(57)【要約】  本発明において、体重減少を誘発する、ならびに糖尿病、脂質異常症、ＮＡＳＨおよび／または肥満を治療する化合物が提供される。そのような化合物を含有する薬学的組成物ならびにそのような化合物および組成物の治療的使用もまた提供され、そのような化合物は、作用時間の延長および他の有利な特性を有するＧＤＦ１５アゴニストとして作用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含む化合物。
【請求項２】
配列番号２からなる化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の２つの化合物を含むホモダイマーであって、前記化合物が、第１の化合物のシステイン残基と第２の化合物のシステイン残基との間の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されている、ホモダイマー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
患者の体重減少を誘発する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項１〜３に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項６】
患者の２型糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項１〜３に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項７】
患者の肥満を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項１〜３に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項８】
患者のＮＡＳＨを治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項１〜３に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９】
患者の脂質異常症を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項１〜３に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
療法における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
体重減少を誘発する際の使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
２型糖尿病の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
肥満の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
脂質異常症の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
ＮＡＳＨの治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
体重減少を誘発するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１７】
２型糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１８】
肥満の治療のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１９】
脂質異常症の治療のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２０】
ＮＡＳＨの治療のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、ポリペプチドが発現されるような条件下で培養し、化合物を回収することによって産生される化合物。
【請求項２２】
患者の体重減少を誘発する方法、２型糖尿病、肥満、ＮＡＳＨおよび／または脂質異常症を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項１〜３の化合物または請求項４の組成物を週１回投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本開示は、生物学および医学に関し、より具体的には、作用時間の延長および他の有利な特性を有する増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）アゴニスト化合物を含む化合物および組成物、ならびに、体重減少を誘発するため、ならびに糖尿病、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および／または肥満を治療するための、それを使用する方法に関する。
【０００２】
ＧＤＦ１５（ＭＩＣ−１、ＮＡＧ−１としても知られている）は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属するシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）ノットタンパク質である。その循環濃度は、癌悪液質および代謝などのさまざまな生物学的機能に関与している（Ｅｍｍｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２３：１２１５−１２１９を参照）。成熟ヒトＧＤＦ１５（配列番号１）は１１２アミノ酸のペプチドである。循環ＧＤＦ１５は、ホモダイマーの各鎖の配列番号１の７７位にあるＣｙｓ残基間の１つの鎖間ジスルフィド結合であると報告されているもの（配列番号２の３１６位に対応する）を介して、成熟タンパク質（２５ｋＤａ）のホモダイマーを形成する。ホモダイマーの形成は、ＧＤＦ１５の生物学的活性に必要であると考えられている（国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／１４７７４３号を参照）。
【０００３】
成熟ＧＤＦ１５ホモダイマーの多くの生物学的機能が報告されている中で、肥満と２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の治療の可能性により、エネルギー恒常性の調節に注目が集まっている。成熟ＧＤＦ１５ホモダイマー活性とエネルギー恒常性との間の関係は、血清レベルの成熟ＧＤＦ１５の増加が、進行した前立腺癌である個体の体重減少と相関するという観察に基づいている（Ｅｍｍｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７））。
【０００４】
さらに、組換えＧＤＦ１５を投与することによって、または腫瘍異種移植片からのその発現および分泌を通してマウスのＧＤＦ１５を増加させると、ＧＤＦ１５が、食物摂取を減らし、エネルギー消費を増やすその能力を介して体重減少を引き起こすことが示された。さらに、ＧＤＦ１５ノックアウトマウスは体重と脂肪量が増加していたのに対し、ＧＤＦ１５を過剰発現しているトランスジェニックマウスは、食餌で誘発される肥満に対して耐性があり、耐糖能の改善を示した。ＧＤＦ１５で誘発される体重減少は、炎症応答を減少させ、げっ歯動物の寿命を延ばすことがさらに示された。
【０００５】
グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）受容体アルファ様（ＧＦＲＡＬ）は、ＧＤＦ１５のリガンド結合受容体として同定されている。ＧＦＲＡＬ欠損マウスおよび抗ＧＦＲＡＬ中和モノクローナル抗体を投与されたラットにおけるＧＤＦ１５の食欲抑制効果の喪失は、ＧＦＲＡＬがＧＤＦ１５の代謝効果の主な原因であることを例証した（Ｅｍｍｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７））。
【０００６】
成熟循環ヒトＧＤＦ１５ホモダイマーアゴニストの自然半減期（ｔ１／２）は比較的短い（約２〜３時間）。しかし、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０１７７１０号は、一般に、フラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ）との結合を含む様々な結合を介してＧＤＦ１５アゴニストのｔ１／２を延長することを記載している。
【０００７】
体重減少を誘発するための、ならびにＴ２Ｄ、脂質異常症、ＮＡＳＨおよび／または肥満を治療するための療法において使用できる、作用時間が延長された生物学的に活性なＧＤＦ１５化合物の必要性が存在している。治療的に望ましい化合物は、ＧＦＲＡＬ受容体を刺激し、有利な特性を提供する。１つの有利な特性は、体重減少を誘発することである。別の有利な特性は、所望の治療効果を達成するために週に１回の投薬で、血流中の薬物の安定したレベルを可能にする治療範囲での長期間におけるインビボでの安定性である。さらに望ましい特性には、免疫原性の低下も含まれる。また、望ましい化合物は、有利な物理的および／または化学的な安定性特性を有する。
【０００８】
上記を考慮して、本開示は、延長されたｔ１／２および他の望ましい特性を有する生物学的に活性なＧＤＦ１５アゴニスト化合物を記載する。より具体的には、本発明の化合物は、リジッドリンカーを介してＧＤＦ１５アナログ化合物のアミノ（Ｎ）末端に連結されたヒンジレスモノマー（ＧＤＦ１５あたり１つのＦｃユニット）ヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する組換え融合タンパク質であり、それにより、これらの化合物は、各モノマーのＧＤＦ１５部分間の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されたホモダイマーを形成する。例示的な化合物である化合物２は、化合物１（配列番号２）の２分子のホモダイマーであり、驚くべきことに、最大約１１７時間の増強されたｔ１／２を示し、これは、延長された効能を提供することができ、週に１回の化合物の投与を可能にし得る。本発明の化合物はまた、物理的安定性も強化されている。例えば、化合物２は、プロテインＡ捕捉プールで低い４．１％の高分子量（ＨＭＷ）可溶性凝集体を有している。化合物２はまた、ｐＨ６．０のクエン酸中４０℃で４週間保存した後、１ｍｇ／ｍｌにおける低い０．７５％の低分子量（ＬＭＷ）パーセントの成長など、化学的安定性の向上も示した。
【０００９】
一実施形態では、配列番号２を含む化合物が提供される。
【００１０】
別の実施形態では、それぞれが配列番号２を含む２つのモノマーを含むホモダイマーを含む化合物が提供され、これらの２つのモノマーは、第１のモノマーのＣｙｓ残基と第２のモノマーのＣｙｓ残基との間の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されている。
【００１１】
別の実施形態では、配列番号２を有する化合物または配列番号２の２つのモノマーのホモダイマー、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００１２】
別の実施形態では、個体において、体重減少を誘発するため、またはＴ２Ｄ、脂質異常症、ＮＡＳＨおよび／または肥満を治療するための方法が提供され、この方法は、配列番号２を有する化合物、配列番号２の２つのモノマーを含むホモダイマー、または配列番号２を有する化合物もしくは配列番号２の２つのモノマーを含むホモダイマーを含む薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む。
【００１３】
別の実施形態では、療法における使用のための、配列番号２または配列番号２の２つのモノマーを含むホモダイマーを含む化合物が提供される。あるいは、体重減少を誘発する際の使用のため、またはＴ２Ｄ、脂質異常症、ＮＡＳＨおよび／もしくは肥満を治療する際の使用するための、配列番号２または配列番号２の２つのモノマーを含むホモダイマーを含む化合物が提供される。
【００１４】
別の実施形態では、体重減少を誘発するための、またはＴ２Ｄ、脂質異常症、ＮＡＳＨおよび／もしくは肥満を治療するための医薬の製造における、配列番号２を含む化合物または配列番号２の２つのモノマーを含むホモダイマーの使用が提供される。
【００１５】
他の実施形態では、ポリペプチドが発現されるような条件下で、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を培養すること、および化合物を回収することにより産生される化合物が提供される。さらに、有効量の本発明の化合物または本発明の組成物を週１回個体に投与することを含む、個体において体重減少を誘発するため、またはＴ２Ｄ、脂質異常症、ＮＡＳＨおよび／もしくは肥満を治療するための方法が提供される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「約」は、例えば、明記された濃度、長さ、分子量、ｐＨ、配列同一性、時間枠、温度、体積などの値の統計的に意味のある範囲内を意味する。このような値または範囲は、所定の値または範囲の典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、さらにより典型的には５％以内の大きさの範囲内であり得る。「約」によって包含される許容される変動は、研究下の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「有効量」は、本発明の化合物または本発明の化合物を含む薬学的組成物の量または用量を意味し、患者または対象への単回または複数回用量の投与で、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求めている組織、システム、動物、哺乳動物またはヒトに対して、生物学的または医学的応答または所望の治療効果を誘発する。好ましくは、必要とする患者に対する、有効量の本発明の化合物または本発明の化合物を含有する組成物は、体重の正味の減少をもたらす。用量は、より高い初期負荷用量、その後でより少ない用量を含むことができる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「個体」、「患者」および「対象」は、互換的に使用され、動物、特にヒトを意味する。ヒトの場合、個体は、本発明の化合物または組成物の投与から利益を得る疾患、障害または状態を特徴とする。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、それらの状態の症状および合併症と闘うかまたは緩和する目的でＧＤＦ１５投与が示される状態を有する個体を管理およびケアすることを意味する。治療は、症状または合併症の発症を予防するため、症状もしくは合併症を軽減するため、または疾患、状態もしくは障害を排除するために、本発明の化合物または本発明の化合物を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。特に、治療することは、本発明の化合物または本発明の化合物を含む組成物を、それを必要とする個体に投与して、正味の体重減少をもたらすことを含む。治療される個体は、動物、特にヒトであり得る。
【００２０】
本発明の薬学的組成物は、このような治療を必要とする個体に非経口的に投与することができる。非経口投与は、シリンジ、任意でペン様シリンジ、または機械駆動式注射器を用いた皮下、筋肉内または静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて行うことができる。さらに、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。そのような薬学的組成物は、当該技術分野で周知である医薬品用の従来の賦形剤を使用する様々な技術のいずれかによって調製することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２００６）を参照）。
【００２１】
本発明の化合物および組成物は、体重減少を誘発するため、ならびに糖尿病、Ｔ２Ｄに関連する状態、脂質異常症、ＮＡＳＨおよび／または肥満を治療するために有用な１つ以上の追加の治療剤と同時に、個別に、または逐次的に組み合わせて使用できる。特許請求される化合物と組み合わせることができる追加の治療剤の非限定的な例には、インスリンまたはインスリン類似体、ビグアナイド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、ジペプチジルペプチダーゼ−４（「ＤＰＰ−４」）阻害剤、ナトリウム依存性グルコース輸送体（ＳＧＬＴ２）阻害剤、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはＧＬＰ−１アナログ、胃抑制性ポリペプチド（ＧＩＰ）またはＧＩＰアナログ、オキシントモジュリン（ＯＸＭ）またはＯＸＭアナログなどのインクレチン化合物、または前述の薬剤のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物および追加の治療剤（複数可）は、単一の丸剤、カプセル、錠剤、もしくは注射可能な製剤などの同じ送達経路および装置を介して一緒に投与するか、または別々の送達装置もしくは経路で同時に投与するか、または逐次的に投与するかのいずれかで投与することができる。
【００２２】
本発明の化合物は、当業者に公知である様々な技術によって調製することができる。例えば、これらの化合物は、組換えＤＮＡ技術を使用したタンパク質または前駆体タンパク質分子の産生を介して調製され得る。ｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含むＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。本発明のタンパク質をコードするコード配列は、遺伝子コードの重複または縮重の結果として変化し得る。ＤＮＡを宿主細胞に導入して、化合物またはその前駆体を生成することができる。宿主細胞は、大腸菌のＫ１２株またはＢ株などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
【００２３】
本発明の化合物またはその前駆体を産生するために、適切な宿主細胞を、発現ベクターなどの発現系で一過性または安定にトランスフェクトまたは形質転換する。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、グルタミンシンセターゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを含有する。
【００２４】
本発明の化合物は、当業者に公知である様々な技術、ならびに以下に記載されている方法によって調製することができる。本発明の化合物を調製するために、記載された各工程のための特定の生合成工程または合成工程を使用してもよいし、使用しなくてもよいし、または異なる方法で組み合わせてもよい。
【００２５】
本明細書のＧＤＦ１５アナログ化合物は、ＧＦＲＡＬ化合物として作用することができ、ＣＨＯＫ１細胞誘導体を使用して哺乳動物細胞発現系で生成される。ＧＤＦ１５タンパク質をコードする遺伝子は、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）を含む発現プラスミドバックボーン（ｐＥＥ１２．４ベースのプラスミド）にサブクローニングされる。例示的なＦｃ−ＧＤＦ１５タンパク質である化合物１（配列番号２）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１６）は、シグナルペプチド配列、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号３）のコード配列とインフレームで融合されて、組織培養培地への所望の産物の分泌を増強する。
【００２６】
発現はウイルス性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞は、エレクトロポレーションおよび適切な量の組換え発現プラスミドを使用して安定してトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は適切な細胞密度で浮遊培養において維持される。トランスフェクトされた細胞の選択は、２５μＭメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含む無血清培地での増殖によって達成され、約３５℃〜３７℃および約５〜７％ＣＯ２でインキュベートされる。ＧＤＦ１５タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞から培地に分泌される。タンパク質のＧＤＦ１５部分は互いに結合し、鎖間ジスルフィド結合を介して相互に接続された２つのＧＤＦ１５タンパク質を含むホモダイマーまたはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質ホモダイマーを作成する。ＧＤＦ１５またはＦｃ−ＧＤＦ１５ホモダイマーは、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、続いて陰イオン交換および疎水性クロマトグラフィーによって精製できる。
【００２７】
採取した培地からのＧＤＦ１５タンパク質ホモダイマーは、Ｃａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ樹脂（ＧＥ）に捕捉される。採取した培地からのＦｃ−ＧＤＦ１５タンパク質ホモダイマーは、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂（ＧＥ）に捕捉される。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）などのランニングバッファーまたはＴｒｉｓを含むランニングバッファーで樹脂を簡単に洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する。タンパク質は、１０ｍＭクエン酸ｐＨ３などの低ｐＨ溶液で樹脂から溶出される。ＧＤＦ１５タンパク質を含む画分はプールされ、潜在的なウイルスを不活化するために低ｐＨに保持することができる。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０などの塩基を加えることで、ｐＨを中性化できる。ＧＤＦ１５タンパク質は、Ｐｏｒｏｓ  ＸＱ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの樹脂を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製できる。ＧＤＦ１５タンパク質は、１５カラム体積にわたる５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中の０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌグラジエントを使用してＡＥＸカラムから溶出される。
【００２８】
Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質は、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＩｍｐＲｅｓ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することによって、疎水性相互作用クロマトグラフィーによってさらに精製できる。カラムは、チャージ溶液を約０．５Ｍ硫酸ナトリウムに調整することで実施され、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８溶液中の０．５Ｍから０Ｍ硫酸ナトリウムに移行する１０カラム容量（ＣＶ）勾配を使用して溶出される。ＨＩＣ後、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中でのアイソクラティック溶出を伴うＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、濃縮されたＣａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＩｍｐＲｅｓプールをローディングすることによって、タンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーにより、さらに精製できる。
【００２９】
精製されたＧＤＦ１５化合物は、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎ（旭化成メディカル）などのウイルス保持フィルターを通過し、その後、再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の接線流限外ろ過を使用して、１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７に濃縮／透析ろ過される。
【００３０】
可溶性ヒトＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、ＣＨＯＫ１細胞誘導体を使用して哺乳動物細胞発現システムにおいて産生される。採取した培地からのポリヒスチジンタグ付きＧＦＲＡＬ  ＥＣＤは、ニッケル固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に捕捉される。次に、樹脂をＰＢＳ  ｐＨ７．４などのランニングバッファー、またはＴｒｉｓ（ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）を含むランニングバッファーで簡単に洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する。結合したＨＩＳタグ付きＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ（配列番号４）は、ＰＢＳまたはＴＲＩＳ（ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中の０−２５０ｍＭイミダゾールを使用して、１０カラム容量にわたって溶出される。ＨＩＳタグ付きＧＦＲＡＬ  ＥＣＤは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのアイソクラティック溶出を伴うＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に濃縮ＩＭＡＣプールをローディングすることによって、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製できる。
【００３１】
哺乳動物の抗体発現はグリコシル化をもたらす。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位の抗体のＦｃ領域において生じる。Ｎ−グリカンは、典型的には、アスパラギンに結合する。ＩｇＧ免疫グロブリンの典型的な定常領域では、Ｎ結合型グリコシル化の部位は１つだけである。しかし、この部位は、グリコシル化を防ぐために改変され得るか、またはさらなるもしくは多様なグリコシル化構造のためにさらなる部位が加えられ得る。また、グリコシル化は、哺乳動物細胞において発現される分子の他の領域で時折発生する。
【００３２】
本発明の化合物は、この様式で、または当業者によって容易に決定される同様の方法で調製される。
【実施例】
【００３３】
以下の非限定的な実施例は、限定ではなく例示の目的で提供される。
【００３４】
実施例１：インビトロ受容体親和性
ヒトＧＦＲＡＬ受容体へのヒトＧＤＦ１５ホモダイマーおよび例示的な化合物２のインビトロ結合パラメータは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される。ＧＦＲＡＬのＥＣＤには、３つのＣｙｓリッチドメイン（Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３）が含まれている。ヒトＧＤＦ１５のホモダイマー（ｄｅｓ−ＡＲＮ配列番号１、つまり、Ｎ末端からＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐを欠くＧＤＦ１５）と、Ｆｃ−ＧＤＦ１５化合物１のホモダイマーである化合物２（配列番号２）の、ＨＩＳタグ付きヒトＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ（配列番号４）に対する親和性は、ＳＰＲによって測定できる。結合速度を表１にまとめる。
【００３５】
ヒトＧＦＲＡＬ  ＥＣＤに結合するヒトＧＤＦ１５（ｄｅｓ−ＡＲＮ配列番号１）または化合物２を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、ヒトＧＤＦ１５ホモダイマー（ｄｅｓ−ＡＲＮ配列番号１）と化合物２の、ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤへの結合速度を測定する。測定は２５℃で実施される。試料をＨＢＳ−ＥＰ＋、ｐＨ７．４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０５％界面活性剤Ｐ２０）に溶解する。ヤギ抗ウサギＧＤＦ１５抗体（Ｒ＆Ｄ）は、アミンカップリングケミストリーを使用して、ＣＭ５センサーチップのフローセルに固定化されている。ＧＤＦ１５試料は、ランニングバッファーへの希釈により２５μｇ／ｍｌに調製される。
【００３６】
ランニングバッファー中への希釈によって、１０００，５００，２５０，１２５，６２．５，３１．３，１５．６，７．８，３．９，２．０、および０（ブランク）ｎＭの最終濃度でヒトＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ試料を調製する。ＳＰＲ実験には、次の手順が含まれる：（１）個別のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３およびＦｃ４）上にＧＤＦ１５試料を捕捉すること、（２）すべてのフローセルにわたって２００μｌのヒトＧＦＲＡＬ  ＥＣＤを１００μｌ／分で注入すること、（３）６００秒間解離すること、（４）グリシン、ｐＨ１．５を２０μｌ／分で１０μｌ（３０秒）注入してチップ表面を再生すること、および（５）ＨＢＳ−ＥＰ＋の２０μｌ／分での１０μｌ（３０秒）の注入を用いてチップ表面を平衡化すること。各濃度のヒトＧＦＲＡＬ  ＥＣＤを２連で注入する。
【００３７】
データは、標準の二重参照を使用して処理され、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して１：１結合モデルに適合し、結合速度（ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１）、解離速度（ｋｏｆｆ、ｓ−１）および最大応答（Ｒｍａｘ；応答単位（ＲＵ））を決定した。ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ（Ｍ）の関係から平衡解離定数（ＫＤ）を計算する。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
結果は、ヒトＧＤＦ１５ホモダイマー（ｄｅｓ−ＡＲＮ配列番号１を含む２つの化合物）がヒトＧＦＲＡＬ  ＥＣＤに対して７．２ｎＭの親和性を有し、化合物２ホモダイマー（配列番号２を含む２つの化合物）がヒトＧＦＲＡＬ  ＥＣＤについて８．３ｎＭの親和性を持つことを示す。
【００４０】
実施例２：インビトロ機能活性
ＧＤＦ１５の受容体であるＧＦＲＡＬは、ＧＤＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、単一の膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ＧＦＲＡＬを含むＧＤＮＦ受容体ファミリーのメンバーは、共受容体ＲＥＴを利用して信号を変換する。ＧＤＮＦ受容体／ＲＥＴ複合体の刺激は、ＥＲＫ、ＡＫＴおよびＳＴＡＴリン酸化を含むシグナル伝達ネットワークを活性化することが知られている。
【００４１】
成熟ヒトＧＤＦ１５バリアントの活性と相対的な効力を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）に、ヒトＧＦＲＡＬ（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿９９７２９３．２）およびヒトＲＥＴ５１（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６６１２４．１）を含むＣＭＶ駆動の哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトし、ジェネティシンおよびピューロマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で３週間増殖させ、両方のタンパク質を安定して発現する細胞のプールを作製する。ＥＲＫ１／２リン酸化の測定がエンドポイントとして選択され、製造業者の指示に従って、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  Ｓｕｒｅｆｉｒｅ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２アッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）およびＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルマイクロプレートリーダーモデル２１０２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を利用してＲＥＴ活性化を評価する。
【００４２】
簡単に言えば、継代数１０〜２０の間であるＨＥＫ２９３−ｈＧＦＲＡＬ／ｈＲＥＴ細胞を、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６ウェルプレートにウェルあたり２０，０００細胞で播種し、５％ＣＯ２／９５％Ｏ２雰囲気下、３７℃で３日間増殖させる。細胞を無血清培地で４時間インキュベートした後、指示どおりに１０分間処理し、アッセイするまで溶解および凍結する。細胞溶解物を４℃で１時間インキュベートすることによって解凍し、オービタルプレートシェーカー上で混合して、白色の３８４ウェルプレートに移す。ＡｌｐｈａＬＩＳＡの「２プレート／１インキュベーション」メソッドは、アッセイキットに付属のアクセプターおよびドナーミックスをライセートに追加すること、およびＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー上でのＡｌｐｈａＬＩＳＡ信号の測定前に、暗所にて室温で８時間インキュベートすることにより利用される。
【００４３】
アッセイのために使用される細胞の各プレートには、アッセイ性能の参照標準としてネイティブのヒト成熟ＧＤＦ１５が含まれている。複数のプレートからのＥＲＫ１／２リン酸化（ｐＥＲＫ１／２）データは、Ｙ軸上の生のＡｌｐｈａＬＩＳＡ信号データを、次の式を使用して、ヒトＧＤＦ１５参照標準に対するＭａｘｉｍａ％に変換することにより、単一のグラフに収集される。
Ｍａｘｉｍａ％＝１００＊（ｘ−分）／（ｍａｘ−分）、
ここで、分＝０でありかつ刺激なしを表し、ｍａｘ＝１００でありかつ化合物の飽和用量で観察された刺激を表し、ｘ＝任意の所定の治療を表す。各化合物のＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．００の４つのパラメータのロジスティック回帰を伴う可変勾配シグモイド用量反応曲線を使用して決定される。表２の各化合物について列挙されているＥＣ５０は、以下の式を用いて各化合物の３つの独立したアッセイについてのＥＣ５０の幾何平均を生成することによって決定される。
【数１】
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【００４４】
ヒトＧＦＲＡＬとヒトＲＥＴ５１の両方を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、化合物２の効力を評価する。ホモダイマーとしてのネイティブのヒト成熟ＧＤＦ１５（配列番号１）は、細胞の各プレート上の参照標準として使用される。テスト項目は、３つの独立した実験で４連で実行される。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
実施例３：正常ラットモデルにおけるインビボ効能
肥満は、糖尿病およびインスリン抵抗性に関連する一般的な併存疾患である。ＧＤＦ１５は食物摂取を抑制し、体重減少を誘発し、グルコース恒常性を改善すると報告されている。したがって、ＧＤＦ１５化合物は、体重減少を誘発するための療法や、Ｔ２Ｄ、脂質異常症、ＮＡＳＨ、および／または肥満などの状態のための療法に有効である可能性がある。化合物２を１５日間の期間、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに投与し、毎日の体重および摂食量を測定する。
【００４７】
正常雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅｎｖｉｇｏ；１４週齢）は、施設到着時に通常の飼料で飼育され（ＴＤ２０１４；Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、以下の研究において使用される。１２時間の明／暗サイクル（０６００点灯）ならびに食餌（ＴＤ２０１４）および水の自由アクセスを有する温度制御した（２４℃）施設に、動物を個別に収容する。
【００４８】
施設に最低１週間順応後、動物の各実験群が同様の体重を有するように、ラットをそれらの体重に応じて無作為化する。体重は３３２〜３６９グラムの範囲であった。
【００４９】
すべての群には５匹のラットが含まれていた。ビヒクル（ＰＢＳ）またはビヒクルに溶解した化合物２（用量範囲０．０１〜０．３ｍｇ／ｋｇ）を、皮下（ＳＣ）注射（１ｍＬ／ｋｇ）により、１５日間、３日ごとに自由摂食した正常ラットに投与する。
【００５０】
１、４、７、１０、および１３日目に皮下注射を行う。毎日の体重および摂食量の測定が、研究期間を通して行われる。体重パーセントは、各動物の初期体重から毎日次のように計算される。
体重％＝（その日の体重／初期体重）Ｘ  １００
【００５１】
すべてのデータは、群あたり５匹の動物の平均±ＳＥＭとして提示される。体重減少パーセントおよび累積摂食量の有効用量濃度は、非線形フィットツールを使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで決定される。統計分析は、反復測定ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較のためのダネットの方法を使用して実施する。有意差は、＊−ｐ＜０．０５、＊＊−ｐ＜０．０１、＊＊＊−ｐ＜０．００１、＊＊＊＊−ｐ＜０．０００１で識別される。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
正常ＳＤ雄性ラットにおける化合物２を用いる長期治療により、用量依存的に、ビヒクルで治療した動物と比較して、食物摂取が統計的に有意に減少し、研究完了時に体重パーセントが統計的に有意に減少した。累積摂食量は、テストされた最高用量で２６４．４８から９１．２２に減少し、体重減少は７％から２６％の減少の範囲である。データは、化合物２が正常ＳＤラットの体重および摂食量を用量依存的な様式で減少させるのに統計的に有意な効果を有することを示しているようである。
【００５４】
実施例４：食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスのインビボ効能
体重減少、代謝、身体組成および肝脂肪変性に対する化合物２の効果を調べるために、化合物２をＣ５７／Ｂｌ６  ＤＩＯマウスに長期的に投与する。
【００５５】
２４〜２５週齢の雄性Ｃ５７／Ｂｌ６  ＤＩＯマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）は、施設到着時にカロリーを豊富に含む食餌で維持し（ＴＤ９５２１７；Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、以下の研究で使用される。１２時間の明／暗サイクル（２２００点灯）ならびに食餌（ＴＤ９５２１７）および水の自由アクセスを有する温度制御した（２４℃）施設に、マウスを個別に収容する。施設に最低２週間順応後、動物の各実験群が同様の体重を有するように、マウスをそれらの体重に応じて無作為化する。体重は、４０〜５０ｇの範囲である。
【００５６】
すべての群には５匹のマウスが含まれる。ビヒクルまたは化合物２（０．００２、０．００６、０．０２、０．０６、および０．２ｍｇ／ｋｇ）をビヒクル（ＰＢＳ）に溶解し、３日間ごとに２１日間、暗サイクルの開始の３０〜９０分前に、自由摂食ＤＩＯマウスに、皮下（ＳＣ）注射（１０ｍＬ／ｋｇ）によって投与する。１、４、７、１０、１３、１６、１９および２２日目にＳＣ注射を行う。研究を通して、体重および摂食量を毎日測定する。
【００５７】
体重の絶対変化は、分子の最初の注射の前の同じ動物の体重を差し引くことによって計算される。１７日目に、動物は０６００で絶食し、１３００で採血して空腹時血糖およびインスリンを測定する。血糖値はＡｃｃｕＣｈｅｋ（登録商標）血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，Ｉｎｃ．；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって測定される。インスリンはＥＬＩＳＡ（ＭＳＤ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって測定される。インスリン抵抗性指数は次の式で計算される。
ＨＯＭＡ  ＩＲ＝空腹時血漿インスリン（ｍＩＵｌ／Ｌ）＊（空腹時血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５。
【００５８】
２４日目に、暗周期の前に動物を屠殺し、肝臓を取り出して凍結する。屠殺時に収集される肝臓のホモジネートから決定される、肝臓トリグリセリド、および血漿分析物を、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐ臨床分析装置で測定する。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
【表５】
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【００６１】
【表６】
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【００６２】
化合物２は、用量依存的に雄性ＤＩＯマウスの体重および摂食量を減少させ、これは、体重減少の誘発および肥満の治療に使用できることを示す（表４）。化合物２は血清グルコースも低下させ、これは、糖尿病の治療に使用できることを示す（表５）。化合物２はさらにコレステロールを低下させ、これは、脂質異常症の治療に使用できることを示す（表５）。化合物２は肝臓の健康を改善し（血清ＡＬＴの低下により実証される）、肝臓のトリグリセリドを減少させ、これは、ＮＡＳＨの治療に使用できることを示す（表５）。１７日目に行われた空腹時血糖およびインスリン検査は、インスリン感受性の増加およびインスリン抵抗性指数の低下を示し、これは、糖尿病の治療において化合物２を使用することの可能性をさらに支持する（表６）。
【００６３】
実施例５：様々なＦｃ−ＧＤＦ１５構築物の安定性
医薬品におけるタンパク質凝集は、全体的な生産収量を低下させ、個人に投与した場合に免疫応答を引き起こす可能性があるため、望ましくない。したがって、化合物をモノマー状態、またはこの場合は共有結合したホモダイマーに維持することが好ましい。
【００６４】
様々なＧＤＦ１５融合タンパク質が凝集および／または分解する傾向をテストするために、様々なＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質を哺乳動物ＣＨＯ細胞で発現させることができる。Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）ランニングバッファーを用いて、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＧＥ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に捕捉でき、手短に述べると、非特異的に結合した物質を除去するために、ランニングバッファーを用いて簡単に洗浄でき、２０ｍＭ酢酸と５ｍＭクエン酸、ｐＨ３を用いて溶出できる。Ｆｃ−ＧＤＦ１５タンパク質を含む画分をプールし、１／１０量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を加えることによってｐＨを中性化する。
【００６５】
次に、プロテインＡ捕捉プールをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析して、高分子量凝集体（ＨＭＷ）％を決定し、これは、どの程度の凝集が発生したかを示す。ＳＥＣ分離法は、３０ｃｍ  ｘ  ０．７８ｃｍのサイズのＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３０００ＳＷＸＬ、５μｍカラムで実施される。移動相は流速０．５ｍＬ／分のＰＢＳｘ１、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）である。最初の低濃度試料は１０ｍｃＬの注入として適用され、２１４ｎｍの吸収波長でモニターされる。ＬＭＷ種％は、化学的安定性、または化合物の低分子量分解生成物を示す。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
タンデムＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質構築物（抗体の２つの類似したＦｃ部分は、エンドツーエンドで互いにつながっており、ヒンジ領域を含んでおり、そしてＧＤＦ１５分子につながっており、次いでＧＤＦ１５部分が自己会合して、ダイマーを作製する）、化合物３（２つの分子のホモダイマー、それぞれ配列番号５を含む）は、化合物２の４．１％ＨＭＷと比較して６０．８％ＨＭＷを有する。これは、タンデムＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質構築物よりも化合物２の方が物理的安定性が高く、凝集が少なく、免疫原性凝集のリスクが少ないことを示唆している。
【００６８】
ヘテロダイマーＦｃ−ＧＤＦ１５（互いに隣り合って結合され、１つのＦｃ部分（鎖Ｂ、配列番号１７）がＧＤＦ１５に接続されている別のＦｃ部分（鎖Ａ、配列番号６）に結合されており、ＧＤＦ１５部分が自己会合してホモダイマーを作製する、抗体の２つの異なるＦｃ部分）、化合物４（２分子のホモダイマー、各分子は配列番号６および配列番号１７のヘテロダイマーを含む）は、わずか２．３％のＬＭＷしか有しない化合物２と比較して、４９．１％の高いＬＭＷ種を有しており、これは、化合物２がより高い化学的安定性を有し、化学的またはタンパク質分解性開裂の傾向が減少することを示唆する。化学的安定性と分解の回避は、長期間にわたって化合物の効力を維持するのに役立つ。また、分解が少ないと、分解副産物が製剤中の有効成分を妨害することによりさらなる効力の問題を引き起こすリスク、または分解副産物が凝集して免疫原性の問題を引き起こすリスクが最小限に抑えられる。
【００６９】
実施例６：二重Ｆｃ変異対単一Ｆｃ変異の安定性
本発明の化合物のＦｃ部分の独特の構造は、２つの特定の変異を有し、いずれか一方の変異のみを有するＦｃ構築物よりも、高濃度で予想外に優れた安定性と高い溶解度を示す。単一の変異を有する２つのＦｃｓが生成され、ＩｇＧ４−ＦｃのＣＨ３／ＣＨ３結合が破壊され、モノマーＦｃ構築物が作成される。最初は化合物７であり、配列番号２の１７３位（配列番号９の１７５位）に対応する完全長ヒトＩｇＧ４重鎖の４０５位のフェニルアラニンがグルタミンに置換された。生成された第２の単一変異体は、化合物８であって、これは、完全長ヒトＩｇＧ４重鎖の４０７位のチロシンがグルタミン酸で置換されたＦｃであり、配列番号２の１７５位に対応する（配列番号１０の１７７位に対応）。デュアルＦｃ変異体である化合物５（配列番号７）もまた生成され、化合物７と８の両方のＦｃ変異を含む。化合物５は、追加の２つのアミノ酸ＡＰが化合物５のＦｃ領域のＮ末端に存在することを除いて、化合物２と同じ配列である。化合物２、５、７および８は、モノマーＩｇＧ４Ｆｃの形成を確実にするために、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号８）のヒンジ領域を欠いている。
【００７０】
本実施例の化合物は哺乳動物のＣＨＯ細胞で発現させ、回収した培地はＰＢＳ（ｐＨ７．４）ランニングバッファーを含むＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＧＥ）に捕捉される。非特異的に結合した物質を除去するためにランニングバッファーで簡単に洗浄し、そして２０ｍＭの酢酸および５ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０で溶出した。ＧＤＦ１５タンパク質を含む画分をプールし、１／１０量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を添加することによりｐＨを中性化する。
【００７１】
中性化されたプロテインＡ捕捉プールは、１０ＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍｌ遠心濃縮機でｐＨ５．０の１０ｍＭクエン酸中でバッファー交換される。次に、シングルおよびダブルＦｃ−ＧＤＦ１５変異体を、１０ＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍｌ遠心濃縮器を使用して、１０ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮することを試みる。
【００７２】
【表８】
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【００７３】
結果は、化合物７と化合物８のホモダイマーである単一のＦｃ変異体が、化合物５のホモダイマーである二重Ｆｃ変異体と比較して溶解度が低下したことを示す。化合物７のホモダイマーは、沈殿および材料損失のために１０ｍｇ／ｍｌを達成できなかった。化合物７のホモダイマーと比較すると、化合物８のホモダイマーは溶解性の改善を示したが、しかし、濃縮プロセス中に材料の喪失のため、１０ｍｇ／ｍｌを達成できなかった。化合物５のホモダイマーは、Ｆｃに新しい二重変異を伴い、９．８ｍｇ／ｍｌで溶解性を保持していた。モノマーＩｇＧ４  Ｆｃのみのコントロールは、１２ｍｇ／ｍｌまで溶解性であった。
【００７４】
実施例７：フレキシブルリンカーまたはリジッドリンカーの化学的安定性の比較
本発明のＧＤＦ１５化合物の化学的安定性をテストするために、そのような化合物を次のバッファーに４℃で一晩透析する：１０ｍＭクエン酸、ｐＨ６（Ｃ６）、１０ｍＭクエン酸、ｐＨ７（Ｃ７）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０（Ｔ７）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０（Ｔ８）または１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）。Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合物の長期安定性を評価するために、１．０ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液をそれぞれのバッファーに４℃、２５℃、４０℃で４週間保存し、ＬＭＷ％を分析ＳＥＣによって測定する。
【００７５】
ＳＥＣ分離法は、３０ｃｍ  ｘ  ０．７８ｃｍのサイズのＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３０００ＳＷＸＬ、５μｍカラムで実施できる。移動相は、ＰＢＳ、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、流速０．５ｍＬ／分である。最初の低濃度試料は１０ｍｃＬの注入として適用され、２１４ｎｍの吸収波長でモニターされる。
【００７６】
ＬＭＷ％で測定される化学的安定性の変化は、時間０の試料と比較して評価される。本質的に上記のように実施された研究により決定されたように、ＧＤＦ１５化合物のＬＭＷ成長％は表９に要約されている。
【００７７】
テストされた化合物は、リジッドＧ４−ＡＰ１０−Ｇ４リンカーを伴う、化合物１のホモダイマーである化合物２（配列番号２）、フレキシブルＬ５Ｑリンカー（ＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱ（配列番号１２））を伴う、化合物５のホモダイマー（配列番号７）、およびリジッドＧ４Ｓ−ＡＰ１０−Ｇ４Ｓリンカーを伴う、化合物６のホモダイマー（配列番号１１）である。
【００７８】
【表９】
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【００７９】
Ｌ５Ｑリンカーは、ＡＰ１０リンカーのいずれかよりも２５℃および４０℃で保存した後のＬＭＷ％が高く、ＡＰ１０（ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ；配列番号１３）リジッドリンカーを含むタンパク質よりも、Ｌ５Ｑフレキシブルリンカーを含むＧＤＦ１５融合タンパク質についての化学分解の傾向が高いことを示唆する。また、Ｇ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ；配列番号１４）を含むリンカーを伴う化合物６のホモダイマーは、ほとんどの条件でＧ４（ＧＧＧＧ；配列番号１５）を含むリンカーを伴う化合物２よりも高いＬＭＷ％を有しており、そのＧ４−ＡＰ１０−Ｇ４リンカーを伴う化合物２のより高い化学的安定性の向上を示唆している。
【００８０】
リジッド（化合物２および化合物６）およびフレキシブルリンカー（化合物５）を伴うＧＤＦ１５化合物の化学的および物理的安定性は、１０ｍｇ／ｍｌの高濃度で評価できる。化合物は最初に４℃で一晩以下のバッファーに透析する。（ａ）１０ｍＭクエン酸ｐＨ６．５、（ｂ）１０ｍＭクエン塩ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および（ｃ）１０ｍＭクエン塩ｐＨ６．５、０．０２％ポリソルベート８０。１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０２％ポリソルベートなどの賦形剤を製剤に添加して、ＧＤＦ１５融合の化学的および物理的安定性への影響をテストする。次に、１０，０００ＭＷＣＯ、１５ｍｌのミリポアスピンコンセントレータを使用して、化合物を１０ｍｇ／ｍｌに濃縮できる。濃縮後、ＨＭＷ％およびＬＭＷ％は、濃縮タンパク質を使用してＳＥＣによって決定できる（ｔ＝０）。
【００８１】
ＳＥＣ分離法は、３０ｃｍ  ｘ  ０．７８ｃｍのサイズのＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３０００ＳＷＸＬ、５μｍカラムで実施できる。移動相は、ＰＢＳ、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、流速０．５ｍＬ／分であった。１０ｍｇ／ｍｌの試料をそれぞれのバッファーで１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１０ｍｃＬの注入として適用し、２１４ｎｍの吸収波長でモニターする。
【００８２】
１０ｍｇ／ｍｌ製剤を４℃、２５℃、４０℃で４週間インキュベートして、ストレス条件下での長期安定性を評価することができる。ＬＭＷ％およびＨＭＷ％は、ＳＥＣによって４週間の時点（ｔ＝４ｗ）で再度決定できる。化学的安定性の変化（ＬＭＷ％）は、時間０の試料と比較して評価できる。
【００８３】
【表１０】
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【００８４】
【表１１】
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【００８５】
表１０に示すように、フレキシブルリンカーを含む１０ｍｇ／ｍｌの化合物５のホモダイマーは、２５℃と４０℃で、リジッドリンカーを伴う化合物６のホモダイマーよりも高いレベルのＬＭＷ％を示し、これはより低い化学的安定性を示す。
【００８６】
表１１に示すように、フレキシブルリンカーを含む１０ｍｇ／ｍｌの化合物５のホモダイマーは、リジッドリンカーを伴う化合物６のホモダイマーよりも高いレベルのＨＭＷ％を示した。化学的および／または物理的安定性が低いと、沈殿および免疫原性の問題が発生する可能性がある。
【００８７】
実施例８：ＧＤＦ１５化合物の薬物動態学的挙動
化合物２の薬物動態学的挙動はサルでテストされている。ＧＤＦ１５化合物の血漿中濃度は、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のＥＬＩＳＡ法によって決定される。サンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉試薬として１または３μｇ／ｍＬでコーティングされたポリクローナルヤギ抗ヒトＧＤＦ１５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ／ＡＦ９５７）またはモノクローナルマウス抗ヒト／霊長類ＧＤＦ１５抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＡＢ９５７）を使用する。次に、ＧＤＦ１５化合物を、マウス抗ヒトＩｇＧ４  ｐＦｃ−ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／９１９０−０５）またはマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／９２００−０５）のいずれかで検出する。プレートは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質システム（ＳｅｒａＣａｒｅ／５１２０）を使用して発色され、酵素反応はＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ／５０−８５−０４）でクエンチされる。
【００８８】
雄性カニクイザルに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の化合物２を０．５ｍＬ／ｋｇの単回皮下用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）で投与する。薬物動態学的特徴付けのために、投与前および投与後６、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０、３３６、４０８、および５０４時間で各動物から血液を採取する。
【００８９】
【表１２】
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【００９０】
表１２のデータは、サルのｔ１／２が１１７時間で測定されることを示している。これは、モノマーＦｃ分子の予想外に長いｔ１／２である。また、サルの薬物動態プロファイルは長期間にわたって安定しており、これは、ヒトの化合物２の薬物動態プロファイルも、治療範囲の長期間にわたって明らかに安定しており、週１回の投与を用いて血流中での定常レベルの薬物を可能にすることを示唆している。
【００９１】
配列
以下の核酸配列および／またはアミノ酸配列は、本開示において言及され、参照のために以下に提供される。
配列番号：１−成熟ヒトＧＤＦ１５
ＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ
配列番号２−融合タンパク質
ＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＧＧＧＧＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ
配列番号３−リーダー配列
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
配列番号４−人工配列
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配列番号５−人工配列
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配列番号６−人工配列
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配列番号７−人工配列
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配列番号８−Ｆｃフラグメント
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号９−人工配列
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ
配列番号：１０−人工配列
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ
配列番号：１１−人工配列
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＧＧＧＧＳＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ
配列番号１２−人工配列
ＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱ
配列番号１３−人工配列
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
配列番号１４−人工配列
ＧＧＧＧＳ
配列番号１５−人工配列
ＧＧＧＧ
配列番号１６−人工配列
ｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｃａｇｃｔｃｇａｇａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇａｇｃｔｃｃａｇｃｃｃｃａｇｃｔｃｃｔｇｃｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｃｃｃｃｃｇｃｔｃｃａｇｃａｃｃｃｇｃａｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇｇｇｇｃｇｇｔｇａｃｃａｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｇｇｔｇｔｔｇｃａｇａｃｔｇｃａｔａｃａｇｔｃｃｇｇｇｃｃｔｃｃｃｔｇｇａａｇａｃｃｔｇｇｇｔｔｇｇｇｃａｇａｔｔｇｇｇｔｇｃｔｃｔｃａｃｃｔｃｇｃｇａｇｇｔｔｃａｇｇｔｇａｃｃａｔｇｔｇｃａｔｔｇｇｇｇｃｔｔｇｔｃｃｃｔｃａｃａａｔｔｔｃｇｃｇｃａｇｃｔａａｃａｔｇｃａｃｇｃｃｃａａａｔｃａａａａｃｃｔｃｃｃｔｇｃａｃｃｇｇｃｔｔａａａｃｃｇｇａｔａｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｔｇｃｃａｇｃａｔｃｃｔａｃａａｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｃｔｇａｔｃｃａｇａａｇａｃｇｇａｔａｃａｇｇｇｇｔｇｔｃａｃｔｇｃａｇａｃｃｔａｔｇａｔｇａｃｃｔｃｃｔｇｇｃｃａａａｇａｔｔｇｃｃａｃｔｇｔａｔｃ
配列番号１７−人工配列
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＡＬＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【配列表】
2021517584000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月19日(2020.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含む化合物。
【請求項２】
配列番号２からなる化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の２つの化合物を含むホモダイマーであって、前記化合物が、第１の化合物のシステイン残基と第２の化合物のシステイン残基との間の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されている、ホモダイマー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を含む、患者の体重減少を誘発するための治療剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を含む、患者の２型糖尿病を治療するための治療剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を含む、患者の肥満を治療するための治療剤。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を含む、患者のＮＡＳＨを治療するための治療剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を含む、患者の脂質異常症を治療するための治療剤。
【請求項１０】
体重減少を誘発するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
２型糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
肥満の治療のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
脂質異常症の治療のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
ＮＡＳＨの治療のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、ポリペプチドが発現されるような条件下で培養し、化合物を回収することによって産生される化合物。
【請求項１６】
患者の体重減少を誘発し、２型糖尿病、肥満、ＮＡＳＨおよび／または脂質異常症を治療する治療剤であって、請求項１〜３の化合物または請求項４の組成物を患者に週１回投与することを特徴とする、治療剤。
【国際調査報告】
2021517584.tif 000015
2021517584.tif 000016
2021517584.tif 000017