(57)【要約】  本発明は、ブテイン（ＢＴＮ）ならびにスルフレチン（ＳＬＦ）および／またはイソリキリチゲニン（ＩＬＱ）、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を含む医薬組成物に関する関する。本発明はさらに、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害、例えば、前糖尿病および／もしくはグルコース調節の食事誘導性障害の治療における前記組成物の使用、ならびに前記治療のためのスルフレチン（ＳＬＦ）またはイソリキリチゲニン（ＩＬＱ）を単独で含む組成物の使用に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＢＴＮ）、ならびに
スルフレチンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＳＬＦ）、および／または
イソリキリチゲニンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ＢＴＮおよびＳＬＦを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＢＴＮおよびＩＬＱを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＳＬＦ：ＢＴＮの比が約０．４：１〜約５：１の重量比である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＩＬＱ：ＢＴＮの比が約０．４：１〜約３：１の重量比である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＢＴＮ、ＳＬＦおよび／またはＩＬＱがダリア植物の抽出物として提供される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抽出物が前記ダリア植物の少なくとも花弁の抽出物である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ダリア植物が、エタノールを含む抽出剤を用いて抽出されたものである、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害の治療において使用するための医薬組成物であって、
ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＢＴＮ）、ならびに
スルフレチンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＳＬＦ）、および／または
イソリキリチゲニンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）
を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量の医薬組成物を投与することを含み、前記医薬組成物が、
ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＢＴＮ）、ならびに
スルフレチンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＳＬＦ）、および／または
イソリキリチゲニンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）
を含む、方法。
【請求項１２】
糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療するための医薬の調製における、
ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＢＴＮ）、ならびに
スルフレチンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＳＬＦ）、および／または
イソリキリチゲニンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）
の使用。
【請求項１３】
ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＢＴＮ）、ならびに
スルフレチンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＳＬＦ）、および／または
イソリキリチゲニンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）
を含む、抗糖尿病剤。
【請求項１４】
前記医薬組成物、医薬および／または剤が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物である、請求項１０に記載の医薬組成物、請求項１１に記載の方法、請求項１２に記載の使用、または請求項１３に記載の抗糖尿病剤。
【請求項１５】
糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のイソリキリチゲニンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療するための医薬の調製における、イソリキリチゲニンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体の使用。
【請求項１７】
糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害の治療において使用するための医薬組成物であって、イソリキリチゲニンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
イソリキリチゲニンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を含む、抗糖尿病剤。
【請求項１９】
２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のスルフレチンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害を治療するための医薬の調製における、スルフレチンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体の使用。
【請求項２１】
２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害の治療において使用するための医薬組成物であって、スルフレチンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
スルフレチンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を含む、抗２型糖尿病および／または前糖尿病剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病および関連する疾患、状態および／または障害を治療するために使用され得るフラボノイドの組合せ、ならびにフラボノイドを使用する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコース代謝は、身体中でグルコースを貯蔵し、放出し、産生しおよび加工する様々な生物学的プロセスを伴う。正常なグルコース代謝の鍵となる特徴は、血液中のグルコースの高度に調節された濃度である。グルコースホメオスタシスに関与する主なホルモンはグルカゴンおよびインスリンである。グルカゴンはα細胞により分泌され、β細胞はプロインスリンを分泌し、プロインスリンは後にインスリンに変換される。インスリン産生はより高い濃度の血中グルコースに応答して増加し、より低い血中グルコースレベルへの複数の経路を誘発する。グルカゴンはインスリンと反対の活性を有する。グルコース代謝に関与する他のホルモンとしては、アミリンおよびインクレチンホルモン、例えばグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）が挙げられる。
【０００３】
糖尿病は、グルコース代謝に関与する正常な生物学的プロセスに障害がある場合に結果として生じる疾患である。疾患の古典的な原因は、不充分なインスリン産生、または産生されるインスリンに身体が充分に応答しないことのいずれかである。疾患の多くの形態があり、３つの主な種類は１型、２型および妊娠糖尿病である。
【０００４】
１型糖尿病は、患者が膵臓中で充分なインスリンを産生できないことにより特徴付けられる。１型糖尿病の発症は、通常、小児期においてである。
【０００５】
２型糖尿病は、インスリン抵抗性の期間により開始し、該期間では、インスリンの機能は血糖に応答して低減する。疾患が進行するにつれて、産生されるインスリンの量が減少することもある。前糖尿病は、正常なグルコース代謝と２型糖尿病との間の異常に上昇したグルコースレベルの状態を記載するために使用される用語である。世界中で７．５億人を超える人々が前糖尿病を有し、例えば、ニュージーランドの成人集団の２５％が前糖尿病であると推定される。前糖尿病から２型糖尿病への進行率は１年当たり約１０％、生涯にわたり７０％である。疾患が疑われる患者において、２型糖尿病は生活様式の要因、例えば、過度の糖消費および運動不足と関連する。
【０００６】
妊娠糖尿病は、妊娠の間の女性において現れる疾患の形態である。
【０００７】
１９８０年以来、世界中で２型糖尿病を患う人々の数は４倍に増加し、２０３０年に５．５２億人の推定数までさらに上昇することが予測される。ＩＤＦ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｏｄｅｌは、糖尿病を有する人の総数は４．１５億（２０１５年）から６．４２億（２０４０年）に増加して、世界中で８０２０億ドルの総年間コストを結果としてもたらすことを予測している。世界の医療費の１２パーセントは糖尿病治療に費やされ、２０４０年までに１０人の成人中１人がこの疾患を患うと予測される。この莫大な経済的負担に加えて、管理不良の糖尿病は重篤な合併症およびより短い平均余命に繋がる。現在、２型糖尿病の治療のために利用可能ないくつかの薬物があり、それらのほとんどは血中グルコースレベルを低下させるのに効果的であるが、それらは部分的に、低血糖症、体重増加および心不全のリスク増加などの副作用を有する。
【０００８】
したがって、糖尿病ならびに前糖尿病および／またはグルコース調節における食事誘導性障害といった関連する疾患、状態および／または障害のための新たな療法を開発する継続的な必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＢＴＮ）と、スルフレチンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＳＬＦ）ならびに／またはイソリキリチゲニンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）のいずれかまたは両方との組合せを用いる治療は、食事誘導性の障害といったグルコース調節における障害の効果を逆転させ得ることを見出した。これらの組合せを用いる治療は、したがって、糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害の治療において有用であり得る。
【００１０】
一態様では、本発明は、ＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱを含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、ＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せはダリア（Ｄａｈｌｉａ）植物の抽出物として提供される。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療するための医薬の調製におけるＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱの使用を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害の治療において使用するための医薬組成物であって、ＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱを含む、医薬組成物を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、ＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱを含む抗糖尿病剤を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＩＬＱを投与することを含む、方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療するための医薬の調製におけるＩＬＱの使用を提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害の治療において使用するための医薬組成物であって、ＩＬＱを含む、医薬組成物を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ＩＬＱを含む抗糖尿病剤を提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＳＬＦを投与することを含む、方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害を治療するための医薬の調製におけるＳＬＦの使用を提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害の治療において使用するための医薬組成物であって、ＳＬＦを含む、医薬組成物を提供する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、ＳＬＦを含む抗２型糖尿病および／または前糖尿病剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本発明は、添付の図面を参照して、例示に過ぎない実施例によりさらに記載される。
【図１】図１Ａ〜Ｅは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）または（３）４週間の高脂肪食ならびにその後のブテイン（Ａ）、イソリキリチゲニン（Ｂ）、スルフレチン（Ｃ）、１：１：１のブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニンの混合物（Ｄ）およびダリア花弁の抽出物（Ｅ）を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける腹腔内耐糖能試験（ｉｐＧＴＴ）の結果のグラフを示す。図１Ｆは、図１Ａ〜Ｅに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフを示す。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）または（３）４週間の高脂肪食ならびにその後のブテイン（Ａ）、１：１のブテインおよびイソリキリチゲニンの組合せ（Ｂ）、１：１のブテインおよびスルフレチンの組合せ（Ｃ）および１：１：１のブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニンの混合物（Ｄ）を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｐＧＴＴの結果のグラフを示す。図２Ｅは、図２Ａ〜Ｄに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフを示す。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）または（３）４週間の高脂肪食ならびにその後のイソリキリチゲニン（Ａ）、スルフレチン（Ｓ）、１：１のイソリキリチゲニンおよびスルフレチンの組合せ（Ｃ）および１：１：１のブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニンの混合物（Ｄ）を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｐＧＴＴの結果のグラフを示す。図３Ｅは、図３Ａ〜Ｄに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフを示す。
【図４】図４Ａ〜Ｅは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）または（３）４週間の高脂肪食ならびにその後ｉｐＧＴＴの１時間前に経口胃管栄養法により異なる濃度（２０ｍｇ／ｋｇ（Ａ）、１０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ）、３．３ｍｇ／ｋｇ（Ｃ）、１ｍｇ／ｋｇ（Ｄ）または０．３３ｍｇ／ｋｇ（Ｅ）体重）において１：１：１のブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニンのミックスの混合物を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｐＧＴＴの結果のグラフを示す。図４Ｆは、図４Ａ〜Ｅに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｅは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）または（３）４週間の高脂肪食ならびにその後ｉｐＧＴＴの１時間前に経口胃管栄養法により異なる濃度（５０ｍｇ／ｋｇ（Ａ）、２０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ）、１０ｍｇ／ｋｇ（Ｃ）、３．３ｍｇ／ｋｇ（Ｄ）または１ｍｇ／ｋｇ（Ｅ）体重）においてブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニンを含むダリア植物の抽出物を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｐＧＴＴの結果のグラフを示す。図５Ｆは、図５Ａ〜Ｅに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフを示す。
【図６】図６Ａ〜Ｅは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）または（３）４週間の高脂肪食ならびに最後の７日間の１２時間毎に１日２回３００ｍｇ／ｋｇ／ｄ（Ａ）、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ（Ｂ）、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ（Ｃ）、２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ（Ｄ）および１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ（Ｅ）において経口投与したメトホルミン（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈、ｐＨ７．７）を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｐＧＴＴの結果のグラフを示す。図６Ｆは、図６Ａ〜Ｅに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフ（Ｆ）を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）；（３）４週間の高脂肪食および最後の７日間のメトホルミン（１２時間毎に１日２回経口的に１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ；Ａ）；（４）４週間の高脂肪食ならびにｉｐＧＴＴの１時間前の１：１：１のブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニンの混合物（ミックス；０．３３ｍｇ／ｋｇ；Ｂ）の投与；または（５）４週間の高脂肪食ならびに最後の７日間投与したメトホルミン（１２時間毎に１日２回経口的に１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）およびｉｐＧＴＴの１時間前のミックス（０．３３ｍｇ／ｋｇ；Ｃ）の投与を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｐＧＴＴ試験の結果のグラフを示す。図７Ｄは、図７Ａ〜Ｃに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフを示す。
【図８】図８Ａ〜Ｅは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）または（３）４週間の高脂肪食ならびに１０００μｇ／ｋｇ／ｄ（Ａ）、２００μｇ／ｋｇ／ｄ（Ｂ）、４０μｇ／ｋｇ／ｄ（Ｃ）、８μｇ／ｋｇ／ｄ（Ｄ）および１．６μｇ／ｋｇ／ｄ（Ｅ）のプラムリンチド（処置の最後の５日間の１２時間毎に１日２回の皮下注射）を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｐＧＴＴの結果のグラフを示す。図８Ｆは、図８Ａ〜Ｅに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフを示す。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、（１）４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）；（２）４週間の低脂肪食（ＬＦＤ）；（３）４週間の高脂肪食および最後の５日間のプラムリンチド（２００μｇ／ｋｇ／ｄ、皮下；１日２回；１２時間毎；Ａ）を用いた処置；（４）４週間の高脂肪食ならびにｉｐＧＴＴの１時間前の１：１：１のブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニンの混合物（ミックス；０．３３ｍｇ／ｋｇ；Ｂ）の投与；または（５）４週間の高脂肪食ならびに最後の５日間皮下に投与したプラムリンチド（２００μｇ／ｋｇ／ｄ；１日２回；１２時間毎）およびｉｐＧＴＴの１時間前のミックス（０．３３ｍｇ／ｋｇ；Ｃ）の経口投与を用いた処置を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｐＧＴＴ試験の結果のグラフを示す。図９Ｄは、図９Ａ〜Ｃに示すｉｐＧＴＴの結果についての曲線下面積を比較した棒グラフ（Ｄ）を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｆは、４週間ＨＦＤを給餌し、かつ経心腔的灌流の１時間前に活性成分（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（生理食塩水中の５％のＥｔＯＨ（ビヒクル単独）、もしくはビヒクルおよびインスリン）を経口投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫組織化学染色した脳切片の画像を示す。図１０Ａは、ビヒクル単独で処置したＬＦＤ給餌マウスの脳切片の画像を示し、図１０Ｂは、インスリンおよびビヒクルで処置したＬＦＤ給餌マウスの脳切片の画像を示し、図１０Ｃは、ビヒクル単独で処置したＨＦＤ給餌マウスの脳切片の画像を示し、図１０Ｄは、インスリンおよびビヒクルで処置したＨＦＤ給餌マウスの脳切片の画像を示し、図１０Ｅは、インスリンならびに１：１：１の重量のブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニンの組合せで処置したＨＦＤ給餌マウスの脳切片の画像を示し、図１０Ｆは、インスリンおよびダリア植物の抽出物で処置したＨＦＤ給餌マウスの脳切片の画像を示す。弓状核（ＡＲＣ）（囲った区画）内のリン酸化プロテインキナーゼＢ（ｐＡＫＴ）免疫応答性細胞の総数を各動物について３つの領域マッチの区画において計数した。
【図１１】図１１は、図１０の脳切片画像についてＡＲＣ（囲った区画）内のｐＡＫＴ免疫応答性細胞の数の棒グラフを示す。
【図１２】図１２ａ〜ｃは、（ａ、ｂ）実施例１の実験１１に記載するインスリン負荷試験からのグルコース濃度対時間のグラフならびに（ｃ）図１２ａおよび図１２ｂに示すグルコース濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）のグラフを示す。
【図１３】図１３は、（Ａ）実施例１の実験１２のマウス対象についての経時的な体重のグラフ；（Ｂ）図１３Ａに示す体重データについてのＡＵＣ；（Ｃ）実施例１の実験１２から得られた経時的な血漿グルコース濃度のグラフ；および（Ｄ）図１３Ｃに示す体重データについてのＡＵＣを示す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｄは、（Ａ〜Ｃ）（Ａ）ＬＦＤ、（Ｂ）ＨＦＤまたは（Ｃ）ＨＦＤおよび抽出物を用いた処置を与えたマウスから得られたグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫応答性細胞の画像；ならびに（Ｄ）実施例１の実験１３からの画像からのＡＲＣ（囲った区画）内の細胞数のチャートを示す。
【図１５】図１５は、（Ａ）実施例１の実験１４にしたがって調製したＨ＆ＥまたはＯＲＯ染色細胞の画像；（Ｂ）図１５Ａに示すデータからの各対象群についてのＯＲＯ染色細胞の割合のグラフ；および（Ｃ）実施例１の実験１４にしたがって得られたマウス対象の肝臓重量を示す。
【図１６】図１６は、経時的なｐＨ７の水性緩衝液中のブテインの溶液のＲＰＬＣ分析のグラフを示す。このグラフはブテインのスルフレチンへの変換を示す。
【図１７】図１７は、市販のＥＬＩＳＡにより測定した４週間のＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかでのマウスにおけるインスリンレベルを比較したグラフを示す（ｎ＝３３／群）。
【図１８】図１８は、アスター（Ａｓｔｅｒ）頭状花の部分の図解を示す。
【図１９】図１９Ａ〜Ｂは、発生の異なるステージにおけるダリア頭状花の写真を示す。図１９Ａは中央が閉じたまま（閉じた中央）のダリア頭状花を示し、図１９Ｂは満開（開いた中央）のダリア頭状花を示す。
【図２０】図２０は、異なる成熟ステージの新鮮なダリアの花の花弁から単離された主な化合物の量のグラフを示す（Ｇ１＝ブテイングリコシド、Ｇ２＝イソリキリチゲニングリコシド、Ｓ＝スルフレチン、Ｂ＝ブテイン、Ｉ＝イソリキリチゲニン）。
【図２１】図２１は、経口耐糖能試験の間の実施例５の平均化したグルコース濃度の結果のグラフを示す。
【図２２】図２２は、図２１に示す実施例５のグルコース濃度の結果から決定した曲線下面積（ＡＵＣ）のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、当然ながら変化し得る、医薬組成物、その使用または製造もしくは治療の方法などの特に例示される実施形態に限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される学術用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためのものに過ぎず、限定的であることは意図されないことも理解されるべきである。
【００２６】
上掲のものであれ下記のものであれ、本明細書において参照される全ての刊行物、特許および特許出願は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書において言及される刊行物は、刊行物において報告されかつ本発明と組み合わせて使用され得るプロトコールおよび試薬を記載および開示する目的のために参照される。本明細書におけるいずれの記載も、本発明が先行発明を理由としてそのような開示より早いという権利を有しないと認めるものと解されるべきではない。
【００２７】
本明細書において特許明細書、他の外部の文献、または他の情報源を参照する場合、これは、概して、本発明の特徴を議論するための文脈を提供する目的のためである。他に特に記載しなければ、そのような外部の文献への参照は、そのような文献、またはそのような情報源が、いかなる権限においても、先行技術であること、または当該技術分野における技術常識の部分を形成することを認めるものと解されるべきではない。
【００２８】
「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される形態の少なくとも１つの活性成分を含む組成物に関する。「医薬組成物」という用語は、機能性食品製品（例えば、健康上の利益を提供するサプリメント）として販売されることが意図される組成物を包含し得る。一部の実施形態では、医薬組成物は機能性食品組成物である。
【００２９】
「薬学的に許容される」は、成分が、医薬組成物中に含まれる他の成分と適合性であり、かつ投与時または投与後の有害な効果の回避および任意の規制上の考慮に基づいて対象への投与のために好適であることを意味する。
【００３０】
「投与する」という用語は、治療すべき疾患（複数可）および／または状態（複数可）を患うまたはそのリスクがある対象に医薬組成物を提供することを指す。
【００３１】
「有効量」は、対象に投与される場合に、薬物の量が効果を達成するために提供される充分な量を意味する。治療方法の場合、この効果は、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害の治療であってもよい。したがって、「有効量」は「治療有効量」であってもよい。「治療有効量」は、対象に投与される場合に、活性成分の量が疾患または疾患の症状を治療するために提供される充分な量を意味する。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「糖尿病」という用語は、インスリン抵抗性および秩序が崩れたグルコース代謝により特徴付けられる疾患に関し、多くの場合、脂質異常症、炎症、網膜症、ニューロパチー、腎症、大血管疾患および認知障害といった合併症が付随する。糖尿病としては、１型、２型および妊娠糖尿病ならびにその症状および／または合併症が挙げられる。１型および２型糖尿病は、典型的にはベータ細胞機能の喪失により特徴付けられる。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「治療すること」、「治療」、「治療する」などの用語は、対象（例えば、患者）、組織または細胞に影響を与えて、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患もしくは関連症状を完全もしくは部分的に予防し、もしくはその重篤度を低減させるという点で予防的であってもよく、かつ／または疾患の部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であってもよい。例えば、糖尿病を「治療すること」への言及は、したがって、（ａ）疾患の進行を停止させる、例えば、症状もしくは合併症の経時的な悪化を予防すること；（ｂ）糖尿病の効果を緩和もしくは改善すること、すなわち、糖尿病の少なくとも１つの症状もしくは合併症の改善を引き起こすこと；（ｃ）糖尿病の追加の症状もしくは合併症の発生を予防すること；（ｄ）糖尿病もしくは糖尿病と関連する症状もしくは合併症が前糖尿病もしくはインスリン抵抗性を有する対象において起こることを予防すること；および／または（ｅ）疾患を発症するリスクの増加を予防すること、例えば、グルコース投与後の血中グルコースレベルを低減することなどにより、糖尿病のリスク因子の増加を予防することを包含する。
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を規定しなければ、複数の指示対象を含むことが留意されるべきである。
【００３５】
したがって、例えば、「賦形剤」（ａｎ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）への言及は、１つまたは複数の賦形剤を含んでもよい、などの意味を含むのである。別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を、本発明を実施または試験するために使用することができるが、好ましい材料および方法がこれより記載される。
【００３６】
名詞の後の「（複数可）」という用語は、単数形または複数形、または両方を想定する。
【００３７】
「および／または」という用語は、「および」または「または」を意味することができる。
【００３８】
他に文脈が必要としなければ、本明細書において言及される全てのパーセンテージは、医薬組成物の重量によるパーセンテージである。
【００３９】
他に文脈が必要としなければ、本明細書において言及される全ての量は、医薬組成物の重量による量であることが意図される。
【００４０】
本発明の様々な特徴が、ある特定の値、または値の範囲を参照して記載される。これらの値は、様々な適切な測定技術の結果に関することが意図され、したがって、任意の特定の測定技術に本来備わっている誤差の余地を含むものとして解釈されるべきである。本明細書において言及される値の一部は、このばらつきを少なくとも部分的に説明するために「約」という用語により表される。「約」という用語は、値を記載するために使用される場合、その値の±２５％、±１０％、±５％、±１％または±０．１％以内の量を意味することができる。
【００４１】
本明細書において使用される「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語は、「少なくとも部分的にからなる」を意味する。その用語を含む本明細書中の記載を解釈する場合、各記載においてその用語により先行される特徴は全て存在する必要があるが、他の特徴もまた存在することができる。「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）および「含まれる」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）などの関連する用語は同じ方式で解釈されるべきである。
【００４２】
医薬組成物
医薬組成物は、ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＢＴＮ）と、スルフレチンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＳＬＦ）ならびに／またはイソリキリチゲニンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）のいずれかまたは両方との組合せを含む。したがって、医薬組成物は、ＢＴＮおよびＳＬＦ、ＢＴＮおよびＩＬＱ、またはＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱを含んでもよい。
【００４３】
本発明者らは、驚くべきことに、ＢＴＮおよびＳＬＦ、ＢＴＮおよびＩＬＱ、またはＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せを含む医薬組成物はグルコース調節の障害を治療できることを見出した。ＢＴＮの非存在下のＳＬＦとＩＬＱとの組合せは同じ有効性を有しないこともまた驚くべきことであった。
【００４４】
ブテインおよびイソリキリチゲニンはカルコンである。スルフレチンはオーロンであり、一部の条件下においてブテインの環化生成物である（実施例２を参照）。ブテイン、イソリキリチゲニンおよびスルフレチンは、植物の抽出物中に存在するものとして記載されてきた。ブテイン、イソリキリチゲニンおよびスルフレチンの構造を表１に示す。
【表１】
2021504340.tif 000002
【００４５】
本発明者らは、グルコース調節の食事誘導性障害の治療としてのＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せを研究した。驚くべきことに、本発明者らは、これらの化合物の組合せの一部のみがグルコース調節の食事誘導性障害に対して有効性を示すことを見出した。ＢＴＮを含まないＩＬＱとＳＬＦとの組合せはこの治療において有効性を欠いていることが見出された。驚くべきことに、これらの活性の組合せはまた、食事のみに誘導されるものではない場合でさえ、グルコース調節の障害に対して有効性を示す。したがって、ＢＴＮおよびＩＬＱ、ＢＴＮおよびＳＬＦ、ならびにＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せが糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害の治療において有効性を有することは驚くべきことである。
【００４６】
一部の実施形態では、ＳＬＦおよび／またはＩＬＱの相対量は、医薬組成物中に存在するＢＴＮの量より多いまたはそれに等しくてもよい。ＳＬＦの量は、医薬組成物中に存在するＢＴＮの量の１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３倍またはより多くの倍数であってもよい。ＩＬＱの量は、医薬組成物中に存在するＢＴＮの量の１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２倍であってもよい。ＳＬＦおよびＩＬＱを合わせた量は、医薬組成物中に存在するＢＴＮの量の１、１．０５または１．１であってもよい。
【００４７】
一部の実施形態では、ＳＬＦまたはＩＬＱの相対量は、医薬組成物中に存在するＢＴＮの量より少なくてもよい。ＳＬＦの量は、医薬組成物中に存在するＢＴＮの量の０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９倍であってもよい。ＢＴＮの量は、医薬組成物中に存在するＳＬＦの量の１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８倍またはより多くの倍数であってもよい。ＩＬＱの量は、医薬組成物中に存在するＢＴＮの量の０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９倍であってもよい。ＢＴＮの量は、医薬組成物中に存在するＩＬＱの量の１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７倍またはより多くの倍数であってもよい。
【００４８】
ＳＬＦ対ＢＴＮの重量比は、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１  ０．８：１、０．９：１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１または５：１であってもよい。ＳＬＦ対ＢＴＮの重量比は、これらの重量比のいずれかの間であってもよく、例えば、ＳＬＦ対ＢＴＮの重量比は、１：１〜５：１、１：１〜２．５：１または１．５：１〜２．５：１であってもよい。重量比は、代替的に、単一の数値として表されてもよく、該数値は、ＳＬＦの量をＢＴＮの量で割ることにより算出されてもよい。このようにして表されるＳＬＦ対ＢＴＮの量は、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８．  ０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５またはより大きくてもよい。この文脈においてより大きい重量比は、医薬組成物中に存在するＢＴＮと比較してより多い量のＳＬＦを意味する。
【００４９】
ＩＬＱ対ＢＴＮの重量比は、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、または２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１または３：１であってもよい。ＩＬＱ対ＢＴＮの重量比は、これらの重量比のいずれかの間であってもよく、例えば、ＩＬＱ対ＢＴＮの重量比は、１：１〜３：１、１：１〜１．８：１、０．５：１〜０．８：１または１．２：１〜１．８：１であってもよい。重量比は、代替的に、単一の数値として表されてもよく、該数値は、ＩＬＱの量をＢＴＮの量で割ることにより算出されてもよい。このようにして表されるＩＬＱ対ＢＴＮの量は、０．４、０．５、０．６、０．８．  ０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３またはより大きくてもよい。この文脈において、より大きい重量比は、ＢＴＮと比較してより多い量のＩＬＱを意味する。
【００５０】
ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せを含む実施形態では、ＳＬＦ：ＩＬＱ：ＢＴＮの比は、ＳＬＦ：ＢＴＮおよびＩＬＱ：ＢＴＮの上記の比の任意の組合せに基づいて決定されてもよく、例えば、ＳＬＦ：ＢＴＮ：ＩＬＱの比は、１：１：１、１：１．８：１．１、１：１．８：１、１：２：１、１：２：１．１、１．１：１．８：１、５：３：１、２．５：２：１、２．５：１．４：１、２：２：１、１．４：１：１．１、２：１：１．６または２：１．４：１であってもよい。ＳＬＦ：ＩＬＱ：ＢＴＮの比は、これらの重量比のいずれかの間であってもよく、例えば、ＢＴＮ：ＳＬＦ：ＩＬＱの重量比は、１：１：１〜５：３：１、１：１：１〜２．５：２：１、１：１：１〜２：１：１、１：１：１〜１：２：１、１：１：１〜１：１．５：１、１：１：１〜２：１．４：１、１：１：１〜２：１：１．６または１．１：１．１：１〜５：３：１であってもよい。
【００５１】
ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せを含む医薬組成物の一部の実施形態では、ＢＴＮの量は、医薬組成物中に存在するＳＬＦまたはＩＬＱの量より多いまたはそれに等しい。これらの実施形態では、ＢＴＮ：ＳＬＦの比は、約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１またはより大きくてもよい。ＢＴＮ：ＳＬＦの比は、これらの比のいずれかからこれらの比のいずれか他のものまでであってもよく、例えば、約１．１：１〜約５：１または約１．５：１〜約２：１であってもよい。これらの実施形態では、ＢＴＮ：ＩＬＱの比は、約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１またはより大きくてもよい。ＢＴＮ：ＩＬＱの比は、これらの比のいずれかからこれらの比のいずれか他のものまでであってもよく、例えば、約１．１：１〜約５：１または約１．８：１〜約２．５：１であってもよい。
【００５２】
一部の実施形態では、ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せを含む医薬組成物において、ＳＬＦの量は、医薬組成物中に存在するＩＬＱの量より多いまたはそれに等しい。ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せを含む医薬組成物の他の実施形態では、ＩＬＱの量は、医薬組成物中に存在するＳＬＦの量より多いまたはそれに等しい。ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱを含む医薬組成物の一部の実施形態では、ＳＬＦおよびＩＬＱの量は均衡が取られており、例えば、組成物の総重量に基づいて互いに約５％または１０％以内である。ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せを含む実施形態では、ＳＬＦ：ＩＬＱの重量比は、約０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１または５：１であってもよい。ＳＬＦ：ＩＬＱの比は、これらの重量比のいずれかの間であってもよく、例えば、ＳＬＦ：ＩＬＱの重量比は、０．５：１〜５：１、０．６：１〜約３：１または０．８：１〜１：１であってもよい。重量比は、代替的に、単一の数値として表されてもよく、該数値は、ＳＬＦの量をＩＬＱの量で割ることにより算出されてもよい。このようにして表されるＳＬＦ対ＩＬＱの量は、０．５、０．６、０．８．  ０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３またはより大きくてもよい。この文脈において、より大きい重量比は、ＩＬＱと比較してより多い量のＳＬＦを意味する。
【００５３】
医薬組成物は、少なくとも約０．００１ｗｔ％、約０．００５ｗｔ％、約０．０１ｗｔ％  約０．０５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％、約０．１５ｗｔ％、約０．５ｗｔ％、約１ｗｔ％、約２ｗｔ％、約３ｗｔ％、約３．３ｗｔ％、約４ｗｔ％、約５ｗｔ％、約６ｗｔ％、約６．７ｗｔ％、約７ｗｔ％、約８ｗｔ％、約９ｗｔ％または約１０ｗｔ％の量でＢＴＮを含んでもよい。医薬組成物中に存在するＢＴＮの最大量は、最大で約９９．９９９ｗｔ％、約９９ｗｔ％、約９８ｗｔ％、約７０ｗｔ％、約５０ｗｔ％、約３０ｗｔ％、約２５ｗｔ％、約２０ｗｔ％、約１５ｗｔ％、約１０ｗｔ％、約５ｗｔ％、約４ｗｔ％、約３ｗｔ％または約２ｗｔ％であってもよい。医薬組成物は、これらの最小量のいずれかからこれらの最大量のいずれかまでの量でＢＴＮを含んでもよく、例えば、医薬組成物は、約０．００１ｗｔ％〜約９９ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約９９ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約９８ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約７０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約３０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約２５ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約１５ｗｔ％、約０．００１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．０１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、または約０．１ｗｔ％〜約２ｗｔ％の量でＢＴＮを含んでもよい。
【００５４】
医薬組成物は、少なくとも約０．００１ｗｔ％、約０．００５ｗｔ％、約０．０１ｗｔ％、約０．０５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％、約０．５ｗｔ％、約１ｗｔ％、約２ｗｔ％、約３ｗｔ％、約３．３ｗｔ％、約４ｗｔ％、約５ｗｔ％、約６ｗｔ％、約６．７ｗｔ％、約７ｗｔ％、約８ｗｔ％、約９ｗｔ％または約１０ｗｔ％の量でＳＬＦを含んでもよい。組成物中に存在するＳＬＦの最大量は、最大で約９９．９９９ｗｔ％、約９９ｗｔ％、約９８ｗｔ％、約７０ｗｔ％、約５０ｗｔ％、約３０ｗｔ％、約２５ｗｔ％、約２０ｗｔ％、約１５ｗｔ％、約１０ｗｔ％、約５ｗｔ％、約４ｗｔ％、約３ｗｔ％、約２ｗｔ％、約１．５ｗｔ％または約１ｗｔ％であってもよい。医薬組成物は、これらの最小量のいずれかからこれらの最大量のいずれかまでの量でＳＬＦを含んでもよく、例えば、医薬組成物は、約０．００１ｗｔ％〜約９９ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約９９ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約９８ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約７０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約３０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約２５ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約１５ｗｔ％、約０．００１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．０１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約２ｗｔ％または約０．１ｗｔ％〜約１ｗｔ％の量でＳＬＦを含んでもよい。
【００５５】
医薬組成物は、少なくとも約０．００１ｗｔ％、約０．００５ｗｔ％、約０．０１ｗｔ％  約０．０５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％、約０．５ｗｔ％、約１ｗｔ％、約２ｗｔ％、約３ｗｔ％、約３．３ｗｔ％、約４ｗｔ％、約５ｗｔ％、約６ｗｔ％、約６．７ｗｔ％、約７ｗｔ％、約８ｗｔ％、約９ｗｔ％または約１０ｗｔ％の量でＩＬＱを含んでもよい。医薬組成物中に存在するＩＬＱの最大量は、最大で約９９．９９９ｗｔ％、約９９ｗｔ％、約９８ｗｔ％、約７０ｗｔ％、約５０ｗｔ％、約３０ｗｔ％、約２５ｗｔ％、約２０ｗｔ％、約１５ｗｔ％、約１０ｗｔ％、約５ｗｔ％、約４ｗｔ％、約３ｗｔ％、約２ｗｔ％、約１．５ｗｔ％または約１ｗｔ％であってもよい。医薬組成物は、これらの最小量のいずれかからこれらの最大量のいずれかまでの量でＩＬＱを含んでもよく、例えば、医薬組成物は、約０．００１ｗｔ％〜約９９ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約９９ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約９８ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約７０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約３０ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約２５ｗｔ％、約１ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約２ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約２０ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約１５ｗｔ％、約０．００１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．０１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、約０．１ｗｔ％〜約２ｗｔ％または約０．１ｗｔ％〜約１．５ｗｔ％の量でＩＬＱを含んでもよい。
【００５６】
一部の実施形態では、医薬組成物は、任意選択的に、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。賦形剤は、担体、希釈剤、アジュバント、安定化剤または他の賦形剤、または任意のその組合せであってもよい。
【００５７】
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は安定化剤であり、例えば、液体の形態、例えば、液体投与形態または医薬組成物の最終形態への中間体として調製された液体形態である場合にＢＴＮのＳＬＦへの変換を予防することができる安定化剤である。安定化剤は、天然または非天然（例えば、合成もしくは半合成）であってもよい。好適な安定化剤としては、極性有機溶媒、例えば、ジメチルスルホキシドならびにアルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール（ｉｓｏ−およびｔｅｒｔ−プロパノールを含む）、ブタノール（ｉｓｏ−、ｓｅｃ−およびｔｅｒｔ−ブタノールを含む）；ｐＨ＜４の緩衝液（例えば、水性緩衝液、例えば、ｐＨ４もしくはそれ未満のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））；またはその組合せが挙げられる。
【００５８】
医薬組成物は、例えば、医薬配合物の技術分野において周知のものなどの技術にしたがって、従来の固体または液体ビヒクルまたは希釈剤の他に、所望の投与モードにとって適切な種類の医薬品添加物（例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、安定化剤、香料など）を用いることにより、配合されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄ．，  ２００５，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。薬学的に許容される担体は、米国薬局方／国民医薬品集（ＵＳＰ／ＮＦ）、英国薬局方（ＢＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、日本薬局方（ＪＰ）または中国薬局方（ＣｈＰ）に含まれる任意の担体であってもよい。一部の実施形態では、賦形剤は非天然（例えば、合成により製造されたもの）であってもよい。
【００５９】
医薬組成物は、任意の好適な投与経路により投与されてもよく、したがって、任意のそのような投与経路のために好適な形態で配合されてもよい。例えば、投与経路は、経口、直腸、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、経膣もしくは非経口（筋肉内、皮下、腹腔内および静脈内を含む）投与または吸入もしくは吹送による投与であってもよい。
【００６０】
医薬組成物は、単位投与形態において調製されてもよい。そのような形態において、医薬組成物は、適切な量の活性成分（複数可）を含有する単位用量にさらに分割される。単位投与形態は、包装された調製物であり得、包装は別個の量の調製物を含有し得る。調製物は、固体、例えば、小包化された錠剤、カプセル（例えば、充填カプセル）、ロゼンジ、バイアルもしくはアンプル中の粉末、または液体、例えば、溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル、もしくはそれを充填したカプセルであってもよい。また、単位投与形態は、カプセル、錠剤、カシェ剤、もしくはロゼンジ自体であり得、または包装された形態の適切な数のこれらのいずれかであり得る。
【００６１】
単位投与形態として調製された場合を含む、医薬組成物は、追加の活性成分（複数可）ありまたはなしで、従来の割合で従来の成分を含んでもよく、そのような単位投与形態は、用いられることを意図する１日当たりの投与量範囲に相応しい任意の好適な有効量の活性成分を含有してもよい。
【００６２】
本明細書に記載される医薬組成物を調製するために、薬学的に許容される担体は固体または液体のいずれかであり得る。固体形態の調製物としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、カシェ剤、坐剤、ロゼンジおよび分注可能な顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、着香剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤、または被包材料としても作用し得る１つまたは複数の物質であり得る。
【００６３】
好適な担体としては、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンなど）、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融解性ワックス、ココアバター、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、ケイ化微結晶セルロース、粉末セルロース、アルギネート、ポリデキストロース、硫酸カルシウム二水和物、リン酸水素カルシウム二水和物、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アクリレートおよびメタクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、アカシアガムなどが挙げられる。錠剤、粉末、カプセル、丸剤、カシェ剤、およびロゼンジは、経口投与のために好適な固体形態として使用され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、活性成分（複数可）および担体、例えばＭＣＣを含む。
【００６４】
液体形態の調製物としては、溶液、分散液、懸濁液、およびエマルション、例えば、水または水−プロピレングリコール溶液が挙げられる。例えば、非経口注射液調製物は、水性ポリエチレングリコール溶液中の溶液として配合され得る。液体調製物は、舌下投与を伴う実施形態のために好ましい。
【００６５】
無菌の液体形態の医薬組成物としては、無菌溶液、懸濁液、エマルション、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分（複数可）は、薬学的に許容される担体、例えば、無菌水、無菌有機溶媒または両方の混合物中に懸濁されてもよい。
【００６６】
水性溶液は、活性成分（複数可）を水中に溶解させ、所望により好適な着色剤、香料、安定化剤および濃化剤を加えることにより調製され得る。水性懸濁液は、微細に分割された活性成分（複数可）を粘性材料、例えば、天然もしくは合成ガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、または他の周知の懸濁化剤と共に水中に分散させることにより作製され得る。
【００６７】
一部の実施形態では、医薬組成物の投与は経口投与である。医薬組成物は、任意の好適な形態での経口投与のために配合されてもよい。例えば、経口投与用の医薬組成物は、以下の形態の１つまたは複数において配合されてもよい：錠剤、トローチ、粉末、顆粒、ロゼンジ、溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル、シロップ、ウェーハまたは溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル、シロップ、粉末、顆粒もしくはその組合せを充填したカプセル。典型的には、医薬組成物の好適な経口形態は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００６８】
錠剤、トローチ、丸剤、ロゼンジ、カプセルなどはまた、以下に列記されるような成分のいずれかを含有してもよい：結合剤、例えば、アカシアガム、コーンスターチもしくはゼラチン；賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、ケイ化微結晶セルロースもしくは粉末セルロース；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、アルギネート、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えば、スクロース、ラクトースもしくはサッカリンが加えられてもよく、または、着香剤、例えば、ペパーミント、冬緑油、もしくサクランボ香料。投与単位形態がカプセルである場合、それは、上記の種類の材料に加えて液体担体を含有してもよい。
【００６９】
一部の実施形態では、投与単位形態はカプセルである。カプセルを形成するために、典型的には、活性成分（複数可）を本明細書に記載される賦形剤（例えば、担体）の１つまたは複数と合わせて固体または液体配合物を得、それを次にカプセルシェル内に入れる。当該技術分野において公知の任意の好適なカプセルシェルが使用されてもよく、該カプセルシェルとしては、ハードおよびソフトカプセルシェルが挙げられる。好適なハードカプセルシェルは、ゼラチン、ＨＰＭＣ、デンプン、プルランおよび／またはポリビニルアセテート（ＰＶＡ）を含んでもよい。好適なソフトカプセルは、ポリオール（例えば、グリセリンまたはソルビトール）などの濃化剤を用いて濃化されたゼラチンを含んでもよい。上記のように、カプセルシェルは、本明細書に記載される以下の投与形態のいずれかを用いて充填されてもよい：溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル、シロップ、粉末、顆粒またはその組合せ。カプセルが固体投与形態を用いて充填される場合、それは、充填の前に乾燥されてもよい。一部の実施形態では、固体投与形態は、カプセルシェルの充填前にフリーズドライされる。代替的に、液体賦形剤をそれがなければ乾燥した固体投与形態に加えて、湿った投与形態、例えば、顆粒、溶液、懸濁液、エマルション、エリキシルまたはシロップを提供してもよい。
【００７０】
様々な他の材料が、コーティングとしてまたはそれ以外に投与単位の物理的形態を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、シェラック、糖または両方を用いてコーティングされてもよい。シロップまたはエリキシルは、活性成分（複数可）、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、サクランボまたはオレンジ香料などの色素および香料を含有してもよい。当然、任意の投与単位形態の調製において使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、かつ用いられる量において実質的に非毒性であるべきである。加えて、活性成分（複数可）は、腸の特定の領域への活性成分（複数可）の特異的な送達を可能とするものといった、持続放出調製物および配合物に組み込まれてもよい。
【００７１】
経口および／または舌下投与などのための液体形態の調製物に使用の直前に変換されることが意図される固体形態の調製物もまた含まれる。そのような液体形態としては、溶液、懸濁液、およびエマルションが挙げられる。これらの調製物は、活性成分（複数可）に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝液、人工および天然甘味剤、分散剤、濃化剤、可溶化剤などを含有してもよい。
【００７２】
鼻腔内配合物といった、気道への投与を目的とする配合物において、医薬組成物は、例えば５〜１０ミクロンまたはそれ未満のオーダーの小粒子サイズを有してもよい。そのような粒子サイズは、当該技術分野において公知の手段、例えば微粒子化により得られてもよい。
【００７３】
気道への投与は、エアロゾル配合物により達成されてもよく、エアロゾル配合物では、活性成分（複数可）は、好適な噴射剤、例えば、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、もしくはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適な気体を用いて加圧パック中で提供される。
【００７４】
エアロゾルはまた、好都合には、界面活性剤を含有してもよい。薬物の用量は、計量弁の提供により制御されてもよい。
【００７５】
代替的に、活性成分（複数可）は、乾燥粉末、例えば、好適な粉末基剤、例えば、ラクトース、デンプン、デンプン誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中の活性成分（複数可）の粉末ミックスの形態で提供されてもよい。粉末形態の医薬組成物は、単位用量形態、例えば、例えばゼラチンのカプセルもしくはカートリッジ、またはブリスターパック中で提供されてもよい。
【００７６】
スプレーの場合、これは、例えば、計量噴霧スプレーポンプにより達成されてもよい。そのようなスプレーのために、活性成分（複数可）は、シクロデキストリンを用いて被包されてもよく、または、鼻粘膜中の送達および保持を増進することが期待される他の剤と共に配合されてもよい。
【００７７】
口腔内の局所投与（例えば、舌下投与）のために好適な配合物としては、本明細書に記載される任意の液体配合物が挙げられ、好ましくは、ドロッパーまたはシリンジによる投与のために好適な粘度を有する液体配合物；香料基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分（複数可）を含むロゼンジ；不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア中に活性成分（複数可）を含むパステル剤；ならびに好適な液体担体中に活性成分（複数可）を含むマウスウォッシュである。
【００７８】
鼻腔への投与のために、溶液または懸濁液は、従来の手段、例えば、ドロッパー、ピペットまたはスプレーを用いる手段により、鼻腔に直接的に適用されてもよい。配合物は、単回または複数回用量形態において提供されてもよい。ドロッパーまたはピペットの後者の場合、これは、対象が適切な予め決定された体積の溶液または懸濁液を投与することにより達成されてもよい。
【００７９】
表皮への局所投与のために、活性成分（複数可）は、軟膏、クリームもしくはローションとして、または経皮パッチとして配合されてもよい。軟膏およびクリームは、例えば、好適な濃化剤および／またはゲル化剤の添加と共に、水性または油性基剤と共に配合されてもよい。ローションは、水性または油性基剤と共に配合されてもよく、一般にはまた、１つまたは複数の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、濃化剤、または着色剤を含有する。
【００８０】
医薬組成物は、非経口投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による）のために配合されてもよく、アンプル、事前充填シリンジ、小体積注入において単位用量形態で、または任意選択的に防腐剤の添加と共に複数用量容器において提供されてもよい。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤を含有してもよい。代替的に、活性成分は、好適なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質非含有水を用いて使用前に構成するために、無菌固体の無菌単離または溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態であってもよい。
【００８１】
非経口投与用の医薬組成物はまた、投与の容易さおよび投与量の均一性のために単位投与形態において提供されてもよい。本明細書において使用される単位投与形態は、治療される対照のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬的賦形剤と組み合わせて所望の治療効果を生成するために算出された予め決定された量の活性材料を含有する。単位投与形態のための仕様は、（ａ）活性成分（複数可）の特有の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）身体の健康が損なわれた疾患状態を有する生きた対象の治療のためのそのような活性成分（複数可）の配合の当該技術分野における本来的な制限により定められ、これらに直接的に依存する。
【００８２】
注射での使用のために好適な投与形態としては、無菌注射溶液または分散液、および無菌注射溶液の即席調製のための無菌粉末が挙げられる。それらは、製造および貯蔵の条件下において安定であるべきであり、酸化作用および細菌または真菌などの微生物の汚染作用から保護されてもよい。
【００８３】
注射溶液または分散液のための溶媒または分散媒体は、従来の溶媒または担体系のいずれかを含有してもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、好適なこれらの混合物、および植物油を含有してもよい。
【００８４】
注射での使用のために好適な投与形態は、静脈内、筋肉内、脳内、髄腔内、腹腔内、硬膜外の注射または注入といった任意の適切な経路により送達されてもよい。
【００８５】
無菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列記したものなどの様々な他の成分と共に、適切な担体中に必要とされる量の活性成分を組み込んだ後、滅菌を行うことにより調製される。概して、分散液は、基本的な分散媒体および上記に列記したものからの必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクル中に様々な滅菌された活性成分を組み込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分および任意の追加の所望の成分の以前に滅菌された懸濁液の真空乾燥または凍結乾燥である。
【００８６】
一部の実施形態では、医薬組成物は、食品製品の形態において提供される。好適な食品製品としては、焼成食品といった固形食品製品および飲料などの液体食品製品が挙げられる。活性成分（複数可）は、製造の間に食品製品中に組み込まれてもよく、または既存の製品に加えられてもよい。したがって、本明細書に開示される食品製品は、ＢＴＮおよびＳＬＦおよび／またはＩＬＱおよび少なくとも１つの一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）成分を含んでもよい。ＧＲＡＳ成分は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により維持されるＧＲＡＳデータベース中に含まれる任意の成分であってもよい。
【００８７】
任意の投与経路のために、治療的に有用な医薬組成物中の活性成分（複数可）の量は、好適な投与量が得られる充分なものであるべきである。したがって、活性成分（複数可）は、好ましくは、有効量において提供される。
【００８８】
薬学的に許容される担体および／または希釈剤としては、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
【００８９】
所望の場合、活性成分（複数可）の持続放出を与えるように適合された配合物が用いられてもよい。
【００９０】
本発明の実施は、そうでないことを指し示さなければ、当該分野の技術的範囲内の従来の製薬および／または医療技術を用いる。そのような技術は当業者に周知であり、文献中に充分に説明されている。
【００９１】
ダリア抽出物
ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱは、化合物の精製形態から合わせられてもよく、化合物の精製形態は、天然の供給源からの抽出後に精製されたものであってもよく、または合成もしくは半合成により製造されたものであってもよい。ブテイン（Ｓｉｇｍａ）、イソリキリチゲニン（ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびスルフレチン（ＢＢＰ）は市販されている。ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱを製造するための当該技術分野において公知の任意の手段が想定され、例えば、ＳＬＦはＢＴＮの酸化的環化により得られてもよい（例えば、実施例２を参照）。
【００９２】
本発明者らは、ダリア植物の抽出物はＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せを提供できることを見出した。これらの抽出物の活性は、１：１：１のＳＬＦ：ＩＬＱ：ＢＴＮを含む医薬組成物の活性と同等であることが示される（実施例１；実験４および５を参照）。
【００９３】
抽出物中のＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの相対量は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）などの当該技術分野における標準技術を使用して決定されてもよい。ＬＣは、ＵＶ検出を伴う逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）または質量分析と連結させたＬＣ（ＬＣ−ＭＳ）であってもよい。ＲＰＬＣは、２０℃においてＣ１８カラム上で、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＯｐｅｎＬａｂを用いて制御されるＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）ＨＰ１１００を使用して、好ましくは、共に０．１体積％のギ酸を含む、水（Ｈ２Ｏ）中のアセトニトリル（ＭｅＣＮ）の移動相を使用して、２×４ｍｍ  Ｃ１８ガードカラムと共にＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ＯＤＳ（３）５μｍ  １００Å  １５０×３ｍｍを使用して、行われてもよい。ＵＶ検出は、２０６ｎｍ、２６２ｎｍ、３４８ｎｍおよび３８２ｎｍにおいて実行されてもよく、ＵＶスペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）ダイオードアレイ検出器を使用して１９０ｎｍ〜６００ｎｍにおいて記録されてもよい。ＬＣ−ＭＳは、２０℃においてＣ１８カラム上で、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣシステムにより、好ましくは、共に０．１体積％のギ酸を含む、水（Ｈ２Ｏ）中のアセトニトリル（ＭｅＣＮ）の移動相を使用して、２×４ｍｍ  Ｃ１８ガードカラムと共にＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ＯＤＳ（３）５μｍ  １００Å  １５０×３ｍｍにより、行われてもよい。ＭＳ検出は、Ｂｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣに連結させたＢｒｕｋｅｒ  Ｍｉｃｒｏ−ＴＯＦ−Ｑ質量分光計においてエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）供給源を使用して陽イオン質量スペクトルとして得られてもよい。
【００９４】
ダリア属（キク科）は、多くの場合にダリア・バリアビリス（Ｄａｈｌｉａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）と呼ばれる、その様々な栽培形態で最もよく知られる。様々なダリア変種のための簡便な命名上の慣習は、ダリア「変種名」である。中央および南アメリカからの天然のダリア種は、異なる構造クラスの、および様々なグリコシド共役体としての、多様なフラボノイドを含有する。任意のダリア変種の抽出物が使用されてもよく、該抽出物としては、ダリア「Ｒｕｓｋｉｎ  Ｄｉａｎｅ」、ダリア「Ｐａｒｏａ  ｇｌｏｗ」、ダリア「Ｅａｓｔｗｏｏｄ  ｍｏｏｎｌｉｇｈｔ」、ダリア「Ｍｅｇａｎ」、ダリア「Ｔｒｅｎｇｒｏｖｅ  ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ」、ダリア「Ｈｉｇｈｗａｒｄ  ｃｌｉｆｆ」およびダリア「Ｈａｍａｒｉ  ａｃｃｏｒｄ」の抽出物が挙げられる。
【００９５】
抽出物は、ＩＬＱおよび／またはＢＴＮを含むダリア植物の任意の部分から形成されてもよい。抽出物を形成するために使用される植物部分がＳＬＦを含む必要はなく、その理由は、ＢＴＮの部分は、別々のステップとしてまたは抽出プロセスの間に行われてもよい酸化的環化によりＳＬＦに変換され得るからである。ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱのそれぞれは黄色の色素沈着を提供する。抽出物は、黄色の色素沈着を含むダリア植物の任意の部分から形成されてもよい。ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱはダリア植物の花弁中に最も濃縮していることが見出されている。したがって、一部の実施形態では、抽出物はダリア植物の花弁から形成される。ダリアの花は、異なる種類の花弁を含み（図１４および図１５を参照）、花の中央に位置する円盤状花弁および花の中央の周囲に位置する放射状花弁を有する。実験は、ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの濃度は全ての花弁種において実質的に類似であることを示した。抽出物は、放射状花弁、円盤状花弁またはその組合せといった任意のダリア花弁から調製されてもよい。一部の実施形態では、抽出物は、ダリア植物の少なくとも放射状花弁から形成される。放射状花弁の抽出が好ましく、その理由は、花の中央部分（円盤状花弁を含む）を「叩く」ことによる放射状花弁の回収を可能とするからである。この回収技術は、花弁を手で摘む必要性を低減するので、加工コストを低減する。
【００９６】
一部の実施形態では、抽出物は、ダリア植物の花全体から形成される。他の実施形態では、抽出物は、少なくとも花弁ならびに花の１つまたは複数の他の部分、例えば、雄ずい、心皮および子房を含む花の部分から形成される。
【００９７】
一部の実施形態では、抽出物は、花弁、およびダリア植物の１つもしくは複数の他の部分から形成されてもよく、該部分は、種子、根、葉、茎、がく、鱗茎、塊茎、その部分、もしくはその組合せから選択されてもよく、または抽出物は植物全体から形成されてもよい。がく、葉および茎といった、ダリア植物の一部の部分は有意な量のＢＴＮ、ＳＬＦおよび／またはＩＬＱを含まないことが見出されているが、これらの植物部分は、抽出前の除去と関連するコストを回避するために抽出物を形成するために使用されてもよい。
【００９８】
ダリア植物は、比較的高濃度のＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱを含む抽出物を提供することができ、それにより抽出物は、コスト効果の高いものとなり、かつこれらの活性成分の高度に適合性の資源となる。ダリア植物中に存在するＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの濃度は回収前に植物が受ける多数の環境要因に依存し得ることが見出されており、該環境要因としては、ＵＶ曝露、１日当たりの光曝露の総量（すなわち、光周期）、空気の温度、土壌の温度、土壌の種類および利用可能な栄養分濃度が挙げられる。一部の実施形態では、抽出物を形成するために使用されるダリア植物は、ニュージーランドのサウスランドにおいて経験される条件と類似の環境条件に曝露されたものである。
【００９９】
ＢＴＮ、ＳＬＦおよび／またはＩＬＱの最も高い濃度はダリア植物の花弁中に見出され得るので、抽出物は、発生の開花ステージにある時のダリア植物から形成されてもよい。抽出物をダリア植物の発生の異なるステージにおいて解析した。活性成分（複数可）の濃度は、植物が満開にあるまたは満開に近付いているが、中央の花が露出されておらず、かつ花が生殖的成熟に達していない時に最も高いことが見出された（実施例４および図１４〜１６を参照）。したがって、一部の実施形態では、抽出物は、植物が満開にあるまたは満開に近付いている時のかつ生殖的成熟に達する前のダリア植物から形成される。
【０１００】
ダリアの花の抽出物中に同定される主なフラボノイドとしては、ブテイン、イソリキリチゲニン、スルフレチン、アピゲニン、ルテオリン、およびその誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱに加えて、医薬組成物は、アピゲニン、その誘導体もしくはその薬学的に許容される塩、および／またはルテオリン、その誘導体もしくはその薬学的に許容される塩を含んでもよい。
【０１０１】
本明細書において使用されるブテイン、スルフレチンおよびイソリキリチゲニン（および任意の他の天然生成物）への言及は、関連する化合物ならびにその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／または誘導体を含む。
【０１０２】
これらの化合物の誘導体としては、グリコシド、ジグリコシド、マロネートおよびメチル化誘導体が挙げられる。これらの誘導体は、典型的には、フェノール酸素基の１つまたは複数において形成される。ダリア抽出物中に存在することが示されている特定の誘導体は、ブテイン４’−Ｏ−β−グルコピラノシド、イソリキリチゲニン４’−Ｏ−β−グルコピラノシドおよび４−メトキシブテインを含む。そのような誘導体は、加水分解を受けやすいことが示されており、したがって、本発明の医薬組成物のための別の化合物の量に対して１つの化合物およびその誘導体の全相対比率を比較することが適切である。したがって、「ＢＴＮ」への言及は、ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を含み、「ＳＬＦ」への言及は、スルフレチンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を含み、「ＩＬＱ」への言及は、イソリキリチゲニンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体を含む。
【０１０３】
「互変異性体」は、化合物の別の構造異性体と平衡にある化合物の構造異性体である。この平衡は、典型的には、従来技術によっては不可能な互変異性を呈する化合物の１つの互変異性体のみを単離させる熱力学により推進される。本発明の任意の化合物が互変異性を呈する限り、本発明は、ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱといった様々な化合物およびその誘導体の全ての互変異性体を含むことが意図される。
【０１０４】
活性成分（複数可）は、非溶媒和形態の他に、水、エタノールなどの薬学的に許容される溶媒との溶媒和形態において存在してもよい。活性成分（複数可）の溶媒和形態もまた本明細書に開示されると考えられる。溶媒和物は、化学量論量または非化学量論量の溶媒を含有する。水和物は、溶媒が水である場合に形成される。アルコラートは、溶媒がアルコールである場合に形成される。一般に、溶媒和形態は、本明細書において提供される医薬組成物および方法の目的のために非溶媒和形態と同等であると考えられる。
【０１０５】
活性成分（複数可）はまた、薬学的に許容される塩として提供されてもよい。薬学的に許容される塩の例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容される陽イオンの塩が挙げられる。塩は、従来の手段、例えば、フラボノイドのフェノール部分の１つまたは複数を、無機および有機塩基といった適切な塩基の１つまたは複数の同等物と反応させることにより、形成されてもよい。
【０１０６】
薬学的に許容される塩への言及は、関連する化合物の塩形態の溶媒付加形態を含むことが理解されるべきである。
【０１０７】
実施例２および図１６は、ｐＨ７の緩衝液およびエタノール中に懸濁された場合に酸化性条件下においてブテインをスルフレチンに変換できることを示す。この分子内環化は、ブテインのフェニル環上のカルボニル基に対してオルトのフェノールが、ブテインのカルボニル基のｓｐ２混成アルファ炭素と共に環化してスルフレチンのオーロン６，５−二環式環を形成する場合に起こる。図１６は、ブテインのエタノール（ＥｔＯＨ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれかの溶液が室温で水性緩衝液（ｐＨ７）を用いて希釈された場合のブテインのスルフレチンへの経時的な線形（０次速度論）変換を示す。抽出後のこの観察される環化に起因して、一部の実施形態では、抽出物中に存在するスルフレチンの量は非天然量である。スルフレチンの非天然量は、ブテインからの変換により得られてもよい。加えて、植物中のＢＴＮおよびＩＬＱの大部分は、ブテイングリコシドおよびイソリキリチゲニングリコシドの形態において存在すると考えられる。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、非天然量の脱グリコシド化ブテインおよび／または脱グリコシド化イソリキリチゲニンを含む。
【０１０８】
ダリア植物の抽出物は、当該技術分野において公知の任意の手段により調製されてもよい。抽出物の医薬組成は、選択される植物材料、植物変種、その生育条件および抽出方法に依存して変化する。
【０１０９】
一部の実施形態では、抽出物は、ダリア植物の１つまたは複数の部分を抽出剤と接触させることにより形成される。当該技術分野において公知の任意の好適な抽出剤が使用されてもよく、該抽出剤としては、例えば、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコールなど）、または極性有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシドなど）、またはその組合せが挙げられる。一部の実施形態では、抽出剤は、水または緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）などの担体と合わせられてもよい。一部の実施形態では、抽出物は、ダリア植物の１つまたは複数の部分を、エタノールなどのアルコール、および任意選択的に１つまたは複数の担体、好ましくは水（例えば、１：１のアルコール：水の比）を含む抽出剤と接触させることにより形成されてもよい。抽出剤は、所望の化合物を抽出するために充分な期間にわたり植物材料との接触状態に維持される。一部の実施形態では、抽出剤は、少なくとも約０．５時間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間またはより長い時間にわたり植物材料との接触状態に維持される。実験は、ダリア「Ｒｕｓｋｉｎ  Ｄｉａｎｅ」から得られた凍結乾燥した花弁の抽出において、最適な抽出時間は約２時間であることを示した。最適な抽出時間は、抽出される植物材料（例えば、花弁、花全体など）の性質、植物材料が新鮮なものであるのかそれとも乾燥したものであるのか、選択される抽出剤、および抽出条件といった様々な要因に依存して変化し得ることが理解されるであろう。抽出は、高温（例えば、５０℃より高い、好ましくは、約９０℃または約７０℃以下）、周囲温度（例えば、約２０〜２５℃）、または低温（例えば、約５℃未満）において実行されてもよい。
【０１１０】
抽出は、酸素の存在下または非存在下において行われてもよい。例えば、抽出は、酸素の存在下で行われてもよく、酸素は、ＢＴＮのＳＬＦへの変換を補助すると考えられる。酸素を除外する抽出は、植物材料との接触前の抽出剤の任意選択のスパージングと共に、窒素雰囲気下で行われてもよい。そのような実施形態では、抽出は、抽出物へのＳＬＦの添加または抽出物を酸化性条件に曝露してＢＴＮの部分をＳＬＦに変換させることをさらに含んでもよい。好適な酸化性条件としては、抽出物を水性緩衝液（例えば、ｐＨ７の水性緩衝液）の存在下で酸素に曝露することまたは酸化剤を加えることが挙げられる。
【０１１１】
酸素の存在下でのまたは酸化剤を加えるステップを含む植物材料の抽出は、酸化性条件下において実行される。そのような条件は、植物中のＢＴＮの部分のＳＬＦへの変換を補助し得る。したがって、ダリア植物の抽出物を形成する方法であって、ダリア植物の少なくとも花弁を酸化性条件下で抽出剤と接触させることを含む、方法もまた提供される。
【０１１２】
抽出剤は、医薬組成物へのダリア抽出物の組込みの前に完全もしくは部分的に除去されてもよく、または、それは担体として医薬組成物中に含まれてもよい。抽出剤は、任意選択的に減圧下（例えば、真空下）において、抽出物を加熱することにより除去されてもよい。より揮発性の植物代謝物の一部もまた抽出剤を用いて除去されてもよいことが理解されるであろう。したがって、一部の実施形態では、抽出剤の除去は、抽出物中の二次代謝物（例えば、フラボノイド）の濃度を濃縮してもよい。一部の実施形態では、抽出物は、粒子状物質を除去するために濾過され、該濾過は、例えば、抽出物を濾紙、細かい篩もしくはスクリーン（例えば、粒子状物質のサイズに依存して５μｍまたは最大０．５ｍｍの孔径を有する篩もしくはスクリーン）に通すことによりおよび／または遠心分離により行われる。抽出剤の少なくとも一部分の除去後、抽出物は、粉末、フィルム、油、溶液、懸濁液、エマルションまたはコロイドの形態であってもよい。
【０１１３】
抽出物を形成するために使用されるダリア植物の１つまたは複数の部分は、新鮮であってもよく、または抽出前に乾燥されてもよい。新鮮な植物材料は、好ましくは、収集の約１週間以内、例えば、収集の約６、５、４、３、２もしくは１日以内、または本質的に直ちに、例えば、収集の１、２、３、４、５、６、１２、もしくは２４時間以内に抽出される。ダリア植物の少なくとも花弁などの植物材料は、凍結乾燥といった当該技術分野において公知の任意の好適な手段により乾燥されてもよい。
【０１１４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の化合物（例えば、ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの１つまたは複数）がダリア抽出物に加えられてもよい。化合物の添加は、ダリア植物中で発現されるある特定の化合物の相対量における天然のばらつきを相殺するため、またはＢＴＮならびにＳＬＦおよび／もしくはＩＬＱの相対量を補うためであってもよい。加えられる化合物は、所望の化合物（例えば、ＢＴＮ、ＳＬＦおよび／もしくはＩＬＱ）の合成型であってもよく、それらは、他のダリア抽出物といった他の植物抽出物から得られた精製化合物であってもよく、またはそれらは、２つもしくはそれより多くのダリア抽出物をブレンドすることにより加えられてもよい。
【０１１５】
一部の実施形態では、特定のフラボノイドは存在しなくてもよく、または検出不可能な量（例えば、約０．００１重量％未満のアナライト）において存在してもよい。
【０１１６】
ダリア植物の一部の抽出物中に同定されるＢＴＮ、ＳＬＦ、ＩＬＱおよび他のフラボノイド化合物の量を表２に記載する。表２に記載される抽出物は、様々なダリア植物からの花をエタノールと接触させることにより得られた（約３部のＥｔＯＨ対１部の植物材料）。
【表２】
2021504340.tif 000003
【０１１７】
治療方法
本発明者らは、驚くべきことに、ＢＴＮおよびＩＬＱ、ＢＴＮおよびＳＬＦならびにＢＴＮ、ＩＬＱおよびＳＬＦの組合せがグルコース調節の障害を治療できることを見出した。これらの組合せの良好な効果は、活性成分のあらゆる組合せが同じ有効性を有するものではなく、顕著なことに、ＢＴＮの非存在下でのＳＬＦとＩＬＱとの組合せを用いる治療は充分な有効性を欠いていたので、特に驚くべきであった。グルコース調節の食事誘導性障害の逆転は、活性のある組合せを用いる治療は、耐糖能および／またはインスリン感受性を少なくとも部分的に回復させることによりグルコースホメオスタシスに正の影響を与えることができることを示唆する。したがって、活性のある組合せは、糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害の治療において有用であり得る。
【０１１８】
本発明は、糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。これらの方法において、医薬組成物は、任意の比においてＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱを含んでもよい。本明細書に記載されるＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱの少なくとも１つを含む任意の医薬組成物は、これらの方法において使用され得る。
【０１１９】
方法は、１型糖尿病、２型糖尿病および妊娠糖尿病といった任意の形態の糖尿病を治療し得る。
【０１２０】
糖尿病と関連する疾患、状態および／または障害としては、糖尿病、その症状、その合併症または糖尿病の基礎となる原因、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるグルコースの調節の障害および／もしくはインスリン抵抗性と関連する任意の疾患、状態および／または障害が挙げられる。これらの疾患、状態および／または障害としては、前糖尿病、糖尿、高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性、およびその組合せが挙げられる。一部の実施形態では、方法は、治療後の期間にわたり血漿グルコース濃度の低減を結果としてもたらしてもよい。組成物の投与後の血漿グルコース濃度は、標準的な経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ；試験手順について実施例６を参照）により決定されるベースライン血漿グルコース濃度と比べて少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％またはより多く低減されてもよい。治療後の期間は、少なくとも約３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分またはより長くてもよい。一部の実施形態では、血漿グルコース濃度は、インスリンおよび／またはＣペプチド濃度に有意に影響することなく低減される。一部の実施形態では、インスリンおよび／またはＣペプチド濃度は、医薬組成物の投与により有意に低減されない。インスリンまたはＣペプチドの濃度は、治療後の濃度の変動が、例えば分散分析により決定される、統計的に有意な量だけ治療前の濃度から異なる場合に、有意に影響（例えば、低減）されると考えられる。Ｃペプチドは、インスリン生合成の間にプロインスリンから切除される。Ｃペプチド濃度は、糖尿病の種類の診断において有用なことがあり、その血漿濃度はＢ細胞中のインスリン産生に相関する。
【０１２１】
一部の実施形態では、本発明は、糖尿病および／または前糖尿病を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、好ましくは前糖尿病が糖尿病に進行しないように、前糖尿病を治療する方法を提供する。
【０１２２】
前糖尿病は、典型的には、治療されないままの場合に糖尿病に進行し得る、異常に調節された血中グルコースレベルの状態に関する。一部の事例では、前糖尿病は、正常より高いが糖尿病の定義された閾値より低い血中グルコースレベルを有するとして定義される状態に関する。前糖尿病は、２つの基準：（１）空腹時グルコースの障害（ＩＦＧ）および（２）耐糖能障害（ＩＧＴ）により定義される中間的な高血糖症の状態として世界保健機関により定義されている。米国糖尿病学会はまた、ＩＦＧおよびＩＧＴの点で前糖尿病を定義し、追加のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）に基づく基準を含む。前糖尿病の定義、診断および治療は、Ｂｅｎｓａｌ，  Ｎ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１５；  ６（２）：  ２９６−３０３（その内容は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において議論されている。一部の実施形態では、対象は、ＨｂＡ１ｃレベルが約４１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ〜約６０ｍｍｏｌ／ｍｏｌである場合に、糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害のための治療を必要としている。典型的には、約４１〜約４９ｍｍｏｌ／ｍｏｌのＨｂＡ１ｃレベルを有する対象は、前糖尿病のための治療を必要としていると考えられる。
【０１２３】
一部の実施形態では、本発明は、グルコース代謝を正常に戻す方法を提供する。
【０１２４】
一部の実施形態では、本発明は、グルコース調節の食事誘導性障害といったグルコース調節の障害を治療する方法を提供する。
【０１２５】
糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害は、ある特定の合併症に関連付けられる。例えば、糖尿病の公知の合併症としては、糖尿病関連炎症、糖尿病網膜症、糖尿病性ネフロロジー（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）および糖尿病性ニューロパチーが挙げられる。本発明は、糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害の治療に関し、これらの疾患、状態および／または障害の合併症の治療に関しないが、糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療することにより、合併症は、回避され、重篤度が低減され、または発症が遅延され得る。
【０１２６】
方法は、有効量のＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱを投与することを伴う。有効量は、多数の要因に基づいて当業者により決定されてもよく、該要因としては、対象の症状の重篤度および種類、対象の病歴、対象の身体的特性（体重、性別など）、投与される医薬組成物中に含まれる活性成分の特定の組合せならびに投与経路が挙げられる。
【０１２７】
一部の実施形態では、ＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せの有効量は、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇであってもよく、例えば、ＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せの有効量は、対象に少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇを投与するために充分な量であってもよい。一部の実施形態では、ＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せの有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであってもよい。一部の実施形態では、ＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せの有効量は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍ２、約０．６ｍｇ／ｍ２、０．７ｍｇ／ｍ２、０．８ｍｇ／ｍ２、０．９ｍｇ／ｍ２、１．０ｍｇ／ｍ２、１．１ｍｇ／ｍ２、１．２ｍｇ／ｍ２、１．３ｍｇ／ｍ２、１．４ｍｇ／ｍ２、１．５ｍｇ／ｍ２、１．６ｍｇ／ｍ２、１．７ｍｇ／ｍ２、１．８ｍｇ／ｍ２、１．９ｍｇ／ｍ２、２．０ｍｇ／ｍ２、２．１ｍｇ／ｍ２、２．２ｍｇ／ｍ２、２．３ｍｇ／ｍ２、２．４ｍｇ／ｍ２、２．５ｍｇ／ｍ２、２．６ｍｇ／ｍ２、２．７ｍｇ／ｍ２、２．８ｍｇ／ｍ２、２．９ｍｇ／ｍ２、３．０ｍｇ／ｍ２、３．５ｍｇ／ｍ２、４．０ｍｇ／ｍ２、４．５ｍｇ／ｍ２、５．０ｍｇ／ｍ２、５．５ｍｇ／ｍ２、５．６ｍｇ／ｍ２、５．７ｍｇ／ｍ２、５．８ｍｇ／ｍ２、５．９ｍｇ／ｍ２、６．０ｍｇ／ｍ２、７．０ｍｇ／ｍ２、８．０ｍｇ／ｍ２、９．０ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、またはより多くであってもよい。ＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せの有効量は、これらの任意の用量の間、例えば、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２または約１．５ｍｇ／ｍ２〜約６．０ｍｇ／ｍ２であってもよい。
【０１２８】
ＢＴＮの有効量は少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇであってもよく、例えば、ＢＴＮの有効量は、対象に少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇを投与するために充分な量であってもよい。一部の実施形態では、ＢＴＮの有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであってもよい。一部の実施形態では、ＢＴＮの有効量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍ２、例えば、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２、約０．４ｍｇ／ｍ２、約０．５ｍｇ／ｍ２、約０．６ｍｇ／ｍ２、０．７ｍｇ／ｍ２、０．８ｍｇ／ｍ２、０．９ｍｇ／ｍ２、１．０ｍｇ／ｍ２、１．１ｍｇ／ｍ２、１．２ｍｇ／ｍ２、１．３ｍｇ／ｍ２、１．４ｍｇ／ｍ２、１．５ｍｇ／ｍ２、１．６ｍｇ／ｍ２、１．７ｍｇ／ｍ２、１．８ｍｇ／ｍ２、１．９ｍｇ／ｍ２、２．０ｍｇ／ｍ２、２．１ｍｇ／ｍ２、２．２ｍｇ／ｍ２、２．３ｍｇ／ｍ２、２．４ｍｇ／ｍ２、２．５ｍｇ／ｍ２、２．６ｍｇ／ｍ２、２．７ｍｇ／ｍ２、２．８ｍｇ／ｍ２、２．９ｍｇ／ｍ２、３．０ｍｇ／ｍ２、３．５ｍｇ／ｍ２、４．０ｍｇ／ｍ２、４．５ｍｇ／ｍ２、５．０ｍｇ／ｍ２、５．５ｍｇ／ｍ２、５．６ｍｇ／ｍ２、５．７ｍｇ／ｍ２、５．８ｍｇ／ｍ２、５．９ｍｇ／ｍ２、６．０ｍｇ／ｍ２またはそれより多くてもよい。ＢＴＮの有効量は、これらの任意の用量の間、例えば、約０．１ｍｇ／ｍ２〜約６ｍｇ／ｍ２または約２．０ｍｇ／ｍ２〜約４．０ｍｇ／ｍ２であってもよい。
【０１２９】
ＳＬＦの有効量は少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇであってもよく、例えば、ＳＬＦの有効量は、対象に少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇを投与するために充分な量であってもよい。一部の実施形態では、ＳＬＦの有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであってもよい。一部の実施形態では、ＳＬＦの有効量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍ２、例えば、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２、約０．４ｍｇ／ｍ２、約０．５ｍｇ／ｍ２、約０．６ｍｇ／ｍ２、０．７ｍｇ／ｍ２、０．８ｍｇ／ｍ２、０．９ｍｇ／ｍ２、１．０ｍｇ／ｍ２、１．１ｍｇ／ｍ２、１．２ｍｇ／ｍ２、１．３ｍｇ／ｍ２、１．４ｍｇ／ｍ２、１．５ｍｇ／ｍ２、１．６ｍｇ／ｍ２、１．７ｍｇ／ｍ２、１．８ｍｇ／ｍ２、１．９ｍｇ／ｍ２、２．０ｍｇ／ｍ２、２．１ｍｇ／ｍ２、２．２ｍｇ／ｍ２、２．３ｍｇ／ｍ２、２．４ｍｇ／ｍ２、２．５ｍｇ／ｍ２、２．６ｍｇ／ｍ２、２．７ｍｇ／ｍ２、２．８ｍｇ／ｍ２、２．９ｍｇ／ｍ２、３．０ｍｇ／ｍ２、３．５ｍｇ／ｍ２、４．０ｍｇ／ｍ２またはより多くであってもよい。ＳＬＦの有効量は、これらの任意の用量の間、例えば、約０．１ｍｇ／ｍ２〜約４ｍｇ／ｍ２または約１．０ｍｇ／ｍ２〜約２．０ｍｇ／ｍ２であってもよい。
【０１３０】
ＩＬＱの有効量は少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇであってもよく、例えば、ＩＬＱの有効量は、対象に少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇを投与するために充分な量であってもよい。一部の実施形態では、ＩＬＱの有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであってもよい。一部の実施形態では、ＩＬＱの有効量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍ２、例えば、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２、約０．４ｍｇ／ｍ２、約０．５ｍｇ／ｍ２、約０．６ｍｇ／ｍ２、０．７ｍｇ／ｍ２、０．８ｍｇ／ｍ２、０．９ｍｇ／ｍ２、１．０ｍｇ／ｍ２、１．１ｍｇ／ｍ２、１．２ｍｇ／ｍ２、１．３ｍｇ／ｍ２、１．４ｍｇ／ｍ２、１．５ｍｇ／ｍ２、１．６ｍｇ／ｍ２、１．７ｍｇ／ｍ２、１．８ｍｇ／ｍ２、１．９ｍｇ／ｍ２、２．０ｍｇ／ｍ２、２．１ｍｇ／ｍ２、２．２ｍｇ／ｍ２、２．３ｍｇ／ｍ２、２．４ｍｇ／ｍ２、２．５ｍｇ／ｍ２、２．６ｍｇ／ｍ２、２．７ｍｇ／ｍ２、２．８ｍｇ／ｍ２、２．９ｍｇ／ｍ２、３．０ｍｇ／ｍ２、３．５ｍｇ／ｍ２、４．０ｍｇ／ｍ２またはより多くであってもよい。ＩＬＱの有効量は、これらの任意の用量の間、例えば、約０．１ｍｇ／ｍ２〜約４ｍｇ／ｍ２または約１．２ｍｇ／ｍ２〜約２．３ｍｇ／ｍ２であってもよい。
【０１３１】
ＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せがダリア抽出物の形態において提供される実施形態では、方法は、有効量のダリア抽出物を対象に投与することを含んでもよい。一部の実施形態では、抽出物の有効量は、少なくとも約５ｍｇ／ｍ２、例えば、少なくとも約１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、９５ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、またはより多くであってもよい。抽出物の有効量は、これらの任意の用量の間、例えば、約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２または約５５ｍｇ／ｍ２〜約６５ｍｇ／ｍ２であってもよい。
【０１３２】
一部の実施形態では、有効量は、医薬組成物および／または活性成分のホルミシス量に関する。ホルミシスは、活性成分に対する二相的用量応答であって、典型的には、低用量において活性成分の有益な活性および高用量において活性の喪失または有害な活性のいずれかを伴うものを指す。ホルミシスは、Ｍａｔｔｓｏｎ，  Ｍ．  Ｐ．  Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．  ２００８；  ７（１）：  １−７（その内容は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明の医薬組成物の一部の実施形態は、有効性が低用量においてより大きいことが示されたという点でホルミシスを実証し、例えば、１：１：１のＳＬＦ：ＩＬＱ：ＢＴＮを含む医薬組成物は、約１ｍｇ／ｋｇにおいて投与された場合にグルコース調節の食事誘導性障害の際立った逆転を示した（実施例１；実験４および図４を参照）。
【０１３３】
方法はまた、ＢＴＮ、ＳＬＦおよび／またはＩＬＱ以外の活性成分を投与することを含んでもよい。この活性成分は、ＢＴＮならびにＳＬＦおよび／またはＩＬＱと同時に、別々にまたは連続的に投与されてもよい。同時にとは、医薬組成物および他の活性成分のそれぞれが同じ医薬組成物中で同時に投与されることを意味する。別々にとは、医薬組成物および他の活性成分のそれぞれが異なる医薬組成物中で同時にかつ任意選択的に異なる投与経路により投与されることを意味する。連続的にとは、医薬組成物および他の活性成分のそれぞれが、任意選択的に異なる投与経路により、別々に投与され、異なる時点であってもよいことを意味する。典型的には、医薬組成物および他の活性成分が連続的に投与される場合、それらは、互いに２４時間以内、または１２、８、６、５、４、３、２、もしくは１時間以内に投与される。医薬組成物は、他の活性成分の前または後に投与されてもよい。さらに、医薬組成物および他の活性成分のための投与経路は、同じまたは異なるものであってもよい。
【０１３４】
一部の実施形態では、他の活性成分は、糖尿病のための任意の既存の療法、例えば、ビグアニド（例えば、メトホルミン）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤（例えば、シタグリプチン、サキサグリプチン、ビルダグリプチン（ｖｉｄａｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチンおよびアログリプチン）、ナトリウム−グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、カナグリフロジン、ダパグリフロジン（ｄａｐａｇｌｉｆｏｚｉｎ）およびエンパグリフロジン）、インスリン（例えば、短期作用性レギュラーインスリン（例えば、ヒューマリン、ノボリン）、中間型ＮＰＨインスリン、長期作用性インスリングラルギン（例えば、ランタス）、インスリンデテミル（例えば、レベミル）、インスリンデグルデク（例えば、トレシーバ）、即効型ヒューマログ（例えば、リスプロ）、ノボログ（例えば、アスパルト）、グルリジン（例えば、アピドラ）、予備混合型７５％インスリンリスプロプロタミン／２５％インスリンリスプロ（例えば、ヒューマログミックス７５／２５）、５０％インスリンリスプロプロタミン／５０％インスリンリスプロ（例えば、ヒューマログミックス５０／５０）、７０％インスリンリスプロプロタミン／３０％インスリンアスパルト（例えば、ノボログ７０／３０）、７０％  ＮＰＨインスリン／３０％レギュラー）、ＧＬＰ−１アゴニスト（例えば、リラグルチド、エキセナチドおよびデュラグルチド）、スルホニル尿素（ＳＵ）（例えば、グリメピリド、グリピジドおよびグリブリド）、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）（例えば、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン）、アミリンアゴニスト（例えば、プラムリンチド）、アルファグルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース）およびその組合せの投与であってもよい。好適な他の活性成分に関する追加の情報は、Ｃｈａｕｎｄｒｙ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ２０１７；８：Ａｒｔｉｃｌｅ  ６（その内容は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３５】
一部の実施形態では、方法は、医薬組成物およびアミリンアゴニスト、例えばプラムリンチドを投与することを含む。本発明者らは、アミリンアゴニストおよび医薬組成物の投与を含む実施形態においてグルコース調節の食事誘導性障害に対する有効性の点で相乗効果を観察した（実施例１；実験８を参照）。したがって、一部の実施形態では、方法は、相乗量の医薬組成物およびアミリンアゴニスト、例えばプラムリンチドを投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、対象に医薬組成物中の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｍ２〜約４．０ｍｇ／ｍ２の各活性成分をアミリンアゴニスト、例えばプラムリンチドと共に投与するために充分な量で医薬組成物を投与することを含む。方法は、ＢＴＮとＳＬＦおよび／またはＩＬＱとの組合せをアミリンアゴニスト、例えばプラムリンチドと共に含む医薬組成物を投与することを含んでもよい。アミリンアゴニストがプラムリンチドである実施形態では、方法は、それ単独で有効性を観察するために必要とされる量より少ない量でプラムリンチドを投与することを含んでもよい。臨床用量未満の用量のプラムリンチドを投与することにより、関連する副作用が低減または回避され得る。方法は、対象に最大で約１０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、最大で約５００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇまたはより少量を投与するために充分な量のプラムリンチドを投与することを含んでもよい。
【０１３６】
方法は、本明細書に記載される任意の投与経路といった、任意の好適な投与経路を含んでもよい。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、別々の部分において、
（ａ）ブテインまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＢＴＮ）、ならびに
（ｂ）スルフレチンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＳＬＦ）、および／または
（ｃ）イソリキリチゲニンもしくはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）
を含むキットを提供する。
【０１３８】
一部の実施形態では、部分（ｂ）または（ｃ）は存在しない。
【０１３９】
一部の実施形態では、キットの部分（ａ）は、ＳＬＦおよび／またはＩＬＱをさらに含む。一部の実施形態では、キットの部分（ｂ）は、ＢＴＮおよび／またはＩＬＱをさらに含む。一部の実施形態では、キットの部分（ｃ）は、ＢＴＮおよび／またはＳＬＦをさらに含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、キットの部分（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の１つまたは複数は、独立して、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。他の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、キットのさらなる部分、すなわち部分（ｄ）中に提供される。
【０１４１】
一部の実施形態では、キットは、別々の部分において、（ｅ）ＢＴＮ、ＳＬＦおよび／またはＩＬＱ以外の活性成分を含んでもよい。部分（ｅ）は、部分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）に加えて、キット中に含まれてもよい。
【０１４２】
一部の実施形態では、キットは、別々の部分において、（ｆ）糖尿病または関連する疾患、状態および／もしくは障害を治療するための使用のための指示を含んでもよい。
【０１４３】
本発明者らは、イソリキリチゲニンは単独で、グルコース調節の食事誘導性障害を治療できることを示した（実施例１；実験１、図１Ｂ；実験３、図３Ａ）。
【０１４４】
したがって、別の態様では、本発明は、糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のイソリキリチゲニンまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、溶媒和物および／もしくは誘導体（ＩＬＱ）を投与することを含む、方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載されるような任意の形態または糖尿病ならびに任意の関連する疾患、状態および／もしくは障害の治療において使用されてもよい。
【０１４５】
糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害を治療するための医薬の調製におけるＩＬＱの使用もまた提供される。
【０１４６】
糖尿病ならびに関連する疾患、状態および／または障害の治療において使用するための医薬組成物であって、ＩＬＱを含む医薬組成物もまた提供される。
【０１４７】
ＩＬＱを含む抗糖尿病剤もまた提供される。
【０１４８】
ＩＬＱは、本明細書に記載される任意の形態において単独で（すなわち、唯一の活性成分として）またはＢＴＮ、ＳＬＦならびに／もしくはＳＬＦ、ＢＴＮおよび／もしくはＩＬＱ以外の活性成分と組み合わせて投与されてもよい。ＩＬＱを含む医薬組成物は、本明細書に記載される任意の量でＩＬＱを含んでもよい。ＩＬＱは、合成または半合成起源のＩＬＱの形態といった、本明細書に記載される任意の供給源から得られたものであってもよい。
【０１４９】
本発明者らは、驚くべきことに、スルフレチンを単独で用いる治療は、グルコース調節の食事誘導性障害を治療できることを見出した。以前に、スルフレチンは、サイトカイン誘導性のベータ細胞損傷を遮断できることが示された。しかしながら、本発明者らは、ＨＦＤのマウスは高インスリン血症であったので、スルフレチンの有効性はベータ細胞損傷とは独立していることを示した（実施例３および図１７を参照）。実施例１は、スルフレチンは、ベータ細胞不全の前に高インスリン血症の状態の間に食事により誘導されたグルコース調節の障害を治療できることを示す。したがって、ＳＬＦは、２型糖尿病および前糖尿病といった、ベータ細胞不全とは独立した食事誘導性のインスリン抵抗性およびグルコース調節の障害の治療において有効性を有することは驚くべきことであった。
【０１５０】
したがって、２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＳＬＦを投与することを含む、方法が本明細書において提供される。
【０１５１】
２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害を治療するための医薬の調製におけるＳＬＦの使用もまた提供される。
【０１５２】
２型糖尿病、前糖尿病および／またはグルコース調節の食事誘導性障害の治療において使用するための医薬組成物であって、ＳＬＦを含む、医薬組成物もまた提供される。
【０１５３】
ＳＬＦを含む抗２型糖尿病および／または前糖尿病剤もまた提供される。
【０１５４】
ＳＬＦは、本明細書に記載される任意の形態において単独で（すなわち、唯一の活性成分として）またはＢＴＮ、ＩＬＱならびに／もしくはＳＬＦ、ＢＴＮおよび／もしくはＩＬＱ以外の活性成分と組み合わせて投与されてもよい。ＳＬＦを含む医薬組成物は、本明細書に記載される任意の量でＳＬＦを含んでもよい。ＳＬＦは、合成または半合成起源のＳＬＦの形態といった、本明細書に記載される任意の供給源から得られたものであってもよい。
【実施例】
【０１５５】
本発明を非限定的な実施例によりさらに記載する。本発明の精神および範囲から離れることなく多くの改変が為され得ることが本発明の技術分野の当業者に理解されるであろう。
【０１５６】
実施例１：実験１〜１０
この実施例は、マウスにおける食事誘導性のグルコース感受性の逆転におけるＢＴＮ、ＳＬＦおよび／またはＩＬＱの有効性を示す一連の実験を記載する。使用したマウスは、ヒト糖尿病および前糖尿病のモデルと考えられる。この実施例の目的のために、表３に示す略語を使用する。
【表３】
2021504340.tif 000004
【０１５７】
実験動物
全ての実験のために、１２〜１４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスをオタゴ大学の動物施設から得た。全ての手順はオタゴ大学動物倫理委員会により承認された。マウスを１２：１２ｈの明／暗サイクル下で個々に飼育し、周囲温度は２３℃であった。動物は、４週の継続期間にわたり低脂肪食（ＬＦＤ、１０％の脂肪を含有する；カタログ番号Ｄ１２４５０Ｂ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）または高脂肪食（ＨＦＤ、６０％の脂肪を含有する；カタログ番号Ｄ１２４９２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）のいずれか、および水への自由なアクセスを有した。各実験のために、動物の新たなコホートを用いた。
【０１５８】
配合物
全ての実験のために、選択された活性成分、すなわち、個々にＢ、ＩもしくはＳ、ミックスまたは抽出物のエタノール溶液を形成した後、０．９ｗｔ％のＮａＣｌ水性溶液を用いて所望の濃度に希釈することにより配合物を調製した。
【０１５９】
代表的な配合物を調製するための概略の実施例は以下の通りである。活性成分（１０ｍｇ）に５００μｌのエタノールおよびその後に９５００μｌの０．９ｗｔ％のＮａＣｌ水性溶液を加えて投与用の１０ｍｌの溶液を作製した。
【０１６０】
２つまたはそれより多くの活性成分の組合せの配合物は、２つまたはそれより多くの活性成分を予備計量し、５部のエタノールおよびその後に９５部の０．９％のＮａＣｌ水性溶液を加えることにより調製されてもよい。代替的に、配合物は、１つの活性成分の既に調製された溶液（例えば、上記の方式で調製される）からアリコートを取り、組合せの他の活性成分（複数可）の溶液と合わせることにより調製されてもよい。
【０１６１】
抽出物
全ての実験のために、ダリア「Ｒｕｓｋｉｎ  Ｄｉａｎｅ」から得た新鮮な閉じたままの花弁（１部）を９６％のエタノール（約３部）と接触させることにより抽出物を調製した。必要とされるまで抽出物を−１８℃でエタノール溶液として貯蔵した。この抽出物中のＲＰＬＣ分析により見出されたフラボノイドの量を以下の表４に示す。
【表４】
2021504340.tif 000005
【０１６２】
耐糖能試験
実験１〜３：化合物の抗糖尿病特性
個々にいずれかの化合物、３つ全ての化合物の混合物（Ｂ、ＳおよびＩ；以下、「ミックス」と称する）または黄色ダリア「Ｒｕｓｋｉｎ  Ｄｉａｎｅ」花弁の全抽出物がグルコースホメオスタシスに激しく影響するかどうかを調べるために、ヒト前糖尿病およびグルコース代謝における障害を模倣するためのモデルとしての食事誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスにおいて腹腔内耐糖能試験（ｉｐＧＴＴ）を行った。個々の化合物、ミックスまたは全抽出物を、５％のエタノールを含有する０．９％のＮａＣｌ中に溶解させ、経口投与した。マウス（ｎ＝７〜８／群）に４週間の高脂肪食（ＨＦＤ）または各々の低脂肪食（ＬＦＤ）のいずれかを給餌し、１６時間絶食させ、経口胃管栄養法により異なる化合物／組合せまたはビヒクル（５％のエタノールを含有する０．９％のＮａＣｌ）を与えた。例えば、５０ｇのマウスへの投与のために、５００μｌの体積を有する経口胃管栄養を調製し、経口胃管栄養は、５００μｇの抽出物または５０μｇの化合物（複数可）を含有した。投与する胃管栄養の体積をマウス対象の体重に基づいて調整した。経口胃管栄養処置の６０分後にグルコース（１．５ｇ／ｋｇ体重；０．９％のＮａＣｌ中に溶解させた）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）し、ｉｐＧＴＴを行った。新たな外科用メスの刃を用いて尾の先端を切断しながら市販の血糖値測定器（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｅｒｆｏｒｍａ；Ｒｏｃｈｅ）を使用して血中グルコースレベルを測定した。統計的検証のために、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。
【０１６３】
実験４〜５：ミックスおよび抽出物の用量応答
これらの実験は、異なる濃度（２０、１０、３．３、１、０．３３ｍｇ／ｋｇ体重）を使用する個々の化合物、ミックス（２０、１０、３．３、１、０．３３ｍｇ／ｋｇ体重）または抽出物（５０、２０、１０、３．３、１ｍｇ／ｋｇ）の用量応答を確立して最大非有効用量を決定することにより、その後の実験における市販の糖尿病薬と組み合わせた相乗効果の試験を可能とする。マウスに４週のＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかを給餌した（実験４および５）。マウスを１６時間絶食させた後、以前に記載したようにｐＧＴＴを実行した。
【０１６４】
実験６および８：メトホルミンおよびプラムリンチドの用量応答
ＢならびにＳおよび／またはＩが、良好に記載される糖尿病薬メトホルミンおよびプラムリンチドと相乗的に作用してグルコースホメオスタシスに影響するかどうかを解析するために、これらの２つの薬剤についての用量応答実験を実行した。マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、慢性的にメトホルミン（最後の７日間の経口胃管栄養法、１日２回（１２時間の間隔）；３００、１００、５０、２０、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ＰＢＳ中）またはプラムリンチド（最後の５日間の皮下注射、１日２回（１２時間の間隔）；１０００、２００、４０、８、１．６μｇ／ｋｇ／ｄ、０．９％のＮａＣｌ中）を用いて処置した。マウスの別々のコホートを各々の対照注射を用いて処置した。マウスを１６ｈ絶食させ、記載したようにｉｐＧＴＴを行った。
【０１６５】
実験７および９：メトホルミンおよびプラムリンチドとの組合せ
糖尿病剤および我々の化合物について用量応答が確立されたので、この実験では、メトホルミンまたはプラムリンチドの最大非有効用量を選択し、最大非有効用量のミックスと組み合わせて投与して、グルコースホメオスタシスの改善における相乗効果について試験した。したがって、マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤのいずれかを給餌し、メトホルミン（最後の７日間の経口胃管栄養法、１日２回（１２時間の間隔）；１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ体重、ＰＢＳ中）またはプラムリンチド（最後の５日間の皮下注射、１日２回（１２時間の間隔）；２００μｇ／ｋｇ／ｄ体重、０．９％のＮａＣｌ中）を用いて処置した。良好に記載されている抗糖尿病薬を用いた慢性処置後、マウスを１６ｈ絶食させ、激しくミックス（０．３３ｍｇ／ｋｇ；５％のエタノールを含有する）を与えた。６０分後、以前に記載したようにｉｐＧＴＴを実行した。
【０１６６】
実験１０：中心的なインスリンシグナリングに対する効果
化合物、配合物および抽出物がグルコースホメオスタシスに影響する方法の作用モードを同定するために、ＡＫＴのリン酸化（ｐＡＫＴ）を測定することにより中心的なインスリンシグナリングに対する効果を調べた。ＡＫＴは視床下部の弓状核におけるインスリンの主な標的である。視床下部におけるインスリン作用の程度を評価するために、リン酸化ＡＫＴ陽性細胞を計数した。マウスに４週間ＬＦＤまたはＨＦＤを給餌し、１６ｈ絶食させ、体重をマッチさせた。経心腔的灌流の６０分前に、マウスに経口胃管栄養法によりＢ（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｉ（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｓ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ミックス（３．３ｍｇ／ｋｇの各化合物）、抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（５％のエタノールを含有する０．９％のＮａＣｌ）を与えた。さらに、マウスに経心腔的灌流の１５分前にインスリン（１ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル注射を与えた。抗ホスホＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３抗体（カタログ番号４０５８；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、Ｂｅｎｚｌｅｒ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ２０１５；６４：２０１５−２７（その内容は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において以前に記載されたようにマウス脳冠状凍結切片に対して免疫組織化学を実行した。
【０１６７】
統計
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．）を使用して、一元配置分散分析または反復測定分散分析およびその後に適宜の多重比較検定によりデータを解析した。結果を平均±ＳＥＭとして表し、ｐ≦０．０５の場合に差異を有意と考えた。
【０１６８】
結果
実験１：化合物の抗糖尿病特性
実験１：抽出物およびある特定の化合物の抗糖尿病特性の初めての証明
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、１０ｍｇ／ｋｇ（０．９％のＮａＣｌ／５％のエタノール中に希釈）のＢ、Ｉ、Ｓ、３つ全てのミックスまたはダリア花弁の抽出物を経口により与え、１時間後にｉｐＧＴＴを行った（ｎ＝６〜７／群）。Ｓ、ミックスおよび抽出物は耐糖能を有意に改善させた。
【０１６９】
この実験では、ＨＦＤ給餌マウスにおけるグルコースホメオスタシスの改善を個々のいずれかの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）、３つ全ての化合物のミックス（３．３ｍｇ／ｋｇの各化合物）またはダリア花弁の全抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ）について調べた。４週間の給餌後、予想の通りＬＦＤ群と比較してＨＦＤ群において耐糖能は有意に障害を受けた（ｐ＜０．０００１）。ｉｐＧＴＴの１時間前に経口胃管栄養法により激しく与えたところ、Ｓ（ｐ＝０．０２７）、ミックス（ｐ＝０．００１３）および抽出物（ｐ＝０．００８１）は耐糖能を有意に改善でき、Ｉは対照群と比較してグルコースホメオスタシスの改善の傾向を示した（図１）（ｐ＝０．１０）。Ｂは、ｉｐＧＴＴを通じていずれの時点においても耐糖能を改善させなかった。これらのデータは、これらの試験した用量においてＳ、ミックスおよびダリア抽出物は食事誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスにおいてグルコースホメオスタシスを改善させるための効果的な薬剤であることを示唆する。
【０１７０】
実験２〜３：Ｂ、ＩおよびＳの間の相互作用
実験２：ＢはＩまたはＳのグルコース低下効果に影響を及ぼさない
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、３．３ｍｇ／ｋｇの各化合物（０．９％のＮａＣｌ／５％のエタノール中に希釈）においてＢ、ＩおよびＢ（Ｉ＋Ｂ）、ＳおよびＢ（Ｓ＋Ｂ）ならびにミックスを経口により与え、１時間後にｉｐＧＴＴを行った（ｎ＝４〜１０／群）。Ｉ＋Ｂ、Ｓ＋Ｂおよびミックスは耐糖能を有意に改善させた。
【０１７１】
実験２は、ＩまたはＳのいずれかとのＢの相互作用を試験する。予想の通り、４週間のＨＦＤの給餌は、ＬＦＤ給餌マウスと比較してグルコース不耐性に繋がった（ｐ＜０．０００１）。化合物および配合物を経口により与え、１時間後にｉｐＧＴＴを行った。Ｂ（３．３ｍｇ／ｋｇ）は単独で、実験１における発見に合致して、いずれの時点においても耐糖能に対する効果を示さなかった。しかしながら、Ｉと組み合わせたＢ（各３．３ｍｇ／ｋｇ体重；ｐ＝０．０２３０）およびＳと組み合わせたＢ（各３．３ｍｇ／ｋｇ体重；ｐ＝０．０１４２）は、耐糖能を有意に改善させた。さらに、３つ全ての化合物のミックス（３．３ｍｇ／ｋｇ体重の各化合物）を用いて処置したマウスは、ＨＦＤにおけるビヒクル処置マウスと比較してグルコースホメオスタシスの改善を示した（ｐ＝０．０２１６）（図２Ｄ）。実験１と同様に、Ｂ単独の経口適用はグルコースホメオスタシスを改善させなかった。しかしながら、ＩまたはＳと共に投与した場合、これらの化合物のグルコース低下能力はＢにより負に影響されず、反対に、データは、ＢはＩの作用を改善させ得ることを示唆する（実験１を参照）。
【０１７２】
実験３：Ｉ＋ＳはＢの非存在下で互いに阻害し合う。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、３．３ｍｇ／ｋｇ（０．９％のＮａＣｌ／５％のエタノール中に希釈）においてＩまたはＳ、ＩおよびＳ（Ｉ＋Ｓ）、またはミックスを経口により与え、１時間後にｉｐＧＴＴを行った（ｎ＝５〜７／群）。ＩまたはＳは耐糖能を改善させる傾向があり、この効果は両方の存在下で無効化された。
【０１７３】
Ｂ単独での経口適用はグルコースホメオスタシスの改善に効果的でないがＩおよびＳの作用に負に影響しないことが確立されたので、我々は次に、ＩおよびＳは互いに相互作用し、それにより、グルコースホメオスタシスの調節に対するそれらの効果を変化させるかどうかを試験した。したがって、ＨＦＤ給餌マウスを個々にＩもしくはＳ、ＩおよびＳの組合せまたはＩ、ＳおよびＢのミックスのいずれかを用いて処置した。マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌した後、ＨＦＤ給餌動物は予想の通りグルコース不耐性であった（ｐ＝０．０００５）。個々にＩ（図３Ａ；３．３ｍｇ／ｋｇ；ｐ＝０．０３０８）もしくはＳ（図３Ｂ；３．３ｍｇ／ｋｇ；ｐ＝０．０２５７）またはミックス（図３Ｄ；各３．３ｍｇ／ｋｇ；ｐ＝０．０５６１）を用いて処置したマウスは、耐糖能の改善または強い傾向をそれぞれ示したが、驚くべきことに、効果は、Ｓと組み合わせてＩ（各３．３ｍｇ／ｋｇ）を用いてマウスを処置した場合に完全に無効化された。
【０１７４】
実験４〜５：ミックスおよび抽出物の用量応答
グルコースホメオスタシスを改善させる化合物の相対力価を決定するために、ミックスおよび抽出物の用量応答を行った。それぞれ０．３３ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ体重に及ぶ５つの異なる濃度を用いてマウスを処置した。
【０１７５】
実験４：ミックスについての用量応答（４週の食餌）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、異なる濃度（０．９％のＮａＣｌ／５％のエタノール中に希釈）においてミックスを経口により与え、１時間後にｉｐＧＴＴを行った（ｎ＝４〜６／群）。
【０１７６】
ＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかを４週間給餌した後、マウスを異なる濃度（２０、１０、３．３、１または０．３３ｍｇ／ｋｇ体重）のミックスを用いて経口胃管栄養法により処置し、１時間後にｉｐＧＴＴを行った（図４）。予想の通り、ＨＦＤでの４週後にマウスは、ＬＦＤのマウスと比較して有意に改善された耐糖能障害を示した（ｐ＝０．０００２）。ミックスは全ての濃度において耐糖能の改善の傾向を示した。特に、１ｍｇ／ｋｇ体重においてＤＩＯ誘導性グルコース不耐性の際立った逆転が観察され（ｐ＝０．００６０）、ＡＵＣはもはやＬＦＤの健常マウスと異ならなかった（図４Ｆ）。これらのデータは、ミックスは有効量において投与された場合にグルコース不耐性の逆転において高度に強力であることを示唆する。
【０１７７】
実験５：抽出物についての用量応答（４週の食餌）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、異なる濃度（０．９％のＮａＣｌ／５％のエタノール中に希釈）において抽出物を経口により与え、１時間後にｉｐＧＴＴを行った（ｎ＝６〜７／群）。
【０１７８】
研究のこの部分のために、４週間ＨＦＤを与えたマウスにダリア花弁の抽出物を投与した。抽出物（１ｍｇ）中の３つの主な活性化合物の濃度はそれぞれ約０．０７６ｍｇであり、したがって、同等の濃度の混合物（１ｍｇ）と比較して１３倍低かった。したがって、実験４と比較して、抽出物中の個々の化合物の相対的により低い濃度に起因して、および抽出物はビヒクル（５％のエタノールを含有する０．９％のＮａＣｌ）中でより可溶性であるという事実に起因して、５０ｍｇ／ｋｇ体重のより高用量を最大用量として選択した。予想の通り、４週間のＨＦＤの給餌により、ＬＦＤのマウスと比較してマウスにおいて耐糖能は障害を受けた（ｐ＜０．０００１）。抽出物は、ホルミシス方式で耐糖能の改善の傾向を示し、１０ｍｇ／ｋｇ体重の中用量が最も効果的であり、ＨＦＤ対照マウスと比較して有意性（ｐ＝０．０４８２）を達成した（図５）。さらに、異なる時点における個々の解析は、抽出物は、ＨＦＤ対照群と比較して２０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０２１２）、１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０４０２）および３．３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０３７５）において３０分の時点においてグルコースレベルを有意に減少させたことを明らかにした（図５）。
【０１７９】
抽出物の最も効果的な用量は、ミックス（実験４；１ｍｇ／ｋｇ）より１０倍高い（実験５；１０ｍｇ／ｋｇ）。しかしながら、３つの化合物の総量はミックス（実験４；１ｍｇ／ｋｇ）と比較して抽出物（実験５；０．７６ｍｇ／ｋｇ）中で類似である。したがって、これらの実験は、最大の観察される抗糖尿病効果を誘発するために必要とされるＢ、ＳおよびＩの濃度はミックスおよび抽出物について類似であることを示し、ＢとＳおよび／またはＩとの組合せは観察される有効性の大部分を提供することを示唆する。
【０１８０】
実験６〜７：ミックスおよびメトホルミンの相互作用
用量応答実験は、ミックスは４週間ＨＦＤを給餌したマウスにおいて１ｍｇ／ｋｇ体重においてグルコース不耐性を逆転できることを明らかにした。いずれも最大有効用量より低い、広く処方される糖尿病薬メトホルミンと組み合わせたミックスの効果を評価するために、我々は最初に、メトホルミンが耐糖能を改善させることができなくなる最大用量を評価した（実験６）。メトホルミンのこの臨床未満用量の組合せを次にミックスと組み合わせて試験する（実験７）。
【０１８１】
実験６：メトホルミンについての用量応答（４週の食餌）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、実験の最後の７日間に１日２回（１２時間毎）異なる濃度（ＰＢＳ中に希釈、ｐＨ７．７）においてメトホルミンを経口投与した。ＨＦＤ−ＣおよびＬＦＤ−Ｃマウスにビヒクル（ＰＢＳ）を与えた。ｉｐＧＴＴを行ったところ（ｎ＝５〜７／群）、３００ｍｇ／ｋｇ／ｄにおいて与えた場合にメトホルミンは耐糖能を有意に改善させた。
【０１８２】
マウスに４週間ＨＦＤを給餌し、最後の週に経口胃管栄養法によりメトホルミンを１日２回与えた。予想の通り、ＨＦＤを４週間給餌した後にマウスはＬＦＤマウスと比較して有意に障害を受けた耐糖能を示した（ｐ＝０．０００１）。予想の通り、１日２回のメトホルミンの注射は、ＨＦＤ対照群と比較して耐糖能を改善させたが、これは用量依存的であり、３００ｍｇ／ｋｇの非常に高濃度でのみ効果的であった（図６；ｐ＝０．００４）。メトホルミンが耐糖能を改善させない最大用量は１００ｍｇ／ｋｇ体重であると決定された。
【０１８３】
実験７：ミックス（４週の食餌）と組み合わせたメトホルミン
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、最後の７日間（１２時間毎）１日当たり１００ｍｇ／ｋｇ（ＰＢＳ中に希釈、ｐＨ７．７）においてメトホルミンを経口投与した。ｉｐＧＴＴの１時間前にマウスにそれぞれミックスまたは生理食塩水を与えた（ｎ＝６〜７／群）。
【０１８４】
実験６においてメトホルミンの最大非有効用量は１００ｍｇ／ｋｇ体重であると決定され、最大非有効用量のミックス（０．３３ｍｇ／ｋｇ体重、実験４）とのこの濃度のメトホルミンの併用投与により潜在的な相乗効果を決定した。マウスに４週間ＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかを与え、実験の最後の７日間経口胃管栄養法によりメトホルミンを連日与えた（実験６と同様）。ｉｐＧＴＴの１時間前に、マウスにミックスを経口により与えた。予想の通り、耐糖能はＬＦＤマウスと比較してＨＦＤ対照動物において有意に障害を受けた（図６；ｐ＝０．０００２）。実験６と同様に、メトホルミン処置マウスとＨＦＤ対照マウスとの間に差異はなく、単独での用量は効果的でないことが確認された（図６Ａ）。この実験において、ミックスは単独で耐糖能をわずかに改善させることができ（図６Ｂ；ｐ＝０．０３０８）、メトホルミンおよびミックスを与えた群においてＡＵＣの有意な減少の強い傾向があった（図６Ｄ、ｐ＝０．０８１）。
【０１８５】
実験８および９：ミックスと組み合わせたプラムリンチド
実験６および７におけるメトホルミンを用いて使用した同じ手順をプラムリンチドを用いても使用した。最初に、ＨＦＤ給餌マウスにおけるプラムリンチドの最大非有効用量を決定した後、最大非有効用量のミックスおよび最小非有効用量のプラムリンチドの併用投与を行った。
【０１８６】
実験８：プラムリンチドについての用量応答（４週の食餌）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、最後の５日間（１２時間毎）連日で異なる濃度（ＰＢＳ中に希釈、ｐＨ７．７）においてプラムリンチドをｓ．ｃ．により与えた。ｉｐＧＴＴを行ったところ（ｎ＝５〜７／群）、１ｍｇ／ｋｇ／ｄにおいて与えた場合にプラムリンチドは耐糖能を有意に改善させた。
【０１８７】
マウスに４週間ＨＦＤを給餌し、５日間１日２回プラムリンチドを皮下（ｓ．ｃ．）に与えた。予想の通り、ＨＦＤのマウスはＬＦＤのマウスと比較して有意に障害を受けた耐糖能を有した（ｐ＝０．０００２）。１０００μｇ／ｋｇ／ｄ体重の試験した最大用量において、プラムリンチドはＨＦＤのマウスに注射したビヒクルと比較して耐糖能を有意に改善させた一方（ｐ＝０．０４９７）、他の濃度はグルコースホメオスタシスに対して有意な効果を有しなかった（図８）。
【０１８８】
実験９：ミックス（４週の食餌）と組み合わせたプラムリンチド
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤを給餌し、最後の５日間２００μｇ／ｋｇ／ｄ（ＰＢＳ中に希釈、ｐＨ７．７）においてプラムリンチドをｓ．ｃ．により投与した。ｉｐＧＴＴの１時間前にマウスにそれぞれミックスまたは生理食塩水を与えた（ｎ＝１２〜１５／群）。
【０１８９】
マウスに４週間ＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかを与え、最後の５日間に最大非有効用量のプラムリンチド（２００μｇ／ｋｇ／ｄ体重）またはビヒクル（ＰＢＳ）を用いて処置した。２群のマウスにｉｐＧＴＴの１時間前に経口胃管栄養法によりプラムリンチドまたは生理食塩水に加えて最大非有効用量（０．３３ｍｇ／ｋｇ体重）のミックスを与えた。予想の通り、耐糖能はＬＦＤマウスと比較してＨＦＤ対照マウスにおいて有意に障害を受けた（ｐ＜０．０００１）。予期した通り、２００μｇ／ｋｇ／ｄ体重の単独のプラムリンチド（図９Ａ）および０．３３ｍｇ／ｋｇ体重のミックス（図９Ｂ）のいずれも個々に耐糖能を改善させることはできなかったが、組合せで与えた場合、耐糖能はビヒクルを与えたＨＦＤマウスと比較して有意に改善された（図９Ｃおよび図９Ｄ；ｐ＝０．０１７８）。これらのデータは、プラムリンチドおよびミックスは耐糖能の改善に関する相乗効果を明らかにすることをサポートする。
【０１９０】
実験１０：視床下部におけるインスリンシグナリングに対するミックスおよび抽出物の効果
分子メカニズムを調べるためならびにミックスおよび抽出物の分子標的を同定するために、マウスに４週間ＨＦＤまたはＬＦＤのいずれかを給餌した後、経口胃管栄養法によりミックス（各３．３ｍｇ／ｋｇ体重）または抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ）を激しく用いた処置を行った。経口胃管栄養の１時間後、マウスに経心腔的灌流を行い、灌流の１５分前にインスリンをｉ．ｐ．（１ｍｇ／ｋｇ体重）により与え、脳を分子解析のために調製した。インスリンシグナル伝達経路の標的タンパク質ｐＡＫＴを免疫組織化学により可視化し、ｐＡＫＴ免疫応答性細胞を計数することにより定量化した。
【０１９１】
経心腔的灌流の１５分前に、インスリン（１ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルのいずれかを注射してインスリンシグナル伝達経路を活性化させた。インスリンの投与は、ビヒクル注射群と比較してそれぞれＬＦＤ（ｐ＜０．０００１）給餌マウスおよびＨＦＤ（ｐ＜０．０００１）給餌マウスの両方の視床下部の弓状核においてｐＡＫＴ陽性細胞を著しく増加させた。ｐＡＫＴ陽性細胞の基本的な数は、ＬＦＤと比較してＨＦＤを給餌したマウスにおいてより多かったが、インスリンはＨＦＤ（ｐ＝０．０４７９）マウスと比較してＬＦＤマウスにおいてより大きい程度でｐＡＫＴ陽性細胞の数を増加させた。これは、４週間ＨＦＤを給餌したマウスは弓状核においてインスリン感受性が低減したことを示唆する。ミックス（ｐ＝０．０２５７）および抽出物（ｐ＝０．０４１９）は共に、この低減されたインスリン感受性を逆転させることができ、弓状核内のｐＡＫＴ陽性細胞の数は健常ＬＦＤ対照マウスと同等であった（図１０および図１１）。
【０１９２】
実験１１：インスリン負荷試験（ＩＴＴ）
この実験は、インスリン感受性を改善させる抽出物の潜在的な力価を決定するために実行し、ＩＴＴを行った。マウスを抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて激しく処置した後、インスリン注射（１ｍｇ／ｋｇ）を与えた。
【０１９３】
マウスに４週間ＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかを与えた後、経口胃管栄養法により激しく抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ）、ミックス（１ｍｇ／ｋｇ体重）またはビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）を用いてＨＦＤ給餌マウスを処置し、１時間後にＩＴＴを行った。４週間のＨＦＤの後、ＬＦＤと比較してインスリン感受性は有意に障害を受けた（ｐ＜０．００１）。ミックス（図１２ｂ）はインスリン感受性に対して効果を有しなかったが、抽出物（図１２ａ）はインスリン感受性を有意に改善させた（ｐ＝０．０４１６；図１２ｃ）。
【０１９４】
実験１２〜１４：抽出物の慢性投与−ＧＴＴ、脳炎症の免疫組織化学解析（ＧＦＡＰおよびｐＩκＢα）ならびに肝臓組織のＯｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ染色（ＯＲＯ）
これらの実験は、抽出物の長期効果について試験するために実行し、マウスに４週間（ＧＴＴ）または５週間（免疫組織化学および肝臓病理組織診断）ＨＦＤまたはＬＦＤのいずれかを給餌し、同時に経口胃管栄養法により１日１回抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を投与した。４週後にＧＴＴを行い、５週後にマウスに経心腔的灌流（４％のＰＦＡ）を行い、脳を分子解析のために調製した。免疫組織化学解析を炎症性マーカーＧＦＡＰ（星状膠細胞）およびｐＩκＢα（ＮＦκＢシグナル伝達経路）について脳切片に対して実行した。さらには、肝臓組織を切除した後、灌流を行って肝臓病理について解析した。
【０１９５】
実験１２：抽出物の慢性投与−ＧＴＴ（４週の食餌）
マウスに４週間ＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかを与え、１日目から経口胃管栄養法により１日１回抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ体重）を与えた。４週後、ＨＦＤを給餌したマウスにおいて体重増加は有意に増加したが（ｐ＜０．００１）、ＨＦＤ−Ｃ群とＨＦＤ−抽出物群との間で変化しなかった。体重増加と類似して、累積の摂食はＨＦＤ群において有意に増加したが（ｐ＜０．０００１）、ＨＦＤ−Ｃ動物とＨＦＤ−抽出物動物との間で同一であった。さらには、ＨＦＤ給餌動物はＬＦＤ給餌動物と比較して有意に障害を受けた耐糖能を示した（ｐ＜０．０００１）。体重増加および摂食に変化はなかったにもかかわらず、４週間の抽出物を用いた慢性処置は、ＨＦＤ−Ｃ動物と比較して耐糖能を有意に改善させた（ｐ＝０．０１６６、一元分散分析；図１３）。
【０１９６】
実験１３：抽出物の慢性投与−ＧＦＡＰ染色（５週の食餌）
マウスに５週間ＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかを与え、同時に経口胃管栄養法により１日１回抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ体重）を用いて処置した。５週後、マウスに経心腔的灌流（４％のＰＦＡ）を行い、脳を分子解析のために調製した。マウス脳冠状切片（３０μｍ）をＧＦＡＰについて染色し、視床下部の弓状核（ＡＲＣ）内の免疫応答性細胞を処置に対して盲検とされた２人の研究者により計数した。マウス脳の免疫組織化学解析は、ＨＦＤにより引き起こされた視床下部の弓状核の星状膠細胞の数の有意な増加を明らかにした（ｐ＝０．００４５）。対照的に、抽出物の投与は、この効果を部分的に逆転させ、抽出物を用いて処置したマウスは、ＨＦＤ−Ｃマウスと比較して星状膠細胞の数の有意な低減を示した（ｐ＝０．０４７９；図１４）。
【０１９７】
実験１４：抽出物の慢性投与−肝臓重量、Ｈ＆ＥおよびＯＲＯ染色
この実験は肝臓脂肪含有量を評価し、脂肪組織における起こり得る形態学的変化を解明するために、我々は肝臓組織のＯＲＯ染色の他にＨ＆Ｅ染色を行った。マウスに５週間ＬＦＤまたはＨＦＤのいずれかを与え、同時に経口胃管栄養法により１日１回抽出物（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ体重）を用いて処置した。５週後、経心腔的灌流の直前に肝臓組織を切除し、液体窒素中にスナップ凍結した。肝臓を８μｍの切片に切断し、Ｈ＆ＥおよびＯＲＯ染色を行って肝臓形態を解析した。さらには、肝臓を解剖することにより総肝臓重量を決定した。
【０１９８】
肝臓Ｈ＆Ｅ染色、肝臓ＯＲＯ染色および総肝臓重量のいずれにおいても群間の差異は検出されなかった（図１５）。
【０１９９】
実施例２：抽出物および純粋なアントクロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性
ダリア「Ｒｕｓｋｉｎ  Ｄｉａｎｅ」抽出物の水性緩衝液への溶解／分散の実験を実行した。ＲＰＬＣ分析は、経時的に組成の大きな変化を示した。
【０２００】
緩衝化された抽出物の不安定性の原因を確認するために、ｐＨ７の水性緩衝液中でブテインの安定性を評価した（ブテインはｐＨ４において安定であった）。ブテインのエタノール（ＥｔＯＨ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれかの溶液を室温で水性緩衝液中に希釈した場合にブテインのスルフレチンへの経時的な線形（０次速度論）変換があった（図１６）。対照的に、ブテインは、ＥｔＯＨ中に希釈して周囲条件下で貯蔵した場合に安定であった（図１６）。ブテインは、ｐＨ７の緩衝溶液中の限られた溶解性を有し、したがって、ある程度のＥｔＯＨが溶解性の目的のために必要とされた。
【０２０１】
ブテインのスルフレチンへの変換は酸化的環化である。酸素を除外しようとする試みは反応を緩慢化させたが、光の除外およびラジカル阻害剤の添加は反応速度に対して効果を有しなかった。
【０２０２】
ダリア抽出物はブテインのスルフレチンへの同じ変換を示したが、イソリキリチゲニンははるかにより緩徐に濃度を減少させ、イソリキリチゲニンについて対応するオーロンのＲＰＬＣピークは観察されなかった。
【０２０３】
実施例３：高脂肪食または低脂肪食を給餌したマウスにおける血清インスリン濃度
マウスに６０％の脂肪を含有する高脂肪食（ＨＦＤ；カタログ番号Ｄ１２４９２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）または１０％の脂肪を含有する低脂肪食（ＬＦＤ；カタログ番号Ｄ１２４５０Ｂ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）のいずれかを４週間給餌した。各試験群におけるインスリンレベルをＥＬＩＳＡにより決定した（ｎ＝３３／群）。ＨＦＤのマウスの平均血清インスリン濃度は約０．７５ｎｇ／ｍｌ（ｐ＝／＜０．００１）であり、ＬＦＤのマウスの平均血清インスリン濃度（約０．４８ｎｇ／ｍｌ）より有意に高かった（図１７を参照）。これらの結果は、ＨＦＤのマウスは高インスリン血症であったことを示唆する。
【０２０４】
実施例４：植物の異なる成熟ステージにおいて回収されたダリア花弁の抽出物中に含有される化合物の分析
花弁（小花）を異なる成熟ステージの５つの新鮮なダリアの花の包葉および花托から除去した。これらは、中央が閉じたまま（ｉｎｔａｃｔ）（閉じている）の小さい花から、中央が完全に開いた完全に成熟した大きい花まで多様であった。１部の花弁対３部のエタノールの比を使用して、新鮮な花弁をエタノール（９６％）中に抽出し、Ｔ＝２時間およびＴ＝２日においてサンプリングした。抽出物をＲＰＬＣにより分析し、結果を図２０に示す。
【０２０５】
実施例５：前糖尿病および２型糖尿病の治療におけるＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱの組合せの有効性を評価する臨床試験
この臨床試験は、ヒトにおけるグルコース代謝の改善における本発明の組成物の安全性および有効性の最初の証拠を提供する。
【０２０６】
研究の設計および方法：
【０２０７】
設計：この試験は、経口グルコース負荷後のグルコース代謝に対する異なる用量の本発明の組成物の効果の逐次的なクロスオーバー二重盲検研究として設計された。
【０２０８】
参加者：前糖尿病または糖尿病を有する１４人の男性参加者をこの研究に登録した。これらの参加者のうち、１０人は治療を完了し、全ての投与量レベルが試験され、これらの参加者についての結果を以下の表６〜９に概説する。全ての参加者は４１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ〜６０ｍｍｏｌ／ｍｏｌのＨｂＡ１ｃレベルを記録した。ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルが４１〜４９ｍｍｏｌ／ｍｏｌの場合に参加者は前糖尿病を有すると考え、ＨｂＡ１ｃレベルが５０〜６０ｍｍｏｌ／ｍｏｌの場合に参加者は糖尿病を有すると考えた。
【０２０９】
除外：
ａ．メトホルミン以外の経口医薬を必要とするもしくはインスリン療法を必要とする２型糖尿病の任意の以前もしくは現在の病歴；
ｂ．１型糖尿病の任意の以前もしくは現在の病歴；
ｃ．生活様式管理もしくはメトホルミン単独治療以外の前糖尿病／糖尿病のための任意の他の治療を受けている；
ｄ．以前の肥満手術；
ｅ．肝臓疾患もしくは正常値上限（ＵＬＮ）の少なくとも３倍のアスパラギン酸トランスアミナーゼ対アラニントランスアミナーゼの比（ＡＳＴ／ＡＬＴ）；
ｆ．腎疾患もしくは６０未満の推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）；ならびに／または
ｇ．既知の心臓疾患。
【０２１０】
組成物の調製：本明細書に記載した液体抽出方法論にしたがってダリア植物材料を抽出した。残留抽出剤を除去して、粉末状固体として抽出物を得た。３単位用量の配合物を調製して３つの異なる濃度の活性物質の組合せのカプセルを得た：（ｉ）５ｍｇ；（ｉｉ）２０ｍｇ；および（ｉｉｉ）５０ｍｇ。各単位用量の配合物を調製するために、適切な量の粉末状固体抽出物を、総質量を構成するための適切な量の微結晶セルロースと合わせ、それを次にヒドロキシプロピルメチルセルロースカプセルシェルに充填した。各カプセルについて指定される用量は、カプセル中に含有される粉末状固体抽出物の質量に関する。例えば、５０ｍｇのカプセルを調製するために、５０ｗｔ％の粉末状固体抽出物と５０ｗｔ％のＭＣＣとの混合物を調製した後、凍結乾燥し、ＨＰＭＣカプセルシェルに充填した。各カプセル内に含有される医薬組成物（例えば、ＢＴＮ、ＳＬＦおよびＩＬＱならびに１つまたは複数の賦形剤を含む）の総質量は約１１０ｍｇ〜約１２０ｍｇであった。５ｍｇのカプセルおよび２０ｍｇのカプセルについて、５０ｍｇのカプセルのために調製した適切な量の混合物をカプセルシェルに充填し、追加のＭＣＣを加えて、各カプセルシェルが満たされることを確実にした。この実施例において使用される場合、「５ｍｇのカプセル」は約５．８５ｍｇの抽出物を含有し、「２０ｍｇのカプセル」は約２３．４ｍｇの抽出物を含有し、「５０ｍｇのカプセル」は約５８〜５９ｍｇの抽出物を含有した。
【０２１１】
以下のプロトコールにしたがって各カプセル中のＢ、ＳおよびＩの相対量を測定し、この分析の結果を以下の表５に提供する。各カプセルの含有量を計量し、５０：５０のＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ（１ｍｌ）中への抽出を超音波処理と共に行った。試料を濾過し（０．４５μｍナイロン）、ＨＰＬＣ分析の前に１／１０において５０：５０のＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ中に希釈して、ＨＰＬＣの検出限界内にそれらを保った。全カプセルの結果を、測定された質量および希釈について訂正した。２×４ｍｍ  Ｃ１８ガードカラムを用いてＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ＯＤＳ（３）５μｍ  １００Å  １５０×３ｍｍ）上で２０℃において、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＯｐｅｎＬａｂを用いて制御されたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００を使用して分析的逆相ＨＰＬＣを実行した。移動相の流速は０．５ｍｌ／分であり、共に０．１％のギ酸を含む、Ｈ２Ｏ（Ｂ）中にＭｅＣＮ（Ａ）を含み、以下の通りにプログラムした：０分（ｔ０）においてＡ  １０％、１２．５分（ｔ１２．５）におけるＡ  １００％まで線形的に増加させ、１５分（ｔ１５）までＡ  １００％に保持し、１６分（ｔ１６）におけるＡ  １０％まで線形的に減少させ、２０分（ｔ２０）まで１０％に保持する。ピークを３８２ｎｍにおいて検出し、純粋な化合物を用いた軟正からの応答係数を使用して定量化した。
【表５】
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【０２１２】
５ｍｇの単位用量（表５のエントリー１〜３）について、ＳＬＦの濃度は約０．０９ｗｔ％〜約０．１５ｗｔ％であり、ＢＴＮの濃度は約０．１８ｗｔ％〜約０．２５ｗｔ％であり、ＩＬＱの濃度は約０．１ｗｔ％〜約０．１５ｗｔ％であった。２０ｍｇの単位用量（表５のエントリー４〜６）について、ＳＬＦの濃度は約０．４ｗｔ％〜約０．５ｗｔ％であり、ＢＴＮの濃度は約０．７５ｗｔ％〜約０．８５ｗｔ％であり、ＩＬＱの濃度は約０．４５ｗｔ％〜約０．５５ｗｔ％であった。５０ｍｇの単位用量（表５のエントリー７〜９）について、ＳＬＦの濃度は約０．９５ｗｔ％〜約１．０５ｗｔ％であり、ＢＴＮの濃度は約１．７ｗｔ％〜約２ｗｔ％であり、ＩＬＱの濃度は約１ｗｔ％〜約１．２ｗｔ％であった。これらの３つの単位用量のそれぞれについて、ＳＬＦ：ＢＴＮ：ＩＬＱの比は約１：約１．８：約１．１であった。
【０２１３】
研究プロトコール：登録および組成物への曝露は逐次的な拡大的順序で行った。登録された１人目は、次の２人の参加者への投与の前に全ての用量を完了した。これらの２人は、次の４人の参加者の前に研究を完了した、などのことを行った。
【０２１４】
研究における登録の前に、参加者は、過去３か月以内にこれらが行われなかった場合、（ａ）ＨｂＡ１ｃ、（ｂ）肝臓機能、（ｃ）腎臓機能、および（ｄ）スクリーニングの時点において医師により適切であるとみなされる任意の追加の試験について、心電図（ＥＣＧ）およびスクリーニング血液検査を受けた。
【０２１５】
参加者は、１２時間の終夜の絶食後に標準的な７５ｇの経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）を受けた。標準的なＯＧＴＴでは、２２２ｍＬのグルコーラの形態で５分にわたり７５ｇのグルコース溶液が経口投与される。各参加者は、グルコース、インスリンおよびＣペプチド濃度の分析のために、−５分および０分および次に３時間にわたり３０分間隔で静脈血試料を採取された。各時点は、グルコース投与と比較して測定された。血液試料を各時点においてシュウ酸塩／フッ化物チューブおよびＥＤＴＡチューブ中に採取した。ＥＤＴＡチューブは氷上で収集した。全てのチューブを収集の３０分以内に遠心分離した後、ピペットを介してクライオバイアルに移し、分析まで収集の１時間以内に−８０度に凍結した。血漿グルコース、ｃペプチドおよびインスリン濃度を各試料から決定した。初期ＯＧＴＴの結果は、参加者によるグルコース調節についての「ベースライン」または対照として働く。
【０２１６】
参加者はまた、少なくとも１週間の間隔で３つのさらなる機会に研究センターに通い、漸増用量の以下の投与量レベル：（１）１５ｍｇ／ｍ２、（２）３０ｍｇ／ｍ２および（３）６０ｍｇ／ｍ２を与えられる。これらのその後の訪問のそれぞれにおいて、各参加者は、繰返しの７５ｇのＯＧＴＴの１時間前に本発明の組成物を用いた処置を受けた。所望の投与量の投与を達成するために、必要とされる数の上記したようなカプセルを水と共に経口投与した。血液収集およびサンプリングを上記のベースラインＯＧＴＴ試験プロトコールと同様に実行し、追加の血液試料を組成物の投与の前に収集した。
【０２１７】
心拍数、血圧、呼吸数、酸素飽和および温度といった観察の全セットもまた組成物の摂取後計５時間にわたり３０分毎に記録した。
【０２１８】
結果
【０２１９】
４つ全ての処置セッションを完了した１０人の参加者についての結果を表６（グルコース濃度）、表７（インスリン濃度）および表８（Ｃペプチド濃度）に概説する。本出願の出願時において、各投与量レベルにおける完全な処置が完了していない他の参加者が研究に登録されており（結果は示さず）、さらなる参加者の登録が継続中である。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０２２０】
データ解析：ベースラインから１８０分まで３０分間隔で測定したグルコース濃度を各投与量レベル（１）〜（３）における処置および対照介入（ベースライン）の結果について要約した。分析者は分析の間にいずれの投与量が各投与量レベル（１）〜（３）に対応するかの詳細について盲検とされた。血中グルコース濃度を、各投与量レベルについて各参加者についての「曲線下面積」（ＡＵＣ）として１８０分にわたり合わせた。分析は、特定の投与量レベルにおける処置および／またはベースラインを完了したが全ての投与量レベルにおける処置を完了していない参加者からのデータを含む全ての利用可能なデータを含む（未加工データは示さず）。ＡＵＣはそのため、１８０分にわたる総グルコース「曝露」を表す。反復測定分散分析（分散分析）を使用してＡＵＣを群間で比較し、反復測定分散分析（分散分析）は、クロスオーバーデザインを可能とし、各参加者は用量介入の範囲を受ける。分散分析からの結果を９５％信頼区画と共に平均として要約し、最小有意差検定を使用してペアワイズ方式で用量群を比較した。両側ｐ値＜０．０５を統計的有意性を指し示すものとした。この分析の結果を表９ならびに図１７および図１８に示す。類似の分析をインスリンおよびＣペプチド濃度の結果について行った（図示せず）。
【表９】
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【０２２１】
全ての投与量は血中グルコースレベルの低減を実証した。ＡＵＣの結果は、６０ｍｇ／ｍ２の投与量の投与後の参加者についてのグルコース曝露の統計的に有意（ｐ＝０．０１）な低減を示す。ＯＧＴＴにわたるグルコース曝露の総低減は、ベースラインと比較した場合にＡＵＣにおける約９％の差異に対応する（表９および図２２を参照）。より低い投与量レベルについての結果は、追加の参加者からのさらなるデータの追加と共に試験の完了時に有意性を示す可能性がある。さらに、任意の用量（１５ｍｇ／ｍ２〜６０ｍｇ／ｍ２）を与えられた後の参加者により副作用は報告されなかった。有害効果は、安全性の血液検査、腎臓機能、肝臓機能または全血球数において観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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