(57)【要約】  本明細書に記載されるのは、Ｔｒｅｇ細胞増殖、生存、活性化および／または機能を調節する（例えば増加させる）ことができる治療薬である。いくつかの実施形態において、調節はＴｒｅｇ細胞に対して選択的または特異的である。本出願は、ＩＬ−２ムテイン、ＩＬ−２ムテインを含む組成物、およびＩＬ−２ムテインを使用する方法を提供する。別の態様において、本実施形態は、組成物、例えば、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される、本明細書に記載された治療的化合物（ＩＬ−２ムテイン）を含む薬学的に許容される組成物を提供する。また、本明細書に記載された治療的化合物を含むキットも本発明の範囲内である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２７のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号７の配列を有するＮ末端リーダーペプチドをさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｃ末端にリンカーペプチドをさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
リンカーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは１、２、３、または４である）の配列を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
ｎは１である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
ｎは２である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
ｎは３である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項８】
ｎは４である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｆｃペプチドをさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｆｃペプチドは、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｎ末端に配列番号７の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１２】
ＦｃペプチドはＣ末端にある、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１３】
ＦｃペプチドはＮ末端にある、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号２７のペプチドおよびＦｃペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１５】
Ｎ末端に配列番号７の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
リンカーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは１、２、３、または４である）である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１７】
ｎは４である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
Ｆｃペプチドは、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１９】
ＦｃペプチドはＣ末端にある、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２０】
ＦｃペプチドはＮ末端にある、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２１】
配列番号４０の配列を含むペプチドを含む、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１４に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１９に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２６】
配列番号２６のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２７】
配列番号７の配列を有するＮ末端リーダーペプチドをさらに含む、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２８】
Ｃ末端にリンカーペプチドをさらに含む、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２９】
リンカーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは１、２、３、または４である）の配列を含む、請求項２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
ｎは１である、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３１】
ｎは２である、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３２】
ｎは３である、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３３】
ｎは４である、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３４】
Ｆｃペプチドをさらに含む、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項３５】
Ｆｃペプチドは、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３６】
Ｎ末端に配列番号７の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３７】
ＦｃペプチドはＣ末端にある、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３８】
ＦｃペプチドはＮ末端にある、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３９】
配列番号２６のペプチドおよびＦｃペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項４０】
Ｎ末端に配列番号７の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４１】
リンカーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは１、２、３、または４である）である、請求項４９に記載のペプチド。
【請求項４２】
ｎは４である、請求項４１に記載のペプチド。
【請求項４３】
Ｆｃペプチドは、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４４】
ＦｃペプチドはＣ末端にある、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４５】
ＦｃペプチドはＮ末端にある、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４６】
配列番号３９の配列を含むペプチドを含む、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４７】
請求項２５に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４８】
請求項３９に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４９】
請求項４３に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５０】
請求項４６に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５１】
Ｔ制御性細胞を活性化する方法であって、Ｔ制御性細胞を請求項１〜４６のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の医薬組成物と接触させる工程を含む前記方法。
【請求項５２】
対象における炎症性障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する工程を含む前記方法。
【請求項５３】
炎症性障害は、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、乾癬、ループス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化群、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎等である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
Ｔ制御性細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を促進または刺激する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する前記方法。
【請求項５５】
炎症性障害の処置のための医薬品の製造における、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５６】
炎症性障害は、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、乾癬、ループス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化群、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎等である、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
請求項１〜４７のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項５８】
請求項５７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５９】
請求項５７に記載の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項６０】
請求項５７に記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項６１】
請求項５９に記載のプラスミドを含む細胞。
【請求項６２】
請求項５８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項６３】
請求項１〜４７のいずれか１項に記載のペプチドまたは本明細書に記載されているペプチドを含むまたは発現する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２３日に出願された米国仮出願第６２／７２１，６４４号、２０１８年５月２４日に出願された米国仮出願第６２／６７５，９７２号、２０１７年１２月６日に出願された米国仮出願第６２／５９５，３５７号、２０１８年８月２３日に出願された米国本出願第１６／１０９，８７５号、および２０１８年８月２３日に出願された米国本出願第１６／１０９，８９７号の優先権を主張するものであり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本明細書に提供される実施形態は、ＩＬ−２ムテインと呼ばれるタンパク質、これを含む組成物、およびこれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＩＬ−２は、３つの膜貫通受容体サブユニット、すなわち、ＩＬ−２が結合すると細胞内シグナル伝達事象を共に活性化するＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγ、ならびに他の２つの受容体サブユニットにＩＬ−２を提示する役目をするＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）に結合する。ＩＬ−２Ｒβγによって伝達されるシグナルには、ＰＩ３キナーゼ、Ｒａｓ−ＭＡＰキナーゼ、およびＳＴＡＴ５経路のシグナルが含まれる。
【０００４】
Ｔ細胞は、典型的には組織に存在する低濃度のＩＬ−２に応答するのにＣＤ２５の発現を必要とする。ＣＤ２５を発現するＴ細胞には、自己免疫性炎症の抑制に不可欠なＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、およびＣＤ２５を発現するように活性化されたＦＯＸＰ３−Ｔ細胞の両方が含まれる。ＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞のどちらかであり得、その両方が炎症促進性であり得、ならびに自己免疫疾患、および対象の免疫系が臓器または他の組織を攻撃する他の疾患に寄与し得る。ＩＬ−２刺激ＳＴＡＴ５シグナル伝達は、正常なＴｒｅｇ細胞増殖および生存ならびに高ＦＯＸＰ３発現に極めて重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＩＬ−２が３つのＩＬ−２Ｒ鎖のそれぞれに対して持つ親和性が低いため、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγに対する親和性のさらなる低下は、ＣＤ２５に対する親和性の増加によって相殺される可能性がある。ＩＬ−２の変異改変体が生成されている。これらのＩＬ−２変異体は、ＩＬ−２ムテインと呼ばれる場合があり、様々な疾患の処置において有用であることが見出されている。しかし、様々な用途および組成物において使用することができる追加のＩＬ−２ムテインに対するニーズが依然としてある。本実施形態は、これらのニーズおよび他のニーズを満足させる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態において、７３、７６、１００、または１３８位に変異を含む、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドが提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、５３、５６、８０、または１１８位に変異を含む、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドが提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３およびＸ４の少なくとも１つがＩであり、ならびに残りがＬまたはＩである、配列番号４３のアミノ酸配列を含むペプチドが提供される。
【０００９】
また、該ペプチドおよび本明細書に記載されたタンパク質をコードする核酸分子を含む医薬組成物が提供される。また、本明細書で本明細書に記載されたタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたタンパク質をコードする核酸分子、ベクター、またはプラスミドを含む細胞が提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、Ｔ制御性細胞を活性化する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、Ｔ制御性細胞を本明細書に記載されたペプチドまたは本明細書に記載された医薬組成物と接触させることを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、対象における炎症性障害を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、以下に限定されるものではないが、それを必要とする対象を含む対象にペプチド（例えば、ペプチドの治療的に有効な量）を投与することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、Ｔ制御性細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を促進または刺激する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、対象にペプチド（例えば、ペプチドの治療的に有効な量）を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本明細書に提供されるＩＬ−２ムテインの非限定的な実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書に記載されるのは、Ｔｒｅｇ細胞増殖、生存、活性化および／または機能を調節する（例えば増加させる）ことができる治療薬である。いくつかの実施形態において、調節はＴｒｅｇ細胞に対して選択的または特異的である。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「選択的」は、Ｔｒｅｇ細胞において活性を調節するが、非制御性Ｔ細胞では活性を促進する能力が限定されるまたは欠如している治療薬またはタンパク質を指す。
【００１６】
いくつかの実施形態において、治療薬はＩＬ−２の変異体である。ＩＬ−２の変異体は、ＩＬ−２ムテインと呼ばれてもよい。ＩＬ−２は、２つの異なる形態、未成熟形態および成熟形態で存在し得る。成熟形態はリーダー配列が除去されている。これは翻訳後プロセス中に行われる。未成熟ＩＬ−２の野生型配列は次の通りである：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT（配列番号１）
成熟ＩＬ−２の野生型配列は次の通りである：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT（成熟ＩＬ−２配列）（配列番号２）
【００１７】
ＩＬ−２ムテイン分子は、ＩＬ−２の残基の１つまたは複数を変異させることによって製造することができる。ＩＬ−２ムテインの非限定的な例は、ＷＯ２０１６／１６４９３７、ＵＳ９５８０４８６、ＵＳ７１０５６５３、ＵＳ９６１６１０５、ＵＳ９４２８５６７、ＵＳ２０１７／００５１０２９、ＵＳ２０１４／０２８６８９８Ａ１、ＷＯ２０１４１５３１１１Ａ２、ＷＯ２０１０／０８５４９５、ＷＯ２０１６０１４４２８Ａ２、ＷＯ２０１６０２５３８５Ａ１、およびＵＳ２００６０２６９５１５に見出すことができ、これらの各々は、その全体が参照により組み入れられる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記の配列（配列番号２）の１位のアラニンが欠失される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子は、成熟ＩＬ−２配列の１２５位のシステインに対して置換されたセリンを含む。ＩＬ−２ムテイン分子である変異および置換の他の組み合わせはＵＳ２００６０２６９５１５に記載されており、その全体が参照により組み入れられる。いくつかの実施形態において、１２５位のシステインはバリンまたはアラニンでも置換される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子はＶ９１Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子はＮ８８Ｄ置換を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子はＮ８８Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子は、Ｈ１６Ｅ、Ｄ８４Ｋ、Ｖ９１Ｎ、Ｎ８８Ｄ、Ｖ９１Ｋ、またはＶ９１Ｒ、それらの任意の組み合わせの置換を含む。いくつかの実施形態において、これらのＩＬ−２ムテイン分子は、本明細書に記載されている１２５位の置換も含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子は、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ａ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｉ、Ｄ２０Ｙ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ  Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｅ９５Ｇ、およびＱ１２６からなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子のアミノ酸配列は、Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ置換、ならびにＴ３Ｎ、Ｔ３Ａ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ  Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｅ９５Ｇ、Ｑ１２６Ｉ、Ｑ１２６Ｌ、およびＱ１２６Ｆから選択される１個の置換により、成熟ＩＬ−２配列に記載されたアミノ酸配列とは異なる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子は、Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ置��、ならびにＤ２０Ｈ、Ｄ２０Ｉ、Ｄ２０Ｙ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｗ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｋ、およびＶ９１Ｓから選択される１個の置換により、成熟ＩＬ−２配列に記載されたアミノ酸配列とは異なる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインはＮ８８Ｒおよび／またはＤ２０Ｈ変異を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子は、アミノ酸３０、アミノ酸３１、アミノ酸３５、アミノ酸６９、およびアミノ酸７４からなる群から選択される位置にポリペプチド配列の変異を含む。いくつかの実施形態において、３０位の変異はＮ３０Ｓである。いくつかの実施形態において３１位の変異はＹ３１Ｈである。いくつかの実施形態において、３５位の変異はＫ３５Ｒである。いくつかの実施形態において、６９位の変異はＶ６９Ａである。いくつかの実施形態において、７４位の変異はＱ７４Ｐである。いくつかの実施形態において、ムテインは３０、３１、および／または３５位に変異を含まない。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子は、上記に提供された成熟ヒトＩＬ−２配列と比べてＮ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ１０９Ｃ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆ、Ｄ８４Ｇ、またはＤ８４Ｉからなる群から選択される置換を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子は、Ｄ１０９Ｃの置換ならびにＮ８８Ｒ置換およびＣ１２５Ｓ置換の一方または両方を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子の１０９位にあるシステインは、約５〜約４０ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール部分に連結される。いくつかの実施形態において、ムテインは１０９、１２６、または８４位に変異を含まない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された置換のいずれかが１２５位の置換と組み合わされる。置換は、Ｃ１２５Ｓ、Ｃ１２５Ａ、またはＣ１２５Ｖ置換であってもよい。いくつかの実施形態において、ムテインは１２５位に変異を含まない。
【００２２】
本明細書で言及されるナンバリングは、ＩＬ−２ムテインに関して特に指示がない限り成熟配列を指す。配列または位置が配列番号１を指すならば、これは未成熟配列である。しかし、未成熟配列（配列番号１）から成熟配列（配列番号２）に位置を置き換えるために行う必要があるのは、配列番号１の言及された位置から２０を引いて配列番号２の対応する位置を得ることだけである。
【００２３】
本明細書に記載された置換または変異に加えて、いくつかの実施形態においてＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応する７３、７６、１００、または１３８位の１つもしくは複数において、または配列番号２に対応する５３、５６、８０、もしくは１１８位の１つもしくは複数の位置に置換／変異を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応する７３および７６；７３および１００；７３および１３８；７６および１００；７６および１３８；１００および１３８；７３、７６、および１００；７３、７６、および１３８；７３、１００、および１３８；７６、１００および１３８位；または７３、７６、１００、および１３８位の各々に変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応する５３および５６；５３および８０；５３および１１８；５６および８０；５６および１１８；８０および１１８；５３、５６、および８０；５３、５６、および１１８；５３、８０、および１１８；５６、８０および１１８位；または５３、５６、８０、および１１８位の各々に変異を含む。ＩＬ−２は他のタンパク質に融合またはテザリングできることから、本明細書で使用される場合、配列番号６または１５を参照する用語は、ＮＣＢＩウェブサイトを用いて使用され得る、アライメントソフトウェアのデフォルト設定で配列がどうアライメントされるかを指す。いくつかの実施形態において、変異はロイシンからイソロイシンである。故に、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応する７３、７６、１００、もしくは１３８位において、または配列番号２に対応する５３、５６、８０、もしくは１１８位の１つもしくは複数の位置に１つまたは複数のイソロイシンを含み得る。いくつかの実施形態において、ムテインは、配列番号２に対応するＬ５３に変異を含む。いくつかの実施形態において、ムテインは、配列番号２に対応するＬ５６に変異を含む。いくつかの実施形態において、ムテインは、配列番号２に対応するＬ８０に変異を含む。いくつかの実施形態において、ムテインは、配列番号２に対応するＬ１１８に変異を含む。いくつかの実施形態において、変異はロイシンからイソロイシンである。いくつかの実施形態において、ムテインは、配列番号２に対応する６９、７４、８８、１２５位の変異、またはこれらのムテインにおけるそれらの任意の組み合わせも含む。いくつかの実施形態において、変異はＶ６９Ａ変異である。いくつかの実施形態において、変異はＱ７４Ｐ変異である。いくつかの実施形態において、変異はＮ８８ＤまたはＮ８８Ｒ変異である。いくつかの実施形態において、変異はＣ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ変異である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応する４９、５１、５５、５７、６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位の１つもしくは複数、または配列番号２に対応する２９、３１、３５、３７、４８、６９、７１、７４、８８、および１２５位の１つもしくは複数に変異を含む。置換は、単独でまたは互いに組み合わせて使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、４９、５１、５５、５７、６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または各々に置換を含む。そのような組み合わせの非限定的な例には、４９、５１、５５、５７、６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位；４９、５１、５５、５７、６８、８９、９１、９４、および１０８位；４９、５１、５５、５７、６８、８９、９１、および９４位；４９、５１、５５、５７、６８、８９、および９１位；４９、５１、５５、５７、６８、および８９位；４９、５１、５５、５７、および６８位；４９、５１、５５、および５７位；４９、５１、および５５位；４９および５１位；５１、５５、５７、６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位；５１、５５、５７、６８、８９、９１、９４、および１０８位；５１、５５、５７、６８、８９、９１、および９４位；５１、５５、５７、６８、８９、および９１位；５１、５５、５７、６８、および８９位；５５、５７、および６８位；５５および５７位；５５、５７、６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位；５５、５７、６８、８９、９１、９４、および１０８位；５５、５７、６８、８９、９１、および９４位；５５、５７、６８、８９、９１、および９４位；５５、５７、６８、８９、および９１位；５５、５７、６８、および８９位；５５、５７、および６８位；５５および５７位；５７、６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位；５７、６８、８９、９１、９４、および１０８位；５７、６８、８９、９１、および９４位；５７、６８、８９、および９１位；５７、６８、および８９位；５７および６８位；６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位；６８、８９、９１、９４、および１０８位；６８、８９、９１、および９４位；６８、８９、および９１位；６８および８９位；８９、９１、９４、１０８、および１４５位；８９、９１、９４、および１０８位；８９、９１、および９４位；８９および９１位；９１、９４、１０８、および１４５位；９１、９４、および１０８位；９１、および９４位；または９４および１０８位の変異が含まれるが、これらに限定されない。各変異は互いに組み合わされてもよい。同じ置換が配列番号２でなされ得るが、ナンバリングは、本開示から明らかなように適切に調整されることになる（配列番号１のナンバリングより２０少ないナンバリングが配列番号２における位置に対応する）。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応する３５、３６、４２、１０４、１１５、もしくは１４６位、または配列番号２の同等の位置（例えば１５、１６、２２、８４、９５、および１２６位）の１つまたは複数の位置に変異を含む。これらの変異は、本明細書に記載された他のロイシンからイソロイシンへの変異、または配列番号１に対応する７３、７６、１００、もしくは１３８位、または配列番号２に対応する５３、５６、８０、もしくは１１８位の１つもしくは複数における変異と組み合わされてもよい。いくつかの実施形態において、変異は、Ｅ３５Ｑ、Ｈ３６Ｎ、Ｑ４２Ｅ、Ｄ１０４Ｎ、Ｅ１１５Ｑ、もしくはＱ１４６Ｅ、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、これらの置換の１つまたは複数は野生型である。いくつかの実施形態において、ムテインは、配列番号１に対応する３５、３６、４２、１０４、１１５、もしくは１４６位、または配列番号２の同等の位置（例えば１５、１６、２２、８４、９５、または１２６位）の１つまたは複数に野生型残基を含む。
【００２６】
これらの位置における変異は、本明細書および上記に記載された配列番号１に対応する７３、７６、１００、もしくは１３８位における、または配列番号２に対応する５３、５６、８０、もしくは１１８位の１つもしくは複数の位置での置換を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載された他の変異のいずれかと組み合わされてもよい。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＮ４９Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＹ５１ＳまたはＹ５１Ｈ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＫ５５Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＴ５７Ａ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＫ６８Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＶ８９Ａ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＮ９１Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＱ９４Ｐ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＮ１０８ＤまたはＮ１０８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号１に対応するＣ１４５ＡまたはＣ１４５Ｓ変異を含む。
【００２７】
これらの置換は、単独でまたは互いに組み合わせて使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ムテインはこれらの置換の各々を含む。いくつかの実施形態において、ムテインはこれらの変異の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つを含む。いくつかの実施形態において、ムテインは、配列番号１に対応する３５、３６、４２、１０４、１１５、もしくは１４６位、または配列番号２の同等の位置（例えば１５、１６、２２、８４、９５、１２６、および１２６位）の１つまたは複数に野生型残基を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＮ２９Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＹ３１ＳまたはＹ３１Ｈ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＫ３５Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＴ３７Ａ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＫ４８Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＶ６９Ａ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＮ７１Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＱ７４Ｐ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＮ８８ＤまたはＮ８８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列番号２に対応するＣ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ変異を含む。これらの置換は、単独でまたは互いに組み合わせて使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ムテインはこれらの変異の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つを含む。いくつかの実施形態において、ムテインはこれらの置換の各々を含む。いくつかの実施形態において、ムテインは、配列番号１に対応する３５、３６、４２、１０４、１１５、もしくは１４６位、または配列番号２の同等の位置（例えば１５、１６、２２、８４、９５、および１２６位）の１つまたは複数に野生型残基を含む。
【００２９】
本明細書に記載されたＩＬ−２ムテインのいずれについても、いくつかの実施形態において、配列番号１に対応する３５、３６、４２、１０４、１１５、もしくは１４６位、または配列番号２の同等の位置（例えば１５、１６、２２、８４、９５、および１２６位）の１つまたは複数は野生型である（例えば、配列番号１または２に示されている通りである）。いくつかの実施形態において、配列番号１に対応する３５、３６、４２、１０４、１１５、もしくは１４６位、または配列番号２の同等の位置（例えば１５、１６、２２、８４、９５、および１２６位）の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または各々は野生型である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATEIKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT（配列番号３）
を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHIQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT（配列番号４）
を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHIRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT（配列番号５）
を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFINRWITFSQSIISTLT（配列番号６）
を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＩＬ−２ムテイン配列はＩＬ−２リーダー配列を含まない。ＩＬ−２リーダー配列は、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）の配列によって表すことができる。したがって、いくつかの実施形態において、上記に例示された配列は、リーダー配列のないペプチドを包含することもできる。配列番号１に対応する７３、７６、１００、もしくは１３８位の１つに、または配列番号２に対応する５３、５６、８０、もしくは１１８位の１つもしくは複数の位置に唯一の変異を有する配列番号３〜６が例示されているが、ペプチドは、これらの位置に１つ、２つ、３つ、または４つの変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、各々の位置の置換は、イソロイシンまたは他のタイプの保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、列挙された位置のロイシンは、独立に、イソロイシン、バリン、メチオニン、またはグリシン、アラニン、グルタミンまたはグルタミン酸で置換される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、配列番号２のＩＬ−２タンパク質は、以下の変異：Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、およびＣ１２５ＳまたはＣ１２５Ａ、ならびにＬ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、およびＬ１１８Ｉからなる群から選択される１つの変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２タンパク質は、Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、およびＬ１１８Ｉからなる群から選択される２つの変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２タンパク質は、Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、およびＬ１１８Ｉからなる群から選択される３つまたは各々の変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２タンパク質は、Ｌ５３ＩおよびＬ５６Ｉ、Ｌ５３ＩおよびＬ８０Ｉ、Ｌ５３ＩおよびＬ１１８Ｉ、Ｌ５６ＩおよびＬ８０Ｉ、Ｌ５６ＩおよびＬ１１８Ｉ、Ｌ８０ＩおよびＬ１１８Ｉ、Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、およびＬ８０Ｉ、Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、およびＬ１１８Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、およびＬ１１８ＩまたはＬ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、およびＬ１１８Ｉを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、またはＬ１１８Ｉ変異を含まない。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインはＴ３Ａ変異を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、配列番号２のＩＬ−２タンパク質は、以下の変異：Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、およびＣ１２５ＳまたはＣ１２５Ａ、ならびに配列番号２の４５〜５５、５０〜６０、５２〜５７、７５〜８５、１００〜１３０、１１５〜１２５の領域の、以下に限定されるものではないが保存的置換などの１つまたは複数の変異を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテイン分子は、本明細書に記載されているＦｃ領域または他のリンカー領域に融合される。そのような融合タンパク質の例は、ＵＳ９５８０４８６、ＵＳ７１０５６５３、ＵＳ９６１６１０５、ＵＳ  ９４２８５６７、ＵＳ２０１７／００５１０２９、ＷＯ２０１６／１６４９３７、ＵＳ２０１４／０２８６８９８Ａ１、ＷＯ２０１４１５３１１１Ａ２、ＷＯ２０１０／０８５４９５、ＷＯ２０１６０１４４２８Ａ２、ＷＯ２０１６０２５３８５Ａ１、ＵＳ２０１７／００３７１０２、およびＵＳ２００６／０２６９５１５に見出すことができ、これらの各々は、その全体が参照により組み入れられる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域はＬＡＬＡ変異として知られるものを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域はＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異（ＥＵナンバリング）を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域はＧ２３７Ａ（ＥＵナンバリング）を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域はＧ２３７位（ＥＵナンバリング）に変異を含まない。Ｋａｂａｔナンバリングを使用すると、これはＬ２４７Ａ、Ｌ２４８Ａ、および／またはＧ２５０Ａに対応する。いくつかの実施形態において、ＥＵナンバリングシステムを使用するとＦｃ領域は、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、および／またはＧ２３７Ａ変異を含む。使用されるナンバリングシステムに関係なく、いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はこれらの残基の１つまたは複数に対応する変異を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７ＧまたはＮ２９７Ａ（ｋａｂａｔナンバリング）変異を含む。Ｋａｂａｔナンバリングは完全長配列に基づくが、Ｆｃ領域について当業者によって使用される伝統的アライメントに基づく断片で使用されることになる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１参照）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、配列：
DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号８）
を含む。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、配列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１５）
を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインはＦｃ領域に連結される。リンカーの非限定的な例は、グリシン／セリンリンカーである。例えば、グリシン／セリンリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）の配列であっても、もしくはこれを含んでもよく、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）の配列であっても、もしくはこれを含んでもよい。これは単に非限定的な例であり、リンカーは様々な数のＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートを有することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、柔軟、剛性または切断可能なリンカーを使用してＦｃ領域に連結される。リンカーは、本明細書に記載されている通り、または以下の表に例示されている通りであってもよい。
【００４１】
【表１】
2021507690.tif 000003
【００４２】
故に、ＩＬ−２／Ｆｃ融合は、ＺＩＬ−２Ｍ−Ｌｇｓ−ＺＦｃの式（式中、ＺＩＬ−２Ｍは、本明細書に記載されているＩＬ−２ムテインであり、Ｌｇｓは、本明細書に記載されているリンカー配列であり（例えばグリシン／セリンリンカー）、およびＺＦｃは、本明細書に記載されたまたは当業者に公知のＦｃ領域である）によって表すことができる。いくつかの実施形態において、式は逆配向ＺＦｃ−Ｌｇｓ−ＺＩＬ−２Ｍであってもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２／Ｆｃ融合は、配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATEIKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１１）
を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２／Ｆｃ融合は、配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHIQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１２）
を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２／Ｆｃ融合は、配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHIRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１３）
を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２／Ｆｃ融合は、配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFINRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１４）
を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、配列番号８のＦｃ領域は、配列番号１５と置き換えられる。
【００４８】
本明細書に記載されたタンパク質は、抗体または他のタイプの治療的分子などの別のタンパク質に融合することもできる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインまたはＩＬ−２／Ｆｃ融合の配列は、以下の表に示される通りである：
【００５０】
【表２】
2021507690.tif 000004
【表３】
2021507690.tif 000005
【表４】
2021507690.tif 000006
【表５】
2021507690.tif 000007
【表６】
2021507690.tif 000008
【００５１】
該タンパク質の各々もまた、本明細書に提供されるＣ１２５ＳおよびＬＡＬＡおよび／またはＧ２３７Ａ変異を有すると考えることができる。Ｃ１２５置換はまた、本出願全体を通して記載されるＣ１２５Ａでもあってもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、表に示されているまたは本出願全体を通して配列は、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ８０、およびＬ１１８位に対応する１つまたは複数の変異を含む、または含まない。いくつかの実施形態において、表に示されているまたは本出願全体を通して配列は、Ｌ５９Ｉ、Ｌ６３Ｉ、Ｉ２４Ｌ、Ｌ９４Ｉ、Ｌ９６ＩもしくはＬ１３２Ｉ位または同じ位置での他の置換に対応する１つまたは複数の変異を含む、または含まない。いくつかの実施形態において、変異はロイシンからイソロイシンである。いくつかの実施形態において、ムテインは、本明細書に示されまたは記載されている以外の別の変異を含まない。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、または配列番号４３の配列を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、融合のＦｃ部分は含まれない。いくつかの実施形態において、ペプチドは、本明細書に提供されたＩＬ−２ムテインから基本的になる。いくつかの実施形態において、タンパク質はＦｃ部分がない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、配列番号４３（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の少なくとも１つはＩであり、残りはＬまたはＩである）を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３はＬであり、Ｘ４はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４はＬであり、Ｘ３はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はＬであり、Ｘ１はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４はＬであり、Ｘ２はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ１およびＸ２はＬであり、Ｘ３およびＸ４はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ１およびＸ３はＬであり、Ｘ２およびＸ４はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ１およびＸ４はＬであり、Ｘ２およびＸ３はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ２およびＸ３はＬであり、Ｘ１およびＸ４はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ２およびＸ４はＬであり、Ｘ１およびＸ３はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ３およびＸ４はＬであり、Ｘ１およびＸ２はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３はＬであり、Ｘ４はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はＬであり、Ｘ１はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４はＬであり、Ｘ２はＩである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４はＬであり、Ｘ３はＩである。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ムテインは、図１に例示されるフォーマットであってもよい。しかし、本明細書に記載されているように、ＩＬ−２ムテインはいくつかの実施形態においてＦｃドメインなしで使用されてもよく、またはＦｃドメインは、ＩＬ−２ムテインのＣ末端に連結されるＦｃドメインとは対照的にＩＬ−２ムテインのＮ末端に連結される。本明細書に記載されたポリペプチドはまた、記載されたペプチドの改変体も包含する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２改変体は、本明細書に提供された配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％実質的に類似するアミノ酸の配列を含む。改変体には、本明細書および上記に記載された様々な置換を有する本明細書に記載されたものが含まれる。いくつかの実施形態において、改変体は、１、２、３、４、または５個の追加の置換を有する。いくつかの実施形態において、置換は、ＧからＡ、ＬからＩ、ＧからＳ、ＫからＲへの、または他のタイプの保存的置換である。いくつかの実施形態において、保存的置換は、以下の表に基づき選択される：
【００５６】
【表７】
2021507690.tif 000009
【００５７】
【表８】
2021507690.tif 000010
【００５８】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントは、目視検査および数理計算によって決定することができ、または例えば、コンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって比較が行われる。例示的なコンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７〜９５頁）である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには、（１）ヌクレオチドに関する単項比較マトリックス（同一には１、および非同一には０の値を含有する）のＧＣＧ実装、ならびにＡｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、３５３〜３５８頁（１９７９）に記載されているＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓの加重アミノ酸比較マトリックス（（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６７４５頁）、または他の同等の比較マトリックス；（２）アミノ酸配列については各ギャップに対してペナルティ８および各ギャップ中の各記号に対して追加のペナルティ２、またはヌクレオチド配列については各ギャップに対してペナルティ５０および各ギャップ中の各記号に対して追加のペナルティ３；（３）エンドギャップに対するペナルティなし；ならびに（４）長いギャップに対する最大ペナルティなしが含まれる。当業者によって使用される配列比較の他のプログラムも使用することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されたＩＬ−２ムテインには、ＩＬ−２Ｒを介して野生型ＩＬ−２によって活性化される特定の経路を通じたシグナル伝達を変更し、Ｔｒｅｇの優先的な増殖／生存／活性化をもたらすタンパク質が含まれる。
【００６０】
本明細書に提供されたＩＬ−２ムテインは、参照により本明細書に組み入れられる、ＩＬ−２改変体の作製に関する米国特許第６，９５５，８０７号に記載されているものを含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して作製することができる。そのような方法は、ＩＬ−２改変体をコードするＤＮＡ配列を構築する工程、および適切に形質転換された、宿主細胞などの宿主においてそれらの配列を発現させる工程を含む。これらの方法の利用により、本明細書に提供される組換えタンパク質が作製される。タンパク質はまた、合成により作製することもでき、または合成断片、および細胞中で組換えにより作製した断片を組み合わせて目的とするタンパク質全体を作製することもできる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、核酸分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）は、目的とするタンパク質をコードする核酸分子を単離または合成して製造される。あるいは、ＩＬ−２の野生型配列は、部位特異的変異誘発などの日常的手法を使用して単離および変異させることができる。
【００６２】
ＩＬ−２改変体をコードするＤＮＡ配列を構築する別の方法は、化学合成であろう。これには例えば、本明細書に記載された特性を示すＩＬ−２改変体をコードするタンパク質配列の化学的手段によるペプチドの直接合成が含まれる。この方法は、天然および非天然アミノ酸の両方を様々な位置に組み込み得る。あるいは、所望のタンパク質をコードする核酸分子が、オリゴヌクレオチド合成機を使用して化学的手段によって合成され得る。オリゴヌクレオチドは、組換え改変体が作製される細胞において好都合なコドンを使用することによって選択することもできる、所望のタンパク質のアミノ酸配列に基づき設計される。遺伝コードは縮重していること、つまり、１つのアミノ酸は１つを超えるコドンによってコードされ得ることが十分に認識される。したがって、特定のＩＬ−２タンパク質をコードする所与のＤＮＡ配列に対して、そのＩＬ−２改変体をコードする多くのＤＮＡ縮重配列があることが理解されよう。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたタンパク質をコードする核酸分子が提供される。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態において、核酸分子はシグナル配列をコードするであろう。シグナル配列は、該配列が発現されることになる細胞に基づき選択することもできる。いくつかの実施形態において、宿主細胞が原核生物であれば、核酸分子はシグナル配列を含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞が真核細胞であれば、シグナル配列が使用され得る。いくつかの実施形態において、シグナル配列はＩＬ−２シグナル配列である。
【００６４】
核酸分子またはその相補体がタンパク質をコードするコドンを含むならば、核酸分子は、本明細書で意味するように該タンパク質を「コードする」。
【００６５】
「組換え」は、ポリペプチドまたはタンパク質に適用される場合、タンパク質の作製は、タンパク質をコードし得るまたはし得ない核酸が、これらが天然には見出されない細胞に導入される少なくとも１つの工程に依存することを意味する。
【００６６】
様々な宿主（動物または細胞系）は、本明細書に記載されたタンパク質を産生するのに使用され得る。適切な宿主細胞の例には、細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、または他の適当な動物細胞もしくは細胞株、およびトランスジェニック動物または植物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、これらの宿主には、周知の真核生物および原核生物宿主、例えば、大腸菌、シュードモナス、桿菌、ストレプトマイセス、真菌、酵母、昆虫（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）など）細胞、動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳ／Ｏなどのマウス細胞、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、およびＢＮＴ  １０などのアフリカミドリザル細胞、ならびにヒト細胞など）、および組織培養下の植物細胞の株などが含まれ得る。動物細胞発現に関して、培養下のＣＨＯ細胞およびＣＯＳ  ７細胞、特にＣＨＯ細胞株ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）またはＨＫＢ株が使用され得る。
【００６７】
当然ながら、全てのベクターおよび発現制御配列が、同じように十分に機能して本明細書に記載されたＤＮＡ配列を発現するわけではないことが理解されるべきである。また、全ての宿主も、同じ発現系を用いて同じように十分に機能するわけではない。しかし、当業者は、必要以上の実験をせずに、これらのベクター、発現制御配列および宿主の中で選択することができる。例えば、ベクターの選択において、ベクターは宿主中で複製しなければならないため、宿主が考慮されなければならない。ベクターコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターにコードされる、抗生物質マーカーなどの任意の他のタンパク質の発現も考慮されるべきである。例えば、本発明において使用するための好ましいベクターには、ＩＬ−２改変体をコードするＤＮＡがコピー数増幅されることを可能にするものが含まれる。そのような増幅可能なベクターは、当技術分野で周知である。
【００６８】
ベクターおよび宿主細胞
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたタンパク質をコードするベクター、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。本明細書に記載されたタンパク質をコードする任意の核酸はベクターに含有されてもよく、ベクターは、例えば、宿主における増殖のための選択可能なマーカーおよび複製起点を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来するものなどの適切な転写または翻訳制御配列をさらに含む。そのような制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳を制御する適当な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が標的タンパク質をコードするＤＮＡと機能的に関連する場合、作動可能に連結されている。故に、プロモーターヌクレオチド配列が核酸分子の転写を指示するならば、プロモーターヌクレオチド配列は、核酸分子に作動可能に連結されている。
【００６９】
本明細書に記載された本明細書で使用することができる宿主細胞
【００７０】
医薬組成物
別の態様において、本実施形態は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される、本明細書に記載された治療的化合物（ＩＬ−２ムテイン）を含む組成物、例えば、薬学的に許容される組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理的に適合性のあらゆる溶媒、分散媒、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、局部、局所、脊髄または皮膚投与（例えば、注射または点滴による）に適していてもよい。
【００７１】
本発明の組成物は、様々な形態であってもよい。これらには、液体溶液（例えば、注射可能および点滴可能な溶液）、分散液または懸濁液、リポソームおよび坐剤などの例えば、液体、半固体および固体剤形が含まれる。好ましい形態は、意図する投与様式および治療用途に依存する。典型的な組成物は、注射可能または点滴可能な溶液の形態である。一実施形態において投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一実施形態において、治療的分子は、静脈内点滴または注射によって投与される。別の実施形態において、治療的分子は、筋肉内または皮下注射によって投与される。別の実施形態において、治療的分子は、局部的に、例えば注射、または局所適用によって標的部位に投与される。
【００７２】
句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
治療的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で滅菌および安定であるべきである。組成物は、高い治療的分子濃度に適した溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または他の秩序構造として製剤化され得る。滅菌注射可能溶液は、活性化合物（すなわち、治療的分子）を、必要に応じて上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせと共に適当な溶媒に必要量で組み込み、その後濾過滅菌して製造することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒、および上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込んで製造される。滅菌注射可能溶液の製造のための滅菌粉末の場合、製造の好ましい方法は、活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末を、前もって滅菌濾過されたその溶液からもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【００７４】
当業者に理解されるように、投与経路および／または様式は所望の結果に応じて変わるであろう。特定の実施形態において、活性化合物は、インプラント、経費パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、急速な放出に対して化合物を保護する担体と共に製造されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤の製造のための多くの方法が特許取得され、または当業者に一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８参照。
【００７５】
特定の実施形態において、治療的化合物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な可食担体と共に経口投与されてもよい。化合物（および所望であれば他の成分）は、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入する、錠剤に圧縮する、または対象の食事に直接組み込むこともできる。経口治療投与に関して、化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用され得る。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するために、不活性化を防ぐ材料で化合物をコーティングする、または不活性化を防ぐ材料と化合物を共投与することが必要となる場合がある。治療的組成物は、当技術分野で公知の医療機器を用いて投与することもできる。
【００７６】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割用量が経時的に投与されてもよく、または治療状況の緊急性によって示される通りに用量が比例的に低減または増加されてもよい。投与のしやすさおよび投与量の均一性のために、投与単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される場合、投与単位形態は、処置される対象のための単一投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生むように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためにそのような活性化合物を配合する技術分野につきものの制限によって決定づけられ、直接左右される。
【００７７】
治療的化合物の治療または予防有効量の例示的、非限定的な範囲は、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜２５ｍｇ／ｋｇである。治療的化合物の投与量および処置レジメンは、当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、治療的化合物は、注射（例えば、皮下または静脈内）によって、約１〜４０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１〜３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約５〜２５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜１５ｍｇ／ｋｇ、１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、１５〜２５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与スケジュールは、例えば、週１回から２、３、もしくは４週間に１回まで変わってもよく、または、いくつかの実施形態において、投与スケジュールは、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、もしくは６カ月に１回であってもよい。１つの実施形態において、治療的化合物は、１週間おきに用量約１０〜２０ｍｇ／ｋｇで投与される。治療的化合物は、約３５〜４４０ｍｇ／ｍ２、典型的には約７０〜３１０ｍｇ／ｍ２、およびより典型的には、約１１０〜１３０ｍｇ／ｍ２の用量に達するように、２０ｍｇ／分を超える、例えば、２０〜４０ｍｇ／分、および典型的には４０ｍｇ／分以上の速度で静脈内点滴によって投与されてもよい。実施形態において、約１１０〜１３０ｍｇ／ｍ２の点滴速度は、約３ｍｇ／ｋｇのレベルを達成する。他の実施形態において、治療的化合物は、約１〜１００ｍｇ／ｍ２、例えば、約５〜５０ｍｇ／ｍ２、約７〜２５ｍｇ／ｍ２、または、約１０ｍｇ／ｍ２の用量に達するように、１０ｍｇ／分未満、例えば、５ｍｇ／分以下の速度で静脈内点滴によって投与されてもよい。いくつかの実施形態において、治療的化合物は、約３０分間にわたり点滴される。投与量値は、軽減される状態のタイプおよび重症度により変わり得ることが留意されるべきである。任意の特定の対象に対して、個体のニーズ、および組成物の投与を管理または監督する者の専門家としての判断に従って、特定の投与レジメンが経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載された投与量範囲は例示のみであり、特許請求される組成物の範囲または実践を限定することを意図するものではないことがさらに理解されるべきである。
【００７８】
医薬本発明の組成物は、本発明の治療的分子の「治療的に有効な量」または「予防的に有効な量」を含み得る。「治療的に有効な量」は、所望の治療結果を達成するための、必要な投与量でのおよび必要な期間にわたる有効な量を指す。治療的分子の治療的に有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体において所望の応答を誘発する治療的化合物の能力に従って変わり得る。治療的に有効な量はまた、治療的分子の任意の毒性または有害効果を、治療的に有益な効果が上回るものでもある。「治療的に有効な投与量」は、好ましくは、測定可能なパラメーター、例えば、免疫攻撃を、未処置の対象と比べて少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。測定可能なパラメーター、例えば、免疫攻撃を阻害する化合物の能力は、移植片拒絶反応または自己免疫障害における効能を予測する動物モデル系で評価されてもよい。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のアッセイによるインビトロでのそのような阻害、阻害する化合物の能力を調べることによって評価することができる。
【００７９】
「予防的に有効な量」は、所望の予防結果を達成するための、必要な投与量でのおよび必要な期間にわたる有効な量を指す。典型的には、予防的用量は、疾患の前またはより初期段階に対象において使用されるため、予防的に有効な量は治療的に有効な量より少ないであろう。
【００８０】
本明細書に記載された治療的化合物を含むキットもまた、本発明の範囲内である。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、治療剤、または治療的分子をキレートする、もしくはさもなければ標識もしくは他の治療剤にカップリングするのに有用な薬剤、または放射線保護組成物；投与用の治療的分子を製造するための装置または他の材料；薬学的に許容される担体；および対象に投与するための装置または他の材料を含む、１つまたは複数の他の要素を含んでもよい。
【００８１】
組み合わせ
本明細書に記載されたタンパク質は、患者が患っている状態を処置するのに有用な他の薬剤と併用して投与することもできる。そのような薬剤の例には、タンパク質性および非タンパク質性の両方の薬物が含まれる。複数の治療薬が共投与される場合、投与量は、関連する技術分野で認識されているように適宜調整され得る。「共投与」および併用療法は同時投与に限定されないが、患者への少なくとも１つの他の治療剤の投与を含む処置過程中に、Ｔｒｅｇ選択的ＩＬ−２タンパク質が少なくとも１回投与される治療レジメンも含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇ選択的ＩＬ−２タンパク質は、ＰＩ３−Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤、例えば、ラパマイシン（ラパミューン、シロリムス）と組み合わせて投与される。ＩＬ−２と組み合わせたこの経路の阻害剤は、Ｔｒｅｇ濃縮に有利に働く。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２タンパク質は、ＩＬ−２タンパク質に直接融合または結合されない別の治療薬なしで投与される。
【００８３】
治療的方法
本明細書で言及される任意の疾患の「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患の少なくとも１つの症状の軽減、疾患の重症度の低下、または、場合によっては疾患もしくは少なくとも１つの他の疾患に伴って起こり得るより重篤な症状への疾患進行の遅延もしくは予防を包含する。処置は、疾患が完全に治癒されることを意味する必要はない。有用な治療剤は、疾患の重症度を低下させ、疾患もしくはその処置に伴う症状の重症度を低下させ、または状態処置後に一定の頻度で生じ得るより重篤な症状もしくはより重篤な疾患の発症を遅延させる必要があるのみである。例えば、疾患が炎症性腸疾患であれば、治療剤は、腸内の明白な炎症部位の数、罹患した腸の総範囲を低減し、疼痛および／もしくは腫脹を低減し、下痢、便秘、または嘔吐などの症状を低減し、ならびに／または腸の穿孔を予防し得る。患者の状態は、バリウム注腸もしくは高位浣腸後に行われるｘ線、内視鏡検査、結腸内視鏡検査、および／または生検などの標準的な手法によって評価することができる。適切な手技は、患者の状態および症状に従って異なる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、タンパク質は炎症性障害を処置するのに使用される。いくつかの実施形態において、炎症性障害は、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ（例えば活動性）、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、ベーチェット病（皮膚に対する影響を含むが、これに限定されない）、脱毛症、円形脱毛症、全頭脱毛症、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（例えば活動性）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば、腎臓、肺、心臓、皮膚等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化群、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症（ＡＮＣＡ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、膜性増殖性糸球体腎症、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎等である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病を処置するのに使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、活動性全身性エリテマトーデスを処置するのに使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、活動性関節リウマチを処置するのに使用される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されたタンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象はそれを必要とする対象である。いかなる上記の治療的タンパク質も、本明細書に記載されている組成物（例えば、医薬組成物）の形態で投与することができる。例えば、組成物は、本明細書に記載されているＩＬ−２タンパク質プラス緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド（１０個未満のアミノ酸を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、またはデキストリンなど、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、ならびに／または他の安定剤、賦形剤、および／もしくは保存料を含んでもよい。組成物は、液体または凍結乾燥物として製剤化されてもよい。医薬製剤で使用され得る成分のさらなる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、（１９８０）および本明細書に記載されている他の文献に示されている。
【００８６】
目的とする疾患を処置するために、本明細書に記載された治療的分子を含む組成物は、非経口、局所、経口、経鼻、膣、直腸、または肺（吸入による）投与を含むが、これらに限定されない任意の適当な方法によって投与されてもよい。注射される場合、組成物は、ボーラス注射または持続点滴によって関節内、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与されてもよい。局所投与（すなわち、疾患部位での）は、経皮送達および留置剤、皮膚パッチ、または坐剤からの徐放として企図される。吸入による送達には、例えば、経鼻または経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態での吸入等が含まれる。体腔に挿入される坐剤による投与は、例えば、選択された体腔に固形の組成物を挿入し、これを溶解させることによって達成することができる。他の代替物には、点眼薬、経口用剤、例えばピル、トローチ、シロップ、およびチューインガムなど、ならびにローション、ゲル、スプレー、および軟膏などの局所用剤が含まれる。ほとんどの場合、ポリペプチドである治療的分子は、局所または注射もしくは吸入によって投与され得る。
【００８７】
処置方法の実行において、上記の治療的分子は、本明細書および上記に記載されているように投与することができる。例えば、組成物は、処置下の状態を処置するために有効であり得る任意の投与量、頻度、および期間で投与されてもよい。投与量は、治療的分子の分子の性質および処置下の障害の性質に依存する。処置は、所望の結果を得るために必要な限り継続されてもよい。本発明の治療的分子は、単回投与量として、または可能性のある投与レジメンの中でも特に、１日数回、１日１回、１日おき、週２回、週３回、週１回、１週間おき、および月１回の投与量を含む、定期的に与えられる一連の投与量として投与されてもよい。処置の周期性は、処置期間を通じて一定であってもよく、または一定でなくてもよい。例えば、処置は、最初は１週間間隔で生じ、その後１週間おきに生じる。数日、数週間、数カ月、または数年の期間を有する処置は、本発明によって包含される。処置は中止され、次いで再開されてもよい。維持用量は、初期処置後に投与されてもよく、またはされなくてもよい。
【００８８】
投与量は、体重１キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として、または皮膚表面１平方メートルあたりのミリグラム（ｍｇ／ｍ２）として、または身長もしくは体重に関係なく固定用量として測定されてもよい。これらの全ては、当技術分野の標準的な投与量単位である。人の皮膚表面積は、標準的な式を使用して身長および体重から計算される。
【００８９】
また、Ｔ制御性細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を促進または刺激する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載されたペプチドまたはこれを含む医薬組成物の治療的に有効な量を投与する工程を含む。
【００９０】
本明細書で使用される場合、句「それを必要とする」は、対象（動物または哺乳動物）が特定の方法または処置を必要とするとして同定されたことを意味する。いくつかの実施形態において、同定は診断のいかなる手段によってもよい。本明細書に記載された方法および処置のいずれにおいても、動物または哺乳動物はそれを必要としている可能性がある。いくつかの実施形態において、動物または哺乳動物は、特定の疾患、障害、もしくは状態が広まっている環境にあるか、または該環境に移動する。
【００９１】
特に定義されない限り、全ての技術的および科学的用語は、開示された実施形態が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「ａ」または「ａｎ」は、文脈が特に明確に指示しない限り、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数」を意味する。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、数値がおおよそであり、小さな変動は開示された実施形態の実践に重大な影響を与えないことを意味する。数値限定が使用される場合、特に文脈よる指示がない限り、「約」は、数値が±１０％変動し、開示された実施形態の範囲内にとどまり得ることを意味する。
【００９４】
本明細書で使用される場合、互換的に使用される用語「個体」または「対象」または「患者」は、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、またはヒトなどの霊長類などの哺乳動物を含む任意の動物を意味する。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに含むの任意の形態、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」など）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および有するの任意の形態、例えば「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および含むの任意の形態、例えば「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および含有するの任意の形態、例えば「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」）は、包括的または非限定的であり、追加の列挙されない要素または方法工程を排除しない。「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の移行句を使用する任意の工程または組成物は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」の移行句に対して同じことを記載すると言うこともできる。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、インビトロ系またはインビボ系で２つの要素を結び付けることを意味する。例えば、本明細書に記載されたペプチドまたは組成物を、Ｔｒｅｇ細胞または個体もしくは患者もしくは細胞と「接触させる」ことは、ヒトなどの個体または患者への化合物の投与、ならびに、例えば、Ｔｒｅｇ細胞を含有する細胞調製物または精製調製物を含有する試料に化合物を導入することを含む。
【００９７】
本明細書で使用される場合、異なるドメインまたは異種配列を有するタンパク質に関して使用されるときの用語「融合された（ｆｕｓｅｄ）」または「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」は、ペプチド結合または他の共有結合のどちらかにより互いに結合されたタンパク質ドメインが、同じペプチド鎖の一部であることを意味する。ドメインまたはセクションは、互いに直接連結もしくは融合されてもよく、または別のドメインもしくはペプチド配列が２つのドメインもしくは配列間にあってもよく、そのような配列は、互いに融合または連結されていると依然として見なされることになる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供された様々なドメインまたはタンパク質は互いに直接連結もしくは融合され、または本明細書に記載されたグリシン／セリン配列などのリンカー配列が２つのドメインを結び付ける。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される実施形態は以下も含むが、これらに限定されない：
１．  ７３、７６、１００、または１３８位に変異を含む、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド。
２．  変異が７３、７６、１００、または１３８位のＬからＩへの変異である、実施形態１に記載のペプチド。
３．  ４９、５１、５５、５７、６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位の１つまたは複数に変異をさらに含む、実施形態１に記載のペプチド。
４．  Ｅ３５、Ｈ３６、Ｑ４２、Ｄ１０４、Ｅ１１５、もしくはＱ１４６位の１つもしくは複数に変異をさらに含む、またはＥ３５、Ｈ３６、Ｑ４２、Ｄ１０４、Ｅ１１５、もしくはＱ１４６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは各々が野生型である、実施形態１に記載のペプチド。
５．  変異がＥ３５Ｑ、Ｈ３６Ｎ、Ｑ４２Ｅ、Ｄ１０４Ｎ、Ｅ１１５Ｑ、またはＱ１４６Ｅの１つまたは複数である、実施形態４のペプチド。
６．  Ｎ４９Ｓ変異を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のペプチド。
７．  Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｈ変異を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のペプチド。
８．  Ｋ５５Ｒ変異を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のペプチド。
９．  Ｔ５７Ａ変異を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のペプチド。
１０．  Ｋ６８Ｅ変異を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のペプチド。
１１．  Ｖ８９Ａ変異を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のペプチド。
１２．  Ｎ９１Ｒ変異を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のペプチド。
１３．  Ｑ９４Ｐ変異を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のペプチド。
１４．  Ｎ１０８ＤまたはＮ１０８Ｒ変異を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のペプチド。
１５．  Ｃ１４５ＡまたはＣ１４５Ｓ変異を含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のペプチド。
１５．１．  Ｖ８９Ａ、Ｑ９４Ｐ、Ｎ１０８ＲまたはＮ１０８Ｄ、およびＬ７３Ｉ、Ｌ７６Ｉ、Ｌ１００Ｉ、Ｌ１１８Ｉ変異の１つまたは複数、および場合によりＣ１４５ＡまたはＣ１４５Ｓ変異を含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のペプチド。
１６．  ５３、５６、８０、または１１８位に変異を含む、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド。
１７．  変異が５３、５６、８０、または１１８位のＬからＩへの変異である、実施形態１６のペプチド。
１８．  ２９、３１、３５、３７、４８、６９、７１、７４、８８、および１２５位の１つまたは複数にさらに変異を含む、実施形態１６または１７に記載のペプチド。
１９．  Ｅ１５、Ｈ１６、Ｑ２２、Ｄ８４、Ｅ９５、もしくはＱ１２６位の１つもしくは複数に変異をさらに含む、またはＥ１５、Ｈ１６、Ｑ２２、Ｄ８４、Ｅ９５、もしくはＱ１２６位の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは各々が野生型である、実施形態１６に記載のペプチド。
２０．  変異がＥ１５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｑ２２Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｅ９５Ｑ、またはＱ１２６Ｅの１つまたは複数である、実施形態１９に記載のペプチド。
２１．  Ｎ２９Ｓ変異を含む、実施形態１６〜２０のいずれか１つに記載のペプチド。
２２．  Ｙ３１ＳまたはＹ５１Ｈ変異を含む、実施形態１６〜２１のいずれか１つに記載のペプチド。
２３．  Ｋ３５Ｒ変異を含む、実施形態１６〜２２のいずれか１つに記載のペプチド。
２４．  Ｔ３７Ａ変異を含む、実施形態１６〜２３のいずれか１つに記載のペプチド。
２５．  Ｋ４８Ｅ変異を含む、実施形態１６〜２４のいずれか１つに記載のペプチド。
２６．  Ｖ６９Ａ変異を含む、実施形態１６〜２５のいずれか１つに記載のペプチド。
２７．  Ｎ７１Ｒ変異を含む、実施形態１６〜２６のいずれか１つに記載のペプチド。
２８．  Ｑ７４Ｐ変異を含む、実施形態１６〜２７のいずれか１つに記載のペプチド。
２９．  Ｎ８８ＤまたはＮ８８Ｒ変異を含む、実施形態１６〜２８のいずれか１つに記載のペプチド。
３０．  Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ変異を含む、実施形態１６〜２９のいずれか１つに記載のペプチド。
３１．  Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８ＲまたはＮ８８Ｄ、およびＬ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ１１８Ｉ変異の１つまたは複数、および場合によりＣ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ変異を含む、実施形態１６〜３０のいずれか１つに記載のペプチド。
３２．  ３０、３１、および／または３５位に対応する変異を含まない、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のペプチド。
３３．  Ｆｃペプチドをさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載のペプチド。
３３Ａ．  Ｆｃペプチドが、Ｋａｂａｔナンバリングを使用するとＬ２４７、Ｌ２４８、およびＧ２５０位に、またはＥＵナンバリングを使用するとＬ２３４、Ｌ２３５、およびＧ２３７位に変異を含む、実施形態３３に記載のペプチド。
３３Ｂ．  Ｆｃペプチドが、以下の変異：Ｌ２４７Ａ、Ｌ２４８Ａ、およびＧ２５０Ａ（Ｋａｂａｔナンバリング）またはＬ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵナンバリング）を含む、実施形態３３に記載のペプチド。
３４．  Ｆｃペプチドが、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、実施形態３３に記載のペプチド。
３５．  配列番号１または配列番号２のペプチドおよびＦｃペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載のペプチド。
３６．  リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列を含む、実施形態３５のペプチド。
３７．  配列番号１７〜４３の配列を含む、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載のペプチド。
３８．  配列番号２７のアミノ酸配列を含むペプチド。
３９．  配列番号７の配列を有するＮ末端リーダーペプチドをさらに含む、実施形態３８に記載のペプチド。
４０．  Ｃ末端にリンカーペプチドをさらに含む、実施形態１に記載のペプチド。
４１．  リンカーペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは１、２、３、または４である）の配列を含む、実施形態４０のペプチド。
４２．  ｎが１である、実施形態４１のペプチド。
４３．  ｎが２である、実施形態４１のペプチド。
４４．  ｎが３である、実施形態４１のペプチド。
４５．  ｎが４である、実施形態４１のペプチド。
４６．  Ｆｃペプチドをさらに含む、実施形態４８〜４５のいずれか１つに記載のペプチド。
４７．  Ｆｃペプチドが、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、実施形態４６のペプチド。
４８．  Ｎ末端に配列番号７の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、実施形態４７のペプチド。
４９．  Ｆｃペプチドが、配列番号２７を含むペプチドのＣ末端にある、実施形態４６のペプチド。
５０．  Ｆｃペプチドが、配列番号２７を含むペプチドのＮ末端にある、実施形態４６のペプチド。
５１．  配列番号２７のペプチドおよびＦｃペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、実施形態１に記載のペプチド。
５２．  リンカーペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは１、２、３、または４である）である、実施形態５１に記載のペプチド。
５３．  ｎが４である、実施形態５２に記載のペプチド。
５４．  Ｆｃペプチドが、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、実施形態５１〜５３に記載のペプチド。
５５．  Ｆｃペプチドが、配列番号２７を含むペプチドのＣ末端にある、実施形態５１〜５４に記載のペプチド。
５６．  Ｆｃペプチドが、配列番号２７を含むペプチドのＮ末端にある、実施形態５１〜５４に記載のペプチド。
５７．  配列番号３７、３８、３９、または４０の配列を含むペプチドを含む、実施形態１４に記載のペプチド。
５８．  実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドを含む医薬組成物。
５９．  Ｔ制御性細胞を活性化する方法であって、Ｔ制御性細胞を実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは実施形態５８に記載の医薬組成物と接触させる工程を含む前記方法。
６０．  対象における炎症性障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは実施形態５８に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する工程を含む前記方法。
６１．  炎症性障害が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化群、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎等である、実施形態６０に記載の方法。
６２．  Ｔ制御性細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を促進または刺激する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは実施形態５８に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する前記方法。
６３．  炎症性障害の処置のための医薬品の製造における、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは実施形態５８に記載の医薬組成物の使用。
６４．  炎症性障害が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化群、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎等である、実施形態６３に記載の使用。
６５．  実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドをコードする核酸分子。
６６．  実施形態６５の核酸分子を含むベクター。
６７．  実施形態６５の核酸分子を含むプラスミド。
６８．  実施形態６５の核酸分子を含む細胞。
６９．  実施形態６７のプラスミドを含む細胞。
７０．  実施形態６６のベクターを含む細胞。
７１．  実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは本明細書に記載されているペプチドを含むまたは発現する細胞。
【実施例】
【００９９】
以下の例は、本明細書に記載された化合物、組成物および方法の例示であるが、限定するものではない。当業者に公知の他の適切な修正および応用は、以下の実施形態の範囲内である。
【実施例１】
【０１００】
配列番号１１、１２、１３、または１４のタンパク質を含む治療的組成物を、ＩＢＤに罹患している対象に投与した。対象の免疫系が下方制御され、ＩＢＤの症状が軽減される。
【実施例２】
【０１０１】
リーダー配列を含むまたは含まない配列番号３、４、５、または６のタンパク質を含む治療的組成物を、ＩＢＤに罹患している対象に投与した。対象の免疫系が下方制御されＩＢＤの症状が軽減される。
【実施例３】
【０１０２】
ＩＬ−ムテインの生成
ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインにＮ末端（配列番号４０）またはＣ末端（配列番号４１）融合したヒトＩＬ−２Ｍポリペプチドをコードする単一遺伝子を含有するｐＴＴ５ベクターを、ＨＥＫ２９３  Ｅｘｐｉ細胞にトランスフェクトした。５〜７日後、ＩＬ−２Ｍを発現する細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄化し、０．２２ｕｍ濾過装置を通して濾過した。ＩＬ−２ＭをプロテインＡ樹脂に捕捉した。樹脂をＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、１０分の１容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を使用して中和しながら、０．２５％酢酸、ｐＨ３．５を使用して捕捉タンパク質を溶出した。タンパク質を３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７に緩衝液交換し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ３．２／３００カラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％ゲルで還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製材料５ｕｇの分析を行った。ＩＬ−２Ｍは、サイズ排除クロマトグラフィーおよび還元／非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されたように、精製後に１０ｍｇ／Ｌ以上で発現し、９５％以上単分散した。
【実施例４】
【０１０３】
ＩＬ−２Ｍ分子はＣＤ２５に結合することができる
免疫吸着プレートを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、濃度０．５μｇ／ｍＬ、７５ｕｌ／ウェルのＣＤ２５でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ  ｐＨ７．４（洗浄緩衝液）で３回洗浄し、次いでＰＢＳ  ｐＨ７．４中２００ｕｌ／ウェル１％  ＢＳＡ（ブロック緩衝液）を用いて室温で２時間ブロックした。洗浄緩衝液で３回洗浄後、ＩＬ−２Ｍ分子を、１％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（アッセイ緩衝液）中、最高濃度２ｎＭで１２倍連続希釈に希釈した。希釈材料を、室温で１時間、７５ｕｌ／ウェルでＣＤ２５コートプレートに添加した。洗浄緩衝液で３回洗浄後、アッセイ緩衝液中０．０５μｇ／ｍＬに希釈したヤギビオチン化抗ＩＬ−２ポリクローナル抗体を、室温で１時間、７５ｕｌ／ウェルでプレートに添加した。洗浄緩衝液で３回洗浄後、アッセイ緩衝液中１：５０００で希釈したストレプトアビジンＨＲＰを、室温で１５分間、７５ｕｌ／ウェルでプレートに添加した。洗浄緩衝液で３回、および洗浄緩衝液（ｔｗｅｅｎ−２０なし）で１回洗浄後、アッセイをＴＭＢで展開し、１Ｎ  ＨＣＬで停止した。ＯＤ４５０ｎｍを測定した。実験には、ＣＤ２５の非存在下、プレート／ブロックへのＩＬ−２Ｍ分子の非特異的結合に関する適当な対照、およびＣＤ２５に結合することができない陰性対照分子が含まれた。
【０１０４】
結果は、２ｎＭ〜１．９ｐＭの濃度で、ＩＬ−２Ｍ分子はナノモル以下のＥＣ５０でＣＤ２５に結合できることを示した。さらに、ＣＤ２５がプレート表面に存在しなかった場合、テストした任意の濃度ではいかなる化合物も検出されず、テスト化合物がプレート表面と非特異的に相互作用していないことを示した（データ不図示）。
【実施例５】
【０１０５】
ＩＬ−２Ｍ分子の効力および選択性を決定するためのインビトロＰ−ＳＴＡＴ５アッセイ
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、単離したばかりのヘパリン化ヒト全血からＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ  ＰｒｅｍｉｕｍおよびＳｅｐｍａｔｅチューブを使用して製造した。野生型ＩＬ−２または実施例１２のＩＬ−２Ｍの存在下、ＰＢＭＣを１０％ウシ胎児血清ＲＰＭＩ培地で２０分間培養し、次いでＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘで１０分間固定した。
【０１０６】
固定した細胞を、ＢＤ  Ｐｅｒｍ  ＩＩＩおよび次いでＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＦＯＸＰ３透過処理緩衝液で連続的に透過処理した。ヒト血清を用いて１０分間ブロックした後、細胞をホスホ−ＳＴＡＴ５  ＦＩＴＣ、ＣＤ２５  ＰＥ、ＦＯＸＰ３  ＡＦ６４７およびＣＤ４  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５に対する抗体で３０分間染色し、次いでプレートリーダーを備えたＡｔｔｕｎｅ  ＮＸＴで取得を行った。配列番号２３のＩＬ−２Ｍは、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５リン酸化を強力および選択的に誘導したが、Ｔｅｆｆではそのような誘導は生じなかった。
【実施例６】
【０１０７】
ＩＬ−２ムテインの免疫原性
ＩＬ−２ムテイン変異体配列を、ｗｗｗ「ドット」ｃｂｓ  「ドット」ｄｔｕ「ドット」ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ／で見出すことができるＮｅｔＭＨＣＩＩＰａｎ  ３．２ソフトウェアを使用して分析した。人工ニューラルネットワークを使用してＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対するペプチド親和性を決定した。その分析の中で、ＭＨＣクラスＩＩ分子との直接相互作用を有する可能性がある９残基ペプチドを結合コアとして認識した。結合に間接的に影響を与える可能性を有する、結合コアに隣接する残基もマスキング残基として調べた。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する予測ＫＤが５０ｎＭより低い場合、結合コアおよびマスキング残基の両方を含むペプチドを強いバインダーとしてマークした。強いバインダーは、Ｔ細胞免疫原性を導入する可能性がより高まる。
【０１０８】
北米および欧州で高度に示される合計９つのＭＨＣＩＩ対立遺伝子を、コンピュータによる解析に含めた。テストしたＩＬ−２Ｍ（ＩＬ−２ムテイン）分子のパネルは、Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、またはＬ１１８Ｉ変異を有するＩＬ−２ムテインを含んだ。ＭＨＣＩＩ対立遺伝子ＤＲＢ１＿１１０１、ＤＲＢ１＿１５０１、ＤＲＢ１＿０７０１、およびＤＲＢ１＿０１０１のみが、評価した分子のいずれかでヒットを生じた。ＤＲＢ＿１５０１に対するペプチドヒットは、Ｃ１２５Ｓ変異を有する野生型ＩＬ−２を含むテストした全ての構築物間で同じであった。Ｌ８０Ｉの付加により、ＤＲＢ１＿０１０１［ＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲ］に対する１個のＴ細胞エピトープが除去され、２個の他のＴ細胞エピトープ［ＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲおよびＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰ］の親和性はやや低下した。ＭＨＣＩＩ対立遺伝子ＤＲＢ１＿０７０１に関して、Ｌ８０Ｉは１個のＴ細胞エピトープ［ＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲ］を除去した。したがって、データは、Ｌ８０Ｉ変異を含むＩＬ−２ムテインは免疫原性が低いはずであることを示した。これは、コンピュータによる解析からの驚くべきおよび予想外の結果であった。
【実施例７】
【０１０９】
追加のＩＬ−２ムテインの生成
ヒトＩＬ−２ＭまたはヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＮ末端に融合したＩＬ−２Ｍを有する単一ＩＬ−２Ｍ（ＩＬ−２ムテイン）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０（およびＩＬ−２Ｍ対照；配列番号３４）ポリペプチドをコードする単一遺伝子を含有するｐＴＴ５ベクターを、ＨＥＫ２９３  Ｅｘｐｉ細胞にトランスフェクトした。５〜７日後、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０（およびＩＬ−２Ｍ対照；配列番号３４）を発現する細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄化し、０．２２ｕｍ濾過装置を通して濾過した。配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０（およびＩＬ−２Ｍ対照；配列番号３４）をプロテインＡ樹脂に捕捉した。樹脂をＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、１０分の１容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を使用して中和しながら、０．２５％酢酸、ｐＨ３．５を使用して捕捉タンパク質を溶出した。タンパク質を３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７に緩衝液交換し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ３．２／３００カラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４〜１２％ゲルで還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製材料５ｕｇの分析を行った。
【０１１０】
ＩＬ−２Ｍ配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０（およびＩＬ−２Ｍ対照；配列番号３４）は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび還元／非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されたように、精製後に４５ｍｇ／Ｌ以上で発現し、９５％以上単分散した。
【実施例８】
【０１１１】
ＩＬ−２ＭはＣＤ２５に結合することができる
免疫吸着プレートを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、濃度０．５μｇ／ｍＬ、７５ｕｌ／ウェルのＣＤ２５でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ  ｐＨ７．４（洗浄緩衝液）で３回洗浄し、次いでＰＢＳ  ｐＨ７．４中２００ｕｌ／ウェル１％  ＢＳＡ（ブロック緩衝液）を用いて室温で２時間ブロックした。洗浄緩衝液で３回洗浄後、ＩＬ−２Ｍ配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０を、１％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（アッセイ緩衝液）中、最高濃度２ｎＭで１２倍連続希釈に希釈した。希釈材料を、室温で１時間、７５ｕｌ／ウェルでＣＤ２５コートプレートに添加した。洗浄緩衝液で３回洗浄後、アッセイ緩衝液中０．０５μｇ／ｍＬに希釈したヤギビオチン化抗ＩＬ−２ポリクローナル抗体を、室温で１時間、７５ｕｌ／ウェルでプレートに添加した。洗浄緩衝液で３回洗浄後、アッセイ緩衝液中１：５０００で希釈した高感受性ストレプトアビジンＨＲＰを、室温で１５分間、７５ｕｌ／ウェルでプレートに添加した。洗浄緩衝液で３回、および洗浄緩衝液（ｔｗｅｅｎ−２０なし）で１回洗浄後、アッセイをＴＭＢで展開し、１Ｎ  ＨＣＬで停止した。ＯＤ４５０ｎｍを測定した。実験には、ＣＤ２５の非存在下、プレート／ブロックへの分子の非特異的結合に関する適当な対照を含めた。結果は、２ｎＭ〜１．９ｐＭで、実施例７のムテインはナノモル以下のＥＣ５０でＣＤ２５に結合できたことを示した。さらに、ＣＤ２５がプレート表面に存在しなかった場合、テストした任意の濃度ではいかなる化合物も検出されず、テスト化合物がプレート表面と非特異的に相互作用していないことを示した。故に、実施例７のムテインは、ＣＤ２５に結合することができる。
【実施例９】
【０１１２】
実施例７のＩＬ−２ムテインは強力および選択的である
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、単離したばかりのヘパリン化ヒト全血からＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ  ＰｒｅｍｉｕｍおよびＳｅｐｍａｔｅチューブを使用して製造した。野生型ＩＬ−２または実施例７のムテインの存在下、ＰＢＭＣを１０％ウシ胎児血清ＲＰＭＩ培地で２０分間培養し、次いでＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘで１０分間固定した。固定した細胞を、ＢＤ  Ｐｅｒｍ  ＩＩＩおよび次いでＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＦＯＸＰ３透過処理緩衝液で連続的に透過処理した。ヒト血清を用いて１０分間ブロックした後、細胞をホスホ−ＳＴＡＴ５  ＦＩＴＣ（ＣＳＴ）、ＣＤ２５  ＰＥ、ＦＯＸＰ３  ＡＦ６４７およびＣＤ４  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５（全てＢＤ）対する抗体で３０分間染色し、次いでプレートリーダーを備えたＡｔｔｕｎｅ  ＮＸＴで取得を行った。実施例７のＩＬ−２ムテインは、強力であり、Ｔｅｆｆと比べてＴｒｅｇに対して選択性を有することが見出された。Ｌ１１８Ｉ変異を有するムテインは、他のムテインと比較して活性および選択性を増加させることが見出された。
【実施例１０】
【０１１３】
ＩＬ−２ムテインはヒト化マウスにおいてＴｒｅｇを拡大する
ヒトＣＤ３４＋  造血幹細胞によりヒト化したＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから購入した。０および７日目に、１ｕｇ  ＩＬ−２ムテイン配列番号３４または他のＩＬ−２ムテイン配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、もしくは配列番号４０をマウスに皮下投与した。７日目にマウスを安楽死させ、全血および脾臓を回収した。全血を９６ウェルのディープウェルプレートに等分し、ＢＤ  Ｆｉｘ  Ｌｙｓｅを使用して１０分間固定した。７０ｕｍフィルター（ＢＤ）を使用して脾細胞を単離し、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製ＲＢＣ溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解した。２％ウシ胎児血清ＰＢＳで洗浄後、脾細胞を近赤外線生死染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２０分間標識し、次いでＢｉｏＬｅｇｅｎｄ固定化緩衝液を使用して２０分間固定した。全血細胞および脾細胞の両方を、次いで、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＦＯＸＰ３透過処理緩衝液を使用して透過処理し、ヒト血清でブロックし、ヒトＣＤ８ａ  ＦＩＴＣ（ＢＬ）、ヒトＣＤ２５  ＰＥ（ＢＤ）、ヒトＦＯＸＰ３  ＡＦ６４７（ＢＤ）、ＣＤ４  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５（ＢＤ）、ヒトＳｉｇｌｅｃ−８  ＰＥ  Ｃｙ７（ＢＬ）、ヒトＣＤ３  ＢＶ４２１（ＢＬ）、ヒトＣＤ４５  ＢＶ６０５（ＢＬ）、ヒトＣＤ５６  ＢＶ７８５（ＢＬ）およびマウスＣＤ４５（ＢＶ７１１）に対する抗体で３０分間染色し、プレートリーダーを備えたＡｔｔｕｎｅ  ＮＸＴで取得を行った。
【０１１４】
ビヒクル対照と比べて、ＩＬ−２Ｍ配列番号３７および配列番号３８および配列番号３９および配列番号４０は、ヒト化マウスのマウス脾臓および全血においてヒトＴｒｅｇを選択的に誘導した。ヒトＣＤ５６ｐｏｓ  ＮＫ細胞、ＣＤ３ｐｏｓ  Ｔ細胞、ＣＤ８ｐｏｓ細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＤ４ｐｏｓヘルパーＴ細胞またはＣＤ２５ｌｏ／ＦＯＸＰ３ｎｅｇ  Ｔエフェクターの頻度に有意な変化はなかった。これらの結果は、ＩＬ−２ムテインが制御性Ｔ細胞の頻度を増加させることを示している。
【実施例１１】
【０１１５】
ＩＬ−２ムテインによって誘導されたシグナル伝達の永続性
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、単離したばかりのヘパリン化ヒト全血からＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ  ＰｒｅｍｉｕｍおよびＳｅｐｍａｔｅチューブを使用して製造した。ＩＬ−２Ｍの存在下、ＰＢＭＣを１０％ウシ胎児血清ＲＰＭＩ培地で６０分間培養した。細胞を次いで３回洗浄し、さらに３時間インキュベートした。細胞を、次いでＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘで１０分間固定した。固定した細胞を、ＢＤ  Ｐｅｒｍ  ＩＩＩおよび次いでＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＦＯＸＰ３透過処理緩衝液で連続的に透過処理した。ヒト血清を用いて１０分間ブロックした後、細胞をホスホ−ＳＴＡＴ５  ＦＩＴＣ、ＣＤ２５  ＰＥ、ＦＯＸＰ３  ＡＦ６４７およびＣＤ４  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５に対する抗体で３０分間染色し、次いでプレートリーダーを備えたＡｔｔｕｎｅ  ＮＸＴで取得を行った。実施例１９の４つのＩＬ−２ムテイン全てが、対照と比較してＴｒｅｇにおいて永続的なシグナル伝達を誘導したが、Ｔｅｆｆでは誘導しなかった。配列番号４０は、配列番号３９、配列番号３８または配列番号３７より優れていた。これらの結果は、インビボでのより大きなＴｒｅｇ拡大をもたらし、低頻度投与を可能にしてＴｒｅｇ拡大を達成するはずの永続的および選択的なシグナル伝達を、ＩＬ−２がＴｒｅｇにおいて誘導し得ることを示している。
【０１１６】
本明細書に提供された例は、ＩＬ−２ムテインがＴｅｆｆよりＴｒｅｇを選択的および強力に活性化するように機能し得るという驚くべきおよび予想外の結果を示している。これは、該分子が、本明細書に記載された状態を処置または改善するのに使用できることを示すものである。本明細書に提供されるＩＬ−２ムテインは、本明細書に提供されるＦｃドメインまたはリンカーに融合した状態または融合しない状態でも生成および使用することができる。
【０１１７】
実施形態は、特定の例を参照して記載されてきた。これらの例は、いかなる形でも実施形態を限定することを意味するものではない。本開示の目的のために、本開示の十分に範囲内である様々な変更および修正がなされ得ることが理解される。当業者に容易に思い浮かぶ、および本明細書に開示され、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨に包含される数多くの他の変更がなされ得る。
【実施例１２】
【０１１８】
ムテインは全般的ＰＯＩおよびより低い凝集を示す
本明細書に提供されるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ変異を含むＦｃ領域に連結したＶ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、およびＣ１２５Ｓの変異、ならびに以下の変異Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、またはＬ１１８Ｉの１つを有するＩＬ−２ムテインを、ＨＥＫ２９３  Ｅｘｐｉ細胞にｐＴＴ５ベクターをトランスフェクトして該ベクターで発現させた。ＩＬ−２ムテインを４ＧＧＧＧＳリピートを有するＦｃ領域のＮ末端に連結した。５〜７日後、異なるＩＬ−２ムテインを発現する細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄化し、０．２２ｕｍ濾過装置を通して濾過した。ＩＬ−２ムテインをプロテインＡ樹脂に捕捉した。樹脂をＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、１０分の１容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を使用して中和しながら、０．２５％酢酸、ｐＨ３．５を使用して捕捉タンパク質を溶出した。タンパク質を３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７に緩衝液交換し、目的とするピーク（ＰＯＩ）パーセントについてＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ  ＳＥＣカラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。結果は、種々のムテインが６０ｍｇ／Ｌ以上で発現したことを示している。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーによって示されたように、Ｌ８０ＩまたはＬ１１８Ｉ変異を有するムテインは９０％超が単分散したが、Ｌ５３ＩまたはＬ５６Ｉ変異を有するムテインではそうならなかったことが、驚くべきことに見出された。故に、Ｌ８０ＩまたはＬ１１８Ｉ置換を有するムテインは凝集が少なかった。４つの分子（Ｌ８０Ｉ、Ｌ１１８Ｉ、Ｌ５３Ｉ、およびＬ５６Ｉを含むＩＬ−２ムテイン）の間の凝集の差は、作製されている変異のタイプのために意外であった。したがって、Ｌ８０ＩまたはＬ１１８Ｉ変異を有するムテインは、他のムテインほど凝集しないという点で他のムテインと比べて驚くべき利点を有する。
【実施例１３】
【０１１９】
ＩＬ−２ムテインは効力が予想外に増加する
実施例１２に記載したムテインを、効力についてインビトロアッセイで分析した。簡単には、ＰＢＭＣをヘパリン化ヒト全血から単離し、３７℃で３０分間、一定濃度の種々のムテインを用いて刺激した。固定化によって刺激を停止した。透過処理後、細胞内ＦｏｘＰ３およびホスホ−ＳＴＡＴ５レベルならびに表面ＣＤ４およびＣＤ２５発現についてＰＢＭＣを染色し、フローサイトメトリーによって分析した。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を、それぞれＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏＦｏｘＰ３−としてゲーティングした。ホスホ−ＳＴＡＴ５について陽性染色した細胞の割合を示した。このアッセイは、Ｔｅｆｆを刺激することなくＴｒｅｇを特異的に刺激するムテインの能力を測定した。各テスト物質の最適用量反応曲線を使用してＥＣ５０値を計算した。
【０１２０】
驚くべきことに、Ｌ１１８Ｉ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ５６Ｉ、またはＬ５３Ｉの変異を有するムテインは、これらの変異のいずれも有さないＩＬ−２ムテインと比較して、（Ｔｒｅｇを刺激する）効力を増加させた。Ｌ１１８Ｉ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ５６Ｉ、またはＬ５３Ｉの変異を有するが、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、およびＮ８８Ｄ変異を持たないＩＬ−２ムテインは、約５１ｐＭであった。Ｌ１１８Ｉ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ５６Ｉ、またはＬ５３Ｉの１つを含むムテインの各ＥＣ５０は、それぞれ約３０、４０、４１、および４５のＥＣ５０を有した。Ｔｒｅｇ刺激（Ｔｅｆｆ刺激の変化なし）に関するＥＣ５０の差は驚くべきものであり、この例に記載された変異の１つを有するムテインについては予測されていなかったであろう。データはまた、Ｌ１１８Ｉ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ５６Ｉ、またはＬ５３Ｉ変異の１つも含むムテインに対する親ＩＬ−２ムテイン（Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、およびＣ１２５Ｓを含む）の比を比較して評価することもできた。この比を使用して、異なる実験に使用される異なる細胞集団を正規化した。この比を使用するとＬ１１８Ｉは、親対照と比較して約２５％多い効力（平均０．１６の標準誤差）の平均増加を有したのに対し、他の変異は、この比を使用すると親対照と比較して活性が減少した。
【０１２１】
Ｌ１１８Ｉ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ５６Ｉ、またはＬ５３Ｉ変異の１つを有するムテインについて、インビトロデータをインビボで確認した。Ｌ１１８Ｉは、Ｌ１１８Ｉ変異がないムテインより強力であることがインビボで見出された。簡単には、ヒトＣＤ３４＋  造血幹細胞で再構成したＮｏｄ−Ｓｃｉｄ−ＩＬ−２Ｒガンマ欠損（ＮＳＧ）マウスに、示されたテスト物質またはビヒクル１マイクログラムを０および７日目に皮下注射した。１１日目に、マウスを殺処分し、ヘパリンを含有するチューブへの心臓穿刺により血液を回収した。末梢血白血球（ＰＢＬ）を赤血球の溶解によって単離し、ヒトマーカーＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびＣＤ５６に反応する抗体で染色した。ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）、活性化エフェクターＴ細胞（ａｃｔ  Ｔｅｆｆ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３−）およびＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋）の割合をフローサイトメトリーによって決定した。全ＣＤ４５＋、全ＣＤ４＋および全ＣＤ８＋細胞の頻度は変わらなかった。同様の結果がマウスの脾臓で観察された。Ｌ８０Ｉ変異を有するＩＬ−２ムテインのこのアッセイで測定した場合のインビボでの効力は、Ｌ８０Ｉ変異がないムテインと比較してわずかに増加し、Ｌ５６ＩまたはＬ５３Ｉ変異のどちらかを有するムテインのこのアッセイで測定した場合のインビボでの効力は、変異がないムテインとほぼ同じであった。ムテインは、２０アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）４リンカーにより、本明細書に記載されているＦｃ領域にＮ末端で連結させた。すなわち、リンカーは、ＩＬ−２ムテインのＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に連結した。
【実施例１４】
【０１２２】
２０アミノ酸リンカーを有するＮ末端Ｆｃ配向がＴｒｅｇ刺激に最も有効である。
Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、およびＮ８８Ｄを有するＩＬ−２ムテインを、異なる長さのＧＧＧＧＳリピートを使用してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ変異の変異を含むＦｃ領域に融合させた。３および４つのＧＧＧＧＳリピートを含むリンカーによりムテインのｃ末端を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃのｎ末端に融合されたＩＬ２−ムテイン分子をテストして、リンカーの長さがＩＬ−２ムテインの効力に影響を与えるかどうかを決定した。単一ＧＧＧＧＳリピートによりムテインのｎ末端を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃのｃ末端に融合されたムテインもテストした。簡単には、ヒトＣＤ３４＋  造血幹細胞で再構成したＮｏｄ−Ｓｃｉｄ−ＩＬ−２Ｒガンマ欠損（ＮＳＧ）マウスに、リンカー長が異なる種々のＩＬ−２ムテインまたはビヒクル１マイクログラムを０日目に皮下注射した。７日目に、マウスを殺処分し、ヘパリンを含有するチューブへの心臓穿刺により血液を回収した。末梢血白血球（ＰＢＬ）を赤血球の溶解によって単離し、ヒトマーカーＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびＣＤ５６に反応する抗体で染色した。ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）、活性化エフェクターＴ細胞（ａｃｔ  Ｔｅｆｆ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３−）およびＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋）の割合をフローサイトメトリーによって決定した。全ＣＤ４５＋、全ＣＤ４＋および全ＣＤ８＋細胞の頻度は変わらなかった。同様の結果がマウスの脾臓で観察された。
【０１２３】
３つのＧＧＧＧＳリピートしか持たないリンカーによるムテイン、または単一ＧＧＧＧＳリピートによりヒトＩｇＧ１  Ｆｃのｃ末端で融合されたムテインと比較して、４つのＧＧＧＧＳリピートを含むリンカーによりヒトＩｇＧ１  ＦｃのＮ末端で融合されたムテインが最も強力であることが見出された。さらに、４つのＧＧＧＧＳリピートを有するタンパク質はＴｒｅｇ拡大に、より有効であったが、この構成はＣＤ５６＋  ＮＫ細胞拡大のいかなる差ももたらさなかった。より長いリンカーによるＮ末端Ｆｃ融合ムテインを含むタンパク質が最も強力であり、また、ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞拡大のいかなる差ももたらさないことを予測することはできなかった。
【実施例１５】
【０１２４】
活動性関節リウマチ患者の処置
配列番号３７、３８、３９、または４０の配列を含むＩＬ−２ムテインタンパク質を含む医薬組成物を、活動性関節リウマチ患者に投与した。ＩＬ−２ムテインは、患者における活動性関節リウマチを処置する上で有効であることが見出された。
【実施例１６】
【０１２５】
活動性全身性エリテマトーデス患者の処置
配列番号３７、３８、３９、または４０の配列を含むＩＬ−２ムテインタンパク質を含む医薬組成物を、活動性全身性エリテマトーデス患者に投与した。ＩＬ−２ムテインは、活動性全身性エリテマトーデスを処置する上で有効であることが見出された。
【実施例１７】
【０１２６】
ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病患者の処置
配列番号３７、３８、３９、または４０の配列を含むＩＬ−２ムテインタンパク質を含む医薬組成物を、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病患者に投与した。ＩＬ−２ムテインは、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病を処置する上で有効であることが見出された。
【実施例１８】
【０１２７】
ＩＬ−２ムテインはヒトＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５を誘導する
６名の健康なドナー由来のヘパリン化全血からの精製ＰＢＭＣを、配列番号３９または４０の配列を含むＩＬ−２ムテインタンパク質の連続希釈物を用いて３７℃で３０分間処置した。細胞を固定し、洗浄し、透過処理し、洗浄した。表面マーカーおよび細胞内／核マーカー（ｐＳＴＡＴ５およびＦＯＸＰ３）の両方を検出する抗体で細胞を染色した。データをＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴサイトメーターで回収した。Ｔｒｅｇを、単核、シングレット、ＣＤ３ｐｏｓ、ＣＤ４ｐｏｓ、ＣＤ２５ｈｉ、ＦｏｘＰ３ｐｏｓとしてゲーティングした。リン酸化ＳＴＡＴ５を発現するゲーティングしたＴｒｅｇの割合を測定した。最適曲線をｐＳＴＡＴ５の用量反応にフィットさせ、ＥＣ５０値を決定した。６名の全ドナーの平均ＥＣ５０値を、配列番号３９のＩＬ−２（３７．２６±７．３０；ｎ＝１６）および配列番号４０のＩＬ−２（２３．１１±５．３５；ｎ＝１５）について決定した。データは、ＩＬ−２ムテインがヒトＴｒｅｇにおいてｐＳＴＡＴ５を誘導できることを示した。配列番号４０の配列を含むＩＬ−２は配列番号３９を含むＩＬ−２配列より強力であったが、両方とも細胞の複数の集団にわたって活性であった。
【実施例１９】
【０１２８】
ＩＬ−２ムテインはインビトロでサルＰＢＭＣにおけるｐＳＴＡＴ５を誘導する
３匹の健康なサル由来のヘパリン化全血からの精製ＰＢＭＣを、配列番号３９または４０の配列を含むＩＬ−２ムテインタンパク質の連続希釈物を用いて３７℃で３０分間処置した。蛍光色素コンジュゲート抗ＣＤ２５および抗ＣＤ４を、ＩＬ−２ムテイン処置の最後の３０分間に添加した。細胞を固定し、洗浄し、透過処理し、洗浄した。表面マーカーおよび細胞内／核マーカー（ｐＳＴＡＴ５およびＦＯＸＰ３）の両方を検出する残りの抗体で細胞を染色した。データをＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴサイトメーターで回収した。Ｔｒｅｇを単核、シングレット、ＣＤ４ｐｏｓ、ＣＤ２５ｈｉ、ＦｏｘＰ３ｐｏｓとしてゲーティングした。リン酸化ＳＴＡＴ５を発現するゲーティングしたＴｒｅｇの割合を測定した。ＩＬ−２ムテインは、サルにおいてｐＳＴＡＴ５を誘導することが見出された。
【実施例２０】
【０１２９】
ＩＬ−２ムテインはインビボでＴｒｅｇ細胞を拡大し、Ｔｒｅｇ増殖を誘導する
静脈全血をサル（カニクイザル）から、配列番号３９または４０のＩＬ−２ムテインを投与する前（２時点／匹、５匹）、および配列番号３９（５時点／匹、２匹）または配列番号４０（５時点／匹、３匹）のどちらかを投与した後でＫ２ＥＤＴＡチューブに回収した。試料を２つに分け、２つのＦＡＣＳパネルについて別々に染色した。１つは「Ｔｒｅｇパネル」であり、１つは一般的な免疫表現型検査パネルであった。ＲＢＣを溶解し、固定化および透過処理後に表面および細胞内マーカーについて細胞を染色した。ＦＡＣ分析のために、全細胞／ｕｌの数をＡＤＶＩＡによって決定した。所与の下位集団／ｕｌの細胞数を、次いで総数／ｕｌおよび全細胞に対する割合で計算した。「投与前からの倍数変化」が決定されるように、サルごとに２回の投与前採血の所与の細胞タイプ／ｕｌの平均数を平均し、投与後採血を正規化するのに使用した。血清サイトカインおよびケモカインを分析するために、Ｋ２ＥＤＴＡ全血からの血漿を試験の終了まで凍結した。ケモカインおよびサイトカイン量を、基準対照の連続希釈物を使用してマルチプレックスＭＳＤアッセイによって定量化した。ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０の平均および範囲を投与前採血で決定した。両方のムテインが、サルにおいてＴｒｅｇを拡大し、Ｔｒｅｇ増殖を誘導することが見出された。これらの結果は、ヒトと類似したインビボ動物モデルでＩＬ−２ムテインが機能することを示している。また、どちらの分子も、サル（非ヒト霊長類）においてＴｃｏｎｖ細胞、ＣＤ４細胞（Ｔｎａｉｖｅ）またはＣＤ８細胞（細胞傷害性Ｔ）、ＮＫ細胞を有意に拡大しないことも見出された。また、どちらの分子も、血清ケモカインを有意に誘導しないことも見出された。このデータは、ＩＬ−２ムテインが、他の経路を不要に拡大または活性化することなくＴｒｅｇ細胞を拡大し、Ｔｒｅｇ細胞増殖を誘導できることを示している。故に、ＩＬ−２ムテインは、Ｔｒｅｇ拡大および増殖に関して驚くほど強力であり、有効であり、選択的である。
【０１３０】
まとめると、本明細書に提供された実施形態および例は、本明細書に記載された疾患および状態を処置するために、ＩＬ−２ムテインが意図されたように機能し、使用され得ることを示している。
【０１３１】
本明細書は、特許、特許出願、および刊行物の数多くの引用を含有する。各々は、全ての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2021507690.tif 000011
【配列表】
2021507690000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月28日(2020.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【表１】
2021507690.tif 000012
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される実施形態は以下も含むが、これらに限定されない：
１．  ７３、７６、１００、または１３８位に変異を含む、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド。
２．  変異が７３、７６、１００、または１３８位のＬからＩへの変異である、実施形態１に記載のペプチド。
３．  ４９、５１、５５、５７、６８、８９、９１、９４、１０８、および１４５位の１つまたは複数に変異をさらに含む、実施形態１に記載のペプチド。
４．  Ｅ３５、Ｈ３６、Ｑ４２、Ｄ１０４、Ｅ１１５、もしくはＱ１４６位の１つもしくは複数に変異をさらに含む、またはＥ３５、Ｈ３６、Ｑ４２、Ｄ１０４、Ｅ１１５、もしくはＱ１４６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは各々が野生型である、実施形態１に記載のペプチド。
５．  変異がＥ３５Ｑ、Ｈ３６Ｎ、Ｑ４２Ｅ、Ｄ１０４Ｎ、Ｅ１１５Ｑ、またはＱ１４６Ｅの１つまたは複数である、実施形態４のペプチド。
６．  Ｎ４９Ｓ変異を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のペプチド。
７．  Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｈ変異を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のペプチド。
８．  Ｋ５５Ｒ変異を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のペプチド。
９．  Ｔ５７Ａ変異を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のペプチド。
１０．  Ｋ６８Ｅ変異を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のペプチド。
１１．  Ｖ８９Ａ変異を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のペプチド。
１２．  Ｎ９１Ｒ変異を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のペプチド。
１３．  Ｑ９４Ｐ変異を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のペプチド。
１４．  Ｎ１０８ＤまたはＮ１０８Ｒ変異を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のペプチド。
１５．  Ｃ１４５ＡまたはＣ１４５Ｓ変異を含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のペプチド。
１５．１．  Ｖ８９Ａ、Ｑ９４Ｐ、Ｎ１０８ＲまたはＮ１０８Ｄ、およびＬ７３Ｉ、Ｌ７６Ｉ、Ｌ１００Ｉ、Ｌ１１８Ｉ変異の１つまたは複数、および場合によりＣ１４５ＡまたはＣ１４５Ｓ変異を含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のペプチド。
１６．  ５３、５６、８０、または１１８位に変異を含む、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド。
１７．  変異が５３、５６、８０、または１１８位のＬからＩへの変異である、実施形態１６のペプチド。
１８．  ２９、３１、３５、３７、４８、６９、７１、７４、８８、および１２５位の１つまたは複数にさらに変異を含む、実施形態１６または１７に記載のペプチド。
１９．  Ｅ１５、Ｈ１６、Ｑ２２、Ｄ８４、Ｅ９５、もしくはＱ１２６位の１つもしくは複数に変異をさらに含む、またはＥ１５、Ｈ１６、Ｑ２２、Ｄ８４、Ｅ９５、もしくはＱ１２６位の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは各々が野生型である、実施形態１６に記載のペプチド。
２０．  変異がＥ１５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｑ２２Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｅ９５Ｑ、またはＱ１２６Ｅの１つまたは複数である、実施形態１９に記載のペプチド。
２１．  Ｎ２９Ｓ変異を含む、実施形態１６〜２０のいずれか１つに記載のペプチド。
２２．  Ｙ３１ＳまたはＹ５１Ｈ変異を含む、実施形態１６〜２１のいずれか１つに記載のペプチド。
２３．  Ｋ３５Ｒ変異を含む、実施形態１６〜２２のいずれか１つに記載のペプチド。
２４．  Ｔ３７Ａ変異を含む、実施形態１６〜２３のいずれか１つに記載のペプチド。
２５．  Ｋ４８Ｅ変異を含む、実施形態１６〜２４のいずれか１つに記載のペプチド。
２６．  Ｖ６９Ａ変異を含む、実施形態１６〜２５のいずれか１つに記載のペプチド。
２７．  Ｎ７１Ｒ変異を含む、実施形態１６〜２６のいずれか１つに記載のペプチド。
２８．  Ｑ７４Ｐ変異を含む、実施形態１６〜２７のいずれか１つに記載のペプチド。
２９．  Ｎ８８ＤまたはＮ８８Ｒ変異を含む、実施形態１６〜２８のいずれか１つに記載のペプチド。
３０．  Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ変異を含む、実施形態１６〜２９のいずれか１つに
記載のペプチド。
３１．  Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８ＲまたはＮ８８Ｄ、およびＬ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ１１８Ｉ変異の１つまたは複数、および場合によりＣ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ変異を含む、実施形態１６〜３０のいずれか１つに記載のペプチド。
３２．  ３０、３１、および／または３５位に対応する変異を含まない、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のペプチド。
３３．  Ｆｃペプチドをさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載のペプチド。
３３Ａ．  Ｆｃペプチドが、Ｋａｂａｔナンバリングを使用するとＬ２４７、Ｌ２４８、およびＧ２５０位に、またはＥＵナンバリングを使用するとＬ２３４、Ｌ２３５、およびＧ２３７位に変異を含む、実施形態３３に記載のペプチド。
３３Ｂ．  Ｆｃペプチドが、以下の変異：Ｌ２４７Ａ、Ｌ２４８Ａ、およびＧ２５０Ａ（Ｋａｂａｔナンバリング）またはＬ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵナンバリング）を含む、実施形態３３に記載のペプチド。
３４．  Ｆｃペプチドが、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、実施形態３３に記載のペプチド。
３５．  配列番号１または配列番号２のペプチドおよびＦｃペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載のペプチド。
３６．  リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）の配列を含む、実施形態３５のペプチド。
３７．  配列番号１７〜４３の配列を含む、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載のペプチド。
３８．  配列番号２７のアミノ酸配列を含むペプチド。
３９．  配列番号７の配列を有するＮ末端リーダーペプチドをさらに含む、実施形態３８に記載のペプチド。
４０．  Ｃ末端にリンカーペプチドをさらに含む、実施形態１に記載のペプチド。
４１．  リンカーペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０）（式中、ｎは１、２、３、または４である）の配列を含む、実施形態４０のペプチド。
４２．  ｎが１である、実施形態４１のペプチド。
４３．  ｎが２である、実施形態４１のペプチド。
４４．  ｎが３である、実施形態４１のペプチド。
４５．  ｎが４である、実施形態４１のペプチド。
４６．  Ｆｃペプチドをさらに含む、実施形態４８〜４５のいずれか１つに記載のペプチド。
４７．  Ｆｃペプチドが、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、実施形態４６のペプチド。
４８．  Ｎ末端に配列番号７の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、実施形態４７のペプチド。
４９．  Ｆｃペプチドが、配列番号２７を含むペプチドのＣ末端にある、実施形態４６のペプチド。
５０．  Ｆｃペプチドが、配列番号２７を含むペプチドのＮ末端にある、実施形態４６のペプチド。
５１．  配列番号２７のペプチドおよびＦｃペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、実施形態１に記載のペプチド。
５２．  リンカーペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０）（ｎは１、２、３、または４である）である、実施形態５１に記載のペプチド。
５３．  ｎが４である、実施形態５２に記載のペプチド。
５４．  Ｆｃペプチドが、配列番号８または配列番号１５の配列を含む、実施形態５１〜５３に記載のペプチド。
５５．  Ｆｃペプチドが、配列番号２７を含むペプチドのＣ末端にある、実施形態５１〜５４に記載のペプチド。
５６．  Ｆｃペプチドが、配列番号２７を含むペプチドのＮ末端にある、実施形態５１〜５４に記載のペプチド。
５７．  配列番号３７、３８、３９、または４０の配列を含むペプチドを含む、実施形態１４に記載のペプチド。
５８．  実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドを含む医薬組成物。
５９．  Ｔ制御性細胞を活性化する方法であって、Ｔ制御性細胞を実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは実施形態５８に記載の医薬組成物と接触させる工程を含む前記方法。
６０．  対象における炎症性障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは実施形態５８に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する工程を含む前記方法。
６１．  炎症性障害が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化群、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎等である、実施形態６０に記載の方法。
６２．  Ｔ制御性細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を促進または刺激する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは実施形態５８に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する前記方法。
６３．  炎症性障害の処置のための医薬品の製造における、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは実施形態５８に記載の医薬組成物の使用。
６４．  炎症性障害が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾
癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、微小変化群、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎等である、実施形態６３に記載の使用。
６５．  実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドをコードする核酸分子。
６６．  実施形態６５の核酸分子を含むベクター。
６７．  実施形態６５の核酸分子を含むプラスミド。
６８．  実施形態６５の核酸分子を含む細胞。
６９．  実施形態６７のプラスミドを含む細胞。
７０．  実施形態６６のベクターを含む細胞。
７１．  実施形態１〜５７のいずれか１つに記載のペプチドまたは本明細書に記載されているペプチドを含むまたは発現する細胞。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
北米および欧州で高度に示される合計９つのＭＨＣＩＩ対立遺伝子を、コンピュータによる解析に含めた。テストしたＩＬ−２Ｍ（ＩＬ−２ムテイン）分子のパネルは、Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、またはＬ１１８Ｉ変異を有するＩＬ−２ムテインを含んだ。ＭＨＣＩＩ対立遺伝子ＤＲＢ１＿１１０１、ＤＲＢ１＿１５０１、ＤＲＢ１＿０７０１、およびＤＲＢ１＿０１０１のみが、評価した分子のいずれかでヒットを生じた。ＤＲＢ＿１５０１に対するペプチドヒットは、Ｃ１２５Ｓ変異を有する野生型ＩＬ−２を含むテストした全ての構築物間で同じであった。Ｌ８０Ｉの付加により、ＤＲＢ１＿０１０１［ＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰＲ（配列番号６０）］に対する１個のＴ細胞エピトープが除去され、２個の他のＴ細胞エピトープ［ＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲ（配列番号６１）およびＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲＰ（配列番号６２）］の親和性はやや低下した。ＭＨＣＩＩ対立遺伝子ＤＲＢ１＿０７０１に関して、Ｌ８０Ｉは１個のＴ細胞エピトープ［ＥＥＡＬＮＬＡＰＳＫＮＦＨＬＲ（配列番号６３）］を除去した。したがって、データは、Ｌ８０Ｉ変異を含むＩＬ−２ムテインは免疫原性が低いはずであることを示した。これは、コンピュータによる解析からの驚くべきおよび予想外の結果であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
ムテインは全般的ＰＯＩおよびより低い凝集を示す
本明細書に提供されるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ変異を含むＦｃ領域に連結したＶ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、およびＣ１２５Ｓの変異、ならびに以下の変異Ｌ５３Ｉ、Ｌ５６Ｉ、Ｌ８０Ｉ、またはＬ１１８Ｉの１つを有するＩＬ−２ムテインを、ＨＥＫ２９３  Ｅｘｐｉ細胞にｐＴＴ５ベクターをトランスフェクトして該ベクターで発現させた。ＩＬ−２ムテインを４ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートを有するＦｃ領
域のＮ末端に連結した。５〜７日後、異なるＩＬ−２ムテインを発現する細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄化し、０．２２ｕｍ濾過装置を通して濾過した。ＩＬ−２ムテインをプロテインＡ樹脂に捕捉した。樹脂をＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、１０分の１容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を使用して中和しながら、０．２５％酢酸、ｐＨ３．５を使用して捕捉タンパク質を溶出した。タンパク質を３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７に緩衝液交換し、目的とするピーク（ＰＯＩ）パーセントについてＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ  ＳＥＣカラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。結果は、種々のムテインが６０ｍｇ／Ｌ以上で発現したことを示している。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーによって示されたように、Ｌ８０ＩまたはＬ１１８Ｉ変異を有するムテインは９０％超が単分散したが、Ｌ５３ＩまたはＬ５６Ｉ変異を有するムテインではそうならなかったことが、驚くべきことに見出された。故に、Ｌ８０ＩまたはＬ１１８Ｉ置換を有するムテインは凝集が少なかった。４つの分子（Ｌ８０Ｉ、Ｌ１１８Ｉ、Ｌ５３Ｉ、およびＬ５６Ｉを含むＩＬ−２ムテイン）の間の凝集の差は、作製されている変異のタイプのために意外であった。したがって、Ｌ８０ＩまたはＬ１１８Ｉ変異を有するムテインは、他のムテインほど凝集しないという点で他のムテインと比べて驚くべき利点を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
Ｌ１１８Ｉ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ５６Ｉ、またはＬ５３Ｉ変異の１つを有するムテインについて、インビトロデータをインビボで確認した。Ｌ１１８Ｉは、Ｌ１１８Ｉ変異がないムテインより強力であることがインビボで見出された。簡単には、ヒトＣＤ３４＋  造血幹細胞で再構成したＮｏｄ−Ｓｃｉｄ−ＩＬ−２Ｒガンマ欠損（ＮＳＧ）マウスに、示されたテスト物質またはビヒクル１マイクログラムを０および７日目に皮下注射した。１１日目に、マウスを殺処分し、ヘパリンを含有するチューブへの心臓穿刺により血液を回収した。末梢血白血球（ＰＢＬ）を赤血球の溶解によって単離し、ヒトマーカーＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびＣＤ５６に反応する抗体で染色した。ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）、活性化エフェクターＴ細胞（ａｃｔ  Ｔｅｆｆ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３−）およびＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋）の割合をフローサイトメトリーによって決定した。全ＣＤ４５＋、全ＣＤ４＋および全ＣＤ８＋細胞の頻度は変わらなかった。同様の結果がマウスの脾臓で観察された。Ｌ８０Ｉ変異を有するＩＬ−２ムテインのこのアッセイで測定した場合のインビボでの効力は、Ｌ８０Ｉ変異がないムテインと比較してわずかに増加し、Ｌ５６ＩまたはＬ５３Ｉ変異のどちらかを有するムテインのこのアッセイで測定した場合のインビボでの効力は、変異がないムテインとほぼ同じであった。ムテインは、２０アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号９）リンカーにより、本明細書に記載されているＦｃ領域にＮ末端で連結させた。すなわち、リンカーは、ＩＬ−２ムテインのＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に連結した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
２０アミノ酸リンカーを有するＮ末端Ｆｃ配向がＴｒｅｇ刺激に最も有効である。
Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、およびＮ８８Ｄを有するＩＬ−２ムテインを、異なる長さのＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートを使用してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ変
異の変異を含むＦｃ領域に融合させた。３および４つのＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートを含むリンカーによりムテインのｃ末端を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃのｎ末端に融合されたＩＬ２−ムテイン分子をテストして、リンカーの長さがＩＬ−２ムテインの効力に影響を与えるかどうかを決定した。単一ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートによりムテインのｎ末端を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃのｃ末端に融合されたムテインもテストした。簡単には、ヒトＣＤ３４＋  造血幹細胞で再構成したＮｏｄ−Ｓｃｉｄ−ＩＬ−２Ｒガンマ欠損（ＮＳＧ）マウスに、リンカー長が異なる種々のＩＬ−２ムテインまたはビヒクル１マイクログラムを０日目に皮下注射した。７日目に、マウスを殺処分し、ヘパリンを含有するチューブへの心臓穿刺により血液を回収した。末梢血白血球（ＰＢＬ）を赤血球の溶解によって単離し、ヒトマーカーＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびＣＤ５６に反応する抗体で染色した。ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）、活性化エフェクターＴ細胞（ａｃｔ  Ｔｅｆｆ、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３−）およびＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋）の割合をフローサイトメトリーによって決定した。全ＣＤ４５＋、全ＣＤ４＋および全ＣＤ８＋細胞の頻度は変わらなかった。同様の結果がマウスの脾臓で観察された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
３つのＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートしか持たないリンカーによるムテイン、または単一ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートによりヒトＩｇＧ１  Ｆｃのｃ末端で融合されたムテインと比較して、４つのＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートを含むリンカーによりヒトＩｇＧ１  ＦｃのＮ末端で融合されたムテインが最も強力であることが見出された。さらに、４つのＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リピートを有するタンパク質はＴｒｅｇ拡大に、より有効であったが、この構成はＣＤ５６＋  ＮＫ細胞拡大のいかなる差ももたらさなかった。より長いリンカーによるＮ末端Ｆｃ融合ムテインを含むタンパク質が最も強力であり、また、ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞拡大のいかなる差ももたらさないことを予測することはできなかった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2021507690000001.app
【国際調査報告】
2021507690.tif 000013
2021507690.tif 000014