(57)【要約】  標的基、薬物動態（ＰＫ）エンハンサー又はモディファイア、又は、他のデリバリー剤のオリゴヌクレオチドへの結合を促進するために有用である改善された結合剤は記載されている。記載の結合剤は、特にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤などのオリゴヌクレオチドを基礎とする化合物との関係で使用されるときに、改善された反応収率、安定性及び生物活性を示すことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2021517113.tif 000207
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
Qは四価炭素（tetravalent carbon）、四置換フェニル、又は、場合により置換されたアルキレンであり、
Rはカップリング部分又はＲＮＡｉ剤を含み、そして
XはNRx 又は結合であり、そしてRx は、H又は場合により置換されたC1-C6 アルキルである）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Qは四価炭素である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Qは
【化２】
2021517113.tif 000208
である、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Qは場合により置換されたアルキレンである、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Qは
【化３】
2021517113.tif 000209
である、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
L1、L2 及びL3 は各々
【化４】
2021517113.tif 000210
である、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
L1、L2 及びL3 は各々
【化５】
2021517113.tif 000211
である、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
L1、L2及びL3は各々
【化６】
2021517113.tif 000212
である、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
Rはカップリング部分を含み、そして該カップリング部分はホスホラミダイトを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
Rは
【化７】
2021517113.tif 000213
からなる群より選ばれる、請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Rはオルガノホスフェート及びＲＮＡｉ剤を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
Rはエステルを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
Rはパラ-ニトロフェノールエステルを含む、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
Rはアミド及びＲＮＡｉ剤を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
Rはカーボネートを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
Rはカルバメート及びＲＮＡｉ剤を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
【表１−１】
2021517113.tif 000214
【表１−２】
2021517113.tif 000215
【表１−３】
2021517113.tif 000216
【表１−４】
2021517113.tif 000217
【表１−５】
2021517113.tif 000218
【表１−６】
2021517113.tif 000219
から選ばれる化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１８】
式II
【化８】
2021517113.tif 000220
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、及び、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
各場合のR1 は、場合により置換されたアルキルであり、
R2 は、場合により置換されたアルキルであり、そして
R4 は、H又は場合により置換されたアルキルである）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１９】
L1、L2 及びL3 は各々
【化９】
2021517113.tif 000221
である、請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
L1、L2 及びL3 は各々
【化１０】
2021517113.tif 000222
である、請求項１８記載の化合物。
【請求項２１】
L1、L2 及びL3 は各々
【化１１】
2021517113.tif 000223
である、請求項１８記載の化合物。
【請求項２２】
各場合のR1 はイソプロピルである、請求項１８記載の化合物。
【請求項２３】
R2 は
【化１２】
2021517113.tif 000224
である、請求項１８記載の化合物。
【請求項２４】
L4 は
【化１３】
2021517113.tif 000225
からなる群より選ばれ、ここで、
【化１４】
2021517113.tif 000226
は結合点を示す、請求項１８記載の化合物。
【請求項２５】
式III
【化１５】
2021517113.tif 000227
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、及び、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、
XはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２６】
XはOである、請求項２５記載の化合物。
【請求項２７】
XはSである、請求項２５記載の化合物。
【請求項２８】
L1、L2及びL3 は各々
【化１６】
2021517113.tif 000228
である、請求項２５記載の化合物。
【請求項２９】
L1、L2及びL3 は各々
【化１７】
2021517113.tif 000229
である、請求項２５記載の化合物。
【請求項３０】
L1、L2及びL3 は各々
【化１８】
2021517113.tif 000230
である、請求項２５記載の化合物。
【請求項３１】
L4は
【化１９】
2021517113.tif 000231
からなる群より選ばれ、ここで、
【化２０】
2021517113.tif 000232
は結合点を示す、請求項２５記載の化合物。
【請求項３２】
【表２−１】
2021517113.tif 000233
【表２−２】
2021517113.tif 000234
【表２−３】
2021517113.tif 000235
【表２−４】
2021517113.tif 000236
【表２−５】
2021517113.tif 000237
【表２−６】
2021517113.tif 000238
【表２−７】
2021517113.tif 000239
から選ばれ、ここで、ＲＮＡ はＲＮＡｉ剤を含み又はからなる、化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３３】
式IV
【化２１】
2021517113.tif 000240
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、及び、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R1及びR2 は、各々独立して、場合により置換されたアルキルであり、
R4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、そして
TLは標的リガンドである）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３４】
L1、L2 及びL3 は各々
【化２２】
2021517113.tif 000241
である、請求項３３記載の化合物。
【請求項３５】
L1、L2 及びL3 は各々
【化２３】
2021517113.tif 000242
である、請求項３３記載の化合物。
【請求項３６】
L1 L2 及びL3 は各々
【化２４】
2021517113.tif 000243
である、請求項３３記載の化合物。
【請求項３７】
L4 は
【化２５】
2021517113.tif 000244
からなる群より選ばれ、ここで、
【化２６】
2021517113.tif 000245
は結合点を示す、請求項３３記載の化合物。
【請求項３８】
各場合のR1 はイソプロピルである、請求項３３記載の化合物。
【請求項３９】
R2 は
【化２７】
2021517113.tif 000246
である、請求項３３記載の化合物。
【請求項４０】
【表３−１】
2021517113.tif 000247
【表３−２】
2021517113.tif 000248
【表３−３】
2021517113.tif 000249
【表３−４】
2021517113.tif 000250
【表３−５】
2021517113.tif 000251
から選ばれ、ここで、TLは標的リガンドを含む、化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４１】
式V
【化２８】
2021517113.tif 000252
（上式中、L1、L2 及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーであり、
R4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、
TLは標的リガンドであり、
YはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４２】
L1、L2 及びL3 は各々
【化２９】
2021517113.tif 000253
である、請求項４１記載の化合物。
【請求項４３】
L1、L2 及びL3 は各々
【化３０】
2021517113.tif 000254
である、請求項４１記載の化合物。
【請求項４４】
L1、L2 及びL3 は各々
【化３１】
2021517113.tif 000255
である、請求項４１記載の化合物。
【請求項４５】
L4 は
【化３２】
2021517113.tif 000256
からなる群より選ばれ、ここで、
【化３３】
2021517113.tif 000257
は結合点を示す、請求項４１記載の化合物。
【請求項４６】
【表４−１】
2021517113.tif 000258
【表４−２】
2021517113.tif 000259
【表４−３】
2021517113.tif 000260
【表４−４】
2021517113.tif 000261
【表４−５】
2021517113.tif 000262
【表４−６】
2021517113.tif 000263
【表４−７】
2021517113.tif 000264
【表４−８】
2021517113.tif 000265
から選ばれ、ここで、TLは標的リガンドであり、そしてＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる、化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４７】
式VI
【化３４】
2021517113.tif 000266
（上式中、L1、L2 及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーであり、
R3 はH、場合により置換されたアルキル、又は、場合により置換されたアリールであり、そして
R4 は、H又は場合により置換されたアルキルである）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４８】
L1、L2 及びL3 は各々
【化３５】
2021517113.tif 000267
である、請求項４７記載の化合物。
【請求項４９】
L1、L2 及びL3 は各々
【化３６】
2021517113.tif 000268
である、請求項４７記載の化合物。
【請求項５０】
L1、L2 及びL3 は各々
【化３７】
2021517113.tif 000269
である、請求項４７記載の化合物。
【請求項５１】
L4 は
【化３８】
2021517113.tif 000270
からなる群より選ばれ、ここで、
【化３９】
2021517113.tif 000271
は結合点を示す、請求項４７記載の化合物。
【請求項５２】
R3 はパラ-ニトロフェニルである、請求項４７記載の化合物。
【請求項５３】
R4 はHである、請求項４７記載の化合物。
【請求項５４】
式VII
【化４０】
2021517113.tif 000272
（上式中、L1、L2 及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーであり、
各場合のR4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５５】
L1、L2及びL3 は各々
【化４１】
2021517113.tif 000273
である、請求項５４記載の化合物。
【請求項５６】
L1、L2及びL3 は各々
【化４２】
2021517113.tif 000274
である、請求項５４記載の化合物。
【請求項５７】
L1、L2及びL3 は各々
【化４３】
2021517113.tif 000275
である、請求項５４記載の化合物。
【請求項５８】
L4 は
【化４４】
2021517113.tif 000276
からなる群より選ばれ、ここで、
【化４５】
2021517113.tif 000277
は結合点を示す、請求項５４記載の化合物。
【請求項５９】
【表５−１】
2021517113.tif 000278
【表５−２】
2021517113.tif 000279
から選ばれ、ここで、ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる、化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６０】
式VIII
【化４６】
2021517113.tif 000280
（上式中、L1、L2 及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーであり、
R3 はH、場合により置換されたアルキル、及び、場合により置換されたアリールであり、
R4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、そして
TLは標的リガンドである）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６１】
L1、L2 及びL3 は各々
【化４７】
2021517113.tif 000281
である、請求項６０記載の化合物。
【請求項６２】
L1、L2及びL3 は各々
【化４８】
2021517113.tif 000282
である、請求項６０記載の化合物。
【請求項６３】
L1、L2 及びL3 は各々
【化４９】
2021517113.tif 000283
である、請求項６０記載の化合物。
【請求項６４】
L4 は
【化５０】
2021517113.tif 000284
からなる群より選ばれ、ここで、
【化５１】
2021517113.tif 000285
は結合点を示す、請求項６０記載の化合物。
【請求項６５】
R3 はパラ-ニトロフェニルである、請求項６０記載の化合物。
【請求項６６】
【表６−１】
2021517113.tif 000286
【表６−２】
2021517113.tif 000287
から選ばれ、ここで、TLは標的リガンドを含む、化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６７】
式IX
【化５２】
2021517113.tif 000288
（上式中、L1、L2 及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーであり、
TLは標的リガンドであり、
各場合のR4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６８】
L1、L2 及びL3は各々
【化５３】
2021517113.tif 000289
である、請求項６７記載の化合物。
【請求項６９】
L1、L2 及びL3 は各々
【化５４】
2021517113.tif 000290
である、請求項６７記載の化合物。
【請求項７０】
L1、L2 及びL3 は各々
【化５５】
2021517113.tif 000291
である、請求項６７記載の化合物。
【請求項７１】
L4 は
【化５６】
2021517113.tif 000292
からなる群より選ばれ、ここで、
【化５７】
2021517113.tif 000293
は結合点を示す、請求項６７記載の化合物。
【請求項７２】
【表７−１】
2021517113.tif 000294
【表７−２】
2021517113.tif 000295
から選ばれ、ここで、TLは標的リガンドであり、そしてＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる、化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項７３】
式II:
【化５８】
2021517113.tif 000296
の化合物をＲＮＡｉ剤と反応させて、式III:
【化５９】
2021517113.tif 000297
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、及び、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
各場合のR1 は、場合により置換されたアルキルであり、
R2 は、場合により置換されたアルキルであり、そして
R4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、
XはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物を生成させる方法。
【請求項７４】
式VI:
【化６０】
2021517113.tif 000298
の化合物を、遊離アミンを含むＲＮＡｉ剤と反応させて、式VII:
【化６１】
2021517113.tif 000299
（上式中、L1、L2 及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーであり、
R3 はH、場合により置換されたアルキル、又は、場合により置換されたアリールであり、そして
各場合のR4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物を生成させる方法。
【請求項７５】
式III
【化６２】
2021517113.tif 000300
の化合物を、アジドを含む標的リガンドと反応させて、式V
【化６３】
2021517113.tif 000301
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーであり、
R4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、
TLは標的リガンドであり、
YはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物を生成させる方法。
【請求項７６】
式VII
【化６４】
2021517113.tif 000302
の化合物を、アジドを含む標的リガンドと反応させ、式IX
【化６５】
2021517113.tif 000303
（上式中、L1、L2 及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーであり、
各場合のR4 は、H又は場合により置換されたアルキルであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物を生成させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１８年２月１７日に提出された米国仮出願番号６２/６３１，６８３号、２０１８年３月２２日に提出された米国仮出願番号第６２/６４６，７３９号、２０１８年４月２７日に提出された米国仮出願番号第６２/６６３，７６３号及び２０１９年１月９日に提出された米国仮出願番号第６２/７９０，３００号の優先権を主張し、これらのすべてを参照により本明細書に取り込む。
【０００２】
発明の分野
本開示は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤などの合成オリゴヌクレオチドとともに使用するのに適したトリアルキン結合剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アンチセンス化合物、アプタマー、リボザイム及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤又は分子などの合成オリゴヌクレオチドは、生物医学研究、診断及び治療で益々使用されている。これらの合成オリゴヌクレオチドは、インビトロ、インサイチュ及びインビボで遺伝子の発現を配列依存的に阻害又はノックダウンするために使用されてきた。
【０００４】
特に治療用インビボ送達において、標的リガンド又は他の薬理学的もしくは薬物動態学的エンハンサー又はモディファイア（modifiers）を合成オリゴヌクレオチドに結合又はリンクさせることがしばしば有用である。有用であるためには、結合化学物質は異なる合成オリゴヌクレオチド、異なる標的リガンド及び薬理学的モディファイアに容易に適応できるようにするためにモジュラー（modular）とすべきである。さらに、結合化学物質は単純な反応条件を有し、効率的であり（つまり、高い化学収率をもたらす）、毒性又はその他の有害な生成物を必要とせず、毒性又はその他の有害な副産物を生成しない。結合化学物質はまた、循環、皮下空間又は細胞外空間などにおいて標的細胞の外部でも安定しているべきであるが、標的細胞の内部などにおいて最終作用部位で容易に切断可能であるべきである。さらに、特にオリゴヌクレオチドベースの治療では、リンカーの長さ及び柔軟性は、とりわけ、特定の例において細胞取り込みを変更することによって、インビボでの治療化合物の効力に実質的に影響を与えることが知られている。
【０００５】
ＲＮＡｉ剤などのオリゴヌクレオチドを基礎とする化合物を標的リガンドに結合するための適切な特性を有する結合剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
概要
１つの態様において、本発明は、式I：
【０００７】
【化１】
2021517113.tif 000002
【０００８】
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
Qは四価炭素（tetravalent carbon）、四置換フェニル又は場合により置換されたアルキレンであり、
Rはカップリング部分又はＲＮＡｉ剤を含み、そして、
XはNRx又は結合であり、そしてRx はH又は場合により置換されたC1-C6 アルキルである）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００９】
１つの態様において、本発明は式II：
【００１０】
【化２】
2021517113.tif 000003
【００１１】
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
各場合のR1 は場合により置換されたアルキルであり、
R2は場合により置換されたアルキルであり、そして
R4 はH又は場合により置換されたアルキルである）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１２】
本明細書に記載される本発明の別の態様は式III：
【００１３】
【化３】
2021517113.tif 000004
【００１４】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R4 はH又は場合により置換されたアルキルであり、
XはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【００１５】
別の態様において、本明細書で、式IV:
【００１６】
【化４】
2021517113.tif 000005
【００１７】
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R1及びR2は各々独立して、場合により置換されたアルキルであり、
R4はH又は場合により置換されたアルキルであり、そして
TLは標的リガンドである）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩が記載される。
【００１８】
本明細書に記載される本発明の別の態様は式V：
【００１９】
【化５】
2021517113.tif 000006
【００２０】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R4はH又は場合により置換されたアルキルであり、
TLは標的リガンドであり、
YはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含む又はからなる）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【００２１】
別の態様において、本明細書で、式VI：
【００２２】
【化６】
2021517113.tif 000007
【００２３】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R3はH、場合により置換されたアルキル、又は、場合により置換されたアリールであり、そして
R4はH又は場合により置換されたアルキルである）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩が記載される。
【００２４】
本明細書に記載される本発明の別の態様は式VII：
【００２５】
【化７】
2021517113.tif 000008
【００２６】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
各々の場合のR4はH又は場合により置換されたアルキルであり、
XはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【００２７】
別の態様において、本明細書で、式VIII：
【００２８】
【化８】
2021517113.tif 000009
【００２９】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R4はH又は場合により置換されたアルキルであり、そして
TLは標的リガンドである）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩が記載される。
【００３０】
本明細書に記載される別の態様は式IX：
【００３１】
【化９】
2021517113.tif 000010
【００３２】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R4 はH又は場合により置換されたアルキルであり、
TLは標的リガンドであり、
XはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の構造による化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【００３３】
本発明の別の態様は式II:
【００３４】
【化１０】
2021517113.tif 000011
【００３５】
をＲＮＡｉ剤と反応させて、式III：
【００３６】
【化１１】
2021517113.tif 000012
【００３７】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、及び、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
各々の場合のR1は場合により置換されたアルキルであり、
R2は場合により置換されたアルキルであり、そして
R4はH又は場合により置換されたアルキルであり、
XはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物を生成させる方法を提供する。
【００３８】
本発明の別の態様は式VI:
【００３９】
【化１２】
2021517113.tif 000013
【００４０】
の化合物を、遊離アミンを含むＲＮＡｉ剤と反応させて、式VII：
【００４１】
【化１３】
2021517113.tif 000014
【００４２】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R3はH、場合により置換されたアルキル、又は、場合により置換されたアリールであり、そして
各場合のR4はH又は場合により置換されたアルキルであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物を生成させる方法を提供する。
【００４３】
本発明の別の態様は式III
【００４４】
【化１４】
2021517113.tif 000015
【００４５】
の化合物を、アジドを含む標的リガンドと反応させて、式V
【００４６】
【化１５】
2021517113.tif 000016
【００４７】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R4はH又は場合により置換されたアルキルであり、
TLは標的リガンドであり、
YはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物を生成させる方法を提供する。
【００４８】
本発明の別の態様は式VII
【００４９】
【化１６】
2021517113.tif 000017
【００５０】
の化合物を、アジドを含む標的リガンドと反応させて、式IX
【００５１】
【化１７】
2021517113.tif 000018
【００５２】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
各場合のR4はH又は場合により置換されたアルキルであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）の化合物を生成させる方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
詳細な説明
ホスホロアミダイトトリアルキンを含む新規化合物、それらの合成及びそれらの使用方法が本明細書に開示される。本明細書に開示される改良された化合物は、ＲＮＡｉ剤などの合成オリゴヌクレオチドを標的リガンド又は他の薬物動態（ＰＫ）エンハンサー又はモディファイアにコンジュゲートするために使用されるときに、改良された反応収率、安定性及び生物活性を示す。
【００５４】
本明細書に開示されているのは、トリアルキン結合剤、それらの合成及びそれらの使用方法である。本明細書に開示されるトリアルキン結合剤は、オリゴヌクレオチドに結合することができ、その後に、オリゴヌクレオチドは、標的リガンド、脂質、コレステロール、送達剤（エンドソーム溶解性ポリマーなど）又は薬理学的モディファイアなどの目的の化合物に容易に結合することができる。本明細書に開示されるトリアルキン結合剤は、１つ以上の標的リガンド及び/又は薬物動態学的モディファイアに結合されたＲＮＡｉ剤などのオリゴヌクレオチドコンジュゲートの有効性を保持し又は幾つかの実施形態において改善しながら、他の既知の結合剤を使用して行うことができるよりも、収量が改善され、不純物が少ないオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成を促進することができる。
【００５５】
本明細書で使用されるときに、「リンカー」という用語は、化合物の２つの部分を結合させる有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合又は酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲL（ＲLは水素、アシル、脂肪族又は置換脂肪族である）、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ2、ＳＯ2ＮＨなどの単位、又は、原子の鎖を含み、それは、限定するわけではないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ2、Ｎ（ＲL）（ＲLは水素、アシル、脂肪族又は置換脂肪族）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環で中断又は終端とすることができる）、-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、-(CH2)n-C(O)- 、-C(O)-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)x-、-C(O)-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)m- 、-C(O)-(CH2)n-C(O)-(CH2)m-、-C(O)-(CH2)n-NH-C(O)-(CH2)m-、-C(O)-(CH2)n-O-(CH2-CH2-O)m-(CH2)x-、-(O-CH2-CH2)n-、-O-(CH2-CH2-O)n-、-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-、-CH2-(O-CH2-CH2)n-、-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-、-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-、-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-、-(CH2-CH2-O)n-、-(CH2-CH2-O)n-CH2-,
【化１８】
2021517113.tif 000019
である。
【００５６】
反応性基は当該技術分野で一般的に入手可能なものであり、そして限定するわけではないが、活性化エステル、ＮＨＳ、ＴＦＰ、ＰＦＰ、テトラジン、ノルボルネン、トランスシクロオクテン、ヒドラジン（例えば、ヒニック）、アミノオキシ試薬及びアルデヒド（例えば、４-ホルミル安息香酸）が挙げられる。
【００５７】
標的リガンド（当該技術分野で、時に、標的基と呼ばれることもある）は、標的細胞又は組織、又は、特定の細胞型への化合物の送達を目標とし又は改善するために使用される。標的リガンドは分子の標的細胞への結合を改良する。したがって、標的リガンドは、それらが結合しているコンジュゲートの薬物動態学的特性又は生体分布特性を向上して、コンジュゲートの細胞分布及び細胞取り込みを改善することができる。細胞又は細胞受容体への標的基の結合はエンドサイトーシスを開始しうる。標的基は、一価、二価、三価、四価であるか、又は、より高い原子価を有しうる。標的基は、限定するわけではないが、細胞表面分子、細胞受容体リガンド、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント及び細胞表面分子に親和性を有する抗体模倣体、疎水性基、コレステロール、コレステリル基又はステロイドであることができる。幾つかの実施形態において、標的基は細胞受容体リガンドを含む。様々な標的基を使用して、薬物及び遺伝子を細胞及び特定の細胞受容体に標的化してきた。細胞受容体リガンドは、限定するわけではないが、炭水化物、グリカン、糖類（限定するわけではないが、ガラクトース、ガラクトース誘導体（Ｎ-アセチル-ガラクトサミンなど）、マンノース及びマンノース誘導体が挙げられる）、ハプテン、ビタミン、葉酸、ビオチン、アプタマー及びペプチド（限定するわけではないが、ＲＧＤ含有ペプチド、ＲＧＤ模倣体、インスリン、ＥＧＦ及びトランスフェリンが挙げられる）であることができる。
【００５８】
本明細書において使用されるときに、「アルキル」という用語は、別段の指定がない限り、１〜１０個の炭素原子を有する、直鎖又は分枝の飽和脂肪族炭化水素基を指す。例えば、「Ｃ1〜Ｃ6アルキル」は、直鎖又は分枝配置で１、２、３、４、５又は６個の炭素を有するアルキル基を含む。アルキル基の非限定的な例としては、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、n-ヘキシルが挙げられる。本明細書において使用されるときに、「アミノアルキル」という用語は、通常の原子価によって許容されるように、任意の位置で１つ以上のアミノ基で置換された、上記に定義されたアルキル基を指す。アミノ基は、非置換、一置換又は二置換であってよい。アミノアルキル基の非限定的な例としては、アミノメチル、ジメチルアミノメチル及び２-アミノプロプ-１-イルが挙げられる。
【００５９】
本明細書に使用されるときに、「アルキレン」という用語は、本明細書に記載されているとおりのアルキル基の二価基を指す。アルキレンはアルキルのサブセットであり、アルキルと同じ残基を指すが、２つの置換点がある。アルキレンの例は、メチレン、-CH2-又は
【化１９】
2021517113.tif 000020
エチレン、-CH2CH2-又は
【化２０】
2021517113.tif 000021
及びプロピレン、-CH2CH2CH2-
【化２１】
2021517113.tif 000022
である。
【００６０】
本明細書において使用されるときに、「シクロアルキル」という用語は、別段の指定がない限り、３〜１４個の炭素原子を有する飽和又は不飽和の非芳香族炭化水素環基を意味する。シクロアルキル基の非限定的な例としては、限定するわけではないが、シクロプロピル、メチルシ-クロプロピル、２，２-ジメチル-シクロブチル、２-エチル-シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。シクロアルキルは、複数のスピロ環又は縮合環を含むことができる。シクロアルキル基は、通常の原子価によって許容されるように、任意の位置で場合により一、二、三、四又は五置換されている。
【００６１】
本明細書において使用されるときに、「シクロアルキレン」という用語は、本明細書に記載されるとおりのシクロアルキル基の二価基を指す。シクロアルキレンはシクロアルキルのサブセットであり、シクロアルキルと同じ残基を指すが、２つの置換点を有する。シクロアルキレンの例としては、シクロプロピレン、
【化２２】
2021517113.tif 000023
１，４-シクロへキシレン、
【化２３】
2021517113.tif 000024
及び、１，５-シクロオキシレン、
【化２４】
2021517113.tif 000025
が挙げられる。シクロアルキレン基は、任意の位置で、通常の原子価により許容されるように、場合により一、二、三、四又は五置換されている。シクロアルキレン基は、単環式、二環式又は三環式であることができる。
【００６２】
本明細書において使用されるときに、「アルケニル」という用語は、特に指定のない限り、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を含み、２〜１０個の炭素原子を有する、直鎖又は分枝の非芳香族炭化水素基を指す。このような基には、最大５つの炭素-炭素二重結合が存在することができる。例えば、「Ｃ2〜Ｃ6」アルケニルは、２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基として定義される。アルケニル基の例としては、限定するわけではないが、エテニル、プロペニル、ブテニル及びシクロヘキセニルが挙げられる。アルケニル基の直鎖、分枝又は環状部分は二重結合を含むことができ、通常の原子価によって許容されるように、任意の位置で、場合により一、二、三、四又は五置換されている。「シクロアルケニル」という用語は、指定された数の炭素原子及び少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を有する単環式炭化水素基を意味する。
【００６３】
本明細書において使用されるときに、「アルキニル」という用語は、特に指定のない限り、２〜１０個の炭素原子を含み、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を含む、直鎖又は分枝の炭化水素基を指す。最大５つの炭素-炭素三重結合が存在することができる。したがって、「Ｃ2〜Ｃ6アルキニル」は、２〜６個の炭素原子を有するアルキニル基を意味する。アルキニル基の例としては、限定するわけではないが、エチニル、２-プロピニル及び２-ブチニルが挙げられる。アルキニル基の直鎖又は分枝部分は、通常の原子価によって許容されるように、任意の位置で、場合により一、二、三、四又は五置換されていることができる。
【００６４】
本明細書において使用されるときに、「アルコキシル」又は「アルコキシ」は、示された数の炭素原子を有する-Ｏ-アルキル基を指す。例えば、Ｃ1-6アルコキシは、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5及びＣ6アルコキシ基を含むことが意図される。例えば、Ｃ1-8アルコキシは、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5、Ｃ6、Ｃ7及びＣ8アルコキシ基を含むことが意図される。アルコキシの例としては、限定するわけではないが、メトキシ、エトキシ、ｎ-プロポキシ、ｉ―プロポキシ、ｎ-ブトキシ、ｓ-ブトキシ、ｔ-ブトキシ、ｎ-ペントキシ、ｓ-ペントキシ、ｎ-ヘプトキシ及びｎ-オクトキシが挙げられる。
【００６５】
本明細書において使用されるときに、「ケト」とは、カルボニル架橋を介して結合した、本明細書において定義されるとおりの任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール又はアリール基を指す。ケト基の例としては、限定するわけではないが、アルカノイル（例えば、アセチル、プロピオニル、ブタノイル、ペンタノイル又はヘキサノイル）、アルケノイル（例えば、アクリロイル）アルキノイル（例えば、エチノイル、プロピノイル、ブチノイル、ペンチノイル又はヘキシノイル）、アリーロイル（例えば、ベンゾイル）、ヘテロアリールロイル（例えば、ピロロイル、イミダゾロイル、キノリノイル又はピリジノイル）が挙げられる。
【００６６】
本明細書において使用されるときに、「アルコキシカルボニル」は、カルボニル架橋を介して結合された、上記で定義されるとおりの任意のアルコキシ基（すなわち、-Ｃ（Ｏ）Ｏ-アルキル）を指す。アルコキシカルボニル基の例としては、限定するわけではないが、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ-プロポキシカルボニル、ｔ-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル又はｎ-ペントキシカルボニルが挙げられる。
【００６７】
本明細書において使用されるときに、「アリールオキシカルボニル」は、オキシカルボニル架橋を介して結合された、本明細書において定義されるとおりの任意のアリール基（すなわち、-Ｃ（Ｏ）Ｏ-アリール）を指す。アリールオキシカルボニル基の例としては、限定するわけではないが、フェノキシカルボニル及びナフチルオキシカルボニルが挙げられる。
【００６８】
本明細書において使用されるときに、「ヘテロアリールオキシカルボニル」は、オキシカルボニル架橋を介して結合された、本明細書において定義されるとおりの任意のヘテロアリール基（すなわち、-Ｃ（Ｏ）Ｏ-ヘテロアリール）を指す。ヘテロアリールオキシカルボニル基の例としては、限定するわけではないが、２-ピリジルオキシカルボニル、２-オキサゾリルオキシカルボニル、４-チアゾリルオキシカルボニル又はピリミジニルオキシカルボニルが挙げられる。
【００６９】
本明細書において使用されるときに、「アリール」又は「芳香族」は、各環に最大６個の原子を有する任意の安定な単環式又は多環式炭素環を意味し、少なくとも１つの環は芳香族である。アリール基の例としては、限定するわけではないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、テトラヒドロナフチル、インダニル及びビフェニルが挙げられる。アリール置換基が二環式であり、１つの環が非芳香族である場合に、結合は芳香環を介することが理解される。アリール基は、通常の原子価により許容されるように、任意の位置で、場合により一、二、三、四又は五置換されている。
【００７０】
本明細書において使用されるときに、「アリーレン」という用語は、本明細書に記載されるとおりのアリール基の二価基を指す。アリーレンはアリールのサブセットであり、アリールと同じ残基を指すが、２つの置換点を有する。アリーレンの例としては、二価のフェニル基を指すフェニレンが挙げられる。アリーレン基は、通常の原子価で許容されるように、任意の位置で、場合により一、二、三、四又は五置換されている。
【００７１】
本明細書において使用されるときに、「カップリング部分（coupling moiety）」という用語は、２つの分子を一緒に結合するために使用できる化学部分を指す。例えば、「カップリング部分」は、別の分子上のアルコールと反応してオルガノホスフェートを形成するホスホロアミダイトを指すことができる。カップリング剤のさらなる例としては、限定するわけではないが、エステル、カーボネート、カルボン酸、オレフィン、アルコール、アミン、アルデヒド、ケトン、アルキン、ハロゲン、グリニャール試薬、脱離基、及び、当該技術分野で知られている２つの分子を結合するために使用されるその他の部分が挙げられる。
【００７２】
本明細書において使用されるときに、「ハロ」という用語はハロゲン基を指す。例えば、「ハロ」は、フルオロ（Ｆ）、クロロ（Ｃｌ）、ブロモ（Ｂｒ）又はヨード（Ｉ）基を指すことができる。
【００７３】
本明細書において使用されるときに、「ヘテロアリール」という用語は、各環に最大７個の原子の安定した単環式又は多環式環を表し、少なくとも１つの環は芳香族であり、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含む。ヘテロアリール基の例としては、限定するわけではないが、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾロニル、ベンゾオキサゾロニル、キノリニル、イソキノリニル、ジヒドロイソインドロニル、イミダゾピリジニル、イソインドロニル、インダゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル及びテトラヒドロキノリンが挙げられる。「ヘテロアリール」はまた、任意の窒素含有ヘテロアリールのＮ-オキシド誘導体を含むと理解される。ヘテロアリール置換基が二環式であり、１つの環が非芳香族であるか、ヘテロ原子を含まない場合に、結合は芳香環を介するか、又は、ヘテロ原子含有環を介することが理解される。ヘテロアリール基は、通常の原子価によって許容されるように、任意の位置で、場合により一、二、三、四又は五置換されている。
【００７４】
本明細書において使用されるときに、「ヘテロアリーレン」という用語は、本明細書に記載されるとおりのヘテロアリール基の二価基を指す。ヘテロアリーレンはヘテロアリールのサブセットであり、ヘテロアリールと同じ残基を指すが、２つの置換点を有する。ヘテロアリールの例としては、ピリジニレン、ピリミジニレン及びピロリレンが挙げられる。ヘテロアリーレン基は、通常の原子価で許容されるように、任意の位置で、場合により一、二、三、四又は五置換されている。
【００７５】
本明細書において使用されるときに、「複素環」、「複素環式」又は「ヘテロシクリル」という用語は、多環式基を含む、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含む３〜１４員の芳香族又は非芳香族複素環を意味する。本明細書において使用されるときに、「複素環式」という用語はまた、「複素環」及び「ヘテロシクリル」という用語と同義であると考えられ、本明細書に示される同じ定義も有するものと理解される。「ヘテロシクリル」は、上記のヘテロアリールならびにそのジヒドロ及びテトラヒドロ類似体を含む。ヘテロシクリル基の例としては、限定するわけではないが、アゼチジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドルアジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキソオキサゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリン、オキソピペラジニル、オキソピロリジニル、オキソモルホリニル、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリジノニル、ピリミジル、ピリミジノイル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、１,４-ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピリジン-２-オニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、ジオキシドチオモルホリニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル及びテトラヒドロチエニル及びそれらのＮ-オキシドが挙げられる。ヘテロシクリル置換基の結合は、炭素原子又はヘテロ原子を介して起こりうる。ヘテロシクリル基は、通常の原子価によって許容されるように、任意の位置で、場合により、一、二、三、四又は五置換されている。
【００７６】
本明細書において使用されるときに、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、多環式基を含む、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含む３〜１４員非芳香族複素環を意味する。ヘテロシクリル基の例としては、限定するわけではないが、アゼチジニル、オキソピペラジニル、オキソピロリジニル、オキソモルホリニル、オキセタニル、ピラニル、ピリジノニル、ピリミジノニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロイソキノリニル、１，４-ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジオキシドチオモルホリニル及びテトラヒドロチエニル及びそれらのＮ-オキシドを挙げることができる。ヘテロシクロアルキル置換基の結合は、炭素原子を介して又はヘテロ原子を介して起こりうる。ヘテロシクリル基は、通常の原子価によって許容されるように、任意の位置で、場合により一、二、三、四又は五置換されている。
【００７７】
本明細書において使用されるときに、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、本明細書に記載されるとおりのヘテロシクロアルキル基の二価基を指す。ヘテロシクロアルキレンはヘテロシクロアルキルのサブセットであり、ヘテロシクロアルキルと同じ残基を指すが、２つの置換点を有する。ヘテロシクロアルキレンの例としては、ピペリジニレン、アゼチジニレン及びテトラヒドロフラニレンが挙げられる。ヘテロシクロアルキレン基は、通常の原子価によって許容されるように、任意の位置で、場合により一、二、三、四又は五置換されている。
【００７８】
本明細書において使用されるときに、「治療する」、「治療」などの用語は、対象における疾患の１つ以上の症状の数、重症度及び/又は頻度の軽減又は緩和を提供するために取られる方法又は工程を意味する。本明細書において使用されるときに、「治療する」及び「治療」は、対象における疾患の１つ以上の症状の数、重症度及び/又は頻度の予防、管理、予防的治療及び/又は阻害を含むことができる。
【００７９】
本明細書において使用されるときに、「細胞に導入する」という語句は、ＲＮＡｉ剤を参照するときに、ＲＮＡｉ剤を細胞に機能的に送達することを意味する。「機能的送達（functional delivery）」という語句は、ＲＮＡｉ剤が期待される生物学的活性、例えば遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを可能にする様式で、ＲＮＡｉ剤を細胞に送達することを意味する。
【００８０】
特に明記しない限り、本明細書において使用されるときに、記号
【化２５】
2021517113.tif 000026
の使用は、本明細書に記載される本発明の範囲に従って、任意の１つ以上の基がそれに結合されうることを意味する。本明細書の幾つかの実施形態において、式Iの化合物における特定の変異体の結合点を記載するために、構造内で記号
【化２６】
2021517113.tif 000027
が複数回使用される。特に明記しない限り、示される変異体は、変異体上の結合点のいずれかが、式Iの化合物上の結合点のいずれかに結合されうるように配向されうる。例えば、変異体Ｌ1は式Iの化合物への２つの結合点を有する。Ｌ1の１つの実施形態は、
【化２７】
2021517113.tif 000028
として示しているが、実施形態はまた、Ｌ1が
【化２８】
2021517113.tif 000029
である化合物を指すと理解されるべきである。
【００８１】
本明細書において使用されるときに、「異性体」という用語は、同一の分子式を有するが、それらの原子の結合の性質又は順序、又は、空間におけるそれらの原子の配置が異なる化合物を指す。原子の空間配置が異なる異性体は「立体異性体」と呼ばれる。互いに鏡像ではない立体異性体は「ジアステレオマー」と呼ばれ、重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は「エナンチオマー」と呼ばれ、又は、時に、光学異性体と呼ばれる。４つの同一でない置換基に結合している炭素原子は「キラル中心」と呼ばれる。本明細書に記載の化合物は、異性体構造が具体的に定義されていないオレフィン二重結合又は他の幾何学的非対称中心を含むときに、化合物はＥ及びＺ幾何異性体の両方を個別に又は混合物で含むことができることが意図される。式Iの化合物又はそれらの薬学的に許容される塩は、例えば、すべての可能な異性体、ならびにそれらのラセミ形態及び光学的に純粋な形態を含むことが意図される。同様に、他に明確に述べられていない限り、すべての互変異性体も含まれることが意図される。
【００８２】
本明細書において使用されるときに、結合基は、１つの分子又は分子の一部を別の第二の分子又は分子の第二の部分に結合する１つ以上の原子である。当該技術分野において、結合基及びスペーサという用語は、時に、互換的に使用される。同様に、当該技術分野で使用されるときに、足場という用語は、時に、結合基と交換可能に使用される。幾つかの実施形態において、結合基はペプチド切断可能な結合基を含むことができる。幾つかの実施形態において、結合基はペプチドフェニルアラニン-シトルリン-フェニルアラニン-プロリンを含むか又はそれからなることができる。幾つかの実施形態において、結合基はＰＥＧ基を含むか又はそれからなることができる。
【００８３】
本明細書において使用されるときに、２つの分子間の結合を参照するときの「結合された」という用語は、２つの分子が共有結合によって結合されている、又は、２つの分子が非共有結合（例えば、水素結合又はイオン結合）を介して結合されることを意味する。用語「結合された」が非共有結合を介した２つの分子間の結合を指す幾つかの例において、、２つの異なる分子間の結合は、生理学的に許容されるバッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）中において、１×１０-4Ｍ未満（例えば、１×１０-5Ｍ未満、１×１０-6Ｍ未満又は１×１０-7Ｍ未満）のＫDを有する。特に明記しない限り、本明細書において使用されるときに、結合されたという用語は、介在する原子又は原子群を伴う又は伴わない、第一の化合物と第二の化合物との間の結合を指すことができる。
【００８４】
当業者は、本明細書に開示される化合物及び組成物が、化合物又は組成物が配置される環境に応じて、プロトン化又は脱プロトン化状態で特定の原子（例えば、Ｎ、Ｏ又はＳ原子）を有することができることを容易に理解及び認識するであろう。したがって、本明細書において使用されるときに、本明細書において開示される構造は、例えば、ＯＨ、ＳＨ又はＮＨなどの特定の官能基がプロトン化又は脱プロトン化されうることを想定する。本明細書の開示は、当業者によって容易に理解されるように、環境のｐＨに基づくプロトン化の状態に関係なく、開示された化合物及び組成物を網羅することを意図している。
【００８５】
構造は、原子価により許容されるように、環上の炭素又はヘテロ原子への結合を示すために、環構造上に「フローティング（floating）」する結合を有するものとして描写され得る。例えば、構造
【化２９】
2021517113.tif 000030
は、Ｒが、環の5つの利用可能な位置のいずれかで水素原子を置換することができることを示す。「フローティング」結合は、二環式構造でも使用され、原子価で許容されるように二環のいずれかの環上の任意の位置への結合を示す。二環式の場合、結合は両方の環に「フローティング」しているように示され、例えば、
【化３０】
2021517113.tif 000031
は、Ｒが、環上の７つの利用可能な位置のいずれかで水素原子を置換することができることを示す。
【００８６】
本明細書の請求項において使用されるときに、「からなる」という語句は、請求項で指定されていない要素、工程又は成分を除外する。本明細書の請求項において使用されるときに、「から本質的になる」という語句は、請求項の範囲を、特定の材料又は工程ならびに特許請求された発明の基本的かつ新規な特性に実質的に影響しないものに限定する。
【００８７】
本明細書において使用されるときに、「医薬組成物」は、薬理学的に有効な量の少なくとも１種のＲＮＡｉ剤及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）とは、医薬有効活性成分（ＡＰＩ、ＲＮＡｉ剤などの治療用製品）以外の物質であって、安全性が適切に評価されており、意図的に薬物送達システムに含まれている物質である。賦形剤は、意図された用量で治療効果を発揮しないか、又は、発揮することを意図していない。賦形剤は、ａ）製造中の薬物送達システムの処理を支援し、ｂ）ＡＰＩの安定性、バイオアベイラビリティ又は患者の受容性を保護、支持又は強化し、ｃ）製品の識別を支援し、及び/又はｄ）保管又は使用中のＡＰＩの全体的な安全性、有効性又は送達のその他の属性を強化する。
【００８８】
賦形剤としては、限定するわけではないが、吸収促進剤、抗付着剤、消泡剤、抗酸化剤、結合剤、バインダ、緩衝剤、キャリア、コーティング剤、着色剤、送達促進剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、エクステンダー、フィラー、フレーバー、滑剤、保湿剤、潤滑剤、油、ポリマー、防腐剤、生理食塩水、塩、溶媒、糖、懸濁剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤及び湿潤剤が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤は不活性物質であっても又はなくてもよい。
【００８９】
医薬組成物は、医薬組成物に一般的に見出される他の追加の成分を含むことができる。医薬上活性な材料としては、限定するわけではないが、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤、又は抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン、ジフェンヒドラミンなど）を挙げることができる。本明細書で定義されるＲＮＡｉ剤を発現又は含む細胞、組織又は単離された器官が「医薬組成物」として使用されうることも想定される。本明細書において使用されるときに、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」、又は単に「有効量」とは、意図する薬理学的、治療的又は予防的結果をもたらすＲＮＡｉ剤の量を指す。
【００９０】
ポリヌクレオチド又はポリ核酸という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリマーを指す。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。モノマー単位が１２０未満のポリヌクレオチドは、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる。天然の核酸は、デオキシリボース又はリボースリン酸の骨格を有する。非天然又は合成ポリヌクレオチドは、インビトロ又は無細胞系で重合され、同じ又は類似の塩基を含むが、天然のリボース又はデオキシリボース-リン酸骨格以外のタイプの骨格を含むことができるポリヌクレオチドである。合成オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られている任意の技術を使用して合成することができる。当該技術分野で知られているポリヌクレオチド骨格としては、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデート、モルホリノ及び天然核酸のリン酸骨格の他の変異体が挙げられる。塩基としてはプリン及びピリミジンが挙げられ、さらに天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン及び天然類似体が挙げられる。プリン及びピリミジンの合成誘導体としては、限定するわけではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート及びハロゲン化アルキルなどの新しい反応基をヌクレオチド上に配置する修飾が挙げられるが、それに限定されない。塩基という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの任意の既知の塩基類似体を包含する。ポリヌクレオチドという用語としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ及び他の天然及び合成ヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。
【００９１】
本発明の合成オリゴヌクレオチドは化学的に修飾することができる。化学的に修飾されたポリヌクレオチドを使用すると、ポリヌクレオチドの様々な特性を改善でき、特性としては、限定するわけではないが、インビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性、細胞内取り込み、活性及び配列特異的ハイブリッド形成が挙げられる。そのような化学修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２'-Ｏ-メチルリボヌクレオチド、２'-デオキシ-２'-フルオロリボヌクレオチド、２'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５-Ｃ-メチルヌクレオチド、２',３'-セコヌクレオチド模倣体（ロックされていない核酸塩基類似体、本明細書ではＮUNA又はＮＵＮＡとして表される）及び逆デオキシ脱塩基残基の組み込みが挙げられる。これらの化学修飾は、様々なポリヌクレオチド構造で使用されるときに、細胞内のポリヌクレオチド活性を維持すると同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に向上させることが示される。
【００９２】
幾つかの実施形態において、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、２つの鎖を有する二本鎖を含み、その一方又は両方は化学的に修飾されることができ、各鎖は約１９〜約２９（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９）のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。本発明の合成オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド位置の約５〜約１００％（例えば、ヌクレオチド位置の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％）で修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００９３】
合成オリゴヌクレオチドは、５'又は３'末端修飾を含むことができる。３'及び５'末端修飾としては、限定するわけではないが、アミン含有基、アルキル基、アルキルアミン基、反応基、ＴＥＧ基及びＰＥＧ基が挙げられる。
【００９４】
「ＲＮＡｉ剤」（「ＲＮＡｉトリガー」とも呼ばれる）は、標的ｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物の配列特異的な方法での翻訳を低下又は阻害（例えば、適切な条件下に低下又は阻害）することができるＲＮＡ又はＲＮＡ様（例えば、化学修飾されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含む組成物を意味する。本明細書において使用されるときに、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉メカニズム（すなわち、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体又はＲＩＳＣ）との相互作用を介してＲＮＡ干渉を誘導する）、又は任意の代替メカニズム又は経路によって作動することができる。ＲＮＡｉ剤は、その用語が本明細書において使用されるときに、主にＲＮＡ干渉機構を介して作動すると考えられるが、開示されるＲＮＡｉ剤は、特定の経路又は作用機構に拘束又は限定されない。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、限定するわけではないが、短（又は小）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びダイサー基質が挙げられる。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的とされるｍＲＮＡ（すなわち、ＨＩＦ-２アルファｍＲＮＡ）に少なくとも部分的に相補的である。ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び/又は１つ以上の非ホスホジエステル結合を含むことができる。
【００９５】
本明細書において使用されるときに、所与の遺伝子の発現を参照するときの「サイレンス」、「減少」、「阻害」、「ダウンレギュレート」又は「ノックダウン」という用語は、遺伝子が転写される細胞、細胞群、組織、器官又は対象において、遺伝子から転写されたＲＮＡのレベル又はｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチド、タンパク質又はタンパク質サブユニットのレベルによって測定される遺伝子の発現が、細胞、細胞群、組織、器官又は対象が本明細書に記載のＲＮＡｉ剤で処置されたときに、そのように処置されていない第二の細胞、細胞群、組織、器官又は対象と比較して低下していることを意味する。
【００９６】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、互いに部分的に、実質的に又は完全に相補的である少なくとも２つの配列を含む。幾つかの実施形態において、２つのＲＮＡｉ剤配列は、第一の配列を含むセンス鎖及び第二の配列を含むアンチセンス鎖を含む。幾つかの実施形態において、２つのＲＮＡｉ剤配列は、ともに第一の配列を含む２つのセンス鎖及び第二の配列を含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は一緒にメロデュプレックスを形成する。センス鎖は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーなどの結合分子を介してアンチセンス鎖に結合されうる。
【００９７】
アンチセンス鎖は、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補の領域は、最も好ましくは、長さが３０ヌクレオチド未満である。ＲＮＡｉ剤センス鎖は、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。ＲＮＡｉ剤は、標的遺伝子を発現する細胞に送達されるときに、インビトロ又はインビボでの前記標的遺伝子の発現を阻害する。
【００９８】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、天然に存在するヌクレオチドを含むことができるか、又は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド模倣体を含むことができる。本発明のＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、当該分野で十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾されうる。ＲＮＡｉ剤のヌクレオシド又はヌクレオチド塩基は、リン酸含有（天然）又は非リン酸含有（非天然）共有ヌクレオシド間結合によって結合されうる、すなわち、ＲＮＡｉ剤は、天然又は非天然のオリゴヌクレオチド骨格を有することができる。幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド塩基間の非標準（非リン酸）結合を含む。
【００９９】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５'又は３'末端修飾を含むことができる。３'及び５'末端修飾としては、限定するわけではないが、アミン含有基、アルキル基、アルキルアミン基、反応基、ＴＥＧ基及びＰＥＧ基が挙げられる。
【０１００】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、オーバーハング、すなわち、通常にセンス鎖及びアンチセンス鎖のコア配列によって形成される二重らせん構造に直接関与しない、典型的に、対になっていないオーバーハングヌクレオチドを含むことができる。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれで独立して、１〜５の塩基の３'及び/又は５'オーバーハングを含むことができる。幾つかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は３'及び５'オーバーハングを含む。幾つかの実施形態において、一方の鎖塩基の１つ以上の３'オーバーハングヌクレオチドは、他の鎖の１つ以上の５'オーバーハングヌクレオチドと対になる。幾つかの実施形態において、一方の鎖の１つ以上の３'オーバーハングヌクレオチドは、他の鎖の１つ以上の５'オーバーハングヌクレオチドと対になっていない。ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチド塩基を含むことも又は含まないこともできる。アンチセンス鎖及びセンス鎖は、５'末端のみが平滑末端を有し、３'末端のみが平滑末端を有し、５'末端と３'末端の両方が平滑末端を有し、又は、５'末端も３'末端の両方とも平滑末端でない二本鎖を形成することができる。幾つかの実施形態において、オーバーハング内の１つ以上のヌクレオチドは、チオホスフェート、ホスホロチオエート、デオキシヌクレオチド反転（３'-３'結合）ヌクレオチドを含むか、又は、修飾リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドである。
【０１０２】
既知のｍＲＮＡ配列のリストは、国際塩基配列データベース構築（International Nucleotide Sequence Database Collaboration）の一部として、米国国立衛生研究所の支部である国立バイオテクノロジー情報センターが管理するデータベースであるデータベースGenBankを含む、様々な研究機関が管理するデータベースに見出すことができる。既知の有効なｓｉＲＮＡ配列及び同族結合部位も関連文献によく示されている。ＲＮＡｉ剤分子は、当該技術分野で知られた技術によって容易に設計及び生産される。さらに、効果的で特定の配列モチーフを見つける機会を増やすことができる計算ツールが存在する（Peiら、2006、Reynoldsら、2004、Khvorovaら、2003、Schwarzら、2003、Ui-Teiら、2004、Healeら、2005、Chalkら、2004、Amarzguiouiら、2004）。
【０１０３】
式I
式Iは構造：
【０１０４】
【化３１】
2021517113.tif 000032
【０１０５】
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
Qは四価炭素原子、四置換フェニル又は場合により置換されたアルキレンであり、
Rはカップリング部分又はＲＮＡｉ剤を含み、そして、
XはNRx又は結合であり、そしてRx はH又は場合により置換されたC1-C6 アルキルである）により示される。
【０１０６】
式Iの幾つかの実施形態において、Qは四価炭素である。式Iの他の実施形態において、Qは
【化３２】
2021517113.tif 000033
であり、
【化３３】
2021517113.tif 000034
は結合点を示す。他の実施形態において、Qは
【化３４】
2021517113.tif 000035
であり、
【化３５】
2021517113.tif 000036
は結合点を示す。
【０１０７】
式Iの幾つかの実施形態において、L1、L2及びL3 は各々
【化３６】
2021517113.tif 000037
である。式Iの幾つかの実施形態において、L1、L2及びL3 は各々
【化３７】
2021517113.tif 000038
である。式Iの幾つかの実施形態において、L1 L2及びL3は各々
【化３８】
2021517113.tif 000039
である。
【０１０８】
式Iの幾つかの実施形態において、XはNHである。
【０１０９】
式Iの幾つかの実施形態において、Rはホスホロアミダイトを含む。式Iの幾つかの実施形態において、Rは、オルガノホスフェート及びＲＮＡｉ剤を含む。式Iの他の実施形態において、Rはエステルを含む。式Iの幾つかの実施形態において、Rはパラ-ニトロフェノールエステルを含む。式Iの幾つかの実施形態において、Rは、アミド及びＲＮＡｉ剤を含む。式Iの他の実施形態において、Rはカーボネートを含む。幾つかの実施形態において、Rは、カルバメート及びＲＮＡｉ剤を含む。
【０１１０】
式Iの幾つかの実施形態において、Rは以下からなる群より選ばれる。
【化３９】
2021517113.tif 000040
【０１１１】
式Iの例示の化合物を下記の表１に示す。
【０１１２】
【表１−１】
2021517113.tif 000041
【０１１３】
【表１−２】
2021517113.tif 000042
【０１１４】
【表１−３】
2021517113.tif 000043
【０１１５】
【表１−４】
2021517113.tif 000044
【０１１６】
【表１−５】
2021517113.tif 000045
【０１１７】
【表１−６】
2021517113.tif 000046
【０１１８】
式II
式IIは構造:
【０１１９】
【化４０】
2021517113.tif 000047
【０１２０】
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、及び、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
各場合のR1 は場合により置換されたアルキルであり、
R2は場合により置換されたアルキルであり、そして
R4 はH又は場合により置換されたアルキルである）により示され、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１２１】
式IIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化４１】
2021517113.tif 000048
である。式IIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化４２】
2021517113.tif 000049
である。式IIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化４３】
2021517113.tif 000050
である。
【０１２２】
式IIの幾つかの実施形態において、各場合のR1 はイソプロピルである。
【０１２３】
式IIの幾つかの実施形態において、R2 は
【化４４】
2021517113.tif 000051
である。
【０１２４】
式IIの幾つかの実施形態において、L4 は:
【化４５】
2021517113.tif 000052
からなる群より選ばれ、ここで、
【化４６】
2021517113.tif 000053
は結合点を示す。
【０１２５】
式III
式IIIは構造:
【０１２６】
【化４７】
2021517113.tif 000054
【０１２７】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、及び、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R4 はH又は場合により置換されたアルキルであり、
XはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）により示され、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１２８】
式IIIの幾つかの実施形態において、XはOであり、そして式IIIの化合物はオルガノホスフェートである。式IIの幾つかの実施形態において、XはSであり、そして式IIIの化合物はホスホロチオエートである。
【０１２９】
式IIIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3は各々
【化４８】
2021517113.tif 000055
である。式IIIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化４９】
2021517113.tif 000056
である。式IIIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化５０】
2021517113.tif 000057
である。
【０１３０】
式IIIの幾つかの実施形態において、L4 は:
【化５１】
2021517113.tif 000058
からなる群により選ばれ、ここで、
【化５２】
2021517113.tif 000059
は結合点を示す。
【０１３１】
式IIIの例示の化合物を下記の表２に示す。
【０１３２】
【表２−１】
2021517113.tif 000060
【０１３３】
【表２−２】
2021517113.tif 000061
【０１３４】
【表２−３】
2021517113.tif 000062
【０１３５】
【表２−４】
2021517113.tif 000063
【０１３６】
【表２−５】
2021517113.tif 000064
【０１３７】
【表２−６】
2021517113.tif 000065
【０１３８】
【表２−７】
2021517113.tif 000066
【０１３９】
式IV
式IVは構造：
【０１４０】
【化５３】
2021517113.tif 000067
【０１４１】
（上式中、L1、L2及びL3 は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、及び、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R1及びR2は各々独立して、場合により置換されたアルキルであり、
R4はH又は場合により置換されたアルキルであり、そして
TLは標的リガンドである）により示され、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１４２】
式IVの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化５４】
2021517113.tif 000068
である。式IVの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化５５】
2021517113.tif 000069
である。式IVの幾つかの実施形態において、L1 L2 及びL3 は各々
【化５６】
2021517113.tif 000070
である。
【０１４３】
式IVの幾つかの実施形態において、L4 は:
【化５７】
2021517113.tif 000071
からなる群より選ばれ、ここで、
【化５８】
2021517113.tif 000072
は結合点を示す。
【０１４４】
式IVの幾つかの実施形態において、各場合のR1 はイソプロピルである。
【０１４５】
式IVの幾つかの実施形態において、R2 は
【化５９】
2021517113.tif 000073
である。
【０１４６】
式IVの例示の化合物は下記の表３に示される。
【０１４７】
【表３−１】
2021517113.tif 000074
【０１４８】
【表３−２】
2021517113.tif 000075
【０１４９】
【表３−３】
2021517113.tif 000076
【０１５０】
【表３−４】
2021517113.tif 000077
【０１５１】
式V
式Vは構造:
【０１５２】
【化６０】
2021517113.tif 000078
【０１５３】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R4はH又は場合により置換されたアルキルであり、
TLは標的リガンドであり、
YはO又はSであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含む又はからなる）により示され、又は、その薬学的に許容される塩である。
【０１５４】
式Vの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【０１５５】
【化６１】
2021517113.tif 000079
である。式IVの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化６２】
2021517113.tif 000080
である。式Vの幾つかの実施形態において、L1 L2 及びL3 は各々
【化６３】
2021517113.tif 000081
である。
【０１５６】
式Vの幾つかの実施形態において、L4 は:
【化６４】
2021517113.tif 000082
からなる群より選ばれ、ここで、
【化６５】
2021517113.tif 000083
は結合点を示す。
【０１５７】
式Vの例示の化合物は下記の表４に示される。
【０１５８】
【表４−１】
2021517113.tif 000084
【０１５９】
【表４−２】
2021517113.tif 000085
【０１６０】
【表４−３】
2021517113.tif 000086
【０１６１】
【表４−４】
2021517113.tif 000087
【０１６２】
【表４−５】
2021517113.tif 000088
【０１６３】
【表４−６】
2021517113.tif 000089
【０１６４】
【表４−７】
2021517113.tif 000090
【０１６５】
【表４−８】
2021517113.tif 000091
【０１６６】
【表４−９】
2021517113.tif 000092
【０１６７】
式VI
式VIは構造
【０１６８】
【化６６】
2021517113.tif 000093
【０１６９】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R3はH、場合により置換されたアルキル、又は、場合により置換されたアリールであり、そして
R4はH又は場合により置換されたアルキルである）により示され、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１７０】
式VIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【０１７１】
【化６７】
2021517113.tif 000094
である。式VIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化６８】
2021517113.tif 000095
である。式VIの幾つかの実施形態において、L1 L2 及びL3 は各々
【化６９】
2021517113.tif 000096
である。
【０１７２】
式VIの幾つかの実施形態において、L4 は:
【化７０】
2021517113.tif 000097
からなる群より選ばれ、ここで、
【化７１】
2021517113.tif 000098
は結合点を示す。
【０１７３】
式VIの幾つかの実施形態において、R3 は場合により置換されたアリールである。式VIの幾つかの実施形態において、R3 はパラ-ニトロフェニルである。
【０１７４】
式VIの幾つかの実施形態において、R4 はHである。
【０１７５】
式VII
式VIIは構造：
【０１７６】
【化７２】
2021517113.tif 000099
【０１７７】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4 は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
各場合のR4はH又は場合により置換されたアルキルであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）により示され、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１７８】
式VIIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【０１７９】
【化７３】
2021517113.tif 000100
である。式VIIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化７４】
2021517113.tif 000101
である。式VIIの幾つかの実施形態において、L1 L2 及びL3 は各々
【化７５】
2021517113.tif 000102
である。
【０１８０】
式VIIの幾つかの実施形態において、L4 は:
【化７６】
2021517113.tif 000103
からなる群より選ばれ、ここで、
【化７７】
2021517113.tif 000104
は結合点を示す。
【０１８１】
式VIIの例示の化合物は下記の表５に示す。
【０１８２】
【表５−１】
2021517113.tif 000105
【０１８３】
【表５−２】
2021517113.tif 000106
【０１８４】
【表５−３】
2021517113.tif 000107
【０１８５】
式VIII
式VIIIは構造：
【０１８６】
【化７８】
2021517113.tif 000108
【０１８７】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
R3はH、場合により置換されたアルキル、及び、場合により置換されたアリールであり、
R4はH又は場合により置換されたアルキルであり、そして
TLは標的リガンドである）により示され、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１８８】
式VIIIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化７９】
2021517113.tif 000109
である。式VIIIの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化８０】
2021517113.tif 000110
である。式VIIIの幾つかの実施形態において、L1 L2 及びL3 は各々
【化８１】
2021517113.tif 000111
である。
【０１８９】
式VIIIの幾つかの実施形態において、L4 は:
【化８２】
2021517113.tif 000112
からなる群より選ばれ、ここで、
【化８３】
2021517113.tif 000113
は結合点を示す。
【０１９０】
式VIIIの幾つかの実施形態において、R3 は場合により置換されたアリールである。式VIIIの幾つかの実施形態において、R3 はパラ-ニトロフェニルである。
【０１９１】
式VIIIの例示の化合物は下記の表６に示される。
【０１９２】
【表６−１】
2021517113.tif 000114
【０１９３】
【表６−２】
2021517113.tif 000115
【０１９４】
【表６−３】
2021517113.tif 000116
【０１９５】
式IX
式IXは構造：
【０１９６】
【化８４】
2021517113.tif 000117
【０１９７】
（上式中、L1、L2及びL3は、各々独立して、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーであり、
L4は、リンカーであり、該リンカーは、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含み、
TLは標的リガンドであり、
各場合のR4 はH又は場合により置換されたアルキルであり、そして
ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる）により示され、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１９８】
式IXの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化８５】
2021517113.tif 000118
である。式IXの幾つかの実施形態において、L1、L2 及びL3 は各々
【化８６】
2021517113.tif 000119
である。式IXの幾つかの実施形態において、L1 L2 及びL3 は各々
【化８７】
2021517113.tif 000120
である。
【０１９９】
式IXの幾つかの実施形態において、L4 は:
【化８８】
2021517113.tif 000121
からなる群より選ばれ、ここで、
【化８９】
2021517113.tif 000122
は結合点を示す。
【０２００】
式IXの例示の化合物は下記の表７に示される。
【０２０１】
【表７−１】
2021517113.tif 000123
【０２０２】
【表７−２】
2021517113.tif 000124
ここで、TLは標的リガンドを含み、そしてＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み又はからなる。
【０２０３】
L1、L2、L3
式I〜IXの幾つかの実施形態において、各場合のL1、L2又はL3 は場合により置換されたアルキレンを含むリンカーである。L1、L2又はL3 は当該技術分野で知られている任意の適切なリンカーを含むことができる。幾つかの実施形態において、L1、L2又はL3 は1〜５０個の原子の長さを有する鎖を含む。L1、L2又はL3の鎖の長さはアルキンと第四級炭素との間の直接的な原子の数を示すが、鎖内の原子から枝分かれしている原子がさらに存在することができる。幾つかの実施形態において、L1、L2又はL3 の長さは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０原子であることができる。
【０２０４】
幾つかの実施形態において、すべての場合のL1、L2及びL3 は同一である。他の実施形態において、各L1、L2及びL3 は異なる部分である。
【０２０５】
幾つかの実施形態において、L1、L2、L3 又はL4 はアミドを含むことができる。
【０２０６】
幾つかの実施形態において、L1、L2、L3 又はL4 はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。
【０２０７】
幾つかの実施形態において、L1、L2、L3又はL4の場合により置換されたアルキレンは、アミド、エーテル、エステル、チオエーテル、チオン、ケトン、アミン、スルホン、スルホンアミド、又は、原子の鎖、例えば、限定するわけではないが、置換もしくは非置換のアルケニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール又はアルキニルヘテロアリールにより中断されうる。
【０２０８】
幾つかの実施形態において、L1、L2及びL3 は各々独立して、
【化９０】
2021517113.tif 000125
からなる群より選ばれることができる。
【０２０９】
L4
式I〜IXの実施形態において、L4 は、場合により置換されたアルキレンを含むリンカーである。L4 は当該技術分野で知られている任意の適切なカップリング部分を含むことができる。幾つかの実施形態において、L4 は１〜５０個の原子の長さを有する鎖を含む。L2 の鎖の長さはアルキンと第四級炭素との間の直接的な原子の数を示すが、鎖内の原子から枝分かれしている原子がさらに存在することができる。幾つかの実施形態において、L2の長さは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０原子であることができる。
【０２１０】
幾つかの実施形態において、L4 は:
【化９１】
2021517113.tif 000126
からなる群より選ばれ、ここで、
【化９２】
2021517113.tif 000127
は結合点を示す。
【０２１１】
R
式I〜IXの実施形態において、Rはカップリング部分又はＲＮＡｉ剤を含む。幾つかの実施形態において、Rはカップリング部分を含み、そして該カップリング部分はホスホロアミダイトである。他の実施形態において、Rはカップリング部分を含み、そして該カップリング部分はエステルである。他の実施形態において、Rはカップリング部分を含み、そして該カップリング部分はカーボネートである。
【０２１２】
幾つかの実施形態において、RはＲＮＡｉ剤を含む。RがＲＮＡｉ剤を含むときに、RはＲＮＡｉ配列の一部を形成しない追加の原子を含むことができる。例えば、幾つかの実施形態において、Rは
【化９３】
2021517113.tif 000128
であることができ、ここで、ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み、ここで、
【化９４】
2021517113.tif 000129
は結合点を示す。幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤はセンス鎖の５’末端で式I〜IXの化合物に結合されている。
【０２１３】
幾つかの実施形態において、Rは
【化９５】
2021517113.tif 000130
からなる群より選ばれる。
【０２１４】
医薬組成物
幾つかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される１つ以上のトリアルキン結合剤を含む治療化合物を含む医薬組成物を提供する。
【０２１５】
本明細書において使用されるときに、「医薬組成物」は、薬理学的に有効な量の活性医薬成分（ＡＰＩ）、及び、場合により、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）は、薬物送達システムに意図的に含まれている活性医薬成分（ＡＰＩ、治療用製品）以外の物質である。賦形剤は、意図された用量で治療効果を発揮しないか、又は発揮することが意図されない。賦形剤は、ａ）製造中の薬物送達システムの処理を支援する、ｂ）ＡＰＩの安定性、バイオアベイラビリティ又は患者受容性を保護、支持又は向上させる、ｃ）製品の識別を支援する、及び/又は、ｄ)保管又は使用中のＡＰＩの全体的な安全性、有効性、送達のその他の属性を向上させるように作用することができる。薬学的に許容される賦形剤は、不活性物質であっても又はなくてもよい。
【０２１６】
賦形剤としては、限定するわけではないが、吸収促進剤、付着防止剤、消泡剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、キャリア、コーティング剤、着色剤、送達促進剤、送達ポリマー、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、エクステンダー、フィラー、フレーバー、滑剤、保湿剤、潤滑剤、油、ポリマー、防腐剤、生理食塩水、塩、溶媒、糖類、懸濁剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤及び湿潤剤が挙げられる。
【０２１７】
本明細書に記載の医薬組成物は、医薬組成物に一般的に見られる他の追加の成分を含むことができる。幾つかの実施形態において、追加の成分は、医薬活性材料である。医薬活性材料としては、限定するわけではないが、かゆみ止め薬、収斂薬、局所麻酔薬又は抗炎症薬（例えば、抗ヒスタミン、ジフェンヒドラミンなど）、小分子薬、抗体、抗体フラグメント、アプタマー及び/又はワクチンが挙げられる。
【０２１８】
医薬組成物はまた、防腐剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着臭剤、浸透圧の変動のための塩、緩衝剤、コーティング剤又は抗酸化剤を含むことができる。それらはまた、既知の治療効果を有する他の薬剤を含むことができる。
【０２１９】
医薬組成物は、局所治療又は全身治療のどちらが望ましいか、及び、治療される領域に応じて、幾つかの方法で投与することができる。投与は当該技術分野で一般に知られている任意の方法で行うことができ、例えば、限定するものではないが、局所的（例えば、経皮パッチによる）、経肺（例えば、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による、例えば、ネブライザー、気管内、鼻腔内によるものを含む）、表皮、経皮、経口又は非経口により行うことができる。非経口投与としては、限定するわけではないが、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入、皮下（例えば、インプラントされたデバイスを介して）、頭蓋内、実質内、くも膜下腔内及び脳室内投与が挙げられる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は皮下注射によって投与される。医薬組成物は、例えば、錠剤、コーティング錠、糖衣錠、ハードもしくはソフトゼラチンカプセル、溶液、乳濁液又は懸濁液の形態で経口投与することができる。投与はまた、例えば坐剤を使用して直腸的に、例えば、軟膏、クリーム、ゲル又は溶液を使用して局所的又は経皮的に、又は、例えば注射可能な溶液を使用して非経口的に投与されうる。
【０２２０】
注射用途に適した医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合には、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM（BASF,Parsippany,NJ）又はリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。それは、製造及び保管の条件下で安定であるべきであり、細菌類及び真菌類などの微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、及び、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらされることができる。
【０２２１】
無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒に、上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせとともに取り込み、必要に応じてフィルタ滅菌することで調製できる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法としては、真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられ、これにより、事前に無菌ろ過された溶液から活性成分及び任意の追加の所望成分の粉末が得られる。
【０２２２】
関節内投与に適した製剤は微結晶形態であることができ、例えば、水性微結晶懸濁液の形態であることができる、本明細書に記載される任意のリガンドの無菌水性調製物の形態であることができる。リポソーム製剤又は生分解性ポリマー系を使用して、関節内投与及び眼内投与の両方のために本明細書に記載されている任意のリガンドを提示することもできる。
【０２２３】
活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムなどの制御放出製剤など、体からの急速な排出から化合物を保護するキャリアとともに調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容されるキャリアとして使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【０２２４】
医薬組成物は、医薬組成物に一般的に見出される他の追加の成分を含むことができる。そのような追加の成分としては、限定するわけではないが、かゆみ止め薬、収斂剤、局所麻酔剤又は抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン、ジフェンヒドラミンなど）が挙げられる。本明細書で使用されるときに、「薬理学的有効量」、「治療有効量」又は単に「有効量」は、薬理学的、治療的又は予防的結果をもたらす医薬活性剤の量を指す。
【０２２５】
トリアルキン結合剤を含む医薬も本発明の対象であり、そのような医薬の製造方法も同様であり、その方法は、トリアルキン結合剤を含む１つ以上の化合物、及び、必要に応じて、既知の治療効果を有する１つ以上の他の物質を、薬学的に許容される形態にすることを含む。
【０２２６】
本明細書に開示されている記載のトリアルキン結合剤及び該トリアルキン結合剤を含む医薬組成物は、キット、容器、パック又はディスペンサにパッケージ又は含まれることができる。トリアルキン結合剤及び該トリアルキン結合剤を含む医薬組成物は、予め充填されたシリンジ又はバイアルにパッケージされうる。
【０２２７】
標的リガンド、薬物動態（ＰＫ）モジュレータ及び送達ビヒクル
幾つかの実施形態において、トリアルキン結合剤は、１つ以上の非ヌクレオチド基にコンジュゲートされ、非ヌクレオチド基としては、限定するわけではないが、標的リガンド、薬物動態（ＰＫ）モジュレータ、送達ポリマー又は送達ビヒクルが挙げられる。非ヌクレオチド基は、カーゴ分子の標的化、送達又は結合を強化することができる。非ヌクレオチド基は、センス鎖の３'又は５'末端で、ＲＮＡｉ剤に共有結合されうる。幾つかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖の５'末端に結合される。幾つかの実施形態において、式Iのトリアルキンリンカーは、不安定な、切断可能な又は可逆的な結合又はリンカーを介してＲＮＡｉ剤に結合される。
【０２２８】
幾つかの実施形態において、非ヌクレオチド基はそれが結合されたＲＮＡｉ剤又はコンジュゲートの薬物動態特性又は生体分布特性を増強して、コンジュゲートの細胞又は組織特異的分布及び細胞特異的取り込みを改善する。幾つかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤のエンドサイトーシスを亢進させる。
【０２２９】
標的リガンド又は標的部分は、それらが結合しているカーゴ分子の薬物動態又は生体内分布特性を増強して、ＲＮＡｉ剤の細胞特異的（幾つかの場合に、器官特異性を含む）分布及び細胞特異的（又は器官特異的）取り込みを改善する。幾つかの実施形態において、標的リガンドとしては、標的化合物及びＰＫエンハンサー又はモジュレータが挙げられる。幾つかの実施形態において、標的リガンドは細胞受容体に向けられる。
【０２３０】
標的リガンドへのコンジュゲーション
幾つかの実施形態において、式Iのトリアルキンリンカーは、カップリング剤によりＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされうる。式IのトリアルキンリンカーをＲＮＡｉ分子にコンジュゲートするための例示的なスキームを以下の反応スキームに示す：
【化９６】
2021517113.tif 000131
（上式中、L1、L2、L3、Q及びXはすべて式Iにおいて記載したとおりであり、Rはカップリング部分を含み、RGは反応性基であり、そしてL4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーである）。
【０２３１】
幾つかの実施形態において、標的リガンド(ＴＬ)はＲＮＡｉ分子へのコンジュゲーション前にトリアルキン部分にコンジュゲートされうる。この反応の例は下記のスキームに示される。
【化９７】
2021517113.tif 000132
（上式中、L1、L2、L3、Q及びXはすべて式Iにおいて記載したとおりであり、Rはカップリング部分を含み、そしてL4 は、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリーレン、又は、場合により置換されたシクロアルキレンを含むリンカーである）。
【０２３２】
ＲＮＡｉ分子はアミノ基（アミンとしても本明細書で参照される）などの反応性基を有して合成されうる。幾つかの実施形態において、反応性基はＲＮＡｉ剤の５′-末端及び/又は３′-末端で結合されうる。幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は二本鎖であることができる。ＲＮＡｉ剤が二本鎖である実施形態において、反応性基はＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖であることができる。
【０２３３】
例えば、幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の5 '末端にNH2-C6H12（ヘキシレンアミン）基を有するＲＮＡｉ剤が合成される。 続いて、末端アミノ基を反応させて、例えば、式Iの化合物のカップリング部分とコンジュゲートを形成することができる。幾つかの実施形態において、カップリング部分はエステルであり、ＲＮＡｉ剤上の反応性基は第一級アミンであり、そしてＲＮＡｉ剤とトリアルキンリンカーとの間にアミド結合が形成される。この反応の例を、式VIの化合物を使用した以下のスキームに示す。
【化９８】
2021517113.tif 000133
（上式中、L1、L2、L3、L4、R3、R4 及びＲＮＡはすべて式VI及びVIIにおいて記載したとおりである）。
【０２３４】
他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は末端-CH2OH基を有して合成される。幾つかの実施形態において、式IのＲ中のカップリング剤はホスホロアミダイトを含む。末端アルコールを含むＲＮＡｉ剤を式IIのトリアルキンと反応して、下記の反応スキームに示されるとおりのホスフェートを生成することができる。
【化９９】
2021517113.tif 000134
【０２３５】
幾つかの実施形態において、標的リガンド(ＴＬ)はトリアルキン結合剤がＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされた後に、本明細書に記載されるとおりのトリアルキン結合剤にコンジュゲートされうる。この反応の例を下記のスキームに示す。
【化１００】
2021517113.tif 000135
【実施例】
【０２３６】
例
例1. 化合物1(2-シアノエチル ((1r,4r)-4-((1,7-ジオキソ-4-(3-オキソ-3-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)プロピル)-1,7-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ヘプタン-4-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１０１】
2021517113.tif 000136
化合物1 (12.00 g、25.6 mmol)及びDIPEA (12.22 g、16.47 mL、94.6 mmol)のDMF (50 mL)中の溶液に、TBTU (28.72 g、89.5 mmol)を0℃で添加した。内部温度は0℃から16℃に上昇した。20℃未満の内部温度を維持しながら、プロパルギルアミン(4.93 g、5.73 mL、89.5 mmol)を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、そして反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をDCM (100 mL)で希釈し、そして1 N HCl (2 x 100 mL)及び飽和水性NaHCO3 (2 x 100 mL)で洗浄した。有機層は曇り、そして室温で撹拌した。1.5時間後に、沈殿物をろ過により回収し、DCM (100 mL)で濯ぎ、そして乾燥した。化合物2の収量：10.4 g (70%)。C34H36N4O5 について計算された[M+H]: 581.70、実測値: 581.79。
【化１０２】
2021517113.tif 000137
【０２３７】
化合物2 (12.17 g、21.0 mmol)のDMF (60 mL)中の溶液に、トリエチルアミン(10.6 g、14.7 mL、105 mmol)を室温にて加えた。反応混合物を一晩撹拌した。次いで、反応混合物を濃縮し、そしてシリカゲルを固定相として使用してCombiFlash（登録商標）により精製し、1%トリエチルアミンを含むDCM中のMeOH (0〜13%)の勾配で溶離した。化合物3の収量：6.08 g (81%)。C19H26N4O3 について計算された[M+H]: 359.45、実測値: 359.35。
【化１０３】
2021517113.tif 000138
【０２３８】
ピリジン(26 mL)中の化合物4 (2.55g、17.69 mmol)を無水酢酸(12.8 mL、135 mmol)で処理し、そして室温で4時間撹拌した。完了時に、すべての揮発分を除去し、そして化合物5 を1%酢酸を含むヘキサン中の酢酸エチルの勾配液で溶離してシリカ上での分離により単離した。収量: 2.56 g (78%)。 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ12.11 (s, br, 1H) 4.56 (m, 1H), 2.21 (m, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.90 (m, 4H), 1.38 (m, 4H)。
【化１０４】
2021517113.tif 000139
【０２３９】
化合物5 (400 mg、2.15 mmol)のDCM (5 mL)中の溶液に、DMF (16 mg、17 μL、0.215 mmol)及び塩化オキサリル(1.36 g、922 μL、10.74 mmol)を0℃で添加した。30分後に、冷却浴を取り外し、そして反応混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、そして生成物を更なる精製なしに次の工程において使用した。
【化１０５】
2021517113.tif 000140
【０２４０】
化合物3 (1000 mg、2.79 mmol)のDCM (10 mL)中の溶液に、ピリジン(1.88 g、1.92 mL、23.7 mmol)を添加した。反応混合物を0℃に冷却し、そして化合物6 (398 mg、1.95 mmol)のDCM (5 mL)中の溶液を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、そして混合物を室温にて一晩撹拌した。水(10 mL)を添加して反応をクエンチした。混合物をDCM (30 mL)で希釈し、そして飽和水性NH4Cl (20 mL)及びブライン(10 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液 (0〜7%)を用いて溶離した。化合物 7の収量: 630 mg (43%)。C28H38N4O6について計算された[M+H]: 527.64、実測値: 527.69。
【化１０６】
2021517113.tif 000141
【０２４１】
化合物7 (288 mg、0.55 mmol)のTHF (1.75 mL)中の溶液に、1 M NaOH溶液(2.73 mL、2.73 mmol)を室温にて添加した。反応混合物を室温にて1.5時間撹拌し、次いで、35℃にさらに30分間加熱した。出発材料の消費時に、反応混合物をpH=5に2 M HClを使用して酸性化し、そして濃縮した。残留物をACN (20 mL)とともに共蒸発させた。乾燥後に、残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜10%)を使用して溶離した。化合物8の収量: 216 mg (81%)。C26H36N4O5について計算された[M+H]: 485.61、実測値: 485.56。
【化１０７】
2021517113.tif 000142
【０２４２】
化合物8 (213 mg、0.44 mmol)を無水ACN (2 x 10 mL)から共沸乾燥し、次いで、ACN (4 mL)中に溶解した。反応混合物を0℃に冷却した。4,5-ジシアノイミダゾール(26 mg、0.22 mmol)を添加し、次いで、2-シアノエチルN,N,N′,N′-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(199 mg、0.66 mmol)を添加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌した。出発材料の消費時に、トリエチルアミン (44 mg、61 μL、0.44 mmol)を添加し、そして反応混合物をオイルに濃縮した。オイルをCombiFlash（登録商標）により固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そして1% トリエチルアミンを含むEtOAcのDCM中の勾配液(50〜100%)により溶離した。化合物9 (化合物1)の収量: 174 mg (58%)。C35H53N6O6Pについて計算された[M+H]: 685.83、実測値: 685.94。
【０２４３】
例2. 化合物2 (2-シアノエチル ((1s,4s)-4-((1,7-ジオキソ-4-(3-オキソ-3-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)プロピル)-1,7-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ヘプタン-4-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１０８】
2021517113.tif 000143
化合物10 (シス-4-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、2.00 g、13.87 mmol)のピリジン (19.75 g、20.20 mL、250 mmol)中の溶液に、無水酢酸(10.83 g、10.03 mL、106 mmol)を0℃にて添加した。冷却浴を取り外し、そして反応混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、そして残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてEtOAcのヘキサン中の勾配液(0〜30%)を使用して溶離した。化合物11の収量: 1.75 g (68%)。C9H14O4について計算された[M-H]: 185.20、実測値: 185.35。
【化１０９】
2021517113.tif 000144
【０２４４】
化合物11 (420 mg、2.26 mmol)のDCM (5 mL)中の溶液に、DMF (16.5 mg、17.4 μL、0.226 mmol)及び塩化オキサリル(1.43 g、0.97 mL、11.3 mmol)を0℃で添加した。30分後に、冷却浴を取り外し、そして反応混合物を室温にて2時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、トルエンとともに共蒸発させ、そして生成物12を精製なしに次の工程において使用した。
【化１１０】
2021517113.tif 000145
【０２４５】
化合物 3 (400 mg、1.12 mmol)のDMF (2 mL)中の溶液に、ピリジン (750 mg、767 μL、9.50 mmol)を添加した。反応混合物を0℃に冷却し、そして化合物12 (457 mg、2.23 mmol)のDCM (2 mL)中の溶液を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、そして反応混合物を室温にて1.5時間撹拌した。混合物をDCM (20 mL)で希釈し、そして飽和水性NH4Cl (10 mL)でクエンチした。有機相をブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜10%)で溶離した。化合物13の収量: 365 mg (62%)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ8.21 (t, 3H), 7.07 (s, 1H), 4.84 (m, 1H), 3.81 (dd, 6H), 3.07 (t, 3H), 2.18 (m, 1H), 1.99 (m, 9H), 1.80-1.72 (m, 8H), 1.64-1.42 (m, 6H)。
【化１１１】
2021517113.tif 000146
【０２４６】
化合物13 (360 mg、0.68 mmol)のTHF (2.2 mL)中の溶液に、1 M NaOH溶液(3.42 mL、3.42 mmol)を室温にて添加した。反応混合物を室温にて2時間撹拌し、次いで、35℃にさらに1.5時間加熱した。出発材料の消費時に、反応混合物をpH = 5に2 M HClを用いて酸性化し、そして濃縮した。残留物をACN (20 mL)とともに共蒸発した。乾燥後に、残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜12%)で溶離した。化合物8の収量: 250 mg (75 %)。 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ8.22 (t, 3H), 6.96 (s, 1H), 4.24 (d, 1H), 3.81 (dd, 6H), 3.75 (s, br, 1H), 3.07 (t, 3H), 2.10 (m, 1H), 1.99 (m, 6H), 1.82-1.58 (m, 10H), 1.36 (m, 4H)。
【化１１２】
2021517113.tif 000147
【０２４７】
化合物14 (245 mg、0.51 mmol)を無水ACN (2 x 10 mL)から共沸乾燥し、次いで、ACN (4 mL)中に溶解した。反応混合物を0℃に冷却した。4,5-ジシアノイミダゾール (30 mg、0.25 mmol)を添加し、次いで、2-シアノエチル N,N,N′,N′-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (229 mg、0.76 mmol)を添加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、次いで、室温にて1.5時間撹拌した。反応混合物をオイルに濃縮し、 次いで、DCM (15 mL)中に溶解した。混合物を飽和水性NaHCO3 (2 x 5 mL)及びブライン(5 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そして1% トリエチルアミンを含むEtOAcのDCM中の勾配液 (50〜100%)で溶離した。化合物15 (化合物2)の収量: 204 mg (59%)。C35H53N6O6Pについて計算された[M-H]: 683.81、実測値: 684.14。
【０２４８】
例3. 化合物3 (2-シアノエチル (5-((1,7-ジオキソ-4-(3-オキソ-3-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)プロピル)-1,7-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ヘプタン-4-イル)アミノ)-5-オキソペンチル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１１３】
2021517113.tif 000148
化合物3 (475 mg、1.33 mmol)のDMF (5 mL)中の溶液に、トリエチルアミン (402 mg、555 μL、3.98 mmol)及び無水グルタル酸 (190 mg、1.65 mmol)を室温にて添加した。反応混合物を1時間撹拌し、次いで、DMAP (8.1 mg、0.066 mmol)、MeOH (424 mg、536 μL、13.25 mmol)及びN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド ヒドロクロリド (508 mg、2.65 mmol)を室温にて添加した。混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物をDCM (20 mL)で希釈し、そして飽和水性NaHCO3 (10 mL)で洗浄した。水性層をDCM (2 x 5 mL)で逆抽出した。合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜7.5%)で溶離した。化合物16の収量: 273 mg (42%)。C25H34N4O6について計算された[M+H]: 487.58、実測値: 487.61。
【化１１４】
2021517113.tif 000149
【０２４９】
化合物16 (173 mg、0.36 mmol)のMeOH (0.87 mL)及びiPrOH (1.74 mL)中の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム (54 mg、1.42 mmol)を0℃にて添加した。30分後に、冷却浴を取り外し、そして塩化リチウム(10 mg)を添加した。反応混合物を室温にて一晩撹拌した。次の日に、水素化ホウ素ナトリウムの追加部分 (27 mg、0.71 mmol)を添加し、そして反応を1時間続けた。反応混合物を濃縮し、CombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜12%)で溶離した。化合物17の収量: 93 mg。C24H34N4O5について計算された[M+H]: 459.57、実測値: 459.63。
【化１１５】
2021517113.tif 000150
【０２５０】
化合物17 (175 mg、0.38 mmol)を無水ACN (2 x 5 mL)から共沸乾燥し、次いで、ACN (3 mL)中に溶解した。反応混合物を0℃に冷却した。4,5-ジシアノイミダゾール (22.5 mg、0.19 mmol)を添加し、次いで、2-シアノエチル N,N,N′,N′-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (173 mg、0.57 mmol)を添加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、次いで、室温にて30分間撹拌した。反応混合物をオイルに濃縮し、次いで、DCM (15 mL)中に溶解した。混合物を飽和水性NaHCO3 (5 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そして1% トリエチルアミンを含むEtOAcのDCM中の勾配液(50〜100%)で溶離した。化合物18 (化合物3)の収量: 132 mg (53%)。C33H51N6O6Pについて計算された[M+H]: 659.79、実測値: 659.93。
【０２５１】
例4. 化合物4 (2-シアノエチル ((1r,4r)-4-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)シクロヘキシル) ジイソプロピルホスホロアミダイト)
【化１１６】
2021517113.tif 000151
化合物19 (4.42 g、5.23 mmol)のDMF (25 mL)中の溶液に、トリエチルアミン (3.63 g、5.00 mL. 35.9 mmol)を室温にて添加した。反応混合物を一晩撹拌した。次いで、反応混合物を濃縮し、そしてCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜20%)で溶離した。化合物20の収量: 3.08 g (95%)。 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ7.82 (t, 3H), 4.14 (d, 6H), 3.58-3.49 (m, 12H), 3.42-3.36 (m, 9H), 3.17 (q, 6H), 2.05 (m, 6H), 1.41 (m, 6H)。
【化１１７】
2021517113.tif 000152
【０２５２】
化合物20 (900 mg、1.45 mmol)及び化合物5 (404 mg、2.17 mmol)のDMF (7 mL)中の溶液に、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU、550 mg、2.17 mmol)を、次いで、DIEA (374 mg、503 μL、2.90 mmol)を0℃で添加した。冷却浴を取り外し、 そして反応混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物をオレンジオイルに濃縮し、それをDCM (25 mL)中に溶解した。混合物を1 M HCl (2 x 10 mL)及び飽和水性NaHCO3 (10 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜8%)で溶離した。化合物 27の収量: 880 mg (77%)。C40H62N4O12について計算された[M+H]: 791.96、実測値: 792.08。
【化１１８】
2021517113.tif 000153
【０２５３】
化合物 27 (925 mg、1.17 mmol)のTHF (6 mL)中の溶液に、1 M NaOH (5.85 mL、5.85 mmol)を室温にて添加した。混合物を35℃に2時間加熱した。反応混合物をpH = 6に2 M HClを用いて酸性化した。塩化ナトリウム(約3 g)を水性相に添加し、そして混合物をDCM (3 x 40 mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜12%)で溶離した。化合物28の収量: 580 mg (66%)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ7.82 (t, 3H), 7.04 (s, 1H), 4.51 (d, 1H), 4.14 (d, 6H), 3.58-3.49 (m, 12H), 3.42-3.36 (m, 9H), 3.18 (q, 6H), 2.06-1.92 (m, 7H), 1.88-1.62 (m, 10H), 1.35 (m, 2H), 1.10 (m, 2H)。
【化１１９】
2021517113.tif 000154
【０２５４】
化合物 28 (577 mg、0.77 mmol)を無水ACN (2 x 20 mL)から共沸乾燥し、次いで、ACN (10 mL)中で溶解した。反応混合物を0℃に冷却した。4,5-ジシアノイミダゾール (45.5 mg、0.39 mmol)を、次いで、2-シアノエチル N,N,N′,N′-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (348 mg、1.12 mmol)を添加した。冷却浴を取り外し、そして反応混合物を1時間室温にて撹拌した。反応混合物をオイルに濃縮し、次いで、DCM (30 mL)中に溶解した。混合物を飽和水性NaHCO3 (2 x 10 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そして1% トリエチルアミンを含むMeOHのDCM中の勾配液(0〜2%)で溶離した。化合物29 (化合物4)の収量: 610 mg (83%)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ7.82(t, 3H), 7.07 (s, 1H), 4.14 (d, 6H), 3.76-3.60 (m, 2H), 3.58-3.48 (m, 14H), 3.42-3.36 (m, 9H), 3.18 (q, 6H), 2.74 (t, 2H), 2.12-2.04 (m, 1H), 2.02-1.89 (m, 8H), 1.83-1.67 (m, 8H), 1.45-1.31 (m, 2H), 1.30-1.21 (m, 2H), 1.13 (dd, 12H)。31P NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ144.6。
【０２５５】
例5. 化合物5 (2-シアノエチル ((1s,4s)-4-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)シクロヘキシル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１２０】
2021517113.tif 000155
化合物20 (1070 mg、1.72 mmol)のDCM (7 mL)中の溶液に、ピリジン (1.22 g、1.25 mL、15.5 mmol)を添加した。反応混合物を0℃に冷却し、そして化合物12 (1.06 g、5.15 mmol)のDCM (3.5 mL)中の溶液を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、そして混合物を室温で2時間撹拌した。混合物をDCM (20 mL)で希釈し、そして飽和水性NH4Cl (10 mL)でクエンチした。層を分離し、そして有機相を飽和水性NaHCO3 (10 mL)及びブライン(10 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜7%)で溶離した。化合物24の収量: 295 mg (22%)。C40H62N4O12について計算された[M+H]: 791.96、実測値: 792.08。
【化１２１】
2021517113.tif 000156
【０２５６】
化合物24 (290 mg、0.37 mmol)のTHF (2 mL)中の溶液に、1 M NaOH (1.83 mL、1.83 mmol)を室温にて添加した。混合物を35℃に3時間加熱した。反応混合物を飽和水性NH4Cl (8 mL)でクエンチし、さらにpH = 6に2 M HClを用いて酸性化した。混合物をDCM (3 x 15 mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜12%)で溶離した。化合物25の収量: 183 mg (67%)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ7.83 (t, 3H), 6.97 (s, 1H), 4.24 (d, 1H), 4.14 (d, 6H), 3.75 (s, br, 1H), 3.58-3.49 (m, 12H), 3.42-3.36 (m, 9H), 3.18 (q, 6H), 2.10 (m, 1H), 1.97 (m, 6H), 1.82-1.60 (m, 10H), 1.38 (m, 4H)。
【化１２２】
2021517113.tif 000157
【０２５７】
化合物25 (180 mg、0.24 mmol)は無水ACN (2 x 5 mL)から共沸乾燥し、次いで、ACN (2 mL)中に溶解した。反応混合物を0℃に冷却した。4,5-ジシアノイミダゾール (14.2 mg、0.12 mmol)を添加し、次いで、2-シアノエチル N,N,N′,N′-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (109 mg、0.36 mmol)を添加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、次いで、室温にて1.5時間撹拌した。2-シアノエチル N,N,N′,N′-テトライソプロピルホスホロジアミダイトの追加部分 (36 mg、0.12 mmol)を添加し、そして反応混合物をさらに3時間撹拌した。反応混合物をオイルに濃縮し、次いで、DCM (15 mL)中に溶解した。その混合物を飽和水性NaHCO3 (2.5 mL)及び水(2.5 mL)の混合物で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そして1% トリエチルアミンを含むMeOHのDCM中の勾配液 (0〜2%)で溶離した。化合物 26 (化合物5)の収量: 116 mg (51%)。C47H77N6O12Pについて計算された[M+H]: 950.15、実測値: 950.18。
【０２５８】
例6. 化合物6 (2-シアノエチル (11,16-ジオキソ-14,14-ビス(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7-ジオキサ-10,15-ジアザイコス（diazaicos）-1-イン-20-イル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１２３】
2021517113.tif 000158
化合物 1 (3.00 g、6.39 mmol)及びDIPEA (2.89 g、3.89 mL 16.47 mL、22.4 mmol)のDMF (50 mL)中の溶液に、TBTU (6.77 g、21.1 mmol)を0℃で添加した。プロパルギル-PEG2-アミン (3.02 g、21.1 mmol)のDMF (5 mL)中の溶液を、次いで、滴下して加えた。冷却浴を取り外し、そして反応混合物を室温にて2時間撹拌した。反応混合物をDCM (30 mL)で希釈し、そして1 N HCl (2 x 30mL)及び飽和水性NaHCO3 (2 x 30 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜10%)で溶離した。化合物19の収量: 4.42 g (82%)。
【化１２４】
2021517113.tif 000159
【０２５９】
化合物 20 (960 mg、1.54 mmol)のDCM (8 mL)中の溶液に、トリエチルアミン (468 mg、645 μL、4.62 mmol)及び無水グルタル酸 (220 mg、1.93 mmol)を添加した。反応混合物を室温にて一晩撹拌した。翌日に、DMAP (9.4 mg、0.077 mmol)、MeOH (494 mg、624 μL、15.42 mmol)及びN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミドヒドロクロリド (591 mg、3.08 mmol)を室温にて添加した。反応混合物を5時間撹拌した。反応混合物をオイルに濃縮し、それをDCM (45 mL)中に溶解し、次いで、飽和水性NaHCO3 (10 mL)及び飽和水性NH4Cl (10 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液(0〜7.5%)で溶離した。化合物21の収量: 880 mg (76%)。C37H58N4O12について計算された[M+H]: 751.90、実測値: 751.90。
【化１２５】
2021517113.tif 000160
【０２６０】
化合物 21 (877 mg、1.17 mmol)のTHF (4 mL)及びMeOH (1.75 mL)中の溶液に、塩化リチウム(25 mg、0.58 mmol)の水(1.75 mL)中の溶液を添加した。混合物を0℃に冷却し、そして水素化ホウ素ナトリウム (265 mg、7.01 mmol)を1回で添加した。冷却浴を取り外し、そして反応混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を飽和水性NH4Cl (5 mL)の添加によりクエンチした。10分間の撹拌後に、混合物を濃縮して、THF及びMeOHを除去した。残留物を水(5 mL)で希釈し、そしてDCM (3 x 20 mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてMeOHのDCM中の勾配液 (0〜12%)で溶離した。化合物 22の収量: 562 mg (66%)。C36H58N4O11について計算された[M+H]: 723.19、実測値: 723.81。
【化１２６】
2021517113.tif 000161
【０２６１】
化合物22 (560 mg、0.77 mmol)を無水ACN (2 x 10 mL)から共沸乾燥し、次いで、ACN (5 mL)中に溶解した。反応混合物を0℃に冷却した。4,5-ジシアノイミダゾール (45.7 mg、0.39 mmol)を添加し、次いで、2-シアノエチル N,N,N′,N′-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (350 mg、1.16 mmol)を添加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、次いで、室温にて30分間撹拌した。反応混合物をオイルに濃縮し、次いで、DCM (30 mL)中に溶解した。混合物を飽和水性NaHCO3 (2 x 10 mL)及びブライン(10 mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過しそして濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そして1% トリエチルアミンを含むMeOHのDCM中の勾配液 (0〜2%)で溶離した。化合物6の収量: 434 mg (61%)。 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ7.82(t, 3H), 7.13 (s, 1H), 4.14 (d, 6H), 3.72-3.65 (m, 2H), 3.58-3.48 (m, 16H), 3.42-3.36 (m, 9H), 3.17 (q, 6H), 2.75 (t, 2H), 2.09-1.92 (m, 8H), 1.83-1.72 (m, 6H), 1.52 (m, 4H), 1.13 (dd, 12H)。 31P NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ146.3。
【０２６２】
例7. 化合物7 (2-シアノエチル (4-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)フェニル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１２７】
2021517113.tif 000162
工程１．
化合物1 (200 mg、0.32 mmol)、4-アセトキシ安息香酸(86.4 mg、0.48 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (123.8 mg、0.17 mL、d = 0.742 g/mL、0.96 mmol)のDMF (2 mL)中の溶液に、HATU (243.2 mg、0.64 mmol)を添加した。反応混合物を室温にて撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 Mlの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。合わせた有機相をHCl (aq)及びブラインで順次に洗浄した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA:  DCM、MPB: DCM中20% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、生成物を提供した。収量: 133 mg。
【０２６３】
工程２．
工程1からのアミド生成物を2 mLのMeOH中に溶解し、そして100 mgのK2CO3 を反応物に添加した。室温で一晩撹拌した後に、反応混合物をシリカゲルの短パッドを通してろ過した。ろ液を回収し、そして減圧下に濃縮した。収量: 115 mg、２つの工程で48%。C38H53N4O11 について計算されたMS (ESI) m/z  [M-H] 741.37、実測値: 741.67。
【化１２８】
2021517113.tif 000163
【０２６４】
化合物2 (100 mg、0.1346 mmol))、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(11.5 mg、0.0673 mmol)及び3Åモレキュラーシーブ(20 mg)のDCM (2 mL)中の溶液に、2-シアノエチル Ν,Ν,Ν’,Ν’- テトライソプロピルホスホロジアミダイト (60.9 mg、0.064 mL、0.2019 mmol、1.5 eq)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下で濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填し、そして精製し(MPA: DCM中1% TEA、MPB: DCM中 1% TEA及び4% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、化合物7を提供した。収量: 105 mg (83%)。C47H70N6O12Pについて計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 941.48、実測値941.88。
【０２６５】
例8. 化合物8 (2-シアノエチル (3-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)フェニル) ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１２９】
2021517113.tif 000164
工程1.
化合物1 (200 mg、0.32 mmol)、3-アセトキシ安息香酸(86.7 mg、0.48 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (123.8 mg、0.17 mL、d = 0.742 g/mL、0.96 mmol)のDMF (2 mL)中の溶液に、HATU (243.2 mg、0.64 mmol)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。合わせた有機層をHCl (aq)及びブラインで順次に洗浄した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し (MPA:  DCM、MPB: DCM中10% MeOH、30分間で0〜40%傾斜)、生成物を提供した。収量: 148 mg。
【０２６６】
工程 2. 
工程1からのアミド生成物を 2 mLのMeOH中に溶解しそして100 mgのK2CO3 を反応物中に添加した。室温で一晩撹拌した後に、反応混合物をシリカゲルの短パッドを通してろ過した。ろ液を回収しそして減圧下に濃縮した。収量: 126 mg、2つの工程で53%。C38H55N4O11 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 743.39、実測値: 743.65。
【化１３０】
2021517113.tif 000165
【０２６７】
化合物 3 (125 mg、0.1683 mmol))、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド (14.4 mg、0.0841 mmol)及び3Åモレキュラーシーブ(20 mg)のDCM (2 mL)中の溶液に、2-シアノエチル Ν,Ν,Ν’,Ν’- テトライソプロピルホスホロジアミダイト (76.1 mg、0.08 mL、0.2524 mmol、1.5 eq)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: DCM 中1% TEA、MPB: DCM中1% TEA及び4% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、化合物8を提供した。収量: 130 mg (82%)。 C47H70N6O12P について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 941.48、実測値941.79。
【０２６８】
例9. 化合物9 (2-シアノエチル (2-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)フェニル) ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１３１】
2021517113.tif 000166
工程1. 
化合物1 (200 mg、0.32 mmol)、トリエチルアミン (97.3 mg、0.134 mL、d = 0.726 g/mL、0.96 mmol)のDCM (2 mL)中の溶液に、O-アセチルサリチロイルクロリド(127.6 mg、0.6423 mmol、1.2 eq、CAS 登録番号: 5538-51-2)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。合わせた有機層をHCl (aq)及びブラインで順次に洗浄した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA:  DCM、MPB: DCM中10% MeOH、30分間0〜50%傾斜)、生成物を提供した。収量: 177.8 mg。
【０２６９】
工程２.
工程1からのアミド生成物を2 mLのMeOH中に溶解し、そして100 mgのK2CO3 を反応物に添加した。室温で一晩撹拌した後に、反応混合物をシリカゲルの短パッドを通してろ過した。ろ液を回収しそして減圧下に濃縮した。収量: 126 mg、2つの工程で53%。C38H53N4O11 について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 741.39、実測値: 741.67。
【化１３２】
2021517113.tif 000167
【０２７０】
化合物4 (105 mg、0.1457 mmol))、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(12.5 mg、0.0728 mmol)及び3Åモレキュラーシーブ(20 mg)のDCM (2 mL)中の溶液に、2-シアノエチル Ν,Ν,Ν’,Ν’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (66 mg、0.069 mL、0.2185 mmol、1.5 eq)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSによりモニタリングして確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: DCM中1% TEA、MPB: DCM中1% TEA及び4% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、化合物9を提供した。収量: 181 mg (83%)。C47H70N6O12P について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 941.48、実測値941.79。
【０２７１】
例10. 化合物10 (2-シアノエチル (4'-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)-[1,1'-ビフェニル]-4-イル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１３３】
2021517113.tif 000168
化合物 1 (200 mg、0.3212 mmol)、4′-ヒドロキシ-4-ビフェニルカルボン酸 (103.2 mg、0.4817 mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン (124.5 mg、0.17 mL、d = 0.742 g/mL、0.96 mmol)のDMF (2 mL)中の溶液に、HATU (244.2 mg、0.64 mmol)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。合わせた有機層をHCl (aq)及びブラインで順次に洗浄した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填し、そして精製し(MPA:  DCM、MPB: DCM中10% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、生成物を提供した。収量: 138 mg、52%。C44H59N4O11 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 819.42、実測値: 819.90。
【化１３４】
2021517113.tif 000169
【０２７２】
化合物5 (138 mg、0.1685 mmol))、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(14.4 mg、0.0843 mmol)及び3Åモレキュラーシーブ(20 mg)のDCM (2 mL)中の溶液に、2-シアノエチル Ν,Ν,Ν’,Ν’- テトライソプロピルホスホロジアミダイト (76.2 mg、0.08 mL、0.2528 mmol、1.5 eq)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。Na2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: DCM中1% TEA、MPB: DCM中1% TEA及び4% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、化合物10を提供した。収量: 171 mg (99%)。C53H74N6O12P について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 1017.51、実測値1017.99。
【０２７３】
例11. 化合物11 (2-シアノエチル ((1r,3r)-3-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)シクロブチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１３５】
2021517113.tif 000170
化合物1 (300 mg、0.4817 mmol)、トランス-3-ヒドロキシシクロブタンカルボン酸(83.9 mg、0.7226 mmol、CAS 番号: 1268521-85-2)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン (186.8 mg、0.252 mL、d = 0.742 g/mL、1.4452 mmol)のDMF (3 mL)中の溶液に、HATU (366.3 mg、0.9635 mmol)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。合わせた有機層を. HCl (aq)及びブラインで順次に洗浄した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA:  DCM、MPB: DCM中10% MeOH、30分で0〜100%傾斜)、生成物を提供した。収量: 333.2 mg、88%。C36H57N4O11 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 721.40、実測値721.96。
【化１３６】
2021517113.tif 000171
【０２７４】
化合物6 (166.5 mg、0.2310 mmol))、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(19.8 mg、0.1155 mmol)及び3Åモレキュラーシーブ(20 mg)のDCM (2 mL)中の溶液に、2-シアノエチル Ν,Ν,Ν’,Ν’- テトライソプロピルホスホロジアミダイト (104.4 mg、0.11 mL、0.3465 mmol、1.5 eq)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA:DCM中1% TEA、MPB: DCM中1% TEA及び4% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、化合物11を提供した。収量: 200 mg (94%)。C45H72N6O12P について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 919.50、実測値:  919.73。
【０２７５】
例12. 化合物12 (2-シアノエチル (4-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)ビシクロ [2.2.2]オクタン-1-イル) ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１３７】
2021517113.tif 000172
化合物1 (600 mg、0.9635 mmol)、4-ヒドロキシビシクロ [2.2.2]オクタン-1-カルボン酸 (245.1 mg、0.1561 mmol、CAS番号: 1127-13-5)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン (373.6 mg、0.503 mL、d = 0.742 g/mL、2.8904 mmol)のDMF (5 mL)中の溶液に、HATU (732.7 mg、1.9269 mmol)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。合わせた有機層をHCl (aq)及びブラインで順次に洗浄した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA:  DCM、MPB:DCM中10% MeOH、30分で0〜100%傾斜)、生成物を提供した。収量: 398 mg、54%。C40H61N4O11 について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 773.45、実測値: 773.80。
【化１３８】
2021517113.tif 000173
【０２７６】
化合物7 (200 mg、0.2581 mmol))、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(22.1 mg、0.1290 mmol)及び3Åモレキュラーシーブ(20 mg)のDCM (2 mL)中の溶液に、2-シアノエチル Ν,Ν,Ν’,Ν’- テトライソプロピルホスホロジアミダイト (116.7 mg、0.123 mL、0.3871 mmol、1.5 eq)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: DCM中1% TEA、MPB: DCM中1% TEA及び4% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、化合物12を提供した。収量: 40 mg (16%)。C49H78N6O12Pについて計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 973.54、実測値973.75。
【０２７７】
例 13. 化合物13 (2-シアノエチル (3-((11,17-ジオキソ-14-(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7,21,24-テトラオキサ-10,18-ジアザヘプタコサ-1,26-ジイン-14-イル)カルバモイル)ビシクロ [1.1.1]ペンタン-1-イル) ジイソプロピルホスホロアミダイト)の合成
【化１３９】
2021517113.tif 000174
化合物 1 (400 mg、0.6423 mmol)、3-ヒドロキシビシクロ[1.1.1]ペンタン-1-カルボン酸 (98.7 mg、0.7708 mmol、CAS番号: 83249-08-5)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン (249.1 mg、0.336 mL、d = 0.742 g/mL、1.9269 mmol)のDMF/DCM (10 mL、1:1 v/v)中の溶液に、HATU (488.4 mg,1.2846 mmol)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。合わせた有機層をHCl (aq)及びブラインで順次に洗浄した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA:  DCM、MPB: DCM中10% MeOH、30分で0〜100%傾斜)、化合物8を提供した。収量: 387.6 mg、82%。C37H57N4O11 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 733.40、実測値: 733.66。
【化１４０】
2021517113.tif 000175
【０２７８】
化合物8 (387.6 mg、0.5289 mmol))、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(45.3 mg、0.2644 mmol)及び3Åモレキュラーシーブ(20 mg)のDCM (2 mL)中の溶液に、2-シアノエチル Ν,Ν,Ν’,Ν’- テトライソプロピルホスホロジアミダイト (239.1 mg、0.252 mL、0.7933 mmol、1.5 eq)を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: DCM中1% TEA、MPB:DCM中 1% TEA及び4% MeOH、30分で0〜50%傾斜)、純粋なホスホロアミダイト生成物を提供した。収量: 206.7 mg (42%)。C46H72N6O12Pについて計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 931.50、実測値931.71。
【０２７９】
例14. 化合物14 (2-シアノエチル (11,16,20-トリオキソ-14,14-ビス(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7-ジオキサ-10,15,21-トリアザヘプタコス-1-イン-27-イル)ジイソプロピルホスホロアミダイト)及び化合物22 (4-ニトロフェニル 11,16-ジオキソ-14,14-ビス(3-オキソ-3-((2-(2-(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)エトキシ)エチル)アミノ)プロピル)-4,7-ジオキサ-10,15-ジアザイコス-1-イン-20-オエート)の合成
【化１４１】
2021517113.tif 000176
3-Lのジャケット付き反応器に500 mLのDCM 及び化合物 4 (75.0 g、0.16 mol)を添加した。反応器の内部温度を0℃に冷却し、そしてTBTU (170.0 g、0.53 mol)を添加した。次いで、懸濁液を、アミン 5 (75.5 g、0.53 mol)で5℃未満に維持しながら滴下して処理した。次いで、反応物をDIPEA (72.3 g、0.56 mol)で5℃未満に維持しながらゆっくりと処理した。添加を完了した後に、反応物を1時間にわたって23℃まで温め、3時間撹拌させた。すべての３つの試薬の10%キッカーチャージを添加し、さらに3時間撹拌させた。化合物 4 <1%となったときに反応を完了したとみなした。反応混合物を飽和アンモニウムクロリド溶液(2 x 500 mL)で洗浄し、そして飽和重炭酸ナトリウム溶液(500 mL)で1回洗浄した。次いで、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、そしてオイルに濃縮した。粗製オイルの質量は188 gであり、QNMRにより72%の化合物6を含んだ。粗製オイルを次の工程に運んだ。C46H60N4O11 の計算質量= 845.0 m/z。実測値[M+H] = 846.0。
【化１４２】
2021517113.tif 000177
【０２８０】
72 wt%の化合物6 (86.0 g、0.10 mol)を含む121.2 gの粗製オイルをDMF (344 mL)中に溶解し、そして内部温度を23℃未満に維持しながらTEA (86 mL、20 v/v%)で処理した。Fmoc-アミン 6 の消費に対するジベンゾフルベン（DBF）の生成をHPLC法1によりモニタリングし(図2)、そして反応は10時間以内に完了した。その溶液に、無水グルタル酸 (12.8 g、0.11 mol)及び中間体アミン 7 を化合物8 に2時間以内に転化した。完了時に、DMF及びTEAを減圧下に30℃で除去し、100 gの粗製オイルを得た。化合物7 の水中への高い溶解度のために、水性ワークアップを使用することができず、クロマトグラフィーがDBF、TMU及び無水グルタル酸を除去するための唯一の方法であった。粗製オイル(75 g)をTeledyne ISCO Combi-flash（登録商標）精製システムで3回で精製した。粗製オイル(25 g)を330 gのシリカカラム上に装填しそして0〜20%メタノール/DCMで30分にわたって溶離し、42 gの化合物8 を得た(3つの工程で54%収率)。C36H55N4O12 の計算質量= 736.4 m/z。実測値[M+H] = 737.0。
【化１４３】
2021517113.tif 000178
【０２８１】
化合物 8 (42.0 g、0.057 mol)を10体積のアセトニトリルで同時ストリッピングし（co-stripped）、その後に、クロマトグラフィー溶媒から残留メタノールを除去するために使用した。このオイルをDMF (210 mL)中に再溶解し、そして0℃に冷却した。溶液を4-ニトロフェノール (8.7 g、0.063 moL)で処理し、次いで、EDC-ヒドロクロリド (12.0 g、0.063 mol)で処理し、10時間以内に完了に達することが判った。溶液を0℃に冷却し、そして10体積の酢酸エチルを、次いで、10体積の飽和塩化アンモニウム溶液を、内部温度を15℃未満に維持しながら添加した。層を分離させ、酢酸エチル層をブラインで洗浄した。合わせた水性層を5体積の酢酸エチルで2回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、そしてオイルに濃縮した。粗製オイル(55 g)をTeledyne ISCO Combi-Flash（登録商標）精製システムで3回で精製した。粗製オイル(25 g)を330 gのシリカカラム上に装填しそして0〜10%メタノール/DCMで30分にわたって溶離し、22 gの純粋な化合物9 (化合物22) (50%収率)を得た。C42H59N5O14 の計算質量= 857.4 m/z。 実測値[M+H] = 858.0。
【化１４４】
2021517113.tif 000179
【０２８２】
エステル9 (49.0 g、57.1 mmol)及び6-アミノ-1-ヘキサノール (7.36 g、6.28 mmol)のジクロロメタン(3 体積)の溶液をトリエチルアミン (11.56g、111.4 mmol)で滴下して処理した。反応を化合物9の消失をHPLC 法1で観測することによりモニタリングし、そして10分で完了することが判った。粗製反応混合物を5体積のジクロロメタン希釈し、そして飽和塩化アンモニウム(5体積)及びブライン(5体積)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、そしてオイルに濃縮した。粗製オイルをTeledyne ISCO Combi-flash（登録商標）精製システムで330 gのシリカカラムを使用して精製した。4-ニトロフェノールを100% 酢酸エチルで溶離し、そして化合物10 をカラムから20%メタノール/DCMを用いてフラッシュし、無色オイルを得た(39 g、81%収率)。C42H69N5O12 の計算質量= 836.0 m/z。実測値[M+H] = 837.0。
【化１４５】
2021517113.tif 000180
【０２８３】
アルコール10を10体積のアセトニトリルとともに同時ストリッピングを2回行い、クロマトグラフィー溶媒から残留メタノールを除去し、乾燥ジクロロメタン(KF < 60 ppm)でもう一度行い、微量の水を除去した。アルコール10 (2.30 g、2.8 mmol)を5体積の乾燥ジクロロメタン(KF < 50 ppm)に溶解し、そしてジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(188 mg、1.1 mmol)で処理した。溶液を0℃に冷却し、そして2-シアノエチル N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロアミダイト (1.00 g、3.3 mmol)で滴下して処理した。溶液を氷浴から取り出し、20℃で撹拌した。反応は3〜6時間のうちに完了することが判った。反応混合物を0℃に冷却し、そして10体積の飽和重炭酸アンモニウム/ブライン1:1 溶液で処理し、次いで、1分間で周囲温度に温め、さらに3分間 20℃で撹拌させた。二相混合物を分液漏斗に移し、そして10体積のジクロロメタンを添加した。有機層を分離し、10体積の飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、未反応のビス-リン試薬を加水分解した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、オイルに濃縮し、3.08 gの94 wt%の化合物14を得た。C51H86N7O13P の計算質量= 1035.6 m/z。実測値 [M+H] = 1036。
【０２８４】
例 15. 化合物15 (4-ニトロフェニル 5-((1,3-ビス(プロプ-2-イン-1-イルオキシ)-2-((プロプ-2-イン-1-イルオキシ)メチル)プロパン-2-イル)アミノ)-5-オキソペンタノエート)の合成
【化１４６】
2021517113.tif 000181
工程1.
ジ-tert-ブチルジカーボネート(2.35 g、10.7 mmol) のtBuOH (10 mL)中の溶液を、トリス(ヒドロキシルメチル)アミノメタン(1.00 g、8.20 mmol、CAS番号: 77-86-1)のMeOH/tBuOHの1:1混合物(15 mL)中の懸濁液に添加し、そして混合物を室温にて18時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去して残留物を提供し、該残留物を冷EtOAcによる沈殿により精製した。真空ろ過により、純粋な化合物を白色固形分として提供した(1.4449、80%収率)。C9H20NO5 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 222.13、実測値222.24。
【０２８５】
工程2．
トリオール-NHBoc 10 (500 mg、2.26 mmol)の乾燥DMF (6 mL)中の溶液を臭化プロパルギル(トルエン中80 wt%、1.46 mL、13.6 mmol)とともに0℃で撹拌した。微粉砕したKOHの部分(951 mg、13.6 mmol)を15分間にわたって添加した。次いで、混合物を35℃に加熱し、そして窒素雰囲気下に24時間撹拌した。反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (20 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: ヘキサン、MPB: EA、30分で0〜10%傾斜)、純粋な生成物11を提供した。収量: 483 mg (64%)。
【０２８６】
工程3及び4.
トリアルク-NHBoc 11(483 mg、1.44 mmol)の乾燥DCM (5.6 mL)中の溶液に、滴下してTFA (2.3 mL)を0℃で添加した。褐色混合物を、次いで、室温にて2時間撹拌した。高真空下での濃縮により、さらなる精製なしに固形分を得た。粗生成物をDMF/TEA (6 mL、5/1 v/v)中に室温で溶解した。無水グルタル酸 (328 mg、2.877 mmol)を混合物に添加した。一晩後に、溶媒を減圧下に除去した。固定相としてシリカゲルを使用してCombiflash（登録商標）により精製し、0.9357 gの生成物14 を得た。(MPA: DCM、MPB: DCM中20% MeOH、30分で0〜50%傾斜)。C18H22NO6 について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 348.15、実測値 348.28。
【化１４７】
2021517113.tif 000182
【０２８７】
化合物 14 (470 mg、1.3 mmol)及びp-ニトロフェノール (936 mg、6.7 mmol、5 eq)のDCM (10 mL)中の溶液に、EDC HCl塩(1.28 g、6.7 mmol、5 eq)を0℃で添加した。反応混合物を、次いで、室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。Na2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: ヘキサン、MPB: EA、30分で0〜60%傾斜)、純粋な生成物を黄色オイルとして提供した。収量: 471 mg (77%)。C24H27N2O8 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 471.18、実測値471.33。
【０２８８】
例16. 化合物16 (4-ニトロフェニル 5-(((S)-1-(((R)-1,5-ジオキソ-1,5-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ペンタン-2-イル)アミノ)-1,5-ジオキソ-5-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ペンタン-2-イル)アミノ)-5-オキソペンタノエート)の合成
【化１４８】
2021517113.tif 000183
工程１．
メチル3,4,5-トリヒドロキシルベンゾエート15 (4.6 g、25 mmol、CAS番号 99-24-1)及び臭化プロパルギル(11.9 g、11.1 mL、d = 1.57 g/mL、100 mmol、4 eq)のDMF (50 mL)中の溶液に、K2CO3 (13.8 g、100 mmol、4 eq)を添加した。反応混合物を、次いで、室温で一晩撹拌した。出発材料が消費されたことをTLCにより確認した後に、反応混合物をろ過しそして減圧下に濃縮した。
【０２８９】
工程2.
上記粗生成物をEtOH/H2O (200 mL、1:1 v/v)中に溶解し、そして次いで、90 mLの4 M NaOH aq を反応物に添加した。出発材料が消費されたことをTLCにより確認した後に、反応混合物を減圧下に濃縮してEtOHを除去し、そしてろ過して、白色固形分17 (6.18 g)を提供した。固形分をさらなる精製なしに次の工程に使用した。
【０２９０】
工程3．
化合物 17 (73 mg、0.35 mmol)及びPNP (139 mg、1 mmol、3 eq)のDCM (5 mL)中の溶液に、EDC HCl塩(191 mg、1 mmol、3 eq)を0℃で添加した。次いで、反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをTLCにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: ヘキサン、MPB: EA、30分で0〜40%傾斜)、化合物16を提供した。C22H14NO7 について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 404.08、実測値: 404.48。
【０２９１】
例17. 化合物17 (4-ニトロフェニル 5-(((S)-1-(((R)-1,5-ジオキソ-1,5-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ペンタン-2-イル)アミノ)-1,5-ジオキソ-5-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ペンタン-2-イル)アミノ)-5-オキソペンタノエート)の合成
【化１４９】
2021517113.tif 000184
工程１．
酸18 (4.225 g、10 mmol)、アミン 19 (2.959 g、10 mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (3.87 g、0.52 mL、d = 0.742 g/mL、30 mmol)のDMF (20 mL)中の溶液に、HBTU (5.685 g、15 mmol)を0℃で添加した。反応混合物を室温で撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (20 mL×3)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA:ヘキサン、MPB: EA、30分で0〜33%傾斜)、生成物20 を提供し、それを次の工程に使用した。C37H51N2O9 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 667.36、実測値: 667.49。
【０２９２】
工程2.
工程１からの生成物をTFA/DCM (20 mL、1:1 v/v)中に溶解した。反応物を室温で3時間撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、混合物を減圧下に一晩濃縮した。収量：3.4 g。C25H25N2O9 について計算されたMS (ESI) m/z [M-H] 497.16、実測値: 497.35。
【０２９３】
工程3.
火炎乾燥した丸底フラスコにトリ酸21 (1.000 g、2.008 mmol)、DMF (14 mL)、プロパルギルアミン (0.3645 g、0.42 mL、d = 0.86 g/mL、6.6265 mmol)及びDIEA (0.9066 g、1.222 mL、d = 0.742 g/mL、7.0281 mmol)を添加した。0℃に冷却し、そしてTBTU (2.256 g、7.0281 mmol. 3.5 eq)を添加した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を減圧下に濃縮した。生成物をろ過により得て、そしてDCM (5 mL)及びH2O (5 mL)で洗浄した。一晩凍結乾燥して、0.8818 gの白色固形分22を提供した。C34H36N5O6 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 610.27、実測値: 610.41。
【０２９４】
工程4、5及び6. 
DMF (1 mL)中の化合物22 (100 mg、0.1642 mmol)を、トリエチルアミン (0.1658 g、0.228 mL、d = 0.726 g/mL、1.6420 mmol)に室温にて添加した。反応混合物を一晩撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、無水グルタル酸 (28.1 mg、0.2463 mmol)及びDMAP (2.0 mg、0.0164 mmol)を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。PNP (114.1 mg、0.821 mmol)及びEDC-HCl (156.8 mg、0.8210 mmol)を添加した。出発材料の消費時に、反応混合物を濃縮し、そして固定相としてシリカゲルを使用してCombiFlash（登録商標）により精製し、DCM中MeOHの勾配液(0〜20%)で溶離した。収量: 34 mg、34%。C30H35N6O9 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 623.25、実測値: 623.38。
【０２９５】
例18 化合物18 (4-ニトロフェニル 5-((1,7-ジオキソ-4-(3-オキソ-3-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)プロピル)-1,7-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ヘプタン-4-イル)アミノ)-5-オキソペンタノエート)の合成
【化１５０】
2021517113.tif 000185
化合物3 (1.00 g、2.79 mmol)のDMF (5 mL)中の溶液に、トリエチルアミン (0.847 g、1.17 mL、8.37 mmol)及び無水グルタル酸 (493 mg、4.32 mmol)を室温にて添加した。反応混合物を一晩撹拌した。翌日に、4-ニトロフェノール (896 mg、6.44 mmol)及びN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミドヒドロクロリド (1.23 g、6.44 mmol)を室温にて添加し、そして反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を濃縮した。残留物をCombiFlash（登録商標）により、固定相としてシリカゲルを使用して精製し、そしてDCM中MeOHの勾配液(0〜6%)で溶離した。化合物31 (化合物18)の収量: 1.13 g (74%)。C30H35N5O8について計算された[M+H]: 594.65、実測値: 594.39。
【０２９６】
例19. 化合物19 (2,3,5,6-テトラフルオロフェニル 3-((1,7-ジオキソ-4-(3-オキソ-3-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)プロピル)-1,7-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ヘプタン-4-イル)カルバモイル)ビシクロ[1.1.1]ペンタン-1-カルボキシレート)の合成
【化１５１】
2021517113.tif 000186
工程1.
酸26 (52.2 mg、0.3073 mmol、1.1 eq)、TBTU (134.5 mg、0.4190 mmol、1.5 eq)及びDIEA (108.1 mg、0.1457 mL、d = 0.742 g/mL、0.8380 mmol)のDMF (0.5 mL)中の溶液に、アミン 25 (100 mg、0.2793 mmol)を添加した。反応物を室温にて撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を減圧下に濃縮した。Combiflash（登録商標）での精製(MPA: DCM、MPB:DCM中20% MeOH、30分で0〜50%傾斜)により、純粋な生成物27 を得た。収量: 114 mg、80%。C27H35N4O6 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 511.26、実測値: 511.75。
【０２９７】
工程2.
上記の生成物をTHF/H2O (0.6 mL、2:1 v/v)中に溶解し、次いで、LiOH (16 mg、0.66 mmol、3 eq)を反応物に添加した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を、0.66 mmol HCl (aq)の添加により中和した。混合物を減圧下に濃縮し、週末にわたって凍結乾燥した。粗生成物をさらなる精製なしに次の工程に使用した。
【０２９８】
工程3. 
化合物28、TFP (182.6 mg、1.1 mmol、5 eq)及びDIEA (179.6 mg、0.242mL、d = 0.742 g/mL、1.39 mmol)のDCM (5 mL)中の溶液に、EDC HCl塩(210.1 mg、1.1 mmol、5 eq)を0℃で添加した。次いで、反応混合物を室温にて撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをTLCにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA: ヘキサン、MPB: EA、30分で0〜50%傾斜)、化合物19を提供した。収量: 89 mg (63%)。C32H33F4N4O6 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 645.23、実測値: 645.79。
【０２９９】
例20. 化合物20 (2,3,5,6-テトラフルオロフェニル 4'-((1,7-ジオキソ-4-(3-オキソ-3-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)プロピル)-1,7-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ヘプタン-4-イル)カルバモイル)-[1,1'-ビフェニル]-4-カルボキシレート)の合成
【化１５２】
2021517113.tif 000187
工程1.
酸29 (78.7 mg、0.3073 mmol、1.1 eq)、TBTU (134.5 mg、0.4190 mmol、1.5 eq)及びDIEA (108.1 mg、0.1457 mL、d = 0.742 g/mL、0.8380 mmol)のDMF (0.5 mL)中の溶液に、化合物25 (100 mg、0.2793 mmol)を添加した。反応物を室温にて撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を減圧下に濃縮した。Combiflash（登録商標）での精製(MPA: DCM、MPB: DCM中20% MeOH、30分で0〜50%傾斜)により、純粋な生成物30 を提供した。収量: 165 mg、99%。C34H37N4O6 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H] 597.27、実測値: 597.81。
【０３００】
工程2.
工程1からの生成物をTHF/H2O (0.6 mL、2:1 v/v)中に溶解し、次いで、LiOH (20 mg、0.83 mmol、3 eq)を添加した。すべての出発材料が消費されたことをLC-MSにより確認した後に、反応混合物を0.83 mmol HCl (aq)の添加により中和した。混合物を減圧下に濃縮し、そして週末にわたって凍結乾燥した。粗生成物をさらなる精製なしに次の工程に使用した。
【０３０１】
工程3. 
化合物31、TFP (231 mg、1.39 mmol、5 eq)及びDIEA (179.6 mg、0.242mL、d = 0.742 g/mL、1.39 mmol)のDCM (5 mL)中の溶液に、EDC HCl塩(266 mg、1.39 mmol、5 eq)を0℃にて添加した。次いで、反応混合物を室温にて撹拌した。すべての出発材料が消費されたことをTLCにより確認した後に、反応混合物を2 mLの飽和NaHCO3 水溶液によりクエンチし、そして酢酸エチル (10 mL×3)で抽出した。有機層をNa2SO4 上で乾燥し、そして高真空下に濃縮した。粗生成物をシリカカラム上に装填しそして精製し(MPA:ヘキサン、MPB: EA、30分で0〜50%傾斜)、純粋な生成物である化合物20を提供した。収量: 87 mg (42%)。C39H35F4N4O6 について計算されたMS (ESI) m/z [M+H]+ 731.25、実測値: 731.85。
【０３０２】
例21. 化合物21 ((1r,4r)-4-((1,7-ジオキソ-4-(3-オキソ-3-(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)プロピル)-1,7-ビス(プロプ-2-イン-1-イルアミノ)ヘプタン-4-イル)カルバモイル)シクロヘキシル (4-ニトロフェニル)カーボネート)の合成
【化１５３】
2021517113.tif 000188
THF (0.5 mL)中の化合物8 (例１を参照されたい) (0.048 g、0.10 mmol)及びDIEA (0.18 mL、1.0 mmol)に、4-ニトロフェニルクロロホルメート(0.044 g、0.22 mmol)を添加し、そして反応物を50℃で撹拌した。完了後に、すべての揮発分を除去し、そして化合物21をDCM中MeOHの勾配液で溶離してシリカ上での分離により単離した。収量: 0.035 g (54%)。
【０３０３】
例22. 三座リガンドの合成及び標的リガンドのＲＮＡｉ剤へのコンジュゲーション
標的リガンドは、１つ以上の標的化された遺伝子の発現を阻害するのに有用な１つ以上のＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされうる。標的リガンドは、標的化された細胞及び/又は組織へのＲＮＡｉ剤の送達を促進する。標的リガンドは、細胞表面受容体と相互作用して、細胞へのＲＮＡｉ剤の導入をもたらす特定の部分を含むことができる。以下は、本明細書に記載される非限定的な実施例に例示される、本明細書に記載されるトリアルキン結合剤を使用する特定の標的リガンド-ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの合成の一般的な手順を記載する。
【０３０４】
Ａ.ＲＮＡｉ剤の合成
ＲＮＡｉ剤は、当該技術分野で一般に知られている方法を使用して合成することができる。本明細書に示される実施例に示されるＲＮＡｉ剤の合成のために、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、オリゴヌクレオチド合成で使用される固相でのホスホロアミダイト技術に従って合成された。規模に応じて、MerMade96E（登録商標）（Bioautomation）、MerMade12（登録商標）（Bioautomation）又はOP Pilot 100（GE Healthcare）を使用した。合成は、制御された細孔ガラス（CPG、500Å又は600Å、Prime Synthesis、Aston、PA、USAから入手）でできた固体支持体上で行った。すべてのＲＮＡ及び２'修飾ＲＮＡホスホロアミダイトは、Thermo Fisher Scientific（Milwaukee、WI、USA）から購入した。具体的には、以下の2'-O-メチルホスホロアミダイトを使用した：（5'-O-ジメトキシトリチル-N6-（ベンゾイル）-2'-O-メチル-アデノシン-3'-O-（2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、5'-O-ジメトキシ-トリチル-N4-（アセチル）-2'-O-メチル-シチジン-3'-O-（2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピル-アミノ）ホスホロアミダイト、（5'-O-ジメトキシトリチル-N2-（イソブチリル）-2'-O-メチル-グアノシン-3'-O-（2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト及び5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-メチルウリジン-3'-O-（2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト。2'-デオキシ-2'-フルオロ-ホスホロアミダイトは2'-O-メチルＲＮＡアミダイトと同じ保護基を有した。5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-イノシン-3'-O-（2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイトはGlen Research（Virginia）から購入した。逆脱塩基(inverted abasic)（3'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシリボース-5'-O-（2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ））ホスホロアミダイトはChemGenes（Wilmington,MA,USA）から購入した。以下のUNAホスホロアミダイト：5'-（4,4'-ジメトキシトリチル）-N6-（ベンゾイル）-2',3'-seco-アデノシン、2'-ベンゾイル-3'-[（2-シアノエチル）-（N,N-ジイソプロピル）]-ホスホロアミダイト、5'-（4,4'-ジメトキシトリチル）-N-アセチル-2',3'-seco-シトシン、2'-ベンゾイル-3'-[（2-シアノエチル）-（N,N-ジイソ-プロピル）]-ホスホロアミダイト、5'-（4,4'-ジメトキシトリチル）-N-イソブチリル-2',3'-seco-グアノシン、2'-ベンゾイル-3'-[（2-シアノエチル）-（N,N-ジイソプロピル）]-ホスホロアミダイト及び5'-（4,4'-ジメトキシ-トリチル）-2',3'-seco-ウリジン、2'-ベンゾイル-3'-[（2-シアノエチル）-（N,N-ジイソ-プロピル）]-ホスホロアミダイトを使用した。TFAアミノ結合ホスホロアミダイトも市販購入した（ThermoFisher）。
【０３０５】
あるいは、トリアルキン部分は固体支持体合成後に導入された（以下のセクションFを参照されたい）。この経路では、センス鎖は、第一級アミンを含む5'及び/又は3'末端ヌクレオチドで官能化された。TFAアミノ結合ホスホロアミダイトを無水アセトニトリル（50 mM）中に溶解し、モレキュラーシーブ（3Å）を添加した。5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール（BTT、アセトニトリル中250 mM）又は5-エチルチオ-1H-テトラゾール（ETT、アセトニトリル中250 mM）を活性剤溶液として使用した。カップリング時間は１０分（ＲＮＡ）、９０秒（2'O-Me）及び６０秒（2'F）であった。ホスホロチオエート結合を導入するために、無水アセトニトリル中の3-フェニル1,2,4-ジチアゾリン-5-オン（POS、PolyOrg,Inc.,Leominster,MA,USAから入手）の100 mM溶液を使用した。
【０３０６】
幾つかの実施形態において、式IIIの化合物は、式IIの化合物を反応させることにより合成され、これはＲＮＡｉ剤の末端に付加することができる。幾つかの実施形態において、式IIのトリアルキン結合剤は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の5’末端に付加される。幾つかの実施形態において、式IIのトリアルキン結合剤は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の3’末端に付加される。幾つかの実施形態において、式IIの化合物は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の5’末端に付加される。幾つかの実施形態において、式IIの化合物は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の3’末端に付加される。このタイプの反応の例を以下のスキームに示す。
【化１５４】
2021517113.tif 000189
【０３０７】
本明細書の特定の例で示されているＲＮＡｉ剤と組み合わせて使用したときに、トリアルキン含有ホスホロアミダイトを無水ジクロロメタン又は無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、他のすべてのアミダイトを無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、そしてモレキュラーシーブ（３Å）を添加した。5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール（BTT、アセトニトリル中250 mM）又は5-エチルチオ-1H-テトラゾール（ETT、アセトニトリル中250 mM）を活性剤溶液として使用した。結合時間は、１０分（ＲＮＡ）、９０秒（2’O-Me）及び６０秒（2’F）であった。ホスホロチオエート結合を導入するために、無水アセトニトリル中の3-フェニル1,2,4-ジチアゾリン-5-オン（POS,PolyOrg,Inc.,Leominster,MA,USAから入手）の１００ｍＭ溶液を使用した。
【０３０８】
Ｂ.支持体結合オリゴマーの切断及び脱保護
固相合成の終了後に、乾燥した固体支持体を、水中４０ｗｔ％メチルアミン及び２８％〜３１％水酸化アンモニウム溶液（Aldrich）の１：１体積の溶液で３０℃で１．５時間処理した。溶液を蒸発させ、固体残留物を水中で再構成した（下記を参照されたい）。
【０３０９】
Ｃ.精製
TSKgel SuperQ-5PW 13μmカラム及びShimadzu LC-8システムを使用したアニオン交換ＨＰＬＣで粗製オリゴマーを精製した。バッファーＡは20 mM Tris、5 mM EDTA、pH 9.0で、20％のアセトニトリルを含み、バッファーＢはバッファーＡと同じであって、1.5 M塩化ナトリウムを添加した。２６０ｎｍのＵＶトレースを記録した。適切な画分をプールし、Sephadex G-25 Fineを充填したGE Healthcare XK 16/40カラムを使用して、100 Mm重炭酸アンモニウム、pH 6.7及び20％アセトニトリル又はろ過水のランニングバッファーでサイズ排除HPLCを実行した。
【０３１０】
Ｄ.アニーリング
等モルのＲＮＡ溶液（センス及びアンチセンス）を1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水、1×、Corning,Cellgro）中で組み合わせて相補鎖を混合し、ＲＮＡｉ剤を形成した。幾つかのＲＮＡｉ剤を凍結乾燥し、-１５〜-２５℃で保存した。二本鎖濃度を、1×PBS中のUV-Vis分光計で溶液の吸光度を測定することにより決定した。次に、２６０ｎｍでの溶液の吸光度に変換係数及び希釈係数を掛けて、二本鎖濃度を決定した。使用した変換係数は０．０３７ｍｇ/（ｍＬ・ｃｍ）であり、又は、幾つかの実験において、実験的に決定された吸光係数から変換係数を計算した。
【０３１１】
Ｅ.標的リガンドのコンジュゲーション
【０３１２】
式IV、V、VIII及びIXの化合物は、標的リガンドを本明細書に記載されるトリアルキン化合物にコンジュゲートさせることにより合成されうる。反応の例をスキームに示す。
【化１５５】
2021517113.tif 000190
（上式中、各変項は式Iに記載されているとおりであり、ＴＬは標的リガンドである）。
【０３１３】
幾つかの実施形態において、標的リガンドコンジュゲーションは以下の手順を使用して実行されうる。以下の手順は、RがＲＮＡｉ剤を含む式Iの化合物への標的リガンドのコンジュゲーションについて記載しているが、RがＲＮＡｉ剤を含まない式Iの化合物に対して標的リガンドコンジュゲーションを行うこともできる。
【０３１４】
アニーリングの前又は後のいずれかに、5'又は3'三座アルキン官能化センス鎖は標的リガンドにコンジュゲートされる。以下の例は、アニールした二本鎖への標的リガンドのコンジュゲーションを記載している：0.5Mトリス（3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（THPTA）、0.5M硫酸銅（II）五水和物（Cu（II）SO4・5H2O）及びアスコルビン酸ナトリウムの2M溶液の原料溶液を脱イオン水中で調製した。標的リガンドのDMSO中の75mg/mL溶液を作成した。トリアルキン官能化二本鎖（3 mg、75 μL、脱イオン水中40mg/mL、約15,000g/mol）を含む1.5 mL遠心分離管において、25 μLの1M Hepes pH 8.5バッファーを添加する。ボルテックスした後、35 μLのDMSOを加え、溶液をボルテックスする。標的リガンドを反応物に加え（6 eq /二本鎖、2 eq /アルキン、約15μL）、溶液をボルテックスする。pH紙を使用して、pHをチェックし、pH約8であることを確認した。別の1.5 mL遠心分離管において、50 μLの0.5M THPTAを10uLの0.5M Cu（II）SO4・5H2Oと混合し、ボルテックスし、室温で5分間インキュベートした。5分後に、THPTA/Cu溶液（7.2 μL、6 eq 5：1 THPTA：Cu）を反応バイアルに加え、ボルテックスした。その直後に、2Mアスコルビン酸塩（5 μL、50 eq/二本鎖、16.7/アルキン）を反応バイアルに加え、ボルテックスした。反応が完了したら（典型的に0.5〜1時間で完了）、反応物を非変性アニオン交換クロマトグラフィーで直ちに精製した。
【０３１５】
Ｆ.トリアルキン結合剤の固体支持体合成後の付加
ＲＮＡｉ分子は、アミノ基（本明細書ではアミンとも呼ばれる）などの反応性基を使用して合成できる。幾つかの実施形態において、反応性基は、ＲＮＡｉ剤の5'末端及び/又は3'末端に結合されうる。幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は二本鎖であることができる。ＲＮＡｉ剤が二本鎖である実施形態において、反応性基は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖上にあることができる。
【０３１６】
例えば、幾つかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の5'末端にNH2-C6H12（ヘキシレンアミン）基を有するＲＮＡｉ剤は合成される。続いて、末端アミノ基を反応させて、例えば、式Iの化合物のカップリング部分とのコンジュゲートを形成することができる。幾つかの実施形態において、カップリング部分はエステルであり、ＲＮＡｉ剤の反応性基は第一級アミンであり、そしてＲＮＡｉ剤とトリアルキンリンカーとの間にアミド結合が形成される。この反応の例を、式VIの化合物を使用して以下のスキームに示す。
【０３１７】
【化１５６】
2021517113.tif 000191
（上式中、L1、L2、L3、L4、R3、R4及びＲＮＡはすべて式VI及びVIIで定義されているとおりである）。
【０３１８】
ＲＮＡｉ分子が固体支持体から切断されたときに、本明細書に記載されているトリアルキン結合剤の付加は、以下のように行われる。センス鎖を、第一級アミンを含む5'及び/又は3'末端ヌクレオチドで官能化した。アミン官能基化二本鎖を、90％DMSO/10％H2Oに約50〜70 mg/mLで溶解させた。40当量のトリエチルアミンを加え、続いて3当量の式VIのトリアルキン-エステルを加えた。完了したら、コンジュゲートを1xリン酸緩衝生理食塩水/アセトニトリル（1:14比）の溶媒系中で2回沈殿させ、乾燥させた。
【０３１９】
インビボの例
本明細書に記載されているリンカーを、様々なＲＮＡｉ剤と組み合わせて使用することができる。以下の例は、Alpha-ENaC及びHIF2αｍＲＮＡ配列に向けられたＲＮＡｉ剤と本明細書に記載のリンカーの使用を示し、本発明の範囲を特定のＲＮＡｉ剤に限定することなく、上記のリンカーの使用例を提供することが意図される。以下の実施例で使用されるＲＮＡｉ剤は以下の表８に示される。表８の化合物は、固体支持体から切断された構造として示される。幾つかの例において、インビボ投与の前に、化合物にさらなる修飾がなされた。AD5614-5617、AD5620、AD5858、AD5860及びAD5919の場合に、トリアルキン結合剤は固体支持体上での合成の一部として、式IIのホスホロアミダイトとしてセンス鎖に付加された。AD04546、AD5347及びAD5453の場合に、センス鎖は表８に示す構造で支持体から切断された。各トリアルキン結合剤は、アミドカップリング反応で式VIの化合物として付加された。標的リガンドは、樹脂からの切断後に付加されたため、AD5614-5617、AD5620、AD5858、AD5860及びAD5919の場合に、トリアルキン結合剤は式IIIの化合物として示される。以下の表８において、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、シチジン、グアノシン又はウリジンを表す。Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン又はウリジンを表す。ｓはホスホロチオエート結合を表し、ｃＰｒｐｕは5’-シクロプロピルホスホネート-2’-O-メチルウリジンを表す。
【０３２０】
【表８−１】
2021517113.tif 000192
【０３２１】
【表８−２】
2021517113.tif 000193
【０３２２】
例２３．腎臓腫瘍を有するマウスモデル（同所性異種移植）
SEAP発現性明細胞腎細胞癌（ccRCC）A498細胞の作成
CMVプロモータ下でレポータ遺伝子分泌アルカリホスファターゼ（SEAP）を発現するpCR3.1発現ベクターは、ClontechのpSEAP2-基本ベクターから増幅されたSEAPコーディング配列PCRのディレクショナルクローニングによって調製された。pCR3.1ベクター（Invitrogen）にクローニングするために、SEAPコード配列を増幅するために使用されるプライマーに便利な制限部位を追加した。得られた構築物pCR3-SEAPを使用して、SEAP-発現性A498 ccRCC細胞株を作製した。簡単に言うと、pCR3-SEAPプラスミドは、製造元の推奨に従って、エレクトロポレーションによってA498 ccRCC細胞にトランスフェクトされた。安定したトランスフェクタントはG418耐性により選択された。選択されたA498-SEAPクローンを、SEAP発現及び統合安定性について評価した。
【０３２３】
SEAP発現性明細胞腎細胞癌（ccRCC）A498細胞の移植
メスの胸腺欠損ヌードマウスを約３％のイソフルランで麻酔し、右側臥位に配置した。左脇腹に、０．５〜１ｃｍの長手方向に小さな腹部切開を行った。湿った綿棒を使用して、左腎臓を腹膜から持ち上げ、穏やかに安定させた。注射の直前に、１．０ｍｌのシリンジに細胞/マトリゲル混合物を満たし、２７ゲージの針カテーテルをシリンジ先端に取り付けた。次に、満たされたシリンジをシリンジポンプ（Harvard Apparatus、モデルPHD2000）に取り付け、プライミングして空気を除去した。シリンジに取り付けられた２７ゲージの針カテーテルの先端を、尾極付近の腎被膜のすぐ下に挿入し、次に、針の先端を腎被膜に沿って３〜４ｍｍ慎重に頭側に進めた。約３０万個の細胞を含む2：1（vol：vol）細胞/マトリゲル混合物の１０μLアリコートを、シリンジポンプを使用して腎臓実質にゆっくりと注入した。注入が完了したことを確保するために、針を腎臓に１５〜２０秒間置いた。次に、針を腎臓から外し、綿棒を注射部位の上に３０秒間置いて、細胞の漏出又は出血を防止した。次に腎臓を穏やかに腹部に戻し、腹壁を閉じた。市販のSEAPアッセイキットを使用して腫瘍増殖をモニタリングするために、移植後７〜１４日ごとに血清を収集した。ほとんどの研究について、腫瘍マウスを移植後５〜６週間使用し、そのとき、腫瘍の測定は典型的に約４〜８ｍｍだった。
【０３２４】
HIF2 ｍＲＮＡ発現の決定
本明細書の実施例で報告されている研究では、注射後の特定の日にマウスを安楽死させ、製造元の推奨に従ってTrizol試薬を使用して腎腫瘍から全ＲＮＡを単離した。相対HiF2αｍＲＮＡレベルは、以下で説明するようにRT-qPCRによって決定され、送達バッファー（等張グルコース）のみで処理されたマウスと比較した。
【０３２５】
定量的PCRの準備として、製造元のプロトコルに従ってTriReagent（Molecular Research Center,Cincinnati，ＯＨ）でホモジナイズされた組織サンプルから全ＲＮＡを単離した。
【０３２６】
High Capacity cDNA逆転写キット（Life Technologies）を使用して、約５００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。ヒト（腫瘍）Hif2α（EPAS1）発現の場合に、TaqMan Gene Expression Master Mix（Life Technologies）又はVeriQuest Probe Master Mix（Affymetrix）を使用して、ヒトHif2α（カタログ番号4331182）及びCycA(PPIA)(カタログ番号4326316E)のための事前製造されたTaqMan遺伝子発現アッセイをbiplex反応で3回使用した。定量的PCRは、7500 Fast又はStepOnePlus Real-Time PCRシステム（Life Technologies）を使用して行った。ΔΔＣT法を使用して、相対的な遺伝子発現を計算した。
【０３２７】
例２４．腎臓腫瘍を有するマウスにおけるＨＩＦ-２α（ＥＰＡＳ１）を標的とするＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされたインテグリン標的リガンドのインビボ投与
表８に示すセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を含むＲＮＡｉ剤を、当該技術分野で既知の一般的にオリゴヌクレオチド合成で使用される一般的な手順に従って固相でホスホロアミダイト技術に従って合成した（本明細書の例22参照されたい）。ＲＮＡｉ剤は、HIF-2α（Hif2α又はEPAS1）遺伝子に少なくとも部分的に相補的な核酸塩基配列を有するアンチセンス鎖を含んでいた。EPAS1は、HIF（低酸素誘導因子）遺伝子ファミリーのメンバーであり、かつ酸素によってレギュレートされる遺伝子の誘導に関与する転写因子の半分をコードし、これは酸素レベルが低下した際（低酸素症として知られる状態）に誘導されるる。Hif2αは、明細胞腎癌（ccRCC）細胞で頻繁に過剰発現することが知られている。Hif2αＲＮＡｉ剤は、配列特異的な方法でHif2αのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物の翻訳を低下又は阻害し、それによりEPAS1遺伝子の発現を阻害できるように設計されていた。
【０３２８】
研究１日目に、以下の群を含む投与計画に従って、腎臓腫瘍を有するマウス（例２３を参照されたい）に尾静脈注射により投薬した：
【０３２９】
【表９】
2021517113.tif 000194
【０３３０】
例２４のＲＮＡｉ剤は、示されたそれぞれのトリアルキンリンカー化合物へのコンジュゲーションを促進するためにセンス鎖の５'末端に官能化アミン反応性基（ＮＨ2-Ｃ6）を有して合成された。群４〜８及び１０の場合に、トリラキンリンカーは、それぞれホスホロアミダイト化合物１、２、３、４及び６を使用してＲＮＡｉ剤に付加された。それぞれのインテグリン標的リガンドは、アジド反応性基（例えば、例２２を参照されたい）を有して合成され、次いで、リンカーのトリアルキン成分にコンジュゲートされた。40キロダルトン（kDa）のPEG部分を結合して、薬物コンジュゲートの循環時間を増加する薬物動態（ＰＫ）モジュレータとして機能させた。標的リガンドαvβ3インテグリンリガンド4.1及び4.5の構造を以下に示す。
【０３３１】
【化１５７】
2021517113.tif 000195
【０３３２】
各群（n=3）において、3匹の腫瘍を有するマウスに投与した。注射後の研究８日目にマウスを屠殺し、例４に記載の手順に従って全ＲＮＡを腎臓腫瘍から単離した。次に、相対ヒトHIF2αｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的PCR（RT-qPCR）によって定量化し、シクロフィリンA（PPIA）発現に対して正規化し、例２３で説明するように、ビヒクル対照群（等張性グルコース）の割合（幾何平均、+/-95％信用区間）として表現した。
【０３３３】
【表１０】
2021517113.tif 000196
【０３３４】
例２５.腎臓腫瘍を有するマウスにおけるHIF-2α（EPAS1）を標的とするＲＮＡｉ剤に結合されたインテグリン標的リガンドのインビボ投与
表８に示すセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を含むＲＮＡｉ剤を、当該技術分野で知られている、一般的にオリゴヌクレオチド合成で使用される一般的な手順に従って、固相でホスホロアミダイト技術に従って合成した（本明細書の例２２を参照されたい）。ＲＮＡｉ剤は、（Hif2α）（EPAS1）遺伝子に少なくとも部分的に相補的な核酸塩基配列を有するアンチセンス鎖を含んでいた。
【０３３５】
研究１日目に、以下の投薬群に従って、腎臓腫瘍を有するマウス（例２３を参照されたい）に尾静脈注射により投薬した。
【０３３６】
【表１１】
2021517113.tif 000197
【０３３７】
例２５のＲＮＡｉ剤を、ヒトHif2α遺伝子を標的とするように向けられたヌクレオチド配列を有して合成され、群３〜６の場合には、トリアルキンリンカー化合物１５〜１８へのコンジュゲーションを促進するために、センス鎖の５'末端に官能化アミン反応性基（ＮＨ2-Ｃ6）を含んだ。群３及び７〜９の場合には、トリアルキンリンカーは、それぞれホスホロアミダイト化合物１４、１０、１２及び１３を使用してＲＮＡｉ剤に付加された。それぞれのインテグリン標的リガンドは、アジド反応性基（例えば、例２２を参照されたい）を有して合成され、次いで、リンカーのトリアルキン成分にコンジュゲートされた。40 kDaのPEG部分及びC-18二酸部分は、薬物コンジュゲートの循環時間を増加させることにより、薬物動態（ＰＫ）モジュレータとして機能するように結合された。C-18二酸部分の構造を以下に示す。
【０３３８】
【化１５８】
2021517113.tif 000198
【０３３９】
C-18二酸部分は、アミド結合を介してセンス鎖の３'末端に結合された。標的リガンドαvβ3インテグリンリガンド2の構造を以下に示す。
【０３４０】
【化１５９】
2021517113.tif 000199
上式中、
【０３４１】
【化１６０】
2021517113.tif 000200
は結合剤の結合点を示す。
【０３４２】
各群（n=3）において、３匹の腫瘍を有するマウスに投与した。注射後の研究８日目にマウスを屠殺し、例４に記載の手順に従って全ＲＮＡを腎臓腫瘍から単離した。次に、相対ヒトHIF2αｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的PCR（RT-qPCR）によって定量化し、ヒトシクロフィリンA（PPIA）の発現に対して正規化し、例２３で説明するように、ビヒクル対照群（等張性グルコース）の割合（幾何平均、+/-95％信頼区間）として表現した。
【０３４３】
【表１２】
2021517113.tif 000201
【０３４４】
例２６.ラットの上皮細胞標的リガンドにコンジュゲートされたα-ENaCＲＮＡｉ剤のインビボ口腔咽頭吸引投与
トリアルキン結合剤は様々なＲＮＡｉ構築物で使用されうる。本発明の結合剤を含むＲＮＡｉ構築物は、この例に記載されるように、様々な異なる投薬方法で投与されうる。トリアルキン結合剤はまた、様々な標的リガンドと共に使用されうる。この例において、トリアルキン結合剤にコンジュゲートされた標的リガンドは、αvβ6標的リガンドである。
【０３４５】
この例において、例２２に記載の方法で、化合物２２のトリアルキン結合剤を固体支持体合成後にセンス鎖に付加させた。
【０３４６】
研究１日目に、以下の投薬群に従って、オスのSprague Dawleyラットに、中咽頭吸引投与（ＯＰ）を介して、ピペットを使用して２００マイクロリットルを投与した。
【０３４７】
【表１３】
2021517113.tif 000202
【０３４８】
化合物２２は、各群のセンス鎖の5'末端のアミン結合と反応した。αvβ6標的リガンドの構造を以下に示す。
【化１６１】
2021517113.tif 000203
【化１６２】
2021517113.tif 000204
上式中、
【化１６３】
2021517113.tif 000205
は結合剤の結合点を示す。
【０３４９】
各群（n=4）において、４匹のラットは投与された。研究９日目にラットを安楽死させ、収集及びホモジナイズ後に、全ＲＮＡを両方の肺から単離した。α-ENaC（SCNN1A）ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的PCRによって定量化し、GAPDH発現に対して正規化し、そしてビヒクル対照群の割合（幾何平均、+ /-95％信頼区間）として表現した。
【０３５０】
【表１４】
2021517113.tif 000206
上記の表１４に示すように、本明細書に開示されたトリアルキン結合性化合物を使用してそれぞれのＲＮＡｉ剤に結合された様々な異なる標的リガンド構造は、対照と比較して遺伝子発現の阻害を示した。
【０３５１】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。その他の態様、利点及び変更は以下の特許請求の範囲内にある。
【配列表】
2021517113000001.app
【国際調査報告】
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