(57)【要約】  正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層と、負又は正に荷電した官能基のセットを含む基材層の上の金属ナノ粒子コーティングと、金属ナノ粒子コーティングの上の金属層と、金属層の上の第１の超疎水性層とを含む複合超疎水性材料が本明細書に開示される。また、本明細書には、前記材料を製造する方法、及び前記材料を使用して自然流産の危険性の増加を予測する方法が開示される。【選択図】図５
2021510646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面増強ラマン散乱に使用するのに適した複合超疎水性材料であって：
正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層；
前記基材層の上の、負又は正に荷電した官能基のセットを含む、金属ナノ粒子コーティング；
前記金属ナノ粒子コーティングの上の金属層；及び
前記金属層の上の第１の超疎水性層を含み：
前記金属ナノ粒子コーティングは、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含み、第１のセットの金属ナノ粒子は、第２のセットの直径より０．１〜９０％小さい直径を有し；
前記第１のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記第２のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記基材層及び前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が、互いに電子的に相補的である、複合超疎水性材料。
【請求項２】
前記基材層の表面の前記金属ナノ粒子コーティングの密度が、２〜２０粒子／μｍ２、例えば２．５〜１０粒子／μｍ２、例えば、３〜５粒子／μｍ２、例えば４．４粒子／μｍ２である；及び／又は、
前記複合材料が、前記金属ナノ粒子コーティングと前記金属層との間に挟まれた第２の超疎水性層をさらに含む、請求項１に記載の複合超疎水性材料。
【請求項３】
水との静的接触角が、１５０°を超える、例えば１５１°〜１７０°、例えば１５５°〜１６５°を示す、請求項１又は２に記載の複合超疎水性材料。
【請求項４】
前記第１のセットのナノ粒子が、１０〜２５０ｎｍ、例えば２０〜１００ｎｍ、例えば３０〜５０ｎｍ、例えば１３０〜２４０ｎｍ、例えば１３５〜２３０ｎｍの平均直径を有する；及び／又は
前記第２のセットのナノ粒子が、２５０〜１，０００ｎｍ、例えば３００〜６００ｎｍ、例えば３１１〜５４０ｎｍの平均直径を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【請求項５】
（ｉａ）前記第１のセットの金属ナノ粒子が、前記第２のセットの直径よりも０．２〜６０％小さい、例えば、第２のセットの直径よりも０．５〜５７％、例えば１〜５５％、例えば１０〜５０％、例えば２５〜４５％小さい、例えば、前記第２のセットの直径よりも６１〜８９％小さい、例えば、前記第２のセットの直径よりも７５〜８５％、例えば７９〜８３％小さい；及び／又は
（ｉｉａ）前記複合物は、３０〜１５０ｎｍ、例えば４０〜１４０ｎｍ、例えば５０〜１２５ｎｍ、例えば１１０〜１２５ｎｍの二乗平均平方根表面粗さを有する；及び／又は
（ｉｉｉａ）前記複合材料上の第２のセットのナノ粒子中の粒子の総数と第１のセットのナノ粒子中の粒子の総数の比が、１：１０〜１０：１、例えば１：５〜５：１、例えば２：１〜４：１である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【請求項６】
前記基材層上の荷電した官能基のセットが正に荷電し、前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が負に荷電している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【請求項７】
前記基材層上の正に荷電した官能基のセットがアンモニウムイオンであり、及び／又は、前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の負に荷電した官能基のセットがカルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンである、請求項６に記載の複合超疎水性材料。
【請求項８】
前記基材層上の荷電した官能基のセットが負に荷電し、前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が正に荷電している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【請求項９】
前記基材層上の負に荷電した官能基のセットがカルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンであり、及び／又は、前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子の正に荷電した官能基のセットがアンモニウムイオンである、請求項８に記載の複合超疎水性材料。
【請求項１０】
（ｉｂ）前記金属層が、厚さ５〜５３ｎｍ、例えば厚さ１５〜４３ｎｍ、例えば厚さ２０〜３３ｎｍ、例えば厚さ２５〜３０ｎｍである；及び／又は
（ｉｉｂ）前記金属層が、銀層、金層又は銀及び金層を含み、任意選択で、前記銀層、金層又は銀及び金層が、厚さ５〜４８ｎｍ、厚さ１０〜３８ｎｍ、厚さ１５〜２８ｎｍ、厚さ２０〜２５ｎｍである；及び／又は
（ｉｉｉｂ）前記金属ナノ粒子コーティング中のナノ粒子間のギャップを介して、前記金属層と前記基材層との間が直接付着している；及び／又は
（ｉｖｂ）前記第１の超疎水性層が、非置換であるか又は１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールを含み、任意選択で、前記第１の超疎水性層が、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群の１種以上を含む；及び／又は
（ｖｂ）前記第２の超疎水性層が、非置換であるか１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールを含み、任意選択で、前記第２の超疎水性層が、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群の１種以上を含む、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【請求項１１】
前記第１のセットの金属ナノ粒子がナノキューブであり、前記第２のセットの金属ナノ粒子が６つを超える面を有するナノ多面体であって、７〜３０個の面を有する１種以上のナノ多面体から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【請求項１２】
前記第２のセットの金属ナノ粒子が、ナノ八面体である、請求項１１に記載の複合超疎水性材料。
【請求項１３】
前記第１及び第２のセットのナノ粒子が、銀ナノ粒子である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【請求項１４】
以下の部材を含むキット：
（ａｉ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料；及び
（ｂｉ）チオール基を含むボロン酸でコーティングされた銀及び／又は金ナノ粒子を含む尿分析製剤：ここで、
前記ナノ粒子は、前記複合超疎水性材料に使用されるのと同じ金属から形成され、及び／又は、前記ボロン酸は４−メルカプトフェニルボロン酸である。
【請求項１５】
自然流産のリスク増加を予測する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）対象から得られた尿試料の非塩成分を含む水溶液を提供すること；
（ｂ）前記水溶液を、チオール基を含むボロン酸でコーティングされた銀及び／又は金ナノ粒子を含む尿分析製剤と、第１の期間反応させて、複合体化試料を提供すること（任意選択で、前記ナノ粒子は複合超疎水性材料に使用されるのと同じ金属から形成され、及び／又は前記ボロン酸は４−メルカプトフェニルボロン酸である）；
（ｃ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料上に前記複合体化試料を置き、蒸発によって水を除去して、乾燥試料を提供すること；及び
（ｄ）前記乾燥試料をラマン分光法に供して、プレグナン及びテトラヒドロコルチゾンの存在量を決定し、次の式に基づいて自然流産のリスクを予測すること：
【数１】
2021510646.tif 000013
ここで、閾値よりも低い値は自然流産のリスクの増加を示し、任意選択で、前記第１の期間は、３〜４８時間、例えば３時間である。
【請求項１６】
前記工程（ａ）で提供される水溶液が、以下の工程によって得られる、請求項１５に記載の方法：
（ｉ）対象から得られた塩及び非塩成分を含む尿試料を逆相カラムに添加して、ロードされたカラムを提供すること；
（ｉｉ）水で溶出することによって前記ロードされたカラムから塩成分を除去し、次いで、Ｃ１−４アルコール（例えば、メタノール）で溶出することによって前記ロードされたカラムから非塩成分を除去して分離し、次いで、Ｃ１−４アルコールを除去すること；及び
（ｉｉｉ）前記分離された非塩成分に水溶液を添加して、前記工程（ａ）の水溶液を提供すること。
【請求項１７】
前記ラマン分光法が、５３２ｎｍのレーザー励起波長を使用して行われ、０．０１〜１ｍＷのレーザー出力と、１〜６０秒の取得時間とを使用して行われ、任意選択で、前記レーザー出力は０．２ｍＷであり、前記取得時間は１秒である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下の（ｉａ）及び（ｉｂ）を含む、表面増強ラマン散乱に使用に適した複合超疎水性材料の製造方法：
（ｉａ）以下を含む金属被覆複合材料を提供すること：
正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層；
前記基材層の上の、負又は正に荷電した官能基のセットを含む金属ナノ粒子コーティングであって、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含み、第１のセットの金属ナノ粒子は第２のセットの直径より０．１〜９０％小さい直径を有する、金属ナノ粒子コーティング；及び
前記金属ナノ粒子コーティングの上の金属層；並びに、
（ｉｂ）前記金属被覆複合材料を、超疎水性材料を含む溶液に浸漬して、前記金属層の上に超疎水性層を形成し、それによって複合超疎水性材料を形成すること：ここで、
前記第１のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記第２のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記基材層及び前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が、互いに電子的に相補的である。
【請求項１９】
前記金属被覆複合材料が以下の（Ａ）及び（Ｂ）によって形成される、請求項１８に記載の方法：
（Ａ）正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層と、
前記基材層上の、負又は正に荷電した官能基のセットを含む金属ナノ粒子コーティングであって、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含む、金属ナノ粒子コーティングを含む、
金属ナノ粒子被覆基材を提供すること；並びに
（Ｂ）前記金属ナノ粒子被覆基材の上に金属層を堆積させること（ここで、任意選択で、前記堆積は金属の熱蒸発による薄膜堆積である）。
【請求項２０】
（ｉｄ）前記金属被覆複合材料が、前記金属ナノ粒子コーティングと前記金属層との間に挟まれた、さらなる超疎水性層を含む；及び／又は
（ｉｉｄ）前記金属層が、厚さが５〜５３ｎｍ、例えば厚さ１５〜４３ｎｍ、例えば厚さ２０〜３３ｎｍ、例えば厚さ２５〜３０ｎｍである；及び／又は
（ｉｉｄ）前記金属層が、銀層、金層又は銀及び金層を含み、任意選択で、前記銀層、金層又は銀及び金層が、厚さ５〜４８ｎｍ、例えば厚さ１０〜３８ｎｍ、例えば厚さ１５〜２８ｎｍ、例えば厚さ２０〜２５ｎｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記金属ナノ粒子被覆基材が、正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材を、負又は正に荷電した官能基のセットを含む金属ナノ粒子を含む溶液と接触させることによって形成され、
前記金属ナノ粒子が、第１及び第２のセットの金属ナノ粒子を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉｅ）前記第１のセットのナノ粒子が、１０〜２５０ｎｍ、例えば２０〜１００ｎｍ、例えば３０〜５０ｎｍ、例えば１３０〜２４０ｎｍ、例えば１３５〜２３０ｎｍの平均直径を有する；及び／又は
（ｉｉｅ）前記第２のセットのナノ粒子が、２５０〜１，０００ｎｍ、例えば３００〜６００ｎｍ、例えば３１１〜５４０ｎｍの平均直径を有する；及び／又は
（ｉｉｉｅ）前記第１のセットの金属ナノ粒子が、前記第２のセットの直径より０．２〜６０％、例えば、０．５〜５７％、例えば１〜５５％、例えば１０〜５０％、例えば２５〜４５％小さい直径を有する、前記第２のセットの直径より、例えば６１〜８９％小さい直径を有する、前記第２のセットの直径より例えば７５〜８５％、例えば７９〜８３％小さい直径を有する；及び／又は
（ｉｖｅ）前記複合物が、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、例えば４０〜１４０ｎｍ、例えば５０ｎｍ〜１２５ｎｍ、例えば１１０〜１２５ｎｍの二乗平均平方根表面粗さを有する；及び／又は
（ｖｅ）前記複合材料上の第２のセットのナノ粒子の粒子の総数と、第１のセットのナノ粒子の粒子の総数の比が、１：１０〜１０：１、例えば１：５〜５：１、例えば２：１〜４：１である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記基材層上の荷電した官能基のセットが正に荷電しており、前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が負に荷電している、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記基材層上の正に荷電した官能基のセットがアンモニウムイオンであり、及び／又は、前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の負に荷電した官能基のセットがカルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記基材層上の荷電した官能基のセットが負に荷電しており、前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が正に荷電している、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記基材層上の負に荷電した官能基のセットがカルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンであり、及び／又は、前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の正に荷電した官能基のセットがアンモニウムイオンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１８の工程（ｉｂ）において使用される超疎水性材料が、非置換であるか又は１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールであり、任意選択で、前記超疎水性材料が、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群より選ばれる１種以上である、及び／又は、
前記さらなる超疎水性層を形成するために使用される超疎水性材料が、非置換であるか又は１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールであり、任意選択で、超疎水性材料が、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群より選ばれる１種以上である、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のセットの金属ナノ粒子がナノキューブであり、前記第２のセットの金属ナノ粒子が６つを超える面を有するナノ多面体であって、７〜３０面を有する１種以上のナノ多面体から選択される、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のセットの金属ナノ粒子が、ナノ八面体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１及び第２のセットのナノ粒子が、銀ナノ粒子である、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）での使用に適した複合超疎水性材料、前記材料の製造方法、及びＳＥＲＳによる自然流産の危険性の増大を予測するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における先行公開文献の一覧又は考察は、必ずしも当該文献が技術水準の一部であること又は技術常識であることを認めたものとみなすべきではない。
【０００３】
自然流産は、切迫流産全体の約２５％を占める。切迫流産は、腟出血を伴う進行中の妊娠と定義され、腹痛を伴うことがある。自然流産の発生率が高いにもかかわらず、現在の出生前ケアでは自然流産の可能性が高い妊婦を正確に特定することはできない。
【０００４】
加えて、自然流産の現在の管理もまた、過度に医薬化されているかもしれない。例えば、流産のリスクを低下させるために、患者はジドロゲステロンのようなプロゲステロンアナログをルーチンに処方されるが、ジドロゲステロンが切迫流産の症状を呈する患者における流産のリスクを予防又は低下させることができるという決定的な証拠はない。さらに、これらの患者のほとんど（約７５％）は、最終的にはジドロゲステロンの処方の有無にかかわらず、健康な出産に進む。したがって、現行のプロトコールでは、切迫流産の症状を呈しているにもかかわらず、自然流産を受けない可能性のある患者に不必要なストレスや医療費をかけているようである。
【０００５】
最近、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって、６つの尿代謝物が、自然流産と関連することが同定された（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１８／１９９８４９を参照のこと）。典型的には、自然流産を患う妊婦は、出産が成功した女性と比較して、テトラヒドロコルチゾン及びヘキサノイルカルニチンのレベルが高く、５β−プレグナン−３α、２０α−ジオールグルクロニド、プロピオニルカルニチン、イソバリルシカルニチン及び３−メチルグルタリルカルニチンのレベルが低い。
【０００６】
しかし、標的尿代謝物を同定するためのＬＣ／ＭＳの使用は、非実用的であり得、そして臨床設定において広く適用され得ない。第１に、計装は費用がかかり（＞Ｓ＄５００，０００）、計装を収容するために大きな面積（＞１ｍ２）を必要とする。さらに、試料の準備及び試験結果の解読を含む、サンプリングプロセス全体を実行することは、訓練された人員を必要とする。全サンプリングプロセスは完了するのに少なくとも数時間を必要とし、したがって、病院環境において高い患者体積を取り扱うことができない。上記の限界を考慮すると、流産の症状を呈する患者群から自然流産に罹患するリスクのある患者を容易かつ迅速に鑑別できる利用可能な検査キットは、現時点では存在しないようである。
【０００７】
これを踏まえると、自然流産のリスクが高い妊婦を同定するために、重要な尿代謝物の迅速かつ高感度な検出を可能にする新たなロバストなセンシングプラットフォーム又は検出キットが依然として必要である。これにより、高リスク患者を早期かつ迅速に特定でき、必要な治療を迅速に行えるようになる。より重要なことに、これらの方法又はキットは正確であり、費用効果があり、実施が容易でなければならない。
【０００８】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）は、プラズモン金属ナノ粒子の表面上又は表面付近に吸着された分子のラマン散乱を増強する技術である。典型的には、分子のラマンシグナルがＳＥＲＳ基材上の関連する「ホットスポット」での電磁増強のために、数桁増強することができる。ＳＥＲＳ現象に加えて、超疎水性ＳＥＲＳプラットフォームはまた、水溶液のランダムな拡散を減少させることによって検出感度をさらに増強するための理想的なプラットフォームとして機能し得る（Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，２０１４，１６，２６９８３−２６９９０；  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，８６，１０４３７−１０４４４）。超疎水性表面は濡れにくい、又は１５０°を超える水滴の静止接触角を有し、ロールオフ角が１０°未満である表面として定義することができる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の態様及び実施形態は、以下の番号付けされた節によって提供される。
【００１０】
＜１＞
表面増強ラマン散乱に使用するのに適した複合超疎水性材料であって：
正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層；
前記基材層の上の、負又は正に荷電した官能基のセットを含む、金属ナノ粒子コーティング；
前記金属ナノ粒子コーティングの上の金属層；及び
前記金属層の上の第１の超疎水性層を含み：
前記金属ナノ粒子コーティングは、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含み、第１のセットの金属ナノ粒子は、第２のセットの直径より０．１〜９０％小さい直径を有し；
前記第１のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記第２のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；かつ
前記基材層及び前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が、互いに電子的に相補的である、複合超疎水性材料。
【００１１】
＜２＞
前記基材層の表面の前記金属ナノ粒子コーティングの密度が、２〜２０粒子／μｍ２、例えば２．５〜１０粒子／μｍ２、例えば、３〜５μｍ２、例えば４．４粒子／μｍ２である、＜１＞に記載の複合超疎水性材料。
【００１２】
＜３＞
前記複合材料が、前記金属ナノ粒子コーティングと前記金属層との間に挟まれた第２の超疎水性層をさらに含む、＜１＞又は＜２＞に記載の複合超疎水性材料。
【００１３】
＜４＞
水との静的接触角が、１５０°を超える、例えば１５１°〜１７０°、例えば１５５°〜１６５°を示す、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００１４】
＜５＞
前記第１のセットのナノ粒子が、１０〜２５０ｎｍ、例えば２０〜１００ｎｍ、例えば３０〜５０ｎｍ、例えば１３０〜２４０ｎｍ、例えば１３５〜２３０ｎｍの平均直径を有する、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００１５】
＜６＞
前記第２のセットのナノ粒子が、２５０〜１，０００ｎｍ、例えば３００〜６００ｎｍ、例えば３１１〜５４０ｎｍの平均直径を有する、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００１６】
＜７＞
前記第１のセットの金属ナノ粒子が、前記第２のセットの直径よりも０．２〜６０％小さい、例えば、第２のセットの直径よりも０．５〜５７％、例えば１〜５５％、例えば１０〜５０％、例えば２５〜４５％小さい、例えば、前記第２のセットの直径よりも６１〜８９％小さい、例えば、前記第２のセットの直径よりも７５〜８５％、例えば７９〜８３％小さい、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００１７】
＜８＞
３０〜１５０ｎｍ、例えば４０〜１４０ｎｍ、例えば５０〜１２５ｎｍ、例えば１１０〜１２５ｎｍの二乗平均平方根表面粗さを有する、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００１８】
＜９＞
前記複合材料の前記第２のセットのナノ粒子中の粒子の総数と前記第１のセットのナノ粒子中の粒子の総数の比が、１：１０〜１０：１、例えば１：５〜５：１、例えば２：１〜４：１である、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００１９】
＜１０＞
前記基材層が、ポリ（ジメチルシロキサン）、ガラス及びシリコンからなる群の１種以上から形成される、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００２０】
＜１１＞
前記基材層上の荷電した官能基のセットが正に荷電し、前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が負に荷電している、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００２１】
＜１２＞
前記基材層上の正に荷電した官能基のセットがアンモニウムイオンであり、任意選択で、前記基材層上にある正に荷電した官能基のセットが、１又は２つのアミノ基を含むシラン化合物、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシランから誘導される、＜１１＞に記載の複合超疎水性材料。
【００２２】
＜１３＞
前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子の負に荷電した官能基のセットが、カルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンであり、任意選択で、前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子の負に荷電した官能基のセットが、１つ以上のカルボン酸基を含むアルキルチオール又は１つ以上の水酸基を含むアルキルチオール、例えば１１−メルカプトウンデカン酸から誘導される、＜１１＞又は＜１２＞に記載の複合超疎水性材料。
【００２３】
＜１４＞
前記基材層上の荷電した官能基のセットが負に荷電し、前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が正に荷電している、＜１＞〜＜１０＞のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００２４】
＜１５＞
前記基材層上の負に荷電した官能基のセットが、カルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンであり、任意選択で、前記基材層上の負に荷電した官能基のセットが、１つ又は複数のカルボン酸基を含むシラン化合物又は１つ又は複数の水酸基を含むシラン化合物から誘導される、＜１４＞に記載の複合超疎水性材料。
【００２５】
＜１６＞
前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子の正に荷電した官能基のセットが、アンモニウムイオンであり、任意選択で、前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子の正に荷電した官能基のセットが、１つ以上のアミノ基を含むアルキルチオール化合物から誘導される、＜１４＞又は＜１５＞に記載の複合超疎水性材料。
【００２６】
＜１７＞
前記金属層が、厚さ５〜５３ｎｍ、例えば厚さ１５〜４３ｎｍ、例えば厚さ２０〜３３ｎｍ、例えば厚さ２５〜３０ｎｍである、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００２７】
＜１８＞
前記金属層が、銀層、金層又は銀及び金層を含み、任意選択で、前記銀層、金層又は銀及び金層が、厚さ５〜４８ｎｍ、厚さ１０〜３８ｎｍ、厚さ１５〜２８ｎｍ、厚さ２０〜２５ｎｍである、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００２８】
＜１９＞
前記金属層が、さらにクロム層を含み、任意選択で、前記クロム層が厚さ２〜５ｎｍである、＜１８＞に記載の複合超疎水性材料。
【００２９】
＜２０＞
前記クロム層が前記金属ナノ粒子コーティングの上にあり、前記金属層が前記クロム層の上にある、＜１８＞又は＜１９＞に記載の複合超疎水性材料。
【００３０】
＜２１＞
前記金属ナノ粒子コーティング中のナノ粒子間のギャップを介して、前記金属層と前記基材層との間が直接付着している、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００３１】
＜２２＞
前記第１の超疎水性層が、非置換であるか又は１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールを含み、任意選択で、前記第１の超疎水性層が、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群の１つ以上を含む、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００３２】
＜２３＞
前記第２の超疎水性層が、非置換であるか１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールを含み、任意選択で、前記第２の超疎水性層が、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群の１種以上を含む、＜３＞〜＜２２＞のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００３３】
＜２４＞
前記第１のセットの金属ナノ粒子がナノキューブであり、前記第２のセットの金属ナノ粒子が６つを超える面を有するナノ多面体であって、７〜３０の面を有する１種以上のナノ多面体から選択される、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００３４】
＜２５＞
前記第２のセットの金属ナノ粒子が、ナノ八面体である、＜２４＞に記載の複合超疎水性材料。
【００３５】
＜２６＞
前記第１及び第２のセットのナノ粒子が、銀ナノ粒子である、前項のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料。
【００３６】
＜２７＞
以下の部材を含むキット：
（ａｉ）＜１＞〜＜２６＞のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料；及び
（ｂｉ）チオール基を含むボロン酸でコーティングされた銀及び／又は金ナノ粒子を含む尿分析製剤：ここで、
前記ナノ粒子は、前記複合超疎水性材料に使用されるのと同じ金属から形成され；及び／又は、前記ボロン酸は４−メルカプトフェニルボロン酸である。
【００３７】
＜２８＞
自然流産のリスク増加を予測する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）対象から得られた尿試料の非塩成分を含む水溶液を提供すること；
（ｂ）前記水溶液を、チオール基を含むボロン酸でコーティングされた銀及び／又は金ナノ粒子を含む尿分析製剤と、第１の期間反応させて、複合体化試料を提供すること（任意選択で、前記ナノ粒子は複合超疎水性材料に使用されるのと同じ金属から形成される、及び／又は、前記ボロン酸は４−メルカプトフェニルボロン酸である）；
（ｃ）＜１＞〜＜２６＞のいずれか一項に記載の複合超疎水性材料上に前記複合体化試料を置き、蒸発によって水を除去して、乾燥試料を提供すること；及び
（ｄ）前記乾燥試料をラマン分光法に供して、プレグナン及びテトラヒドロコルチゾンの存在量を決定し、次の式に基づいて自然流産のリスクを予測すること：
【数１】
2021510646.tif 000003
ここで、閾値よりも低い値は自然流産のリスクの増加を示し、任意選択で、前記第１の期間は、３〜４８時間、例えば３時間である。
【００３８】
＜２９＞
前記反応がｐＨ１０〜１２のｐＨ値、例えば１１で行われる、＜２８＞に記載の方法。
【００３９】
＜３０＞
前記工程（ｃ）を実行する前に、前記工程（ｂ）の反応生成物を第２の期間で遠心分離し、上清を除去し、ｐＨ１０〜１２、例えば１１の液体で置換し、
前記の遠心分離、上清の除去及び液体の置換は、さらに１〜４回、例えばさらに２回繰り返される、＜２９＞に記載の方法。
【００４０】
＜３１＞
前記方法の工程（ａ）で提供される水溶液が、以下の工程で得られる、＜２８＞〜＜３０＞のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）対象から得られた塩及び非塩成分を含む尿試料を逆相カラムに添加して、ロードされたカラムを提供すること；
（ｉｉ）水で溶出することによって前記ロードされたカラムから塩成分を除去し、次いで、Ｃ１−４アルコール（例えば、メタノール）で溶出することによって前記ロードされたカラムから非塩成分を除去して分離し、次いで、Ｃ１−４アルコールを除去すること；及び
（ｉｉｉ）前記分離された非塩成分に水溶液を添加して、工程（ａ）の水溶液を提供すること（ここで、任意選択で、該水溶液は、ｐＨ値が１０〜１２、例えば１１である）。
【００４１】
＜３２＞
前記ラマン分光法が、５３２ｎｍのレーザー励起波長を使用して行われ、０．０１〜１ｍＷのレーザー出力と、１〜６０秒の取得時間とを使用して行われ、任意選択で、前記レーザー出力は０．２ｍＷであり、前記取得時間は１秒である、＜２８＞〜＜３１＞のいずれか一項に記載の方法。
【００４２】
＜３３＞
以下の（ｉａ）及び（ｉｂ）を含む、表面増強ラマン散乱に使用に適した複合超疎水性材料の製造方法：
（ｉａ）以下を含む金属被覆複合材料を提供すること：
正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層；
前記基材層の上の、負又は正に荷電した官能基のセットを含む金属ナノ粒子コーティングであって、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含み、第１のセットの金属ナノ粒子は第２のセットの直径より０．１〜９０％小さい直径を有する、金属ナノ粒子コーティング；及び
前記金属ナノ粒子コーティングの上の金属層；並びに、
（ｉｂ）前記金属被覆複合材料を、超疎水性材料を含む溶液に浸漬して、前記金属層の上に超疎水性層を形成し、それによって複合超疎水性材料を形成すること：ここで、
前記第１のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記第２のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記基材層及び金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が、互いに電子的に相補的である。
【００４３】
＜３４＞
前記金属被覆複合材料が以下の（Ａ）及び（Ｂ）によって形成される、＜３３＞に記載の方法：
（Ａ）正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層と、
前記基材層上の、負又は正に荷電した官能基のセットを含む金属ナノ粒子コーティングであって、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含む、金属ナノ粒子コーティングを含む、
金属ナノ粒子被覆基材を提供すること；並びに
（Ｂ）前記金属ナノ粒子被覆基材の上に金属層を堆積させること（ここで、任意選択で、前記堆積は金属の熱蒸発による薄膜堆積である）。
【００４４】
＜３５＞
前記金属被覆複合材料が、前記金属ナノ粒子コーティングと前記金属層との間に挟まれた、さらなる超疎水性層を含む、＜３４＞に記載の方法。
【００４５】
＜３６＞
前記さらなる超疎水性層が、前記金属ナノ粒子被覆基材を、超疎水性材料を含む溶液に浸漬して、前記金属ナノ粒子の層の上に超疎水性層を形成することによって形成され、
前記金属ナノ粒子被覆基材が、正又はは負に荷電した官能基のセットを含む基材層と、負又は正に荷電した官能基を含む基材層のセットの上の金属ナノ粒子コーティングとを含み、
前記金属ナノ粒子コーティングが、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含む、＜３５＞に記載の方法。
【００４６】
＜３７＞
前記金属層が、厚さが５〜５３ｎｍ、例えば厚さ１５〜４３ｎｍ、例えば厚さ２０〜３３ｎｍ、例えば厚さ２５〜３０ｎｍである、＜３３＞〜＜３６＞のいずれか一項に記載の方法。
【００４７】
＜３８＞
前記金属層が、銀層、金層又は銀及び金層を含み、任意選択で、前記銀層、金層又は銀及び金層が、厚さ５〜４８ｎｍ、例えば厚さ１０〜３８ｎｍ、例えば厚さ１５〜２８ｎｍ、例えば厚さ２０〜２５ｎｍである、＜３３＞〜＜３７＞のいずれか一項に記載の方法。
【００４８】
＜３９＞
前記金属層が、クロム層をさらに含み、任意選択で、該クロム層が、厚さ２〜５ｎｍである、＜３８＞に記載の方法。
【００４９】
＜４０＞
前記クロム層が、前記金属ナノ粒子層の上にあり、前記銀層、金層又は銀及び金層が、前記クロム層の上にある、＜３８＞又は＜３９＞に記載の方法。
【００５０】
＜４１＞
前記金属ナノ粒子被覆基材が、正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材を、負又は正に荷電した官能基のセットを含む金属ナノ粒子を含む溶液と接触させることによって形成され、
前記金属ナノ粒子が、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含む、＜３３＞〜＜４０＞のいずれか一項に記載の方法。
【００５１】
＜４２＞
前記第１のセットのナノ粒子が、１０〜２５０ｎｍ、例えば２０〜１００ｎｍ、例えば３０〜５０ｎｍ、例えば１３０〜２４０ｎｍ、例えば１３５〜２３０ｎｍの平均直径を有する、＜３３＞〜＜４１＞のいずれか一項に記載の方法。
【００５２】
＜４３＞
前記第２のセットのナノ粒子が、２５０〜１，０００ｎｍ、例えば３００〜６００ｎｍ、例えば３１１〜５４０ｎｍの平均直径を有する、＜３３＞〜＜４２＞のいずれか一項に記載の方法。
【００５３】
＜４４＞
前記第１のセットの金属ナノ粒子が、前記第２のセットの直径より０．２〜６０％、例えば、０．５〜５７％、例えば１〜５５％、例えば１０〜５０％、例えば２５〜４５％小さい直径を有する、前記第２のセットの直径より、例えば６１〜８９％小さい直径を有する、前記第２のセットの直径より、例えば７５〜８５％、例えば７９〜８３％小さい直径を有する、＜３３＞〜＜４３＞のいずれか一項に記載の方法。
【００５４】
＜４５＞
前記複合物が、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、例えば４０〜１４０ｎｍ、例えば５０ｎｍ〜１２５ｎｍ、例えば１１０〜１２５ｎｍの二乗平均平方根表面粗さを有する、＜３３＞〜＜４４＞のいずれか一項に記載の方法。
【００５５】
＜４６＞
前記複合材料上の第２のセットのナノ粒子の粒子の総数と、第１のセットのナノ粒子の粒子の総数の比が、１：１０〜１０：１、例えば１：５〜５：１、例えば２：１〜４：１である、＜３３＞〜＜４５＞のいずれか一項に記載の方法。
【００５６】
＜４７＞
前記基材が、ポリ（ジメチルシロキサン）、ガラス及びシリコンからなる群の１種以上である、＜３３＞〜＜４６＞のいずれかに一項に記載の方法。
【００５７】
＜４８＞
前記基材層上の荷電した官能基のセットが正に荷電し、前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が負に荷電している、＜３３＞〜＜４７＞のいずれか一項に記載の方法。
【００５８】
＜４９＞
前記基材層上の正に荷電した官能基のセットが、アンモニウムイオンであり、任意選択で、前記基材層の正に帯電した官能基のセットが、１又は２個のアミノ基を含むシラン化合物、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシランから誘導される、＜４８＞に記載の方法。
【００５９】
＜５０＞
前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の負に荷電した官能基のセットが、カルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンであり、任意選択で、前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の負に荷電した官能基のセットが、１つ以上のカルボン酸基を含有するアルキルチオール又は１つ以上の水酸基を含有するアルキルチオール、例えば１１−メルカプトウンデカン酸から誘導される、＜４８＞又は＜４９＞に記載の方法。
【００６０】
＜５１＞
前記基材層上の荷電した官能基のセットが負に荷電しており、前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が正に荷電している、＜３３＞〜＜４７＞のいずれか一項に記載の方法。
【００６１】
＜５２＞
前記基材層上の負に荷電した官能基のセットが、カルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンであり、任意選択で、前記基材層上の負に荷電した官能基のセットが、１つ以上のカルボン酸基を含むシラン化合物又は１つ以上の水酸基を含むシラン化合物から誘導される、＜５１＞に記載の方法。
【００６２】
＜５３＞
前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の正に荷電した官能基のセットが、アンモニウムイオンであり、任意選択で、前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の正に荷電した官能基のセットが、１つ以上のアミノ基を含むアルキルチオール化合物から誘導される、＜５１＞又は＜５２＞に記載の方法。
【００６３】
＜５４＞
＜３３＞の工程（ｉｂ）において使用される超疎水性材料が、非置換であるか又は１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールであり、任意選択で、前記超疎水性材料が、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群から選択される１種以上である、＜３３＞〜＜５３＞のいずれか一項に記載の方法。
【００６４】
＜５５＞
前記のさらなる超疎水性層を形成するために使用される超疎水性材料が、非置換であるか又は１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールであり、任意選択で、超疎水性材料が、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群のうちの１種以上から選択される、＜３５＞〜＜５４＞のいずれか一項に記載の方法。
【００６５】
＜５６＞
前記第１のセットの金属ナノ粒子がナノキューブであり、前記第２のセットの金属ナノ粒子が６つを超える面を有するナノ多面体であって、７〜３０面を有する１種以上のナノ多面体から選択される、＜３３＞〜＜５５＞のいずれか一項に記載の方法。
【００６６】
＜５７＞
前記第２のセットの金属ナノ粒子が、ナノ八面体である、＜５６＞に記載の方法。
【００６７】
＜５８＞
前記第１及び第２のセットのナノ粒子が、銀ナノ粒子である、＜３３＞〜＜５７＞のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、（ａ、ｃ）ＳＥＭ像；（ｂ、ｄ）吸収スペクトル；及び（ｅ、ｆ）本発明の実施形態において使用されるＡｇＮＣ及びＡｇＮＯのサイズ分布を示す。
【図２】図２は、それぞれ、（ａ、ｂ）ＡｇＮＯ；及び（ｃ、ｄ）水及びエタノール中のＡｇＮＣのＳＥＭ像を示す。
【図３】図３は、（ａ）シリコン基材の表面官能基化の概略図、及び（ｂ）処理された又は官能基化された基材４０、６０及び８０の静的接触角を示す。
【図４】図４は、（ａ）超疎水性基材１０７の初期バッチ、及び（ｂ）超疎水性基材１０９の最適化されたバッチの製造の概略図を示す。
【図５】図５は、（ａ〜ｆ）２０〜１２０分のＡｇナノ粒子混合物中での基材８０のインキュベーション時間を使用して調製された超疎水性基材１０７のＳＥＭ像及び静的接触角を示す。
【図６】図６は、ＰＦＤＴ溶液に１５〜４５時間浸漬した後の超疎水性基材１０７のＳＥＲＳスペクトルを示す。
【図７】図７は（ａ〜ｃ）ＡｇＮＣ、ＡｇＮＯ、及びＡｇＮＣとＡｇＮＯの両方をそれぞれ含む基材のＡＦＭ像、（ｄ、ｅ）ＡｇＮＣのみを含む基材のＳＥＭ像及び静的接触角、（ｆ、ｇ）ＡｇＮＯのみを含む基材のＳＥＭ像及び静的接触角、を示す。
【図８】図８は、親水性基材と比較した超疎水性基材の液体濃縮効果を示す：（ａ、ｂ）それぞれ親水性及び超疎水性基材１０７の静的接触角；（ｃ）親水性基材上の乾燥試料のスポット領域の光学画像；（ｄ）基材１０７上の乾燥試料のＳＥＭ像；（ｅ、ｆ）親水性及び超疎水性基材１０９それぞれの静的接触角；（ｇ）親水性基材上の乾燥試料のスポット領域の光学画像；（ｈ）基材１０９上の乾燥試料のＳＥＭ像。
【図９】図９は、（ａ）静的接触角、及び（ｂ）超疎水性基材１０９の粒子密度に対するＡｇＮＣ対ＡｇＮＯの粒子比の効果を示す。
【図１０】図１０は、（ａ）静的接触角、及び（ｂ）超疎水性基材１０９の粒子密度に対する、Ａｇナノ粒子混合物（ＡｇＮＣ及びＡｇＮＯ）における基材８０のインキュベーション時間の効果を示す。
【図１１】図１１は、（ａ）超疎水性基材１０９の静的接触角に対する、ＡｇＮＣ又はＡｇＮＯ単独、並びにＡｇＮＣ及びＡｇＮＯの二成分集合体を有することの効果；及び（ｂ）それぞれの基材のＡＦＭ像を示す。
【図１２】図１２は、（ａ）超疎水性シリカビーズアレイ；（ｂ）超疎水性基材１０９；及び（ｃ）ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡを有する超疎水性基材１０９の、メチレンブルーのＳＥＲＳスペクトル及び対応する分析増強因子（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ；ＡＥＦ）を示す。
【図１３】図１３は、尿代謝物及び毒素を検出するための超疎水性基材１０７の初期バッチの使用を示す：（ａ、ｂ）種々の濃度での５β−プレグナン−３α，２０α−ジオールグルクロニド（プレグナン）のＳＥＲＳスペクトル、及び濃度の関数としてのシグナル強度の較正曲線をそれぞれ示す；（ｃ、ｄ）種々の濃度でのｐ−アルサニル酸及びロキサルソンのＳＥＲＳスペクトルをそれぞれ示す。
【図１４】図１４は、（ａ）ＡｇＮＣ表面１３５上に固定された４−ＭＰＢＡ（１３０）上へのＴＨＣ（１２０）及びプレグナン（１２５）の結合の概略図；（ｂ）４−ＭＰＢＡのＳＥＲＳスペクトル及び、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡを有する超疎水性基材１０９を用いてＴＨＣ及びプレグナンとそれぞれインキュベートした後の４−ＭＰＢＡのＳＥＲＳスペクトル；（ｃ）領域（ｉ）における実験的及びシミュレートされたＳＥＲＳスペクトル；並びに（ｄ）ＴＨＣ（１２０）及びプレグナン（１２５）に結合した際の４−ＭＰＢＡのスペクトルの領域（ｉｉ）。
【図１５】図１５は、（ａ、ｂ）超疎水性基材１０９上の１０−４〜１０−９Ｍの異なる濃度で、それぞれプレグナン及びＴＨＣとインキュベートした後のＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡのＳＥＲＳスペクトル；（ｃ）ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡに関連するそれぞれのＳＥＲＳスペクトル、及びそれぞれプレグナン及びＴＨＣとインキュベートした後のＳＥＲＳスペクトルのＰＣＡクラスタリング；（ｄ、ｅ）１０−４〜１０−９Ｍのプレグナン及びＴＨＣのそれぞれのＰＬＳ濃度予測モデル；並びに（ｆ）異なるプレグナン百分率でのプレグナン及びＴＨＣの混合物のＰＬＳモデルを示す。
【図１６】図１６は（ａ）人工又は実際の尿試料のＺＩＰＴＩＰ前処理の概略図；（ｂ）処理された試料２３８をＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡで処理し、続いて超疎水性基材１０９上でＳＥＲＳを検出し、ケモメトリック分析２４０を行う概略図である。
【図１７】図１７は、（ａ）人工尿中の様々な濃度のプレグナンを用いて調製されたＰＬＳ予測モデル；（ｂ）安定妊娠をシミュレートする人工尿試料（プレグナン９８．７％）及び流産をシミュレートする尿試料（プレグナン９７．４％）から得られたＳＥＲＳスペクトルのＰＣＡクラスタリング；（ｃ）様々な濃度のプレグナンを有する人工尿試料とインキュベートした後の、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡに関するＳＥＲＳスペクトル；（ｄ）９８．７％プレグナン（安定妊娠をシミュレートするため）及び９７．４％プレグナン（流産のリスクをシミュレートするため）をスパイクした人工尿試料とインキュベートした後のそれぞれＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡに関連するＳＥＲＳスペクトル；及び（ｅ）模擬安定妊娠及び模擬流産を表す２点（星印）でフィットさせた、人工尿中の様々な濃度のプレグナンを用いて確立されたＰＬＳモデルを示す。
【図１８】図１８は、（ａ）妊娠していない女性の実際の尿試料中の様々な濃度のプレグナンを使用して作成されたＰＬＳ予測モデルを示す。予測プロットは、出産が成功した個体（Ｓ１−Ｓ３）及び流産した個体（Ｍ１−Ｍ３）に対応する点（星印）でフィットされた；（ｂ）異なる濃度のプレグナンをスパイクした非妊婦の実際の尿試料のＳＥＲＳスペクトル；（ｃ）出産が成功した女性（Ｓ１−Ｓ３）及び流産した個体（Ｍ１−Ｍ３）に対応する妊婦からの実際の尿試料のＳＥＲＳスペクトル；並びに（ｄ）出産が成功した妊婦（Ｓ１）及び流産した妊婦（Ｍ１）からの実際の試料から得られたＳＥＲＳスペクトルのＰＣＡクラスタリング、を表す。
【図１９】図１９は、（ａ、ｂ）それぞれＡｇＮＳのＳＥＭ像及び粒度分布、（ｃ）ＳＥＭ像及び静的接触角、及び（ｄ）ＡｇＮＳ及びＡｇＮＯの二成分集合体を含む超疎水性基材の粒子密度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
上述したように、本発明は、表面増強ラマン散乱に使用するのに適した複合超疎水性材料に関し、当該材料は
正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層；
前記基材層の上の、負又は正に荷電した官能基のセットを含む、金属ナノ粒子コーティング；
前記金属ナノ粒子コーティングの上の金属層；及び
前記金属層の上の第１の超疎水性層を含み：
前記金属ナノ粒子コーティングは、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含み、第１のセットの金属ナノ粒子は、第２のセットの直径より０．１〜９０％小さい直径を有し；
前記第１のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記第２のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記基材層及び前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が、互いに電子的に相補的である。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、用語「超疎水性」は高度に疎水性である１つ以上の表面を有し、これらの表面を湿潤させることを極めて困難にする材料をいう。例えば、本明細書で言及される超疎水性材料は、１５０°を超える水との静的接触角を示す１つ以上の表面を有する材料であり得る。本明細書で言及することができる水との適切な静的接触角の例には１５１°〜１７０°、例えば１５５°〜１６５°の接触角が含まれるが、これらに限定されない。静的接触角測定手法の詳細は、以下の実施例の節に記載されている。
【００７１】
誤解を避けるために、本出願において数値が提示される場合、エンドポイントの任意の適切な組み合わせが本明細書において明示的に企図される。例えば、以下の接触角範囲が考えられる：１５０°超、１５０°超１５１°以下、１５０°超１５５°以下、１５０°超１６５°以下、１５０°超１７０°以下；１５１°〜１５５°、１５１°〜１６５°、１５１°〜１７０°、１５５°〜１６５°、１５５°〜１７０°。
【００７２】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）は、粗い金属表面上に吸着された分子によって、又は表面上のナノ構造によってラマン散乱を増強する表面感応技術である。したがって、本明細書で論じられる結果として得られる複合材料は、ＳＥＲＳ分析を可能にする適切に粗い表面を有することができる。例えば、複合材料は、３０〜１５０ｎｍ、例えば４０〜１４０ｎｍ、例えば５０〜１２５ｎｍ、例えば１１０〜１２５ｎｍの二乗平均平方根粗さを有することができる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「基材」は、正又は負の官能基での官能基化に適した任意の適切な基材を指す。適切な基材の例としてはセレン、ポリ（ジメチルシロキサン）、シリコン、ガラス、プラスチックなどが挙げられるが、これらに限定されない。前記基材は、チップ又はウェーハなどの任意の適切な平面形態で提供されてもよい。このような基材をどのように官能基化して荷電表面を提示することができるかの詳細は、以下に提供される。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、用語「正に荷電した官能基」は、適切な条件下で正の電荷を有する官能基をいう。適切な官能基の例としては、アミノ官能基（例えば、アンモニウム基の形態）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、用語「負に荷電した官能基」は、適切な条件下で負の電荷を有する官能基をいう。適切な官能基の例としてはカルボン酸及びアルコール官能基（例えば、カルボキシレート基及びアルコキシドの形態）、スルホン酸、核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
用語「金属ナノ粒子」は、本明細書では金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金と銀の合金、及びそれらの任意の適切な組合せを指すものとする。
【００７７】
上記のように、基材層の上の金属ナノ粒子コーティングは、基材層の電荷と反対の電荷を有する。例えば、基材が正に荷電している場合、金属ナノ粒子コーティングは負に荷電している金属ナノ粒子を含み、その逆も同様である。これにより、基材と金属ナノ粒子との間に静電引力が形成され、コーティング層の形成が可能となる。
【００７８】
金属ナノ粒子コーティング層は、基材の表面上に堆積された２つの異なるサイズの金属ナノ粒子のセットによって形成される。示されるように、金属ナノ粒子の第１のセットは、第２のセットの直径よりも０．１〜９０％小さい直径を有する。例えば、金属ナノ粒子の第１のセットは、第２のセットの直径よりも０．２〜６０％、例えば０．５〜５７％、例えば１〜５５％、例えば１０〜５０％、例えば２５〜４５％小さい直径を有することができる。代替の実施形態では、金属ナノ粒子の第１のセットが第２のセットの直径よりも６１〜８９％、例えば７５〜８５％、例えば第２のセットの直径よりも７９〜８３％小さい直径を有することができる。誤解を避けるために、上記の全ての数値を組み合わせて適切な範囲を提供することが特に意図される。例えば、上記の値はまた、０．２〜８９％、０．５〜８９％、及び０．５〜８３％などの範囲を開示する。
【００７９】
本明細書で言及され得る特定の実施形態では、ナノ粒子の第１のセットが１０〜２５０ｎｍ、例えば２０〜１００ｎｍ、例えば３０〜５０ｎｍ、又は１３０〜２４０ｎｍ、例えば１３５〜２３０ｎｍの平均直径を有してもよく、及び／又はナノ粒子の第２のセットは２５０〜１，０００ｎｍ、例えば３００〜６００ｎｍ、例えば３１１〜５４０ｎｍの平均直径を有してもよい。理解されるように、これらの範囲は、任意の適切な方法で組み合わせることができる。例えば、第１のセットのナノ粒子が１３０〜２５０ｎｍの平均直径を有する場合、第２のセットのナノ粒子は、２５０〜３００ｎｍ、２５０〜３１１ｎｍ、２５０〜５４０ｎｍ、２５０〜６００ｎｍ、及び２５０〜１，０００ｎｍの範囲から選択される直径を有する可能性がある。第１のセットのナノ粒子が２５０ｎｍの直径を有する状況では、第２のセットのナノ粒子の下限は、それに応じて、少なくとも０．１％大きくなるように（すなわち、直径が少なくとも約２５０．２５ｎｍになるように）調整される。
【００８０】
ナノ粒子の第１及び第２のセットの任意の適切な比率を使用することができる。例えば、本明細書で言及することができる本発明の実施形態では、複合材料の第２のセットのナノ粒子中の粒子の総数と第１のセットのナノ粒子中の粒子の総数の比は、１：１０〜１０：１、例えば、１：５〜５：１、例えば、２：１〜４：１であってよい。
【００８１】
第１及び第２のセットの金属ナノ粒子は、任意の適切な形状を有し得る。例えば、第１及び第２のセットの金属ナノ粒子は、回転楕円体形状又は多面体形状を有することができる。適切な多面体形状の例には、立方体、及び６つを超える面を有する多面体（例えば７〜３０個の面を有する多面体）が含まれる。第１及び第２のセットの金属ナノ粒子は、同一の形状（したがって、サイズのみによって区別される）を有しても、又は異なる形状（したがって、サイズ及び形状の両方によって区別される）を有してもよい。本明細書で言及され得る特定の実施形態では、第１のセットの金属ナノ粒子はナノキューブであり得、第２のセットの金属ナノ粒子は７〜３０の面を有する１つ又は複数のナノ多面体から選択することができる６つを超える面を有するナノ多面体であり得る（例えば、第２のセットの金属ナノ粒子はナノ八面体とすることができる）。
【００８２】
金属ナノ粒子層は、金属ナノ粒子の表面上の荷電官能基のそれぞれのセットと基材との間の電荷引力によって基材層の表面に静電的に結合される個々のナノ粒子から構成される。
【００８３】
特定の実施形態では、基材層上の荷電官能基のセットは、正に荷電されてもよく、金属ナノ粒子コーティング上の荷電官能基は負に荷電されてもよい。基材層上の官能基が正に荷電している場合、それらはアンモニウムイオンであり得る。基材に結合し、アンモニウムイオンを提供することができる任意の適切なリガンドが、この目的のために使用され得る。例えば、基材層上の正に荷電した官能基のセットは、３−アミノプロピルトリエトキシシランのような、１個又は２個のアミノ基を含有するシラン化合物から誘導され得る。第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の官能基が負に荷電している場合、それらはカルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンであり得る。金属に結合し、カルボキシレートイオン又は水酸化物イオンを提供することができる任意の適切なリガンドを、この目的のために使用することができる。例えば、第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の負に荷電した官能基のセットは、１つ以上のカルボン酸基を含むアルキルチオール又は１つ以上の水酸基を含むアルキルチオール、例えば１１−メルカプトウンデカン酸から誘導され得る。
【００８４】
特定の実施形態では、基材層上の荷電官能基のセットが負に荷電されてもよく、金属ナノ粒子コーティング上の荷電官能基は正に荷電されてもよい。基材層上の官能基が負に荷電している場合、それらはカルボキシレートイオン又はアルコキシドイオンであり得る。基材に結合し、カルボキシレート又はアルコキシドイオンを提供することができる任意の適切なリガンドを、この目的のために使用することができる。例えば、基材層上の負に荷電した官能基のセットは、１つ以上のカルボン酸基を含むシラン化合物又は１つ以上の水酸基を含むシラン化合物から誘導されてもよい。第１及び第２のセットの金属ナノ粒子上の官能基が正に荷電している場合、それらはアンモニウムイオンであり得る。金属に結合し、アンモニウムイオンを提供することができる任意の適切なリガンドを、この目的のために使用することができる。例えば、金属ナノ粒子の第１及び第２のセット上の正に荷電した官能基のセットは、１つ以上のアミノ基を含有するアルキルチオール化合物から誘導され得る。
【００８５】
基材層の表面上の金属ナノ粒子コーティングは、２〜２０粒子／μｍ２、例えば２．５〜１０粒子／μｍ２、例えば３〜５粒子／μｍ２、例えば４．４粒子／μｍ２の濃度を有し得る。理解されるように、上記の密度は、隣接する金属ナノ粒子間に存在するギャップをもたらす可能性があり、これは、金属ナノ粒子コーティング層の上に配置された層との相互作用のために、基材の表面の一部を露出させる可能性がある。例えば、金属ナノ粒子コーティング中のギャップは、金属ナノ粒子コーティングの上に配置された金属層を、当該ギャップを介して基材層に直接付着させることを可能にし、それによって、物理的制約を通して、並びに金属ナノ粒子上の正及び負に荷電した官能基と基材との間の静電相互作用を通して、基材の表面上の適所に金属ナノ粒子を固定することができる。
【００８６】
金属層は、厚さ５〜５３ｎｍ、例えば厚さ１５〜４３ｎｍ、例えば厚さ２０〜３３ｎｍ、例えば厚さ２５〜３０ｎｍとすることができる。金属層は、銀層、金層、又は銀及び金層であってもよく、厚さ５〜４８ｎｍ、例えば厚さ１０〜３８ｎｍ、例えば厚さ１５〜２８ｎｍ、例えば厚さ２０〜２５ｎｍであってもよい。特定の実施形態では、金属層が２〜５ｎｍの厚さであり得るクロム層をさらに含み得る。存在する場合、クロム層は金属ナノ粒子コーティングの上に直接存在し得、金属層の残り（すなわち、銀、金又は銀及び金層）は、クロム層の上に存在する。
【００８７】
第１の超疎水性層は、任意の適切な超疎水性材料又はそれらの組み合わせを使用することができる。適切な超疎水性材料の例としては、非置換であるか又は１つ以上のフルオロ基によって置換されたＣ１０〜Ｃ２０チオールが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、第１の超疎水性層は、１−ドデカンチオール、１−ヘキサデカンチオール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオールからなる群の１つ以上から形成されてもよい。
【００８８】
本発明の特定の実施形態では、金属ナノ粒子コーティングと金属層との間に第２の超疎水性層が挟まれる。理論に束縛されることを望むものではないが、第２の疎水性層は金属ナノ粒子の露出表面上の荷電官能基を置き換え、それによって、よりクリーンなＳＥＲＳ基材バックグラウンドスペクトルを提供する。第２の超疎水性層は、第１の超疎水性層と同じ材料から形成することができる。
【００８９】
本発明の実施形態では、金属ナノ粒子及び金属層は、銀、金、又はそれらの組み合わせ／合金から選択されてもよい。任意の適切な組み合わせが可能であるが、本明細書で言及される特定の実施形態では、金属ナノ粒子及び金属層は、銀から形成され得る（金属層は、任意選択で、クロムの層及び銀の層から形成される）。
【００９０】
表面増強ラマン散乱での使用に適した複合超疎水性材料は、以下を含む方法によって製造することができる：
（ｉａ）以下を含む金属被覆複合材料を提供すること：
正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層；
前記基材層の上にあり、負又は正に荷電した官能基のセットを含み、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含み、第１のセットの金属ナノ粒子は第２のセットの直径より０．１〜９０％小さい直径を有する、金属ナノ粒子コーティング；及び
前記金属ナノ粒子コーティングの上の金属層；並びに、
（ｉｂ）前記金属被覆複合材料を、超疎水性材料を含む溶液に浸漬して、前記金属層の上に超疎水性層を形成し、それによって複合超疎水性材料を形成すること：ここで、
前記第１のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記第２のセットの金属ナノ粒子の金属が、金及び／又は銀であり；
前記基材層及び前記金属ナノ粒子コーティング上の荷電した官能基が、互いに電子的に相補的である。
【００９１】
理解されるように、上記の方法によって作製された複合超疎水性材料の結果として生じる構成要素及び寸法は、上記のものと同一であり、したがって、本明細書では、この方法に関連して記載される。
【００９２】
金属被覆複合材料は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）によって形成してもよい：
（Ａ）正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層と、
前記基材層の上の、負又は正に荷電した官能基のセットを含む金属ナノ粒子コーティングを含み、
前記金属ナノ粒子コーティングが、第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含む、金属ナノ粒子被覆基材を提供すること；並びに
（Ｂ）前記金属ナノ粒子被覆基材の上に金属層を堆積させること（ここで、任意選択で、前記堆積は、金属の熱蒸発による薄膜堆積で行われる）。
【００９３】
金属層及び金属ナノ粒子の詳細は、複合超疎水性材料製品に関して上記で説明されている。
【００９４】
特定の実施形態では、金属被覆複合材料が金属ナノ粒子コーティングと金属層との間に挟まれたさらなる超疎水性層を含んでもよい。このさらなる超疎水性層が存在する実施形態では、金属ナノ粒子被覆基材を、超疎水性材料を含む溶液に浸漬して、金属ナノ粒子層の上に超疎水性層を形成することによって形成することができ、金属ナノ粒子被覆基材は、正又は負に荷電した官能基のセットを含む基材層と、負又は正に荷電した官能基のセットを含む基材層の上に金属ナノ粒子コーティングとを含み、金属ナノ粒子コーティングは第１のセット及び第２のセットの金属ナノ粒子を含む。
【００９５】
金属ナノ粒子でコーティングされた基材は一組の正又は負に荷電した官能基を含む基材を、一組の負又は正に荷電した官能基を含む金属ナノ粒子を含む溶液と接触させることによって形成することができる。ここで、金属ナノ粒子は、第１及び第２のセットの金属ナノ粒子を含む。前記第１及び第２のセットの金属ナノ粒子は、複合超疎水性材料製品に関連して上で説明されている。
【００９６】
上記の複合超疎水性材料の単独で使用すると、試料中の分析物のＳＥＲＳ検出を改善することができるが、尿の処理済み試料に直接添加することができる金属ナノ粒子と組み合わせて使用する場合に特に有効である。したがって、本発明は、以下を含む部材のキットも含む：
（ａｉ）上記の複合超疎水性材料；及び（ｂｉ）チオール基を含むボロン酸でコーティングされた銀及び／又は金ナノ粒子を含む尿分析製剤。
【００９７】
理解されるように、複合超疎水性材料を単独で使用すると、分析物のＳＥＲＳ検出及び定量を直接可能にし得る。すなわち、プレグナン及び／又はテトラヒドロコルチゾンの直接検出によるものであり、これは以下の実施例２においてより詳細に考察される。実施例２に記載される技術は、テトラヒドロコルチゾンを検出するために使用され得ることが理解される。あるいは複合超疎水性材料が金属ナノ粒子と組み合わせて使用される場合、ＳＥＲＳ検出は間接的手段によるものであってもよく、それにより、分析物の定量はボロン酸のＳＥＲＳスペクトルに対するそれらの影響によって得られる（以下の実施例３〜６を参照のこと）。チオール基を含むボロン酸でコーティングされた銀及び／又は金ナノ粒子は以下の実施例により詳細に記載されるように、基材の分析増強因子をさらに増強する「ミラー効果」を提供し得ることに留意されたい。
【００９８】
尿分析処方物の銀及び／又は金ナノ粒子は、その複合超疎水性材料を形成するために使用される金属と同じ金属から形成され得る。すなわち、超疎水性材料が金属ナノ粒子及び金属層に銀を使用して形成される場合、尿分析製剤のナノ粒子は、銀ナノ粒子であり得る。超疎水性材料が金属ナノ粒子及び金属層のために金を使用して形成される場合、尿分析製剤のナノ粒子は、金ナノ粒子などであり得る。
【００９９】
任意の適切なボロン酸を使用することができ、適切なボロン酸の例は、以下の式Ｉの化合物によって提供される：
【化１】
2021510646.tif 000004
ここで：
Ｘ１がＮ又はＣＲ３；
Ｘ２がＮ又はＣＲ４；
Ｘ３がＮ又はＣＲ５；であり、
Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ３、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＮ、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌを表し、
ここで、Ｘ１〜Ｘ３のいずれもＮではない又はいずれか１つがＮであり、
Ｘ１〜Ｘ３のいずれか一つがＮであるとき、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＮ、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌを表す。
【０１００】
本明細書中で言及され得る適切なボロン酸は、４−メルカプトフェニルボロン酸である。
【０１０１】
尿分析製剤のナノ粒子は、任意の適切なサイズ又は形状を有し得る。例えば、尿分析製剤のナノ粒子は、回転楕円体又は立方体などの多面体の形態であってもよい。前記ナノ粒子は、５０，０００〜１５０，０００ｎｍ２などの任意の好適な表面積を有し得る。本明細書中で言及され得る特定の例において、尿分析製剤のナノ粒子は、９９，８１０．４ｎｍ２の表面積を提供する、１２８．９ｎｍのエッジ長を有する立方体の形状であり得る。ボロン酸が４−メルカプトフェニルボロン酸である場合、この分子は、ナノ粒子の表面に結合したときに約０．３４ｎｍ２の表面積を有すると推定される。したがって、立方体の表面に結合した４−メルカプトフェニルボロン酸分子の総数（完全な被覆を仮定する）は、２９３，５６０分子であると推定される。
【０１０２】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１８／１９９８４９号に概説されるように、妊娠中の女性の尿中の特定の分子のレベルは、対象における流産のリスクを確認するために使用され得る。ＷＯ２０１８／１９９８４９号に示される分子のいずれか又は全ては、ＳＥＲＳを使用して上記の部材のキットと組み合わせて使用され得るが、プレグナン（すなわち、３α，２０α−ジヒドロキシ−５−プレグナン−３−グルクロニド又は５β−プレグナン−３α，２０α−ジオールグルクロニド）及びテトラヒドロコルチゾンが、このような方法において特に有用であり得ることが見出された。したがって、自然流産のリスク増加を予測する方法が提供され、この方法は以下の工程を含む：
（ａ）対象から得られた尿試料の非塩成分を含む水溶液を提供すること；
（ｂ）前記水溶液を、チオール基を含むボロン酸でコーティングされた銀及び／又は金ナノ粒子を含む尿分析製剤と、第１の期間反応させて、複合体化試料を提供すること（任意選択で、前記ナノ粒子は複合超疎水性材料に使用されるのと同じ金属から形成され、及び／又はボロン酸は４−メルカプトフェニルボロン酸である）；
（ｃ）複合超疎水性材料上に上記の複合体化試料を置き、蒸発によって水を除去して、乾燥試料を提供すること；及び
（ｄ）乾燥試料をラマン分光法に供して、プレグナン及びテトラヒドロコルチゾンの存在量を決定し、次の式に基づいて自然流産のリスクを予測すること：
【数２】
2021510646.tif 000005
ここで、閾値より低い値は自然流産のリスクの増加を示し、任意選択で、前記第１の期間は、３〜４８時間、例えば３時間である。
【０１０３】
本明細書（及び国際公開第２０１８／１９９８４９号）に記載されるように、７６のプレグナン／テトラヒドロコルチゾンの比率は安定した妊娠を示し、その対応するプレグナンパーセンテージは９８．７％である。３８のプレグナン／テトラヒドロコルチゾン比は流産リスクを示し、対応するプレグナンのパーセンテージは９７．４％である。
【０１０４】
上記の反応工程（ｂ）は、任意の適切なｐＨで実施され得るが、反応は１０〜１２、例えば１１のｐＨ範囲で最もスムーズに進行し得る。工程（ｂ）のｐＨが１０〜１２であるいくつかの実施形態では、工程（ｂ）の生成物を第２の期間で遠心分離し、上清を除去し、ｐＨ１０〜１２（例えば１１）のＫＯＨ水溶液などの液体で置換することができ、この遠心分離、上清除去及び液体置換工程を、上記方法の工程（ｃ）を行う前にさらに１〜４回（例えばさらに２回）繰り返すことができる。
【０１０５】
上記方法の工程（ａ）で使用される水溶液は、以下の工程によって得ることができる：
（ｉ）対象から得られた塩及び非塩成分を含む尿試料を逆相カラムに添加して、ロードされたカラムを提供すること；
（ｉｉ）前記ロードされたカラムから水で溶出することによって塩成分を除去し、次いで、Ｃ１−４アルコール（例えば、メタノール）で溶出することによって前記ロードされたカラムから非塩成分を除去及び分離し、次いで、Ｃ１−４アルコールを除去すること；及び
（ｉｉｉ）分離された非塩成分に水溶液を添加して、工程（ａ）の水溶液を提供すること。特定の実施形態において、工程（ａ）の水溶液は、１０〜１２、例えば１１のｐＨを有し得る。
【０１０６】
ラマン分光法のための任意の適切な設定が選択され得るが、本明細書で言及され得る好適な条件のセットは、ラマン分光法が０．０１〜１ｍＷのレーザー出力及び１〜６０秒の取得時間を使用して、５３２ｎｍのレーザー励起波長を使用して行われる場合である。例えば、レーザー出力は０．２ｍＷであってもよく、取得時間は１秒であってもよい。
【０１０７】
各試料について得られるスペクトルの数は、１０〜５，０００  ＳＥＲＳスペクトル、例えば２０〜２，０００  ＳＥＲＳスペクトルであり得る。本発明の実施形態では、合計３０個のＳＥＲＳスペクトルが最適であり得る。
【０１０８】
理解されるように、実際の試料が分析される前に、１１−メルカプトウンデカン酸から生じる干渉シグナルがないことを確認するために、超疎水性（ＳＰＨＢ）基材自体のバックグラウンドスキャンが実行される。試料は、ＳＰＨＢ基材バックグラウンドからのＳＥＲＳシグナルのベースラインが平坦で特徴のない場合にのみ分析される。較正曲線を確立するために、９０〜１００％の、異なる量のプレグナン／テトラヒドロコルチゾン濃度比でスパイクした非妊娠女性の尿試料を用いて、ＳＥＲＳ実験及び分析を行った。次いで、この較正曲線を使用して、試験試料中のＴＨＣと比較したプレグナンの相対的存在量を予測した。各特定の分析物の定量化には、分析物固有の較正曲線が必要であることに留意されたい。
【０１０９】
ＳＥＲＳ分析のさらなる詳細は、以下の実施例のセクションに提供される。
【０１１０】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、以下の非限定的な実施例に関してここで考察される。
【実施例】
【０１１１】
［材料］
硝酸銀（≧９９％）、無水１，５−ペンタンジオール（ＰＤ、≧９７％）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ、平均ＭＷ＝５５，０００ｇ／ｍｏｌ）、トルエン（９９．５％）、１１‐メルカプトウンデカン酸（９５％）、４‐メルカプトフェニルボロン酸（９０％）、アンモニア溶液（２８〜３０％）、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオール（ＰＦＤＴ，９７＋％）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。塩化銅（ＩＩ）（≧９８％）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（９８％）は、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒから購入した。エタノール（ＡＣＳ、ＩＳＯ、Ｒｅａｇ．Ｐｈ  Ｅｕｒ）はＥＭＳＵＲＥから購入した。塩酸（ＨＣｌ、３７％）はＡｎａｌａｒ  Ｎｏｒｍａｐｕｒから購入した。テトラヒドロコルチゾン（ＴＨＣ）は、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから購入した。５β−プレグナン−３α，２０α−ジオールグルクロニド（「プレグナン」と呼ぶ）は、ＡＸＩＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ．から購入した。全ての化学物質をさらに精製することなく使用した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（＞１８．０ＭΩ・ｃｍ）は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ａｒｉｕｍ  ６１１  ＵＶ超純水システムを用いて得た。
【０１１２】
［全般的な方法］
ＳＥＭイメージングは、ＪＥＯＬ−ＪＳＭ−７６００Ｆ顕微鏡を用いて加速電圧５ｋＶで行った。ＵＶ−ｖｉｓ分光測定は、Ｃａｒｙ  ６０  ＵＶ−Ｖｉｓ分光計を用いて行った。ゼータ電位測定は、ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ＮＡＮＯを用いて、ＤＴＳ１０７０折り畳みキャピラリーセルを用いて行った。Ａｇの熱蒸発はＳｙｓｋｅｙ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ（台湾）を用いて行った。試料の粗さは、Ｚｅｉｓｓ倒立顕微鏡上でＪＰＫ  Ｎａｎｏｗｉｚａｒｄ  ３  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定した。ｘ−ｙ  ＳＥＲＳ測定はＲａｍａｎｔｏｕｃｈ  Ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｎ  Ｉｎｃ、大阪、日本）により、励起波長５３２ｎｍ（出力０．０１〜１ｍＷ、取得時間１〜６０秒）で行った。５００ｃｍ−１〜１６００ｃｍ−１の間のデータ収集には、蓄積時間１０秒で、２０×（Ｎ．Ａ．０．４５）対物レンズを使用した。すべてのＳＥＲＳスペクトルは、ラマン画像ごとに少なくとも１０個の個々のスペクトルを平均化することによって得られた。サンプルの前処理には、Ｃ１８カラムを充填したＺＩＰＴＩＰ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。ＰＣＡ及びＰＬＳ分析は、Ｐａｎｏｒａｍａソフトウェア（ＬａｂＣｏｇｎｉｔｉｏｎ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）を用いて行った。
【０１１３】
［接触角測定］
接触角は、Ｆｉｒｅｗｉｒｅデジタルカメラを装備したＴｈｅｔａ  Ｌｉｔｅ張力計を用いて測定した。静的接触角は、４μＬの水滴の固着液滴を基材上に滴下することによって測定した。固液界面と液気界面のなす角度が静的接触角である。前進接触角は、少量の液体（２０μＬ）を液滴にゆっくりと添加することによって測定される接触角の最大値として測定された。液体の添加中、接触線は残ったが、湿潤プロセスの間に接触角は増加した。また、後退接触角が、液滴から少量の液体をゆっくりと除去した場合の接触角の最小値として測定された。液体の除去中、接触線は残ったが、脱湿潤プロセス中に接触角は減少した。前進接触角と後退接触角の差により、接触角ヒステリシスが生じた。各タイプの接触角測定は平均ぬれ角を得るために、各基材にわたって少なくとも５回行った。
【０１１４】
［基材の液体濃縮効果］
基材の液体濃縮効果を測定するために、改変Ｓｔｏｂｅｒ法を用いて合成したシリカ粒子懸濁液を基材上で使用した。
【０１１５】
典型的には、脱イオン水（１．５ｍＬ）及びアンモニア溶液（１．５ｍＬ）の混合物を、３０分間激しく撹拌しながら、オルトケイ酸テトラエチルのエタノール溶液（０．３５Ｍ、０．７６ｍＬ）に滴下した。遠心分離でシリカビーズを得てから、エタノールと水で洗い、その後脱イオン水に再懸濁した。水溶性シリカビーズの１μＬをそれぞれの超疎水性基材とＯ２プラズマ処理されたＳｉ基材（親水性基材）に投入し、周囲条件下で乾燥させた。次いで、乾燥したスポットをＳＥＭで特性評価し、超疎水性表面及び親水性表面の両方の表面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。
【０１１６】
［全般的手順１−銀ナノキューブ（ＡｇＮＣ）の合成及び精製］
銀ナノキューブ（ＡｇＮＣ）の調製は、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６、４５、４５９７．に記載のポリオール法に従って行った。典型的には、まず、固体がＰＤに完全に溶解するまで、混合物を繰り返しボルテックス及び超音波処理を行って、ＣｕＣｌ２（８ｍｇ／ｍＬ）及びＰＶＰ（２０ｍｇ／ｍＬ）の２つの１０ｍＬ溶液を別々に調製した。次いで、３５μＬのＣｕＣｌ２溶液をＡｇＮＯ３（２０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ）の溶液に加え、固体が完全に溶解するまで、ボルテックス及び超音波処理を繰り返し行った。
【０１１７】
１００ｍＬ丸底フラスコを王水で洗浄し、１９０℃で１０分間加熱し、１，５−ペンタンジオール（ＰＤ）２０ｍＬを加え、３０秒毎に２５０μＬのポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）溶液（ＰＶＰはＡｇＮＣを安定化する）を滴下し、５００μＬのＡｇＮＯ３溶液（ＣｕＣｌ２を含む）を１分ごとに素早く加えた。このプロセスを、反応混合物が赤褐色に変わるまで続けた。「一般手順２」における銀ナノ八面体（ＡｇＮＯ）のその後の成長のために、この溶液をさらに処理せずに使用した。
【０１１８】
さらなる自己組織化実験のためのＡｇＮＣを精製するために、ＡｇＮＣ溶液にアセトンを添加し、遠心分離して過剰なＰＤを除去し、次いで上清をエタノールに分散させて過剰なアセトンを除去した。得られた懸濁液を１０ｍＬのエタノールに分散させ、続いて１００ｍＬのＰＶＰ水溶液（０．２ｇ／Ｌ）で希釈した。次いで、混合物を、孔径５０００、６５０、４５０及び２２０ｎｍのＰＶＤＦフィルター膜を用いて、各孔径で数回真空濾過した。
【０１１９】
ＡｇＮＣの初期バッチを、紫外可視分光法及びＳＥＭイメージングによって特性分析し、ＡｇＮＣの吸光度（プラズモン共鳴）及びエッジ長を決定した（図１ａ及び１ｂ）。エッジ長は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてＳＥＭ像で測定し、１１６±３ｎｍであると決定した（図１ｅ）。
【０１２０】
その後の最適化されたＡｇＮＣバッチについて、１００個の粒子についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してエッジ長を測定及び分析し、１２８±７ｎｍであると決定した。合成されたままのＡｇＮＣ濃度は約２ｍｇ／ｍＬで、１．２×１０１１粒子／ｍＬの粒子濃度であった。
【０１２１】
［全般的手順２−銀ナノ八面体（ＡｇＮＯ）の合成及び精製］
ＡｇＮＯの合成は、「全般的手順１」で合成したＡｇＮＣを用いて行った。最初に、固体が完全に溶解するまで、１０ｍＬのＰＤ中で繰り返しボルテックス及び超音波処理することによって、ＣｕＣｌ２（８ｍｇ／ｍＬ）及びＰＶＰ（２０ｍｇ／ｍＬ）の前駆体溶液を別々に調製した。次いで、４０μＬのＣｕＣｌ２溶液をＡｇＮＯ３溶液（ＰＤ中４０ｍｇ／ｍＬ）に添加し、完全に溶解するまで繰り返しボルテックス及び超音波処理した。
【０１２２】
ＰＤ中の合成されたままのＡｇＮＣ溶液を含む丸底フラスコを１９０℃に１０分間加熱した。その後、３０秒ごとに２５０μＬのＰＶＰ溶液を滴下し、毎分５００μＬのＡｇＮＯ３溶液（ＣｕＣｌ２を含む）を素早く添加した。このプロセスを約１時間続け、反応混合物は灰褐色になった。
【０１２３】
合成されたままのＡｇＮＯを精製するために、アセトンをＡｇＮＯ溶液に添加し、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して過剰のＰＤを除去し、続いて１０ｍＬのエタノールに分散させて過剰なアセトンを除去した。次いで、得られた懸濁液を１０ｍＬのエタノール（ＡＲグレード）に再分散させ、次いで１００ｍＬのＰＶＰ水溶液（０．２ｇ／Ｌ）で希釈した。次いで、混合物を、孔径５０００及び６５０ｎｍのＰＶＤＦフィルター膜を用いて、各孔径で数回真空濾過した。
【０１２４】
ＡｇＮＯの初期バッチは、紫外可視分光法及びＳＥＭイメージングによって特性評価し、ＡｇＮＯの吸光度（プラズモン共鳴）及びエッジ長を決定した（図１ｃ及びｄ）。エッジ長はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてＳＥＭ像で測定し、２７０±６ｎｍであると決定した（図１ｆ）。
【０１２５】
その後の最適化されたＡｇＮＯのバッチについて、１００個の粒子についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してエッジ長を測定及び分析し、２９９±２２ｎｍであることが決定された。合成されたままのＡｇＮＯは約１３．７ｍｇ／ｍＬの濃度を有し、粒子濃度は１．２×１０１１粒子／ｍＬであった。
【０１２６】
［全般的手順３−負に荷電したＡｇＮＣ（８５）及びＡｇＮＯ（９０）の調製］
典型的には、１ｍＬのエタノールをＡｇＮＣ溶液（０．１ｍＬ、１．２×１０１１粒子／ｍＬ）に添加し、続いて遠心分離して上清を捨てた。次いで、ＡｇＮＣを１．５ｍｌのＩＰＡ／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）中に再懸濁し、２５℃にて５００ｒｐｍで攪拌し続けた。１１−メルカプトウンデカン酸（１１−ＭＵＡ、０．０５ｍＬ、０．１ｍＭ）のＩＰＡ溶液を、ＡｇＮＣの攪拌溶液に滴下して加え、反応混合物を室温で４時間攪拌した。次いで、反応混合物を撹拌から外し、６５００ｒｐｍで４．５分間遠心分離して、上清を除去した。このプロセスをもう一度繰り返し、ＡｇＮＣをＩＰＡ中の１１ＭＵＡの新鮮な溶液とさらに３時間インキュベートした。その後、得られた溶液を遠心分離し、上清を除去した。次いで、ＡｇＮＣを１．５ｍＬのＩＰＡ／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）中に分散させ、超音波処理し、遠心分離した。このプロセスを２回繰り返し、得られた負に荷電したＡｇＮＣ（８０）を窒素環境中に貯蔵して酸化を防止した。ゼータ電位測定を行って、ＡｇＮＣが負に荷電していることを確認した。
【０１２７】
ＩＰＡ中の１１−ＭＵＡ（０．１ｍＬ、１０ｍＭ）の溶液を使用して、４つの別々のＡｇＮＯ溶液（０．１ｍＬ、１．２×１０１１粒子／ｍＬ）について上記の合成プロセスを繰り返し、負に荷電したＡｇＮＯ（９０）を得た。ＡｇＮＯのゼータ電位は約−２７ｍＶであると決定された。
【０１２８】
１１−ＭＵＡで官能基化されたＡｇＮＣ及びＡｇＮＯの最初のバッチのゼータ電位を、試料を水及びエタノール中にそれぞれ分散させて測定した（表１）。また、水及びエタノール中のＡｇＮＣ及びＡｇＮＯのＳＥＭ像は図２ａ〜ｄに示す通りである。
【０１２９】
【表１】
2021510646.tif 000006
【０１３０】
［全般的手順４−  ４−メルカプトフェニルボロン酸（４−ＭＰＢＡ）によるＡｇＮＣの官能基化］
ＡｇＮＣの４−ＭＰＢＡによる官能基化は、ＩＰＡ中の１１−ＭＵＡ（０．０５ｍＬ，０．１ｍＭ）溶液が、ＩＰＡ中の４−ＭＰＢＡ（０．０５ｍＬ，０．１ｍＭ）溶液に置き換えられた点を除き、「全般的手順３」で述べた手順と同一の手順で行った。
【０１３１】
典型的には、１ｍＬのエタノールをＡｇＮＣ溶液（０．１ｍＬ、１．２×１０１１粒子／ｍＬ）に添加し、遠心分離して続いて上清を捨てた。次いで、ＡｇＮＣを１．５ｍｌのＩＰＡ／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）中に再分散させ、２５℃にて５００ｒｐｍで攪拌し続けた。ＩＰＡ中の４−ＭＰＢＡ（０．０５ｍＬ、０．１ｍＭ）の溶液をＡｇＮＣの撹拌溶液に滴下し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。次いで、反応混合物を撹拌から外し、６５００ｒｐｍで４．５分間遠心分離して、上清を除去した。このプロセスをもう一度繰り返し、ＡｇＮＣをＩＰＡ中の４−ＭＰＢＡの新鮮な溶液とさらに３時間インキュベートした。その後、得られた溶液を遠心分離し、上清を除去した。次いで、ＡｇＮＣを１．５ｍＬのＩＰＡ／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）中に分散させ、超音波処理し、遠心分離した。このプロセスを２回繰り返し、得られた官能基化ＡｇＮＣを窒素環境中に貯蔵して酸化を防止した。合成されたボロン酸官能基化ＡｇＮＣは、以降の実施例において「ＡｇＮＣ／４−ＭＢＰＡ」と表記する。
【０１３２】
ＡｇＮＣ上のボロン酸官能基により、ＡｇＮＣの表面への尿代謝物（例えば、ＴＨＣ及びプレグナン）の捕捉することができる。これは、ＴＨＣ及びプレグナンの水酸基をアルカリ条件下でボロン酸と縮合反応させて、溶液中にボロン酸エステルを形成することによって行われる（図１４ａ、ｃ及びｄ）。
【０１３３】
ＡｇＮＣ表面上の４−ＭＰＢＡの密度は、以下の計算に示すように推定された。
ＡｇＮＣのエッジ長＝１２８．９ｎｍ
ＡｇＮＣの表面積＝６×（１２８．９ｎｍ）２＝９９，８１０．４ｎｍ２
４−ＭＰＢＡ分子の推定表面積（シミュレーションから導出）＝０．３４ｎｍ２
ＡｇＮＣ表面上の４ＭＰＢＡ分子数（フルカバレッジを仮定）
＝９９８１０．４／０．３４＝２９３，５６０分子
【０１３４】
［全般的手順５−シリコン基材の表面官能基化］
典型的には、シリコン（Ｓｉ）基材１０は、Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２の混合物２０でクリーニングされるか、あるいは５分間、酸素プラズマ処理３０に供される（図３ａ）。その後、処理された基材４０は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（２体積％）を有する無水トルエン液５０中に５分間浸漬して、Ｓｉ基材を官能基化した。続いて、アミン終端Ｓｉ基材６０を無水トルエン及びメタノールでリンスした後、Ｎ２ガスでブロー乾燥してリガンド及び溶媒を除去した。次いで、官能基化された基材を、ｐＨ５の塩酸溶液（７０）にさらに５分間浸漬して、基材表面をさらにプロトン化し、正に荷電させた。次いで、得られた基材８０を、さらなる使用のために窒素環境中に保持した。種々の処理された基材４０、６０及び８０の静的接触角を決定し、図３ｂに示した。
【０１３５】
［全般的手順６−銀ナノスフェア（ＡｇＮＳ）の合成］
ＡｇＮＳの合成は、Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２０１４，２６，２８３６−２８４６．に記載された方法に従って行った。典型的には、５ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１ｍＭタンニン酸を含む１００ｍＬの水溶液を調製し、激しく攪拌しながら３つ口丸底フラスコ中で１５分間加熱し、次いで、１ｍＬのＡｇＮＯ３（２５ｍＭ）をこの沸騰溶液中に添加した。溶液は直ちに明黄色になった。その結果得られたＡｇＮＳを、過剰なＴＡを除去するために、遠心法（１０，０００ｇ〜１８，０００ｇ、サイズに応じて）精製し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水又はクエン酸ナトリウム溶液（２．２ｍＭ）に再分散してから、試料の特性評価を行った。ＡｇＮＳのゼータ電位は−３０ｍＶであると決定され、ＡｇＮＳのサイズは約４１ｎｍであった（図１９ａ及びｂ）。
【０１３６】
［実施例１．超疎水性基材の製造及び特性評価］
（超疎水性基材１０７の初期バッチ）
（超疎水性基材１０７の初期バッチの作製）
静電自己組織化は、正に荷電したＳｉ基材８０（「一般手順５」から調製したもの）を、ＡｇＮＯ（８５）及びＡｇＮＣ（９０）を粒子比５：１で含む２ｍＬの負に荷電した水性Ａｇナノ粒子混合物に１００分間浸漬することによって行った（図４ａ）。自己組織化は、基材８０のＮＨ３＋終端に結合するＡｇナノ粒子上の１１−ＭＵＡ層９５のＣＯＯ−官能性による静電引力を介して行われた。この自己組織化アプローチにより、Ａｇナノ粒子の単層を生成した。二成分自己組織化基材をＡｇナノ粒子水溶液から取り出し、エタノールですすぎ、Ｎ２ガスを用いて２回ブロー乾燥した。
【０１３７】
次いで、得られた基材を熱蒸発により、２ｎｍのＣｒの金属層（１００）で被覆し、続いて、それぞれ０．１及び０．５Å／ｓで２５ｎｍのＡｇで被覆した。これは、二成分Ａｇナノ粒子が基材８０へ付着するのを改善するのに役立つ。次いで、基材を１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオール（ＰＦＤＴ）１０５（５ｍＭ、１：１エタノール／ヘキサン、ｖ／ｖ）の溶液中に一晩沈め、超疎水性基材１０７を得た。
【０１３８】
その後のＳＥＲＳ測定においてクリーンなスペクトルバックグラウンドを作り出すために、基材を５ｍＭのＰＦＤＴ溶液に１５時間浸漬し、エタノールで洗浄し、少なくとも６回ブロー乾燥して過剰なＰＦＤＴ溶液を除去した。浸漬の各サイクルの後、溶液を新鮮なＰＦＤＴ溶液と交換した。基材のＳＥＲＳバックグラウンドノイズは、浸漬時間を４５時間に長くすると減少することが観察された（図６）。
【０１３９】
（ＰＦＤＴで基材を官能基化した場合の疎水性に及ぼす影響）
基材１０３及び１０７の静的接触角を測定して、基材のＰＦＤＡでのコーティングによるのそれらの疎水性への影響を決定した。両方の基材の静的接触角は、Ａｇナノ粒子との２０分及び４０分のインキュベーションした後に測定され、表２に示すようになった。
【０１４０】
【表２】
2021510646.tif 000007
【０１４１】
（基材１０７の疎水性に対するＡｇナノ粒子混合物（８５＋９０）中の基材８０のインキュベーション時間の影響）
基材の疎水性に対するＡｇナノ粒子懸濁液中の基材８０のインキュベーション時間の影響を調べるために、２０〜１２０分の異なるインキュベーション時間で上記の手順を繰り返し、それぞれの基材１０７を得た。
【０１４２】
異なるインキュベーション時間にてＡｇナノ粒子で処理した種々の基材１０７のＳＥＭ像及び静的接触角は、図５に示されるように決定された。基材８０をＡｇナノ粒子と共に１００分間インキュベートすると、１６３°±１．５°の最大の接触角が得られることが観察された。
【０１４３】
粒子密度と接触角ヒステリシスも決定され、表３に示す通りであった。インキュベーション時間が長いと、より粒子密度が高くなり、より接触角ヒステリシスが低くなることが観察された。
【０１４４】
【表３】
2021510646.tif 000008
【０１４５】
（ＡｇＮＣ又はＡｇＮＯ単独を有する場合と比較した、基材１０７の疎水性に対するＡｇＮＣ及びＡｇＮＯの二成分集合体の影響）
基材の疎水性に対するＡｇＮＣ及びＡｇＮＯの二成分集合体を有することの効果を理解するために、ＡｇＮＣ又はＡｇＮＯのみを含む基材を、１００分のインキュベーション時間で、上記の手順に従って合成した。
【０１４６】
基材の静的接触角及び二乗平均平方根（ＲＭＳ）表面粗さを決定し、表４に示した。それぞれの基材のＡＦＭ像は図７ａ−ｃに示すとおりであり、ＡｇＮＣ及びＡｇＮＯ基材のＳＥＭ像及び静的接触角は、図７ｄ及びｅ、並びに図７ｆ及びｇにそれぞれ示した。
【０１４７】
【表４】
2021510646.tif 000009
【０１４８】
（親水性基材と比較した基材１０７の液体濃縮効果）
基材１０７の液体濃縮効果は、上記の「基材の液体濃縮効果」において説明した手順に従って決定した。
【０１４９】
基材１０７上及び親水性基材上のシリカ懸濁液の液滴を比較すると、基材１０７上の液体−固体接触面積が５１倍減少していることが観察された（図８ａ及びｂ）。基材１０７上の液滴を乾燥させると、乾燥した接触面積は０．０８ｍｍ２と測定され、これは乾燥前の接触面積からさらに３．４倍減少した（図８ｂ及びｄ）。一方、乾燥時の親水性基材の接触面積は１．２倍にしか減少しなかった。従って、超疎水性基材の全体的な濃縮効果は、約１４８倍であると決定された。
【０１５０】
このように、超疎水性基材１０７上の分析物試料の接触面積の顕著な減少は、高感度検出に必要とされるより小さな面積への分析物の濃縮をもたらすことができる。
【０１５１】
（超疎水性基材１０９の最適化及び改良バッチ）
（超疎水性基材１０９の最適化されたバッチの作製）
静電自己組織化は、ＡｇＮＯ（８５）及びＡｇＮＣ（９０）を４：１の粒子比で含む負に荷電した水性Ａｇナノ粒子混合物２ｍＬ中に、正に荷電したＳｉ基材８０（「全般的手順５」から調製したもの）を２０分間浸漬することによって行った（図４ｂ）。自己組織化は、基材８０のＮＨ３＋終端に結合するＡｇナノ粒子上の１１−ＭＵＡ層９５のＣＯＯ−官能性による静電引力を介して行われた。この自己組織化アプローチは、Ａｇナノ粒子の単層を生成した。二成分自己組織化基材をＡｇナノ粒子水溶液から取り出し、エタノールですすぎ、Ｎ２ガスを用いて２回ブロー乾燥した。
【０１５２】
その後、基材は、エタノール／ヘキサン（１：１、ｖ／ｖ）中の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカンチオール１０５溶液（ＰＦＤＴ，５ｍＭ）に７２時間浸した。このステップは、表面から１１−ＭＵＡを置き換えることによって、ＰＦＤＴがＡｇナノ粒子８５及び９０の露出表面に結合することができた。これは、ＳＥＲＳ検出のためのクリーンなスペクトルバックグラウンドを与えるのに役立つ。
【０１５３】
次に、得られた基材を熱蒸着によって２５ｎｍのＡｇ層（１０３）で０．５Å／ｓでコーティングして、二成分Ａｇナノ粒子のＳｉへの接着を促進した。次いで、基材をエタノール／ヘキサン（１：１、ｖ／ｖ）中のＰＦＤＴ  １０５（５ｍＭ）に少なくとも１５時間浸漬して、超疎水性を達成した。その後のＳＥＲＳ測定においてきれいなスペクトルバックグラウンドを作り出すために、基材をエタノール／ヘキサン（１：１、ｖ／ｖ）中の１０ｍＭのＰＦＤＴに１週間浸漬し、２４時間ごとに溶液を新鮮なＰＦＤＴ溶液で置き換えた。
【０１５４】
（基材１０９の疎水性に対してＡｇＮＣ対ＡｇＮＯの粒子比の違いが及ぼす影響）
基材の疎水性に対するＡｇＮＣ対ＡｇＮＯの粒子比の効果を理解するために、「超疎水性基材の最適化されたバッチの作製」に記載の手順を、２：１、１：１、１：２及び１：４のＡｇＮＣ：ＡｇＮＯの粒子比で繰り返した。ＡｇＮＣ：ＡｇＮＯ比率が１：４の場合、最大の粒子密度であり、１５８°±８°の最大の接触角を与えることが観察された（図９ａ及びｂ）
【０１５５】
（基材１０９の疎水性に対するＡｇナノ粒子混合物（８５＋９０）中の基材８０のインキュベーション時間の影響）
基材の疎水性に対するＡｇナノ粒子懸濁液中の基材８０のインキュベーション時間の影響を調べるために、２０〜１００分の異なるインキュベーション時間で上記の手順を繰り返し、それぞれの基材１０９を得た。
【０１５６】
異なるインキュベーション時間にてＡｇナノ粒子で処理した様々な基材１０９の静的接触角及び粒子密度を測定し、それぞれ図１０ａ及びｂに示した。２０分の浸漬時間を最適化時間として選択したが、これは基材に一貫して高い静的接触角を与える最短のインキュベーション時間であったためである。粒子比が４：１の場合、粒子密度は４．４±０．２粒子／μｍ２（ＳＥＭ像中の粒子の数のカウントから推定）であると決定された。この粒子比では、二乗平均平方根表面粗さも１１６．４±６．２ｎｍで最大となる。
【０１５７】
（ＡｇＮＣ又はＡｇＮＯ単独を有する場合と比較した、基材１０９の疎水性に対するＡｇＮＣ及びＡｇＮＯの二成分集合化の効果）
ＡｇＮＣ及びＡｇＮＯの二成分集合体を有することの基材の疎水性に対する効果を理解するために、ＡｇＮＣ又はＡｇＮＯのみを含有する基材を、２０分のインキュベーション時間で、上記の手順に従って合成した。それぞれの基材１０９の静的接触角及びＡＦＭ像を決定し、図１１ａ及びｂに示した。二成分集合体は、１５８°±８°の最大の静止接触角を与えることが観察された。
【０１５８】
（親水性基材と比較した基材１０９の液体濃縮効果）
基材１０９の液体濃縮効果は、「基材の液体濃縮効果」に記載された手順に従って決定した。基材１０９上のシリカ懸濁液の液滴の乾燥接触面積を親水性基材と比較すると、基材１０９上の乾燥接触面積は０．１３ｍｍ２であり、これは親水性基材上の２４ｍｍ２の面積よりも顕著に低かった（図８ｇ及びｈ）。計算された濃縮係数は、約１８０であると決定された。
【０１５９】
このように、超疎水性基材１０９上の分析物試料の接触面積の有意な減少は、高感度検出に必要とされるより小さな面積への分析物の濃縮をもたらし得る。
【０１６０】
（ＡｇＮＳとＡｇＮＯの二成分集合体を含む超疎水性基材）
ＡｇＮＣがＡｇＮＳで置き換えられたことを除いて、ＡｇＮＳ／ＡｇＮＯ超疎水性基材を、超疎水性基材１０９について上述した方法に従って合成した。
【０１６１】
最初に、２：１の粒子比でＡｇＮＯ及びＡｇＮＳを含む負に荷電した水性Ａｇナノ粒子混合物２ｍＬに、正に荷電したＳｉ基材を４０分間浸漬することによって、静電自己組織化を行った（粒子の各部分は、１．２×１０１１粒子／ｍＬを含有した）。二成分自己組織化基材を水性Ａｇナノ粒子混合物から取り出し、エタノールですすぎ、Ｎ２ガスを用いて２回ブロー乾燥した。次いで、基材をＰＦＤＴ溶液（５ｍＭ）の溶液に７２時間浸漬して、Ａｇナノ粒子の表面上で、１１−ＭＵＡリガンド及びクエン酸ナトリウムを置換した。
【０１６２】
次に、得られた基材を、熱蒸発によって０．５Å／ｓで２５ｎｍのＡｇの層でコーティングして、二成分Ａｇナノ粒子のＳｉへの接着を促進し、次いで、基材を、エタノール／ヘキサン（１：１、ｖ／ｖ）中のＰＦＤＴ（５ｍＭ）に少なくとも１５時間浸漬して、超疎水性を達成した。
【０１６３】
合成したままの基材をＳＥＭで特性分析し、静的接触角と粒子密度を求めた（図１９ｃとｄ）。静止接触角は、脱イオン水の液滴（４μＬ）を使用して決定され、１５０．２°±１．０°が得られた。
【０１６４】
［実施例２．初期超疎水性基材１０７を用いたプレグナン、ｐ−アルサニル酸及びロキサルソンのＳＥＲＳ検出］
基材１０７の性能を検証するために、これらの基材を用いて、尿代謝物及び毒素の直接ＳＥＲＳ検出を行った。
【０１６５】
本実験の尿代謝物として、自然流産を決定する際に重要な尿代謝物とみなされている５β−プレグナン−３α，２０α−ジオールグルクロニド（プレグナン）を選択した。プレグナンの水溶液（１×１０−６Ｍ）をまず調製し、続いて脱イオン水で一連の１０倍連続希釈して、様々な濃度（１×１０−７Ｍ〜１×１０−９Ｍ）の希釈溶液を得た：次に、プレグナン溶液の１μＬの液滴を、ＳＥＲＳによる分析のために基材１０７上にドロップキャストした。液滴を乾燥した後に、レーザー照射（波長、５３２ｎｍ；出力、０．０６ｍＷ）及び取得時間１０秒の下で、ＳＥＲＳスペクトルが得られた。
【０１６６】
基材１０７上の種々の濃度のプレグナンのＳＥＲＳスペクトルは、図１３ａに示す通りである。図１３ｂに示すように、６１４ｃｍ−１におけるピークの強度を使用して較正曲線を得た。プレグナンに起因するＳＥＲＳシグナルは、１ｎＭ程度の低い濃度で検出され得ることが観察された。これは、プレグナン自体のＳＥＲＳスペクトルの強度を使用して、超疎水性基材１０７上のプレグナンを直接検出し、定量化する方法を表す。
【０１６７】
同様に、ＳＥＲＳ検出は、ｐ−アルサニル酸及びロキサルソンのような超微量毒素の検出に拡張された。ｐ−アルサニル酸及びロキサルソンの水溶液（１×１０−３Ｍ）を、１０ｍＬの脱イオン水に固体を溶解することによって最初に調製した。次いで、これに続いて、脱イオン水で一連の１０倍連続希釈を行い、種々の濃度（１×１０−４Ｍ〜１×１０−９Ｍ）の希釈溶液を得た：溶液の１μＬの液滴を、ＳＥＲＳによる分析のために基材１０７上にドロップキャストした。ＳＥＲＳスペクトルは液滴を乾燥させた後、図１３ｃ及びｄにそれぞれ示すように、上記と同じパラメーター下で得た。ｐ−アルサニル酸及びロキサルソンのＳＥＲＳスペクトルを分析し、表５に示すように帰属された。
【０１６８】
ｐ−アルサニル酸については、１１３１ｃｍ−１及び７８３ｃｍ−１でのピークの強度は濃度の低下に伴って低下し、ロキサルソンについても、１３５５ｃｍ−１でのピーク強度が濃度の低下に伴って同様の傾向を示した（表６）。
【０１６９】
【表５】
2021510646.tif 000010
【０１７０】
【表６】
2021510646.tif 000011
【０１７１】
［実施例３．ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡと共に使用した場合の、最適化された超疎水性基材１０９のＳＥＲＳ分析増強因子（ＡＥＦ）の決定（基材１０９単独及び超疎水性シリカビーズアレイのＳＥＲＳ分析増強因子（ＡＥＦ）と比較して）］
ＳＥＲＳ基材のＡＥＦは、ＳＥＲＳ検出の性能の重要な指標である。したがって、超疎水性基材１０９単独、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡ、及び超疎水性シリカビーズアレイと共に使用された場合のＡＥＦを、分析物としてメチレンブルーを使用して決定し、比較した。
【０１７２】
（実験手順）
ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡを有する超疎水性基材１０９を用いて得られたＳＥＲＳスペクトルについては、メチレンブルー（１×１０−７Ｍ〜１×１０−１４Ｍ）及びＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡ（〜１．２×１０７粒子）を含む１μＬの液滴を基材１０９上に滴下し、ＳＥＲＳスペクトルを記録する前に乾燥させた。４−ＭＰＢＡはメチレンブルーに結合できないが、乾燥過程で隣接するＡｇＮＣ粒子間のスペースにメチレンブルー分子が物理的にトラップされ、超疎水性基材１０９からの濃縮効果に起因して、メチレンブルーのＳＥＲＳ増強はなお起こりうる。
【０１７３】
同様に、基材１０９単独又はシリカビーズアレイを使用して得られたＳＥＲＳスペクトルについて、メチレンブルー溶液（１×１０−３Ｍから１×１０−１１Ｍまで）の１μＬの液滴を基材（基材１０９単独又はシリカビーズアレイ）上にドロップキャストし、ＳＥＲＳスペクトルを記録する前に乾燥させた。
【０１７４】
通常のラマンシグナル測定では、Ｓｉ基材１０上にメチレンブルー溶液（１０−３Ｍ）の１μＬを滴下したものを用いて、メチレンブルーのラマンスペクトルを得た。１秒及び１００秒の取得時間を使用して、ＳＥＲＳ及びラマンスペクトルをそれぞれ取得した。
【０１７５】
超疎水性シリカビーズアレイは、最初にシリコン基材８０をシリカビーズ（１重量％）の水性懸濁液中に１０分間浸漬することによって作製した。次いで、この基材を窒素気流下でブロー乾燥し、続いてＰＦＤＴ（５ｍＭ）で一晩官能基化した。
【０１７６】
（結果と考察）
超疎水性ＳＥＲＳ基材上に吸着した分析物分子のＳＥＲＳ増強を定量するための分析増強因子（ＡＥＦ）を、以下の式に従って決定した。
ＡＥＦ＝［ＩＳＥＲＳ／ＩＲａｍａｎ］×［ＣＲａｍａｎ／ＣＳＥＲＳ］、
ここで：
ＩＳＥＲＳはＳＥＲＳ基材を用いて記録された最低濃度でのＳＥＲＳシグナルの強度；
ＣＳＥＲＳはＳＥＲＳ基材を用いて測定された分析物の対応する濃度；
ＩＲａｍａｎは最低濃度での通常のラマンシグナル（ＳＥＲＳ基材なし）の強度；
ＣＲａｍａｎは通常のラマン検出（ＳＥＲＳ基材なし）に使用した分析物の対応する濃度である。
【０１７７】
ＡＥＦは、個々の基材の検知限界が、超疎水性シリカビーズアレイ、超疎水性基材１０９単独、及びＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡと共に使用した場合で、それぞれ、１０−６、１０−１１、及び１０−１４Ｍであることに基づいて計算される。
【０１７８】
ＳＥＲＳ基材のＡＥＦを決定するために任意の他の分析物を使用することができるが、この実施例のＡＥＦはメチレンブルーの１６２８ｃｍ−１バンドでの強度（Ｃ＝Ｃ伸縮に起因する）に基づいて計算した。
【０１７９】
種々の基材のＡＥＦを決定し、図１２ａ−ｃに示した。超疎水性基材１０９単独のＡＥＦは、２．４×１０９を達成しており、超疎水性シリカビーズアレイのＡＥＦである５．０×１０２よりもはるかに優れていることが観察された。
【０１８０】
さらに、基材１０９と共にＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡを使用すると、ＳＥＲＳシグナル強度がさらに向上し、２．４×１０１２のＡＥＦが達成された（図１２ｃ）。これは、超疎水性シリカビーズアレイ及び基材１０９それぞれのＡＥＦよりも約１０１０倍及び１０３倍高かった。超疎水性基材１０９によって提供されるＳＥＲＳ増強以外に、ＡｇＮＣの使用は、基材１０９とＡｇＮＣとの間に挟まれた分析物のＳＥＲＳ信号をさらに増強するための追加のプラズモン表面（及び「ホットスポット」）を提供する。したがって、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡは、基材のＡＥＦを増強するための「ミラー効果」を提供し、検出のためのより高いＳＥＲＳ感度を与える。
【０１８１】
［実施例４．ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡを含む超疎水性基材１０９を用いたプレグナン及び／又はＴＨＣのＳＥＲＳ定量］
ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡと超疎水性基材１０９との組み合わせを、目的の尿代謝物の検出及び定量に適用した。標的となる尿代謝物は、５β−プレグナン−３α，２０α−ジオールグルクロニド１２５（プレグナン）及びテトラヒドロコルチゾン１２０（ＴＨＣ）であり、妊婦の尿試料中のこれら２つの代謝産物の濃度は、自然流産の可能性の予測指標として役立つことが確認されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／１９９８４９参照）。
【０１８２】
尿は、多数の代謝産物から構成される複雑な生物学的マトリックスであり、尿試料中のプレグナン及びＴＨＣのＳＥＲＳ検出及び定量を潜在的に妨害し得る。このことを踏まえると、測定及び分析のために超疎水性ＳＥＲＳ基材１０９を使用する前に、溶液中の標的尿代謝物を分離することが重要である。ＴＨＣ１２０及びプレグナン１２５はともに、複数の水酸基（−ＯＨ）を含み、アルカリ条件下で、ＡｇＮＣ表面１３５にグラフトされたボロン酸１３０（４−ＭＢＰＡ）と縮合反応し、ボロン酸エステルを形成した（図１４ａ）。次いで、捕捉された代謝産物を有するＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡは、分離され、（ＡｇＮＣ及び基材１０９の両方を有する「ミラー効果」を利用することによる）より高いＳＥＲＳ感度のために超疎水性基材１０９上にドロップキャストすることができる。
【０１８３】
（実験手順）
純粋なプレグナンとＴＨＣについて、最初に個別のＳＥＲＳ実験を行った。１０μＬのプレグナン又はＴＨＣ溶液（１０−４〜１０−９Ｍ）を、ｐＨ１１のＫＯＨ水溶液中のＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡ（〜０．２ｍｇ／ｍＬ）と混合し、超音波処理し、次いで３時間反応させた。３時間後、混合物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、生成物を１０μＬのｐＨ１１溶液に再分散させた。このプロセスを、超疎水性基材１０９上にドロップキャスティングする前に２回繰り返し、次いで、周囲条件下で乾燥させた。５３２ｎｍのレーザー励起波長を用いて、０．２ｍＷ、１秒の収集時間で、ラマンスペクトルを収集した。
【０１８４】
試料の分析を実行する前に、基材１０９のバックグラウンドスキャンを実行した。これは、１１−ＭＵＡから生じる干渉シグナルがないことを保証するためであった。実際の試料の分析は、ラマンスペクトルのベースラインが平坦で特徴のない場合にのみ行った。
【０１８５】
多重測定では、０．１ｍＭストック溶液を用いて、９０〜１００％の範囲の比率で、プレグナン：ＴＨＣの様々な濃度比を調製した。例えば、測定用の９０％プレグナン：ＴＨＣ溶液を調製するために、９０μＬのプレグナンを１０μＬのＴＨＣと混合し、次いで、この混合物を、先に記載したのと同じ条件下でＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡと反応させた。ＳＥＲＳ測定も、上記と同じ実験パラメーターに従って行った。
【０１８６】
（データ解析）
（主成分分析（ＰＣＡ））
検出方法のロバスト性及び信頼性を改善するために、ハイパースペクトルＳＥＲＳ測定を使用して、測定当たり２０００を超えるＳＥＲＳスペクトルを生成した。多数のデータセットに基づいて検出方法を構築することで、統計的により信頼性が高くなるが、スペクトルを手動で分析することは困難であり、実用的ではない。さらに、プレグナン（１２５）及びＴＨＣ（１２０）と結合した際の４−ＭＰＢＡ（１３０）のスペクトル変化は、濃度範囲にわたって劇的ではなく、特定のスペクトル領域に限定される（図１５ａ及びｂ）。
【０１８７】
そのため、主成分分析（ＰＣＡ）を用いて、抽出されたＳＥＲＳスペクトルを分析し、測定されたスペクトル範囲全体にわたって、４−ＭＰＢＡ、４−ＭＰＢＡ−プレグナン、及び４−ＭＰＢＡ−ＴＨＣに特有のスペクトルの特徴を識別し、分類した。ＰＣＡは大きなデータセットを分析するための標準的な統計的手順であり、市販のソフトウェア（Ｐａｎｏｒａｍａ）を使用してＰＣＡを実施した。
【０１８８】
典型的には、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡ（ｐＨ  １１）、ＴＨＣと共にインキュベートしたＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡ、及びプレグナンと共にインキュベートしたＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡについての２５の未処理スペクトルを、それぞれソフトウェアに入力した（合計７５スペクトル）。標準正規変量（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｖａｒｉａｔｅ）補正とＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ微分アルゴリズムを適用して、スペクトルノイズを低減し、バックグラウンドシグナルからの干渉を除去した。ＰＣＡ解析では、実験的に測定した全スペクトル範囲を選択し、２つのＰＣを適用することで、少なくとも９８％の精度でスペクトル同定が可能であった。
【０１８９】
（部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰）
さらに、部分最小二乗回帰（ＰＬＳ）を用いて、異なる濃度のプレグナン及びＴＨＣに対するＳＥＲＳ測定の予測力を試験した。これは、個々の尿代謝物についての標準較正曲線を確立することによって行われた。純粋な分析物については、測定された各濃度について２５のスペクトルを入力し、１５０のスペクトルを使用して、各分析物について１０−４〜１０−９Ｍの間の検量線を導出した。
【０１９０】
標準正規変量補正とＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ微分アルゴリズムを適用して、スペクトルノイズを低減し、干渉を除去した。解析では、実験的に測定したスペクトル範囲全体を選択し、交差検証における二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥＣＶ）の最小値を与えるために適切な数のローディングベクトルを採用した。プレグナンを含むスペクトルには３つのローディングベクトルを使用し、ＴＨＣには２つのローディングベクトルを使用した。ローディングベクトルの最小数は１）オーバーフィッティング（すなわち、偶然の相関とノイズ成分の取り込み）の可能性を最小化する、２）最小ＲＭＳＥＣＶからの偏差を５％未満にする、という２つの考えに基づいて選択された。
【０１９１】
（結果と考察）
ＴＨＣとプレグナンでそれぞれインキュベートした後の４−ＭＰＢＡのＳＥＲＳスペクトルについて、明瞭なスペクトル変化が観察された（図１４ｂ）。特に、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡは、１１８２ｃｍ−１及び１３２８ｃｍ−１で特徴的な４−ＭＰＢＡ振動モードを示し、これはそれぞれボロン酸（δＢＯ＋νＣＢ）の芳香族Ｃ−Ｈ変角モードと伸縮モードに対応する。ＴＨＣ及びプレグナンと相互作用すると、ＳＥＲＳスペクトルは主に２つのスペクトル領域（すなわち、領域（ｉ）及び（ｉｉ））において劇的な変化を示した。
【０１９２】
領域（ｉ）では、４−ＭＰＢＡ  １３０の芳香族Ｃ−Ｈ変角ピークがＴＨＣ  １２０及びプレグナン１２５（図１４ｃ）の両方でブロードになったが、領域（ｉｉ）では、δＢＯ＋νＣＢの強度が劇的に減少し、ＴＨＣ  １２０とプレグナン  １２５で、それぞれ１３２８ｃｍ−１〜１３３２ｃｍ−１、〜１３３３ｃｍ−１にブルーシフトした（図１４ｄ）。ＳＥＲＳ強度の低下は、４−ＭＰＢＡ  １３０に結合することに伴う、尿代謝物１２０と１２５によるＢ−ＯとＣ−Ｂ結合の制約によるものである。スペクトル変化の実験的観察は、また理論的にシミュレートしたスペクトルで裏付けられた（図１４ｃ及びｄ）。これらの変化により、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡによる純粋な形態での尿代謝物の捕捉が成功していることが明確に確認され、プレグナン１２５とＴＨＣ  １２０が４−ＭＰＢＡ  １３０に結合する間のスペクトル変化の違いにより、これら２つの代謝物を区別して検出する方法が可能となった。従って、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡとタンデムに超疎水性基材１０９を使用することにより、ＴＨＣ及び／又はプレグナンに結合した際の４−ＭＰＢＡのスペクトル変化を検出することで、標的代謝物の間接的なＳＥＲＳ検出及び定量化が可能となった。この場合、４−ＭＰＢＡは捕捉剤及びラマンレポーターの両方として効果的に作用し、分析物に結合した際の化学結合に対する変化を反映する。
【０１９３】
図１５ｃは、個別に測定された４−ＭＰＢＡ、４−ＭＰＢＡ−プレグナン、及び４−ＭＰＢＡ−ＴＨＣについてのＰＣＡ処理ＳＥＲＳデータの代表的な２Ｄプロットを示す。様々なＳＥＲＳスペクトルを分解するために２つの主成分（ＰＣ）を使用することによって、ＳＥＲＳスペクトルは、それぞれ４−ＭＰＢＡ単独、プレグナンを有する４−ＭＰＢＡ、及びＴＨＣを有する４−ＭＰＢＡから生じる３つの別個のクラスターに分類することができる。これらの２つのＰＣは、３つのスペクトルデータセットすべての間の正味の分散の９８．１％に対応している。プレグナンの定量について、図１５ｄは、４−ＭＰＢＡ−プレグナンについてのＰＬＳ回帰を示しており、９９％を超える予測精度及び１ｎＭの検出限界であった。同様に、図１５ｅは４−ＭＰＢＡ−ＴＨＣに対するＰＬＳ回帰を示しており、予測精度は９９％を超え、検出限界は１ｎＭであった。
【０１９４】
さらに、プレグナン及びＴＨＣの両方の同時多重分析のためのＰＬＳ予測モデルも確立した。両代謝物は実際の患者の試料中に存在するため、両代謝物の多重解析は実際的に重要であり、両代謝物の存在量の比は、自然流産のリスクを決定する重要な因子である。
【０１９５】
ＰＬＳ予測モデルを作成するために、種々の比率のプレグナン：ＴＨＣとの混合物からＳＥＲＳシグナルを収集した。特定の比率のプレグナン及びＴＨＣをＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡと反応させ、続いて、上記の実験手順で説明したように精製した。この比は９０％〜１００％プレグナンの範囲であり、これは、実際の患者の試料中の生理学的に関連するプレグナンレベルに対応する。図１５ｆは、９つのローディングベクトルを用いて確立された、多重測定のためのＰＬＳモデルを示す。この多重モデルの予測精度は約９８．５％であり、ＳＥＲＳ測定からプレグナン及びＴＨＣの両方の相対的存在量を予測するその能力が際立っている。
【０１９６】
［実施例５．ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡを含む超疎水性基材１０９を用いた人工尿試料中のプレグナン及び／又はＴＨＣのＳＥＲＳ定量］
実施例４で考察した実験プロトコール及び結果は、実際の尿試料中に存在する複雑な試料マトリックスの非存在下での代謝産物の検出に関する。従って、より現実的な試料マトリックスにおける本発明の適用性を調べるために、検出方法を人工尿における検出に拡張した。
【０１９７】
（実験手順）
（人工尿の調製とスパイキング）
人工尿は実際の尿を制御された条件でシミュレーションすることを可能にし、様々な成分の相対的な存在量を適宜調節することができる。まず、人工尿を、２４．２ｇの尿素、１０．０ｇの塩化ナトリウム、６．０ｇのリン酸一カリウム、６．４ｇのリン酸ナトリウムを１００ｍＬの脱イオン水に混合することによって調製した。
【０１９８】
次いで、この人工尿試料に特定の比率のプレグナン及びＴＨＣを加えて、標準較正曲線を導き、安定な妊娠及び流産に関連する試料をシミュレートした。この実施例のために使用したプレグナン及びＴＨＣの原液の濃度は１ｎＭであった。多重測定のために異なる比率のプレグナン及びＴＨＣを有する人工尿をスパイクするために、１０μＬのプレグナン及び／又はＴＨＣ溶液を９０μＬの人工尿に添加し、プレグナンの比率は９０〜１００％の範囲とした。例えば、人工尿を９０％プレグナンでスパイクするために、９０μＬの人工尿に９μＬのプレグナン及び１μＬのＴＨＣを添加した。
【０１９９】
先行研究に基づくと、安定した妊娠は、７６：１のプレグナン：ＴＨＣ比（９８．７％プレグナン）に相当し、一方、自然流産は３８：１の比（９７．４％プレグナン）に相当する。したがって、この実施例で使用したプレグナン：ＴＨＣの濃度範囲は、プレグナン及びＴＨＣの生理学的濃度を網羅している。
【０２００】
（人工尿試料のＺＩＰＴＩＰ前処理）
ＺＩＰＴＩＰは、Ｃ−１８樹脂で充填された市販のミニカラムであり、これは、生物学的試料の脱塩、濃縮、及び精製のために日常的に使用される。試料の前処理の前に、２０μＬのメタノール及び２０μＬの脱イオン水で溶出することによって、ＺＩＰＴＩＰカラムを活性化した。
【０２０１】
次いで、１０μＬのスパイクした人工尿試料をＺＩＰＴＩＰカラム２１０に通して溶出し、次いで１０μＬの水（２２０）で洗浄して、塩２２５を除去した（図１６ａ）。次いで、１０μＬのメタノール（２３０）を使用して、カラムから分析物２３５を溶出した。その後、メタノール溶媒を蒸発させ、濾過した試料をｐＨ１１のＫＯＨ水溶液（２３６）１０μＬに溶解させて試料２３８とした。
【０２０２】
（ＳＥＲＳ検出のためのＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡによる試料の処理）
次いで、試料分析物２３８をＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）と混合し、超音波処理し、３時間反応させた（図１６ｂ）。３時間後、混合物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、生成物をｐＨ１１のＫＯＨ水溶液１０μＬ中に再分散させた。このプロセスを２回繰り返してから、ＳＥＲＳ検出のために超疎水性基材１０９上にドロップキャスティングした。平均読み取り値を得るために、基材１０９の異なる位置に試料をドロップキャスティングして、最低３つの個々の試料を調製した。ＳＥＲＳスペクトルを収集し、ケモメトリック分析２４０に使用した。
【０２０３】
（データ解析）
ＳＥＲＳスペクトルを、主成分分析（ＰＣＡ）及び部分最小二乗（ＰＬＳ）分析に供し、各シミュレートした条件からの２５のスペクトルを、実施例４に記載したのと同じプロトコールを使用して分析した。
【０２０４】
ＰＬＳ分析を使用して、人工尿中の分析物の多重検出のための標準較正曲線を確立した。ＰＬＳモデルは、スパイクした人工尿中の９０〜１００％のプレグナンから構築した。
【０２０５】
（結果と考察）
図１７ａは、種々の濃度のプレグナンでスパイクした人工尿試料から得られたＰＬＳ予測モデルを示す。＞９７％の高い精度で、試験された範囲のプレグナン濃度について良好な線形相関が観察された。これは、実験プロトコール及びデータ分析アプローチが、正確度を失うことなく、人工尿試料に適用され得ることを示す。
【０２０６】
安定妊娠と自然流産をシミュレートした飼料のＰＣＡ分析（２つのＰＣを使用して種々のＳＥＲＳスペクトルを分解する）も実施した。ＳＥＲＳスペクトルは安定妊娠と自然流産にそれぞれ対応する２つの異なるクラスターに分類され（図１７ｂ）、予測結果はそれぞれ９８．９±０．３％と９７．２±０．８％であった。２つのＰＣは、２つのスペクトルデータセット間の正味の分散の８９．８％に対応した。種々の比率のプレグナン：ＴＨＣ（９０〜１００％）のＳＥＲＳスペクトルは、図１７ｃに示す通りである。安定妊娠（９８．７％のプレグナン）及び流産（９７．４％のプレグナン）に対応するＳＥＲＳスペクトルは、図１７ｄに示されるとおりである。
【０２０７】
ＰＬＳ回帰はまた、両方の模擬尿試料におけるプレグナンの相対量を正確に予測することができた（図１７ｅ）。プレグナン：ＴＨＣ比が７６：１の安定妊娠をシミュレートした試料について、理論上のプレグナンのパーセンテージは９８．９％であり、本モデルのＰＬＳ予測正確性は、９８．９±０．３％と、エラーウィンドウは非常に狭かった。プレグナン：ＴＨＣ比が３８：１の自然流産をシミュレートした試料では、理論上のプレグナンのパーセンテージは９７．３％であり、ＰＬＳ予測正確性は９７．２±０．８％に対応し、エラーウィンドウは非常に狭かった。したがって、実験的及び分析的アプローチは、正確さを失うことなく、人工尿試料にうまく適用できることは明らかである。
【０２０８】
［実施例６．ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡを含む超疎水性基材１０９を用いた実際の尿試料中のプレグナン及び／又はＴＨＣのＳＥＲＳ定量］
自然流産の診断における本実験プロトコール及び分析アプローチの適用性をさらに実証するために、本実施例では実際の尿試料を使用した。
【０２０９】
まず、血清プロゲステロン値が１．０１ｎｍｏｌ／Ｌである非妊婦から採取した尿検体を用いて標準的な較正曲線を設定した。これらの尿試料に、特定の比率のプレグナン及びＴＨＣをスパイクし、続いて、標準的なＺＩＰＴＩＰ処理、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡとの反応、遠心分離による精製、ＳＥＲＳ測定及び分析（実施例４及び５に記載）を行った。プレグナン及びＴＨＣの原液の濃度は０．１ｎＭであった。較正曲線は、その特定の検体のＳＥＲＳ応答に非常に依存するので、使用される全ての検体について新しい較正曲線を作成した。定量の正確性をより高めるために、全ての基材について新しい較正曲線を作成することも好ましい。
【０２１０】
安定した妊娠と自然流産を表す尿試料については、患者の血清プロゲステロンレベルに基づいて６つの尿試料を選択し、尿試料のプレグナン：ＴＨＣ存在比をＬＣ／ＭＳにより決定した（表７）。妊娠が安定している患者の血清プロゲステロン濃度は、７４．８８、１０６．４５、６４．４２ｎｍｏｌ／Ｌであり、尿試料中の対応するプレグナン：ＴＨＣ存在比はそれぞれ９８．７、９９．３、９９．１％であった。自然流産患者の血清プロゲステロンレベルは７．７２、８．９、及び１５．４２ｎｍｏｌ／Ｌであり、対応する尿試料中のプレグナン：ＴＨＣ存在比はそれぞれ９４．１、９３．１、及び９３．６％であった。これらの尿試料を、標準的なＺＩＰＴＩＰ処理、ＡｇＮＣ／４−ＭＰＢＡとの反応、遠心分離による精製、測定及び分析（実施例５に記載）に供した。
【０２１１】
図１８ａは、様々な濃度のプレグナンでスパイクされた実際の非妊娠尿試料から得られたＰＬＳ予測モデルを示す。試験されたプレグナン濃度範囲については、９９％を超える高い正確度で良好な線形相関が観察され、これは、本実験プロトコール及びデータ分析アプローチが正確さを失うことなく、実際の尿試料に適用され得ることを示す。異なるプレグナン濃度でスパイクした非妊娠女性の尿のＳＥＲＳスペクトル、及び妊娠女性からの実際の尿試料のＳＥＲＳスペクトルは、それぞれ図１８ｂ及びｃに示されるとおりである。ＰＣＡクラスタリングはまた、それぞれ２５の未処理スペクトルを用いて、２つの実際の尿試料（１つは自然流産（Ｍ１）であり、もう１つは成功出産（Ｓ１）である）にも適用された（図１８ｄ）。
【０２１２】
さらに、ＰＬＳ回帰はまた、実際の尿試料中のプレグナンの相対量を正確に予測した。プレグナン：ＴＨＣ比が９８．７、９９．３、及び９９．３％の安定妊娠に対応する尿試料について、本モデルを使用したＰＬＳ予測では、それぞれ１０１．３±０．２、９９．２±０．２、９８．６±０．７％の濃度を与え、非常に狭いエラーウィンドウを示した（表７）。プレグナン：ＴＨＣ比が９４．１％、９３．１％、及び９３．６％の自然流産に対応する試料について、本モデルは、それぞれ９６．９±０．８％、９４．８±０．５％、及び９４．７±０．６％の濃度を与え、これらも非常に狭いエラーウィンドウを示した（表７）。
【０２１３】
ＳＥＲＳ測定値は、ＬＣ／ＭＳ測定値から得られる既知の測定値と非常によく相関したため、本発明は尿からの尿代謝物のポイントオブケア非侵襲的検出を達成することができ、これは自然流産の非侵襲的診断として役立ち得ることは明白である。さらに、この性能は、異なるレベルのウロビリン（尿の色の違いで定性的に観察される）を有する実際の尿試料で最も明白に実証された。ウロビリンの量が異なっていても、流産リスクに対するＰＬＳ予測の精度への影響は最小限であった。
【０２１４】
【表７】
2021510646.tif 000012
【図１】
2021510646.tif 000014
【図２】
2021510646.tif 000015
【図３】
2021510646.tif 000016
【図４】
2021510646.tif 000017
【図５】
2021510646.tif 000018
【図６】
2021510646.tif 000019
【図７】
2021510646.tif 000020
【図８】
2021510646.tif 000021
【図９】
2021510646.tif 000022
【図１０】
2021510646.tif 000023
【図１１】
2021510646.tif 000024
【図１２】
2021510646.tif 000025
【図１３】
2021510646.tif 000026
【図１４】
2021510646.tif 000027
【図１５】
2021510646.tif 000028
【図１６】
2021510646.tif 000029
【図１７】
2021510646.tif 000030
【図１８】
2021510646.tif 000031
【図１９】
2021510646.tif 000032
【国際調査報告】
2021510646.tif 000033
2021510646.tif 000034
2021510646.tif 000035