(57)【要約】  本出願は、生分解性医療用途の製造のための生分解性ベースのポリマーに関する。バイオベース材料は、グリシジルメタクリレートで修飾されたデキストランと、２−イソシアナトエチルメタクリレートで修飾されたポリ（ε−カプロラクトン）とによって構成されるコポリマーを含み、これらは、種々の配合物で組み合わされ、多様な用途のための生物医学的デバイスとして使用され得る膜、３−Ｄ足場、および中空チューブを製造するために使用される。このような用途は、とりわけ、ドラッグデリバリーシステム、組織工学の足場、末梢神経の修復および再生に関する。
2021528127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシジルメタクリレートで修飾されたデキストランと、２−イソシアナトエチルメタクリレートで修飾されたポリε−カプロラクトンとを含む、光重合生分解性コポリマー配合物。
【請求項２】
前記修飾されたデキストランの割合が、２５％〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１に記載のコポリマー配合物。
【請求項３】
前記修飾されたポリε−カプロラクトンの割合が、５０％〜７５％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１または２に記載のコポリマー配合物。
【請求項４】
前記配合物が、水溶性の糖型または塩型の既知の多孔質剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコポリマー配合物。
【請求項５】
前記多孔質剤が、スクロース、塩化ナトリウム、および炭酸ナトリウムを含むリストから選択される、請求項４に記載のコポリマー配合物。
【請求項６】
前記多孔質剤がＤ−マンニトールである、請求項４に記載のコポリマー配合物。
【請求項７】
Ｄ−マンニトールの含有量が、前記コポリマー配合物の２０〜８０％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコポリマー配合物。
【請求項８】
前記コポリマーが、フィルム、シート、チューブ、ロッド、プラグ、マイクロスフェア、３−Ｄスコフォールド（scoffolds）、またはメッシュに成形される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコポリマー配合物。
【請求項９】
前記コポリマー配合物が固体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコポリマー配合物。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項１に記載のコポリマー配合物から固体材料を調製するための光重合の方法：
グリシジルメタクリレートで修飾されたデキストランを、室温でＤＭＳＯに溶解する；
２−イソシアナトエチルメタクリレートで修飾されたポリε−カプロラクトンを、先の溶液に添加する；
先のコマクロモノマーを完全に溶解し、光開始剤を添加する；
２８０ｎｍの波長を有するＵＶ光下で前記配合物を光架橋させるために放置する；
最終コポリマーを水で７日間以下の期間洗浄し、次いで真空下で乾燥させる。
【請求項１１】
２０００００ｇ／ｍｏｌ以下の範囲のデキストランを使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
デキストラン７００００ｇ／ｍｏｌを使用する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
６００ｇ／ｍｏｌ以下の範囲のポリε−カプロラクトンを使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記最終コポリマー配合物を４０℃で乾燥させる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１５】
前記光開始剤を０．０２〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で使用する、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記コマクロモノマーを完全に溶解した後、水溶性の糖型または塩型の既知の多孔質剤を前記溶液に添加し、可溶化のために放置する、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記多孔質剤を含む前記コポリマーを蒸留水に浸漬し、３７℃で３日間炉中に放置した後、前記最終コポリマーを水で洗浄し、減圧下で乾燥させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生物医学的用途に使用するための、請求項１に記載の光重合生分解性コポリマー配合物。
【請求項１９】
再生医療に使用するための、請求項１に記載の光重合生分解性コポリマー配合物。
【請求項２０】
神経ガイドとして使用するための、請求項１に記載の光重合生分解性コポリマー配合物。
【請求項２１】
生物医学的ドレーン、ステント目的のための生物医学的チューブ、抗接着シートなどの体内用途のための生物医学的シート、一時的創傷ケア被覆などの局所使用のためのまたは瘢痕を防ぐための生物医学的シート、創傷ケアフォーム、身体に導入される針およびチューブのための保護シース、ドラッグデリバリーのための（マイクロ）スフェア、塞栓目的のための（マイクロ）スフェア、粒子、およびプラグ、皮膚増強、しわおよび皮膚輪郭の欠損の治療などの美容手術目的のための（マイクロ）スフェア、人工血管、組織工学の足場、半月板修復のための人工皮膚または足場プラグとして使用するための、請求項１に記載の光重合生分解性コポリマー配合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本出願は、コポリマー、それらの製造およびそれらの医療用途に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
損傷後の神経再生を増強するための良好な代替法として、管形成技術が提唱されている。この技術の範囲は、新たに形成された軸索を遠位断端から近位断端までガイドするために両神経端に縫合される中空管の使用に依拠する。生体適合性コポリマー材料は、それらの物理化学的および生物学的特性のために、この特定の種類の医療デバイスの調製のために使用されてきた。この意味で、生体適合性である細菌由来の多糖類であるデキストランは、組織再生関連用途に適したデバイスの調製のための良好な候補として現れる（Radiat Phys Chem 142 (2018) 115-120およびInzynieria i Aparatura Chemiczna (2014) 251-252）。
【０００３】
さらに、この天然ポリマーは、外科用接着剤（Acta Biomaterialia 53 (2017) 343-354）および組織再生目的のためのヒドロゲル（Radiat Phys Chem 142 (2018) 115-120）のコア材料として、生物医学分野において広く使用されている。さらに、デキストランは、生理的環境下で分解し、その分解産物は無毒であると考えられる。分解は、肝臓、脾臓、腎臓、および結腸などの器官におけるデキストラナーゼ酵素の作用を介して生じる（Biol Pharm Bull 20 (1997) 181-187）。しかしながら、その興味深い利点はあるもの、デキストランは低い機械的特性を示し（J. Mater. Chem. B 2 (2014) 8346-8360およびAdv Healthc Mater. 5 (2016) 2732-2744）、したがってその修飾がしばしば必要とされる（Carbohydr Polym 82 (2010) 412-418 and Carbohydr Polym 114 (2014) 467-475）。
【０００４】
ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）は、生体吸収性、疎水性、および半結晶性ポリエステルである（Biomaterials 26 (2005) 4817-4827）。その調整可能な分解および機械的特性は、その良好な適合性と共に、このポリマーを１９７０年代から生物医学分野に非常に魅力的なものにしてきた。この間、それは種々のドラッグデリバリーシステムにおいて使用されたが、その分解速度が遅いので、ＰＧＡおよびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）などの他の吸収性ポリマーが好ましかった。しかしながら、２０００年代以降、組織工学技術の発達に伴い、ＰＣＬはインビトロおよびインビボの両方で広範囲に試験され、生体適合性の点で良好な結果を示している。具体的には、末梢神経再生のために、このポリマーは、他の生体吸収性ポリマーと同様に、他のポリマーと混合され、細胞および神経成長因子の両方を播種された神経ガイド（nerve guides）単独で試験されてきた。ＰＣＬ−ＰＶＡ（J Mater Sci Mater Med 24 (2013) 1639-1647）、グリア細胞由来のカプセル化神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を有するＰＣＬ（ACS Biomater Sci Eng. 1 (2015) 504-512）、ＲＧＤとしてペプチドで官能化されたＰＣＬ表面（N. Biotechnol 31 (2014) 203-213）で調製された神経ガイドは、いくつかの例である。残念ながら、遅い分解速度に関連する問題は、依然として言及されている。
【０００５】
本技術の特性を調整する可能性のために、記載された実施形態は、分解率が重要な役割を果たす他の生物医学的用途にも適用することができる。このような用途は、ステント目的のための生物医学的チューブ；体内用途のための生物医学的シート；身体に導入される針およびチューブのための生物医学的シース；塞栓目的のための粒子およびプラグ；人口血管；組織工学の足場；ドラッグデリバリーを標的とするための人工皮膚および（マイクロ）スフェアを含む。具体的には、最後の例では薬物の投与のための非侵襲的かつ無痛の投与経路を作り出す努力が増加している。この意味で、種々の幾何学的形状およびサイズを有するドラッグデリバリーシステムが、経口経路の主要な欠点を克服するために提案されている（Prog Polym Sci 39 (2014) 2030-2075）。本研究は、新たな投与経路の探索、および特定の標的に対する各薬物の要件に適合し得る新たなポリマー材料の開発に基づいて行われた。
【０００６】
〔概要〕
本出願は、グリシジルメタクリレートで修飾されたデキストランと、２−イソシアナトエチルメタクリレートで修飾されたポリε−カプロラクトンとを含む、光重合生分解性コポリマー配合物に関する。
【０００７】
一実施形態では、修飾されたデキストランの割合が、２５％〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【０００８】
別の実施形態では、修飾ポリε−カプロラクトンの割合が、５０％〜７５％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【０００９】
さらに別の実施形態では、配合物が、水溶性の糖型または塩型の既知の多孔質剤（porogenic agents）をさらに含む。
【００１０】
一実施形態では、多孔質剤が、スクロース、塩化ナトリウム、および炭酸ナトリウムを含むリストから選択される。
【００１１】
別の実施形態では、多孔質剤がＤ−マンニトールである。
【００１２】
一実施形態では、Ｄ−マンニトールの含有量が、コポリマー配合物の２０〜８０％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００１３】
一実施形態では、コポリマー配合物が、フィルム、シート、チューブ、ロッド、プラグ、マイクロスフェア、またはメッシュに成形される。
【００１４】
一実施形態では、コポリマー配合物が固体である。
【００１５】
本出願はまた、以下の工程を含む、コポリマー配合物から固体材料を調製するための光重合の方法に関する：
グリシジルメタクリレートで修飾されたデキストランを、室温でＤＭＳＯに溶解する；
２−イソシアナトエチルメタクリレートで修飾されたポリε−カプロラクトンを、先の溶液に添加する；
先のコマクロモノマーを完全に溶解し、光開始剤を添加する；
２８０ｎｍの波長を有するＵＶ光下で配合物を光架橋させるために放置する；
最終コポリマーを水で７日間以下の期間洗浄し、次いで真空下で乾燥させる。
【００１６】
一実施形態では、デキストランを２０００００ｇ／ｍｏｌ以下の範囲で使用する。
【００１７】
別の実施形態では、デキストラン７００００ｇ／ｍｏｌを使用する。
【００１８】
一実施形態では、ポリε−カプロラクトンを６００ｇ／ｍｏｌ以下の範囲で使用する。
【００１９】
一実施形態では、最終コポリマー配合物を４０℃で乾燥させる。
【００２０】
一実施形態では、光開始剤を０．０２〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で使用する。
【００２１】
別の実施形態では、コマクロモノマーを完全に溶解した後、水溶性の糖型または塩型の既知の多孔質剤を溶液に添加し、可溶化のために放置する。
【００２２】
さらに別の実施形態において、多孔質剤を含む光重合コポリマーを蒸留水に浸漬し、３７℃で３日間炉中に放置した後、最終コポリマーを水で洗浄し、減圧下で乾燥させる。
【００２３】
さらに、本出願はまた、生物医学的用途に使用するための光重合生分解性コポリマー配合物に関する。
【００２４】
一実施形態では、光重合生分解性コポリマー配合物が、再生医療に使用するためのものである。
【００２５】
別の実施形態では、光重合生分解性コポリマー配合物が、神経ガイドとして使用するためのものである。
【００２６】
さらに別の実施形態では、光重合生分解性コポリマー配合物が、生物医学的ドレーン、ステント目的のための生物医学的チューブ、抗接着シートなどの体内用途のための生物医学的シート、一時的創傷ケア被覆などの局所使用のためのまたは瘢痕化を防止するための生物医学的シート、創傷ケアフォーム、身体に導入される針およびチューブのための保護シース、ドラッグデリバリーのための（マイクロ）スフェア、塞栓目的のための（マイクロ）スフェア、粒子、およびプラグ、皮膚増強、しわおよび皮膚輪郭の欠損の治療などの美容手術目的のための（マイクロ）スフェア、人工血管、組織工学の足場、半月板修復のための人工皮膚または足場プラグとして使用するためのものである。
【００２７】
〔概略の説明〕
今日まで、再生医療に使用される必要な特性を有する適切なポリマーはまだ不足している。
【００２８】
したがって、本技術の目的は、主に末端間縫合が不可能な神経断裂損傷における、末梢神経再生を含む、再生医療におけるその使用の要件を包含するデキストランベースの材料を提供することである。この目的のために、デキストランを、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）との反応によって二重結合を組み込むことによって修飾した。一実施形態では、この反応がデキストラン修飾の量を調節するために少ない反応時間を必要とする（Macromolecules 28 (1995) 6317-6322）。この反応の生成物はデキストラン−ＧＭＡである。
【００２９】
所望の材料の特性を微調整するために、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）ジメタクリレートコ−マクロモノマーを、デキストラン−ＧＭＡを含む配合物に添加する。
【００３０】
一実施形態では、ＰＣＬジメタクリレートコマクロモノマーがヒドロキシル末端基を有するＰＣＬのＩＥＭＡとの反応から得られ、その結果、ＰＣＬ−ＩＥＭＡが得られる（Int. J. Pharm 352 (2008) 172-181)）。
【００３１】
最終コポリマー特性におけるコマクロモノマー含有量の影響に対処することも、本技術の目的であった。
【００３２】
ＰＣＬ−ＩＥＭＡおよびデキストラン−ＧＭＡを有する配合物は、医療用途に使用されるユニークな特性を有する、最終材料であるコポリマーを創出するＵＶ光照射によって架橋される。
【００３３】
グリシジルメタクリレートでのデキストランの修飾は、Ｄ２Ｏ中のデキストラン−ＧＭＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより証明された。デキストランポリマーの典型的なピークは別として、二重結合のプロトンに起因するさらなるレゾナンス（ressonances）、およびメタクリレート基に属する−ＣＨ３基のプロトンが観察された。デキストランの修飾の割合は、デキストランおよびＧＭＡの二重結合に対応するシグナルの積分値の間の関係から計算した。得られた値は、３１〜３４％の範囲である（Macromolecules 28 (1995) 6317-6322）。
【００３４】
ＰＣＬの修飾反応の場合、添加されたＩＥＭＡはすべて反応で消費された。これは、イソシアネート基の強いバンド特性が見えないＦＴ−ＩＲによって確認された。
【００３５】
上述した２つの材料、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの組み合わせ、ならびに光架橋反応によるそれらの共重合は、再生医療において使用されるべき最終材料に必要な特性を有する新しい生成物を与え得ることが見出された。
【００３６】
さらに、最終材料であるコポリマーの多孔性を増加させるために、光重合反応およびコポリマーの完全性を損なうことなく、Ｄ−マンニトールを添加することが可能である。
【００３７】
製造されたコポリマーの機械的および化学的特性にアクセスするために、膨潤能力および分解試験を行った。末梢神経の再構築および再生を含む、医療用途におけるコポリマーの性能にアクセスするために、インビトロおよびインビボ試験も実施した。
【００３８】
〔図面の簡単な説明〕
本出願の理解を容易にするために、添付の図面は好ましい実施形態を表すが、それにもかかわらず、本明細書に開示される技術を限定することを意図しない。
【００３９】
添付の図面は、本技術の様々な実施形態を示し、本明細書の一部である。図示された実施形態は、本発明の単なる例であり、本技術の範囲を限定するものではない。
【００４０】
図１は、デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡのＦＴＩＲスペクトルを示す。ＦＴＩＲスペクトルは、室温で、ＡＴＲモードを有するＪａｓｃｏ  ＦＴ／ＩＲ−４２００分光計を使用して得た。データは、４ｃｍ−１のスペクトル分解能および６４回の蓄積で４０００〜５００ｃｍ−１の範囲で収集した。
【００４１】
図２は、デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【００４２】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、三重検出ＴＩＸ５ｍｍプローブを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００ＭＨ分光計で、２５℃で得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、三重検出ＴＩＸ５ｍｍプローブを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００ＭＨ分光計で、２５℃で得た。デキストランおよびデキストラン−ＧＭＡについては、使用した溶剤はＤ２Ｏであり、他に記載されているように（Macromolecules 28 (1995) 6317-6322）、特異的な条件下を使用した。簡単に述べると、３０ｓの緩和遅延（relaxation delay）で８７．７°のパルス角度を用いた。４．８ｐｐｍの水シグナルを、デカップリングによる溶媒抑制によって除去した。デカップリングパワーを、アノメリックプロトンシグナルの強度が影響を受けないレベルに調整した。ＰＣＬ−ジオールおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡについては、使用した溶媒はＤＭＳＯ−ｄ６であった。ＴＭＳを内部標準として使用した。
【００４３】
図３は、デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡの熱重量曲線を示す。
【００４４】
材料の熱安定性を、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ５００装置を用いた熱重量分析（ＴＧＡ）によって評価した。２５℃〜６００℃の温度を使用した。１０℃．ｍｉｎ−１の昇温速度および分析は、窒素雰囲気下で行った。
【００４５】
図４は、デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡの熱流量曲線を示す。
【００４６】
分解前の材料の熱挙動を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価した。使用した装置は、ＲＳＣ９０冷却ユニットを有するＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ１００である。
【００４７】
デキストランおよびデキストラン−ＧＭＡを最初に２５℃から２５０℃まで加熱し、続いてそれらの熱履歴を除去するために２５０℃から−８０℃までの冷却サイクルを行った。次いで、サンプルを−８０℃から２５０℃までの２回目の昇温サイクルに供した。
【００４８】
ＰＣＬ−ジオールおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの場合、２５℃から１５０℃まで最初の昇温サイクルを行い、その後−８０℃まで冷却サイクルを行った。２回目の昇温サイクルは、−８０℃から１５０℃まで行った。
【００４９】
昇温速度は１０℃．ｍｉｎ−１であり、Ｎ２雰囲気（５０ｍＬ．ｍｉｎ−１）下で分析を行った。使用したサンプルの重量は７ｍｇ〜９ｍｇであった。
【００５０】
図５は、異なるコマクロモノマー含有割合比を有するデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーの熱重量曲線を示す（表記［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］を使用）
１００／０
５０／５０
２５／７５
また、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡについて得られた曲線を比較のために含めた。
【００５１】
材料の熱安定性を、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ５００装置を用いた熱重量分析（ＴＧＡ）によって評価した。２５℃〜６００℃の温度の範囲を使用した。１０℃．ｍｉｎ−１の昇温速度および分析は、窒素雰囲気下で行った。
【００５２】
図６は、動的機械熱分析（ＤＭＴＡ）により得られたデキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、ＰＣＬ−ＩＥＭＡ、およびデキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡコポリマーのＴｇを示す。サンプルのＤＭＴＡは、Ｔｒｉｔｅｃ２０００ＤＭＡ中で行った。サンプルをステンレス鋼材ポケットに入れ、シングルカンチレバーモードで分析した。試験は−１５０℃から３００℃までの温度範囲で、１０℃．ｍｉｎ−１の昇温速度で、多周波モードで行った。Ｔｇは１Ｈｚにおけるｔａｎδ曲線のピークから決定した。
【００５３】
図７は、異なるコマクロモノマー含有割合比を有するデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーの膨潤能力を示す（表記［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］を使用）
１００／０
５０／５０
２５／７５
１ｃｍの直径を有する円形膜の膨潤能力をＰＢＳ（ｐＨ＝７．４、０．０１Ｍ）中で測定した。既知の乾燥重量を有する乾燥サンプルを、膨潤平衡が達成されるまで、３７℃で、５ｍＬのＰＢＳ中に浸漬した。所定の時間に、サンプルをＰＢＳから取り出し、表面の水を濾紙によって穏やかに吸い取った。
【００５４】
膨潤能力の割合は、以下の式を用いて計算した：膨潤能力（％）＝（Ｗ＿ｓ−Ｗ＿ｄ）／Ｗ＿ｄ×１００
ここで、Ｗ＿ｓは膨潤したサンプルの重量であり、Ｗ＿ｄはＰＢＳに浸漬する前の乾燥サンプルの重量である。測定は３回行った。
【００５５】
図８は、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーのインビトロ加水分解を示す。以下の表記を、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比を示すために使用する（［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］）。試験はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４、０．０１Ｍ）中で行った。１ｃｍの直径を有し、既知の重量を有する乾燥円形膜を、３７℃で、３０日間、ＰＢＳに浸漬した。所定の時間に、膜をＰＢＳから取り出し、蒸留水ですすぎ、それらの重量が安定するまで乾燥させた。
【００５６】
分解の程度の推定は、以下の式に従って、インキュベーション後の重量損失を計算することによって行った：重量損失（％）＝（Ｗ＿０−Ｗ＿ｔ）／Ｗ＿０×１００
ここで、Ｗ＿０は浸漬する前の乾燥サンプルの初期重量であり、Ｗ＿ｔは、ＰＢＳに浸漬し、乾燥させた後の乾燥サンプルの重量である。測定は３回行った。
【００５７】
図９は、コポリマー中に播種したヒト歯髄幹細胞（ｈＤＰＳＣｓ）のＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）生存率アッセイによって評価された吸光度を示す。使用した表記は、材料の最終組成物中のコマクロモノマーの割合を指す（［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］）。
【００５８】
コポリマーを、２４ウェル細胞培養プレート中の各ウェルに固定し、関連する対照を、細胞を有さない、固定剤単独（ＳＧ）およびコポリマーを用いて調製した。次いで、材料を４×１０４細胞／ウェル濃度で播種した。細胞を、０．５ｍＬの完全培養培地中に一晩接着させたままにした。各時点［２４時間（１日）、７２時間（３日）、１２０時間（５日）、および１６８時間（７日）］で、培養培地を各ウェルから除去し、１０％（ｖ／ｖ）の１０×Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率試薬と共に、新鮮な完全培地を各ウェルに添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートし、細胞生存率の変化を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣにおける吸光分光法によって検出した。上清を収集し、９６ウェルプレートに移し、吸光度を５７０ｎｍおよび５９５ｎｍで読み取った。その後、細胞をＰＢＳで洗浄して、Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）の残渣を除去し、新鮮な培養培地を各ウェルにリセットした。Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）の励起波長は５７０ｎｍであり、発光は５９５ｎｍである。各ウェルについて、５９５ｎｍでの吸光度（正規化波長）を５７０ｎｍでの吸光度（実験結果）に差し引いた。補正された吸光度を、各実験ウェルに対する対照ウェルの平均を差し引くことによって得る。
【００５９】
図１０は、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡコポリマーの皮下移植から得られた組織学的スコアを示す。使用した表記は、材料の最終組成物におけるコマクロモノマー比を指す。スコアは、ＩＳＯ  １０９９８−６スコアシステムに従って得た。
【００６０】
「ＳＨＡＭ」は、対照−移植なしの切開を指す。
【００６１】
図１１は、多孔質剤Ｄ−マンニトールと共にデキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡコポリマー（２５／７５）を用いて調製された神経ガイド導管の膨潤能力の割合を示す。使用した表記は、デキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡの割合含有量および添加したＤ−マンニトールの含有量（割合）を指す：（［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール））
２５／７５（０）
２５／７５（５０）
膨潤能力の割合は、上記と同じ式を用いて計算した。
【００６２】
図１２は、チューブ形状コンフォメーションを有するデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーのインビトロ加水分解を示す。以下の表記は、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比、およびＤ−マンニトールの含有量を示すために使用する：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール）。
【００６３】
インビトロ加水分解は、図２の説明で述べた同じ方法を用いて計算した。
【００６４】
図１３は、ラットの坐骨神経がコポリマー神経ガイドによって架橋された期間中の後の運動障害の割合を示す。以下の表記は、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比、およびＤ−マンニトールの含有量を示すために使用する：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール）。
【００６５】
図１４は、痛刺激を用いることによって得られた引込め反射を示す。以下の表記は、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比、およびＤ−マンニトールの含有量を示すために使用される：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール）。
【００６６】
図１５は、ラット坐骨神経をポリマー神経ガイドによって架橋した期間中のラットの足跡によって与えられた静的機能指標を示す。以下の表記は、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比、およびＤ−マンニトールの含有量を示すために使用する：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール）。
【００６７】
〔実施形態の説明〕
以下、本出願の好ましい実施の形態を、添付した図面を参照して詳細に説明する。しかしながら、それらは、本出願の範囲を限定することを意図していない。
【００６８】
本技術の目的は、生体適合性、生分解性、適切な透過性、適切な生体力学的特性、表面特性、およびカスタマイズされた寸法などの要件を包含する、再生医療におけるその使用のためのデキストランベースの材料を提供することである。
【００６９】
最終材料を得るために、最初に、デキストランを、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）との反応によって二重結合を組み込んで修飾した。最初に、２．５ｇ（１．５４×１０−２ｍｏｌ）のデキストランを、３０℃の水浴中に浸漬した丸底フラスコ中の２２．５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。デキストランを完全に溶解した後、０．５ｇ（４．０９×１０−３ｍｏｌ）のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を溶液中に溶解し、２．０５ｍＬ（１．５４×１０−２ｍｏｌ）のＧＭＡを添加した。反応は窒素雰囲気下で８時間進行した。この時間後、溶液を中和するために、０．３３ｍＬのＨＣｌ３７％（ｗ／ｗ）を添加した。次いで、反応の生成物を水に対して透析した。生成物を凍結乾燥させ、スポンジ様の生成物を得た。この反応により、デキストラン−ＧＭＡの配合物が得られる。
【００７０】
本技術では、デキストランを用いることが好ましい。好ましい実施形態では、デキストラン７００００ｇ／ｍｏｌを使用した。そうは言うものの、このパラメータは変更することができ、他の分子量を２０００００ｇ／ｍｏｌまでの範囲で使用することができる。
【００７１】
さらに、天然ポリマーの修飾のためにという事実にもかかわらず、好ましい実施形態においてＧＭＡが選択された。
【００７２】
デキストラン−ＧＭＡを得るための予備反応に続いて、ＰＣＬジメタクリレートコマクロモノマーを合成した。
【００７３】
好ましい実施形態では、ＰＣＬジメタクリレートがヒドロキシル末端基を含むＰＣＬのＩＥＭＡとの反応から得られた（ＰＣＬ−ＩＥＭＡ）。４０℃の水浴中に置いた丸底フラスコ中で、２．２ｇ（４ｍｍｏｌ）のＰＣＬ−ジオールを３０ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に、窒素雰囲気下で溶解した。ＰＣＬ−ジオール可溶化後、１．２７ｇ（８．２ｍｍｏｌ）のＩＥＭＡおよび１５０ｍｇのジブチルスズジラウレート（約３滴）を反応混合物に添加した。反応を２４時間進行させた。生成物を、ｎ−ヘキサン中での沈殿によって回収し、真空下で、恒量になるまで、室温で乾燥させた。
【００７４】
本技術では、ヒドロキシル末端基を含むＰＣＬを用いることが好ましい。本出願において、ポリε−カプロラクトンは、６００ｇ／ｍｏｌ以下の範囲で使用される。
【００７５】
同様に、好ましい実施形態では、ＰＣＬを修飾するためにＩＥＭＡが使用される。
【００７６】
デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの調製後、２５：５０〜５０：７５［デキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］の範囲で、異なる量の両方の材料を含む配合物を調製した。コポリマーを２ｍＬのＤＭＳＯに完全に可溶化するまで溶解した。
【００７７】
最終材料は、ＰＣＬジメタクリレート（ＰＣＬ−ＩＥＭＡ）およびデキストラン−ＧＭＡを含む配合物にＵＶ光（波長＝２８０ｎｍ）を、室温で、２時間照射し、２つのコポリマー間の光架橋反応を促進することによって得られる。
【００７８】
本出願の文脈において、室温は、１５℃〜２５℃の温度として定義される。
【００７９】
本技術では、ＵＶ光による照射が好ましいが、最終材料は最終形状の複雑さを増加させることを可能にし、生物医学的デバイスの調製のために報告されている（Biofabrication 10 (2018) 1-20およびJ. Neural Eng. 15 (2018) 1-12）、ＵＶ放射線を使用する３Ｄ印刷などの付加的な製造技術によっても得ることができる。
【００８０】
光架橋反応は、ＵＶ光と光開始剤とを０．０２〜２％  ｗ／ｖの濃度で組み合わせて行う。一実施形態では、光開始剤濃度は０．１％  ｗ／ｖである。
【００８１】
一実施形態では、光開始剤はＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９である。
【００８２】
異なる相対量のデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡを用いて作られたこの反応の得られたコポリマーは透明材料であり、それらの熱機械的特性は、コマクロモノマー含有量に依存することが見出された。
【００８３】
材料の形状は、金型に応じて変えることができる。好ましい実施形態では、膜形状および中空チューブ形状を調製した。しかしながら、本発明の方法では、これらの材料を球形に調製することも可能であり、これはドラッグデリバリーシステム用途のために一般に使用される。
【００８４】
ＰＣＬ−ＩＥＭＡ含有量の高いコポリマーは、より高い熱安定性（約８％高い）およびより低いガラス転移温度（６４〜９３％低い）を示し、より柔軟な材料に変換する。
【００８５】
医療用途では、これらの材料の多孔性が考慮すべき重要なパラメータである（Tissue Eng Part C Methods 19 (2013) 233-243）。
【００８６】
透過性チューブは栄養素および酸素の交換を可能にし、チューブのドレナージを可能にし、また、チューブ内部の血管新生を可能にすることが報告されている。これらの因子は全て、神経再生の増強に重要な役割を有することが示されている（Tissue Eng Part C Methods 19 (2013) 233-243）。
【００８７】
一実施形態では、スクロース、塩化ナトリウム、および炭酸ナトリウムなどの水溶性の糖型または塩型の既知の多孔質剤を添加することによって、多孔性を調製された材料に提供することができる。
【００８８】
記載された多孔質剤（PLoS One 7 (2012) e48824）を用いたいくつかの試験から、Ｄ−マンニトールは、光重合反応およびコポリマーの完全性を損なうことなく、材料に多孔性を与えることができる。
【００８９】
コポリマー配合物の２０〜８０％（ｗ／ｗ）の含有量のＤ‐マンニトールの存在は、光架橋反応を妨害しない。
【００９０】
一実施形態では、デキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡの配合物に添加されるＤ−マンニトールの量は、０％（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、添加されるＤ−マンニトールの量は、８０％（ｗ／ｗ）であった。Ｄ−マンニトールを有する配合物では、ＤＭＳＯ中でデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡを完全に可溶化した後に添加する。Ｄ−マンニトールの完全な可溶化が達成されると、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９も添加され、可溶化される。次いで、配合物をＵＶ光下で光架橋させる。重合後、材料を蒸留水中に浸漬し、３日間３７℃で炉中に放置し、Ｄ−マンニトールを除去する。次いで、最終材料をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で７日間洗浄し、減圧下、４０℃で乾燥させる。
【００９１】
要約すると、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの固体コポリマーを調製するための光重合の方法は、以下の工程に従う：
−デキストラン−ＧＭＡを、室温でＤＭＳＯに溶解する；
−ＰＣＬ−ＩＥＭＡを先の溶液に添加する；
−先のコマクロモノマーを完全に溶解し、光開始剤を添加する；
−２８０ｎｍの波長を有するＵＶ光下で配合物を光架橋させるために放置する；
−最終コポリマーを水で７日間洗浄し、次いで真空下で乾燥させる。
【００９２】
使用するデキストラン−ＧＭＡの量は２５〜５０％（ｗ／ｗ）である。
【００９３】
使用するＰＣＬ−ＩＥＭＡの量は５０〜７５％（ｗ／ｗ）である。
【００９４】
好ましい実施形態では、最終材料をミリＱ水で洗浄する。
【００９５】
好ましい実施形態では、最終材料を４０℃で減圧乾燥させる。
【００９６】
一実施形態では、デキストラン−ＧＭＡを２ｍＬのＤＭＳＯに溶解する。
【００９７】
一実施形態では、配合物を１時間光架橋させるために放置する。
【００９８】
一実施形態では、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの完全な溶解の後、水溶性の糖型または塩型の既知の多孔質剤を溶液に添加し、可溶化するために放置する。光架橋工程の後、次いで得られたコポリマーをdestilled水に浸漬し、炉中に３７℃で３日間放置して多孔質剤を除去した後、最終コポリマーを洗浄し、減圧乾燥させる。
【００９９】
デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡのＦＴＩＲスペクトル：
デキストランスペクトルでは、この多糖類に見られる典型的なバンド、すなわち３３００ｃｍ−１で観察できる−ＯＨ基（ａ）の伸縮振動を同定することができる。２９１０ｃｍ−１では、ＣＨ基およびＣＨ２基（それぞれ、ｂとｃ）の両方の伸縮振動に対応するバンドを観察することができる。１０００〜１１００ｃｍ−１には、エーテル結合（ｄ）の伸縮振動に対応するバンドがあり、９１４ｃｍ−１ではα−グリコシド結合（ｅ）の振動に起因するバンドである。４４  １６３６ｃｍ−１では、結合水（ｆ）の曲げに対応するバンドを観察することができる。
【０１００】
デキストラン−ＧＭＡのスペクトルに関しては、本来のデキストランのスペクトルとの関係においていくつかの違いを観察することができる。約１７１０ｃｍ−１（ｇ）の新しいバンドは、エステル結合のカルボニル基（ＧＭＡ中に存在する）の伸縮振動に対応する。メタクリレート基の変角振動は、８１３ｃｍ−１（ｈ）の両方のスペクトルで見ることができる。二重結合の伸縮振動は、１６５０ｃｍ−１で見ることができる。
【０１０１】
ＰＣＬ−ジオールスペクトルでは、（ａ）−ＯＨ基の振動に対応する３３４０ｃｍ−１、（ｂ）ＣＨ２の非対称および対称伸縮に対応する２９４０ｃｍ−１および２８６５ｃｍ−１のバンドをそれぞれ同定することができる。（ｃ）１７３０ｃｍ−１のピークは、エステル結合の−Ｃ＝Ｏ基の伸縮振動に起因する。
【０１０２】
ＰＣＬ−ＩＥＭＡのスペクトルでは、ウレタン結合の特徴的なバンドを同定することが可能であり、ＰＣＬ−ジオール構造の成功した修飾を確認する。これらのバンドの最初は（ｄ）１７２０ｃｍ−１であり、これはウレタン結合に属するカルボニル基と重なるＰＣＬ−ジオール由来のエステルのカルボニル基の伸縮振動に対応する。次いで、（ｅ）では、１６３０ｃｍ−１はＣ＝Ｃ基の伸縮振動に起因する。さらに、（ｆ）１５６６ｃｍ−１では、Ｎ−Ｈの変角振動およびＣ−Ｎ基の伸縮振動に対応するバンドも観察できた。さらに、−ＯＨ基に対応するブロードなバンドの消失、および−ＮＨ基の伸縮振動のよりシャープなバンド特性の出現が注目される。（ｇ）８１７ｃｍ−１にはメタクリレート基の二重結合の変角振動に対応するバンドが現れる。イソシアネート基（２２７０ｃｍ−１）の強いバンド特性は見えない。これは、全てのイソシアネート基が修飾の間に消費されたことを示す。
【０１０３】
デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトル：
Ｄ２Ｏ中のＰ＿ＬＭＷの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは、４．０ｐｐｍ〜３．３ｐｐｍの範囲の多重項ピークおよび５．３ｐｐｍ（ａ’）付近に見られるアノメリックプロトンピークであるデキストランポリマーの典型的なピークを観察することができる。
【０１０４】
デキストラン−ＧＭＡのスペクトルは、二重結合のプロトンに起因する、約６．１および５．７ｐｐｍ（ｋ）で、およびメタクリレート基に属する−ＣＨ３基のプロトンに対応する、約１．９ｐｐｍ（ｊ）で、さらなるレゾナンス（ressonances）を示す。デキストランの修飾の割合は、デキストランおよびＧＭＡの二重結合に対応するシグナルの積分値の間の関係から計算した。
【０１０５】
ＰＣＬ−ジオールの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＰＣＬの典型的なレゾナンスを示す。ＰＣＬ−ＩＥＭＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの場合、７．２〜７．４ｐｐｍにおいて、ウレタン結合の−ＮＨ基（ｍ）に対応するレゾナンスが明確に示される。５．６および６．１ｐｐｍにおける二重結合（ｌ）のプロトンに対応するピーク、および１．８ｐｐｍにおける−ＣＨ３基（ｋ）のプロトンのピークを同定することも可能である。さらに、ＰＣＬ−ジオール（ｊ）中の末端基のプロトンに対応するレゾナンスが、ＰＣＬ−ＩＥＭＡのスペクトルにおいて消失したことが分かる。
【０１０６】
デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの熱重量分析：
デキストランの熱分析曲線は、２段階の重量損失を示す。デキストラン−ＧＭＡ  ＧＭＡについては、３段階の重量損失を同定することができる。２５〜１５０℃の重量損失の第１段階は、両方のサンプルに共通であり、残留水分の損失に起因し得る。２７０〜３７０℃の間の分解の第２段階は、多糖類デキストラン鎖の分解を指す。重量損失のこの段階は、両方の曲線にも存在する。デキストラン−ＧＭＡについて観察された重量損失のさらなる段階は、デキストランの修飾部分の分解に起因し得る。これらのデータは、デキストランの熱安定性がＧＭＡによる修飾によって影響されないことを示唆する。
【０１０７】
ＰＣＬ−ジオールの分解は２段階で起こる。これは、ＰＣＬ−ジオールマトリックス内に存在するより小さい鎖の早期の分解によるものであり得る。ＰＣＬ＿ＩＥＭＡに関するものでは、重量損失の２つの主要な段階も示す。第１段階（３４５〜３５０℃）はウレタン結合の分解に起因し、続いて第２段階（３７８〜４４３℃）はエステル結合の分解に起因し得る。また、沸点２１１℃付近にピークがないことから、サンプルに未反応のＩＥＭＡがないことを確認することができる（Int. J. Pharm    352 (2008) 172-181）。
【０１０８】
デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの示差走査熱量測定：
デキストランおよびデキストラン−ＧＭＡの熱流量曲線では、同定できる唯一の熱事象はＴｇであり、これらの物質は、予想通り、完全にアモルファスであることを示している。一方、ＰＣＬ−ジオールの熱流量曲線は−４１．０℃で１つの熱事象を示し、それはガラスＴｇに対応する。さらに、材料の融解（Ｔｍ）（−９．０℃および７．５℃）に対応し、冷却サイクルにおいて結晶化（Ｔｃ）（−２８．６℃）に対応する２つの他の熱事象が存在する。この事実は、ＰＣＬ−ジオールが半結晶性ポリマーであることを確認する。ＩＥＭＡで修飾すると、ＰＣＬ−ジオールはその構造秩序を失い、アモルファス材料をもたらす。さらに、Ｔｇ値のわずかな低下が観察される（−４２．９℃）。ＰＣＬ−ジオール構造にＩＥＭＡが含まれることは、主鎖ポリマー鎖間の自由体積の増加に寄与し、観察されたＴｇの減少の正当性を示す。
【０１０９】
コポリマーの熱重量分析：
デキストラン−ＧＭＡのみ（１００／０）を用いて調製されたコポリマーは、対応する前駆体と比較してより高い熱安定性を示し（デキストラン−ＧＭＡ）、これは、それらの架橋構造によって説明される（Biomaterials 24 (2003) 759-767）。異なるコマクロモノマー含有割合比を有するコポリマーデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの熱重量曲線は、それらの異なる組成にもかかわらず、明らかに２段階の重量損失を示す。結果は、ＰＣＬ−ＩＥＭＡがコポリマーの熱安定性を増加させ、ＰＣＬ−ＩＥＭＡがコポリマーの熱安定性にプラスの影響を及ぼすことを示す。また、ＰＣＬ−ＩＥＭＡの含有量がより高い（２５／７５）コポリマーは、含有量がより低い（５０／５０）コポリマーと比較して、一貫してより安定である。この挙動は、最終材料の架橋の増加に起因し得る。全ての膜は、約３００℃の温度まで熱的に安定であることが見出された。
【０１１０】
動的機械熱分析（ＤＭＴＡ）：
ＤＭＴＡ分析は、全ての材料がＴｇに対応するピークを有することを示す。デキストランは、全てのサンプルのより高いＴｇ値を示す。それをＧＭＡで修飾すると、Ｔｇ値は予想通りわずかに減少する。しかしながら、ＰＣＬ−ジオールとＰＣＬ−ＩＥＭＡとの間では、ＩＥＭＡの包含が主鎖ポリマー鎖間の自由体積の増加に寄与するようなＴｇ値の有意な減少はない。コポリマーデキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡに関して、１００／０配合物（ＰＣＬ−ＩＥＭＡなし）は架橋ネットワークの確立のために、予想されるように、デキストラン−ＧＭＡよりも高いＴｇを有する。コポリマー５０／５０および２５／７５のＤＭＴＡ分析は、ＰＣＬ−ＩＥＭＡの含有量の増加に伴ってそれらのＴｇの低下を明らかにする。
【０１１１】
膨潤試験：
デキストラン−ＧＭＡに対するＰＣＬ−ＩＥＭＡの含有量の増加（０〜７５％から）に伴い、ＰＣＬの吸水性特性のため、予想通り、最終コポリマーの膨潤能力は２００％から約１００％（［デキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］５０：５０］）および５０％（［デキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］２５：７５］）へと減少した。それゆえ、材料の膨潤能力を調節することが可能であり、これは医療用途にとって非常に重要な特性である。
【０１１２】
分解試験：
インビトロ加水分解試験は、３０日間の間に、コポリマーがそれらの全重量の８〜１２％の間で失われたことを示した。さらに、コポリマーはその構造的完全性を維持することができ、この期間中に分解の兆候またはコンフォメーションの喪失を示さなかったため、その構造および機能を損なわなかった。
【０１１３】
膨潤試験および分解試験から得られた有望な結果に加えて、コポリマーを細胞インビトロ試験で試験した。
【０１１４】
したがって、材料の加水分解による分解性を調節することが可能であり、これは医療用途にとって非常に重要な特性である。
【０１１５】
細胞生存率および細胞適合性：
コポリマーの細胞生存率および細胞適合性を７日間試験した。この時間の後、材料と接触した細胞の生存率および増殖を分析した。すべての材料は、材料のない対照と比較して、類似の細胞生存率および代謝速度を示した。これは調製された材料の生体適合性を証明する。
【０１１６】
したがって、材料の表面と接触する細胞生存率を調節することが可能であり、これは医療用途において非常に重要な特性である。
【０１１７】
予備的なインビトロ試験（ラットにおける皮下移植）：
これらのコポリマーから得られた優れた細胞生体適合性指標のために、予備的なインビボ試験を行った。
【０１１８】
調製したコポリマーのサンプルをラットに皮下移植し、１５日間分析し、３、７および１５日後に細胞数および生物学的反応を評価した。試験終了時に、デキストラン−ＧＭＡのみで構成されるコポリマーは「軽度刺激性」と分類され、配合物中のＰＣＬ−ＩＥＭＡとのコポリマーは「非刺激性」の分類に対応するスコアを得た。
【０１１９】
インビボ試験（マウスの坐骨神経間隙を架橋する）−神経管ガイドとして試験されたチューブ：
膨潤能力、分解速度、インビトロおよびインビボ評価に関して本出願のコポリマー対象物で達成された良好な特性に関して、コポリマーを、神経ガイドとして試験されるチューブ形態に成形した。
【０１２０】
膨潤能力に関するものでは多孔質チューブおよび非多孔質チューブの両方が６０％未満の値を示し、非多孔質チューブであるのは４０％のみであり、これはチューブが移植されたときの、チューブ上の挙動に関する重要な特性である。調製したチューブの分解速度に関して、加水分解研究は、１８０日後、それらがそれらの構造的完全性を維持し、それらの初期重量の１２〜１６％の間でしか失わないことを明らかにした。
【０１２１】
本明細書に記載されるコポリマーを用いて調製される神経ガイドチューブは、分解または破損なしの縫合に対するそれらの耐性に関して、十分な機械的特性を有し、これは、移植プロセスにとって重要な特性である。さらに、それらは、神経自体（１〜２Ｎ）よりも、破損することなくより高い負荷（２．２〜２．４Ｎ）に耐えることができる。
【０１２２】
これらのコポリマーで作られた神経チューブ−ガイドのインビボでの性能を、神経断裂損傷後のラットの坐骨神経を架橋することにより評価した。手術のために、体重３００〜３５０ｇの成体の雄Ｓａｓｃｏ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、それぞれ６匹ずつの２群に分けた。すべての動物を、１２−１２時間の明／暗サイクルで、ケージあたり２匹の動物で、温度および湿度を制御した室内で飼育した。標準的な実験室条件下で、通常のケージ活動を可能にした。動物には、標準的な固形飼料および水を自由に与えた。動物の苦しみおよび苦痛に対するヒトのエンドポイントを考慮して適切な措置を講じることにより、痛みおよび不快感を最小限にした。実験に入る前に、動物を２週間飼育した。
【０１２３】
手術のために、ラットを無菌状態下でうつ伏せに置いた。切り取られた外側右大腿部の皮膚を、ルーチンの方法で、消毒溶液で擦った。手術は、Ｍ−６５０手術顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で行った。使用した麻酔はケタミン９ｍｇ／１００ｇ；キシラジン１．２５ｍｇ／１００ｇ；アトロピン０．０２５ｍｇ／１００体重で構成し、筋肉内に適用した。麻酔の効果の下で、大転子から遠位の半分まで延在する皮膚切開を行った。次いで、筋肉分割切開を行い、動物の坐骨神経を露出させた。固定化後、真っ直ぐな顕微手術用はさみの助けを借りて、切断（神経断裂）を誘導した。神経は末端神経分枝直上ですぐに損傷していた。両方の群において、近位および遠位断端をコポリマーＤおよびＥ神経ガイドに３ｍｍ挿入し、７／０モノフィラメントナイロンを使用して２つの神経弓突起縫合糸で所定の位置に保持した。２つの断端間の神経間隙は１０ｍｍと測定された。両群とも反対側の脚および坐骨神経は無傷のままとし、通常の神経のコントロールと考えられた。自己切断を防ぐため、動物の右足に抑止物質を適用した。全ての手順は、１９８６年１１月のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って、ポルトガルの獣医局の承認を得て行われた。
【０１２４】
先述した神経断裂損傷および本発明の神経チューブ−ガイドによる修復後の神経の運動能力は、姿勢正伸筋突伸反応（ＥＰＴ）の伝導によって評価された。ＥＰＴ試験結果の登録のために、後肢を除いて、ラットの身体を手術タオルに包む。次いで、動物は、デジタル天秤の台に向かって操作者によって支持され、下げられる。台に近づけることにより、動物は台との視覚的接触を確立することができる。次いで、動物は、後肢を伸ばすことによって台との接触を予想し得る。この接触は、遠位中足および指によって行われる。デジタル台天秤（モデルＴＭ５６０；Ｇｉｂｅｒｔｉｎｉ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）に適用した重量（力）を、グラムで、実験（ＥＥＰＴ）メンバーおよび正常（ＮＥＰＴ）メンバーの両方について記録した。測定を３回繰り返し、考慮した値はそれらの間の平均である。Ｋｏｋａらによって報告されているように（Exp. Neurol 168 (2001) 192-195）、ＥＥＰＴおよびＮＥＰＴを以下の式で積分して、機能的欠損の割合を得た。移植の２０週間後、数週間にわたる運動回復の割合の改善が観察される。
【０１２５】
侵害受容性機能を、Ｍａｓｔｅｒｓら（Anesthesiology 79 (1993) 340-346）によって記載されるように改変されたホットプレート試験による引込め反射潜在性（ＷＲＬ）の評価によって評価した。通常のラットは、４．３秒以内にホットプレートから足を引っ込める。１２秒後に足の引込めが起こらなかった場合は熱刺激を除去し、組織損傷を防ぐために試験を中断した。これらの場合において、動物は、１２秒の最大ＷＲＬを割り当てられた。時間経過とともに、ＷＲＬの低下の傾向が確認される。
【０１２６】
静的坐骨神経指数（ＳＳＩ）測定は、動物の立位により行った。全ての足跡は、少なくとも４回の時折の休息期間中に得られた。測定は、通常（Ｎ）側と実験（Ｅ）側の両方から行った。動物あたり４つの工程を分析し、それらの明確さに基づいてそれらの跡を選択した。得られた３つの異なる測定値の平均距離を使用して、以下の因子を計算した：足指拡がり因子（Toe spread factor）（ＴＳＦ）、中間足指拡がり因子（Intermediate toe spread factor）（ＩＴＳＦ）。このパラメータの計算は、Ｂａｉｎによって記載された式（Plast Reconstr Surg 83 (1989) 129-136）を用いて行った。これらの動物試験の結果を図７〜９にまとめる。
【０１２７】
上記で開示された結果によって証明されるように、これらのコポリマーを用いて調製された神経チューブ−ガイドは、動物が通常により近い足跡を生成することができたので、実験的な後足の機能回復を増強することが証明された。デキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーを用いて調製された材料は、特に再生医療のための神経ガイドとして、医療目的のための使用に適した、優れた生物学的性質、ならびに熱機械的性質（引張強度、縫合強度、ガラス転移温度）および膨潤性を示した。
【０１２８】
本明細書に記載のコポリマーは、フィルム、シート、チューブ、ロッド、プラグ、マイクロスフェア、またはメッシュ（固体または多孔質のいずれか）に加工することができる。
【０１２９】
これらのコポリマーから作ることができる他の製品の例は、生物医学的ドレーン；ステント目的のための生物医学的チューブ；抗接着シートなどの体内用途のための生物医学的シート；一時的創傷ケア被覆などの局所使用のためのまたは瘢痕を防ぐための生物医学的シート；創傷ケアフォーム；身体に導入される針およびチューブのための保護シース；ドラッグデリバリーのための（マイクロ）スフェア；塞栓目的のための（マイクロ）スフェア、粒子、およびプラグ；皮膚増強、しわおよび皮膚輪郭欠損の治療などの美容手術目的のための（マイクロ）スフェア；人口血管；半月板修復のための人工皮膚または足場プラグなどの組織工学の足場である。
【０１３０】
実施例：
使用される以下の表記は、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡによって構成されるコポリマーの最終組成物中のコマクロモノマーの割合を指す（［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］）。
【０１３１】
実施例Ｉ：デキストランの修飾
２．５ｇ（１．５４×１０−２ｍｏｌ）の量のデキストラン（７０．０００ｇ／ｍｏｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を、丸底フラスコ中の２２．５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＵＡ）に溶解した。フラスコを３０℃の水浴に浸漬した。デキストランの完全な可溶化後、０．５ｇ（４．０９×１０−３ｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（ＴＣＩ  Ｅｕｒｏｐｅ、ベルギー）を溶液に溶解し、２．０５ｍＬ（１．５４×１０−２ｍｏｌ）のグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ベルギー）を添加した。反応は窒素雰囲気下で８時間進行した。この後、０．３３ｍＬの塩酸（ＨＣｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＵＡ）３７％（ｗ／ｗ）を加えて溶液を中和した。次いで、反応の生成物を水に対して透析した。生成物を凍結乾燥させ、スポンジ様の生成物を得た。本生成物の参照に使用した表記は［デキストラン−ＧＭＡ］であった。デキストランの修飾の割合は、デキストランおよびＧＭＡの二重結合に対応するシグナルの積分値（１Ｈ  ＮＭＲスペクトル）の間の関係によって得られた。得られた値は、平均して３１〜３４％であった。
【０１３２】
実施例ＩＩ：ポリ（ε−カプロラクトン）ジオールの修飾
４０℃の水浴中に置いた丸底フラスコ中で、２．２ｇ（４ｍｍｏｌ）のポリ（ε−カプロラクトン）プロパンジオール（ＰＣＬ−プロパンジオール）（Ｐｅｒｓｔｏｒｐ、ＵＫ）を、３０ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（ＶＷＲ、ＥＵＡ）中に窒素雰囲気下で溶解した。ＰＣＬ−ジオール可溶化後、１．２７ｇ（８．２ｍｍｏｌ）の２−イソシアナトエチルメタクリレート（ＩＥＭＡ）（ＴＣＩ  Ｅｕｒｏｐｅ、ベルギー）および１５０ｍｇのジブチルスズジラウレート（３滴）（Ｆｌｕｋａ、ＵＳＡ）を反応混合物に添加した。反応を２４時間進行させた。生成物をｎ−ヘキサン（ＪＭＧＳ、ポルトガル）中で沈殿させることによって回収し、真空下、恒量になるまで室温で乾燥させた。本手順から得られた生成物について使用した表記は［ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］であった。最終生成物のＦＴ−ＩＲスペクトルでは、イソシアネート基（２２７０ｃｍ−１）の強いバンド特性は見られない。これは、全てのイソシアネート基が修飾の間に消費されたことを示す。
【０１３３】
実施例ＩＩＩ：コポリマーＡ
デキストラン−ＧＭＡ（０．５ｇ）を２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。溶解後、生体適合性光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（登録商標）（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スイス）を０．１／ｗ／ｖ（１．１１×１０−２ｍｍｏｌ）の濃度で添加した。次いで、溶液をペトリ皿に入れ、ＵＶチャンバー（Ｄｒ．Ｇｒｏｂｅｌ、ＵＶ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ  ＧｍｂＨのモデルＢＳ−０２）中で２８０ｎｍの波長の光で２時間光架橋のために放置して、透明な膜を得た。次いで、膜を蒸留水で７日間洗浄した。洗浄工程の後、膜を直径１ｃｍの円形に切断し、デシケーター中で真空下、室温で乾燥させた。上述の通り、このコポリマーの表記は１００／０である。
【０１３４】
実施例ＩＶ：コポリマーＢ
デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡを５０：５０（ｗ／ｗ）の割合で２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。溶解後、光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（登録商標）（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スイス）を０．１／ｗ／ｖ（１．１１×１０−２ｍｍｏｌ）の濃度で添加した。次いで、溶液をペトリ皿に入れ、ＵＶチャンバー（Ｄｒ．Ｇｒｏｂｅｌ、ＵＶ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ  ＧｍｂＨのモデルＢＳ−０２）中で２８０ｎｍの波長の光で２時間光架橋のために放置して、透明な膜を得た。次いで、膜を蒸留水で７日間洗浄した。洗浄工程の後、膜を直径１ｃｍの円形に切断し、デシケーター中で真空下、室温で乾燥させた。上述の通り、このコポリマーの表記は５０／５０である。
【０１３５】
実施例Ｖ：コポリマーＣ
デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡは、２５：７５（ｗ／ｗ）の割合で２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。溶解後、光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（登録商標）（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スイス）を０．１／ｗ／ｖ（１．１１×１０−２ｍｍｏｌ）の濃度で添加した。次いで、溶液をペトリ皿に入れ、ＵＶチャンバー（Ｄｒ．Ｇｒｏｂｅｌ、ＵＶ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ  ＧｍｂＨのモデルＢＳ−０２）中で２８０ｎｍの波長の光で２時間光架橋のために放置して、透明な膜を得た。次いで、膜を蒸留水で７日間洗浄した。洗浄工程の後、膜を直径１ｃｍの円形に切断し、デシケーター中で真空下、室温で乾燥させた。上述の通り、このコポリマーの表記は２５／７５である。コポリマーＡ〜Ｃの組成を表１にまとめる。
【０１３６】
【表１】
2021528127.tif 000003
【０１３７】
実施例ＶＩ：コポリマーＤ
デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡは、２５：７５（ｗ／ｗ）の割合で２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。溶解後、光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（登録商標）（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スイス）を０．１／ｗ／ｖ（１．１１×１０−２ｍｍｏｌ）の濃度で添加した。このコポリマーの表記は、コマクロモノマーの割合および添加したＤ−マンニトールの重量における割合を参照する：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ（Ｄ−マンニトール）］（Ｄ）２５／７５（０）。
【０１３８】
実施例ＶＩＩ：コポリマーＥ
デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡは、２５：７５（ｗ／ｗ）の割合で２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。溶解後、多孔質剤Ｄ−マンニトール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を混合物に添加した（５０％ｗ／ｗ）。次いで、光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（登録商標）（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スイス）を０．１／ｗ／ｖ（１．１１ｘ１０−２ｍｍｏｌ）の濃度で添加した。このコポリマーの表記は、コマクロモノマーの割合および添加したＤ−マンニトールの重量における割合を参照する：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ（Ｄ−マンニトール）］（Ｅ）２５／７５（５０）
実施例ＶＩＩ：神経ガイド導管の調製
コポリマーＤおよびＥから神経ガイド導管を調製した。コポリマーを、内部にステンレス鋼ロッドを有する石英チューブから構成される型に入れて、中空チューブ形状を実現した。コポリマーを有する型を、ＵＶチャンバー（２８０ｎｍの波長を有するＵＶ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ  ＧｍｂＨのＤｒ．ＧｒｏｂｅｌのモデルＢＳ−０２）中で２０分間光架橋のために放置した。その後、神経ガイドを型から取り出し、２日間吸収紙中に放置して過剰のＤＭＳＯを除去した。次いで、神経ガイドをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄した。コポリマーＥの場合、Ｄ−マンニトールを除去するために、重合後、得られた材料を蒸留水中に浸漬し、３日間、３７℃の炉中に放置した。次いで、コポリマーＥをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で７日間洗浄した。
【０１３９】
神経ガイドを４０℃で減圧乾燥させた。乾燥工程の後、特性決定のために、１ｃｍのチューブのセグメントを切断した。
【０１４０】
図１は、コポリマーＡ〜Ｃの膨潤能力を示す。３つのコポリマーは、約２〜３時間後にそれらの膨潤能力を安定化させた。
【０１４１】
デキストランは水とのその高い親和性について周知されており、これは、コポリマーＡ（１００／０）によって示されるより高い膨潤能力を説明する。次に、コポリマーＢおよびＣの配合物中の疎水性ＰＣＬ−ＩＥＭＡの含有量が増加するにつれて、膨潤能力が減少する（約２００％から約１００〜５０％に）ことが確認された。
【０１４２】
図２は、シミュレートされた生理学的条件下（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４、３７℃）でのコポリマーＡ〜Ｃのインビトロ加水分解を示す。
【０１４３】
コポリマーＡはコポリマーＢおよびコポリマーＣに比べてより高い分解速度を示す。上述のように、デキストランは水との高い親和性を有し、高い膨潤能力をもたらし、分解率に有利である。ＰＣＬ−ＩＥＭＡを組み込むと重量損失の減少が観察される。ＰＣＬ−ＩＥＭＡの疎水性は、分解媒体が架橋ネットワーク内に容易に浸透することを可能にせず、重量損失の値の低下をもたらす。
【０１４４】
図３は、コポリマーＡ〜Ｃに播種されたヒト歯髄幹細胞（ｈＤＰＳＣ）のＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）生存率アッセイによって評価された吸光度をプロットしたものである。結果は、膜を細胞培養プレートに固定化するために使用される固定化剤が任意の時点での対照と比較して、細胞接着および細胞代謝に有意に影響しないことを示す。これは、対照（Ｃｔ）について得られた吸光度値の、固定化剤を有する対照（Ｃｔ  ＳＧ）について得られた値との類似性によって観察することができる。
【０１４５】
播種時の膜への細胞接着が、対照および固定化剤対照よりも有意に劣っているという事実は注目に値する。
【０１４６】
後のインキュベーション時間（５日目および７日目）において、コポリマーＣは、対照と比較して改善された細胞生存率および代謝活性を示す。
【０１４７】
５日間のインキュベーションで、最大吸光度および細胞代謝活性測定値に達した。これは、細胞が５〜７日間の期間にコンフルエンスに達し、利用可能な表面空間の欠如による細胞代謝活性の停止をもたらすという事実による。
【０１４８】
図４は、ＩＳＯ  １０９９３−６：２０１６  Ｐａｒｔ  ６：移植後の局所効果の試験に従って得られたコポリマーＡ〜Ｃの組織学的スコアを示す。
【０１４９】
安楽死させると、露出した皮下組織は平滑で、出血または炎症の目に見える徴候は認められなかった。すべてのグループにおいて、コポリマーは、皮下組織の薄い透明なカプセルに含まれていた。
【０１５０】
顕微鏡では、移植後３日目に、混合した細胞に侵入が全ての群で観察された。しかしながら、この時点では、マクロファージおよびリンパ球などの単核炎症細胞の優勢がＳｈａｍおよびコポリマーの両方に存在していた。最小の壊死事象は、全ての群において観察可能であった（ｓｈａｍ：０，１３９；コポリマーＡ：０，５６３；コポリマーＢ：０，３８９；およびコポリマーＣ：０，０４５；最大４つのスコアのうちの平均スコア）。線維症に関しては、ｓｈａｍを含む全群が４つの平均スコアのうち１．４未満のスコアであった。
【０１５１】
移植７日目では、急性炎症反応は依然として単核細胞の優性が継続して検出可能である。壊死所見は４つの平均スコアのうち、値が０．４５０に達するコポリマーＣを除いて、ほとんど全てのサンプルおよびｓｈａｍにおいて有意に減少する。線維症に関しては、すべてのサンプルおよびｓｈａｍは、３日間群解析のスコアを維持している。
【０１５２】
移植１５日後、多形核白血球の予想される減少がコポリマーＡを除くほとんどすべての群で観察された。さらに、主にリンパ球凝集体によって構成される中度の慢性応答が、試験したすべての群で依然として検出可能であった。この時点で、コポリマーＡおよびコポリマーＣサンプルでは壊死は観察されなかった（０．００平均スコア）が、コポリマーＢは、ｓｈａｍで観察された残留壊死スコア値（０．０９１）よりも低い残留壊死スコア値（０．０５９）を示す。
【０１５３】
線維症は全群で１．９未満のままであった。コポリマーＣでは血管新生のわずかな増加が観察され、コポリマーＡではわずかな減少が記録された。
【０１５４】
標準ガイドラインに従って、３日目および１５日目にコポリマーＡを「軽度刺激性」と、７日目にコポリマーＡおよびコポリマーＣを「軽度刺激性」とスコア化した。その他のすべての試料を「非刺激性」とスコア化した。計算したスコアはコポリマーＢおよびコポリマーＣが「非刺激性」とみなされることを示す。この図から、本明細書に記載のコポリマーは、身体拒絶に関して改善された特性を有する非常に低い免疫応答を示したことが推測される。
【０１５５】
図５は、３７℃でＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で評価したコポリマーＤおよびＥの膨潤能をプロットしたものである。結果は、神経ガイドの膨潤能力が浸漬の約４〜５時間後に安定化することを示す。コポリマーＤは約４０％の膨潤能力を示し、一方コポリマーＥについて得られた値は約６０％である。ダークライト画像では、（ａ）乾燥状態の神経ガイド、および（ｂ）湿潤状態の神経ガイドを示す。膨潤（ｂ）平衡が達成された後、チューブの内径の寸法が妥協されないことは明らかである。同様に、内径が増加し、これは移植目的に有用である。
【０１５６】
図６は、シミュレートされた生理学的条件下（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４、３７℃）で、コポリマーＤおよびＥで調製された神経ガイドのインビトロ加水分解を示す。
【０１５７】
１８０日後、コポリマーＤはその重量の約１６％を失い、コポリマーＥは約１３％を失ったことが分かる。両方のプロファイルは、両方の神経ガイドが１００日まで分解速度に有意な変化を伴わずに連続的に分解し得ることを示す。この図から、本発明のコポリマーを用いて調製された神経ガイドは材料について観察されたものと適合し、移植プロセスについて良好な値を有する分解パターンを示したことがわかる。
【０１５８】
図７は、ＥＰＴ測定から得られた、運動障害の割合をプロットしたものである。四肢延伸中の動物の等しい運動を確実にすることが困難であることに起因する振動値にもかかわらず、線形回帰トレースは、両方の群における運動障害値の割合の低下の一般的な傾向を示す。したがって、数週間にわたる運動回復の割合の改善が観察される。この図から、本発明のコポリマーを用いて調製された神経ガイドは、Ｔの有意な増強、すなわち運動機能の回復に寄与することがわかる。
【０１５９】
図８は、痛刺激の使用によって得られたＷＲＬ値を示す。線形回帰直線は、時間の経過とともにＷＲＬが減少する傾向を示す。これは、感覚機能の向上が観察されたことを意味する。振動値にもかかわらず、２０週目では、最初の時点と比較して、すべての動物が刺激に反応するまでの時間が少なかった。この図から、本発明のコポリマーを用いて調製された神経ガイドは、ラットに移植された場合、ＷＲＬ値において発現された感受性機能を、健康なものに近いレベルまで回復させることに寄与することがわかる。
【０１６０】
図９は、立っているラットの足跡の分析によって得られたＳＳＩ値を示す。線形回帰トレースは、両方のコポリマーについて、ＳＳＩの平均値が時間の経過とともに増加する傾向があることを示す。これは、機能的な回復が一貫して達成されたことを意味する。また、両方の神経ガイドを受けた動物は、手術後１週目と比較して、実験終了時に優れたＳＳＩを示す。この図から、本発明のコポリマーを用いて調製された神経ガイドは、ラットに移植された場合、それらの実験の足跡において発現された感受性機能の回復に寄与し、通常の足跡により類似するようになったがわかる。
【０１６１】
本出願の好ましい実施形態を例示の目的で開示してきたが、当業者は本発明の範囲から逸脱することなく、様々な修正、追加、および置換が可能であることを理解するのであろう。したがって、本発明は上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明は以下の特許請求の範囲によって、それらの均等物の範囲とともに定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡのＦＴＩＲスペクトルを示す。ＦＴＩＲスペクトルは、室温で、ＡＴＲモードを有するＪａｓｃｏ  ＦＴ／ＩＲ−４２００分光計を使用して得た。データは、４ｃｍ−１のスペクトル分解能および６４回の蓄積で４０００〜５００ｃｍ−１の範囲で収集した。
【図２】図２は、デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【０１６３】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、三重検出ＴＩＸ５ｍｍプローブを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００ＭＨ分光計で、２５℃で得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、三重検出ＴＩＸ５ｍｍプローブを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００ＭＨ分光計で、２５℃で得た。デキストランおよびデキストラン−ＧＭＡについては、使用した溶剤はＤ２Ｏであり、他に記載されているように（Macromolecules 28 (1995) 6317-6322）、特異的な条件下を使用した。簡単に述べると、３０ｓの緩和遅延（relaxation delay）で８７．７°のパルス角度を用いた。４．８ｐｐｍの水シグナルを、デカップリングによる溶媒抑制によって除去した。デカップリングパワーを、アノメリックプロトンシグナルの強度が影響を受けないレベルに調整した。ＰＣＬ−ジオールおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡについては、使用した溶媒はＤＭＳＯ−ｄ６であった。ＴＭＳを内部標準として使用した。
【図３】図３は、デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡの熱重量曲線を示す。
【０１６４】
材料の熱安定性を、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ５００装置を用いた熱重量分析（ＴＧＡ）によって評価した。２５℃〜６００℃の温度を使用した。１０℃．ｍｉｎ−１の昇温速度および分析は、窒素雰囲気下で行った。
【図４】図４は、デキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ、およびＰＣＬ−ＩＥＭＡの熱流量曲線を示す。
【０１６５】
分解前の材料の熱挙動を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価した。使用した装置は、ＲＳＣ９０冷却ユニットを有するＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ１００である。
【０１６６】
デキストランおよびデキストラン−ＧＭＡを最初に２５℃から２５０℃まで加熱し、続いてそれらの熱履歴を除去するために２５０℃から−８０℃までの冷却サイクルを行った。次いで、サンプルを−８０℃から２５０℃までの２回目の昇温サイクルに供した。
【０１６７】
ＰＣＬ−ジオールおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡの場合、２５℃から１５０℃まで最初の昇温サイクルを行い、その後−８０℃まで冷却サイクルを行った。２回目の昇温サイクルは、−８０℃から１５０℃まで行った。
【０１６８】
昇温速度は１０℃．ｍｉｎ−１であり、Ｎ２雰囲気（５０ｍＬ．ｍｉｎ−１）下で分析を行った。使用したサンプルの重量は７ｍｇ〜９ｍｇであった。
【図５】図５は、異なるコマクロモノマー含有割合比を有するデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーの熱重量曲線を示す（表記［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］を使用）  １００／０  ５０／５０  ２５／７５  また、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡについて得られた曲線を比較のために含めた。
【０１６９】
材料の熱安定性を、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ５００装置を用いた熱重量分析（ＴＧＡ）によって評価した。２５℃〜６００℃の温度の範囲を使用した。１０℃．ｍｉｎ−１の昇温速度および分析は、窒素雰囲気下で行った。
【図６】図６は、動的機械熱分析（ＤＭＴＡ）により得られたデキストラン、デキストラン−ＧＭＡ、ＰＣＬ−ジオール、ＰＣＬ−ＩＥＭＡ、およびデキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡコポリマーのＴｇを示す。サンプルのＤＭＴＡは、Ｔｒｉｔｅｃ２０００ＤＭＡ中で行った。サンプルをステンレス鋼材ポケットに入れ、シングルカンチレバーモードで分析した。試験は−１５０℃から３００℃までの温度範囲で、１０℃．ｍｉｎ−１の昇温速度で、多周波モードで行った。Ｔｇは１Ｈｚにおけるｔａｎδ曲線のピークから決定した。
【図７】図７は、異なるコマクロモノマー含有割合比を有するデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーの膨潤能力を示す（表記［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］を使用）  １００／０  ５０／５０  ２５／７５  １ｃｍの直径を有する円形膜の膨潤能力をＰＢＳ（ｐＨ＝７．４、０．０１Ｍ）中で測定した。既知の乾燥重量を有する乾燥サンプルを、膨潤平衡が達成されるまで、３７℃で、５ｍＬのＰＢＳ中に浸漬した。所定の時間に、サンプルをＰＢＳから取り出し、表面の水を濾紙によって穏やかに吸い取った。
【０１７０】
膨潤能力の割合は、以下の式を用いて計算した：膨潤能力（％）＝（Ｗ＿ｓ−Ｗ＿ｄ）／Ｗ＿ｄ×１００
ここで、Ｗ＿ｓは膨潤したサンプルの重量であり、Ｗ＿ｄはＰＢＳに浸漬する前の乾燥サンプルの重量である。測定は３回行った。
【図８】図８は、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーのインビトロ加水分解を示す。以下の表記を、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比を示すために使用する（［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］）。試験はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４、０．０１Ｍ）中で行った。１ｃｍの直径を有し、既知の重量を有する乾燥円形膜を、３７℃で、３０日間、ＰＢＳに浸漬した。所定の時間に、膜をＰＢＳから取り出し、蒸留水ですすぎ、それらの重量が安定するまで乾燥させた。
【０１７１】
分解の程度の推定は、以下の式に従って、インキュベーション後の重量損失を計算することによって行った：重量損失（％）＝（Ｗ＿０−Ｗ＿ｔ）／Ｗ＿０×１００
ここで、Ｗ＿０は浸漬する前の乾燥サンプルの初期重量であり、Ｗ＿ｔは、ＰＢＳに浸漬し、乾燥させた後の乾燥サンプルの重量である。測定は３回行った。
【図９】図９は、コポリマー中に播種したヒト歯髄幹細胞（ｈＤＰＳＣｓ）のＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）生存率アッセイによって評価された吸光度を示す。使用した表記は、材料の最終組成物中のコマクロモノマーの割合を指す（［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］）。
【０１７２】
コポリマーを、２４ウェル細胞培養プレート中の各ウェルに固定し、関連する対照を、細胞を有さない、固定剤単独（ＳＧ）およびコポリマーを用いて調製した。次いで、材料を４×１０４細胞／ウェル濃度で播種した。細胞を、０．５ｍＬの完全培養培地中に一晩接着させたままにした。各時点［２４時間（１日）、７２時間（３日）、１２０時間（５日）、および１６８時間（７日）］で、培養培地を各ウェルから除去し、１０％（ｖ／ｖ）の１０×Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率試薬と共に、新鮮な完全培地を各ウェルに添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートし、細胞生存率の変化を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣにおける吸光分光法によって検出した。上清を収集し、９６ウェルプレートに移し、吸光度を５７０ｎｍおよび５９５ｎｍで読み取った。その後、細胞をＰＢＳで洗浄して、Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）の残渣を除去し、新鮮な培養培地を各ウェルにリセットした。Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）の励起波長は５７０ｎｍであり、発光は５９５ｎｍである。各ウェルについて、５９５ｎｍでの吸光度（正規化波長）を５７０ｎｍでの吸光度（実験結果）に差し引いた。補正された吸光度を、各実験ウェルに対する対照ウェルの平均を差し引くことによって得る。
【図１０】図１０は、デキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡコポリマーの皮下移植から得られた組織学的スコアを示す。使用した表記は、材料の最終組成物におけるコマクロモノマー比を指す。スコアは、ＩＳＯ  １０９９８−６スコアシステムに従って得た。
【０１７３】
「ＳＨＡＭ」は、対照−移植なしの切開を指す。
【図１１】図１１は、多孔質剤Ｄ−マンニトールと共にデキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡコポリマー（２５／７５）を用いて調製された神経ガイド導管の膨潤能力の割合を示す。使用した表記は、デキストラン−ＧＭＡ：ＰＣＬ−ＩＥＭＡの割合含有量および添加したＤ−マンニトールの含有量（割合）を指す：（［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール））  ２５／７５（０）  ２５／７５（５０）  膨潤能力の割合は、上記と同じ式を用いて計算した。
【図１２】図１２は、チューブ形状コンフォメーションを有するデキストラン−ＧＭＡおよびＰＣＬ−ＩＥＭＡのコポリマーのインビトロ加水分解を示す。以下の表記は、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比、およびＤ−マンニトールの含有量を示すために使用する：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール）。
【０１７４】
インビトロ加水分解は、図２の説明で述べた同じ方法を用いて計算した。
【図１３】図１３は、ラットの坐骨神経がコポリマー神経ガイドによって架橋された期間中の後の運動障害の割合を示す。以下の表記は、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比、およびＤ−マンニトールの含有量を示すために使用する：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール）。
【図１４】図１４は、痛刺激を用いることによって得られた引込め反射を示す。以下の表記は、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比、およびＤ−マンニトールの含有量を示すために使用される：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール）。
【図１５】図１５は、ラット坐骨神経をポリマー神経ガイドによって架橋した期間中のラットの足跡によって与えられた静的機能指標を示す。以下の表記は、コポリマーの最終組成物におけるコマクロモノマー含有割合比、およびＤ−マンニトールの含有量を示すために使用する：［デキストラン−ＧＭＡ／ＰＣＬ−ＩＥＭＡ］（Ｄ−マンニトール）。
【図１】
2021528127.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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