(57)【要約】【課題】チロソール及びヒドロキシチロソールを生産する酵母及びその作製方法を提供する。【解決手段】ＰｃＡＡＳとＡＤＨの配列を酵母ＢＹ４７４１に導入してチロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え酵母を得、前記ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え酵母にｐｄｃ１遺伝子ノックアウトカセット、ｔｙｒＡ発現カセットを導入してチロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母を得、ＨｐａＢＣのＤＮＡ配列をＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母に導入してヒドロキシチロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−ＨｐａＢＣ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母を得た。酵母ＢＹ４７４１において、チロソール又はヒドロキシチロソールの生合成経路を構築することにより、チロソール又はヒドロキシチロソールの生産量を上向させた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パセリ由来のチロシンデカルボキシラーゼとエンテロバクター属由来のアルコールデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列を酵母ＢＹ４７４１に導入してＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え酵母を得る操作を備える、ことを特徴とするチロソールを生産する酵母。
【請求項２】
チロシンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示すチロシンデカルボキシラーゼのＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示すアミノ酸配列をコードし、アルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示すアルコールデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示すアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とする請求項１に記載のチロソールを生産する酵母。
【請求項３】
請求項１における前記ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え酵母にｐｄｃ１遺伝子ノックアウトカセットを導入してＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−ｐｄｃ１組換え酵母を得、その中、前記ｐｄｃ１遺伝子ノックアウトカセットの作製方法が、酵母ＢＹ４７４１のゲノムをテンプレートとし、プライマーを用いてｐｄｃ１断片の上流及び下流５００ｂｐのホモロジーアームをそれぞれ増幅し、プライマーを用いてＧ４１８耐性遺伝子断片を増幅し、前記上流及び下流５００ｂｐのホモロジーアームと前記Ｇ４１８耐性遺伝子断片とを融合させてｐｄｃ１ノックアウトカセットを得る操作を備える、ことを特徴とする請求項１に記載のチロソールを生産する酵母。
【請求項４】
請求項３における前記ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１組換え酵母にｔｙｒＡ発現カセットを導入してＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母を得、その中、前記ｔｙｒＡ発現カセットの作製方法が、酵母ＢＹ４７４１のゲノムをテンプレートとし、プライマー用いて上流５００ｂｐのホモロジーアームを増幅し、請求項4における前記ｐｄｃ１ノックアウトカセットをテンプレートとし、プライマーを用いてｔｙｒＡ断片を増幅し、上流５００ｂｐのホモロジーアームとｔｙｒＡ断片を融合させてｔｙｒＡ発現カセットを作製する操作を備える、ことを特徴とする請求項３に記載のチロソールを生産する酵母。
【請求項５】
大腸菌由来の４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼＤＮＡ配列遺伝子クラスターを請求項４における前記ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母に導入してヒドロキシチロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−ＨｐａＢＣ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母を得る、ことを特徴とするヒドロキシチロソールを生産する酵母。
【請求項６】
前記４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼのアミノ酸配列遺伝子クラスターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示す４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼのＤＮＡ配列遺伝子クラスターは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示すアミノ酸配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示すアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とする請求項５に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母。
【請求項７】
（１）ＰｃＡＡＳとＡＤＨのＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入して、ベクター−ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え発現プラスミドを作製する操作と、
（２）請求項３における前記ｐｄｃ１ノックアウトカセットを作製する操作と、
（３）請求項４における前記ｔｙｒＡ発現カセットを作製する操作と、
（４）前記工程（２）で得られたｐｄｃ１ノックアウトカセット及び前記工程（３）で得られたｔｙｒＡ発現カセットを工程（１）で得られたベクター−ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨプラスミドに挿入してＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡプラスミドを得、それを酵母ＢＹ４７４１に導入して組換えＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ酵母株を得る操作と、を備え、
前記工程（１）における発現ベクターが、ｐＪＦＥ３、ｐＵＣ１９、ｐΔＢＬＥ２．０、ｐＧＫ系ベクター、ｐＸＰ３１８であり、
前記工程（１）の発現ベクターが、ｐＪＦＥ３である、ことを特徴とするチロソールを生産する酵母の的作製方法。
【請求項８】
（１）ＨｐａＢとＨｐａＣの遺伝子を合成してＨｐａＢＣ発現カセットを作製する操作と、
（２）ＨｐａＢＣ発現カセットを組換えＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ酵母に導入して組換えＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ−ＨｐａＢＣ酵母を得る工程と、を備える、ことを特徴とするヒドロキシチロソールを生産する酵母の的作製方法。
【請求項９】
請求項１〜４の何れか１項に記載のチロソールを生産する酵母及び請求項７に記載のチロソールを生産する酵母の作製方法の、チロソールの生産における使用であって、
前記使用の具体的形態が、前記チロソールを生産する酵母の発酵培養を行うことでチロソールを得、前記発酵培養の培養液がグルコース、フラクトース、スクロース又はグルコースとチロシンの混合物の中の一つ又はそれらの混合物である、請求項１〜４の何れか１項に記載のチロソールを生産する酵母及び請求抗７に記載のチロソールを生産する酵母の作製方法の、チロソールの生産における使用。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母及び請求項８に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法の、ヒドロキシチロソールの生産における使用であって、
前記使用の具体的形態が、前記ヒドロキシチロソールを生産する酵母の発酵培養を行うことでヒドロキシチロソールを得、前記発酵培養の培養液がグルコース、フラクトース、スクロース又はグルコースとチロシンの混合物の中の一つ又はそれらの混合物である、請求項５又は６に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母及び請求項８に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法の、ヒドロキシチロソールの生産における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物工学技術分野に属し、チロソールを高収率で生産する遺伝子組換え酵母、ヒドロキシチロソールを異種合成する出芽酵母及びそれら酵母の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロソールは天然抗酸化剤であり、オリーブ油由来のフェニルエタノールの誘導体の一つである。別名で紅景天アグリコンとも呼び、紅景天の主な薬学的活性成分であって、サリドロシド、ヒドロキシチロソールの前駆体物質である。細胞が酸化の損害を受けないように保護することができ、重要な工業価値を有するフェノール系化合物の一つである。チロソール及びその誘導体は、複数種類の有機化合物の合成前駆体であり、チロソールは医薬薬剤に用いられる。チロソールの誘導体であるヒドロキシチロソールは、非常に強い抗酸化作用及びいろいろの生理学的医薬機能を有し、ヒドロキシチロソールの抗酸化性はチロソールより強く、且つ数多くの重合体が合成でき、知られている毒性もないので、バイオ医薬品、機能性食品等の業界において応用が広く、心血管、骨減少などの疾患の発生が予防できる。現在、主にオリーブ葉からの抽出によりヒドロキシチロソールを獲得しているが、植物から抽出するということは、コストが高く、大量の耕地を必要とする。
【０００３】
化学方法としてフェニルエタノール合成法が用いられるが、多くの場合、ヒドロキシ基を先に保護し、その後、硝化、還元、ジアゾ化及び加水分解を経てパラヒドロキシフェニルエタノールを取得しており、その収率は７０％である。フェニルエタノールは価格が高く、供給が制限された。ニトロトルエンを用いて合成する場合に、原料のコストが低いのにプロセスが複雑であり、収率が低い。パラヒドロキシスチレンを利用する合成は、収率が９６％、純度が９９％に達し、収率と純度の何れも非常に高いので一定の価値があるが、原料のコストが高い欠点がある。化学法によるチロソールの製造は、原料のコストが高く且つ環境にやさしくない等の欠点があり、それらは何れもチロソールの工業化生産を直接に制限している。従って、生物法によるチロソール及びヒドロキシチロソールの合成は既に研究のホットスポットとなっている。
【０００４】
チロソール（Ｔｙｒｏｓｏｌ）の化学名は４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｏｌであり、分子式はＣ８Ｈ１０Ｏ２であり、分子量は１３８．１６４であり、ＣＡＳ番号は５０１−９４−０であり、構造式は式（１）で表される。
【０００５】
式（１）
2021517828.tif 000003
【０００６】
複数の特許文献において、チロソールを生産する遺伝子組換え大腸菌が開示されている。具体的に、発明の名称が「大腸菌を用いるチロソールの生合成方法及びその使用」である中国特許文献（出願番号：２０１３１０１３３２３８．７）、発明の名称が「チロソール及び／又はサリドロシド及びイカリサイドＤ２（Ｉｃａｒｉｓｉｄｅ  Ｄ（２）を高収率で生産する大腸菌発現株及びその使用」である中国特許文献（出願番号：２０１４１０１１５０１１．（４）、発明の名称が「グルコースを利用してヒドロキシチロソールを生産する組換え大腸菌及びその組換え法と使用」である中国特許文献（出願番号：２０１５１０２４２６２６．８）、発明の名称が「チロソールを生産する組換え株及びその作製方法」である中国特許文献（出願番号：２０１７１００９１９９９．９）、発明の名称が「異種代謝経路によりチロソール及びヒドロキシチロソールを生産する方法」である中国特許文献（出願番号：２０１７１１０５４６８０．（５）等が挙げられる。
【０００７】
しかしながら、大腸菌を用いて製造プロセスには、内毒素の除去には、工業化応用における大腸菌内毒素を完全的に除きは不可能である。内毒素はグラム陰性細菌の細胞壁中の成分の一つであり、リポポリサッカライドとも呼ぶ。リポポリサッカライドは人体に毒性を与えられることができる。
【０００８】
タイトルが「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｔｈｔｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ」である文献において、組換え酵母、及び酵素転化を利用して代謝経路を調節することによりグリセリンを生産する方法が開示されている。
【０００９】
タイトルが「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ｔｙｒｏｓｏｌ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓａｋｅ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｒｐ３  ｍｕｔａｎｔ」である文献において、出芽酵母のトリプトファン栄養変異体からアルコール耐性変異体を分離し、さらに新型高カゼイン酵母株育種の開発における策略が開示されている。
【００１０】
また、酵母を利用して、具体的には出芽酵母を利用してチロソール及びヒドロキシチロソールを生合成する技術は未だに報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記従来技術における問題に鑑みてなされたものであり、その第１の課題はチロソールを生産する酵母を提供することにある。組換え酵母を開発し、即ち酵母ＢＹ４７４１においてのチロソールの生合成経路を構築し、酵母ＢＹ４７４１の遺伝子テンプレート中のｐｄｃ１の遺伝子断片をノックアウトすることで、酵母株におけるアルコールの合成経路を減弱させ、チロソールの生産量を増加させ、且つチロソールを生産できる遺伝子を導入し、更にヒドロキシチロソールのヒドロキシラーゼ遺伝子に転化させることにより、ヒドロキシチロソールを異種合成する酵母株を作製した。
【００１２】
本発明の第２の課題は、ヒドロキシチロソールを生産する酵母を提供することにある。
本発明の第３の課題は、チロソールを生産する酵母の作製方法を提供することにある。
本発明の第４の課題は、ヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の第５の課題は、前記チロソールを生産する酵母又はその作製方法の、チロソールの生産における使用を提供することにある。
本発明の第６の課題は、前記ヒドロキシチロソールを生産する酵母又はその作製方法の、ヒドロキシチロソールの生産における使用を提供することにある。
【発明を解決するための手段】
【００１４】
以上の技術的課題を解決するために、本発明は以下のような技術的手段を提供する。
【００１５】
チロソールを生産する酵母であって、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）由来のチロシンデカルボキシラーゼＰｃＡＡＳ（ＴｒｙＤＣ，  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）とエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ，Ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のＤＮＡ配列を酵母ＢＹ４７４１に導入してＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え酵母を得る。
【００１６】
好ましくは、チロシンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示すチロシンデカルボキシラーゼのＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示すアミノ酸配列をコードすることができる。
【００１７】
好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示すアルコールデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示すアミノ酸配列をコードすることができる。
好ましくは、前記ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え酵母にｐｄｃ１遺伝子ノックアウトカセットを導入してＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１組換え酵母を得る。
【００１８】
さらに、好ましくは、前記ｐｄｃ１遺伝子ノックアウトカセットの作製方法が、酵母ＢＹ４７４１のゲノムをテンプレートとし、プライマーを用いてｐｄｃ１断片の上流及び下流の５００ｂｐホモロジーアームをそれぞれ増幅し、プライマーを用いてＧ４１８耐性遺伝子断片を増幅し、前記上流及び下流５００ｂｐのホモロジーアームと前記Ｇ４１８耐性遺伝子断片を融合させてｐｄｃ１ノックアウトカセットを得る工程を備える。
【００１９】
好ましくは、前記ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１組換え酵母にｔｙｒＡ発現カセットを導入してＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母を得る。
【００２０】
さらに、好ましくは、前記ｔｙｒＡ発現カセットの作製方法が、酵母ＢＹ４７４１のゲノムをテンプレートとし、プライマー用いて上流５００ｂｐのホモロジーアームを増幅し、前記ｐｄｃ１ノックアウトカセットをテンプレートとし、プライマーを用いてｔｙｒＡ断片を増幅し、上流５００ｂｐのホモロジーアームとｔｙｒＡ断片とを融合させてｔｙｒＡ発現カセットを作製する工程を備える。
【００２１】
ヒドロキシチロソールを生産する酵母であって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼ（ＨｐａＢＣ，４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）のＤＮＡ配列遺伝子クラスターを前記チロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母に導入してヒドロキシチロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−ＨｐａＢＣ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組換え酵母を得る。
【００２２】
好ましくは、前記４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼのアミノ酸配列遺伝子クラスターが、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５である４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼ（ＨｐａＢ）と、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７である４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼ（ＨｐａＣ）を含む。
【００２３】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示す４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼ（ＨｐａＢ）のＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示すアミノ酸配列をコードすることができ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示す４−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼ（ＨｐａＣ）のＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示すアミノ酸配列をコードすることができる。
チロソールを生産する酵母の作製方法であって、具体的に、
（１）ＰｃＡＡＳとＡＤＨのＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入して、ベクター−ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え発現プラスミドを作製する工程と、
【００２４】
（２）酵母ＢＹ４７４１のゲノムをテンプレートとし、プライマーを用いてｐｄｃ１断片の上流及び下流５００ｂｐのホモロジーアームを増幅し、プライマーを用いてＧ４１８耐性遺伝子断片を増幅し、得られた断片を融合させてｐｄｃ１ノックアウトカセットを作製する工程と、
【００２５】
（３）酵母ＢＹ４７４１のゲノムをテンプレートとし、プライマーを用いて上流５００ｂｐのホモロジーアームを増幅し、ｐｄｃ１ノックアウトカセットをテンプレートとし、プライマーを用いてｔｙｒＡ断片を増幅し、得られた断片を融合させてｔｙｒＡ発現カセットを作製する工程と、
【００２６】
（４）工程（２）で得られたｐｄｃ１ノックアウトカセットと工程（３）で得られたｔｙｒＡ発現カセットを工程（１）で得られたベクター−ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨプラスミドに挿入してＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡプラスミドを得、それを酵母ＢＹ４７４１に導入して組換えＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ酵母株を得る工程と、を備える。
【００２７】
好ましくは、工程（１）における発現ベクターが、ｐＪＦＥ３、ｐＵＣ１９、ｐΔＢＬＥ２．０、ｐＧＫ系ベクター、ｐＸＰ３１８である。
さらに、好ましくは、ベクターがｐＪＦＥ３である。
ヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法であって、具体的に、
（１）ＨｐａＢとＨｐａＣの遺伝子を合成してＨｐａＢＣ発現カセットを作製する工程と、
【００２８】
（２）ＨｐａＢＣ発現カセットを組換えＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ酵母に導入して組換えＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ−ＨｐａＢＣ酵母を得る工程と、を備える。
また、前記チロソールを生産する酵母とチロソールを生産する酵母の作製方法の、チロソールの生産における使用を提供する。
【００２９】
好ましくは、前記使用の具体的形態が、前記チロソールを生産する酵母の発酵培養を行うことでチロソールを得、前記発酵培養の培養液がグルコース、フラクトース、スクロース又はグルコースとチロシンの混合物の中の一つ又はそれらの混合物である。
【００３０】
また、前記ヒドロキシチロソールを生産する酵母及びヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法の、ヒドロキシチロソールの生産における使用を提供する。
【００３１】
好ましくは、前記使用の具体的形態が、前記ヒドロキシチロソールを生産する酵母の発酵培養を行うことでヒドロキシチロソールを得、前記発酵培養の培養液がグルコース、フラクトース、スクロース又はグルコースとチロシンの混合物の中の一つ又はそれらの混合物である。
【発明の効果】
【００３２】
（１）本発明において、ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え酵母にｐｄｃ１ノックアウトカセットを導入することで、酵母におけるアルコール合成経路を遮断させ、ＰＥＰを介してチロソールを合成する代謝経路を通じて、チロソールの生産量を上向させた。
【００３３】
（２）本発明において、ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１組換え酵母にｔｙｒＡ発現カセットを導入することで、ＰＲＥＰが４ＨＰＰに転化する代謝工程が両方向から一方向へなるようにさせ、チロソールの生産量を上向させた。
【００３４】
（３）本発明は、１種類の酵母を開発して、チロソールの生合成経路を作製し、チロソールの生産量を上向させ、且つチロソールをさらにヒドロキシチロソールに転化させることができるヒドロキシラーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロキシチロソールを異種合成する酵母株を作製した。出芽酵母は大腸菌と比べて、安全性が良く、生産量が安定で、抗感染性能が強い等の利点を有するので、工業化生産に適合する。
【００３５】
（４）本発明は、新型の環境にやさしいチロソール及びヒドロキシチロソールの生物学的製造技術を提供することで、チロソール及びヒドロキシチロソールの工業化生産のために基礎付けの役割を果たしており、重要な経済的価値及び社会的価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本発明の一部を構成する図面は、本発明を更に理解させるために提供するものであり、本発明の例示的実施例及びその説明は、本発明を解釈するために用いるものであって、本発明に対する不当な限定となるものではない。
【図１】グルコース又はチロシンを基質としてチロソール及びヒドロキシチロソールを合成する経路を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
指摘すべきは、以下の詳細説明は例示的であり、その要旨は本発明に対しての更なに説明を提供するためである。特別の指定がない限り、本文で用いる技術用語及び化学用語は、当業者が通常に理解しうるものと同じ意味を有する。
【００３８】
注意すべきは、本文で用いる用語はただ具体的な実施形態を説明するためであり、本発明の例示的実施形態を制限するとのことが意図されるのではない。明確な指定がない限り、本文で用いる単数形式も複数形式を含むことを意図するものである。また、理解すべきは、本文において用語「含む」及び／又は「備える」用いる時は、特徴、工程、操作、機器、セット及び／又はそれらの組合わせが存在することを明示する。
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。
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【００４０】
実施例１
ｐＪＦＥ３−ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え発現プラスミドの作製
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示すアミノ酸配列をホストの出芽酵母コドン選択性によってコドン最適化を行い、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に対応する最適化後のヌクレオチド配列を取得した後、遺伝子合成を行った。プライマーを選択し、ＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ  ＦＸＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、目的遺伝子を得た。アガロースゲル電気泳動にてバンドの大きさが正確であるのを検証した後、バンドを切取り、ＯＭＥＧＡゲル抽出キットで遺伝子断片を回収した。ＰＣＲ増幅用プライマーは以下の通りである。
【００４１】
ＰｃＡＡＳ−Ｆの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９であり、ＰｃＡＡＳ−Ｒの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０であり、ａｄｈ−Ｆの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１であり、ａｄｈ−Ｒの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２である。
【００４２】
ＧＢｄｉｒ＋ｐＳＣ１０１−ＢＡＤ−ＥＴｇＡ−ｔｅｔプラスミドを備えるＥ．ｃｏｌｉ株を、テトラサイクリン耐性を備えるプレート上でそのシングルコロニーを取って１ｍＬのＬＢ液体培地（滅菌、４ｕｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）が入れているＥＰチューブに入れ、３０ｏＣ、２００ｒｐｍ下で一晩培養した。東洋紡株式会社のＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて目的遺伝子断片を増幅するとともに、毎断片がいずれも隣接する断片と５０ｂｐの相同配列があるように保証した。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動にて分離した後、ＤＮＡ断片ゲル回収キットを用いて回収し、ＤＮＡ濃度を測定した。その後、融合断片を用いてＲＥＤ／ＥＴプラスミド組換えを行った。具体的に、
【００４３】
（１）一晩培養した菌液から４０μＬを吸込み、４μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む１ｍＬの新しいＬＢ培地に添加し、３０ｏＣ、２００ｒｐｍ下で２ｈ振とうした。
（２）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて断片の接合を行った。反応系は表２に示した。
【００４４】
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上記試薬をＰＣＲチューブに入れ、反応条件は表３に示す。
【００４５】
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【００４６】
（３）工程（１）の前記菌液に４０μＬの  １０  ％  Ｌ−アラビノース溶液を添加し、３７ｏＣ、２００ｒｐｍ下で４０ｍｉｎ振とうした。
【００４７】
（４）ＶＳＷＰ０１３００  ＭＦ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ表面ろ過膜（白色、ＭＣＥ、親水、０．０２５μｍ、光沢面１３ｍｍ）で工程（２）から得られた反応系に対して塩除去を４０ｍｉｎ行った。
【００４８】
（５）工程３の菌液を９０００ｒｐｍ下で１ｍｉｎ間遠心分離を行って上清液を除去し、５００μＬの無菌のｄｄＨ２Ｏを添加して菌液を再懸濁し、９０００ｒｐｍ下で１ｍｉｎ遠心分離を行って上清液を除去した。２回繰返した後、上清液を除去し、５０μＬの無菌のｄｄＨ２Ｏを入れて菌液を再懸濁して氷上に置いた。
（６）塩を除去した後の工程（４）における溶液と工程（５）にて処理した菌液を均一に混合して氷上に１ｍｉｎ間放置した。
（７）全部の混合物を吸込みエレクトロポレーション（エレクトロポレーションパラメータ：１３５０Ｖ、２００Ω、２５ｍＡ、１μＦ）を行った。
【００４９】
（８）１ｍＬの新しいＬＢ液体培地（滅菌、耐性なし）をエレクトロポレーションキュベットに添加し、均一に吹き出した後、ＥＰチューブに吸込み、３７ｏＣ、２００ｒｐｍ下で１ｈ培養した。
【００５０】
（９）５０μＬの菌液を５０−１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを含むＬＢプレート上に塗布し、３７ｏＣで一晩培養した。
（１０）単クローンを選抜し、ＰＣＲ及びシーケンシングを行って検証した。
実施例２
ｐｄｃ１ノックアウトカセットの作製
【００５１】
出芽酵母のゲノムをテンプレートとし、プライマーのＰＤＣ１ＵＦ／ＰＤＣ１ＵＲ及びＰＤＣ１ＤＦ／ＰＤＣ１ＤＲを用いてｐｄｃ１断片遺伝子の上流及び下流５００ｂｐのホモロジーアームを増幅し、プライマーのＧ４１８Ｆ／Ｇ４１８Ｒを用いて、Ｇ４１８耐性遺伝子断片を増幅し、融合ＰＣＲ法を採用してｐｄｃ１ノックアウトカセットを作製し、シーケンシングを行って検証した。
プライマーの配列：
【００５２】
ＰＤＣ１ＵＦの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３であり、ＰＤＣ１ＵＲの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４であり、Ｇ４１８Ｆの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５であり、Ｇ４１８Ｒの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６であり、ＰＤＣ１ＤＦの配列はＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７であり、ＰＤＣ１ＤＲの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８である。
【００５３】
実施例３
ｔｙｒＡ発現カセットの作製
出芽酵母のゲノムをテンプレートとし、プライマーのＰＤＣ１Ｆ−ＹＺ／ＰＤＣ１ＵＦ１及び上流５００ｂｐのホモロジーアームを用い、実施例２で作製したｐｄｃ１ノックアウトカセットをテンプレートとし、プライマーＧ４１８Ｆ１／ＰＤＣＩＲ−ＹＺを用いてｔｙｒＡ及びｐｄｃ１下流５００ｂｐの断片を増幅し、大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ（３）ゲノムをテンプレートとし、プライマーｔｙｒＡＦ１／ｔｙｒＡＲ１を用いて遺伝子ｔｙｒＡ断片を増幅し、融合ＰＣＲ法を採用して、ｔｙｒＡ発現カセットを作製し、シーケンシングを行って検証した。
【００５４】
プライマーの配列：
ＰＤＣ１Ｆ−ＹＺの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９であり、ＰＤＣ１ＵＦ１の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０であり、ＴＹＲＡＦ１の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１であり、ＴＹＲＡＲ１の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２であり、Ｇ４１８Ｆ１の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３であり、ＰＤＣＩＲ−ＹＺの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４である。
実施例４
ＨｐａＢＣ発現カセットの作製
【００５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示すアミノ酸配列をホストの出芽酵母コドン選択性によってコドン最適化を行い、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に対応するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示す最適化後のヌクレオチド配列を得た後、遺伝子合成を行った。実施例１の方法に従ってＨｐａＢＣ発現カセットを作製した。
実施例５
出芽酵母を例としてのチロソールを微生物異種合成する菌株の作製方法：
【００５６】
実施例１から得られた菌株をＬＢ培地に播種し、３７ｏＣ、２００ｒｐｍの条件下で１４ｈ培養し、ＯＭＥＧＡプラスミド抽出キットＤ６９４３−０１を用いてｐＪＦＥ３−ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組換え発現プラスミドを取得した。ＰＥＧ／ＬｉＡｃ法を採用して出芽酵母ＢＹ４７４１に形質転換させ、ＵＲＡ選択培地を利用してスクリーニングを行って単クローンを取り、プラスミドを抽出してプライマーのＹＺ１Ｆ及びＹＺ１Ｒを用いてＰＣＲを行って検証し、ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ菌株を得た。さらに、実施例２のｐｄｃ１ノックアウトカセット及び実施例３のｔｙｒＡ発現カセットをＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ菌株に導入することにより、ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ菌株を得た。ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ菌株に基づき、ＰＥＧ／ＬｉＡｃ法を採用して実施例５で作製したＨｐａＢＣ発現カセットをｄｐｄｃ１−ｔｙｒＡ菌株に導入して、ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ−ＨｐａＢＣ菌株を得た。
ＹＺ１Ｆの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５であり、ＹＺ１Ｒの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６である。
実施例６
出芽酵母を例としてのチロソールを合成する微生物の発酵：
チロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ菌株及びＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ菌株のプレート上でその単クローンを取り、５ｍＬの酵母選択栄養欠陥型培地（ＳＤ培地、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐｏｕｔ  Ｍｅｄｉａ）に播種し、３０−３２  ｏＣ、２００ｒｐｍ条件下で２４ｈ培養した後、５０ｍＬのＳＤ培地に最初播種のＯＤ６００が０．２になるように再播種し、３０ｏＣ、２００ｒｐｍ条件下で１２ｈ培養した後、１００ｍＬのＳＤ培地に最初播種のＯＤ６００が０．２になるように再播種し、グルコース、フラクトース、スクロース又はグルコースとチロシン等をそれぞれ添加して７２時間発酵実験を行った。文献（Ｓａｔｏｈ，  Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０１（２）に報告されたＨＰＬＣ法により発酵液中のチロソールの濃度を測定した。異なる炭素源の培養条件下でのチロソール生産量は表４に示した。
【００５７】
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実施例７
出芽酵母を例としてのヒドロキシチロソールを合成する微生物の発酵：
ヒドロキシチロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ−ＨｐａＢＣ菌株のプレート上でその単クローンを取って５ｍＬの酵母選択栄養欠陥型培地（ＳＤ培地、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐｏｕｔ  Ｍｅｄｉａ）に播種し、３０−３２ｏＣ、２００ｒｐｍ条件下で２４ｈ培養した後、５０ｍＬのＳＤ培地に最初播種のＯＤ６００が０．２になるように再播種し、３０ｏＣ、２００ｒｐｍの条件下で１２ｈ培養した後、１００ｍＬのＳＤ培地に最初播種のＯＤ６００が０．２になるように再播種し、発酵実験を行った。文献（Ｓａｔｏｈ，  Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０１（２）に報告されたＨＰＬＣ法により発酵液中のヒドロキシチロソールの濃度を測定した。発酵７２ｈ後、得られたヒドロキシチロソールの生産量は９７８ｍｇ／Ｌであった。
【００５８】
上記は本発明の好適な実施例だけであり、本発明を制限することに用いるものではなく、当業者にとって、本発明はいろんな変更及び変化がなし得ることは理解するであろう。本発明の主旨及び原則の範囲内において行われた何らかの修正、均等置換、改良などはいずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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