(57)【要約】  本発明は、炎症を軽減するための組成物および方法を提供する。一つの態様では、本発明は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含むタンパク質阻害剤を提供する。本発明はまた、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質と、ネクロトーシス細胞から放出されたまたは得られたミトコンドリアとの間の；またはＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質と、カルジオリピンの間の相互作用を阻害することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄細胞で発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ）様４（ＴＲＥＭＬ４）の外部ドメインを含むタンパク質を含む、対象における炎症を軽減するための組成物。
【請求項２】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：１、配列番号：１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１４、および配列番号：１４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、ネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）への外部ドメインの結合を与える一つまたは複数の変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記一つまたは複数の変異は、全長ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｋ７８、Ｋ８６、Ｔ９５、Ｇ１５６、およびＨ１６０からなる群から選択される一つまたは複数の残基にある、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：２、配列番号：２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３、配列番号：３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：４、配列番号：４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：５、配列番号：５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：６、配列番号：６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：７、配列番号：７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：８、配列番号：８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：９、配列番号：９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１０、配列番号：１０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１１、配列番号：１１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１２、配列番号：１２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１３、および配列番号：１３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記タンパク質は、第一のドメインおよび第二のドメインを含み；
ここで第一のドメインはＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む；および
第二のドメインは免疫グロブリンの少なくとも一つの領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃドメインを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記タンパク質は、配列番号：２６、配列番号：２６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２７、配列番号：２７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２８、配列番号：２８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２９、配列番号：２９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３０、配列番号：３０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３１、配列番号：３１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３２、配列番号：３２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３３、配列番号：３３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３４、配列番号：３４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３５、配列番号：３５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３６、配列番号：３６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３７、配列番号：３７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３８、配列番号：３８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３９、および配列番号：３９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質を含む、対象における炎症を軽減するための組成物であって、
ここで第一のドメインは、骨髄細胞で発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）の外部ドメインを含む；および
ここで第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、組成物。
【請求項１４】
前記第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、配列番号：１５、および配列番号：１５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記タンパク質は、配列番号：４０、および配列番号：４０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１３に記載の組成物をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２０】
骨髄細胞で発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ）様４（ＴＲＥＭＬ４）の外部ドメインを含むタンパク質を対象に投与することを含む、対象における炎症を軽減するための方法。
【請求項２１】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：１、配列番号：１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１４、および配列番号：１４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質は、第一のドメインおよび第二のドメインを含み、
ここで第一のドメインはＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む；および
第二のドメインは免疫グロブリンの少なくとも一つの領域を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、ネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）への外部ドメインの結合を与える一つまたは複数の変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記一つまたは複数の変異は、全長ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｋ７８、Ｋ８６、Ｔ９５、Ｇ１５６、およびＨ１６０からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：２、配列番号：２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３、配列番号：３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：４、配列番号：４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：５、配列番号：５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：６、配列番号：６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：７、配列番号：７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：８、配列番号：８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：９、配列番号：９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１０、配列番号：１０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１１、配列番号：１１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１２、配列番号：１２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１３、および配列番号：１３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃドメインを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質は、配列番号：２６、配列番号：２６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２７、配列番号：２７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２８、配列番号：２８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２９、配列番号：２９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３０、配列番号：３０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３１、配列番号：３１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３２、配列番号：３２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３３、配列番号：３３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３４、配列番号：３４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３５、配列番号：３５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３６、配列番号：３６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３７、配列番号：３７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３８、配列番号：３８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３９、および配列番号：３９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を発症するリスクがある、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質を対象に投与することを含む、対象における炎症を軽減するための方法であって、
ここで第一のドメインは、骨髄細胞で発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）の外部ドメインを含む；および
ここで第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、方法。
【請求項３５】
前記第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、配列番号：１５、および配列番号：１５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記タンパク質は、配列番号：４０、および配列番号：４０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を発症するリスクがある、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質と（ｂ）ネクロトーシス細胞に由来または放出されたミトコンドリアおよびカルジオリピンからなる群から選択される一つとの間の相互作用の阻害剤を含む、炎症を軽減するための組成物。
【請求項４２】
前記阻害剤は、小分子、抗体、抗体断片、タンパク質、およびペプチド模倣薬からなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
（ａ）ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質と（ｂ）ネクロトーシス細胞に由来または放出されたミトコンドリアおよびカルジオリピンからなる群から選択される一つとの間の相互作用を含む組成物を対象に投与することを含む、対象における炎症を軽減するための方法。
【請求項４４】
上記阻害剤は、小分子、抗体、抗体断片、タンパク質、およびペプチド模倣薬からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を発症するリスクがある、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
以下の工程を含む方法：
ａ．  対象からサンプルを得る工程；
ｂ．  前記サンプルにおける、ネクロトーシス細胞に由来または放出されたミトコンドリアおよびカルジオリピンからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを検出する工程；および
ｃ．  前記少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、対照群または対照サンプルにおける前記少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増加していることを検出する工程。
【請求項４８】
炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の障害の治療を前記対象に施すことをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＴＲＥＭＬ４またはそのバリアントの外部ドメインを含むタンパク質を含む組成物を前記対象に投与することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質を含む組成物を前記対象に投与することを含む方法であって、
ここで第一のドメインは、ＴＲＥＭ２またはそのバリアントの外部ドメインを含む；および
ここで第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）ＴＲＥＭもしくはＴＲＥＭＬタンパク質とネクロトーシス細胞に由来もしくは放出されたミトコンドリアとの間の相互作用；または（ｂ）ＴＲＥＭもしくはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンとの間の相互作用の阻害剤を含む組成物を前記対象に投与することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
ＴＲＥＭＬ４またはそのバリアントの外部ドメインおよび検出可能な標識を含む組成物を前記対象に投与することを含む、ネクロトーシス細胞（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を検出するための組成物。
【請求項５４】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：１、配列番号：１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１４、および配列番号：１４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、ネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）への外部ドメインの結合を与える一つまたは複数の変異を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記一つまたは複数の変異は、全長ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｋ７８、Ｋ８６、Ｔ９５、Ｇ１５６、およびＨ１６０からなる群から選択される一つまたは複数の残基にある、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：２、配列番号：２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３、配列番号：３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：４、配列番号：４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：５、配列番号：５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：６、配列番号：６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：７、配列番号：７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：８、配列番号：８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：９、配列番号：９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１０、配列番号：１０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１１、配列番号：１１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１２、配列番号：１２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１３、および配列番号：１３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記タンパク質は、第一のドメインおよび第二のドメインを含み；
ここで第一のドメインはＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む；および
ここで第二のドメインは免疫グロブリンの少なくとも一つの領域を含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５９】
前記第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃドメインを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記タンパク質は、配列番号：２６、配列番号：２６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２７、配列番号：２７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２８、配列番号：２８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２９、配列番号：２９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３０、配列番号：３０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３１、配列番号：３１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３２、配列番号：３２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３３、配列番号：３３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３４、配列番号：３４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３５、配列番号：３５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３６、配列番号：３６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３７、配列番号：３７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３８、配列番号：３８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３９、および配列番号：３９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記検出可能な標識は、蛍光分子、金属安定同位体（ｓｔａｂｌｅ  ｍｅｔａｌ  ｉｓｏｔｏｐｅ）、またはオリゴヌクレオチドを含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６６】
前記組成物は、第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質を含み、ここで第一のドメインはＴＲＥＭ２の外部ドメインまたはそのバリアントを含む；ここで第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、ネクロトーシス細胞（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を検出するための組成物。
【請求項６７】
前記第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する、およびここで前記組成物は検出可能な標識をさらに含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、配列番号：１５、および配列番号：１５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
前記第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７０】
前記タンパク質は、配列番号：４０、および配列番号：４０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記検出可能な標識は、蛍光分子、金属安定同位体（ｓｔａｂｌｅ  ｍｅｔａｌ  ｉｓｏｔｏｐｅ）、またはオリゴヌクレオチドを含む、請求項６６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１８年２月１４日に出願された米国仮出願第６２／６３０，３３３号および２０１８年１１月２７日に出願された米国仮出願第６２／７７１，７３０号の優先権を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
炎症および炎症関連臓器障害は、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、冠動脈疾患および末梢血管疾患、ならびにメタボリックシンドロームの他の合併症、神経変性および精神神経症候群、ならびに敗血症、典型的な感染症関連炎症障害を含む、満たされていないニーズを伴う多くの一般的なヒト疾患における最終的な共通の最終経路（ｅｎｄ  ｐａｔｈｗａｙ）である。敗血症は、重篤な感染症に対する免疫応答が血行動態に壊滅的な変化を引き起こし、低血圧、低酸素血症、臓器不全、および死に至るときに発生する不適応疾患（ｍａｌａｄａｐｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）である。世界的に主要な死因であるにもかかわらず、抗生物質の早期投与および支持療法を超えた敗血症に対する効果的な治療介入はない。細菌産物を隔離する薬剤（例：抗ＬＰＳ抗体）から炎症性サイトカインの阻害剤（例：抗ＴＮＦ−α抗体およびインターロイキン１アンタゴニスト）まで、敗血症における数十の臨床薬が提案され、臨床的に評価されている。しかし、これらの薬剤はどれも患者に大きな利益をもたらすことはなかった。
【０００３】
したがって、当技術分野では、敗血症、および自己免疫疾患および障害を含む炎症の促進（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を特徴とする他の疾患のための、治療改善へのニーズが依然としてある。本発明は、この満たされていないニーズに取り組む。
【発明の概要】
【０００４】
一つの態様では、本発明は、骨髄細胞で発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ）様４（ＴＲＥＭＬ４）の外部ドメインを含むタンパク質を含む、対象における炎症を軽減するための組成物を提供する。
【０００５】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：１、配列番号：１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１４、および配列番号：１４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００６】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、ネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）への外部ドメインの結合を与える一つまたは複数の変異を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数の変異は、全長ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｋ７８、Ｋ８６、Ｔ９５、Ｇ１５６、およびＨ１６０からなる群から選択される一つまたは複数の残基にある。
【０００７】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：２、配列番号：２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３、配列番号：３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：４、配列番号：４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：５、配列番号：５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：６、配列番号：６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：７、配列番号：７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：８、配列番号：８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：９、配列番号：９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１０、配列番号：１０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１１、配列番号：１１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１２、配列番号：１２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１３、および配列番号：１３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
一つの実施形態では、タンパク質は、第一のドメインおよび第二のドメインを含み；ここで第一のドメインはＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む；およびここで第二のドメインは免疫グロブリンの少なくとも一つの領域を含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する。一つの実施形態では、第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
一つの実施形態では、タンパク質は、配列番号：２６、配列番号：２６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２７、配列番号：２７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２８、配列番号：２８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２９、配列番号：２９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３０、配列番号：３０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３１、配列番号：３１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３２、配列番号：３２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３３、配列番号：３３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３４、配列番号：３４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３５、配列番号：３５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３６、配列番号：３６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３７、配列番号：３７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３８、配列番号：３８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３９、および配列番号：３９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一つの態様では、本発明は、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００１１】
一つの態様では、本発明は、第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質を含む、対象における炎症を軽減するための組成物であって、ここで第一のドメインは、骨髄細胞で発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）の外部ドメインを含む；およびここで第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、組成物を提供する。
【００１２】
一つの実施形態では、第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する。
【００１３】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、配列番号：１５、および配列番号：１５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一つの実施形態では、タンパク質は、配列番号：４０、および配列番号：４０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
一つの態様では、本発明は、第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。ここで第一のドメインは、ＴＲＥＭ２を含む；およびここで第二のドメインは、Ｆｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。
【００１６】
一つの態様では、本発明は、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含むタンパク質を対象に投与することを含む、対象における炎症を軽減するための方法を提供する。一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：１、配列番号：１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１４、および配列番号：１４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、タンパク質は第一のドメインおよび第二のドメインを含み；ここで第一のドメインはＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む；およびここで第二のドメインは免疫グロブリンの少なくとも一つの領域を含む。
【００１７】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、ネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）への外部ドメインの結合を与える一つまたは複数の変異を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数の変異は、全長ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｋ７８、Ｋ８６、Ｔ９５、Ｇ１５６、およびＨ１６０からなる群から選択される。
【００１８】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：２、配列番号：２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３、配列番号：３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：４、配列番号：４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：５、配列番号：５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：６、配列番号：６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：７、配列番号：７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：８、配列番号：８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：９、配列番号：９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１０、配列番号：１０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１１、配列番号：１１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１２、配列番号：１２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１３、および配列番号：１３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一つの実施形態では、第二のドメイン、は免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する。一つの実施形態では、第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、タンパク質は、配列番号：２６、配列番号：２６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２７、配列番号：２７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２８、配列番号：２８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２９、配列番号：２９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３０、配列番号：３０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３１、配列番号：３１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３２、配列番号：３２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３３、配列番号：３３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３４、配列番号：３４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３５、配列番号：３５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３６、配列番号：３６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３７、配列番号：３７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３８、配列番号：３８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３９、および配列番号：３９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
一つの実施形態では、対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を有する。一つの実施形態では、対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を発症するリスクがある。
【００２１】
一つの実施形態では、本発明は、第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質を対象に投与することを含む、対象における炎症を軽減するための方法を提供し、ここで第一のドメインは、ＴＲＥＭ２の外部ドメインを含む；およびここで第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する。
【００２２】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、配列番号：１５、および配列番号：１５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、タンパク質は、配列番号：４０、および配列番号：４０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
一つの実施形態では、対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を有する。一つの実施形態では、対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を発症するリスクがある。
【００２４】
一つの態様では、本発明は、（ａ）ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質と（ｂ）ネクロトーシス細胞に由来または放出されたミトコンドリアおよびカルジオリピンからなる群から選択される一つとの間の相互作用の阻害剤を含む、炎症を軽減するための組成物を提供する。一つの実施形態では、阻害剤は、小分子、抗体、抗体断片、タンパク質、およびペプチド模倣薬からなる群から選択される。
【００２５】
一つの態様では、本発明は、（ａ）ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質と（ｂ）ネクロトーシス細胞に由来または放出されたミトコンドリアおよびカルジオリピンからなる群から選択される一つとの間の相互作用を含む組成物を対象に投与することを含む、対象における炎症を軽減するための方法を提供する。一つの実施形態では、阻害剤は、小分子、抗体、抗体断片、タンパク質、およびペプチド模倣薬からなる群から選択される。一つの実施形態では、対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を有する。一つの実施形態では、対象は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を発症するリスクがある。
【００２６】
一つの実施形態では、本発明は、対象からサンプルを得る工程；サンプルにおける、ネクロトーシス細胞に由来または放出されたミトコンドリアおよびカルジオリピンからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを検出する工程；および少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、対照群または対照サンプルにおける上記少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較して増加していることを検出する工程を含む方法を提供する。
【００２７】
一つの実施形態では、方法は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の障害の治療を対象に施すことをさらに含む。一つの実施形態では、方法は、ＴＲＥＭＬ４またはそのバリアントの外部ドメインを含むタンパク質を含む組成物を対象に投与することを含む。一つの実施形態では、方法は、第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで第一のドメインは、ＴＲＥＭ２またはそのバリアントの外部ドメインを含む；およびここで第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する。一つの実施形態では、方法は、（ａ）ＴＲＥＭもしくはＴＲＥＭＬタンパク質とネクロトーシス細胞に由来もしくは放出されたミトコンドリアおよびカルジオリピンとの間の相互作用；または（ｂ）ＴＲＥＭもしくはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンとの間の相互作用の阻害剤を含む組成物を対象に投与することを含む。
【００２８】
一つの態様では、本発明は、ネクロトーシス細胞を検出するための組成物を提供し、ここで組成物は、ＴＲＥＭＬ４またはそのバリアントの外部ドメインおよび検出可能な標識を含む。一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：１、配列番号：１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１４、および配列番号：１４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、ネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞への外部ドメインの結合を与える一つまたは複数の変異を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数の変異は、全長ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｋ７８、Ｋ８６、Ｔ９５、Ｇ１５６、およびＨ１６０からなる群から選択される。一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：２、配列番号：２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３、配列番号：３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：４、配列番号：４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：５、配列番号：５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：６、配列番号：６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：７、配列番号：７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：８、配列番号：８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：９、配列番号：９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１０、配列番号：１０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１１、配列番号：１１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１２、配列番号：１２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：１３、および配列番号：１３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
一つの実施形態では、タンパク質は、第一のドメインおよび第二のドメインを含み；ここで第一のドメインはＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む；およびここで第二のドメインは免疫グロブリンの少なくとも一つの領域を含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する。一つの実施形態では、第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３１】
一つの実施形態では、タンパク質は、配列番号：２６、配列番号：２６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２７、配列番号：２７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２８、配列番号：２８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２９、配列番号：２９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３０、配列番号：３０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３１、配列番号：３１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３２、配列番号：３２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３３、配列番号：３３と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３４、配列番号：３４と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３５、配列番号：３５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３６、配列番号：３６と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３７、配列番号：３７と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３８、配列番号：３８と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：３９、および配列番号：３９と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光分子、金属安定同位体（ｓｔａｂｌｅ  ｍｅｔａｌ  ｉｓｏｔｏｐｅ）、またはオリゴヌクレオチドを含む。
【００３２】
一つの態様では、本発明は、ネクロトーシス細胞を検出するための組成物を提供し、ここで組成物は第一のドメインおよび第二のドメインを含むタンパク質を含み、ここで第一のドメインはＴＲＥＭ２またはそのバリアントの外部ドメインを含む；およびここで第二のドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を除去するための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンのＦｃドメインを含み、およびここで組成物は検出可能な標識をさらに含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１に対して残基Ｎ２９７に変異を一つ含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインを脱グリコシル化する。
【００３３】
一つの実施形態では、ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、配列番号：１５、および配列番号：１５と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、配列番号：２０、配列番号：２０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２１、配列番号：２１と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、配列番号：２２、および配列番号：２２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、タンパク質は、配列番号：４０、および配列番号：４０と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＴＲＥＭ外部ドメインＦｃ融合タンパク質の発現および精製を示す、実験例の結果を示す。タンパク質は、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した（図１Ａ）。さらに、分析的サイズ排除クロマトグラフィーは、タンパク質の大部分が単分散であり、二量体Ｆｃ融合タンパク質の予想される分子量で溶出したことを示した（図１Ｂ）。
【図２】図２は、リポ多糖（ＬＰＳ）敗血症からの防御の媒介における、異なる用量のｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃタンパク質の治療活性の測定を示す、実験例の結果を示す。Ｆｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。データは、ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃタンパク質がＬＰＳ誘発性内毒血症（ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ）からマウスを保護することを示している。腹腔内ＬＰＳ注射の２時間後、マウスに実験１で１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃタンパク質を投与し、または実験２で眼窩静脈叢投与（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により５ｍｇ／ｋｇのｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃを投与した。血糖値および体温を測定して記録した。生存率を２４時間ごとに５日間モニタリングし、Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌログランク検定で分析した。
【図３】図３は、ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃの遅延投与がＬＤ１００用量のＬＰＳからマウスをレスキューするために十分であるかどうかを評価する実験例の結果を示す。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。データは、ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃタンパク質の遅延投与が致死性内毒血症のマウスをレスキューすることを示している。ＬＰＳのＬＤ１００の処理の６時間後、マウスに５  ｍｇ／ｋｇのｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃタンパク質またはヒトＩｇＧ１  ＦｃＮ２９７Ｑバリアントを眼窩静脈叢投与（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により注射した。血糖値および体温を測定して記録した。生存率を２４時間ごとに６日間モニタリングし、Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌログランク検定で分析した。
【図４】図４は、図４は、ｍＴＲＥＭＬ４の特異性、およびｈＴＲＥＭ１、ｈＴＲＥＭＬ１、ｈＴＲＥＭ２が内毒血症からマウスをレスキューする能力を評価する実験例の結果を示す。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。実験は、致死性内毒血症におけるＴＲＥＭ−Ｆｃタンパク質の治療活性を示している。マウスをランダムにグループ化し、ＬＰＳのＬＤ１００で処理した。ＬＰＳ処理の６時間後、マウスにＴＲＥＭ−Ｆｃタンパク質を１０  ｍｇ／ｋｇで眼窩静脈叢投与（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により注射した。体温は、直腸温検出器によって測定および記録した。生存率を５日間モニタリングし、Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌログランク検定で分析した。
【図５】図５は、ｈＴＲＥＭ１、ｈＴＲＥＭＬ１、ｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ２、ｍＴＲＥＭＬ４、およびｈＴＲＥＭＬ４のネクローシス細胞結合活性を示す実験例の結果を示す。ネクローシス細胞は、９５℃で１０分間、ｅｘｐｉ２９３細胞を熱処理することによって調製した。示されているＴＲＥＭ−Ｆｃタンパク質をネクローシス細胞に１０  μｇ／ｍｌで加え、氷上で３０分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ１−Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ６４７二次抗体の染色を行った。データを取得し、フローサイトメーターで分析した。ｈＴＲＥＭ２およびｍＴＲＥＭＬ４のみが、ネクローシス細胞に特異的に結合し、生存細胞には結合しなかった。
【図６】図６は、ｈＴＲＥＭＬ４とｍＴＲＥＭＬ４およびｈＴＲＥＭ２とのタンパク質配列アラインメントを示す。ｈＴＲＥＭ２のアルツハイマー病（ＡＤ）関連の位置を強調表示している。ｈＴＲＥＭＬ４は、ｍＴＲＥＭＬ４およびｈＴＲＥＭ２とは異なり、ＡＤのＴＲＥＭ２に見られるものと類似したこれらの重要な位置に変異を有する。
【図７】図７は、ｈＴＲＥＭＬ４およびその変異体Ｌ６５Ｒ、Ｋ７１Ｅ、Ｋ８６Ｄ、およびこれらの３つすべての位置での三重変異体（ＬＫＫ／ＲＥＤ）のネクローシス細胞結合を示す実験例の結果を示す。ネクローシス細胞は、９５℃で１０分間、ｅｘｐｉ２９３細胞を熱処理することによって調製した。ＴＲＥＭ−Ｆｃタンパク質をネクローシス細胞に１０  μｇ／ｍｌで加え、氷上で３０分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ１−Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ６４７二次抗体の染色を行った。データを取得し、フローサイトメーターで分析した。
【図８】図８は、ｈＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ、ｈＴＲＥＭ２、ｍＴＲＥＭＬ４、およびアイソタイプ・コントロール（Ｆｃ  Ｎ２９７Ｑ）の、ネクロトーシスＬ９２９線維芽細胞およびネクロトーシスマウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）への細胞結合を示す実験例の結果を示す。ネクロトーシスを、Ｌ９２９において５０  ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤで６時間、またはＢＭＤＭにおいて１  μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ＋２５  μＭ  ｚＶＡＤで１２時間誘導した。示されているＴＲＥＭタンパク質をネクロトーシス細胞に１０  μｇ／ｍｌで加え、氷上で３０分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ二次抗体染色をさらに１５分間行った。ＴＲＥＭタンパク質のネクロトーシス細胞への結合にアクセスし、フローサイトメーターで分析した。図５および図７に示した研究と一致して、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ、ｈＴＲＥＭ２、およびｍＴＲＥＭＬ４はネクローシス細胞に結合し、それらのネクローシス細胞結合活性の一般化可能性を証明する。
【図９】図９は、生細胞、アポトーシス細胞、ネクロトーシス細胞、ピロトーシス細胞、およびフェロトーシス細胞におけるマウスＴＲＥＭ−Ｆｃ融合タンパク質の死細胞結合の特異性を示す実験例の結果を示す。Ｌ９２９細胞は、５０  ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ９５でアポトーシスを１６時間誘導し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤでネクロトーシスを６時間誘導した。５００  ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで４時間、その後３  ｍＭ  ＡＴＰ処理で３０分間、マウスのＢＭＤＭ細胞においてピロトーシスを誘導した。フェロトーシスは、１０  μＭのエラスチンを含むＬ９２９細胞で８時間誘導した。すべての死細胞を収集し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、示されているｍｏｕｅ  ＴＲＥＭタンパク質とともに氷上で１０  μｇ／ｍｌで３０分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ二次抗体染色をさらに１５分間行った。ＴＲＥＭタンパク質のネクロトーシス細胞への結合にアクセスし、フローサイトメーターで分析した。ｍＴＲＥＭ２およびｍＴＲＥＭＬ４は、ネクロトーシス細胞に特異的に結合した。
【図１０】図１０は、生細胞、アポトーシス細胞、ネクロトーシス細胞、およびピロトーシス細胞におけるヒトＴＲＥＭ−Ｆｃ融合タンパク質の死細胞結合の特異性を示す実験例の結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、２．５  μＭ  スタウロスポリンでアポトーシスを１６時間、１０  μＭ  エラスチンでフェロトーシスを８時間、または１  μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ＋３  ｍＭ  ＡＴＰでピロトーシスを４時間誘導した。ＦＡＤＤ−／−Ｊｕｒｋａｔ細胞では、１６時間、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦによってネクロトーシスを誘導した。すべての死細胞を収集し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、示されたヒトＴＲＥＭタンパク質とともに氷上で１０  μｇ／ｍｌで３０分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ二次抗体染色をさらに１５分間行った。ＴＲＥＭタンパク質のネクロトーシス細胞への結合にアクセスし、フローサイトメトリーで分析した。ｈＴＲＥＭ２およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄは、ネクロトーシス細胞に特異的に結合した。
【図１１】図１１は、ネクロトーシスがＲＩＰＫ１阻害剤ネクロスタチン−１により阻害された場合の死細胞へのｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ、およびｍＴＲＥＭＬ４の結合の欠失を示す実験例の結果を表す。ＦＡＤＤ−／−Ｊｕｒｋａｔ細胞を、２０  ｎｇ／ｍｌヒト組換えＴＮＦで２４時間、または２０  ｎｇ／ｍｌ  ｈＴＮＦおよび１０  μＭネクロスタチン−１で２４時間処理した。細胞を回収し、ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、示されたＴＲＥＭ−Ｆｃタンパク質とともに氷上で１０  μｇ／ｍｌで３０分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ二次抗体染色をさらに１５分間行った。ＴＲＥＭタンパク質のネクロトーシス細胞への結合にアクセスし、フローサイトメトリーで分析した。
【図１２】図１２は、ｍＴＲＥＭ２、ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ４、およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６ＤとｍＴＲＥＭＬ４−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の競合結合研究を使用した実験例の結果を示す。ネクローシス細胞は、９５℃で１０分間、ｅｘｐｉ２９３細胞を熱処理することによって調製した。ネクローシスｅｘｐｉ２９３細胞を、容量設定された（ｔｉｔｒａｔｅｄ）濃度の非標識ｍＴＲＥＭ２、ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ４、またはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄとともに０．２  μＭのＡｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃタンパク質で染色した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。ｍＴＲＥＭＬ４−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７のＭＦＩの結合活性をフローサイトメーターによって取得し、各タンパク質の％ｍａｘ結合に対して正規化した。ｍＴＲＥＭ２、ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭ２、およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄは、共有結合エピトープ（ｓｈａｒｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を示すｍＴＲＥＭＬ４−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の結合を強力に阻害する。
【図１３】図１３は、図１３Ａおよび図１３Ｂを含み、ＬＰＳ投与および腸管穿孔モデル（ＣＬＰ）による実験的敗血症からマウスをレスキューするためのｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃの能力を評価する実験例の結果を示す。マウスをランダムにグループ化し、ＬＰＳのＬＤ１００用量（図１３Ａ）を注射するか、または（図１３Ｂ）１ｃｍ盲腸結紮および２５Ｇ針穿刺によるＣＬＰを行った。マウスに、ＬＰＳまたはＣＬＰの８時間後に、１０  ｍｇ／ｋｇのＴＲＥＭタンパク質またはアイソタイプ・コントロールＦｃタンパク質（ｈＩｇＧ１  Ｆｃ  Ｎ297Ｑ）を静脈内投与した。生存率をモニタリングし、７日間記録した。生存比較はＭａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌログランク検定で分析した。Ｋ８６Ｄ変異は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃの有効性を大幅に増大させた。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図１４】図１４は、腸管穿孔モデル（ＣＬＰ）による実験的敗血症からマウスをレスキューするために、異なるＦｃバリアントを有するｍＴＲＥＭＬ４−ＦｃおよびｈＴＲＥＭ２−Ｆｃの能力を評価する実験例の結果を示す。データは、Ｆｃ−エフェクター機能がＴＲＥＭ−Ｆｃの有効性を無効にすることを示している。マウスをランダムにグループ化し、１ｃｍ盲腸結紮および２５Ｇ針穿刺によるＣＬＰを行った。マウスに、ＣＬＰの８時間後に、１０  ｍｇ／ｋｇの示されたＴＲＥＭ−Ｆｃ融合タンパク質を静脈内注射で投与した。生存率を７日間モニタリングした。生存比較はＭａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌログランク検定で分析した。インタクトなエフェクター機能を備えたＦｃバリアント（ヒトＩｇＧ１）とは対照的に、ＦｃＲを介したエフェクター機能を欠失したＦｃバリアント（ヒトＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ）および補体のみがマウスを保護した。
【図１５】図１５は、アポトーシス細胞死体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｏｒｐｓｅ）ではなくネクロトーシスが、ｈＴＲＥＭ２−ＦｃおよびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃによって遮断されうる炎症性サイトカイン産生を活性化できることを示す実験例の結果を表す。（上の行）１００  ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳまたは１００万個の示されたＴＲＥＭ−Ｆｃ被覆生Ｊｕｒｋａｔ細胞、アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞（スタウロスポリン）、またはネクロトーシスＦＡＤＤ−／−Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＴＮＦａ）によって刺激されたＷＴおよびＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭ（１×１０6細胞／ウェル）におけるＩＬ−６およびＴＮＦａのｑＰＣＲ分析。（下の行）１００  ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳまたは１００万個の示されたＴＲＥＭ−Ｆｃ被覆生存Ｌ９２９細胞、アポトーシスＬ９２９細胞（抗ＣＤ９５）、またはネクロトーシスＬ９２９細胞（ＴＮＦａ＋ｚＶＡＤ）によって刺激されたＷＴおよびＴＲＥＭ２−／−ＴＨＰ−１（１×１０6細胞／ウェル）におけるＩＬ−６およびＴＮＦａのｑＰＣＲ分析。データは、３つの独立した実験から組み合わせられた平均ＳＥＭを示し、多重比較を伴う二元配置分散分析によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。各細胞型のバーは、左から順に、Ｆｃ、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃ、およびｈＴＲＥＭ２−Ｆｃである。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図１６】図１６は、ＴＲＥＭ２、ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄがネクロトーシス細胞から単離されたミトコンドリアに結合するが、ｈＴＲＥＭＬ４  ＷＴは結合しないことを示す実験例の結果を示す。Ｌ９２９細胞は、５０  ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ９５でアポトーシスを１６時間誘導し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤでネクロトーシスを６時間誘導した。ミトコンドリアを生Ｌ９２９細胞、アポトーシスＬ９２９細胞、およびネクロトーシスＬ９２９細胞から単離し、１０  μｇ／ｍｌの示されたＴＲＥＭ−Ｆｃ融合タンパク質とともに氷上で３０分間インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ１二次およびＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎで染色した。染色を取得し、フローサイトメーターで分析した。
【図１７】図１７は、アポトーシス細胞または生細胞ではなくネクロトーシス細胞から単離されたミトコンドリアが、ＬＰＳ刺激と同程度にマウスＢＭＤＭの炎症性サイトカイン産生（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＬ１−β）を刺激したことを示す実験例の結果を示す。さらに、ＢＭＤＭに対するネクロトーシスミトコンドリアの炎症効果は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃの投与によって大幅に減衰したが、ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃの投与による大幅な減衰はなかった。Ｌ９２９細胞を５０  ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ９５と１６時間インキュベートしてアポトーシスを誘導し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤと６時間インキュベートしてネクロトーシスを誘導した。ミトコンドリアを生Ｌ９２９細胞、アポトーシスＬ９２９細胞、およびネクロトーシスＬ９２９細胞から単離し、生理食塩水、１０  μｇ／ｍｌのｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、または１０  μｇ／ｍｌのｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃとともに氷上で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。１００万個のＢＭＤＭを２４ウェルプレートのウェルごとに播種し、１００万個のＬ９２９細胞から単離した１００  ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳまたはアポトーシス／ネクロトーシスミトコンドリアで刺激した。刺激から６時間後、ＩＬ−６およびＴＮＦａの発現をｑＰＣＲによって測定した。データは、３つの独立した実験から組み合わせられた平均ＳＥＭを示し、多重比較を伴う二元配置分散分析によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。各細胞型のバーは、左から順に、生理食塩水、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃである。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図１８】図１８は、マクロファージがネクロトーシス死体（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｏｒｐｓｅ）に応答するためにＴＲＥＭ２が必要であることを示す実験例の結果を示す。ＷＴまたはＴＲＥＭ２欠損マウスからＢＭＤＭを調製し、生Ｊｕｒｋａｔ細胞、アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞、またはネクローシスＪｕｒｋａｔ細胞とインキュベートした。ＷＴ  ＢＭＤＭのみが、ネクロトーシス死体の投与に応答して炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、およびＴＮＦ−α）を産生した；この効果はＴＲＥＭ２のノックアウト、またはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃの投与により失われた。ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃは無効であった。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、２．５  μＭ  スタウロスポリンでアポトーシスのために１６時間誘導した。ＦＡＤＤ−／−Ｊｕｒｋａｔ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦでネクロトーシスのために１６時間誘導した。細胞を洗浄し、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、またはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃタンパク質で１０  μｇ／ｍｌで、氷上で３０分間コーティングした後、ＰＢＳで３回洗浄した。２４ウェルプレートの各ウェルの１００万個のＷＴ、またはＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭを１００  ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ、または１００万個のアポトーシス細胞／１００万個のネクロトーシス細胞で刺激した。刺激から６時間後、マウスＩＬ−６およびＴＮＦａの発現をｑＰＣＲによって測定した。データは、３つの独立した実験から組み合わせられた平均ＳＥＭを示し、多重比較を伴う二元配置分散分析によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。ＷＴ  ＢＭＤＭは各群の左側のバーであり、Ｔｒｅｍ２−／−ＢＭＤＭは各群の右側のバーである。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図１９】図１９は、図１９Ａ〜図１９Ｃを含み、ＴＲＥＭ２がマクロファージがネクロトーシスミトコンドリアに応答するために必要であることを示す実験例の結果を示す。ＷＴまたはＴＲＥＭ２欠損マウスからＢＭＤＭを調製し、生Ｌ９２９細胞、アポトーシスＬ９２９細胞、またはネクロトーシスＬ９２９細胞とインキュベートした。ＷＴ  ＢＭＤＭのみが、ネクロトーシスミトコンドリアの投与に応答して炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ１−βおよびＴＮＦ−α）を産生した；この効果はＴＲＥＭ２のノックアウト、またはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃの投与により失われた。ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃは無効であった。Ｌ９２９細胞を、５０  ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ９５でアポトーシスを１６時間誘導し、５０ｎｇ／ｎｌ  ＴＮＦ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤでネクロトーシスを６時間誘導した。ミトコンドリアを生Ｌ９２９細胞、アポトーシスＬ９２９細胞、およびネクロトーシスＬ９２９細胞から単離し、１０  μｇ／ｍｌでｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、またはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃタンパク質とともに氷上で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。２４ウェルプレートの各ウェルの１００万個のＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭまたはＷＴ  ＢＭＤＭを１００万個の細胞由来の１００  ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳまたはアポトーシス／ネクロトーシスミトコンドリアで刺激した。刺激から６時間後、ＩＬ−６（図１９Ａ）、ＩＬ−１β（図１９Ｂ）、およびＩＬ−１βの発現をｑＰＣＲによって測定した。データは、３つの独立した実験から組み合わせられた平均ＳＥＭを示し、多重比較を伴う二元配置分散分析によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。ＷＴ  ＢＭＤＭは各群の左側のバーであり、Ｔｒｅｍ２−／−ＢＭＤＭは各群の右側のバーである。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図２０】図２０は、図２０Ａ〜図２０Ｃを含み、ＴＲＥＭ２はヒト単球がネクロトーシスミトコンドリアに応答するために必要であることを示す実験例の結果を示す。ＴＲＥＭ２欠損ＴＨＰ１細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子欠失によって作製し、生Ｌ９２９細胞、アポトーシスＬ９２９細胞、またはネクロトーシスＬ９２９細胞由来のミトコンドリアとインキュベートした。ＷＴ  ＴＨＰ−１細胞のみが、ネクロトーシスミトコンドリアの投与に応答して炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ１−β、およびＴＮＦ−α）を産生した；この効果はＴＲＥＭ２のノックアウト、またはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃの投与により失われた。ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃは無効であった。Ｌ９２９細胞を、５０  ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ９５でアポトーシスを１６時間誘導し、５０ｎｇ／ｎｌ  ＴＮＦ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤでネクロトーシスを６時間誘導した。ミトコンドリアを生Ｌ９２９細胞、アポトーシスＬ９２９細胞、およびネクロトーシスＬ９２９細胞から単離し、１０  μｇ／ｍｌでｈＴＲＥＭＬ４、またはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄタンパク質とともに氷上で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。２４ウェルプレートの各ウェルの１００万個のＷＴ  Ｔｈｐ１またはＴＲＥＭ２−／−Ｔｈｐ１細胞を１００万個の細胞由来の１００  ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳまたはアポトーシス／ネクロトーシスミトコンドリアで刺激した。刺激から６時間後、ＩＬ−６（図２０Ａ）、ＴＮＦα（図２０Ｂ）、およびＩＬ−１β（図２０Ｃ）の発現をｑＰＣＲによって測定した。ＷＴ  Ｔｈｐ−１は各群の左側のバーであり、Ｔｒｅｍ２−／−  Ｔｈｐ１は各群の右側のバーである。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図２１】図２１は、ネクロトーシス死体（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｏｒｐｓｅ）内のミトコンドリアがヒト単球の活性化に必要であることを示す実験例の結果を示す。パーキンを安定的に過剰発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を１２．５  μＭ  ＣＣＣＰで処理し、マイトファジーを誘導した。ＣＣＣＰ処理の４８時間後、細胞を回収し、ミトコンドリアがないことを確認するためにｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで染色した。未処理およびミトコンドリア枯渇３Ｔ３細胞を５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤに６時間曝してネクロトーシスを誘導した。２４ウェルプレートの各ウェルの１００万個のＴｈｐ−１細胞を１００万個のネクロトーシス３Ｔ３細胞またはミトコンドリア欠損３Ｔ３細胞で刺激した。刺激から６時間後、ＩＬ−６、ＴＮＦα、およびＩＬ−１βの発現をｑＰＣＲによって測定した。ミトコンドリアを欠くネクロトーシスＮＩＨ−３Ｔ３細胞（＋ＴＮＦα＋ｚＶＡＤ＋ＣＣＣＰ）は、ミトコンドリアを含むネクロトーシスＮＩＨ−３Ｔ３細胞（＋ＴＮＦα＋ｚＶＡＤ−ＣＣＣＰ）と比較して、ＴＨＰ−１細胞における炎症性サイトカイン産生を刺激しなかった。データは、３つの独立した実験から組み合わせられた平均ＳＥＭを示し、対応のあるｔ−検定によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図２２】図２２は、マクロファージがネクロトーシスミトコンドリアを感知するために、ＴＬＲ２／４ではなく、他の病原体を感知するシグナル伝達が必要であることを示す実験例の結果を示す。ＢＭＤＭは、ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８，ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、Ｓｔｉｎｇ、ｃＧａｓ、ＩＲＦ３／７、Ｃａｓｐａｓｅ  １／１１、またはＩＦＮＡＲが不足しているマウス、ならびにＮＦｋＢシグナル伝達が骨髄細胞（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ／Ｉｋｋｂ）で特異的に除去されたマウスから作製された。すべてのマウスのＢＭＤＭを、２４ウェルプレートに１００万細胞／ウェルで播種した。Ｌ９２９細胞を５０  ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ９５で１６時間、アポトーシスを誘導し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤで６時間、ネクロトーシスを誘導した。ミトコンドリアを生Ｌ９２９細胞、アポトーシスＬ９２９細胞、またはネクロトーシスＬ９２９細胞から単離し、示された遺伝子型のＢＭＤＭを刺激するために使用した。刺激から６時間後、ＴＮＦαの発現をｑＰＣＲによって測定した。ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、またはＮＦｋＢを欠くＢＭＤＭは、ネクロトーシスミトコンドリアの投与に応答して炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）を産生しなかった。
【図２３】図２３は、ネクロトーシスミトコンドリアセンシングの再構成にはＴＲＥＭ２およびＴＬＲ４シグナル伝達が必要であることを示す実験例の結果を示す。６ウェルディッシュのＨｅｋ  ｂｌｕｅ−ＴＬＲ４およびＨｅｋ  ｂｌｕｅ−ＩＬ−１８ ２９３細胞に、製造元の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を使用して、示された全長ＴＲＥＭタンパク質をコードする２  μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後３６時間で細胞を回収し、９６ウェルプレートに、各ウェルに５×１０4細胞を播種した。細胞を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）または１００万個のＬ９２９細胞由来の生／アポトーシス／ネクロトーシスミトコンドリアで刺激した。刺激から６時間後、細胞上清をＱＵＡＮＴＩ  ｂｌｕｅ培地で１／５０に希釈し、３７℃のインキュベーターで１時間インキュベートした。ＳＥＡＰ活性を、６５５  ｎｍでの吸光度を読み取ることで検出し、未処理群に対して正規化した。ＴＬＲ４コンポーネントおよびＴＲＥＭ２を含むＨＥＫ細胞のみが、ネクロトーシスミトコンドリアに応答してシグナル伝達（発現されたＳＥＡＰレポーターの比色分析で測定）を生成した。データは、３つの独立した実験から組み合わせられた平均ＳＥＭを示し、多重比較を伴う二元配置分散分析によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。各細胞型に対するバーは、左から順に：未トランスフェクト、ＴＲＥＭ１−ＦＬ、ＴＲＥＭＬ１−ＦＬ、ＴＲＥＭ２−ＦＬ、ＴＲＥＭＬ２−ＦＬ、ＴＲＥＭＬ４−ＦＬ、ＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−ＦＬである。
【図２４】図２４は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−ＦｃがＴＲＥＭ２／ＴＬＲ４を介したネクロトーシスミトコンドリアの感覚（ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）を阻害することを示す実験例の結果を示す。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＴＬＲ４  ２９３細胞に完全長ＴＲＥＭ２プラスミドをトランスフェクトした後、１０  μｇ／ｍｌのヒトＴＲＥＭＬ４−ＦｃまたはＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃの存在下または非存在下で、１００万個の生、アポトーシス、およびネクロトーシスミトコンドリアで刺激した。刺激から６時間後、細胞上清をＱＵＡＮＴＩ  ｂｌｕｅ培地で１／５０に希釈し、３７℃のインキュベーターで１時間インキュベートした。ＳＥＡＰ活性を、６５５  ｎｍでの吸光度を読み取ることで検出し、未処理群に対して正規化した。ＷＴ  ｋＴＲＥＭＬ４−ＦｃではなくｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃのみが、ネクロトーシスミトコンドリアの効果を阻害してＮＦｋＢシグナル伝達を促進することができた。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。データは、３つの独立した実験から組み合わせられた平均ＳＥＭを示し、多重比較を伴う二元配置分散分析によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。Ｈｅｋ  ｂｌｕｅ−ＴＬＲ４は各群の左側のバーであり、Ｈｅｋ  ｂｌｕｅ−ＴＬＲ４−ＴＲＥＭ２は各群の右側のバーである。
【図２５】図２５は、アポトーシス細胞ではなくネクロトーシス細胞由来のミトコンドリアの投与がマウスにおいて急速で致死的な敗血症様の表現型を生じることを示す実験例の結果を示す。ミトコンドリアをその後、ネクロトーシスまたはアポトーシス後にＬ９２９細胞から単離した。ミトコンドリアをＰＢＳで３回洗浄し、最後に１００  μｌのＰＢＳに再懸濁した。ミトコンドリアのエンドトキシンレベルを、ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｓｔｒｉｐによって検出した。各マウスには、１００  μｌ  ＰＢＳ中の１，０００万または１億個のミトコンドリアを、眼窩静脈叢投与（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により注入した（ｎ＝５）。体温を測定して記録した。生存率を３日間モニタリングし、Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌログランク検定で分析した。１，０００万または１億個のアポトーシスミトコンドリアの投与は、マウスの生存または体温に影響を与えなかった。しかし、ネクロトーシスミトコンドリアの注入は、体温の低下を伴う用量依存的な方法で死亡数を引き起こした（produced mortality）。
【図２６】図２６は、ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃではなく組換えｈＴＲＥＭ２−ＦｃおよびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃが、ネクロトーシスミトコンドリアの注入によって生じる敗血症様症候群を予防することを示す実験例の結果を示す。Ｌ９２９細胞を５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦａ＋１０  μＭ  ｚＶＡＤで１６時間、ネクロトーシスを誘導した。ミトコンドリアをネクロトーシス細胞から単離し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６で計数し、最終的にＰＢＳ  １００  μｌあたり１億個に再懸濁した。次に、ミトコンドリアを、示されたＴＲＥＭタンパク質またはＦｃで１  μｇ／１  μｌで氷上で３０分間コーティングした。各マウスには、１００  μｌ  ＰＢＳ中の１億個のミトコンドリアを、眼窩静脈叢投与（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により注入した（ｎ＝５）。体温を測定して記録した。生存率を４日間モニタリングし、Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌログランク検定で分析した。ｈＴＲＥＭ２−ＦｃおよびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃによるコーティングのみが死亡率を低下させ、体温の低下を抑制した。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図２７】図２７は、ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−ＦｃではなくｈＴＲＥＭ２−ＦｃおよびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃが、ネクロトーシス細胞由来のミトコンドリアの投与に応答して、全身性炎症性サイトカインの蓄積を阻害することを示す実験例の結果を示す。ネクロトーシスミトコンドリアを、ＴＮＦ＋ｚＶＡＤで１６時間処理したＬ９２９細胞から単離し、次に、示されたＴＲＥＭ−Ｆｃタンパク質で１  μｇ／１  μｌで氷上で３０分間コーティングした。各マウスには、１００  μｌ  ＰＢＳ中の１億個の示されたミトコンドリアを、眼窩静脈叢投与（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により注入した（ｎ＝５）。注入前、および注射後１時間、３時間、および６時間に採血した。血漿ＩＬ−６およびＴＮＦａの発現はＥＬＩＳＡで測定した。ｈＴＲＥＭ２−ＦｃおよびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃによるコーティングのみが、ＩＬ−６およびＴＮＦα濃度の増加を阻止した。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図２８】図２８は、図２８Ａおよび図２８Ｂを含み、ミトコンドリアがマウスおよび患者の敗血症の間に血漿中に全身的に蓄積することを示す実験例の結果を示す（図２８Ａ）。ＬＰＳ注入またはＣＬＰの２４時間後にマウスから血漿を収集し、１２，０００ｇで１５分間遠心してミトコンドリアをペレット化した。ミトコンドリアをＴｏｍｍ２２  Ａｂで染色した後、ＡｃｃｕｒｉＣ６でカウントした（図２８Ｂ）。健康なドナーおよび敗血症患者から血漿を採取し、１２，０００ｇで１５分間遠心してミトコンドリアをペレット化した。ミトコンドリアをＴｏｍｍ２２  Ａｂで染色した後、ＡｃｃｕｒｉＣ６でカウントした。これらの結果は、血中循環ミトコンドリアレベルの測定が、ｈＴＲＥＭ２−ＦｃまたはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−ＦｃのようなＴＲＥＭターゲッティング療法の使用を導くための有望なバイオマーカーとして役立つ可能性があることを示す。
【図２９】図２９は、図２９Ａ、図２９Ｂ、および図２９Ｃを含み、ＴＲＥＭ２がミトコンドリア特異的な脂質カルジオリピンに直接結合することを示す実験例の結果を示す。図２９Ａは、ｈＴＲＥＭ２−ＦｃはＥＬＩＳＡプレートウェルに吸着されたカルジオリピンに結合するが、対照Ｆｃタンパク質は結合しないことを示すＥＬＩＳＡ結合試験の概要を述べる。図２９Ｂは、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６ＤはＥＬＩＳＡプレートウェルに吸着されたカルジオリピンに結合するが、野生型ｈＴＲＥＭＬ４は結合しないことを示すＥＬＩＳＡ結合試験を示す。図２９Ｃは、カルジオリピン吸着ＥＬＩＳＡプレートウェルへのｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ４およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄの結合の濃度作用相関を示す。
【図３０】図３０は、カルジオリピンはヒトＴｈｐ−１細胞の活性化に対するネクロトーシスミトコンドリアの効果を表現型模写するが、他のリン脂質は表現型模写しないことを示す実験例の結果を示す。１００  μＭのホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびネクロトーシスミトコンドリアを使用して、５０万個のＴｈｐ−１を刺激した。刺激から６時間後、ＩＬ−６およびＴＮＦαをｑＰＣＲによって測定した。
【図３１】図３１は、ＣＬがＴＲＥＭ２に依存する形でマクロファージにおける炎症性サイトカイン産生を直接刺激することを示す実験例の結果を示す。マウスＢＭＤＭを、ＬＰＳ、ネクロトーシスミトコンドリア、またはカルジオリピンリポソームで刺激した。カルジオリピンは、ＢＭＤＭに、ＬＰＳまたはネクロトーシスミトコンドリアに見合う程度の炎症性サイトカインＩＬ−６およびＴＮＦαを生成させた。この効果は、ＴＲＥＭ２欠損マウス由来のＢＭＤＭでは失われた。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１。ＷＴ  ＢＭＤＭは各群の左側のバーであり、Ｔｒｅｍ２−／−ＢＭＤＭは各群の右側のバーである。
【図３２】図３２は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−ＦｃおよびｈＴＲＥＭ２−ＦｃによるカルジオリピンリポソームのプレコーティングがＢＭＤＭの炎症性活性化を無効にしたが、野生型ｈＴＲＥＭＬ４−ＦｃによるカルジオリピンリポソームのプレコーティングはＢＭＤＭの炎症性活性化を無効にしなかったことを示す実験例の結果を示す。カルジオリピンリポソームを、１０  μｇ／ｍｌのｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃ、またはｈＴＲＥＭ２−Ｆｃタンパク質とともに、氷上で３０分間インキュベートした。２４ウェルプレートの各ウェルの１００万個のＷＴ  ＢＭＤＭを、示されたＦｃタンパク質でプレコーティングされたカルジオリピンリポソームで刺激した。刺激から６時間後、ＩＬ−６およびＴＮＦαをｑＰＣＲによって測定した。データは、平均ＳＥＭを示し、多重比較を伴う二元配置分散分析によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１。使用したＦｃバリアントは、Ｎ２９７Ｑ変異を有する脱グリコシル化ヒトＩｇＧ１であった。
【図３３】図３３は、カルジオリピンがＴＲＥＭ２に依存する形でＴｈｐ−１細胞のネクロトーシスミトコンドリア活性化に必要であることを示す実験例の結果を示す。カルジオリピン合成（Ｃｒｌｓ１）の律速酵素を、Ｌ９２９細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して欠失させ、ネクロトーシスをＴＮＦαおよびｚＶＡＤで誘導し、１００万個の細胞由来のミトコンドリアを使用してＴＲＥＭ２欠損およびＷＴ  Ｔｈｐ−１細胞を刺激した。刺激から６時間後、ＩＬ−６およびＴＮＦαをｑＰＣＲによって測定した。データは、平均ＳＥＭを示し、多重比較を伴う二元配置分散分析によって分析されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１。ＷＴ  ＢＭＤＭは各群の左側のバーであり、Ｔｒｅｍ２−／−ＢＭＤＭは各群の右側のバーである。
【図３４】図３４は、ＣＬがＴＲＥＭ２に結合するためのネクロトーシスミトコンドリアの必要な特性であることを示す実験例の結果を示す。ＷＴまたはＣｒｌｓ１欠損Ｌ９２９細胞は、ＴＮＦαおよびｚＶＡＤの投与によりネクロトーシスを起こすよう誘導され、結果として生じたネクロトーシスミトコンドリアが単離された。ｈＴＲＥＭ２−Ｆｃ、ｈＴＲＥＭ２−Ｒ４７Ｈ−Ｆｃ（ＡＤ関連の変異）、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃ、ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ、またはｍＴＲＥＭＬ４−Ｄ９３Ｋがミトコンドリアに投与され、フローサイトメトリーによって結合が検出された。ｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ、およびｍＴＲＥＭＬ４融合タンパク質のみが、ネクロトーシスミトコンドリアに結合した。Ｃｒｌｓ１を欠失させると、ＴＲＥＭ２−Ｆｃの結合が完全に無効になり、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−ＦｃおよびｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃの結合が大幅に減衰した。ＭＦＩは蛍光強度を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
一つの態様では、本発明は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害の治療または予防のための組成物を提供する。たとえば、特定の実施形態では、組成物および方法は、炎症を阻害、軽減、または予防するためのＴＲＥＭ２シグナル伝達の阻害に基づく。
【００３７】
敗血症およびその他の炎症性疾患の間、マクロファージ等の免疫細胞上のＤＡＭＰ受容体に結合するいわゆる損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出により、過剰な炎症が持続する。細胞外ＡＴＰおよびプリン代謝産物、細胞外核酸、ＨＭＧＢ１、およびＳ１００タンパク質を含むがこれらに限定されない、いくつかのＤＡＭＰが記載されている。一部のＤＡＭＰは、ネクロトーシスと呼ばれる炎症性プログラム細胞ネクローシス経路の産物であると提唱されている。ネクロトーシスは、高濃度の炎症性サイトカイン、たとえばＴＮＦ−α、およびＲＩＰＫ１／ＲＩＰＫ３シグナル経路を活性化する他のデスレセプター経路、たとえばＦａｓによって引き起こされる。ネクロトーシス細胞死体から放出されたミトコンドリアは、ＴＬＲ４とともに受容体ＴＲＥＭ２によって認識されるドミナントなＤＡＭＰであることが本明細書に記載されている。ＴＲＥＭ２／ＴＬＲ４を介したシグナル伝達は、マクロファージおよび単球による炎症性サイトカインの産生を促進する；ＴＲＥＭ２の薬理学的遮断は、疾患の末期段階でさえ、敗血症の生理を反転させる。したがって、本明細書に記載されるように、本発明は、新規なＴＲＥＭ受容体アンタゴニストの組成物および使用方法に関する。さらに、循環ネクロトーシスミトコンドリアは炎症の状態で検出可能であり、したがって、ＴＲＥＭおよびＴＲＥＭＬに対する治療法のバイオマーカーとなることが、本明細書に記載されている。
【００３８】
特定の実施形態では、組成物は、骨髄細胞で発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ）ファミリーまたはＴＲＥＭ様（ＴＲＥＭＬ）ファミリーのタンパク質の一つまたは複数のメンバーの阻害剤の阻害剤を含む。たとえば、一つの実施形態では、阻害剤は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の活性を阻害する、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、小分子、抗体、ペプチド模倣薬等を含む。一つの実施形態では、阻害剤は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質のデコイ受容体として作用するペプチドを含み、それにより、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の内因性活性を阻害する。一つの実施形態では、タンパク質は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメイン、またはそのバリアントまたは断片を含む。
【００３９】
一部の実施形態では、タンパク質は、第一のドメインおよび第二のドメインを含む融合タンパク質である。一つの実施形態では、第一のドメインは、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメイン、またはそれらのバリアントまたは断片を含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、融合タンパク質の安定性または半減期を向上するペプチドを含む。たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリンの少なくとも一つの領域、またはそのバリアントもしくは断片を含む。たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。
【００４０】
一つの実施形態では、第一のドメインは、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメイン、またはそのバリアントまたは断片を含み、第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメイン、またはそのバリアントまたは断片を含む。
【００４１】
特定の実施形態では、組成物は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とミトコンドリア、たとえばネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞に由来または放出されるミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する阻害剤を含む。一つの実施形態では、組成物は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンとの間の相互作用を阻害する阻害剤を含む。特定の実施形態では、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する阻害剤は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、小分子、抗体、抗体断片、ペプチド模倣薬等から選択される。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明は、細胞、組織、または対象におけるＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬシグナル伝達経路を阻害するための方法を提供する。一つの実施形態では、方法は、細胞、組織、または対象に、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の阻害剤を投与することを含む。一つの実施形態では、阻害剤は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む。一つの実施形態では、阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明は、対象における一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質を阻害することによって、対象における炎症を軽減するための方法を提供する。一つの実施形態では、方法は、細胞、組織、または対象に、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の阻害剤を投与することを含む。一つの実施形態では、阻害剤は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む。一つの実施形態では、阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する。
【００４４】
一部の実施形態では、本発明は、対象における一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質を阻害することによる、対象における炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害の治療または予防のための方法を提供する。一つの実施形態では、方法は、細胞、組織、または対象に対して一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の阻害剤を投与することを含む。一つの実施形態では、阻害剤は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む。一つの実施形態では、阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明は、サンプル中のカルジオリピンまたはミトコンドリア、たとえばネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞に由来または放出されるミトコンドリアの存在または量を検出することにより、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を診断する方法を提供する。たとえば、カルジオリピンまたはネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞に由来または放出されるミトコンドリアの検出を使用して、対象が炎症促進性ＴＲＥＭシグナル伝達を有することを特定することができる。一部の実施形態では、カルジオリピンまたはネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞に由来または放出されるミトコンドリアの検出は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を治療するための治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または治療法（ｔｈｅｒａｐｙ）の候補として対象を特定する。一つの実施形態では、カルジオリピンまたはネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞に由来または放出されるミトコンドリアの検出は、本明細書に記載のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬシグナル伝達の阻害剤、たとえばＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬ外部ドメインを含む阻害剤、または一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する阻害剤を用いた治療の候補として対象を特定する。一つの実施形態では、方法は、対象由来のサンプル中のカルジオリピンまたはミトコンドリア、たとえばネクローシス細胞またはネクロトーシス細胞に由来または放出されるミトコンドリアの存在または量を検出すること、ならびに炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害の治療を対象に施すことを含む。一つの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬシグナル伝達の阻害剤を対象に投与することを含む。
【００４６】
一つの態様では、本発明は、ネクロトーシス細胞の検出のための組成物および方法を提供する。たとえば、一つの実施形態では、組成物は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質、またはそのバリアントまたは断片を含むペプチドを含む。一つの実施形態では、ペプチドは、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質、またはそのバリアントまたは断片上の外部ドメインを含む。一部の実施形態では、組成物は、蛍光標識、ＤＮＡバーコード、重金属、放射性標識等を含むがこれらに限定されない検出可能な標識を含む。組成物は、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、免疫蛍光法、またはネクロトーシス細胞の検出に好適な他のアッセイの試薬として使用できる。
【００４７】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および材料を記載する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、以下の各用語は、このセクションでそれに関連する意味を有する。
【００４９】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の一つまたは複数（すなわち、少なくとも一つ）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、一つの要素または複数の要素を意味する。
【００５０】
量、時間的持続時間等の測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」は、開示された方法を実行するためにそのような変動が適切であるため、指定された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００５１】
生物、組織、細胞、またはそれらの構成要素の文脈で使用される場合の用語「異常」は、「正常の」（予想される）それぞれの特性を示すそれらの生物、組織、細胞またはその構成要素と少なくとも一つの観察可能または検出可能な特性（たとえば、年齢、治療、時刻等）が異なるそれらの生物、組織、細胞またはその構成要素を指す。ある細胞型または組織型では正常または予想される特性は、異なる細胞型または組織型では異常である可能性がある。
【００５２】
「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、疾患が寛解しない場合、動物の健康が悪化し続ける動物の健康状態ある。対照的に、動物の「障害」は、動物が恒常性を維持できるが、動物の健康状態は障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。治療せずに放置しても、障害が必ずしも動物の健康状態をさらに低下させるわけではない。
【００５３】
疾患または障害の徴候または症状の重症度、そのような徴候または症状が患者によって経験される頻度、またはその両方が減少する場合、疾患または障害は「軽減」される。
【００５４】
「コードする」は、ポリヌクレオチド、たとえば遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ内のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指し、ヌクレオチドは、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）、またはアミノ酸の定義された配列のいずれか、およびそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして機能する。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生命システム（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。コード鎖（そのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表で提供される）、および非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される）の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードしていると言うことができる。
【００５５】
化合物の「有効量」は、化合物が投与される対象または系統（ｓｙｓｔｅｍ）に対し効果を提供するのに十分な化合物の量である。
【００５６】
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現システムにおいて供給してもよい。発現ベクターは、当技術分野で知られているすべてのもの、たとえばコスミド、プラスミド（たとえば、裸、またはリポソームに含まれる）、および組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルス（たとえば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む。
【００５７】
「相同」は、二つのポリペプチド間または二つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。二つの比較された配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、たとえば、二つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で相同である。二つの配列間の相同性の割合は、二つの配列が共有する一致または相同位置の数を比較した位置の数で除し、１０を乗じた関数である。たとえば、二つの配列の１０個の位置のうち６個が一致または相同である場合、二つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。一般に、比較は、最大の相同性を与えるために二つの配列が整列されているときに行う。
【００５８】
二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が、特定の領域にわたって同一である特定の割合の残基を有することを意味する。割合は、二つの配列を最適に整列させ、特定の領域にわたって二つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が生じる位置の数を決定して、一致する位置の数を算出し、一致する位置の数を特定の領域内の位置の総数除し、結果に１００を乗じて配列同一性の割合を算出することによって計算できる。二つの配列の長さが異なる場合、またはアラインメントによって一つまたは複数の付着端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｎｄ）が生成され、指定された比較領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は計算の分母に含むが、分子には含まない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等と見なすことができる。同一性は、手動で計算することも、コンピューターシーケンスアルゴリズム、たとえばＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ２．０を使用して計算することもできる。
【００５９】
「単離された」は、自然の状態から変化または除去されたことを意味する。たとえば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同一の核酸またはペプチドは「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在してもよく、または、非天然環境、たとえば、宿主細胞に存在してもよい。
【００６０】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基についての以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを指す。
【００６１】
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするフレーズヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロンを含みうる程度までイントロンを含みうる。
【００６２】
用語「患者」、「対象」、「個体」等は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載の方法に適した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕを問わず、任意の動物またはその細胞を指す。一部の実施形態では、患者、対象または個人はヒトである。
【００６３】
組成物の「非経口的」投与は、たとえば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射、または点滴の手法を含む。
【００６４】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これを加水分解して単量体の「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲ（商標）等を使用した、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含むがこれらに限定されない当技術分野で利用可能な任意の手段によって、および合成手段によって得られるすべての核酸配列を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書に記載されるように、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は互換的に使用され、ペプチド結合で共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸を含まねばならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合された二つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、たとえば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖、および多くの種類があり、当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる、より長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、たとえば、特に、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６６】
本明細書で使用される用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構によって認識される、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。場合によっては、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の例では、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター／調節配列は、たとえば、組織特異的な方法で遺伝子産物を発現するものであってもよい。
【００６８】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００６９】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、プロモーターに対応するインデューサーが細胞内に存在する場合にのみ、実質的に遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００７０】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、実質的に細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００７１】
「治療的」処置（”ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ”  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、病状の徴候を示す対象に、それらの徴候を軽減または排除する目的で施す処置である。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「疾患または障害の治療」は、疾患または障害の症状が患者によって経験される頻度を減らすことを意味する。
【００７３】
本明細書で使用される「治療有効量」という句は、そのような疾患の症状を緩和することを含む、疾患または状態を予防または治療する（発症を遅らせるまたは予防する、進行を予防する、阻害する、減少させるまたは回復に向かわせる）のに十分または有効な量を指す。
【００７４】
本明細書で使用される用語としての疾患を「治療する」は、対象が経験する疾患または障害の少なくとも一つの徴候または症状の頻度または重症度を低減させることを意味する。
【００７５】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが、当技術分野で知られている。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、細胞への核酸の移動を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物、たとえば、ポリリジン化合物、リポソーム等を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能なサブ範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。たとえば、１〜６等の範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等のサブ範囲、およびその範囲内の個々の数、たとえば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を具体的に開示しているとみなすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００７７】
説明
本発明は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬシグナル伝達経路を阻害するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、炎症を軽減し、炎症性および自己免疫性の疾患および障害を治療または予防するために使用される。本発明は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む阻害剤が敗血症の治療に有用であるという発見に部分的に基づいている。たとえば、本明細書では、ＴＲＥＭおよびＴＲＥＭＬ阻害剤が敗血症を介した死亡率を低下させることを示している。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する組成物および方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬ外部ドメインを含むペプチド阻害剤を含む組成物に関する。
【００７９】
組成物
一つの態様では、本発明は、対象または生命システムにおいてＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬシグナル伝達を調節するための組成物を提供する。組成物は、たとえば、炎症を軽減し、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を治療または予防するために使用することができる。
【００８０】
一つの実施形態では、組成物は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質のモジュレーターを含む。例示的なＴＲＥＭタンパク質は、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＥＭ３、ＴＲＥＭ４、ＴＲＥＭ５、およびＮＣＲ２（Ｎｋｐ４４）を含むが、これらに限定されない。例示的なＴＲＥＭＬタンパク質は、ＴＲＥＭＬ１、ＴＲＥＭＬ２、ＴＲＥＭＬ３、ＴＲＥＭＬ４、およびＴＲＥＭＬ６を含むが、これらに限定されない。さらに、本発明は、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、マウス、またはラットを含むがこれらに限定されない、任意の種のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質のモジュレーターを包含する。さらに、本発明は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の任意のアイソフォームまたはスプライスバリアントのモジュレーターを包含する。
【００８１】
ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の例示的なモジュレーターは、核酸分子、ベクター、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ペプチド模倣薬、小分子等を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
一部の実施形態では、モジュレーターは、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬをコードする核酸分子またはＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の転写、翻訳、スプライシング、分解、酵素活性、結合活性、またはそれらの組み合わせを調節することにより、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬをコードする核酸分子またはＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質のレベルまたは活性を調節する。一部の実施形態では、モジュレーターは、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬをコードする核酸分子またはＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の発現を減少させ、それにより、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬ活性を低下させる。一部の実施形態では、モジュレーターは、内因性のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬをコードする核酸分子またはＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の活性を低下させる。
【００８３】
一部の実施形態では、組成物は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の阻害剤を含む。ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の例示的な阻害剤は、核酸分子、ベクター、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ペプチド模倣薬、小分子等を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬをコードする核酸分子またはＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の発現を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬをコードする核酸分子またはＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の活性を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、内因性ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質に結合し、それにより、内因性ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の活性を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、たとえば、デコイタンパク質または競合的アンタゴニストとして、内因性ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質のリガンドに結合する。
【００８４】
特定の実施形態では、阻害剤は小分子を含む。たとえば、一つの実施形態では、阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する小分子を含む。本発明の阻害剤が小分子である場合、小分子アンタゴニストは、当業者に知られている標準的な方法を使用して得ることができる。そのような方法は、化学的有機合成または生物学的手段を含む。生物学的手段は、当技術分野で周知の方法を使用した、生物学的供給源からの精製、組換え合成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システムを含む。
【００８５】
様々な疾患および状態を治療するのに潜在的に有用な分子的に多様な化合物のコンビナトリアルライブラリーは、ライブラリーを作製する方法と同様に当技術分野で周知である。この方法は、固相合成、溶液法、単一化合物の並列合成、化学混合物の合成、剛性コア構造、柔軟な線形配列、デコンボリューション戦略（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）、タグ付け技術、リード化合物開発（ｌｅａｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）のための偏りのある構造に対し、リード化合物発見（ｌｅａｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）のための偏りのない分子ランドスケープを生成することを含む、当業者に周知の様々な技術を使用することができる。
【００８６】
小さなライブラリー合成の一般的な方法では、活性化されたコア分子がいくつかのビルディングブロックとともに濃縮され、共有結合したコアビルディングブロックアンサンブルのコンビナトリアルライブラリーが生成される。コアの形状と剛性によって、形状空間におけるビルディングブロックの方向が決定される。ライブラリーは、コア、結合、またはビルディングブロックを変更して、バイアスをかけて特徴付けられた生物学的構造をターゲットにする（「フォーカストライブラリー［ｆｏｃｕｓｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ］」）か、または可動性のコアを使用して構造的バイアス（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉａｓ）を少なくして合成することができる。
【００８７】
一つの実施形態では、阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質を阻害する抗体または抗体断片を含む。たとえば、一つの実施形態では、阻害剤は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質に特異的な抗体または抗体断片を含む。一つの実施形態では、抗体は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質に特異的に結合する。一つの実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の少なくとも一つのリガンドに特異的に結合する。一つの実施形態では、抗体は、カルジオリピンまたはミトコンドリアに特異的に結合する。一つの実施形態では、抗体は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する。一つの実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体はキメラ抗体である。さらなる実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は抗体断片である。
【００８８】
一部の実施形態では、抗体は、インタクトなモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはその免疫学的部分または活性断片である。したがって、様々な実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；「細胞内抗体［ｉｎｔｒａｂｏｄｙ］」）、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体（例：ラクダ抗体等）、合成抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６を参照）である。抗体は、所望の免疫抗原を含むインタクトなポリペプチドまたは断片を使用して調製することができる。動物を免疫するために使用されるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から得るか、または化学的に合成してもよく、そして必要に応じて、担体タンパク質に結合してもよい。ペプチドに化学的に結合できる好適な担体は、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニンを含む。次に、結合したポリペプチドを使用して、動物（例：マウス、ラット、またはウサギ）を免疫することができる。
【００８９】
当業者によって理解されるように、所望の抗原を認識して結合することができる抗体は、本発明において有用である。抗体を作製および使用する方法は、当技術分野で周知である。たとえば、本発明で有用なポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の標準的な免疫学的技術に従ってウサギを免疫化することによって産生される（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｉｎ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹを参照のこと）。そのような技術は、別のタンパク質の一部、たとえばマルトース結合タンパク質またはグルタチオン（ＧＳＨ）タグポリペプチド部分、および／または所望の抗原性タンパク質が免疫原性になるような部分、およびそれぞれの抗原性タンパク質アミノ酸残基を含む部分を含むキメラタンパク質（例：キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合されている所望の抗原）で動物を免疫することを含む。キメラタンパク質は、マーカータンパク質をコードする適切な核酸を、たとえばｐＭＡＬ−２またはｐＣＭＸであるがこれらに限定されない、この目的に好適なプラスミドベクターにクローニングすることによって生成される。
【００９０】
しかしながら、本発明は、これらの抗体または抗原のこれらの部分を含む方法および組成物のみに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、その用語が本明細書の他の場所で定義されているように、抗原またはその一部に対する他の抗体を含むと解釈されるべきである。さらに、本発明は、とりわけ、所望の特定の抗原に結合する抗体を包含すると解釈されるべきであり、それらは、たとえばウエスタンブロット、酵素結合免疫測定法の溶液、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気アフィニティーセルソーティング（ＭＡＣＳ）、および抗原タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸で一過性にトランスフェクトされた細胞の免疫蛍光顕微鏡法において存在する抗原に結合することができる。
【００９１】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づいて、抗体が抗原の任意の部分と特異的に結合でき、全長タンパク質を使用してそれに特異的な抗体を生成できることを理解するであろう。しかしながら、本発明は、全長タンパク質を免疫原として使用することに限定されない。むしろ、本発明は、タンパク質の免疫原性部分を使用して、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生することを含む。すなわち、本発明は、抗原の免疫原性部分または抗原決定基を使用して動物を免疫化することを含む。
【００９２】
所望の特定の抗原の配列およびタンパク質の様々な保存ドメインおよび非保存ドメインを局在化する詳細な分析で武装すると、当業者は、本明細書に提供される開示に基づいて、当技術分野で周知の、または今後開発される方法を使用した抗原の様々な部分に特異的な抗体を取得する方法を理解するであろう。
【００９３】
当業者は、本明細書で提供される開示に基づいて、本発明が単一の抗原性エピトープを認識する単一抗体の使用を含むが、本発明が単一抗体の使用に限定されないことを理解するであろう。代わりに、本発明は、抗体が同一のまたは異なる抗原性タンパク質エピトープを標的としうる少なくとも一つの抗体の使用を包含する。
【００９４】
ポリクローナル抗体の生成は、所望の動物に抗原を接種し、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８，  Ｉｎ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）に記載されているような標準的な抗体産生方法を使用して、そこから抗原に特異的に結合する抗体を単離することによって達成される。
【００９５】
タンパク質またはペプチドの全長またはペプチド断片を標的とするモノクローナル抗体は、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８，  Ｉｎ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）およびＴｕｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８，  Ｂｌｏｏｄ，  ７２：１０９−１１５）に記載されているような任意の周知のモノクローナル抗体調製手順を使用して調製することができる。大量の所望のペプチドはまた、化学合成技術を使用して合成することができる。あるいは、所望のペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、大量のペプチドの生成に好適な細胞内の適切なプロモーター配列から発現させることができる。ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書で参照される標準手順を使用してペプチドで免疫化されたマウスから産生される。
【００９６】
本明細書に記載の手順を使用して得られたモノクローナル抗体をコードする核酸は、当技術分野で利用可能であり、たとえば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：１２５−１６８）、およびそこに引用されている参考文献に記載されている技術を使用してクローニングおよび配列決定することができる。さらに、本発明の抗体は、たとえば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、およびそこに引用されている参考文献、およびＧｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７：７５５−７５９）に記載されている技術、および当技術分野で周知の、または今後開発される抗体をヒト化する他の方法を使用して「ヒト化」することができる。
【００９７】
本発明はまた、所望の抗原のエピトープと特異的に反応するヒト化抗体の使用を含む。本発明のヒト化抗体は、ヒトフレームワークを有し、所望の抗原と特異的に反応する抗体、典型的にはマウス抗体由来の一つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。本発明で使用される抗体がヒト化されている場合、抗体は、Ｑｕｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，１８０，３７０号）、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（上記を参照）、およびそこに引用されている参考文献、またはＧｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７（４）：７５５−７５９）に記載されているように産生できる。Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．で開示された方法は、所望の抗原、たとえばヒトアクセプターフレームワーク領域（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）に結合する所望の抗原のエピトープに結合することができるドナー免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の重鎖および軽鎖をコードする組換えＤＮＡセグメントを発現することによって産生されるヒト化免疫グロブリンの設計を部分的に対象とする。一般的に言えば、Ｑｕｅｅｎ特許の発明は、実質的に任意のヒト化免疫グロブリンの設計に適用可能である。Ｑｕｅｅｎは、ＤＮＡセグメントは通常、天然に関連するプロモーター領域または異種プロモーター領域を含む、ヒト化免疫グロブリンコード配列に作動可能に連結された発現制御ＤＮＡ配列を含むと説明している。発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核生物プロモーターシステムであってもよく、または発現制御配列は、原核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の原核生物プロモーターシステムであってもよい。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、導入されたヌクレオチド配列の高レベルの発現に好適な条件下で維持され、続いて、必要に応じて、ヒト化軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体またはインタクトな抗体、結合断片、または他の免疫グロブリンフォームの収集および精製が行われてもよい（参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｙｃｈｏｋ，  Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９７９））。
【００９８】
本発明はまた、本明細書に記載の抗体の機能的等価物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を含む。機能的等価物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有し、たとえば、ハイブリダイズした一本鎖抗体、ならびにそれらの断片を含む。そのような機能的等価物を製造する方法は、ＰＣＴ出願国際公開番号第９３／２１３１９号およびＰＣＴ出願国際公開番号第８９／０９６２２号に開示されている。
【００９９】
機能的等価物は、抗体の可変領域または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「実質的に同じ」アミノ酸配列は、本明細書において、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  １９８８  Ｐｒｏｃ．  ＮＡＴ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８によるＦＡＳＴＡ検索法によって決定された、別のアミノ酸配列との約７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列（または７０〜９９の間の任意の整数）として定義される。キメラ抗体または他のハイブリッド抗体は、実質的または排他的にヒト抗体定常領域に由来する定常領域、および実質的または排他的に各安定ハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体の可変領域の配列に由来する可変領域を有する。
【０１００】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦｖ断片は、相互接続リンカーの有無にかかわらず、軽鎖の可変領域に結合した抗体の重鎖の可変領域からなるポリペプチドである。したがって、Ｆｖは抗体結合部位を含む。
【０１０１】
本発明の抗体の機能的等価物は、抗体全体の結合特性と同じ、または実質的に同じ結合特性を有する抗体の断片をさらに含む。このような断片は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）2断片の一方または両方を含んでもよい。抗体断片は、抗体全体の６つの補体決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）すべてを含むが、３、４、または５つの補体決定領域等、そのような領域のすべてより少ない断片も機能する。機能的等価物は、ＩｇＧ免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスのメンバーであるが、以下の免疫グロブリンクラスのいずれか１つ：ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびそれらのサブクラスであってもよく、またはそれらと組み合わせてもよい。ＩｇＧサブクラス等の様々なサブクラスの重鎖は、様々なエフェクター機能に関与しているため、所望の重鎖定常領域を選択することにより、所望のエフェクター機能を備えたハイブリッド抗体が産生される。例示的な定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ３（ＩｇＧ３）、およびガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ型またはラムダ型であってもよい。
【０１０２】
本発明の免疫グロブリンは、一価、二価または多価であってもよい。一価免疫グロブリンは、ジスルフィド架橋を介してハイブリッド軽鎖と結合したハイブリッド重鎖で形成された二量体（ＨＬ）である。二価免疫グロブリンは、少なくとも一つのジスルフィド架橋を介して結合した２つの二量体で形成された四量体（Ｈ2Ｌ2）である。
【０１０３】
一つの実施形態では、組成物は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質を阻害するタンパク質を含む。たとえば、一部の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の発現または活性を阻害する。
【０１０４】
たとえば、一つの実施形態では、本発明のペプチド阻害剤は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質に直接結合することによって少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質を阻害し、それによって少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の正常な機能的活性を妨げる。一つの実施形態では、本発明のペプチド阻害剤は、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質のリガンドに直接結合することによって少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質を阻害し、それによって少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の正常な機能的活性を妨げる。一つの実施形態では、本発明のペプチド阻害剤は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害することによって、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質を阻害する。別の実施形態では、本発明のペプチド阻害剤は、少なくとも一つの内因性ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質と競合することによって、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質を阻害する。さらに別の実施形態では、本発明のペプチド阻害剤は、トランスドミナントネガティブ変異体として作用することにより、少なくとも一つのＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の活性を阻害する。
【０１０５】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む。一部の実施形態では、タンパク質阻害剤は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインの断片またはバリアントを含む。組成物は、たとえば、任意の生物由来のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の任意のアイソフォーム由来の外部ドメインを含んでもよい。一つの実施形態では、組成物は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の全長の外部ドメインを含む。一つの実施形態では、組成物は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の組換え外部ドメインを含む。
【０１０６】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、ヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、
【０１０７】
【化１】
2021513969.tif 000002
【０１０８】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、タンパク質阻害剤は、一つまたは複数の変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。たとえば、一部の実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対してＴ３５、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｋ７８、Ｋ８６、Ｔ９５、Ｇ１５６、およびＨ１６０から選択される一つまたは複数の残基において一つまたは複数の変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。一つの実施形態では、その天然のシグナルペプチドを含む全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４は、
【０１１０】
【化２】
2021513969.tif 000003
【０１１１】
を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメイン内の変異の表記は、配列番号４４に対する。たとえば、Ｔ３５に変異を含むｈＴＲＥＭＬ４外部ドメインは、ｈＴＲＥＭＬ４外部ドメインを含むが、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４（配列番号：４４）の３５位のスレオニンに関係する一残基における変異を有するｈＴＲＥＭＬ４断片を指す。
【０１１２】
一部の実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５Ｘ、Ｌ６５Ｘ、Ｌ６６Ｘ、Ｓ６９Ｘ、Ｋ７１Ｘ、Ｋ７８Ｘ、Ｋ８６Ｘ、Ｔ９５Ｘ、Ｇ１５６Ｘ、およびＨ１６０Ｘから選択される一つまたは複数の変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５Ｓ、Ｌ６５Ｒ、Ｌ６６Ｖ、Ｓ６９Ｔ、Ｋ７１Ｅ、Ｋ７８Ｅ、Ｋ８６Ｄ、Ｔ９５Ｋ、Ｇ１５６Ｅ、およびＨ１６０Ｄから選択される一つまたは複数の変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。
【０１１３】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｋ８６Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＫ８６Ｄ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄの外部ドメインは、
【０１１４】
【化３】
2021513969.tif 000004
【０１１５】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１１６】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｌ６５Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＬ６５Ｒ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒの外部ドメインは、
【０１１７】
【化４】
2021513969.tif 000005
【０１１８】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１１９】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｋ７１Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＫ７１Ｅ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７１Ｅ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７１Ｅの外部ドメインは、
【０１２０】
【化５】
2021513969.tif 000006
【０１２１】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１２２】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｔ９５Ｋ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＴ９５Ｋ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ９５Ｋ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ９５Ｋの外部ドメインは、
【０１２３】
【化６】
2021513969.tif 000007
【０１２４】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１２５】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｔ３５Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＴ３５Ｓ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ３５Ｓ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ３５Ｓの外部ドメインは、
【０１２６】
【化７】
2021513969.tif 000008
【０１２７】
を含む。
【０１２８】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｌ６６Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＬ６６Ｖ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６６Ｖ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６６Ｖの外部ドメインは、
【０１２９】
【化８】
2021513969.tif 000009
【０１３０】
を含む。
【０１３１】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｓ６９Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＳ６９Ｔ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｓ６９Ｔ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｓ６９Ｔの外部ドメインは、
【０１３２】
【化９】
2021513969.tif 000010
【０１３３】
を含む。
【０１３４】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｋ７８Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＫ７８Ｅ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７８Ｅ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７８Ｅの外部ドメインは、
【０１３５】
【化１０】
2021513969.tif 000011
【０１３６】
を含む。
【０１３７】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｇ１５６Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＧ１５６Ｅ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｇ１５６Ｅ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｇ１５６Ｅの外部ドメインは、
【０１３８】
【化１１】
2021513969.tif 000012
【０１３９】
を含む。
【０１４０】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、Ｈ１６０Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＨ１６０Ｄ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｈ１６０Ｄ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｈ１６０Ｄの外部ドメインは、
【０１４１】
【化１２】
2021513969.tif 000013
【０１４２】
を含む。
【０１４３】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＬ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ三重変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄの外部ドメインは、
【０１４４】
【化１３】
2021513969.tif 000014
【０１４５】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１４６】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＬ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋ四重変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋの外部ドメインは、
【０１４７】
【化１４】
2021513969.tif 000015
【０１４８】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１４９】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、マウスＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。たとえば、マウスＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、
【０１５０】
【化１５】
2021513969.tif 000016
【０１５１】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１５２】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、ヒトＴＲＥＭ２の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、
【０１５３】
【化１６】
2021513969.tif 000017
【０１５４】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１５５】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、ヒトＴＲＥＭ１の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ＴＲＥＭ１の外部ドメインは、
【０１５６】
【化１７】
2021513969.tif 000018
【０１５７】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１５８】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、ヒトＴＲＥＭＬ１の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ１の外部ドメインは、
【０１５９】
【化１８】
2021513969.tif 000019
【０１６０】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１６１】
一つの実施形態では、タンパク質阻害剤は、ヒトＴＲＥＭＬ２の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ２の外部ドメインは、
【０１６２】
【化１９】
2021513969.tif 000020
【０１６３】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、タンパク質阻害剤は、第一のドメインおよび第二のドメインを含む融合タンパク質を含む。一つの実施形態では、第一のドメインは、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、第一のドメインは、配列番号：１〜１８のいずれか一つ、またはそのバリアントもしくは断片によって提供される外部ドメインを含む。
【０１６５】
一つの実施形態では、第二のドメインは、融合タンパク質の安定性または半減期を増強するペプチドを含む。たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、赤血球細胞表面、または新生児Ｆｃ受容体に結合する免疫グロブリン、ＨＳＡ、またはペプチドもしくは抗体断片の少なくとも一つの領域を含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリンの少なくとも一つの領域の断片またはバリアントを含む。たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。例示的な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ペプチドは、たとえば、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２９２（９）：  ３９００−３９０８；  Ｂｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２３：４０３−４１１；  Ｌｅａｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  ＭＡｂｓ，  ５：８９６−９０３；  Ｔａｏ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  １９８９，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４３：２５９５−２６０１；  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３４７−３５３；  Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４８：３４６１−３４６８；  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００：１６−２６；  Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ＮＡＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２５：１２５６−１２６４；  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＭＡｂｓ，  １：５７２−５７９；  Ｖａｆａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６５：１１４−１２６，およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ，  ９（１）：６３−７３（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されるように、エフェクター機能を低下させるための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンを含む。
【０１６６】
一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、
【０１６７】
【化２０】
2021513969.tif 000021
【０１６８】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１６９】
一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＦｃドメインはＦｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を低下させるように変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させるために、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３３１、Ｐ３２９またはＫ３３２のうちの一つまたは複数で変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｇ、およびＰ３３１Ｓのうちの一つまたは複数で変異している。ペプチドは、たとえばＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２９２（９）：  ３９００−３９０８；  Ｂｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２３：４０３−４１１；  Ｌｅａｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  ＭＡｂｓ，  ５：８９６−９０３；  Ｔａｏ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  １９８９，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４３：２５９５−２６０１；  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３４７−３５３；  Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４８：３４６１−３４６８；  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００：１６−２６；  Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２５：１２５６−１２６４；  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＭＡｂｓ，  １：５７２−５７９；およびＶａｆａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６５：１１４−１２６に記載されているように、Ｆｃ領域に一つまたは複数の変異を有するＩｇＧ１を含んでもよい。
【０１７０】
特定の実施形態では、ペプチドは、たとえば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １７７（２）：１１２９−１１３８に記載されるように、エフェクター機能を低下させるためにそのヒンジ領域に一つまたは複数の変異を含むＩｇＧ１ドメインを含む。
【０１７１】
一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を低下させるように変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ２のＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させるために、Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｖ２３４、Ｇ２３７、Ｐ２３８、およびＨ２６８のうちの一つまたは複数で変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、およびＨ２６８Ａのうちの一つまたは複数で変異している。
【０１７２】
一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を低下させるように変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させるために、Ｆ２３４およびＬ２３５のうちの一つまたは複数で変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのうちの一つまたは複数で変異している。一つの実施形態では、第二のドメインは、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４クロスアイソタイプを含む。
【０１７３】
たとえば、一部の実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの脱グリコシル化バリアントを含む。一部の実施形態では、第二のドメインは、グリコシル化を防ぐためにＮ２９７が変異している、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む。一部の実施形態では、第二のドメインは、野生型全長ＩｇＧ１と比較して、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、またはＮ２９７Ｇ変異を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む。
【０１７４】
たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含み、ここでバリアントはＮ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、Ｆｃドメインのバリアントは、
【０１７５】
【化２１】
2021513969.tif 000022
【０１７６】
またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０１７７】
たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含み、ここでバリアントはＮ２９７Ａ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、Ｆｃドメインのバリアントは、
【０１７８】
【化２２】
2021513969.tif 000023
【０１７９】
を含む。
【０１８０】
たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含み、ここでバリアントはＮ２９７Ｇ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、Ｆｃドメインのバリアントは、
【０１８１】
【化２３】
2021513969.tif 000024
【０１８２】
を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、第二のドメインは、血清中の半減期の延長をもたらす変異を含むＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。一部の実施形態では、変異は、Ｆｃドメインと新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との会合を増加させる。一部の実施形態では、それらの突然変異は、「ＹＴＥ」三重突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を含む。一部の実施形態では、それらの変異は、「ＬＳ」二重変異（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、第二のドメインは、エフェクター機能を除去または低下させ、およびＦｃドメインの半減期を延長する変異の組み合わせを含むＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。たとえば、Ｎ２９７Ａ変異とＹＴＥ三重変異（「ＡＹＴＥ」）の組み合わせ、またはＮ２９７Ａ変異とＬＳ二重変異（「ＡＬＳ」）の組み合わせ。
【０１８５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、第一のドメインと第二のドメインを分離するリンカードメインを含む。一つの実施形態では、リンカードメインは、
【０１８６】
【化２４】
2021513969.tif 000025
【０１８７】
を含む。別の実施形態では、リンカードメインは、５マー（
【０１８８】
【化２５】
2021513969.tif 000026
【０１８９】
の一つまたは複数のリピートを含む。一つの実施形態では、リンカードメインは、
【０１９０】
【化２６】
2021513969.tif 000027
【０１９１】
の３つのリピートを含む。別の実施形態では、リンカードメインはＡＡＡを含む。一つの実施形態では、リンカードメインは、
【０１９２】
【化２７】
2021513969.tif 000028
【０１９３】
およびＡＡＡを含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、分泌リーダー配列を含む。たとえば、一つの実施形態では、リーダー配列は、ＩｇＧ重鎖のリーダー配列に由来するＨ７リーダーペプチドを含む。一つの実施形態では、リーダー配列は、
【０１９５】
【化２８】
2021513969.tif 000029
【０１９６】
を含む。他の例示的なリーダーペプチドは、ＩｇＧカッパ軽鎖、ＩｇＧラムダ軽鎖、ヒト血清アルブミン由来のリーダーペプチド、およびインターロイキン２由来のリーダーペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０１９７】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭＬ４を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここで、Ｆｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０１９８】
【化２９】
2021513969.tif 000030
【０１９９】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２００】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２０１】
【化３０】
2021513969.tif 000031
【０２０２】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２０３】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２０４】
【化３１】
2021513969.tif 000032
【０２０５】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２０６】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７１Ｅを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２０７】
【化３２】
2021513969.tif 000033
【０２０８】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２０９】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ９５Ｋを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２１０】
【化３３】
2021513969.tif 000034
【０２１１】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２１２】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ３５Ｓを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２１３】
【化３４】
2021513969.tif 000035
【０２１４】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２１５】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６６Ｖを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２１６】
【化３５】
2021513969.tif 000036
【０２１７】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２１８】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｓ６９Ｔを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２１９】
【化３６】
2021513969.tif 000037
【０２２０】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２２１】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７８Ｅを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２２２】
【化３７】
2021513969.tif 000038
【０２２３】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２２４】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｇ１５６Ｅを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２２５】
【化３８】
2021513969.tif 000039
【０２２６】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２２７】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｈ１６０Ｄを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２２８】
【化３９】
2021513969.tif 000040
【０２２９】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２３０】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２３１】
【化４０】
2021513969.tif 000041
【０２３２】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２３３】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２３４】
【化４１】
2021513969.tif 000042
【０２３５】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２３６】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、マウスＴＲＥＭＬ４を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２３７】
【化４２】
2021513969.tif 000043
【０２３８】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２３９】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２４０】
【化４３】
2021513969.tif 000044
【０２４１】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２４２】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ１を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２４３】
【化４４】
2021513969.tif 000045
【０２４４】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２４５】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭＬ１を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２４６】
【化４５】
2021513969.tif 000046
【０２４７】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２４８】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭＬ２を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列
【０２４９】
【化４６】
2021513969.tif 000047
【０２５０】
を含み、ここで外部ドメインに下線を付している。
【０２５１】
一つの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載のタンパク質のうちの２つの二量体を含む。一つの実施形態では、二量体は、２つの同一のタンパク質を含むホモ二量体である。一つの実施形態では、二量体は、２つの同一でないタンパク質を含むヘテロ二量体である。
【０２５２】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有する任意のフォームのタンパク質バリアントを含むと解釈されるべきである。一つの実施形態では、タンパク質バリアントは、本明細書に開示されるアミノ酸配列に、少なくとも約５０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。
【０２５３】
本発明はまた、本明細書に開示される実質的な長さのアミノ酸配列を有する任意のフォームの断片を含むと解釈されるべきである。一つの実施形態では、断片は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の長さの少なくとも約５０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【０２５４】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ酸配列との実質的な相同性および実質的な長さの両方を有する、タンパク質バリアントの任意のフォームの断片を含むと解釈されるべきである。一つの実施形態では、タンパク質バリアントの断片は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であり、本明細書に開示されるアミノ酸配列の長さの約５０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【０２５５】
あるいは、タンパク質は、組換え手段によって、またはより長いタンパク質からの切断によって作製されてもよい。タンパク質は、アミノ酸分析または配列決定によって確認することができる。
【０２５６】
本発明によるタンパク質のバリアントは、（ｉ）一つまたは複数のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（たとえば、保存アミノ酸残基）で置換され、そのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるものである場合とそうでない場合があるもの、（ｉｉ）一つまたは複数の修飾アミノ酸残基、たとえば、置換基の結合によって修飾される残基が存在するもの、（ｉｉｉ）タンパク質が本明細書に記載のタンパク質またはドメインの選択的スプライスバリアント（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）を含むもの、（ｉｖ）本明細書に記載のタンパク質またはドメインの断片、および／または（ｖ）タンパク質が別のタンパク質またはペプチド、たとえばリーダー、または分泌配列、または精製（たとえば、Ｈｉｓ−タグ）もしくは検出（たとえば、Ｓｖ５エピトープタグ）に使用される配列と融合しているものであってもよい。断片は、元の配列のタンパク質分解切断（マルチサイトタンパク質分解［ｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ］を含む）によって生成されたタンパク質またはペプチドを含む。バリアントは、翻訳後修飾または化学修飾されている場合がある。そのようなバリアントは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
【０２５７】
当技術分野で知られているように、２つのペプチド間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換物を第二のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。バリアントは、元の配列とは異なる、たとえば、目的のセグメントあたりの残基の４０％未満で元の配列とは異なる、目的のセグメントあたりの残基の２５％未満で元の配列とは異なる、目的のセグメントあたりの残基の１０％未満で元の配列とは異なる、または目的のセグメントあたりほんの数残基で元の配列とは異なるペプチド配列を含むように定義され、同時に元の配列の機能を維持するために元の配列と十分に相同である。本発明は、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％相同または同一であるアミノ酸配列を含む。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムおよび方法を使用して決定することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０））を使用して決定することができる。
【０２５８】
本発明のタンパク質は、翻訳後修飾されていてもされていなくてもよい。たとえば、本発明の範囲内にある翻訳後修飾には、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディングおよびタンパク質分解プロセシングを含む。一部の修飾またはプロセシングイベントは、追加の生物学的機構の導入を必要とする。たとえば、プロセシングイベント、たとえばシグナルペプチド切断およびコアグリコシル化は、イヌミクロソーム膜またはアフリカツメガエル卵抽出物（米国特許第６，１０３，４８９号）を標準的な翻訳反応に添加することによって試験できる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、従来の方法、たとえばＲｅｅｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１（４）：１３６５，  １９９２）に記載されている方法を使用してリン酸化することができる。
【０２５９】
本発明のタンパク質は、翻訳後修飾によって、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成される非天然アミノ酸を含みうる。ポリペプチド翻訳中に非天然アミノ酸を導入するための様々なアプローチが利用可能である。
【０２６０】
本発明のタンパク質は、他の分子、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合することができる。これは、化学的に反応性のあるＰＥＧ誘導体で修飾できるシステイン変異または非天然アミノ酸を挿入することによって達成できる。一つの実施形態では、タンパク質は、融合タンパク質を調製するために、他のタンパク質に結合される。これは、たとえば、得られる融合タンパク質が本明細書に記載のタンパク質阻害剤の機能性を保持しているという条件で、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成することができる。
【０２６１】
本発明のタンパク質の環状誘導体もまた、本発明の一部である。環化により、タンパク質は他の分子との会合により有利な立体構造をとることができる。環化は、当技術分野で知られている技術を使用して達成することができる。たとえば、ジスルフィド結合は、遊離スルフヒドリル基を有する２つの適切に間隔を置いた成分の間に形成されてもよく、またはアミド結合は、１つの成分のアミノ基と別の成分のカルボキシル基との間に形成されてもよい。環化はまた、Ｕｌｙｓｓｅ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９５，  １１７，  ８４６６−８４６７によって記載されているようにアゾベンゼン含有アミノ酸を使用して達成されてもよい。結合を形成する成分は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸成分、またはその２つの組み合わせであってもよい。本発明の一つの実施形態では、環状ペプチドは、正しい位置でのβターンを含んでもよい。アミノ酸Ｐｒｏ−Ｇｌｙを正しい位置に添加することにより、βターンを本発明のペプチドに導入することができる。
【０２６２】
上記のようにペプチド結合結合（peptide bond linkage）を含む環状タンパク質よりもフレキシブルな環状タンパク質を生成することが望ましい場合がある。ポリペプチドの左右の位置にシステインを導入し、２つのシステインの間にジスルフィド架橋を形成することにより、よりフレキシブルなタンパク質を調製することができる。２つのシステインはβシートおよびβターンを変形させないように配置されている。ジスルフィド結合の長さとベータシート部分の水素結合の数が少ないため、タンパク質はよりフレキシブルになる。環状タンパク質の相対的な柔軟性は、分子動力学シミュレーションによって決定できる。
【０２６３】
本発明はまた、得られたタンパク質を所望の細胞成分または細胞型または組織に移動させることができる標的化タンパク質、または標的化ドメインに融合または組み込まれた、本明細書に記載のペプチド阻害剤に関する。キメラタンパク質または融合タンパク質はまた、追加のアミノ酸配列またはドメインを含んでもよい。キメラタンパク質または融合タンパク質は、様々な成分が異なる供給源に由来するという意味で組換えであり、したがって、自然界ではともに見出されない（すなわち、異種である）。
【０２６４】
一つの実施形態では、標的化ドメインは、膜貫通ドメイン、膜結合ドメイン、またはタンパク質がたとえば小胞または細胞表面と結合するように指示する配列であってもよい。一つの実施形態では、標的化ドメインは、タンパク質を特定の細胞型または組織に標的化することができる。たとえば、標的化ドメインは、細胞表面リガンド、または標的組織の細胞表面抗原に対する抗体であってもよい。標的化ドメインは、本発明のタンパク質を細胞成分に標的化することができる。
【０２６５】
本発明のタンパク質は、従来の技術によって合成することができる。たとえば、タンパク質は、固相ペプチド合成を使用する化学合成によって合成されてもよい。これらの方法は、固相または液相合成法のいずれかを使用する（たとえば、固相合成技術についてＪ．  Ｍ．  Ｓｔｅｗａｒｔ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌ．  （１９８４）  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ  Ｖｏｌ．  ２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０，  ｐｐ．  ３−２５４；および古典的な溶液合成についてＭ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  １９８４，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｅｄｓ．，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｓｕｐｒｓ，  Ｖｏｌ  １を参照のこと）。例として、本発明のポリペプチドは、Ｎ−フルオレニルメトキシ−カルボニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−ホスホスレオニン誘導体としてホスホスレオニンを直接組み込む９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相化学を使用して合成されてもよい。
【０２６６】
少なくとも一つの他の分子と結合した本発明のペプチドまたはタンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、組換え技術を介して、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端またはＣ末端、および所望の生物学的機能を有する選択されたタンパク質または選択可能なマーカーの配列を融合することによって調製することができる。得られた融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、選択されたタンパク質またはマーカータンパク質に融合されたＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬ外部ドメインを含むタンパク質を含む。融合タンパク質を調製するために使用できるタンパク質の例は、免疫グロブリンおよびその領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、および短縮型ｍｙｃを含む。
【０２６７】
本発明のタンパク質は、生物学的発現システムを使用して発現することができる。これらのシステムを使用すると、ランダム配列の大きなライブラリーを作成し、特定のタンパク質に結合する配列についてこれらのライブラリーをスクリーニングすることができる。ライブラリーは、ランダムペプチド配列をコードする合成ＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることによって作成できる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７１１；  Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４；  Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ  １９９０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：６３７８を参照のこと）ライブラリーは、重複するペプチドの同時合成によって構築することもできる（米国特許第４，７０８，８７１号を参照）。
【０２６８】
本発明のタンパク質は、無機酸、たとえば塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸等、または有機酸、たとえばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベネゼンスルホン酸、およびトルエンスルホン酸と反応することにより、医薬塩に変換することができる。
【０２６９】
本発明はさらに、本発明のタンパク質またはその断片が、異種タンパク質（すなわち、無関係のタンパク質またはその一部、たとえばポリペプチドの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、または少なくとも５００アミノ酸）に組換え融合または化学的に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）されて融合タンパク質を生成する融合タンパク質を包含する。融合は必ずしも直接である必要はないが、リンカー配列を介して生じる場合がある。
【０２７０】
一例では、本発明のタンパク質またはその断片を様々なタイプの免疫グロブリンに由来する配列に融合させることができる融合タンパク質。たとえば、本発明のポリペプチドは、たとえば、本明細書に記載されるように、ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ分子の定常領域（たとえば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン）に融合されて、より溶解性が高く、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定性な融合タンパク質またはその断片を産生しうる。別の実施形態では、そのような融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでリガンドとその受容体との間の相互作用を阻害するように対象に投与することができる。相互作用のそのような阻害は、特定の細胞応答を引き起こすシグナル伝達を遮断または抑制する。
【０２７１】
一つの態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端で異種シグナル配列に融合された本発明のポリペプチドを含む。たとえば、本発明のタンパク質に天然に見出されるシグナル配列は、異種起源に由来するシグナル配列で置換することができる。様々なシグナル配列が市販されている。たとえば、メリチンおよびヒト胎盤性アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．）の分泌配列は、真核生物の異種シグナル配列として利用可能である。原核生物の異種シグナル配列の例として、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，上記；および  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９２，  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）を列挙できる。別の例は、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌配列（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９２，  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）である。
【０２７２】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、タグ配列、たとえば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．，  ９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  Ｃａｌｉｆ．，  ９１３１１）で提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドに融合することができ、とりわけ、それらの多くは市販されている。たとえば、Ｇｅｎｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４で記載されているように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。ペプチドタグの他の例は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）および「ｆｌａｇ」タグ（Ｋｎａｐｐｉｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７（４）：７５４−７６１）である。これらのタグは、本発明の組換え生産されたタンパク質の精製に特に有用である。
【０２７３】
一つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のタンパク質阻害剤をコードする単離された核酸配列を含む組成物を提供する。たとえば、一つの実施形態では、組成物は、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質とカルジオリピンまたはミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する抗体またはタンパク質阻害剤をコードする単離された核酸分子を含む。一つの実施形態では、単離された核酸分子は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含むペプチド阻害剤をコードする。
【０２７４】
一つの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のタンパク質阻害剤の生物学的に機能的な断片をコードする単離された核酸配列を含む。当技術分野で理解されるように、生物学的に機能的な断片は、全長配列の生物学的機能を保持する全長配列の一つまたは複数の部分である。
【０２７５】
様々な実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号：１〜４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質阻害剤をコードする。
【０２７６】
さらに、本発明は、本明細書に開示されるタンパク質阻害剤に対して実質的な相同性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を包含する。一部の実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号：１〜４３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質阻害剤をコードする。
【０２７７】
タンパク質阻害剤をコードする単離された核酸配列は、当技術分野で知られている多くの組換え方法のいずれかを使用して、たとえば、例として遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、同じものを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、または標準的な技術を使用して、同じものを含む細胞および組織から直接単離することによって得ることができる。あるいは、所望の遺伝子は、クローニングよりむしろ合成的に生成できる。
【０２７８】
単離された核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意のタイプの核酸を含んでもよい。たとえば、一つの実施形態では、組成物は、たとえば、タンパク質阻害剤またはその機能的断片をコードする、単離されたｃＤＮＡ分子を含む、単離されたＤＮＡ分子を含む。一つの実施形態では、組成物は、タンパク質阻害剤またはその機能的断片をコードする単離されたＲＮＡ分子を含む。
【０２７９】
本発明の核酸分子は、血清中または細胞培養用の増殖培地中の安定性を改善するように改変することができる。本発明の核酸分子の安定性、機能性、および／または特異性を高め、免疫刺激特性を最小化するために、改変を加えることができる。たとえば、安定性を高めるために、３’残基は、分解に対して安定化されてもよく、たとえば、それらは、プリンヌクレオチド、具体的にはアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択されてもよい。あるいは、修飾アナログによるピリミジンヌクレオチドの置換、たとえば、２’−デオキシチミジンによるウリジンの置換は許容され、分子の機能に影響を与えない。
【０２８０】
本発明の一つの実施形態では、核酸分子は、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドアナログを含んでもよい。たとえば、末端は、修飾ヌクレオチドアナログを組み込むことによって安定化されうる。
【０２８１】
ヌクレオチドアナログの非限定的な例は、糖および／または骨格修飾リボヌクレオチドを含む（すなわち、リン酸糖骨格への修飾を含む）。たとえば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも一つを含むように修飾されてもよい。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドに接続するホスホエステル基は、修飾基、たとえばホスホチオエート基によって置換される。例示的な糖修飾リボヌクレオチドでは、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基で置換され、ここで、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【０２８２】
修飾の他の例は、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも一つの非天然に存在する核酸塩基を含むリボヌクレオチドである。アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように塩基を修飾してもよい。例示的な修飾核酸塩基は、５位で修飾されたウリジンおよび／またはシチジン、たとえば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよび／またはグアノシン、たとえば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、たとえば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、たとえば、Ｎ６−メチルアデノシンが好適である、を含むが、これらに限定されない。上記の修飾を組み合わせてもよい。
【０２８３】
場合によっては、核酸分子は、以下の化学修飾のうちの少なくとも一つを含む：一つまたは複数のヌクレオチドの２’−Ｈ、２’−Ｏ−メチル、または２’−ＯＨ修飾。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼに対する増強された耐性を有しうる。ヌクレアーゼ耐性を高めるために、核酸分子は、たとえば、２’修飾リボースユニットおよび／またはホスホロチオエート結合を含んでもよい。たとえば、２’−ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。ヌクレアーゼ耐性を高めるために、本発明の核酸分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−フッ素、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−アミノ、および／またはホスホロチオエート結合を含んでもよい。ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、たとえば２’−４’−エチレン架橋核酸、および特定の核酸塩基修飾、たとえば２−アミノ−Ａ、２−チオ（たとえば、２−チオ−Ｕ）、G-clamp修飾の含有も、標的への結合親和性を高めることができる。
【０２８４】
一つの実施形態では、核酸分子は、２’修飾ヌクレオチド、たとえば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。一つの実施形態では、核酸分子は、少なくとも一つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、一部の実施形態では、核酸分子のすべてのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０２８５】
本明細書で論じられる核酸剤は、他の点では未修飾のＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにたとえば効力を改善するために修飾されたＲＮＡおよびＤＮＡ、およびならびにヌクレオシド代替物のポリマーを含む。未修飾ＲＮＡは、核酸の成分、すなわち糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在する、たとえば人体で天然に存在するものと同じまたは本質的に同じである分子を指す。当技術分野では、まれなまたは異常であるが天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと呼んでいる。たとえば、Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９４，  ２２：２１８３−２１９６）を参照されたい。このようなまれなまたは異常なＲＮＡは、しばしば修飾ＲＮＡと呼ばれ、通常、転写後修飾の結果であり、本明細書で使用される非修飾ＲＮＡという用語の範囲内にある。本明細書で使用される修飾ＲＮＡは、核酸の一つまたは複数の成分、すなわち糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在するものとは異なる、たとえば人体に存在するものとは異なる分子を指す。それらは「修飾ＲＮＡ」と呼ばれるが、もちろん、修飾のために、厳密に言えば、ＲＮＡではない分子を含む。ヌクレオシド代替物は、リボリン酸骨格が非リボリン酸構築物で置換されている分子であり、これにより、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格で見られるもの、たとえば、非荷電リボリン酸骨格模倣物と実質的に類似するように、塩基が正しい空間的関係で提示されることが可能になる。
【０２８６】
本発明の核酸の修飾は、リン酸基、糖基、骨格、Ｎ末端、Ｃ末端、または核酸塩基のうちの一つまたは複数に存在しうる。
【０２８７】
本発明はまた、本発明の単離された核酸が挿入されるベクターを含む。当技術分野は、本発明において有用である好適なベクターで満ちている。
【０２８８】
簡単に言えば、タンパク質阻害剤をコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的には、タンパク質阻害剤またはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。使用するベクターは、真核細胞での複製および任意での組み込みに好適である。典型的なベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含む。
【０２８９】
本発明のベクターはまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化および遺伝子治療に使用することができる。遺伝子送達の方法は当技術分野で知られている。たとえば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０２９０】
本発明の単離された核酸は、いくつかのタイプのベクターにクローニングすることができる。たとえば、上記核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターを含む。
【０２９１】
さらに、ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されうる。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびその他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも一つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および一つまたは複数の選択可能なマーカーを含む（たとえば、国際公開第０１／９６５８４；国際公開第０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０２９２】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスベースの系が開発されてきた。たとえば、レトロウイルスは遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野で知られている技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが当技術分野で知られている。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当技術分野で知られている。一つの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【０２９３】
たとえば、レンチウイルス等のレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定した組み込みおよび娘細胞でのその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成するための好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞等の非増殖細胞に形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルス等の腫瘍レトロウイルスに由来するベクターよりも優れている。それらはまた、免疫原性が低いという追加の利点を有する。一つの実施形態では、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、様々な障害の治療のための強力な遺伝子送達ツールになっている。ＡＡＶベクターは、病原性の欠如、最小限の免疫原性、および安定した効率的な方法で有糸分裂後の細胞を形質導入する能力を含む、遺伝子治療に理想的に好適なものにする多くの機能を備えている。ＡＡＶベクター内に含まれる特定の遺伝子の発現は、ＡＡＶ血清型、プロモーター、および送達方法の適切な組み合わせを選択することにより、一つまたは複数のタイプの細胞を特異的に標的にすることができる。
【０２９４】
一部の実施形態では、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、または本発明によって産生されたウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および／または発現を可能にする方法で導入遺伝子に作動可能に連結される従来の調節エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスまたは少し離れて作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、たとえばスプライシングおよびポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および必要に応じて、コードされた産物の分泌を促進する配列を含む。天然、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターを含む多数の発現制御配列が当技術分野で知られており、利用することができる。
【０２９５】
追加のプロモーターエレメント、たとえばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが示されている。プロモーター領域間の間隔はしばしばフレキシブルであるため、領域が互いに反転または移動したときにプロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーター領域間の間隔を５０ｂｐ離すことができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協調的または独立して機能し、転写を活性化できるようである。
【０２９６】
好適なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ；ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ルース肉腫ウイルスプロモーター、ならびにたとえばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない他の構成的プロモーター配列も使用できる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれるときにそれが作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が望まれないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０２９７】
ベクターに見られるエンハンサー配列も、そこに含まれる遺伝子の発現を調節する。通常、エンハンサーはタンパク質因子と結合して遺伝子の転写を増強する。エンハンサーは、それが調節する遺伝子の上流または下流に位置してもよい。エンハンサーはまた、特定の細胞または組織型における転写を増強するために組織特異的であってもよい。一つの実施形態では、本発明のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写を促進するための一つまたは複数のエンハンサーを含む。
【０２９８】
タンパク質阻害剤の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子、またはその両方を含み、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることができる。他の態様では、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片で運ばれ、同時トランスフェクション手順で使用できる。選択可能なマーカーおよびとレポーター遺伝子の両方に適切な調節配列を隣接させて、宿主細胞での発現を可能にすることができる。有用な選択可能なマーカーは、たとえば、ｎｅｏ等の抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０２９９】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定し、調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織に存在しないか、または発現されない遺伝子であり、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、たとえば酵素活性によって示されるポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時期にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｅ．ｇ．，  Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）をコードする遺伝子を含んでもよい。好適な発現システムは周知であり、既知の技術を使用して調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動型転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用することができる。
【０３００】
遺伝子を細胞に導入および発現する方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターの文脈で、ベクターは、当技術分野の任意の方法によって、宿主細胞、たとえば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。たとえば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。
【０３０１】
ペプチドまたはタンパク質を宿主細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を含む。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野で周知である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０３０２】
目的のペプチドまたはタンパク質を宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、たとえばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス等に由来してもよい。たとえば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０３０３】
ペプチドまたはタンパク質を宿主細胞に導入するための化学的手段は、コロイド分散系、たとえば巨大分子複合体、ナノカプセル、微粒子、ビーズ、および脂質ベースの系、たとえば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（たとえば、人工膜小胞）である。
【０３０４】
非ウイルス送達系を利用する場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞への核酸の導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ）のために脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は脂質と結合しうる。脂質に結合する核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームの脂質二重層内に分散し、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に結合する連結分子を介してリポソームに付着し、リポソームに封入され、リポソームと複合体を形成し、脂質を含む溶液に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質に懸濁液として含まれ、ミセルに含まれ、もしくはミセルとの複合体が形成され、または他の方法で脂質と結合されてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。たとえば、それらは、ミセルとして、または「崩壊した」構造を有する二層構造で存在してもよい。それらはまた、単に溶液中に分散し、大きさまたは形状が均一でない凝集体を形成してもよい。脂質は、天然に存在する脂質または合成脂質であってもよい脂肪性物質である。たとえば、脂質は、細胞質に自然に存在する脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、たとえば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドを含む化合物のクラスを含む。使用に好適な脂質は、商業的供給源から入手することができる。たとえば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、ミズーリ州セントルイスのシグマから入手することができる；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州プレインビュー）から入手することができる；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができる；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ．（アラバマ州バーミンガム）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存できる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単一および多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を備えた小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配列し、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。たとえば、脂質はミセル構造をとるか、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在しうる。リポフェクタミン−核酸複合体も企図される。
【０３０５】
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを行うことができる。そのようなアッセイは、たとえば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、たとえばサザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；たとえば例として免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）によって、または本発明の範囲内にある薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって、特定のポリペプチドの存在または不在を検出する「生化学的」アッセイを含む。
【０３０６】
一つの実施形態では、本発明は、タンパク質阻害剤、またはタンパク質阻害剤をコードする核酸分子を含む送達ビヒクルを提供する。例示的な送達ビヒクルは、微粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、リポソーム、およびミセルを含むが、これらに限定されない。たとえば、一部の実施形態では、送達ビヒクルは、タンパク質阻害剤、またはタンパク質阻害剤をコードする核酸分子を搭載している。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、その搭載されたカーゴの制御放出、遅延放出、または連続的放出を提供する。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、送達ビヒクルを治療部位に標的化する標的化部分を含む。
【０３０７】
一つの実施形態では、本発明は、タンパク質阻害剤またはタンパク質阻害剤をコードする核酸分子を含む移植可能なスキャフォールドまたはデバイスを提供する。たとえば、一部の実施形態では、本発明は、ヒドロゲル、エレクトロスピニングされたスキャフォールド、ポリマーマトリックス等を含むがこれらに限定されない、スキャフォールド中またはスキャフォールド上にタンパク質阻害剤またはタンパク質阻害剤をコードする核酸分子を含む組織工学スキャフォールドを提供する。
【０３０８】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載の組成物の一つまたは複数を含む医薬組成物を提供する。製剤は、従来の賦形剤、すなわち、治療部位への投与に好適な薬学的に許容される有機または無機の担体物質との混合物として使用することができる。医薬組成物は滅菌されてもよく、そして必要に応じて、助剤、たとえば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝液に影響を与えるための塩、着色剤、および／または芳香剤等と混合されてもよい。それらはまた、必要に応じて、他の活性剤、たとえば、他の鎮痛剤と組み合わせることができる。
【０３０９】
本発明の組成物の投与は、たとえば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内注射によって、または注入によって、または他の任意の許容される全身的方法によって行うことができる。
【０３１０】
本明細書で使用される場合、「追加の成分」は、以下のうちの一つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；着色剤；防腐剤；生理学的に分解可能な組成物、たとえばゼラチン；水性ビヒクルおよび溶媒；油性ビヒクルおよび溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；バッファー；塩；増粘剤；フィラー；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；および薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれうる他の「追加の成分」は、当技術分野で知られており、たとえば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎａｒｏ，  ｅｄ．  （１９８５，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）に記載されている。
【０３１１】
本発明の組成物は、組成物の総重量で約０．００５重量％から２．０重量％の防腐剤を含んでもよい。防腐剤は、環境中の汚染物質にさらされた場合の腐敗を防ぐために使用される。本発明に従って有用な防腐剤の例は、以下の群から選択されるものが含まれるが、これらに限定されない：ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素、およびそれらの組み合わせ。
【０３１２】
一つの実施形態では、組成物は、組成物の一つまたは複数の成分の分解を阻害する抗酸化剤およびキレート剤を含む。いくつかの化合物のための例示的な抗酸化剤は、ＢＨＴ、ＢＨＡ、α−トコフェロール、およびアスコルビン酸である。例示的なキレート剤は、エデト酸塩（たとえば、エデト酸二ナトリウム）、およびクエン酸を含む。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に有害である可能性がある組成物中の金属イオンをキレート化するのに有用である。ＢＨＴおよびエデト酸二ナトリウムは、それぞれ、いくつかの化合物の抗酸化剤およびキレート剤でありうるが、他の好適かつ同等の抗酸化剤およびキレート剤は、したがって、当業者に知られているように置換することができる。
【０３１３】
液体懸濁液は、従来の方法を使用して調製して、水性または油性ビヒクル中で本発明の化合物または他の組成物の懸濁液を達成することができる。水性ビヒクルは、たとえば、水、および等張食塩水を含む。油性ビヒクルは、たとえば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、たとえば落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはココナッツ油、分画植物油、および鉱物油、たとえば液体パラフィンを含む。液体懸濁液は、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、防腐剤、バッファー、塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含むがこれらに限定されない、一つまたは複数の追加の成分をさらに含んでもよい。油性懸濁液は、増粘剤をさらに含んでもよい。既知の懸濁剤は、ソルビトールシロップ、水素化食用油脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、およびセルロース誘導体、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むが、これらに限定されない。既知の分散剤または湿潤剤は、天然に存在するリン脂質、たとえばレシチン、アルキレンオキシドと脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸に由来する部分エステル、およびヘキシトール、または脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステル（たとえば、それぞれステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）との縮合生成物を含むが、これらに限定されない。既知の乳化剤は、レシチン、およびアラビアゴムを含むが、これらに限定されない。既知の防腐剤は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルパラヒドロキシ安息香酸、アスコルビン酸、およびソルビン酸を含むが、これらに限定されない。
【０３１４】
ＴＲＥＭおよびＴＲＥＭＬシグナル伝達を抑制する方法
一つの態様では、本発明は、ＴＲＥＭおよびＴＲＥＭＬシグナル伝達を阻害する方法を提供する。たとえば、本明細書に記載の阻害剤の投与は、ＴＲＥＭおよびＴＲＥＭＬを介したシグナル伝達を低減し、炎症を低減することが本明細書に示されている。
【０３１５】
本明細書に記載の組成物は、対象または生命システム（たとえば、細胞、細胞集団、組織、器官、または別の系）に導入して、対象においてまたは生命システムにおいて、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬシグナル伝達を阻害するか、炎症を軽減するか、または炎症性、または自己免疫性の疾患または障害を治療することができる。
【０３１６】
治療法
本発明は、それを必要とする対象における炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害の治療または予防のための方法を提供する。本発明の方法は、異常なＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬ活性を特徴とする任意の疾患または障害を治療または予防するために使用することができる。
【０３１７】
本発明の方法によって治療または予防できる炎症性、自己炎症性、および自己免疫性の疾患および障害の例は、全身性炎症反応症候群、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、重症敗血症、敗血症性ショック、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、原発性および続発性マクロファージ活性化症候群、原発性および続発性血球貪食性リンパ組織球症、サイトカイン放出症候群、サイトカインストーム症候群、腫瘍崩壊症候群、成人発症スティル病、経皮的または外科的血管再生に起因するもの等の虚血再灌流障害、塞栓性疾患、血管攣縮性疾患、血管炎疾患、末梢血管疾患、低灌流状態、脳卒中または心筋梗塞、急性呼吸促迫症候群、喘息、アレルギー性疾患、アナフィラキシー、脳炎、クローン病および潰瘍性大腸炎を含むがこれらに限定されない炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺疾患、非特異的間質性肺炎、特発性器質化肺炎、アレルギー性疾患、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、炎症性骨溶解症、乾癬、脳マラリア、関節炎、たとえば関節リウマチ、毛包炎、膿痂疹、肉芽腫、リポイド肺炎、血管炎、変形性関節症、慢性ウイルスまたは細菌感染に起因する神経変性疾患および慢性炎症、インスリン依存性真性糖尿病（または１型糖尿病）、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満関連症候群、インスリン自己免疫症候群、関節リウマチ、乾癬性関節炎、慢性ライム関節炎、全身性エリテマトーデス、混合結合組織疾患、未分化結合組織疾患、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、セリアック病、橋本甲状腺炎およびグレーブス病を含む自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性心筋炎、自己免疫性肝炎、天疱瘡、抗尿細管基底膜疾患（ａｎｔｉ−ｔｕｂｕｌａｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ；腎臓）、家族性拡張型心筋症、肥大性心筋症、たこつぼ心筋症（Ｔａｋｔｓｕｂｏ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｈｙ）、グッドパスチャー症候群、シェーグレン症候群、重症筋無力症、多腺性機能不全（ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｆａｉｌｕｒｅ）、白斑、末梢神経障害、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、急性糸球体腎炎、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、全頭脱毛症、アジソン病、慢性ベリリウム症、強直性脊椎炎、若年性皮膚筋炎、多発性軟骨炎、強皮症、限局性腸炎、遠位回腸炎（ｄｉｓｔａｌ  ｉｌｅｉｔｉｓ）、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎（ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｉｌｅｉｔｉｓ）、および回腸末端炎、あらゆる病因由来の膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ  ｆｒｏｍ  ａｎｙ  ｅｔｉｏｌｏｇｙ）、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ベーチェット病、セリアック病、慢性活動性肝炎、ＣＲＥＳＴ症候群および全身性硬化症（ｓｙｓｔｅｎｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、皮膚筋炎、多腺性筋炎、壊死性筋炎（ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｍｙｏｓｉｔｉｄｅｓ）、好酸球増多筋痛症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙａｎｇｉｉｔｉｓ）、ＡＮＣＡ関連血管炎、ＡＮＣＡ陰性血管炎（ＡＮＣＡ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）、後天性表皮水疱症、表皮水疱症（ＥＢＡ）、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、ヘモクロマトーシス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、特発性ＩｇＡ腎症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ＩｇＡ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、インスリン自己免疫症候群、若年性関節リウマチ、ランバート・イートン症候群、線形ＩｇＡ皮膚症（ｌｉｎｅａｒ  ＩｇＡ  ｄｅｒｍａｔｏｓｉｓ）、ナルコレプシー、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、周期熱、ネフローゼ症候群、類天疱瘡、天疱瘡、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、乾癬、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）、ライター症候群、スティフマン症候群、毛細管漏出症候群、変形性関節症、同種移植片拒絶等の移植片拒絶反応、あらゆる病因由来のアテローム性動脈硬化症等を含むが、これらに限定されない。
【０３１８】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、免疫抑制剤、ステロイド、生物学的療法等を含むがこれらに限定されない、疾患に関連する他の治療薬または予防薬と同時投与される。
【０３１９】
一つの態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物を対象に投与することにより、対象において疾患または障害を予防するための方法を提供する。たとえば、任意の診断または予後アッセイによって特定された疾患または障害のリスクがある対象。予防薬の投与は、疾患または障害の進行を予防または遅延させるように、疾患または障害に特徴的な症状が現れる前に行うことができる。
【０３２０】
本発明の別の態様は、治療目的のために一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞または対象を、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の発現または活性を調節する本明細書に記載の組成物と接触させることを含む。
【０３２１】
一部の実施形態では、方法は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性の疾患または障害と診断された、その疑いがある、または発症するリスクのある対象に、本明細書に記載の組成物の有効量を投与することを含む。一部の態様では、組成物は、状態が存在するか、または発症するリスクがある細胞または組織に接触させられる。一つの実施形態では、組成物は、対象に全身投与される。
【０３２２】
本発明の組成物は、多種多様な方法で、必要とする患者または対象に投与することができる。投与方法は、術中の静脈内、血管内、筋肉内、皮下、脳内、腹腔内、軟組織注射、外科的配置、関節鏡による配置、および経皮的挿入、たとえば、直接注射、カニューレ挿入またはカテーテル挿入を含む。任意の投与は、発明の組成物の単回投与または反復投与であってもよい。投与は、治療される個人の単一部位または複数部位に対するものであってもよい。反復投与は、本質的に同時に行われてもよく、時間的に分離されてもよい。
【０３２３】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、疾患または障害の別の治療の前、最中、または後に投与される。一つの実施形態では、本発明の組成物は、抗生物質の投与、ならびに敗血症の治療のための昇圧剤および機械的換気の使用の前、最中、または後に投与される。
【０３２４】
本発明の医薬組成物の投与が企図される対象は、ヒトおよび他の霊長類、商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物、たとえば非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌを含むが、これらに限定されない。
【０３２５】
本発明の医薬組成物は、治療（または予防）される疾患に適切な方法で投与することができる。投与の量および頻度は、対象の状態、ならびに対象の疾患の種類および重症度等の要因によって決定されるが、適切な用量は臨床試験によって決定されてもよい。
【０３２６】
「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、疾患の種類、疾患の程度、および状態の個人差を考慮して、医師によって決定されてもよい。
【０３２７】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含む、任意の便利な方法で実施することができる。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、髄内、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内に患者に投与することができる。一つの実施形態では、本発明の組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与によって投与される。
【０３２８】
本発明を実施するのに有用な医薬組成物は、１  ｎｇ／ｋｇ／日および１００  ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与することができる。一つの実施形態では、本発明は、哺乳動物において本発明の化合物の濃度が１μＭ〜１０μＭ（ｆｒｏｍ  １  μＭ ａｎｄ  １０  μＭ）になる用量の投与を想定している。
【０３２９】
典型的には、本発明の方法で哺乳動物に投与されうる用量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり０．５  μｇから約５０  ｍｇの量の範囲であり、一方、投与される正確な用量は、哺乳動物の種類および治療される病状の種類、哺乳動物の年齢および投与経路を含むがこれらに限定されない、任意の数の要因に応じて変化する。一つの実施形態では、用量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり約１  μｇから約５０  ｍｇまで変化するであろう。一つの実施形態では、用量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり約１  ｍｇから約１０  ｍｇまで変化するであろう。
【０３３０】
化合物は、哺乳動物に１日数回の頻度で投与することができ、またはより少ない頻度、たとえば１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、またはさらにより少ない頻度、たとえば数ヶ月に１回、または年に一度以下で投与することができる。投与の頻度は、当業者には容易に明らかであり、治療される疾患の種類および重症度、哺乳動物の種類および年齢等であるがこれらに限定されない、任意の数の要因に依存するであろう。
【０３３１】
本発明の核酸またはペプチド阻害剤の対象への投与は、遺伝子治療を使用して達成することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ技術によって細胞に治療遺伝子を挿入することに基づく遺伝子治療。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療に好適なベクターおよび方法が記載されており、この問題の専門家として知られている；たとえば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２  （１９９６），  ５３４−５３９；  Ｓｃｈａｐｅｒ，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ  ７９  （１９９６），  ９１１−９１９；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６  （１９９２），  ８０８−８１３；  Ｉｓｎｅｒ，  Ｌａｎｃｅｔ  ３４８  （１９９６），  ３７０−３７４；  Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ  ７７  （１９９５），  １０７７−１０８６；  Ｗａｎｇ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２  （１９９６），  ７１４−７１６；  国際公開第９４／２９４６９号；国際公開第９７／００９５７号、またはＳｃｈａｐｅｒ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７  （１９９６），  ６３５−６４０、およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、直接挿入するために、またはリポソームまたはウイルスベクター（たとえば、アデノウイルスまたはレトロウイルスベクター）を介して細胞に挿入するために設計することができる。一つの実施形態では、細胞は、生殖系列の細胞、胚性細胞または卵細胞であるか、またはそれらに由来する。場合によっては、セルはコアセルである。本発明に従って使用することができる好適な遺伝子分配システム（ｇｅｎｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）は、リポソーム、受容体によって媒介される分配システム、裸のＤＮＡ、およびウイルスベクター、たとえばヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含んでもよい。遺伝子治療のための体内の特定部位への核酸の分配は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８  （１９９１），  ２７２６−２７２９）によって記載されるようなバイオリスティック分配システムを使用することによっても達成することができる。ＤＮＡを組換えて細胞をトランスフェクトするための標準的な方法は、分子生物学の研究対象に関する専門家に周知である。たとえば、国際公開第９４／２９４６９を参照されたい；上記も参照されたい。遺伝子治療は、組換えＤＮＡ分子または本発明のベクターを患者に直接投与するか、または細胞をポリヌクレオチドまたは本発明のベクターでｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を患者に投与することによって実施することができる。
【０３３２】
診断方法
一つの態様では、本発明は、対象のサンプル中の一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の一つまたは複数のリガンドの存在または存在量を検出することによって、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を有するとして対象を検出または診断する方法を提供する。たとえば、特定の実施形態では、方法は、対象のサンプル中のネクロトーシス細胞に由来または放出されたミトコンドリアの存在または存在量を検出することを含む。一つの実施形態では、方法は、対象のサンプル中のカルジオリピンの存在または存在量を含む。一つの実施形態では、ネクロトーシス細胞に由来または放出されるカルジオリピンまたはミトコンドリアの存在の検出は、本明細書の他の場所で説明されるように、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の阻害剤によって治療可能な炎症性、自己炎症性、または自己免疫障害を有するとして対象を特定する。
【０３３３】
特定の実施形態では、方法は、対象のサンプル中のミトコンドリアの検出を含む。一部の実施形態において、ミトコンドリアは、分画遠心法、免疫沈降、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を含むがこれらに限定されない好適な精製または分離技術を使用してサンプルから単離される。一部の実施形態では、方法は、一つまたは複数のミトコンドリア関連マーカー、たとえばミトコンドリア膜タンパク質またはリン脂質を検出することを含む。サンプル中のミトコンドリアの存在または存在量を検出するために使用することができる例示的なミトコンドリア関連マーカーは、ＶＤＡＣ、ＴＯＭＭ２０、ＴＯＭＭ２２、ＴＯＭＭ４０、ＨＳＰ６０、ＣＯＸＩＶ、シトクロムＣ等を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、方法は、ミトコンドリアを特異的に染色する試薬または色素を投与することを含む。ミトコンドリアを染色するための例示的な試薬および色素は、ＪＣ−１、ＪＣ−９、ローダミン１２３、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）等を含むが、これらに限定されない。
【０３３４】
特定の実施形態では、方法は、ネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアの存在または存在量を検出することを含む。たとえば、一つの実施形態では、方法は、ネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアに特異的なマーカーを検出することを含み、それにより、これらのミトコンドリアを、正常細胞、生細胞、またはアポトーシス細胞に関連するミトコンドリアから区別する。
【０３３５】
特定の実施形態では、方法は、本明細書の他の場所に記載の標識タンパク質試薬を介して、ネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のカルジオリピンまたはミトコンドリアの検出を介して、ネクロトーシス細胞を検出することを含む。たとえば、本明細書の他の場所に記載されるように、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む標識タンパク質試薬を使用して、ネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のカルジオリピンまたはミトコンドリアを検出することができ、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、ＲＥＡＰ−ｓｅｑ、蛍光顕微鏡、免疫組織化学、イムノアッセイ等を含むがこれらに限定されない様々なアッセイで使用することができる。
【０３３６】
一つの実施形態では、方法は、対象のサンプル中のカルジオリピンの存在または存在量を検出することを含む。特定の実施形態では、カルジオリピンは、カルジオリピンに特異的に結合する抗体、抗体断片、またはプローブによって検出され、様々なイムノアッセイ、たとえばウエスタンブロット、免疫沈降、およびラジオイムノアッセイで使用することができる。分析されるタンパク質は、細胞内（最も一般的には蛍光顕微鏡法または免疫組織化学の適用）または細胞外（最も一般的にはＥＬＩＳＡ等の免疫測定法の適用）に局在化しうる。
【０３３７】
生物学的サンプルは、任意の生物学的組織または体液のものであってもよい。多くの場合、サンプルは患者から得られたサンプルである「臨床サンプル」になる。生物学的サンプルは、所望のバイオマーカーを検出するのに好適な任意の生物材料を含んでもよく、そして個体から得られた細胞性および／または非細胞性材料を含んでもよい。例示的な生物学的サンプルは、血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、涙液、脳脊髄液、喀痰、泌尿生殖器分泌物、化膿性分泌物、便、関節内（関節）液等を含むが、これらに限定されない。
【０３３８】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるマーカー（たとえば、ネクロトーシス細胞に由来または放出されるカルジオリピンまたはミトコンドリア）のレベルは、対照群におけるマーカーのレベルと比較される。たとえば、一つの実施形態では、マーカーのレベルは、健康な対象の個人または集団におけるメーカーのレベルと比較される。一つの実施形態では、マーカーのレベルは、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を有さないことが知られている対象の個体または集団におけるマーカーのレベルと比較される。一つの実施形態では、マーカーのレベルは、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害の既知の重症度を有する対象の個体または集団におけるマーカーのレベルと比較される。一つの実施形態では、マーカーのレベルは、より早い時点で対象から得られたサンプル中のマーカーのレベルと比較される。たとえば、一つの実施形態では、マーカーのレベルは、治療レジメンが開始される前に得られたサンプル中のマーカーのレベルと比較される。
【０３３９】
以下に説明するように、検査されるサンプルのマーカーのレベルと対照のマーカーのレベルの比較は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を診断する；炎症性、自己炎症性、または自己免疫疾患の進行をモニターする；特定の治療に好適な対象を特定または分類するか、または治療に対する反応を評価するために使用できる。場合によっては、対照群は、本発明のアッセイの初期カットオフまたは閾値を確立することのみを目的としている。したがって、場合によっては、本発明の系および方法は、対照群と比較する必要なしに、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を診断、モニター、または分類することができる。
【０３４０】
したがって、本発明は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を有する、または炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を発症するリスクがある対象を特定する方法を特徴とし、本明細書に開示されるバイオマーカーの検出による炎症性、自己炎症性、または自己免疫障害の無症候性または非特異的指標のみを示す対象を含む。
【０３４１】
これらのバイオマーカーは、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性疾患の治療や治療を受けている対象をモニターする；および炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を有する対象に有効である治療法および治療法を選択または変更するのにも役立つ。ここで、このような治療法および治療法の選択および使用は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害の進行を遅らせるか、またはその発症を予防する。特定の実施形態では、バイオマーカーは、対象が、抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、免疫抑制剤、ステロイド、生物学的療法等を含むがこれらに限定されない、障害に関連する例示的な治療薬または予防薬によって治療可能な炎症性、自己炎症性、または自己免疫障害を有するかどうかを特定するために使用される。特定の実施形態では、バイオマーカーは、本明細書の他の場所に記載されるように、対象が一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の阻害剤によって治療できるＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬ関連炎症を有するかどうかを特定するために使用される。
【０３４２】
本発明は、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害の診断および予後のための改良された方法を提供する。炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を発症するリスクは、本明細書に記載のバイオマーカーの一つまたは複数を測定し、測定値をコンパレーター値（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ  ｖａｌｕｅ）、参照値、または指標値と比較することによって評価できる。このような比較は、複数の個別のバイオマーカーおよびその他のパラメーターの結果からの情報を単一の測定値または指標に結合するために、数学的アルゴリズムまたは式を使用して行うことができる。炎症性、自己炎症性、または自己免疫障害のリスクが高いと特定された対象は、本明細書に記載の一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の一つまたは複数の阻害剤を含むがこれらに限定されない予防薬または治療薬等の治療レジメンを受けることを任意選択で選択することができる。
【０３４３】
炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を発症する前に対象を特定することにより、対象の病状への転換を遅らせる、減少する、または予防するためのさまざまな治療的介入または治療レジメンの選択および開始が可能になる。少なくとも一つのバイオマーカーのレベルをモニターすることにより、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害の治療過程をモニターすることもできる。たとえば、サンプルは、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害の治療レジメンまたは治療的介入を受けている対象から提供することができる。サンプルは、治療前、治療中、または治療後の様々な時点で対象から取得できる。
【０３４４】
本発明はまた、特定の対象に適切であるか、そうでなければカスタマイズされた、炎症性、自己炎症性、または自己免疫性障害を治療または予防するための薬剤を特定するための方法を提供する。これに関して、治療薬または薬物に曝露された対象由来の試験サンプルを採取することができ、一つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定することができる。一つまたは複数のバイオマーカーのレベルは、治療の前後の対象に由来するサンプルと比較することができ、またはそのような治療または曝露の結果としてリスク因子の改善を示した一つまたは複数の対象に由来するサンプルと比較することができる。
【０３４５】
試薬
一つの態様では、本発明は、ネクロトーシス細胞またはネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアを検出するための組成物および方法を提供する。たとえば、特定の実施形態では、組成物は、本明細書の他の場所に記載されるように、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含むタンパク質試薬を含み、ここでペプチドは、ネクロトーシス細胞またはネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアに結合する。特定の実施形態では、タンパク質試薬は、検出可能な標識に融合されるか、さもなければ結合され、タンパク質が、イムノアッセイ、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、免疫蛍光法等を含むがこれらに限定されない好適なアッセイで使用されることを可能にする。例示的な標識は、蛍光分子（たとえば、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン、アロフィコシアニン等）、蛍光色素、安定金属同位体、オリゴヌクレオチドバーコード、タンパク質タグ（たとえば、ストレプトアビジン、Ｈｉｓタグ）、酵素（たとえば、ＨＲＰ、ルシフェラーゼ等）、化学ハプテン（たとえば、ビオチン、ＤＮＰ、ＰＥＧ、アジド、アルキン（クリックケミストリー用））等を含むが、これらに限定されない。
【０３４６】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む。一部の実施形態では、タンパク質試薬は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインの断片またはバリアントを含む。組成物は、たとえば、任意の生物由来のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質外部ドメインの任意のアイソフォーム由来の外部ドメインを含んでもよい。一つの実施形態では、組成物は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の全長外部ドメインを含む。一つの実施形態では、組成物は、ＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の組換え外部ドメインを含む。
【０３４７】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、ヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：１のアミノ酸配列、またはそのバリアントまたは断片を含む。
【０３４８】
一部の実施形態では、タンパク質試薬は、一つまたは複数の変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。たとえば、一部の実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｋ７１、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｋ７８、Ｋ８６、Ｔ９５、Ｇ１５６、およびＨ１６０から選択される一つまたは複数の残基に一つまたは複数の変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。
【０３４９】
一部の実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５Ｘ、Ｌ６５Ｘ、Ｌ６６Ｘ、Ｓ６９Ｘ、Ｋ７１Ｘ、Ｋ７８Ｘ、Ｋ８６Ｘ、Ｔ９５Ｘ、Ｇ１５６Ｘ、およびＨ１６０Ｘから選択される一つまたは複数の変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対して、Ｔ３５Ｓ、Ｌ６５Ｒ、Ｌ６６Ｖ、Ｓ６９Ｔ、Ｋ７１Ｅ、Ｋ７８Ｅ、Ｋ８６Ｄ、Ｔ９５Ｋ、Ｇ１５６Ｅ、およびＨ１６０Ｄから選択される一つまたは複数の変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。
【０３５０】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｋ８６Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＫ８６Ｄ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄの外部ドメインは、配列番号：２のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５１】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｌ６５Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＬ６５Ｒ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒの外部ドメインは、配列番号：３のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５２】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｋ７１Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＫ７１Ｅ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７１Ｅ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７１Ｅの外部ドメインは、配列番号：４のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５３】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｔ９５Ｋ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＴ９５Ｋ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ９５Ｋ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ９５Ｋの外部ドメインは、配列番号：５のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５４】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｔ３５Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＴ３５Ｓ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ３５Ｓ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ３５Ｓの外部ドメインは、配列番号：６のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５５】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｌ６６Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＬ６６Ｖ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６６Ｖ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６６Ｖの外部ドメインは、配列番号：７のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５６】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｓ６９Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＳ６９Ｔ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｓ６９Ｔ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｓ６９Ｔの外部ドメインは、配列番号：８のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５７】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｋ７８Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＫ７８Ｅ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７８Ｅ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７８Ｅの外部ドメインは、配列番号：９のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５８】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｇ１５６Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＧ１５６Ｅ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｇ１５６Ｅ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｇ１５６Ｅの外部ドメインは、配列番号：１０のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３５９】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、Ｈ１６０Ｘ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＨ１６０Ｄ変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｈ１６０Ｄ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｈ１６０Ｄの外部ドメインは、配列番号：１１のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３６０】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＬ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ三重変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄの外部ドメインは、配列番号：１２のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３６１】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、全長野生型ヒトＴＲＥＭＬ４に対するＬ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋ四重変異を含むヒトＴＲＥＭＬ４（ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋ）の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋの外部ドメインは、配列番号：１３のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３６２】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、マウスＴＲＥＭＬ４の外部ドメインを含む。たとえば、マウスＴＲＥＭＬ４の外部ドメインは、配列番号：１４のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３６３】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、ヒトＴＲＥＭ２の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、配列番号：１５のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３６４】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、ヒトＴＲＥＭ１の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ＴＲＥＭ１の外部ドメインは、配列番号：１６のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３６５】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、ヒトＴＲＥＭＬ１の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ１の外部ドメインは、配列番号：１７のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３６６】
一つの実施形態では、タンパク質試薬は、ヒトＴＲＥＭＬ２の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、ＴＲＥＭＬ２の外部ドメインは、配列番号：１８のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３６７】
一部の実施形態では、タンパク質試薬は、第一のドメインおよび第二のドメインを含む融合タンパク質を含む。一つの実施形態では、第一のドメインは、一つまたは複数のＴＲＥＭまたはＴＲＥＭＬタンパク質の外部ドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、第一のドメインは、配列番号：１〜１８のいずれか一つ、またはそのバリアントもしくは断片によって提供される外部ドメインを含む。
【０３６８】
一つの実施形態では、第二のドメインは、融合タンパク質の安定性または半減期を増強するペプチドを含む。たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、赤血球細胞表面、または新生児Ｆｃ受容体に結合する免疫グロブリン、ＨＳＡ、またはペプチドもしくは抗体断片の少なくとも一つの領域を含む。一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリンの少なくとも一つの領域の断片またはバリアントを含む。たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。例示的な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ペプチドは、たとえば、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２９２（９）：  ３９００−３９０８；  Ｂｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２３：４０３−４１１；  Ｌｅａｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  ＭＡｂｓ，  ５：８９６−９０３；  Ｔａｏ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  １９８９，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４３：２５９５−２６０１；  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３４７−３５３；  Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４８：３４６１−３４６８；  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００：１６−２６；  Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ＮＡＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２５：１２５６−１２６４；  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＭＡｂｓ，  １：５７２−５７９；  Ｖａｆａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６５：１１４−１２６，およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ，  ９（１）：６３−７３（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されるように、エフェクター機能を低下させるための一つまたは複数の変異を含む免疫グロブリンを含む。
【０３６９】
一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。たとえば、一つの実施形態では、野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号：１９のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３７０】
一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。一部の実施形態では、ＦｃドメインはＦｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を低下させるように変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させるために、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３３１、Ｐ３２９またはＫ３３２のうちの一つまたは複数で変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｇ、およびＰ３３１Ｓのうちの一つまたは複数で変異している。ペプチドは、たとえばＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２９２（９）：  ３９００−３９０８；  Ｂｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２３：４０３−４１１；  Ｌｅａｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  ＭＡｂｓ，  ５：８９６−９０３；  Ｔａｏ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  １９８９，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４３：２５９５−２６０１；  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３４７−３５３；  Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４８：３４６１−３４６８；  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００：１６−２６；  Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２５：１２５６−１２６４；  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＭＡｂｓ，  １：５７２−５７９；およびＶａｆａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６５：１１４−１２６に記載されているように、Ｆｃ領域に一つまたは複数の変異を有するＩｇＧ１を含んでもよい。
【０３７１】
特定の実施形態では、ペプチドは、たとえば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １７７（２）：１１２９−１１３８に記載されるように、エフェクター機能を低下させるためにそのヒンジ領域に一つまたは複数の変異を含むＩｇＧ１ドメインを含む。
【０３７２】
一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を低下させるように変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ２のＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させるために、Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｖ２３４、Ｇ２３７、Ｐ２３８、およびＨ２６８のうちの一つまたは複数で変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、およびＨ２６８Ａのうちの一つまたは複数で変異している。
【０３７３】
一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体または補体を介してＦｃエフェクター機能を低下させるように変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させるために、Ｆ２３４およびＬ２３５のうちの一つまたは複数で変異している。たとえば、特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのうちの一つまたは複数で変異している。一つの実施形態では、第二のドメインは、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４クロスアイソタイプを含む。
【０３７４】
たとえば、一部の実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの脱グリコシル化バリアントを含む。一部の実施形態では、第二のドメインは、グリコシル化を防ぐためにＮ２９７が変異している、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む。一部の実施形態では、第二のドメインは、野生型全長ＩｇＧ１と比較して、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、またはＮ２９７Ｇ変異を含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む。
【０３７５】
たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含み、ここでバリアントはＮ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、Ｆｃドメインのバリアントは、配列番号：２０のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３７６】
たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含み、ここでバリアントはＮ２９７Ａ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、Ｆｃドメインのバリアントは、配列番号：２１のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３７７】
たとえば、一つの実施形態では、第二のドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含み、ここでバリアントはＮ２９７Ｇ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、Ｆｃドメインのバリアントは、配列番号：２２のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３７８】
一部の実施形態では、第二のドメインは、血清中の半減期の延長をもたらす変異を含むＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。一部の実施形態では、変異は、Ｆｃドメインと新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との会合を増加させる。一部の実施形態では、それらの突然変異は、「ＹＴＥ」三重突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を含む。一部の実施形態では、それらの変異は、「ＬＳ」二重変異（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含む。
【０３７９】
一部の実施形態では、第二のドメインは、エフェクター機能を除去または低下させ、およびＦｃドメインの半減期を延長する変異の組み合わせを含むＦｃドメインの断片またはバリアントを含む。たとえば、Ｎ２９７Ａ変異とＹＴＥ三重変異（「ＡＹＴＥ」）の組み合わせ、またはＮ２９７Ａ変異とＬＳ二重変異（「ＡＬＳ」）の組み合わせ。
【０３８０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、第一のドメインと第二のドメインを分離するリンカードメインを含む。一つの実施形態では、リンカードメインは、
【０３８１】
【化４７】
2021513969.tif 000048
【０３８２】
を含む。別の実施形態では、リンカードメインは、５マー（
【０３８３】
【化４８】
2021513969.tif 000049
【０３８４】
の一つまたは複数のリピートを含む。別の実施形態では、リンカードメインはＡＡＡを含む。
【０３８５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、分泌リーダー配列を含む。たとえば、一つの実施形態では、リーダー配列は、ＩｇＧ重鎖のリーダー配列に由来するＨ７リーダーペプチドを含む。一つの実施形態では、リーダー配列は、
【０３８６】
【化４９】
2021513969.tif 000050
【０３８７】
を含む。他の例示的なリーダーペプチドは、ＩｇＧカッパ軽鎖、ＩｇＧラムダ軽鎖、ヒト血清アルブミン由来のリーダーペプチド、およびインターロイキン２由来のリーダーペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０３８８】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭＬ４を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここで、Ｆｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：２６のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３８９】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：２７のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９０】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：２８のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９１】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７１Ｅを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：２９のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９２】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ９５Ｋを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３０のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９３】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｔ３５Ｓを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３１のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９４】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６６Ｖを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３２のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９５】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｓ６９Ｔを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３３のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９６】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ７８Ｅを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３４のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９７】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｇ１５６Ｅを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３５のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９８】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｈ１６０Ｄを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３６のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０３９９】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３７のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０４００】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋを含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３８のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０４０１】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、マウスＴＲＥＭＬ４を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：３９のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０４０２】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：４０のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０４０３】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ１を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：４１のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０４０４】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭＬ１を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：４２のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０４０５】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭＬ２を含む第一のドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのバリアントを含む第二のドメインを含み、ここでＦｃドメインは、グリコシル化部位Ｎ２９７Ｑ変異を含む。たとえば、一つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号：４３のアミノ酸配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０４０６】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有する任意のフォームのタンパク質バリアントを含むと解釈されるべきである。一つの実施形態では、タンパク質バリアントは、本明細書に開示されるアミノ酸配列に、少なくとも約５０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。
【０４０７】
本発明はまた、本明細書に開示される実質的な長さのアミノ酸配列を有する任意のフォームの断片を含むと解釈されるべきである。一つの実施形態では、断片は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の長さの少なくとも約５０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【０４０８】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ酸配列との実質的な相同性および実質的な長さの両方を有する、タンパク質バリアントの任意のフォームの断片を含むと解釈されるべきである。一つの実施形態では、タンパク質バリアントの断片は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であり、本明細書に開示されるアミノ酸配列の長さの約５０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【０４０９】
特定の実施形態では、タンパク質試薬は、検出可能な標識を含む。たとえば、一つの実施形態では、タンパク質試薬は、検出可能な標識に融合された、またはそうでなければ結合された上記のタンパク質を含む。一つの実施形態では、検出可能な標識は、造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ）、検出剤等を含む。
【０４１０】
造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、細胞または組織への曝露後に試薬を視覚化できるようにする物質である。視覚化は、肉眼でのイメージング、ならびに機器での検出もしくは通常は目に見えない情報の検出が必要なイメージングを含み、光子、音、またはその他のエネルギー量子の検出が必要なイメージングを含む。例は、染色剤、生体染色色素、蛍光マーカー、放射性マーカー、酵素、またはマーカーまたは酵素をコードするプラスミド構築物を含む。好適な造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、たとえば、蛍光分子、標識抗体、標識アビジン：ビオチン結合剤、コロイド金属（たとえば、金、銀）、レポーター酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、超常磁性トランスフェリン、第二のレポーターシステム（たとえば、チロシナーゼ）、および超常磁性キレートを含む。画像化および標的化のために使用することができる多くの材料および方法は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ，  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，  ｅｄ．  （１９９５）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａに提供されている。
【０４１１】
一部の実施形態では、造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、磁気共鳴イメージング造影剤（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ）である。磁気共鳴イメージング造影剤の例は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’Ｎ’’’−テトラエチルリン酸（ＤＯＴＥＰ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＤＯＴＡ）、およびそれらの誘導体（米国特許第５，１８８，８１６号、米国特許第５，２１９，５５３号および米国特許第５，３５８，７０４号を参照のこと）。一部の実施形態では、造影剤ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）はＸ線造影剤（Ｘ−Ｒａｙ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ）である。当技術分野で既知のＸ線造影剤は、５−アミノ−イソフタル酸の多くのハロゲン化誘導体、特にヨウ素化誘導体を含む。
【０４１２】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、たとえば、ネクロトーシス細胞またはネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアを検出するために使用することができるフローサイトメトリーアッセイにおいて使用される標識を含む。たとえば、特定の実施形態では、検出可能な標識は、蛍光分子、色素等を含む。一つの実施形態では、試薬の検出可能な標識は、二次標識された生体分子と相互作用して検出可能な複合体（すなわち、ビオチン−ストレプトアビジン複合体）を形成する生体分子を含む。
【０４１３】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、たとえば、ネクロトーシス細胞またはネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアを検出するために使用することができるマスサイトメトリーアッセイで使用される標識を含む。たとえば、特定の実施形態では、検出可能な標識は、安定金属同位体を含み、それにより、マスサイトメトリーアッセイにおける試薬の検出を可能にする。
【０４１４】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、蛍光顕微鏡において、ネクロトーシス細胞またはネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアを検出するために使用される、蛍光分子または色素等の蛍光標識を含む。例示的な蛍光標識は、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、フルオレセイン、ローダミン、エオシン、テキサスレッド、オレゴングリーン、ルシファーイエロー、シアニンおよびそれらの誘導体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標識製品群等を含むが、これらに限定されない。
【０４１５】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、ネクロトーシス細胞またはネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアを検出するために、配列決定によるトランスクリプトームおよびエピトープの細胞索引付け（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｄｅｘｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＣＩＴＥ−ｓｅｑ）（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １４：８６５−８６８）において使用されるオリゴヌクレオチドバーコードを含む。たとえば、一部の実施形態では、検出可能な標識は、様々なＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定技術によって検出されるオリゴヌクレオチドを含み、ここでオリゴヌクレオチドの検出は、試薬が、サンプル中のネクロトーシス細胞またはネクロトーシス細胞から放出されたまたは由来のミトコンドリアに結合したことを示す。
【実施例】
【０４１６】
実験例
以下の実験例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。これらの例は、説明のみを目的として提供されており、特に明記されていない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるすべての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０４１７】
これ以上の説明がなくても、当業者は、前述の説明および以下の例示的な例を使用して、本発明を作成および利用し、特許請求される方法を実施できると考えられる。したがって、以下の実施例は、本開示の残りの部分を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０４１８】
実施例１：  ＴＲＥＭＬ４およびＴＲＥＭ２外部ドメインは炎症を軽減する
ＴＲＥＭＬ４遺伝子は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）を認識するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）からのシグナルを増幅することによる、炎症の重要な調節因子であることが最近確認された。これらの経路は、疾患、たとえば敗血症ならびに炎症性および自己免疫疾患を媒介する炎症過程の主要な推進力であり、医薬品開発の主要な標的となる。ＴＲＥＭＬ４の機能は遺伝子モデルで確立されているが、この経路に対する薬剤はない。ＴＲＥＭＬ４受容体を操作できる最初に記載された薬理学的ツール（ＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ）が本明細書に記載されており、それは内毒素血症および敗血症のマウスモデルにおいて非常に強力な治療法である。
【０４１９】
今日まで、敗血症患者に大きな利益をもたらす治療薬はない。これらの臨床的失敗の潜在的理由は、敗血症が一度にいくつかの炎症経路を活性化する多因子性疾患であり、無数の下流の炎症誘発性エフェクターの産生をもたらすことである。これらの経路の一つ（たとえば、ＴＬＲ４／エンドトキシン）またはこれらのメディエーターの一つ（たとえば、ＴＮＦ−α）のみを標的とする薬剤は、効果がない可能性がある。全身感染に対する免疫応答を大域的に制御できる炎症のマスター調節ノードを特定することが望まれていた。
【０４２０】
マクロファージは炎症性サイトカインの主要な産生細胞であり、ＴＬＲの完全な補体を発現できるため、ＴＬＲアゴニストで順次刺激された骨髄由来マクロファージを比較するＲＮＡｓｅｑ実験を実施し、ＴＲＥＭＬ４を、過剰活性化マクロファージにおいて唯一上方制御される遺伝子として同定した。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、敗血症の動物モデルからｅｘ  ｖｉｖｏで採取されたマクロファージで検証された。ともに、これらの研究は、敗血症マウス由来のマクロファージにおいて有意に上方制御された遺伝子としてＴＲＥＭＬ４を明らかにした。
【０４２１】
ＴＲＥＭＬ４は、刺激型のＤＡＰ１２シグナル伝達サブユニットに結合するＴＲＥＭ様ファミリーの１回膜貫通タンパク質である。本明細書に提示された実験は、ＴＲＥＭＬ４が炎症の急性期における重要なフィードフォワード遺伝子である可能性があるかどうかを試験するために実施された。
【０４２２】
ＴＲＥＭＬ４外部ドメインがＴＲＥＭＬ４シグナル伝達の抑制性デコイ受容体として機能できるかどうかを試験した。したがって、ヒトおよびマウスの両方のＴＲＥＭＬ４外部ドメイン、ならびにＮ２９７Ｑ変異を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ断片に融合したＴｇ様スーパーファミリーフォールドを含むヒトＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭＬ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＥＭＬ２外部ドメインをクローニングし、発現させた。脱グリコシル化ｈＩｇＧ１Ｎ２９７Ｑバリアントを使用して、Ｆｃ部分が融合タンパク質に不要なエフェクター機能を与えることなく、血清半減期の延長のみを与えるようにした。他の変異、たとえばＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇは、Ｆｃ受容体および／または補体への結合を変化させるＦｃの追加の変異と同様に、類似した有効性を示す。構築物のアミノ酸配列は、本明細書の他の場所で提供される通りである。
【０４２３】
ＴＲＥＭ外部ドメインＦｃ融合タンパク質は、ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、製造元の指示を使用した一過性トランスフェクションによって発現され、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製された（図１Ａ）。分析サイズ排除クロマトグラフィーは、タンパク質の大部分が二量体Ｆｃ融合タンパク質の予想分子量で単分散溶出されたことを示した（図１Ｂ）。収量は１０  ｍｇ／Ｌの発現培地を超え、タンパク質はＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア）を使用して滅菌リン酸緩衝生理食塩水にバッファー交換された。敗血症におけるその有効性を試験するために、標準的なリポ多糖（ＬＰＳ）内毒素血症モデルが使用された。致死量１００（ＬＤ１００）のＬＰＳを８週齢のオスマウスに腹腔内投与した。最初に、ＬＰＳ敗血症からの保護を媒介する際のｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃタンパク質の異なる用量の治療活性が測定された（図２）。２時間後、体温の低下、運動活動、血漿グルコースの低下を含む、このモデルの既知の初期イベントを検証した後、１  ｍｇ／ｋｇまたは１０  ｍｇ／ｋｇ（実験＃１）または５  ｍｇ／ｋｇ（実験＃２）のｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃタンパク質を静脈内投与した。体温、血糖値、死亡率をモニターした。測定されたパラメーターにおいて、用量依存的な影響が認められた。次に、ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃの遅延投与が、ＬＤ１００用量のＬＰＳからマウスをレスキューするのに十分であるかどうかを試験した（図３）。投与された５  ｍｇ／ｋｇは、ＬＰＳ注射の６時間後に投与された。この時点で、このモデルのすべての既知の病原性メディエーターが全身的に放出された。遅延投与は体温の変化を逆転させ、ＬＰＳを介した死亡からマウスをレスキューするのに十分であることが観察された。
【０４２４】
ｍＴＲＥＭＬ４の特異性を決定するために、ｈＴＲＥＭ１、ｈＴＲＥＭＬ１、およびｈＴＲＥＭ２がマウスを内毒素血症からレスキューする能力も試験した（図４）。以前の実験と同様に、これらのタンパク質はＬＰＳ投与の６時間後に静脈内投与された。ｈＴＲＥＭ２およびｍＴＲＥＭＬ４は内毒素血症のマウスをレスキューすることができたが、他はレスキューできなかった。
【０４２５】
以前の研究は、ｍＴＲＥＭＬ４およびｍＴＲＥＭ２がネクローシス細胞に結合することを証明した（Ｈｅｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １８２（３）：１２７８−１２８６）。したがって、本構築物がネクローシス細胞に結合する能力を調査するために実験を行った。ｈＴＲＥＭ１、ｈＴＲＥＭＬ１、ｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ２、ｍＴＲＥＭＬ４、およびｈＴＲＥＭＬ４は、Ｆｃ（ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ）融合タンパク質として発現された。特に明記されていない限り、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）の非グリコシル化／脱グリコシル化バージョンをすべての研究に使用した。９５℃で１０分間の熱処理によって調製されたネクローシスｅｘｐｉ２９３細胞に結合するそれらの能力を評価するためにアッセイを実施した。結合は、抗ヒト二次抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価された。図５に示すように、ｈＴＲＥＭ２およびｍＴＲＥＭＬ４のみがネクローシス細胞に特異的に結合したが、生細胞には結合せず、これは内毒素血症の治療におけるそれらの有効性と相関している。
【０４２６】
ｈＴＲＥＭＬ４がネクローシス細胞に結合しない理由（そしておそらく内毒素血症に効果がない理由）を理解するために、ｈＴＲＥＭＬ４、ｍＴＲＥＭＬ４、およびｈＴＲＥＭ２のアミノ酸配列を比較した。興味深いことに、ｈＴＲＥＭＬ４は、ｈＴＲＥＭ２のアルツハイマー病（ＡＤ）変異に対応する位置、Ｌ６５、Ｋ７１、およびＫ８６においてｍＴＲＥＭＬ４とは異なることが観察された（図６）。ｈＴＲＥＭＬ４におけるこれらの位置がｍＴＲＥＭＬ４の対応する残基Ｌ６５Ｒ、Ｋ７１Ｅ、Ｋ８６Ｄに変異した構築物、およびＬ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄの三重変異体構築物を設計した。ｈＴＲＥＭ２では、ｈＴＲＥＭＬ４のＴ９５と同等の位置がリジンに変異すると、ＡＤリスクが低下する。したがって、この変異を含む構築物も設計された。図７に示すように、これらのｈＴＲＥＭＬ４バリアントのネクローシス細胞結合活性を評価すると、Ｋ８６Ｄ変異がネクローシス細胞結合活性を与えるのに十分であることが観察された。ネクローシス結合活性は、Ｌ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ／Ｔ９５Ｋの四重変異でもＬ６５Ｒ／Ｋ７１Ｅ／Ｋ８６Ｄ三重変異でも観察され、どちらもＫ８６Ｄを含んでいる。したがって、これらの結果は、ネクローシス細胞結合活性を与えるｈＴＲＥＭＬ４（Ｋ８６Ｄ）の新規で非自明な変異を明らかにしている。
【０４２７】
細胞はいくつかの方法でネクローシスを起こす可能性がある。一つの方法は、温度、浸透圧、力、ｐＨ、または化学的曝露による物理的損傷等による偶発的な細胞死である。細胞はまた、ネクロトーシス、ピロトーシス、またはフェロトーシス等を介して、プログラムされた炎症性ネクローシスを起こす可能性がある。図５および図７では、ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ、およびｈＴＲＥＭ２が熱殺菌された細胞に結合できることが示されている。これらの同じタンパク質が他のネクローシス細胞型に結合できるかどうかを確認するために、ネクロトーシスＬ９２９線維芽細胞（５０  ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α＋１０μＭ  ＭＺ−ＶＡＤ＋１  μｇ／ｍＬ  ＬＰＳで処理）およびネクロトーシスマウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用して同様の細胞結合研究を実施した。図８に示すように、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ、ｈＴＲＥＭ２、およびｍＴＲＥＭＬ４のみがこれらのネクロトーシス細胞に結合し、ｈＴＲＥＭＬ４ＷＴまたは対照ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）は結合しなかった。したがって、これらの結果は、ＴＲＥＭタンパク質が多様なネクローシス細胞に結合し、ｈＴＲＥＭＬ４がそのためにＫ８６Ｄ変異を必要とすることを立証している。
【０４２８】
受容体のＴＲＥＭおよびＴＲＥＭＬファミリーおよび異なる細胞死体の反応性の範囲をさらに明らかにするために実験を行った。図９に示すように、マウスＴＲＥＭおよびＴＲＥＭＬタンパク質のうち、ｍＴＲＥＭ２およびｍＴＲＥＭＬ４のみがネクロトーシス細胞死体に結合し、生細胞、アポトーシス細胞、ピロトーシス細胞、またはフェロトーシス細胞には結合しなかった。ｍＴＲＥＭ４  Ｄ９３Ｋの変異は、ｈＴＲＥＭＬ４と一致するように相互変異を行い、ネクロトーシス細胞への結合を無効にした。図１０に示すように、ｈＴＲＥＭ２およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄのみがネクロトーシス細胞に結合し、生細胞、アポトーシス細胞、ピロトーシス細胞を含む他のタイプの細胞には結合しなかった。ネクロトーシス経路での相互作用の特異性を検証すると、ｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ、およびｍＴＲＥＭＬ４のネクロトーシス細胞への結合は、ＴＮＦ−α＋ｚＶＡＤとのインキュベーション中にネクロスタチン−１でＲＩＰＫ１を阻害することによって無効にできることを見出した（図１１）。
【０４２９】
ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭ２、およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄがネクローシス細胞上の共有エピトープに結合するかどうかを特定するために、競合結合研究を行った。簡単に説明すると、ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃはアミン反応性色素ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−ＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ）と結合した。ネクローシスｅｘｐｉ２９３細胞をｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ−６４７コンジュゲートで染色し、様々な濃度の非標識ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭ２、ｈＴＲＥＭＬ４、およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ（すべてＦｃ融合タンパク質として）を滴定した。図１２に示すように、ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭ２、およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄは、ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ−６４７の細胞結合を強力に阻害し、ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４はしないことは、ｍＴＲＥＭＬ４、ｈＴＲＥＭ２、およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄがネクローシス細胞上の共有エピトープに結合することを示している。
【０４３０】
Ｋ８６Ｄ変異がｈＴＲＥＭＬ４へのネクローシス細胞結合を与えることを証明したので、それが敗血症の治療においてｈＴＲＥＭＬ４タンパク質に有効性を与えるかどうかを決定することが求められた。内毒素血症研究は、前述のものと同様に、ＬＰＳの腹腔内投与によって行われ、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃ（ｈＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ）は、敗血症からマウスをレスキューする際にｈＴＲＥＭ２−ＦｃまたはｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃと同様の有効性を示したが、ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃは中程度の有効性のみ示したことを見出した（図１３Ａ）。ハイバー敗血症モデル（ｈｉｇｈ−ｂａｒ  ｓｅｐｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ）におけるｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃの有効性を評価するために、マウスの盲腸を縫合糸で結紮し、結紮セグメントを針で穿刺し、管腔内容物を腹膜に逃がすことができるようにする、敗血症の腸管穿孔（ＣＬＰ）モデルを使用して実験を行った。マウスは、盲腸穿刺の８時間後に、５ｍｇ／ｋｇ  ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ（ｈＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ）、ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ（ｈＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ）、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃ（ｈＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ）、または対照ＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）で処理された。図１３Ｂに示すように、ＩｇＧ１対照で処理されたマウスは４〜５日後に１００％死亡した。ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）は中程度の保護を提供し、４０％のマウスの死亡を防いだ。ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）はマウスの８０％を保護し、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）はマウスの１００％を保護した。これらの結果は、内毒素血症研究（図２〜図４）の結果を確証し、ＴＲＥＭタンパク質のネクローシス細胞結合活性を敗血症研究におけるそれらの有効性と関連付ける。重要なことに、ネクローシス細胞結合を与えるＴＲＥＭＬ４のＫ８６Ｄ変異は有効性に必要であり、ネクローシス細胞結合を与える同様の変異が有効性に同じ影響を与えることが示されている。
【０４３１】
本研究では、不活性なＦｃ部分、Ｎ２９７Ｑの変異を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を一貫して使用して、Ｆｃエフェクター機能および補体結合に必要な重要なグリコシル化を除去した。Ｆｃエフェクター機能が敗血症におけるＴＲＥＭタンパク質の有効性に影響を与えるかどうかを確認するために、Ｎ２９７Ｑ変異をＷＴアスパラギンに戻し、ＴＲＥＭ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃエフェクター機能を回復させた。図１４に示すように、Ｆｃエフェクター機能を欠くｈＴＲＥＭ２およびｍＴＲＥＭＬ４の非グリコシル化（または「脱グリコシル化」）Ｆｃ融合タンパク質のみが、ＣＬＰモデルで保護を提供し、ｈＴＲＥＭ２−Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）は１００％の保護を提供し、ｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）は８０％の保護を提供する。Ｆｃ対照で治療したマウス、およびＷＴ  ＩｇＧ１Ｆｃ配列およびインタクトのＦｃエフェクター機能を備えたｈＴＲＥＭ２−ＦｃおよびｍＴＲＥＭＬ４−Ｆｃで治療したマウスは敗血症からの保護を提供しなかった。この予想外の非自明な結果は、敗血症での有効性にはＴＲＥＭリガンドの遮断が必要であるが、抗体エフェクター機能がこの有益な効果を打ち消すことを明確に示している。Ｆｃ受容体および／または補体への結合を変化させるＦｃエフェクター活性を不活性化する同様の変異は、敗血症におけるＴＲＥＭ−Ｆｃ融合タンパク質の有効性に対し同じ影響を与えることが示されている。
【０４３２】
炎症反応におけるＴＲＥＭ２遮断の効果を機構的に解明するために、マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）をアポトーシス細胞またはネクロトーシス細胞とともにインキュベートすることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの共培養研究を実施した。図１５に示すように、ネクロトーシス（シコニン処理）ではなくアポトーシス（スタウロスポリン処理）の細胞死体を添加すると、ＬＰＳ処理と同様にＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生が増加した。死体を生理食塩水ではなくｍＴＲＥＭＬ４−ＦｃまたはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃ、アイソタイプ・コントロールｈＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）、またはＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃとともにインキュベートすると、炎症効果が消失した。これらの結果は、ネクロトーシス細胞死体がマクロファージを活性化し、ＴＲＥＭ−ＴＲＥＭリガンド相互作用の薬理学的遮断がこの効果を逆転させる可能性があることを示している。
【０４３３】
マクロファージを刺激するためにＴＲＥＭ受容体に関与するネクロトーシス細胞に存在するリガンドを同定することが求められた。ネクロトーシス細胞で組換えｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃを使用して免疫沈降／質量分析研究を行ったところ、数十のミトコンドリア内膜タンパク質が検出されたことが見出された。したがって、ＴＲＥＭタンパク質が様々な種類のミトコンドリアに結合する能力をフローサイトメトリーで評価した。図１６に示すように、ｍＴＲＥＭＬ４およびｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄは、ネクロトーシス細胞に由来するミトコンドリアに特異的に結合するが、生細胞またはアポトーシス細胞に由来するミトコンドリアには結合しない。
【０４３４】
ネクロトーシス細胞から単離されたミトコンドリアがダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）としてネクロトーシス細胞死体の炎症作用を媒介するかどうかを確認するために、それらをマウスマクロファージに直接投与した。図１７に示すように、ネクロトーシス細胞から単離されたミトコンドリアは、ＢＭＤＭにおける炎症性サイトカイン産生（ＩＬ−６、ＩＬ１−β、ＴＮＦ−α）を刺激し、この効果は、ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄで特異的に遮断できたが、ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４では遮断できなかった。
【０４３５】
どのＴＲＥＭタンパク質がネクロトーシス細胞死体およびそれらに関連するミトコンドリアＤＡＭＰに対するマクロファージ反応を媒介するかを確証するために、ＴＲＥＭ２欠損マウス由来のＢＭＤＭを使用して研究を行い、ＬＰＳ反応はインタクトなままだったが、ＴＲＥＭ２欠損ＢＭＤＭがネクロトーシス死体（図１８）またはネクロトーシス細胞から精製されたミトコンドリア（図１９）に反応しないことを見出した。同様の結果がヒトＴＨＰ−１単球細胞でも観察された。ＴＲＥＭ２がＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムで削除されたとき、それらの細胞はネクロトーシス細胞由来のミトコンドリアによって刺激される能力を失った（図２０）。ミトコンドリアがネクロトーシス細胞の主要なＤＡＭＰを構成するかどうかを特定するために、パーキンの過剰発現およびカルボニルシアニド  ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）での処理により、ミトコンドリア欠損ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を調製した。これらのミトコンドリア欠損細胞は、ＴＮＦ−α＋ｚＶＡＤで処理すると依然としてネクロトーシスを起こしたが、それらの死体はＢＭＤＭでのサイトカイン分泌を刺激しなかった（図２１）。
【０４３６】
ネクロトーシス死体およびそのミトコンドリアのＴＲＥＭ２検出に他のシグナル伝達成分が必要かどうかを確証するために、ネクロトーシス細胞由来のミトコンドリアおよびＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、骨髄特異的ＩＫＫ（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ：ＩＫＫff）、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、Ｓｔｉｎｇ、ｃＧａｓ、Ｃａｓｐａｓｅ  １／１１、Ｉｒｆ３／７、およびＩＦＮＡＲノックアウトマウスに由来するＢＭＤＭを用いて共培養研究を行った。図２２に示すように、骨髄細胞のＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、またはＩＫＫを欠損したマウスは、ＬＰＳまたはネクロトーシスミトコンドリアに反応できなかった。ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、Ｓｔｉｎｇ、ｃＧａｓ、Ｃａｓｐａｓｅ１／１１、およびＩｒｆ３／７はネクロトーシスミトコンドリアの検出に不可欠であったため、これらの要件は特異的であった。ただし、図２３に示すように、ＴＬＲ４、ＣＤ１４、およびＭＤ２を含むＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＴＬＲ４レポーター細胞株（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）におけるＴＬＲ４シグナル伝達だけでは、ネクロトーシスミトコンドリアに反応するのに十分ではなかった。しかし、全長ＴＲＥＭ２のトランスフェクションは、ＮＦｋＢの下流のＳＥＡＰレポーターの生成から明らかなように、細胞がネクロトーシスミトコンドリアに反応することを可能にしたが、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭＬ１、ＴＲＥＭＬ２、ＴＲＥＭＬ４、さらにはＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄはそうではなかった。全長ＴＲＥＭ２のトランスフェクションでは、ＩＬ−１８ＲａおよびＩＬ−１８Ｒｂを含む関連するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＩＬ１８レポーター細胞株においてネクロトーシスミトコンドリアへの反応ができなかった。図２４に示すように、ＷＴ  ｈＴＲＥＭＬ４−ＦｃではなくｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃを投与すると、ＴＲＥＭ２をトランスフェクトしたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＴＬＲ４細胞がネクロトーシスミトコンドリアに反応する能力が阻害された。これらの結果は、ＴＲＥＭ２およびＴＬＲ４経路が協同して、ネクロトーシス死体およびそのミトコンドリアの検出によって引き起こされる炎症反応を可能にすることを示している。
【０４３７】
ＴＲＥＭ２ネクロトーシスミトコンドリア系のｉｎ  ｖｉｖｏ関連性を調査するために、マウスへの異なるタイプのミトコンドリアの投与の効果を決定することが求められた。図２５に示すように、アポトーシス細胞由来の１，０００万または１億個のミトコンドリアをマウスに静脈内投与しても、マウスの生存率や深部体温には影響がなかった。対照的に、ネクロトーシス細胞由来のミトコンドリアの投与は、急速な時間枠内で用量依存的な毒性を生じ、マウスの４０〜８０％を殺し、深部体温の大幅な低下を引き起こした。図２６に示すように、ネクロトーシスミトコンドリアのこの影響は、ミトコンドリアをｈＴＲＥＭ２−ＦｃまたはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃでプレコーティングすることで防ぐことができたが、ＷＴｈＴＲＥＭＬ４−Ｆｃまたはアイソタイプ・コントロールｈＩｇＧ１Ｆｃ（Ｎ２９７Ｑ）では防ぐことができなかった。図２７に示すように、ネクロトーシスミトコンドリアの投与は、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインの全身濃度の急速な増加を引き起こした。ミトコンドリアをｈＴＲＥＭ２−ＦｃまたはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃでプレコーティングすると、この効果が消失した。まとめると、図１７から図２７のこれらの結果は、遺伝的および薬理学的に、ネクロトーシス細胞由来ミトコンドリアを、ＴＲＥＭ２によって感知されるネクロトーシス死体由来のドミナントなＤＡＭＰとして証明する。それらは、ＴＲＥＭ２とネクロトーシス死体、特にネクロトーシス細胞のミトコンドリアとの間の相互作用を阻害する薬剤が、治療的有用性のために拮抗せねばならない重要なインターフェースであることを示している。
【０４３８】
敗血症における炎症の増幅および持続におけるネクロトーシス細胞死体およびそれらのミトコンドリアの明確で劇的な病因的役割を考慮して、ミトコンドリアの循環レベルが、ＴＲＥＭ２遮断の有望な治療指標を通知するための有望なバイオマーカーとして検出できるかどうかを調べた。図２８に示すように、循環ミトコンドリアは、抗ミトコンドリア膜タンパク質抗体（抗Ｔｏｍｍ２２等）を使用したフローサイトメトリー、ならびにミトコンドリア特異的色素（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ等）を使用して、マウスおよびヒト患者の血漿で検出できる。ミトコンドリアは、血漿／血清サンプルを１２，０００  ＲＣＦで１５分間遠心分離することにより単離でき、示された抗体または色素試薬で染色できる。ミトコンドリアは、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）またはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）等の磁気分離アプローチを使用して分離することもできる。ＬＰＳを投与された、またはＣＬＰを受けたマウスは、血漿中の循環ミトコンドリアのレベルが高かった。同様に、敗血症の患者由来の血漿サンプルもまた、より高いレベルの循環ミトコンドリアを有していた。これらの結果は、血中のミトコンドリアの全身レベルの測定が、ＴＲＥＭ２遮断が治療的に有用である可能性がある適応症の予測に潜在的有用性があることを示している。ミトコンドリアのタイプを区別するための追加のマーカー（たとえば、生細胞、アポトーシス細胞、またはネクロトーシス細胞に由来する）は、そのような診断バイオマーカーをさらに強化することができると予想される。たとえば、ミトコンドリアは、ｈＴＲＥＭ２−ＦｃまたはｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−Ｆｃの結合によってさらに特徴付けることができる。
【０４３９】
理論上、ネクロトーシス細胞のミトコンドリアは、炎症作用を媒介する可能性のあるいくつかの潜在的なＤＡＭＰを含む。ミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピン（ＣＬ）がＴＲＥＭ２のミトコンドリア−ＤＡＭＰリガンドになりうるかどうかを試験した。ＣＬは通常、ミトコンドリア内膜に含まれているが、ミトコンドリアストレスまたは細胞死の状態の間にミトコンドリア外膜に外在化されうる。ＣＬリポソームを調製し、ウェルをＣＬリポソームでプレコートし、組換えｈＴＲＥＭ２−ＦｃまたはＦｃ対照タンパク質でプローブしたＥＬＩＳＡアッセイで、ｈＴＲＥＭ２がそれらに直接結合できることが見出された（図２９Ａ〜図２９Ｃ）。ＴＲＥＭ２がＣＬに直接結合することを確認した後、ＢＭＤＭ刺激アッセイを実施し、ＣＬリポソームの炎症誘発性活性をＬＰＳまたは精製ネクロトーシスミトコンドリアと比較した。図３０に示すように、ＣＬリポソームの投与は、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生を刺激したが、他のタイプのリン脂質リポソーム（たとえば、ＤＯＰＡ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＧ）はしなかった。さらに、図３１に示すように、ＣＬリポソームは野生型マウスＢＭＤＭを刺激して、ＬＰＳまたはネクロトーシスミトコンドリアと区別がつかない程度にＩＬ−６およびＴＮＦ−αを産生した。しかし、ＴＲＥＭ２欠損ＢＭＤＭはＣＬリポソームの投与に反応しなかった。ｈＴＲＥＭＬ４−Ｋ８６Ｄ−ＦｃまたはｈＴＲＥＭ２−Ｆｃの投与によるＣＬの薬理学的遮断は、同じアッセイで同様に炎症性サイトカイン産生を阻害した（図３２）。さらに、ＣＬがネクロトーシスミトコンドリアの炎症特性に必要であるかどうかを試験するために実験を行った。図３３に示すように、ＣＬの産生に必要なカルジオリピンシンターゼ１遺伝子（ＣＲＬＳ１）の欠失により、ネクロトーシスミトコンドリアはＴＨＰ−１細胞を刺激できなくなった。図３４に示すように、ＣＲＬＳ１欠損細胞由来のネクロトーシスミトコンドリアもＴＲＥＭ２に結合しなかった。これは、ＴＲＥＭ２に関与するのが、これらのミトコンドリア上の特定の分子リガンドであることを示している。したがって、これらの結果は、ＣＬがＴＲＥＭ２を介してその炎症作用を媒介するミトコンドリア由来のダメージ関連分子パターンであることを示している。
【０４４０】
ＴＲＥＭ２およびＴＲＥＭＬ４は、敗血症および炎症に関連する他の病状の治療のための魅力的な治療標的であることが示されている。重要なことに、ＴＲＥＭＬ４−ＦｃおよびＴＲＥＭ２−Ｆｃの外部ドメインは、敗血症のマウスモデルにおける治療薬として薬理学的に活性である。ＴＲＥＭＬ４−ＦｃおよびＴＲＥＭ２−Ｆｃは、介入の臨界期であると考えられている時点をはるかに超えた時点でマウスモデルにおいて治療的に投与できることも示され、ヒトの疾患に関連する可能性のある治療法となっている。ＴＲＥＭ２／ＴＲＥＭＬ４アンタゴニストとしての治療的有用性を可能にするために、特定の新規変異をヒトＴＲＥＭＬ４外部ドメインにおいて作成しなければならないことも示されている。組換えＴＲＥＭ２／ＴＲＥＭＬ４タンパク質が効果的であるためには、Ｆｃエフェクター機能を有してはならないことも示されており、これは重要な非自明な結果である。最後に、治療効果の対象とならなければならないＴＲＥＭ２の重要で非自明な特徴は、ＴＲＥＭ２とネクロトーシスミトコンドリア、特にミトコンドリアのリン脂質カルジオリピンとの相互作用であることが示されている。
【０４４１】
本明細書で引用されたすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は特定の実施形態を参照して開示されてきたが、本発明の他の実施形態および変形は、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって発明されうることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての実施形態および同等の変形を含むと解釈されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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