(57)【要約】非ヒト動物ならびにそれを作製し、使用する方法および組成物が提供され、非ヒト動物は、免疫グロブリン重鎖可変領域内に操作されたまたは組み換え多様性クラスターを含むゲノムを有し、操作されたまたは組み換え多様性クラスターは、各々、２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列に作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントの挿入を含む。非ヒト動物由来の抗体を生成する方法も提供され、抗体は、場合により、ヒト可変領域およびげっ歯類、例えば、定常領域を含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含む、操作された重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントを含む、ヌクレオチド分子。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が、（ｉ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントおよび（ｉｉ）一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接した、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントを含む操作されたＤＨ領域を含み、
前記（ｉ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントおよび前記（ｉｉ）一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接した再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントが、（ｉ）および（ｉｉ）が、１２／２３規則に従ってＤＨ−ＤＨ組み換え事象において結合できるように、作動可能に結合され、
場合により、前記操作されたＤＨ領域が、ヒトＤＨ遺伝子セグメントのみを含む、請求項１に記載のヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド分子が、
（ａ）前記操作されたＤＨ領域の上流であり、作動可能に結合された少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、
（ｂ）前記操作されたＤＨ領域の下流であり、作動可能に結合された少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖結合（ＪＨ）遺伝子セグメント、または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせをさらに含む、請求項２に記載のヌクレオチド分子。
【請求項４】
前記少なくとも一つのＶＨ遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントを含み、前記少なくとも一つのＪＨ遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載のヌクレオチド分子。
【請求項５】
前記少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含む、請求項３または４に記載のヌクレオチド分子。
【請求項６】
前記少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトＪＨ１遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ２遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ３遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含み、場合により、前記再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６遺伝子セグメントが、生殖系列配置にある、請求項３〜５のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項７】
少なくとも一つの再構成されていないＶＨ遺伝子セグメントが、場合により、生殖系列配置で、前記再構成されていないヒトＶＨ３−７４と再構成されていないヒトＶＨ１−６遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項８】
一つ以上の機能的げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子をさらに含み、場合により、前記一つ以上の機能的げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に位置し、および／またはヒトＡｄａｍ６遺伝子を置換する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項９】
前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントの５’末端に隣接する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１０】
前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１１】
２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された、前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントが、
（ａ）２３ｍｅｒのＲＳＳ作動可能に結合されたヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、場合により、前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記ＤＨ３−３遺伝子セグメントの５’末端に隣接する、
（ｂ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、場合により、前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記ＤＨ２−２遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、
（ｃ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、場合により、前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記ＤＨ２−８遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、
（ｄ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒト２−１５遺伝子セグメント、場合により、前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記ＤＨ２−１５遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１２】
配列番号５２として記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１３】
配列番号６１として記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１４】
配列番号７０として記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１５】
配列番号７１として記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１６】
配列番号７２として記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１７】
作動可能な結合で５’から３’に；
（ａ）一つ以上の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント；
（ｂ）５’から３’に
（ｉ）一つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、前記一つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントの各々が、その５’および３’末端で１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、および
（ｉｉ）その５’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントを含む２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含む、操作されたＤＨ領域；および
（ｃ）一つ以上の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメント、を含む、ヌクレオチド分子。
【請求項１８】
作動可能な結合で５’から３’に；
（ａ）一つ以上の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント；
（ｂ）操作されたＤＨ領域、前記操作されたＤＨ領域が、５’から３’に
（ｉ）その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＤＨ２遺伝子セグメントを含む、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメント、場合により、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記少なくとも一つのヒトＤＨ２遺伝子セグメントは、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメント、またはその任意の組み合わせを含む、および
（ｉｉ）一つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント、前記一つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントの各々が、その５’および３’末端で１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接している、を含む；および
（ｃ）一つ以上の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメント、を含む、ヌクレオチド分子。
【請求項１９】
前記一つ以上の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントが、５’から３’に、再構成されていないヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントおよび再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントを含み、前記ヌクレオチドは、前記再構成されていないヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントと前記再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に一つ以上の機能的げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子をさらに含み、前記再構成されていないヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、前記一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子、および再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントが、連続している、請求項１７または１８に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２０】
前記一つ以上の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントが、場合により、生殖系列配置で、再構成されていないヒトＶＨ３−７４遺伝子セグメントと再構成されていないヒトＶＨ１−６遺伝子セグメントの間に渡り、されらを含む、機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２１】
前記一つ以上の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２２】
前記一つ以上の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含む、請求項２１に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２３】
前記一つ以上の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトＪＨ１遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ２遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ３遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含み、場合により、前記再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６遺伝子セグメントが、生殖系列配置にある、請求項２２に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２４】
その３’末端に、重鎖免疫グロブリン定常領域（ＣＨ）またはその一部をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２５】
前記ＣＨが、げっ歯類ＣＨ領域またはその一部である、請求項２４に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２６】
前記げっ歯類ＣＨ領域またはその一部が、げっ歯類イントロンエンハンサー領域およびげっ歯類ＩｇＭ遺伝子を含む、請求項２５に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２７】
薬物選択カセットをさらに含み、
前記薬物選択カセットが、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記ＤＨ遺伝子セグメントの上流に位置し、
前記薬物選択カセットが、一つ以上の部位特異的組み換え部位と場合により隣接する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
【請求項２８】
免疫グロブリン重鎖配列との相同な組み換えを可能にするよう配置された５’および３’相同アームを含み、場合により、前記免疫グロブリン重鎖配列が、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座に位置し、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域、またはその組み合わせを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子を含む、ターゲティングベクター。
【請求項２９】
ＤＨ−ＤＨ組み換えを操作するために免疫グロブリン重鎖可変領域を修飾する方法であって、
一つ以上の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントを含むＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントの各々が、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、
２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントをさらに含むように前記ＤＨ領域を修飾する工程を含む、方法。
【請求項３０】
前記一つ以上の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントが、一つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記一つ以上の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントが、場合により、生殖系列配置で、前記生殖系列ヒトＤＨ１−１と前記生殖系列ヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、全ての機能的生殖系列ヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
修飾工程が、
（ａ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを有する前記一つ以上の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントの少なくとも一つ、
（ｂ）２３ｍｅｒのＲＳＳを有する再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントに隣接する前記二つの１２ｍｅｒのＲＳＳの少なくとも一つ、または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、を置換する工程を含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントを含むＪＨ領域をさらに含み、
前記ＪＨ領域が、前記ＤＨ領域に作動可能に結合され、
前記一つ以上の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントの少なくとも一つを、前記２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合され前記ＤＨ遺伝子セグメントで置換する工程が、前記ＪＨ領域内に含まれる少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントで欠失する工程を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＪＨ領域が、ヒト生殖系列ＪＨ１遺伝子セグメント、ヒト生殖系列ＪＨ２遺伝子セグメント、ヒト生殖系列ＪＨ３遺伝子セグメント、ヒト生殖系列ＪＨ４遺伝子セグメント、ヒト生殖系列ＪＨ５遺伝子セグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ６遺伝子セグメントを含むヒト生殖系列ＪＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含み、場合により、前記ヒト生殖系列ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６遺伝子セグメントが、生殖系列配置にあり、
前記ＪＨ領域内に含まれる少なくとも一つの生殖系列ＪＨ遺伝子セグメントの欠失が、前記再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、およびＪＨ３遺伝子セグメントの欠失、場合により、前記ＪＨ４およびＪＨ５遺伝子セグメントの欠失をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合され前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントが、
（ａ）２３ｍｅｒのＲＳＳ作動可能に結合されたヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、場合により、前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記ＤＨ３−３遺伝子セグメントの５’末端に隣接する、
（ｂ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、場合により、前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記ＤＨ２−２遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、
（ｃ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、場合により、前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記ＤＨ２−８遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、
（ｄ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメント、場合により、前記２３ｍｅｒのＲＳＳが、前記ＤＨ２−１５遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせを含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
置換される前記少なくとも一つの再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントが、前記ＤＨ領域の最も３’の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントを含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
置換される前記少なくとも一つの再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントが、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントに対応するＤＨ遺伝子セグメントを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子、請求項２８に記載のターゲティングベクター、または請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法に従って修飾された免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
【請求項３９】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の核酸、請求項２８に記載のターゲティングベクター、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法に従って修飾された免疫グロブリン重鎖可変領域、または請求項３８に記載の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含み、場合により、げっ歯類生殖系列ゲノムである、げっ歯類ゲノム。
【請求項４０】
（ｉ）再構成されていない重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、
（ｉｉ）操作された重鎖可変領域多様性（ＤＨ）領域、前記操作されたＤＨ領域が、一つ以上の生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントおよび２３ｍｅｒ組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された一つ以上のＤＨ遺伝子セグメントを含む、および
（ｉｉｉ）再構成されていない重鎖結合（ＪＨ）遺伝子セグメント、を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、げっ歯類生殖系列ゲノムであって、
（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、組み換え時に、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする再構成された重鎖可変領域配列を含み、場合により、前記再構成された重鎖可変領域配列が、ＶＨ（ＤＨ−ＤＨ）ＪＨ組み換え現象後に形成される、げっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項４１】
２３ｍｅｒ組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された前記一つ以上のＤＨ遺伝子セグメントが、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨセグメントを含む、請求項４０に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項４２】
２３ｍｅｒ組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された前記一つ以上のＤＨ遺伝子セグメントが、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨセグメントを含む、請求項４０または４１に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項４３】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、ヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントのみを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域である、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項４４】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域が、免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合されている、請求項４３に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項４５】
前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、場合により、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座の、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項４４に記載のげっ歯生殖系列ゲノム。
【請求項４６】
前記再構成されていないＶＨ遺伝子セグメントが、場合により、生殖系列配置の、ＶＨ３−７４〜ＶＨ６−１の間に渡り、それらを含む、機能的生殖系列ヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項４７】
前記再構成されていない重鎖ＪＨ遺伝子セグメントが、ヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項４８】
げっ歯類生殖系列ゲノムが、内在性Ａｄａｍ６遺伝子を欠く、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項４９】
一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子をさらに含み、場合により、前記一つ以上のげっ歯類内在性Ａｄａｍ６遺伝子が、内在性げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子を含む、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５０】
前記一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子が、二つのヒトＶＨ遺伝子セグメントの間に挿入される、請求項４９に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５１】
前記一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に挿入される、請求項５０に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５２】
前記一つ以上の一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子が、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに挿入される、請求項４９に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５３】
前記一つ以上の一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子が、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントの間に挿入される、請求項４９に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５４】
末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子をさらに含む、請求項３９〜５３のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５５】
前記操作されたＤＨ領域に対してホモ接合性であることを特徴とする、請求項３９〜５４のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５６】
前記操作されたＤＨ領域に対してヘテロ接合性であることを特徴とする、請求項３９〜５４のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５７】
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、請求項３９〜５６のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
【請求項５８】
請求項３９〜５７のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノムを含む、げっ歯類またはげっ歯類細胞。
【請求項５９】
前記げっ歯類またはげっ歯類細胞が、ラット、マウス、ラット細胞、またはマウス細胞である、請求項５８に記載のげっ歯類またはげっ歯類細胞。
【請求項６０】
前記げっ歯類細胞が、げっ歯類胚性幹細胞である、請求項５８または５９に記載のげっ歯類またはげっ歯類細胞。
【請求項６１】
請求項６０に記載のげっ歯類胚性幹細胞から生成される、げっ歯類またはげっ歯類細胞。
【請求項６２】
再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を含む体細胞ゲノムをさらに含み、
場合により、前記再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ遺伝子セグメントが、ＩｇＭ定常領域遺伝子配列に作動可能に結合され、および／またはＤＨＡまたはＤＨＢが、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記ＤＨ遺伝子セグメントまたはその一部からもたらされ、ＤＨＡまたはＤＨＢの少なくとも９コの塩基対が、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記ＤＨ遺伝子セグメントの少なくとも９コの塩基対またはその一部およびその各々と同一である、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載のげっ歯類、げっ歯類胚、またはげっ歯類細胞。
【請求項６３】
前記げっ歯類における全ての再構成された重鎖ＶＤＪコード配列の少なくとも９５％が、少なくとも１０アミノ酸長のＣＤＲ３を有し、場合により、前記げっ歯類における全ての再構成された重鎖ＶＤＪ遺伝子配列の少なくとも７０％が、少なくとも１１アミノ酸長のＣＤＲ３を有し、場合により、前記げっ歯類における全ての再構成された重鎖ＶＤＪ遺伝子配列の少なくとも１５％が、少なくとも１４アミノ酸長のＣＤＲ３を有する、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載のげっ歯類。
【請求項６４】
参照げっ歯類におけるＤＨ−ＤＨ組み換えの頻度と比較して、少なくとも少なくとも３倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示すことを特徴とする、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載のげっ歯類。
【請求項６５】
ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類を作製する方法であって、請求項６０に記載の胚性幹細胞からげっ歯類を作製することを含む、方法。
【請求項６６】
ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類を作製する方法であって、
（ａ）各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨ遺伝子セグメントを含むＤＮＡフラグメントを含む、げっ歯類胚性幹細胞のゲノムを修飾する工程、場合により、前記ＤＮＡフラグメントが、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子、請求項２８に記載のターゲティングベクター、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法に従って修飾された免疫グロブリン重鎖可変領域、または請求項３８に記載の免疫グロブリン重鎖を含む、
（ｂ）（ａ）の前記修飾されたげっ歯類胚性幹細胞を使用してげっ歯類を生成する工程、を含む、方法。
【請求項６７】
ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含む、げっ歯類を作製する方法であって、
２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨセグメントを含むように免疫グロブリン重鎖可変領域の再構成されていないＤＨ領域を修飾する工程、前記再構成されていないＤＨ領域が、一つ以上の生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントをさらに含む、
これにより、前記げっ歯類を作製する工程を含む、方法。
【請求項６８】
修飾する工程が、前記一つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを置換する工程、場合により、一つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントで置換する工程を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域であり、場合により、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域が、少なくとも一つのＶＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ遺伝子クラスター、一つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ領域、および一つの再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子クラスターを含み、前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ領域が、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含むように修飾される、請求項６７または６８記載の方法。
【請求項７０】
前記修飾する工程が、
（ｉ）機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメント、場合により、ＶＨ３−７４〜ＶＨ６−１に渡り、それらを含む、全ての前記機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、場合により、全ての前記機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、生殖系列配置で位置する、
（ｉｉ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントで置換されるＤＨ７−２７を除き、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、および
（ｉｉｉ）少なくとも、再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメント、および場合により、少なくとも再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントと、を含む前記免疫グロブリン重鎖可変領域を生じる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントが、５’−２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された  ＤＨ３−３遺伝子セグメントを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記修飾する工程が、
（ｉ）機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメント、場合により、ＶＨ３−７４〜ＶＨ６−１に渡り、それらを含む、全ての機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、場合により、全ての前記機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメントが、生殖系列配置で位置する、
（ｉｉ）再構成されていないＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントを除き、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、その各々が、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントで置換される、および
（ｉｉｉ）再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメント、場合により、再構成されていないヒトＪＨ１遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ２遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ３遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントの完全なレパートリー、を含む前記免疫グロブリン重鎖可変領域をもたらす、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントが、３’２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、３’２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、または３’２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントを含み、場合により、前記再構成されていないＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントが、それぞれ、３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、および３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された前記ヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントで置換される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、
（ａ）一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子をさらに含み、場合により、前記一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子が、二つの再構成されていないＶＨ遺伝子セグメントの間、場合により、再構成されていないヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントと再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に位置する、および／または
（ｂ）免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合され、場合により、前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域、場合により、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、請求項６５〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
抗体を作製するか、またはそれをコードする核酸を得る方法であって、
げっ歯類を抗原で免疫する工程、前記げっ歯類が、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含む操作されたＤＨ領域を含む生殖系列ゲノムを含み、場合により、前記げっ歯類が、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載のげっ歯類である、
前記げっ歯類が、前記抗原に結合する抗体、またはそれをコードする核酸を含む前記抗原に対する免疫応答を生じさせる工程を含む、方法。
【請求項７７】
前記げっ歯類またはげっ歯類細胞から、前記抗体、またはそれをコードする核酸を回収することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記げっ歯類細胞が、Ｂ細胞またはハイブリドーマである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントが、５’２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む、請求項７６〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントが、３’２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
げっ歯類重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に結合された再構成重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を含む、げっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座であって、場合により、前記再構成重鎖は、ＤＨＡおよびＤＨＢの各々が、それぞれ、最大１個のヌクレオチド変異で、第１および第２の生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントと４０％の同一性を示すため、高度変異される、および／またはＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列と決定される、げっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
【請求項８３】
前記ＤＨＢ遺伝子セグメントが、ヒト生殖系列ＤＨ３−３遺伝子セグメントからもたらされる、請求項８２に記載のげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
【請求項８４】
前記ＤＨＡ遺伝子セグメントが、ヒト生殖系列ＤＨ２−２、ＤＨ２−８またはＤＨ２−１５遺伝子セグメントからもたらされる、請求項８２に記載のげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
【請求項８５】
前記再構成重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列が、２０を超えるアミノ酸長のＣＤＲ３をコードする、請求項８２〜８４のいずれか一項に記載のげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
【請求項８６】
前記ＪＨ遺伝子セグメントが、ヒト生殖系列ＪＨ６遺伝子セグメントからもたらされる、請求項８２〜８５のいずれか一項に記載のげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
【請求項８７】
請求項８２〜８６のいずれか一項に記載のゲノム、核酸、または免疫グロブリン遺伝子座を含む、げっ歯類またはげっ歯類細胞。
【請求項８８】
前記げっ歯類が、ラットもしくはマウスであるか、または前記げっ歯類細胞が、ラット細胞もしくはマウス細胞である、請求項８７に記載のげっ歯類またはげっ歯類細胞。
【請求項８９】
前記げっ歯類細胞が、げっ歯類Ｂ細胞である、請求項８７または８８に記載のげっ歯類またはげっ歯類細胞。
【請求項９０】
骨髄腫細胞と融合された、請求項８９に記載のげっ歯類Ｂ細胞を含む、ハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／６８５，２０３号（２０１８年６月１４日出願）、第６２／７０２，２０６号（２０１８年７月２３日出願）、および第６２／８１２，５８０号（２０１９年３月１日出願）の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９（３）に基づく利益を主張するものであり、それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
配列表の公的な写しは、ＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介してファイル名「１０３４７＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として電子的に提出され、そのファイルは、２０１９年６月１３日に作成され、約５０キロバイトのサイズであり、明細書と同時に作成されている。このＡＳＣＩＩフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体製品は、バイオ医薬業界に革命を起こし、いくつかの疾患の処置において大きな進歩を遂げた。これらのモノクローナル抗体製品の多くは、抗体分子（すなわち、従来の免疫グロブリン遺伝子セグメント）の天然の特性を活用し、一部の例では、標識（例えば、ペグ化、放射標識）または他の薬物との結合などの他の特性を取り込んでいた。現在の承認率では、約７０種のモノクローナル抗体製品が２０２０年までに発売される見込みである。これらの前進および治療使用用のモノクローナル抗体の使用により集められた知識にも関わらず、モノクローナル抗体が結合し、および／またはアクセスすることが困難な標的と関連する疾患は残り、効果的な処置を開発するための異なるアプローチの必要性が強調されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、様々な疾患の処置のため使用することができる、非ヒト動物（例えば、げっ歯類（例えば、ラット、例えば、マウス））を操作して、新たな抗体ベースの治療、および一部の実施形態では、抗体剤（例えば、モノクローナル抗体および／またはそのフラグメント）を同定し、開発するための追加のインビボシステムを確立することが望ましいという認識を包含する。さらに、本発明はまた、野生型（または参照）ＣＤＲ３と比較してより長いアミノ酸長および多様性、一部の実施形態では、特定の抗原への結合を指示する多様性により特徴付けられる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含有する抗体の発現の増大を導き得る、ＤＨとＤＨの再構成を可能にする組み換えシグナル配列に作動可能に結合されるよう操作された一つ以上のＤＨセグメントを含む、免疫グロブリン重鎖可変領域（例えば、異種免疫グロブリン重鎖可変領域、例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域）内に操作された重鎖多様性（ＤＨ）クラスター（または操作されたＤＨ領域）を有する非ヒト動物が望ましいことを包含する。一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒトへの投与のための抗体および／または抗体ベースの治療の開発のためのインビボシステムを提供する。
【０００５】
本明細書において、２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された少なくとも一つの免疫グロブリン重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントを含むヌクレオチド分子が記載され、場合により、ＤＨ遺伝子セグメントは、例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域（例えば、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域）の操作されたＤＨ領域内に位置してもよい。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、２３ｍｅｒ（ＲＳＳ）に作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含む操作された免疫グロブリン重鎖可変多様性（ＤＨ）を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域は、（ｉ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメント、および（ｉｉ）一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接した再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントを含み、（ｉ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメント、および（ｉｉ）一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接した生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントは、（ｉ）および（ｉｉ）が、１２／２３ルールに従いＤＨ−ＤＨ組み換え現象に加わることができるように、作動可能に結合される。また、ターゲティングベクター、非ヒト動物（例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス））、および本明細書に記載のヌクレオチド分子を含む非ヒト動物細胞（例えば、げっ歯類細胞（例えば、ラット細胞またはマウス細胞）、本明細書に記載のヌクレオチド分子を使用する方法などが提供される。
【０００６】
一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも１９個のヌクレオチドを含み、および／または２個のシステインをコードする。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、および／または２個のシステインをコードする。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも２３個のヌクレオチドを含み、および／または２個のシステインをコードする。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも２８個のヌクレオチドを含み、および／または２個のシステインをコードする。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも３１個のヌクレオチドを含み、および／または２個のシステインをコードする。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも３７個のヌクレオチドを含み、および／または２個のシステインをコードする。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含み、および／または２個のシステインをコードする。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、ＤＨ３−９遺伝子セグメント、ＤＨ３−１０遺伝子セグメント、ＤＨ３−１６遺伝子セグメント、ＤＨ３−２２遺伝子セグメント、ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、またはヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントからなる群から選択されるＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、およびヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、およびヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントからなる群から選択されるヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、（ａ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントの５’末端に隣接する、（ｂ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、（ｃ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、（ｄ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒト２−１５遺伝子セグメント、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、操作されたＤＨ領域、免疫グロブリン重鎖可変領域など）は、配列番号５２にとして記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、操作されたＤＨ領域、免疫グロブリン重鎖可変領域など）は、配列番号６１にとして記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、操作されたＤＨ領域、免疫グロブリン重鎖可変領域など）は、配列番号７０にとして記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、操作されたＤＨ領域、免疫グロブリン重鎖可変領域など）は、配列番号７１にとして記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、操作されたＤＨ領域、免疫グロブリン重鎖可変領域など）は、配列番号７２にとして記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、５’から３’に２３ｍｅｒのＲＳＳおよびＤＨ遺伝子セグメントを含み、例えば、５’から３’に２３ｍｅｒのＲＳＳ、（ヒト）ＤＨ遺伝子セグメント、および１２ｍｅｒのＲＳＳを含み、例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ＤＨ遺伝子セグメントの５’末端に隣接し、例えば、ＤＨ遺伝子セグメントは、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合される。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントを含み、例えば、ヌクレオチド分子は、５’から３’に２３ｍｅｒのＲＳＳ、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、および１２ｍｅｒのＲＳＳを含む。
【００１４】
少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳと共に含む操作されたＤＨ領域は、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントをさらに含んでもよく（例えば、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、生殖系列ＤＨ遺伝子セグメント、例えば、その生殖系列配置のＤＨ遺伝子セグメントなどを含む）、再配置されていないＤＨ遺伝子セグメントは、５’末端の２３ｍｅｒに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントの上流にあり、作動可能に結合されている。一部の実施形態では、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、５’から３’にＤＨ遺伝子セグメントおよび２３ｍｅｒのＲＳＳを含み、例えば、５’から３’に１２ｍｅｒのＲＳＳ、（ヒト）ＤＨ遺伝子セグメント、および２３ｍｅｒのＲＳＳを含み、例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ＤＨ遺伝子セグメントの３’末端に隣接し、例えば、ＤＨ遺伝子セグメントは、３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるなどである。一部の実施形態では、３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２遺伝子セグメントを含み、ＤＨ２遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、およびヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントからなる群から選択される。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、５’から３’に３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、および３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、５’から３’に、１２ｍｅｒのＲＳＳ、ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、および２３ｍｅｒのＲＳＳを含む第１の隣接ヌクレオチド配列、１２ｍｅｒのＲＳＳ、ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、および２３ｍｅｒのＲＳＳを含む第２の隣接ヌクレオチド配列、ならびに１２ｍｅｒのＲＳＳ、ヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメント、および２３ｍｅｒのＲＳＳを含む第３の隣接ヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含む操作されたＤＨ領域は、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントをさらに含んでもよく（例えば、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、生殖系列ＤＨ遺伝子セグメント、例えば、その生殖系列配置のＤＨ遺伝子セグメントなどを含んでもよい）、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再配置されていないＤＨ遺伝子セグメントは、３’末端の２３ｍｅｒに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントの上流であり、作動可能に結合されている。一部の実施形態では、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域は、（ｉ）一つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントの一つ以上の各々は、その５’および３’末端で１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、（ｉｉ）その５’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント）を含む、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域は、５’から３’に、（ｉ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメント、例えば、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＤＨ２遺伝子セグメント、場合により、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＤＨ２遺伝子セグメントは、その３末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメント、または任意の組み合わせを含む、および（ｉｉ）一つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントの各々は、その５’および３’末端で１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接している、を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域は、ヒトＤＨ遺伝子セグメントのみを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子（例えば、操作されたＤＨ領域、免疫グロブリン重鎖可変領域など）は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントおよび一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントを含み、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントおよび一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、（ｉ）別のＤＨ遺伝子セグメント、（ｉｉ）ＶＨ遺伝子セグメント、（ｉｉｉ）ＪＨ遺伝子セグメント、または（ｉｖ）その任意の組み合わせとの組み換えを受けていない。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、（ｉ）別のＤＨ遺伝子セグメント、（ｉｉ）ＶＨ遺伝子セグメント、（ｉｉｉ）ＪＨ遺伝子セグメント、またはその任意の組み合わせと組み換えされた一つ以上のＤＨ遺伝子セグメント含む操作されたＤＨ遺伝子領域を含む分子、例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする再構成されたＶＤＪまたはＶＤＤＪコード配列を含むヌクレオチド分子を含む。
【００２０】
従って、一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含む本明細書に記載のヌクレオチド分子は、作動可能な結合で、（ａ）操作されたＤＨ領域の上流にあり、作動可能に結合された、少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント（例えば、再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント）、（ｂ）操作されたＤＨ領域の上流にあり、作動可能に結合された、少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖結合（ＪＨ）遺伝子セグメント（例えば、再構成されていないヒトＪＨ６）遺伝子セグメント、または（ａ）と（ｂ）の組み合わせを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、少なくとも一つの再構成されていないＶＨ遺伝子セグメントは、再構成されていないヒトＶＨ３−７４と再構成されていないヒトＶＨ１−６遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む。一部の実施形態では、少なくとも一つの再構成されていないＶＨ遺伝子セグメントは、生殖系列配置で、再構成されていないヒトＶＨ３−７４と再構成されていないヒトＶＨ１−６遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む。一部の実施形態では、少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントは、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントは、再構成されていないヒトＪＨ１遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ２遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ３遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントは、生殖系列配置で、再構成されていないヒトＪＨ１遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ２遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ３遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、例えば、作動可能な結合で５’から３’に：
（ａ）少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、
（ｂ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含む操作されたＤＨ領域、
（ｃ）少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖結合（ＪＨ）遺伝子セグメント、を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、
（ａ）少なくとも一つの再構成されていないＶＨ遺伝子セグメントは、
（ｉ）再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント、
（ｉｉ）再構成されていないヒトＶＨ２−１遺伝子セグメントおよび再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント、ならびに／または
（ｉｉｉ）再構成されていないヒトＶＨ３−７４から再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントに渡り、それらを含む全ての機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、例えば、生殖系列配置の全ての機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、場合により、げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子は、再構成されていないヒトＶＨ２−１とＶＨ６−１遺伝子セグメントの間で偽遺伝子を置換する、を含み；
（ｂ）操作されたＤＨ領域は、５’から３’に：
（ｉ）一つまたは複数、例えば、複数の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、複数の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの各々は、その５’および３’末端に１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、およびその５’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメント、場合により、複数の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントは、生殖系列配置で、再構成されていないヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントと再構成されていないヒトＤＨ１−２６の間に渡り、それらを含む再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含み、および／またはその５’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒト遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントであり、例えば、操作されたＤＨは、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ３−３で置換された、再構成されていないヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメントを除き、生殖系列配置の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む；
（ｉｉ）その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳと作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つ以上、例えば、複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントの各々は、その５’および末端と３’末端で１２ｍｅｒのＲＳＳと隣接し、場合により、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳと作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＤＨ遺伝子セグメントは、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ２−２遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントを含み、および／または一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントは、再構成されていないヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントと再構成されていないヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含むＤＨ遺伝子セグメントを含み、場合により、操作されたＤＨは、再構成されていないヒトＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントは、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ２−２遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、およびその３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントを除き、生殖系列配置で、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む；
（ｉｉｉ）または（ｂ）（ｉ）と（ｂ）（ｉｉ）の組み合わせを含み；
（ｃ）少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントは、
（ｉ）再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメント、
（ｉｉ）再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメント、および／または
（ｉｉｉ）再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、例えば、再構成されていないヒトＪＨ１遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ２遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ３遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメント、場合により、再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６遺伝子セグメントは、生殖系列配置である、を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＶＨ領域（少なくとも一つの機能的ＶＨ遺伝子セグメント、操作されたＶＨ領域、および少なくとも一つの機能的ＪＨ遺伝子セグメントを含む）は、ヒト免疫グロブリンＶＨ領域であり、例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む、各遺伝子セグメント（例えば、その中の各ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメント）は、ヒト（ＶＨ、ＤＨ、またはＪＨ）遺伝子セグメントである。
【００２４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫グロブリンＶＨ領域を含むヌクレオチド分子は、作動可能な結合で、５’から３’に
（ａ）少なくとも、再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないヒトＶＨ３−７４と再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、全ての再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは一部、例えば、場合により、二つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの間にげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子、例えば（例えば、げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子は、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に位置する）を含む、機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー
（ｂ）生殖系列配置で、再構成されていないヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントと再構成されていないヒトＤＨ１−２６遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、５’から３’に再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト操作されたＤＨ領域、および５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された再構成されていないヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、例えば、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された再構成されていないヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントで置換されている、再構成されていないヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメントを除く、生殖系列配置で再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、および
（ｃ）少なくとも再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメント、を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫グロブリンＶＨ領域を含むヌクレオチド分子は、作動可能な結合で、５’から３’に：
（ａ）少なくとも、再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないヒトＶＨ３−７４と再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、全ての再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは一部、例えば、場合により、二つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの間にげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子、例えば（例えば、げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子は、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に位置する）を含む、機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー
（ｂ）生殖系列配置で、再構成されていないヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントと再構成されていないヒトＤＨ１−２６遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、５’から３’に再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト操作されたＤＨ領域、および５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された再構成されていないヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、例えば、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された再構成されていないヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントで置換されている、再構成されていないヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメントを除く、生殖系列配置で再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、および
（ｃ）再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメント、を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫グロブリンＶＨ領域を含むヌクレオチド分子は、作動可能な結合で、５’から３’に
（ａ）少なくとも、再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないヒトＶＨ３−７４と再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、全ての再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは一部、例えば、場合により、二つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの間にげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子、例えば（例えば、げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子は、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に位置する）を含む、機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー
（ｂ）５’から３’に、再構成されていないヒトＤＨ１−１遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ２−２遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＤＨ３−１６遺伝子セグメントと再構成されていないヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト操作されたＤＨ領域、場合により、操作されたＤＨは、再構成されていないヒトＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントは、それぞれ、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ２−２遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、およびその３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントで置換されていることを除き、生殖系列配置で、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む、および
（ｃ）再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、例えば、再構成されていないヒトＪＨ１遺伝子セグメント、再構成されていないＪＨ２ヒト遺伝子セグメント、再構成されていないＪＨ３ヒト遺伝子セグメント、再構成されていないＪＨ４ヒト遺伝子セグメント、再構成されていないＪＨ５ヒト遺伝子セグメント、および再構成されていないＪＨ６ヒト遺伝子セグメント、場合により、再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６遺伝子セグメントは、生殖系列配置にある、を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、５’から３’に、（ａ）少なくとも一つの（ヒト）ＶＨ遺伝子セグメントを含む（ヒト）免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域、本明細書に記載の（ヒト）操作されたＤＨ領域、および（ｂ）重鎖免疫グロブリン定常領域（ＣＨ）またはその一部に作動可能に結合された少なくとも一つの（ヒト）ＪＨ遺伝子セグメントを含み、場合により、ＣＨは、げっ歯類イントロンエンハンサー領域、げっ歯類ＩｇＭ遺伝子、げっ歯類ＩｇＤ遺伝子、げっ歯類ＩｇＧ遺伝子、げっ歯類ＩｇＡ遺伝子、げっ歯類ＩｇＥ遺伝子、または任意のその組み合わせを含む、げっ歯類ＣＨである。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、５’から３’に、（ａ）少なくとも一つのヒトＶＨ遺伝子セグメント、本明細書に記載のヒト操作されたＤＨ領域、および（ｂ）少なくともげっ歯類イントロンエンハンサー領域、場合により、げっ歯類ＩｇＭ遺伝子を含む、げっ歯類ＣＨ領域に作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ領域を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、５’から３’に、（ａ）少なくとも一つのヒトＶＨ遺伝子セグメント、本明細書に記載のヒト操作されたＤＨ領域、および（ｂ）少なくともげっ歯類イントロンエンハンサー領域、場合により、げっ歯類ＩｇＭ遺伝子を含む、げっ歯類ＣＨ領域に作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト重鎖ＶＨ領域を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、５’から３’に、（ａ）少なくとも一つのヒトＶＨ遺伝子セグメント、本明細書に記載のヒト操作されたＤＨ領域、および（ｂ）内在性げっ歯類ＣＨ領域に、例えば、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座で作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒトＶＨ領域を含む。一部の実施形態では、げっ歯類は、ラットであってもよい。一部の実施形態では、げっ歯類は、マウスであってもよい。
【００２８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子は、ヒトＶＨ２‐１とＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に位置し、例えば、生殖系列配置で、ヒトＶＨ２−１とＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に位置するヒトＡｄａｍ６遺伝子を置換する。一部の実施形態では、げっ歯類は、ラットであってもよい。一部の実施形態では、げっ歯類は、マウスであってもよい。
【００２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド分子は、一つまたは複数の薬物選択カセット、例えば、一つまたは複数の部位特異的組み換え部位に隣接する薬剤耐性遺伝子、例えば、ｌｏｘＰ部位特異的組み換え認識部位に隣接するネオマイシン薬剤耐性遺伝子を含み、一つまたは複数の薬剤耐性カセットの少なくとも一つは、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントの直ぐ上流にある。一部の実施形態では、ヌクレオチド分子は、図２で説明される配列を含む。
【００３０】
また、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）のゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むように修飾するためのターゲティングベクターも、本明細書に記載される。一般に、本明細書に記載のターゲティングベクターは、本明細書に記載のヌクレオチド分子のいずれかを含み、場合により、免疫グロブリン重鎖可変領域内に相同組み換えのための５’および３’相同アームを含み、場合により、免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域である。一部の実施形態では、本明細書に記載のターゲティングベクターは、再構成されていないヒト遺伝子セグメント、例えば、ＶＨ６−１遺伝子セグメントを含む５’相同アーム、ならびに／またはげっ歯類（例えば、マウス）ＣＨ領域またはその一部、例えば、げっ歯類（マウス）ＣＨイントロンエンハンサー領域および／もしくはげっ歯類（マウス）ＩｇＭ遺伝子を含む３’相同アームを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、ターゲティングベクターは、本明細書に記載のヌクレオチド分子、および免疫グロブリン重鎖配列が、場合により、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座に位置し、および／またはヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖配列との相同性組み換えを可能にするよう配置された５’および３’相同アームを含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒト遺伝子セグメント（例えば、ＶＨ６−１遺伝子セグメント）、ヒト操作されたＤＨ領域、少なくとも一つの再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む５’相同アーム、ならびにげっ歯類（マウス）ＣＨイントロンエンハンサー領域および／またはげっ歯類（マウス）を含む３’相同アームを含む、本明細書に記載のターゲティングベクターは、場合により、それらの繁殖性を保存する機能的ＡＤＡＭ６遺伝子、機能的ＣＨ１ドメインを欠く逆キメラ非ＩｇＭ抗体の産生のため、インタクトな内在性ＩｇＭ遺伝子および別の内在性修飾定常領域遺伝子（例えば、ＩｇＧ）を含む修飾された内在性重鎖定常領域遺伝子配列、逆キメラヒト化共通軽鎖をコードする配列、逆キメラヒト化カッパ軽鎖をコードする配列、逆キメラヒト化ラムダ軽鎖をコードする配列、ハイブリッドカッパ／ラムダまたはカッパ／ラムダ軽鎖をコードする配列、ヒスチジンアミノ酸を有し、ｐＨ感受性抗原結合および／または増大した抗原レセプター多様性のため末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を発揮し得る可変ドメインの発現のためヒスチジンコドンで修飾された、再構成されていない生殖系列ヒト重鎖遺伝子セグメントおよび／または再構成されている（いない）生殖系列軽鎖遺伝子セグメントを含んでもよい、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むげっ歯類、例えば、マウス免疫グロブリン可変配列のヒト免疫グロブリン可変配列での置換を含むマウス、例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいてＤＨ領域を操作するのに有用であり得る。例えば、米国特許第９，０３５，１２８号；第９，０６６，５０２号；第９，１６３，０９２号；第９，１５０，６６２号；第９，３３４，３３３号；第９，８５０，４６２号；第９，８４４，２１２号；第９，０２９，６２８号；第９，００６，５１１号；第９，３９４，３７３号；第９，２０６，２６１号；第９，２０６，２６２号；第９，２０６，２６３号；第９，２２６，４８４号；第９，３９９，６８３号；第９，５４０，４５２号；第９，０１２，７１７号；第９，７９６，７８８号、第８，６９７，９４０号；第８，７５４，２８７号；第９，３３４，３３４号；第９，８０１，３６２号；第９，３３２，７４２号；第９，９６９，８１４号；米国特許公開第２０１１／０１９５４５４号、第２０１２／００２１４０９号、第２０１２／０１９２３００号、第２０１３／０１８５８２１号、第２０１３／０３０２８３６号、第２０１３／００４５４９２号、および第２０１８／０１２５０４３号；国際特許出願公開第２０１７２１０５８６号、および第２０１９／１１３０６５号を参照のこと、その各々が、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
【００３２】
したがって、例えば、げっ歯類におけるＤＨ−ＤＨ組み換えのためＤＨ領域を操作する方法が本明細書に記載されている。一部の実施形態では、方法は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含むよう、一つ以上の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントを含むＤＨ領域を修飾する工程を含む。一部の実施形態では、ＤＨ−ＤＨ組み換えを操作するよう免疫グロブリン重鎖可変領域を修飾する方法は、一つ以上の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントを含むＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントの各々は、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、および２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントをさらに含むようＤＨ領域を修飾する工程を含む。一部の実施形態では、ＤＨ領域は、一つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含むヒトＤＨ領域であり、例えば、複数の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントは、場合により、例えば、生殖系列配置で、ＤＨ１−１とＤＨ７−２７遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む全ての機能的な再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、修飾は、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する一つ以上の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメント、例えば、機能的な再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの一つ以上を、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントで置換することを含む。一部の実施形態では、ＤＨ領域の一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する大部分の３’再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントで置換され、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、５’から３’に、２３ｍｅｒのＲＳＳ、ＤＨ遺伝子セグメント、および１２ｍｅｒのＲＳＳを含む。一部の実施形態では、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作された対応するＤＨ遺伝子セグメントで置換されている。一部の実施形態では、ＤＨ領域は、再構成されていないヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメント（例えば、生殖系列ＤＨ７−２７遺伝子セグメント）を含み、再構成されていないヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメントは、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメント（例えば、再構成されていないヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント）によって置換されている。一部の実施形態では、ＤＨ領域は、再構成されていないＤＨ２−２遺伝子セグメント、再構成されていないＤＨ２−８遺伝子セグメント、および／または再構成されていないＤＨ２−１５遺伝子セグメントを含み（例えば、操作されたＤＨは、生殖系列配置で、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む）、再構成されていないＤＨ２−２遺伝子セグメント、再構成されていないＤＨ２−８遺伝子セグメント、および／または再構成されていないＤＨ２−１５遺伝子セグメントは、それぞれ、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ２−２遺伝子セグメント、その３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、および／またはその３’末端で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントで置換されている。一部の実施形態では、修飾は、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメント（例えば、ヒト生殖系列ＤＨ遺伝子セグメント）に隣接する二つの１２ｍｅｒのＲＳＳの一つを２３ｍｅｒのＲＳＳで置換することを含む。一部の実施形態では、修飾されるべき免疫グロブリン重鎖可変領域は、ＤＨ領域に加えて、ＤＨ領域に作動可能に結合されたＪＨ領域（場合により、ヒト生殖系列ＪＨ１遺伝子セグメント、ヒト生殖系列ＪＨ２遺伝子セグメント、ヒト生殖系列ＪＨ３遺伝子セグメント、ヒト生殖系列ＪＨ４遺伝子セグメント、ヒト生殖系列ＪＨ５遺伝子セグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ６遺伝子セグメントを含むヒト生殖系列ＪＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含み、場合により、ヒト生殖系列ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６遺伝子セグメントは、生殖系列配置にある）を含み、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントの置換は、ＪＨ領域に含まれる少なくとも一つの再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントを欠失させることを含み、例えば、ＤＨ領域と隣接する再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、および／またはＪＨ５遺伝子セグメントの欠失をもたらす。一部の実施形態では、ＪＨ領域に含まれる少なくとも一つの生殖系列ＪＨ遺伝子セグメントを欠失させることは、再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、およびＪＨ３遺伝子セグメントを欠失させること、および場合により、ＪＨ４およびＪＨ５遺伝子セグメントをさらに欠失させることを含む。一部の実施形態では、全ての機能的ＤＨ遺伝子セグメントの一つ以上を置換すること、例えば、ＤＨ７−２７遺伝子セグメントを、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、例えば、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ３−３遺伝子セグメントで置換することは、ＤＨ領域と隣接する再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、およびＪＨ３遺伝子セグメントの欠失をもたらす。一部の実施形態では、全ての機能的ＤＨ遺伝子セグメントの一つ以上を置換すること、例えば、ＤＨ７−２７遺伝子セグメントを、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、例えば、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ３−３遺伝子セグメントで置換することは、ＤＨ領域と隣接する再構成されていないヒトＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、およびＪＨ５遺伝子セグメントの欠失をもたらす。一部の実施形態では、ＤＨ領域は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントを含むよう修飾され、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントは、（ａ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ３−３遺伝子セグメント、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ＤＨ３−３遺伝子セグメントの５’末端に隣接する、（ｂ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ＤＨ２−２遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、（ｃ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ＤＨ２−８遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、（ｄ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメント、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳは、ＤＨ２−１５遺伝子セグメントの３’末端に隣接する、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせを含む。
【００３３】
かかる方法は、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、例えば、本明細書に記載の（ヒト）免疫グロブリン重鎖可変領域を含むヌクレオチド分子をもたらし得、再構成された（いない）（ヒト）免疫グロブリン重鎖領域は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域またはその一部、例えば、少なくともげっ歯類ＣＨイントロンエンハンサー領域および／またはげっ歯類ＩｇＭ遺伝子を、例えば、場合により、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座で含むげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域に場合により作動可能に結合されてもよい。一部の実施形態では、組み換えの際、かかる免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、例えば、長さが、ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ、ＶＨＤＨＪＨ６、またはＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ６組み換えの結果であってもよい、２０アミノ酸より長い相補性決定領域３（ＣＤＲ３）アミノ酸長を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を含む。したがって、ＣＤＲ３の長さが、少なくとも２０アミノ酸長である、ＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする再構成された免疫グロブリン重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ、ＶＨ（ＤＨ）ＪＨ６、またはＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ６配列を含む、げっ歯類、げっ歯類細胞、遺伝子座および／またはヌクレオチド分子が、本明細書において提供される。
【００３４】
また、例えば、そのゲノム、例えば生殖系列ゲノムに、本発明の操作されたＤＨ領域、例えば、本明細書に記載される核酸、ターゲティングベクターおよび／または免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含む非ヒト動物、例えば、げっ歯類も、本明細書に記載される。また、かかる非ヒト動物ゲノム、例えば、げっ歯類ゲノムも、本明細書に記載される。一部の実施形態では、生殖系列ゲノム、またはげっ歯類生殖系列ゲノムが、記載される免疫グロブリン重鎖可変領域を含むげっ歯類が本明細書に記載され、免疫グロブリン重鎖可変領域は、（ｉ）少なくとも一つの再構成されていない重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、（ｉｉ）操作された重鎖可変領域多様性（ＤＨ）領域、操作されたＤＨ領域は、各々が一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する一つまたは複数の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメント、および各々が２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された一つ以上のＤＨ遺伝子セグメントを含む、および（ｉｉｉ）少なくとも一つの再構成されていない重鎖結合（ＪＨ）遺伝子セグメントを含み、（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、組み換えの際、免疫グロブリン重鎖可変領域が、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする再構成された重鎖可変領域配列を含むように、作動可能に結合しており、場合により、再構成された重鎖可変領域配列は、ＶＨ（ＤＨ−ＤＨ）ＪＨ組み換え現象の後に形成され、場合により、各々が２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された一つまたは複数のＤＨ遺伝子セグメントの少なくとも一つは、ＶＨ（ＤＨ−ＤＨ）組み換え現象中に、各々が一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳ、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する一つまたは複数の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントの一つに結合する。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントは、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントは、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態において、免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントのみを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域である。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合されている。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、例えば、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノムの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、生殖系列配置でＶＨ３−７４からＶＨ６−１に渡るヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、場合により、二つのヒトＶＨ遺伝子セグメントに挿入される（例えば、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントとの間に挿入される）、および／またはヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに挿入されてもよい、一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６ポリペプチド（例えば、げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子）をコードする一つ以上のヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、げっ歯類である。一部の実施形態では、げっ歯類ゲノムは、操作されたＤＨ領域に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、げっ歯類ゲノムは、操作されたＤＨ領域に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、げっ歯類は、ラットであってもよい。一部の実施形態では、げっ歯類は、マウスであってもよい。一部の実施形態では、げっ歯類、げっ歯類ゲノム、またはげっ歯類細胞は、ラット、マウス、ラットゲノム、マウスゲノム、ラット細胞、またはマウス細胞、例えば、げっ歯類（ラットもしくはマウス）胚性幹細胞である。
【００３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のげっ歯類、げっ歯類ゲノム、またはげっ歯類細胞は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする再構成された重鎖ＶＤＪおよび／またはＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、（１）その生殖系列ゲノムで、例えば、生殖系列細胞において、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座、および（２）その体細胞ゲノムにおいて、例えば、Ｂ細胞において、再構成された重鎖可変領域ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を含む、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスが記載され、第１または第２のＤＨ遺伝子セグメント（それぞれ、ＤＨＡまたはＤＨＢ）は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、またはその一部（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、体細胞性で高度変異されたそのバリアント、および／またはその縮重バリアントの少なくとも一部のものと同一の配列を含む）からもたらされる。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、ナイーブＢ細胞であり、および／または再構成された重鎖可変領域コード配列は、ＩｇＭ定常領域配列に作動可能に結合されており、ＤＨＡとＤＨＢ遺伝子セグメントの少なくとも一つは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントにコードされたヌクレオチド分子と整列する少なくとも９つの連続したヌクレオチドを含み、ＤＨＡおよびＤＨＢ遺伝子セグメントの各々は、生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントのヌクレオチド分子と整列する少なくとも５つの連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、形質細胞またはメモリーＢ細胞であり、および／または再構成された重鎖可変領域コード配列は、体細胞性で高度変異されており、および／または非ＩｇＭ定常領域配列（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥなど）に作動可能に結合され、ＤＨＡおよびＤＨＢの各々は、それぞれ、最大１個のヌクレオチド変異で、第１および第２の生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントの４０％同一性を示す。一部の実施形態では、げっ歯類における全ての再構成された重鎖ＶＤＪおよび／またはＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列の少なくとも９５％は、少なくとも１０アミノ酸長のＣＤＲ３を有し、場合により、げっ歯類における全ての再構成された重鎖ＶＤＪおよび／またはＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列の少なくとも７０％は、少なくとも１１アミノ酸長のＣＤＲ３を有し、場合により、げっ歯類における全ての再構成された重鎖ＶＤＪおよび／またはＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列の少なくとも１５％は、少なくとも１４アミノ酸長のＣＤＲ３を有する。一部の実施形態では、げっ歯類におけるＶＤＪおよび／またはＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列の集団は、少なくとも１５アミノ酸長、場合により、少なくとも１６アミノ酸長、場合により、少なくとも１７アミノ酸長、および場合により、少なくとも１８アミノ酸長のＣＤＲ３を有する。一部の実施形態では、再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を発現するげっ歯類もしくはげっ歯類細胞、またはそれを当該コード配列を含む核酸もしくは免疫グロブリン遺伝子座が、本明細書に記載され、第２の生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ３−３であり、場合により、再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列は、２０アミノ酸長を超えるＣＤＲ３をコードする。一部の実施形態では、再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を発現するげっ歯類もしくはげっ歯類細胞、または当該コード配列を含む核酸もしくは免疫グロブリン遺伝子座が、本明細書に記載され、第１の生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ２−２、ＤＨ２−８またはＤＨ２−１５であり、場合により、再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列は、２０アミノ酸長を超えるＣＤＲ３をコードする。一部の実施形態では、２０アミノ酸長を超えるＣＤＲ３をコードする再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ６コード配列を発現するげっ歯類またはげっ歯類細胞が、本明細書に記載される。
【００３６】
一部の実施形態では、げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合された再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を含むげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座が、提供される。一部の実施形態では、ＤＨＢ遺伝子セグメントは、ヒト生殖系列ＤＨ３−３遺伝子セグメントからもたらされる。一部の実施形態では、ＤＨＡ遺伝子セグメントは、ヒト生殖系列ＤＨ２−２、ＤＨ２−８またはＤＨ２−１５遺伝子セグメントからもたらされる。一部の実施形態では、ＤＨＡおよびＤＨＢの各々は、それぞれ、最大１個のヌクレオチド変異で、第１および第２の生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントと４０％の同一性を示すので、再構成された重鎖は、ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列であと決定されている。一部の実施形態では、再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列は、２０アミノ酸長を超えるＣＤＲ３をコードする。一部の実施形態では、ＪＨ遺伝子セグメントは、ヒト生殖系列ＪＨ６遺伝子セグメントからもたらされる。一部の実施形態では、ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を含むげっ歯類またはげっ歯類細胞が提供される。一部の実施形態では、げっ歯類は、ラットもしくはマウス細胞であるか、またはげっ歯類細胞は、ラット細胞もしくはマウス細胞である。一部の実施形態において、げっ歯類細胞は、げっ歯類Ｂ細胞である。一部の実施形態では、骨髄腫細胞と融合された再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を発現するげっ歯類Ｂ細胞を含むハイブリドーマが提供される。一部の実施形態では、ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ配列は、各々ＤＨＡおよびＤＨＢとして同定される配列が、それぞれ、最大１個のヌクレオチド変異で、第１および第２の生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントと４０％の同一性を示すときでさえ、ＤＨ−ＤＨ組み換えの結果であると確認されている。
【００３７】
一部の実施形態では、ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、非ヒト動物または細胞が提供され、操作されたＤＨ領域は、第１および第２の組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、第１のＲＳＳは、２３ｍｅｒのＲＳＳであり、第２のＲＳＳは、１２ｍｅｒのＲＳＳである。一部の実施形態では、第１のＲＳＳは、１２ｍｅｒのＲＳＳであり、第２のＲＳＳは、２３ｍｅｒのＲＳＳである。
【００３８】
一部の実施形態では、ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、非ヒト動物が提供され、操作されたＤＨ領域は、各々２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合されている一つ以上のＤＨセグメントを含む。
【００３９】
一部の実施形態では、ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、非ヒト細胞または組織が提供され、操作されたＤＨ領域は、各々２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合されている一つ以上のＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、細胞は、リンパ細胞系列由来または骨髄細胞系列由来である。一部の実施形態では、細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびＴ細胞から選択される。一部の実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、またはその任意の組み合わせから選択される。
【００４０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト細胞から作製された不死化細胞、例えば、本明細書に記載の非ヒト動物から単離されたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させることから作製されたハイブリドーマ細胞が提供される。
【００４１】
一部の実施形態では、非ヒト細胞は、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、げっ歯類の胚性幹細胞である。一部の実施形態では、げっ歯類胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞であり、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ系統、またはその混合に由来する。一部のある実施形態では、げっ歯類胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞であり、１２９およびＣ５７ＢＬ系統の混合である。
【００４２】
一部の実施形態では、非ヒト動物を作製するための本明細書に記載の非ヒト胚性幹細胞の使用が提供される。一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞であり、本明細書に記載される通り、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むマウスを作製するために使用される。一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、ラット胚性幹細胞であり、本明細書に記載される通り、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むラットを作製するために使用される。一部の実施形態において、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むラットを作製する非限定的な例示的方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１４０３０９４８７号に開示される方法を含み得る。
【００４３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト胚性幹細胞を含む、それから作製される、それから得られる、またはそれから生成される非ヒト胚が提供される。一部の実施形態では、非ヒト胚は、げっ歯類胚であり、一部の実施形態では、マウス胚であり、一部の実施形態では、ラット胎である。
【００４４】
一部の実施形態では、非ヒト動物を作製するための本明細書に記載の非ヒト胚の使用が提供される。一部の実施形態では、非ヒト胚は、マウス胚であり、本明細書に記載される通り、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むマウスを作製するために使用される。一部の実施形態では、非ヒト胚は、ラット胚であり、本明細書に記載される通り、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むラットを作製するために使用される。
【００４５】
ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類を作製する方法であって、（ａ）各々が２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つまたは複数のＤＨセグメントを含むＤＮＡフラグメントを含むようげっ歯類胚性幹細胞のゲノムを修飾する工程、例えば、ＤＮＡフラグメントは、本明細書に記載のヌクレオチド分子、ターゲティングベクター、および／または操作されたＤＨ領域を含む、（ｂ）修飾されたげっ歯類胚性幹細胞（ａ）を使用してげっ歯類を生み出す工程を含む方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨセグメントを含むよう免疫グロブリン重鎖可変領域の再構成されていないＤＨ領域を修飾する工程を含み、再構成されていないＤＨ領域は、各々が、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳ、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する一つまたは複数の再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントをさらに含み、これにより、当該げっ歯類を作製する。一部の実施形態では、修飾することは、一つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを置換すること、場合により、一つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨセグメントで置換するか、または欠失させることを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、少なくとも一つのＶＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ遺伝子クラスターを含む、一つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ領域、および一つの再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子クラスター、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ領域は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨセグメントを含むよう修飾されている、である。一部の実施形態では、修飾工程は、（ｉ）機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメント、例えば、ＶＨ３−７４からＶＨ６−１に渡り、それらを含む全ての機能的ＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、（ｉｉ）２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのＤＨ遺伝子セグメントで置換されているＤＨ７−２７を除く、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、ならびに（ｉｉｉ）少なくとも再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメント、および場合により、少なくとも再構成されていないＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないＪＨ６遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域をもたらす。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＤＨ遺伝子セグメントは、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ３−３遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、修飾工程は、（ｉ）機能性ヒトＶＨ遺伝子セグメント、例えば、ＶＨ３−７４からＶＨ６−１に渡り、それらを含む全ての機能的ＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、（ｉｉ）再構成されていないヒトＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントが、それぞれ、その３’で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ２−２遺伝子セグメント、その３’で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、およびその３’で２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントで置換されていることを除き、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、ならびに（ｉｉｉ）再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないヒトＪＨ１遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ２遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ３遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ４遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＪＨ５遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ６遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む免疫グロブリン重鎖可変領域をもたらす。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域（ａ）は、一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子をさらに含み、場合により、一つまたは複数のげっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子は、二つの再構成されていないＶＨ遺伝子セグメントの間、例えば、再構成されていないヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントと再構成されていないヒトＶＨ６−１遺伝子セグメントの間に位置し、および／または（ｂ）免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合され、場合により、免疫グロブリン重鎖定常領域は、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域である。一部の実施形態では、げっ歯類は、ラットまたはマウスである。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物、本明細書に記載の非ヒト細胞もしくは組織、本明細書に記載の不死化細胞、本明細書に記載の非ヒト胚性幹細胞、または本明細書に記載の非ヒト胚を含むキットが提供される。
【００４７】
一部の実施形態では、治療または診断のための薬物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載のキットが提供される。一部の実施形態では、疾患、障害もしくは状態の処置、予防、または改善のための薬物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載のキットが提供される。
【００４８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、またはターゲティングベクターが提供される。一部の実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、またはターゲティングベクターは、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、またはターゲティングベクターは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つまたは複数のＤＨセグメントを含むＤＮＡフラグメントを含む。一部の実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、またはターゲティングベクターは、一つ以上の選択マーカーをさらに含む。一部の実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、またはターゲティングベクターは、一つまたは複数の部位特異的組み換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔ、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。一部の実施形態では、導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、またはターゲティングベクターは、図２に示される。
【００４９】
一部の実施形態では、非ヒト動物、非ヒト細胞、非ヒト胚性幹細胞、および／または非ヒト胚を作製するための、本明細書に記載の導入遺伝子、核酸構築物、ＤＮＡ構築物、またはターゲティングベクターの使用が提供される。
【００５０】
一部の実施形態では、一つまたは複数のＤＨセグメントは、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されている。一部の実施形態では、一つまたは複数のＤＨセグメントは、各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されている。
【００５１】
一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域は、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域は、３’のＲＳＳに作動可能に結合された一つのＤＨセグメントを含む。５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、一つのＤＨセグメントは、合成ＤＨセグメントであり、一部の実施形態では、合成ヒトＤＨセグメントであり、一部の実施形態では、ヒトＤＨ３−３セグメントと同一または実質的に同一である配列を有する合成ヒトＤＨセグメントである。３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、一つのＤＨセグメントは、合成ＤＨセグメントであり、一部の実施形態では、合成ヒトＤＨセグメントであり、一部の実施形態では、ヒトＤＨ３−３セグメントと同一または実質的に同一である配列を有する合成ヒトＤＨセグメントである。
【００５２】
一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域は、各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントを含む。各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、三つのＤＨセグメントは、合成ＤＨセグメントである。各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、三つのＤＨセグメントは、ヒトＤＨ２ファミリーセグメントである。各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、三つのＤＨセグメントは、ヒトＤＨ２−２、ヒトＤＨ２−８、ヒトＤＨ２−１５、ヒトＤＨ２−２１およびその組み合わせから選択される。各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、三つのＤＨセグメントは、ヒトＤＨ２−２、ヒトＤＨ２−８、およびヒトＤＨ２−１５である。
【００５３】
一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域は、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントを含む。各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、三つのＤＨセグメントは、合成ＤＨセグメントである。各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、三つのＤＨセグメントは、ヒトＤＨ２ファミリーセグメントである。各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、三つのＤＨセグメントは、ヒトＤＨ２−２、ヒトＤＨ２−８、ヒトＤＨ２−１５、ヒトＤＨ２−２１およびその組み合わせから選択される。各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントの一部の実施形態では、三つのＤＨセグメントは、ヒトＤＨ２−２、ヒトＤＨ２−８、およびヒトＤＨ２−１５である。
【００５４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域は、複数のヒトＤＨセグメントを含み、複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントの少なくとも一つは、５’または３’のＲＳＳに作動可能に結合され、一部の実施形態では、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合される。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域は、複数のヒトＤＨセグメントを含み、複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントの少なくとも三つは、各々、５’または３’のＲＳＳに作動可能に結合され、一部の実施形態では、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合される。
【００５５】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織のゲノムは、一つ以上の野生型ＤＨセグメントを欠く。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織のゲノムは、全てまたは実質的に全ての野生型ＤＨセグメントを欠く。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織のゲノムは、ヒトＤＨセグメントのみを含有する。
【００５６】
一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域である。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合されている。一部の実施形態において、免疫グロブリン重鎖定常領域は、内在性（例えば、非ヒト）免疫グロブリン重鎖定常領域である。
【００５７】
一部の実施形態において、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ＶＨ３−７４からＶＨ６−１までのヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態において、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、少なくともヒトＪＨ遺伝子セグメントＪＨ６を含む。一部の実施形態において、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、少なくともヒトＪＨ遺伝子セグメントＪＨ４、ＪＨ５およびＪＨ６を含む。一部の実施形態において、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトＪＨ遺伝子セグメントＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５およびＪＨ６を含む。
【００５８】
非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の一部の実施形態では、ゲノムは、内在性Ａｄａｍ６遺伝子を欠く。非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の一部の実施形態では、ゲノムは、一つ以上のげっ歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含み、一部の実施形態では、一つまたは複数のヌクレオチド配列は、第１と第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントの間に挿入される、一部の実施形態では、一つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに挿入され、一部の実施形態では、一つまたは複数のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントの間に挿入される。一部の実施形態において、第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−２であり、第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ６−１である。
【００５９】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域に対してホモ接合性、ヘテロ接合性、またはヘミ接合性である。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域に対してトランスジェニックである。
【００６０】
一部の実施形態では、ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む非ヒト動物の作製方法が提供され、方法は、（ａ）ＤＮＡフラグメントを非ヒト胚性幹細胞に挿入する工程、ＤＮＡフラグメントは、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含む；（ｂ）（ａ）で生成された非ヒト胚性幹細胞を得る工程；（ｃ）（ｂ）の非ヒト胚性幹細胞を使用して、非ヒト動物を作る工程を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、一つまたは複数のＤＨセグメントを含むＤＮＡフラグメントは、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合される。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つの合成ヒトＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つの合成ヒトＤＨ３−３セグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのヒトＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのヒトＤＨセグメントを含み、ヒトＤＨセグメントは、ヒトＤＨ２−２、ヒトＤＨ２−８およびヒトＤＨ２−１５である。
【００６２】
一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、一つまたは複数のＤＨセグメントを含み、その各々は、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合される。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、５’の２３ｍｅｒに作動可能に結合された一つの合成ヒトＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つの合成ヒトＤＨ３−３セグメントを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つの合成ヒトＤＨ３−３セグメントを含み、合成ヒトＤＨ３−３セグメントは、ヒトＤＨ７−２７セグメントの代わりにヒトＤＨ領域に位置する。
【００６３】
一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、一つ以上の選択マーカーを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、一つ以上の部位特異的組み換え部位を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む非ヒト動物の作製方法が提供され、方法は、非ヒト動物または非ヒト動物の細胞のゲノムが、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含む、操作されたＤＨ領域を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域を含むように、非ヒト動物または非ヒト動物の細胞のゲノムを修飾し、これにより、当該非ヒト動物を作製する工程を含む。
【００６５】
非ヒト動物を作製する一部の実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞のゲノムは、各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含むように修飾される。非ヒト動物を作製する一部の実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞のゲノムは、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含むように修飾される。
【００６６】
一部の実施形態では、非ヒト動物において抗体を作製する方法が提供される。一部の実施形態では、抗体を作製するか、またはそれをコードする核酸を得る方法は、非ヒト動物（例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス））を抗原で免疫する工程、げっ歯類は、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つまたは複数のＤＨセグメントを含む操作されたＤＨ領域を含む生殖系列ゲノムを有する、げっ歯類に、抗体を含む抗原に対する免疫応答、または抗原に結合する、それをコードする核酸を産生させる工程を含む。一部の実施形態では、方法は、抗体、またはそれをコードする核酸を、げっ歯類または例えば、Ｂ細胞であるげっ歯類細胞、またはハイブリドーマから回収する工程をさらに含む。一部の実施形態では、一つまたは複数のＤＨセグメントは、各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されている。一部の実施形態では、一つまたは複数のＤＨセグメントは、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されている。
【００６７】
一部の実施形態では、方法は、抗体を非ヒト動物で産生する方法が提供され、該方法は、（ａ）非ヒト動物を抗原で免疫する工程、非ヒト動物は、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含む、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖定常領域含むゲノムを有する；（ｂ）非ヒト動物が、抗原に対するゲノムを有する；（ｂ）非ヒト動物が、抗原に対する応答を生じるのに十分な条件下でげっ歯類を維持する工程；および（ｃ）非ヒト動物または非ヒト動物細胞から、抗原に結合する抗体を回収する工程を含む。一部の実施形態では、非ヒト細胞は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、非ヒト細胞は、ハイブリドーマである。
【００６８】
一部の実施形態では、ゲノムが、一つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＤＨセグメントを含む操作されたＤＨ領域、および少なくとも一つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む非ヒト動物が提供され、げっ歯類が、抗原で免疫されたとき、ヒトＤＨ−ＤＨ組み換えおよび／またはＪＨ６遺伝子セグメントへの増強された組み換えにより生成されたＣＤＲ３領域を含むヒト重鎖可変ドメインを含む抗体を生成することを特徴とするように、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、一つ以上の内在性免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に結合され、抗体は、抗原への特異的結合を示す。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された少なくとも一つのヒトＤＨセグメントは、ヒトＤＨ７−２７セグメントの代わりに位置する。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、全六つよりは少ないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、六つのヒトＪＨ遺伝子セグメントのうち一つのみを含む。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含み、機能的ＪＨ１遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ２遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ３遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ４遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ５遺伝子セグメントを欠く。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、六つのヒトＪＨ遺伝子セグメントのうち三つのみを含む。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトＪＨ４遺伝子セグメント、ヒトＪＨ５遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ６遺伝子セグメントのみを含み、機能的ＪＨ１遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ２遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ３遺伝子セグメントを欠く。一部の実施形態では、ゲノムが、全六つより少ないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、例えば、六つのヒト遺伝子セグメントのうち一つのみを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域（例えば、ヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含み、機能的ＪＨ１遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ２遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ３遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ４遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ５遺伝子セグメントを欠くヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域）を含む、非ヒト動物は、ゲノムが、全六つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む対照非ヒト動物と比較して、ＪＨ６遺伝子セグメントに対して増強した組み換えを示し、例えば、非ヒト動物は、ＪＨ６遺伝子セグメント配列もしくはその一部を含み、および／または対照非ヒト動物より少なくとも２０アミノ酸長のＣＤＲ３をコードする、より高いパーセンテージの再配列された免疫グロブリン重鎖配列を含む。一部の実施形態では、ゲノムが、全六つより少ないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、例えば、六つのヒトＪＨ遺伝子セグメントのうち三つのみを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域（例えば、ヒトＪＨ４遺伝子セグメント、ヒトＪＨ５遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ６遺伝子セグメントを含み、機能的ＪＨ１遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ２遺伝子セグメントを欠き、機能的ＪＨ３遺伝子セグメントを欠くヒト免疫グロブリン重鎖可変領域）を含む、非ヒト動物は、ゲノムが、全六つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む対照非ヒト動物と比較して、ＪＨ６遺伝子セグメントに対して増強した組み換えを示し、例えば、非ヒト動物は、ＪＨ６遺伝子セグメント配列もしくはその一部を含み、および／または対照非ヒト動物より少なくとも２０アミノ酸長のＣＤＲ３をコードする、より高いパーセンテージの再構成された免疫グロブリン重鎖配列を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、ゲノムが、一つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、３’で２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接する少なくとも一つのヒトＤＨセグメントを含む操作されたＤＨ領域、および少なくとも二つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む非ヒト動物が提供され、げっ歯類が、抗原で免疫されたとき、ヒトＤＨ−ＤＨ組み換えにより生成されたＣＤＲ３領域を含むヒト重鎖可変ドメインを含む抗体を生成することを特徴とするように、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、一つ以上の内在性免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に結合され、抗体は、抗原への特異的結合を示す。一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域は、各々、３’で２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接した少なくとも三つのヒトＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域は、各々、３’で２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接する三つのヒトＤＨセグメントを含み、三つのヒトＤＨセグメントは、ヒトＤＨ２−２、ヒトＤＨ２−８およびヒトＤＨ２−１５である。一部の実施形態において、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ＶＨ３−７４からＶＨ６−１までのヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【００７０】
一部の実施形態では、抗原は、病原体、例えば、細菌、真菌、またはウイルス病原体である。一部の実施形態では、本明細書の非ヒト動物の免疫は、病原体、例えば、細菌、真菌、またはウイルス病原体で非ヒト動物を感染させることを含む。一部の実施形態では、本明細書の非ヒト動物の免疫は、非ヒト動物に、病原体、例えば、細菌、真菌、またはウイルス病原体から単離されたゲノムまたはタンパク質性物質を投与することを含む。一部の実施形態では、抗原は、受容体（例えば、補体受容体、ケモカイン受容体など）、またはその一部である。一部の実施形態では、抗原は、受容体、またはその一部をコードする核酸である。一部の実施形態では、抗原は、受容体、またはその一部を発現する細胞である。一部の実施形態では、抗原は、イオンチャネル、またはその一部である。一部の実施形態では、抗原は、イオンチャネルまたはその一部をコードする核酸である。一部の実施形態では、抗原は、イオンチャネル、またはその一部を発現する細胞である。
【００７１】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、内在性軽鎖遺伝子座への、一つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントの挿入をさらに含むゲノムを有する。一部の実施形態では、ヒトＶＬおよびＪＬセグメントは、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントであり、内在性κ軽鎖遺伝子座に挿入される。一部の実施形態では、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、げっ歯類Ｃκ遺伝子（例えば、マウスまたはラットＣκ遺伝子）に作動可能に結合される。一部の実施形態では、ヒトＶＬおよびＪＬセグメントは、ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントであり、内在性λ軽鎖遺伝子座に挿入される。一部の実施形態では、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、げっ歯類Ｃλ遺伝子（例えば、マウスまたはラットＣλ遺伝子）に作動可能に結合される。
【００７２】
一部の実施形態において、医薬としての使用のような、医薬における使用のための薬物またはワクチンの製造および／または開発における、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の使用が提供される。一部の実施形態では、ヒトに投与するための抗体の製造および／または開発における、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の使用が提供される。一部の実施形態において、疾患、障害または状態の治療、予防または改善のための医薬の製造における本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の使用が提供される。
【００７３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、治療または診断のための薬物の製造および／または開発における使用のため提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、疾患、障害または状態の処置、予防または改善のための医薬の製造における使用のため提供される。
【００７４】
一部の実施形態では、本明細書で提供される非ヒト動物は、げっ歯類であり、一部の実施形態では、マウスであり、一部の実施形態では、ラットである。多くの実施形態では、本明細書で提供される非ヒト動物細胞は、げっ歯類細胞であり、一部の実施形態では、マウス細胞であり、一部の実施形態では、ラット細胞である。多くの実施形態では、本明細書で提供される非ヒト動物は、げっ歯類組織であり、一部の実施形態では、マウス組織であり、一部の実施形態では、ラット組織である。
【００７５】
一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳは、配列番号１５１として表される配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
以下の図から成る本明細書に含まれる図面は、例示目的のみであり、限定を目的としない。
【００７７】
【図１】図１は、修飾されていないＤＨ領域（上部パネル）および操作されたＤＨ領域（下部パネル）を有する免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントについてのＤＪ組み換え現象において遺伝子セグメントの規則正しいアセンブリを示す、本発明の実施形態のノンスケールの一般的な説明を示す。１２ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）は、塗りつぶされていない三角形として示される。２３ｍｅｒのＲＳＳは、縦ストライプを有する三角形として示される。例示的な修飾されていないＶＨ遺伝子セグメント（塗りつぶされていない四角形）およびＤＨ遺伝子セグメント（塗りつぶされた四角形）は、それぞれ、塗りつぶされていないし角形および塗りつぶされた四角形として示され、アルファベット文字を使用する一般的な命名で提供される。２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤ遺伝子セグメント（例えば、ＤＨ３−３）および修飾されていないＪＨ遺伝子セグメントは、それぞれ、横ストライプが塗られた四角形および塗りつぶされていない四角形として示され、それらの適切な命名で提供される。μ０プロモーター（μ０ｐｒｏ）も示される。組み換えＤＪ遺伝子セグメントへのＶＨ遺伝子セグメントの組み換えは、示されていない。
【００７８】
【図２】図２は、実施例１に従い作製されたターゲティングベクターの例示的な実施形態のノンスケールの説明を示す。ハッシュ線は、ターゲティングベクターに含まれるが、具体的に示されていないＤＨ遺伝子セグメントを表す。
【００７９】
【図３】図３は、エレクトロポレーション（ＥＰ）を介してマウスＥＳ細胞のゲノム内のヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座に２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターを挿入する非限定的な例示的な実施形態のノンスケールの説明を示す。ハッシュ線は、重鎖可変領域遺伝子座に含まれるが、具体的には示されていないＶＨ遺伝子セグメントまたはＤＨ遺伝子セグメントを表す。
【００８０】
【図４】図４は、実施例１および２に記載される、２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターのエレクトロポレーションおよび組込み後のヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座における選択カセットのＣｒｅ介在性欠失の非限定的な例示的実施形態のノンスケールの説明を示す。ハッシュ線は、重鎖可変領域遺伝子座に含まれるが、具体的には示されていないＶＨ遺伝子セグメントまたはＤＨ遺伝子セグメントを表す。
【００８１】
【図５】図５は、エレクトロポレーション（ＥＰ）を介してマウスＥＳ細胞のゲノム内のヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座に２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターを挿入する非限定的な例示的な実施形態のノンスケールの説明を示す。ハッシュ線は、重鎖可変領域遺伝子座に含まれるが、具体的には示されていないＶＨ遺伝子セグメントまたはＤＨ遺伝子セグメントを表す。
【００８２】
【図６】図６は、実施例１および２に記載される、２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターのエレクトロポレーションおよび組込み後のヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座における選択カセットのＣｒｅ介在性欠失の非限定的な例示的実施形態のノンスケールの説明を示す。ハッシュ線は、重鎖可変領域遺伝子座に含まれるが、具体的には示されていないＶＨ遺伝子セグメントまたはＤＨ遺伝子セグメントを表す。
【００８３】
【図７】図７は、エレクトロポレーション（ＥＰ）を介してマウスＥＳ細胞のゲノム内のヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座に１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３／ＪＨ１−６ターゲティングベクターを挿入する非限定的な例示的な実施形態のノンスケールの説明を示す。ハッシュ線は、重鎖可変領域遺伝子座に含まれるが、具体的には示されていないＶＨ遺伝子セグメントまたはＤＨ遺伝子セグメントを表す。塗りつぶされた三角形は、偽遺伝子を表す。
【００８４】
【図８】図８は、実施例１および２に記載される、１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターのエレクトロポレーションおよび組込み後のヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座における選択カセットのＣｒｅ介在性欠失の例示的な非限定的な実施形態のノンスケールの説明を示す。ハッシュ線は、重鎖可変領域遺伝子座に含まれるが、具体的には示されていないＶＨ遺伝子セグメントまたはＤＨ遺伝子セグメントを表す。
【００８５】
【図９Ａ】図９Ａは、１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターで修飾された動物から単離された特定のアミノ酸長（ｘ軸）のＣＤＲ３を有するＤＨ−ＤＨ組み換え現象（下部パネル）から生じる、全ての機能的免疫グロブリン（Ｉｇ）読み取りのパーセンテージ（ｙ軸）をグラフ化する、本発明の実施形態に関連する結果を示す。「Ｓ１」、「Ｓ２」および「Ｓ３」は、各々、異なる実験マウスを表す。
【００８６】
【図９Ｂ】図９Ｂは、１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターで修飾された動物から単離された特定のアミノ酸長（ｘ軸）のＣＤＲ３を有するＤＨ−ＤＨ組み換え現象（下部パネル）から生じる、全てのＩｇ読み取りのパーセンテージ（ｙ軸）をグラフ化する、本発明の実施形態に関連する結果を示す。「Ｓ１」、「Ｓ２」および「Ｓ３」は、各々、異なる実験マウスを表す。
【００８７】
【図１０Ａ】図１０Ａは、１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターで修飾された動物から単離された特定の数のシステイン残基（ｘ軸）を含むＣＤＲ３を有するＤＨ−ＤＨ組み換え現象から生じる、全ての機能的免疫グロブリン（Ｉｇ）読み取りのパーセンテージ（ｙ軸）をグラフ化する、本発明の実施形態に関連する結果を示す。「Ｓ１」、「Ｓ２」および「Ｓ３」は、各々、異なる実験マウスを表す。
【００８８】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターで修飾された動物から単離された特定の数のシステイン残基（ｘ軸）を含むＣＤＲ３を有するＤＨ−ＤＨ組み換え現象から生じる、全ての免疫グロブリン（Ｉｇ）読み取りのパーセンテージ（ｙ軸）をグラフ化する、本発明の実施形態に関連する結果を示す。「Ｓ１」、「Ｓ２」および「Ｓ３」は、各々、異なる実験マウスを表す。
【００８９】
【図１１】図１１は、両方のコホートが、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードするＤＮＡ免疫原で免疫された、ヒト化免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座（ＶＩ；例えば、米国特許第８，６９７，９４０号および第８，６４２，８３５号を参照のこと；その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を有する個々のマウス、ならびに本明細書に記載の２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターで修飾されたマウスにおける典型的な抗体タイター（ｙ軸）をグラフ化する、本発明の実施形態に関連する結果を示す。抗体タイターを、ＧＰＣＲを発現するよう操作された２９３細胞（ＧＰＣＲ；ｘ軸）およびＧＰＣＲを発現しない細胞（対照；ｘ軸）上のＭＳＤ細胞結合により決定した。
【００９０】
【図１２Ａ】図１２Ａは、２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターおよび５〜３０アミノ酸長（ｘ軸）のアミノ酸（ＡＡ）を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）で修飾されたマウスの骨髄（ＢＭ）または脾臓から単離された表７に記載される厳密な判断基準に従った、ＶＨＤＨＡ−ＤＨＢＪＨ再構成の結果であると推定される、パーセンテージ（％；ｙ軸）の再構成された免疫グロブリン重鎖ＶＨＤＨＪＨ遺伝子セグメントを示す、本発明の実施形態に関連する結果を示す。ＢＭ細胞数および脾臓細胞数は、互いに標準化されていない。ｎ＝１。
【００９１】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、パネル図１２Ａに示されるグラフの拡大を提供する、本発明の実施形態に関連する結果を示す。ＢＭ細胞数および脾臓細胞数は、互いに標準化されていない。ｎ＝１。
【００９２】
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターで修飾されたマウスの骨髄または脾臓の両方において２１より長いアミノ酸長のＣＤＲ３を有する読み取り値のパーセンテージを示す、本発明の実施形態に関連する結果を示す。ＢＭ細胞数および脾臓細胞数は、互いに標準化されていない。ｎ＝１。
【００９３】
【図１３】図１３は、２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターおよび全てが２０アミノ酸長を超えた（ｘ軸）アミノ酸（ＡＡ）長を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）で修飾されたマウスの骨髄（ＢＭ）または脾臓から単離された（表７に記載される厳密な判断基準に従った）、推定される再構成された免疫グロブリン重鎖ＶＨＤＨＡ−ＤＨＢＪＨ遺伝子配列のパーセンテージ（％；ｙ軸）を示す、本発明の実施形態に関連する結果を示す。ＢＭ細胞数および脾臓細胞数は、互いに標準化されていない。ｎ＝１。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
定義
本発明の範囲は、本明細書に添付される請求の範囲により規定されるものであり、本明細書に記載される特定の実施形態により限定されない。当分野の当業者は、本開示を読むことで、かかる記載される実施形態に対し均等であり得る様々な改変、または別の手段で請求の範囲内にあり得る様々な改変を認識するであろう。概して、専門用語は、明確な別段の示唆がない限り、当技術分野で理解されている意味に従う。特定の用語の明示的な定義は、本明細書におよび以下に提供されるが、本明細書全体にわたる特定の例におけるこれらの用語および他の用語の意味は、文脈から当業者に明らかとなるであろう。以下の用語および他の用語のさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。本明細書内またはその関連部分内に引用されている参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００９５】
請求項で請求項を変更するための「第１の」、「第２の」、「第３の」などの順序の用語の使用は、それ自体は一つの請求項要素の別の要素に対する優位性、先行、もしくは順序、または方法の行為が実施される時間的順序を暗示せず、特定の名称を持つ一つの請求項要素を（順序の用語の使用以外は）同じ名称を持つ別の要素から区別して請求項要素を区別するための標識としてのみ使用される。
【００９６】
本明細書および本特許請求の範囲において、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、そうではないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の一つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記述は、そうではないことが示されるかまたはそうでなければ文脈から明らかでない限り、一つ、二つ以上、または群のすべての要素が、所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する場合に満足される。本発明は、群の正確に一つの要素が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、二つ以上、または群の要素全体が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、別途指定されない限り、または矛盾または不一致が起こることが当業者には明らかでない限り、変形、組み合わせ、および記載された請求項の一つ以上からの一つ以上の限定、要素、句、記述用語などが、同じ基礎請求項に依存する別の請求項（または関連する任意のその他の請求項）に導入される並べ替えすべてを網羅することを理解すべきである。記載されたような要素が存在する場合（例えば、マーカッシュ群または類似の形式で）、要素の各サブグループも開示され、任意の要素を群から除去することができる。当然のことながら、一般的に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むとして言及される場合、本発明の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などから成る、または実質的にそれらから成る。簡潔にするために、これらの実施形態はすべての場合において、多くの言葉では本明細書に特に記述されていない。これも当然のことながら、本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、請求項から明示的に除外される可能性がある。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は同意義として使用される。約／およその有無に関わらず、本明細書で使用される任意の数字は、当業者によって理解される任意の正常変動、例えば、＋／−５％を網羅することが意図される。
【００９８】
投与：対象またはシステム（例えば、細胞、器官、組織、生物体、または関連構成要素もしくはその構成要素群）に対する組成物の投与を意味する。当業者であれば、投与経路は、例えば、その組成物が投与される対象またはシステム、組成物の性質、投与目的などに応じて異なり得ることを認識するであろう。
【００９９】
例えば、一部の実施形態では、動物対象（例えば、ヒトまたはげっ歯類）への投与は、気管支投与（気管支注入を含む）、口腔投与、腸内投与、皮間投与、動脈内投与、皮内投与、胃内投与、髄内投与、筋肉内投与、鼻内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、静脈内投与、心室内投与、粘膜投与、経鼻投与、経口投与、直腸投与、皮下投与、舌下投与、局所投与、気管投与（気管内注入を含む）、経皮投与、膣投与、および／または硝子体投与であってもよい。一部の実施形態では、投与は、間欠投薬を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる連続投薬（例えば、灌流）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物によって産生される抗体は、対象（例えば、ヒト対象またはげっ歯類）に投与され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される非ヒト動物によって産生される抗体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、緩衝液、希釈剤、賦形剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物によって産生される抗体を含む医薬組成物は、例えば、バイアル、シリンジ（例えば、ＩＶシリンジ）、またはバッグ（例えば、ＩＶバッグ）などの保存または投与用の容器に含まれ得る。
【０１００】
生物学的活性：生物系、インビトロまたはインビボ（例えば、生物中）で活性を持つ任意の薬剤の特徴を意味する。例えば、薬剤が生物内に存在する場合、その生物内で生物学的効果を持つ薬剤は、生物学的に活性であるとみなされる。
【０１０１】
特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性な場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を与えるそのタンパク質またはポリペプチドの一部は、「生物学的に活性」な部分と一般的に呼ばれる。
【０１０２】
同等：互いに同一ではない場合があるが、観察された差異または類似性に基づき合理的に結論を下すことができるような比較を可能にするのに十分類似性がある、二つ以上の薬剤、実体、状況、条件群などを意味する。当業者であれば、文脈内において、同等とみなされるために二つ以上のこのような薬剤、実体、状況、条件群などに対して、ある所定の状況でどの程度の同一性が必要かを理解するであろう。
【０１０３】
保存的：保存的アミノ酸置換、すなわち、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖Ｒ基を持つ別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。一般的に、保存的アミノ酸置換は、対象のタンパク質の機能特性、例えば、リガンドに結合する受容体の能力などを実質的に変化させない。類似の化学特性を備えた側鎖を持つアミノ酸群の例には次のものが含まれる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの脂肪族側鎖、セリンおよびスレオニンなどの脂肪族−ヒドロキシル側鎖、アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド含有側鎖、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンなどの芳香族側鎖、リジン、アルギニン、およびヒスチジンなどの塩基性側鎖、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖、ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄含有側鎖。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。
【０１０４】
一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘導などで使用される、アラニンを含むタンパク質の任意の未変性残基の置換である可能性がある。一部の実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５（この文献はその全体が参照により本明細書に援用される）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を持つ保存的置換が行われる。一部の実施形態では、置換は中等度に保存的な置換であり、この場合において該置換はＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで負ではない値を有する。
【０１０５】
対照：結果が比較される基準となる「対照」という当技術分野で公知の意味を指す。一般的に、対照は、変数についての結論を出すために、このような変数を分離することによって実験の完全性を増加させるのに使用される。一部の実施形態では、対照は、コンパレーターを提供するために、試験反応またはアッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。「対照」は、「対照動物」を指すことがある。「対照動物」は本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変（すなわち、野生型動物）である場合がある。ある実験では、「試験」（すなわち、試験されている変数）が適用される。その「対照」である第２の実験では、その試験されている変数が適用されない。対照は、陽性対照または陰性対照である場合がある。
【０１０６】
一部の実施形態では、対照は歴史的対照（すなわち、以前に実施された試験またはアッセイの、または以前に知られた量または結果）である。一部の実施形態では、対照は印刷されたかまたはそれ以外の方法で保存された記録であるか、またはそれを含む。
【０１０７】
破壊：ＤＮＡ分子（例えば、遺伝子または遺伝子座などの内因性相同配列）との相同組み換え事象の結果を意味する。
【０１０８】
一部の実施形態では、破損は、ＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換、交換、ミスセンス変異、もしくはフレームシフト、またはこれらの任意の組み合わせを達成または示す場合がある。挿入は、遺伝子全体、遺伝子のフラグメント（例えば、エクソン）の挿入を含む場合があり、これらは内因性配列以外の起源のもの（例えば、異種配列）であるか、または対象の特定の遺伝子に由来もしくは該遺伝子から単離したコード配列であってもよい。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の（例えば、遺伝子によってコードされたタンパク質の）発現および／または活性を増加する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性を減少する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質）の配列を変える場合がある。一部の実施形態では、破損は、ゲノム内の染色体または染色体位置の配列を変化させ得る。一部の実施形態では、破損は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質）を切断またはフラグメント化する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子またはコードされた遺伝子産物を伸長させる場合がある。一部のかかる実施形態では、破壊は融合タンパク質のアセンブリを実現する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルに影響するが、その活性には影響しない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の活性に影響するが、そのレベルには影響しない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルに対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の活性に対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれに対しても顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、有意な効果は、例えば、限定されないが、ＳｔｕｄｅｎｔＴ検定により測定することができる。
【０１０９】
内在性遺伝子座または内在性遺伝子：本明細書に記載の変更、破壊、欠失、挿入、改変、置換または交換を導入する前に、親または参照の生物において存在する遺伝子座を意味する。
【０１１０】
一部の実施形態では、内在性遺伝子座は自然界で見られる配列を全体的にまたは部分的に含む。一部の実施形態では、内在性遺伝子座は野生型遺伝子座である。一部の実施形態では、参照生物は野生型生物である。一部の実施形態では、参照生物は遺伝子操作された生物である。一部の実施形態では、参照生物は実験室で繁殖された生物（野生型または遺伝子操作型）である。
【０１１１】
内在性プロモーター：例えば、野生型の生物において、内在性遺伝子または遺伝子座と自然に関連付けられるプロモーターを指す。
【０１１２】
操作された：概して、人の手により操作された態様を意味する。一般的なことであり、当技術分野の当業者に理解されているとおり、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫物も通常、実際の操作は過去の実体に対して行われていたのだとしても、「操作された」とみなされる。さらに、当技術分野の当業者により認識されているように、様々な技法が利用可能であり、それらを介して、本明細書に記載される「操作」を行うことができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、自然界での順序では一緒に連結されていない二つ以上の配列がヒトの手により操作され、操作ポリヌクレオチド中で互いに直接連結された場合に、「操作された」とみなされ得る。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、自然界で第１のコード配列と作動的に結合しているが、第２のコード配列とは作動的に結合せずに存在し、ヒトの手により連結されて第２のコード配列と作動的に結合した制御配列を含んでいてもよい。本明細書の操作されたＤＨ遺伝子セグメントの実施形態では、ＤＨ遺伝子セグメントをヒトの手によって操作して、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合される（例えば、少なくとも一方が、２３ｍｅｒのＲＳＳに隣接する、隣に存在する、すぐ横にある）。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作されたＤＨ遺伝子セグメントは、別のＤＨ遺伝子セグメントからもたらされ、例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントは、他のＤＨ遺伝子セグメントのヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含むが、遺伝子コードの縮重および／または１２ｍｅｒのＲＳＳの２３ｍｅｒのＲＳＳとの置換による差異のためである。他のＤＨ遺伝子セグメントおよびそれからもたらされた操作されたＤＨ遺伝子セグメント（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント）は、対応する遺伝子セグメントとみなされ得る。例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントは、一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接したＤＨ３−３遺伝子セグメントに対応するとみなされることができ、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ３−３遺伝子セグメントならびに一方の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが、他方の端で別の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接したＤＨ３−３遺伝子セグメントは、遺伝子コードの縮重および／または二つの１２ｍｅｒのＲＳＳの２３ｍｅｒのＲＳＳでの置換による差異を除き、同一のヌクレオチド配列を共有する。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列であって、その各々が、自然界では互いに連結されていないポリペプチド要素またはドメインをコードする、該第１の核酸配列と第２の核酸配列とが、単一の操作されたポリヌクレオチドにおいて互いに連結されていてもよい。同様に、一部の実施形態では、細胞または生物体が操作され、それによりその遺伝情報が改変された（例えば、従前には存在していなかった新たな遺伝物質が導入されたり、または従前には存在していた遺伝物質が変更もしくは除去された）場合に、「操作された」とみなされ得る。
【０１１４】
例えば、一部の実施形態では、「操作」には、分析または比較を行うようプログラムされた、または推奨された配列および／もしくは選択された配列を別手段により分析するようプログラムされた、コンピューターシステムの使用を介して（例えば核酸配列、ポリペプチド配列、細胞、組織および／または生物体の）選択または設計を行うことを含んでもよい。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では「操作」には、インビトロ化学合成技術の使用、および／もしくは組み換え核酸技術、例えば（例としてポリメラーゼ鎖反応などを介した）核酸増幅ハイブリダイゼーション、突然変異、形質転換、トランスフェクションなどの使用が含まれてもよく、ならびに／または様々な任意の制御交配法の使用が含まれてもよい。当技術分野の当業者に認識されているように、確立されている様々なこうした技術（例えば組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法など））が当技術分野に周知であり、様々な概説および詳説の参照文献中に記載されており、それらは本明細書全体を通じて引用および／または考察されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１１５】
遺伝子：産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする、染色体中のＤＮＡ配列を意味する。明確化のため、用語「遺伝子」は、概してポリペプチドをコードする核酸の一部を意味し；当該用語は任意選択的に制御配列を包含する場合があり、これは当技術分野の当業者には文脈から明らかであるはずである。この定義は、「遺伝子」という用語を非タンパク質をコードする発現単位に適用することを除外する意図はなく、本明細書に使用される当該用語は、多くの場合においてはポリペプチドをコードする核酸を指すことを明らかにすることを意図している。
【０１１６】
一部の実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えばエクソン配列）と非コード配列（例えばイントロン配列）の両方を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、一つ以上の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含んでもよく、および／または例えば、遺伝子発現（例えば、細胞型特異的発現、誘導発現など）の一つ以上の態様を制御することができる、もしくは影響を与えることができるイントロン配列を含んでもよい。
【０１１７】
異種：異なる供給源からの作用剤または実体を意味する。例えば、特定の細胞もしくは生物体に存在するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物に関連して使用されるとき、当該用語は、関連ポリペプチドもしくはそのフラグメント、遺伝子もしくはそのフラグメント、または遺伝子産物もしくはそのフラグメントが、（１）ヒトの手によって遺伝子操作されたこと、（２）ヒトの手によって（例えば、遺伝子操作によって）細胞または生物（またはその前駆体）に導入されたこと、および／または（３）関連細胞または生物（例えば、関連細胞タイプまたは生物タイプ）によって自然には生成されない、またはその中に存在しないことを明確にする。別の例には、自然には関連付けられておらず、一部の実施形態では非内因性である調節要素（例えば、プロモーター）の制御下で、特定の天然の細胞または生物体中に通常存在するが、例えば突然変異または置換により改変されている、ポリペプチドもしくはそのフラグメント、遺伝子もしくはそのフラグメント、または遺伝子産物もしくはそのフラグメントも含まれる。
【０１１８】
宿主細胞：細胞の中に異種（例えば、外来性）核酸またはタンパク質が導入された細胞を意味する。当業者が本開示を読めば、このような用語が特定の主題細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫を指すためにも使用されることを理解するであろう。特定の改変は突然変異または環境の影響のために後続世代にも起こる可能性があるので、このような子孫は、実際は、親細胞と同一でない場合があるが、それでも「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【０１１９】
一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞または真核細胞であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞であるか、またはそれを含む。一般的に、宿主細胞は、細胞が指定される種に関わらず、異種核酸またはタンパク質の受け入れおよび／または生産に適した任意の細胞である。細胞の例としては、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）など）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）など）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。
【０１２０】
一部の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述細胞から派生する細胞株。一部の実施形態では、細胞は一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、単離細胞であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は生物の一部である。
【０１２１】
「ヒト化」：起源は非ヒトであり、それに対する部分が、改変（例えば、ヒト化）分子が、その生物学的機能を保持し、および／または当該保持された生物学的機能を遂行する構造が維持されるように、対応するヒト分子の対応する部分で置換された分子（例えば、核酸、タンパク質など）を指す。対照的に、「ヒト」などは、ヒト起源のみ、例えば、ヒトのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のみをそれぞれ含有するヒトのヌクレオチドまたはタンパク質を有する分子を包含する。「ヒト（ヒト化）」という用語は、当該ヒト（ヒト化）分子が、（ａ）ヒト分子であり得る、または（ｂ）ヒト化された分子であり得ることを反映するために使用される。
【０１２２】
同一性：配列の比較に関連し、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用できる当技術分野で公知の多種アルゴリズムによって決定される同一性を意味する。
【０１２３】
一部の実施形態では、本明細書に記述された同一性は、１０．０のギャップ開始ペナルティ、０．１のギャップ延長ペナルティを用い、Ｇｏｎｎｅｔ類似性マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８年）を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用して決定される。
【０１２４】
インビトロ：多細胞生物体内ではなく、例えば試験管または反応容器、細胞培養などの人工的環境において発生する事象を意味する。
【０１２５】
インビボ：例えばヒトおよび／または非ヒト動物などの多細胞生物体内で発生する事象を意味する。細胞ベース系の文脈において、当該用語を使用して、（例えばインビトロシステムとは対照的に）生細胞内で発生する事象を意味する場合もある。
【０１２６】
単離された：（１）（天然環境および／または実験環境のいずれかで）最初に生成された時に関連していた成分の少なくとも一部から分離された物質および／もしくは実体、ならびに／または（２）人の手によって設計、生成、調製、および／もしくは製造された物質および／もしくは実体を意味する。単離された物質および／または実体は、それらが最初に関連付けられた約１０種以上の他の構成要素のから分離されてもよい。一部の実施形態では、単離された因子は、少なくとも約８０％以上純粋である。物質は、それにその他の成分が実質的に含まれない場合、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者であれば理解するように、例えば、一つ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）などの特定のその他の成分と組み合わされた後でも、物質はまだ「単離された」または「純粋」とさえもみなされる場合があり、このような実施形態では、物質の単離または純度のパーセントはこのような担体または賦形剤を含めることなく計算される。
【０１２７】
一例を挙げると、一部の実施形態では、自然界に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体高分子は、（ａ）導出の起源またはソースが、自然界の天然状態でそれに付随する成分の一部またはすべてと関連していない時、（ｂ）それが、自然界でそれを生産する種と同じ種のその他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない時、または（ｃ）自然界でそれを生産する種ではない細胞またはその他の発現系によって発現されるか、またはそうでなければそれからの成分と関連している時、「単離された」とみなされる。従って、例えば、一部の実施形態では、化学的に合成された、または自然界でそれを生産するものとは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドとみなされる。あるいはまたは追加的に、一部の実施形態では、一つ以上の精製技術を受けたポリペプチドは、それが、ａ）それが自然界で関連している、および／またはｂ）最初に生産された時にそれが関連していたその他の成分から分離されている限りは「単離された」ポリペプチドとみなされることができる。
【０１２８】
非ヒト動物：ヒトではない任意の脊椎生物体を意味する。
【０１２９】
一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（例えば、サメまたはエイ）、両生類、は虫類、哺乳類、および鳥である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、またはげっ歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物はラットまたはマウスなどのげっ歯類である。
【０１３０】
核酸：その最も広い意味において、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれ、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指し、一般に核酸分子、核酸配列、ヌクレオチド分子、ヌクレオチド分子と交換可能であり、これらの用語は互いに交換可能である。
【０１３１】
一部の実施形態では、「核酸」とはオリゴヌクレオチド鎖であるか、またはホスホジエステル結合でオリゴヌクレオチド鎖組み込むことができる化合物および／または物質である。文脈から明らかであるように一部の実施形態では、「核酸」とは個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指し、一部の実施形態では、「核酸」とは個別の核酸残基を備えるオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるかまたはそれを含み、一部の実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の天然核酸残基を含むかまたはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の核酸類似体を含むかまたはそれらから成る。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で「核酸」とは異なる。例えば、一部の実施形態では、「核酸」は、当技術分野では知られており、骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、一つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それらを含むか、またはそれらから成り、それらは本発明の範囲内であるとみなされる。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合ではなく、一つ以上のホスホロチオエートおよび／または５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は一つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、または一つ以上の天然ヌクレオシドから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５  プロピニル−シチジン、Ｃ−５  プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、およびそれらの組み合わせ）であるか、またはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、天然核酸のものと比べて、一つ以上の改変された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は、ポリペプチドフラグメント（例えば、ペプチド）をコードするヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のイントロンを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のエクソンを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のコード配列を含む。一部の実施形態では、「核酸」は、天然起源物からの単離、相補的鋳型��基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組み換え細胞または系での複製、および化学合成の一つ以上によって調製される。一部の実施形態では、「核酸」は、少なくとも３個以上の残基の長さである。一部の実施形態では、「核酸」は一本鎖であり、一部の実施形態では、「核酸」は二重鎖である。一部の実施形態では、「核酸」は、ポリペプチドもしくはそのフラグメントをコードするか、またはコードする配列の補体である、少なくとも一つの要素を含むヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は酵素活性を持つ。
【０１３２】
作動可能に結合された：記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある近位を意味する。
【０１３３】
一部の実施形態では、作動可能に結合されたヌクレオチド配列は、互いに連続しており、  例えば、ＲＳＳに作動可能に結合された免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む核酸配列は、ＲＳＳヌクレオチド配列と隣接する免疫グロブリン遺伝子セグメントヌクレオチド配列を含み、例えば、免疫グロブリン遺伝子セグメントが、ＲＳＳヌクレオチド配列にすぐ隣接するような連続的様式で、免疫グロブリン遺伝子セグメントは、少なくとも一方の側面で（例えば、隣接）ＲＳＳヌクレオチド配列が隣接する。
【０１３４】
他の実施形態では、作動可能な連結は、連続性を必要としない。例えば、互いに「作動可能に結合された」再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、再構成されていない可変領域遺伝子セグメントが、必ずしも互いに連続しているとは限らない、再破裂された可変領域遺伝子を形成するよう再構成する能力がある。互いに、および連続する定常領域遺伝子に作動可能に結合された再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、抗原結合タンパク質のポリペプチド鎖として定常領域遺伝子と結合して発現される再構成された可変領域遺伝子を形成するよう再構成する能力がある。コード配列に「作動可能に結合され」対照配列は、対照配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように結合されている。「作動可能に結合され」配列には、関心の遺伝子と隣接する発現制御配列および、トランスにまたは距離を置いて作用して対象の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。
【０１３５】
「発現制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを生じさせるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。「発現制御配列」には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック配列）、タンパク質安定性を強化する配列、および望ましい場合、タンパク質分泌を強化する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。例えば、原核生物では、こうした制御配列は一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む一方、真核生物では、こうした制御配列は典型的に、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシングのために必須である要素を含むことを意図しており、その存在が有利である追加的要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【０１３６】
概して、各再構成されていない免疫グロブリンＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪ遺伝子セグメントは、１２ｍｅｒのＲＳＳまたは２３ｍｅｒのＲＳＳであってもよい組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合される（例えば、関連される、一つの端または両方の端で隣接する、隣接される、など）。ＲＳＳ（２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む）が側端で隣接した任意の遺伝子セグメントは、組み換えを受けておらず、したがって、「再構成されていない」遺伝子セグメントとみなされ得る。一部の実施形態では、本明細書における再構成されていない遺伝子セグメントは、各々、両方の端で２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、その生殖系列（例えば、野生型）構成の遺伝子セグメント、例えば、生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントおよび生殖系列ＪＨ遺伝子セグメントを含んでもよい。対照的に、生殖系列ＤＨ遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、各々の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する。２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、例えば、操作されたＤＨ遺伝子セグメントはまた、組み換えを受けておらず、したがって、（ｉ）２３ｍｅｒのＲＳＳおよび（ｉｉ）１２ｍｅｒのＲＳＳを含む。操作されたＤＨ遺伝子セグメント（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント）は、１２ｍｅｒのＲＳＳと作動可能に結合された別のＤＨ遺伝子セグメントと、組み換えの１２／２３規則に従って再構成することができる。
【０１３７】
生理学的条件：細胞または生物体が生存および／または繁殖する条件に言及する当技術分野で公知の意味を含む。一部の実施形態では、この用語は、生物体または細胞系に対し自然界で発生し得る外的環境または内的環境の条件を意味する。一部の実施形態では、生理学的条件は、ヒトまたは非ヒト動物の身体内にある条件であり、特に手術部位の、および／または手術部位内の条件である。生理学的条件は、典型的には、例えば２０〜４０℃の範囲の温度、１気圧、ｐＨ６〜８、１〜２０ｍＭのグルコース濃度、大気レベルの酸素濃度、および地球上で生じる重力などを含む。一部の実施形態では、実験室での条件は操作され、および／または生理学的条件に維持される。一部の実施形態では、生理学的条件は、生物体（例えば、非ヒト動物）内に生じるものである。
【０１３８】
ポリペプチド：アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。
【０１３９】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在するアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在しないアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、お互いに別々に自然界に存在する部分を含むアミノ酸配列を持つ（すなわち、例えば、ヒトおよび非ヒト部分など、二つ以上の異なる生物からのもの）。一部の実施形態では、ポリペプチドは、それが人の手の作用を通して、設計および／または生産されるという点で、遺伝子操作されたアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、複数のフラグメントを含有してもよく、または複数のフラグメントからなっていてもよく、それらフラグメントの各々は、対象のポリペプチドに見られる場合とは相互に異なる空間配置で同一の親ポリペプチドに見られるものであり（例えば、親ポリペプチドでは直接連結されていたフラグメントが、対象のポリペプチドでは空間的に分離されている場合、もしくはその逆の場合もあり、および／またはフラグメントが、対象のポリペプチドにおいて親ポリペプチドとは異なる順序で存在している場合もある）、したがって、対象のポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体となる。
【０１４０】
組み換え：組み換え手段によって設計、操作、調製、発現、生成または単離されたポリペプチドを意味し、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド、組み換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，１９９７  ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．，２００２，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．，２００２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７；Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３−５１５８を参照のこと、その各々が、その全体が参照により本明細書に援用される）、または選択された配列要素の相互スプライシングを伴うその他の任意の手段によって調製、発現、生成もしくは単離されたポリペプチドを意味する。
【０１４１】
一部の実施形態では、このような選択された配列要素の一つ以上は自然界に存在する。一部の実施形態では、このような選択された配列要素の一つ以上はインシリコで設計される。一部の実施形態では、一つ以上のこのような選択配列要素は、例えば、天然または合成起源の既知の配列要素の変異誘導（例えば、インビボまたはインビトロ）から生じる。例えば、一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、対象のソース生物体（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノム（またはポリペプチド）に見られる配列を含む。一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、二つの異なる生物体（例えば、ヒトおよび非ヒト生物体）において相互に別々に自然界で生じる（すなわち、例えば、ヒトおよび非ヒト部分などの二つ以上の異なる生物体に由来する）配列を含む。一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、変異誘導（例えば、非ヒト動物での、インビトロまたはインビボ）から生じるアミノ酸配列を持ち、したがって、組み換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列に由来しかつポリペプチド配列に関連するが、インビボで非ヒト動物のゲノム内に自然には存在しない可能性がある配列である。
【０１４２】
参照：対象の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値が比較される、標準または対照の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値を指す。「参照」は「参照動物」を指す場合がある。「参照動物」は本明細書に記述された修飾、本明細書に記述されたものとは異なる修飾を持つか、または未修飾（すなわち、野生型動物）である場合がある。一般的には、当業者には理解されるであろうように、参照薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の薬剤、動物（例えば、哺乳類）、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値を決定または特徴付けるために利用されるものと同等の条件下で決定または特徴付けられる。
【０１４３】
一部の実施形態では、参照薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値の試験または算出と実質的に同時に試験および／または算出される。一部の実施形態では、参照薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、場合により、有形媒体で具現化された公知の参照である。一部の実施形態では、参照は対照を指す場合がある。
【０１４４】
実質的：対象となる特徴または特性の完全またはほぼ完全な範囲または程度を示す定性的条件を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象はあったとしても、完了まで進む、および／または完全な状態まで進行する、または絶対的な結果を達成または避けることは稀であることを理解するであろう。従って「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の欠如の可能性をとらえるために使用される。
【０１４５】
実質的な相同性：アミノ酸配列または核酸配列間の類似を意味する。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に相同な残基を含む場合、「実質的に相同」であると一般的にみなされる。相同残基は同一の残基である場合がある。あるいは、相同残基は、適度に類似した構造および／または機能的特徴を持つ非同一残基であってもよい。例えば、当業者には周知のように、特定のアミノ酸は「疎水性」または「親水性」アミノ酸、および／または「極性」または「非極性」側鎖を持つものとして一般的に分類される。一つのアミノ酸の同じタイプの別のアミノ酸での置換は、「相同」置換とみなされる場合がよくある。一般的なアミノ酸分類が下記に要約される。
【表８】
2021528057.tif 000002
【表９】
2021528057.tif 000003
【０１４６】
当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。かかるプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．およびＢ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ  Ｍｉｓｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８に記載されている。相同配列を特定することに加えて、上述のプログラムは相同性の程度の指標を一般的に提供する。
【０１４７】
一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも９５％以上が相同の場合、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも９個以上の残基である。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿って不連続な残基を含み、例えばポリペプチドまたはその一部のフォールディングされた構造により引き合わされた非隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０個以上の残基である。
【０１４８】
「実質的な同一性」は、アミノ酸または核酸配列間の類似を意味する。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に同一な残基を含む場合、「実質的に同一」であると一般的にみなされる。当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。かかるプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．およびＢ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ  Ｍｉｓｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８に記載されている。同一配列の特定に加え、上述のプログラムは多くの場合、同一性の程度の指標も提供する。
【０１４９】
一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも９５％以上が同一の場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０個以上の残基である。
【０１５０】
ターゲティングベクターまたは標的化構築物：標的化領域を含むポリヌクレオチド分子を意味する。標的化領域は、標的細胞、組織または動物の配列と同一または実質的に同一の配列を含み、相同組み換えにより、標的化構築物を、細胞、組織または動物のゲノム内の位置に統合する。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位またはＦｒｔ部位）を使用して標的にする標的化領域も含まれる。
【０１５１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の標的化構築物は、特に対象となる核酸配列または遺伝子と、選択可能マーカーと、制御配列およびまたは調整配列と、こうした配列が関与する組み換えを補助または促進するタンパク質を外部から付加することにより仲介する組み換えを可能にする、その他の核酸配列とをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化構築物は対象の遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象の遺伝子は、内在性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を持つポリペプチドの全部または一部をコードする異種遺伝子である。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化構築物は対象のヒト化遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象のヒト化遺伝子は、内在性配列によってコードされるポリペプチドと類似の機能を持つポリペプチドの全部または一部をコードする。一部の実施形態では、標的化構築物（またはターゲティングベクター）は、人の手によって操作された核酸配列を含み得る。例えば一部の実施形態では、標的化構築物（またはターゲティングベクター）は、自然界での状態では互いに結合されていないが、操作されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドにおいて互いに直接結合されるように人の手により操作されている二つ以上の配列を含む、操作されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドを含むように構築され得る。
【０１５２】
導入遺伝子または導入遺伝子構築物：人の手を用いて（例えば、本明細書に記載の方法を用いて）細胞に導入された核酸配列（例えば、対象のポリペプチドの全部または一部をコードする配列）を意味する。導入遺伝子は、部分的または全体的に異種、すなわち、導入されるトランスジェニック動物または細胞に対して外来性であってもよい。導入遺伝子は、例えばイントロンまたはプロモーターなどの一つ以上の転写制御配列と、任意の他の核酸とを含む場合があり、それらは選択された核酸配列の発現に必要になり得る。導入遺伝子は、導入遺伝子を取り込んだ子孫（例えば、細胞）のその後の選択を可能にする一つ以上の選択マーカーを含み得る。
【０１５３】
トランスジェニック動物、トランスジェニック非ヒト動物、またはＴｇ＋：本明細書において交換可能に使用され、任意の非天然非ヒト動物を意味し、非ヒト動物の細胞の一つ以上が、対象のポリペプチドの全部または一部をコードする、異種核酸および／または遺伝子を含有している。
【０１５４】
一部の実施形態では、異種核酸配列および／または遺伝子は、例えばマイクロインジェクションを用いるか、または組み換えウイルスによる感染を用いるなどの計画的な遺伝子操作を介した前駆細胞への導入によって、直接的または間接的に細胞内に導入される。遺伝子操作という用語は、伝統的な交配技術を含めずに、むしろ組み換えＤＮＡ分子の導入を対象にするものである。この分子は、染色体内に組み込まれてもよく、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。用語「Ｔｇ＋」には、異種核酸および／もしくは遺伝子に対してヘテロ接合性もしくはホモ接合性である動物、ならびに／または異種核酸および／または遺伝子の単一コピーもしくは多コピーを有する動物が含まれる。
【０１５５】
ベクター：核酸分子であって、それが会合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。
【０１５６】
一部の実施形態では、ベクターは、染色体外複製ならびに／または、真核および／もしくは原核細胞などの宿主細胞中でそれらが結合している核酸の発現能力がある。作動可能に結合された遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【０１５７】
野生型：（変異、罹患、改変された状態または状況などと対照をなす）「正常」な状態または状況で自然界に存在する構造および／または活性を有する実体を意味する、当技術分野で公知の意味を有する。当業者であれば、野生型の遺伝子およびポリペプチドは複数の異なる形態（例えば、アレル）で存在することが多いことを理解するであろう。
【０１５８】
本発明の他の特徴、目的および利益は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明で明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明のいくつかの実施形態を示しているが、それらは例示の目的で提示されているものであり、限定を目的として提示されていないことを理解されたい。本発明の範囲内のさまざまな変更および修正は、詳細説明から当業者には明らかとなるであろう。
【０１５９】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、とりわけ、ヒト免疫グロブリンの一つ以上の部分（機能的フラグメント、結合部分など）をコードする異種遺伝物質を有するトランスジェニックまたは操作された非ヒト動物を提供し、その異種遺伝物質は、異種遺伝物質が、重鎖定常（ＣＨ）遺伝子と作動可能に結合されるように、免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座に挿入される。かかる非ヒト動物は、再構成されたＶ（ＤＤ）Ｊ配列によりコードされる抗体を生成する能力を示すことが意図されている。かかる非ヒト動物が、野生型免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座（または自然界で出現する免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座）から生成された免疫グロブリン重鎖可変ＣＤＲ３多様性を有する抗体集団と比較して、ＣＤＲ３多様性が増加した重鎖可変領域によって特徴付けられる抗体集団を示すことも意図されている。したがって、提供される非ヒト動物は、特定の抗原、特に、従来（または野生型）の抗体により結合が好ましくない一つ以上のエピトープにより特徴付けられる、低いおよび／または乏しい免疫原性または抗原に結合する、抗体ベースの治療の開発に特に有用である。特に、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域におけるＤＨ領域の一つ以上のＤＨセグメント（例えば、５’または３’）に隣接する２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列の導入、これにより、ＶＤＪ組み換え中にＤＨとＤＨセグメントの再構成の能力をもたらし、および単一のＤＨセグメントを含むＶＤＪ組み換えから生成された抗体と比較して、より長いアミノ酸長により特徴付けられ得る、重鎖可変領域、特に、ＣＤＲ３領域を有する抗体の発現を包含する。こうしたトランスジェニック非ヒト動物は、確立されている創薬技術の標的能を超えて疾患標的を結合させる抗体および／または抗体ベースの治療薬を特定し、開発するためのインビボシステムを提供する。さらに、こうしたトランスジェニック非ヒト動物は、ヒトに影響を及ぼす種々の疾患および／または疾患病状の中核をなすタンパク質−タンパク質相互作用を破壊することに重点を置くか、または破壊するように設計された、抗体および／または抗体ベースの治療薬の開発に有用な動物モデル系を提供する。
【０１６０】
図１の上部パネルに示されるように、免疫グロブリン遺伝子セグメント間の組み換えは、１２／２３規則と一般的に呼ばれる規則に従い、組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）が隣接した遺伝子セグメントは、順序付けられたプロセスによって結合される。各ＲＳＳは、コード配列（例えば、ＶＨ、ＤＨまたはＪＨセグメント）と連続する七つのヌクレオチド（ヘプタマー；５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’；配列番号１４４）の保存されたブロック、続いて長さ１２ｂｐまたは２３ｂｐのいずれかであるスペーサーとして知られた、保存されていない領域、および９つのヌクレオチド（ノナーマー；５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣ−３’；配列番号１４５）の第２の保存されたブロックからなる。スペーサーは、配列が変動し得るが、その保存された長さは、ＤＮＡ二重らせんの１または２回転に相当する。これにより、ヘプタマー配列およびノナーマー配列はＤＮＡヘリックスの同じ側に移動し、組み換えを触媒するタンパク質の複合体に結合することができる。２３ｂｐスペーサーを含むＲＳＳは、２３ｍｅｒのＲＳＳであり、１２ｂｐのスペーサーを含むＲＳＳは、１２ｍｅｒのＲＳＳである。例外が報告されているが、組換えの１２／２３規則は一般に、１２ｍｅｒのＲＳＳと２３ｍｅｒのＲＳＳの間の組み換えを促進し、２３ｍｅｒのＲＳＳと別の２３ｍｅｒのＲＳＳの間の組み換え、または１２ｍｅｒのＲＳＳと別の１２ｍｅｒのＲＳＳの間の組換えを阻止し、例えば、直接的な生殖系列ＶＨと生殖系列ＪＨ組み換え（すなわち、２３ｍｅｒと２３ｍｅｒの結合）または生殖系列ＤＨと生殖系列ＤＨ組み換え（すなわち、１２ｍｅｒと１２ｍｅｒの結合）を阻止する。
【０１６１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、各々が、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合され、したがって、ＤＨ−ＤＨ組み換え能力がある、一つ以上のＤＨセグメントの存在により特徴付けられる、操作された多様性クラスター（すなわち、操作されたＤＨ領域）を含有する免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、かかる組み換えから生成されたＣＤＲ３を含有する抗体は、特定の抗原（例えば、ウイルス、膜チャネルなど）への直接結合を指示する、より長いアミノ酸長から生じる増大した多様性を有することにより特徴付けられ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ＶＤＪ組み換えが、当該ＶＨ、ＪＨと一つより多くのＤＨセグメントの間で生じて、対象の抗原に結合する重鎖可変領域を作るように、操作されたＤＨ領域と作動可能に結合された、ヒト重鎖可変（ＶＨ）および結合（ＪＨ）遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域は、参照免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座と比較して、増大した頻度でＤＨとＤＨ組み換えを可能にする（または促進する）よう操作された、一つ以上（例えば、１、２、３、４、５、１０またはそれ以上）のヒトＤＨセグメントを含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、非ヒト動物のゲノム内の免疫グロブリン重鎖可変領域で、２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）に作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントに作動可能に結合された複数のＶＨとＪＨ遺伝子セグメントを含む。多くの実施形態では、ＶＨおよびＪＨセグメントは、ヒトＶＨおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントである。
【０１６２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、非ヒト動物が、ヒト可変領域（すなわち、重鎖および軽鎖）ならびに非ヒト定常領域を含む抗体を産生するように、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（例えば、κおよび／またはλ）をさらに含む。一部の実施形態では、当該ヒトまたはヒト化免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、げっ歯類軽鎖定常領域（例えば、げっ歯類ＣκまたはＣλ）に作動可能に結合されたヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、米国特許第９，７９６，７８８号；第９，９６９，８１４号；米国特許公開第２０１１／０１９５４５４Ａ１号、第２０１２／００２１４０９Ａ１号、第２０１２／０１９２３００Ａ１号、第２０１３／００４５４９２Ａ１号、第２０１３／０１８５８２１Ａ１号、第２０１３／０３０２８３６Ａ１号、第２０１８／０１２５０４３号；国際特許出願公開第２０１１／０９７６０３号、第２０１２／１４８８７３号、第２０１３／１３４２６３号、第２０１３／１８４７６１号、第２０１４／１６０１７９号、第２０１４／１６０２０２号、および第２０１９／１１３０６５号（その各々が、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。
【０１６３】
本発明の様々な態様が以下のセクションに詳細に記載される。セクションの使用は、本明細書に記載の実施形態を制限することを意図しない。各セクションは、本明細書に記載の任意の態様または実施形態に適用することができる。本出願では、特に指定のない限り、「または」の使用は、「および／または」を意味する。
【０１６４】
ＶＤＪ組み換え
免疫グロブリン合成に関与する遺伝子は、動物の全ての細胞において見出され、染色体に沿って順次位置する、遺伝子セグメントに配置される。遺伝するヒト遺伝子セグメントの構成、例えば、ヒト遺伝子セグメントの生殖系列配置、例えば、ヒトの生殖系列ゲノム（例えば、次世代に受け継がれるゲノム）におけるヒト遺伝子セグメントの順序は、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１８，１００−１１６（２００１）において見いだされ、それはその全体が参照により本明細書に組込まれ、生殖系列配置においてヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座内で見出される機能的遺伝子セグメントおよび偽遺伝子も示す。いくつかの遺伝子成分が関与する、一連の組み換え現象は、遺伝子セグメント（例えば、Ｖ、ＤおよびＪ）の順序付けられた配列から免疫グロブリンをアセンブルするのを助ける。遺伝子セグメントのこのアセンブリは、不正確であるとして知られ、それ故に、免疫グロブリン多様性は、異なる遺伝子セグメントの組み合わせ、および不正確な結合を通じた固有の結合の形成の両方により達成される。さらに、多様性は、免疫グロブリンの可変領域配列が、抗原に対する親和性および特異性を増加させるよう改変されている、体細胞超変異として知られるプロセスを通して生成される。免疫グロブリン分子は、二つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖とから構成されるＹ字型のポリペプチドであり、その各々は、二つの構造成分、一つの可変ドメインおよび一つの定常ドメインを有する。それは、遺伝子セグメントのアセンブリによって形成される重鎖および軽鎖の可変ドメインである一方、定常ドメインは、ＲＮＡスプライシングを通じて可変ドメインに融合される。遺伝子セグメントをアセンブル（または結合）する機序は、重鎖および軽鎖について類似するが、１回の結合現象のみが、軽鎖（すなわち、ＶからＪ）に必要となる一方、２回の現象が、重鎖に必要となる（すなわち、ＤからＪおよびＶからＤＪ）。
【０１６５】
重鎖および軽鎖可変領域についての遺伝子セグメントのアセンブリ（それぞれ、ＶＤＪ組み換えおよびＶＪ組み換えとして言及される）は、Ｖ、ＤおよびＪコード配列と比べ正確な位置でＤＮＡ再構成を確実にする、組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）と呼ばれる、各遺伝子セグメントに隣接する保存された非コードＤＮＡ配列により誘導される（例えば、Ｒａｍｓｄｅｎ，Ｄ．Ａ．ら、１９９４年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１０）：１７８５〜９６を参照のこと；その全体が参照により本明細書に組込まれる）。当業者によって理解される重鎖遺伝子セグメントのＶＤＪ組み換えに関与する配列の代表的な概略図が、図１に記載される。各ＲＳＳは、コード配列（例えば、Ｖ、ＤまたはＪセグメント）、続いてスペーサー（１２ｂｐまたは２３ｂｐのいずれか）と連続する７個のヌクレオチド（ヘプタマー）の保存されたブロック、および９個のヌクレオチド（ノナマー）の第２の保存されたブロックからなる。個体間で１２ｂｐまたは２３ｂｐのスペーサーにおいて相当な配列相違が許容されるが、これらの配列の長さは、典型的には変動しない。免疫グロブリン遺伝子セグメント間の組み換えは、一般的に１２／２３ルールとして言及されるルールに従い、ここで、１２ｂｐのスペーサー（または１２ｍｅｒ）を有するＲＳＳが隣接した遺伝子セグメントは、２３ｂｐのスペーサー（あるいは２３ｍｅｒ、例えば、全体が参照により本明細書に組込まれる、Ｈｉｏｍ，Ｋ．ａｎｄ  Ｍ．Ｇｅｌｌｅｒｔ、１９９８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．、１（７）：１０１１〜９を参照のこと）が隣接した遺伝子セグメントと典型的に結合する。ＲＳＳの配列は、特定の遺伝子セグメントとの組み換えの効率および／または頻度に影響を及ぼすと報告されている（例えば、Ｒａｍｓｄｅｎ，Ｄ．ＡおよびＧ．Ｅ．Ｗｕ、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：１０７２１〜５；Ｂｏｕｂｎｏｖ，Ｎ．Ｖ．ら、１９９５年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３：１０６０〜７；Ｅｚｅｋｉｅｌ，Ｕ．Ｒ．ら、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：３８１〜９；Ｓａｄｏｆｓｋｙ，Ｍ．ら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２１９３〜９；Ｃｕｏｍｏ，Ｃ．Ａ．ら、１９９６年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１６：５６８３〜９０；Ｒａｍｓｄｅｎ，Ｄ．Ａ．ら、１９９６年、ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：３１９７〜３２０６を参照のこと；その各々が、その全体が参照により本明細書に組込まれる）。実際に、多数の報告で、遺伝子セグメント特に、ＤＨセグメントの使用は個体間で極めて偏りがあり変動することが指摘されている。別段の指示がない限り、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかである場合を除き、ＲＳＳを参照することなく、再構成されていない遺伝子セグメントは、遺伝子セグメントが自然に関連している、例えば、隣接している、場合により、作動可能に結合されているなどの二つのＲＳＳを含むと推定される。一部の実施形態では、本明細書における再構成されていない遺伝子セグメントは、各々、両方の端で２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、その生殖系列（例えば、野生型）構成の遺伝子セグメント、例えば、生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントおよび��殖系列ＪＨ遺伝子セグメントを含んでもよい。対照的に、生殖系列のＤＨ遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、各々の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する。
【０１６６】
したがって、再構成されていない遺伝子セグメントはまた、かかる生殖系列配置と関連する任意のＲＳＳを含む、その生殖系列配置の遺伝子セグメントを指す。さらに、その生殖系列配置における複数の遺伝子セグメントは、概して、その生殖系列（例えば、再構成されていない）構成の各々の個々の遺伝子セグメントだけでなく、機能的遺伝子セグメントの順序および／または位置も指す。例えば、ヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの生殖系列配置について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．−Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．、１８、１００〜１１６（２００１年）を参照のこと。
【０１６７】
重鎖および軽鎖可変領域を形成するための遺伝子セグメントのアセンブルにより、免疫グロブリンの抗原結合領域（または部位）の形成がもたらされる。かかる抗原結合領域は、部分的に、一般的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域の存在によって特徴付けられる。重鎖と軽鎖の両方について３個のＣＤＲ（すなわち、計６個のＣＤＲ）があり、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の両方がＶ遺伝子セグメントによって完全にコードされている。しかしながら、ＣＤＲ３は、軽鎖について、ＶとＪセグメントの結合から生じる配列によってコードされ、重鎖について、Ｖ、ＤとＪセグメントの結合から生じる配列によってコードされる。したがって、組み換えの間に、重鎖可変領域コード配列を形成するために利用される追加の遺伝子セグメントにより、重鎖の抗原結合部位の多様性が有意に増加する。したがって、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含有する提供される非ヒト動物は、ＤＨからＤＨへの組み換えにより特徴付けられるＣＤＲ３多様性を生じ、従来のＶＤＪ組み換えにより生成される重鎖可変領域のＣＤＲ３領域と比較して、増長したアミノ酸長を有する。
【０１６８】
理論により結び付けられないが、重鎖ＣＤＲ３レパートリーのさらなる多様性は、再構成された重鎖可変領域遺伝子配列を形成する結合の数の増加、および／またはＣＤＲ３領域の長さの増長を通じて可能であり得ると考えられる。結合の数を増加させる、および／またはＣＤＲ３領域の長さを増長させる一つの機構は、ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ遺伝子配列を導く、続くＤＨ−ＪＨとＶ−ＤＨＪＨ組み換えに先立つ、ＤＨ−ＤＨ組み換え現象において、第１のＤＨセグメント（ＤＨ「Ａ」と一般的に言及され得る）の別のＤＨセグメント（ＤＨ「Ｂ」と一般的に言及され得る）への結合を通じてであり得る。天然では、ＤＨ−ＤＨ組み換え現象は、１２／２３規則によって阻止されると長い間考えられていた（Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、１９８４年、ＥＭＢＯ  Ｊ．３（６）：１２０９〜１９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、ＤＨ−ＤＨ組み換え現象が、１２／２３規則（８００のうち１  または約０．１２５％のナイーブＢ細胞；例えば、Ｏｌｌｉｅｒ，Ｐ．Ｊ．ら、１９８５年、ＥＭＢＯ  Ｊ．４（１３Ｂ）：３６８１〜８８；Ｍｉｌｎｅｒ，Ｅ．Ｃ．Ｂ．ら、１９８６年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ７：３６〜４０；Ｌｉｕ，Ｚ．ら、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５（１１）：４６８８；Ｌｉｕ，Ｚ．ら、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５（１５）：６２９６；Ｍｅｅｋ，Ｋ．Ｄ．ら、１９８９年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９（２）：５１９〜３３；Ｍｅｅｋ，Ｋ．Ｄ．ら、１９８９年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：３９〜５７；Ｂａｓｋｉｎ，Ｂ．ら、１９９８年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１２：４４〜７；Ｂｒｉｎｅｙ，Ｂ．Ｓ．ら、２０１２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：５６〜６４を参照のこと；その各々が、その全体が参照により本明細書に組込まれる）に反してヒトにおいて非常に低い頻度で生じ、いくつかの重鎖において観察される異常に長いＣＤＲ３を生成する主要な機構であると考えられる（Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．、第９編、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ、Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ．、第５章、２０１７年；その全体が参照により取り込まれる）ことが明らかになった。しかしながら、いくつかの可能性のある治療標的（例えば、非限定的に、ウイルス、細胞表面受容体、ＧＰＣＲのようなＩＶ型膜貫通型タンパク質、イオンチャネル）は、正常な抗体にはアクセスできないが、長いＨＣＤＲ３配列を有する抗体によって認識され得るエピトープをマスクするか、またはへこませる。例えば、非常に長いＨＣＤＲ３を有する抗体は、慢性ウイルス感染症を有する患者においてしばしば見出され、ある場合では、広範な中和活性を有する（例えば、ＨＩＶ−１またはインフルエンザに対する広範な中和抗体）。これらの隠れたエピトープに達する能力がある抗体を選択するために、非常に長いＨＣＤＲ３を有する重鎖の頻度を増加させることが有用である。理論に結び付けられることは望まないが、これを達成する一つの方法は、２３ｍｅｒのＲＳＳを含み、ＤＨ遺伝子セグメントのより長いＪＨ６遺伝子セグメントへの組み換えの頻度を増加させるようＤＨセグ��ントを操作することにより、重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ再構成の頻度を増加させることである。マウスでは、ＤＨ−ＪＨ結合は、二つの順序付けられたステップ：（１）近位ＤＱ５２セグメント（ヒトではＤＨ７−２７として言及される）の最も近いＪＨセグメント（ＪＨ１またはＪＨ２）の一つへの一次再構成で生じると考えられる。次に、ＤＱ５２の上流の強力なμ０プロモーターにより、残りのＪＨセグメント（ＪＨ３およびＪＨ４）が組み換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）によりアクセスしやすくなり；（２）遠位ＤＨセグメントの残りのＪＨセグメント（ＪＨ３またはＪＨ４）の一つへの第２の再構成。図１の上部パネルを参照のこと。これは、マウス（ＪＨ３−ＪＨ４）とヒト（ＪＨ４−ＪＨ６）の両方で観察される下流ＪＨセグメントのより頻繁な使用と一致する（Ｎｉｔｓｃｈｋｅら、２００１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６：２５４０〜５２、その全体が参照により本明細書に組込まれる）。理論に結び付けられることは望まないが、ＤＨ７−２７およびＪＨ１−ＪＨ３（またはＪＨ１−ＪＨ５）の、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳおよび３’の１２ｍｅｒのＲＳＳを有する合成ＤＨ遺伝子（例えば、合成ＤＨ３−３セグメント）での置換は、高い頻度のＶＨ（ＤＨ−ＤＨ）ＪＨ組み換えをもたらし、３ステップの機構によって生じ得ると仮定される：（１）２３（ＤＨ）ＪＨを生じるための、ＪＨ４、ＪＨ５、またはＪＨ６への２３−ＤＨ−１２再構成、（２）１２（ＤＨ−ＤＨ）ＪＨを生じるための、遠位ＤＨ（ＤＨ１−１〜ＤＨ１−２６）の２３（ＤＨ）ＪＨへの再構成（２３（ＤＨ）ＪＨへのＶＨ再構成は、１２／２３規則によって妨げられる）、（３）免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするＶＤＤＪコード配列を生じるための、ＶＨの１２（ＤＨ−ＤＨ）ＪＨへの再構成。例えば、図１の下部パネルを参照のこと。また、長いＨＣＤＲ３領域（例えば、Ｗａｎｇら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  １５３：１３７９〜９３を参照、その全体が参照により本明細書に組込まれる）を安定化させると考えられるジスルフィド結合を形成することができる長いＤＨ遺伝子セグメント（形成する二つのシステインをコードする３１個より長いヌクレオチドを含む）であるＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントの、それぞれ、５’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳおよび３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたそれらの遺伝子セグメントでの置換はまた、三つのステップの機構：  （１）１２（ＤＨ）ＪＨを生じるための、ＪＨ４、ＪＨ５、またはＪＨ６への１２：ＤＨ−１２再構成、（２）１２（ＤＨ−ＤＨ）ＪＨを生じるための、遠位１２：ＤＨ２−２：２３、１２：ＤＨ２−８：２３、または１２：ＤＨ２−１５−２３の１２（ＤＨ）ＪＨへの再構成、および（３）免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするＶＤＤＪコーディング配列を生じるための、ＶＨの１２（ＤＨ−ＤＨ）ＪＨへの再構成により生じ得る高頻度のＶＨ（ＤＨ−ＤＨ）ＪＨ組み換えを生じるとも仮定される。本明細書に記載される通り、操作されたＤＨ領域は、一つ以上のＤＨセグメントに隣接する５’または３’の隣接位置のいずれかに２３ｍｅｒのスペーサーを配置することによって構築��れ、これにより、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座におけるＤＨからＤＨへの組み換えが可能になる。
【０１６９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、参照非ヒト動物と比較して、１２／２３規則に従っていないＶＤＪ組み換えを示す免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、野生型ＤＨセグメントと比較して、修飾された一つ以上のＤＨセグメントに隣接した、または隣接している一つ以上のＲＳＳを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変領域の一つ以上のＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ−ＤＨ組み換えの頻度が、参照非ヒト動物と比較して、非ヒト動物において増加するように、各々、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳのいずれかに作動可能に結合される。組み換え効率および／または頻度は、一部の実施形態では、抗体配列の集団（例えば、個体または個体の群由来）における遺伝子セグメントの使用頻度により決定され得る（例えば、Ａｒｎａｏｕｔ，Ｒ．ら、２０１１年、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（８）：ｅ２２３６５；Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ，Ｊ．ら、２０１１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０８（５０）：２００６６〜７１を参照のこと、その全体が参照により本明細書に組込まれる）。したがって、本明細書に記載の非ヒト動物は、一部の実施形態では、ＤＨ−ＤＨ組み換えが、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、増加した頻度で生じるように、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された、または隣接した一つ以上のＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類は、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、少なくとも３倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類は、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、少なくとも４倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類は、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、少なくとも５倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類は、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、少なくとも１０倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類は、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、少なくとも２０倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類は、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、少なくとも３０倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類は、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、少なくとも４０倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含むげっ歯類は、参照非ヒト動物におけるＤＨ−ＤＨ組み換えと比較して、少なくとも５０倍増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを示す。
【０１７０】
提供されるインビボシステム
本発明は、特定の抗原は、低いおよび／または乏しい免疫原性と関連し、故に、抗体ベースの治療のための不十分な標的であるという認識に基づく。実際に、多数の疾患標的（例えば、ウイルス、チャンネルタンパク質）は、難治性であるか、または新薬の開発にはつながらないと特徴付けられてきた。したがって、本発明は、確立された薬物開発テクノロジーおよび／またはアプローチに付随する課題を克服する抗体および抗体ベースの治療を開発するためのインビボシステムの作製に基づく。一部の実施形態では、本発明は、一つ以上のＤＨ  ＲＳＳが、１２ｍｅｒのＤＨ−１２ｍｅｒのフォーマットから１２ｍｅｒのＤＨ−２３ｍｅｒまたは２３ｍｅｒのＤＨ−１２ｍｅｒのフォーマットに変更されるか、修飾されるか、または操作さ、これにより、参照インビボシステムで観察されるＤＨからＤＨへの組み換えと比較して、増加した頻度でのＤＨからＤＨへの組み換えを可能にする、操作されたＤＨ領域を含む、免疫グロブリン遺伝子座、特に、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座の存在により特徴付けられるインビボシステムを提供する。本開示は、ゲノムが、操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むトランスジェニックげっ歯類の構築を具体的に示し、その操作されたＤＨ領域は、増加した頻度のＤＨ−ＤＨ組み換えを可能にする一つ以上のＤＨセグメントの各々と比べて位置しる２３ｍｅｒのＲＳＳに各々作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含む。本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を生成するために、各々が５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された任意の数のＤＨセグメント（例えば、従来または合成）を達成するように合わせることができる。操作されたＤＨ領域は、一度、免疫グロブリン重鎖可変領域に統合される（すなわち、ＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントならびに／または一つ以上の定常領域と作動可能に結合して配置される）と、例えば、特定の抗原への結合を指示するための加えられた多様性を有する重鎖（すなわち、長いＣＤＲ３、例えば、重鎖ＣＤＲ３配列の少なくとも９５％は、少なくとも１４アミノ酸長である）により特徴付けられる抗体を生成するための、ＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの一つより多いＤＨセグメントとの組み換えを提供する。一部の実施形態では、かかる重鎖可変領域は、ウイルス、チャンネルタンパク質、ＧＰＣＲなどの届きにくいエピトープにアクセスする能力を有する。
【０１７１】
任意の特定の理論により結び付けられることを望まないが、本発明者らは、本明細書において提供されるデータが、一部の実施形態では、ゲノムが、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨの包含により特徴付けられる操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含むげっ歯類は、Ｖ（ＤＤ）Ｊ組み換えにより産生される抗体を効率的に生成することを示すことに気付いた。本発明者らは、本明細書において提供されるデータが、一部の実施形態では、ゲノムが、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのＤＨの包含により特徴付けられる操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含むげっ歯類は、Ｖ（ＤＤ）Ｊ組み換えにより産生される抗体を効率的に生成することを示すことにも気付いた。ＪＨ６遺伝子セグメントの上流のいくつかまたは全五つのＪＨ遺伝子セグメントの欠失が、ＪＨ６遺伝子セグメントへの優先的な組み換えをもたらすことも、本明細書において示される。特に、ＪＨ６遺伝子セグメントは、６３個のヌクレオチド、例えば、それぞれ、５２、５３、５０、４０、および５１個のヌクレオチドを含む、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、およびＪＨ５遺伝子セグメント以外の１０個のヌクレオチドを含む。したがって、本開示は、少なくとも一部の実施形態では、例えば、再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列、例えば、少なくとも２０アミノ酸長のＣＤＲ３、例えば、２０〜３０アミノ酸長のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインをコードする、ＶＨＤＨＪＨおよびＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ、例えば、ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ６配列を生成するげっ歯類を提供することにより、難治性疾患標的に対する抗体および／または抗体ベースの治療を生成するためのインビボシステムの開発を包含する。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列、例えば、ＶＨＤＨＪＨおよびＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ遺伝子配列の少なくとも８〜１０％は、少なくとも２１アミノ酸長のＣＤＲ３領域をコードする。
【０１７２】
一部の実施形態では、（１）その生殖系列ゲノム、例えば、生殖系列細胞で、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座、および（２）その体細胞ゲノム、例えば、Ｂ細胞で、再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を含む、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスが、本明細書において記載され、第１または第２のＤＨ遺伝子セグメント（すなわち、それぞれ、ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列のＤＨＡまたはＤＨＢ）は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、またはその一部を含み、例えば、第１または第２のＤＨ遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントと共に整列している少なくとも９個の連続ヌクレオチドを有し、第１および第２のＤＨ遺伝子セグメントの各々は、任意のオーバーラップの無関係な対応する生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントと共に整列している少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、生殖系列配置で構成された複数のヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの存在により特徴付けられる、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域、エンハンサーおよび制御領域に作動可能に結合された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、一つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合された一つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、少なくともヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ３−７４、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７２、ＶＨ２−７０、ＶＨ１−６９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−６４、ＶＨ４−６１、ＶＨ４−５９、ＶＨ１−５８、ＶＨ３−５３、ＶＨ５−５１、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−４８、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−４５、ＶＨ３−４３、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−３４、ＶＨ３−３３、ＶＨ４−３１、ＶＨ３−３０、ＶＨ４−２８、ＶＨ２−２６、ＶＨ１−２４、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２０、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−９、ＶＨ１−８、ＶＨ３−７、ＶＨ２−５、ＶＨ７−４−１、ＶＨ４−４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−２およびＶＨ６−１を含む。
【０１７５】
一部のある実施形態では、提供された非ヒト動物は、ヒトＤＨ遺伝子セグメントＤＨ１−１、ＤＨ２−２、ＤＨ３−３、ＤＨ４−４、ＤＨ５−５、ＤＨ６−６、ＤＨ１−７、ＤＨ２−８、ＤＨ３−９、ＤＨ３−１０、ＤＨ５−１２、ＤＨ６−１３、ＤＨ２−１５、ＤＨ３−１６、ＤＨ４−１７、ＤＨ５−１８、ＤＨ６−１９、ＤＨ１−２０、ＤＨ２−２１、ＤＨ３−２２、ＤＨ６−２５およびＤＨ１−２６を含む。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、ＤＨ１−１４、ＤＨ４−１１、ＤＨ４−２３、ＤＨ５−２４、またはその組み合わせをさらに含む。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、ヒトＤＨ７−２７をさらに含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、（１）その生殖系列ゲノム、例えば、生殖系列細胞で、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントを含む操作されたＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座、および（２）その体細胞ゲノム、例えば、Ｂ細胞で、再構成された重鎖ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列を含む、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスが、本明細書において記載され、第１または第２のＤＨ遺伝子セグメント（すなわち、それぞれ、ＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨコード配列のＤＨＡまたはＤＨＢ）は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメント、またはその一部を含み、例えば、第１または第２のＤＨ遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨ遺伝子セグメントと共に整列している少なくとも９個の連続ヌクレオチドを有し、第１および第２のＤＨ遺伝子セグメントの各々は、任意のオーバーラップの無関係な、対応する生殖系列ＤＨ  遺伝子セグメントと共に整列している少なくとも５個の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、二つのシステインコドンを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも３７個のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも１９個のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも２３個のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも２８個のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも３１個のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも３７個のヌクレオチドを含有する。
【０１７７】
一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ１遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ４遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ５遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ６遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ７遺伝子セグメントを含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２−２遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−３遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ４−４遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ５−５遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ６−６遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ１−７遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２−８遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−９遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−１０遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ５−１２遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ６−１３遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２−１５遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−１６遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ４−１７遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ５−１８遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ６−１９遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ１−２０遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ２−２１遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ３−２２遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ６−２５遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ１−２６遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ１−１４遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ４−１１遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ４−２３遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ５−２４遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ７−２７遺伝子セグメントを含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、再構成されていないヒトゲノム可変遺伝子座に見られる順序で一般的に配置されたヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全または実質的に完全なレパートリーを含み、完全または実質的に完全なレパートリーのヒトＤＨ遺伝子セグメントの一つが、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作されたＤＨ遺伝子セグメントで置換される。一部の実施形態では、完全または実質的に完全なレパートリーのヒトＤＨ遺伝子セグメントの一つは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作された対応するＤＨ遺伝子セグメントで置換され、例えば、野生型ＤＨ２−２遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作されたＤＨ２−２遺伝子セグメントで置換される。一部の実施形態では、完全または実質的に完全なレパートリーのヒトＤＨ遺伝子セグメントの一つは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作された別のＤＨ遺伝子セグメントで置換され、例えば、野生型ＤＨ７−２７遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作されたＤＨ３−３遺伝子セグメントで置換される。一部の実施形態では、再構成されていないヒトゲノム可変遺伝子座に見られる順序で一般的に配置されたヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全または実質的に完全なレパートリーのＤＨ１−１遺伝子セグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳ、例えば、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作された対応するまたは別のＤＨ遺伝子セグメントで置換される。一部の実施形態では、再構成されていないヒトゲノム可変遺伝子座に見られる順序で一般的に配置されたヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全または実質的に完全なレパートリーのＤＨ１−１、ＤＨ２−２、ＤＨ２−８、ＤＨ２−１５、ＤＨ２−２１遺伝子セグメントまたはその任意の組み合わせは、２３ｍｅｒのＲＳＳ、例えば、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作された対応するまたは別のＤＨ遺伝子セグメントで置換される。一部の実施形態では、再構成されていないヒトゲノム可変遺伝子座に見られる順序で一般的に配置されたヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全または実質的に完全なレパートリーのＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントの各々は、２３ｍｅｒのＲＳＳ、例えば、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう操作された対応するまたは別のＤＨ遺伝子セグメントで置換される。
【０１８０】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、少なくともヒトＪＨ遺伝子セグメントＪＨ６を含む。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、少なくともヒトＪＨ遺伝子セグメントＪＨ４、ＪＨ５およびＪＨ６を含む。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、ヒトＪＨ遺伝子セグメントＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５およびＪＨ６を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域は、例えば、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）および免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）などの一つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域は、げっ歯類ＩｇＭ、げっ歯類ＩｇＤ、げっ歯類ＩｇＧ３、げっ歯類ＩｇＧ１、げっ歯類ＩｇＧ２ｂ、げっ歯類ＩｇＧ２ａ、げっ歯類ＩｇＥおよびげっ歯類ＩｇＡ定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態では、当該ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖エンハンサー（すなわちエンハンサー配列またはエンハンサー領域）に作動可能に結合される。一部の実施形態では、当該ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖制御領域（または制御配列）に作動可能に結合される。一部の実施形態では、当該ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖エンハンサー（またはエンハンサー配列）および一つ以上の非ヒト免疫グロブリン制御領域（または制御配列）に作動可能に結合される。
【０１８２】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、内在性Ａｄａｍ６遺伝子を含有しない（または欠く）。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、同種の野生型非ヒト動物の生殖系列ゲノムに見られるのと同じ生殖系列ゲノム位置に内在性Ａｄａｍ６遺伝子（またはＡｄａｍ６コード配列）を含有しないか、または欠く。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子を含有しないか、または欠く。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、一つ以上の非ヒト（例えば、げっ歯類）Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列の挿入を含む。当該挿入は、非ヒト動物、細胞または組織の生殖系列ゲノム中の操作された免疫グロブリン重鎖遺伝子座または別の場所（例えば無作為に導入された非ヒトＡｄａｍ６コード配列）内の、本明細書に記載の操作された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の外側（例えば最も５’のＶＨ遺伝子セグメントの上流）であってもよい。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、機能的内在性Ａｄａｍ６偽遺伝子を含有しないか、または欠く。
【０１８３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される提供される非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、抗体分子中に内在性非ヒトＶＨ領域を、全体または部分で、検出可能に発現しない。一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、抗体分子中に内在性非ヒトＶＨ領域（例えば、ＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ）を、全体または部分でコードする一つ以上のヌクレオチド配列を含有しない（または欠く、もしくは欠失を含有する）。一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、内在性非ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの欠失を、全体または部分で含む生殖系列ゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、繁殖可能である。
【０１８４】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、生殖系列構造中に配置され、非ヒトＣκ遺伝子セグメントの上流に挿入され、かつ作動可能に結合された複数のヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの存在により特徴付けられる免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座をさらに含む。一部のある実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の近位可変クラスター（または近位アーム、もしくは近位重複）に出現する少なくともヒトＶκ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、少なくともヒトＶκ遺伝子セグメントＶκ２−４０、Ｖκ１−３９、Ｖκ１−３３、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−８、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２４、Ｖκ６−２１、Ｖκ３−２０、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−１６、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１２、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−９、Ｖκ１−８、Ｖκ１−６、Ｖκ１−５、Ｖκ５−２およびＶκ４−１を含む。一部の実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、Ｖκ２−４０、Ｖκ１−３９、Ｖκ１−３３、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−８、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２４、Ｖκ６−２１、Ｖκ３−２０、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−１６、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１２、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−９、Ｖκ１−８、Ｖκ１−６、Ｖκ１−５、Ｖκ５−２およびＶκ４−１から選択される少なくとも１、２、３、４、５、１０、または１５個のヒトＶκ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、ヒトＪκ遺伝子セグメントＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５を含む。一部の実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５から選択される少なくとも１、２、３、または４個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。
【０１８５】
多くの実施形態では、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー（すなわち、エンハンサー配列またはエンハンサー領域）に作動可能に結合される。一部の実施形態では、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、マウスＩｇκ軽鎖イントロンエンハンサー領域（Ｉｇκ  ＥｉまたはＥｉκ）に作動可能に結合される。一部の実施形態では、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖制御領域（または制御配列）に作動可能に結合される。一部の実施形態では、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、マウスＩｇκ軽鎖３’エンハンサー領域（Ｉｇκ３’Ｅｉまたは３’Ｅｉκ）に作動可能に結合される。一部の実施形態では、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、マウスＥｉκに作動可能に結合され、マウス３’Ｅκに作動可能に結合される。一部の実施形態では、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー（またはエンハンサー配列もしくはエンハンサー領域）および一つ以上の非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖制御領域（または制御配列）に作動可能に結合される。一部の実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、野生型免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に出現する同じ非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）を含有する。一部の実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、異なる種（例えば、異なるげっ歯類種）の野生型免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に出現する非ヒトＩｇκ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）を含有する。
【０１８６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、ヒトＶｐｒｅＢ遺伝子（またはヒトＶｐｒｅＢ遺伝子コード配列）を含有しない（すなわち、欠く）。
【０１８７】
一部の実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の非ヒトＣκ遺伝子は、例えば、マウスＣκ遺伝子またはラットＣκ遺伝子などのげっ歯類Ｃκ遺伝子を含む。一部の実施形態では、操作された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の非ヒトＣκ遺伝子は、１２９系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、混合１２９ｘＣ５７ＢＬ／６系統またはその組み合わせを含む遺伝的背景に由来するマウスＣκ遺伝子であるか、またはそれを含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、抗体分子中に内在性非ヒトＶκ領域を、全体または部分で検出可能に発現しない。一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、抗体分子中に内因性非ヒトＶκ領域を、全体または部分でコードする一つ以上のヌクレオチド配列を含有しない（または欠く、またはその欠失を含有する）。一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、内在性非ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの欠失を、全体または部分で含む生殖系列ゲノムを有する。
【０１８９】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、野生型または不活性化（例えば、遺伝子ターゲティングによる）免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座をさらに含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、抗体分子中に内在性非ヒトＶλ領域を、全体または部分で検出可能に発現しない。一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、抗体分子中に内因性非ヒトＶλ領域を、全体または部分でコードする一つ以上のヌクレオチド配列を含有しない（または欠く、またはその欠失を含有する）。一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、内在性非ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの欠失を、全体または部分で含む生殖系列ゲノムを有する。一部の実施形態では、本明細書に記載の提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、内在性非ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントの欠失を、全体または部分で含む生殖系列ゲノムとして。
【０１９１】
かかる操作された免疫グロブリン遺伝子座を有するターゲティングベクター、非ヒト細胞および動物の生成のガイダンスは、米国特許第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、第９，００６，５１１号、第９，０１２，７１７号、第９，０２９，６２８号、第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１５０，６６２号および第９，１６３，０９２号において見ることができ、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、非ヒト（例えば、哺乳類）ゲノムのかかる遺伝子操作および／もしくは操作を成し遂げる、または非ヒト動物の生殖系列ゲノムに導入するためのかかる配列を操作する、当該技術分野において公知の、様々なテクノロジーを認識する。
【０１９２】
ＤＮＡ構築物
多くの場合、本明細書に記載の免疫グロブリン遺伝子セグメントを含有するポリヌクレオチド分子、特に、各々が、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントは、適当な宿主細胞においてポリヌクレオチド分子を複製するために、ベクター、好ましくは、ＤＮＡベクターに挿入される。
【０１９３】
サイズによって、ＤＨセグメントは、市販の供給源から入手可能なゲノム供給源から直接クローニングされ得るか、またはＧｅｎＢａｎｋから入手可能な公開配列に基きインシリコで設計され得る。或いは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーは、免疫グロブリン配列を提供することができる。ＢＡＣライブラリーは、１００〜１５０ｋｂの平均挿入サイズを含有し、３００ｋｂもの大きさの挿入を保有し得る（Ｓｈｉｚｕｙａら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８９：８７９４〜８７９７；Ｓｗｉａｔｅｋら、１９９３年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７：２０７１〜２０８４；Ｋｉｍら、１９９６年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３４  ２１３〜２１８、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。例えば、ヒトおよびマウスゲノムＢＡＣライブラリーが構築されており、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）。ゲノムＢＡＣライブラリーは、免疫グロブリン配列ならびに転写制御領域の供給源として利用することもできる。
【０１９４】
あるいは、免疫グロブリン配列は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）から単離、クローニング、および／または移転させてもよい。免疫グロブリン遺伝子座全体、またはその実質的な部分は、クローン化され、一つまたは数個のＹＡＣ内に含有され得る。複数のＹＡＣが使用され、重複相同性の領域を含有する場合、それらは、酵母宿主株内で再結合されて、遺伝子座全体を提示する単一構築物を産生することができる。ＹＡＣアームは、当技術分野に公知の方法および／または本明細書に記載の方法により、構築物を胚性幹細胞または胚に導入することにより、哺乳類選択カセットでさらに修飾することができる。
【０１９５】
ＤＮＡ構築物は、当技術分野に公知の方法を使用して調製することができる。例えば、ＤＮＡ構築物は、大きなプラスミドの一部として調製することができる。かかる調製により、当技術分野で公知の効率的な方法で正しい構築物のクローニングおよび選択が可能になる。本明細書に記載の５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに各々作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含有するＤＮＡフラグメントは、それらが、所望の動物への組み込みのため残りのプラスミド配列から容易に単離され得るように、プラスミド上の便利な制限酵素部位の間に位置することができる。
【０１９６】
一部の実施形態では、プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において使用される方法は、当技術分野において公知である。原核細胞と真核細胞の両方に適した他の発現システム、ならびに一般的な組み換え法に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２編、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９年を参照；その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０１９７】
非ヒト動物の産生
非ヒト動物のゲノム中の免疫グロブリン重鎖可変領域内でＤＨとＤＨ組み換えを可能にする一つ以上のＤＨセグメントに隣接する２３ｍｅｒのＲＳＳの統合から生じる長いアミノ酸長によって特徴付けられる、重鎖ＣＤＲ３多様性を有する抗体を発現する非ヒト動物が、提供される。本明細書に記載の適当な例には、げっ歯類、特に、マウスが含まれる。一つ以上のＤＨセグメントは、多くの実施形態では、異種ＤＨセグメント（例えば、ヒトＤＨセグメント）を含む。野生型または参照非ヒト動物と比較して、増加した頻度でＤＨとＤＨ組み換えが可能な当該ＤＨセグメントを含有する非ヒト動物、非ヒト胚および細胞を作製するための非ヒト動物、胚、細胞およびターゲティング構築物も提供される。
【０１９８】
一部の実施形態では、一つ以上のＤＨセグメントは、非ヒト動物のゲノム中の免疫グロブリン重鎖可変領域の多様性クラスター（すなわち、ＤＨ領域）内の５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに隣接する（または作動可能に結合される）ように修飾される。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域のＤＨ領域（またはその一部）は、欠失されていない（すなわち、インタクトである）。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域のＤＨ領域（またはその一部分）は、各々、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントで変更、破壊、欠失、操作、または置換される。一部の実施形態では、ＤＨ領域の全てまたは実質的に全てが、各々、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上の合成ＤＨセグメントで置換され、一部の実施形態では、一つ以上の従来のＤＨ遺伝子セグメントは、免疫グロブリン重鎖可変領域のＤＨ領域で欠失も置換もされていない。一部の実施形態では、ＤＨ領域は、従来のＤＨセグメント（すなわち、各々、５’の１２ｍｅｒのＲＳＳおよび３’の１２ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメント）と操作されたＤＨ遺伝子セグメント（すなわち、各々５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメント）の両方を含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＨ領域は、合成ＤＨ領域である。一部の実施形態では、ＤＨ領域は、ヒトＤＨ領域である。一部の実施形態では、ＤＨ領域は、マウスＤＨ領域である。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域（またはその一部）は、当該操作されたＤＨ領域（またはその一部）が、一つ以上のＶＨ遺伝子セグメントおよび／または一つ以上のＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に結合されるように、免疫グロブリン重鎖可変領域に挿入される。一部の実施形態では、当該操作されたＤＨ領域は、免疫グロブリン重鎖可変領域の二つのコピーの一つに挿入され、当該操作されたＤＨ領域に関してヘテロ接合性の非ヒト動物を生じさせる。一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域に対してホモ接合性の非ヒト動物が、提供される。一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域に対してヘテロ接合性の非ヒト動物が、提供される。
【０１９９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、各々、そのゲノム内で５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含有するＤＨ領域を含む、ランダムに統合されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含有する。したがって、かかる非ヒト動物は、操作されたＤＨ領域を含有するするヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子を有するとして記載され得る。操作されたＤＨ領域は、例えば、ＰＣＲ、ウェスタンブロット、サザンブロット、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、またはアレル（ＧＯＡ）の獲得もしくはアレル（ＬＯＡ）の喪失アッセイを含む、様々な方法を使用して検出することができる。一部のかかる実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域に対してヘミ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域の一つ以上のコピーを含有する。
【０２００】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の操作されたＤＨ領域は、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する（または作動可能に結合される）少なくとも一つのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の操作されたＤＨ領域は、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する（または作動可能に結合される）少なくとも一つのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の操作されたＤＨ領域は、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する（または作動可能に結合される）少なくともヒトＤＨ３−３セグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の操作されたＤＨ領域は、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する（または作動可能に結合される）少なくともヒトＤＨ２セグメントを含み、ヒトＤＨ２セグメントは、ヒトＤＨ２−２、ヒトＤＨ２−８、ヒトＤＨ２−１５およびヒトＤＨ２−２１からなる群から選択される。
【０２０１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の操作されたＤＨ領域は、各々、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する（または作動可能に結合される）一つより多くのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の操作されたＤＨ領域は、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する（または作動可能に結合される）一つより多くのＤＨセグメントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の操作されたＤＨ領域は、各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する（または作動可能に結合される）ヒトＤＨ２−２、ヒトＤＨ２−８、およびヒトＤＨ２−１５セグメントを含む。
【０２０２】
一つ以上の非ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に結合されたヒトＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座由来の一つより多くのＤＨセグメントによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む抗体を発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法を含む、ゲノムが、操作されたＤＨを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む非ヒト動物を作製するための組成物および方法であって、操作されたＤＨ領域は、各々、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する（または作動可能に結合された）一つ以上のＤＨセグメントを含む、組成物および方法が提供される。一部の実施形態では、かかる抗体を内在性エンハンサーおよび／または内在性制御配列の制御下で発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供される。一部の実施形態では、かかる抗体を異種エンハンサーおよび／または異種制御配列の制御下で発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供される。方法は、Ｖ（ＤＤ）Ｊ組み換えから生じる免疫グロブリン重鎖を含む抗体が発現されるように、非ヒト動物のゲノムにおいて、一つ以上のＤＨセグメント、および野生型ＤＨセグメントと比較して、増加した頻度でＤＨとＤＨ組み換えを可能にする他の配列を挿入する工程を含む。
【０２０３】
一部の実施形態では、方法は、一つ以上のＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に結合された５’の２３ｍｅｒのＲＳＳおよび３’の１２ｍｅｒのＲＳＳを有するＤＨ遺伝子セグメントを含むＤＮＡを挿入する工程を含む。本明細書に記載される通り、ＤＨ遺伝子セグメントは、μ０プロモーター配列の下流に位置する。一部の実施形態では、方法は、当該ＪＨ遺伝子セグメントが、組み換え中にＲＡＧ遺伝子（例えば、ＲＡＧ−１および／またはＲＡＧ−２）にアクセス可能であるように、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳおよび３’の１２ｍｅｒのＲＳＳを有するＤＨセグメントを、μ０プロモーター配列と関連する位置に挿入する工程を含む。上述されたＤＨセグメントおよび隣接ＲＳＳを含む遺伝物質は、非ヒト動物のゲノムに挿入され、これにより、隣接するＤＨ遺伝子セグメントならびにＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントとの組み換えを可能にするために当該ＤＨセグメントおよび必須のＲＳＳを含有する操作されたＤＨ領域を有する非ヒト動物を生成し得る。
【０２０４】
一部の実施形態では、方法は、各々、六つのＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に結合された５’の１２ｍｅｒのＲＳＳおよび３’の２３ｍｅｒのＲＳＳを有する三つのＤＨ遺伝子セグメントを含むＤＮＡを挿入する工程を含む。本明細書に記載される通り、ＤＨ遺伝子セグメントは、各々、５’および３’の１２ｍｅｒのＲＳＳと関連する複数のＤＨ遺伝子セグメント内に位置する。一部の実施形態では、方法は、各々、５’の１２ｍｅｒのＲＳＳおよび３’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連するＤＨ２−２、ＤＨ２−８およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントを、各々、従来または野生型ＲＳＳと関連する複数の他のＤＨ遺伝子セグメントを有する多様性クラスター内に挿入する工程を含む。上述されたＤＨ遺伝子セグメントおよび隣接ＲＳＳを含む遺伝物質は、非ヒト動物のゲノムに挿入され、これにより、隣接するＤＨ遺伝子セグメントならびにＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントとの組み換えを可能にするために当該ＤＨセグメントおよび必須のＲＳＳを含有する操作されたＤＨ領域を有する非ヒト動物を生成し得る。
【０２０５】
適切な場合、ＤＨセグメントに対応する（またはコードする）配列は、非ヒト動物における発現のため最適化されているコドンを含むように修飾されてもよい（例えば、米国特許第５，６７０，３５６号および第５，８７４，３０４号を参照、その各々は、その全体が参照により組み込まれる）。コドン最適化配列は、合成配列であり、好ましくは、非コドン最適化親ポリヌクレオチドによりコードされる同一ポリペプチド（または完全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する完全長ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント）をコードする。一部の実施形態では、ＤＨセグメントに対応する（またはコードする）配列は、特定の細胞タイプ（例えば、げっ歯類細胞）のためコドン利用を最適化するよう変更した配列を含み得る。例えば、非ヒト動物（例えば、げっ歯類）のゲノムに挿入されるべきＤＨセグメントに対応する配列のコドンは、非ヒト動物の細胞における発現のため最適化されてもよい。かかる配列は、コドン最適化配列として記載されてもよい。
【０２０６】
５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨセグメントのＤＨ領域への挿入は、当該ＤＨセグメントが、ＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメント（例えば、複数のＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメント）に作動可能に結合されるように、比較的少ないゲノム修飾を利用し、より長いアミノ酸長を有するＣＤＲ３により特徴付けられる重鎖を含む抗体の発現をもたらす。
【０２０７】
ノックアウトおよびノックインを含む、トランスジェニック非ヒト動物を生成する方法は、当技術分野に周知である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、（２０００年）を参照；その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。例えば、トランスジェニックげっ歯類の生成は、場合により、一つ以上の内在性げっ歯類遺伝子（または遺伝子セグメント）の遺伝子座の破壊および一部の実施形態では、内在性げっ歯類遺伝子（または遺伝子セグメント）と同じ位置での、げっ歯類ゲノムへの各々２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合される一つ以上のＤＨセグメントの導入を含んでもよい。一部の実施形態では、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントは、げっ歯類のゲノム内のランダムに挿入された免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨ領域に導入される。一部の実施形態では、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントは、げっ歯類のゲノムにおける内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨ領域に導入され、一部の実施形態では、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、一つ以上の定常領域遺伝子（例えば、ヒトまたはマウス）に作動可能に結合されたヒト遺伝子セグメント（例えば、Ｖおよび／またはＪ）を含有するよう変更されるか、修飾されるか、または操作される。
【０２０８】
ゲノムが、多様性クラスターが、各々、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含む、操作された多様性クラスター（すなわち、ＤＨ領域）を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、げっ歯類を生成するための、操作されたＤＨ領域を構築するための代表的なターゲティングベクターおよびげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞への統合の略図（ノンスケール）が、図２において提供される。げっ歯類ＥＳ細胞のゲノム中の免疫グロブリン重鎖可変領域へのかかるベクターの挿入するための典型的なストラテジーおよび方法は、図３〜８において提供される。図２〜８の各々において、示されているＮｏｔＩ制限酵素認識部位は適切であり、様々なプライマー／プローブセット（表４を参照）の名称およびおよその位置（点線）は、示された様々なアレルについて示され（ノンスケール）、特に明記されない限り、塗りつぶされていない記号および線は、ヒト配列を表し、塗りつぶされた記号および黒色の腺は、マウス配列を表す。以下の略語が、図の各々について使用される、ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン耐性遺伝子；ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子；ｈｙｇ：ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｌｐ：ｌｏｘＰ部位特異的組み換え認識部位；Ｅｉ：マウス重鎖イントロンエンハンサー；ＩｇＭ：マウス免疫グロブリンＭ定常領域遺伝子；Ｌ：ｌｏｘＰ部位配列；Ｆｒｔ：フリッパーゼ認識標的配列；μ０ｐｒｏ：μ０プロモーター配列。
【０２０９】
図２において説明される通り、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つのＤＨセグメントを有する（図２、上および中）および各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された三つのセグメントＤＨを有する（図２、下）複数のＤＨセグメントを含有するＤＮＡフラグメントは、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）テクノロジー（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２〜６５９；その全体が参照により本明細書に取り込まれる）および当該技術分野において公知の分子生物学的技術を使用して作製される。図２において、特に示されない限り、塗りつぶされていない記号および線は、ヒト配列を表し、一方、塗りつぶされた記号および黒色の線は、マウス配列を表す。ヒトＶＨ６−１、ＤＨ２−２、ＤＨ２−８、ＤＨ２−１５、ＤＨ３−３、およびＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５およびＪＨ６遺伝子セグメントのノンスケールの相対的位置は、存在し、名称のない残りの任意の遺伝子セグメントが、ＤＨ遺伝子セグメントであるとき、示される。一般に、点線で示されるＤＨ領域は、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含み（例えば、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｅｃｔｉｏｎ＝ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ＆ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ＝ｌｏｃｕｓ＆ｓｐｅｃｉｅｓ＝ｈｕｍａｎ＆ｇｒｏｕｐ＝ＩＧＨを参照；その全体が参照により本明細書に取り込まれる）、以下の例外：上の二つのターゲティングベクターは、５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳおよび３’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接するＤＨ３−３遺伝子セグメントを含む配列により置換されている、最後のＤＨ７−２７遺伝子を欠き（塗りつぶされていない矢印として示される）；下のターゲティングベクターは、５’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳおよび３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接するＤＨ２−２遺伝子セグメント、５’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳおよび３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接するＤＨ２−８遺伝子セグメント、および５’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳおよび３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接するＤＨ２−１５遺伝子セグメントにより置換されている、再構成されていないヒトＤＨ２−２遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＤＨ２−８遺伝子セグメント、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントを欠く（操作されたＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントの各々は、塗りつぶされていない矢印として示される）、を伴う。塗りつぶされていない棒グラフは、ターゲティングベクター／ＥＳ細胞の正しい修飾を請け負うのを助けるための１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターに位置するプライマーおよびプローブ配列に相同な固有の人工４０ｍｅｒの位置を表す。「１」、「２」、「１０」、「１６」、「８」、および「１８」として示される固有の人工４０ｍｅｒの配列は、それぞれ、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、および配列番号７８として記載される。
【０２１０】
ＤＮＡフラグメントは、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座への正確な標的化挿入のための相同アームとアセンブリされる（図３、５、７）。部位特異的組み換え認識部位（例えば、ｌｏｘＰ）に隣接した選択カセット（例えば、ネオマイシン）は、ＥＳ細胞クローンへの適切な挿入のスクリーニングを促進するためターゲティングベクターに含まれ、陽性ＥＳ細胞クローン中のリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）の一過性発現によって除去され得る（図４、６、８）。ＤＮＡフラグメントは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座に一旦統合されると、重鎖可変領域の正しいアセンブリ（すなわち、組み換え）、転写および発現に必須の配列を含む。ターゲティングベクターは、操作されたＤＨ領域が、５’でヒトＶＨゲノムＤＮＡが、３’でヒトＪＨゲノムＤＮＡおよび非ヒト（例えば、げっ歯類）ゲノム重鎖定常領域ＤＮＡ（例えば、イントロンエンハンサーおよびＩｇＭ定常領域遺伝子）が隣接するように、設計される。非ヒト細胞（例えば、げっ歯類胚性幹細胞）のゲノムへの組み込み用の最終的なターゲティングベクターは、ＶＨゲノムＤＮＡ（例えば、一つ以上のＶＨ遺伝子セグメントを含有する）、操作されたＤＨ領域、３’ＪＨゲノムＤＮＡ、および非ヒト（例えば、げっ歯類）ゲノム重鎖定常領域ＤＮＡを含有し、これらの全てが、一旦非ヒト動物のゲノムに組み込まれると、ＶＨ遺伝子セグメント、操作されたＤＨ領域とＪＨ遺伝子セグメントの間での組み換えが可能にするように作動可能に結合される。一旦アセンブリされると、ターゲティングベクターは、直線にされ、げっ歯類ＥＳ細胞にエレクトロポレーションされる。
【０２１１】
ターゲティングベクターは、ターゲティングベクターに含有される配列（すなわち、操作されたＤＨ領域）が、一つより多くのＤＨセグメントによりコードされるアミノ酸を有するＣＤＲ３を含有する抗体を発現する非ヒト細胞または非ヒト動物（例えば、マウス）の能力を生じるように、げっ歯類（例えば、マウス）胚性幹細胞に導入される。
【０２１２】
本明細書に記載される通り、操作されたＤＨ領域が、げっ歯類ゲノムの免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、操作された内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり得る、ヒト可変領域遺伝子セグメントを含有するように操作された免疫グロブリン重鎖遺伝子座）に導入された、トランスジェニックげっ歯類が生成される。
【０２１３】
ヒト可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン遺伝子座は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，６３３，４２５号、第５，７７０，４２９号、第５，８１４，３１８号、第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号、第６，９９８，５１４号、第７，７９５，４９４号、第７，９１０，７９８号、第８，２３２，４４９号、第８，５０２，０１８号、第８，６９７，９４０号、第８，７０３，４８５号、第８，７５４，２８７号、第８，７９１，３２３号、第８，８０９，０５１号、第８，９０７，１５７号、第９，０３５，１２８号、第９，１４５，５８８号、第９，２０６，２６３号、第９，４４７，１７７号、第９，５５１，１２４号、第９，５８０，４９１号、および第９，４７５，５５９号、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、ならびに米国特許出願公開第２０１００１４６６４７号、第２０１１０１９５４５４号、第２０１３０１６７２５６号、第２０１３０２１９５３５号、第２０１３０３２６６４７号、第２０１３００９６２８７号、および第２０１５／０１１３６６８号、その各々が、その全体が参照により本明細書に取り込まれ、およびＰＣＴ出願公開第２００７１１７４１０号、第２００８１５１０８１号、第２００９１５７７７１号、第２０１００３９９００号、第２０１１００４１９２号、第２０１１１２３７０８号、および第２０１４０９３９０８号において見ることができ、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１４】
一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物は、マウスにおいて前駆Ｂ細胞において再構成することができる、操作されたＤＨ領域を含む内在性完全なヒト免疫グロブリン導入遺伝子を含む（Ａｌｔら、１９８５年、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １：２３１〜２３６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの実施形態では、操作されたＤＨ領域を含む完全なヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、（無作為に）挿入されてもよく、内在性免疫グロブリン遺伝子はまた、ノックアウトされてもよく（Ｇｒｅｅｎら、１９９４年、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＹＡＣｓ、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３〜２１；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７年、Ｆｒｏｍ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１１３４〜１１４３；その各々が、その全体が参照により取り込まれる）、例えば、内在性免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、例えば、各々の内在性遺伝子座の小さいが重要な部分の標的化された欠失、続いて無作為に統合された巨大な導入遺伝子、またはミニ染色体としてヒト免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活化される（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、２０００年、Ｄｏｕｂｌｅ  ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ  ｍｉｃｅ：ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｉ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：７２２〜７２７；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２１５】
一部の実施形態では、操作されたＤＨ領域を含むヒトまたはヒト化免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子座は、それぞれ、内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座にある。マウスが子孫を残す能力を維持しつつ、マウス生殖系列免疫グロブリン可変遺伝子座の、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変遺伝子座での大規模なインサイツ遺伝子置換方法は、既に報告されている。例えば、米国特許第６，５９６，５４１号および第８，６９７，９４０号を参照、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、マウスの定常領域をそのまま残しながら、マウス重鎖とκ軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座の両方の６個のメガ塩基の、それらのヒトカウンターパートとの正確な置換が記載されている。結果として、マウス定常領域を維持しながら、その生殖系列の免疫グロブリン可変レパートリー全体の、同等なヒト生殖系列の免疫グロブリン可変配列での正確な置換を有するマウスが生成された。ヒト可変領域を、マウス定常領域に結合して、再構成し、生理学的に適切なレベルで発現するキメラのヒトとマウスの免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現された抗体は、「逆キメラ」であり、すなわち、それらは、ヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。ヒトまたはヒト化可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現する、ヒト化免疫グロブリン可変領域を有するこれらのマウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと呼ばれる。
【０２１６】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、野生型マウスのものと本質的に識別不可能な完全な機能的液性免疫系を呈する。それらは、Ｂ細胞発生のすべての段階で正常な細胞集団を呈する。それらは、正常なリンパ器官形態を呈する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの抗体配列は、正常なＶ（Ｄ）Ｊ再構成および正常な体細胞超変異頻度を呈する。これらのマウスにおける抗体集団は、正常なクラススイッチ（例えば、正常なアイソタイプシス−スイッチ）から生じるアイソタイプ分布を反映する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを免疫することで、治療候補物質としての使用に適したヒト免疫グロブリン可変ドメインを有する大規模で多様な抗体レパートリーを生成する、安定的な液性免疫反応が生じる。このプラットフォームは、医薬的に許容可能な抗体および他の抗原結合タンパク質を作製するための天然アフィニティ成熟したヒト免疫グロブリン可変領域配列の豊富な供給源を提供する。単一の内在性ＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換は、ヒト化免疫グロブリン可変ドメインを含む免疫反応を生じ得ることも示された。例えば、Ｔｉｅｎら、（２０１６年）Ｃｅｌｌ  １６６：１４７１〜８４を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。マウス免疫グロブリン可変配列と、ヒト免疫グロブリン可変配列を正確に置換することによって、当該ヒト免疫グロブリン可変配列は、逆キメラの様式で内因性非ヒト定常領域遺伝子配列と動作可能に結合され、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスが作製される。
【０２１７】
逆キメラ様式で修飾されたマウスは、内在性免疫グロブリン遺伝子座で、内在性定常領域に作動可能に結合されたヒト（ヒト化）可変領域（例えば、（Ｄ）、Ｊ、および一つ以上のヒトＶ遺伝子セグメントを含む）を、例えば、
（ａ）内在性重鎖遺伝子座に：
（ｉ）内在性重鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域、再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域は、複数の再構成されていないヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的ヒト再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント）、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントを含む、
場合により、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントは、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的ヒトＤＨ遺伝子セグメント）および／または一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的ヒトＪＨ遺伝子セグメント）である、
（ｉｉ）内在性重鎖定常領域に作動可能に結合された拘束性の再構成されていないヒト（ヒト化）重鎖可変領域、拘束性の再構成されていないヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントと作動可能に結合された単一の再構成されていないヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメントから本質的になる、場合により、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントは、それぞれ、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび／または一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントである、
（ｉｉｉ）内在性重鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾された再構成されていないヒト（ヒト化）重鎖可変領域、ヒスチジン修飾された再構成されていないヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列において、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含む、
（ｉｖ）内在性重鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含む重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、内在性重鎖定常領域は、（１）軽鎖と関連するＩｇＭアイソタイプをコードするインタクトな内在性ＩｇＭ遺伝子、および（２）機能的ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く非ＩｇＭ遺伝子、例えばＩｇＧ遺伝子を含む、非ＩｇＭ遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるＣＨ１ドメインを欠く非ＩｇＭアイソタイプをコードする；
および／または
（ｂ）内在性軽鎖遺伝子座に：
（ｉ）内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域、再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、複数の再構成されていないヒト軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的ヒト再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメント）および一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントを含む、
場合により、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントは、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的ヒトＪＨＬ遺伝子セグメント）である、
場合により、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内在性免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）遺伝子座であり、再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変κ（Ｖκ）および結合κ（Ｊκ）遺伝子セグメントを含み、内在性軽鎖定常領域は、内在性κ鎖定常領域配列であり、および／または内在性免疫グロブリン軽鎖軽鎖遺伝子座は、内在性免疫グロブリン軽鎖ラムダ（λ）であり、再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変λ（Ｖλ）遺伝子セグメントおよび結合λ（Ｊλ）遺伝子セグメントを含み、内在性軽鎖定常領域は、内在性λ鎖定常領域配列であり、場合により、内在性免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座は、（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）およびげっ歯類免疫グロブリン軽鎖定常（Ｃλ）遺伝子セグメントに作動可能に結合され、内在性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座は、一つ以上のげっ歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）、および一つ以上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含み、場合により、三つのヒトＥλを含む、
（ｉｉ）内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されたヒト（ヒト化）軽鎖可変領域配列を含む共通軽鎖コード配列、再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントと再構成されたヒト軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子セグメントを含む、
（ｉｉｉ）内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された拘束性の再構成されていないヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、拘束性の再構成されていないヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントに作動可能に結合された二つ以下の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントを含む、
（ｉｖ）内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾再構成されていないヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、ヒスチジン修飾再構成されていないヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む；または
（ｖ）内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域、ヒスチジン修飾再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む、を含むように修飾されたマウスを含み、
場合により、マウスはさらに、
（ｉ）マウスは、非ヒト動物の野生型の生殖能力を呈するように、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖遺伝子座；および／または
（ｉｉ）場合により、再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％が、鋳型には無い付加を含むように、抗原受容体の多様性を増すために外来性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、
そのマウスは、既に記載されている。例えば、米国特許第８，６９７，９４０号、第８，７５４，２８７号、第９，２０４，６２４号、第９，３３４，３３４号、第９，８０１，３６２号、第９，３３２，７４２号、および第９，５１６，８６８号、米国特許出願公開第２０１１０１９５４５４号、第２０１２００２１４０９号、第２０１２０１９２３００号、第２０１３００４５４９２号、第２０１５０２８９４８９号、第２０１８０１２５０４３号、第２０１８０２４４８０４号、ＰＣＴ特許出願公開第２０１９／１１３０６５号、第２０１７２１０５８６号および第２０１１１６３３１４号、Ｌｅｅら、（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２：３５６を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
一部の実施形態では、本発明は、ゲノム、例えば、生系列ゲノムが、
ヒトＶＨ遺伝子セグメント、本発明のヒト操作されたＤＨ遺伝子領域、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内在性免疫グロブリン遺伝子座、免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に作動可能に結合され、および／または
ヒトＶＬ遺伝子セグメント、およびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内在性鎖遺伝子座、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に作動可能に結合される、を含む、遺伝子修飾された非ヒト動物を含む。
【０２１９】
一部の実施形態では、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスは、そのゲノムで、一つ以上のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントを有する内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座での一つ以上の内在性ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントの置換を含み、一つ以上のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたヒトＤＨ遺伝子セグメントを含み、例えば、内在性非ヒト軽鎖遺伝子座にて、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子；場合により、非ヒト、例えば、げっ歯類、例えば、マウスまたはラットに作動可能に結合された再構成されていないまたは再構成されたヒトＶＬおよびヒトＪＬセグメント、またはヒト免疫グロブリン軽鎖定常（ＣＬ）領域遺伝子に作動可能に結合される。
【０２２０】
特定の実施形態では、遺伝子修飾された非ヒト動物は、そのゲノム、例えば、生殖系列ゲノムにおいて操作されたＤＨ領域を含む一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域、および免疫グロブリン定常領域を含む免疫グロブリン定常領域を含有する免疫グロブリン遺伝子座（内在性または外来性）を含み、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に結合される。
【０２２１】
概して、遺伝子修飾免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン定常領域に作動可能に結合された免疫グロブリン可変領域（免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む）を含む。一部の実施形態では、遺伝子修飾免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖定常領域遺伝子に作動可能に結合された、操作されたＤＨ領域を含む、一つ以上のヒト再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子修飾免疫グロブリン遺伝子座は、κ鎖定常領域遺伝子に作動可能に結合されたヒト再構成されていない免疫グロブリン可変領域κ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子修飾免疫グロブリン遺伝子座は、κ鎖定常領域遺伝子に作動可能に結合されたヒト再構成されていない免疫グロブリン可変領域λ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子修飾免疫グロブリン遺伝子座は、λ鎖定常領域遺伝子に作動可能に結合されたヒト再構成されていない免疫グロブリン可変領域λ遺伝子セグメントを含む。
【０２２２】
特定の実施形態では、非ヒト動物は、内在性重鎖遺伝子座に、内在性重鎖定常領域に作動可能に結合された操作されたＤＨ領域を含む再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、免疫グロブリン可変領域は、一つ以上の再構成されていないヒトＩｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、一つ以上の再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、少なくとも一つのヒト免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）セグメント、一つ以上の免疫グロブリン重鎖多様性（ＤＨ）セグメント（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上の再構成されていないヒトＤＨセグメント）、および一つ以上の免疫グロブリン重鎖結合（ＪＨ）セグメント（場合により、一つ以上の再構成されていないヒトＪＨセグメント）を含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、複数の再構成されていないヒトＶＨセグメント、一つ以上の再構成されていない（ヒト）ＤＨセグメント（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上の再構成されていない（ヒト）ＤＨセグメント）および一つ以上の再構成されていない（ヒト）ＪＨセグメントを含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、少なくとも３個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１８個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも３０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも４０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも５０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも６０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも７０個のＶＨ遺伝子セグメント、または少なくとも８０個のＶＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ遺伝子セグメントは、機能的ヒトＤＨ遺伝子セグメントの全てを含み、機能的ヒトＤＨ遺伝子セグメントの少なくとも一つは、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう修飾される。一部の実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ遺伝子セグメントは、機能的ヒトＪＨ遺伝子セグメントの全てを含む。Ｉｇ重鎖遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１１：５１４７〜５２および補足情報において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
一部の実施形態では、本明細書において提供される非ヒト動物は、内在性重鎖遺伝子座で、少なくとも非ヒトＩｇＭ遺伝子を含む内在性重鎖定常領域に作動可能に結合された拘束性の再構成されていないヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含み、拘束性の再構成されていないヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、複数のＤＨ遺伝子セグメント（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上の再構成されていない（ヒト）ＤＨ遺伝子セグメントを含む、ヒトＤＨ遺伝子セグメント）および複数のＪＨ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＪＨ遺伝子セグメント）により特徴付けられ、拘束性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、複数の遠位再構成を再構成し、形成することができ、各々の再構成は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨセグメントの一つ、およびＪＨ  セグメントの一つからもたらされ、各々の再構成は、異なる重鎖可変ドメインをコードする（例えば、米国特許出願公開第２０１３００９６２８７号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２またはＶＨ１−６９である。
【０２２４】
特定の実施形態では、非ヒト動物は、内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域を内在性軽鎖座位で含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されていないヒトＩｇκ可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン可変領域は、複数の再構成されていないヒトＶκセグメントおよび一つ以上の再構成されていないヒトＪκセグメントを含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＪκセグメントの全てを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、４個の機能的Ｖκセグメントおよび全てのヒトＪκセグメントを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、１６個の機能的Ｖκセグメントおよび全てのヒトＪκセグメント（例えば、全ての機能的ヒトＶκセグメントおよびＪκセグメント）を含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＪＶκセグメントの全ておよび全てのヒトＪκセグメントを含む。Ｉｇκ遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １  １１：５１４７〜５２および補足情報において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２５】
一部の実施形態では、内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された拘束性の再構成されていないヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、再構成されていないヒト（ヒト化）軽鎖可変領域が、２個以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび複数のＪＬ遺伝子セグメントを含むという点で特徴付けられる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７９６，７８８号に記載される、デュアル軽鎖マウス、またはＤＬＣ）。一部の実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、ＩＧＫＶ３−２０およびＩＧＫＶ１−３９である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、厳密に、マウスの内在性κ軽鎖遺伝子座で、マウス軽鎖定常領域に作動可能に結合された２個の再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個の再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、場合により、厳密な２個の再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、５個の再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントは、ヒトＪκ１遺伝子セグメント、ヒトＪκ２遺伝子セグメント、ヒトＪκ３遺伝子セグメント、ヒトＪκ４遺伝子セグメント、およびヒトＪκ５遺伝子セグメントであり、再構成されていないヒトカッパ軽鎖遺伝子セグメントは、抗体のヒト可変ドメインを再構成し、コードする能力があり、場合により、非ヒト動物は、免疫グロブリン軽鎖可変領域を形成するよう再構成する能力を有する内在性Ｖκ遺伝子セグメントを含まない。
【０２２６】
特定の実施形態では、内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されていないヒトＩｇλ可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、複数のヒトＶλセグメントおよび一つ以上のヒトＪλセグメントを含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、一つ以上のヒトＶλセグメント、一つ以上のヒトＪλセグメント、および一つ以上のヒトＣλ定常領域配列を含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＶλセグメントの全てを含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＪλセグメントの全てを含む。Ｉｇλ遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、米国特許第  ９，０３５，１２８号および第６，９９８，５１４号において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）および内在性（例えば、げっ歯類）Ｃλ遺伝子セグメントに作動可能に結合され、内在性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座はさらに、一つ以上のげっ歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）、および一つ以上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含み、場合により、３個のヒトＥλを含む。
【０２２７】
特定の実施形態では、内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、非ヒト動物が、内在性κ定常ドメインと融合されたＶλおよびＪλ遺伝子セグメントに由来するヒトλ可変ドメイン配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するように、内在性（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子に作動可能に結合された再構成されていないヒトＩｇλ可変領域遺伝子セグメントを含み、例えば、米国特許第９，２２６，４８４号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
一部の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子間配列も含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、非ヒト（例えば、げっ歯類、ラット、マウス）Ｉｇ可変領域遺伝子間配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子間配列は、内在性の種起源の遺伝子間配列である。
【０２２９】
一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、再構成された軽鎖可変領域（一般的な軽鎖可変領域）である。一部の実施形態では、再構成されたＩｇ軽鎖可変領域遺伝子は、ヒト再構成Ｉｇ軽鎖可変領域遺伝子である。典型的な再構成されたＩｇ軽鎖可変領域は、例えば、米国特許第９，９６９，８１４号、第１０，１３０，１８１号、および第１０，１４３，１８６号、ならびに米国特許出願公開第２０１２００２１４０９号、第２０１２０１９２３００号、第２０１３００４５４９２号、第２０１３０１８５８２１号、第２０１３０３０２８３６号、および第２０１５０３１３１９３号において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、一般的な軽鎖可変領域を含む非ヒト生物（「一般的な軽鎖」生物）を使用して、二重特異性抗体が産生される。一部の実施形態では、共通軽鎖コード配列は、内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ／Ｊκ配列を含み、単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ／Ｊκ配列は、（ｉ）ヒトＪκ５遺伝子セグメントに融合されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含むヒトＶκ１−３９／Ｊκ５配列、または（ｉｉ）ヒトＪκ１遺伝子セグメントに融合されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含むヒトＶκ３−２０／Ｊκ１配列のいずれかである。
【０２３０】
一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、かかる非ヒト生物において生成される抗体へのｐＨ依存性の結合特性を導入するよう設計されたヒスチジンコドンの挿入および／または置換を含む、軽鎖および／または重鎖の免疫グロブリン可変領域である。かかる実施形態の一部では、ヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３をコードする核酸配列に挿入され、および／または置換される。様々なかかる軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン遺伝子座は、米国特許第９，３０１，５１０号、第９，３３４，３３４号、および第９，８０１，３６２号、ならびに米国特許出願公開２０１４００１３４５６において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、ヒトＶκおよびＪκセグメント配列を含む単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含み、場合により、Ｖκセグメント配列は、ヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメントからもたらされ、単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１およびその組み合わせ（ＩＭＧＴナンバリングに準拠）からなる群から選択された位置で発現される、Ｖκセグメント配列の少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換を含む。一部の実施形態では、内在性重鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾再構成されていないヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列（例えば、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されるよう修飾された（ヒト）ＤＨ遺伝子セグメント）において、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、再構成されていないヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、再構成されていないヒトＶＨ、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合されたＤＨセグメントを含む再構成されていないヒトＤＨまたは合成ＤＨ、および再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、場合により、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された、再構成されていないヒトＤＨまたは合成ＤＨ遺伝子セグメントまたはＤＨ遺伝子セグメントは、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンとの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む。一部の実施形態では、内在性重鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾再構成されていないヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、再構成されていないＶＬおよび再構成されていないＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒスチジン修飾再構成されていないヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、２個以下の再構成されていないヒトＶＬ（例えば、２個以下のＶκ遺伝子セグメント）および一つ以上の再構成されていないヒトＪＬ（例えば、Ｊκ）遺伝子セグメントを含み、２個以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントの各々は、ＣＤＲ３コード配列中に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換��または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む。一部の実施形態では、２個以下の再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントは、各々、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの１回以上の置換を含む、ヒトＶκ１−３９およびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、再構成を行う能力を有し、ヒトＶκおよびヒトＪκ遺伝子セグメントは、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１（ＩＧＭＴナンバリングに準拠）、およびその組み合わせからなる群から選択される位置で、一つ以上のヒスチジンを含むヒト軽鎖可変ドメインをコードし、一つ以上のヒスチジンは、一つ以上の置換からもたらされる。
【０２３１】
一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、内在性の種起源の重鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子またはラット定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、ヒトと非ヒトの配列の混合である。例えば、一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、ヒトＣＨ１領域ならびに非ヒト（例えば、内在性の種起源、マウス、ラット）のＣＨ２および／またはＣＨ３領域をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、Ｃμ、Ｃδ、Ｃγ（Ｃγｌ、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４）、ＣαまたはＣε定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、内在性定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、非ヒト動物が、重鎖のみの抗体を発現するように、変異ＣＨ１領域をコードする（例えば、米国特許第８，７５４，２８７号、米国特許出願公開第２０１５／０２８９４８９号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、（一般的またはデュアル軽鎖生物において）二重特異性抗体を作製するために重鎖を生成することが目的である、一部の実施形態では、重鎖のＦｃドメインは、重鎖ヘテロ二量体形成を促進し、および／または重鎖ホモ二量体形成を阻害するための修飾を含む。かかる修飾は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５，８２１，３３３号、第７，６４２，２２８号および第８，６７９，７８５号、ならびに米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、軽鎖定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、κ定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、λ定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、内在性の種起源の軽鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子またはラット定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、ヒトと非ヒト配列の混合である。
【０２３３】
一部の実施形態では、ヒト可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域、および可変領域遺伝子セグメントが作動可能に結合された免疫グロブリン定常領域遺伝子は、内在性免疫グロブリン遺伝子座に位置する。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリン遺伝子座は、内在性重鎖遺伝子座である。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリン遺伝子座は、内在性κ遺伝子座である。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリン遺伝子座は、内在性λ遺伝子座である。一部の実施形態では、ヒト可変領域遺伝子セグメントが作動可能に結合された定常領域遺伝子は、内在性定常領域遺伝子である。
【０２３４】
一部の実施形態では、本明細書において提供される非ヒト動物のゲノム中の内在性免疫グロブリン遺伝子座の一つ以上、または一つ以上の内在性遺伝子座の一部（例えば、可変領域および／または定常領域）は、不活化される。内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子剤およびその一部は、限定されないが、生物のゲノムから遺伝子座またはその一部の欠失、遺伝子座またはその一部の異なる核酸配列での置換、遺伝子座の一部の逆位、および／または遺伝子座の一部の非ヒト生物のゲノム中の別の位置への移動を含む、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して不活化され得る。一部の実施形態では、遺伝子座の不活化は、部分的な不活化のみである。一部の実施形態では、遺伝子座の可変領域は不活化されるが、定常領域は機能性を維持する（例えば、非内在性可変領域遺伝子セグメントに作動可能に結合されているためである）。
【０２３５】
一部の実施形態では、遺伝子修飾された非ヒト動物は、不活化された内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座座位を含む。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座またはその一部は、内在性重鎖遺伝子座の内在性可変領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位される内在性重鎖遺伝子座の可変領域の少なくとも一部は、可変領域のＪセグメントを含む。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座またはその一部は、内在性重鎖遺伝子座の内在性定常領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位にされる内在性重鎖遺伝子座の定常領域の少なくとも一部は、内在性定常領域のＯμ遺伝子を含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、遺伝子修飾された非ヒト動物は、不活化された内在性免疫グロブリンκ鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリンκ鎖遺伝子座またはその一部は、内在性κ鎖遺伝子座の内在性可変領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位にされる内在性κ鎖遺伝子座の可変領域の少なくとも一部は、可変領域のＪセグメントを含む。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリンκ鎖遺伝子座またはその一部は、内在性κ鎖座位の内在性定常領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位にされる内在性κ鎖遺伝子座の定常領域の少なくとも一部は、内在性定常領域のＣκ遺伝子を含む。
【０２３７】
一部の実施形態では、遺伝子修飾された非ヒト動物は、不活性化された内在性免疫グロブリンλ鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリンλ鎖遺伝子座またはその一部は、内在性λ鎖遺伝子座の内在性可変領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、内在性λ鎖遺伝子座中の少なくとも一つのＶ−Ｊ−Ｃ遺伝子クラスターの少なくとも一部が、欠失、置換、移動および／または逆位にされる。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリンλ鎖遺伝子座またはその一部は、内在性λ鎖遺伝子座の内在性定常領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位にされる内在性λ鎖遺伝子座の定常領域の少なくとも一部は、内在性定常領域のＣ遺伝子を含む。
【０２３８】
様々な実施形態では、免疫グロブリン遺伝子座修飾は、非ヒト動物の生殖能力に影響を与えない。一部の実施形態では、重鎖遺伝子座は、機能的な、例えば、内在性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方を含み、遺伝子修飾は、内在性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方の発現および／または機能に影響を与えない。一部の実施形態では、遺伝子修飾された非ヒト動物のゲノムはさらに、異所性に位置する機能的、例えば、内在性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。外来性のＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂを発現する典型的な非ヒト動物は、米国特許第  ８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号に記載され、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３９】
一部の実施形態では、遺伝子修飾された非ヒト動物はさらに、増加した抗原受容体多様性のため、外来性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、発現する。外来性ＴｄＴを発現する典型的な非ヒト動物は、ＰＣＴ特許出願公開第２０１７２１０５８６に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４０】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物のゲノムはさらに、一つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖遺伝子を含む（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号、米国特許第８，６４２，８３５号、米国特許第８，６９７，９４０号、米国特許第８，７９１，３２３号、および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８７Ａ１号および第２０１８／０１２５０４３Ａ１号、およびＰＣＴ出願公開第２０１９／１１３０６５号を参照、各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、操作されたＤＨ領域は、例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）株などの異なる修飾された下部の胚性幹細胞に導入され得る（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号または米国特許第８，６４２，８３５号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載のターゲティングベクターを、修飾された系統由来の細胞に導入することにより作製され得る。一例を挙げると、本明細書に記載のターゲティングベクターは、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号に記載される非ヒト動物に導入されてもよく、その全体が参照により本明細書に取り込まれ、非ヒト動物は、完全なヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現する。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子（可変領域遺伝子および／または定常領域遺伝子）をさらに含むように作製される。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域、および異種（例えば、ヒト）由来の遺伝物質を含み、遺伝物質は、一つ以上のヒト重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を、全体または部分でコードする。
【０２４１】
本明細書に記載の非ヒト動物は、多くの場合、非ヒト動物の意図される使用に応じて、追加のヒト遺伝子またはヒト化遺伝子を含むように、上述の通り、または当該技術分野において公知の方法を使用して調製され得る。かかる追加のヒトまたはヒト化遺伝子の遺伝物質は、上述の通り、または所望される他の遺伝子修飾された下部を用いて当該技術分野において公知の繁殖技術を通じて、遺伝子修飾を有する細胞（例えば、胚性幹細胞）のゲノムのさらなる改変を通じて導入され得る。
【０２４２】
例えば、本明細書に記載される通り、操作されたＤＨ領域を含む非ヒト動物は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、米国特許出願公開第２０１１−０１９５４５４  Ａ１号、第２０１２−００２１４０９  Ａ１号、第２０１２−０１９２３００  Ａ１号、第２０１３−００４５４９２  Ａ１号、第２０１３−０１８５８２１  Ａ１号、第２０１３−０１９８８８０  Ａ１号、第２０１３−０３０２８３６  Ａ１号、第２０１５−００５９００９  Ａ１号；国際特許出願公開第２０１１／０９７６０３号、第２０１２／１４８８７３号、第２０１３／１３４２６３号、第２０１３／１８４７６１号、第  ２０１４／１６０１７９号、第２０１４／１６０２０２号として記載される一つ以上の修飾（例えば、交雑または複数の遺伝子ターゲティング戦略を介して）さらに含む。
【０２４３】
トランスジェニック創始非ヒト動物は、そのゲノム中の操作されたＤＨ領域の存在および／または非ヒト動物の組織または細胞においてＤＨ−ＤＨ組み換えから生じるアミノ酸を含有するＣＤＲ３領域を含む抗体の発現に基づき同定することができる。次に、トランスジェニック創始非ヒト動物を使用して、操作されたＤＨ領域を有するさらなる非ヒト動物と交配させ、これにより、各々、１コピー以上の操作されたＤＨ領域を有する一連の非ヒト動物を生成することができる。さらに、操作されたＤＨ領域を有するトランスジェニック非ヒト動物を、所望される他の導入遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）を有する他のトランスジェニック非ヒト動物とさらに交配され得る。
【０２４４】
トランスジェニック非ヒト動物はまた、導入遺伝子の発現の制御または指示を可能にする選択されたシステムを含有するように生成されてもよい。典型的なシステムは、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（例えば、Ｌａｋｓｏ，Ｍ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２〜６２３６を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）および出芽酵母のＦＬＰ／Ｆｒｔリコンビナーゼシステム（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１〜１３５５ｍその全体が参照により本明細書に取り込まれる）を含む。かかる動物は、例えば、一方が選択された修飾（例えば、操作されたＤＨ領域）を含む導入遺伝子を含有し、他方がリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）をコードする導入遺伝子を含有する、２種のトランスジェニック動物を交配することによる、「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供することができる。
【０２４５】
マウス（すなわち、ヒトＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントと作動可能に結合され、その全てが、一つ以上のマウス重鎖定常領域遺伝子に作動可能に結合された、操作されたＤＨ領域を有するマウス）において、操作されたＤＨ領域を利用する実施形態が、本明細書で広範に論じられているが、操作されたＤＨ領域を含む他の非ヒト動物も提供される。一部の実施形態では、かかる非ヒト動物は、内在性ＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に結合された操作されたＤＨ領域を含む。一部の実施形態では、かかる非ヒト動物は、ヒト化ＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に結合された操作されたＤＨ領域を含む。かかる非ヒト動物は、例えば、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、未去勢オスウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などを含む、本明細書において開示される野生型免疫グロブリン重鎖遺伝子座と皮革して、増加した頻度でＤＨ−ＤＨ組み換えから生じるアミノン酸を含むＣＤＲ３を有する抗体を発現するよう遺伝子修飾され得る任意のものを含む。例えば、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が直ちに利用可能でない非ヒト動物について、他の方法を利用して、遺伝子修飾を含む非ヒト動物を作製する。かかる方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を修飾する工程、および体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を利用して、適当な細胞、例えば、除核卵母細胞に遺伝子修飾したゲノムを導入する工程、および修飾された細胞（例えば、修飾された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させる工程を含む。
【０２４６】
非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、雌牛、げっ歯類、ニワトリなど）の修飾方法は、、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＣａｓタンパク質（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を利用して、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域を含めるようゲノムを修飾する工程を含む。非ヒト動物の生殖系列ゲノムを修飾する方法の指針は、例えば、米国特許出願公開第２０１５−０３７６６２８Ａ１号、第２０１６−０１４５６４６Ａ１号、および第２０１６−０１７７３３９Ａ１号において見ることができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、哺乳類である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、小さな哺乳類、例えば、トビネズミ上科またはネズミ上科の小さな哺乳類である。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾された動物は、げっ歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載のげっ歯類は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載のげっ歯類は、ネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾動物は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、ならびにメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、および高原モグラネズミ）から選択される科由来である。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾げっ歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾マウスは、ネズミ科のメンバー由来である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、げっ歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載のげっ歯類は、マウスおよびラットから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、マウスである。
【０２４８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスであるげっ歯類である。一部の実施形態では、本発明のマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら、１９９９年、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．ら、２０００年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（５）：１０２４〜１０２８，１０３０，１０３２を参照；その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾マウスは、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統との混合である。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは、前述の１２９系統の混合、または前述のＢＬ／６系統の混合である。一部の実施形態では、本明細書に記載の混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統の混合である。
【０２４９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ラットである。一部の実施形態では、本明細書に記載のラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、フィッシャー系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載のラット系統は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２種以上の系統の混合である。
【０２５０】
方法
様々なインビトロ技術およびインビボ技術が、抗体ベースの治療薬を生み出すために開発されてきた。詳細には、インビボ技術は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を備えたトランスジェニック動物（すなわち、げっ歯類）であって、遺伝子が、動物のゲノムにランダムに組み込まれている（例えば、米国特許第５，５６９，８２５号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）か、または動物の内在性免疫グロブリン定常領域と作動可能に結合された内在性免疫グロブリン遺伝子座に寸分たがわずに配置されている、動物の生成を特徴としてきた（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、および第８，７９１，３２３号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。両方のアプローチは、ヒトへの使用に有望な抗体治療候補の生成に、よい結果をもたらしてきた。さらに、両方のアプローチは、インビボで生成された抗体レパートリーから抗体候補が選択されるという点で、インビトロアプローチよりも優れており、この選択には、宿主免疫システムの内部環境内での抗原に対する親和性および特異性の選択が含まれる。このように、抗体は、インビトロ技術に付随し得る人工環境またはインシリコ予測ではなく、自然提示された抗原に（関連する生物学的エピトープおよび表面内で）結合するものである。インビボ技術から得られる頑強な抗体レパートリーにも関わらず、複合体（例えば、ウイルス、チャンネルポリペプチド）または細胞質抗原に対する抗体は、依然として困難なままである。さらに、種（例えば、ヒトおよびマウス）間で高い程度の配列同一性を共有するポリペプチドに対する抗体を生成することも、免疫寛容に起因して課題のままである。
【０２５１】
したがって、本発明は、とりわけ、従来にはない遺伝子セグメント再構成（すなわち、ＤＨからＤＨへの組み換え）から生成される、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３の多様性を付加した抗体の産生により特徴付けられるインビボシステムの構築は、各々、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを使用して作製され得るという認識に基づく。５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳを有することにより、かかる操作されたＤＨ遺伝子セグメントを欠く免疫グロブリン重鎖遺伝子座と比較して、ＤＨセグメント間の組み換えは、増加する。かかる付加された多様性は、特定の抗原（例えば、ウイルス、チャンネルポリペプチド）への結合を指示することができる。ＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも二つのＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントの組み換え時に、ＤＨからＤＨへの組み換えから生じるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含有する重鎖可変領域コード配列が形成される。さらに、ＤＨからＤＨへの組み換えから生じるこのＣＤＲ３は、アミノ酸長の増加により、さらなる多様性を含有する。さらに、かかるＣＤＲ３領域は、従来のＶＤＪ組み換えによって生成された抗体によって結合することができない特定の抗原（またはエピトープ）への結合を指示する能力を有する。
【０２５２】
提供される非ヒト動物は、ヒト抗体を作製するのに利用され得、ヒト抗体は、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞の遺伝物質によってコードされる一つ以上の可変領域核酸配列由来の可変ドメインを含む。例えば、提供される非ヒト動物は、非ヒト動物が、対象の当該抗原への免疫反応を生じさせるのに十分な条件下および時間で、対象の抗原（例えば、ウイルスまたはチャンネルポリペプチド、全体または部分で）で免疫される。抗体は、非ヒト動物（または一つ以上の細胞、例えば、一つ以上のＢ細胞）から単離され、例えば、親和性、特異性、エピトープマッピング、リガンドと受容体の相互作用を阻害する能力、阻害受容体活性などを測定する、種々のアッセイを用いて特徴付けられる。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物によって産生される抗体は、非ヒト動物から単離された一つ以上のヒト可変領域ヌクレオチド配列からもたらされる一つ以上のヒト可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗薬物抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）が、提供される非ヒト動物において生じ得る。
【０２５３】
本明細書に記載の非ヒト動物は、様々なアッセイに有用なヒト抗体を産生するための、改良されたインビボシステムおよび生物学的物質（例えば、細胞）の供給源を提供する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のウイルスを標的にし、および／またはウイルス活性を調節し、および／または他の結合パートナー（例えば、細胞表面受容体）とのウイルス相互作用を調節する治療を開発する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のチャンネルタンパク質を標的にし、および／またはチャンネルタンパク質活性を調節し、および／または他の結合パートナーとのチャンネルタンパク質相互作用を調節する治療を開発する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のウイルス、チャンネルまたはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ポリペプチドに結合する候補治療薬（例えば、抗体、ｓｉＲＮＡなど）を同定し、スクリーニングし、および／または開発する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のウイルスポリペプチド、一つ以上のヒトチャンネルポリペプチドまたは一つ以上のヒトＧＰＣＲポリペプチドの活性を阻害する候補治療薬（例えば、抗体、ｓｉＲＮＡなど）をスクリーニングし、開発する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のＧＰＣＲポリペプチドまたは一つ以上のヒトチャンネルポリペプチドのアンタゴニストの結合特性を決定する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のヒトＧＰＣＲポリペプチドを結合するか、または一つ以上のヒトチャンネルポリペプチドを結合する一つ以上の候補治療抗体のエピトープまたは複数のエピトープを決定する。
【０２５４】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、抗体の薬物動態プロファイルを決定する。一部の実施形態では、一つ以上の提供される非ヒト動物および一つ以上の対照または参照の非ヒト動物が、各々、一つ以上の候補治療抗体に様々な用量（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｍｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上）で曝露される。候補治療薬抗体は、非経口および経口投与経路を含む、任意の望ましい投与経路を介して投与され得る。非経口経路は、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または他の経路の注入を含む。経口経路は、例えば、経口、経鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼を含む。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射、例えば、静脈内液体バックを使用によってもよい。血液は、非ヒト動物（ヒト化および対照）から、様々な時点（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、または最大３０日またはそれ以上の日数）で単離される。様々なアッセイは、総ＩｇＧ、抗治療抗体応答、凝集などを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載の非ヒト動物から取得された飼料を使用して、投与される候補治療抗体の薬物動態特性を決定してもよい。
【０２５５】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、標的抗原の活性を阻害または調節する治療効果、および細胞変化の結果としての遺伝子発現または本明細書に記載の非ヒト動物の細胞の標的抗原（細胞表面受容体の場合）の細胞表面密度に対する効果を測定する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物またはそれから単離された細胞は、対象の抗原に結合する候補治療薬に曝露され、続く期間の後、標的抗原依存性プロセス（または相互作用）、例えば、リガンドと受容体の相互作用または抗原関連シグナル伝達に対する効果について分析される。
【０２５６】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、チャンネル活性（またはチャンネルシグナル伝達、またはチャンネル介在性相互作用、またはチャンネル活動電位）を阻害または調節する効果、および細胞変化の結果としての遺伝子発現または本明細書に記載の非ヒト動物のチャンネル密度に対する治療効果を測定する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物またはそれから単離された細胞は、ヒトチャンネル（またはその一部）に結合する候補治療薬に曝露され、続く期間の後、チャンネル依存性プロセス（または相互作用）、例えば、リガンドと受容体の相互作用またはチャンネル活動電位に対する効果について分析される。
【０２５７】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、抗体を発現し、従って、細胞、細胞株、および細胞培養物は、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストの結合または機能についてアッセイするため、結合および機能アッセイにおける使用のための抗体の供給源として働くよう生成され得、アンタゴニストまたはアゴニストは、ヒトポリペプチド配列またはエピトープに特異的であるか、あるいは、リガンドと受容体の相互作用（結合）において機能するヒトポリペプチド配列またはエピトープに特異的である。一部の実施形態では、候補治療抗体またはｓｉＲＮＡにより結合されるエピトープは、提供される非ヒト動物から単離された細胞を使用して決定することができる。
【０２５８】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物由来の細胞は、場当たり的に単離され、使用され得るか、または多世代にわたって培養物中で維持され得る。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物由来の細胞は、（例えば、ウイルスの使用を介して）不死化され、培養物中（例えば、連続培養物中）で無期限に維持される。
【０２５９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒト対象抗原に結合する抗体バリアントの生成のためのインビボシステムを提供する。かかるバリアントは、二つ以上のヒト標的抗原により共有される共通のエピトープに対して所望される機能性、特異性、低い交差反応性を有する抗体を含む。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を利用して、所望または改善された機能性についてスクリーニングされる一連の抗体バリアントを生成するための抗体のパネルを生成する。
【０２６０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、抗体ライブラリーを生成するためのインビボシステムを提供する。かかるライブラリーは、所望のエフェクター機能に基づき異なるＦｃ領域に移植され、および／または当技術分野で公知の技術（例えば、部位特異的変異誘導、エラープローンＰＣＲなど）を使用して可変領域配列の親和性成熟の供給源として使用され得る、重鎖および軽鎖可変領域配列の供給源を提供する。
【０２６１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、薬物またはワクチンの分析および検査のためのインビボシステムを提供する。一部の実施形態では、候補薬物またはワクチンは、一つ以上の提供される非ヒト動物にデリバリーされ、続いて、薬物またはワクチンに対する免疫応答、薬物またはワクチンの安全特性、あるいは疾患もしくは状態および／または疾患もしくは状態の一つ以上の症状に対する効果の一つ以上を決定するために非ヒト動物がモニターされ得る。安全特性を決定するために使用される典型的な方法は、毒性、至適用量濃度、抗体（すなわち抗薬物）応答、薬物またはワクチンの有効性、および潜在的リスク因子の測定を含む。かかる薬物またはワクチンは、かかる非ヒト動物で改良され、および／または開発されてもよい。
【０２６２】
ワクチンの有効性は、多数の方法で決定されてもよい。簡潔に述べると、本明細書に記載の非ヒト動物は、当技術分野で公知の方法を使用してワクチンされ、次に、ワクチンを負荷されるか、またはワクチンは、既に感染した非ヒト動物に投与される。ワクチンに対する非ヒト動物の応答を、非ヒト動物（またはそれらから単離された細胞）のモニタリング、および／またはそれらに対する一つ以上のアッセイを行うことにより測定して、ワクチンの有効性を決定してもよい。次に、ワクチンに対する非ヒト動物の応答は、当該技術分野において公知および／または本明細書に記載の一つ以上の手段を使用して、対照動物と比較される。
【０２６３】
ワクチンの有効性は、ウイルス中和アッセイによりさらに決定されてもよい。簡潔に述べると、本明細書に記載の非ヒト動物は、免疫化され、血清が、免疫後の様々な日数で採取される。血清の連続希釈物は、ウイルスと予めインキュベーションされ、その間に、ウイルスに特異的である血清中の抗体が、ウイルスと結合する。次に、ウイルス／血清混合物を許容細胞に加えて、プラークアッセイまたはマイクロ中和アッセイにより感染性を決定する。血清中の抗体がウイルスを中和するなら、対照群と比較して、プラーク数が少ないか、または相対ルシフェラーゼ単位が低くなる。
【０２６４】
本明細書に記載の非ヒト動物は、癌および／または炎症性疾患において使用するための抗体ベースの治療の開発および特徴決定のための、改良されたインビボシステムを提供する。炎症は癌と関連があるとされてきた（例えば、Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖ，Ｓ．Ｉ．ら、２０１０年、Ｃｅｌｌ  １４０：８８３〜９９；Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ，Ｓ．、２００６年、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７９：１２３〜３０において概説され、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。実際、発生中の腫瘍環境は、部分的に、様々な炎症性メディエータの浸潤により特徴付けられている。また、持続炎症は、より高い可能性の発生中の癌を導き得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、抗癌治療および／または抗炎症治療の開発および／または同定のためのインビボシステムを提供する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物または対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載のものとは異なる遺伝子修飾を有する、または遺伝子修飾を有さない、すなわち野生型）は、腫瘍（または腫瘍細胞）が移植され、続いて、一つ以上の候補治療が投与され得る。一部の実施形態では、候補治療は、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または抗体カクテルを含み得る。一部の実施形態では、候補治療は、例えば、逐次的にまたは同時に投与される二つ以上の単一特異性抗体の投与などの併用療法を含む。腫瘍は、非ヒト動物内の１カ所以上の位置で定着するのに十分な時間そのままにされた後、一つ以上の候補治療薬が投与され得る。腫瘍細胞増殖、成長、生存などは、候補治療薬の投与前と後の両方で測定されてもよい。候補治療薬の細胞毒性もまた、必要に応じて、非ヒト動物で測定されてもよい。
【０２６５】
キット
本発明はさらに、本明細書に記載の、少なくとも一つの非ヒト動物、非ヒト細胞、ＤＮＡフラグメント、および／またはターゲティングベクターを充填した一つ以上の容器を含むパックまたはキットを提供する。キットは、任意の適用可能な方法（例えば調査方法）において使用されてもよい。医薬品および生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定されたフォームの通知書を任意でかかる容器に関連づけてもよく、その通知書は、（ａ）ヒト投与に関する製造、使用または販売に関する当局による承認、（ｂ）使用に関する説明書、またはその両方、または二つ以上の実体の間の物質および／または生物製品（例えば本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト細胞）の移送を支配する契約書、を反映している。
【０２６６】
本発明の他の特性は、例示のために与えられ、かつその限定を意図しない例示的な実施形態の以下の記載の過程で明らかになるであろう。
【実施例】
【０２６７】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作成し、使用するかを当業者に説明するために提供されており、発明者がその発明として見なすものの範囲を限定することを意図していない。別途示されていない限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧またはその近くである。
【０２６８】
実施例１．ターゲティングベクターの設計と構築
本実施例は、げっ歯類（例えば、マウス）などの非ヒト動物のゲノム内への挿入のためのターゲティングベクターの構築を説明する。特に、本実施例で説明する方法は、ゲノムが、操作したＤＨ領域は、各々、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合された一つ以上のＤＨセグメントを含む、操作した重鎖多様性（ＤＨ）領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、げっ歯類（例えば、マウス）のゲノムへの挿入のためのターゲティングベクターの生成を示す。本実施例では、三つのターゲティングベクターを記載する：５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合し、一つのヒトＪＨセグメントに作動可能に結合した近位（または３’）ＤＨセグメントを含む操作したＤＨ領域を含有する、第１のターゲティングベクター、５’の２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合し、三つのヒトＪＨセグメントに作動可能に結合した近位（または３’）ＤＨセグメントを含む操作したＤＨ領域を含有する、第２のターゲティングベクター、および各々、３’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連し、六つのヒトＪＨセグメントに作動可能に結合した、三つのＤＨセグメントを含む操作したＤＨ領域を含有する、第３のターゲティングベクター（図２）。これらのターゲティングベクターの各々を生成し、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域内に別々に挿入した（図３、５、７）。以下に記載する通りされるように、操作したＤＨ領域を、重鎖可変（ＶＨ）および重鎖結合（ＪＨ）セグメントと作動可能に結合し、ＶＤＪ組み換え時に、ＤＨ−ＤＨ組み換えから生じるＣＤＲ３を有する抗体を発現させた。
【０２６９】
免疫グロブリン重鎖可変領域への挿入のための、各々、５’または３’の２３ｍｅｒのＲＳＳと関連する一つ以上のヒトＤＨセグメントを含有するターゲティングベクターを、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）テクノロジー（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２〜６５９を参照、その全体が参照により本明細書に取り込む）、および当該技術分野において公知の分子生物学的技術を用いて生成した。本実施例に記載する方法を利用して、任意のＤＨセグメント、ＤＨセグメントのセット、または必要に応じてＤＨセグメントの組み合わせを使用することができる。
【０２７０】
Ａ．２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクター（図２）
簡潔に述べると、第１のターゲティングベクターを、複数のヒトＤＨセグメント、およびヒトＤＨ７−２７の場所にに位置付けられた合成ヒトＤＨ３−３セグメントを含有するゲノムＤＮＡフラグメントを使用して構築した。インビトロＣａｓ９／ＧＡ修飾のためのドナーを、新規合成（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏ）により作製し、５’から３に：（ａ）ＤＨ７−２７の５’の１２ｍｅｒのＲＳＳの上流３５０ｂｐから始まる１００ｂｐの相同アーム、（ｂ）ネオマイシン耐性カセットの挿入のためのＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ部位、（ｃ）ＤＨ７−２７の５’末端の１２のＲＳＳの上流の２５０ｂｐの領域、（ｄ）５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳ（ＪＨ４由来）および３’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳ（ＤＨ３−３由来）で操作した、合成ヒトＤＨ３−３セグメント、および（３）ＪＨ５の３ｂｐ下流で始まる、１００ｂｐの相同ボックスを含む。ｌｏｘｐ−ＵｂＣ−Ｅｍ７−Ｎｅｏ−ｌｏｘｐカセット、例えば、ｌｏｘＰ部位特異的組み換え認識部位が隣接したネオマイシン耐性遺伝子を、大腸菌およびマウスＥＳ細胞での選択を可能にするためのＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ部位へのライゲーションにより、合成ＤＨセグメントの上流および下流約２５０ｂｐに置いた。ネオマイシンカセットを含むこの２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ドナー（配列番号６１）を使用して、二つのＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体を使用してインビトロＣａｓ９／ＧＡによりＢＡＣを修飾した。修飾に先立ち、ＢＡＣは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスのキメラＩｇＨ遺伝子座と配列が同一であった（例えば、ＪＨ遺伝子セグメントを欠き、内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む６３９４対立遺伝子、および内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む１４６０対立遺伝子に対してヘテロ接合性である、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの例示的な非限定的な内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を示す、図３および４を参照）。具体的には、ＢＡＣは、最も近位のヒトＶＨ遺伝子（ＶＨ６−１）から始まり、２７個のヒトＤＨ遺伝子、全６個のヒトＪＨ遺伝子、マウスＩｇＨイントロンエンハンサー（Ｅμ）、マウスＩｇＭスイッチ領域（Ｓμ）、およびマウスＩｇＭ遺伝子の最初の４個のエクソンを含む１４６０対立遺伝子と同一であった。ＢＡＣはまた、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃ）耐性カセットおよび約２９ｋｂの、ＶＨ６−１遺伝子から上流のヒト遺伝子間配列を含んでいた。ヒトとマウスの結合は、ヒトＪＨ６遺伝子の３’の２２２ｂｐおよびマウスＥμエンハンサーの５’の４９０ｂｐである。ＧＡを介した２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ６ドナーのＢＡＣへの挿入は、ＤＨ７−７遺伝子セグメントの操作した２３：Ｄ３−３：１２セグメントでの置換およびＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、およびＪＨ５遺伝子セグメントの欠失を含む、最終２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターを生じた（図２）。表１は、２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターの正確な構築を決定するために使用したｇＲＮＡ、プライマーおよびプローブの配列を提供する。
【表１】
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【０２７１】
２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターをＮｏｔＩで直線にし、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域に対してヘテロ接合性であり（すなわち、げっ歯類重鎖エンハンサーおよび制御領域を含むげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合した複数のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントを含有し、一つ位以上のマウスＡｄａｍ６遺伝子（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号、各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をコードする挿入したヌクレオチド配列を含有する、第１の重鎖対立遺伝子（１４６０ｈｅｔ）；および複数のヒトＶＨおよびＤＨセグメント、ＪＨ領域欠失ならびにげっ歯類重鎖エンハンサーおよび制御領域を含むげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域を含有し、一つ以上のマウスＡｄａｍ６遺伝子（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号、各々、その全体が参照により本明細書に組込まれる）をコードする挿入したヌクレオチド配列を含有する、第２の重鎖対立遺伝子（６３９４ｈｅｔ））、内在性免疫グロブリン重鎖Ｃκ領域（１２９３）に作動可能に結合したヒト免疫グロブリン軽鎖ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含むヒト化内在性κ遺伝子座についてホモ接合性（ＨＯ）であるゲノムを有するマウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションした（図３を参照）。６７９９対立遺伝子を、エレクトロポレーションおよび１４６０対立遺伝子の、ネオマイシンカセットを含む２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターとの適切な相同組み換えにより生成する。（図３）。６３９４および６７９対立遺伝子に対してヘテロ接合性のこれらの操作したマウスＥＳ細胞を用いて、陽性ＥＳクローン（下記参照）の効率的なスクリーニングおよび続く薬物耐性カセットのｃｒｅ介在性除去を促進し、以後、６３９４および６７９９対立遺伝子の欠失を、それぞれ６６４３および６８００と称する（図４）。
【０２７２】
Ｂ．２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクター（図２）
同様の方法で、第１のターゲティングベクター（２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６）を、複数のヒトＤＨセグメント、およびヒトＤＨ７−２７の場所に位置付けられた合成ヒトＤＨ３−３セグメントを含有する同じゲノムＤＮＡフラグメントを使用して構築した。しかしながら、この第２のターゲティングベクターは、六つのヒトＪＨセグメントのうちの三つ（すなわち、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６）を含んでいた。最終２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターを生成するために、ドナーを使用して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスのキメラＩｇＨ遺伝子座と配列が同一のＢＡＣを修飾した（例えば、ＪＨ遺伝子セグメントを欠き、内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む６３９４対立遺伝子、および内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む１４６０対立遺伝子に対してヘテロ接合性である、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの例示的な非限定的な内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を示す、図３および４を参照）。ドナーは、５’から３に：（ａ）Ｄ７−２７の５’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳの上流３５０ｂｐから始まる１００ｂｐの相同アーム、（ｂ）ネオマイシン耐性カセットの挿入のためのＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ部位、（ｃ）Ｄ７−２７の５’末端の１２のＲＳＳの上流の２５０ｂｐの領域、（ｄ）５’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳ（ＪＨ４由来）および３’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳ（ＤＨ３−３由来）で操作した、合成ヒトＤＨ３−３セグメント、および（ｅ）ＪＨ３の３ｂｐ下流で始まる、１００ｂｐの相同ボックスを含んでいた。ｌｏｘｐ−ＵｂＣ−Ｅｍ７−Ｎｅｏ−ｌｏｘｐカセット、例えば、ｌｏｘＰ部位特異的組み換え認識部位が隣接したネオマイシン耐性遺伝子を、大腸菌およびマウスＥＳ細胞での選択を可能にするためのＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ部位へのライゲーションにより、合成ＤＨセグメントの上流約２５０ｂｐに置いた。ネオマイシンカセットを含む、配列番号５２として記載するヌクレオチド配列を含むこの２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ４−６ドナーを使用して、１４６０対立遺伝子と配列が同一なＢＡＣを修飾した（図３および図４）。具体的には、ＢＡＣは、最も近位のヒトＶＨ遺伝子（ＶＨ６−１）から始まり、２７個のヒトＤＨ遺伝子、全６個のヒトＪＨ遺伝子、マウスＩｇＨイントロンエンハンサー（Ｅμ）、マウスＩｇＭスイッチ領域（Ｓμ）、およびマウスＩｇＭ遺伝子の最初の４個のエクソンを含む１４６０対立遺伝子と同一であった。ＢＡＣはまた、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃ）耐性カセットおよび約２９ｋｂの、ＶＨ６−１遺伝子から上流のヒト遺伝子間配列を含んでいた。ヒトとマウスの結合は、ヒトＪＨ６遺伝子の３’の２２２ｂｐおよびマウスＥμエンハンサーの５’の４９０ｂｐである。二つのＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体を使用したインビトロＣａｓ９／ＧＡを介した２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ４−６ドナーのＢＡＣへの挿入は、ＤＨ７−７遺伝子セグメントの操作した２３：Ｄ３−３：１２セグメントでの置換およびＪＨ１、ＪＨ２、およびＪＨ３遺伝子セグメントの欠失を含む、最終２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクター（図２）を生じた。表２は、２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターの正確な構築を決定するために使用したｇＲＮＡ、プライマーおよびプローブの配列を提供する。
【表２】
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【０２７３】
２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターをまたＮｏｔＩで直線にし、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域に対してヘテロ接合性であり（すなわち、げっ歯類重鎖エンハンサーおよび制御領域を含むげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合した複数のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントを含有し、一つ位以上のマウスＡｄａｍ６遺伝子（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号、各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をコードする挿入したヌクレオチド配列を含有する、第１の重鎖対立遺伝子（１４６０ｈｅｔ）；および複数のヒトＶＨおよびＤＨセグメント、ＪＨ領域欠失ならびにげっ歯類重鎖エンハンサーおよび制御領域を含むげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域を含有し、一つ以上のマウスＡｄａｍ６遺伝子（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号、各々、その全体が参照により本明細書に組込まれる）をコードする挿入したヌクレオチド配列を含有する、第２の重鎖対立遺伝子（６３９４ｈｅｔ））、内在性免疫グロブリン重鎖Ｃκ領域（１２９３）に作動可能に結合したヒト免疫グロブリン軽鎖ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含むヒト化内在性κ遺伝子座についてホモ接合性（ＨＯ）であるゲノムを有するマウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションした（図５を参照）。６７９７対立遺伝子を、エレクトロポレーションおよび１４６０対立遺伝子の、ネオマイシンカセットを含む２３：Ｄ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターとの適切な相同組み換えにより生成する。（図５）。６３９４および６７９７対立遺伝子に対してヘテロ接合性のこれらの操作したマウスＥＳ細胞を用いて、陽性ＥＳクローン（下記参照）の効率的なスクリーニングおよび続く薬物耐性カセットのｃｒｅ介在性除去を促進し、以後、６３９４および６７９７対立遺伝子の欠失を、それぞれ６６４３および６７９８と称する（図６）。
【０２７４】
Ｃ．１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３／ＪＨ１−６ターゲティングベクター（図２）
簡潔に述べると、第３のターゲティングベクターを、各々、１２ｍｅｒの５’ＲＳＳおよび２３ｍｅｒの３’ＲＳＳを有する、三つのＤＨ２ファミリー遺伝子セグメント（ＤＨ２−２、ＤＨ２−８およびＤＨ２−１５）を含む複数のＤＨヒトセグメントを含有するＤＮＡフラグメントを使用して構築した。最初に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスのキメラＩｇＨ遺伝子座と配列が同一のＢＡＣ（例えば、ＪＨ遺伝子セグメントを欠き、内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む６３９４対立遺伝子、および内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む１４６０対立遺伝子に対してヘテロ接合性である、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの例示的な非限定的な内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を示す、図３および４を参照）。具体的には、ＢＡＣは、最も近位のヒトＶＨ遺伝子（ＶＨ６−１）から始まり、大腸菌およびマウスＥＳ細胞における選択のため第１のヒトＤＨセグメント（ＤＨ１−１）の５１２ｂｐ上流の、ｌｏｘＰ部位特異的組み換え認識部位が隣接したｌｏｘｐ−ＵｂＣ−Ｅｍ７−Ｎｅｏ−ｌｏｘｐカセット、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子に挿入するための細菌相同組み換え（ＢＨＲ）を使用して修飾した、全２７種のヒトＤＨ遺伝子、全６種のヒトＪＨ遺伝子、マウスＩｇＨイントロンエンハンサー（Ｅμ）、マウスＩｇＭスイッチ領域（Ｓμ）、およびマウスＩｇＭ遺伝子の最初の４つのエクソンを含む、１４６０対立遺伝子と同一であった。この得られたＢＡＣを、続いて、インビトロＣａｓ９／ＧＡを使用して三つのドナーで修飾した。
１．  ５’から３’に、ＤＨ２−２の５’末端の１２  ＲＳＳの１４１９ｂｐ上流から始まる５０ｂｐの相同ボックス、複数のクローニング部位（ＭｒｅＩ−ＮｓｉＩ−ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ−ＭｒｅＩ）、ヒトＶＨ１−６９（ＣＡＣＡＧＴＧＴＧＡ  ＡＡＡＣＣＣＡＣＡＴ  ＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧ  ＡＣＡＣＡＡＡＣＣ；Ｔ−＞Ａ、Ｇ−＞Ｃ；配列番号１５１）からもたらされた推定３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳにより置換した３’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳを有する修飾したＤ２−２遺伝子、およびＤ２−２の３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳの８６３ｂｐの下流で終わる５０ｂｐ相同ボックスを含有した、ＤＨ２−２の修飾のための第１のドナー。ＤＨ２−２の修飾のためのこの第１のドナーのヌクレオチド配列を、配列番号７０として記載する。ＤＨ領域は、約１０ｋｂの四つの直接リピートからなるため、スクリーニング用の固有のプライマーおよびプローブの設計は、非常に困難である。この問題を克服するために、二つの固有な４０ｂｐの配列が挿入した；一つは、５’相同ボックスの７４ｂｐ下流であり、もう一つは、３’相同ボックスの４０ｂｐ上流であった。これらの固有の４０ｍｅｒを、ＰＣＲ／配列決定プライマーおよびＴａｑｍａｎプローブの結合部位として使用し、図２の塗りつぶしていない長方形「１」および「２」で示し、それぞれ、配列番号７３および配列番号７４として記載したヌクレオチド配列を含む。
２．  ５’から３’に、ＤＨ２−８の５’末端の１２  ＲＳＳの５５２ｂｐ上流から始まる５０ｂｐの相同ボックス、複数のクローニング部位（ＭｒｅＩ−ＮｓｉＩ−ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ−ＭｒｅＩ）、ヒトＶＨ１−６９（ＣＡＣＡＧＴＧＴＧＡ  ＡＡＡＣＣＣＡＣＡＴ  ＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧ  ＡＣＡＣＡＡＡＣＣ；Ｔ−＞Ａ、Ｇ−＞Ｃ；配列番号１５１）からもたらされた推定３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳにより置換した３’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳを有する修飾したＤ２−８遺伝子、およびＤ２−８の３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳの８６７ｂｐの下流で終わる５０ｂｐ相同ボックスを含有した、ＤＨ２−８の修飾のための第２のドナー。ＤＨ２−８の修飾のためのこの第２のドナーのヌクレオチド配列を、配列番号７１として記載する。ＤＨ領域は、約１０ｋｂの四つの直接リピートからなるため、スクリーニング用の固有のプライマーおよびプローブの設計は、非常に困難である。この問題を克服するために、二つの固有な４０ｂｐの配列が挿入した；一つは、５’相同ボックスの７４ｂｐ下流であり、もう一つは、３’相同ボックスの４０ｂｐ上流であった。これらの固有の４０ｍｅｒを、ＰＣＲ／配列決定プライマーおよびＴａｑｍａｎプローブの結合部位として使用し、図２の塗りつぶしていない長方形「１０」および「１６」で示し、それぞれ、配列番号７５および配列番号７６として記載したヌクレオチド配列を含む。
３．  ５’から３’に、ＤＨ２−１５の５’末端の１２  ＲＳＳの３９１ｂｐ上流から始まる５０ｂｐの相同ボックス、複数のクローニング部位（ＭｒｅＩ−ＮｓｉＩ−ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ−ＭｒｅＩ）、ヒトＶＨ１−６９（ＣＡＣＡＧＴＧＴＧＡ  ＡＡＡＣＣＣＡＣＡＴ  ＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧ  ＡＣＡＣＡＡＡＣＣ；Ｔ−＞Ａ、Ｇ−＞Ｃ；配列番号１５１）からもたらされた推定３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳにより置換した３’末端の１２ｍｅｒのＲＳＳを有する修飾したＤ２−１５遺伝子、およびＤ２−１５の３’末端の２３ｍｅｒのＲＳＳの８６７ｂｐの下流で終わる５０ｂｐ相同ボックスを含有した、ＤＨ２−１５の修飾のための第３のドナー。ＤＨ２−２の修飾のためのこの第３のドナーのヌクレオチド配列を、配列番号７２として記載する。ＤＨ領域は、約１０ｋｂの四つの直接リピートからなるため、スクリーニング用の固有のプライマーおよびプローブの設計は、非常に困難である。この問題を克服するために、二つの固有な４０ｂｐの配列が挿入した；一つは、５’相同ボックスの７４ｂｐ下流であり、もう一つは、３’相同ボックスの４０ｂｐ上流であった。これらの固有の４０ｍｅｒを、ＰＣＲ／配列決定プライマーおよびＴａｑｍａｎプローブの結合部位として使用し、図２の塗りつぶしていない長方形「８」および「１８」で示し、それぞれ、配列番号７７および配列番号７８として記載したヌクレオチド配列を含む。
３種のドナーでのインビトロＣａｓ９／ＧＡ修飾後、最終ターゲティングベクターは、５’から３’に、ヒト可変領域ＤＮＡ、ネオマイシン選択カセット、各々、５’で１２ｍｅｒのＲＳＳが、３’で２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接した、三つのヒトＤＨセグメント操作したヒトＤＨ領域、六つのヒトＪＨセグメントを含有する、４９ｋｂの５’相同アーム、およびマウス重鎖イントロンエンハンサー（Ｅｉ）およびマウスＩｇＭ定常領域遺伝子を含有する２４ｋｂの３’相同アームを含有していた。（図２）。表３は、１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３／ＪＨ１−６ターゲティングベクターの正確な構築を決定するために使用したｇＲＮＡ、プライマーおよびプローブの配列を提供する。
【表３−１】
2021528057.tif 000006
【表３−２】
2021528057.tif 000007
【表３−３】
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【表１０−１】
2021528057.tif 000009
【表１０−２】
2021528057.tif 000010
【０２７５】
１２：ＤＨ２−２：２３：｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ｘ３／ＪＨ１−６ターゲティングベクターをまた、ＮｏｔＩで直線にし、機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全なレパートリー、ＤＨ７−２７を除くＤＨ領域の欠失、および機能的ヒトＪＨ遺伝子セグメント（６０１１）の完全なレパートリーを含有するヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域に対してホモ接合性であり、内在性マウス免疫グロブリン重鎖Ｃκ領域（１２９３）に作動可能に結合した、ヒト免疫グロブリン軽鎖ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含むヒト化内在性κ遺伝子座に対してホモ接合性（ＨＯ）である、ゲノムを有するマウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションした（図７を参照）。２０１８７対立遺伝子を、エレクトロポレーションおよび６０１１対立遺伝子の、ネオマイシンカセットを含む１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３／ＪＨ１−６ターゲティングベクターとの適切な相同組み換えにより生成する。（図７）。これらの操作したマウスＥＳ細胞を用いて、陽性ＥＳクローン（下記参照）の効率的なスクリーニングおよび続くネオマイシン薬物耐性カセットのｃｒｅ介在性除去を促進し、以後、２０１８７対立遺伝子の除去を、２０１８８とする（図８）。
【０２７６】
実施例２．ＥＳ細胞スクリーニング
本実施例は、ゲノムが、操作した重鎖多様性（ＤＨ）領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む非ヒト動物（例えば、げっ歯類）の作製を示し、操作したＤＨ領域は、各々、２３ｍｅｒのＲＳＳに作動可能に結合した一つ以上のＤＨセグメントを含む。
【０２７７】
実施例１に記載され、ＢＡＣ  ＤＮＡと共に含有されるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性クラスターへのＤＮＡフラグメントの挿入を標的としたターゲティングベクターの適正なアセンブルを、各ターゲティングベクターの構築中の配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応に確認した。標的ＢＡＣ  ＤＮＡを、ポリメラーゼ鎖反応により確認し、次に、エレクトロポレーションを介して胚性幹（ＥＳ）細胞を導入し、続いて選択培地で培養した。各ターゲティングベクターのエレクトロポレーションのため使用したＥＳ細胞のゲノムを、それぞれ図３、５および７に示す。エレクトロポレーションの１０日後に薬物耐性コロニーを拾い、操作したＤＨ遺伝子セグメント（表４；Ｆ：フォワードプライマー、Ｐ：プローブ、Ｒ：リバースプライマー）の正しい統合を検出するプライマー／プローブを使用して、既に記載された（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．ら、２０１０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）通り、正しいターゲティングについて、ＴＡＱＭＡＮ（商標）および核型分析によりスクリーニングした。
【０２７８】
ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．ら、２０１０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２８５〜２９４；ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．、２００９年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５３０：３１１〜３２４；Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、２００７年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２５：９１〜９９、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）を使用し、標的ＥＳ細胞を、非圧縮８細胞ステージのＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ胚に注入して、操作したＤＨ領域に対してヘテロ接合性であり、ＤＨ−ＤＨ組み換えから生成したＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含有する抗体を発現する、健康な完全ＥＳ細胞由来のＦ０世代マウスを生み出した。Ｆ０世代のヘテロ接合性のオスを、Ｃ５７Ｂｌ６／ＮＴａｃのメスと交配して、Ｆ１ヘテロ接合体を生成し、このＦ１ヘテロ接合体同士を交雑させて、Ｆ２世代のホモ接合体および野生型マウスを生み出した。
【０２７９】
例えば、ＥＳ細胞段階でまたは胚中で、除去されていないターゲティング構築物によって導入された任意のｌｏｘ付加選択カセットを除去するために、薬物選択カセットを、Ｃｒｅ欠失マウス系統（例えば、国際特許出願公開第２００９／１１４４００号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）を交配することにより、リコンビナーゼの続く添加（例えば、Ｃｒｅ処理により）により場合により除去してもよい。場合により、選択カセットをマウス内に保持する。本明細書に記載のターゲティングベクターに操作した選択カセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼの一過性発現により陽性ＥＳ細胞において除去した（それぞれ、図４、６および８を参照）。
【表４−１】
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【表４−２】
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【０２８０】
実施例３．２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６，２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６、または１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３／ＪＨ１−６ターゲティングベクターで修飾したマウスの特徴決定
免疫表現型
【０２８１】
２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６または２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターで修飾した動物の免疫表現型解析を、それぞれの６８００または６７９５修飾した対立遺伝子に対してヘテロ接合性のマウスについて行った（図４および図６を参照）。１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２−２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３／ＪＨ１−６ターゲティングベクターを用いて修飾した動物の免疫表現型解析を、２０１８８修飾対立遺伝子に対してホモ接合性で交配したマウスについ行った。Ｂ細胞の発生を、これらの動物において、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により解析した。簡潔に述べると、脾臓および脚骨（大腿骨および脛骨）を、以下から採取した：
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（ｎ＝３、２６％  Ｃ５７ＢＬ／６、２３％  １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ  ５１％  Ｂａｌｂ／ｃＡｎＮＴａｃ、例えば、米国特許第８，５０２，０１８号および第８，６４２，８３５号を参照）、
６６４３ｈｅｔ／６８００ｈｅｔ／１２９３ｈｏマウス（２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターで修飾した、２５％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、２５％  １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ、５０％  Ｂａｌｂ／ｃＡｎＮＴａｃ；図４を参照；ｎ＝３）；
６６４３ｈｅｔ／６７９８ｈｅｔ／／１２９３ｈｏマウス（２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターで修飾した、２５％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、２５％  １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ、５０％  Ｂａｌｂ／ｃＡｎＮＴａｃ；図６を参照；ｎ＝３）；または
２０１８８ｈｏ／１２９３ｈｏマウス（１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２．１５２３／ＪＨ１−６ターゲティングベクターで修飾した、２５％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、２５％  １２９Ｓ６／ＳｖＦｖＴａｃ、５０％  Ｂａｌｂ／ｃＡｎＮＴａｃ；ｎ＝３）。
骨髄を遠心分離により大腿骨から収集した。脾臓および骨髄調製物由来の赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）で溶解し、続いて２％ＦＢＳを含む１×ＰＢＳで洗浄した。単離した細胞（１×１０６個）を、選択した抗体カクテルと４℃で３０分間インキュベーションした。染色１：ラット抗マウスＣＤ４３−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  １２１２０６、クローン１Ｂ１１）、ラット抗マウスｃ−ｋｉｔ−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  １０５８０８、クローン２Ｂ８）、ラット抗マウスＩｇＭ−ＰｅＣｙ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２５−５７９０−８２、クローンＩＩ／４１）、ラット抗マウスＩｇＤ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ４０５７１０、クローン１１−２６ｃ．２ａ）、ラット抗マウスＣＤ３−ＰＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  １００２１４、クローン１７−Ａ２）、ラット抗マウスＢ２２０−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７−０４５２−８２、クローンＲＡ３−６Ｂ２）、およびラット抗マウスＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ  ５６０１４３、クローン１Ｄ３）。染色２：ラット抗マウスｋａｐｐａ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  ５５０００３、クローン１８７．１）、ラット抗マウスｌａｍｂｄａ−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ４０７３０８、クローンＲＭＬ−４２）、ラット抗マウスＩｇＭ−ＰｅＣｙ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２５−５７９０−８２、クローンＩＩ／４１）、ラット抗マウスＩｇＤ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ４０５７１０、クローン１１−２６ｃ．２ａ）、ラット抗マウスＣＤ３−ＰＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  １００２１４、クローン１７−Ａ２）、ラット抗マウスＢ２２０−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７−０４５２−８２、クローンＲＡ３−６Ｂ２）、およびラット抗マウスＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ  ５６０１４３、クローン１Ｄ３）。染色後に、細胞を洗浄し、２％のホルムアルデヒド中で固定した。データ収集をＢＤ  ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２８２】
６８００または６７９８対立遺伝子に対してヘテロ接合性のマウスでは、脾臓と骨髄の両方で総Ｂ細胞数が減少し、対照ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと比較したとき、骨髄で観察されたプロＢ細胞の増加が認められた（データは示していない）。全体として、Ｂ細胞は、κおよびλ使用と類似した（データは示していない）。２０１８８対立遺伝子に対してホモ接合性のマウスでは、脾臓においてわずかに高いレベルのλ＋Ｂ細胞を認めた（データは示していない）。対照のＶＥＬＯＬＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと比較して、６８００、６７９８、または２０１８８の対立遺伝子を発現するマウスにおいて、Ｂ細胞集団に観察した差は、これらの動物のＢ細胞の発生に影響を及ぼすと認められなかった（データは示していない）。
【０２８３】
ＤＨ−ＤＨ再構成および特徴決定の頻度
【０２８４】
２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクター、２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクター、または１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターで修飾した免疫していない未感作マウスにおける遺伝子再構成を、ＩｇＭレパートリー配列決定により解析した。脾臓Ｂ細胞由来のＩｇＭレパートリーライブラリーを、マウス定常ＩｇＭに特異的なプライマーを用いて、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して調製した（表５、「ｎｎｎｎｎｎ」は、配列決定のための試料の多重化を可能にする６ｂｐのインデックス配列を表す）。次に、調製したレパートリーライブラリーを、ＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で配列決定した。
【０２８５】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ対形成末端配列（２×３００サイクル）を、重鎖ＩｇＭ定常領域プライマーの品質および完全一致に基づき、混合し、  マージし、選別した。再構成した重鎖配列を、生殖系列Ｖ、Ｄ、おおびＪ参照データベース（ＩＭＧＴ）に整列させた。続く解析は、オープンリーディングフレーム内に終止コドンを有さず、インフレームのＶＤＪ結合を有する配列として定義した、生産性再構成のみを含めた。
【表５】
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【０２８６】
２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターまたは２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターで修飾した免疫していない動物において、ＤＨ７−２７の発現を検出せず、ＪＨの使用は、予想通り、ＪＨ６、またはＪＨ４、ＪＨ５、およびＪＨ６に限定した（データを示していない）。ＪＨ４との組み換えを、修飾動物と対照動物の両方においてより高い頻度（約５０％）で見られた（データは示していない）が、１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターで修飾した免疫していない動物において、全てのＪＨ１−６遺伝子セグメントとの組み換えを検出した。全ての修飾動物において、操作したＤＨ遺伝子セグメントで組み換えた、様々なＶＨ遺伝子セグメント（例えば、非限定的に、ＶＨ４−３９、ＶＨ３−２３など）、および様々なＤＨ遺伝子セグメント（例えば、非限定的に、ＤＨ１−７、ＤＨ３−１０、およびＤＨ５−１２）を使用した。興味深いことに、ＤＨ２−２、ＤＨ２−８、およびＤＨ２−１５遺伝子セグメントの使用は、対照動物（２．５７％、３．４４％；３．５８％；ｎ＝３）と比較して、１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターで修飾した動物（２．４１％；６．３４％；６．９１％；ｎ＝３）において高い傾向を示した。（表６）。
【０２８７】
結合領域内で同定した最小の二つの連続するＤＨセグメントを有する機能的配列を、以下の基準を使用して、ＤＨ−ＤＨ組み換え現象から生じるとしてさらに確認した。２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６ターゲティングベクターまたは２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６ターゲティングベクターで修飾したマウスから単離した配列において、任意の重複と無関係である、（１）ＩＧＨＤ３−３  ＤＨ遺伝子セグメントの生殖系列配列に、最小の９個の連続する塩基対で整列した同一の「連続的」または  ３’のＤＨ  セグメントおよび（２）生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントに対して最小の５個の連続する塩基対で整列した、同定したリーディング５’と連続した３’ＤＨ遺伝子セグメントの両方の場合、ＤＨ−ＤＨ組み換え現象を確認した。１２：ＤＨ２−２：２３｜１２：ＤＨ２−８：２３｜１２：ＤＨ２−１５：２３ターゲティングベクターで修飾したマウスから単離した配列において、任意の重複と無関係である、（１）ＩＧＨＤ２−２  ＤＨ遺伝子セグメント、ＩＧＨＤ２−８  ＤＨ遺伝子セグメント、ＩＧＨＤ２−１５  ＤＨ遺伝子セグメントの生殖系列配列に、最小の９個の連続する塩基対で整列した同定した「リーディング」または５’のＤＨセグメント、および（２）生殖系列ＤＨ遺伝子セグメントに対して最小の５個の連続する塩基対で整列した、同定したリーディング５’と連続した３’ＤＨ遺伝子セグメントの両方の場合、ＤＨ−ＤＨ組み換え現象を確認した。
【０２８８】
表６は、絶対量としての機能的Ｉｇ読み取り値および総読み取り値の割合としての数値、ＤＨ２−２遺伝子セグメント、ＤＨ２−８遺伝子セグメント、またはＤＨ２−１５遺伝子セグメントからもたらされた全ての機能的読み取り値のパーセンテージ、およびＤＨ−ＤＨ組み換え現象の結果として確認すべき基準を満たす、ＤＨ２−２遺伝子セグメント、ＤＨ２−８遺伝子セグメント、またはＤＨ２−１５遺伝子セグメントからもたらされる全ての読み取り値のパーセンテージを提供する。
【表６】
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【０２８９】
表６に示した通り、全ての免疫していない修飾動物は、対照動物と比較して、ＤＨ−ＤＨ組み換え事象の増加を示した。例えば、２０１８８対立遺伝子に対してホモ接合性の、操作した２−２、２−８および２−１５遺伝子セグメントで修飾した動物において、ＤＨ−ＤＨ組み換え現象は、三つの操作した２−２、２−８、２−１５  ＤＨ遺伝子セグメントの一つを含む全ての再構成の１．６９％〜４．１６％であった。対照的に、ＤＨ−ＤＨ組み換えを、対照動物において２−２、２−８、または２−１５遺伝子セグメントからもたらされた全ての再構成の０．２％未満で確認した。別の実験では、６８００匹のマウスに対してヘテロ接合性のマウス（図４）における操作したＤＨ３−３遺伝子セグメントに関与する、確認したＤＨ−ＤＨ組み換え現象の頻度は、ＤＨ３−３遺伝子セグメントからもたらされた全ての機能的読み取り値の０．６〜１．２％の範囲内であった。
【０２９０】
全ての修飾動物において、再構成したＶＨ（ＤＨＡ−ＤＨＢ）ＪＨ再構成は、より長いＣＤＲ３長（例えば、非限定的に、約２１アミノ酸のＣＤＲ３長）をコードし、より多くのシステイン残基を組み込んでいた（例えば、図９および図１０）。
【０２９１】
要約すると、操作したＤＨ遺伝子セグメントで修飾したマウスは、操作したＤＨ遺伝子セグメントの利用により、ＤＨ−ＤＨ組み換え現象の増大した頻度で比較的正常なＢ細胞表現型を示す。さらに、ＤＨ−ＤＨ組み換え配列は、長さが長く、より高い確率のシステイン取り込みを有するＣＤＲ３をコードした。
【０２９２】
実施例４．抗体産生
本実施例は、ゲノムが、本明細書に記載の操作したＤＨ領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、げっ歯類における抗体の生成を示す。本実施例に記載される方法、および／または当該技術分野で周知の免疫方法を使用して、本明細書に記載の操作したＤＨ領域を含有するげっ歯類を、必要に応じて、ポリペプチドもしくはそのフラグメント（例えば、所望のエピトープからもたらされたペプチド）、またはポリペプチドもしくはそのフラグメントの組み合わせで免疫化することができる。
【０２９３】
簡潔に述べると、本明細書に記載の操作したＤＨ領域を含むマウスのコホートを、当該技術分野で公知の免疫方法を用いて対象の抗原で免疫する。抗体免疫反応（すなわち、血清力価）を、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイにより、および／またはＭＳＤにより操作した細胞上でモニターする。望ましい免疫反応が得られた場合、脾臓細胞（および／または他のリンパ組織）を採取し、マウスミエローマ細胞と融合させて、それらの生存能を保持し、不死化ハイブリドーマ細胞株を形成させる。ハイブリドーマ細胞株を（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＭＳＤにより）スクリーニングし、選択して、抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定する。ハイブリドーマを、所望の相対結合親和性とアイソタイプについてさらに特徴付けてもよい。この技術を使用して、数種の抗原特異的キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびげっ歯類定常ドメインを保有する抗体）を得る。
【０２９４】
重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、完全ヒト抗体の調製のため、望ましいアイソタイプ（定常領域）の重鎖および軽鎖に結合してもよい。かかる抗体を、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生してもよい。次に、完全ヒト抗体を、相対結合親和性および／または対象の抗原の中和活性に関して特徴付ける。
【０２９５】
抗原特異的キメラ抗体、または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接単離してもよい。最初に、ヒト可変領域およびげっ歯類定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離し、親和性、選択性、エピトープなどを含むが、これらに限定されない望ましい特徴について、特徴付け、選択する。げっ歯類（例えば、非限定的に、ラット、マウスなど）定常領域を、所望のヒト定常領域で置換して、完全ヒト抗体を生成する。選択した定常領域は、特定の用途に応じ変動し得る一方、高親和性抗原結合および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５８２，２９８号に記載される通り、ミエローマ細胞との融合を行うことなく、抗原特異的抗体をまた、抗原陽性Ｂ細胞（免疫化マウス由来）から直接単離する。この方法を使用して、数種の完全ヒト抗原特異的抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を作製する。
【０２９６】
１回の実験で、対照マウス（例えば、ヒト化免疫グロブリン重質およびκ軽鎖可変領域遺伝子座を有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（ｎ＝４〜６；例えば、米国特許第８，６９７，９４０号および第８，６４２，８３５号を参照；各々が、その全体が参照により本明細書に取り込まれる））および試験マウス（例えば、本明細書に記載の操作した２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６または２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６領域を含むよう修飾したマウス（ｎ＝４〜６））を、異なる抗原および／またはそれ（Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル、ケモカイン受容体、または病原体）をコードする核酸で免疫した。
【０２９７】
マウスは、低力価から高い特異的な力価までの範囲の応答で、試験した抗原の各々に対する応答を生じることができた（データは示していない）。本明細書に記載の操作した２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６領域を有するマウスは、ヒト化免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座を有する対照マウスに匹敵するＧＰＣＲ発現細胞株に対する力価を示した（図１１；塗りつぶした丸は、ＧＰＣＲを発現する操作した細胞株を表し、塗りつぶされていない丸は、ＧＰＣＲを発現しない対照細胞である）。
【０２９８】
さらに、操作したＤＨ領域を含むマウスにおいて生成したＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に特異的な２３個の試験した抗体の１００％が、１０アミノ酸長以上の重鎖ＣＤＲ３長を有し、２０％が、１４アミノ酸長のＣＤＲ３を有し、１個の抗体が、１８アミノ酸長のＣＤＲ３を有した（データは示していない）。対照的に、ヒト化免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座を有するが、操作したＤＨ領域を有しないマウスで生成したＧＰＣＲに特異的な８個の試験した抗体のうち約６０％のみが、１０アミノ酸長以上のＣＤＲ３を有し、１４アミノ酸長以上のＣＤＲ３を有するものはなかった（データは示していない）。
【０２９９】
複数の抗ウイルス抗体を、操作した２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ４−６領域を有するマウスから単離し、少なくとも一つが、対照分子のものよりも優れた中和活性を示した（データは示していない）。
【０３００】
操作した２３：ＤＨ３−３：１２／ＪＨ６を有し、イオンチャンネルで免疫したマウス由来の抗体は、ＶＨＤＨＪＨとＶＨＤＨＡ−ＤＨＢＪＨ再構成（本実施例について記載した厳密な基準により決定）から生じる２１アミノ酸長より長いＨＣＤＲ３を有する抗体の集団を含み、ＨＣＤＲ３の長さがより長いほど、脾臓と比較して骨髄においてより見られた（図１２）。本実施例の厳格な基準（本実施例の厳格な基準を使用したとき、検出した各々のＤＨ遺伝子セグメントは、生殖系列Ｄ遺伝子セグメントに最小４０％の同一性を示さなければならず、３’ＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ３−３遺伝子セグメントから、各々ＤＨ遺伝子セグメントにおいて最大１個のヌクレオチド変異でもたらされなければならない）に従い、ＶＨＤＨＡ−ＤＨＢＪＨ再構成の結果であると決定した配列がコードしたＣＤＲ３長の解析を、図１３に示す。以下の表７は、本実施例に記述される厳密な基準、または本実施例における厳密でない基準を使用した骨髄または膵臓におけるＶＨＤＨＡ−ＤＨＢＪＨ組み換えの頻度の比較を提供する（本実施例の厳密でない基準を用いるとき、検出した各ＤＨ遺伝子セグメントは、生殖系列Ｄ遺伝子セグメントと最小で５個のヌクレオチド同一性を示なければならず、３’ＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ３−３遺伝子セグメントからもたらされなければならない）。
【表７】
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【０３０１】
均等
本発明の少なくとも一つの実施形態のこのような記述されたいくつかの側面を持つ、様々な修正、変更、および改善を当業者であれば容易に思いつくことが当業者には理解されるはずである。このような修正、変更、および改善は本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内であることが意図される。従って、前述の説明および図面は例示のみとしてのものであり、本発明は以下の請求項によって詳細に記述される。
【０３０２】
当業者であれば、アッセイまたは本明細書に記述されたその他のプロセスで得られた値に起因する一般的な標準偏差または誤差を認識するであろう。本発明の背景を説明し、その実践に関して追加的詳細を提供するために本明細書において言及される出版物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021528057.tif 000022
【図８】
2021528057.tif 000023
【図９Ａ】
2021528057.tif 000024
【図９Ｂ】
2021528057.tif 000025
【図１０Ａ】
2021528057.tif 000026
【図１０Ｂ】
2021528057.tif 000027
【図１１】
2021528057.tif 000028
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021528057.tif 000034
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