(57)【要約】  本発明は、ヒアルロン酸加水分解酵素であるヒトヒアルロニダーゼの酵素活性および熱安定性を高めるタンパク質工学技術分野に関し、配列番号１の野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列のうち、αヘリックス部位および／またはその連結部位に該当する部位で１つ以上のアミノ酸残基の置換と、選択的に、追加的なＮ−末端および／またはＣ−末端のアミノ酸残基が欠失した、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体、またはその断片に関する。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０において、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｇ、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ、およびＩ３６１Ｔで構成された群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、αヘリックス８部位、および／またはαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位に位置したアミノ酸の置換をさらに含み、Ｎ−末端およびＣ−末端部位の一部のアミノ酸が欠失したＰＨ２０の変異体、およびその断片に関する。
2021507676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０において、
Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｇ、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ、およびＩ３６１Ｔからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とするＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項２】
Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｌ３５４Ｉ、およびＮ３５６Ｅからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０のαヘリックス部位、および／またはその連結部位に該当する部位で１つ以上のアミノ酸残基の置換をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項４】
前記αヘリックス部位は、αヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）であり、前記その連結部位は、αヘリックス７とαヘリックス８の連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）であることを特徴とする請求項３に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項５】
前記αヘリックス部位、およびその連結部位に該当する部位は、Ｔ３４１〜Ｎ３６３、Ｔ３４１〜Ｉ３６１、Ｌ３４２〜Ｉ３６１、Ｓ３４３〜Ｉ３６１、Ｉ３４４〜Ｉ３６１、Ｍ３４５〜Ｉ３６１、またはＭ３４５〜Ｎ３６３であることを特徴とする請求項４に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項６】
前記αヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）、および／またはαヘリックス７とαヘリックス８との連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）が、Ｈｙａｌ１の対応部位のアミノ酸配列の一部のアミノ酸残基で置換されたことを特徴とする請求項４に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項７】
Ｌ３５４Ｉおよび／またはＮ３５６Ｅのアミノ酸残基の置換を含み、
さらに、Ｔ３４１、Ｌ３４２、Ｓ３４３、Ｉ３４４、Ｍ３４５、Ｓ３４７、Ｍ３４８、Ｋ３４９、Ｌ３５２、Ｌ３５３、Ｄ３５５、Ｅ３５９、Ｉ３６１、およびＮ３６３からなる群から選択された１つ以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項８】
Ｌ３５４Ｉおよび／またはＮ３５６Ｅのアミノ酸残基の置換を含み、
さらに、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｄ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｄ３５５Ｋ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ、およびＮ３６３Ｇからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項７に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項９】
Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、およびＩ３６１Ｔのアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項７に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１０】
さらに、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｄ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、およびＮ３６３Ｇからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項９に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１１】
次のいずれかのアミノ酸残基置換群を含むことを特徴とする請求項１０に記載のＰＨ２０変異体またはその断片:
(a) T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(b) L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(c) M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, I361T, およびN363G;
(d) T341G, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(e) T341A, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(f) T341C, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(g) T341D, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, および I361T;
(h) I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T; および
(i) S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T。
【請求項１２】
さらに、Ｃ−末端および／またはＮ−末端での一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１３】
Ｎ−末端のＭ１〜Ｐ４２からなる群から選択されたアミノ酸残基の前で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１２に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１４】
Ｎ−末端のＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、またはＰ４２のアミノ酸残基の前で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１３に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１５】
Ｃ−末端のＶ４５５〜Ｌ５０９からなる群から選択されたアミノ酸残基の後で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１２に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１６】
Ｃ−末端のＶ４５５〜Ｓ４９０からなる群から選択されたアミノ酸残基の後で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１５に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１７】
Ｃ−末端のＶ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８またはＳ４９０のアミノ酸残基の後で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１６に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１８】
Ｎ−末端に、配列番号３のMATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAのアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン由来のシグナルペプチド、配列番号４のMKWVTFISLLFLFSSAYSのアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミン由来のシグナルペプチド、または配列番号５のMAAHLLPICALFLTLLDMAQGのアミノ酸配列を有するヒトＨｙａｌ１由来のシグナルペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１９】
配列番号６０〜１１５のアミノ酸配列からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項２０】
配列番号９９のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１９に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片を含む癌治療用組成物。
【請求項２２】
他の抗癌剤との併用治療の用途に用いられることを特徴とする請求項２１に記載の癌治療用組成物。
【請求項２３】
前記他の抗癌剤は、免疫抗癌剤であることを特徴とする請求項２２に記載の癌治療用組成物。
【請求項２４】
前記免疫抗癌剤は、免疫チェックポイント阻害剤(immune  checkpoint inhibitor)であることを特徴とする請求項２３に記載の癌治療用組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片をコードする核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２８】
動物細胞、植物細胞、酵母、大腸菌および昆虫細胞からなる群から選択されることとを特徴とする請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の宿主細胞を培養するステップを含むＰＨ２０変異体またはその断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸加水分解酵素であるヒトヒアルロニダーゼの酵素活性および熱安定性を向上させた新規なヒトヒアルロニダーゼ変異体に関し、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０、好ましくは、Ｌ３６〜Ｓ４９０のアミノ酸残基からなる成熟された野生型ＰＨ２０のαヘリックス部位、および／またはその連結部位に該当する部位で１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、選択的に、Ｎ−末端および／またはＣ−末端のアミノ酸残基の一部が欠失したヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体、またはその断片、およびその製造方法、並びにそれを含む薬学組成物に関する。 
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚は、表皮、真皮、皮下脂肪層から構成されており、皮膚には、６種類のグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）が存在する。グリコサミノグリカンには、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、コンドロイチン硫酸塩（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、デルマタン硫酸塩（ｄｅｒｍａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ヘパラン硫酸塩（ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、ケラチン硫酸塩（ｋｅｒａｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）が属する。
【０００３】
グリコサミノグリカンは、二糖類形態の糖が繰り返して連結されている構造を成す。糖の長さはグリコサミノグリカン毎に異なるが、数百個から数千個に至る。グリコサミノグリカンの中でも、ヒアルロン酸は、体内存在量の半分以上が皮膚に存在する。ヒアルロン酸は、細胞膜に存在するヒアルロン酸合成酵素（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）により合成されるものであって、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）と結合せずに単独で存在し、硫酸基のない唯一のグリコサミノグリカンである。他のグリコサミノグリカンらはプロテオグリカンと結合し、硫酸基を有している。ヒアルロン酸は、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）とＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）がβ−１，３結合により連結されており、かかる二糖類が略５，０００回繰り返される。Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸は、β−１，４結合により連結されている。ヒトの体において、略１／３程度（５ｇ）のヒアルロン酸が毎日分解されると知られている。
【０００４】
ヒアルロニダーゼは、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）に位置しているヒアルロン酸を分解する酵素である。ヒトには、６種類のヒアルロニダーゼが存在すると知られている（Ｈｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、Ｈｙａｌ４、ＨｙａｌＰＳ１、およびＰＨ２０／ＳＰＡＭ１）。ヒトにおいて、Ｈｙａｌ１とＨｙａｌ２は殆どの組織で発現され、ＰＨ２０／ＳＰＡＭ１（以下、ＰＨ２０ともいう）は、精子の細胞膜と先体（ａｃｒｏｓｏｍｅ）膜で発現される。しかし、ＨｙａｌＰＳ１は、シュードジーン（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）として発現されない。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を切断する方法によって３種類に分けられる。つまり、Ｈ２Ｏを用いて、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸との間のβ−１，４結合を切断する酵素（ＥＣ３．２．１．３５）と、β−１，３結合を切断する酵素（ＥＣ３．２．１．３６）、およびＨ２Ｏを用いずにβ−１，４結合を切断する細菌のヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．９９．１）に分けられる。
【０００５】
Ｈｙａｌ１の触媒アミノ酸残基はＤ１２９とＥ１３１であり、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ方法によりヒアルロン酸を加水分解する。Ｈｙａｌ１は、酸性であるｐＨ３〜４で最適の活性を示し、ｐＨ４．５以上では酵素活性がない。ＰＨ２０は、Ｈｙａｌ１と異なり、ｐＨ３〜８の広いｐＨ区間で酵素活性を示す。
【０００６】
Ａｒｍｉｎｇらは、ＰＨ２０の触媒アミノ酸がＤ１１１とＥ１１３であることを明らかにした(Arming et al., 1997)。Ａｒｍｉｎｇらは、シグナル配列が除去されたＰＨ２０の一番目のアミノ酸であるＬｅｕを１番と命名したため、シグナル配列に含まれているＰＨ２０では、触媒アミノ酸残基はそれぞれＤ１４６とＥ１４８に該当する。
【０００７】
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を加水分解し、細胞外基質のヒアルロン酸の粘性（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を減少させて組織（皮膚）への透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を増加させる。皮膚の皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）部位はｐＨが略７．０〜７．５の中性であるため、種々のヒアルロニダーゼの中でも、ＰＨ２０が臨床で多く用いられている(Bookbinder et al., 2006)。ＰＨ２０が臨床で用いられている例としては、眼科手術で眼球弛緩剤および麻酔注射添加剤として利用されており、抗体治療剤を皮下注射する時にもＰＨ２０が併用投与されている(Bookbinder et al., 2006)。また、腫瘍細胞でヒアルロン酸が過発現される特性を利用して、腫瘍細胞の細胞外基質のヒアルロン酸をＰＨ２０で加水分解し、坑癌治療剤の腫瘍細胞接近性を高めるのに用いられている。また、組織中に過多存在する体液および血液の再吸収を促進するのにも用いられている。
【０００８】
ＰＨ２０は、Ｌａｔｈｒｏｐらにより、モルモット（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ）の精子から最初に同定され、他の多くの種の精子でも発現されることが知られている。ヒトのＰＨ２０遺伝子は、ＬｉｎらおよびＧｍａｃｈｌらによりクローニングされた。ヒトＰＨ２０は、５０９個のアミノ酸残基から構成されている配列番号１のアミノ酸配列を有しており、モルモットのＰＨ２０とは６０％のアミノ酸配列が一致する。ヒトのＰＨ２０酵素は、ＳＰＡＭ１（ｓｐｅｒｍ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）遺伝子からコードされ、精子の細胞膜の表面および先体膜の内側に、ＰＨ２０のＳｅｒ４９０がグリコシルホスファチジルイノシトール（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、ＧＰＩ）と結合された形態で存在する。精子は、ヒアルロン酸の多い卵子のｃｕｍｕｌｕｓ  ｌａｙｅｒを通過して卵子内に侵透する時に、ＰＨ２０を用いてヒアルロン酸を加水分解する。ＰＨ２０は、精子中におけるタンパク質量の１％以内で存在し、６個のＮ−糖化サイトを有する（Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３）。
【０００９】
現在、商業的に多く利用されているＰＨ２０は、ウシやヒツジの逍丸から抽出した形態である。その例としては、アンファダーゼ（Ａｍｐｈａｄａｓｅ（登録商標））（ウシヒアルロニダーゼ）とビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ（登録商標））（ヒツジヒアルロニダーゼ）などが挙げられる。
【００１０】
Ｂｏｖｉｎｅ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＢＴＨ）は、ウシの野生型ＰＨ２０において、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）およびＣ−末端の５６個のアミノ酸をタンパク質の翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程で除去した形態である。ＢＴＨも糖タンパク質であって、アミノ酸を含む全成分において、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）が５％、グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）が２．２％を占める。動物由来のヒアルロニダーゼを人体に高用量で繰り返して投与する場合には、中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が生成され得る。動物由来のヒアルロニダーゼには、ＰＨ２０以外にも、他の生体物質が含まれているため、人体に投与する際に、アレルギー反応を引き起こす原因となり得る(Bookbinder et al., 2006)。特に、ウシから抽出したＰＨ２０の場合は、狂牛病の憂慮により、その生産および利用に制限がある。このような問題を改善するために、ヒトＰＨ２０の組換えタンパク質に関する研究が進んできた。
【００１１】
ヒトＰＨ２０の組換えタンパク質は、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ＤＳ−２昆虫細胞、動物細胞などで発現されたものが報告されている。昆虫細胞と酵母から生産された組換えＰＨ２０タンパク質は、タンパク質の翻訳後修飾過程におけるＮ−糖化の様相がヒトＰＨ２０と異なる。
【００１２】
ヒアルロニダーゼの中で、タンパク質の構造が明らかになっているものとしては、Ｈｙａｌ１（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＰＥ４）(Chao et al., 2007)とＢｅｅ  ｖｅｎｏｍ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＣＱ、１ＦＣＵ、１ＦＣＶ）がある。Ｈｙａｌ１は、触媒ドメインとＥＧＦ−類似ドメインの２つのドメインから構成されており、触媒ドメインは、タンパク質の二次構造を特徴付けるαヘリックスとβストランドがそれぞれ８回ずつ繰り返される（β／α）８の形態を成す(Chao et al., 2007)。ＥＧＦ−類似ドメインは、Ｈｙａｌ１のＣ−末端が異なってスプライシングされた変異体で全て保存されている。Ｈｙａｌ１とＰＨ２０のアミノ酸配列は３５．１％一致し、ＰＨ２０のタンパク質構造はまだ明らかになっていない。
【００１３】
ヒトＰＨ２０の組換えタンパク質は、Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ社により開発され、Ｈｙｌｅｎｅｘという商品名で販売されている(Bookbinder et al., 2006; Frost, 2007)。
【００１４】
ＰＨ２０の触媒アミノ酸であるＤ１４６とＥ１４８を、それぞれアスパラギン（Ｄ１４６Ｎ）とグルタミン（Ｅ１４８Ｑ）に突然変異させた時には、酵素活性がなかった(Arming et al., 1997)。また、ＰＨ２０のＲ２４６をグリシンで置換すると、酵素活性の９０％が減少し、Ｅ３１９をグルタミン、Ｒ３２２をスレオニンで置換すると、酵素活性が無くなった。ＰＨ２０のＣ−末端部位のアミノ酸３６個が除去された（４７４−５０９アミノ酸切断）変異体は、野生型ＰＨ２０よりも酵素活性が７５％減少した。この突然変異は、細胞外に分泌されず、ＨｅＬａ細胞内に残存していた。ＰＨ２０においてＣ−末端の１３４個のアミノ酸が除去されると、ＰＨ２０の酵素活性がなく、細胞外に分泌されなかった。Ｆｒｏｓｔらによると、ＰＨ２０のＣ−末端の４７７−４８３部位は水溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）発現において必須である(Frost, 2007)。Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨ２０（１〜５０９）またはＣ−末端が４６７で切断されたＰＨ２０変異体の活性は、Ｃ−末端が４７７〜４８３の何れかで切断されたＰＨ２０変異体の１０％に過ぎなかった(Frost, 2007)。
【００１５】
一方、組換えＰＨ２０は、熱安定性や発現率が依然として十分ではなく、より向上した特性を有するヒアルロニダーゼの需要が大きい状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、野生型ＰＨ２０、好ましくは、成熟された野生型ＰＨ２０に比べて熱安定性、酵素活性および発現率が向上した新規なヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体またはその断片を提供するところにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、前記ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体またはその断片を含む癌治療用組成物及びそれを利用した治療方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明は、野生型ＰＨ２０、好ましくは、成熟された野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、αヘリックス部位、および／またはその連結部位に該当する部位で１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、選択的に、Ｎ−末端および／またはＣ−末端のアミノ酸残基の一部が欠失したヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体、またはその断片を提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記本発明によるヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体、またはその断片を含む癌治療用組成物及びそれを利用した治療方法を提供する。 
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＰＨ２０のタンパク質の三次構造モデルである。タンパク質の結晶構造が明らかになっているＨｙａｌ１（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＰＥ４）を鋳型とし(Chao et al., 2007)、Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌ  ｓｅｒｖｅｒ(https://swissmodel.expasy.org/)でＰＨ２０のタンパク質の三次構造をモデリングした。図１Ａには、ＰＨ２０のタンパク質の三次構造モデルと、触媒アミノ酸であるＤ１４６とＥ１４８が示されている。ＰＨ２０のタンパク質の三次構造は、βストランドとαヘリックスが８回繰り返して構成されている。図１Ｂは、ＰＨ２０のαヘリックス８と、αヘリックス８のＮ−末端方向の連結部位を成すＧ３４０〜Ｉ３４４残基が位置したエータ（η）８ループを示す。Ｇ３４０、Ｔ３４１、Ｌ３４２、Ｓ３４３、Ｉ３４４残基がそれぞれ示されている。図１Ｃには、ＰＨ２０のαヘリックス８に位置したアミノ酸のうち、隣合う二次構造と相互作用を成すアミノ酸残基（Ｃ３５１、Ｙ３５７、Ｎ３６３）が示されている。Ｃ３５１は、αヘリックス１に位置したＣ６０とジスルフィド結合を成し、Ｙ３５７は、βストランド７とαヘリックス７との間に位置したＦ３１５と疎水性相互作用を成し、Ｎ３６３は、αヘリックス１に位置したＤ６９残基と水素結合を成している。
【図２】野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ：ＷＴ）ＰＨ２０と、本発明で作製した変異体らのタンパク質の発現量を比較したものである。ＷＴおよび変異体らは、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞でｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ方法により発現された。ＷＴは、発現量が１６．１ｍｇ／Ｌである。変異体ＨＭ１とＨＭ６ベースの変異体らは、タンパク質の発現量がＷＴよりも多く、ＨＭ４とＨＭ７のタンパク質の発現量が最も多かった。変異体ＨＭ６において追加のアミノ酸置換（Ｙ３６５ＦおよびＩ３６７Ｌ）を導入したＨＭ１１は、タンパク質の発現が６．４ｍｇ／ｍＬに減少した。
【図３】変異体ＨＭ１とＨＭ６に対する実験結果である。図３Ａは、ＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ６の精製後におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。精製には、ＨｉｓＴｒａｐカラムとＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用した。ＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ６の分子量は〜７０ｋＤａである（図の説明：Ｍ、分子量マーカー；ＣＳ、上清；ＦＴ、ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ、Ｅｌｕｔｉｏｎ、溶出分画）。図３Ｂは，ｐＨ７．０で比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）により測定したＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ６の酵素活性値である。本発明において、比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）により測定した酵素活性は、比活性度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）で示した。図３Ｃは、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙ方法により、ＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ６の酵素活性を示したものである。２．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｗ／ｖ）で４℃でＳＤＳを除去した後、３７℃で１〜４時間酵素反応を進行した。変異体ＨＭ６は、ＷＴおよび変異体ＨＭ１よりも早くｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎされ、ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）でヒアルロン酸を加水分解した。白色のバンドは、ＷＴおよび変異体タンパク質によりヒアルロン酸が分解されたものである。図３Ｄは、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙ方法により、ＷＴおよび変異体ＨＭ１の酵素活性をｐＨ５〜８でそれぞれ示したものである。ＷＴおよび変異体ＨＭ１は、ｐＨ５〜８区間で活性を示し、ｐＨ５．０で酵素活性が最も高い。変異体ＨＭ１は、ヒト血清アルブミンまたはヒトＨｙａｌ１のシグナルペプチドを有している。白色のバンドは、ＷＴおよび変異体タンパク質によりヒアルロン酸が分解されたものである。図３Ｅは、フェニル（Ｐｈｅｎｙｌ）カラムを用いてＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ６を分離した結果である。変異体ＨＭ１とＨＭ６が、ＷＴよりも早くフェニルカラムから溶出される。
【図４】アミド（Ａｍｉｄｅ）−８０カラムを用いて、１０分および１時間後におけるＷＴおよび変異体ＨＭ６が分解したヒアルロン酸の最終生成物を分析した結果である。
【図５】ＰＨ２０のＧ３４０〜Ｉ３４４区間のアミノ酸突然変異に対する実験結果である。図５Ａは、変異体ＨＭ７、ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１に対するＨｉｓＴｒａｐカラム精製後におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。図５Ｂは、ｐＨ７．０で比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）方法により、ＷＴおよび変異体ＨＭ６、ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１、ＨＭ７の酵素活性を測定した結果である。図５Ｃは、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙを用いて、ＷＴおよび変異体ＨＭ６、ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１、ＨＭ７の酵素活性を測定したものである。図５Ｃの下側の棒グラフは、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ）でゲルを染色した後、バンドを定量して酵素活性程度を示したものである。白色のバンドは、ＷＴおよび変異体タンパク質によりヒアルロン酸が分解されたものである。図５Ｄは、フェニルカラムを用いて、ＷＴおよび変異体ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１、ＨＭ７を分析した結果である。図５Ｅは、ＩＥＦゲルを用いて、ｐＨ３〜７区間で、ＷＴおよび変異体ＨＭ６、ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１、ＨＭ７を等電点値によって分離した結果である。
【図６】変異体ＨＭ１１に対する実験結果である。図６Ａは、変異体ＨＭ１１に対する、ＨｉｓＴｒａｐカラムを用いたタンパク質の精製結果である。図６Ｂは、ｐＨ７．０で、比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）を用いてＷＴおよび変異体ＨＭ１１の酵素活性を測定した結果である。
【図７】Ｎ−末端が切断されたＰＨ２０変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２、およびＨＭ２５に対する実験結果である。図７Ａは、ＰＨ２０変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２、およびＨＭ２５に対する、ＨｉｓＴｒａｐカラムを用いたタンパク質の精製結果である。図７Ｂは、ＰＨ２０変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２、ＨＭ２５、ＨＰ６１、およびＨＰ６２のＥｘｐｉＣＨＯ細胞での発現量を示したものである。図７Ｃは、ｐＨ７．０で、比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）により、ＰＨ２０変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２、ＨＭ２５、ＨＰ６１、およびＨＰ６２の酵素活性を比活性度で示したものである。図７Ｄは、ＰＨ２０変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２の酵素活性をｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙにより示したものである。白色のバンドは、ＷＴおよび変異体タンパク質によりヒアルロン酸が分解されたものである。図７Ｅは、フェニルカラムを用いて、ＷＴおよび変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２を分析した結果である。図７Ｆは、ＰＨ２０変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ４２の、温度増加による粒子サイズの変化を示したものである。
【図８】ＨＭ６を鋳型として作製したＣ−末端切断変異体であるＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６に対する実験結果である。図８Ａは、変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６に対するＨｉｓＴｒａｐ精製後におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。対照群として、ＷＴおよび変異体ＨＭ６を含ませた。図８Ｂは、ｐＨ７．０で、比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）方法によりＷＴおよび変異体ＨＭ６、ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６の酵素活性を測定した結果である。図８Ｃは、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙ方法により、ＷＴおよび変異体ＨＭ６、ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６の酵素活性を１、２、４時間測定した結果である。図８Ｃの右側のグラフは、酵素反応１時間後にアルシアンブルーで染色した後、酵素活性を棒グラフで示したものである。白色のバンドは、ＷＴおよび変異体タンパク質によりヒアルロン酸が分解されたものである。図８Ｄは、フェニルカラムを用いて、ＷＴおよび変異体ＨＭ６、ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６を分析した結果である。図８Ｅは、ＩＥＦゲルを用いて、ｐＨ３〜７区間で、変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６を等電点値によって分離した結果である。
【図９】ＨＭ１０を鋳型として作製したＰＨ２０変異体ＨＭ１９とＨＭ２０に対する実験結果である。図９Ａは、ＰＨ２０変異体ＨＭ１９とＨＭ２０に対する、ＨｉｓＴｒａｐカラムを用いたタンパク質の精製結果である。図９Ｂは、ＰＨ２０変異体ＨＭ１９とＨＭ２０の酵素活性をｐＨ７．０で比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）により比較したものである。図９Ｃは、ＷＴおよびＨＭ１０、ＨＭ１９、ＨＭ２０に対して、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙにより、３７℃で１時間酵素反応した後、アルシアンブルー染色薬でＳＤＳゲルを染色したものである。白色のバンドは、ＷＴおよび変異体タンパク質によりヒアルロン酸が分解されたものである。
【図１０】動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、以下、ＤＬＳという）装備を用いて、ＷＴとＰＨ２０変異体らの凝集温度を測定した値である。測定は３回繰り返して行い、平均±Ｓ．Ｅ．値で示した。
【図１１】アクリルアミド（０〜０．５Ｍ）の添加時に、ＷＴとＰＨ２０変異体のトリプトファン残基の蛍光変化を測定した後、シュテルン−フォルマー・プロット（Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ  ｐｌｏｔ）で示したものである。アミノ酸中のトリプトファンは２９５ｎｍで励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）され、３４０ｎｍで最大蛍光波長を放出する（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）。アクリルアミドは小さい分子でタンパク質の構造内部に侵透し、トリプトファンの蛍光放出をクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することができる。タンパク質の構造が柔軟であるほど、アクリルアミドによる蛍光クエンチングがより大きい。Ｆ０はアクリルアミドのない時の蛍光値であり、Ｆはアクリルアミドを（０〜０．５Ｍ）添加した時の蛍光値である。蛍光測定値の変化をＦ０／Ｆの割合で示した。図１１Ａは、ＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ４、ＨＭ６、ＨＭ７に対するシュテルン−フォルマー・プロットである。図１１Ｂは、ＷＴおよび変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６のシュテルン−フォルマー・プロットである。
【図１２】ＨＭ１０ベースのＰＨ２０変異体のＥｘｐｉＣＨＯ細胞での発現量を示したものである。図１２Ａは、各変異体の発現量をグラフで示したものである。図１２Ｂは、各変異体の発現量を表で示したものである。ＷＴとＰＨ２０変異体らは、Ｃ−末端に６ｘＨｉｓ−ｔａｇを有しており、ＨｉｓＴｒａｐカラム精製後におけるタンパク質の発現量をｍｇ／Ｌで示した。ＨＭ３０〜ＨＭ３３変異体らは、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されなかった。
【図１３】変異体ＨＭ２９、ＨＭ３０、ＨＭ３１、ＨＭ３２、およびＨＭ３３の細胞培養液に対するウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）の結果である。ＨＭ１０ベースの変異体であるＨＭ２９、ＨＭ３０、ＨＭ３１、ＨＭ３２、ＨＭ３３は、Ｃ−末端がＡ４６７、Ｃ４６４、Ｄ４６１、Ｃ３５８、およびＣ４５５の次で切断される。Ｃ−末端がＡ４６７で切断されたＨＭ２９は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されたが、Ｃ−末端がＣ４６４で切断されたか、より短い場合には、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されなかった。一次抗体（Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）はｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＰＨ２０  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）であり、１：５００に希釈した。二次抗体（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）はＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰであり、１：２，０００に希釈した。
【図１４】ＨＭ１０を鋳型として作製したＣ−末端切断変異体らに対する実験結果である。図１４Ａは、ＨＭ１０を鋳型として作製したＣ−末端切断変異体らに対して、ｐＨ７．０で比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）により酵素活性を測定した結果である。図１４Ｂは、ＨＭ１０を鋳型として作製した１７個のＰＨ２０変異体ら(ＨＭ４３、ＨＭ４４、ＨＭ４５、ＨＭ２０、ＨＭ１９、ＨＭ３５、ＨＭ３６、ＨＭ３７、ＨＭ３８、ＨＭ３９、ＨＭ４７、ＨＭ４８、ＨＭ４９、ＨＭ５０、ＨＭ５１、ＨＭ５２、ＨＭ１０)の、Ｃ−末端切断サイトによる酵素活性を比較したものである。図１４Ｃは、ＨＭ１０を鋳型として作製したＰＨ２０変異体らのうち、ＨＭ２９、ＨＭ３５、ＨＭ３６、ＨＭ３７、ＨＭ３８、ＨＭ３９、ＨＭ４３、ＨＭ４４、およびＨＭ４５に対して、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙにより、３７℃で１時間酵素反応後、アルシアンブルー染色薬でＳＤＳゲルを染色したものである。白色のバンドは、ＷＴおよび変異体タンパク質によりヒアルロン酸が分解されたものである。
【図１５】ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されたＨＰ３４（図１５Ａ）とＨＰ４６（図１５Ｂ）に対するタンパク質精製において、最終カラムを経た後のＳＤＳゲルを示したものである。ＨＰ３４は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｂｕｔｙｌ  ＨＰ、Ｈｅｐａｒｉｎ、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの４段階の精製を経ており、ＳＤＳゲルはＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム精製後の結果である。ＨＰ４６は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、  Ｂｕｔｙｌ  ＨＰ、Ｈｅｐａｒｉｎカラムの３段階の精製を経ており、ＳＤＳゲルはＨｅｐａｒｉｎカラム精製後の結果である。
【図１６】ＨＭ２１を鋳型として作製した、６ｘＨｉｓ−ｔａｇのないＰＨ２０変異体であるＨＰ３４とＨＰ４６の酵素活性を示したものである。図１６Ａは、ｐＨ７．０で、比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）方法によりＷＴおよび変異体ＨＭ２１、ＨＰ３４、ＨＰ４６の酵素活性を測定した結果である。図１６Ｂは、ｐＨ５．３で、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ  ａｓｓａｙ方法により、ＨＷ２と変異体ＨＭ２１、ＨＰ３４、ＨＰ４６の酵素活性を測定した結果である。Ｋｍ：Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数、ｋｃａｔ：ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒ、ｋｃａｔ／Ｋｍ：ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）。
【図１７】ＨＭ２１ベースの変異体の特性分析結果を示したものである。図１７Ａは、ＨＭ２１を鋳型として作製した、６ｘＨｉｓ−ｔａｇのないＰＨ２０変異体であるＨＰ３４とＨＰ４６の凝集温度をＤＬＳにより測定したものである。対照群として、ＨＷ２とＨＭ２１の凝集温度を示した。図１７Ｂは、ＨＷ２とＰＨ２０変異体ＨＰ２０、ＨＰ３４、ＨＰ４６の酵素活性をｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙにより１時間測定した結果である。図１７Ｃは、ｐＨ３．０とｐＨ７．０で、ＨＷ２とＨＰ４６試料を１４時間放置した後、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙを行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、２．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｗ／ｖ）でＳＤＳを除去し、３７℃で１時間酵素反応を進行した結果である。図１７Ｄは、ＰＨ２０変異体ＨＭ２１、ＨＭ５３、ＨＭ５４、ＨＭ５５、ＨＭ５６、ＨＰ５９、およびＨＰ６０のＥｘｐｉＣＨＯ細胞での発現量を示したものである。図１７Ｅは、ｐＨ５．３で、比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）により、ＰＨ２０変異体ＨＭ２１、ＨＭ５３、ＨＭ５４、ＨＭ５５、ＨＭ５６、ＨＰ５９、およびＨＰ６０の酵素活性を比活性度で示したものである。
【図１８】ＰＨ２０とＰＨ２０変異体の、それぞれ１．５ｎｇ／ｍＬと１５ｎｇ／ｍＬ濃度処理時におけるＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌのｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ測定結果である。
【図１９】ＰＨ２０とＰＨ２０変異体の、それぞれ１．５ｎｇ／ｍＬと１５ｎｇ／ｍＬ濃度処理時におけるＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌのｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
別段の定めがない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２２】
本発明は、野生型ＰＨ２０、好ましくは、成熟された野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、αヘリックス部位、および／またはその連結部位に該当する部位、好ましくは、αヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）、および／またはαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）で１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、選択的に、Ｎ−末端および／またはＣ−末端のアミノ酸残基の一部が切断されて欠失したヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体、またはその断片を提供する。
【００２３】
本発明において、各変異体のアミノ酸残基の位置は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０のアミノ酸の位置に該当する。
【００２４】
また、本発明において、「成熟された野生型ＰＨ２０」とは、配列番号１の野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、シグナルペプチドであるＭ１〜Ｔ３５と、ＰＨ２０の実質的な機能とは関係のないＡ４９１〜Ｌ５０９が欠失した、配列番号１のＬ３６〜Ｓ４９０のアミノ酸残基からなるタンパク質を意味する。
【００２５】
【表１】
2021507676.tif 000003
【００２６】
具体的に、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０において、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｇ、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ、およびＩ３６１Ｔで構成された群から選択された１つ以上の変異、好ましくは、アミノ酸残基の置換を含むことを特徴とし、好ましくは、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｌ３５４Ｉ、およびＮ３５６Ｅで構成された群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明において、「ＰＨ２０変異体」は、野生型ＰＨ２０の配列において、一部のアミノ酸残基の変異、好ましくは、アミノ酸残基の置換を含むもののみならず、そのアミノ酸残基の置換とともに、Ｎ−末端またはＣ−末端における一部のアミノ酸残基の欠失が起こったものを何れも含む概念で用いられるものであって、「ＰＨ２０変異体またはその断片」という表現と実質的に同様の概念で用いられる。
【００２８】
本発明では、タンパク質の三次構造が知られているヒトヒアルロニダーゼであるＨｙａｌ１（配列番号２）に基づき、ヒトＰＨ２０のタンパク質構造モデリングを通じて、活性部位の外に位置したＰＨ２０のタンパク質の三次構造を研究した結果、ＰＨ２０のαヘリックス８部位に位置したアミノ酸を選択し、Ｈｙａｌ１のαヘリックス８のアミノ酸配列で置換することにより、酵素の触媒作用には影響を与えないながらも、タンパク質構造の熱安定性を強化することを試した。特に、αヘリックス８は、ＰＨ２０のタンパク質の三次構造において外側に位地しており、隣合うαヘリックスまたはβストランドとの相互作用が、他のαヘリックスに比べて少ない。本発明によると、ヒトＰＨ２０のαヘリックス８部位、およびαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位のアミノ酸配列を、親水性の大きいＨｙａｌ１のαヘリックス８部位、およびαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位のアミノ酸配列で一部置換すると、中性ｐＨでの酵素活性とタンパク質の凝集温度（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔａｇｇ．）が増加するという実験結果に基づいて、野生型ＰＨ２０よりも酵素活性と熱安定性が増加した新しいＰＨ２０変異体、またはその断片を提供することができることを突き止めた。
【００２９】
従って、本発明に係るＰＨ２０変異体は、野生型ＰＨ２０(配列番号１のアミノ酸配列を有する)、好ましくは、成熟された野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列(配列番号１のアミノ酸配列中でＬ３６〜Ｓ４９０からなる配列を有する)において、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｇ、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ、およびＩ３６１Ｔからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換、好ましくは、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｌ３５４Ｉ、およびＮ３５６Ｅからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、
αヘリックス部位、および／またはその連結部位に該当する部位、好ましくは、αヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）および／またはαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）、さらに好ましくは、Ｔ３４１〜Ｎ３６３、Ｔ３４１〜Ｉ３６１、Ｌ３４２〜Ｉ３６１、Ｓ３４３〜Ｉ３６１、Ｉ３４４〜Ｉ３６１、Ｍ３４５〜Ｉ３６１、またはＭ３４５〜 Ｎ３６３に該当する部位で１つ以上のアミノ酸残基が置換されたことを特徴とする。
【００３０】
特に、本発明に係るＰＨ２０変異体は、前記野生型ＰＨ２０、好ましくは、成熟された野生型ＰＨ２０のαヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）、および／またはαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）が、配列番号２の配列を有するＨｙａｌ１の対応部位（表２および表３参照）のアミノ酸配列の中の一部のアミノ酸残基で置換されることができるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
【表２】
2021507676.tif 000004
【００３２】
【表３】
2021507676.tif 000005
【００３３】
をより具体的に、本発明に係る新規なＰＨ２０変異体またはその断片は、野生型ＰＨ２０、好ましくは、成熟された野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、Ｌ３５４Ｉおよび／またはＮ３５６Ｅのアミノ酸残基の置換を含み、
さらに、Ｔ３４１とＮ３６３との間で選択された１つ以上の位置、特に、Ｔ３４１、Ｌ３４２、Ｓ３４３、Ｉ３４４、Ｍ３４５、Ｓ３４７、Ｍ３４８、Ｋ３４９、Ｌ３５２、Ｌ３５３、Ｄ３５５、Ｅ３５９、Ｉ３６１、およびＮ３６３からなる群から選択された１つ以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含むことが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３４】
前記Ｔ３４１、Ｌ３４２、Ｓ３４３、Ｉ３４４、Ｍ３４５、Ｓ３４７、Ｍ３４８、Ｋ３４９、Ｌ３５２、Ｌ３５３、Ｄ３５５、Ｅ３５９、Ｉ３６１、およびＮ３６３からなる群から選択された１つ以上の位置でのアミノ酸残基の置換は、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｄ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｄ３５５Ｋ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ、およびＮ３６３Ｇからなる群から選択された１つ以上であることがさらに好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３５】
好ましくは、本発明に係る新規なＰＨ２０変異体またはその断片は、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、およびＩ３６１Ｔからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とし、
さらに、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｄ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、およびＮ３６３Ｇからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【００３６】
さらに好ましくは、本発明に係る新規なＰＨ２０変異体またはその断片は、次からなる群から選択されたいずれか１つでもよいが、これに限定されるものではない:
(a) T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(b) L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(c) M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, I361T, およびN363G;
(d) T341G, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(e) T341A, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(f) T341C, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(g) T341D, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, および I361T;
(h) I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T; および
(i) S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T。
【００３７】
本発明において、「Ｓ３４７」のように、１文字（ｏｎｅ  ｌｅｔｔｅｒ）のアミノ酸残基名と数字がともに記載された表現は、配列番号１のアミノ酸配列における各位置でのアミノ酸残基を意味する。
【００３８】
例えば、「Ｓ３４７」は、配列番号１のアミノ酸配列における３４７番目の位置でのアミノ酸残基がセリンであることを意味する。
【００３９】
また、「Ｓ３４７Ｔ」は、配列番号１の３４７番目のセリンがスレオニンで置換されたことを意味する。
【００４０】
本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、特定のアミノ酸残基の位置で、アミノ酸残基が保存的に置換された変異体またはその断片も含む意味と解釈される。
【００４１】
ここで、用語「保存的置換」とは、１またはそれ以上のアミノ酸を該当ＰＨ２０変異体の生物学的または生化学的機能の損失を引き起こしない類似の生化学的特性を有するアミノ酸で置き換えることを含むＰＨ２０変異体の変形を意味する。
【００４２】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で代替させる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、該当技術分野に規定されており、周知である。これらのアミノ酸残基のファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有ずるアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐した側鎖を有ずるアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有ずるアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００４３】
本発明のＰＨ２０変異体は、保存的アミノ酸置換をもって活性を保持し続けることができると予想される。
【００４４】
また、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片と実質的に同じ機能および／または効果を有し、８０％または８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列相同性を有するＰＨ２０変異体またはその断片も含む意味で解釈される。
【００４５】
本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、成熟された野生型ＰＨ２０よりも動物細胞での発現が増加し、タンパク質の折り畳みも増加して熱安定性が増加する効果を奏し、さらに、熱安定性が増加するにもかかわらず、これらの酵素活性は、成熟された野生型ＰＨ２０よりも増加するか類似であった。
【００４６】
一方、成熟された野生型ＰＨ２０のＣ−末端部位が切断されると酵素活性が減少すると知られているが、本発明に係るＰＨ２０変異体らは、タンパク質の折り畳みおよび熱安定性の増加により、Ｃ−末端が切断されたにもかかわらず、成熟された野生型ＰＨ２０よりも増加するか類似の酵素活性を維持し、また、Ｎ−末端のアミノ酸が５個まで切断されても酵素活性を維持し、Ｎ−末端のＰ４１残基からが、タンパク質の発現および酵素活性において重要な役割を果たすことを示した。
【００４７】
したがって、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、野生型ＰＨ２０のαヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）、および／またはαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）での一部のアミノ酸残基の置換と共に、Ｃ−末端および／またはＮ−末端での一部のアミノ酸残基の欠失を特徴とするが、これに限定されるものではない。
【００４８】
一側面において、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ−末端のＭ１〜Ｐ４２からなる群から選択されたアミノ酸残基の前、好ましくはＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、またはＰ４２のアミノ酸残基の前で切断が起こり、Ｎ−末端での一部のアミノ酸残基が欠失したか、および／または、Ｃ−末端のＶ４５５〜Ｌ５０９からなる群から選択されたアミノ酸残基の後、好ましくは、Ｖ４５５〜Ｓ４９０からなる群から選択されたアミノ酸残基の後、最も好ましくはＶ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８またはＳ４９０のアミノ酸残基の後で切断が起こり、Ｃ−末端での一部のアミノ酸残基が欠失したことを特徴とする。  
【００４９】
上記のＮ−末端のＭ１〜Ｐ４２からなる群から選択されたアミノ酸残基の前で切断が起こるという表現は、Ｎ−末端のＭ１〜Ｐ４２から選択されたアミノ酸残基のすぐその前のアミノ酸残基までが切断されて欠失していることを意味する。
【００５０】
例えば、Ｌ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、またはＰ４２のアミノ酸残基の前で切断が起こるという表現は、それぞれ配列番号１の配列において、Ｍ１からＬ３６のすぐその前のアミノ酸残基であるＴ３５まで、Ｍ１からＮ３７のすぐその前のアミノ酸残基であるＬ３６まで、Ｍ１からＦ３８のすぐその前のアミノ酸残基であるＮ３７まで、Ｍ１からＲ３９のすぐその前のアミノ酸残基であるＦ３８まで、Ｍ１からＡ４０のすぐその前のアミノ酸残基であるＲ３９まで、Ｍ１からＰ４１のすぐその前のアミノ酸残基であるＡ４０まで、Ｍ１からＰ４２のすぐその前のアミノ酸残基であるＰ４１までが切断されて除去されたということを意味する。
【００５１】
また、Ｃ−末端のＶ４５５〜Ｌ５０９からなる群から選択されたアミノ酸残基の後で切断が起こるという表現は、Ｃ−末端のＶ４５５〜Ｌ５０９から選択されたアミノ酸残基のすぐその後のアミノ酸残基から切断されて欠失していることを意味する。
【００５２】
例えば、Ｃ−末端のＶ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８またはＳ４９０のアミノ酸残基の後で切断が起こるという表現は、それぞれ配列番号１の配列において、上記のＶ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８またはＳ４９０のアミノ酸残基の後のアミノ酸残基から切断されて除去されたということを意味する。
【００５３】
好ましくは、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、配列番号６０〜１１５のアミノ酸配列からなる群から選択されてもよいが、これに限定されるのではない。
【００５４】
最も好ましくは、本発明に係る新規なＰＨ２０変異体またはその断片は、配列番号９９のアミノ酸配列を有することを特徴とする。前記配列番号９９のアミノ酸配列を有する新規なＰＨ２０変異体は、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、およびＩ３６１Ｔの１５個のアミノ酸残基の置換を含み、Ｎ−末端のＦ３８残基の前で切断され、Ｃ−末端のＦ４６８残基の後で切断されたことを特徴とする。
【００５５】
本発明に係る具体的な実施例で作製したＰＨ２０変異体において、置換または切断されたアミノ酸の配列は、表１１に記載のとおりである。
【００５６】
本発明のように、タンパク質の三次構造を形成する二次構造であるαヘリックスとその連結部位のアミノ酸の置換により、ＰＨ２０の酵素活性と熱安定性を増加させようとする研究は報告されていない。先行研究によると、野生型ＰＨ２０は、Ｃ−末端に位置したアミノ酸残基の切断位置によって酵素活性が変わると報告されているが、本発明では、ＰＨ２０の二次構造を成す特定のαヘリックスを、他のヒトヒアルロニダーゼのαヘリックスで置換することで、野生型ＰＨ２０よりも安定性の高いＰＨ２０変異体を作製した。この変異体らは、置換されたαヘリックスドメインが、ＰＨ２０の他の二次構造を成す部分との相互作用が野生型ＰＨ２０とは異なる様相を示すことにより、Ｃ−末端の切断位置にかかわらず一定の酵素活性を示す変異体であることを特徴とする。
【００５７】
本発明の具体的な実施例で、成熟された野生型ＰＨ２０に比べて酵素活性と熱安定性が増加し本発明に係る新しいＰＨ２０変異体、またはその断片は、野生型ＰＨ２０、好ましくは、成熟された野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｇ、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ、およびＩ３６１Ｔからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、αヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）、および／またはαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）に位置している一部のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されることを特徴とする。
【００５８】
具体的には、αヘリックス８と、αヘリックス７とαヘリックス８の連結部位でのアミノ酸残基の置換は、Ｔ３４１〜Ｎ３６３、Ｔ３４１〜Ｉ３６１、Ｌ３４２〜Ｉ３６１、Ｓ３４３〜Ｉ３６１、Ｉ３４４〜Ｉ３６１、Ｍ３４５〜Ｉ３６１、またはＭ３４５〜 Ｎ３６３区間から一部のアミノ酸残基の置換を含む。
【００５９】
αヘリックス８とαヘリックス７及びαヘリックス８の連結部位を置換したＰＨ２０変異体において、Ｃ−末端の切断による効果を確認するために、３個のＰＨ２０変異体ＨＭ６、ＨＭ１０、およびＨＭ２１を鋳型として選定した。
【００６０】
ＨＭ６は、Ｍ３４５〜Ｎ３６３区間のアミノ酸を、Ｈｙａｌ１のアミノ酸配列で置換した変異体(配列番号１でＭ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、およびＩ３６１Ｔが置換される。)であって、追加的なＣ−末端の切断を含まない（すなわち、成熟された野生型ＰＨ２０のように、Ｃ−末端のアミノ酸残基がＳ４９０である形態）、本発明に係るＰＨ２０変異体のうち、αヘリックス８部位と、αヘリックス７及びαヘリックス８の連結部位の置換が最も少ない変異体であり、
ＨＭ１０は、Ｌ３４２〜Ｉ３６１区間のアミノ酸を、Ｈｙａｌ１のアミノ酸配列で置換した変異体(配列番号１で３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、およびＩ３６１Ｔが置換される。)であって、追加的なＣ−末端の切断を含まない、本発明に係るＰＨ２０変異体のうち、成熟された野生型ＰＨ２０と類似の酵素活性を有し、熱安定性が最も高い変異体であり、
ＨＭ２１は、Ｔ３４１〜Ｉ３６１区間のアミノ酸を、Ｈｙａｌ１のアミノ酸配列で置換した変異体(配列番号１でＴ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、およびＩ３６１Ｔが置換される。)であって、追加的なＣ−末端の切断を含まなく、ｐＨ７．０で酵素活性が野生型ＰＨ２０に比べて約２倍高い変異体である。
【００６１】
本発明で作製したＨＭ６ベースのＰＨ２０変異体は、Ｎ−末端はＬ３６で切断され、Ｃ−末端は、表４に示すように、Ｉ４６５、Ｆ４６８、またはＰ４７１の次で切断された。
【００６２】
【表４】
2021507676.tif 000006
【００６３】
ＨＭ１０ベースのＰＨ２０変異体は、共通して、Ｎ−末端がＦ３８残基の前で切断され、Ｃ−末端は、表５に示すように、Ｖ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、またはＴ４８８残基の後で切断された。
【００６４】
【表５】
2021507676.tif 000007
【００６５】
ＨＭ１０を鋳型として用いてαヘリックス８部位およびαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位に該当するＬ３４２〜Ｉ３６１部位でのアミノ酸残基の置換を含み、Ｎ−末端がＦ３８残基の前で切断され、Ｃ−末端がＩ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、 Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、またはＴ４８８で切断された変異体らの例で示されたように、本発明に係るＰＨ２０変異体らは、Ｃ−末端の切断位置にかかわらず成熟された野生型ＰＨ２０と類似の酵素活性を示した。
【００６６】
表６に示されたように、２つのＨＭ２１ベースのＰＨ２０変異体は、共通して、Ｎ−末端がＦ３８残基の前で切断され、Ｃ−末端は、Ｆ４６８またはＫ４７０残基の後で切断された。
【００６７】
【表６】
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【００６８】
驚くべきことに、成熟された野生型ＰＨ２０に比べて酵素活性が約２倍高いＨＭ２１を鋳型として用いてαヘリックス８部位およびαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位に該当するＴ３４１〜Ｉ３６１区間でのアミノ酸残基の置換を含み、Ｎ−末端がＦ３８残基の前で切断され、Ｃ−末端がＦ４６８またはＫ４７０残基の後で切断された変異体らは、Ｃ−末端の切断位置にかかわらずＨＭ２１の高い酵素活性を維持した。
【００６９】
Ｆｒｏｓｔらの研究では、ＰＨ２０のＣ−末端が４７７よりも前で切断されてより短い際には、Ｃ−末端が４７７の次で切断された変異体に比べて酵素活性が１０％台に減少したが(Frost, 2007)、本発明では、ＰＨ２０のαヘリックス８とその連結部位のアミノ酸を置換する場合、タンパク質の安定性が増加するため、Ｃ−末端の切断位置にかかわらず酵素活性が維持された。この結果は、野生型ＰＨ２０のＣ−末端の切断による酵素活性の減少問題を解決した点から、その意義が大きい。
【００７０】
また、本発明では、従来の研究では知られていないＰＨ２０のＮ−末端部位のアミノ酸の影響を研究した。
【００７１】
野生型ＰＨ２０のαヘリックス８部位およびαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位（Ｍ３４５〜Ｉ３６１）での一部のアミノ酸残基をＨｙａｌ１の対応部位、すなわち、αヘリックス８部位およびαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位のアミノ酸残基で置換した変異体ＨＭ６(配列番号１でＭ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、 Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、およびＩ３６１Ｔが置換され、追加的なＣ−末端の切断を含まない。)でＮ−末端切断アミノ酸の効果を確認するために、ＨＭ６を鋳型として用いて配列番号１のアミノ酸配列におけるＬ３６〜Ｖ４７のアミノ酸残基らがFRGPLLPNRで置換したり、Ｌ３６〜Ａ５２のアミノ酸残基らがFRGPLLPNRPFTTVで置換した変異体を製作した。また、ＨＭ６を鋳型として用いて配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ−末端がＮ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、またはＰ４２残基の前で切断された変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２、およびＨＭ２５を作製した(表７参照）。
【００７２】
【表７】
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【００７３】
その結果、ＨＭ６のＮ−末端がＮ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、またはＰ４１残基の前で切断される場合には、酵素活性に大きい影響を与えなかったが、Ｎ−末端がＰ４２残基の前で切断される場合には、酵素活性が著しく減少し、Ｐ４１以後のＰＨ２０のＮ−末端部分が、タンパク質の発現および酵素活性において重要であることを示した。また、ＨＭ６のＮ−末端のＬ３６〜Ｖ４７またはＬ３６〜Ａ５２区間のアミノ酸を、Ｈｙａｌ１のアミノ酸で置換した場合には、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されなかったため、Ｎ−末端部分がタンパク質の発現において重要であることを示した。
【００７４】
また、本発明では、ＰＨ２０の固有なシグナルペプチドではない、動物細胞でのタンパク質の発現量が多い他のタンパク質のシグナルペプチドを用いて、組換えＰＨ２０タンパク質の発現を向上させようとした。
【００７５】
したがって、さらに他の側面において、本発明に係る新規なＰＨ２０変異体は、Ｍ１〜Ｔ３５の野生型ＰＨ２０のシグナルペプチドに代えて、さらに、Ｎ−末端が表８に記載のような配列番号３のMATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAのアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン由来のシグナルペプチド、配列番号４によるMKWVTFISLLFLFSSAYSのアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミン由来のシグナルペプチド、または配列番号５によるMAAHLLPICALFLTLLDMAQGのアミノ酸配列を有するヒトＨｙａｌ１由来のシグナルペプチドを含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【００７６】
上記の「Ｍ１〜Ｔ３５の野生型ＰＨ２０のシグナルペプチドに代えて」ということは、野生型ＰＨ２０のシグナルペプチドの一部または全部が欠失し、野生型ＰＨ２０のシグナルペプチドの機能を果たすことができない場合を意味し、Ｎ−末端の一部がさらに欠失した場合、例えば、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、またはＰ４２残基の前での切断が起こり、野生型ＰＨ２０のシグナルペプチドの欠失とともに追加的なＮ−末端の欠失が起こった場合を含む意味で用いられる。
【００７７】
【表８】
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【００７８】
本発明は、他の側面において、本発明に係る新規なＰＨ２０変異体を含む癌治療用組成物およびそれを用いた癌治療方法に関する。
【００７９】
本発明に係る新規なＰＨ２０変異体で治療できる癌または癌腫は、特に制限されず、 固形癌および血液癌を全て含む。このような癌は、例えば、黒色腫などの皮膚癌、肝臓癌、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸部癌、脳腫瘍、前立腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎臓癌、食道癌、胆管癌、睾丸癌、直膓癌、頭頸部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経母細胞腫、および神経膠腫からなる群から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。好ましくは、本発明の組成物で治療できる癌は、大腸癌、乳癌、肺癌、および、腎臓癌からなる群から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００８０】
前記組成物は、薬学組成物であってもよい。前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な組成物をさらに含んでもよく、前記組成物は、薬物の製剤化に通常利用されるもので、ラクトース、テクストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルからなる群から選択された１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。前記薬学組成物は、また、薬学組成物製造に通常利用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、および保存剤からなる群から選択された１つ以上をさらに含んでもよい。 
【００８１】
前記薬学組成物は、経口または非経口で投与されてもよい。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃腸での分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されてもよい。
【００８２】
前記薬学組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態やエキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤等の形態で剤形化されてもよく、分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。
【００８３】
特に、本発明に係る癌治療用組成物は、他の抗癌剤との併用治療の用途に用いられることを特徴とする。
【００８４】
本発明に係る新規なＰＨ２０変異体との併用治療の用途に使用可能な抗癌剤は、化学抗癌剤、抗体形態の抗癌剤、ＲＮＡｉ、細胞治療剤などが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００８５】
好ましくは、本発明に係る新規なＰＨ２０変異体との併用治療の用途に使用可能な抗癌剤は、免疫抗癌剤、好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤(immune checkpoint inhibitor)であるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
他の観点において、本発明は、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片をコードする核酸に関する。
【００８７】
本明細書で使用される「核酸」とは、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に存在したり、または、部分的に精製された形態または、実質的に純粋な形態で存在する場合もある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び該当技術分野に広く知られたその他のものを含む標準技術によって他の細胞成分またはその他汚染物質、例えば他の細胞の核酸またはタンパク質から精製されて出る場合「単離」されるか、「実質的に純粋になる」ものである。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。 
【００８８】
また他の観点において、本発明は、前記核酸を含むベクターに関する。本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片の発現のために、ＰＨ２０変異体をコードするＤＮＡを標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅またはＰＨ２０変異体を発現するハイブリドーマを使用したｃＤＮＡクローニング）で収得することができて、ＤＮＡが転写及び翻訳制御配列に「作動するように結合」されて発現ベクター内に挿入されることができる。
【００８９】
本明細書で使用される「作動するように結合」とは、ベクター内の転写及び翻訳制御配列がＰＨ２０変異体またはその断片をコードする遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図的機能をするようにＰＨ２０変異体またはその断片をコードする遺伝子がベクター内にライゲーションされることを意味することができる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現用宿主細胞に適するように選択される。ＰＨ２０変異体をコードする遺伝子は標準方法（例えば、ＰＨ２０変異体またはその断片をコードする遺伝子断片及びベクター上の相補性制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が全く存在しない場合、平滑（ｂｌｕｎｔ）末端ライゲーション）で発現ベクター内に挿入される。
【００９０】
また、前記組み換え発現ベクターは、宿主細胞でＰＨ２０変異体をコードする遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」とは、ＰＨ２０変異体またはその断片をコードする遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、インハンサー及びその他発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含むことができる。通常の技術者は、形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の発現水準などのような因子に応じて調節配列を異なるように選択して、発現ベクターのデザインが変わる可能性があることを認識することができる。
【００９１】
本発明は、また他の観点において、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明に係る宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母、大腸菌および昆虫細胞からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。 
【００９２】
具体的には、本発明に係る宿主細胞は、大腸菌、バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis) 、ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)またはスタフィロコッカス属(Staphylococcus sp.)のような原核細胞であってもよい。また、アスペルギルス属(Aspergillus sp.)のような真菌、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces sp.)及びニューロスポラ・クラッサのような酵母、その他の下等真核細胞、および昆虫から由来した細胞のような高等真核生物の細胞のような真核細胞であってもよい。
【００９３】
また、前記宿主細胞、植物やほ乳動物から由来されることができる。好ましくは、猿腎臓細胞７（ＣＯＳ７:monkey kidney cells）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ: Chinese hamster ovary）細胞、Ｗ１３８、子ハムスター腎臓（ＢＨＫ: baby hamster kidney）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞などが利用可能であるが、これに限定されない。特に好ましくはＣＨＯ細胞が用いてもよい。
【００９４】
前記核酸または前記ベクターは、宿主細胞に形質移入またはトランスフェクションされる。「形質移入」または「トランスフェクション」させるために、原核または真核宿主細胞内に外因性核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するには通常使用される様々な技術、例えば電気泳動法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションまたはリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを使用することができる。本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片を発現させるために種々の発現宿主／ベクターの組合せが利用されることができる。核細宿主に適した発現ベクターとしては、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)、サイトメガロウイルス、及びレトロウイルスから由来した現調節配列などが含まれる。細菌宿主に使用できる発現ベクターには、pET、pRSETＲ、pBluescript、pGEX2T、pUCベクター、col E1、pCR1、pBR322、pMB9及びこれらの誘導体のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で得られる細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０とλｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に多様なファージラムダ（ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）誘導体で例示することができるファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性一本鎖のＤＮＡファージのようなその他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、2μプラスミド及びその誘導体であり、昆虫細胞に有用なベクターはｐＶＬ９４１である。酵母細胞に有用な発現ベクターは、2μｍプラスミドおよびその誘導体であり、昆虫細胞に有用なベクターは、pVL941である。
【００９５】
本発明は、また他の観点において、宿主細胞を培養して本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片を発現させるステップを含む本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片の製造方法に関する。
【００９６】
前記ＰＨ２０変異体またはその断片を発現することができる組み換え発現ベクターが、哺乳類宿主細胞内に導入される場合、ＰＨ２０変異体またはその断片は、宿主細胞で発現するようにするのに十分な期間の間、または、さらに好ましくは宿主細胞が培養される培養培地内にＰＨ２０変異体またはその断片が分泌されるようにするのに十分な期間の間宿主細胞を培養することによって製造されることができる。
【００９７】
場合により、発現したＰＨ２０変異体は、宿主細胞から分離して均一に精製することができる。前記ＰＨ２０変異体の分離または精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法、例えばクロマトグラフィーによって実行されることができる。前記クロマトグラフィーは、例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疏水性クロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上の組み合わせであってもよいが、これに限定されるものではない。前記クロマトグラフィー以外に、追加でろ過、超ろ過、塩析、透析などを組み合わせ用いてもよい。
【００９８】
以下、本発明を実施例挙げてより詳しく説明する。これらの実施例はひたすら本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当該技術分野において通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００９９】
実施例１．ＰＨ２０変異体の作製
ＰＨ２０変異体を作製するために、野生型ＰＨ２０のｃＤＮＡ（ｃｌｏｎｅ  ＩＤ：ｈＭＵ００２６０４）を韓国ヒトジーンバンク（Ｋｏｒｅａ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ）から購入した。野生型ＰＨ２０は、アミノ酸Ｌ３６からＳ４９０までを暗号化する。重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、ＰＣＲという）によりＰＨ２０の遺伝子を増幅し、ｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯベクターのＸｈｏＩとＮｏｔＩ制限酵素サイトに挿入した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞での発現のために、ＰＨ２０の固有なシグナルペプチドに代えて、ヒト成長ホルモン、ヒト血清アルブミン、またはヒトＨｙａｌ１のシグナルペプチドのうち１つをシグナルペプチドとして使用した。ＨｉｓＴｒａｐカラムを用いたタンパク質の精製のために、ＰＨ２０  ｃＤＮＡの３´−末端に、６ｘＨｉｓ−ｔａｇのＤＮＡ配列が位置するようにした。ＰＨ２０変異体のアミノ酸の置換にはＰＣＲ方法を利用し、アミノ酸の置換はＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより確認した。
【０１００】
ＰＨ２０変異体のクローニングに使用したプライマーのリストは表９にまとめ、その具体的な配列は表１０にまとめた。
【０１０１】
【表９】
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【０１０２】
【表１０】
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【０１０３】
酵素活性と熱安定性が増加したＰＨ２０変異体を探した後、６ｘＨｉｓ−ｔａｇのない形態でもＰＨ２０変異体のｃＤＮＡを作製した。
【０１０４】
ＥｘｐｉＣＨＯ細胞の細胞数が６ｘ１０６／ｍＬになった時に、野生型または変異体ＰＨ２０のｃＤＮＡがｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯベクターに挿入されたプラスミドで、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＥｘｐｉＣＨＯ細胞をトランスフェクションさせた。細胞培養液としては、ＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（１００〜５００ｍＬ）を使用した。トランスフェクションの後、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を総６日間１３０ｒｐｍで振盪培養し、この期間中に、３７℃で１日間培養し、温度を３２℃に下げて５日間さらに培養した。培養が完了した時に、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞上清を回収した。
【０１０５】
ＥｘｐｉＣＨＯ細胞から生産したＣ−末端に６ｘＨｉｓが付いた野生型および変異体ＰＨ２０の組換えタンパク質は、ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ装備を用いて、ＨｉｓＴｒａｐカラム、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム、フェニルカラムの３段階で精製した。
【０１０６】
ＨｉｓＴｒａｐカラムを用いたタンパク質の精製のために、バッファーＡ(20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 0.5 M NaCl)およびバッファーＢ(20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole)を製造した。タンパク質をＨｉｓＴｒａｐカラムに結合させ、非特異的（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合したタンパク質を除去するために、バッファーＡを５ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）流し、ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙが一定に維持されることを確認してから２０％のバッファーＢを５ＣＶ流して、タンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質を透析バッファー(20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 50 mM NaCl)を利用して透析した。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いたタンパク質の精製のために、バッファーＡ(20 mM sodium phosphate, pH 7.5)およびバッファーＢ(20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 0.5 M NaCl)を製造した。タンパク質をＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合させ、バッファーＡを５ＣＶ流し、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、０〜１００％の濃度勾配でバッファーＢを５ＣＶ流して、タンパク質を溶出した。
【０１０７】
フェニルカラムを用いたタンパク質の精製のために、バッファーＡ(20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 1.5 M (NH4)2SO4)およびバッファーＢ(20 mM sodium phosphate, pH 7.0)を製造した。タンパク質をフェニルカラムに結合させ、バッファーＡを５ＣＶ流し、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、０〜１００％の濃度勾配でバッファーＢを５ＣＶ流して、タンパク質を溶出した。
【０１０８】
野生型と変異体ＰＨ２０の酵素活性を比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）とｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙ、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ  ａｓｓａｙを利用して測定した。
【０１０９】
比濁分析（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）は、ヒアルロン酸とアルブミン（ＢＳＡ）の混合時に生成される沈殿を吸光度を利用して測定する方法であって、ＰＨ２０によりヒアルロン酸が加水分解されると、アルブミンと混合の時、吸光度が減少する。ヒアルロニダーゼＰＨ２０（Ｓｉｇｍａ）を１、２、５、７．５、１０、１５、２０、３０、５０、６０Ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈し、各チューブに準備する。精製されたタンパク質サンプルをｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ(20 mM TrisＸHCl, pH 7.0, 77 mM NaCl, 0.01% (w/v) bovine serum albumin)に溶解して１００Ｘ、３００Ｘ、６００Ｘ、１２００Ｘ、２４００Ｘとなるように希釈し、各チューブに準備する。新しいチューブに、３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸溶液の濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように１０倍希釈し、各チューブの体積が１８０μＬとなるようにする。希釈したヒアルロン酸溶液に酵素６０μＬを入れて混合し、３７℃で４５分間反応させる。反応が終わると、９６ウェルプレートの各ウェルに、反応させた酵素５０μＬおよび酸性アルブミン溶液（ａｃｉｄｉｃ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２５０μＬを入れ、１０分間振盪した後、６００ｎｍで分光光度計により吸光度を測定する。
【０１１０】
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙは、タンパク質を１０％のＳＤＳゲル（０．１７ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を含む）で１時間電気泳動し、２．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｗ／ｖ）を用いて４℃で２時間ＳＤＳを除去する。その後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌバッファーで、ＰＨ２０の最適温度である３７℃で１〜４時間酵素反応を行い、０．５％のアルシアンブルー試薬を利用してタンパク質を染色した。ヒアルロン酸と結合していないアルシアンブルー試薬は、脱染溶液（ｄｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を利用して除去した。アルシアンブルーで染色されたＳＤＳゲルの写真を撮った後、バンドを定量した。
【０１１１】
タンパク質の熱安定性を、動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を利用した凝集温度の測定、Ｓｙｐｒｏ−Ｏｒａｎｇｅ染料を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより測定した融点（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）、特定の温度で一定時間放置した後に酵素活性を測定する方法などにより測定した。ＤＬＳを利用した凝集温度の測定は、光の散乱を用いて分子の凝集現象を測定するため敏感度が高く、一般に、タンパク質の融点（Ｔｍ）より温度が低い。
【０１１２】
本発明で作製したＰＨ２０変異体において、置換または切断したアミノ酸の配列は以下の表１１のとおりである。
【０１１３】
本発明に係る変異体のうち、Ｃ−末端に６ｘＨｉｓ−ｔａｇが付着された変異体はＨＭと命名し、６ｘＨｉｓ−ｔａｇのない変異体はＨＰと命名しており、Ｃ−末端に６ｘＨｉｓ−ｔａｇが付着された成熟された野生型ＰＨ２０（Ｌ３６−Ｓ４９０）はＷＴと命名し、６ｘＨｉｓ−ｔａｇがなく、且つＣ−末端がＹ４８２の次で切断された成熟された野生型ＰＨ２０（Ｌ３６〜Ｙ４８２）はＨＷ２と命名した。
【０１１４】
【表１１】
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【０１１５】
実施例２．ＰＨ２０の変異体ＨＭ１とＨＭ６の作製
ＰＨ２０のアミノ酸配列Ｍ３４５〜Ｎ３６３は、図１Ｂに示したように、タンパク質の三次構造モデルにおいて、αヘリックス８部位およびαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位に該当する。αヘリックス８のアミノ酸のうちＣ３５１は、αヘリックス１のＣ６０とジスルフィド結合を、Ｙ３５７はαヘリックス７のＦ３１５と疎水性相互作用を、Ｎ３６３はαヘリックス１のＤ６９と水素結合を形成し、αヘリックス８と隣合う二次構造を安定化させている（図１Ｃ）。
【０１１６】
ＰＨ２０のαヘリックス８部位およびαヘリックス７とαヘリックス８の連結部位に位置したアミノ酸を置換することで、ＷＴよりも酵素活性と熱安定性が高い変異体を作製するために、Ｍ３４５〜Ｎ３６３区間で１２個のアミノ酸を置換した変異体ＨＭ１と、Ｙ３６５〜Ｖ３７９区間で７個のアミノ酸を置換したＨＭ２、およびＭ３４５〜Ｖ３７９区間のアミノ酸１９個を置換したＨＭ３を、それぞれ作製した。ＰＨ２０のαヘリックス８に位置したアミノ酸のうち、ジスルフィド結合に関与するＣ３５１と、疎水性相互作用に関与するＹ３５７は置換しなかった。変異体ＨＭ１、ＨＭ２、ＨＭ３において、置換したアミノ酸の配列は表１１に示されている。変異体ＨＭ１、ＨＭ２、ＨＭ３の遺伝子が含まれたｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯプラスミドでＥｘｐｉＣＨＯ細胞にトランスフェクションした時に、変異体ＨＭ１はＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現され（図３Ａ）、変異体ＨＭ２とＨＭ３は発現されなかった。タンパク質の発現有無は、酵素活性の測定だけでなく、ヒトＰＨ２０に対する抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９３００９）を利用してウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）によっても確認した。抗体の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）はＱ１７３〜Ｐ２２２区間である。この実験結果は、αヘリックス８のアミノ酸配列の中でも、変異体ＨＭ２、ＨＭ３の作製に使用したＹ３６５〜Ｖ３７９区間のアミノ酸の置換が、タンパク質の構造に深刻な影響をもたらし、変異体ＨＭ２、ＨＭ３のタンパク質が発現されなかったと考えられる。変異体ＨＭ１は、野生型ＷＴに比べて発現量が３．４倍高かった（図２）。変異体ＨＭ１は、Ｎ３６３をグリシンで置換し、αヘリックス８のＮ３６３とαヘリックス１のＤ６９との間の水素結合を除去したものである（図１Ｃ）。Ｎ３６３とＤ６９との間の水素結合を修復するために、ＨＭ１においてＧ３６３をアスパラギンで置換した変異体ＨＭ６を作製した。変異体ＨＭ６において、置換したアミノ酸は表１１に示されている。
【０１１７】
変異体ＨＭ６はＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現され、その発現量は変異体ＨＭ１と類似であった（ＷＴに比べて発現量が３．４倍多い）（図２）。比濁分析（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）方法により酵素活性を測定した時に、変異体ＨＭ６は、ＷＴに比べて酵素活性が１．３倍増加した（図３Ｂ）。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙは、一般に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、２．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｗ／ｖ）を用いてＳＤＳを除去し、３７℃で１〜４時間反応しながらヒアルロニダーゼがヒアルロン酸を加水分解する程度をアルシアンブルー染色薬を用いて測定する。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｇｅｌからＳＤＳが除去されると、タンパク質の折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）がすぐ起こり、ｓｕｂｓｔｒａｔｅがタンパク質の折り畳みには影響を与えないと知られている。ＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ６の酵素活性をｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙ方法により３７℃で１〜４時間測定した時に、ＨＭ６は、ＷＴおよび変異体ＨＭ１よりも高い酵素活性を示した（図３Ｃ）。この結果は、変異体ＨＭ１とＨＭ６のタンパク質の折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）とそれによるｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎがＷＴより早く、作製した変異体らがＷＴよりも高い酵素活性を示すということを提示する。ＰＨ２０自体のシグナルペプチドを利用した時にはＥｘｐｉＣＨＯ細胞でのタンパク質の発現量が低かった。これを解決するために、ヒト血清アルブミンまたはヒトＨｙａｌ１のシグナルペプチド配列を使用した。図３Ｃに示したように、変異体ＨＭ１のシグナルペプチドとして、ヒト血清アルブミンとヒトＨｙａｌ１のシグナルペプチドを使用した時に、タンパク質の発現が増加し、二種類のシグナルペプチドの間に大きい差はなかった。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙ方法により酵素活性を測定した時に、ヒト血清アルブミンのシグナルペプチドを有するＷＴと、ヒト血清アルブミンまたはＨｙａｌ１のシグナルペプチドを有する変異体ＨＭ１は、ｐＨ５〜８区間で酵素活性を示した（図３Ｄ）。本発明では、ＨＭ１以後に作製した変異体のシグナルペプチドとして、ヒト血清アルブミンのシグナルペプチドを使用した。
【０１１８】
ＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ６の熱安定性を凝集温度で比較すると、それぞれ４６．５℃、５３．０℃、５０．５℃であって、変異体ＨＭ１とＨＭ６の凝集温度がＷＴよりそれぞれ６．５℃および４．０℃高い（図１０）。凝集温度の測定結果は、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙで示したタンパク質の折り畳み結果と一致する。この結果らは、αヘリックス８のＮ３６３残基が成す水素結合が、タンパク質構造の熱安定性と酵素活性において重要な役割を果たすことを最初に提示する。
【０１１９】
また、フェニルカラムを用いて、ＷＴおよび変異体ＨＭ１、ＨＭ６の親水性／疎水性特性を比較した時に、ＨＭ１とＨＭ６は何れもＷＴよりも先に溶出された。これは、変異体ＨＭ１とＨＭ６が、アミノ酸の置換により、ＷＴに比べてより親水性性質を有することを提示する。ところが、フェニルカラムから溶出された変異体ＨＭ１とＨＭ６は、ＷＴと異なり、２つのピークが存在し、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを処理した場合に同一の分子量を示した。これは、Ｎ−糖化による差であると考えられる（図３Ｅ）。
【０１２０】
実施例３．ＰＨ２０変異体ＨＭ４、ＨＭ７、ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ１１、ＨＭ１２の作製
実施例２で、変異体ＨＭ１とＨＭ６の作製により、Ｍ３４５〜Ｎ３６３とＭ３４５〜Ｉ３６１区間のアミノ酸の置換がＰＨ２０の酵素活性および熱安定性を両方とも増加させたことは、タンパク質工学の点から大きな進展を遂げたことであると考えられる。したがって、変異体ＨＭ１とＨＭ６をベースとし、Ｎ−末端とＣ−末端の方向にさらに拡張してさらにアミノ酸を置換した。
【０１２１】
先ず、変異体ＨＭ１とＨＭ６において置換したアミノ酸を含み、さらに、Ｇ３４０〜Ｉ３４４の間のアミノ酸をＧ３４０Ｖ、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎで置換した変異体ＨＭ４、ＨＭ７をそれぞれ作製した。変異体ＨＭ４とＨＭ７において、置換したアミノ酸の配列は表１１に示されている。変異体ＨＭ４とＨＭ７はＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現された。ＨＭ７に対するタンパク質の精製結果は、図５Ａに示されている。ＨＭ４、ＨＭ７は、タンパク質の発現がＷＴに比べて何れも６．３倍増加しており、凝集温度はそれぞれ１０℃および１１．５℃増加した。しかし、比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）方法により測定したＨＭ４とＨＭ７の酵素活性は、ＷＴに比べて略１５％に過ぎなかった（図５Ｂ）。一般に、酵素活性と熱安定性は交換（ｔｒａｄｅ−ｏｆｆ）の関係が成立するが、本発明では、変異体ＨＭ１とＨＭ６において導入した置換によっては、酵素活性は維持されながら熱安定性が増加し、変異体ＨＭ４とＨＭ７では、過度な熱安定性の増加により酵素活性が減少したと考えられる。タンパク質工学の点から、変異体ＨＭ４、ＨＭ７で現れた１１．５℃の凝集温度の増加は、非常に有意な結果である。シュテルン−フォルマー・プロットによりタンパク質の構造の柔軟性を分析した時に、αヘリックス８とその連結部位を置換したＨＭ１、ＨＭ６、ＨＭ４、ＨＭ７は、何れもＷＴよりも構造の柔軟性が高かった（図１１Ａ）。この結果は、局所的な熱安定性の増加が、タンパク質構造の全体の柔軟性を増加させたことを提示する。
【０１２２】
変異体ＨＭ６とＨＭ７の差異点は、Ｇ３４０〜Ｉ３４４の間のアミノ酸である。変異体ＨＭ７の熱安定性の増加に関与するアミノ酸を確認するために、変異体ＨＭ６をベースとし、Ｉ３４４Ｎが置換されたＨＭ８、Ｓ３４３とＩ３４４Ｎが置換されたＨＭ９、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎが置換されたＨＭ１０、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、およびＩ３４４Ｎが置換されたＨＭ２１をそれぞれ作製した。変異体ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１において、置換したアミノ酸の配列は表１１に示されている。変異体ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現された（図５Ａ）。変異体ＨＭ６をベースとし、αヘリックス８のＮ−末端の方向にＩ３４４Ｎ、Ｓ３４３Ｅ、Ｌ３４２Ｗ突然変異を導入するほど、変異体ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０の凝集温度がそれぞれ５２．５℃、５３℃、５５．５℃に増加した（図１０）。しかし、変異体ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０ではＷＴと類似の酵素活性が維持された（図５Ｂ）。この結果は、変異体ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０において導入されたアミノ酸置換が、酵素の熱安定性には局所的な影響を与えたが、酵素活性には大きい影響を与えないことを提示する。ところが、ＨＭ２１は、ＨＭ１０よりも熱安定性が減少したが、ｐＨ７．０でＷＴより２倍高い特性を示した。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙで１時間ＷＴと各変異体を気質と反応させた時に、酵素活性はＨＭ２１＞ＨＭ１０＞ＨＭ９＞ＨＭ８＞ＨＭ６＞ＷＴの順に示された（図５Ｃ）。
【０１２３】
フェニルカラムを利用して変異体ＨＭ７、ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１の物性を調べた時に、これらのＰＨ２０変異体らは、ＷＴよりも早く溶出され、何れも親水性性質を有することを提示する。ところが、アミノ酸の置換位置によって主ピークのパターンが異なって現れる特性を示した（図５Ｄ）。
【０１２４】
変異体ＨＭ７の場合も、変異体ＨＭ１、ＨＭ６と同様に、フェニルカラムで２つのピークが現れ、２種類の形態が存在することを提示する。
【０１２５】
等電点によるＷＴおよび変異体の移動様相を確認するために、等電点焦点化（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ、以下、ＩＥＦという）分析を実施した（図５Ｅ）。ＩＥＦゲルで、ＷＴおよび変異体ＨＭ６、ＨＭ８が類似の移動様相を示し、Ｓ３４３Ｅ突然変異が含まれた変異体ＨＭ９、ＨＭ１０、ＨＭ２１、ＨＭ７は、より酸性（ａｃｉｄｉｃ）の方へ移動した。この結果は、Ｇ３４０〜Ｉ３４４の間のアミノ酸のうちＳ３４４Ｅ置換によるグルタミン酸の導入により、タンパク質の等電点に変化が生じることを示す。
【０１２６】
そして、変異体ＨＭ６をベースとし、αヘリックス８のＣ−末端の方向に確張してアミノ酸を置換して変異体ＨＭ１１、ＨＭ１２を作製した。変異体ＨＭ１１とＨＭ１２において、置換したアミノ酸の配列は表１１に示されている。変異体ＨＭ１１はＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されたが、その発現量が野生型ＷＴより低く（図２）、変異体ＨＭ１２はＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されなかった。変異体ＨＭ１１はＷＴに比べて３２％の活性を示した（図６Ｂ）。
【０１２７】
実施例４．Ｎ−末端が切断されたＨＭ６ベースの変異体の作製
ＰＨ２０のＣ−末端部位は、ＰＨ２０の発現と酵素活性において重要な役割を果たすことが既に知られているが、ＰＨ２０のＮ−末端部位のアミノ酸の役割はあまり知られていない。ＰＨ２０のＮ−末端部位のアミノ酸の切断が酵素活性にどのような影響を与えるかを確認するために、変異体ＨＭ６をベースとし、Ｎ−末端がＮ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、Ｐ４２で切断された変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２、およびＨＭ２５を作製した（表１１）。そして、さらに、Ｎ−末端のアミノ酸に変形を加えたＨＰ６１、ＨＰ６２を作製した。
【０１２８】
前記変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２、ＨＰ６１、ＨＰ６２はＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されたが、ＨＭ２５は発現されなかった（図７Ａおよび図７Ｂ）。Ｎ−末端が切断されたＰＨ２０変異体らは、Ｎ末端の開始位置によって酵素活性の差を示した。アミノ酸１〜３個が切断された変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１は、鋳型であるＨＭ６に比べて酵素活性が類似であったが、アミノ酸の４〜５個が切断されたＨＭ２４とＨＭ４２は、活性がＨＭ６よりも少し減少した（図７Ｃ）。ところが、６個のアミノ酸が切断されたＨＭ２５は、ＥｘｐｉＣＨＯで殆ど発現されなかっただけでなく、酵素活性も３．５Ｕ／μｇと著しく低かった。Ｎ−末端のアミノ酸に変形を加えたＨＰ６１とＨＰ６２は、酵素活性の変化が大きくなく表す。
【０１２９】
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙ方法（１時間反応）により測定したＮ−末端切断変異体の酵素活性は、ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１の場合、鋳型であるＨＭ６の酵素活性と類似であったが、ＨＭ２４、ＨＭ４２は、ＨＭ６の酵素活性より減少した（図７Ｄ）。６個のアミノ酸が切断されたＨＭ２５は、タンパク質の量が少なくて分析が不可能であった。
【０１３０】
フェニルカラムを利用して変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２の物性を分析した時に、これらの変異体らは、ＷＴより先にカラムから溶出され、親水性性質を示した（図７Ｅ）。この結果は、変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ２４、ＨＭ４２が変異体ＨＭ６をベースとして作製されたものであり、Ｌ３６〜Ａ４０残基の特性を考慮すると、ＨＭ６の親水性特性によることであると考えられる。
【０１３１】
ＤＬＳにより測定したＮ−末端切断変異体の凝集温度は、アミノ酸の開始位置によって変異体毎に差があった（図７Ｆ）。変異体ＨＭ４０、ＨＭ１３、ＨＭ４１、ＨＭ４２は、Ｎ−末端が切断されたにもかかわらず５０℃以上の凝集温度を示し、鋳型であるＨＭ６の特性がそのまま維持された。中でも、ＨＭ４０とＨＭ４２は、ＨＭ６よりも３〜４℃高い凝集温度を示し、熱安定性が増加したと考えられる。また、ＰＨ２０のＮ−末端部位に位置したアミノ酸を置換した場合、タンパク質の発現と酵素活性に与える影響を確認するために、ＰＨ２０のＮ−末端アミノ酸配列３６〜４７（ＬＮＦＲＡＰＰＶＩＰＮＶ）をＦＲＧＰＬＬＰＮＲで置換した変異体ＨＭ１７と、ＰＨ２０のＮ−末端アミノ酸配列３６〜５２（ＬＮＦＲＡＰＰＶＩＰＮＶＰＦＬＷＡ）をＦＲＧＰＬＬＰＮＲＰＦＴＴＶで置換した変異体ＨＭ１８を作製した。変異体ＨＭ１７とＨＭ１８において、置換したアミノ酸の配列は表１１に示されている。変異体ＨＭ１７とＨＭ１８はＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現されなかった。Ｎ−末端に位置した５個のアミノ酸まで切断されてもタンパク質の発現と酵素活性を示したが、３６〜４７または３６〜５２のように、より多くのアミノ酸配列の置換は、タンパク質の折り畳みに影響を与えるということを提示する。
【０１３２】
実施例５．ＰＨ２０のＣ−末端が切断されたＨＭ６ベースの変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６の作製
ＰＨ２０のＣ−末端は、タンパク質の発現と酵素活性において重要な部位であると知られている。本発明では、変異体ＨＭ６をベースとして、Ｃ−末端のアミノ酸をそれぞれＩ４６５、Ｆ４６８、Ｋ４７１で切断した変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６を作製した。変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６において、置換したアミノ酸の配列は表１１に示されている。変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６はＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現され（図８Ａ）、タンパク質の発現量はＨＭ１６＞ＨＭ１５＞ＨＭ１４の順であって、Ｃ−末端のアミノ酸が多く切断されるほど、タンパク質の発現量が減少した（図８Ａ）。ところが、変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６の酵素活性は、ＨＭ１６＞ＨＭ１４（≫ＷＴ）＞ＨＭ１５の順であった（図８Ｂ）。Ｆｒｏｓｔらによると、ＰＨ２０のＣ−末端４７７−４８３部位はｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎに必要であり、Ｃ−末端がＣ４６７で切断される場合、酵素活性は、Ｃ−末端が４７７−４８３で切断されたＰＨ２０変異体に比べて１０％に過ぎず、Ｃ−末端が４６７より前で切断される場合は、酵素活性がなかった。しかし、本発明で作製したＣ−末端が切断された変異体（ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６）らは、変異体ＨＭ６をベースとして作製し、Ｍ３４５〜Ｉ３６１区間のアミノ酸の置換によりタンパク質の折り畳みが増加し、これにより熱安定性が増加したため、Ｃ−末端のＩ４６５、Ｆ４６８、Ｐ４７１の次で切断されても、ＷＴと酵素活性が類似であり、著しい酵素活性の減少はなかった。
【０１３３】
ＷＴおよび変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６の構造の柔軟性を、アクリルアミドを用いた蛍光クエンチングにより調べた（図１１Ｂ）。変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６は、何れもＷＴより構造が柔軟であった。この結果から、変異体ＨＭ６をベースとして作製したＣ−末端切断変異体の場合も、構造の柔軟性を維持することが分かる。
【０１３４】
比濁分析（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）方法により測定した変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６の酵素活性は、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙでも確認された（図８Ｃ）。
【０１３５】
フェニルカラムを用いてＣ−末端が切断された変異体の物性を分析した時に、変異体ＨＭ１４、ＨＭ１５、ＨＭ１６は、何れもＷＴより先に溶出されて親水性性質を示し、変異体らの親水性は、変異体ＨＭ１６＞ＨＭ１４＞ＨＭ１５の順であった（図８Ｄ）。
【０１３６】
実施例６．Ｎ−末端とＣ−末端のアミノ酸切断を含むＨＭ１０ベースの変異体ＨＭ１９、ＨＭ２０の作製
本発明で作製したＰＨ２０変異体らは、ＨＭ６をベースとし、Ｇ３４０〜Ｉ３４４のアミノ酸を追加置換したＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０が、ＷＴよりもタンパク質の発現量、酵素活性、熱安定性の点から優れた性能を示した。ＨＭ８、ＨＭ９、ＨＭ１０のうち、酵素活性と熱安定性が高いＨＭ１０をベースとし、Ｎ−末端がＦ３８で切断され、Ｃ−末端がＫ４７０またはＦ４６８で切断された変異体ＨＭ１９とＨＭ２０を作製した。ＨＭ１９とＨＭ２０は、何れもＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現され、ＨｉｓＴｒａｐカラムを利用して精製された（図９Ａ）。比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）方法により酵素活性を測定した時に、ＨＭ１９とＨＭ２０は、ＷＴに比べて１０％高い酵素活性を示した（図９Ｂ）。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙでも、ＨＭ１９とＨＭ２０はＷＴより高い酵素活性を示した（図９Ｃ）。
【０１３７】
実施例７．ＨＭ１０ベースのＰＨ２０変異体の特性分析
ＨＭ１０ベースのＣ−末端切断変異体らは、Ｃ−末端の長さが短くなるほど、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞での発現量が減少する傾向を示し、Ｃ−末端の長さがＣ４６４以下である場合には発現されなかった（図１２）。Ｃ４６４は、Ｃ４３７とジスルフィド結合を形成し、タンパク質構造の維持において重要であるため必ず必要である。
【０１３８】
Ｃ−末端が４６４で切断されるかより短い場合に、ＥｘｐｉＣＨＯで発現されないかを確認するために、ウエスタンブロット実験を行った。図１３のように、ＨＭ３０、ＨＭ３１、ＨＭ３２、ＨＭ３３変異体はウエスタンブロットで探知されなかった。
【０１３９】
比濁分析（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）方法により測定したＨＭ１０ベースのＣ−末端切断変異体の酵素活性は、図１４Ａおよび図１４Ｂに示されている。Ｃ−末端切断変異体らは、ＷＴに比べて±２０％の酵素活性を示した。Ｃ−末端がＩ４８０以後で切断される場合には、酵素活性が全般的に増加した。そして、ＨＭ１９とＨＭ２０から６ｘＨｉｓ−ｔａｇを除去した変異体であるＨＰ１９とＨＰ２０は、６ｘＨｉｓ−ｔａｇがあった時に比べて酵素活性がそれぞれ２３％、９．６％減少することが示され、６Ｈｉｓ−ｔａｇが酵素活性に影響を与えると考えられる。
【０１４０】
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙ方法によりＨＭ１０ベースのＣ−末端切断変異体の酵素活性を測定した時に、これらの変異体らは、ＷＴよりも高い酵素活性を示し、鋳型であるＨＭ１０の酵素活性と類似であって、Ｃ−末端の長さによる差は大きくなかった（図１４Ｃ）。
【０１４１】
実施例８．ＨＭ２１ベースのＰＨ２０変異体の特性分析
変異体ＨＰ３４は、４段階のカラムを経て精製し（図１５Ａ）、ＨＰ４６は、３段階のカラムを経て精製した（図１５Ｂ）。ＨＰ３４とＨＰ４６の生産量は、それぞれ１．７３ｍｇ／Ｌおよび２５．６ｍｇ／Ｌであった。ＨＰ３４とＨＰ４６は６ｘＨｉｓ−ｔａｇのない変異体であって、６ｘＨｉｓ−ｔａｇがある変異体らとは精製過程が異なり、タンパク質の発現量を比較することが困難である。
【０１４２】
比濁分析（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）で、ＨＰ３４とＨＰ４６の活性はそれぞれ４５．６Ｕ／μｇおよび４７．２Ｕ／μｇであって、ＷＴに比べて約２倍高い活性を示し、鋳型であるＨＭ２１よりも活性が略１０％程度増加した（図１６Ａ）。
【０１４３】
Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ  ａｓｓａｙにより各変異体のｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、図１６Ｂに示した。ＨＰ３４とＨＰ４６の触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、野生型ＨＷ２に比べて１．７〜２倍高く、比活性度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）がＷＴより高い結果と相通ずる。ミカエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ）定数（Ｋｍ）は、これらの変異体がＨＷ２より低く、基質に対する親和度が増加したと考えられる。この結果から、ＨＭ２１、ＨＰ３４、ＨＰ４６変異体らが基質と強く結合するだけでなく、基質を生成物に変える効率も高い特性を有していると結論付けることができる。このような特性は、Ｔ３４１をセリンで置換したことによる効果である。３４１番に位置したスレオニンをアラニン、グリシン、アスパラギン酸などのアミノ酸で置換する場合、酵素活性に影響を与えると予測することができる。
【０１４４】
ＤＬＳにより測定したＨＰ３４とＨＰ４６の凝集温度は、それぞれ５１．５℃と５１．０℃と示され、鋳型であるＨＭ２１と類似であり、ＨＷ２に比べて略５℃高い熱安定性を示した（図１７Ａ）。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙにより測定した変異体ＨＰ３４の活性は、ＨＰ２０と類似に示されたのに対し、ＨＰ４６は、ＨＰ２０より高い酵素活性を示した。このことから、鋳型として、ＨＭ１０よりはＨＭ２１のタンパク質の折り畳みが、より優れると考えられる（図１７Ｂ）。
【０１４５】
野生型ＨＷ２と変異体ＨＰ４６をｐＨ７．０およびｐＨ３．０の条件で一晩放置した後、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙにより酵素活性を比較した時に、ＨＰ４６は、ｐＨ７．０だけでなくｐＨ３．０でも高い活性を示し、優れた安定性を示した（図１７Ｃ）。
【０１４６】
ＨＭ５３、ＨＭ５４、ＨＭ５５、ＨＭ５６、ＨＰ５９、ＨＰ６０は、ＨＭ２１ベースの変異体のうち、３４１番位置のアミノ酸に対して変異を有している変異体である。３４１番位置のアミノ酸が変異されることにより、その発現程度と活性に様々な影響を与えることを確認した（図１７Ｄ、図１７Ｅ）。
【０１４７】
実施例９．ＰＨ２０変異体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性分析
低分子化学合成物質に比べて大きい分子量を有するバイオ医薬品は、人体内に入った時に不意の免疫反応を起こす危険性を有している。大きい分子量のバイオ物質の二次構造や、三次構造において、折り畳みや隣接ドメインとの相互作用により作られる外部との接触面は、人体内の免疫作用系に抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）を提供することで、バイオ物質に対する免疫反応を促進させることができる。かかる免疫反応は、薬物に対する抗体（ａｎｔｉ−ｄｒｕｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＤＡ）を生成させ得るし、このような反応により、薬物の有効性を阻害したり、薬物に対する過敏反応を誘発したり、薬物の人体内における除去（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を促進し得る。したがって、薬物に対する免疫反応は、臨床試験での結果に影響を与える可能性があり、長期間にわたって使用する際には、重大な異常反応を誘発し得る。かかる免疫反応には、種々の要因が影響し得るが、薬物自体や疾病に特異的な反応、または、投薬方法や各患者毎による要因によって誘発し得る。薬物自体による要因としては、バイオ医薬品の人体内ペプチドとの類似／非類似性、翻訳後修飾（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、不純物、凝集体の形成、剤型の特性などが挙げられる。各患者毎による要因としては、性別や、服用している他の薬物との反応性、ＨＬＡ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）  ｔｙｐｅによる遺伝的要因などが挙げられる。
【０１４８】
このような免疫原性反応は、免疫反応の生成原因にかかわらず抗原決定基を認識するＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌやＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌによって進行される。個人毎におけるＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ遺伝子の多様性のため、ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌの抗原決定基は個人差があり、したがって、健常ドナーにより提供されたそれぞれの血液中のＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌでのバイオ薬物に対する反応性は、臨床過程で生じ得る免疫反応性を評価するにあたり非常に重要な判断基準となることができる。ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌは、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ；ＡＰＣ）が自分のＩＩ型ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を介して提示された抗原を認識して活性化される。活性化されたＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌは、サイトカインを放出してマクロファージ、細胞毒性Ｔ細胞、Ｂ細胞を活性化させ、結果的に、抗体が多く生産されるようにする。これと異なり、ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌは、直接的な細胞毒性を有しており、抗原に感染された細胞、損傷されたか、本来の機能を失った細胞を直接除去する。ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌは、Ｔ細胞受容体を有しており、全ての細胞の表面に位置したＩ型ＭＨＣ分子に付いている特定の抗原のペプチドを認識することができる。ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌはまた、抗原提示細胞により提示された抗原を認識して活性化されることができ、このような活性化は、ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌのサイトカインにさらに増進されることができる。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで新規バイオ物質のＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌとＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化程度を測定することで、臨床過程で誘発され得る免疫原性反応を予測することができる。本実施例では、ＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌとＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌを分離した後、対照物質としてのＰＨ２０とＰＨ２０変異体（ＨＰ４６）をそれぞれ１．５ｎｇ／ｍＬおよび１５ｎｇ／ｍＬで処理してから、活性化されたＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌとＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの分布を測定することで、対照物質と比較することにより、ＰＨ２０変異体の免疫原性を予測しようとした。各Ｔ  ｃｅｌｌの活性化程度はＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｉｎｄｅｘを利用して測定し、Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ）は、下記のように定義される。ＳＩ値が２以上である場合に、有意水準に活性化されたと判断することができる。
【０１４９】
Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ）＝（試験試料を処理した後のＴ  ｃｅｌｌの活性化度）／（ｖｅｈｉｃｌｅ処理後のＴ  ｃｅｌｌの活性化度）
【０１５０】
免疫原性反応はＨＬＡタイプによって変わり得るため、より多様なＨＬＡタイプでの反応を測定するために、１０人の健常ドナー（ｈｅａｌｔｈｙ  ｄｏｎｏｒ）から受けたＰＢＭＣから分離したＴ  ｃｅｌｌを用いて実験を行った。使用された１０個のＰＢＭＣのＨＬＡタイプは、以下の表１２のとおりである。
【０１５１】
【表１２】
2021507676.tif 000042
【０１５２】
ＰＨ２０とＰＨ２０変異体でのＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化度の測定結果は、表１３にまとめたとおりである。ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化度の測定結果を見ると、ＰＨ２０とＰＨ２０変異体は、両方とも活性化度が比較的低い水準であると判断される。ＰＨ２０は、２つの実験でＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化度が２以上と測定され、ＰＨ２０変異体は、ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化が測定されなかった。ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓの場合は、ＰＨ２０は、１つの実験で活性化が測定され、ＰＨ２０変異体も、１つの実験で活性化が測定された。しかし、ＰＨ２０は、１．５ｎｇ／ｍＬと１５ｎｇ／ｍＬの両方でＳＩ値が２以上と測定されたが、ＰＨ２０変異体は、１．５ｎｇ／ｍＬでは２以下のＳＩ値が、１５ｎｇ／ｍＬでは２以上のＳＩ値が測定された（図１８および図１９参照）。
【０１５３】
したがって、低い濃度では、ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化度がＰＨ２０変異体では低いと観察され、ＰＨ２０変異体に比べて、ＰＨ２０でのＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化度が高いと判断される。上記のような結果から導出される結論は、
１）ＰＨ２０とＰＨ２０変異体でのＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌおよびＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化度が比較的低く、
２）ＰＨ２０よりも、ＰＨ２０変異体でのＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌとＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの活性化可能性が低いと判断される。
【０１５４】
このような結果から、ＰＨ２０変異体が、臨床での免疫原性反応を誘発する可能性がＰＨ２０より低いと予想される。
【０１５５】
【表１３】
2021507676.tif 000043
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、成熟された野生型ＰＨ２０に比べてＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現された時にタンパク質の発現量が増加し、タンパク凝集温度は４〜１１．５℃程度に増加して、高い熱安定性を有すると共に、また、効率的に生産されることができる効果がある。
【０１５７】
また、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、ヒアルロニダーゼの活性を測定する実験中一つであるｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｇｅｌ  ａｓｓａｙの結果でタンパク質の折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）が向上されて成熟された野生型ＰＨ２０よりも早くｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎされる効果があって、Ｃ−末端の切断位置にかかわらず元の酵素活性 を維持する効果がある。
【０１５８】
さらに、本発明に係るＰＨ２０変異体またはその断片は、低い免疫原性をを有しているため、人体に繰り返して投与することが可能である。
【０１５９】
＜参考文献＞
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Frost,G.I.(2007).Recombinanthumanhyaluronidase(rHuPH20):anenabling platformforsubcutaneousdrugandfluidadministration.ExpertOpinDrugDeliv4, 427-440.
【図１Ａ】
2021507676.tif 000044
【図１Ｂ】
2021507676.tif 000045
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2021507676.tif 000051
【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
2021507676.tif 000053
【図４Ｂ】
2021507676.tif 000054
【図５Ａ】
2021507676.tif 000055
【図５Ｂ】
2021507676.tif 000056
【図５Ｃ】
2021507676.tif 000057
【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
2021507676.tif 000060
【図６Ｂ】
2021507676.tif 000061
【図７Ａ】
2021507676.tif 000062
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
2021507676.tif 000066
【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
2021507676.tif 000068
【図８Ｂ】
2021507676.tif 000069
【図８Ｃ】
2021507676.tif 000070
【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
2021507676.tif 000072
【図９Ａ】
2021507676.tif 000073
【図９Ｂ】
2021507676.tif 000074
【図９Ｃ】
2021507676.tif 000075
【図１０】
2021507676.tif 000076
【図１１Ａ】
2021507676.tif 000077
【図１１Ｂ】
2021507676.tif 000078
【図１２Ａ】
2021507676.tif 000079
【図１２Ｂ】
2021507676.tif 000080
【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月29日(2020.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０において、
Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｇ、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ、およびＩ３６１Ｔからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とするＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項２】
Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｌ３５４Ｉ、およびＮ３５６Ｅからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＰＨ２０のαヘリックス部位、および／またはその連結部位に該当する部位で１つ以上のアミノ酸残基の置換をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項４】
前記αヘリックス部位は、αヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）であり、前記その連結部位は、αヘリックス７とαヘリックス８の連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）であることを特徴とする請求項３に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項５】
前記αヘリックス部位、およびその連結部位に該当する部位は、Ｔ３４１〜Ｎ３６３、Ｔ３４１〜Ｉ３６１、Ｌ３４２〜Ｉ３６１、Ｓ３４３〜Ｉ３６１、Ｉ３４４〜Ｉ３６１、Ｍ３４５〜Ｉ３６１、またはＭ３４５〜Ｎ３６３であることを特徴とする請求項４に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項６】
前記αヘリックス８部位（Ｓ３４７〜Ｃ３８１）、および／またはαヘリックス７とαヘリックス８との連結部位（Ａ３３３〜Ｒ３４６）が、Ｈｙａｌ１の対応部位のアミノ酸配列の一部のアミノ酸残基で置換されたことを特徴とする請求項４に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項７】
Ｌ３５４Ｉおよび／またはＮ３５６Ｅのアミノ酸残基の置換を含み、
さらに、Ｔ３４１、Ｌ３４２、Ｓ３４３、Ｉ３４４、Ｍ３４５、Ｓ３４７、Ｍ３４８、Ｋ３４９、Ｌ３５２、Ｌ３５３、Ｄ３５５、Ｅ３５９、Ｉ３６１、およびＮ３６３からなる群から選択された１つ以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項８】
Ｌ３５４Ｉおよび／またはＮ３５６Ｅのアミノ酸残基の置換を含み、
さらに、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｄ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｄ３５５Ｋ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ、およびＮ３６３Ｇからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項７に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項９】
Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、およびＩ３６１Ｔのアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項７に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１０】
さらに、Ｔ３４１Ａ、Ｔ３４１Ｃ、Ｔ３４１Ｄ、Ｔ３４１Ｇ、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、およびＮ３６３Ｇからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする請求項９に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１１】
次のいずれかのアミノ酸残基置換群を含むことを特徴とする請求項１０に記載のＰＨ２０変異体またはその断片:
(a) T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(b) L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D,およびI361T;
(c) M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, I361T, およびN363G;
(d) T341G, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(e) T341A, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(f) T341C, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(g) T341D, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T;
(h) I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T; および
(i) S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, およびI361T。
【請求項１２】
さらに、Ｃ−末端および／またはＮ−末端での一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１３】
Ｎ−末端のＭ１〜Ｐ４２からなる群から選択されたアミノ酸残基の前で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１２に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１４】
Ｎ−末端のＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１、またはＰ４２のアミノ酸残基の前で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１３に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１５】
Ｃ−末端のＶ４５５〜Ｌ５０９からなる群から選択されたアミノ酸残基の後で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１２に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１６】
Ｃ−末端のＶ４５５〜Ｓ４９０からなる群から選択されたアミノ酸残基の後で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１５に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１７】
Ｃ−末端のＶ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８またはＳ４９０のアミノ酸残基の後で切断され、一部のアミノ酸残基が欠失していることを特徴とする請求項１６に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１８】
Ｎ−末端に、配列番号３のMATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAのアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン由来のシグナルペプチド、配列番号４のMKWVTFISLLFLFSSAYSのアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミン由来のシグナルペプチド、または配列番号５のMAAHLLPICALFLTLLDMAQGのアミノ酸配列を有するヒトＨｙａｌ１由来のシグナルペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項１９】
配列番号６０〜１１５のアミノ酸配列からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項２０】
配列番号９９のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１９に記載のＰＨ２０変異体またはその断片。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片を含む癌治療用組成物。
【請求項２２】
他の抗癌剤との併用治療の用途に用いられることを特徴とする請求項２１に記載の癌治療用組成物。
【請求項２３】
前記他の抗癌剤は、免疫抗癌剤であることを特徴とする請求項２２に記載の癌治療用組成物。
【請求項２４】
前記免疫抗癌剤は、免疫チェックポイント阻害剤(immune  checkpoint inhibitor)であることを特徴とする請求項２３に記載の癌治療用組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＰＨ２０変異体またはその断片をコードする核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【国際調査報告】
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