(57)【要約】  本明細書中に開示されている組成物はプライマーを含有しており、本プライマーは、（ａ）標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であるループ可能プライマー、あるいは（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、あるいは（ｃ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、または、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、のうちのいずれかのプライマーに該当するものである。また、鋳型ＤＮＡから対象の標的遺伝子座を増幅するための方法も、開示されている。本方法は、ループ可能プライマー、スプリットプライマーおよび／またはスプリットループ可能プライマーを使用する少なくとも２回の予備増幅サイクルを含み、各増幅サイクルは、プライマーを鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングし、アニーリングされたプライマーを伸長することを含む。更に、対象の標的遺伝子座を増幅するためのキットも、開示されている。本キットは、ループ可能プライマー、スプリットプライマー、および／またはスプリットループ可能プライマーを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー含有の組成物であって、前記プライマーが、以下：
（ａ）標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、前記ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、前記ループ可能プライマー、または
（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、または
（ｃ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、または、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーである、組成物。
【請求項２】
前記プライマーがループ可能プライマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションと前記ステム形成セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、
前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションと前記アダプターセクションとの間に位置する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記アダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記３’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループが形成される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの５’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含み但し前記標的特異的セクションの前記３’端部分を含まないループが形成される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記５’側に位置する１つ以上のＧまたはＣヌクレオチドを更に含み、任意で、前記ステム形成セクションの前記３’側に位置する１つ以上の相補的なＧまたはＣヌクレオチドにより前記ステム構造を安定化させる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも順方向ループ可能プライマーと逆方向ループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記プライマーがスプリットプライマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションのうちの１つとの間に位置する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションの３’側に位置する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも順方向スプリットプライマーと逆方向スプリットプライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記プライマーが、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アダプターセクションが、前記第２の標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記スプリットループ可能プライマーが、前記第２の標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記分子インデクシングセクションが、前記第２の標的特異的セクションの５’側および前記アダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
前記プライマーが、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第２のアダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションを含むループが形成される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第２のアダプターセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記分子インデクシングセクションが、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションとの間に位置する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記第２のアダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であって、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記３’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループが形成される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅および／または配列決定用の、ユニバーサルアダプター配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
少なくとも５０個の異なるプライマーを含み、前記プライマーの各々が異なるステム形成セクションを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
少なくとも５０個の異なるプライマーを含み、前記プライマーの各々が異なる分子インデクシング配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
少なくとも２，５００個の異なるプライマーを含み、前記プライマーの各々が前記ステム形成セクションと前記分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４１】
少なくとも２回の予備増幅サイクルを含む、鋳型ＤＮＡから対象の標的遺伝子座を増幅する方法であって、その際、以下：
（ａ）標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを備えるループ可能プライマーであって、前記ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために前記標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、前記ループ可能プライマー、または
（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、または
（ｃ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションとを含むか、または、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記方法において、
各予備増幅サイクルが、前記プライマーを前記鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングし、前記アニーリングされたプライマーを伸長することを含む、増幅方法。
【請求項４２】
前記方法が、前記ループ可能プライマーまたは前記スプリットプライマーまたは前記スプリットループ可能プライマーを使用する３回以上の予備増幅サイクルを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、前記ループ可能プライマーまたは前記スプリットプライマーまたは前記スプリットループ可能プライマーを使用する５回以上の予備増幅サイクルを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、前記ループ可能プライマーまたは前記スプリットプライマーまたは前記スプリットループ可能プライマーを使用する１０回以下の予備増幅サイクルを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記プライマーがループ可能プライマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションと前記ステム形成セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションと前記アダプターセクションとの間に位置する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記アダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシング配列とを含むループが形成される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記３’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループが形成される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの５’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含み但し前記標的特異的セクションの前記３’端部分を含まないループが形成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記５’側に位置する１つ以上のＧまたはＣヌクレオチドを更に含み、任意で、前記ステム形成セクションの前記３’側に位置する１つ以上の相補的なＧまたはＣヌクレオチドにより前記ステム構造を安定化させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、前記鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーをアニーリングし、前記アニーリングされた順方向ループ可能プライマーおよび前記アニーリングされた逆方向ループ可能プライマーを伸長することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記プライマーがスプリットプライマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５９】
前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションのうちの１つとの間に位置する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションの３’側に位置する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、前記鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向スプリットプライマーおよび逆方向スプリットプライマーをアニーリングし、前記アニーリングされた順方向スプリットプライマーおよび前記アニーリングされた逆方向スプリットプライマーを伸長することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記プライマーが、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項６４】
前記アダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記アダプターセクションが、前記第２の標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記スプリットループ可能プライマーが、前記第２の標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記分子インデクシングセクションが、前記第２の標的特異的セクションの５’側および前記アダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、前記鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーをアニーリングし、前記アニーリングされた順方向スプリットループ可能プライマーおよび前記アニーリングされた逆方向スプリットループ可能プライマーを伸長することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記プライマーが、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項７２】
前記第２のアダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションを含むループが形成される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第２のアダプターセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記分子インデクシングセクションが、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションとの間に位置する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記第２のアダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であって、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記３’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループが形成される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を前記鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーをアニーリングし、前記アニーリングされた順方向スプリットループ可能プライマーおよび前記アニーリングされた逆方向スプリットループ可能プライマーを伸長することを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを用いた複数回のＰＣＲサイクルを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項８１】
前記１つ以上のＰＣＲプライマーがそれぞれ、配列決定用アダプターおよび／またはサンプルバーコードを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
各予備増幅サイクルが、少なくとも５０個の異なるプライマーで、各プライマーが異なるステム形成セクションを含むものを、前記鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項８３】
各予備増幅サイクルが、少なくとも５０個の異なるプライマーで、各プライマーが異なる分子インデクシング配列を含むものを、前記鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項８４】
各予備増幅サイクルが、少なくとも２，５００個の異なるプライマーで、各プライマーが前記ステム形成セクションと前記分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含むものを、前記鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項８５】
対象の標的遺伝子座を増幅するためのキットであって、以下のプライマー：
（ａ）標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを備える、ループ可能プライマーであって、前記ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、前記ループ可能プライマー、または
（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、または
（ｃ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションとを含むか、または、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを具備する、キット。
【請求項８６】
ポリメラーゼを更に含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
プロテアーゼを更に含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８８】
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な、１つ以上のＰＣＲプライマーを更に含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８９】
前記１つ以上のＰＣＲプライマーがそれぞれ、配列決定用アダプターおよび／またはサンプルバーコードを含む、請求項８８に記載のキット。
【請求項９０】
前記プライマーがループ可能プライマーである、請求項８５に記載のキット。
【請求項９１】
前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションと前記ステム形成セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
前記アダプターセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項９１に記載のキット。
【請求項９３】
前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項９０に記載のキット。
【請求項９４】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションと前記アダプターセクションとの間に位置する、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記アダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシング配列とを含むループが形成される、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項９０に記載のキット。
【請求項９７】
前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記３’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループが形成される、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項９６に記載のキット。
【請求項９９】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの５’部分に対しハイブリダイズ可能である、請求項９０に記載のキット。
【請求項１００】
前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含み但し前記標的特異的セクションの前記３’端部分を含まないループが形成される、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０１】
前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記５’側に位置する１つ以上のＧまたはＣヌクレオチドを更に含み、任意で、前記ステム形成セクションの前記３’側に位置する１つ以上の相補的なＧまたはＣヌクレオチドにより前記ステム構造を安定化させる、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０２】
少なくとも順方向ループ可能プライマーと逆方向ループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項９０に記載のキット。
【請求項１０３】
前記プライマーがスプリットプライマーである、請求項８５に記載のキット。
【請求項１０４】
前記プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションのうちの１つとの間に位置する、請求項１０４に記載のキット。
【請求項１０６】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションの３’側に位置する、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
少なくとも順方向スプリットプライマーと逆方向スプリットプライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０８】
前記プライマーが、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項８５に記載のキット。
【請求項１０９】
前記アダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションを含むループが形成される、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
前記アダプターセクションが、前記第２の標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
前記スプリットループ可能プライマーが、前記第２の標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１３】
前記分子インデクシングセクションが、前記アダプターセクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置する、請求項１１２に記載のキット。
【請求項１１４】
前記分子インデクシングセクションが、前記第２の標的特異的セクションの５’側および前記アダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記第２の標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項１１３に記載のキット。
【請求項１１５】
少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１６】
前記プライマーが、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーである、請求項８５に記載のキット。
【請求項１１７】
前記第２のアダプターセクションが、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションとの間に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションを含むループが形成される、請求項１１６に記載のキット。
【請求項１１８】
前記第２のアダプターセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記ステム形成セクションの３’側に位置する、請求項１１７に記載のキット。
【請求項１１９】
前記スプリットループ可能プライマーが、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションを更に含む、請求項１１６に記載のキット。
【請求項１２０】
前記分子インデクシングセクションが、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションとの間に位置する、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
前記分子インデクシングセクションが、前記標的特異的セクションの５’側および前記第２のアダプターセクションの３’側に位置し、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループが形成される、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であって、前記ステム形成セクションと前記標的特異的セクションの前記３’部分との間のハイブリダイゼーションによって、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’端部分とを含むループが形成される、請求項１１６に記載のキット。
【請求項１２３】
前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、前記ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む、請求項１２２に記載のキット。
【請求項１２４】
少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含み、前記プライマーが、増幅用の同じ対象の遺伝子座を標的としたものである、請求項１２３に記載のキット。
【請求項１２５】
前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅および／または配列決定用の、ユニバーサルアダプター配列を含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項１２６】
少なくとも５０個の異なるプライマーの貯留物を含み、前記プライマーの各々が異なるステム形成セクションを含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項１２７】
少なくとも５０個の異なるプライマーの貯留物を含み、前記プライマーの各々が、異なる分子インデクシング配列を含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項１２８】
少なくとも２，５００個の異なるプライマーの貯留物を含み、前記プライマーの各々が前記ステム形成セクションと前記分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項１２９】
対象の標的遺伝子座のコピー数多型を判別する方法であって、
鋳型ＤＮＡから対象の前記標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）１つ以上のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記ループ可能プライマー、
（ｂ）１つ以上のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）１つ以上のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第２のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して前記予備増幅産物を増幅することと、
前記増幅産物の配列決定を行い、前記分子インデクシング配列を使用して対象の前記標的遺伝子座のコピー数多型を判別することと、
を含む、方法。
【請求項１３０】
胎児の異数性を判別する方法であって、
母体の血液サンプルから分離された無細胞ＤＮＡから、１つ以上の染色体の、複数の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）複数のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記ループ可能プライマー、
（ｂ）複数のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記分子インデクシングセクションとを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）複数のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第２のアダプターセクションと前記分子インデクシングセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して前記予備増幅産物を増幅することと、
前記増幅産物の配列決定を行い、前記分子インデクシング配列を使用して胎児の異数性を判別することと、
を含む、方法。
【請求項１３１】
マルチプレックス増幅の方法であって、
鋳型ＤＮＡから１つ以上の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーであって、前記プライマーの各々が標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含む、前記ループ可能プライマー、
（ｂ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、前記プライマーの各々が、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含む、前記スプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、前記プライマーの各々が、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１アダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループを形成しており、前記第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが、それらの標的特異的セクション内に相補的な配列を含み、前記ステム形成セクションによる保護無しの場合にプライマーの二量体が形成され得る、前記第１および第２のスプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して前記予備増幅産物を増幅することと、
を含む、方法。
【請求項１３２】
対立遺伝子特異的増幅の方法であって、
鋳型ＤＮＡから１つ以上の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを備える、ループ可能プライマーであって、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記ループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記３’部分にＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記ループ可能プライマー、
（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、前記スプリットループ可能プライマーであって、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションにＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記スプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーであって、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、前記スプリットループ可能プライマーが、前記標的特異的セクションの前記３’部分にＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して前記予備増幅産物を増幅することと、
を含む、方法。
【請求項１３３】
対立遺伝子特異的定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の方法であって、
鋳型ＤＮＡから１つ以上の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーであって、各々が、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のループ可能プライマー、
（ｂ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のスプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記第１の蛍光プローブおよび前記第２の蛍光プローブの存在下にて、前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して、前記予備増幅産物を増幅することと、
前記第１の蛍光プローブおよび前記第２の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む、方法。
【請求項１３４】
対立遺伝子特異的デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）の方法であって、
鋳型ＤＮＡから１つ以上の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーであって、各々が、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のループ可能プライマー、
（ｂ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のスプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記予備増幅することと、
前記予備増幅産物を複数の反応容量にパーティショニングすることと、
前記第１の蛍光プローブおよび前記第２の蛍光プローブの存在下にて、前記ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して、前記予備増幅産物を各反応容量にて増幅することと、
前記第１の蛍光プローブおよび前記第２の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む、方法。
【請求項１３５】
対立遺伝子特異的定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の方法であって、
前記第１の蛍光プローブおよび前記第２の蛍光プローブの存在下にて、鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を増幅することであって、その際、以下：
（ａ）少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーであって、各々が、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のループ可能プライマー、
（ｂ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、
前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のスプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のスプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記増幅することと、
前記第１の蛍光プローブおよび前記第２の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む、方法。
【請求項１３６】
対立遺伝子特異的デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）の方法であって、
鋳型ＤＮＡを含むサンプルを複数の反応容量にパーティショニングすることと、
前記第１の蛍光プローブおよび前記第２の蛍光プローブの存在下にて、鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を各反応容量にて増幅することであって、その際、以下：
（ａ）少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーであって、各々が、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のループ可能プライマー、
（ｂ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、前記第１の標的特異的セクションと前記第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、前記ステム形成セクションが、前記アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、前記第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記アダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションが、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のスプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、前記第１のアダプターセクションと前記第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、前記標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、前記ステム形成セクションが、前記第２のアダプターセクションと前記標的特異的セクションの前記５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、前記標的特異的セクションの前記３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列と、第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列とを含み、前記第１のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、前記第２のスプリットループ可能プライマーの前記標的特異的セクションの前記５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、前記第１および第２のスプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、前記増幅することと、
前記第１の蛍光プローブおよび前記第２の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６１７，０６６号の利益を主張するものであり、該文献は、その全体が、本明細書において参照により援用されている。
【０００２】
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式にて電子的に送信された配列表が含まれており、この配列表は、その全体が、本明細書において参照により援用されている。前記ＡＳＣＩＩコピーは、作成日を２０１８年１２月２７日とし、名称をＮ＿０２２＿ＷＯ＿Ｏｌ＿ＳＬ．ｔｘｔとし、且つサイズを３，８４４バイトとしたものである。
【０００３】
次世代シーケンシングにおいて使用されてきた分子バーコードまたはインデクシング配列は、分子バーコードまたはインデクシング配列で各核酸断片にタグ付けすることにより、複製によって導入される定量的な偏りを低減するものである。配列リードにおいて、分子バーコードまたはインデクシング配列がそれぞれ異なる場合、元の核酸分子どうしもがそれぞれ異なることを表す。分子バーコードまたはインデクシング配列を参照することによって、元の核酸分子内にポリメラーゼが存在しないというエラーが原因で生じた配列変化などのＰＣＲアーティファクトを同定し、元の核酸分子内に存在する実際の多型／変異から分離することが可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、分子バーコードまたはインデクシング配列を高マルチプレックスＰＣＲに適用するためには、プライマーの二量体が形成されるのを抑制すること、バーコードの再サンプリングを回避すること、非特異的プライマーを結合すること、ならびにプライマーコンカテマーの形成を低減することに対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、核酸を増幅するための組成物、方法、およびキットに関する。第１の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、プライマー含有の組成物に関するものであり、このプライマーは、以下：
（ａ）標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、ループ可能プライマー、あるいは
（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、あるいは
（ｃ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、または、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーに該当するものである。
【０００６】
第２の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、鋳型ＤＮＡから対象の標的遺伝子座を増幅する方法に関するものであり、本方法は、
少なくとも２つの予備増幅サイクルを含む。本予備増幅サイクルに使用されるプライマーは、以下：
（ａ）標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であるループ可能プライマー、あるいは
（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、あるいは
（ｃ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションとを含むか、または、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーであって、各予備増幅サイクルが、プライマーを鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングし、アニーリングされたプライマーを伸長することを含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーに該当するものである。
【０００７】
第３の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、対象の標的遺伝子座を増幅するためのキットに関するものであり、本キットに具備されるプライマーは、以下：
（ａ）標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含むループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である、ループ可能プライマー、あるいは
（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを備える、スプリットプライマー、あるいは
（ｃ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、または、第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーに該当するものである。
【０００８】
第４の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、対象の標的遺伝子座のコピー数多型を判別するため方法に関するものであり、本方法は、
鋳型ＤＮＡから対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）１つ以上のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと分子インデクシングセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、ループ可能プライマー、
（ｂ）１つ以上のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと分子インデクシングセクションとを含むループおよびステム構造を形成するために、第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、スプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）１つ以上のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、第２のアダプターセクションと分子インデクシングセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
増幅産物の配列決定を行い、分子インデクシング配列を使用して対象の標的遺伝子座のコピー数多型を判別することと、
を含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用するものである。
【０００９】
第５の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、胎児異数性を判別する方法に関するものであり、本方法は、
母体の血液サンプルから分離された無細胞ＤＮＡから、１つ以上の染色体の、複数の対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際に、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）複数のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと分子インデクシングセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、ループ可能プライマー、
（ｂ）複数のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと分子インデクシングセクションとを含むループおよびステム構造を形成するために、第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、スプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）複数のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、第２のアダプターセクションと分子インデクシングセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
増幅産物の配列決定を行い、分子インデクシング配列を使用して胎児の異数性を判別することと、
を含む。
【００１０】
第６の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、マルチプレックス増幅の方法に関するものであり、本方法は、
鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーであって、これらプライマーの各々が標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含む、第１および第２のループ可能プライマー、
（ｂ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、これらプライマーの各々が、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、ステム構造およびアダプターセクションを含むループを形成するために、第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含む、スプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、これらプライマーの各々が、第１アダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１アダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、第２のアダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、
第１のプライマーおよび第２のプライマーが、それらの標的特異的セクション内に相補的配列を含み、ステム形成セクションによる保護無しの場合にプライマーの二量体が形成され得る、第１および第２のスプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
を含む。プライマーの二量体が形成されるのを防止することは、ＰＣＲタイリング（例えば、シングルマルチプレックスＰＣＲ反応において、オーバーラップまたはタイリングされた標的配列を増幅する場合）おいて、特に有用とされる。
【００１１】
第７の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、対立遺伝子特異的増幅の方法に関するものであり、本方法は、
鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを備える、ループ可能プライマーであって、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、ループ可能プライマーが、標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分にＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、ループ可能プライマー、
（ｂ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを備える、スプリットループ可能プライマーであって、ステム形成セクションが、アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、スプリットループ可能プライマーが、標的特異的セクションにＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、スプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを備える、スプリットループ可能プライマーであって、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションは、第２のアダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含むみ、スプリットループ可能プライマーが、標的特異的セクションの３’部分にＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、スプリットループ可能プライマー、
のうちのいずれかのプライマーを使用する、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して、予備増幅産物を増幅することと、
を含む。
【００１２】
第８の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、対立遺伝子特異的定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の方法に関するものであり、本方法は、
鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１のループ可能プライマーのアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、第２のループ可能プライマーのアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列を含み、第１のループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、第２のループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、第１および第２のループ可能プライマー、
（ｂ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１のスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、第２のスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列を含み、第１のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、第２のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、第１および第２のスプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、この標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、第２のアダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１のスプリットループ可能プライマーの第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、第２のスプリットループ可能プライマーの第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列を含み、第１のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、第２のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、第１および第２のループ可能プライマー、のいずれかである、増幅することと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブの存在下にて、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して、予備増幅産物を増幅することと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む。
代替的に、対立遺伝子特異的ｑＰＣＲのための方法は、予備増幅ステップを必要とせず、代わりに、第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブの存在下にて（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のプライマーを使用して、鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を増幅することと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む。
【００１３】
第９の態様において、本明細書中に記載されている本発明は、対立遺伝子特異的デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）の方法に関するものであり、本方法は、
鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、その際、少なくとも２回の予備増幅サイクルを用い、以下：
（ａ）少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーであって、各々が標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１のループ可能プライマーのアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、第２のループ可能プライマーのアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列を含み、第１のループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、第２のループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、第１および第２のループ可能プライマー、
（ｂ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、アダプターセクションを含むループおよびステム構造を形成するために、第２の標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１のスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、第２のスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列を含み、第１のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、第２のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、第１および第２のスプリットループ可能プライマー、あるいは
（ｃ）少なくとも第１のスプリットループ可能プライマーおよび第２のスプリットループ可能プライマーであって、各々が第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、この標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、第２のアダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分を含むループおよびステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１のスプリットループ可能プライマーの第１および／または第２のアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、第２のスプリットループ可能プライマーの第１および／または第２のアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列を含み、第１のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、第２のスプリットループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、第１および第２のループ可能プライマー、のいずれかである、増幅することと、
予備増幅産物を複数の反応容量にパーティショニングすることと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブの存在下にて、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して、予備増幅産物を各反応容量にて増幅することと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む。
代替的に、対立遺伝子特異的ｄＰＣＲのための方法は、予備増幅ステップを必要とせず、代わりに、
サンプルを複数の反応容量にパーティショニングすることと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブの存在下にて（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のプライマーを使用して、鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を増幅することと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む。
【００１４】
これらの特徴および他の特徴、ならびにその編成および操作方法は、添付の図面と併せて解釈することにより、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本明細書に記載されているプライマーのいくつかの実施形態（スキームＡ〜Ｃ、および対照スキーム）を示す。
【図２】標的特異的セクションの３’端部分が相補的配列を有するステム構造を形成するように構成されている、ループ可能プライマーの一実施形態を示す。
【図３】標的特異的セクションの５’端部分が相補的配列を有するステム構造を形成するように構成されている、ループ可能プライマーの一実施形態を示す。
【図４】標的特異的セクションが５’端部分および３’端部分にスプリットされ、これらの端部分がアダプター配列によって分離されている、スプリットパラメータの一実施形態を示す。
【図５】本明細書中に記載されているプライマーを使用した２回の予備増幅サイクルを含む、増幅プロセスのワークフローの実施例を示す。
【図６】本明細書中に記載されているプライマーを使用した２回の予備増幅サイクルを含む、例示的な増幅プロセスの目標達成率を示す。
【図７】本明細書中に記載されているプライマーを使用した３回または１０回の予備増幅サイクルを含む、増幅プロセスのワークフローの実施例を示す。
【図８】本明細書中に記載されているプライマーを使用した３回または１０回の予備増幅サイクルを含む、例示的な増幅プロセスの目標達成率を示す。
【図９】反復試験サンプル間でＭＩＴ計数が一貫していることを示す（スキームＡ、２回の予備増幅サイクル）。
【図１０】ループ可能プライマーの２つの不適合ヌクレオチド（ｎｔ）を含む、ループ可能プライマーの一実施形態によるプライマーおよび産物配列を示す。
【図１１】ループ可能プライマーの一実施形態によるプライマーおよび産物配列を示す。
【図１２】スプリットプライマーの一実施形態によるプライマーおよび産物配列を示す。
【図１３】本明細書中に記載されているスプリットループ可能プライマーのいくつかの実施形態（スキームＤ〜Ｅ）を示す。
【図１４】高マルチプレックスＰＣＲにおいて、反復試験サンプル間でＭＩＴ計数が一貫していたことを示す（スキームＡ、２回の予備増幅サイクル、図５のワークフロー）。この実施例の増幅プロセスの目標達成率は８３％である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明を実施することを目的として本発明者らによって想到された本発明のいくつかの具体的な実施形態について、これから、詳しく言及していく。これら具体的な実施形態の或る具体的な実施例は、添付の図面に例証されている。これらの具体的な実施形態に関連して、本発明が記載されているが、当然のことながら、本発明を記載の実施形態だけに限定することは意図されていない。対照的に意図されているのは、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲内に含まれ得るような代替物、修正物、および同等物を網羅することである。
【００１７】
本発明に関する理解が徹底されるように、多数の具体的な詳細を、下記説明に記載する。本発明の特定の例示的実施形態は、これらの特定の詳細の一部または全てを用いることなしに実装することが可能である。
【００１８】
本発明の様々な技術および機序は、明確さを期して、時には単数形で記載されることもある。但し、いくつかの実施形態は、別途明記されていない限り、技法を複数回にわたって反復すること、または機序を複数回にわたってインスタンス化することを含むことに留意すべきである。
【００１９】
本明細書において参照により援用されている特許出願の開示は、以下の通り：「ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＣＬＥＡＮＩＮＧ  ＮＯＩＳＹ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＤＡＴＡ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＤＡＴＡ  ＴＯ  ＭＡＫＥ  ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮＳ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００６／０４５２８１号、「ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＣＬＥＡＮＩＮＧ  ＮＯＩＳＹ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＤＡＴＡ  ＡＮＤ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＩＮＧ  ＣＨＲＯＭＳＯＭＥ  ＣＯＰＹ  ＮＵＭＢＥＲ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００８／００３５４７号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＥＬＬ  ＧＥＮＯＴＹＰＩＮＧ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／０３４５０６号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＥＭＢＲＹＯ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／０４５３３５号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＡＬＬＥＬＥ  ＣＡＬＬＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＬＯＩＤＹ  ＣＡＬＬＩＮＧ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／０５２７３０号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＯＮ−ＩＮＶＡＳＩＶＥ  ＰＲＥＮＡＴＡＬ  ＰＬＯＩＤＹ  ＣＡＬＬＩＮＧ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１０／０５０８２４号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＯＮ−ＩＮＶＡＳＩＶＥ  ＰＲＥＮＡＴＡＬ  ＰＬＯＩＤＹ  ＣＡＬＬＩＮＧ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０３７０１８号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＯＮ−ＩＮＶＡＳＩＶＥ  ＰＲＥＮＡＴＡＬ  ＰＬＯＩＤＹ  ＣＡＬＬＩＮＧ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０６１５０６号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＯＮ−ＩＮＶＡＳＩＶＥ  ＰＲＥＮＡＴＡＬ  ＰＡＴＥＲＮＩＴＹ  ＴＥＳＴＩＮＧ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０６６９３８号、「ＨＩＧＨＬＹ  ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ  ＰＣＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０６６３３９号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＲＥＤＵＣＩＮＧ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＣＯＮＴＡＭＩＮＡＴＩＯＮ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０５５２０５号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ  ＦＥＴＡＬ  ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＩＮ  ＭＡＴＥＲＮＡＬ  ＢＬＯＯＤ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０５７９２４号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＩＮＧ  ＬＯＷ  ＦＥＴＡＬ  ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０５１９２６号、「ＰＲＥＮＡＴＡＬ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  ＲＥＳＴＩＮＧ  ＳＴＡＮＤＡＲＤＳ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０５７８４３号、「ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＰＬＯＩＤＹ  ＩＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＡＬ  ＳＥＧＭＥＮＴＳ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０２６９５７号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＩＮＧ  ＰＬＯＩＤＹ」と題した国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０３１６８６号、および「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＮＵＬＣＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」と題した米国特許出願第１５／３７２，２７９号である。
【００２０】
ループ可能プライマー
【００２１】
本明細書に記載されている本発明の実施形態の多くは、標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを備える、ループ可能プライマーに関するものであり、本ループ可能プライマーにおいて、ステム形成セクションは、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの一部分に対しハイブリダイズ可能である。標的特異的セクションは、増幅用の鋳型ＤＮＡの標的配列に対しハイブリダイズ可能である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、アダプターセクションが標的特異的セクションとステム形成セクションとの間に位置し、ステム形成セクションと標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、アダプターセクションを含むループが形成される。アダプターセクションは、例えば、標的特異的セクションの５’側、およびステム形成セクションの３’側に、位置する場合がある。いくつかの実施形態では、アダプターセクションに、ＰＣＲ増幅および／または配列決定用の、ユニバーサルアダプター配列が含まれている。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ループ可能プライマーに、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションが更に含まれている。分子インデクシング配列、分子インデックスタグ（ＭＩＴ）、または一意の識別子（ＵＩＤ）配列は、Ｋｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １０８（２３）：９５３０−９５３５  （２０１１）、ならびに、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＮＵＬＣＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」と題した米国特許第１５／３７２，２７９号に記載されており、これらの文献の各々は、その全体が、本明細書において参照により援用されている。いくつかの実施形態では、各分子インデクシング配列の長さは、約１〜２０ｂｐ、または約２〜１５ｂｐ、または約３〜１０ｂｐ、または約４〜８ｂｐである。本明細書に記載されている本発明による順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーの両方を、対象の標的遺伝子座を増幅する目的に使用する場合、増幅産物に、２つの分子インデクシング配列を含めてもよい。こうした分子インデクシング配列の組み合わせによって、シングル分子インデクシング配列を使用した場合よりも、なお更に精確な分子計数が可能となる。一実施形態において、各ループ可能プライマー上の分子インデクシング配列は、一意な分子インデクシング配列とされる。別の実施形態において、ループ可能順方向および逆方向プライマーの各ペア上の分子インデクシング配列の組み合わせは、一意とされる。
【００２４】
分子インデクシングセクションは、例えば、標的特異的セクションとアダプターセクションとの間に位置する場合がある。分子インデクシングセクションは、例えば、標的特異的セクションの５側、およびアダプターセクションの３’側に位置する場合がある。いくつかの実施形態では、ステム形成セクションと標的特異的セクションの一部分との間のハイブリダイゼーションによって、アダプターセクションと分子インデクシングセクションとを含むループが形成される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のループ可能プライマーのうち、標的特異的セクションがステム構造の一部を成していないプライマーは、除外されている。
【００２６】
本明細書に記載されているループ可能プライマーは、ユニバーサルアダプター配列および分子インデクシング配列、ならびに標的特異的配列の少なくとも一部を隠蔽／保護するという理由から、高マルチプレックスＰＣＲにてプライマーの二量体形成および非特異的結合を抑制することによって、アッセイの特異性を有意に向上させることを可能としている。
【００２７】
スキームＡ：
図２に、ループ可能プライマーの１つのスキームを示す。本スキーム中、標的特異的セクションは、５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能である。標的特異的セクションの３’部分がステム構造内で保護されている場合、標的特異的セクションの５’部分が、標的ハイブリダイゼーションの開始に利用可能となる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ステム形成セクションと標的特異的セクションの３’部分との間のハイブリダイゼーションによって、アダプターセクションと標的特異的セクションの５’部分とを含むループが形成される。ステムループは、分子インデクシング配列およびアダプター配列を偽の相互作用から保護するように設計されている。また、３’末端のステムは、プライマーが非標的特異的に延在するのを（すなわち、プライマーの二量体形成を）防止する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ループ可能プライマーが、標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む。いくつかの実施形態では、ループ可能プライマーは、３’末端に１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの不適合ヌクレオチドを含み、Ａテーリングを防いでいる。代替的にまたは追加的に、ループ可能プライマーの５’末端は、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、標的特異的セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、含み得る。いくつかの実施形態では、ループ可能プライマーは、５’末端に１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの不適合ヌクレオチドを含む。
【００３０】
図１０に図示されているように、スキームＡによるループ可能プライマーの好ましい実施形態は、５’〜３’へ、１つ以上の不適合ヌクレオチドと、ステム形成セクションと、アダプターセクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、ステム形成セクションが標的特異的セクションの３’部分の逆相補となっている。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ステム形成セクションと標的特異的セクションの３’部分との間に形成されるステム構造のサイズは、約５〜２０ｂｐ、または約５〜１０ｂｐ、または約１０〜１５ｂｐ、または約１５〜２０ｂｐである。
【００３２】
いくつかの実施形態において、スキームＡによるループ可能プライマーには、ＰＣＲ反応に適した好ましいアニーリング温度および融解温度があり、ステム形成セクションと標的特異的セクションの３’部分は、好ましいアニーリング温度またはそれ未満の温度ではステム構造を形成するが、融解温度またはそれより高い温度ではステム構造を形成しない。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、６０℃以下、５９℃以下、または５８℃以下、または５７℃以下、または５６℃以下、または５５℃以下、５４℃以下、または５３℃以下、または５２℃以下、または５１℃以下、または５０℃以下が、好ましい。いくつかの実施形態において、融解温度は、６０℃以上、または６１℃以上、または６２℃以上、または６３℃以上、または６４℃以上、または６５℃以上、６６℃以上、または６７℃以上、または６８℃以上、または６９℃以上、または７０℃以上である。いくつかの実施形態では、３０℃〜８０℃といったような極端なアニーリング温度が、有用とされる場合もある。
【００３３】
スキームＢ：
図３に、ループ可能プライマーのもう１つのスキームを示す。本スキーム中、標的特異的セクションは、５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの５’部分に対しハイブリダイズ可能である。標的特異的セクションの５’部分がステム構造内で保護されている場合、標的特異的セクションの３’部分が、標的ハイブリダイゼーションを開始する目的に利用可能となる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ステム形成セクションと標的特異的セクションの５’部分との間のハイブリダイゼーションにより形成されるループは、アダプターセクションを含み但し標的特異的セクションの３’端部分は含まない。ステムループは、分子インデクシング配列およびアダプター配列を偽の相互作用から保護するように設計されている。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ループ可能プライマーは、標的特異的セクションの５’側に位置する１つ以上のＧまたはＣヌクレオチドを更に含み、ステム形成セクションの３’側に位置する１つ以上の相補的なＧ／Ｃヌクレオチドによりステム構造を安定化させているいくつかの実施形態では、ループ可能プライマーは、標的特異的セクションの５’側（すなわち、ステムループの頸部）に位置する１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのＧ／Ｃヌクレオチドを含む。
【００３６】
図１１に図示されているように、スキームＢによるループ可能プライマーの好ましい実施形態は、５’〜３’へ、ステム形成セクションと、１つ以上のＧ／Ｃヌクレオチドと、アダプターセクションと、分子インデクシングセクションと、１つ以上のＧ／Ｃヌクレオチドと、標的特異的セクションとを含み、ステム形成セクションが標的特異的セクションの３’部分の逆相補となっている。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ステム形成セクションと標的特異的セクションの５’部分との間に形成されるステム構造のサイズは、約５〜２０ｂｐ、または約５〜１０ｂｐ、または約１０〜１５ｂｐ、または約１５〜２０ｂｐである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、スキームＢによるループ可能プライマーには、ＰＣＲ反応に適した好ましいアニーリング温度および融解温度があり、ステム形成セクションおよび標的特異的セクションの５’部分は、好ましいアニーリング温度またはそれ未満の温度ではステム構造を形成するが、融解温度またはそれより高い温度ではステム構造を形成しない。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、６０℃以下、５９℃以下、または５８℃以下、または５７℃以下、または５６℃以下、または５５℃以下、５４℃以下、または５３℃以下、または５２℃以下、または５１℃以下、または５０℃以下が、好ましい。いくつかの実施形態において、融解温度は、６０℃以上、または６１℃以上、または６２℃以上、または６３℃以上、または６４℃以上、または６５℃以上、６６℃以上、または６７℃以上、または６８℃以上、または６９℃以上、または７０℃以上である。いくつかの実施形態では、３０℃〜８０℃といったような極端なアニーリング温度が、有用とされる場合もある。
【００３９】
スプリットプライマー
【００４０】
本明細書に記載されている本発明の実施形態の多くは、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するアダプターセクションとを含み、標的特異的セクションは、増幅用の鋳型ＤＮＡの標的配列に対しハイブリダイズ可能である、スプリットプライマーに関する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、スプリットプライマーに、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションが更に含まれている。分子インデクシングセクションは、例えば、アダプターセクションと標的特異的セクションのうちの１つとの間に位置する場合がある。分子インデクシングセクションは、例えば、アダプターセクションの３’側に位置する場合がある。いくつかの実施形態では、各分子インデクシング配列の長さは、約１〜２０ｂｐ、または約２〜１５ｂｐ、または約３〜１０ｂｐ、または約４〜８ｂｐである。本明細書に記載されている本発明による順方向スプリットプライマーおよび逆方向スプリットプライマーの両方を、対象の標的遺伝子座を増幅する目的に使用する場合、増幅産物に、２つの分子インデクシング配列を含めてもよい。こうした分子インデクシング配列の組み合わせによって、シングル分子インデクシング配列を使用した場合よりも、なお更に精確な分子計数が可能となる。一実施形態において、各スプリットプライマー上の分子インデクシング配列は、一意な分子インデクシング配列とされる。別の実施形態において、スプリット順方向および逆方向プライマーの各ペア上の分子インデクシング配列の組み合わせは、一意とされる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、アダプターセクションに、ＰＣＲ増幅および／または配列決定用の、ユニバーサルアダプター配列が含まれている。
【００４３】
スキームＣ：
図４に、スプリットプライマーの１つのスキームを示す。本スキーム中、アダプターセクションは、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置する。第１の標的特異的セクションおよび第２の標的特異的セクションの両方が、標的配列に対するハイブリダイゼーションに利用可能である。
【００４４】
言い換えると、標的特異的セクションは２つの部分にスプリットされ、その間にユニバーサルアダプター配列が位置する。プライマーの両端が標的配列に結合した後、分子インデクシング配列およびアダプター配列が保護される。スプリットプライマーは、シーケンシング距離を短縮するという点で有利であり得る。
【００４５】
図１２に図示されているように、スキームＣによるスプリットプライマーの好ましい実施形態は、５’〜３’へ、第１の標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションと第２の標的特異的セクションとを含む。
【００４６】
スプリットループ可能プライマー
【００４７】
本明細書に記載されている本発明の実施形態の多くは、スプリットループ可能プライマーに関するものであり、本プライマーは、
（ａ）第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含むか、あるいは（ｂ）第１のアダプターセクションと、第２のアダプターセクションと、第１のアダプターセクションと第２のアダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、標的特異的セクションとを含み、（第１および／または第２の）標的特異的セクションが、増幅を目的とする鋳型ＤＮＡの標的配列に対しハイブリダイズ可能である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、スプリットループ可能プライマーに、分子インデクシング配列含有の分子インデクシングセクションが更に含まれている。分子インデクシングセクションは、例えば、アダプターセクションと（第２の）標的特異的セクションとの間に位置する場合がある。分子インデクシングセクションは、例えば、（第２の）アダプターセクションの３’側に位置する場合がある。いくつかの実施形態では、各分子インデクシング配列の長さは、約１〜２０ｂｐ、または約２〜１５ｂｐ、または約３〜１０ｂｐ、または約４〜８ｂｐである。本明細書に記載されている本発明による順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーの両方を、対象の標的遺伝子座を増幅する目的に使用する場合、増幅産物に、２つの分子インデクシング配列を含めてもよい。こうした分子インデクシング配列の組み合わせによって、シングル分子インデクシング配列を使用した場合よりも、なお更に精確な分子計数が可能となる。一実施形態において、各スプリットループ可能プライマー上の分子インデクシング配列は、一意な分子インデクシング配列とされる。別の実施形態において、スプリットループ可能順方向および逆方向プライマーの各ペア上の分子インデクシング配列の組み合わせは、一意とされる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、（第１および第２の）アダプターセクションに、ＰＣＲ増幅および／または配列決定用の、ユニバーサルアダプター配列が含まれている。
【００５０】
スキームＤ：
図１３に、スプリットループ可能プライマーの１つのスキームを示す。本スキーム中、第１の標的特異的セクションと、第２の標的特異的セクションと、第１の標的特異的セクションと第２の標的特異的セクションとの間に位置するステム形成セクションと、アダプターセクションとを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの５’部分に対しハイブリダイズ可能である。第１の標的特異的セクションが、ステム構造内で保護されている場合、第２の標的特異的セクションが標的ハイブリダイゼーションの開始に利用可能となる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ステム形成セクションと第２の標的特異的セクションとの間のハイブリダイゼーションによって、アダプターセクションと分子インデクシング配列とを含むループが形成される。ステムループは、分子インデクシング配列およびアダプター配列を偽の相互作用から保護するように設計されている。また、３’末端のステムは、プライマーが非標的特異的に延在するのを（すなわち、プライマーの二量体形成を）防止する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、スプリットループ可能プライマーが、第２の標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む。いくつかの実施形態では、スプリットループ可能プライマーは、３’末端に１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの不適合ヌクレオチドを含み、Ａテーリングを防いでいる。代替的にまたは追加的に、ステム形成セクションの５’末端は、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、第２の標的特異的セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、含み得る。いくつかの実施形態では、スプリットループ可能プライマーは、ステム形成セクションの５’末端に１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの不適合ヌクレオチドを含む。
【００５３】
図１３に図示されているように、スキームＤによるスプリットループ可能プライマーの好ましい実施形態は、５’〜３’へ、第１の標的特異的セクションと、１つ以上の不適合ヌクレオチドと、ステム形成セクションと、アダプターセクションと、分子インデクシングセクションと、第２の標的特異的セクションとを含み、ステム形成セクションは、第２の標的特異的セクションの一部の逆補数である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ステム形成セクションと第２の標的特異的セクションとの間に形成されるステム構造のサイズは、約５〜２０ｂｐ、または約５〜１０ｂｐ、または約１０〜１５ｂｐ、または約１５〜２０ｂｐである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、第１の標的特異的セクションの方が、第２の標的特異的セクションよりも長い。いくつかの実施形態では、第２の標的特異的セクションの方が、第１の標的特異的セクションよりも長い。
【００５６】
いくつかの実施形態では、第２の標的特異的セクションの少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％。ステム形成領域に対しハイブリダイズ可能であってステムを形成し得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、スキームＤによるスプリットループ可能プライマーには、ＰＣＲ反応に適した好ましいアニーリング温度および融解温度があり、ステム形成セクションと第２の標的特異的セクションは、好ましいアニーリング温度またはそれ未満の温度ではステム構造を形成するが、融解温度またはそれより高い温度ではステム構造を形成しない。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、６０℃以下、５９℃以下、または５８℃以下、または５７℃以下、または５６℃以下、または５５℃以下、５４℃以下、または５３℃以下、または５２℃以下、または５１℃以下、または５０℃以下が、好ましい。いくつかの実施形態において、融解温度は、６０℃以上、または６１℃以上、または６２℃以上、または６３℃以上、または６４℃以上、または６５℃以上、６６℃以上、または６７℃以上、または６８℃以上、または６９℃以上、または７０℃以上である。いくつかの実施形態では、３０℃〜８０℃といったような極端なアニーリング温度が、有用とされる場合もある。
【００５８】
スキームＥ：
図１３に、スプリットループ可能プライマーのもう１つのスキームを示す。本スキーム中、第１アダプターセクションと、第２アダプターセクションと、第１アダプターセクションと第２アダプターセクションとの間に位置するステム形成セクションと、５’部分を含む標的特異的セクションとを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能である。標的特異的セクションの３’部分がステム構造内で保護されている場合、標的特異的セクションの５’部分が、標的ハイブリダイゼーションを開始する目的に利用可能となる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ステム形成セクションと標的特異的セクションの３’部分との間のハイブリダイゼーションにより形成されるループは、第２のアダプターセクションと、分子インデクシング配列と、標的特異的セクションの５’部分とを含む。ステムループは、分子インデクシング配列および第２のアダプター配列を偽の相互作用から保護するように設計されている。また、３’末端のステムは、プライマーが非標的特異的に延在するのを（すなわち、プライマーの二量体形成を）防止する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、スプリットループ可能プライマーが、標的特異的セクションの３’末端に、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、ステム形成セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、更に含む。いくつかの実施形態では、スプリットループ可能プライマーは、３’末端に１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの不適合ヌクレオチドを含み、Ａテーリングを防いでいる。代替的にまたは追加的に、ステム形成セクションの５’末端は、１つ以上の不適合ヌクレオチドで、標的特異的セクションに対しハイブリダイズ不可能なものを、含み得る。いくつかの実施形態では、スプリットループ可能プライマーは、ステム形成セクションの５’末端に１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの不適合ヌクレオチドを含む。
【００６１】
図１３に図示されているように、スキームＡによるスプリットループ可能プライマーの好ましい実施形態は、５’〜３’へ、第１のアダプターセクションと、１つ以上の不適合ヌクレオチドと、ステム形成セクションと、第２のアダプターセクションと、分子インデクシングセクションと、標的特異的セクションとを含み、ステム形成セクションが標的特異的セクションの３’部分の逆相補となっている。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ステム形成セクションと標的特異的セクションの３’部分との間に形成されるステム構造のサイズは、約５〜２０ｂｐ、または約５〜１０ｂｐ、または約１０〜１５ｂｐ、または約１５〜２０ｂｐである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、第１のアダプターセクションの方が、第２のアダプターセクションよりも長い。いくつかの実施形態では、第２のアダプターセクションの方が、第１のアダプターセクションよりも長い。
【００６４】
いくつかの実施形態において、スキームＥによるスプリットループ可能プライマーには、ＰＣＲ反応に適した好ましいアニーリング温度および融解温度があり、ステム形成セクションと標的特異的セクションの３’部分は、好ましいアニーリング温度またはそれ未満の温度ではステム構造を形成するが、融解温度またはそれより高い温度ではステム構造を形成しない。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、６０℃以下、５９℃以下、または５８℃以下、または５７℃以下、または５６℃以下、または５５℃以下、５４℃以下、または５３℃以下、または５２℃以下、または５１℃以下、または５０℃以下が、好ましい。いくつかの実施形態において、融解温度は、６０℃以上、または６１℃以上、または６２℃以上、または６３℃以上、または６４℃以上、または６５℃以上、６６℃以上、または６７℃以上、または６８℃以上、または６９℃以上、または７０℃以上である。いくつかの実施形態では、３０℃〜８０℃といったような極端なアニーリング温度が、有用とされる場合もある
【００６５】
プライマー組成物
【００６６】
本明細書に記載されている本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載されているループ可能プライマー、スプリットプライマーおよび／またはスプリットループ可能プライマーを含む、プライマー組成物に関する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、プライマー組成物は、少なくとも順方向ループ可能プライマーと逆方向ループ可能プライマーとを含む。これらのプライマーは、増幅用の同じ対象遺伝子座を標的とするものである。いくつかの実施形態において、順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーの両方は、図２に図示されているスキームＡに対応している。
いくつかの実施形態において、順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーの両方は、図３に図示されているスキームＢに対応している。
【００６８】
いくつかの実施形態において、プライマー組成物は、少なくとも順方向スプリットプライマーと逆方向スプリットプライマーとを含む。これらのプライマーは、増幅用の同じ対象遺伝子座を標的とするものである。いくつかの実施形態において、順方向スプリットプライマーおよび逆方向ループ可能スプリットプライマーの両方は、図３に図示されているスキームＣに対応している。
【００６９】
いくつかの実施形態において、プライマー組成物は、少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含む。これらのプライマーは、増幅用の同じ対象遺伝子座を標的とするものである。いくつかの実施形態において、順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーの両方は、図１３に図示されているスキームＥに対応している。
いくつかの実施形態において、順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーの両方は、図１３に図示されているスキームＥに対応している。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるループ可能プライマーを含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の、順方向および逆方向ループ可能プライマーの異なるペアを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるループ可能プライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれ異なるステム形成セクションを含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるループ可能プライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれ異なる分子インデクシング配列を含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、少なくとも５０，０００個、または少なくとも１００，０００個のループ可能プライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれステム形成セクションと分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の、順方向および逆方向ループ可能スプリットプライマーの異なるペアを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットプライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれ異なる標的特異的セクションを含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットプライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれ異なる分子インデクシング配列を含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、少なくとも５０，０００個、または少なくとも１００，０００個のスプリットプライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれ標的特異的セクションと分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットループ可能プライマーを含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の、順方向および逆方向スプリットループ可能プライマーの異なるペアを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットループ可能プライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれ異なるステム形成セクションを含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットループ可能プライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれ異なる分子インデクシング配列を含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、少なくとも５０，０００個、または少なくとも１００，０００個のスプリットループ可能プライマーを含み、これらのプライマーはそれぞれステム形成セクションと分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含む。
【００７６】
核酸の増幅方法
【００７７】
本明細書に記載されている本発明の更なる実施形態は、
鋳型ＤＮＡから対象の標的遺伝子座を増幅するための方法に関する。本方法は、
上記ループ可能プライマーまたは上記スプリットプライマーまたは上記スプリットループ可能プライマーを使用する少なくとも２回の予備増幅サイクルを含み、各予備増幅サイクルは、プライマーを鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングし、アニーリングされたプライマーを伸長することを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本方法は、
少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、または最大１５回、または最大１０回、または最大７回、または最大５回の予備増幅サイクルを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーをアニーリングし、アニーリングされた順方向ループ可能プライマーおよびアニーリングされた逆方向ループ可能プライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態において、順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーの両方は、図２に図示されているスキームＡに対応している。
いくつかの実施形態において、順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーの両方は、図３に図示されているスキームＢに対応している。
【００８０】
いくつかの実施形態では、各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向スプリットプライマーおよび逆方向スプリットプライマーをアニーリングし、アニーリングされた順方向スプリットプライマーおよびアニーリングされた逆方向スプリットプライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態において、順方向ループ可能プライマーおよび逆方向ループ可能プライマーの両方は、図４に図示されているスキームＣに対応している。
【００８１】
いくつかの実施形態では、各予備増幅サイクルが、対象の同じ遺伝子座を、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物に標的化する少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーをアニーリングし、アニーリングされた順方向スプリットループ可能プライマーおよびアニーリングされた逆方向スプリットループ可能プライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態において、順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーの両方は、図１３に図示されているスキームＤに対応している。
いくつかの実施形態において、順方向スプリットループ可能プライマーおよび逆方向スプリットループ可能プライマーの両方は、図１３に図示されているスキームＥに対応している。
【００８２】
図１０に図示されているように、スキームＡによる一対の順方向および逆方向ループ可能プライマーが使用されている場合、予備増幅産物は、５’〜３’へ、１つ以上の不適合ヌクレオチドと、第１のステム形成セクションと、第１のアダプターセクションと、第１の分子インデクシングセクションと、増幅された標的配列と、第２の分子インデクシングセクションと、第２のアダプターセクションと、第２のステム形成セクションと、１つ以上の不適合ヌクレオチドとを含み得る。
【００８３】
図１１に図示されているように、スキームＢによる一対の順方向および逆方向ループ可能プライマーが使用されている場合、予備増幅産物は、５’〜３’へ、第１のステム形成セクションと、１つ以上のＧ／Ｃヌクレオチドと、第１のアダプターセクションと、第１の分子インデクシングセクションと、増幅された標的配列と、第２の分子インデクシングセクションと、第２のアダプターセクションと、１つ以上のＧ／Ｃヌクレオチドと、第２のステム形成セクションとを含み得る。
【００８４】
図１２に図示されているように、スキームＣによる一対の順方向および逆方向スプリットプライマーが使用される場合、予備増幅産物は、５’〜３’へ、５’標的特異的配列と、第１のアダプターセクションと、第１の分子インデクシングセクションと、増幅された標的配列と、第２の分子インデクシングセクションと、第２のアダプターセクションと、第２のステム形成セクションと、３’標的特異的配列とを含み得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、アダプターセクションは、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを用いた複数回のＰＣＲサイクルを更に含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物の下流ハイスループット配列用の配列アダプターを備える。いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、更なる分析用にＰＣＲ産物を貯留するための、サンプルバーコードを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるループ可能プライマーで、各プライマーが異なるステム形成セクションを含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるループ可能プライマーで、各プライマーが異なる分子インデクシング配列を含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、少なくとも５０，０００個、または少なくとも１００，０００個の異なるループ可能プライマーで、各プライマーがステム形成セクションと分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるループ可能プライマーで、各プライマーが順方向および逆方向ループ可能プライマーのペアを含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットプライマーで、各プライマーがそれぞれ異なる標的特異的セクションを含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットプライマーで、各プライマーが異なる分子インデクシング配列を含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。いくつかの実施形態では、各予備増幅サイクルは、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、少なくとも５０，０００個、または少なくとも１００，０００個の異なるスプリットプライマーで、各プライマーが標的特異的セクションと分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の、順方向および逆方向ループ可能スプリットプライマーの異なるペアを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットループ可能プライマーで、各プライマーが異なるステム形成セクションを含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なるスプリットループ可能プライマーで、各プライマーが異なる分子インデクシング配列を含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも２０，０００個、少なくとも５０，０００個、または少なくとも１００，０００個の異なるスプリットループ可能プライマーで、各プライマーがステム形成セクションと分子インデクシング配列との異なる組み合わせを含むものを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、各予備増幅サイクルは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、または少なくとも１０，０００個の異なる順方向および逆方向スプリットループ可能プライマーのペアを、鋳型ＤＮＡまたはその予備増幅産物にアニーリングすることを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、スキームＡによるループ可能プライマーには、ＰＣＲ反応に適した好ましいアニーリング温度および融解温度があり、ステム形成セクションおよび標的特異的セクションの３’部分は、好ましいアニーリング温度またはそれ未満の温度ではステム構造を形成するが、融解温度またはそれより高い温度ではステム構造を形成しない。本予備増幅サイクルのアニーリング温度は、好ましいアニーリング温度以下（例えば、６０℃以下、５９℃以下、または５８℃以下、または５７℃以下、または５６℃以下、または５５℃以下、５４℃以下、または５３℃以下、または５２℃以下、または５１℃以下、または５０℃以下）とされる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、スキームＢによるループ可能プライマーには、ＰＣＲ反応に適した好ましいアニーリング温度および融解温度があり、ステム形成セクションおよび標的特異的セクションの５’部分は、好ましいアニーリング温度またはそれ未満の温度ではステム構造を形成するが、融解温度またはそれより高い温度ではステム構造を形成しない。本予備増幅サイクルのアニーリング温度は、好ましいアニーリング温度以下（例えば、６０℃以下、５９℃以下、または５８℃以下、または５７℃以下、または５６℃以下、または５５℃以下、５４℃以下、または５３℃以下、または５２℃以下、または５１℃以下、または５０℃以下）とされる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、スキームＣによるスプリットループ可能プライマーには、ＰＣＲ反応に適した好ましいアニーリング温度および融解温度があり、ステム形成セクションおよび第２の標的特異的セクションは、好ましいアニーリング温度またはそれ未満の温度ではステム構造を形成するが、融解温度またはそれより高い温度ではステム構造を形成しない。本予備増幅サイクルのアニーリング温度は、好ましいアニーリング温度以下（例えば、６０℃以下、５９℃以下、または５８℃以下、または５７℃以下、または５６℃以下、または５５℃以下、５４℃以下、または５３℃以下、または５２℃以下、または５１℃以下、または５０℃以下）とされる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、スキームＥによるスプリットループ可能プライマーには、ＰＣＲ反応に適した好ましいアニーリング温度およびアニーリング温度があり、ステム形成セクションおよび標的特異的セクションの５’部分は、好ましいアニーリング温度またはそれ未満の温度ではステム構造を形成するが、融解温度またはそれより高い温度ではステム構造を形成しない。本予備増幅サイクルのアニーリング温度は、好ましいアニーリング温度以下（例えば、６０℃以下、５９℃以下、または５８℃以下、または５７℃以下、または５６℃以下、または５５℃以下、５４℃以下、または５３℃以下、または５２℃以下、または５１℃以下、または５０℃以下）とされる。
【００９７】
他の実施形態において、予備増幅サイクルのアニーリング温度は、５０℃未満、または４０℃未満、または３０℃未満、または２０℃未満、または６０℃超、または６５℃超、または７０℃超となる場合がある。他の実施形態において、極端なアニーリング温度は、３０℃〜８０℃などの予備増幅サイクルに有用な場合がある。
【００９８】
核酸増幅用のキット
【００９９】
本明細書に記載されている本発明の更なる実施形態は、鋳型ＤＮＡから対象の標的遺伝子座を増幅するためのキットに関するものであり、本キットは、上記のループ可能プライマーまたは上記のスプリットプライマーまたは上記のスプリットループ可能プライマーを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本キットは、少なくとも順方向ループ可能プライマーと逆方向ループ可能プライマーとを含む。これらのプライマーは、増幅用の同じ対象遺伝子座を標的とするものである。いくつかの実施形態において、本キットは、少なくとも順方向スプリットプライマーと逆方向スプリットプライマーとを含む。これらのプライマーは、増幅用の同じ対象遺伝子座を標的とするものである。いくつかの実施形態において、本キットは、少なくとも順方向スプリットループ可能プライマーと逆方向スプリットループ可能プライマーとを含む。これらのプライマーは、増幅用の同じ対象遺伝子座を標的とするものである。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本キットは、予備増幅サイクル中にループ可能プライマーまたはスプリットプライマーまたはスプリットループ可能プライマーを伸長させるための、ポリメラーゼを更に含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本キットは、予備増幅サイクルの完了時に前述のポリメラーゼを不活性化するためのプロテアーゼを更に含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本キットは、ループ可能プライマーまたはスプリットプライマーまたはスプリットループ可能プライマーのアダプターセクションのユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な、１つ以上のＰＣＲプライマーを更に含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物の下流ハイスループット配列用の配列アダプターを備える。いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、更なる分析用にＰＣＲ産物を貯留するための、サンプルバーコードを含む。
【０１０４】
用途
【０１０５】
スキームＡ（３’標的ステムループ）のループ可能プライマーは、ユニバーサルアダプター配列およびＭＩＴ配列を隠蔽／保護し、高マルチプレックスＰＣＲにてプライマーの二量体形成および非特異的結合を抑制することにより、アッセイの特異性を向上させる。したがって、スキームＡのループ可能プライマーがとりわけ有用とされる用途は、以下の通りである。
【０１０６】
コピー数多型（ＣＮＶ）、すなわち、異数性、微小欠失などの検出：各ＤＮＡ断片産物が一意（または一意の組み合わせ）の分子インデックスタグに付着されている状況では、特定の遺伝子座（アンプリコンの配列）のサンプル中の断片数の追跡が可能になる。
【０１０７】
ＰＣＲエラーの除去、実際の変異検出：ＰＣＲアーティファクト、例えば、元の分子内に存在しないポリメラーゼエラーが原因で生じた配列変化を、ＭＩＴバーコードを使用することによって同定し、元の分子内に存在する実際の多型／変異から分離することが可能である。
【０１０８】
ＰＣＲタイリング：プライマーの３’末端のステムは、プライマーの二量体形成を防ぐ。これは、シングルマルチプレックスＰＣＲ反応で重複またはタイリングされたアンプリコンを増幅する用途に極めて有用である。
【０１０９】
対立遺伝子特異的増幅：ステム領域（プライマーの３’末端）に変異塩基が位置する対立遺伝子特異的プライマーは、不適合野生型でステムが開放されるのを阻害し、それにより、野生型の増幅が防止される。
【０１１０】
変異対立遺伝子特異的定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルＰＣＲ（ｑＰＣＲ）：変異および野生型のプライマーは、タグ配列がそれぞれ異なり、種々の蛍光プローブの色および他の検出方法により検出することが可能となっている。
【０１１１】
本明細書中に記載されている本発明の追加的な実施形態は、対象の標的遺伝子座のコピー数多型を判別するため方法に関するものであり、本方法は、
１つ以上のループ可能プライマーを用いた少なくとも２つの予備増幅サイクルを使用して鋳型ＤＮＡから対象の標的遺伝子座を予備増幅することであって、ループ可能プライマーの各々が、標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションは、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
増幅産物の配列決定を行い、分子インデクシング配列を使用して、対象の標的遺伝子座のコピー数多型を判別することと、
を含む。
【０１１２】
本明細書に記載されている本発明の追加的な実施形態は、胎児異数性を判別する方法に関するものであり、本方法は、
複数のループ可能プライマーを用いた少なくとも２つの予備増幅サイクルを使用して、母体の血液サンプルから単離された無細胞ＤＮＡから１つ以上の染色体の複数の対象の標的遺伝子座子座を予備増幅することであって、ループ可能プライマーの各々が、標的特異的セクションとアダプターセクションと分子インデクシングセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションは、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、分子インデクシングセクションが分子インデクシング配列を含む、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
増幅産物の配列決定を行い、分子インデクシング配列を使用して胎児の異数性を判別することと、
を含む。
【０１１３】
本明細書中に記載されている本発明の追加的な実施形態は、マルチプレックス増幅の方法に関する。本方法は、
少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーを用いた少なくとも２つの予備増幅サイクルを使用して、鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、各ループ可能プライマーが、標的特異的セクションと、アダプターセクションと、ステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションは、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーが、それらの標的特異的セクション内に相補的配列を含み、ステム形成セクションによる保護無しの場合にプライマーの二量体が形成され得る、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して、予備増幅産物を増幅することと、
を含む。
【０１１４】
本明細書中に記載されている本発明の追加的な実施形態は、対立遺伝子特異的増幅の方法に関する。本方法は、
ループ可能プライマーを用いた少なくとも２つの予備増幅サイクルを使用して、鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、このループ可能プライマーが、標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、アダプターセクションは、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列を含み、ループ可能プライマーは、標的特異的セクションの５’部分もしくは３’部分にＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、予備増幅することと、
ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して、予備増幅産物を増幅することと、
を含む。
【０１１５】
本明細書中に記載されている本発明の追加的な実施形態は、対立遺伝子特異的定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の方法に関する。本方法は、
少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーを用いた少なくとも２つの予備増幅サイクルを使用して、鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、これらループ可能プライマーの各々が、標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１のループ可能プライマーのアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、第２のループ可能プライマーのアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列を含み、第１のループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、第２のループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、予備増幅すること、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブの存在下にてユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して予備増幅産物を増幅することと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む。
代替的に、対立遺伝子特異的ｑＰＣＲのための方法は、予備増幅ステップを必要とせず、代わりに、
第１および第２の蛍光プローブの存在下にて第１および第２のループ可能プライマーを使用して鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を増幅することと、
第１および第２の蛍光プローブからの蛍光信号のリアルタイム強度を検出することと、
を含む。
【０１１６】
本明細書中に記載されている本発明の追加的な実施形態は、対立遺伝子特異的定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の方法に関する。本方法は、
少なくとも第１のループ可能プライマーおよび第２のループ可能プライマーを用いた少なくとも２つの予備増幅サイクルを使用して、鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を予備増幅することであって、これらループ可能プライマーの各々が、標的特異的セクションとアダプターセクションとステム形成セクションとを含み、標的特異的セクションが５’部分と３’部分とを含み、ステム形成セクションが、ステム構造を形成するために、標的特異的セクションの３’部分に対しハイブリダイズ可能であり、第１のループ可能プライマーのアダプターセクションが、ＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第１の蛍光プローブに結合し得る第１のプローブ特異的配列とを含み、第２のループ可能プライマーのアダプターセクションがＰＣＲ増幅用のユニバーサルアダプター配列および第２の蛍光プローブに結合し得る第２のプローブ特異的配列を含み、第１のループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’もしくは３’部分が、第１のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含み、第２のループ可能プライマーの標的特異的セクションの５’もしくは３’部分が、第２のＳＮＶもしくはＳＮＰ対立遺伝子を含む、予備増幅すること、
予備増幅産物を複数の反応容量にパーティショニングすることと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブの存在下にて、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能な１つ以上のＰＣＲプライマーを使用して、予備増幅産物を各反応容量にて増幅することと、
第１の蛍光プローブおよび第２の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む。
代替的に、対立遺伝子特異的ｄＰＣＲのための方法は、予備増幅ステップを必要とせず、代わりに、
サンプルを複数の反応容量にパーティショニングすることと、
第１および第２の蛍光プローブの存在下にて第１および第２のループ可能プライマーを使用して、各反応容積にて鋳型ＤＮＡから対象の１つ以上の標的遺伝子座を増幅することと、
第１および第２の蛍光プローブからの蛍光信号の存在または不在を検出することと、
を含む。
【０１１７】
【実施例】
【０１１８】
実施例１
２サイクルのワークフロー
【０１１９】
図５に図示されているような、２サイクルのワークフローを使用して概念実証実験を実施し、サンプルＤＮＡを増幅した。プライマースキームの組み合わせごとに（図１）、市販の高フィデリティ酵素ミックスおよびＤＮＡを調製した。
【表１】
2021510541.tif 000003
【０１２０】
ダイレクトＰＣＲ反応によるＭＩＴ：サンプルは循環させる条件は、以下の通りである。２サイクル後に、２０μＬの調製済みプロテアーゼ溶液を反応液に添加し、６５℃で１５分間インキュベートした後、９５℃で１５分間不活化させた。
【表２】
2021510541.tif 000004
【表３】
2021510541.tif 000005
【０１２１】
バーコーディング反応の配列決定：結果として得られた３０μＬ中１０μＬの容量をＱ５バーコーディング反応に取り込み、３５回循環させて完全なプラトーにした。
【表４】
2021510541.tif 000006
【表５】
2021510541.tif 000007
【０１２２】
貯留および精製：
２μＬの各サンプルを一体的に貯留し、５０μＬの貯留物をＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンカラムを使用して精製した。
【表６】
2021510541.tif 000008
【０１２３】
サンプルをｑＰＣＲで定量し、配列決定を行った。
【０１２４】
図６に図示されているように、スキームＡ、スキームＢおよびスキームＣの各々で、または２回にわたる予備増幅サイクルにて対象の標的遺伝子座を増幅することができた（その後、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能であるプライマーを使用して下流ＰＣＲ増幅を行った）。スキームＡは最良の目標達成率を示している。図９に図示されているように、反復試験サンプル間で、ＭＩＴ計数が極めて一貫していた（スキームＡ、２回の予備増幅サイクル）。
【０１２５】
実施例２
３／１０サイクルのワークフロー
【０１２６】
図７に図示されているような、３サイクルまたは１０サイクルのワークフローを使用して概念実証実験を実施し、サンプルＤＮＡを増幅した。
プライマースキームの組み合わせごとに（図１）、市販の高フィデリティ酵素ミックスおよびＤＮＡを調製した。
【表７】
2021510541.tif 000009
【０１２７】
ダイレクトＰＣＲ反応によるＭＩＴ：
サンプルは循環させる条件は、以下の通りである。３回または１０回のサイクル後に、２０μＬの調製済みプロテアーゼ溶液を反応液に添加し、６５℃で１５分間インキュベートした後、９５℃で１５分間不活化させた。
【表８】
2021510541.tif 000010
【表９】
2021510541.tif 000011
【０１２８】
バーコーディング反応の配列決定：
結果として得られた３０μＬ中１０μＬの容量をＱ５バーコーディング反応に取り込み、３５回サイクルして完全なプラトーにした。
【表１０】
2021510541.tif 000012
【表１１】
2021510541.tif 000013
【０１２９】
貯留および精製：
２μＬの各サンプルを一体的に貯留し、５０μＬの貯留物をＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンカラムを使用して精製した。
【表１２】
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【０１３０】
サンプルをｑＰＣＲで定量し、配列決定を行った。
【０１３１】
図８に図示されているように、スキームＡ、スキームＢおよびスキームＣの各々で、３回または１０回にわたる予備増幅サイクルにて対象の標的遺伝子座を増幅することができた（その後、ユニバーサルアダプター配列に対しハイブリダイズ可能であるプライマーを使用して下流ＰＣＲ増幅を行った）。スキームＡは３つの予備増幅サイクルで最良の目標達成率を示し、スキームＣは１０回の予備増幅サイクルで最良の目標達成率を示している。
【０１３２】
前述の説明で、当業者に容易に分かるように、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなしに、本明細書中に開示されている本発明に対して様々な置き換えおよび修正を施すことができる。本明細書中に例証的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つ以上の要素または制限（１つもしくは複数）を用いることなしに、実施することが可能である。使用されている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されている。そのような用語および表現の使用において、図示され、説明されている特徴または、その一部の同等物を除外することを意図したものではないが、本発明の範囲内で様々な変更を施すことが可能であることが認識されている。ゆえに、当然のことながら、本発明は、具体的な実施形態および任意選択的な特徴によって例証されているが、本明細書に開示された概念の修正態様および／または変形態様は、当業者が施すことが可能であり、そのような修正態様および変形態様は、本発明の範囲内であると見なされる。
【図１】
2021510541.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021510541.tif 000019
【図６】
2021510541.tif 000020
【図７】
2021510541.tif 000021
【図８】
2021510541.tif 000022
【図９】
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【図１０】
2021510541.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021510541.tif 000027
【図１４】
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【配列表】
2021510541000001.app
【国際調査報告】
2021510541.tif 000029
2021510541.tif 000030
2021510541.tif 000031
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