(57)【要約】  本発明は、アデノウイルスとＣＤＫ４／阻害剤との組み合わせに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスとＣＤＫ４／阻害剤とを含む、組み合わせ。
【請求項２】
組み合わせが、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤を含む、請求項１記載の組み合わせ。
【請求項３】
組み合わせが、さらに、ブロモドメイン阻害剤を含む、請求項１及び２のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項４】
腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のための、請求項１〜３のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項５】
対象における腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のためのアデノウイルスであって、
該方法は、対象にアデノウイルス及びＣＤＫ４／６阻害剤を投与することを含む、
アデノウイルス。
【請求項６】
対象における腫瘍又はがんの処置のための方法における使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤であって、
該方法は、対象にアデノウイルス及びＣＤＫ４／６阻害剤を投与することを含む、
ＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項７】
アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、請求項１記載の組み合わせ、請求項４記載の使用のための組み合わせ、請求項５記載の使用のためのアデノウイルス及び請求項６記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項８】
アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、請求項１及び７のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項４及び７のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項５及び７のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項６及び７のいずれか一項記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項９】
アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１である、請求項１及び７〜８のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項４及び７〜８のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項５及び７及び８のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項６及び７〜８のいずれか一項記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項１０】
ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞をＧ１期で停止させ、Ｅ２Ｆ１を阻害するＣＤＫ４／６阻害剤である、請求項１及び７〜９のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項４及び７〜９のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項５及び７〜９のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項６及び７〜９のいずれか一項記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項１１】
ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１とも呼ばれるパルボシクリブ、ＬＹ−２８３５２１９とも呼ばれるアベマシクリブ、ＬＥＥ０１１とも呼ばれるリボシクリブ、Ｇ１Ｔ２８とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、請求項１及び７〜１０のいずれか一項記載の組み合わせ、請求項４及び７〜１０のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項５及び７〜１０のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項６及び７〜１０のいずれか一項記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項１２】
病的腫瘍又はがんが、Ｒｂを発現しているか又はＲｂ陽性である、請求項４及び７〜１１のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項５及び７〜１１のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項６及び７〜１１のいずれか一項記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項１３】
腫瘍細胞の細胞が、１つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び／又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、請求項４及び７〜１２のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項５及び７〜１２のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項６及び７〜１２のいずれか一項記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項１４】
腫瘍又はがんが、細胞周期とは無関係に細胞核にＹＢ−１を含有する、請求項４及び７〜１３のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項５及び７〜１３のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項６及び７〜１３のいずれか一項記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【請求項１５】
疾患が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん（ｍＢＣ）、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項４及び７〜１４のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項５及び７〜１４のいずれか一項記載の使用のためのアデノウイルス並びに請求項６及び７〜１４のいずれか一項記載の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスとＣＤＫ４／阻害剤との組み合わせ、疾患、例えば、腫瘍の処置におけるこのような組み合わせの使用、疾患、例えば、腫瘍の処置における使用のための、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせた腫瘍溶解性ウイルス、好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルス及び疾患、例えば、腫瘍の処置における使用のための、腫瘍溶解性ウイルス、好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルスと組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤に関する。
【０００２】
現在、数多くの治療概念が、腫瘍の処置に使用されている。外科手術を使用する以外に、化学療法及び放射線療法が優勢である。しかしながら、これらの技術は全て、かなりの副作用を伴う。複製選択的腫瘍溶解性ウイルスの使用により、腫瘍の処置のための新たなプラットフォームが提供される。それに関連して、ウイルス剤の選択的腫瘍内複製が開始され、これにより、ウイルス複製、感染した腫瘍細胞の溶解及びウイルスの隣接腫瘍細胞への拡散がもたらされる。ウイルスの複製能力は、腫瘍細胞に限られているため、正常な組織は、複製から免れ、このため、ウイルスによる溶解を免れる。
【０００３】
本発明の根底にある課題は、腫瘍溶解性ウイルス及び特に、アデノウイルスに基づく腫瘍治療の効力を増大させるための手段を提供することである。
【０００４】
これらの課題及び他の課題は、添付の独立請求項の主題によって解決され、好ましい実施態様は、添付の従属請求項から採用することができる。
【０００５】
また、本発明の根底にある課題は、第１の態様においても解決される。また、第１の態様は、アデノウイルスとＣＤＫ４／６阻害剤とを含む、組み合わせによるこのような第１の態様の第１の実施態様でもある。
【０００６】
以下に、このような第１の態様の更なる実施態様が開示される。
【０００７】
実施態様２：アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様１の組み合わせ。
【０００８】
実施態様３：アデノウイルスが、ＹＢ−１依存的様式で複製している、実施態様１及び２のいずれか１つの組み合わせ。
【０００９】
実施態様４：アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にＹＢ−１を有する細胞では複製している、実施態様３の組み合わせ。
【００１０】
実施態様５：アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される、実施態様２〜４のいずれか１つの組み合わせ。
【００１１】
実施態様６：がん遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質である、実施態様５の組み合わせ。
【００１２】
実施態様７：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様６の組み合わせ。
【００１３】
実施態様８：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様６の組み合わせ。
【００１４】
実施態様９：Ｅ１Ａタンパク質が、ＹＢ−１の核内への局在を誘引しない、実施態様６〜８のいずれか１つの組み合わせ。
【００１５】
実施態様１０：がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様５〜９のいずれか１つの組み合わせ。
【００１６】
実施態様１１：欠失が、ＣＲ３ストレッチの欠失並びにＮ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様１０の組み合わせ。
【００１７】
実施態様１２：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合可能である、実施態様６〜１１のいずれか１つの組み合わせ。
【００１８】
実施態様１３：Ｅ１Ａタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、ＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域における欠失である、実施態様６〜１２のいずれか１つの組み合わせ。
【００１９】
実施態様１４：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合不可能である、実施態様１３の組み合わせ。
【００２０】
実施態様１５：ウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１４のいずれか１つの組み合わせ。
【００２１】
実施態様１６：ウイルスが、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１５のいずれか１つの組み合わせ。
【００２２】
実施態様１７：ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスＥ３領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１６のいずれか１つの組み合わせ。
【００２３】
実施態様１８：ウイルスが、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１７のいずれか１つの組み合わせ。
【００２４】
実施態様１９：ウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１８のいずれか１つの組み合わせ。
【００２５】
実施態様２０：ウイルスが、アデノウイルス血清型５である、実施態様１〜１９のいずれか１つの組み合わせ。
【００２６】
実施態様２１：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様１〜２０のいずれか１つの組み合わせ。
【００２７】
実施態様２２：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１である、実施態様２１の組み合わせ。
【００２８】
実施態様２３：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、アデノウイルスＥ３領域が、機能的に不活性である、実施態様２１の組み合わせ。
【００２９】
実施態様２４：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、ｄｌ５２０が、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様２１〜２３のいずれか１つの組み合わせ。
【００３０】
実施態様２５：アデノウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているｄｌ５２０である、実施態様２１〜２４のいずれか１つの組み合わせ。
【００３１】
実施態様２６：ウイルスが、ＹＢ−１をコードする、実施態様１〜２５のいずれか１つの組み合わせ。
【００３２】
実施態様２７：ＹＢ−１をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び／又はＹＢ−１依存性プロモーターの制御下にある、実施態様２６の組み合わせ。
【００３３】
実施態様２８：ＹＢ−１依存性プロモーターが、アデノウイルスＥ２後期プロモーターである、実施態様２７の組み合わせ。
【００３４】
実施態様２９：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂリン酸化を低下させる化合物である、実施態様１〜２８のいずれか１つの組み合わせ。
【００３５】
実施態様３０：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂ発現を低下させる化合物である、実施態様１〜２９のいずれか１つの組み合わせ。
【００３６】
実施態様３１：ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１とも呼ばれるパルボシクリブ、ＬＹ−２８３５２１９とも呼ばれるアベマシクリブ、ＬＥＥ０１１とも呼ばれるリボシクリブ、Ｇ１Ｔ２８とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様１〜３０のいずれか１つの組み合わせ。
【００３７】
実施態様３２：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ１を阻害する、実施態様１〜３１のいずれか１つの組み合わせ。
【００３８】
実施態様３３：組成物が、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤を含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの組み合わせ。
【００３９】
実施態様３４：ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びＢＭＮ６７３を含む群から選択される、実施態様３３の組み合わせ。
【００４０】
実施態様３５：組成物が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの組み合わせ。
【００４１】
実施態様３６：ブロモドメイン阻害剤が、ＪＱ１、ＯＴＸ−０１５、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＣＰＩ−０６１０、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ−１及びＭＳ４３６を含む群から選択される、実施態様３５の組み合わせ。
【００４２】
実施態様３７：組み合わせの成分が、別々の投与のためのものである、実施態様１〜３６のいずれか１つの組み合わせ。
【００４３】
また、本発明の根底にある課題は、第２の態様においても解決される。また、第２の態様は、アデノウイルスとＣＤＫ４／６阻害剤とを含む、疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの処置における使用のための、第１の態様（その任意の実施態様を含む）の組み合わせによるこのような第２の態様の第１の実施態様でもある。
【００４４】
以下に、このような第２の態様の更なる実施態様が開示される。
【００４５】
実施態様１：疾患、好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び／又は予防のための方法における使用のための、アデノウイルスとＣＤＫ４／６阻害剤とを含む、
組み合わせ。
【００４６】
実施態様２：アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様１の使用のための組み合わせ。
【００４７】
実施態様３：アデノウイルスが、ＹＢ−１依存的様式で複製している、実施態様１及び２のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００４８】
実施態様４：アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にＹＢ−１を有する細胞では複製している、実施態様３の使用のための組み合わせ。
【００４９】
実施態様５：アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される、実施態様２〜４のいずれか１つの使用ための組み合わせ。
【００５０】
実施態様６：がん遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質である、実施態様５の使用ための組み合わせ。
【００５１】
実施態様７：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様６の使用のための組み合わせ。
【００５２】
実施態様８：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様６の使用のための組み合わせ。
【００５３】
実施態様９：Ｅ１Ａタンパク質が、ＹＢ−１の核内への局在を誘引しない、実施態様６〜８のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００５４】
実施態様１０：がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様５〜９のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００５５】
実施態様１１：欠失が、ＣＲ３ストレッチの欠失並びにＮ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様１０の使用のための組み合わせ。
【００５６】
実施態様１２：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合可能である、実施態様６〜１１のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００５７】
実施態様１３：Ｅ１Ａタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、ＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域における欠失である、実施態様６〜１２のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００５８】
実施態様１４：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合不可能である、実施態様１３の使用のための組み合わせ。
【００５９】
実施態様１５：ウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１４のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００６０】
実施態様１６：ウイルスが、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１５のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００６１】
実施態様１７：ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスＥ３領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１６のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００６２】
実施態様１８：ウイルスが、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１７のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００６３】
実施態様１９：ウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１８のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００６４】
実施態様２０：ウイルスが、アデノウイルス血清型５である、実施態様１〜１９のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００６５】
実施態様２１：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様１〜２０のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００６６】
実施態様２２：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１である、実施態様２１の使用のための組み合わせ。
【００６７】
実施態様２３：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、アデノウイルスＥ３領域が、機能的に不活性である、実施態様２１の使用のための組み合わせ。
【００６８】
実施態様２４：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、ｄｌ５２０が、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様２１〜２３のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００６９】
実施態様２５：アデノウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているｄｌ５２０である、実施態様２１〜２４のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００７０】
実施態様２６：ウイルスが、ＹＢ−１をコードする、実施態様１〜２５のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００７１】
実施態様２７：ＹＢ−１をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び／又はＹＢ−１依存性プロモーターの制御下にある、実施態様２６の使用のための組み合わせ。
【００７２】
実施態様２８：ＹＢ−１依存性プロモーターが、アデノウイルスＥ２後期プロモーターである、実施態様２７の使用のための組み合わせ。
【００７３】
実施態様２９：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂリン酸化を低下させる化合物である、実施態様１〜２８のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００７４】
実施態様３０：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂ発現を低下させる化合物である、実施態様１〜２９のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００７５】
実施態様３１：ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１とも呼ばれるパルボシクリブ、ＬＹ−２８３５２１９とも呼ばれるアベマシクリブ、ＬＥＥ０１１とも呼ばれるリボシクリブ、Ｇ１Ｔ２８とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様１〜３０のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００７６】
実施態様３２：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ１を阻害する、実施態様１〜３１のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００７７】
実施態様３３：組成物が、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤を含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００７８】
実施態様３４：ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びＢＭＮ６７３を含む群から選択される、実施態様３３の使用のための組み合わせ。
【００７９】
実施態様３５：組成物が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００８０】
実施態様３６：ブロモドメイン阻害剤が、ＪＱ１、ＯＴＸ−０１５、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＣＰＩ−０６１０、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ−１及びＭＳ４３６を含む群から選択される、実施態様３５の使用のための組み合わせ。
【００８１】
実施態様３７：組み合わせの成分が、別々の投与のためのものである、実施態様１〜３６のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００８２】
実施態様３８：腫瘍細胞は、ＣＤＫ４／６シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様１〜３７のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００８３】
実施態様３９：腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないＧ１−Ｓ移行を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００８４】
実施態様４０：腫瘍細胞が、ＲＢ１遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子及びＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００８５】
実施態様４１：腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００８６】
実施態様４２：遺伝子が、ＣＣＮＤ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を含む群から選択される、実施態様４１の使用のための組み合わせ。
【００８７】
実施態様４３：遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様４１の使用のための組み合わせ。
【００８８】
実施態様４４：分裂促進性シグナル伝達経路が、ＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路を含む群から選択される、実施態様４３の使用のための組み合わせ。
【００８９】
実施態様４５：腫瘍細胞の細胞が、１つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び／又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様１〜４４のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００９０】
実施態様４６：薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様４５の使用のための組み合わせ。
【００９１】
実施態様４７：耐性が、ＡＢＣトランスポーターにより媒介される、請求項４６の使用のための組み合わせ。
【００９２】
実施態様４８：ＡＢＣトランスポーターが、ＭＲＰ及びＭＤＲ、特に、ＭＤＲ−１を含む群から選択される、請求項４７の使用のための組み合わせ。
【００９３】
実施態様４９：耐性が、多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、特に、細胞分裂阻害剤及び／又は放射線に対して多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である、実施態様４５〜４８のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００９４】
実施態様５０：腫瘍細胞が、Ｒｂ陽性である、実施態様１〜４９のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００９５】
実施態様５１：腫瘍細胞が、核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５０のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００９６】
実施態様５２：腫瘍細胞が、誘引後に核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５１のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【００９７】
実施態様５３：ＹＢ−１の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも１つの手段により誘発される、実施態様５２の使用のための組み合わせ。
【００９８】
実施態様５４：手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様５３の使用のための組み合わせ。
【００９９】
実施態様５５：腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん（ｍＢＣ）、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項１〜５４のいずれか１つの使用のための組み合わせ。
【０１００】
また、本発明の根底にある課題は、第３の態様においても解決される。また、第３の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び／又は予防における使用のための、アデノウイルスによるこのような第３の態様の第１の実施態様でもある。ここで、方法は、アデノウイルス及びＣＤＫ４／６阻害剤を対象に投与することを含む。
【０１０１】
以下に、このような第３の態様の更なる実施態様が開示される。
【０１０２】
実施態様２：アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様１の使用のためのアデノウイルス。
【０１０３】
実施態様３：アデノウイルスが、ＹＢ−１依存的様式で複製している、実施態様１及び２のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１０４】
実施態様４：アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にＹＢ−１を有する細胞では複製している、実施態様３の使用のためのアデノウイルス。
【０１０５】
実施態様５：アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される、実施態様２〜４のいずれか１つの使用ためのアデノウイルス。
【０１０６】
実施態様６：がん遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質である、実施態様５の使用ためのアデノウイルス。
【０１０７】
実施態様７：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様６の使用のためのアデノウイルス。
【０１０８】
実施態様８：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様６の使用のためのアデノウイルス。
【０１０９】
実施態様９：Ｅ１Ａタンパク質が、ＹＢ−１の核内への局在を誘引しない、実施態様６〜８のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１１０】
実施態様１０：がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様５〜９のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１１１】
実施態様１１：欠失が、ＣＲ３ストレッチの欠失並びにＮ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様１０の使用のためのアデノウイルス。
【０１１２】
実施態様１２：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合可能である、実施態様６〜１１のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１１３】
実施態様１３：Ｅ１Ａタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、ＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域における欠失である、実施態様６〜１２のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１１４】
実施態様１４：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合不可能である、実施態様１３の使用のためのアデノウイルス。
【０１１５】
実施態様１５：ウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１４のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１１６】
実施態様１６：ウイルスが、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１５のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１１７】
実施態様１７：ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスＥ３領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１６のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１１８】
実施態様１８：ウイルスが、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１７のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１１９】
実施態様１９：ウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１８のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１２０】
実施態様２０：ウイルスが、アデノウイルス血清型５である、実施態様１〜１９のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１２１】
実施態様２１：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様１〜２０のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１２２】
実施態様２２：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１である、実施態様２１の使用のためのアデノウイルス。
【０１２３】
実施態様２３：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、アデノウイルスＥ３領域が、機能的に不活性である、実施態様２１の使用のためのアデノウイルス。
【０１２４】
実施態様２４：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、ｄｌ５２０が、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様２１〜２３のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１２５】
実施態様２５：アデノウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているｄｌ５２０である、実施態様２１〜２４のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１２６】
実施態様２６：ウイルスが、ＹＢ−１をコードする、実施態様１〜２５のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１２７】
実施態様２７：ＹＢ−１をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び／又はＹＢ−１依存性プロモーターの制御下にある、実施態様２６の使用のためのアデノウイルス。
【０１２８】
実施態様２８：ＹＢ−１依存性プロモーターが、アデノウイルスＥ２後期プロモーターである、実施態様２７の使用のためのアデノウイルス。
【０１２９】
実施態様２９：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂリン酸化を低下させる化合物である、実施態様１〜２８のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１３０】
実施態様３０：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂ発現を低下させる化合物である、実施態様１〜２９のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１３１】
実施態様３１：ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１とも呼ばれるパルボシクリブ、ＬＹ−２８３５２１９とも呼ばれるアベマシクリブ、ＬＥＥ０１１とも呼ばれるリボシクリブ、Ｇ１Ｔ２８とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様１〜３０のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１３２】
実施態様３２：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ１を阻害する、実施態様１〜３１のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１３３】
実施態様３３：方法が、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１３４】
実施態様３４：ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びＢＭＮ６７３を含む群から選択される、実施態様３３の使用のためのアデノウイルス。
【０１３５】
実施態様３５：方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１３６】
実施態様３６：ブロモドメイン阻害剤が、ＪＱ１、ＯＴＸ−０１５、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＣＰＩ−０６１０、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ−１及びＭＳ４３６を含む群から選択される、実施態様３５の使用のためのアデノウイルス。
【０１３７】
実施態様３７：アデノウイルス、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様１〜３６のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１３８】
実施態様３８：腫瘍細胞は、ＣＤＫ４／６シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様１〜３７のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１３９】
実施態様３９：腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないＧ１−Ｓ移行を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１４０】
実施態様４０：腫瘍細胞が、ＲＢ１遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子及びＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１４１】
実施態様４１：腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１４２】
実施態様４２：遺伝子が、ＣＣＮＤ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を含む群から選択される、実施態様４１の使用のためのアデノウイルス。
【０１４３】
実施態様４３：遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様４１の使用のためのアデノウイルス。
【０１４４】
実施態様４４：分裂促進性シグナル伝達経路が、ＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路を含む群から選択される、実施態様４３の使用のためのアデノウイルス。
【０１４５】
実施態様４５：腫瘍細胞の細胞が、１つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び／又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様１〜４４のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１４６】
実施態様４６：薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様４５の使用のためのアデノウイルス。
【０１４７】
実施態様４７：耐性が、ＡＢＣトランスポーターにより媒介される、請求項４６の使用のためのアデノウイルス。
【０１４８】
実施態様４８：ＡＢＣトランスポーターが、ＭＲＰ及びＭＤＲ、特に、ＭＤＲ−１を含む群から選択される、請求項４７の使用のためのアデノウイルス。
【０１４９】
実施態様４９：耐性が、多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、特に、細胞分裂阻害剤及び／又は放射線に対して多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である、実施態様４５〜４８のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１５０】
実施態様５０：腫瘍細胞が、Ｒｂ陽性である、実施態様１〜４９のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１５１】
実施態様５１：腫瘍細胞が、核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５０のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１５２】
実施態様５２：腫瘍細胞が、誘引後に核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５１のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１５３】
実施態様５３：ＹＢ−１の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも１つの手段により誘発される、実施態様５２の使用のためのアデノウイルス。
【０１５４】
実施態様５４：手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様５３の使用のためのアデノウイルス。
【０１５５】
実施態様５５：腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん（ｍＢＣ）、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項１〜５４のいずれか１つの使用のためのアデノウイルス。
【０１５６】
また、本発明の根底にある課題は、第４の態様においても解決される。また、第４の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び／又は予防における使用のための、ＣＤＫ４／６阻害剤によるこのような第４の態様の第１の実施態様でもある。ここで、方法は、アデノウイルス及びＣＤＫ４／６阻害剤を対象に投与することを含む。
【０１５７】
以下に、このような第４の態様の更なる実施態様が開示される。
【０１５８】
実施態様２：アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様１の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１５９】
実施態様３：アデノウイルスが、ＹＢ−１依存的様式で複製している、実施態様１及び２のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６０】
実施態様４：アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にＹＢ−１を有する細胞では複製している、実施態様３の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６１】
実施態様５：アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される、実施態様２〜４のいずれか１つの使用ためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６２】
実施態様６：がん遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質である、実施態様５の使用ためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６３】
実施態様７：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様６の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６４】
実施態様８：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様６の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６５】
実施態様９：Ｅ１Ａタンパク質が、ＹＢ−１の核内への局在を誘引しない、実施態様６〜８のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６６】
実施態様１０：がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様５〜９のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６７】
実施態様１１：欠失が、ＣＲ３ストレッチの欠失並びにＮ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様１０の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６８】
実施態様１２：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合可能である、実施態様６〜１１のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１６９】
実施態様１３：Ｅ１Ａタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、ＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域における欠失である、実施態様６〜１２のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７０】
実施態様１４：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合不可能である、実施態様１３の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７１】
実施態様１５：ウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１４のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７２】
実施態様１６：ウイルスが、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１５のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７３】
実施態様１７：ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスＥ３領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１６のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７４】
実施態様１８：ウイルスが、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１７のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７５】
実施態様１９：ウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１８のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７６】
実施態様２０：ウイルスが、アデノウイルス血清型５である、実施態様１〜１９のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７７】
実施態様２１：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様１〜２０のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７８】
実施態様２２：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１である、実施態様２１の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１７９】
実施態様２３：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、アデノウイルスＥ３領域が、機能的に不活性である、実施態様２１の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８０】
実施態様２４：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、ｄｌ５２０が、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様２１〜２３のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８１】
実施態様２５：アデノウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているｄｌ５２０である、実施態様２１〜２４のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８２】
実施態様２６：ウイルスが、ＹＢ−１をコードする、実施態様１〜２５のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８３】
実施態様２７：ＹＢ−１をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び／又はＹＢ−１依存性プロモーターの制御下にある、実施態様２６の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８４】
実施態様２８：ＹＢ−１依存性プロモーターが、アデノウイルスＥ２後期プロモーターである、実施態様２７の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８５】
実施態様２９：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂリン酸化を低下させる化合物である、実施態様１〜２８のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８６】
実施態様３０：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂ発現を低下させる化合物である、実施態様１〜２９のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８７】
実施態様３１：ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１とも呼ばれるパルボシクリブ、ＬＹ−２８３５２１９とも呼ばれるアベマシクリブ、ＬＥＥ０１１とも呼ばれるリボシクリブ、Ｇ１Ｔ２８とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様１〜３０のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８８】
実施態様３２：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ１を阻害する、実施態様１〜３１のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１８９】
実施態様３３：方法が、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９０】
実施態様３４：ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びＢＭＮ６７３を含む群から選択される、実施態様３３の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９１】
実施態様３５：方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９２】
実施態様３６：ブロモドメイン阻害剤が、ＪＱ１、ＯＴＸ−０１５、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＣＰＩ−０６１０、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ−１及びＭＳ４３６を含む群から選択される、実施態様３５の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９３】
実施態様３７：アデノウイルス、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様１〜３６のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９４】
実施態様３８：腫瘍細胞は、ＣＤＫ４／６シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様１〜３７のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９５】
実施態様３９：腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないＧ１−Ｓ移行を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９６】
実施態様４０：腫瘍細胞が、ＲＢ１遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子及びＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９７】
実施態様４１：腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９８】
実施態様４２：遺伝子が、ＣＣＮＤ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を含む群から選択される、実施態様４１の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０１９９】
実施態様４３：遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様４１の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２００】
実施態様４４：分裂促進性シグナル伝達経路が、ＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路を含む群から選択される、実施態様４３の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０１】
実施態様４５：腫瘍細胞の細胞が、１つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び／又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様１〜４４のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０２】
実施態様４６：薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様４５の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０３】
実施態様４７：耐性が、ＡＢＣトランスポーターにより媒介される、請求項４６の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０４】
実施態様４８：ＡＢＣトランスポーターが、ＭＲＰ及びＭＤＲ、特に、ＭＤＲ−１を含む群から選択される、請求項４７の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０５】
実施態様４９：耐性が、多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、特に、細胞分裂阻害剤及び／又は放射線に対して多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である、実施態様４５〜４８のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０６】
実施態様５０：腫瘍細胞が、Ｒｂ陽性である、実施態様１〜４９のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０７】
実施態様５１：腫瘍細胞が、核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５０のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０８】
実施態様５２：腫瘍細胞が、誘引後に核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５１のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２０９】
実施態様５３：ＹＢ−１の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも１つの手段により誘発される、実施態様５２の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２１０】
実施態様５４：手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様５３の使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２１１】
実施態様５５：腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん（ｍＢＣ）、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項１〜５４のいずれか１つの使用のためのＣＤＫ４／６阻害剤。
【０２１２】
また、本発明の根底にある課題は、第５の態様においても解決される。また、第５の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び／又は予防における使用のための、ＰＡＲＰ阻害剤によるこのような第５の態様の第１の実施態様でもある。ここで、方法は、アデノウイルス、ＣＤＫ４／６阻害剤及びＰＡＲＰ阻害剤を対象に投与することを含む。
【０２１３】
以下に、このような第５の態様の更なる実施態様が開示される。
【０２１４】
実施態様２：アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様１の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２１５】
実施態様３：アデノウイルスが、ＹＢ−１依存的様式で複製している、実施態様１及び２のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２１６】
実施態様４：アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にＹＢ−１を有する細胞では複製している、実施態様３の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２１７】
実施態様５：アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される、実施態様２〜４のいずれか１つの使用ためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２１８】
実施態様６：がん遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質である、実施態様５の使用ためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２１９】
実施態様７：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様６の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２０】
実施態様８：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様６の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２１】
実施態様９：Ｅ１Ａタンパク質が、ＹＢ−１の核内への局在を誘引しない、実施態様６〜８のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２２】
実施態様１０：がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様５〜９のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２３】
実施態様１１：欠失が、ＣＲ３ストレッチの欠失並びにＮ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様１０の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２４】
実施態様１２：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合可能である、実施態様６〜１１のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２５】
実施態様１３：Ｅ１Ａタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、ＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域における欠失である、実施態様６〜１２のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２６】
実施態様１４：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合不可能である、実施態様１３の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２７】
実施態様１５：ウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１４のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２８】
実施態様１６：ウイルスが、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１５のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２２９】
実施態様１７：ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスＥ３領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１６のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３０】
実施態様１８：ウイルスが、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１７のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３１】
実施態様１９：ウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１８のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３２】
実施態様２０：ウイルスが、アデノウイルス血清型５である、実施態様１〜１９のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３３】
実施態様２１：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様１〜２０のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３４】
実施態様２２：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１である、実施態様２１の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３５】
実施態様２３：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、アデノウイルスＥ３領域が、機能的に不活性である、実施態様２１の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３６】
実施態様２４：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、ｄｌ５２０が、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様２１〜２３のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３７】
実施態様２５：アデノウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているｄｌ５２０である、実施態様２１〜２４のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３８】
実施態様２６：ウイルスが、ＹＢ−１をコードする、実施態様１〜２５のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２３９】
実施態様２７：ＹＢ−１をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び／又はＹＢ−１依存性プロモーターの制御下にある、実施態様２６の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４０】
実施態様２８：ＹＢ−１依存性プロモーターが、アデノウイルスＥ２後期プロモーターである、実施態様２７の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４１】
実施態様２９：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂリン酸化を低下させる化合物である、実施態様１〜２８のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４２】
実施態様３０：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂ発現を低下させる化合物である、実施態様１〜２９のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４３】
実施態様３１：ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１とも呼ばれるパルボシクリブ、ＬＹ−２８３５２１９とも呼ばれるアベマシクリブ、ＬＥＥ０１１とも呼ばれるリボシクリブ、Ｇ１Ｔ２８とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様１〜３０のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４４】
実施態様３２：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ１を阻害する、実施態様１〜３１のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４５】
実施態様３３：方法が、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４６】
実施態様３４：ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びＢＭＮ６７３を含む群から選択される、実施態様３３の使用のためのＰＡＲＰ。
【０２４７】
実施態様３５：方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４８】
実施態様３６：ブロモドメイン阻害剤が、ＪＱ１、ＯＴＸ−０１５、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＣＰＩ−０６１０、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ−１及びＭＳ４３６を含む群から選択される、実施態様３５の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２４９】
実施態様３７：アデノウイルス、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様１〜３６のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５０】
実施態様３８：腫瘍細胞は、ＣＤＫ４／６シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様１〜３７のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５１】
実施態様３９：腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないＧ１−Ｓ移行を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５２】
実施態様４０：腫瘍細胞が、ＲＢ１遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子及びＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５３】
実施態様４１：腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５４】
実施態様４２：遺伝子が、ＣＣＮＤ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を含む群から選択される、実施態様４１の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５５】
実施態様４３：遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様４１の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５６】
実施態様４４：分裂促進性シグナル伝達経路が、ＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路を含む群から選択される、実施態様４３の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５７】
実施態様４５：腫瘍細胞の細胞が、１つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び／又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様１〜４４のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５８】
実施態様４６：薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様４５の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２５９】
実施態様４７：耐性が、ＡＢＣトランスポーターにより媒介される、請求項４６の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６０】
実施態様４８：ＡＢＣトランスポーターが、ＭＲＰ及びＭＤＲ、特に、ＭＤＲ−１を含む群から選択される、請求項４７の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６１】
実施態様４９：耐性が、多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、特に、細胞分裂阻害剤及び／又は放射線に対して多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である、実施態様４５〜４８のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６２】
実施態様５０：腫瘍細胞が、Ｒｂ陽性である、実施態様１〜４９のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６３】
実施態様５１：腫瘍細胞が、核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５０のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６４】
実施態様５２：腫瘍細胞が、誘引後に核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５１のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６５】
実施態様５３：ＹＢ−１の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも１つの手段により誘発される、実施態様５２の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６６】
実施態様５４：手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様５３の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６７】
実施態様５５：腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん（ｍＢＣ）、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項１〜５４のいずれか１つの使用のためのＰＡＲＰ阻害剤。
【０２６８】
本発明の根底にある課題は、第６の態様において解決される。また、第６の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び／又は予防における使用のための、ブロモドメイン阻害剤によるこのような第６の態様の第１の実施態様でもある。ここで、方法は、アデノウイルス、ＣＤＫ４／６阻害剤及びブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む。
【０２６９】
以下に、このような第６の態様の更なる実施態様が開示される。
【０２７０】
実施態様２：アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様１の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７１】
実施態様３：アデノウイルスが、ＹＢ−１依存的様式で複製している、実施態様１及び２のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７２】
実施態様４：アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にＹＢ−１を有する細胞では複製している、実施態様３の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７３】
実施態様５：アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される、実施態様２〜４のいずれか１つの使用ためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７４】
実施態様６：がん遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質である、実施態様５の使用ためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７５】
実施態様７：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様６の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７６】
実施態様８：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様６の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７７】
実施態様９：Ｅ１Ａタンパク質が、ＹＢ−１の核内への局在を誘引しない、実施態様６〜８のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７８】
実施態様１０：がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様５〜９のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２７９】
実施態様１１：欠失が、ＣＲ３ストレッチの欠失並びにＮ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様１０の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８０】
実施態様１２：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合可能である、実施態様６〜１１のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８１】
実施態様１３：Ｅ１Ａタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、ＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域における欠失である、実施態様６〜１２のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８２】
実施態様１４：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合不可能である、実施態様１３の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８３】
実施態様１５：ウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１４のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８４】
実施態様１６：ウイルスが、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１５のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８５】
実施態様１７：ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスＥ３領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１６のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８６】
実施態様１８：ウイルスが、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１７のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８７】
実施態様１９：ウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１８のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８８】
実施態様２０：ウイルスが、アデノウイルス血清型５である、実施態様１〜１９のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２８９】
実施態様２１：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様１〜２０のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９０】
実施態様２２：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１である、実施態様２１の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９１】
実施態様２３：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、アデノウイルスＥ３領域が、機能的に不活性である、実施態様２１の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９２】
実施態様２４：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、ｄｌ５２０が、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様２１〜２３のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９３】
実施態様２５：アデノウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているｄｌ５２０である、実施態様２１〜２４のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９４】
実施態様２６：ウイルスが、ＹＢ−１をコードする、実施態様１〜２５のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９５】
実施態様２７：ＹＢ−１をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び／又はＹＢ−１依存性プロモーターの制御下にある、実施態様２６の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９６】
実施態様２８：ＹＢ−１依存性プロモーターが、アデノウイルスＥ２後期プロモーターである、実施態様２７の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９７】
実施態様２９：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂリン酸化を低下させる化合物である、実施態様１〜２８のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９８】
実施態様３０：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂ発現を低下させる化合物である、実施態様１〜２９のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０２９９】
実施態様３１：ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１とも呼ばれるパルボシクリブ、ＬＹ−２８３５２１９とも呼ばれるアベマシクリブ、ＬＥＥ０１１とも呼ばれるリボシクリブ、Ｇ１Ｔ２８とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様１〜３０のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３００】
実施態様３２：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ１を阻害する、実施態様１〜３１のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０１】
実施態様３３：方法が、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０２】
実施態様３４：ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びＢＭＮ６７３を含む群から選択される、実施態様３３の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０３】
実施態様３５：方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０４】
実施態様３６：ブロモドメイン阻害剤が、ＪＱ１、ＯＴＸ−０１５、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＣＰＩ−０６１０、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ−１及びＭＳ４３６を含む群から選択される、実施態様３５の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０５】
実施態様３７：アデノウイルス、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様１〜３６のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０６】
実施態様３８：腫瘍細胞は、ＣＤＫ４／６シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様１〜３７のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０７】
実施態様３９：腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないＧ１−Ｓ移行を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０８】
実施態様４０：腫瘍細胞が、ＲＢ１遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子及びＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３０９】
実施態様４１：腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１０】
実施態様４２：遺伝子が、ＣＣＮＤ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を含む群から選択される、実施態様４１の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１１】
実施態様４３：遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様４１の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１２】
実施態様４４：分裂促進性シグナル伝達経路が、ＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路を含む群から選択される、実施態様４３の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１３】
実施態様４５：腫瘍細胞の細胞が、１つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び／又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様１〜４４のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１４】
実施態様４６：薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様４５の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１５】
実施態様４７：耐性が、ＡＢＣトランスポーターにより媒介される、請求項４６の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１６】
実施態様４８：ＡＢＣトランスポーターが、ＭＲＰ及びＭＤＲ、特に、ＭＤＲ−１を含む群から選択される、請求項４７の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１７】
実施態様４９：耐性が、多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、特に、細胞分裂阻害剤及び／又は放射線に対して多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である、実施態様４５〜４８のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１８】
実施態様５０：腫瘍細胞が、Ｒｂ陽性である、実施態様１〜４９のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３１９】
実施態様５１：腫瘍細胞が、核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５０のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３２０】
実施態様５２：腫瘍細胞が、誘引後に核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５１のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３２１】
実施態様５３：ＹＢ−１の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも１つの手段により誘発される、実施態様５２の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３２２】
実施態様５４：手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様５３の使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３２３】
実施態様５５：腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん（ｍＢＣ）、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項１〜５４のいずれか１つの使用のためのブロモドメイン阻害剤。
【０３２４】
本発明の根底にある課題は、第７の態様において解決される。また、第７の態様は、対象における疾患、より好ましくは、腫瘍又はがんの治療及び／又は予防のための方法であって、アデノウイルス及びＣＤＫ４／６阻害剤を対象に投与することを含む方法によるこのような第７の態様の第１の実施態様でもある。
【０３２５】
以下に、このような第７の態様の更なる実施態様が開示される。
【０３２６】
実施態様２：アデノウイルスが、腫瘍溶解性アデノウイルスである、実施態様１の方法。
【０３２７】
実施態様３：アデノウイルスが、ＹＢ−１依存的様式で複製している、実施態様１及び２のいずれか１つの方法。
【０３２８】
実施態様４：アデノウイルスが、核内にＹＢ−１を欠いた細胞では複製欠損であるが、核内にＹＢ−１を有する細胞では複製している、実施態様３の方法。
【０３２９】
実施態様５：アデノウイルスが、がん遺伝子タンパク質をコードし、ここで、がん遺伝子タンパク質が、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、ここで、アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される、実施態様２〜４のいずれか１つの方法。
【０３３０】
実施態様６：がん遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質である、実施態様５の方法。
【０３３１】
実施態様７：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能である、実施態様６の方法。
【０３３２】
実施態様８：Ｅ１Ａタンパク質が、機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合不可能である、実施態様６の方法。
【０３３３】
実施態様９：Ｅ１Ａタンパク質が、ＹＢ−１の核内への局在を誘引しない、実施態様６〜８のいずれか１つの方法。
【０３３４】
実施態様１０：がん遺伝子タンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を示す、実施態様５〜９のいずれか１つの方法。
【０３３５】
実施態様１１：欠失が、ＣＲ３ストレッチの欠失並びにＮ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から選択されるものである、実施態様１０の方法。
【０３３６】
実施態様１２：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合可能である、実施態様６〜１１のいずれか１つの方法。
【０３３７】
実施態様１３：Ｅ１Ａタンパク質が、野生型がん遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、ここで、該欠失が、好ましくは、ＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域における欠失である、実施態様６〜１２のいずれか１つの方法。
【０３３８】
実施態様１４：Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂに結合不可能である、実施態様１３の方法。
【０３３９】
実施態様１５：ウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１４のいずれか１つの方法。
【０３４０】
実施態様１６：ウイルスが、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１５のいずれか１つの方法。
【０３４１】
実施態様１７：ウイルスが、機能的に活性なアデノウイルスＥ３領域を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１６のいずれか１つの方法。
【０３４２】
実施態様１８：ウイルスが、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスである、実施態様１〜１７のいずれか１つの方法。
【０３４３】
実施態様１９：ウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているアデノウイルスである、実施態様１〜１８のいずれか１つの方法。
【０３４４】
実施態様２０：ウイルスが、アデノウイルス血清型５である、実施態様１〜１９のいずれか１つの方法。
【０３４５】
実施態様２１：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な発現されたウイルスがん遺伝子を欠いているウイルスを含む群から選択される、実施態様１〜２０のいずれか１つの方法。
【０３４６】
実施態様２２：アデノウイルスが、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１である、実施態様２１の方法。
【０３４７】
実施態様２３：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、アデノウイルスＥ３領域が、機能的に不活性である、実施態様２１の方法。
【０３４８】
実施態様２４：アデノウイルスが、ｄｌ５２０であり、ここで、ｄｌ５２０が、Ｅ１Ｂ  １９kDaタンパク質の発現を欠いている、実施態様２１〜２３のいずれか１つの方法。
【０３４９】
実施態様２５：アデノウイルスが、繊維においてＲＧＤモチーフを発現しているｄｌ５２０である、実施態様２１〜２４のいずれか１つの方法。
【０３５０】
実施態様２６：ウイルスが、ＹＢ−１をコードする、実施態様１〜２５のいずれか１つの方法。
【０３５１】
実施態様２７：ＹＢ−１をコードする遺伝子が、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター及び／又はＹＢ−１依存性プロモーターの制御下にある、実施態様２６の方法。
【０３５２】
実施態様２８：ＹＢ−１依存性プロモーターが、アデノウイルスＥ２後期プロモーターである、実施態様２７の方法。
【０３５３】
実施態様２９：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂリン酸化を低下させる化合物である、実施態様１〜２８のいずれか１つの方法。
【０３５４】
実施態様３０：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞、好ましくは、腫瘍細胞におけるＲｂ発現を低下させる化合物である、実施態様１〜２９のいずれか１つの方法。
【０３５５】
実施態様３１：ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＰＤ０３３２９９１とも呼ばれるパルボシクリブ、ＬＹ−２８３５２１９とも呼ばれるアベマシクリブ、ＬＥＥ０１１とも呼ばれるリボシクリブ、Ｇ１Ｔ２８とも呼ばれるトリラシクリブ及びディナシクリブを含む群から選択される、実施態様１〜３０のいずれか１つの方法。
【０３５６】
実施態様３２：ＣＤＫ４／６阻害剤が、細胞をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ１を阻害する、実施態様１〜３１のいずれか１つの方法。
【０３５７】
実施態様３３：方法が、さらに、ＰＡＲＰ阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの方法。
【０３５８】
実施態様３４：ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ及びＢＭＮ６７３を含む群から選択される、実施態様３３の方法。
【０３５９】
実施態様３５：方法が、さらに、ブロモドメイン阻害剤を対象に投与することを含む、実施態様１〜３２のいずれか１つの方法。
【０３６０】
実施態様３６：ブロモドメイン阻害剤が、ＪＱ１、ＯＴＸ−０１５、Ｉ−ＢＥＴ１５１、ＣＰＩ−０６１０、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ−１及びＭＳ４３６を含む群から選択される、実施態様３５の方法。
【０３６１】
実施態様３７：アデノウイルス、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はブロモドメイン阻害剤が、対象に別々に又は任意の組み合わせとして投与される、実施態様１〜３６のいずれか１つの方法。
【０３６２】
実施態様３８：腫瘍細胞は、ＣＤＫ４／６シグナル伝達経路が破壊されている、実施態様１〜３７のいずれか１つの方法。
【０３６３】
実施態様３９：腫瘍細胞が、細胞周期の制御されていないＧ１−Ｓ移行を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの方法。
【０３６４】
実施態様４０：腫瘍細胞が、ＲＢ１遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子及びＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子を含む群から選択される遺伝子において、機能喪失突然変異又は欠失を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの方法。
【０３６５】
実施態様４１：腫瘍細胞が、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の活性化突然変異を有する、実施態様１〜３８のいずれか１つの方法。
【０３６６】
実施態様４２：遺伝子が、ＣＣＮＤ１、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を含む群から選択される、実施態様４１の方法。
【０３６７】
実施態様４３：遺伝子が、分裂促進性シグナル伝達経路の成分をコードする遺伝子である、実施態様４１の方法。
【０３６８】
実施態様４４：分裂促進性シグナル伝達経路が、ＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路を含む群から選択される、実施態様４３の方法。
【０３６９】
実施態様４５：腫瘍細胞の細胞が、１つ又は複数の薬学的に活性な薬剤及び／又は放射線に対して耐性を有するか又は感受性がない、実施態様１〜４４のいずれか１つの方法。
【０３７０】
実施態様４６：薬学的に活性な薬剤が、細胞分裂阻害剤である、実施態様４５の方法。
【０３７１】
実施態様４７：耐性が、ＡＢＣトランスポーターにより媒介される、請求項４６の方法。
【０３７２】
実施態様４８：ＡＢＣトランスポーターが、ＭＲＰ及びＭＤＲ、特に、ＭＤＲ−１を含む群から選択される、請求項４７の方法。
【０３７３】
実施態様４９：耐性が、多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、特に、細胞分裂阻害剤及び／又は放射線に対して多耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は多耐性（ｐｏｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）である、実施態様４５〜４８のいずれか１つの方法。
【０３７４】
実施態様５０：腫瘍細胞が、Ｒｂ陽性である、実施態様１〜４９のいずれか１つの方法。
【０３７５】
実施態様５１：腫瘍細胞が、核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５０のいずれか１つの方法。
【０３７６】
実施態様５２：腫瘍細胞が、誘引後に核内にＹＢ−１を有する、実施態様１〜５１のいずれか１つの方法。
【０３７７】
実施態様５３：ＹＢ−１の核への輸送が、放射線照射、細胞分裂阻害剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される少なくとも１つの手段により誘発される、実施態様５２の方法。
【０３７８】
実施態様５４：手段が、細胞、臓器又は生物、好ましくは、それを必要とする生物、より好ましくは、腫瘍を患っている生物に適用される、実施態様５３の方法。
【０３７９】
実施態様５５：腫瘍が、膀胱がん、乳がん、転移性乳がん（ｍＢＣ）、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び白血病を含む群から選択される、請求項１〜５４のいずれか１つの方法。
【０３８０】
また、第８の態様において、本発明は、医薬の製造のための組成物の使用に関し、ここで、該組成物は、本発明の第１の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して開示された組成物であり、該医薬は、本発明の第２の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して特定された疾患の治療及び／又は予防のためのものである。
【０３８１】
また、第９の態様において、本発明は、医薬の製造のためのアデノウイルスの使用に関し、ここで、アデノウイルスは、本発明の第３の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して開示されたアデノウイルスであり、該医薬は、本発明の第３の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して特定された疾患の治療及び／又は予防のためのものである。
【０３８２】
また、第１０の態様において、本発明は、医薬の製造のためのＣＤＫ４／６阻害剤の使用に関し、ここで、ＣＤＫ４／６阻害剤は、本発明の第４の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して開示されたＣＤＫ４／６阻害剤であり、該医薬は、本発明の第４の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して特定された疾患の治療及び／又は予防のためのものである。
【０３８３】
また、第１１の態様において、本発明は、医薬の製造のためのＰＡＲＰ阻害剤の使用に関し、ここで、ＰＡＲＰ阻害剤は、本発明の第５の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して開示されたＰＡＲＰ阻害剤であり、該医薬は、本発明の第５の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して特定された疾患の治療及び／又は予防のためのものである。
【０３８４】
また、第１２の態様において、本発明は、医薬の製造のためのブロモドメイン阻害剤の使用に関し、ここで、ブロモドメイン阻害剤は、本発明の第６の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して開示されたブロモドメイン阻害剤であり、該医薬は、本発明の第６の態様（その任意の実施態様を含む）に関連して特定された疾患の治療及び／又は予防のためのものである。
【０３８５】
本発明の一態様の各実施態様及び任意の実施態様が、本発明の他の各態様及び任意の態様（その任意の実施態様を含む）の実施態様でもあることが、当業者により認識されるのであろう。
【０３８６】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、驚くべきことに、腫瘍溶解性ウイルス、好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルスをＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせることにより、このような腫瘍溶解性アデノウイルスに基づく腫瘍治療の効力が向上することを見出した。より具体的には、ＣＤＫ４／６阻害剤が、Ｅ２Ｆ−１を阻害することにより、好ましくは、腫瘍細胞においてその有効濃度を低下させ、細胞におけるＧ１停止を同調させると推定される。このため、より多くの感染細胞がウイルスのライフサイクル全体を完了させることができる。
【０３８７】
本明細書で提供された証拠及び洞察に基づいて、当業者は、任意の−突然変異体−アデノウイルスが本発明の実施における使用に適していると理解するであろう。同使用は、そのようなアデノウイルスにより、少なくとも野生型発現の１０％、２０％又は３０％程度、Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６それぞれの活性が達成されることを許容する。このような突然変異体アデノウイルスは、Ｅ１Ａを改変することにより生成することができると、当業者により理解されるであろう。例示的な突然変異体アデノウイルスは、アデノウイルスＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ｄｌ５２０、ＡｄΔ２４、ＡｄΔ２４−ＲＧＤ、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ＶＣＮ−０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ＯＲＣＡ−０１０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ及び機能的Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子産物と結合可能な発現されたウイルス性腫瘍遺伝子を欠いているウイルスである。
【０３８８】
アデノウイルスについての名称の由来は、Wallace P. Rowe及びRobert J. Huebnerにより（Rowe, et al., 1953）、１９５３年にヒトの扁桃及び咽頭扁桃組織からウイルスが初めて分離されたことによる。アデノウイルス科は、５つの属、すなわち、Mastadenoviruses、Aviadenoviruses、Siadenoviruses、Atadenoviruses及びIchtadenovirusesを含む（Modeow, 2013）。げっ歯類の新生児におけるその発がん性のため、それらは、７つのサブグループＨＡｄＶ−Ａ〜ＨＡｄＶ−Ｇに分類することができ（Boulanger and Blair, 1991）、全部で６２の血清型に分類することができる。それにより、腫瘍溶解性ウイルス療法に関する研究は、主に、Mastadenovirus  Ｃ型血清型５に焦点が当てられている。
【０３８９】
８０〜１１０nmのサイズを有する非被覆の二十面体キャプシドは、キャプシドの頂点にある、ペントンベース及び繊維と呼ばれるスパイク様タンパク質構造から構築される１２個のペントンと、ヘキソンと呼ばれる２４９面とからなる、２５２個のキャプソメアから構成される（Modrow, 2013）。アデノウイルスの全ライフサイクルは、細胞侵入を伴う初期段階、ウイルスゲノムの核移行、初期遺伝子の転写及び翻訳並びに後期遺伝子の転写及び翻訳を伴う後期段階に細分することができる。それにより、後期タンパク質は、主に、構造タンパク質の構築とビリオンの成熟を担っている（Russell, 2000）。許容細胞では、初期段階に約６〜８時間かかり、続けて、後期段階に約４〜６時間かかる。結合は、少なくともアデノウイルスＨＡｄＶ−Ａ、−Ｃ、−Ｅ及び−Ｆについては、繊維構造のあらゆる末端に存在するノブ構造とターゲット細胞上のレセプターとの相互作用を介して生じる。このレセプターは、コクサッキーＢウイルス吸着を担うものと同じものとして検出されたため、このレセプターは、コクサッキー及びアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）と呼ばれている（Bergelson, 1997）。加えて、ターゲット細胞の表面への結合は、特定のアデノウイルス型の繊維タンパク質の結合を媒介する、体液中の可溶性タンパク質である「架橋分子」、例えば、血液凝固因子ＶＩＩ及びＸにより支持される（Modrow, 2013）。この吸着段階の後、ペントンベースにおけるＲＧＤモチーフ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）は、この過程で共レセプターとして機能するヘテロ二量体インテグリンαｖβ３又はαｖβ５と相互作用する。この相互作用により、ウイルスの内在化がもたらされる（Wickham et al., 1993）。その後、細胞膜においてクラスリン媒介内在化を介したエンドサイトーシスが起こり、ウイルスは、エンドソームに存在する。細胞内小胞の酸性化後、ウイルス繊維タンパク質は、そのコンホメーションを変化させ、エンドソーム膜を破壊する（Greber et al., 1996）。この時点で、ウイルス粒子は、細胞質中で浮遊している。微小管のダイニンに残存粒子が結合することにより、ウイルスゲノムは核内に移入される（Modrow, 2013）。
【０３９０】
アデノウイルスのゲノムは、長さ３６〜３８kbの二本鎖、線状ＤＮＡからなる。両５’末端に共有結合している２つの末端タンパク質（ＴＰ）分子の相互作用により、準環状状態が形成される（Modrow, 2013）。一般的には、アデノウイルスゲノムの５つのコード領域は、主に、感染の初期段階に活性な初期遺伝子Ｅ１〜Ｅ４と、主に、ウイルス粒子形成に必要なタンパク質をコードする後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）に細分することができる（Modrow, 2013）。
【０３９１】
アデノウイルス複製は、大型Ｅ１Ａタンパク質（Ｅ１Ａ１３Ｓ）により強力に誘引される初期ウイルス遺伝子Ｅ２の発現に特に依存している。感染後に最初に転写されるウイルス遺伝子は、初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）である。一次Ｅ１Ａ転写物は、差次的スプライシングによりプロセシングされ、１３Ｓ、１２Ｓ、１１Ｓ、１０Ｓ及び９Ｓの沈降係数を有する５つの異なるメッセージを生成する。１３Ｓ及び１２Ｓ  ｍＲＮＡは、感染初期に最も豊富に存在する。一方、９Ｓ  ｍＲＮＡは、後期に最も豊富に存在する。１１Ｓ及び１０Ｓ  ｍＲＮＡは、感染後の後期により豊富になるマイナー種である。１３Ｓ、１２Ｓ、１１Ｓ、１０Ｓ及び９Ｓ  Ｅ１Ａ  ｍＲＮＡはそれぞれ、２８９残基（Ｒ）、２４３Ｒ、２１７Ｒ、１７１Ｒ及び５５Ｒのタンパク質をコードし、それらは全て、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのみ検出される９Ｓ産物を除いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能である。一般的には、アデノウイルス遺伝子の発現は、感染の過程で高度にレギュレーションされ、その複雑性は高い。これにより、効率的なウイルス複製に必要なウイルスＤＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質をコードするＥ２遺伝子の転写は、Ｅ２初期プロモーター及びＥ２後期プロモーターの２つのプロモーターの制御下にある。
【０３９２】
その２つの重複した転写制御領域のために、Ｅ２−初期プロモーターは、＋１位から始まる主プロモーターと、−２６位から始まる副プロモーターに細分することができ、両方とも、ＴＡＴＡモチーフを含有する（Swaminathan and Thimmapaya, 1996）。これらのモチーフは、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）の結合部位として機能する。さらに、−６８位と−７７位との間の活性化転写因子（ＡＴＦ）に対する１つの結合部位と、互いに逆向きに並んだ２つのＥ２Ｆ／ＤＰ−１結合部位（ＴＴＴＣＧＣＧＣ）は、主要Ｅ２初期プロモーターの−３５位及び−６３位に位置している（Swaminathan and Thimmapaya, 1996）。Ｅ１Ａを介したＥ２初期プロモーターの活性化は、主に、主要プロモーター部分に局在する２つのＥ２Ｆ結合部位に依存している。
【０３９３】
感染の中間段階では、約６hpi（感染後時間）後、Ｅ２遺伝子の発現は、Ｅ２後期プロモーターにより制御される。その１５７bp配列の位置ｎｔ  −３３〜−２２には、ＴＡＴＡボックスが存在し、これは、細胞ＴＢＰに結合することができ、細胞内ＴＢＰにより活性化されることができる（Swaminathan and Thimmapaya, 1996）。さらに、２つのＳＰ１認識部位及び３つのＣＣＡＡＴボックスが、Ｅ２後期プロモーターに特徴的である。
【０３９４】
細胞因子ＹＢ−１が、逆方向ＣＣＡＡＴボックスに結合可能であることが示されたため、Ｙ−ボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）とＥ２後期プロモーターとの間の相互作用が調査された。Holm et al.は、２００２年に、Ｅ２後期プロモーターに存在するＹ−ボックス（逆方向ＣＣＡＡＴボックス）とＹＢ−１との特異的相互作用が、このプロモーターの活性を制御する能力を有することを実際に示した（Holm et al., 2002）。そのトランス活性化活性を発揮するために、ＹＢ−１は、アデノウイルス複合体Ｅ１Ｂ−５５ｋ／Ｅ４−ｏｒｆ６を介して核内に移行しなければならない。これらの初期ウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａ−１３Ｓのトランス活性化後に発現される（Frisch and Mymryk, 2002）。
【０３９５】
ＹＢＸ１遺伝子によりコードされる細胞因子ＹＢ−１は、転写、スプライシング、翻訳制御及びＤＮＡ損傷の修復において複数の機能を有するコールドショックドメイン担持ＤＮＡ結合タンパク質である（Kohno et al., 2003）。さらに、細胞因子ＹＢ−１は、がん細胞における多剤耐性表現型の発達に関与するＭＤＲ１及びＭＲＰ１遺伝子のその活性化により、薬剤耐性に重要な役割を果たしている（Mantwill et al., 2006）。ＹＢ−１の発現は、外因性ストレス要因、例えば、アデノウイルス感染、化学療法又はＵＶ照射の暴露を介して、その後の核輸送により誘引される（Mantwill et al., 2006）。
【０３９６】
アデノウイルスの初期遺伝子及び後期遺伝子の転写活性化は、ウイルスのライフサイクルにとって極めて重要である。簡潔に、ウイルスのライフサイクルは、Ｅ１Ａ転写の活性化により開始され、続けて、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４遺伝子の活性化のカスケードが起こる。最後に、主な後期プロモーター（ＭＬＰ）が活性化され、主にゲノムカプシド形成に関与するカプシド及びアクセサリータンパク質の発現を調整する（Turner et al 2015）。非増殖細胞に存在するウイルスＤＮＡ複製に対する防御を克服するために、ウイルスは、初期１Ａタンパク質（Ｅ１Ａ）を発現する。これらの最初期タンパク質は、細胞をＳ期に移行させ、他の全てのウイルス初期遺伝子の発現を誘引する。感染の間、幾つかのＥ１Ａアイソフォームが、ヒトアデノウイルス５型に存在する２８９、２４３、２１７、１７１及び５５残基のタンパク質として発現される。感染に関して、ウイルス遺伝子発現の主な要因は、大型Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質である（Radko et al 2015）。
【０３９７】
感染に際して、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質の発現は、ヒトアデノウイルスの主なターゲットである最終分化上皮細胞においてさえも、Ｇ０／Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行及びウイルス複製を促進する。この過程は、アデノウイルスのライフサイクルに必須であると考えられる。
【０３９８】
正常な細胞を温存しつつ、がん細胞に感染し、複製し、殺傷するように、アデノウイルスが設計された。腫瘍細胞における感染及び複製に続けて、腫瘍溶解性ウイルスは、該細胞を殺傷し、その後の増幅サイクルのためにビリオンを放出する。腫瘍細胞内のみでの複製を達成するために、２種類の遺伝子改変がなされ、３つのサブクラスの腫瘍溶解性アデノウイルス（本明細書において、ＣＲＡｄとも呼ばれる）が設計されており、これらは全て、本発明の実施において使用することができる。さらに、本発明の実施における使用に適した腫瘍溶解性アデノウイルスは、中でも、ＷＯ第２００３／０９９８５９号に記載されている。
【０３９９】
Ｉ型ＣＲＡｄは、ゲノムのＥ１領域における突然変異又は欠失を特徴とし、細胞周期レギュレーター、例えば、ｐ５３及び網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の不活性化を妨害する。その結果、Ｉ型ＣＲＡｄは、活発に分裂している腫瘍細胞内で複製する。例えば、Ｅ１Ｂ−５５kDaタンパク質を発現することができないＯｎｙｘ−０１５（ｄｌ１５２０としても公知）は、ｐ５３を不活性化することができず、ｐ５３誘引細胞周期停止を回避することができない。幾つかの研究から、Ｏｎｙｘ−０１５選択性の分子基盤がｐ５３又はｐ５３経路に関与する遺伝子のうちの１つの発現の欠如によると考えられた。しかしながら、O’Shea et al.では、ｐ５３不活化ではなく、後期ウイルスＲＮＡ排出により、Ｏｎｙｘ−０１５ウイルス選択性が決定されることが示された。Ｅ１Ａ領域に欠失を有する他のＩ型ＣＲＡｄは、Ｒｂに結合することができず、Ｓ期への進行を誘発することができない。例えば、ｄｌ９２２−９４７及びΔ２４は、Ｅ１Ａ領域のＣＲ２ドメインにおいて２４ヌクレオチドの欠失を含有し、Ｅ１Ａ−Ｒｂ相互作用を阻害する。その結果、これらのウイルスは、遊離の非結合型Ｅ２Ｆを利用可能な腫瘍細胞で主に複製する。
【０４００】
アデノウイルス複製を腫瘍細胞に限定する別の方法は、ウイルス複製に必要なウイルス遺伝子の転写をレギュレーションすることである。ＩＩ型ＣＲＡｄにおいて、ゲノムは、腫瘍特異的プロモーターの制御下に置かれる。それらのプロモーターは、正常組織と比較して、一部の腫瘍で優先的に発現されることが公知の遺伝子（例えば、テロメラーゼ又はシクロオキシゲナーゼＩＩ）；又は正常組織と比較して、腫瘍で過剰発現される遺伝子（例えば、前立腺特異的抗原、ＰＳＡ又はα−フェトプロテイン、ＡＦＰ）に由来した。ＩＩＩ型ＣＲＡｄ、例えば、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（Ａｄ−Ｄｅｌｏ３−ＲＧＤ）は、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパク質におけるトランス活性化ドメインＣＲ３の欠失を特徴とする。ＸＶｉｒ−Ｎ−３１は、正常細胞における複製欠損アデノウイルスである。ＸＶｉｒ−Ｎ−３１は、核内に細胞多機能タンパク質ＹＢ−１が存在することにより、その複製能が回復する。したがって、ＣＲＡｄは、腫瘍細胞においてのみ複製可能であり、このため、それらを最終的に溶解する。ｐ５３、ｒａｓ、ＲＢのいずれの突然変異も、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１の複製欠損を補完するのに有効ではない。ＸＶｉｒ−Ｎ−３１は、Ｅ１Ａ１３Ｓを欠いているため、Ｅ１Ｂ５５ｋタンパク質及びＥ４ｏｒｆ６タンパク質は発現しない。この欠損は、Ｅ１Ａ１３Ｓとは独立して、Ｅ１Ｂ５５ｋ及びＥ４ｏｒｆ６の発現を誘発する腫瘍細胞の核内でのＹＢ−１の存在により補完される。核内でのＹＢ−１の存在によりひとたび誘引されると、Ｅ１Ｂ５５ｋ及びＥ４ｏｒｆ６は、さらに、細胞ＹＢ−１を核内に移入させ、ウイルス複製を推進する。
【０４０１】
細胞周期は、ギャップ１（Ｇ１）、合成（Ｓ）、ギャップ２（Ｇ２）及び有糸分裂（Ｍ）期を経て連続的に進行する。この進行は、複雑なシグナル伝達ネットワークを介してレギュレーションされる。ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）タンパク質であるＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６は、特定のサイクリンタンパク質と複合体を形成した場合、細胞周期進行の主なレギュレーターとなる。ＣＤＫの構成的発現と種々のサイクリンの時間的制御とにより、異なるサイクリン−ＣＤＫ複合体による特定の細胞周期のレギュレーションが可能となる。ＣＤＫ活性は、幾つかの阻害性タンパク質によりネガティブにレギュレーションされる。ＣＤＫの生物学及び機能の種々の側面は、以前に包括的にレビューされている。
【０４０２】
構造的かつ機能的相同性を示すＣＤＫ４及びＣＤＫ６は、サイクリンＤタンパク質と複合体を形成した場合、Ｇ１期にある休止細胞のＳ期への移行をレギュレーションする。サイクリンＤタンパク質は、サイクリンＤ１〜３の３つのサブタイプを有し、有糸分裂促進性刺激の存在下で蓄積する。ＣＤＫ４／６のネガティブレギュレーターは、ＣＤＫ４（ＩＮＫ４）タンパク質の阻害因子であるｐ１６ＩＮＫ４Ａ、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、ｐ１８ＩＮＫ４Ｃ及びｐ１９ＩＮＫ４Ｄを含む。これらは、サイクリンＤ１との結合を減少させるか又はそれらの触媒ドメインを直接的に占有することによりＣＤＫ４／６活性を阻害する。
【０４０３】
ＣＤＫ４／６のキナーゼ活性により、Ｒｂ、ｐ１０７及びｐ１３０を含む網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質ファミリーのメンバーのリン酸化がもたらされ、同リン酸化により、それらの機能的不活性化がもたらされる。休止細胞では、活性型低リン酸化Ｒｂが、他のコレプレッサーとともに、ＤＰ−１／２と複合体を形成するＥ２Ｆ転写因子ファミリーのメンバーに結合し、Ｅ２Ｆの機能をサプレッションする（Rubin et al 2005）。リン酸化されると、Ｒｂは、この複合体から解離し、中でも、細胞周期のＳ期への移行に必要なサイクリンＡ、サイクリンＥ及びＤＨＦＲを含むＥ２Ｆターゲット遺伝子の転写が可能となる。したがって、ＣＤＫ４／６活性の阻害により、Ｒｂ脱リン酸化及びＥ２Ｆ活性のレプレッションがもたらされ、これにより、Ｇ０／Ｇ１停止が促進される。これにより、がん細胞におけるターゲット治療としてのＣＤＫ４／６阻害剤の開発が促進されている。
【０４０４】
ＣＤＫ４／６−Ｒｂシグナル伝達経路の破壊及び細胞周期の制御されていないＧ１−Ｓ移行は、がん細胞に共通の特徴である。これは、ＲＢ１遺伝子（Ｒｂをコードする）、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びｐ１４ＡＲＦをコードする）又はＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５ＩＮＫ４Ｂをコードする）の機能喪失突然変異又は欠失を含む種々の分子的変化により起こる場合がある。また、このようなデレギュレーションは、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１をコードする）、Ｅ２Ｆ１−３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６又は種々の有糸分裂促進性シグナル伝達経路、例えば、ＰＩ３Ｋ経路もしくはＭＡＰＫ経路の成分の増幅又は活性化突然変異にもよる場合がある。
【０４０５】
幾つかのＡＴＰ競合性低分子ＣＤＫ阻害剤が開発されている。しかしながら、第一世代阻害剤、例えば、フラボピリドールは非選択的であり、複数のＣＤＫを阻害することおそれがあり、これにより、限定された効力及び高い毒性をもたらされる場合がある。次世代ＣＤＫ４／６阻害剤は高選択性を示し、パルボシクリブ（PfizerからのＰＤ−０３３２９９１）、アベマシクリブ（Eli LillyからのＬＹ−２８３５２１９）及びリボシクリブ（NovartisからのＬＥＥ０１１）及びトリラシクリブ（Ｇ１Ｔ２８）を含む。これらのＣＤＫ４／６阻害剤は、白血病、乳がん、メラノーマ、グリオーマ、膵臓がん、肝細胞がん、肺腺がん、肉腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん及び転移性乳がん（ｍＢＣ）を含む幾つかのがん実体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて前臨床試験されている。ほとんどの研究で、それらは、Ｇ０／Ｇ１停止及び細胞増殖の阻害と相関する、Ｒｂリン酸化、Ｅ２Ｆターゲット遺伝子のタンパク質発現及び転写における用量依存的減少を伴う、一貫した分子的及び機能的表現型を実証された。加えて、これらの全ての報告から、Ｒｂ発現は、これらの阻害剤に対する感受性のための前提条件であることが実証されている。
【０４０６】
ＣＤＫ４／６阻害剤、例えば、ＰＤ−０３３２９９１により、リン酸化Ｒｂの減少と相関する総Ｒｂタンパク質の用量依存的減少がもたらされる。この総Ｒｂの減少は、ＲＢ１転写物レベル及びＥ２Ｆターゲット遺伝子であるＣＣＮＡ２及びＣＣＮＥ２の転写の減少と部分的に相関する。また、Ｅ２Ｆ発現量も、顕著にダウンレギュレーションされる。
【０４０７】
本発明の実施における使用に適したＣＤＫ４／６阻害剤を図２５に開示する。
【０４０８】
実施例部分から明らかなように、任意のＣＤＫ４／６阻害剤は、ウイルス、好ましくは、アデノウイルス、より好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルスと組み合わせて使用するのに適している。それにより、ＣＤＫ４／６阻害剤は、細胞をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ１、より具体的には、Ｅ２Ｆ１活性を阻害する。
【０４０９】
任意のＣＤＫ４／６阻害剤が、治療有効濃度で使用されることは、当業者に理解されるであろう。
【０４１０】
ＰＡＲＰ１は、一本鎖切断（ＤＮＡの「ニック」）を修復するのに重要なタンパク質である。ほ乳類では、１７のＰＡＲＰファミリーメンバーが発見されており、これらのうちの６つのみが、ポリＡＤＰ−リボース（ｐＡＤＰｒ）を合成する。ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２及びＰＡＲＰ３は、ＤＮＡ修復に役割を有する。ＰＡＲＰ１は、一本鎖切断（ＳＳＢ）及び二本鎖切断（ＤＳＢ）を受けたＤＮＡに結合する。ついで、ＰＡＲＰ１は、活性部位における重要なアミノ酸残基を整列させるコンホメーション変化を受けることにより、その活性を向上させる。ＰＡＲＰ１が活性化されると、ＰＡＲＰ１は、ｐＡＤＰｒを合成する。ｐＡＤＰｒは、タンパク質に結合し、その機能を変化させる。存在するｐＡＤＰｒのレベルがＤＮＡ損傷を反映しており、ｐＡＤＰｒに対する応答がＤＮＡ修復後に終結することを確実にするために、ｐＡＤＰｒは、ｐＡＤＰｒグリコヒドロラーゼにより急速に分解される。
【０４１１】
ＤＮＡ修復経路を阻害することにより、ＰＡＲＰ１阻害剤は、ＤＮＡ内の一本鎖切断を増加させる。ＢＥＲがもはや起こらないために、このＤＮＡ損傷は修復されず、複製後の娘細胞に引き継がれる。これにより、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２突然変異を有する腫瘍ではＤＳＢが増加する（Scott et al.  2015, J Clin Oncol., 33(12): 1397-140）。ＰＡＲＰ薬剤候補であるルカパリブ、ベリパリブ及びオラパリブを含むＰＡＲＰ阻害剤の化学構造は、全てのＰＡＲＰ阻害剤構造を特徴付けるベンズアミド部分を含めて、図２６に示され、Antolin and Mestres 2014, Oncotarget, 30;5(10):3023-8に記載されている。
【０４１２】
加えて、ＹＢ−１が、ＰＡＲＰ活性を増強し、ＰＡＲＰ１阻害剤の有効性を低下させることが十分に確立されている（Alemasova et al.2018, Oncotarget, 34, 23349-65）。このことから、ＹＢ−１依存性腫瘍溶解性アデノウイルスは、ＣＤＫ４／６阻害剤及びＰＡＲＰ阻害剤の両方との組み合わせで、がん細胞殺傷において相乗的に作用するであろうことが示唆される。オラパリブ及びＢＭＮ６７３（Talazolarib developed from Pfizer, USA, Clin Cancer Res. 2013, 15;19(18):5003-15）は、ＰＡＲＰ阻害剤の例である。
【０４１３】
任意のＰＡＲＰ阻害剤が、治療有効濃度で使用されることは、当業者に理解されるであろう。
【０４１４】
本発明の実施における使用に適したＣＤＫ４／６阻害剤を図２５に開示する。
【０４１５】
エピジェネティックな状況における異常は、がんの特徴であり、リシン残基のアセチル化は、翻訳後修飾であり、細胞のシグナル伝達及び疾患生物学に広く関連している。アセチル化部位を「書く（ｗｒｉｒｅ）」酵素（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ＨＡＴ）及びアセチル化部位を「消去する（ｅｒａｓｅ）」酵素（ヒストンデアセチラーゼ、ＨＤＡＣ）は、現在の薬剤開発における広範な研究領域である。アセチル化リシン残基による巨大分子複合体へのタンパク質のリクルートは、ブロモドメイン（ＢＲＤ）により媒介される。ブロモドメインは、ε−Ｎ−リシンアセチル化モチーフを認識する進化的に高度に保存されたタンパク質相互作用モジュールである。保存されたＢＲＤフォールドは深く、主に疎水性のアセチルリシン結合部位を含有する。同部位は、低分子量の薬学的に活性な分子の開発に魅力的なポケットを提示する。ＢＲＤを含有するタンパク質は、多種多様な疾患の発症に関与している。
【０４１６】
近年、ＢＥＴ（ブロモドメイン及び末端外）ファミリーのＢＲＤをターゲットとする２つの非常に強力かつ選択的な阻害剤により、がんにおけるこれらのＢＲＤのターゲット化を支持する説得力のあるデータが提供された。ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４及びＢＲＤＴから構成されるブロモドメインタンパク質のＢＥＴ（ブロモドメイン及び末端外ドメイン）サブファミリーは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰＯＬＩＩ）による転写レギュレーションにおいて多様な役割を果たし、新しいクラスのエピジェネティックな薬剤ターゲットである。これらのタンパク質は、アセチル化リシン残基において活性化クロマチンに結合することにより、転写の開始期及び伸長期を促進する。これらのいわゆる後成的な「リーダー」による活性化クロマチンの認識により、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の活性転写部位へのリクルートが促進される。ＢＲＤ４／Ｐ−ＴＥＦｂ相互作用は、有糸分裂後の素早い転写再開に重要である（Muller et al., 2011, Expert Rev. Mol. Medicine, 13, e19）。Ｐ−ＴＥＦｂは、Drosophila細胞由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使用して、ロングラン−オフ転写物の生成に必要な因子として同定され、精製された。Ｐ−ＴＥＦｂは、Drosophilaの触媒サブユニットであるＣｄｋ９及びレギュラトリーサブユニットであるサイクリンＴを含有するサイクリン依存性キナーゼである。ヒトでは、Ｃｄｋ９並びに幾つかのサイクリンサブユニットであるサイクリンＴ１、Ｔ２及びＫのうちの１つを含有する、複数の形態のＰ−ＴＥＦｂが存在する。Ｐ−ＴＥＦｂは、ブロモドメインタンパク質ＢＲＤ４を含む他の因子と会合し、超伸長複合体と呼ばれる大型のタンパク質複合体と会合することが見出されている（Yang Z, et al.,2005. Mol Cell; 19:535-45；Fu et al., 1999, J Biol Chem., 274:34527-30）。
【０４１７】
ＪＱ１（チエノ−トリアゾロ−１−４−ジアゼピン）は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４を含むブロモドメインタンパク質のＢＥＴファミリーの強力な阻害剤である（Filippakopoulos et al., 2010 Nature 468, 1067-1073）。ＪＱ１は、ブロモドメインとアセチル基の間の相互作用を妨げ、特定の遺伝子をダウンレギュレーションさせる。ＯＴＯＸ１５、ＢＡＹ１２３８０９７、ＧＳＫ２８２０１５１、Ｉ−ＢＥＴ７６２及びＰＬＸ５１１０７を含む更なるＢＥＴブロモドメイン阻害剤が記載されている（Perez-Salvia and Esteller 2017, EPIGENETICS, 12, 323-339；Brandt et al., 2015ACS Chem. Biol., 10, 22-39）。ＪＱ−１は、ベンゾジアゼピンに構造的に関連している。式は、Ｃ２３Ｈ２５ＣｌＮ４Ｏ２Ｓである。
【０４１８】
近年、ＢＥＴ阻害剤であるＪＱ１が、アデノウイルス感染及びアデノウイルスベクター媒介遺伝子送達を促進することが示されている。細胞をＪＱ１で処理すると、転写伸長のＰ−ＴＥＦｂのサブユニットであるＣＤＫ９とのＢＲＤ４会合の増加が誘引される。しかしながら、論文で述べられたように、アデノウイルス感染及び導入遺伝子発現をレギュレーションするために、ＢＥＤ４が利用する機構を精密にするには、更なる研究が必要である（Baojie Lv et al 2018, Scientific reports, 8, 11554）。重要なこととして、ウイルス複製及びウイルス転写は調査されなかった。しかしながら、ＣＤＫ９は、停止したポリメラーゼの再開を刺激し、転写中のポリメラーゼの数、このため、時間当たりのｍＲＮＡ合成量を増加させることにより転写を活性化することが公知である（Gressel et al. 2017, eLife, 6, e29736）。加えて、ＢＥＴ阻害剤耐性は、ＣＤＫ４／６阻害剤により克服することができることが示された（Jin et al. 2018, Mol Cell;71(4):592-605）。近年、細胞周期の有糸分裂後期から初期Ｇ１期までのＰ−ＴＥＦｂ−Ｂｒｄ４相互作用の劇的な増加及びＰ−ＴＥＦｂの染色体への能動的なリクルート、続けて、Ｇ１進行に重要な遺伝子の転写開始が実証された。重要なこととして、Ｂｒｄ４の枯渇は、必須のＧ１遺伝子の転写を減少させることにより、プロセス全体を停止させ、Ｇ１細胞周期停止及びアポトーシスをもたらした（Yang et al., 2008, Mol Cell Biol., 28:967-976, Kohoutek, 2009, Cell Division, 4. 19）。
【０４１９】
しかしながら、ＣＤＫ４／６阻害剤及びＢＥＴ阻害剤と併用して、ＹＢ−１依存性腫瘍溶解性アデノウイルスを使用することについては何も知られていない。
【０４２０】
他のブロモドメイン阻害剤が、ウイルス、好ましくは、アデノウイルス、より好ましくは、腫瘍溶解性アデノウイルス、例えば、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１及びＣＤＫ４／６阻害剤を使用する三重治療における使用に等しく適切であろうことが理解されるであろうし、本発明の範囲内にある。
【０４２１】
任意のブロモドメイン（Ｂｅｔ）阻害剤が、治療上有効濃度で使用されることは、当業者に理解されるであろう。
【０４２２】
本発明の実施における使用に適したブロモドメイン阻害剤は、図２７に開示されている。
【０４２３】
本明細書に記載された本発明のウイルス及び組み合わせにより特に処置することができる腫瘍は、好ましくは、神経系の腫瘍、眼の腫瘍、皮膚の腫瘍、軟組織の腫瘍、胃腸の腫瘍、呼吸器系の腫瘍、骨格の腫瘍、内分泌系の腫瘍、女性生殖器系の腫瘍、乳腺の腫瘍、男性生殖器系の腫瘍、尿排出系の腫瘍、混合腫瘍及び胚性腫瘍を含む造血系の腫瘍並びに白血病を含む群から選択されるような腫瘍である。これらの腫瘍が、特に、本明細書で特に定義されたような、耐性腫瘍であることは、本発明の範囲内にある。
【０４２４】
神経系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４２５】
１．頭蓋の腫瘍及び脳（頭蓋内）の腫瘍、好ましくは、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経節腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維腫、血管芽細胞腫、脂肪腫、頭蓋咽頭腫、奇形腫及び脊索腫；
【０４２６】
２．脊髄及び脊柱管の腫瘍、好ましくは、膠芽腫、髄膜腫、神経芽腫、神経線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、線維肉腫及び多発性骨髄腫；並びに
【０４２７】
３．末梢神経の腫瘍、好ましくは、シュワン神経膠腫、神経線維腫、神経線維肉腫及び神経周囲線維芽細胞腫。
【０４２８】
眼の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４２９】
１．眼瞼の腫瘍及び眼瞼腺の腫瘍、好ましくは、腺腫、腺がん、乳頭腫、組織球腫、肥満細胞腫瘍、基底細胞腫瘍、メラノーマ、扁平上皮がん、線維腫及び線維肉腫；
【０４３０】
２．結膜の腫瘍及び瞬膜の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、血管腫、血管肉腫、腺腫、腺がん、線維肉腫、メラノーマ及び乳頭腫；並びに
【０４３１】
３．眼窩、視神経及び眼球の腫瘍、好ましくは、網膜芽細胞腫、骨肉腫、肥満細胞腫瘍、髄膜腫、網状細胞腫瘍、グリオーマ、シュワン神経膠腫、軟骨腫、腺がん、扁平上皮がん、形質細胞腫瘍、リンパ腫、横紋筋肉腫及びメラノーマ。
【０４３２】
皮膚の腫瘍群は、好ましくは、組織球腫、脂肪腫、線維肉腫、線維腫、肥満細胞腫瘍、悪性メラノーマ、乳頭腫、基底細胞腫瘍、ケラトアカントーマ、血管周囲細胞腫、毛嚢の腫瘍、汗腺の腫瘍、脂腺の腫瘍、血管腫、血管肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、形質細胞腫及びリンパ管腫の腫瘍を含む。
【０４３３】
軟組織の腫瘍群は、好ましくは、胞巣状軟部肉腫、類上皮細胞肉腫、軟組織の軟骨肉腫、軟組織の骨肉腫、軟組織のユーイング肉腫、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、線維肉腫、線維腫、平滑筋肉腫、平滑筋腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性血管周囲細胞腫、血管腫、血管肉腫、悪性間葉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、悪性シュワン神経膠腫、悪性黒色細胞シュワン神経膠腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫の腫瘍を含む。
【０４３４】
胃腸の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４３５】
１．口腔の腫瘍及び舌の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、線維肉腫、メルケル細胞腫瘍、誘導性線維芽細胞腫、線維腫、線維肉腫、ウイルス性乳頭腫症、特発性乳頭腫症、鼻咽頭ポリープ、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫及び肥満細胞腫瘍；
【０４３６】
２．唾液腺の腫瘍、好ましくは、腺がん；
【０４３７】
３．食道の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、平滑筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、バレットがん及び傍食道腫瘍；
【０４３８】
４．膵外分泌腫瘍、好ましくは、腺がん；並びに
【０４３９】
５．胃の腫瘍、好ましくは、腺がん、平滑筋腫、平滑筋肉腫及び線維肉腫。
【０４４０】
呼吸器系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４４１】
１．鼻及び鼻腔の腫瘍、喉頭及び気管の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、線維肉腫、線維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、オンコサイトーマ（横紋筋腫）、腺がん及び筋芽細胞腫；並びに
【０４４２】
２．肺の腫瘍、好ましくは、扁平上皮がん、線維肉腫、線維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、オンコサイトーマ（横紋筋腫）、腺がん、筋芽細胞腫、小細胞がん、非小細胞がん、気管支腺がん、気管支肺胞腺がん及び肺胞腺がん。
【０４４３】
骨格の腫瘍群は、好ましくは、骨肉腫、軟骨肉腫、傍骨肉腫、血管肉腫、滑膜細胞肉腫、血管肉腫、線維肉腫、悪性間葉腫、巨細胞腫、骨腫及び多小葉性骨腫を含む。
【０４４４】
内分泌系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４４５】
１．甲状腺／副甲状腺の腫瘍、好ましくは、腺腫及び腺がん；
【０４４６】
２．副腎の腫瘍、好ましくは、腺腫、腺がん及び褐色細胞腫（副腎髄質腫）；
【０４４７】
３．視床下部／下垂体の腫瘍、好ましくは、腺腫及び腺がん；
【０４４８】
４．内分泌膵臓の腫瘍、好ましくは、インスリノーマ（β細胞腫瘍、ＡＰＵＤｏｍ）及びＺｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群（膵臓のデルタ細胞のガストリン分泌腫瘍）；並びに
【０４４９】
５．多発性内分泌新生物（ＭＥＮ）及び化学外胚葉腫。
【０４５０】
女性性器系腫瘍の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４５１】
１．卵巣の腫瘍、好ましくは、腺腫、腺がん、嚢胞腺腫及び未分化がん；
【０４５２】
２．子宮の腫瘍、好ましくは、平滑筋腫、平滑筋肉腫、腺腫、腺がん、線維腫、線維肉腫及び脂肪腫；
【０４５３】
３．子宮頸部の腫瘍、好ましくは、腺がん、腺腫、平滑筋肉腫及び平滑筋腫；
【０４５４】
４．膣及び外陰部の腫瘍、好ましくは、平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維平滑筋腫、線維腫、線維肉腫、ポリープ及び扁平上皮がん。
【０４５５】
乳腺の腫瘍群は、好ましくは、線維腺腫、腺腫、腺がん、間葉系腫瘍、がん、がん肉腫を含む。
【０４５６】
男性性器系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４５７】
１．精巣の腫瘍、好ましくは、セミノーマ、間質細胞腫瘍及びセルトリ細胞腫瘍；
【０４５８】
２．前立腺の腫瘍、好ましくは、腺がん、未分化がん、扁平上皮がん、平滑筋肉腫及び移行細胞がん；並びに
【０４５９】
３．陰茎及び外陰部の腫瘍、好ましくは、肥満細胞腫瘍及び扁平上皮がん。
【０４６０】
尿排出系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４６１】
１．腎臓の腫瘍、好ましくは、腺がん、移行細胞がん（上皮性腫瘍）、線維肉腫、軟骨肉腫（間葉性腫瘍）、ウィルムス腫瘍、腎芽腫及び胎児性腎腫（胎児性多能性芽腫）；
【０４６２】
２．尿管の腫瘍、好ましくは、平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維乳頭腫、移行細胞がん；
【０４６３】
３．膀胱の腫瘍、好ましくは、移行細胞がん、扁平上皮がん、腺がん、ボトリオイド（胎児性横紋筋肉腫）、線維腫、線維肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、乳頭腫及び血管肉腫；並びに
【０４６４】
４．尿道の腫瘍、好ましくは、移行細胞がん、扁平上皮がん及び平滑筋肉腫。
【０４６５】
造血系の腫瘍群は、好ましくは、以下を含む。
【０４６６】
１．リンパ腫、リンパ性白血病、非リンパ性白血病、骨髄増殖性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫。
【０４６７】
混合腫瘍及び胚芽腫瘍の群は、好ましくは、血管肉腫、胸腺腫及び中皮腫を含む。
【０４６８】
好ましくは、これらの腫瘍は、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、骨肉腫、膠芽腫、メラノーマ、小細胞肺がん及び結腸直腸がんを含む群から選択される。更なる腫瘍は、本明細書に記載されるように耐性である腫瘍、好ましくは、多耐性である腫瘍、特に、上記されたような腫瘍群でもある。
【０４６９】
また、本発明の組み合わせが投与される対象が、それぞれ特定され、スクリーニングされることも、本発明の範囲内にある。その多様な態様において本発明から利益を受けることができる患者のこのような特定は、対象のサンプルの核におけるＹＢ−１の検出に基づく。
【０４７０】
実施態様において、腫瘍組織の検査は、ＹＢ−１に対する抗体、ＹＢ−１に対するアプタマー及びＹＢ−１に対するシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）及びＹＢ−１に対するアンチカリンを含む群から選択される剤を使用することにより行われる。基本的に、対応するマーカーについて同じ手段を作製し、それに応じて使用することができる。抗体、特にモノクローナル抗体の製造は、当業者に公知である。ＹＢ−１又はマーカーの特異的検出のための更なる手段は、ターゲット構造、本件では、ＹＢ−１又は前記マーカーに高い親和性で結合するペプチドである。従来技術では、このようなペプチドを生成するためのファージディスプレイ等の方法が公知である。典型的には、ペプチドライブラリーを出発点とし、ここで、個々のペプチドは、８〜２０個のアミノ酸長を有し、ライブラリーのサイズは、約１０２〜１０１８、好ましくは１０８〜１０１５の異なるペプチドである。ターゲット分子結合ポリペプチドの特別な形態は、いわゆるアンチカリンであり、これは、例えば、ドイツ国特許出願ＤＥ第１９７４２７０６号に記載されている。
【０４７１】
本明細書中に開示されたＹＢ−１又は対応するマーカーの特異的結合のための、そして、細胞核におけるＹＢ−１の細胞周期非依存性局在化の検出のための更なる手段は、いわゆる、アプタマー、すなわち、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかとして、一本鎖又は二本鎖のいずれかとして存在し、ターゲット分子に特異的に結合するＤ−核酸である。アプタマーの生成は、例えば、欧州特許ＥＰ第０５３３８３８号に記載されている。アプタマーの特別な形態は、いわゆる、アプタザイムであり、これは、例えば、Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, no. 29, pages 4369 - 4373に記載されている。これらは、アプタマー部分とは別に、リボザイム部分を含み、アプタマー部分に結合するターゲット分子の結合又は放出の際に触媒活性を獲得し、核酸基質を開裂させ、この開裂がシグナル生成を伴って進行する限りにおいて、アプタマーの特別な実施態様である。
【０４７２】
アプタマーの更なる形態は、いわゆる、シュピーゲルマー、すなわち、Ｌ−核酸で調製されるターゲット分子結合核酸である。このようなシュピーゲルマーの製造方法は、例えば、ＷＯ第９８／０８８５６号に記載されている。
【０４７３】
腫瘍組織のサンプルは、穿刺又は手術により得ることができる。ＹＢ−１が細胞周期とは無関係に、核内に局在するかどうかの評価は、多くの場合、顕微観察技術及び／又は免疫組織分析を使用することにより、好ましくは、抗体又は他の前述の手段のいずれかを使用することにより行われる。核内においてＹＢ−１を検出するための、特に、ＹＢ−１が細胞周期とは無関係にそこに局在することを検出するための更なる手段は、当業者に公知である。例えば、ＹＢ−１の局在化は、それらをスクリーニングする場合、染色された組織切片において容易に検出することができる。核内におけるＹＢ−１の存在の頻度は、局在化が細胞周期とは無関係にあることを既に示している。核内におけるＹＢ−１の細胞周期とは無関係にあることの検出のための更なる選択肢は、ＹＢ−１に対する染色及びＹＢ−１が核内に局在するかどうかの検出並びに細胞の段階の決定にある。ＹＢ−１の検出と同様に、ＹＢ−１に対する前述の手段を使用することによっても、これを行うことができる。この手段の検出は、当業者に公知の方法により行われる。ＹＢ−１に特異的に結合し、分析されるサンプル内の任意の他の構造、特に細胞には結合しない前記剤により、それらの局在化及びＹＢ−１へのそれらの特異的結合のために、ＹＢ−１の局在化も、該手段の適切なラベリングにより検出し、確立することができる。前記手段のラベリング方法は、当業者に公知である。
【図面の簡単な説明】
【０４７４】
以下に、本発明を、図面及びサンプルを参照することにより更に実証するものとする。これらから、新規な特徴、実施態様及び利点を得ることができる。
【図１】図１ａは、ＣＤＫ４／６阻害剤ＬＹ（ＬＹ−２８３５２１９）、ＰＤ（ＰＤ−０３２９９１）又はＬＥＥ（ＬＥＥ０１１）と組み合わせて使用された場合の、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（ＸＶｉｒ）、野生型アデノウイルス（ＷＴ）及び対照（Ｃｔｒｌ）についての細胞生存率の指標としての相対吸光度を示す棒グラフである。図１ｂは、ＣＤＫ４／６阻害剤ＬＹ（ＬＹ−２８３５２１９）、ＰＤ（ＰＤ−０３２９９１）又はＬＥＥ（ＬＥＥ０１１）と組み合わせられた場合の、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（ＸＶｉｒ）及び野生型アデノウイルス（ＷＴ）についてのウイルス力価を示す棒グラフである。図１ｃは、ＣＤＫ４／６阻害剤ＬＹ（ＬＹ−２８３５２１９）、ＰＤ（ＰＤ−０３２９９１）又はＬＥＥ（ＬＥＥ０１１）と組み合わせられた場合の、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（ＸＶｉｒ）及び野生型アデノウイルス（ＷＴ）についての相対的な繊維ＤＮＡを示す棒グラフである。
【図２】図２は、ウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図３】図３ａ〜ｄは、棒グラフである。
【図４】図４ａ〜ｄは、棒グラフである。
【図５】図５は、棒グラフである。
【図６】図６は、一連の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、パルボシクリブ処理の有無における、ＧＦＰを発現しているＥ１欠失アデノウイルスに感染させたＴ２４細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【図８】図８は、化合物Ｎｕｔｌｉｎ  ３ａ、Ｌｅｅ、Ｃｌ１０４０及びロスコビチン（Ｒｏｓｃｏｖｅｒｔｉｎｅ）を使用した、４８時間後のアデノウイルスｄｌ７０３のウイルスＤＮＡ複製を示す棒グラフである。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｃは、示された濃度のＮｕｔｌｉｎ−３ａ及びＬＥＥ０１１（リボシクリブ）（図９Ａ）、ロスコビチン（図９Ｂ）及びＣＩ−１０４０（図９Ｃ）で処理されたＵＭＵＣ細胞のウェスタンブロット解析の結果を示す。Ｒｂは、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。ｐｈＲＢは、リン酸化された網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。Ｅ２Ｆ−１は、転写因子Ｅ２Ｆ−１を意味する。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照としての役割を果たした。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｃは、示された濃度のＮｕｔｌｉｎ−３ａ及びＬＥＥ０１１（リボシクリブ）（図９Ａ）、ロスコビチン（図９Ｂ）及びＣＩ−１０４０（図９Ｃ）で処理されたＵＭＵＣ細胞のウェスタンブロット解析の結果を示す。Ｒｂは、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。ｐｈＲＢは、リン酸化された網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。Ｅ２Ｆ−１は、転写因子Ｅ２Ｆ−１を意味する。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照としての役割を果たした。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｃは、示された濃度のＮｕｔｌｉｎ−３ａ及びＬＥＥ０１１（リボシクリブ）（図９Ａ）、ロスコビチン（図９Ｂ）及びＣＩ−１０４０（図９Ｃ）で処理されたＵＭＵＣ細胞のウェスタンブロット解析の結果を示す。Ｒｂは、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。ｐｈＲＢは、リン酸化された網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。Ｅ２Ｆ−１は、転写因子Ｅ２Ｆ−１を意味する。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照としての役割を果たした。
【図１０】図１０は、処理後４８時間で測定されたＵＭＵＣ３細胞における細胞周期分布を示す棒グラフである。ここで、ＣＤＫ４／６阻害剤の濃度は、以下のとおりとした。ロスコビチン（Ｒｏｓｃｏｖｅｔｉｎｅ）：１０μM、ＣＩ−１０４０：１μM、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ：１０μM及びＬＥＥ０１１：１０μM。
【図１１】図１１は、パルボシクリブ処理の有無における、アデノウイルスヘキソン遺伝子発現を示す顕微鏡画像のパネルである。
【図１２】図１２は、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１単独、１５nM ＰＡＲＰ阻害剤ＰＡＲＰｉ、５００nM ＰＤ（パルボシクリブ）又は１５nM ＰＡＲＰｉと５００nM ＰＤとの組み合わせに暴露させたＴ２４細胞の効力アッセイの結果を、細胞生存率として示す棒グラフである。ここで、細胞は、感染させなかったか（左欄）、１０MOIで感染させたか（中央欄）又は５０MOIで感染させたか（右欄）のいずれかとした。
【図１３】図１３は、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（２０MOI）、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１及び１５nM ＰＡＲＰｉ、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１及び５００nM ＰＤ並びにＸＶｉｒ−Ｎ−３１、１５nM ＰＡＲＰｉ及び５００nM ＰＤでの処理後（１dpi、２dpi、３dpi、４dpi、５dpi及び６dpi）のＳＲＢ染色Ｔ２４細胞の培養物を示す写真のパネルである。
【図１４】図１４は、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（１０MOI）、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１及び１６０nM ＰＡＲＰｉ、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１及び４００nM ＰＤ並びにＸＶｉｒ−Ｎ−３１、１６０nM ＰＡＲＰｉ及び４００nM ＰＤでの処理後（１dpi、２dpi、３dpi、４dpi、５dpi及び６dpi）のＳＲＢ染色ＵＭＵＣ細胞の培養物を示す写真のパネルである。
【図１５】図１５は、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ及びブロモドメイン阻害剤であるＪＱ−１での感染後５日目のＴ２４細胞に対する効力アッセイの結果を示す棒グラフである。Ｙ軸：％  細胞生存。
【図１６】図１６は、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１単独、２００nM アベマシクリブ、５００nM ＪＱ１又は２００nM アベマシクリブと５００nM ＪＱ１との組み合わせと共に曝露させた後５日目のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の効力アッセイの結果を、細胞生存率として示す棒グラフである。ここで、細胞を感染させなかったか又は５、１０又は２０MOIで感染させたかのいずれかとした。
【図１７】図１７は、示された濃度のＣＤＫ４／６阻害剤ＬＹ−２８３５２１９（アベマシクリブ）及びＷｅｅ阻害剤ＭＫ−１７７５（アダボセルチブ）で処理されたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の、処理後２４時間及び４８時間でのウェスタンブロット分析の結果を示す。Ｒｂは、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。ｐｈＲＢは、リン酸化された網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。Ｅ２Ｆ−１は、転写因子Ｅ２Ｆ−１を意味する。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照としての役割を果たした。
【図１８】図１８は、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ及びアダボセルチブ（Ｗｅｅ阻害剤、ＭＫ−１７７５）での感染後５日目のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対する効力アッセイの結果を示す。細胞生存率として表現。
【図１９】図１９は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を示された阻害剤で処理した後の細胞周期分布を示す。
【図２０】図２０は、種々の細胞株におけるＥ２Ｆ１発現に対するＥ２Ｆ１指向性ｓｉＲＮＡの影響を示す棒グラフである。Ｙ軸：％  ｓｉＣＴＲＬトランスフェクション細胞としてのアクチンに対して正規化されたＥ２Ｆ１発現。
【図２１】図２１は、Ｅ２Ｆ１阻害により、ｓｉＲＮＡ−Ｅ２Ｆ−１で処理されたＴ２４細胞において、Ｅ２−初期発現が増加することを示す棒グラフである。Ｙ軸：アクチンに対して正規化されたアデノウイルス遺伝子発現（％  ｓｉＣＴＲＬ）。
【図２２】図２２は、アデノウイルスＥ２初期発現を決定するためのプライマーの位置を示すスキームである。
【図２３】図２３は、アデノウイルスの野生型Ｅ２初期プロモーター（上側）及びＥ２Ｆ結合部位に突然変異を有する突然変異型Ｅ２初期プロモーター（下側）のヌクレオチド配列の表示である。
【図２４】図２４は、感染後２４時間でＲＴ−ｑＰＣＲにより得られたＡｄＷＴ−ＲＧＤ及びＡｄＥ２Ｆｍ（繊維中にＲＧＤモチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）も含有する）感染Ｔ２４細胞におけるＲＮＡ発現を示す棒グラフである。ＡＤ−ＷＴ遺伝子発現を１００％に設定した。
【図２５−１】図２５は、本発明での使用に適した種々のＣＤＫ４／６阻害剤を示す。
【図２５−２】図２５は、本発明での使用に適した種々のＣＤＫ４／６阻害剤を示す。
【図２６】図２６は、本発明での使用に適した種々のＰＡＲＰ阻害剤を示す。
【図２７−１】図２７は、本発明での使用に適した種々のＢｅｔ阻害剤を示す。
【図２７−２】図２７は、本発明での使用に適した種々のＢｅｔ阻害剤を示す。
【図２７−３】図２７は、本発明での使用に適した種々のＢｅｔ阻害剤を示す。
【図２８】図２８は、ＷＴ−Ａｄ５及びＥ１Ａ遺伝子のＣＲ３ドメインの欠失によりＥ１Ａ１２タンパクのみを発現している腫瘍溶解性アデノウイルスであるアデノウイルスｄｌ５２０の構造を示す。
【図２９】図２９は、Ｅ１Ｂ１９Ｋタンパクの欠失、Ｅ３領域における２ｋｂの欠失、Ｅ１Ａ１３Ｓタンパクの欠失、繊維タンパクへのＲＧＤモチーフの導入を特徴とする、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１の構造を示す。
【図３０】図３０は、Kleijn et al.（Kleijn et al., PLoS One. 2014; 9(5): e97495）にも記載されており、Ｅ１Ａ遺伝子のＣＲ２ドメインの欠失を特徴とするＡｄ−デルタ２４及びＡｄ−デルタ２４−ＲＧＤの構造を示す。それらは、デレギュレーションされた網膜芽細胞腫−経路（Ｒｂ）を有する腫瘍細胞においてのみ複製する。Ａｄ−デルタ２４−ＲＧＤは、さらに、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１において示されるように、繊維ノブにＲＧＤモチーフを含有する。腫瘍溶解性アデノウイルスｄｌ９２２−９４７は、デルタ２４と類似していることに留意されたい。このウイルスにおける欠失もＥ１Ａ−ＣＲ２ドメインに位置し、ＲＢ結合（網膜芽細胞腫タンパク質）に影響を及ぼすためである。
【図３１】図３１は、ＲＢ経路を欠いた腫瘍で複製するように特異的に操作されている複製能を有するアデノウイルスであるＶＣＮ−０１の構造が修飾された繊維による感染能の増強を表わし、可溶性ヒアルロニダーゼの発現による分布の改善を表わすことを示す（Pascual-Pasto et al. Sci Transl Med. 2019,11 476）。ＶＣＮ−０１のＥ１Ａにおける欠失は、デルタ２４における欠失（Ｅ１ＡにおけるＣＲ２ドメインの欠失）と類似している。さらに、このＥ１Ａタンパク質の発現は、Ｅ１ＡプロモーターにＥ２Ｆ結合部位を導入することによりレギュレーションされる。加えて、それは、繊維ノブにＲＧＤモチーフを含有し、可溶性ヒアルロニダーゼを発現する（Martinez-Velez et al. 2016, Clin Cancer Res. 1;22(9):2217-25. The Oncolytic Adenovirus VCN-01 as Therapeutic Approach Against Pediatric Osteosarcoma）。
【図３２】図３２は、Ｅ１Ａｄｌ１１０７及びＥ１Ａｄｌ１１０１の構造を示す。ここで、これら２つの腫瘍溶解性アデノウイルスの欠失は、ｐ３００（ｐ３００  ＨＡＴ又はＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００としても公知のヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００）又はｐＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）への結合に影響を及ぼす（Howe et al., MOLECULAR THERAPY 2000, 2, 485-495）。
【図３３】図３３は、腫瘍溶解性アデノウイルスＣＢ０１６（及び野生型アデノウイルス５（ＷＴ−Ａｄ５）のうちの１つ）の構造を示す。ここで、Ｅ１Ａ−ＣＲ２ドメインにおける欠失は、Ａｄ−デルタ２４におけるのと類似している。加えて、ＣＢ０１６は、ＣＲ１ドメインにおける欠失を含有する。加えて、ＣＢ０１６は、繊維にＲＧＤモチーフ又は血清型３由来の繊維のいずれかを含有する（LaRocca et al., Oral Oncol. 2016, 56, 25-31）。
【図３４】図３４は、Ｅ１Ａ  ＣＲ２−ドメインにおけるＥ１ＡΔ２４欠失、Ｅ３／１９Ｋタンパク質における効力増強Ｔ１突然変異及び感染性増強繊維ＲＧＤ修飾（Dong et al., Hum Gene Ther. 2014 Oct 1; 25(10): 897-904）を含有するアデノウイルスＯＲＣＡ−０１０の構造を示す。
【０４７５】
実施例１：材料及び方法
細胞培養
ヒト膀胱がん細胞株を、１０％ ＦＢＳ（Biochrom AG）及び１％ ＮＥＡ（Biochrom AG）を補充したＲＰＭＩ又はＤＭＥＭ培地（Biochrom AG）中において、それぞれ５％又は１０％ ＣＯ２でサブコンフルエントな条件下で培養した。細胞株及び実験条件に応じて、０．２〜１×１０６、０．５〜１×１０５、０．２５〜０．５×１０５及び５００〜７００個 細胞をそれぞれ１０ｃｍあたりに、６ウェル、１２ウェル及び９６ウェルフォーマットに播種した。
【０４７６】
細胞株
ＨｅＬａＰ
ＨｅＬａＰ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）は、患者Henrietta Lacksにちなんで命名された子宮頚部腺がん由来の上皮細胞である。この細胞株は、最も広く分布し、最も古い細胞株である（Rahbari et al., 2009）。１９５１年に確立された最初の永久細胞株であったためである（Gey et al., 1952）。培養は、３７℃、１０％ ＣＯ２条件下でＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ、１％ ＰＳ）中で行った。
【０４７７】
ＨｅＬａＲＤＢ
ＨｅＬａＲＤＢは、ＨｅＬａＰ細胞株の亜細胞株であり、糖タンパク質Ｐの過剰発現に基づいて、ダウノブラスチンに対する耐性を有する。このアントラサイクリンを含有する培地での培養により耐性が達成された。この細胞増殖抑制剤は、二本鎖ＤＮＡ配列に介在し、細胞の転写と複製を阻害する（Mizuno et al., 1975）。ダウノブラスチン処理により引き起こされるストレス反応の結果として、細胞因子ＹＢ−１は、親細胞株と比較して、より高い核局在化を示す（Holm et al., 2004）。ダウノブラスチンに対する耐性を維持するために、細胞を、０．２５μg/ml ダウノブラスチンを含有するＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ、１％ ＰＳ）中において、１０％ ＣＯ２条件下、３７℃で１４日毎に培養した。
【０４７８】
Ａ５４９
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）は、１９７２年にヒト肺胞基底の腺がんから単離された（Giard et al., 1973）。培養を３７℃及び１０％ ＣＯ２で、Dulbecco’s ＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ及び１％ ＰＳ）中において行った。
【０４７９】
Ｔ２４
Ｔ２４細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−４）は、１９７０年に原発性ヒト膀胱がんから得られた（Bubenik, Baresova et al., 1973）。ＨＲＡＳ遺伝子における点突然変異により（Reddy et al., 1982）、ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ経路が活性化されている。さらに、この細胞株には、腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３の遺伝子座における更なる突然変異が存在する（Pinto-Leite et al., 2014）。細胞を、１０％ ＦＣＳ、１％ ＰＳ及び１％ 非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩにより、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養した。
【０４８０】
ＨＥＫ２９３
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）は、１９７３年に単離されたヒト胚性腎細胞である。全Ｅ１領域を含むアデノウイルス血清型５のゲノムの４．５kbサイズ部分の安定したトランスフェクションのために（Graham and Smiley, 1977）、この細胞株は、Ｅ１欠損アデノウイルスの産生及びウイルス力価の測定に使用される。
【０４８１】
表１：プライマー
名称    フォワードプライマー    リバースプライマー
企業名
繊維
Eurofins    AAGCTAGCCCTGCAAACATCA    CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA
Ｅ２初期
Invitrogen
CCGTCATCTCTACAGCCCAT    GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC
Ｅ２後期
Invitrogen    CTTCCTAGCGACTTTGTGCC    GTCAGAGTGGTAGGCAAGGT
Ｅ１Ａ１２Ｓ
Metabion    CGACGAGGATGAAGTCCTGTGTCTG    CTCAGGATAGCAGGCGCCAT
Ｅ１Ａ１２Ｓショート
Metabion    GAGGATGAAGTCCTGTGT    CTCAGGATAGCAGGCGCCAT
Ｅ１Ａ１３Ｓ
Metabion    TGTTTGTCTACAGTCCTGTGTCTG    CTCAGGATAGCAGGCGCCAT
Ｅ１Ａ１３Ｓショート
Metabion    TTGTCTACAGTCCTGTGT    CTCAGGATAGCAGGCGCCAT
Ｅ４ｏｒｆ６
Metabion    TCCCTCCCAACACACAGAGT    GACAGGAAACCGTGTGGAAT
Ｒｂ
Life Techno.    AGCAACCCTCCTAAACCACT    TGTTTGAGGTATCCATGCTATCA
Ｅ２Ｆ１
Life Technology    ACGCTATGAGACCTCACTGAA    TCCTGGGTCAACCCCTCAAG
Ｅ２Ｆ２
Life Technology    CGTCCCTGAGTTCCCAACC    GCGAAGTGTCATACCGAGTCTT
ＧＡＰＤＨ
MWG    TGGCATGGACTGTGGTCATGAG    ACTGGCGTCTTCACCACCATGG
アクチン
Eurofins    TAAGTAGGTGCACAGTAGGTCTGA    AAAGTGCAAAGAACACGGCTAAG
Ｌ４  ３３Ｋ
Eurofins    GAACCAGGGCCGCCCATACTG    GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC
Ｌ４  ２２Ｋ
Eurofins    CCGTTAGCCCAAGAGCAAC    CGGCCGTGATGGTAGAGAAG
Ｌ４ＨｅｘＡｓｓ
Eurofins    CTGTGGTACTTCCCAGAGAC    CAGGTGAGTTATACCCTGCC
【０４８２】
ウイルス    特性
Ａｄ−ＷＴ＋ＡｄＷＴ−ＲＧＤ    野生型マストアデノウイルス、Ｃ型、血清型５及びＡＤＷＴ及び更なるＲＧＤ繊維モチーフ
ＡｄＷＴ−Ｅ２Ｆｍｕｔ．    マストアデノウイルス、Ｃ型、血清型５、Ｅ２初期プロモーターの両Ｅ２Ｆ結合部位における突然変異、追加のＲＧＤ繊維モチーフ及びＥ３領域における２，７kbサイズの欠失（ΔＥ３）
ＸＶｉｒ−Ｎ−３１    マストアデノウイルス、Ｃ型、血清型５、Ｅ１Ｂ領域（１．７１６〜１９１５、２００bp）における欠失、Ｅ３領域（２８．１３２〜３０．８１３）における欠失及びＥ１Ａ領域における１２塩基欠失を伴う。核ＹＢ−１発現のみを表わすがん細胞中で複製する。
ＸＶｉｒ−Ｎ−３１／Ｅ２ＦＭ    マストアデノウイルス、Ｃ型、血清型５
Ｅ１Ｂ領域（１．７１６〜１９１５、２００bp）における欠失、Ｅ３領域（２８．１３２〜３０．８１３）における欠失及びＥ１Ａ領域における１２塩基欠失を伴う。核ＹＢ−１発現のみを表わすがん細胞中で複製する。Ｅ２初期プロモーターの両Ｅ２Ｆ結合部位における突然変異、追加のＲＧＤ繊維モチーフ及びＥ３領域における２，７kbサイズの欠失（ΔＥ３）
【０４８３】
ターゲット遺伝子    ｓｉＲＮＡ構築物    製造メーカー
対照    対照（非ｓｉｌ．）ｓｉＲＮＡ、２０μM    Qiagen、the Netherlands
Ｅ２Ｆ−１    Ｅ２Ｆ−１（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１６２２２０）、１０μM    Sigma, Merck、Germany
ＹＢ−１    ＹＢＸ１  ｓｉＲＮＡ  ＦｌｅｘｉＴｕｂｅ、１０μM    Qiagen、the Netherlands
【０４８４】
方法
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
特定の遺伝子のダウンレギュレーションを、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを使用して行った。ここで、リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fischer）試薬 ５μlを一方のチューブ中のOpti-MEM １５０μlに加え、３６pmol ｓｉＲＮＡを他方のチューブ中のOpti-MEM １５０μlと合わせた。両チューブの内容物を合わせ、軽くボルテックスした後、この溶液を室温で５分間インキュベーションした。ついで、ｓｉＲＮＡ−脂質複合体 ２５０μlを前日に６ウェルプレートに播種された２５０．０００〜１．０００．０００個 細胞に、培地を変えずに加え、ウェル当たり３０pmolのｓｉＲＮＡの最終濃度に達した。３７℃、１０％ ＣＯ２で４８時間インキュベーションした後、感染又は溶解が起こった。
【０４８５】
ｓｉＲＮＡと組み合わせたＲＮＡ定量
ウイルスをｓｉＲＮＡトランスフェクションと組み合わせた細胞中のＲＮＡも定量した。ここで、１２５．０００個 細胞を播種し、翌日、３０pmol 対照−、ＹＢ−１−、及びＥ２Ｆ１−ｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ構築物でトランスフェクションした。４８時間のインキュベーション後、感染が起こり、感染後２４時間で溶解が起こった。ライゼートを−２０℃で保存した。
【０４８６】
ＲＮＡ単離
細胞をＰＢＳですすぎ、溶解バッファー（mirVana  ｍｉＲＮＡ単離キット、Life Technologies）で溶解し、１．５mlの反応チューブに移した。ホモジネート添加剤（mirVana  ｍｉＲＮＡ単離キット、Life Technologies） ５０μlをこのライゼートに加え、再懸濁させ、氷上で１０分間インキュベーションした。酸−フェノール−クロロホルム ５００μlを加え、約３０秒間ボルテックスし、氷上で２分間インキュベーションした。室温で１４．０００ｇ、５分間遠心分離した後、水相と有機相とを分離する。上側の水相を新たなスナップキャップに移し、等量のイソプロパノールと合わせ、転倒混和した。室温で１０分間インキュベーションした後、サンプルを４℃及び１４．０００ｇで３０分間遠心分離した。続けて、上清を除去し、ＲＮＡペレットを７５％ エタノール １mlで洗浄した。サンプルを７５００ｇ、４℃で５分間軽く遠心分離した。上清を除去した後、風乾させたペレットを、ヌクレアーゼを含まない水 ２０μlに溶解させ、サーモミキサー中において、５５℃及び５００ｒｐｍで１０分間インキュベーションした。続けて、ＲＮＡ濃度を分光光度測定により測定した。ＤＮＡのｒｕｔの増幅を避けるために、ＤＮＡｓｅ消化を行った。ここで、デオキシリボヌクレアーゼＩ，増幅グレードキット（Invitrogen、life technologies製）を使用した。１μg ＲＮＡに、１０×ＤＮＡｓｅ  Ｉ反応バッファー １μl及びＤＮＡｓｅ  Ｉ １μlを加え、ＤＥＰＣ処理水で１０μlの最終容量まで満たし、室温で正確に１５分間インキュベーションする。２５mM ＥＤＴＡ溶液 １μlを加えることにより、ＤＮａｓｅ  Ｉを不活性化し、それにより、ＤＮＡｓｅ消化の進行を停止させる。サンプルを６５℃で１０分間インキュベーションし、ついで、逆転写に使用した。
【０４８７】
逆転写
ＲＮＡをｃＤＮＡに書き換えるために、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Thermo Scientific）を使用した。２μg ＤＮＡ消化サンプルのＲＮＡを、ＰＣＲソフトチューブ中の転写バッファー、１００mM ｄＮＴＰ及びＲＮＡｓｅ阻害剤を含有するMastermixに加えた。ここで、Ｅ２初期プロモーター及びＥ２後期プロモーターを介して転写されるＲＮＡは、通常、逆転写に使用されるランダムプライマーでは書き換えることができないと考えなければならなかった。これらのランダムプライマーは、二本鎖アデノウイルスゲノムの両鎖に結合するであろうためである。したがって、Ｅ２初期定量及びＥ２後期定量に使用されたサンプルについてのＲＮＡからｃＤＮＡへの書き換えを、特異的Ｅ２初期リバースプライマー（表１）を使用することにより行った。結果を正規化するのに使用されたハウスキーピング遺伝子であるアクチンについては、ランダムプライマーを使用した。
【０４８８】
ＤＮＡ複製分析
感染細胞内でのウイルス複製を調査するために、ＤＮＡ複製分析を行った。１２５．０００個 細胞を６ウェルプレートに播種し、１０〜２０MOIで感染させた。感染後それぞれ２、８、１２、２４、３６及び４８時間後、溶解を行った。ここで、培地を除去し、接着細胞をＰＢＳ １mlで洗浄した。ＤＮＡ溶解バッファー ２００μlを加えた後、接着細胞を、細胞スクレーパーを使用してプレートから掻き取った。ついで、ライゼートをスナップキャップに移した。酵素プロテイナーゼＫ ３μlを加え、サーモミキサーにおいて、５６℃及び５５０rpmで一晩インキュベーションした。翌日、ＤＮＡ分離を行った。
【０４８９】
ＤＮＡ単離
ＤＮＡ精製のために、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール ２００μlをライゼートに加えた。ボルテックスし、続けて、氷上で５分間インキュベーションした後、相分離を４℃、１６４３０ｇで３分間遠心分離することにより達成した。上側の水相を、相のより良好な可視化のために、１０mM ＴｒｉｓＣｌ中のクロロホルム ２００μl及びクレゾールレッド ２０μlを含有する新たなスナップキャップに移した。ボルテックスし、氷上で５分間インキュベーションした後、４℃、１６４３０ｇで３分間遠心分離を行った。再度、上側の水相をエタノール ８００μl及び３M 酢酸ナトリウム溶液 ５０μlと合わせた。より良好な沈殿を達成するために、グリコーゲン ２μlを加えた。チューブを短く転倒混和させた後、この溶液を４℃、１６４３０ｇで３０分間遠心分離した。続けて、ＤＮＡペレットを７０％ エタノール ４００μlで覆い、室温で１０分間インキュベーションした。室温、４７６０ｇで７分間遠心分離した後、ＤＮＡペレットを３７℃で約５〜１０分間乾燥させた。続けて、このペレットを０，１×ＴＥバッファー １００μlに溶解させ、４０℃、４００rpmで約３時間振とうした。ＤＮＡが完全に溶解したら、ＤＮＡ濃度を、測定用ＤＮＡ溶液 ２μ及びブランク溶液としての０，１×ＴＥバッファーを使用する分光光度計により測定した。ついで、ＤＮＡを４℃で保存した。
【０４９０】
ｑＰＣＲ
更なる定量のために、リアルタイム定量ＰＣＲを使用した。テンプレートＤＮＡ又はｃＤＮＡ ５μlそれぞれを、１０ng/μlの最終濃度で使用した。ｑＰＣＲを、Mastermix GoTaq PCR（Promega Corporation）（Mastermix ７．５μl、プライマー １．５μl、Ｈ２Ｏ １μl） １０μl及びＤＮＡテンプレート ５μlを使用して、ダプリケートでピペットされた９６ウェルプレートで行った。相対的定量を、２つの正規化遺伝子を用いた比較ＣＴ法を使用して行った。プレートをホイルで閉じ、室温、２２０ｇで２分間遠心分離した。ついで、プレートをサーマルサイクラーでの特定の温度−時間プログラムに従ってインキュベーションした。使用されたプライマーを表１に列記する。反応をCFX96リアルタイムＰＣＲ検出システム（Bio-Rad Laboratories）で行った。
【０４９１】
ｑＰＣＲサイクル条件
繊維：９４℃で２分間、９４℃で１５秒間、６０℃で１５秒間及び７２℃で１５秒間、４５サイクル
他のウイルス遺伝子：９４℃で１．５分間、９４℃で１５秒間、５８℃で１５秒間及び７２℃で１５秒間、４５サイクル
Ｒｂ：９４℃で２分間、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間、４４サイクル
Ｅ２Ｆ：９５℃で２分間、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間、４０サイクル
【０４９２】
タンパク質単離
細胞を、１％ ＳＤＳバッファーを使用して溶解し、核膜の破壊を達成した。タンパク質の変性を避けるために、全プロセスを氷上で行った。培地を吸引した後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した。ダプリケートのアプローチの１つのウェルの接着細胞を、１％ ＳＤＳバッファー ２００μlで溶解し、細胞スクレーパーにより掻き取った。ついで、ライゼートをダプリケートのアプローチの他のウェルに移し、再度掻き取った。ついで、両ウェルのライゼートを合わせて、スナップキャップチューブに移した。続けて、ライゼートをシリンジで処理して、粘性ＤＮＡを破壊し、４℃、３１０００rpmで３０分間遠心分離した。タンパク質が上清中に存在するため、上清を新たなスナップキャップチューブに移し、更なる工程に使用した。
【０４９３】
タンパク質定量
タンパク質の量を定量するために、Pierce TM BCAタンパク質キットによるビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを行った。ここで、ＢＣＡ溶液Ａ＋Ｂ（５０：１） １１２．５μl及びサンプル １２．５μlを９６ウェルプレートの１つのウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベーションした。タンパク質濃度に応じて、溶液の染色が生じた。既知のタンパク質濃度を有する標準系列により、サンプルのタンパク質濃度をマイクロプレートリーダーにおける５６２nmでの測光測定により決定した。
【０４９４】
ＳＤＳゲル電気泳動
後続のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動においてタンパク質を分離するために、計算量のライゼート及び溶解バッファーをローディングバッファー−ＤＤＴ−混合物（６：１） １５μlと混合した。ついで、タンパク質ロード物質を１００℃で５分間加熱した。色タンパク質標準 ５μl及びサンプル ４０μlをゲル上にロードした。ウイルスタンパク質の検出についてのタンパク質分離のために、１０％ ゲルを使用した。ｓｉＲＮＡによるダウンレギュレートされた遺伝子を研究するために、１２％ ゲルを使用した。分離ゲル及びスタッキングゲルの組成をバッファー及び溶液のセクションに列記する。約２０分間、ゲルをＴＧＳ−バッファー中、９０Ｖで泳動させて、全てのタンパク質を１つのバンドに集めた。続けて、ゲルをＴＧＳ−バッファー中、１５０Ｖで約６０分間泳動させて、タンパク質をサイズにより分離した。
【０４９５】
ウェスタンブロット
タンパク質をゲルからメンブランに転写するために、ウェスタンブロット技術を使用してブロットした。疎水性ＰＶＤＦ膜を活性化するために、メタノール中で約２分間インキュベーションした。続けて、メンブランをスポンジ、ろ紙及びゲルと共にブロッティングバッファー中において堆積させた。４℃、１００Ｖでの約２時間の電気泳動により、タンパク質をブロッティングバッファー中でメンブランに移した。非特異的な抗体結合を避けるために、メンブランを、細胞タンパク質をそれぞれ分析するために、ＴＢＳＴ中の５％ 粉乳 １０ml中で、その後のウイルスタンパク質を検出する抗体の使用のために、５％ ＢＳＡ−ＴＢＳＴ ５ml中でそれぞれ、室温で１時間回転させることでブロッキングした。メンブランをそれぞれ５分間ＴＢＳＴ中で５回洗浄した後、メンブランを一次抗体溶液と共に４℃で一晩回転させながらインキュベーションした。抗体ＧＡＰＤＨ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６については、この工程を室温で１時間行った。ここで、抗体を、０．０２％ アジ化ナトリウムを含むＴＢＳＴ中の５％ ＢＳＡに、異なる係数で希釈した。更なる５回の洗浄工程後、メンブランを二次抗体の１：１０．０００希釈中、室温で３０分間回転させてインキュベーションした。ウイルス抗体に対する二次抗体（抗マウス）を５％ ＢＳＡ−ＴＢＳＴ中に希釈し、他の全ての抗体をＴＢＳＴ中の５％粉乳中に希釈した。これらの二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている。５回の最後の洗浄工程後、ペルオキシダーゼのシグナルを可視化するために、メンブランをEnhanced-Chemi-Luminescence（ＥＣＬ）溶液中で５分間インキュベーションした。一次抗体ＤＰ−１及びＥ２Ｆ−１と共にインキュベーションされたメンブランについては、GE−Healthcare製のAmersham ECL Primeウェスタンブロット検出試薬を使用して、より明るいシグナルを達成した。他の全てについては、研究室において調製されたＥＣＬ溶液を使用した。使用直前に１：１で混合されたＥＣＬ  Ａ及びＥＣＬ  Ｂの組成を、バッファー及び溶液のセクションに列記する。最後に、フィルム上にシグナルを呈することによりタンパク質を検出することができた。
【０４９６】
抗体：
チェックポイントキナーゼ１（ｓｃ−３７７２３１、Santa Cruz Biotechnology）
総ＲＢ（５５４１３６、BD Biosciences）
ホスホＲＢ  Ｓｅｒ７８０（８１８０、Cell Signaling Technology）
Ｅ２Ｆ１（ｓｃ−２５１、Santa Cruz Biotechnology）
Ｅ２Ｆ２（ａｂ１３８５１５、abcam）
Ｅ２Ｆ３（ＰＧ３７、Thermo FisherScientific）
Ｅ２Ｆ４（ＷＵＦ１０、Thermo FisherScientific）
Ｅ２Ｆ５（ｓｃ−９９９、Santa Cruz Biotechnology）
サイクリンＤ１（９２Ｇ２、Cell Signaling Technology）
サイクリンＥ２（４１３２、Cell Signaling Technology）
ＣＤＫ２（７８Ｂ２、Cell Signaling Technology）
ＧＡＰＤＨ（１４Ｃ１０、Cell Signaling Technology）
アクチン（Ａ２０６６、Sigma-Aldrich Chemie GmbH）
Ｅ１Ａ（ｓｃ−２５、Santa Cruz Biotechnology）
Ｅ１Ｂ５５ｋ（M. Dobbelsteinが親切に提供）
Ｅ４ｏｒｆ６（M. Dobbelsteinが親切に提供）
Ｅ２Ａ（ＤＢＰ、M. Dobbelsteinが親切に提供）
ヘキソン（ＡＢＩＮ２６８６０２９、Antibodies online）
【０４９７】
低分子阻害剤処理
ＰＤ−０３３２９９１  イセチオナート（パルボシクリブ、Sigma-Aldrich Chemie GmbH）及びＬＹ−２８３５２１９（アベマシクリブ、Selleck Chemicals）を１０mM ストック溶液として滅菌水中に溶解させた。ＬＥＥ０１１（リボシクリブ、MedChem Express）及びＮｕｔｌｉｎ−３ａ（Sigma）をそれぞれ、１０mM及び５μM ストック溶液としてＤＭＳＯ中に溶解させた。作業濃度を直ちに使用するために新鮮に調製した。
【０４９８】
ウイルス感染及び併用処理
ウイルス誘引細胞死の決定のために、細胞を１２ウェルプレートに播種した。ＰＤ−０３３２９９、ＬＹ−２８３５２１９及びＬＥＥ０１１との併用処理のために、細胞を阻害剤で２４時間前処理した。この細胞を、ＦＢＳを含まない培地 ２００〜４００μl中において、示されたMOIで示されたウイルスに感染させた。低分子阻害剤を１hpiで含むか又は含まない完全培地を細胞に加えた。
【０４９９】
細胞生存（ＳＲＢアッセイ）
細胞を１０％ ＴＣＡにより、４℃で１時間固定し、１％ 酢酸中の０．５％ スルホローダミンＢ（ＳＲＢ、Sigma-Aldrich Chemie GmbH）により、ＲＴで３０分間染色し、続けて、１％ 酢酸で洗浄して、過剰のＳＲＢを除去した。乾燥ＳＲＢを１０mM Ｔｒｉｓバッファー中に溶解させ、定量を５９０nmでの測光測定により行った。
【０５００】
力価試験
感染性ウイルス粒子産生の決定のために、感染細胞及び上清を、細胞スクレーパーを使用して３dpiで回収した。ウイルスを、複数サイクルの凍結融解、続けて、１６００rcfでの遠心分離により、インタクトな細胞から放出させた。細胞ライゼートの上清をAdEasyウイルス力価キットの取扱説明書（９７２５００）に記載されているように、Ｈｅｋ２９３細胞を使用してウイルス粒子産生について試験した。下記試薬を使用した：ヤギ抗ヘキソン抗体（１０５６、Chemicon）、ウサギ抗ヤギ抗体（Ｐ０４４９、Dako）、ＤＡＢ溶液（Dako）。
【０５０１】
実施例２：Ｅ１マイナスアデノウイルスの複製に対するＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ０３３２９９１の効果
Ｅ１欠失アデノウイルスは、非常に低い効力ではあるが、がん細胞において複製することが示された。Ｔ２４細胞を、１００MOI 緑色蛍光タンパク質を発現するＥ１マイナスアデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ）に感染させ、感染の１日前及びインキュベーション時間中に５００nM ＰＤ０３３２９９１で処理した。このような条件下で、ＧＦＰ発現の増加が観察されたため、Ｅ１Ａ非依存性ウイルス複製及びアデノウイルスＥ２初期プロモーターの活性化により媒介される遺伝子発現が示された。
【０５０２】
実施例３：野生型アデノウイルス又はＸＶｉｒ−Ｎ−３１と種々のＣＤＫ４／６阻害剤との併用
Ｅ２初期突然変異アデノウイルスＡｄ−ＷＴ／Ｅ２Ｍ及びＡｄ−ＧＦＰをＰＤ０３３２９９１と組み合わせて使用した結果に基づいて、実験を、種々のＣＤＫ４／６阻害剤を野生型アデノウイルスＡｄ−ＷＴ又はＸＶｉｒ−Ｎ−３１のいずれかと組み合わせて使用して行った。これらの薬剤は、細胞をＧ１期で停止させるため、全ての阻害剤が、ウイルス複製を支持することができたことが見出されたのは驚くべきことであった。
【０５０３】
さらに、３つの臨床的に進行しているＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ−０３３２９９、ＬＹ−２８３５２１９及びＬＥＥ０１１による細胞の処理により、細胞の生存性、ウイルス複製及びウイルス力価産生に対する感染に影響を及ぼし得るかどうかを検討した。
【０５０４】
処理に際して、３つの阻害剤は全て、ＲＢの発現及びリン酸化レベルに対して類似の効果を表わす。これは、以前から多数の刊行物に記載されている。２４時間でのほぼ完全な脱リン酸化後及び総タンパク質のダウンレギュレーション後にも、リン酸化レベルは、経時的に部分的に回復する。ＣＤＫ２レベルは、処理時にアップレギュレーションされ、サイクリンＤ２及びサイクリンＥ２レベルはダウンレギュレーションされた。
【０５０５】
実施例４：ＣＤＫ４／６阻害剤と腫瘍溶解性アデノウイルスとの組み合わせにより生じる相乗効果
ＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ−０３３２９９、ＬＹ−２８３５２１９及びＬＥＥ０１１を細胞のアデノウイルス感染と組み合わせた。細胞の感染は、処理後２４時間に行った。ターゲット分子に対する下流の影響は、処理後８〜２４時間の間にしか検出できないためである。
【０５０６】
結果を図１に示す。
【０５０７】
ＣＤＫ４／６阻害剤により、細胞生存性、ウイルス複製及びウイルス力価に対して相乗効果が誘引された。（ａ）細胞を３つのＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ−０３３２９９、ＬＹ−２８３５２１９及びＬＥＥ０１１で２４時間前処理し、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（Moi６０）又は野生型アデノウイルス（Moi８０）に感染させた。感染後の４日で、細胞生存をＳＲＢアッセイにより測定した。グラフは、最低３つの独立した実験の平均を示す。（ｂ）感染後３日で、ライゼートを細胞から調製し、力価試験をＨＥＫ２９３細胞について行った。ウイルス力価は、対照に対する倍  変化として示す。（ｃ）ＤＮＡを感染細胞から４、２４、３６及び４８hpiで抽出し、線維ｃＤＮＡに対するｑＰＣＲを使用することによりウイルス複製について分析した。値を４hpiでのＧＡＰＤＨに対して正規化する。グラフは、少なくとも２つの独立した実験の代表を示す。エラーバーは、標準誤差を表わす。
【０５０８】
図１から明らかなように、３つ全てのＣＤＫ４／６阻害剤は、細胞溶解（図１ａ）、細胞内での複製（図１８）及びウイルス粒子の形成（図１ｂ）を劇的に支持した。
【０５０９】
実施例５：選択されたウイルスタンパク発現レベルに対するＣＤＫ４／６阻害剤パルボシクリブ（ＰＤ−０３３２９９）の効果
これらの効果をより詳細に分析するために、選択されたウイルスタンパク質の発現レベルを処理された細胞又は処理されていない細胞において決定した。この実験のために、阻害剤パルボシクリブ（ＰＤ−０３３２９９）を代表的なＣＤＫ４／６阻害剤として使用した。細胞を１５MOIで感染させた。５００nMでのＰＤ処理を、感染２４時間及びタンパク質単離を行うまで行った。１２、２４及び３６時間後、タンパク質単離を、１％ ＳＤＳバッファーを使用して行った。アクチンをポジティブ対照として含めた。ローディング対照は、全ての系統において同じタンパク質レベルの細胞アクチンを示すため、系統間の適切な比較が保証される。hpi：感染後時間。
【０５１０】
結果を図２に示す。図２は、ＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ０３３２９９１（ＰＤ）と組み合わせたＡｄ−ＷＴ及びＸＶｉｒ−Ｎ−３１感染Ｔ２４細胞のウイルスタンパク質発現の結果を示す。本実験で調査されたウイルスタンパク質（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ−５５ｋ、ＤＢＰ（Ｅ２Ａ）及びヘキソン）は全て、ＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ−０３３２９９１で処理された細胞では、アデノウイルス野生型ウイルスと比較して、より高いレベルで発現していた。この効果は、Ｅ１Ａについては１２hpi、他のタンパク質については２４hpiという早い時期に観察することができた。
【０５１１】
実施例６：ＣＤＫ４／６阻害剤により媒介される効果の特異性
実施例５に従うＣＤＫ４／６阻害剤のクラスは、ＲＢの発現を必要とする。したがって、３つのＲＢ陽性及び２つのＲＢマイナス膀胱がん由来細胞株を使用し、これらの細胞を併用療法で処理した。細胞株をＩＣ５０濃度のＰＤ−０３３２９９１（Ｔ２４：５００nM、ＲＴ１１２：２０００nM、２５３Ｊ：１００nM）で２４時間前処理し、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（Ｔ２４  MOI５０、２５３Ｊ  MOI２５、ＲＴ１１２  MOI４５０）に感染させた。値は、少なくとも２つの独立した実験の平均である。エラーバーは、標準誤差を示す。４dpiで、細胞生存を、ＳＲＢアッセイ（ａ、ｃ）を使用して測定した。（ｂ、ｄ）細胞ライゼートを３dpiで調製し、力価試験をＨｅｋ２９３細胞について行った。ウイルス力価は、対照に対する倍  変化として示す。
【０５１２】
結果を図３に示す。
【０５１３】
図３から明らかなように、ＲＢ陽性の細胞株のみが、細胞増殖及び細胞生存それぞれの顕著な低下を示した（図３ａ、ｃ）。また、ウイルス粒子の形成は、ＰＤ−０３３２９９１処理時にＲＢ陽性細胞株においてのみ増加した（図３ｂ、ｄ）。
【０５１４】
実施例７：ＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ−０３３２９９１とＸＶｉｒ−Ｎ−３１との併用処理の効果
ＲＢ陽性細胞株におけるウイルス複製に対するＰＤ−０３３２９９１の効果を調査するため、繊維ＤＮＡコピーの相対定量を、ｑＰＣＲを使用して行った。膀胱がん細胞株を２４時間前処理し、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１（Ｔ２４  MOI４０、ＵＭＵＣ３及び２５３Ｊ  MOI２０、ＲＴ１１２  MOI４００）に感染させた。ＤＮＡを２４〜４８hpiで抽出し、ｑＰＣＲを使用してウイルス繊維について分析した。値をＧＡＰＤＨに対して正規化する。データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。エラーバーＳ．Ｄ。
【０５１５】
結果を図４に示す。
【０５１６】
図４から分かるように、ＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ−０３３２９９１とＸＶｉｒ−Ｎ−３１との併用処理により、ウイルス複製が劇的に増大する。
【０５１７】
実施例８：ＣＤＫ４／６阻害剤の時間動特性
ＲＢの脱リン酸化及び分解に対するＣＤＫ４／６阻害剤の時間動特性は、細胞の処理後約１０時間である。また、上記示された結果から、ＲＢ下流ターゲットの経時的で部分的な回復が示された（図１）。この観察は、ＣＤＫ４／６阻害剤の時間動特性及びウイルス誘引細胞死に対する効果が実施例７に例示されたように、この併用療法の重要なパラメータであることを意味する。併用療法の適用のために、細胞の前処理のための異なる時点を試験した。それに従って、細胞を感染前（感染前日／時間、dai／hai）又は感染後１時間のいずれかで処理し、細胞増殖を、ＳＲＢアッセイを使用して測定した。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を表わし、値は、３つの独立した実験の平均である。
【０５１８】
結果を図５に示す。
【０５１９】
図５から明らかなように、並行処理は、細胞死の増加に既に十分であった。
【０５２０】
実施例９：種々のアデノウイルスとＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ０３３２９９１との併用処理
本実施例を、細胞殺傷のために、種々の腫瘍溶解性アデノウイルスをＣＤＫ４／６阻害剤、例えば、ＰＤ０３３２９９１と共に使用することができ、ウイルス複製及び細胞殺傷における観察された増加がＸＶｉｒ−Ｎ−３１に限定されなかったという実験的証拠を提供するために行った。それに従い、以下のように、Ａｄ−デルタ２４及びＯｎｙｘ−０１５によるＴ２４がん細胞：Ｔ２４膀胱がん細胞を、２０MOI 示された腫瘍溶解性アデノウイルスに感染させた。５００nM ＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ０３３２９９１での処理を感染の１日前及び感染後４日間行った。感染から４日後に撮影した。細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生は、ウイルス複製と細胞殺傷を示す。
【０５２１】
結果を図６に示す。
【０５２２】
図６から分かるように、ＲＢリン酸化を減少させるＣＤＫ４／６阻害剤の代表例としてのＣＤＫ４／６阻害剤ＰＤ０３３２９９１により、他の腫瘍溶解性アデノウイルス、例えば、Ａｄ−デルタ２４及びＯｎｙｘ−０１５と組み合わせた場合、細胞殺傷が増加した。
【０５２３】
実施例１０：パルボシクリブと組み合わせたＧＦＰを発現するリコンビナントＥ１欠失アデノウイルス（Ａｄ−マイナス／ＧＦＰ）をＴ２４細胞に感染させると、ＧＦＰ発現が増大する
１００．０００個 Ｔ２４細胞/ウェルを６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中において、５％ ＣＯ２、３７℃で増殖させた。Ｔ２４細胞を、感染の２４時間前及び再度感染後１時間で、５００nM パルボシクリブで処理した。ＧＦＰを発現するＥ１欠失アデノウイルス（Ａｄ−マイナス／ＧＦＰ）の感染を、血清を含まない培地 ４００μl中で行った。１０倍の倍率の蛍光顕微鏡を使用して、感染後４８時間で写真を撮った。
【０５２４】
パルボシクリブ処理の有無によるＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡分析の結果を図７に示す。
【０５２５】
結果から、Ｔ２４細胞をパルボシクリブで処理することにより、パルボシクリブによって誘引されるウイルスＤＮＡ複製により媒介されるＧＦＰ発現が強く増大したことが示される。
【０５２６】
実施例１１：種々の細胞周期阻害剤で処理されたＵＭＵＣ細胞におけるＥ１Ａとは無関係のウイルス複製
異なる処理条件下でのｄｌ７０３（Mantwill et al.2013, Journal of Translational Medicine, 11, 216）の複製の差異を調査するため、ＤＮＡ複製分析を行った。１００．０００個 ＵＭＵＣ細胞を６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中において、５％ ＣＯ２条件下、３７℃で増殖させた。播種後２４時間で、細胞を１０μM Ｌｅｅ（リボシクリブ）、１μM ＣＩ−１０４０、１０μM Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ及び１０μM ロスコビチンで２４時間処理し、感染後、適切な量の阻害剤を培地に再度加えた。５０MOI ｄｌ７０３（マストアデノウイルス、Ｃ型、血清型５、Ｅ１領域に３．２kbサイズの欠失を有する）の感染を処理後２４時間後で行った。感染後４時間及び４８時間で、ＤＮＡを単離し、ｑＰＣＲを、ウイルス繊維遺伝子に特異的なプライマーを使用して行った。繊維ｆｗｄ．５’−AAGCTAGCCCTGCAAACATCA−３’；繊維ｒｅｖ．５’−CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA−３’。
【０５２７】
結果を図８に示す。
【０５２８】
図８から明らかなように、ＵＭＵＣ細胞をＣＤＫ４／６阻害剤ＬＥＥ０１１（リボシクリブ）で処理することにより、Ｅ１マイナスアデノウイルスｄｌ７０３のウイルスＤＮＡ複製が劇的に増大した（ほぼ１００倍）。この増大から、Ｅ２Ｆ−１発現の抑制と組み合わせたリボシクリブによる特異的誘引Ｇ１停止により、Ｅ１とは無関係のアデノウイルス複製が促進されることが強く示唆される。その結果、Ｅ１Ａ遺伝子に特異的な欠失を有するウイルスだけが、ＣＤＫ４／６処理下でアデノウイルスＤＮＡ複製の増大を示すのではなく、Ｅ１Ａ遺伝子の完全な欠失を有するアデノウイルスであっても、ウイルスＤＮＡ複製の増大を示す。
【０５２９】
Ｍｅｋ阻害剤ＧＩ−１０４０は、Ｅ２Ｆ−１発現阻害及びＧ１停止に関して類似の性質を示したが、その複製は、リボシクリブ処理細胞と比較してはるかに低かった。これは、ウイルス複製に必要な他の重要な細胞周期関連経路、例えば、ＭＥＫ／ＥＲＫが同時に阻害されるという事実によると考えられる。加えて、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害は、腫瘍溶解性アデノウイルス複製との併用療法のために、臨床状況において、それを不適当にする、１００倍以上の粒子形成を減少させることが示された（Schumann and Doppelstein 2016, Cancer Research, 66, 1282-1288）。
【０５３０】
実施例１２：示された細胞周期阻害剤で処理されたＵＭＵＣ細胞のウェスタンブロット分析
示された濃度のＣＩ−１０４０、ロスコビチン、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ及びＬＥＥ０１１（リボシクリブ）で処理されたＵＭＵＣ細胞のウェスタンブロット分析。１×１０６個 細胞を１０cm皿に播種した。処理後２４時間で、核膜の破壊を達成するために、１％ ＳＤＳバッファーを使用して、タンパク質を単離した。全てのサンプルをシリンジに数回吸引して、ＤＮＡを破壊し、続けて、４℃、３００００rpmで３０分間遠心分離した。上清を新たな反応チューブに移し、更なる工程に直接使用するか又は−８０℃で保存した。タンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。４℃、１００Ｖで約２時間の電気泳動により、４０μg 総タンパク質をロードし、示された特異抗体に対してプローブした。
【０５３１】
結果を図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃに示す。
【０５３２】
図９から明らかなように、ロスコビチン及びＮｕｔｌｉｎ−３ａは、Ｒｂ、ｐｈＲＢ及びＥ２Ｆ−１発現に対して顕著な効果を有さなかったが、１０μMでのＬＥＥ−０１１（リボシクリブ）及び１μMでのＭＩ−１０４０により、Ｅ２Ｆ−１並びにＲｂ及びｐｈＲｂ発現の阻害が誘引された。
【０５３３】
実施例１３：Ｅ１欠失複製欠損アデノウイルスｄｌ７０３のウイルスＤＮＡ複製に対するＣＤＫ４／６阻害剤の分析
細胞周期分析のために、細胞を６ウェルプレート（２，５×１０Ｅ４c/ウェル）に播種した。ｄｌ７０３による感染前８時間で、細胞を示された濃度の細胞周期阻害剤で処理した。１０MOI ｄｌ７０３による感染後、細胞を再度４８時間処理した。未処理細胞及びｄｌ７０３感染のみさせた細胞を対照とした。感染後４８時間で、細胞をトリプシン処理により回収し、ボルテックスしながら、８０％ エタノールで固定した。細胞周期の状態を調査するために、固定された細胞をＲＴ及び３００ｇで５分間遠心分離し、エタノールを吸引した。細胞を再懸濁させ、１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ（ウシ血清アルブミン）で洗浄し、再度遠心分離した。細胞をＥＤＵで染色し、細胞周期分析を、Thermo Fischer製のClick-iT（商標）Plus EdUフローサイトメトリーアッセイキット、カタログ番号．Ｃ１０６３２を使用して行った。加えて、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ細胞で３回洗浄した後、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム、５０μg/ml）で染色した。FACScaliburフローサイトメトリーシステムで染色した後、測定を直接行った。データをFlowJoソフトウェアで分析した。
【０５３４】
ＣＤＫ４／６阻害剤の特徴
ＣＩ１０４０：二重特異的スレオニン／チロシンキナーゼであるマップキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）は、多くの場合ヒト腫瘍で活性化されるＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の重要な成分である。ＣＩ−１０４０は、ＭＥＫを強力に阻害し（Allen et al. 2003, Semin Oncol. (5 Suppl 16):105-16）、Ｇ１停止を引き起こすベンズヒドロキサマート化合物である。
【０５３５】
Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ：ＭＤＭ２の低分子アンタゴニストであるＮｕｔｌｉｎ−３は、正常なＭＤＭ２発現細胞株並びに野生型ｐ５３を伴うＭＤＭ２過剰発現細胞株の両方においてｐ５３機能を効果的に回復させ、細胞周期停止及びアポトーシスをもたらす（Wang et al 2012, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, Volume 44, Issue 8, 1 August 2012, Pages 685-691）。
【０５３６】
ロスコビチン（セリシクリブ又はＣＹＣ２０２）は、薬理学的サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤のファミリーにおける実験的薬剤候補であり、ＣＤＫ２、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９を含む複数の酵素ターゲットを優先的に阻害する。同阻害により、処理された細胞の細胞周期内の増殖期又は状態が変化する（Whitaker et al. 2004, Cancer Research 64, 262-272）。
【０５３７】
ＬＥＥ０１１（リボシクリブ；商品名Kisqali］）は、サイクリンＤ１／ＣＤＫ４及びＣＤＫ６の阻害剤であり、ある種の乳がんの処置に使用される。ＣＤＫ４／６の阻害は、細胞周期をＧ１で停止させ、Ｅ２Ｆ−１発現を阻害する（Kim S. et al, Oncotarget. 2018 Oct 16;9(81):35226-35240；Yang C et al., Oncogene (2017)36,2255-2264）。
【０５３８】
結果を図１０に示す。
【０５３９】
ＣＤＫ４／６阻害剤ＬＥＥ０１１（リボシクリブ）及びＣＩ−１０４０により、明確なＧ１停止が誘引された。ロスコビチンによる処理により、Ｇ２／ｍ停止細胞のわずかな増加が示された。Ｎｕｔｌｉｎ−３ａは、使用された濃度において、細胞周期に対してほとんど又は全く影響を及ぼさなかった。リコンビナントＥ１欠失（Ｅ１Ａタンパク質を有さない）アデノウイルスｄｌ７０３によるＵＭＵＣ細胞の感染により、細胞周期分布は顕著に変化しなかった。
【０５４０】
実施例１４：パルボシクリブにより処理後のｉｎ  ｖｉｔｒｏアデノウイルスヘキソン染色が増加した
膀胱細胞株ＲＴ１１２、Ｔ２４及びＵＭＵＣを６ウェルプレートに播種した（２×１０５個/ウェル）。播種後１日目に、細胞を５００nM パルボシクリブで感染前２４時間及び再度感染後１時間で処理した。示されたMOIのＡＤ−ＷＴによる感染を、血清を含まないＤＭＥＭ培地 ４００μl中で行った。ヘキソン染色を、Agilent（ｃａｔ：９７２５００）製のAdeasyウイルス力価キットを使用して、製造メーカーの説明書に従って、感染後２日目に行った。
【０５４１】
結果を図１１に示す。
【０５４２】
図１１から明らかなように、例示的なＣＤＫ４／６阻害剤としてのパルボシクリブ（５００nM）の処理により、褐色／赤色により示されるように、感染後４８時間でパルボシクリブ処理細胞においてヘキソン陽性細胞が顕著に増加した。パルボシクリブ処理下において細胞は、ウイルス粒子をより多く産生可能であり、ウイルスＤＮＡ複製の増大を示すとの結論に達した。アデノウイルスのヘキソン発現は、ウイルス複製の排他的開始に起因するためである。
【０５４３】
実施例１０〜１４の対象となる結果から、ＣＤＫ４／６阻害剤のみが、複製欠損アデノウイルス（Ｅ１遺伝子を欠いているｄｌ７０３）及びＡｄ−ＧＦＰの複製及び遺伝子発現を増加させることができ、他の細胞周期阻害剤はできないことが明らかである。さらに、このようなウイルス複製及び遺伝子発現の増加をもたらすために、ＣＤＫ４／６阻害剤により、（感染した）細胞をＧ１で停止させ、Ｆ２Ｆ１発現が阻害されなければならない。
【０５４４】
実施例１５：ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、パルボシクリブ及びＰＡＲＰ阻害剤を含む３剤併用療法を使用するＴ２４細胞の処理
ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、パルボクリブ及びＰＡＲＰ阻害剤（ＢＭＮ６７３（タラゾラリブ））を含む３剤併用療法を使用するＴ２４細胞の３剤併用療法の有効性を示すために、効力アッセイを行った。
【０５４５】
ウェル当たりに１２．５００個 Ｔ２４細胞を１２ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中において、３７℃で一晩増殖させた。細胞の阻害剤処理を細胞播種後２４時間及び再度感染後１時間で、示された濃度を培地に加えることにより行った。細胞の感染を、血清を含まない培地 ２５０μl中において、阻害剤処理後２４時間で行った。固定及びＳＲＢ染色を感染後４日目に行った。ＰＤ、パルボシクリブ；ＰＡＲＰｉ：ＢＭＮ６７３。
【０５４６】
ＳＲＢ染色のために、培地を吸引により除去した。細胞を１０％ 冷ＴＣＡ １ml（ウェル当たり）により、４℃で１時間固定した。ＴＣＡを吸引により除去し、細胞層を水道水で４回洗浄した。細胞を１％ 酢酸中の０．５％ ＳＲＢ（スルホローダミンＢ） １ml（ウェル当たり）で３０分間染色した。未結合ＳＲＢを１％ 酢酸 １ml/ウェルにより、５回の洗浄ステップで除去した。各洗浄ステップの後、酢酸を吸引により除去した。プレートを２時間風乾させた。ＳＲＢ染色細胞を可溶化するために、１０mM Ｔｒｉｓ塩基 ２００μlを各ウェルに加えた。その後、それぞれ２０μlを９６ウェルプレートのウェルに分注した。９６ウェルプレートをElisaプレートリーダーにロードし、サンプルの吸光を５６０nmで測定した。モック処理細胞を１００％ 細胞生存に設定した。
【０５４７】
結果を図１２に示す。
【０５４８】
図１２に示された結果から、パルボシクリブ、ＢＭＮ６７３及びＸＶｉｒ−Ｎ−３１からなる３剤併用療法が細胞殺傷に関して単剤又は併用療法に対して優れた性能を示したことが明確に実証されている。ほぼ９０％ 細胞殺傷を、１０MOI ＸＶｉｒ−Ｎ−３１をＰＡＲＰ阻害剤ＰＡＲＰｉ（ＢＭＮ６７３）及びＣＤＫ４／６阻害剤パルボシクリブ（ＰＤ）と組み合わせて使用して達成することができた。ＸＶｉｒ−Ｎ−３１を含まないＰＡＲＰｉとパルボシクリブとの組み合わせでは、細胞の６５％しか殺傷されなかった。Ｔ２４細胞及びＵＭＵＣ細胞は、ＣＤＫ４／６阻害剤に感受性である（Ｅ２Ｆ−１ダウンレギュレーションによるＧ１停止を提供する）。
【０５４９】
実施例１６：ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、パルボシクリブ及びＰＡＲＰ阻害剤を含む３剤併用療法の動力学
ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、パルボクリブ及びＰＡＲＰ阻害剤（ＢＭＮ６７３（タラゾラリブ））を含む３剤併用療法を使用するＴ２４細胞の３剤併用療法の動力学を示すために、効力アッセイを行い、効力を種々の時点で評価した。
【０５５０】
ウェル当たりに３．０００個 Ｔ２４細胞を１２ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中において、３７℃で一晩増殖させた。細胞の阻害剤処理を細胞播種後２４時間及び再度感染後１時間で、示された濃度を培地に加えることにより行った。細胞の感染を、血清を含まない培地 ２５０μl中において、阻害剤処理後２４時間で行った。固定及びＳＲＢ染色を感染後１〜５日目（dpi：感染後日数）に行った。１５nM ＰＡＲＰｉは、Ｔ２４細胞のＩＣ８０値に相当する。
【０５５１】
結果を図１３に示す。
【０５５２】
図１３から明らかなように、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１以外に、ＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ（ＰＤ）及びＰＡＲＰ阻害剤ＰＡＲＰＩ（ＢＭＮ６７３）を使用した３剤併用療法は、動力学の観点からも、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１のみを使用する単剤療法又はＸＶｉｒ−Ｎ−３１とＰＡＲＰ阻害剤又はＣＤＫ４／６阻害剤のいずれかとを使用する併用療法よりはるかに効果的である。重要なことに、腫瘍細胞の再増殖が、ＣＤＫ４／６感受性細胞株であるＵＭＵＣ及びＴ２４では、４日目及び５日目（dpi：感染後日数）に顕著に減少した。
【０５５３】
実施例１７：ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、パルボシクリブ及びＰＡＲＰ阻害剤を含む３剤併用療法の動力学
ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、パルボクリブ及びＰＡＲＰ阻害剤（ＢＭＮ６７３（タラゾラリブ））を含む３剤併用療法を使用するＵＭＵＣ細胞の３剤併用療法の動力学を示すために、効力アッセイを行い、効力を種々の時点で評価した。
【０５５４】
ＵＭＵＣ−３の播種：ウェル当たりに３．０００個 細胞を１２ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中において、３７℃で一晩増殖させた。細胞の阻害剤処理を細胞播種後２４時間及び再度感染後１時間で、示された濃度を培地に加えることにより行った。細胞の感染を阻害剤処理後２４時間で行った。固定及びＳＲＢ染色を感染後１〜６日目（dpi：感染後日数）に行った。１６０nM ＰＡＲＰｉは、ＵＭＵＣ３細胞のＩＣ８０値に相当する。
【０５５５】
結果を図１４に示す。
【０５５６】
図１４に示された結果から、パルボシクリブ、ＢＭＮ６７３及びＸＶｉｒ−Ｎ−３１からなる３剤併用療法が単剤又は併用療法に対して優れた性能を示したことが明確に実証されている。重要なことに、腫瘍細胞の再増殖が、ＣＤＫ４／６感受性細胞株であるＵＭＵＣ及びＴ２４では、４日目及び５日目（dpi：感染後日数）に顕著に減少した。
【０５５７】
実施例１８：ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ＣＤＫ４／６阻害剤及びブロモドメイン阻害剤を含む３剤併用療法
５０００個 Ｔ２４細胞を１２ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地 １ml中において増殖させた。翌日、細胞を５００nM パルボシクリブ及び３００nM ＪＱ−１で処理した。処理後２４時間で、細胞を、ＦＣＳを含有しないＲＰＭＩ培地 ２００μl中において、示されたMOIのＸＶｉｒ−Ｎ−３１で感染させた。１時間後、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地 ８００μlを各ウェルに加えた。加えて、５００nM パルボシクリブ及び３００nM ＪＱ−１を培地に加えた。ＳＲＢ染色を感染後５日で行った。モック処理細胞を１００％ 細胞生存に設定した。
【０５５８】
結果を図１５に示す。
【０５５９】
図１５から明らかなように、ブロモドメイン阻害剤ＪＱ１により、低MOIにおいて、ＣＤＫ４／６阻害剤パルボシクリブと組み合わせたＸＶｉｒ−Ｎ−３１の細胞殺傷能が向上した。感染後４８時間での光学顕微鏡分析から、ＪＱ１／パルボシクリブ／ＸＶｉｒ−Ｎ−３１処理細胞において既に大量の細胞死が認められる。ＪＱ−１により、パルボシクリブ処理細胞において、ウイルス転写が増加することにより、ウイルス複製が増加したという結論に達した。３００nM ＪＱ１単独での単剤療法では、１０及び２０MOIでのＸＶｉｒ−Ｎ−３１の細胞殺傷を増大させなかったためである。
【０５６０】
アデノウイルス感染がん細胞において観察されるＪＱ−１の増強の前提条件は、パルボシクリブのＧ１停止誘引能である。パルボシクリブに対して耐性である細胞では（実施例１８、同一の処理手順を参照のこと）、細胞殺傷の増加は観察されなかった。この観察は、Baojie Lv et al 2018, Scientific reports, 8, 11554とは明らかに対照的であり、同文献では、細胞を、ＪＱ１の濃度で処理しており、Ｇ１停止を引き起こさず、パルボシクリブを併用しなかった。
【０５６１】
実施例１９：ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ＣＤＫ４／６阻害剤及びブロモドメイン阻害剤を含む３剤併用療法
１００．０００個 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞/ウェルを１２ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中において、５％ ＣＯ２、３７℃で増殖させた。細胞を、２００nM アベマシクリブ＋５００nM ＪＱ１により、感染前２４時間及び再度感染後１時間で、適切な量を培地に加えることにより処理した。ＸＶｉｒ−Ｎ−３１の感染は、血清を含まないＲＰＭＩ培地 ５００μl中において行った。ＳＲＢ染色を感染後５日で行った。モック処理細胞を１００％ 細胞生存に設定した。
【０５６２】
結果を図１６に示す。
【０５６３】
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対して耐性であるため、Ｇ１停止を引き起こさないことが確立されている。ＪＱ１の添加によっては、ＣＤＫ４／６（アベマシクリブ）耐性ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の細胞殺傷は増加しなかった。このことは、ＣＤＫ４／６媒介Ｇ１停止が細胞殺傷に対するＪＱ１媒介効果の前提条件であることを示している。
【０５６４】
このため、図１６（及び図１５）に、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４をターゲットとするブロモドメイン阻害剤により、ＣＤＫ４／６阻害剤が処理細胞においてＧ１停止を誘引するという前提の下で、ＸＶｉｒ−Ｎ−３の細胞殺傷効果がさらに向上することを示す。
【０５６５】
実施例２０：ＣＤＫ４／６阻害剤ＬＹ−２８３５２１９（アベマシクリブ）及びＷｅｅ阻害剤ＭＫ−１７７５（アダボセルチブ）で処理されたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞のウェスタンブロット分析
１×１０６個 細胞を１０cm皿に播種した。処理後２４時間で、核膜の破壊を達成するために、１％ ＳＤＳバッファーを使用して、タンパク質を単離した。全てのサンプルをシリンジに数回吸引して、ＤＮＡを破壊し、続けて、４℃、３００００rpmで３０分間遠心分離した。上清を新たな反応チューブに移し、更なる工程に直接使用するか又は−８０℃で保存した。タンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。４℃、１００Ｖで約２時間の電気泳動により、４０μg 総タンパク質をロードし、示された特異抗体に対してプローブした。
【０５６６】
結果を図１７に示す。
【０５６７】
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は、アベマシクリブ（Ａｂｅｎａｃｉｃｌｉｂ）処理に対して耐性であることが公知である（Dowless M et al.,2018, Clin Cancer Res: 24, 6028-6039）。Ｗｅｅ１は、Ｇ２／Ｍ細胞周期チェックポイント制御の重要な成分であり、ＣＤＣ２のリン酸化をレギュレーションすることにより細胞周期停止を媒介する。ＭＫ１７７５によるＷｅｅ１の阻害は、異なるタイプのがん腫においてＤＮＡ損傷剤の細胞傷害作用を増強することが報告されている。幾つかの研究から、低分子キナーゼ阻害剤ＭＫ−１７７５によるＷｅｅ１の薬理学的阻害により、腫瘍細胞においてＴｙｒ１５でのＣＤＣ２リン酸化が除去されることが実証されている（Kreahling et al 2013, PLoS One. 8(3), e 57523）。強力なＧ１停止が、併用処理で観察されるが、Ｒｂ及びＥ２Ｆ−１発現に変化は観察されない。
【０５６８】
実施例２１：ＸＶｉｒ−Ｎ−３１、ＣＤＫ４／６阻害剤アベマシクリブ及びアダボセルチブ（Ｗｅｅ阻害剤ＭＫ−１７７５）を含む３剤併用療法
１００．０００個 ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞/ウェルを１２ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中において、５％ ＣＯ２、３７℃で増殖させた。細胞を、２００nM アベマシクリブにより、感染前２４時間及び再度感染後１時間で、適切な量を培地に加えることにより処理した。ＸＶｉｒ−Ｎ−３１の感染は、血清を含まないＲＰＭＩ培地 ５００μl中において行った。ＳＲＢ染色を感染後５日で行った。モック処理細胞を１００％ 細胞生存に設定した。
【０５６９】
結果を図１８に示す。
【０５７０】
図１７（及び図１８）に、ＣＤＫ４／６阻害剤アベマシクリブとＷｅｅ阻害剤ＭＫ−１７７５との組み合わせにより、Ｅ２Ｆ−１を阻害することなく、Ｇ１停止が誘引されたことが実証されている。図１８における効力アッセイから、この組み合わせによっては、腫瘍溶解性アデノウイルスＸＶｉｒ−Ｎ−３１の細胞殺傷効果が増強されないことが示される。これらの結果から、ＣＤＫ４／６阻害剤アベマシクリブとＷｅｅ阻害剤ＭＫ−１７７５との組み合わせによる誘引されるＧ１停止では、ＸＶｉｒ−Ｎ−３１の細胞殺傷能を促進されなかったことが明確に実証されている。このため、Ｅ２Ｆ−１発現の阻害は、ウイルス腫瘍溶解を増強するための更なる必要条件である。
【０５７１】
実施例２２：Ｅ２Ｆ−１阻害との組み合わせにおけるＧ１停止はＣＤＫ４／６阻害剤との組み合わせにおけるＸＶｉｒ−Ｎ−３１の細胞殺傷増強の前提条件である
処理後４８時間で、細胞をＰＢＳ（ＲＮａｓｅ  Ａを含有、１００U/ml）で２回洗浄した。細胞をトリプシン処理し、１５００rpm、４℃で５分間遠心分離した。細胞を、氷冷した８０％ エタノール １mlをペレットにゆっくり滴加し、一晩インキュベーションすることにより固定した。染色を、染色溶液（ヨウ化プロピジウム、５０μg/ml） １mlを細胞に加え、穏やかに揺り動かしながらＲＴで３０〜６０分間インキュベーションすることにより行った。ＭＫ：ＭＫ−１７７５；ＬＹ：ＬＹ−２８３５２１９。
【０５７２】
結果を図１９に示す。
【０５７３】
図１９から明らかなように、ＳＫ−Ｍ−ＮＣ細胞をＬＹ（アベマシクリブ）で処理しても、細胞周期の影響はなかった。ＭＫ−１７７５処置単独では、５００nMで、Ｇ２／Ｍにある細胞が増加した。両者の組み合わせにより、強力なＧ１停止が生じた。
【０５７４】
実施例２３：ウイルスＤＮＡ複製に対するＥ２Ｆ−１発現の役割
Ｉ．
ウェル当たりに２×１０５個 Ｔ２４、Ａ５４９及びＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートに播種し、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（又はＤＭＥＭ培地） １．５ml中において増殖させた。翌日、３０pmol ｓｉＲＮＡ−陰性対照ｓｉＲＮＡ（Qiagen  ＃１０２２０７６）又はｓｉＥ２Ｆ１（Sigma  ＃ＮＭ＿００５２２５、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ  ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１６２２２０）のいずれかをOpti-MEM培地 １５０μLで希釈し、リポフェクタミンRNAiMAX ９μlをOpti-MEM １５０μL中で調製した。ｓｉＲＮＡ溶液及びリポフェクタミンRNAiMAX溶液を混合し、５分間インキュベーションした。この混合物を細胞に滴加した。４８時間後、ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲを行った。
【０５７５】
結果を図２０に示す。図２０から明らかなように、Ｅ２−初期発現は低下する。
【０５７６】
ＩＩ
６ウェルプレートの各ウェルについて、２×１０５個 Ｔ２４細胞を、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ１６４０培地 １．５mlに播種した。翌日、３０pmol ｓｉＲＮＡ−陰性対照ｓｉＲＮＡ（Qiagen  ＃１０２２０７６）又はｓｉＥ２Ｆ１（Sigma  ＃ＮＭ＿００５２２５、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ  ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１６２２２０）のいずれかをOpti-MEM培地 １５０μLで希釈し、リポフェクタミンRNAiMAX ９μlをOpti-MEM １５０μL中で調製した。ｓｉＲＮＡ溶液及びリポフェクタミンRNAiMAX溶液を混合し、５分間インキュベーションした。この混合物をＴ２４細胞に滴加した。感染を、血清を含まない培地 ４００μl中で１０MOI ＡＤＷＴＲＧＤと共に細胞をインキュベーションし、１０〜１５分毎にプレートを揺り動かしながら４８時間後に行った。１時間後、完全培地 １．６mlを加えた。ＲＮＡ分離を感染後２４時間で行った。
【０５７７】
結果を図２１に示す。
【０５７８】
ＩＩＩ
細胞を冷ＰＢＳですすぎ、MirVanaキット（Thermo Fisherカタログ番号ＡＭ１５６０）からの溶解バッファー ５００μlを加えることにより破壊し、ライゼートをスパチュラで収集し、１．５mlチューブにピペットで移した。有機抽出のために、ホモジネート添加物 ５０μlを加え、サンプルを氷上で１０分間インキュベーションし、酸−フェノール：クロロホルム ５００μlを加え、サンプルを６０秒間ボルテックスし、氷上で２分間インキュベーションした。サンプルを１４０００×ｇ、室温で５分間遠心分離して、水相と有機相とに分離した。上相を注意深く新たなチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えた。室温で１０分間インキュベーションした後、ＲＮＡを沈殿させ（１４０００×ｇ、４℃、３０分）、７５％ エタノール １mLで２回洗浄した（遠心分離  ７５００×ｇ、４℃、５分）。ＲＮＡを５〜１０分間風乾させ、ＲＮａｓｅを含まない水 ２０〜５０μlに再懸濁させ、５００rpm、５５℃で１０分間振とうすることにより溶解させ、Nanodropで測定した。ＤＮＡ消化（デオキシリボヌクレアーゼＩ、Invitrogen  Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０６８−０１５）後、１μg ＲＮＡサンプルを１０×ＤＮＡｓｅ  Ｉ反応バッファー １μl、ヌクレアーゼを含まない水、ＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／μl） １μlと合わせて、９μlの容量にし、室温で１５分間インキュベーションした。２５mM ＥＤＴＡ溶液 １μlを加え、６５℃で１０分間加熱することにより、ＤＮＡｓｅ  Ｉを不活性化する。逆転写を、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Thermo Fisher／Applied Biosystems（商標）カタログ番号：４３６８８１４）を使用して行った。線維及びアクチンＰＣＲの転写にはランダムヘキサマーを使用し、Ｅ２初期ＰＣＲの転写にはＥ２初期プライマーを使用する。
【０５７９】
使用されたプライマー及びｓｉＲＮＡ
Ｅ２初期ｆｗ:CCGTCATCTCTACAGCCCAT
Ｅ２初期ｒｅｖ：GGGCTTTGTCAGAGTCTTGC
繊維ｆｗ：AAGCTAGCCCTGCAAACATCA
繊維ｒｅｖ：CCCAAGCTACCAGTGGCAGTA
アクチンｆｗ：TCACCCACACTGTGCCCATCTACG
アクチンｒｅｖ：CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG
Ｅ２Ｆ１ｆｗ：CATCCCAGGAGGTCACTTCTG
Ｅ２Ｆ１ｒｅｖ：GACAACAGCGGTTCTTGCTC
対照ｓｉＲＮＡ
センス：UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT
アンチセンス：ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT
Ｅ２Ｆ−１  ｓｉＲＮＡ
CUGAGGAGUUCAUCAGCCU[dT][dT]
AGGCUGAUGAACUCCUCAG[dT][dT]
【０５８０】
ＲＴ−ｑＰＣＲによりＥ２初期発現の役割を証明するために、適切なプライマーを選択することが絶対的に必要である。プライマーの位置は、Ｅ２初期プロモーターとＥ２後期プロモーターの間にあるはずである。そうでなければ、Ｅ２後期プロモーターが、結果に強く影響することになるであろう。プライマーの位置を図２２に示す。
【０５８１】
図２０及び２１から明らかなように、ｓｉＲＮＡによるＥ２Ｆ１のダウンレギュレーションにより、Ｅ２−初期発現が増加する。これは、Ｅ２初期発現におけるＥ２Ｆ１のリプレッシブな役割によってのみ説明することができた。Ｅ２Ｆ−１が活性化因子であるとすれば、結果として、Ｅ２初期発現が低下するであろう。加えて、Ｅ２Ｆ−１に対するｓｉＲＮＡは、ＣＤＫ４／６阻害剤の効果を模倣し、これによっても、Ｅ２Ｆ−１発現が阻害される（Yang C et al., Oncogene 2017, 36,2255-2264）。
【０５８２】
実施例２４：アデノウイルスＥ２初期プロモーターにおける２つのＥ２Ｆ結合部位の突然変異を有するリコンビナントアデノウイルスはＥ２初期発現の増加を示す
アデノウイルスＥ２初期プロモーターの２つのＥ２Ｆ結合部位に突然変異を有する突然変異アデノウイルスを生成した。野生型Ｅ２初期プロモーターと変異型Ｅ２初期プロモーターとの両方のプロモーターを図２３に示す。
【０５８３】
ＲＮＡ−発現分析をＡｄＷＴ−ＲＧＤ及びＡｄＥ２Ｆｍ（ＲＧＤモチーフも含む）感染Ｔ２４細胞において行い、感染後２４時間でのＲＴ−ｑＰＣＲにより得た。ＡＤ−ＷＴ遺伝子発現を１００％に設定した。この方法は、実施例２３のセクションＩＩＩに記載された方法と同一であった。
【０５８４】
結果を図２４に示す。
【０５８５】
図２４から明らかなように、Ｅ２初期遺伝子発現の発現は、ＡＤ−ＷＴ感染細胞と比較して、ＡｄＥ２Ｆｍ感染細胞においてより高かった。したがって、Ｅ２Ｆ−１は、Ｅ２初期プロモーター活性化においてリプレッシブな役割を果たしていると結論しなければならない。これは、Ｅ２Ｆ−１が活性化因子であると仮定される現在の理解とは明らかに対照的である（DeCaprio JA, Virology. 2009 Feb 20;384(2):274-84）。
【０５８６】
現在公知の全ての腫瘍溶解性アデノウイルスにおけるＥ２領域の構造は、図２２に示されたように構築されることは周知である。このため、Ｅ２Ｆ−１の作用機序は、ここで記載されたものと同一である。結果として、それらの全て、すなわち、全ての腫瘍溶解性アデノウイルス（ＣｏｌｏＡｄ１及びデルタ２４−ＲＧＤを含む）を、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【０５８７】
ＣｏｌｏＡｄ１は、以下のように特徴付けることができる。
【０５８８】
Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（以前はＣｏｌｏＡｄ１）は、前臨床活性が実証された腫瘍選択的キメラアデノウイルスである。ＣｏｌｏＡｄ１のカプシドは、ヒトにおける血清有病率が限られている血清型であるＡｄ１１ｐ由来である。ＥｎＡｄは、多くのがん細胞に広く発現しているＣＤ４６及び／又はデスモグレイン２，６の両方に結合することにより細胞に感染する。ＥｎＡｄゲノムのほとんどは、Ｅ３に大きな欠失があり、Ｅ４により小さな欠失があるＡｄ１１ｐに由来する。加えて、Ｅ２Ｂ領域は、Ａｄ１１ｐ及びＡｄ３からの配列のキメラからなる。ＥｎＡｄにおけるＥ４欠失は、Ｅ４ＯＲＦ４にあり、Ａｄ５は、タンパク質ホスファターゼ２Ａを不活性化するタンパク質をコードし、それにより、タンパク質翻訳機構を活性化すると共に、フィードバック阻害ループにおけるＥ１Ａタンパク質の活性をレギュレーションする。これらの欠失は、おそらく、キメラＥ２Ｂ領域と組み合わせられて、おそらく、ＥｎＡｄの顕著ながん選択的複製に寄与する（Deyer et al., Mol Ther Oncolytics. 2017, 16; 5: 62-74）。
【０５８９】
デルタ２４−ＲＧＤ（ＤＮＸ−２４０１）は、以下のように特徴付けることができる。
【０５９０】
デルタ２４−ＲＧＤ（ＤＮＸ−２４０１）は、ｐ１６／ＲＢ／Ｅ２Ｆ経路の異常を有する腫瘍細胞において優先的に複製し、溶解するように操作された条件複製可能な腫瘍溶解性ウイルスである。Fueyo et al., Oncogene. 2000 Jan 6;19(1):2-12。Ｒｂ経路をターゲットとする突然変異腫瘍溶解性アデノウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗神経膠腫効果を生じる。Dai B. et al. Mol Cancer Therapy. 2017 Apr;16(4):662-670。
【０５９１】
先の明細書、特許請求の範囲及び図面に開示された本発明の特徴は、個々にかつ任意の組み合わせの両方で、その種々の実施態様における本発明の実現にとって重要であることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021517119.tif 000041
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