(57)【要約】  化学療法剤と遮断阻害剤を含むヒドロゲルマトリックスを有する、癌を処置するための組成物及び方法が開示されている。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体中の非免疫原性癌を処置する方法であって、化学療法剤と遮断阻害剤とを含むヒドロゲルマトリックスを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記化学療法剤がゲムシタビンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遮断阻害剤がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ−９３６５５９からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遮断阻害剤がＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２遮断阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２遮断阻害剤がイピリムマブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遮断阻害剤が、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤が、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣＶ１、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＣＣ−９０００２及びＴＴＩ−６２１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒドロゲルマトリックスが、生体応答性足場が腫瘍微小環境内の因子への曝露に際して、前記化学療法薬及び前記遮断阻害剤を前記腫瘍微小環境中に放出することを含む、請求項１〜８のそしてに記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒドロゲルマトリックスが、活性酸素種（ＲＯＳ）分解性ヒドロゲルを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒドロゲルが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間、前記化学療法薬及び前記遮断阻害剤を前記腫瘍微小環境中へ放出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学療法薬及び遮断阻害剤が同じ速度で前記ヒドロゲルから放出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法薬及び前記遮断阻害剤が異なる速度で前記ヒドロゲルから放出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌腫、腎癌、頭部及び頸部癌並びに膀胱癌からなる群から選択される、低ＰＤ−Ｌ１発現を有する癌又は非免疫原性癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
癌を有する被験体中の腫瘍中に遮断阻害剤感受性を誘導する方法であって、化学療法剤と遮断阻害剤とを含むヒドロゲルマトリックスを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記遮断阻害剤感受性がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤感受性を含み、前記遮断阻害剤がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ−９３６５５９からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記遮断阻害剤感受性がＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２遮断阻害剤感受性を含み、前記遮断阻害剤がＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２遮断阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２遮断阻害剤がイピリムマブを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遮断阻害剤感受性がＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤感受性を含み、前記遮断阻害剤がＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤が、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣＶ１、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＣＣ−９０００２及びＴＴＩ−６２１からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
化学療法剤と遮断阻害剤とを含む生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【請求項２３】
前記化学療法剤がゲムシタビンを含む、請求項２２に記載の生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【請求項２４】
前記遮断阻害剤がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤である、請求項２２に記載の生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【請求項２５】
前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ−９３６５５９からなる群から選択される、請求項２４に記載の生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【請求項２６】
前記遮断阻害剤がＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２遮断阻害剤である、請求項２２に記載の生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【請求項２７】
前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２遮断阻害剤がイピリムマブを含む、請求項２６に記載の生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【請求項２８】
前記遮断阻害剤がＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤である、請求項２２に記載の生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【請求項２９】
前記ＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤が、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣＶ１、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＣＣ−９０００２及びＴＴＩ−６２１からなる群から選択される、請求項２８に記載の生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【請求項３０】
前記ヒドロゲルマトリックスが、活性酸素種（ＲＯＳ）分解性ヒドロゲルを含む、請求項２２に記載の生体応答性ヒドロゲルマトリックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１２月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／５９８，２５４号の利益を主張し、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。本発明は、国立衛生研究所によって授与されたグラント第１Ｌ１ＴＲ００１１１１号に基づく政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ．背景技術
プログラム死−１／プログラム死−リガンド１（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１）経路を標的とする免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）は、黒色腫、非小細胞肺癌、腎臓癌、頭部及び頸部癌並びに膀胱癌など、様々な悪性病変において顕著な臨床反応を誘導する。しかしながら、高いネオアンチゲン負荷によって特徴付けられる免疫原性腫瘍、エフェクターＴ細胞の事前浸潤及びＰＤ−Ｌ１の発現を有する患者のみが、ＩＣＢ後の投与後に、持続的な臨床反応を達成するように見受けられる。さらに、ＩＣＢの臨床適用には、正常な臓器中での様々な副作用も伴ってきた。これらの研究に基づいて、免疫原性腫瘍表現型を促進することを意図した戦略、ＩＣＢ応答を増加させること及び重大な副作用を回避することは、癌免疫療法の分野における中心的テーマであり続けている。必要とされているのは、することができる新しい癌療法及び処置戦略である。
【発明の概要】
【０００３】
ＩＩ．概要
化学療法剤と遮断阻害剤（ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とを含む生体応答性ヒドロゲルマトリックスに関連する方法及び組成物が開示されている。
【０００４】
被験体中の非免疫原性癌を処置する／阻害する／縮小する又は癌を有する被験体中の腫瘍中での遮断阻害剤感受性（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤感受性など）を誘導する方法であって、化学療法剤（ゲムシタビンを含むが、これに限定されない。）と遮断阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ−９３６５５９などのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤；例えば、イピリムマブなどのＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２阻害剤；並びに／又は例えば、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣＶ１、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＣＣ−９０００２及びＴＴＩ−６２１などのＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤を含むが、これらに限定されない。）とを含むヒドロゲルマトリックスを前記被験体に投与することを含む方法が本明細書に開示されている。
【０００５】
ヒドロゲルマトリックスが、生体応答性足場が腫瘍微小環境内の因子への曝露に際して、腫瘍微小環境中に化学療法薬及び遮断阻害剤（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤など）を放出することを含む、いずれかの前記態様の方法も開示されている。
【０００６】
一態様において、ヒドロゲルマトリックスが活性酸素種（ＲＯＳ）分解性ヒドロゲルを含む、いずれかの前記態様の方法が本明細書に開示されている。
【０００７】
ヒドロゲルが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間、腫瘍微小環境中に化学療法薬及び遮断阻害剤（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤など）を放出する、いずれかの前記態様の方法も開示されている。
【０００８】
一態様において、化学療法薬及び遮断阻害剤（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤など）が、同じ速度で又は異なる速度でヒドロゲルから放出される、いずれかの前記態様の方法が本明細書に開示されている。
【０００９】
癌が、黒色腫、非小細胞肺癌腫、腎癌、頭部及び頸部癌並びに膀胱癌からなる群から選択される、低ＰＤ−Ｌ１発現を有する癌又は非免疫原性癌、いずれかの前記態様の方法も開示されている。
【００１０】
化学療法剤（ゲムシタビンを含むが、これに限定されない。）と遮断阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ−９３６５５９などのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤；例えば、イピリムマブなどのＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２阻害剤；並びに／又は例えば、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣＶ１、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＣＣ−９０００２及びＴＴＩ−６２１などのＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤を含むが、これらに限定されない。）とを含む生体応答性ヒドロゲルマトリックスも本明細書に開示されている。
【００１１】
一態様において、ヒドロゲルマトリックスが活性酸素種（ＲＯＳ）分解性ヒドロゲルを含む、いずれかの前記態様の生体応答性ヒドロゲルマトリックスが本明細書に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
ＩＩＩ．図面の簡単な説明
添付図面は、本明細書の一部に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、いくつかの実施形態を表し、明細書と共に、本開示の組成物及び方法を説明する。
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ及び１Ｆは、インサイチュで形成された活性酸素種（ＲＯＳ）応答性のＰＶＡ−ＴＳＰＢＡ足場の模式図及び性質決定を示す。図１Ａは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ（ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ））中にゲムシタビン（ＧＥＭ）及び抗ＰＤ−Ｌ１（ａＰＤＬ１）を送達するためにＲＯＳ分解性ヒドロゲル足場を用いる相乗的化学免疫療法の模式図を示す。図１Ｂは、ＧＥＭ及びａＰＤＬ１を搭載されたゲル足場の代表的な低温走査型電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）画像を示している。スケールバー、０．５μｍ。挿入図：足場の拡大画像。スケールバー、０．１μｍ。図１Ｃは、ＦＩＴＣがＧＥＭに対する蛍光性代替物として使用され（緑）、ａＰＤＬ１がＣｙ５．５（赤）で標識されたヒドロゲルの凍結切片の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー、２５μｍ。図１Ｄは、７日間における、Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＭ）あり及びなしの１×ＰＢＳ中でのヒドロゲルの形態変化を示す。図１Ｅ及び１Ｆは、Ｈ２Ｏ２（１ｍＭ）あり又はなしのＰＢＳとともに温置されたときの、ヒドロゲルからのＧＥＭ（１ｅ）及びａＰＤＬ１（１ｆ）の累積的放出特性を示す。
【図２】は、ＰＶＡ−ＴＳＰＢＡゲルのＨ２Ｏ２−応答性機序の模式図を示す。
【図３】図３Ａは、ＴＳＰＢＡの合成経路を示す。図３Ｂは、少なくとも３つ組の測定に基づくＴＳＰＢＡの１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ−ＤＭＳＯ中）スペクトルを示す。
【図４】図４は、少なくとも３つ組の測定に基づく、異なる時点での（注射から１５分（０日）、１、２及び３日後）、ａＰＤＬ１及びＧＥＭを搭載されたゲル注射後に収集されたＢ１６腫瘍の共焦点免疫蛍光画像を示す。赤及び緑の蛍光は、それぞれ、ａＰＤＬ１（Ｃγ３ヤギ抗ラットＩｇＧ）及びＦＩＴＣ（ＧＥＭに対する蛍光性代替物）を示す。注：抗体は絶えず放出され、ＰＤＬ１がＧＥＭによって上方制御されると、腫瘍中での保持が強化された。
【図５】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、低用量のＧＥＭ＠Ｇｅｌが腫瘍におけるＴ細胞浸潤を強化したことを示す。図５Ａは、表記の処置後に収集された腫瘍内のＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリー分析を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ＝３）を表す。図５Ｂは、表記の処置を受けているマウス（ｎ＝５）中の腫瘍増殖を示す。増殖曲線は、平均±ＳＥＭを表す。図５Ｃは、表記の処置を受けているマウス（ｎ＝５）のカプラン・マイヤー生存曲線を示す。統計的有意性は、チューキー事後検定を用いて一元配置分散分析によって計算された。Ｐ値：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ及び６Ｇは、ＧＥＭ＠Ｇｅｌ移植が免疫原性腫瘍表現型を誘発することを示す。ヒドロゲル又はＧＥＭ＠ヒドロゲルが移植されたマウスから採取されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を、処置から２日後に、フローサイトメトリーによって分析した。図６Ａは、腫瘍内のＴ細胞浸潤の代表的フローサイトメトリー分析及び（６ｂ）対応する定量結果を示す。図６Ｃは、ＣＤ４５＋細胞に対するＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋）ゲーティングの代表的なフローサイトメトリー分析画像（左）及び対応する定量（右）を示す。図６Ｄは、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５＋細胞中のＭ２−マクロファージ（ＣＤ２０６＋）の代表的なフローサイトメトリー分析画像（左）及び対応する定量（右）を示す。図６Ｅは、ＧＥＭ＠ヒドロゲル処置あり（上）又はなし（下）での、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の共焦点免疫蛍光画像を示す。赤及び青の色は、それぞれ、Ｃｙ３がコンジュゲートされた抗ＰＤ−Ｌ１抗体からのａＰＤＬ１シグナル及びＤＡＰＩからの核を表す。スケールバー、２０μｍ。図６Ｆは、ヒドロゲル又はＧＥＭ＠ヒドロゲル処置後における腫瘍細胞及び腫瘍に浸潤しているリンパ球のＰＤ−Ｌ１発現並びにＰＤ−Ｌ１平均強度の対応する定量を示す。図６Ｇは、ＧＥＭ＠ヒドロゲル処置前及び後の、全身的ＩＬ６及びＩＦＮγレベルを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．に基づく。統計的有意性は、チューキー事後検定を用いて一元配置分散分析によって計算された。Ｐ値：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、インビトロでの癌細胞へのＧＥＭの作用を示す。図７Ａは、少なくとも３つ組の測定に基づくフローサイトメトリー及び免疫蛍光法によって評価された場合、ＧＥＭ（５μＭ）でのＢ１６Ｆ１０細胞の処処理が、２４時間以内に、生存している細胞に対して顕著なＰＤ−Ｌ１上方制御を引き起こしたことを示す。図７Ｂは、ウェスタンブロットもＰＤ−Ｌ１上方制御を示したことを示す。
【図８】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅ、８Ｆ、８Ｇ、８Ｈ及び８Ｉは、局所化学免疫療法がインビボでのＢ１６Ｆ１０黒色腫増殖を抑制することを示す。（８ａ）処置された群及び対照群中でのＢ１６Ｆ１０腫瘍のインビボ生物発光画像法。処置群当たり４〜５匹の代表的なマウスを示した。（８ｂ−８ｃ）対照及び処置群（０日に開始される処置）における個別の（８ｂ）及び平均（８ｃ）腫瘍増殖動態。挿入図：処置の２週後での代表的なマウスの写真。白い矢印は、腫瘍を示す。（８ｄ）処置された及び対照マウスに対する生存曲線。増殖曲線は、平均±ＳＥＭを表し、対応する群の最初の動物が死亡したときに、増殖曲線が停止された、カプラン・マイヤー生存曲線（ｎ＝７〜１０）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（８ｅ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を示している腫瘍の免疫蛍光。スケールバー、１００μｍ。（８ｆ〜８ｇ）様々な処置の際の、腫瘍ｇ当たりＣＤ８＋（８ｆ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（ｇ）の絶対数。（８ｈ〜８ｉ）様々な処置の際の、腫瘍中の制御性Ｔ細胞に対する腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞（８ｈ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（８ｉ）の比。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を表す。統計的有意性は、チューキー事後検定を用いて一元配置分散分析によって計算された。Ｐ値：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図９】図９は、遊離の薬物で処置されたマウス（ｎ＝６）中での腫瘍増殖を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。統計的有意性は、チューキー事後検定を用いて一元配置分散分析によって計算された。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈ及び１０Ｉは、局所的化学免疫療法が全身的抗癌免疫応答を誘導することを示す。図１０Ａは、マウスが右及び左側腹部中に腫瘍細胞が接種されたことを示す。対照マウスは処置されなかったのに対して、処置されたマウスは左側腹部上のみにヒドロゲルを移植された。図１０Ｂは、対照及び処置されたマウスの腫瘍部位から収集された癌細胞のＰＤ−Ｌ１発現及び（１０ｃ）ＰＤ−Ｌ１平均強度の対応する定量を示す（ｎ＝３）。（１０ｄ）局所的ａＰＤＬ１−ＧＥＭ＠ヒドロゲル処置に応答した、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍のインビボ生物発光画像化。（１０ｅ）左及び右腫瘍の増殖曲線並びに（１０ｆ）処置されていない及び処置されたマウス中における１０日での重量。（１０ｇ）処置後１０日での代表的なマウスの写真。白い矢印は、腫瘍を示す。（１０ｈ）対照及び処置されたマウスの腫瘍中での、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率、及び代表的なドットプロット、並びに（１０ｉ）腫瘍のｇ当たりのＣＤ８＋細胞の絶対数。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を表す。統計的有意性は、チューキー事後検定を用いて一元配置分散分析によって計算された。Ｐ値：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図１１】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ及び１１Ｇは、局所的化学免疫療法がＴ細胞記憶応答を誘導することを示す。（１１ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋及びＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＴＣＭ細胞の存在に関して、腫瘍を有する対照及び処置されたマウスから単離された脾細胞を分析した。（１１ｂ〜１１ｃ）脾細胞中のＴＣＭの対応する定量。（１１ｄ）Ｂ１６Ｆ１０癌細胞の静脈内注射で再度攻撃誘発された後のインビボ生物発光画像化。（１１ｅ）代表的な肺写真（１０日）並びに（１１ｆ）再攻撃誘発後の対照（ナイーブ）及び処置された（治癒）マウスから収集された肺のＨ＆Ｅ染色。青い矢印は、肺中の転移性腫瘍を表した。スケールバー、１００μｍ。（１１ｇ）ナイーブ及び治癒マウスに対する生存曲線。生存研究のために、各群に対して５匹のマウスが示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。統計的有意性は、チューキー事後検定を用いて一元配置分散分析によって計算された。Ｐ値：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図１２】図１２は、インビトロでの４Ｔ１細胞中でのＧＥＭの効果を示す。様々な濃度（０、１、２、５、１０μＭ）のＧＥＭでの、４８時間の４Ｔ１細胞の処理は、フローサイトメトリーによって評価された場合、残存する生きた細胞に対してＰＤ−Ｌ１上方制御をもたらした。データは、平均±ＳＤとして示されている。エラーバーは、少なくとも３つ組の測定に基づく。Ｐ値：＊、Ｐ＜０．０５。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは、局所化学免疫療法が低免疫原性４Ｔ１癌腫腫瘍を抑制することを示す。図１３Ａは、対照及び処置されたマウス中での４Ｔ１腫瘍増殖のインビボ生物発光画像化を示している。図１３Ｂは、対照及び処置されたマウスでの腫瘍増殖動態を示す。図１３Ｃは、対照及び処置されたマウスに対する生存曲線を示す。増殖曲線は、平均±ＳＥＭを表し、対応する群の最初の動物が安楽死したときに、増殖曲線が停止された、カプラン・マイヤー生存曲線（ｎ＝７〜１０）。増殖曲線は、平均±ＳＥＭを表す。統計的有意性は、チューキー事後検定を用いて一元配置分散分析によって計算された。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄ及び１４Ｅは、腫瘍の手術後再発を予防するためのゲル足場を示す。図１４Ａは、表記されている様々な処置後における、Ｃ５７Ｂ６マウス中でのＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖のインビボ生物発光画像化を示す。（１４Ｂ、１４Ｃ及び１４Ｄ）腫瘍の個別の（１４ｂ）及び平均定量的生物発光シグナル（１４ｃ）並びに対照及び被処置群での腫瘍増殖動態（１４ｄ）。黒い矢印は、手術の日を示す（９日）。図１４Ｅは、異なる処置に対する生存曲線を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。対応する群の最初の動物が安楽死したときに、増殖曲線が停止された、カプラン・マイヤー生存曲線（ｎ＝７〜１０）。増殖曲線は、平均±ＳＥＭを表す。統計的有意性は、チューキー事後検定を用いて一元配置分散分析によって計算された。＊Ｐ  ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１５】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ及び１５Ｄは、４Ｔ１腫瘍の手術後再発を予防するためのゲル足場を示す。表記された処置を受けている対照及び被処置群中での（１５ａ）個別の及び（１５ｂ）平均腫瘍増殖動態。図１５Ｃは、異なる処置に対する生存曲線を示す。図１５Ｄは、対照及び処置されたマウスの体重の測定を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す；増殖曲線は、対応する群の最初の動物が死亡したときに、停止された；カプラン・マイヤー生存曲線（図に示されているように、ｎ＝５〜９）。＊Ｐ＜０．０５。黒い矢印は、手術の日（１４日）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＩＶ．詳細な説明
本化合物、組成物、物品、機器及び／又は方法が開示及び記述される前に、これらは、別段の明示がなければ、特定の合成方法若しくは特定の組換えバイオテクノロジー法に、又は別段の明示がなければ、特定の試薬に限定されるものではなく、それ故、当然、変形し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００１４】
Ａ．  定義
明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。このため、例えば、「薬学的担体（ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ）」という表記は、２つ以上のこのような担体の混合物などを含む。
【００１５】
本明細書において、範囲は、「約」を用いたある特定の値から及び／又は「約」を用いた別の特定の値までとして表現することができる。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、ある特定の値から及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」を使用して値が近似値として表される場合、特定の値が他の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、各範囲の終了点は、他の終了点に関連して、及び他の終了点とは無関係に重要であることがさらに理解されよう。本明細書に開示されたいくつかの値があり、それぞれの値はまた、その値自体に加えて、「約」を用いたその特定の値としても、本明細書に開示されていることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示されているときには、その値「より少ない又は等しい」、「その値より多い又は等しい」及び値間の可能な範囲も開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０より少ない又は等しい」及び「１０より多い又は等しい」も開示されている。本出願全体を通じて、データは多数の異なる形式で提供されていること、このデータは終点と開始点及びデータ点のあらゆる組み合わせに対する範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」と特定のデータ点１５が開示されていれば、１０及び１５より多い、より多い又は等しい、より少ない、より少ない又は等しい及び等しい並びに１０と１５の間が開示されていると考えられることが理解される。２つの特定の単位間の各単位も開示されることも理解される。例えば、「１０及び１５」が開示されていれば、１１、１２、１３及び１４も開示されている。
【００１６】
被験体への「投与」は、作用剤を被験体に導入又は送達するあらゆる経路を含む。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、細静脈内、皮内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、移植された貯蔵所（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を介して、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術）などを含むあらゆる適切な経路によって実施することができる。本明細書において使用される「同時的投与」、「組み合わせでの投与」、「同時投与」又は「同時に投与された」は、同じ時点で、又は本質的に互いの直後に化合物が投与されることを意味する。後者の場合には、観察される結果が、化合物が同時点で投与された場合に達成される結果と区別できないほど十分に近い時間で、２つの化合物が投与される。「全身投与」は、例えば、循環系又はリンパ系中への進入を通じて、被験体の身体の広範な領域（例えば、身体の５０％超）に作用剤を導入又は送達する経路を介して作用剤を被験体に導入又は送達することを表す。これに対して、「局所投与」とは、投与の点の領域又は投与の点に直接隣接した領域に作用剤を導入又は送達し、治療的に著しい量で作用剤を全身的に導入しない経路を介して、作用剤を被験体に導入し、又は送達することを表す。例えば、局所的に投与された作用剤は、投与の点の局所的近傍において容易に検出可能であるが、被験体の身体の遠位の部分では検出不能であり、又は無視できる量で検出可能である。投与には、自己投与又及び他者による投与が含まれる。
【００１７】
「生体適合性」とは、レシピエントに対して一般的に無毒であり、かつ被験体に対して重大な有害作用を引き起こさないような材料及びそのあらゆる代謝産物又は分解産物を一般的に指す。
【００１８】
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物、方法などが列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するものとする。組成物及び方法を定義するために使用される場合における「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、列挙された要素を含むが、その組み合わせに対するあらゆる本質的な重要性をもつ他の要素を排除することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離方法及び精製方法による微量汚染物質、並びにリン酸緩衝食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を除外しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、その他の微量を超える成分及び本発明の組成物を投与するための方法中における重要な工程を除外することを意味するものとする。移行のためのこれらの各用語によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００１９】
「対照」は、比較目的で実験に使用される、代替の被験体又は試料である。対照は、「陽性」又は「陰性」であり得る。
【００２０】
「制御放出」又は「持続放出」は、インビボで所望の薬物動態特性を達成するために、制御された様式での、所定の剤形からの作用剤の放出を表す。「制御放出」作用剤送達の一態様は、所望される作用剤放出の動態を確立するために、処方及び／又は剤形を操作する能力である。
【００２１】
作用剤の「有効量」は、所望の効果を与えるための作用剤の十分な量を表す。「有効」である作用剤の量は、被験体の年齢及び全身状態、個別の１種類又は複数種類の作用剤などの多くの要因に応じて、被験体ごとに異なるであろう。したがって、定量化された「有効量」を特定することは必ずしも可能ではない。しかしながら、あらゆる被験体の場合における適切な「有効」量は、日常的な実験を用いて当業者が決定するものであってよい。また、本明細書で使用されるとき、別途具体的に述べられていない限り、作用剤の「有効量」はまた、治療有効量及び予防有効量の両方をカバーする量を指すことができる。治療効果を達成するために必要な作用剤の「有効量」は、被験体の年齢、性別及び体重などの要因によって異なってもよい。投与方式は、最適な治療反応をもたらすように調整することができる。例えば、数回に分けた用量を毎日投与してもよいか又は治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減らしてもよい。
【００２２】
「減少」は、より小さな、遺伝子発現、タンパク質発現、症候、疾病、組成物、症状又は活性の量をもたらすあらゆる変化を表すことができる。当該物質ありでの遺伝子産物の遺伝的出力が当該物質なしでの遺伝子産物の出力と比較してより少ないときにも、物質は遺伝子の遺伝的出力を減少させると理解される。また、減少は。例えば、症候が以前に観察されたより低いような、障害の症候の変化であり得る。減少は、統計的に有意な量での、症状、症候、活性、組成のあらゆる個別的、中央値の又は平均の減少であり得る。このため、減少が統計的に有意である限り、減少は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％の減少であり得る。
【００２３】
「阻害する」、「阻害すること」及び「阻害」は、活性、応答、症状、疾病又はその他の生物学的パラメータを減少することを意味する。これには、活性、応答、症状又は疾病の完全な消失が含まれ得るが、これに限定されない。これには、例えば、天然の又は対照レベルと比較して、活性、応答、症状又は疾病の１０％の低下も含まれ得る。このため、低下は、天然の又は対照レベルと比較した、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％又はその間のあらゆる量の低下であり得る。
【００２４】
本明細書において使用される「予防する」、「予防すること」、「予防」という用語及び文法的なこれらの変形は、部分的に又は完全に、疾病の開始若しくは再発及び／若しくは疾病の付随するその症候の１種以上を遅延若しくは妨げる、又は被験体が疾病を取得若しくは再取得しないようにする、又は疾病若しくは疾病の付随する症候の１種以上を取得若しくは再取得する被験体のリスクを低下させる方法を表す。
【００２５】
「薬学的に許容される」コンポーネントは、生物学的に又は他の点で望ましくないものではないコンポーネントを指すものであり得る。すなわち、そのコンポーネントは、重大な望ましくない生物学的作用も引き起こすことなく、又はそれが含まれる製剤中のいずれの他のコンポーネントとも有害な形で相互作用することなく、本発明の医薬製剤に含有させ、本明細書に記述したように被験体に投与することができる。ヒトへの投与を指すために使用される場合、本用語は、一般に、そのコンポーネントが毒性試験及び製造試験において要求される基準を満たしていること又はそのコンポーネントが米国食品医薬品局が作成する不活性成分ガイドに掲載されていることを、黙示的に意味する。
【００２６】
「薬学的に許容される担体」（時に「担体」と称される。）という用語は、一般に安全かつ無毒である、医薬組成物又は治療用組成物を調製するために有用な、獣医学的なかつ／又はヒト用の、薬学的な又は治療用の使用に許容される担体を含む、担体又は賦形剤を意味する。「担体」又は「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（油／水エマルジョン又は水／油エマルジョンなど）及び／又は様々な種類の湿潤剤を含み得るが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、「担体」という用語は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤又はその他の材料であって医薬製剤に使用するために当該技術分野で周知であり、かつ、ここでさらに説明するものを包含するが、これらに限定されない。
【００２７】
「薬理学的に活性な」誘導体又は類似体という表現におけるような「薬理学的に活性な」（又は単に「活性な」）は、誘導体又は類似体（例えば、塩、エステル、アミド、コンジュゲート、代謝産物、異性体、フラグメントなど）であって、親化合物と同一の種類の薬理活性を有し、かつ、その程度において近似的に同等であるものを指すことができる。
【００２８】
「ポリマー」とは、その構造を小単位であるモノマーの反復によって表すことができる、天然又は合成の分子量が比較的大きい有機化合物をいう。ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレン、ゴム、セルロースが含まれる。合成ポリマーは、通常、モノマーの付加重合又は縮合重合によって形成される。「コポリマー」という用語は、２種類以上の異なる繰り返し単位（モノマー残基）から形成されたポリマーを指す。限定としてではなく例として、コポリマーは、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー又はグラフトコポリマーであり得る。特定の態様では、ブロックコポリマーの種々のブロックセグメントは、それ自体がコポリマーを含み得ることもまた考慮される。「ポリマー」という用語は、天然のポリマー、合成ポリマー、ホモポリマー、ヘテロポリマー又はコポリマー、付加ポリマーなどを含むがこれらに限定されないあらゆる形態のポリマーを包含する。
【００２９】
「治療剤」は、有益な生物学的効果を有するあらゆる組成物を表す。有益な生物学的効果には、治療的効果、例えば、障害又は他の望ましくない生理的症状の処置、及び予防的効果、例えば、障害又は他の望ましくない生理的症状（例えば、非免疫原性癌）の予防の両方が含まれる。これらの用語は、塩、エステル、アミド、促進剤（ｐｒｏａｇｅｎｔ）、活性代謝産物、異性体、フラグメント、類似体などを含むがこれらに限定されない、本明細書に具体的に挙げられている有益な作用剤の薬学的に許容される、薬理学的に活性な誘導体も包含する。「治療剤」という用語が使用される場合、次いで、又は特定の作用剤が具体的に特定されている場合、その用語は、その作用剤自体の他に、薬学的に許容される、薬理学的に活性な、塩、エステル、アミド、促進剤、コンジュゲート、活性な代謝産物、異性体、フラグメント、類似体などを含むことが理解されるべきである。
【００３０】
組成物（例えば、作用剤を含む組成物）の「治療有効量」又は「治療有効用量」は、所望の治療結果を達成するために有効である量を表す。いくつかの実施形態において、所望の治療結果はＩ型糖尿病の抑制である。いくつかの実施形態において、所望の治療結果は肥満の抑制である。所与の治療剤の治療有効量は、通常、治療される障害又は疾患の種類及び重症度、並びに被験体の年齢、性別及び体重などの要因に関して異なるであろう。この用語はまた、疼痛緩和などの所望の治療効果を促進するために有効な、治療剤の量又は治療薬の送達速度（例えば、経時的な量）を指すこともできる。正確な所望の治療効果は、治療されるべき症状、被験体の耐性、投与されるべき作用剤及び／又は作用剤製剤（例えば、治療剤の効力、製剤中の作用剤の濃度など）、並びに当業者によって認識される様々なその他の要因に応じて異なるであろう。いくつかの事例では、何日間、何週間、又は何年間もの期間にわたる、被験体への組成物の複数回投与量の投与後に、所望の生物学的又は医学的応答が達成される。
【００３１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有するように定義されるいくつかの用語に言及する。
【００３２】
「オプション（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続いて記載されたイベント又は状況が発生する場合と発生しない場合があり、当該記載は、前記イベント又は状況が発生する場合と発生しない場合を含むことを意味する。
【００３３】
本願を通して、様々な刊行物が参照されている。本願が属する技術分野の水準をより完全に記述するために、これらの刊行物の開示内容の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。開示された参考文献はまた、その参考文献が依拠している文章中で論じられている、それらに含まれる材料について、参照により個別的にかつ具体的に本明細書中に組み込まれる。
【００３４】
Ｂ．  組成物
開示された組成物を作製するために使用されるコンポーネントは、本明細書に開示された方法の中で使用される組成物自体と同様に開示されている。これら及び他の材料は、本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されているとき、これらの合成物の、それぞれの様々な、個別の及び集合的な、組み合わせ及び並べ替えへの具体的な言及は、明示的に開示されていないことがあるが、それぞれが本明細書において具体的に企図され、記載されていることが理解される。例えば、化学療法剤と遮断阻害剤を含む特定のヒドロゲルマトリックスが開示及び論述されており、化学療法剤と遮断阻害剤を含むヒドロゲルマトリックスを含む多数の分子に対して為し得る多数の修飾が論述されている場合、具体的に反対の記載がなければ、具体的に想定されているのは、化学療法剤と遮断阻害剤を含むヒドロゲルマトリックス並びに可能である修飾のそれぞれの及び全ての組み合わせ及び並べ替えである。したがって、分子Ｄ、Ｅ及びＦのクラスのみならず分子Ａ、Ｂ及びＣのクラスが開示され、かつ、組み合わせ分子、Ａ−Ｄの例が開示されている場合、それぞれが個別に記載されていないときであっても、それぞれが個別に、かつ集合的に考慮される。つまり、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆが開示されているものとみなされる。同様に、これらのあらゆるサブセット又は組み合わせもまた開示されている。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブグループは、開示されているものとみなされる。この考え方は、開示された組成物を生産かつ使用する方法中の工程を含むがこれらに限定されない、本願の全ての態様に適用される。したがって、実行可能な様々な追加の工程が存在する場合、これらの追加の工程のそれぞれは、開示された方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせによって実行されることができることが理解される。
【００３５】
事前の化学療法は、免疫療法の治療結果を増強し、これは、長期の化学療法後の化学療法耐性も反転させた。いくつかの化学治療薬は、単一の処置として使用された場合に穏やかな活性を有するが、免疫療法とのそれらの組み合わせは強化された抗癌効果をもたらし得る。これらの観察は、いくつかの化学療法薬は免疫原性腫瘍表現型を促進するために使用することができると仮定することの論拠となる。他方、改変された送達ビヒクル又は足場は、低下した全身毒性で、免疫療法薬を輸送するための有望なツールとますます考えられている。しかしながら、インビボ投与した際の、搭載物の制御された放出及び支持マトリックスの分解の動態は、処置の有効性のために特に適切な側面である。
【００３６】
ここでは、ゲムシタビン（ＧＥＭ）が免疫原性腫瘍表現型を誘導し、ＩＣＢがその後の治療的免疫応答を促進する局所化された化学免疫療法に適した生体応答性足場が生成された（図１ａ）。注射可能なＲＯＳ応答性ヒドロゲルは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で発現される、癌の発症と進行を促進した極めて豊富なＲＯＳの故に、腫瘍部位内への移植に際して、治療薬を搭載及び放出するために使用することができると仮定された。ここでは、ＲＯＳ分解性ヒドロゲル足場の臨床的に適切な原型が、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫及び４Ｔ１乳房腫瘍（相対的に低い免疫原性）を有するマウスモデルにおいて、局所的ＧＥＭ送達及びａＰＤ−Ｌ１の局所的放出を通じた抗腫瘍応答を介して、免疫原性腫瘍表現型を促進する。最初の切除後の腫瘍再発の予防によって、この化学免疫療法の治療的利点も実証される。したがって、一態様において、化学療法剤と遮断阻害剤とを含むヒドロゲルマトリックスが本明細書に開示されている。
【００３７】
一態様において、開示されているヒドロゲルマトリックス中で使用することができる遮断阻害剤は、例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２遮断阻害剤（例えば、イピリムマブなど）及びＣＤ４７／シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）遮断阻害剤（例えば、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣＶ１、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＣＣ−９０００２及び／又はＴＴＩ−６２１など）などの、免疫チェックポイントのあらゆる阻害剤であり得る。開示されたヒドロゲルマトリックス中で使用するためのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤の例には、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ−９３６５５９を含むがこれらに限定されない、本分野において既知のあらゆるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤が含まれ得る。このように、一態様において、化学療法剤と遮断阻害剤を含むヒドロゲルマトリックスであって、遮断阻害剤が、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ−９３６５５９などのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤；例えば、イピリムマブなどのＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２阻害剤；並びに／又は例えば、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣＶ１、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＣＣ−９０００２及びＴＴＩ−６２１などのＣＤ４７／ＳＩＲＰａ阻害剤である、ヒドロゲルマトリックスが本明細書に開示されている。ヒドロゲルマトリックスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の遮断阻害剤を同時に取り込むように設計できることが理解され、本明細書において想定されている。
【００３８】
ヒドロゲルマトリックスは腫瘍の微小環境に対して生体応答性であり、例えば、過酸化物（例えば、過酸化水素）、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル及び一重項酸素を含むがこれらに限定されない活性酸素種；酸性の存在：酸化還元電位（グルタチオン（ＧＳＨ））；特異的な腫瘍関連酵素；低酸素；及びアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）などの微小環境内の因子への曝露に際して、化学療法剤及び／又は遮断阻害剤（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤など）を放出するように設計することができることが理解され、本明細書において想定されている。このように、一態様において、ヒドロゲルマトリックスが活性酸素種（ＲＯＳ）分解性ヒドロゲルを含む、いずれかの前記態様の生体応答性ヒドロゲルマトリックスが本明細書に開示されている。
【００３９】
１．  抗体
（１）  抗体全般
「抗体」という用語は、本明細書において、広義に使用され、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１と相互作用することから阻害され、ＣＴＬＡ−４がＢ７−１／２と相互作用することから阻害され、又はＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用することから阻害されるように、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１／２、ＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰαと相互する能力に関して選択される限り、完全な状態の免疫グロブリン分子に加えて、免疫グロブリン分子のフラグメント又はポリマー、及び免疫グロブリン分子のヒト若しくはヒト化バージョン又はそのフラグメントも「抗体」という用語に含まれる。抗体は、その所望の活性に関して、本明細書に記載されているインビトロアッセイを用いて、又は類似の方法によって検査することができ、その後、そのインビボ治療及び／又は予防活性が、既知の臨床的検査方法にしたがって検査される。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２にさらに分けられ得る。当業者は、マウスに対する同等のクラスを認識するであろう。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【００４０】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、抗体分子の小さな部分集団中に存在し得る天然に存在する可能性がある変異を除いて、集団内の各抗体が同一である。本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である「キメラ」抗体、並びに所望の拮抗的活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを含む。
【００４１】
開示されているモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を生産するあらゆる手法を用いて作製することができる。例えば、開示されているモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されているものなど、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することができるリンパ球を誘発するために、通例、マウス又はその他の適切な宿主動物が免疫化剤で免疫化されるあるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。
【００４２】
モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法によっても作製され得る。開示されたモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定することができる。抗体又は活性な抗体フラグメントのライブラリーは、例えば、Ｂｕｒｔｏｎらの米国特許第５，８０４，４４０号及びＢａｒｂａｓらの米国特許第６，０９６，４４１号に記載されているような、ファージディスプレイ技術を用いて、生成し、スクリーニングすることもできる。
【００４３】
インビトロ法も、一価抗体を調製するのに適している。抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを作製するための抗体の消化は、本分野において既知の日常的技術を用いて達成することができる。例えば、消化は、パパインを用いて実施することができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８号及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、各々が単一の抗原結合部位を有するＦａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と残りのＦｃ断片を生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、抗原をなお架橋することができる断片を生じる。
【００４４】
本明細書において使用される「抗体又はそのフラグメント」という用語は、二重若しくは多重抗原特異性又はエピトープ特異性を有するキメラ抗体及びハイブリッド抗体並びにハイブリッドフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのフラグメントを包含する。このように、特異的な抗原を結合する能力を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１／２、ＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰα結合活性を維持する抗体のフラグメントは、「抗体又はそのフラグメント」という用語の意味の中に含まれる。このような抗体及びフラグメントは、本分野において既知の技術によって作製することができ、実施例に記載されている方法にしたがって、並びに抗体を生産し、特異性及び活性について抗体をスクリーニングするための一般的な方法において、特異性及び活性に関してスクリーニングすることができる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）参照）。
【００４５】
抗体フラグメント及び抗原結合タンパク質（一本鎖抗体）のコンジュゲートも、「抗体又はそのフラグメント」という意味に含まれる。
【００４６】
抗体又は抗体フラグメントの活性が修飾されていない抗体又は抗体フラグメントと比較して、著しく変化され又は損なわれていなければ、フラグメントは、他の配列に付着されているか否かを問わず、特定の領域又は特異的なアミノ酸残基の挿入、欠失、置換又はその他の選択された修飾も含むことができる。これらの修飾は、ジスルフィド結合することができるアミノ酸を除去／追加すること、その生体寿命を増加させること、その分泌特性を変化させることなど、なんらかの追加の特性を与えることができる。いずれの事例でも、抗体又は抗体フラグメントは、そのコグネイト抗原への特異的結合など、生理活性特性を保有しなければならない。抗体又は抗体フラグメントの機能的な又は活性な領域は、タンパク質の特異的領域の変異誘発に続く、発現されたポリペプチドの発現及び検査によって特定され得る。このような方法は当業者にとって自明であり、抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる。（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
【００４７】
本明細書において使用される、「抗体」又は「複数の抗体」という用語は、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体も表すことができる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット又はウサギに由来するもの）は、ヒトでは本来抗原性であり、このため、ヒトに投与されたときに、望ましくない免疫応答を生じることができる。したがって、方法中でのヒト抗体又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を惹起する可能性を減らす役割を果たす。
【００４８】
（２）  ヒト抗体
開示されているヒト抗体は、任意の技術を用いて調製することができる。開示されているヒト抗体は、トランスジェニック動物から取得することもできる。例えば、免疫化に応答して、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック、変異体マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）参照）。具体的には、これらのキメラ及び生殖系列変異体マウス中の抗体重鎖連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合型欠失は内在性抗体産生の完全な阻害をもたらし、ヒト生殖系列抗体遺伝子アレイをこのような生殖系列変異体マウス中に首尾よく移植すると、抗原攻撃誘発に際して、ヒト抗体の産生をもたらす。所望の活性を有する抗体は、本明細書において記載されているように、Ｅｎｖ−ＣＤ４−共受容体複合体を用いて選択される。
【００４９】
（３）  ヒト化抗体
抗体ヒト化技術は、一般に、抗体分子の１種以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術の使用を伴う。したがって、非ヒト抗体（又はそのフラグメント）のヒト化形態は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワーク中に組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部を含有するキメラ抗体又は抗体鎖（又は、ｓＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２若しくは抗体のその他の抗原結合部分などのそれらのフラグメント）である。
【００５０】
ヒト化抗体を生成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対するあるレベルの特異性及び親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲからの残基によって置き換えられる。いくつかの事例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出されない残基も含有し得る。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源からヒト化抗体中に導入された１種以上のアミノ酸残基を有する。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基が、及び場合によりいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に、典型的にはヒト抗体のものである抗体定常領域（ｆｃ）の少なくとも一部を含有する（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６，Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８），及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【００５１】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、本分野において周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者の方法にしたがって（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって作製することができる。ヒト化抗体を作製するために使用することができる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，９３９，５９８号（ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）及び米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．）にも記載されている。
【００５２】
（４）  抗体の投与
抗体の投与は、本明細書に開示されているように行うことができる。抗体送達のための核酸アプローチも存在する。患者又は被験体自身の細胞が核酸を取り込み、コードされている抗体又は抗体フラグメントを産生及び分泌するように、広く中和する抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１／２、ＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰα抗体及び抗体フラグメントを、抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸調製物（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）として患者又は被験体に投与することもできる。核酸の送達は、例えば、本明細書に開示されているようなあらゆる手段によることができる。
【００５３】
２．  薬学的担体／薬学的生成物の送達
上記されているように、組成物は、薬学的に許容される担体中で、インビボで投与することもできる。「薬学的に許容される」によって、生物学的に又はその他望ましくないことがない材料が意味され、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こすことなく、又は材料がその中に含まれている薬学的組成物のいずれの他のコンポーネントとも有害な形で相互作用することなく、核酸又はベクターとともに、被験体に投与され得る。担体は、当業者に周知であるとおり、当然、活性成分のいずれの分解をも最小化するように、及び被験体中のいずれの有害な副作用をも最小化するように選択されるであろう。
【００５４】
組成物は、局所鼻腔内投与又は吸入剤による投与を含む、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外式に、局所的になど投与され得る。本明細書において使用される「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方又は両方を通じた鼻及び鼻腔中への組成物の送達を意味し、噴霧機構若しくは液滴機構による、又は核酸若しくはベクターのエアロゾル化を通じた送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧又は液滴機構による送達を介した鼻又は口を通じたものであり得る。送達は、挿管を介して、呼吸器系のいずれかの領域（例えば、肺）への直接的なものでもあり得る。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の種、年齢、体重及び全身状態、処置されているアレルギー性障害の重度、使用されている具体的な核酸又はベクター、その投与の様式などに応じて、被験体ごとに変動し得る。したがって、全ての組成物に対して正確な量を特定することは可能でない。しかしながら、適切な量は、本明細書中の教示が与えられれば、日常的な実験のみを用いて、当業者が決定することができる。
【００５５】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般的には注射によって特徴付けられる。注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液として、注射前に液体中での懸濁液の溶解に適した固体形態、又はエマルジョンとして、慣用の形態で調製することができる。非経口投与のための、より最近に改変されたアプローチは、一定した投薬量が維持されるように、徐放又は持続放出系の使用を伴う。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【００５６】
材料は、溶液、懸濁液中であり得る（例えば、微粒子、リポソーム又は細胞中に取り込まれる。）。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して、特定の細胞種を標的とし得る。以下の参照文献は、腫瘍組織を標的として特定のタンパク質を誘導するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」及びその他の、抗体がコンジュゲートされたリポソーム（脂質によって媒介される結腸癌腫への薬物標的化を含む。）などのビヒクル、細胞特異的なリガンドを通じたＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球介在性の腫瘍標的化及びインビボでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、腫瘍組織を標的として特定のタンパク質を誘導するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、恒常的又はリガンド誘導性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与している。これらの受容体は、クラスリンで被覆された窪み中で群を形成し、クラスリンで被覆された小胞を介して細胞の中に入り、酸性化されたエンドソームを通過し、その中で、受容体は選別され、次いで、細胞表面にリサイクルされ、細胞内に保存されるか、又はリソゾーム中で分解される。内部移行経路は、栄養素取り込み、活性化されたタンパク質の除去、高分子の排除、ウイルス及び毒素の日和見的進入、リガンドの解離及び分解並びに受容体レベル制御など様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞の種類、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの価数及びリガンド濃度に応じて、１より多い細胞内経路をたどる。受容体依存性エンドサイトーシスの分子的及び細胞的機序は概説されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【００５７】
ａ）  薬学的に許容される担体
抗体を含む、組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。
【００５８】
適切な担体及びその製剤化は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５中に記載されている。典型的には、製剤を等張にするために、適切な量の薬学的に許容される塩が製剤中で使用される。薬学的に許容される担体の例には、食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、成形された物品、例えば、フィルム、リポソーム又は微粒子の形態である半透性マトリックスなどの持続放出調製物が含まれる。例えば、投与の経路及び投与されている組成物の濃度に応じて、ある種の担体がより好ましいことがあり得ることは、当業者に自明であろう。
【００５９】
薬学的担体は、当業者に既知である。これらは、最も典型的には、無菌水、食塩水及び生理的ｐＨの緩衝化された溶液などの溶液を含む、ヒトに薬物を投与するための標準的な担体であろう。組成物は、筋肉内に又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手法にしたがって投与されるであろう。
【００６０】
薬学的組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含み得る。薬学的組成物は、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などの１種以上の活性成分も含み得る。
【００６１】
薬学的組成物は、局所又は全身的処置が所望されるかどうか、及び処置されるべき領域に応じて、多数の方法で投与され得る。投与は、局所的（眼に、膣に、直腸に、鼻腔内になど）、経口的に、吸入によって、又は非経口的に、例えば、点滴、皮下、腹腔内又は筋肉内注射により得る。開示されている抗体は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、又は経皮的に投与することができる。
【００６２】
非経口投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、食塩水及び緩衝化された溶媒を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル液、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養素補充液、電解質補充液（デキストロースリンゲル液をベースとするものなど）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなど、防腐剤及びその他の添加物も存在し得る。
【００６３】
局所投与用の製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体及び粉末が含まれ得る。慣用の薬学的担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり得、又は望ましいことがあり得る。
【００６４】
経口投与用の組成物には、粉末若しくは顆粒、水若しくは非水性溶媒中の懸濁液若しくは溶液、カプセル、小袋又は錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤又は結合剤が望ましいことがあり得る。
【００６５】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸などの無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸との反応によって、又は水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基並びにモノ、ジ、トリアルキル及びアリールアミン及び置換されたエタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容される酸又は塩基付加塩として潜在的に投与され得る。
【００６６】
ｂ）  治療的使用
組成物を投与するための有効用量及びスケジュールは実験により決定され得、このような決定を行うことは本分野における技術の範疇である。組成物の投与のための用量範囲は、障害の症候がもたらされる所望の効果を生じるのに十分大きな投与量範囲である。用量は、例えば不必要な交差反応、アナフィラキシー型反応等の副作用を引き起こす程多いものであってはならない。一般的に、用量は、年齢、状態、性別、患者中の疾患の程度、投与経路、又は、他の薬剤がそのレジメンに含まれているか否かと共に変化し、当業者により決定することができる。用量は、任意の禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｏｎｓ）の場合には、個別の医師により調整することができる。用量は変えることができ、１日又は数日間で毎日、１回以上の用量投与で投与されることができる。手引きは、所与の部類の薬剤製品に対する適切な用量に関する文献に見出すことができる。例えば、抗体に対する適切な用量を選択する上での手引きは、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，，Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２  ａｎｄ  ｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５−３８９中に見出すことができる。単独で使用される抗体の典型的な一日投与量は、上に挙げられている要素に応じて、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重又はそれを超える範囲であり得る。
【００６７】
３．  癌を治処置し、腫瘍中の遮断阻害剤感受性を誘導する方法
開示されている組成物は、癌などの調節されない細胞増殖が起こる任意の疾病を処置するために使用することができる。したがって、一態様において、被験体中の非免疫原性癌を処置する／阻害する／縮小する及び／又は癌を有する被験体中の腫瘍中に遮断阻害剤感受性（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤感受性など）を誘導する方法であって、化学療法剤と遮断阻害剤とを含むヒドロゲルマトリックスを被験体に投与することを含む方法が本明細書に開示されている。
【００６８】
ヒドロゲルマトリックスは腫瘍の微小環境に対して生体応答性であり、例えば、過酸化物（例えば、過酸化水素）、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル及び一重項酸素を含むがこれらに限定されない活性酸素種；酸性の存在：酸化還元電位（グルタチオン（ＧＳＨ））；特異的な腫瘍関連酵素；低酸素；及びアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）などの微小環境内の因子への曝露に際して、化学療法剤及び／又は遮断阻害剤（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤）を放出するように設計することができることが理解され、本明細書において想定されている。
【００６９】
一態様において、被験体中の非免疫原性癌を処置する／阻害する／縮小する及び／又は癌を有する被験体中の腫瘍中に遮断阻害剤感受性（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤感受性など）を誘導する開示された方法において使用されるヒドロゲルマトリックスは、化学療法薬及び遮断阻害剤（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断阻害剤など）を放出することができ、同じ速度で又は異なる速度でヒドロゲルから放出されることが本明細書において想定されている。ヒドロゲルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間、化学療法薬及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤を腫瘍微小環境中へ放出するように設計することができる。したがって、一態様において、被験体中の非免疫原性癌を処置する及び／又は癌を有する被験体中の腫瘍中に遮断阻害剤感受性（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤感受性など）を誘導する開示された方法が開示されており、化学療法薬及び遮断阻害剤（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤など）を放出することができ、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間、ヒドロゲルから放出される。
【００７０】
被験体中の非免疫原性癌を処置する／阻害する／縮小する及び／又は癌を有する被験体中の腫瘍中に遮断阻害剤感受性（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／２及び／又はＣＤ４７／ＳＩＲＰα阻害剤感受性など）を誘導する開示された方法は、癌などの調節されない細胞増殖が起きるあらゆる疾病、障害又は症状を処置するために使用することができることが理解され、本明細書において想定されている。
【００７１】
本明細書において使用される「処置する」、「処置すること」、「処置」及びこれらの文法的変形は、１種以上の、疾病若しくは症状、疾病若しくは症状の症候又は疾病若しくは症状の根底に存在する原因の強度又は頻度を部分的に又は完全に抑制し、遅延し、治療し、治癒し、緩和し、和らげ、変化させ、治し、軽減し、改善し、安定化し、鎮静化し、及び／又は低減する意図又は目的での、組成物の投与を含む。本発明による処置は、予防的に、予防的に、緩和的に又は治療的に適用することができる。予防的処置は、発症前に（例えば、癌の明白な徴候の前に）、早期の発症中に（例えば、癌の初期の徴候及び症候の際に）又は癌の発症が確定した後に被験体に施される。予防的投与は、感染症の症状が現れる前の何日ないし何年間にわたって実施され得る。
【００７２】
処置するために開示された組成物を使用することができる癌の代表的な、但し非限定的なリストは、以下のものである：リンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；菌状息肉症；ホジキン病；骨髄性白血病を含むがこれに限定されない白血病；形質細胞腫；組織球腫；膀胱癌；脳癌、神経系癌、頭部及び頸部癌、頭部及び頸部の扁平上皮細胞癌腫、腎臓癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、喉、喉頭及び肺の扁平上皮細胞癌腫；結腸癌；子宮頸癌；子宮頸癌腫；乳癌；上皮癌；腎癌、泌尿生殖器癌；肺癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）；食道癌腫；頭部及び頸部癌腫；大腸癌；造血器癌；精巣癌；結腸及び直腸の癌；前立腺癌；ＡＩＤＳ関連リンパ腫若しくは肉腫、転移性癌若しくは癌全般；又は膵臓癌。
【００７３】
このため、一態様において、癌を処置する及び／又は癌を有する被験体中の腫瘍中にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断阻害剤感受性を誘導する方法であって、癌が低ＰＤ−Ｌ１発現を有する癌又は黒色腫、非小細胞肺癌腫、腎癌、頭部及び頸部癌及び／若しくは膀胱癌からなる群から選択される非免疫原性癌、方法が本明細書に開示されている。
【実施例】
【００７４】
Ｃ．  実施例
以下の実施例は、本明細書の特許請求の範囲に記載された化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法がどのように作製され及び評価されるかの完全な開示及び記述を当業者に提供するために提示されており、純粋に例示的であることが意図されており、本開示を限定することは意図されていない。数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされてきたが、いくつかの誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は、重量部であり、温度は、℃単位又は周囲温度であり、圧力は、大気圧又は大気圧に近い。
【００７５】
１．  実施例１：相乗的免疫療法のためにゲムシタビンとチェックポイント阻害を有する、インサイチュで形成された活性酸素種に応答性の足場
ａ）  結果
ＲＯＳ応答性ヒドロゲルは、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）をＲＯＳ不安定性リンカー：Ｎ１−（４−ボロノベンジル）−Ｎ３−（４−ボロノフェニル）−Ｎ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミニウム（ＴＳＰＢＡ）（図２）と架橋することによって得られ、ＴＳＰＢＡは、Ｎ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３−テトラメチルプロパン−１，３−ジアミンの、過剰な４−（ブロモメチル）フェニルボロン酸との四級化反応を介して合成された（図３）。ＴＳＰＢＡは、ＰＶＡ上の複数のジオールと複合体を形成する２つのフェニルボロン酸を含油する。ＰＶＡ−ＴＳＰＢＡヒドロゲルの形成は、さらに、レオロジー試験によって確認された。ＴＳＰＢＡのＰＶＡ溶液への添加は、弾性率（Ｇ’）の急速な増加をもたらし、ＰＶＡ鎖間のネットワークの形成を実証している。ヒドロゲルは、デュアルシリンジを通じてＰＶＡとリンカーを混合した後に、迅速に形成されることができる（図１ａ）。インビボでのゲル形成及び分解を健康なマウス中で調べた。ゲルの完全性は最大７日保たれたのに対して、ゲルの全体的なサイズは徐々に減少した。注射の３週後に、ゲルは注射部位にもはや見出されず、ゲルの生分解性を示している。
【００７６】
治療的に適切な用量のＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１をＰＶＡ−ＴＳＰＢＡヒドロゲル中に封入した。薬物を搭載されたヒドロゲルは、空のヒドロゲルと比較して類似のレオロジー特性を示し、ヒドロゲルの形成は薬物封入によって影響を受けなかったことを示している。乾燥された足場ネットワークの形態は、約０．５μｍの膨潤した細孔径で、低温走査型電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）によって明瞭に観察された（図１ｂ）。ヒドロゲル中での治療薬の分布を可視化するために、ＧＥＭに対する蛍光性代替物としてのフルオレセイン（ＦＩＴＣ）及びＣｙ５．５標識されたａＰＤ−Ｌ１をヒドロゲル中に搭載した。ヒドロゲルの凍結切片の共焦点画像から、ＦＩＴＣは均一な分布を示したのに対して、ａＰＤ−Ｌ１に伴う点状のシグナルはヒドロゲル内部に検出された（図１ｃ）。
【００７７】
ＴＭＥ中のＨ２Ｏ２に曝されると、ＴＳＰＢＡは酸化され、加水分解されることができ、ポリマー性足場の解離及びＰＶＡ及び搭載物の放出をもたらす。ヒドロゲルのＲＯＳ感受性分解可能性を確認するために、３７℃で、０．１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に試料を浸した。足場の形態の変化が経時的に明瞭に観察された（図１ｄ）。それぞれ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１の放出特性を定量化した。予想されたとおり、対照ＰＢＳのものと比べて、引き金を引かれた様式で、Ｈ２Ｏ２溶液中のヒドロゲルからＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１が放出された。ＧＥＭの大半は１日以内に放出されたのに対して、ａＰＤ−Ｌ１はより持続的な放出特性を示し、３日以内に８０％が放出された（図１ｅ〜ｆ）。Ｂ１６Ｆ１０マウスモデル中に薬物を搭載した足場を腫瘍内注射した後に、放出パターンをインビボでさらに調べた。腫瘍切片の共焦点画像化（図４）は、ＦＩＴＣシグナル（ＧＥＭの蛍光性代替物）は迅速に（１日以内に）明瞭となったのに対して、ａＰＤＬ１に対応するシグナルは３日以内に徐々に増加し、インビトロでの研究と一致している。これらの異なる放出動態は、意図された逐次的作用のために、ＴＭＥ中へのＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１の送達を促した。
【００７８】
次に、インビボでのＧＥＭ＠Ｇｅｌ処置後に、免疫細胞及び腫瘍細胞の応答を測定した。ヒドロゲル中にＧＥＭを搭載し、腫瘍周囲に注射した。ＧＥＭ＠Ｇｅｌ内の高用量のＧＥＭ（２５ｍｇ／ｋｇ）はＴＩＬを著しく枯渇させ（図５ａ）、腫瘍なしでの生存に対しては有意な効果を有さないことが見出された（図５ｂ〜ｃ）。これに対して、空のヒドロゲル又はＧＥＭ＠Ｇｅｌ内の低用量のＧＥＭ（５ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍部位でＴＩＬの絶対数を増加させた（図６ａ〜ｂ）。ＴＭＥ内での低用量のＧＥＭ＠Ｇｅｌの総合的な免疫効果をさらに評価するために、ＲＯＳ、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ））及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ））の腫瘍内存在を調べた。腫瘍内ＲＯＳレベルは、空のヒドロゲル又はＧＥＭ＠Ｇｅｌの移植後に著しく低下した。さらに、Ｔｒｅｇは著しく影響を受けなかったが、ＭＤＳＣ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋）及びＭ２極性化ＴＡＭ（ＣＤ２０６ｈｉＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋）の著しい低下（図６ｃ〜ｄ）が観察された。興味深いことに、空のヒドロゲルで処置されたマウスでも、ＴＡＭの著しい低下（全細胞内のＣＤ２０６ｈｉＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋の百分率）が観察された（図６ｄ）。総合すると、これらのデータは、ＧＥＭ＠ＧｅｌがＴＩＬの頻度を増大し、他の免疫抑制性の細胞成分を低下させることを示す。
【００７９】
ＧＥＭによるインビトロでのＢ１６Ｆ１０癌細胞の処理は細胞死をもたらし、生存している細胞中でのＰＤ−Ｌ１の発現を増加させた。フローサイトメトリー、免疫蛍光法及びウェスタンブロットによって評価されたように、Ｂ１６Ｆ１０癌細胞上のでＰＤ−Ｌ１発現は、ＧＥＭ用量及び時間依存性であることが見出された（図７ａ〜ｂ）。インビボ研究では、ＧＥＭ
【００８０】
＠Ｇｅｌは、処理されていない腫瘍及び空のヒドロゲルで処理された腫瘍と比較して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬの両方でのＰＤ−１発現並びに癌細胞、樹状細胞及びマクロファージ上でのＰＤ−Ｌ１発現も誘導した（図６ｅ〜ｆ）。腫瘍細胞中でのＰＤ−Ｌ１発現も時間依存性様式で呈され、処理の２４時間後までに平均蛍光強度の著しい増加を示し、処理の４８時間後にさらに増加を示した。循環１型Ｔヘルパー（Ｔｈ１）サイトカインも、ＧＥＭ＠Ｇｅｌ移植前及び後に測定された（図６ｇ）。それらのうち、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γは、ＧＥＭ＠Ｇｅｌ移植後に著しく上方制御することが見出され（図６ｇ）、ＩＦＮ−γは、腫瘍細胞中でＰＤ−Ｌ１発現を誘導することが知られている。これらのデータは、ＧＥＭ＠Ｇｅｌが炎症性及び免疫原性のＴＭＥを誘発することができることを立証した。
【００８１】
提案された相乗的化学免疫療法戦略が抗腫瘍効果を促進することができるかどうかを検証するために、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫腫瘍モデルを使用した。腫瘍を有するマウスに、ＧＥＭ＠Ｇｅｌ（２００μＬ、１０％ｗ／ｗ）（ＧＥＭ：５ｍｇ／ｋｇ）、ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ（ａＰＤＬ１：５０μｇ／マウス）又はＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ（ａＰＤ−Ｌ１：５０μｇ／マウス、ＧＥＭ：５ｍｇ／ｋｇ）を腫瘍周囲に移植した。腫瘍増殖は、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生物発光シグナルによってモニターされた（図８ａ）。空のヒドロゲル及びＧＥＭ＠Ｇｅｌは類似の効果を示したが、非処置対照より優れていなかった。ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ処置されたマウスは腫瘍増殖の遅延を示した。これに対して、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌを受けている１０匹のマウスのうち６匹は、検出可能な腫瘍を示さなかった（図８ｂ〜ｃ）。マウス中の腫瘍サイズは、マウスの生存とも相関した。ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌでの処置後少なくとも６０日、６０％のマウスは検出可能な腫瘍なしに生存した。これに対して、全ての対照群では、２ヶ月後に、いずれのマウスも生存しなかった（図３ｄ）。ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌを、封入されていないＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１と比較した。局所的に又は全身に送達された封入されていない薬物と比べて、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ処置は、腫瘍増殖を阻害する上で優れていた（図９）。
【００８２】
さらに、処理後１０日目に、腫瘍を採集し、免疫蛍光法及びフローサイトメトリーによって分析した。ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ処置されたマウスは、対照マウスと比べて、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞による顕著な浸潤を示した（図８ｅ）。１０日目に、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ処置されたマウス中で、腫瘍重量も著しくより低く、ＴＩＬの絶対数の増加と並行していた。より顕著なことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞／ｇ腫瘍の絶対数は、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ処置されたマウス中で、非処置対照と比べて２０倍超、ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ処置されたマウスに対して２．５倍、増加していた（図８ｆ）。さらに、Ｔエフェクター細胞対Ｔｒｅｇの腫瘍内比率は、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ療法後に、マウスで著しく増加した（図８ｇ〜ｉ）。総合すると、これらの観察は、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ移植は、頑強なＴ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答の引き金を引くことを示している。
【００８３】
ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌの局所的送達が全身的な免疫応答も誘導するかどうかを評価するために、ヒドロゲルがその中に移植された原発性腫瘍の反対側部位に腫瘍細胞が接種された（図１０ａ）。非処置マウス中の腫瘍と比べて、両方の腫瘍部位でＰＤ−Ｌ１が腫瘍細胞によって上方制御されることが観察された（図１０ｂ〜ｃ）。これは、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ移植によって局所的に誘導されたＩＦＮ−γの全身分布によって説明することができる（図６ｇ）。中和抗体によって、全身のＩＦＮ−γを遮断することは、遠位の腫瘍中でのＰＤ−Ｌ１上方制御に著しく影響を与えることができる。さらに、腫瘍生物発光（図１０ｄ〜ｅ）及び腫瘍重量（図１０ｆ）は、非処置対照マウスと比べて（図１０ｈ〜ｉ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する等しい浸潤を有する、ヒドロゲル移植腫瘍部位と非処置腫瘍部位の両方で著しく減少した（図１０ｇ）。ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌで処置されたマウスは、対照群と比較して、脾臓中で、内在性ＣＤ４４＋ＣＤ１２２ｈｉセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の著しく増加された頻度を示したので、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌで処置されたマウス中では、Ｔ細胞記憶応答も生成された（図１１ａ〜ｃ）。腫瘍細胞で再度攻撃された場合、肺の生物発光画像化（図１１ｄ）及びＨ＆Ｅ染色（図１１ｅ〜ｆ）によって明確に示されるように、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌでの処置後に検出可能な腫瘍を有さなかったマウスは著しい腫瘍増殖を示さなかった。総合的な生存が、対照群と比較して、著しく優れていることも見出された（図１１ｇ）。これらの収集された結果は、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌの局所的送達によって、全身的な抗腫瘍効果及びメモリＴ細胞形成が達成され得ることを示している。
【００８４】
提案された化学免疫療法が広く応用可能であることをさらに実証するために、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の４Ｔ１腫瘍モデルを実施した。４Ｔ１細胞は、低レベルのＰＤ−Ｌ１を発現することが報告されていた。インビトロ実験は、ＧＥＭが４Ｔ１癌細胞中でＰＤ−Ｌ１発現を誘導することを示した（図１２）。インビボ研究のために、雌のＢＡＢＬ／ｃマウスの右側腹部中に４Ｔ１を皮下接種した。７日後に、ＧＥＭ＠Ｇｅｌ（２００μＬ、１０％ｗ／ｗ）（ＧＥＭ：５ｍｇ／ｋｇ）、ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ（ａＰＤＬ１：５０μｇ／マウス）又はＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ（ａＰＤ−Ｌ１：５０μｇ／マウス、ＧＥＭ：５ｍｇ／ｋｇ）で、４Ｔ１腫瘍を有するマウスを処置した。勇気づけられることに、生物発光画像化によって示されているように、ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌは４Ｔ１を有するマウス中で抗癌効果を促進することも見出された（図１３ａ）。ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌで処置されたマウス中で、腫瘍増殖も著しく抑圧され（図１３ｂ）、生存率も延長した（図１３ｃ）。
【００８５】
併用療法を研究するときには、毒性効果は、常に十分な配慮を必要とする。本研究では、炎症応答なしに、移植の４０日後にヒドロゲルは完全に分解され、ヒドロゲルの優れた生分解性及び生体適合性を示している。より高い分子量を有するＰＶＡは、高度に適合性であり、胆汁排泄を介して身体から除去されると考えられている。ＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１が搭載されたヒドロゲルを受けた後に、マウスの体重は、著しく影響を受けなかった。さらに、処置から４０日後にマウスから得られた臓器の組織学分析は、明らかな異常又は注目すべき臓器の損傷を示さなかった。
【００８６】
インサイチュで形成されたＲＯＳに応答性の足場の効力をさらに調べるために、Ｂ１６Ｆ１０不完全腫瘍切除モデルでの実験を実施した。ＧＥＭ、ａＰＤ−Ｌ１又は両方を含有するＲＯＳ応答性足場を切除腔中に直接注射した。系統的に（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ）又は局所的に投与された封入されていない薬物も対照群として含められた。ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌを受けているマウスは、局所的な腫瘍再発からより保護され（３０％の腫瘍再発率）（図１４ａ〜ｄ）、他の群と比べて著しくより高い生存率を有していた（図１４ｅ）。体重によれば、明らかな全身毒性はインビボで観察されなかった。さらに、４Ｔ１腫瘍再発モデルで同様の結果が得られた（ルシフェラーゼ自体が極めて免疫原性であるので、ルシフェラーゼレポーターに対する一切の免疫応答を避けるために、ここでは、ｌｕｃを発現していない４Ｔ１腫瘍を使用した。）（図１５）。ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌ処置は、明白な毒性なしに癌再発を抑制した（図１５）。一方、４Ｔ１乳癌モデルは高い転移能を有するが、他の群と比較して、転移性病巣は肺内に見出されなかった。まとめると、これらの結果は、ＲＯＳ応答足場は、癌の再発を抑制するために、手術後にＩＣＢを増強するための効果的な貯蔵所としての役割を果たすことを示している。
【００８７】
ｂ）  議論
ＲＯＳ感受性部分からなるインサイチュで形成されたヒドロゲル足場は、免疫原性腫瘍表現型及び免疫媒介性腫瘍拒絶を促進するために、腫瘍を有するマウス中で、異なる動態でＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１を局所的に送達することができることが本明細書において実証される。
【００８８】
腫瘍細胞中でのＰＤ−Ｌ１発現及びＴＩＬは、化学療法後にかなり上昇し、ＰＤ−Ｌ１媒介性のＴ細胞疲弊をもたらす。本明細書では、化学療法及びＩＣＢの異なる動態及び局所投与によって、相乗的な抗癌効果が達成され得ることが決定された。腫瘍部位でのこのカスケード処置を達成するために、ＲＯＳがＴＭＥ中で特に豊富であることを考慮に入れて、ＲＯＳ応答性ヒドロゲル足場を合成し、ＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１を搭載した。インサイチュでの構築後、ＲＯＳ応答性ヒドロゲルは、ＧＥＭ及びａＰＤ−Ｌ１の両方をＲＯＳ依存性の様式で放出した。注目すべきことに、ａＰＤ−Ｌ１と比較したＧＥＭのより小さな分子量が、ヒドロゲルからのより迅速なその放出に寄与した。
【００８９】
ＧＥＭは、幅広いスペクトルの抗腫瘍活性を有するリボヌクレオチド還元酵素阻害剤である。それぞれ、低用量ＧＥＭ＠Ｇｅｌへの曝露に際して、ＰＤ−Ｌ１の著しい上方制御及びＰＤ−１の発現が腫瘍細胞及びＴＩＬ中で観察された。特筆すべきことに、ＧＥＭ＠Ｇｅｌは、エフェクターＴ細胞の機能不全を引き起こすことに寄与する腫瘍浸潤性ＭＤＳＣの著しい低下も引き起こした。ＧＥＭは腫瘍内ＭＤＳＣを阻害することが知られているので、ＧＥＭ＠Ｇｅｌの移植に際してのＭＤＳＣの枯渇は驚くべきことではなかった。類似のパターンをたどって、ＧＥＭ＠ＧｅｌはＴ細胞浸潤の強化及びＣＤ２０６を発現しているＴＡＭの著しい低下も誘導した。しかしながら、空のヒドロゲルで処置されたマウスでも、ＴＡＭの減少及びＲＯＳの低下が観察された。ＲＯＳはマクロファージ分化のために重要であるので、ヒドロゲルによって引き起こされたＲＯＳ枯渇は、腫瘍部位中にＴ細胞を補充すること及びＭ２−マクロファージの分化を遮断することに寄与することができる。したがって、ＲＯＳ応答性足場は治療薬の放出を制御するための貯蔵所として作用するのみならず、相乗的処置効果を達成するために、ＴＭＥ内のＲＯＳの消去剤としての役割も果たす。
【００９０】
ＧＥＭ−ａＰＤ−Ｌ１＠Ｇｅｌは免疫原性腫瘍表現型を誘導し、これに続くａＰＤ−Ｌ１の活性は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫及び４Ｔ１乳房腫瘍（相対的な低いＰＤ−Ｌ１発現）を有するマウスモデル中で腫瘍の退縮を促進する。さらに、局所的処置は、遠位の腫瘍増殖を抑制する系統的（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ）抗癌免疫応答を生成した。まとめると、提案された相乗的化学免疫療法戦略は、全身毒性を抑制しながら、低免疫原性腫瘍を処置する上での新しい機会を与える。さらに、足場は、同じくＲＯＳが特に豊富な切除された腫瘍の手術床（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｅｄ）にも適用することができるので、手術後に癌の再発を抑制するのに、この戦略を臨床的に適したものとする。注目すべきことに、腫瘍の切除は、免疫抑制によってもたらされた不能となった腫瘍を除去すると考えられるが、外科的アプローチによって誘導される炎症は腫瘍再発のリスクを上昇することもできることを示唆する研究が存在する。切除腔内に生成された足場は、ＲＯＳを消去することに寄与することができ、このため、炎症を低減することができる。最後に、ＩＣＢは患者によって耐容されると考えられるが、併用療法は副作用のリスクを増加させ得る。本研究では、遊離の薬物の全身投与で処置された１匹のマウスは約１０％の体重減少を示したが、薬物を搭載された足場で処置されたマウスでは、毒性が観察されなかった。
【００９１】
要約すると、ＴＭＥ応答性ヒドロゲル足場からの化学療法薬とＩＣＢの制御放出に基づいて、相乗的化学免疫療法戦略が開発された。ヒドロゲル足場によって放出された低用量ＧＥＭは、それぞれ、腫瘍細胞及びＴＩＬ上のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の上方制御によって、及び腫瘍内のＴＡＭ及びＭＤＳＣを枯渇させることによって、腫瘍の免疫原性表現型を誘発する。重要なことには、ＲＯＳ応答性ゲルは治療薬の調整された放出のための貯蔵所としての役割を果たすことができるのみならず、ＲＯＳの消去剤としての役割も果たし、このため、免疫原性表現型をさらに強化することができる。この戦略は、現在のところＩＣＢに対して非応答性である低免疫原性腫瘍を処置する上で有望である。さらに、足場の局所的移植は全身性免疫応答及びＴ細胞記憶形成を促進するので、この戦略は、転移性腫瘍を処置し、腫瘍の再発を予防するために使用することができる。
【００９２】
ｃ）  材料及び方法
（１）  研究デザイン
本研究の目的は、ＩＣＢ療法の応答及び効率を増強するために、ＴＭＥ応答性ヒドロゲル足場からの化学療法薬とＩＣＢの制御放出を基礎とする戦略を開発することであった。Ｂ１６Ｆ１０又は４Ｔ１腫瘍及び不完全腫瘍切除モデルにおいて、インビボでの抗腫瘍効果を評価した。生存曲線を作るために様々な処置群からのマウスを追跡し、腫瘍進行を評価するために画像化し、免疫記憶を評価するために腫瘍で再攻撃した。標本サイズ（ｎ＝５〜１０／群）は、経験に基づいて決定した。腫瘍サイズ及び体重に基づいて、動物を無作為に群に割り当てた。研究者らは、実験及び結果評価の間、割り当てを盲検化されなかった。健康が損なわれた徴候を示しているときに、又は腫瘍の容量が１．５ｃｍ３を超えたときに、動物を安楽死させた。全ての実験は、少なくとも３つ組で実施した。
【００９３】
（２）  材料。
別段の明記がなければ、全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受領したとおりに使用した。ゲムシタビン塩酸塩（米国薬局方（ＵＳＰ）参照標準）は、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号１２８８４６３）から購入し、インビボで使用された抗ＰＤＬ１抗体（ａＰＤＬ１）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ（カタログ番号１２４３２９、クローン：１０Ｆ．９Ｇ２）から購入した。
【００９４】
（３）  ＴＳＰＢＡの合成。
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１．３−プロパンジアミン（０．１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及び４−（ブロモメチル）フェニルボロン酸（０．５ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を、それぞれ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍＬ）中に溶解し、一緒に混合した。６０℃で一晩撹拌した後、混合物をＴＨＦ（１００ｍＬ）中に注ぎ入れ、ろ過し、ＴＨＦ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。一晩真空乾燥した後、純粋なＴＳＰＢＡ（０．３ｇ、収率７０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ−ＤＭＳＯ，δ）：８．１３２（ｓ，４Ｈ），７．８５（ｄ，４Ｈ），７．４９（ｄ，４Ｈ），４．５８（ｓ，４Ｈ），３．２６（ｓ，４Ｈ），２．９７（ｓ，１２Ｈ），２．３８（ｍ，２Ｈ）（図３）。
【００９５】
（４）  ＰＶＡ−ＴＳＰＢＡヒドロゲルの形成。
ＰＶＡ（Ｍｗ＝７２ＫＤａ、９８％加水分解されている、５ｇ）及び脱イオン水（１００ｍＬ）を一緒に混合し、９０℃で撹拌して、透明な溶液を取得した。ＴＳＰＢＡ（Ｈ２Ｏ中５重量％、２ｍＬ）及びＰＶＡ（Ｈ２Ｏ中５重量％、２ｍＬ）を一緒に混合し、ヒドロゲルが直ちに形成され、これをインビトロ実験のために使用した。ＧＥＭ及びａＰＤＬ１が搭載されたゲルの製作のために、ＰＶＡ水溶液に所定量のＧＥＭ又はａＰＤＬ１を添加した。インビボ適用のために、デュアルシリンジ中にＰＶＡ及びＴＳＰＢＡ水溶液を充填し、インサイチュでゲルを形成するために、腫瘍に直接注射した。
【００９６】
（５）  ａＰＤＬ１−ＧＭＥ＠ヒドロゲルの性質決定。
低温走査型電子顕微鏡画像は、Ｇａｔａｎ  Ａｌｔｏを備えたＪＥＯＬ７６００Ｆによって取得された。蛍光画像は、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０）を用いて分析した。２５ｍｍアルミニウムクロスハッチ平行プレートを備えたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＲ−２０００応力制御レオメータを使用して、２５℃でゲル化する前後のＰＶＡの動的レオロジー挙動を測定した。
【００９７】
（６）  ＰＶＡ−ＴＳＰＢＡヒドロゲルからのＧＥＭ及びａＰＤＬ１の放出。
ＰＢＳ中で常時撹拌しながら、３７℃で放出研究を行った。ＧＥＭ及び抗体放出を研究するために、Ｈ２Ｏ２（１ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ）を試料に添加した。放出されたＧＥＭはＨＰＬＣによって分析され、抗体放出はＲａｔ  ＩｇＧトータルＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定された。
【００９８】
（７）  インビボ腫瘍モデル。
マウスモデルに対する抗癌効果を検査するために、９又は１４日後に、１×１０６の、ルシフェラーゼがタグとして付加されたＢ１６Ｆ１０又は４Ｔ１腫瘍細胞のいずれかをマウスの右側腹部中に移植した（腫瘍は、約１００ｍｍ３に達する。）。マウスを秤量し、異なる群（ｎ＝７〜１０）中に無作為に分けた。ヒドロゲル、ＧＥＭ＠Ｇｇｅｌ、ａＰＤＬ１＠Ｇｅｌ及びａＰＤＬ１−ＧＥＭ＠Ｇｅｌ（ａＰＤＬ１：５０μｇ／マウス、ＧＥＭ：５ｍｇ／ｋｇ、２００μＬ、１０％ｗ／ｗ）などの異なる製剤を、腫瘍周囲に、マウスに局所的に移植した。腫瘍負荷は、癌細胞の生物発光シグナルによってモニターした。ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ画像化システム（Ｃａｌｉｐｅｒ、ＵＳＡ）を用いて、画像を撮影した。腫瘍は、デジタルキャリパーを用いても測定した。腫瘍容量（ｍｍ３）は、（長径×短径２）／２として計算した。
【００９９】
癌再発に対する効果を測定するために、９又は１４日後に、１×１０６の、Ｂ１６Ｆ１０（又は４Ｔ１）又はルシフェラーゼがタグとして付加されたＢ１６Ｆ１０（又は４Ｔ１）腫瘍細胞のいずれかをマウスの右側腹部中に移植し、腫瘍（サイズが約１００ｍｍ３に達する）を切除し、手術床中の残存微小腫瘍を模倣するために、約１％の残存組織を残した。要約すれば、チャンバー誘導を介して、イソフルラン（維持のために１〜３％、導入のために最大５％）麻酔で動物を麻酔し、ノーズコーンをを介して維持した。切除前及び後に、腫瘍細胞の生物発光シグナルによって、残存する腫瘍組織の量を測定した。腫瘍領域を摘み、無菌的に準備した。概ね９９％の腫瘍を除去するために、殺菌した機器を使用した。腫瘍切除前及び後に、腫瘍組織の積算された生物発光シグナル強度によって、残存する腫瘍組織の量を測定した。Ａｕｔｏｃｌｉｐ創傷クリップシステムによって、創傷を塞いだ。マウスを秤量し、異なる群（ｎ＝７〜１０）中に無作為に分けた。手術後、ヒドロゲル、ＧＥＭ＠Ｇｅｌ、ａＰＤＬ１＠Ｇｅｌ及びａＰＤＬ１−ＧＥＭ＠Ｇｅｌなどの異なる製剤を、マウスの手術床中に移植した。原発性腫瘍の切除後に、同じ用量での遊離のＧＥＭ＋ａＰＤＬ１をマウス中に局所的に又は系統的に投与した。腫瘍負荷は、癌細胞の生物発光シグナルによってモニターした。必要であれば、画像化前に、除毛クリームを用いて毛を刈り、剃った。腫瘍は、デジタルキャリパーを用いても測定した。腫瘍容量（ｍｍ３）は、（長径×短径２）／２として計算した。健康が損なわれた徴候を示しているときに、又は腫瘍の容量が１．５ｃｍ３を超えたときに、動物を二酸化炭素で安楽死させた。
【０１００】
（８）  インビボ生物発光及び画像化。
ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ）を用いて、生物発光画像を集めた。動物中へのＤＰＢＳ（１５ｍｇ／ｍＬ）中のｄ−ルシフェリン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ（商標））の腹腔内注射（１０μＬ／ｇ体重）から１０分後に、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ）を用いてデータを取得した。生物発光画像化のための曝露時間は５分であった。平均放射輝度（光子−１ｃｍ−２ｓｒ−１、色のバーによって表されている）（ＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．２）として、関心領域（ＲＯＩ）を定量した。
【０１０１】
（９）  細胞株
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０及びマウス乳癌腫細胞株４Ｔ１は、アメリカ培養細胞系統保存機関から購入した。Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃ−ＧＦＰ及び４Ｔ１−ｌｕｃ−ＧＦＰ細胞は、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌのノースカロライナ大学のＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇ博士からいただいた。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、１０％胎児ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。４Ｔ１細胞は、１０％胎児ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。マスターセルバンク及びワーキングセルバンクを受領後直ちに作製した。第三及び第四継代を実験に使用した。マイコプラズマの存在を除外するために、３ヶ月ごとに細胞を検査した。受領後に、細胞の認証は行わなかった。
【０１０２】
（１０）  マウス。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ（アメリカ）から購入した。全ての実験を通じて、年齢を合わせた（６〜１０週）雌を使用した。本発明者らは、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌのノースカロライナ大学及びノースカロライナ州立大学の学内実験動物委員会によって承認された動物プロトコールにしたがって、全てのマウス研究を行った。統計的検出力、実行可能性及び倫理面のバランスを取るように確定された後に、実験群のサイズは、動物愛護のための規制当局によって承認を受けた。Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌのノースカロライナ大学及びノースカロライナ州立大学の動物研究に関する連邦及び州指針にしたがって、全てのマウスを飼育した。
【０１０３】
（１１）  抗体。
インビボで使用された抗ＰＤＬ１抗体（ａＰＤＬ１）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ（カタログ番号１２４３２９、クローン：１０Ｆ．９Ｇ２）から購入した。フローサイトメトリーのために使用された抗体には、ＣＤ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１８６４４）、ＣＤ４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１８６６７）、ＣＤ８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１８６０９）、ＰＤ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１３５２２７）、ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１１７３０９）、ＰＤＬ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１２４３１１）、ＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０１２１１）及び細胞内Ｆｏｘｐ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号７１−５７７５−４０）が含まれた。染色された細胞は、Ｃａｌｉｂｕｒ  ＦＡＣＳ装置（ＢＤ）上で分析した。プロット当たり最低１０００のイベントを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ヴァージョン１０）を用いて分析した。ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１８８６６）、ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１８９２０）及びヤギ抗ラットＩｇＧ（最小交差反応性）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５４０８）を含む二次抗体を免疫染色のために使用した。
【０１０４】
（１２）  サイトカイン検出。
ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの血漿レベルは、製造業者の指示書にしたがって、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｔｈ１  Ｐａｎｅｌ多重アッセイ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号７４００２５）によって測定した。ＧＥＭ＠Ｇｅｌ移植前及び移植から２日後に、血漿をマウスから収集した。
【０１０５】
（１３）  共焦点顕微鏡。
採集した腫瘍を切断して、Ｏ．Ｃ．Ｔ．中に瞬間凍結させた。クリオトームを用いてマイクロメートル切片を切り、スライド上に載せた。ＰＢＳでの再水和の前に１０分間、氷冷したアセトン中に切片を固定した。ＢＳＡ（３％）でブロッキングした後、一晩４℃で、一次抗体で切片を染色した。蛍光標識された二次抗体の添加後に、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０）を用いてスライドを分析した。
【０１０６】
（１４）  統計分析。
全ての結果は、表記されているように、平均±ｓ．ｄ．、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表されている。別段の記載がなければ、全ての実験で、生物学的反復を使用した。２より多い群を比較した場合、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施し、有意（Ｐ＜０．０５）と決定されたときに、チューキーの事後検定を用いて多重比較を行った。生存は、ログランク検定を用いて決定した。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（５．０）を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【０１０７】
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Ｋ．Ｄ．Ｍｏｙｎｉｈａｎ，Ｃ．Ｆ．Ｏｐｅｌ，Ｇ．Ｌ．Ｓｚｅｔｏ，Ａ．Ｔｚｅｎｇ，Ｅ．Ｆ．Ｚｈｕ，Ｊ．Ｍ．Ｅｎｇｒｅｉｔｚ，Ｒ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｒａｋｈｒａ，Ｍ．Ｈ．Ｚｈａｎｇ，Ａ．Ｍ．Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄｓ，Ｓ．Ｋｕｍａｒｉ，Ｒ．Ｌ．Ｋｅｌｌｙ，Ｂ．Ｈ．Ｋｗａｎ，Ｗ．Ａｂｒａｈａｍ，Ｋ．Ｈｕ，Ｎ．Ｋ．Ｍｅｈｔａ，Ｍ．Ｊ．Ｋａｕｋｅ，Ｈ．Ｓｕｈ，Ｊ．Ｒ．Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｄ．Ａ．Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｋ．Ｄ．Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｄ．Ｊ．Ｉｒｖｉｎｅ，Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈａｔ  ｅｎｇａｇｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２２，１４０２−１４１０（２０１６）．
Ｋ．Ｋａｇａｗａ，Ｓ．Ｔｏｍｉｚａｗａ，Ｅｘｏｃｙｔｏｔｉｃ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｌｉｖｅｒ  ｔｏ  ｂｉｌｅ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３０，１０１−１０８（１９８０）．
Ｌ．Ｅ．Ｋｌｅｖｏｒｎ，Ｒ．Ｍ．Ｔｅａｇｕｅ，Ａｄａｐｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅａｌ  Ｗｏｒｌｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７，３５４−３６３（２０１６）．
Ｌ．Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ａ．Ｂｕｑｕｅ，Ｏ．Ｋｅｐｐ，Ｌ．Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，９７−１１１（２０１７）．
Ｌ．Ｇｕ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １６，５６−６６（２０１６）．
Ｌ．Ｚ．Ｓｈｉ，Ｔ．Ｆｕ，Ｂ．Ｇｕａｎ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．Ｂｌａｎｄｏ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｌ．Ｘｉｏｎｇ，Ｓ．Ｋ．Ｓｕｂｕｄｈｉ，Ｊ．Ｇａｏ，Ｐ．Ｓｈａｒｍａ，Ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＩＬ−７  ａｎｄ  ＩＦＮ−［ｇａｍｍａ］  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｕｍｏｕｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ［ａｌｐｈａ］−ＣＴＬＡ−４＋［ａｌｐｈａ］−ＰＤ−１  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７，（２０１６）．
Ｍ．Ａ．Ｋｕｒｓｕｎｅｌ，Ｇ．Ｅｓｅｎｄａｇｌｉ，Ｔｈｅ  ｕｎｔｏｌｄ  ｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．３１，７３−８１（２０１６）．
Ｍ．Ｂｌａｃｋ，Ｉ．Ｂ．Ｂａｒｓｏｕｍ，Ｐ．Ｔｒｕｅｓｄｅｌｌ，Ｔ．Ｃｏｔｅｃｈｉｎｉ，Ｓ．Ｋ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ−Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｍ．Ｐｅｔｒｏｆｆ，Ｄ．Ｒ．Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｋｏｔｉ，Ａ．Ｗ．Ｃｒａｉｇ，Ｃ．Ｈ．Ｇｒａｈａｍ，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７，１０５５７−１０５６７（２０１６）．
Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  Ｒｏｓｓｅｎ，Ｗ．Ｓｌｕｉｔｅｒ，Ｆ．Ｂｏｎｔｈｕｉｓ，Ｈ．Ｊｅｅｋｅｌ，Ｒ．Ｌ．Ｍａｒｑｕｅｔ，Ｃ．Ｈ．ｖａｎ  Ｅｉｊｃｋ，Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，５６２５−５６２９（２０００）．
Ｍ．Ｍａｎｄａｉ，Ｊ．Ｈａｍａｎｉｓｈｉ，Ｋ．Ａｂｉｋｏ，Ｎ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．Ｂａｂａ，Ｉ．Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｄｕａｌ  Ｆａｃｅｓ  ｏｆ  ＩＦＮｇａｍｍａ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＰＤ−Ｌ１  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏ−ａｎｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２，２３２９−２３３４（２０１６）．
Ｎ．Ａ．Ｈｏｔａｌｉｎｇ，Ｌ．Ｔａｎｇ，Ｄ．Ｊ．Ｉｒｖｉｎｅ，Ｊ．Ｅ．Ｂａｂｅｎｓｅｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１７，３１７−３４９（２０１５）．
Ｎ．Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｍ．Ｌ．Ｂｏｎｎｅｌｙｋｋｅ−Ｂｅｈｒｎｄｔｚ，Ｌ．Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ，Ｉ．Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｓｔｅｉｎｉｃｈｅ，Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｙ．Ｆｅｎｇ，Ｐ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｔｈｅ  ｗｏｕｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．ＥＭＢＯ  Ｊ．３４，２２１９−２２３６（２０１５）．
Ｎ．ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，Ａ．Ｊ．Ｆｕｒｎｅｓｓ，Ｒ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｓ．Ｒａｍｓｋｏｖ，Ｒ．Ｌｙｎｇａａ，Ｓ．Ｋ．Ｓａｉｎｉ，Ｍ．Ｊａｍａｌ−Ｈａｎｊａｎｉ，Ｇ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．Ｂｉｒｋｂａｋ，Ｃ．Ｔ．Ｈｉｌｅｙ，Ｔ．Ｂ．Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｓ．Ｓｈａｆｉ，Ｎ．Ｍｕｒｕｇａｅｓｕ，Ｒ．Ｍｉｔｔｅｒ，Ａ．Ｕ．Ａｋａｒｃａ，Ｊ．Ｌｉｎａｒｅｓ，Ｔ．Ｍａｒａｆｉｏｔｉ，Ｊ．Ｙ．Ｈｅｎｒｙ，Ｅ．Ｍ．Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ，Ｄ．Ｍｉａｏ，Ｂ．Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｄ．Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｌ．Ａ．Ｇａｒｒａｗａｙ，Ｖ．Ｍａｋａｒｏｖ，Ｎ．Ａ．Ｒｉｚｖｉ，Ａ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．Ｄ．Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｔ．Ｍｅｒｇｈｏｕｂ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｓ．Ａ．Ｓｈｕｋｌａ，Ｃ．Ｊ．Ｗｕ，Ｋ．Ｓ．Ｐｅｇｇｓ，Ｔ．Ａ．Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｒ．Ｈａｄｒｕｐ，Ｓ．Ａ．Ｑｕｅｚａｄａ，Ｃ．Ｓｗａｎｔｏｎ，Ｃｌｏｎａｌ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｌｉｃｉｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１，１４６３−１４６９（２０１６）．
Ｎ．Ｒｅｚｎｉｋｏｖ，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｐ．Ｆｒａｔｚｌ，Ｍ．Ｍ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ａ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒ．１，１６０４１（２０１６）．
Ｎ．Ｓ．Ｋａｔｈｅｄｅｒ，Ｒ．Ｋｈｅｚｒｉ，Ｆ．Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｓ．Ｗ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ．Ｊａｉｎ，Ｍ．Ｍ．Ｒａｈｍａｎ，Ｋ．Ｏ．Ｓｃｈｉｎｋ，Ｔ．Ａ．Ｔｈｅｏｄｏｓｓｉｏｕ，Ｔ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｇ．Ｊｕｈａｓｚ，Ｄ．Ｂｉｌｄｅｒ，Ａ．Ｂｒｅｃｈ，Ｈ．Ｓｔｅｎｍａｒｋ，Ｔ．Ｅ．Ｒｕｓｔｅｎ，Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４１，４１７−４２０（２０１７）．
Ｐ．Ｓｈａｒｍａ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｏｗａｒｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｕｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｃｅｌｌ  １６１，２０５−２１４（２０１５）．
Ｐ．Ｓｈａｒｍａ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，５６−６１（２０１５）．
Ｐ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ｍ．Ｓｕ，Ｍ．Ｌｉａｎｇ，Ｊ．Ｆｕ，Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１−ｌｉｇａｎｄ  １（ＰＤ−Ｌ１）ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ＰＤ−Ｌ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５，１４７０−１４７６（２００８）．
Ｒ．Ａ．Ｓｅｄｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｄａｒｒａｈ，Ｍ．Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｔ−ｃｅｌｌ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，２４７−２５８（２００８）．
Ｒ．Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ，Ｍ．Ｒｅｔｓｋｙ，Ｗ．Ｈｒｕｓｈｅｓｋｙ，Ｍ．Ｂａｕｍ，Ｉ．Ｇｕｋａｓ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ：ａ  ｃｅｎｔｕｒｙ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｍｄｎ３８６（２００８）．
Ｓ．Ｂ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ａ．Ｍ．Ｔａｂｅｒ，Ｉ．Ｊｉｌｅａｅｖａ，Ｅ．Ｐ．Ｐｅｇｕｅｓ，Ｃ．Ｌ．Ｓｅｎｔｍａｎ，Ｍ．Ｔ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，９７−１０１（２０１５）．
Ｓ．Ｂｏｈｍ，Ａ．Ｍｏｎｔｆｏｒｔ，Ｏ．Ｍ．Ｐｅａｒｃｅ，Ｊ．Ｔｏｐｐｉｎｇ，Ｐ．Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ，Ｇ．Ｌ．Ｅｖｅｒｉｔｔ，Ａ．Ｃｌｅａｒ，Ｊ．Ｒ．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｅｎｎｉｓ，Ｔ．Ｄｏｗｅ，Ａ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｅ．Ｃ．Ｂｒｏｃｋｂａｎｋ，Ａ．Ｃ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ａ．Ｊｅｙａｒａｊａｈ，Ａ．Ｚ．Ｆａｒｕｑｉ，Ｉ．Ａ．ＭｃＮｅｉｓｈ，Ｎ．Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．Ｌｏｃｋｌｅｙ，Ｆ．Ｒ．Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｕｂｏ−Ｏｖａｒｉａｎ  Ｈｉｇｈ−Ｇｒａｄｅ  Ｓｅｒｏｕｓ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２，３０２５−３０３６（２０１６）．
Ｓ．Ｋｉｔａｎｏ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｙ．Ｋｏｙａｍａ，Ｔ．Ｏｋａｎｏ，Ｙ．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）ａｎｄ  ｐｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）ｗｉｔｈ  ｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．１２，２２７−２３３（１９９１）．
Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｔａｕｂｅ，Ｒ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ−ｄｒｉｖｅｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １６，２７５−２８７（２０１６）．
Ｓ．Ｐ．Ａｒｌａｕｃｋａｓ，Ｃ．Ｓ．Ｇａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｈ．Ｋｏｈｌｅｒ，Ｍ．Ｋｉｔａｏｋａ，Ｍ．Ｆ．Ｃｕｃｃａｒｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．Ｙａｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．９，ｅａａｌ３６０４（２０１７）．
Ｔ．Ｄｏｉ，Ｔ．Ｏｋａｙａｍａ，Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ｏｋａ，Ｎ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｙａｓｕｄａ，Ｙ．Ｎａｉｔｏ，Ｙ．Ｉｔｏｈ．（ＡＡＣＲ，２０１５）．
Ｔ．Ｋｏｎｎｏ，Ｋ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｉｅｔｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８，１７７０−１７７７（２００７）．
Ｔ．Ｎ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，６９−７４（２０１５）．
Ｔ．Ｗａｌｚｅｒ，Ｃ．Ａｒｐｉｎ，Ｌ．Ｂｅｌｏｅｉｌ，Ｊ．Ｍａｒｖｅｌ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４４  ａｎｄ  ＣＤ１２２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，２７０４−２７１１（２００２）．
Ｔ．ＹＡＭＡＯＫＡ，Ｙ．ＴＡＢＡＴＡ，Ｙ．ＩＫＡＤＡ，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｄｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）ｗｉｔｈ  Ｏｔｈｅｒ  Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｆｔｅｒ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７，４７９−４８６（１９９５）．
Ｖ．Ａ．Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＤ−１  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７５，１７６７−１７７８（２０１６）．
Ｗ．Ｃｅｅｌｅｎ，Ｐ．Ｐａｔｔｙｎ，Ｍ．Ｍａｒｅｅｌ，Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ，ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：Ｒｅｃｅｎｔ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８９，１６−２６（２０１４）．
Ｗ．Ｚｏｕ，Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｌ．Ｃｈｅｎ，ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）ａｎｄ  ＰＤ−１  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．８，３２８ｒｖ３２４（２０１６）．
Ｙ．Ｋａｎｅｏ，Ｓ．Ｈａｓｈｉｈａｍａ，Ａ．Ｋａｋｉｎｏｋｉ，Ｔ．Ｔａｎａｋａ，Ｔ．Ｎａｋａｎｏ，Ｙ．Ｉｋｅｄａ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２０，４３５−４４２（２００５）．
Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃｈｏｋｓｉ，Ｋ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｐｏｂｅｚｉｎｓｋａｙａ，Ｉ．Ｌｉｎｎｏｉｌａ，Ｚ．Ｇ．Ｌｉｕ，ＲＯＳ  ｐｌａｙ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３，８９８−９１４（２０１３）．
【図１】
2021506763.tif 000003
【図２】
2021506763.tif 000004
【図３】
2021506763.tif 000005
【図４】
2021506763.tif 000006
【図５】
2021506763.tif 000007
【図６】
2021506763.tif 000008
【図７】
2021506763.tif 000009
【図８】
2021506763.tif 000010
【図９】
2021506763.tif 000011
【図１０】
2021506763.tif 000012
【図１１】
2021506763.tif 000013
【図１２】
2021506763.tif 000014
【図１３】
2021506763.tif 000015
【図１４】
2021506763.tif 000016
【図１５】
2021506763.tif 000017
【国際調査報告】
2021506763.tif 000018
2021506763.tif 000019
2021506763.tif 000020