(57)【要約】  本発明は、とりわけ、対象に経口形態で提供可能であり、１０キロダルトン以上の質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せを有効成分として含む医薬組成物を調製する方法と関連する。１以上の有効成分は、腸による粒子の取込み、及び有効成分の血流中への放出を容易にするように、粒子状で分配される。そのような医薬組成物を調製する方法は、１以上の有効成分、単糖又は二糖、１以上の更なる化合物、及びキトサンを含む水性組成物を調製することと、並びに調製された水性組成物を、該組成物の水分画が可溶性又は混和性であり、該組成物の溶質は可溶性ではない逆溶媒及び／又は超臨界流体中に噴霧し、これにより該溶質を沈殿させ、平均直径が５０ナノメートル（ｎｍ）〜２０マイクロメートル（μｍ）の粒子を生成させることと、上記粒子を収集することと、上記粒子を含む医薬組成物を調製することとを含む。示された成分の均質な分布を含む、平均直径が５０ｎｍ〜２０μｍの粒子の収集物も提供される。疾患の治療で使用されるそのような粒子の収集物を含む経口投与剤形の医薬製剤も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身性有効成分を経口送達するための医薬組成物を調製する方法であって、
−  全身性有効成分として、組成物の乾燥重量の０．０２〜２５％の量で、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せ、
−  組成物の乾燥重量の２〜２５％の量で、単糖又は二糖、
−  組成物の乾燥重量の０〜１０％の量で、１つ又は複数の更なる化合物、
−  組成物の乾燥重量の少なくとも４８．３％の量で、キトサン
を含む水性組成物を調製することと、
調製された前記水性組成物を、前記組成物の水分画が可溶性又は混和性であり、前記組成物の溶質は可溶性ではない逆溶媒及び／又は超臨界流体中に噴霧し、これにより前記溶質を沈殿させ、平均直径が５０ナノメートル（ｎｍ）〜２０マイクロメートル（μｍ）の粒子を生成させることと、
前記粒子を収集することと、
前記全身性有効成分を含む前記粒子を含む経口送達用の医薬組成物を調製することと
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記逆溶媒が、超臨界ＣＯ２である、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、
前記超臨界ＣＯ２が、摂氏３０〜５５度の温度及び／又は少なくとも７３Ｂａｒの圧力を有する、方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法において、
前記調製された水性組成物が、最終水性組成物の乾燥重量として０．００１〜０．５％の量でアミノ酸を含む、方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法において、
前記調製された水性組成物が、透過エンハンサー、可溶化剤、乳化剤のうちの１つ若しくは複数、又はその組合せを含む、方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法において、
前記調製された水性組成物が、ポリソルベート２０〜８０及び／又はソルビタンステアレートを含む、方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法において、
前記有効成分が、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、酵素、細胞受容体に対する可溶性タンパク質リガンド、血液凝固系の因子、融合タンパク質、及び／又は抗体を含む、方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法において、
前記有効成分が、インターフェロン、エリスロポエチン、抗体、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ヴィルブランド因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、エタネルセプト、又はプロリダーゼを含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により取得可能な、平均直径が５０ｎｍ〜２０μｍの粒子の収集物。
【請求項１０】
平均直径が５０ｎｍ〜２０μｍの粒子の収集物であって、
−  有効成分として、粒子の乾燥重量の０．０２〜２５％の量で、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せ、
−  粒子の乾燥重量の２〜２５％の量で、単糖又は二糖、
−  粒子の乾燥重量の０〜１０％の量で、１つ又は複数の更なる化合物、
−  粒子の乾燥重量の少なくとも４８．３％の量で、キトサン
の均質な分布を含む、粒子の収集物。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載の粒子の収集物において、
前記有効成分が、抗体、好ましくはオマリズマブ抗体を含む、粒子の収集物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の粒子の収集物において、
−  粒子の乾燥重量の５〜２５％のオマリズマブ、
−  粒子の乾燥重量の２．５〜２０％のスクロース、
−  粒子の乾燥重量の０．０２５〜０．２％のポリソルベート２０〜８０、
−  粒子の乾燥重量の２．５〜１０％のアミノ酸、
−  粒子の乾燥重量の少なくとも４４．８％のキトサン、
を含む、粒子の収集物。
【請求項１３】
有効成分として、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を治療上意義のある量でそれを必要とする対象の血液に送達する方法であって、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法に基づき、前記タンパク質又は前記核酸分子を含む医薬組成物を調製することと、前記医薬組成物を前記対象に経口投与することとを含む方法。
【請求項１４】
経口投与剤形であり、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の粒子の収集物を含む、疾患の治療で使用される医薬製剤。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用される医薬製剤において、
前記投与剤形が、錠剤、ハード又はソフトカプセル、カプレット、ロゼンジ、ピル、ミニ錠剤、ペレット、又は粉末である、医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的ポリマー、例えばタンパク質及び核酸分子等を胃腸送達するための医薬製剤に関する。本発明は、そのような製剤を製造するための方法とも関連する。
【背景技術】
【０００２】
経口経路により送達される、生物学的高分子を含有する粒子の胃腸系経由の取込みは、一連のバリア、例えば局所的低ｐＨ、消化酵素、及び受動取込みを妨害する粘液層の存在を通じて妨げられる（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  Ｐ．、Ａｒｔｕｓｓｏｎ  Ｐ．、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ、第１０６巻：２５６〜２７６頁，２０１６年、及びＭｕｈｅｅｍ  Ａ．ら、Ｓａｕｄｉ  Ｐｈａｒｍ  Ｊ、第２４巻（４号）：３７９〜５０６頁，２０１６年）．
【０００３】
消化管は、生体分子の取込みを促進するいくつかの系を含む。これらの系のほとんどは、特定の物質に対して特異的である。最近、粒子も腸バリアを横断することができることが明らかにされた。粒子が辿る正確な経路は不明であり、また粒子の種類に応じて異なる可能性がある。いくつかの試験は、いくつかの粒子はＭ細胞及びいわゆるパイエル板を経由して移動することを示唆する。
【０００４】
胃の過酷な環境を通過する方法は容易に入手可能である。そのような方法として、錠剤又はピルの腸溶コーティング、遅延放出製剤、及び酸性環境に対して抵抗性であるカプセルが挙げられるが、但しこれらに限定されない。そのような送達媒体は、好ましくは、胃を通過した後に放出される粒子を含む。そのような胃通過性の送達媒体は、実質的にそのままの粒子を胃通過後の環境に送達する。そのような環境は、好ましくは、小腸及び／又は結腸である。小腸内での放出を促進するトリガーは、有利には、ｐＨ、所定の時間が経過した後に、例えば徐放性若しくは遅延放出処方物等内で媒体が分解するのを可能にする時間、及び／又は消化酵素の存在であり得る。結腸内での放出を促進するトリガーは、有利には、例えば遅延性又は徐放性の処方物内での時間であり得る。遅延放出処方物は、一般的に、所定の時間が経過した後、速やかにその内容物を放出する。徐放性処方物は、一般的に、より長期間にわたり連続的に放出し、放出は特定の時点又は環境の変化又はその他のシグナルにより惹起され、放出は経時的に一定であり得るが、但し一定である必要はない。胃の低ｐＨから保護された後、残りの消化管は、微絨毛内に吸収腸細胞のような系を含む。腸壁上での受動及び能動輸送機構は、粒子取込みの標的となり得る。粒子に生体分子を負荷すれば、粒子から血流中への生体分子の放出を促進することができる。
【０００５】
生物学的に活性な高分子（生物学的製剤）の経口送達がこれまでの課題となっているが、小型の生物学的製剤に限りある程度成功したにすぎない。Ｍｉｌｌｏｔｔｉら（２０１１年）は、ヒトインスリンを経口送達するためのキトサン−６−メルカプトニコチン酸粒子の調製について記載する。分子サイズが６ｋＤａ未満のインスリンは、それ自体では腸壁を通過しないが、しかしチオール化したキトサンを含む粒子と会合したとき、バイオアベイラビリティーは低いながらも通過する（Ｍｉｌｌｏｔｔｉら、２０１１年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第１８巻（３号）、１９０〜１９７頁）。
【０００６】
１０〜５００ｋＤａの範囲のｋＤａを有するタンパク質、及びオリゴヌクレオチドは、現在のところ、静脈内注射又は皮下注射のみにより送達される。経口製剤中のペプチド及びタンパク質はバイオアベイラビリティーが低い（＜１０％）ことから、より良い手段及び方法に対する広範な研究が開始された。そのような研究は、とりわけ、透過エンハンサーの使用に関係したが、結果はまちまちである（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｋ．ら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、第２５巻（８号）：１７８２〜１７８８頁、２００７年；Ｙｅｗａｌｅ  Ｃ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒａｐ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第３２巻（５号）：２３６〜３８７頁、２０１５年を参照）。これらの方法は、一般的な実践法にまでなおも発展させなければならない。
【０００７】
本発明は、粒子及び粒子を作成する方法を提供し、それを用いることで腸バリアを効率的に横断することが可能であり、血流中に流入したら、トラップされたタンパク質又は核酸分子を効率的に生物学的に利用可能にする。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、１つ又は複数の有効成分、単糖又は二糖、１つ又は複数の更なる化合物及びキトサンを含む水性組成物を調製すること、調製された水性組成物を、該組成物の水分画が可溶性又は混和性であり、該組成物の溶質は可溶性ではない逆溶媒及び／又は超臨界流体中に噴霧し、これにより該溶質を沈殿させ、平均直径が５０ナノメートル（ｎｍ）〜２０マイクロメートル（μｍ）の粒子を生成させること、前記粒子を収集すること、並びに前記粒子を含む医薬組成物を調製することを含む、有効成分として１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せを含む医薬組成物を調製する方法を提供する。平均直径が５０ｎｍ〜２０μｍの粒子の収集物であって、示された成分の均質な分布を含む、粒子の収集物も提供される。示された成分は特許請求の範囲で特定され、並びに有効成分（１０キロダルトン又はそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド又はそれより長い核酸分子）、キトサン、及びその他の示された成分を含む。疾患の治療で使用されるそのような粒子の収集物を含む経口投与剤形の医薬製剤も提供される。
【０００９】
１つの実施形態では、
−  有効成分として、組成物の乾燥重量の０．０２〜２５％の量で、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せ、
−  組成物の乾燥重量の２〜２５％の量で、単糖又は二糖、
−  組成物の乾燥重量の０〜１０％の量で、１つ又は複数の更なる化合物、
−  組成物の乾燥重量の少なくとも４８．３％の量で、キトサン、
を含む水性組成物を調製することと、
調製された水性組成物を、該組成物の水分画が可溶性又は混和性であり、該組成物の溶質は可溶性ではない逆溶媒及び／又は超臨界流体中に噴霧し、これにより該溶質を沈殿させ、平均直径が５０ナノメートル（ｎｍ）〜２０マイクロメートル（μｍ）の粒子を生成させることと、
前記粒子を収集することと、前記粒子を含む医薬組成物を調製することと
を含む、医薬組成物を調製する方法が提供される。
【００１０】
−  全身性有効成分として、組成物の乾燥重量の０．０２〜２５％の量で、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せ、
−  組成物の乾燥重量の２〜２５％の量で、単糖又は二糖、
−  組成物の乾燥重量の０〜１０％の量で、１つ又は複数の更なる化合物、
−  組成物の乾燥重量の少なくとも４８．３％の量で、キトサン、
を含む水性組成物を調製することと、
調製された水性組成物を、該組成物の水分画が可溶性又は混和性であり、該組成物の溶質は可溶性ではない逆溶媒及び／又は超臨界流体中に噴霧し、これにより該溶質を沈殿させ、平均直径が５０ナノメートル（ｎｍ）〜２０マイクロメートル（μｍ）の粒子を生成させることと、
前記粒子を収集することと、前記全身性有効成分を含む前記粒子を含む経口送達用の医薬組成物を調製することと
を含む、全身性有効成分を経口送達するための医薬組成物を調製する方法も提供される。
【００１１】
調製された水性組成物は、好ましくは、組成物の乾燥重量の０〜８％、好ましくは０〜６％、好ましくは０〜４％、好ましくは０〜２％、好ましくは０〜１．７％の量で、１つ又は複数の更なる化合物を含む。
【００１２】
１つの実施形態では、本発明は、
−  有効成分として、組成物の乾燥重量の０．０２〜２５％の量で、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せ、
−  組成物の乾燥重量の２〜２５％の量で、単糖又は二糖、
−  組成物の乾燥重量の０〜１．７％の量で、１つ又は複数の更なる化合物、
−  組成物の乾燥重量の少なくとも４８．３％の量で、キトサン、
を含む水性組成物を調製することと、
調製された水性組成物を、該組成物の水分画が可溶性又は混和性であり、該組成物の溶質は可溶性ではない逆溶媒及び／又は超臨界流体中に噴霧し、これにより該溶質を沈殿させ、平均直径が５０ナノメートル（ｎｍ）〜２０マイクロメートル（μｍ）の粒子を生成させることと、
前記粒子を収集することと、前記粒子を含む医薬組成物を調製することと
を含む、医薬組成物を調製する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、
−  ○有効成分として、最終水性組成物の０．００１〜１．５重量％の量で、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せ、
○最終水性組成物の０．１〜１．５重量％の量で、単糖又は二糖、
○最終水性組成物の０．０〜０．５、好ましくは０．１重量％の量で、１つ又は複数の更なる化合物、
○最終水性組成物の少なくとも０．５重量％の量で、キトサン、
を含む水性組成物を調製することと、
−  調製された水性組成物を、該組成物の水分画が可溶性又は混和性であり、該組成物の溶質は可溶性ではない逆溶媒中に噴霧することと、
−  溶質を沈殿させ、これにより平均直径が５０ナノメートル（ｎｍ）〜２０マイクロメートル（μｍ）の粒子を生成させることと、
−  前記粒子を収集することと、
前記粒子を含む医薬組成物を調製することと
を含む、医薬組成物を調製する方法を提供する。
【００１４】
調製された水性組成物は、好ましくは、最終水性組成物の０．０〜０．４重量％、最終水性組成物の好ましくは０．０〜０．３重量％、好ましくは０．０〜０．２重量％、及び好ましくは０．０〜０．１重量％の量で、１つ又は複数の更なる化合物を含む。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載されるような方法により取得可能な、平均直径が５０ｎｍ〜２０μｍの粒子の収集物を更に提供する。
【００１６】
本明細書に記載されるような医薬組成物を調製する方法は、好ましくは、調製された粒子又は粒子の収集物を含む、経口投与剤形を調製することを更に含む。
【００１７】
調製された医薬組成物は、好ましくは、全身性有効成分を経口送達するための医薬組成物である。
【００１８】
平均直径が５０ｎｍ〜２０μｍの粒子の収集物であって、
−  有効成分として、粒子の乾燥重量の０．０２〜２５％の量で、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せ、
−  粒子の乾燥重量の２〜２５％の量で、単糖又は二糖、
−  粒子の乾燥重量の０．０〜１０、好ましくは０．０〜８、好ましくは０．０〜６、好ましくは０．０〜４、好ましくは０．０〜２、好ましくは１．７％の量で、１つ又は複数の更なる化合物、
−  粒子の乾燥重量の少なくとも４８．３％の量で、キトサン
の均質な分布を含む、粒子の収集物も提供される。
【００１９】
有効成分として、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せを治療上意義のある量でそれを必要とする対象の血液に送達する方法が更に提供され、該方法は、本明細書に記載されるような方法に基づき、タンパク質又は核酸分子を含む医薬組成物を調製すること、及び前記医薬組成物を前記対象に経口投与することを含む。
【００２０】
疾患の治療で使用される、本明細書に記載されるような粒子の収集物を含む、経口投与剤形の医薬製剤も提供される。製剤は、好ましくは固体投与剤形である。好ましくは、分子質量が１０キロダルトンのタンパク質として抗体を含む、本明細書に記載されるような粒子の収集物、有効成分として、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を治療上意義のある量でそれを必要とする対象の血液に送達する方法が更に提供され、該方法は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に基づき、タンパク質又は核酸分子を含む医薬組成物を調製すること、及び前記医薬組成物を前記対象に経口投与することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
有効成分は、許容性（Permissive）の生体系に提供されたとき、生物学的効果を有する成分である。それは、それを必要とする個人に投与した際に、その治療効果が期待されるような成分であるのが一般的である。それは、それ自体が、或いは１つ若しくは複数のその他の分子及び／又は細胞と組み合わせたときに治療効果を有し得る。その他の分子及び／又は細胞は、同一の医薬組成物内若しくは異なる医薬組成物内に存在し得る、又は個人内部にすでに存在し得る。
【００２２】
有効成分は、個人の循環器に投与又は提供されたときに生物学的効果を有する成分である。そのような成分は、全身性有効成分とも呼ばれる。理論に拘泥するものではないが、本発明の粒子、粒子の収集物、組成物及び医薬組成物、並びに本明細書に記載される前記粒子を含むその他の手段は、成分を充填し、前記成分に対して胃腸管内安定性を提供し、及び胃腸管から血流への成分の輸送を促進することができると考えられている。粒子は、充填された成分が対象の血液中に徐放されるのを促進すると更に考えられている。これは、特に分子量約１００〜３００ｋＤａのタンパク質、例えば抗体等を含む成分のｉ．ｖ．注射と比較したとき、幅広いバイオアベイラビリティーをもたらす。有効成分は、医薬（medicament）とも呼ばれ得る。
【００２３】
本発明で使用される有効成分は、好ましくは水に可溶性である。用語「水に可溶性」又は「水溶性」とは、有効成分の水への溶解度は、一般的に、２０℃において、水１００ｍｌ当たり約１ｇ以上、好ましくは約３ｇ以上、より好ましくは約５ｇ以上であることを意味する。好ましくは、有効成分は水に容易に可溶である。用語「水に容易に可溶性」とは、生理学的に活性な物質の水への溶解度は、２０℃において、水１００ｍｌ当たり約５ｇ以上、好ましくは約１０ｇ以上であることを意味する。
【００２４】
有効成分は、化学物質又は生体分子であり得る。有効成分は、好ましくは１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せである。医薬組成物は、１つ、２つ、３つの有効成分、又はそれより多くの有効成分さえも含み得る。タンパク質の場合、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有する有効成分、核酸分子の場合、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い有効成分、又はそれらが組み合わされた有効成分すべての総量は、水性組成物の０．００１〜１．５重量％、好ましくは水性組成物の０．０１〜１．５％、より好ましくは０．０５〜１．５％、より好ましくは０．１〜０．５重量％である。示された質量のタンパク質又は示された数のヌクレオチド長の核酸分子に該当しない有効成分も、粒子中に存在することができるが、その場合、水性組成物の最終重量に対するその重量は、「１つ又は複数の更なる化合物」として記載される。水性組成物中の有効成分量の上限は１．５％であり得る。
【００２５】
有効成分は、好ましくは、６０以上のアミノ酸残基から構成されるタンパク質である。このタンパク質には、細胞の機構により合成されたタンパク質、翻訳後に修飾されたタンパク質、ポリペプチド、その誘導体が含まれる。有効成分は、ペプチド様の構造を有する化合物であり得る。タンパク質は、好ましくは約１０キロダルトン若しくはそれより大きい、好ましくは１５キロダルトン若しくはそれより大きい、より好ましくは２０、３０、５０、７５、１００、１２５、若しくは１５０キロダルトン、又はそれより大きい分子量を有する。好ましい実施形態では、タンパク質は、１００〜２０，０００キロダルトンの分子量を有する。本発明は、１００キロダルトンを超える分子量のタンパク質にとって特に有用である。いくつかの実施形態では、タンパク質は抗体である。抗体は、一般的に１００〜３００キロダルトンの質量を有する。タンパク質は、従って、好ましくは、１００〜３００キロダルトン、好ましくはおよそ１００〜２００キロダルトンの分子量を有する。本発明は、より長期間にわたり反復して投与される必要のあるタンパク質又は核酸分子に特に適する。多くのタンパク質及び核酸分子は、針を通じて多かれ少なかれ侵襲的な方法で投与される。多くの場合、これは、医薬は有資格者により、一般的に病院内で投与されることを必要とする。本発明の医薬組成物は経口により投与可能である。本発明の医薬組成物は、胃腸管から他の身体に栄養分を移送する血流に、腸管腔からかなりの量の有効成分が移送されるのを促進する。すべてではないが、胃腸管からの血液のほとんどが、肝臓を通過した後、他の身体に分配される。一般的に、２０％又はそれより多くの有効成分が移送される。好ましい実施形態では、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％が血流に移送される。
【００２６】
用語「質量」、「分子質量」、又は「分子量」、「サイズ」、又は「分子サイズ」は、本明細書に記載されるような粒子内にあるタンパク質に関連して、及び／又は本明細書に記載されるような有効成分に関連して交換可能に使用される。例えば、抗体の質量、又は抗体の分子質量、又は抗体の分子量は、一般的に１００〜３００キロダルトンである。
【００２７】
二糖は、好ましくは生体適合性及び生分解性の二糖である。二糖は、グリコシド結合により連結した２つの単糖を有する。非限定的な例は、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、及びマルトースである。好ましい実施形態では、少なくとも１つの単糖はグルコースである。好ましい実施形態では、グリコシド結合はグルコシド（glucosidic）結合である。好ましい実施形態では、二糖は、化学式Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１を有する。特に好ましい実施形態では、二糖はスクロースである。
【００２８】
単糖又は二糖は、好ましくは、最終水性組成物の０．０１〜１．５重量％の量で、好ましくは、最終水性組成物の０．０１〜０．２５重量％の量で存在する。単糖又は二糖は、好ましくは、最終水性組成物の０．１〜１．５重量％の量で、好ましくは、最終水性組成物の０．１〜０．２５重量％の量で存在する。水性組成物に含まれる単糖又は二糖の量の上限は２％であり得る。
【００２９】
キトサンは、ランダムに分布したβ−（１＞４）結合型のＤ−グルコサミン（脱アセチル化ユニット）及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化ユニット）から構成される直鎖状多糖である。それは、甲殻類（カニ及び小エビ等）の外骨格及び菌類の細胞壁における構造要素であるキチンの脱アセチル化により生成可能である。脱アセチル化の程度（％ＤＤ）は、ＮＭＲ分光法により決定可能である。本発明のキトサン内の％ＤＤの程度は、６０〜１００％の範囲である。平均して、本発明のキトサンの分子量は、３８００〜２０，０００ダルトンである。キトサンを生成する方法は当技術分野において知られている。キトサンを合成する一般的な方法は、試薬として過剰の水酸化ナトリウム及び溶媒として水を使用する、キチンの脱アセチル化である。今日、キトサンは、化学的にも合成可能である。本発明で使用されるようなキトサンは、一般的に弱塩基であり、また水及び有機溶媒に不溶性である。しかしながら、キトサンは、グルコサミンユニットを可溶性の形態Ｒ−ＮＨ３＋に変換することができる希薄な酸性水溶液（ｐＨ＜６．５）に可溶性である（Ｋｕｍａｒ、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ、Ｓａｓｈｉｗａ、＆Ｄｏｍｂ、２００４）。本発明で使用されるようなキトサンは、室温及び大気圧において、１０ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満の量で水に溶解する。
【００３０】
キトサンは、好ましくは、最終水性組成物の少なくとも１重量％、最終水性組成物の好ましくは２重量％、好ましくは４重量％、より好ましくは８重量％、より好ましくは少なくとも１６重量％の量で存在する。キトサンは、好ましくは、最終水性組成物の１〜１０重量％の量で存在する。
【００３１】
粒子は、水性組成物を逆溶媒中に噴霧することにより、及び／又は水性組成物を超臨界流体中に噴霧することにより生成される。好ましい実施形態では、調製された水性組成物は、該組成物の水分画が可溶性又は混和性であるが、該組成物の溶質は可溶性ではない逆溶媒中に噴霧される。組成物の水分画は、逆溶媒及び／又は超臨界流体に溶解可能である。水性組成物中の溶媒及び／又は小滴若しくは粒子は、逆溶媒及び／又は超臨界流体に実質的に不溶性であるのが一般的である。小滴は、エマルジョン、コロイド、及び／又は分散物の状態で存在することができる。もちろん、水溶液は、逆溶媒及び／又は超臨界流体中に速溶性である溶質、粒子又は小滴を含むということも考え得る。そのようなケースでは、溶質、粒子、又は小滴は、一般的に、逆溶媒及び／又は超臨界流体内で形成される粒子にはそれほど寄与しない。好ましい実施形態では、逆溶媒は超臨界流体である。
【００３２】
本発明の方法により生成される粒子は、好ましくは、５０ｎｍ〜２０μｍ、好ましくは５０ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは５０ｎｍ〜５μｍ、好ましくは５０ｎｍ〜１μｍの平均直径を有する。粒径分布を記載する際の最も一般的に使用されるメトリクスは、Ｄ値である。Ｄ値、例えばＤ１０、Ｄ５０、及びＤ９０等は、累積質量の１０％、５０％、及び９０％に対する切片である。生成される粒子の代表的な例：
Ｄ１０（ｎｍ）  Ｄ５０（ｎｍ）  Ｄ９０（ｎｍ）
１０４          ２８５            ８５４
【００３３】
Ｄ１０値は、より小さい直径を有する粒子が、収集物内に存在する全粒子の総質量の１０％に当たる質量を全体として有する直径を表す。同様に、Ｄ５０値は、より小さい直径を有する粒子が、収集物内に存在する全粒子の総質量の５０％に当たる質量を全体として有する直径を表す。粒子の収集物のＤ５０値及び直径分布は、下記の噴霧変数：温度、ノズルサイズと形状、圧力、ＣＯ２流速、溶液流速、噴霧される液体の組成により影響を受け得る。
本明細書において粒子の平均直径について触れる場合、収集物のＤ５０値を指す。好ましい実施形態では、粒子は５０〜５００ｎｍの平均直径を有する。
【００３４】
国際公開第２００５／００４８３８号は、キトサン誘導体を含むタンパク質を鼻腔内送達するための製剤について記載する。該製剤は、タンパク質粒子と可溶性キトサンのブレンド品を含む。可溶性キトサンは、室温及び大気圧において、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの量で水に溶解するキトサンの誘導体である。該製剤は、少なくともタンパク質及びキトサンについて均質な分布を有する粒子を含まない。Ｋａｓｈｉｄらは、薬物粒子の粒子サイズ及び形態は粒子状鼻腔医薬品にとって重要な特性をなすと述べている。粒子サイズ及び形態は薬物の溶解と関連し、また鼻孔内で好適な薬物溶解特性を取得するためにコントロールされるべきである。シミュレートされた好適な流体について、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での溶解速度が検討されるべきである。粒子サイズ及び形態は、ざらついた感じ及び鼻腔に対する炎症の可能性を最低限に抑えるためにも重要である。５ミクロン未満の過剰に微細な粒子は、肺中に吸入されるおそれがあり、鼻腔用製品として避けるべきである。一般的に、５〜１０ミクロンの範囲内の粒子が鼻孔内に配置される（Ｋａｓｈｉｄら（２０１６年）、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５巻、８９１〜９１２頁）、ＤＯＩ１０．２０９５９／ｗｊｐｒ２０１６６−６４２７）。
【００３５】
超臨界流体は、好ましくは、摂氏３０〜５５度の温度を有する。好適な超臨界流体の例は、エタン、プロパン、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、又は二酸化炭素（ＣＯ２）である。超臨界流体は、好ましくは、超臨界ＣＯ２である。超臨界流体の圧力は、もちろん、超臨界流体の超臨界状態を惹起するのに十分高い。ＣＯ２の場合、圧力は、好ましくは、少なくとも７３Ｂａｒである。好ましくは、圧力は少なくとも１００Ｂａｒであり、より好ましくは、圧力は１００〜１８０Ｂａｒである。
【００３６】
システムを微調整するために調整可能であることが当業者にとって知られているパラメーターの中でも、ＣＯ２及び水性組成物の流速は代表的なパラメーターである。好適な速度は、ＣＯ２について１５０〜３５０ｋｇ／時であり、また水性組成物について２〜８ｍｌ／分である。同様に、水性組成物が噴霧されるノズルのサイズ及び形状は、望み通りに変更可能であることを当業者は知っている。
【００３７】
１つ又は複数の更なる化合物は、代表的な薬学的添加物、例えば１つ又は複数のアミノ酸、粘着防止剤、バインダー、コーティング、着色剤、崩壊剤、着香剤、滑剤、潤滑剤、防腐剤、吸着剤、甘味料等、又はその組合せ等であり得るが、但しこれらに限定されない。１つ又は複数の更なる化合物も、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せである有効成分を含むことができる。
【００３８】
１つ又は複数の更なる化合物は、最終水性組成物の０〜１０重量％の量で、最終水性組成物の好ましくは０．０００〜０．５重量％、より好ましくは０．００５〜０．５重量％、好ましくは０．０５〜０．５重量％、好ましくは０．０〜０．１重量％、好ましくは０．００５〜０．１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％、好ましくは０．０５〜０．１重量％の量で存在することができる。
【００３９】
１つの実施形態では、調製された水性組成物は、最終水性組成物の０．００５〜０．０１５重量％の量でアミノ酸を含み、範囲の下限は、好ましくは０．００５、より好ましくは０．０１である。上限は、好ましくは０．０１５、より好ましくは０．０１である。任意の範囲下限が、任意の範囲上限と組み合わせることができる。範囲は、最終水性組成物の好ましくは０．００１〜０．５、より好ましくは０．０１〜０．２５、より好ましくは０．０２〜０．１重量％である。
【００４０】
アミノ酸は、好ましくはヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、又はグルタミンである。アミノ酸は、好ましくはヒスチジン、リジン、又はアルギニンである。好ましくは、アミノ酸はヒスチジンである。２つ又はそれより多くのアミノ酸が存在するとき、そのうちの少なくとも１つは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、又はグルタミンである。好ましい実施形態では、そのうちの２つ又はそれより多くは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、及びグルタミンからなる群より選択される。好ましくは、そのうちの少なくとも１つはヒスチジンである。
【００４１】
調製された水性組成物は、好ましくは、透過エンハンサー、可溶化剤、乳化剤のうちの１つ若しくは複数、又はその組合せを含む。その安全性プロファイル及び有効性に基づき、双性イオン界面活性剤である、又は含窒素環を有する、又は陰イオン界面活性剤である、但しこれらに限定されない透過増強化学物質は、高分子を含有するナノ粒子を用いた処置に対する好ましい付加物である。
【００４２】
難水溶性薬物の水への溶解度は、可溶化剤の作用を通じて強化され得る。可溶化剤は、有効成分のバイオアベイラビリティーを増加させることができる。周知の可溶化剤はシクロデキストリンである。水性組成物は、ポリソルベート２０〜８０及び／又はソルビタンステアレートを含み得る。
【００４３】
最終水性組成物内の水の含有量は変化し得る。当業者は、より濃縮された又はより稀釈された組成物を、望み通りに使用することができる。水に対する乾燥重量の比は、１−２０、１−３０、１−４０、１−５０、１−６０、１−７０、１−８０、１−９０、１−１００、１−１２０、１−１４０、１−１６０、１−１８０、１−２００以下であり得る。好ましい実施形態では、最終水性組成物内の水に対する乾燥重量の比は、丸めると１−２５から１−２００、好ましくは１−３０から１−１６０；好ましくは１−５０から１−１００、好ましくは１：２７から１：１６６の範囲である。
【００４４】
有効成分は、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、酵素、細胞受容体に対する可溶性タンパク質リガンド、血液凝固系の因子、融合タンパク質、及び／又は抗体を含み得る。２つ又はそれより多くの有効成分の場合、すべての成分は、オリゴヌクレオチド、タンパク質、又はその組合せであり得る。有効成分の組合せは、原則として非限定的である。
【００４５】
核酸分子は、好ましくはオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖である。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、細胞内の特定の転写物について、そのレベルを操作することを理由に現在検討されている。オリゴヌクレオチドは、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓタイプのゲノム編集アプローチに対するガイドとしても使用される。また、オリゴヌクレオチドは、複製及び非複製遺伝子発現カセット、例えば核酸ワクチン、遺伝子療法媒体等としても使用されるが、但しこれらに限定されない。２つ又はそれより多くの有効成分の場合、２つ又はそれより多くのオリゴヌクレオチド、好ましくは２つ又はそれより多くの、１５ヌクレオチド又はそれ超のオリゴヌクレオチドを有することが好ましい。２つ又はそれより多くのオリゴヌクレオチドは、複数の異なる標的、一つの標的の異なる複数の位置にある同一の標的、又はその組合せを標的とし得る。本明細書で参照するような核酸分子内の１５又はそれより多いヌクレオチドの数は、核酸分子の長さを指す。例えば、それぞれ１５ヌクレオチドからなる、相互にハイブリダイズした２本の相補的一本鎖オリゴヌクレオチドを有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、長さ１５ヌクレオチドの核酸分子又はオリゴヌクレオチドといわれる。核酸分子は、好ましくは長さ１５〜１０，０００ヌクレオチド、好ましくは長さ１５〜５，０００、より好ましくは長さ１５〜２，０００ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成され得る長さのオリゴヌクレオチドである。一般的に、そのようなオリゴヌクレオチドは、１５〜６０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは長さ１５〜４０、より好ましくは長さ１５〜２５のヌクレオチドを有する。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。オリゴヌクレオチドは時に１５ヌクレオチドより短い場合もある。オリゴヌクレオチドは人工骨格を有し得る。そのような人工骨格として、ロックド（Locked）核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］ウリジン（ＭＣＥ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、又はその組合せが挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【００４６】
サイトカインは、細胞シグナル伝達において重要であるタンパク質の広いカテゴリーである。その放出は、その周辺にある細胞の挙動に対して効果を有する。サイトカインは、免疫調節剤として、自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達、及び内分泌シグナル伝達に関与しているということができる。サイトカインとして、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子を挙げることができる。
【００４７】
酵素はタンパク質性の触媒である。酵素は化学反応を加速させる。酵素が作用し得る分子は基質と呼ばれ、酵素は基質を生成物として知られている異なる分子に変換する。細胞内のほとんどすべての代謝プロセスは、生命を持続するのに十分速い速度で生ずるように、酵素触媒反応を必要とする。様々な酵素がいわゆる酵素置換療法のテーマである。置換療法は、身体内で不足している又は存在しない酵素の置換を目的とする。今日、これは、酵素を含有する溶液の静脈内（ＩＶ）輸液、又は天然の免疫系から遮蔽された酵素のデポを用いた皮下注射を患者に施すことによりなされる。置換療法は、いくつかのリソソーム蓄積症：ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ、及びポンペ病に利用可能である。アデノシンデアミナーゼ及びプロリダーゼは、酵素補充療法のその他の非限定的な例である。本発明の粒子を用いれば、酵素を経口により投与することが今や可能となる。
【００４８】
多くの細胞は、細胞受容体に結合する分子に対して受容性である。そのような分子は、ステロイド及びその他の小分子であり得る。多くの場合、そのような受容体は、１０ｋＤａ又はそれより大きいタンパク質性リガンドに対する受容体である。このタンパク質性分子は、一般的にシグナル伝達タンパク質である。そのようなシグナル伝達タンパク質は、増殖因子、例えばＥＧＦ、ＷＮＴ３等の、但しこれに限定されないＷＮＴタンパク質、骨形態形成タンパク質等であり得るが、但しこれらに限定されない。タンパク質性リガンドは、可溶性であり得る、又は可溶性にすることができる。例えば、細胞膜関連タンパク質の場合、膜貫通領域及び細胞質領域（もしあれば）とＦｃ尾部との交換による。有効成分は血液凝固系の因子であり得る。血液凝固系（凝固）は、細胞（血小板）コンポーネント及びタンパク質（凝固因子）コンポーネントの両方と関係する。凝固は、凝固と相互作用し、それを刺激するタンパク質のカスケードにより誘発される。これは凝固カスケードと呼ばれる。それは、組織因子経路（いわゆる外因性の経路）、接触活性化経路（固有の経路）、及び一般的な経路を含む。様々な因子が同定されている。それらは様々な名称で呼ばれている。多くの場合、それらは単純に番号で、すなわち第Ｉ〜ＸＩＩＩ因子と呼ばれる。その他の因子は、例えばフォン・ヴィルブランド因子、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、プラスミノーゲン等である。
【００４９】
有効成分は融合タンパク質であり得る。膜タンパク質の細胞外部分を可溶化するために、融合タンパク質を作成することができる。有効成分はその他の理由からも融合体であり得る。
【００５０】
好ましい実施形態では、有効成分は抗体である。抗体は、多くの状況において非常に有用である。抗体のいくつかある欠点の１つとして、抗体は、１日のある期間にわたって投与されなければならず、またｉｖ注射、滴下溶液、筋肉内注射等の形態で、針を通じて投与されなければならないことが挙げられる。本発明の実施形態のいくつかある長所の１つとして、より大きなタンパク質、例えば抗体等（付加物、例えば毒素、標識、更なる結合ユニット等に応じて、ＩｇＧが１２０〜１８０ｋＤａの代表的な平均サイズを有する場合）は、経口投与した際に、実質的に非修飾の形態で有効に取り込まれるようになることが挙げられる。抗体は任意のアイソタイプの抗体であり得る。抗体は、好ましくはＩｇＧ、及びＩｇＡ、ＩｇＭ、又はその組合せである。抗体は、モノクローナル抗体であり得る。抗体は、二重特異性抗体であり得る。様々なその他の手段、例えば三重特異性抗体又はそれより多重の特異性抗体等も、今日生成されている。
【００５１】
好ましい実施形態では、方法は、２つ又はそれより多くの有効成分を提供することを含む。本実施形態では、有効成分は、２つ又はそれより多くの異なる抗体を含むことが好ましい。抗体は、１つの同一標的分子上の異なるエピトープを標的とすることができる。一般的に、抗体は、異なる複数の標的分子上の異なる複数のエピトープを標的とすることができる。１つ又は複数の抗がん抗体が好ましい。その他の好ましい抗体は、ワクチンの文脈において病原体に対する抗体、又は例えば自己免疫疾患の文脈においては１つ若しくは複数の炎症促進性サイトカインに対する抗体、又は蕁麻疹、アレルギー、喘息、及びアレルギー性喘息の治療における抗体である。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、有効成分は、抗体、又はその誘導体若しくは類似体の抗原結合部分である。好適な部分は、ＦＡＢ断片、単鎖Ｆｖ断片、及びその他のモダリティーである。ナノボディ及びモノボディが使用可能であり、ラクダ抗体、例えば一本鎖重鎖抗体等が使用可能である。結合ペプチドが使用可能である。好適なペプチドは、例えば、実質的に高次構造的な制約を受けるペプチドであるいわゆるバイシクルである。抗体の一部分の誘導体及び類似体は、同一の一般的構造、例えば免疫グロブリンフォールド等を有するが、但し異なるアミノ酸配列を有するペプチドである。類似体は、異なる構造を有するが、但し抗体と類似した結合特性を有するタンパク質、例えば可溶性Ｔ細胞受容体等である。
【００５３】
抗体又はその一部分、誘導体、及び／又は類似体も、やはり薬物コンジュゲートであり得る。そのような薬物コンジュゲートの非限定的な例は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ナノボディ薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）、単鎖Ｆｖ薬物コンジュゲートである。
【００５４】
好ましい実施形態では、有効成分は、インターフェロン、エリスロポエチン、抗体、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ヴィルブランド因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、エタネルセプト、又はプロリダーゼである。特に好ましい実施形態では、抗体はオマリズマブである。
【００５５】
本発明は、本発明の方法により取得可能な、平均直径５０ｎｍ〜２０μｍを有する粒子の収集物を更に提供する。
【００５６】
平均直径５０ｎｍ〜２０μｍを有する粒子の収集物であって、
−  有効成分として、粒子の乾燥重量の０．０２〜２５％の量で、１０キロダルトン若しくはそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子、又はその組合せ、
−  粒子の乾燥重量の２〜２５％の量で、単糖又は二糖、
−  粒子の乾燥重量の０〜１０％、好ましくは０〜８％、好ましくは０〜６％、好ましくは０〜４％、好ましくは０〜２％、好ましくは０．０〜１．７％の量で、１つ又は複数の更なる化合物
−  粒子の乾燥重量の少なくとも４８．３％、及び好ましくは少なくとも５０％の量で、キトサン
の均質な分布を含む、粒子の収集物も提供される。
【００５７】
有効成分、単糖又は二糖、１つ又は複数の更なる化合物、キトサンは、粒子を生成する方法について記載されているものと同様である。１つの好ましい実施形態では、粒子の有効成分は、抗体、好ましくはオマリズマブ抗体である。
【００５８】
本明細書に記載されるような粒子の収集物において、有効成分は、好ましくは、粒子の乾燥重量の０．０２〜２５％の量で存在する。好ましくは、有効成分は、粒子の乾燥重量の０．２〜２０％、好ましくは粒子の乾燥重量の０．４〜１５％、好ましくは粒子の乾燥重量の１．０〜１０％の量で存在する。１つより多くの有効成分が存在するとき、示された範囲は、すべての有効成分の合計に関する。単糖又は二糖は、好ましくは、粒子の乾燥重量の２〜２５％、好ましくは１〜１５％、好ましくは１〜１２％の量で、粒子の乾燥重量の好ましくは２〜１０％、より好ましくは３〜８％、好ましくは４〜６％の量で存在する。これらの範囲における単糖又は二糖の好ましい下限は２％である。１つ又は複数の更なる化合物は、好ましくは、粒子の乾燥重量の０〜１２％、好ましくは０〜１０％の量で存在する。好ましくは、１つ又は複数の更なる化合物は、粒子の乾燥重量の０〜５％、好ましくは０．１〜５％、好ましくは０．５〜５％の量で、好ましくは２〜４％の量で存在する。１つ又は複数の更なる化合物は、好ましくは、粒子の乾燥重量の０．０〜１．７％、好ましくは０．１〜１．７、より好ましくは０．２〜１、より好ましくは０．４〜０．８％の量で存在する。キトサンは、好ましくは、粒子の乾燥重量の少なくとも４８．３％、及び好ましくは少なくとも５０％、及びより好ましくは少なくとも６０％の量で存在する。１つの実施形態では、キトサンは、粒子の乾燥重量の少なくとも７０％の量で存在する。本明細書において、収集物内の粒子の列挙された成分の重量を足し算しても１００％に達しない場合、残りの重量は、１つ又は複数の好適な薬学的添加物から一般的に構成される。一般的に、キトサンの重量は、その他の成分とキトサンの重量の合計が、収集物内の粒子の乾燥重量の１００％となるよう選択される。換言すれば、化合物の％が選択され、残りは、１００％となるまでキトサンが占める。
本明細書に記載されるような粒子の収集物は、粒子の総重量の０〜１０％；好ましくは１〜１０％、粒子の総重量の好ましくは１〜８％、より好ましくは１〜６％、より好ましくは１〜４％の含水量を有し得る。
【００５９】
収集物内の粒子は、均質な組成を一般的に有する。医薬品は、２つ又はそれより多くの異なる粒子の収集物を含み得るが、その場合、粒子の収集物それぞれは、該医薬品内のその他の粒子の収集物の組成と異なる均質な組成を有する。好ましくは、但し必ずしもそうではないが、前記１つ又は複数のその他の収集物は、本発明の収集物でもある。複数の収集物の実施形態が、特に有効成分のうちの２つ又はそれより多くが異なる放出プロファイルを必要とするとき、２つ又はそれより多くの有効成分を投与するのに有用である。医薬品が、２つ又はそれより多くの異なる粒子の収集物を有する場合、収集物の少なくとも１つは、特許請求の範囲に規定するような、成分の均質な分布を有し、有効成分（１０キロダルトン又はそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド又はそれより長い核酸分子）とキトサンとを含む粒子から構成される。好ましい実施形態では、２つ又はそれより多くの異なる粒子の収集物のそれぞれは、特許請求の範囲に規定するような、成分の均質な分布を有し、有効成分（１０キロダルトン又はそれより大きい質量を有するタンパク質、１５ヌクレオチド又はそれより長い核酸分子）とキトサンとを含む粒子から構成される。
【００６０】
好ましい実施形態では、粒子の収集物は、
−  粒子の乾燥重量の０．０２〜２５％、好ましくは０．２〜２０％、好ましくは０．４〜１５％、又は好ましくは１．０〜１０％の１つ又は複数の有効成分、
−  粒子の乾燥重量の２〜２５％、２．５〜１５％、２．５〜１２％、２．５〜１０％、より好ましくは３〜８％、好ましくは４〜６％のスクロース、
−  粒子の乾燥重量の０．２〜１％のポリソルベート２０〜８０、
−  粒子の乾燥重量の０．１〜０．３％の１つ又は複数のアミノ酸、
−  粒子の乾燥重量の少なくとも４８．７％、及び好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％のキトサンを含む。
【００６１】
好ましい実施形態では、粒子の収集物は、
−  粒子の乾燥重量の５〜２５％のオマリズマブ、
−  粒子の乾燥重量の２〜２５％のスクロース、
−  粒子の乾燥重量の０．２〜１％のポリソルベート２０〜８０、
−  粒子の乾燥重量の０．１〜０．３％の１つ又は複数のアミノ酸、
−  粒子の乾燥重量の少なくとも４８．７、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも６０％のキトサンを含む。
【００６２】
粒子の収集物内の水分の重量は、本明細書において上記したように、例えば粒子の総重量の１〜１０％、好ましくは約５〜１０％等であり得るが、但しこれらに限定されない。
【００６３】
本発明の方法を用いて生成される粒子、及び粒子の収集物、及び粒子を含む医薬組成物は、いずれもいわゆる固体粒子を指し、これらは、好ましくは２０％又はそれより低い、好ましくは１０％又はそれより低い水（水分）含有量の堅固な内部を有する。含水量は、一般的に粒子の総重量に基づき１〜１０％である。有効成分を含む粒子の様々なコンポーネントは、一般的に粒子内で均質に分布している。粒子又は粒子の収集物は、もちろん、コーティング可能、又はその他の材料に組込み可能である。
【００６４】
本発明は、本発明に基づく粒子の収集物を含む徐放性組成物を更に提供する。徐放性組成物は、血流中に存在するとき、充填された有効成分を放出することができる。
【００６５】
本発明は、有効成分として、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を、それを必要とする対象の血液に、好ましくは治療上意義のある量で送達する方法を更に提供し、該方法は、本発明の方法に基づきタンパク質又は核酸分子を含む医薬組成物を調製すること、及び前記医薬組成物を前記対象に経口投与することを含む。疾患の治療で使用される、本発明の粒子の収集物を含む経口投与剤形、好ましくは固体経口投与剤形の医薬製剤も提供される。固体投与剤形は、好ましくは錠剤、ハード又はソフトカプセル、カプレット、ロゼンジ、ピル、ミニタブレット、ペレット、又は粉末である。非固体投与剤形の非限定的な例は、ゲル、液体又はゲルを含むカプセル等である。
【００６６】
有効成分として、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を、それを必要とする対象の血液に、好ましくは治療上意義のある量で送達する際に使用される、本明細書に記載されるような粒子の収集物を含むこと、本明細書に記載されるような有効成分として、前記１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を含む、粒子の収集物を含む固体経口投与剤形の調製を含むことに基づく医薬組成物が更に提供され、その場合、前記経口投与剤形は経口により前記対象に投与される。
【００６７】
有効成分として、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を、それを必要とする対象の血液に、好ましくは治療上意義のある量で送達する際に使用される、本明細書に記載されるような粒子の収集物を含むこと、本明細書に記載されるような有効成分として、前記１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を含む、粒子の収集物を含む固体投与剤形の調製を含むことに基づく医薬組成物が更に提供され、その場合、前記経口投与剤形は前記対象に経口投与される。
【００６８】
有効成分として、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を、好ましくは治療上意義のある量で含む、疾患の全身治療で使用される、本明細書に記載されるような粒子又は粒子の収集物を含む経口投与剤形の医薬組成物が更に提供される。疾患は、好ましくはがん、免疫疾患、又は感染症である。好ましくは、微生物、例えばウイルス、（マイコ）バクテリア、又は寄生虫等による感染症。
【００６９】
本発明は、有効成分の経口送達用の医薬を製造するための、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を有効成分として含む粒子又は粒子の収集物の使用を更に提供する。本発明は、経口投与剤形の医薬を製造するための、１０ｋＤａ若しくはそれより大きいタンパク質、又は１５ヌクレオチド若しくはそれより長い核酸分子を有効成分として含む粒子又は粒子の収集物の使用を更に提供する。
【００７０】
本発明の粒子は、好ましくは、腸管への医薬の経口送達に適するシステム中にパッケージングされる。そのような方法は、錠剤又はピルの腸溶性コーティング、遅延放出製剤、及び酸性環境に抵抗性のカプセルを含むが、但しこれらに限定されない。胃内低ｐＨからの保護の後、残りの消化管は、微絨毛内に吸収性腸細胞のようなシステムを含有する。腸壁上の能動輸送機構は、粒子の取込みにおいて、標的とされる可能性がある。本発明の粒子は、粒子から血流中への生体分子の放出を促進する。理論に拘泥するものではないが、粒子は少なくとも部分的にそのままの状態で腸壁を通じて移動すると考えられている。
【００７１】
ほぼ球状の粒子の直径は、粒子を貫く最長軸を決定し、最大表面積を有する直角方向の断面を選択し、表面端部上の２ポイントを通過する最長ラインの距離を選択することにより決定可能である。
【００７２】
粒子の直径を測定する好ましい方法は、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）による、又はＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）による。
【００７３】
用語「水分」とは、本明細書で使用する場合、粒子内の水を意味する。この水は、一般的に遊離形態で存在するのではなく、粒子内の乾燥材料と会合している。
【００７４】
明確化及び簡潔な説明を目的として、特性が同一の実施形態又は異なる実施形態の一部として本明細書に記載されているが、しかしながら、本発明の範囲は、記載されている特性の全部又は一部の組合せを有する実施形態を含み得るものと認識される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】超臨界装置設定の例について図式的概観を示す図である。
【図２】キトサン粒子を示す図である。キトサン中に１％のＩＦＮを含む。
【図３】ＨＰＬＣにより測定されたキトサンからのＩＦＮ放出を示す図である。
【図４】室温で６及び１２ヶ月経過後のインターフェロン／キトサン粒子の安定性を示す図である。
【図５】オマリズマブが明らかにそのままの状態で残留したことを表すＳＤＳ―ＰＡＧＥを示す図である。
【図６】走査型電子顕微鏡による球状粒子を示す図である。
【図７】ラットにおける十二指腸内投与後の血清オマリズマブレベルを示す図である。
【図８】参照オマリズマブ及び放出されたオマリズマブのＨＰＬＣプロファイルの重ね合わせを示す図である。
【図９】ＣＤ分析を示す図である。
【図１０】融解曲線分析を示す図である。
【図１１】バッチ分析におけるＮ−グリカン（％）を示す図である。
【図１２】サンプル１（左側）及び２（右側）に関する連続沈降係数分布を示す図である。
【図１３】レーン５内の、注射後のＸｏｌａｉｒ  ＩｇＧ（ｔ＝０）とアミン結合ＩｇＥ表面との間のＳＰＲ相互作用分析を示す図である（２９９３ＲＵのタンパク質を含有する）。
【図１４】レーン５内の、注射後のＢＰ００１  ＤＳ  ＩｇＧサンプル（ｔ＝０）とアミン結合ＩｇＥ表面との間のＳＰＲ相互作用分析を示す図である（２９９３ＲＵのタンパク質を含有する）。
【図１５】レーン６内の、注射後のオマリズマブ（ｔ＝６ヶ月）とアミン結合ＩｇＥ表面との間のＳＰＲ相互作用を示す図である（２４９４ＲＵのタンパク質を含有する）。
【図１６】レーン６内の、注射後のＢＰ００１「ＤＰｉｎＰＢＳ」サンプルとアミン結合ＩｇＥ表面との間のＳＰＲ相互作用を示す図である（２４９４ＲＵのタンパク質を含有する）。
【図１７】サンプル１（４４８５Ａ）及びサンプル２（４４８５Ｂ）のスペクトルを統合した、円偏光二色性の分析を示す図である。
【図１８】サンプル１（４４８５Ａ）及びサンプル２（４４８５Ｂ）のスペクトルを統合した、溶融曲線分析を示す図である。
【図１９】沈降速度分析を示す図である。サンプル１（４４８５Ａ）及びサンプル２（４４８５Ｂ）の連続沈降係数分布の重ね合わせ。
【図２０】サンプル１及びサンプル２と固定化されたヒトＩｇＥとの結合を測定する速度論的滴定実験を示す図である。各繰返し測定では、単一サイクル内で４つの（漸増する）ＩｇＧ濃度を注入した。２回の結合実験を各パネルに示す。黒線の重なりは、１：１相互作用モデルに対するデータの全体的な近似を表す。
【図２１】図２０の結合データの１：１結合モデルへの近似に由来する速度論的及びアフィニティーパラメーターを示す図である。線は、サンプル１（橙色）、サンプル２（青色）、及びＸｏｌａｉｒ（登録商標）参照（赤色）を表す。
【図２２】経口及び皮下投与後のミニブタ（minipig）におけるオマリズマブ血清レベルを示す図である。
【実施例】
【００７６】
実施例１
例えば粒子の腸溶性コーティング、粒子又はその粒子を含有するカプセルを含む胃通過性の錠剤による胃内低ｐＨからの保護の後、残りの消化管は、微絨毛内に吸収性腸細胞のようなシステム、選択的分子に対する腸壁上での能動輸送機構、粒子の取り込みとその後の粒子中に存在し血流中に放出される生物学的製剤を放出するために標的となり得るシステムを含む。
【００７７】
本発明の粒子は、腸の第１の部分（ｐＨ８）内ではタンパク質はほとんど放出されない特性を有し得る。粒子は、腸壁上での輸送を可能にする。血液循環内に至ると、有効成分は放出される（ｐＨ７．４）。好ましくは、血液中での有効成分に関する放出プロファイルは、持続的プロファイルである。これは、有効成分は長期にわたり放出されることを意味する。
【００７８】
生物学的に活性な高分子（生物学的製剤）を経口送達することは今日までの課題であり、また分子サイズが６ｋＤａ未満のインスリンのような小型の生物学的製剤においてある程度成功したにすぎず、その結果もたらされたバイオアベイラビリティーは低い。表１は、経口製剤において興味深いと思われる高分子の非限定的な例とそのｋＤａを示す。
【００７９】
表１
高分子                              約ＭＷ（ｋＤａ）
インスリン                                      ６
カルシトニン                                    ３
インターフェロンアルファ−２ａ                １７
エリスロポエチン                              ２１
モノクローナル抗体                          １４６
アンチセンスオリゴヌクレオチド                  ６
第ＶＩＩＩ因子                              ２８０
第ＩＸ因子                                    ５６
フォン・ヴィルブランド因子    ８００−２０，０００
ＴＮＦ                                        ２６
ＧＨ                                          ２２
エタネルセプト（エンブレル）                １５０
融合タンパク質                        ７５−５００
プロリダーゼ                                １０８
【００８０】
１０〜５００ｋＤａの範囲のｋＤａを有する生物学的製剤は、現在のところ静脈内又は皮下注射のみにより送達されるが、経口経路は長期療法にとってきわめて好ましい。
【００８１】
経口製剤中のペプチド及びタンパク質のバイオアベイラビリティーは低い（＜１０％）ので、透過エンハンサーの使用が開始されたが、結果はまちまちである。
【００８２】
材料及び方法
複雑な高分子をカプセル化するために本出願で使用される技術は、生物学的製剤用に固形製剤を創出する代替的方法としての超臨界二酸化炭素技術に基づく。
【００８３】
この技術の前提は、高温及び高圧（３０℃／７３Ｂａｒ）において、ＣＯ２は超臨界となる、すなわち「超臨界状態にある」ことである。このような条件下では、ＣＯ２は気体の高拡散性と液体の溶媒和能力を併せ持つ。
【００８４】
高圧に対して安全に耐えることができ、また水性組成物をＣＯ２が超臨界状態にある圧力チャンバー中に噴霧している際に、いくつかのパラメーターを変更する能力を有する特別な専用機器が、この技術で使用される。図１。
【００８５】
この方法を通じて、タンパク質及び添加物を含有する水性組成物をノズル経由で噴霧することにより、固体粒子は取得可能である。その後、ｓｃＣＯ２は溶媒を効率的に抽出し、直径分布の幅が狭い、完全に無溶媒の粉末をもたらす。ＣＯ２廃棄物は水分画を含有する。
【００８６】
この粒子の直径は、ナノメートル（ｎｍ）〜マイクロメーター（μｍ）の範囲であり得る。
【００８７】
非溶剤プロセスの条件は比較的穏和なので、生物学的活性を高く保持したまま、乾燥したタンパク質粒子製剤を創出することが可能になる。粉末特性は、圧力、温度、ノズル寸法、溶液の流速、ＣＯ２の流速、タンパク質の濃度、並びに添加物の性質及び濃度等の様々なパラメーターのコントロールにより調節可能である。
【００８８】
【表１】
2021528498.tif 000002
【００８９】
【表２】
2021528498.tif 000003
【００９０】
噴霧する前に、このキトサンを、酢酸（ｐＨ３）を用いて酸性化された水に最初に溶解した。その後、噴霧直前に、タンパク質をこの溶液に溶解した。
【００９１】
乾燥した粉末カプセルを、容器底部のフィルター上でトラップし、実験終了時に手作業により収集した。乾燥した粉末を、更なる特徴付けまで冷蔵庫（２〜８℃）中で保管した。
【００９２】
タンパク質放出テスト
粉末（ＢＣＡ用に２０ｍｇ又はＨＰＬＣテスト用に２００ｍｇ）を試験管に秤量する。各チューブに対して、容積（ＢＣＡテストにつき１ｍｌ又はＨＰＬＣテストにつき１０ｍｌ）放出媒体を添加する。放出媒体は、血液のｐＨを模倣するバッファー系としてｐＨ７．４のＰＢＳ、又は腸のｐＨを模倣するバッファー系としてｐＨ８のリン酸バッファーである。
【００９３】
粒子懸濁物を含むチューブは、ローラーバンク上で３７℃に保つ。サンプリングを０．５、１、１．５、２、４、７、１７、及び２４時間に実施する（別途表示されない限り）。各サンプルポイントにおいて、放出媒体の半分をチューブから取り出し（短時間遠心分離して粒子を沈殿させた後）、同量の新鮮な媒体を懸濁物に添加して放出テストを継続する。タンパク質レベルを、ＱｕａｎｔｉＰｒｏ  ＢＣＡアッセイキット又はＨＰＬＣを使用して決定する。
【００９４】
結果
サイトカインインターフェロン−アルファ−２ａ（ＩＦＮ）
粒子内に埋め込まれた市販のバイオシミラーインターフェロンアルファ−２ａ（ＩＦＮ）に関する試験。
キトサンの水溶液を超臨界ＣＯ２中に噴霧した。キトサンを、酢酸（ｐＨ３）を用いて酸性化された水に溶解した。噴霧する直前にＩＦＮを溶解した。
【００９５】
【表３】
2021528498.tif 000004
【００９６】
【表４】
2021528498.tif 000005
【００９７】
材料を、粒径（ＳＥＭ；ＤＬＳ）、ＩＦＮの負荷（ＨＰＬＣ）、及びＩＦＮの放出について特徴づけた。構造的完全性（structural integrity）をＳＤＳ―ＰＡＧＥを使用してテストした。
【００９８】
ｓｃＣＯ２中での噴霧乾燥
噴霧実験を、１〜２グラムの固体スケールにおいて実施した。タンパク質（ＩＦＮ）に対するポリマーの比は、９９対１パーセントであった。固体を水６０グラムに溶解した。
この小スケール噴霧実験における粉末収率（回収された固体の量）は、一般的に４０〜８０パーセントであった。
【００９９】
粉末の特徴付け（ＳＥＭ）、図２
粉末の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による特徴付けから、キトサンベースの粉末は直径１〜１０ミクロンの間で変化する球状粒子をもたらすことが明らかとなった。
【０１００】
粒子内のタンパク質負荷
キトサンベースの粒子では、ｐＨ４の酢酸内で粒子をインキュベートすることにより、キトサンを溶解すること、及び粒子内のＩＦＮを決定するためにＨＰＬＣに注入可能である溶液を取得することが可能であることが証明された。
【０１０１】
キトサン内の１％のＩＦＮについて、２つの異なるバッチを三重で溶解した。
結果を４表に示す。
【０１０２】
【表５】
2021528498.tif 000006
【０１０３】
タンパク質放出テスト
タンパク質放出テストを、ＢＣＡタンパク質アッセイ法を使用して実施した。生成した粒子は、ＢＣＡアッセイ法を使用したとき、ｐＨ７．４において２４時間以内に最大８０％のＩＦＮを放出すると思われた。図３。
【０１０４】
ＩＦＮ／キトサン粒子の安定性を１年間にわたり実証した。粒子は、１年の保管期間後に一定した放出プロファイルを維持した。図４。
【０１０５】
結論
カプセル化されたインターフェロンアルファ−ａを含む粒子が、放出プロファイル及び負荷効率に関して良好な再現性を有するｓｃＣＯ２技術を使用することで生成され得る。
【０１０６】
モノクローナル抗体、オマリズマブ
粒子に埋め込まれたオマリズマブに関する試験
キトサンの水溶液を超臨界ＣＯ２中に噴霧した。キトサンを、酢酸（ｐＨ３）を用いて酸性化された水に溶解した。噴霧直前に抗体（オマリズマブ）を溶解した。
【０１０７】
【表６】
2021528498.tif 000007
【０１０８】
【表７】
2021528498.tif 000008
【０１０９】
材料を、粒径（ＳＥＭ；ＤＬＳ）、オマリズマブの負荷（ＨＰＬＣ）、及びオマリズマブの放出について特徴づけた。構造的完全性を、ＥＬＩＳＡ及びＳＤＳ―ＰＡＧＥを使用してテストした。
【０１１０】
オマリズマブの負荷
５ｍｇの粒子を、オーバーナイト又はそれより長い期間、３７℃のストーブ内でローリングさせることにより、ｐＨ４で１．５ｍｌの酢酸に溶解した。溶解したら、溶液を０．４５μｍフィルター上でフィルター処理を行い、ＨＰＬＣによる分析前に、視認できるほど大きくはないあらゆる粒子を取り除いた。
【０１１１】
オマリズマブの放出
１０ｍｇの粒子を、ＰＢＳ（血液中での放出を模倣する）又は腸内での放出を模倣するｐＨ８のリン酸バッファーに懸濁した。懸濁物を３７℃で継続してローリングさせた。所定の時間間隔をおいて、ＨＰＬＣによる分析前に、粒子最上部から透明なバッファーをピペット吸引し、０．４５μｍ上で濾過した。
【０１１２】
Ｅｌｉｓａ
ＥＬＩＳＡを市販キットを使用して実施した。ＨＰＬＣにより決定した濃度に基づき、サンプルを最高濃度のキャリブレータの濃度の四分の一まで稀釈した。
【０１１３】
ＳＤＳ―ＰＡＧＥ
およそ２μｇのタンパク質を、４〜２０％トリスＨＣｌゲルのスロットに負荷した。ゲルを９０Ｖで５分間泳動し、その後１８０分間、電圧を適用した。総泳動時間は４５〜６０分であった。クーマシーブリリアントブルーを使用してゲルを染色した。
【０１１４】
結果
粒子の負荷
初期実験における粒子の負荷は、キトサンの１６％に設定したが、実測によれば１４％の実負荷であり得ることを示唆した。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡ
生物学的完全性は、ＥＬＩＳＡの結果に基づき、カプセル化及びその後の放出の後でもそのままの状態であると思われる。
【０１１６】
ＳＤＳ―ＰＡＧＥ
この実験から、オマリズマブ（ＴＭ０１９２）はそのままの状態に留まったのは明らかである。図５。
【０１１７】
粒径及びＳＥＭ
粒径を、動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して決定した。生成した大部分の粒子において、粒径は約５００ｎｍである。図６のＳＥＭは、該粒子を示している。
【０１１８】
ラットにおけるバイオアベイラビリティー
十二指腸内投与後に、ラットにおけるカプセル化されたオマリズマブのバイオアベイラビリティーを評価するために、ラットに十二指腸内投与した。ラット１８匹を３群に分割した。群１に、０．２ｍｌのオマリズマブの溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を投与した。群２及び群３には、バッファー（群２）、及び透過エンハンサーを含むバッファー（群３）に懸濁した２００μｌのオマリズマブ粒子懸濁物（１０ｍｇ／ｍｌ）を投与した。実験終了時にラットを絶命させ、血液血清を収集した。１、４、及び２４時間後に、血清を収集した（各時点、二重）。オマリズマブの血清レベルをＥＬＩＳＡキットで測定した。図７。
【０１１９】
現行の粒径を用いれば、カプセル化されたタンパク質は腸に取り込まれ、その後血液中に放出されることを示している。
【０１２０】
透過エンハンサーの想定される効果は、おそらくは大量の基礎摂取により隠蔽された。有意な効果は、透過エンハンサーについて認められなかった。これは、キトサン粒子には、バイオアベイラビリティーが高い抗体がすでに含まれていることにより説明され得る。キトサンそのものが、それ自体透過エンハンサーであることが知られている。
【０１２１】
結論
カプセル化されたオマリズマブを含む粒子が、放出プロファイル及び負荷効率に関して良好な再現性を有するｓｃＣＯ２技術を使用することで生成され得る。
【０１２２】
それに加えて、オマリズマブ分子の化学的及び生物学的完全性は、ＨＰＬＣ及びＥＬＩＳＡデータに基づき、そのままの状態に保たれていると思われる。
【０１２３】
更に、予備的なラット試験では、オマリズマブの血中レベルはオマリズマブカプセル化粒子が適用された群において検出され得るが、カプセル化されずに適用されたオマリズマブの群では検出されない可能性があることが明らかとなった。
【０１２４】
このプロジェクトで得られた結果は、ｓｃＣＯ２支援式のキトサンカプセル化技術は、経口製剤で使用される高分子の安定な製剤開発において適用可能であることを示唆する。
【０１２５】
実施例２
オマリズマブのタンパク質構造及び機能に関するＢｉＯｒａｌｉＸ製造プロセスの評価
緒言
オマリズマブの構造、組成、及び機能を評価するために、プロセスの適用前後に一連のテストを実施した、すなわち：
−  構造テスト：円偏光二色性、Ｎ−グリカン、ペプチドマップ、インタクトマス、ジスルフィド架橋
−  分析的テスト（凝集／粒径）：ＳＶ−ＡＵＣ
−  機能的テスト：ＳＰＲ結合速度論及び効力（ＥＬＩＳＡに基づく）
【０１２６】
サンプル
１．この目的で使用された抗体はオマリズマブであった。このモノクローナル抗体は、イヌハムスター卵巣細胞を使用して、発酵プロセス内で製造され、９５％を超える純度を取得するために精製された。この原薬（ＤＳ）は、更なる処理まで凍結保存（−２０℃）された。
〇サンプル１は、上記のようなＤＳサンプルである。
〇サンプル２は、上記記載のＤＳが本発明に曝露され、下記の手順後に更に処理された後のサンプルであった：
・取得された粒子は、ＰＢＳバッファー中に放出され、出荷前に凍結された。
・サンプルは、特徴付け及び比較のために外部研究室に送付された。
図８は、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））のオリジネーターバージョンと比較した、サンプル２のＨＰＬＣの結果であり、サンプル中の両有効成分の実体は同じであることを示す。
ベース材料（それについてはサンプル１が代表的である）及びサンプル２が代表的である材料について実施された活動（機能、結合、及び分析的特徴）の概要を、次表及び図９〜図１６に提示する。
２サンプルは、２回の独立した機会に分析されたが、しかしながらいずれの機会においても、データを関連付け、また比較を可能とするために、同一の参照サンプル（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））を分析した。
【０１２７】
【表８】
2021528498.tif 000009
2021528498.tif 000010
2021528498.tif 000011
【０１２８】
結論
サンプル２（粒子中に処理され、ＰＢＳ中に放出された未処理タンパク質）について収集したデータは、サンプル１（未処理タンパク質）について収集したデータと極めて高い類似性を示す。
【０１２９】
分析、構造、及び機能的テストから、分子は元のままであり、機能的であることが明らかとなった。
【０１３０】
実施例３
オマリズマブのタンパク質構造及び機能に基づくＢｉＯｒａｌｉＸ製造プロセスの評価
緒言
オマリズマブの構造、組成、及び機能を評価するために、プロセスの適用前後に一連のテストを実施した、すなわち：
−  構造テスト：円偏光二色性、ペプチドマップ、インタクトマス、ジスルフィド架橋
−  分析的テスト（凝集／粒径）：ＳＶ−ＡＵＣ
−  機能的テスト：ＳＰＲ結合速度論及び効力（ＥＬＩＳＡに基づく）
実施例２とは異なり、各テストから得られた結果は同一の分析機会から取得した。これは、両サンプルの結果は、例えば同一日に、同一技師により実施された同一の分析ラン若しくはシークエンス、及び／又は分析において取得されたことを意味する。
【０１３１】
サンプル
この目的で使用した抗体はオマリズマブであった。このモノクローナル抗体はＨａｌｉｘ社で製造された凍結乾燥製品である（バッチ番号Ｂ３０１０６４０）。オマリズマブ医薬品は、更なる処理まで凍結保存（−２０℃）された。
〇サンプル１は、上記したようなオマリズマブ医薬品である。このサンプルは、
・オマリズマブ（５９％）
・Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物（０．７７％）
・Ｌ−ヒスチジン（０．４９％）
・スクロース（３９．８％）
・ポリソルベート（０．１４％）
を含有する。
〇サンプル２は、本発明に曝露された後のオマリズマブ医薬品である。このサンプルは、
・オマリズマブ（１６％）
・スクロース（１０％）
・キトサン（７４％）
・ＰＳ２０（０．０３％）
・ヒスチジン（０．３％）
を含有する。
【０１３２】
サンプル２の粒子を、ＰＢＳバッファー中に放出し、特徴付け及びサンプル１との比較のために外部研究室に出荷される前に凍結した。ベース材料（それについてはサンプル１が代表的である）及びテスト材料（それについてはサンプル２が代表的である）について実施された活動（機能、結合、及び分析的特徴）の概要を、次表及び図１７〜図２１に提示する。
【０１３３】
【表９】
2021528498.tif 000012
2021528498.tif 000013
2021528498.tif 000014
【０１３４】
結論
サンプル２について収集したデータ（粒子中で処理され、ＰＢＳ中に放出された未処理タンパク質）は、サンプル１（未処理タンパク質）について収集したデータと極めて高い類似性を示す。分析、構造、及び機能的テストから、分子は元のままであり、機能的であることが明らかである。
【０１３５】
実施例４
経口及び皮下投与後のミニブタにおけるオマリズマブの薬物動態及び安全性
材料及び方法
使用した材料：
アビセルＰＨ−１０１      Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社  １１３６３
ヒュームドシリカ        Ｓｉｇｍａ社  Ｓ５５０５
Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ１００−５５      Ｅｖｏｎｉｋ社
カプセルＮｒ０        Ｓｐｒｕｙｔ  Ｈｉｌｌｅｎ社  ７０１
ＥＬＩＳＡ  Ｓｈｉｋａｒｉ  Ｑ−ＯＭＡ      Ｍａｔｒｉｋｓ  Ｂｉｏｔｅｋ社  ３０１２４４７１
オマリズマブ          Ｂｉｏｓａｎａ  Ｐｈａｒｍａ社  ＢＰ００１
キトサン              Ｓｉｇｍａ社  ４４８８６９
ＰＳ２０              Ｓｉｇｍａ社  ４２８３０２
Ｌ−ヒスチジン        Ｓｉｇｍａ社  １３０８５０５
【０１３６】
スプレー溶液の組成：
１０％のスクロース、７３．７％のキトサン、０．０３％のＰＳ２０、０．３％のヒスチジン、及び１６％のオマリズマブから構成される混合物の１％を含有するＷＦＩ。
【０１３７】
粒子製剤の調製
コーティング材料、オマリズマブ、及び添加物を含有する溶液を超臨界二酸化炭素中に噴霧することにより、粒子を調製した。
超臨界スプレー条件
二酸化炭素（ＣＯ２）３００ｋｈ／ｈ、ノズル１６５０、溶液２．５ｍｌ／分。
取得された粒子サイズ分布：Ｄ１０  ０．７５μｍ、Ｄ５０  １．４９μｍ、Ｄ９０  ３．１１μｍ（レーザー回折粒子サイズ分析）
粒子内のオマリズマブの質量負荷は、ＨＰＬＣにより決定されたように１６．４重量％であった。
【０１３８】
経口（ｐｏ）投与用カプセルの調製
各カプセル（タイプ０）中に、１５６ｍｇの粒子（オマリズマブ，２５ｍｇ）を秤量した。１％のヒュームドシリカを含むＡｖｉｃｅｌｌ  ＰＨ１０１からなる添加物混合物（７０〜８０ｍｇ）で、各カプセルを充填した。
Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ１００−５５を含有する溶液中にディップコーティングすることにより、カプセルを腸溶性コーティングした。各カプセルを５回浸漬し、その結果１カプセル当たり平均約３８ｍｇの重量増加を引き起こした。コーティングの品質についてテストされたカプセルのすべてにおいて、ｐＨ２の塩酸に２時間耐えることが証明された。カプセルは、５〜６５分の間でリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）に溶解した。
【０１３９】
皮下（ｓｃ）投与用の溶液の調製物
オマリズマブ溶液を、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で注射用水（ＷＦＩ）に溶解した。
【０１４０】
動物試験
年齢が４〜６歳及び体重が４０〜５５ｋｇのオスのミニブタ１８匹に、２５、５０、又は７５ｍｇのオマリズマブを、カプセル用のボーラスシューターを使用して、水平方向のｓｃ注射又はｐｏにより投与した。皮下注射の場合、注射用水（ＷＦＩ）に溶解したオマリズマブ溶液を使用した。粒子含有カプセルを用いて経口投与を実施した。０（投与前）、投与後１、３、５、２４、４８、１２０、２４０、４８０、７２０、及び９６０時間経過した後に、血液を頸静脈から標準的なファルコンチューブ及びＫ２−ＥＤＴＡに収集した。その後、約３０分〜１時間凝固させることにより血液を血清に処理した。３８００ｒｐｍで１５分間遠心分離後、血清をエッペンドルフチューブ中に収集した。残留する赤血球を取り除くために、８０００ｒｐｍで２分間、エッペンドルフチューブの遠心分離がこれに後続した。
酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）を使用してオマリズマブレベルを更に分析するまで、血清サンプルを凍結保存（−２０℃）した。
【０１４１】
オマリズマブ血清レベルのＥＬＩＳＡ媒介式の検出
血清サンプルを、Ｍａｔｒｉｋｓ  Ｂｉｏｔｅｋ社製Ｓｈｉｋａｒｉ  Ｑ−Ｏｍａ  ＥＬＩＳＡキットを使用してオマリズマブのレベルについてアッセイした。このキットは、サンドイッチ式であり、ヒト血漿又は血清中に存在するオマリズマブがウェル底部上のＩｇＥに結合することに基づく。オマリズマブと結合するホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートが、その後添加される。ウェルの洗浄後、結合した酵素活性はクロモゲン基質の添加により検出される。発色はサンプル又は標準中のオマリズマブの量に比例する。結果は標準曲線を使用して決定された。アッセイは、ヒト血清の代わりにミニブタ血清中のオマリズマブを検出する意図的使用について調査された。
キットと共に供給された校正サンプルを使用して、定量化（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）を実施した。インキュベーション前に血清サンプルを１０倍稀釈した。
【０１４２】
安全性パラメーター
血液学及び化学評価用の血液及び血清サンプルを、ベースライン（ｔ＝０）、並びに投与後２４、４８、１２０、２４０、４８０、７２０、及び９６０時間において採取した。
【０１４３】
下記の血液学パラメーターを測定した：白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均細胞容積、平均細胞ヘモグロビン、平均細胞ヘモグロビン濃度、血小板数、網状赤血球数、網状赤血球数、赤血球分布幅、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、大型の未染色細胞。
血清化学について、下記項目を決定した：ナトリウム、カリウム、塩化物、タンパク質ゲルからの総タンパク質、アルカリホスファターゼ、コレステロール、リン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルブミン、アルブミン／グロブリン比、血中尿素窒素、グルコース、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、カルシウム、クレアチニン。
【０１４４】
結果
動物の福祉及び安全性：
動物は、異常な挙動又は疼痛の兆候又はその他の有害効果を示さなかった。試験開始前の２週間及び投与後の１週間、動物を秤量した。体重の増加又は減少に有意な傾向は認められず、試験期間中の動物の健康について、プラスの確証を得た。
【０１４５】
オマリズマブの血清レベル
全種類の投与法はいずれも、初期において、用量依存性の血清中オマリズマブの上昇、及び長期漸進的なウォッシュアウトを示す（図２２を参照）。
経口投与は、皮下投与と比較したとき、それよりも高いバイオアベイラビリティーを示す。皮下注射の際、２５、５０、又は７５ｍｇのオマリズマブをそれぞれ投与したとき、１２０００、８０００、又は４０００ｎｇ／ｍｌの最高血清レベルに到達した。経口投与すると、その結果、２５、５０、又は７５ｍｇのオマリズマブをそれぞれ投与したとき、最高血清レベルは２７０００、１１０００、又は５０００ｎｇ／ｍｌとなった。
経口投薬のＴ１／２値は、皮下注射と比較してそれより長い。口腔投与の相対的バイオアベイラビリティーは、皮下注射と比較して２．３〜３．１倍であった。
Ｔｍａｘ値（すなわち、最高濃度に到達するのに要する時間）は、皮下（投与）群と比較したとき、すべての経口投薬群において明確に遅延した。
【０１４６】
安全性：
投与前の数値と比較したとき、すべてのパラメーターにおいて有意な変化は認められなかった。
【０１４７】
結論：
この試験は、微粒子中に製剤化されたオマリズマブで満たされた胃耐性カプセルを使用して、オマリズマブを経口投薬することで、ミニブタの血清において、優れた用量依存性の高バイオアベイラビリティーが引き起こされることを示している。粒子製剤は、血液及び血清中、一連のパラメーターにおいて測定されるような毒性効果を示すことなく、オマリズマブを、腸上皮を横断して血流中に移動させる能力を有することを証明した。
微粒子を製剤化したオマリズマブの経口投薬法を使用したとき、オマリズマブの通常の臨床的皮下投与経路と比較して、ヒトにおいてより高いバイオアベイラビリティーを引き起こす可能性があることは明白である。
ｓｃ群の生物統計学は、Ｔｍａｘ（９６と１２０時間）及びＴ．（３８５と５８０時間）に関して、臨床現場でのｓｃ投与に基づく文献に由来する結果との類似性を示す（Ｒｉｖｉｅｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｅｑｕｉｖ．Ａｖａｉｌａｂ  ２０１１，３；６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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