(57)【要約】  本発明は、核酸の生の融解曲線データを分析するためのウェーブレット変換の使用に関する。その効果は、ノイズに敏感な計算を低減し、そして計算効率および計算速度を増加させる。本発明は、データ中の微小な変動の識別を必要とする大きな生データセットを生成する1つの実験内のいくつかの多重化された標的の複合分析を含む試験試料の分類に特に適している。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料由来の核酸の融解曲線生データを分析する方法であって、該方法は以下の工程を含む：
核酸由来の融解曲線生データを生成する工程、
該生データに対して離散ウェーブレット変換を実行して、さらにdwt係数と呼ばれる離散ウェーブレット変換係数を生成する工程、
該dwt係数の分析を実行する工程、および
該分析に基づいて試験試料を分類する工程。
【請求項２】
前記融解曲線生データが、1つ以上のSNPを有する核酸または長さ変異を有する核酸、または挿入または欠失である長さ変異を有する核酸から取得される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記融解曲線生データが、微小なマイクロサテライト変化を有する核酸、またはホモポリマーリピート配列変異を有する核酸である微小なマイクロサテライト変化を有する核酸から取得される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が増幅された核酸である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記融解曲線生データが、色素標識核酸、または色素標識ビーコンプローブの存在下で増幅された核酸を解離することによって生成される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸由来の融解曲線生データを生成する工程の後に、該生データに対してデータ削減を実行して生データの選択を生成する工程が行われ、および前記離散ウェーブレット変換が生データの選択に対して実行される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記dwt係数の分析を実行する工程は、最も関連性が高いと識別されたそれらのdwt係数を選択することおよび該選択されたdwt係数の分析を実行することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記離散ウェーブレット変換は、1次元ウェーブレット変換である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記離散ウェーブレット変換が、DaubechiesファミリーからのマザーウェーブレットまたはDB8ウェーブレットからのマザーウェーブレットを使用する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分類する工程が、遺伝子型決定記録および遺伝子型決定の1つ以上の視覚的表示である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
核酸由来の融解曲線生データを生成する工程、
任意選択で、該生データに対してデータ削減を実行して生データの選択を生成する工程、
該生データに対して離散ウェーブレット変換またはさらにdwt係数と呼ばれる離散ウェーブレット変換係数を生成する生データの選択を実行する工程、
該dwt係数の分析を実行する工程であって、ここで該dwt係数の分析を実行する工程は、任意選択で、最も関連性が高いと識別されたそれらのdwt係数を選択することおよび該選択されたdwt係数の分析を実行することを含む工程、および
該分析に基づいて試験試料を分類する工程が、自動化システムにおいて実行される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
コンピュータ実装方法である、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項12に記載のコンピュータ実装方法を実行するための手段を含む、データ処理装置。
【請求項１４】
プログラムがコンピュータによって実行されるときに、該コンピュータに請求項12に記載のコンピュータ実装方法を実行させる、命令を含むコンピュータプログラム。
【請求項１５】
コンピュータによって実行されるときに、該コンピュータに請求項12に記載のコンピュータ実装方法を実行させる、命令を含むコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、概して核酸分析の分野に関する。より具体的には、融解曲線生データの分析および標的核酸情報の信頼できる解釈を可能にする方法およびシステムに適用する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムDNA等の核酸を分析するための分子技術の開発に大きな関心が寄せられてきた。核酸増幅法は、ゲノム分析に広く使用されており、そして核酸コピー数を決定するための定量分析、試料供給源定量、および遺伝子発現の転写分析を可能にする。
【０００３】
定量分析は、遺伝子型決定のために、および変異体スキャニングのために、実際の増幅産物をアーティファクトから識別するために使用される汎用性のあるツールである高解像度融解（high-resolution melting or melt）（HRM）曲線分析を含み、特に、単純な配列反復または単一塩基変化等の小規模変異体を検出すること、および核酸増幅が先行して、限られた数または高存在量の分子のセットを提供する場合に適している（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。融解曲線分析における1つの重要な特徴は、融解温度Tmであり、これは、1つの特定の二重鎖の分子の50%が解離する温度である。しばしば、融解曲線分析は、専門家によって視覚的に識別されるようなTm自体またはTmシフトを決定すること、または情報マップ、ニューラルネットワークまたはスメア検出アルゴリズム等のアルゴリズムを使用することに焦点を当てる（非特許文献５）。逆実験（reverse experiment）も使用され得、その場合、高温、例えば95℃で解離した分子から開始し、そして温度が徐々に低下するにつれて会合反応に続く。PCR産物の融解プロファイルは、そのGC含量、長さ、配列およびヘテロ接合性に依存し、そして非常に異なる分子は、類似の融解温度を有し得る。したがって、融解曲線分析は、通常、小規模変異体間を識別するために実施される。これらの小規模変異体は、増幅のみの実験では解明され得ない。
【０００４】
全てではないにしても、現代の実施の大部分は、特定の波長帯域における温度関数として蛍光の変化を測定するが、より複雑な方法が考案されている（非特許文献６）。蛍光の変化は、融解中に共解離するインターカレーター色素を使用することによって、または分子ビーコンと呼ばれる特異的分子レポーターとの相互作用を介して取得され得る。生の測定は、調査中の混合物中の種々のオリゴヌクレオチドを特徴づけ、そして識別するために、手動またはコンピュータープログラムを使用することのいずれかによる処理を必要とする。データ処理は、通常、バックグラウンド除去で始まり、次いで、サンプル曲線と何らかの参照シグナルとの間のTm差の識別または曲線形状の違いのいずれかに焦点を当てる。参照シグナルは、通常、1つの周知のオリゴヌクレオチドから、十分に特徴付けられたオリゴヌクレオチドの混合物から、または配列情報から出発する計算によって取得される。通常、生データの微分曲線が計算される方法が適用される。融解曲線の負の一次導関数のグラフは、このように形成されたピークによって、解離温度を正確に示すことをより容易にする。微分曲線を取得するために様々なアルゴリズムが存在する。「有意である」ピークまたはピークシフトを識別するためのいくつかのアプローチも存在する。ピーク位置、ピークの高さおよびときにはピーク幅も、更なる分析における特徴として使用される。シグナルは、シグナルに存在する周波数および割合を分析するシグナル処理において重要な強力な数学的ツールであるフーリエ変換を用いて容易に分析され得る。
【０００５】
核酸の融解曲線分析の分野における方法および最適化方法が記載されている。
【０００６】
特許文献１は、形のダブルシグモイド（a double sigmoid of the form：下記一般式）を測定データに適合させる方法を記載している。続いて、この適合された曲線から微分値が解析的に得られ、そしてTmは、微分曲線の最大値を決定することによって得られる。
【数１】
2021510547.tif 000002
【０００７】
特許文献２は、未知の試料についての融解曲線が既知のＤＮＡ断片について測定された融解曲線の集合と比較される、一本鎖DNA断片についての方法を記載している。「未知の」曲線に対して最小の統計的誤差を有する既知の曲線または曲線の組み合わせは、その結果、その未知の試料の代表とみなされる。
【０００８】
特許文献３は、減少指数関数を用いた融解曲線バックグラウンド補正の方法を記載している。
【０００９】
特許文献４は、Tmが負の一次導関数曲線におけるピークを見出すことによって、または標準化された融解曲線に閾値を適用することによって決定される、クラスターについてのTm決定の方法を記載している。
【００１０】
特許文献５は、試料測定値間の差をキャプチャする偏差関数を決定する方法と、ブランク測定の実行のために期待されるバックグラウンドを記述する数学モデルとを記載している。この偏差曲線はさらに分析される。
【００１１】
特許文献６は、測定データがノイズ補正され、スケーリングされ、低温領域の推定漸近線に適合され、最後にクラスタ化される方法を記載している。
【００１２】
特許文献７は、予め決定された「高い」および「低い」温度範囲ThおよびTlが定義され、融解状態を示すシグナル差が識別され、そして観察される最高のシグナル微分値が第1ピークの候補として選択される方法を記載している。このピーク候補は、そのシグナル差に関連する温度がThまたはTl範囲内にあること、およびこれらの温度範囲外にピーク候補がないことを確認することによってチェックされる。
【００１３】
特許文献８は、崩壊数に基づいて融解曲線データを平滑化する方法であって、移動平均の計算と幾分類似する方法を提案している。平滑化されたデータは、その後微分計算を含む更なる処理に使用され得る。
【００１４】
特許文献９は、負の勾配が融解曲線を生成するために各生データ点で計算される、PCR反応後の融解曲線の分析の方法を定義している。この融解曲線は、その後特定の核酸の存在を示すために、および／または試料中に存在する量を決定するために使用される、SVM、LVQまたはランダムフォレスト等の分類アルゴリズムに適切な特徴を抽出することを目的として、フーリエ分析法を使用するスペクトル分析に供される。
【００１５】
非特許文献７は、機械学習アルゴリズムによる融解曲線の分類の前の生データの特徴エンジニアリング後処理ステップを記載している。この後処理ステップでは、初期の測定値のセットが区分的線形補間を介して300の値のセットに補間される。従来の融解曲線分析とは対照的に、温度値は、従属変数として選択される。このセットは、1000のデータ点を得るために再び補間され、そしてこのデータベクトルは、機械学習アルゴリズムを用いて解析される。
【００１６】
HRM分析のための多くのアプリケーションが存在するが、検出されなければならない微細なTmシフトのために、単一ヌクレオチドでの識別は、依然として困難である。
【００１７】
現在の方法の1つの制限は、生データから一次導関数曲線を取得するために適用される計算に関連する。これらの計算は、ノイズに敏感であり、何らかの形の平滑化、または形成された「真の」ピークとノイズによって導入または「増強された」ピークとを区別する方法のいずれかを必要とする。
【００１８】
第2の制限は、データ中に存在するすべての情報の最適以下のキャプチャ（sub-optimal capture）に関する。最も頻繁には、ピーク探索およびTm識別は、情報の一部のみをキャプチャする。
【００１９】
あるいは、記載された「曲線形状」方法はすべての情報をキャプチャするが、このアプローチは、大きな特徴ベクトルとなり、そしてその後の処理または分類が更に煩雑となり、現在の方法の更なる制限をもたらす。
【００２０】
したがって、分析の内部雑音の存在下で融解曲線（melt or melting curves）における小さな差を分析する改善された方法が、当技術分野で必要とされているように思われる。
【００２１】
本発明の目的は、上述の欠点の全部または一部を改善することである。
【００２２】
本発明は、ウェーブレット変換を使用して、生の、すなわち、いかなる数学的関数によっても変換されていない融解曲線データを分析する方法を提供することによって、これらの目的を達成する。その効果は、高感度の計算におけるノイズの低減並びに計算効率および計算速度の増加である。本発明の方法において、変化する温度の関数として収集された生の蛍光融解曲線データ読み取り値がウェーブレット変換にかけられる前に、数学的に変換されないか、さもなければ変更されないことが重要である。言い換えると、ウェーブレット変換は、生データ収集プロセス全体にわたって、またはその選択された部分の間またはその中の窓に収集されるような生の融解曲線データに直接適用される（すなわち、生の融解曲線データ収集プロセスの間にキャプチャされるような生データの連続的な選択に対して実行される）ことが必須である。これは、生の融解曲線データの収集とそのウェーブレット変換版の生成との間に、本発明の方法が導関数、補間法、リサンプリング、オーバーサンプリング等の計算のような他のいかなる数学的データ変換も実行しないことを意味する。本発明の方法が、生データにウェーブレット変換を適用する前に含んでもよい唯一の操作は、収集された生データ全体における選択、例えば、温度点1（T1）から温度点2（T2）までを選択し、次いで、T1からT2までの生データ窓のこの特定の選択にのみウェーブレット変換を適用することである。このような選択を行うことによって、ウェーブレット変換を介して処理されなければならない生データの量が削減され、これは計算を実行する速度にとって有利であるが、いかなる数学的な方法においても決して修正されないためT1からT2までの前記生データ窓内で実行される方法の感度が保存される。
【００２３】
ウェーブレット変換をフィールド内の蛍光読み取りに適用する教示はごくわずかに存在する。しかし、それらのいずれも、生の、すなわち変換されていない融解曲線データを分析するためのウェーブレット変換の使用を含まない。
【００２４】
例えば、特許文献１０は、一般に、収集された生の蛍光発光データを変換して改良された一次または他の導関数プロットを生成する方法を教示している。しかし、特許文献１０は、ウェーブレット変換を含むことができる周波数変換の使用に言及しているが（他の多くの既存の変換型の中で言及されている）、そのような変換を受ける前に、等間隔の温度間隔でデータ点を生成するために生データが補間され、オーバーサンプリングされ、またはリサンプリングされる必要があることを明示的に教示している。したがって、特許文献１０は、生の融解曲線データに対するウェーブレット変換の使用を決して教示または示唆していない。
【００２５】
別の例は、ウェーブレット分析法に基づく融解曲線の処理に言及する特許文献１１であるが、特許文献１１の方法では、蛍光シグナルが一次導関数として最初にプロットされ、次の数学的変換は、データの一次導関数からのみ開始する。その結果、特許文献１１も、生の融解曲線データに対してウェーブレット変換を適用することの利点を教示していない。
【００２６】
最後に、特許文献１２は、サンガーシーケンス反応由来のクロマトグラムにおけるピークを分析するためのウェーブレットの使用を教示している。したがって、特許文献１２は、生の融解曲線データへのウェーブレット変換の適用を教示していない。さらに、特許文献１２は、クロマトグラムデータをフィルター処理およびノイズ除去する必要があることも明示的に教示している。
【００２７】
その結果、融解曲線核酸分析から取得された生の蛍光リードアウト（またはその選択された部分）に対して離散ウェーブレット変換を実行することを含む本発明の方法は、当技術分野では決して開示されていない。本発明の方法は、データ中の微細な変動の識別を必要とする大きな生データセットを生成する1つの実験内のいくつかの多重化された標的の複合分析を含む試験試料を分類するのに特に適している。それらの主な利点は、ノイズの低減と計算効率および計算速度の改善とを含む。本発明のこれらおよび他の利点は、以下に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】欧州特許第2241990号
【特許文献２】米国特許第6106777号
【特許文献３】米国特許第8068992号
【特許文献４】欧州特許第2695951号
【特許文献５】米国特許第9273346号
【特許文献６】米国特許出願公開第2014/0067345号
【特許文献７】欧州特許第2226390号
【特許文献８】米国特許出願公開第2005/0255483号
【特許文献９】国際公開第2017/025589号
【特許文献１０】米国特許出願公開第2009/0037117号
【特許文献１１】中国特許出願公開第102880812号
【特許文献１２】中国特許出願公開第103593659号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Reed, G. H.,Kent, J. O. & Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis forsimple and efficient molecular diagnostics.Pharmacogenomics 8, 597-608 (2007).
【非特許文献２】Wittwer, C. T.High-resolution DNA melting analysis: Advancements andlimitations.Hum.Mutat.30, 857-859 (2009).
【非特許文献３】Liao, Y. etal.Simultaneous Detection, Genotyping, and Quantification of HumanPapillomaviruses by Multicolor Real-Time PCR and Melting Curve Analysis.J.Clin.Microbiol.51, 429-435 (2013).
【非特許文献４】Ramezanzadeh, M.,Salehi, M. & Salehi, R. Assessment of high resolution melt analysisfeasibility for evaluation of beta-globin gene mutations as a reproducible,cost-efficient and fast alternative to the present conventionalmethod.Adv.Biomed.Res. 5, 71 (2016).
【非特許文献５】Palais, R. & Wittwer, C. T. Mathematical algorithms for high-resolution DNA meltinganalysis.Methods Enzymol.454, 323-343 (2009).
【非特許文献６】Gray, R. D. & Chaires, J. B. Analysis of Multidimensional G-Quadruplex MeltingCurves.Curr.Protoc.Nucleic Acid Chem. Chapter Unit17.4 (2011).
【非特許文献７】Athamanolap, P.et al.Trainable High Resolution Melt Curve Machine Learning Classifier forLarge-Scale Reliable Genotyping of Sequence Variants.PLOS ONE 9, e109094(2014).
【発明の概要】
【００３０】
一実施形態において、本発明は、試験試料由来の核酸の融解曲線生データを分析する方法を提供し、該方法は、核酸から融解曲線生データを生成する工程、該生データに対して離散ウェーブレット変換を実行してdwt係数を生成する工程、該dwt係数の分析を実行する工程、および該分析に基づいて試験試料を分類する工程を含む。
【００３１】
関連する態様において、試験試料由来の核酸の融解曲線生データを分析する方法が提供され、ここで核酸由来の融解曲線生データを生成する工程、該生データに対して離散ウェーブレット変換を実行してdwt係数を生成する工程、該dwt係数の分析を実行する工程、および該分析に基づいて試験試料を分類する工程は、自動化システムにおいて実行される。
【００３２】
別の態様は、試験試料由来の核酸の融解曲線生メトリックを取得し、そして変換するためのコンピュータ実装方法に関し、該方法は、核酸由来の融解曲線生データを生成する工程、該生データに対して離散ウェーブレット変換を実行してdwt係数を生成する工程、前記核酸の分析に最も関連性が高いと識別されたdwt係数を選択する工程、該選択されたdwt係数の分析を実行する工程、および該分析に基づいて試験試料を分類する工程とを含む。
【００３３】
本発明は更に、試験試料由来の核酸の融解曲線生データを取得し、そして変換するためのコンピュータ実装方法を実行するための手段を含むデータ処理装置に関する。
【００３４】
本発明はまた、プログラムがコンピュータによって実行されるときに、該コンピュータに、試験試料由来の核酸の融解曲線生データを取得し、そして変換するためのコンピュータ実装方法を実行させる命令を含むコンピュータプログラムに関する。
【００３５】
本発明はまた、コンピュータによって実行されるときに、該コンピュータに、試験試料由来の核酸の融解曲線生データを取得し、そして変換するためのコンピュータ実装方法を実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は試験試料由来の核酸の融解曲線生データを分析するための例示的な方法のフローチャートである。
【図２】図２は温度関数における参照試料中のSEC31A遺伝子の生の融解プロファイルを示すグラフである。蛍光の測定は、Y軸上に示され、測定された融解サイクルは、X軸上に示される。0.3℃の温度上昇毎に1回の蛍光測定が行われる。各曲線は、参照試料中のSEC31A遺伝子の1つの融解プロファイルを示す。データは、317個の試料について示されており、データ測定における変動性を示している。図２Ａは、20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示す正方形を有する破線によって示される融解プロファイルである。図２Ｂは、100% WT（MSS）として特徴付けられる試料を示す十字を有する実線によって示される融解プロファイルである。図２Ｃは、分子ビーコンのヘアピン構造の融解プロファイルを示す、空の試料（NTC）として特徴付けられる試料を示す円を有する点線によって示される融解プロファイルである。
【図３】図３は、Daubechies DB8由来のスケール関数を用いたSEC31A遺伝子についてのdwt係数のセットを示すグラフである。分解の第3レベルにおける係数が示されている。データは、317個の試料について示されている。図３Ａは、正方形を有する破線が20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示している。図３Ｂは、十字を有する実線が100% WT（MSS）を示している。図３Ｃは、円を有する点線が空の試料（NTC）を示している。
【図４】図４は、Daubechies DB8由来のウェーブレット関数を用いたSEC31A遺伝子についてのdwt係数のセットを示すグラフである。分解の第3レベルにおける係数が示されている。データは、317個の試料について示されている。図４Ａは、正方形を有する破線が20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示す。図４Ｂは、十字を有する実線が100% WT（MSS）である。図４Ｃは、円を有する点線が空の試料（NTC）である。
【図５】図５は、3つの主要クラスの試料の各々についてDaubechies DB8由来のスケール関数を用いた1セットのdwt係数を示すグラフである。分解の第3レベルにおける係数が示されている。各曲線は、参照試料中のSEC31A遺伝子の1つのウェーブレットプロファイルを示す。正方形を有する破線は20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示し、十字を有する実線は100% WT（MSS）であり、そして円を有する点線は空の試料（NTC）である。当該図は、3つのクラスの試料について取得されたスケール関数パターンにおける差を強調する。
【図６】図６は、 3 つの主要なクラスの試料の各々について、Daubechies DB8 由来のウェーブレット関数を用いた1セットのdwt係数を示すグラフである。分解の第3レベルにおける係数が示されている。各曲線は、参照試料中のSEC31A遺伝子の1つのウェーブレットプロファイルを示す。正方形を有する破線は20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示し、十字を有する実線は100% WT（MSS）であり、そして円を有する点線は空の試料（NTC）である。当該図は、3つのクラスの試料について取得されたスケール関数パターンにおける差を強調する。
【図７】図７は、Daubechies DB4由来のスケール関数を用いたSEC31A遺伝子についての１セットのdwt係数を示すグラフである。分解の第3レベルにおける係数が示されている。データは、317個の試料について示されている。図７Ａは、正方形を有する破線が20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示している。図７Ｂは、十字を有する実線が100% WT（MSS）を示している。図７Ｃは、円を有する点線が空の試料（NTC）を示している。
【図８】図８は、Daubechies DB4由来のウェーブレット関数を用いたSEC31A遺伝子についての１セットのdwt係数を示すグラフである。分解の第3レベルにおける係数が示されている。データは、317個の試料について示されている。図８Ａは、正方形を有する破線が20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示している。図８Ｂは、十字を有する実線が100% WT（MSS）を示している。図８Ｃは、円を有する点線が空の試料（NTC）を示している。
【図９】図９は、Haarウェーブレット由来のスケール関数を用いたSEC31A遺伝子についての1セットのdwt係数を示すグラフである。分解の第3レベルにおける係数が示されている。データは、317個の試料について示されている。図９Ａは、正方形を有する破線が20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示している。図９Ｂは、十字を有する実線が100% WT（MSS）を示している。図９Ｃは、円を有する点線が空の試料（NTC）を示している。
【図１０】図１０は、Haarウェーブレット由来のウェーブレット関数を用いたSEC31A遺伝子についての1セットのdwt係数を示すグラフである。分解の第3レベルにおける係数が示されている。データは、317個の試料について示されている。図１０Ａは、正方形を有する破線が20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示している。図１０Ｂは、十字を有する実線が100% WT（MSS）を示している。図１０Ｃは、円を有する点線が空の試料（NTC）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、プロセッサにつながれたメモリにより記憶および／または提供される命令を実行するように構成されたプロセッサ等のプロセスもしくは方法、装置、システム、コンピュータプログラム方法または製品、コンピュータプログラム、コンピュータ可読記憶媒体、および／またはプロセッサを含む、多数の方法で実施され得る。本明細書において、これらの実装形態、または本発明がとり得る任意の他の形態が、方法として参照されてもよい。一般に、開示された方法のステップの順序は、本発明の範囲内で変更されてもよい。
【００３８】
本明細書で使用される用語「または（or）」は、包括的な「または（or）」演算子であり、そして文脈が別段の明確な規定をしない限り、用語「および／または」と同等である。「a」、「an」、および「the」の意味は、複数の参照を含む。
【００３９】
本明細書で使用される用語「DWT」は、離散ウェーブレット変換を示し、用語「dwt係数」は、離散ウェーブレット変換係数を示す。ウェーブレット変換は、生データに対してプログラム又はサブルーチンを用いた計算を意味する。したがって、1セットのdwt係数は、離散ウェーブレット変換された1セットの値である。核酸分析に最も関連性が高いdwt係数は、実験の有意な事象をキャプチャする係数であり、例えば、二本鎖核酸分子の融解実験の場合、最も関連性が高いdwt係数は、生データ融解曲線におけるピークまたはピークシフトであり得る。
【００４０】
本明細書で使用される用語「融解曲線生データ」、「生データ融解曲線」および「生の融解曲線データ」は同等であり、そして互換的に使用される。本明細書で使用されるそれらは、温度の変化に応じた核酸解離または会合実験中に実行される蛍光測定（すなわち、融解曲線実験中に実行される蛍光測定）からキャプチャされる、修正されていない（「生」）数値のセットを参照するものとして解釈されることを意味する。言い換えると、それらは、任意の関数によって数学的に変換または修正されていない核酸解離または会合実験後に取得される機械捕捉蛍光シグナル関連識別子を示すということができる。
【００４１】
本明細書で使用される用語「生データに対して離散ウェーブレット変換を実行する」は、融解曲線実験から収集した数値の未修正のセットに対して直接的に離散ウェーブレット変換を実行することを指すと解釈される。本明細書で使用される用語「未修正」は、ウェーブレット変換にかけられる前に、数学的に変換されていないか、さもなければいかなる数学的値変換関数によっても変更されていないことを意味する。これは、本発明の範囲内で、ウェーブレット変換が、生データ収集プロセス全体にわたって、または選択された一部の間に、またはこの収集プロセスの間に選択された窓内で収集された生の融解曲線データに対して直接適用されることを意味する。これは、本発明の方法が、生の融解曲線データの収集とそのウェーブレット変換バージョンの生成との間に、例えば、導関数、補間法、リサンプリング、オーバーサンプリング等の計算を含むいかなる数学的データ変換をも実行しないことを意味する。本発明の方法が生データに対してウェーブレット変換を適用する前に含んでもよい唯一の操作は、例えば、温度点1（T1）から温度点2（T2）まで収集された生データセット全体における選択（または、本明細書で時々使用されるように、「窓」）を選択することである。この例では、前記窓の外側の生データ値を無視することによって一度データ生セット全体が削減されると、ウェーブレット変換はT1からT2までの前記選択された窓内に包含されるような生の未修正データの特定の選択のみに対して適用される。このような選択を行うことにより、ウェーブレット変換を介して処理されなければならない生データの量が削減され、これは計算の実行速度に有利である。上記に沿って、本明細書で使用される表現「生データに対してデータ削減を実行して生データの選択を生成する」は、融解曲線実験の間に収集された全ての生データ値のセット全体に含まれる窓から未修正の生データ値の連続セットを選択し、そして前記窓の外側由来の未修正の生データ値を無視することと解釈される。選択された生データ窓の外側由来のそのような生データ値を無視する1つの考えられる理由は、例えば、それらが検出閾値以下または検出閾値に非常に近い生の蛍光データを含む等、それらが所与の核酸の特徴付けに関連するいかなる有益な情報も含まないからである。したがって、本明細書で使用される用語「データ削減」は単に、収集された生データセット全体内の好ましい、可能性がある情報リッチな窓における生データの選択を指すものとして解釈され、本明細書で開示される方法において選択された窓に含まれる生データ値はそのまま残るため、削減演算（reduction operation）を含むいかなる数学的値変換関数の適用をも決して暗示するものではない。
【００４２】
本発明の態様は、改善された標的核酸分析の方法を提供することである。該方法は、被験体のゲノムの一部を増幅させること、該増幅された部分の融解曲線生データを取得すること、被験体のゲノムの複数の部分を同時に増幅させること、前記増幅のために複数の反応容器を同時に使用すること、1つの反応内で複数の独立したレポーター分子を測定すること、カラーフィルターを使用して前記複数のレポーター分子を識別すること、感光検出器を使用して複数のレポーター分子を識別すること、離散ウェーブレット変換によるデータ処理、試験試料を分類するための全ての取得されたウェーブレット係数の使用、いくつかの取得されたウェーブレット係数のみを使用してまたは他の特徴と組み合わせて使用して試験試料を分類すること、データおよび係数の保存、および報告することを含む、完全なサービスおよび製品の一部であってもよい。
【００４３】
一実施形態において、本発明は試験試料由来の核酸の融解曲線生データを分析する方法を提供し、この方法は核酸由来の融解曲線生データを生成する工程、生データに対して離散ウェーブレット変換を実行してdwt係数を生成する工程、dwt係数の分析を実行する工程、および該分析に基づいて試験試料を分類する工程を含む。
【００４４】
本発明の特定の実施形態は、試験試料由来の核酸の融解曲線生データを分析する方法に関し、該方法は、被験体由来の核酸の供給源を準備する工程、前記核酸を増幅させる工程、該増幅された核酸を解離または結合させて融解曲線生データを生成する工程、任意選択で、該生データに対してデータ削減を実行して生データの選択を生成する工程、該生データの選択に対して離散ウェーブレット変換を実行してdwt係数を生成する工程、該dwt係数の分析を実行する工程、および該分析に基づいて試験試料を分類する工程を含む。
【００４５】
典型的には、核酸の供給源は、調査中の標的配列を潜在的に含む。
【００４６】
特定の実施形態において、前記方法の前に、以下の工程：核酸の供給源から標的配列を潜在的に含む核酸を遊離させるおよび／または単離する工程、該標的を潜在的に含む前記遊離および／または精製された核酸を、前記核酸を増幅させる工程のために準備する工程のいずれかが行われる。
【００４７】
本発明の方法に使用する核酸は、天然に存在する、修飾された、または人工の核酸であり得る。好ましい態様において、本発明のプロセスは、核酸の供給源を準備することから開始する。調査中の核酸は、ヒト被験体または動物被験体、好ましくは患者試料に由来する。生体試料は、本発明の方法に従って分析される核酸を含む核酸または細胞を含む。試料は、組織試料、スワブ検体、体液、体液沈殿物または洗浄液検体であってもよい。非限定的な例には、ヒトまたは動物の新鮮な組織試料、凍結組織試料、FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋組織）に包埋された組織試料、全血、血漿、血清、尿、便、唾液、脳脊髄液、腹水、胸水、リンパ液、乳頭吸引物、痰および射出精液が含まれる。試料は、当技術分野で既知の任意の適切な方法を使用して収集されてもよい。
【００４８】
試料から核酸を得る方法およびシステムは、記載されており、そして試料からの核酸の単離および／または精製または試料を液化して調査中の核酸を遊離させること（国際公開第2014128129号）、またはそれらの組み合わせを必要としてもよい。特定の態様において、試料は、結腸癌、結腸直腸癌または胃癌等の消化管悪性腫瘍が疑われる患者から得られる。
【００４９】
本明細書で使用される用語「核酸」およびその同等の「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」は、ヌクレオチド（nucleotide）サブユニット間にホスホジエステル結合を含むリボヌクレオシド（ribonucleosides）又はデオキシリボヌクレオシド（deoxyribonucleosides）のポリマーを指す。
【００５０】
分析される核酸分子は、DNAまたはRNA、例えば、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNAまたはmeDNA、cDNA、mRNA、tRNA、hnRNA、microRNA、IncRNA、siRNA等、またはそれらの任意の組み合わせを含む。典型的には、核酸分子の一部は、融解曲線分析の前に増幅される。典型的には、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応またはPCR、好ましくは定性PCR（qualitative PCR）（qPCR）を使用する。qPCRの主な特徴は、核酸産物がサーモサイクリングの間に反応の進行に伴い「リアルタイム」で検出されることである。注意すべきことに、二本鎖核酸分子は、増幅されていない二本鎖分子でもあり得る。これは、試料の核酸含量が検出を可能にするのに十分に高い場合に可能である。したがって、増幅工程は、本発明の方法およびシステムにおける任意の工程であってもよい。一本鎖核酸は、増幅反応または第2の核酸とのハイブリダイゼーションにより二本鎖構造となった後に順次分析され得る。RNA分析のために、典型的には、増幅工程の前に逆転写（RT）工程が行われる。
【００５１】
したがって、本方法は、核酸中の標的ヌクレオチド配列またはヌクレオチド数の変化の検出に関する。それらは、単一ヌクレオチドレベルでの識別を必要としてもよい。本方法の好ましい設定において、アンプリコンは核酸配列の一部を増幅させることによって生成され、前記一部は調査中の特定の標的配列を含む。qPCRを実行するための試薬および要素の最小限必要なアレンジメントは、通常、核酸鋳型、例えば核酸の供給源から受け取ったDNAのリアルタイムPCRサーモサイクリングにおける検出を可能にする任意の試薬を含む。このような試薬は、qPCRのタイプに応じて、PCRグレードポリメラーゼ、少なくとも1つのプライマーセット、検出可能な色素またはプローブ、dNTP、PCR緩衝液等を含むが、これらに限定されない。当業者は、他の技術が核酸を増幅させるために使用され得ることを認識するであろう。
【００５２】
融解または融解曲線分析は、温度変動の間の二本鎖核酸分子の解離特性または会合特性の評価である。本明細書で使用される融解曲線データは、調査中の核酸分子の解離特性または会合特性のいずれかを示すデータに関する。
【００５３】
融解曲線分析およびHRM（高解像度融解）分析は、試料中の核酸配列の存在を検出および分析するために一般的に使用される方法である。核酸の解離特性および会合特性を監視する1つの方法は、色素の補助で行われる。qPCRおよび融解曲線分析に使用される検出化学物質は、（a）標的結合色素、例えば、LC Green、LC Green+、Eva Green、SYTO9CYBR Green等のDNA結合蛍光体の蛍光を通常検出する化学物質、または（b）例えばビーコンプローブ等の蛍光体標識DNAプローブ、および／または例えばスコーピオンプライマー等のプライマーを通常利用する標的特異的化学物質に依拠する。当技術分野において、他の検出化学物質が融解曲線分析に適用され得ることはよく知られている。
【００５４】
蛍光体は、1つの波長で光エネルギーを吸収し、そしてそれに応答して、別のより長い波長で光エネルギーを再放出する。各蛍光体は、光を吸収する特有の波長範囲と、発光する別の明確な波長範囲とを有する。この特性は、リアルタイムPCR機器による、および他の分析ツールおよび／または分析技術による増幅産物の特異的検出のためのそれらの使用を可能にする。同じ特性は、それらの吸収および再発光波長帯が重なり合わない（多重化されている）場合に、カラーフィルターを使用して、1つの反応内で異なる蛍光体を観察することを可能にする。したがって、蛍光体の組み合わせは、増幅産物の範囲の検出または多重化を可能にする。蛍光体は、最終的に、クエンチャー分子と組み合わせて使用され得、該クエンチャーは、該蛍光体の蛍光発光を消光してシグナルが生成されないようにする。蛍光体からのクエンチャーの除去は、蛍光シグナルの生成をもたらす。クエンチャーを含む検出方法およびこのような方法に適用可能なクエンチャーは、記載されており、そして当技術分野でよく知られている。
【００５５】
したがって、本発明の一実施形態は、解離測定を含む。1つの特定の実施形態において、核酸、例えばDNAは、融解曲線試験手順の間に、1つ以上のインターカレーター性色素の存在下で加熱される。加熱中のDNAの解離は、生ずる蛍光の大幅な減少によって測定可能である。別の特定の実施形態において、核酸、例えばDNAは、融解曲線試験手順の間に、1つ以上の色素標識核酸、例えば1つ以上のプローブの存在下で加熱される。プローブに基づく蛍光融解曲線分析の場合に、核酸における変動の検出は、プローブ−標的ハイブリッドの熱変性によって生成される融解温度に基づく。核酸の加熱、または増幅の場合に生成されたアンプリコンの加熱が進行するにつれて、シグナルの強度の変化が、典型的には或る温度間隔にわたって温度関数において検出され、融解曲線生データが取得される。
【００５６】
実施例のセクションにおいて議論されそして示される融解曲線生データは、好ましくは蛍光体標識DNAプローブ、特に分子ビーコンプローブを通常利用する標的特異的化学物質の補助で生成される。原則として、可能な実施形態において、融解曲線分析を実行するのに適した任意の標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが、本発明の方法において使用され得る。好ましい既知のプローブは、蛍光体およびクエンチャーからなる対を含んでもよく、そしてループまたはヘアピン等の二次構造を有利に形成してもよい。分子ビーコンプローブまたは分子ビーコンは、それらが標的核酸配列に結合すると蛍光が回復する内部消光蛍光体を有するヘアピン形状分子である。この理由のために、分子ビーコンは、ポリメラーゼの作用によって分解されず、そして融解曲線コーリングを介してそれらの標的へのそれらのハイブリダイゼーション動態を研究する際に使用され得る。分子ビーコンの構造および作用メカニズムは、当技術分野でよく知られている。典型的な分子ビーコンプローブは、約25ヌクレオチド長又はそれより長い。典型的には、標的配列に相補的であり、そして該配列に結合する領域は、18塩基対領域〜30塩基対領域である。
【００５７】
核酸変異検出は、単一ヌクレオチドレベルで行われてもよく、そして単一ヌクレオチド変異、単一ヌクレオチド挿入または欠失の検出を含んでもよい。本発明の実施形態に従った融解曲線分析が使用されてもよい実施例は、典型的な一塩基多型（SNP）、一塩基挿入または一塩基欠失検出シナリオであり、ここで、研究中の試料は、目的のSNP、挿入または欠失についてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかであり得る。
【００５８】
したがって、本発明は、特定の特異的な設定において、1つ以上のSNP、挿入または欠失を有する核酸から取得される融解プロファイルを分析する方法を提供する。その目的のために、本発明の方法は、色素標識プローブを使用して、PCR後分析のための任意の追加の機器を必要とせずに、標準的な定量的PCRサーモサイクリング機器において1つ以上のSNP、挿入または欠失を検出する。したがって、特定の有利な実施形態において、シグナル生成試薬が少なくとも1つの標識された（すなわち、シグナル生成）オリゴヌクレオチドプローブであり、好ましくは1つ以上の標的SPN、挿入または欠失の配列に相補的であり、そして前記標的配列にハイブリダイズすることができる配列を含む、分子ビーコンプローブである。最も好ましくは、標的配列にハイブリダイズすることができる配列は、前記標的配列の突然変異体と同一または完全に相補的な配列を含み、前記突然変異体は、その野生型形態と比較して1つ以上のヌクレオチド変異を含む。次に、野生型および突然変異体の生の融解データ間で分散が測定され、そして融解曲線生データの特徴となる。
【００５９】
実施例のセクションにおいて示される増幅および融解曲線分析のために標的化される核酸は、特定の設定においてマイクロサテライト不安定性（MSI）と関連付けられるであろう。MSIは、不完全なミスマッチ修復によるものである。ヒト消化器癌、特に結腸直腸癌に関連するマイクロサテライト配列および蛍光体標識プローブを使用するそれらの分析は、国際公開第2013153130号および国際公開第2017050934号に記載されている。MSIスクリーニング検査では、正常組織と腫瘍組織の間のDNA配列の変化を探し、そしてMSI-High（MSH）と呼ばれる不安定性が高いか否かを識別することができる。MSHの反対はMSSと呼ばれ、これはマイクロサテライト安定の略語である。
【００６０】
したがって、本発明はさらに、特定の特異的な設定において、微小なマイクロサテライト変化を有する核酸から取得される融解プロファイルを分析する方法を提供する。その目的のために、本発明の方法は、色素標識プローブを使用して、PCR後分析のためのいかなる追加の機器も必要とせずに、標準的な定量的PCRサーモサイクリング機器において短いホモポリマーリピート領域における長さ変動を検出する。したがって、特定の有利な実施形態において、シグナル生成試薬は、少なくとも1つの標識された（すなわち、シグナル生成）オリゴヌクレオチドプローブであり、好ましくは標的ホモポリマーリピート配列に相補的であり、そして前記標的ホモポリマーリピート配列およびその特異的フランキング配列にハイブリダイズすることができる配列を含む、分子ビーコンプローブである。最も好ましくは、標的ホモポリマーリピート配列にハイブリダイズすることができる配列は、前記標的ホモポリマーリピート配列の突然変異体と同一または完全に相補的な配列を含み、前記突然変異体は、その野生型形態と比較して、前記標的ホモポリマーリピート配列中の少なくとも1つのホモヌクレオチドの欠失を含む。次に、野生型および突然変異体の生の融解データ間で分散が測定され、そして融解曲線生データの特徴となる。
【００６１】
融解曲線生データを取得するために使用される温度間隔は、解離事象が観察されるように選択される。典型的には、二本鎖核酸の融解温度は、鎖が解離し、そして色素が放出されるような温度間隔中に包含されなければならない。あるいは、該温度は、プローブの完全な解離が達成されるように選択される。本発明の方法は、単一ヌクレオチド突然変異、単一ヌクレオチド挿入または単一ヌクレオチド欠失等の単一ヌクレオチド変異等の小規模変異体を検出することを目的とする。したがって、温度増加は小さくなければならず、すなわち、少なくとも5℃未満でなければならない。4℃、3℃、2℃または1℃未満であればさらによい。典型的には、選択された間隔内の各温度増加は、0.5℃未満、0.4℃以下、好ましくは0.3℃以下、場合により0.2℃以下またはいくつかの用途では0.1℃以下（または装置によって維持され得る最小温度誤差に等しい間隔）でさえある。該方法の特定の設定において、蛍光は、各温度上昇工程について測定される。多重化が適用される場合、蛍光は、各蛍光体について各温度上昇工程について測定される。
【００６２】
例えば、多重化を使用する一例において、実験のための温度範囲は、各プローブの完全な解離が保証され、そして各個々のプローブの解離がより小さい温度間隔によって完全に特徴付けられてもよいように選択されてもよい。しかしながら、実験の特定の設定において、選択された間隔内の温度増加があまりに小さく選択されると、冗長なデータが測定されることがある。この冗長なデータは、その後生データセットから削除されてもよい。このような場合、例えば、1回おきまたは2回おきの測定は、更なる分析に関連する情報を失うことなく、生データセットから除去される。これは、多重化が適用され、そしてより大きな生データセットが生成される場合に特に有益である。
【００６３】
したがって、本発明はさらに、特定の設定において、核酸から取得された融解プロファイルを分析する方法を提供し、ここで、核酸由来の融解曲線生データを生成する工程の後に、生データに対して削減を実行して生データの選択を生成する工程が行われる。特定の有利な実施形態においてデータ削減工程は、生データから冗長データを除去することを含み、好ましくは測定値の除去が繰り返し周波数で適用される。データ削減が適用される場合、その直後に、生データの選択に対して離散ウェーブレット変換（DWT）を実行する工程が行われる。データ削減が適用されない場合、DWTは生データから直接生成される。
【００６４】
更なる工程では、変換が適用されて、生データセットにおいて容易に利用可能ではないそのデータから更なる情報が取得される。したがって、変換は、生データに埋もれた有用な情報を抽出する。生の核酸融解データの微分曲線への変換を適用する先行技術の方法は、しばしばバックグラウンドノイズの増幅および融解データの有意な特徴の人工的な平滑化を含む。本発明の方法は、離散ウェーブレット変換（DWT）計算を生のメトリック（metrics）に対して直接適用するか、または加熱中の二本鎖核酸の解離プロセスによって取得される生のメトリックの削減されたセットに対して直接適用する。そうすることにより、生データのノイズに敏感な微分計算が回避される。本発明の方法は、生の核酸融解データにおいて微小ではあるが分子的に有意な差異を区別するのに特に適しており、これは、微分曲線分析を含む以前の技術を上回る利点である。
【００６５】
ウェーブレットは、データを異なる周波数成分に分割した後に、そのスケールに一致する解像度で各成分を調べる数学的関数である。これらの基底関数は、限られた持続時間を有する短波である。ウェーブレット変換の基底関数は、周波数に関してスケーリングされる。基底関数として使用され得る多くの様々なウェーブレットが存在する。マザーウェーブレットとも呼ばれる基底関数〜（t）は、変換関数である。
【００６６】
用語ウェーブレットは、小波を意味する。小ささは、この（窓）関数が有限長（コンパクトにサポートされる）であるという条件を指す。波は、この関数が振動性であるという条件を指す。用語マザーは、変換プロセスで使用される種々のサポート領域を有する関数が1つのメイン関数またはマザーウェーブレットから導出されることを意味する。言い換えると、マザーウェーブレットは、他の窓関数を生成するためのプロトタイプである。一般に、ウェーブレットψ（t）は、複素数値関数である。一般的なウェーブレット関数は、。一般的なウェーブレット関数は、以下の通りに定義される：
【数２】
2021510547.tif 000003
【００６７】
このシフトパラメータ「τ」は、時間の窓の位置を決定し、したがってシグナルx（t）のどの部分が分析されているかを定義する。ウェーブレット変換解析において、周波数変数「ω」はスケール変数「s」に置き換えられ、そしてタイムシフト変数「t1」は「τ」に置き換えられる。
【００６８】
ウェーブレット変換は、これらのマザーウェーブレット関数を利用し、そしてシグナルx（t）のスケーリングされたウェーブレット関数ψ（t）の重み付けされたセットへの分解を実行する。ウェーブレットを使用する主な利点は、それらが空間にローカライズされていることである。
【００６９】
DWTは、ウェーブレットが離散的にサンプリングされる任意のウェーブレット変換である。他のウェーブレット変換と同様に、フーリエ変換を上回る主な利点は、時間分解能であり、それにより周波数情報および位置情報（時間の位置）の両方をキャプチャする。生メトリックに対するウェーブレット変換の適用は、種々のスケールで再構成出力ウェーブレット係数のセットを生成する。（a）一方は、入力シグナル成分の低周波成分である近似出力であり、そして（b）他方は、様々なレベルでの入力シグナルの詳細である高周波成分を与える多次元出力である。特徴を異なるスケール（又は周波数）に分離することで、オペレーターまたはコンピュータアルゴリズムが或る特定の決定または分析に最も関連性が高いウェーブレット係数を選択することが可能となり、このプロセスは、しばしばウェーブレットフィルタリングと呼ばれる。このプロセスは、繰り返し適用されることで、シグナルを複数の周波数帯に分割することができる。融解曲線データに対して適用される場合に、最高周波数のウェーブレット係数は殆どがノイズであるのに対して、最低解像度係数は、先行する増幅反応における機器のゲインまたは増幅効率に関連する情報をキャプチャする。両方とも融解曲線分析を受ける試料における特定のオリゴヌクレオチドの識別自体には、殆ど関連性を有しないまたは全く関連性を有しないが、そのような識別の信頼性に関しては潜在的な関連性を有する。離散ウェーブレット変換（DWT）の計算およびプロットに必要な全ての関数を含むパッケージが記載されている（Aldrich,2015）。
【００７０】
実施例に示されるように、データに対して離散ウェーブレット変換を実行して離散ウェーブレット変換係数（dwt係数）を生成する工程は、特定の設定において、Daubechiesファミリーからのマザーウェーブレットを使用して、生データまたは削減データの一次元（1D）ウェーブレット変換を計算することになる。マザーウェーブレットは、離散ウェーブレット変換の基礎として選択される未修正のウェーブレットである（Daubechies, 1992）。DB8マザーウェーブレットを使用した場合に良好な結果が得られた。マザーウェーブレットは、引き続きピラミッドdwtアルゴリズムを使用して、拡張され、シフトされ、そしてスケーリングされることで、分析されるべきシグナルを最もよく表すチャイルドウェーブレットのセットを生成し、該アルゴリズムから得られるウェーブレット係数およびスケール係数のセットは、離散ウェーブレット変換の結果である。特定の例において、DWTの境界条件は、周期的である。該変換に入力される生データは、測定された全てのデータまたは実験の全ての有意な事象をカバーするサブセットであり得る。
【００７１】
したがって、本発明の方法における1つの工程は、生データに対する離散ウェーブレット変換、またはdwt係数を生成するための生データの選択を含む。1つの特定の実施形態において、離散ウェーブレット変換は、1D離散ウェーブレット変換である。上記実施形態の更に好ましい設定において、1D離散ウェーブレット変換は、1D Daubechiesウェーブレット変換である。
【００７２】
離散ウェーブレット変換を適用するためには、マザーウェーブレットが選択される必要がある。さらに好ましい設定において、Daubechiesウェーブレット変換は、Daubechiesファミリーからのマザーウェーブレットを使用し、最も好ましくはDB8マザーウェーブレットである。
【００７３】
原則として、可能な実施形態において、単一ヌクレオチドレベルでの識別を可能にする情報をキャプチャする有意係数を生成するのに適した任意のウェーブレット変換、Daubechies DB4ウェーブレット、Haarウェーブレット（これはDaubechiesファミリーの一部とみなすこともできる）、最小非対称、coiflet、best localized等が、本発明の方法において使用され得る。代替的な実施形態は、リフティングアルゴリズムまたは双対木複素ウェーブレット変換を含むdwtを計算するための代替的なアルゴリズムを使用することができる。離散ウェーブレット変換の他の形式は、（ダウンサンプリングが省略される）非間引きウェーブレット変換（non- or undecimated wavelet transform）、（ウェーブレットの正規直交基底が周波数空間において適切に構築されたトップハットフィルタから形成される）Newland変換を含む。ウェーブレットパケット変換は、離散ウェーブレット変換にも関連する。複素ウェーブレット変換は、さらに別の形式である。
【００７４】
本発明の方法の1つの工程において、dwt係数が選択され、そして分析される。典型的には、共に調査中のオリゴヌクレオチド混合物についての特徴的なシグネチャーを提供するスケール係数およびウェーブレット係数が選択される。最終結果は、手近なタスクにとって有意な係数のみを含み、そして計算効率の高いアルゴリズムを使用して分析対象の試料の組成物についての特徴的なシグネチャーをキャプチャするコンパクトな特徴ベクトルである。この特徴ベクトルは、機械学習技術のための完全な入力である。したがって、DWT等のデータ処理アルゴリズムは、測定データから関連する特徴を抽出することになる。関連する特徴は、入力サンプルがニューラルネットワーク、ツリーベースモデルまたはサポートベクトルマシン等の機械学習モデルによって分析および分類されることを可能にする入力特徴として使用されることになる。
【００７５】
好ましい実施形態において、機械学習モデルが使用されるべきであり、本発明のウェーブレット分析（およびフィルタリングされたデータ削減）方法は、特徴を抽出し、そしてそれらの機械学習アルゴリズムのうちの1つ（または複数）についての入力としてそれらを提示する。このような実施形態において、未知の試料が首尾よく分析され得る前に、分類アルゴリズムを訓練するために既知の組成を有する適切な参照試料が必要とされる。
【００７６】
したがって、本発明は、特定の特異的な設定において、生データに対して離散ウェーブレット変換を実行してdwt係数を生成する工程がdwt係数を含むコンパクトな特徴ベクトルの生成をもたらす、試験試料由来の核酸の融解曲線生データを分析する方法を提供する。dwt係数の選択に応じて、コンパクトな特徴ベクトルは、dwt係数を含む完全またはフィルタリングされたコンパクトな特徴ベクトルとなる。このコンパクトな特徴ベクトルは、更なる工程において、dwt係数を分析し、そして該分析に基づいて試験試料を分類するために使用されることになる。
【００７７】
好ましい設定において、分析および分類の工程が機械学習モデルによって行われる。機械学習は、データの分析に関し、特に、データ中のパターンおよび関係をアルゴリズム的に見つけ、そしてこれらを使用して、様々なドメインにおける分類および予測等のタスクを実行することに関する。機械学習モデルは、特徴ベクトル中に含まれるデータを処理し、そして試験試料を分類する出力を生成することになる。有利には、機械学習モデルは、融解曲線生データから生成されたコンパクトな特徴ベクトルを受け取り、そして該コンパクトな特徴ベクトル中に含まれるデータを処理して、SNP、一塩基挿入または一塩基欠失等の核酸変異を特徴付ける出力を生成するように、訓練を通して構成されている。特定の好ましい設定において、出力は、MSIに関連付けられ、そして不安定性が高いか否かを識別することになる。
【００７８】
したがって、本発明はさらに、特定の特異的な設定において試験試料由来の核酸の融解曲線生データを分析する方法を提供し、該方法は、被験体由来の核酸の供給源を準備する工程と、前記核酸を増幅する工程と、増幅された核酸を解離または会合させて融解曲線生データを生成する工程と、任意選択で、生データに対してデータ削減を実行する工程と、データに対して離散ウェーブレット変換を実行して、dwt係数を含む完全またはフィルタリングされたコンパクトな特徴ベクトルを生成する工程と、機械学習技術のための入力として、完全またはフィルタリングされたコンパクトな特徴ベクトルを使用する工程とを含む。
【００７９】
その目的のために、本方法は、特徴的なシグネチャーを提供するスケール係数およびウェーブレット係数を選択して、完全なまたはフィルタリングされたコンパクトな特徴ベクトルを生成する。ウェーブレット変換を活用して、このdwt係数の選択は、野生型遺伝子（図3Bおよび図4B）および突然変異遺伝子（図3Aおよび図4A）について得られたパターン間の明確な区別を可能にする。したがって、dwt係数は、それらの核酸組成に従って試験試料を分類するために使用される。
【００８０】
本発明は、現在のアプローチが特定の状態または表現型に関与することが知られているいくつかの遺伝子についての患者試料または生物試料の複合分析を可能にするので、複数の反応において複数の検出分子を使用するいくつかの標的分子の複合分析に特に適している。その目的のために、各標的が核酸変異の特徴を含むそれぞれの標識を有する、複数の標的分子を定義するデータが使用される。そのような実施のために、（1つ以上の蛍光体を使用して1つ以上の実験で測定された）各標的分子について取得された特徴ベクトルは、次いで、組み合わされ、そして1つとして機械学習アルゴリズムに供給される。特にこのような用途において、特徴ベクトルのコンパクトさは、明らかな利点であり、科学機器および医療装置に通常見られる小型埋め込みシステムに強力な計算方法を適用することを可能にする。
【００８１】
本発明の方法は、自動化に修正可能である。したがって、本発明は、本明細書に記載された方法を適用するシステムにも関する。したがって、更なる実施形態において、本発明の方法が提供され、ここで、試験試料から得られた核酸を増幅させる工程、該増幅された核酸を解離または会合させて融解曲線生データを生成する工程、任意選択で、該生データに対してデータ削減を実行する工程、該データに対して離散ウェーブレット変換を実行してdwt係数を生成する工程、dwt係数の分析を実行する工程、および分析に基づいて試験試料を分類する工程が、自動化システムにおいて実行される。
【００８２】
有利には、前記方法の前に、以下の工程：核酸の供給源由来の配列を潜在的に含む核酸を遊離させるおよび／または単離する工程、標的を潜在的に含む前記遊離および／または精製された核酸を、前記核酸を増幅させる工程のために準備する工程のいずれかが行われ、ここで、少なくとも、核酸の供給源由来の標的ホモポリマーリピート配列を潜在的に含む核酸を遊離させるおよび／または単離する工程、標的配列を潜在的に含む前記遊離および／または精製された核酸を、前記核酸を増幅させる工程のために準備する工程も自動化システムにおいて実行される。
【００８３】
さらに、特に有利であり、そして最小限の取扱いおよび上記の実施形態の技術的な準備の実施形態を必要とする場合、少なくとも、核酸の供給源から標的配列を潜在的に含む核酸を遊離させるおよび／または単離する工程、標的配列を潜在的に含む前記遊離および／または精製された核酸を、アンプリコンを生成する工程のために準備する工程、標的配列を含む核酸配列を増幅させる工程、シグナル生成オリゴヌクレオチドプローブの存在下で増幅された核酸を加熱する工程、温度関数における前記シグナルの強度の変化を検出して少なくとも1つの融解曲線を得る工程が前記自動化システムと係合可能なカートリッジにおいて実行される方法が提供され得る。
【００８４】
自動化システムにおいて該方法が自動化されたプロセスで実行され、このことは該方法または該プロセスの工程が人間による外部制御または影響を殆ど伴わずにまたは全く伴わずに動作することができる装置または機械を用いて実行されることを意味する。
【００８５】
特定の設定において、自動化システムは、以下の要素：機器、コンソールおよびカートリッジからなる。機器およびコンソールは、消耗品であるカートリッジと組み合わせて動作する。機器は、アッセイを実行するための制御モジュールを備える。コンソールは、アッセイの間に、機器の動作およびカートリッジの状態を制御および監視するためのコンピュータである。カートリッジにおいてアッセイ、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が実行されることになる。試薬が事前に装入されたカートリッジに試料を挿入した後に、該カートリッジは機器に装填され、そして該機器はカートリッジ内で自律的に実行されるアッセイを制御する。アッセイの実行後に、コンソールソフトウェアは結果を処理し、そして自動化システムのエンドユーザーがアクセス可能なレポートを生成する。
【００８６】
自動化システムは、開放型または閉鎖型の自動化システムであり得る。試料がカートリッジベースのシステムに添加または挿入された後に、カートリッジベースのシステムは閉鎖され、そしてシステムの動作中は閉鎖されたままとなる。閉鎖型のシステムは、機内に全ての必要な試薬を収容しているため、閉鎖型の構成は、該システムがコンタミネーションのない検出を実行するという利点を提供する。あるいは、開放型のアクセス可能なカートリッジが自動化システムにおいて使用され得る。必要な試薬は、必要に応じて開放型のカートリッジに添加され、その後に試料が開放型のカートリッジに挿入され得、そして該カートリッジが閉鎖型の自動化システムにおいて実行され得る。
【００８７】
好ましくは、1つ以上の反応チャンバーおよび1つ以上の流体チャンバーを含むカートリッジベースのシステムが使用される。流体チャンバーのいくつかは、試料から溶解物を生成するために使用される流体を保持してもよい。他のチャンバーは、反応緩衝液、洗浄液および増幅溶液等の流体を保持してもよい。反応チャンバーは、洗浄、溶解および増幅等の検出の種々の工程を行うために使用される。
【００８８】
本明細書で使用される用語「カートリッジ」は、そのようなカートリッジに収容するまたはそれと接続するのに適したより大きな機器の内側または外側に嵌まるものとして移送または移動され得る単独の物体として形成されるチャンバーおよび／またはチャネルの自己充足型のアセンブリとして理解されるべきである。カートリッジ内に含まれるいくつかの部材は固く接続されていてもよいが、その他は柔軟に接続されていてもよく、そしてカートリッジの他の構成要素に対して可動であってもよい。同様に、本明細書で使用される用語「流体カートリッジ」は、流体、好ましくは液体を処置、処理、排出または分析するのに適した少なくとも1つのチャンバーまたはチャネルを含むカートリッジとして理解されるものとする。そのようなカートリッジの一例は国際公開第2007004103号において挙げられる。有利には、流体カートリッジは、マイクロ流体カートリッジであり得る。流体カートリッジの文脈では、用語「下流」および「上流」は、流体がそのようなカートリッジ中を流れる方向に関するものとして定義され得る。すなわち、流体が同じカートリッジ内の第2の区分に向かって流れるカートリッジ内の流体経路の区分は、第2の区分の上流に位置していると解釈されるべきである。同様に、流体がその後に到達する区分は、前記流体がその前に通過した区分に対して下流に位置している。
【００８９】
一般的に、本明細書で使用される用語「流体」またはときには「マイクロ流体」は、小さいスケール、典型的には少なくとも1次元または2次元（例えば、幅および高さまたはチャネル）においてミリメートル未満のスケールに幾何学的に制約される流体の挙動、制御および操作を扱うシステムおよび装置を指す。そのような小容量の流体は、小サイズおよび低エネルギーの消費しか必要としないマイクロスケールで移動され、混合され、分離され、あるいは処理される。マイクロ流体システムは、マイクロ空気圧システム等の構造物（圧力源、液体ポンプ、マイクロバルブ等）およびマイクロリットル、ナノリットルおよびピコリットル容量を取り扱うためのマイクロ流体構造物（マイクロ流体チャネル等）を含む。例示的な流体システムは、欧州特許第1896180号、欧州特許第1904234号および欧州特許第2419705号に記載されており、したがって、本明細書に示される発明の或る特定の実施形態において適用され得る。
【００９０】
融解曲線データは、サーマルサイクリング、PCR、定量的PCRまたは類似の処理等の増幅を行うための任意の機器または方法によって処理された適切な蛍光部を含む試料から取得され得る。融解曲線データは、試料温度をDNA試料の融点温度より高く調整する手段を備えた任意の蛍光測定装置または分光測定装置から取得され得る。そのような機器の例には、限定されるものではないが、サーマルサイクラー（モジュラーおよびマルチブロックの両方）、定量的PCRに一般的に使用される光学サーモサイクラー、温度制御部を備えた蛍光光度計、PCR機器、バッチヒーターまたはチラー、および他の類似の機器が含まれ、これらはすべて、蛍光を測定する間の定義された期間に、特定の温度の生成および維持を可能にするように、関連する光学系を備える。当業者は、融解曲線データの生成に関連して使用される当技術分野で既知の他の機器または方法が本発明の趣旨および範囲内であることを認識するであろう。
【００９１】
上述の実施形態による特に望ましい実施形態において、本発明による方法の結果の解釈を能率化および促進するために、融解曲線の分析も、コンピュータ実装方法によって自動化された方式で実行される。
【００９２】
本明細書に記載される方法の実施形態は、本明細書に記載されるコンピュータ実装方法の実施形態でもある。本明細書に記載される方法によって得られる技術的効果は、本明細書に記載されるコンピュータ実装方法によって得られる技術的効果でもある。本明細書におけるコンピュータ実装方法は、微小ではあるが分子的に有意な差異の区別を必要とする大きな生データセットを生成するいくつかの標的多重化実験の複合分析を含む試験試料を分類するのに特に適している。
【００９３】
現在のアプローチは、特定の状態または表現型に関与することが知られているいくつかの遺伝子についての患者試料または生物試料の複合分析を可能にするので、本明細書においてコンピューターで実施される方法は、複数の反応において複数の検出分子を使用するいくつかの標的分子の複合分析に特に適している。そのような実施のために、各標的分子について取得された特徴ベクトル（1つ以上の蛍光体を使用して1つ以上の実験において測定される）は、次いで、組み合わされ、そして1つとして機械学習アルゴリズムに供給される。特に、このような用途について、特徴ベクトルのコンパクトさは、明らかな利点であり、科学機器および医療装置において通常見られる小型埋め込みシステムに対する強力な計算方法の適用を可能にする。
【００９４】
したがって、別の態様は、試験試料由来の核酸の融解曲線生メトリックを取得し、そして変換するためのコンピュータ実装方法に関し、この方法は、核酸由来の融解曲線生データを生成する工程、dwt係数を生成するために該データに対して離散ウェーブレット変換を実行する工程、前記核酸の融解曲線分析に最も関連性が高いと識別された係数を選択する工程、該dwt係数の分析を実行する工程、および該分析に基づいて試験試料を分類する工程を含む。
【００９５】
有利には、分析および分類する工程は、SNP、一塩基挿入または一塩基欠失等の核酸変異を特徴付ける出力を生成する機械学習モデルによって行われる。特定の好ましい設定において、出力はMSIに関連付けられ、そして不安定性が高いか否かを識別することになる。その目的のために、本発明の方法は、典型的にはデータ可視化の工程を含むことになる。データ可視化は、データを視覚的に引きつける画像、色、ストーリー等に変えることによって、より解釈しやすい方法で複雑な情報を伝達する。このような可視化は、例えばカラーコードの使用により、ウェーブレット変換出力グラフに基づいて増幅された核酸におけるヌクレオチド変異を単純かつ迅速に識別するのに役立ち得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、コンピュータ実装方法において核酸由来の融解曲線生データを生成する工程は、被検体由来の核酸の供給源を準備する工程、前記核酸を増幅する工程、および増幅された核酸を解離または会合させて融解曲線生データを生成する工程を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において、前記コンピュータ実装方法の前に、以下の工程：核酸の供給源由来の標的配列を潜在的に含む核酸を遊離させるおよび／または単離する工程；および／または標的を潜在的に含む前記遊離および／または精製された核酸を、前記核酸を増幅させる工程のために準備する工程のいずれかが行われる。
【００９８】
本発明は、さらに、試験試料由来の核酸の融解曲線生メトリックを取得し、そして変換するためのコンピュータ実装方法を実行するための手段を含むデータ処理装置に関する。本発明は、さらに、核酸から融解曲線生データを生成するための手段と組み合わせた、および／またはつながれた、任意選択で、核酸の供給源から標的配列を潜在的に含む核酸を遊離させるおよび／または単離するための手段と組み合わせた、および／またはつながれたデータ処理装置に関する。
【００９９】
核酸由来の融解曲線生データを生成するための手段は、以下の1つ以上：
被験体由来の核酸の供給源を準備する手段、前記核酸を増幅させるための手段、および該増幅された核酸を解離または会合させるための手段を含んでもよい。
【０１００】
核酸の供給源から標的配列を潜在的に含む核酸を遊離させるおよび／または単離するための手段は、データ処理装置と係合可能なカートリッジを含んでもよい。
【０１０１】
本発明はまた、プログラムが（任意選択で1つ以上の追加の手段につながれた）コンピュータによって実行されるときに、コンピュータに、試験試料由来の核酸の融解曲線生メトリックを取得し、そして変換するためのコンピュータ実装方法を実行させる命令を含むコンピュータプログラムに関する。
【０１０２】
本発明はまた、（任意選択で1つ以上の追加の手段につながれた）コンピュータによって実行されるときに、コンピュータに、試験試料由来の核酸の融解曲線生メトリックを取得し、そして変換するためのコンピュータ実装方法を実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体に関する。
【０１０３】
以下の実施例は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に規定される。
【実施例】
【０１０４】
実施例1.癌患者試料中のSEC31A MSIマーカーの分子ビーコン融解曲線
【０１０５】
chr4:82864395に位置し、そして9個のアデニン（A）のホモポリマーリピートを含む、ヒトSEC31Aマーカー中のホモポリマーヌクレオチドリピート配列中の長さ1ヌクレオチドの非常に小さな変化は、図1に示されるフローチャートに従って評価された。
【０１０６】
SEC31Aの野生型（WT）ホモポリマーリピート配列（太字および下線）およびその特異的な周囲配列を以下に示す:
【０１０７】
【表１】
2021510547.tif 000004
【０１０８】
SEC31Aのリピート配列におけるヌクレオチド変化を検出するために、配列番号２（下記表２）の配列を有する分子ビーコン検出プローブが設計され、そして蛍光標識分子としてAtto647で標識された一方、BHQ2はクエンチャーとして使用された（分子ビーコンプローブのステム領域はイタリック体で示され、該プローブハイブリダイズ領域は太字で示され、ここで9個の代わりに8個のアデニンリピートを含む変異SEC31Aマーカーと同一のリピート配列は太字かつ下線で示される）。
【０１０９】
【表２】
2021510547.tif 000005
【０１１０】
結腸直腸癌患者由来のFFPE試料は、Biocartis Idylla（商標）流体カートリッジに準備された。カートリッジは閉じられ、そして自動化されたPCRベースの遺伝子分析のためのBiocartis Idylla（商標）プラットフォームに装填され、その後に、自動化された試料処理が開始された。第1に、患者のDNAは、FFPE試料から放出され、次いでカートリッジのPCR区間にポンプ圧送された。次に、SEC31Aホモポリマーリピート配列を囲む領域の非対称PCR増幅は、以下のプライマーを使用して各カートリッジにおいて行われた。
FWD:5'-CAACTTCAGCAGGCTGT-3'（配列番号3）およびREV: 5'-agtctgagaagcatcaatttt-3'（配列番号4）。PCR増幅は、上記のSEC31A、−特異的分子ビーコンプローブの存在下で行われた。
【０１１１】
PCR後、PCR産物は、カートリッジ内にて95℃で2分間変性され、次いでSEC31A特異的分子ビーコンプローブのその標的へのハイブリダイゼーションに十分な時間を与えるために1分間45℃まで冷却された。次に、その混合物を0.3℃刻みで40℃から76.6℃まで加熱し（1サイクル当たり12秒）、そして同時に0.3℃毎の増加後に蛍光シグナル（1サイクル当たり約8秒）をモニタリングすることによって、Idyllaシステム上で融解曲線分析が実行され、融解曲線生データ（さらに「X」と呼ぶ）が準備された。
【０１１２】
図2は、SEC31Aについて温度関数においていくつかの参照試料から得られた蛍光シグナル測定結果を示す。図2Aは、20%変異+80% WT（MSI）として特徴付けられる試料を示す融解プロファイルを示す。図2Bは、100% WT（MSS）として特徴付けられる試料を示す融解プロファイルを示す。図2Cは、空の試料（NTC）として特徴付けられる試料を示す融解プロファイルを示す。
【０１１３】
実施例2.癌患者試料におけるSEC31A MSIマーカーのウェーブレット変換曲線
ウェーブレットフィルタ、ウェーブレット変換および多重解像度解析を計算するための関数のパッケージ（Aldrich, 2015）が適用され、生の融解曲線データ（X）を示す単変量または多変量時系列についての離散ウェーブレット変換係数が計算された。生の融解曲線データは、317人の患者の試料から取得された。第１の実施は、Aldrich, 2015のウェーブレットパッケージで増強されたRプログラム（https://www.r-project.org/）を使用して構築された。本SEC31A実験のために、DB8マザーウェーブレットを使用した一次元ウェーブレット変換が適用された。離散ウェーブレット変換は、Percival and Walden(2000), pp.100-101により記述された擬似コードに基づいたピラミッドアルゴリズムを介して計算された。境界（boundary）設定が「周期的（periodic）」にされている場合、得られるウェーブレット係数およびスケーリング係数は、元の系列に変更を加えずに計算され、このような場合、ピラミッドアルゴリズムは、Xを円形であるかのように扱う。しかし、境界設定が「反射（reflection）」にされている場合、系列を拡張するための呼び出しが行われ、元の系列の2倍の長さに反射される新しい系列が得られる。ウェーブレット係数およびスケーリング係数は、その後各レベルで2倍のウェーブレット係数およびスケーリング係数が得られる反射された系列に対して周期的境界条件を使用して計算される。いくつかのレベルの分解が適用され得る。図は、分解の第3のレベルにおけるウェーブレット係数を示す。
【０１１４】
本実験について、周期的境界条件が適切であることが示された。図3のグラフは、Daubechies DB8由来のスケール関数を使用した317人の患者の試料におけるSEC31A遺伝子についてのウェーブレット変換された値を示す。図4のグラフは、Daubechies DB8由来のウェーブレット関数を使用した同一の患者試料におけるSEC31A遺伝子についてのウェーブレット変換された値を示す。図3および図4から導き出され得るように、プロットされたウェーブレット変換値に基づいて、野生型遺伝子（図3Bおよび図4B）および突然変異遺伝子（図3Aおよび図4A）について得られたパターンの間で明確な区別がなされ得る。図5および図6のグラフは、それぞれDaubechies DB8由来のスケール関数およびウェーブレット関数を使用して、各サンプルクラス（野生型、突然変異体およびNTC）について1つのパターンを示すSEC31A遺伝子についてのウェーブレット変換パターンの直接比較を示す。
【０１１５】
実施例3.癌患者試料中のいくつかのMSIマーカーについてのウェーブレット変換曲線
多重化技術およびいくつかの同時反応を使用して、結腸直腸癌に関与することが知られているいくつかの遺伝子についてWTまたは突然変異状態が得られる。更なる実験において、2つの二本鎖および3つの一本鎖を使用した7遺伝子についてのMSI状態が決定された。
【０１１６】
実施例４．癌患者試料におけるSEC31A MSIマーカー分類
実施例1〜3において記載されたように得られたウェーブレット係数およびスケール係数は、その後分類のためのニューラルネットへの入力として使用された。DWTの結果として得られるデータベクトルは、最も際立った分解レベルのためにサンプリングされる。スケールベクトルは、値分布がウェーブレット係数の値分布に匹敵することを保証するために、スケーリングされ、そしてゼロを中心とされる。これにより、両方の係数セットからコンパイルされた観測ごとに1つの特徴ベクトルを使用することが可能になる。これは、機械学習アルゴリズムによる分類を改善する。
【０１１７】
ニューラルネットの定義および訓練は、Tensorflowソフトウェアパッケージを使用した。プログラム入力、プログラム出力およびプログラムユーザーインターフェースは、実施例2において記載されたようにRプログラムを使用して準備された。Kerasパッケージは、Tensorflow機能をRと統合するために使用された。
【０１１８】
第1の設定において、R-Keras-Tensorflowシステムは、参照試料を使用したニューラルネットの訓練および未知の試料の分類の両方のために使用された。本実施は、2017年3月15日から実施されている。
【０１１９】
第2の設定において、R-Keras-Tensorflowシステムは、ニューラルネットの訓練に使用され、そして未知の試料の分類のために得られたコードは、Biocartis Idylla（商標）プラットフォームに統合され、そして未知の試料の自動処理および自動分類を可能にした。
【０１２０】
実施例５．他のウェーブレットフィルタを使用した癌患者試料中のSEC31AMSIマーカーについてのウェーブレット変換曲線
好ましい実施形態の次に、有用な変換された測定データを取得するために、他のマザーウェーブレットも適用され得る。本実施例において、DB4およびHaarマザーウェーブレットは、実施例２において使用されたのと同じデータセットに対して実行される。
【０１２１】
ウェーブレットフィルタ、ウェーブレット変換および多重解像度解析を計算するための関数のパッケージ（Aldrich, 2015）が適用され、生の融解曲線データ（X）を示す単変量または多変量時系列についての離散ウェーブレット変換係数が計算された。生の融解曲線データは、317人の患者の試料から取得された。第1の実施は、Aldrich,2015のウェーブレットパッケージで増強されたRプログラム（https://www.r-project.org/）を使用して構築された。
【０１２２】
本SEC31A実験のために、DB4およびHaarマザーウェーブレットを使用して一次元ウェーブレット変換が適用された。離散ウェーブレット変換は、Percival and Walden(2000),pp.100-101により記述された擬似コードに基づいたピラミッドアルゴリズムを介して計算された。境界（boundary）設定が「周期的（periodic）」にされている場合、得られるウェーブレット係数およびスケーリング係数は、元の系列に変更を加えずに計算され、このような場合、ピラミッドアルゴリズムは、Xを円形であるかのように扱う。しかし、境界設定が「反射（reflection）」にされている場合、系列を拡張するための呼び出しが行われ、元の系列の2倍の長さに反射される新しい系列が得られる。ウェーブレット係数およびスケーリング係数は、その後各レベルで2倍のウェーブレット係数およびスケーリング係数が得られる反射された系列に対して周期的境界条件を使用して計算される。いくつかのレベルの分解が適用され得る。図は、分解の第3のレベルにおけるウェーブレット係数を示す。
【０１２３】
本実験について、周期的境界条件が適切であることが示された。図7のグラフは、Daubechies DB4由来のスケール関数を使用した317人の患者の試料におけるSEC31A遺伝子についてのウェーブレット変換された値を示す。図8のグラフは、Daubechies DB4由来のウェーブレット関数を使用した同一の患者試料におけるSEC31A遺伝子についてウェーブレット変換された値を示す。図9のグラフは、Haarウェーブレット由来のスケール関数を使用した317人の患者の試料におけるSEC31A遺伝子についてのウェーブレット変換された値を示す。図10のグラフは、Haarウェーブレット由来のウェーブレット関数を使用した同一の患者試料におけるのSEC31A遺伝子についてのウェーブレット変換された値を示す。図7、8、9および10から導き出され得るように、プロットされたウェーブレット変換値に基づいて、DaubechiesDB4について野生型遺伝子（図7Bおよび図8B）および突然変異遺伝子（図7Aおよび図8A）について得られたパターンの間で、同様にHaarウェーブレットについて野生型遺伝子（図9Bおよび図10B）および突然変異遺伝子（図9Aおよび図10A）について得られたパターンの間で明確な区別がなされ得る。
【０１２４】
参考文献
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【符号の説明】
【０１２５】
図1
obtain & prepair sample  試料を取得及び調製する
start experiment  実験を開始する
PCR step  PCRステップ
Melting step  融解ステップ
obtain melting curve raw data  融解曲線生データを取得する
store raw data  生データを記憶する
data reduction preferred?  データ削減優先?
yes  はい
perform data reduction  データ削減を実行する
no  いいえ
discrete wavelet transform  離散ウェーブレット変換
store dwt coefficients  dwt係数を記憶する
select most relevant coefficients  最も関連性が高い係数を選択する
classify sample  試料を分類する
report diagnostic result  診断結果を報告する
show results on screen  結果を画面に表示する
図２
true.genotype  真の遺伝子型
cycle  サイクル
図３
true.genotype  真の遺伝子型
図４
true.genotype  真の遺伝子型
図５
true.genotype  真の遺伝子型
図６
true.genotype  真の遺伝子型
図７
mutantPerc  突然変異Perc
図8
mutantPerc  突然変異Perc
図9
mutantPerc  突然変異Perc
図10
mutantPerc  突然変異Perc
【図１】
2021510547.tif 000006
【図２】
2021510547.tif 000007
【図３】
2021510547.tif 000008
【図４】
2021510547.tif 000009
【図５】
2021510547.tif 000010
【図６】
2021510547.tif 000011
【図７】
2021510547.tif 000012
【図８】
2021510547.tif 000013
【図９】
2021510547.tif 000014
【図１０】
2021510547.tif 000015
【配列表】
2021510547000001.app
【国際調査報告】
2021510547.tif 000016
2021510547.tif 000017