(57)【要約】【課題】ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルを提供する。【解決手段】生分解性のポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロック側鎖のカテコール構造で第二鉄イオンをキレート化する。ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンを含有する両親媒性ポリマーを第二鉄イオン化合物と錯化し、且つ溶媒置換法によってポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルを得る。ミセルをＦｅ３＋磁気共鳴Ｔ１イメージング造影剤として使用することにより、従来のガドリニウム剤による毒性や副作用を防止することができる。縦緩和率（ｒ１）は５.６ｍＭ-１ｓ-１であり、マウスの体内循環時間は１５０分に達し、且つ画像形成効果が鮮明であり、総合性能は商用ガドリニウム造影剤よりも遥かに高く、優れた応用が見込める。  【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ポリマーナノミセル中の疎水性ブロックは、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロックであり、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロック側鎖のカテコール基は、第二鉄イオンをキレート化し、以下の構造式で示すキレート結合を有することを特徴とするポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセル。
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【請求項２】
前記両親媒性ポリマーナノミセル中の親水性ブロックは、ポリサルコシンブロック、ポリエチレングリコールブロック、ポリ（オリゴエチレングリコール）メタクリレートブロック、ポリビニルアルコールブロック及びポリアクリル酸ブロックからなる少なくとも1種であることを特徴とする請求項１に記載のポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセル。
【請求項３】
前記両親媒性ポリマーナノミセル中の親水性ブロックのセグメントの長さは、１〜１５００であり、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロックのセグメントの長さは、１〜５００であることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセル。
【請求項４】
両親媒性ポリマーは、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロックを含むジブロック、トリブロック、マルチブロック、ランダム、星形、環形またはグラフトポリマーであることを特徴とする請求項１に記載のポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセル。
【請求項５】
構造式が式（１）〜（５）に示すうちのいずれか一種であり、
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Ｒ１は、アルキル基、ベンジル基、シリル基から独立して選択され、 Ｒ２は、アルキル基から独立して選択され、ｍは１〜１５００の整数であり、ｎは１〜５００の整数であり、ｎ１は１〜２００の整数であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセル。
【請求項６】
前記ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンのセグメントの長さは５〜５０の範囲であり、ポリサルコシン又はポリエチレングリコールのセグメントの長さは５〜２００の範囲にあることを特徴とする請求項５に記載のポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセル。
【請求項７】
請求項１に記載のポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルの磁気共鳴イメージング分野における使用であって、磁気共鳴T１イメージング造影剤としての使用。
【請求項８】
前記磁気共鳴T１イメージング造影剤は、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセル、薬学用賦形剤、希釈剤及び補助材料を含むことを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記磁気共鳴T１イメージング造影剤は、平均粒径が２０〜２００ｎｍで、キレート化鉄イオンの含有量が１０〜１０００ｐｐｍであることを特徴とする請求項７又は８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気共鳴イメージング分野に属し、具体的には、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセル及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴イメージング（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ、略称はＭＲＩ）は、核磁気共鳴の原理に基づいて、体外から高周波勾配磁場を印加し、体内から放出された電磁波を検出することにより、体内の構造画像を描出することができるものである。それは、非侵襲性であり、リアルタイムモニタリング及び高解像度の軟組織情報及び三次元構造イメージングを提供することが可能である等の利点を有しており、最先端の臨床医学検査技術の一つである（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７，８，７００-７１１）。
【０００３】
臨床応用において、正常組織と病変組織との間のコントラストを向上させるために、３０％を超える診断では磁気共鳴造影剤の使用を必要とする。現在臨床で使用されている磁気共鳴造影剤は、主にＧｄ-ＤＴＰＡ(商品名：Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ)、Ｇｄ-ＤＯＴＡ(商品名：Ｄｏｔａｒｅｍ)などのガドリニウムイオンの錯体（Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００９，３０，１２５９-１２６７）であるが、一般的に、このような種類の小分子ガドリニウム造影剤は、血液及び組織内での消失半減期が３０ｍｉｎ以内であるため、滞留時間が比較的短く、臨床における使用に影響を与える（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２０１３，７６４，１-１６）。
【０００４】
この他にも、多くの臨床研究により、Ｇｄ３＋薬剤には生物毒性が存在し、ヒトの皮膚および内臓で濃縮され、腎機能不全の患者が、致命的且つ希少疾患である腎性全身性線維症（ＮＳＦ）にまで悪化するリスクを増加させ（Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌ．２００６，２１，１７４５-１７４５）、且つ脳組織内に長期間堆積すること（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．２０１７，２８５，５４６-５５４）が明らかになっている。
従って、低毒性又は無毒性の磁気共鳴造影剤の開発は、現在、早急に解決すべき課題である。
【０００５】
現在、臨床で使用されている低毒性又は無毒性の非ガドリニウム磁気共鳴造影剤は、主にフェリデックス(超常磁性酸化鉄注射液)をはじめとしたＴ２イメージング造影剤であり、ガドリニウム造影剤と比較して、１)体内で細網内皮系に貪食されやすく、肝臓や脾臓等の標的部位の病変の検出及び診断に用いられる、２) Ｔ２ＷＩ（Ｔ２強調画像）で各金属鉄がより多くの信号強度変化を生成することができ、緩和性能が高く、検出がさらに敏感である、３)体内で生分解性があり、細胞内の正常な代謝経路を経て体内の鉄循環に入る、という利点を有する。また、欠点の一つは、Ｔ２イメージング造影剤は、ガス、骨皮質及び体内の鉄沈着などの低シグナル物質との区別が難しく、さらに、使用範囲が制限されており、細網内皮系に限定されることである。その生体適合性を変化させ、血液中での循環時間を長くするために、酸化鉄ナノ粒子に表面改質を行う必要がある。
【０００６】
例えば、特許ＣＮ１０２５５２９４４Ｂは、鼻咽頭癌標的磁気共鳴造影剤を開示している。化学共沈法を用いて粒径約１０〜１５ｎｍの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４を合成した後、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を１０〜１５ｎｍの超常磁性Ｆｅ３Ｏ４に被覆するか接続して、表面をアミノ化したＦｅ３Ｏ４-ＡＰＴＥＳ表面改質粒子を得た。ポリエチレングリコールをＦｅ３Ｏ４-ＡＰＴＥＳとＥＢウイルス潜在膜タンパク質１モノクローナル抗体(ＬＭＰ１，Ｃｌｏｎｅ  ＣＳ．１-４)との間のリンカーアームとし、両者を接続することにより安定な分散Ｆｅ３Ｏ４-ＡＰＴＥＳ-ＰＥＧ-ＬＭＰ１を得て、Ｃｌｏｎｅ  ＣＳ．１-４コロイド溶液を磁気共鳴造影剤とした。
【０００７】
しかしながら、酸化鉄ナノ粒子の表面改質は、一般的に工程が煩雑であり、時間がかかりコストが高く、且つＴ２イメージング磁気共鳴造影剤が実質的に淘汰されているため、ガドリニウムの代替となる新規の磁気共鳴Ｔ１イメージング造影剤の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れた生体適合性及び生体分解性を有する、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルを提供することを目的とする。得られた両親媒性ポリマーナノミセルのＦｅ３＋磁気共鳴造影剤又はこれから調製して得られるＦｅ３＋磁気共鳴造影剤は、毒性がなく、新規のガドリニウム非含有Ｔ１イメージングＭＲＩ造影剤として有効で、緩和性能が高く、体内循環時間が長い。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ナノミセルを形成する両親媒性ポリマー中の疎水性ブロックは、生分解性を有するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロックである。上記ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルは、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロック側鎖のカテコール基で第二鉄イオンをキレート化する。ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルは以下の構造式で示すキレート結合を有する。
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【００１０】
本発明は、生体適合性に優れたポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルを提供する。疎水性ブロックは、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロックであり、毒性がなく、生体適合性に優れている。上記両親媒性ポリマー中の親水性ブロックは、生体適合性に優れたポリマーブロックを選択すればよい。上記親水性ブロックは、ポリサルコシンブロック、ポリエチレングリコールブロック、ポリ（オリゴエチレングリコール）メタクリレートブロック、ポリビニルアルコールブロックまたはポリアクリル酸ブロックのうちから選択して用いることが好ましい。上記親水性ブロックは、ポリサルコシンブロック、ポリエチレングリコールブロックまたはポリ（オリゴエチレングリコール）メタクリレートブロックであることがさらに好ましい。
【００１１】
ポリマーの重合度は、ポリマーの溶解性、柔軟性に影響を与え、さらに両親媒性ポリマーの疎水性ブロックと親水性ブロックとの重合度が、形成されるミセルの安定性に影響を与える。これらを総合して考えると、上記ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロックのセグメントの長さは、１〜５００であることが好ましく、上記親水性ブロックのセグメントの長さは、１〜１５００であることが好ましい。
【００１２】
本発明に記載のミセルは、広義に定義されるミセルである。両親媒性ポリマーの疎水部と水との親和力は小さく、親水部同士の引力は大きいため、両親媒性ポリマーが水中で一定の濃度になると、疎水部同士が引き合い、会合して種々の形状(例えば、球形、層状、棒状等)の会合体を形成する。この会合体が広義のミセルである。これに対応して、上記両親媒性ポリマーは、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンブロックを含むジブロック、トリブロック、マルチブロック、ランダム、星形、環形、グラフトポリマーなどの様々なトポロジー構成を有する両親媒性ポリマーを含む。
上記ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンを含有する両親媒性ポリマーの代表的な例は、以下の構造を含む。
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【００１３】
ここで、Ｒ１は、アルキル基、ベンジル基、シリル基から独立して選択され、Ｒ２は、アルキル基から独立して選択され、ｍは、１〜１５００の整数であり、ｎは、１〜５００の整数であり、ｎ１は１〜２００の整数である。
【００１４】
重合度が小さいほど両親媒性ポリマーの合成は容易であり、重合反応に要する時間はより短く、且つ形成されるミセルの安定性が比較的良好である。従って、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンのセグメントの長さは、５〜５０の範囲で、ポリサルコシン又はポリエチレングリコールのセグメントの長さは、５〜２００の範囲であることがさらに好ましい。
【００１５】
本発明は、さらに、操作が簡単で、容易に実施できる上記ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルの調製方法を提供する。
【００１６】
上記方法は、（１）参考文献（Ｍｉａｏｅｒ  Ｙｕ，ａｎｄ  Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｊ．Ｄｅｍｉｎｇ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９８，３１（１５），４７３９-４７４５）に報告されたポリアミノ酸の調製方法を、既存の共重合方法と組み合わせてポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンを含有する両親媒性ポリマーを合成するステップ１と、
【００１７】
（２）ステップ１で得られたポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンを含有する両親媒性ポリマーを第二鉄イオン化合物と錯化し、且つ溶媒置換法によってポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルを得るステップ２、を含む。
【００１８】
上記第二鉄イオン化合物は、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、臭化第二鉄等のうち１種またはそれ以上であることが好ましい。第二鉄イオン化合物は硝酸第二鉄であることがさらに好ましい。
【００１９】
本発明は、上記ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルの磁気共鳴イメージング分野における、磁気共鳴Ｔ１イメージング造影剤としての使用又は調製された磁気共鳴Ｔ１イメージング造影剤としての使用を提供する。
【００２０】
ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルから磁気共鳴造影剤を調製する場合には、薬学用賦形剤、希釈剤又は補助材料等を添加することができる。本発明が提供する磁気共鳴Ｔ１イメージング造影剤は、経口又は非経口投与(静脈投与を主とする)で、ヒト及びヒト以外の哺乳動物(例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ等)に投与することができる。投与量は投与対象、磁気共鳴イメージング部位、剤形、投与経路等により異なる。
【００２１】
本発明が提供するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルは、磁気共鳴造影剤とするか又は磁気共鳴造影剤に調製された粒径がナノオーダーに達していれば、良好な分散性を有し、磁気共鳴造影剤粒子が凝集しやすく動物が死亡するという問題を防止することができる。その平均粒径は２０〜２００ｎｍであることが好ましい。
【００２２】
本発明が提供するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルを磁気共鳴造影剤とするか又は磁気共鳴造影剤に調製する際に、キレート化された鉄イオンが存在することにより磁気共鳴イメージングを実現することができる。イメージング効果を最適化する観点から、鉄イオンの含有量は１０〜１０００ｐｐｍであることが好ましい。
【００２３】
本発明が提供するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルは、磁気共鳴造影剤とするか又は磁気共鳴造影剤に調製する。実験結果により、その縦緩和率（ｒ１）は５.６ｍＭ-１ｓ-１であり、マウスの体内循環時間は１５０分に達し、且つイメージング効果が鮮明であり、総合性能は商用ガドリニウム造影剤よりも遥かに高いことが確認された。このことから、画像診断において、従来のＧｄ３＋造影剤に代わり、毒性がなく高効率な新規のガドリニウム非含有Ｔ１イメージングＭＲＩ造影剤となることが期待される。
【００２４】
本発明のポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルは、磁気共鳴Ｔ１イメージング造影剤として、肝臓や脾臓等の細網内皮系をターゲットとしたＴ１強調イメージングを実現するだけでなく、血管造影、すなわち血管イメージングを実現することもできる。さらに、本発明が提供する磁気共鳴Ｔ１イメージング造影剤は、血液循環を経て全身に分布して、全身の組織器官内に入ってＴ１強調イメージングを実現する。このため、従来の磁気共鳴鉄系造影剤が肝臓や脾臓等の細網内皮系のみをターゲットとしていたという限界を突破し、鉄系磁気共鳴造影剤の医学的な応用範囲を広げ、優れた応用が期待できる。
【発明の効果】
【００２５】
従来技術と比較した本発明の利点は以下のとおりである。
【００２６】
（１）本発明が提供するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルは、Ｆｅ３＋磁気共鳴造影剤として使用することができる。生体毒性が極めて低く、また、該ミセルは良好な分散性を有し、磁気共鳴造影剤粒子が凝集やすく動物が死亡するという問題を防止することができる。
【００２７】
（２）本発明で使用されるポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンを含有する両親媒性ポリマーは、ポリアミノ酸材料であり、優れた生体適合性と生分解性を有し、潜在的な応用の優位性が顕著である。
【００２８】
（３）本発明が提供するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルを、磁気共鳴T１イメージング造影剤とした場合、その縦緩和率（ｒ１）は５.６ｍＭ-１ｓ-１であり、マウスの体内循環時間は１５０分間に達し、且つイメージング効果が鮮明であり、総合性能は商用ガドリニウム造影剤よりも遥かに高い。
【００２９】
（４）本発明が提供するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルは、調製方法が簡単で、実施が容易であり、工業生産に適している。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例１により調製したポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリサルコシンブロック共重合体（Ａ）及びポリサルコシン（Ｂ）のプロトン核磁気共鳴スペクトル測定結果を示す図である。
【図２】実施例１により調製したポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルのＴＥＭ観察写真である。
【図３】実施例１により調製したポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルの動的光散乱を測定した結果を示す図である。
【図４】実施例１により調製したポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルの体外実験により得られた縦緩和時間（Ｔ１）と鉄イオン濃度との関係を示す図である。
【図５】実施例１により調製したポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルをＦｅ３＋磁気共鳴造影剤として投与したマウスの磁気共鳴による血管イメージング図である。
【図６】実施例１により調製したポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルの細胞毒性を測定した結果を示す図である。
【図７】実施例３により調製したポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリオリゴエチレングリコールメタクリレートグラフト重合体のプロトン核磁気共鳴スペクトル測定結果を示す図である。
【図８】実施例３により調製したポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルの動的光散乱を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の更なる理解のために、以下に、実施例を参照して、本発明が提供するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンキレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルの調製及び使用については、具体的に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、当業者により本発明の核心となる技術的思想に基づいてなされる非本質的な改良及び調整は、依然として本発明の保護範囲に属する。
本発明の実施例における特性評価方法は、以下のとおりである。
【００３２】
核磁気共鳴スペクトルはＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＭＸ４００超伝導核磁気共鳴装置を用いて２５℃で測定した。重水素化ＤＭＳＯを溶媒とし、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準とした。
【００３３】
溶液中のポリマーナノミセルの流体力学的直径は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）検出器により測定した。測定波長は６５７ｎｍで、固定角度は９０°として、各サンプル３回の平行試験を行った。
ナノミセルの粒径と形状はＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＴ７７００透過型電子顕微鏡を用いて観察した。加速電圧は１００ＫＶとした。
【００３４】
金属キレートポリマーナノ粒子溶液のＴ１加重磁気共鳴イメージングの緩和率ｒ１は、磁場強度が３.０Ｔの磁気共鳴イメージング装置（Ｓｉｇｎａ  ＨＤｘｔ，ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００３５】
金属キレートポリマーナノ粒子溶液の細胞毒性実験は、ＭＴＴ法によって実施した。試験細胞は、マウス胎児線維芽細胞（ＮＩＨ  ３Ｔ３）で、試験結果は、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により得た。
実施例１
（１）ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリサルコシンブロック共重合体（ＰＤＯＰＡ-ｂ-ＰＳａｒ）の構造式は以下のとおりである。
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ここで、Ｒ１はベンジル基であり、ｍ＝５〜２００であり、ｎ＝５〜５０である。
具体的な合成ステップは、以下の工程を含む。
【００３６】
Ｓｃｈｌｅｎｋ瓶にサルコシンＮＣＡを加え、ＤＭＦで溶解し、さらにベンジルアミンのＤＭＦ溶液を加えた。サルコシンＮＣＡとベンジルアミンとのモル比は５〜２００：１として、室温で１日反応させた後、ベンジルオキシカルボニル（ｃｂｚ）で保護されたＤＯＰＡーＮＣＡのＤＭＦ溶液を加えた。ＤＯＰＡーＮＣＡとベンジルアミンのモル比は５〜５０：１として、室温で１日反応させた。ポリマー溶液をジエチルエーテルに入れて沈殿させ、濾過し、得られたポリマーを１日真空乾燥して、ｃｂｚで保護されたポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリサルコシンブロック共重合体を得た。
【００３７】
３００ｍｇのブロック共重合体を３ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解し、４倍当量の臭化水素の酢酸溶液（３３％）を加えて、３時間反応させた。その後、ジエチルエーテルで沈殿させ、濾過し、得られた重合体を１日真空乾燥して、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリサルコシンブロック共重合体を得た。このときの収率は８９％であり、重合体のプロトン核磁気共鳴スペクトル測定結果は、図1に示すとおりである。
【００３８】
（２）秤量した７.７ｍｇのＰＤＯＰＡ-ｂ-ＰＳａｒをＤＭＦに溶解して溶液を調製した後、１.６９ｍｇのＦｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏを含むＤＭＦ溶液をゆっくりと加えて、均一に混合した。その後、脱イオン水中で４８時間透析してミセル溶液を得、さらに孔径が０.４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した後に定容した。定容後のＦｅ３＋の濃度は９４ｍｇ/Ｌであった。
【００３９】
上記ミセルのＴＥＭ観察写真は図２に示すとおりであり、ＤＬＳ試験結果は図３に示すとおりである。図２及び３から、調製したミセルの平均粒径は２０ｎｍであることがわかった。
【００４０】
体外実験により得られた上記ミセルの縦緩和時間（Ｔ１）と鉄イオン濃度との関係は、図４に示すとおりである。図４から縦緩和率は５.６ｍＭ-１ｓ-１であることがわかった。この値は、商用ガドリニウム造影剤(例えばＧｄ-ＤＴＰＡ等)の緩和率よりも高く、本発明の試料の優れた体外磁気共鳴の増強能力を示している。
【００４１】
イソフルランガスでマウスを麻酔した後、調製したミセル生理食塩水溶液を、マウスの尾静脈から注入した。上記ミセルをＦｅ３＋磁気共鳴造影剤として投与したマウスの血管の磁気共鳴イメージング図は図５に示すとおりである。図５から、造影剤を注入してから０〜３０分で、マウスの血管シグナル強度が急速に上昇してピークに達し、マウスの血管構造がはっきりと観察できることがわかった。その後、血管シグナル強度は徐々に低下して、注入後１５０分ほどで完全に排出された。これは本発明が提供するポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）キレート第二鉄イオンを含有する両親媒性ポリマーナノミセルプローブの血管内における循環代謝が完了したことを示す。本発明が提供するＦｅ３＋磁気共鳴造影剤では、商品化されているＧｄ３＋試薬の体内循環時間が６０分間未満で短いという欠点を補うことができる。
【００４２】
上記ミセルの細胞毒性は、ＭＴＴ法によって測定した。各サンプルに５つの平行サンプルを配置した。細胞毒性アッセイの結果は図６に示すとおりである。５〜５００μｇ/ｍＬの濃度条件のいずれのサンプルでも非常に低い細胞毒性を示した。濃度が５０μｇ/ｍＬを超えると、濃度の上昇するにつれて細胞生存率がわずかに低下するが、いずれも８５％以上に維持されている。このことは、本発明のＦｅ３＋磁気共鳴造影剤は、生体毒性が低く、良好な生体適合性を有することを示している。
実施例２
【００４３】
（１）マクロ開始剤としてポリエチレングリコールアミンを用いた他は、実施例１と同様の条件でポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＰＤＯＰＡ-ｂ-ＰＥＧ）を調製した。構造式は以下に示すとおりである。
2021518479.tif 000006
ここで、Ｒ２はメチル基であり、ｍ＝５〜２００であり、ｎ＝５〜５０である。
【００４４】
（２）秤量した９.７ｍｇのＰＤＯＰＡ-ｂ-ＰＥＧをＤＭＦで溶解して溶液を調製した後に、３.２７ｍｇのＦｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏを含むＤＭＦ溶液をゆっくりと加え、脱イオン水中で４８時間透析した。得られたミセル溶液を孔径が０.４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した後に定容して使用した。
性能試験条件は、実施例1と同様とした。ミセルの平均粒径は３０ｎｍで、ＭＲＩにおける体外増強作用を有した。
実施例３
【００４５】
（１）ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリオリゴエチレングリコールメタクリレートグラフトポリマー（ＰＯＥＧＭＡ-ｇ-ＰＤＯＰＡ）の構造式は、以下に示すとおりであり、
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ここで、Ｒ１はｎ-ブチル基であり、ｍ＝５〜２００であり、ｎ１＝５〜５０であり、
具体的な合成ステップは、以下の工程を含む。
【００４６】
ＰＤＯＰＡ（poly(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)）は、実施例１と同じ条件で、ｎ-ブチルアミンによるｃｂｚで保護されたＤＯＰＡーＮＣＡの開環重合および脱保護によって調製した。ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリオリゴエチレングリコールメタクリレート（ＰＯＥＧＭＡ）は、ＲＡＦＴ重合によって調製した。２４７.４ｍｇのＰＯＥＧＭＡ及び１３４.０ｍｇのＰＤＯＰＡを１ｍＬのＤＭＦに溶解し、３５℃の油浴中で４日間反応させた。ポリマー溶液をジエチルエーテルに入れて沈殿させ、濾過し、1日真空乾燥して、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリオリゴエチレングリコールメタクリレートグラフトポリマーを得た。重合体のプロトン核磁気共鳴スペクトルの測定結果は、図７に示すとおりである。
【００４７】
（２）秤量した２２.７ｍｇのＰＯＥＧＭＡ-ｇ-ＰＤＯＰＡをＤＭＦで溶解して溶液を調製した。その後、５.８３ｍｇのＦｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏを含むＤＭＦ溶液をゆっくりと加え、脱イオン水中で４８時間透析した。得られたミセル溶液を孔径が０.４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、定容し使用した。
【００４８】
その他の性能試験条件は実施例１と同様とした。ＤＬＳ試験結果は図８に示すとおりであり、ミセルの平均粒径は３０ｎｍで、ＭＲＩにおける体外増強作用を有した。
実施例４
【００４９】
（１）開始剤としてポリプロピレンイミン−テトラミン−デンドリマーの第一世代（Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａｍｉｎｅ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ，ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ１）を用いた他の調製条件は、実施例１と同様として、ポリ３，４−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン-ポリサルコシン星形重合体（ＰＤＯＰＡ-ｂ-ＰＳａｒ  ｓｔａｒ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を調整した。構造式は以下に示すとおりであり、
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ここで、ｍ＝５〜２００であり、ｎ＝５〜５０である。
【００５０】
（２）秤量した１０.１ｍｇのＰＤＯＰＡ-ｂ-ＰＳａｒ  ｓｔａｒ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒをＤＭＦで溶解して溶液を調製した。その後、２.２１ｍｇのＦｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏを含むＤＭＦ溶液をゆっくりと加え、脱イオン水中で４８時間透析した。得られたミセル溶液を孔径が０.４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、定容して使用した。
他の性能試験条件は実施例１と同様とした。ミセルの平均粒径は３５ｎｍで、ＭＲＩにおける体外増強作用を有した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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