(57)【要約】  本発明は、ＣＤ４ドメイン１およびＣＤ４ドメイン２（ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２）を含有するタンパク質に関するものであり、ここで、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２と比較して１以上の突然変異を含有する。本発明はまた、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を治療するための、該タンパク質の使用方法に関する。【選択図】図１
2021518171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ４ドメイン１およびドメイン２（ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２）ムテインを含むタンパク質であって、ここで、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に対して少なくとも９０％同一であり、
（ａ）非荷電アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の置換、
（ｂ）酸性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の置換、
（ｃ）酸性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における非荷電アミノ酸の置換、または
（ｄ）置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるグリシンもしくは埋もれた疎水性側鎖を有するアミノ酸の置換
のうちの少なくとも１つの置換を含み、該置換が、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２において野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）とは非同一である位置におけるものである、タンパク質。
【請求項２】
ヒトＣＤ４ドメイン１およびドメイン２（ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２）ムテインを含むタンパク質であって、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に対して少なくとも９０％同一であり、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｖ４、Ｌ５、Ｇ６、Ｋ７、Ｋ８、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｖ１２、Ｌ１４、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｋ３５、Ｉ３６、Ｌ３７、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｆ６７、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｉ７１、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｅ７７、Ｄ８０、Ｔ８１、Ｖ８６、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｅ９１、Ｖ９３、Ｑ９４、Ｌ９５、Ｌ９６、Ｖ９７、Ｆ９８、Ｇ９９、Ｔ１０１、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｄ１０５、Ｈ１０７、Ｌ１０８、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１６、Ｔ１１７、Ｌ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｖ１２８、Ｑ１２９、Ｃ１３０、Ｒ１３１、Ｓ１３２、Ｐ１３３、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｉ１３８、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｌ１４９、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｄ１５３、Ｇ１５５、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｅ１６９、Ｆ１７０、Ｋ１７１、Ｉ１７２、Ｄ１７３、Ｉ１７４、Ｖ１７５、Ｖ１７６またはＡ１７８に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、タンパク質。
【請求項３】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｖ４、Ｇ６、Ｋ７、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｖ１２、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｋ３５、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｅ７７、Ｄ８０、Ｔ８１、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｅ９１、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｇ９９、Ｔ１０１、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｄ１０５、Ｈ１０７、Ｌ１０８、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｖ１２８、Ｑ１２９、Ｃ１３０、Ｒ１３１、Ｓ１３２、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｉ１３８、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｄ１５３、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｅ１６９、Ｆ１７０、Ｋ１７１、Ｉ１７２、Ｄ１７３、Ｉ１７４、Ｖ１７５またはＡ１７８に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ７、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｄ８０、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｌ９６、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３１、Ｒ１３４、Ｎ１３７、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｋ１７１、Ｄ１７３、Ｉ１７４またはＶ１７５に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｄ１０、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｄ８０、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｋ１４２、Ｌ１４４、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｋ１６６またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｑ２０、Ｉ３４、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｇ６５、Ｐ６８、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｓ１４７、Ｗ１５７、Ｔ１６０、Ｎ１６４またはＫ１６６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｄ１０、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｐ４８、Ｎ５２、Ａ５５、Ｒ５９、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｄ８０、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｋ１４２、Ｌ１４４、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｔ１５６、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｋ１６６またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項８】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ５、Ｇ６、Ｖ１２、Ｌ１４、Ａ１８、Ｉ２４、Ｉ３６、Ｌ３７、Ｑ４０、Ｌ４４、Ｌ５１、Ａ５５、Ｇ６５、Ｆ６７、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｖ９３、Ｇ９９、Ｉ７１、Ｌ７４、Ｖ８６、Ｖ９３、Ｌ９５、Ｌ９６、Ｖ９７、Ｆ９８、Ａ１０２、Ｌ１０８、Ｌ１１４、Ｌ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２１、Ｖ１２８、Ｐ１３３、Ｉ１３８、Ｇ１４１、Ｌ１４４、Ｖ１４６、Ｌ１４９、Ｇ１５５、Ｖ１６１、Ｖ１６８、Ｆ１７０、Ｉ１７２、Ｉ１７４またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項９】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ａ５５、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｖ１４６、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１０】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ１１６、Ｖ１２８、Ｖ１４６、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１１】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ７、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｋ３５、Ｋ４６、Ｋ５０、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｋ１６６、Ｋ１６７またはＫ１７１に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１２】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＶ４、Ｔ１１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｓ２３、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｓ４２、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｎ６６、Ｉ７０、Ｉ７６、Ｔ８１、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｔ１０１、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｈ１０７、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｑ１２９、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｔ１４３、Ｓ１４５、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｔ１５６、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｖ１７５またはＡ１７８に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１３】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｇ６、Ｋ８、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｋ２１、Ｓ２３、Ａ５５、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１４】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１３記載のタンパク質。
【請求項１５】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７またはＶ１６８に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１６】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１５記載のタンパク質。
【請求項１７】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＳ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１６記載のタンパク質。
【請求項１８】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１４６またはＶ１６８に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１９】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＣＤ４  Ｄ１ドメインにおける少なくとも１つの置換およびＣＤ４  Ｄ２ドメインにおける少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の置換を含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、請求項１〜２０のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２２】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における表面露出側鎖を有するアミノ酸位置における１０、９、８、７、６、５、４、３、２個または１個より少ない置換を含む、請求項１〜２１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２３】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ａ５５およびＫ７２；
（２）Ａ５５およびＫ７５；
（３）Ａ５５およびＱ９４；
（４）Ａ５５およびＱ１１０；
（５）Ａ５５およびＬ１１６；
（６）Ａ５５およびＶ１２８；
（７）Ａ５５およびＲ１３４；
（８）Ａ５５およびＶ１４６；
（９）Ａ５５およびＮ１６４；
（１０）Ａ５５およびＫ１６７；
（１１）Ａ５５およびＶ１６８；
（１２）Ｓ２３およびＫ７２；
（１３）Ｓ２３およびＫ７５；
（１４）Ｓ２３およびＱ９４；
（１５）Ｓ２３およびＱ１１０；
（１６）Ｓ２３およびＬ１１６；
（１７）Ｓ２３およびＶ１２８；
（１８）Ｓ２３およびＲ１３４；
（１９）Ｓ２３およびＶ１４６；
（２０）Ｓ２３およびＮ１６４；
（２１）Ｓ２３およびＫ１６７；
（２２）Ｓ２３およびＶ１６８；
（２３）Ｇ６およびＫ７２；
（２４）Ｇ６およびＫ７５；
（２５）Ｇ６およびＱ９４；
（２６）Ｇ６およびＱ１１０；
（２７）Ｇ６およびＬ１１６；
（２８）Ｇ６およびＶ１２８；
（２９）Ｇ６およびＲ１３４；
（３０）Ｇ６およびＶ１４６；
（３１）Ｇ６およびＮ１６４；
（３２）Ｇ６およびＫ１６７；
（３３）Ｇ６およびＶ１６８；
（３４）Ｋ７２およびＫ７５；
（３５）Ｋ７２およびＱ９４；
（３６）Ｋ７２およびＱ１１０；
（３７）Ｋ７２およびＬ１１６；
（３８）Ｋ７２およびＶ１２８；
（３９）Ｋ７２およびＲ１３４；
（４０）Ｋ７２およびＶ１４６；
（４１）Ｋ７２およびＮ１６４；
（４２）Ｋ７２およびＫ１６７；
（４３）Ｋ７２およびＶ１６８；
（４４）Ｋ７５およびＱ９４；
（４５）Ｋ７５およびＱ１１０；
（４６）Ｋ７５およびＬ１１６；
（４７）Ｋ７５およびＶ１２８；
（４８）Ｋ７５およびＲ１３４；
（４９）Ｋ７５およびＶ１４６；
（５０）Ｋ７５およびＮ１６４；
（５１）Ｋ７５およびＫ１６７；
（５２）Ｋ７５およびＶ１６８；
（５３）Ｑ９４およびＱ１１０；
（５４）Ｑ９４およびＬ１１６；
（５５）Ｑ９４およびＶ１２８；
（５６）Ｑ９４およびＲ１３４；
（５７）Ｑ９４およびＶ１４６；
（５８）Ｑ９４およびＮ１６４；
（５９）Ｑ９４およびＫ１６７；
（６０）Ｑ９４およびＶ１６８；
（６１）Ｑ１１０およびＬ１１６；
（６２）Ｑ１１０およびＶ１２８；
（６３）Ｑ１１０およびＲ１３４；
（６４）Ｑ１１０およびＶ１４６；
（６５）Ｑ１１０およびＮ１６４；
（６６）Ｑ１１０およびＫ１６７；
（６７）Ｑ１１０およびＶ１６８；
（６８）Ｌ１１６およびＶ１２８；
（６９）Ｌ１１６およびＲ１３４；
（７０）Ｌ１１６およびＶ１４６；
（７１）Ｌ１１６およびＮ１６４；
（７２）Ｌ１１６およびＫ１６７；
（７３）Ｌ１１６およびＶ１６８；
（７４）Ｖ１２８およびＲ１３４；
（７５）Ｖ１２８およびＶ１４６；
（７６）Ｖ１２８およびＮ１６４；
（７７）Ｖ１２８およびＫ１６７；
（７８）Ｖ１２８およびＶ１６８；
（７９）Ｖ１４６およびＮ１６４；
（８０）Ｖ１４６およびＫ１６７；
（８１）Ｖ１４６およびＶ１６８；または
（８２）Ｎ１６４およびＫ１６７
における置換を含む、請求項１〜２２のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２４】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ｓ２３、Ａ５５およびＫ７２；
（２）Ｓ２３、Ａ５５およびＫ７５；
（３）Ｓ２３、Ａ５５およびＱ９４；
（４）Ｓ２３、Ａ５５およびＱ１１０；
（５）Ｓ２３、Ａ５５およびＬ１１６；
（６）Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１２８；
（７）Ｓ２３、Ａ５５およびＲ１３４；
（８）Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１４６；
（９）Ｓ２３、Ａ５５およびＮ１６４；
（１０）Ｓ２３、Ａ５５およびＫ１６７；
（１１）Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１６８；
（１２）Ｇ６、Ｓ２３およびＫ７２；
（１３）Ｇ６、Ｓ２３およびＫ７５；
（１４）Ｇ６、Ｓ２３およびＱ９４；
（１５）Ｇ６、Ｓ２３およびＱ１１０；
（１６）Ｇ６、Ｓ２３およびＬ１１６；
（１７）Ｇ６、Ｓ２３およびＶ１２８；
（１８）Ｇ６、Ｓ２３およびＲ１３４；
（１９）Ｇ６、Ｓ２３およびＶ１４６；
（２０）Ｇ６、Ｓ２３およびＮ１６４；
（２１）Ｇ６、Ｓ２３およびＫ１６７；
（２２）Ｇ６、Ｓ２３およびＶ１６８；
（２３）Ｇ６、Ａ５５およびＫ７２；
（２４）Ｇ６、Ａ５５およびＫ７５；
（２５）Ｇ６、Ａ５５およびＱ９４；
（２６）Ｇ６、Ａ５５およびＱ１１０；
（２７）Ｇ６、Ａ５５およびＬ１１６；
（２８）Ｇ６、Ａ５５およびＶ１２８；
（２９）Ｇ６、Ａ５５およびＲ１３４；
（３０）Ｇ６、Ａ５５およびＶ１４６；
（３１）Ｇ６、Ａ５５およびＮ１６４；
（３２）Ｇ６、Ａ５５およびＫ１６７；
（３３）Ｇ６、Ａ５５およびＶ１６８；
（３４）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＫ７２；
（３５）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＫ７５；
（３６）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＱ９４；
（３７）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＱ１１０；
（３８）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ１１６；
（３９）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１２８；
（４０）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＲ１３４；
（４１）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１４６；
（４２）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＮ１６４；
（４３）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＫ１６７；または
（４４）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１６８
における置換を含む、請求項１〜２３のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２５】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２）Ｋ７２、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（３）Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（４）Ｑ９４、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（５）Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（６）Ｑ９４、Ｑ１１０およびＲ１３４；
（７）Ｑ９４、Ｑ１１０およびＮ１６４；
（８）Ｑ９４、Ｑ１１０およびＫ１６７；
（９）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（１０）Ｋ７２、Ｋ７５およびＲ１３４；
（１１）Ｋ７２、Ｋ７５およびＮ１６４；
（１２）Ｋ７２、Ｋ７５およびＫ１６７；
（１３）Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（１４）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＲ１３４；
（１５）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＮ１６４；
（１６）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ１６７；
（１７）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＶ１４６；
（１８）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＬ１１６；
（１９）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７２；
（２０）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７５；
（２１）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ９４；
（２２）Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ１１０；
（２３）Ｖ１４６、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（２４）Ｖ１４６、Ｒ１３４およびＮ１６４；
（２５）Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２６）Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２７）Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２８）Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２９）Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３０）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（３１）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３２）Ｋ７２、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３３）Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３４）Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３５）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＫ７２；
（３６）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＫ７５；
（３７）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＱ９４；
（３８）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＱ１１０；
（３９）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＬ１１６；
（４０）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＶ１４６；
（４１）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＮ１６４；
（４２）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（４３）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＫ７２；
（４４）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＫ７５；
（４５）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＱ９４；
（４６）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＱ１１０；
（４７）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＮ１６４；または
（４８）Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＫ１６７
における置換を含む、請求項１〜２４のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２６】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ｇ６、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（２）Ｇ６、Ａ５５、Ｖ１４６およびＶ１６８；
（３）Ｇ６、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１４６；
（４）Ｇ６、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１４６およびＶ１６８；
（５）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（６）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１４６およびＶ１６８；
（７）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６およびＶ１６８；
（８）Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７２；
（９）Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７５；
（１０）Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ９４；
（１１）Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ１１０；
（１２）Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＬ１１６；
（１３）Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＲ１３４；
（１４）Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＶ１４６；
（１５）Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ１６７；
（１６）Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７２；
（１７）Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７５；
（１８）Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ９４；
（１９）Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ１１０；
（２０）Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＬ１１６；
（２１）Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＲ１３４；
（２２）Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＶ１４６；
（２３）Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ１６７；
（２４）Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（２５）Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２６）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（２７）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（２８）Ｓ２３、Ａ５５、Ｑ９４、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（２９）Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（３０）Ｓ２３、Ａ５５、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（３１）Ｓ２３、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（３２）Ｓ２３、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３３）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（３４）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３５）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３６）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３７）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３８）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３９）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４０）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（４１）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（４２）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｖ１４６およびＫ１６７；
（４３）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（４４）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（４５）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（４６）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（４７）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（４８）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（４９）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｖ１４６およびＫ１６７；
（５０）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（５１）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（５２）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（５３）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（５４）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；
（５５）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（５６）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７５、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（５７）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｑ９４、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（５８）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｑ１１０、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（５９）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｎ１６４およびＶ１６８；
（６０）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｋ１６７およびＶ１６８；
（６１）Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６２）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６およびＲ１３４；
（６３）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６およびＮ１６４；
（６４）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６およびＫ１６７；
（６５）Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６６）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６７）Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６８）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；または
（６９）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７における置換を含む、請求項１〜２５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２７】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２）Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４）Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（５）Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（６）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；
（７）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１４６およびＶ１６８；
（８）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（９）Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（１０）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（１１）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（１２）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；または
（１３）Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｋ１６７およびＶ１６８
における置換を含む、請求項１〜２６のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２８】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ｒ１３４およびＫ１６７；
（２）Ｒ１３４およびＮ１６４；
（３）Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４）Ａ５５およびＲ１３４；
（５）Ａ５５およびＮ１６４；
（６）Ａ５５およびＫ１６７；
（７）Ｓ２３およびＲ１３４；
（８）Ｓ２３およびＮ１６４；
（９）Ｓ２３およびＫ１６７；
（１０）Ｋ７２およびＫ７５；
（１１）Ｋ７５およびＲ１３４；
（１２）Ｋ７５およびＮ１６４；
（１３）Ｋ７５およびＫ１６７；
（１４）Ｋ７５およびＱ９４；
（１５）Ｋ７５およびＱ１１０；
（１６）Ｓ２３およびＫ７５；
（１７）Ａ５５およびＫ７５；
（１８）Ｑ９４およびＱ１１０；
（１９）Ｓ２３およびＡ５５；
（２０）Ｌ５およびＳ２３；
（２１）Ｋ２およびＮ１６４；
（２２）Ｋ２およびＫ１６７；
（２３）Ｋ７およびＫ８；
（２４）Ｋ７およびＡ５５；
（２５）Ｋ８およびＮ１６４；
（２６）Ｋ８およびＫ１６７；
（２７）Ｋ８およびＡ５５；
（２８）Ｔ１７およびＮ１６４；
（２９）Ｔ１７およびＫ１６７；
（３０）Ｉ７０およびＮ１６４；
（３１）Ｉ７０およびＫ１６７；
（３２）Ａ５５およびＩ７０；
（３３）Ａ５５およびＫ７２；
（３４）Ｋ７２およびＮ１６４；
（３５）Ｋ７２およびＫ１６７；
（３６）Ｑ９４およびＮ１６４；
（３７）Ｑ９４およびＫ１６７；
（３８）Ｑ１１０およびＮ１６４；
（３９）Ｑ１１０およびＫ１６７；
（４０）Ｋ１４２およびＫ１６７；
（４１）Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４２）Ａ５５、Ｒ１３４およびＮ１６４；
（４３）Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（４４）Ａ５５、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４５）Ａ５５、Ｋ７およびＫ８；
（４６）Ｓ２３、Ｒ１３４およびＮ１６４；
（４７）Ｓ２３、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（４８）Ｓ２３、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４９）Ｓ２３、Ａ５５およびＲ１３４；
（５０）Ｓ２３、Ａ５５およびＮ１６４；
（５１）Ｓ２３、Ａ５５およびＫ１６７；
（５２）Ｋ７５、Ｒ１３４およびＮ１６４；
（５３）Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（５４）Ｋ７５、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（５５）Ｋ７５、Ｑ９４およびＱ１１０；
（５６）Ａ５５、Ｋ７５およびＲ１３４；
（５７）Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；
（５８）Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（５９）Ａ５５、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（６０）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ９６；
（６１）Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６２）Ｋ７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６３）Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６４）Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６５）Ｋ７５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６６）Ｔ１７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６７）Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６８）Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（６９）Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（７０）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４；
（７１）Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（７２）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（７３）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２およびＫ１６７；
（７４）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（７５）Ｋ７、Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７．
（７６）Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（７７）Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；または
（７８）Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７
における置換を含む、請求項１〜２７のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２９】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ｒ１３４およびＫ１６７；
（２）Ｒ１３４およびＮ１６４；
（３）Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４）Ｑ９４およびＱ１１０；
（５）Ｋ２およびＮ１６４；
（６）Ｋ２およびＫ１６７；
（７）Ｋ７およびＫ８；
（８）Ｋ８およびＮ１６４；
（９）Ｋ８およびＫ１６７；
（１０）Ｔ１７およびＮ１６４；
（１１）Ｔ１７およびＫ１６７；
（１２）Ｉ７０およびＮ１６４；
（１３）Ｉ７０およびＫ１６７；
（１４）Ｋ７２およびＮ１６４；
（１５）Ｋ７２およびＫ１６７；
（１６）Ｋ７５およびＲ１３４；
（１７）Ｋ７５およびＮ１６４；
（１８）Ｋ７５およびＫ１６７；
（１９）Ｋ７５およびＱ９４；
（２０）Ｋ７５およびＱ１１０；
（２１）Ｑ９４およびＮ１６４；
（２２）Ｑ９４およびＫ１６７；
（２３）Ｑ１１０およびＮ１６４；
（２４）Ｑ１１０およびＫ１６７；
（２５）Ｋ１４２およびＫ１６７；
（２６）Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２７）Ｋ７５、Ｑ９４およびＱ１１０；
（２８）Ｋ７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２９）Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３０）Ｔ１７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３１）Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３２）Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３３）Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３４）Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３５）Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３６）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４；
（３７）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３８）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２およびＫ１６７；
（３９）Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４０）Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（４１）Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；または
（４２）Ｋ７、Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７
における置換を含む、請求項１〜２８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項３０】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（２）Ａ５５、Ｒ１３４およびＮ１６４；
（３）Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；
（４）Ａ５５、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（５）Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；
（６）Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（７）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ９６；
（８）Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（９）Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（１０）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；または
（１１）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７
における置換を含む、請求項１〜２９のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項３１】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の位置：
（１）Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；
（２）Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；
（３）Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；または
（４）Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７
における置換を含む、請求項１〜３０のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項３２】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、
（ａ）ｉ．非荷電アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の置換、
ｉｉ．酸性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の置換、もしくは
ｉｉｉ．酸性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における非荷電アミノ酸の置換、および／または
（ｂ）置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるグリシンもしくは疎水性アミノ酸の置換
のうちの少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜３１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項３３】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置のアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜３２のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項３４】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、類人猿、旧世界ザルまたは新世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置のアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む、請求項３３記載のタンパク質。
【請求項３５】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、類人猿または旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置のアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む、請求項３４記載のタンパク質。
【請求項３６】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、類人猿ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置のアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む、請求項３５記載のタンパク質。
【請求項３７】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置のアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む、請求項３６記載のタンパク質。
【請求項３８】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、
（１）Ｋ１の、Ｎによる置換（Ｋ１Ｎ）；
（２）Ｋ２の、Ｅによる置換（Ｋ２Ｅ）、Ｎによる置換（Ｋ２Ｎ）またはＴによる置換（Ｋ２Ｔ）；
（３）Ｌ５の、Ｙによる置換（Ｌ５Ｙ）、Ｉによる置換（Ｌ５Ｉ）、Ｅによる置換（Ｌ５Ｅ）、Ｗによる置換（Ｌ５Ｗ）、Ｖによる置換（Ｌ５Ｖ）、Ｆによる置換（Ｌ５Ｆ）またはＴによる置換（Ｌ５Ｔ）；
（４）Ｇ６の、Ａによる置換（Ｇ６Ａ）；
（５）Ｋ７の、Ｅによる置換（Ｋ７Ｅ）；
（６）Ｋ８の、Ｅによる置換（Ｋ８Ｅ）；
（７）Ｔ１５の、Ｎによる置換（Ｔ１５Ｎ）またはＥによる置換（Ｔ１５Ｅ）；
（８）Ｔ１７の、Ｎによる置換（Ｔ１７Ｎ）またはＥによる置換（Ｔ１７Ｅ）；
（９）Ｓ２３の、Ｎによる置換（Ｓ２３Ｎ）、Ｔによる置換（Ｓ２３Ｔ）、Ｋによる置換（Ｓ２３Ｋ）、Ｙによる置換（Ｓ２３Ｙ）またはＡによる置換（Ｓ２３Ａ）；
（１０）Ａ５５の、Ｖによる置換（Ａ５５Ｖ）、Ｉによる置換（Ａ５５Ｉ）、Ｐによる置換（Ａ５５Ｐ）、Ｌによる置換（Ａ５５Ｌ）、Ｍによる置換（Ａ５５Ｍ）、Ｆによる置換（Ａ５５Ｆ）、Ｙによる置換（Ａ５５Ｙ）、Ｗによる置換（Ａ５５Ｗ）またはＴによる置換（Ａ５５Ｔ）；
（１１）Ｉ７０の、Ｅによる置換（Ｉ７０Ｅ）、Ｌによる置換（Ｉ７０Ｌ）またはＶによる置換（Ｉ７０Ｖ）；
（１２）Ｋ７２の、Ｓによる置換（Ｋ７２Ｓ）；
（１３）Ｋ７５の、Ｅによる置換（Ｋ７５Ｅ）またはＱによる置換（Ｋ７５Ｑ）；
（１４）Ｑ９４の、Ｅによる置換（Ｑ９４Ｅ）；
（１５）Ｌ９６の、Ｖによる置換（Ｌ９６Ｖ）、Ｑによる置換（Ｌ９６Ｑ）、Ｔによる置換（Ｌ９６Ｔ）、Ｉによる置換（Ｌ９６Ｉ）またはＹによる置換（Ｌ９６Ｙ）；
（１６）Ｑ１１０の、Ｅによる置換（Ｑ１１０Ｅ）またはＨによる置換（Ｑ１１０Ｈ）；
（１７）Ｌ１１６の、Ｆによる置換（Ｌ１１６Ｆ）またはＷによる置換（Ｌ１１６Ｗ）；
（１８）Ｖ１２８の、Ｉによる置換（Ｖ１２８Ｉ）またはＬによる置換（Ｖ１２８Ｌ）；
（１９）Ｒ１３４の、Ｇによる置換（Ｒ１３４Ｇ）またはＴによる置換（Ｒ１３４Ｔ）；
（２０）Ｋ１４２の、Ｒによる置換（Ｋ１４２Ｒ）、Ｇによる置換（Ｋ１４２Ｇ）またはＳによる置換（Ｋ１４２Ｓ）；
（２１）Ｖ１４６の、Ｉによる置換（Ｖ１４６Ｉ）、Ｌによる置換（Ｖ１４６Ｌ）、Ｆによる置換（Ｖ１４６Ｆ）またはＷによる置換（Ｖ１４６Ｗ）；
（２２）Ｎ１６４の、Ｄによる置換（Ｎ１６４Ｄ）、Ｈによる置換（Ｎ１６４Ｈ）、Ｒによる置換（Ｎ１６４Ｒ）またはＥによる置換（Ｎ１６４Ｅ）；
（２３）Ｋ１６７の、Ｔによる置換（Ｋ１６７Ｔ）、Ｒによる置換（Ｋ１６７Ｒ）またはＬによる置換（Ｋ１６７Ｌ）；
（２４）Ｖ１６８の、Ｉによる置換（Ｖ１６８Ｉ）またはＬによる置換（Ｖ１６８Ｌ）；および
（２５）Ｖ１７６の、Ｉによる置換（Ｖ１７６Ｉ）
の少なくとも１つを含む、請求項１〜３７のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項３９】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＫ２Ｅ、Ｇ６Ａ、Ｋ７Ｅ、Ｋ８Ｅ、Ｔ１７Ｎ、Ｔ１７Ｅ、Ｓ２３Ｎ、Ｓ２３Ｔ、Ａ５５Ｖ、Ａ５５Ｉ、Ｉ７０Ｅ、Ｋ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｑ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｌ１１６Ｆ、Ｖ１２８Ｌ、Ｒ１３４Ｇ、Ｋ１４２Ｒ、Ｖ１４６Ｉ、Ｖ１４６Ｆ、Ｎ１６４Ｄ、Ｋ１６７Ｔ、Ｖ１６８ＬおよびＶ１７６Ｉ置換の少なくとも１つを含む、請求項３８記載のタンパク質。
【請求項４０】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＧ６Ａ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｋ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｑ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｖ１２８Ｌ、Ｒ１３４Ｇ、Ｖ１４６Ｉ、Ｎ１６４Ｄ、Ｋ１６７ＴおよびＶ１６８Ｌ置換の少なくとも１つを含む、請求項３９記載のタンパク質。
【請求項４１】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＫ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｑ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｖ１２８Ｌ、Ｒ１３４Ｇ、Ｖ１４６Ｉ、Ｎ１６４Ｄ、Ｋ１６７ＴおよびＶ１６８Ｌ置換の少なくとも１つを含む、請求項４０記載のタンパク質。
【請求項４２】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＫ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｑ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つを含む、請求項４１記載のタンパク質。
【請求項４３】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＬ１１６Ｆ、Ｖ１２８Ｌ、Ｖ１４６ＩおよびＶ１６８Ｌ置換の少なくとも１つを含む、請求項４２記載のタンパク質。
【請求項４４】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、以下の置換：
（１）Ａ５５ＶおよびＫ７２Ｓ；
（２）Ａ５５ＶおよびＫ７５Ｅ；
（３）Ａ５５ＶおよびＫ７５Ｑ；
（４）Ａ５５ＶおよびＱ９４Ｅ；
（５）Ａ５５ＶおよびＱ１１０Ｅ；
（６）Ａ５５ＶおよびＬ１１６Ｆ；
（７）Ａ５５ＶおよびＶ１２８Ｌ；
（８）Ａ５５ＶおよびＲ１３４Ｇ；
（９）Ａ５５ＶおよびＶ１４６Ｉ；
（１０）Ａ５５ＶおよびＮ１６４Ｄ；
（１１）Ａ５５ＶおよびＫ１６７Ｔ；
（１２）Ａ５５ＶおよびＶ１６８Ｌ；
（１３）Ｓ２３ＮおよびＫ７２Ｓ；
（１４）Ｓ２３ＮおよびＫ７５Ｅ；
（１５）Ｓ２３ＮおよびＫ７５Ｑ；
（１６）Ｓ２３ＮおよびＱ９４Ｅ；
（１７）Ｓ２３ＮおよびＱ１１０Ｅ；
（１８）Ｓ２３ＮおよびＬ１１６Ｆ；
（１９）Ｓ２３ＮおよびＶ１２８Ｉ；
（２０）Ｓ２３ＮおよびＲ１３４Ｇ；
（２１）Ｓ２３ＮおよびＶ１４６Ｉ；
（２２）Ｓ２３ＮおよびＮ１６４Ｄ；
（２３）Ｓ２３ＮおよびＫ１６７Ｔ；
（２４）Ｓ２３ＮおよびＶ１６８Ｌ；
（２５）Ｇ６ＡおよびＫ７２Ｓ；
（２６）Ｇ６ＡおよびＫ７５Ｅ；
（２７）Ｇ６ＡおよびＫ７５Ｑ；
（２８）Ｇ６ＡおよびＱ９４Ｅ；
（２９）Ｇ６ＡおよびＱ１１０Ｅ；
（３０）Ｇ６ＡおよびＬ１１６Ｆ；
（３１）Ｇ６ＡおよびＶ１２８Ｌ；
（３２）Ｇ６ＡおよびＲ１３４Ｇ；
（３３）Ｇ６ＡおよびＶ１４６Ｉ；
（３４）Ｇ６ＡおよびＮ１６４Ｄ；
（３５）Ｇ６ＡおよびＫ１６７Ｔ；
（３６）Ｇ６ＡおよびＶ１６８Ｌ；
（３７）Ｋ７２ＳおよびＫ７５Ｅ；
（３８）Ｋ７２ＳおよびＫ７５Ｑ；
（３９）Ｋ７２ＳおよびＱ９４Ｅ；
（４０）Ｋ７２ＳおよびＱ１１０Ｅ；
（４１）Ｋ７２ＳおよびＬ１１６Ｆ；
（４２）Ｋ７２ＳおよびＶ１２８Ｌ；
（４３）Ｋ７２ＳおよびＲ１３４Ｇ；
（４４）Ｋ７２ＳおよびＶ１４６Ｉ；
（４５）Ｋ７２ＳおよびＮ１６４Ｄ；
（４６）Ｋ７２ＳおよびＫ１６７Ｔ；
（４７）Ｋ７２ＳおよびＶ１６８Ｌ；
（４８）Ｋ７５ＥおよびＱ９４Ｅ；
（４９）Ｋ７５ＥおよびＱ１１０Ｅ；
（５０）Ｋ７５ＥおよびＬ１１６Ｆ；
（５１）Ｋ７５ＥおよびＶ１２８Ｌ；
（５２）Ｋ７５ＥおよびＲ１３４Ｇ；
（５３）Ｋ７５ＥおよびＶ１４６Ｉ；
（５４）Ｋ７５ＥおよびＮ１６４Ｄ；
（５５）Ｋ７５ＥおよびＫ１６７Ｔ；
（５６）Ｋ７５ＥおよびＶ１６８Ｌ；
（５７）Ｋ７５ＱおよびＱ９４Ｅ；
（５８）Ｋ７５ＱおよびＱ１１０Ｅ；
（５９）Ｋ７５ＱおよびＬ１１６Ｆ；
（６０）Ｋ７５ＱおよびＶ１２８Ｌ；
（６１）Ｋ７５ＱおよびＲ１３４Ｇ；
（６２）Ｋ７５ＱおよびＶ１４６Ｉ；
（６３）Ｋ７５ＱおよびＮ１６４Ｄ；
（６４）Ｋ７５ＱおよびＫ１６７Ｔ；
（６５）Ｋ７５ＱおよびＶ１６８Ｌ；
（６６）Ｑ９４ＥおよびＱ１１０Ｅ；
（６７）Ｑ９４ＥおよびＬ１１６Ｆ；
（６８）Ｑ９４ＥおよびＶ１２８Ｌ；
（６９）Ｑ９４ＥおよびＲ１３４Ｇ；
（７０）Ｑ９４ＥおよびＶ１４６Ｉ；
（７１）Ｑ９４ＥおよびＮ１６４Ｄ；
（７２）Ｑ９４ＥおよびＫ１６７Ｔ；
（７３）Ｑ９４ＥおよびＶ１６８Ｌ；
（７４）Ｑ１１０ＥおよびＬ１１６Ｆ；
（７５）Ｑ１１０ＥおよびＶ１２８Ｌ；
（７６）Ｑ１１０ＥおよびＲ１３４Ｇ；
（７７）Ｑ１１０ＥおよびＶ１４６Ｉ；
（７８）Ｑ１１０ＥおよびＮ１６４Ｄ；
（７９）Ｑ１１０ＥおよびＫ１６７Ｔ；
（８０）Ｑ１１０ＥおよびＶ１６８Ｌ；
（８１）Ｌ１１６ＦおよびＶ１２８Ｌ；
（８２）Ｌ１１６ＦおよびＲ１３４Ｇ；
（８３）Ｌ１１６ＦおよびＶ１４６Ｉ；
（８４）Ｌ１１６ＦおよびＮ１６４Ｄ；
（８５）Ｌ１１６ＦおよびＫ１６７Ｔ；
（８６）Ｌ１１６ＦおよびＶ１６８Ｌ；
（８７）Ｖ１２８ＬおよびＲ１３４Ｇ；
（８８）Ｖ１２８ＬおよびＶ１４６Ｉ；
（８９）Ｖ１２８ＬおよびＮ１６４Ｄ；
（９０）Ｖ１２８ＬおよびＫ１６７Ｔ；
（９１）Ｖ１２８ＬおよびＶ１６８Ｌ；
（９２）Ｖ１４６ＩおよびＮ１６４Ｄ；
（９３）Ｖ１４６ＩおよびＫ１６７Ｔ；
（９４）Ｖ１４６ＩおよびＶ１６８Ｌ；または
（９５）Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ
を含む、請求項１〜４３のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項４５】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＡ５５Ｖ置換を含む、請求項１〜４４のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項４６】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＳ２３Ｎ置換を含む、請求項１〜４５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項４７】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＬ５Ｙ、Ａ５５ＶおよびＬ９６Ｖ置換を含む、請求項１〜４６のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項４８】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＡ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換を含む、請求項１〜４７のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項４９】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＳ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換を含む、請求項１〜４８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５０】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＬ５Ｙ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換を含む、請求項１〜４９のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５１】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＬ５Ｙ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換を含む、請求項１〜５０のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５２】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがＱ４０Ａ置換を含む、請求項１〜５１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５３】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２または配列番号４４を含む、請求項１〜５２のいずれか１項記載のタンパク質
【請求項５４】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＮ３２、Ｋ３５、Ｌ４４、Ｋ４６またはＲ５９に対応する位置に置換を含まない、請求項１〜５３のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５５】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ５０、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｋ７２、Ｅ７７、Ｅ９１、Ｒ１３１、Ｄ１５３、Ｋ１６７、Ｅ１６９またはＫ１７１に対応する位置に置換を含まない、請求項１〜５４のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５６】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＦ９８に対応する位置に置換を含まない、請求項１〜５５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５７】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがバリンによるＦ９８の置換（Ｆ９８Ｖ）を含まない、請求項１〜５６のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５８】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＩ７６に対応する位置に置換を含まない、請求項１〜５７のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５９】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインがプロリンによるＩ７６の置換（Ｉ７６Ｐ）を含まない、請求項１〜５８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６０】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された場合に該タンパク質の凝集温度を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜５９のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６１】
該タンパク質が、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された場合に少なくとも６０℃の凝集温度を有する、請求項１〜６０のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６２】
該タンパク質が、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された場合に、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含む対応タンパク質の凝集温度より少なくとも７℃高い凝集温度を有する、請求項１〜６１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６３】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、ＣＤ４＋  ＣＣＲ５＋細胞系のＨＩＶ感染に対する該タンパク質のＩＣ５０を減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜６２のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６４】
該タンパク質が少なくとも１２時間、２４時間、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、３．５日、４日、４．５日、５日、５．５日、６日、６．５日、７日、７．５日、８日、８．５日、９日、９．５日または１０日の血漿半減期を有する、請求項１〜６３のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６５】
該タンパク質が少なくとも１２時間の血漿半減期を有する、請求項１〜６４のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６６】
該タンパク質が少なくとも３日の血漿半減期を有する、請求項１〜６５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６７】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、色素インターカレーションアッセイにより測定された場合に該タンパク質の融解温度を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜６６のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６８】
ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが、発現されるＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインの量を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜６７のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項６９】
霊長類レンチウイルスエンベロープ糖タンパク質結合部分を更に含む、請求項１〜６８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７０】
該結合部分が少なくとも１つのスルホチロシンを含む、請求項６９記載のタンパク質。
【請求項７１】
該結合部分が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項６９または７０記載のタンパク質。
【請求項７２】
免疫グロブリンＦｃドメインを更に含む、請求項１〜７１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７３】
ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２  Ｆｃドメインである、請求項７２記載のタンパク質。
【請求項７４】
ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項７３記載のタンパク質。
【請求項７５】
ＦｃドメインがＣ２２０に置換または欠失を含む、請求項７２〜７４のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７６】
ＦｃドメインがＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４ＳおよびＮ４３４Ｆ置換の少なくとも１つを含む、請求項７２〜７５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７７】
ＦｃドメインがＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ置換を含む、請求項７６記載のタンパク質。
【請求項７８】
ＦｃドメインがＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ置換を含む、請求項７６記載のタンパク質。
【請求項７９】
該タンパク質が、天然に存在する野生型非ヒト霊長類タンパク質と同一ではない、前記請求項のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項８０】
該タンパク質がＣＤ４ドメイン３（Ｄ３）および／またはドメイン４（Ｄ４）領域を含まない、前記請求項のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項８１】
請求項１〜８０のいずれか１項記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項８２】
請求項８１記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８３】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項８２記載の発現ベクター。
【請求項８４】
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８３記載の発現ベクター。
【請求項８５】
請求項８２〜８４のいずれか１項記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８６】
請求項１〜８０のいずれか１項記載のタンパク質または請求項８２〜８４のいずれか１項記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
【請求項８７】
請求項１〜８０のいずれか１項記載のタンパク質、請求項８２〜８４のいずれか１項記載の発現ベクターまたは請求項８６記載の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、ＨＩＶ感染の治療を要する対象におけるＨＩＶ感染の治療方法。
【請求項８８】
対象がヒトである、請求項８７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本特許出願は米国仮特許出願第６２／６４５，９０３号（２０１８年３月２１日付け出願）に基づく優先権の利益を主張するものである。該優先権出願の全開示の全体をあらゆる目的で参照により本明細書に組み入れることとする。
【０００２】
米国政府の援助に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成金番号ＡＩ０９１４７６、ＡＩ１２９８６８およびＡＩ１２６６２３に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、全般的には、ＣＤ４を含むタンパク質、およびＨＩＶの治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
許容宿主ＣＤ４＋  Ｔ細胞上で発現されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する膜貫通受容体であるＣＤ４に由来するポリペプチドは、ＨＩＶ感染を抑制するために使用されうる。そのようなＣＤ４由来ポリペプチドは、ウイルス粒子に結合して許容宿主細胞上のＣＤ４の認識を妨げることにより、ＨＩＶ感染を遮断または「中和」するように仲介しうる。ＣＤ４の可溶性形態（ｓＣＤ４）は、ＨＩＶ感染を抑制するためのアプローチとして１９８０年代に最初に提示された（Ｈｕｓｓｅｙ，Ｒ．Ｅ．ら（１９８８）ＮＡＴＵＲＥ，３３１（６１５１）：７８−８１；Ｄｅｅｎ，Ｋ．Ｃ．ら（１９８８）ＮＡＴＵＲＥ，３３１（６１５１）：８２−４；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｈ．ら（１９８７）ＳＣＩＥＮＣＥ，２３８（４８３４）：１７０４−７；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ａ．ら（１９８８）ＮＡＴＵＲＥ，３３１（６１５１）：７６−８；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．ら（１９８９）ＮＡＴＵＲＥ，３３７（６２０４）：２６７−７０；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら（１９８８）ＮＡＴＵＲＥ，３３１（６１５１）：８４−６）。しかし、血漿中のｓＣＤ４の短い半減期は、ＨＩＶ感染を治療するための組換えタンパク質治療薬としてのその使用に対する熱意をくじいた（Ｗａｔａｎａｂｅ  ら（１９８９），前掲；Ｓｃｈｏｏｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．ら（１９９０）ＡＮＮ．ＩＮＴＥＲＮ．ＭＥＤ．，１１２（４）：２４７−５３）。更に、患者から直接分離されたＨＩＶ株（すなわち、一次分離株）の相当な割合がｓＣＤ４による中和に対して耐性である（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら（１９９１）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，８８（１６）：７０５６−６０；Ｄａａｒ，Ｅ．Ｓ．ら（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，８７（１７）：６５７４−８；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｗ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，６６（５）：３１２５−３０）。
【０００５】
ｓＣＤ４の半減期のこれまでの改善は、免疫グロブリン（Ｉｇ）結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）を加えることにより行われている（Ｃａｐｏｎ，Ｄ．Ｊ．ら（１９８９）ＮＡＴＵＲＥ，３３７（６２０７）：５２５−３１；Ｃｈａｍｏｗ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９２）ＩＮＴ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ  ＳＵＰＰＬ．，７：６９−７２；Ｂｙｒｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９０）ＮＡＴＵＲＥ，３４４（６２６７）：６６７−７０）。免疫グロブリンＦｃを含有するｓＣＤ４の形態はＣＤ４−Ｉｇと称される。このアプローチにもかかわらず、ヒトＣＤ４−Ｉｇの半減期は、通常の抗体で予想されるものに尚も達していない（Ｈｏｄｇｅｓ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９１）ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢ．ＡＧＥＮＴＳ  ＣＨＥＭＯＴＨＥＲ．，３５（１２）：２５８０−６；Ｋａｈｎ，Ｊ．Ｏ．ら（１９９０）ＡＮＮ．ＩＮＴＥＲＮ．ＭＥＤ．，１１２（４）：２５４−６１；Ｃｈａｍｏｗ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）ＢＩＯＣＯＮＪＵＧ．ＣＨＥＭ．，５（２）：１３３−４０）。ＣＤ４−Ｉｇの最適とは言えない薬物動態学的特性は治療状況におけるその有用性を制限している。
【０００６】
これまでに種々の開発がなされているが、ＨＩＶおよびエイズの治療および処置のための新規かつ有効な療法が尚も絶えず必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概括
本発明は、天然に存在するヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（すなわち、ヒトＣＤ４ドメイン１およびＣＤ４ドメイン２）を含むタンパク質より高い安定性および／または活性を有するヒトＣＤ４ドメイン１およびＣＤ４ドメイン２の両方（ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２）を含むタンパク質の知見に部分的に基づいている。ある実施形態においては、該タンパク質は、天然に存在するヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質と比較して、例えば熱スキャンアッセイにおける動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された場合の、より高い凝集温度、および／またはより長い血漿半減期を示す。更に、本明細書に記載されているタンパク質はヒト対象におけるＨＩＶの治療に好適でありうると想定される。
【０００８】
１つの態様においては、本発明は、ヒトＣＤ４ドメイン１およびドメイン２（ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２）ムテインを含むタンパク質を提供し、ここで、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に対して少なくとも９０％同一であり、
ａ．非荷電アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の置換、
ｂ．酸性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の置換、
ｃ．酸性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における非荷電アミノ酸の置換、または
ｄ．置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるグリシンもしくは埋もれた疎水性側鎖を有するアミノ酸の置換
のうちの少なくとも１つの置換を含み、該置換は、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２において野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）とは非同一である位置におけるものである。
【０００９】
もう１つの態様においては、本発明は、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に対して少なくとも９０％同一であり、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｖ４、Ｌ５、Ｇ６、Ｋ７、Ｋ８、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｖ１２、Ｌ１４、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｋ３５、Ｉ３６、Ｌ３７、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｆ６７、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｉ７１、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｅ７７、Ｄ８０、Ｔ８１、Ｖ８６、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｅ９１、Ｖ９３、Ｑ９４、Ｌ９５、Ｌ９６、Ｖ９７、Ｆ９８、Ｇ９９、Ｔ１０１、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｄ１０５、Ｈ１０７、Ｌ１０８、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１６、Ｔ１１７、Ｌ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｖ１２８、Ｑ１２９、Ｃ１３０、Ｒ１３１、Ｓ１３２、Ｐ１３３、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｉ１３８、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｌ１４９、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｄ１５３、Ｇ１５５、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｅ１６９、Ｆ１７０、Ｋ１７１、Ｉ１７２、Ｄ１７３、Ｉ１７４、Ｖ１７５、Ｖ１７６またはＡ１７８に対応する位置に少なくとも１つの置換を含む、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインを含むタンパク質を提供する。
【００１０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｖ４、Ｇ６、Ｋ７、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｖ１２、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｋ３５、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｅ７７、Ｄ８０、Ｔ８１、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｅ９１、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｇ９９、Ｔ１０１、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｄ１０５、Ｈ１０７、Ｌ１０８、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｖ１２８、Ｑ１２９、Ｃ１３０、Ｒ１３１、Ｓ１３２、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｉ１３８、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｄ１５３、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｅ１６９、Ｆ１７０、Ｋ１７１、Ｉ１７２、Ｄ１７３、Ｉ１７４、Ｖ１７５またはＡ１７８に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００１１】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿、旧世界ザルまたは新世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば類人猿、旧世界ザルまたは新世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ７、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｄ８０、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｌ９６、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３１、Ｒ１３４、Ｎ１３７、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｋ１７１、Ｄ１７３、Ｉ１７４またはＶ１７５に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００１２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿または旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば類人猿または旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｄ１０、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｄ８０、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｋ１４２、Ｌ１４４、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｋ１６６またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００１３】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば類人猿ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｑ２０、Ｉ３４、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｇ６５、Ｐ６８、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｓ１４７、Ｗ１５７、Ｔ１６０、Ｎ１６４またはＫ１６６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００１４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｄ１０、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｐ４８、Ｎ５２、Ａ５５、Ｒ５９、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｄ８０、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｋ１４２、Ｌ１４４、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｔ１５６、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｋ１６６またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００１５】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、置換されるアミノ酸より大きな体積、例えば側鎖体積を有する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるグリシンもしくは疎水性アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ５、Ｇ６、Ｖ１２、Ｌ１４、Ａ１８、Ｉ２４、Ｉ３６、Ｌ３７、Ｌ４４、Ｌ５１、Ａ５５、Ｇ６５、Ｆ６７、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｖ９３、Ｇ９９、Ｉ７１、Ｌ７４、Ｖ８６、Ｖ９３、Ｌ９５、Ｌ９６、Ｖ９７、Ｆ９８、Ａ１０２、Ｌ１０８、Ｌ１１４、Ｌ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２１、Ｖ１２８、Ｐ１３３、Ｉ１３８、Ｇ１４１、Ｌ１４４、Ｖ１４６、Ｌ１４９、Ｇ１５５、Ｖ１６１、Ｖ１６８、Ｆ１７０、Ｉ１７２、Ｉ１７４またはＶ１７６に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ａ５５、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｖ１４６、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｉ２４、Ｌ４４、Ｌ５１、Ａ５５、Ｌ６９、Ｇ９９、Ａ１０２、Ｖ１２８、Ｇ１４１、Ｖ１４６、Ｖ１６１およびＶ１６８に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００１６】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、正味正電荷の低減を伴うタンパク質を与える少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、非荷電アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の、少なくとも１つの置換、または酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えばＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＨまたはＹによる、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ７、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｋ３５、Ｋ４６、Ｋ５０、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｋ１６６、Ｋ１６７またはＫ１７１に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００１７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における非荷電アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えばＤまたはＥによる、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＶ４、Ｔ１１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｓ２３、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｓ４２、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｎ６６、Ｉ７０、Ｉ７６、Ｔ８１、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｔ１０１、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｈ１０７、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｑ１２９、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｔ１４３、Ｓ１４５、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｔ１５６、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｖ１７５またはＡ１７８に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００１８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、ＣＤ４  Ｄ１ドメインにおける少なくとも１つの置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上、およびＣＤ４  Ｄ２ドメインにおける少なくとも１つの置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００１９】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における表面露出側鎖を有するアミノ酸位置における１０、９、８、７、６、５、４、３、２個または１個より少ない置換を含む。
【００２０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｇ６、Ｋ８、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｋ２１、Ｓ２３、Ａ５５、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００２１】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｌ５、Ｇ６、Ｋ７、Ｋ８、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ａ５５、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｇ９９、Ａ１０２、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４、Ｋ１６６、Ｋ１６７またはＫ１７１に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００２２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００２３】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ５、Ｋ８、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。例えば、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７またはＶ１６８に対応する位置における少なくとも１つの置換、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８またはＶ１７６に対応する位置における少なくとも１つの置換、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＳ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換、あるいは野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＳ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＡ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含みうる。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１４６またはＶ１６８に対応する位置における少なくとも１つの置換、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｋ７、Ｋ８、Ｔ１７、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００２４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ａ５５およびＫ７２；Ａ５５およびＫ７５；Ａ５５およびＱ９４；Ａ５５およびＱ１１０；Ａ５５およびＬ１１６；Ａ５５およびＶ１２８；Ａ５５およびＲ１３４；Ａ５５およびＶ１４６；Ａ５５およびＮ１６４；Ａ５５およびＫ１６７；Ａ５５およびＶ１６８；Ｓ２３およびＫ７２；Ｓ２３およびＫ７５；Ｓ２３およびＱ９４；Ｓ２３およびＱ１１０；Ｓ２３およびＬ１１６；Ｓ２３およびＶ１２８；Ｓ２３およびＲ１３４；Ｓ２３およびＶ１４６；Ｓ２３およびＮ１６４；Ｓ２３およびＫ１６７；Ｓ２３およびＶ１６８；Ｇ６およびＫ７２；Ｇ６およびＫ７５；Ｇ６およびＱ９４；Ｇ６およびＱ１１０；Ｇ６およびＬ１１６；Ｇ６およびＶ１２８；Ｇ６およびＲ１３４；Ｇ６およびＶ１４６；Ｇ６およびＮ１６４；Ｇ６およびＫ１６７；Ｇ６およびＶ１６８；Ｋ７２およびＫ７５；Ｋ７２およびＱ９４；Ｋ７２およびＱ１１０；Ｋ７２およびＬ１１６；Ｋ７２およびＶ１２８；Ｋ７２およびＲ１３４；Ｋ７２およびＶ１４６；Ｋ７２およびＮ１６４；Ｋ７２およびＫ１６７；Ｋ７２およびＶ１６８；Ｋ７５および９４；Ｋ７５およびＱ１１０；Ｋ７５およびＬ１１６；Ｋ７５およびＶ１２８；Ｋ７５およびＲ１３４；Ｋ７５およびＶ１４６；Ｋ７５およびＮ１６４；Ｋ７５およびＫ１６７；Ｋ７５およびＶ１６８；Ｑ９４およびＱ１１０；Ｑ９４およびＬ１１６；Ｑ９４およびＶ１２８；Ｑ９４およびＲ１３４；Ｑ９４およびＶ１４６；Ｑ９４およびＮ１６４；Ｑ９４およびＫ１６７；Ｑ９４およびＶ１６８；Ｑ１１０およびＬ１１６；Ｑ１１０およびＶ１２８；Ｑ１１０およびＲ１３４；Ｑ１１０およびＶ１４６；Ｑ１１０およびＮ１６４；Ｑ１１０およびＫ１６７；Ｑ１１０およびＶ１６８；Ｌ１１６およびＶ１２８；Ｌ１１６およびＲ１３４；Ｌ１１６およびＶ１４６；Ｌ１１６およびＮ１６４；Ｌ１１６およびＫ１６７；Ｌ１１６およびＶ１６８；Ｖ１２８およびＲ１３４；Ｖ１２８およびＶ１４６；Ｖ１２８およびＮ１６４；Ｖ１２８およびＫ１６７；Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｖ１４６およびＮ１６４；Ｖ１４６およびＫ１６７；Ｖ１４６およびＶ１６８；またはＮ１６４およびＫ１６７。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｓ２３、Ａ５５およびＫ７２；Ｓ２３、Ａ５５およびＫ７５；Ｓ２３、Ａ５５およびＱ９４；Ｓ２３、Ａ５５およびＱ１１０；Ｓ２３、Ａ５５およびＬ１１６；Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１２８；Ｓ２３、Ａ５５およびＲ１３４；Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１４６；Ｓ２３、Ａ５５およびＮ１６４；Ｓ２３、Ａ５５およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３およびＫ７２；Ｇ６、Ｓ２３およびＫ７５；Ｇ６、Ｓ２３およびＱ９４；Ｇ６、Ｓ２３およびＱ１１０；Ｇ６、Ｓ２３およびＬ１１６；Ｇ６、Ｓ２３およびＶ１２８；Ｇ６、Ｓ２３およびＲ１３４；Ｇ６、Ｓ２３およびＶ１４６；Ｇ６、Ｓ２３およびＮ１６４；Ｇ６、Ｓ２３およびＫ１６７；Ｇ６、Ｓ２３およびＶ１６８；Ｇ６、Ａ５５およびＫ７２；Ｇ６、Ａ５５およびＫ７５；Ｇ６、Ａ５５およびＱ９４；Ｇ６、Ａ５５およびＱ１１０；Ｇ６、Ａ５５およびＬ１１６；Ｇ６、Ａ５５およ��Ｖ１２８；Ｇ６、Ａ５５およびＲ１３４；Ｇ６、Ａ５５およびＶ１４６；Ｇ６、Ａ５５およびＮ１６４；Ｇ６、Ａ５５およびＫ１６７；Ｇ６、Ａ５５およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＫ７２；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＫ７５；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＱ９４；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＱ１１０；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ１１６；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１２８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＲ１３４；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１４６；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＮ１６４；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＫ１６７；またはＧ６、Ｓ２３、Ａ５５およびＶ１６８。
【００２５】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０およびＲ１３４；Ｑ９４、Ｑ１１０およびＮ１６４；Ｑ９４、Ｑ１１０および１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｋ７５およびＲ１３４；Ｋ７２、Ｋ７５およびＮ１６４；Ｋ７２、Ｋ７５およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＲ１３４；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＮ１６４；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ１６７；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＶ１４６；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＬ１１６；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７２；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７５；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ９４；Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ１１０；Ｖ１４６、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｖ１４６、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＫ７２；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＫ７５；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＱ９４；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＱ１１０；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＬ１１６；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＶ１４６；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＫ７２；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＫ７５；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＱ９４；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＱ１１０；Ｖ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＮ１６４；またはＶ１２８、Ｖ１６８、Ｖ１４６およびＫ１６７。
【００２６】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｇ６、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｇ６、Ａ５５、Ｖ１４６およびＶ１６８；Ｇ６、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１４６；Ｇ６、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１４６およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１４６およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６およびＶ１６８；Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７２；Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７５；Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ９４；Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ１１０；Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＬ１１６；Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＲ１３４；Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＶ１４６；Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ１６７；Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７２；Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ７５；Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ９４；Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＱ１１０；Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＬ１１６；Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＲ１３４；Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＶ１４６；Ｓ２３、Ｖ１２８、Ｖ１６８およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｑ９４、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｖ１４６およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４���Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｖ１４６およびＫ１６７；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｖ１４６、Ｎ１６４、Ｋ１６７、Ｖ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７５、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｑ９４、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｑ１１０、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｎ１６４およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｋ１６７およびＶ１６８；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６およびＲ１３４；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６およびＮ１６４；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００２７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８およびＶ１６８；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｖ１２８、Ｖ１４６およびＶ１６８；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｇ６、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；またはＳ２３、Ａ５５、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｖ１２８、Ｒ１３４、Ｋ１６７およびＶ１６８。
【００２８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５およびＲ１３４；Ａ５５およびＮ１６４；Ａ５５およびＫ１６７；Ｓ２３およびＲ１３４；Ｓ２３およびＮ１６４；Ｓ２３およびＫ１６７；Ｋ７２およびＫ７５；Ｋ７５およびＲ１３４；Ｋ７５およびＮ１６４；Ｋ７５およびＫ１６７；Ｋ７５およびＱ９４；Ｋ７５およびＱ１１０；Ｓ２３およびＫ７５；Ａ５５およびＫ７５；Ｑ９４およびＱ１１０；Ｓ２３およびＡ５５；Ｌ５およびＳ２３；Ｋ２およびＮ１６４；Ｋ２およびＫ１６７；Ｋ７およびＫ８；Ｋ７およびＡ５５；Ｋ８およびＮ１６４；Ｋ８およびＫ１６７；Ｋ８およびＡ５５；Ｔ１７およびＮ１６４；Ｔ１７およびＫ１６７；Ｉ７０およびＮ１６４；Ｉ７０およびＫ１６７；Ａ５５およびＩ７０；Ａ５５およびＫ７２；Ｋ７２およびＮ１６４；Ｋ７２およびＫ１６７；Ｑ９４およびＮ１６４；Ｑ９４およびＫ１６７；Ｑ１１０およびＮ１６４；Ｑ１１０およびＫ１６７；Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｋ７およびＫ８；Ｓ２３、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｓ２３、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５およびＲ１３４；Ｓ２３、Ａ５５およびＮ１６４；Ｓ２３、Ａ５５およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４およびＱ１１０；Ａ５５、Ｋ７５およびＲ１３４；Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ９６；Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｔ１７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７、Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７．Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＫ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００２９】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４およびＱ１１０；Ｋ２およびＮ１６４；Ｋ２およびＫ１６７；Ｋ７およびＫ８；Ｋ８およびＮ１６４；Ｋ８およびＫ１６７；Ｔ１７およびＮ１６４；Ｔ１７およびＫ１６７；Ｉ７０およびＮ１６４；Ｉ７０およびＫ１６７；Ｋ７２およびＮ１６４；Ｋ７２およびＫ１６７；Ｋ７５およびＲ１３４；Ｋ７５およびＮ１６４；Ｋ７５およびＫ１６７；Ｋ７５およびＱ９４；Ｋ７５およびＱ１１０；Ｑ９４およびＮ１６４；Ｑ９４およびＫ１６７；Ｑ１１０およびＮ１６４；Ｑ１１０およびＫ１６７；Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４およびＱ１１０；Ｋ７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｔ１７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＫ７、Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００３０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ９６；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００３１】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５およびＲ１３４；Ａ５５およびＮ１６４；Ａ５５およびＫ１６７；Ｓ２３およびＲ１３４；Ｓ２３およびＮ１６４；Ｓ２３およびＫ１６７；Ｋ７２およびＫ７５；Ｋ７５およびＲ１３４；Ｋ７５およびＮ１６４；Ｋ７５およびＫ１６７；Ｋ７５およびＱ９４；Ｋ７５およびＱ１１０；Ｓ２３およびＫ７５；Ａ５５およびＫ７５；Ｑ９４およびＱ１１０；Ｓ２３およびＡ５５；Ｌ５およびＳ２３；Ｋ２およびＮ１６４；Ｋ２およびＫ１６７；Ｋ７およびＫ８；Ｋ７およびＡ５５；Ｋ８およびＮ１６４；Ｋ８およびＫ１６７；Ｋ８およびＡ５５；Ｔ１７およびＮ１６４；Ｔ１７およびＫ１６７；Ｉ７０およびＮ１６４；Ｉ７０およびＫ１６７；Ａ５５およびＩ７０；Ａ５５およびＫ７２；Ｋ７２およびＮ１６４；Ｋ７２およびＫ１６７；Ｑ９４およびＮ１６４；Ｑ９４およびＫ１６７；Ｑ１１０およびＮ１６４；Ｑ１１０およびＫ１６７；Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｋ７およびＫ８；Ｓ２３、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｓ２３、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５およびＲ１３４；Ｓ２３、Ａ５５およびＮ１６４；Ｓ２３、Ａ５５およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４およびＱ１１０；Ａ５５、Ｋ７５およびＲ１３４；Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ９６；Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｔ１７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７、Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＫ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００３２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４およびＱ１１０；Ｋ２およびＮ１６４；Ｋ２およびＫ１６７；Ｋ７およびＫ８；Ｋ８およびＮ１６４；Ｋ８およびＫ１６７；Ｔ１７およびＮ１６４；Ｔ１７およびＫ１６７；Ｉ７０およびＮ１６４；Ｉ７０およびＫ１６７；Ｋ７２およびＮ１６４；Ｋ７２およびＫ１６７；Ｋ７５およびＲ１３４；Ｋ７５およびＮ１６４；Ｋ７５およびＫ１６７；Ｋ７５およびＱ９４；Ｋ７５およびＱ１１０；Ｑ９４およびＮ１６４；Ｑ９４およびＫ１６７；Ｑ１１０およびＮ１６４；Ｑ１１０およびＫ１６７；Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４およびＱ１１０；Ｋ７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｔ１７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＫ７、Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００３３】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ９６；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００３４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、非荷電アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の、少なくとも１つの置換；酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の、少なくとも１つの置換；または酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における非荷電アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００３５】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるグリシンもしくは疎水性アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００３６】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００３７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿、旧世界ザルまたは新世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００３８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿または旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００３９】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００４０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。
【００４１】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の置換の少なくとも１つを含む：Ｋ１の、Ｎによる置換（Ｋ１Ｎ）；Ｋ２の、Ｅによる置換（Ｋ２Ｅ）、Ｎによる置換（Ｋ２Ｎ）またはＴによる置換（Ｋ２Ｔ）；Ｌ５の、Ｙによる置換（Ｌ５Ｙ）、Ｉによる置換（Ｌ５Ｉ）、Ｅによる置換（Ｌ５Ｅ）、Ｗによる置換（Ｌ５Ｗ）、Ｖによる置換（Ｌ５Ｖ）、Ｆによる置換（Ｌ５Ｆ）またはＴによる置換（Ｌ５Ｔ）；Ｋ７の、Ｅによる置換（Ｋ７Ｅ）；Ｋ８の、Ｅによる置換（Ｋ８Ｅ）；Ｔ１５の、Ｎによる置換（Ｔ１５Ｎ）またはＥによる置換（Ｔ１５Ｅ）；Ｔ１７の、Ｎによる置換（Ｔ１７Ｎ）またはＥによる置換（Ｔ１７Ｅ）；Ｓ２３の、Ｎによる置換（Ｓ２３Ｎ）、Ｔによる置換（Ｓ２３Ｔ）、Ｋによる置換（Ｓ２３Ｋ）、Ｙによる置換（Ｓ２３Ｙ）またはＡによる置換（Ｓ２３Ａ）；Ａ５５の、Ｖによる置換（Ａ５５Ｖ）、Ｉによる置換（Ａ５５Ｉ）、Ｐによる置換（Ａ５５Ｐ）、Ｌによる置換（Ａ５５Ｌ）、Ｍによる置換（Ａ５５Ｍ）、Ｆによる置換（Ａ５５Ｆ）、Ｙによる置換（Ａ５５Ｙ）、Ｗによる置換（Ａ５５Ｗ）またはＴによる置換（Ａ５５Ｔ）；Ｉ７０の、Ｅによる置換（Ｉ７０Ｅ）、Ｌによる置換（Ｉ７０Ｌ）またはＶによる置換（Ｉ７０Ｖ）；Ｋ７２の、Ｓによる置換（Ｋ７２Ｓ）；Ｋ７５の、Ｅによる置換（Ｋ７５Ｅ）またはＱによる置換（Ｋ７５Ｑ）；Ｑ９４の、Ｅによる置換（Ｑ９４Ｅ）；Ｌ９６の、Ｖによる置換（Ｌ９６Ｖ）、Ｑによる置換（Ｌ９６Ｑ）、Ｔによる置換（Ｌ９６Ｔ）、Ｉによる置換（Ｌ９６Ｉ）またはＹによる置換（Ｌ９６Ｙ）；Ｑ１１０の、Ｅによる置換（Ｑ１１０Ｅ）またはＨによる置換（Ｑ１１０Ｈ）；Ｌ１１６の、Ｆによる置換（Ｌ１１６Ｆ）またはＷによる置換（Ｌ１１６Ｗ）；Ｖ１２８の、Ｉによる置換（Ｖ１２８Ｉ）またはＬによる置換（Ｖ１２８Ｌ）；Ｒ１３４の、Ｇによる置換（Ｒ１３４Ｇ）またはＴによる置換（Ｒ１３４Ｔ）；Ｋ１４２の、Ｒによる置換（Ｋ１４２Ｒ）、Ｇによる置換（Ｋ１４２Ｇ）またはＳによる置換（Ｋ１４２Ｓ）；Ｖ１４６の、Ｉによる置換（Ｖ１４６Ｉ）、Ｌによる置換（Ｖ１４６Ｌ）、Ｆによる置換（Ｖ１４６Ｆ）またはＷによる置換（Ｖ１４６Ｗ）；Ｎ１６４の、Ｄによる置換（Ｎ１６４Ｄ）、Ｈによる置換（Ｎ１６４Ｈ）、Ｒによる置換（Ｎ１６４Ｒ）またはＥによる置換（Ｎ１６４Ｅ）；Ｋ１６７の、Ｔによる置換（Ｋ１６７Ｔ）、Ｒによる置換（Ｋ１６７Ｒ）またはＬによる置換（Ｋ１６７Ｌ）；Ｖ１６８の、Ｉによる置換（Ｖ１６８Ｉ）またはＬによる置換（Ｖ１６８Ｌ）；およびＶ１７６の、Ｉによる置換（Ｖ１７６Ｉ）。
【００４２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＫ２Ｅ、Ｋ７Ｅ、Ｋ８Ｅ、Ｔ１７Ｎ、Ｔ１７Ｅ、Ａ５５Ｖ、Ｉ７０Ｅ、Ｋ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｋ１４２Ｒ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つを含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の置換を含む：Ｋ２ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ２ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７ＥおよびＫ８Ｅ；Ｋ８ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ８ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｔ１７ＮおよびＮ１６４Ｄ；Ｔ１７ＮおよびＫ１６７Ｔ；Ｔ１７ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｔ１７ＮおよびＫ１６７Ｔ；Ｉ７０ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｉ７０ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７２ＳおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ７２ＳおよびＫ１６７Ｔ；Ｑ９４ＥおよびＱ１１０Ｅ；Ｑ９４ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｑ９４ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｑ１１０ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｑ１１０ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｒ１３４ＧおよびＮ１６４Ｄ；Ｒ１３４ＧおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ１４２ＲおよびＫ１６７Ｔ；Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ２Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ８Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｔ１７Ｎ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｔ１７Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｉ７０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７２Ｓ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７５Ｅ、Ｑ９４ＥおよびＱ１１０Ｅ；またはＫ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ。
【００４３】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＬ５Ｙ、Ｋ８Ｅ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｋ７５Ｅ、Ｑ９４Ｅ、Ｌ９６Ｖ、Ｑ１１０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つ、Ｌ５Ｙ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つ、またはＡ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つを含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の置換を含む：Ａ５５Ｖ；Ｌ５Ｙ、Ａ５５ＶおよびＬ９６Ｖ；Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｌ５Ｙ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；またはＬ５Ｙ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ。
【００４４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＧ６Ａ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｋ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｑ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｖ１２８Ｌ、Ｒ１３４Ｇ、Ｖ１４６Ｉ、Ｎ１６４Ｄ、Ｋ１６７ＴおよびＶ１６８Ｌ置換の少なくとも１つを含む。
【００４５】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＫ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｑ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｖ１２８Ｌ、Ｒ１３４Ｇ、Ｖ１４６Ｉ、Ｎ１６４Ｄ、Ｋ１６７ＴおよびＶ１６８Ｌ置換の少なくとも１つを含む。
【００４６】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＫ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｑ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つを含む。
【００４７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＬ１１６Ｆ、Ｖ１２８Ｌ、Ｖ１４６ＩおよびＶ１６８Ｌ置換の少なくとも１つを含む。
【００４８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の置換を含む：Ａ５５ＶおよびＫ７２Ｓ；Ａ５５ＶおよびＫ７５Ｅ；Ａ５５ＶおよびＫ７５Ｑ；Ａ５５ＶおよびＱ９４Ｅ；Ａ５５ＶおよびＱ１１０Ｅ；Ａ５５ＶおよびＬ１１６Ｆ；Ａ５５ＶおよびＶ１２８Ｌ；Ａ５５ＶおよびＲ１３４Ｇ；Ａ５５ＶおよびＶ１４６Ｉ；Ａ５５ＶおよびＮ１６４Ｄ；Ａ５５ＶおよびＫ１６７Ｔ；Ａ５５ＶおよびＶ１６８Ｌ；Ｓ２３ＮおよびＫ７２Ｓ；Ｓ２３ＮおよびＫ７５Ｅ；Ｓ２３ＮおよびＫ７５Ｑ；Ｓ２３ＮおよびＱ９４Ｅ；Ｓ２３ＮおよびＱ１１０Ｅ；Ｓ２３ＮおよびＬ１１６Ｆ；Ｓ２３ＮおよびＶ１２８Ｉ；Ｓ２３ＮおよびＲ１３４Ｇ；Ｓ２３ＮおよびＶ１４６Ｉ；Ｓ２３ＮおよびＮ１６４Ｄ；Ｓ２３ＮおよびＫ１６７Ｔ；Ｓ２３ＮおよびＶ１６８Ｌ；Ｇ６ＡおよびＫ７２Ｓ；Ｇ６ＡおよびＫ７５Ｅ；Ｇ６ＡおよびＫ７５Ｑ；Ｇ６ＡおよびＱ９４Ｅ；Ｇ６ＡおよびＱ１１０Ｅ；Ｇ６ＡおよびＬ１１６Ｆ；Ｇ６ＡおよびＶ１２８Ｌ；Ｇ６ＡおよびＲ１３４Ｇ；Ｇ６ＡおよびＶ１４６Ｉ；Ｇ６ＡおよびＮ１６４Ｄ；Ｇ６ＡおよびＫ１６７Ｔ；Ｇ６ＡおよびＶ１６８Ｌ；Ｋ７２ＳおよびＫ７５Ｅ；Ｋ７２ＳおよびＫ７５Ｑ；Ｋ７２ＳおよびＱ９４Ｅ；Ｋ７２ＳおよびＱ１１０Ｅ；Ｋ７２ＳおよびＬ１１６Ｆ；Ｋ７２ＳおよびＶ１２８Ｌ；Ｋ７２ＳおよびＲ１３４Ｇ；Ｋ７２ＳおよびＶ１４６Ｉ；Ｋ７２ＳおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ７２ＳおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７２ＳおよびＶ１６８Ｌ；Ｋ７５ＥおよびＱ９４Ｅ；Ｋ７５ＥおよびＱ１１０Ｅ；Ｋ７５ＥおよびＬ１１６Ｆ；Ｋ７５ＥおよびＶ１２８Ｌ；Ｋ７５ＥおよびＲ１３４Ｇ；Ｋ７５ＥおよびＶ１４６Ｉ；Ｋ７５ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ７５ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７５ＥおよびＶ１６８Ｌ；Ｋ７５ＱおよびＱ９４Ｅ；Ｋ７５ＱおよびＱ１１０Ｅ；Ｋ７５ＱおよびＬ１１６Ｆ；Ｋ７５ＱおよびＶ１２８Ｌ；Ｋ７５ＱおよびＲ１３４Ｇ；Ｋ７５ＱおよびＶ１４６Ｉ；Ｋ７５ＱおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ７５ＱおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７５ＱおよびＶ１６８Ｌ；Ｑ９４ＥおよびＱ１１０Ｅ；Ｑ９４ＥおよびＬ１１６Ｆ；Ｑ９４ＥおよびＶ１２８Ｌ；Ｑ９４ＥおよびＲ１３４Ｇ；Ｑ９４ＥおよびＶ１４６Ｉ；Ｑ９４ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｑ９４ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｑ９４ＥおよびＶ１６８Ｌ；Ｑ１１０ＥおよびＬ１１６Ｆ；Ｑ１１０ＥおよびＶ１２８Ｌ；Ｑ１１０ＥおよびＲ１３４Ｇ；Ｑ１１０ＥおよびＶ１４６Ｉ；Ｑ１１０ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｑ１１０ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｑ１１０ＥおよびＶ１６８Ｌ；Ｌ１１６ＦおよびＶ１２８Ｌ；Ｌ１１６ＦおよびＲ１３４Ｇ；Ｌ１１６ＦおよびＶ１４６Ｉ；Ｌ１１６ＦおよびＮ１６４Ｄ；Ｌ１１６ＦおよびＫ１６７Ｔ；Ｌ１１６ＦおよびＶ１６８Ｌ；Ｖ１２８ＬおよびＲ１３４Ｇ；Ｖ１２８ＬおよびＶ１４６Ｉ；Ｖ１２８ＬおよびＮ１６４Ｄ；Ｖ１２８ＬおよびＫ１６７Ｔ；Ｖ１２８ＬおよびＶ１６８Ｌ；Ｖ１４６ＩおよびＮ１６４Ｄ；Ｖ１４６ＩおよびＫ１６７Ｔ；Ｖ１４６ＩおよびＶ１６８Ｌ；またはＮ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ。
【００４９】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＡ５５Ｖ置換を含む。
【００５０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＳ２３Ｎ置換を含む。
【００５１】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＬ５Ｙ、Ａ５５ＶおよびＬ９６Ｖ置換を含む。
【００５２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＡ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換を含む。
【００５３】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＳ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換を含む。
【００５４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＬ５Ｙ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換を含む。
【００５５】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＬ５Ｙ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換を含む。
【００５６】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＱ４０Ａ置換を含む。
【００５７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２もしくは配列番号４４のアミノ酸配列を含み、または配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２もしくは配列番号４４に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、配列番号４６のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含み、これは配列番号４７のヌクレオチド配列によりコードされる。ある実施形態においては、リーダー配列は配列番号４６に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００５９】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、ｇｐ１２０と接触する野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸残基の置換を含まない。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＮ３２、Ｋ３５、Ｌ４４、Ｋ４６またはＲ５９に対応する位置に置換を含まない。
【００６０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩橋を形成するアミノ酸残基の置換を含まない。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ５０、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｋ７２、Ｅ７７、Ｅ９１、Ｒ１３１、Ｄ１５３、Ｋ１６７、Ｅ１６９またはＫ１７１に対応する位置に置換を含まない。
【００６１】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＦ９８に対応する位置に置換を含まず、例えば、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはバリンによるＦ９８の置換（Ｆ９８Ｖ）を含まない。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＩ７６に対応する位置に置換を含まず、例えば、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはプロリンによるＩ７６の置換（Ｉ７６Ｐ）を含まない。
【００６２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、動的光散乱（ＤＬＳ）による測定で該タンパク質の凝集温度を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、ＣＤ４＋  ＣＣＲ５＋細胞系のＨＩＶ感染に対する該タンパク質のＩＣ５０を減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上を含む。
【００６３】
ある実施形態においては、該タンパク質は、動的光散乱（ＤＬＳ）による測定で少なくとも６０℃の凝集温度を、または動的光散乱（ＤＬＳ）による測定で野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２の対応タンパク質の凝集温度より少なくとも７℃高い凝集温度を有する。ある実施形態においては、該タンパク質は少なくとも１２時間、２４時間、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、３．５日、４日、４．５日、５日、５．５日、６日、６．５日、７日、７．５日、８日、８．５日、９日、９．５日または１０日の血漿半減期を有する。ある実施形態においては、該タンパク質は少なくとも１２時間の血漿半減期を有する。ある実施形態においては、該タンパク質は少なくとも３日の血漿半減期を有する。
【００６４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、色素インターカレーションアッセイによる測定で該タンパク質の融解温度を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００６５】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、発現されるＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインの量を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００６６】
ある実施形態においては、該タンパク質は霊長類レンチウイルスエンベロープ糖タンパク質結合部分を更に含む。該結合部分は、例えば、少なくとも１つのスルホチロシンを含むことが可能であり、および／または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むことが可能である。
【００６７】
ある実施形態においては、該タンパク質は免疫グロブリンＦｃドメインを更に含む。ある実施形態においては、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２  Ｆｃドメイン、例えばＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。ある実施形態においては、ＦｃドメインはＣ２２０における置換または欠失を含む。ある実施形態においては、ＦｃドメインはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４ＳおよびＮ４３４Ｆ置換の少なくとも１つを含む。例えば、ＦｃドメインはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ置換、またはＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ置換を含みうる。
【００６８】
ある実施形態においては、該タンパク質は、天然に存在する野生型非ヒト霊長類タンパク質と同一ではない。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型非ヒト霊長類タンパク質の対応部分と同一ではない。
【００６９】
ある実施形態においては、該タンパク質はＣＤ４ドメイン３（Ｄ３）および／またはドメイン４（Ｄ４）領域、例えばヒトＣＤ４  Ｄ３および／またはＤ４領域を含まない。
【００７０】
もう１つの態様においては、本発明は、前記タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。もう１つの態様においては、本発明は、前記核酸のいずれかを含む発現ベクターを提供する。ある実施形態においては、発現ベクターはウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。もう１つの態様においては、本発明は、前記発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。もう１つの態様においては、本発明は、前記タンパク質のいずれかまたは前記発現ベクターのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【００７１】
もう１つの態様においては、本発明は、ＨＩＶ感染の治療を要する対象におけるＨＩＶ感染の治療方法を提供する。該方法は、前記タンパク質のいずれか、前記発現ベクターのいずれか、または前記医薬組成物のいずれかの有効量を対象に投与することを含む。
【００７２】
本発明のこれら及び他の態様および特徴は以下の詳細な説明および特許請求の範囲に記載されている。
【００７３】
詳細な説明
本発明は、天然に存在するヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（すなわち、ヒトＣＤ４ドメイン１およびＣＤ４ドメイン２）を含むタンパク質より高い安定性および／または活性を有するヒトＣＤ４ドメイン１およびＣＤ４ドメイン２の両方（ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２）を含むタンパク質の知見に部分的に基づいている。ある実施形態においては、該タンパク質は、より高い生産収率、例えば熱スキャンアッセイにおける動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された場合の、より高い凝集温度、例えば色素インターカレーションアッセイにより測定された場合の、より高い融解温度、および／または天然に存在するヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質より長い血漿半減期を示す。更に、本明細書に記載されているタンパク質はヒト対象におけるＨＩＶの治療に適している可能性があると想定される。
【００７４】
本発明の種々の特徴および態様を以下に更に詳細に記載する。
【００７５】
Ｉ．タンパク質
１つの態様においては、本発明は、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインが野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に対して少なくとも９０％同一であり、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｖ４、Ｌ５、Ｇ６、Ｋ７、Ｋ８、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｖ１２、Ｌ１４、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｋ３５、Ｉ３６、Ｌ３７、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｆ６７、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｉ７１、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｅ７７、Ｄ８０、Ｔ８１、Ｖ８６、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｅ９１、Ｖ９３、Ｑ９４、Ｌ９５、Ｌ９６、Ｖ９７、Ｆ９８、Ｇ９９、Ｔ１０１、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｄ１０５、Ｈ１０７、Ｌ１０８、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１６、Ｔ１１７、Ｌ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２１、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｖ１２８、Ｑ１２９、Ｃ１３０、Ｒ１３１、Ｓ１３２、Ｐ１３３、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｉ１３８、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｌ１４９、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｄ１５３、Ｇ１５５、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｅ１６９、Ｆ１７０、Ｋ１７１、Ｉ１７２、Ｄ１７３、Ｉ１７４、Ｖ１７５、Ｖ１７６またはＡ１７８に対応する位置に少なくとも１つの置換を含む、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインを含むタンパク質を提供する。本明細書中で用いる「ムテイン」なる語は、野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
【００７６】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｖ４、Ｇ６、Ｋ７、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｖ１２、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｋ３５、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｅ７７、Ｄ８０、Ｔ８１、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｅ９１、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｇ９９、Ｔ１０１、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｄ１０５、Ｈ１０７、Ｌ１０８、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｖ１２８、Ｑ１２９、Ｃ１３０、Ｒ１３１、Ｓ１３２、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｉ１３８、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｄ１５３、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｅ１６９、Ｆ１７０、Ｋ１７１、Ｉ１７２、Ｄ１７３、Ｉ１７４、Ｖ１７５またはＡ１７８に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００７７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿、旧世界ザルまたは新世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば類人猿、旧世界ザルまたは新世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ７、Ｄ１０、Ｔ１１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ａ１８、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｇ４１、Ｓ４２、Ｌ４４、Ｋ４６、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｉ７６、Ｄ８０、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｌ９６、Ａ１０２、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３１、Ｒ１３４、Ｎ１３７、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｇ１４１、Ｋ１４２、Ｔ１４３、Ｌ１４４、Ｓ１４５、Ｖ１４６、Ｓ１４７、Ｅ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｋ１６６、Ｋ１６７、Ｖ１６８、Ｋ１７１、Ｄ１７３、Ｉ１７４またはＶ１７５に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００７８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿または旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば類人猿または旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｄ１０、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｇ６５、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｄ８０、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｋ１４２、Ｌ１４４、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｔ１５６、Ｗ１５７、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｋ１６６またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００７９】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、類人猿ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば類人猿ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｑ２０、Ｉ３４、Ｎ５２、Ｄ５３、Ａ５５、Ｒ５９、Ｇ６５、Ｐ６８、Ｅ８７、Ｄ８８、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｓ１４７、Ｗ１５７、Ｔ１６０、Ｎ１６４またはＫ１６６に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００８０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば旧世界ザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置におけるアミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｄ１０、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｑ２５、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｎ３９、Ｐ４８、Ｎ５２、Ａ５５、Ｒ５９、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｄ８０、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｓ１２４、Ｑ１２９、Ｒ１３４、Ｇ１４０、Ｋ１４２、Ｌ１４４、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｔ１５６、Ｔ１６０、Ｖ１６１、Ｌ１６２、Ｎ１６４、Ｋ１６６またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００８１】
類人猿、旧世界ザル、新世界ザルおよび原猿類を含む典型的な非ヒト霊長類（ＮＨＰ）が、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）アミノ酸配列と典型的なＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２アミノ酸配列との間の配列アライメントと共に、図４に挙げられている。
【００８２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、置換されるアミノ酸より大きな体積、例えば側鎖体積を有する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるグリシンもしくは疎水性アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。疎水性アミノ酸は、例えば、埋もれた疎水性アミノ酸でありうる。本明細書中で用いるアミノ酸Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、ＹおよびＷは疎水性アミノ酸とみなされ、グリシンおよび疎水性アミノ酸の相対体積は以下のとおりである：Ｇ＜Ａ＜Ｖ＜Ｐ＜Ｌ＝Ｉ＜Ｍ＜Ｆ＜Ｙ＜Ｗ。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ５、Ｇ６、Ｖ１２、Ｌ１４、Ａ１８、Ｉ２４、Ｉ３６、Ｌ３７、Ｌ４４、Ｌ５１、Ａ５５、Ｇ６５、Ｆ６７、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｖ９３、Ｇ９９、Ｉ７１、Ｌ７４、Ｖ８６、Ｖ９３、Ｌ９５、Ｌ９６、Ｖ９７、Ｆ９８、Ａ１０２、Ｌ１０８、Ｌ１１４、Ｌ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２１、Ｖ１２８、Ｐ１３３、Ｉ１３８、Ｇ１４１、Ｌ１４４、Ｖ１４６、Ｌ１４９、Ｇ１５５、Ｖ１６１、Ｖ１６８、Ｆ１７０、Ｉ１７２、Ｉ１７４またはＶ１７６に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えば置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｉ２４、Ｌ４４、Ｌ５１、Ａ５５、Ｌ６９、Ｇ９９、Ａ１０２、Ｖ１２８、Ｇ１４１、Ｖ１４６、Ｖ１６１およびＶ１６８に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、表１において特定されている１以上のアミノ酸置換を含む。
【表１】
2021518171.tif 000003
2021518171.tif 000004
【００８３】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、置換されるアミノ酸より大きな体積、例えば側鎖体積を有する、そしてまた、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置に存在する疎水性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるグリシンもしくは疎水性アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の少なくとも１つを含む：Ｇ６の、Ａによる置換（Ｇ６Ａ）；Ｉ２４の、Ｍによる置換（Ｉ２４Ｍ）；Ｌ４４の、Ｗによる置換（Ｌ４４Ｗ）；Ｌ５１の、Ｍによる置換（Ｌ５１Ｍ）；Ａ５５の、Ｖによる置換（Ａ５５Ｖ）またはＩによる置換（Ａ５５Ｉ）；Ｌ６９の、Ｍによる置換（Ｌ６９Ｍ）；Ｇ９９の、Ａによる置換（Ｇ９９Ａ）；Ａ１０２の、Ｖによる置換（Ａ１０２Ｖ）；Ｖ１２８の、Ｌによる置換（Ｖ１２８Ｌ）；Ｇ１４１の、Ｖによる置換（Ｇ１４１Ｖ）またはＭによる置換（Ｇ１４１Ｍ）；Ｖ１４６の、Ｉによる置換（Ｖ１４６Ｉ）またはＭによる置換（Ｖ１４６Ｍ）；Ｖ１６１の、Ｉによる置換（Ｖ１６１Ｉ）またはＬによる置換（Ｖ１６１Ｌ）；およびＶ１６８の、Ｌによる置換（Ｖ１６８Ｌ）。
【００８４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、正味正電荷の低減を伴うタンパク質を与える少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、非荷電アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の、少なくとも１つの置換、または酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。ある実施形態においては、非荷電アミノ酸は、非荷電極性アミノ酸（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、ＱおよびＨ）、ＡまたはＹである。
【００８５】
本明細書中で用いるアミノ酸Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、ＰおよびＣは非荷電アミノ酸であるとみなされ、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、ＱおよびＨは非荷電極性アミノ酸であるとみなされ、アミノ酸ＤおよびＥは酸性アミノ酸であると見なされ、アミノ酸ＫおよびＲは塩基性アミノ酸であるとみなされる。
【００８６】
例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えばＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＨまたはＹによる、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ７、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｋ３５、Ｋ４６、Ｋ５０、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｒ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｋ１６６、Ｋ１６７またはＫ１７１に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、表２において特定されている１以上のアミノ酸置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の、表３において特定されている１以上の置換を含む。
【表２】
2021518171.tif 000005
【表３】
2021518171.tif 000006
【００８７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置にも存在する非荷電または酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の少なくとも１つを含む：Ｋ１の、Ｎによる置換（Ｋ１Ｎ）；Ｋ２の、Ｎによる置換（Ｋ２Ｎ）、Ｔによる置換（Ｋ２Ｔ）またはＥによる置換（Ｋ２Ｅ）；Ｋ７の、Ｅによる置換（Ｋ７Ｅ）；Ｋ２１の、Ｎによる置換（Ｋ２１Ｎ）；Ｋ２２の、Ｔによる置換（Ｋ２２Ｔ）；Ｋ４６の、Ｔによる置換（Ｋ４６Ｔ）；Ｒ５９の、Ｑによる置換（Ｒ５９Ｑ）；Ｋ７５の、Ｑによる置換（Ｋ７５Ｑ）またはＥによる置換（Ｋ７５Ｅ）；Ｒ１３１の、Ｔによる置換（Ｒ１３１Ｔ）またはＱによる置換（Ｒ１３１Ｑ）；Ｒ１３４の、Ｔによる置換（Ｒ１３４Ｔ）またはＧによる置換（Ｒ１３４Ｇ）；Ｋ１４２の、Ｇによる置換（Ｋ１４２Ｇ）またはＳによる置換（Ｋ１４２Ｓ）；Ｋ１６６の、Ｎによる置換（Ｋ１６６Ｎ）、Ｑによる置換（Ｋ１６６Ｑ）、Ｈによる置換（Ｋ１６６Ｈ）またはＥによる置換（Ｋ１６６Ｅ）；Ｋ１６７の、Ｔによる置換（Ｋ１６７Ｔ）；およびＫ１７１の、Ｑによる置換（Ｋ１７１Ｑ）、Ｓによる置換（Ｋ１７１Ｓ）、Ｎによる置換（Ｋ１７１Ｎ）またはＥによる置換（Ｋ１７１Ｅ）。
【００８８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における非荷電アミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、例えばＤまたはＥによる、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＶ４、Ｔ１１、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｓ１９、Ｑ２０、Ｓ２３、Ｑ２５、Ｈ２７、Ｎ３０、Ｎ３２、Ｉ３４、Ｓ４２、Ｐ４８、Ｎ５２、Ｓ６０、Ｌ６１、Ｑ６４、Ｎ６６、Ｉ７０、Ｉ７６、Ｔ８１、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｔ１０１、Ｎ１０３、Ｓ１０４、Ｈ１０７、Ｑ１１０、Ｓ１１３、Ｔ１１７、Ｓ１２０、Ｐ１２２、Ｇ１２３、Ｓ１２４、Ｓ１２５、Ｑ１２９、Ｇ１３５、Ｎ１３７、Ｑ１３９、Ｇ１４０、Ｔ１４３、Ｓ１４５、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｔ１５６、Ｔ１５８、Ｔ１６０、Ｌ１６２、Ｑ１６３、Ｎ１６４、Ｑ１６５、Ｖ１７５またはＡ１７８に対応する位置におけるアミノ酸の、少なくとも１つの置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、表４において特定されている１以上のアミノ酸置換を含む。
【表４】
2021518171.tif 000007
2021518171.tif 000008
【００８９】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、非ヒト霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における対応位置にも存在する酸性アミノ酸による、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における非荷電アミノ酸の少なくとも１つの置換を含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の少なくとも１つを含む：Ｔ１７の、Ｅによる置換（Ｔ１７Ｅ）；Ｎ３２の、Ｄによる置換（Ｎ３２Ｄ）；Ｑ９４の、Ｅによる置換（Ｑ９４Ｅ）；Ｑ１１０の、Ｅによる置換（Ｑ１１０Ｅ）；Ｇ１２３の、Ｄによる置換（Ｇ１２３Ｄ）；Ｑ１２９の、Ｅによる置換（Ｑ１２９Ｅ）；およびＮ１６４の、Ｄによる置換（Ｎ１６４Ｄ）。
【００９０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、ＣＤ４  Ｄ１ドメイン（配列番号１のアミノ酸残基１〜９８に対応する）における少なくとも１つの置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上、およびＣＤ４  Ｄ２ドメイン（配列番号１のアミノ酸残基９９〜１７８に対応する）における少なくとも１つの置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上を含む。
【００９１】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００９２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における表面露出側鎖を有するアミノ酸位置における１０、９、８、７、６、５、４、３、２個または１個より少ない置換を含む。
【００９３】
配列同一性は、当技術分野における技量の範囲内である種々の方法により、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを使用して決定されうる。プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａｒｌｉｎら，（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｊ．ＭＯＬ．ＥＶＯＬ．３６，２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．２５：３３８９−３４０２（それらを参照により本明細書に組み入れることとする））により利用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析は配列類似性検索に適合化される。配列データベースの検索における基本的問題の考察は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９４）ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ６：１１９−１２９（その全てを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することが可能である。ヒストグラム、記述、アラインメント、期待値［すなわち、データベース配列に対するマッチ（一致）を報告するための統計的有意性閾値］、カットオフ、マトリックスおよびフィルターに関する検索パラメータはデフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるデフォルト・スコアリング・マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，（１９９２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（その全てを参照により本明細書に組み入れることとする）である。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは以下のとおりに調整されうる：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿った全てのｗｉｎｋ．ｓｕｐ．ｔｈ位置で単語ヒットを生成させる）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップ化アライメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。同等のＢｌａｓｔｐパラメータ設定はＱ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２である。検索は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｐｔｉｏｎパラメータを使用することによっても行われうる（例えば、−Ｇ，ギャップを開くためのコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドでは５、タンパク質では１１；−Ｅ，ギャップを拡張するためのコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドでは２／タンパク質では１；−ｑ，ヌクレオチドミスマッチに関するペナルティ［整数］：デフォルト＝−３；−ｒ，ヌクレオチドマッチに関する報酬［整数］：デフォルト＝１；−ｅ，期待値［実数］：デフォルト＝１０；−Ｗ，語長［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドでは１１／メガブラスト���ｍｅｇａｂｌａｓｔ）では２８／タンパク質では３；−ｙ，ビット単位のブラスト拡張に関するドロップオフ（Ｘ）：デフォルト＝ｂｌａｓｔｎでは２０／その他では７；−Ｘ，ギャップ化アライメントに関するＸドロップオフ値（ビット単位）：デフォルト＝全てのプログラムに関して１５（ｂｌａｓｔｎには適用不可能）；および−Ｚ，ギャップ化アライメントに関する最終Ｘドロップオフ値（ビット単位）：ｂｌａｓｔｎでは５０、その他では２５）。ペアワイズタンパク質アライメントのためのＣｌｕｓｔａｌＷも使用されうる（デフォルトパラメーターは、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスおよびギャップ開始ペナルティ＝１０およびギャップ拡張ペナルティ＝０．１を含みうる）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間のベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）比較はＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ拡張ペナルティ）を使用し、タンパク質比較における同等の設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００９４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｌ５、Ｇ６、Ｋ７、Ｋ８、Ｔ１５、Ｔ１７、Ｋ２１、Ｋ２２、Ｓ２３、Ａ５５、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｇ９９、Ａ１０２、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４、Ｋ１６６、Ｋ１６７またはＫ１７１に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ５、Ｋ８、Ｓ２３、Ａ５５、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｌ９６、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。例えば、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＳ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換、あるいは野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＡ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含みうる。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２、Ｋ７、Ｋ８、Ｔ１７、Ｉ７０、Ｋ７２、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４またはＫ１６７に対応する位置における少なくとも１つの置換を含む。
【００９５】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５およびＲ１３４；Ａ５５およびＮ１６４；Ａ５５およびＫ１６７；Ｓ２３およびＲ１３４；Ｓ２３およびＮ１６４；Ｓ２３およびＫ１６７；Ｋ７２およびＫ７５；Ｋ７５およびＲ１３４；Ｋ７５およびＮ１６４；Ｋ７５およびＫ１６７；Ｋ７５およびＱ９４；Ｋ７５およびＱ１１０；Ｓ２３およびＫ７５；Ａ５５およびＫ７５；Ｑ９４およびＱ１１０；Ｓ２３およびＡ５５；Ｌ５およびＳ２３；Ｋ２およびＮ１６４；Ｋ２およびＫ１６７；Ｋ７およびＫ８；Ｋ７およびＡ５５；Ｋ８およびＮ１６４；Ｋ８およびＫ１６７；Ｋ８およびＡ５５；Ｔ１７およびＮ１６４；Ｔ１７およびＫ１６７；Ｉ７０およびＮ１６４；Ｉ７０およびＫ１６７；Ａ５５およびＩ７０；Ａ５５およびＫ７２；Ｋ７２およびＮ１６４；Ｋ７２およびＫ１６７；Ｑ９４およびＮ１６４；Ｑ９４およびＫ１６７；Ｑ１１０およびＮ１６４；Ｑ１１０およびＫ１６７；Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｋ７およびＫ８；Ｓ２３、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｓ２３、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５およびＲ１３４；Ｓ２３、Ａ５５およびＮ１６４；Ｓ２３、Ａ５５およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４およびＱ１１０；Ａ５５、Ｋ７５およびＲ１３４；Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｋ７５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ９６；Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｔ１７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７、Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＫ２、Ｔ１７、Ｋ２１、Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００９６】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４およびＫ１６７；Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４およびＱ１１０；Ｋ２およびＮ１６４；Ｋ２およびＫ１６７；Ｋ７およびＫ８；Ｋ８およびＮ１６４；Ｋ８およびＫ１６７；Ｔ１７およびＮ１６４；Ｔ１７およびＫ１６７；Ｉ７０およびＮ１６４；Ｉ７０およびＫ１６７；Ｋ７２およびＮ１６４；Ｋ７２およびＫ１６７；Ｋ７５およびＲ１３４；Ｋ７５およびＮ１６４；Ｋ７５およびＫ１６７；Ｋ７５およびＱ９４；Ｋ７５およびＱ１１０；Ｑ９４およびＮ１６４；Ｑ９４およびＫ１６７；Ｑ１１０およびＮ１６４；Ｑ１１０およびＫ１６７；Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４およびＱ１１０；Ｋ７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｔ１７、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｉ７０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｋ１４２およびＫ１６７；Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｋ１４２、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｋ７２、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＫ７、Ｋ８、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００９７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｒ１３４およびＮ１６４；Ａ５５、Ｒ１３４およびＫ１６７；Ａ５５、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５およびＬ９６；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｌ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の位置に置換を含む：Ｌ５、Ａ５５およびＬ９６；Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；Ｓ２３、Ａ５５、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７；またはＬ５、Ｓ２３、Ａ５５、Ｌ９６、Ｒ１３４、Ｎ１６４およびＫ１６７。
【００９８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の置換の少なくとも１つを含む：Ｋ１の、Ｎによる置換（Ｋ１Ｎ）；Ｋ２の、Ｅによる置換（Ｋ２Ｅ）、Ｎによる置換（Ｋ２Ｎ）またはＴによる置換（Ｋ２Ｔ）；Ｌ５の、Ｙによる置換（Ｌ５Ｙ）、Ｉによる置換（Ｌ５Ｉ）、Ｅによる置換（Ｌ５Ｅ）、Ｗによる置換（Ｌ５Ｗ）、Ｖによる置換（Ｌ５Ｖ）、Ｆによる置換（Ｌ５Ｆ）またはＴによる置換（Ｌ５Ｔ）；Ｋ７の、Ｅによる置換（Ｋ７Ｅ）；Ｋ８の、Ｅによる置換（Ｋ８Ｅ）；Ｔ１５の、Ｎによる置換（Ｔ１５Ｎ）またはＥによる置換（Ｔ１５Ｅ）；Ｔ１７の、Ｎによる置換（Ｔ１７Ｎ）またはＥによる置換（Ｔ１７Ｅ）；Ｓ２３の、Ｎによる置換（Ｓ２３Ｎ）、Ｔによる置換（Ｓ２３Ｔ）、Ｋによる置換（Ｓ２３Ｋ）、Ｙによる置換（Ｓ２３Ｙ）またはＡによる置換（Ｓ２３Ａ）；Ａ５５の、Ｖによる置換（Ａ５５Ｖ）、Ｉによる置換（Ａ５５Ｉ）、Ｐによる置換（Ａ５５Ｐ）、Ｌによる置換（Ａ５５Ｌ）、Ｍによる置換（Ａ５５Ｍ）、Ｆによる置換（Ａ５５Ｆ）、Ｙによる置換（Ａ５５Ｙ）、Ｗによる置換（Ａ５５Ｗ）またはＴによる置換（Ａ５５Ｔ）；Ｉ７０の、Ｅによる置換（Ｉ７０Ｅ）、Ｌによる置換（Ｉ７０Ｌ）またはＶによる置換（Ｉ７０Ｖ）；Ｋ７２の、Ｓによる置換（Ｋ７２Ｓ）；Ｋ７５の、Ｅによる置換（Ｋ７５Ｅ）またはＱによる置換（Ｋ７５Ｑ）；Ｑ９４の、Ｅによる置換（Ｑ９４Ｅ）；Ｌ９６の、Ｖによる置換（Ｌ９６Ｖ）、Ｑによる置換（Ｌ９６Ｑ）、Ｔによる置換（Ｌ９６Ｔ）、Ｉによる置換（Ｌ９６Ｉ）またはＹによる置換（Ｌ９６Ｙ）；Ｑ１１０の、Ｅによる置換（Ｑ１１０Ｅ）またはＨによる置換（Ｑ１１０Ｈ）；Ｒ１３４の、Ｇによる置換（Ｒ１３４Ｇ）またはＴによる置換（Ｒ１３４Ｔ）；Ｋ１４２の、Ｒによる置換（Ｋ１４２Ｒ）、Ｇによる置換（Ｋ１４２Ｇ）またはＳによる置換（Ｋ１４２Ｓ）；Ｎ１６４の、Ｄによる置換（Ｎ１６４Ｄ）、Ｈによる置換（Ｎ１６４Ｈ）、Ｒによる置換（Ｎ１６４Ｒ）またはＥによる置換（Ｎ１６４Ｅ）；およびＫ１６７の、Ｔによる置換（Ｋ１６７Ｔ）、Ｒによる置換（Ｋ１６７Ｒ）またはＬによる置換（Ｋ１６７Ｌ）。
【００９９】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＫ２Ｅ、Ｋ７Ｅ、Ｋ８Ｅ、Ｔ１７Ｎ、Ｔ１７Ｅ、Ａ５５Ｖ、Ｉ７０Ｅ、Ｋ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｋ１４２Ｒ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つを含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の置換を含む：Ｋ２ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ２ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７ＥおよびＫ８Ｅ；Ｋ８ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ８ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｔ１７ＮおよびＮ１６４Ｄ；Ｔ１７ＮおよびＫ１６７Ｔ；Ｔ１７ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｔ１７ＮおよびＫ１６７Ｔ；Ｉ７０ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｉ７０ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７２ＳおよびＮ１６４Ｄ；Ｋ７２ＳおよびＫ１６７Ｔ；Ｑ９４ＥおよびＱ１１０Ｅ；Ｑ９４ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｑ９４ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｑ１１０ＥおよびＮ１６４Ｄ；Ｑ１１０ＥおよびＫ１６７Ｔ；Ｒ１３４ＧおよびＮ１６４Ｄ；Ｒ１３４ＧおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ１４２ＲおよびＫ１６７Ｔ；Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ２Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ８Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｔ１７Ｎ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｔ１７Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｉ７０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７２Ｓ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｋ７５Ｅ、Ｑ９４ＥおよびＱ１１０Ｅ；またはＫ７２Ｓ、Ｋ７５Ｅ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ。
【０１００】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＬ５Ｙ、Ｋ８Ｅ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｋ７５Ｅ、Ｑ９４Ｅ、Ｌ９６Ｖ、Ｑ１１０Ｅ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つ、Ｌ５Ｙ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つ、またはＡ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換の少なくとも１つを含む。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは以下の置換を含む：Ａ５５Ｖ；Ｌ５Ｙ、Ａ５５ＶおよびＬ９６Ｖ；Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；Ｌ５Ｙ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ；またはＬ５Ｙ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｌ９６Ｖ、Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ。
【０１０１】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２もしくは配列番号４４のアミノ酸配列を含み、または配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２もしくは配列番号４４に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、配列番号４６のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含み、これは配列番号４７のヌクレオチド配列によりコードされる。ある実施形態においては、リーダー配列は配列番号４６に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【０１０３】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、ｇｐ１２０と接触する野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるアミノ酸残基の置換を含まない。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＮ３２、Ｋ３５、Ｌ４４、Ｋ４６またはＲ５９に対応する位置における置換を含まず、天然に存在するアミノ酸が維持されている。
【０１０４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩橋を形成するアミノ酸残基の置換を含まない。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１、Ｋ２、Ｋ５０、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｋ７２、Ｅ７７、Ｅ９１、Ｒ１３１、Ｄ１５３、Ｋ１６７、Ｅ１６９またはＫ１７１に対応する位置における置換を含まず、天然に存在するアミノ酸が維持されている。
【０１０５】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＦ９８に対応する位置に置換を含まず、例えば、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはバリンによるＦ９８の置換（Ｆ９８Ｖ）を含まない。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＩ７６に対応する位置に置換を含まず、例えば、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはプロリンによるＩ７６の置換（Ｉ７６Ｐ）を含まない。
【０１０６】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、該タンパク質の凝集温度を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上を含む。ある実施形態においては、該タンパク質は少なくとも６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃または７０℃の凝集温度を有する。ある実施形態においては、該タンパク質は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含む対応タンパク質の凝集温度より少なくとも７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃または１２℃高い凝集温度を有する。凝集温度は、本明細書の実施例１および２に記載されている熱スキャンアッセイにおける動的光散乱（ＤＬＳ）を含む、当技術分野で公知の任意の方法により測定されうる。
【０１０７】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、該タンパク質の融解温度を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上を含む。ある実施形態においては、該タンパク質は少なくとも５０．３℃、５１℃、５２℃、５３℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃または６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃の融解温度を有する。ある実施形態においては、該タンパク質は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含む対応タンパク質の融解温度より少なくとも０．１℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃または１６℃高い融解温度を有する。融解温度は、本明細書の実施例３に記載されている色素インターカレーションアッセイを用いる熱スキャンアッセイ含む、当技術分野で公知の任意の方法により測定されうる。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインの収量を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、本明細書に記載されている１以上の置換を含む。ある実施形態においては、該タンパク質は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含む対応タンパク質の収量の約１．１〜５倍、約１．５〜５倍、約２〜５倍、約３〜５倍、約４〜５倍、約１．１〜４倍、約１．５〜４倍、約２〜４倍、約４〜４倍、約１．１〜３倍、約１．５〜３倍、約２〜３倍、約１．１〜２倍、約１．５〜２倍、または約１．１〜１．５倍の収量で産生される。ある実施形態においては、該タンパク質は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含む対応タンパク質の収量より少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％高い収量で産生される。
【０１０８】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインによるウイルス、例えばＨＩＶの中和を増強する少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、本明細書に記載されている置換の１以上を含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインは、ＣＤ４＋  ＣＣＲ５＋細胞系のＨＩＶ感染に対する該タンパク質のＩＣ５０を減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ウイルス中和は、本明細書の実施例５に記載されているとおり、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインを含むタンパク質をウイルスおよびＣＤ４＋  ＣＣＲ５＋  ＴＺＭ−ｂｌ細胞（これはウイルス感染に際してホタルルシフェラーゼを発現する）と共にインキュベートすることを含む、当技術分野で公知の任意の方法により測定されうる。
【０１０９】
ある実施形態においては、該タンパク質は、例えばマウス（例えば、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス）、ラット、アカゲザルまたはヒトの血漿において、少なくとも１２時間、２４時間、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、３．５日、４日、４．５日、５日、５．５日、６日、６．５日、７日、７．５日、８日、８．５日、９日、９．５日または１０日の血漿半減期を有する。例えば、ある実施形態においては、該タンパク質はラットにおいて少なくとも１２時間の血漿半減期を有する。ある実施形態においては、該タンパク質はヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいて少なくとも３日の血漿半減期を有する。
【０１１０】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインを含むタンパク質は霊長類レンチウイルスエンベロープ糖タンパク質結合部分を更に含む。該結合部分は、例えば、ＨＩＶに対する共受容体であるＣＣＲ５のペプチド模倣体を含みうる。ある実施形態においては、該結合部分は、少なくとも１つのスルホチロシンを含む。ある実施形態においては、該結合部分は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある実施形態においては、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７のいずれかにおけるチロシン残基が硫酸化されている。
【０１１１】
その代わりに、またはそれに加えて、ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインを含むタンパク質は免疫グロブリンＦｃドメインを更に含む。本明細書中で用いる「免疫グロブリンＦｃドメイン」なる語は、特に示されていない限り、免疫グロブリン重鎖定常領域のフラグメントを意味する。免疫グロブリンＦｃドメインは、例えば、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含みうる。免疫グロブリンＦｃドメインは、例えば、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびに免疫グロブリンヒンジ領域を含みうる。ある実施形態においては、免疫グロブリンヒンジ領域はＣ２２０の置換または欠失、例えばＣ２２０Ｓを含む。免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン間の境界は当技術分野でよく知られており、例えば、ＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇのワールド・ワイド・ウェブにおいて利用可能）において見出されうる。
【０１１２】
ある実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ  Ｆｃドメインに由来する。ある実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらすヒトＩｇＧ１アイソタイプまたは別のアイソタイプに由来する。ある実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインはヒトＩｇＧ１アイソタイプに由来する。ある実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）をほとんどまたは全く誘発しないヒトＩｇＧ２アイソタイプまたは別のアイソタイプに由来する。ある実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ３アイソタイプに由来する。ある実施形態においては、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ４アイソタイプに由来する。
【０１１３】
ある実施形態においては、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの安定性および／または半減期を増加させる置換、例えば本明細書に記載されている置換の１以上を含む。例えば、ある実施形態においては、ＦｃドメインはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４ＳおよびＮ４３４Ｆ置換の少なくとも１つを含む。例えば、Ｆｃドメインは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ置換、またはＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ置換を含みうる。全てのＦｃドメイン残基番号は通常のヒトＩｇＧ番号付けに従っている（Ｈｅｓｓｅｌｌら（２００７）ＮＡＴＵＲＥ，４４９（７１５８）：１０１−４）。
【０１１４】
ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインを含むタンパク質は免疫グロブリンＦｃドメインおよび／または霊長類レンチウイルスエンベロープ糖タンパク質結合部分を更に含む。ある実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはＦｃドメインおよび／またはエンベロープ糖タンパク質結合部分に直接的に連結または融合される。他の実施形態においては、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２ムテインはリンカーによりＦｃドメインおよび／またはエンベロープ糖タンパク質結合部分に共有結合されうる。
【０１１５】
ＩＩ．タンパク質の製造
本発明のタンパク質の製造方法は当技術分野で公知である。例えば、ＣＤ４ムテインを含むタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、本明細書に記載されている配列情報を使用して化学的に合成することが可能である。合成ＤＮＡ分子を、例えば発現制御配列を含む他の適切なヌクレオチド配列に連結して、所望のタンパク質をコードする通常の遺伝子発現構築物を得ることが可能である。
【０１１６】
ＣＤ４を含む所望のタンパク質をコードする核酸を発現ベクター内に組込んで（連結）して、これを通常のトランスフェクションまたは形質転換技術により宿主細胞内に導入することが可能である。形質転換された宿主細胞を、該タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞が発現することを可能にする条件下で増殖させることが可能でる。
【０１１７】
当技術分野で公知の方法を使用して、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号３５）をコードするヌクレオチド配列を突然変異させることにより、ＣＤ４ムテインをコードする核酸を生成させることが可能である。更に、ある実施形態においては、本発明のタンパク質をコードする核酸を、当該分野で公知の方法を使用して、異種細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、ＣＨＯ細胞などにおける発現のためにコドン最適化することが可能である。
【０１１８】
本明細書に開示されているＣＤ４ムテインをコードする典型的なヌクレオチド配列には、配列番号９（配列番号８に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号１１（配列番号１０に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号１３（配列番号１２に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号１５（配列番号１４に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号１７（配列番号１６に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号１９（配列番号１８に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号２１（配列番号２０に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号２３（配列番号２２に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号２５（配列番号２４に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号２７（配列番号２６に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号２９（配列番号２８に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号３１（配列番号３０に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号３３（配列番号３２に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号３７（配列番号３６に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号３９（配列番号３８に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号４１（配列番号４０に示されているアミノ酸配列をコードする）、配列番号４３（配列番号４２に示されているアミノ酸配列をコードする）および配列番号４５（配列番号４４に示されているアミノ酸配列をコードする）が含まれる。
【０１１９】
具体的な発現および精製条件は、使用される発現系に応じて変動する。例えば、遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させたい場合には、それを、操作された遺伝子を適切な細菌プロモーター、例えばＴｒｐまたはＴａｃおよび原核生物シグナル配列の下流に配置することにより、それを発現ベクター内にクローニングすることが可能である。発現された分泌タンパク質は屈折体または封入体内に蓄積し、フレンチプレスまたは超音波処理による細胞の破壊の後で回収することが可能である。ついで、当技術分野で公知の方法により、屈折体を可溶化し、該タンパク質をリフォールディングさせ、切断する。
【０１２０】
タンパク質は、該タンパク質の発現を可能にする条件下、そのようなタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を増殖（培養）させることにより産生されうる。発現後、当技術分野で公知の技術、例えばプロテインＡ精製を用いて、該タンパク質を回収し、精製または単離することが可能である。
【０１２１】
ＩＩＩ．発現ベクター
もう１つの態様においては、本発明は、前記タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。もう１つの態様においては、本発明は、前記核酸のいずれかを含む発現ベクターを提供する。ある実施形態においては、発現ベクターはウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【０１２２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属およびパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）科の小さな無エンベロープ正二十面体ウイルスである。ＡＡＶは約４．７ｋｂの一本鎖直鎖状ＤＮＡゲノムを有する。ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１２および非ヒト霊長類由来の１００個を超える血清型を含む血清学的に識別可能な多数の型を含む（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（２００８）Ｊ．ＣＥＬＬ  ＢＩＯＣＨＥＭ．，１０５（１）：１７−２４およびＧａｏら（２００４）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，７８（１２），６３８１−６３８８を参照されたい）。ＡＡＶは幾つかの組織型の分裂細胞および静止細胞の両方に感染可能であり、ＡＡＶ血清型は、それによって異なる組織向性を示す。
【０１２３】
野生型ＡＡＶゲノムは２つの１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含有し、これらは、ＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド形成および組込みを導くシグナル配列を含有する。ＩＴＲに加えて、３つのＡＡＶプロモーター、すなわち、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０が、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのオープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーターは、単一のＡＡＶイントロンの特異的スプライシングと組合されて、ｒｅｐ遺伝子由来の４つのｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質はゲノム複製をもたらす。Ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、ｃａｐ遺伝子のスプライス変異体である３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）をコードする。これらのタンパク質はＡＡＶ粒子のキャプシドを形成する。
【０１２４】
複製、キャプシド形成および組込みのためのシス作用性シグナルはＩＴＲ内に含有されているため、４．３ｋｂの内部ゲノムの一部または全部は外来ＤＮＡ（例えば、目的の外因性タンパク質のための発現カセット）で置換されうる。この場合、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、例えばプラスミド上で、トランスで提供される。ＡＡＶベクターを製造するためには、ＡＡＶ複製を許容する宿主細胞系は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ＩＴＲ隣接発現カセット、ならびにヘルパーウイルスにより提供されるヘルパー機能（例えば、ＡＶ遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ）を発現する必要がある（Ｗｅｉｔｚｍａｎら，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１−２３，２０１１）。ＡＡＶベクターを作製および精製するための方法は詳細に記載されている（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒら，（２０１２）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，１４Ｄ．１．１−１４Ｄ．１．２１，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓを参照されたい）。ＡＡＶベクターの製造には多数の細胞型が適しており、それらには、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞および昆虫細胞が含まれる（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号、第５，３８７，４８４号、第５，７４１，６８３号、第５，６９１，１７６号、第５，６８８，６７６号、第８，１６３，５４３号、米国特許公開番号２００２００８１７２１、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４７７５７、ＷＯ００／２４９１６およびＷＯ９６／１７９４７を参照されたい）。ＡＡＶベクターは、典型的には、ＩＴＲ隣接発現カセットを含有する１つのプラスミドと、追加的ＡＡＶおよびヘルパーウイルス遺伝子を提供する１以上の追加的プラスミドとにより、これらの細胞型において製造される。
【０１２５】
任意の血清型のＡＡＶが本発明において使用されうる。同様に、任意のＡＶ型が使用されうると想定され、当業者は、所望の組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の製造に適したＡＡＶおよびＡＶ型を特定することが可能であろう。ＡＡＶおよびＡＶ粒子は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオジキソナール勾配またはＣｓＣｌ勾配により精製されうる。
【０１２６】
ＡＡＶベクターは、４．７ｋｂのサイズの又は４．７ｋｂより大きな若しくは小さな（５．２ｋｂもの又は僅か３．０ｋｂの特大または特小ゲノムを含む）一本鎖ゲノムを有しうる。更に、ベクターゲノムは、ウイルス内でゲノムが実質的に二本鎖となるように、実質的に自己相補的でありうる。全ての型のゲノムを含むＡＡＶベクターが本発明の方法における使用に適している。
【０１２７】
典型的なＡＡＶベクターはＧａｒｄｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら（２０１５）ＮＡＴＵＲＥ，５１９（７５４１）：８７−９１に記載されている。典型的なＡＡＶベクターヌクレオチド配列は配列番号３４に示されている。
【０１２８】
ＩＶ．医薬組成物
治療用途の場合、本明細書に開示されているタンパク質または発現ベクターは、好ましくは、薬学的に許容される担体と組合される。本明細書中で用いる「薬学的に許容される」なる語は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に相応して、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなくヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、物質、組成物および／または剤形に関するものである。
【０１２９】
本明細書中で用いる「薬学的に許容される担体」なる語は、妥当な利益／リスク比に相応して、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなくヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適したバッファー、担体および賦形剤を意味する。薬学的に許容される担体には、標準的な医薬担体のいずれか、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルション）、および種々のタイプの湿潤剤が含まれる。組成物は安定剤および保存剤をも含みうる。担体、安定剤およびアジュバントの具体例は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい。薬学的に許容される担体には、薬学的投与に適したバッファー、溶媒、分散媒、コーティング、等張および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および物質の使用は当技術分野で公知である。
【０１３０】
ある実施形態においては、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着または浸透を修飾、維持または保持するための製剤化物質を含有しうる。そのような実施形態においては、適切な製剤化物質には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗微生物剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；バッファー（例えば、ボラート、ビカルボナート、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、シトラート、ホスファートまたは他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；単糖；二糖；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；張性増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬アジュバント（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照されたい）。
【０１３１】
ある実施形態においては、医薬組成物はナノ粒子、例えばポリマーナノ粒子、リポソームまたはミセルを含有しうる（Ａｎｓｅｌｍｏら（２０１６）ＢＩＯＥＮＧ．ＴＲＡＮＳＬ．ＭＥＤ．１：１０−２９を参照されたい）。
【０１３２】
ある実施形態においては、医薬組成物は持続性または制御化送達製剤を含みうる。持続性または制御化送達手段、例えばリポソーム担体、生分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射剤を製剤化するための技術も当業者に公知である。徐放性製剤には、造形物、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の、例えば多孔性ポリマー微粒子または半透性ポリマーマトリックスが含まれうる。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタマートとのコポリマー、ポリ（２−ヒドロキシエチル−インエタクリラート）、エチレンビニルアセタートまたはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれうる。徐放性組成物には、当技術分野で公知の幾つかの方法のいずれかにより製造されうるリポソームが含まれうる。
【０１３３】
本明細書に開示されているタンパク質または発現ベクターを含有する医薬組成物は単位剤形として提供されることが可能であり、任意の適切な方法により製造されうる。医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化されるべきである。投与経路の例としては、静脈内（ＩＶ）、皮下、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、くも膜下腔内および直腸投与が挙げられる。典型的な投与経路はＩＶ注入である。有用な製剤は薬学分野で公知の方法により製造されうる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照されたい。非経口投与に適した製剤化成分には、無菌希釈剤、例えば注射用水、塩類溶液（生理食塩水）、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；バッファー、例えばアセタート、シトラートまたはホスファート；張性調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースが含まれる。
【０１３４】
静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物に対して保護されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でありうる。
【０１３５】
医薬製剤は、好ましくは無菌である。滅菌は、任意の適切な方法、例えば、滅菌濾過膜による濾過により達成されうる。組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥および還元（再構成）の前または後に濾過滅菌が行われうる。
【０１３６】
本明細書に記載されている組成物は局所的または全身的に投与されうる。ある実施形態においては、投与は非経口投与である。ある実施形態においては、医薬組成物は皮下投与され、ある実施形態においては、静脈内投与される。非経口投与のための製剤には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマルションが含まれる。
【０１３７】
ある実施形態においては、有効成分の治療的有効量は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲、５０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇである。ある実施形態においては、ウイルスベクターの治療有効量は１０２〜１０１５ベクターゲノム（ｖｇ）コピー、例えば、１０２〜１０１０、１０２〜１０５、１０５〜１０１５、１０５〜１０１０、１０１０〜１０１５、１０１０〜１０１４、１０１０〜１０１２、または１０１２〜１０１４ｖｇコピーの範囲である。投与される量は、治療される疾患または適応症のタイプおよび度合、患者の全身健康状態、有効成分のインビボ効力、医薬製剤および投与経路のような変数に左右される。望ましい血中レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、初期投与量は、上限レベルを超えて増加されうる。あるいは、初期投与量は最適量より少なくすることが可能であり、１日投与量は治療の経過中で徐々に増加されうる。ヒトへの投与量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇを投与するように設計された通常の第Ｉ相用量漸増試験において最適化されうる。投与頻度は、投与経路、投与量、抗体の血清半減期、治療される疾患のような要因により変動しうる。典型的な投与頻度は１日１回、週１回および２週間に１回である。典型的な投与経路は非経口、例えば静脈内注入である。ある実施形態においては、本明細書に開示されているタンパク質または発現ベクターは凍結乾燥され、ついで、投与時に緩衝生理食塩水で還元（再構成）される。
【０１３８】
Ｖ．治療用途
本明細書に開示されているタンパク質、発現ベクター、組成物および方法は、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を治療するために使用されうる。本発明は対象におけるＨＩＶ感染の治療方法を提供する。該方法は、本明細書に開示されているタンパク質、発現ベクターまたは医薬組成物の有効量を、単独で、または別の治療用物質と組合せて、対象に投与して、対象におけるＨＩＶ感染を治療することを含む。本発明はまた、宿主細胞、例えばヒト宿主細胞内へのＨＩＶの侵入を遮断する方法を提供する。該方法は、本明細書に開示されているタンパク質、発現ベクターまたは医薬組成物の有効量を、単独で、または別の治療用物質と組合せて、宿主細胞にさらして、宿主細胞内へのＨＩＶの侵入を遮断することを含む。本発明はまた、ＨＩＶに感染した宿主細胞、例えばヒト宿主細胞を殺滅する方法を提供する。該方法は、本明細書に開示されているタンパク質、発現ベクターまたは医薬組成物の有効量を、単独で、または別の治療用物質と組合せて、宿主細胞にさらして、感染宿主細胞を殺滅することを含む。本発明はまた、ウイルス粒子、例えばＨＩＶウイルス粒子の不活化を引き起こす方法を提供する。該方法は、本明細書に開示されているタンパク質、発現ベクターまたは医薬組成物の有効量を、単独で、または別の治療用物質と組合せて、ウイルス粒子の不活化を引き起こすことを含む。本発明はまた、対象の血漿からウイルス粒子、例えばＨＩＶウイルス粒子を除去する方法を提供する。該方法は、本明細書に開示されているタンパク質、発現ベクターまたは医薬組成物の有効量を、単独で、または別の治療用物質と組合せて、対象にさらして、対象の血漿からウイルス粒子を除去することを含む。
【０１３９】
本明細書中で用いる「有効量」なる語は、有益なまたは所望の結果を得るのに十分な、活性物質（例えば、本発明の突然変異ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、または本発明の突然変異ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質を発現するウイルスベクター）の量を意味する。有効量は１以上の投与、適用または投薬において投与可能であり、特定の製剤または投与経路に限定されるとは意図されない。
【０１４０】
本明細書中で用いる「治療する」、「治療し」および「治療」は、対象、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これは、（ａ）疾患を抑制すること、すなわち、その発生を阻止すること、および（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、病態を退縮させることを含む。本明細書中で用いる「対象」および「患者」なる語は、本明細書に記載されている方法および組成物により治療される生物を意味する。そのような生物は、好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）を含み、より好ましくはヒトを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
本明細書に記載されている方法および組成物は、単独で、または他の治療用物質および／もしくは治療方式と組合せて使用されうる。本明細書中で用いる「組合せて」投与されるなる語は、患者に対する複数の治療の効果が或る時点で重複するように、対象の障害罹患の経過中に２つ（またはそれ以上）の異なる治療が対象に適用されることを意味すると理解される。ある実施形態においては、１つの治療の適用が、第２の治療の適用が始まる際に尚も行われていて、投与に関する重複が存在する。これは、本明細書においては、「同時」または「共適用」と称されることがある。他の実施形態においては、１つの治療の適用が、その他の治療の適用が始まる前に終了する。いずれの場合も、ある実施形態においては、治療は、組合せ投与ゆえに、より有効である。例えば、第２の治療はより有効であり、例えば、第２の治療をより少量で用いた場合に同等の効果が見られ、または第１の治療の非存在下で第２の治療が適用された場合に見られるものよりも症状を大幅に軽減し、あるいは第１の治療で同様の状況が見られる。ある実施形態においては、症状または他の障害関連パラメータにおける低減が、その他の治療の非存在下で適用される１つの治療で観察されるものより大きくなるように、適用が行われる。そのような２つの治療の効果は部分的に相加的、完全に相加的、または相加的を超えるものでありうる。適用された第１の治療の効果が、第２の治療が適用される際に尚も検出可能であるように、適用が行われうる。
【０１４２】
ある実施形態においては、本明細書に記載されている方法または組成物は、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素インヒビター（例えば、ラミブジン、アバカビル、ジドブジン、スタブジン、ジダノシン、エムトリシタビンおよびテノホビル）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（例えば、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリンおよびネビラピン）、プロテアーゼインヒビター（例えば、アンプレナビル、フォサムプレナビル、アタザナビル、ダルナビル、インジナビル、ロピナビル、リトナビル、ネルフィナビル、サキナビルおよびチプラナビル）、融合または侵入インヒビター（例えば、エンフビルチドおよびマラビロック）、インテグラーゼインヒビター（例えば、ラルテグラビルおよびカボテグラビル）またはそれらの任意の組合せと組合せて投与（適用）される。ある実施形態においては、本明細書に記載されている方法または組成物は、潜伏感染再活性化剤（ＬＲＡ）、例えば、ＨＤＡＣインヒビター（例えば、ボリノスタット）またはＴＬＲ７アゴニスト（例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１６０００８３７４Ａ１に記載されているＧＳ−９６２０）と組合せて投与される。
【０１４３】
本明細書の全体において、組成物が特定の成分を有する、含有する又は含むと記載されている場合、あるいはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含有する又は含むと記載されている場合、挙げられている成分から実質的になる又はそれらからなる本発明の組成物が追加的に存在すること、および挙げられているプロセス工程から実質的になる又はそれらからなる本発明のプロセスおよび方法が存在することが想定される。
【０１４４】
本出願においては、要素または成分が、挙げられている要素または成分の一覧に含まれる又は該一覧から選択されると記載されている場合、該要素または成分は、挙げられている要素または成分の任意の１つでありうる、あるいは該要素または成分は、挙げられている要素または成分の２以上からなる群から選択されうると理解されるべきである。
【０１４５】
更に、本明細書に記載されている組成物または方法の要素および／または特徴は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の様態で組合されることが、それが本明細書において明示的または暗示的であるかどうかにかかわらず可能である、と理解されるべきである。例えば、特定の化合物に言及されている場合、文脈から別のように理解されない限り、その化合物は、本発明の組成物の種々の実施形態において、および／または本発明の方法において使用されうる。換言すれば、本出願においては、明確かつ簡潔な適用が記載され示されることを可能にする様態で実施形態が記載され示されているが、実施形態は、本教示および本発明から切り離されることなく種々に組合され又は分離されうる、と意図され、理解される。例えば、本明細書に記載され示されている全ての特徴は、本明細書に記載され示されている本発明の全態様に適用可能でありうると理解される。
【０１４６】
「の少なくとも１つ」なる表現は、文脈および用法から別のように理解されない限り、該表現の前の列挙物のそれぞれを個々に、および該列挙物の２以上の種々の組合せを含むと理解されるべきである。３以上の列挙物に関する「および／または」なる表現は、文脈から別のように理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。
【０１４７】
「含む」、「含み」、「含んで」、「有する」、「有して」、「有し」、「含有する」、「含有して」または「含有し」（それらの文法的等価物を含む）なる語の使用は、特に示されていない限り又は文脈から別のように理解されない限り、オープンエンドかつ非限定的であり、例えば、追加的な非列挙要素または工程を除外しない、と一般に理解されるべきである。
【０１４８】
「約」なる語が定量的な値の前で用いられている場合、特に示されていない限り、本発明はその特定の定量的な値自体をも含む。本明細書中で用いる「約」なる語は、特に記載または示唆されていない限り、名目値からの±１０％の変動を意味する。
【０１４９】
工程の順序または或る行為の実施の順序は、本発明が依然として実施可能である限り、重要でないと理解されるべきである。更に、２以上の工程または行為は同時に実施されうる。
【０１５０】
本明細書におけるあらゆる全ての例示、または例示的言語表現、例えば「例えば」または「含む」の使用は、本発明をより詳細に例示することを意図しているに過ぎず、特許請求の範囲において限定されていない限り本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１５１】
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照して、より完全に理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２または野生型アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質に関する熱スキャンアッセイの結果を示す。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含有するｅＣＤ４−ＩｇＧ１または野生型アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含有するｅＣＤ４−ＩｇＧ１に関する温度の関数としての粒子半径を示すグラフを図１Ａに示す。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含有するｅＣＤ４−ＩｇＧ２またはアカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含有するｅＣＤ４−ＩｇＧ２に関する温度の関数としての半径を示すグラフを図１Ｂに示す。凝集を動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。この場合、ナノメートル（ｎｍ）単位で示されている粒子半径の増加はタンパク質凝集を示す。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に基づくｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質に関する５０％凝集温度は５１℃（ＩｇＧ１）および５３℃（ＩｇＧ２）であった。野生型アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に基づくｅＣＤ４−Ｉｇに関する凝集温度は６２℃（ＩｇＧ１）および６７℃（ＩｇＧ２）であった。
【図２】図２はＣＣＲ５模倣スルホペプチド「ｍｉｍ２．」の存在下または非存在下のＣＤ４−Ｉｇタンパク質に関する凝集温度を示すグラフである。試験した各タンパク質は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合した野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含有し、該スルホペプチドの存在下または非存在下の場合を除いて同一であった。
【図３】図３は、霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２アミノ酸配列の関連性を示す系統樹である。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２配列は他の類人猿のものと共にグループ化される。原猿類、新世界ザルおよび旧世界ザルのＣＤ４  Ｄ１Ｄ２配列のそれぞれは、それらの進化的関係に合致して、異なるグループを形成する。
【図４−１】図４は霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２アミノ酸配列（配列番号１および４８〜９０）の配列アラインメントである。類人猿（それぞれ配列番号１および４８〜５４）、旧世界ザル（それぞれ配列番号５５〜７６）、新世界ザル（それぞれ配列番号７７〜８６）および原猿類（それぞれ配列番号８７〜９０）のＣＤ４  Ｄ１Ｄ２のアミノ酸配列をアライメント（整列）させた。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）と同一でない位置が太字で示されている。番号付けはヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に対応している。したがって、原猿類におけるＦ４３に先行する２アミノ酸インデルはここでは欠失として扱われ、番号付けはこのインデルを省いている。ＣＤ４プレタンパク質上に存在するシグナルペプチドは番号付けにおいては示されておらず、また、含まれていない。Ｘは、現在利用可能なデータが存在しない位置を示す。アミノ酸１〜５８（図４Ａ）、５９〜１１８（図４Ｂ）および１１９〜１７８（図４Ｃ）のアラインメントが示されている。ＣＤ４ドメイン１（Ｄ１）はアミノ酸１〜９８に対応し、ＣＤ４ドメイン２（Ｄ２）はアミノ酸９９〜１７８に対応する。
【図４−２】図４は霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２アミノ酸配列（配列番号１および４８〜９０）の配列アラインメントである。類人猿（それぞれ配列番号１および４８〜５４）、旧世界ザル（それぞれ配列番号５５〜７６）、新世界ザル（それぞれ配列番号７７〜８６）および原猿類（それぞれ配列番号８７〜９０）のＣＤ４  Ｄ１Ｄ２のアミノ酸配列をアライメント（整列）させた。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）と同一でない位置が太字で示されている。番号付けはヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に対応している。したがって、原猿類におけるＦ４３に先行する２アミノ酸インデルはここでは欠失として扱われ、番号付けはこのインデルを省いている。ＣＤ４プレタンパク質上に存在するシグナルペプチドは番号付けにおいては示されておらず、また、含まれていない。Ｘは、現在利用可能なデータが存在しない位置を示す。アミノ酸１〜５８（図４Ａ）、５９〜１１８（図４Ｂ）および１１９〜１７８（図４Ｃ）のアラインメントが示されている。ＣＤ４ドメイン１（Ｄ１）はアミノ酸１〜９８に対応し、ＣＤ４ドメイン２（Ｄ２）はアミノ酸９９〜１７８に対応する。
【図４−３】図４は霊長類ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２アミノ酸配列（配列番号１および４８〜９０）の配列アラインメントである。類人猿（それぞれ配列番号１および４８〜５４）、旧世界ザル（それぞれ配列番号５５〜７６）、新世界ザル（それぞれ配列番号７７〜８６）および原猿類（それぞれ配列番号８７〜９０）のＣＤ４  Ｄ１Ｄ２のアミノ酸配列をアライメント（整列）させた。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）と同一でない位置が太字で示されている。番号付けはヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に対応している。したがって、原猿類におけるＦ４３に先行する２アミノ酸インデルはここでは欠失として扱われ、番号付けはこのインデルを省いている。ＣＤ４プレタンパク質上に存在するシグナルペプチドは番号付けにおいては示されておらず、また、含まれていない。Ｘは、現在利用可能なデータが存在しない位置を示す。アミノ酸１〜５８（図４Ａ）、５９〜１１８（図４Ｂ）および１１９〜１７８（図４Ｃ）のアラインメントが示されている。ＣＤ４ドメイン１（Ｄ１）はアミノ酸１〜９８に対応し、ＣＤ４ドメイン２（Ｄ２）はアミノ酸９９〜１７８に対応する。
【図５】図５は、ＣＤ４ドメイン２の疎水性コアを安定化させる特定の突然変異のコンピュータ生成視覚的表示である。ＣＤ４の内部をより良好に可視化するために、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）構造の仮想断層撮影断面表示および編集を可能にするツールを開発した。このコンピュータツールを使用して、ＣＤ４  Ｄ１およびＤ２の疎水性コア内の、より大きな疎水性アミノ酸による、グリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸の置換を分析した。この図は２つの空間充填突然変異を示し、これらは、置換されるものより大きな体積の疎水性アミノ酸により、埋もれた疎水性アミノ酸を置換する。ここに示されているのは、１２８位においてモデル化された野生型Ｖ１２８（図５Ａ）または置換Ｖ１２８Ｌ（図５Ｂ）のいずれかを有するヒトＣＤ４結晶構造３ＣＤ４の２Ｄ断面である。Ｌ１００、Ｌ１４４、Ｖ１６１およびＦ１７０により囲まれた疎水性ポケットをＶ１２８Ｌ置換が充填することに注目されたい。ここには、同じＣＤ４結晶構造の２Ｄ断面も示されており、Ｌ５、Ｋ７、Ｖ１６１およびＦ１７０により囲まれたＶ１６８を包囲する空間（図５Ｃ）、ならびにこの疎水性ポケットの大部分を充填する置換Ｖ１６８Ｌ（図５Ｄ）が示されている。炭素原子は灰色で示されており、酸素原子は白色で示されており、窒素原子は黒色で示されている。
【図６−１】図６は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２との間で異なる１以上の位置における置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。「バックグラウンド」は、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う黒色線はＩｇＧ１を示し、灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う灰色線はＩｇＧ２を示す。
【図６−２】図６は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２との間で異なる１以上の位置における置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。「バックグラウンド」は、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う黒色線はＩｇＧ１を示し、灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う灰色線はＩｇＧ２を示す。
【図６−３】図６は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２との間で異なる１以上の位置における置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。「バックグラウンド」は、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う黒色線はＩｇＧ１を示し、灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う灰色線はＩｇＧ２を示す。
【図６−４】図６は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２との間で異なる１以上の位置における置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。「バックグラウンド」は、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う黒色線はＩｇＧ１を示し、灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う灰色線はＩｇＧ２を示す。
【図６−５】図６は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２との間で異なる１以上の位置における置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。「バックグラウンド」は、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う黒色線はＩｇＧ１を示し、灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う灰色線はＩｇＧ２を示す。
【図６−６】図６は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２との間で異なる１以上の位置における置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。「バックグラウンド」は、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う黒色線はＩｇＧ１を示し、灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う灰色線はＩｇＧ２を示す。
【図６−７】図６は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２との間で異なる１以上の位置における置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。「バックグラウンド」は、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う黒色線はＩｇＧ１を示し、灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号を伴う灰色線はＩｇＧ２を示す。
【図７−１】図７は、示されている置換組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色線および黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号はＩｇＧ１を示し、灰色線および灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号はＩｇＧ２を示す。
【図７−２】図７は、示されている置換組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色線および黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号はＩｇＧ１を示し、灰色線および灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号はＩｇＧ２を示す。
【図７−３】図７は、示されている置換組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色線および黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号はＩｇＧ１を示し、灰色線および灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号はＩｇＧ２を示す。
【図７−４】図７は、示されている置換組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。黒色線および黒色の空白のまたは塗りつぶされた記号はＩｇＧ１を示し、灰色線および灰色の空白のまたは塗りつぶされた記号はＩｇＧ２を示す。
【図８−１】図８は、２個を超える置換の表示組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。
【図８−２】図８は、２個を超える置換の表示組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）におけるＦｃドメインのアイソタイプが示されている。
【図９】図９は、示されている置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。
【図１０−１】図１０は、示されている置換組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。
【図１０−２】図１０は、示されている置換組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％凝集温度を示す一連のグラフである。ＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、示されているアミノ酸置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を測定した。バックグラウンドは、置換が試験された突然変異バックグラウンド（つまり、１以上の追加的置換が存在するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体において置換が評価されたのかどうか）を示す。該置換の幾つかは複数の突然変異バックグラウンドにおいて評価された。複数の置換は、各置換がバックスラッシュで区切られた一覧として示されている。各グラフのｘ軸は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、置換位置に、示されている置換を有していたのか、または野生型アミノ酸残基（「野生型」）を有していたのかを示す。
【図１１】図１１は、示されている置換またはそれらの組合せを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体に関するＤＬＳ熱スキャンアッセイに関する一次データを示す折れ線グラフである。ｙ軸は、該アッセイがｘ軸（５０〜７５℃が示されている）に沿って温度をスキャンした場合の、ＤＬＳにより検出された物質の平均半径を示す。
【図１２】図１２は、示されている置換組合せを使用してＤＬＳ熱スキャンアッセイにより測定された場合のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％の凝集温度を示す棒グラフである。凝集温度は最高から最低の順に示されている。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を含有する対照タンパク質は黒色で示されており、置換を有する変異体は灰色で示されている。データは、ヒンジにおけるＣ２２０Ｓ置換、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、およびスルホペプチドとしてのｍｉｍ２またはｍｉｍ６のいずれかを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体に関して示されている。
【図１３】図１３は、ＳＹＰＲＯオレンジ色素インターカレーションアッセイの結果を示す棒グラフである。該アッセイによって測定されたｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％融解温度が示されている。融解温度は最高から最低の順に示されている。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を含有する対照タンパク質は黒色で示されており、置換を有する変異体は灰色で示されている。データは、ヒンジにおけるＣ２２０Ｓ置換、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、およびスルホペプチドとしてのｍｉｍ２またはｍｉｍ６のいずれかを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体に関して示されている。
【図１４】図１４は、アプライド・バイオシステムズ・タンパク質熱シフト（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ）色素インターカレーションアッセイの結果を示す棒グラフである。アッセイにより測定されたｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の５０％融解温度が示されている。融解温度は最高から最低の順に示されている。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を含有する対照タンパク質は黒色で示されており、置換を有する変異体は灰色で示されている。「Ｃｈｉｍｐ」は、チンパンジーＣＤ４由来のＣＤ４  Ｄ１Ｄ２配列を有する、それ以外は同一であるｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質を示す。データは、ヒンジにおけるＣ２２０Ｓ置換、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、およびスルホペプチドとしてのｍｉｍ２またはｍｉｍ６のいずれかを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体に関して示されている。
【図１５】図１５は、アミノ酸置換の組合せを含有するＣＤ４ムテインに関する色素インターカレーション熱スキャンアッセイの結果を示す一連の棒グラフである。ＳＹＰＲＯオレンジ（Ｏｒａｎｇｅ）色素インターカレーションアッセイにおけるｍｉｍ６スルホペプチドを含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質の５０％融解温度が図１５Ａ〜Ｃに示されている。アプライド・バイオシステムズ・タンパク質熱シフト（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ）アッセイにおけるスルホペプチドを欠くＣＤ４−Ｉｇタンパク質に関する５０％融解温度が図１５Ｄに示されている。ここに示されている全ての変異体はヒンジにＣ２２０Ｓ置換を有する。
【図１６】図１６は、種々のｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質に関するタンパク質発現収量を示す棒グラフである。この図に示されている変異体の全てには、ｍｉｍ６スルホペプチド、ヒンジにおけるＣ２２０Ｓ置換およびＩｇＧ１  Ｆｃが含まれる。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質は黒色で示されており、アミノ酸置換を含有する変異体の全ては灰色で示されている。
【図１７−１】図１７は、種々のｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質に関する発現収量を示す一連の棒グラフである。図１７Ａ〜Ｈの各パネルは別々のタンパク質発現収量実験を表す。２つの対照が黒色で示されている。これらの２つの対照は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質、および置換Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを含有するｅＣＤ４−Ｉｇである。全ての他の変異体は灰色で示されている。示されている変異体の全てには、ヒンジにおけるＣ２２０Ｓ置換、およびＩｇＧ１  Ｆｃが含まれる。図１７Ａ〜Ｇにおける変異体は全て、ｍｉｍ６スルホペプチドを含有する全てのｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質であり、一方、図１７Ｈにおける変異体は、スルホペプチドを欠く全てのＣＤ４−Ｉｇタンパク質である。
【図１７−２】図１７は、種々のｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質に関する発現収量を示す一連の棒グラフである。図１７Ａ〜Ｈの各パネルは別々のタンパク質発現収量実験を表す。２つの対照が黒色で示されている。これらの２つの対照は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質、および置換Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを含有するｅＣＤ４−Ｉｇである。全ての他の変異体は灰色で示されている。示されている変異体の全てには、ヒンジにおけるＣ２２０Ｓ置換、およびＩｇＧ１  Ｆｃが含まれる。図１７Ａ〜Ｇにおける変異体は全て、ｍｉｍ６スルホペプチドを含有する全てのｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質であり、一方、図１７Ｈにおける変異体は、スルホペプチドを欠く全てのＣＤ４−Ｉｇタンパク質である。
【図１８】図１８は、野生型ＣＤ４−Ｉｇ、またはコンホメーション安定性を改善する置換を有する示されているＣＤ４−ＩｇまたはｅＣＤ４−Ｉｇ変異体のヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける薬物動態を示す一連の折れ線グラフである。図１８Ａ〜Ｃに示されているデータは並行して集められたものであり、直接的に比較可能であり、明瞭化のために３つのパネルに分けられているに過ぎない。図１８Ａは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２配列、またはＲ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７もしくはＫ７２／Ｋ７５／Ｑ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７位に突然変異を含有するＣＤ４  Ｄ１Ｄ２配列を含有するＣＤ４−Ｉｇ変異体（スルホペプチドを含まない）の薬物動態を示す。野生型ＣＤ４−Ｉｇの半減期は２．４日であり、一方、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ＣＤ４−Ｉｇの半減期は４．２日であり、Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ＣＤ４−Ｉｇの半減期は８．６日であった。図１８Ｂは、Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７位に置換を含有するＣＤ４−Ｉｇ（スルホペプチドを含まない）およびｅＣＤ４−Ｉｇ（スルホペプチドを含む）タンパク質の薬物動態を示す。図１８Ｃは、Ｋ７２／Ｋ７５／Ｑ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７位に置換を有するＣＤ４−Ｉｇ（スルホペプチドを含まない）およびｅＣＤ４−Ｉｇ（スルホペプチドを含む）タンパク質ならびにＱ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７位に置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質の薬物動態を示す。
【図１９】図１９は、コンホメーション安定性もしくはＦｃＲｎ結合を改善する示されている置換または野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を含有するｅＣＤ４−ＩｇのヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける薬物動態を示す折れ線グラフである。広範囲中和性モノクローナル抗体１０−１０７４をヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスの２つの群における対照として使用した。これら２つの対照群のそれぞれは別々の折れ線で示されている。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２対照に加えて、この薬物動態実験において評価されたｅＣＤ４−Ｉｇ変異体にはアミノ酸置換の以下の組合せが含まれていた：Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ、Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ、Ｓ２３Ｎ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ、およびＳ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ。また、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における置換Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体は、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）、またはＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）を含有するＩｇＧ１  Ｆｃのコンテキストにおいて評価された。
【図２０】図２０は、置換Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを含有するｅＣＤ４−Ｉｇの変異体を評価する野生型ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける薬物動態実験を示す。Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の薬物動態を、Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有する対照と比較した（図２０Ａ）。表面電荷置換Ｒ１３４Ｇ、Ｎ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔを、個別に、および組合せて、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌバックグラウンド内に導入した。したがって、この薬物動態実験で試験された追加的変異体はＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｒ１３４Ｇ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｋ１７６Ｔ／Ｖ１６８Ｌ、およびＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ／Ｖ１６８Ｌであった。第１日および第５日のタンパク質濃度から計算された半減期を比較した（図２０Ｂ）。半減期における唯一の有意差（Ｐ＝０．０３；両側パラメトリックｔ検定）は、Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体と、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｒ１３４Ｇ／Ｖ１６８Ｌを含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体との間のものであった。
【図２１】図２１は、コンホメーション安定性を改善する置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体および野生型ＣＤ４−Ｉｇの、ラットにおける薬物動態を示す折れ線グラフである。野生型ヒトＣＤ４−Ｉｇ、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１、およびＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２を１０ｍｇ／ｋｇでラットに皮下投与した。野生型ヒトＣＤ４−Ｉｇの半減期は１１時間と計算され、一方、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１およびｅＣＤ４−ＩｇＧ２の半減期は、それぞれ、４８時間および４２時間と計算された。
【図２２】図２２はＡ５５Ｖ置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体によるウイルス中和を示す。Ａ５５Ｖ置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体によるウイルス中和を、感染に際してホタルルシフェラーゼを発現するＣＤ４＋  ＣＣＲ５＋  ＴＺＭ−ｂｌ細胞において測定した。野生型ヒトＡ５５残基またはＡ５５Ｖ置換のいずれかを有するＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体を系列５倍希釈にわたって力価測定した。Ａ５５Ｖ置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体がＢＧ５０５（図２２Ａ）、ＰＶＯ．４（図２２Ｂ）および９０１４（図２２Ｃ）偽ウイルスによる感染を中和する能力を比較した。ｅＣＤ４−Ｉｇの非存在下で発現されたルシフェラーゼの量に対するウイルス感染率が相対光単位（％ＲＬＵ）として示されている。破線は５０％ウイルス感染を示す。
【図２３】図２３は、Ｓ２３Ｎ置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体によるウイルス中和を示す。Ｓ２３Ｎ置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体によるウイルス中和を、感染に際してホタルルシフェラーゼを発現するＣＤ４＋  ＣＣＲ５＋  ＴＺＭ−ｂｌ細胞において測定した。野生型ヒトＳ２３残基またはＳ２３Ｎ置換のいずれかを有するＬ５Ｙ／Ａ５５Ｖ／Ｉ７６Ｐ／Ｌ９６Ｖ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体を系列５倍希釈にわたって力価測定した。Ｓ２３Ｎ置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体がＢＧ５０５（図２３Ａ）およびＰＶＯ．４（図２３Ｂ）偽ウイルスによる感染を中和する能力を比較した。ｅＣＤ４−Ｉｇの非存在下で発現されたルシフェラーゼの量に対するウイルス感染率が相対光単位（％ＲＬＵ）として示されている。破線は５０％ウイルス感染を示す。
【図２４】図２４は、示されているｅＣＤ４−Ｉｇ変異体によるウイルス中和を示す散布図である。３９８Ｆ１、ＢＧ５０５、２４６Ｆ３、Ｔｒｏ．１１、Ｘ２２７８、９０１４、ＰＶＯ．４、Ｔ２５７−１０、ＣＥ０２１７、ＺＭ６５１、ＣＮＥ８、ＣＮＥ５５、ＢＪＯＸ２０００、ＣＨ１１９、Ｘ１６３４および８９．６を含む試験ウイルスのパネルに対してウイルス中和アッセイを行った。標的細胞は、感染に際してホタルルシフェラーゼを発現するＣＤ４＋  ＣＣＲ５＋  ＴＺＭ−ｂｌ細胞であった。ｅＣＤ４−Ｉｇの非存在下で発現されたルシフェラーゼの量に対するウイルス感染率が相対光単位（％ＲＬＵ）として示されている。破線は５０％ウイルス感染を示す。Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔバックグラウンドのコンテキストにおいては、置換Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｌ９６Ｖの存在は、ＨＩＶ感染の５０％を抑制するのに必要なｅＣＤ４−Ｉｇの濃度の有意な減少をもたらした（Ｐ＜０．０００１、ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）マッチドペア検定）。
【図２５】図２５は、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸によってグリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸が置換されているｅＣＤ４−Ｉｇ変異体によるウイルス中和を示す。試験されたｅＣＤ４−Ｉｇ変異体には、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）対照（灰色）、Ａ５５Ｖ、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｔ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、およびＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ｑ４０Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌが含まれていた。試験ウイルスは、伝染性／始祖（ｆｏｕｎｄｅｒ）（ｔ／ｆ）ウイルスＰＲＢ９３１−０６のエンベロープ糖タンパク質から生成される偽ウイルスである。標的細胞は、感染に際してホタルルシフェラーゼを発現するＣＤ４＋  ＣＣＲ５＋  ＴＺＭ−ｂｌ細胞であった。ｅＣＤ４−Ｉｇの非存在下で発現されたルシフェラーゼの量に対するウイルス感染率が相対光単位（％ＲＬＵ）として示されている。破線は５０％ウイルス感染を示す。
【図２６】図２６は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の、アカゲザル（リーサス・マカク）における薬物動態を示す一連の折れ線グラフである。マカクにおいて評価されたｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の全ては置換Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを有していた。示されている場合には、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体は免疫グロブリンＦｃドメイン内に「ＬＳ」置換（Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）を有していた。各アカゲザルにおける各ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の半減期がアカゲザルの番号の隣に示されている（例えば、動物番号ｒ１３００７、半減期＝２．８日）。３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１（図２６Ａ）、３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２（図２６Ｂ）、３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１  ＬＳ（図２６Ｃ）、３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２  ＬＳ（図２６Ｄ）、１０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１  ＬＳ（図２６Ｅ）、１０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２  ＬＳ（図２６Ｆ）、および１ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１  ＬＳ（図２６Ｇ）の静脈内注入を３頭のアカゲザルの群に行った。半減期は抗薬物抗体の潜在的出現の前の最初の１０日間のデータから計算された。黒色の記号は、ＩｇＧ１の投与を受けた動物における血漿ｅＣＤ４−Ｉｇ濃度を示し、灰色の記号は、ＩｇＧ２の投与を受けた動物における血漿ｅＣＤ４−Ｉｇ濃度を示す。
【図２７】図２７は、ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体による、アカゲザルにおけるウイルス複製の抑制を示す折れ線グラフである。ＳＨＩＶ−ＡＤ８に感染したアカゲザルに３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇのＩｇＧ１またはＩｇＧ２形態を投与した。その後の種々の時点で、血漿ウイルス量を測定した（ｍＬ当たりのウイルスＲＮＡコピー）。黒色の記号は、ＩｇＧ１の投与を受けた動物におけるウイルス量を示し、灰色の記号は、ＩｇＧ２の投与を受けた動物におけるウイルス量を示す。
【０１５３】
実施例
以下の実施例は単なる例示に過ぎず、本発明の範囲または内容を何ら限定するものではない。
【０１５４】
実施例１  −  非ヒト霊長類ｅＣＤ４−ＩｇはヒトｅＣＤ４−Ｉｇより高い安定性を示す
ＣＤ４−ＩｇはＣＤ４のドメイン１および２（ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２）と抗体Ｆｃドメインとの融合体である。ｅＣＤ４−Ｉｇは、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２と、抗体Ｆｃドメインと、ＨＩＶおよびＳＩＶ共受容体のチロシン硫酸化領域に類似したチロシン硫酸化ペプチド（スルホペプチド）との融合体である（Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら（２０１５）ＮＡＴＵＲＥ，５１９（７５４１）：８７−９１）。この実施例は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２または非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の凝集温度の測定を記載する。
【０１５５】
タンパク質のコンホメーション安定性（アンフォールディングに対するタンパク質の抵抗性）はタンパク質治療用物質における重要な特性である。部分的アンフォールディングは、治療用タンパク質がインビボで他の分子に非特異的に付着することを可能にし、そして今度はこれが該治療用タンパク質の半減期を減少させうる。
【０１５６】
コンホメーション安定性は動的光散乱（ＤＬＳ）により測定可能であり、ＤＬＳは、溶液中の粒子サイズを測定するための方法であり、そして該粒子サイズは、異なる条件下での粒子サイズを測定するために使用されうる（Ｎｏｂｂｍａｎｎ，Ｕ．ら（２００７）ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＧＥＮＥＴ．ＥＮＧ．ＲＥＶ．，２４：１１７−２８）。ブラウン運動による粒子の運動は、大きな粒子の場合よりも小さな粒子の場合のほうが速い。ＤＬＳは、粒子の運動を検出することにより粒子サイズを計算しうる。可溶性タンパク質分子は、同じタンパク質の凝集体より小さいため、ＤＬＳにより検出される粒子サイズの増加はタンパク質凝集を示す。熱スキャンＤＬＳアッセイは、タンパク質サンプルの温度をゆっくり上昇させながら、凝集体の形成を検出する。このアッセイにおいては、より高いコンホメーション安定性を有するタンパク質は比較的高い温度で凝集し始め、一方、より低いコンホメーション安定性を有するタンパク質は比較的低い温度で凝集し始める。
【０１５７】
典型的には、組換えタンパク質治療用物質の場合、６０℃以上の凝集温度が望ましい。図１Ａに示されているとおり、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体は５１℃の凝集温度を有していた。図１Ｂに示されているとおり、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインと野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体は５３℃の凝集温度を有していた。図１Ａに示されているとおり、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと野生型アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体は６２℃の凝集温度を有し、これは、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を有する対応ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体のものより９℃高い。図１Ｂに示されているとおり、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインと野生型アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とを有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体は６７℃の凝集温度を有し、これは、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を有する対応ｅＣＤ４−Ｉｇ変異体のものより１４℃高い。
【０１５８】
したがって、野生型アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に基づくｅＣＤ４−Ｉｇは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に基づくｅＣＤ４−Ｉｇと比較して改善されたコンホメーション安定性を示す。
【０１５９】
野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２をそれぞれが含むＣＤ４−Ｉｇ（スルホペプチドを含有しない）およびｅＣＤ４−Ｉｇ（「ｍｉｍ２」（配列番号３）スルホペプチドを含有する）の凝集温度も測定した。図２に示されているとおり、ＣＤ４−Ｉｇは８０．４℃の凝集温度を有し、一方、ｅＣＤ４−Ｉｇは５１℃の凝集温度を有していた。したがって、追加的結合部分（例えば、スルホペプチド）の存在はＣＤ４−Ｉｇのコンホメーション安定性を著しく低下させうる。
【０１６０】
実施例２  −  ＤＬＳアッセイを用いるヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２の安定性を改善するアミノ酸置換の特定
この実施例は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２、例えばＣＤ４−ＩｇおよびｅＣＤ４−Ｉｇを含むタンパク質の凝集温度を増加させるアミノ酸置換の特定を記載する。
【０１６１】
コンホメーション安定性の改善をヒトｅＣＤ４−Ｉｇにもたらすアミノ酸置換を特定するために、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を、種々の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）種に由来するＣＤ４  Ｄ１Ｄ２と比較した。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２アミノ酸配列を、以下のものを含む種々の類人猿、サルおよび原猿種のＣＤ４  Ｄ１Ｄ２アミノ酸配列とアライメントさせた：チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）、ボノボ（ｂｏｎｏｂｏ）、ゴリラ（ｇｏｒｉｌｌａ）、ボルネオオランウータン（Ｂｏｒｎｅａｎ  ｏｒａｎｇｕｔａｎ）、ホオジロテナガザル（ｗｈｉｔｅ−ｃｈｅｅｋｅｄ  ｇｉｂｂｏｎ）、アジルテナガザル（ａｇｉｌｅ  ｇｉｂｂｏｎ）、フクロテナガザル（ｓｉａｍａｎｇ）、コロブスザル（Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）、アビシニアコロブス（Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｇｕｅｒｅｚａ）、アンゴランコロブス（Ａｎｇｏｌａｎ  ｃｏｌｏｂｕｓ）、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）、ベルベットモンキー（ｖｅｒｖｅｔ  ｍｏｎｋｅｙ）、サバエウスモンキー（Ｓａｂａｅｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）、タンタルスモンキー（Ｔａｎｔａｌｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）、アカオナガザル（ｒｅｄ  ｇｕｅｎｏｎ）、スーティーマンガベイ（ｓｏｏｔｙ  ｍａｎｇａｂｅｙ）、マンドリル（ｍａｎｄｒｉｌｌ）、クロキンシコウ（ｂｌａｃｋ  ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅ  ｍｏｎｋｅｙ）、キンシコウ（ｇｏｌｄｅｎ  ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅ  ｍｏｎｋｅｙ）、リーフモンキー（ｌｅａｆ  ｍｏｎｋｅｙ）、ブタオザル（ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）、ニホンザル（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｍａｃａｑｕｅ）、ウォルフグエノン（Ｗｏｌｆ’ｓ  ｇｕｅｎｏｎ）、タラポイン（Ｔａｌａｐｏｉｎ）、ホオジロマンガベイ（ｇｒａｙ−ｃｈｅｅｋｅｄ  ｍａｎｇａｂｅｙ）、オリーブバブーン（ｏｌｉｖｅ  ｂａｂｏｏｎ）、ドウイロティティ（ｃｏｐｐｅｒｙ  ｔｉｔｉ）、マーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）、コモンリスザル（ｃｏｍｍｏｎ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙ）、ボリビアリスザル（Ｂｏｌｉｖｉａｎ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙ）、ホエザル（ｈｏｗｌｅｒ  ｍｏｎｋｅｙ）、ボリビアアカホエザル（Ｂｏｌｉｖｉａｎ  ｒｅｄ  ｈｏｗｌｅｒ  ｍｏｎｋｅｙ）、ノドジロオマキザル（Ｐａｎａｍａｎｉａｎ  ｗｈｉｔｅ−ｔｈｒｏａｔｅｄ  ｃａｐｕｃｈｉｎ）、ナンシーヨザル（Ｎａｎｃｙ  Ｍａ’ｓ  ｏｗｌ  ｍｏｎｋｅｙ）、アザラヨザル（Ａｚａｒａ’ｓ  ｏｗｌ  ｍｏｎｋｅｙ）、メガネザル（ｔａｒｓｉｅｒ）、マレーヒヨケザル（Ｓｕｎｄａ  ｆｌｙｉｎｇ  ｌｅｍｕｒ）、ハイイロネズミキツネザル（ｇｒａｙ  ｍｏｕｓｅ  ｌｅｍｕｒ）およびコクレルシファカ（Ｃｏｑｕｅｒｅｌ’ｓ  ｓｉｆａｋａ）（図３および４）。これらのＮＨＰ種のうち、ヒトのＣＤ４  Ｄ１Ｄ２配列は他の類人猿のものに最も類似しており、旧世界ザルのものに２番目に類似しており、新世界ザルのものに３番目に類似しており、原猿類のものには最も類似していない（図３）。アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とは８８％同一であることが判明し、Ｔ１７、Ｓ２３、Ｉ２４、Ｎ３９、Ｎ５��、Ｒ５９、Ｎ６６、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｄ８８、Ｑ８９、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｑ１２９、Ｒ１３４、Ｋ１４２、Ｌ１４４、Ｓ１４７、Ｌ１５１、Ｌ１６２、Ｎ１６４およびＫ１６７位において差異が見られた。チンパンジーＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とは９８％同一であることが判明し、Ｉ３４、Ａ５５、Ｐ６８およびＥ８７位に差異が見られた。
【０１６２】
ある置換がＣＤ４ドメイン１（Ｄ１）およびドメイン２（Ｄ２）の疎水性コアを安定化させるかどうかを判定するために、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるグリシンまたは疎水性アミノ酸を、置換されるアミノ酸より大きな体積（例えば、側鎖体積）を有する疎水性アミノ酸で置換した。疎水性アミノ酸は、ある場合には、埋もれた疎水性アミノ酸であった。この実験においては、アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、ＹおよびＷは疎水性アミノ酸とみなされ、グリシンおよび疎水性アミノ酸の相対体積は以下のとおりであるとみなされた：Ｇ＜Ａ＜Ｖ＜Ｐ＜Ｌ＝Ｉ＜Ｍ＜Ｆ＜Ｙ＜Ｗ。例えば、Ｇ６、Ｉ２４、Ｌ４４、Ｌ５１、Ａ５５、Ｌ６９、Ｇ９９、Ａ１０２、Ｖ１２８、Ｇ１４１、Ｖ１４６、Ｖ１６１およびＶ１６８位はそれぞれ、ＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２においては、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２の場合より大きな体積の疎水性アミノ酸であると認められる（図４）。理論によって拘束されることを望むものではないが、グリシンまたは疎水性アミノ酸が、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸で置換される、該タンパク質の疎水性コア内の或るアミノ酸置換は、コンホメーション安定性を増強すると仮定された。したがって、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２のコンホメーション安定性は、タンパク質の疎水性コアを安定化させる方法により改善されうる。潜在的な置換を分析するために、タンパク質の疎水性コア内の空間を視覚化するためのコンピュータソフトウェアプログラムを開発した。該プログラムはタンパク質データバンク（ＰＤＢ）構造の仮想断層撮影断面表示および編集を可能にした。例えば、Ｌ１００、Ｌ１４４、Ｖ１６１およびＦ１７０によって囲まれておりＶ１２８を包囲する疎水性ポケット内の空になった空間に注目されたい（図５Ａ）。置換Ｖ１２８Ｌのモデリングはこの疎水性ポケットのほとんどを充填する（図５Ｂ）。同様に、Ｌ５、Ｖ１６１、Ｆ１７０およびＫ７によって囲まれておりＶ１６８を包囲する疎水性ポケットに注目されたい（図５Ｃ）。この疎水性ポケットは置換Ｖ１６８Ｌにより充填される（図５Ｄ）。ここに示されているＶ１２８およびＶ１６８のモデリングに加えて、このツールは、例えばＧ６、Ａ５５およびＶ１４６における置換のモデリングを可能にした。したがって、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２の構造を分析して空間を特定し、そしてこれらの空間の充填によりＣＤ４  Ｄ１およびＤ２の疎水性コアを安定化しうる置換を特定した。
【０１６３】
これらの比較に基づき、ＮＨＰ  ｅＣＤ４−Ｉｇの優れた凝集温度をヒトｅＣＤ４−Ｉｇにもたらす突然変異を特定するために、突然変異誘発分析を行った。実施例１に記載されているとおりにＤＬＳ熱スキャンアッセイを用いて、置換を評価した。置換を、個別に、および／またはＣＤ４  Ｄ１Ｄ２内の他の位置における突然変異と組合せて（すなわち、異なる突然変異バックグラウンドにおいて）評価した。特に示されていない限り、試験したｅＣＤ４−Ｉｇ変異体はスルホペプチドｍｉｍ１（配列番号２）、ｍｉｍ２（配列番号３）、ｍｉｍ４（配列番号４）、ｍｉｍ５（配列番号５）またはｍｉｍ６（配列番号６）を含んでいた。特に示されていない限り、試験したｅＣＤ４−Ｉｇ変異体は、Ｃ２２０Ｓ置換の存在下または非存在下の、含まれているＩｇＧ１またはＩｇＧ２  Ｆｃドメインを含んでいた。
【０１６４】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ１は、類人猿であるゴリラにおいてはＮである（図４Ａ）。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２バックグラウンド（配列番号１）に基づくｅＣＤ４−ＩｇへのＫ１Ｎの導入は、熱安定性に関する動的光散乱（ＤＬＳ）アッセイでの測定では、ｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を２．３℃増加させた（図６Ａ）。
【０１６５】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ２は、コロブス、スーティーマンガベイおよびマンドリルを含む幾つかの旧世界ザルにおいてはＮであり、新世界ザルにおいてはＴであり、原猿類においてはＥである（図４Ａ）。野生型のヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄバックグラウンドにおいては、Ｋ２Ｔ、Ｋ２ＮおよびＫ２ＥはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度をそれぞれ３℃、３．７℃および４．６℃増加させた（図６Ｂ〜Ｄ）。Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７ＴバックグラウンドにおけるＫ２Ｅ置換は凝集温度を３．９℃増加させた（図６Ｄ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ２位における置換、例えばＥによる置換（Ｋ２Ｅ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１６６】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＧ６は、原猿類であるメガネザルにおいてはＡである（図４Ａ）。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドへのＧ６Ａの導入はｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を４．６℃増加させた。Ａ５５Ｖバックグラウンドにおいては、Ｇ６Ａの導入はｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を０．８℃増加させた（図６Ｅ）。
【０１６７】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ７は、ナンシーヨザル、アザラヨザルおよびスピックスヨザルを含む幾つかの新世界ザルにおいてはＥである（図４Ａ）。それはまた、幾つかの他の新世界ザルおよび原猿類においてはＲでありうる。Ｋ７Ｅ置換はコンホメーション安定性を中程度に改善した（図６Ｆ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ７位における置換、例えばＥによる置換（Ｋ７Ｅ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１６８】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ８における置換もＫ７に対するその接近性ゆえに評価した。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＥによるＫ８の置換はコンホメーション安定性を劇的に改善した（図６Ｇ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ８位における置換、例えばＥによる置換（Ｋ８Ｅ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１６９】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＴ１５はゴリラ（類人猿）においてはＮであり、スーティーマンガベイ（旧世界ザル）においてはＡであり、原猿類および或る新世界ザルにおいてはＰであり、残りの新世界ザルにおいてはＳである。Ｔ１５ＮはＮ結合型グリコシル化のためのＮ−Ｘ−Ｔコンセンサスモチーフを生成させる（図４Ａ）。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＴ１５Ｎの導入はｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を７．９℃増加させた（図６Ｈ）。
【０１７０】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＴ１７は、アカゲザルを含むほとんどの旧世界ザルにおいてＮである。Ｎの存在はＮ結合型グリコシル化のためのＮ−Ｘ−Ｔコンセンサスモチーフを生成させる（図４Ａ）。ヒトｅＣＤ４−ＩｇにおけるＴ１７Ｎ置換の導入はｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させた（図６Ｉ）。また、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＴ１７は新世界ザルの全てにおいてＥであり、Ｔ１７Ｅ置換はコンホメーション安定性における中程度の改善をもたらした（図６Ｊ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＴ１７位における置換、例えばＮによる置換（Ｔ１７Ｎ）またはＥによる置換（Ｔ１７Ｅ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１７１】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ２１は、旧世界ザルであるサバエウスモンキーおよびタンタルスモンキーにおいてはＮである（図４Ａ）。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２バックグラウンドを有するｅＣＤ４−ＩｇへのＫ２１Ｎの導入はその凝集温度を１１℃増加させた（図６Ｋ）。
【０１７２】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ２２は、アフリカミドリザル、ベルベットモンキー、サバエウスモンキー、タンタルスモンキーおよびアカオナガザルを含む幾つかの旧世界ザルにおいてはＴである（図４Ａ）。野生型のヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２バックグラウンドを有するｅＣＤ４−ＩｇへのＫ２１Ｔの導入はその凝集温度を６．３℃増加させた（図６Ｌ）。
【０１７３】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＳ２３は、アカゲザルを含む種々の旧世界ザルおよび新世界ザルにおいてはＮであり、或る他の旧世界ザルおよび新世界ザルにおいてはＴであり、原猿類においてはＳ、ＹまたはＡである（図４Ａ）。Ｓ２３Ｎは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）に基づくｅＣＤ４−Ｉｇ分子、および置換Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを含有するヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に基づくｅＣＤ４−Ｉｇ分子において、凝集温度をそれぞれ１０．１℃および４．８℃増加させた（図６Ｍ）。Ｓ６Ｔは、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを含有するバックグラウンドにおいて凝集温度を２．３℃増加させた（図６Ｎ）。
【０１７４】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＧ３８は、原猿類であるマレーヒヨケザルにおいてはである。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドにおけるＧ３８Ａの変化はｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を９℃減少させた。
【０１７５】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＬ５１は、ある原猿類においてはＭである（図４Ａ）。Ｌ５１からＩへの変化は野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）およびＧ６Ａ／Ａ５５ＶバックグラウンドにおいてｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度をそれぞれ１．８℃および２．２℃増加させた（図６Ｐ）。
【０１７６】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＡ５５はチンパンジーならびにボノボおよび原猿類においてはＶである（図４Ａ）。この位置は、新世界ザルの全て、ならびにアフリカミドリザル、ベルベットモンキー、サバエウスモンキー、タンタルスモンキーおよびマンドリルを含む幾つかの旧世界ザルにおいてはＩである。旧世界ザルであるアカオナガザルは、この位置にスレオニンを有する唯一の異端的存在である。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２バックグラウンドにおけるヒトｅＣＤ４−ＩｇにおけるＡ５５からＶへの突然変異（Ａ５５Ｖ）はその凝集温度を５．７℃増加させ、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１Ｋ６７Ｔ突然変異バックグラウンドにおけるヒトｅＣＤ４−ＩｇにおけるＡ５５からＶへの突然変異（Ａ５５Ｖ）は凝集温度を４．９℃増加させた（図６Ｑ）。しかし、Ｇ６Ａのコンテキストにおいては、ｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度は不変であった。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を有するｅＣＤ４−ＩｇのコンテキストにおけるＡ５５からＩへの突然変異はその凝集温度を７．１℃増加させた（図６Ｒ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＡ５５位における置換、例えばＶによる置換（Ａ５５Ｖ）またはＩによる置換（Ａ５５Ｉ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１７７】
Ａ５５は、埋もれた疎水性アミノ酸である。理論によって拘束されることを望むものではないが、この位置における嵩高い疎水性アミノ酸の存在はＣＤ４  Ｄ１の疎水性コアの安定性を改善し、それにより、その全体的なコンホメーション安定性を改善すると考えられる。結果として、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２における埋もれたグリシン残基または埋もれた疎水性残基を、置換されるアミノ酸より大きな体積を有する疎水性アミノ酸で置換すると、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度が増加しうる。例えば、以下の位置に、ＣＤ４  Ｄ２Ｄ２における埋もれたグリシン残基または埋もれた疎水性残基が存在し、これらは、より大きな体積の疎水性アミノ酸により置換されうる：野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ５、Ｇ６、Ｖ１２、Ｌ１４、Ａ１８、Ｉ２４、Ｉ３６、Ｌ３７、Ｌ４４、Ｌ５１、Ａ５５、Ｇ６５、Ｆ６７、Ｐ６８、Ｌ６９、Ｖ９３、Ｇ９９、Ｉ７１、Ｌ７４、Ｖ８６、Ｖ９３、Ｌ９５、Ｌ９６、Ｖ９７、Ｆ９８、Ａ１０２、Ｌ１０８、Ｌ１１４、Ｌ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２１、Ｖ１２８、Ｐ１３３、Ｉ１３８、Ｇ１４１、Ｌ１４４、Ｖ１４６、Ｌ１４９、Ｇ１５５、Ｖ１６１、Ｖ１６８、Ｆ１７０、Ｉ１７２、Ｉ１７４またはＶ１７６。また、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＧ６、Ｉ２４、Ｌ４４、Ｌ５１、Ａ５５、Ｌ６９、Ｇ９９、Ａ１０２、Ｖ１２８、Ｇ１４１、Ｖ１４６、Ｖ１６１およびＶ１６８を含むこれらの位置の幾つかはＮＨＰにおいては異なっている。
【０１７８】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＩ７０は新世界ザルおよび原猿類においては他のアミノ酸で置換されている（図４Ｂ）。アミノ酸置換Ｉ７０Ｅの導入は、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−Ｉｇバックグラウンドにおいて、コンホメーション安定性が２℃改善した（図６Ｓ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＩ７０位における置換、例えばＥによる置換（Ｉ７０Ｅ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１７９】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ７２は新世界ザルおよび原猿類においては他のアミノ酸で置換されている（図４Ｂ）。アミノ酸置換Ｋ７２Ｓの導入は野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドおよびＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−Ｉｇバックグラウンドにおけるコンホメーション安定性をそれぞれ１．３℃および３℃改善した（図６Ｔ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ７２位における置換、例えばＳによる置換（Ｋ７２Ｓ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１８０】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ７５はＮＨＰにおいては他のアミノ酸で置換されている（原猿類におけるＥおよび種々の新世界ザルにおけるＱを含む）（図４Ｂ）。Ｋ７５Ｅは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２バックグラウンド（配列番号１）を有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を４．１℃増加させた（図６Ｕ）。同様に、Ｋ７５Ｑは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２バックグラウンド（配列番号１）を有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を３℃増加させた（図６Ｖ）。
【０１８１】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２におけるＶ８６を野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドまたはＧ６Ａ／Ａ５５ＶバックグラウンドのコンテキストにおいてＬで置換することはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度に実質的に影響を及ぼさなかった（図６Ｗ）。
【０１８２】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２におけるＶ９３を野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドのコンテキストにおいてＩで置換することはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を僅かに０．２℃増加させたが、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖバックグラウンドにおいては凝集温度を９．２５℃低下させた（図６Ｘ）。
【０１８３】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＱ９４は類人猿およびヒトにおいてはＱのみであり、旧世界霊長類、新世界霊長類および原猿類においてはＥである（図４Ｂ）。Ｑ９４ＥはＲ１３４ＧバックグラウンドにおけるｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を僅かに低下させた（図６Ｕ）。
【０１８４】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＶ９７をＧ６Ａ／Ａ５５ＶバックグラウンドのコンテキストにおいてＩで置換することはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を僅かに低下させた（図６Ｚ）。
【０１８５】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＡ１０２は、新世界ザルであるリスザルにおいてはＶである（図４Ｂ）。Ａ１０２Ｖは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２バックグラウンド（配列番号１）を有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１．１℃増加させた（図６ＡＡ）。
【０１８６】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＱ１１０は、アカゲザルを含む或る旧世界霊長類においてはＥであり、ある原猿類においてはＨである（図４Ｂ）。Ｑ１１０ＥはＱ９４Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７ＴバックグラウンドにおけるｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を変化させなかった（図６ＢＢ）。
【０１８７】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ１１６位は霊長類間で見かけ上は変わらないが、Ｌ１１６、Ｃ１３０、Ｖ１４６、Ｗ１５７およびＣ１５９により囲まれた疎水性ポケットに隣接しているため、興味深かった。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＬ１１６をＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８ＬバックグラウンドのコンテキストにおいてＦ（置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸）で置換することはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を７．２℃増加させた（図６ＣＣ）。しかし、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６Ｉ／Ｖ１６８Ｌバックグラウンドにおいては、Ｌ１１６Ｆは凝集温度の０．４℃の低下をもたらした。同様に、Ｌ１１６をＷ（置換されるアミノ酸より大きな体積の別の疎水性アミノ酸）で置換することはＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８ＬバックグラウンドにおいてはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１．４℃増加させたが、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６Ｉ／Ｖ１６８Ｌバックグラウンドにおいては凝集温度を６℃低下させた（図６ＤＤ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＬ１１６位における置換、例えばＦまたはＷによる置換（Ｌ１１６ＦまたはＬ１１６Ｗ）が、Ｖ１４６Ｉとの組合せの場合を除き、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１８８】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＶ１２８は、原猿類であるメガネザルにおいてはＬである（図４Ｃ）。Ｖ１２８をＩ（置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸）で置換することは野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドにおけるｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１．６℃増加させた（図６ＥＥ）。タンパク質構造を視覚化し編集するために開発されたコンピュータツールを使用して、置換Ｖ１２８Ｌをモデル化した（図５）。Ｖ１２８Ｌ（置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸による置換）は、Ｌ１００、Ｌ１４４、Ｖ１６１およびＦ１７０により囲まれた疎水性ポケットを、野生型Ｖ１２８より大きな度合で充填する。Ｖ１２８Ｌは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を２．７℃増加させた（図６ＦＦ）。これらの結果は、Ｖ１２８位における置換、特に、Ｖより大きな体積の疎水性アミノ酸による置換が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇのコンホメーション安定性および凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１８９】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＲ１３４はボルネオオランウータン（類人猿）においてはＴであるが、マカク（旧世界ザル）、メガネザル（原猿類）、マレーヒヨケザル（原猿類）およびハイイロネズミキツネザル（原猿類）においてはＧである（図４Ｃ）。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドを有するｅＣＤ４−ＩｇにＲ１３４Ｇ置換を含めることは凝集温度を４．１℃増加させた（図６ＧＧ）。また、種々の突然変異バックグラウンド（例えば、Ｋ１６７ＴまたはＱ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｋ１４２Ｒ／Ｎ１６４Ｄ）にＲ１３４Ｇ置換を含めることはヒトｅＣＤ４−Ｉｇのコンホメーション安定性を著しく改善した（図６ＧＧ）。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＲ１３４位における置換、例えばＧによる置換（Ｒ１３４Ｇ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１９０】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＧ１４０はボルネオオランウータン（類人猿）においてはＡであり、幾つかの旧世界ザルにおいてはＶまたはＲである。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドにおいてＧ１４０をＡにより置換することはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を７．８℃増加させた（図６ＨＨ）。
【０１９１】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ４２は、アカゲザルを含む種々の旧世界ザルおよび新世界ザルにおいてはＲであり、原猿類においてはＧまたはＳでありうる（図４Ｃ）。種々のバックグラウンドコンテキストにおいて、Ｋ１４２ＲはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させなかった（図６ＩＩ）。
【０１９２】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＶ１４６は種々の新世界ザルおよび原猿類においてはＬまたはＭである（図４Ｃ）。また、Ｖ１４６は、Ｌ１１６、Ｃ１３０、Ｖ１４６、Ｗ１５７およびＣ１５９により囲まれたＣＤ４  Ｄ２の構造における疎水性ポケットに隣接している。Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６ＬバックグラウンドにおいてＶ１４６をＬ（置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸）により置換することはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を２．２℃増加させた（図６ＪＪ）。しかし、Ｖ１４６をＩ（置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸）により置換することは、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６Ｌバックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を７．６℃増加させた（図６ＫＫ）。同様に、Ｖ１４６をＦまたはＷ（それぞれは、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸である）により置換することは、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６Ｌのバックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度をそれぞれ３．６℃および４．１℃増加させた（図６ＬＬおよびＭＭ）。いずれかの特定の理論により拘束されるものではないが、これらの結果は、Ｖ１４６を、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸により置換すること（例えば、Ｖ１４６Ｉ、Ｖ１４６Ｆ、Ｖ１４６Ｌ、Ｖ１４６Ｗ、Ｖ１４６ＭおよびＶ１４６Ｐ）により、Ｌ１４６、Ｃ１３０、Ｖ１４６、Ｗ１５７およびＣ１５９により囲まれたＣＤ４  Ｄ２の構造における疎水性ポケットを充填することが、ＤＬＳのような熱安定性アッセイで測定された場合のタンパク質安定性を増強しうることを示唆している。
【０１９３】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＮ１６４は、チンパンジー、ボノボおよびゴリラ以外の類人猿ならびに旧世界ザルおよび原猿類においてはＤである（図４Ｃ）。このＤはおそらく祖先由来であり、一方、ある類人猿に存在するＮおよび新世界ザルに存在するＨはおそらく誘導されたものである。Ｎ１６４Ｄ置換の存在下および非存在下のヒトｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を、他の幾つかの置換（Ｒ１３４Ｇ、Ｒ１３４Ｇ／Ｋ１６７Ｔ、およびＱ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｋ１４２Ｒ／Ｋ１６７Ｔ）と組合せて測定した（図６ＮＮ）。これらの突然変異バックグラウンドのそれぞれにおいて、Ｎ１６４Ｄはコンホメーション安定性の改善をｅＣＤ４−Ｉｇにもたらした。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＮ１６４位における置換、例えばＤによる置換（Ｎ１６４Ｄ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１９４】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＫ１６７はコロブス以外の旧世界ザルの全て、および原猿類の全てにおいてはＴである。コロブスにおいては、この位置はＲであり、新世界ザルにおいては、それはＬである。ヒトｅＣＤ４−ＩｇにおけるＫ１６７を例えばＴ（Ｋ１６７Ｔ）に突然変異させることはコンホメーション安定性を改善した（図６ＯＯ）。コンホメーション安定性におけるこの改善は３つの異なる突然変異バックグラウンド（Ｒ１３４Ｇ、Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｋ１４２Ｒ／Ｎ１６４Ｄ、およびＱ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ）において観察された。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＫ１６７位における置換、例えばＴによる置換（Ｋ１６７Ｔ）が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０１９５】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＶ１６８は、新世界霊長類であるヨザルおよび原猿類においてはＬである（図４Ｃ）。タンパク質構造を視覚化し編集するために開発されたコンピュータツールを使用して、置換Ｖ１２８Ｌをモデル化した。Ｖ１６８をＬ（置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸）により置換することは野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドにおけるｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を０．８℃増加させた（図６ＰＰ）。したがって、Ｖ１６８位における置換、特に、Ｖより大きな体積の疎水性アミノ酸による置換は、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇのコンホメーション安定性および凝集温度を増加させる。
【０１９６】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）におけるＶ１７６をＩにより置換した。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドにおいては、Ｖ１７６ＩはｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を９．２℃増加させた。
【０１９７】
置換の以下の組合せが、試験されたバックグラウンドにおいて凝集温度を増加させた：Ｋ２Ｅ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ａ）；Ｋ２Ｅ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｂ）；Ｋ７Ｅ／Ｋ８Ｅ（図７Ｃ）；Ｋ８Ｅ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｄ）；Ｋ８Ｅ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｅ）；Ｔ１７Ｎ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｆ）；Ｔ１７Ｎ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｇ）；Ｔ１７Ｅ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｈ）；Ｔ１７Ｅ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｉ）；Ｉ７０Ｅ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｊ）；Ｉ７０Ｅ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｋ）；Ｋ７２Ｓ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｌ）；Ｋ７２Ｓ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｍ）；Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ（図７Ｎ）；Ｑ９４Ｅ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｐ）；Ｑ９４Ｅ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｑ）；Ｑ１１０Ｅ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｓ）；Ｑ１１０Ｅ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｔ）；Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｖ）；Ｒ１３４Ｇ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｗ）；Ｋ１４２Ｒ／Ｎ１６４Ｄ（図７Ｘ）；Ｋ１４２Ｅ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｙ）；Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ（図７Ｚ）；およびＫ１６６Ｎ／Ｋ１６７Ｔ（図７ＡＡ）。置換の以下の組合せは、試験されたバックグラウンドにおいて凝集温度が低下させた：Ｑ９４／Ｒ１３４（図７Ｏ）、Ｑ１１０／Ｒ１３４（図７Ｒ）、Ｒ１３４／Ｋ１４２（図７Ｕ）、およびＫ１４２／Ｎ１６４（図７Ｘ）。驚くべきことに、Ｑ９４ＥおよびＱ１１０Ｅは個々には凝集温度を増加させなかったにもかかわらず、Ｑ９４／Ｑ１１０の組合せの置換は凝集温度を概ね増加させた（図７Ｎ）。
【０１９８】
また、３つ、４つまたは５つの位置の置換の組合せの存在下および非存在下のタンパク質に関しても凝集温度を比較した。置換位置の組合せには以下のものを含んでいた：Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７（図７Ａ）、Ｒ１３４／Ｋ１４２／Ｎ１６４／Ｋ１６７（図７Ｂ）、Ｔ１７／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７（図７Ｃ）、Ｑ９４／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７（図７Ｄ）、Ｑ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７（図７Ｅ）、Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７（図７Ｆ）、Ｑ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｋ１４２／Ｋ１６７（図７Ｇ）、Ｑ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４（図７Ｈ）、Ｑ９４／Ｑ１１０／Ｋ１４２／Ｋ１６７（図７Ｉ）、およびＫ７５／Ｑ９４／Ｑ１１０（図７Ｊ）。これらの置換組合せの全てはコンホメーション安定性を有意に改善した。
【０１９９】
Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７の３つの位置における置換は、それ以外の点では野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドである場合に、ｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を５３℃から６３℃へ１０℃増加させた（図８Ａ）。具体的には、このｅＣＤ４−Ｉｇ変異体はアミノ酸置換Ｒ１３４Ｇ／Ｋ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有していた。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＲ１３４、Ｋ１６４およびＫ１６７位における置換、例えばＲ１３４Ｇ、Ｋ１６４ＤおよびＫ１６７Ｔ置換が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２と比較した場合のＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２の優れたコンホメーション安定性が最小数の置換によって再現されうることをも示している。Ｒ１３４Ｇ／Ｋ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体のコンホメーション安定性の改善に基づいて、この突然変異バックグラウンドにおいて、多数の他の置換を評価した。
【０２００】
ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２のコンホメーション安定性を改善したアミノ酸置換およびそれらの組合せは、しばしば、正電荷の正味の損失をもたらした。例えば、Ｋ７２Ｓ、Ｒ１３４ＧおよびＫ１６７Ｔのそれぞれは正荷電塩基性アミノ酸を非荷電アミノ酸によって置換している。Ｔ１７Ｅ、Ｉ７０Ｅ、Ｑ９４Ｅ、Ｑ１１０ＥおよびＮ１６４Ｄのそれぞれは非荷電アミノ酸を負荷電酸性アミノ酸によって置換している。同様に、Ｋ２Ｅ、Ｋ７Ｅ、Ｋ８ＥおよびＫ７５Ｅのそれぞれは正荷電塩基性アミノ酸を負荷電酸性アミノ酸によって置換している。これらの結果は、正電荷の正味の損失または負電荷の獲得につながる置換が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を増加させることを示唆している。
【０２０１】
更に、コンホメーション安定性を改善するアミノ酸置換の多くは塩橋を破壊しないことが観察された。ヒトＣＤ４の既存Ｘ線結晶構造を分析することにより、潜在的塩橋に関与する位置を特定した。潜在的塩橋は以下のものであった（各塩橋がハイフンにより示されている）：Ｋ１−Ｅ９１、Ｋ２−Ｅ９１、Ｋ７−Ｄ１０、Ｋ８−Ｅ１１９、Ｋ２９−Ｋ８５、Ｋ５０−Ｅ７７、Ｒ５４−Ｄ７８、Ｒ５８−Ｅ１３、Ｒ５９−Ｄ５６、Ｋ７２−Ｄ５６、Ｋ８９−Ｅ８５、Ｒ１３１−Ｅ１６９、Ｋ１３６−Ｄ１５３、Ｋ１６７−Ｅ１６９、およびＫ１７１−Ｅ１６９。ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とＮＨＰ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２とにおいて異なる位置のうち、潜在的塩橋に関与する位置はＫ１、Ｋ２、Ｋ５０、Ｄ５６、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｋ７２、Ｅ７７、Ｅ９１、Ｒ１３１、Ｄ１５３、Ｋ１６７、Ｅ１６９およびＫ１７１であった。コンホメーション安定性の改善は、Ｔ１７、Ａ５５、Ｉ７０、Ｋ７５、Ｑ９４、Ｑ１１０、Ｒ１３４およびＮ１６４位に置換を含有するＣＤ４由来ポリペプチドにおいて観察された。それらの位置はいずれも塩橋に関与していない。これらの結果は、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇのコンホメーション安定性を改善する置換は塩橋に関与していないことが多いことを示唆している。
【０２０２】
Ｌ５、Ｉ７６、Ｌ９６およびＦ９８位の置換を含有するｅＣＤ４−Ｉｇの突然変異形態のコンテキストにおいて、Ａ５５Ｖを含む置換の組合せを更に調べた（図９）。Ａ５５Ｖをこれらの他の置換の４つ全て（Ｌ５Ｙ、Ｉ７６Ｐ、Ｌ９６ＶおよびＦ９８Ｖ）と共に置換することはｅＣＤ４−Ｉｇのコンホメーション安定性を低下させることが判明した（図９Ａ）。Ｆ９８Ｖは、個別に評価された場合には、コンホメーション安定性の相当な低下を招いた（図９Ｂ）。理論により拘束されることを望むものではないが、Ｆ９８Ｖ置換はドメイン１とドメイン２との境界を不安定化させた可能性がある。ドメイン１とドメイン２との境界に同様に位置する置換Ｉ７６Ｐを野生型に復帰させたところ、Ｉ７６ＰはＣＤ４  Ｄ１Ｄ２のコンテキストにおけるコンホメーション安定性に対して中程度に有害であることが判明した（図９Ｃ）。驚くべきことに、Ｓ２３Ｎ／Ｌ９６Ｖ置換のペアの存在はコンホメーション安定性を有意に改善した（図９Ｄ）。したがって、Ａ５５ＶおよびＳ２３ＮはＣＤ４  Ｄ１Ｄ２のコンテキストにおけるコンホメーション安定性を改善したが、Ｉ７６ＰおよびＦ９８Ｖはコンホメーション安定性に有害であった。
【０２０３】
グリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸を、置換されるアミノ酸より大きな体積を有する異なる疎水性アミノ酸により置換する置換を組合せ、得られたｅＣＤ４−Ｉｇのタンパク質の凝集温度を測定した（図１０）。例えば、Ｇ６ＡとＡ５５Ｖとの組合せは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を４．５℃増加させた（図１０Ａ）。Ｖ１２８ＬとＶ１２８Ｌとの組合せは、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖバックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を２．９℃増加させた（図１０Ｂ）。Ｇ６Ａ、Ａ５５Ｖ、Ｖ１２８ＬおよびＶ１６８Ｌの組合せは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を７．４℃増加させた（図１０Ｃ）。Ｇ６Ａ、Ｓ２３Ｎ、Ｖ１２８Ｌ、Ｖ１４６ＩおよびＶ１６８Ｌの組合せは、Ａ５５Ｖバックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１５．７℃増加させた（図１０Ｄ）。Ｇ６Ａ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｖ１２８Ｌ、Ｖ１４６ＩおよびＶ１６８Ｌの組合せは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１９．４℃増加させた（図１０Ｅ）。Ｓ２３ＮとＶ１４６Ｉとの組合せは、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌバックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を７．４℃増加させた（図１０Ｆ）。Ｓ２３Ｎ、Ｖ１２８ＬおよびＶ１６８Ｌの組合せは、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖバックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を７．３℃増加させた（図１０Ｇ）。Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｖ１２８Ｌ、Ｖ１４６ＩおよびＶ１６８Ｌの組合せは、Ｇ６Ａバックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１４．８℃増加させた（図１０Ｈ）。Ｓ２３Ｎ、Ｖ１２８Ｌ、Ｖ１４６ＩおよびＶ１２８Ｌの組合せは、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖバックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１４．９℃増加させた（図１０Ｉ）。Ｇ６Ａ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｌ１１６Ｆ、Ｖ１２８ＬおよびＶ１６８Ｌの組合せは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１９℃増加させた（図１０Ｊ）。Ｇ６Ａ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｖ１２８Ｌ、Ｖ１４６ＦおよびＶ１６８Ｌの組合せは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１５．４℃増加させた（図１０Ｋ）。Ｇ６Ａ、Ｓ２３Ｎ、Ａ５５Ｖ、Ｖ１２８Ｌ、Ｖ１４６ＷおよびＶ１６８Ｌの組合せは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドを有するｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度を１５．９℃増加させた（図１０Ｌ）。したがって、グリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸を、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸により置換する置換の組合せは、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２含有タンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇの凝集温度の相当な増加をもたらした。
【０２０４】
グリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸を、置換されるアミノ酸より大きな体積のアミノ酸により置換することによってもたらされる凝集温度の増加を更に例示するために、ＤＬＳアッセイからの一次熱スキャンデータを或る例に関して示す（図１１）。これらの例においては、Ｇ６Ａ、Ａ５５Ｖ、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖ、Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、Ｓ２３ＮおよびＶ１４６Ｉの追加がｅＣＤ４−Ｉｇの熱安定性を漸進的に改善した。
【０２０５】
この実施例に記載されているＤＬＳ熱スキャンアッセイにより測定されたｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質の凝集温度が最高温度から最低温度までの降順で示されている（図１２）。
【０２０６】
この実施例に記載されているＣＤ４−ＩｇおよびｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質変異体の熱スキャンアッセイ結果を表５に要約する。全てのＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、＊で表示されているものを除き、ヒンジ領域にＣ２２０Ｓ置換を含んでいた（標準的なＩｇＧ１番号付け）。
【表５】
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【０２０７】
実施例３  −  色素インターカレーションアッセイを用いた、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２の安定性を改善するアミノ酸置換の特定
この実施例は、コンホメーション安定性を増強するＣＤ４ムテイン（例えば、ＣＤ４−ＩｇおよびｅＣＤ４−Ｉｇ）における置換およびその組合せを特定するための、色素インターカレーションに基づく別のタイプの熱スキャンアッセイの使用を記載する。ＤＬＳアッセイと同様に、温度が徐々に上昇するにつれて、コンホメーションの不安定性がアンフォールドタンパク質内への色素のインターカレーションを可能にする。インターカレーションした色素は蛍光を発し、それらの光はタンパク質のアンフォールディングまたは「融解」の度合の定量的測定値として検出される。したがって、データは５０％溶融温度として示される。２つの補完的なタイプの色素インターカレーションアッセイを用いた。１つはＳＹＰＲＯオレンジ（Ｏｒａｎｇｅ）インターカレーションに基づくものであり、もう１つはアプライド・バイオシステムズ・タンパク質熱シフトアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）の独自色素成分に基づくものであった。
【０２０８】
まず、ＳＹＰＲＯオレンジ色素インターカレーションアッセイを用いて、コンホメーション安定性を増強するｅＣＤ４−Ｉｇ内の置換およびその組合せを特定した。このＳＹＰＲＯオレンジ色素インターカレーションアッセイからの融解温度が示されている（図１３）。これらの結果は表６にも示されている。ここに示されているｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質の全てはｍｉｍ６スルホペプチド、ヒンジ領域内のＣ２２０Ｓ置換およびＩｇＧ１  Ｆｃを含んでいた。
【表６】
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【０２０９】
幾つかの追加的なＳＹＰＲＯオレンジ色素インターカレーションアッセイを行って、タンパク質のコンホメーション安定性を増強する能力に関して関心が持たれたｅＣＤ４−Ｉｇ内の置換の組合せを比較した。置換Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７ＴおよびＫ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質を、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）または野生型アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含有するものと比較した（図１５Ａ）。このアッセイを今度はＩｇＧ２  ＦｃのコンテキストにおけるＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔで繰り返した（図１５Ｂ）。次に、置換Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ、Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ、およびＳ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質を、広域中和性抗体１０−１０７４、および野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）または野生型アカゲザルＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含有する対照ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質と比較した（図１５Ｃ）。図１５Ａ〜Ｃに示されているｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質は全て、ｍｉｍ６スルホペプチド、およびヒンジ領域内のＣ２２０Ｓ置換を含んでいた。
【０２１０】
コンホメーション安定性が最も高いＣＤ４ムテインのうちの２つを、アプライド・バイオシステムズ・タンパク質熱シフトアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）を用いて、熱安定性に関して比較した。この実験においては、該ＣＤ４ムテインは、スルホペプチドを欠くＣＤ４−Ｉｇタンパク質であった。比較された置換の組合せはＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ（平均融解温度６８．５℃）およびＳ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  Ｖ１６８Ｌ（平均融解温度６６．１℃）であった（図１５Ｄ）。これらのタンパク質は共に、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を有するＣＤ４−Ｉｇ（平均融解温度５３．３℃）よりも実質的に安定であった。Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌの安定化は、グリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸を、Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  Ｖ１６８Ｌより大きな度合でより大きな体積の疎水性アミノ酸によって置換することに基づいているが、タンパク質安定化のためのこれらのアプローチは相補的である。更に、図１５Ｄは、いずれの置換組合せも、スルホペプチドの存在または非存在には無関係に、ＣＤ４ムテインを実質的に安定化させることを示している。これらの各タンパク質のそれぞれはヒンジ領域内にＣ２２０Ｓ置換を含んでいた。
【０２１１】
このように、この実施例においては、異なる色素インターカレーションアッセイを用いて測定した場合にタンパク質安定性を増強するヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）内の多数の置換および置換組合せを特定した。
【０２１２】
実施例４  −  ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２の発現を改善するアミノ酸置換の特定
この実施例は、ＣＤ４ムテイン、例えばＣＤ４−ＩｇおよびｅＣＤ４−Ｉｇのの発現を増強するヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における置換およびその組合せの特定を記載する。高いタンパク質収量は少なくとも３つの点で望ましい特性である。第１に、プロデューサー細胞からの分泌の前に適切にフォールディングし凝集しない翻訳タンパク質の割合はタンパク質収量に反映される。したがって、タンパク質収量の測定は、適切なタンパク質フォールディングおよび安定性を測定するための代替的アプローチである。実際、タンパク質発現を増強する置換を特定するため、タンパク質安定性アッセイ（例えば、ＤＬＳ）が用いられる。第２に、組換えタンパク質治療用物質の収量が多ければ多いほど、同じ量のタンパク質を製造するために必要な資源が少なくなり、製造コストが低くなる。第３に、ＣＤ４ムテインがいずれかの遺伝子治療ベクター媒介性送達系（例えば、ＡＡＶ）により送達される場合、より高いタンパク質収量は、血漿中に存在するＣＤ４ムテインの濃度を増加させる、または血漿中のＣＤ４ムテインの同じ濃度を得るのに必要なベクターの量を減少させると予想される。高いタンパク質収量は望ましい特性であるため、タンパク質収量に対する種々の置換および置換組合せの効果を評価した。
【０２１３】
個々の置換および置換組合せを含有する種々のＣＤ４ムテインをＥｘｐｉ２９３細胞において発現させ、累積タンパク質収量を、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）を有するｅＣＤ４−Ｉｇと比較した（図１６）。この分析は、どの置換がタンパク質収量を一般的に増加させるのかを示した。これらの収量実験で発現されたタンパク質の量を表７に示す。
【表７】
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【０２１４】
グリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸を、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸により置換することの、タンパク質発現に対する効果を検討するために、幾つかの対照実験を設計した。Ｓ２３位の部位における突然変異の、タンパク質の安定性および収量に対する相当な影響ゆえに、Ｓ２３位における突然変異も含有させた。置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸によるグリシンおよび埋もれた疎水性アミノ酸の置換としてＳ２３ＮおよびＧ６Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌの組合せを含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質およびＣＤ４−Ｉｇタンパク質に関する前記の改善に基づき、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌおよび野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）の両方をこれらのタンパク質発現実験の対照として含めた（図１７）。各パネル（図１７Ａ〜Ｇ）は、並行して発現された対照タンパク質を使用した別々のタンパク質発現実験を表す。以下の観察が認められた：最大から最小への順に（すなわち、ここでは、＞は「より大きい」を意味する）、ｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質の発現はＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ＞Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖ＞Ａ５５Ｖ＞野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２であった（図１７Ａ）。Ｌ１１６ＷおよびＬ１１６Ｆは共に、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを含有するｅＣＤ４−Ｉｇの発現を改善した（図１７Ｂ）。Ｓ２３Ｎ以外のＳ２３位における置換、例えばＳ２３Ｔもタンパク質発現を増強した（図１７ＢおよびＤ）。Ｃ１３０Ｖ／Ｃ１５９ＡによるＣ１３０−Ｃ１５９ジスルフィドの置換はタンパク質発現を改善した（図１７Ｃ〜Ｄ）。Ｖ１４６をより大きな体積の疎水性アミノ酸で置換すること（例えば、Ｖ１４６Ｉ、Ｖ１４６Ｌ、Ｖ１４６ＦおよびＶ１４６Ｗ）はタンパク質発現を一般的に増強した（図１７Ｅ〜Ｇ）。同様に、Ｌ１１６をより大きな体積の疎水性アミノ酸で置換すること（例えば、Ｌ１１６ＦおよびＬ１１６Ｗ）はタンパク質発現を一般的に増強した（図１７Ｂ、ＤおよびＧ）。しかし、Ｌ１１６およびＶ１４６の両方における、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸による置換の組合せは、タンパク質発現をそれ以上は増強しない傾向にあった（図１７Ｇ）。したがって、タンパク質発現を最大化する［例えば、しばしば、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）配列に基づく発現タンパク質より３〜４倍多く発現させる］置換の組合せには、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６Ｉ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６Ｆ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１４６Ｗ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｌ１１６Ｆ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｌ１１６Ｗ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｃ１３０Ｖ／Ｃ１５９Ａ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｌ１１０Ｉ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、およびＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ／Ｖ１７６Ｉが含まれた。また、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌは、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）バックグラウンドのコンテキストにおいては十分には発現されなかったムテインの発現をレスキューするらしいことが認められた［例えば、Ｇ１４０ＡおよびＶ１７６Ｉ（図１６）と（図１７ＥおよびＦ）との比較］。図１７に示されているタンパク質発現収量は表８〜１５に示されている。また、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、およびＳ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを有するスルホペプチドを欠くＣＤ４−Ｉｇ変異体に関して、タンパク質発現を比較した（図１７Ｈ）。図１７Ｈからのタンパク質発現収量は表１５に示されている。この実験は、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌが、野生型またはＳ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｌ９６Ｖ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２のいずれかを含有する、他の点では同一であるＣＤ４−Ｉｇタンパク質より効率的に発現されること、およびＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌによる発現の増強が該スルホペプチドに無関係であることを示した。これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２の特にＧ６、Ａ５５、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｖ１４６、Ｖ１６８およびＶ１７６位において、グリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸を、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸により置換することが、タンパク質発現を増強しうることを示している。注目すべきことに、Ｇ６Ａ、Ａ５５、Ｌ１１６、Ｖ１２８、Ｖ１４６、Ｖ１６８およびＶ１７６の側鎖は表面に露出していない。したがって、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌは、表面露出側鎖（Ｓ２３）を有する位置にはただ１つの置換を有する。
【表８】
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【０２１５】
実施例５  −  ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体の薬物動態
この実施例は、実施例２〜４において確認された改善された安定性を有するＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体を含むタンパク質の、ヒトＦｃＲｎトランスジェニック免疫不全マウスにおける薬物動態を記載する。野生型ヒトＣＤ４−ＩｇまたはヒトＣＤ４−ＩｇもしくはｅＣＤ４−Ｉｇの変異体のインビボ薬物動態（ｐｋ）をヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける静脈内投与の後で測定した。
【０２１６】
ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける第１の実験においては、野生型ヒトＣＤ４−Ｉｇの半減期は２．４日であり、一方、Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７またはＫ７２／Ｋ７５／Ｑ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６位に置換を有するＣＤ４−Ｉｇの変異体はそれぞれ４．２日または８．６日の半減期を有していた（図１８Ａ）。したがって、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２タンパク質の凝集温度を増加させる置換はインビボでの半減期を有意に増加させた。また、Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７  ｅＣＤ４−Ｉｇの半減期は５．５日と測定された（図１８Ｂ）。更に、Ｋ７２／Ｋ７５／Ｑ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７およびＱ９４／Ｑ１１０／Ｒ１３４／Ｎ１６４／Ｋ１６７位に置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇの半減期はそれぞれ９．０日および３．７日であった（図１８Ｃ）。これらの結果は、ＤＬＳおよび色素インターカレーション熱スキャンアッセイにおけるｅＣＤ４−Ｉｇのコンホメーション安定性を改善する置換が該タンパク質の薬物動態を改善することを示唆している。
【０２１７】
ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける第２の実験においては、突然変異の追加的な組合せを含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の薬物動態を比較した（図１９）。この実験においては、長い半減期を有することが知られている対照広域中和性抗体１０−１０７４を対照として使用した。１０−１０７４（ＩｇＧ１  Ｆｃを含有する）は１１．６日の半減期を有していた。野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃと以下のアミノ酸置換とを含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の半減期は、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）では３．５日、Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔでは４．６日、Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔでは６．１日、Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔでは６．３日、およびＳ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔでは６．９日であった（図１９、表１６）。したがって、ｅＣＤ４−Ｉｇの半減期は最大で２倍増加した。また、Ｆｃドメイン置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）、またはＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）を含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質の半減期を、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２におけるＳ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ置換のコンテキストにおいて野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有する、他の点では同一である変異体の半減期と比較した。Ｆｃドメイン内にＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ置換を含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体はｅＣＤ４−Ｉｇの半減期を実質的に変化させないようであった（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ置換を有さない場合は６．３日であったのに対して、置換を有する場合は６．０日であった）（表１６）。しかし、ＦｃドメインにおけるＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ置換はこのｅＣＤ４−Ｉｇ変異体の半減期をＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ置換の非存在下の６．３日から該置換の存在下の１０．２日へと大幅に延長させた（６２％の増加）（図１９）。野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）および野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含有するｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質と比較して、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２におけるＳ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ置換およびＦｃドメインにおけるＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ置換はその半減期を３．５日から１０．２日へとほぼ３倍増加させた。
【表９】
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【０２１８】
実施例６  −  野生型マウスにおけるＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体の薬物動態
この実施例は、野生型ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２に置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇのタンパク質の薬物動態を記載する。
【０２１９】
この実験の第１の目的は、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸によってグリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸を置換することによって安定化されるｅＣＤ４−Ｉｇ変異体が、酸性度を増加させる置換の組合せによって大幅に安定化されたｅＣＤ４−Ｉｇ変異体に類似した半減期を示すｅＣＤ４−Ｉｇを与えたかどうかを決定することであった。この実施例で試験した対照タンパク質は、以下の置換を有するＣＤ４  Ｄ１Ｄ２配列を有していた：Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ。表面の変化により大幅に安定化されたこの変異体の薬物動態を、置換Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを有する変異体の薬物動態と比較した（図２０Ａ）。Ｓ２３Ｎ以外に、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌは該タンパク質の疎水性コアに内部置換のみを含む。
【０２２０】
この実験の第２の目的は、（ｉ）ＣＤ４ムテインをより酸性にする置換と、（ｉｉ）置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸によるグリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸の内部置換とを組合せることがＣＤ４ムテインの薬物動態に影響を及ぼすかどうかを決定することであった。この大きく内部安定化された変異体に表面荷電置換を加えることが薬物動態に及ぼす影響を評価するために、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２内に以下の置換組合せを含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体をこの実験に含めた：Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｒ１３４Ｇ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｋ１６７Ｔ／Ｖ１６８Ｌ、およびＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ／Ｖ１６８Ｌ（図２０Ａ）。第１日〜第５日の期間の半減期を計算した。なぜなら、これらのｅＣＤ４−Ｉｇタンパク質に対するマウス抗体応答はこれらの野生型（すなわち、非免疫不全）ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの全てではなく一部で第８日に観察されたからである。平均半減期を表１７に示す。この実験は、グリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸を、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸により置換することによって大幅に安定化された変異体の全てが、該タンパク質を大部分はより酸性にする置換Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有する変異体と少なくとも同じ長さの半減期を示すことを示した（図２０Ｂ）。これらの変異体の１つであるＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｒ１３４Ｇ／Ｖ１６８Ｌは、置換Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｋ７２Ｓ／Ｋ７５Ｅ／Ｑ９４Ｅ／Ｑ１１０Ｅ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを有する対照変異体よりも有意に長い半減期を示した（Ｐ＝０．０３、両側パラメトリックｔ検定）。更に、この例（例えば、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｒ１３４Ｇ／Ｖ１６８ＬとＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌとの比較）は、酸性アミノ酸による野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における塩基性アミノ酸の置換が、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸によるグリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸の置換と組合されて、ＣＤ４ムテイン、例えばｅＣＤ４−Ｉｇのインビボ半減期を増加させうることを示している。要約すると、この例は、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸によるグリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸の置換を含有するＣＤ４ムテイン、例えばｅＣＤ４−Ｉｇが、該タンパク質のインビボ半減期を、本明細書中に特徴づけられている他の置換組合せと少なくとも同じ程度に増加させうることを示している。
【表１０】
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【０２２１】
実施例７  −  ラットにおけるＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体の薬物動態
この実施例は、実施例２において確認された改善された安定性を有するＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体を含むタンパク質の、ラットにおける薬物動態を記載する。置換Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを有するヒトｅＣＤ４−Ｉｇ変異体および野生型ヒトＣＤ４−Ｉｇのインビボ薬物動態（ｐｋ）をラットにおける１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質の皮下投与の後で測定した。
【０２２２】
野生型ヒトＣＤ４−Ｉｇの半減期はラットにおいては１１時間であり（図２１）、これは公開文献（例えば、Ｃｈａｍｏｗ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）ＢＩＯＣＯＮＪＵＧ．ＣＨＥＭ．，５（２）：１３３−４０）と一致している。しかし、突然変異Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有するｅＣＤ４−Ｉｇの変異体は、実質的に、より長い半減期、例えば、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１では４８時間およびＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２では４２時間の半減期を有していた。これらの結果は、ＤＬＳ熱スキャンアッセイにおいてｅＣＤ４−Ｉｇのコンホメーション安定性を改善する置換、例えばＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ置換が、該タンパク質の薬物動態をも改善することを示唆している。
【０２２３】
実施例８  −  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体によるウイルス中和
この実施例は、実施例２〜７において確認された改善された安定性および薬物動態を有するＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体を含むタンパク質によるウイルスの中和を記載する。
【０２２４】
Ａ５５Ｖ置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体をウイルス中和に関して試験した。Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ突然変異バックグラウンドにおいて、Ａ５５Ｖ置換の効果を試験した。Ａ５５Ｖ突然変異は、ＨＩＶの３つの異なる一次分離株であるＢＧ５０５（図２２Ａ）、ＰＶＯ．４（図２２Ｂ）および９０１４（図２２Ｃ）の感染をｅＣＤ４−Ｉｇが中和する効力を改善した。Ｓ２３Ｎ置換の存在下および非存在下のｅＣＤ４−Ｉｇ変異体もウイルス中和に関して試験した。Ｌ５Ｙ／Ａ５５Ｖ／Ｉ７６Ｐ／Ｌ９６Ｖ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ突然変異バックグラウンドにおいて、Ｓ２３Ｎ置換の効果を試験した。Ｓ２３Ｎ置換の存在は、２つの異なるＨＩＶ株であるクレードＡウイルスＢＧ５０５（図２３Ａ）およびクレードＢウイルスＰＶＯ．４（図２３Ｂ）をｅＣＤ４−Ｉｇが中和する能力が改善した。総合すると、これらの結果は、ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）のＳ２３およびＡ５５位における置換、例えばＳ２３ＮおよびＡ５５Ｖ置換が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇによるウイルス中和を増強することを示唆している。
【０２２５】
置換Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｌ９６Ｖ／Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体（６８．５℃の凝集温度）が試験ウイルスのパネルを中和する能力を、置換Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔを含有する変異体（６０℃の凝集温度）の場合と比較した。試験ウイルスは３９８Ｆ１、ＢＧ５０５、２４６Ｆ３、Ｔｒｏ．１１、Ｘ２２７８、９０１４、ＰＶＯ．４、Ｔ２５７−１０、ＣＥ０２１７、ＺＭ６５１、ＣＮＥ８、ＣＮＥ５５、ＢＪＯＸ２０００、ＣＨ１１９、Ｘ１６３４および８９．６であった。６８．５℃の凝集温度を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体は、６０℃の凝集温度を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体よりも有意に良好にウイルス感染を中和した（Ｐ＜０．０００１、ウィルコクソン・マッチドペア検定）（図２４）。ウイルス感染の５０％を中和するのに必要なｅＣＤ４−Ｉｇの幾何平均濃度は、前記の８．５℃高い凝集温度を有する変異体では約１桁低かった。
【０２２６】
また、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸によるグリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸の置換を含有するｅＣＤ４−Ｉｇに関しても、ウイルス中和を試験した（図２５）。このアッセイで使用した試験ウイルスは感染−創始（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ−ｆｏｕｎｄｅｒ）（ｔ／ｆ）ウイルスＰＲＢ９３１−０６であった。試験したｅＣＤ４−Ｉｇ変異体には、野生型ヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）対照（灰色）、Ａ５５Ｖ、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、Ｇ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌ、およびＧ６Ａ／Ｓ２３Ｎ／Ｑ４０Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌが含まれた。この実験は、ウイルス中和が、Ａ５５Ｖ、Ｇ６Ａ／Ａ５５Ｖ、およびＧ６Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｓ２３Ｔ／Ｖ１２８Ｌ／Ｖ１６８Ｌを含有する変異体に関して、非常に類似していることを示した。しかし、Ｓ２３Ｔの代わりにＳ２３Ｎを含有させると、ウイルス中和が改善された。更に、Ｑ４０Ａによりもたらされる中和の増強は、Ｓ２３ＮおよびＡ５５Ｖによりもたらされる中和の増強と重複しておらず、これらの３つの置換が組合された場合に最大の中和効力が観察された。したがって、置換されるアミノ酸より大きな体積の疎水性アミノ酸によるグリシンまたは埋もれた疎水性アミノ酸の置換はウイルス中和に悪影響を及ぼさない。
【０２２７】
これらの結果は、凝集温度を増加させるヒトＣＤ４  Ｄ１Ｄ２（配列番号１）における置換が、ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇによるウイルス中和をも増強することを示唆している。
【０２２８】
実施例９  −  アカゲザルにおけるＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体の薬物動態
この実施例は、実施例２において確認された改善された安定性を有するＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体を含むタンパク質の、アカゲザルにおける薬物動態を記載する。
【０２２９】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２免疫グロブリンＦｃ領域を使用して、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ置換を有するｅＣＤ４−Ｉｇ変異体を構築した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２  Ｆｃ領域内で、モノクローナル抗体の半減期を延長させることが示されている置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（略称：「ＬＳ」）を含有する変異体を作製した。これらの変異体の薬物動態をアカゲザルにおいてインビボで評価した。ここで試験した変異体は以下の凝集温度を有していた。Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１、６０℃；Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２、６６℃；Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ＬＳ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１、６８℃；およびＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２、６６℃。
【０２３０】
３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１（図２６Ａ）、３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２（図２６Ｂ）、３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ＬＳ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ１（図２６Ｃ）、および３０ｍｇ／ｋｇのＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ＬＳ  ｅＣＤ４−ＩｇＧ２（図２６Ｄ）の静脈内注入を３頭のアカゲザルの群に行った。各ＣＤ４由来ポリペプチドは二相性薬物動態プロファイルを示す傾向にあり、その場合、２．７〜６．２日の半減期を示す第１相、およびポリペプチドの血漿中濃度が急速に低下する第２相が存在した。注目すべきことに、特に、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−Ｉｇに関して観察された半減期は、ＣＤ４−Ｉｇに関して報告されたものよりも有意に長かった。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２  ＦｃにおけるＬＳ置換の存在は半減期を中程度に延長させるようであった。
【０２３１】
同じｅＣＤ４−ＩｇＧ１タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇ（図２６Ｅ）または１ｍｇ／ｋｇ（図２６Ｇ）でアカゲザル（マカク）に投与したところ、それらを３０ｍｇ／ｋｇで投与した場合（図２６Ｃ）に観察されたのと同じ薬物動態プロファイルが観察された。同様に、同じｅＣＤ４−ＩｇＧ２タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇ（図２６Ｆ）でアカゲザル（マカク）に投与したところ、それらを３０ｍｇ／ｋｇで投与した場合（図２６Ｄ）に観察されたのと同じ薬物動態プロファイルが観察された。
【０２３２】
実施例１０  −  ＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体での感染アカゲザルの治療
この実施例は、実施例２において確認された改善された安定性を有するＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体を含むタンパク質でのＳＨＩＶ感染アカゲザルの治療を記載する。
【０２３３】
ＳＨＩＶ−ＡＤ８に感染したアカゲザルを、Ｒ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ  ｅＣＤ４−ＩｇのＩｇＧ１またはＩｇＧ２形態の３０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与により治療した（図２７）。各タンパク質は血漿中ウイルス量を１桁以上抑制した。該動物の全てにおいて、ウイルス量は少なくとも１つの時点で検出限界まで抑制された。ｅＣＤ４−ＩｇのＩｇＧ１形態を投与した動物においては、より高いウイルス量からこれらの動物に開始した場合でも、ウイルス量はより遅く再増加した。これらの結果は、例えばＲ１３４Ｇ／Ｎ１６４Ｄ／Ｋ１６７Ｔ置換を含む、本明細書に記載されているＣＤ４  Ｄ１Ｄ２変異体を含むタンパク質、例えばｅＣＤ４−Ｉｇがウイルス複製を抑制し、それにより霊長類におけるウイルス感染を治療しうることを示唆している。
【０２３４】
文献による援用
本明細書で言及されている特許および科学文書のそれぞれの全開示をあらゆる目的で本明細書に組み入れることとする。
【０２３５】
均等物
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化されうる。したがって、前記の実施形態は、本明細書に記載されている本発明を限定するものではなく、あらゆる点において例示的であるとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前記説明ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等の意味および範囲内に含まれる全ての変更が本発明に含まれると意図される。
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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