(57)【要約】  本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と特異的に結合する新型抗体と抗体断片に関し、特に完全ヒト化の単鎖抗体ｓｃＦｖに関する。本発明は、さらにこれらの抗体をコーディングする核酸、ベクターと前記核酸を発現する宿主細胞に関する。その他、本発明は、本発明の抗体を含む組成物およびその治療と診断における用途にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、
（ｉ）配列番号４または５に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号３１、４１または４２に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉ）配列番号１０に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号４６に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉｉ）配列番号１６または１７に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号５０または５８に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、
（ｉｖ）配列番号２３に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号６４に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、または、
（ｖ）配列番号２７に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号５９、７１または７２に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が下記の３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８、３２、３３または３４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２９、３５、３６または３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３０、３８、３９または４０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１３、１４または１５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号４７または５１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４８または５４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号４９または５５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、または
（ｅ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号５２、６５、６６または６７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号５６、６８、６９または７０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含むか、または、
前記抗体が、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのＣＤＲ配列の組み合せの変異体を含み、前記変異体が、１、２、３、４、５または好ましくは６個のＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、１０個以下、または、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を含み、好ましくは重鎖ＣＤＲ３が変異せず維持される、
前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体が、
（ａ）配列番号４、５および６から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、
（ｃ）配列番号１６、１７または１９から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、
（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および
（ｅ）配列番号２７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＨ
から選択される重鎖可変領域ＶＨを含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体が、
（ａ）配列番号３１、４１、４２および４３から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号５０および５８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、および
（ｅ）配列番号５９、７１、７２および７３から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらに対して１０個以下（好ましくは５個以下）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列のＶＬ
から選択される軽鎖可変領域ＶＬを含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体が重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬを含み、前記ＶＨおよびＶＬが、
（ａ）配列番号４、５および６から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに、配列番号３１、４１、４２および４３のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに、配列番号４６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号１６、１７および１９から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに、配列番号５０および５８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに、配列番号６４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、および
（ｅ）配列番号２７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列のＶＨ、ならびに、配列番号５９、７１、７２および７３から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ
から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体が以下の一つ以上の特性：
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体と同じまたは類似の結合親和性および／または特異性を示す；
（ｉｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体とＢＣＭＡとの結合を抑制（例えば、競合的に抑制）する；
（ｉｉｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体と同じまたは重複するエピトープと結合する；
（ｉｖ）表１に示されるいずれか一つの抗体と競合的にＢＣＭＡと結合する；
（ｖ）表１に示されるいずれか一つの抗体の一つ以上の生物学的特性を有する
を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体が以下の一つ以上の特性：
（ｉ）高親和性、例えば１００ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば５〜３０ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤ値で、ヒトＢＣＭＡ（配列番号７４に示されるポリペプチド）と結合する；
（ｉｉ）高親和性、例えば１００ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば１〜４０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ未満、より好ましくは１０または５ｎＭ未満のＥＣ５０値で、細胞の表面に発現するＢＣＭＡ（配列番号７４に示されるポリペプチド）と結合する；
（ｉｉｉ）３×１０−２ｓ−１未満、１．５×１０−２ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満または３×１０−３ｓ−１未満、例えば約１．４６×１０−３ｓ−１の解離速度定数（Ｋｄ）で、ヒトＢＣＭＡ（例えば、配列番号７４に示されるポリペプチド）と結合する；
（ｉｖ）ヒトＢＣＭＡの細胞外領域（ＥＣＤ）におけるエピトープと特異的に結合する；
（ｖ）ヒトＢＣＭＡを発現する細胞（特に多発性骨髄腫細胞）の成長を阻害および抑制し、かつ／または前記細胞を死滅させる
を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体が完全ヒト化抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体が単鎖ｓｃＦｖ抗体であり、好ましくは前記単鎖ｓｃＦｖがＮ末端からＣ末端までに、ＶＬドメイン−リンカー−ＶＨドメインまたはＶＨドメイン−リンカー−ＶＬドメインを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記リンカーが、１個〜約２５個のアミノ酸、約５個〜約２０個のアミノ酸、または約１０個〜約２０個のアミノ酸、好ましくは１５〜２０個のアミノ酸を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記リンカーが配列番号９３のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記単鎖ｓｃＦｖ抗体が、配列番号９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３および１２６から選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも１、２または３個であり、かつ、３０、２０または１０個以下のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の単鎖ｓｃＦｖ抗体およびＦｃ領域を含む、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１５】
前記単鎖ｓｃＦｖ抗体がヒンジ領域、好ましくはＣＤ８ヒンジ領域、より好ましくは配列番号９５に示されるアミノ酸配列または配列番号９５のアミノ酸配列に対して少なくとも１、２または３個であり、かつ、５個以下のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むヒンジ領域によってＦｃ領域に接続される、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、好ましくは前記Ｆｃ領域が低または無フコシル化である、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５および１２８から選択されるアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも１、２または３個であり、かつ、２０個以下、１０個以下または５個以下のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片をコーディングする、単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは前記ベクターが発現ベクターである、前記ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは前記宿主細胞が酵母細胞および哺乳動物細胞から選択される、前記宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片を発現するのに適する条件において請求項２０に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体を含む、複合体または融合物。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片、または請求項２２に記載の複合体または融合物、および任意に薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
試料におけるＢＣＭＡを検出する方法であって、
（ａ）前記試料と、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片、または請求項２２に記載の複合体または融合物とを接触させること、および
（ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片、または請求項２２に記載の複合体または融合物と、ＢＣＭＡタンパク質との複合物の形成を検出すること
を含む、前記方法。
【請求項２５】
Ｂ細胞関連疾患の治療方法であって、対象に有効量の請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片、または請求項２２に記載の複合体または融合物、または請求項２３に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記Ｂ細胞関連疾患が、Ｂ細胞悪性腫瘍、形質細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患から選択され、好ましくは多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、未定悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増生疾患、免疫調節疾患、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーヴス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性または免疫細胞関連澱粉様変性、および意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞悪性腫瘍であり、好ましくは多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と特異的に結合する新型抗体と抗体断片に関し、特に単鎖抗体（例えば、単鎖ｓｃＦｖ）に関する。本発明は、更に、これらの抗体と抗体断片をコードする核酸、ベクターと前記核酸を発現する宿主細胞に関する。その他、本発明は、本発明の抗体を含む組成物およびその治療と診断における用途にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、ＣＤ２６９またはＴＮＦＲＳ１７とも呼ばれ、腫瘍壊死因子受容体のファミリーメンバーである。ＢＣＭＡは、ＩＩＩ型膜貫通タンパク質であり、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）にＴＮＦＲファミリーメンバーの特徴的なシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を有し、当該ドメインはリガンド結合モチーフを形成する。ＢＣＭＡとＴＮＦＲファミリーメンバー、膜貫通活性化因子ＣＭＡＬ相互作用体（ＴＡＣＩ）とＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）は、機能上に関連している。ＢＣＭＡは、膜貫通ドメインＮ末端のＣＲＤで、ＴＡＣＩと一定の相似性を有することを発現する。その他、ヒトＢＣＭＡとマウスおよびアカゲザルのＢＣＭＡは、細胞外ドメインＥＣＤにおいてそれぞれ約６５％と８５％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【０００３】
研究によって、ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ）とＢ細胞増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）と結合し、異なる発育段階におけるＢ細胞の生存を促進することができることが示される。しかし、異常な信号の伝達によりＢ細胞が異常に増殖することを促進することができ、自己免疫疾患と腫瘍を形成することを引き起こす。Ｒｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｉｖｉｅｗｓ２０１１、第２４４巻：１１５−１３３を参照する。
【０００４】
ＡＰＲＩＬは、Ｇ７０とも呼ばれ、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーである。文献報道によれば、ＡＰＲＩＬは、前立腺がん、乳がん、アルツハイマー病、免疫疾患、炎症と胃腸障害に関連している。Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｔ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１１８５−９０を参照する。可溶性ＡＰＲＩＬとＢＣＭＡの結合により骨髄（ＢＭ）における形質細胞と形質芽球細胞の生存を促進することができ（ＢＬＯＯＤ、２０１４年５月、１２３巻、２０期、ｐ３１２８−３１３８）、ＴＡＣＩとの結合によりＴ細胞の非依存性の抗体反応、Ｂ細胞調節とクラススイッチ組換えを引き起こすことができる（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍｏｔｏｇｙ、２０１４第１０卷：３６５−３７３を参照する）。
【０００５】
ＢＡＦＦはもう一つのＴＮＦリガンドファミリーのメンバーである。ＢＡＦＦとＢＣＭＡの結合により形質細胞の生存を促進することができる。ＢＡＦＦはＢ細胞、形質芽球細胞と形質細胞の表面に発現されるＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）と結合し、未成熟のＢ細胞の生存と成熟を促進することができる。その他、ＢＡＦＦはＴＡＣＩと結合してもよく、Ｔ細胞の非依存性の抗体反応、Ｂ細胞調節とクラススイッチ組換えを引き起こす（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍｏｔｏｇｙ、２０１４第１０卷：３６５−３７３を参照する）。
【０００６】
非腫瘍細胞において、ＢＣＭＡは主に形質細胞と成熟したＢ細胞亜群に発現される。６０−７０％の多発性骨髄腫（ＭＭ）患者において、ＢＣＭＡも癌化した形質細胞の表面に発現される。ＭＭ患者の血清におけるＢＣＭＡのレベルが上昇し、上昇したレベルが疾患の状況と、治療反応と全体の生存に関連する。ＢＣＭＡ遺伝子の欠陥あるマウスは、正常なＢ細胞レベルがあるが、その形質細胞の生存期間が著しく短くなる。従って、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫の免疫治療の望ましい標的である。
【０００７】
単鎖ｓｃＦｖ抗体は、小分子の遺伝子工学抗体であり、ＤＮＡレベルで、遺伝子工学方法を利用して天然抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を軽鎖可変領域（ＶＬ）と接続して（通常、人工合成された接続ペプチド（または「リンカー」）によって接続される）なる小分子組換え抗体である。完全な抗体分子に比べると、ｓｃＦｖ単鎖抗体は、完全な抗体可変領域を含み、元の抗体の抗原特異性と結合活性を保留し、抗体分子のＦｃ領域を含まないので、免疫原性が弱く、人体に用いられて免疫反応を生じにくく、分子量が少なく、透過性が強く、組織に浸入しやすく、画像診断または治療に用いられる時、一般的な完全な抗体の到達できない組織の内部に入ることができ、糖化修飾をせずに機能付ける抗体分子を形成することができ、原核発現システムの大量生産に役立ち、操作しやすく、遺伝子工学構造として新性質を有するその他の抗原特異的結合分子、例えば全長抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃなどを製造することに適用されるというメリットを有する。
【０００８】
ＢＣＭＡのＢ細胞悪性腫瘍、特に多発性骨髄腫における治療標的とする有効性に鑑みて、本分野では、依然として新たなＢＣＭＡと特異的に結合する分子を必要とする。本発明は、高標的特異性と高親和性でＢＣＭＡと結合し、特に腫瘍細胞の表面に発現されるＢＣＭＡと結合して、低副作用を有する完全ヒト単鎖抗体を提供することによって、このニーズに満足する。本発明に係る完全ヒト単鎖抗体は、腫瘍と癌症の診断と治療に単独に用いられるだけでなく、より有利なのは、遺伝子工学構造として高ＢＣＭＡ標的性を有するその他の診断と治療分子、例えば様々な形式の抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび抗体に基づく融合物と複合体などを製造することに適用される。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、完全ヒト化の抗ヒトＢＣＭＡ抗体およびそのコーディング遺伝子並びに応用を提供する。遺伝子工学手段と酵母表面ディスプレイ技術によって、本発明者は、酵母表面にディスプレイされたヒト抗体ライブラリーから抗ヒトＢＣＭＡの完全ヒト化抗体を選択し、その可変領域の遺伝子配列を得て、それに基づいて完全ヒト単鎖ｓｃＦｖ抗体およびそのヒトＦｃ領域との融合構成物を構成し、哺乳動物の細胞発現、精製によって、ｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体分子を得る。本発明に係る組換え単鎖抗体分子は、高親和性で非膜結合型ヒトＢＣＭＡと結合するだけではなく、高親和性で細胞表面に発現されるＢＣＭＡとも結合する。
【００１０】
従って、本発明はＢＣＭＡと特異的に結合する抗体、特に単鎖抗体およびそれをコーディングする核酸分子並びにそれらの治療と診断における用途を提供する。
【００１１】
一態様において、本発明はＢＣＭＡ（ヒトＢＣＭＡタンパク質が好ましい）と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。好ましい一実施形態において、本発明に係る抗体は単鎖抗体である。好ましい一実施形態において、本発明に係る抗体は単鎖ｓｃＦｖ抗体である。他の好ましい一実施形態において、本発明に係る抗体はｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体である。一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、約１００ｎＭ〜５ｎＭのＫＤでヒトＢＣＭＡタンパク質と結合し、ここでＫＤ値は例えばバイオフィルム層光学干渉技術（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ検出法）に従って測定する。一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、約４０ｎＭ〜４ｎＭのＥＣ５０で細胞表面に発現されるヒトＢＣＭＡタンパク質と結合し、ここでＥＣ５０値は、例えばフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）に従って測定する。本発明の一部の実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体またはその断片のＢＣＭＡに関連する病症の治療における用途を提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか１つの抗体のＶＨ領域配列またはその変異体を含む。他の一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか一つの抗体のＶＬ領域配列またはその変異体を含む。他の一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか一つの抗体のＶＨとＶＬ配列対またはその変異体を含む。他の一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか一つの抗体のＶＨ領域配列の１つ、２つまたは３つのＣＤＲ（好ましくは３つのＣＤＲである）またはその変異体を含む。他の一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか一つの抗体のＶＬ領域配列の１つ、２つまたは３つのＣＤＲ（好ましくは３つのＣＤＲである）またはその変異体を含む。一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか一つの抗体の６つのＣＤＲ領域配列またはその変異体を含む。一実施形態において、抗体のＣＤＲ配列は、表２に示されるＣＤＲ配列である。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、単鎖ｓｃＦｖ抗体である。好ましくは、ｓｃＦｖ抗体はＶＨ配列と、ＶＬ配列とリンカーを含む。好ましくは、ｓｃＦｖ抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬドメイン−リンカー−ＶＨドメイン、またはＶＨドメイン−リンカー−ＶＬドメインを含む。
【００１４】
一部の実施形態において、さらに本発明の単鎖ｓｃＦｖ抗体と野生型または変えたＦｃ領域から融合形成されたｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を提供する。一部の実施形態において、本発明に係る抗体のＦｃ領域は低フコシル化または無フコシル化である。一部の実施形態において、ｓｃＦｖ抗体は、ヒンジ領域によってＦｃ領域と融合される。
【００１５】
他の態様において、本発明は、本発明の抗体、特に、単鎖抗体に基づいて構成した融合物と複合体に関する。
【００１６】
他の態様において、本発明は、Ｂ細胞に関連する病症を治療する方法と組成物に関して、前記対象に有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片、または本発明の融合物または複合体を投与する。一部の実施形態において、Ｂ細胞に関連する病症は、Ｂ細胞悪性腫瘍、形質細胞悪性腫瘍、自己免疫疾患から選択され、好ましくは、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、未定悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増生疾患、免疫調節病症、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーヴス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血と急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性または免疫細胞関連澱粉様変性、または意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症から選択される。一部の好ましい実施形態において、Ｂ細胞関連疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍であり、好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。一部の実施形態において、本発明の抗体分子、融合物または複合体は、他の治療剤と併用する。
【００１７】
他の態様において、本発明は、試料におけるＢＣＭＡを検出する方法とキットに関し、前記方法は、（ａ）前記試料を本発明の抗体またはその抗原結合断片、融合物または複合体と接触することと、（ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片、融合物または複合体とＢＣＭＡタンパク質との間の複合物の形成を検出することとを含む。一部の実施形態において、試料は多発性骨髄腫（ＭＭ）患者に由来する。前記検出は、インビトロでもインビボでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、フローサイトメトリーにより測定し、酵母ディスプレイライブラリーから選択されて取得した本発明の例示的な抗ＢＣＭＡ抗体と多発性骨髄腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の親和性を示す。
【図２】図２は、本発明の例示的なｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体の発現ベクタークローン策略を概略的に示す。
【図３】図３は、フローサイトメトリーにより測定し、本発明の例示的なｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体とＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の親和性を示す。
【図４】図４は、本発明の抗体の例示的なＣＤＲ配列を示す。
【図５】図５は、本発明の抗体の例示的なＶＨ配列を示す。
【図６】図６は、本発明の抗体の例示的なＶＬ配列を示す。
【図７】図７は、ヒトＢＣＭＡ抗原およびその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の例示的なアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、本発明の例示的なｓｃＦｖ−Ｆｃ構成物の構造に用いられｓｃＦｖ−Ｆｃ構成物構造の参照に用いられるリンカー、ヒンジ領域とＦｃ領域のアミノ酸配列とヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
明確に反対すると指定しない限り、本発明における実施は、本分野の技術的な日常化学、生物化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学と細胞生物学の方法を用いる。これらの方法の説明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓ、２００８年７月に更新）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓとＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．、１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈとＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、ｅｄｓ．、１９９１）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；およびＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙのような定期刊行物専門書を参照する。
【００２０】
定義
別に定義しない限り、本出願に用いられる全ての技術と科学用語はいずれも、当業者が通常に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語を定義する。
【００２１】
用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より５％小さく上限として記載数値より５％大きい範囲における数値を含むことを意味する。
【００２２】
用語「および／または」が２つまたは複数の選択可能オプションを接続するために用いられる時、選択可能オプションのうちのいずれか一項または選択可能オプションのいずれか２項または複数項を指すと理解すべきである。
【００２３】
本出願に使用される場合、用語「包含する」または「含み」とは、前記要素、整数またはステップを含むが、他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本出願において、用語「包含する」または「含む」を用いる場合、特記しない限り、述べられた要素、整数またはステップからなる場合を含む必要がある。例えば、ある具体的な配列の抗体可変領域を「包含する」ことを言及する場合、当該配列からなる抗体可変領域を含むことを指す。
【００２４】
本出願において、用語「抗原結合分子」は、標的抗原と結合する抗原結合領域または抗原結合部分の分子、例えばタンパク質またはポリペプチドを包含する。本発明において、標的抗原がＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である場合、ＢＣＭＡと結合する抗原結合分子がＢＣＭＡ結合分子とも呼ばれる。抗原結合分子は、例えば、抗体およびその抗原結合断片、単鎖ｓｃＦｖ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体のようなｓｃＦｖに基づいて構成した様々な融合物と複合体を含む。当業者が明瞭になるように、抗体の抗原結合部分は、通常、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を包含する。一部の場合には、上下文によって、「ＢＣＭＡ結合分子」が、「本発明の抗体」または「抗ＢＣＭＡ抗体」と切り替えて使用することができる。
【００２５】
本出願において、用語「抗体」は、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを指し、前記免疫グロブリン可変領域は、抗原を特異的に識別して結合する。当該用語は、様々な抗体構造を含むが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体または複数重鎖抗体、単特異性または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全ヒト化抗体またはキメラ抗体またはヒト化抗体、全長抗体と抗体断片を含むが、これらに限定されず、所望の抗原結合活性を表現すればよい。
【００２６】
当業者は、「全抗体」（本出願では、「全長抗体」、「完全抗体」、「完全な抗体」と切り替えて使用することができる）が少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）を包含することが明らかにする。各重鎖は、重鎖可変領域（本出願ではＶＨと略される）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本出願ではＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。可変領域は、抗体の重鎖または軽鎖における抗体とその抗原の結合に参与するドメインである。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、複数種のエフェクター機能を示している。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２種類のタイプ（ｋａｐｐａ（κ）とｌａｍｂｄａ（λ）と称される）における１種類に入れることができる。抗体の重鎖は、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて主にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧとＩｇＭという５種類の異なるタイプに分けることができ、これらのタイプにおける数種類は更に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２というサブタイプに分けることができる。異なる抗体タイプに対応する重鎖定常領域はそれぞれ、α、δ、ε、γおよびμと称される。例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ、Ｗ．編集、第二版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的で全体を参考としてここに引用される）。
【００２７】
用語「抗体断片」は、完全な抗体でない分子を指し、完全な抗体における当該完全な抗体に結合される抗原を結合するための部分を包含する。組換えＤＮＡ技術、または酵素、または完全な抗体を化学的開裂することによって、抗原結合断片を製造することができる。抗原結合断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、二重鎖抗体（diabody）、三重鎖抗体（triabody）、四重鎖抗体（tetrabody）、ミニ抗体（minibody）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）および抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬとＣＨ１ドメインからなる一価の断片であり、例えば、パパインで完全抗体を消化することによってＦａｂ断片を得ることができる。リンカーによってＦａｂの軽鎖（Ｌ鎖）と重鎖（Ｈ鎖）を融合して単一なポリペプチド鎖、即ち単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）（例えばＵＳ２００７０２７４９８５Ａ１を参照する）を構成することができる。その他、ペプシンがヒンジ領域のジスルフィド結合の下で完全抗体を消化することによってＦ（ａｂ’）２を生じることができ、それはＦａｂ’のダイマーであり、二価の抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、中性条件でヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊することによって還元され、Ｆ（ａｂ’）２ダイマーからＦａｂ’モノマーに転換する。Ｆａｂ’モノマーは、基本的に、ヒンジ領域を有するＦａｂ断片である。Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームであるＶＬとＶＨドメインからなる。また、組換え法を用いて、Ｆｖ断片を独立してコーディングする２つドメインであるＶＬとＶＨの遺伝子を、接続ペプチド（リンカー）をコーディングする核酸配列によって接続し、組換えして発現して単鎖Ｆｖを形成し、当該単一のタンパク鎖でＶＨ領域とＶＬ領域をペアリングさせて抗原結合部位を提供する。二重鎖抗体は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、当該断片は同一のポリペプチド鎖にショートリンカーによって接続されるＶＬとＶＨを包含する。二重鎖抗体において、リンカーが短く過ぎるため、同一の鎖におけるＶＨとＶＬとの２つのドメインの間にペアリングができず、他鎖の相補性ドメインとペアリングさせられて２つの抗原結合部位を生じる。二重鎖抗体は二価または二重特異性のものでもよい。二重鎖抗体の更に詳しい説明は、例えば、ＥＰ４０４、０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照することができる。三重鎖抗体と四重鎖抗体とミニ抗体は、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）と、邵栄光ら（編集）、抗体薬物研究と応用、人民衛生出版社（２０１３）に説明される。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は通常、標的抗原を識別するようにもう一つの可変領域と互いに作用する必要がなく、１つの可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン、魚類のＩｇＮＡＲに由来するＶＨ様単一ドメイン（ｖ−ＮＡＲ））のみで抗原結合を与えることができる抗体を指す。（抗体断片に関する更に詳しい説明は、基礎免疫学（Fundamental Immunology）、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編集、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照することもできる。
【００２８】
本出願に用いられる用語「モノクローナル抗体」は、基本的に同種の抗体群体から得られる抗体を表示し、即、通常の極少量で存在する変異可能な抗体（例えば、天然突然変異またはモノクローナル抗体の制品の製造中に発生する変異体抗体を含有する）を除き、前記群体を構成する各抗体は同じおよび／または同じエピトープと結合するものである。モノクローナル抗体は、数種類の技術によって製造でき、前記技術はハイブリドーマ方法と、組換えＤＮＡ方法と、酵母ディスプレイ方法と、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全体または一部を包含する遺伝子導入動物を用いる方法を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
用語「ヒト抗体」または「完全ヒト化抗体」は本出願において切り替えて使用することができ、そのうちのフレームワーク領域とＣＤＲ領域の２つがいずれもヒト生殖系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を含む抗体を指す。そして、抗体に定常領域が含まれば、定常領域も、ヒト生殖系の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系の免疫グロブリン配列によってコーディングされないアミノ酸（例えば、インビトロでランダムにまたはスポットにおける特異的な変異誘発またはインビボの体細胞の突然変異による突然変異）を含むことができ、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３にある。しかし、本出願に用いられるように、用語「ヒト抗体」は、そのうちのＣＤＲ配列がその他の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系に由来してヒトフレームワーク配列に移植される抗体を含むことを意図しない。
【００３０】
本出願に用いられるように、用語「組換えヒト抗体」は、組換え方式によって製造、発現、発生または単離される全てのヒト抗体を含み、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子で遺伝子導入または染色体導入する動物（例えば、マウス）またはそれによって製造されたハイブリドーマから単離された抗体と、（ｂ）ヒト抗体を発現する宿主細胞に自己転換し、例えば、遺伝子導入腫から単離された抗体と、（ｃ）酵母ディスプレイライブラリーのような組換えヒト抗体ライブラリー、組合せのヒト抗体ライブラリーから単離された抗体と、（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子をその他ＤＮＡ配列に接続することを含む任意のその他の方式によって製造、発現、発生または単離された抗体とを含む。これらの組換えヒト抗体は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域のヒト生殖系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、一部の実施形態において、組換えヒト抗体をインビトロで変異誘発することができ（または、ヒトＩｇ配列を用いて動物に遺伝子導入する時、体内における体細胞の変異誘発である）、それによって得られる組換え抗体のＶＨとＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系のＶＨとＶＬ配列に由来してそれに関連するにも関わらず、体内のヒト抗体生殖系のライブラリーに天然に存在しない。
【００３１】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの生物種に由来して、定常領域配列が別の生物種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウスの抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す。
【００３２】
用語「ヒト化抗体」は、他の哺乳動物種、例えばマウスの生殖系に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に接続する抗体を指す。ヒトフレームワーク配列に余分なフレームワーク領域修飾を行うことができる。
【００３３】
「単離された」抗体は、既にその天然環境における成分と単離された抗体である。一部の実施形態において、抗体を９５％または９９％より高い純度までに精製して、前記純度は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって定められる。抗体の純度を評価する方法の概述について、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ、Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ  ８４８（２００７）７９−８７を参照する。
【００３４】
エピトープは、抗体の結合する抗原領域である。エピトープは、連続的なアミノ酸から形成されまたはタンパク質の３級フォールディングによって並列した非連続的なアミノ酸から形成される。
【００３５】
用語「ＢＣＭＡ」と「Ｂ−細胞成熟抗原」が切り替えて使用することができ、ヒトＢＣＭＡの変異体、アイソタイプ、生物種ホモログおよびＢＣＭＡ（例えばヒトＢＣＭＡ）と少なくとも１つの同じエピトープを有する類似物を含む。図７は、例示的なヒトＢＣＭＡ配列（配列番号７４）を示す。ＢＣＭＡタンパク質は、細胞外ドメインおよび細胞外ドメインの断片のようなＢＣＭＡの断片を含むこともでき、例えば、本発明の如何なる抗体と結合する能力を保持する断片である。
【００３６】
用語「特異的に結合する」は、抗体が抗原と選択的にまたは優先して結合することを表示する。生物光干渉測量において、抗体が約５×１０−７Ｍまたはさらに低く、約１×１０−７Ｍまたはさらに低く、約５×１０−８Ｍまたはさらに低く、約１×１０−８Ｍまたはさらに低く、約５×１０−９Ｍまたはさらに低いＫＤで、ヒトＢＣＭＡと結合すれば、当該抗体は「ヒトＢＣＭＡと特異的に結合する」抗体である。
【００３７】
「親和性」または「結合親和性」は、結合組のメンバーの間の相互作用を反映する固有結合の親和性を指す。分子Ｘのその配偶子Ｙに対する親和性は、通常、平衡解離定数（ＫＤ）によって示され、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｄｉｓとｋｏｎである）との比値である。親和性は本分野の既知の常用方法で測定される。親和性を測定するための具体的な方法は、本出願におけるＦｏｒｔｅＢｉｏ動力学結合測定法である。
【００３８】
ＢＣＭＡのような抗原と結合する参照抗体「競合結合する抗体」は、競合検定に参照抗体と抗原（例えば、ＢＣＭＡ）との結合を５０％またはさらに多くに阻害する抗体を指し、逆に、競合検定に参照抗体も当該抗体と抗原（例えば、ＢＣＭＡ）との結合を５０％またはさらに多くに阻害する。例示的な競合検定は「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に説明される。競合結合する抗体は、参照抗体と同じエピトープ領域、例えば、同じエピトープ、隣接するエピトープまたは重複するエピトープと結合することができる。
【００３９】
本出願における用語「Ｆｃ領域」は、少なくとも一部の定常領域を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を定義するのに用いられる。当該用語は、天然配列Ｆｃ−領域と変異体Ｆｃ−領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ−領域は重鎖のＣｙｓ２２６からまたはＰｒｏ２３０からカルボキシル末端に延伸する。しかし、Ｆｃ−領域のＣ−末端のリシン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、存在しなくてもよい。本出願では特記しない限り、Ｆｃ−領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムによるものであり、ＥＵ索引とも呼ばれる。例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２に記載される。
【００４０】
抗体に関連する用語「変異体」は、本出願において、既に少なくとも１個、例えば、１〜３０、１〜２０または１〜１０個、例えば、１または２または３または４または５個のアミノ酸の置換、欠如および／または挿入によってアミノ酸変異が生じた目標抗体領域（例えば、重鎖可変領域または軽鎖可変領域、または重鎖ＣＤＲ領域または軽鎖ＣＤＲ領域）を含む抗体を指し、ここで、変異体は基本的に変化前の抗体分子の生物学的特性を保持する。一態様において、本発明は、本出願に言及される如何なる抗体の変異体を含む。一実施形態において、抗体の変異体は変化前の抗体の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の生物学的活性（例えば、抗原結合能力）を保持する。一部の実施形態において、前記変化は、抗体の変異体が抗原に対する結合を失うことを引き起こさないが、高くなる抗原親和性と異なるエフェクター機能などのような性質を任意に与えることができる。理解すべきことは、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域、または各ＣＤＲ領域は単独に変化しまたは組み合わせて変化することができる。一部の実施形態において、１個または複数個または全ての３個の重鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸変異は１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を超えない。一部の実施形態において、１個または複数個または全ての３個の軽鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸変異は１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を超えない。一部の実施形態において、１個または複数個または全ての６個のＣＤＲにおけるアミノ酸変異は１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を超えない。好ましくは、前記アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、保存的な置換が好ましい。一部の実施形態において、抗体の変異体と親抗体は目標抗体配列領域に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％または９９％または更に高いアミノ酸同一性を有する。例えば、一実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれかの抗体と比べ、重鎖可変領域に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％または更に高い配列同一性を有する。もう一つの実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれかの抗体と比べ、軽鎖可変領域に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％または更に高い配列同一性を有する。もう一つの実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示される何れかの抗体と比べ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％または更に高い配列同一性を有する。
【００４１】
本出願において、「配列同一性」は、比較ウィンドウでヌクレオチドまたはアミノ酸を一つずつ比較してその配列が同じであることの割合を指す。以下の方式によって「配列同一性パーセント」を計算することができ、２本の最適に照合する配列を比較ウィンドウで比較して、マーチング位置の数を得るように２本の配列における同じ核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同じアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓとＭｅｔ）の存在する位置の数を確定して、マーチング位置の数を比較ウィンドウにおける総位置数（即ち、ウィンドウの大きさ）で割り、その結果を１００に乗じて、配列同一性パーセントを生成する。配列同一性パーセントを確定するための最適な照合は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公開されているパソコンソフトウェアを使用するように本分野に既知の様々な方式に従って実現することができる。当業者は、比較している全長配列範囲内または目標配列領域内の最大の照合に必要とする如何なるアルゴリズムを含む配列を照合するための適切なパラメータを確定することができる。
【００４２】
本発明において、抗体配列にとって、アミノ酸配列同一性パーセントは、候補抗体の配列を参照抗体の配列と最適に照合した後、好ましい案にＫａｂａｔ番号付け規則に従って最適な照合を行ってから定められる。照合後、目標抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の可変領域全体、またはその一部、例えば、１つまたは複数のＣＤＲ領域）を参照抗体の同じ領域と比較する。目標抗体領域と参照抗体領域との間の配列同一性パーセントは、目標抗体領域と参照抗体領域の両者のうちに同じアミノ酸で占められる位置の数を２つの領域の照合位置総数（ブランクを記入しない）で割って１００を乗じて得られるパーセントである。本出願において、目標抗体領域を指定しない場合、参照抗体配列の全長で照合することに適用される。一部の実施形態において、抗体にとって、配列同一性は重鎖可変領域全体および／または軽鎖可変領域全体に分布することができ、または配列パーセント同一性はフレームワーク領域のみに限定され、ＣＤＲ領域に対応している配列は１００％同じであるように保持する。
【００４３】
Ａ．本発明におけるＢＣＭＡ結合分子と組成物
Ｉ．本発明における抗ＢＣＭＡ抗体
本発明の一態様において、高標的特異性と高親和性でＢＣＭＡ（特に、膜結合性のＢＣＭＡ）と結合する抗体、特に単鎖抗体（例えば、単鎖ｓｃＦｖ抗体）を提供する。
【００４４】
本発明に係る抗体は、以下の１つまたは複数の特性を有する。
（ｉ）高親和性で、例えば、１００ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば５〜３０ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤ値で、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）と結合する；
（ｉｉ）高親和性で、例えば、１００ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば１〜４０ｎＭ、好ましくは２０ｎＭ未満、より好ましくは１０未満または５ｎＭのＥＣ５０値で、細胞の表面に発現するＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）と結合する；
（ｉｉｉ）ＢＣＭＡにおける、特にＢＣＭＡの細胞外領域ＥＣＤにおけるエピトープと特異的に結合（例えば、表１に示されるいずれか一つの抗体と同じまたは類似するエピトープを識別する）する；
（ｉｖ）表１に示されるいずれか一つの抗体と同じまたは類似する結合親和性および／または特異性を示す；
（ｖ）本出願に記載の抗体分子、例えば、表１に示されるいずれか一つの抗体分子とＢＣＭＡとの結合を抑制（例えば、競争的に抑制）する；
（ｖｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体と同じまたは重複するエピトープと結合する；
（ｖｉｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体とＢＣＭＡを競合結合しおよび／またはＢＣＭＡにおける同じエピトープと結合する；
（ｖｉｉｉ）ヒトＢＣＭＡと結合してサルＢＣＭＡと交差反応する；
（ｉｘ）本出願に記載の抗体分子、例えば、表１に示されるいずれか一つの抗体分子の１つまたは複数の生物学的特性を有する；
（ｘ）本出願に記載の抗体分子、例えば、表１に示されるいずれか一つの抗体の１つまたは複数の薬物動態学的特性を有する；
（ｘｉ）ＢＣＭＡの１つまたは複数の活性を抑制することによって、例えば、ＢＣＭＡを発現するＢ細胞または形質細胞の数量を減少することと、前記細胞の存活または増殖を抑制することとの１つまたは複数を引き起こす；
（ｘｉｉ）基本的に、ＢＡＦＦ−ＲまたはＴＡＣＩと結合しない；
（ｘｉｉｉ）ＢＣＭＡと、そのリガンド、例えばＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬまたは２つとの結合を抑制または減少する。
【００４５】
一部の実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体分子は高親和性で、例えば、下記解離平衡定数（ＫＤ）で、ヒトＢＣＭＡ（例えば配列番号７４のポリペプチド）と結合し、前記ＫＤは約１００ｎＭ未満であり、約８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭまたは５０ｎＭ以下であり、更に好ましくは、約４０ｎＭ、３０ｎＭまたは２０ｎＭ以下であり、更に好ましくは、約１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭまたは２ｎＭ以下であり、例えば、光干渉による生体測定法（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和測量法）によって測定する。
【００４６】
一部の実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体分子とヒトＢＣＭＡ（例えば配列番号７４のポリペプチド）との結合の解離速度定数（Ｋｄｉｓ）は、３×１０−２、１．５×１０−２、５×１０−３または３×１０−３ｓ−１未満であり、例えば、約１．４６×１０−３ｓ−１である。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体分子のＢＣＭＡとの結合の結合速度定数（Ｋｏｎ）は１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５または８×１０５Ｍ-１ｓ-１より大きく、例えば、約７．２９×１０５Ｍ-１ｓ−１のＫａでＢＣＭＡと結合する。
【００４７】
一部の実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体分子は高親和性でＢＣＭＡを発現する細胞と結合し、好ましくは、細胞の表面にヒトＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫細胞系（例えば、ＮＣＩ−Ｈ９２９）であり、好ましくは、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）で測定され、前記抗体と細胞の結合するＥＣ５０値は約２００ｎＭ、１５０ｎＭまたは１００ｎＭ未満であり、好ましくは、約８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭまたは５０ｎＭ以下であり、更好ましくは、約４０ｎＭ、３０ｎＭまたは２０ｎＭ以下であり、更好ましくは、約１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭまたは２ｎＭ以下である。
【００４８】
一実施形態において、抗体分子は、配列番号７４のアミノ酸配列を含むヒトＢＣＭＡと結合する。一部の実施形態において、抗体分子はＢＣＭＡに結合し、好ましくはＢＣＭＡの細胞外領域におけるエピトープに結合する。
【００４９】
一部の実施形態において、抗体分子は全長抗体である。他の一部の実施形態において、抗体分子は抗体断片である。例えば、本発明に係る抗体分子は、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、単鎖ｓｃＦｖ抗体、二重鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重鎖抗体、四重鎖抗体、ミニ抗体、または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含んでもよくまたはそれらであることができる。好ましい一実施形態において、本発明の抗体分子は、単鎖ｓｃＦｖ抗体である。好ましい一実施形態において、本発明の抗体分子は、ｓｃＦｖおよびそれに接続するＦｃ領域を含む。好ましい一実施形態において、本発明の抗体分子は、完全ヒト化のものである。
【００５０】
抗体の可変領域
「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖における抗体とその抗原との結合に参与するドメインである。重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）は、更に超可変領域（ＨＶＲ、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる）、その間に挿入されるより保存的な領域（即ち、フレームワーク領域（ＦＲ））に分けられる。各ＶＨとＶＬは３個のＣＤＲと４個のＦＲからなり、アミノ基末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。一部の状況において、単独のＶＨまたはＶＬドメインは抗原−結合特異性を十分に与える。その他、特定した抗原と結合する抗体は、前記抗原と結合する抗体に由来するＶＨまたはＶＬドメインを使用して相補ＶＬまたはＶＨドメインライブラリーを選別して分離する（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ、Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０−８８７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２（１９９１）６２４−６２８を参照する）。本出願において、「ＶＨ」または「ＶＨドメイン」は、全長抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂまたは本出願に開示されるその他の抗体断片の重鎖可変領域ＶＨを含む。本出願において、「ＶＬ」または「ＶＬドメイン」は、全長抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂは本出願に開示されるその他の抗体断片の軽鎖可変領域ＶＬを含む。
【００５１】
一実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体分子は、（ｉ）表１に示されるいずれか１つの抗体の抗原結合領域（例えば、重鎖可変領域と軽鎖可変領域対）と同じである抗原結合領域と、または（ｉｉ）アミノ酸配列では（ｉ）の抗原結合領域と、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する抗原結合領域とを含む。
【００５２】
もう一つの実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体分子は、（ｉ）表１に示されるいずれか１つの抗体の重鎖可変領域と同じである重鎖可変領域と、または（ｉｉ）アミノ酸配列に（ｉ）の重鎖可変領域と、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する重鎖可変領域と、または（ｉｉｉ）（ｉ）の重鎖可変領域の変異体とを含み、前記変異体は少なくとも１個、かつ、３０、２０または１０個を超えないアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含み、かつ、好ましくは、前記変異体は３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）において合計１０個を超えなく、好ましくは５〜０個のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換である）を含む。
【００５３】
もう一つの実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体分子は、（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の軽鎖可変領域と同じである軽鎖可変領域と、または（ｉｉ）アミノ酸配列に（ｉ）の軽鎖可変領域と、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する軽鎖可変領域と、または（ｉｉｉ）（ｉ）の軽鎖可変領域の変異体とを含み、前記変異体は少なくとも１個、かつ、３０、２０または１０個を超えないアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含み、かつ、好ましくは、前記変異体が３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）において合計１０個を超えなく、好ましくは５〜０個のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換である）を含む。
【００５４】
もう一つの実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体分子は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の重鎖可変領域と同じである重鎖可変領域と、または
（ｉｉ）アミノ酸配列に（ｉ）の重鎖可変領域と、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する重鎖可変領域と、または
（ｉｉｉ）（ｉ）の重鎖可変領域の変異体とから由来し、前記変異体は少なくとも１個、かつ、３０、２０または１０個を超えないアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含み、かつ、好ましくは、前記変異体が３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）において合計１０個を超えなく、好ましくは５〜０個のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換である）を含む。
【００５５】
かつ、前記軽鎖可変領域は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の軽鎖可変領域と同じである軽鎖可変領域と、または
（ｉｉ）アミノ酸配列に（ｉ）の軽鎖可変領域と、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する軽鎖可変領域と、または
（ｉｉｉ）（ｉ）の軽鎖可変領域の変異体とから由来し、前記変異体は少なくとも１個、かつ、３０、２０または１０個を超えないアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含み、かつ、好ましくは、前記変異体が３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）において合計１０個を超えなく、好ましくは５〜０個のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換である）を含む。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明は、表１に示されるいずれか一つの抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域対のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ抗体またはその変異体を提供する。一好ましい実施形態において、前記抗体は、配列番号４／３１、５／４１、５／４２、１０／４６、１６／５０、１７／５８、２３／６４、２７／５９、２７／７１と２７／７２から選択される選択されるアミノ酸配列対を含む。一好ましい実施形態において、前記変異体は、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有し、またはＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列に、少なくとも１個、かつ、３０、２０または１０個を超えないアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含む。
【００５７】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは、配列番号４、５と６から選択される選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬは配列番号３１、４１、４２と４３から選択される選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、配列番号６のアミノ酸配列において、Ｘは如何なるアミノ酸を表し、好ましくは、配列番号４または５の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基を表す。一部の実施形態において、配列番号４３のアミノ酸配列において、Ｘは如何なるアミノ酸を表し、好ましくは、配列番号４１または４２の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基を表す。
【００５８】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは配列番号４のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号３１のアミノ酸配列を含む。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変異を含む変異体も提供する。
【００５９】
一部の実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含み、前記ＶＨは配列番号５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号４１と４２から選択される選択されるアミノ酸配列を含む。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変異を含む変異体も提供する。
【００６０】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号４６のアミノ酸配列を含む。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変異を含む変異体も提供する。
【００６１】
一部の実施形態において、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含み、前記ＶＨは配列番号１６、１７または１９から選択される選択されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号５０と５８から選択される選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、配列番号１９のアミノ酸配列において、Ｘは如何なるアミノ酸を表し、好ましくは、配列番号１６または１７の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基を表す。
【００６２】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは配列番号１６のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号５０のアミノ酸配列を含む。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変異を含む変異体も提供する。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは配列番号１７のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号５８のアミノ酸配列を含む。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変異を含む変異体も提供する。
【００６４】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは配列番号２３のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号６４のアミノ酸配列を含む。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変異を含む変異体も提供する。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号５９、７１、７２と７３から選択される選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、配列番号７３のアミノ酸配列において、Ｘは如何なるアミノ酸を表し、好ましくは、配列番号７１または７２の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基を表す。
【００６６】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号５９のアミノ酸配列を含む。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変異を含む変異体も提供する。
【００６７】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬを含む抗ＢＣＭＡ抗体を提供し、前記ＶＨは配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号７１または７２のアミノ酸配列を含む。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨおよび／またはＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変異を含む変異体も提供する。
【００６８】
上記のいずれか１つの実施形態において、好ましくは、前記参考重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、本発明の抗体の重鎖可変領域は１つまたは複数のＣＤＲ（好ましくは全ての３つのＣＤＲである）領域に１０個を超えなく、好ましくは５個を超えない（例えば、３、２、１または０個）アミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含む。
【００６９】
上記のいずれか１つの実施形態において、好ましくは、前記参考軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して、本発明の抗体の軽鎖可変領域ＶＬは１つまたは複数のＣＤＲ（好ましくは全ての３つのＣＤＲである）領域に１０個を超えなく、好ましくは５個を超えない（例えば、３、２、１または０個）アミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含む。
【００７０】
抗体のＣＤＲ領域
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」（本出願において超可変領域「ＨＶＲ」と切り替えて使用する）は、抗体可変領域において主に抗原エピトープと結合することを担当するアミノ酸領域である。重鎖と軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ−末端から順に番号付ける。抗体の重鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる。
【００７１】
既定のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列にそのＣＤＲ配列を定めるための複数の方案が本分野において周知される。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列変異性に基づいて定められるものであるとともに、最もよく用いられるものである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは構造リングの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造リングとの間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触性」（Ｃｏｎｔａｃｔ）ＨＶＲが、取得可能な複雑な結晶構造の分析に基づいたものである。異なるＣＤＲ確定案によって、これらのＨＶＲにおける各ＨＶＲ／ＣＤＲの残基は以下のとおりである。
【００７２】
【表１】
2021512592.tif 000002
【００７３】
ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基づいて以下のようなＫａｂａｔ残基位置に位置付けるＨＶＲ配列である。
【００７４】
ＶＬにおける位置２４−３６または２４−３４（ＬＣＤＲ１）、位置４６−５６または５０−５６（ＬＣＤＲ２）と位置８９−９７または８９−９６位置（ＬＣＤＲ３）と、ＶＨにおける位置２６−３５または２７−３５Ｂ（ＨＣＤＲ１）、位置５０−６５または４９−６５（ＨＣＤＲ２）と、位置９３−１０２、９４−１０２または９５−１０２（ＨＣＤＲ３）である。
【００７５】
一実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基づいて以下のようなＫａｂａｔ残基位置に位置付けるＨＶＲ配列である。
【００７６】
ＶＬにおける位置２４−３４（ＬＣＤＲ１）、位置５０−５６（ＬＣＤＲ２）と、位置８９−９７（ＬＣＤＲ３）およびＶＨにおける位置２７−３５Ｂ（ＨＣＤＲ１）、位置５０−６５（ＨＣＤＲ２）と、位置９３−１０２（ＨＣＤＲ３）である。
【００７７】
ＨＶＲは、参考ＣＤＲ配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか１つ）と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することに基づいて定められることができる。
【００７８】
特記しない限り、本発明において、用語「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」または「ＨＶＲ」または「ＨＶＲ配列」は上記のいずれか一つの方式で定められるＨＶＲまたはＣＤＲ配列を含む。
【００７９】
特記しない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）を言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））に基づいた番号付け位置を指す。
【００８０】
一好ましい実施形態において、本発明の抗体のＨＣＤＲ１はＡｂＭ案に基づいて定められたＣＤＲ配列であるが、残りのＣＤＲはＫａｂａｔ案に基づいて定められるＣＤＲ配列である。もう一つの好ましい実施形態において、本発明のＣＤＲ配列は表２に示されるようである。
【００８１】
異なる特異性（即ち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかし、抗体と抗体との間にあるＣＤＲが異なるにもかかわらず、ＣＤＲには限られた数のアミノ酸位置のみを抗原との結合に直接参与する。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭとＣｏｎｔａｃｔ方法のうちの少なくとも２つを使用することにより、最小の重複領域を確定することができ、それによって抗原と結合するための「最小結合単位」を提供する。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であることができる。当業者が明らかにしたように、抗体の構造とタンパク質のフォールディングによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基を確定することができる。従って、本発明は、本出願に提供される如何なるＣＤＲの変異体も考慮する。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基はそのまま保持することができ、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａに基づいて定義された残りのＣＤＲ残基は保存的なアミノ酸残基で置換されることができる。
【００８２】
一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか１つの抗体に対応するＣＤＲと同じである少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲまたはその変異体を含む。一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか１つの抗体に対応する重鎖ＣＤＲと同じである少なくとも１つ、２つまたは３つのＨＣＤＲまたはその変異体を含む。一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、表１に示されるいずれか１つの抗体に対応する軽鎖ＣＤＲと同じである少なくとも１つ、２つまたは３つのＨＣＤＲまたはその変異体を含む。本出願において、ＣＤＲ変異体は、既に少なくとも１つ、例えば、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸の置換、欠如および／または挿入によって修飾されるＣＤＲであり、ＣＤＲ変異体を含む抗原結合分子は基本的に未修飾のＣＤＲの抗原結合分子の生物学的特性を保持し、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の生物学的活性（例えば抗原結合能力）を保持する。各ＣＤＲが単独で修飾されても組み合わせて修飾されてもよいことを理解できる。好ましくは、アミノ酸修飾はアミノ酸置換であり、特に保存的なアミノ酸置換であり、例えば、表Ａに示される好ましい保存的なアミノ酸置換である。
【００８３】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、前記ＨＣＤＲ３は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の重鎖可変領域のＨＣＤＲ３と同じであり、または、
（ｉｉ）（ｉ）のＨＣＤＲ３に対して、少なくとも一個、かつ、５個以下（好ましくは１〜３個であり、またはより好ましくは１〜２個である）のアミノ酸変異（好ましくは置換であり、より好ましくは保存的な置換である）を含む。
【００８４】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、かつ前記抗体の重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）と軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の重鎖と軽鎖可変領域の配列のＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３とは同じであり、または、
（ｉｉ）（ｉ）のＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３に対して、合計で少なくとも一個、かつ、５個以下（好ましくは１〜３個であり、より好ましくは１〜２個である）のアミノ酸変異（好ましくは置換であり、より好ましくは保存的な置換である）を含む。
【００８５】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とはそれぞれ同じであり、または、
（ｉｉ）（ｉ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３に対して、合計で少なくとも一個、かつ、１０個以下を含み、好ましくは５個以下（好ましくは１、２または３個である）のアミノ酸変異（好ましくは置換、より好ましくは保存的な置換）を含み、かつ、好ましくはＨＣＤＲ３領域におけるアミノ酸変異が３個以下（例えば、２、１または０個）である。
【００８６】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、かつ、前記軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の重鎖と軽鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３とはそれぞれ同じであり、または、
（ｉｉ）（ｉ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３に対して、合計で少なくとも一個、かつ、１０個以下（好ましくは１〜５個であり、好ましくは１、２または３個である）のアミノ酸変異（好ましくは置換であり、より好ましくは保存的な置換である）を含む。
【００８７】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３とはそれぞれ同じであり、または、
（ｉｉ）（ｉ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３に対して、合計で少なくとも一個、かつ、１０個以下（好ましくは１〜５個であり、好ましくは１、２または３個である）のアミノ酸変異（好ましくは置換であり、より好ましくは保存的な置換である）を含む。
【００８８】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、かつ前記軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３とＨＣＤＲ３は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の軽鎖と重鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ３とはそれぞれ同じであり、または、
（ｉｉ）（ｉ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３とＨＣＤＲ３に対して、合計で少なくとも一個、かつ、１０個以下（好ましくは１〜５個であり、好ましくは１、２または３個である）のアミノ酸変異（好ましくは置換であり、より好ましくは保存的な置換である）を含む。
【００８９】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、かつ前記軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含み、前記抗体は、
（ｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体の重鎖と軽鎖可変領域の全ての６個ＣＤＲ領域の配列を含み、または、
（ｉｉ）表１に示されるいずれか一つの抗体に対して、全ての６個ＣＤＲ領域で１０個以下、好ましくは５個以下（例えば、３、２、１または０個である）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を含む。
【００９０】
一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号４または５に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号３１、４１または４２に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉ）配列番号１０に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号４６に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉｉ）配列番号１６または１７に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号５０または５８に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、
（ｉｖ）配列番号２３に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号６４に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列、または、
（ｖ）配列番号２７に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列、および、配列番号５９または７１または７２に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む。
【００９１】
好ましい一実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、以下の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）から選択される選択されるＨＣＤＲ１、２と３配列とＬＣＤＲ１、２と３配列を含む。
（ｉ）配列番号４のＶＨと配列番号３１のＶＬ；
（ｉｉ）配列番号５のＶＨと配列番号４１のＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号５のＶＨと配列番号４２のＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１０のＶＨと配列番号４６のＶＬ；
（ｖ）配列番号１６のＶＨと配列番号５０のＶＬ；
（ｖｉ）配列番号１７のＶＨと配列番号５８のＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号２３のＶＨと配列番号６４のＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号２７のＶＨと配列番号５９のＶＬ；
（ｉｘ）配列番号２７のＶＨと配列番号７１のＶＬ；
（ｘ）配列番号２７のＶＨと配列番号７２のＶＬ。
【００９２】
一部の実施形態において、本発明は、配列番号３、９、１３、１４、１５、２２と２６のＨＣＤＲ３と、当該ＨＣＤＲ３を含む抗体または抗原結合断片を提供する。
【００９３】
一部の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号３のＨＣＤＲ３、および、配列番号３０、３８、３９と４０から選択される選択されるＬＣＤＲ３、または（ｉｉ）配列番号９のＨＣＤＲ３、および、配列番号４５のＬＣＤＲ３、または（ｉｉｉ）配列番号１３、１４と１５から選択されるＨＣＤＲ３、および、配列番号４９と５５から選択されるＬＣＤＲ３、または（ｉｖ）配列番号２２のＨＣＤＲ３と配列番号６３のＬＣＤＲ３、または（ｖ）配列番号２６のＨＣＤＲ３、および、配列番号５６、６８、６９と７０から選択されるＬＣＤＲ３から選択されるＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３配列の組み合せ、および当該組み合せを含む抗体または抗原結合断片を提供する。本発明は、前記ＣＤＲ組み合せの変異体も提供し、例えば、前記ＣＤＲで、合計で少なくとも一個、かつ、２０、１０または５個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含む変異体。本発明は、前記変異体を含む抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片も提供する。
【００９４】
他の一部の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２と配列番号３のＨＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２と配列番号９のＨＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号１１のＨＣＤＲ１、配列番号１２のＨＣＤＲ２と配列番号１３または１４または１５のＨＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣＤＲ２と配列番号２２のＨＣＤＲ３、（ｖ）配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２５のＨＣＤＲ２と配列番号２６のＨＣＤＲ３から選択されるＣＤＲ配列の組み合せ、および、当該組み合せを含む抗体または抗原結合断片を提供する。一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１のＨＣＤＲ１、配列番号１２のＨＣＤＲ２と配列番号１３または１４のＨＣＤＲ３を含む。
【００９５】
もう一つの実施形態において、本発明は、配列番号１／２／３、７／８／９、１１／１２／１３、１１／１２／１４、２０／２１／２２、および、２４／２５／２６というアミノ酸配列の組み合せから選択される重鎖ＣＤＲ組み合せ（順番に従ってそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３である）を提供する。本発明は、前記重鎖ＣＤＲ組み合せの変異体も提供し、好ましい一実施形態において、前記変異体は、前記３つのＣＤＲ領域に、合計で少なくとも１個、かつ、２０、１０または５個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含む。本発明は、前記重鎖ＣＤＲ組み合せまたは前記変異体を含む抗ＢＣＭＡ抗体も提供する。
【００９６】
一部の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２と配列番号３０のＬＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号３２または３３または３４のＬＣＤＲ１、配列番号３５または３６または３７のＬＣＤＲ２と配列番号３８または３９または４０のＬＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号４４のＬＣＤＲ２と配列番号４５のＬＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４７のＬＣＤＲ１、配列番号４８のＬＣＤＲ２と配列番号４９のＬＣＤＲ３、（ｖ）配列番号５１のＬＣＤＲ１、配列番号５４のＬＣＤＲ２と配列番号５５のＬＣＤＲ３、（ｖｉ）配列番号６１のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号６３のＬＣＤＲ３、（ｖｉｉ）配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号５６のＬＣＤＲ３、（ｖｉｉｉ）配列番号６５または６６または６７のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号６８または６９または７０のＬＣＤＲ３から選択されるＣＤＲ組み合せ、および、当該組み合せを含む抗体または抗原結合断片を提供する。
【００９７】
もう一つの実施形態において、本発明は、配列番号２８／２９／３０、３２／３５／３８、３３／３６／３９、３２／４４／４５、４７／４８／４９、５１／５４／５５、６１／６２／６３、５２／６２／５６、６５／６２／６８、および６６／６２／６９というアミノ酸配列の組み合せから選択される軽鎖ＣＤＲ組み合せ（順番に従ってそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３である）を提供する。本発明は、前記軽鎖ＣＤＲ組み合せの変異体も提供し、好ましい一実施形態において、前記変異体は、前記３つのＣＤＲ領域に、合計で、少なくとも１個、かつ、２０、１０または５個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含む。本発明は、前記軽鎖ＣＤＲ組み合せまたは前記変異体を含む抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片も提供する。
【００９８】
一部の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２と配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２と配列番号３０のＬＣＤＲ３、（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２と配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号３２または３３または３４のＬＣＤＲ１、配列番号３５または３６または３７のＬＣＤＲ２と配列番号３８または３９または４０のＬＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２と配列番号９のＨＣＤＲ３、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号４４のＬＣＤＲ２と配列番号４５のＬＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号１１のＨＣＤＲ１、配列番号１２のＨＣＤＲ２と配列番号１３または１４または１５のＨＣＤＲ３、配列番号４７のＬＣＤＲ１、配列番号４８のＬＣＤＲ２と配列番号４９のＬＣＤＲ３、（ｖ）配列番号１１のＨＣＤＲ１、配列番号１２のＨＣＤＲ２と配列番号１３または１４または１５のＨＣＤＲ３、配列番号５１のＬＣＤＲ１、配列番号５４のＬＣＤＲ２と配列番号５５のＬＣＤＲ３、（ｖｉ）配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣＤＲ２と配列番号２２のＨＣＤＲ３、配列番号６１のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号６３のＬＣＤＲ３、（ｖｉｉ）配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２５のＨＣＤＲ２と配列番号２６のＨＣＤＲ３、配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号５６のＬＣＤＲ３、（ｖｉｉｉ）配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２５のＨＣＤＲ２と配列番号２６のＨＣＤＲ３、配列番号６５または６６または６７のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号６８または６９または７０のＬＣＤＲ３から選択されるＣＤＲ組み合せ、および、当該組み合せを含む抗体または抗原結合断片を提供する。
【００９９】
もう一つの実施形態において、本発明は、配列番号１／２／３／２８／２９／３０、１／２／３／３２／３５／３８、１／２／３／３３／３６／３９、７／８／９／３２／４４／４５、１１／１２／１３／４７／４８／４９、１１／１２／１４／５１／５４／５５、２０／２１／２２／６１／６２／６３、２４／２５／２６／５２／６２／５６、２４／２５／２６／６５／６２／６８、および２４／２５／２６／６６／６２／６９というアミノ酸配列の組み合せから選択される重鎖と軽鎖ＣＤＲ組み合せ（順番に従ってそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３）を提供する。本発明は、前記ＣＤＲ組み合せの変異体も提供し、好ましい一実施形態において、前記変異体は前記６個ＣＤＲ領域に、合計で少なくとも１個、かつ、２０、１０または５個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的な置換である）を含む。本発明は、前記重鎖と軽鎖ＣＤＲ組み合せまたは前記変異体を含む抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片も提供する。
【０１００】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２と配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２と配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０１】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２と配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３５のＬＣＤＲ２と配列番号３８のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０２】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２と配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号３３のＬＣＤＲ１、配列番号３６のＬＣＤＲ２と配列番号３９のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０３】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２と配列番号９のＨＣＤＲ３、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号４４のＬＣＤＲ２と配列番号４５のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０４】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１のＨＣＤＲ１、配列番号１２のＨＣＤＲ２と配列番号１３のＨＣＤＲ３、配列番号４７のＬＣＤＲ１、配列番号４８のＬＣＤＲ２と配列番号４９のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０５】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１のＨＣＤＲ１、配列番号１２のＨＣＤＲ２と配列番号１４のＨＣＤＲ３、配列番号５１のＬＣＤＲ１、配列番号５４のＬＣＤＲ２と配列番号５５のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０６】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣＤＲ２と配列番号２２のＨＣＤＲ３、配列番号６１のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号６３のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０７】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２５のＨＣＤＲ２と配列番号２６のＨＣＤＲ３、配列番号５２のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号５６のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０８】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２５のＨＣＤＲ２と配列番号２６のＨＣＤＲ３、配列番号６５のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号６８のＬＣＤＲ３を含む。
【０１０９】
一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２５のＨＣＤＲ２と配列番号２６のＨＣＤＲ３、配列番号６６のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２と配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む。
【０１１０】
一部の実施形態において、配列番号１５におけるＸは如何なるアミノ酸残基を表し、好ましくは在配列番号１３または１４の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基であり、好ましくはＳまたはＲまたはその保存的な置換残基である。一部の実施形態において、配列番号３４におけるＸは、如何なるアミノ酸残基を表し、好ましくは配列番号３２または３３の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基である。一部の実施形態において、配列番号３７におけるＸは、如何なるアミノ酸残基を表し、好ましくは配列番号３５または３６の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基である。一部の実施形態において、配列番号４０におけるＸは、如何なるアミノ酸残基を表し、好ましくは配列番号３８または３９の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基である。一部の実施形態において、配列番号６７におけるＸは、如何なるアミノ酸残基を表し、好ましくは配列番号６５または６６の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基である。一部の実施形態において、配列番号７０におけるＸは、如何なるアミノ酸残基を表し、好ましくは配列番号６８または６９の対応する位置にあるアミノ酸残基またはその保存的な置換残基である。
【０１１１】
本発明の抗体の上記実施形態において、「保存的な置換」は、あるアミノ酸を化学の類似なアミノ酸に置換することを引き起こすアミノ酸変異を指す。機能上の類似なアミノ酸の保存的な置換表は、本分野において熟知するものである。本発明のいずれか一つの実施形態において、好ましい一態様において、保存的な置換残基は、以下の保存的な置換表Ａに由来し、好ましくは表Ａに示される好ましい置換残基である。
【０１１２】
【表２】
2021512592.tif 000003
【０１１３】
例示的な抗体配列
本発明は、実施例のように分離して特徴づけされる、ＢＣＭＡと特異的に結合（例えば、ヒトＢＣＭＡ）する完全ヒト化抗体を提供する。下記表１に本発明のこれらの例示的な抗体の可変領域配列を示す。下記表２にこれらの抗体の例示的なＣＤＲ配列（図４にも示す）を示す。
【０１１４】
【表３】
2021512592.tif 000004
【０１１５】
【表４】
2021512592.tif 000005
【０１１６】
本発明は、上記抗体の変異体も提供する。一実施形態において、抗体のアミノ酸配列またはアミノ酸配列をコーディングする核酸が既に突然変異されたが、表１に説明された配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％または更に高い同一性を有する。一部の実施形態において、抗体は、突然変異された可変領域のアミノ酸配列を含み、表１に示される可変領域配列と比べる時、可変領域に１、２、３、４、５または１０個以下のアミノ酸が既に突然変異されたが、基本的に同じ抗原結合活性を保留する。
【０１１７】
なお、上記抗体は、何れもＢＣＭＡと結合できるため、ＢＣＭＡと結合する本発明のその他の抗体を生じるようにＶＨとＶＬ（アミノ酸配列と前記アミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列である）を「混合とマッチングする」ことができる。本分野に既知の結合測定法（例えば、ＥＬＩＳＡと実施例部分に記述された他の測定法である）を使用してこのような「混合とマッチングした」抗体とＢＣＭＡとの結合を測定することができる。これらの鎖を混合とマッチングする時、好ましくは、具体的なＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列を構造が類似するＶＨ配列に切り替える。同様に、所定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列は、構造上に類似するＶＬ配列に切り替えることが好ましい。
【０１１８】
他の態様において、本発明は、上記抗体の変異体も提供する。一実施形態において、抗体は、１つまたは複数または全ての６個ＣＤＲ領域におけるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列をコーディングする核酸に、既に突然変異される。一部の実施形態において、突然変異されたＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、表１の対応するＣＤＲ領域と比べる時、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が既に突然変異されたが、基本的に同じ抗原結合活性を保留する。
【０１１９】
その他、表１の各抗体が何れもＢＣＭＡと結合できかつ抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２と３領域から提供されるため、ＢＣＭＡと結合する本発明のその他の分子を生じるように、ＶＨ  ＣＤＲ１、２と３配列とＶＬ  ＣＤＲ１、２と３配列を「混合とマッチングする」（即ち、異なる抗体に由来するＣＤＲを混合とマッチングすることができ、但し、各抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、２と３とＶＬ  ＣＤＲ１、２と３を含有することが好ましい）ことができる。本分野に既知の結合測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒｅ）と実施例に説明されたそれらの測定法を使用し、これらの「混合とマッチングした」抗体とＢＣＭＡとの結合を測定することができる。ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合してマッチングする時、所定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造上の類似するＣＤＲ配列に切り替えることが好ましい。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合とマッチングする時、所定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造上に類似するＣＤＲ配列に切り替えることが好ましい。当業者は、本発明のその他の抗体を生じるように、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を本出願に示される抗体の構造上に類似するＣＤＲ配列に置換することができることを明らかにする。前記のほか、一実施形態において、本出願に記載される抗体の抗原結合断片は、ＶＨ  ＣＤＲ１、２と３、またはＶＬ  ＣＤＲ１、２と３を含むことができ、当該断片は単領域の形でＢＣＭＡと結合する。
【０１２０】
ＩＩ．単鎖ｓｃＦｖ抗体
好ましい一態様において、本発明に係る抗体は単鎖ｓｃＦｖ抗体である。
【０１２１】
本出願において、「単鎖ｓｃＦｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」または「単鎖ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンまたは抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単一ポリペプチド鎖を指し、当該単一タンパク鎖においてＶＨ領域とＶＬ領域がペアリングして抗原結合部位を提供する。
【０１２２】
好ましい実施形態において、本発明の単鎖ｓｃＦｖ抗体のＶＨ領域とＶＬ領域は、例えば、可動性リンカーのようなリンカーによって共有結合的に接続される。用語「可動性リンカー」は、アミノ酸からなるペプチドリンカーである。このようなペプチドリンカーは、抗体における各可変ドメイン、例えば、ＶＨとＶＬ領域を接続することができる。ペプチドリンカーは、通常、フレキシブルを発現するグリシンおよび溶解性を発現するセリンまたはトレオニンに富む。例えば、グリシンおよび／またはセリン残基を単独に使用しても組み合わせて使用してもよい。可動性リンカーまたはペプチドリンカーの非限定的な例は、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８０（６）：１９１０−１９１７（２００８）、ＷＯ２０１２／１３８４７５とＷＯ２０１４／０８７０１０に開示され、その内容全体を参考として取り込まれる。本分野の既知のように、ｓｃＦｖの構成において、好ましくは、リンカーがＶＨとＶＬとのペアリングを促進するように役立ち、かつ、ＶＨとＶＬ対が機能の有効な抗原結合部位を形成することを干渉しない。
【０１２３】
一部の実施形態において、本発明に係るｓｃＦｖ単鎖抗体は、ペプチド結合で接続するアミノ酸残基からなる可動性リンカーまたはペプチドリンカーを含む。一部の実施形態において、前記アミノ酸は２０種類の天然アミノ酸から選択される。他の一部の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸はグリシン、セリン、トレオニン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンとリシンから選択される。好ましい一実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ＰｒｏとＧｌｕから選択される。
【０１２４】
一部の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜３０個のアミノ酸、または約１０個から約２５個のアミノ酸、約１５個から約２０個のアミノ酸または約１０個から約２０個のアミノ酸または如何なる途中に介するアミノ酸の長さである。好ましい実施形態において、リンカーは１５〜２５個のアミノ酸残基の長さを有し、より好ましい実施形態において、１５〜１８個のアミノ酸残基の長さを有する。一部の実施形態において、リンカーの長さは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個または更に多くのアミノ酸である。
【０１２５】
本発明のペプチドリンカーに用いられる実例は、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および、本分野に既知のその他のフレキシブルリンカーを含み、但し、ｎは少なくとも１、２、３、４または５の整数である。当業者は、一部の実施形態において、ＶＨとＶＬとの間のリンカーは全て可動性リンカーからなり、または可動性リンカー部分および小さいフレキシブル構造を付与する１つまたは複数の部分からなることが理解できる。
【０１２６】
好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９３）である。一実施形態において、配列番号９３のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列は配列番号９４に示される。一実施形態において、配列番号９３のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列は配列番号９７に示される。
【０１２７】
一実施形態において、ペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒ接続ペプチドである。一実施形態において、ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎリンカーであり、ここで、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン（ｘ＝３、ｎ＝８、９または１０）または（ｘ＝４とｎ＝６、７または８）であり、一実施形態において、ｘ＝４、ｎ＝６または７である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｎを含むことができ、ここで、ｎは１以上の整数であり、例えば、ｎは１〜７の整数である。好ましい一実施形態において、ｘ＝４であり、ｎ＝７である。一実施形態において、リンカーは（Ｇ４Ｓ）３である。一実施形態において、リンカーは（Ｇ４Ｓ）４である。一実施形態において、リンカーは（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２である。
【０１２８】
その他の例示的なリンカーは、ＧＧＧ、ＤＧＧＧＳ、ＴＧＥＫＰ（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ５５２５−５５３０（１９９７）を参照する）、ＧＧＲＲ（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、上記と同様である）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ここで、ｎ＝１、２、３、４または５（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ９３、１１５６−１１６０（１９９６）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰというアミノ酸配列を含むが、これらに限定されない。選択的に、ＤＮＡ−結合部位とペプチド自身をモデリングできるパソコンプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４））を使用することができ、またはバクテリオファージまたは酵母ディスプレイ方法によって、フレキシブルリンカーを合理的に設計することができる。
【０１２９】
本発明の単鎖ｓｃＦｖ抗体におけるＶＨとＶＬはいずれか１つの方向を選択することができる。一部の実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ、またはＶＬ−リンカー−ＶＨを含む。好ましい一実施形態において、本発明単に係る単鎖ｓｃＦｖ抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含む。好ましい一実施形態において、ＶＬはそのＣ末端がリンカーによってＶＨのＮ末端に共有結合接続される。
【０１３０】
一部の実施形態において、リンカーの他に、ＶＬとＶＨドメインとの間に所定の機能を有するその他のポリペプチド断片、例えば、免疫反応を調節する機能を有するポリペプチド断片、または細胞溶解または細胞殺滅を引き起こすことを有するポリペプチド断片を挿入することができる。
【０１３１】
一部の実施形態において、単鎖抗体を安定させるように、ｓｃＦｖにジスルフィド結合を導入することができる。例えば、鎖内または鎖間のジスルフィド結合を導入することによってｓｃＦｖのＶＨとＶＬのフレームワーク領域を接続することができる。一実施形態において、抗体ＶＨとＶＬの各１つのアミノ酸残基、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基づくＶＨの４４位とＶＬの１００位、またはＶＨの１０５位とＶＬの４３位をシステインに突然変異することができる。
【０１３２】
本発明の単鎖ｓｃＦｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３、１９８８）のように、ＶＨ−とＶＬ−コーディング配列を含む核酸によって発現することができる。さらに、米国特許番号５，０９１，５１３、５，１３２，４０５と４，９５６，７７８および米国特許公開番号２００５０１９６７５４と２００５０１９６７５４を参照することもできる。一部の実施形態において、本発明の単鎖ｓｃＦｖ抗体は、真核細胞、例えば酵母細胞、Ｈ２９３細胞またはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞に発現される。一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号９９のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号９９は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１００のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１３３】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１３４】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号４に示される配列を有するＶＨと、配列番号３１に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号４に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号３１に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号３のＨＣＤＲ３と配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２８のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２９のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号３０のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号２８のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２９のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号３０のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１３５】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１０２のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１０２は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１０３のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１３６】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５に示される配列を有するＶＨと、配列番号４１に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号４１に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号３のＨＣＤＲ３と配列番号３８のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号３２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３５のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号３８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号３２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３５のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号３８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１３８】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１０５のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１０５は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１０６のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１３９】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５に示される配列を有するＶＨと、配列番号４２に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号４２に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号３のＨＣＤＲ３と配列番号３９のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号３３のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３６のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号３９のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号３３のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号３６のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号３９のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１４１】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１０８のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１０８は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１０９のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１４２】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１０に示される配列を有するＶＨと、配列番号４６に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１０に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号４６に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号９のＨＣＤＲ３と配列番号４５のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号９のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号３２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４４のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号４５のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号７のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号９のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号３２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４４のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号４５のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１４４】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１１１のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１１１は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１１２のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１４５】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１６に示される配列を有するＶＨと、配列番号５０に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１６に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号５０に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１３のＨＣＤＲ３と配列番号４９のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号１３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号４７のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４８のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号４９のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号１３のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号４７のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４８のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号４９のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１４７】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１１４のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１１４は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１１５のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１４８】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１７に示される配列を有するＶＨと、配列番号５８に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１７に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号５８に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１４のＨＣＤＲ３と配列番号５５のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号１４のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５１のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５４のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号５５のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１２のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号１４のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号５１のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５４のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号５５のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１５０】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１２０のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１２０は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１２１のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１５１】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号６４のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２３に示される配列を有するＶＨと、配列番号６４に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２３に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号６４に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２２のＨＣＤＲ３と配列番号６３のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２０のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２１のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号２２のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号６１のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号６３のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２０のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２１のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号２２のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号６１のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号６３のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１５３】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１１７のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１１７は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１１８のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１５４】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７に示される配列を有するＶＨと、配列番号５９に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号５９に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２６のＨＣＤＲ３と配列番号５６のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２４のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２５のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号２６のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号５６のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２４のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２５のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号２６のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号５２のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号５６のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１５６】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１２３のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１２３は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１２４のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１５７】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号７１のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７に示される配列を有するＶＨと、配列番号７１に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号７１に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２６のＨＣＤＲ３と配列番号６８のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２４のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２５のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号２６のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号６５のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号６８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２４のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２５のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号２６のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号６５のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号６８のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１５９】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖまたはその抗原結合断片であり、配列番号１２６のアミノ酸配列の抗原結合領域またはその変異体を含み、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片）と特異的に結合する。一部の実施形態において、変異体と配列番号１２６は少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する。一実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号１２７のヌクレオチドによってコーディングされる。
【０１６０】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に任意に選択するリンカー、例えば、リンカーペプチドと、を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１６１】
一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号７２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７に示される配列を有するＶＨと、配列番号７２に示される配列を有するＶＬと、を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２７に示される配列のＶＨの３つのＨＣＤＲ配列および／または配列番号７２に示される配列のＶＬの３つのＬＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２６のＨＣＤＲ３と配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２４のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２５のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号２６のＶＨ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号６６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号６９のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号２４のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２５のＶＨ  ＣＤＲ２と配列番号２６のＶＨ  ＣＤＲ３、および、配列番号６６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＬ  ＣＤＲ２と配列番号６９のＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１６２】
ＩＩＩ．ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体
Ｆｃ領域を有する抗体は、いくつかのメリットを有し、Ｆｃ領域によってエフェクター機能、例えば、ＣＤＣとＡＤＣＣ免疫学的活性を介在できることと、Ｆｃ領域の二量化機能で二価の抗体を形成することによって、高い抗原と結合する親和性を提供し、および／または血漿中の半減期と腎臓クリアランス率を変化させることと、二価の抗体が単価のＦａＢまたはｓｃＦｖ抗体と異なる速度でインターナリゼーションし、免疫機能またはベクター機能を変えることができることとを含むが、これらに限定されない。例えば、α放射体は、インターナリゼーションすることで標的細胞を殺す必要がないが、多くの薬物と毒素が免疫複合物のンターナリゼーションから利益を受ける。
【０１６３】
従って、好ましい一実施形態において、本発明に係る単鎖ｓｃＦｖ抗体と抗体Ｆｃ領域が融合して形成したｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を提供する。一部の実施形態において、前記抗体は、本発明の単鎖ｓｃＦｖ抗体と野生型または変えられたＦｃ領域を含む。好ましい一実施形態において、前記抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆｃ−ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＦｃ−ＶＬ−リンカー−ＶＨ、または、好ましくはＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＦｃまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ−Ｆｃを含む。好ましい一実施形態において、Ｆｃは、ヒンジ領域によって可変領域（ＶＨまたはＶＬ）に接続される。一部の実施形態において、Ｆｃは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域に由来し、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する。好ましい一実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号１３２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１３２のアミノ酸配列に対して少なくとも１、２または３個であり、かつ、２０個、１０個または５個以下のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列、または、配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも９５〜９９％の同一性を有する配列を有する。一部の実施形態において、本発明の単鎖ｓｃＦｖ抗体は、ヒンジ領域によってＦｃ領域に接続される。一実施形態において、ヒンジ領域はＣ８ヒンジ領域であり、例えば、配列番号９５に示されるアミノ酸配列、または配列番号９５のアミノ酸配列に対して少なくとも１、２または３個であり、かつ、５個以下のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
一部の好ましい実施形態において、本発明は、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片である）と特異的に結合し、配列番号１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５と１２８から選択されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも１、２または３個であり、かつ、２０個以下、１０個以下または５個以下のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体を提供する。
【０１６５】
下記表３に、本発明の一部の例示的なＳｃＦｖ−Ｆｃ抗体のアミノ酸配列およびその単鎖ｓｃＦｖを構成するためのアミノ酸配列とヌクレオチド配列を示す。表３にも、ＵＳ２０１７０２２６２１６Ａ１の説明に基づいて構成したｓｃＦｖ−Ｆｃ組換え単鎖抗体を参照するアミノ酸配列とヌクレオチド配列を示す。これらのｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体に用いられるリンカーとヒンジのアミノ酸配列とヌクレオチド配は、図８に示される。
【０１６６】
【表５】
2021512592.tif 000006
【０１６７】
一部の実施形態において、本発明のｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体は、エフェクター機能を有する。用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ−領域に起因するそれらの生物的活性を指し、抗体の種類によって変化する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧとＩｇＭという主な５つの抗体種類が存在し、これらの一部は亜綱（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１とＩｇＡ２に更に分けることができる。異なる種類の免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γとμと呼ばれる。抗体のエフェクター機能は、例えば、Ｃ１ｑ結合と補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節とＢ−細胞活性化を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本発明のｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体はエフェクター細胞が介在する細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性によってＢＣＭＡを発現する細胞（特にＭＭ細胞）の成長を阻害、抑制しおよび／または前記細胞を死滅させる。
【０１６８】
一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のＡＤＣＣ活性を高めるアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ−領域の位置２９８、３３３および／または３３４の置換（残基のＥＵ番号付け）を有するＦｃ−領域を含む。一部の実施形態において、Ｆｃ−領域を変化させることで、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）（例えば、ＵＳ６，１９４，５５１、ＷＯ９９／５１６４２とＩｄｕｓｏｇｉｅ、Ｅ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８−４１８４を参照する）の変更（即ち、向上または低減）を引き起こすことができる。
【０１６９】
他の一部の実施形態において、そのグリコシル化程度を増加または低減することおよび／またはそのグリコシル化モードを変えるようにＦｃを変化させることができる。Ｆｃのグリコシル化部位の追加または欠如に対して、アミノ酸配列を変えて１つまたは複数のグリコシル化部位を生成または除去することによって容易に実現することができる。例えば、１つまたは複数のグリコシル化部位を解消するために１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができ、これによって当該部位のグリコシル化を解消することができる。種類を変えたグリコシル化抗体、例えば、フコシル残基の量を減少した低いまたは無フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を追加した抗体を製造することができる。このような変えたグリコシル化モデルは既に抗体のＡＤＣＣ能力の向上が示されている。
【０１７０】
従って、一部の好ましい実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域が低いまたは無フコシル化抗体であることで、抗体Ｆｃドメインとエフェクター細胞に発現されたＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ）の結合親和性を顕著に向上させることができ、それによって抗体が強化した抗体依存性細胞が介在する細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性を有することを引き起こす抗体を提供する。例えば、抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％または２０％から４０％であることができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定することができ、Ａｓｎ２９７に接続される全ての糖構造（例えば、複合型、ヘテロ接合型および高マンノース型の構造である）の総和に対して、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによってフコースの量を確定し、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載された通りである。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）にあるアスパラギン残基を指し、しかし、抗体における微小な配列変化のため、Ａｓｎ２９７は位置２９７の上位または下位約±３個のアミノ酸位置、即ち位置２９４と３００との間に位置する可能性がある。例えばＵＳ２００３／０１５７１０８、ＵＳ２００４／００９３６２１を参照する。「無フコシル化」または「低フコシル化」抗体変異体に関連する開示された実例は、さらに、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ、Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６（２００４）１２３９−１２４９、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ、Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）６１４−６２２を含む。無フコシル化または低フコシル化抗体の細胞株にこのような抗体変異体を生成することができる。このような細胞の実例は、タンパク質フコシル化に欠かるＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ、Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９（１９８６）：５３３−５４５、ＵＳ  ２００３／０１５７１０８とＷＯ２００４／０５６３１２、特に実施例１１）、および、遺伝子ノックアウト細胞株、例えばα−１，６−フコース転移酵素遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトのＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ、Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）６１４−６２２、Ｋａｎｄａ、Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（２００６）６８０−６８８とＷＯ２００３／０８５１０７を参照する）を含む。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９にフコース転移酵素遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）−フコース転移酵素）に��かることによって、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞株にフコースに欠かる抗体を発現することができる。その他、ＥＰ１，１７６，１９５にも、機能が壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が説明されており、このような細胞株に発現された抗体は低フコシル化を示す。好ましくは、フコシダーゼを利用して抗体のフコシル残基を切除することができる。例えば、フコシダーゼα−Ｌ−フコシダーゼを利用して抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
【０１７１】
その他、本発明は、二分型（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）のオリゴ糖を有する抗体変異体、例えば、Ｆｃ領域に接続される二分岐のオリゴ糖がＧｌｃＮＡｃで二等分される抗体も考慮する。これらの抗体変異体は低減したフコシル化および／または向上したＡＤＣＣ機能を有することができる。これらの抗体変異体の実例は、例えばＷＯ２００３／０１１８７８、ＵＳ６，６０２，６８４とＵＳ２００５／０１２３５４６に説明される。本発明は、Ｆｃ領域に接続されるオリゴ糖に少なくとも１つの半乳糖残基を有する抗体変異体も考慮する。これらの抗体変異体は向上したＣＤＣ機能を有することができる。これらの抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７、ＷＯ１９９８／５８９６４とＷＯ１９９９／２２７６４に説明される。
【０１７２】
標的分子を評価するＡＤＣＣ活性のインビトロ測定試験の非限定的な実例は、ＵＳ５，５００，３６２（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ、Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６）７０５９−７０６３とＨｅｌｌｓｔｒｏｍ、Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（１９８５）１４９９−１５０２を参照する）、ＵＳ  ５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ、Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１−１３６１を参照する）に説明される。または、非放射性測定方法（例えば、フローサイトメトリーに用いられるＡＣＴＩ（商標）非放射性の細胞傷害測定（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）とＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性の細胞傷害測定（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照する）を採用することができる。これらの測定に適用されるエフェクター細胞は、外周血単核細胞（ＰＢＭＣ）とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。好ましくは、または、その他に、インビボで標的分子のＡＤＣＣ活性を評価することができ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ、Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５（１９９８）６５２−６５６に開示された動物モデルに評価する。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣ測定（例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２（１９９６）１６３−１７１、Ｃｒａｇｇ、Ｍ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ  １０１（２００３）１０４５−１０５２とＣｒａｇｇ、Ｍ．Ｓ．とＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ  １０３（２００４）２７３８−２７４３を参照する）を行うことができる。抗体のＣ１ｑ結合とＣＤＣ活性を確定するように、Ｃ１ｑ結合を測定することができる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９とＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑとＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照する。
【０１７３】
一部の実施形態において、本発明は、全部でないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体も考慮し、それをある応用の望ましい候補物になり、前記応用において抗体のインビボ半減期が重要であるが、一部のエフェクター機能（例えば、補体とＡＤＣＣ）が必要ではなくまたは有害である。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／喪失を確定するように、上記のようなインビトロおよび／またはインビボ測定試験を行うことができる。例えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠如する（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠如する恐れがある）ことを確保するがＦｃＲｎ結合能力を保持するように、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の結合の測定を行うことができる。例えば、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を解消又軽減する突然変異、例えば、突然変異のＰ３２９Ｇおよび／またはＬ２３４ＡとＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、または、突然変異のＰ３２９Ｇおよび／またはＳ２２８ＰとＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含むことができる。
【０１７４】
一部の実施形態において、本発明のｓｃＦｖ−Ｆｃ領域抗体は、Ｆｃ領域の二量化作用によって二価の抗体を形成することができ、これによって、高くなる抗体総親和性と安定性を更に有し、または多重特異性、例えば双特異性を形成することができる。例えば、Ｆｃ領域は、ｉ）ヒトＩｇＧ１の亜綱のホモ二量Ｆｃ−領域、またはｉｉ）ヒトＩｇＧ４の亜綱のホモ二量Ｆｃ−領域、または、ｉｉｉ）イソ二量Ｆｃ−領域を含むことができ、ここで、ａ）一つのＦｃ−領域のポリペプチドは、突然変異のＴ３６６Ｗを含むが、もう一つのＦｃ−領域のポリペプチドは、突然変異のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡとＹ４０７Ｖを含み、またはｂ）一つのＦｃ−領域のポリペプチドは、突然変異のＴ３６６ＷとＹ３４９Ｃを含むが、もう一つのＦｃ−領域のポリペプチドは、突然変異のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶとＳ３５４Ｃを含み、またはｃ）一つのＦｃ−領域のポリペプチドは、突然変異のＴ３６６ＷとＳ３５４Ｃを含むが、もう一つのＦｃ−領域のポリペプチドは、突然変異のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶとＹ３４９Ｃを含む。
【０１７５】
一部の実施形態において、本発明のｓｃＦｖ−Ｆｃ組換え抗体は、Ｆｃ領域部分によって蛍光色素、細胞毒素、放射性同位体などを含むがこれらに限定されないその他の分子と直接融合または接合でき、例えば、抗原定量研究に用いられ、抗体を固定化して親和性の測定に用いられ、治療剤の標的輸送に用いられ、免疫エフェクター細胞Ｆｃ−の介在を用いる細胞毒性試験および多くのその他の用途である。
【０１７６】
Ｂ．ポリヌクレオチドと宿主
一態様において、本発明は、基本的に精製された核酸分子を提供し、前記核酸分子は、上記ＢＣＭＡを結合する抗体鎖のセクションまたはドメインを含むポリペプチドをコーディングする。一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、ＢＣＭＡと結合する抗体鎖（例えば、本発明の如何なる抗体であり、単鎖ｓｃＦｖ抗体とｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体およびその断片を含む）をコーディングする。
【０１７７】
本発明の一部の核酸は、表１に示される如何なる抗体の重鎖可変領域またはその変異体をコーディングするヌクレオチド配列および／または表１に示される対応する抗体の軽鎖可変領域またはその変異体のヌクレオチド配列を含む。具体的な一実施形態において、核酸分子は、表１に示されるＤＮＡ  ＶＨ配列および／またはＤＮＡ  ＶＬ配列である。本発明の一部の他の核酸分子は、表１中に示される核酸分子のヌクレオチド配列と基本的に同じ（例えば、少なくとも６５％、８０％、９５％、または９９％の同一性）であるヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターが発現する時、これらのポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドは、ＢＣＭＡ抗原結合能力を示すことができる。
【０１７８】
本発明において、さらにポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは上記記載されたＢＣＭＡと結合する抗体に由来する重鎖ＶＨまたは軽鎖ＶＬ配列の少なくとも一つのＣＤＲ領域と通常の全ての３つのＣＤＲ領域をコーディングする。更なる一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、上記記載されたＢＣＭＡと結合する抗体の重鎖および／または軽鎖の完全または基本的に完全な可変領域配列をコーディングする。
【０１７９】
当業者が明らかになるように、遺伝暗号の退化性のため、各抗体またはポリペプチドアミノ酸配列は、複数の核酸配列によってコーディングすることができる。
【０１８０】
本発明の一部の核酸配列は、重鎖ＶＨをコーディングするヌクレオチド配列を含み、それは、（ｉ）配列番号７５−８２から選択されるヌクレオチド配列または例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の他の核酸配列は、軽鎖ＶＬをコーディングするヌクレオチド配列を含み、それは、配列番号８３−９２のヌクレオチド配列または例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１８１】
一部の実施形態において、本発明の核酸配列は、本発明の上記如何なる単鎖ｓｃＦｖ抗体をコーディングする。一部の実施形態において、ｓｃＦｖ抗体をコーディングする本発明の核酸配列は、以下に選択される重鎖ＶＨ配列をコーディングするヌクレオチド配列と軽鎖ＶＬ配列をコーディングするヌクレオチド配列を含む。
【０１８２】
（ｉ）配列番号７５の配列またはそれと基本的に同じ配列、および配列番号８３の配列またはそれと基本的に同じ配列であり、
（ｉｉ）配列番号７６の配列またはそれと基本的に同じ配列、および配列番号８４または８５の配列またはそれと基本的に同じ配列であり、
（ｉｉｉ）配列番号７７の配列またはそれと基本的に同じ配列、および配列番号８６の配列またはそれと基本的に同じ配列であり、
（ｉｖ）配列番号７８の配列またはそれと基本的に同じ配列、および配列番号８７の配列またはそれと基本的に同じ配列であり、
（ｖ）配列番号７９の配列またはそれと基本的に同じ配列、および配列番号８８の配列またはそれと基本的に同じ配列であり、
（ｖｉ）配列番号８０の配列またはそれと基本的に同じ配列、および配列番号８９の配列またはそれと基本的に同じ配列であり、
（ｖｉｉ）配列番号８１の配列またはそれと基本的に同じ配列、および配列番号９０の配列またはそれと基本的に同じ配列であり、
（ｖｉｉｉ）配列番号８２の配列またはそれと基本的に同じ配列、および配列番号９１または９２の配列またはそれと基本的に同じ配列である。
【０１８３】
好ましい一実施形態において、ｓｃＦｖ抗体をコーディングする本発明の核酸は、さらに、リンカーをコーディングするヌクレオチド配列、例えば、配列番号９４に示される配列またはそれと基本的に同じ配列を含む。
【０１８４】
さらに好ましい一実施形態において、ｓｃＦｖ抗体をコーディングする本発明の核酸は、配列番号１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４と１２７から選択される配列、またはそれと基本的に同じ配列を含む。
【０１８５】
上記のいずれか一つの実施形態において、好ましい一態様において、「基本的に同じ」ヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列と配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更に高い同一性を有する配列を指す。ヌクレオチド配列の同一性は、本分野の公知される各配列照合方法を使用して確定することができる。例えば、ＮＣＢＩ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のウェブサイトからＢＬＡＳＴ配列照合検索ツールを入手することができる。典型的には、パーセント同一性は、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔのデフォルトパラメータで行われる。
【０１８６】
初めから固相化ＤＮＡを合成すること、またはＢＣＡＭと結合する抗体またはその結合断片をコーディングする既存の配列（例えば、表１−３に示される配列）をＰＣＲ突然変異誘発することによって、これらのポリヌクレオチド配列を生成することができる。核酸の直接的な化学合成は、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０のリン酸トリエステル法と、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９、１９７９のリン酸ジエステル法と、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９、１９８１のジエチルホスホルイミド法と米国特許号４，４５８，０６６の固相支持法のような本分野に既知の方法によって完成することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列の突然変異導入は、例えばＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ  （編集）、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＮＹ、１９９２、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０、Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７、１９９１、ａｎｄ  Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１：１７、１９９１に説明されたように行うことができる。
【０１８７】
Ｃ．抗体の製造
抗体は、例えばＵＳ４，８１６，５６７に記載されるように、組換え法と組成物を使用して製造することができる。
【０１８８】
一実施形態において、本出願に記載のＢＣＭＡと結合する抗体をコーディングする単離された核酸を含むベクターを提供する。この核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコーディングすることができる。更なる実施形態において、ベクターは発現ベクターである。更なる実施形態において、本発明は、この核酸を含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は（例えば、既に以下のベクターで転化される）、（１）抗体ＶＬを含有するアミノ酸配列と抗体ＶＨを含有するアミノ酸配列をコーディングする核酸を含むベクター、または（２）抗体ＶＬを含有するアミノ酸配列をコーディングする核酸を含む第１ベクターと抗体ＶＨを含有するアミノ酸配列をコーディングする核酸を含む第２ベクターを含む。一実施形態において、宿主細胞は真核であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはリンパ様細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗体の発現に適する条件で上記に提供したような抗体をコーディングする核酸を含む宿主細胞を培養し、かつ、任意的に宿主細胞（または宿主細胞培地）から抗体を回収する、抗ＢＣＭＡ抗体を製造する方法を提供する。
【０１８９】
抗ＢＣＭＡ抗体の組換え製造に対して、抗体をコーディングする核酸、例えば、上記のような核酸を分離することができ、さらにクローニングおよび／または宿主細胞における発現のために１つまたは複数のベクター内に挿入する。この核酸は、通常のプロセス（例えば、抗体の重鎖と軽鎖可変領域をコーディングする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）によって、容易に分離しシークエンシングすることが可能である。
【０１９０】
複数の発現ベクターは、ＢＣＭＡと結合する抗体鎖（例えば、本発明の如何なる抗体、ｓｃＦｖ抗体と全長抗体を含む）をコーディングするポリヌクレオチドを発現するために用いられる。ウイルスに基づいた発現ベクターと非ウイルス発現ベクターは、何れも哺乳動物の宿主細胞に抗体を生成するために用いられる。非ウイルスベクターとシステムは、プラスミド、遊離したベクターと人工染色体を含み、一般的には、タンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセット（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：３４５、１９９７を参照する）を含む。有用なウイルスベクターは、ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、疱疹ウイルスを逆転写するベクターと、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰ  ＥＢウイルスウイルス、ワクシニアウイルスベクターとＳｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターとを含む。Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７、１９９５とＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３、１９９２を参照する。
【０１９１】
発現ベクターの選択は、それに存在し当該ベクターを発現する所望の宿主細胞に依存する。一般的に、発現ベクターは、ＢＣＭＡと結合する抗体鎖またはポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドに有効に接続されるプロモーターを含有する。プロモーターの他に、ＢＣＭＡと結合する抗体鎖または断片を効果的に発現するためのその他の調節素子を要求しまたは必要とする可能性がある。これらの素子は、通常、ＡＴＧ開始コドンと近隣するリボソーム結合部位またはその他配列を含む。その他、使用される細胞システムに適用されるエンハンサーを取り込むことによって発現の効率（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５、１９９４とＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６、１９８７を参照する）を強化することができる。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物の宿主細胞における発現を高めるために用いられる。
【０１９２】
発現ベクターは、さらに、ＢＣＭＡ結合ポリペプチドを含有する融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列を提供することができる。または、ベクターを挿入する前に、ＢＣＭＡと結合する抗体／ポリペプチド配列をシグナル配列に接続することができる。好ましい一実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１３３に示されるアミノ酸配列を含む。ＢＣＭＡと結合する抗体の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインをコーディングする配列を受け取るためのベクターは、さらに定常領域または他の部分をコーディングすることがある。このようなベクターは、可変領域を定常領域との融合タンパクに発現するように許可し、それによって完全な抗体またはその断片の生成を引き起こす。通常、このような定常領域は、ヒトの定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。好ましい一実施形態において、可変領域と融合するＦｃ領域は、配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１９３】
ベクターのクローンまたは発現のための適切な宿主細胞は、原核または真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化とＦｃエフェクター機能が不要な場合、抗体は細菌に生成することができる。抗体断片とポリペプチドの細菌における発現に対して、例えば、ＵＳ５，６４８，２３７、ＵＳ５，７８９，１９９とＵＳ５，８４０，５２３を参照する。（さらに、Ｃｈａｒｌｔｏｎ、Ｋ．Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８卷、Ｌｏ、Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編集）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００３）、ｐｐ．２４５−２５４に示される、抗体断片の大腸菌における発現を参照する）。発現後、抗体が可溶性画分において細菌細胞のペースト状物から分離して、さらに精製することができる。原核生物の他、糸状菌または酵母などのような真核微生物は、抗体コーディングベクターのための適切なクローンまたは発現の宿主であり、グリコシル化経路が既に「ヒト化」される真菌と酵母菌株を含み、これは、一部または完全のヒトグリコシル化モードを有する抗体の生成を引き起こす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９−１４１４とＬｉ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００６）２４：２１０−２１５を参照する。グリコシル化抗体の発現のための宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）に由来することもできる。無脊椎動物細胞の実例は、植物と昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株が昆虫細胞と組み合わせて使用することができ、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに用いられることが既に鑑定される。植物細胞の培養物も宿主として用いることができる。例えば、ＵＳ５，９５９，１７７、ＵＳ６，０４０，４９８、ＵＳ６，４２０，５４８、ＵＳ７，１２５，９７８とＵＳ６，４１７，４２９（遺伝子導入植物において抗体を製造するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を説明する）を参照する。宿主として用いられる脊椎動物細胞は、例えば、浮遊状態における成長が適応化した有用の哺乳動物細胞系を含む。有用の哺乳動物宿主細胞系のその他の実例は、ＳＶ４０形質転換のサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）、ヒト胎児腎臓系（２９３または例えばＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９９７）５９に説明した２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，  Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３−２５１に説明したＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、Ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、例えばＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３  （１９８２）４４−６８に説明し、ＭＲＣ ５細胞、とＦＳ４細胞である。その他の有用の哺乳動物宿主細胞系は、中国ハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）細胞を含み、���ＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７（１９８０）４２１６−４２２０）とＹ０、ＮＳ０とＳｐ２／０のような骨髄腫細胞系を含む。抗体の製造に適切な一部の哺乳動物宿主細胞系の概述に対して、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．とＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２４８、Ｌｏ．Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編集）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）ｐｐ．２５５−２６８を参照する。一部の好ましい実施形態において、哺乳動物宿主細胞はＢＣＭＡと結合する本発明の抗体のポリペプチドを発現して生成するために用いられる。
【０１９４】
Ｄ．抗体の選別、鑑定と特徴付け
本分野に既知の各種の試験によって、その物理的／化学的特性および／または生物的活性に対して、本出願に提供される抗ＢＣＭＡ抗体を選別、鑑定または特徴付けする。
【０１９５】
ヒト抗体を発現する酵母ディスプレイライブラリーから注目される標的抗原と高親和性で結合する酵母を選択することができる。酵母の表面に抗体または抗体断片をレンダリングまたはディスプレイしおよびライブラリーを選別する多くの方法が存在し、例えばＵＳ２０１１００７６７５２Ａ１、ＵＳ９８４５４６４Ｂ２、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ、１９９７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５，５５３−５５７、Ｂｌａｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｇｅｎｅ、３４２、２１１−２１８、Ｓａｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５、２０１６７−２０１７２、Ｔａｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０６、１２８９１−１２８９６、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎとＤｕｂｅｌ、２０１０、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＫｕｒｏｄａとＵｅｄａ  ２０１１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、３３、１−９、Ｒａｋｅｓｔｒａｗ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、ＰＥＤＳ、２４、５２５−５３０、邵栄光ら（編集）、抗体薬物研究と応用、人民衛生出版社（２０１３）を参照する。例えば、以下の非制限的な方式によって酵母ディスプレイライブラリー選別を行うことができ、先ず、磁気ビーズ選別（ＭＡＣＳ）によって選別することができる。例えば、ＩｇＧまたは抗体断片をレンダリングする酵母群をビオチン化標的抗原としばらくの間に接触してから、洗浄して、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｉｏｔｅｃから得られる）と孵化することができ、ＬＳ磁気柱（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｉｏｔｅｃから得られる）に取得することで標的抗原と結合する酵母細胞をエンリッチメントする。その後、ＦＡＣＳ技術によって複数回エンリッチメントすることができる。ＦＡＣＳ分取において、酵母群体を、濃度を低減したビオチン化の標的抗原（高親和性抗体を選別するために）または異なる生物種に由来する抗原同族体（異なる生物種の交差反応性の傾向を有する抗体を選別するために）と接触した後、細胞を洗浄して、二種類標準溶液（例えば、ストレプトアビジン−ＰＥと抗ヒトＬＣ−ＦＩＴＣの混合物を含む）に再懸濁して氷で孵化し、細胞を洗浄してからＦＡＣＳ洗浄緩衝液のような緩衝液に再懸濁して、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のようなフローサイトメトリーにＬＣ−ＦＩＴＣ陽性（ＩｇＧレンダリング）とストレプトアビジン−ＰＥ陽性（標的結合）に発現される酵母細胞を分取し、更なる増殖と選択のために用いられる。ＦＡＣＳ分取において、標的抗原とＩｇＧレンダリング酵母の代わりに、負選択試薬、例えばＸｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２０１３、Ｖｏｌ２６、Ｎｏ．１０、ｐｐ６６３−６７０）に説明した多重特異性試薬（ＰＳＲ）を用いて孵化を行うこともでき、上記の同じ二種類標準とＦＡＣＳ分取によって、抗体の非特異性結合および後続のドラッガブル問題を弱くする。
【０１９６】
抗体の鑑定に対して、その抗原結合活性をもって、例えば、ＥＬＩＳＡ、αＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、抗体またはインバータアレイなどのような既知の方法および実施例に記載の方法によって、本発明の抗体を鑑定または特徴付けることができる。
【０１９７】
例えば、抗体をガラスまたはニトロセルロースチップに滴下することができる。ＢＣＭＡを含む溶液でスライドを阻害して孵化して、未結合の抗体を除去するように洗浄し、蛍光でマークされた対応する二次抗体で結合された抗体を検出する。蛍光スライドスキャナーで蛍光信号を測定する。類似的に、インバータアレイに対して、組換えＢＣＭＡ、細胞上清、細胞または組織溶解液、体液などをガラスまたはニトロセルロースチップに滴下する。スライドを密封してＢＣＭＡにおける所定のエピトープに対する抗体でアレイを孵化する。未結合の抗体を洗浄し、蛍光でマークされた対応する二次抗体で結合された抗体を検出する。蛍光信号が蛍光スライドスキャナーによって測定される（Ｄｅｒｎｉｃｋ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、５２（２０１１）２３２３−２３３１）。
【０１９８】
ＦｏｒｔｅＢｉｏ測定法で抗体を検出することができる。ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、既存の方法（Ｅｓｔｅｐ、Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ、２０１３．５（２）：ｐ．２７０−８）に従って行うことができる。例えば、ＡＨＱセンサーを分析緩衝液の正中線の下で３０分間平衡を保ち、その後、正中線の上で６０秒検出して基線を立てる。その後、精製された抗体を分析緩衝液の正中線で入れたＡＨＱセンサーを、１００ｎＭ抗原に暴露し５分間作用し、センサーを分析緩衝液に転移して分析緩衝液の正中線の下で５分間測定する。１：１の結合モデルを使用して動力学分析を行う。
【０１９９】
フローサイトメトリーによって抗体と表面にＢＣＭＡを発現する細胞との結合を検出することもできる。例えば、ＢＣＭＡを発現するＨ９２９細胞と一連の希釈された抗体をＰＢＳ  １％  ＢＳＡに、氷にしばらくの間に（例えば、３０分間）孵化することができる。その後、二次抗体（例えば、フィコビリンでマークされた二次抗体）とＰＢＳ  １％  ＢＳＡに、氷にしばらくの間に（例えば、３０分間）孵化することができる。細胞を洗浄した後フローサイトメトリーによって細胞を分析する。フローサイトメトリーはＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に行われ、ＧｒａｐｈｐａｄソフトウェアによってＥＣ５０値を計算する。
【０２００】
Ｅ．融合物と複合体
他の態様において、本発明は、本発明に係る抗体を含む融合物または複合体を提供する。本発明の抗体を異種分子に融合または接合することによって融合物または複合体を生成することができる。一部の実施形態において、本発明に係る抗体のポリペプチドは、一つまたは複数の異種分子と融合または接合することができ、前記異種分子は、タンパク／ポリペプチド／ペプチド、マーカー、薬物と細胞傷害剤を含むが、これらに限定されない。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたは化学分子が抗体と融合または接合する方法は本分野の既知のことである。例えば、米国特許号５，３３６，６０３、５，６２２，９２９とＥＰ３６７，１６６を参照する。
【０２０１】
一実施形態において、本発明に係る抗体は、異種タンパクまたはポリペプチドまたはペプチドと組換えて融合することで融合タンパクを形成する。もう一つの実施形態において、本発明に係る抗体は、タンパク分子または非タンパク分子と接合することで複合体を生じる。
【０２０２】
一部の実施形態において、本発明に係る抗体は、全長抗体または抗体断片の形式で異種分子と融合または接合することができる。好ましい一実施形態において、本発明に係る単鎖ｓｃＦｖ抗体は、融合または接合に用いられる。更に好ましい実施形態において、本発明に係る単鎖ｓｃＦｖを含む融合タンパクを提供する。このような融合タンパクは、本分野に既知の組換え法によって容易に製造することができる。もう一つの好ましい実施形態において、本発明に係る単鎖ｓｃＦｖを含む複合体、例えば、本発明のｓｃＦｖと非タンパク薬物分子を含む複合体を提供する。
【０２０３】
リンカーは本発明に係る融合物および／または複合体における異なる実体を共有結合して接続するために用いられる。リンカーは、化学リンカーまたは単鎖ペプチドリンカーを含む。一部の実施形態において、本発明に係る単鎖抗体、例えば、ｓｃＦｖ抗体は、ペプチドリンカーによってその他のペプチド断片またはタンパク質に融合される。一部の実施形態において、本発明に係る単鎖抗体、例えばｓｃＦｖ抗体は、化学リンカーによってその他の分子、例えば、マーカーまたは薬物分子に接合される。
【０２０４】
本発明を形成するためのペプチドリンカーは、アミノ酸残基からなるペプチドを含む。このようなリンカーペプチドは、通常、フレキシブルであり、ｓｃＦｖのようなそれに接続される抗原結合部分が独立して移動できる。リンカーペプチドの長さは、当業者が実際の状況によって容易に決定するものであり、例えば、長さが少なくとも４〜１５個のアミノ酸であり、またはより長く、例えば、約２０〜２５個のアミノ酸である。
【０２０５】
本発明を形成するための化学リンカーは、例えば、各カップリング剤を含む。カップリング剤の実例は、Ｎ−スクシンイミド−３−（２−ピリジルジスルフィド基）プロピオン酸エステル（ＳＰＤＰ）、スクシンイミド−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸エステル（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミド酸エステルの双官能誘導物（例えば、ヘキサジイミド酸二メチルＨＣｌ）、活性化エステル（例えば、オクタン二酸ジスクシンイミドエステル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ジアゾ化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾ誘導物（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）および双活性フルオロ化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）がある。その他、リンカーは、ポリペプチドを標的部位に輸送した後の釈放に役立つ「細胞溶解の可能なリンカー」であることができる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感度リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたは二硫化物を含むリンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２（１９９２）１２７−１３１；ＵＳ５，２０８，０２０）を使用することができる。
【０２０６】
Ｆ．診断と検出のための方法と組成物
一態様において、本発明は、本発明に係る抗ＢＣＭＡ抗体、融合物または複合体の診断と検出における用途を提供する。本出願に提供される抗ＢＣＭＡ抗体、融合物または複合体はいずれも、生物試料におけるヒトＢＣＭＡの存在を検出するために用いられる。本出願に用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を含む。例示的な検出方法は、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、抗体分子による複合の磁気ビーズ、ＥＬＩＳＡ測定法、ＰＣＲ−技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、生物試料は、体液、細胞または組織を含む。一部の実施形態において、生物試料は、血、血清または生物に由来するその他の液体試料である。
【０２０７】
一実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体、融合物または複合体の診断または検出のための方法を提供する。更なる態様において、生物試料におけるＢＣＭＡの存在を検出する方法を提供する。一部の実施形態において、当該方法は、生物試料を抗ＢＣＭＡ抗体、融合物または複合体がＢＣＭＡとの結合を許可する条件において本出願に記載の抗ＢＣＭＡ抗体、融合物または複合体と接触し、抗ＢＣＭＡ抗体、融合物または複合体とＢＣＭＡとの間に複合物を形成するか否かを検出することを含む。このような方法は、インビトロでもインビボ方法でもよい。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体、融合物または複合体を、例えば、ＢＣＭＡが患者の選択した生物的マーカーに用いられる場合、抗ＢＣＭＡ抗体治療に適切な対象を選択するために用いる。本発明の抗体、融合物または複合体を使用して診断できる例示的な病症は、Ｂ細胞関連疾患、例えば、多発性骨髄腫を含む。一部の実施形態において、本発明の抗体、融合物または複合体で多発性骨髄腫（ＭＭ）患者を分類する方法を提供し、前記方法は、前記患者のＢ細胞、好ましくは悪性Ｂ細胞が前記Ｂ細胞の表面にＢＣＭＡタンパク質を発現するか否かを決定することを含み、前記Ｂ細胞がその表面にＢＣＭＡタンパク質を発現すれば、前記患者がそれに応じてＢＣＭＡを標的部位としての治療剤（例えば、抗−ＢＣＭＡ抗体）を用いて治療する可能性がある。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、診断剤または検出可能な剤と接合することができる。一部の実施形態において、本発明は、本発明の如何なる抗ＢＣＭＡ抗体、融合物または複合体を含む診断または検出のための試薬キットを提供する。
【０２０８】
Ｇ．治療のための方法と組成物
他の態様において、本発明は、前記対象に有效量の本発明に係る抗体またはその抗原結合断片、または本発明の融合物または複合体を投与することを含むＢ細胞関連疾患の治療方法に関する。
【０２０９】
用語「個体」または「対象」は、互いに切り替えて用いることができ、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトである。
【０２１０】
用語「治療」は、治療を受けている個体における疾病の天然過程を変化させようとする臨床介入を指す。所望の治療效果は、疾病の出現または再発を防止すること、症状を軽減すること、疾病の如何なる直接的または間接的病理学結果を減少すること、転移を防止すること、病状進展速度を低減すること、疾病の状態を改善または緩和させること、および、予後を緩和または改善させることを含むが、これらに限定されない。
【０２１１】
Ｂ細胞関連疾患は、異常なＢ細胞の活性に関連する病症であり、Ｂ細胞悪性腫瘍、形質細胞悪性腫瘍、自身免疫疾病を含むが、これらに限定されない。ＢＣＭＡ抗体を使用して治療できる例示的な病症は、例えば、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、未定悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増生疾患、免疫調節病症、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーヴス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血と急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性または免疫細胞関連澱粉様変性、または意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、全身性エリテマトーデス、リューマチ性関節炎を含む。
【０２１２】
実施例に示されるように、本発明者は、ヒト抗体ライブラリーから選別された抗体配列に基づいて本発明の抗体を構成する。従って、有利であることは、一部の実施形態において、本発明に係る抗体は完全ヒト化ＶＨ領域と完全ヒト化ＶＬ領域のアミノ酸配列を含む完全ヒト抗体であり、例えば、表１に示される抗体、および表３に示される単鎖ｓｃＦｖおよびそれによって構成されるヒトｈＦｃ断片を含むｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体である。一部の実施形態において、本発明に係る複合体と融合物は、完全ヒト抗体、例えば完全ヒト単鎖ｓｃＦｖを含む複合体と融合物である。従って、好ましい一態様において、本発明の抗体、融合物と複合体は、特にヒトの治療応用に適用される。一部の好ましい実施形態において、本発明に係る抗体、融合物と複合体は、ヒトのＢ細胞関連疾患、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療に用いられる。一部の実施形態において、本発明に係る抗ＢＣＭＡ抗体、融合物と複合体の抗腫瘍作用は、例えば、腫瘍の体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、腫瘍細胞の増殖または腫瘍細胞の生存の減少を含むが、これらに限定されない。
【０２１３】
多発性骨髄腫は、成熟した形質細胞のＢ細胞悪性腫瘍である。骨髓に、クローン性形質細胞が異常に増生し、近隣の骨を侵入することができ、および、血液を侵入することがある。多発性骨髄腫の変異体形式は、顕性の多発性骨髄腫、スモウルダリング多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型多発性骨髄腫、ＩｇＤ型多発性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨孤立性形質細胞腫および髓外形質細胞腫を含む。（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（編集）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１５版（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００１）を参照する）。
【０２１４】
複数の異なる種類の非ホジキンリンパ腫が存在する。例えば、非ホジキンリンパ腫は、侵入型（迅速に生長する）と不活性型（遅く成長する）に分けることができる。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫母細胞性大細胞リンパ腫、前体Ｂリンパ母細胞性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫を含む。骨髓または幹細胞の移植の後に発生するリンパ腫は、通常、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【０２１５】
本発明のＢＣＭＡ抗体、融合物と複合体をその他の治療形式と組み合せて投与して、上記疾病、例えば、腫瘍の治療に用いることができることが理解すべきである。前記その他の治療形式は、治療剤、放射治療、化学療法、移植、免疫療法などを含む。一部の実施形態において、本発明に係る抗体分子、融合物と複合体とその他の治療剤と組み合わせて用いられる。例示的な治療剤は、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎剤、化学療法剤、放射治療剤、治療性抗体またはその他の活性剤と補助剤、例えば、抗腫瘍薬物を含む。
【０２１６】
Ｈ．組成物と製剤
本発明は、さらに本出願のいずれか一つまたは複数のＢＣＭＡ結合抗体分子、融合物と複合体、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含む組成物を考慮する。組成物は、医薬組成物を含むが、それに限定されない。医薬組成物は、細胞または動物に単独で用いても一つまたは複数のその他の治療形式と組み合せ用いることができる。
【０２１７】
本発明に係る抗体、融合物と複合体の薬物製剤を製造でき、例えば、所望の純度を有する抗体、融合物と複合体を、一つまたは複数の好ましい薬剤として許容可能なベクター（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．（編集）（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形式で製造する。薬剤として許容可能なベクターは、用いられる剤量と濃度下で受容者に対して一般的に毒がなく、かつ、リン酸塩、クエン酸塩とその他の有机酸のような緩衝剤；アスコルビン酸とメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；ベンゼンフェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルのようなｐ−ヒドロキシ安息香酸アルキル；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールとｍ−クレゾール）、低分子量（約１０個以下の残基）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリ（ビニルピロリドン）のような親水ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギナーゼ、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；単糖、二糖、および、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属複合物（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合物）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン型表面活性剤を含むが、これらに限定されない。
【０２１８】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、ＵＳ６，２６７，９５８に説明される。水性抗体製剤は、ＵＳ６，１７１，５８６とＷＯ２００６／０４４９０８に記載するものを含み、以下の製剤は、ヒスチジン−アセテート緩衝液を含む。
【０２１９】
本出願における製剤は、さらに、治療される所定の適応症に対して必要に応じて一つ以上の活性成分を含むことができ、好ましくは、相補活性かつ互いに不利な影響を与えない活性成分を有する。このような活性成分は、予期の目的に有効な量で適切に組み合わせた形で存在する。
【０２２０】
以下の実施例を本発明の理解を補助するように説明する。如何なる形式で実施例を、本発明の保護範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０２２１】
実施例１．酵母ディスプレイ技術による抗ＢＣＭＡ完全ヒト化抗体の選別
酵母ディスプレイ技術によって、総多様性が１×１０８より大きい６個の合成抗体ライブラリーからＢＣＭＡと特異的に結合する完全ヒト化抗体（ライブラリーの設計と構成がＷＯ２００９０３６３７９、ＷＯ２０１０１０５２５６、ＷＯ２０１２００９５６８を参照できる）を選別する。要するに、選別過程は、先ず、第１回目の選別は、磁気ビーズ分離方法（ＭＡＣＳ）によってビオチンでマークされた、Ｆｃと融合される組換えヒトＢＣＭＡで、６個の異なる合成抗体ライブラリーを選別することによって完成し、第２回目の選別は、基本的に、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６の方法に従って、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によってＦｃと融合するサルおよびマウスのＢＣＭＡで完成し、第３回目の選別において、ＦＡＣＳ技術によって、基本的にＸｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２０１３の説明に従って、多重特異性試薬（ＰＳＲ）を用いて抗体ライブラリーにおける抗体を陰性選択し、抗体の非特異的な結合および後続のドラッガブル問題を弱くし、第４回目の選別は、ＦＡＣＳ技術によって、Ｈｉｓラベルのヒト化ＢＣＭＡ単体タンパクを用いて完成し、最後の選別は、ＦＡＣＳ技術によって、それぞれヒト、サルとマウスのＢＣＭＡ特異的な抗体をエンリッチメントする。
【０２２２】
量産最適化は、最初の選別における一般的なステップである。要するに、初期選別にエンリッチメントされる抗体群体の重鎖領域（本段階の多様性が１０３〜１０４の間にある）を分離してそれを酵母菌における天然ヒト軽鎖配列ライブラリーと改めて組み合せることによって完成する。この過程は、軽鎖束の組換え（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｂａｔｃｈ  ｓｈｕｆｆｌｅ、ＬＣＢＳ）と呼ばれ、最終に、ヒト化ＢＣＭＡ結合傾向を有する、重鎖／軽鎖ペアリングの多様性が１０７〜１０８の間にある抗体ライブラリーを製造する。当該抗体ライブラリーは、上記段落に説明した１回の磁気ビーズ選別と４回のフローサイトメトリー選別を経て、ヒト、サルとマウスＢＣＭＡの特異的な抗体を更にエンリッチメントする。上記のように、この過程において、それぞれヒト、サルとマウスのＢＣＭＡとＦｃの融合タンパク、およびＨｉｓラベルのヒト化ＢＣＭＡ単体タンパクを使用して陽性選別とし、ＰＳＲを陰性選別とする。
【０２２３】
上記選別過程を完成した後、エンリッチメントされた特異的な抗体配列を含む酵母群体を寒天プレートに塗り、所定の抗体遺伝子を含む酵母単クローンコロニーを得ることができる。クローンを取って、ｓａｎｇｅｒ法によってその可変領域を順位付けし、約４６０個の配列が独特なＨ３：Ｌ３抗体（即ち、独特な重鎖ＣＤＲ３領域と軽鎖ＣＤＲ３領域対を有する抗体）が鑑定される。その後、酵母が発現しタンパクＡ親和クロマトグラフィーの方法を用いて精製して一部の抗体を得る。
【０２２４】
これらの抗体と複数の組換えＢＣＭＡタンパク質およびＢＣＭＡ安定的組換えたＣＨＯ−Ｓ細胞系およびＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ９２９との結合能力を更に測定することで、最終的にＮＣＩ−Ｈ９２９との親和性がよい１０株のクローン株を得て更なる分析を行う。これらの抗体もサルＢＣＭＡと一定の交差反応性を有することが示される。上記表１に、この１０株の抗体分子のアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列を示す。
【０２２５】
実施例２．酵母発現抗体とＮＣＩ−Ｈ９２９細胞との親和性の検証
フローサイトメトリーによって、上記１０株のＮＣＩ−Ｈ９２９と親和性がよい酵母発現抗体および１株のＮＣＩ−Ｈ９２９と親和性がない抗体（ＡＤＩ−３４８１９）（ネガティブコントロールとする）を更なる細胞結合検証を行う。具体的な方法は、以下のとおりである。
１．ヒトＮＣＩ−Ｈ９２９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−９０６８）細胞を取って、細胞の密度を２×１０６／ｍｌに調整し、９６メッシュのマイクロプレートの各孔に１００μｌを入れ、４００Ｇで５ｍｉｎ遠心して、上清を除去する。
２．抗ＢＣＭＡ抗体を４００ｎＭ濃度から、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳに３倍の勾配で合計１２個のスポットまでに希釈し続け、各メッシュに１００μｌの希釈した抗体を入れ、４℃で３０ｍｉｎ孵化する。
３．４００Ｇで５ｍｉｎ遠心して、ＰＢＳを入れて二回洗浄して、その後、各メッシュに１００μｌのＰＢＳ（１％  ＢＳＡ）に希釈された二次抗体（フィコビリンタンパク（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、ＰＥ）でマークされた羊抗ヒトＩｇＧ抗体、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、最終の濃度が５μｇ／ｍｌ）を入れ、４℃で３０ｍｉｎ孵化する（光を避ける）。
４．４００Ｇで５ｍｉｎ遠心して、ＰＢＳを入れて二回洗浄して各メッシュを１００μｌ  ＰＢＳで細胞を再懸濁する。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にフローサイトメトリーを行い、ＰＥ陽性信号を検出し、Ｃ６ソフトウェアに基づいてＭＦＩ計算する。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアでＥＣ５０値を計算する。
【０２２６】
検出結果は図１と以下の表４に示される。実験結果から、１０株の抗体が４００ｎＭ濃度でいずれもＮＣＩ−Ｈ９２９細胞と強い親和性を有し、抗体濃度の希釈につれて、それとＮＣＩ−Ｈ９２９の親和性も次第に弱くなることが確認された。
【０２２７】
【表６】
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【０２２８】
実施例３．ｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体の発現ベクターの構成
ｓｃＦｖの形の候補抗と標的の親和性を検証するために、それぞれ上記１０株の抗体の単鎖抗体の可変領域（ｓｃＦｖ）とヒトＦｃ断片の組換えタンパクの発現ベクターを構成する。同時に、ＡＤＩ−３４８１９抗体の組換え単鎖抗体の発現ベクター（ネガティブコントロールとする）、およびＵＳ２０１７０２２６２１６  Ａ１に公開されるｈｕＢＣＭＡ−１０配列の組換え単鎖抗体の発現ベクター（標準品コントロールとする）も構成する。構成されたこれらのｓｃＦｖ−Ｆｃ組換えタンパクのアミノ酸配列およびその対応するコーディングヌクレオチド配列が上記表３に示される。
【０２２９】
表３に示されるｓｃＦｖ−Ｆｃ組換えタンパクを発現する発現ベクターを構成する。要するに、エンドヌクレアーゼによってマウスκ軽鎖シグナルペプチド（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ、配列番号１３３、番号配列ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣ  ＴＧＴＧＧＧＴ  ＧＣＣＣＧ  ＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡ、配列番号１３４）とヒトＩｇＧ１  Ｆｃ番号配列（配列番号１３２）付きｐＤＤ１−ｈＦｃベクター（ｐＤＤ１−ｈＦｃベクターがｐＴＴ５ベクターに基づき、前記シグナルペプチドとｈＦｃコード遺伝子を挿入することで構成する）を制限し、同族組換えの方法によって合成されたｓｃＦｖ配列を軽鎖シグナルペプチドとｈＦｃのコード遺伝子との間にクローニングして融合発現を形成する。図２はベクターの構成を示す模式図である。
【０２３０】
実施例４．ｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体の発現
所要のトランスフェクションの体積によってＨＥＫ２９３細胞を培養し、トランスフェクションの前の日に細胞密度を１．２×１０６／ｍｌに調整する。
１．３ｍＬＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５−０７０）を取ってトランスフェクション緩衝液として、それぞれ上記に対応するｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体のコード遺伝子を携帯するプラスミド３０μｇを均一まで混合してから濾過して５ｍｉｎ静置する。
２．９０μＬの１ｍｇ／ｍＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）をプラスミド−ＯｐｔｉＭＥＭ混合液に入れ、均一まで混合してから室温で１５ｍｉｎ孵化する。混合物を穏やかに細胞に入れ、３６．５℃で、８％のＣＯ２下で培養する。
３．２０ｈ後、０．６ｍＬの２００ｇ／ＬのＦＥＥＤ（大豆ペプトンＰｈｙｔｏｎｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ（ＢＤ、２１１９０６）と植物ペプトンＰｈｙｔｏｎｅ（ＢＤ、２１０９３１）同比例）、０．３ｍＬの２００ｇ／Ｌのグルコース母溶液、３０μＬの２．２Ｍバルプロ酸ナトリウム塩（ＶＰＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４５４３）を追加する。
４．活力が６０％より低いまでに培養し続けて、上清を収集し、濾過後親和クロマトグラフィー精製をする。
【０２３１】
実施例５．タンパクＡ法によるｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体の精製
１．超純水でフィラーおよび重力柱を洗浄し、フィラー保護液を除去する。
２．０．１Ｍ  ＮａＯＨで重力柱およびフィラーを２ｈ浸透する。各重力柱に３００μＬタンパクＡ親和クロマトグラフィーメディア（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  ｓｕｒｅ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５４３８−０３）フィラーを添加する。
３．細胞成分溶液を８０００ｒ／ｍｉｎで４０ｍｉｎ遠心し、再び０．４５μｍフィルターで濾過し、４℃で保存して使用に供する。
４．大量の超純水で重力柱とフィラーを洗浄し、アルカリ液を除去する。
５．精製前、１０ｍｌ結合／洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２））でフィラーを平衡する。
６．試料を入れ、精製される上清がカラムを通る。
７．洗浄して、５〜１０ｍｌ結合／清洗緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２））でフィラーを洗浄し、非特異的な結合タンパクを除去する。
８．リースして、１ｍＬのリース緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液、ｐＨ  ３．５）でフィラーを洗浄し、特異的な結合タンパクを収集する。
９．収集液に８５μｌ／ｍｌの比例で中和緩衝液（２Ｍ  Ｔｒｉｓ）を入れ、ｐＨが６〜７になるまで調節する。
【０２３２】
実施例６．ｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体のＦｏｒｔｅｂｉｏ検出
光ファイバーバイオセンサーのバイオフィルム層光学干渉技術（ＢＬＩ）に基づいて、抗体分子の動力学定数を測定する。
【０２３３】
ＢＬＩの基本原理は、生物分子がセンサーの表面に結合すると、生物膜を形成し、生物膜がセンサーを透過する光の波形に干渉現象を起こし、干渉現象が位相変移の方式で検出され、それによってセンサーに結合する分子数量の変化を検出でき、実時間応答値の変化によって動力学曲線をフィッティングし、結合定数（Ｋｏｎ）、解離定数（Ｋｄｉｓ）、親和性（ＫＤ）を計算することである。
【０２３４】
実験に用いられるＦｏｒｔｅｂｉｏ設備番号がＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６であり、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、従来方法（Ｅｓｔｅｐ、Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ、２０１３．５（２）：ｐ．２７０−８）に従って行われる。具体的なフローは以下のとおりである。
【０２３５】
１．実験が始まる前の３０分に、試料の数量によって、適切な数量のＡＨＣ  Ｓｅｎｓｏｒを取ってＳＤ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｌＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に浸透する。
２．１００μｌのＳＤ  ｂｕｆｆｅｒ、ｓｃＦｖ−ｈＦｃ抗体、ヒトＢＣＭＡ−Ｈｉｓ抗原（ＡＣＲＯ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、ＢＣＡ−Ｈ５２２Ｙ）を取って、それぞれ９６メッシュの黒色のポリスチレン半分のマイクロプレートに入れる。
３．試料の位置によってマイクロプレートを配置し、センサー位置を選択し、運転ステップおよび時間を設け、Ｂａｓｅｌｉｎｅ、Ｌｏａｄｉｎｇ〜１ｎｍ、Ｂａｓｅｌｉｎｅ、ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ時間が試料の結合、解離速度に決められて、回転数が１０００ｒｐｍであり、温度が３０℃である。
４．表５には、１０個のｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体とヒトＢＣＭＡ−Ｈｉｓ親和性の検出結果が示される。
【０２３６】
【表７】
2021512592.tif 000008
参照ｓｃＦｖ−Ｆｃ＊がＵＳ２０１７０２２６２１６Ａ１のＢＣＭＡ−１０配列におけるｓｃＦｖによって構成されるｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換えタンパク（実施例３、配列番号１３１を参照する）の親和性水平。
【０２３７】
上表のデータから、１０株の単鎖抗体と単価のヒト化ＢＣＭＡ（ＢＣＭＡ−Ｈｉｓ）の親和性（ＫＤ値）がいずれも、参照単鎖抗体とＢＣＭＡ−Ｈｉｓとの親和性に相当する。そのうち、ＡＤＩ−３４８５７とＡＤＩ−３４８６０の２株の単鎖抗体とＢＣＭＡ−Ｈｉｓとの親和性は、参照単鎖抗体のものと最も近い。
【０２３８】
実施例７．ｓｃＦｖ−ｈＦｃ組換え単鎖抗体とＮＣＩ−Ｈ９２９の親和性の検出
ｓｃＦｖ−ｈＦｃ融合抗体の製造が完了した後、更にそれとＮＣＩ−Ｈ９２９との親和性を検証する。具体的な方法は、以下のとおりである。
１．ヒトＮＣＩ−Ｈ９２９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−９０６８）細胞を取って、細胞の密度を２×１０６／ｍｌに調整し、９６メッシュのマイクロプレートの各メッシュに１００μｌを入れ、４００Ｇで５ｍｉｎ遠心して、上清を除去する。
２．ｓｃＦｖ−ｈＦｃ抗体を４００ｎＭ濃度から、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳに３倍の勾配で合計１２個のスポットまでに希釈し続け、各メッシュに１００μｌの希釈した抗体を入れ、４℃で３０ｍｉｎ孵化する。
３．４００Ｇで５ｍｉｎ遠心して、ＰＢＳを入れて二回洗浄して、その後、各メッシュに１００μｌのＰＢＳ（１％  ＢＳＡ）に希釈された二次抗体（（フィコビリンタンパク（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、ＰＥ）でマークされた羊抗ヒトＩｇＧ抗体、ＳｏｕｔｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ、最終の濃度が５μｇｇ／ｍｌ）を入れ、４℃で３０ｍｉｎ孵化する（光を避ける）。
４．４００Ｇで５ｍｉｎ遠心して、ＰＢＳを入れて二回洗浄して各メッシュを１００μｌ  ＰＢＳで細胞を再懸濁する。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にフローサイトメトリーを行い、ＰＥ陽性信号を検出し、Ｃ６ソフトウェアに基づいてＭＦＩ計算する。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアでＥＣ５０値を計算する。
【０２３９】
検出結果は図３と以下の表６に示される。図における結果から、ＡＤＩ−３４８４６単鎖抗体の他に、その他の単鎖抗体とＮＣＩ−Ｈ９２９細胞との親和性（ＥＣ５０値）がいずれも参照単鎖抗体とＮＣＩ−Ｈ９２９細胞との親和性に優れることが示される。
【０２４０】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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