(57)【要約】本明細書に開示されるのは、改変された、非天然真核細胞において、特徴的なグリカン構造を有するプロテオグリカンを生成する方法である。これらの方法は、ダイナミックレンジのタンパク質グリコシル化をアクセス可能にする。これらのプロテオグリカンを生成することを可能にする改変された、非天然真核細胞の組成物もまた本明細書に開示される。
2021528074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたゲノムを含む、改変された、非天然真核細胞であって、ここで、改変されたゲノムは、
（ａ）グリカン修飾酵素をコードする少なくとも１つの内在性ポリ核酸配列のノックアウト；および
（ｂ）（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列を含む、少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、ここで、グリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列は、グリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する調整可能な制御エレメントに作動可能に連結されている；
を含む、前記改変された、非天然真核細胞。
【請求項２】
（ｂ）における調整可能な制御エレメントが、誘導性プロモーターエレメント、合成プロモーターパネル、ｍｉＲＮＡ応答エレメント、およびＯＲＦ制御エレメントからなる群から選択される、請求項１に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項３】
改変された、非天然真核細胞が、（ｂ）少なくとも２つのポリ核酸配列の組み込みを含み、ここで、各ポリ核酸配列は、（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含み、ここで、グリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列は、グリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する調整可能な制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項４】
（ｂ）における少なくとも２つのポリ核酸配列の各々の調整可能な制御エレメントがユニークである、請求項３に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項５】
（ｂ）における少なくとも２つのポリ核酸配列の少なくとも１つの調整可能な制御エレメントが、誘導性プロモーターエレメント、合成プロモーターパネル、ｍｉＲＮＡ応答エレメント、およびＯＲＦ制御エレメントからなる群から選択される、請求項３または４に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項６】
誘導性プロモーターが、化学調節プロモーターまたは物理調節プロモーターである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項７】
化学調節プロモーターが、ＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔプロモーター配列またはＰｈｌＦ活性化可能プロモーター配列を含む、請求項６に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項８】
（ａ）におけるグリカン修飾酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、およびモノアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項９】
（ａ）におけるグリカン修飾酵素が、ＦＵＴ８である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１０】
（ａ）におけるグリカン修飾酵素が、β４ＧＡＬＴ１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１１】
改変された、非天然真核細胞のゲノムが、少なくとも２つのグリカン修飾酵素のノックアウトを含み、ここで、少なくとも２つのグリカン修飾酵素の１つは、ＦＵＴ８であり、少なくとも２つのグリカン修飾酵素の１つは、β４ＧＡＬＴ１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１２】
改変された、非天然真核細胞が、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質の配列を含むポリ核酸配列の組み込みをさらに含み、ここで、目的のタンパク質は、グリカンの付加により修飾され得る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１３】
目的のタンパク質が、免疫グロブリンである、請求項１２に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１４】
免疫グロブリンが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭクラスに属する、請求項１３に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１５】
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンである、請求項１３または１４に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１６】
真核細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ−７細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１７】
真核細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１８】
グリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、および／または構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質の配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込みが、１以上のランディングパッドにおけるものである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項１９】
特徴的なグリカン構造を含む糖タンパク質を生成する方法であって、改変されたゲノムを含む非天然真核細胞において、少なくとも１つの目的のタンパク質および少なくとも１つのグリカン修飾酵素を発現することを含み、ここで、改変されたゲノムは、
（ａ）グリカン修飾酵素をコードする少なくとも１つの内在性ポリ核酸配列のノックアウト；
（ｂ）（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、ここで、グリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列は、グリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する調整可能な制御エレメントに作動可能に連結されている；および
（ｃ）構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、ここで、少なくとも１つの目的のタンパク質の各々は、タンパク質として発現される場合、グリカンの付加により修飾され得る；
を含む、前記方法。
【請求項２０】
（ｂ）における調整可能な制御エレメントが、誘導性プロモーターエレメント、合成プロモーターパネル、ｍｉＲＮＡ応答エレメント、およびＯＲＦ制御エレメントからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
改変された、非天然真核細胞が、（ｂ）少なくとも２つのポリ核酸配列の組み込みを含み、ここで、各ポリ核酸配列は、（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含み、ここで、グリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列は、グリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する調整可能な制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｂ）における少なくとも２つのポリ核酸配列の各々の調整可能な制御エレメントがユニークである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｂ）における少なくとも２つのポリ核酸配列の少なくとも１つの調整可能な制御エレメントが、誘導性プロモーターエレメント、合成プロモーターパネル、ｍｉＲＮＡ応答エレメント、およびＯＲＦ制御エレメントからなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
誘導性プロモーターが、化学調節プロモーターまたは物理調節プロモーターである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
化学調節プロモーターが、ＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔプロモーター配列またはＰｈｌＦ活性化可能プロモーター配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）におけるグリカン修飾酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、およびモノアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）におけるグリカン修飾酵素が、ＦＵＴ８である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）におけるグリカン修飾酵素が、β４ＧＡＬＴ１である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
改変された、非天然真核細胞のゲノムが、少なくとも２つのグリカン修飾酵素のノックアウトを含み、ここで、少なくとも２つのグリカン修飾酵素の１つが、ＦＵＴ８であり、少なくとも２つのグリカン修飾酵素の１つが、β４ＧＡＬＴ１である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
（ｃ）の目的のタンパク質が、免疫グロブリンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
免疫グロブリンが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭクラスに属する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
真核細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ−７細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の改変された、非天然真核細胞。
【請求項３４】
真核細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
グリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、および／または構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質の配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込みが、１以上のランディングパッドにおけるものである、請求項１９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１９〜３５のいずれか一項に記載の方法によって生成された、免疫グロブリン。
【請求項３７】
少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％フコシル化を含む、請求項３６に記載の免疫グロブリン。
【請求項３８】
少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％ガラクトシル化を含む、請求項３６に記載の免疫グロブリン。
【請求項３９】
少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％シアリル化を含む、請求項３６に記載の免疫グロブリン。
【請求項４０】
（ａ）少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％フコシル化；および／または
（ｂ）少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％ガラクトシル化；および／または
（ｃ）少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％シアリル化
を含む、請求項３６に記載の免疫グロブリン。
【請求項４１】
請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの免疫グロブリンを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１８年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／６８７，６４８号に対する優先権を主張し、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本明細書に開示されるのは、改変された、非天然真核細胞において、特徴的なグリカン構造を有するプロテオグリカンを生成する方法である。これらの方法は、ダイナミックレンジのタンパク質グリコシル化をアクセス可能にする。これらのプロテオグリカンを生成することを可能にする改変された、非天然真核細胞の組成物もまた本明細書に開示される。
【背景技術】
【０００３】
背景
タンパク質グリコシル化は、薬物動態特性や効能などの、治療用タンパク質のin vivoおよびin vitro構造上のおよび機能上の特性に影響を与え得る。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、いくつかのがんおよび自己免疫疾患の処置を含む多種多様の治療用途に利用されている（Weiner L.M., et al., Cell. 2012 Mar 16; 148(6): 1081-84; Jefferis R., Trends Pharmacol. Sci. 2009 Jul; 30(7): 356-62；Chiu M.L. and Gilliland G.L., Curr. Opin. Struct. Biol. 2016 Jun; 38: 163-73）。Ｎ連結型グリコシル化は、ｍＡｂの構造、機能、および薬物動態に有意に影響を及ぼす（Liu L., J. Pharm. Sci. 2015 Jun; 104(6): 1866-84）。高レベルの不均一性は、Ｎ連結型グリコシル化組成物、分岐および連結位置異性化に関して存在する。この高レベルの不均一性およびこれらの異なるグリコフォームが機能に与える影響の結果として、特徴的なＮ連結型グリカン構造を有する生成物を得るための糖鎖工学バイオ医薬品への関心が高まっている。Ｎ結合型グリコシル化を操作するための１つの戦略は、培養温度、ｐＨ、および供給源などのインプロセス制御に基づいている（Li F., et al., MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 466-79）。他の選択肢は、グリコシルトランスフェラーゼ活性またはタンパク質発現レベルをノックダウンするための特定のインヒビターまたはＲＮＡｉ構築物の使用を含む。加えて、グリコシルトランスフェラーゼレベルは、関連する遺伝子をサイレンシングまたは除去すること、および単糖類生合成に必要な遺伝子を除去することによって有意に低減させることができる。このアプローチを使用したアフコシル化タンパク質を生成するいくつかの例は実証されている（Kanda Y., et al., J. Biotechnol. 2007 Jun 20; 130(3): 300-10; Yamane-Ohnuki N., et al., Biotechnol. Bioeng. 2004 Sep 5; 87(5): 614-22；Mori K., et al., Biotechnol. Bioeng. 2004 Dec 30; 88(7): 901-8；Yang Z., et al., Nat. Biotechnol. 2015 Aug; 33(8): 842-44）。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書に開示されるのは、改変された、非天然真核細胞において、特徴的なグリカン構造を有するプロテオグリカンを生成する方法である。ゲノム改変のこの経路は、これまでに観察されていない、ダイナミックレンジのタンパク質グリコシル化をアクセス可能にする。また本明細書に開示されるのは、これらのプロテオグリカンを生成することを可能にする改変された、非天然真核細胞の新規な組成物である。開示された細胞により、および開示された方法に従って生成され得るプロテオグリカンは、糖タンパク質、モノクローナル抗体、Ｆｃ融合タンパク質、および他の改変されたタンパク質などの、宿主細胞においてグリコシル化および発現される任意の治療用タンパク質を含む。
【０００５】
いくつかの側面において、本開示は、改変されたゲノムを含む、改変された、非天然真核細胞であって、ここで改変されたゲノムは、（ａ）グリカン修飾酵素をコードする少なくとも１つの内在性ポリ核酸配列のノックアウト；および（ｂ）（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列を含む、少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、ここでグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列は、グリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する調整可能な制御エレメントに作動可能に連結されている；を含む、前記改変された、非天然真核細胞を提供する。
【０００６】
いくつかの態様において、（ｂ）における調整可能な制御エレメントは、誘導性プロモーターエレメント、合成プロモーターパネル、ｍｉＲＮＡ応答エレメント、およびＯＲＦ制御エレメントからなる群から選択される。
【０００７】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞は、（ｂ）少なくとも２つのポリ核酸配列の組み込みを含み、ここで各ポリ核酸配列は、（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含み、ここでグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列は、グリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する調整可能な制御エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの態様において、（ｂ）における少なくとも２つのポリ核酸配列の各々の調整可能な制御エレメントは、ユニークである。いくつかの態様において、（ｂ）における少なくとも２つのポリ核酸配列の少なくとも１つの調整可能な制御エレメントは、誘導性プロモーターエレメント、合成プロモーターパネル、ｍｉＲＮＡ応答エレメント、およびＯＲＦ制御エレメントからなる群から選択される。
【０００８】
改変された、非天然真核細胞のいくつかの態様において、（ｂ）における調整可能な制御エレメントは、誘導性プロモーターを含む。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、化学調節プロモーターまたは物理調節プロモーターである。いくつかの態様において、化学調節プロモーターは、ＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔプロモーター配列またはＰｈｌＦ活性化可能プロモーター配列を含む。
【０００９】
いくつかの態様において、（ａ）におけるグリカン修飾酵素は、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、およびモノアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。いくつかの態様において、（ａ）におけるグリカン修飾酵素は、ＦＵＴ８である。いくつかの態様において、（ａ）におけるグリカン修飾酵素は、β４ＧＡＬＴ１である。いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞のゲノムは、少なくとも２つのグリカン修飾酵素のノックアウトを含み、ここで少なくとも２つのグリカン修飾酵素１つは、ＦＵＴ８であり、および少なくとも２つのグリカン修飾酵素１つは、β４ＧＡＬＴ１である。
【００１０】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞は、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質の配列を含むポリ核酸配列をさらに含み、ここで目的のタンパク質は、グリカンの付加により修飾され得る。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、免疫グロブリンである。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭクラスに属する。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンである。
【００１１】
いくつかの態様において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ−７細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞である。いくつかの態様において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。
いくつかの態様において、グリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、および／または構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質の配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込みは、１以上のランディングパッドにおけるものである。
【００１２】
別の側面に従って、本開示は、特徴的なグリカン構造を含む糖タンパク質を生成する方法を提供する。当該方法は、改変されたゲノムを含む、改変された、非天然真核細胞において、少なくとも１つの目的のタンパク質および少なくとも１つのグリカン修飾酵素を発現することを含み、ここで改変されたゲノムは、（ａ）グリカン修飾酵素をコードする少なくとも１つの内在性ポリ核酸配列のノックアウト；（ｂ）（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列を含む、少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、ここでグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列は、グリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する調整可能な制御エレメントに作動可能に連結されている；および（ｃ）構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、ここで少なくとも１つの目的のタンパク質の各々がタンパク質として発現される場合、グリカンの付加により修飾され得る、を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、（ｂ）における調整可能な制御エレメントは、誘導性プロモーターエレメント、合成プロモーターパネル、ｍｉＲＮＡ応答エレメント、およびＯＲＦ制御エレメントからなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞は、（ｂ）少なくとも２つのポリ核酸配列の組み込みを含み、ここで各ポリ核酸配列は、（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含み、ここでグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードする配列は、グリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する調整可能な制御エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの態様において、（ｂ）における少なくとも２つのポリ核酸配列の各々の調整可能な制御エレメントは、ユニークである。いくつかの態様において、（ｂ）における少なくとも２つのポリ核酸配列の少なくとも１つの調整可能な制御エレメントは、誘導性プロモーターエレメント、合成プロモーターパネル、ｍｉＲＮＡ応答エレメント、およびＯＲＦ制御エレメントからなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの態様において、（ｂ）における調整可能な制御エレメントは、誘導性プロモーターを含む。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、化学調節プロモーターまたは物理調節プロモーターである。いくつかの態様において、化学調節プロモーターは、ＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔプロモーター配列またはＰｈｌＦ活性化可能プロモーター配列を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、（ａ）におけるグリカン修飾酵素は、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、およびモノアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。いくつかの態様において、（ａ）におけるグリカン修飾酵素は、ＦＵＴ８である。いくつかの態様において、（ａ）におけるグリカン修飾酵素は、β４ＧＡＬＴ１である。いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞のゲノムは、少なくとも２つのグリカン修飾酵素のノックアウトを含み、ここで少なくとも２つのグリカン修飾酵素の１つは、ＦＵＴ８であり、および少なくとも２つのグリカン修飾酵素の１つは、β４ＧＡＬＴ１である。
【００１７】
いくつかの態様において、（ｃ）の目的のタンパク質は、免疫グロブリンである。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭクラスに属する。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンである。
いくつかの態様において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ−７細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞である。いくつかの態様において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００１８】
いくつかの態様において、グリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、および／または構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質の配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込みは、１以上のランディングパッドにおけるものである。
【００１９】
別の側面に従って、本開示は、本明細書に開示のいずれかの方法により生成された免疫グロブリンを提供する。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％フコシル化を含む。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％ガラクトシル化を含む。
【００２０】
いくつかの態様において、免疫グロブリンは、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％シアリル化を含む。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、（ａ）少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％フコシル化；および／または（ｂ）少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％ガラクトシル化；および／または（ｃ）少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％シアリル化を含む。
【００２１】
別の側面に従って、本開示は、本明細書に開示のとおりの少なくとも１つの免疫グロブリンを含む組成物を提供する。
本発明のこれらのおよび他の側面は、以下でさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれ、これは、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによってよりよく理解され得る。図面に例証されているデータは、決して開示の範囲を制限するものではないことを理解されたい。
【００２３】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ。モノクローナル抗体構造。図１Ａ。Ａｓｎ２９７において付着しているＮ連結型グリカンを有する典型的なＩｇＧの様々な領域およびドメイン。図１Ｂ。各糖の関連する生物学的効果を有する複雑なＮ連結型グリカン構造。図１Ｃ。一般に観察されるグリカン構造の表示、ここでＧ０、Ｇ１、およびＧ２は、末端のガラクトースの数を指す。ＦおよびＳは、フコースまたはシアル酸の存在を表す。
【００２４】
【図２】図２。ＣＨＯゲノム内のＬＰ２、Ｒｏｓａ、およびＣ５遺伝子座へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化挿入に使用のためのランディングパッドドナーベクターの概略図。重要な構成要素は、５’および３’遺伝子座特異的左および右相同アーム（ＬＨＡおよびＲＨＡ）、ＢｘＢ１リコンビナーゼのためのａｔｔＰ付着部位（野生型またはＧＡ突然変異体）、２Ａ自己切断型ペプチドにより一緒に融合されたＥＢＦＰまたはＥＹＦＰ蛍光レポータータンパク質および選択可能マーカー（ブラストサイジンまたはハイグロマイシン）からなるマルチシストロン性遺伝子の発現を駆動するｈＥＦ１ａ構成的プロモーター、および終結配列を含む。
【００２５】
【図３】図３。ＬＰ２遺伝子座への組み込みのための２ｘ  ＪＵＧ−４４４ペイロードの概略マップ。野生型ＢｘＢ１リコンビナーゼの５’ａｔｔＢ付着部位は、ＬＰ２の野生型ＢｘＢ１  ａｔｔＰ部位とのＤＮＡ組換えのために必要である。ピューロマイシン（ｐｕｒｏ）耐性マーカーは、組み込まれたペイロードの選択のために使用される。構成的プロモーターｍＣＭＶおよびｈＥＦ１ａは、ｍＡｂ軽鎖および重鎖の夫々の発現を駆動する。各転写ユニット間のｃＨＳ４インスレーターのペアは示されない。
【００２６】
【図４】図４。ｄＬＰ細胞株のＲｏｓａ遺伝子座に組み込むための合成サーキットの概略図。ＢｘＢ１（ＧＡ突然変異体）（Inniss M.C., et al., Biotechnol. Bioeng. 2017 Aug; 114(8): 1837-46）リコンビナーゼの５’ａｔｔＢ付着部位は、ＲｏｓａのＢｘＢ１（ＧＡ突然変異体）ａｔｔＰ部位とのＤＮＡ組換えのために必要である。ピューロマイシンまたはブラストサイジン耐性マーカーは、組み込まれたペイロードの選択のために使用される。ｔＬＰ細胞株のＣ５遺伝子座への組み込みを可能にするＷＴ−ａｔｔＢ−ＢｘＢ１を有するＤｏｘ誘導性β４ＧＡＬＴ１サーキットであるｐＭＣ４．１は示されない。
【００２７】
【図５】図５。ｍｉＲＮＡ制御によるＦＵＴ８の弱い構成的発現のための遺伝子サーキット。ＦＵＴ８遺伝子は、弱い構成的プロモーター（ｈＵＢＣまたはｈＡＣＴＢ）から発現され、５’および３’領域においてｍｉＲ−ＦＦ４  ＭＲＥ部位の脇に配置され、１、４または８の総ＭＲＥをもたらす。ｐＭＣ１７において、ｍｉＲ−ＦＦ４は、スプライシングにより切り出された（spliced-out）イントロンとしてｈＥＦ１ａ−ｍＫａｔｅイントロン構築物から構成的に発現される。ｍｉＲ−ＦＦ４は、ＦＵＴ８  ｍＲＮＡ上の相補的なＭＲＥに結合し、よってＦＵＴ８転写産物を不安定化する。ｐＭＣ１８およびｐＭＣ１９構築物において、ｍｉＲ−ＦＦ４は、より強力なＵ６プロモーターから駆動され、夫々４および８ＭＲＥを有するＦＵＴ８を調節する。
【００２８】
【図６】図６。合成プロモーターライブラリを使用したＦＵＴ８の構成的発現のための遺伝子サーキット。大体６０００の異なる複数のＴＦＢＳは、コアプロモーターの上流に位置し、それらは、ＦＵＴ８発現を駆動する。合成プロモーターライブラリは、広い範囲のＦＵＴ８発現を提供する。
【図７】図７。低いＦＵＴ８発現を達成するための翻訳レベルを調整するための可変の合成ｕＯＲＦを有する遺伝子サーキットの概略図。
【００２９】
【図８】図８。ｔＬＰ細胞株のＣ５遺伝子座に組み込むための合成サーキットの概略図。ＢｘＢ１（ＧＡ突然変異体）（Inniss M.C., et al., Biotechnol. Bioeng. 2017 Aug; 114(8): 1837-46）リコンビナーゼの５’ａｔｔＢ付着部位は、Ｃ５のＢｘＢ１（ＧＡ突然変異体）ａｔｔＰ部位とのＤＮＡ組換えのために必要である。ハイグロマイシン耐性マーカーは、組み込まれたペイロードの選択のために使用され、ＥＹＦＰは、蛍光マーカーである。
【００３０】
【図９】図９Ａ〜９Ｂ。ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１ノックアウト。図９Ａ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるエクソン切除および対をなすｇＲＮＡを、ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって確認した。ＦＵＴ８  Ｋ／Ｏは、５．２ｋｂの切除により生成された。β４ＧＡＬＴ１  Ｋ／Ｏは、１．８ｋｂの切除により生成された。図９Ｂ。野生型および生成されたノックアウトクローンから放出されたＪＵＧ−４４４および標識されたグリカンのＨＩＬＩＣ分析は、ＰＣＲスクリーンにより同定された。グリコシル化種のパーセンテージは、関連するピークに隣接して、またはその上に示される。
【００３１】
【図１０】図１０。ｄＬＰ  ＦＵＴ８  ＫＯ細胞株に組み込まれたｐＭＣ１（構成的に発現されるＦＵＴ８をコードする）およびｄＬＰ  β４ＧＡＬＴ１  ＫＯ細胞株に組み込まれたｐＭＣ２（構成的に発現されるβ４ＧＡＬＴ１をコードする）を用いたＪＵＧ−４４４のＨＩＬＩＣグリカン分析。グリコシル化種のパーセンテージは、関連するピークの上に示される。
【００３２】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂ。７日間の流加培養後、ドキシサイクリン誘導因子の添加（４８時間ごとに添加）に起因するＪＵＧ−４４４のフコシル化またはガラクトシル化とドキシサイクリンとの関係性のプロット。図１１Ａ。ＦＵＴ８発現が可変のＤｏｘ濃度で誘導された場合の総フコシル化レベルのパーセント。図１１Ｂ。β４ＧＡＬＴ１発現が可変のＤｏｘ濃度で誘導された場合の総ガラクトシル化レベルのパーセント。
【００３３】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂ。７日間の流加培養後、アブジン酸誘導因子の添加（２４時間ごとに添加）に起因するＪＵＧ−４４４のフコシル化またはガラクトシル化とアブジン酸との関係性のプロット。図１２Ａ。ＦＵＴ８発現が可変のＡＢＡ濃度で誘導された場合の総フコシル化レベルのパーセント。図１２Ｂ。β４ＧＡＬＴ１発現が可変のＡＢＡ濃度で誘導された場合の総ガラクトシル化レベルのパーセント。
【００３４】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂ。７日間の流加培養後、小分子誘導因子の添加（ＡＢＡおよびＤｏｘを夫々２４時間ごとおよび４８時間ごとに添加）に起因するＪＵＧ−４４４のフコシル化またはガラクトシル化とアブジン酸またはドキシサイクリンとの関係性のプロット。図１３Ａ。ＦＵＴ８発現が可変のＡＢＡ濃度で誘導された場合の総フコシル化レベルのパーセント。Ｄｏｘ濃度は、すべてのレベルのＡＢＡについて１０００ｎＭにおいて一定に保たれた。図１３Ｂ。β４ＧＡＬＴ１発現が可変のＤｏｘ濃度で誘導された場合の総ガラクトシル化レベルのパーセント。１０００ｎＭ  Ｄｏｘにおいて、総Ｇａｌレベルを、ＡＢＡのいくつかの濃度において調べた。
【００３５】
【図１４】図１４。可変のフコシル化およびガラクトシル化レベルで発現されたＪＵＧ−４４４のＦｃγＲＩＩＩａ結合ＳＰＲ分析。異なるグリコシル化プロファイルを誘導するために使用されるＡＢＡ（２４時間ごとに添加）およびＤｏｘ（４８時間ごとに添加）濃度が示される。バーは、ＳＰＲによって捕捉されるＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）に結合するＪＵＧ−４４４のＫｄ（ｎＭ）値を示す。
【００３６】
【図１５】図１５。野生型ＪＵＧ−４４４ならびにｐＭＣ２およびｐＭＣ２０を発現するβ４ＧＡＬＴ１  ＫＯ細胞で発現したＪＵＧ−４４４におけるＪＵＧ−４４４グリカン組成の比較。Ｇ０、Ｇ１、およびＧ２は、末端ガラクトース残基の数を示す。バーは左から右へＧ０、Ｇ１、Ｇ２、およびシアリル化（Siaylated）である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃ。プロモーターミニライブラリを使用した構成的ＦＵＴ８発現。図１６Ａ。ＦＵＴ８を構成的に発現するサーキットの概略図。構成的プロモーターは、ｈＥＦ１ａ、ＲＳＶ、ｈＰＧＫ、ｈＵＢＣ、ＨＳＶ−ＴＫ、およびｈＡＣＴＢであった。図１６Ｂ。示された構成的プロモーターを有する、ＦＵＴ８構成的に発現するサーキットを含有する細胞株におけるＦＵＴ８  ｍＲＮＡレベル。図１６Ｃ。図１６Ｂの細胞株において発現されたｍＡｂのフコシル化レベル。
【００３７】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃ。ｍＡｂ  Ｎ−グリカンフコシル化を制御するためのイントロンｍｉＲＮＡサーキットの利用。図１７Ａ。ＦＵＴ８を構成的に発現するサーキットの概略図。ｍＡｂのフコシル化レベルを低減させるために、ｍｉＲＮＡ標的（または図１７Ｂ〜１７Ｃの結合部位（ＢＳ））を合成ＦＵＴ８配列の３’ＵＴＲに挿入した。構成的プロモーターは、ＲＳＶ、ｈＰＧＫ、およびｈＵＢＣであった。図１７Ｂ。示された構成的プロモーターを有するＦＵＴ８を構成的に発現するサーキットを含有する細胞株におけるＦＵＴ８  ｍＲＮＡレベル。図１７Ｃ。図１７Ｂの細胞株において発現されたｍＡｂのフコシル化レベル。
【００３８】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃ。ｍＡｂ  Ｎ−グリカンフコシル化を制御するためのＵ６プロモーター転写ｍｉＲＮＡサーキットの利用。図１８Ａ。ＦＵＴ８を構成的に発現するサーキットの概略図。ｍＡｂのフコシル化レベルを低減させるために、ｍｉＲＮＡ標的（または図１８Ｂ〜１８Ｃの結合部位（ＢＳ））を合成ＦＵＴ８配列の３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲに挿入した。構成的プロモーターは、ｈＵＢＣおよびｈＡＣＴＢであった。図１８Ｂ。示された構成的プロモーターを有するＦＵＴ８を構成的に発現するサーキットを含有する細胞株におけるＦＵＴ８  ｍＲＮＡレベル。図１８Ｃ。図１８Ｂの細胞株において発現されたｍＡｂのフコシル化レベル。
【００３９】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄ。グリコール改変細胞株の細胞株安定性。図１９Ａ。示された時間において分析されたＭＣ１細胞において発現したｍＡｂｓのフコシル化レベル。図１９Ｂ。示された時間において分析されたＧＪ１３８細胞において発現したｍＡｂｓのフコシル化レベル。図１９Ｃ。示された時間において分析されたＭＣ１細胞において発現したｍＡｂｓの力価レベル。図１９Ｄ。示された時間において分析されたＧＪ１３８細胞において発現したｍＡｂｓの力価レベル。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞における発現により産生される治療用および改変されたタンパク質は、グリコシル化によって変化するさまざまな特性を有する可能性があり、それは使用する細胞の種類、培養条件などによって影響を受ける可能性がある。この一例はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、それはいくつかのがんや自己免疫疾患の処置を含む、多種多様な治療用途に利用されている（Weiner L.M., et al., Cell. 2012 Mar 16; 148(6): 1081-84; Jefferis R., Trends Pharmacol. Sci. 2009 Jul; 30(7): 356-62; Chiu M.L. and Gilliland G.L., Curr. Opin. Struct. Biol. 2016 Jun; 38: 163-73）。市販されているすべてのｍＡｂはＩｇＧクラスに属し、２つの重鎖と２つの軽鎖からなり、抗原結合（Ｆａｂ）領域と結晶化可能（Ｆｃ）領域を有し、Ｆｃは免疫応答を調節するＦｃγ受容体に結合する能力を有する（図１Ａ）。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのＦｃを介したエフェクター機能は、抗体治療の重要なメカニズムである。Ｎ連結型グリコシル化は、ｍＡｂの構造、機能、および薬物動態に大きく影響する（図１Ｂ）（Liu L., J. Pharm. Sci. 2015 Jun; 104(6): 1866-84）。Ｆｃグリコシル化の場合において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、重鎖のＡｓｎ２９７に付着し、続いてグリカンがＥＲおよびゴルジネットワークで処理される。Ｎ連結型グリカンは、多数の異なる糖部分および複数の可能な連結により、極めて複雑で多様である（図１Ｃ）。この高レベルの不均一性、およびこれらの異なるグリコフォームが機能に及ぼす影響の結果として、特徴的なＮ連結型グリカン構造を有する生成物を得るためのバイオ医薬品の糖鎖工学への関心が高まっている（Li F., et al., MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 466-79; Kanda Y., et al., J. Biotechnol. 2007 Jun 20; 130(3): 300-10; Yamane-Ohnuki N., et al., Biotechnol. Bioeng. 2004 Sep 5; 87(5): 614-22; Mori K., et al., Biotechnol. Bioeng. 2004 Dec 30; 88(7): 901-8; Yang Z., et al., Nat. Biotechnol. 2015 Aug; 33(8): 842-44）。
【００４１】
本明細書に開示されるのは、特徴的なグリカン構造を有するプロテオグリカンを糖鎖工学的に改変する新規の方法である。開示された方法は、これまでに観察されていない、ダイナミックレンジのタンパク質グリコシル化（例として、免疫グロブリンの０〜９５％フコシル化および０〜５％総ガラクトシル化）をアクセス可能にする。開示された方法は、Ｆｃグリコシル化種の大きなマトリックスを可能にするフコシル化およびガラクトシル化の正確で独立した制御を提供し、これは、新規のｍＡｂならびにバイオテクノロジーおよびバイオ医薬において使用のための、目的に合わせた（tailored）in vitroおよびin vivo効果を有する他の種類の高分子治療薬の開発を可能にする。また、本明細書で実証されるのは、Ｆｃエフェクター機能に影響を及ぼすＩｇＧグリコフォームの設計および制御である。重要なことには、本明細書に記載の方法は、ＩｇＧ１を超えて、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および、グリカンが半減期およびエフェクター機能などの潜在的に臨床に影響を与えることが知られている他の組換え糖タンパク質に適用することができる。
【００４２】
いくつかの側面において、本開示は、in vivoにおいて、特徴的なグリカン構造を含む糖タンパク質を生成する方法に関する。いくつかの態様において、当該方法は、改変されたゲノム（以下に記載）を含む、改変された、非天然真核細胞において少なくとも１つの目的のタンパク質および少なくとも１つのグリカン修飾酵素を発現することを含み、ここで少なくとも１つの目的のタンパク質の各々は、タンパク質として発現される場合、グリカンの付加により修飾され得る。
【００４３】
他の側面において、本開示は、改変されたゲノムを含む、改変された、非天然真核細胞に関する。本明細書に使用されるとき、用語「改変されたゲノム」は、天然に存在するものとは異なるゲノムになるように変更されているゲノムを指す。いくつかの態様において、改変されたゲノムは、（ａ）グリカン修飾酵素をコードする少なくとも１つの内在性ポリ核酸配列のノックアウト；および（ｂ）（ａ）におけるノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーの配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込み、およびグリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する、作動可能に連結されている調整可能な制御エレメントを含む。
【００４４】
本明細書に使用されるとき、用語「グリカン」は、多糖類、またはグリコシド結合的に（glycosidically）、またはグリコシド結合（すなわち、糖類を、別の糖類であってもなくてもよい別の基に繋ぐ共有結合の種類）を介して連結された少なくとも２つの単糖類からなる化合物を指す。
【００４５】
本明細書に使用されるとき、用語「グリカン修飾酵素」は、グリコシド結合の形成または除去を触媒するタンパク質を指す。グリカン修飾酵素の例は、当該技術分野において技能を有する人たちに知られており、これらに限定されないが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、モノアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ（例として、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９、ＦＵＴ１０、およびＦＵＴ１１）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（例として、β３ＧＡＬＮＴ１、β３ＧＡＬＮＴ２、β３ＧＡＬＴ１、β３ＧＡＬＴ２、β３ＧＡＬＴ４、β３ＧＡＬＴ５、β３ＧＡＬＴ６、β３ＧＮＴ２、β３ＧＮＴ３、β３ＧＮＴ４、β３ＧＮＴ５、β３ＧＮＴ６、β３ＧＮＴ７、β３ＧＮＴ８、β４ＧＡＬＮＴ１、β４ＧＡＬＮＴ２、β４ＧＡＬＮＴ３、βＧＡＬＮＴ４、β４ＧＡＬＴ１、β４ＧＡＬＴ２、β４ＧＡＬＴ３、β４ＧＡＬＴ４、β４ＧＡＬＴ５、β４ＧＡＬＴ６、β４ＧＡＬＴ７、ＧＡＬＮＴ１、ＧＡＬＮＴ２、ＧＡＬＮＴ３、ＧＡＬＮＴ４、ＧＡＬＮＴ５、ＧＡＬＮＴ６、ＧＡＬＮＴ７、ＧＡＬＮＴ８、ＧＡＬＮＴ９、ＧＡＬＮＴ１０、ＧＡＬＮＴ１１、ＧＡＬＮＴ１２、ＧＡＬＮＴ１３、ＧＡＬＮＴ１４、ＧＡＬＮＴＬ１、ＧＡＬＮＴＬ２、ＧＡＬＮＴＬ４、ＧＡＬＮＴＬ５、およびＧＡＬＮＴＬ６）、およびシアリルトランスフェラーゼ（例として、ＳＩＡＴ４Ｃ、ＳＩＡＴ９、ＳＴ３ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ２、ＳＴ３ＧＡＬ３、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＳＴ３ＧＡＬ５、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＳＴ６Ｇａｌ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＴ８ＳＩＡ２、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＴ８ＳＩＡ５、ＳＴ８ＳＩＡ６、およびＳＴ８Ｓｉａ）を含む。
【００４６】
本明細書に使用されるとき、用語「ノックアウト」は、内在性遺伝子が不活性にされるような内在性遺伝子の破壊を指す。いくつかの態様において、ノックアウトは、遺伝子をコードする内在性ポリ核酸配列の少なくとも一部（すなわち、遺伝子コード領域の少なくとも一部）の切除または除去によってもたらされる。本明細書に使用されるとき用語「〜の少なくとも一部」は、単一のヌクレオチド、またはポリ核酸配列をコードする遺伝子の少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％を含む一続きの連続した核酸を指してもよい。いくつかの態様において、ノックアウトは、外因性のＤＮＡ片の組み込みまたは導入を介してもたらされる。本明細書に使用されるとき、用語「組み込み」は、細胞のゲノムへの外因性の配列のＤＮＡの挿入またはノックインを指す。遺伝子ノックアウトおよびノックインを実施する方法は、当該技術分野において技能を有する人たちに知られており、これらに限定されないが、相同組換えおよび部位特異的ヌクレアーゼ（例として、リコンビナーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）の使用を含む。
【００４７】
いくつかの態様において、細胞に組み込まれた１以上のポリ核酸配列は、細胞のゲノムにおいて定義された部位である、１以上の「ランディングパッド」（ＬＰ）において組み込まれる。本明細書の他の場所で説明されるように、ランディングパッドは、組換え部位を認識して組換えをもたらすリコンビナーゼを使用して、１以上のポリ核酸配列の部位特異的組み込みのための組換え部位を含有し得る。加えて、ランディングパッドは選択可能なマーカーを含有し得る。「マルチＬＰ」細胞株においては、複数のランディングパッドが使用され、かかる場合において、好ましくは、ランディングパッドはオルソゴナルである（orthogonal）。
【００４８】
いくつかの態様において、改変されたゲノムは、グリカン修飾酵素をコードする１超の内在性のポリ核酸配列のノックアウトを含む。いくつかの態様において、ノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーの配列および作動可能に連結された調整可能な制御エレメントを含む組み込まれたポリ核酸配列の数は、ノックアウトされたグリカン修飾酵素の数より小さい（例として、ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１のノックアウト、ならびにβ４ＧＡＬＴ１ではなくＦＵＴ８の機能的コピーの組み込み、またはその逆）。
【００４９】
本明細書に使用されるとき、用語「機能的コピー」は、ネイティブなタンパク質をコードするポリ核酸（すなわち、ネイティブな細胞に見出される配列）と、改変されたタンパク質をコードするin vitroで作り出されたポリ核酸（すなわち、機能的コピー）との間の同一性の程度に関する。いくつかの態様において、ネイティブなタンパク質のポリ核酸配列と機能的コピーをコードするポリ核酸配列は同一である。他の態様において、配列は異なる。例えば、いくつかの態様において、ネイティブなタンパク質をコードするポリ核酸配列と機能的コピーをコードするポリ核酸配列は、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％、または９９〜１００％の同一性を共有する。いくつかの態様において、機能的コピーをコードするポリ核酸配列は、ネイティブなタンパク質のポリ核酸配列よりも、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または１０００超ヌクレオチド長いまたは短い。
【００５０】
実際に、いくつかの態様において、機能的コピーのポリ核酸配列は、ネイティブなタンパク質と共有しないタンパク質機能特性をコードしてもよい（例として、機能的特性によりコードされたタンパク質は、ネイティブなタンパク質と共有されない少なくとも１つの機能を実行し得る）。他の態様において、グリカン修飾酵素の機能的コピーのポリ核酸配列は、ネイティブなタンパク質の少なくとも１つの機能をコードしなくてもよい（例として、ネイティブなタンパク質は、機能的コピーを共有しない少なくとも１つの機能を実行し得る）。それでもなお、「機能的コピー」とみなされるためには、改変されたタンパク質をコードするポリ核酸は、改変されたタンパク質がネイティブなタンパク質の標的化された機能の活性を少なくともある程度、例えば、ネイティブなタンパク質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％実行できるように、ネイティブタンパク質のそれと十分な同一性を維持しなければならない。
【００５１】
いくつかの態様において、標的化された機能は、グリコシド結合の形成または除去を触媒する能力である。例えば、ネイティブなタンパク質が、グリカン修飾酵素である場合、グリカン修飾酵素の機能的コピー（例として、フコシルトランスフェラーゼ機能的コピー）は、機能的コピーが、ネイティブなグリカン修飾酵素の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％効率的に、グリコシド結合の形成または除去を触媒（例として、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースドナー基質からアクセプター基質へ転移）することができるように、ネイティブなグリカン修飾酵素（例として、ネイティブなフコシルトランスフェラーゼ）と十分な同一性を有する。いくつかの態様において、機能的コピーによりコードされる改変されたタンパク質は、ネイティブなタンパク質よりもより効率的に標的化された機能を実行することができる（例として、ネイティブなタンパク質の活性の少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または５００％超）。
【００５２】
本明細書に使用されるとき、用語「調整可能な制御エレメント」は、具体的なアウトプットを増加または減少させるように改変することができるポリ核酸配列を指す。いくつかの態様において、調整可能な制御エレメントは、ｍＲＮＡ発現を調節するように機能する（すなわち、アウトプットは、ｍＲＮＡレベルである）。例えば、いくつかの態様において、調整可能な制御エレメントは、誘導性プロモーター（例として、材料および方法、設計、例３および例４を参照のこと）、合成プロモーターパネル（例として、設計−「合成プロモーターライブラリによるＦＵＴ８の転写調節」を参照のこと）および／またはｍｉＲＮＡ応答エレメント（例として、設計−「合成遺伝子発現のマイクロＲＮＡ制御」を参照のこと）を含む。いくつかの態様において、調整可能な制御エレメントは、タンパク質発現を調節するように機能する（すなわち、アウトプットは、タンパク質レベルである）。例えば、いくつかの態様において、調整可能な制御エレメントは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）制御エレメント（例として、設計−「合成遺伝子発現の上流ＯＲＦ制御」を参照のこと）を含む。いくつかの態様において、調整可能な制御エレメントは、タンパク質機能を調節するように機能する（すなわち、アウトプットは、タンパク質機能である）。例えば、いくつかの態様において、調整可能な制御エレメントは、アウトプットを生成するタンパク質の活性を増加または減少させるタンパク質をコードするポリ核酸配列を含む。
【００５３】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞は、少なくとも２つのポリ核酸配列の組み込みを含み、ここで各々は、グリカン修飾タンパク質の機能的コピーの配列、およびグリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御する、作動可能に連結された調整可能な制御エレメントを含む。いくつかの態様において、少なくとも２つのポリ核酸配列の各々の調整可能な制御エレメント―各々は、グリカン修飾酵素の機能的コピーの配列および作動可能に連結された調整可能な制御エレメントを含む―は、ユニークであり、すなわち、改変された、非天然真核細胞におけるグリカン修飾酵素のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を制御するすべての他の調整可能な制御エレメントとは異なる。
【００５４】
調整可能な制御エレメントは、ノックアウトされたグリカン修飾酵素の機能的コピーをコードするポリ核酸配列などの、それが作動可能に連結されているポリ核酸配列の発現または転写を制御する。調整可能な制御エレメントは、それが調節するポリ核酸配列に対して正しい機能的場所および配向にある場合、「作動可能に連結している」と見なされ、それによって、そのポリ核酸配列の転写開始または発現を制御する調整可能な制御エレメントの能力がもたらされる。
【００５５】
いくつかの態様において、調整可能な制御エレメントは、誘導性プロモーターを含む。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、化学調節プロモーターまたは物理調節プロモーターである。化学調節プロモーターの例は、当該技術分野において技能を有する人たちに知られており、これらに限定されないが、アルコール調節プロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、および病因に関連するプロモーターを含む。そのため、化学的に調節プロモーターは、小分子誘導因子（例として、ＡＢＡ、Ｄｏｘ、クマート、およびジベレリン酸）の存在に応答性であってもよい。いくつかの態様において、化学調節プロモーターは、ＴＲＥ−ＴｉｇｈｔプロモーターまたはＰｈｌＦ活性化可能プロモーターのポリ核酸配列を含む。物理調節プロモーターの例は、当該技術分野において技能を有する人たちに知られており、これらに限定されないが、温度調節プロモーターおよび光調節プロモーターを含む。
【００５６】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞においてノックアウトされた少なくとも１つのグリカン修飾酵素は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、モノアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００５７】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞においてノックアウトされた少なくとも１つのグリカン修飾酵素は、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９、ＦＵＴ１０、ＦＵＴ１１、およびそれらのオルソゴナルからなる群から選択されるフコシルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、少なくとも１つのグリカン修飾酵素は、ＦＵＴ８である。
【００５８】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞においてノックアウトされた少なくとも１つのグリカン修飾酵素は、β３ＧＡＬＮＴ１、β３ＧＡＬＮＴ２、β３ＧＡＬＴ１、β３ＧＡＬＴ２、β３ＧＡＬＴ４、β３ＧＡＬＴ５、β３ＧＡＬＴ６、β３ＧＮＴ２、β３ＧＮＴ３、β３ＧＮＴ４、β３ＧＮＴ５、β３ＧＮＴ６、β３ＧＮＴ７、β３ＧＮＴ８、β４ＧＡＬＮＴ１、β４ＧＡＬＮＴ２、β４ＧＡＬＮＴ３、βＧＡＬＮＴ４、Ｂ４ＧＡＬＴ１、β４ＧＡＬＴ２、β４ＧＡＬＴ３、β４ＧＡＬＴ４、β４ＧＡＬＴ５、β４ＧＡＬＴ６、β４ＧＡＬＴ７、ＧＡＬＮＴ１、ＧＡＬＮＴ２、ＧＡＬＮＴ３、ＧＡＬＮＴ４、ＧＡＬＮＴ５、ＧＡＬＮＴ６、ＧＡＬＮＴ７、ＧＡＬＮＴ８、ＧＡＬＮＴ９、ＧＡＬＮＴ１０、ＧＡＬＮＴ１１、ＧＡＬＮＴ１２、ＧＡＬＮＴ１３、ＧＡＬＮＴ１４、ＧＡＬＮＴＬ１、ＧＡＬＮＴＬ２、ＧＡＬＮＴＬ４、ＧＡＬＮＴＬ５、ＧＡＬＮＴＬ６、およびそれらのオルソログ）からなる群から選択されるガラクトシルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、少なくとも１つのグリカン修飾酵素は、β４ＧＡＬＴ１である。
【００５９】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞においてノックアウトされた少なくとも１つのグリカン修飾酵素は、ＳＩＡＴ４Ｃ、ＳＩＡＴ９、ＳＴ３ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ２、ＳＴ３ＧＡＬ３、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＳＴ３ＧＡＬ５、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＳＴ６Ｇａｌ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＴ８ＳＩＡ２、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＴ８ＳＩＡ５、ＳＴ８ＳＩＡ６、ＳＴ８Ｓｉａおよびそれらのオルソログからなる群から選択されるシアリルトランスフェラーゼである。
【００６０】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞のゲノムは、少なくとも２つのグリカン修飾酵素のノックアウトを含み、ここで少なくとも２つのグリカン修飾酵素の１つは、ＦＵＴ８であり、および少なくとも２つのグリカン修飾酵素の１つは、β４ＧＡＬＴ１である。
【００６１】
いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞は、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つのポリ核酸配列の組み込みをさらに含み、ここで目的のタンパク質は、グリカンの付加により修飾され得る。いくつかの態様において、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている目的のタンパク質をコードするポリ核酸配列は、潜在的に複数のゲノムの場所において、複数のコピーとして組み込まれている。いくつかの態様において、複数のコピーの構成的または誘導性プロモーターは、同一である。他の態様において、少なくとも１つのコピーの構成的または誘導性プロモーターは、ユニークである。
【００６２】
いくつかの態様において、少なくとも１つの目的のタンパク質は、免疫グロブリンである（例として、材料および方法、設計、および例２〜６を参照のこと）。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭクラスに属する。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンである。
【００６３】
真核細胞は、グリカン修飾タンパク質の生成に用いられている。Lalonde M.E. and Duocher Y., J. Biotechnol. 2017 Jun 10; 251: 128-140を参照のこと、その全体は本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ−７細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞に由来する。いくつかの態様において、改変された、非天然真核細胞は、ＣＨＯ細胞に由来する。
【００６４】
他の側面において、本開示は、上に記載のとおりに生成されたプロテオグリカンに関する。いくつかの態様において、プロテオグリカンは、免疫グロブリンである。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％フコシル化を含む。フコシル化のパーセンテージを決定する方法は、当該技術分野において技能有する人達に知られている（例として、材料および方法を参照のこと）。
【００６５】
いくつかの態様において、免疫グロブリンは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％ガラクトシル化を含む。ガラクトシル化のパーセンテージを決定する方法は、当該技術分野において技能有する人達に知られている（例として、材料および方法を参照のこと）。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％シアリル化を含む。シアリル化のパーセンテージを決定する方法は、当該技術分野において技能有する人達に知られている（例として、材料および方法を参照のこと）。
【００６６】
いくつかの態様において、免疫グロブリンは、（ａ）少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％フコシル化；（ｂ）少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％ガラクトシル化；および／または（ｃ）少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％シアリル化を含む。
【００６７】
いくつかの側面において、本開示は、少なくとも１つのプロテオグリカンを含む組成物に関する。いくつかの態様において、プロテオグリカンは、免疫グロブリンである。いくつかの態様において、組成物は医薬組成物であり、これは、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性のある担体、アジュバント、薬学的に許容し得る賦形剤、および任意に他の治療成分を日常的に含有し得る。医薬組成物の医薬担体、賦形剤、および他の構成要素の性質は、投与の様式に依存する。本開示の医薬組成物は、当業者に知られている任意の手段および経路によって投与されてもよい。
【実施例】
【００６８】
例
例１．例２〜８についての方法および材料
ＣＨＯ細胞培養およびトランスフェクション：血清フリー、懸濁に適合したＣＨＯ−Ｋ１細胞を８ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補充したＣＤ−ＣＨＯ培地中で、フラスコ内で、３７℃および７％ＣＯ２で、１３０ｒｐｍにて震盪しながら成長させた。播種密度は、３ｘ１０５細胞／ｍＬであり、培養は、３日または４日ごとに分割した。トランスフェクションを、Neon電気穿孔法（１６００Ｖ、１０ｍｓ、３パルス）を使用して、１０ｕｌトランスフェクションあたり３ｘ１０５細胞で常に実施した。
【００６９】
ノックアウト細胞株の生成およびゲノムＰＣＲ診断試験：２５０ｎｇ  Ｕ６−ｇＲＮＡペアおよび２５０ｎｇ  ｐＳＰ−Ｃａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰの、ＬＰ２に組み込まれているＪＵＧ−４４４を有するｄＬＰ細胞へのトランスフェクション。トランスフェクションの３日後、ＧＦＰ陽性単細胞をＦＡＣＳで選別し、ゲノムＤＮＡをエクソン切除についてアッセイした。
【００７０】
【表１】
2021528074.tif 000003
【００７１】
遺伝子サーキットの構築および組み込み：合成ＦＵＴ８遺伝子（１１個のエクソンを含むｃＤＮＡ配列）および合成β４ＧＡＬＴ１遺伝子（５個のエクソンを含むｃＤＮＡ配列）をＩＤＴからｇＢｌｏｃｋとして取得した。Modular Gateway/Gibsonアセンブリを、すべての遺伝子サーキットの構築に使用した（Duportet X., et al., Nucleic Acids Res. 2014 Dec 1; 42(21): 13440-51）。サーキットの組み込みは、５００ｎｇのｐＥＸＰＲ−ＢｘＢ１および少なくとも５００ｎｇの各サーキットのトランスフェクションを要求する。トランスフェクションの３日後、ｍＫａｔｅシグナルをＦＡＣＳ分析によってアッセイした。選択は７日間行われてもよい。トランスフェクションの１０日後、細胞をＦＡＣＳで選別し、ｍＫａｔｅ陽性かつＥＹＦＰ陰性細胞（Ｒｏｓａ遺伝子座へのサーキット組み込み）またはｍＫａｔｅ陽性かつＥＢＦＰ陰性細胞（Ｃ５遺伝子座へのサーキット組み込み）を得た。
【００７２】
流加培養およびグリカン分析：７日間の流加培養を使用して、グリカン分析のためのｍＡｂを生成した。流加培養（１２５ｍＬ震盪フラスコに２５ｍＬ）を１．５ｘ１０６細胞／ｍＬで播種した。３日目から、培養物を１日２回ｐＨ７．２に滴定し、Cell Boost 5、２０％Ｄ−グルコース、およびＬ−グルタミンを１日１回補充した。合成サーキットを誘導する必要がある場合、０日目から流加培養にＤｏｘを４８時間ごとに、またはＡＢＡを２４時間ごとに添加した。７日目に培養物を回収し、Octetによる力価測定およびＰｒｏＡ樹脂上でのＪＵＧ−４４４精製のために清澄化した培地を保存した。グリカンを精製されたＪＵＧ−４４４から酵素的に切断し、２−アミノベンズアミド標識化剤で誘導体化し、ＨＩＬＩＣによって分析した（Shang T.Q., et al., J. Pharm. Sci. 2014 Jul; 103(7): 1967-78）。
【００７３】
ＦｃγＲＩＩＩａ結合ＳＰＲ分析：
機器およびソフトウェア：制御ソフトウェアバージョン２．０．１と評価ソフトウェアバージョン３．０とを備えたBiacore（商標）T200機器（GE Healthcare）を使用して、相互作用分析に使用した。
【００７４】
センサーチップ、試薬、およびバッファー：アミンカップリング試薬、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、エタノールアミン−ＨＣｌ、シリーズＳセンサーチップＣＭ５、１０ｍＭグリシンを含むｐＨ１．５再生溶液、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５、５０ｍＭ水酸化ナトリウム、Biacore標準化溶液（７０％グリセロール）、０．５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭグリシンｐＨ９．５およびＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー１０×（３０ｍＭＥＤＴＡ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．５％界面活性剤Ｐ２０（Tween 20）を含む０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー）を、GE Healthcareから購入した。ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で発現した組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ（リガンド）はSyngeneからのものであり、抗ＰＥＮＴＡヒスチジン抗体はQiagenからのものであった。この研究で使用されたＪＵＧ−４４４  ｍＡｂは、ＩｇＧ１で発現された完全ヒトｍＡｂであった。すべてのＪＵＧ−４４４  ｍＡｂは社内で精製し、後にＰＢＳに透析した。最終的に、すべての精製ｍＡｂを分割し、速度論的アッセイに使用するまで１０℃で保存した。
【００７５】
Biacore T200上への抗ＰＥＮＴＡヒスチジンｍＡｂの固定化：１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で１０μｇ／ｍｌに希釈した抗ＰＥＮＴＡヒスチジンｍＡｂを、製造業者の指示および手順に従って標準的なアミンカップリングキットを用いて、シリーズＳ  ＣＭ５バイオセンサチップに直接固定化した。バイオセンサ表面の未反応部分をエタノールアミンでブロックした。抗ＰＥＮＴＡヒスチジンｍＡｂ固定化手順により、およそ１５００ＲＵの表面密度を得た。フローセル２および４に固定化された抗ＰＥＮＴＡヒスチジンｍＡｂを介する捕捉されたＦｃγ受容体を含有する修飾されたカルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用した。フローセル１および３にＦｃγ受容体を含有しない同様に修飾されたカルボキシメチルデキストラン表面を参照表面として使用した。
【００７６】
ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ捕捉アッセイ手順：Biacore T200システムのサンプルコンパートメントを１０℃、分析温度を２５℃、データ収集速度を１Ｈｚに設定した。ＨＢＳ−ＥＰ＋をランニングバッファーとして使用した。各サイクルにおいて、ＨＢＳ−ＥＰ＋中１μｇ／ｍｌでＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ（リガンド）を５０μｌ／分の流速で６０秒間注入し、約３０〜６０ＲＵの最小捕捉レベルに到達した。ＪＵＧ−４４４抗体、ＨＢＳ−ＥＰ＋中４．７〜１５０．４μｇ／ｍｌ、を１８０秒間注入した後、６つの抗原濃度すべてについて３００秒間の解離段階を行い、キットの指示に従って１０ｍＭグリシンｐＨ１．５溶液で表面を再生した（３００秒の接触）。会合および解離速度定数ｋａ（単位Ｍ−１ｓ−１）およびｋｄ（単位ｓ−１）を、５０μｌ／分の連続流速下で決定した。
【００７７】
データ処理と分析：結合データを、最初に評価バージョン３．０ソフトウェアを使用して処理した。ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ捕捉アッセイを使用して生成された二重参照減算データを、１：１ラングミュア結合モデルにグローバルに適合させた。ＪＵＧ−４４４  ｍＡｂ−ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ相互作用の速度定数を、３１．２５〜１０００ｎＭの範囲の６つの異なるアナライト濃度で速度論的結合測定を行うことによって導き出した。会合および解離速度定数を、グローバルフィット分析（データセット内の各曲線に同一の値を割り当てる）を使用して結合データから抽出した。Ｒｍａｘパラメータ設定をローカルにフロートフィットした（floated fit locally）。次いで、Ｆｃγ受容体とＪＵＧ−４４４  ｍＡｂとの間の反応の平衡解離定数（単位Ｍ）を、以下の式：ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによって速度論的速度定数から計算した。
【００７８】
例２．設計
概要：無血清および懸濁培養に適合したＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用して、ＦＵＴ８および／またはβ４ＧＡＬＴ１遺伝子のノックアウト、ならびにＪＵＧ−４４４と合成遺伝子サーキットとの特定の組み込みのための複数のランディングパッドを有する新規の細胞株を構築した。最初に、組換え部位と選択可能なマーカーとを含有するランディングパッド（ＬＰ）をゲノムに組み込んだ。次いで、調和するリコンビナーゼを使用して、ＤＮＡペイロードを、その遺伝子座に特異的に挿入し、ゲノム内の明確に定義された部位での再現性のある組み込みを可能にした。ｍＡｂと遺伝子サーキットの両方にランディングパッドを利用することにより、細胞はコピー数と遺伝子座の両方について正規化され、一貫した再現可能な発現レベルが可能になる（Duportet X., et al., Nucleic Acids Res. 2014 Dec 1; 42(21): 13440-51; Gaidukov L., et al., Nucleic Acids Res. 2018 May 4; 46(8): 4072-86）。ＪＵＧ−４４４はＩｇＧ１サブクラスの抗体であり、ＪＵＧ−４４４のグリコシル化は、Ｆｕｔ８およびβ４ＧａｌＴ１酵素活性のモジュレーションのための機能的読み出しとして機能した。ランディングパッドに組み込まれた合成サーキットに、構成的または誘導性プロモーター下でＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１遺伝子を再導入した。小分子誘導因子を添加すると、添加した小分子のレベルに対応して、様々なレベルのＦｕｔ８およびβ４ＧａｌＴ１酵素が発現した。これは、順に、発現された酵素レベルを反映する様々なレベルのＪＵＧ−４４４グリコシル化をもたらした。ＪＵＧ−４４４を試験ｍＡｂとして使用した一方で、このシステムは、抗体−薬物抱合体や二重特異性モノクローナル抗体を含む、すべてのタイプのｍＡｂに適合する。実際、これは、所望の生物学的効果のためにグリコシル化の精度が必要とされる、生物的に製造された遺伝的に発現された任意の治療用タンパク質に関連する。
【００７９】
オルソゴナルなランディングパッドを備えたＣＨＯ細胞株の生成：組換え部位と選択可能なマーカーとを含有するランディングパッド（ＬＰ）を、安定した遺伝子発現を有することが実証されている遺伝子座においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集アプローチを使用して組み込んだ（Duportet X., et al., Nucleic Acids Res. 2014 Dec 1; 42(21): 13440-51; Gaidukov L., et al., Nucleic Acids Res. 2018 May 4; 46(8): 4072-86）（図２）。次いで、調和する部位特異的リコンビナーゼを使用して、ＤＮＡペイロードをその遺伝子座に特異的に挿入する。種々の蛍光レポーターと抗生物質選択マーカーとを有する２個または３個のオルソゴナルな組換え部位を使用して、マルチＬＰ細胞株の特定のランディングパッド部位へのペイロード組み込みを標的化する。ダブルランディングパッド（ｄＬＰ）細胞株の場合、ＬＰ２部位は重鎖および軽鎖遺伝子の２つのコピーをコードするＪＵＧ−４４４ペイロードにより組み込まれ、Ｒｏｓａ部位は合成サーキットの組み込みに利用可能である。トリプルランディングパッド（ｔＬＰ）細胞株の場合、Ｃ５ランディングパッドが合成サーキットの組み込みのために追加で利用可能である。
【００８０】
ランディングパッドへのｍＡｂの組み込み：ＪＵＧ−４４４軽鎖および重鎖遺伝子の２重のコピーを第１のランディングパッド（ＬＰ２）に組み込んだ。ＢｘＢ１媒介組換えは、ＬＰ２のａｔｔＰ部位とペイロードのａｔｔＢ部位の間で発生した（図３）。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ho S.C., et al., J. Biotechnol. 2013 Jun 10; 165(3-4): 157-66）における最も高いｍＡｂ産生にとって、ウエスタン分析による最適な軽鎖と重鎖との比率が３：１であることを考慮して、ＬＣをより強力なｍＣＭＶプロモーターから発現させ、ＨＣをより弱いｈＥＦ１ａプロモーターから発現させた。ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、この構成は、ｈＥＦ１ａがＬＣとＨＣの両方の発現を駆動するプロモーターである構成よりも高い力価を生産した。この構成は、広範なタンパク質発現に対して機能するはずである。
【００８１】
ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１ノックアウトの設計：ＪＵＧ−４４４を発現するＬＰ２を有するＣＨＯ細胞株を使用して、グリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン内のエクソンのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的切除によりＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１ノックアウトを生成した。エクソン７をＦＵＴ８から完全に切除し、エクソン２をβ４ＧＡＬＴ１から部分的に切除した。機能的ノックアウトを、フコシル化またはガラクトシル化種の欠如についてＪＵＧ−４４４グリカン構造の分析によって確証した。
【００８２】
ランディングパッドへの組み込みのためのＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１合成サーキットの設計：合成生物学的サーキットを、細胞活性を制御する論理機能を実行するために、調整可能で特性化されたパーツまたはモジュールのアレイから設計および構築した。この例において、合成ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１遺伝子は、構成的または小分子誘導性プロモーターの下で発現した（図４）。すべてのサーキットはまた、蛍光マーカーとしてｍＫａｔｅを構成的に発現した。使用した構成的プロモーターは、ＦＵＴ８とβ４ＧＡＬＴ１の両方においてｈＥＦ１ａであった。Ｔｅｔ−Ｏｎ  ｒｔＴＡ３（逆テトラサイクリントランスアクチベーター）システムにおいては、ｒｔＴＡ３はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下でＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔプロモーターに結合し、遺伝子発現を誘導する（Dow L.E., et al., PLoS One. 2014 Apr 17; 9(4): e95236）。アブシジン酸（ＡＢＡ）誘導二量体化システムにおいては、ＰｈｌＦ  ＤＮＡ結合ドメイン上の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）とＶＰ１６転写アクチベータードメインの核局在化シグナル（ＮＬＳ）とが、これらのＡＢＩおよびＰＹＬドメインを異なる細胞内コンパートメントに隔離する（Liang F.S., et al., Sci. Signal. 2011 Mar 15; 4(164): rs2）。ＰｈｌＦおよびＶＰ１６はまた、夫々ＡＢＡおよびＰＹＬドメインに融合され、それは、ＡＢＡの存在下で二量体化を経て、ＰｈｌＦ活性化可能プロモーターからの発現を駆動する。合成ＦＵＴ８（ｐＭＣ１、ｐＭＣ３、およびｐＭＣ１１）を有するサーキットを、ＪＵＧ−４４４を発現し、内在性ＦＵＴ８ノックアウトを有するｄＬＰ細胞株に組み込んだ。合成β４ＧＡＬＴ１（ｐＭＣ２、ｐＭＣ４、およびｐＭＣ１２）を有するサーキットを、ＪＵＧ−４４４を発現し、内在性β４ＧＡＬＴ１ノックアウトを有するｄＬＰ細胞株に組み込んだ。フコシル化とガラクトシル化を同時に独立して制御するために、ｐＭＣ１１およびｐＭＣ４．１サーキットを、ＪＵＧ−４４４を発現し、内在性ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１の両方のノックアウトを有するｔＬＰ細胞株に組み込んだ。
【００８３】
合成遺伝子発現のマイクロＲＮＡ制御：マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、真核細胞において遺伝子調節を制御するＲＮＡ干渉システムの重要なエレメントである（Bartel D.P., Cell. 2009 Jan 23; 136(2): 215-33）。ｍｉＲＮＡはタンパク質複合体によって処理され、細胞におけるｍＲＮＡレベルをノックダウンし、タンパク質発現を低減させる。そのため、目的のタンパク質の５’−および／または３’−ＵＴＲへの合成マイクロＲＮＡ応答エレメント（ＭＲＥ）の組み込みは、遺伝子発現レベルをさらに下方に調整する必要がある、すでに低レベルの構成的プロモーターをさらに下方調節するために使用し得る。具体的には、１ｘ、４ｘ、および８ｘ  ＭＲＥが特定のｍｉＲＮＡ（ＦＦ４）に（例として、弱い構成的プロモーター（例として、ｈＵＢＣおよびｈＡＣＴＢ）から発現されるＦＵＴ８合成遺伝子に）組み込まれる。相補的な合成ｍｉＲＮＡ−ＦＦ４は、ヒトＵ６プロモーター（高いｍｉＲ−ＦＦ４発現）またはｈＥＦ１ａ−ｍＫａｔｅ−イントロン構築物（低いｍｉＲ−ＦＦ４発現）のいずれかから構成的に発現する。後者の場合、ｍｉＲ−ＦＦ４は蛍光タンパク質ｍＫａｔｅからスプライシングにより切り出されたイントロンとして生産され、赤色蛍光はｍｉＲ−ＦＦ４の存在を示す（図５）。種々の弱い構成的プロモーターと種々の数のＭＲＥおよびｍｉＲ−ＦＦ４の種々の発現レベルとの組み合わせは、様々なレベルのＦＵＴ８発現のための弱い構成的プロモーターのライブラリをもたらす。
【００８４】
合成プロモーターライブラリによるＦＵＴ８の転写調節：合成プロモーターライブラリは、転写レベルでの遺伝子発現の調節を微調整するための別のアプローチである。ｈＥＦ１ａなどの一般的に使用される構成的プロモーターによるＦＵＴ８の遺伝子発現は、ＦＵＴ８の極めて高い発現をもたらし、野生型レベルの抗体フコシル化を導いた。低いＦＵＴ８  ｍＲＮＡレベルでさえ、高レベルのフコシル化を導く。よって、広範囲のフコシル化を達成するには、弱く広範囲の発現が必要である。大体６０００の種々の複数の転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含む、これまでに構築された合成プロモーターライブラリ（Nissim L., Cell. 2017 Nov 16; 171(5): 1138-50）は、この問題の解決策を提供する（図６）。合成プロモーターの強度は、ＣＨＯ細胞における蛍光マーカーの発現によってスクリーニングすることができる。これまでに同定された複数のＴＦＢＳ（Wingender E., et al., Nucleic Acids Res. 2013 Jan; 41; 24;Vaquerizas J.M., et al., Nat. Rev. Genet. 2009 Apr; 10(4): 252-63）はコアプロモーターの上流に位置し、ＦＵＴ８はこの合成プロモーターの下で発現する。
【００８５】
合成遺伝子発現の上流ＯＲＦ制御：２アミノ酸ペプチドをコードする短い、上流のオープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を、目的のタンパク質をコードするＯＲＦの上流に挿入して、その発現を抑制することができる（Ferreira J.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013 Jun 9; 110(28): 11284-89）。ｕＯＲＦに先行する塩基配列の変更、または連続する複数のｕＯＲＦおよび非ＡＵＧ開始コドン中の使用は、３桁にわたる発現レベルを導く可変の翻訳開始速度をもたらす（図７）。例えば、ＦＵＴ８の発現レベルを調整し、ＣＨＯ細胞での低レベルのフコシル化を達成するために、ＦＵＴ８の翻訳開始をこの様式で制御することができる。
【００８６】
調整可能なシアリル化のための合成サーキットの設計：シアリル化は末端のガラクトシル化種で起こり、ＩｇＧの抗炎症活性に役割を果たす（Kaneko Y., Science. 2006 Aug 4; 313(5787): 670-73）。シアリル化レベルをモジュレーションする前に、例２に記載されているように、ガラクトシル化レベルを増加させなければならない。β４ＧＡＬＴ１  ＫＯ細胞においてｐＭＣ２を発現する細胞は、第３のランディングパッドでのＳＴ６ＧＡＬ１サーキットの組み込みに使用することができる。構成的およびＤｏｘ誘導性プロモーター下のＳＴ６ＧＡＬ１を有するサーキットは、ＪＵＧ−４４４のα−２，６−シアリル化をモジュレーションするために使用される（図８）。フコシル化、ガラクトシル化、およびシアリル化の同時かつ独立したモジュレーションが望まれる場合、ＡＢＡおよびＤｏｘシステムに加えて別の小分子誘導性システムが必要である。クマート（Mullick A., Xu Y., et al., BMC Biotechnol. 2006 Nov 3; 6: 43）およびジベレリン酸（Gao Y., et al., Nat. Methods. 2016 Dec; 13(12): 1043-49）誘導性システムは、第３のオルソゴナルな誘導性システムとして使用することができる。
【００８７】
例３：ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１ノックアウトの検証
ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１ノックアウト（ＫＯ）を、これまでに行ったのと同様に、触媒活性に不可欠なエクソンのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲット切除によって生成した（Zong H., et al., Eng. Life Sci. 2017 Feb 23; 17(7): 801-8; Sun T., et al., Eng. Life Sci. 2015 Jul 21; 15(6): 660-66）。ＫＯクローンを、ゲノムＤＮＡのＰＣＲスクリーニングにより同定した（図９Ａ）。各々の推定のノックアウトから酵素的に放出および標識されたＪＵＧ−４４４グリカンを疎水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）により分析し、フコシル化および／またはガラクトシル化種の喪失を確認した（図９Ｂ）。予想どおり、野生型細胞（ノックアウトのないｄＬＰ）で発現したＪＵＧ−４４４と比較すると、ＦＵＴ８  ＫＯクローンはＧ１Ｆ種からＧ１への変換、およびＧ０Ｆ種からＧ０への変換を示した。β４ＧＡＬＴ１  ＫＯクローンはＧ１Ｆ種のＧ０Ｆへの変換を示した。ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１ダブルＫＯクローンは、Ｇ０ＦおよびＧ１Ｆ種のＧ０への変換を示し、Ｍａｎ５およびＧ０−Ｎ種の増加もまた観察された。
【００８８】
例４：構成的プロモーター下でのＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１発現
ｐＭＣ１サーキット（図４を参照のこと）のＦＵＴ８  ＫＯ細胞株への組み込みは、ＪＵＧ−４４４の総フコシル化を９２．７％のほぼ野生型レベルまで回復させた（図１０、表２）。観察されたガラクトシル化種のレベルのわずかな増加も存在した。ｐＭＣ２サーキット（β４ＧＡＬＴ１発現を駆動するｈＥＦ１ａプロモーター）のβ４ＧＡＬＴ１  ＫＯ細胞株への組み込みは、８７．１％総ガラクトシル化種をもたらし、これは、ＪＵＧ−４４４を発現するＢ４ＧＡＬＴ１野生型細胞に見出された６．９％総ガラクトシル化種からの大幅な増加である。到達したガラクトシル化のレベルの大幅な増加に起因して、シアリル化種のパーセンテージは０．３％から６．８％に増加した。末端ガラクトシル化はシアリル化の前提条件であるため、ガラクトシル化レベルが高いほどシアリル化のレベルが高くなることは驚くべきことではない。比較的強力な構成的プロモーターであるｈＥＦ１ａで観察されたフコシル化およびガラクトシル化レベルは、高いフコシル化およびガラクトシル化レベルが誘導性システムで達成可能であるべきであることを示す一方で、ノックアウトは、到達することができる最も低いレベルのフコシル化およびガラクトシル化を示す。この研究の明らかな拡張は、より弱い構成的プロモーター、またはｈＥＦ１ａプロモーターの弱められたバージョンを使用すること、様々なグリコシル化レベルを達成することである。
【００８９】
表２：ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１ノックアウトの、および組み込まれた構成的サーキットであるｐＭＣ１およびｐＭＣ２を有する、ＪＵＧ−４４４グリカン種の組成、ここで末端ガラクトシル化はガラクトース末端グリカン分岐を有するグリコフォームを指し、総ガラクトシル化はガラクトースを含有するすべてのグリコフォームを指す。星印で印付けられた値は、他の低レベルの非末端ガラクトシル化グリカン種の共遊走を含む。
【表２】
2021528074.tif 000004
【００９０】
例５：誘導性プロモーター下でのＦＵＴ８またはβ４ＧＡＬＴ１単一遺伝子調節
ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１の発現を調節するためのＤｏｘ誘導性サーキット（ｐＭＣ３およびｐＭＣ４）を、ＦＵＴ８またはβ４ＧＡＬＴ１シングルノックアウト細胞株に組み込んだ。Ｄｏｘを添加しない場合、ｐＭＣ３からのＴＲＥＴプロモーターからの漏出発現に起因するＦＵＴ８発現のベースレベルは、ＪＵＧ−４４４の８．２％総フコシル化をもたらした。到達した総フコシル化の最高レベルは、１０００ｎＭ  Ｄｏｘで８１．９％であった（図１１Ａ）。８．２％から８１．９％の範囲は、Ｄｏｘの滴定によって達成可能である。ｐＭＣ４からのβ４ＧＡＬＴ１発現のベースレベルは、ＪＵＧ−４４４の５．３％総ガラクトシル化をもたらした。到達した総ガラクトシル化の最高レベルは、１０００ｎＭ  Ｄｏｘで７０．５％であった（図１１Ｂ）。これらの実験で達成された最大のフコシル化およびガラクトシル化レベルは、ｈＥＦ１ａプロモーターで見出されたものよりもわずかに低かった。しかしながら、７日間の流加培養中に変更された誘導因子レジメンは、より高いレベルを潜在的に達成するために使用され得る。これらのランディングパッドからの発現レベルは、少なくとも２か月間、堅牢で安定したままであることに注意すべきである（Gaidukov L., et al., Nucleic Acids Res. 2018 May 4; 46(8): 4072-86）。
【００９１】
ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１の発現を調節するためのＡＢＡ誘導性サーキット（ｐＭＣ１１およびｐＭＣ１２）を、ＦＵＴ８またはβ４ＧＡＬＴ１シングルノックアウト細胞株に組み込んだ。ＡＢＡを添加しない場合、ｐＭＣ１１からのＦＵＴ８発現のベースレベルは、ＪＵＧ−４４４の２．０％総フコシル化をもたらした。到達した総フコシル化の最高レベルは、２５０ｕＭ  ＡＢＡで６８．８％であった（図１２Ａ）。２．０％から６８．８％の範囲は、ＡＢＡの滴定によって達成可能である。ｐＭＣ１２からのβ４ＧＡＬＴ１発現のベースレベルは、ＪＵＧ−４４４の２．２％総ガラクトシル化をもたらした。到達した総ガラクトシル化の最高レベルは、２５０ｕＭ  ＡＢＡで６４．６％であった（図１２Ｂ）。この実験で達成した最大フコシル化およびガラクトシル化レベルは、Ｄｏｘ誘導性システムで見られたものよりも低かった。しかしながら、フコシル化とガラクトシル化の非誘導レベルは、Ｄｏｘ誘導性システムと比較した場合よりも、おそらくＡＢＡの非存在下での少ない漏出発現に起因して、ＡＢＡ誘導性システムでは低かった。
【００９２】
例６：誘導性プロモーター下でのＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１遺伝子の同時調節
ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１遺伝子の同時の独立した制御のために、ｐＭＣ１１およびｐＭＣ４．１サーキットを、ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１ノックアウトの両方を含有するトリプルランディングパッド細胞株に組み込んだ。ＡＢＡ誘導性システムは誘導因子なしでフコシル化のより緊密な調節をもたらすので、ｐＭＣ１１をＦＵＴ８発現のために選択した。アフコシル化はノックアウトで容易に達成可能である一方で、広いエフェクター機能のモジュレーションのために、より低い範囲の総フコシル化にアクセス可能であることは重要である。Ｄｏｘ誘導性システムは誘導時に高レベルのガラクトシル化をもたらし、これは、エフェクター機能研究に望ましく、その後のシアリル化に必要であるので、ｐＭＣ４．１をβ４ＧＡＬＴ１発現のために選択した。
【００９３】
１０００ｎＭ  Ｄｏｘ濃度において、総ガラクトシル化のレベルはほぼ４５％の中程度のレベルにのみ到達した。このレベルのガラクトシル化において、１．６％から７４．１％の範囲の総フコシル化に達した（図１３Ａ）。この範囲は、低レベルおよび高レベルのガラクトシル化についてさらにアッセイすることができる。極めて低レベルのフコシル化（ＡＢＡの不在）では、４．６％から５９．１％の範囲の総ガラクトシル化が実証された（図１３Ｂ）。この範囲は、中および高レベルのフコシル化についてさらにアッセイすることができる。二重誘導性発現システムの結果は、in vivoでｍＡｂに対してこれまで確立されたことのないフコシル化およびガラクトシル化の全範囲へのアクセスである。
【００９４】
例７：ＪＵＧ−４４４エフェクター機能研究
ＡＤＣＣは、ＩｇＧのＦａｂ部分が標的細胞の標的抗原に結合し、ＩｇＧのＦｃ部分がエフェクター細胞の表面のＦｃγＲＩＩＩａに結合することによって開始される。エフェクター細胞は、抗体で覆われた標的細胞の死を引き起こす細胞傷害性因子を放出する。ＩｇＧのグリコシル化プロファイルは、ＩｇＧのＦｃγＲＩＩＩａへの結合に影響を与え得る。ＩｇＧのＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって決定することができる。９つの異なるグリコシル化プロファイルを有するＪＵＧ−４４４（図１４）は、ダブルノックアウト細胞株のｐＭＣ１１およびｐＭＣ４．１サーキットからの可変のＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１発現を誘導することにより達成された。次いで、これらの９つの抗体グリコフォームのＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性をＳＰＲによって分析した。観察された最も低い結合親和性（ＫＤ＝８８．７ｎＭ）は、９１．５％フコシル化と１．９％ガラクトシル化を伴うＪＵＧ−４４４のものであった。観察された最も高い結合親和性（ＫＤ＝６．２ｎＭ）は、１．２％フコシル化と７５．４％ガラクトシル化を伴うＪＵＧ−４４４であった。Ｆｃフコシル化とＦｃγＲＩＩＩａ結合の間には明確な関係があり、フコシル化レベルが低いほど、ＦｃのＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性は増加した。加えて、より高いＦｃガラクトシル化レベルもまた結合親和性を増加させたが、フコシル化で見られるの変化ほど劇的ではなかった。これは、ＡＤＣＣを増加させるアフコシル化および高ガラクトシル化のこれまでに報告された効果を確認する（Liu S.D., et al., Cancer Immunol. Res. 2015 Feb; 3(2): 173-83; Thomann M., et al., Mol. Immunol. 2016 May; 73: 69-75）。
【００９５】
例８：構成的プロモーター下でのＳＴ６ＧＡＬ１発現
驚くべきことに、β４ＧＡＬＴ１  ＫＯ細胞株におけるｐＭＣ２およびｐＭＣ２０サーキット（図４および図８を参照のこと）の発現は、総ガラクトシル化およびシアリル化レベルを、野生型ＪＵＧ−４４４においてそれぞれ６．４％および０．０％から、改変されたＪＵＧ−４４４において７９．７％および７４．０％へと劇的に増加した（図１５）。興味深いことに、内在性ＦＵＴ８の発現は、ＷＴ  ＪＵＧ−４４４における９４．６％と比較して、８１．０％フコシル化をもたらした。フコシル化、ガラクトシル化、およびシアリル化の間のこの相互作用は、これまでに実証されておらず、完全に予想外であった。
【００９６】
例９：結論
この研究は、合成生物学的アプローチを使用して、独立した制御された様式において、ｍＡｂフコシル化およびガラクトシル化をモジュレーションすることができることを実証する。発現宿主の改変または精製されたｍＡｂの酵素的修飾においてある程度の進歩があった一方で、内在性ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１遺伝子がノックアウトされ、合成バージョンが誘導性プロモーター下でゲノムに組み込まれた最初のケースである。したがって、これは、これらのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が調整可能なレベルで安定的に発現され、in vivoでこれまでに容易にアクセスできなかった広範囲のガラクトシル化およびフコシル化種を可能にする最初の例でもある。各遺伝子の同時の正確なモジュレーションの力は、ｍＡｂが特定のＦｃ媒介エフェクター機能に適した特定のグリコシル化パターンで細胞株製造プロセスにおいて改変できること、または任意の所望のレベルのフコシル化およびガラクトシル化のバイオ医薬品を生産できることを意味する。このアプローチは、ＦＵＴ８およびβ４ＧＡＬＴ１遺伝子に限定されない。今や、シアリル化のレベルを変更することも達成することができる、高レベルのガラクトシル化を確実に達成することができ、所望される効力、安全性／免疫原性および薬物動態特性を備えた新規のｍＡｂ治療薬の開発への扉を開くはずである。重要なことには、この方法は、ｍＡｂ治療法を超えて、任意の新規の組換えタンパク質治療法に広く適用できるはずである。
【００９７】
例１０．例１１〜１４の方法と材料
ランディングパッド細胞の構築：ＬＰ２およびＬＰ２０遺伝子座を標的化してマルチランディングパッドＣＨＯ細胞株を構築した。手短に言えば、ｈＥＦ１ａ−ａｔｔＰ−ＢｘＢ１−ＥＢＦＰ−Ｐ２Ａ−Ｂｌａ（カセット１）またはｈＥＦ１ａ−ａｔｔＰ−ＢｘＢ１−ＧＡ−ＥＹＦＰ−Ｐ２Ａ−Ｈｙｇｒｏ（カセット２）を含有し、左および右相同アームを有するドナーベクターを、Neon電気穿孔法を用いて、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）ベクターおよびGeneArt（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ  Ｕ６  Strings（商標）ＤＮＡで共トランスフェクトした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換えの後、ＢＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳによって単細胞に選別した。
ベクター構築：ギブソンアセンブリクローニング法を使用して、プロモーターと遺伝子フラグメントをエントリーベクターに挿入した。発現ベクターを、デスティネーションプラスミドによるＬＲクローニングによって構築した。
【００９８】
ＣＨＯ細胞培養および流加培養：懸濁ＣＨＯ細胞を、８ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充した無血清ＣＤ−ＣＨＯ培地で成長させた。培養物を、７％ＣＯ２を含む震盪インキュベーター（３７℃）中で１３０ｒｐｍでインキュベートした。７日間の流加培養を、５０ｍＬの作業容量を含有するエルレンマイヤーフラスコ２５０ｍＬで、または２５ｍＬの作業容量を含むエルレンマイヤーフラスコ１２５ｍＬで行った。０日目に、細胞を１．５ｘ１０６細胞／ｍＬの播種密度で播種した。３日目から６日目まで、ｐＨを０．９４Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／０．０６Ｍ  Ｋ２ＣＯ３で１日２回滴定し、細胞培養物にCell Boost 5サプリメント（Hyclone）と２０％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースを補充した。７日目に、培養物を回収し、培地を清澄化した。
【００９９】
ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ｑＰＣＲ：全ＲＮＡをTRIzol試薬（Invitrogen）で抽出し、QuantiTect逆転写キット（Qiagen）を使用するｃＤＮＡ合成に１ｕｇを使用した。ｍＲＮＡ発現を、LightCycler（登録商標）９６システム（Roche）でのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイによって定量した。相対的な遺伝子発現を、正規化のための参照遺伝子としてＢ−アクチンを使用するΔΔＣＴ法によって分析した。
【０１００】
例１１．プロモーターミニライブラリを使用した構成的ＦＵＴ８発現は、大部分において高いフコシル化レベルのｍＡｂをもたらす
ノックアウト細胞株におけるＦＵＴ８発現を回復するために、一般的に使用される哺乳動物構成的プロモーター下でＦＵＴ８の合成バージョンを発現する遺伝子サーキットを導入した（ｈＥＦ１ａ、ＲＳＶ、ｈＰＧＫ、ｈＵＢＣ、ＨＳＶ−ＴＫ、ｈＡＣＴＢ）（図１６Ａ）。細胞のＦＵＴ８転写レベルは変化したが（図１６Ｂ）、これらのサーキットからのＦＵＴ８発現は、大部分において高度にフコシル化されたｍＡｂをもたらした（図１６Ｃ）。まず、ＦＵＴ８を構成的に発現するサーキットをＦＵＴ８  ＫＯ細胞株のＬＰ２０遺伝子座に組み込んだ。ゲノムの組み込みを、蛍光マーカーであるｍＫａｔｅ発現によって確認した。流加培養の７日後、ｍＡｂ生産をＨＩＬＩＣにより分析した。ｈＥＦ１ａ、ＲＳＶ、ｈＰＧＫプロモーターを含む強力な構成的プロモーター下でＦＵＴ８を発現する細胞株はすべて、同じ流加培養条件下での内在性フコシル化レベルに対応する９１％超のフコシル化ｍＡｂを生産した。比較的弱いプロモーターであるｈＵＢＣ、ＴＫ、およびｈＡＣＴＢは、それぞれ８０％、７５％、３０％のフコシル化種を生成した。細胞株のＦＵＴ８  ｍＲＮＡ発現を、流加培養の０日目に分析した。ｈＥＦ１ａ−ＦＵＴ８細胞株は、野生型と比較して大体４０倍の増加で発現した；しかしながら、ｍＡｂフコシル化レベルはＷＴと同様であった。ＴＫ−ＦＵＴ８細胞株とｈＡＣＴＢ−ＦＵＴ８細胞株とを比較すると、ｍＲＮＡレベルは２倍未満異なっていたが、フコシル化レベルは有意に異なっていた（７０％対３０％）。すべての細胞株は、ＷＴレベル（１０．９％）よりも高いガラクトシル化種を生産し、大部分がＧ１種として表された。
【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
例１２．イントロンｍｉＲＮＡサーキットに起因するｍＡｂのフコシル化の低減
ｍＡｂのフコシル化レベルを低減させるために、ｍｉＲＮＡ結合部位を合成ＦＵＴ８配列の３’ＵＴＲに挿入した（図１７Ａ）。結合部位はｍｉＲＮＡの配列を完全に補完し、転写されたｍＲＮＡとのＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の形成を可能にした。いずれの内在性ＣＨＯゲノムも標的としない合成ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−ＦＦ４を使用した。ｍｉＲ−ＦＦ４  ｍｉＲＮＡをコードする配列を、ｍＫａｔｅ蛍光タンパク質のイントロン領域に埋め込んだ。このように、プレｍＲＮＡスプライシングプロセスの間に、イントロンｍｉＲＮＡは成熟する。成熟したｍｉＲＮＡは次いでｍＲＮＡに結合し、翻訳の抑制と不安定化を誘導し得る。抑制の範囲を最大化するために、中程度の強度を示す３つのプロモーター（ＲＳＶ、ｈＰＧＫ、およびｈＵＢＣ）を選択した。抑制レベルを上げるために、３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡ結合部位の４回繰り返しを有する細胞を作成した。相対的なＦＵＴ８  ｍＲＮＡ発現を、野生型細胞株に対して正規化した。すべてのｍｉＲＮＡ遺伝子サーキット細胞は、親の遺伝子サーキット細胞株と比較して低減したｍＲＮＡ発現を示した（図１７Ｂ）。ＲＳＶ−ＦＵＴ８および４ｘ結合部位を有するサーキットを有する細胞は、１ｘ結合部位対応細胞と比較して、およそ１６倍低減したｍＲＮＡレベルを示した一方で、４ｘ結合部位を有するｈＰＧＫ−ＦＵＴ８およびｈＵＢＣ−ＦＵＴ８を有するサーキットを有する細胞は、それらの夫々の１ｘ結合部位細胞と比較してｍＲＮＡレベルに有意差を示さなかった。しかしながら、ｍＡｂの低減したフコシル化レベルは、それらの夫々の１ｘ結合部位細胞株と比較して、４Ｘ結合部位を有するサーキットを有するすべての細胞株において見出された（図１７Ｃ）。ＲＳＶまたはｈＰＧＫ  １ｘ結合部位サーキットは、結合部位を有しないサーキットと比較して、フコシル化レベルにおいて最小限の差異（２．６％および０．２％）を示した（図１７Ｃ）。概して、相対的なＦＵＴ８  ｍＲＮＡの発現は、結合部位を有しない細胞と比較して低減した。加えて、フコシル化を除いて、相対的なグリコフォームの存在量に有意差はなかった。
【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
例１３．ｍＡｂにおける大幅に低減したフコシル化は、Ｕ６プロモーター転写ｍｉＲＮＡサーキットから達成された
フコシル化レベルをさらに低減させるために、追加のｍｉＲＮＡ発現サーキットを構築した（図１８Ａ）。ここで、ｍｉＲ−ＦＦ４をＵ６プロモーターから生産し、ｍＫａｔｅの発現とは独立してｍｉＲＮＡを発現させた。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位（４ｘ）をＦＵＴ８  ｃＤＮＡ配列の５’ＵＴＲに追加した。よって、サーキットは、１）３’ＵＴＲに１つのｍｉＲ−ＦＦ４結合部位、２）３’ＵＴＲに４つのｍｉＲ−ＦＦ４結合部位、３）３’ＵＴＲに４つのｍｉＲ−ＦＦ４結合部位および５’ＵＴＲに４つのｍｉＲ−ＦＦ４結合部位を含む。２つの構成的プロモーター（ｈＵＢＣおよびｈＡＣＴＢ）を使用し、それは、いずれのｍｉＲＮＡ調節もなしで８９％および２８％のフコシル化レベルを有するｍＡｂを生産した。３’ＵＴＲの１ｘ  ｍｉＲ−ＦＦ４結合部位がフコシル化レベルを低減させることを見出した（図１８Ｃ）。ｍｉＲ−ＦＦ４  １ｘ結合部位を有するｈＵＢＣプロモーター駆動ＦＵＴ８サーキットであるＧＪ１３５は、５９．１％フコシル化レベルを示し、これは、ＧＪ１３１（イントロンＦＦ４  １ｘ結合サーキット）よりも２１％低減したフコシル化レベルである。追加の３’ＵＴＲ（ＧＪ１３６）の３ｘ結合部位は、１２．０％のフコシル化ｍＡｂをもたらし、これは、非結合部位サーキットから６．４倍減少した。しかしながら、興味深いことに、ＧＪ１３６と、５’ＵＴＲに４ｘの追加のｍｉＲ−ＦＦ４結合部位を有するＧＪ１３７との間で、フコシル化レベルに有意差は見られなかった。同じくｍｉＲ−ＦＦ４  １ｘ結合部位を有するｈＵＢＣプロモーター駆動ＦＵＴ８サーキットであるＧＪ１３９は、１４％フコシル化ｍＡｂを有する抗体を生成した。同様に、ｍｉＲ−ＦＦ４  １ｘ結合部位を有するｈＡＣＴＢプロモーター駆動ＦＵＴ８サーキットであるＧＪ１３８は、１４％フコシル化ｍＡｂを生産し、これは、ｍｉＲＮＡ結合部位を有しないサーキットから２倍減少した。４ｘ  ｍｉＲ−ＦＦ４結合部位を有するＧＪ１３９は、高度に抑制されたレベルのフコシル化、０．９％を示した。５’ＵＴＲに追加の４ｘｍｉＲ−ＦＦ４結合部位を有する細胞株であるＧＪ１４０は、わずかに高いレベルのフコシル化、３．２％を生成したことが見出された。
【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
例１４．改変された細胞は、長期培養の間、細胞株の安定性を維持した
ＣＨＯ細胞を使用した治療用組換えタンパク質生産のためには、タンパク質の品質と力価を維持することが重要である。改変された細胞株の安定性を評価するために、ＭＣ１およびＧＪ１３８細胞プールを３か月間継代培養し、４週間ごとに流加培養を行った。回収した清澄化培地からの抗体をＨＩＬＩＣで分析し、Octetプラットフォームを使用して力価を測定した。およそ９０世代の３か月の培養中に力価の有意な減少はなかった（図１９Ａ〜１９Ｄ）。ＭＣ１プールは、３つの時点（４、８、および１２週）のすべてにおいて高度にフコシル化された抗体（９６．９８％）を生産し、ガラクトシル化（１８．４５％）およびシアリル化レベル（０．４４％）などの他のグリコシル化プロファイルを維持した。Ｇ０、Ｇ１、およびＧ２グリカンの相対比率も一定であり、夫々７８．９３％、１６．８８％、および１．４１％であった。合成ＦＵＴ８配列の３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡ  １ｘ結合部位を有するＧＪ１３８は、９０世代を通じて低いフコシル化レベル（１２．８３％）を示した。総ガラクトシル化レベル（１３．７６％）はＭＣ１プールよりもおよそ４．７％少なかったが、それらは細胞プール内でガラクトシル化レベルを維持した。ＧＪ１３８細胞プールにおけるシアリル化は、ＭＣ１と比較して低減したレベル（０．２７％）を示した。ＧＪ１３８のＧ０、Ｇ１、およびＧ２種の相対的な存在量は、長期培養の間保持された。これらの細胞プールのタンパク質生産性は、９０世代にわたって有意な変化を示さなかった。
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
【表８】
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【０１１０】
参考文献
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【０１１１】
他の態様
本明細書に開示されているすべての特色は、任意の組み合わせにおいて組み合わされてもよい。本明細書に開示されている各特色は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替の特色によって置き換えられてもよい。よって、特に明記しない限り、開示されている各特色は、同等または同様の特色の一般的なシリーズの例にすぎない。
上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本開示を様々な使用法および条件に適合させるために本開示の様々な変更および修正を行うことができる。よって、他の態様もまた特許請求の範囲内にある。
【０１１２】
等価物
いくつかの発明の態様を本明細書において、説明し、例証したが、当業者であれば、本明細書において説明した機能を実行するための、および／または、本明細書において説明した結果および／または１以上の利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想到することができ、このような変更および／または改良の各々は、本明細書に説明される発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書において説明されるすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成は例示のためであり、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、発明教示内容が用いられる特定用途に依存することを容易に理解することができる。当業者であれば、本明細書において説明した特定の発明の態様の多くの等価物を、単に所定の実験を用いて認識または確認することができる。したがって、上記態様は、ほんの一例として提示されたものに過ぎず、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内であり、発明の態様は、具体的に説明されたまたはクレームされた以外の方法で実施されてもよいことは理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書において説明される各々の特色、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。加えて、２以上のこのような特色、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせも、当該特色、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に矛盾していなければ、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０１１３】
本明細書において定義されかつ用いられた定義はすべて、辞書の定義、参照することにより組み込まれた文書における定義および／または定義された用語の通常の意味に優先されて理解されるべきである。
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文書全体を包含してもよい。
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
【０１１４】
本明細書および特許請求の範囲にて使用される表現「および／または」は、等位接続された要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきであり、すなわち、要素は、ある場合において接続的に存在し、その他の場合において離接的に存在する。「および／または」を用いて列挙される複数の要素も同様に解釈されるべきであり、すなわち、要素のうちの「１以上」が等位接続される。他の要素は、「および／または」節によって具体的に同定された要素以外に、具体的に同定されたそれらの要素に関連していても関連していなくても、任意に存在してもよい。よって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への参照は、「含む」などのオープンエンド言語と共に用いられた場合、１つの態様においては、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を指し、別の態様においては、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を指し；更に別の態様においては、ＡおよびＢの両方（任意にその他の要素を含む）；などを指す。
【０１１５】
本明細書および特許請求の範囲に用いられるように、「または」は、上に定義したように「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えばリストにおけるアイテムを分ける場合、「または」または「および／または」は包括的と解釈され、すなわち、多数の要素または要素のリストのうちの少なくとも１つを含むが、１超の要素も含み、任意に、リストにない追加のアイテムを含むと解釈される。「〜のうちの１つのみ」または「ちょうど１つの」などの反対を明らかに示す用語、または、特許請求の範囲に用いられる場合は、「〜からなる」という用語のみが、多数の要素または要素のリストのうちのちょうど１つの要素が含まれることを指す。一般に、本明細書において使用される用語「または」は、「いずれか」、「〜のうちの１つの」、「〜のうちの１つのみ」、または「〜のうちのちょうど１つのみ」などの排他的な用語が先行する場合にのみ、排他的な代替（すなわち「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すと解釈される。「本質的に〜からなる」は、特許請求の範囲に用いられる場合、特許法の分野にて用いられる通常の意味を有する。
【０１１６】
本明細書および特許請求の範囲に用いられるように、１以上の要素のリストを参照した際の「少なくとも１つ」との表現は、要素のリストにおける任意の１つ以上の要素から選択された少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリストに具体的に列挙された各々およびすべての要素の少なくとも１つを必ずしも含むわけではなく、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを排除するものではない。この定義は、要素が、「少なくとも１つの」との表現が指す要素のリストの中で具体的に同定された要素以外に、それらの具体的に同定された要素に関係していても関連していなくても、任意に存在してもよいことを許容する。よって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの態様においては、１超のＡを含む（任意に２つ以上のＡを含む）が、Ｂが存在しない（任意にＢ以外の要素を含む）ことを指し；別の態様においては、少なくとも１つの、任意で１超のＢを含むが、Ａは存在しない（任意にＡ以外の要素を含む）ことを指し、更に別の態様においては、少なくとも１つの、任意で１超のＡを含み、かつ少なくとも１つの、任意で１超のＢを含む（任意に他の要素を含む）；などを指す。
【０１１７】
明確に反対の指示がない限り、１超の工程または動作を含むクレームされたいずれの方法において、当該方法の工程または動作の順番は、記載された方法の工程または動作の順番に必ずしも限定されないことは理解されるべきである。
特許請求の範囲においても、上記明細書においても、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「〜から構成される」などのすべての移行句は、オープンエンド、すなわち、それを含むがそれに限定されないことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査手続便覧の２１１１．０３項に記載される通り、「〜からなる」および「本質的に〜からなる」といった移行句のみが、クローズドまたはセミクローズドエンドの移行句である。オープンエンドの移行句（例として、「含む」）を使用して本文書に記載された態様も、代替の態様において、オープンエンドの移行句によって記載された特色「からなる」および「から本質的になる」と企図されることもまた理解されたい。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替の態様である「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」をまた企図する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ−Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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