓ１−／−マウスのＴＦ誘導性血栓塞栓症により引き起こされる致死性を防止しない
本発明者らは、以前に、ＴＦ誘導性血栓塞栓症モデルではＰｒｏｓ１＋／＋マウスの８８％が生き残ったが、低ＴＦ用量注射（約１．１ｎＭ）後２０分間依然として生存していたのはＰｒｏｓ１＋／−マウスの２５％に過ぎなかったことを示した。より高いＴＦ投薬量（約４．３ｎＭ）を使用した場合、Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＰｒｏｓ１＋／−マウスは両方とも２０分以内に死亡した。しかしながら、Ｐｒｏｓ１＋／−は、Ｐｒｏｓ１＋／＋よりも早期に死亡した。ＨＡマウスおよびＷＴマウスは、この高ＴＦ用量に等しく感受性であり、それらの８５％よりも多くが１５分以内に病死した（図２Ａ）。対照的に、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）による血栓予防下のＷＴマウスは＞７５％が生き残った（図２Ａ）。したがって、ＬＭＷＨとは対照的に、ＨＡは、ＴＦ誘導性血栓塞栓症からマウスを保護しない。その後、本発明者らは、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスを同じモデルで調査した。ＴＦ（約２．１ｎＭ）を注入した後、Ｐｒｏｓ１遺伝子型に関わらず、マウスの４０〜６０％が死亡した（Ｐ＞０．０５）（図２Ｂ）しかしながら、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスよりも早期に病死し、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスよりも早期に死亡する傾向があった（死亡までの平均時間：Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋は１２±４分、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−は７±２分、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスは８±３分、ｎ＝４〜６／群、Ｐ＝０．４３）。同様のデータが、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスで得られた（データ非表示）。
【０１００】
ＴＦ誘導血栓塞栓負荷中に死亡したＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスの肺動脈に、フィブリン塊が検出された（図２Ｃ）。重要なことには、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスよりもＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−の肺により多くの血栓があった（それぞれ、ｎ＝４８対２６）。さらに、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−肺のほとんどの動脈は完全に閉塞されたが、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋肺では部分的にしか閉塞されなかった。
【０１０１】
ＴＦ誘導性血栓塞栓負荷中に病死したＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスはいずれも、電撃性紫斑病を発症しなかった。同様のデータが、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスで得られた（データ非表示）。
【０１０２】
実施例３：ＦＶＩＩＩの喪失は、腸間膜細動脈の血栓症からＰｒｏｓ１−／−マウスを部分的に保護する
その後、本発明者らは、内因性凝固経路の欠損に感受性なモデルである腸間膜細動脈における血栓形成を記録した。Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスでは、血栓は、２０分間で閉塞サイズに成長し、傷害細動脈はすべて閉塞された（図２Ｄ）。予想通り、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋の細動脈はいずれも血栓症を示さなかったが、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスは、部分的な血栓を示した（図２Ｄ）。
【０１０３】
Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスでは血栓形成中に塞栓が生成されたが、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスでは生成されなかった。Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスでは、部分的な血栓成長中に多発性微小塞栓が剥離し、閉塞性血栓の形成が防止された。
【０１０４】
実施例４：Ｐｒｏｓ１標的化は、ＨＡを有するマウスの尾部出血を制限するが抑止はしない
軽度または重度出血モデルを使用して、尾部離断により出血表現型を評価した。
【０１０５】
両モデルにおいて、血液喪失は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスと比較して、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−で低減された（図３Ａ〜３Ｂ）。軽度モデルで負荷すると、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−マウスは、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスよりも出血が少なかった（図３Ａ）。対照的に、重度モデルに曝露されると、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−マウスは、同等の血液喪失を示した（図３Ｂ）。しかしながら、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスは、両モデルにおいて、Ｆ８＋／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスよりも出血が多く（図３Ａ〜３Ｂ）、Ｆ８−／−マウスにおけるＰｒｏｓ１の喪失は、Ｆ８−／−マウスの出血表現型を部分的に修正したに過ぎなかったことを示した。
【０１０６】
その後、ＰＳ中和抗体を使用して、ＰＳ活性の阻害がＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−マウスにおける尾部出血をどのように変更するかを調査した。この抗体は、Ｐｒｏｓ１の完全な遺伝的喪失（図３Ｂ）と同じ程度に、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−マウスの血液喪失を制限した（図３Ｃ）。
【０１０７】
実施例５：Ｐｒｏｓ１標的化またはＰＳ阻害は、急性関節血症（ＡＨ）からＨＡマウスまたはＨＢマウスを完全に保護する
出血は血友病患者のどの箇所でも起こり得るが、ほとんどの出血は、関節で生じる。Ｐｒｏｓ１喪失が血友病マウスの関節血症を防止するか否かを決定するために、本発明者らは、ＡＨモデルをＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−、およびＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスに適用した。傷害後の膝腫脹は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−マウスと比較してＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスで低減された（図４Ａ）。また、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスとＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスとの間に膝腫脹の差異はなかった（図４Ａ）。出血は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋（ＩＢＳ＝２、ｎ＝５）の関節腔および滑膜では観察されたが、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−（ＩＢＳ＝０、ｎ＝５）およびＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウス（ＩＢＳ＝０、ｎ＝５）では観察されなかった（図４Ｂ）。Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋の関節腔および滑膜には、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスよりも多くのフィブリンが存在した（図４Ｂ）。同様のデータが、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウス（それぞれ、ＩＢＳ＝０、ｎ＝３、およびＩＢＳ＝２、ｎ＝３）で得られた（図９Ａ〜９Ｂ）。
【０１０８】
こうした結果は、ＰＳ中和抗体または対照抗体をＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−マウスに４日間の間に連続して皮下注入することにより（ＡＨ誘導の１日前から開始して）確認された（ＰＳ中和抗体群の膝腫脹は、対照群の０．６９±０．０９ｍｍに対して０．４３±０．０７だった。ｎ＝９、Ｐ＝０．０４）。ＰＳ中和抗体群のＰＳ血漿レベルは、対照の４５±３％に対して２６±６％だった（ｎ＝５、Ｐ＝０．０１７）。加えて、ＰＳ阻害は、その代わりに、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスにおけるＡＨ負荷の前に、マウスＰＳ（ｍＰＳ）ｓｉＲＮＡを静脈内注射することにより達成された（図４Ｃ〜４Ｄ）。ＩＢＳ評価により、対照ｓｉＲＮＡで処置したものと比較して（ＩＢＳ＝２、ｎ＝３）、ｍＰＳ  ｓｉＲＮＡで処置したＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウス（ＩＢＳ＝０．５、ｎ＝３）では関節内出血が欠如したことが確認された（図４Ｃ）。重要なことには、血漿（対照での８４±１１％に対して２６±３％、ｎ＝３、Ｐ＝０．００６）および滑膜におけるＰＳ発現は両方とも、ｍＰＳ  ｓｉＲＮＡにより低減された（図５Ａ）。
【０１０９】
実施例６：ＰＳおよびＴＦＰＩは両方ともマウスの滑膜で発現される
血友病マウスにおけるＰｒｏｓ１の遺伝的喪失およびＰＳ阻害の顕著な関節内止血効果を理解するために、膝切片をＰＳおよびＴＦＰＩについて免疫染色した。ＰＳは、対照ｓｉＲＮＡで処置したＡＨを有するＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスでは主に滑膜組織の内層に存在したが、ｍＰＳ  ｓｉＲＮＡを受け取ったＡＨを有するＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスではＰＳの滑膜染色が顕著に低減された（図５Ａ）。対照的に、ＴＦＰＩ染色は、対照ｓｉＲＮＡで処置したものよりも、ｍＰＳ  ｓｉＲＮＡを受け取った血友病マウスの滑膜組織でより顕著だった（図５Ａ）。しかしながら、ＴＦＰＩ発現は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスの両方の滑膜内層で同等だった（図５Ｂ）。
【０１１０】
ＰＳが線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）により発現されることをさらに示すために、本発明者らは、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋、およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−  ＦＬＳから収集された順化培地に対するウエスタンブロットを実施した。図５Ｃ示されているように、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋  ＦＬＳの培地は、ＰＳと同等であり、血漿および血小板で観察されたものと同様の分子量約７５ｋＤａにバンドを示した。予想通り、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１−／−  ＦＬＳから得られた培地では、染色は検出されなかった（図５Ｃ）。
【０１１１】
また、本発明者らは、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−  ＦＬＳ順化培地でのＴＦＰＩ発現を研究した（図５Ｄ）。培地はすべて、胎盤ライセートで観察されたものと同様の約５０ｋＤａにバンドを示した。ＴＦＰＩアイソフォーム発現は、完全グリコシル化ＴＦＰＩαおよびＴＦＰＩβが同じ分子量で移動するため３０、タンパク質脱グリコシル化の後で調査した。ＦＬＳ培地に由来する脱グリコシル化ＴＦＰＩは、胎盤ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩαの陽性対照）と同様のＴＦＰＩαの分子量に単一バンドとして移動した（図５Ｄ）。これは、ＦＬＳはＴＦＰＩαを発現するが、ＴＦＰＩβを発現しないことを示す。さらに、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋  ＦＬＳでは、トロンビンによる刺激後にＰＳおよびＴＦＰＩ発現が増加した（図５Ｅ〜５Ｆ）。
【０１１２】
実施例７：ＰＳおよびＴＦＰＩは両方とも、ＨＡまたはＨＢを有する患者の滑膜で発現される
その後、ヒトＨＡ、ＨＢ、および骨関節炎膝滑膜組織を、ＰＳおよびＴＦＰＩの両方について分析した（図６Ａ）。要求時のＨＡ患者（ｎ＝７）の滑膜内層および下内層に、ＴＦＰＩおよびＰＳの強力なシグナルが見出された。対照的に、予防下のＨＡ患者（ｎ＝５）では、ＰＳおよびＴＦＰＩの免疫染色は両方とも減少した。要求時のＨＢ患者は、滑膜内層および下内層中のＰＳおよびＴＦＰＩの両方について、要求時のＨＡ患者よりも低いシグナルを示した（ｎ＝４）。骨関節炎患者（ｎ＝７）に由来する切片は、予防下の血友病患者と同様に、ＴＦＰＩおよびＰＳの強い染色を示さなかった。どのアイソフォームのＴＦＰＩがヒトＦＬＳにより発現されるかを評価するために、健康対象および骨関節炎患者から単離されたヒトＦＬＳの順化培地に対してウエスタンブロッティングを実施した。マウスＦＬＳと同様に、ヒトＦＬＳは、ＴＦＰＩαを発現するが、ＴＦＰＩβを発現しない（図６Ｂ）。
【０１１３】
実施例８：Ｐｒｏｓ１の喪失は、ＨＡマウスにおけるＴＦＰＩ依存性ＰＳ活性の欠如およびＡＰＣに対する耐性の原因である
Ｐｒｏｓ１を欠如するかまたはＰＳが阻害されたＨＡマウスまたはＨＢマウスにおけるＡＨからの十分な保護は、関節でのＡＰＣおよびＴＦＰＩに対するＰＳコファクター活性の欠如により、少なくとも部分的には説明することができた。しかしながら、尾部出血モデルで負荷されたＨＡマウスにおいて、Ｐｒｏｓ１の欠如またはＰＳ阻害の止血効果が部分的だった理由は、さらに調査する必要がある。
【０１１４】
ｅｘ  ｖｉｖｏのＴＦ誘発性トロンビン生成試験は、トロンビンを生成する血漿の能力と血友病の臨床重症度との間に相関性があることを示している。したがって、本発明者らは、トロンビン生成に対するＰｒｏｓ１喪失の影響をＨＡマウスの血漿で調査した。マウス血漿ではトロンビン生成試験を使用してＰＳのＴＦＰＩコファクター活性を示すことができないため、無血小板血漿（ＰＦＰ）ではなく多血小板血漿（ＰＲＰ）でＴＦＰＩ依存性ＰＳ活性を評価した。これは、マウス血漿にはＴＦＰＩαが欠如し、マウス血小板には存在することにより説明される。
【０１１５】
１ｐＭのＴＦに応答したトロンビンピークおよび内在性トロンビン能力（ＥＴＰ）は両方とも、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋  ＰＲＰよりもＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−で有意により高く（１０７２±１６０対５９０±１０ｎｍｏｌ／Ｌ．分、ｎ＝３／群、Ｐ＝０．０４）、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−  ＰＲＰには、ＰＳ  ＴＦＰＩコファクター活性が欠如していることが示唆された（図７Ａ）。以前の研究と一致して、１、２．５、または５ｐＭのＴＦの存在下のＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスのＰＦＰでは、トロンビンピークおよびＥＴＰは両方とも同等だった（データ非表示）。
【０１１６】
Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスが機能欠損ＡＰＣ依存性ＰＳ活性を示したか否かを評価するため、本発明者らは、ＡＰＣの非存在下、野生型（ＷＴ）組換えＡＰＣの存在下、または突然変異（Ｌ３８Ｄ）組替えマウスＡＰＣ（Ｌ３８Ｄ  ＡＰＣ、ＰＳコファクター活性が除去されたバリアント）の存在下で、Ｃａ２＋イオノフォア活性化ＰＲＰ中でのトロンビン生成試験を使用した。このアッセイでは、ＡＰＣ滴定により、８ｎＭのＷＴ  ＡＰＣの添加は、ＷＴマウスの活性化ＰＲＰにてＥＴＰを９０％低減することができたが、同じ濃度のＬ３８Ｄ  ＡＰＣは、ＥＴＰを３０％減少させたに過ぎなかったことが示された（データ非表示）。こうしたデータに基づき、活性化ＰＲＰのトロンビン生成曲線を記録した（３匹マウス／アッセイ）。算出されたＡＰＣ比（ＥＴＰ＋ＡＰＣ ＷＴ／ＥＴＰ＋ＡＰＣ Ｌ３８Ｄ）は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−血漿ではＡＰＣ耐性を示したが、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋血漿では示さなかった（それぞれ、０．８７±０．１３対０．２３±０．０８、Ｐ＝０．０１）（図７Ｂ）。
【０１１７】
また、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウス（２匹マウス／アッセイ）に由来するＰＦＰにおけるＡＰＣ依存性ＰＳ活性を、２ｎＭ  ＷＴ  ＡＰＣおよびＬ３８Ｄ  ＡＰＣの存在下で試験した。算出されたＡＰＣ比は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−ではＡＰＣ耐性を示したが、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスでは示さなかった（それぞれ、１．０８±０．０４対０．２５±０．０９、Ｐ＝０．０００３）（図７Ｂ）。
【０１１８】
実施例９：Ｐｒｏｓ１マウスを欠如するＨＡマウスにおけるフィブリンネットワークの改善
尾部出血マウスモデルは、血小板機能異常だけでなく、凝固および繊維素溶解の変更にも感受性である。尾部出血に関する研究された遺伝子型間の差異を理解するために、本発明者らは、走査型電子顕微鏡画像法を使用して、フィブリン構造を調査した（図７Ｃ）。Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−血漿の血餅は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋血漿血餅と比較して、高度に分岐したフィブリン線維のより高密度のネットワークを示した（図１１ａ〜１１ｂ）。対照的に、Ｆ９＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−血漿の血餅は、Ｆ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋血漿血餅よりも高密度のネットワークを示さなかったが、線維分岐増大の傾向を示した（図１１ｃ〜１１ｄ）。
【０１１９】
Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスのフィブリン線維、およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスのフィブリン線維は、それぞれＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスまたはＦ９＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスの線維と比較して、より大きな直径を示した。にも関わらず、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／−マウスの繊維表面は、それぞれＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋またはＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスと比較してより少ない多孔性を示し、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−およびＦ９−／−Ｐｒｏｓ１−／―由来の線維は、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋またはＦ９−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋由来の線維よりも、透過性がより低く、そのため繊維素溶解に対してより耐性であり得ることが示唆された３８。こうしたデータは、ＴＦＰＩおよびＡＰＣ両コファクター活性の結果（図７Ａ〜７Ｂ）を補完するものであり、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１−／−での尾部出血が、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスと比較して改善されたが、Ｆ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウスほど完全には修正されなかった理由の説明を支援する。
【０１２０】
実施例１０：血漿でのＰＳ阻害は、ＨＡを有する患者のトロンビン生成を回復させる
その後、本発明者らは、ヒトＨＡ血漿でのトロンビン生成に対するＰＳ阻害の効果を検討した。ＰＦＰ中のＥＴＰは、ＰＳ中和抗体の存在下では２〜４倍増加した。効率的にＦＸａを阻害するために、Ｃ末端ドメインに対する抗ヒトＴＦＰＩ抗体を使用したところ、ＦＶＩＩＩ阻害物質の存在下でさえ同様の結果が得られた（図７Ｄ〜７Ｅ）。ＰＲＰ試料でのＰＳ阻害は、著しい効果を示し、ＥＴＰを１０倍超増加させた（１９１２±３７および１８７２±６４ｎＭ＊分）（それぞれ、図７Ｆおよび７Ｇ）。したがって、ＰＳ阻害は、血友病血漿中のＥＴＰを完全に回復させた（比較のため、正常血漿中のＥＴＰは、１４９５±２ｎＭ＊分）。同様の結果が、抗ＴＦＰＩ抗体を使用して得られた（図７Ｄ〜７Ｇ）。こうしたデータは、本発明者らがマウスで観察した、ＰＳ阻害により駆動されるＨＡ  ＰＦＰおよびＰＲＰにおけるトロンビン生成の改善を確認する。
【０１２１】
実施例１１：物質および方法
マウス
バックグラウンドがＣ５７ＢＬ／６ＪであるＦ８−／−マウス（Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ／Ｊ）およびＦ９−／−マウス（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｆ９ｔｍ１Ｄｗｓ／Ｊ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から得た。Ｐｒｏｓ１＋／−マウスは、原集団の子孫だった１５。実験は、スイス連邦獣医局（Ｔｈｅ  Ｓｗｉｓｓ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｏｆｆｉｃｅ）による認可を受けた。マウスを、記載の通りに遺伝子型決定した１５〜１７。
【０１２２】
ＴＦ誘導性肺塞栓症
静脈血栓塞栓症のモデルは、Ｗｅｉｓｓら１８のものを多少改変して用いた１５。麻酔した６〜９週歳のマウスは、４．２５ｎＭ（１：２希釈）または２．１ｎＭ（１：４希釈）のヒト組換えＴＦ（ｈｒＴＦ、デイドイノビン、Ｓｉｅｍｅｎｓ社）を静脈内に受け取った（２μＬ／ｇ）。呼吸停止を発症した２分後にまたは２０分間の観察期間の完了時に、肺を回収し、４％ＰＦＡで固定した。肺切片は、ヘマトキシリン−エオジンでフィブリンを染色した。肺におけるフィブリン塊の程度を、１０個の無作為に選択した非重複視野（×１０倍の拡大率）における血管内血栓の数として評価した。
【０１２３】
ＨＡマウスの尾部クリップモデル（Ｔａｉｌ  ｃｌｉｐｐｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）
出血表現型を評価するために、２つの異なる尾部クリップモデルを記載の通りに評価した１４。手短に言えば、８〜１０週齢マウスの遠位尾部を２ｍｍで離断し（軽度傷害）、出血は静脈だったか、または４ｍｍで離断し（重度傷害）、出血は動脈および静脈だった１９。出血を、３０分後または１０分後の血液喪失としてそれぞれ定量化した。重度傷害モデルでは、幾つかのＦ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／−マウスは、尾部離断の２分前に、２．１ｍｇ／ｋｇの用量のウサギ抗ヒトＰＳ−ＩｇＧ（Ｄａｋｏ社）またはウサギアイソタイプＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を静脈内に受け取った。
【０１２４】
急性関節血症モデル
麻酔した９〜１２週齢マウスにおける関節出血の誘導、膝直径測定、および無痛覚範囲を、Ｏｖｌｉｓｅｎらに従って実施した２０。関節直径は、０時間および７２時間の時点で、デジタルノギス（ミツトヨ社  ５４７−３０１、神奈川県）を用いて測定した。７２時間の時点で、マウスを犠牲にし、膝を単離し、４％ＰＦＡで固定し、脱灰し、パラフィンに包埋した。関節内出血スコア（ＩＢＳ）を、記載の通りに評価した２１。
【０１２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＳ阻害
１０週齢マウスは、皮下浸透圧ミニポンプ（モデル２００１、Ａｌｚｅｔ）により１ｍｇ／ｋｇ／日のウサギ抗ヒトＰＳ−ＩｇＧ（Ｄａｋｏ社、バーゼル、スイス）またはウサギアイソタイプＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の持続注入を受け取った。
【０１２６】
あるいは、１０週齢マウスを、製造業者の使用説明書に従ってトランスフェクション剤（Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３．０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して、１ｍｇ／ｋｇのマウス特異的ｓｉＲＮＡ（ｓ７２２０６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）または対照ｓｉＲＮＡ（４４５９４０５、ｉｎ  ｖｉｖｏ陰性対照＃１  Ａｍｂｉｏｎ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の単一用量で処置した。ＰＳ阻害の２．５日後に、急性関節血症モデルを適用した。
【０１２７】
統計的方法
値は、平均±ｓｅｍとして表された。非連結遺伝子座のカイ平方を使用して、メンデル対立遺伝子分離を評価した。カプラン−マイヤー法を使用して、ＴＦ誘導性静脈血栓塞栓症モデルにおける生存データをプロットした。ログランク検定を使用して、曲線を統計的に比較した（Ｐｒｉｓｍ６．０ｄ；ＧｒａｐｈＰａｄ社）。他のデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ社製Ｐｒｉｓｍ６．０ｄを用いて、ｔ検定、一元配置および二元配置ＡＮＯＶＡ検定により分析した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であるとみなした。
【０１２８】
マウス血漿の調製
６〜９週齢マウスをペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、全血を下大静脈から３．１３％クエン酸塩に採取した（１容積の抗凝血剤／９容積の血液）。血液を、２６℃に予加温した遠心分離機で１０分間１０３１ｇにて遠心分離し、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。あるいは、血液を、２４００ｇで１０分間室温（ＲＴ）にて遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）を得た。無血小板血漿（ＰＦＰ）を得るために、１００００ｇで１０分間の追加遠心分離を実施した。
【０１２９】
血小板の計数および凝固パラメーターの測定
血小板の計数を、自動細胞計数器（プロサイトＤｘ血液学分析器、ＩＤＥＸＸ社）で実施した。フィブリノゲン、ＦＶＩＩＩ、およびＦＩＸ活性を、自動化Ｓｙｓｍｅｘ  ＣＡ−７０００凝固分析器（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｄｉｇｉｔａｎａ社）で測定した。プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を、凝固計（ＭＣ４ｐｌｕｓ、Ｍｅｒｌｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社）で測定した。
【０１３０】
ＥＬＩＳＡによるマウスＰＳ抗原およびＴＡＴ複合体の測定
９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｔｈｅｒｍｏ社）のウェルを、１ウェル当たり５０μＬの１０μｇ／ｍＬ  ウサギポリクローナル抗ヒトＰＳ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ緩衝液（０．０５Ｍ  ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、プレートを、２％のＴＢＳ−ＢＳＡでブロックキングした。希釈血漿試料（希釈範囲：１：３００〜１：６００）をウェルに添加し、ＲＴで２時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μＬの１μｇ／ｍＬビオチン化ニワトリポリクローナル抗マウスプロテインＳを添加し、ＲＴで２時間インキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を添加することによりシグナルを増幅し、プレートを１時間インキュベートした。プレートを、３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を添加した。１００μＬのＨＣｌ（１Ｍ）を添加することにより反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度を測定した。１４匹の健康マウス（８匹の雄および６匹の雌、７〜１２週齢）から得た正常血漿プールの系列希釈を使用することにより標準曲線を設定した。結果は、正常血漿プールに対するパーセンテージとして表した。
【０１３１】
製造業者の使用説明書に従って市販のＥＬＩＳＡ（エンザイグノストＴＡＴマイクロ、Ｓｉｅｍｅｎｓ社）を使用して、各血漿試料のＴＡＴレベルを重複して測定した。
【０１３２】
マウス組織処理および切片化、免疫組織化学法、ならびに顕微鏡検査
前処理していない組織切片（４μｍ）を、不溶性フィブリン、ＰＳ、またはＴＦＰＩについて、ヘマトキシリン／エオシンもしくはマッソン３色染色で染色したか、または免疫染色した。以下の抗体を使用した：フィブリン（ｍＡｂクローン１０２−１０）１  終濃度１５．６μｇ／ｍＬ、ＲＴで３０分間インキュベーション、二次抗体ウサギ抗ヒト（ａｂ７１５５  Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、英国）１：２００希釈、ＲＴで３０分間インキュベーション；ＰＳ（ＭＡＢ  ４９７６、Ｒ＆Ｄ社、希釈１：５０）ＲＴで３０分間インキュベーション、二次抗体ウサギ抗ラット（ａｂ７１５５  Ａｂｃａｍ社）１：２００希釈、ＲＴで３０分間インキュベーション；ＴＦＰＩ（ＰＡＨＴＦＰＩ−Ｓ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）終濃度１８．６μｇ／ｍＬ、ＲＴで３０分間インキュベーション、二次抗体ウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ａｂ７１０６、Ａｂｃａｍ社）１：２００希釈、ＲＴで３０分間インキュベーション。染色はすべて、製造業者の使用説明書に従って免疫染色器ＢＯＮＤ  ＲＸ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ムッテンツ、スイス）を用いて実施した。２０×（ＮＡ０．８）、４０×（ＮＡ０．９５）空気対物レンズを有する３Ｄ  ＨＩＳＴＥＣＨ  Ｐａｎｏｒａｍｉｃ  ２５０  Ｆｌａｓｈ  ＩＩを使用して、スライド全体を走査した。画像処理は、Ｐａｎｏｒａｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを使用して実施した。
【０１３３】
Ｆ８の完全遺伝的喪失を有するマウスへのＦＶＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏ投与
６〜９週齢のマウスをケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。本発明者らは、１時間で１００％のＦＶＩＩＩレベルに到達するための０．３Ｕ／ｋｇの組換えＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、Ｂａｘａｌｔａ社）（通常用量）または１時間で＞２００％に到達するための過剰用量の組換えＦＶＩＩＩ（２Ｕ／ｋｇ）のいずれかを静脈内投与した。通常用量または過剰用量のいずれかを、頚静脈カテーテルを導入する１時間前および１時間後（マウスＪＶＣ  ２Ｆｒ  ＰＵ  １０ｃｍ、Ｉｎｓｔｅｃｈ社）ならびにその後中心線に留置した４時間、８時間、および１６時間後に注射した。最初の注射の２４時間後にマウスを犠牲にした。血液を採取し、臓器を回収した。ＦＶＩＩＩ、フィブリノゲン、およびトロンビン−抗トロンビン複合体（ＴＡＴ）を、例に記載される通りに測定した。肺を単離し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、パラフィンに包埋した。
【０１３４】
腸間膜動脈のＦｅＣｌ３傷害血栓症モデル
生体顕微鏡法を使用した腸間膜動脈における血栓症モデルを、参考文献２を多少改変したものに従って実施した。マウスを、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内注射することにより麻酔した。１００μＬローダミン６Ｇ（１．０ｍＭ）を注射することにより、血小板をｉｎ  ｖｉｖｏで直接的に標識した。研究領域を選択した後、１０％ＦｅＣｌ３を染み込ませたろ紙（１Ｍワットマン紙の直径１ｍｍパッチ）を局所的に１分間適用することにより、血管壁傷害を生成した。血栓形成を、アフィニティ補正水浸型オプティクス(ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｗａｔｅｒ−ｉｍｍｅｓｉｏｎ  ｏｐｔｉｃｓ）（Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）を備えた、ＦＩＴＣフィルターセット付きの蛍光顕微鏡（ＩＶ−５００、Ｍｉｃｒｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）下にてリアルタイムでモニターした。光輝性蛍光標識血小板および白血球は、ビデオ起動型ストロボスコープ落射照明（Ｃｈａｄｗｉｃｋ  Ｈｅｌｍｕｔｈ社、エルモンテ、カリフォルニア州）による１３５５μｍ×９６５μｍ観察野の観察を可能にした。ＮＡ０．３．を有する対物１０倍のＺｅｉｓｓ社製Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒを使用した。場面はすべて、カスタマイズした低遅延シリコン強化ターゲットカメラ（Ｄａｇｅ  ＭＴＩ社、ミシガン市、インディアナ州）、タイムベース生成装置、およびＨｉ−８  ＶＣＲ（ＥＶ、Ｃ−１００、ソニー社、日本）を使用してビデオテープに記録した。血液細胞流の停止により決定された血管壁閉塞までの時間を測定した。
【０１３５】
線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）単離、培養、およびフローサイトメトリー
８〜１０週齢マウスのマウスＦＬＳを、３に従って単離および培養した。３回継代した後に、細胞の位相差画像を撮影し、細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲートラット抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（Ｍ１／７０、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＰＥコンジュゲートラット抗マウスＣＤ９０．２抗体（３０−Ｈ１２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＦＩＴＣコンジュゲートラット抗マウスＣＤ１０６抗体（４２９ＭＶＣＡＭ．Ａ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＰＥコンジュゲートハムスター抗マウスＣＤ５４抗体（３Ｅ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、および蛍光色素コンジュゲートアイソタイプ対照抗体と共に、暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。最終洗浄および遠心分離ステップの後、インキュベートしたすべての細胞を、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）およびＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ７．０ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。健康個体およびＯＡ患者に由来するヒトＦＬＳを、Ａｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入し、製造使用説明書に従って培養した。
【０１３６】
ウエスタンブロッティング
ヒト試料およびマウス試料におけるＰＳおよびＴＦＰＩを、還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により検出した。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、その後、以下のものを使用して視覚化した：マウスＰＳの場合は２ｕｇ／ｍＬモノクローナルＭＡＢ−４９７６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社）、マウスＴＦＰＩの場合は１μｇ／ｍＬポリクローナルＡＦ２９７５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社）。組換えマウスＰＳ４（３０ｎｇ）、組換えヒトＴＦＰＩ全長（Ｔ．Ｈａｍｕｒｏ、Ｋａｋｅｔｓｕｋｅｎ、日本により提供）、洗浄血小板のライセート、Ｆ８−／−Ｐｒｏｓ１＋／＋マウス由来のＰＦＰ、およびＦ８＋／＋Ｐｒｏｓ１＋／＋マウス由来の胎盤ライセートを、ＰＳ、ＴＦＰＩα対照として使用した。コンフルエントマウスおよびヒトＦＬＳ順化培地に由来する試料を、無血清培地（ＯｐｔｉＭｅｍ社）での２４時間インキュベーション後に収集し、アミコンフィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、１０ｋＤａカットオフ）を使用して４０倍に濃縮した。ＴＦＰＩウエスタンブロッティングでは、試料を、ゲルに負荷する前に、５つのタンパク質デグリコシダーゼ（ｄｅｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｏ−グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、脱グリコシル化キット、Ｖ４９３１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）の混合物で１２時間３７℃にて処理した。最終検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Ｄａｋｏ社）およびＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用し、Ｆｕｊｉ  ＬＡＳ  ３０００ＩＲ  ＣＣＤカメラでモニターすることにより完了した。
【０１３７】
ヒト膝滑膜の免疫組織化学
重度膝関節症の関節形成術を受けた１２人のＨＡ患者および４人のＨＢ患者に由来する滑膜組織のパラフィン包埋検体を、フィレンツェ大学のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＳｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙのアーカイブにて別記のように収集した５、６。７人のＨＡ患者を要求時に処置し、５人を二次予防で処置した。４人のＨＢ患者はすべて、要求時に処置した。７人の骨関節炎（ＯＡ）患者に由来する滑膜試料を対照として使用した５、６。免疫組織化学分析では、滑膜組織切片（５μｍ厚）を、脱パラフィンし、再水和し、抗原回収のためにクエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）中で１０分間沸騰し、続いてメタノール中３％Ｈ２Ｏ２で１５分間室温にて処理して、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、製造業者のプロトコールに従ってＵｌｔｒａ  Ｖブロック（ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｎｔｉ−Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ、ＨＲＰ、カタログ番号ＴＰ−１２５−ＨＬ、ＬａｂＶｉｓｉｏｎ社）を用いてＲＴにて１０分間インキュベートした。非特異的部位結合をブロッキングした後、スライドを、ＰＢＳで希釈したウサギポリクローナル抗ヒトプロテインＳ／ＰＲＯＳ１抗体（１：５０希釈、カタログ番号ＮＢＰ１−８７２１８、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）またはヒツジポリクローナル抗ヒト組織因子経路阻害物質（ＴＦＰＩ）抗体（１：５００希釈、カタログ番号ＰＡＨＴＦＰＩ−Ｓ、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＳ免疫染色では、その後、組織切片を、ビオチン化二次抗体と共に、続いてストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｎｔｉ−Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ、ＨＲＰ；ＬａｂＶｉｓｉｏｎ社）と共に製造業者のプロトコールに従ってインキュベートした。ＴＦＰＩ免疫染色では、その代りに、組織切片を、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧ（１：１０００希釈；カタログ番号ａｂ９７１２５；Ａｂｃａｍ社）で３０分間インキュベートした。３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣキット、カタログ番号ＴＡ−１２５−ＳＡ；ＬａｂＶｉｓｉｏｎ社）を色原体として使用して免疫反応性を発色させた。最後に、滑膜切片をマイヤーヘマトキシリン（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ社）で対比染色し、洗浄し、水性封入剤でマウントし、Ｌｅｉｃａ社製ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で観察した。一次抗体に接触しなかったか、またはアイソタイプ一致および濃度一致非免疫ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と共にインキュベートした切片が、抗体特異性の陰性対照として含まれていた。光顕微鏡画像を、Ｌｅｉｃａ社製ソフトウェアアプリケーションパッケージＬＡＳ  Ｖ３．８（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を備えたＬｅｉｃａ社製ＤＦＣ３１０ＦＸ１．４メガピクセルデジタルカラーカメラで撮影した。
【０１３８】
フィブリン塊超微細構造調査
フィブリン塊を、約５ｎＭ  ＴＦ（デイドイノビン、Ｓｉｅｍｅｎｓ社）の添加によりＰＦＰから３７℃で調製した。その後、それらを２％グルタルアルデヒドで固定し、脱水し、走査型電子顕微鏡を使用した視覚化のために、Ｚｕｂａｉｒｏｖａら７に従って金パラジウムでスパッタコーティングした。ＳＴＥＰａｎｉｚｅｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｐａｎｉｚｅｒ．ｃｏｍ）を使用して、ネットワーク密度および線維分岐の半定量的評価を実施した。
【０１３９】
マウス試料における較正された自動化トロンボグラフィーアッセイ（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈｙ  ａｓｓａｙ）
較正された自動化トロンボグラム（ＣＡＴ、ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）法を使用して、ＰＦＰおよびＰＲＰ中でのトロンビン生成を決定した。
【０１４０】
ＰＲＰ（１５０Ｇ／Ｌ）におけるＴＦＰＩ依存性ＰＳ活性を、以下の通りに評価した。手短かに言えば、１０μＬマウスＰＲＰ（１５０Ｇ／Ｌ）を、１０μＬのＰＲＰ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社）および３０μＬの緩衝液Ａ（２５ｍｍ  Ｈｅｐｅｓ、１７５ｍｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）と混合した。１０μＬの蛍光発生基質／ＣａＣｌ２混合物を用いて３７℃にてトロンビン生成を開始させた。終濃度は以下の通りだった：１６．６％マウス血漿、１ｐＭ  ｈｒＴＦ、４μＭリン脂質、１６ｍＭ  ＣａＣｌ２、および０．４２ｍＭ蛍光発生基質。
【０１４１】
マウスＰＦＰおよびＰＲＰにおけるＡＰＣ依存性ＰＳ活性を、Ｄａｒｇａｕｄ  Ｙら８に従って、ＣＡＴに基づくＡＰＣ耐性試験で評価した。ＰＲＰ（１５０Ｇ／Ｌ）を、４０μＭ  Ｃａ２＋イオノフォア（Ａ２３１８７）を使用して５分間３７Ｃで事前に活性化した。終濃度は以下の通りだった：１６．６％マウス血漿、２２μＭ  Ａ２３１８７、１ｐＭ  ｈｒＴＦ、４μＭリン脂質、２ｎＭ（ＰＦＰの場合）もしくは８ｎＭ（ＰＲＰの場合）野生型組み替えマウスＡＰＣ（ｗｔ−ｒｍＡＰＣ）５または突然変異組替えマウスＡＰＣ（ｒｍＡＰＣ  Ｌ３８Ｄ）、１６ｍＭ  ＣａＣｌ２、および０．４２ｍＭ蛍光発生基質。ｒｍＡＰＣ  Ｌ３８Ｄの生成および特徴付けをｒｅｆ９、１０に従って実施し、精製をｒｅｆ１１、１２に従って実施した。
【０１４２】
ＰＦＰに対するＴＦ滴定では、以下の試薬を使用した：ＰＰＰ試薬およびＭＰ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社）。
【０１４３】
ディスペンサーを備えたＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）蛍光光度計を使用して、蛍光を測定した。３９０ｎｍ（励起フィルター）および４６０ｎｍ（発光フィルター）の波長での蛍光強度を検出した。専用ソフトウェアプログラムＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（登録商標）バージョン３．０．０．２９（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ｂｖ社）は、較正物質（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ｂｖ社）に対するトロンビン活性の計算を可能にし、トロンビン活性を経時的に表示した。経験はすべて、３７℃にて重複して実施し、測定は通常６０分間続いた。
【０１４４】
ヒト試料でのＣＡＴアッセイ
書面によるインフォームドコンセントを患者から得た。静脈血を、静脈穿刺により３．２％クエン酸ナトリウム（容積／容積）に採取し、２０００ｇで５分間遠心分離した。その後、乏血小板血漿（ＰＰＰ）を１００００ｇで１０分間遠心分離して、ＰＦＰを得た。ＰＦＰをアリコートし、瞬間凍結し、使用まで−８０℃で保管した。ＰＲＰの場合、血液を、１８０ｇ×１０分間で遠心分離した。対象はすべて、参加へのインフォームドコンセントを与えた。ヒトＰＦＰおよびＰＲＰにおけるトロンビン生成を、多少変更したｒｅｆ１３に従って評価した。手短かに言えば、６８μＬのＰＦＰまたはＰＲＰ（１５０Ｇ／Ｌ）を、１２μＬのポリクローナルウサギ抗ヒトＰＳ  ＩｇＧ抗体（０．４２ｍｇ／ｍＬ、Ｄａｋｏ社）またはＴＦＰＩに対するモノクローナル抗体（０．６６μｍ、ＭＷ１８４８、Ｓａｎｑｕｉｎ社）または緩衝液Ａのいずれかと共に、３７℃で１５分間インキュベートした。ＰＦＰ試料の場合は低ＰＰＰおよび５ｐｍ  ＰＰＰ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  ｓｔａｇｏ社）の２０μＬ  ７：１混合物を用いて、ＰＲＰ試料の場合はＰＲＰ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社）を用いて、凝固を開始させた。２０μＬのＣａＣｌ２および蛍光発生基質（Ｉ−１１４０；Ｂａｃｈｅｍ社）を添加した後、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ測定器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）でトロンビン生成を追跡した。
【０１４５】
考察
ＰＳの存在は、トロンビン生成の重要な制御因子である。本発明者らは、ＰＳを標的とすることが、血友病の有望な治療を構成し得ると考えた。
【０１４６】
マウスにおける広範な研究は、血友病マウスにおける出血および重度関節損傷への寄与にＰＳおよびＴＦＰＩが中心的な役割を果たすことを支持する概念データの証拠を提供する。Ｐｒｏｓ１の標的化またはＰＳの阻害は、尾部出血アッセイにおける出血表現型のｉｎ  ｖｉｖｏ改善および関節血症からの完全な保護（図３Ａ〜３Ｃおよび図４）から判断して、マウスの血友病を寛解する能力を有する。関節は非常に弱いＴＦの発現を示し、滑膜細胞は大量のＴＦＰＩαおよびＰＳを産生するため（図５）、外在性経路の活性は、関節内の血友病素因性関節の出血を大幅に低減する。さらに、トロンボモジュリン（ＴＭ）および内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）は両方ともＦＬＳにより発現され、ＡＨの状況では、ＴＭ−トロンビン複合体が、ＥＰＣＲ結合ＰＣを活性化して非常に強力な抗凝血剤ＡＰＣを生成することを示唆する。重要なことには、ＴＦＰＩαの発現は、トロンビンにより上方制御される（図５Ｆ）。したがって、通常は、数日から数週間にわたって続く場合がある著しい局所炎症および関節症状をもたらすＡＨは、複数の抗凝血剤、すなわちＡＰＣ、ＴＦＰＩα、およびそれらのコファクターＰＳの局所生成および分泌も促進し、これは、血友病における関節損傷の病態生理の説明を支援することができる。
【０１４７】
血友病患者に由来する臨床試料を使用した観察は、マウス研究から学んだ教訓と一致する。ヒトでは、阻害物質を有するまたは有しないＨＡ患者に由来する血漿のＰＳをブロッキングすることにより、ＥＴＰが正常化される（図７Ｄ〜７Ｇ）。ＨＢ患者は、ＨＡ患者よりも少ないＴＦＰＩおよびＰＳの関節内発現を示し、ＨＢ患者はＨＡ患者よりも出血が少ないという現在の知識と一致する（図６）。さらに、予防を受けているＨＡ患者は、出血の状況でのみＦＶＩＩＩ濃縮物を受ける、つまりいわゆる「要求時治療」を受ける患者よりも少ないＴＦＰＩおよびＰＳ滑膜発現を示す（図６Ａ）。最後に、ヒトＦＬＳは、マウスで観察されたようにＴＦＰＩαおよびＰＳを両方とも分泌し、したがってヒトに対するマウス血友病データの外挿が強化される。
【０１４８】
この報告書における広範な知見により、本発明者らは、ＰＳの標的化が血友病に有用な療法へと橋渡しされ得る可能性があるという提案に導かれた。ヒト関節およびマウス関節におけるＰＳは、関節血症に対する新規の病態生理学的寄与因子であり、特に関節内のＡＰＣおよびＴＦＰＩαの両方に対するその二重コファクター活性のため、魅力的で有望な治療標的を構成する。ＰＳが存在すると、関節血症は、滑液でのＴＦＰＩα発現を増加させる。マウスにおけるＰＳの標的化は、マウスを関節血症から保護する。したがって、本発明者らは、ＴＭ−ＥＰＣＲ−ＰＣ経路と合わせてＦＬＳにより生成されるＴＦＰＩαおよびそのコファクターＰＳは両方とも、関節血症に対して重要な病理学的効果を有する強力な関節内抗凝固系を構成することを提案する。本発明者らが血友病マウスでの使用に成功したマウスＰＳサイレンシングＲＮＡ（図４Ｈ〜４Ｉおよび図５Ａ）は、本発明者らが血友病患者のために開発することになる治療手法である。現行の因子補充療法に対するサイレンシングＲＮＡの利点は、その半減期がより長く注射の頻度が低減されること、および皮下投与経路可能であることである。
【０１４９】
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１．Ｈｉｓａｄａ  Ｙ，  Ｙａｓｕｎａｇａ  Ｍ，  Ｈａｎａｏｋａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｂｒｉｎ  ｃｌｏｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１３；３：２６０４．
２．Ａｎｇｅｌｉｌｌｏ−Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  Ａ，  Ｆｏｎｔａｎａ  Ｐ，  Ｂｕｒｎｉｅｒ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ３７  ｌｉｍｉｔｓ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ  ｂｙ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２０１１；１２４（８）：９３０−９３９．
３．Ａｒｍａｋａ  Ｍ，  Ｖａｓｓｉｌｉｋｉ  Ｇ，  Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓ  Ｄ，  Ｋｏｌｌｉａｓ  Ｇ．  Ａ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ．  ２００９．
４．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＡ，  Ｈｅｅｂ  ＭＪ，  Ｘｕ  Ｘ，  Ｓｉｎｇｈ  Ｉ，  Ｚｌｏｋｏｖｉｃ  ＢＶ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．  Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ．  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．  ２００９；９４（１２）：１７２１−１７３１．
５．Ｍｅｌｃｈｉｏｒｒｅ  Ｄ，  Ｌｉｎａｒｉ  Ｓ，  Ｍａｎｅｔｔｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ，  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ，  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｓｕｇｇｅｓｔ  ｔｈａｔ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ  ｍａｙ  ｂｅ  ｌｅｓｓ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｈａｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ．  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．  ２０１６；１０１（２）：２１９−２２５．
６．Ｍｅｌｃｈｉｏｒｒｅ  Ｄ，  Ｍｉｌｉａ  ＡＦ，  Ｌｉｎａｒｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ−ＯＰＧ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ：  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｔｏ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ２０１２；３９（８）：１６７８−１６８６．
７．Ｚｕｂａｉｒｏｖａ  ＬＤ，  Ｎａｂｉｕｌｌｉｎａ  ＲＭ，  Ｎａｇａｓｗａｍｉ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ａｌｔｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｃｌｏｔｓ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１５；５：１７６１１．
８．Ｄａｒｇａｕｄ  Ｙ，  Ｌｕｄｄｉｎｇｔｏｎ  Ｒ，  Ｇｒａｙ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ−−ｗｈｉｃｈ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｌａｓｍａ  ｆｏｒ  ＴＧＴ？  Ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．  ２０１０；１２５（４）：３５３−３５６．
９．Ｈａｒｍｏｎ  Ｓ，  Ｐｒｅｓｔｏｎ  ＲＪ，  Ｎｉ  Ａｉｎｌｅ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００８；２８３（４５）：３０５３１−３０５３９．
１０．Ｐｒｅｓｔｏｎ  ＲＪ，  Ａｊｚｎｅｒ  Ｅ，  Ｒａｚｚａｒｉ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ／ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  Ｇｌａ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００６；２８１（３９）：２８８５０−２８８５７．
１１．Ｂｕｒｎｉｅｒ  Ｌ，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＡ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＳＰＣ−５４  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．  ２０１３；５０（４）：２５２−２５８．
１２．Ｍｏｓｎｉｅｒ  ＬＯ，  Ｙａｎｇ  ＸＶ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｎｏｒｍａｌ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｂｌｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００７；２８２（４５）：３３０２２−３３０３３．
１３．Ｍａｕｒｉｓｓｅｎ  ＬＦ，  Ｃａｓｔｏｌｄｉ  Ｅ，  Ｓｉｍｉｏｎｉ  Ｐ，  Ｒｏｓｉｎｇ  Ｊ，  Ｈａｃｋｅｎｇ  ＴＭ．  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＦＰＩ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．  Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２０１０；８（４）：７５０−７５８．
１４．Ｐｏｌｄｅｒｄｉｊｋ  ＳＧ，  Ａｄａｍｓ  ＴＥ，  Ｉｖａｎｃｉｕ  Ｌ，  Ｃａｍｉｒｅ  ＲＭ，  Ｂａｇｌｉｎ  ＴＰ，  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  ＪＡ．  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＡＰＣ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｒｐｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１６．
１５．Ｓａｌｌｅｒ  Ｆ，  Ｂｒｉｓｓｅｔ  ＡＣ，  Ｔｃｈａｉｋｏｖｓｋｉ  ＳＮ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００９；１１４（１１）：２３０７−２３１４．
１６．Ｂｉ  Ｌ，  Ｌａｗｌｅｒ  ＡＭ，  Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ  ＳＥ，  Ｈｉｇｈ  ＫＡ，  Ｇｅａｒｈａｒｔ  ＪＤ，  Ｋａｚａｚｉａｎ  ＨＨ，  Ｊｒ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９５；１０（１）：１１９−１２１．
１７．Ｌｉｎ  ＨＦ，  Ｍａｅｄａ  Ｎ，  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  Ｏ，  Ｓｔｒａｉｇｈｔ  ＤＬ，  Ｓｔａｆｆｏｒｄ  ＤＷ．  Ａ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９７；９０（１０）：３９６２−３９６６．
１８．Ｗｅｉｓｓ  ＥＪ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＪＲ，  Ｌｅａｓｅ  ＫＥ，  Ｃｏｕｇｈｌｉｎ  ＳＲ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ＰＡＲ３．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００２；１００（９）：３２４０−３２４４
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
2021507681.tif 000003
【図１（ｃ）】
2021507681.tif 000004
【図１（ｄ）】
2021507681.tif 000005
【図１（ｅ）】
2021507681.tif 000006
【図１（ｆ）】
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【図１（ｇ）】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図２（ｄ）】
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【図３】
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【図４（ａ）】
2021507681.tif 000014
【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図５（ｃ）】
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【図６（ａ）】
2021507681.tif 000020
【図６（ｂ）】
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【図７（ａ）】
2021507681.tif 000022
【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
2021507681.tif 000024
【図７（ｄ）】
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【図７（ｅ）】
2021507681.tif 000026
【図７（ｆ）】
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【図７（ｇ）】
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【図８】
2021507681.tif 000029
【図９】
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【図１０（ａ）】
2021507681.tif 000031
【図１０（ｂ）】
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【図１１（ａ）】
2021507681.tif 000033
【図１１（ｂ）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021507681.tif 000036