(57)【要約】  本開示は、例えば、ＣＤ３に結合する抗原結合タンパク質、少なくとも１種の緩衝剤、少なくとも１種の糖類及び少なくとも１種の界面活性剤を含む低ｐＨ製剤を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合タンパク質、少なくとも１種の緩衝剤、少なくとも１種の界面活性剤、及び少なくとも１種の糖類を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物のｐＨが、３．５〜５の範囲である、医薬組成物。
【請求項２】
前記抗原結合タンパク質が、抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、ＣＤ３に結合するヘテロ二量体抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ヘテロ二量体抗体が、
ａ）第１のＦｃドメイン及び
（ｉ）配列番号１５に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号１６に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号１７に記載されるｖｌＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、並びに
（ｉｉ）配列番号１１に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号１２に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号１３に記載されるｖｈＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む第１の単量体であって、前記ｓｃＦｖが、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合される第１の単量体；
ｂ）
ｉ）配列番号６５に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号６６に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号６７に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３８重鎖可変ドメイン、並びに
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む第２の単量体；並びに
ｃ）定常ドメイン及び配列番号６９に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号７０に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号７１に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗ＣＤ３  ｓｃＦｖが、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗ＣＤ３  ｓｃＦｖが、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが、配列番号６８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが、配列番号６８に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインが、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインが、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記第１の単量体が、配列番号３３５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記第１の単量体が、配列番号３３５に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記第２の単量体が、配列番号３３７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記第２の単量体が、配列番号３３７に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記軽鎖が、配列番号３３６に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記軽鎖が、配列番号３３６に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ヘテロ二量体抗体が、
ａ）
１）第１の可変重鎖ドメイン；
２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖
；並びに
３）ヒトＣＤ３に結合し、且つ
（ｉ）配列番号３８７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３８８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号１８９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、
（ｉｉ）ｓｃＦｖリンカー、並びに
（ｉｉｉ）配列番号３８３に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３８４に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３８５に記載されるｖｈＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖであって、前記ｓｃＦｖが、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端の間でドメインリンカーを使用して共有結合されるｓｃＦｖを含む第１の重鎖を含む第１の単量体；
ｂ）第２の可変重鎖ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の重鎖を含む第２の単量体；並びに
ｃ）可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を含み；
前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインがヒトＳＴＥＡＰ１に結合し、前記第２の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインがヒトＳＴＥＡＰ１に結合し、且つ
（ｉ）前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインが、配列番号３６０に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６１又は３６３に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３６２に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲを含み、且つ前記可変軽鎖ドメインが、配列番号３５７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３５８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３５９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲを含むか；
又は
（ｉｉ）前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインが、配列番号３６８に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６９に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３７０に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲを含み、且つ前記可変軽鎖ドメインが、配列番号３７１に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３７２に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３７３に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインが、配列番号３７７又は３７９と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインが、配列番号３７７又は３７９のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記可変軽鎖ドメインが、配列番号３７８と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記可変軽鎖ドメインが、配列番号３７８のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインが、配列番号３８０と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインが、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記可変軽鎖ドメインが、配列番号３８１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２２又は請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記可変軽鎖ドメインが、配列番号３８１のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ｓｃＦｖが、配列番号３８２及び配列番号３８３の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記ｓｃＦｖリンカーが、配列番号３９１を含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ｓｃＦｖが、配列番号３９０の配列を含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ａ）前記第１の単量体が、配列番号３６６又は配列番号３６７の配列を含み、前記第２の単量体が、配列番号３６５の配列を含み、且つ前記共通の軽鎖が、配列番号３６４の配列を含むか；又は
ｂ）前記第１の単量体が、配列番号３７６の配列を含み、前記第２の単量体が、配列番号３７５の配列を含み、且つ前記共通の軽鎖が、配列番号３７４の配列を含む、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記少なくとも１種の緩衝剤が、酢酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸塩又はこれらの組合せからなる群から選択される酸である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
【請求項３１】
前記少なくとも１種の緩衝剤が、５〜２００ｍＭの濃度範囲で存在する、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記少なくとも１種の緩衝剤が、１０〜５０ｍＭの濃度範囲で存在する、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１種の糖類が、単糖、二糖、環状多糖、糖アルコール、線状分岐デキストラン、及び線状非分岐デキストランからなる群から選択される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記二糖が、スクロース、トレハロース、マンニトール、及びソルビトール又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記糖アルコールが、ソルビトールである、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記少なくとも１種の糖類が、１〜１５％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記少なくとも１種の糖類が、５〜１２％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記少なくとも１種の糖類が、７〜１２％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記少なくとも１種の糖類が、９〜１２％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも１種の界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロクサマー１８８、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、トリトンＸ−１００、ポリオキシエチレン３、及びＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記少なくとも１種の界面活性剤が、０．００１〜０．５％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記少なくとも１種の界面活性剤が、０．００４〜０．５％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記少なくとも１種の界面活性剤が、０．００１〜０．０１％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記少なくとも１種の界面活性剤が、０．００４〜０．０１％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記組成物のｐＨが、４．０〜５．０の範囲である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記組成物のｐＨが、４．２である、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
１５０〜５００ｍＯｓｍの範囲のモル浸透圧濃度を有する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
ポリオール及びアミノ酸からなる群から選択される賦形剤をさらに含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記賦形剤が、０．１〜１５％（ｗ／Ｖ）の濃度範囲で存在する、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記組成物が、１０ｍＭグルタミン酸塩、９％（ｗ／Ｖ）スクロース及び０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０を含み、且つ液体医薬組成物のｐＨが、４．２である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記ヘテロ二量体抗体が、０．１〜８ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在する、請求項４〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記ヘテロ二量体抗体が、０．１〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で存在する、請求項４〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記ヘテロ二量体抗体が、５０μｇ〜２００ｍｇの範囲の量で存在する、請求項４〜５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記ヘテロ二量体抗体が、１ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜１６及び３０〜５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記ヘテロ二量体抗体が、５ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜１６及び３０〜５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記ヘテロ二量体抗体が、２０ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜１６及び３０〜５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記ヘテロ二量体抗体が、１０ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜３及び１７〜５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
凍結乾燥組成物である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
液体組成物である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
再構成された凍結乾燥組成物である、請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の前記組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６０】
前記癌が、多発性骨髄腫である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌が、前立腺癌である、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６２８，２６７号明細書及び２０１９年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／７９９，５７７号明細書の優先権の利益を主張し、これら開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
参照による援用
本出願は、参照により２０１５年１１月２５日に出願された国際公開第２０１６／０８６１９６号パンフレット；２０１５年１１月２５日に出願された米国特許出願公開第２０１６０２１５０６３号明細書；２０１６年１１月２３日に出願された国際公開第２０１７／０９１６５６号パンフレット；及び２０１５年３月３０日に出願された米国特許第９，８２２，１８６号明細書を援用し、これらは、それらの全体、特にその中の図面、説明文及び請求項に関して参照により本明細書に明示的に援用される。
【０００３】
本明細書と同時に提出されたコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照によって援用され、当該表は、以下のとおりに特定される：２０１９年２月５日に作成された７５６，６４６バイトの「５２５８８Ｐ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と命名されたＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質系医薬品は、（前）臨床開発において及び市販製品として最も成長著しい治療薬に含まれる。低分子化学薬剤と比較して、タンパク質医薬品は、比較的低い濃度で高い特異性及び活性を有し、通常、種々の癌、自己免疫疾患及び代謝障害などの大きい影響のある疾患の療法を提供する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ；３２（７）：３７２−８０，Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．１９９９  Ａｕｇ  ２０；１８５（２）：１２９−８８）。
【０００５】
商業規模での精製プロセスの進歩により、現在、組換え体タンパク質などのタンパク質系医薬品は、最初の製造時に高い純度で得ることができる。しかしながら、タンパク質は、わずかに安定であるにすぎず、化学的にも物理的にも非常に劣化しやすい。化学的劣化は、脱アミド、酸化、新たなジスルフィド架橋の切断若しくは形成、加水分解、異性化又は脱グリコシルなどの共有結合を伴う修飾を指す。物理的劣化には、タンパク質のアンフォールディング、表面への望ましくない吸着及び凝集が含まれる。これらの物理的及び化学的な不安定性への対処は、タンパク質医薬品の開発において最も難しい課題の１つである（Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ  ２００３，ｐｐ．１３２５−１３３６、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ；３２（７）：３７２−８０）。
【０００６】
タンパク質凝集は、タンパク質の物理的不安定性の主要な現象に相当するものであり、溶媒と疎水性タンパク質残基との間の熱力学的に不利な相互作用を最小化する固有の傾向に起因して生じる。タンパク質凝集は、リフォールディング、精製、滅菌、輸送及び保管のプロセス中に日常的に起こるため、特に問題がある。凝集は、タンパク質の天然状態が熱力学的に極めて有利な（例えば、中性ｐＨ及び３７℃）溶液条件下であっても、ストレスの不在下であっても生じる場合がある（Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ  ２００３，ｐｐ．１３２５−１３３６、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ；３２（７）：３７２−８０，Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．１９９９  Ａｕｇ  ２０；１８５（２）：１２９−８８，Ｍａｈｌｅｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００９  Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９−３４．）。
【０００７】
また、Ｆｃ分子などの半減期延長様式を含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの半減期延長抗体コンストラクトは、タンパク質凝集及び／又は他の劣化現象から保護されるべきである。タンパク質凝集が問題となるのは、治療用タンパク質の生物活性を弱めることがあるためである。さらに、タンパク質の凝集は、薬物製品の望ましくない外観をもたらし、また最終産物から凝集体を除去するために必要とされる綿密な精製工程により産物収率を低下させる。より最近では、凝集したタンパク質の存在により（ヒト化タンパク質又は完全なヒトタンパク質であっても）、患者は、活性タンパク質単量体に対する免疫反応を起こすことになり、その結果、中和抗体及び薬物耐性の形成又は他の有害な副作用がもたらされるというリスクが顕著に増大する可能性があるといった懸念及びエビデンスも増加している（Ｍａｈｌｅｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００９  Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９−３４）。
【０００８】
概して、文献において、様々な機構によってタンパク質凝集を最小化するいくつかの試みが報告されている。タンパク質を、それらの一次構造を改変して、それにより内部の疎水性を増大させ、且つ外部の疎水性を低減することによって安定化し、こうして凝集体形成及び他の化学的変化から保護することができる。しかしながら、タンパク質の遺伝子操作は、機能性の喪失及び／又は免疫原性の増大をもたらす場合がある。別の手法は、凝集体の解離（「脱凝集」と呼ばれる）に着目し、温度、圧力、ｐＨ及び塩などの様々な機構を使用することによって機能的な天然単量体を回復させる。現時点では、タンパク質凝集体は、主に下流処理のプロセシング工程において不純物として除去される。しかしながら、高分子量（ＨＭＷ）のレベルが高い場合、顕著な量のＨＭＷ除去により、実質的な収率損失がもたらされるだけでなく、堅牢な下流プロセスの設計が困難なものとなる（Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ  ２００３，ｐｐ．１３２５−１３３６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生物学及びバイオテクノロジー用途におけるタンパク質の安定性及び活性の維持は、深刻な課題を提起する。治療用タンパク質の安定化を増強し、製剤、充填、輸送、保管及び投与中の凝集並びに変性又は劣化を低減することにより、機能喪失及び有害な免疫原性反応を防止する最適化された医薬組成物が当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、本明細書では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、少なくとも１種の緩衝剤、少なくとも１種の界面活性剤及び少なくとも１種の糖類を含む医薬組成物が記載され、その医薬組成物のｐＨは、３．５〜５の範囲である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ３に結合する二重特異性抗体などの二重特異性抗体である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３に結合するヘテロ二量体抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ａ）第１のＦｃドメイン並びに（ｉ）配列番号１５に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号１６に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号１７に記載されるｖｌＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、並びに（ｉｉ）配列番号１１に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号１２に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号１３に記載されるｖｈＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む第１の単量体であって、前記ｓｃＦｖが、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合される第１の単量体；ｂ）ｉ）配列番号６５に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号６６に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号６７に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３８重鎖可変ドメイン、並びにｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む第２の単量体；並びにｃ）定常ドメイン並びに配列番号６９に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号７０に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号７１に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインを含む軽鎖を含み、医薬組成物のｐＨは、３．５〜５の範囲である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインは、配列番号６８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインは、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１の単量体は、配列番号３３５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第２の単量体は、配列番号３３７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３３６に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１９】
様々な態様において、抗原結合タンパク質は、ａ）１）第１の可変重鎖ドメイン；２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；並びに３）ヒトＣＤ３に結合し、且つ（ｉ）配列番号３８７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３８８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３８９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、（ｉｉ）ｓｃＦｖリンカー、並びに（ｉｉｉ）配列番号３８３に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３８４に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３８５に記載されるｖｈＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖであって；前記ｓｃＦｖが、ドメインリンカーを使用して前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端の間で共有結合されるｓｃＦｖを含む第１の重鎖を含む第１の単量体を含むヘテロ二量体抗体である。ヘテロ二量体抗体はさらに、ｂ）第２の可変重鎖ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の重鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を含む。第１の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、ヒトＳＴＥＡＰ１に結合し、且つ第２の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、ヒトＳＴＥＡＰ１に結合する。第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３６０に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６１又は３６３に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３６２に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲを含み、且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号３５７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３５８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３５９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲを含む。或いは、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３６８に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６９に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３７０に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲを含み、且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号３７１に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３７２に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３７３に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲを含む。様々な実施形態において、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３７７又は３７９と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一又は１００％同一）なアミノ酸配列を含み、且つ／又は可変軽鎖ドメインは、配列番号３７８と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。或いは、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３８０と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一又は１００％同一）なアミノ酸配列を含み、且つ／又は可変軽鎖ドメインは、配列番号３８１と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖは任意選択により、配列番号３８２及び配列番号３８３の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含む。ｓｃＦｖリンカーは任意選択により、配列番号３９１を含む。様々な態様において、ｓｃＦｖは、配列番号３９０の配列を含む。様々な態様において、ａ）第１の単量体は、配列番号３６６又は配列番号３６７の配列を含み、第２の単量体は、配列番号３６５の配列を含み、且つ共通の軽鎖は、配列番号３６４の配列を含むか；又はｂ）第１の単量体は、配列番号３７６の配列を含み、第２の単量体は、配列番号３７５の配列を含み、且つ共通の軽鎖は、配列番号３７４の配列を含む。
【００２０】
本開示の医薬組成物は、少なくとも１種の緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、酢酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸塩又はこれらの組合せからなる群から選択される酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の緩衝剤は、約５ｍＭ〜約２００ｍＭ（又は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ）の範囲の濃度で組成物中に存在する。
【００２１】
本開示の医薬組成物は、少なくとも１種の糖類を含む。いくつかの実施形態では、糖類は、単糖、二糖、環状多糖、糖アルコール、線状分岐デキストラン、及び線状非分岐デキストランからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、糖類は、糖アルコール（例えば、ソルビトール）である。いくつかの実施形態では、糖類は、スクロース、トレハロース、マンニトール、及びソルビトール又はこれらの組合せからなる群から選択される二糖である。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の糖類は、約１〜約１５％（ｗ／Ｖ）（又は約９〜約１２％（ｗ／Ｖ）又は約５％〜約１２％（ｗ／Ｖ）又は約７％〜約１２％（ｗ／Ｖ））の範囲の濃度で組成物中に存在する。
【００２２】
本開示の医薬組成物は、少なくとも１種の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロクサマー１８８、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、トリトンＸ−１００、ポリオキシエチレン３、及びＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、又はこれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤は、０．００４〜約０．５％（ｗ／Ｖ）（又は約０．００１〜約０．０１％（ｗ／Ｖ）、又は約０．００１％〜約０．５％（ｗ／Ｖ）又は約０．００４％〜約０．０１％（ｗ／Ｖ））の範囲の濃度で組成物中に存在する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは、４．０〜５．０の範囲である。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは、４．２である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組成物は、約１５０〜約５００ｍＯｓｍの範囲のモル浸透圧濃度を有する。
【００２５】
本開示の医薬組成物は任意選択によりさらに、ポリオール及びアミノ酸からなる群から選択される賦形剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、賦形剤は、約０．１〜約１５％（ｗ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１０ｍＭグルタミン酸塩、９％（ｗ／Ｖ）スクロース及び０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０を含み、且つ液体医薬組成物のｐＨは、４．２である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ又は２０ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、約５０μｇ〜約２００ｍｇの範囲の量で組成物中に存在する。
【００２７】
本開示の医薬組成物は、凍結乾燥組成物又は液体組成物であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥組成物又は再構成された凍結乾燥組成物である。
【００２８】
別の態様では、本明細書では、本開示の組成物を必要とする対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法が記載される。いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌である。
【００２９】
本明細書中の様々な実施形態は、様々な状況下で「含む」という語を使用して提示される一方、関連する実施形態はまた、「〜からなる」又は「本質的に〜からなる」という語を使用して記載され得ると理解されるべきである。本開示は、ある特徴を「含む」と記載された実施形態が、その特徴「からなる」実施形態を含むことを意図する。用語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を指し、例えば、「免疫グロブリン分子」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を表すと理解されることに留意されたい。そのため、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用され得る。
【００３０】
値の範囲を記載するとき、記載されている特徴は、その範囲内に見出される個々の値であり得ることもまた理解されるべきである。例えば、「約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ」は、限定されないが、ｐＨ４、４．２、４．６、５．１、５．５など、及びそのような値の間にある任意の値であり得る。さらに、「約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ」は、目的の製剤のｐＨが、保管中にｐＨ４〜ｐＨ６の範囲において２ｐＨ単位で変動するという意味で解釈されるべきではなく、むしろ、溶液のｐＨについてその範囲内で値を選んでもよく、ｐＨはそのｐＨ付近で緩衝されたままであることを意味する。いくつかの実施形態では、用語「約」が使用される場合、列挙された数に対してその列挙された数の５％、１０％、１５％又はそれ以上を足すか又は引くことを意味する。意図される実際の変動は、文脈から決定できる。
【００３１】
本明細書に記載される範囲のいずれかにおいて、範囲の端点は、その範囲に含まれる。しかしながら、この説明はまた、小さい方の端点及び／又は大きい方の端点が除外された同じ範囲も意図する。本発明の追加の特徴及び変形形態は、図面及び詳細な説明を含む本出願の全体から当業者には明らかであろうが、そのような特徴は全て本発明の態様として意図される。同様に、本明細書に記載される本発明の特徴を組み換えて、特徴の組合せが本発明の態様又は実施形態として上記に具体的に記載されているかどうかにかかわらず、本発明の態様としても意図される追加の実施形態にすることができる。また、本発明にとって不可欠なものとして本明細書に記載されるそのような限定のみが、そのようにみなされるべきであり；本明細書に不可欠なものとして記載されていない限定を欠く本発明の変形形態は、本発明の態様として意図される。
【００３２】
本明細書に引用される全ての参考文献は、参照により本明細書によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ヘテロ二量体抗体のいくつかの形式を示す。「ボトルオープナー」形式の２つの形態が示され、１つはｓｃＦｖを含む抗ＣＤ３抗原結合ドメイン及びＦａｂ（抗原結合ドメインの例として）を含む抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有し、１つはこれらの逆を有する。ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ（又は「ＸｍＡｂ２＋１形式」）及び中央−Ｆｖ形式が全て示される。加えて、１つの単量体が単にＦｃドメインを含む「１アーム」形式が示され、１アーム中央−ｓｃＦｖ及び１アーム中央−Ｆｖの両方が示される。二重ｓｃＦｖ形式もまた示される。
【図１Ｂ】同上。
【図２】可変重鎖及び軽鎖ドメイン（下線のＣＤＲ）を含む「高−中間＃１」の抗ＣＤ３＿Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７コンストラクト、及び個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、並びに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖコンストラクトの配列を示す。図面で示される配列全てに当てはまることであるが、この荷電リンカーは、必要に応じて非荷電リンカー又は異なる荷電リンカーに置き換えられてもよい。
【図３】中間ＣＤ３８：可変重鎖及び軽鎖ドメイン（下線のＣＤＲ）を含むＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１．２４コンストラクト、及び個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、並びに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖコンストラクトの配列を示す。
【図４】低ＣＤ３８：可変重鎖及び軽鎖ドメイン（下線のＣＤＲ）を含むＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１コンストラクト、及び個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、並びに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖコンストラクトの配列を示す。
【図５】ＸＥＮＰ１８９７１の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。
【図６】ＸＥＮＰ１８９６９の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。
【図７】ヒトＣＤ３εの配列を示す（配列番号１３０）。
【図８】ヒトＣＤ３８タンパク質の全長（配列番号１３１）及び細胞外ドメイン（ＥＣＤ；配列番号１３２）を示す。
【図９Ａ】ヘテロ二量体化変異体セット（非対称及びｐＩ変異体を含む）の有用な対を示す。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図９Ｄ】同上。
【図９Ｅ】同上。
【図１０】等配電子変異体の抗体定常領域及びそれらの対応する置換のリストを示す。ｐＩ＿（−）は、ｐＩの低い変異体を示し、ｐＩ＿（＋）は、ｐＩの高い変異体を示す。これらは、任意選択的且つ独立して本発明のヘテロ二量体化変異体（及び同様に本明細書で概説されるとおりの他の変異体型）と組み合わせることができる。
【図１１】ＦｃγＲ結合を切断する有用な切断変異体を示す（「ノックアウト」又は「ＫＯ」変異体と称される場合がある）。
【図１２】本開示の抗体の２つの実施形態を示す。
【図１３Ａ】成分として１つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを上げるか又は下げる際に用途を見出すいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。単一の電荷を有する単一の先行技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（８）：９８９−９９５（１９９３）から「Ｗｈｉｔｌｏｗ」として参照される。このリンカーはｓｃＦｖの凝集を減少させ、且つタンパク分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。
【図１３Ｂ】同上。
【図１４】ヘテロ二量体の収量（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸによって決定される）及び熱安定性（ＤＳＣによって決定される）とともに操作されたヘテロ二量体−非対称Ｆｃ変異体のリストを示す。決定されなかった熱安定性は、「ｎ．ｄ．」によって示される。
【図１５Ａ】安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。置換は、Ｈ１＿Ｌ１．４  ｓｃＦｖ配列に対してなされる。アミノ酸付番は、Ｋａｂａｔ付番である。
【図１５Ｂ】同上。
【図１６Ａ】安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組合せに関して、４つの配列が列挙される：（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独。
【図１６Ｂ】同上。
【図１７】ＸＥＮＰ１８９７１の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。
【図１８】ＸＥＮＰ１８９６９の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。
【図１９】実施形態の可能な組合せの行列を示す。「Ａ」は、参照されるＣＤ３配列のＣＤＲを、左側のＣＤ３８コンストラクトのＣＤＲと組み合わせることができることを意味する。すなわち、例えば、左の一番上のセルについては、可変重鎖ＣＤ３Ｈ１．３０配列のｖｈＣＤＲ及びＣＤ３  Ｌ１．４７配列の可変軽鎖のｖｌＣＤＲを、ＣＤ３８  ＯＫＴ１０  Ｈ１．７７配列のｖｈＣＤＲ及びＯＫＴ１０Ｌ１．２４配列のｖｌＣＤＲと組合せることができる。「Ｂ」は、ＣＤ３コンストラクトに由来するＣＤＲを、ＣＤ３８コンストラクトに由来する可変重鎖及び軽鎖ドメインと組み合わせることができることを意味する。すなわち、例えば、左の一番上のセルについては、可変重鎖ＣＤ３Ｈ１．３０配列のｖｈＣＤＲ及びＣＤ３  Ｌ１．４７配列の可変軽鎖のｖｌＣＤＲを、可変重鎖ドメインＣＤ３８  ＯＫＴ１０  Ｈ１．７７配列及びＯＫＴ１０Ｌ１．２４配列と組み合わせることができる。「Ｃ」は、ＣＤ３配列に由来する可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインが、ＣＤ３８配列のＣＤＲとともに使用されるように反転される。「Ｄ」は、各々に由来する可変重鎖及び可変軽鎖の両方が組み合わせられる場合である。「Ｅ」は、ＣＤ３のｓｃＦｖがＣＤ３８抗原結合ドメインコンストラクトのＣＤＲとともに使用される場合であり、「Ｆ」は、ＣＤ３のｓｃＦｖがＣＤ３８抗原結合ドメインの可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインとともに使用される場合である。
【図２０】抗体Ａとしても本明細書で参照されるＸｍＡｂ１８９６８の配列を示し、ＣＤＲに下線が引かれている。
【図２１−１】様々なＣＤＲ配列、可変領域配列、重鎖及び軽鎖配列、ｓｃＦｖ配列、骨格配列などを関連付ける表であり、本出願に添付されている配列表に記載される配列識別子を伴う。記載されたいくつかのボトルオープナー形式の骨格（配列番号３４７〜３５４）に関して、配列は、Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖ並びにＦａｂ側のｖｈ及びｖｌ）を伴わずに提供される。当業者によって認識されることになり且つ下に概説されるとおり、これらの配列は、本明細書で概説されるいずれかのｖｈとｖｌの対とともに使用することができ、一方の単量体はｓｃＦｖ（任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）を含み、他方の単量体はＦａｂ配列（例えば、「Ｆａｂ側の重鎖」に結合されたｖｈ及び「定常軽鎖」に結合されたｖｌ）を含む。ｓｃＦｖは、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ３８であってもよく、Ｆａｂが他方である。（「Ｆａｂ」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含む部分を指す。）すなわち、例えば、ＣＤ３及びＣＤ３８について本明細書で概説されるいずれかのＦｖ配列を、任意の組合せでこれらの骨格に組み込むことができる。
【図２１−２】同上。
【図２１−３】同上。
【図２１−４】同上。
【図２１−５】同上。
【図２１−６】同上。
【図２１−７】同上。
【図２１−８】同上。
【図２１−９】同上。
【図２１−１０】同上。
【図２１−１１】同上。
【図２１−１２】同上。
【図２１−１３】同上。
【図２１−１４】同上。
【図２１−１５】同上。
【図２１−１６】同上。
【図２１−１７】同上。
【図２１−１８】同上。
【図２１−１９】同上。
【図２１−２０】同上。
【図２１−２１】同上。
【図２１−２２】同上。
【図２１−２３】同上。
【図２２Ａ】ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって決定される、製剤Ａ（図２２Ａ）及び製剤Ｂ（図２２Ｂ）において製剤化される場合の抗体Ａのメインピークの減少を示す。
【図２２Ｂ】同上。
【図２３】ＳＥ−ＵＨＰＬＣによって決定される、製剤Ｃにおいて製剤化される場合の抗体Ａのメインピークの減少を示す。
【図２４Ａ】ＣＥ−ＨＰＬＣによって決定される、製剤Ａ（図２４Ａ）及び製剤Ｂ（図２４Ｂ）において製剤化される場合の抗体Ａのメインピークの減少を示す。
【図２４Ｂ】同上。
【図２５】ＣＥ−ＨＰＬＣによって決定される、製剤Ｃにおいて製剤化される場合の抗体Ａのメインピークの減少を示す。
【図２６】ｒＣＥによって決定される、製剤Ａにおいて製剤化される場合の−３０℃での抗体Ａのメインピークの減少を示す。
【図２７】ｒＣＥによって決定される、製剤Ｂにおいて製剤化される場合の４０℃での抗体Ａのメインピークの減少を示す。
【図２８】ｒＣＥによって決定される、製剤Ｃにおいて製剤化される場合の抗体Ａのメインピークの減少を示す。
【図２９】ＭＡＭによって決定される、製剤Ｂ及びＣにおいて製剤化される場合の３ヶ月間の４℃、２℃、及び４０℃での抗体Ａの脱アミドのパーセントを示す。
【図３０−１】ＭＡＭによって決定される、製剤Ｄにおいて製剤化される場合の０週間、２週間及び４週間の４０℃での抗体Ａの脱アミドのパーセントを示す。
【図３０−２】同上。
【図３１】ＭＡＭによって決定される、製剤Ｂ及びＣにおいて製剤化される場合の１ヶ月間の４０℃での抗体Ａの脱アミドのパーセントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示は、ＣＤ３に結合する抗原結合タンパク質を含む低ｐＨ製剤を記載する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３に結合する二重特異性抗体）などの抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、悪性細胞をＴ細胞と一過的に結びつけ、それにより結合された悪性細胞のＴ細胞に媒介される死滅を誘導するために、そのような様式でＣＤ３とＣＤ３８を共結合させるヘテロ二量体抗体である。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３及びＳＴＥＡＰ１に共結合するヘテロ二量体抗体である。
【００３６】
特定のタンパク質系医薬品は、長期間にわたって液体製剤中で安定ではなく、特に、４℃以上の冷蔵温度で安定ではない。本発明の基盤となる普遍的なコンセプトは、本発明による抗原結合タンパク質を含む液体医薬組成物のコロイド安定性が低ｐＨで向上するという発見である。
【００３７】
製剤の様々な態様は、以下に記載される。節見出しの使用は単に読み物の便宜のためであり、それ自体を限定することは意図されない。本明細書全体は、統一された開示として見なされることが意図されており、本明細書に記載される特徴の全ての組合せが企図されることを理解すべきである。
【００３８】
一態様では、本明細書では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、少なくとも１種の緩衝剤、少なくとも１種の界面活性剤及び少なくとも１種の糖類を含む医薬組成物が記載され、その医薬組成物のｐＨは、３．５〜５の範囲である。
【００３９】
緩衝剤
本発明の医薬組成物は、酢酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸塩、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、グリシン、トリス、グルタミン酸塩、及びこれらの組合せからなる群から任意選択的に選択され得る緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、酢酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸塩及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の緩衝剤を含む。
【００４０】
緩衝剤は、製剤においてｐＨを制御するために利用される場合が多い。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約３．５〜５、又は約４〜５、又は約４．２の製剤のｐＨを維持する濃度で加えられる。製剤に対するｐＨの影響は、加速安定性試験及び熱量測定スクリーニング試験などのいくつかの手法のうちのいずれか１つ以上を使用して特徴付けられ得る（Ｒｅｍｍｅｌｅ  Ｒ．Ｌ．Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８（１６）：５２４１−７（１９９９））。
【００４１】
有機酸、リン酸塩及びトリスは、タンパク質製剤中の好適な緩衝剤である（表１）。緩衝剤種の緩衝能はｐＨがｐＫａと等しいときに最大になり、ｐＨがこの値から増加又は低下すると低下する。緩衝能の９０パーセントはそのｐＫａの１ｐＨ単位内に存在する。緩衝能はまた、緩衝剤濃度の増加とともに比例して増加する。
【００４２】
緩衝剤を選択する際、通常、いくつかの要因が検討される。例えば、緩衝剤種及びその濃度は、そのｐＫａ及び所望の製剤ｐＨに基づいて定義されるべきである。緩衝剤が、タンパク質薬物、他の製剤賦形剤と相溶性であり、且ついずれかの分解反応を触媒しないことを保証することもまた重要である。近年、クエン酸塩及びコハク酸塩などのポリアニオンのカルボン酸塩緩衝剤が、タンパク質の側鎖残基と共有結合性の付加体を形成することが示されている。検討されることになる第３の態様は、緩衝剤が誘導し得る刺痛及び刺激の感覚である。例えば、クエン酸塩は、注射時に刺痛を引き起こすことが知られる（Ｌａｕｒｓｅｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，９８（２）：２１８−２１（２００６））。製剤が投与時に血液に迅速に希釈されるＩＶ経路によって投与されるときよりも、薬物溶液が比較的長い期間当該部位に残存するＳＣ又はＩＭ経路を介して投与される薬物にとって、刺痛及び刺激の可能性は、より大きい。直接的なＩＶ注入によって投与される製剤に関して、緩衝剤（及び任意の他の製剤成分）の総量がモニターされる必要がある。例えば、リン酸カリウム緩衝剤の形態で投与されるカリウムイオンは、患者において心血管作用を誘導する可能性があることが報告されている（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．，７３（２）：２８３−９０（２００６））。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
製剤中に存在する緩衝系は、生理的に適合性であり且つ所望のｐＨを維持するものから選択される。
【００４５】
緩衝剤は、既定のレベルで製剤のｐＨを維持するのに好適な任意の量で存在し得る。緩衝剤は、約０．１ｍＭと約１０００ｍＭ（１Ｍ）の間、又は約５ｍＭと約２００ｍＭの間、又は約５ｍＭと約１００ｍＭの間、又は約１０ｍＭと約５０ｍＭの間の濃度で存在し得る。好適な緩衝剤濃度は、約２００ｍＭ以下の濃度を包含する。いくつかの実施形態では、製剤中の緩衝剤は、約１９０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１００ｍＭ、約８０ｍＭ、約７０ｍＭ、約６０ｍＭ、約５０ｍＭ、約４０ｍＭ、約３０ｍＭ、約２０ｍＭ、約１０ｍＭ又は約５ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、緩衝剤の濃度は、少なくとも０．１、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、７００、又は９００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝剤の濃度は、１、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０ｍＭと１００ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、緩衝剤の濃度は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、又は４０ｍＭと５０ｍＭの間である。いくつかの実施形態では、緩衝剤の濃度は、約１０ｍＭである。
【００４６】
本明細書で述べられるとおりの製剤を緩衝するために使用される他の例示的なｐＨ緩衝剤としては、グリシン、グルタミン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、酢酸塩、及びアスパラギン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。ヒスチジン及びグルタミン酸などのアミノ酸もまた、緩衝剤として使用され得る。
【００４７】
界面活性剤
本明細書に記載される医薬組成物は、少なくとも１種の界面活性剤を含む。界面活性剤は、表面誘起分解を防ぐために、タンパク質製剤中で一般的に使用される。界面活性剤は、界面位置に関してタンパク質に打ち勝つ能力を有する両親媒性の分子である。界面活性剤分子の疎水性部分は界面位置（例えば、空気／液体）を占めるのに対し、分子の親水性部分はバルク溶媒の方向に配向された状態を保つ。十分な濃度（典型的には、洗剤の臨界ミセル濃度付近）において、界面活性剤分子の表面層は、タンパク質分子が界面において吸着するのを防ぐ役割を果たす。これにより、表面誘起分解は最小化される。界面活性剤としては、例えば、ソルビタンポリエトキシレートの脂肪酸エステル、すなわち、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）を参照のこと）が挙げられる。２つは、分子Ｃ−１２及びＣ−１８にそれぞれ疎水性特性を付与する脂肪族鎖の長さのみが異なる。したがって、ポリソルベート−８０は、ポリソルベート−２０よりも界面活性が高く、且つより低い臨界ミセル濃度を有する。界面活性剤ポロクサマー１８８も、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（登録商標）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、及びＯｖｉｄｒｅｌ（登録商標）などのいくつかの市販液体製品中に使用されてきた。
【００４８】
洗剤はまた、タンパク質の熱力学的配座安定性にも影響を及ぼし得る。ここでも、所定の賦形剤の効果は、タンパク質特異的である。例えば、ポリソルベートは、一部のタンパク質の安定性を低下させ、その他の安定性を向上させることが示されている。洗剤のタンパク質不安定化は、部分的又は全体的にアンフォールドしたタンパク質状態との特異的な結合に関与し得る洗剤分子の疎水性尾部の点で理にかなっている。これらの種類の相互作用は、より拡張したタンパク質状態への配座平衡の移行を引き起こし得る（すなわち、結合するポリソルベートを補完してタンパク質分子の疎水性部分の露出を増加させる）。或いは、タンパク質の天然状態がいくつかの疎水性表面を示す場合、天然状態に結合する洗剤はその立体配座を安定化させ得る。
【００４９】
ポリソルベートの別の態様は、これらが本質的に酸化分解を起こしやすい点である。これらは、タンパク質残基側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量の過酸化物を原材料として含有する場合が多い。安定剤の添加から生じる酸化損傷の可能性のために、最低有効濃度の賦形剤が製剤中に使用されるべきであるという点が強調される。界面活性剤の場合、所定のタンパク質の有効濃度は、安定化機構によって決まる。界面活性剤の安定化機構が表面変性の防止に関連する場合、有効濃度は洗剤の臨界ミセル濃度付近になることが想定されている。反対に、安定化機構が特定のタンパク質−洗剤相互作用と関連する場合、有効な界面活性剤濃度は、タンパク質濃度及び相互作用の化学量論に関連付けられることになる（Ｒａｎｄｏｌｐｈ  Ｔ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：１５９−７５（２００２））。
【００５０】
また、凍結及び乾燥中の表面関連凝集現象を防止するために、界面活性剤を適量で添加してもよい（Ｃｈａｎｇ，Ｂ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：１３２５，（１９９６））。例示的な界面活性剤としては、天然に存在するアミノ酸に由来する界面活性剤を含む、アニオン性、カチオン性、非イオン性、双性イオン性、及び両性界面活性剤が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウム、ケノデオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、並びにグリコデオキシコール酸ナトリウム塩が挙げられるがこれらに限定されない。カチオン性界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム一水和物、及び臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムが挙げられるがこれらに限定されない。双性イオン性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３−１０、及びＳＢ３−１２が挙げられるがこれらに限定されない。非イオン性界面活性剤としては、ジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、及びＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０が挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態では、界面活性剤としては、ラウロマクロゴール４００；ステアリン酸ポリオキシル４０；ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、４０、５０、及び６０；モノステアリン酸グリセロール；ポリソルベート４０、６０、６５、及び８０；大豆レシチン及び他のリン脂質、例えば、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ、及びＤＯＰＧ；スクロース脂肪酸エステル；メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。
【００５１】
本明細書に記載される医薬組成物は、様々な比率において個別に又は混合物のいずれかとして、少なくとも１種の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００１％〜約５％ｗ／ｖ（又は約０．００４〜約０．５％ｗ／ｖ若しくは約０．００１〜約０．０１％ｗ／ｖ若しくは約０．００４〜約０．０１％ｗ／ｖ）の濃度の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも０．００１、少なくとも０．００２、少なくとも０．００３、少なくとも０．００４、少なくとも０．００５、少なくとも０．００７、少なくとも０．０１、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも３．５、少なくとも４．０、又は少なくとも４．５％ｗ／ｖの濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００４％〜約０．５％ｗ／ｖの濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００４〜約０．５％ｗ／ｖの濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００１〜約０．０１％ｗ／ｖの濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００４〜約０．０１％ｗ／ｖの濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００４、約０．００５、約０．００７、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖの濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００１％〜約０．０１％ｗ／ｖの濃度で組み入れられた界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０であり、ポリソルベート８０は約０．０１％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【００５２】
糖類
本明細書に記載される医薬組成物は、少なくとも１種の糖類を含む。糖類は、安定剤又は充填剤として添加され得る。本明細書で使用する場合、用語「安定剤」は、水性及び固体状態での、凝集又はその他の物理的劣化及び化学的劣化（例えば、自己分解、脱アミド、酸化など）を防ぐことができる賦形剤を意味する。医薬組成物中で使用される安定剤としては、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニンＨＣＬ、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、Ｎ−メチルピロリデン、セルロース及びヒアルロン酸などの多糖類を含むポリヒドロキシ化合物、並びに塩化ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ７４：２２５，（１９９１））。
【００５３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の糖類は、単糖、二糖、環状多糖、糖アルコール、線状分岐デキストラン、及び線状非分岐デキストラン、並びにこれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の糖類は、スクロース、トレハロース、マンニトール、及びソルビトール又はこれらの組合せからなる群から選択される二糖である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．０１％〜約４０％ｗ／ｖ、又は約００．１％〜約２０％ｗ／ｖ、又は約１％〜約１５％ｗ／ｖの濃度で少なくとも１種の糖類を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも３０、又は少なくとも４０％ｗ／ｖの濃度で少なくとも１種の糖類を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４％〜約１５％ｗ／ｖの濃度で少なくとも１種の糖類を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１％〜約１５％ｗ／ｖの濃度で少なくとも１種の糖類を含む。さらなる実施形態では、医薬組成物は、約９％、約９．５％、約１０％、約１０．５％、約１１％、約１１．５％、又は約１２％ｗ／ｖの濃度で少なくとも１種の糖類を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約９％〜約１２％ｗ／ｖの濃度で少なくとも１種の糖類を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の糖類は、約９％ｗ／ｖの濃度で組成物中にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の糖類は、スクロース、トレハロース、マンニトール、及びソルビトール又はこれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、糖類はソルビトールであり、約９％〜約１２％ｗ／ｖの範囲で組成物中に存在する。
【００５５】
必要があれば、製剤はまた、凍結乾燥「ケーキ」を形成するのに好適な糖類などの、適切な量の充填剤及びモル浸透圧濃度調節剤を含む。
【００５６】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、１０ｍＭグルタミン酸塩、９％（ｗ／Ｖ）スクロース及び０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０を含み、医薬組成物のｐＨは、４．２である。
【００５７】
他の考慮事項
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、それを必要とする患者への投与に好適な組成物に関する。用語「対象」、又は「個体」、又は「動物」、又は「患者」は、本明細書では互換的に使用され、本発明の医薬組成物の投与が望ましい任意の対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれ、ヒトが好ましい。本発明の医薬組成物は、安定であり、且つ薬学的に許容されるものであり、すなわち、医薬組成物が投与される対象において著しく望ましくない局所的又は全身的な作用を引き起こすことなく所望の治療効果を引き出すことができる。本発明の薬学的に許容される組成物は、無菌であり、且つ／又は薬学的に不活性であり得る。具体的には、用語「薬学的に許容される」は、動物における使用及びより特定するとヒトにおける使用のための、規制当局又は他の一般に認識されている薬局方によって承認されていることを意味し得る。
【００５８】
本開示によって提供される製剤は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（例えば、ヘテロ二量体抗体）を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、治療有効量で提供される。「治療有効量」は、所望の治療効果を引き出す前記ヘテロ二量体抗体の量を意味する。治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％において致死的な用量）によって決定することができる。治療効果と毒性作用との間の用量比は、治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表現することができる。大きい治療指数を示す製剤が一般に好ましい。
【００５９】
タンパク質製剤は一般に、非経口投与される。非経口で与えられる場合、それらは無菌でなければならない。無菌希釈剤は、薬学的に許容され（ヒトへの投与のために安全且つ非毒性）、且つ凍結乾燥後に再構成される製剤などの液体製剤の調製に有用である液体を含む。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル液又はデキストロース溶液が挙げられる。希釈剤は、塩及び／又は緩衝剤の水溶液を含み得る。
【００６０】
賦形剤は、それらが薬物製品の安定性、送達及び製造性を与えるか又は高めるため、製剤中に含まれる添加剤である。賦形剤を含有する理由にかかわらず、賦形剤は、薬物製品の不可欠な成分であり、したがって、安全且つ患者によって十分に耐容性を示される必要がある。タンパク質薬物に関して、賦形剤の選択は、それらが薬物の有効性及び免疫原性に影響を及ぼす可能性があるため特に重要である。したがって、タンパク質製剤は、好適な安定性、安全性、及び市場性を与える賦形剤の適切な選択とともに開発される必要がある。
【００６１】
本明細書に記載される賦形剤は、それらの化学種又はそれらの製剤中における機能的役割のいずれかによって整理される。各賦形剤の種類を議論する際、安定化の様式についての簡単な説明が提供される。本明細書で提供される教示及び手引きがあれば、当業者は、粘度を望ましくないレベルまで増大させることなく賦形剤の量又は範囲を容易に変動させることができるであろう。賦形剤は、最終溶液の所望の重量オスモル濃度（すなわち、等張性、低張性又は高張性）、ｐＨ、所望の安定性、凝集若しくは分解若しくは沈殿に対する耐性、凍結、凍結乾燥若しくは高温条件下での保護、又は他の特性を実現するために選択され得る。様々な種類の賦形剤が当技術分野で知られている。例示的な賦形剤としては、塩、アミノ酸、他の等張化剤、界面活性剤、安定剤、充填剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、抗酸化剤、金属イオン、キレート剤及び／又は保存剤が挙げられる。
【００６２】
さらに、製剤中に特定の賦形剤が、例えばパーセント（％）ｗ／ｖで報告される場合、当業者は、その賦形剤の等モル濃度も意図されることを認識するであろう。
【００６３】
他の安定剤及び充填剤
安定剤としては、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、及びガラス形成剤としての役割を果たし得る化合物の一部類が挙げられる。凍結保護剤は、低温での凍結中又は凍結状態においてタンパク質を安定化するために作用する。凍結乾燥保護剤は、フリーズドライの脱水段階中にタンパク質の天然様立体配座特性を保存することによって、タンパク質をフリーズドライされた固形剤形で安定化させる。ガラス状態特性は、温度に応じたそれらの緩和特性に応じて、「頑丈」又は「脆弱」に分類されている。安定性を与えるためには、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、及びガラス形成剤が、タンパク質と同じ相に留まることが重要である。糖、ポリマー、及びポリオールはこのカテゴリに入り、場合によっては３つの役割の全てを果たすことができる。
【００６４】
ポリオールは、糖（例えば、マンニトール、スクロース、又はソルビトール）、及び他の多価アルコール（例えば、グリセロール及びプロピレングリコール）を含む賦形剤の一部類を包含する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーはこのカテゴリに含まれる。ポリオールは、液状及び凍結乾燥非経口タンパク質製剤の両方において、安定化賦形剤及び／又は等張化剤として一般的に使用される。ポリオールは、タンパク質を物理的分解経路及び化学的分解経路の両方から保護することができる。
【００６５】
例示的なＣ３〜Ｃ６ポリオールとしては、プロピレングリコール、グリセリン（グリセロール）、トレオース、トレイトール、エリトロース、エリスリトール、リボース、アラビノース、アラビトール、リキソース、マルチトール、ソルビトール、ソルボース、グルコース、マンノース、マンニトール、レヴロース、デキストロース、マルトース、トレハロース、フルクトース、キシリトール、イノシトール、ガラクトース、キシロース、フルクトース、スクロース、１，２，６−ヘキサントリオールなどが挙げられる。高次糖としては、デキストラン、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールが挙げられる。フルクトース、マルトース又はガラクトースなどの還元糖は、非還元糖より容易に酸化する。糖アルコールのさらなる例は、グルシトール、マルチトール、ラクチトール又はイソ−マルツロースである。さらなる例示的な凍結乾燥保護剤としては、グリセリン及びゼラチン、並びに糖であるメリビオース、メレチトース、ラフィノース、マンノトリオース及びスタキオースが挙げられる。還元糖の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソ−マルツロース及びラクツロースが挙げられる。非還元糖の例としては、糖アルコール及び他の直鎖ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが挙げられる。モノグリコシドとしては、ラクトース、マルトース、ラクツロース及びマルツロースなどの二糖類の還元によって得られる化合物が挙げられる。
【００６６】
アミノ酸
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物はさらに、１種以上のアミノ酸を含む。アミノ酸は、緩衝剤、充填剤、安定剤及び抗酸化剤としてタンパク質製剤において多用途に使用されている。ヒスチジン及びグルタミン酸は、それぞれ５．５〜６．５及び４．０〜５．５のｐＨ範囲においてタンパク質製剤を緩衝するために利用される。ヒスチジンのイミダゾール基は、ｐＫａ＝６．０を有し、グルタミン酸側鎖のカルボキシル基は、４．３のｐＫａを有し、このことがそれらを、それらの対応するｐＨ範囲で緩衝するのに好適にしている。グルタミン酸は、一部の製剤（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎ（登録商標））において見出される。ヒスチジンは一般に、市販タンパク質製剤（例えば、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標））において見出される。それは、注射時に痛むことで知られる緩衝剤であるクエン酸塩に代わる良好な選択肢を提供する。興味深いことに、ヒスチジンはまた、液体及び凍結乾燥された体裁の両方において高濃度で使用されるとき、安定化効果を有することが報告されている（Ｃｈｅｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，２０（１２）：１９５２−６０（２００３））。ヒスチジン（最大６０ｍＭ）はまた、抗体の高濃度製剤の粘度を低減することが観察された。しかしながら、同じ試験において、その著者らは、ステンレス鋼容器中での抗体の凍結融解試験の間、ヒスチジンを含有する製剤において凝集の増加及び変色を観察した。その著者らは、これを鋼容器の腐蝕から浸出した鉄イオンの影響が原因であるとした。ヒスチジンを用いる際のもう１つの注意事項は、金属イオンの存在下で光酸化を受けることである（Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，，８（１２）：５１４９−６０（１９６９））。製剤中の抗酸化剤としてのメチオニンの使用は、有望なように見える；それは、いくつかの酸化ストレスに対して有効であることが観察されている（Ｌａｍ  ＸＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，８６（１１）：１２５０−５（１９９７））。
【００６７】
アミノ酸のグリシン、プロリン、セリン及びアラニンは、タンパク質を安定化する。グリシンはまた、凍結乾燥製剤（例えば、Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標））中で一般的に使用される充填剤である。アルギニンは、凝集を阻害する際に有効な薬剤であることが示されており、液体及び凍結乾燥製剤（例えば、Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）液体））の両方で使用されてきた。
【００６８】
抗酸化剤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物はさらに、１種以上の抗酸化剤を含む。タンパク質残基の酸化は、いくつかの異なる原因から生じる。特定の抗酸化剤の添加の他に、酸化的なタンパク質の損傷の防止には、大気中の酸素、温度、光への曝露、及び化学的汚染などの製品の製造工程及び保管中のいくつかの要因を慎重に制御する必要がある。最も一般的に使用される医薬用抗酸化剤は、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、又はキレート剤である。治療用タンパク質製剤中の抗酸化剤は水溶性でなければならず、生成物の貯蔵寿命全体を通して活性を維持しなければならない。還元剤及び酸素／フリーラジカルスカベンジャーは、溶液中の活性酸素種を切断することによって機能する。ＥＤＴＡなどのキレート剤は、フリーラジカル形成を促進する微量金属夾雑物を結合することによって効果を発揮し得る。例えば、ＥＤＴＡを、酸性線維芽細胞増殖因子の液体製剤中で利用して、金属イオンに触媒されるシステイン残基の酸化を阻害した。ＥＤＴＡは、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）及びＯｎｔａｋ（登録商標）などの市販製品に使用されている。
【００６９】
しかしながら、抗酸化剤それら自体は、タンパク質に対して他の共有結合性又は物理的変化を誘導する場合がある。いくつかのこのような事例が、文献において報告されている。還元剤（グルタチオンのような）は、ジスルフィドシャッフリングを引き起こす可能性がある分子内ジスルフィド結合の破壊をもたらすことができる。遷移金属イオンの存在下で、アスコルビン酸及びＥＤＴＡは、いくつかのタンパク質及びペプチドにおいてメチオニン酸化を促進することが示されている（Ａｋｅｒｓ  ＭＪ，ａｎｄ  Ｄｅｆｅｌｉｐｐｉｓ  ＭＲ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｖｅｎ  Ｆｒｏｋｊａｅｒ，Ｌａｒｓ  Ｈｏｖｇａａｒｄ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，ＵＫ（１９９９））；Ｆｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６（９）：４０４６−１０５０（１９９７）；Ｙｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，２１（１２）：２３７７−８３（２００４））。チオ硫酸ナトリウムは、ｒｈｕＭａｂ  ＨＥＲ２において光と温度によって誘導されるメチオニン酸化のレベルを低下させることが報告されているが；チオ硫酸塩−タンパク質付加体の形成もまた、この研究において報告された（Ｌａｍ  ＸＭ，Ｙａｎｇ  ＪＹ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８６（１１）：１２５０−５（１９９７））。適切な抗酸化剤の選択は、タンパク質の特定のストレス及び感受性に応じてなされる。
【００７０】
金属イオン
いくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、１種以上の金属イオンを含む。一般に、遷移金属イオンはタンパク質中で物理的及び化学的分解反応を触媒し得るため、タンパク質製剤中の遷移金属イオンは望ましくない。しかしながら、特定の金属イオンは、それらがタンパク質に対する補助因子である場合に製剤中に含まれ、またそれらが配位化合物を形成するタンパク質の懸濁製剤（例えば、インスリンの亜鉛懸濁剤）中に含まれる。近年、アスパラギン酸がイソアスパラギン酸に異性化することを阻害するためのマグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）の使用が提案されている（国際公開第２００４／０３９３３７号パンフレット）。
【００７１】
金属イオンがタンパク質において安定性又は活性の増大を付与する２つの例は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ（ｒｈＤＮａｓｅ、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））及び第ＶＩＩＩ因子である。ｒｈＤＮａｓｅの場合、Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、特異的結合部位を通じて、酵素の安定性を増大させた（Ｃｈｅｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，８８（４）：４７７−８２（１９９９））。実際に、ＥＧＴＡによって溶液からカルシウムイオンを除去することで、脱アミド及び凝集の増加が生じた。しかしながら、この効果は、Ｃａ＋２イオンでのみ観察され；その他の二価のカチオン（Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２）は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させることが観察された。同様の効果が、第ＶＩＩＩ因子において観察された。Ｃａ＋２及びＳｒ＋２イオンはタンパク質を安定化させた一方で、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２などのその他のものは酵素を不安定化させた（Ｆａｔｏｕｒｏｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１５５，１２１−１３１（１９９７）。第ＶＩＩＩ因子を用いた別の研究では、Ａｌ＋３イオンの存在下で凝集速度の顕著な増加が観察された（Ｄｅｒｒｉｃｋ  ＴＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３（１０）：２５４９−５７（２００４））。著者らは、緩衝剤塩のような他の賦形剤にはＡｌ＋３イオンが混入していることが多いことを指摘しており、配合製品中で適切な品質の賦形剤を使用することの必要性を例示している。
【００７２】
保存剤
いくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、１種以上の保存剤を含む。保存剤は、同じ容器からの２回以上の取り出しを伴う複数回使用非経口製剤を開発する際に必要となる。その主な機能は、薬物製品の貯蔵寿命又は使用期間にわたって微生物の増殖を阻害し、製品の無菌性を確保することである。一般的に使用される保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられる。抗菌保存剤活性を有する化合物の他の例としては、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリドが挙げられる。他の種類の保存剤としては、ブチルアルコール、フェノール、ベンジルアルコールなどの芳香族アルコール；アテコール（ａｔｅｃｈｏｌ）、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールが挙げられる。保存剤は長い使用の歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対する不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている（Ｒｏｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，９４（２）：３８２−９６（２００５））。
【００７３】
複数回使用の注射ペンの体裁は、保存製剤を含む。例えば、ｈＧＨの保存製剤は現在、市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（液体、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（登録商標）（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）は、フェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ−クレゾールにより製剤化される。
【００７４】
保存処理された剤形の製剤開発中に、いくつかの態様が検討される。保存剤濃度の最適化は、タンパク質安定性を損なうことなく抗微生物有効性を付与する濃度範囲を有する剤形において所与の保存剤を試験することが必要となる。例えば、３つの保存剤が、インターロイキン−１受容体（Ｉ型）に対する液体製剤の開発において、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて成功裏にスクリーニングされた。保存剤は、市販されている製品中で一般に使用されている濃度での安定性に対する影響に基づいて、順位付けされた（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ＲＬ  Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，１５（２）：２００−８（１９９８））。
【００７５】
一部の保存剤は、注射部位反応を引き起こす場合があり、これは、保存剤を選択する際の考慮事項についての別の要素である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ中の保存剤及び緩衝剤の評価に焦点を当てた臨床試験において、ｍ−クレゾールを含有する製剤と比べて、フェノール及びベンジルアルコールを含有する製剤中では、疼痛の知覚がより低いことが観察された（Ｋａｐｐｅｌｇａａｒｄ  Ａ．Ｍ．，Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ．６２  Ｓｕｐｐｌ  ３：９８−１０３（２００４））。興味深いことに、一般的に使用される保存剤のうち、ベンジルアルコールは麻酔特性を有する（Ｍｉｎｏｇｕｅ  ＳＣ，ａｎｄ  Ｓｕｎ  ＤＡ．，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ．，１００（３）：６８３−６（２００５））。
【００７６】
しかしながら、本開示はまた、いずれの保存剤も含まない医薬組成物を企図する。
【００７７】
抗原結合タンパク質
「抗原結合タンパク質」は、指定された標的抗原（ＣＤ３及び／又はＣＤ３８など）に結合する部分を含むタンパク質である。抗原結合タンパク質は、抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する立体構造をとることを可能にする骨格又はフレームワーク部分を含む。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、抗体若しくは免疫グロブリン、又は抗原結合抗体断片、又は抗体タンパク質製品である。
【００７８】
用語「抗体」は、インタクトな抗原結合免疫グロブリンを指す。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つを含む、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭの抗体であり得る。様々な実施形態において、インタクトな抗体は、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む。抗体は可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ形式において、可変領域は一般に、約１００〜１１０以上のアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、抗原認識に主に関与し、且つ異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に変動する。可変領域は通常、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３も参照のこと）、それらはフレームワーク領域（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，前掲も参照のこと）の内側にある。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員することを可能にする。
【００７９】
様々な態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。ある種の態様では、抗体は、ヒト抗体である。ある種の態様では、抗体（又は他の抗原結合タンパク質）は、キメラであるか又はヒト化されている。用語「キメラ」は、２つ以上の異なる抗体に由来するドメインを含有する抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、１つの種に由来する定常ドメイン及び第２の種に由来する可変ドメインを含有することができるか、又はより一般的には、少なくとも２つの種に由来する一続きのアミノ酸配列を含有することができる。「キメラ」及び「ヒト化」の両方が、２つ以上の種に由来する領域を組み合わせる抗原結合タンパク質を指す場合が多い。キメラ抗体はまた、同じ種の中の２つ以上の異なる抗体のドメインを含有することもできる。一実施形態では、キメラ抗体は、ＣＤＲ移植抗体である。
【００８０】
用語「ヒト化」は、抗原結合タンパク質に関して使用される場合、元の供給源の抗体よりも真のヒト抗体に類似した構造及び免疫機能を有するように操作された、非ヒト供給源に由来するＣＤＲ領域を少なくとも有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を指す。例えば、ヒト化は、マウス抗体などの非ヒト抗体に由来するＣＤＲをヒトフレームワーク領域に移植することを伴い得る。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体の全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、又はそのＣＤＲの範囲内を除いてそのような抗体と同一である。一部又は全てが非ヒト生物に起源をもつ核酸によってコードされるＣＤＲがヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植されて抗体を生成し、その特異性は、移植されたＣＤＲによって決定される。そのような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６において記載されており、これらは全て、全体として参照により援用される。対応するドナー残基に対して選択されたアクセプターフレームワーク残基の「復帰変異」が、初期移植コンストラクトにおいて失われる親和性を回復するために利用されることが多い（例えば、全てが全体として参照により援用される、米国特許第５５３０１０１号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６１号明細書；同第５６９３７６２号明細書；同第６１８０３７０号明細書；同第５８５９２０５号明細書；同第５８２１３３７号明細書；同第６０５４２９７号明細書；及び同第６４０７２１３号明細書を参照のこと）。ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も最適に含み、これは通常、ヒト免疫グロブリンのものであり、したがって、通常、ヒトＦｃ領域を含むことになる。
【００８１】
任意選択により、組成物の抗体は、二重特異性抗体、すなわち、２つの異なる標的（例えば、ＣＤ３及び第２の異なる標的）に結合する抗体である。様々な態様において、組成物の抗体は、ヘテロ二量体抗体である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、第１のＦｃドメイン及び抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む第１の単量体を含むヘテロ二量体抗体を含む。ヘテロ二量体抗体はさらに、抗ＣＤ３８重鎖可変ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む第２の単量体を含む。ヘテロ二量体抗体はまた、定常ドメイン及び抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む。単量体の特徴はさらに下に記載される。
【００８３】
ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、及び可変軽鎖ドメインを含む。任意選択により、可変軽鎖のＣ末端は、ｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端は、可変重鎖のＮ末端に結合されるが（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）、配置は切り換えることができる（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。したがって、ｓｃＦｖの描写及び説明において、いずれかの向きのｓｃＦｖが特定的に含まれる。様々な態様において、ｓｃＦｖドメインリンカーは、荷電リンカーである。いくつかの好適なｓｃＦｖリンカーが使用されてもよく、多くは図面に記載される。荷電ｓｃＦｖリンカーは、第１と第２の単量体の間のｐＩで分離を促進するために利用され得る。すなわち、正又は負（又は異なる単量体上でｓｃＦｖを使用する骨格の場合、両方）のいずれかの荷電ｓｃＦｖリンカーを組み込むことによって、荷電リンカーを含む単量体が、Ｆｃドメイン中にさらなる電荷を生じさせることなくｐＩを変化させることを可能にする。
【００８４】
ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用してＦｃドメインのＮ末端に共有結合される。「ドメインリンカー」は、本明細書に概説されるいずれかの２つのドメインをともに連結する。必要があれば、荷電ドメインリンカーが使用され得る。荷電ドメインリンカーはまた、例えば、本開示の単量体のｐＩ分離を増加させることができ、したがって、図面に含まれるものは、リンカーが利用される本明細書のいずれの実施形態において使用することができる。
【００８５】
リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含み得る：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒ。リンカーペプチドは、２つの分子を、それらが互いに対して妥当な立体構造をとり、その結果、所望の活性を保持するように連結するのに十分である長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは、約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーを、いくつかの実施形態で用途を見出す約５〜約１０個のアミノ酸とともに使用してもよい。有用なリンカーとしては、グリシン−セリン重合体、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３３）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３４）（ｎは、少なくとも１（及び通常３〜４）の整数である）、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合体、並びに他の可動性リンカーが挙げられる。或いは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体を含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性の重合体が、リンカーとして用途を見出され得る。
【００８６】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの任意の配列を含んでもよいが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基ではない；例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、Ｃκ又はＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質などの他のタンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来の配列、及び他のタンパク質由来の他の天然配列に由来してもよい。
【００８７】
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号１５に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号１６に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号１７に記載されるｖｌＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、並びに（ｉｉ）配列番号１１に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号１２に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号１３に記載されるｖｈＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む。任意選択により、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメインを含む。また任意選択により、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。これに関して、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、様々な実施形態において、配列番号１０の可変重鎖ドメイン及び配列番号１４の可変軽鎖ドメインを含む。任意選択により、可変重鎖及び可変軽鎖ドメインは、配列ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ（配列番号１５８）を含むｓｃＦｖドメインリンカーによって連結される。これに関して、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、様々な実施形態において、配列番号１８（抗体ＡのｓｃＦｖ）に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。様々な態様において、参照配列に対して１００％未満の同一性パーセントを生じる配列変異は、ＣＤＲ配列の外部の改変を表す。様々な態様において、ｓｃＦｖは、抗ＣＤ３＿Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７（抗体Ａに相当する）に属するものとして本明細書に記載される配列を含む。
【００８８】
「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメイン、及び場合によりヒンジの一部を除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを指す。したがって、「Ｆｃドメイン」は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、且つこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭに関して、Ｆｃは、Ｊ鎖を含んでもよい。ＩｇＧに関して、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）並びにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）の間の下位のヒンジ領域を含む。ヘテロ二量体抗体は、好ましくはＩｇＧ抗体である（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを含む）。Ｆｃ領域の境界は異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、残基Ｃ２２６又はＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、付番は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変がＦｃ領域に対してなされて、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体又はＦｃＲｎ受容体への結合を変化させる。
【００８９】
様々な態様において、第１の単量体（すなわち、第１のＦｃドメイン及び抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ）は、配列番号３３５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号３３５（抗体Ａに相当する）に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。
【００９０】
ヘテロ二量体抗体はさらに、任意選択により、ｉ）抗ＣＤ３８重鎖可変ドメイン及びｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む第２の単量体を含む。抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインは、以下のＣＤＲ配列を含む：配列番号６５に記載される可変重鎖（ｖｈ）ＣＤＲ１、配列番号６６に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号６７に記載されるｖｈＣＤＲ３。任意選択により、抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインは、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。様々な態様において、第２の単量体（すなわち、抗３８重鎖可変ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン）は、配列番号８２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号８２（抗体Ａに相当する）に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。
【００９１】
様々な態様において、ヘテロ二量体抗体はさらに、定常ドメイン及び抗ＣＤ３８可変軽鎖（ｖｌ）ドメインを含む軽鎖を含む。抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインは、以下のＣＤＲを含む：配列番号６９に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号７０に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号７１に記載されるｖｌＣＤＲ３。任意選択により、抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインは、配列番号６８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号６８（抗体Ａに相当する）に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖（定常ドメイン及び抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインを含む）は、配列番号８４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号８４（抗体Ａに相当する）に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。
【００９２】
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、抗体Ａであり、且つ配列番号１４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメインを含む抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む第１の単量体、配列番号６４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３８可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、並びに配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む。例えば、一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号３３５のアミノ酸配列を含む第１の単量体、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第２の単量体、並びに配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、ＣＤ３及びＳＴＥＡＰ１に結合するヘテロ二量体抗体を含む。ＳＴＥＡＰ１は、３つの細胞外ループ及び２つの細胞内ループをもたらす６つの膜貫通ドメインを含む３３９アミノ酸のタンパク質である。ヒトＳＴＥＡＰ１のアミノ酸配列は、配列番号３５６として本明細書に記載される。細胞外ループの推定される位置は、アミノ酸９２〜１１８（細胞外ループ１）、アミノ酸１８５〜２１７（細胞外ループ２）、及びアミノ酸２７９〜２９０（細胞外ループ３）である。ＳＴＥＡＰ１は、正常組織と比較して前立腺癌において差次的に発現され、骨及びリンパ節前立腺癌転移巣における発現の増加が、原発性前立腺癌試料と比較して観察された。ＳＴＥＡＰ１は、例えば、Ｔ細胞依存性の細胞傷害活性又は前立腺癌細胞のリダイレクト溶解を誘発するための二重特異性抗ＳＴＥＡＰ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞リクルート抗体などの、診断及び抗体に基づく治療薬のための理想的な標的となる。本開示の抗原結合タンパク質は任意選択により、第２の細胞外ループの外側の領域でＳＴＥＡＰ１に結合する。抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの実施形態において、アミノ酸９２〜１１８（細胞外ループ１）及び／又はアミノ酸２７９〜２９０（細胞外ループ３）内にあるＳＴＥＡＰ１の領域に結合する。また、任意選択により、抗原結合タンパク質は、ＳＴＥＡＰ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｎｏ．Ｑ８ＮＦＴ２；配列番号１７７）に結合しない。本開示は、本明細書に記載される形式、任意選択により図１Ａの「ボトルオープナー」又は図１Ｂの中央−ｓｃＦｖ形式（「ＸｍＡｂ２＋１」形式とも呼ばれる）のいずれかでＳＴＥＡＰ１及びＣＤ３に結合する抗原結合タンパク質を含む組成物を提供する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、第１のＦｃドメイン及び抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む第１の単量体並びにさらに抗ＳＴＥＡＰ１重鎖可変ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む重鎖定常領域を含む第２の単量体を含むヘテロ二量体抗体を含む。ヘテロ二量体抗体はまた、定常ドメイン及び抗ＳＴＥＡＰ１可変軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む。骨格を成す単量体の例示的な態様は、上に記載される。この実施形態において、ヘテロ二量体抗体はさらに、ｉ）抗ＳＴＥＡＰ１重鎖可変ドメイン及びｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む第２の単量体を含む。抗ＳＴＥＡＰ１重鎖可変ドメインは、任意選択により、配列番号３６０に記載される可変重鎖（ｖｈ）ＣＤＲ１、配列番号３６１又は配列番号３６３に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３６２に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む。軽鎖の抗ＳＴＥＡＰ１可変軽鎖ドメインは、配列番号３５７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３５８に記載されるｖｌＣＤＲ２及び配列番号３５９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む。或いは、抗ＳＴＥＡＰ１可変重鎖ドメインは、配列番号３６８に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６９に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３７０に記載されるｖｈＣＤＲ３を含み；且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号３７１に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３７２に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３７３に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む。
【００９５】
任意選択により、抗ＳＴＥＡＰ１重鎖可変ドメインは、配列番号３７７又は配列番号３７９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号３７７又は配列番号３７９に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。任意選択により、抗ＳＴＥＡＰ１可変軽鎖ドメインは、配列番号３７８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号３７８に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、抗ＳＴＥＡＰ１可変重鎖ドメインは、配列番号３８０又は配列番号３７９を含み、抗ＳＴＥＡＰ１可変軽鎖ドメインは、配列番号３７８を含む。
【００９６】
また、任意選択により、抗ＳＴＥＡＰ１重鎖可変ドメインは、配列番号３８０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号３８０に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。任意選択により、抗ＳＴＥＡＰ１可変軽鎖ドメインは、配列番号３８１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、配列番号３８１に記載されるアミノ酸配列と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、抗ＳＴＥＡＰ１可変重鎖ドメインは、配列番号３８０を含み、抗ＳＴＥＡＰ１可変軽鎖ドメインは、配列番号３８１を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ＣＤ３及びＳＴＥＡＰ１に結合するヘテロ二量体抗体であり、且つＣＤ３結合ドメイン（任意選択により、上に記載されるとおりのｓｃＦｖ）が、配列番号３８３に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３８４に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３８５に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖ドメイン、並びに配列番号３８７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３８８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３８９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖ドメインを含む実施形態などがある。例えば、本開示は、配列番号３８２と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び／又は配列番号３８６と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む多重特異性（例えば、二重特異性）コンストラクトを含む組成物を提供する。様々な態様において、ヘテロ二量体抗体は、配列番号３９０を含む抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖは、上により詳細に記載され、且つ上記のｓｃＦｖの特徴もまた本明細書で適用される。
【００９８】
様々な実施形態において、抗原結合タンパク質は、図１Ｂに示される中央−ｓｃＦｖ又は「ＸｍＡｂ２＋１」形式のヘテロ二量体抗体である。その形式は、第３の抗原結合ドメインを形成する挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依拠し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分は１つの標的に結合し、且つ「追加の」ｓｃＦｖドメインは別のもう１つの標的に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体の１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域の間に挿入され、それにより第３の抗原結合ドメインをもたらす。この実施形態において、一方の単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン（及び任意選択のリンカー／ヒンジ）及びＦｃドメインを含む第１の重鎖を、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖとともに含む。ｓｃＦｖは、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端の間で任意選択のドメインリンカーを使用して共有結合される（ＶＨ１−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２−［ヒンジを含む任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３、又はｓｃＦｖに関して反対の向き、ＶＨ１−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ＶＬ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ２−［ヒンジを含む任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。いくつかの実施形態では、第１の単量体は、ＶＨ１−ＣＨ１−ドメインリンカー−ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３である。他方の単量体は、標準的なＦａｂ側（すなわち、ＶＨ１−ＣＨ１−ドメインリンカー（例えば、ヒンジ）−ＣＨ２−ＣＨ３）である。この実施形態はさらに、標的に結合する２つの同一のＦａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらのコンストラクトは、本明細書及び国際公開第２０１７／２１８７０号パンフレットにおいて所望され記載される非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加Ｆｃ変異体などを含む。
【００９９】
いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３及びＳＴＥＡＰ１に結合する「ＸｍＡｂ２＋１」形式のヘテロ二量体抗体であり、且つＣＤ３結合ドメイン（任意選択により、上に記載されるとおりのｓｃＦｖ）は、配列番号３８３に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３８４に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３８５に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖ドメイン、並びに配列番号３８７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３８８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３８９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖ドメインを含む。例えば、コンストラクトは、任意選択により、配列番号３８０と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び／又は配列番号３８１と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む。様々な態様において、ｓｃＦｖリンカーは、配列番号３９１のアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ヘテロ二量体抗体は、配列番号３９０を含む抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む。
【０１００】
様々な態様において、抗原結合タンパク質は、ＳＴＥＡＰ１に結合する２つのＦａｂを含むＸｍＡｂ２＋１形式ヘテロ二量体抗体である。これに関して、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３６０に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６１又は配列番号３６３に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３６２に記載されるｖｈＣＤＲ３を含み；且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号３５７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３５８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３５９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む。或いは、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３６８に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６９に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３７０に記載されるｖｈＣＤＲ３を含み；且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号３７１に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３７２に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３７３に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む。好ましい実施形態では、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３７７（抗体Ｂに相当する）又は配列番号３７９と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含み、且つ／又は可変軽鎖ドメインは、配列番号３７８（抗体Ｂに相当する）と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。或いは、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３８０と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含み、且つ／又は可変軽鎖ドメインは、配列番号３８１と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。上記のとおり、参照配列と比較して１００％未満の配列同一性をもたらす本明細書に記載されるいずれかの可変ドメイン配列（又は全長単量体配列）における変異は、好ましくはＣＤＲ領域の外部に存在する。
【０１０１】
したがって、本開示は、（ａ）１）第１の可変重鎖ドメイン；２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；並びに３）ヒトＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む第１の重鎖を含む第１の単量体を含むヘテロ二量体抗体を含む医薬組成物を提供する。ｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号３８７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３８８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３８９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、（ｉｉ）ｓｃＦｖリンカー、並びに（ｉｉｉ）配列番号３８３に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３８４に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３８５に記載されるｖｈＣＤＲ３を含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む。ｓｃＦｖは、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端の間でドメインリンカーを使用して共有結合される。ヘテロ二量体抗体はさらに、ｂ）第２の可変重鎖ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の重鎖を含む第２の単量体並びにｃ）可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を含み；第１の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインはヒトＳＴＥＡＰ１に結合し、且つ第２の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインはヒトＳＴＥＡＰ１に結合する。いくつかの態様では、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３６０に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６１又は配列番号３６３に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３６２に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲを含む。可変軽鎖ドメインは、任意選択により、配列番号３５７に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３５８に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３５９に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲを含む。或いは、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３６８に記載されるｖｈＣＤＲ１、配列番号３６９に記載されるｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３７０に記載されるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲを含む。可変軽鎖ドメインは、任意選択により、配列番号３７１に記載されるｖｌＣＤＲ１、配列番号３７２に記載されるｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３７３に記載されるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲを含む。任意選択により、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３７７（抗体Ｂに相当する）又は３７９と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含み、且つ／又は可変軽鎖ドメインは、配列番号３７８（抗体Ｂに相当する）と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖは、任意選択により、それぞれ配列番号３８２及び配列番号３８６と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を有する可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含み、且つｓｃＦｖリンカーは、任意選択により、配列番号３９１を含む。様々な実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号３９０の配列を含む。
【０１０２】
本開示の様々な態様において、抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質は、配列番号３６６又は３６７と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む第１の単量体、配列番号３６５と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む第２の単量体、及び配列番号３６４と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含むＸｍＡｂ２＋１形式のヘテロ二量体抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質は、配列番号３６６と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む第１の単量体、配列番号３６５と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む第２の単量体、及び配列番号３６４（抗体Ｂに相当する）と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含むＸｍＡｂ２＋１形式のヘテロ二量体抗体である。或いは、抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質は、配列番号３７６と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む第１の単量体、配列番号３７５と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む第２の単量体、及び配列番号３７４と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）なアミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含むＸｍＡｂ２＋１形式のヘテロ二量体抗体である。
【０１０３】
様々な態様において、抗原結合タンパク質は、ＶＨ１−ＣＨ１−［ドメインリンカー］−ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２−［ドメインリンカー（任意選択によりヒンジを含む）］−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１の重鎖；ＶＨ１−ＣＨ１−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２の重鎖；及びＶＬ１を含む共通の軽鎖を含み；ＶＨ１及びＶＬ１はＳＴＥＡＰ１に結合し、且つＶＨ２及びＶＬ２はＣＤ３に結合する。この形式において、ＶＨ２は、任意選択により、配列番号３８３（ＣＤＲ１）、配列番号３８４（ＣＤＲ２）、及び配列番号３８５（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含むが、ＶＬ２は、配列番号３８７（ＣＤＲ１）、配列番号３８８（ＣＤＲ２）、及び配列番号３８９（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含む。ＶＨ１は、配列番号３６０（ＣＤＲ１）、配列番号３６１又は３６３（ＣＤＲ２）、及び配列番号３６２（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含み；且つＶＬ１は、配列番号３５７（ＣＤＲ１）、配列番号３５８（ＣＤＲ２）、及び配列番号３５９（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含む。或いは、ＶＨ１は、配列番号３６８（ＣＤＲ１）、配列番号３６９（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７０（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含み；且つＶＬ１は、配列番号３７１（ＣＤＲ１）、配列番号３７２（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７３（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含む。任意選択により、抗原結合タンパク質は、Ｅ２３３Ｐ、ｄｅｌＬ２３４、Ｌ２３５Ｖ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２６７Ｋ、ｒ２９２ｃ、ｎ２９７ｇ、ｖ３０２ｃ、Ｅ３５７Ｑ、及びＳ３６４Ｋ（ＥＵ付番、小文字は本明細書でさらに記載されるＳＥＦＬ２置換を参照する）を含むがこれらに限定されない第１の重鎖における改変を含み、且つ第２の重鎖は、Ｎ２０８Ｄ、Ｅ２３３Ｐ、ｄｅｌＬ２３４、Ｌ２３５Ｖ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２６７Ｋ、ｒ２９２ｃ  Ｑ２９５Ｅ、ｎ２９７ｇ、ｖ３０２ｃ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３８４Ｄ、Ｑ４１８Ｅ、及びＮ４２１Ｄ（ＥＵ付番、小文字は本明細書でさらに記載されるＳＥＦＬ２置換を参照する）を含むがこれらに限定されない改変を含む。この実施形態の文脈における使用のためのリンカーは、任意選択により、ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ（配列番号３９１）である。
【０１０４】
中央ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、任意選択により、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖はｐＩ変異体を含む。いくつかの実施形態では、中央ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体、及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、及び第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む形式を含む。
【０１０５】
多重特異性抗原結合タンパク質の異なる結合領域は、独立して、１０−４Ｍ以下、１０−５Ｍ以下、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、又は１０−１２Ｍ以下、又は１０−１３Ｍ以下（例えば、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍ）のそれらの対応する抗原（例えば、ＣＤ３及びＳＴＥＡＰ１又はＣＤ３及びＣＤ３８）に関するＫＤを示し、ここで、ＫＤは、特異的な抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。ＳＴＥＡＰ１結合領域（又はＣＤ３８結合領域）は、例えば、ＣＤ３結合領域がＣＤ３に結合する際と同じ親和性を有してＳＴＥＡＰ１（又はＣＤ３８）に結合する必要はない。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、製剤は、約５０μｇ〜約２００ｍｇ（又は約５００μｇ〜約１５０ｍｇ、又は約５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、又は約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、又は約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、又は約５０ｍｇ〜約７５ｍｇ）の範囲の量で本明細書に記載される抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約５０μｇ、約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約３５０μｇ、約４００μｇ、約４５０μｇ、約５００μｇ、約５５０μｇ、約６００μｇ、約６５０μｇ、約７００μｇ、約７５０μｇ、約８００μｇ、約８５０μｇ、約９００μｇ、約９５０μｇ、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５、ｍｇ、約１００ｍｇ、約１０５ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１１５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１４５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１５５ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１６５ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１８５ｍｇ、約１９０ｍｇ、約１９５ｍｇ又は約２００ｍｇの量で抗体を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、製剤は、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬ（又は約０．５〜約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約１〜約１０ｍｇ／ｍＬ又は約１〜約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０〜約２０ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度で抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１１ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１３ｍｇ／ｍＬ、約１４ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ、約１７ｍｇ／ｍＬ、約１８ｍｇ／ｍＬ、約１９ｍｇ／ｍＬ、又は約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載されるヘテロ二量体抗体のいずれかなどの抗体）を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、製剤は、約０．１〜約８ｍｇ／ｍＬ（又は約０．５〜約５ｍｇ／ｍＬ又は約１〜約５ｍｇ／ｍＬ、又は約３〜約６ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度で抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、又は約８ｍｇ／ｍＬの濃度で抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載されるヘテロ二量体抗体のいずれかなどの抗体）を含む。
【０１０９】
ヘテロ二量体抗体形式はさらに、全体として及び特に図面及び図面の説明文に関して参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１７／２１８７０７号パンフレットにおいて記載される。好ましい態様では、ヘテロ二量体抗体は、図１Ａにおいて「ボトルオープナー」と呼ばれる構造をとる。「ボトルオープナー」形式の１つ重鎖はｓｃＦｖを含有し、他の重鎖は、従来の重鎖及び軽鎖を含む「通常の」Ｆａｂ形式である。２つの重鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域）におけるアミノ酸変異体の使用によって結びつけられる。「ボトルオープナー」形式にはいくつかの明確な利点がある。２つのｓｃＦｖコンストラクトに依拠する抗体類似体は、安定性及び凝集の問題を有する場合が多く、これは、「通常の」重鎖と軽鎖の対形成の追加により本開示において軽減される。加えて、２つの重鎖及び２つの軽鎖に依拠する形式とは対照的に、重鎖と軽鎖の不適切な対形成（例えば、軽鎖２と対形成する重鎖１など）による問題はない。
【０１１０】
ヘテロ二量体抗体は、様々な態様において、野生型抗体ドメイン配列と比較して、ヘテロ二量体抗体形成を促進し（すなわち、ホモ二量体化を減少させ）、抗体の機能性を調整するなどの改変を含む。改変は一般に、Ｆｃドメインに集中する（これが要求されるわけではないが）。改変は、天然配列に対する置換、欠失、又は挿入のアミノ酸位置によって参照される。例えば、Ｎ４３４Ｓ又は４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対する４３４位でのセリンのＦｃドメイン置換であり、付番はＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有するＦｃ改変を定義する。野生型アミノ酸の同一性は、特定されていなくてもよく、その場合、前述の変異体は、４２８Ｌ／４３４Ｓと称される。置換がもたらされる順序は任意であり、すなわち、例えば、４２８Ｌ／４３４Ｓは、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同じであるなどである。抗体に関して検討される全ての位置に関して、特に断りのない限り、アミノ酸位置の付番はＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス又はＫａｂａｔ若しくはＥＵ付番スキームのようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す（参照により全体として本明細書に援用される、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５）。改変は、付加、欠失、又は置換であり得る。置換は、天然に存在するアミノ酸、及び場合により合成アミノ酸を含んでもよい。例としては、全てが全体として参照により援用される米国特許第６，５８６，２０７号明細書；米国特許出願公開第２００４−０２１４９８８Ａ１号明細書；国際公開第９８／４８０３２号パンフレット；国際公開第０３／０７３２３８号パンフレット；国際公開第０５／３５７２７Ａ２号パンフレット；国際公開第０５／７４５２４Ａ２号パンフレット；国際公開第１７／２１８７０７号パンフレット；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；及びＬ．Ｗａｎｇ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が挙げられる。
【０１１１】
ヘテロ二量体タンパク質を生成するために使用され得るいくつかの機構が存在する。ヘテロ二量体の生成をもたらすアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体（例えば、下記の「ノブ・アンド・ホール」又は「非対称」変異体及び下記の「電荷対」変異体）並びにヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする「ｐＩ変異体」を含み得る。全体として及び具体的には「ヘテロ二量体化変異体」の議論について参照により本明細書に援用される国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレット及び国際公開第２０１７／２１８７０７号パンフレットに一般に記載されるとおり、ヘテロ二量体化についての有用な機構には、「ノブ・アンド・ホール」（「ＫＩＨ」；本明細書において「非対称」変異体と呼ばれる場合がある）、国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットに記載される「静電ステアリング」又は「電荷対」、国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットに記載されるｐＩ変異体、及び国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレット及び本明細書に概説される一般的な追加Ｆｃ変異体が含まれる。
【０１１２】
ヘテロ二量体抗体の精製を容易にすることができるいくつかの基本的な機構が存在する；あるものはｐＩ変異体の使用に依拠し、その結果、各単量体が異なるｐＩを有し、それにより、Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、及びＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製が可能になる。或いは、「ボトルオープナー」形式などの一部の骨格形式は、サイズに基づく分離も可能にする。ヘテロ二量体の形成がホモ二量体を上回るように「非対称にする」ことも可能である。したがって、立体二量体化変異体及びｐＩ又は電荷対変異体の組合せは、本発明において、特定の用途を見出す。
【０１１３】
Ａ．ｐＩ（等電点）変異体
ｐＩ変異体に関して、単量体ポリペプチドの一方又は両方にアミノ酸改変を導入することができ；すなわち、単量体の一方（単純化のために本明細書では「単量体Ａ」と呼ぶ）のｐＩを、単量体Ｂから離れるように操作することができるか、又は単量体Ａ及びＢの両方を変えることができ、単量体ＡのｐＩが上昇し、単量体ＢのｐＩが低下する。一方又は両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を取り除くか、又は付加すること（例えば、中性アミノ酸を正又は負に荷電したアミノ酸残基によって置き換える、例えば、グリシンをグルタミン酸に置き換える）、荷電した残基を正又は負の電荷から反対の電荷に変える（アスパラギン酸からリジンに）こと、又は荷電した残基を中性残基に変える（例えば、電荷の消失；リジンからセリンに）ことによって行われ得る。いくつかのこれらの変異体が図面において示される。これらの改変は、ヘテロ二量体がホモ二量体から分離できるように、単量体の少なくとも１つにおいてｐＩの十分な変化を生じさせる。当業者によって理解されるとおり、これは、「野生型」重鎖定常領域及びそのｐＩを上げるか又は下げるように（ｗｔＡ−＋Ｂ又はｗｔＡ−−Ｂ）操作されている変異領域を用いること、又は一方の領域を上げ、他方の領域を下げる（Ａ＋−Ｂ−又はＡ−Ｂ＋）ことによって達成され得る。
【０１１４】
したがって、様々な態様において、ヘテロ二量体抗体は、二量体タンパク質の両方でなければ少なくとも一方の単量体の等電点（ｐＩ）を変えて、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」又は「ｐＩ置換」）を一方又は両方の単量体に組み込むことによって「ｐＩ抗体」を形成する定常領域における１つ以上の改変を含む。２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが、わずか０．１ｐＨ単位でも異なれば達成することができ、０．２、０．３、０．４、及び０．５以上の差は全て好適である。
【０１１５】
良好な分離を得るために各々又は両方の単量体に含まれることになるｐＩ変異体の数は、成分の出発ｐＩ、例えば、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３８  Ｆａｂの出発ｐＩに部分的に依存することになる。すなわち、どの単量体を操作するか、又はどの「方向」（例えば、正側若しくは負側）にするかを決定するために、２つのドメインのＦｖ配列が計算され、そこから決定がなされる。異なるＦｖは、利用され得る異なる出発ｐＩを有することになる。いくつかの実施形態では、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号明細書の図１９におけるチャートを使用して、変異体重鎖定常ドメインに基づいて計算される。或いは、各単量体のｐＩが比較され得る。一般に、ｐＩを操作して、少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の総ｐＩ差をもたらすが、０．２〜０．５が好ましい。
【０１１６】
ｐＩ変異体の好ましい組合せは、図１０において示される。これらの変化はＩｇＧ１に対して示されるが、アイソタイプハイブリッドだけでなく全てのアイソタイプをこの方法で改変することができる。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４である場合、Ｒ１３３Ｅ及びＲ１３３Ｑもまた使用され得る。
【０１１７】
一実施形態では、Ｆａｂ単量体（負側）は、置換２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ（Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ヒトＩｇＧ１に対して）を含み、且つｓｃＦｖ単量体（正側）は、（ＧＫＰＧＳ）４を含む正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む。
【０１１８】
ｐＩを調整するための改変は、軽鎖においてもなされ得る。軽鎖のｐＩを下げるためのアミノ酸置換としては、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅ及び軽鎖のＣ末端でのペプチドＤＥＤＥの付加が挙げられるが、これらに限定されない。定常ラムダ軽鎖に基づくこのカテゴリにおける変化は、Ｒ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１９９Ｅでの１つ以上の置換を含む。加えて、軽鎖のｐＩを上げてもよい。
【０１１９】
Ｂ．非対称／立体変異体
ヘテロ二量体化非対称変異体のセットのいくつかの好適な対がある。これらの変異体は、「セット」の「対」でもたらされる。すなわち、対の一方のセットは、第１の単量体に組み込まれ、対のもう一方のセットは、第２の単量体に組み込まれる。これらのセットは、一方の単量体上の残基ともう一方の単量体上の残基との間の１対１の対応を有する「ノブ・イン・ホール」変異体として必ずしもふるまわず；すなわち、これらのセットの対は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げる２つの単量体の間での界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体のパーセンテージが、予想された５０％よりもむしろ９０％を超えることを可能にする（２５％のホモ二量体  Ａ／Ａ：５０％のヘテロ二量体  Ａ／Ｂ：２５％のホモ二量体  Ｂ／Ｂ）ことに留意するべきである。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって促進される。すなわち、各重鎖においてアミノ酸を変えることによって、異なる重鎖が、同じＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりも、ヘテロ二量体構造を形成するように会合する可能性が高くなる。立体変異体の好適な例は、図９において含まれる。
【０１２１】
１つの機構は、当技術分野において、「ノブ・アンド・ホール」と一般に称されるものであり、立体的な影響を生じさせて、ヘテロ二量体形成に有利に働き、ホモ二量体形成を抑制するアミノ酸操作を指し、任意選択により使用されてもよい。これはさらに、全てがそれらの全体として参照により援用される米国特許出願公開第２０１３０２０５７５６号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）；Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  ２７０：２６；米国特許第８，２１６，８０５号明細書において記載される。図面は、「ノブ・アンド・ホール」に依拠するいくつかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」の対を特定する。加えて、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）において記載されるとおり、これらの「ノブ・アンド・ホール」変異をジスルフィド結合と組み合わせて、ヘテロ二量体化の形成を非対称にすることができる。
【０１２２】
ヘテロ二量体の生成において用途を見出すさらなる機構は、全体として参照により本明細書に援用されるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）において記載されるとおり、「静電ステアリング」と呼ばれる場合がある。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれる場合がある。この実施形態において、静電気は、ヘテロ二量化に向けて形成を非対称にするために使用される。当業者が理解するとおり、これらはまた、ｐＩ、したがって、精製に対して影響を有する場合があり、したがって、場合によっては、ｐＩ変異体であるとも見なされ得る。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製ツールとしては使用されなかったため、それらは「立体変異体」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対形成するＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（すなわち、これらは単量体の対応するセットである）及びＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対形成するＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本明細書で概説されるｐＩ変異体又は図面及び説明文並びに配列番号が参照により本明細書に明示的に援用される米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号明細書の図３７で示される他の立体変異体などの他の変異体と任意選択により且つ独立して任意の量で組み合わせることができる追加の単量体Ａ及び単量体Ｂの変異体。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書で概説される立体変異体は、任意のｐＩ変異体（又はＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体などの他の変異体）とともに任意選択により且つ独立して一方又は両方の単量体に組み込むことができ、且つ独立して且つ任意選択により本発明のタンパク質に含まれ得るか、又はそれから除外され得る。
【０１２５】
好適な非対称変異体のリストは、図９及び図１２において見出される。Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含むがこれらに限定されないセットの対は、多くの実施形態において特に有用である。命名法の用語において、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、単量体の一方が二重変異体セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、もう一方が二重変異体セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味する。
【０１２６】
Ｃ．機能性を調整するための追加Ｆｃ変異体
１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合を変えること、ＦｃＲｎ受容体への変化した結合などを含むが、これらに限定されない様々な理由で作製され得るいくつかの有用なＦｃアミノ酸の改変がある。
【０１２７】
ＦｃγＲ受容体の１つ以上に対する結合を変えるために作製され得るいくつかの有用なＦｃ置換がある。結合の増加及び結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加は一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害；ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上で結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞性反応）の増加をもたらす。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）に対する結合の減少は、いくつかの状況において同様に有益であり得る。本発明において用途を見出すアミノ酸置換としては、全てが全体として及び特に開示される変異体に関して参照により本明細書に明示的に援用される米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号明細書（特に、図４１）、同第２００６／０１２１０３２号明細書、同第２００６／０２３５２０８号明細書、同第２００７／０１４８１７０号明細書において列挙されるものが挙げられる。用途を見出す特定の変異体としては、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ及び２９９Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
加えて、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ又はＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、全体として参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号明細書において具体的に開示されるとおりの、ＦｃＲｎ受容体に対する結合の増加及び血清半減期の増大において用途を見出す追加Ｆｃ置換がある。
【０１２９】
機能性変異体の別のカテゴリは、「ＦｃγＲ切断変異体」又は「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯ又はＫＯ」変異体である。一部の治療応用のために、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）の１つ以上又は全てに対するＦｃドメインの通常の結合を低減するか又は除去して、さらなる作用機序を回避することが望ましい。すなわち、例えば、特に、ＣＤ３に一価で結合する二重特異性抗体の使用において、ＡＤＣＣ活性を消去するか又は著しく低減するためにＦｃγＲＩＩＩａ結合を切断することが望ましい場合がある。いずれかの低減のレベルが考えられる（例えば、結合又は活性における５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の低減）。切断変異体の改変の例は図１１に示され、各々が、独立して且つ任意選択により含まれてもよいし、又は除外されてもよく、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される切断変異体を利用する好ましい態様を有する。本明細書で参照される切断変異体は、ＦｃγＲ結合を切断するが、一般にＦｃＲｎ結合は切断しないことが留意されるべきである。
【０１３０】
Ｄ．追加の抗体の考慮事項
本開示は、本明細書に記載される製剤における他のヘテロ二量体抗体の使用を企図する。例えば、上記の可変重鎖及び軽鎖配列、並びにｓｃＦｖ配列（及びこれらの可変重鎖及び軽鎖配列を含むＦａｂ配列）は、図面、形式及び説明文が参照により本明細書に明示的に援用される国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットの図２又は国際公開第２０１７／２１８７０７号パンフレットの図１、並びに図１Ａ及び１Ｂにおいて示されるものなどの他の形式において使用され得る。さらに、ＣＤ３結合領域及びＣＤ３８結合領域のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列、可変軽鎖及び可変重鎖配列、並びに／又は全長重鎖及び軽鎖配列）は、本明細書とともに提供され且つ図２１において要約される配列表において提供される。得られるヘテロ二量体抗体がＣＤ３及びＣＤ３８の両方と結合する限り、図２１において参照される配列の任意の組合せが本明細書において企図される。抗ＣＤ３／抗ＣＤ３８抗体はさらに、全体として及び特に抗ＣＤ３／抗ＣＤ３８抗体の説明並びにそれらのアミノ酸及び核酸配列、配列表、及び図面に関して参照により本明細書に援用される、参照文献の国際公開第２０１６／０８６１９６号パンフレット；米国特許出願公開第２０１６０２１５０６３号明細書；国際公開第２０１７／０９１６５６号パンフレット；及び米国特許第９，８２２，１８６号明細書において記載される。
【０１３１】
ＣＤ３結合に関して、ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３に対して中間の又は「中程度の」親和性を有する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含み得る。これに関して、ヘテロ二量体抗体は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０２１５０６３号明細書及び国際公開第２０１７／０９１６５６号パンフレットにおいて記載されるアッセイを使用して任意選択により測定される約１５〜５０ｎＭ（例えば、１６〜５０ｎＭ、１５〜４５ｎＭ、約２０〜４０ｎＭ、約２５〜４０ｎＭ、又は約３０〜４０ｎＭ）の親和性（ＫＤ）を有してＣＤ３に結合する。
【０１３２】
別の態様では、本方法のヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３に対する「強力な」又は「高親和性」結合体である抗ＣＤ３抗原結合ドメイン（例えば、１つの例は、（適宜荷電リンカーを任意選択により含む）Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７として示される重鎖及び軽鎖可変ドメインである）を含む。様々な実施形態において、抗体コンストラクトは、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０２１５０６３号明細書及び国際公開第２０１７／０９１６５６号パンフレットにおいて記載されるアッセイを使用して任意選択により測定される約３〜１５ｎＭ（例えば、３〜１０ｎＭ又は約４〜７ｎＭ）の親和性（ＫＤ）を有してＣＤ３に結合する。他の実施形態では、方法は、ＣＤ３に対する「軽い」又は「低親和性」結合体である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含むヘテロ二量体抗体を利用する。これに関して、ヘテロ二量体抗体は、任意選択により、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０２１５０６３号明細書及び国際公開第２０１７／０９１６５６号パンフレットにおいて記載されるアッセイを使用して任意選択により測定される約５１ｎＭ以上（例えば、５１〜１００ｎＭ）の親和性（ＫＤ）を有してＣＤ３に結合する。ヘテロ二量体抗体はまた、例えば、ＣＤ３８又はＳＴＥＡＰ１にも結合する。
【０１３３】
二重特異性抗体のＣＤ３８に関する親和性はまた、ＣＤ３８を発現する細胞を標的化する際の抗体の有効性に影響を及ぼす。ＣＤ３８に対して「中程度」又は「低」親和性を有する二重特異性抗体は、低減された毒性プロファイルを有してインビトロ及びインビボで標的細胞を効率的に殺滅することができる。様々な実施形態において、ＣＤ３８に対して「高」親和性を示す二重特異性抗体は、例えば１ｎＭ未満の親和性（ＫＤ）を有してＣＤ３８に結合し；ＣＤ３８に対して「中程度」又は「中間」の親和性を示す二重特異性抗体は、例えば、約１〜１０ｎＭ（例えば、２〜８ｎＭ又は３〜７ｎＭ）の親和性（ＫＤ）を有してＣＤ３８に結合し；ＣＤ３８に対して「低」又は「軽い」親和性を示す二重特異性抗体は、例えば、約１１ｎＭ以上（例えば、１１〜１００ｎＭ）の親和性（ＫＤ）を有してＣＤ３８に結合し、全ては、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０２１５０６３号明細書及び国際公開第２０１７／０９１６５６号パンフレットに記載される方法を使用して任意選択により測定される。
【０１３４】
一般に、特異的な結合は、例えば、抗原に対して少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、或いは少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ以上のＫＤを有する抗体によって示されてもよく、ここで、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。通常、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原に対して対照分子の２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍以上であるＫＤを有することになる。また、特定の抗原に対する特異的な結合は、例えば、対照と比較して抗原に関して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍以上の抗原又はエピトープに対するＫＡ又はＫａを有する抗体によって示されてもよく、ここで、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。抗体に関する開示はまた、抗原結合タンパク質にも適用されることが理解されるであろう。
【０１３５】
任意選択により、ヘテロ二量体抗体は、２２０位のシステインのセリンによる置換を含み；一般にこれは、ヘテロ二量体抗体の「ｓｃＦｖ単量体」側上にあるが、それはまたジスルフィド形成を減少させるために「Ｆａｂ単量体」側、又は両方に対してあってもよい。これらの置換されたシステイン（Ｃ２２０Ｓ）の一方又は両方が本明細書の配列内に具体的に含まれる。
【０１３６】
Ｅ．断片
本開示はまた、抗体断片（ｓｃＦｖなどの任意選択の追加の抗原結合ドメインと並んでＦａｂ及びＦｃドメインを一般に含む、可変及び定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を成す全長抗体から区別される）の使用を企図する。抗体断片は、ｐＩ操作など、ヘテロ二量体を生成するように操作され得る少なくとも１つの定常ドメインを含有する。使用され得る他の抗体断片は、ｐＩ操作された本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ及びＣＬドメインの１つ以上を含有する断片を含む。
【０１３７】
Ｆ．キメラ／ヒト化
ヘテロ二量体抗体は、異なる種の混合物、例えば、キメラ抗体及び／又はヒト化抗体であってもよい。一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種に由来する領域を組み合わせている抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、慣例上マウス（又は場合によってはラット）由来の可変領域及びヒト由来の定常領域を含む。「ヒト化抗体」は一般に、可変ドメインのフレームワーク領域がヒト抗体において見出される配列と交換された非ヒト抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体の全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、又はそのＣＤＲの範囲内を除いてそのような抗体と同一である。一部又は全てが非ヒト生物に起源をもつ核酸によってコードされるＣＤＲがヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植されて抗体を生成し、その特異性は、移植されたＣＤＲによって決定される。そのような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６において記載されており、これらは全て、全体として参照により援用される。対応するドナー残基に対して選択されたアクセプターフレームワーク残基の「復帰変異」が、初期移植コンストラクトにおいて失われる親和性を回復するために必要であることが多い（全てが全体として参照により援用される、米国特許第５５３０１０１号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６１号明細書；同第５６９３７６２号明細書；同第６１８０３７０号明細書；同第５８５９２０５号明細書；同第５８２１３３７号明細書；同第６０５４２９７号明細書；及び同第６４０７２１３号明細書）。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでもよく、これは通常、ヒト免疫グロブリンのものであり、したがって、通常、ヒトＦｃ領域を含むことになる。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを使用して作製され得る。全体として参照により援用されるＲｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４。非ヒト抗体のヒト化及び再構築のための様々な技術及び方法が、当技術分野でよく知られている（全てが全体として参照により援用される、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ＆Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、及びそこで引用される参考文献を参照のこと）。ヒト化の方法としては、全てが全体として参照により援用されるＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８６：１００２９−３３；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，���．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９；Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：３２１−８において記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減するヒト化又は他の方法は、例えば、全体として参照により援用されるＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３において記載されるとおりのリサーフェシング方法を含んでもよい。
【０１３８】
投与量
用語「有効用量」又は「有効投与量」は、所望の効果を達成するか又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語「治療有効用量」は、疾患にすでに罹患している患者の疾患及びその合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量又は用量は、治療される病態（適応症）、送達される抗体コンストラクト、治療の内容及び目的、疾患の重症度、前治療、患者の病歴及び治療薬に対する反応性、投与経路、体格（体重、体表面積又は臓器サイズ）及び／又は患者の状態（年齢及び全身健康状態）並びに患者自身の免疫系の全身状態に依存することになる。適当な用量は、１回の投与又は複数回にわたる投与で患者に投与できるように、また最適な治療効果を得るために主治医の判断に従って調整することができる。
【０１３９】
治療有効量の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、好ましくは、疾患症状の重症度を低下させるか、疾患症状がない期間の頻度若しくは期間を増加させるか、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは能力障害の予防をもたらす。標的細胞の抗原発現腫瘍の治療に関して、治療有効量の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）、例えば抗標的細胞抗原／抗ＣＤ３抗体コンストラクトは、好ましくは、細胞増殖又は腫瘍増殖を未治療の患者と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する分子の能力は、有効性を予測する動物モデルにおいて評価され得る。
【０１４０】
用語「有効且つ非毒性用量」は、重大な毒性作用を生じさせずに又は本質的に生じさせずに、病的細胞の激減、腫瘍の除去、腫瘍の縮小又は疾患の安定化をもたらすのに十分高い、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の許容用量を指す。そのような有効且つ非毒性用量は、例えば、当技術分野で記載される用量漸増試験によって決定されてもよく、その用量は、重篤な有害副事象（用量制限毒性、ＤＬＴ）を誘発する用量未満であるべきである。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、用語「毒性」は、有害事象又は重篤な有害事象として現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副事象は、全身的な薬物忍容性の欠如及び／又は投与後の局所的な忍容性の欠如を指す場合がある。毒性は、その薬物によって引き起こされる催奇性作用又は発癌性作用も含み得る。
【０１４２】
用語「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、投与直後に（局所耐性）及びより長期の薬物適用期間中に重篤な有害事象を誘発しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、例えば、治療中及び経過観察期間中に定期的に評価することができる。測定値は、臨床評価、例えば臓器の所見及び臨床検査値異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ標準に従って正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の所見は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に示される、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固などの基準を含み得る。試験され得る検査パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル及び尿検査並びに他の体液、例えば血清、血漿、リンパ液又は脊髄液、髄液などの検査を含む。したがって、安全性は、例えば、身体検査、画像化技術（すなわち超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的デバイスを用いた他の計測（すなわち心電図）、バイタルサインにより、検査パラメータを測定し、有害事象を記録することにより評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法において、チンパンジーではない霊長類における有害事象は、組織病理学的方法及び／又は組織化学的方法により試験され得る。
【０１４３】
上記の用語は、例えば、１９９７年７月１６日のＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓ６；ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇでも参照されている。
【０１４４】
典型的な投与量は、上記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ〜最大約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１０μｇ／ｋｇ〜最大約１０ｍｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ〜最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。製剤は、ヘテロ二量体抗体が、例えば、体重のキログラム当たり０．１〜５０ｍｇの範囲の抗体（化学修飾を伴わないタンパク質単独の質量を計算する）の用量を達成する単位用量で提供されるように提供され得る。
【０１４５】
製剤の治療上の使用
本明細書に記載される製剤は、それを必要とする患者において、本明細書に記載される病的な医学的状態を治療、改善及び／又は予防する医薬組成物として有用である。用語「治療」は、治療的治療及び予防的又は抑止的手段の両方を指す。治療は、疾患、疾患の症状又は疾患素因を治癒する、治す、軽減する、緩和する、変化させる、矯正する、改善する、好転させる又は影響を与えることを目的とした、疾患／障害、疾患／障害の症状又は疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織又は細胞に対する製剤の適用又は投与を含む。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、用語「改善」は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質を含む組成物のそれを必要とする対象への投与による、本明細書の以下に示す腫瘍又は癌若しくは転移性癌を有する患者の疾患状態のあらゆる好転を指す。そのような好転は、患者の腫瘍又は癌若しくは転移性癌の進行の緩徐化又は停止として見られる場合もある。本明細書で使用する場合、用語「予防」は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（すなわち、抗体コンストラクト）を含む組成物のそれを必要とする対象への投与による、本明細書の以下に示す腫瘍又は癌若しくは転移性癌を有する患者の発症又は再発の回避を意味する。
【０１４７】
一実施形態では、本発明は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患又は免疫障害の治療又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に本明細書に記載される製剤を投与する工程を含む方法を提供する。用語「疾患」は、本明細書に記載される医薬組成物による治療から利益を得ることになる任意の状態を指す。これには、哺乳類において問題の疾患の素因になる病理学的状態を含めた慢性及び急性障害又は疾患が含まれる。用語「ウイルス性疾患」は、対象のウイルス感染の結果である疾患を表す。用語「免疫障害」は、自己免疫疾患、過敏症、免疫不全などの免疫障害を含むこの用語の一般的な定義に沿って本明細書で使用される。
【０１４８】
「新生物」は、必ずというわけではないが、通常、腫瘤を形成する組織の異常な増殖である。腫瘤も形成する場合、それは、一般に「腫瘍」と称される。新生物又は腫瘍は、良性、潜在性悪性（前癌性）又は悪性であり得る。悪性新生物は、一般に癌と呼ばれる。それらは、通常、周囲の組織に侵入してそれを破壊し、転移を形成し得、すなわち、それらは、身体の他の部分、組織又は臓器に広がる。したがって、用語「転移性癌」は、原発腫瘍のもの以外の他の組織又は臓器への転移を包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明の目的において、それらは、用語「腫瘍」又は「癌」にも包含される。用語「必要とする対象」又は「治療を必要とする」対象は、すでにその障害を有する対象及びその障害を予防しようとする対象を含む。必要とする対象又は「患者」は、予防的治療又は治療的治療のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
【０１４９】
投与経路
例示的な投与経路としては、局所経路（例えば、皮膚上、吸入、鼻、点眼、耳介／耳、膣、粘膜）；経腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸）；及び非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、医薬製剤は、非経口、例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内投与される。非経口投与は、ボーラス注射などの注射、又は持続注入などの注入によって実現され得る。投与は、長期間放出のためのデポーを介して実現され得る。いくつかの実施形態では、製剤は、初回のボーラス後に持続注入によって静脈内投与されて、薬物製品の治療上の循環レベルを維持する。いくつかの実施形態では、製剤は、１回用量として投与される。医薬組成物は、医療装置を使用して投与され得る。医薬組成物の投与用医療装置の例については、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書に記載されている。
【０１５０】
特に、本発明は、好適な組成物の中断のない投与を実現する。非限定的な例として、中断のない又は実質的に中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療薬の流入を調整するための、患者が装着した小型ポンプシステムによって実現され得る。医薬組成物は、前記ポンプシステムを使用することによって投与することができる。そのようなポンプシステムは、一般に当技術分野で知られており、通常、注入する治療薬を含有するカートリッジの定期交換に依拠する。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、交換時以外には中断しない患者体内への治療薬の流入に一時的な中断が結果として生じる場合がある。そのような場合でも、カートリッジ交換前の投与段階及びカートリッジ交換後の投与段階は、依然として、ともにこのような治療薬の「中断のない投与」を構成する本発明の医薬的手段及び方法の意味の範囲内と見なされるであろう。
【０１５１】
製剤の連続投与又は中断のない投与は、流体をレザバーから送り出すための流体送出機構及び送出機構を駆動するための駆動機構を含む、流体送達デバイス又は小型ポンプシステムによる静脈内又は皮下投与であり得る。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚に穿通し、好適な組成物を患者体内に送達するための針又はカニューレを含み得る。前記ポンプシステムを、静脈、動脈又は血管を問わず、患者の皮膚に直接固定又は装着することでポンプシステムと患者の皮膚とを直接接触させることが可能になる。このポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間〜数日間装着することができる。レザバーの容積が小さい小型のポンプシステムの場合もある。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物のためのレザバーの容積は、０．１〜５０ｍｌであり得る。
【０１５２】
連続投与は、皮膚に装着され時折交換されるパッチによって経皮的でもあり得る。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。経皮投与は、例えば、第１の使用済みパッチの直接隣の皮膚表面に、第１の使用済みパッチを除去する直前に、新しい第２のパッチを装着すると同時に第１の使用済みパッチの交換を完了できる有利さがあることから、中断のない投与に特に適していることに注目されたい。流入の中断又は電池故障の問題は生じない。
【０１５３】
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、まず凍結乾燥材料を投与前に適切な液体で再構成する。凍結乾燥材料を、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は凍結乾燥前にタンパク質が存在した同じ製剤で再構成し得る。医薬組成物は、１回の治療で投与するか、又は必要に応じて抗癌療法などの追加の療法、例えば他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と併用して投与することができる。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明の組成物と同時に投与され得るか、又は前記製剤の投与前若しくは投与後に既定の時間間隔及び用量で別々に投与され得る。
【０１５４】
キット
さらなる態様として、本明細書に記載されるのは、対象への投与のためのそれらの使用を容易にする様式でパッケージ化された本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物を含むキットである。一実施形態では、そのようなキットは、任意選択により容器に貼付されたラベルを伴って密封ボトル、容器、単回使用若しくは複数回使用用バイアル、プレフィルドシリンジ、又はプレフィルド注射デバイスなどの容器にパッケージ化されるか、又は方法を実践する際の化合物又は組成物の使用を記載するパッケージに含まれる、本明細書に記載される製剤（例えば、本明細書に記載される抗体を含む組成物）を含む。一態様では、組成物は、単位剤形にパッケージ化される。キットはさらに、特定の投与経路に従う組成物を投与するのに好適なデバイスを含んでもよい。好ましくは、キットは、本明細書に記載される抗体又は本明細書に記載される製剤の使用を記載するラベルを含有する。
【０１５５】
本明細書に記載される医薬組成物は、様々な形態、例えば固体、液体、凍結、気体又は凍結乾燥の形態で製剤化することができ、とりわけ軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアロゾル、顆粒剤、丸剤、懸濁液、エマルジョン、カプセル、シロップ剤、液体、エリキシル剤、抽出物、チンキ又は流エキスの形態であり得る。
【０１５６】
一般に、本発明の医薬組成物に関して、すなわち、意図される投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて様々な保管形態及び／又は剤形が考えられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（２０１２）を参照されたい）。当業者であれば、このような特定の剤形の選択は、例えば、抗体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得ることを認識するであろう。
【０１５７】
例えば、医薬組成物中の主なビヒクル又は担体は、本質的に水性又は非水性であり得る。好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンを混合した生理食塩水もさらなる例示的なビヒクルである。
【実施例】
【０１５８】
材料及び方法
ＳＥ−ＵＨＰＬＣ：サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーは、組換え体モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はＸ−ｍＡｂの定量的分析のための方法である。ＳＥ−ＵＨＰＬＣは、流体力学的体積の違いに基づいて、タンパク質を分離する。より大きい流体力学的体積を有する分子は、より小さい体積を有する分子よりも早く溶出する。試料は、ＳＥ−ＵＨＰＬＣカラム（ＢＥＨ２００、４．６ｘ３００ｍｍ、（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１８６００５２２６））上にロードされ、均一濃度で分離され、溶出液はＵＶ吸光度によってモニターされる。積分された総面積と比較した分離された各成分のパーセンテージを計算することによって純度が決定される。ＳＥ−ＵＨＰＬＣの設定は以下のとおりである：流速：０．４ｍＬ／分、実行時間：１２分、ＵＶ検出：２８０ｎｍ、カラム温度：周囲温度、標的タンパク質負荷：６μｇ、タンパク質適合性フローセル：５ｍｍ。
【０１５９】
カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、荷電変異体分布に対する定量的純度分析のための方法である。移動相Ａ：１ｘＣＸ−１  ｐＨ勾配緩衝剤Ａ、ｐＨ５．６（１０ｘＣＸ−１  ｐＨ勾配緩衝剤Ａ、ｐＨ５．６、２５０ｍＬ及び移動相Ｂ：１ｘＣＸ−１  ｐＨ勾配緩衝剤、ｐＨ１０．２。
【０１６０】
ＣＥ−ＨＰＬＣ：カチオン交換高速液体クロマトグラフィーは、荷電変異体分布に対する定量的純度分析のための方法である。移動相Ａ：２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ６．７及び移動相Ｂ：２５ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ６．７。抗体ＡのＣＥ−ＨＰＬＣのために使用されるカラムは、Ｂｉｏ  Ｍａｂ  ＮＰ−５、４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５１９０−２４０７）である。ＣＥ−ＨＰＬＣ法の設定は、以下のとおりである：流速：０．７５ｍＬ／分、実行時間：６０分、カラム温度設定点：３０℃±５℃、検出波長：２８０ｎｍ、標的タンパク質負荷：２０μｇ。抗体ＢのＣＥ−ＨＰＬＣ法のために使用されるカラムは、ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ＳＰ−Ｆ、４．６ｘ１００ｍｍ、５μｍ（ＹＭＣ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、ＳＦ００Ｓ０５−１０４６ＷＰ）である。ＣＥ−ＨＰＬＣ法の設定は、以下のとおりである：流速：１．０ｍＬ／分、実行時間：４５分、オートサンプラー温度設定点：５±３℃、カラム温度設定点：３０±２℃、検出波長：２８０ｎｍ、標的タンパク質負荷：７０±１０ｕｇ。
【０１６１】
ｒＣＥ−ＳＤＳ：還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウムは、変性及び還元条件下での定量的純度分析のための方法である。
【０１６２】
ＭＡＭ：多属性法は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのオービトラップ型質量分析計及びＣｈｒｏｍｅｌｅａｏｎソフトウェアを使用する複数の製品品質属性（ＰＱＡ）（酸化、異性化、脱アミド及び糖化）のための方法である。熱ストレス（４０℃でのインキュベーション）時の化学修飾は、ペプチドマッピングを使用して測定された。タンパク質を酵素的に消化し、得られたペプチドを、逆相クロマトグラフィーを使用して分離した。タンパク質をグアニジンＨＣｌで変性させ、続いてジチオトレイトール（ＤＴＴ）で還元した。ＤＴＴ中でのインキュベーション後、遊離システイン残基をヨード酢酸の添加によってアルキル化した。次に、試料を、消化のために５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、２０ｍＭメチオニン、ｐＨ７．８に緩衝剤交換した。トリプシン及びエラスターゼを、別々の反応チューブに加えた（酵素対タンパク質比  １：２０）。試料を、それぞれ３７℃で６０分間及び３７℃で３０分間消化した。グアニジンＨＣｌ、２５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．７を添加することによって、消化を抑えた。
【０１６３】
凍結乾燥された薬物製品の含水量は、オーブンによる熱量滴定によって決定された。凍結乾燥された薬物製品についての含水限界は、２％である。カール・フィッシャー法の原理は、熱量滴定によって決定された試料中の含水量に基づく。水は、オーブン中の試料を加熱することによって放出される。乾燥空気又は窒素などの不活性ガスが蒸発した水分を滴定装置に運んだ。存在する水の量は、滴定中に生成したクーロン（電流／時間）の量を測定することによって決定される。全ての水が滴定によって消費されたとき、過剰のヨウ素が発生する。終点は、一定の強さの交流を２つのＰｔ電極にかけることによって容積に関して示される。これは、最小限の量の遊離ヨウ素の存在下で大幅に低下する指標電極のＰｔ線間の電圧差をもたらす。この電圧差を使用して、滴定の終点を決定する。
【０１６４】
実施例１−低ｐＨ製剤中の抗体安定性
以下の実施例は、様々なタンパク質濃度（すなわち、１ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬ）の液体製剤又は凍結乾燥製剤のいずれかにおいて、様々な異なる温度（４℃、２５℃、４０℃、−３０℃及び−４０℃）で最大３年間、本明細書に記載されるヘテロ二量体抗体の安定性を検証するためのアッセイを記載する。ヘテロ二量体抗体の安定性は、以下のアッセイを使用して分析された：外観（各時点での２０個のバイアルの目視検査を介する）、ｐＨ、重量オスモル濃度、ＣＥ−ＨＰＬＣ、ｒＣＥ、ＭＡＭ（多属性法）及びカール・フィッシャー（含水量）。検証試験の試料は、５ｃｃのバイアル中に充填された１．３ｍＬであった。ヘテロ二量体抗体ＤＳ（ポリソルベート８０を含まない材料）は、１０．６ｍｇ／ｍＬであり、５ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬに達するまで緩衝剤（Ｇ４２Ｓｕ）で希釈された。製剤は、３２６ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度値を有するＧ４２ＳｕＴ製剤中において等張であった。
【０１６５】
ヘテロ二量体抗体の安定性は、以下の製剤において評価された：
製剤Ａ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の１ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の凍結乾燥製剤；
製剤Ｂ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の５ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の凍結乾燥製剤；
製剤Ｃ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の５ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の液体製剤；及び
製剤Ｄ：１０ｍＭ  酢酸塩、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ５．２中の１ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の液体製剤。
【０１６６】
結果：
抗体Ａは、製剤Ｃ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にＳＥ−ＵＨＰＬＣを介して１３．４％のメインピークの減少を有することが決定された。図２３を参照されたい。対照的に、抗体Ａは、製剤Ａ（図２２Ａ）及び製剤Ｂ（図２２Ｂ）中で製剤化された場合、同じ条件下でのＳＥ−ＵＨＰＬＣを介して、それぞれ０．２％及び０．０％のメインピークの減少を有することが決定された。抗体Ａは、製剤Ｃ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にＣＥ−ＨＰＬＣを介して５８．２％のメインピークの減少を有することが決定された。図２５を参照されたい。対照的に、抗体Ａは、製剤Ａ（図２４Ａ）及び製剤Ｂ（図２４Ｂ）中で製剤化された場合、同じ条件下でのＣＥ−ＨＰＬＣを介して、それぞれ１０．５％及び０．５％のメインピークの減少を有することが決定された。
【０１６７】
抗体Ａは、製剤Ａ中で製剤化された場合、−３０℃で３ヶ月後にｒＣＥを介して２．９％のメインピークの減少を示した（図２６）。抗体Ａは、製剤Ｃ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にｒＣＥを介して１９．９％のメインピークの減少を示した。図２８を参照されたい。しかしながら、抗体Ａは、製剤Ａにおいて（図２６）、４０℃で３ヶ月後にｒＣＥを介して０．６％のメインピークの減少を示し、製剤Ｂ中で製剤化された場合、ｒＣＥを介して０．０％のメインピークの減少を示した。図２７を参照されたい。
【０１６８】
抗体Ａは、製剤Ｃ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にＭＡＭを介してＮ１０３（ＣＤ３  ｓｃＦｖ−ＦＣ）にて９．１％の脱アミドを示した。図２９の最後の列を参照されたい。対照的に、抗体Ａは、製剤Ｂ中で製剤化された場合、ＭＡＭを介して０．３％の脱アミドを示した。図２９の右から２番目の列を参照されたい。抗体Ａは、製剤Ｄ中で製剤化された場合、４０℃で４週間後にＭＡＭを介してＮ１０３（ＣＤ３  ｓｃＦｖ−ＦＣ）にて１３．８％の脱アミドを示し（図３０を参照のこと）、製剤Ｃ中で製剤化された場合、４０℃で１ヶ月後にＭＡＭを介してＮ１０３（ＣＤ３  ｓｃＦｖ−ＦＣ）にて３．７％の脱アミドを示した。図３１を参照されたい。対照的に、抗体Ａは、製剤Ｂ中で製剤化された場合、４０℃で１ヶ月後にＭＡＭを介して０．４％の脱アミドを示した。図３１を参照されたい。
【０１６９】
本明細書に提供されるデータは、凍結乾燥製剤Ａ及び凍結乾燥製剤Ｂが、液体製剤中の脱アミドのリスクが高いために液体製剤Ｃ及び液体製剤Ｄより安定であることを実証している。
【０１７０】
実施例２−低ｐＨ製剤中の抗体安定性
以下の実施例は、様々なタンパク質濃度（例えば、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬ）の液体製剤又は凍結乾燥製剤において、様々な異なる温度（４℃、２５℃、４０℃、−３０℃及び−４０℃）で様々な時点にて、本明細書に記載されるヘテロ二量体抗体の安定性を検証するためのアッセイを記載する。ヘテロ二量体抗体の安定性は、以下の製剤において評価された：
製剤Ｅ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の１ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の凍結乾燥製剤；
製剤Ｆ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の５ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の凍結乾燥製剤；
製剤Ｇ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の２０ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の凍結乾燥製剤；
製剤Ｈ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の１ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の液体製剤；
製剤Ｉ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の５ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の液体製剤；及び
製剤Ｊ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の２０ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の液体製剤。
【０１７１】
凍結乾燥製剤Ｅ〜Ｇの安定性は、液体液体製剤Ｈ〜Ｊの安定性と比較された。
【０１７２】
ヘテロ二量体抗体の安定性は、以下のアッセイを使用して分析された：外観（各時点での２０個のバイアルの目視検査を介する）、ｐＨ、重量オスモル濃度、ＣＥ−ＨＰＬＣ、ｒＣＥ、ＭＡＭ（多属性法）及びカール・フィッシャー（含水量）。検証試験の試料は、５ｃｃのバイアル中に充填された１．３ｍＬであった。製剤Ｅ〜Ｇは、それぞれ３１４ｍＯｓｍ／ｋｇ及び３１１ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度値を有して等張であった。試験された製剤のいずれにおいてもタンパク質性粒子は観察されなかった。
【０１７３】
ヘテロ二量体抗体の安定性は、以下の製剤において評価された：
結果：
抗体Ａは、製剤Ｊ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にＣＥＸを介して３４．７％のメインピークの減少を有することが決定された。対照的に、抗体Ａは、製剤Ｇ中で製剤化された場合、同じ条件下でＣＥＸを介して２．８％のメインピークの減少を有することが決定された。表２を参照されたい。
【０１７４】
【表２】
2021512881.tif 000003
【０１７５】
抗体Ａは、製剤Ｊ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にＳＥ−ＵＨＰＬＣを介して１５．３％のメインピークの減少を有することが決定された。対照的に、抗体Ａは、製剤Ｇ中で製剤化された場合、同じ条件下でＳＥ−ＵＨＰＬＣを介して１．６％のメインピークの減少を有することが決定された。表３を参照されたい。
【０１７６】
【表３】
2021512881.tif 000004
【０１７７】
抗体Ａは、製剤Ｊ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にｒＣＥを介して３．７％のメインピークの減少を示した。しかしながら、抗体Ａは、製剤Ｇ中において４０℃で３ヶ月後にｒＣＥを介して０．０％のメインピークの減少を示した。表４を参照されたい。
【０１７８】
【表４】
2021512881.tif 000005
【０１７９】
製剤Ｇ中で製剤化された場合、抗体Ａは、実施例１において上に記載される製剤Ｂと同じ％脱アミドを示すと予想される。
【０１８０】
本明細書に提供されるデータは、凍結乾燥製剤Ｇが、試験された時点で製剤Ｇにおいて観察されたメインピークの減少の減少％によって実証されるとおり、液体製剤Ｊより安定であることを実証している。また、ヘテロ二量体抗体濃度２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する製剤Ｊが、製剤Ａ（ヘテロ二量体抗体１ｍｇ／ｍＬ）及びＢ（ヘテロ二量体抗体５ｍ／ｍＬ）と同様のメインピークの減少の％を有することが決定され、これは、製剤Ｊ（２０ｍｇ／ｍＬ）中においてより高い濃度で存在するヘテロ二量体抗体のために驚くべきことであると判断された。
【０１８１】
実施例３−低ｐＨ製剤中の抗体安定性
以下の実施例は、１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の液体製剤又は凍結乾燥製剤において、様々な異なる温度（４℃、２５℃、４０℃、−３０℃及び−４０℃）で最大３年間、本明細書に記載されるヘテロ二量体抗体の安定性を検証するためのアッセイを記載する。ヘテロ二量体抗体の安定性は、以下の製剤において評価された：
製剤Ｋ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の１０ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の凍結乾燥製剤；及び
製剤Ｌ：１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ４．２中の１０ｍｇ／ｍＬ  ヘテロ二量体抗体の液体製剤。
【０１８２】
凍結乾燥製剤Ｋの安定性は、液体製剤Ｌの安定性と比較された。この試験において、抗体Ｂが利用された。
【０１８３】
ヘテロ二量体抗体の安定性は、以下のアッセイを使用して分析された：外観（各時点での２０個のバイアルの目視検査を介する）、ｐＨ、重量オスモル濃度、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ｒＣＥ、ＭＡＭ（多属性法）及びカール・フィッシャー（含水量）。検証試験の試料は、５ｃｃのバイアル中に充填された１．３ｍＬであった。製剤Ｋは、３０５ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度値を有して等張であった。試験された製剤のいずれにおいてもタンパク質性粒子は観察されなかった。
【０１８４】
ヘテロ二量体抗体の安定性は、以下の製剤において評価された：
結果：
抗体Ｂは、製剤Ｌ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にＣＥＸを介して３４．５のメインピークの減少を有することが決定された。対照的に、抗体Ｂは、製剤Ｋ中で製剤化された場合、同じ条件下でＣＥＸを介して０．７％のメインピークの減少を有することが決定された。表５を参照されたい。
【０１８５】
【表５】
2021512881.tif 000006
【０１８６】
抗体Ｂは、製剤Ｌ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にＳＥ−ＨＰＬＣを介して２２．５％のメインピークの減少を有することが決定された。対照的に、抗体Ｂは、製剤Ｋ中で製剤化された場合、同じ条件下でＣＥＸを介して０．７％のメインピークの減少を有することが決定された。ＳＥ−ＨＰＬＣデータに関しては、表６を参照されたい。
【０１８７】
【表６】
2021512881.tif 000007
【０１８８】
抗体Ｂは、製剤Ｌ中で製剤化された場合、４０℃で３ヶ月後にＭＡＭを介して６．８％の脱アミドを示した。表７を参照されたい。対照的に、抗体Ｂは、製剤Ｋ中で製剤化された場合、ＭＡＭを介して＜０．６％の脱アミドを示した。
【０１８９】
【表７】
2021512881.tif 000008
【０１９０】
本明細書に提供されるデータは、凍結乾燥製剤Ｋが、液体製剤中の脱アミドのリスクが高いために液体製剤Ｌより安定であることを実証している。
【図１Ａ】
2021512881.tif 000009
【図１Ｂ】
2021512881.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
2021512881.tif 000013
【図５】
2021512881.tif 000014
【図６】
2021512881.tif 000015
【図７】
2021512881.tif 000016
【図８】
2021512881.tif 000017
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2021512881.tif 000019
【図９Ｃ】
2021512881.tif 000020
【図９Ｄ】
2021512881.tif 000021
【図９Ｅ】
2021512881.tif 000022
【図１０】
2021512881.tif 000023
【図１１】
2021512881.tif 000024
【図１２】
2021512881.tif 000025
【図１３Ａ】
2021512881.tif 000026
【図１３Ｂ】
2021512881.tif 000027
【図１４】
2021512881.tif 000028
【図１５Ａ】
2021512881.tif 000029
【図１５Ｂ】
2021512881.tif 000030
【図１６Ａ】
2021512881.tif 000031
【図１６Ｂ】
2021512881.tif 000032
【図１７】
2021512881.tif 000033
【図１８】
2021512881.tif 000034
【図１９】
2021512881.tif 000035
【図２０】
2021512881.tif 000036
【図２１−１】
2021512881.tif 000037
【図２１−２】
2021512881.tif 000038
【図２１−３】
2021512881.tif 000039
【図２１−４】
2021512881.tif 000040
【図２１−５】
2021512881.tif 000041
【図２１−６】
2021512881.tif 000042
【図２１−７】
2021512881.tif 000043
【図２１−８】
2021512881.tif 000044
【図２１−９】
2021512881.tif 000045
【図２１−１０】
2021512881.tif 000046
【図２１−１１】
2021512881.tif 000047
【図２１−１２】
2021512881.tif 000048
【図２１−１３】
2021512881.tif 000049
【図２１−１４】
2021512881.tif 000050
【図２１−１５】
2021512881.tif 000051
【図２１−１６】
2021512881.tif 000052
【図２１−１７】
2021512881.tif 000053
【図２１−１８】
2021512881.tif 000054
【図２１−１９】
2021512881.tif 000055
【図２１−２０】
2021512881.tif 000056
【図２１−２１】
2021512881.tif 000057
【図２１−２２】
2021512881.tif 000058
【図２１−２３】
2021512881.tif 000059
【図２２Ａ】
2021512881.tif 000060
【図２２Ｂ】
2021512881.tif 000061
【図２３】
2021512881.tif 000062
【図２４Ａ】
2021512881.tif 000063
【図２４Ｂ】
2021512881.tif 000064
【図２５】
2021512881.tif 000065
【図２６】
2021512881.tif 000066
【図２７】
2021512881.tif 000067
【図２８】
2021512881.tif 000068
【図２９】
2021512881.tif 000069
【図３０−１】
2021512881.tif 000070
【図３０−２】
2021512881.tif 000071
【図３１】
2021512881.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月6日(2020.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021512881000001.app
【国際調査報告】
2021512881.tif 000073
2021512881.tif 000074
2021512881.tif 000075
2021512881.tif 000076