(57)【要約】  本発明は二本鎖ｍｉＲＮＡを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体及びこれを含む癌予防又は治療用組成物に関する。より詳しくは、本発明は、癌細胞の増殖を効果的に抑制したり或いは癌細胞の自発的死滅を誘導する方式を特徴とするｍｉＲ−５４４ａを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体及び該構造体を含む抗癌組成物に関する。
2021512108.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）の構造を含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体。
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ        構造式（１）
前記構造式（１）で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介の共有結合を意味し、ＲはｍｉＲ−５４４ａを意味する。
【請求項２】
前記親水性物質Ａは（Ｐ）ｎ、（Ｐｍ−Ｊ）ｎ又は（Ｊ−Ｐｍ）ｎで表示され、Ｐは親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、ｎは１〜２００、ｍは１〜１５、Ｊはｍ個の親水性物質単量体間又はｍ個の親水性物質単量体とオリゴヌクレオチドとを連結するリンカーであることを特徴とする、請求項１に記載の二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項３】
前記親水性物質は、分子量が２００〜１０，０００であることを特徴とする、請求項２に記載の二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項４】
前記親水性物質単量体（Ｐ）は、下記化合物（１）の構造を有することを特徴とする、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
2021512108.tif 000010
前記化合物（１）で、ＧはＣＨ２、Ｏ、Ｓ及びＮＨからなる群から選ばれる。
【請求項５】
前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３及びＣＯ２からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項６】
前記疎水性物質の分子量は、２５０〜１，０００であることを特徴とする、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項７】
前記疎水性物質は、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和又は飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、及びリポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項８】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート及びコレステリルアミンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項９】
前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−及びトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１０】
前記Ｘ及びＹで表示される共有結合は、非分解性結合又は分解性結合であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１１】
前記非分解性結合は、アミド結合又はリン酸化結合であることを特徴とする、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１２】
前記分解性結合は、二硫化結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合又は酵素分解性結合であることを特徴とする、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１３】
前記ｍｉＲ−５４４ａは、配列番号１と配列番号２の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡで構成される二本鎖が有効成分として含まれることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド構造体を含む癌予防又は治療用組成物。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチド構造体は、癌細胞の自殺機序を誘導して癌を治療することを特徴とする、請求項１４に記載の癌予防又は治療用組成物。
【請求項１６】
前記癌は、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、膵癌、胆嚢及び胆道癌、乳癌、白血病、食道癌、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、子宮頸癌、皮膚癌の原発性癌とこれからその他臓器に転移して誘発される転移癌及び異常過剰細胞分裂を促進して生成される腫瘍性細胞疾患からなる群から選ばれる１種以上の癌であることを特徴とする、請求項１４に記載の癌予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ｍｉＲＮＡを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体及びこれを含む癌予防又は治療用組成物に関する。より具体的に、本発明は、癌細胞の増殖を効果的に抑制したり或いは癌細胞の自発的死滅を誘導するｍｉＲ−５４４ａを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体及び該構造体を含む抗癌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子が正常に制御されないことから発生する疾病、代表的に癌と称される疾患に対する効果的で伝統的な治療方法は、外科的に腫瘍を切除して除去する方法が用いられているが、原発性癌が他の器官に転移する場合には外科的手術が不可であり、抗癌薬物治療法が用いられている。薬物治療に使用される抗癌剤は主に単分子物質を有機的又は無機的方法で合成して使用したが、これは、癌疾患が主に信号伝達体系に含まれたリン酸活性因子タンパク質の過発現などによって信号体系を撹乱させるタンパク質に効果的に結合してタンパク質の活性を抑制する用途に開発・使用された。
【０００３】
最近の抗癌剤開発は、癌を誘発する核心遺伝子変異（Ｄｒｉｖｅｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ）を標的にし、核心遺伝子変異によって生成されたタンパク質の活性を選択的に阻害する方式の標的治療剤が開発されている。肺癌の場合、８５％〜９０％が非小細胞肺癌であり、これはさらに、扁平細胞癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）などに分けることができる。腺癌の生存に主要な遺伝子変異としては、概略３０％を占めるＫＲＡＳ変異と１５％を占めるＥＧＦＲ変異などが知られている。特に、変異されたＥＧＦＲタンパク質を標的にする標的治療剤が開発され、臨床的に使用されているが、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）（商品名：Ｔａｒｃｅｖａ）とゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）（商品名：Ｉｒｅｓｓａ）などが市販されている。これらの標的治療剤は、ＥＧＦＲ変異がある肺癌患者に高い反応率を示してはいるが、たいてい１年以内にそれらの薬物に対する耐性を誘発すると報告されている。耐性発生原因としては、既存のＥＧＦＲ変異に加えて、ＥＧＦＲタンパク質にＴ７９０Ｍ変異がさらに発生すること、又はＥＧＦＲ信号伝達体系の下位段階に含まれたＲＡＦ及びＰＩ３Ｋなどの遺伝子に変異が誘発されることが報告されている。このように単分子を用いた肺癌治療剤の場合、耐性誘発などの致命的な限界を露出している。
【０００４】
上記の伝統的な薬物治療方法を代替するための薬物治療剤の開発が多方面で試みられてきたが、その一つが、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；以下、ｓｉＲＮＡと表記）の利用である（Ｉｏｒｎｓ，Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｖｏｌ．６，ｐｐ．５５６−６８．２００７．）。ｓｉＲＮＡは、１６〜２７のヌクレオチドで構成された一本鎖ＲＮＡであり、細胞内でリスク（ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）と知られたリボ核酸タンパク質結合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）の構成成分として活動をする（Ｔｏｍａｒｉ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  Ｖｏｌ．１９，ｐｐ．５１７−２９，２００５，Ｃｈｕ，Ｃ．Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｎａ  Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．１７１４−９，２００８，Ｍｉｔｔａｌ，Ｖ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  Ｖｏｌ．５，ｐｐ．３５５−６５，２００４，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．３２６−３０．２００４）。ＲＩＳＣはＲＮＡ酵素はさみとして機能するが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ；以下、ｍＲＮＡと表記）を切断してｍＲＮＡからタンパク質が生成されることを阻害する。ＲＩＳＣに含まれたｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡと結合して二本鎖ＲＮＡを形成し、ＲＩＳＣはＲＮＡ酵素はさみとして作用して目標となるｍＲＮＡを切断し、ｍＲＮＡがそれ以上タンパク質を反復生成する型板（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として機能しないようにする。
【０００５】
このように、ｓｉＲＮＡベースの抗癌治療剤は、タンパク質生成段階以前のｍＲＮＡを遮断するという点、そしてＲＮＡと細胞内在的なＲＩＳＣシステムを活用するという点において上記単分子物質の抗癌剤に比べて進歩した技術と評価されるが、ｓｉＲＮＡベースの技術でも解決できない副作用があり、これは非標的効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）と呼ばれる現象である（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｎａ  Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１１７９−８７，２００６．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｎａ  Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１１９７−２０５，２００６．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｖｏｌ．２１，ｐｐ．６３５−７，２００３．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｎａ  Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１８９４−９１０，２００７．，Ｐｅｅｋ，Ａ．Ｓ．＆  Ｂｅｈｌｋｅ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１１０−８，２００７．）。上述したように、ｓｉＲＮＡ配列と相補的に結合するｍＲＮＡを分解するが、ｓｉＲＮＡ配列全体と相補的ではなく一部分だけが相補的なｍＲＮＡとも結合して分解を誘発し、これを、標的以外のｍＲＮＡの分解を誘発するということから非標的効果と呼ぶ。
【０００６】
上述されたｓｉＲＮＡベースの抗癌治療剤の技術的難点を克服するためにマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ；以下、ｍｉＲＮＡと表記）を治療剤として使用しようとする研究が進行中である（Ａｇｏｓｔｉｎｉ，Ｍ．＆  Ｋｎｉｇｈｔ，Ｒ．Ａ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  Ｖｏｌ．５，ｐｐ．８７２−８１，２０１４．，ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．４９６−５０７，２０１２．，Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｊ．Ｃ．＆  Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．１９，ｐｐ．６０−７１，２０１２．，Ｄａｎｇｗａｌ，Ｓ．＆  Ｔｈｕｍ，Ｔ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｖｏｌ．５４，ｐｐ．１８５−２０３，２０１４．）。ｍｉＲＮＡは、１６〜２７のヌクレオチドで構成されたＲＮＡであり、タンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対比してタンパク質非生成ＲＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）に分類される（Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．＆  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．６４２−５５，２００９．，ＭａｃＦａｒｌａｎｅ，Ｌ．−Ａ．＆  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．５３７−５６１，２０１０．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．２１５−３３，２００９．）。ｍｉＲＮＡは高等動植物細胞の遺伝体に記録されており、細胞の生成、成長、分化、死滅を含む細胞の代謝及び機能を調節するのに核心的な役割を担うものとして知られている。現在までヒトの遺伝体では２０００余種のｍｉＲＮＡが知られており、その相当数のｍｉＲＮＡの機能はまだ知られていない。
【０００７】
ｍｉＲＮＡは、遺伝体からＰｏｌ  ＩＩと呼ばれるＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によってＲＮＡに転写されるが、初期長さは特定できないほど多様である（Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．＆  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．６４２−５５，２００９．，Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．＆  Ｖｏｉｎｎｅｔ，Ｏ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１４１−１４８，２００９．）。これは、ｍｉＲＮＡが遺伝体に含まれた位置の多様性に起因するが、ｍＲＮＡのタンパク質生成非関与部分であるイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）に位置してｍＲＮＡ生成同一時点に転写される場合及び遺伝体上で遺伝子間の空間（ｉｎｔｅｒ−ｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）に位置して独自に転写される場合など、様々な方式で生成されるためである（Ｍａｌｏｎｅ，Ｃ．Ｄ．＆  Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．６５６−６８，２００９．）。このように初期に生成されたｍｉＲＮＡ母体を一次ｍｉＲ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ）というが、一次ｍｉＲは核内のドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）と呼ばれるＲＮＡ切断酵素（ＲＮａｓｅ）などによって前駆体ｍｉＲ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ，ｐｒｅ−ｍｉＲ）に編集される（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．２１５−３３，２００９．）。Ｐｒｅ−ｍｉＲは、ＲＮＡヘアピン構造（ＲＮＡ  ｈａｉｒ−ｐｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をなし、概略７０〜８０個のヌクレオチドで構成される。細胞核内部のＰｒｅ−ｍｉＲは、エクスポーチン（ｅｘｐｏｒｔｉｎ）タンパク質などによって核から細胞質に移動し、細胞質内でダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるさらに他のＲＮＡ切断酵素（ＲＮａｓｅ）によって二次加工されて１６〜２７個のヌクレオチドで構成される二本鎖の成熟ｍｉＲ（ｍａｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ；以下、別の修飾語無しでｍｉＲと記述する場合は成熟ｍｉＲを意味する）を生成する。二本鎖ｍｉＲから一本のＲＮＡが選択的に選ばれ、前記リボ核酸タンパク質結合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）であるＲＩＳＣと結合して活性を有し、ｍｉＲの配列を用いて目標ｍＲＮＡと結合する。
【０００８】
一般に、ｍＲＮＡはタンパク質生成に関与するかどうかを基準に大きく三つの部分に分けられるが、タンパク質翻訳情報を含んでいるコーディング部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と、コーディング部分のそれぞれ５’と３’の部分であって、タンパク質翻訳情報を持たない５’−ＵＴＲ（Ｕｎ−Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ）と３’−ＵＴＲとに区分できる。ｍＲＮＡとの相補的配列を用いて目標ｍＲＮＡの分解を誘発するｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの５’−、３’−ＵＴＲ及びコーディング部分を問わずに作用するのに対し、ｍｉＲは主に３’−ＵＴＲと結合する（Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．＆  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．６４２−５５，２００９．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．２１５−３３，２００９．）。
【０００９】
ｍＲＮＡとの結合位置の相違に加えて、ｓｉＲＮＡと他のｍｉＲＮＡの独特の特徴は、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ全体配列と相補的な配列を含むｍＲＮＡと主に結合するのに対し、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’終端から２〜８ヌクレオチド位に位置した、限定された大きさのシード部分（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）配列が主に目標ｍＲＮＡ認識に使用される点が異なり、したがって、全体ｍｉＲＮＡの配列が目標遺伝子と完壁な相補的な配列を持たず、非相補的配列が一定部分含まれてもｍｉＲＮＡ活性に影響を与えない（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．２１５−３３，２００９．）。シード部分の配列サイズが６〜８ヌクレオチドであるだけに、これと相補的な配列を３’ＵＴＲに有するｍＲＮＡの種類は多様であり、このような理由で１種のｍｉＲＮＡで種々のｍＲＮＡを同時に制御することができる。このようなｍｉＲＮＡの性質は、ｍｉＲＮＡが細胞の分裂、成長、分化、死滅に至る多い部分の細胞生理学的側面の制御に関与する効率的な調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）としての機能を与える。また、調節因子としてのｍｉＲＮＡの機能は効果的な抗癌効果を具現する上で長所として作用するが、ｓｉＲＮＡは単一遺伝子発現の抑制を目標とするのに対し、ｍｉＲＮＡは多数の癌誘発遺伝子の発現を同時に阻害できるわけである。
【００１０】
多数のｍＲＮＡが、３’ＵＴＲに１種以上のｍｉＲＮＡが結合する可能性がある部分を含んでおり、ある生物情報学的な計算によれば、全ｍＲＮＡの略３０％がｍｉＲＮＡによってタンパク質の生成が調節されていると知られている。
【００１１】
ｍｉＲＮＡのこのような信号伝達体系内の主要調節因子として作用する事実は、癌を含む主要疾患でも重要な役割を担うという点から分かる（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ，Ｌ．−Ａ．＆  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．５３７−５６１．２０１０．，Ｍａｌｏｎｅ，Ｃ．Ｄ．＆  Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．６５６−６８．２００９．，Ｎｉｃｏｌｏｓｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖｏｌ．９，ｐｐ．２９３−３０２．２００９．，Ｌａｎｄｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．２０５−１０．２０１２．）。実際に様々な研究から、癌細胞におけるｍｉＲＮＡの発現様式は正常細胞における発現様式と大きな差を示すことが明らかになった。しかも、癌の発生した原発臓器によってもｍｉＲＮＡ発現様式が大きく異なってくるが、肺癌、肝癌、皮膚癌、血液癌などの様々な癌が原発臓器による独特なｍｉＲＮＡ発現様式を示し、これによってｍｉＲＮＡが癌生物学において主要な役割を担うということが知られている。特に、癌腫で発現するｍｉＲＮＡが、それらの正常細胞における発現量に比べて通常低いことが知られている。
【００１２】
前記癌におけるｍｉＲＮＡの深い連関性に基づいてｍｉＲＮＡを抗癌治療剤として利用しようとする試みが最近始まっており、その一例として、ｍｉＲ−３４ａと名付けられたｍｉＲＮＡの癌細胞増殖抑制及び死滅誘導能力を検証するための臨床実験を実施した例がある。（Ｗｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｖｏｌ．７０，ｐｐ．５９２３−３０．２０１０．，ＷＯ２００８／１５４３３３，Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ，Ｈ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１９３−９．２０１０．，Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．７４５−５２．２００７．）。
【００１３】
ｍｉＲＮＡを抗癌治療剤として使用するためには、生体外部から注入されたｍｉＲＮＡが生体内部で分解されずに病理組織に伝達されるための効果的な方法が必要である。そのために、ｍｉＲＮＡ配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチド構造体を使用することができる。ＲＮＡオリゴの末端部位に化学物質などを連結して増進した薬動力学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的特徴を有させることによって生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導できるということが知られている（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．４３２  Ｉｓｓｕｅ．７０１４  ｐｐ．１７３−８，２００４）。この時、ＲＮＡオリゴのセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））又はアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合した化学物質の性質によってＲＮＡオリゴの安定性が変わる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）のような高分子化合物が接合された形態のＲＮＡオリゴは、陽イオン性物質が存在する条件でオリゴとの陰イオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することによって、改善されたオリゴ安定性を持つ伝達体になる（Ｋｉｍ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｖｏｌ．１２９（２）  ｐｐ．１０７−１６，２００８）。特に、高分子複合体で構成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）は薬物伝達運搬体として用いられる別のシステムである、微小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）又はナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などに比べてその大きさがきわめて小さいながらも分布が非常に一定であり、自発的に形成される構造であるので、製剤の品質管理及び再現性確保が容易であるという長所がある。
【００１４】
また、ＲＮＡオリゴの細胞内伝達効率性を向上させるために、ＲＮＡオリゴに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ））を単純共有結合又はリンカー−媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）の共有結合で接合させたオリゴ接合体を用いて、オリゴの安定性確保及び効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許第１０−０８８３４７１号）。しかし、オリゴの化学的変形及びポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは、生体内における低い安定性とターゲット臓器への伝達が円滑でないという短所は依然として残っている。このような短所を解決するために、二重螺旋オリゴＲＮＡに親水性及び疎水性物質が結合した二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体が開発されたが、該構造体は疎水性物質の疎水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）と命名された自己組立ナノ粒子を形成するようになるが（大韓民国登録特許第１０−１２２４８２８号参照）、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は既存の伝達技術に比べて非常にサイズが小さいながらも均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子が得られるという長所がある。
【００１５】
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは癌細胞増殖抑制及び癌細胞死滅誘導能力に優れたｍｉＲＮＡを見出そうと努力した結果、抗癌効能に優れたｍｉＲ−５４４ａを見出し、それを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体が癌誘発遺伝子として知られた多数の遺伝子発現を効果的に遮断することによって抗癌効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
この背景技術の部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、したがって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知られた先行技術を形成する情報を含めなくてもよい。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の目的は、ＥＧＦＲ変異のある肺癌細胞において肺癌治療剤として使用中のエルロチニブに対する薬物耐性を克服でき、癌細胞増殖抑制及び癌細胞死滅誘導能力に優れたｍｉＲＮＡを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体及びこれを有効成分として含む癌予防又は治療用組成物を提供することである。
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明は、下記構造式（１）の構造を含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体を提供する：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ        構造式（１）
【００１９】
前記構造式（１）で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介の共有結合を意味し、ＲはｍｉＲ−５４４ａ配列を意味する。
【００２０】
本発明はまた、前記オリゴヌクレオチド構造体を含む癌予防又は治療用組成物を提供する。
【００２１】
本発明はまた、前記オリゴヌクレオチド構造体を投与する段階を含む癌予防又は治療方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記オリゴヌクレオチド構造体の癌予防又は治療用途を提供する。
【００２３】
本発明はまた、癌予防又は治療用の薬剤を製造するための前記オリゴヌクレオチド構造体の使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−４】８種の肺癌細胞株にｍｉＲＮＡライブラリーをトランスフェクションして細胞の増殖抑制を測定するｍｉＲＮＡライブラリースクリーニング結果を示す図である。
【図５】ＰＣ９及びＰＣ９／ＥＲ細胞株においてｍｉＲ−５４４ａの細胞死滅誘発効果を示す図である。
【図６】ｍｉＲ−５４４ａのＥＧＦＲ信号伝達体系に関連したタンパク質調節効果をウェスタンブロットで測定した結果を示す図である。
【図７】ＰＣ９、ＰＣ９／ＥＲ、Ｈ１９７５及びＨ５９６細胞株においてｍｉＲ−５４４ａのＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ阻害効果をＲＴ−ｑＰＣＲ分析法を用いて分析した結果である。
【図８】ルシフェラーゼ測定法によるｍｉＲ−５４４ａのターゲット配列検証結果を示す図であり、ＥＧＦＲ  ３’ＵＴＲ配列からターゲット配列を除去すれば、ｍｉＲ−５４４ａによるルシフェラーゼ活性阻害が抑制されることが確認できる。
【図９】ＥＧＦＲ変異を有する肺癌細胞株においてエルロチニブとｍｉＲ５４４ａによる細胞生存量を示す図である。
【図１０】オリゴヌクレオチド構造体で製造されたｍｉＲＮＡによる肺癌細胞株の細胞死滅効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
特に定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で用いられた命名法はこの技術分野において周知であり且つ通常使用されるものである。
【００２６】
本発明では、ＥＧＦＲ変異のある肺癌細胞においてＥＧＦＲ信号伝達体系を抑制して細胞の増殖を阻害する方式で効能に優れたｍｉＲＮＡを見出し、その抗癌効果を確認しようとした。
【００２７】
本発明では、１７００余種のｍｉＲＮＡスクリーニングライブラリーをＥＧＦＲ変異のある肺癌細胞株に処理して癌細胞成長抑制能を測定し、下記の塩基配列を有するｍｉＲ−５４４ａを見出し（図１〜図４）、それらが抗癌効能に優れていることを確認した（図５、図６、図９）。
【００２８】
したがって、本発明は、一観点においてｍｉＲ−５４４ａを含み、下記構造式（１）の構造を含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体に関する。
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ        構造式（１）
【００２９】
前記構造式（１）で、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー媒介の共有結合を意味し、ＲはｍｉＲ−５４４ａを意味する。
【００３０】
本発明において、前記ｍｉＲ−５４４ａは配列番号１及び配列番号２の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体（ｈｙｂｒｉｄ）であり得る。
ｍｉＲ−５４４ａ
５’−ＡＵＵＣＵＧＣＡＵＵＵＵＵＡＧＣＡＡＧＵＵＣ−３’（配列番号１）
５’−ＡＣＵＵＧＣＵＡＡＡＡＡＵＧＣＡＧＡＡＵＵＵ−３’（配列番号２）
【００３１】
前記背景技術で述べたように、ｍｉＲＮＡ活性配列の二番目の塩基から８〜９番目の塩基までに該当するシード配列（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）が活性の主要な因子であるが、二本鎖オリゴヌクレオチドを製造する際、これを含む長い二本鎖を製造して使用することもできる。
【００３２】
本発明でライブラリースクリーンによって見出された前記ｍｉＲＮＡは、ＥＧＦＲ変異を持つ肺癌細胞株のＥＧＦＲ信号伝達体系活性化を抑制することによって抗癌効能を示すことを確認した。
【００３３】
このようなｍｉＲＮＡはデュプレックスであるか、単一分子ポリヌクレオチドを含むことができ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）であり得るが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明のようにＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドに親水性物質及び疎水性物質が結合したオリゴ接合体の場合、ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドの両末端に親水性物質及び疎水性物質が接合された形態の接合体によってオリゴヌクレオチドを生体内に効率的に伝達できる他、安定性も向上し得る。
【００３５】
疎水性物質の疎水性相互作用によって自己組立ナノ粒子を形成するが、このようなナノ粒子は体内への伝達効率及び体内における安定性にきわめて優れるだけでなく、構造の改善によって粒子の大きさが非常に均一なのでＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易であり、よって、薬物への製造工程が簡単であるという長所がある。
【００３６】
一実施例において、本発明に係るｍｉＲＮＡｓを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体において親水性物質と定義したＡは、（Ｐ）ｎ、（Ｐｍ−Ｊ）ｎ又は（Ｊ−Ｐｍ）ｎで表示され、Ｐは親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、ｎは１〜２００、ｍは１〜１５、Ｊはｍ個の親水性物質単量体間を又はｍ個の親水性物質単量体とオリゴヌクレオチドとを連結するリンカーであり得る。
【００３７】
前記親水性物質がＡの場合、本発明に係る二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（１’）の構造を有する。
【数１】
2021512108.tif 000003
前記構造式（１’）で、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは前記構造式（１）における定義と同一であり、ＳはｍｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳはｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味する。
【００３８】
一実施例において、本発明に係るｍｉＲＮＡｓを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（２）の構造を含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体であり得る。
Ａ−Ｘ−５’Ｒ３’Ｙ−Ｂ        構造式（２）
前記構造式（２）で、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ及びＲは、構造式（１）における定義と同一である。
【００３９】
より好ましくは、二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（２’）の構造を有する。
【数２】
2021512108.tif 000004
【００４０】
一実施例において、前記親水性物質は、分子量が２００〜１０，０００である陽イオン性又は非イオン性高分子物質であり得、好ましくは、１，０００〜２，０００の非イオン性高分子物質であり得る。前記親水性物質として非イオン性親水性高分子化合物、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン又はポリオキサゾリンを使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されない。
【００４１】
他の実施例において、前記親水性物質が（Ｐｍ−Ｊ）ｎ又は（Ｊ−Ｐｍ）ｎである場合、本発明に係る二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（３）又は構造式（４）の構造を有する。
（Ｐｍ−Ｊ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ        構造式（３）
（Ｊ−Ｐｍ）ｎ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ        構造式（４）
【００４２】
前記構造式（３）及び構造式（４）で、Ｐは親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、ｎは１〜２００、ｍは１〜１５、Ｊはｍ個の親水性物質単量体間又はｍ個の親水性物質単量体とオリゴヌクレオチドとを連結するリンカーであり得、ＸとＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）媒介の共有結合、Ｒは本発明の特異的ｍｉＲＮＡｓであり得る。より好ましくは、本発明に係るｍｉＲＮＡを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（３’）の構造を有する。
【数３】
2021512108.tif 000005
【００４３】
前記構造式（３’）で、Ｐ、Ｂ、Ｊ、ｍ、ｎ、Ｘ及びＹは、前記構造式（３）における定義と同一であり、ＳはｍｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳはｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味する。
【００４４】
より好ましくは、本発明に係るｍｉＲＮＡを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（４’）の構造を有する。
【数４】
2021512108.tif 000006
【００４５】
前記構造式（４’）で、Ｐ、Ｂ、Ｊ、ｍ、ｎ、Ｘ及びＹは、前記構造式（４）における定義と同一であり、ＳはｍｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳはｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖を意味する。
【００４６】
前記構造式（３）及び構造式（４）における親水性物質単量体（Ｐ）は、非イオン性親水性高分子の単量体のうち、本発明の目的に符合するものであれば制限なく使用可能であり、好ましくは、表１に記載する化合物（１）〜化合物（３）から選択された単量体、より好ましくは化合物（１）の単量体が使用可能であり、化合物（１）においてＧは好ましくはＣＨ２、Ｏ、Ｓ及びＮＨからで選択され得る。
【００４７】
特に、親水性物質単量体の中でも化合物（１）で表示される単量体には様々な官能基を導入することができ、生体内親和性が良く、免疫反応を少なく誘導するなど、生体適合性（ｂｉｏ−ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）に優れ、且つ構造式（３）及び構造式（４）による構造体内に含まれたオリゴヌクレオチドの生体内安定性を増加させ、伝達効率を増加させ得るという長所から、本発明に係る構造体の製造に非常に適している。
【００４８】
【表１】
2021512108.tif 000007
【００４９】
構造式（３）及び構造式（４）における親水性物質は、総分子量が１，０００〜２，０００の範囲であることが好ましい。したがって、例えば、化合物（１）によるヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、すなわち構造式（３）及び構造式（４）におけるＧがＯ、ｍが６である物質を用いる場合、ヘキサエチレングリコールスぺーサ（ｓｐａｃｅｒ）の分子量が３４４であるので、反復回数（ｎ）は３〜５が好ましい。
【００５０】
本発明は、必要によって前記構造式（３）及び構造式（４）で（Ｐｍ−Ｊ）又は（Ｊ−Ｐｍ）と表示される親水性グループの反復単位、すなわち、親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）がｎと表示される適切な個数で使用され得ることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質単量体であるＰとリンカーであるＪは、独立して各親水性物質ブロック間に同一であってもよく、互いに異なってもよい。すなわち、親水性物質ブロックが３個使用される場合（ｎ＝３）、一番目のブロックには化合物（１）による親水性物質単量体が、二番目のブロックには化合物（２）による親水性物質単量体が、三番目ブロックには化合物（３）による親水性物質単量体が使用されるなど、全ての親水性物質ブロック別に異なる親水性物質単量体が使用されてもよく、全ての親水性物質ブロックに化合物（１）〜化合物（３）による親水性物質単量体から選ばれるいずれか一つの親水性物質単量体が一様に使用されてもよい。同様に、親水性物質単量体の結合を媒介するリンカーも、各親水性物質ブロック別にいずれも同一のリンカーが使用されてもよく、各親水性物質ブロック別に互いに異なるリンカーが使用されてもよい。また、親水性物質単量体の個数であるｍも同様、各親水性物質ブロック間に同一であってもよく、互いに異なってもよい。すなわち、一番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が３個連結（ｍ＝３）され、二番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が５個（ｍ＝５）、三番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が４個連結（ｍ＝４）されるなど、互いに異なる個数の親水性物質単量体が使用されてもよく、全ての親水性物質ブロックで同一個数の親水性物質単量体が使用されてもよい。
【００５１】
本発明において前記リンカー（Ｊ）は、ＰＯ３−、ＳＯ３及びＣＯ２からなる群から選ばれることが好ましいが、これに制限されず、使用される親水性物質の単量体などによって本発明の目的に符合するものであればいかなるリンカーも使用可能であることは、通常の技術者には明らかである。
【００５２】
前記親水性物質単量体の全部又は一部は、必要によってターゲット特異的リガンドのような他の物質との結合のために必要な官能基を有するように変更されても構わない。
【００５３】
場合によって、前記遺伝子に特異的ｍｉＲＮＡを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体のアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）が１個〜３個結合し得る。
【００５４】
例えば、ｍｉＲＮＡを含む二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（３’）又は構造式（４’）の構造を有する。
【数５】
2021512108.tif 000008
【００５５】
前記疎水性物質（Ｂ）は、疎水性相互作用によって、構造式（１）によるオリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割を担う。
【００５６】
前記疎水性物質は、分子量が２５０〜１，０００であることが好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和又は飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）などが使用され得るが、これに制限されず、本発明の目的に符合するいかなる疎水性物質も使用可能であるという点は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者には明らかである。
【００５７】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート及びコレステリルアミンからなる群から選ばれ、前記グリセリド誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドなどから選ばれ得るが、このとき、グリセリドの脂肪酸はＣ１２〜Ｃ５０の不飽和又は飽和脂肪酸が好ましい。
【００５８】
特に、前記疎水性物質の中でも飽和又は不飽和炭化水素又はコレステロールが、本発明に係るオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができるという長所を有するので好ましい。
【００５９】
前記疎水性物質は、親水性物質の反対末端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）に結合し、ｍｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれの位置に結合しても構わない。
【００６０】
本発明において、親水性物質、親水性物質ブロック又は疎水性物質とオリゴヌクレオチドは、単純共有結合又はリンカー媒介の共有結合（Ｘ又はＹ）によって結合する。前記共有結合は非分解性結合又は分解性結合のいずれであっても構わない。このとき、非分解性結合にはアミド結合又はリン酸化結合があり、分解性結合には二硫化結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合又は酵素分解性結合などがあるが、これに限定されるものではない。
【００６１】
本発明の他の実施例では、本発明に係るｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド構造体を製造して肺癌細胞株を処理し、細胞株をアネキシンＶで染色して流細胞分析機で分析した。その結果、図９に示すように、ＲＮＡ構造体を用いる生体内における安定性増加のためのナノ粒子を使用する場合、濃度依存的に細胞株の自己死滅効果を誘発できることが確認できた。
【００６２】
したがって、本発明は、他の観点において、前記オリゴヌクレオチド構造体を含む癌予防又は治療用組成物に関する。本発明はまた、前記オリゴヌクレオチド構造体を投与する段階を含む癌予防又は治療方法に関する。本発明はまた、前記オリゴヌクレオチド構造体の癌予防又は治療用途を提供する。本発明はまた、癌予防又は治療用の薬剤を製造するための前記オリゴヌクレオチド構造体の使用方法を提供する。
【００６３】
本発明において、前記癌は、肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、膵癌、胆嚢及び胆道癌、乳癌、白血病、食道癌、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、子宮頸癌、皮膚癌の原発性癌とこれからその他臓器に転移して誘発される転移癌及び異常過剰細胞分裂を促進して生成される腫瘍性細胞疾患からなる群から選ばれる１種以上の癌であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００６４】
本発明で提供する癌治療用組成物の有効成分として使用可能なｍｉＲＮＡ配列はヒト遺伝体由来の配列であるが、ｍｉＲＮＡの由来遺伝体をヒト遺伝体に限定せず、他の動物由来遺伝体から得られたｍｉＲＮＡ配列も使用可能である。
【００６５】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの生物学的等価効能を発生させる様々なｍｉＲＮＡ誘導体（ｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ）の形態で使用できるが、同一のシード部分（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むｍｉＲＮＡ配列を含む変形されたｍｉＲＮＡを使用することができる。このとき、配列１又は配列２の長さを減らしてもよいが、長さが１５個のヌクレオチドで構成された短い誘導体の使用も可能である。
【００６６】
前記ｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ誘導体としては、ＲＮＡリン酸骨格構造（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を硫黄などの他の元素に置換した形態であるホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）構造を部分的に含むことができ、ＲＮＡに代えてＤＮＡ、ＰＮＡ（ｐｅｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）及びＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）分子に全体又は部分的に置換した形態でも使用可能であり、また、ＲＮＡ糖２’水酸化基を様々な機能性構造に置換した形態で使用可能であり、これはメチル化、メトキシ化、フルオロ化などを含むが、これらの変形に限定されない。
【００６７】
前記ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡ（ｍａｔｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ）とこれから誘導された前記ｍｉＲＮＡ誘導体の二本鎖ＲＮＡに限定するものでなく、ｍｉＲＮＡ前駆体の形態で使用されてもよく、ｍｉＲＮＡ前駆体も、上述したＲＮＡリン酸骨格構造、ＲＮＡ核酸のＤＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡなどへの部分又は全体置換、ＲＮＡ糖分子の２’水酸化基の変形が可能である。
【００６８】
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ前駆体又は一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）形態で使用可能であるが、これを化学的な方法で合成したり又はプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）の形態で細胞に伝達して発現することが可能である。
【００６９】
本発明において、ｍｉＲＮＡを培養皿で培養した細胞に伝達する方法は、陽イオン性脂質との混合物を使用する方法、電気的な刺激で伝達する方法、及びウイルスを利用する方法などを用いることができるが、これらの方法に制限されない。
【００７０】
前記ｍｉＲＮＡを有効成分として含む癌治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む薬学組成物であり得、担体と共に製剤化され得る。
【００７１】
本発明で用語“薬学的に許容可能な担体”とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を指す。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体には、滅菌及び生体に適したものであり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分の１成分以上を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化してもよい。
【００７２】
前記ｍｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む癌予防又は治療用組成物は、これを有効成分として含むいかなる剤形でも適用可能であり、経口用又は非経口用剤形に製造できる。薬学的剤形は、口腔（ｏｒａｌ）、直腸（ｒｅｃｔａｌ）、鼻腔（ｎａｓａｌ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌ；頬及び舌の下を含む）、皮下、膣（ｖａｇｉｎａｌ）又は非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ；筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適した形態又は吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）又は注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与に適した形態を含む。
【００７３】
本発明の組成物を有効成分として含む経口投与用剤形には、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水溶性又は油性懸濁液、調製粉末又は顆粒、エマルジョン、ハード又はソフトカプセル、シロップ又はエリキシル剤に製剤化できる。錠剤及びカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロース又はゼラチンのような結合剤、ジカルシウムホスフェートのような賦形剤、トウモロコシ澱粉又はサツマイモ澱粉のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム又はポリエチレングリコールワックスのような潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前記言及した物質の他にも、脂肪油のような液体担体をさらに含有することができる。
【００７４】
本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形には、皮下注射、静脈注射又は筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式又は呼吸器で吸入可能なエアゾール剤などのスプレー用に製剤化できる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤又は緩衝剤と一緒に水で混合して溶液又は懸濁液として製造し、これをアンプル又はバイアルの単位投与用に製剤化できる。坐剤として注入するためには、ココアバター又は他のグリセリドなどの通常の坐薬ベースを含む坐薬又は浣腸剤のような直腸投与用組成物で製剤化できる。エアゾール剤などのスプレー用に剤形化する場合、水分散された濃縮物又は湿潤粉末が分散されるように推進剤などが添加剤とともに配合され得る。
【００７５】
実施例
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００７６】
実施例１：ｍｉＲＮＡライブラリーを用いたｍｉＲＮＡスクリーニング
【００７７】
特許出願番号１０−２０１６−００２２４６２で使用したｍｉＲＮＡライブラリーを同様に使用して肺癌細胞株の死滅を誘導するｍｉＲＮＡを選別する実験を行った。実験に使用された肺癌細胞株は次の通りである；Ｈ２００９、Ｈ５９６、Ｈ１６５０、ＰＣ９、ＰＣ９／ＧＲ、Ｈ１９７５、ＨＣＣ８２７、Ａ５４９（ＡＴＣＣ又は韓国細胞株銀行から購入）。各細胞株をウェルプレートに分注して培養し、これに４０ｎＭの濃度にｍｉＲＮＡをトランスフェクション試薬であるＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に処理してｍｉＲＮＡを細胞中に伝達した。さらに９６時間を培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞の相対的な成長を測定した（図１〜図４）。このうち、使用された細胞株に優れた効能を示すｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ−５４４ａを選定した。
【００７８】
実施例２：ｍｉＲＮＡによる細胞死滅効果分析
【００７９】
実施例１で行われた実験は、ｍｉＲＮＡによる細胞の増殖抑制効果を測定する方法で行われた。細胞の増殖を抑制できる方法は２種類に大別でき、その一つは、細胞成長サイクル（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ）において特定段階から次の段階に転移されないようにする方法があり、もう一つは、細胞の死滅を誘導する方法である。実施例１で選別されたｍｉＲＮＡがどの方式で細胞増殖抑制効果を奏するかを調べるために、ＰＣ９及びＰＣ９／ＥＲ細胞株を対象に実験を行った。前記の細胞株を６ウェルプレートに分注して培養した後、ｍｉＲＮＡコントロール及びｍｉＲ−５４４ａをそれぞれ４０ｎＭの濃度となるようにトランスフェクション試薬であるＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞内に伝達した。さらに４８時間を培養した後、細胞をＦＩＴＣ蛍光染料が標識されたアネキシンＶ（ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）とＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｅ）で処理し、流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した。
【００８０】
その結果、ｍｉＲ−５４４ａで処理した細胞株の場合は、ｍｉＲＮＡコントロールで処理した細胞株に比べて死滅する細胞の数が飛び切り多いことを確認した。これは、ｍｉＲ−５４４ａが細胞の死滅を誘発することによって細胞増殖抑制効果を発揮することを意味する（図５）。
【００８１】
実施例３：細胞死滅を誘導するｍｉＲ−５４４ａの作用機序分析
【００８２】
実施例１及び２で確認したｍｉＲ−５４４ａの肺癌細胞株死滅誘導メカニズムを確認するために、使用された細胞株の信号伝達体系に及ぶ影響を測定した。実施例で使用された肺癌細胞株はＥＧＦＲタンパク質に変異が存在してＥＧＦＲ信号伝達体系が活性化されており、これが細胞株の生存に重要な役割を担うということが知られている。
【００８３】
したがって、ｍｉＲ−５４４ａによる細胞株死滅作用機序がＥＧＦＲ信号伝達体系を調節すると予想され、ＥＧＦＲ信号伝達体系に関与するタンパク質の発現量をウェスタンブロットで測定した。その結果は図６に記録されている通りである。ｍｉＲ−５４４ａを処理した試料の場合、対照群に比べてＥＧＦＲタンパク質の発現量が顕著に減少したことが確認でき、ＥＧＦＲタンパク質の活性を示す指標であるリン酸化ＥＧＦＲの場合も、対照群に比べて減少していることが確認できる。
【００８４】
細胞の成長を促進する信号伝達体系であるＥＲＫ信号伝達体系はＥＧＦＲの下位体系に位置しているが、ｍｉＲ−５４４ａによってＥＧＦＲ信号伝達体系が抑制されたことから、ＥＲＫタンパク質の活性化された形態であるリン酸化ＥＲＫの量が減少したことが確認できた（図６）。
【００８５】
実施例４：ｍｉＲ−５４４ａがＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現を阻害することを確認
【００８６】
図６に提示されたデータのように、ｍｉＲＮＡによってタンパク質の発現が減少する場合、ｍＲＮＡも一般にｍｉＲＮＡによって発現が阻害されると知られている。これを確認するために肺癌細胞株ＰＣ９、ＰＣ９／ＥＲ、Ｈ１９７５及びＨ５９６にｍｉＲ−５４４ａ又はネガティブコントロールを処理した後、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの相対的な発現量を分析した。
【００８７】
その結果、実験に使用された全ての細胞株においてＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現量が顕著に減少することが確認できた（図７）。
【００８８】
実施例５：ルシフェラーゼ測定方法を用いてｍｉＲ−５４４ａの直接ターゲットｍＲＮＡを確認
【００８９】
ｍｉＲＮＡはターゲットｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）に結合することによってターゲットｍＲＮＡにおけるタンパク質生成を阻害するため、ｍｉＲＮＡとターゲットｍＲＮＡとの関係を直接測定する方法としてルシフェラーゼ測定法を通常利用する。ターゲットスキャン（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ）ソフトウェアからｍｉＲＮＡ結合配列が含まれた３’ＵＴＲ配列を提供するが、これをホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の３’ＵＴＲに遺伝子クローニング（ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ）技法で挿入し、この方式で製作されたベクターを該当のｍｉＲＮＡと同時にＨＥＫ（Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞にトランスフェクションしてベクターのルシフェラーゼ発現量を測定した。ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡがｍｉＲ−５４４ａのターゲットになるか否かを確認するために、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲをａ、ｂに分けてそれぞれホタルルシフェラーゼベクターに挿入した。この時、トランスフェクション効率を補正するためにウミシイタケルシフェラーゼ（ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）も同時にトランスフェクションして測定値を補正した。ｍｉＲＮＡ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼを同時に注入し、４８時間培養後にルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で測定した。
【００９０】
その結果、図８に示すように、各ターゲットｍＲＮＡが該当のｍｉＲＮＡによって直接制御されるということが確認できた。また、ＥＧＦＲ３’ＵＴＲでｍｉＲＮＡが作用する配列を予測して該当の部位に突然変異（ＥＧＦＲ  ３’ＵＴＲ  ２５０−２５６、２２８８−２２９５、３４７６−３４８２ｎｔ）を誘発した時、ｍｉＲＮＡによる発現抑制現象が消えることを確認した。したがって、ターゲットｍＲＮＡはｍｉＲＮＡが作用部位に直接結合して制御されるということを確認した。
【００９１】
実施例６：ｍｉＲ−５４４ａの薬物耐性克服評価
【００９２】
ＥＧＦＲ変異を有する肺癌に対する治療剤として臨床で使用するエルロチニブとの効能をｍｉＲ−５４４ａと比較して評価を行った。ＥＧＦＲ変異のある細胞株ＰＣ９、ＰＣ９／ＧＲ、ＰＣ９／ＥＲ、Ｈ１９７５、Ｈ５９６、Ｈ１６５０を９６ウェルプレートに分注して培養した後、図９に表示されている濃度にエルロチニブを処理し、さらに９６時間培養した後、細胞の相対的生存量を測定した。これらの細胞株は、次のような遺伝子的特性及び薬物抵抗性から使用された。ＰＣ９はｄｅｌＥ７６４−Ａ７５０変異を有し、エルロチニブに優れた反応性があるので、エルロチニブ処理時に細胞株を効果的に死滅させることができる。一方、ＰＣ９／ＧＲ、ＰＣ９／ＥＲは、ＰＣ９と同様にｄｅｌＥ７６４−Ａ７５０変異を含み、さらにＴ７９０Ｍ変異を有する。これによって、エルロチニブに対する抵抗性を有する細胞株である。Ｈ１９７５はＬ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ変異を、Ｈ５９６は過発現したＥＧＦＲを、Ｈ１６５０はｄｅｌＥ７６４−Ａ７５０変異を有し、いずれもエルロチニブに対する抵抗性がある細胞株である。生存量は、実施例１で使用したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて測定した。同様に、ｍｉＲコントロール、ｍｉＲ−５４４ａを図９に表示されている濃度にＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬で処理し、エルロチニブ処理群と同じ条件で相対的生存量を測定した。
【００９３】
その結果、図９に示すように、エルロチニブによく反応するものと知られたＰＣ９細胞株ではエルロチニブの濃度０．１ｕＭで細胞株を死滅させることができるが、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍなどの変異によるエルロチニブ耐性がある他の細胞株では、ＰＣ９細胞株に比して１００倍である１０ｕＭ濃度に処理する場合に細胞の死滅を誘導できることを確認した。一方、ｍｉＲ−５４４ａの場合、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異の有無に関係なく０．００１〜０．０１ｕＭの処理濃度で細胞の死滅を誘導できることを確認した。
【００９４】
これは、エルロチニブに比して低濃度でｍｉＲＮＡが効果的であり、またＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異によるエルロチニブ耐性に関係なく効果的に作用できることを意味し、図６に開示されたウェスタンブロット結果でも同じ結果が確認できた。ＰＣ９細胞株ではｍｉＲ−５４４ａとエルロチニブが活性化されたＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）を抑制し、下位信号伝達因子であるＥＲＫのリン酸化を阻害する。結果として、ＰＡＲＰから分かるように、細胞の死滅を誘導する。しかし、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異によるエルロチニブ耐性を持つ他の細胞株ではｍｉＲ−５４４ａだけがこのような効果を示している。
【００９５】
実施例７：ＲＮＡオリゴヌクレオチド構造体の合成
【００９６】
本発明で製造した二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（５）のような構造を有する。
【数６】
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【００９７】
前記構造式（５）で、ＳはｍｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳはｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖、ＰＯ４はリン酸基、エチレングリコールは親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）であり、ヘキサエチレングリコール（ｈｅｘａ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）がリンカー（Ｊ）であるリン酸基（ＰＯ３−）によって結合し、Ｃ２４は疎水性物質であり、二硫化結合が含まれているテトラドコサン（ｔｅｔｒａｄｏｃｏｓａｎｅ）、そして５’及び３’は二重螺旋オリゴＲＮＡの末端方向を意味する。
【００９８】
前記構造式（５）におけるｍｉＲＮＡのセンス鎖は、ＤＭＴ−ヘキサエチレングリコール−ＣＰＧを支持体とし、β−シアノエチルホスホアミダイトを用いてオリゴヌクレオチド骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法によって３’末端部位にヘキサエチレングリコールが結合したセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド−親水性物質構造体を合成した後、二硫化結合が含まれているテトラドコサンを５’末端に結合させて所望のオリゴヌクレオチド−高分子構造体のセンス鎖を製造した。前記鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、前述した反応によってセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。
【００９９】
実施例８：ｍｉＲＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチド構造体による細胞死滅誘導
【０１００】
前記実施例によって選別されたｍｉＲＮＡを、生体内における安定性を確保するために実施例６の方法でオリゴヌクレオチド構造体を製造した。このような方式で製造されたナノ粒子も肺癌細胞株において細胞死滅を誘発するか否かを評価するために、肺癌細胞株Ａ５４９、Ｈ１６５０を９６ウェルプレートに分注して培養し、ナノ粒子を１０００ｎＭとなるように培養液に添加した。ナノ粒子を添加した培養液に細胞を培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞の相対的な成長を測定した。
【０１０１】
その結果、オリゴヌクレオチド構造体で製造されたｍｉＲＮＡによって細胞死滅が誘導されることを確認した（図１０）。
【０１０２】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に説明したところ、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明に係る二重螺旋オリゴヌクレオチド構造体及びこれを含む癌治療用組成物は、ｍｉＲ−５４４ａを含むことによって、ＥＧＦＲ変異のある肺癌において臨床で用いられる薬物であるエルロチニブに比べて改善された抗癌効果を示すので、抗癌治療剤として広く活用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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