(57)【要約】  神経損傷後の予備の神経細胞の代償性可塑性を促進する方法は、予備の神経細胞を、治療用ペプチドを含む有効量の治療薬と接触させることを含み、治療用ペプチドは、配列番号３２に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。【選択図】図１４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経損傷後の予備の神経細胞の代償性可塑性を促進する方法であって、
前記予備の神経細胞を、治療用ペプチドを含む有効量の治療薬と接触させることを含み、前記治療用ペプチドが、配列番号３２に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２】
前記予備の神経細胞が、神経幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予備の神経細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）および／またはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記予備の神経細胞が、ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、前記予備の神経細胞の代償性神経突起伸長を誘導する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記神経突起伸長が、前記予備の神経細胞の軸索発芽を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記神経突起伸長が、樹状突起の発芽または前記予備の神経細胞の分岐を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、前記神経損傷に向けて予備の神経細胞の代償性遊走を誘導する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記神経損傷が、中枢神経系にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経損傷が、脳にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、虚血、脳卒中、動脈瘤、脳出血、血栓、または塞栓症によって引き起こされる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＢＩが、脳震とうである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記虚血が、限局性虚血または全体的虚血である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が、配列番号３２に対して少なくとも７８％、少なくとも８５％、または少なくとも９２％の同一性を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療用ペプチドが、配列番号３２の残基４、５、６、７、９、１０、１２、または１３のうちの少なくとも１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換を含み、アミノ酸残基４ＥがＤもしくはＱで置換され、アミノ酸残基５ＲがＨ、ＬもしくはＫで置換され、アミノ酸残基６ＬがＩ、ＶもしくはＭで置換され、アミノ酸残基７ＫがＲもしくはＨで置換され、アミノ酸残基９ＮがＥもしくはＤで置換され、アミノ酸残基１０ＤがＥもしくはＮで置換され、アミノ酸残基１２ＬがＩ、ＶもしくはＭで置換され、および／またはアミノ酸残基１３ＫがＲもしくはＨで置換される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療用ペプチドが、配列番号１〜２５および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療薬が、前記治療用ペプチドに連結された輸送部分をさらに含み、細胞による前記治療用ペプチドの取り込みを促進する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記輸送部分が、ＨＩＶ  Ｔａｔ輸送部分である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記輸送部分が、ペプチドリンカーによって前記治療用ペプチドに連結されている、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療薬が、配列番号３５〜６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記予備の神経細胞が、損傷後７日以内に前記治療薬と接触する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
それを必要とする対象の神経損傷を治療する方法であって、
治療用ペプチドを含む有効量の治療薬を前記対象に投与することにより、前記神経損傷後の予備の神経細胞における代償性可塑性を促進することであって、前記治療用ペプチドが、配列番号３２に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、促進することを含む、方法。
【請求項２３】
前記予備の神経細胞が、神経幹細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記予備の神経幹細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）および／またはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記予備の神経細胞が、ニューロンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドが、前記予備の神経細胞において代償性神経突起伸長を誘導する、請求項２２〜２５の一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記神経突起伸長が、前記予備の神経細胞における軸索発芽を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記神経突起伸長が、樹状突起の発芽または前記予備の神経細胞における分岐を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、前記神経損傷に向けて予備の神経細胞の代償性遊走を誘導する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記神経損傷が、中枢神経系にある、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記神経損傷が、脳にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、虚血、脳卒中、動脈瘤、脳出血、血栓、または塞栓症によって引き起こされる、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＴＢＩが、脳震とうである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３４】
前記虚血が、限局性虚血または全体的虚血である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３５】
前記アミノ酸配列が、配列番号３２に対して少なくとも７８％、少なくとも８５％、または少なくとも９２％の同一性を有する、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療用ペプチドが、配列番号３２の残基４、５、６、７、９、１０、１２、または１３のうちの少なくとも１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換を含み、アミノ酸残基４ＥがＤもしくはＱで置換され、アミノ酸残基５ＲがＨ、ＬもしくはＫで置換され、アミノ酸残基６ＬがＩ、ＶもしくはＭで置換され、アミノ酸残基７ＫがＲもしくはＨで置換され、アミノ酸残基９ＮがＥもしくはＤで置換され、アミノ酸残基１０ＤがＥもしくはＮで置換され、アミノ酸残基１２ＬがＩ、ＶもしくはＭで置換され、および／またはアミノ酸残基１３ＫがＲもしくはＨで置換される、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療用ペプチドが、配列番号１〜２５および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療薬が、前記治療用ペプチドに連結された輸送部分をさらに含み、細胞による前記治療用ペプチドの取り込みを促進する、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記輸送部分が、ＨＩＶ  Ｔａｔ輸送部分である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記輸送部分が、ペプチドリンカーによって前記治療用ペプチドに連結されている、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療薬が、配列番号３５〜６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記予備の神経細胞が、損傷後７日以内に前記治療薬と接触する、請求項２２〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が、ヒトまたは他の非ヒト哺乳動物である、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療薬が、前記対象に全身的に、髄腔内的に、または硝子体内的に投与される、請求項請求項２２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年９月５日に出願された米国仮出願第６２／７２７４２０号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記述
この出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前はＣＷＲ０２６８６８ＷＯＯＲＤ．ｔｘｔである。テキストファイルは２４ＫＢであり、２０１９年８月２８日に作成され、明細書の出願とともにＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出されている。
【背景技術】
【０００３】
神経損傷は神経組織の機能不全または死をもたらし、多種多様な症状および影響を示す。損傷は、外傷性脳損傷もしくは虚血状態などの外部事象、脳卒中、動脈瘤、脳出血、血栓、もしくは塞栓症などの内部事象、または多発性硬化症などの慢性神経変性疾患によって引き起こされる可能性がある。
【０００４】
実例として、脳卒中は脳への血流が遮断されたときに発生し、神経組織の死と局所神経障害を引き起こす。兆候と症状は、脳卒中の場所と程度によって異なる場合がある。米国では、すべてのタイプの脳卒中が年間８０万件近くあり、虚血性脳卒中がこれらの脳卒中の約８０％を占めている。Ｒｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２３（４）：ｅ１８−ｅ２０９。欧州では、脳卒中の推定年間発生率は１１０万を超えており、米国と同様の割合で、約８０％が虚血性脳卒中である。Ｈｅｕｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｔｒｏｋｅ  ４０（５）：１５５７〜１５６３。
【０００５】
急性脳卒中患者の評価と治療のガイドラインは、再灌流療法、および脳卒中を悪化させるか、または臨床経過を複雑にする可能性のある要因に焦点を当てている。急性虚血性脳卒中の診断は、局所虚血および結果として生じる神経障害と一致する病歴および身体検査の組み合わせによって行われる。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のいずれかの脳画像法を使用して、出血およびその他の限局性病変を除外し、虚血の初期兆候を考証する。
【０００６】
脳卒中は慢性疾患と見なすこともできる。慢性脳卒中疾患の症状には、認知障害、嚥下障害、歩行障害などがあり、急性増悪は、嚥下もしくは歩行の代償不全、またはせん妄の形をとることがある。すべての慢性疾患と同様に、慢性脳卒中疾患の患者では、さらに急性脳卒中のリスクが高くなり、同じ年齢と性別の一般集団における最初の脳卒中のリスクよりも約６倍高い再発性脳卒中のリスクを伴う。
【０００７】
神経損傷に対する多くの治療的アプローチは、損傷したニューロンの機能を取り戻すための修復戦略に取り組んでいる。しかし、機能の完全な喪失および／または神経死の前に介入する時間枠は短い。したがって、多くの神経損傷に対処する技術の進歩にもかかわらず、機能を回復し、および／または神経損傷後の負の影響を改善するための効果的かつ柔軟な治療の必要性が残っている。本開示は、これらのおよび関連する需要に対処する。
【発明の概要】
【０００８】
この要約は、以下の詳細な説明でさらに説明される簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供されている。この要約は、特許請求された主題の主要な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求された主題の範囲を決定する際の補助として使用されることも意図されていない。
【０００９】
本開示は、一般に、それを必要とする対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、虚血、脳卒中（例えば、虚血性脳卒中、および／または慢性脳卒中疾患）、動脈瘤、脳出血、血栓、塞栓症、多発性硬化症（ＭＳ）、またはアルツハイマー病によって引き起こされる神経損傷などの神経損傷を治療する治療薬、化合物、および方法、ならびに対象の神経系におけるグリア瘢痕形成および／またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）に関連する疾患または障害の治療方法に関する。
【００１０】
一態様では、本開示は、神経損傷後の予備の神経細胞の代償性可塑性を促進する方法を提供する。この方法は、予備の神経細胞を、予備の神経細胞におけるＰＴＰσの触媒活性、シグナル伝達、または機能のうちの１つ以上を阻害する有効量の治療薬と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、治療薬は治療用ペプチドを含み、治療用ペプチドが、配列番号３２に対して少なくとも７０％の同一性または配列番号３３に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１１】
別の態様では、本開示は、対象の神経損傷を治療する方法を提供する。この方法は、治療用ペプチドを含む有効量の治療薬を対象に投与することにより、神経損傷後の予備の神経細胞の代償性可塑性を促進することを含み、治療用ペプチドが、配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する、または配列番号３３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
これらの態様の様々な実施形態では、予備の神経細胞は、神経幹細胞であり得るか、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）および／またはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）を含み得るか、またはニューロンであり得る。いくつかの実施形態では、代償性可塑性は、軸索の発芽または樹状突起の発芽もしくは分岐など、予備の神経細胞の神経突起伸長に現れる可能性がある。いくつかの実施形態では、代償性可塑性は、神経損傷に向かう予備の神経細胞の代償性遊走に現れる可能性がある。いくつかの実施形態では、神経損傷は、脳などの中枢神経系にある。いくつかの実施形態では、神経損傷は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、虚血、脳卒中、動脈瘤、脳出血、血栓、または塞栓症によって引き起こされる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、治療薬は、さらに、治療用ペプチドに連結された輸送部分を含み、細胞による治療用ペプチドの取り込みを促進する。いくつかの実施形態では、輸送部分は、ＨＩＶ  Ｔａｔ輸送部分である。いくつかの実施形態では、治療薬は対象に、全身的に、髄腔内的に、または硝子体内的に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の前述の態様および付随する利点の多くは、添付の図面と併せて解釈される場合、以下の詳細な説明を参照することによって本発明の前述の態様および付随する利点はよりよく理解されるので、より容易に理解されるであろう。
【００１５】
【図１】動物モデルでＰＴＰσの細胞特異的欠失を実装するアプローチの例を概略的に示す。
【図２Ａ−２Ｃ】：図２Ａは、Ｔ２強調ＭＲＩスキャン画像を示し、図２Ｂは、治療が脳卒中後２４時間で開始する前に、ビヒクルおよびＩＳＰ治療群が、一過性近位中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）手術によって誘発された、脳卒中後１８時間での同じ梗塞サイズを有することを示すグラフを示す。図２Ｃは、脳卒中後の継続的なＩＳＰ治療により、脳卒中動物（６７．７４２％）の生存率が経時的に増加したのに対し、ビヒクル治療を受けた脳卒中動物は経時的に（４４．８２８％）増加したことをグラフにより示す。
【図３Ａ−３Ｃ】コンピュータ自動運動オープンフィールド分析の結果をグラフにより示し、脳卒中後の連続ＩＳＰ治療マウスにおける、総距離、水平活動、および垂直活動それぞれのパラメータについて、脳卒中後２週間後から４週間後の運動活動の強化を示す。ｎ＝７〜１２、＊＜ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ。
【図４】脳卒中後のＩＳＰ治療は、粘着物除去試験で測定した脳卒中の影響を受けた手足の感覚運動機能を改善することをグラフにより示す。
【図５Ａ−５Ｂ】脳卒中後のＩＳＰ治療が、バーンズ迷路の標的穴を見つけるための時間（図５Ａ）およびエラー試行回数（図５Ｂ）によって測定される、脳卒中マウスの認知機能を改善することをグラフにより示す。
【図６Ａ−６Ｃ】コンピュータ自動運動オープンフィールド分析の結果をグラフにより示し、脳卒中後４週における総距離（図６Ａ）、水平活動（図６Ｂ）、および垂直活動（図６Ｃ）それぞれのパラメータにおいて、遅延した（脳卒中後７日目）脳卒中後のＩＳＰ治療マウスにおける運動活動の強化を示す。各グループにおいてｎ＝７、＊、ｐ＜０．０５および＊＊、ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ。
【図７Ａ−７Ｆ】ＩＳＰ治療が神経芽細胞形成と皮質脊髄路軸索発芽の両方を増強することを示す。図７Ａ〜７Ｃは、脳卒中後のＩＳＰ治療が、側脳室の近くと隣接する線条体組織の両方で脳卒中後のマウスのＤＣＸ＋神経芽細胞を増強したことを説明する画像およびグラフである。＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４。スケールバー＝１００μｍ。図７Ｄ〜７Ｆは、それぞれ概略図、画像、およびグラフであり、脳卒中後のＩＳＰ治療が対側皮質脊髄路からの軸索発芽を促進することを示す。対側皮質ＢＤＡトレースによってラベル付けされた頸髄（矢印）で交差したＣＳＴ繊維。（ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定、各グループでｎ＝３）。
【図８Ａ−８Ｆ】条件付き（誘導可能な）ＫＯマウスにおけるＰＴＰσ遺伝子のＮＳＣ特異的欠失の生成と特性評価、およびトマトレポーターの同時標識を示す。図８Ａは、同時標識を用いてＰＴＰσ遺伝子の誘導可能な／条件付きＫＯ（ｃＫＯ）を生成する手順を概略的に示す。図８Ｂおよび８Ｃは、誘導ありまたは誘導なしの場合の、条件付きおよび組換え対立遺伝子を確認する電気泳動画像を示す。ＰＴＰσ遺伝子組換えは、成体ＮＳＣ＋ニッチ（図８Ｂ）および濃縮された初代成体ＮＳＣニューロスフェア（図８Ｃ）のみで観察された。図８Ｄ〜８Ｆは、のＳＶＺまたはＳＧＺ由来の成体生まれの線条体内トマト＋細胞（図８Ｄ）およびＤＧ（図８Ｅ）、および海馬のＣＡ３領域へのそれらの投影（図８Ｆ）を示す画像である。スケールバー＝１００μｍ。
【図９Ａ−９Ｈ】神経修復の軸索発芽メカニズムにおけるＰＴＰσ欠失を評価するための戦略を示す。図９Ａは、条件付きＰＴＰσマウスにおけるＡＡＶを介した成体ニューロン特異的なＰＴＰσ遺伝子の欠失とトマトレポーターの同時標識を生成する手順を概略的に示す。図９Ｂは、対象のマウスの組織における条件付きおよび組換えされた対立遺伝子を確認する例示的な電気泳動分析の画像である。図９Ｃは、トマトレポーターによってラベル付けされた誘導ＰＴＰσ欠失の画像であり、皮質ニューロンのトマトレポーターラベル付け（ｄとしてラベル付け、図９Ｄの倍率で）および線条体へのそれらの投影（ｅとしてラベル付け、図９Ｅの倍率で）、脳梁（ｆとラベル付けされている、図９Ｆの倍率で）と対側皮質（ｇとラベル付けされている、図９Ｇの倍率で）の交差、を示す。図９Ｈは、皮質脊髄路（ＣＳＴ）と、トマトレポーターが皮質脊髄路（ＣＳＴ）のラベル付けにも成功したことを示す画像を示す。スケールバー＝５０μｍ。
【図１０Ａ−１０Ｅ】成体神経幹細胞培養の確立と特徴づけを示す図である。図１０Ａは、ｗｔまたはｃＫＯマウスからの成体神経幹細胞（ＮＳＣ）培養の確立を概略的に示す。図１０Ｂおよび１０Ｃは、成体ＮＳＣがＣＳＰＧを生成し（図１０Ｂ）、ネスチン陽性であること（図１０Ｃ）を確認する画像である。図１０Ｄは、ｗｔ  ＮＳＣ（ネスチン陽性、矢印）がＣＳ５６免疫染色（緑色）によって視覚化された外側のＣＳＰＧリムを貫通できない勾配スポットアッセイの画像である。対照的に、図１０Ｅは、ｃＫＯ  ＮＳＣがＣＳＰＧリムに侵入できることを示す画像であり、それらではＰＴＰσ機能が失われていることを示す。スケールバー＝１００ｕｍ。
【図１１Ａ−１１Ｅ】アグレカン基質コーティングは成体ＮＳＣの遊走を減少させ、ｃＫＯ  ＮＳＣ細胞のＰＴＰσ遺伝子の欠失（ｗｔと比較して）は基礎レベル（アグレカンコーティングなし）とアグレカンコーティングの両方で遊走の促進をもたらすことを示す。図１１Ａは、アグレカン基質コーティングなしの野生型ＮＳＣの代表的な画像である。図１１Ｂは、アグレカン基質コーティングなしの代表的なｃＫＯ  ＮＳＣの画像である。ＮＳＣがそれ自体でＣＳＰＧを生成することを考慮すると、ＰＴＰσの削除または阻害がアグレカン基質コーティングなしでＮＳＣの遊走を促進する理由を説明する。虚血性脳では、反応性星状細胞グリアが病変の周囲の基質内に追加のＣＳＰＧを生成するため、余分なアグレカン基質コーティングの存在下でのＮＳＣの遊走も試験された。図１１Ｃは、アグレカン基質コーティングを施した代表的な野生型ＮＳＣの画像であり、追加のアグレカンコーティングがＷＴ  ＮＳＣの遊走を阻害し、ｃＫＯ細胞のＰＴＰσを欠失すると、追加のアグレカンコーティングがあってもｃＫＯ細胞の遊走を促進できることを示す。図１１Ｄは、アグレカン基質コーティング有する代表的なｃＫＯ  ＮＳＣの画像である。スケールバー＝５０ｕｍ。（Ｅ）に示す遊走の定量化。＊＊および＊＊＊は、ｗｔ細胞と比較してｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１を示し、＃および＃＃＃は、アグレカンコーティング条件がない場合と比較してｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１を示す（二元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後比較）。
【図１２Ａ−１２Ｂ】ＩＳＰによるＣＳＰＧｓ−ＰＴＰσ経路の薬理学的阻害が遺伝的ＰＴＰσ欠失と同様の結果を示したことを示す。図１２Ａは、アグレカンコーティングを有して、または有さずに培養された対照およびＩＳＰ処理細胞の遊走を示す一連の画像である。示されるように、アグレカンコーティングは成体ＮＳＣの遊走を減少させ、ＩＳＰ処理はＮＳＣの遊走に対するＣＳＰＧの阻害を軽減する。図１２Ｂは、図１２Ａに示されている様々な条件下での細胞の正規化遊走指数をグラフにより示す。二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊および＊＊＊は、対照処理されたＮＳＣと比較してｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１を示し、＃はアグレカンコーティングされていない状態と比較してｐ＜０．０５を示す。スケールバー＝１００ｕｍ。
【図１３Ａ−１３Ｃ】一次ＰＴＰσ  ｃＫＯ成体ＮＳＣは、アグレカン基質上の野生型ＮＳＣと比較して、神経突起伸長が増加することを示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ野生型およびｃＫＯ  ＮＳＣにおけるＭＡＰ２免疫染色の代表的な画像であり、インビトロで５日間分化させた。スケールバー＝５０ｕｍ。図１３Ｃは、偏りのないイメージングと５０個の分化した神経細胞の定量化によって実行された神経突起の長さの定量化をグラフにより示す。＊＊は、スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０１を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ＩＳＰ処理がＷＴ初代ＮＳＣ細胞における神経突起伸長を増強することを示した。図１４は、５日間インビトロで分化した野生型ＮＳＣにおけるＭＡＰ２免疫染色の一連の代表的な画像である。神経突起の長さの定量化は、偏りのないイメージングと各条件での５０の分化した神経細胞の定量化によって実行された。図１４Ｂは、対照、スクランブルペプチドで処理された細胞、およびＩＳＰペプチドで処理された細胞で観察された神経突起の長さをグラフにより示す。対照とスクランブルペプチド処理細胞の間に有意差はなく、＊＊は、対照またはスクランブルペプチド処理細胞と比較して、ＩＳＰ処理細胞でｐ＜０．０１を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、一般に、治療を必要とする対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、虚血、脳卒中（例えば、虚血性脳卒中、および／または慢性脳卒中疾患）、動脈瘤、脳出血、血栓、塞栓症、多発性硬化症（ＭＳ）、またはアルツハイマー病によって引き起こされる神経損傷などの神経損傷を治療する治療薬、化合物、および方法、ならびに対象の神経系のグリア瘢痕形成および／またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）に関連する疾患または障害の治療方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、神経損傷後の予備の神経細胞の代償性可塑性の促進に関する。
【００１７】
この開示は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）が、動物およびヒトの脳卒中患者の両方の慢性期を通して梗塞周辺領域のグリア瘢痕に蓄積または調節できるという本発明者らの発見に部分的に基づいている。脳卒中の慢性期における梗塞周辺領域でのＣＳＰＧのこの蓄積は、脳卒中後の神経可塑性再編成の阻害に関係しており、これには、新しい局所回路の形成、半球間接続、および皮質脊髄路軸索発芽が含まれ、脳卒中の動物およびヒト患者の回復に潜在的に制限を引き起こす。以下でより詳細に説明するように、本発明者らは、神経細胞におけるＰＴＰσ触媒活性、シグナル伝達、および／または機能を阻害または調節する全身ペプチド治療（例えば、細胞内σペプチド（ＩＳＰ）治療）がＣＳＰＧ障壁を克服し、一般的な運動機能、特定の上肢の感覚運動機能、および認知機能を含む、マウス脳卒中モデルの機能回復の複数の側面を著しく改善することを発見した。回復のメカニズムの調査中に、神経細胞におけるＰＴＰσシグナル伝達のＩＳＰ調節が、負傷したニューロンの存在に対して機能を補償することを可能にする損傷（例えば、無傷のニューロン）から免れた神経細胞の遊走および発芽活動を誘発することによって回復のいくつかの側面に寄与することが決定された。これにより、神経損傷後にＩＳＰ治療が遅れた場合でも、最終的には改善効果の誘導が可能になった。さらに、全身ペプチド治療は、脳卒中後の脳の慢性萎縮の減少につながる、ＰＴＰσ触媒活性、シグナル伝達、および／または機能を阻害または調節した。したがって、神経損傷の近位および遠位にある予備の（例えば、損傷していない）神経細胞の可塑性を促進するこの実証された能力は、悪性脳卒中などの損傷が起こった後の回復および生存を促進する治療に非常に関連する。
【００１８】
上述によれば、一態様では、本開示は、神経損傷後の予備の神経細胞の代償性可塑性を促進する方法を提供する。この方法は、予備の神経細胞を、予備の神経細胞におけるＰＴＰσの触媒活性、シグナル伝達、または機能のうちの１つ以上を阻害または調節する有効量の治療薬と接触させることを含む。この方法は、有効量の開示された治療薬または組成物を対象に投与することによって、神経損傷後の予備の神経細胞における代償性可塑性を促進することによって、対象の神経損傷のさらなる治療方法に適用可能であり、これもまた本開示に含まれる。いくつかの実施形態では、治療薬は治療用ペプチドを含む。治療用ペプチドは、配列番号３２に対して少なくとも７０％の同一性または配列番号３３に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、対象（例えば、ヒトまたは他の霊長類、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどのヒト以外の哺乳動物）の疾患、障害、または状態（例えば、神経損傷）の医学的管理を指す。治療は、疾患または状態（例えば、神経損傷）の治療または改善における何らかの成功の兆候を含み得、これには、症状の減少、寛解、軽減、または疾患もしくは状態を患者にとってより許容できるようにする、退化または衰退の速度を減速する、または退化をより衰弱させないようにするなどの任意のパラメータが含まれる。症状の治療または改善は、医師による検査の結果を含む、客観的または主観的なパラメータに基づくことができる。例えば、本明細書で言及される「ＮＩＨＳＳスケール」は、脳卒中によって引き起こされる機能障害のレベルを測定するために一般的に使用されるスケールである（Ｋａｓｎｅｒ  Ｓ  Ｅ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００６；７：６０３〜１２）。したがって、「治療する」という用語は、疾患または状態（例えば、神経損傷）に関連する症状または状態の発症を軽減するか、または阻止または阻害するための本開示の組成物の投与を含む。さらに、この用語には、緩和治療、つまり、疾患、病的状態、または障害の治癒ではなく、症状の緩和のために設計された治療；予防的治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の発症を最小限に抑えるか、部分的または完全に阻害することを目的とした治療；支持療法、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の改善に向けられた別の特定の療法を補足するために採用される治療、を含む。
【００２０】
「治療効果」という用語は、対象における疾患もしくは状態、疾患もしくは状態の症状、または疾患もしくは状態の副作用の一般的な改善、軽減、または排除を指す。
【００２１】
「治療的に有効な」という用語は、容易に決定することができる、予備のニューロンにおける誘発された代償性可塑性および／または増加した運動機能、感覚運動機能、または認知などの治療効果をもたらす組成物の量を指す。本明細書で定義される治療薬の有効量は、対象の病状、年齢、および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する治療薬の能力などの要因に応じて変化し得る。投与レジメンは、最適な治療反応を提供するように調整することができる。有効量はまた、治療的に有益な効果が活性化合物の毒性または有害な効果を上回る量である。
【００２２】
「代償性可塑性」という用語は、損傷した神経細胞の喪失または悪化を補償する神経機能に寄与する、健康な神経細胞における表現型の変化の誘導を指す。健康な神経細胞は「予備の」神経細胞と呼ばれ、この方法で対処された神経損傷で直接損傷を受けていないことを示す。
【００２３】
いくつかの実施形態では、予備の神経細胞は神経幹細胞である。神経幹細胞は多能性の未分化神経細胞であり、最終的には神経系のニューロンとグリアに分化することができる。他の実施形態では、予備の神経細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）および／またはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）を含むことができる。さらに他の実施形態では、予備の神経細胞はニューロンである。ニューロン、または神経細胞は、神経組織内の細胞であり、体の一部に沿って（例えば、軸索に沿って）電気インパルスを伝達し、細胞を分離する小さなシナプス空間への神経伝達物質の放出を介して他の細胞との通信に影響を与える。本開示に包含されるように、ニューロンは、特定の細胞マーカーの発現によって神経幹細胞と区別可能である。具体的には、ニューロンは通常、ネスチン−およびＤＣＸ＋（未成熟ニューロンの場合）またはネスチン−およびＮｅｕＮ＋もしくはａｐｔ２＋（成熟ニューロンの場合）である。対照的に、神経幹細胞は通常、ネスチン＋およびＤＣＸ−である。
【００２４】
以下でより詳細に説明するように、ＰＴＰσの触媒活性シグナル伝達および／または機能の阻害が、神経損傷（例えば、脳卒中）後の予備の神経細胞における神経突起伸長を誘導することが確立された。したがって、いくつかの実施形態では、治療薬／ペプチドは、予備の神経細胞の代償性神経突起伸長を誘導する。神経突起伸長は、予備の神経細胞における軸索の発芽に現れる可能性がある。軸索の発芽は、細胞体からの軸索、すなわち神経線維の伸長発達、または成長である。軸索は通常、電気インパルスを神経細胞体から別の細胞に向けて伝導するように機能する。他の実施形態では、神経突起伸長は、予備の神経細胞における樹状突起の発芽に現れる可能性がある。樹状突起は、他の神経細胞から受け取った電気化学的刺激を細胞体に伝播する、神経細胞の分岐した原形質の伸長である。いずれの実施形態でも、神経突起の発芽は、軸索の発芽または樹状突起の発芽もしくは分岐のいずれであれ、隣接する、周囲の、またはさらには離れた神経細胞とのシナプス接触の増加をもたらす。特定の理論に限定されることなく、シナプス接触の増加は、他の細胞の損傷によるシナプス接触の喪失を補う。神経突起の発芽による代償性シナプスの増加に伴い、代替接続またはバイパス接続を確立できるため、損傷した神経細胞の喪失または悪化後に機能を回復するのに役立ち得るシグナル伝達経路を再ルーティングできる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の神経突起伸長は、神経損傷部位の近位、または損傷部位の遠位にある予備の神経細胞で起こり得る。「近位」または「遠位」という用語は、相対距離を示す用語であり、状況に応じて異なる距離を示すことができる。場合によっては、部位神経損傷の近位にある予備の神経細胞は、損傷部位に近いかそうでなければ近くにある細胞であり、例えば、損傷した神経細胞に直接接触するか、または損傷した細胞から細胞の長さもしくは幅で測定可能な距離内にある。対照的に、神経損傷部位の遠位にある予備の神経細胞は、脳の異なる組織または領域、あるいは脊髄などの中枢神経系の他の領域など、遠く離れている可能性がある。例えば、いくつかの実施形態では、治療薬／ペプチドは、対側皮質脊髄路の位置など、神経損傷の部位の遠位にある予備のニューロンにおいて神経突起伸長を誘導する。
【００２６】
他の実施形態では、治療薬／ペプチドは、神経損傷に向かって予備の神経細胞の代償性遊走を誘発する。いくつかの実施形態では、代償性遊走を示す予備の神経細胞は神経幹細胞である。他の実施形態では、代償性遊走を示す予備の神経細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）および／またはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）である。いくつかの実施形態では、治療薬／ペプチドは、神経損傷部位の近位にある予備の神経細胞の代償性遊走を誘発する。本開示は、予備の神経細胞が神経損傷の部位に入る結果となる予備の神経細胞の代償性遊走を含む実施形態を包含するが、本開示はそのように限定されない。本開示はまた、予備の神経細胞の代償的遊走が、治療薬／ペプチドの投与前よりも予備の神経細胞を神経損傷の部位に近づける結果となる実施形態を包含する。いくつかの実施形態では、遊走する予備の神経細胞は、ＣＳＰＧのリングを横切る。
【００２７】
開示された方法は、中枢神経系で発生する神経損傷に対処する。いくつかの実施形態では、神経損傷は脳にある。以下でより詳細に説明するように、脳卒中モデルを使用して、神経損傷後に予備の神経細胞の誘発された可塑性を確立した。増強された可塑性の効果が、損傷部位の遠位にある神経細胞を含む予備の神経細胞で生じたことを考慮すると、本開示は脳卒中の例だけでなく、他の形態の神経損傷を含みうることが当業者によっても理解されるであろう。したがって、神経損傷は、神経細胞が損傷する脳震とうなどの外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）などの神経変性疾患、アルツハイマー病、虚血（例えば、限局性虚血または全体的虚血）、脳卒中（例えば、虚血性脳卒中、および／または慢性脳卒中疾患）、動脈瘤、脳出血、血栓、塞栓症などによって引き起こされる可能性がある。
【００２８】
本明細書で「脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）」、「脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）」、または「脳血管虚血」とも呼ばれる「虚血」という用語は、代謝要求を満たすのに脳への血流が不十分である状態である。これは、不十分な酸素供給または脳低酸素症につながり、したがって、「虚血性脳卒中」とも呼ばれる脳組織の死または脳梗塞につながる。「虚血性脳卒中」は脳卒中のサブタイプであり、通常、脳動脈の閉塞による脳への血液供給の中断の結果である。「脳虚血」および「虚血性脳卒中」という用語は、本明細書では交換可能に使用し得る。
【００２９】
脳虚血には２つのタイプ、つまり脳の特定の領域に限定される「限局性虚血」および脳組織の広い領域を包含する「全体的虚血」がある。通常、脳虚血は、患者が次の症状のうちの１つ以上を示すことを特徴とする：話すことと理解することの問題、顔、腕または脚の麻痺またはしびれ、片方または両眼で見ることの問題、頭痛および歩行の問題。脳卒中の種類と最も適切な治療法を決定するために、緊急チームは脳卒中の種類と脳卒中の影響を受ける脳の領域を評価する必要がある。また、脳腫瘍または薬物反応など、症状の他の考えられる原因を除外する必要がある。脳卒中の種類を決定するために一般的に使用されるいくつかの検査がある：身体検査、血液検査（グルコースレベル、血液細胞のカウント、ナトリウム、カリウムまたはカルシウムなどの血清電解質、コレステロール、総脂質、ＨＤＬ、ＬＤＬまたは抗トロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、ファクターＶＩＩＩなどの凝固因子、活性化プロテインＣ耐性、特に関連するのは凝固因子と血小板の測定）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、頸動脈超音波、脳血管造影図、および心エコー図。虚血性脳卒中の診断に関する総説については、Ａｍ  Ｆａｍ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．，２０１５，  ９１（８）：５２８〜３６を参照されたい。虚血性脳卒中の急性期は、本明細書では「急性虚血性脳卒中」と呼ばれ、発症から４時間以内と定義される。脳卒中または虚血性脳卒中の慢性期は、本明細書では慢性脳卒中疾患と呼ばれ、虚血性脳卒中の急性期の後に発生する。
【００３０】
次に、予備の神経細胞におけるＰＴＰσの触媒活性、シグナル伝達、または機能のうちの１つ以上の阻害、およびこの目的のための治療薬についてここで説明する。
【００３１】
ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能は、以下を含むいくつかの方法で抑制、阻害、および／または遮断することができる：ＰＴＰσの細胞内ドメインの活性の直接阻害（例えば、小分子、ペプチド模倣物、抗体、イントラボディ、またはドミナントネガティブポリペプチドを使用することによって）；ＰＴＰσの細胞内ドメインの活性、シグナル伝達、および／または機能のうちの１つ以上を阻害する遺伝子および／またはタンパク質の活性化（例えば、遺伝子および／またはタンパク質の発現または活性を増加させることによって）；ＰＴＰσの下流メディエーターである遺伝子および／またはタンパク質の阻害（例えば、メディエーター遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性を遮断することによって）；ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能のうちの１つ以上を負に調節する遺伝子および／またはタンパク質の導入（例えば、組換え遺伝子発現ベクター、組換えウイルスベクターまたは組換えポリペプチドを使用することによって）；または、例えば、ＰＴＰσの低形質変異体による遺伝子置換（例えば、相同組換え、組換え遺伝子発現またはウイルスベクターを使用した過剰発現、または突然変異誘発によって）。
【００３２】
ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能のうちの１つ以上を阻害または低減する治療薬は、ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能を低減および／または抑制する治療薬を含むことができる。そのような治療薬は、細胞内に送達することができ、細胞内に送達されると、対象の運動機能、感覚運動機能、または認知のうちの少なくとも１つを増強する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能のうちの１つ以上を阻害または低減する治療薬は、ＰＴＰσの細胞内ドメインに結合しおよび／またはそれと複合体を形成する治療用ペプチドまたは小分子、特に、ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能を阻害するための細胞内くさび形ドメインを含む。したがって、予備の神経細胞（例えば、神経幹細胞、ＯＰＣ、ＧＰＣ、ニューロン、および／またはグリア細胞）のＰＴＰσの細胞内ドメインに結合しおよび／または複合体を形成する治療用ペプチドまたは小分子を使用して、これらの細胞の代償性可塑性を促進する代償性細胞増殖、運動性（例えば、遊走）、神経突起成長、生存または他の特性を促進することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、治療薬は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１５５１０３Ａ１に記載されるような、ＰＴＰσの細胞内触媒ドメインのくさび形ドメイン（すなわち、くさびドメイン）のペプチド模倣物であり得る。細胞（例えば、ニューロンおよび／またはグリア細胞）で発現されるか、細胞内輸送部分に結合した場合のＰＴＰσのくさびドメインのペプチド模倣物は、予備の神経細胞で発現されるくさびドメインに結合および／またはカメラに結合し、その結果、細胞の成長、運動性、および生存を促進するために、予備の神経細胞におけるＰＴＰσシグナル伝達の廃止をもたらす。例えば、これらの治療用ペプチドのＰＴＰσインタクトくさびドメインへの結合は、（ｉ）ＰＴＰσがホスファターゼ標的などの標的タンパク質と相互作用する能力を妨害し、（ｉｉ）ＰＴＰσと、触媒的に不活性な第２ホスファターゼドメインＤ２などのＰＴＰσに含まれる別のドメインとの間の分子間相互作用を促進する活性を妨害し、（ｉｉｉ）活性ホスファターゼ部位へのタンパク質のアクセスを防ぎ、（ｉｖ）くさびドメインの通常のインタラクターを打ち負かし、および／または（ｖ）ホスファターゼ活性を立体的に阻害することができる。
【００３５】
上に示したように、いくつかの実施形態では、治療薬は、ＰＴＰσのくさびドメインのアミノ酸配列の約１０〜約２０個の連続するアミノ酸部分と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％同一の約１０〜約２０個のアミノ酸配列を含む治療用ペプチドを含み、本質的に治療用ペプチドからなり、および／または治療用ペプチドからなり得る。いくつかの実施形態では、約１０〜約２０個の連続するアミノ酸部分は、Ｎ末端αヘリックスの連続するアミノ酸およびくさびドメインの４アミノ酸ターンを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＰσの参照くさびドメインは、ヒトＰＴＰσ配列である。いくつかの実施形態では、治療用ペプチドは、配列番号３２に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７８％、少なくとも約８５％、少なくとも約９２％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、治療用ペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７８％、少なくとも約８５％、少なくとも約９２％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３６】
以下に開示するように、細胞質ゾル担体を有するＰＴＰσのくさびドメインに対応するかまたは実質的に同一であるペプチド（例えば、治療用ペプチド）は、脳卒中後の神経可塑性再編成のＣＳＰＧ媒介阻害を軽減することができ、運動機能、感覚運動機能、または認知のうちの少なくとも１つを増強する。有利なことに、治療用ペプチドは全身投与することができる。
【００３７】
表１に示すように、ＰＴＰσのくさびドメイン配列は高等哺乳動物間で高度に保存されており、ヒトからマウスおよびラットへの単一のアミノ酸変化（６位のスレオニンからメチオニン）のみが１００％の相同性を妨げている。
表１：くさびドメインタンパク質配列のアラインメント。
【表１】
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【００３８】
表１に示すように、ＰＴＰσのくさびドメインの１番目のαヘリックスにはアミノ酸１〜１０が含まれ、ターン領域にはアミノ酸１１〜１４が含まれ、２番目のαヘリックスにはアミノ酸１５〜２４が含まれる。例えば、ヒトＰＴＰσのくさびドメイン（配列番号２５）の１番目のαヘリックスは、ＤＭＡＥＨＴＥＲＬＫ（配列番号２９）のアミノ酸配列を有し、ターンはＡＮＤＳ（配列番号３０）のアミノ酸配列を有し、２番目のαヘリックスはＬＫＬＳＱＥＹＥＳＩ（配列番号３１）のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
くさびドメインは、ＬＡＲファミリーの他のメンバーであるＬＡＲおよびＰＴＰδとも配列相同性を共有する。これらのアミノ酸は、くさびドメインの全体的な構造に必要である可能性がある。保存されたアミノ酸には、１番目のαヘリックスの終わりとターンの開始を示す１３位のアラニンが含まれているため、一般的なくさびのサイズと構造に必要になる可能性がある。
【００４０】
くさびドメインの一般的な二次および三次構造はほとんどの受容体ＰＴＰを通じて一貫するため、ＰＴＰσくさびドメインを標的とする治療用ペプチドにいくつかの保存的置換を行って同様の結果を得ることができる。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどのうちの１つの非極性（疎水性）残基の別のものへの置換、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間など１つの極性（親水性）残基の別のものへの置換、またはリジン、アルギニン、またはヒスチジンなどのうちの１つの塩基性残基を別の残基に置換すること、および／または、アスパラギン酸またはグルタミン酸などのうちの１つの酸性残基を別の残基に置換することが含まれる。
【００４１】
これらの保存的置換は、αヘリックスまたはターンのいずれかの非固有ドメイン、具体的には１番目のαヘリックスの１〜３および７〜１０位、ターンの１２と１３位、２番目のαヘリックスの１５、１６、１８〜２４位で発生する可能性がある。これらのアミノ酸は、くさびドメインの全体的な構造に必要である可能性があるが、くさびのＰＴＰσへの結合の特異性は必要ない。
【００４２】
ＰＴＰσに固有のアミノ酸、特にＰＴＰσとＬＡＲで差次的に発現するアミノ酸は、くさびドメイン結合の特異性に必要であることがわかった。これらには、１番目のαヘリックスの４位と５位のＥＨドメインと、それに続く６位のスレオニンまたはメチオニン（ラットとマウスの置換）が含まれる。ターンには、すべての高等哺乳類の１４位に固有のセリンがある。最後に、２番目のαヘリックスの１７位に固有のロイシンがある。これらの固有のアミノ酸の潜在的な役割については、以下で説明する。
【００４３】
１４位のターンのセリン残基は、くさびドメインに位置するため、特に注目される。αヘリックスの間のターンに位置するこのアミノ酸は、ＰＴＰσの一般的な二次および三次構造からわずかに拡張されており、結合相互作用に利用できるようになっている。さらに、セリンは、そのヒドロキシル基とそれに含まれる極性のために、隣接するセリン間の水素結合など、いくつかの同種親和性および異種親和性の結合事象を促進することが知られている。セリンはまた、リン酸化などの様々な修飾を受けることが知られており、特異性の必要が高くなる可能性がある。くさびドメインのターンに焦点を合わせ、保存されたセリンを含む小さなペプチドは、同様の機能でより大きな安定性を提供する可能性がある。このようなペプチドはループとして合成でき、両端にシステインがあり、ジスルフィド結合が形成される。
【００４４】
１番目のαヘリックスの固有のアミノ酸には、４位のグルタミン酸と５位のヒスチジン、６位のスレオニンまたはメチオニンが含まれる。ヒスチジンはコンセンサスくさびドメインに関与するが、ＬＡＲ、ＰＴＰδ、ＰＴＰμまたはＣＤ４５には見られない。これらの３つのアミノ酸はすべて荷電または極性のいずれかであるため、ＰＴＰσくさびの特異性にはこの配列またはその成分のうちの１つが必要である可能性がある。
【００４５】
さらに、２番目のαヘリックスには１７位に固有のロイシンが含まれている。ロイシンは、ロイシンジッパーの三次元構造に重要な粘着分子として関係する。くさびドメインと構造的に類似するこれらの分子では、約７つの間隔で配置された反対のαヘリックスのロイシンが反対側のαヘリックスの疎水性領域と相互作用する。９番目の位置にある１番目のαヘリックスにもロイシンがあるため、この固有のロイシンは、ＰＴＰσくさびの全体的な３次元構造の完全性に必要であると考えられている。
【００４６】
したがって、いくつかの実施形態では、治療用ペプチドは、約１４〜約２０のアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、アミノ酸配列ＥＨＸ１ＥＲＬＫＡＮＤＳＬＫＬ（配列番号３２）（ここで、Ｘ１はＴまたはＭである）を含み得る。配列番号３２を含む治療用ペプチドは、治療用ペプチドが、配列番号３２と少なくとも約７０％、少なくとも約７８％、少なくとも約８５％、少なくとも約９２％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの保存的置換を含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、保存的置換は、配列番号３２のアミノ酸残基４Ｅ、５Ｒ、６Ｌ、７Ｋ、９Ｎ、１０Ｄ、１２Ｌ、または１３Ｋであり得る。非限定的な例として、アミノ酸残基４ＥをＤまたはＱで置換することができ、アミノ酸残基５ＲをＨ、Ｌ、もしくはＫで置換することができ、アミノ酸残基６ＬをＩ、Ｖ、もしくはＭ、アミノで置換することができ、酸残基７ＫはＲもしくはＨで置換することができ、アミノ酸残基９ＮはＥもしくはＤで置換することができ、アミノ酸残基１０ＤはＥもしくはＮで置換することができ、アミノ酸残基１２ＬはＩ、Ｖ、もしくはＭで置換することができ、および／またはアミノ酸残基１３Ｋは、ＲもしくはＨで置換することができる。得られる配列が上記の同一性パラメータを達成する限り、示された置換のいずれか１つ以上を任意の組み合わせで実施することができる。
【００４８】
治療用ペプチドの説明の多くの態様は、一般に、配列番号３２の文脈で本明細書に提示され、本開示は、治療用ペプチドが、配列番号３３に記載のくさびドメインのバリアントを含む実施形態も包含する。本明細書に記載されている治療用ペプチドの他のすべての側面および特徴もまた特に明記しない限り、この変形実施形態にも適用されることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態では、治療用ペプチドは、約１４〜約２０のアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、アミノ酸配列ＤＭＡＥＨＸ１ＥＲＬＫＡＮＤＳ（配列番号３３）を含み得、ここで、Ｘ１はＴまたはＭである。配列番号３３を含む治療用ペプチドは、治療用ペプチドが、配列番号３３と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有するように、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの保存的置換を含むことができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、保存的置換は、配列番号３３のアミノ酸残基７Ｅ、８Ｒ、９Ｌ、１０Ｋ、１２Ｎ、または１３Ｄのものであり得る。例として、アミノ酸残基７ＥはＤまたはＱで置換することができ、アミノ酸残基８ＲはＨ、Ｌ、またはＫで置換することができ、アミノ酸  残基  ９ＬはＩ、Ｖ、またはＭで置換することができ、アミノ酸残基１０ＫはＲまたはＨで置換することができ、アミノ酸残基１２ＮはＥまたはＤで置換することができ、アミノ酸残基１３ＤはＥまたはＮで置換することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、治療用ペプチドは、配列番号１〜２５、３２、３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５１】
本明細書に記載の治療用ペプチドは、他の様々な変更、置換、挿入、および欠失の対象となる可能性があり、そのような変更は、その使用において特定の利点を提供する。この点で、ＰＴＰσのくさびドメインに結合および／または複合体を形成する治療用ペプチドは、１つ以上の変更が行われ、ＰＴＰσ機能の１つ以上の活性、シグナル伝達、および／または機能を阻害または低減する能力を保持する、引用されたポリペプチドの配列に対応するか、または実質的であるが不完全な同一性を有することができる。
【００５２】
治療用ペプチドは、アミド、タンパク質とのコンジュゲート、環化ポリペプチド、重合ポリペプチド、類似体、フラグメント、化学修飾ポリペプチドおよび同様な誘導体を含む様々な形態のポリペプチド誘導体のいずれかであり得る。
【００５３】
保存的置換はまた、そのようなペプチドが必要な結合活性を示すという条件で、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化された残基の使用を含み得ることが理解されるであろう。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「化学誘導体」という用語、またはその文法的変形は、官能性側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。そのような誘導体化分子には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステル、または他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成し得る。２０の標準アミノ酸のうちの１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むポリペプチドが化学誘導体にも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに使用でき、５−ヒドロキシリシンはリジンの代わりに使用でき、３−メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりに使用でき、ホモセリンはセリンの代わりに使用でき、オルニチンはリジンの代わりに使用できる。本明細書に記載のポリペプチドはまた、必要な活性が維持される限り、その配列が本明細書に示されるポリペプチドの配列に対して１つ以上の付加および／または欠失または残基を有する任意のポリペプチドを含み得る。
【００５５】
本明細書に記載の治療用ペプチドの１つ以上のペプチドはまた、翻訳後プロセシングなどの自然のプロセスによって、および／または当技術分野で知られている化学修飾技術によって修飾することができる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含むペプチドで起こり得る。同じタイプの修飾が、所与のペプチドのいくつかの部位で同じ程度または異なる程度で存在し得ることが理解されるであろう。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、アセトミドメチル（Ａｃｍ）基の付加、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フィアビンへの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などのタンパク質への転移ＲＮＡ媒介アミノ酸の付加（参考のために、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，１９９３を参照されたい）が含まれるが、これに限定されない。
【００５６】
本明細書に記載のペプチドおよび／またはタンパク質はまた、例えば、生物学的に活性な変異体、バリアント、フラグメント、キメラ、および類似体を含み得、フラグメントは、１つ以上のアミノ酸のトランケーションを有するアミノ酸配列を包含し、トランケーションは、アミノ末端（Ｎ末端）、カルボキシ末端（Ｃ末端）、またはタンパク質の内部に由来し得る。本発明の類似体は、１つ以上のアミノ酸の挿入または置換を含む。バリアント、変異体、断片、キメラおよび類似体は、ＬＡＲファミリーホスファターゼの阻害剤として機能する可能性がある（本例に限定されない）。
【００５７】
本明細書に記載の治療用ポリペプチドは、当業者に知られている方法によって調製することができる。ペプチドおよび／またはタンパク質は、組換えＤＮＡを使用して調製することができる。例えば、１つの調製物は、細胞内のペプチドおよび／またはタンパク質の発現をもたらす条件下で宿主細胞（細菌または真核生物）を培養することを含み得る。
【００５８】
ポリペプチドの精製は、親和性法、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性、またはタンパク質精製に通常使用される他の精製技術によって行うことができる。精製工程は、非変性条件下で実施することができる。他方、変性工程が必要とされる場合、タンパク質は、当技術分野で知られている技術を使用して復元され得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用ペプチドは、ポリペプチドが他のポリペプチド、タンパク、検出可能な部分、ラベル、固体マトリックス、または担体に都合よく連結および／または固定され得る「リンカー」を提供する目的で、ポリペプチドのいずれかの末端に付加され得る追加の残基を含み得る。
【００６０】
アミノ酸残基リンカーは通常少なくとも１残基であり、４０残基以上、より多くの場合１〜１０残基であり得る。連結に使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸などである。さらに、主題のポリペプチドは、末端ＮＨ２アシル化、例えばアセチル化、またはチオグリコール酸アミド化によって、末端カルボキシアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンなどの末端修飾によって修飾される配列によって異なり得る。よく知られているように、末端修飾は、プロテイナーゼ消化により感受性を低下させるのに有用であり、したがって、溶液、特にプロテアーゼが存在する可能性のある体液中のポリペプチドの半減期を延長するのに役立つ。これに関して、ポリペプチド環化もまた有用な末端修飾であり、環化によって形成される安定な構造のために、そして本明細書に記載されるような環状ペプチドについて観察される生物学的活性の観点からも特に好ましい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、リンカーは、治療用ペプチドを他のポリペプチド、タンパク質、および／または検出可能な部分、標識、固体マトリックス、または担体などの分子に連結する柔軟なペプチドリンカーであり得る。柔軟なペプチドリンカーは、長さが約２０アミノ酸以下であり得る。例えば、ペプチドリンカーは、約１２以下のアミノ酸残基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２のアミノ酸残基を含むことができる。場合によっては、ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニン、およびスレオニンのうちの２つ以上のアミノ酸を任意の組み合わせで含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、システイン残基を含まない。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用ペプチドを含む治療薬は、複合タンパク質の形態で提供され得るか、または薬物送達構築物は、治療用ペプチドに連結される少なくとも輸送サブドメインまたは部分（すなわち、輸送部分）を含む。輸送部分は、哺乳動物（すなわち、ヒトまたは動物）の組織または細胞（例えば、神経細胞）への治療用ポリペプチドの取り込みを促進することができる。輸送部分は、治療用ペプチドに共有結合することができる。共有結合は、ペプチド結合または不安定な結合（例えば、容易に切断可能であるか、または内部の標的細胞環境において化学変化を受けやすい結合）を含み得る。さらに、輸送部分は、治療用ポリペプチドに架橋され得る（例えば、化学的架橋、ＵＶ架橋）。輸送部分はまた、本明細書に記載の連結ポリペプチドを用いて治療用ポリペプチドに連結することができる。
【００６３】
輸送部分は、治療薬中で複数回繰り返すことができる。輸送部分の繰り返しは、所望の細胞によるペプチドおよび／またはタンパク質の取り込みに影響を与える（例えば、増加させる）可能性がある。輸送部分はまた、治療用ペプチドのアミノ末端領域またはそのカルボキシ末端領域または両方の領域のいずれかに位置し得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、輸送部分は、輸送部分に一度連結された治療用ポリペプチドが受容体非依存性メカニズムによって細胞に浸透することを可能にする、少なくとも１つの輸送ペプチド配列を含むことができる。本開示に包含されるＴａｔ配列の例は、配列番号３４に記載されている。例えば、例示的で非限定的な実施形態では、輸送ペプチドは、少なくともＴａｔ媒介タンパク質送達配列および配列番号１〜２５、３２、および３３のうちの１つと少なくとも７０％同一の配列を含む合成融合ペプチドである。特定の例示的な実施形態では、Ｔａｔ媒介タンパク質送達配列が、配列番号１〜２５、３２、および３３のうちの１つのくさびドメイン配列に１つの残基のペプチドリンカーで連結されている場合、融合ペプチドは、それぞれ、配列番号３５〜６１のアミノ酸配列を有し得る。配列番号３５〜５９のそれぞれに示されるＸａａ（および配列番号６０および６１のそれぞれに示される最初のＸａａ）は、グリシン、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸などの任意のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、示されたリンカーアミノ酸（Ｘａａで示される）は、グリシン、セリン、アラニン、またはスレオニンである。いくつかの実施形態では、示されたリンカーアミノ酸（Ｘａａで示される）は、システインではない。配列番号３５〜６１は、それぞれ単一のリンカーアミノ酸残基を有する配列を開示すが、２つ以上のアミノ酸残基を含むより長いペプチドリンカーを有する他の実施形態もまた、この開示に含まれることが理解される。より長いペプチドリンカーは上に記載されている。
【００６５】
本開示に包含される既知の輸送部分、サブドメインなどの他の例は、例えば、カナダ特許文書第２，３０１，１５７号（アンテナペディアのホメオドメインを含むコンジュゲート）ならびに米国特許第５，６５２，１２２号、第５，６７０，６１７号、第５，６７４，９８０号、第５，７４７，６４１号、および第５，８０４，６０４号に記載されており、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのような例には、Ｔａｔ  ＨＩＶタンパク質のアミノ酸を含むコンジュゲート、単純ヘルペスウイルス−１  ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２、長さが４〜３０のヒスチジン繰り返しの範囲のヒスチジンタグ、または受容体に依存しないプロセスによる活性カーゴ部分の取り込みを促進できるその変異誘導体または相同体が含まれる。
【００６６】
アンテナペディアホメオドメインの３番目のαヘリックスの１６アミノ酸領域は、タンパク質（融合タンパク質として作成）が細胞膜を通過できるようにすることも示されている（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／１１８０９号およびカナダ出願第２，３０１，１５７号）。同様に、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質は細胞膜を通過できることが示された。
【００６７】
さらに、輸送部分は、活性剤部分（例えば、細胞内ドメイン含有フラグメント阻害剤ペプチド）に共有結合した塩基性アミノ酸に富む領域を有するポリペプチドを含むことができる。本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸に富む領域」という用語は、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジンなどの塩基性アミノ酸の含有量が高いタンパク質の領域に関する。「塩基性アミノ酸に富む領域」は、例えば、１５％以上の塩基性アミノ酸を有し得る。場合によっては、「塩基性アミノ酸に富む領域」は、１５％未満の塩基性アミノ酸を有し、なおも輸送剤領域として機能し得る。他の例では、塩基性アミノ酸領域は、３０％以上の塩基性アミノ酸を有するであろう。
【００６８】
輸送部分は、プロリンに富む領域をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、プロリンに富む領域という用語は、その配列中に５％以上（最大１００％）のプロリンを有するポリペプチドの領域を指す。場合によっては、プロリンに富む領域に５％〜１５％のプロリンが含まれていることがある。さらに、プロリンに富む領域は、天然に存在するタンパク質（例えば、ヒトゲノムによってコードされるタンパク質）で一般的に観察されるものよりも多くのプロリンを含むポリペプチドの領域を指す。本願のプロリンリッチ領域は、トランスポート剤領域として機能できる。
【００６９】
一実施形態では、本明細書に記載の治療用ペプチドは、形質導入剤に非共有結合することができる。非共有結合したポリペプチド形質導入剤の例は、Ｃｈａｒｉｏｔタンパク質送達システムである（その全体がすべて本明細書に参照により組み込まれる米国特許第６，８４１，５３５号；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（３５）：２４９４１〜２４９４６、およびＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃ  １９：１１７３−１１７６を参照）。
【００７０】
本明細書に記載の治療薬は、修飾することができる（例えば、化学的に修飾できる）。そのような修飾は、分子の操作または精製を容易にし、分子の溶解度を増加させ、投与を容易にし、所望の位置を標的とし、半減期を増加または減少させるように設計することができる。そのような修正の多くは当技術分野で知られており、熟練した開業医が適用することができる。
【００７１】
一実施形態では、本明細書に開示される治療方法において、治療有効量の治療薬が、慢性脳卒中疾患に関連する慢性機能を有する対象に投与される。治療薬を含む製剤は、例えば、脳卒中の検出または発症時から、脳卒中の検出または発症後の数日、数週間、数ヶ月、および／または数年までの期間に、対象に１回または複数回投与することができる。
【００７２】
治療薬は、例えば、局所投与および／または全身投与を含む、任意の適切な経路によって対象に送達することができる。全身投与には、例えば、非経口投与が含まれ得る。「非経口投与」という句は、経腸および注射に代表される局所投与以外の投与様式を指し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入を含むが、それに限定されない。いくつかの実施形態では、全身投与は、筋肉内、静脈内、関節内、動脈内、髄腔内、硝子体内、皮下、または腹腔内投与を含む。治療薬はまた、経口、経皮、局所、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入または鼻腔内滴下）または直腸から投与することができる。いくつかの実施形態では、治療薬は、注入ポンプを使用する静脈内投与を介して対象に投与されて、治療薬の毎日または毎週の用量を送達することができる。
【００７３】
局所投与の望ましい特徴は、治療薬の効果的な局所濃度を達成すること、ならびに治療薬の全身投与による潜在的な有害な副作用を回避することを含み得る。一実施形態では、治療薬は、対象の脳に直接導入することができる。
【００７４】
治療薬の薬学的に許容される製剤は、水性ビヒクルに懸濁し、従来の皮下注射針を介して、または注入ポンプを使用して導入することができる。
【００７５】
注射の場合、治療薬は、液体溶液、通常はハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性のある緩衝液に製剤することができる。さらに、治療薬は、固体形態に製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた提供される。注射は、例えば、治療薬のボーラス注射または持続注入（注入ポンプを使用するなど）の形でもよい。
【００７６】
任意の動物またはヒトの対象に投与される治療薬の量、体積、濃度、および／または用量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、性別、投与の時間と経路、一般的な健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存することが理解されよう。上記の量、体積、濃度、および／または治療薬の用量の特定の変動は、以下に記載される実験方法を使用して当業者によって容易に決定され得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用ペプチドなどの治療薬は、それを必要とする対象に、約０．１μモル、約１μモル、約５μモル、約１０μモル、もしくはそれ以上、または治療される対象のまたは約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量または量で局所的および／または全身的に投与することができる。治療薬は、自発運動、感覚運動、および／または認知障害が最大限に回復するまで、毎日、毎週、隔週、毎月、またはそれより少ない頻度で投与することができる。
【００７８】
治療薬は、１〜１０００ｍｇ  ＩＶ、例えば、１００〜６００ｍｇ  ＩＶの間、例えば、２００〜４００ｍｇ  ＩＶ、例えば、約３００ｍｇ  ＩＶの固定単位用量で投与することができる。皮下投与される場合、治療薬は、通常、１ｍｇ〜１００ｍｇＳＣ（例えば、７５ｍｇ）の用量で投与される。それはまた、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約６．０、４．０、３．０、２．０、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でボーラスで投与することができる。場合によっては、例えば皮下ポンプを介した連続投与で適応され得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、予備の神経細胞は、損傷後７日以内、例えば、神経損傷が発生してから約１、約２、約３、約４、約５、約６、および約７日以内に治療薬と接触する。
【００８０】
対象の治療の実施形態では、対象は、損傷後７日以内、例えば、神経損傷が発生してから約１、約２、約３、約４、約５、約６、および約７日以内に治療薬を投与される。例えば、いくつかの実施形態では、治療薬、例えば、治療用ペプチドは、脳卒中などの神経損傷の発症後１２時間以上、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１０、２１、２２、２３または２４時間以上後に対象に投与される。例えば、治療薬は、急性脳卒中後、または脳卒中の発症から約１２時間以上後に投与することができる。
【００８１】
別の実施形態では、治療薬は、静脈内注射によって全身的に、または損傷部位に局所的に、通常、神経損傷、例えば、脳卒中が発生したの場合の約２４時間、約４８時間、約１００時間、または約２００時間以上後に対象に投与することができる。
【００８２】
他の実施形態では、治療薬を投与するために使用される薬学的に許容される製剤はまた、対象への活性化合物の持続的送達を提供するために製剤化され得る。例えば、製剤は、対象への最初の投与後、少なくとも１週間、２週間、３週間、または４週間を含めて、活性化合物を送達することができる。例えば、本明細書に記載の方法に従って治療される対象は、治療薬で少なくとも３０日間治療することができる（反復投与または持続送達システムの使用、あるいはその両方による）。
【００８３】
持続送達のための手法には、ポリマーカプセル、製剤を送達するためのミニポンプ、生分解性インプラント、または移植されたトランスジェニック自家細胞の使用が含まれる（米国特許第６，２１４，６２２号を参照）。埋め込み型輸液ポンプシステム（例、ＩＮＦＵＳＡＩＤポンプ（Ｔｏｗａｎｄａ，ＰＡ））；Ｚｉｅｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｋａｎｏｆｆ，１９９４を参照されたい。）および浸透圧ポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売されている）は市販されており、あるいは当技術分野で知られている。別の投与モードは、埋め込み型の外部プログラム可能な輸液ポンプを介したものである。輸液ポンプシステムおよびリザーバーシステムは、例えば、米国特許第５，３６８，５６２号および第４，７３１，０５８号にも記載されている。
【００８４】
医薬組成物は、代償性神経可塑性、例えば、強化された運動機能、感覚運動機能、および／または認知に現れる可塑性の有益な効果を経験することができる任意の対象に投与することができる。本明細書に記載の実施形態はそのように限定されることを意図していないが、そのような動物の中で最も重要なものはヒトである。
【００８５】
示されるように、記載された治療薬は、対象の神経損傷を治療する方法で使用することができる。この方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の治療有効量の治療薬を投与することを含むことができる。治療有効量は、予備の神経細胞の代償性可塑性、例えば、対象の運動機能、感覚運動機能、または認知のうちの少なくとも１つに現れることができる可塑性を増強するのに有効な量（用量）を含み得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療薬は、治療薬の投与なしの対象における神経細胞の量、例えば、ＮＳＣ、ニューロン、および／またはグリア細胞の量と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％のニューロンの量の増加によって、および／またはグリア細胞の生成によって、対象の中枢神経系における神経細胞、例えば、ＮＳＣ、ニューロン、および／またはグリア細胞の生成を増強するのに有効な量で投与することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって治療される対象は、急性中大脳動脈（ＭＣＡ）の虚血性事象または脳卒中、例えば、虚血性脳卒中を患っている。虚血性脳卒中は、血栓症（例えば、静脈血栓症）、塞栓症、または全身性低灌流によって引き起こされる虚血（グルコースおよび酸素供給の欠如）による脳への血液供給の障害による、急速に発達する脳機能の喪失である。その結果、脳の患部が機能できなくなり、体の片側で１つ以上の手足を動かすことができなくなるか、言葉を理解または発話できなくなるか、または視野の片側が見えなくなる。
【００８８】
急性中大脳動脈（ＭＣＡ）の虚血性事象または虚血性脳卒中の症状には、例えば、半身麻痺、顔の感覚および筋力低下、しびれ、感覚または振動感覚の低下、臭覚、味覚、聴覚または視覚の変化（全体または部分的）、まぶたの垂れ下がり（ｐｔｏｓｉｓ）と眼筋の衰弱、反射の減少、バランスの問題と眼振、呼吸と心拍数の変化、頭を片側に向けることができない鎖乳突筋肉の衰弱、舌の衰弱（突出させることができないおよび／または左右に移動できない）、失語症、失行症、視野欠損、記憶障害、半側空間無視、無秩序な思考、混乱、性的過剰ジェスチャー、病態失認、歩行障害、運動協調の変化、およびめまい、ならびに／または平衡異常が含まれる。
【００８９】
虚血性事象または脳卒中、例えば、虚血性脳卒中では、発症時間は、利用可能な任意の方法によって決定することができる。例えば、対象は、例えば本明細書に記載されるように、脳卒中の様々な症状に関して、例えば医師によって、脳卒中の発症のおおよその時間を特定するために質問され得る。被験者が脳卒中で目覚めたとき、または症状の開始が検出できない場合など、脳卒中の発症時間を特定するのが難しい場合がある。そのような場合、脳卒中の発症は、対象が最後に健康であることがわかった時刻、例えば、最後にわかった正常（ＬＫＮ）を識別することによって決定することができる。場合によっては、脳のＭＲＩを使用して、被験者の発症時間および／または脳卒中期間を決定できる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．；Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ（２０１０）  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｈｅｌｐｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｉｍｅ  ｆｒｏｍ  ｓｙｍｐｔｏｍ  ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｓｔｒｏｋｅ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｋｎｏｗｎ  ｏｎｓｅｔ  ｔｉｍｅ，２５７（３）：７８２−９２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９０】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象における神経損傷を治療する方法は、本明細書に記載されるように、神経損傷のための追加の治療を施すことをさらに含む。別の言い方をすれば、現在開示されている治療方法は、神経損傷に対処する際の併用療法の一部となり得る。例えば、脳卒中を治療するための追加の治療法はまた、例えば、血栓溶解（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ））、血栓摘出、血管形成術およびステント留置、治療的低体温、および薬物療法（例えば、アスピリン、クロピドグレルおよびジピリダモール）を含み得る。いくつかの実施形態では、追加の治療は、例えば、血栓溶解剤、神経保護剤、抗炎症剤、ステロイド、サイトカイン、または成長因子である。使用される血栓溶解剤は、組織プラスミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼであり得る。使用される神経保護剤は、Ｎ−メチル−Ｄアスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体（ＡＭＰＡ）、グリシン受容体、カルシウムチャネル受容体、ブラジキニンＢ２受容体およびナトリウムチャネル受容体、またはブラジキニンＢ１受容体、α−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体、およびアデノシンＡ１受容体からなる群からからなる群から選択される受容体に対するアゴニストであり得る。使用する抗炎症剤は、インターロイキン−１および腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーであり得る。
【００９１】
神経学的回復の標準試験（例、国立衛生研究所脳卒中スケール（ＮＩＨＳＳ）、バーセル指数、修正ランキンスケール（ｍＲＳ）、グラスゴー転帰スケール、モントリオール認知評価（ＭｏＣＡ）、脳卒中影響スケール（ＳＩＳ−１６））は、有効性を判断するために熟練した技術者によって使用することができる。ＮＩＨＳＳは、質問に答え、意識レベル、言語、視野喪失、眼球外運動、運動能力、運動失調、構音障害、感覚喪失、消滅および不注意に関連する活動を実行する対象の能力に基づいて、脳卒中の重症度を分類する。１５の項目があり、各項目の評価は３〜５の評点であるスコア付けされ、０は正常であり、すべての項目に対する最大重症度スコアは４２である。１〜４のＮＩＨＳＳは、軽度の脳卒中を示す。５〜１５のスコアは中等度の脳卒中を示し、１６〜２０のスコアは中等度から重度の脳卒中を示し、２１−４２のスコアは、重度の脳卒中を示す。
【００９２】
一般的な定義
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。開業医は、当技術分野の定義および用語に関しては、特にＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１０）、Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１０）、Ｍｉｒｚａｅｉ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｃａｒｒａｓｃｏ，  Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  −  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（２０１６）、Ｃｏｍａｉ，  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（２０１７）、Ａｌｂｅｒｔｓ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｗ．  Ｗ．  Ｎｏｒｔｏｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｓｉｘｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１４）、およびＫａｎｄｅｌ，  Ｅ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／Ｍｅｄｉｃａｌ；５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）に関する。
【００９３】
便宜上、本明細書、実施例および特許請求の範囲で使用される特定の用語がここで提供される。定義は、特定の実施形態を説明するのを助けるために提供され、発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されるので、特許請求される発明を制限することを意図するものではない。
【００９４】
文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとす。特許請求の範囲または明細書において「含む」という単語と併せて使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という単語は、特に明記しない限り、１つ以上を示す。特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、または代替物が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために使用されるが、開示は、代替物および「および／または」のみを指す定義を支持する。
【００９５】
文脈上明確に別段の定めがない限り、説明および特許請求の範囲全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、「含むがこれに限定されない」という意味で排他的または網羅的な意味ではなく、包括的な意味で解釈されるべきである。単数形または複数形を使用する単語には、それぞれ複数形および単数形も含まれる。「本質的にからなる」という用語は、参照される組成物が追加の要素、変異、および／または配列を含み得るが、その追加の要素、バリエーション、および／または配列が示された組成物の機能に有意に寄与しないことを示す。
【００９６】
「約」という単語は、例えば、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを示す、記載された参照される数の上または下のわずかな変動の範囲内の数を示す。例えば、「約」は、示された参照される数の上または下の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲内の数を指すことができる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、モノマーが、アミド結合を介して一緒に結合されたアミノ酸残基であるポリマーを指す。アミノ酸がαアミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれも使用することができ、Ｌ−異性体が好ましい。本明細書で使用されるポリペプチドまたはタンパク質という用語はまた、任意のアミノ酸配列を含み、糖タンパク質などの修飾配列を含む。ポリペプチドという用語は、天然に存在するタンパク質、ならびに組換えまたは合成的に産生されるタンパク質を網羅することを特に意図する。「ペプチド」という用語は、単に、比較的短いポリペプチドポリマー、例えば、最大約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、または約９０のアミノ酸長を指す。タンパク質またはペプチドの文脈における「キメラ」または「融合」という用語は、ポリペプチドをコードする第１のアミノ酸配列と、外来であり最初のポリペプチドのドメインと実質的に相同ではないドメイン（例えば、ポリペプチド部分）を定義する第２のアミノ酸配列との融合を指す。キメラタンパク質は、生物に見られる（異なるタンパク質ではあるが）外来ドメインを提示し、これも最初のタンパク質を発現するか、または異なる種類の生物によって発現されたタンパク質構造の「種間」、「遺伝子間」などの融合である可能性がある。
【００９８】
当業者は、単一のアミノ酸または配列中のアミノ酸のパーセンテージを変更、追加、または削除するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、削除、または追加が、変更の結果、アミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換される「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者によく知られている。次の６つのグループは、相互に保存的に置換されていると考えられるアミノ酸の例である。
（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００９９】
配列同一性への言及は、タンパク質配列などの２つのポリマー配列の類似性の程度を指す。配列同一性の決定は、認められたアルゴリズムおよび／または技術を使用して当業者によって容易に達成され得る。配列同一性は、通常、比較ウィンドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のペプチドまたはポリヌクレオチド配列の部分は、参照配列（これは追加または削除を含まない）と比べて２つの配列の最適なアラインメントのための追加または削除を含み得る。パーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基または核酸塩基が出現する位置の数を決定し、一致する位置の数を算出し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを算出する。そのような比較を実行するためのＢＬＡＳＴ  ＮまたはＢＬＡＳＴ  Ｐなどの様々なソフトウェア駆動型アルゴリズムが容易に利用可能である。
【０１００】
「野生型」（または「ｗｔ」）という用語は、タンパク質またはその一部をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列、またはタンパク質配列またはその一部をそれぞれ指し、通常はｉｎ  ｖｉｖｏで存在する。
【０１０１】
本明細書に記載の方法で使用される治療薬、化合物、組成物などは、それらを使用する前に精製および／または単離されると考えられる。精製された材料は、典型的には「実質的に純粋」であり、これは、核酸、ポリペプチドまたはそれらのフラグメント、または他の分子が、それに自然に付随する成分から分離されていることを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に関連するタンパク質および他の有機分子を含まず、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または９９重量％である場合、実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、天然の供給源からの抽出によって、通常はそのタンパク質を発現しない細胞における組換え核酸の発現によって、または化学合成によって得ることができる。「隔離された材料」は、自然の場所および環境から除去されている。単離または精製されたドメインまたはタンパク質フラグメントの場合、ドメインまたはフラグメントは、天然に存在する配列においてタンパク質に隣接するアミノ酸配列を実質的に含まない。
【０１０２】
ポリペプチドを指す場合、「部分」、「フラグメント」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本明細書で言及される少なくともいくつかの生物学的活性（例えば、結合などの相互作用の阻害）を保持する任意のポリペプチドを含む。本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドが依然としてその機能を果たす限り、限定されることなく、部分、フラグメント、バリアント、または誘導体分子を含み得る。本発明のポリペプチドまたはその一部は、タンパク質分解フラグメント、欠失フラグメント、および特に、動物に送達されたときに作用部位により容易に到達するフラグメントを含み得る。
【０１０３】
開示された方法および組成物に使用できる、組み合わせて使用できる、準備に使用できる、または製品である材料、組成物、および構成要素が開示される。これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物のすべての単一の組み合わせおよび順列への特定の言及が明示的に開示されていないとしても、様々な個々のおよび集合的な組み合わせのそれぞれが具体的に企図されることが理解される。この概念は、説明された方法のステップを含むがこれに限定されない、本開示のすべての側面に適用される。したがって、前述の実施形態の特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または要素の代わりとすることができる。例えば、実行できる様々な追加のステップがある場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせで実行でき、そのような各組み合わせまたはサブセットの組み合わせは具体的に企図されており、開示されていると見なされるべきでことがあるが理解される。さらに、本明細書に記載の実施形態は、本明細書の他の場所に記載されているものまたは当技術分野で知られているものなどの任意の適切な材料を使用して実施できることが理解される。
【０１０４】
本明細書で引用された刊行物およびそれらが引用されている主題は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
以下は、特定の例示的な実施形態の説明であり、本発明者らは、細胞内σペプチド（ＩＳＰ）治療が神経損傷のモデルにおける回復を促進することを実証した。具体的には、例えばＩＳＰ治療によるＣＳＰＧ誘導ＰＴＰσのシグナル伝達の阻害がＣＳＰＧ障壁を克服し、一般的な運動機能、特定の上肢感覚運動機能ならびに認知機能など、マウス脳卒中モデルの機能回復の複数の側面を改善することが示された。回復のメカニズムも調べた。ＰＴＰσシグナル伝達のＩＳＰ変調は、損傷を受けたニューロンの存在を補償する機能を可能にする損傷から免れた神経細胞（すなわち、損傷を受けていないニューロン）の遊走と発芽活動を誘発することによって回復のいくつかの側面に貢献した。これにより、神経損傷後にＩＳＰ治療が遅れた場合でも、最終的には改善効果の誘導が可能になった。
【０１０６】
最初に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける脳卒中後のＩＳＰ治療の有効性を、近位中大脳動脈閉塞（ｐＭＣＡＯ）モデルを使用して試験した。マウスの３つのコホート（ｎ＝５９）は、線条体と皮質組織の両方に大きな脳卒中を誘発するためにＭＣＡＯ手術を受け、人間にとって致命的となる傾向がある人間の「悪性」脳卒中を模倣した。脳卒中マウスは、脳卒中損傷のサイズを決定するためにＴ２加重ＭＲＩスキャンにかけられ、脳卒中発症後２４時間から６週間の毎日のビヒクル（５％ＤＭＳＯ）または毎日のＩＳＰ（２０μｇ／マウス／日または３０μｇ／マウス／日ＳＣ注射）のいずれかの治療を受けた２つの均等に分布したグループに盲目的にグループ化された。
【０１０７】
脳卒中後２４時間で治療を開始する前に、マウスはＭＲＩによって特徴づけられた。データは、２つのグループの動物がＭＲＩスキャンによる虚血性損傷の程度に差がないことを示した（例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照）。脳卒中の２４時間後に開始されたＩＳＰ治療（脳卒中発症から４．５時間の脳卒中ｒｔＰＡの治療期間に対する唯一のＦＤＡ承認治療と比較して）は、脳卒中動物の生存率を有意に改善することができた（例えば、図２Ｃを参照）。これはおそらく、脳卒中の急性期の脳の炎症反応と腫れ反応を最終的に打ち消す抗ＣＳＰＧ効果の効果によるものである。
【０１０８】
コンピュータで監視された自動オープンフィールド分析を使用して、生き残ったすべてのマウスで、脳卒中後のＩＳＰ治療により、脳卒中後２〜４週間で、複数のパラメータ（つまり、総移動距離、総水平活動および総垂直活動、それぞれ図３Ａ、３Ｂ、３Ｃを参照）で脳卒中マウスの運動機能が有意に増加することがわかった。
【０１０９】
脳卒中後の最も一般的な機能障害は対側上肢の運動障害であり、人間の脳卒中生存者の９０％以上が感覚障害を経験すことを考え、脳卒中後のＩＳＰ治療が感覚運動行動試験における脳卒中マウスのパフォーマンスに及ぼす影響（すなわち、粘着テープ除去試験）も検討された。この試験では、マウスは影響を受けた前足と影響を受けていない前足に付着したテープを除去する必要がある。データは、ＩＳＰ治療により、マウスが影響を受けた足のテープを除去することができる速度が大幅に改善されたことを示した（影響を受けていない手足に明らかな影響はない）。これは、ＩＳＰ治療の結果が、脳卒中によって誘発される感覚および運動機能の障害に特に関連することを示す（図４）。
【０１１０】
認知機能の低下は、脳卒中生存者の障害の主な原因でもある。したがって、脳卒中マウスの認知機能に対するＩＳＰ治療の効果も調べた。マウスの学習／記憶機能を評価するためにバーンズ迷路試験を使用した。データは、脳卒中後４週間でＩＳＰがマウスを治療した場合、バーンズ迷路の逃げ穴を見つけるために使用する時間が大幅に短縮され、エラー試行も少なくなることを示した（図５Ａを参照）。
【０１１１】
これらのデータは、全身ＩＳＰ治療が、一般的な自発運動機能、特定の上肢感覚運動機能、および認知機能を含む、脳卒中マウスの機能回復の複数の側面を改善することを示す。これらのデータは、ＩＳＰ治療が脳卒中後の脳の慢性萎縮を減少させることも示唆する（図５Ｂを参照）。生存マウスにおける急性期生存率と慢性機能の改善は、神経損傷患者に利益をもたらす可能性のある少なくとも２つの可能なメカニズムを示唆しており、したがって、悪性脳卒中などの損傷後の生存率を促進し、傷害生存者の長期的な機能回復を促進するための魅力的で目的となりうる経路を提供する。
【０１１２】
傷害の時間に対するＩＳＰ投与のタイミング、および回復に対する対応する効果を試験するために、成体のＣ５７ｂｌ／６Ｊ雌および雄マウスを上記のように一過性の近位ＭＣＡＯ手術（３５分）に供した。動物は、脳卒中前および脳卒中後７日でベースライン行動試験を受け、治療開始前に２つのグループの動物に違いがないことを確認した。脳卒中後７日で開始されたＩＳＰの脳卒中後遅延治療の有効性が試験され、これはＳＶＺおよびＳＧＺ  ＮＳＣが活性化された時点である。マウスは、ＩＳＰ（１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）またはビヒクルを３週間連続して毎日注射される。脳卒中後４週間まで毎週、オープンフィールド移動試験と粘着テープ除去試験を実施した。図６Ａ〜６Ｃは、遅延ＩＳＰ治療パラダイムが、４週目までのオープンフィールド移動試験で、複数のパラメータ（つまり、それぞれ総距離、水平活動、垂直活動）のパフォーマンスの向上に大きな効果をもたらしたことを示す。ここに示されている脳卒中後７日間は、現在のＦＤＡ承認のｔＰＡ治療期間よりも大幅に広い治療期間を提供するため、これは顕著に臨床的にトランスレーショナルな衝撃を及ぼす。
【０１１３】
マウス脳卒中モデルを使用して、ＩＳＰ治療はまた、神経芽細胞形成と損傷の遠位の位置での皮質脊髄路軸索発芽の両方を強化することが示された。図７Ａ〜７Ｆを参照されたい。示されているように、これらのアッセイは、脳卒中後のＩＳＰ治療が、側脳室の近くと隣接するストラドル組織の両方の脳卒中後のマウスのＤＣＸ＋神経芽細胞を増強することを示した。脳卒中後のＩＳＰ治療は、対側皮質脊髄路領域からの軸索発芽を強化した。これは、脳卒中後のＩＳＰ治療が対側皮質からの皮質脊髄路投射を増加させ、誘発された可塑性と予備の神経細胞のメカニズムを確立する最初の証明である。
【０１１４】
ＩＳＰ治療によって誘発された、神経損傷からの上記のこの顕著な機能回復の根底にあるメカニズムをさらに調査するために、誘導可能な条件付きＰＴＰσノックアウトモデルが生成された。図１は、ＰＴＰσの細胞特異的欠失を実装するためのアプローチを概略的に示す。ＰＴＰσ  ｆｌｏｘマウス、ネスチン−ＣｒｅＥＲＴ２−ＰＴＰσ条件付きノックアウトマウス（神経幹細胞特異的ｃＫＯ）、および皮質ニューロン特異的ｃＫＯ（ＰＴＰσ  ｆｌｏｘマウスにＡＡＶ−ｈＳｙｎ−ｃｒｅウイルス注射を使用）を作製した。３世代の交配後、ネスチン−ＣｒｅＥＲＴ２−ＰＴＰσ条件付きノックアウトマウス（ｃＫＯ）が得られた。ｃＫＯマウスは、成体ＮＳＣのＰＴＰσを希望の時間に条件付きで削除することができる。さらに、これらの条件付きＫＯマウスの対側または傍梗塞部位へのＡＡＶ−ｈＳｙｎ１−ｃｒｅ注射により、対側または梗塞周囲部位の成熟発芽ニューロンのＰＴＰσ遺伝子を特異的に可能にするであろう。
【０１１５】
条件付きＫＯマウスは、予想されるメンデルの法則の比率で生まれ、遺伝子組換えを誘発せずに、ｆｌｏｘ対立遺伝子がｃＫＯマウスの正常な発達と生存に影響を与えなかったことを確認した。皮質ニューロンＰＴＰσマウスは、ＡＡＶ−ｈＳｙｎ−ｃｒｅウイルスをＰＴＰσ  ｆｌｏｘマウスの運動皮質および体性感覚皮質に注射することによって生成された。ｆｌｏｘ対立遺伝子の標的化および対立遺伝子の組換えの成功は、ＮＳＣ特異的ｃＫＯの脳領域を含む成体ＮＳＣのｃＫＯマウス、およびＡＡＶ−ｈＳｙｎ−ｃｒｅ注射マウスの皮質特異的組換えで確認された（図１、８Ａ〜８Ｆ、および９Ａから９Ｈを参照）。
【０１１６】
図８Ａ〜８Ｆは、条件付きノックアウトマウスが神経新生におけるＣＳＰＧ−ＰＴＰσ経路の役割と、脳卒中などの神経損傷後の機能回復への寄与の研究を可能にすることを示す。図９Ａ〜９Ｈは、条件付きノックアウトマウスが、ＡＡＶ−ｈＳｙｎ−ｃｒｅを傍梗塞領域および対側皮質領域に注入して意図した時間に既存の成熟ニューロンの遺伝子を欠失することにより、軸索発芽メカニズムに対するＰＴＰσ調節の効果の研究を可能にすることを示す。このモデルの梗塞周囲注射と対側皮質注射により、近位投射（梗塞周囲ニューロンの発芽）と任意の遠位投射（対側皮質ニューロンの発芽）の寄与を区別することができる。
【０１１７】
初期の結果が、ＩＳＰ処置が梗塞ゾーンに向かって遊走するＤＣＸ＋細胞の数を高めることを示すため（上記の図７Ａ〜７Ｆを参照）、野生型またはｃＫＯ  ＰＴＰσマウスからのＳＶＺ  ＮＳＣの遊走を調べた。成体の野生型およびＮＳＣ−ｃＫＯマウスＳＶＺから、成体の神経幹細胞（ＮＳＣ）ニューロスフェア培養物が確立された（図１０Ａ）。遊走アッセイは、ネスチン（＋）ＮＳＣがＣＳＰＧを生成することを示した（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。ＣＳＰＧスポットアッセイでは、以前の研究と一致して野生型ＮＳＣがＣＳＰＧリングの縁を越えることができないことが実証された（図１０Ｄ）。非常に対照的に、ｃＫＯ  ＮＳＣはＣＳＰＧリングの外縁を横切ることができ、ｃＫＯ  ＮＳＣでのＰＴＰσ機能の廃止に成功したことを実証した（図１０Ｅ）。
【０１１８】
さらに、ＣＳＰＧ誘導性ＰＴＰσシグナル伝達は、成人のＮＳＣにおける遊走と神経突起の成長の調節に重要であることが初めて実証された。アグレカン基質コーティングは、成体ＮＳＣの遊走の減少をもたらし、ｃＫＯ  ＮＳＣ細胞におけるＰＴＰσ遺伝子の欠失は、基礎レベル（アグレカンコーティングなし）およびアグレカンコーティングの両方での遊走の増強をもたらす（図１１Ａ〜１１Ｅを参照）。ＩＳＰによるＣＳＰＧｓ−ＰＴＰσ経路の薬理学的阻害は、遺伝的ＰＴＰσ欠失と同様の結果を示した（図１２Ａおよび１２Ｂを参照）。さらに、成人のｃＫＯ  ＮＳＣにおけるＰＴＰσの遺伝的欠失とＩＳＰペプチドによるＰＴＰσの薬理学的阻害の両方が、分化したＮＳＣにおける神経突起伸長の一貫した増加をもたらすが、スクランブルされたＩＳＰペプチドは効果がなかった（図１３Ａ〜１３Ｃ、１４Ａ、および１４Ｂを参照）。
【０１１９】
要約すると、ＰＴＰσ条件付きノックアウトマウスから得られたこれらのデータは、成体ＮＳＣを含む神経損傷後の予備の神経細胞の基本的な生物学におけるＰＴＰσの明確な機能的重要性を実証した。観察された機能には、神経分化、神経突起伸長および遊走が含まれ、これらは、基礎条件下での神経新生ならびに脳卒中などの損傷後の可塑性に関与する重要な細胞メカニズムである。重要なことに、脳卒中後７日でも開始されたＩＳＰ治療は、機能回復を促進するのに依然として効果的であることが実証された。脳卒中患者の急性治療期間（薬理学的に６時間、外科的に２４時間）を過ぎて現在利用できる治療法がないため、この結果は非常に重要である。
【０１２０】
ＣＳＰＧ−ＰＴＰσ経路の役割は、脊髄損傷（ＳＣＩ）モデルの損傷ニューロンで以前により研究されてきたが、これは、神経新生がＳＣＩの神経修復の主要な要因ではないためである。ただし、ＤＣＸ＋神経芽細胞の神経新生と遊走は、脳卒中後の回復に機能的に寄与することが示されている。現在のデータは、成人ＮＳＣにおけるＰＴＰσの遺伝的欠失およびＩＳＰによるＰＴＰσの薬理学的阻害が、新たに分化した神経芽細胞における神経突起伸長およびこれらの細胞の遊走の両方を一貫して増強することを実証する。
【実施例】
【０１２１】
以下の例は、本開示を限定するものではなく、説明する目的で提供されている。
【０１２２】
例
開示の様々な実施形態の実践のための材料と方法
１．動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ研究所から購入し、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ大学の動物施設に収容した。マウスは１２時間の明／暗サイクルで維持され、自由に餌を与えられた。すべての動物プロトコルは、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。この研究では、１０〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを使用した。
【０１２３】
２．一過性限局性虚血のマウスモデル
一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）は、シリコーンゴムでコーティングされたモノフィラメント（Ｃａｔ．６０２２１２ＰＫ１０Ｒｅおよび６０２３１２ＰＫ１０Ｒｅ、Ｄｏｃｃｏｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して左ＭＣＡを４５分間管腔内閉塞することにより、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢、２５−３０ｇ）で誘発された。一時的に、マウスをイソフルランスで麻酔した。体温は恒温ブランケットコントロールユニット（Ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）によってモニターされ、３７±０．５℃に維持された。動物の痛みを最小限に抑えるために、マウスにブプレノルフィンを皮下注射した。頭蓋冠の上にある皮膚に正中切開を行い、皮膚を横方向に引っ張って、マウスの左頭頂頭蓋骨の表面（ブレグマの後方０．５ｍｍおよび横側３．５ｍｍ）に柔軟なマイクロチップを固定した。次に、マウスの左総頸動脈（ＣＣＡ）、外頸動脈（ＥＣＡ）、および内頸動脈（ＩＣＡ）を分離するために、首の正中線を切開した。シリコーンゴムでコーティングされたモノフィラメントは、ＥＣＡの動脈切開を介して導入され、Ｌｏｎｇａの方法に従ってＩＣＡを介してＭＣＡの起点に向かってゆっくりと進めた。ＭＣＡを一貫して首尾よく確実に遮断するために、レーザードップラー流速計（ＰｅｒｉＦｌｕｘシステム５０００、Ｐｅｒｉｍｅｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）によってすべての脳卒中動物の局所脳血流を監視した。切開を閉じた後、マウスに１ｍｌの温かい生理食塩水を皮下投与し、回復するまで加熱した動物の集中治療室に置いた。
【０１２４】
３．磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
梗塞体積は、脳虚血の誘発の２３時間後に、３ｃｍの鳥かごコイル（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を備えた水平バイオスペック９．４Ｔスキャナーを使用して測定された。ＭＲＩスキャン手順の間、マウスは１．５％イソフルラン／酸素混合物で麻酔され、腹臥位でクレードルに置かれた。マウスの体温は、フィードバック制御システム（ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ，ＮＹ）を介してスキャナーに暖かい空気を吹き込むことによって３３℃に維持した。実験中、呼吸数もモニターした。虚血性浮腫の体積を定量化するために、マルチスライスＴ２強調軸画像は、次のパラメータでリラクゼーションエンハンスメント（ＲＡＲＥ）シーケンスを使用した高速取得を使用して取得された。ＴＥ／ＴＲ、１５／２０００ｍｓ；ＲＡＲＥファクター、８；ＮＡＶ、４；マトリックスサイズ、２５６ｘ２５６；スライス厚、１ｍｍ；スライス数、１３；視野、２．４ｘ２．４ｃｍ。画像の再構成と分析は、学内で開発されたＭＡＴＬＡＢベースのソフトウェア（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して実行された。虚血性浮腫のボリュームと脳組織のＲＯＩは、Ｔ２強調画像から抽出された。したがって、虚血性梗塞体積のパーセンテージは、次の式として計算された：Σ（対側領域−同側非梗塞領域）／Σ対側領域Ｘ１００％。
【０１２５】
４．ペプチドの調製
ペプチドはＣＳ−Ｂｉｏ（ＣＡ，ＵＳＡ）から純度＞９８％のものを購入した。凍結乾燥ペプチドを滅菌水に溶解し、使用するまで−８０℃で保存した。ペプチド配列は次のとおりである。
ＩＳＰ：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＤＭＡＥＨＭＥＲＬＫＡＮＤＳＬＫＬＳＱＥＹＥＳＩ
（配列番号６２）
スクランブルＩＳＰ（ＳＩＳＰ）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＩＲＥＤＤＳＬＭＬＹＡＬＡＱＥＫＫＥＳＮＭＨＥＳ（配列番号：６３）
【０１２６】
５．全身ペプチド治療
最初に、１０％ＤＭＳＯのビヒクル溶液（２３．７３ｍｌ滅菌生理食塩水中１．２５ｍｌ  ＤＭＳＯ）を各マウス用に調製した。次に、適切なＩＳＰペプチドをビヒクル溶液に添加し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ（それぞれ１匹のマウスの１日量に対応）に分注し、−８０℃で凍結した。最終的なＩＳＰペプチド濃度は０．３μｇ／μｌであった。ＭＲＩスキャン後、虚血性マウスは、脳卒中損傷のサイズに応じて２つの均等に分散されたグループにランダムにグループ化された。虚血後２４時間およびその後６週間毎日の午後に、マウスにＩＳＰ（３０μｇ／日、１００μｌ）またはビヒクル（生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ、１００μｌ）を皮下注射した。実験は盲検的様式で行われた。
【０１２７】
６．脳卒中動物の脳萎縮の定量化
脳卒中後の６週間の脳切片（２５μｍ）をＰＬＬコーティングされたスライドにマウントした。切片を１０分間、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ４．５）中で再水和し、次いで４２℃で３０分間、予熱した１０％ギムザ溶液で染色した。ＫＨ２ＰＯ４バッファーで簡単にすすいだ後、切片を無水エタノールで脱水し、キシレンで汚れを取り、Ｈｉｓｔｏｓｅａｌでマウントした。一連の切片の組は、Ｐａｔｈ  Ｓｃａｎ  Ｅｎａｂｌｅｒ  ＩＶスライドスキャナーによって画像化された。対側および同側の脳領域は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化された。萎縮率の計算式は次のとおりである。  Σ  （対側脳領域−同側脳領域）／Σ反対側の脳領域Ｘ１００％。
【０１２８】
７．軸索発芽の順行性追跡および定量化
ｔＭＣＡＯの４週間後、マウスを１．５％イソフルラン／酸素混合物で麻酔し、定位固定フレームで安定させた。１．５μｌのビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ、ＭＷ１０，０００；ＰＢＳ中１０％、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を傷害反対側の皮質の３つの部位に注射した（座標：１．Ａ／Ｐ０．０ｍｍ、Ｍ／Ｌ−２ｍｍ、Ｄ／Ｖ−１ｍｍ；２．Ａ／Ｐ０．５ｍｍ、Ｍ／Ｌ−１．５ｍｍ、Ｄ／Ｖ−１ｍｍ；３．Ａ／Ｐ０．５ｍｍ、Ｍ／Ｌ−２ｍｍ、Ｄ／Ｖ−１ｍｍ、）。２週間後、ＰＢＳ、続いて４％パラホルムアルデヒドで心臓を灌流した後、脳と頸髄を採取した。４％パラホルムアルデヒドで一晩後固定し、２０％および３０％スクロースで凍結保護した後、冠状脳切片および横脊髄切片を３０μｍの厚さに切断した。ＢＤＡを検出するために、切片を０．１Ｍ  ＰＢですすぎ、０．３％Ｈ２Ｏ２で３０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、続いてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２時間インキュベートした。染色は、２，３’ジアミノベンジイン四塩酸塩（０．１Ｍ  ＰＢ中０．５ｍｇ／ｍｌ）で展開された。正中線を横切るＢＤＡ＋繊維の数と長さを、盲検法で評価した。切片はＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析された。
【０１２９】
８．神経行動アッセイ
すべての行動試験は、盲検的様式で明期に実施された。ストレスを軽減するために、試験開始の１時間前にマウスを行動試験室に順応させた。マウス間の本能的な匂いを避けるために、すべての装置を７５％エタノールで洗浄した。
【０１３０】
８．１運動機能
マウスの運動活動は、前述のように、ｔＭＣＡＯの１日前、３、７、１４、２１、３５、４２日後にＡｃｃｕｓｃａｎ活動モニター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ，ＵＳＡ）を使用して評価した。このモニターには、１６個の水平赤外線センサーと８個の垂直赤外線センサー（間隔２．５ｃｍ）がある。各マウスを４２ｘ４２ｘ３１ｃｍのＰｌｅｘｉｇｌａｓオープンボックスに１時間入れ、餌と水を供給した。観察者の偏見を避けるために、この運動試験はコンピュータとソフトウェアによって自動的に監視された。自発運動活性は、自動化されたＶｅｒｓａｍａｘソフトウェア（Ａｃｃｕｓｃａｎ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ，ＵＳＡ）によって計算された。次の変数が測定された。（Ａ）水平活動（水平方向のセンサーで発生したビーム遮断の総数）。（Ｂ）総移動距離（ｃｍ、動物が移動した距離）；（Ｃ）垂直活動（垂直方向のセンサーで発生したビーム遮断の総数）。
【０１３１】
８．２バーンズ迷路試験
虚血性マウスの空間記憶は、ｔＭＣＡＯの２８日後にＢａｒｎｅｓ迷路（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＷｏｏｄＤａｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して調べられた。迷路は、周囲に２０個の穴がある直径９１．５ｃｍの円形プラットフォームで構成されている。マウスは、プラットフォームの上の吹き付けファンおよび明るい光で、ぶらぶらと遊ばないようにした。０日目に、開始チャンバーを除去した後、マウスを穏やかに誘導してターゲットの穴に入らせた。１日目に、ターゲットの穴の下に配置された脱出トンネルを見つけるために、２回のセッションで４回の試行でマウスを訓練した。マウスがターゲットの穴に入ると、穴が覆われ、マウスはそこに２分間留まることができた。マウスが５分以内にターゲットの穴を見つけることができなかった場合、マウスは観察者によって標的の穴に入るように導かれた。２日目に、マウスがターゲットの穴に入るまで、またはマウスがターゲットの穴を見つけることができなかったときは５分で停止させられるまで、１つの試行が実行され、ビデオテープに記録された。逃げる穴を見つけるのに費やした時間と、マウスによって作られた隠れ穴を見つける際のエラー数を、観察者が盲検的様式で測定した。
【０１３２】
８．３粘着物除去試験
この試験は、感覚運動障害を調べるために、脳卒中後７、１４、２１、２８、３５、４２日目に実施された。各マウスは、１分間の馴化期間中に透明なシリンダー（直径１５ｃｍ）に入れられた。その後、２つの異なる色の粘着ラベル（パンチで作られた直径２．５ｍｍ、Ｔｏｕｇｈ  Ｓｐｏｔｓ）が各マウスの前足に等しい圧力で適用された。粘着ラベルを除去するのに必要な時間は、最大２分で測定された。最適なレベルのパフォーマンスを達成するには、手術前にマウスを４日間トレーニングする必要がある。
【０１３３】
９．神経幹細胞培養
初代幹細胞は、５週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得られた。安楽死後、脳全体を直ちに採取し、顕微鏡下で解剖して、脳室下帯（ＳＶＺ）組織を得た。スタブナイフで機械的に解離した後、組織片をトリプシンを用いて処理し、増殖因子（上皮成長因子および塩基性線維芽細胞増殖因子）（ＮＢＭ−ＧＦ）添加神経基礎培地中に１０４細胞／ｃｍ２の密度で個々の細胞として再懸濁した。その後の細胞の継代は、細胞が生存可能系を確立するまで７日ごとにａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ＃ＡＴ−１０４、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して行い、継代ごとに細胞破片が自然に減少した。各継代の４日目に、増殖スフェアにＮＢＭ−ＧＦを供給した。この研究では、継代Ｐ３〜Ｐ８でニューロスフェアを使用した。
【０１３４】
１０．ＣＳＰＧ勾配交差アッセイ
ＣＳＰＧ勾配を、前述のようにカバースリップ上で作成した。簡単に説明すると、２４ウェルガラスカバースリップをポリ−Ｌ−リジンとニトロセルロースでコーティングし、７００ｕｇ／ｍｌアグレカン（Ａ１９６０）と１０ｕｇ／ｍｌラミニン（１１２４３２１７００１、Ｓｉｇｍａ）の混合物をコーティングされたカバースリップにスポットした。乾燥後、コーティングされたカバースリップをラミニンとともに３７℃で３時間インキュベートした。トランスフェクトされた神経幹細胞を、１０４個の細胞／カバースリップの密度で播種し、ＮＢＭ−ＧＦ培地で培養した。７日後、ウェルを４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定し、染色するまで４℃でリン酸緩衝生理食塩水に保存した。
【０１３５】
１１．ＣＳＰＧ上での神経幹細胞の遊走
インビトロでの神経幹細胞の遊走に対するＣＳＰＧの効果を決定するために、平底４８ウェルプレートを最初にポリ−Ｌ−リジンで一晩コーティングし、続いて水で濯いだ。アグレカン（Ａ１９６０、シグマ）を滅菌水で希釈した１ｕｇ／ｍｌおよび１０ｕｇ／ｍｌの濃度で４８ウェルプレートに一晩コーティングした後、水ですすいだ。対照ウェルには、ポリ−Ｌ−リジンのみが含まれた。２．５μＭ  ＩＳＰペプチドまたはスクランブルペプチドを含むＮＢＭ−ＧＦ培地の各ウェルに同じサイズのニューロスフェアを播種し（条件ごとに７ウェルにｎ＝７ニューロスフェア）、プレートを３７℃で２１時間インキュベートした。その後、Ｌｅｉｃａ  ＤＭｉ８広視野顕微鏡を使用して各ウェルの画像を撮影した。遊走活動は、ニューロスフィアの総面積をニューロスフィアの内部面積で割ったものとして定義された。ニューロスフェアの内部面積と総面積は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって測定された。距離測定は、観察者が盲検的様式で行った。
【０１３６】
１２．神経幹細胞分化アッセイ
簡単に説明すると、未処理の２４ウェルプレートのガラスカバースリップをポリオルニチンとラミニンでコーティングした。継代時のニューロスフェア分割後、個々の細胞を５００μｌのＮＢＭ−ＧＦに１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。１日おきに２５０μｌの培地を各ウェルから除去し、３００μｌの新鮮なＮＢＭ−ＧＦを添加した。付着した細胞が約７０％のコンフルエンシーに達したとき（約５日目）、各ウェル内のすべてのＮＢＭ−ＧＦを穏やかに除去し、ＩＳＰペプチド（２．５μＭ）またはスクランブルペプチド（２．５μＭ）を含むが成長因子を含まない神経基礎培地（ＮＢＭ）と直ちに交換した。２５０μｌの培地を除去し、ＩＳＰまたはスクランブルペプチドを含む３００μｌの培地を加えることにより、各ウェルに毎日給餌した。ＮＢＭ−ＧＦを完全に交換してから５日目に、ウェルを４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定し、染色するまで４℃でリン酸緩衝生理食塩水に保存した。
【０１３７】
１３．免疫組織化学
マウスをアベルチンで麻酔し、ＰＢＳおよび４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。脳を解剖し、４％ＰＦＡで４℃で一晩後固定し、２０％スクロースと３０％スクロースで平衡化した。厚さ２５μｍの切片を４％ＢＳＡ／０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ１００で１時間インキュベートした。ブロッキング後、切片を一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、続いてＡｌｅｘａ蛍光４８８または５９４と結合した適切な二次抗体とインキュベートした。以下の一次抗体を使用した：５−ＨＴ（１：５００、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ）およびＣＳ５６（１：５００、Ｃ８０３５、Ｓｉｇｍａ）。各染色について、少なくとも３匹の個々の動物／グループを検査し、画像を蛍光顕微鏡で撮影した。染色は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を使用して定量化された。
【０１３８】
１４．免疫細胞化学
カバースリップ上で培養した細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で１０分間透過処理した後、１０％正常ヤギ血清で１時間インキュベートした。その後、細胞を希釈した一次抗体中で４℃で一晩インキュベートし、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５９４（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と結合した適切な二次抗体ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＭもしくはＩｇＧでインキュベートした。ガラスカバースリップは、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を含むＭｏｗｉｏｌの顕微鏡スライドにマウントされた。次の一次抗体を使用した：ＭＡＰ２（１：５００、ＡＢ５６２２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ネスチン（１：５００、ＮＢ１００−１６０４、Ｎｏｖｕｓ）、およびＣＳ５６（１：５００、Ｃ８０３５、Ｓｉｇｍａ）。条件ごとに３つのカバースリップを分析した。各カバースリップのフィールドのランダムな選択は、Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＭＢＦ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ、ＶＴ，ＵＳＡ）によって選択および画像化され、定量的データはＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して取得された。
【０１３９】
１５．統計分析
すべての研究は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．００ソフトウェアを盲検的様式で使用して分析された。データは、平均±平均の標準誤差として示されている。統計的有意性はｐ＜０．０５に設定された。統計分析は、両側不対スチューデントのｔ検定、一元配置またはテューキーの多重比較検定、ダネットの多重比較検定、またはシダックの多重比較検定による事後分析を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによって実行された。サンプルサイズを事前に決定するために統計的検定は使用されなかったが、サンプルサイズは本分野で一般的に使用されているものと同様である。
【０１４０】
例示的な実施形態が例示および説明されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その中で様々な変更を行うことができることが理解されよう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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