(57)【要約】  本発明は、薬物の製造、特にエイズの異常な免疫活性化、またはエイズの異常な免疫活性化に関連する免疫再構築不全を治療および／または予防する薬物の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用を公開する。本発明では、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）で実験を行ったところ、エイズの異常な免疫活性化、またはエイズの異常な免疫活性化に関連する免疫再構築不全において、免疫阻害活性を有し、高効率、低毒性を示し、優れた治療指数を有することを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイズの異常な免疫活性化、またはエイズの異常な免疫活性化に関連する免疫再構築不全を治療および／または予防する薬物の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用。
【請求項２】
前記のエイズの異常な免疫活性化はＮＦ−κＢに関連するエイズの異常な免疫活性化であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記のエイズの異常な免疫活性化はエイズの慢性の異常な免疫活性化であることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記の薬物の形態は錠剤であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記の（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドは前記薬物の有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の使用。
【請求項６】
ＮＦ−κＢシグナル経路阻害薬剤の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用。
【請求項７】
前記の（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドは前記薬剤の有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
Ｔリンパ球活性阻害薬剤の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用。
【請求項９】
前記の（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドは前記薬剤の有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は出願日が２０１８年２月１３日の中国特許出願２０１８１０１４９１４９．４号の優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、化学製薬の分野に属し、薬物の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用に関し、具体的に、エイズの異常な免疫活性化またはエイズの免疫再構築不全を治療および／または予防する薬物の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
タイワンクロヅルは、衛矛科クロヅル属の木質藤本の植物で、山地林縁の陰湿地に生え、長江流域より南の各地および西南地区に分布し、その化学成分は主にジテルペン、トリテルペン、セスキテルペン、アルカロイドなどである。最近の２０年の研究では、タイワンクロヅルは抗炎症、免疫阻害、避妊、抗腫瘍、抗菌などの活性を有し、特に免疫阻害作用においては、タイワンクロヅルにおけるトリプトリド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）が強い薬理的活性を有することを表明した。しかし、トリプトリド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）の毒性・副作用によって、臨床におけるその使用が制限される。中国特許１２２３５９５号（特許文献１）の発明者は、トリプトリドの構造と効果の関係に対する鋭意な研究により、トリプトリド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）の構造に対して改変と修飾を行い、新規な低毒性のトリプトリド誘導体を公開し、当該誘導体は抗炎症免疫阻害剤として自己免疫性疾患、感染性疾患などの予防と治療に使用され、特に（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（ＬＬＤＴ−８、Ｔ８と略され、その構造式は下記に示される）は、複数の体外試験システムおよび体内実験動物モデルの研究において、幅広い抗炎症免疫阻害活性を有し、高効率・低毒性で、優れた治療指数を有することが証明された。
【０００４】
2021513554.tif 000002
【０００５】
エイズ（ＡＩＤＳ、後天性免疫不全症候群）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染による伝染病で、その特徴はＨＩＶウイルスが特異的にヘルパーＴリンパ球（ＣＤ４＋）を攻撃し、ヒトの免疫系の進行性破壊につながり、最終的に様々な日和見感染および相応する腫瘍の発生を引き起こすことである。前世紀９０年代以来、利用された高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）は、顕著に血漿のＨＩＶ量を低下させ、かつ有効にＣＤ４＋Ｔ細胞カウント数を増加させ、患者が免疫再構築できるようにすることで、ＡＩＤＳ関連疾患の発生率と病死率を低下させることができる。しかし、最新の研究では、ＨＩＶウイルス感染は慢性炎症性疾患で、免疫システムの持続的な活性化はエイズの最も主な免疫病理的変化で、ＨＩＶ感染の全過程に伴い、ＨＩＶ感染によるＣＤ４＋Ｔ細胞の減少、ウイルス貯蔵庫の形成と長期間の維持、再構築障害が含まれ、特に長期間の抗ウイルスにより成功的に治療された患者の合併症および高い病死率も異常な免疫活性化と直接または間接に関連すると考えられる。免疫再構築とは、エイズ患者、骨髄移植またはほかの重度な免疫阻害が存在する患者の免疫システムの機能が回復する過程を指す。また、免疫再構築の過程に障害が生じる場合、免疫再構築不全と呼ばれる。免疫再構築不全は主にエイズ患者において発生し、これらの患者は免疫不応答者（Ｉｍｍｕｎｅ  ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ、ＩＮＲ）とも呼ばれる。エイズ患者において、免疫不応答とは２年の通常の抗ウイルス治療後、ウイルス量が検出下限以下であるが、ＣＤ４細胞が増加しない状況（２５０／μＬ未満）である。このような患者は様々な日和見感染、腫瘍などが発生しやすく、病死率が高い。異常な免疫活性化とは免疫システムが長期間にわたって異常に高まる活性化状態にあることである。異常な免疫活性化がエイズの発症、抗ウイルス治療の効果、合併症の発生のいずれにおいても重要な役割を果たすことから、近年、免疫活性化をエイズの潜在的な治療標的として研究されているが、現在、国内外で異常な免疫活性化または免疫再構築不全の治療または予防に有効に使用できる薬物はまだない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許１２２３５９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明の解決しょうとする技術的課題は、既存技術におけるエイズの異常な免疫活性化およびエイズの免疫再構築不全に対する薬物が欠けているという欠陥を克服し、薬物の製造、特にエイズの異常な免疫活性化またはエイズの免疫再構築不全を治療および／または予防する薬物の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用を提供することである。
【０００８】
ＨＩＶによる免疫活性化は従来のウイルス感染後の生体で生じる免疫応答および免疫活性化と異なり、現在の研究によると、主な機序は以下の通りである。
【０００９】
１．直接経路：ＨＩＶ遺伝子産物（例えばｇｐ１２０）が直接リンパ球やマクロファージを活性化させる。
【００１０】
２．間接経路：ＨＩＶ感染期間において、ＨＩＶ感染によって生体が免疫不全状態になり、体内における一部の長期間に感染している病原体、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢウイルスが再活性化と複製をすることで、免疫活性化につながる。
【００１１】
３．腸内細菌叢の移行：粘膜リンパ組織における大量のＣＤ４＋Ｔ細胞を失うことにより、腸管粘膜バリアにおける免疫成分の破壊が生じることで、腸内細菌叢が移行し、さらに免疫活性化につながる。
【００１２】
４．制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の減少：Ｔｒｅｇは生体の免疫系の安定状態の維持に重要な意義があり、その作用は免疫活性化状態の下方調節である。その活性化と変換は免疫活性化と免疫再構築のいずれとも密接に関連する。ある研究では、長期間に進行していないＨＩＶ感染者において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇが顕著に典型的な進行した感染者よりも多く、かつＴｒｅｇ比率がＣＤ８＋Ｔ細胞活性化亜集団に負関連することが示された。
【００１３】
５．ＣＤ４＋ Ｔ細胞パイロトーシス：２０１４年にＧｉｌａｄ  Ｄｏｉｔｓｈらによって雑誌Ｎａｔｕｒｅで発表された研究では、ほとんど（９５％）のＨＩＶウイルスによるＣＤ４＋Ｔ細胞の死亡は、ＩＬ−１βなどの炎症性因子および細胞内容物の放出が伴い、またこのようなカスパーゼ−１（ｃａｓｐａｓｅ−１）が介するパイロトーシスは、さらなる体内における未感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の集合、感染およびパイロトーシスの誘導において促進作用を果たすことで、体内において「パイロトーシス−−未感染ＣＤ４＋ Ｔ細胞の集合の誘導−−新たなＣＤ４＋Ｔ細胞の感染−−新たなパイロトーシス」という悪循環が形成することが示された。２０１５年に、Ｇａｌｌｏｗａｙらの研究がＣｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓで発表され、彼らは一連の実験により、ＨＩＶウイルスに感染したＣＤ４＋Ｔ細胞と未感染のＣＤ４＋ Ｔ細胞の直接の接触（シナプス結合を形成）は、ウイルス拡散およびパイロトーシスの必須条件で、遊離のＨＩＶウイルスは、負荷量が非常に高くても、直接パイロトーシスを引き起こすことはないことが証明された。
【００１４】
持続的な免疫活性化は、ＨＩＶの持続的な複製および免疫再構築障害を含む一連の深刻な結果につながり、特にＡＩＤＳ患者の病死率を増加させ、長期間に有効な抗ウイルス治療でもこのような影響を完全に排除することができず、その影響は主に以下の面を含む。
【００１５】
１．ウイルス複製：Ｔ細胞活性化の直接の結果は細胞内ＮＦ−κＢを生成させ、宿主遺伝子に組み込んだウイルス遺伝子の転写を増加させ、新たなウイルス粒子を生成させることで、悪循環に入らせてしまうことである。
【００１６】
２．アポトーシス：活性化したＴ細胞にとって、免疫活性化はこれらの分化、転化、ひいてはアポトーシスを意味する。免疫活性化に関連するアポトーシスは末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少の要因の一つともされている。
【００１７】
３．免疫老化と枯渇：後天性免疫反応において、ナイーブＴ細胞が抗原提示細胞と接触すると、活性化され、増殖・分化してエフェクターＴ細胞および記憶Ｔ細胞になる。しかし、持続的な抗原による刺激またはほかの機序による持続的な免疫活性化はエフェクターＴ細胞に機能を失わせ、この現象は「免疫枯渇」と呼ばれる。また、感染者の胸腺も年齢に相応しない萎縮が生じ、これは胸腺で発育したＴ細胞が末梢で消耗されたＴ細胞の補充に間に合わないことを意味する。同時に、免疫活性化は、骨髄の造血機能の低下、リンパ組織の線維化などにもつながる。
【００１８】
４．免疫再構築障害：免疫不応答者において、抗ウイルス治療が有効で、血漿におけるウイルスの複製が基本的に阻害されるが、まだウイルスが残り、ウイルス貯蔵庫（主に記憶Ｔ細胞）および持続的な低レベルのウイルス複製による可能性がある。また、これらの残留ウイルスおよびその低レベルの複製は持続的な免疫活性化、免疫再構築不全に関連する。
【００１９】
５．炎症に関連するほかの異常：例えば骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化、神経認識退化、老衰なども、現在、免疫活性化に関連し、患者の病死率の顕著な増加につながるとされている。
【００２０】
ＨＩＶ感染による異常な免疫活性化および炎症は非ＡＩＤＳ関連疾患と免疫再構築不全の重要な発症機序で、過剰な免疫活性化と炎症を阻害すると、ＡＩＤＳ患者のＣＤ４＋Ｔ細胞の回復を促進し、非ＡＩＤＳ関連疾患の発生を減少させる可能性がある。しかし、阻害しすぎると、免疫再構築不全の重症化につながる可能性があるため、免疫再構築不全を重症化させることなく、異常な免疫活性化を阻害することができる薬物を探すことが非常に重要である。しかも、薬物として、治療効果のほか、その投与の安全性問題も考慮すべきであり、本発明者は、創造的に研究し、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）のＡＩＤＳ患者の過剰な免疫活性化と炎症に対する阻害作用を見出し、ＡＩＤＳ患者の異常な免疫活性化または免疫再構築不全および非ＡＩＤＳ関連疾患の治療に新たな治療薬を創った。
【００２１】
また、ＮＦ−κＢ経路の活性化はＨＩＶの複製および潜伏・再活性化に非常に重要で、かつＮＦ−κＢ経路は細胞内における多くの炎症性因子の発現を制御する。
【００２２】
本発明では、機序の面において（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）がＮＦ−κＢの活性を阻害することによって細胞の免疫活性化を阻害することができることを解明し、かつ、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）がＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の活性化と増殖を阻害することが見出された。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は主に以下の技術手段によって上記技術的課題を解決する。
【００２４】
本発明は、エイズの異常な免疫活性化、またはエイズの異常な免疫活性化に関連する免疫再構築不全を治療および／または予防する薬物の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用を提供する。中で、エイズの異常な免疫活性化はエイズの免疫再構築不全に関連する（劉宇超、李太生、慢性ヒト免疫不全ウイルス感染者の免疫活性化と免疫再構築不全、協和医学雑誌、Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４−５，ｐ１００−１０４，２０１７．）。
【００２５】
本発明に係るエイズの異常な免疫活性化は、ＮＦ−κＢに関連するエイズの異常な免疫活性化が好ましい。
【００２６】
本発明に係るエイズの異常な免疫活性化は、エイズの慢性の異常な免疫活性化が好ましい。
【００２７】
本発明において、前記の薬物の形態は特に限定されず、固形錠剤、液体、ゲル、半流動体またはエアゾールなどの様々な物質の形態でもよいが、固形錠剤が好ましい。
【００２８】
本発明において、前記のトリプトリド誘導体は、前記薬物の有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることが好ましい。
【００２９】
また、本発明は、ＮＦ−κＢシグナル経路阻害剤の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用を提供する。前記の（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドは、前記薬物の有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることが好ましい。
【００３０】
また、本発明は、Ｔリンパ球活性阻害剤の製造における（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドの使用を提供する。前記の（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドは、前記薬物の有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることが好ましい。
【００３１】
本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。
【００３２】
本発明で用いられる試薬および原料はいずれも市販品として得られる。
【００３３】
本発明の積極的な進歩効果は以下の通りである。
【００３４】
本発明では、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）で実験を行ったところ、それがエイズの異常な免疫活性化、またはエイズの異常な免疫活性化に関連する免疫再構築不全において、免疫阻害活性を有し、かつ、高効率、低毒性を示し、優れた治療指数を有することを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドによるＮＦ−κＢ活性に対する阻害の検出結果の図である。
【図２】図２は、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドによるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する阻害作用の結果の図である。
【図３】図３は、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドによるＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の活性化に対する阻害作用である。
【図４】図４は、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）の細胞毒性の検出である。
【図５】図５は、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）によるＮＦ−κＢシグナル経路に対する阻害活性の検出である。
【図６Ａ】図６は、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）によるＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の免疫活性化に対する阻害の検出である。新しく分離された健常者の末梢血細胞ＰＢＭＣｓ、またはさらに抗ＣＤ４抗体で被覆された磁気ビーズの陽性スクリーニングによってＣＤ４＋Ｔ細胞を分離し、ＰＭＡ（１００ｎＭ）およびイオノマイシン（１μＭ）で刺激するか、または抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆された磁気ビーズで刺激して細胞を７２時間活性化させ、同時にＴ８またはトリプトリド（１００ｎｇ／ｍＬ）を入れた。細胞を収集し、抗ＣＤ４−ＰＥ抗体で染色してＣＤ４＋Ｔ細胞を選択し、フローサイトメトリーによって細胞表面におけるＣＤ３８およびＨＬＡ−ＤＲの発現を検出した。図６Ａは複数回の完全に独立して繰り返したフローサイトメトリーによる検出の結果で、図６Ｂはフローサイトメトリーによる検出の統計結果で、それぞれ陽性細胞率を統計、および平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算したものである。相応するスチューデントｔ検定によって有意差を分析した。
【図６Ｂ】図６は、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）によるＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の免疫活性化に対する阻害の検出である。新しく分離された健常者の末梢血細胞ＰＢＭＣｓ、またはさらに抗ＣＤ４抗体で被覆された磁気ビーズの陽性スクリーニングによってＣＤ４＋Ｔ細胞を分離し、ＰＭＡ（１００ｎＭ）およびイオノマイシン（１μＭ）で刺激するか、または抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆された磁気ビーズで刺激して細胞を７２時間活性化させ、同時にＴ８またはトリプトリド（１００ｎｇ／ｍＬ）を入れた。細胞を収集し、抗ＣＤ４−ＰＥ抗体で染色してＣＤ４＋Ｔ細胞を選択し、フローサイトメトリーによって細胞表面におけるＣＤ３８およびＨＬＡ−ＤＲの発現を検出した。図６Ａは複数回の完全に独立して繰り返したフローサイトメトリーによる検出の結果で、図６Ｂはフローサイトメトリーによる検出の統計結果で、それぞれ陽性細胞率を統計、および平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算したものである。相応するスチューデントｔ検定によって有意差を分析した。
【図７】図７は、Ｔ８またはトリプトリドによるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する阻害の検出である。ＰＢＭＣｓをＣＦＳＥで染色した。ＰＨＡ−Ｐ（５μｇ／ｍＬ）を入れて細胞の増殖を刺激し、同時に被験化合物Ｔ８またはトリプトリド（１００ｎｇ／ｍＬ）を入れた。７２時間後、細胞を収集し、抗ＣＤ４−ＰＥ抗体で染色してＣＤ４＋Ｔ細胞を選択し、フローサイトメトリーによってＣＦＳＥを検出して細胞の増殖を分析した。（Ａ）は３回の完全に独立して繰り返したフローサイトメトリーによる検出の結果で、（Ｂ）はフローサイトメトリーによる検出の統計結果である。相応するスチューデントｔ検定によって有意差を分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
具体的な実施形態
以下、実施例の形によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を記載された実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法および条件、あるいは商品の説明書に従って選ばれる。
【００３７】
実施例１  Ｔ８によるＮＦ−κＢ活性に対する阻害の検出
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣから購入）にＮＦ−κＢ駆動含有ルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐ３κＢ−ｌｕｃ、１００ｎｇ）および内部参照プラスミドｐＢｇａｌ（生物在線ｗｗｗ．ｂｉｏｏｎ．ｃｏｍ．ｃｎから購入）（ｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｅｃｔｏｒ、β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド、５ｎｇ）を形質移入させた。２４時間後、細胞をＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理するか、処理せず、そして同時にＴ８化合物（１００ｎＭ）を入れたか、入れなかった。さらに２４時間後、細胞を収集し、レポーター分解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）で分解させた。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってルシフェラーゼ活性を検出し、β−Ｇｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってβ−ガラクトシダーゼ活性を検出し、Ｔ８によるＮＦ−κＢ活性に対する阻害作用を分析した。
【００３８】
検出結果は図１に示すように、当該試験結果から、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドはＮＦ−κＢ活性を阻害し、有効的にバックグラウンドＮＦ−κＢ活性（ＴＮＦ−αで処理されていない）を阻害するのみならず、有効にＴＮＦ−αによって活性化されるＮＦ−κＢ活性を阻害できたことがわかる。
【００３９】
実施例２  Ｔ８によるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する阻害作用
健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（ＡＴＣＣから購入）をＩＬ−２（２０ＩＵ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ血清の培地で培養し、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシン イミジルエステル）（１０ｎＭ）で３７℃で１０分間染色し、上記培地で２回洗浄した後、ＰＨＡ−Ｐ（フィトヘマグルチニン−Ｐ）（５μｇ／ｍｌ）で細胞の増殖を刺激し、同時にＴ８化合物（１００ｎＭ）を入れるか、入れずに、４８時間培養した後、細胞を収集し、抗ヒトＣＤ４フローサイトメトリー用抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で染色し（４℃、３０分間）、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞を選択してＣＦＳＥ染色強度を検出して細胞の増殖を分析した。
【００４０】
検出結果は図２に示すように、検出結果から、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドがＰＨＡによって刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害したことがわかる（細胞の増殖は１６．６％からバックグラウンド増殖１．９％に低下した）。
【００４１】
実施例３  Ｔ８によるＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の活性化に対する阻害作用
健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１×１０７をＰＭＡ（プロピレングリコールメチルエーテルアセタート）（２０ｎＭ）およびＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（イオノマイシン）（１μＭ）で３７℃で刺激し、同時にＴ８化合物（１００ｎＭ）を入れたか、入れなかった。４８時間後、抗ヒトＣＤ４、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ細胞フローサイトメトリー用抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を入れて染色し、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞を選択して細胞表面分子ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲの発現を検出した。
【００４２】
検出結果は図３に示すように、検出結果から、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドがＰＨＡ＋イオノマイシンによって誘導された細胞の活性化を阻害したことがわかる（ＣＤ３８は４１．６％から３１％に、ＨＬＡ−ＤＲは３６．３％から３．５％に低下した）。
【００４３】
比較例１  （５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）の細胞毒性の検出
【００４４】
１．実験材料
【００４５】
１）被験化合物
（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）は、上海医薬グループから提供され、白色の粉末で、純度＞９９％で、４℃で保存して使用に備えた。
【００４６】
調製方法：ＤＭＳＯで母液を調製し、培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｇｉｂｃｏ）で作業液を調製した。細胞培養時、ＤＭＳＯの最終濃度は＜０．０２％で、当該ＤＭＳＯ濃度は細胞成長に影響がない。
【００４７】
２）細胞および試薬
ＨＥＫ２９３Ｔを１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する完全ＤＭＥＭ培地で培養した。
【００４８】
ＤＭＥＭ培地およびウシ胎児血清はＧｉｂｃｏ社から、ペニシリンおよびストレプトマイシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入された。
【００４９】
ＭＴＴ  ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−３2，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ドデシルスルホン酸ナトリウム）、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｏｒｍａｍｉｎｅ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）はいずれもｓｉｇｍａ社から購入された。
【００５０】
ＭＴＴ（ホルマザン）溶解液（１００ｍＬ）：ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ドデシルスルホン酸ナトリウム）１０ｇ、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｏｒｍａｍｉｎｅ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）５０ｍＬ、Ｈ２Ｏ  ５０ｍＬを加熱して均一に撹拌し、４℃で保存した。
【００５１】
２．実験方法
ＭＴＴ比色法による細胞毒性の検出：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート（１×１０４／１００μＬ／ウェル）に敷き、１００μＬの異なる濃度の化合物（化合物の濃度は図面を参照する）を入れ、各希釈度に重複ウェルを３つずつ設け、同時に化合物を含有しない対照ウェルを設けた。３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベーターにおいて７２時間インキュベートした。各ウェルから上清を１００μＬ吸いて捨て、２０μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を入れ、３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベーターにおいて４時間インキュベートした後、各ウェルに１００μＬのホルマザン溶解液を入れて一晩インキュベートし、通常の光学顕微鏡による観察においてホルマザンが全部溶解したら、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＣＣ５０値（５０％  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、５０％細胞毒性濃度）、すなわち、５０％のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に毒性を生成した時の実験薬物濃度を算出した。
【００５２】
３．実験結果
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で２種類の化合物の細胞毒性を検出したところ、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＣＣ５０（５０％  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、５０％細胞毒性濃度）値は約４３５ｎｇ／ｍｌで、対照品（トリプトリド）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＣＣ５０値は約１７ｎｇ／ｍｌであった。これから、トリプトリドと比べ、Ｔ８がより低い細胞毒性を示したことがわかる（詳細は図４を参照する）。
【００５３】
比較例２  （５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）によるＮＦ−κＢシグナル経路に対する阻害活性の検出
【００５４】
１．実験材料
【００５５】
１）被験化合物（同上）
【００５６】
２）細胞および試薬
ＨＥＫ２９３Ｔを１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する完全ＤＭＥＭ培地で培養した。
【００５７】
ＤＭＥＭ培地、ウシ胎児血清およびＯＰＴＩ−ＭＥＭはＧｉｂｃｏ社から、ペニシリンおよびストレプトマイシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から、ＴＮＦ−αはＲ＆Ｄ社から、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  トランスフェクション試薬はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から、ルシフェラーゼアッセイシステムおよびＧｌｏアッセイシステムはＰｒｏｍｅｇａ社から購入された。
【００５８】
ｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＶｅｃｔｏｒプラスミドはＰｒｏｍｅｇａ社から購入された（ＣＡＴＡＬＯＧ＃Ｅ１０８１）。
【００５９】
２．実験方法
ＮＦ−κＢレポーター遺伝子プラスミドｐ３κＢ−ｌｕｃをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入して発現させ、同時にｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｅｃｔｏｒを形質移入の内部参照として共形質移入し、ＴＮＦ−αで処理してＮＦ−κＢの活性化を誘導し、Ｔ８およびトリプトリドを入れ、ルシフェラーゼ活性を検出することによってＮＦ−κＢレポーター遺伝子の発現を示し、Ｔ８およびトリプトリドによるＴＮＦ−αによって誘導されたＮＦ−κＢ活性化作用に対する影響を評価した。
【００６０】
細胞形質移入：ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  トランスフェクション試薬によって試薬の説明書に従ってＨＥＫ２９３Ｔに形質移入した。２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルにおいて１μＬのトランスフェクション試薬で１００ｎｇのプラスミドを形質移入させた。それぞれ５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地でプラスミドおよびトランスフェクション試薬を希釈して混合した。混合液を室温で５分間静置した後、混合液を各ウェルの細胞に入れ、軽く均一に混合した後、３７℃インキュベーターに戻して続いて所定時間まで培養した。
【００６１】
ルシフェラーゼ活性の検出：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＮＦ−κＢレポーター遺伝子プラスミドｐ３κＢ−ｌｕｃプラスミド（１００ｎｇ）、内部参照プラスミドｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｅｃｔｏｒ（５ｎｇ）を形質移入し、２４時間後、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）を入れ（あるいは入れずに）２４時間刺激し、細胞を収集してレポーター分解緩衝液で分解させた後、ルシフェラーゼアッセイシステムによってルシフェラーゼの活性を検出し、そしてβ−Ｇｌｏアッセイシステムによってβ−ガラクトシダーゼの活性を検出した。
【００６２】
３．実験結果
図５から、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）はいずれも有効にバックグラウンドＮＦ−κＢシグナル経路の活性を阻害し、両者は活性が相当し、バックグラウンドＮＦ−ｋＢ活性に対する阻害の有意差分析では、Ｐ＝０．１で、有意差がなかったことがわかる。（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）は有効にＴＮＦ−αによって活性化されたＮＦ−κＢシグナル経路の活性を阻害し、両者は活性が相当し、ＴＮＦ−αによって活性化されたＮＦ−ｋＢ活性に対する阻害の有意差分析では、Ｐ＝０．０５６で、有意差がなかったことがわかる。
【００６３】
比較例３  （５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）による免疫細胞の活性化に対する阻害の検出
【００６４】
１．実験材料
【００６５】
１）被験化合物（同上）
【００６６】
２）細胞および試薬：
末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣｓ）は上海市長海医院から購入され、細胞は１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ）を含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
【００６７】
ＲＰＭＩ−１６４０培地、ウシ胎児血清はＧｉｂｃｏ社から、ペニシリンおよびストレプトマイシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から、ＩＬ−２はＲ＆Ｄ社から、ホルボールエステル（ホルボール １２−ミリスタート  １３−アセタート、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）およびイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）はＳｉｇｍａ社から、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＣＤ４抗体で被覆されたマイクロビーズはＭＡＣＳ社から、フローサイトメトリー用抗体ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入された。
【００６８】
２．実験方法：
新しく分離された健常者の末梢血細胞ＰＢＭＣ（３×１０７）をＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）を含有する細胞培地で培養した。ＰＭＡ（１００ｎＭ）およびイオノマイシン（１μＭ）で７２時間刺激し、同時に被験化合物（１００ｎｇ／ｍＬ）を入れた。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４−ＰＥ、ＣＤ３８−ＰＥ−Ｃｙ７、ＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣ抗体を入れ、４℃で３０分間染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳによって上記分子の発現を検出した。
【００６９】
新しく分離された健常者の末梢血細胞ＰＢＭＣを、抗ＣＤ４抗体で被覆された磁気ビーズで陽性スクリーニングによってＣＤ４＋Ｔ細胞を分離し、ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）を含有する培地で培養した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆された磁気ビーズで細胞を刺激して７２時間活性化させ、同時に被験化合物を入れた。細胞を収集し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４−ＰＥ、ＣＤ３８−ＰＥ−Ｃｙ７、ＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣ抗体を入れ、４℃で３０分間染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって上記分子の発現を検出した。
【００７０】
３．実験結果
細胞活性化指標であるＣＤ３８およびＨＬＡ−ＤＲの発現を検出することにより、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）が顕著にＰＭＡ＋イオノマイシンまたは抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によって活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の免疫活性化を阻害することができることが証明された。
【００７１】
（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）はＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の免疫活性化に対する阻害効果が相当する（詳細は図６を参照する）。
【００７２】
比較例４
【００７３】
１．実験材料：
【００７４】
１）被験化合物（同上）
【００７５】
２）細胞および試薬：
末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣｓ）は上海市長海医院から購入され、細胞は１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ）を含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。細胞を５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｐ、ＰＨＡ−Ｐ）を含有する完全培地で７２時間培養し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導した。
【００７６】
ＲＰＭＩ−１６４０培地、ウシ胎児血清はＧｉｂｃｏ社から、ペニシリンおよびストレプトマイシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から、ＩＬ−２はＲ＆Ｄ社から、ＰＨＡ−ＰはＳｉｇｍａ社から、ＣＦＳＥ色素はａｂｃａｍ社から、抗ＣＤ４−ＰＥ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入された。
【００７７】
２．実験方法：
新しく分離された健常者の末梢血細胞ＰＢＭＣ（１×１０７）をＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）を含有する細胞培地で培養した。ＣＦＳＥ（１０ｎＭ）、３７℃で１０分間染色した。培地を２回洗浄した後、ＰＨＡ−Ｐ（５μｇ／ｍＬ）を入れ、同時に被験化合物Ｔ８またはトリプトリド（１００ｎｇ／ｍＬ）を入れた。３７℃で７２時間後、細胞を収集し、抗ＣＤ４−ＰＥ抗体で４℃で３０分間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーによって細胞の増殖を分析した。
【００７８】
３．実験結果
図７から、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ８）およびその対照品（トリプトリド）が顕著に健常者の末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害することができ、かつ健常者の末梢血ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖に対する阻害効果が相当することがわかる。
【００７９】
以上、本発明の具体的な実施形態を記述したが、当業者にとって、これらは例示の説明だけで、本発明の原理と実質に反しないという前提下において、これらの実施形態に対して様々な変更や修正をすることができる。そのため、本発明の保護範囲は添付の請求の範囲によって限定される。
【図１】
2021513554.tif 000003
【図２】
2021513554.tif 000004
【図３】
2021513554.tif 000005
【図４】
2021513554.tif 000006
【図５】
2021513554.tif 000007
【図６Ａ】
2021513554.tif 000008
【図６Ｂ】
2021513554.tif 000009
【図７】
2021513554.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月15日(2020.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイズの異常な免疫活性化、または、エイズの異常な免疫活性化に関連する免疫再構築不全の治療および／または予防における使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記エイズの異常な免疫活性化はＮＦ−κＢに関連するエイズの異常な免疫活性化であることを特徴とする請求項１に記載の使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、医薬組成物。
【請求項３】
前記エイズの異常な免疫活性化はエイズの慢性の異常な免疫活性化であることを特徴とする請求項１または２に記載の使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、医薬組成物。
【請求項４】
形態は錠剤であることを特徴とする請求項１に記載の使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、医薬組成物。
【請求項５】
前記（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドは有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、医薬組成物。
【請求項６】
ＮＦ−κＢシグナル経路阻害薬剤として使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドを含む医薬組成物。
【請求項７】
前記（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドは前記薬剤の有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることを特徴とする請求項６に記載の使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、医薬組成物。
【請求項８】
Ｔリンパ球活性阻害薬剤として使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドを含む医薬組成物。
【請求項９】
前記（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリドは前記薬剤の有効成分の一つまたは唯一の有効成分であることを特徴とする請求項８に記載の使用のための（５Ｒ）−５−ヒドロキシトリプトリド、または、医薬組成物。
【国際調査報告】
2021513554.tif 000011
2021513554.tif 000012
2021513554.tif 000013
2021513554.tif 000014