(57)【要約】  本発明が、Ｔ細胞で高い転写活性有するキメラプロモーターに関わり、上記キメラプロモーターは、エンハンサーｓＤＴＳと、当該エンハンサーに作動可能に連結されたプロモーターからなり、ただし、上記エンハンサーの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される；上記エンハンサーが、上記プロモーターの５’末端又は３’末端に位置する。本発明は、当該キメラプロモーターを含む核酸コンストラクト、ベクターとＴ細胞も関わる。本発明のキメラプロモーターは、Ｔ細胞における外来遺伝子の高効率発現を促進できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増強されたプロモーター配列は、エンハンサーｓＤＴＳと、当該エンハンサーに作動可能に連結されたプロモーターからなり、上記エンハンサーｓＤＴＳの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示され；上記エンハンサーが、上記プロモーターの５’末端又は３’末端、好ましくは５’末端に位置することを特徴とする増強されたプロモーター配列。
【請求項２】
上記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、ＰＧＫプロモーター、β−ａｃｔｉｎプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、Ｕ６プロモーターとＳＶ４０プロモーターから選べられ；好ましくは、上記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター又はβ−ａｃｔｉｎプロモーターであり；より好ましくは、上記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターであることを特徴とする請求項１に記載の増強されたプロモーター配列；
好ましくは、上記ＥＦ１αプロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されても良く；上記ｈＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されても良く；上記β−ａｃｔｉｎプロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されても良い。
【請求項３】
ヌクレオチドコンストラクトが、請求項１又は２に記載の増強されたプロモーター配列を含有する核酸コンストラクト；
好ましくは、上記核酸コンストラクトは、５’末端から３’末端まで、作動可能に連結される上記増強されたプロモーター配列、目的のタンパク質のコード配列及び転写ターミネーターを順に含有する発現カセットである。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の増強されたプロモーター配列を含有するベクター。
【請求項５】
上記ベクターは一過性発現ベクター、ウイルス発現ベクターと転置可能なベクターから選べられる真核発現ベクターであることを特徴とする請求項４に記載のベクター；
好ましくは、上記ベクターは、目的の遺伝子の発現カセットをホスト細胞のゲノムへ組み込むためのベクターであり、好ましくは転置可能なベクターであり；好ましくは、上記転置可能なベクターが、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、ｆｒｏｇ  ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｎ５又はＴｙから選べられる転置因子を含有する。
【請求項６】
上記転置可能なベクターの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に、順に、作動可能に連結される上記増強されたプロモーター、一つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼの制限サイト又は任意的な目的のコード配列、及び転写終了配列を含有することを特徴とする請求項５に記載のベクター。
好ましくは、上記３’ＬＴＲの３’末端に作動可能にトランスポゼースのコード配列及びそのプロモーター配列を連結され；
好ましくは、上記ベクターの核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示され；
好ましくは、上記転写終了配列は、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ転写終了配列である。
【請求項７】
上記目的の遺伝子は、ＰＤ−１一本鎖抗体のコード配列であり；及び／又は、上記制限サイトは、ＡｓｃＩ制限サイト、ＸｂａＩ制限サイト、ＰｖｕＩ制限サイト、ＥｃｏＲＩ制限サイトとＳａｌＩ制限サイトから選べられることを特徴とする請求項５又は６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の増強されたプロモーター配列が、外来遺伝子のＴ細胞内の発現を促進する応用。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の増強されたプロモーター配列又は請求項３に記載の核酸コンストラクト又は請求項４−７のいずれか一つに記載のベクターを含有するＴ細胞；
好ましくは、上記Ｔ細胞のゲノムには、請求項１又は２に記載の増強されたプロモーター配列をプロモーターとすることで目的の外来遺伝子の発現を駆動させる発現カセットが組み込まれている。
【請求項１０】
Ｔ細胞のゲノムに、請求項１又は２に記載の増強されたプロモーター配列及び当該プロモーター配列と作動可能に連結される抗体のコード配列を含有する発現カセットを組み込んでいる、安定的に抗体を発現するＴ細胞；
好ましくは、上記抗体は、ＰＤ−１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ４抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ抗体、ＣＤ４７抗体、ＣＤ１３７抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ２７抗体、ＯＸ４０抗体、ＤＮＡＭ−１抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＩＣＳＯＳ抗体、２Ｂ４抗体、ＣＤ１６０抗体、ＴＩＭ３抗体、ＬＡＧ３抗体、ＢＴＬＡ抗体とＴＩＧＩＴ抗体などから選べられ；
より好ましくは、上記抗体は、ＰＤ−１抗体であり；好ましくは、上記ＰＤ−１抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０示され、そのコード配列は、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１示された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学分野に属し、Ｔ細胞に高い活性を有するプロモーター及びその用途に関わる。上記プロモーターは、人工合成されたキメラプロモーターであり、当該プロモーターは、Ｔ細胞に高い活性を有する。本発明は、当該プロモーターを含む組換えベクター、組換えウイルス、及び上記プロモーターの外来遺伝子に対する制御が遺伝子組み換えＴ細胞治療における用途を関わる。
【背景技術】
【０００２】
がんは、１００年前に研究されたが、今までも完全には克服されていない。。手術治療、化学療法、放射線療法などの治療法の出現により、がん患者の生存率は大幅に改善されたが、これらの治療法は世界中の数千万人のがん患者を救うには十分ではない。バイオテクノロジーの活発な発展により、バイオセラピーは新しい治療法として産生され、現在、がん治療の分野で４番目に大きな治療法となる。
【０００３】
バイオテクノロジーが、免疫療法（細胞、サイトカイン、抗体、ワクチンなど）、遺伝子療法、血管新生を調節する療法、小分子標的薬、幹細胞および組織工学再生医療などの複数のモードを含む。その中でも、がんの免疫療法は２０１３年にサイエンス雑誌で最も注目されている６つの科学分野の１つに選ばれて以来、学術機関や製薬会社から多大な注目を集めている。
【０００４】
がんの免疫療法には、主に養子細胞療法、免疫調節剤、腫瘍ワクチン、及び免疫チェックポイント遮断薬が含まれる。その中で、免疫チェックポイント遮断薬は多くのがん、特に悪性および化学薬物耐性がある癌に大きな影響を与えるから、４つの免疫チェックポイント遮断薬がＦＤＡに承認される；さらに、養子細胞療法の分野では、特に新世代のＣＡＲ−Ｔ細胞療法技術は、白血病やリンパ腫などの血液腫瘍に対して驚くべき治療効果を示す。現在、ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製は主にウイルスおよび非ウイルス発現系に基づき、ウイルスベクターは細胞の複製および挿入突然変異を引き起こし、それが生物学的安全性の問題を引き起こす可能性がある。２０１３年、ＭＤアンダーソンがんセンターのクーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）実験室は、非ウイルストランスフェクション法を使用し、つまり、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンシステムで遺伝子修飾を行い、ＣＤ１９抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を得た。
【０００５】
プロモーターは、遺伝子の構成要素の一つであり、通常は構造遺伝子の５’末端の上流にあり、ＲＮＡポリメラーゼが認識・結合し、転写を開始するＤＮＡ配列である。プロモーターは、導入された遺伝子の発現効率に影響を与える重要な要素の１つであり、高効率のプロモーターを選択することが外来遺伝子の高効率発現の鍵となる点である。
【０００６】
プロモーターの転写モードにより、それらは３つに分けられる：構成的プロモーター、組織または器官特異的プロモーターおよび誘導性プロモーター。
【０００７】
構成的プロモーターは、構成的プロモーターの調節で、異なる組織、器官、発生段階での遺伝子発現に明らかな違いがないものであって、そして構成的プロモーターと呼ばれる。哺乳類動物で一般的に使用される構成的プロモーターが、ウイルス由来のマウスまたはヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（それぞれｍＣＭＶおよびｈＣＭＶと略される）、およびサル液胞ウイルスＳＶ４０プロモーター；天然ヒトゲノム由来のＥＦ１αプロモーター、ユビキチンプロモーター（ユビキチン、略してＵｂｉ）、β−アクチンプロモーター、ＰＧＫ−１プロモーター、Ｒｏｓａ２６プロモーター、ＨＳＰ７０プ
ロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ｅＩＦ４Ａ１プロモーター、Ｅｇｒ１プロモーター、ＦｅｒＨプロモーター  、ＳＭ２２αプロモーター、エンドセリン−１プロモーターなどを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腫瘍免疫療法では、外来遺伝子の効率かつ安定な発現を維持することが非常に重要である。ただし、一部のウイルス由来の構成的プロモーターは、一過性の発現活性が高い（ＣＭＶプロモーターなど）が、エピジェネティックな修飾のために、その発現はオフにされやすい；一方、一部のヒト由来の天然構成プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターは安定した発現を示すが、それらの発現活性は比較的弱く、免疫療法のニーズを満たすことは困難である。したがって、研究者は一連の、外来遺伝子の発現に広く使用されているキメラプロモーターＣＡＧ（ヒトＣＭＶエンハンサー−ニワトリβ−ａｃｔｉｎプロモーター−ウサギβ−ｇｌｏｂｉｎイントロンを含む）を代表とするシスエレメントを含む人工キメラプロモーターを設計・構築し、それらのプロモーターが、主に発現を安定させる役割を果たすプロモーターコア配列と、発現効率を高めることができる上流エンハンサーまたは下流イントロンを含む。
【０００９】
エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、それに関連する遺伝子の転写頻度を増加させるＤＮＡ配列を指し、プロモーターを介して下流の遺伝子の転写を増加させる。有効的なエンハンサーは、遺伝子の５’末端、または遺伝子の３’末端に位置してもよく、遺伝子のイントロンに位置してもよい。エンハンサーの効果は非常にはっきりで、遺伝子転写の頻度を１０−２００倍、ないし千倍に増やすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来技術における発現ベクタープロモーターの転写強度の不足という技術的問題を解決するために、発明者ら、多くの試験と創造的な労働を通じて、一連の新しいキメラプロモーターを設計・構築し、その中からＴ細胞で効率的に発現できる複数のプロモーターを得た。当該プロモーターは、Ｔ細胞における外来遺伝子（全長抗体遺伝子など）の高効率発現を促進するのに特に適する。
【００１１】
したがって、本発明の一つによると、エンハンサーｓＤＴＳと、エンハンサーに作動可能に連結されたプロモーターからなる増強されたプロモーター配列（すなわちキメラプロモーター）を提供し、ただし、上記エンハンサーｓＤＴＳの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された。
一つまたは複数の実施の形態において、上記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、ＰＧＫプロモーター、β−ａｃｔｉｎプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、Ｕ６プロモーターとＳＶ４０プロモーターから選べられる。
一つまたは複数の実施の形態において、上記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、ｈＣＭＶプロモーターとβ−ａｃｔｉｎプロモーターであって、より好ましくは、ＥＦ１αプロモーターである。
一つまたは複数の実施の形態において、上記エンハンサーが、上記プロモーターの５’末端又は３’末端に位置し、好ましくは上記プロモーターの５’末端に位置する。
一つまたは複数の実施の形態において、上記増強されたプロモーター配列の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された核酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された核酸配列からなる。
【００１２】
本発明が、さらに核酸コンストラクトを提供し、上記ヌクレオチドコンストラクトが、本文に記載された増強されたプロモーター配列を含有する。
一つまたは複数の実施の形態において、上記核酸コンストラクトは、５’末端から３’末端まで、作動可能に連結される上記増強されたプロモーター配列、目的のタンパク質的コード配列及び転写ターミネーターを順に含有する発現カセットである。
【００１３】
本発明が、さらにベクターを提供し、上記ベクターが、本文に記載された増強されたプロモーター配列を含有する。
一つまたは複数の実施の形態において、上記ベクターは、真核発現ベクターであり、一過性発現ベクター、ウイルス発現ベクター和転置可能なベクターから選べられるものである。
一つまたは複数の実施の形態において、上記ベクターは、目的の遺伝子の発現カセットを、ホスト細胞のゲノムに組み込むためのベクターであり、好ましくは、転置可能なベクターである。
一つまたは複数の実施の形態において、上記転置可能なベクターが、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、ｆｒｏｇ  ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｎ５又はＴｙから選べられる転置因子を含む。
一つまたは複数の実施の形態において、上記転置可能なベクターの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に、順に、作動可能に連結される上記増強されたプロモーター配列、一つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼの制限サイト又は任意的な目的のコード配列、及び転写終了配列を含有する。
一つまたは複数の実施の形態において、３’ＬＴＲの３’末端には、さらに作動可能にトランスポゼースのコード配列及びそのプロモーター配列を連結している。
一つまたは複数の実施の形態において、上記ベクターは、さらに一つ又は複数の選択可能なマーカーを含有する。
一つまたは複数の実施の形態において、上記目的のコード配列は、抗体のコード配列である。
一つまたは複数の実施の形態において、上記抗体は、ＰＤ−１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ４抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ抗体、ＣＤ４７抗体、ＣＤ１３７抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ２７抗体、ＯＸ４０抗体、ＤＮＡＭ−１抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＩＣＳＯＳ抗体、２Ｂ４抗体、ＣＤ１６０抗体、ＴＩＭ３抗体、ＬＡＧ３抗体、ＢＴＬＡ抗体とＴＩＧＩＴ抗体から選べられる；好ましくは、ＰＤ−１一本鎖抗体である。
一つまたは複数の実施の形態において、上記制限サイトは、ＡｓｃＩ制限サイト、ＸｂａＩ制限サイト、ＰｖｕＩ制限サイト、ＥｃｏＲＩ制限サイトとＳａｌＩ制限サイトから選べられる。
一つまたは複数の実施の形態において、上記ベクターの核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示された。
【００１４】
本発明が、さらに本文に記載された増強されたプロモーター配列が、外来遺伝子（例えば全長抗体遺伝子）のＴ細胞での発現を促進することにおける応用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】：各プロモーターヌクレオチド配列を持つ発現ベクターの構造の模式図。
【図２】：Ｔ細胞株で発現したｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰ、ｐＮＢ３３８Ａ−Ｅ−ＥＧＦＰ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰプラスミドの蛍光強度（図２Ａ）と陽性率（図２Ｂ）。
【図３】：Ｔ細胞株で発現したｐＮＢ３２８−Ｅ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３２８−ｈＣ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３２８−β−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−ＮｌｕｃプラスミドのＮｌｕｃ蛍光値。
【図４】：ｐＮＢ３２８−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３２８−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３２８−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−ｍ２７９Ｖプラスミドが、ＰＤ−１抗体発現を発現することの比較。
【図５】：ＥＦ１ａ及びｓＤＴＳ＋ＥＦ１ａプロモーターは、ＣＨＯ細胞におけるＥＧＦＰタンパク質の発現を仲介する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明に含まれる一部の用語を説明する。本明細書で特に定義がない限り、本明細書で使用される各用語は、当技術分野で公知されている意味を有することを理解すべく。
【００１７】
本発明において、用語「発現カセット」とは、作動可能に連結されたプロモーターおよび遺伝子コード配列を含む、遺伝子を発現するために必要な完全なエレメントを指す。
用語「コード配列」とは、核酸配列にそのタンパク質産物を直接に確定するアミノ酸配列部分を指す。コード配列の境界は、通常にｍＲＮＡの５  ’オープンリーディングフレームのすぐ上流のリボソーム結合部位（原核細胞の場合）と、ｍＲＮＡの３’オープンリーディングフレームのすぐ下流の転写終結配列によって決定される。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡと組換え核酸配列を含んでも良いが、それらに限定されない。
【００１８】
用語「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）とは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ区）アミノ酸配列と重鎖可変領域（ＶＨ区）アミノ酸配列をヒンジで連結してなる、抗原と結合する能を有する抗体フラグメントを指す。ある実施の形態において、目的な一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、目的の抗体から由来する。目的の抗体は、ヒトマウスキメラ抗体およびヒト化抗体を含むヒト抗体であっても良い。抗体は、分泌型と膜アンカー型であっても良い。
【００１９】
用語「作動可能に連結され」又は「作動可能に連結」とは、ＤＮＡ調節配列（例えばエンハンサー、プロモーターなど）が、目的のタンパク質のコード配列が発現できるように当該コード配列と連結することを指す。
【００２０】
本発明は、プロモーター活性を改良することにより、遺伝子の発現を促進する強度を向上させ、Ｔ細胞における外来遺伝子、特に全長抗体遺伝子の高効率発現を実現する。
【００２１】
本発明の増強されたプロモーター配列は、エンハンサーｓＤＴＳと、エンハンサーに作動可能に連結されたプロモーターからなり、ただし、上記エンハンサーｓＤＴＳの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された。
【００２２】
本発明の増強されたプロモーター配列におけるプロモーターは、本分野に通常にＴ細胞で外来遺伝子を発現するための各類プロモーター配列であっても良く、ＥＦ１αプロモーター、ＰＧＫプロモーター、β−ａｃｔｉｎプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、Ｕ６プロモーターとＳＶ４０プロモーターを含むが、それらに限定されない；好ましくは、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、ｈＣＭＶプロモーターとβ−ａｃｔｉｎプロモーターであり、より好ましくは、ＥＦ１αプロモーターである。例示的なＥＦ１αプロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：３に示されても良い；例示的なｈＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されても良い；例示的なβ−ａｃｔｉｎプロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されても良い。
【００２３】
ある実施の形態において、本発明の増強されたプロモーター配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４又は５からなり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３からなる。
【００２４】
本発明が、本文に記載された増強されたプロモーター配列を含む核酸コンストラクトを
含む。
【００２５】
ある実施の形態において、当該核酸コンストラクトは、本文に記載された増強されたプロモーター配列と目的のタンパク質のコード配列を含有する発現カセットである。発現カセットには、通常に、ホスト細胞に識別され、転写される配列を終了する転写終了配列（即、転写ターミネーター）を含有する。転写終了配列が、本文に記載されたコード配列と、３’末端に作動可能に連結する。選択されるホスト細胞において機能を有する任意なターミネーターは、本発明に用いられても良く、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ転写終了配列を含むが、それに限定されない。
【００２６】
ある実施の形態において、上記核酸コンストラクトは、ベクターである。ベクターは、通常にプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスとコスミドを含むが、それらに限定されない。ベクターは、一過性発現ベクター、ウイルス発現ベクターと転置可能なベクターを含む発現ベクターであっても良い。好ましくは、ベクターは、真核発現ベクターである。ベクターとして使えるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスとレンチウイルスを含むが、それらに限定されない。
【００２７】
通常に、好適なベクターが、ホスト細胞で機能する少なくとも一つの複製開始点、便利な制限エンドヌクレアーゼ制限サイトと一つ又は複数の選択可能なマーカーを含む。
選択可能な制限サイトが、ＡｓｃＩ制限サイト、ＸｂａＩ制限サイト、ＰｖｕＩ制限サイト、ＥｃｏＲＩ制限サイトとＳａｌＩ制限サイトを含むが、それらに限定されない。通常に、上記コード配列が、本発明的増強されたプロモーター配列と転写終了配列と、作動可能に連結されるように、ベクターには、一部の制限サイトが、本発明に記載された増強されたプロモーター配列と転写終了配列の間に位置し、当該位置でベクターを切断し、目的のタンパク質のコード配列を插入する。
【００２８】
ウイルスベクターに感染された細胞集団から発現細胞を同定・選択するために、選択可能なマーカーが、選択可能なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のうちのいずれか一つ又は両者を含む。有用な選択可能なマーカー遺伝子が、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。適合的レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含んでも良い。
【００２９】
ある実施の形態において、ベクターは、目的の遺伝子の発現カセットを、ホスト細胞のゲノムに組み込むためのベクターであり、好ましくは、転置可能なベクターである。ある実施の形態において、当該転置可能なベクターは、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ
ｂｅａｕｔｙ、ｆｒｏｇ  ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｎ５又はＴｙから選べられる転置因子を含む真核発現ベクターである。こんな転置可能なベクターが、対応するトランスポゾンの５’逆方向末端反復配列（５’ＬＴＲ）と対応するトランスポゾンの３’逆方向末端反復配列（３’ＬＴＲ）を含有する。トランスポゼースは、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、ｆｒｏｇ  ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｎ５又はＴｙ転置システムから由来するトランスポゼースであっても良い。異なる転置システムから由来するトランスポゼースを使用する際に、上記ベクターにおける５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの配列もそれに応じて、当該転置システムと適応する配列へ変化することは、当業者に容易的に確定されることである。
【００３０】
ある実施の形態において、トランスポゼースは、ｐｉｇｇｙｂａｃ転置システムから由来するトランスポゼースである。そして、これらの実施の形態において、トランスポゾン５’逆方向末端反復配列と３’逆方向末端反復配列は、それぞれにｐｉｇｇｙｂａｃトラ
ンスポゾンの５’逆方向末端反復配列と３’逆方向末端反復配列である。ある実施の形態において、トランスポゾン５’逆方向末端反復配列は、ＣＮ  ２０１５１０６３８９７４．７（その内容は引用の方式で本明細書に取り入られる）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された。ある実施の形態において、トランスポゾン３’逆方向末端反復配列は、ＣＮ  ２０１５１０６３８９７４．７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示された。ある実施の形態において、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゼースは、ｃ−ｍｙｃを含む核局在化シグナルコード配列のトランスポゼースである。ある実施の形態において、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゼースのコード配列は、ＣＮ  ２０１５１０６３８９７４．７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された。
トランスポゼースコード配列のプロモーターは、本分野に既知の、トランスポゼースコード配列の発現を制御するための各種プロモーターであっても良い。ある実施の形態において、ＣＭＶプロモーターで、トランスポゼースコード配列の発現を制御する。ＣＭＶプロモーターの配列は、ＣＮ  ２０１５１０６３８９７４．７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示された。
【００３１】
ある実施の形態において、本発明のベクターは、ＣＮ  ２０１５１０６３８９７４．７に開示されたｐＮＢ３２８ベクターを骨格とするが、本文に記載された増強されたプロモーター配列で、当該ベクターに元に含まれるＥＦ１αプロモーターを取り替える。
【００３２】
ある実施の形態において、本発明のベクターは空のベクターであり、即、目的のタンパク質のコード配列を含有しないものである。通常に、これらの空のベクターが、制限で目的のタンパク質のコード配列を、上記増強されたプロモーター配列と転写終了配列の間に連結するために、本文に記載された増強されたプロモーター配列、一つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼ制限サイトと転写終了配列を順に含有する。ある実施の形態において、本発明のベクターは、本文に記載された増強されたプロモーター配列と転写終了配列の間に、目的のタンパク質のコード配列を挿入したベクターであって、好ましくは転置可能なベクターである。これらのベクターにおいて、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に、本文に記載された増強されたプロモーター配列、目的のタンパク質のコード配列と転写終了配列を順に含有し、好ましくは、３’ＬＴＲの３’末端にトランスポゼースのコード配列及びそのプロモーター配列も含有する。
【００３３】
本発明が、本文に記載された各ヌクレオチド配列の相補配列も含む。本文の多ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ形式又はＲＮＡ形式であっても良い。
【００３４】
本文に記載されたヌクレオチド配列は、通常にＰＣＲ増幅法で得られる。具体的に、本文に開示されたヌクレオチド配列に従ってプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリー又は本分野の当業者が既知の一般的な方法で調整するｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、増幅で関連する配列を得られる。配列が長い場合、２回又は以上のＰＣＲ増幅を実行し、増幅されたフラグメントを正しい順序でつなぎ合わせることがよくある。ある実施の形態において、適切な場合、人工合成の方法で、本発明の特定のヌクレオチド配列を合成することができる。
【００３５】
本発明において、目的のタンパク質は、本分野に公知される各種のタンパク質、酵素、抗体及び必要な機能を持つ他のタンパク質を含むが、それらに限定されない。好ましくは、目的のタンパク質は、単鎖抗体、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などを含む、抗腫瘍効果を有する様々な抗体などの、Ｔ細胞で発現する必要がある当技術分野で既知のタンパク質である。
【００３６】
本発明の増強されたプロモーター配列は、Ｔ細胞における様々な抗体、好ましくは全長抗体の遺伝子発現を促進するのに特に適している。例示的な抗体が、ＰＤ−１抗体、ＰＤ
−Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ４抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０Ｌ抗体、ＣＤ４７抗体、ＣＤ１３７抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ２７抗体、ＯＸ４０抗体、ＤＮＡＭ−１抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＩＣＳＯＳ抗体、２Ｂ４抗体、ＣＤ１６０抗体、ＴＩＭ３抗体、ＬＡＧ３抗体、ＢＴＬＡ抗体とＴＩＧＩＴ抗体等を含むが、それらに限定されない。
【００３７】
ある実施の形態において、Ｔ細胞でＰＤ−１抗体を発現するために、又はＰＤ−１抗体の発現カセットをＴ細胞のゲノムに組み込むために、本発明の発現ベクターが、本文に記載された増強されたプロモーター配列とＰＤ−１抗体のコード配列を含有する。
【００３８】
従来のトランスフェクション法で、本発明のベクターを目的の細胞に導入することができる；これらの導入方法が、ウイルス形質導入、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント、遺伝子銃法による形質転換、電気による形質転換などを含むが、これらに限定されない。ある実施の形態において、電気による形質転換で、本文に記載されたベクターを、目的の細胞へトランスフェクトする。
【００３９】
目的の細胞は、当分野で公知される様々なＴ細胞であっても良く、末梢血Ｔリンパ球、細胞障害性キラーＴ細胞（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、サプレッサー／制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、サイトカイン誘発性キラー細胞（ＣＩＫ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびその他の混合細胞集団Ｔ細胞を含むが、それらに限定されない。ある実施の形態において、Ｔ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍患者のＰＢＭＣから由来しても良い。ある実施の形態において、Ｔ細胞は初代培養Ｔ細胞である。
【００４０】
そして、ある実施の形態において、本発明が、本文に記載された増強されたプロモーター配列が、外来遺伝子（例えば全長抗体遺伝子）のＴ細胞での発現を促進することにおける応用を提供する。
【００４１】
ある実施の形態において、本発明が、さらに本文に記載された増強されたプロモーター配列又は核酸コンストラクト又はベクターを含有するＴ細胞も提供する。好ましくは、上記Ｔ細胞のゲノムに、プロモーターとして、本文に記載された増強されたプロモーター配列を、目的の外来遺伝子が発現する発現カセットを促進するように組み込んでいる。より好ましくは、本発明のＴ細胞的ゲノムに、本文に記載された増強されたプロモーター配列と当該プロモーター配列と作動可能に連結されたＰＤ−１抗体のコード配列を含有する発現カセットを組み込んでいる。ある実施の形態において、本文に記載されたエンハンサー配列を含まないが同じプロモーター配列を含むコントロールＴ細胞と比較して、同じ条件下で測定された本発明のＴ細胞における目的のタンパク質の発現量は、コントロールＴ細胞における目的のタンパク質の発現量の少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、および少なくとも１．５倍である。
【００４２】
ある実施の形態において、本文に記載されたＰＤ−１抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示され、その例示的なコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示された。
【００４３】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明する。当業者は、以下の実施形態が本発明を例示するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解する。特定の技術または条件が実施例に示されていない場合、それは、当該分野の文献に記載されている技術または条件（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｈｕａｎｇ  Ｐｅｉｔａｎｇら翻訳、第３版、科学出版社の「分子クローニング実験ガイド」を参照する）に従って、または製品仕様に従って実行されるものとする。メーカーを標識していない試薬または機器は、いずれも市販される一般的な製品である。
【００４４】
実施例１：各プロモーターのヌクレオチド配列を持つ発現ベクターの構築
１．増強された緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ発現ベクターの構築
上海捷瑞生物会社に委託し、配列ｓＤＴＳ−ＬＴＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を合成し、ＡｓｃＩ制限サイトを配列の上流に導入し、ＸｂａＩ制限サイトをその下流に挿入し、それを、ＡｓｃＩ  ＋  ＸｂａＩで二重制限したｐＮＢ３２８ベクター（ｐＮＢ３２８ベクターの構造と配列については、ＣＮ  ２０１５１０６３８９７４．７を参照し、その全内容は、引用の方式で本明細書に取り入られる；ｐＮＢ３２８ベクターが、ＥＦ１αプロモーターを含む）にロードし、ｐＮＢ３３８Ａ−Ｅと呼ばれる組換えプラスミドを形成する。
【００４５】
上海捷瑞生物会社に委託し、配列ｓＤＴＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を合成し、ＸｂａＩ制限サイトを配列の上流に導入し、ＰｖｕＩ制限サイトをその下流に挿入し、それを、ＸｂａＩ＋ＰｖｕＩで二重制限したｐＮＢ３２８ベクターにロードし、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅと呼ばれるＥＦ１αを含む組換えプラスミドを形成する（その核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示された）。
【００４６】
上海捷瑞生物会社に委託し、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ遺伝子配列（その核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示された）を合成し、ＥｃｏＲＩ制限サイトを配列の上流に導入し、ＳａｌＩ制限サイトをその下流に挿入し、それを、ＥｃｏＲＩ＋ＳａｌＩで二重制限したｐＮＢ３２８ベクター、ｐＮＢ３３８Ａ−ＥベクターとｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅベクターにロードし、それぞれにｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰ、ｐＮＢ３３８Ａ−Ｅ−ＥＧＦＰとｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰと呼ばれる組換えプラスミドを形成する。
【００４７】
２．各種プロモーターを持つルシフェラーゼレポーター遺伝子発現ベクターの構築  
上海捷瑞生物会社に委託し、ｐＮＬ１．３．ＣＭＶ［ｓｅｃＮｌｕｃ−ＣＭＶ］プラスミドにおけるナノルシフェラーゼ（Ｎａｎｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、単にＮｌｕｃいう）遺伝子のコード配列（その核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された）、ＥｃｏＲＩ制限サイトを配列の上流に導入し、ＳａｌＩ制限サイトをその下流に挿入し、それを、ＥｃｏＲＩ＋ＳａｌＩで二重制限したｐＮＢ３２８−ＥベクターとｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅベクターにロードし、それぞれにｐＮＢ３２８−Ｅ−ＮｌｕｃとｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＮＬｕｃと呼ばれる組換えプラスミドを形成する。
【００４８】
上海捷瑞生物会社に委託し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されたｈＣＭＶプロモーターとβ−Ａｃｔｉｎプロモーターヌクレオチド配列を合成し、ＸｂａＩ制限サイトを配列の上流に導入し、ＥｃｏＲＩ制限サイトをその下流に挿入し、それを、ＸｂａＩ＋ＥｃｏＲＩで二重制限したｐＮＢ３２８−Ｅ−ＮＬｕｃベクター（元のｐＮＢ３２８−Ｅ−ＮＬｕｃベクターのＥＦ１αプロモーターを置き換える）にロードし、それぞれにｐＮＢ３２８−ｈＣ−ＮｌｕｃとｐＮＢ３２８−β−ＮＬｕｃと呼ばれる組換えプラスミドを構築する；同時に、それを、ＸｂａＩ＋ＥｃｏＲＩで二重制限したｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＮＬｕｃベクターにロードし、それぞれにｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ＮｌｕｃとｐＮＢ３３８Ｂ−β−ＮＬｕｃと呼ばれる組換えプラスミドを構築する。
【００４９】
３．各種プロモーターを持つＰＤ−１抗体発現ベクターの構築
上海捷瑞生物会社に委託し、ＰＤ−１抗体ヌクレオチド配列（核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示された）を合成し、ＥｃｏＲＩ制限サイトを配列の上流に導入し、ＳａｌＩ制限サイトをその下流に挿入し、それを、ＥｃｏＲＩ＋ＳａｌＩで二重制限したｐＮＢ３２８−Ｅ−ＮＬｕｃ  、ｐ
ＮＢ３２８−ｈＣ−ＮＬｕｃ、ｐＮＢ３２８−β−ＮＬｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＮＬｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ＮｌｕｃとｐＮＢ３３８Ｂ−β−ＮＬｕｃベクターにロードし、それぞれにｐＮＢ３２８−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３２８−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３２８−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ｍ２７９ＶとｐＮＢ３３８Ｂ−ｍ２７９Ｖと呼ばれる組換えプラスミドを形成する。
各発現ベクターの構造の模式図を図１に示す。
【００５０】
実施例２：Ｔ細胞の構築
Ｆｉｌｃｏｌｌ分離法で、ドナー血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣを２−４時間付着培養し、その中に、付着していない懸濁した細胞は、最初のＴ細胞である；懸濁した細胞を１５ｍｌ遠心チューブに集め、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨て、生理食塩水を加え、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、生理食塩水を捨て、このステップを繰り返した。
【００５１】
実施例２：Ｔ細胞の構
１．５ｍｌの遠心チューブ１５本を取り、各チューブに５×１０６個の細胞を加え、１−１５の番号を付け、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨て、エレクトロポレーションキット（Ｌｏｎｚａ製）を用意し、各チューブに１００ｕｌの比率でエレクトロポレーション試薬を加え、６ｕｇの上記プラスミドをチューブ１−１５に加え、細胞を別々に再懸濁し混合した；混合溶液をエレクトロポレーションカップに移し、それをエレクトロポレーション機器に入れ、必要な手順を選択し、電気ショックを実行した；キットにおけるマイクロピペットを使用し、エレクトロポレーションされた細胞懸濁液を、培養液（２％ＦＢＳを含むＡＩＭ−Ｖ培養液）を含む６ウェルプレートに移し、均一まで混合して、３７°Ｃ、５％ＣＯ２でインキュベートし、６時間後、刺激因子ＩＬ−２、ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で３−４日間培養し、Ｔ細胞の成長状況を観察し、ＥＧＦＰ、ＮｌｕｃおよびＰＤ−１抗体を発現するＴ細胞を取得した。
【００５２】
実施例３：ＥＧＦＰを発現するｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰ、ｐＮＢ３３８Ａ−Ｅ−ＥＧＦＰ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰプラスミドの比較・同定
実施例２で得られたプラスミドｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰ、ｐＮＢ３３８Ａ−Ｅ−ＥＧＦＰ、およびｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰで修飾された活性化Ｔ細胞を、エレクトロポレーション後８日目および１８日目にそれぞれ蛍光顕微鏡で観察し、５×１０５個の細胞ペレットを収集し、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、４００ｕｌ  ＰＢＳを加えて細胞をフローチューブに移し、機械でテストした。
【００５３】
結果を図２Ａち２Ｂおよび表１に示されたように、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰプラスミドの発現は、陽性率と蛍光強度ともｐＮＢ３３８Ａ−Ｅ−ＥＧＦＰプラスミドの発現よりも優れ、ｐＮＢ３３８Ａ−Ｅ−ＥＧＦＰプラスミドの発現は、陽性率と蛍光強度ともｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰプラスミドの発現よりも優れた。これは、ｓＤＴＳ配列を含むプラスミドの発現がｓＤＴＳ配列を含まないプラスミドの発現よりも強く、ｓＤＴＳ配列が、ＥＦ１αプロモーターの前と５’ＬＴＲの後に位置する方式で組み合わるプラスミド（ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰ）の発現がより強いことを示している。
【００５４】
【表１】
2021510080.tif 000002
【００５５】
実施例４：Ｎｌｕを発現するｐＮＢ３２８−Ｅ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３２８−ｈＣ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３２８−β−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−Ｎｌｕｃプラスミドの比較
実施例２に構築されたｐＮＢ３２８−Ｅ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３２８−ｈＣ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３２８−β−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−Ｎｌｕｃプラスミドで修飾された活性化Ｔ細胞を、７日目と１７日目に、２×１０６細胞の数で細胞を回収し、２×１０６細胞／ウェルで３ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地を入れた６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、２４時間培養した後、細胞上清を回収し、後で使用するために−２０℃で保存した。多機能マイクロプレートリーダーで、細胞上清へ分泌した新しいフルオレセインＮｌｕｃの蛍光値を検出した。
【００５６】
結果を下の図３と表２−４に示されたように、異なるプロモーター（ＥＦ１α／ｈＣＭＶ／β−Ａｃｔｉｎ）を持ち、ｓＤＴＳ配列を含むプラスミド（ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−Ｎｌｕｃ）が、ｓＤＴＳ配列を持たないが同じプロモーターを持つプラスミド（ｐＮＢ３２８−Ｅ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３２８−ｈＣ−Ｎｌｕｃ、ｐＮＢ３２８−β−Ｎｌｕｃ）よりも高い発現されたＮｌｕｃ蛍光値を持っている。
【００５７】
【表２】
2021510080.tif 000003
【００５８】
【表３】
2021510080.tif 000004
【００５９】
【表４】
2021510080.tif 000005
【００６０】
結果によって、異なるプロモーターの仲介で、ｓＤＴＳ配列を含む発現プラスミドのいずれかも、ｓＤＴＳ配列を含まないプラスミドより優れ、かつ発現しようとする遺伝子と関係ないことを知られる。
【００６１】
実施例５：ｐＮＢ３２８−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３２８−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３２８−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−ｍ２７９Ｖプラスミドが、ＰＤ−１抗体発現を発現することの比較
実施例２に構築されたｐＮＢ３２８−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３２８−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３２８−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−ｍ２７９Ｖプラスミドで修飾された活性化Ｔ細胞を、８日目と１８日目に、２×１０６細胞の数で細胞を回収し、２×１０６細胞／ウェルで３ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地を入れた６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、２４時間培養した後、細胞上清を回収し、後で使用するために−２０℃で保存した。二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡより、ヒト化の組換えタンパク質でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ＨＲＰ標識マウス抗ヒトＩｇＧ４  ｍＡｂの検出を行い、標準として市販の抗ＰＤ−１抗体を使用し、５０倍希釈後にサンプルを定量的に検出した。
【００６２】
結果を下の図４と表５−７に示されたように、異なるプロモーター（ＥＦ１α／ｈＣＭＶ／β−Ａｃｔｉｎ）を持ち、ｓＤＴＳ配列を含むプラスミド（ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−ｍ２７９Ｖ）が、ｓＤＴＳ配列を持たないが同じプロモーターを持つプラスミド（ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−β−ｍ２７９Ｖ）よりも高い発現されたＰＤ−１抗体の量を持っている。
【００６３】
【表５】
2021510080.tif 000006
【００６４】
【表６】
2021510080.tif 000007
【００６５】
【表７】
2021510080.tif 000008
【００６６】
これらの結果によって、異なるプロモーターの仲介で、ｓＤＴＳ配列を含む発現プラスミドのいずれかもｓＤＴＳ配列を含まないものより優れる；同時に、ｓＤＴＳ配列を含むプラスミドは、レポーター遺伝子の発現だけでなく、機能性タンパク質の発現にも優れていることも示している。
【００６７】
比較例１：ＥＦ１ａ及びｓＤＴＳ＋ＥＦ１ａプロモーターは、ＣＨＯ細胞におけるＥＧＦＰタンパク質の発現を仲介する
実施例１で構築されたｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰとｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰを使用し、それぞれにＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。具体的に、遠心チューブ２本を取り、各チューブに５×１０６個のＣＨＯ細胞を加え、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨て、エレクトロポレーションキット（Ｌｏｎｚａ製）を用意し、各チューブに比率で合計で１００ｕｌのエレクトロポレーション試薬を加え、各チューブに６ｕｇのｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰと６ｕｇのｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰを加え、細胞を別々に再懸濁し混合した；混合溶液をエレクトロポレーションカップに移し、それをエレクトロポレーション機器に入れ、必要な手順を選択し、電気ショックを実行した。エレクトロポレーション後、ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳ  １６４０  ／  ＤＭＥＭ（１：１混合）培地
で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。エレクトロポレーション後の８日目に、５×１０６の細胞ペレットを収集し、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、４００ｕｌ  ＰＢＳを加えて細胞をフローチューブに移し、機械でテストした。結果は、図５に示された。
【００６８】
８日目に、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰを導入したＣＨＯ細胞の陽性率は、ｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰを導入したＣＨＯ細胞の陽性率の約１．９倍である。実施例３には、８日目に、ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ＥＧＦＰを導入したＴ細胞の陽性率は、ｐＮＢ３２８−Ｅ−ＥＧＦＰを導入したＴ細胞の陽性率の約４．３倍である。この結果は、本発明の増強されたプロモーターが、Ｔ細胞におけるプロモーター転写の強度を特異的に増強することができることを示している。
【００６９】
比較例２：ｐＮＢ３３８ｈ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｈ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｈ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−β−ｍ２７９Ｖプラスミドが、ＰＤ−１抗体発現を発現することの比較
実施例１の方法でｐＮＢ３３８ｈ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｈ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｈ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−ｈＣ−ｍ２７９ＶとｐＮＢ３３８ｅ−β−ｍ２７９Ｖ組換えプラスミドを構築した；ｐＮＢ３３８Ｂ−Ｅ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８Ｂ−ｈＣ−ｍ２７９ＶとｐＮＢ３３８Ｂ−β−ｍ２７９Ｖとが異なり、ｐＮＢ３３８ｈ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｈ−ｈＣ−ｍ２７９ＶとｐＮＢ３３８ｈ−β−ｍ２７９Ｖには、ｓＤＴＳ配列の代わりにｈＣＭＶエンハンサー配列を使用し、ｐＮＢ３３８ｅ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−ｈＣ−ｍ２７９ＶとｐＮＢ３３８ｅ−β−ｍ２７９Ｖには、ｓＤＴＳ配列の代わりにＣＤ３ｅエンハンサーを使用した。
【００７０】
ｐＮＢ３３８ｈ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｈ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｈ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−β−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−ｈＣ−ｍ２７９Ｖ、ｐＮＢ３３８ｅ−β−ｍ２７９Ｖプラスミドで修飾された活性化Ｔ細胞を、８日目と１８日目に、２×１０６細胞の数で細胞を回収し、２×１０６細胞／ウェルで３ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地を入れた６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、２４時間培養した後、細胞上清を回収し、後で使用するために−２０℃で保存した。二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡより、ヒト化の組換えタンパク質でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ＨＲＰ標識マウス抗ヒトＩｇＧ４  ｍＡｂの検出を行い、標準として市販の抗ＰＤ−１抗体を使用し、５０倍希釈後にサンプルを定量的に検出した。
【００７１】
結果は、異なるプロモーターを持ち、ｓＤＴＳ配列を含むプラスミドが発現したＰＤ−１抗体の量は、いずれか対応するプロモーターを含み、ｈＣＭＶエンハンサー配列またはＣＤ３ｅエンハンサー配列を含むプラスミドよりも高いことを示した。
【００７２】
これらの結果は、異なるプロモーターの仲介で、ｓＤＴＳ配列を含む発現プラスミドが、他のエンハンサー配列プラスミドよりも優れていることを示した；同時に、ｓＤＴＳ配列を含むプラスミドが特定の遺伝子を発現する能は、遺伝子発現を仲介する他のエンハンサー配列よりも強いことも示した。
【図１】
2021510080.tif 000009
【図２】
2021510080.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
2021510080.tif 000013
【国際調査報告】
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2021510080.tif 000016
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