(57)【要約】  本開示は、操作された免疫療法のために自家又は同種異系の状況で使用される、操作された幹細胞から改変されたＴ細胞を作製する方法を提供する。内因性ＴＣＲ発現又はＨＬＡ発現のノックアウトにより、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを軽減又は排除し、レシピエントのＴ細胞及びＮＫ細胞による排除に対する耐性をもたらし、制御可能なＴ細胞活性を可能にする改変された多能性幹細胞の操作が可能となる。したがって、本方法は、免疫反応性が低減されたＴ細胞の発生を可能にする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性ＴＣＲ発現又はＨＬＡ発現を排除するように操作された改変された多能性幹細胞。
【請求項２】
欠損ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、欠損ＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子又は欠損β２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）遺伝子を含み、任意に、前記欠損遺伝子はノックアウトによって作製される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記欠損遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１、相同組換え又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を使用して編集される、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
単鎖ＨＬＡ三量体（安定化ペプチドに連結されたβ２ミクログロブリンに連結されたＨＬＡを含む単鎖ＨＬＡ三量体）をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記ＨＬＡ三量体は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｅ及びＨＬＡ−Ｇの組み合わせである、単鎖ＨＬＡ三量体をコードする外因性コンストラクト；
腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記腫瘍抗原は、腫瘍関連表面抗原（５Ｔ４等）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＢＣＭＡ、Ｂ−ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、ＣＡ−１２５、癌胚抗原（ＣＥＡ）、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ８、ＣＬＬ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＭＶ特異抗原、ＣＳ−１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ−４、ＤＬＬ３、ジシアロガングリオシドＧＤ２、膵管上皮ムチン、ＥＢＶ特異抗原、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＬＦ２Ｍ、エンドグリン、エフリンＢ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮性腫瘍抗原、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＦＬＴ３、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＨＢＶ特異抗原、ＨＣＶ特異抗原、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の組み合わせ、ＨＥＲＶ−Ｋ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ−１型エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＨＰＶ特異抗原、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＩＧＦＩ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、インフルエンザウイルス特異抗原；ＣＤ３８、インスリン成長因子（ＩＧＦｌ）−１、腸カルボキシルエステラーゼ、カッパー鎖、ＬＡＧＡ−１ａ、ラムダ鎖、ラッサ熱ウイルス特異抗原、レクチン反応性ＡＦＰ、系譜特異抗原又は組織特異抗原（ＣＤ３等）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、Ｍ−ＣＳＦ、黒色腫関連抗原、メソテリン、メソテリン、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＭＵＣ−１、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、変異ｐ５３、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、ＰＡＰ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、前立腺特異抗原タンパク質、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、表面接着分子、生存及びテロメラーゼ、ＴＡＧ−７２、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、並びにテネイシン−ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ  Ａ１）、チログロブリン、腫瘍間質抗原、血管内皮細胞成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、ウイルス特異表面抗原（ＨＩＶ特異抗原（例えばＨＩＶ  ｇｐ１２０）等）、並びに、これらの表面マーカーの任意の誘導体又は変異体から選択される、ＣＡＲをコードする外因性コンストラクト；
ＴＣＲをコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記ＴＣＲは、α／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、癌抗原若しくは癌関連抗原に反応性のＴＣＲ、マウスＭＨＣ若しくは他の非ヒトＭＨＣに対して反応性であるＴＣＲ、クラスＩ拘束性ＴＣＲ若しくはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ、ＨＰＶ認識ＴＣＲ、ウイルス反応性ＴＣＲ、ＥＢＶ  ＴＣＲ、ＣＭＶ  ＴＣＲ、若しくはインフルエンザＴＣＲ、ＨＰＶ−１６  Ｅ６  ＴＣＲ、ＨＰＶ−１６  Ｅ７  ＴＣＲ、若しくはＭＡＧＥＡ３／Ａ６  ＴＣＲ若しくは操作された変異体である、又はＴＣＲは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４／８二重陽性Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞若しくは発達中のＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫＴ細胞若しくはＮＫ  Ｔ細胞に由来する、ＴＣＲをコードする外因性コンストラクト；及び／又は、
遺伝子改変された細胞の排除を可能にする又は非侵襲的イメージングのためのＰＥＴレポーター遺伝子として使用される自殺遺伝子をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫであり、化学誘導型カスパーゼ、小分子／化学誘導型二量体化因子（ＣＩＤ）によって誘導される二量体化、選択可能な表面マーカー、又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＥＧＦＲ若しくはＬＮＧＦＲから選択される選択可能な表面マーカーである、自殺遺伝子をコードする外因性コンストラクト；
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
改変された多能性幹細胞を作製する方法であって、
（ａ）内因性ＴＣＲの発現を排除する又はドナーＨＬＡの発現を遮断するように遺伝子座を編集することと、
（ｂ）ＣＡＲ遺伝子、ＴＣＲ遺伝子又はＨＬＡ遺伝子をコードする外因性コンストラクトを導入することと、
を含む、方法。
【請求項６】
造血幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を分離する工程を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞を準備することと、
（ｂ）Ｔ細胞分化又はＴ細胞様分化を誘導することと、
を含む、方法。
【請求項８】
Ｔ細胞分化は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）システム、ｎｏｔｃｈアゴニスト、ＯＰ９−ＤＬＬ１、ＯＰ９−ＤＬＬ４、胎児胸腺器官培養物（ＦＴＯＣ）、化学誘導、骨髄／肝臓／胸腺又はその他のヒト化マウス、胚様体（ＥＢ）を使用して誘導される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞系譜は、１つ以上のバイオマーカーの発現を検出することによって選択され、任意に、前記対象のＴ細胞系譜は、ＣＤ８単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞、中胚葉前駆細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞を準備することと、
（ｂ）特定の細胞系譜の生成を促進、減少又は排除するように、細胞運命調節因子をコードする遺伝子を編集することと、
（ｃ）Ｔ細胞分化を誘導することと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記細胞運命調節因子は、転写因子、Ｔ−ＢＥＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ、ＲＵＮＸ３、ＧＡＴＡ３、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ６、ＤＥＣ２、ＭＡＦ、ＴＨＰＯＫ、ＧＡＴＡ３、Ｓｍａｄｓ、Ｓｔａｔ６、ＰＵ．１、ＲＯＲｇｔ、ＲＯＲａ、Ｓｔａｔ３、ＡＨＲ、Ｂｃｌ−６、ＭＡＦ、ＦｏｘＰ３、Ｓｍａｄ３、Ｓｔａｔ５、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＧＲＡＩＬ又はＰＬＺＦである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記特定の系譜は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、Ｔｒｅｇ、ＩＬＣ、ＮＫ又はＮＫＴである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
改変されていないコントロール細胞と比較して、プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質とＴＣＲβタンパク質との間のペアリングが富化又は増大された改変された多能性幹細胞。
【請求項１４】
前記改変された多能性幹細胞は、プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質をコードする外因性コンストラクトを含み、任意に、前記外因性コンストラクトは、ウイルスコンストラクト、ＡＡＶコンストラクト、レンチウイルスコンストラクト又はレトロウイルスコンストラクトである、請求項１３に記載の改変された多能性幹細胞。
【請求項１５】
前記改変された多能性幹細胞は、欠損ＴＣＲα遺伝子を含み、任意に、前記欠損ＴＣＲα遺伝子は、操作されたヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮを使用したノックアウト、相同組換えを使用したノックアウト又はアンチセンスＲＮＡによって作製される、請求項１３又は１４に記載の改変された多能性幹細胞。
【請求項１６】
前記改変された多能性幹細胞は、ＴＣＲα及びＴＣＲβのペアリングを実質的に含まない、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞。
【請求項１７】
前記改変された多能性幹細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、外因性ＴＣＲ及び／又は抗原受容体を更に含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞。
【請求項１８】
改変された多能性幹細胞を作製する方法であって、外因性プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質を導入する工程及び／又は欠損ＴＣＲα遺伝子を作製する工程を含む、方法。
【請求項１９】
対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞を準備する工程と、人工胸腺オルガノイドにおいてＴ細胞分化を誘導する工程とを含む、方法。
【請求項２０】
対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞を準備する工程と、ペプチド：ＭＨＣの存在下又は不存在下でＴ細胞分化を誘導する工程とを含み、任意に、前記対象のＴ細胞系譜は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞であるヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）又は成熟αβＴ細胞若しくはγδＴ細胞である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月１６日付で出願された米国仮特許出願第６２／７１０，５９１号及び２０１８年５月１８日付で出願された米国仮特許出願第６２／６７３，６２４号に対する優先権を主張し、その両方の開示全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０１９年２月１４日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前はＫ−１０６１＿０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、２．６７キロバイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
ヒト癌は、本質的に正常細胞で構成され、この正常細胞が遺伝的又はエピジェネティックな変換を受けて異常な癌細胞となる。そうすることで、癌細胞は、正常細胞によって発現されるものとは明確に異なるタンパク質及び他の抗原を発現し始める。これらの異常な腫瘍抗原は、身体の自然免疫系によって、癌細胞を特異的に標的とし死滅させるのに使用され得る。しかしながら、癌細胞は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球等の免疫細胞が癌細胞を標的とすることに成功しないように様々な機構を利用する。
【０００４】
現行のＴ細胞療法は、患者において癌細胞を標的とし、死滅させるために富化又は改変されたヒトＴ細胞に頼っている。Ｔ細胞が特定の癌細胞を標的とし死滅させる能力を増加するため、特定の標的癌細胞へとＴ細胞を方向づけるコンストラクトを発現するようＴ細胞を操作する方法が開発された。特定の腫瘍抗原と相互作用することができる結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞が特定の腫瘍抗原を発現する癌細胞を標的とし、死滅させることを可能とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌細胞を特異的に標的として死滅させるためのＣＡＲ、ＴＣＲ及び抗原受容体改変Ｔ細胞の作製方法の改善が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、とりわけＴ細胞へと効率的に分化する遺伝子操作された幹細胞及びそれらの派生物を含む組成物及び方法を提供することにより上記要求に取り組んでいる。特に、本開示は、操作された免疫療法のために自家又は同種異系の状況で使用され得る幹細胞の生成を提供する。細胞ベースの免疫療法で使用される場合に、本明細書に記載される改変された多能性幹細胞は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを軽減又は排除し、レシピエントのＴ細胞及びＮＫ細胞による排除に対する耐性をもたらし、制御可能なＴ細胞活性を可能にし得る（例えば、自殺遺伝子又はキルスイッチを含むように操作される）。
【０００７】
養子細胞療法からのＴ細胞応答はレシピエント由来のＴ細胞によって媒介され得る。移植片拒絶反応は、外因性導入遺伝子に対する免疫原性、ヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）の不一致に対する反応性（非血縁／半合致）又はマイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）（例えば、ＨＡ−１、ＨＡ−２等）に対する反応性（血縁／非血縁ＨＬＡ一致／半合致）に起因する場合がある。ドナーＴ細胞によって応答が媒介されることでも、ＨＬＡ／ＭｉＨＡの不一致に対する反応性からＧＶＨＤにつながる場合があり、腫瘍抗原／腫瘍関連ＭｉＨＡに対する反応性から抗腫瘍事象につながる場合がある。
【０００８】
細胞療法に対する宿主免疫反応性（例えば、ＨＬＡ又はＭｉＨＡの不一致により誘発されるＧＶＨＤ）を防ぐために、一態様では、本開示は、内因性ＴＣＲ発現を排除するように操作された改変された多能性幹細胞を提供する。幾つかの実施の形態では、内因性ＴＣＲの遺伝子編集はＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ（ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２）のノックアウト（ＫＯ）によって操作される。幾つかの実施形態では、細胞は（細胞源及び分化状態に依存して）ＲＡＧ１／ＲＡＧ２のＫＯによって操作される。
【０００９】
移植片拒絶反応を防ぐために、本開示は、ドナーＨＬＡの発現を遮断するように、及び／又は１つのＨＬＡ−クラスＩ「非多型」アレルを再導入してＮＫ殺傷（例えば、単鎖ＨＬＡ−Ｅ）を妨げるように操作された改変された多能性幹細胞を提供する。幾つかの実施の形態では、ＨＬＡクラスＩ分子（例えば、β２ミクログロブリン、個々のＨＬＡ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ）、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及び／又は裸リンパ球症候群Ｉ型（ＢＬＳＩ）と関連する遺伝子）に改変が加えられる。幾つかの実施の形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子（例えば、転写因子（ＲＦＸＡＮＫ又はＲＦＸ５又はＲＦＸＡＰ）又はトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ＢＬＳ  ＩＩに関連する遺伝子及び／又は個々のＨＬＡ分子（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯのα鎖及びβ鎖））に改変が加えられる。幾つかの実施の形態では、腫瘍反応性を促進するように改変が加えられる（例えば、腫瘍特異的ＴＣＲ又はＣＡＲの導入）。幾つかの実施の形態では、細胞は阻害受容体（例えば、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４）を排除するように更に改変される。幾つかの実施の形態では、細胞は共刺激受容体（例えば、ＣＤ２８、ＴＮＦＲＳＦ９）を導入するように改変される。
【００１０】
一態様では、本開示は、内因性ＴＣＲ発現又はＨＬＡ発現を排除するように操作された改変された多能性幹細胞を提供する。
【００１１】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞は、欠損ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、欠損ＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子又は欠損β２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）遺伝子を含み、任意に、前記欠損遺伝子はノックアウトによって作製される。幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞は、欠損ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子を含む。
【００１２】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞は、欠損ＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子を含む。
【００１３】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞は、欠損β２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）遺伝子を含む。
【００１４】
幾つかの実施の形態では、前記欠損遺伝子はノックアウトによって作製される。
【００１５】
幾つかの実施の形態では、前記欠損遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１、相同組換え又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を使用して編集される。幾つかの実施の形態では、前記欠損遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して編集される。
【００１６】
幾つかの実施の形態では、前記細胞は、単鎖ＨＬＡ三量体、すなわち安定化ペプチドに連結されたβ２ミクログロブリンに連結されたＨＬＡを含む単鎖ＨＬＡ三量体をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記ＨＬＡ三量体は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｅ及びＨＬＡ−Ｇの組み合わせである、単鎖ＨＬＡ三量体をコードする外因性コンストラクト、
腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記腫瘍抗原は、腫瘍関連表面抗原（５Ｔ４等）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＢＣＭＡ、Ｂ−ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、ＣＡ−１２５、癌胚抗原（ＣＥＡ）、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ８、ＣＬＬ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＭＶ特異抗原、ＣＳ−１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ−４、ＤＬＬ３、ジシアロガングリオシドＧＤ２、膵管上皮ムチン（ductal-epithelial mucine）、ＥＢＶ特異抗原、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＬＦ２Ｍ、エンドグリン、エフリンＢ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮性腫瘍抗原、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＦＬＴ３、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＨＢＶ特異抗原、ＨＣＶ特異抗原、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の組み合わせ、ＨＥＲＶ−Ｋ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ−１型エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＨＰＶ特異抗原、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＩＧＦＩ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、インフルエンザウイルス特異抗原；ＣＤ３８、インスリン成長因子（ＩＧＦｌ）−１、腸カルボキシルエステラーゼ、カッパー鎖、ＬＡＧＡ−１ａ、ラムダ鎖、ラッサ熱ウイルス特異抗原、レクチン反応性ＡＦＰ、系譜特異抗原又は組織特異抗原（ＣＤ３等）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、Ｍ−ＣＳＦ、黒色腫関連抗原、メソテリン、メソテリン、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＭＵＣ−１、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、変異ｐ５３、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、ＰＡＰ、プロスターゼ（prostase）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、前立腺特異抗原タンパク質、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、表面接着分子、生存及びテロメラーゼ（surviving and telomerase）、ＴＡＧ−７２、フィブロネクチンのエクストラドメイン（extra domain）Ａ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、並びにテネイシン−ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ  Ａ１）、チログロブリン、腫瘍間質抗原、血管内皮細胞成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、ウイルス特異表面抗原（ＨＩＶ特異抗原（例えばＨＩＶ  ｇｐ１２０）等）と並んで、これらの表面マーカーの任意の誘導体又は変異体から選択される、ＣＡＲをコードする外因性コンストラクト、
ＴＣＲをコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記ＴＣＲは、α／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、癌抗原若しくは癌関連抗原に反応性のＴＣＲ、マウスＭＨＣ若しくは他の非ヒトＭＨＣに対して反応性であるＴＣＲ、クラスＩ拘束性ＴＣＲ若しくはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ、ＨＰＶ認識ＴＣＲ、ウイルス反応性ＴＣＲ、ＥＢＶ  ＴＣＲ、ＣＭＶ  ＴＣＲ、若しくはインフルエンザＴＣＲ、ＨＰＶ−１６  Ｅ６  ＴＣＲ、ＨＰＶ−１６  Ｅ７  ＴＣＲ、若しくはＭＡＧＥＡ３／Ａ６  ＴＣＲ若しくは操作された変異体である、又はＴＣＲは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４／８二重陽性Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞若しくは発達中のＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫＴ細胞若しくはＮＫ  Ｔ細胞に由来する、ＴＣＲをコードする外因性コンストラクト、及び／又は、
遺伝子改変された細胞の排除を可能にする又は非侵襲的イメージングのためのＰＥＴレポーター遺伝子として使用される自殺遺伝子をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫであり、化学誘導型カスパーゼ、小分子／化学誘導型二量体化因子（ＣＩＤ）によって誘導される二量体化、選択可能な表面マーカー、又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＥＧＦＲ若しくはＬＮＧＦＲから選択される選択可能な表面マーカーである、自殺遺伝子をコードする外因性コンストラクト、
を含む。
【００１７】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞は単鎖ＨＬＡ三量体をコードする外因性コンストラクトを含む。幾つかの実施の形態では、単鎖ＨＬＡ三量体はＨＬＡクラスＩ  ＨＬＡ−Ｅを含む。幾つかの実施の形態では、単鎖ＨＬＡ三量体は安定化ペプチドに連結されたβ２ミクログロブリンに連結されたＨＬＡを含む。幾つかの実施の形態では、ＨＬＡ三量体はＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｅ及びＨＬＡ−Ｇの組み合わせである。
【００１８】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性コンストラクトを含む。幾つかの実施の形態では、ＣＡＲは腫瘍抗原を標的とする。幾つかの実施の形態では、前記腫瘍抗原は、腫瘍関連表面抗原（５Ｔ４等）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＢＣＭＡ、Ｂ−ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、ＣＡ−１２５、癌胚抗原（ＣＥＡ）、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＬＬ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＭＶ特異抗原、ＣＳ−１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ−４、ＤＬＬ３、ジシアロガングリオシドＧＤ２、膵管上皮ムチン、ＥＢＶ特異抗原、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＬＦ２Ｍ、エンドグリン、エフリンＢ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮性腫瘍抗原、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＦＬＴ３、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＨＢＶ特異抗原、ＨＣＶ特異抗原、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の組み合わせ、ＨＥＲＶ−Ｋ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ−１型エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＨＰＶ特異抗原、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＩＧＦＩ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、インフルエンザウイルス特異抗原、ＣＤ３８、インスリン成長因子（ＩＧＦｌ）−１、腸カルボキシルエステラーゼ、カッパー鎖、ＬＡＧＡ−１ａ、ラムダ鎖、ラッサ熱ウイルス特異抗原、レクチン反応性ＡＦＰ、系譜特異抗原又は組織特異抗原（ＣＤ３等）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、Ｍ−ＣＳＦ、黒色腫関連抗原、メソテリン、メソテリン、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＭＵＣ−１、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、変異ｐ５３、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、ＰＡＰ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、前立腺特異抗原タンパク質、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、表面接着分子、生存及びテロメラーゼ、ＴＡＧ−７２、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、並びにテネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ  Ａ１）、チログロブリン、腫瘍間質抗原、血管内皮細胞成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、ウイルス特異表面抗原（ＨＩＶ特異抗原（例えばＨＩＶ  ｇｐ１２０）等）と並んで、これらの表面マーカーの任意の誘導体又は変異体から選択される。
【００１９】
幾つかの実施の形態では、ＣＡＲはＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＬＬ１、ＣＳ１、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＣＤ７０及びＣＤ２０からなる群から選択される抗原を特異的に標的とする。幾つかの実施の形態では、ＣＡＲはＣＤ１９を特異的に標的とする。
【００２０】
幾つかの実施の形態では、ＣＡＲは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ１６、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３（α、β、δ、ε、γ、ζ）、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３リガンド、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、ＤＡＰ−１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃγ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ１、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８））、ＭＨＣクラスＩ分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ−１、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ−３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ；Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＮＦ、ＴＮＦｒ、ＴＮＦＲ２、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１及びＶＬＡ−６又はそれらのフラグメント、短縮物（truncations）、若しくは組み合わせからなる群から選択される分子に由来する共刺激ドメイン又はスペーサードメインを含む。
【００２１】
幾つかの実施の形態では、ＣＡＲはＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζドメインを含む。
【００２２】
幾つかの実施の形態では、ＣＡＲは２つ以上の抗原を特異的に標的とする。
【００２３】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はＴＣＲをコードする外因性コンストラクトを含む。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはα／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、癌抗原反応性ＴＣＲ又は癌関連抗原反応性ＴＣＲ、マウスＭＨＣ又は他の非ヒトＭＨＣに対して反応性のＴＣＲ、クラスＩ拘束性ＴＣＲ又はクラスＩＩ拘束性ＴＣＲである。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４／８二重陽性Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞若しくは発達中のＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ  Ｔ細胞に由来する。
【００２４】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはＨＰＶ認識ＴＣＲ、ウイルス反応性ＴＣＲ、ＣＭＶ  ＴＣＲ、ＥＢＶ  ＴＣＲ、インフルエンザＴＣＲである。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはＨＰＶ−１６  Ｅ７  ＴＣＲである。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはＨＰＶ−１６  Ｅ６  ＴＣＲ、ＭＡＧＥＡ３／Ａ６  ＴＣＲ又は操作された変異体である。
【００２５】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはＩＲＥＳエレメントによって連結されている。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲは２Ａエレメントによって連結されている。幾つかの実施の形態では、２ＡエレメントはＰ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａである。
【００２６】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲは非バイシストロン性アプローチ（non-bicistronic approach）によって連結される。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲは種々のゲノム位置で組み込まれる。
【００２７】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞は、遺伝子改変された細胞の排除を可能にする自殺遺伝子をコードする外因性コンストラクトを含む。幾つかの実施の形態では、自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫである。幾つかの実施の形態では、ｓｒ３９ＴＫは非侵襲的イメージングのためのＰＥＴレポーター遺伝子として使用される。
【００２８】
幾つかの実施の形態では、自殺遺伝子は化学誘導型カスパーゼ（chemically induced caspase）、小分子／化学誘導型二量体化因子（chemically induced dimerizer）（ＣＩＤ）によって誘導された二量体化又は選択可能な表面マーカーである。幾つかの実施の形態では、選択可能な表面マーカーはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＥＧＦＲ又はＬＮＧＦＲである。幾つかの実施の形態では、自殺遺伝子は有害事象、注入細胞の自己反応性、癌の根絶又はその他の場合に活性化される。
【００２９】
幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトはウイルスコンストラクトである。幾つかの実施の形態では、ウイルスコンストラクトはＡＡＶコンストラクト、アデノウイルスコンストラクト、レンチウイルスコンストラクト又はレトロウイルスコンストラクトである。
【００３０】
幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトは幹細胞のゲノムへと組み込まれる。幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトは幹細胞のゲノムへと組み込まれない。幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトはトランスポザーゼ、レトロトランスポザーゼ、エピソーマルプラスミド又はランダム組込みによって導入される。
【００３１】
幾つかの実施の形態では、ノックアウトは相同組換えによってもたらされる。
【００３２】
幾つかの実施の形態では、改変された細胞はＴ細胞又は非Ｔ細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞はαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＩＬＣ又はＴｒｅｇに由来する。
【００３３】
幾つかの実施の形態では、改変された細胞はＢ細胞、末梢血単核細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、体細胞型又は胚性幹細胞に由来する。
【００３４】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はＭＨＣ反応性を有しない。
【００３５】
一態様では、本開示は、（ａ）内因性ＴＣＲの発現を排除する又はドナーＨＬＡの発現を遮断するように遺伝子座を編集することと、（ｂ）ＣＡＲ遺伝子、ＴＣＲ遺伝子又はＨＬＡ遺伝子をコードする外因性コンストラクトを導入することとを含む、改変された多能性幹細胞を作製する方法を提供する。
【００３６】
幾つかの実施の形態では、上記方法は、最初に造血幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を分離する工程を更に含む。
【００３７】
幾つかの実施の形態では、上記方法は、内因性ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、ＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子又はβ２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）遺伝子を編集することを含む。
【００３８】
幾つかの実施の形態では、編集された遺伝子はノックアウトによって作製される。
【００３９】
幾つかの実施の形態では、上記遺伝子はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１、相同組換え又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を使用して編集される。幾つかの実施の形態では、上記遺伝子はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して編集される。
【００４０】
幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトは単鎖ＨＬＡ三量体をコードする。幾つかの実施の形態では、単鎖ＨＬＡ三量体はＨＬＡクラスＩ  ＨＬＡ−Ｅを含む。幾つかの実施の形態では、単鎖ＨＬＡ三量体は安定化ペプチドに連結されたβ２ミクログロブリンに連結されたＨＬＡを含む。幾つかの実施の形態では、ＨＬＡ三量体はＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｅ及びＨＬＡ−Ｇの組み合わせである。
【００４１】
幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。幾つかの実施の形態では、ＣＡＲはＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＬＬ１、ＣＳ１、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＣＤ７０又はＣＤ２０からなる群から選択される抗原を特異的に標的とする。
【００４２】
幾つかの実施の形態では、ＣＡＲはＣＤ１９を特異的に標的とする。幾つかの実施の形態では、ＣＡＲはＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζを含む。
【００４３】
幾つかの実施の形態では、ＣＡＲは２つ以上の抗原を特異的に標的とする。
【００４４】
幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトはＴＣＲをコードする。
【００４５】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはα／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、癌抗原反応性ＴＣＲ又は癌関連抗原反応性ＴＣＲ、マウスＭＨＣ又は他の非ヒトＭＨＣに対して反応性のＴＣＲ、クラスＩ拘束性ＴＣＲ又はクラスＩＩ拘束性ＴＣＲに由来する。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはハイブリッドＴＣＲ又は操作されたＴＣＲである。
【００４６】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはＨＰＶ認識ＴＣＲ、ウイルス反応性ＴＣＲ、ＥＢＶ  ＴＣＲ、インフルエンザＴＣＲである。
【００４７】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはＨＰＶ−１６  Ｅ７  ＴＣＲ、ＨＰＶ−１６  Ｅ６  ＴＣＲ又はＭＡＧＥＡ３／Ａ６  ＴＣＲ又は操作された変異体である。
【００４８】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲはＩＲＥＳエレメントによって連結されている。
【００４９】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲは２Ａエレメントによって連結されている。
【００５０】
幾つかの実施の形態では、２ＡエレメントはＰ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａである。
【００５１】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲは非バイシストロン性アプローチによって連結される。
【００５２】
幾つかの実施の形態では、ＴＣＲの各鎖は種々のゲノム位置で組み込まれる。
【００５３】
幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトは遺伝子改変された細胞の排除を可能にする自殺遺伝子をコードする。幾つかの実施の形態では、自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫである。幾つかの実施の形態では、自殺遺伝子は化学誘導型カスパーゼ、小分子／化学誘導型二量体化因子（ＣＩＤ）によって誘導された二量体化又は選択可能な表面マーカーである。
【００５４】
幾つかの実施の形態では、選択可能な表面マーカーはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＥＧＦＲ又はＬＮＧＦＲである。
【００５５】
幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトはウイルスコンストラクトである。
【００５６】
幾つかの実施の形態では、ウイルスコンストラクトはＡＡＶコンストラクト、アデノウイルスコンストラクト、レンチウイルスコンストラクト又はレトロウイルスコンストラクトである。
【００５７】
幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトは幹細胞のゲノムへと組み込まれる。幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトは幹細胞のゲノムへと組み込まれない。幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトは幹細胞のゲノムへと組み込まれない。幾つかの実施の形態では、外因性コンストラクトはトランスポザーゼ、レトロトランスポザーゼ、エピソーマルプラスミド又はランダム組込みによって導入される。
【００５８】
幾つかの実施の形態では、ノックアウトは相同組換えによってもたらされる。
【００５９】
幾つかの実施の形態では、改変された細胞はＴ細胞又は非Ｔ細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞はαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＩＬＣ又はＴｒｅｇに由来する。
【００６０】
一態様では、本開示は、（ａ）本明細書に記載される改変された多能性幹細胞を準備する工程と、（ｂ）Ｔ細胞分化又はＴ細胞様分化を誘導する工程とを含む、対象のＴ細胞系譜を作製する方法を提供する。
【００６１】
幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞分化は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）システム、ｎｏｔｃｈアゴニスト、ＯＰ９−ＤＬＬ１、ＯＰ９−ＤＬＬ４、胎児胸腺器官培養物（ＦＴＯＣ）、化学誘導、骨髄／肝臓／胸腺又はその他のヒト化マウス、胚様体（ＥＢ）を使用して誘導される。
【００６２】
幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞系譜は１つ以上のバイオマーカーの発現を検出することによって選択される。
【００６３】
幾つかの実施の形態では、前記Ｔ細胞系譜は、１つ以上のバイオマーカーの発現を検出することによって選択され、任意に、前記対象のＴ細胞系譜は、ＣＤ８単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞、中胚葉前駆細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞である。
【００６４】
幾つかの実施の形態では、前記対象のＴ細胞系譜は、ＣＤ８単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞、中胚葉前駆細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞である。
【００６５】
一態様では、本開示は、対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の改変された多能性幹細胞を準備することと、
（ｂ）特定の細胞系譜の生成を促進、減少又は排除するように、細胞運命調節因子をコードする遺伝子を編集することと、
（ｃ）Ｔ細胞分化を誘導することと、
を含む、方法を提供する。
【００６６】
幾つかの実施の形態では、前記細胞運命調節因子は、転写因子、Ｔ−ＢＥＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ、ＲＵＮＸ３、ＧＡＴＡ３、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ６、ＤＥＣ２、ＭＡＦ、ＴＨＰＯＫ、ＧＡＴＡ３、Ｓｍａｄｓ、Ｓｔａｔ６、ＰＵ．１、ＲＯＲｇｔ、ＲＯＲａ、Ｓｔａｔ３、ＡＨＲ、Ｂｃｌ−６、ＭＡＦ、ＦｏｘＰ３、Ｓｍａｄ３、Ｓｔａｔ５、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＧＲＡＩＬ又はＰＬＺＦである。
【００６７】
幾つかの実施の形態では、前記特定の系譜は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、Ｔｒｅｇ、ＩＬＣ、ＮＫ又はＮＫＴである。
【００６８】
一態様では、本開示は、対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の改変された多能性幹細胞を準備することと、
（ｂ）不所望な細胞系譜の生成を減少又は排除するように、細胞運命調節因子を編集することと、
（ｃ）Ｔ細胞分化を誘導することと、
を含む、方法を提供する。
【００６９】
幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞分化は人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）システム、ｎｏｔｃｈアゴニスト、ＯＰ９−ＤＬＬ１、ＯＰ９−ＤＬＬ４、胎児胸腺器官培養物（ＦＴＯＣ）、化学誘導、骨髄／肝臓／胸腺又はその他のヒト化マウス、胚様体（ＥＢ）を使用して誘導される。
【００７０】
幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞系譜は１つ以上のバイオマーカーの発現を検出することによって選択される。
【００７１】
幾つかの実施の形態では、対象のＴ細胞系譜はＣＤ８単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞、中胚葉前駆細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞である。
【００７２】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子は転写因子である。
【００７３】
幾つかの実施の形態では、不所望な系譜はＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、Ｔｒｅｇ、ＩＬＣ、ＮＫ又はＮＫＴである。
【００７４】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＴ−ＢＥＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ、又はＲＵＮＸ３である。
【００７５】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＧＡＴＡ３、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ６、ＤＥＣ２、ＭＡＦ、又はＴＨＰＯＫである。
【００７６】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＧＡＴＡ３、Ｓｍａｄｓ、Ｓｔａｔ６、又はＰＵ．１である。
【００７７】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＲＯＲｇｔ、ＲＯＲａ、又はＳｔａｔ３である。
【００７８】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＡＨＲである。
【００７９】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＢｃｌ−６、又はＭＡＦである。
【００８０】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＦｏｘＰ３、Ｓｍａｄ３、Ｓｔａｔ５、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、又はＧＲＡＩＬである。
【００８１】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＰＬＺＦである。
【００８２】
一態様では、本開示は、対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の改変された多能性幹細胞を準備する工程と、
（ｂ）所望の細胞系譜の生成を促進するように、細胞運命調節因子を編集する工程と、
（ｃ）Ｔ細胞分化を誘導する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００８３】
幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞分化は人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）システム、ｎｏｔｃｈアゴニスト、ＯＰ９−ＤＬＬ１、ＯＰ９−ＤＬＬ４、胎児胸腺器官培養物（ＦＴＯＣ）、化学誘導、骨髄、肝臓、胸腺又はその他のヒト化マウス、胚様体（ＥＢ）を使用して誘導される。
【００８４】
幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞系譜は１つ以上のバイオマーカーの発現を検出することによって選択される。
【００８５】
幾つかの実施の形態では、対象のＴ細胞系譜はＣＤ８単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞、中胚葉前駆細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞である。
【００８６】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子は転写因子である。
【００８７】
幾つかの実施の形態では、所望の系譜はＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、Ｔｒｅｇ、ＩＬＣ、ＮＫ又はＮＫＴである。
【００８８】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＴ−ＢＥＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ、又はＲＵＮＸ３である。
【００８９】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＧＡＴＡ３、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ６、ＤＥＣ２、ＭＡＦ、又はＴＨＰＯＫである。
【００９０】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＧＡＴＡ３、Ｓｍａｄｓ、Ｓｔａｔ６、又はＰＵ．１である。
【００９１】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＲＯＲｇｔ、ＲＯＲａ、又はＳｔａｔ３である。
【００９２】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＡＨＲである。
【００９３】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＢｃｌ−６、又はＭＡＦである。
【００９４】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＦｏｘＰ３、Ｓｍａｄ３、Ｓｔａｔ５、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、又はＧＲＡＩＬである。
【００９５】
幾つかの実施の形態では、細胞運命調節因子はＰＬＺＦである。
【００９６】
幾つかの実施の形態では、操作された幹細胞は癌細胞を特異的に標的として死滅させるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を更に発現する。
【００９７】
ＣＡＲは、例えば（ｉ）抗原特異的成分（「抗原結合分子」）と、（ｉｉ）１つ以上の共刺激ドメイン（ヒンジドメインを含む）と、（ｉｉｉ）１つ以上の活性化ドメインとを含み得る。各ドメインは不均一であり得る、つまり、異なるタンパク質鎖に由来する配列から構成され得る。ＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は癌療法を含む様々な療法に使用され得る。
【００９８】
ＴＣＲはＴ細胞が癌細胞の表面又は癌細胞の内部に提示された癌標的を識別可能にするタンパク質である。癌に特異的な内因性ＴＣＲを単離し、その後に様々な型の固形癌及び血液癌を認識して攻撃する多数のＴ細胞へと操作することができる。
【００９９】
幾つかの実施の形態では、ＣＡＲは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、Ｔ細胞受容体のα鎖、Ｔ細胞受容体のβ鎖、Ｔ細胞受容体のγ鎖、Ｔ細胞受容体のδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４若しくはＴ細胞受容体のζ鎖の膜貫通ドメイン又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される膜貫通ドメインを含み得る。
【０１００】
幾つかの実施の形態では、細胞内ドメインは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＣＤ２９、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ−１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃγ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、免疫グロブリン様タンパク質のシグナル伝達領域を含む。
【０１０１】
幾つかの実施の形態では、前記癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（非Ｔ細胞ＡＬＬを含む）、急性骨髄白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄白血病、慢性若しくは急性の白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、毛様細胞性白血病、ホジキン病、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、多発性骨髄腫、脊髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、形質細胞増殖性障害（無症候性骨髄腫（くすぶり型多発性骨髄腫又は無痛性骨髄腫）を含む）、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、形質細胞腫（形質細胞異常増殖症；孤立性骨髄腫；孤立性形質細胞腫；髄外性形質細胞腫；及び多発性形質細胞腫を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群（Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、高月病、及びＰＥＰ症候群としても知られる）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣ）、小細胞若しくは大細胞濾胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、Ｔ細胞リンパ腫、形質転換後濾胞性リンパ腫、若しくはワルデンストレームマクログロブリン血症、又はそれらの組み合わせである。
【０１０２】
一態様では、本発明は、改変されていないコントロール細胞と比較して、プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質とＴＣＲβタンパク質との間のペアリングが富化された改変された多能性幹細胞を提供する。
【０１０３】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はプレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質をコードする外因性コンストラクトを含み、任意に、外因性コンストラクトはウイルスコンストラクト、ＡＡＶコンストラクト、レンチウイルスコンストラクト又はレトロウイルスコンストラクトである。
【０１０４】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はプレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質をコードする外因性コンストラクトを含む。
【０１０５】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はウイルスコンストラクトである外因性コンストラクトを含む。幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はＡＡＶコンストラクト、レンチウイルスコンストラクト又はレトロウイルスコンストラクトである外因性ウイルスコンストラクトを含む。
【０１０６】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞は幹細胞のゲノムへと組み込まれている外因性コンストラクトを含む。
【０１０７】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞は欠損ＴＣＲα遺伝子を含む。幾つかの実施の形態では、欠損ＴＣＲα遺伝子はノックアウトによって作製される。或る特定の実施の形態では、ＴＣＲα遺伝子ノックアウトは操作されたヌクレアーゼによってもたらされる。幾つかの実施の形態では、操作されたヌクレアーゼはＴＣＲα遺伝子に特異的であり、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮから選択される。
【０１０８】
他の実施の形態では、改変された多能性幹細胞は相同組換えによってもたらされるＴＣＲα遺伝子ノックアウトを含む。或る特定の実施の形態では、欠損ＴＣＲα遺伝子はアンチセンスＲＮＡによって作製される。
【０１０９】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はＴＣＲα及びＴＣＲβのペアリングを実質的に含まない。
【０１１０】
幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、外因性ＴＣＲ及び／又は抗原受容体を更に含む。
【０１１１】
幾つかの実施の形態では、造血幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を使用して、改変された多能性幹細胞が作製される。幾つかの実施の形態では、改変された多能性幹細胞はＭＨＣ反応性を有しない。
【０１１２】
一態様では、本発明は、改変された多能性幹細胞を作製する方法であって、外因性プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質を導入する工程及び／又は欠損ＴＣＲα遺伝子を作製する工程を含む、方法を提供する。
【０１１３】
幾つかの実施の形態では、外因性プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質はプレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクト又はＲＮＡコンストラクトのエレクトロポレーションによって導入される。
【０１１４】
幾つかの実施の形態では、欠損ＴＣＲα遺伝子はノックアウト又はアンチセンス技術によって作製される。或る特定の実施の形態では、上記方法は、対象のＣＡＲタンパク質をコードするコンストラクトを導入する工程を更に含む。
【０１１５】
幾つかの実施の形態では、上記方法は、最初に患者又は健康なドナーから造血幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を分離する工程を更に含む。
【０１１６】
一態様では、本発明は、対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、改変された多能性幹細胞を準備する工程と、人工胸腺オルガノイドにおいてＴ細胞分化を誘導する工程とを含む、方法を提供する。
【０１１７】
一態様では、本発明は、対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、本明細書に記載の改変された多能性幹細胞を準備することと、ペプチド：ＭＨＣの存在下又は不存在下でＴ細胞分化を誘導することとを含み、任意に、前記対象のＴ細胞系譜は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞であるヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）又は成熟αβＴ細胞若しくはγδＴ細胞である、方法を提供する。
【０１１８】
一態様では、本発明は、改変された多能性幹細胞を準備する工程と、ペプチド：ＭＨＣの存在下でＴ細胞分化を誘導する工程とを含む、対象のＴ細胞系譜を作製する方法を提供する。一態様では、本発明は、改変された多能性幹細胞を準備する工程と、ペプチド：ＭＨＣの不存在下でＴ細胞分化を誘導する工程とを含む、対象のＴ細胞系譜を作製する方法を提供する。
【０１１９】
幾つかの実施の形態では、上記方法はＴ細胞系譜を選択することを更に含み、ここで、Ｔ細胞系譜は１つ以上のバイオマーカーの発現を検出することによって選択される。幾つかの実施の形態では、対象のＴ細胞系譜は細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。幾つかの他の実施の形態では、対象のＴ細胞系譜はヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞である。或る特定の実施の形態では、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞である。
【０１２０】
幾つかの実施の形態では、上記方法はＴ細胞系譜を選択することを含み、ここで、対象のＴ細胞系譜は制御性Ｔ細胞である。
【０１２１】
幾つかの実施の形態では、上記方法はＴ細胞系譜を選択することを含み、ここで、対象のＴ細胞系譜は上皮内リンパ球（ＩＥＬ）である。
【０１２２】
幾つかの実施の形態では、上記方法はＴ細胞系譜を選択することを含み、ここで、対象のＴ細胞系譜は成熟αβＴ細胞又は成熟γδＴ細胞である。
【０１２３】
ＣＡＲは、例えば（ｉ）抗原特異的成分（「抗原結合分子」）と、（ｉｉ）１つ以上の共刺激ドメイン（ヒンジドメインを含む）と、（ｉｉｉ）１つ以上の活性化ドメインとを含み得る。各ドメインは不均一であり得る、つまり、異なるタンパク質鎖に由来する配列から構成され得る。ＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は癌療法を含む様々な療法に使用され得る。
【０１２４】
短縮ヒンジドメイン（「ＴＨＤ」）を含む共刺激ドメインを含むＣＡＲは完全ヒンジドメイン（「ＣＨＤ」）を含む共刺激ドメインを含むＣＡＲと比較して予想外に優れた特性をもたらす。そのようなＣＡＲをコードするポリヌクレオチドはｐＴＡ及びＴＣＲαを含む本発明の操作された幹細胞又はＴＣＲαを欠いた内因性幹細胞へと形質導入され得る。形質導入されたＴ細胞を患者に移植すると、ＣＡＲは癌細胞の表面に存在するエピトープを認識して結合するようにＴ細胞を導くため、非癌性細胞ではなく癌細胞の結合が可能となる。この結合はＴ細胞における細胞溶解機構の活性化をもたらし、結合された癌細胞を特異的に死滅させる。医学的合併症の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は一般に幹細胞移植と関連しており、免疫抑制療法で治療することができる。本発明は、抗原特異性を保持するが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に対する反応性を有しない改変されたＴ細胞を作製することにより、ＧｖＨＤを発症する可能性を潜在的に排除する。したがって、本発明は、癌を治療するための新規の改善された療法に関して、存在する、満たされていない要求を満たす。
【０１２５】
ＴＣＲはＴ細胞が癌細胞の表面又は癌細胞の内部に提示された癌標的を識別可能にするタンパク質である。癌に特異的な内因性ＴＣＲを単離し、その後に様々な型の固形癌及び血液癌を認識して攻撃する多数のＴ細胞へと操作することができる。
【０１２６】
幾つかの実施の形態では、ＣＡＲは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、Ｔ細胞受容体のα鎖、Ｔ細胞受容体のβ鎖、Ｔ細胞受容体のγ鎖、Ｔ細胞受容体のδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４若しくはＴ細胞受容体のζ鎖の膜貫通ドメイン又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される膜貫通ドメインを含み得る。
【０１２７】
幾つかの実施の形態では、細胞内ドメインは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＣＤ２９、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ−１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃγ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、免疫グロブリン様タンパク質のシグナル伝達領域を含む。
【０１２８】
幾つかの実施の形態では、前記癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（非Ｔ細胞ＡＬＬを含む）、急性骨髄白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄白血病、慢性若しくは急性の白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、毛様細胞性白血病、ホジキン病、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、多発性骨髄腫、脊髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、形質細胞増殖性障害（無症候性骨髄腫（くすぶり型多発性骨髄腫又は無痛性骨髄腫）を含む）、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、形質細胞腫（形質細胞異常増殖症；孤立性骨髄腫；孤立性形質細胞腫；髄外性形質細胞腫；及び多発性形質細胞腫を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群（Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、高月病、及びＰＥＰ症候群としても知られる）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣ）、小細胞若しくは大細胞濾胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、Ｔ細胞リンパ腫、形質転換後濾胞性リンパ腫、若しくはワルデンストレームマクログロブリン血症、又はそれらの組み合わせである。
【０１２９】
本明細書に記載されるように、改変された多能性幹細胞は、同種異系の状況、又は養子細胞移植（adoptive cell transfer）としても知られる「ｅＡＣＴ（商標）」と略記される、操作された自己細胞療法（Engineered Autologous Cell Therapy）に使用することができる。ｅＡＣＴ（商標）は、患者自身のＴ細胞を収集し、その後、１つ以上の特定の癌細胞の細胞表面に発現される１つ以上の抗原を認識し、標的とするように遺伝子操作するプロセスである。Ｔ細胞は、例えばＣＡＲ又はＴＣＲを発現するように操作され得る。ＣＡＲ陽性（ＣＡＲ＋）Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。ＣＡＲは、例えば、特定の腫瘍抗原に対する特異性を有する細胞外単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み得て、該ｓｃＦｖは、少なくとも１つの活性化ドメインに直接又は間接に連結される、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達部分に直接又は間接に連結され、それらの成分は任意の順序で配列され得る。共刺激ドメインは、当該技術分野で知られている共刺激タンパク質に由来し得て、活性化ドメインは、例えばＣＤ３−ζのいずれかの形態に由来し得る。幾つかの実施の形態では、ＣＡＲは２個、３個、４個、又はそれ以上の共刺激ドメインを有するように設計される。幾つかの実施の形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインが別々のポリペプチド鎖として発現されるように操作される。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法及びコンストラクトの例は、米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８号、同第２０１４／０２２７２３７号、同第２０１４／００９９３０９号、及び同第２０１４／００５０７０８号、国際公開第２０１２０３３８８５号、国際公開第２０１２０７９０００号、国際公開第２０１４１２７２６１号、国際公開第２０１４１８６４６９号、国際公開第２０１５０８０９８１号、国際公開第２０１５１４２６７５号、国際公開第２０１６０４４７４５号、及び国際公開第２０１６０９０３６９号；並びにSadelain et al, Cancer Discovery, 3: 388-398 (2013)に記載され、各々、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１３０】
本明細書に記載される任意の態様又は実施の形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施の形態と組み合わせられ得る。本発明はその詳細な説明と併せて記載されているが、上述の記載は解説を意図するものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、及び変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１３１】
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される米国特許、及び公開又は未公開の米国特許出願はいずれも、引用することにより本発明の一部をなす。本明細書で引用される公開された外国の特許及び特許出願はいずれも引用することにより本明細書の一部を成す。本明細書で引用される他の公開された参照文献、辞書、文書、原稿、ゲノムデータベース配列及び科学文献はいずれも、引用することにより本明細書の一部を成す。
【０１３２】
本発明の他の特徴及び利点は、図面、及び実施例を含む以下の詳細な説明、並びに特許請求の範囲から明らかとなる。
【０１３３】
添付の図面と併せて考慮された場合、上記及び更なる特徴は以下の詳細な記述からより明確に理解される。しかしながら、図面は限定ではなく、解説の目的であるにすぎない。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】改変された多能性幹細胞からの操作されたＴ細胞の生成及び例示的な改変方略を示す図である。
【図２】例示的な改変方略を示す図である。
【図３】細胞副産物の排除を目的とする遺伝子編集の略図である。左側は正常な幹細胞からＴ細胞への正常な分化樹である。右側では、編集された幹細胞は不所望な細胞副産物を生成せずに、最終的なＴ細胞のみを生成する。
【図４】ＡＴＯシステムの実験模式図である。多能性幹細胞は中胚葉前駆細胞へと誘導される。中胚葉前駆細胞をソーティングして、ＤＬＬ１を発現するように操作されたＭＳ５間質細胞と複合化する。集成した細胞複合体を空気−液体界面膜上に滴下して、８週間〜１２週間にわたってＴ細胞へと発生させる。
【図５】ＡＴＯにおけるｉＰＳＣからのＴ細胞発生の動態を示す図である。ｉＰＳＣはＴ系譜委任細胞に特徴的な表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ５及びＣＤ７を獲得する。最初に（２週目）細胞はＣＤ４ＩＳＰ又はＣＤ４／８ＤＰである。３週目に、全ての細胞はＣＤ４／８ＤＰである。５週目までに、細胞の大部分はαβＴ細胞受容体を発現しており、ＣＤ８ＳＰである。
【図６】ソーティングされた細胞の発現を示す図である。ＣＤ４単一陽性（ＣＤ４ＳＰ）細胞、ＣＤ４／８二重陽性（ＤＰ）細胞及びＣＤ８単一陽性（ＣＤ８ＳＰ）細胞をＡＴＯ発達の終わりにソーティングした。ソーティングされた集団を、ＩＬ２及びＣＤ３／２８ビーズを含むＯｐｔｉｍｉｚｅｒ培地中で２週間増殖させた。増殖の終わりに、細胞を計数して、増殖倍率を計算した。２つの反復実験が示されている（ＡＴＯ２０及びＡＴＯ２１）。
【図７】活性化マーカーを示す図である。健康なドナーのコントロール細胞を未処理のプレート又はＯＫＴ３（ＣＤ３刺激抗体）でコーティングしたプレートで一晩培養した。ＣＤ４集団又はＣＤ８集団のいずれかにおける表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって調査した。ＣＤ６９及び４−１ＢＢの上方調節はＯＫＴ３と一緒に培養した細胞で観察された。
【図８】ＡＴＯからのｉＰＳＣ由来Ｔ細胞における活性化マーカーを示す図である。健康なドナー細胞（図７）と同様に、ＡＴＯにおけるｉＰＳＣ由来のＴ細胞はＯＫＴ３でコーティングされたプレート上で一晩共培養した後に、表面マーカーＣＤ６９及び４−１ＢＢの上方調節を示す。
【図９】活性化マーカーの概要及び増殖を示す図である。左のグラフは、図７及び図８のデータをまとめたものである。右のグラフは、刺激された細胞におけるＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔの希釈を示し、これは細胞をＯＫＴ３で培養した場合に増殖が誘導されたことを指摘している。刺激時の増殖はＴ細胞機能の証である。
【図１０】サイトカインの分泌を示す図である。免疫サイトカインＩＦＮｇ、ＩＬ２、ＴＮＦａ、ＩＬ−８及びＩＬ−１０は、健康なドナーのコントロール及びＡＴＯにおいてｉＰＳＣから生成されたＴ細胞からＯＫＴ３での刺激時に分泌された。刺激時のサイトカインの分泌はＴ細胞機能の証である。
【図１１】ｉＰＳＣ由来のＣＤ１９  ＣＡＲ発現Ｔ細胞が標的に対して機能的であることを示す図である。Kite社の製造方法（ＡｘｉＣｅｌ）においてＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように製造されたＴ細胞又はＣＤ１９−ＣＡＲで形質導入されたｉＰＳＣから発生されたＴ細胞をＣＤ１９＋白血病標的細胞（Ｒａｊｉ）と一緒に一晩共培養した。細胞はクラスターを形成し（左）、エフェクター及び標的を共培養した場合に表面マーカー４−１ＢＢは上方調節された（中央、右）。ＣＤ１９  ＣＡＲで形質導入されたｉＰＳＣからのＴ細胞は標的の癌系統の機能的認識を裏付けている。
【図１２】ｉＰＳＣがＣＡＲ形質導入又は遺伝子編集の後に中胚葉前駆細胞を生成し得ることを示す図である。親（２０２ｉ）ｉＰＳＣ系統にＣＤ１９  ＣＡＲ（ＥＦＬｂｒｉｇｈｔ）を形質導入して、クローン（クローン２、クローン５、クローン８、クローン１１）にソーティングするか又はβ２ミクログロブリンの発現を排除するように遺伝子編集して、クローン（ｂ２ｍ  Ｒ２、ｂ２ｍ  Ｒ６、ｂ２ｍ  Ｒ９、ｂ２ｍ  Ｙ３）にソーティングした。全ての形質導入又は遺伝子編集された系統又はクローンは親系統に匹敵する効率で中胚葉前駆細胞を形成することができた。
【図１３】Ｔ細胞分化の発生段階を示す図である。
【図１４】二重陰性（ＤＮ）及び二重陽性（ＤＰ）の胸腺細胞発生の初期段階を示す図である。
【図１５】表面発現されたＴＣＲの分子構成を表す図である。
【図１６Ａ−１６Ｃ】改変されていないｉＰＳＣ（図１６Ａ）、ＣＡＲ−ＫＩ−ＴＲＡＣ  ｉＰＳＣ（図１６Ｂ）及び改変されたｉＰＳＣからのＣＤ４５＋ＣＤ５６−ＣＤ３＋ＣＡＲ＋Ｅ７ＴＣＲａｂ＋Ｔ細胞（図１６Ｃ）の５週目のＴ細胞分化を示すフローサイトメトリープロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１３５】
定義
本発明がより容易に理解されるように、まず特定の用語を以下に定義する。以下の用語及び他の用語に対する更なる定義は、本明細書を通して記載される。
【０１３６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、数量を特定していないもの（the singular forms "a," "an" and "the"）は、文脈より別段の明確な指示がない限り複数の指示対象を含む。
【０１３７】
具体的に述べられない又は文脈より明らかでない限り、本明細書で使用される「又は」の用語は「又は」と「及び」の両方を含み、それらを包含すると理解される。
【０１３８】
本明細書において使用される場合、「及び／又は」の用語は、２つの指定される特徴又は成分の各々ともう一方とを含む、又はもう一方を含まない具体的な開示として理解される。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等の句で使用される「及び／又は」の用語は、Ａ及びＢ；Ａ又はＢ；Ａ（単独）；及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」等の句において使用される「及び／又は」の用語は、Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）の態様の各々を包含することが意図される。
【０１３９】
本明細書で使用される「例えば」及び「すなわち」の用語は、限定を意図せずに例として使用されるにすぎず、本明細書において明らかに列挙されるそれらの項目のみを指すものと解釈されるべきではない。
【０１４０】
「以上」、「少なくとも」、「それよりも多く」等の用語、例えば「少なくとも１つ」は、限定されないが、示される値よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００以上多い値を含むと理解される。また、任意のより大きな数、又はその間の分数も含まれる。
【０１４１】
逆に、「以下」の用語は示される値よりも小さい各値を含む。例えば、「１００ヌクレオチド以下」は、１００個、９９個、９８個、９７個、９６個、９５個、９４個、９３個、９２個、９１個、９０個、８９個、８８個、８７個、８６個、８５個、８４個、８３個、８２個、８１個、８０個、７９個、７８個、７７個、７６個、７５個、７４個、７３個、７２個、７１個、７０個、６９個、６８個、６７個、６６個、６５個、６４個、６３個、６２個、６１個、６０個、５９個、５８個、５７個、５６個、５５個、５４個、５３個、５２個、５１個、５０個、４９個、４８個、４７個、４６個、４５個、４４個、４３個、４２個、４１個、４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個及び０個のヌクレオチドを含む。また、任意のより小さな数、又はその間の分数も含まれる。
【０１４２】
「複数」、「少なくとも２つ」、「２以上」、「少なくとも第２の」等の用語は、限定されないが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００以上を含むと理解される。また、任意のより大きな数、又はその間の分数も含まれる。
【０１４３】
明細書を通して、「含んでいる、含む（comprising）」の文言、又は「含む（comprises）」若しくは「含んでいる（comprising）」等の変化形は、示される要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を含むことを含意するが、任意の他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を排除しないと理解される。本明細書において「含んでいる、含む」の言葉と共に態様が記載される場合はいつでも、「からなる」及び／又は「から本質的になる」の用語で記載される他の類似の態様も提供されると理解される。
【０１４４】
具体的に述べられておらず又は文脈より明らかでない限り、本明細書で使用される「約」の用語は、当業者によって決定される特定の値又は組成に対する許容可能な誤差範囲に含まれる値又は組成を指し、その値又は組成がどのように測定され又は決定されるのか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」又は「を本質的に含む、を本質的に含んでいる（comprising essentially of）」は、当該技術分野における１回の実施当たりの１つ以上の標準偏差の範囲内を意味し得る。「約」又は「を本質的に含む、を本質的に含んでいる」は、最大１０％（すなわち±１０％）の範囲を意味し得る。したがって、「約」は、示される値よりも１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、又は０．００１％大きい又は小さい範囲に含まれると理解され得る。例えば、約５ｍｇは、４．５ｍｇ〜５．５ｍｇの間の任意の量を含み得る。さらに、特に生物学的なシステム又はプロセスに関して、上記用語は、或る値の最大１０倍又は最大５倍を意味する場合がある。特定の値又は組成が本開示で提供される場合、別段の指示がない限り、「約」又は「を本質的に含む、を本質的に含んでいる」の意味は、その特定の値又は組成に対する許容可能な誤差の範囲に含まれるとされる。
【０１４５】
本明細書に記載されるように、任意の濃度範囲、パーセンテージの範囲、比率範囲、又は整数の範囲は、別段の指示がない限り、述べられる範囲に含まれる任意の整数、また適切な場合には、その分数（或る整数の１０分の１、及び１００分の１等）の値を含むものと理解される。
【０１４６】
本明細書で使用される単位、接頭辞及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ：Systeme International de Unites）の容認される形態で提示される。数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。
【０１４７】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この開示が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Juo, "The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", 2nd ed., (2001), CRC Press、"The Dictionary of Cell & Molecular Biology", 5th ed., (2013), Academic Press、及び"The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology", Cammack et al. eds., 2nd ed., (2006), Oxford University Pressは、この開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【０１４８】
「投与すること、投与する（Administering）」は、当業者に知られている様々な方法及び送達システムのいずれかを使用する、被験体に対する薬剤の物理的な導入を指す。本明細書に開示される製剤に対する例示的な投与経路として、例えば注射又は点滴による静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊柱又は他の非経口的な（parenteral：腸管外）投与経路が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」の句は、経腸及び局所の投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内の注射及び点滴、また同様にｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔を含む。幾つかの実施形態では、上記製剤は、非経口的ではない経路、例えば経口で投与される。他の非経口的ではない経路として、局所、表皮、又は粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、経膣的、直腸、舌下又は局所的なものが挙げられる。また、投与は、例えば１回、複数回、及び／又は１つ以上の延長された期間に亘って行われ得る。
【０１４９】
「抗体」（Ａｂ）の用語は、限定されず、抗原に特異的に結合する糖タンパク質免疫グロブリンを含む。一般に、抗体は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖、又はそれらの抗原結合分子を含み得る。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメイン、すなわちＣＬを含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存される領域が介在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分され得る。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順で並ぶ、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。Ａｂの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【０１５０】
抗体として、例えば、モノクローナル抗体、組み換えにより生成された抗体、単一特異的抗体、多重特異的抗体（二重特異的抗体を含む）、ヒト抗体、操作された抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２本の重鎖分子及び２本の軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖−抗体重鎖対、イントラボディ（intrabodies）、抗体融合体（本明細書では「抗体コンジュゲート」と称されることがある）、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ（affybodies）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば抗−抗−Ｉｄ抗体を含む）、ミニボディ（minibodies）、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と称されることがある）、及び上記のいずれかの抗原結合フラグメントが挙げられ得る。或る特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。
【０１５１】
免疫グロブリンは、限定されないが、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む、一般的に知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスもまた、当業者に良く知られており、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＡｂクラス又はサブクラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。「抗体」の用語は、例として、天然起源と非天然起源の両方のＡｂ、モノクローナル及びポリクローナルのＡｂ；キメラＡｂ及びヒト化Ａｂ；ヒトＡｂ又は非ヒトＡｂ；全合成Ａｂ；並びに単鎖Ａｂを含む。非ヒトＡｂは、ヒトにおけるその免疫原性を減少させるため、組み換え法によってヒト化され得る。明確に述べられない場合、また別段の指示がない限り、「抗体」の用語は、前述の免疫グロブリンのいずれかの抗原結合フラグメント又は抗原結合部分も含み、一価及び二価のフラグメント又は部分、並びに単鎖Ａｂを含む。
【０１５２】
「抗原結合分子」、「抗原結合部分」又は「抗体フラグメント」は、抗体の抗原結合部（例えばＣＤＲ）を含む任意の分子を指し、この分子は該抗体に由来する。抗原結合分子は、抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。抗体フラグメントの例として、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、ｄＡｂ、直鎖抗体、ｓｃＦｖ抗体、並びに抗原結合分子から形成される多重特異性抗体が挙げられる。ペプチボディ（Peptibodies）（すなわち、ペプチド結合ドメインを含むＦｃ融合分子）は、好適な抗原結合分子の別の例である。幾つかの実施形態では、抗原結合分子は腫瘍細胞上の抗原に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合分子は、過剰増殖性疾患（hyperproliferative disease）に関与する細胞上の抗原、又はウイルス若しくは細菌の抗原に結合する。或る特定の実施形態では、抗原結合分子はＢＣＭＡ、ＣＬＬ−１又はＦＬＴ３に結合する。更なる実施形態では、抗原結合分子は、その１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗原に特異的に結合する抗体フラグメントである。更なる実施形態では、抗原結合分子は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。幾つかの実施形態では、抗原結合分子は、アビマー（avimers）を含む、又はそれからなる。
【０１５３】
本明細書で使用される「可変領域」又は「可変ドメイン」の用語は、交換可能に使用され、当該技術分野において一般的である。可変領域は、典型的には抗体の一部、一般的には、軽鎖又は重鎖の一部、典型的には成熟重鎖中のアミノ末端の約１１０個〜１２０個のアミノ酸、及び成熟軽鎖中の約９０個〜１１５個のアミノ酸を指し、それらは、抗体間で配列が広範囲に異なり、その特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性において使用される。配列における可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される領域に濃縮されるのに対し、可変ドメイン中のより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と称される。いかなる特定の機構又は理論にも縛られることを望むものではないが、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、抗体の抗原との相互作用及び特異性を主として担うものと考えられる。或る特定の実施形態では、可変領域はヒト可変領域である。或る特定の実施形態では、可変領域は、齧歯類又はネズミ科のＣＤＲ、及びヒトのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の実施形態では、可変領域は霊長類（例えば非ヒト霊長類）の可変領域である。或る特定の実施形態では、可変領域は、齧歯類又はネズミ科のＣＤＲ、及び霊長類（例えば非ヒト霊長類）のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【０１５４】
本明細書で使用されるように、抗原と、第１の結合分子、抗体又はその抗原結合分子との相互作用が、参照結合分子、参照抗体又はその抗原結合分子の抗原と相互作用する能力を遮断する、制限する、阻害する、又は減少させる場合、抗原結合分子、抗体又はその抗原結合分子は、参照抗体又はその抗原結合分子と「交差競合する」。交差競合は、完全なものであってもよく、例えば、抗原に対する結合分子の結合が、参照結合分子の抗原に結合する能力を完全に遮断するか、又は交差競合は、部分的であってもよく、例えば、抗原に対する結合分子の結合が、参照結合分子の抗原に結合する能力を減少させる。或る特定の実施形態では、参照抗原結合分子と交差競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子と同じ、又はそれと重複するエピトープを結合する。他の実施形態では、参照抗原結合分子と交差競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子とは異なるエピトープを結合する。多くの種類の競合結合アッセイ、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；固相直接又は間接酵素免疫定量法（ＥＩＡ）；サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552）；及び直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82）を使用して、或る一つの抗原結合分子が他方と競合するかどうかを判断することができる。
【０１５５】
「抗原」は、免疫応答を誘発する、又は抗体若しくは抗原結合分子によって結合されることが可能な任意の分子を指す。免疫応答は、抗体産生若しくは特定の免疫適格細胞（immunologically-competent cells）の活性化のいずれか、又はそれらの両方を含み得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役割を果たし得ることを容易に理解する。抗原は内因性に発現され得て、すなわちゲノムＤＮＡによって発現され得るか、又は組み換えによって発現され得る。抗原は、癌細胞等の特定の組織に特異的となり得るか、又は広く発現され得る。さらに、より大きな分子のフラグメントが抗原として作用し得る。一実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。
【０１５６】
「同種異系」の用語は、一個体に由来する任意の材料を指し、該材料はその後、同種の別の個体に導入される（例えば同種異系Ｔ細胞移植）。
【０１５７】
「形質導入」及び「形質導入された」の用語は、外来ＤＮＡがウイルスベクターによって細胞へと導入されるプロセスを指す（Jones et al., "Genetics: principles and analysis," Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)を参照されたい）。幾つかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０１５８】
「癌」は、身体における異常な細胞の制御されていない成長を特徴とする、幅広い各種疾患のグループを指す。制御されていない細胞の分裂及び成長は、隣接する組織に侵入して、またリンパ系又は血流によって身体の離れた部分へと転移し得る、悪性腫瘍の形成をもたらす。「癌」又は「癌組織」は、腫瘍を含む場合がある。本発明の方法によって治療され得る癌の例として、限定されないが、リンパ腫、白血病、骨髄腫、及び他の白血球の悪性腫瘍（leukocyte malignancies）を含む免疫系の癌が挙げられる。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣ：primary mediastinal large B cell lymphoma）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ：diffuse large B cell lymphoma）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、形質転換後濾胞性リンパ腫（transformed follicular lymphoma）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ：splenic marginal zone lymphoma）、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性又は急性の白血病、急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病（chronic myeloid leukemia）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（非Ｔ細胞ＡＬＬを含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、幼少期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍（spinal axis tumor）、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、石綿によって誘導されるものを含む、環境によって誘導される癌、他のＢ細胞悪性腫瘍、及び上記癌の組み合わせに由来する腫瘍のサイズを減少するため使用され得る。特定の一実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。特定の癌は、化学療法又は放射線療法に反応性となり得るが、そうでなければその癌は難治性となり得る。難治性癌は、外科的処置に適用できない癌を指し、その癌は最初に化学療法若しくは放射線療法に無反応であるか、又はその癌は経時的に無反応となるいずれかである。
【０１５９】
本発明の方法により治療され得る更なる癌の例には、再発性又は治療抵抗性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、特定不能のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫又は濾胞性リンパ腫に起因するＤＬＢＣＬが含まれる。
【０１６０】
本明細書に使用される「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、転移の数の減少、全体生存期間又は無増悪生存期間の増加、平均余命の増加、又は腫瘍と関係する様々な生理学的症状の改善として提示され得る、生物学的効果を指す。また、抗腫瘍効果は、腫瘍の発生の予防、例えばワクチンを指す場合がある。
【０１６１】
本明細書で使用される「サイトカイン」は、特異抗原との接触に反応して１つの細胞によって放出される非抗体タンパク質を指し、ここで、サイトカインは第２の細胞と相互作用して、第２の細胞における反応を媒介する。サイトカインは、細胞によって内因性に発現され得るか、又は被験体に投与され得る。サイトカインは、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び肥満細胞を含む免疫細胞によって放出されて、免疫応答を伝播し得る。サイトカインは、レシピエント細胞において様々な反応を誘導し得る。サイトカインは、ホメオスタシスサイトカイン（homeostatic cytokines）、ケモカイン、炎症誘発性サイトカイン、エフェクター及び急性期タンパク質を含み得る。例えば、インターロイキン（ＩＬ）７及びＩＬ−１５を含むホメオスタシスサイトカインは、免疫細胞の生存及び増殖を促進し、炎症誘発性サイトカインは炎症反応を促進し得る。ホメオスタシスサイトカインの例として、限定されないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１５及びインターフェロン（ＩＦＮ）γが挙げられる。炎症誘発性サイトカインの例として、限定されないが、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７ａ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＴＮＦ−β、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、可溶性細胞間接着分子１（ｓＩＣＡＭ−１）、可溶性血管接着分子１（ｓＶＣＡＭ−１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ及び胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）が挙げられる。エフェクターの例として、限定されないが、グランザイムＡ、グランザイムＢ、可溶性Ｆａｓリガンド（ｓＦａｓＬ）及びパーフォリンが挙げられる。急性期タンパク質の例として、限定されないが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）が挙げられる。
【０１６２】
「ケモカイン」は細胞走化性又は指向性運動を媒介するサイトカインの一種である。ケモカインの例として、限定されないが、ＩＬ−８、ＩＬ−１６、エオタキシン、エオタキシン−３、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ又はＣＣＬ２２）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１又はＣＣＬ２）、ＭＣＰ−４、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１ａ）、ＭＩＰ−１β（ＭＩＰ−１ｂ）、ガンマ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、並びに胸腺及び活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ又はＣＣＬ１７）が挙げられる。
【０１６３】
「治療的有効量」、「有効用量」、「有効量」又は「治療的に有効な投薬量」の治療剤、例えば操作されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、単独で又は別の治療剤と組み合わせて使用された場合に、疾患の発症から被験体を保護する、又は疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度及び持続期間の増加、若しくは疾患の罹患に起因する機能障害若しくは身体障害の予防によって明示される疾患の退縮を促進する、任意の量である。治療剤の疾患の退縮を促進する能力は、熟練した医師に知られている様々な方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト被験体において、ヒトにおける効能を予測する動物モデル系において、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによって評価され得る。
【０１６４】
本明細書で使用される「リンパ球」の用語は、ナチュラルキラー（ＮＫ：natural killer）細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞を含む。ＮＫ細胞は、生得免疫系の主な成分を占める細胞傷害性（細胞毒性）リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は腫瘍及びウイルスによって感染された細胞を拒絶する。ＮＫ細胞は、アポトーシス又はプログラム細胞死のプロセスによって作用する。ＮＫ細胞は、細胞を死滅させるために活性化を必要としないことから、「ナチュラルキラー」と名付けられた。Ｔ細胞は、細胞媒介免疫（抗体が関与しない）において主な役割を果たす。そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、他の種類のリンパ球からそれら自体を分化させる。免疫系の特殊化された器官である胸腺は、主としてＴ細胞の成熟を担う。６種類のＴ細胞、すなわち、ヘルパーＴ細胞（例えばＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔ−キラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はキラーＴ細胞としても知られる）、メモリーＴ細胞（（ｉ）ナイーブ細胞のようなステムメモリーＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋及びＩＬ−７Ｒα＋であるが、それらは、大量のＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３及びＬＦＡ−１を発現し、メモリー細胞に特有の多数の機能的な属性を示す；（ｉｉ）セントラルメモリーＴＣＭ細胞は、Ｌ−セレクチン及びＣＣＲ７を発現し、ＩＦＮγ又はＩＬ−４ではなくＩＬ−２を分泌する；並びに（ｉｉｉ）エフェクターメモリーＴＥＭ細胞はＬセレクチンもＣＣＲ７も発現しないものの、ＩＦＮγ及びＩＬ−４のようなエフェクターサイトカインを産生する）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、サプレッサーＴ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）及びγδＴ細胞が存在する。一方、Ｂ細胞は、液性免疫（抗体が関与する）で最も重要な役割を果たす。Ｂ細胞は抗体及び抗原を作製し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の役割を行い、抗原の相互作用による活性化の後、メモリーＢ細胞となる。哺乳動物では、未成熟Ｂ細胞は、骨髄で形成される。
【０１６５】
「遺伝子操作された」、「操作された」又は「改変された」の用語は、限定されるものではないが、コーディング領域若しくは非コーディング領域若しくはそれらの一部を欠失させることによる、又はアンチセンス技術による、又はコーディング領域若しくはそれらの一部を導入しているタンパク質の発現の増加による、遺伝子中の欠損の生成を含む細胞の改変方法を指す。幾つかの実施形態では、改変される細胞は、患者又はドナーのいずれかから取得することができる、幹細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）である。細胞を改変して、細胞のゲノムに組み込まれ得る、外因性コンストラクト、例えば、プレＴＣＲαタンパク質、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等を発現させてもよい。
【０１６６】
「免疫応答」は、侵入病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、癌性若しくは他の異常な細胞、又は自己免疫若しくは病理学的炎症の場合、正常なヒトの細胞若しくは組織の選択的な標的化、それらへの結合、それらに対する損傷、それらの破壊、及び／又は脊椎動物の身体からのそれらの排除をもたらす、免疫系の細胞（例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、及び好中球）及びこれらの細胞のいずれか又は肝臓によって産生される可溶性高分子（Ａｂ、サイトカイン、及び補体を含む）の作用を指す。
【０１６７】
「免疫療法」の用語は、免疫応答を誘導する、増強する、抑制する、又は修飾することを含む方法による、疾患に冒された、又は疾患にかかる若しくは疾患の再発を患うリスクがある被験体の治療を指す。免疫療法の例として、限定されないが、Ｔ細胞療法が挙げられる。Ｔ細胞療法は、養子Ｔ細胞療法（adoptive T cell therapy）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）免疫療法、自己細胞治療、操作された自己細胞療法（ｅＡＣＴ（商標））、及び同種異系Ｔ細胞移植を含み得る。しかしながら、当業者は、本明細書に開示されるコンディショニング法（conditioning methods）が任意の移植Ｔ細胞療法の有効性を増強し得ることを認識するであろう。Ｔ細胞療法の例は、米国特許出願公開第２０１４／０１５４２２８号及び同第２００２／０００６４０９号、米国特許第５，７２８，３８８号及び国際公開第２００８／０８１０３５号に記載される。
【０１６８】
免疫療法のＴ細胞は、当該技術分野において知られている任意の供給源に由来し得る。例えば、Ｔ細胞は、造血幹細胞集団、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、胚性幹細胞（ＥＳ）からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化されてもよく、又はＴ細胞は被験体から得られてもよい。Ｔ細胞を、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍から得ることができる。さらに、Ｔ細胞は、当該技術分野において利用可能な１つ以上のＴ細胞株に由来してもよい。また、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離及び／又はアフェレーシス（apheresis）等の当業者に知られている任意の多くの技術を使用して被験体から収集された血液単位から得ることもできる。Ｔ細胞療法用のＴ細胞を単離する更なる方法は、米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８号に開示され、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１６９】
「ｅＡＣＴ（商標）」と略記することができ、養子細胞移植としても知られる「操作された自己細胞療法」の用語は、患者自身のＴ細胞を収集し、その後、１つ以上の特定の腫瘍細胞又は悪性腫瘍の細胞表面上に発現される１つ以上の抗原を認識し、標的とするように遺伝的に変更するプロセスである。Ｔ細胞は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作され得る。ＣＡＲ陽性（＋）Ｔ細胞は、少なくとも１つの共刺激ドメイン及び少なくとも１つの活性化ドメインを含む細胞内シグナル伝達部に連結された特定の腫瘍抗原に対する特異性を有する細胞外単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現するように操作される。共刺激ドメインは、天然起源の共刺激ドメイン、又はその変異体、例えば短縮ヒンジドメイン（「ＴＨＤ」）を有する変異体に由来し得て、活性化ドメインは、例えばＣＤ３−ζに由来し得る。或る特定の実施形態では、ＣＡＲは２個、３個、４個又はそれ以上の共刺激ドメインを有するように設計される。ＣＡＲ  ｓｃＦｖは、例えば、全ての正常なＢ細胞、並びに限定されないがＮＨＬ、ＣＬＬ、及び非Ｔ細胞ＡＬＬを含むＢ細胞悪性腫瘍を含む、Ｂ細胞系統の細胞によって発現される膜貫通タンパク質であるＣＤ１９を標的とするように設計され得る。幾つかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインが別々のポリペプチド鎖として発現されるように操作される。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法及びコンストラクトの例は、米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８号、同第２０１４／０２２７２３７号、同第２０１４／００９９３０９号、及び同第２０１４／００５０７０８号に記載され、これらの引用文献はそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１７０】
本明細書で使用される「患者」は、癌（例えばリンパ腫又は白血病）に冒された任意のヒトを含む。「被験体」及び「患者」の用語は、本明細書では区別なく使用される。
【０１７１】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞」の用語は、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養される任意の細胞を指す。特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞はＴ細胞を含み得る。
【０１７２】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」の用語は区別なく使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含み、タンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いにつながれた２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるように、上記用語はまた、当該技術分野において、例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと一般的に称される短い鎖と、当該技術分野において一般的にはタンパク質と称され、多くの種類が存在する、より長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」として、例えば、特に、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同性のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類縁体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。
【０１７３】
本明細書で使用される「刺激」は、その同族のリガンドと刺激分子を結合することによって誘導される一次応答を指し、ここで、その結合はシグナル伝達事象を媒介する。「刺激分子」は、Ｔ細胞上の分子、例えば、抗原提示細胞上に存在する同族の刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を指す。「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）上に存在する場合、Ｔ細胞上の刺激分子と特異的に結合することができ、それによって、限定されないがＴ細胞の活性化、免疫応答の開始、増殖等を含むＴ細胞による一次応答を媒介するリガンドである。刺激リガンドとして、限定されないが、抗ＣＤ３抗体、ペプチドで充填されたＭＨＣクラスＩ分子、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体が挙げられる。
【０１７４】
本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション等の一次シグナルと組み合わせて、限定されないがＴ細胞の増殖及び／又は主要な分子の上方制御若しくは下方制御等のＴ細胞の応答をもたらすシグナルを指す。
【０１７５】
本明細書で使用される「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族の共同刺激分子を特異的に結合する抗原提示細胞上の分子を含む。共刺激リガンドの結合は、限定されないが、Ｔ細胞の増殖、活性化、分化等を含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドは、一次シグナルに加えて、刺激分子によって、例えば、ペプチドがロードされた主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子とのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体の結合によって提供されるシグナルを誘導する。共刺激リガンドとして、限定されないが、３／ＴＲ６、４−１ＢＢリガンド、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ：herpes virus entry mediator）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、ＩＬＴ４、免疫グロブリン様転写物（ＩＬＴ：immunoglobulin-like transcript）３、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、Ｂ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンド、リンフォトキシンβ受容体、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＯＸ４０リガンド、ＰＤ−Ｌ２、又はプログラム細胞死（ＰＤ）Ｌ１が挙げられ得る。共刺激リガンドとして、限定されず、４−１ＢＢ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７、ＩＣＯＳ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ナチュラルキラー細胞受容体Ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＯＸ４０、ＰＤ−１、又は腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４又はＬＩＧＨＴ）等のＴ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、限定されないが増殖等のＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーである。共刺激分子として、限定されないが、「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、限定されないが増殖等のＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーである。共刺激分子として、限定されないが、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ１６、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３（α；β；δ；ε；γ；ζ）、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３リガンド、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、ＤＡＰ−１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃγ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ１、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８））、ＭＨＣクラスＩ分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ−１、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ−３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ；Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＮＦ、ＴＮＦｒ、ＴＮＦＲ２、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１若しくはＶＬＡ−６、又はそれらのフラグメント、短縮物、若しくは組み合わせが挙げられる。
【０１７７】
「減少する、減少させる（reducing）」及び「減じる（decreasing）」の用語は、本明細書において区別なく使用され、本来よりも少ない、あらゆる変化を示す。「減少する、減少させる」及び「減じる」は測定前と測定後の比較を必要とする、相対的な用語である。「減少する、減少させる」及び「減じる」は完全な欠乏を含む。
【０１７８】
被験体の「治療（Treatment）」又は被験体を「治療する、治療すること（treating）」は、症状、合併症若しくは病状の発症、進行、発現、重症度若しくは再発、又は疾患と関連する生化学的指標の転換、緩和、改善、阻害、遅延又は予防の目的で、被験体に対して行われる任意の種類の処置若しくはプロセス、又は被験体に対する有効成分の投与を指す。一実施形態では、「治療」又は「治療する、治療すること」は部分寛解を含む。別の実施形態では、「治療」又は「治療する、治療すること」は完全寛解を含む。
【０１７９】
本明細書で使用される場合に、「ＴＣＲ代用物（TCR proxy）」は、内因性ＴＣＲ及び／又はプレＴＣＲの不存在下で幹細胞からのＴ細胞の発生を可能にする又は容易にする下流シグナル伝達エレメントを惹起する分子（例えば、ペプチド、タンパク質、合成分子等）である。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲ代用物は、規定されたＴＣＲ、プレＴＣＲ、ｐＴａ単量体、ｐＴａ／ＴＣＲβヘテロ二量体、ＴＣＲα分子、ＴＣＲβ分子、ＴＣＲγ分子、ＴＣＲδ分子、ＴＣＲα／βヘテロ二量体、ＴＣＲγ／δヘテロ二量体、先の分子のホモ二量体、ＴＣＲ様分子又はＴＣＲシグナルを惹起してＴ細胞発生を可能にする他の分子である。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲ代用物は１つ以上の分子（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれより多くの分子）を含む。幾つかの実施の形態では、１つ以上の分子はタンパク質である。幾つかの実施の形態では、ＴＣＲ代用物はタンパク質複合体である。
【０１８０】
本明細書で使用される場合に、「選択可能」の用語は分子が抗体により標的化され得ることを意味する。幾つかの実施の形態では、選択可能な表面マーカーは抗原結合分子（例えば、抗体）によって標的化され得る表面上に発現される分子である。
【０１８１】
パーセント同一性を計算するため、典型的には、配列間の最も大きな一致を与える方法で比較される配列を整列させる。パーセント同一性を特定するために使用され得るコンピュータープログラムの一例は、ＧＡＰ（Devereux et al., (1984), Nucl. Acid Res. 12:387、ウィスコンシン州マディソンのウィスコンシン大学、Genetics Computer Group）を含むＧＣＧプログラムパッケージである。コンピューターアルゴリズムであるＧＡＰを使用して、パーセント配列同一性が特定される２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを整列させる。配列を、それらの各アミノ酸又はヌクレオチドの最適なマッチング（アルゴリズムによって特定される、「一致スパン（matched span）」）について整列させる。また或る特定の実施形態では、上記アルゴリズムによって、標準的な比較マトリクス（Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix、Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrixを参照されたい）が使用される。
【０１８２】
本発明の様々な態様は、以下のサブセクションに更に詳細に記載される。
【０１８３】
詳細な説明
本開示は、とりわけ、Ｔ細胞へと効率的に分化する改変された多能性幹細胞、遺伝子操作された幹細胞及びそれらの派生物、並びにそれらの製造方法及び使用方法を提供する。特に、本開示は、操作された免疫療法のために自家又は同種異系の状況で使用され得る幹細胞の生成を提供する。細胞ベースの免疫療法で使用する場合に、本明細書に記載される改変された多能性幹細胞は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを軽減又は排除し、レシピエントのＴ細胞及びＮＫ細胞による排除に対する耐性をもたらし、制御可能なＴ細胞活性を可能にし得る（例えば、自殺遺伝子又はキルスイッチを含むように操作される）。
【０１８４】
養子細胞療法からのＴ細胞応答はレシピエント由来のＴ細胞によって媒介され得る。移植片拒絶反応は、外因性導入遺伝子に対する免疫原性、ヒト組織適合性抗原（ＨＬＡ）の不一致に対する反応性（非血縁／半合致）又はマイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）（例えば、ＨＡ−１、ＨＡ−２等）に対する反応性（血縁／非血縁ＨＬＡ一致／半合致）に起因する場合がある。ドナーＴ細胞によって応答が媒介されることでも、ＨＬＡ／ＭｉＨＡの不一致に対する反応性からＧＶＨＤにつながる場合があり、腫瘍抗原／腫瘍関連ＭｉＨＡに対する反応性から抗腫瘍事象につながる場合がある。
【０１８５】
細胞療法に対する宿主免疫反応性（例えば、ＨＬＡ又はＭｉＨＡの不一致により誘発されるＧＶＨＤ）を防ぐために、一態様では、本開示は、内因性ＴＣＲ発現を排除するように操作された改変された多能性幹細胞を提供する。幾つかの実施形態では、内因性ＴＣＲの遺伝子編集はＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ（ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２）のノックアウト（ＫＯ）によって操作される。幾つかの実施形態では、細胞は（細胞源及び分化状態に依存して）ＲＡＧ１／ＲＡＧ２のＫＯによって操作される。
【０１８６】
移植片拒絶反応を防ぐために、本開示は、ドナーＨＬＡの発現を遮断するように及び／又は１つのＨＬＡ−クラスＩ「非多型」アレルを再導入してＮＫ殺傷（例えば、単鎖ＨＬＡ−Ｅ）を防ぐように操作された改変された多能性幹細胞を提供する。幾つかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子（例えば、β２ミクログロブリン、個々のＨＬＡ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ）、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及び／又は裸リンパ球症候群Ｉ型（ＢＬＳＩ）と関連する遺伝子）に改変が加えられる。幾つかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子（例えば、転写因子（ＲＦＸＡＮＫ又はＲＦＸ５又はＲＦＸＡＰ）又はトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ＢＬＳ  ＩＩに関連する遺伝子及び／又は個々のＨＬＡ分子（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯのα鎖及びβ鎖））に改変が加えられる。幾つかの実施形態では、腫瘍反応性を促進するように改変が加えられる（例えば、腫瘍特異的ＴＣＲ又はＣＡＲの導入）。幾つかの実施形態では、細胞は阻害受容体（例えば、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４）を排除するように更に改変される。幾つかの実施形態では、細胞は共刺激受容体（例えば、ＣＤ２８、ＴＮＦＲＳＦ９）を導入するように改変される。
【０１８７】
多能性幹細胞
様々な多能性幹細胞を、本発明の実施のために使用することができる。例えば、骨髄（臍帯血又は末梢血も）中の造血幹細胞（ＨＳＣ）は、他の全ての成熟血液細胞に加えて、拘束性胸腺始原体を生み出す。これらの胸腺始原体は胸腺に移動し、そこで成熟Ｔ細胞への発達を始める。Ｄｅｌｔａ及びＪａｇｇｅｄ、特に胸腺中のＮｏｔｃｈ１及びＤｅｌｔａ様４というリガンドを介したＮｏｔｃｈ受容体のシグナル伝達は、転写カスケード（すなわち、Ｔｃｆ７、Ｇａｔａ３、Ｂｃｌ１１ｂ等）を駆動し、それがリコンビナーゼ活性化遺伝子ＲＡＧ１及びＲＡＧ２によるＴＣＲ遺伝子座の再構成をもたらす。最初に産生的なＴＣＲβの再構成（すなわち、ＴＣＲタンパク質を生ずる）は、ｐＴａと対をなして表面に移動するタンパク質を生成する。この表面トラフィッキングはシグナルを細胞へと返送し、こうして更なる発達の進行が可能となる。表面のｐＴａ−ＴＣＲβは、成熟ＴＣＲで起こるようにＭＨＣと相互作用する必要はなく、生存シグナルは、ペプチド：ＭＨＣとは独立であり得る。次いで、細胞はＴＣＲαの再構成に進み、α／βのペアリングの成功と自己ペプチド：ＭＨＣの弱い認識（すなわち、正の選択及び負の選択又は中枢性トレランス）とについて精査された後に、成熟ナイーブＴ細胞となり、末梢に循環する。生産的なＴＣＲβ及び／又はＴＣＲαを生成することができないＴ細胞は、表面ＴＣＲ複合体を発現せず、細胞に発生又は成熟し続けるように指示するシグナルを受信しないこととなり、最終的には死に至る。本明細書に記載されるように、多能性幹細胞はＴ細胞応答を調節し、分化を制御するように改変される。
【０１８８】
幾つかの実施形態では、胚性幹細胞（ＥＳ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）が使用され得る。適切なＨＳＣ、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞及びその他の幹細胞は、培養された不死化細胞系統であっても又は患者から直接単離されてもよい。幹細胞の単離、発達及び／又は培養のための様々な方法は、当該技術分野において知られており、本発明の実施のために使用することができる。
【０１８９】
幾つかの実施形態では、幹細胞はリプログラムされたＴ細胞から作製された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。本明細書に記載されるように、幹細胞由来Ｔ細胞は操作された免疫療法のために自家又は同種異系の状況で使用され得る。
【０１９０】
幾つかの実施形態では、原料物質はＴ細胞又は非Ｔ細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。原料物質は胚性幹細胞であり得る。原料物質はＢ細胞又は末梢血単核細胞分離株、造血前駆細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞からの任意の他の細胞又は任意の他の体細胞型であり得る。
【０１９１】
多能性幹細胞の改変
本発明によれば、ｉＰＳＣ又はその他の幹細胞（例えば、胚性幹細胞）の改変を用いて、多数の、ことによると無限の数の、所望の系譜を有する操作されたＴ細胞を作製することができる。本発明により、操作された幹細胞からＴ細胞に分化することが可能な改変された幹細胞が作製される。例示的な改変方略は図１及び図２に示されている。
【０１９２】
改変のために標的化される遺伝子座は内因性プロモーターを利用する又は抗原受容体の発現を駆動する外因性プロモーターを含む標的化方略を使用して決定され得る。幾つかの実施形態では、標的化される遺伝子座は内因性プロモーターを使用するαβＴ細胞の生産的に再構成されたＴＲＡＣ遺伝子座又はＴＲＢＣ遺伝子座である。幾つかの実施形態では、遺伝子座は内因性プロモーター又は外因性プロモーターを使用するＴＲＧＣ又はＴＲＤＣである。
【０１９３】
幾つかの実施形態では、遺伝子座は外因性プロモーターを有する生産的／非生産的なＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ又はＴＲＧＣ又はＴＲＤＣである。標的化方略は外因性プロモーターを有する／有しない生産的／非生産的なＴＲＡＣ又はＴＲＢＣの任意の組み合わせの１つ以上を利用することができる。
【０１９４】
本発明によれば、ＨＳＣ又はその他の幹細胞（胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）の改変を、多数の、ことによると無限の数の、所望の系譜を有する操作されたＴ細胞を作製するために使用することができる。
【０１９５】
本発明により、操作された幹細胞からＴ細胞に分化することが可能な改変された幹細胞が作製される。幾つかの実施形態では、細胞はＡＴＯシステムにおいて分化される。プレＴＣＲα（ｐＴａ）の導入及び／又はＴＣＲα（ＴＣＲα）のノックアウトは、強制的／持続的なＴＣＲβ（ＴＣＲβ）とのｐＴａのペアリングをもたらす。ｐＴａ−ＴＣＲβペアは、ＴＣＲαの不存在下で幹細胞が成熟Ｔ細胞に発達するために必要なシグナルをもたらす。ｐＴａ−ＴＣＲβはＴ細胞の分化を促進するが、宿主ペプチド：ＭＨＣ分子に対する反応性がない。ｐＴａは細胞によって天然に提供され得る又は操作された外因性コンストラクトとして提供され得る。幹細胞は操作されたＣＡＲ又は外因性ＴＣＲ、すなわち標的分子を認識する抗原受容体を有しても又は有しなくてもよい。標的分子は排除する組織（例えば、癌性病変又はその他）又は免疫寛容を誘導する組織（例えば、膵島細胞）で発現され得る。
【０１９６】
ｐＴａ−ＴＣＲβは（例えば、ＡＴＯによって）発生を駆動するのに十分であるが、一切抗原受容体の反応性を伝えない（すなわち、ＭＨＣに対する受容体の反応性がないため、ＴＣＲβを介してＧｖＨＤは起こらない）。したがって、本方法は表面発現されたＴＣＲ複合体を有するが、ＭＨＣ反応性を有しないＴ細胞の発生を可能にする。
【０１９７】
本発明の別の実施形態は、ｐＴａ及び／又は相補鎖、すなわちペプチド：ＭＨＣ若しくは他のリガンドを認識し得るｐＴａとは独立して抗原を認識することができるＴＣＲβ又はペプチド：ＭＨＣ若しくは他のリガンドを認識し得るＴＣＲβの使用を含む。ペプチド：ＭＨＣ又はリガンドは、幹細胞、発達中の胸腺細胞、成熟Ｔ細胞、共培養された細胞系統、ＡＴＯにおいて幹細胞と複合化した間質細胞系統又はその他の分化システムによって、天然に又は操作された状態で提供される。ｐＴａ及び／又はＴＣＲβはこのリガンドに天然に結合することができるか、ｐＴａ及び／又はＴＣＲβはこのリガンドに結合するように改変若しくは操作され得るか、又はリガンドは天然若しくは操作されたｐＴＡ及び／若しくはＴＣＲβに結合するように改変若しくは操作され得る。発生に対して得られた効果は、細胞増殖を増強又は妨害することができるか、Ｔ細胞の発生を加速又は減速することができるか、特定の発生段階でＴ細胞の発生を停止させることができるか、又は細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、限定されるものではないが、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７等を含むヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）、αβＴ細胞、γδＴ細胞、補助受容体非依存性（すなわち、ＣＤ４ＣＤ８二重陰性）の成熟αβＴ細胞又は成熟γδＴ細胞及びその他のような特定の系譜へと発生するように胸腺細胞を指向することができる。
【０１９８】
本発明の別の態様は、プレＴＣＲα（ｐＴａ）を導入する及び／又はＴＣＲα（ＴＣＲα）をノックアウトして、強制的又は持続的なＴＣＲβ（ＴＣＲβ）とのｐＴａのペアリングをもたらすことを含む、ＣＡＲ又はＴＣＲを発現する細胞の作製方法に関する。ｐＴａ−ＴＣＲβペアはＴＣＲαの不存在下で幹細胞が成熟Ｔ細胞に発達するために必要なシグナルをもたらす。ｐＴａは細胞によって天然に提供され得る又は操作された外因性コンストラクトとして提供され得る。幹細胞は操作されたＣＡＲ又は外因性ＴＣＲ、すなわち標的分子を認識する抗原受容体を有しても又は有しなくてもよい。標的分子は排除する組織（例えば、癌性病変又はその他）又は免疫寛容を誘導する組織（例えば、膵島細胞）で発現され得る。
【０１９９】
特定の標的遺伝子座のノックアウトは、操作されたヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ等）を用いて、ヌクレアーゼを用いずに、相同組換え（ＨＲ）又は当該技術分野で知られる他の遺伝子改変法によって達成され得る。標的遺伝子はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１、相同組換え、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）又は他の技術を使用して編集され得る。
【０２００】
遺伝子は上記の技術を使用してノックアウトされ得る。遺伝子をノックアウトして破壊されたままにすることもできる又は別の遺伝子を破壊された遺伝子の場所にノックインすることもできる。ノックインされる遺伝子は内因性遺伝子座の発現を利用するためにインフレームとなるように設計され得る。幾つかの実施形態では、外因性プロモーターをドナー（ノックイン）コンストラクトへと導入して、発現を駆動することができる。
【０２０１】
幹細胞は、操作されたＣＡＲ又は外因性ＴＣＲ、すなわち標的分子を認識する抗原受容体を有しても又は有しなくてもよい。標的分子は排除する組織（例えば、癌性病変又はその他）又は免疫寛容を誘導する組織（例えば、膵島細胞）で発現され得る。
【０２０２】
ヌクレアーゼ、ＨＲテンプレート、抗原受容体（すなわち、ＣＡＲ又はＴＣＲ）及び外因性コンストラクトはＤＮＡ又はＲＮＡのエレクトロポレーション、ウイルスを媒介した送達、受動移入等によって送達され得る。コンストラクトは生得の遺伝子調節エレメント、構成的な生理学的発現レベルを利用して内因性遺伝子座にノックインされ得る又は規定のプロモーターを含み得る。規定のプロモーターは、構成的に活性であり得る又は細胞発生及び／又は細胞周期等の別個の段階に限定され得る。
【０２０３】
ＭＨＣに関連する改変
幾つかの実施形態では、β２ミクログロブリンのノックアウトを使用することで、クラス１ａ  ＨＬＡ遺伝子の発現を排除して、操作された細胞のレシピエント（宿主）免疫系による細胞の認識を排除することができる。
【０２０４】
幾つかの実施形態では、宿主免疫系による低減又は排除はＭＨＣ  Ｉ複合体又はＭＨＣ  ＩＩ複合体へのペプチドのプロセシング又はローディングに関連する細胞機構を含む遺伝子の破壊によって達成され得る。例としては、限定されるものではないが、カルネキシン、ＢｉＰ、カルレティキュリン、ＥＲｐ５７、タパシン、ＴＡＰ、ＥＲＡＡＰ又はプロテアソーム若しくはイムノプロテアソームのタンパク質が含まれる。
【０２０５】
幾つかの実施形態では、遺伝子ＣＩＩＴＡ又はＲＦＸ５のノックアウトを使用して、ＭＨＣクラスＩＩの低減又は排除を達成することができる。標的細胞における特定の個々のＭＨＣ  Ｉ遺伝子及びＭＨＣ  ＩＩ遺伝子の標的化を使用して、ＭＨＣ  Ｉタンパク質及び／又はＭＨＣ  ＩＩタンパク質の発現を低減させる又は排除することもできる。
【０２０６】
関連する抗原受容体
幾つかの実施形態では、内因性ＴＣＲα遺伝子、ＴＣＲβ遺伝子、ＴＣＲγ遺伝子、ＴＣＲδ遺伝子の組換えを防ぐために、組換え関連遺伝子、例えばＲＡＧ１、ＲＡＧ２がノックアウトされる。幾つかの実施形態では、ＲＡＧ１／２ノックアウトを使用して、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の組換えを防ぐことができる。
【０２０７】
免疫認識を妨げるための遺伝子付加
ＮＫ細胞によるＭＨＣのない細胞の認識を妨げるために、幾つかの実施形態では、セミインバリアントＨＬＡ−Ｅ分子の導入が使用される。この分子はネイティブのＨＬＡ−Ｅ配列、コドン最適化／縮重改変配列、１つ以上のアミノ酸の除去によって生成されるＨＬＡ−Ｅの短縮形、ＨＬＡ−Ｅへの１つ以上のアミノ酸の付加によって生成されるＨＬＡ−Ｅの伸長形であり得る。ＨＬＡ−Ｅ分子はネイティブのＨＬＡ−Ｅ又は上記の任意の変異体及びβ２ミクログロブリンの融合物であり得る。β２ミクログロブリンはネイティブの配列、コドン最適化／縮重改変配列、アミノ酸の付加又は除去等であり得る。ＨＬＡ−Ｅ分子は、ＨＬＡ−Ｅ分子において、特にペプチド溝に結合するペプチド配列を含むような更なる融合物であり得る。幾つかの実施形態では、融合物の任意のセグメント間にリンカーを使用することができる。
【０２０８】
内因性プロモーターを利用して遺伝子座へとＨＬＡ−Ｅ分子を任意の形で導入して発現を駆動することによって、発現が誘導され得る。代替的に、コンストラクトは発現の駆動のために外因性プロモーターを有し得る。
【０２０９】
細胞産物の制御／排除
自殺遺伝子として知られる遺伝子を細胞産物へと組み込むことができる。この遺伝子の目的は有害事象、注入細胞の自己反応性、癌の根絶又はその他の場合に、遺伝子改変された細胞の排除を可能にすることである。幾つかの実施形態では、自殺遺伝子はランダムなゲノム位置又は標的化された遺伝子座（例えば、代謝遺伝子座、ＤＮＡ／ＲＮＡ複製遺伝子座等）に導入される。
【０２１０】
自殺遺伝子は外因性プロモーターによって駆動され得る又は組み込まれた遺伝子座の内因性プロモーターを利用することができる。
【０２１１】
幾つかの実施形態では、自殺遺伝子はガンシクロビルの導入により細胞の排除が可能となるｓｒ３９ＴＫである。この遺伝子を、陽電子放出断層撮影を使用して遺伝子改変された細胞をイメージングすることでレシピエント／宿主における細胞を局在化するために使用することもできる。
【０２１２】
自殺遺伝子はまた化学誘導型カスパーゼ、小分子／化学誘導型二量体化因子（ＣＩＤ）により誘導される二量体化であり得る。自殺遺伝子はまた抗体の導入によって抗体依存性細胞毒性、補体カスケード等により細胞を排除することができる選択可能な表面マーカー（ＣＤ１９又はＣＤ２０又はＣＤ３４又はＥＧＦＲ又はＬＮＧＦＲ等）であり得る。
【０２１３】
選択可能なマーカーの場合に、このマーカーは磁気ビーズ結合抗体、フローサイトメトリーによるソーティング、抗体による活性化等によって遺伝子改変された細胞を富化するために使用され得る。
【０２１４】
遺伝子改変された細胞は単一細胞クローンとして作製され得る。幾つかの実施形態では、細胞は１つの集団に由来し得る。
【０２１５】
ゲノムの全体又は一部をシーケンシングして、組込みの位置を特定及び／又は検証することができる。シーケンシングは最終的な細胞産物、マスターセルバンク等の作製の間の細胞系統のゲノムにおける変化を特定するために使用することもできる。
【０２１６】
ＴＣＲ代用物
発達中のＴリンパ球はαＴ細胞受容体及びβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座のゲノム再構成を受けて、各細胞に排他的なユニークなヘテロ二量体ＴＣＲが生成される。これらのＴＣＲは、別の細胞の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）にローディングされたペプチドとして提示されたあらゆる抗原を認識し得る。胸腺の発達における２つの別個の段階により、自己ＭＨＣと相互作用し得るが（ポジティブセレクション）、健康な自己抗原を認識しない（ネガティブセレクション）機能的な免疫細胞が身体を占めることが確実となる。これらの段階はＴＣＲとＭＨＣとの間の相互作用によって生成されるシグナルによって媒介される。シグナルが生成されない（例えば、ＴＣＲが自己ＭＨＣに結合し得ないため、免疫細胞が防御をもたらさない）場合には、細胞は「無視による細胞死」として知られるプロセスを経る。強いシグナルが生成される（例えば、ＴＣＲが自己ＭＨＣに強く結合する）場合に、細胞はアポトーシスを起こす。
【０２１７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるユニバーサル同種異系Ｔ細胞免疫療法（ａｌｌｏ）はレシピエント宿主に対する不所望な反応性を妨げるためにＴＲＡＣ遺伝子座及び／又はＴＲＢＣ遺伝子座について編集又は欠失されている細胞を含む。幹細胞由来のａｌｌｏの文脈では、いずれかの遺伝子の損失は胸腺細胞の部分的な発生をもたらすが、完全に成熟したナイーブＴ細胞の発生をもたらさない。ＴＲＡＣのノックアウトはＣＤ４ＣＤ８二重陽性段階で機能停止した細胞（例えば、内因性のプレＴＣＲα（ｐＴａ）とペアリングし得る機能的なＴＣＲβ遺伝子）を生ずる。ＴＲＢＣのノックアウトは二重陰性（ＤＮ）段階で停止した細胞をもたらす（決してＴＣＲシグナルを取得しない）。
【０２１８】
幾つかの実施形態では、細胞はＴＣＲ代用物を導入するように操作され得る。本明細書で使用される場合に、ＴＣＲ代用物は内因性ＴＣＲ及び／又はプレＴＣＲの不存在下で幹細胞からのＴ細胞の発生を可能にする又は容易にする下流シグナル伝達エレメントを惹起する分子（例えば、タンパク質）である。幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物は規定されたＴＣＲ、プレＴＣＲ、ｐＴａ単量体、ｐＴａ／ＴＣＲβヘテロ二量体、ＴＣＲα分子、ＴＣＲβ分子、ＴＣＲγ分子、ＴＣＲδ分子、ＴＣＲα／βヘテロ二量体、ＴＣＲγ／δヘテロ二量体、先の分子の任意のホモ二量体、ＴＣＲ様分子又はＴＣＲシグナルを惹起してＴ細胞発生を可能にする他の分子である。
【０２１９】
幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物は遺伝子編集されていない細胞で発現され、それが内因性遺伝子座の再構成及び／又は発現を抑制する（対立遺伝子排除）。幾つかの実施形態では、内因性ＴＣＲを欠くように編集された細胞において、ＴＣＲ代用物は正の生存シグナルを惹起し、成熟ナイーブＴ細胞への発生を駆動する。幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物は、既知のペプチド−ＭＨＣ（例えば、ウイルス抗原反応性ＴＣＲ、癌／精巣抗原反応性ＴＣＲ等）に対して反応性の、末梢Ｔ細胞からクローニングされたＴＣＲである。幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物はｐＴａ及びＴＣＲβ等のキメラ分子である。
【０２２０】
幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物は下流ＴＣＲシグナル（例えば、ＣＤ３鎖）を惹起するＴＣＲのサブコンポーネントである。幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物はＴＣＲシグナルをＴ細胞に与える完全合成分子である。
【０２２１】
幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物は治療用ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞で発現されると腫瘍抗原に結合することとなるＴＣＲ）である。幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物は治療用ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞で発現されると腫瘍抗原に結合することとなるＴＣＲ）ではない。
【０２２２】
幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物はキメラの、マウスの及び／又は操作された治療用ＴＣＲである。幾つかの実施形態では、ＴＣＲ代用物は非アロ反応性α／βＴＣＲ又はγ／δＴＣＲ、他のＴＣＲ鎖の１つを加えた／差し引いたプレＴＣＲ、単鎖ＴＣＲキメラ、Ｖドメインがない操作されたＴＣＲ変異体である。
【０２２３】
キメラ抗原受容体及びＴ細胞受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ又はＣＡＲ−Ｔ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、本発明により改変された多能性幹細胞へと導入され得る。これらの操作された受容体は、当該技術分野で知られる技術に従って、改変された多能性幹細胞に容易に挿入され、該多能性幹細胞により発現され得る。ＣＡＲにより、単一の受容体は、特異抗原を認識するとともに、その抗原に結合した場合に免疫細胞を活性化させてその抗原を持っている細胞を攻撃して破壊するよう、プログラム化され得る。これらの抗原が腫瘍細胞上に存在する場合、ＣＡＲを発現する免疫細胞は、腫瘍細胞を標的とし、死滅させることができる。キメラ抗原受容体は、共刺激（シグナル伝達）ドメインを含むことで、それらの効力が高められる。米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号、並びにKrause et al.及びFinney et al.（上記参照）、Song et al., Blood 119:696-706 (2012)、Kalos et al., Sci. Transl. Med. 3:95 (2011)、Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011)、及びGross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)を参照のこと。
【０２２４】
幾つかの実施形態では、短縮ヒンジドメイン（「ＴＨＤ」）を含む共刺激ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はそれらのフラグメント等の免疫グロブリンファミリーのメンバーの幾つか又は全てを更に含む。
【０２２５】
幾つかの実施形態では、ＴＨＤは、ヒト完全ヒンジドメイン（「ＣＨＤ」）に由来する。その他の実施形態では、ＴＨＤは、共刺激タンパク質の齧歯類、マウス、又は霊長類（例えば、非ヒト霊長類）ＣＨＤに由来する。幾つかの実施形態では、ＴＨＤは、共刺激タンパク質のキメラＣＨＤに由来する。
【０２２６】
本発明のＣＡＲ又はＴＣＲのための共刺激ドメインは、膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを更に含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合されるように設計され得る。膜貫通ドメインは、同様にＣＡＲの細胞内ドメインに融合され得る。幾つかの実施形態では、ＣＡＲ中のドメインの１つと本来関連性がある膜貫通ドメインが使用される。幾つかの場合においては、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避けることで、受容体複合体のその他のメンバーとの相互作用を最小限にするように、選択され得るか、又はアミノ酸置換により修飾され得る。膜貫通ドメインは、天然源又は合成源のいずれかに由来し得る。その起源が天然である場合に、上記ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明の特定の使用の膜貫通領域は、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ−１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃγ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−７Ｒα、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢｌ、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１；ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣクラス１分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ−４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ−３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ；Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＮＦ受容体タンパク質、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＳＦ１４、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、若しくはＶＬＡ−６、又はそれらのフラグメント、短縮形、若しくはそれらの組み合わせに由来し（すなわち含み）得る。
【０２２７】
任意に、短いリンカーは、ＣＡＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインのいずれか又は幾つかの間で結合を形成し得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリンの繰り返し（配列番号３）（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２）に由来し得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、３個〜２０個のアミノ酸、及びＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。
【０２２８】
本明細書に記載されるリンカーは、ペプチドタグとしても使用され得る。リンカーペプチド配列は、対象となる１つ以上のタンパク質を結合するための任意の適切な長さの配列であり得て、好ましくは、連結するペプチドの一方又は両方の適切な折り畳み及び／又は機能及び／又は活性を可能にするように十分に柔軟となるように設計される。したがって、リンカーペプチドは、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、又は２０個以下のアミノ酸の長さを有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーペプチドは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、又は少なくとも２０個のアミノ酸の長さを有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、少なくとも７個かつ２０個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１９個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１８個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１７個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１６個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１５個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１４個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１３個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１２個以下のアミノ酸、又は少なくとも７個かつ１１個以下のアミノ酸を有する。或る特定の実施形態では、リンカーは、１５個〜１７個のアミノ酸を有し、特定の実施形態では、１６個のアミノ酸を有する。幾つかの実施形態では、リンカーは、１０個〜２０個のアミノ酸を有する。幾つかの実施形態では、リンカーは、１４個〜１９個のアミノ酸を有する。幾つかの実施形態では、リンカーは、１５個〜１７個のアミノ酸を有する。幾つかの実施形態では、リンカーは、１５個又は１６個のアミノ酸を有する。幾つかの実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸を有する。幾つかの実施形態では、リンカーは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のアミノ酸を有する。
【０２２９】
幾つかの実施形態では、スペーサードメインが使用される。幾つかの実施形態では、スペーサードメインは、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、４−１ＢＢ、又は本明細書に記載されるその他の分子に由来する。幾つかの実施形態では、スペーサードメインは、小分子の添加に際して発現を制御するために、化学的に誘導されたダイマライザーを含み得る。幾つかの実施形態では、スペーサーは使用されない。
【０２３０】
本発明の操作されたＴ細胞の細胞内（シグナル伝達）ドメインは、活性化ドメインへのシグナル伝達をもたらし、次いでそれは免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であり得る。
【０２３１】
或る特定の実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、活性化ＮＫ細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８４、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、サイトカイン受容体、ＤＡＰ−１０、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｆｃγ受容体、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−７Ｒα、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）、インテグリン、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢｌ、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、Ｌｙ１０８）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１；ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＭＨＣクラス１分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ−４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）、ＰＳＧＬ１、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１；ＣＤ１５０；ＩＰＯ−３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４；２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＮＦ受容体タンパク質、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＳＦ１４、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、若しくはＶＬＡ−６、又はそれらのフラグメント、短縮形、若しくはそれらの組み合わせを包含する（すなわち含む）が、それらに限定されない。
【０２３２】
ＴＣＲは、抗原反応性を伝えるために導入され得る。幾つかの実施形態では、抗原反応性は、ペプチドのＭＨＣ提示により限定される。ＴＣＲは、α／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ等であり得る。幾つかの実施形態では、ＴＣＲは、マウス定常鎖（２Ａ結合）を有するＨＰＶ−１６Ｅ７  ＴＣＲである。幾つかの実施形態では、それらの鎖は、ＩＲＥＳ又は任意の２Ａファミリーのメンバーの配列（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ等）によって連結され得る。幾つかの実施形態では、ＴＣＲは、ＨＰＶ認識ＴＣＲ、又はその他のウイルス性反応性ＴＣＲ（例えば、ＥＢＶ、インフルエンザ等）である。幾つかの実施形態では、癌反応性ＴＣＲ又は癌関連抗原反応性ＴＣＲが使用され得る（例えば、ＮＹＥＳＯ、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００等）。
【０２３３】
幾つかの実施形態では、ＴＣＲは、正常／健康なペプチド反応性又はその他の抗原反応性／拘束性のＴＣＲである。幾つかの実施形態では、ＴＣＲは、マウスＭＨＣ又はその他の非ヒトＭＨＣに対して反応性である。幾つかの実施形態では、ＴＣＲは、クラスＩ拘束性ＴＣＲ又はクラスＩＩ拘束性ＴＣＲである。
【０２３４】
抗原結合分子
適切なＣＡＲは、抗原（例えば、細胞表面抗原）に結合するように、その標的となる抗原と相互作用する抗原結合分子を導入することによって操作され得る。幾つかの実施形態では、抗原結合分子は、その抗体フラグメント、例えば１種以上の単鎖抗体フラグメント（「ｓｃＦｖ」）である。ｓｃＦｖは、互いに連結された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を有する単鎖抗体フラグメントである。米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号、並びにEshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136を参照のこと。ｓｃＦｖは、親抗体の標的抗原と特異的に相互作用する能力を維持している。ｓｃＦｖは、キメラ抗原受容体において有用である。それというのも、ｓｃＦｖは、その他のＣＡＲ成分と一緒に単鎖の一部として発現されるように操作され得るからである。同上。Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626)、Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797も参照のこと。抗原結合分子は、典型的には、対象となる抗原を認識して結合することができるようにＣＡＲの細胞外部分の範囲内に含まれることを理解されたい。対象となる２つ以上の標的に特異性を有する二重特異性及び多重特異性のＣＡＲが、本発明の範囲内で考慮される。
【０２３５】
幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明のＴＨＤと、標的抗原に特異的に結合する抗原結合分子とを含むＣＡＲ又はＴＣＲをコードする。幾つかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍抗原である。幾つかの実施の形態では、前記抗原は、腫瘍関連表面抗原（５Ｔ４等）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＢＣＭＡ、Ｂ−ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、ＣＡ−１２５、癌胚抗原（ＣＥＡ）、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＬＬ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＭＶ特異抗原、ＣＳ−１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ−４、ＤＬＬ３、ジシアロガングリオシドＧＤ２、膵管上皮ムチン、ＥＢＶ特異抗原、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＬＦ２Ｍ、エンドグリン、エフリンＢ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮性腫瘍抗原、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＦＬＴ３、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＨＢＶ特異抗原、ＨＣＶ特異抗原、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の組み合わせ、ＨＥＲＶ−Ｋ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ−１型エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＨＰＶ特異抗原、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＩＧＦＩ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、インフルエンザウイルス特異抗原、ＣＤ３８、インスリン成長因子（ＩＧＦｌ）−１、腸カルボキシルエステラーゼ、カッパー鎖、ＬＡＧＡ−１ａ、ラムダ鎖、ラッサ熱ウイルス特異抗原、レクチン反応性ＡＦＰ、系譜特異抗原又は組織特異抗原（ＣＤ３等）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、Ｍ−ＣＳＦ、黒色腫関連抗原、メソテリン、メソテリン、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＭＵＣ−１、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、変異ｐ５３、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、ＰＡＰ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、前立腺特異抗原タンパク質、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、表面接着分子、生存及びテロメラーゼ、ＴＡＧ−７２、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、並びにテネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ  Ａ１）、チログロブリン、腫瘍間質抗原、血管内皮細胞成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、ウイルス特異表面抗原（ＨＩＶ特異抗原（例えばＨＩＶ  ｇｐ１２０）等）と並んで、これらの表面マーカーの任意の誘導体又は変異体から選択される。
【０２３６】
ベクター、細胞及び医薬組成物
本明細書では、改変された多能性幹細胞の作製方法が提供される。様々なベクターを使用して、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＴＣＲ代用物、ｐＴａタンパク質又は任意のその他の対象の外因性タンパク質を導入することができる。
【０２３７】
当該技術分野において知られている任意のベクターが本発明に対して好適となり得る。幾つかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。幾つかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン−バールウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０２３８】
外因性プロモーターはヒト配列、マウス配列又は任意の他の種の配列のユビキチンＣ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、β−アクチン等であり得る。プロモーターはこれらの配列のゲノムのインフレーム版、スプライスアウトされたイントロン、無傷のイントロン等のフラグメント、又はこれらの配列の任意の部分的接合物を使用することができる。プロモーターはＬＴＲ等のウイルス性エレメントから得ることもできる。プロモーターの起源となるウイルスはＭＰＳＶ、ＭＳＧＶ、ＨＴＬＶ、ＨＩＶ等であり得る。スペーサードメインは小分子の添加時に滴定可能に発現を制御するためにスロットル（throttle）／化学誘導型二量体化因子を含み得る。
【０２３９】
本発明の細胞を、当該技術分野で知られている任意の供給源によって得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで造血幹細胞集団から分化されてもよく、又はＴ細胞は被験体から得られてもよい。Ｔ細胞は、例えば末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍から得られてもよい。さらに、Ｔ細胞は、当該技術分野において利用可能な１つ以上のＴ細胞株に由来し得る。また、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離及び／又はアフェレーシス等の当業者に知られている数多くの技術を使用して被験体から収集された血液単位から得られてもよい。或る特定の実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、後の処理に適切なバッファー又は培地に入れる。幾つかの実施形態では、細胞をＰＢＳで洗浄する。理解されるように、洗浄工程は、例えばＣｏｂｅ（商標）２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ（商標）等の半自動フロースルー遠心分離機等を使用することによって使用され得る。幾つかの実施形態では、洗浄された細胞を１つ以上の生体適合性のバッファー、又はバッファーを含む若しくは含まない他の生理食塩水溶液に再懸濁する。或る特定の実施形態では、アフェレーシス試料の望ましくない成分が除去される。Ｔ細胞療法用にＴ細胞を単離する追加の方法は、米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８号に開示され、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０２４０】
或る特定の実施形態では、幹細胞は、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離を使用することによる赤血球の溶解及び単球の枯渇によってＰＢＭＣから単離される。幾つかの実施形態では、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋のＴ細胞等のＴ細胞の特定の亜集団は、当該技術分野において知られている正又は負の選択技術によって更に単離される。例えば、負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負に選択される細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせによって遂行され得る。幾つかの実施形態では、負に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫付着（negative magnetic immunoadherence）又はフローサイトメトリーによる細胞の選別及び／又は選択を使用することができる。例えば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を富化するため、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２０及びＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を含む。或る特定の実施形態では、フローサイトメトリー及び細胞選別は、本発明における使用に対する目的の細胞集団を単離するために使用される。
【０２４１】
幾つかの実施形態では、ＰＢＭＣは、本明細書に記載される方法を使用して、免疫細胞（ＣＡＲ又はＴＣＲ等）により遺伝子修飾に直接使用される。或る特定の実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、Ｔリンパ球を更に単離し、遺伝子修飾及び／又は拡大の前又は後のいずれかに、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、ナイーブ、幹細胞メモリー、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、及びエフェクターのＴ細胞亜集団へと選別する。
【０２４２】
幾つかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、これら各種のＣＤ８＋細胞と関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ、幹細胞メモリー、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー、及びエフェクター細胞へと更に選別される。幾つかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーは、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに対して陰性である。幾つかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ６２Ｌ＋のＴ細胞である。幾つかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７に対して陰性であり、グランザイムＢ及びパーフォリンに対して陽性である。或る特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は亜集団へと更に選別される。例えば、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞及びエフェクター細胞へと選別され得る。
【０２４３】
幾つかの実施形態では、免疫細胞、例えばＴ細胞は、単離に続いて、既知の方法を使用して遺伝子修飾されるか、又は遺伝子修飾に先だってｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫細胞が活性化され、拡大される（すなわち、前駆細胞の場合、分化される）。別の実施形態では、免疫細胞、例えばＴ細胞は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体によって遺伝子修飾され（例えば、ＣＡＲをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターによって形質導入される）、次いでｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化及び／又は拡大される。Ｔ細胞を活性化及び拡大する方法は当該技術分野において知られており、例えば米国特許第６，９０５，８７４号、同第６，８６７，０４１号、及び同第６，７９７，５１４号、並びにＰＣＴ公報国際公開第２０１２／０７９０００号に記載され、それらの内容は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。一般的には、かかる方法は、ＰＢＭＣ又は単離されたＴ細胞と、一般的にはビーズ又は他の表面に付着された抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体等の刺激物質及び共刺激物質とを、ＩＬ−２等の適切なサイトカインを含む培養培地中で接触させることを含む。同じビーズに付着された抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は、「代理」抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役割を果たす。一例は、ヒトＴ細胞の生理学的な活性化に対するＣＤ３／ＣＤ２８活性化因子／刺激因子システムである、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）システムである。他の実施形態では、米国特許第６，０４０，１７７号及び同第５，８２７，６４２号、並びにＰＣＴ公報国際公開第２０１２／１２９５１４号（それらの内容は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるような方法を使用して、フィーダー細胞、並びに適切な抗体及びサイトカインによって、Ｔ細胞は活性化され、刺激されて増殖する。
【０２４４】
或る特定の実施形態では、Ｔ細胞はドナー被験体から得られる。幾つかの実施形態では、ドナー被験体は、癌又は腫瘍に冒されたヒト患者である。他の実施形態では、ドナー被験体は癌又は腫瘍に冒されていないヒト患者である。
【０２４５】
本発明の他の態様は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む組成物、本明細書に記載されるベクター、本明細書に記載されるポリペプチド、又は本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞に関する。幾つかの実施形態では、上記組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、及び／又はアジュバントを含む。幾つかの実施形態では、上記組成物は賦形剤を含む。一実施形態では、上記組成物は、本明細書に記載される短縮ヒンジドメイン（「ＴＨＤ」）を含むＣＡＲ又はＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、上記組成物は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＤを含むＣＡＲ又はＴＣＲを含む。別の実施形態では、上記組成物は、本明細書に記載されるＴＣＤを含むＣＡＲ又はＴＣＲを含むＴ細胞を含む。
【０２４６】
他の実施形態では、上記組成物は、非経口的な送達に対し、吸入に対し、又は経口等の消化管による送達に対して選択される。かかる薬学的に許容可能な組成物の作製は、当業者の能力の範囲に含まれる。或る特定の実施形態では、バッファーを使用して上記組成物を生理学的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８の範囲のｐＨに維持する。或る特定の実施形態では、非経口投与が検討される場合、上記組成物は、薬学的に許容可能なビヒクル中、追加の治療剤と共に又はそれを伴わずに、本明細書に記載される組成物を含む、パイロジェンフリー（pyrogen-free）の非経口的に許容可能な水溶液の形態である。或る特定の実施形態では、非経口注射用のビヒクルは滅菌蒸留水であり、該蒸留水中において、少なくとも１つの追加の治療剤と共に又はそれを伴わずに、本明細書に記載される組成物が適切に保存される無菌の等張液として製剤化される。或る特定の実施形態では、上記作製は、所望の分子と、製品の制御放出又は持続放出を提供する、高分子化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸等）、ビーズ、又はリポソームとの製剤化を含み、その後、デポー注射によって送達される。或る特定の実施形態では、所望の分子を導入するために、埋め込み可能な薬物送達デバイスが使用される。
【０２４７】
細胞分化
改変された多能性幹細胞産物は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）システム、ｎｏｔｃｈアゴニスト、ＯＰ９−ＤＬＬ１、ＯＰ９−ＤＬＬ４、胎児胸腺器官培養物（ＦＴＯＣ）、化学誘導、骨髄／肝臓／胸腺又はその他のヒト化マウス、胚様体（ＥＢ）又は他の分化技術を使用して、Ｔ細胞へと分化され得る。
【０２４８】
分化される細胞型はＣＤ８単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞、中胚葉前駆細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞等であり得る。
【０２４９】
人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）
ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子改変されたマウスモデル、ヒト化マウス、及びＯＰ９−ＤＬＬ１又は最近記載された人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムにより、癌抗原に対する抗原受容体を含む所望の成熟Ｔ細胞を生成するように幹細胞が改変又は培養され得る多くの手段が明らかになった。
【０２５０】
本発明による改変された多能性幹細胞はＯＰ９−ＤＬＬ１又は人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）細胞培養システムにおいて更に分化され得る。ＡＴＯはＴ細胞分化を再現する無血清の３次元細胞培養技術である。ＡＴＯ技術は癌及びその他の疾患を治療するための既製の操作されたＴ細胞を作製する可能性を有する。
【０２５１】
適切な人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）システムは非常に効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化と、臍帯血、骨髄及び末梢血ＨＳＰＣからの天然の及びＴＣＲ操作されたヒトＴ細胞のポジティブセレクションとに対応する。ＡＴＯ由来のＴ細胞はナイーブ表現型、多様なＴＣＲレパートリー並びにＴＣＲ依存性の活性化及び増殖を示す。ＡＴＯ由来の操作されたＴ細胞もナイーブ表現型に成熟し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原特異的な腫瘍の死滅を更に示す。したがって、ＡＴＯは養子細胞療法のためにナイーブＴ細胞及び潜在的に非アロ反応性の操作されたＴ細胞を作製する効率的な方法を提供する。ＡＴＯ培養システムによる操作されたＴ細胞を生成する例示的な方法は、例えば米国仮特許出願第６２／５１１，９０７号、同第６２／５１４，４６７号、Evseenko et al., 2010 PNAS、Seet et al., 2017 Nature Methods（それらの内容は、引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。ＡＴＯ培養システムに関連する他の例示的な方法は国際公開第２０１７／０７５３８９号の国際特許出願に記載されている。
【０２５２】
ＴＣＲ操作された幹細胞はＡＴＯシステムにおいてＴ細胞を生成する。さらに、ＡＴＯ由来のＴ細胞はＴＣＲの多様性及び対立遺伝子排除を示す。ＡＴＯシステムにおける操作された幹細胞は、対立遺伝子排除の証拠を提供するＶｂｅｔａ抗体パネルのフローサイトメトリー調査によって著しく限定されたＴＣＲを示す。
【０２５３】
所望のＴ細胞系譜を生成する方法
幾つかの実施形態では、改変された多能性細胞は、重要な発生遺伝子のゲノム編集のために、細胞不純物を排除して、ＡＴＯプラットフォームからのＴ細胞分化産物の活性を調節するように更に操作される。
【０２５４】
幹細胞を免疫細胞に分化させる過程の間に、不所望な細胞系譜副産物が生ずる可能性がある。例えば、幹細胞をαβＴ細胞に分化させる場合に、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、γδＴ細胞及びその他の非免疫細胞型が培養物中で発生する場合もある。本明細書に記載される方法では、転写因子等の或る特定の重要なマスター細胞の運命調節因子をノックアウト又は改変すると共に、不所望な細胞副産物の生成を減少又は排除するために、あらゆるゲノム編集プラットフォーム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１、ＺＦＮ等）が利用される。
【０２５５】
癌治療
本明細書に記載の方法は、被験体において癌を治療するため、腫瘍のサイズを減少させるため、腫瘍細胞を死滅させるため、腫瘍細胞増殖を予防するため、腫瘍の成長を予防するため、患者から腫瘍を排除するため、腫瘍の再燃を予防するため、腫瘍転移を予防するため、患者において寛解を誘導するため、又はそれらの任意の組み合わせに使用され得る。或る特定の実施形態では、上記方法は完全奏功を誘導する。他の実施形態では、上記方法は部分奏功を誘導する。幾つかの実施形態では、治療は成人患者及び／又は小児患者を対象とする。
【０２５６】
幾つかの実施形態では、細胞産物は腫瘍学、免疫抑制、自己免疫制御、ワクチンにおいて又は予防的手段として使用され得る。細胞は市販製品、臨床試験、前臨床研究、基礎研究として使用され得る。細胞はヒト医学及び／又は獣医学のために使用され得る。幾つかの実施形態では、細胞産物は検出試薬／創薬研究（discovery research）として使用され得る。
【０２５７】
治療され得る癌は、血管新生化されていない、まだ実質的に血管新生化されていない、又は血管新生化された腫瘍を含む。また、癌は固形腫瘍又は非固形腫瘍を含み得る。幾つかの実施形態では、癌は血液の癌である。幾つかの実施形態では、癌は白血球の癌である。他の実施形態では、癌は形質細胞の癌である。幾つかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫又は骨髄腫である。或る特定の実施形態では、上記癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（非Ｔ細胞ＡＬＬを含む）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及び血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ））、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、慢性若しくは急性の肉芽腫性疾患、慢性若しくは急性の白血病、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、毛様細胞性白血病、血球貪食症候群（マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ））、ホジキン病、大細胞肉芽腫（large cell granuloma）、白血球接着不全症、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、多発性骨髄腫、脊髄形成異常及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、限定されないが急性骨髄白血病（ＡＭＬ）を含む骨髄疾患、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、形質細胞増殖性障害（例えば、無症候性骨髄腫（くすぶり型多発性骨髄腫又は無痛性骨髄腫））、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、形質細胞腫（例えば、形質細胞異常増殖症；孤立性骨髄腫；孤立性形質細胞腫；髄外性形質細胞腫；及び多発性形質細胞腫）、ＰＯＥＭＳ症候群（Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、高月病、及びＰＥＰ症候群）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣ）、小細胞若しくは大細胞濾胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、Ｔ細胞リンパ腫、形質転換後濾胞性リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又はそれらの組み合わせである。
【０２５８】
幾つかの実施形態では、癌は骨髄腫である。特定の一実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。幾つかの実施形態では、癌は白血病である。幾つかの実施形態では、癌は急性骨髄白血病である。
【０２５９】
幾つかの実施形態では、癌は再発性又は治療抵抗性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、特定不能のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫又は濾胞性リンパ腫に起因するＤＬＢＣＬである。
【０２６０】
幾つかの実施形態では、上記方法は化学療法剤を投与することを更に含む。或る特定の実施形態では、選択される化学療法剤は、リンパ枯渇（lymphodepleting）（プレコンディショニング）化学療法剤である。有益なプレコンディショニング治療のレジメンは、相関的な有益なバイオマーカーと共に、米国仮特許出願第６２／２６２，１４３号及び同第６２／１６７，７５０号に記載され、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。これらは、例えば、指定される有益な用量のシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｍ２／日〜２０００ｍｇ／ｍ２／日）及び指定される用量のフルダラビン（２０ｍｇ／ｍ２／日〜９００ｍｇ／ｍ２／日）を患者に投与することを含むＴ細胞療法を必要とする患者をコンディショニングする方法を記載する。或る一つのかかる投薬レジメンは、治療的有効量の操作されたＴ細胞の患者への投与の３日前に、約５００ｍｇ／ｍ２／日のシクロホスファミド及び約６０ｍｇ／ｍ２／日のフルダラビンを毎日患者に投与することを含む、患者を治療することを含む。
【０２６１】
他の実施形態では、抗原結合分子、形質導入された（又は操作された）細胞（ＣＡＲ又はＴＣＲ等）、及び化学療法剤は、各々、被験体における疾患又は状態を治療するのに有効な量で投与される。
【０２６２】
或る特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ又はＴＣＲを発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与され得る。化学療法剤の例として、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、及びウレドーパ（uredopa）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（triethylenethiophosphaoramide）、及びトリメチロロメラミン（trimethylolomelamine）のレジメ（resume）を含む、エチレンイミン及びメチラメラミン（methylamelamines）；クロラムブチル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン（prednimustine）、トロホスファミド（trofosfamide）、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチン（ranimustine）等のニトロソウレア；アクラシノマイシン（aclacinomysins）、アクチノマイシン、アントラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジオリピン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン（zorubicin）等の抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート等の葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン等のプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ等のピリミジン類縁体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、マイトテイン、トリロスタン等の抗副腎剤；フロリン酸（frolinic acid）等の葉酸補液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビスアントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキウレア；レンティナン；��ニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン（nitracrine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２、２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシッド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）；クロラムブチル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチン等の白金類縁体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）等のレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が挙げられる。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ及び／又はＴＣＲを発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物は、腫瘍に対するホルモンの作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifene）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲン薬；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド及びゴセレリン等の抗アンドロゲン薬；並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体と併せて投与され得る。また適切な場合には、限定されないが、ＣＨＯＰ、すなわち、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））、ドキソルビシン（ヒドロキシドキソルビシン）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（商標））及びプレドニゾンを含む化学療法剤の組み合わせが投与される。
【０２６３】
幾つかの実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞又は核酸の投与と同時に又は投与の１週以内に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞又は核酸の投与の後、１週間〜４週間、すなわち１週間〜１ヶ月、１週間〜２ヶ月、１週間〜３ヶ月、１週間〜６ヶ月、１週間〜９ヶ月、又は１週間〜１２ヶ月投与される。幾つかの実施形態では、化学療法剤は、細胞又は核酸を投与する少なくとも１ヶ月前に投与される。幾つかの実施形態では、上記方法は、２以上の化学療法剤を投与することを更に含む。
【０２６４】
様々な追加の治療剤が、本明細書に記載される組成物と併せて使用され得る。例えば、有用な可能性がある追加の治療剤として、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（商標））、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標））、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ（CureTech）、及びアテゾリズマブ（Roche）等のＰＤ−１阻害剤が挙げられる。他の潜在的な有用な追加の治療剤には、ウレルマブ及びウトミルマブ等の４−１ＢＢ（ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９とも呼ばれ得る）阻害剤が含まれる。
【０２６５】
本発明との併用に適している追加の治療剤として、限定されないが、イブルチニブ（ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（商標））、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（商標））、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（商標））、カツマキソマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アキシチニブ、マシチニブ、パゾパニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ、レスタウルチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、バンデタニブ、エントレクチニブ、カボザンチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ラドチニブ（radotinib）、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ルキソリチニブ、パクリチニブ、コビメチニブ、セルメチニブ、トラメチニブ、ビニメチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、アフリベルセプト、アジポチド、デニロイキンジフチトクス、エベロリムス及びテムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤、ソニデギブ及びビスモデギブ等のヘッジホッグ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤（パルボシクリブ）等のＣＤＫ阻害剤が挙げられる。
【０２６６】
追加の実施形態では、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲを含む免疫を備える組成物は、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤又は抗炎症薬として、限定されないが、ステロイド及びグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、及びトリアムシノロンを含む）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキセート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド、及びミコフェノール酸（mycophenolate）を含む非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられ得る。例示的なＮＳＡＩＤとして、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ−２阻害剤、及びシアリレート（sialylates）が挙げられる。例示的な鎮痛剤として、アセトアミノフェン、オキシコドン、及び塩酸プロポキシフェンのトラマドールが挙げられる。例示的なグルココルチコイドとして、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、又はプレドニゾンが挙げられる。例示的な生物学的応答修飾物質として、細胞表面マーカー（例えばＣＤ４、ＣＤ５等）に対する分子、サイトカイン阻害剤（例えば、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））及びインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）））、ケモカイン阻害剤、及び接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答修飾物質は、分子の組み換え形態と並んで、モノクローナル抗体も含む。例示的なＤＭＡＲＤとして、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキセート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）及び筋肉内）、及びミノサイクリンが挙げられる。
【０２６７】
或る特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、サイトカインと併せて投与される。本明細書で使用される「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に対して作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質を指すことを意味する。サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中でも、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子（ＨＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子（ＮＧＦ）；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、β及びγ等のインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５等のインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β等の腫瘍壊死因子；並びにＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書で使用されるサイトカインの用語は、天然起源の又は組み換え細胞培養物由来のタンパク質、及び本来の配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０２６８】
本発明の別の態様は、有効量の本明細書に開示される改変されたＴ細胞を被験体に投与することを含む、腫瘍に対する免疫を誘導する方法に関する。本発明の別の態様は、被験体において免疫応答を誘導する方法であって、有効量の本出願の操作された免疫細胞を投与することを含む、方法に関する。幾つかの実施形態では、免疫応答はＴ細胞媒介免疫応答である。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞媒介免疫応答は、１つ以上の標的細胞に対するものである。幾つかの実施形態では、操作された免疫細胞はＣＡＲ又はＴＣＲを含み、ここでＣＡＲ又はＴＣＲは、本開示に記載されるＴＨＤを含む。幾つかの実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。
【０２６９】
本発明の別の態様は、悪性腫瘍を治療又は予防する方法であって、有効量の少なくとも１つの免疫細胞を、それを必要とする被験体に投与することを含み、該免疫細胞は少なくとも１つのＣＡＲ又はＴＣＲを含む、方法に関する。
【０２７０】
本発明の別の態様は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法であって、上記被験体に、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、ＣＡＲ若しくはＴＣＲ、細胞、又は組成物を投与することを含む、方法に関する。１つの実施形態では、上記方法は、ＣＡＲ又はＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む。別の実施形態では、上記方法は、ＣＡＲ又はＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを投与することを含む。別の実施形態では、上記方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるＣＡＲ又はＴＣＲを投与することを含む。別の実施形態では、上記方法は、ＣＡＲ又はＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む細胞、又は該ポリヌクレオチドを含むベクターを投与することを含む。
【０２７１】
幾つかの実施形態では、Ｔ細胞療法において使用するためのドナーＴ細胞は、（例えば自己Ｔ細胞療法のために）患者から得られる。他の実施形態では、Ｔ細胞療法においてＴ細胞へと分化するドナー幹細胞は、患者ではない被験体から得られる。
【０２７２】
Ｔ細胞は、治療的有効量で投与され得る。例えば、Ｔ細胞の治療的有効量は、少なくとも約１０４個の細胞、少なくとも約１０５個の細胞、少なくとも約１０６個の細胞、少なくとも約１０７個の細胞、少なくとも約１０８個の細胞、少なくとも約１０９個の細胞、又は少なくとも約１０１０個の細胞であり得る。別の実施形態では、Ｔ細胞の治療的有効量は、約１０４個の細胞、約１０５個の細胞、約１０６個の細胞、約１０７個の細胞、又は約１０８個の細胞である。特定の一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＴＣＲ  Ｔ細胞の治療的有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０７細胞／ｋｇ、約２×１０７細胞／ｋｇ、約３×１０７細胞／ｋｇ、約４×１０７細胞／ｋｇ、約５×１０７細胞／ｋｇ、約６×１０７細胞／ｋｇ、約７×１０７細胞／ｋｇ、約８×１０７細胞／ｋｇ、又は約９×１０７細胞／ｋｇである。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＴＣＲ  Ｔ細胞の治療的有効量は、約１×１０５細胞／ｋｇ、約２×１０５細胞／ｋｇ、約３×１０５細胞／ｋｇ、約４×１０５細胞／ｋｇ、約５×１０５細胞／ｋｇ、約６×１０５細胞／ｋｇ、約７×１０５細胞／ｋｇ、約８×１０５細胞／ｋｇ、又は約９×１０５細胞／ｋｇである。
【０２７３】
免疫寛容
本発明の方法は、被験体における免疫寛容疾患を治療するために使用することができる。或る特定の実施形態では、上記方法は完全奏功を誘導する。他の実施形態では、上記方法は部分奏功を誘導する。
【０２７４】
中枢性寛容又は末梢性寛容の欠陥は、自己免疫疾患を引き起こして、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、１型糖尿病、自己免疫性多内分泌腺症候群１型（ＡＰＳ−１）及び免疫調節異常、多腺内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖症候群（ＩＰＥＸ）等の症候群を引き起こす場合があり、潜在的に喘息、アレルギー及び炎症性腸疾患の一因となる。免疫寛容は、移植拒絶反応、例えば幹細胞移植、腎臓移植、肝臓移植等の移植拒絶において問題となる場合もある。
【０２７５】
内因性ＴＣＲ又はＨＬＡの発現を排除するように操作されたＨＳＣ細胞、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞は、治療標的に応じて特定のＣＡＲ、ＴＣＲ又は他の抗原認識分子を発現するように更に操作され得る。
【０２７６】
本明細書で言及される全ての出版物、特許、及び特許出願は、個々の出版物、特許又は特許出願が各々、具体的かつ個別に引用することにより本明細書の一部をなすことが指示されるのと同じ程度に、引用することにより本明細書の一部をなす。しかしながら、本明細書における参照文献の引用は、かかる参照文献が本発明に対する先行技術の認識として解釈されるべきではない。引用することにより本明細書の一部をなす参照文献に提供される定義又は用語のいずれかが本明細書に提供される用語及び考察とは異なる場合は、本発明の用語及び定義を優先する。
【０２７７】
本発明は、以下の実施例によって更に説明されるが、更なる限定として解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参照文献の内容は、引用することにより明らかに本明細書の一部をなす。
【実施例】
【０２７８】
実施例１：改変された多能性幹細胞の作製
この実施例は、ｉＰＳＣにリプログラムするためのＰＢＭＣ及び純化Ｔ細胞の特性評価、並びに内因性ＴＣＲ又はＨＬＡの発現を排除するように操作された改変された多能性幹細胞の調製を説明する。
【０２７９】
Ｆｉｃｏｌｌを使用して３つのアフェレーシス装置からＰＢＭＣを分離し、Ｔ細胞をMiltenyi社のＰａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用して同じアフェレーシス装置からネガティブセレクション（非接触選択（touchless selected））した。アフェレーシス装置のドナー（被験者Ａ、被験者Ｂ及び被験者Ｃ）は女性で２５歳未満の、非喫煙者、非飲酒者であり、血液又は他の組織の遺伝病の病歴はなかった。分離されたＰＢＭＣ及び純化Ｔ細胞を、凍結保存前にＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９又はＴＣＲα／βに対する抗体を使用してフローサイトメトリーによって分析した。Ｔ細胞の純度はＴＣＲα／βの存在、並びにＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ５６の不存在によって特徴付けられた。これらの結果は、該方法によりＴ細胞が単離及び純化されたことを示した（データは示していない）。
【０２８０】
ＰＢＭＣ及びＴ細胞を核型分析によって更に分析することで、リプログラミングの前に染色体異常（ＫａｒｙｏＳｔａｔアッセイ、Thermofisher社）を評価した。３人のドナーからの全てのＰＢＭＣ及びＴ細胞は正常な核型（すなわち、正常な染色体配列）を示した（データは示していない）。
【０２８１】
これらの細胞を、改変されたセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ  ２．０）を介して送達された山中因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）を使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にリプログラムした。１０個のｉＰＳＣクローンを分離し、クローンｉＰＳＣ系統へと増殖させ、それぞれのインプット細胞集団のためにバンク保存した。全てのクローンは、免疫蛍光染色によってＴＲＡ−１−６０について陽性に染色された（データは示していない）。
【０２８２】
多能性スコアカードアッセイ（Pluripotency Scorecard Assay）によって、各ｉＰＳＣクローン系統の多能性を評価した。多能性のパネル及び３つの一次胚葉マーカーの発現レベルを、一連の既知のヒトＰＳＣ及びそれらの分化した対応物からの発現レベルと比較した。正の値は、試料におけるマーカーの発現レベルが参照におけるマーカーの発現レベルと同等又はそれより高いことを示す。スコアカード分析における１．５より大きい値はマーカーが上方調節されたことを示す。負の値は、試料におけるマーカーの発現レベルが参照におけるマーカーの発現レベルより低いことを示す。全てのクローン系統は、多能性について陽性を示し、３つの一次胚葉について陰性を示した。ＰＢＭＣ及びＴ細胞由来のｉＰＳＣクローン及び胚様体（ＥＢ）のＰＳＣスコアカード分析の代表的な結果を表２に示す。
【０２８３】
2021513839.tif 000003
【０２８４】
リプログラムされた細胞をクローン細胞系統へと増殖させてバンク保存する。該細胞系統の全ゲノムシーケンシングを行うことで、標的とされる遺伝子編集のための遺伝子座、特にαＴ細胞受容体遺伝子座及びβＴ細胞受容体遺伝子座の同一性及び配列を確立する。
【０２８５】
ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座を、Sangamo Therapeutics社によって設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して編集する。これらのＺＦＮを、Thermo Fisher社のＮｅｏｎエレクトロポレーションシステムを使用したエレクトロポレーションによってｉＰＳＣに導入する。ＦＭＣ６３  ＣＤ１９  ＣＡＲと一緒にＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζをコードするコンストラクトを、アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＡＶ６）を使用して細胞に送達する。該コンストラクトはＴＲＡＣ遺伝子座を標的とし、内因性のＴＲＡＣプロモーターを利用してＣＡＲの発現を駆動する。
【０２８６】
ＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子座を、Sangamo Therapeutics社によって設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して編集する。これらのＺＦＮを、Thermo Fisher社のＮｅｏｎエレクトロポレーションシステムを使用したエレクトロポレーションによってｉＰＳＣに導入する。ＨＰＶ−１６  Ｅ７  ＴＣＲをコードするコンストラクトを、ＡＡＶ６を使用して細胞に送達する。ＴＣＲをＴＲＢＣ遺伝子座に挿入して、ｉＰＳＣからのαβ（ＴＣＲαβ）Ｔ細胞の発生を駆動する。
【０２８７】
β２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）遺伝子座を、Sangamo Therapeutics社によって設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して編集する。これらのＺＦＮを、Thermo Fisher社のＮｅｏｎエレクトロポレーションシステムを使用したエレクトロポレーションによってｉＰＳＣに導入する。ＨＬＡ−Ｅ単鎖三量体（ＨＬＡ−Ｅ  ＳＣＴ）をコードするコンストラクトを、ＡＡＶ６を使用して細胞に送達する。ｂ２ｍ遺伝子座を、クラス１ａ  ＨＬＡ分子の発現を排除し、これらの細胞のＴ細胞による認識を妨げるように編集する。ＨＬＡ−Ｅ  ＳＣＴをｂ２ｍ遺伝子座に挿入して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるこれらの細胞の認識を妨げる。
【０２８８】
遺伝子編集されたｉＰＳＣをマスターセルバンクとし、全ゲノムシーケンシングを行うことで、標的外の切断又は組込みを特定する。マスターセルバンクを核型分析する。後続の研究において、ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座及びβ２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）遺伝子座を編集及び改変した。ＴＲＡＣ研究において、ＦＭＣ６３  ＣＤ１９  ＣＡＲと一緒にＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζをコードするコンストラクト（配列番号１）を、ＺＦＮを使用して１７９ｉ及び／又は２０２ｉのヒトｉＰＳＣに送達した。得られたヒトｉＰＳＣプール集団を培養し、単一クローン作製の前にフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって特性評価した。
【０２８９】
ｉＰＳＣプール集団を８日間培養し、ゲノムＤＮＡ抽出のために採取した。コントロール（ＺＦＮ処理なし）及び編集されたプール（ＺＦＮ処理あり）からの標的部位に隣接する２５０ｂｐの領域をＰＣＲによって増幅し、シーケンシングして、ＴＩＤＥ（分解による挿入／欠失の追跡）（Brinkman et al. 2014 Nucl. Acids Res. 42(22): e168）によって分析した。ＴＩＤＥ分析では、スコア＞０は挿入を示し、スコア＜０は欠失を示す。３の倍数ではないサイズでの挿入又は欠失はフレームシフトを示し、ＴＲＡＣタンパク質の喪失につながり得る可能性がある。ポリクローナル集団のＴＩＤＥ分析の結果を表３に示す。
【０２９０】
2021513839.tif 000004
【０２９１】
単一のクローンを１４日間培養し、ゲノムＤＮＡ抽出のために細胞を採取した。標的アレルを増幅し、ノーザンブロッティング分析によって特性評価した。２０２ｉ  ＰＳＣ及び１７９ｉ  ｉＰＳＣの単一クローンの結果は、幾つかの単一クローンでのＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＤ１９  ＣＡＲの挿入を示している（データは示していない）。さらに、単一クローンをデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）及び標的化されるアレルに特異的なプライマー／プローブセットによって特性評価して、挿入のコピー数を決定した。２コピーのＣＤ１９  ＣＡＲノックイン（ＣＡＲ−ＫＩ−ＴＲＡＣ）アレル及び０コピーの野生型アレルを有する単一クローンを、更なる研究に選択した。ｂ２ｍ研究において、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を、標的化された切断部位に隣接する約８００ｂｐの相同アームの間に挿入した。得られたｉＰＳＣ  ２０２ｉプール集団を培養し、ＴＩＤＥ分析（表４）並びにβ２ミクログロブリン及びＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析によって特性評価した（データは示していない）。
【０２９２】
2021513839.tif 000005
【０２９３】
実施例２：改変された多能性幹細胞からのＴ細胞分化
ｉＰＳＣを誘導して、中胚葉前駆細胞（ｈＥＭＰ）に分化させる。ｈＥＭＰを、ｈＤＬＬ４を発現するように形質導入されたＭＳ５細胞と複合化させる。１×１０４個のｈＥＭＰを５×１０５個のＭＳ５と混ぜ合わせる。細胞を遠心分離し、上清を除去し、細胞を液滴として０．４μｍのＰＴＦＥ膜に付着させる。
【０２９４】
ＡＴＯを６週間成長させる。ＡＴＯを膜から採取し、Miltenyi社のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃチューブ中に置き、Miltenyi社のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターでプログラムＥＢ０１を使用して実行する。７０μｍストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過する。細胞をソーティングして、以下の集団：ＣＤ４５＋ＣＤ５６（−）ＣＤ３＋Ｅ７ＴＣＲαβ＋ＣＤ１９ＣＡＲ＋を純化する。
【０２９５】
細胞を計数し、２×１０５個の細胞を、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２及び６×１０５個のＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Thermo Fisher社）を有する２００μｌのＯｐＴｉｍｉｓｅｒ培地中で成長させる。合計２週間にわたり培地を２日毎に交換して、細胞を増殖させる。１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を維持して、細胞をより大きなウェルに２日毎に再プレーティングする。
【０２９６】
この実施例に記載される手順を使用して細胞を誘導した。ｉＰＳＣ細胞のＴ細胞への分化を評価するために、ＦＡＣＳを使用して、改変されていない及び改変された（ＣＡＲ−ＫＩ−ＴＲＡＣ）ｉＰＳＣを３週目、４週目及び５週目に分析し、ＣＤ５６、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＴＣＲαβ、ＣＤ３又はＣＤ１９ＣＡＲ等の表面マーカーで染色した。５週目の結果を図１６Ａ〜図１６Ｃに示す。
【０２９７】
実施例３：Ｔ細胞分化産物を制御する方法
転写因子等の或る特定の重要なマスター細胞の運命調節因子をノックアウト又は改変して、不所望な細胞副生成物の生成が減少又は排除されるように、ｉＰＳＣを操作する（図３）。
【０２９８】
標的遺伝子を、表１に示される細胞系譜の発生が排除されるようにノックアウトによって編集する。
【０２９９】
2021513839.tif 000006
【０３００】
実施例４：操作されたｐＴａ陽性幹細胞の作製
この実施例は操作されたｐＴａ陽性幹細胞の調製を説明する。
【０３０１】
胚性幹細胞（ＥＳ）を、ウイルス媒介送達によって送達された外因性ｐＴａを発現するように改変する。コンストラクトは生得の遺伝子調節エレメント、構成的な生理学的発現レベルを利用して内因性遺伝子座にノックインされる又は規定のプロモーターを含む。規定のプロモーターは、構成的に活性であり得る又は細胞発生及び／又は細胞周期等の別個の段階に限定され得る。ｐＴａ−ＴＣＲβペアリングが富化されたｐＴａを発現するＥＳ細胞を特定し、当該技術分野において知られる細胞分離技術によって分離する。
【０３０２】
実施例５：操作されたＴＣＲαノックアウト幹細胞の作製
この実施例は操作されたＴＣＲαノックアウト幹細胞の調製を説明する。
【０３０３】
操作されたヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を使用して内因性ＴＣＲαをノックアウトするように、人工多能性幹細胞を操作する。ｐＴａ−ＴＣＲβペアリングが富化された表面発現されたＴＣＲαを欠いたｉＰＳ細胞を特定し、当該技術分野において知られる細胞分離技術によって分離する。１７９ｉ細胞及び２０２ｉ細胞を、実施例６に記載される手順を使用して操作又は編集した。ＴＩＤＥ分析を使用して、プール集団及び後続の単一クローンを特性評価した（表５）。
【０３０４】
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【０３０５】
実施例６：ｐＴａ改変されたＥＳ細胞からのＴ細胞分化
この実施例はＥＳ細胞から分化したＴ細胞の調製を説明する。
【０３０６】
実施例１に記載される分離されたｐＴａ改変された細胞を刺激して、Ｔ細胞への分化を促進する。分離されたｐＴａ改変された細胞を得て、人工胸腺オルガノイドにおいてＴ細胞分化を誘導した。１つ以上のバイオマーカーの発現を検出することによって、Ｔ細胞系譜を選択する。本実施例では、対象のＴ細胞系譜は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、表面発現されたＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＩＬ−７Ｒα、ＣＤ３ε、プレＴＣＲ、ＣＤ８及び／又はＣＤ４の相対レベルによって特定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図６】
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【図６−１】
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【図７】
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【図７−１】
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【図８】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９】
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【図９−１】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２−１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ａ−１】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｂ−１】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｃ−１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月6日(2020.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性ＴＣＲ発現又はＨＬＡ発現を排除するように操作された改変された多能性幹細胞。
【請求項２】
欠損ＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、欠損ＴＣＲβ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子又は欠損β２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）遺伝子を含み、任意に、前記欠損遺伝子はノックアウトによって作製される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記欠損遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１、相同組換え又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を使用して編集される、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
単鎖ＨＬＡ三量体（安定化ペプチドに連結されたβ２ミクログロブリンに連結されたＨＬＡを含む単鎖ＨＬＡ三量体）をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記ＨＬＡ三量体は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｅ及びＨＬＡ−Ｇの組み合わせである、単鎖ＨＬＡ三量体をコードする外因性コンストラクト；
腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記腫瘍抗原は、腫瘍関連表面抗原（５Ｔ４等）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＢＣＭＡ、Ｂ−ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、ＣＡ−１２５、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ８、ＣＬＬ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＭＶ特異抗原、ＣＳ−１、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ−４、ＤＬＬ３、ジシアロガングリオシドＧＤ２、膵管上皮ムチン、ＥＢＶ特異抗原、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＬＦ２Ｍ、エンドグリン、エフリンＢ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮性腫瘍抗原、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＦＬＴ３、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＨＢＶ特異抗原、ＨＣＶ特異抗原、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の組み合わせ、ＨＥＲＶ−Ｋ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ−１型エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＨＰＶ特異抗原、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＩＧＦＩ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、インフルエンザウイルス特異抗原；ＣＤ３８、インスリン成長因子（ＩＧＦｌ）−１、腸カルボキシルエステラーゼ、カッパー鎖、ＬＡＧＡ−１ａ、ラムダ鎖、ラッサ熱ウイルス特異抗原、レクチン反応性ＡＦＰ、系譜特異抗原又は組織特異抗原（ＣＤ３等）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、Ｍ−ＣＳＦ、黒色腫関連抗原、メソテリン、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＭＵＣ−１、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、ＰＡＰ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、前立腺特異抗原タンパク質、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、表面接着分子、生存及びテロメラーゼ、ＴＡＧ−７２、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、並びにテネイシン−ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ  Ａ１）、チログロブリン、腫瘍間質抗原、血管内皮細胞成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、ウイルス特異表面抗原（ＨＩＶ特異抗原（例えばＨＩＶ  ｇｐ１２０）等）、並びに、これらの表面マーカーの任意の誘導体又は変異体から選択される、ＣＡＲをコードする外因性コンストラクト；
ＴＣＲをコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記ＴＣＲは、α／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、癌抗原若しくは癌関連抗原に反応性のＴＣＲ、マウスＭＨＣ若しくは他の非ヒトＭＨＣに対して反応性であるＴＣＲ、クラスＩ拘束性ＴＣＲ若しくはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ、ＨＰＶ認識ＴＣＲ、ウイルス反応性ＴＣＲ、ＥＢＶ  ＴＣＲ、ＣＭＶ  ＴＣＲ、若しくはインフルエンザＴＣＲ、ＨＰＶ−１６  Ｅ６  ＴＣＲ、ＨＰＶ−１６  Ｅ７  ＴＣＲ、若しくはＭＡＧＥＡ３／Ａ６  ＴＣＲ若しくは操作された変異体である、又はＴＣＲは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４／８二重陽性Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞若しくは発達中のＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫＴ細胞若しくはＮＫ  Ｔ細胞に由来する、ＴＣＲをコードする外因性コンストラクト；及び／又は、
遺伝子改変された細胞の排除を可能にする又は非侵襲的イメージングのためのＰＥＴレポーター遺伝子として使用される自殺遺伝子をコードする外因性コンストラクトであって、任意に、前記自殺遺伝子はｓｒ３９ＴＫであり、化学誘導型カスパーゼ、小分子／化学誘導型二量体化因子（ＣＩＤ）によって誘導される二量体化、選択可能な表面マーカー、又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＥＧＦＲ若しくはＬＮＧＦＲから選択される選択可能な表面マーカーである、自殺遺伝子をコードする外因性コンストラクト；
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
改変された多能性幹細胞を作製する方法であって、
（ａ）内因性ＴＣＲの発現を排除する又はドナーＨＬＡの発現を遮断するように遺伝子座を編集することと、
（ｂ）ＣＡＲ遺伝子、ＴＣＲ遺伝子又はＨＬＡ遺伝子をコードする外因性コンストラクトを導入することと、
を含む、方法。
【請求項６】
造血幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を分離する工程を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞を準備することと、
（ｂ）Ｔ細胞分化又はＴ細胞様分化を誘導することと、
を含む、方法。
【請求項８】
Ｔ細胞分化は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）システム、ｎｏｔｃｈアゴニスト、ＯＰ９−ＤＬＬ１、ＯＰ９−ＤＬＬ４、胎児胸腺器官培養物（ＦＴＯＣ）、化学誘導、骨髄／肝臓／胸腺又はその他のヒト化マウス、胚様体（ＥＢ）を使用して誘導される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞系譜は、１つ以上のバイオマーカーの発現を検出することによって選択され、任意に、前記対象のＴ細胞系譜は、ＣＤ８単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４単一陽性Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ＣＤ３陽性細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞、中胚葉前駆細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞を準備することと、
（ｂ）特定の細胞系譜の生成を促進、減少又は排除するように、細胞運命調節因子をコードする遺伝子を編集することと、
（ｃ）Ｔ細胞分化を誘導することと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記細胞運命調節因子は、転写因子、Ｔ−ＢＥＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ、ＲＵＮＸ３、ＧＡＴＡ３、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ６、ＤＥＣ２、ＭＡＦ、ＴＨＰＯＫ、ＧＡＴＡ３、Ｓｍａｄｓ、Ｓｔａｔ６、ＰＵ．１、ＲＯＲｇｔ、ＲＯＲａ、Ｓｔａｔ３、ＡＨＲ、Ｂｃｌ−６、ＭＡＦ、ＦｏｘＰ３、Ｓｍａｄ３、Ｓｔａｔ５、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＧＲＡＩＬ又はＰＬＺＦである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記特定の系譜は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、Ｔｒｅｇ、ＩＬＣ、ＮＫ又はＮＫＴである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
改変されていないコントロール細胞と比較して、プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質とＴＣＲβタンパク質との間のペアリングが富化又は増大された改変された多能性幹細胞。
【請求項１４】
前記改変された多能性幹細胞は、プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質をコードする外因性コンストラクトを含み、任意に、前記外因性コンストラクトは、ウイルスコンストラクト、ＡＡＶコンストラクト、レンチウイルスコンストラクト又はレトロウイルスコンストラクトである、請求項１３に記載の改変された多能性幹細胞。
【請求項１５】
前記改変された多能性幹細胞は、欠損ＴＣＲα遺伝子を含み、任意に、前記欠損ＴＣＲα遺伝子は、操作されたヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮを使用したノックアウト、相同組換えを使用したノックアウト又はアンチセンスＲＮＡによって作製される、請求項１３又は１４に記載の改変された多能性幹細胞。
【請求項１６】
前記改変された多能性幹細胞は、ＴＣＲα及びＴＣＲβのペアリングを実質的に含まない、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞。
【請求項１７】
前記改変された多能性幹細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、外因性ＴＣＲ及び／又は抗原受容体を更に含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞。
【請求項１８】
改変された多能性幹細胞を作製する方法であって、外因性プレＴＣＲα（ｐＴａ）タンパク質を導入する工程及び／又は欠損ＴＣＲα遺伝子を作製する工程を含む、方法。
【請求項１９】
対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞を準備する工程と、人工胸腺オルガノイドにおいてＴ細胞分化を誘導する工程とを含む、方法。
【請求項２０】
対象のＴ細胞系譜を作製する方法であって、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の改変された多能性幹細胞を準備する工程と、ペプチド：ＭＨＣの存在下又は不存在下でＴ細胞分化を誘導する工程とを含み、任意に、前記対象のＴ細胞系譜は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞であるヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）又は成熟αβＴ細胞若しくはγδＴ細胞である、方法。
【国際調査報告】
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