(57)【要約】本開示は、ＢＦＬ−１の選択的な標的化またはＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１の二重標的化のための構造安定化および／またはシステイン反応性のペプチド阻害剤を特徴とする。そのようなペプチドをＢＦＬ−１および／またはＭＣＬ−１を発現するかまたはそれに依存性のがんまたは細胞過剰性疾患（例えば自己免疫状態もしくは炎症性状態）の処置において使用する方法もまた開示される。そのようなペプチドと、ＤＮＡ損傷応答経路の阻害剤、例えばＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤もしくはＰＡＲＰ阻害剤またはＭＣＬ−１の阻害剤もしくはＢＣＬ−２の選択的な阻害剤もしくはＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬの阻害剤とを含む、ＢＦＬ−１を発現するかもしくはそれに依存性のがん（例えばＡＭＬ）、ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１を発現するかまたはそれに依存性のがん、または細胞過剰性の上記疾患の処置のための組合せ治療薬もまた提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）求電子性弾頭部と、
（ｉｉ）配列番号３９に記載される配列の改変されたアミノ酸配列であって、少なくとも５アミノ酸長であり、ペプチド構造を安定化する改変を少なくとも１つ含み、配列番号３９の１つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている、改変されたアミノ酸配列と
を含むペプチドであって、
（ａ）ＢＦＬ−１／Ａ１に結合するか、または
（ｂ）ＢＦＬ−１／Ａ１およびＭＣＬ−１に結合する、ペプチド。
【請求項２】
前記改変されたアミノ酸配列が、５〜３５アミノ酸長である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記改変されたアミノ酸配列が、８〜１８アミノ酸長である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチド構造を安定化する改変が、ステープルおよび／またはステッチである、請求項１、２、または３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ステープルが、ｉ位およびｉ＋３位、ｉ位およびｉ＋４位、またはｉ位およびｉ＋７位のうちの１つまたは複数にある、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチド構造を安定化する改変が、配列番号３９の少なくとも２つのアミノ酸の、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸での置換を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸が、Ｓ−ペンテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニン；Ｒ−プロペニルアラニン、Ｓ−ペンテニルアラニン；Ｒ−ペンテニルアラニン、Ｓ−ペンテニルアラニン；ビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−ペンテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニン；およびビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−オクテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニンからなる群から選択される、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチド構造を安定化する改変が、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ、ＵＶ−環化付加ステープル／ステッチ、オキシムステープル／ステッチ、チオエーテルステープル／ステッチ、ダブルクリックステープル／ステッチ、ビス−ラクタムステープル／ステッチ、ビス−アリール化ステープル／ステッチ、またはこれらの任意の２つもしくはそれを超える組合せである、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
別のアミノ酸によって置換される配列番号３９の前記１つまたは複数のアミノ酸が、配列番号３９のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１非相互作用面にある、請求項１から８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
配列番号３９における０〜５個のアミノ酸が、Ｃ末端から除去されているか、または除去され、アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１〜６個のアミノ酸で置き換えられている、請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号３９の前記非相互作用面にある０〜６個のアミノ酸が、アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号３９の以下のアミノ酸Ａ１、Ｌ４、Ｒ５、Ｆ７、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、およびＱ１５のうちの１つまたは複数が、アルファ−メチル化またはアルファ−エチル化された天然のアミノ酸で置換されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号３９の以下のアミノ酸Ａ１、Ｌ４、Ｒ５、Ｆ７、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、およびＱ１５のうちの１つまたは複数が、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号３９の以下のアミノ酸Ｔ２、Ｑ３、Ｒ６、Ｋ１０、Ｆ１３、およびＲ１４のうちの１つまたは複数が、アルファ−メチル化またはアルファ−エチル化された天然のアミノ酸で置換されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
配列番号３９の以下のアミノ酸Ｔ２、Ｑ３、Ｒ６、Ｋ１０、Ｆ１３、およびＲ１４のうちの１つまたは複数が、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１６】
配列番号３９の前記１つまたは複数のアミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１７】
（ｉ）前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号３９もしくは１６のペプチドと比べて低減されている、
（ｉｉ）前記ペプチドの全体的な正電荷が、配列番号３９もしくは１６のペプチドと比べて低減されている、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、請求項１から１６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記求電子性弾頭部が、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、ポリペプチド骨格に連結された求電子性アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有する、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのＮ末端にある、請求項１から２２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのＮ末端にない、請求項１から２２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２５】
（ｉ）求電子性弾頭部と、
（ｉｉ）Ａ０Ｂ０Ｃ０Ｄ０Ｅ０Ａ１Ｂ１Ｃ１Ｄ１Ｅ１Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２Ｅ２（配列番号９３）の５つまたはそれを超えるアミノ酸（配列中、
（ａ）Ａ０は、存在しない、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｂ）Ｂ０は、存在しない、Ｔ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｉ、Ｍ、Ｂ（ノルロイシン）、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｃ）Ｃ０は、存在しない、Ｑ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｄ）Ｄ０は、存在しない、Ｌ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｉ、またはＦであり、
（ｅ）Ｅ０は、Ｒ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｋ、Ｔ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｆ）Ａ１は、Ｒ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｅ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｇ）Ｂ１は、Ｆ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｈ）Ｃ１は、Ｇ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｉ）Ｄ１は、Ｄであり、
（ｊ）Ｅ１は、存在しない、Ｋ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｋ）Ａ２は、存在しない、Ｌ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｗ、Ｖ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｌ）Ｂ２は、存在しない、Ｎ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｓ、Ｄ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｍ）Ｃ２は、存在しない、Ｆ、Ａ、Ｌ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｎ）Ｄ２は、存在しない、Ｒ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｅ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｏ）Ｅ２は、存在しない、Ｑ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｌ、またはステープル／ステッチ位置である）と
を含むペプチドであって、
（ａ）ＢＦＬ−１／Ａ１に結合するか、または
（ｂ）ＢＦＬ−１／Ａ１およびＭＣＬ−１に結合する、ペプチド。
【請求項２６】
５〜３５アミノ酸長である、請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
８〜１８アミノ酸長である、請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２８】
（ｉ）前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号３９もしくは１６のペプチドと比べて低減されている、
（ｉｉ）前記ペプチドの全体的な正電荷が、配列番号３９もしくは１６のペプチドと比べて低減されている、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである、請求項２５、２６、または２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記求電子性弾頭部が、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である、請求２５から２８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、ポリペプチド骨格に連結された求電子性アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有する、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３１】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３２】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である、請求項２５から２９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３３】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項２５から２９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３４】
前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのＮ末端にある、請求項２５から３３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３５】
前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのＮ末端にない、請求項２５から３３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３６】
前記ステープルが、存在する場合、ｉ位およびｉ＋３位、ｉ位およびｉ＋４位、またはｉ位およびｉ＋７位のアミノ酸の間にある、請求項２５から３３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３７】
配列番号９３の少なくとも２つのアミノ酸の、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸での置換を含む、請求項２５から３６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３８】
前記オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸が、Ｓ−ペンテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニン；Ｒ−プロペニルアラニン、Ｓ−ペンテニルアラニン；Ｒ−ペンテニルアラニン、Ｓ−ペンテニルアラニン；ビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−ペンテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニン；およびビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−オクテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニンからなる群から選択される、請求項３７に記載のペプチド。
【請求項３９】
炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ、ＵＶ−環化付加ステープル／ステッチ、オキシムステープル／ステッチ、チオエーテルステープル／ステッチ、ダブルクリックステープル／ステッチ、ビス−ラクタムステープル／ステッチ、ビス−アリール化ステープル／ステッチ、またはこれらの任意の２つもしくはそれを超える組合せを含む、請求項２５から３６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項４０】
ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合するペプチドであって、求電子性弾頭部と、以下に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％同一である配列とを含み、
【化１４】
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ＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１／Ａ１に選択的に結合する、ペプチド。
【請求項４１】
８〜１８アミノ酸長である、請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４２】
前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのＮ末端にある、請求項４０または４１に記載のペプチド。
【請求項４３】
前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのＮ末端にない、請求項４０または４１に記載のペプチド。
【請求項４４】
前記求電子性弾頭部が、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である、請求項４０から４３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項４５】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、ポリペプチド骨格に連結された求電子性アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有する、請求項４４に記載のペプチド。
【請求項４６】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される、請求項４５に記載のペプチド。
【請求項４７】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項４８】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項４９】
炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ、ＵＶ−環化付加ステープル／ステッチ、オキシムステープル／ステッチ、チオエーテルステープル／ステッチ、ダブルクリックステープル／ステッチ、ビス−ラクタムステープル／ステッチ、ビス−アリール化ステープル／ステッチ、またはこれらの任意の２つもしくはそれを超える組合せを含む、請求項４０から４８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５０】
前記アミノ酸配列に対して少なくとも１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％、または１００％同一である配列を含む、請求項４０から４９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記アミノ酸配列からの８６％の変動が、前記アミノ酸配列のＢＦＬ−１非相互作用アルファヘリックス面にある、請求項４０または４１に記載のペプチド。
【請求項５２】
ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合するペプチドであって、以下に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％同一である配列を含み、
【化１５】
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前記ペプチドがＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１／Ａ１に選択的に結合し、前記ペプチドがＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合し、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合し、
Ｊが求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２が非天然のアミノ酸である、ペプチド。
【請求項５３】
８〜１８アミノ酸長である、請求項５２に記載のペプチド。
【請求項５４】
前記求電子性弾頭部が、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である、請求項５２または５３に記載のペプチド。
【請求項５５】
前記アミノ酸配列に対して少なくとも１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％同一である配列を含む、請求項５２、５３、または５４に記載のペプチド。
【請求項５６】
前記アミノ酸配列からの８６％の変動が、前記アミノ酸配列のＢＦＬ−１非相互作用アルファヘリックス面にある、請求項５２または５３に記載のペプチド。
【請求項５７】
前記の配列の２位、３位、６位、７位、８位、９位、１２位、１３位、１４位、１５位、または１６位（１位は、「Ｊ」である）のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸が、別のアミノ酸に置換されていてもよい、請求項５２から５６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５８】
前記の配列の２位、３位、６位、７位、８位、９位、１２位、１３位、１４位、１５位、または１６位（１位は、「Ｊ」である）のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸が、アラニン、Ｄ−アラニン、またはα−アミノイソ酪酸に置換されている、請求項５２から５６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５９】
７位および／もしくは１５位におけるアミノ酸が、グルタミン酸で置換されている、ならびに／または１３位におけるアミノ酸が、アスパラギン酸で置換されている、ならびに／または１６位におけるアミノ酸が、ロイシンで置換されている、ならびに／または２位、３位、６位、８位、９位、１２位、１４位、および１５位のうちの１つもしくは複数におけるアミノ酸が、アラニン、Ｄ−アラニン、もしくはα−アミノイソ酪酸で置換されている（１位は、「Ｊ」である）、請求項５２または５３に記載のペプチド。
【請求項６０】
８位および／または１２位におけるアミノ酸が、アラニン、Ｄ−アラニン、またはα−アミノイソ酪酸で置換されている、請求項５９に記載のペプチド。
【請求項６１】
前記ペプチドが、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を含むかまたはそれからなり、
前記ペプチドが、ＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１／Ａ１に選択的に結合し、前記ペプチドが、ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合し、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合し、
Ｊが、求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２が、非天然のアミノ酸である、請求項５２、５３、または５４に記載のペプチド。
【請求項６２】
前記ペプチドが、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を含むかまたはそれからなり、
前記ペプチドが、ＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１／Ａ１に選択的に結合し、前記ペプチドが、ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合し、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合し、
Ｊが、求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２が、非天然のアミノ酸である、請求項５２、５３、または５４に記載のペプチド。
【請求項６３】
前記求電子性弾頭部が、ポリペプチド骨格に連結された求電子性部分を有し、リンカーが、窒素含有複素環  窒素含有複素環式アミノ酸、またはアミノ官能化ベンゼン環、炭素環、多環、もしくは複素環である、請求項５２から６２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６４】
前記求電子性部分が、求電子性アクリルアミド、置換アクリルアミド、ビニル−スルホンアミド、またはα，β不飽和アミドである、請求項６３に記載のペプチド。
【請求項６５】
前記求電子性弾頭部が、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である、請求項５２から６２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６６】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される、請求項６５に記載のペプチド。
【請求項６７】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である、請求項５２から６２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６８】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項５２から６２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６９】
１５〜３５アミノ酸長である、請求項５２から６８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７０】
ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合するペプチドであって、以下に記載されるアミノ酸配列のアルファヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１相互作用面の少なくとも２つのアミノ酸を含み、
【化１６】
2021506800.tif 000020
Ｊが、求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２が、非天然のアミノ酸である、ペプチド。
【請求項７１】
５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長である、請求項７０に記載のペプチド。
【請求項７２】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である、請求項７０または７１に記載のペプチド。
【請求項７３】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項７０または７１に記載のペプチド。
【請求項７４】
前記非天然のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸である、請求項７０から７３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７５】
前記オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸が、Ｓ−ペンテニルアラニンおよび／またはＲ−オクテニルアラニンである、請求項７４に記載のペプチド。
【請求項７６】
ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合するペプチドであって、以下に記載されるアミノ酸配列を含み、
【化１７】
2021506800.tif 000021
Ｊが、求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２が、非天然のアミノ酸である、ペプチド。
【請求項７７】
前記ペプチドが、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を含むかまたはそれからなり、Ｊが、求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２が、非天然のアミノ酸である、請求項７６に記載のペプチド。
【請求項７８】
前記ペプチドが、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を含むかまたはそれからなり、Ｊが、求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２が、非天然のアミノ酸である、請求項７６に記載のペプチド。
【請求項７９】
Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、
Ｘ１が、Ｓ−ペンテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｒ−オクテニルアラニンである、
Ｘ１が、Ｓ−ペンテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、
Ｘ１が、Ｒ−プロペニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、または
Ｘ１が、Ｒ−ペンテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項７６から７８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８０】
前記求電子性弾頭部が、ポリペプチド骨格に連結された求電子性部分を含む、請求項７６から７９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８１】
前記求電子性部分が、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である、請求項８０に記載のペプチド。
【請求項８２】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、求電子性アクリルアミド、置換アクリルアミド、ビニル−スルホンアミド、またはα，β不飽和アミドを含む、請求項８１に記載のペプチド。
【請求項８３】
前記求電子性基を有する非天然のアミノ酸が、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される、請求項８１または８２に記載のペプチド。
【請求項８４】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である、請求項７６から７９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８５】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項７６から７９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８６】
１５〜３５アミノ酸長である、請求項７６から８５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８７】
８〜１８アミノ酸長である、請求項７６から８５に記載のペプチド。
【請求項８８】
請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項８９】
ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記ヒト対象に、治療有効量の、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項８８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９０】
前記ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患が、造血系悪性腫瘍、固形腫瘍、自己免疫疾患、および炎症性疾患からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患が、白血病またはリンパ腫である造血系悪性腫瘍である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患が、黒色腫、乳がん、または肺がんである固形腫瘍である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患が、自己免疫性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、脈管炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、またはシェーグレン病である自己免疫疾患である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患が、喘息、乾癬、炎症性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、または脈管炎である炎症性疾患である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患が、がんである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
前記がんが、固形腫瘍または液性腫瘍である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記がんが、乳がん、自律神経節がん、膵臓がん、皮膚がん、ＣＮＳがん、造血系もしくはリンパ系のがん、肺がん、大腸がん、胃がん、軟組織肉腫、または骨がんである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記造血系悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、または多発性骨髄腫である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記ヒト対象に、治療有効量の、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項８８に記載の医薬組成物を、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項１００】
前記阻害剤が、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）キナーゼ阻害剤、血管拡張性失調症およびｒａｄ３関連（ＡＴＲ）キナーゼ阻害剤、チェックポイントキナーゼ１および／もしくはチェックポイントキナーゼ２（ＣＨＫ１／２）阻害剤、ならびに／またはポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患が、造血系悪性腫瘍、固形腫瘍、自己免疫疾患、および炎症性疾患からなる群から選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記造血系悪性腫瘍が、白血病またはリンパ腫であり、
前記固形腫瘍が、黒色腫、乳がん、または肺がんであり、
前記自己免疫疾患が、自己免疫性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、脈管炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、またはシェーグレン病であり、
前記炎症性疾患が、喘息、乾癬、炎症性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、または脈管炎である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記造血系悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、または多発性骨髄腫である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患が、がんである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０５】
前記がんが、固形腫瘍または液性腫瘍である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記がんが、黒色腫、リンパ腫、または白血病である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記がんが、急性骨髄性白血病である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記がんが、乳がん、自律神経節がん、膵臓がん、皮膚がん、ＣＮＳがん、造血系もしくはリンパ系のがん、肺がん、大腸がん、胃がん、軟組織肉腫、または骨がんである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記阻害剤が、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、リン酸クロロキン、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６からなる群から選択されるＡＴＭ阻害剤である、請求項９９から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記阻害剤が、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８からなる群から選択されるＡＴＲ阻害剤である、請求項９９から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＣＨＫ１／２阻害剤が、ＡＺＤ７７６２、ＣＣＴ  ２４１５３３、ＬＹ  ２６０３６１８、ＬＹ  ２６０６３６８、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート、ＰＤ  ４０７８２４、ＰＦ４７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、ＴＣＳ  ２３１２、およびＳＲＡ７３７からなる群から選択される、請求項９９から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３、およびＥ７４４９からなる群から選択される、請求項９９から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患を処置するための組合せ治療薬であって、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドと、ＤＮＡ損傷応答経路の阻害剤とを含む、組合せ治療薬。
【請求項１１４】
前記阻害剤が、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤である、請求項１１３に記載の組合せ治療薬。
【請求項１１５】
ＭＣＬ−１を発現するかまたはＭＣＬ−１依存性の疾患を処置するための組合せ治療薬であって、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドと、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤とを含む、組合せ治療薬。
【請求項１１６】
前記阻害剤が、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤である、請求項１１５に記載の組合せ治療薬。
【請求項１１７】
前記ペプチドが、
【化１８】
2021506800.tif 000022
からなる群から選択され、
Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１１８】
前記ペプチドが、ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）であり、Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１１９】
前記ペプチドが、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）であり、Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１２０】
前記阻害剤が、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、リン酸クロロキン、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６からなる群から選択されるＡＴＭキナーゼ阻害剤である、請求項１１３から１１９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１２１】
前記阻害剤が、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８からなる群から選択されるＡＴＲキナーゼ阻害剤である、請求項１１３から１１９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１２２】
前記阻害剤が、ＡＺＤ７７６２、ＣＣＴ  ２４１５３３、ＬＹ  ２６０３６１８、ＬＹ  ２６０６３６８、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート、ＰＤ  ４０７８２４、ＰＦ４７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、ＴＣＳ  ２３１２、およびＳＲＡ７３７からなる群から選択されるＣＨＫ１／２阻害剤である、請求項１１３から１１９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１２３】
前記阻害剤が、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３、およびＥ７４４９からなる群から選択されるＰＡＲＰ阻害剤である、請求項１１３から１１９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１２４】
ＭＣＬ−１を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患またはＭＣＬ−１依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記ヒト対象に、治療有効量の、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項８８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１２５】
前記対象に、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記阻害剤が、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ペプチドが、
【化１９】
2021506800.tif 000023
からなる群から選択され、
Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１２４、１２５、または１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ペプチドが、ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）であり、Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１２４、１２５、または１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ペプチドが、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）であり、Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１２４、１２５、または１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記阻害剤が、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、リン酸クロロキン、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６からなる群から選択されるＡＴＭキナーゼ阻害剤である、請求項１２５から１２９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１３１】
前記阻害剤が、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８からなる群から選択されるＡＴＲキナーゼ阻害剤である、請求項１２５から１２９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１３２】
前記阻害剤が、ＡＺＤ７７６２、ＣＣＴ  ２４１５３３、ＬＹ  ２６０３６１８、ＬＹ  ２６０６３６８、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート、ＰＤ  ４０７８２４、ＰＦ４７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、ＴＣＳ  ２３１２、およびＳＲＡ７３７からなる群から選択されるＣＨＫ１／２阻害剤である、請求項１２５から１２９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１３３】
前記阻害剤が、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３、およびＥ７４４９からなる群から選択されるＰＡＲＰ阻害剤である、請求項１２５から１２９のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１３４】
配列番号４０〜４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、安定化されたペプチド。
【請求項１３５】
配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１３４に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１３６】
配列番号４２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１３４に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１３７】
求電子性弾頭部をさらに含む、請求項１３４から１３６のいずれか一項に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１３８】
前記求電子性弾頭部が、前記安定化されたペプチドのＮ末端にある、請求項１３７に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１３９】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である、請求項１３７または１３８に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１４０】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項１３７または１３８に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１４１】
請求項１３７から１３９のいずれか一項に記載の安定化されたペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４２】
ＢＦＬ−１を発現するかもしくはＢＦＬ−１依存性の疾患またはＭＣＬ−１を発現するかもしくはＭＣＬ−１依存性の疾患を処置するための組合せ治療薬であって、請求項１３７から１４０のいずれか一項に記載の安定化されたペプチドと、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤とを含む、組合せ治療薬。
【請求項１４３】
前記阻害剤が、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤である、請求項１４２に記載の組合せ治療薬。
【請求項１４４】
ＭＣＬ−１を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患またはＭＣＬ−１依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記ヒト対象に、治療有効量の、請求項１３７から１４０のいずれか一項に記載の安定化されたペプチドまたは請求項１４１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１４５】
配列番号４４〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、安定化されたペプチド。
【請求項１４６】
配列番号４４に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１４５に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１４７】
配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１４５に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１４８】
求電子性弾頭部をさらに含む、請求項１４５から１４７のいずれか一項に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１４９】
前記求電子性弾頭部が、前記安定化されたペプチドのＮ末端にある、請求項１４８に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１５０】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である、請求項１４８または１４９に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１５１】
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、請求項１４８または１４９に記載の安定化されたペプチド。
【請求項１５２】
請求項１４８から１５１のいずれか一項に記載の安定化されたペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１５３】
ＢＦＬ−１を発現するかもしくはＢＦＬ−１依存性の疾患またはＭＣＬ−１を発現するかもしくはＭＣＬ−１依存性の疾患を処置するための組合せ治療薬であって、請求項１４８から１５１のいずれか一項に記載の安定化されたペプチドと、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤とを含む、組合せ治療薬。
【請求項１５４】
前記阻害剤が、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤である、請求項１５３に記載の組合せ治療薬。
【請求項１５５】
ＭＣＬ−１を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患またはＭＣＬ−１依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記ヒト対象に、治療有効量の、請求項１４８から１５１のいずれか一項に記載の安定化されたペプチドまたは請求項１５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１５６】
ＭＣＬ−１を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患またはＭＣＬ−１依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行うための組合せ治療薬であって、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドと、ＭＣＬ−１の阻害剤とを含む、組合せ治療薬。
【請求項１５７】
前記ＭＣＬ−１阻害剤が、Ｓ６４３１５、Ｓ６３８４５、ＢＡＹ  １０００３９４、ＭＩＫ６６５、ＡＭＧ３９７、およびＡＭＧ１７６からなる群から選択される、請求項１５６に記載の組合せ治療薬。
【請求項１５８】
ＢＣＬ−２を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患またはＢＣＬ−２依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行うための組合せ治療薬であって、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドと、ＢＣＬ−２の阻害剤とを含む、組合せ治療薬。
【請求項１５９】
前記ＢＣＬ−２阻害剤が、ベネトクラックスである、請求項１５８に記載の組合せ治療薬。
【請求項１６０】
ＢＣＬ−ＸＬを発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患またはＢＣＬ−ＸＬ依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行うための組合せ治療薬であって、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドと、ＢＣＬ−ＸＬの阻害剤とを含む、組合せ治療薬。
【請求項１６１】
前記ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤が、ナビトクラックスである、請求項１６０に記載の組合せ治療薬。
【請求項１６２】
ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、および／もしくはＭＣＬ−１を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患、またはＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、および／もしくはＭＣＬ−１依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行うための組合せ治療薬であって、請求項１から８７のいずれか一項に記載のペプチドと、ＢＣＬ−ＸＬの阻害剤、ＢＣＬ−２の阻害剤、および／またはＭＣＬ−１の阻害剤とを含む、組合せ治療薬。
【請求項１６３】
前記ＭＣＬ−１阻害剤が、Ｓ６４３１５、Ｓ６３８４５、ＢＡＹ  １０００３９４、ＭＩＫ６６５、ＡＭＧ３９７、およびＡＭＧ１７６からなる群から選択される、請求項１６２に記載の組合せ治療薬。
【請求項１６４】
前記ＢＣＬ−２阻害剤が、ベネトクラックスである、請求項１６２に記載の組合せ治療薬。
【請求項１６５】
前記ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤が、ナビトクラックスである、請求項１６２に記載の組合せ治療薬。
【請求項１６６】
前記ペプチドが、
【化２０】
2021506800.tif 000024
からなる群から選択され、
Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１５６から１６５のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１６７】
前記ペプチドが、ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）であり、Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１５６から１６５のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【請求項１６８】
前記ペプチドが、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）であり、Ｊが、システイン反応性アクリルアミドＤ−ニペコチン酸部分または他のシステイン反応性部分であり、Ｘ１が、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２が、Ｓ−ペンテニルアラニンである、請求項１５６から１６５のいずれか一項に記載の組合せ治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮出願第６２／５９９，２２９号の優先権を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された付与番号５Ｒ３５ＣＡ１９７５８３およびＲ５０ＣＡ２１１３９９のもとに、政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本開示は、構造安定化および／またはシステイン反応性ＮＯＸＡペプチド、ならびにそのようなペプチドを、単独で、またはＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤（たとえば、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤）、またはＭＣＬ−１の阻害剤、ＢＣＬ−２の選択的阻害剤、もしくはＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬの阻害剤と組み合わせて、がんおよび細胞過剰性疾患、たとえば、自己免疫状態および炎症性状態の処置において使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
アポトーシス促進性メンバーおよび抗アポトーシス性メンバーの両方を含む、ＢＣＬ−２タンパク質ファミリーは、細胞の運命を決定するチェックおよびバランスの複雑なネットワークを形成する。このファミリーは、最大で４つの保存された「ＢＣＬ−２相同性」（ＢＨ）ドメインの存在によって構造が定義され、これらのドメインは、すべてがアルファヘリックス部分を含む。ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１などの抗アポトーシスタンパク質は、すべてのＢＨドメインにおいて配列の保存を呈するが、一方で、アポトーシス促進性タンパク質は、「マルチＢＨドメイン」メンバー（たとえば、ＢＡＸおよびＢＡＫ）と、アルファヘリックスＢＨ３ドメインにおいてのみ配列の類似性を示す「ＢＨ３オンリー」メンバー（たとえば、ＢＩＭおよびＮＯＸＡ）とに分けられる。ＢＨ３オンリーサブグループは、多様であり、異質な刺激からの死滅促進シグナルを、ミトコンドリアに位置するアポトーシス機構に伝達する。ＢＨ３オンリータンパク質の死滅シグナルは、抗アポトーシス性タンパク質によって中和されるか、または直接的もしくは間接的に、ミトコンドリアの執行者（executioner）ＢＡＸおよびＢＡＫへと送達される。活性化されると、ＢＡＸ／ＢＡＫは、ミトコンドリア外膜の透過処理を誘導し、放出されたミトコンドリア因子が、死滅プログラムを不可逆的に実行するカスパーゼを誘導することを可能にする。
【０００５】
ヒトのがんは、処置に抵抗し、細胞生存を確実にするために、ミトコンドリア性アポトーシスを、常時抑制している。もっとも一般的な戦略は、ほとんどが、１つまたは複数の抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリータンパク質、たとえば、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ−１、またはＢＦＬ−１の過剰発現を伴う。これらのタンパク質は、マルチドメインタンパク質ＢＡＸおよびＢＡＫ、ならびにＢＨ３オンリーストレスセンサータンパク質、たとえば、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、およびＮＯＸＡを含む、アポトーシス促進性メンバーのＢＨ３ヘリックスの捕捉を含む、ミトコンドリア性アポトーシスの抑制という共通の機序を共有する。抗アポトーシス性タンパク質間における結合特異性のオーバーラップを考慮して、１つのメンバーの分子標的化が、別のものの上方制御をもたらすことも多く、「モグラ叩き（whack-a-mole）」の腫瘍学バージョンをもたらしている。たとえば、選択的小分子阻害剤ＡＢＴ−７３７によるＢＣＬ−２の小分子標的化は、リンパ腫細胞株において、ＭＣＬ−１またはＢＦＬ−１の上方制御をトリガーすることが示されている。ＢＣＬ−２の選択的小分子阻害剤は、現在、ＦＤＡに承認されており、ＭＣＬ−１の選択的化合物は、近年、臨床試験へと進んだため、ＢＦＬ−１が、優先度の高い、薬が未開発のがんの標的として残っている。実際に、ＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１選択的阻害剤に対する耐性を付与するその能力に加えて、ＢＦＬ−１は、黒色腫、白血病、およびリンパ腫を含む、ヒトのがんの宿主において、独立した腫瘍発生作動因子である。
【０００６】
ＢＣＬ−２関連タンパク質であるＢＦＬ−１／Ａ１は、広範な液性腫瘍および固形腫瘍において、ミトコンドリア性アポトーシス経路の抑制に関与している。たとえば、ＢＦＬ−１は、過剰発現されるか、またはユビキチン媒介型分解に耐性となるように変異されると、ＢＣＲ依存性／上昇型ＮＦκＢサブクラスの胚中心リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫を含む、個別のリンパ腫において、化学療法耐性を誘導する。ＢＦＬ−１はまた、臨床的に関連性のあるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ耐性変異を有するものを含め、ヒト黒色腫のおよそ３０％において、病理学的生存因子として特定されている。
【０００７】
抗アポトーシス性のＢＣＬ−２ファミリー生存タンパク質である骨髄系細胞白血病−１（ＭＣＬ−１）は、広範ながんの発生、維持、および化学療法耐性に関与しており、ヒトのがんにおいてもっとも広く発現される上位１０個の病理学的因子のうちの１つである（たとえば、Beroukhim,  Nature,  463(7283):899-905  (2010)を参照されたい）。ヒトのがんにおいて高度に過剰発現されると、ＭＣＬ−１は、アポトーシス促進性のＢＣＬ−２ファミリーメンバーの本質的なＢＨ３ドメインヘリックスに結合し、それを封鎖することによって、非常に高いアポトーシス耐性を獲得する。
【０００８】
したがって、ＢＦＬ−１および／またはＭＣＬ−１活性を妨害する化合物は、様々ながんおよび細胞過剰性疾患、たとえば、自己免疫状態および炎症性状態を処置するのに有用であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Beroukhim,  Nature,  463(7283):899-905  (2010)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
要旨
本開示は、ＢＦＬ−１に共有結合で結合することができ、非共有結合的相互作用によりＢＦＬ−１および／またはＭＣＬ−１に結合することもできる、構造安定化および／またはシステイン反応性ＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドに関する。本開示はまた、そのようなペプチドを、単独で、または他の治療剤（たとえば、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤（たとえば、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤）、ＭＣＬ−１の選択的阻害剤、ＢＣＬ−２の選択的阻害剤、ＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬの阻害剤）と組み合わせて、ＢＦＬ−１および／またはＭＣＬ−１依存性またはそれを発現するがん（たとえば、造血系悪性腫瘍、黒色腫）の処置において使用するための方法も特徴とする。
【００１１】
第１の態様では、本開示は、求電子性弾頭部と、配列番号３９に記載される配列の改変されたアミノ酸配列とを含む、ペプチドを提供する。改変されたアミノ酸配列は、少なくとも５アミノ酸長であり、ペプチド構造を安定化する改変を少なくとも１つ含み、配列番号３９の１つまたは複数の（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個の）アミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている。ペプチドは、ＢＦＬ−１／Ａ１に結合するか、またはＢＦＬ−１／Ａ１およびＭＣＬ−１の両方に結合する。少なくとも５つのアミノ酸は、たとえば、ＡＴＱＬＲ（配列番号１１０）、ＲＦＧＤＫ（配列番号１４３）、ＬＮＦＲＱ（配列番号１２４）、ＴＱＬＲＲ（配列番号１４５）、ＦＧＤＫＬ（配列番号１４６）、ＱＬＲＲＦ（配列番号１４７）、ＧＤＫＬＮ（配列番号１４８）、ＬＲＲＦＧ（配列番号１４９）、ＤＫＬＮＦ（配列番号１５０）、ＲＲＦＧＤ（配列番号１４２）、およびＫＬＮＦＲ（配列番号１４４）のバリアントであり得る。たとえば、５個のアミノ酸のうちの少なくとも２つは、構造安定化のために改変されており（たとえば、炭化水素ステープルを形成することができる非天然のアミノ酸で置換することによって）、１つまたは複数の（たとえば、１、２、３個の）アミノ酸は、他のアミノ酸と置換されている。ある特定の事例では、置換は、ヘリックスの非相互作用面にある。ある特定の事例では、置換は、ヘリックスの非相互作用面にある。一部の場合には、置換は、保存的アミノ酸置換である。ある特定の実施形態では、少なくとも５個のアミノ酸のうちの１つまたは複数のアミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている。
【００１２】
一部の実施形態では、改変されたアミノ酸配列は、５〜３５個のアミノ酸（たとえば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３２、３５個）の長さである。一部の実施形態では、改変されたアミノ酸配列は、８〜１８（たとえば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）アミノ酸長である。
【００１３】
一部の実施形態では、ペプチド構造を安定化する改変は、ステープルおよび／またはステッチである。一部の事例では、ステープルは、ｉ位およびｉ＋３位、ｉ位およびｉ＋４位、またはｉ位およびｉ＋７位のうちの１つまたは複数にある。一部の実施形態では、ペプチド構造を安定化する改変は、配列番号３９の少なくとも２つ（たとえば、２、３、４、５、６個）のアミノ酸の、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸での置換を含む。一部の事例では、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸は、Ｓ−ペンテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニン；Ｒ−プロペニルアラニン、Ｓ−ペンテニルアラニン；Ｒ−ペンテニルアラニン、Ｓ−ペンテニルアラニン；ビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−ペンテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニン；およびビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−オクテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニンからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、１位および５位、２位および６位、３位および７位、６位および１０位、１０位および１４位、１１位および１５位、１２位および１６位、１位および８位、３位および１０位、６位および１３位、７位および１４位、または８位および１５位を含む（ここで、位置は、配列番号３９に基づく）。
【００１４】
ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化する改変は、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ、ＵＶ−環化付加ステープル／ステッチ、オキシムステープル／ステッチ、チオエーテルステープル／ステッチ、ダブルクリックステープル／ステッチ、ビス−ラクタムステープル／ステッチ、ビス−アリール化ステープル／ステッチ、またはこれらの任意の２つもしくはそれを超える組合せである。
【００１５】
ある特定の実施形態では、別のアミノ酸によって置換される配列番号３９の１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸は、配列番号３９のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１非相互作用面にある。一部の実施形態では、配列番号３９における０〜５個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されるか、または除去され、アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１〜６個のアミノ酸と置き換えられる。一部の実施形態では、配列番号３９の非相互作用面にある０〜６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号３９の以下のアミノ酸Ａ１、Ｌ４、Ｒ５、Ｆ７、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、アルファ−メチル化またはアルファ−エチル化された天然のアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号３９の以下のアミノ酸Ａ１、Ｌ４、Ｒ５、Ｆ７、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号３９の以下のアミノ酸Ｔ２、Ｑ３、Ｒ６、Ｋ１０、Ｆ１３、およびＲ１４のうちの１つまたは複数は、アルファ−メチル化またはアルファ−エチル化された天然のアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号３９の以下のアミノ酸Ｔ２、Ｑ３、Ｒ６、Ｋ１０、Ｆ１３、およびＲ１４のうちの１つまたは複数は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号３９の以下のアミノ酸Ａ１、Ｔ２、Ｑ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｆ７、Ｇ８、Ｋ１０、Ｌ１１、Ｎ１２、Ｆ１３、Ｒ１４、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、アルファメチルもしくはエチルで改変されているか、またはＬ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の事例では、別のアミノ酸によって置換される配列番号３９の１つまたは複数のアミノ酸は、配列番号３９のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１相互作用面にある。他の事例では、別のアミノ酸によって置換される配列番号３９の１つまたは複数のアミノ酸は、配列番号３９のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１非相互作用面および相互作用面にある。ある特定の実施形態では、配列番号３９の１つまたは複数のアミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている。
【００１６】
一部の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数（番号付けは、配列番号３９に基づく）は、置換も、ステープルも、ステッチもされない：Ｌ４とＧ８とが一緒に；Ｒ５とＤ９とが一緒に；Ｆ７とＬ１１とが一緒に；Ｇ８とＮ１２とが一緒に；Ｄ９とＦ１３とが一緒に；Ｔ２とＤ９とが一緒に；Ｌ４とＬ１１とが一緒に；Ｒ５とＮ１２とが一緒に；Ａ１；Ｌ４；Ｇ８；またはＤ９。
【００１７】
一部の実施形態では、ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号３９または１６のペプチドと比べて低減されている。一部の実施形態では、ペプチドの全体的な正電荷は、配列番号３９または１６のペプチドと比べて低減されている。ある特定の実施形態では、ペプチドの全体的な疎水性および全体的な正電荷は、配列番号３９または１６のペプチドと比べて低減されている。
【００１８】
一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である。ある特定の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、ポリペプチド骨格に連結された求電子性アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有する。一部の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン（azepaneazirine）、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される。一実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。別の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。ある特定の事例では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端にある。他の事例では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端にない。
【００１９】
第２の態様では、本開示は、求電子性弾頭部と、Ａ０Ｂ０Ｃ０Ｄ０Ｅ０Ａ１Ｂ１Ｃ１Ｄ１Ｅ１Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２Ｅ２（配列番号９３）の５個またはそれを超えるアミノ酸（配列中、
（ａ）Ａ０は、存在しない、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｂ）Ｂ０は、存在しない、Ｔ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｉ、Ｍ、Ｂ（ノルロイシン）、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｃ）Ｃ０は、存在しない、Ｑ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｄ）Ｄ０は、存在しない、Ｌ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｉ、またはＦであり、
（ｅ）Ｅ０は、Ｒ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｋ、Ｔ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｆ）Ａ１は、Ｒ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｅ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｇ）Ｂ１は、Ｆ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｈ）Ｃ１は、Ｇ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｉ）Ｄ１は、Ｄであり、
（ｊ）Ｅ１は、存在しない、Ｋ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｋ）Ａ２は、存在しない、Ｌ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｗ、Ｖ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｌ）Ｂ２は、存在しない、Ｎ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｓ、Ｄ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｍ）Ｃ２は、存在しない、Ｆ、Ａ、Ｌ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｎ）Ｄ２は、存在しない、Ｒ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｅ、またはステープル／ステッチ位置であり、
（ｏ）Ｅ２は、存在しない、Ｑ、Ａ、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｌ、またはステープル／ステッチ位置である）とを含むペプチドを特徴とする。
【００２０】
ペプチドは、ＢＦＬ−１／Ａ１に（共有結合でおよび／もしくは非共有結合で）結合するか、またはペプチドは、ＢＦＬ−１／Ａ１に（共有結合で）結合し、ＭＣＬ−１に（非共有結合で）結合する。
【００２１】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、５〜３５（たとえば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２２、２５、３０、３５）アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドは、８〜１８（たとえば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）アミノ酸長である。
【００２２】
一部の実施形態では、ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号３９または１６のペプチドと比べて低減されている。一部の実施形態では、ペプチドの全体的な正電荷は、配列番号３９または１６のペプチドと比べて低減されている。ある特定の実施形態では、ペプチドの全体的な疎水性および全体的な正電荷は、配列番号３９または１６のペプチドと比べて低減されている。
【００２３】
一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である。ある特定の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、ポリペプチド骨格に連結された求電子性アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有する。一部の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される。一実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。別の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。ある特定の事例では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端にある。他の事例では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端にない。
【００２４】
一部の実施形態では、ペプチドは、ステープルおよび／またはステッチを含む。一部の事例では、ステープルは、存在する場合、ｉ位およびｉ＋３位、ｉ位およびｉ＋４位、またはｉ位およびｉ＋７位のうちの１つまたは複数にある。一部の実施形態では、ペプチド構造を安定化する改変は、配列番号９３の少なくとも２つ（たとえば、２、３、４、５、６個）のアミノ酸の、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸での置換を含む。一部の事例では、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸は、Ｓ−ペンテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニン；Ｒ−プロペニルアラニン、Ｓ−ペンテニルアラニン；Ｒ−ペンテニルアラニン、Ｓ−ペンテニルアラニン；ビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−ペンテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニン；およびビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−オクテニルアラニン、Ｒ−オクテニルアラニンからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ペプチドは、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ、ＵＶ−環化付加ステープル／ステッチ、オキシムステープル／ステッチ、チオエーテルステープル／ステッチ、ダブルクリックステープル／ステッチ、ビス−ラクタムステープル／ステッチ、ビス−アリール化ステープル／ステッチ、またはこれらの任意の２つもしくはそれを超える組合せを含む。ある特定の実施形態では、配列番号９３の以下の位置のうちの任意の２つまたはそれよりも多くが、ステープルまたはステッチに関与する：Ａ０、Ｂ０、Ｃ０、Ｅ０、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｅ１、Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２、Ｅ２。ある特定の事例では、ステープル位置は、Ｅ２位の後に導入され得る。
【００２５】
第３の態様では、本開示は、ＢＦＬ−１／Ａ１に（たとえば、Ｃ５５に）共有結合で結合するペプチドを提供する。求電子性弾頭部と、配列番号９４〜１０９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％同一である配列とを含む、ペプチド。ペプチドは、ＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１／Ａ１に選択的に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、８〜１８（たとえば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）アミノ酸長である。
【００２６】
ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端にある。他の実施形態では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端にない。一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である。ある特定の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、ポリペプチド骨格に連結された求電子性アクリルアミドまたは置換アクリルアミドを有する。一部の場合には、リンカーは、窒素含有複素環、窒素含有複素環式アミノ酸、アミノ官能化ベンゼン環、炭素環、多環、または複素環である。一部の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される。一実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。
【００２７】
ある特定の事例では、ペプチドは、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ、ＵＶ−環化付加ステープル／ステッチ、オキシムステープル／ステッチ、チオエーテルステープル／ステッチ、ダブルクリックステープル／ステッチ、ビス−ラクタムステープル／ステッチ、ビス−アリール化ステープル／ステッチ、またはこれらの任意の２つもしくはそれを超える組合せを含む。
【００２８】
一部の事例では、ペプチドは、アミノ酸配列に対して少なくとも１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％、または１００％同一である配列を含む。一部の事例では、アミノ酸配列からの変動は、アミノ酸配列のＢＦＬ−１非相互作用アルファヘリックス面にある。ある特定の事例では、アミノ酸配列は、アルファ−メチルもしくはアルファ−エチル天然のアミノ酸を含むように改変されている、ならびに／またはアラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸で置換されている。
【００２９】
第４の態様では、本開示は、ＢＦＬ−１／Ａ１に（たとえば、ＢＦＬ−１／Ａ１のＣ５５に）共有結合で結合するペプチドであって、配列番号６０〜７５に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％同一である配列を含む、ペプチドを特徴とする。ある特定の事例では、ペプチドは、ＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１／Ａ１に選択的に結合する。一部の事例では、ペプチドは、ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合し、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合する。
【００３０】
ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である。
【００３１】
一部の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列に対して少なくとも１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％同一である配列を含む。ある特定の事例では、アミノ酸配列からの変動は、アミノ酸配列のＢＦＬ−１非相互作用アルファヘリックス面にある。一部の事例では、前記の配列の２位、３位、６位、７位、８位、９位、１２位、１３位、１４位、１５位、または１６位（１位は、「Ｊ」である）のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸は、別のアミノ酸に置換されていてもよい。一部の事例では、これらの位置におけるアミノ酸のうちの１つまたは複数は、アラニン、Ｄ−アラニン、またはα−アミノイソ酪酸のうちの１つまたは複数に置換されている。一部の事例では、７位および／もしくは１５位におけるアミノ酸は、グルタミン酸で置換されている、ならびに／または１３位におけるアミノ酸は、アスパラギン酸で置換されている、ならびに／または１６位におけるアミノ酸は、ロイシンで置換されている、ならびに／または２位、３位、６位、８位、９位、１２位、１４位、および１５位のうちの１つもしくは複数におけるアミノ酸は、アラニン、Ｄ−アラニン、もしくはα−アミノイソ酪酸で置換されている（１位は、「Ｊ」である）。一部の事例では、８位および／または１２位におけるアミノ酸は、アラニン、Ｄ−アラニン、またはα−アミノイソ酪酸で置換されている（１位は、「Ｊ」である）。
【００３２】
一部の事例では、ペプチドは、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を含むかまたはそれからなり、ここで、ペプチドは、ＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１／Ａ１に選択的に結合し、ペプチドは、ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合し、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合し、Ｊは、求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２は、非天然のアミノ酸である。
【００３３】
一部の事例では、ペプチドは、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を含むかまたはそれからなり、ここで、ペプチドは、ＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１／Ａ１に選択的に結合し、ペプチドは、ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合し、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合し、Ｊは、求電子性弾頭部であり、Ｘ１およびＸ２は、非天然のアミノ酸である。
【００３４】
一部の事例では、求電子性弾頭部は、ポリペプチド骨格に連結された求電子性部分を有する。一部の場合には、リンカーは、窒素含有複素環、窒素含有複素環式アミノ酸、アミノ官能化ベンゼン環、炭素環、多環、または複素環である。一部の実施形態では、求電子性部分は、求電子性アクリルアミド、置換アクリルアミド、ビニル−スルホンアミド、またはα，β不飽和アミドである。一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である。一部の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される。一実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。
【００３５】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、１５〜３５（たとえば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５）アミノ酸長である。一部の実施形態では、改変されたアミノ酸配列は、８〜１８（たとえば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）アミノ酸長である。
【００３６】
第５の態様では、本開示は、ＢＦＬ−１／Ａ１に（たとえば、ＢＦＬ−１／Ａ１のＣ５５に）共有結合で結合するペプチドであって、配列番号６０〜７５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のアルファヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１相互作用面の少なくとも２つ（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９個）のアミノ酸を含む、ペプチドを提供する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長である。
【００３８】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号６０〜７５の少なくとも５個（たとえば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個）のアミノ酸を含み、そのうち３、２、または１つのアミノ酸が、置換されている。一部の事例では、置換は、アラニン、Ｄ−アラニン、またはα−アミノイソ酪酸へのものである。
【００３９】
一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。他の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。
【００４０】
ある特定の事例では、非天然のアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸である。一部の事例では、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸は、Ｓ−ペンテニルアラニンおよび／またはＲ−オクテニルアラニンである。
【００４１】
第６の態様では、本開示は、ＢＦＬ−１／Ａ１に共有結合で結合するペプチドであって、配列番号６０〜７５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、ペプチドを特徴とする。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００４２】
一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ２は、Ｓ−ペンテニルアラニンである。一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｓ−ペンテニルアラニンであり、Ｘ２は、Ｒ−オクテニルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｓ−ペンテニルアラニンであり、Ｘ２は、Ｓ−ペンテニルアラニンである。他の実施形態では、Ｘ１は、Ｒ−プロペニルアラニンであり、Ｘ２は、Ｓ−ペンテニルアラニンである。なおも他の実施形態では、Ｘ１は、Ｒ−ペンテニルアラニンであり、Ｘ２は、Ｓ−ペンテニルアラニンである。
【００４３】
ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、ポリペプチド骨格に連結された求電子性部分を含む。一部の実施形態では、求電子性部分は、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である。ある特定の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、求電子性アクリルアミド、置換アクリルアミド、ビニル−スルホンアミド、またはα，β不飽和アミドを含む。一部の事例では、求電子性基を有する非天然のアミノ酸は、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド；（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、アクリルアミド、アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、トランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル−スルホンアミドからなる群から選択される。ある特定の事例では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。他の事例では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。
【００４４】
一部の実施形態では、ペプチドは、１５〜３５（たとえば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５）アミノ酸長である。一部の実施形態では、ペプチドは、８〜１８（たとえば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）アミノ酸長である。
【００４５】
第７の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【００４６】
第８の態様では、本開示は、ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行う方法を特徴とする。本方法は、ヒト対象に、治療有効量の、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドまたは本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む。
【００４７】
一部の実施形態では、ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患は、造血系悪性腫瘍、固形腫瘍、自己免疫疾患、および炎症性疾患からなる群から選択される。ある特定の事例では、造血系悪性腫瘍は、白血病またはリンパ腫である。ある特定の事例では、黒色腫、乳がん、または肺がんである、固形腫瘍。ある特定の事例では、自己免疫性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、脈管炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、またはシェーグレン病である、自己免疫疾患。ある特定の事例では、喘息、乾癬、炎症性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、または脈管炎である、炎症性疾患。
【００４８】
一部の実施形態では、ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患は、がんである。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍または液性腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、乳がん、自律神経節がん、膵臓がん、皮膚がん、ＣＮＳがん、造血系もしくはリンパ系のがん、肺がん、大腸がん、胃がん、軟組織肉腫、または骨がんである。一部の実施形態では、造血系悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、または多発性骨髄腫である。
【００４９】
一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０〜７９、１５１、および１５３から選択される。一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６２である。一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０である。
【００５０】
一部の実施形態では、本方法は、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤は、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）キナーゼ阻害剤、血管拡張性失調症およびｒａｄ３関連（ＡＴＲ）キナーゼ阻害剤、チェックポイントキナーゼ１および／もしくはチェックポイントキナーゼ２（ＣＨＫ１／２）阻害剤、ならびに／またはポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である。一部の事例では、ＡＴＭ阻害剤は、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、リン酸クロロキン、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＡＴＲ阻害剤は、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＣＨＫ１／２阻害剤は、ＡＺＤ７７６２、ＣＣＴ  ２４１５３３、ＬＹ  ２６０３６１８、ＬＹ  ２６０６３６８、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート、ＰＤ  ４０７８２４、ＰＦ４７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、ＴＣＳ  ２３１２、およびＳＲＡ７３７からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３、およびＥ７４４９からなる群から選択される。
【００５１】
第９の態様では、本開示は、ＭＣＬ−１を発現するかまたはＭＣＬ−１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行う方法を特徴とする。本方法は、ヒト対象に、治療有効量の、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドまたは本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む。
【００５２】
一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０〜７９、１５１、および１５３から選択されるか、または配列番号１２６〜１４１に記載される配列の構造安定化バージョンである。
【００５３】
一部の実施形態では、本方法は、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤は、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、および／またはＰＡＲＰ阻害剤である。一部の事例では、ＡＴＭ阻害剤は、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、リン酸クロロキン、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＡＴＲ阻害剤は、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＣＨＫ１／２阻害剤は、ＡＺＤ７７６２、ＣＣＴ  ２４１５３３、ＬＹ  ２６０３６１８、ＬＹ  ２６０６３６８、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート、ＰＤ  ４０７８２４、ＰＦ４７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、ＴＣＳ  ２３１２、およびＳＲＡ７３７からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３、およびＥ７４４９からなる群から選択される。
【００５４】
第１０の態様では、本開示は、ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患、およびＭＣＬ−１を発現するかまたはＭＣＬ−１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行う方法を特徴とする。本方法は、ヒト対象に、治療有効量の、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドまたは本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む。
【００５５】
一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０〜７９、１５１、および１５３から選択されるか、または配列番号１２６〜１４１に記載される配列の構造安定化バージョンである。一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０および６２から選択されるか、または配列番号１２６および１２８に記載される配列の構造安定化バージョンである。
【００５６】
一部の実施形態では、本方法は、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤は、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、および／またはＰＡＲＰ阻害剤である。一部の事例では、ＡＴＭ阻害剤は、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、リン酸クロロキン、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＡＴＲ阻害剤は、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＣＨＫ１／２阻害剤は、ＡＺＤ７７６２、ＣＣＴ  ２４１５３３、ＬＹ  ２６０３６１８、ＬＹ  ２６０６３６８、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート、ＰＤ  ４０７８２４、ＰＦ４７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、ＴＣＳ  ２３１２、およびＳＲＡ７３７からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３、およびＥ７４４９からなる群から選択される。
【００５７】
第１１の態様では、本開示は、ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患（たとえば、造血系悪性腫瘍、固形腫瘍、自己免疫疾患、および炎症性疾患）を処置するための組合せ治療薬であって、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドと、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤とを含む、組合せ治療薬を提供する。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤は、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、および／またはＰＡＲＰ阻害剤である。
【００５８】
第１２の態様では、本開示は、ＭＣＬ−１を発現するかまたはＭＣＬ−１依存性の疾患（たとえば、造血系悪性腫瘍、固形腫瘍、自己免疫疾患、および炎症性疾患）を処置するための組合せ治療薬であって、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドと、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤とを含む、組合せ治療薬を提供する。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤は、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、および／またはＰＡＲＰ阻害剤である。
【００５９】
第１３の態様では、本開示は、ＢＦＬ−１／Ａ１を発現するかまたはＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患およびＭＣＬ−１を発現するかまたはＭＣＬ−１依存性の疾患（たとえば、造血系悪性腫瘍、固形腫瘍、自己免疫疾患、および炎症性疾患）を処置するための組合せ治療薬であって、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドと、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤とを含む、組合せ治療薬を提供する。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤は、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、および／またはＰＡＲＰ阻害剤である。
【００６０】
これらの実施形態は、第１１〜第１３の態様に適用される。一部の実施形態では、ＡＴＭ阻害剤は、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、リン酸クロロキン、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＣＨＫ１／２阻害剤は、ＡＺＤ７７６２、ＣＣＴ  ２４１５３３、ＬＹ  ２６０３６１８、ＬＹ  ２６０６３６８、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート、ＰＤ  ４０７８２４、ＰＦ４７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、ＴＣＳ  ２３１２、およびＳＲＡ７３７からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３、およびＥ７４４９からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０〜７９、１５１、および１５３から選択されるか、または配列番号１２６〜１４１に記載される配列の構造安定化バージョンである。一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０および６２から選択されるか、または配列番号１２６および１２８に記載される配列の構造安定化バージョンである。
【００６１】
第１４の態様では、本開示は、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一である（たとえば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である）アミノ酸配列を含む、ステープルペプチドを提供する。ある特定の事例では、ステープルペプチドは、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列を含むが、ただし、１〜１０個（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸置換を有することを除く。ある特定の事例では、置換は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸へのものである。ステープルペプチドは、ＢＦＬ−１および／またはＭＣＬ−１に結合する。
【００６２】
第１４の態様では、本開示は、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一である（たとえば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である）アミノ酸配列を含む、ステープルペプチドを提供する。ある特定の事例では、ステープルペプチドは、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列を含むが、ただし、１〜１０個（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸置換を有することを除く。ある特定の事例では、置換は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸へのものである。ステープルペプチドは、ＢＦＬ−１および／またはＭＣＬ−１に結合する。
【００６３】
これらの実施形態は、第１４の態様に適用される。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、システイン反応性部分をさらに含む。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分を含む。これらの部分は、ステープルペプチドのＮ末端に結合され得るか、または含まれ得る。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、ＤＮＡ損傷応答経路阻害剤と組み合わされる。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路阻害剤は、ＡＴＭキナーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路阻害剤は、ＡＴＲキナーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路阻害剤は、ＣＨＫ１／２阻害剤である。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤である。一部の実施形態では、ＡＴＭ阻害剤は、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、リン酸クロロキン、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＣＨＫ１／２阻害剤は、ＡＺＤ７７６２、ＣＣＴ  ２４１５３３、ＬＹ  ２６０３６１８、ＬＹ  ２６０６３６８、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート、ＰＤ  ４０７８２４、ＰＦ４７７３６、ＳＢ  ２１８０７８、ＴＣＳ  ２３１２、およびＳＲＡ７３７からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３、およびＥ７４４９からなる群から選択される。本明細書に開示されるステープルペプチドは、ＢＦＬ−１を発現するかまたはそれに依存性の状態（たとえば、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患）を処置するために使用することができる。本明細書に開示されるステープルペプチドは、ＭＣＬ−１を発現するかまたはそれに依存性の状態（たとえば、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患）を処置するために使用することができる。
【００６４】
第１５の態様では、本開示は、ＭＣＬ−１を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患、またはＭＣＬ−１依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行うための組合せ治療薬であって、本明細書に記載されるＮＯＸＡ安定化ペプチドと、ＭＣＬ−１の阻害剤とを含む、組合せ治療薬を提供する。ある特定の事例では、ＭＣＬ−１阻害剤は、Ｓ６４３１５、Ｓ６３８４５、ＢＡＹ  １０００３９４、ＭＩＫ６６５、ＡＭＧ３９７、およびＡＭＧ１７６からなる群から選択される。
【００６５】
第１６の態様では、本開示は、ＢＣＬ−２を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患、またはＢＣＬ−２依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行うための組合せ治療薬であって、本明細書に記載されるＮＯＸＡ安定化ペプチドと、ＢＣＬ−２の阻害剤とを含む、組合せ治療薬を提供する。ある特定の事例では、ＢＣＬ−２阻害剤は、ベネトクラックスである。
【００６６】
第１７の態様では、本開示は、ＢＣＬ−ＸＬを発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患、またはＢＣＬ−ＸＬ依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行うための組合せ治療薬であって、本明細書に記載されるＮＯＸＡ安定化ペプチドと、ＢＣＬ−ＸＬの阻害剤とを含む、組合せ治療薬を提供する。ある特定の事例では、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤は、ナビトクラックスである。
【００６７】
第１８の態様では、本開示は、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、および／もしくはＭＣＬ−１を発現しＢＦＬ−１／Ａ１を発現する疾患、またはＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、およびＭＣＬ−１依存性かつＢＦＬ−１／Ａ１依存性の疾患の処置を、それを必要とするヒト対象において行うための組合せ治療薬であって、本明細書に記載されるＮＯＸＡ安定化ペプチドと、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、および／またはＭＣＬ−１の阻害剤とを含む、組合せ治療薬を提供する。ある特定の事例では、ＭＣＬ−１阻害剤は、Ｓ６４３１５、Ｓ６３８４５、ＢＡＹ  １０００３９４、ＭＩＫ６６５、ＡＭＧ３９７、およびＡＭＧ１７６からなる群から選択される。ある特定の事例では、ＢＣＬ−２阻害剤は、ベネトクラックスである。ある特定の事例では、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤は、ナビトクラックスである。
【００６８】
これらの実施形態は、第１５〜１８の態様のそれぞれに適用される。一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０〜７９、１５１、および１５３から選択されるか、または配列番号１２６〜１４１に記載される配列の構造安定化バージョンである。一部の実施形態では、ＮＯＸＡペプチドは、配列番号６０および６２から選択されるか、または配列番号１２６および１２８に記載される配列の構造安定化バージョンである。
【００６９】
特に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載するものと同様のまたは同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を以下に記載する。本明細書において記載する全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本出願がコントロールすることになる。材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００７０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、ＮＯＸＡ  ＢＨ３／ＢＦＬ−１ΔＣ複合体（ＰＤＢ：３ＭＱＰ）の構造を示し、短縮型ＮＯＸＡペプチドステープルスキャンライブラリーに選択したＮＯＸＡ残基を濃い灰色で強調する。
【図２】図２は、すべての炭化水素（ｉ、ｉ＋４）または（ｉ、ｉ＋７）ステープルが、Ｎ末端システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分を有するペプチド鋳型の長さにわたって連続的に配置された、ＮＯＸＡ  ＢＨ３ステープルスキャンペプチドライブラリーの配列を提供する。配列（すなわち、ステープルペプチドのＮ末端に配置されているＤ−ニペコチン酸誘導体化を有する）には、上から下に、配列番号１〜２１が割り当てられている。
【図３】図３は、Ｄ−ニペコチン酸（Ｄ−ＮＡ）を有するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの、ネイティブなＣｙｓ５５のみを保持するＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓとの反応性を示す。
【図４】図４は、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを発現する２９３Ｔ細胞における、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの、ＢＦＬ−１に対する細胞透過性および反応性を示す。
【図５】図５は、Ａ３７５Ｐ細胞を３０分間ＮＯＸＡ−１５で処置した場合のＬＤＨ放出の定量化を示し、ＮＯＸＡ−１５による非特異的細胞溶解の誘導を示す。
【図６】図６は、Ｎ末端のシステイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分を有するＮＯＸＡ−１５  ＳＡＨＢアラニンスキャンライブラリーの配列を提供する。配列（すなわち、ステープルペプチドのＮ末端に配置されているＤ−ニペコチン酸誘導体化を有する）には、上から下に、配列番号２２〜３４が割り当てられている。
【図７】図７は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  ＳＡＨＢアラニンスキャンライブラリーのＬＤＨ放出の棒グラフであり、アラニン変異の結果として溶解活性が欠如した３つのペプチドを示す。
【図８】図８は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  ＳＡＨＢアラニンスキャンライブラリーの、組換えＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓとの反応性を示す、クーマシー染色したゲルであり、限局的アラニン変異誘発に起因して低減されたかまたは部分的な反応性を示すＬ２９ＡおよびＤ３４Ａなどの選択的な位置を除く、アラニン変異の広範な耐容性を強調する。
【図９】図９は、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを発現する２９３Ｔ細胞における、非溶解性Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５アラニン変異体ＳＡＨＢの、ＢＦＬ−１に対する細胞透過性および反応性を示す、ウエスタンブロットである。
【図１０】図１０は、Ｎ末端のシステイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分を有するＮＯＸＡ−１５  ＳＡＨＢ変異体の配列を列挙する。配列（すなわち、ステープルペプチドのＮ末端に配置されているＤ−ニペコチン酸誘導体化を有する）には、上から下に、配列番号３５〜３８が割り当てられている。
【図１１】図１１は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  ＳＡＨＢ  ＡｒｇからＧｌｕへの電荷逆転変異体ペプチドのＬＤＨ放出を示す棒グラフであり、溶解活性の顕著な低減または排除を示す。
【図１２】図１２は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  ＳＡＨＢ  ＡｒｇからＧｌｕへの電荷逆転変異体の、組換えＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓとの反応性を示す、クーマシー染色したゲルである。
【図１３】図１３は、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを発現する２９３Ｔ細胞における、非溶解性Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  ＳＡＨＢ  ＡｒｇからＧｌｕへの電荷逆転変異体の、ＢＦＬ−１に対する細胞透過性および反応性を示すブロットである。
【図１４】図１４は、組換えＧＳＴ−ＭＣＬ−ΔＮΔＣ、ＢＣＬ−ＸＬΔＣ（タグなし）、Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ、およびビオチン化ＳＡＨＢの等モル混合物のストレプトアビジンプルダウンによって示されるように、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａが、ＢＦＬ−１標的化に関して、そのアセチル化対応物を上回る顕著な競合的利点を呈することを示す、銀染色したゲルである。
【図１５】図１５は、組換えＧＳＴ−ＭＣＬ−ΔＮΔＣ、ＢＣＬ−ＸＬΔＣ（タグなし）、Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ、およびビオチン化ＳＡＨＢの等モル混合物のストレプトアビジンプルダウンによって示されるように、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅが、ＢＦＬ−１標的化に関して、そのアセチル化対応物を上回る顕著な競合的利点を呈することを示す、銀染色したゲルである。
【図１６】図１６は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａが、ストレプトアビジンプルダウンおよびＢＦＬ−１ウエスタン分析によってモニタリングした場合に、Ａ３７５Ｐライセートにおいて、対応するアセチル化構築物と比較して、ネイティブなＢＦＬ−１の標的化の増強を呈することを示す、ブロットである。いずれの構築物も、ストレプトアビジンプルダウンのＭＣＬ−１ウエスタン分析によって示されるように、同様にＭＣＬ−１に結合する。
【図１７】図１７は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅが、ストレプトアビジンプルダウンおよびＢＦＬ−１ウエスタン分析によってモニタリングした場合に、Ａ３７５Ｐライセートにおいて、対応するアセチル化構築物と比較して、ネイティブなＢＦＬ−１の標的化の増強を呈することを示す、ブロットである。いずれの構築物も、ストレプトアビジンプルダウンのＭＣＬ−１ウエスタン分析によって示されるように、同様にＭＣＬ−１に結合する。
【図１８】図１８は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ１５  Ｆ３２Ａが、免疫沈降およびウエスタン分析によって測定した場合に、２９３Ｔライセートにおいて、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ相互作用について、ｔＢＩＤと効果的に競合し、強力な共有結合的コンジュゲーションを達成するが、そのアセチル化対応物はそうではないことを示す、ブロットを含む（左）。対照的に、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ１５  Ｆ３２ＡもＡｃ−ＮＯＸＡ１５  Ｆ３２Ａも、ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１およびｔＢＩＤの相互作用を解離することはできない（右）。
【図１９】図１９は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ１５  Ｒ３１Ｅが、免疫沈降およびウエスタン分析によって測定した場合に、２９３Ｔライセートにおいて、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ相互作用について、ｔＢＩＤと効果的に競合し、強力な共有結合的コンジュゲーションを達成するが、そのアセチル化対応物はそうではないことを示す、ブロットを示す（左）。対照的に、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ１５  Ｒ３１ＥもＡｃ−ＮＯＸＡ１５  Ｒ３１Ｅも、ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１およびｔＢＩＤの相互作用を解離することはできない（右）。
【図２０】図２０は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅが、蛍光偏光競合的結合アッセイにおいて、ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９ＳとＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３との相互作用を破壊する能力を示すが、そのアセチル化対応物はそうではないことを示す、グラフである。
【図２１】図２１は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ１５  Ｒ３１ＥもＡｃ−ＮＯＸＡ１５  Ｒ３１Ｅも、ＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３のＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ／Ｃ５５Ｓへの結合について競合しないことを示すグラフであり、選択的な共有結合的標的化にはＢＦＬ−１のＢＨ３結合ポケットにおけるＣ５５が必要であることを示す。
【図２２】図２２は、Ａｃ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅの両方が、ＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３のＭＣＬ−１ΔＮΔＣへの結合と競合する、類似かつ比較的限定的から中等度の能力を呈することを示す、グラフである。
【図２３】図２３は、Ａｃ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥもＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅも、ＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３のＢＣＬ−ＸＬΔＣへの結合について、競合することができないことを示す、グラフである。
【図２４】図２４は、全ゲノムＣＲＩＳＰＲスクリーニングによって判定される、細胞生存について様々なレベルのＢＦＬ−１への依存性を示すＡＭＬ細胞株のプロットである。
【図２５】図２５は、全ゲノムＣＲＩＳＰＲスクリーニングによって判定される、ＡＭＬ細胞株におけるＢＦＬ−１依存性と正相関する遺伝子依存性を示す表である。
【図２６】図２６は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤ＫＵ−５５９３３の組合せでのＢＦＬ−１依存性Ｕ９３７細胞の処置が、Ｃａｌｃｕｓｙｎ分析およびプロットした用量−効果曲線（右）によって示されるように、細胞生存率の相乗的な減少を引き起こしたことを示す（左）、グラフである。
【図２７】図２７は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＫＵ−５５９３３単独または組合せで処置したＵ９３７細胞が、単剤処置と比較して、組合せ処置の場合に、経時的に、有意に増加したカスパーゼ−３／７活性化を呈することを示す、棒グラフである。
【図２８】図２８は、ＢＦＬ−１依存性ではないＭＶ４−１１細胞株の共処置が、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤の細胞傷害性相乗作用をほとんどまたはまったくもたらさなかったことを示す、グラフである。
【図２９】図２９は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＫＵ−５５９３３の組合せで処置したＭＶ４−１１細胞が、単剤処置と比較して、カスパーゼ−３／７活性化の増加を呈さないことを示す、棒グラフである。
【図３０】図３０は、ａｐｏ  ＢＦＬ−１およびそのシステイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ阻害剤との複合体の結晶構造の結晶化条件およびデータ収集および精緻化統計量を提供する表である。
【図３１Ａ】図３１Ａは、ＢＦＬ−１ΔＣのアミノ酸配列（配列番号８３）を提供し、影付きのα−ヘリックスは、図３１Ｂに示される構造に対応する。ＢＨ１−３ドメインは、下線で示される。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ａｐｏ  ＢＦＬ−１ΔＣ（ＰＤＢ識別子：５ＷＨＩ）のリボン図および表面図であり、α−ヘリックスおよびα−ヘリックス２〜４によって形成されるＢＨ３結合表面溝の相対的な配置を示す。溝内に配置される表面アクセス可能なシステインが認められる。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、ＢＦＬ−１（ＰＤＢ識別子：５ＷＨＩ）、ＭＣＬ−１（ＰＤＢ識別子：４ＷＭＳ）、およびＢＣＬ−ＸＬ（ＰＤＢ識別子：１Ｒ２Ｄ）のａｐｏ構造のα−ヘリックスの配向間の類似性（上部）および違い（下部）を示す、リボン図オーバーレイを示す。
【図３１Ｄ】図３１Ｄは、ＢＦＬ−１、ＭＣＬ−１、およびＢＣＬ−ＸＬのＢＨ３結合溝の頂部にある残基と底部にある残基との間のα−炭素距離測定値の比較の表である。
【図３１Ｅ】図３１Ｅは、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のα２〜α５領域のアミノ酸配列のアライメントを示し、影付きは、図３１Ｄの構造に対応する。ＢＦＬ−１は、システインがＢＨ３結合溝内の示される位置に位置している唯一のタンパク質である（α３のＣを参照されたい）。配列には、上から下に、配列番号８４〜９１が割り当てられている。
【図３１Ｆ】図３１Ｆは、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のＢＨ３結合溝の構造比較を示し、ＢＦＬ−１のみが、表面アクセス可能なシステイン残基を含むことを示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、Ｎ末端のシステイン反応性Ｄ−ニペコチン酸（Ｄ−ＮＡ）を含むｉ、ｉ＋７ステープルＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチド（アミノ酸２６〜４０）による、Ｃ５５を有するＢＦＬ−１構築物の選択的な誘導体化を示す、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ架橋分析の結果を提供する。＊ＡＴ８ＬＲＲＦＧＤＸＬＮＦＲＱ、ここで、＊＝ＡｃまたはＤ−ニペコチン酸であり、８＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、Ｘ＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。（配列番号９２）
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢとの共有結合的反応によるＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓの分子量の増加を示す、インタクト質量分析を提供する。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、示されるＣ末端ビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの、組換えＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＢＦＬ−１タンパク質の混合物とのインキュベーションの結果を示し、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢによるＢＦＬ−１の選択的な共有結合的改変を示す（レーン３）。ストレプトアビジンプルダウンにより、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢとＢＣＬ−ＸＬとの間に相互作用がないこと、およびＭＣＬ−１の比較的最小限な同等の結合が判明した（レーン５〜６）。対照的に、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢは、銀染色によって示されるように、強力なＢＦＬ−１プルダウンを示したが、Ａｃ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢは示さなかった（レーン６）。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、図３２Ｃに記載の同一条件に供し、続いて、ストレプトアビジンプルダウンにより得られた電気泳動した溶離液のＢＦＬ−１ウエスタンブロットを行った、ＢＦＬ−１を発現するＡ３７５Ｐ黒色腫細胞に由来するライセートを示すブロットである。Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢとのインキュベーションにより、Ａｃ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢと比較して、顕著に増強されたＢＦＬ−１プルダウンがもたらされた。
【図３３Ａ】図３３Ａは、両親媒性ＢＨ３ヘリックスとＢＦＬ−１との間の相補的な親水性相互作用を呈する、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ／ＢＦＬ−１ΔＣ複合体（ＰＤＢ識別子：５ＷＨＨ）の結晶構造を示し、ｉ、ｉ＋７ステープルが、シス配向で観察され、非相互作用表面に位置している。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、ＢＦＬ−１／Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ共有結合的複合体の立体図を示す。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、両親媒性ＢＨ３ヘリックスとＢＦＬ−１との間の相補的な疎水性相互作用を呈する、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ／ＢＦＬ−１ΔＣ複合体の結晶構造を示し、ｉ、ｉ＋７ステープルが、シス配向で観察され、非相互作用表面に位置している。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、ＢＦＬ−１のＣ５５とＤ−ＮＡ部分との間の共有結合での結合を特定する。
【図３３Ｅ】図３３Ｅは、ＢＦＬ−１／Ａ１との非共有結合的ＮＯＸＡ  ＢＨ３（ＰＤＢ識別子：３ＭＱＰ）複合体を示す。
【図３３Ｆ】図３３Ｆは、ＢＦＬ−１との共有結合的Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ複合体を示す。
【図３３Ｇ】図３３Ｇは、Ｄ−ＮＡ部分が、どのようにして、Ｃ５５に下接して位置する疎水性細孔の残基と補助的接触に至るかを示す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、ＢＦＬ−１のａｐｏ構造およびＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ結合型構造体のリボンのオーバーレイであり、共有結合的リガンド相互作用による、α２およびα３の相対的な上方への変位、ならびにα４の下方への変位を示す。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１のリガンド非結合型およびＮＯＸＡ  ＢＨ３結合型の溝の頂部の残基と底部の残基との間のα−炭素距離測定値の比較の表である。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、対応する距離差行列プロットにおいて明らかである限局的な変化を示す（黒色の矢印を参照されたい）。
【図３４Ｄ】図３４Ｄは、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢによるＢＦＬ−１の共有結合での結合時の、α−炭素距離差のプロットを示し、ＢＨ３結合溝のα２〜α４領域内の残基の変位を定量的に示す。
【図３４Ｅ】図３４Ｅは、ＢＦＬ−１ΔＣのａｐｏ形態を示す。
【図３４Ｆ】図３４Ｆは、ＢＦＬ−１ΔＣのリガンド結合形態が、Ｃ５５に下接する別個の疎水性細孔の形成を含む、より大きな相互作用面をもたらすことを示す（白色の矢印を参照されたい）。
【図３５Ａ】図３５Ａは、ＢＦＬ−１とのＮＯＸＡ  ＢＨ３非共有結合的結合の距離差行列プロットを示し、共有結合によるＢＨ３標的化で観察されたものに類似するα２〜α４領域における限局的な変化を示す（黒色の矢印を参照されたい）。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、マウスＮＯＸＡ  ＢＨ３のＭＣＬ−１との非共有結合での結合の距離差行列プロットを示し、注目すべきことに、ＮＯＸＡ  ＢＨ３のＢＦＬ−１との相互作用（共有結合および非共有結合での）で観察されたα２〜α４領域の限局的な変化が欠如している。
【図３６】図３６は、様々な種類のステープルを生成するために使用した例示的な非天然のアミノ酸の化学構造を示す（上部）。中央部のパネルは、様々な長さのステープルを有するペプチドを図示する。下部のパネルは、ペプチド配列に沿ったステープルウォークを図示する。
【図３７】図３７は、例示的なステープルウォークに沿った、様々な種類の二重および三重ステープリング戦略の図を示す、概略図である。
【図３８】図３８は、様々な長さの分岐二重ステープル部分を使用した例示的なステープルウォークを示す、概略図である。
【図３９】図３９は、ステープルペプチド誘導体を生成するために用いられる例示的な化学的代替法を示す、概略図である。
【図４０】図４０は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤ＡＺＤ０１５６の組合せでのＢＦＬ−１依存性Ｕ９３７細胞の処置が、Ｃａｌｃｕｓｙｎ分析用量−効果プロット（右）によって示されるように、細胞生存率の相乗的減少を引き起こしたことを示す（左）、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）ＡＺＤ０１５６、および（ｉｉｉ）８：１  Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ：ＡＺＤ０１５６である。右のパネル：プロット内のそれぞれのドットは、「強い相乗作用」として分類される。
【図４１】図４１は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＺＤ０１５６単独および組合せで処置したＵ９３７細胞が、単剤処置と比較して、組合せ処置の場合に、経時的に、有意に増加したカスパーゼ−３／７活性化を呈したことを示す、棒グラフである。それぞれの時点について、棒は（左から右に）、（ｉ）４０μＭ  Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）５μＭ  ＡＺＤ０１５６、および（ｉｉ）４０μＭ  Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ＋５μＭ  ＡＺＤ０１５６である。
【図４２】図４２は、ＢＦＬ−１依存性ではないＭＶ４；１１細胞株の共処置が、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤ＡＺＤ０１５６の細胞傷害性相乗作用をほとんどまたはまったくもたらさなかったことを示す、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）ＡＺＤ０１５６、および（ｉｉｉ）８：１  Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ：ＡＺＤ０１５６である。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）強いアンタゴニズム、（ｉｉ）強い相乗作用、（ｉｉｉ）相乗作用、（ｉｖ）相加作用、（ｖ）相加作用、および（ｖｉ）相加作用である。
【図４３】図４３は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＺＤ０１５６単独および組合せで処置したＭＶ４；１１細胞が、単剤処置と比較して、カスパーゼ−３／７活性化の増加を呈さないことを示す、棒グラフである。それぞれの時点について、棒は（左から右に）、（ｉ）４０μＭ  Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）５μＭ  ＡＺＤ０１５６、および（ｉｉ）４０μＭ  Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ＋５μＭ  ＡＺＤ０１５６である。
【図４４】図４４は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤ＡＺＤ０１５６の組合せでのＢＦＬ−１依存性ＯＣＩ−ＡＭＬ−３細胞の処置が、Ｃａｌｃｕｓｙｎ分析用量−効果プロット（右）によって示されるように、細胞生存率の相乗的減少を引き起こしたことを示す（左）、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：プロット内のそれぞれのドットは、「強い相乗作用」として分類される。
【図４５】図４５は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤ＡＺＤ０１５６の組合せでのＢＦＬ−１依存性Ｊｕｒｋａｔ細胞の処置が、Ｃａｌｃｕｓｙｎ分析用量−効果プロット（右）によって示されるように、細胞生存率の相乗的減少を引き起こしたことを示す（左）、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）強いアンタゴニズム、（ｉｉ）アンタゴニズム、（ｉｉｉ）強い相乗作用、（ｉｖ）強い相乗作用、（ｖ）強い相乗作用、および（ｖｉ）強い相乗作用である。
【図４６】図４６は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤Ｋｕ−６００１９の組合せでのＢＦＬ−１依存性Ｕ９３７細胞の処置が、Ｃａｌｃｕｓｙｎ分析用量−効果プロット（右）によって示されるように、細胞生存率の相乗的減少を引き起こしたことを示す（左）、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）相加作用、（ｉｉ）強い相乗作用、（ｉｉｉ）強い相乗作用、（ｉｖ）強い相乗作用、（ｖ）強い相乗作用、および（ｖｉ）強い相乗作用である。
【図４７】図４７は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤Ｋｕ−５５９３３の組合せでのＢＦＬ−１依存性Ｕ９３７細胞の処置が、Ｃａｌｃｕｓｙｎ分析用量−効果プロット（右）によって示されるように、細胞生存率の相乗的減少を引き起こしたことを示す（左）、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）強いアンタゴニズム、（ｉｉ）強い相乗作用、（ｉｉｉ）強い相乗作用、（ｉｖ）強い相乗作用、および（ｖ）強い相乗作用である。
【図４８】図４８は、ＢＦＬ−１依存性ではないＭＶ４；１１細胞株の共処置が、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤Ｋｕ−６００１９の細胞傷害性相乗作用をほとんどまたはまったくもたらさなかったことを示す、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）相加作用、（ｉｉ）強い相乗作用、（ｉｉｉ）相加作用、（ｉｖ）相乗作用、（ｖ）相加作用、および（ｖｉ）相加作用である。
【図４９】図４９は、ＢＦＬ−１依存性ではないＭＶ４；１１細胞株の共処置が、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＴＭ阻害剤Ｋｕ−５５９３３の細胞傷害性相乗作用をほとんどまたはまったくもたらさなかったことを示す、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）相乗作用、（ｉｉ）相乗作用、（ｉｉｉ）相加作用、（ｉｖ）アンタゴニズム、（ｖ）アンタゴニズム、および（ｖｉ）強い相乗作用である。
【図５０】図５０は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＣＨＫ１／２阻害剤ＡＺＤ７７６２の組合せでのＢＦＬ−１依存性Ｕ９３７細胞の処置が、Ｃａｌｃｕｓｙｎ分析用量−効果プロット（右）によって示されるように、細胞生存率の相乗的減少を引き起こしたことを示す（左）、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）相加作用、（ｉｉ）アンタゴニズム、（ｉｉｉ）強い相乗作用、（ｉｖ）強い相乗作用、（ｖ）強い相乗作用、および（ｖｉ）強い相乗作用である。
【図５１】図５１は、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＰＡＲＰ阻害剤オラパリブの組合せでのＢＦＬ−１依存性Ｕ９３７細胞の処置が、Ｃａｌｃｕｓｙｎ分析用量−効果プロット（右）によって示されるように、細胞生存率の相乗的減少を引き起こしたことを示す（左）、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）強いアンタゴニズム、（ｉｉ）強い相乗作用、（ｉｉｉ）強い相乗作用、（ｉｖ）強い相乗作用、（ｖ）強い相乗作用、および（ｖｉ）相乗作用である。
【図５２】図５２は、ＢＦＬ−１依存性ではないＭＶ４；１１細胞株の共処置が、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＣＨＫ１／２阻害剤ＡＺＤ７７６２の細胞傷害性相乗作用をほとんどまたはまったくもたらさなかったことを示す、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：ドットは（左から右に）、（ｉ）強い相乗作用、（ｉｉ）相乗作用、（ｉｉｉ）相加作用、（ｉｖ）アンタゴニズム、（ｖ）アンタゴニズム、および（ｖｉ）相加作用である。
【図５３】図５３は、ＢＦＬ−１依存性ではないＭＶ４；１１細胞株の共処置が、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＰＡＲＰ阻害剤オラパリブの細胞傷害性相乗作用をまったくもたらさなかったことを示す、グラフである。左のパネル：左パネルのそれぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。右のパネル：６つのドットのそれぞれは、強いアンタゴニズムである。
【図５４】図５４は、示される用量のＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１Ｅ、ＡＴＭ阻害剤ＡＺＤ０１５６、または組合せで処置したＫＧ−１細胞の細胞生存率（Ａ）、Ｃａｌｃｕｓｙｎ用量−効果プロット（Ｂ）、およびカスパーゼ−３／７活性化（Ｃ）の結果を示す。Ａ：それぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）示される薬物、および（ｉｉｉ）ＮＯＸＡ：薬物の組合せである。Ｂ：ドットは（左から右に）、（ｉ）強いアンタゴニズム、（ｉｉ）〜（ｖｉ）相加作用である。Ｃ：それぞれの時点について、棒は（左から右に）、（ｉ）４０μＭ  Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ、（ｉｉ）５μＭ  ＡＺＤ０１５６、および（ｉｉ）４０μＭ  Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ＋５μＭ  ＡＺＤ０１５６である。
【図５５】図５５は、示される用量の選択的ＭＣＬ−１阻害剤Ｓ６３８４５、ＡＴＭ阻害剤ＡＺＤ０１５６、または組合せで処置したＭＶ４；１１細胞（Ａ）およびＵ９３７細胞（Ｂ）の細胞生存率を示す。両方のパネルについて、それぞれの濃度について、棒は（左から右に）、（ｉ）０ｎＭ  Ｓ６３８４５、（ｉｉ）１．２５ｎＭ  Ｓ６３８４５、（ｉｉｉ）２．５ｎＭ  Ｓ６３８４５、（ｉｖ）５ｎＭ  Ｓ６３８４５、および（ｖ）１０ｎＭ  Ｓ６３８４５である。
【図５６】図５６は、（Ａ）ＢＦＬ−１分子量のシフト（＊によって示される）によって示され、還元および変性ゲル電気泳動によって検出される、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｆ３２ＡおよびＲ３１Ｅペプチドの、組換えＢＦＬ−１ΔＣ（上部）および全長ＢＦＬ−１（下部）との共有結合的反応性、（Ｂ）ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ（２０μＭ）で１２時間処置したときのＨＡ−ＢＦＬ−１分子量のシフト（＊によって示される）によって示され、ライセートの還元および変性ゲル電気泳動ならびに抗ＨＡウエスタン分析によって検出される、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｆ３２ＡおよびＲ３１Ｅペプチドの、２９３Ｔ細胞において発現させたＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ（上部）および全長ＨＡ−ＢＦＬ１（下部）との共有結合的反応性、ならびに（Ｃ）Ｕ９３７ライセートのストレプトアビジンプルダウンおよび抗ＢＦＬ−１ウエスタン分析によって評価される、システイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１ＥおよびＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｆ３２ＡペプチドによるネイティブなＢＦＬ−１の標的化を示す。注目すべきことに、ネイティブなＢＦＬ−１は、組換えまたは発現させたＢＦＬ−１よりも高い分子量で泳動する。
【図５７】図５７は、単剤および組合せとして、示される用量のＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＺＤ０１５６での、２４時間のＵ９３７細胞の処置に応答した、ミトコンドリア膜電位の喪失を示す。ＦＣＣＰは、ミトコンドリア膜電位の喪失の陽性対照としての機能を果たす、ミトコンドリア脱共役剤である。
【図５８】図５８は、ウエスタンブロッティングによってモニタリングした場合の、ＡＴＭ  Ｓ１９８１およびＣＨＫ２  Ｓ３３／３５のリン酸化状態に対する、示される用量のＡＺＤ０１５６で２時間のＵ９３７細胞の処置の作用を示す。
【図５９】図５９は、示される時点における、調製されたライセートのＢＡＸウエスタン分析による、Ｕ９３７細胞におけるＢＡＸタンパク質のレベルに対する、ＡＺＤ０１５６処置（５μＭ）の作用を示す。
【図６０】図６０は、示される用量のＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１Ｅでの３０分間（Ａ）および４時間（Ｂ）のＵ９３７細胞の処置が、ＬＤＨ放出を引き起こさないことを示す。
【図６１】図６１は、膜摂動によって望ましくない非特異的細胞傷害性を誘導する、選択的なシステイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ構築物の能力を示す。配列番号７８および１５０〜１５３（上から下）。
【図６２】図６２は、（Ａ）ゲノムスケールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９スクリーンにおいて評価した、ＡＭＬ細胞株にわたるＢＦＬ−１依存性Ｚ−スコアおよびＢＦＬ−１スケーリングランク値、（Ｂ）ゲノムスケールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９スクリーンにおいて評価したものの中の上位スコアのＢＦＬ−１依存性ヒトがん細胞株のＢＦＬ−１依存性Ｚ−スコアおよびＢＦＬ−１スケーリングランク値、ならびに（Ｃ）ゲノムスケールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９スクリーンから、および以下の基準：（１）遺伝子が少なくとも２つのＡＭＬ細胞株における潜在的依存性としてスコア付けされること（スコアが−０．１を下回る）、（２）遺伝子が、少なくとも２つのＡＭＬ細胞株において発現されること（ＴＰＭが１を超える）、（３）遺伝子が、全致死遺伝子であると予測されないこと、および（４）ピアソン相関およびスピアマン相関がいずれも０．９を超えることに基づいて特定された、ＡＭＬ細胞株におけるＢＦＬ−１共依存性のピアソン相関およびスピアマン相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
詳細な説明
現在、ＭＣＬ−１およびＢＦＬ−１／Ａ１によって作動されるアポトーシス耐性を標的とするために利用可能なＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎに承認された薬物は存在しない。特に、ＢＦＬ−１選択的標的化剤も、ＢＦＬ−１／ＭＣＬ−１二重標的化剤も、共有結合的および非共有結合的二重阻害剤の組合せも、臨床試験へ進んでいない。本開示は、共有結合的ＢＦＬ−１選択的標的化剤、およびＢＦＬ−１に共有結合で結合し、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合することができるＢＦＬ−１／ＭＣＬ−１二重標的化剤の特性を呈する、構造安定化およびシステイン反応性ＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドを提供する。本開示はまた、そのような安定化されたペプチドを、単独で、または他の治療剤（たとえば、ＡＴＭキナーゼ／ＡＴＲキナーゼ阻害剤）と組み合わせて、ＢＦＬ−１および／もしくはＭＣＬ−１依存性のがんならびに／またはそれらを発現するがん（たとえば、造血系悪性腫瘍、黒色腫もしくは他の固形腫瘍、細胞過剰性疾患、たとえば、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、または本明細書で以下に記載される他のがん）の処置において使用するための方法も特徴とする。そのようなステープルペプチドは、ＭＣＬ−１および／もしくはＢＦＬ−１を発現する、ならびに／またはそれらに依存性の、がんまたは細胞過剰性疾患において、単独および組合せで、アポトーシスを再活性化するのに有用である。
【００７３】
タンパク質
ヒトＭＣＬ−１のアミノ酸配列を、以下に提供する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ０７８２０）。
【化１】
2021506800.tif 000003
【００７４】
ヒトＢＦＬ−１のアミノ酸配列を、以下に提供する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１６５４８）。
【化２】
2021506800.tif 000004
【００７５】
ヒトＮＯＸＡのアミノ酸配列を、以下に提供する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３７９４）。
【化３】
2021506800.tif 000005
【００７６】
ＮＯＸＡペプチド
本開示の例示的なＮＯＸＡペプチドは、配列番号８２のアミノ酸２６から開始し、アミノ酸４０までのＢＨ３ペプチドである。このペプチドは、アミノ酸配列：ＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号３９）を有し、ＢＦＬ−１／Ａ１と相互作用する。このペプチドに使用した番号付けを、以下に提供する。
【表１】
2021506800.tif 000006
【００７７】
ＮＯＸＡのＢＦＬ−１相互作用残基（すなわち、ＢＦＬ−１と相互作用するＮＯＸＡ  ＢＨ３アルファヘリックスの残基）は、Ｌｅｕ−２１、Ｇｌｕ−２２、Ｖａｌ−２３、Ｇｌｕ−２４、Ｃｙｓ−２５、Ａｌａ−２６、Ｌｅｕ−２９、Ａｒｇ−３０、Ｐｈｅ−３２、Ｇｌｙ−３３、Ａｓｐ−３４、Ｌｅｕ−３６、Ａｓｎ−３７、およびＧｌｎ−４０である（アミノ酸番号付けは、配列番号８２に基づく）。上記に提供される配列番号３９の位置番号付けに関連して、ＢＦＬ−１相互作用残基は、Ａｌａ−１、Ｌｅｕ−４、Ａｒｇ−５、Ｐｈｅ−７、Ｇｌｙ−８、Ａｓｐ−９、Ｌｅｕ−１１、Ａｓｎ−１２、およびＧｌｎ−１５である。アラニン−１、ロイシン−４、フェニルアラニン−７、グリシン−８、およびロイシン−１１は、疎水性相互作用に関与し、一方でアルギニン−５、アスパラギン酸−９、およびアスパラギン−１２は、水素結合相互作用に関与する。
【００７８】
ＢＦＬ−１と相互作用しないＮＯＸＡの残基（すなわち、ＮＯＸＡ  ＢＨ３アルファヘリックスの相互作用しない側鎖にある残基）は、Ｔｈｒ−２７、Ｇｌｎ−２８、Ａｒｇ−３１、Ｌｙｓ−３５、Ｐｈｅ−３８、およびＡｒｇ−３９である（アミノ酸番号付けは、配列番号８２に基づく）。上記に提供される配列番号３９の位置番号付けに関連して、ＮＯＸＡペプチドのアルファヘリックスの相互作用面にない残基は、残基Ｔｈｒ−２、Ｇｌｎ−３、Ａｒｇ−６、Ｌｙｓ−１０、Ｐｈｅ−１３、およびＡｒｇ−１４である。
【００７９】
ＮＯＸＡアルファヘリックスのＭＣＬ−１相互作用残基（すなわち、ＭＣＬ−１と相互作用するＮＯＸＡ  ＢＨ３アルファヘリックスの残基）は、Ｇｌｎ−２８、Ｌｅｕ−２９、Ａｒｇ−３０、Ｐｈｅ−３２、Ｇｌｙ−３３、Ｌｅｕ−３６、Ａｓｎ−３７、Ｇｌｎ−４０である（アミノ酸番号付けは、配列番号８２に基づく）。
【００８０】
ＭＣＬ−１と相互作用しないＮＯＸＡの残基（すなわち、ＮＯＸＡ  ＢＨ３アルファヘリックスの非相互作用側鎖にあるヘリックスの残基）は、Ａｌａ−２６、Ｔｈｒ−２７、Ａｒｇ−３１、Ａｓｐ−３４、Ｌｙｓ−３５、Ｐｈｅ−３８、およびＡｒｇ−３９である（アミノ酸番号付けは、配列番号８２に基づく）。
【００８１】
ある特定の実施形態では、本開示のＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドは、配列番号３９において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸置換を有し得る（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸が、保存的または非保存的に置換されている）。一部の事例では、配列番号３９の１〜３個のアミノ酸が、置換されている。配列番号３９におけるアミノ酸置換は、アルファヘリックスの相互作用側鎖および非相互作用側鎖の一方または両方におけるものであり得る。ＮＯＸＡペプチドのアルファヘリックスのＢＦＬ−１と相互作用しない非相互作用側鎖においては、相互作用側鎖よりも高い変動性が許容される。実際に、これらのアミノ酸のほぼすべて（たとえば、ヘリックスの非相互作用面の５、４、３、２、または１個のアミノ酸）が、置換されていてもよい（たとえば、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、またはアラニン）。ある特定の実施形態では、これらのペプチドのヘリックスの相互作用面は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸置換を有する。一部の事例では、置換は、保存的アミノ酸置換である。他の事例では、置換は、非保存的アミノ酸置換である。一部の事例では、１つを超えるアミノ酸置換が存在する場合、置換は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方である。一部の場合には、配列番号３９の１〜３つのアミノ酸（たとえば、１、２、または３つ）が置換される場合、置換は、すべてが、ＮＯＸＡヘリックスの非相互作用面にある。一部の場合には、配列番号３９の１〜３つのアミノ酸（たとえば、１、２、または３つ）が置換される場合、置換は、すべてが、ＮＯＸＡヘリックスの相互作用面にある。一部の場合には、配列番号３９の１〜３つのアミノ酸（たとえば、１、２、または３つ）が置換される場合、置換は、ＮＯＸＡヘリックスの相互作用面および非相互作用面の両方にある。ある特定の事例では、置換されるアミノ酸は、Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、置換アラニン、または置換グリシン誘導体からなる群から選択される。ある特定の事例では、Ａ２６、Ｔ２７、Ｑ２８、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｆ３２、Ｇ３３、Ｋ３５、Ｌ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、またはＱ４０（番号付けは配列番号８２による）のうちの１つまたは複数が、置換される。ある特定の事例では、置換されるアミノ酸は、Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、置換アラニン、または置換グリシン誘導体からなる群から選択される。ある特定の事例では、配列番号３９のＬ２９およびＤ３４（番号付けは配列番号８２による）のうちの一方または両方は、置換されない。一部の事例では、配列番号３９のＬ２９（番号付けは配列番号８２による）は、イソロイシン、フェニルアラニン、Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、置換アラニン、または置換グリシン誘導体で置換される。
【００８２】
ある特定の実施形態では、本開示のＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドは、１、２、３、４、５個のアミノ酸が、配列番号３９に記載される配列のＣ末端から除去／欠失されていてもよい。ある特定の実施形態では、本開示のＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドは、１、２、３、４、５個のアミノ酸が、配列番号３９に記載される配列のＮ末端から除去／欠失されていてもよい。ある特定の実施形態では、本開示のＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドは、１、２、３、４、５個のアミノ酸が、配列番号３９に記載される配列のＮ末端およびＣ末端の両方から除去／欠失されていてもよい。ある特定の事例では、これらの除去されたアミノ酸は、Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、置換アラニン、または置換グリシン誘導体からなる群から選択される１〜６個（１、２、３、４、５、または６個）のアミノ酸と置き換えられてもよい。
【００８３】
配列番号３９の配列に対する改変の非限定的な例は、以下に提供される。
【表２】
2021506800.tif 000007
【００８４】
本開示はまた、配列番号３９に対して、少なくとも１４％（たとえば、少なくとも１４〜５０％、少なくとも１４〜４５％、少なくとも１４〜４０％、少なくとも１４〜３５％、少なくとも１４〜３０％、少なくとも１４〜２５％、少なくとも１４〜２０％、少なくとも２０％〜５０％、少なくとも２０％〜４５％、少なくとも２０％〜４０％、少なくとも２０％〜３５％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも２０％〜２５％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２７％、少なくとも３４％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるＮＯＸＡペプチドも包含する。配列番号３９におけるアミノ酸配列の変動性は、アルファヘリックスの相互作用側鎖および非相互作用側鎖の一方または両方におけるものであり得る。ＮＯＸＡ  ＢＨ３ヘリックスの非相互作用面のアミノ酸のほぼすべてが、変動し得る。ヘリックスの相互作用面のアミノ酸もまた、変動し得る。
【００８５】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号３９のバリアントを特徴とし、ここで、ＮＯＸＡペプチドバリアントは、ＢＦＬ−１に非共有結合で結合する。本開示はまた、配列番号３９のバリアントを特徴とし、ここで、ＮＯＸＡペプチドバリアントは、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合する。一部の事例では、本明細書に記載される配列番号３９のバリアントは、ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１の両方に非共有結合で結合する。
【００８６】
ある特定の事例では、ＮＯＸＡペプチドは、以下に記載されるアミノ酸配列を有する。
【化４】
2021506800.tif 000008
【００８７】
本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、治療的使用のために最適化することができる。たとえば、上述のＮＯＸＡペプチドのうちのいずれかが、膜破壊（細胞溶解）を引き起こす場合、このペプチドは、ペプチドの全体的な疎水性を低下させることによって、最適化することができる。これは、たとえば、特に、疎水性残基を、より低い疎水性を有するアミノ酸（たとえば、アラニン）と置換することによって、達成することができる。膜破壊は、ペプチドの全体的な正電荷を低減することによっても、低下させることができる。これは、塩基性残基を、非荷電または酸性の残基と置換することによって、達成することができる。ある特定の事例では、ペプチドの全体的な疎水性およびペプチドの全体的な正電荷の両方が、低下される。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、５〜３５アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、５〜２５アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、５〜２０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、５〜１８アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、１０〜３５アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、１０〜２５アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、１０〜２０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、１０〜１８アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、１５〜２６アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡペプチドは、１５〜１８アミノ酸長である。
【００８９】
ある特定の事例では、ＮＯＸＡペプチドは、構造安定化されている。これらのＮＯＸＡペプチドを安定化させるために、ペプチドがステープルおよび／またはステッチされ得るように、ペプチドには、たとえば、ＮＯＸＡペプチドのアミノ酸を、非天然のアミノ酸と置き換えるための２つまたはそれを超える置換が含まれ得る。
【００９０】
安定化されたペプチド
ペプチドヘリックスは、多数の重要な生物学的プロセス、たとえば、アポトーシスを調節する鍵となるタンパク質−タンパク質相互作用の重要な媒介因子であるが、しかしながら、そのようなヘリックスは、タンパク質内のその環境から取り出され、単離した状態で調製された場合、通常、ランダムなコイル立体構造を採用し、生物学的活性の劇的な低減、およびしたがって治療能力の減少が生じる。本開示は、ＮＯＸＡの構造安定化ペプチドを提供する。本開示は、内部（分子内）架橋（またはステープル）によって結合された少なくとも２つの改変されたアミノ酸を含み、ある特定の事例では、構造安定化ペプチドが結合する標的タンパク質（たとえば、ＢＦＬ−１）内のシステイン（Ｃｙｓ）残基と共有結合的結合を形成することができる、反応性基（「弾頭部」、たとえば、求電子性基を有する非天然のアミノ酸）を有する、構造安定化ＮＯＸＡペプチド（たとえば、上述のもの）を含む。本明細書に記載される安定化されたペプチドには、ステープルペプチドおよびステッチペプチド、ならびに複数のステッチ、複数のステープル、ステープルとステッチとの混合、または構造強化のための他の化学的戦略を含むペプチドが含まれる（たとえば、Balaram  P.  Cur.  Opin.  Struct.  Biol.  1992;2:845、Kemp  DS,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  1996;118:4240、Orner  BP,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2001;123:5382、Chin  JW,  et  al.,  Int.  Ed.  2001;40:3806、Chapman  RN,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2004;126:12252、Horne  WS,  et  al.,  Chem.,  Int.  Ed.  2008;47:2853、Madden  et  al.,  Chem  Commun  (Camb).  2009  Oct  7;  (37):  5588-5590、Lau  et  al.,  Chem.  Soc.  Rev.,  2015,44:91-102、およびGunnoo  et  al.,  Org.  Biomol.  Chem.,  2016,14:8002-8013を参照されたく、それらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００９１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＸＡポリペプチドのうちの１つまたは複数は、ペプチドステープリングによって安定化することができる（たとえば、Walensky,  J.  Med.  Chem.,  57:6275-6288  (2014)を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ペプチドは、そのネイティブな二次構造を維持するという点で、「安定化」される。たとえば、ステープリングは、α−ヘリックス二次構造を有するようにしたポリペプチドが、そのネイティブなα−ヘリックス立体構造を維持することを可能にする。この二次構造は、タンパク質分解および熱に対するポリペプチドの耐性を増加させ、また、標的結合親和性、疎水性、および細胞透過性を増加させ得る。したがって、本明細書に記載されるステープルされた（架橋した）ポリペプチドは、対応するステープルしていない（架橋していない）ポリペプチドと比べて、改善された生物学的活性を有する。
【００９２】
「ペプチドのステープル化」は、合成方法論から作り出された用語であり、ポリペプチド鎖に存在する２個のオレフィン含有側鎖（例えば、架橋可能な側鎖）が、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有接合し（例えば、「一緒にステープル化され」）、架橋環を形成している（例えば、Blackwell  et  al.,  J.  Org.  Chem.,  66:  5291-5302,  2001；Angew  et  al.,  Chem.  Int.  Ed.  37:3281,  1994を参照のこと）。「ペプチドのステープル化」という用語は、本明細書で使用される場合、そのような反応を促進し、単一の「ステープル」ポリペプチドを提供する任意の数の反応条件および／または触媒を使用した、ポリペプチド鎖に存在する場合がある２個の（例えば、少なくとも一対の）二重結合含有側鎖、三重結合含有側鎖、または二重結合含有および三重結合含有側鎖の接合を含む。「マルチプライ（multiply）ステープル」ポリペプチドという用語は、１個を超える個々のステープルを含み、２個、３個、またはそれを超えるさまざまな間隔の独立したステープルを含んでいてもよいポリペプチドを指す。さらに「ペプチドのステッチ化」という用語は、本明細書で使用される場合、２個のステープルが、例えば共通の残基に連結している「ステッチ」（例えば、直列のまたはマルチプライステープル）ポリペプチドを提供する、単一のポリペプチド鎖における複数のかつ直列の「ステープル化」事象を指す。ペプチドのステッチ化は、例えば、ＷＯ２００８／１２１７６７およびＷＯ２０１０／０６８６８４で開示されており、これら両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の場合では、ステープルは、本明細書で使用される場合、不飽和結合を保持することができるかまたは減少させることができる。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドのうちの１つまたは複数は、たとえば、炭化水素ステープリングによって、安定化することができる。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、ＮＯＸＡのアミノ酸２６〜４０を含むかもしくはそれからなるか、またはそこに１〜１３個（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１３個）のアミノ酸置換、欠失、および／もしくは挿入）を含む、ポリペプチドである。ある特定の事例では、ステープルペプチドは、少なくとも２つ（たとえば、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換を含み、ここで、置換されるアミノ酸は、２、３、または６アミノ酸離間しており、置換されるアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然のアミノ酸である。多数の公知の非天然または天然にないアミノ酸が存在し、それらのいずれも、本開示のペプチドに含めることができる。非天然のアミノ酸の一部の例は、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ−アミノ酪酸、ベータ−シアノアラニン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−２−フェニル−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、４−アミノ−シクロペンテンカルボン酸、３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、４−ピペリジル酢酸、４−アミノ−ｌ−メチルピロール−２−カルボン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２−アミノヘプタン二酸、４−（アミノメチル）安息香酸、４−アミノ安息香酸、オルト、メタ、および／パラ置換フェニルアラニン（たとえば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ハロ、−ＮＯ２、ＣＨ３で置換されている）、二置換フェニルアラニン、置換チロシン（たとえば、−Ｃ＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ハロ、−ＮＯ２、ＣＨ３でさらに置換されている）、およびスタチンである。加えて、アミノ酸は、ヒドロキシル化、リン酸化、スルホン化、アシル化、またはグリコシル化されたアミノ酸残基を含むように誘導体化されていてもよい。
【００９４】
炭化水素ステープルポリペプチドは、２個の非天然アミノ酸間に１個または複数のテザー（連結）を含み、このテザーは、ポリペプチドのα−ヘリックス二次構造を顕著に強化する。一般的に、テザーは、１つまたは２つの螺旋ターン（すなわち、約３．４または約７個のアミノ酸）の長さにわたって伸長する。したがって、ｉおよびｉ＋３個目；ｉおよびｉ＋４個目；またはｉおよびｉ＋７個目に位置するアミノ酸は、化学的修飾および架橋に関して理想的な候補である。したがって、例えば、ペプチドが、配列．．．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有する場合、Ｘ１とＸ４との間、またはＸ１とＸ５との間、またはＸ１とＸ８との間の架橋がそのペプチドの有用な炭化水素のステープル化形態であり、Ｘ２とＸ５との間、またはＸ２とＸ６との間、またはＸ２とＸ９との間などの架橋も同様である。複数の架橋（例えば、２、３、４個、またはそれを超える）の使用も検討される。複数の架橋の使用は、ペプチドの安定化および最適化において非常に効果的であり、特にペプチド長の増加を伴う。したがって、本開示は、配列をさらに安定化させるためか、またはより長いポリペプチド伸長の構造安定化、タンパク質分解抵抗性、酸安定性、熱安定性、細胞透過性、および／または生物活性の強化を促進するために、ポリペプチド配列内に１個を超える架橋の組込みを包含する。炭化水素ステープルポリペプチドの作製および使用に関する追加の説明は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１７２２８５号、同第２０１０／０２８６０５７号、および同第２００５／０２５０６８０号で見出すことができ、これら全ての内容は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋３個目の残基にある場合、Ｒ−プロペニルアラニンおよびＳ−ペンテニルアラニン；またはＲ−ペンテニルアラニンおよびＳ−ペンテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋４個目の残基にある場合、Ｓ−ペンテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、ステープルが、ｉおよびｉ＋７個目の残基にある場合、Ｓ−ペンテニルアラニンおよびＲ−オクテニルアラニンは、これらの位置においてアミノ酸で置換されている。一部の場合では、ペプチドがステッチ化されている場合、「ステッチ」に関与するペプチドのアミノ酸は、ビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−ペンテニルアラニン、およびＲ−オクテニルアラニン；またはビス−ペンテニルグリシン、Ｓ−オクテニルアラニン、およびＲ−オクテニルアラニンで置換されている。
【００９６】
ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、１位および５位、２位および６位、３位および７位、６位および１０位、１０位および１４位、１１位および１５位、１２位および１６位、１位および８位、３位および１０位、６位および１３位、７位および１４位、または８位および１５位に作製され、ここで、提供される位置は、配列番号３９または上述の配列番号３９の改変バージョン（たとえば、配列番号９４から１０９のいずれか１つ）に基づく。ステープルの位置は、ステープルウォークにおいて、異なるステープルの場所を試験することによって変動させることができる。
【００９７】
図３６の上部のパネルは、様々な架橋化合物を生成するために使用することができる非天然のアミノ酸の例示的な化学構造を示す。図３６の中央部のパネルは、ｉ位およびｉ＋３位、ｉ位およびｉ＋４位、ならびにｉ位およびｉ＋７位の残基間に炭化水素架橋を有するペプチドを図示する。図３６の下部のパネルは、ペプチド配列に沿ったステープルウォークを図示する。図３７は、二重および三重ステープリング戦略を用いた様々なペプチド配列、ならびに例示的なステープルウォークを示す。図３８は、様々な長さの分岐ステッチ部分を使用した例示的なステープルウォークを示す。
【００９８】
一態様では、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢポリペプチドは、式（Ｉ）を有し、
【化５】
2021506800.tif 000009
式中、
それぞれのＲ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、またはＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキルであり、
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４］ｎであり、これらのそれぞれは、０〜６個のＲ５で置換され、
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、または放射性同位体であり、
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、または
【化６】
2021506800.tif 000010
であり、
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、または治療剤であり、
ｎは、１〜４の整数であり、
ｘは、２〜１０の整数であり、
それぞれのｙは、独立して、０〜１００の整数であり、
ｚは、１〜１０（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の整数であり、
それぞれのＸａａは、独立して、アミノ酸である。一部の実施形態では、式（Ｉ）のＮ末端［Ｘａａ］ｙは、存在しない、Ａ、ＡＴ、ＡＴＱＬＲ（配列番号１１０）、ＡＴＱＬＲＲ（配列番号１１１）、ＡＴＱＬＲＲＦ（配列番号１１２）、ＡＴＱＬＲＲＦＧＤ（配列番号１１３）、ＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫ（配列番号１１４）、またはＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬ（配列番号１１５）である。一部の実施形態では、［Ｘａａ］ｘは、ＴＱＬ、ＱＬＲ、ＬＲＲ、ＦＧＤ、ＬＮＦ、ＮＦＲ、ＦＲＱ、ＴＱＬＲＲＦ（配列番号１１６）、ＬＲＲＦＧＤ（配列番号１１７）、ＦＧＤＫＬＮ（配列番号１１８）、ＧＤＫＬＮＦ（配列番号１１９）、またはＤＫＬＮＦＲ（配列番号１２０）である。一部の実施形態では、式（Ｉ）のＣ末端［Ｘａａ］ｙは、ＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２１）、ＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２２）、ＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２３）、ＬＮＦＲＱ（配列番号１２４）、Ｑ、ＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２５）、またはＲＱである。ある特定の事例では、上記および配列番号１１０〜１２５に記載される配列は、少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換または欠失を有し得る。ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢポリペプチドは、本明細書に記載される任意のアミノ酸配列を含み得る。
【００９９】
テザーは、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分（例えば、Ｃ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルキル、Ｃ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルケニル、またはＣ５、Ｃ８、もしくはＣ１１アルキニル）を含んでいてもよい。テザーされたアミノ酸は、アルファ二置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ３またはメチル）とすることができる。
【０１００】
一部の場合では、ｘは２、３、または６である。一部の場合では、各ｙは、独立して、１から１５または３から１５の整数である。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。一部の場合では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはメチルである。例えば、Ｒ１およびＲ２は、両方ともメチルとすることができる。一部の場合では、Ｒ３はアルキル（例えば、Ｃ８アルキル）であり、ｘは３である。一部の場合では、Ｒ３はＣ１１アルキルであり、ｘは６である。一部の場合では、Ｒ３はアルケニル（例えば、Ｃ８アルケニル）であり、ｘは３である。一部の場合では、ｘは６であり、Ｒ３はＣ１１アルケニルである。一部の場合では、Ｒ３は、直鎖状アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一部の場合では、Ｒ３は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１０１】
別の態様では、２つのアルファ，アルファ二置換立体中心は、両方がＲ構成もしくはＳ構成にあるか（たとえば、ｉ、ｉ＋４の架橋）、または一方の立体中心がＲであり、他方がＳである（たとえば、ｉ、ｉ＋７の架橋）。したがって、式Ｉは、
【化７】
2021506800.tif 000011
として示され、
Ｃ’およびＣ”二置換立体中心は、両方が、Ｒ構成にあり得るか、またはそれらは、たとえば、ｘが３である場合、両方が、Ｓ構成にあり得る。ｘが６である場合、Ｃ’二置換立体中心は、Ｒ構成にあり、Ｃ”二置換立体中心は、Ｓ構成にある。Ｒ３二重結合は、ＥまたはＺ立体化学構成にあり得る。
【０１０２】
一部の事例では、Ｒ３は、［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４］ｎであり、Ｒ４は、直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。
【０１０３】
一部の実施形態では、本開示は、アミノ酸配列ＡＴＱＬＲＲＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号３９）を含む、内部架橋した（「ステープル」または「ステッチ」された）ペプチドであって、２、３、もしくは６アミノ酸離間している２個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルによって置き換えられているか、３個のアミノ酸の側鎖が、内部ステッチによって置き換えられているか、４個のアミノ酸の側鎖が、２個の内部ステープルによって置き換えられているか、または５個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルおよび内部ステッチの組合せによって置き換えられている、ペプチドを特徴とする。ある特定の事例では、配列番号３９の４位、８位、および９位のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸は、ステープルでもステッチでも置き換えられていない。ある特定の事例では、配列番号３９の４位および／または９位におけるアミノ酸は、ステープルでもステッチでも置き換えられていない。ステープル／ステッチペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ステープル／ステッチペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ステープル／ステッチペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８アミノ酸長である。例示的なＮＯＸＡステープルペプチドは、図２に示されている。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号２〜２１のうちのいずれか１つに記載されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ＮＯＸＡステープルペプチドは、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号２２〜３４のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号３５〜３８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号９４〜１０９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２、３、または６アミノ酸離間している少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造安定化するように改変されている（たとえば、それらを、炭化水素ステープリングを許容する非天然のアミノ酸で置換することによって）。
【０１０４】
炭化水素テザー（tether）が普通であるが、他のテザーもまた、本明細書に記載されるＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドにおいて用いることができる。たとえば、テザーは、エーテル、チオエーテル、エステル、アミン、もしくはアミド、またはトリアゾール部分のうちの１つまたは複数を含み得る。一部の場合には、天然に存在するアミノ酸側鎖を、テザーに組み込むことができる。たとえば、テザーは、官能基、たとえば、セリンにおけるヒドロキシル、システインにおけるチオール、リジンにおける第一級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸における酸、アスパラギンもしくはグルタミンにおけるアミドと、カップリングすることができる。したがって、２つの天然に存在しないアミノ酸をカップリングすることによって作製されたテザーを使用するのではなく、天然に存在するアミノ酸を使用してテザーを作製することが可能である。単一の天然に存在しないアミノ酸を、天然に存在するアミノ酸と一緒に使用することも可能である。トリアゾール含有（たとえば、１，４トリアゾールまたは１，５トリアゾール）架橋を、使用することができる（たとえば、Kawamoto  et  al.  2012  Journal  of  Medicinal  Chemistry  55:1137、国際公開第ＷＯ  ２０１０／０６０１１２号を参照されたい）。加えて、異なる種類のステープリングを行う他の方法が、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載されるＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドとともに用いることができる（たとえば、ラクタムステープリング：Shepherd  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  127:2974-2983  (2005)、ＵＶ−環化付加ステープリング：Madden  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.,  21:1472-1475  (2011)、ジスルフィドステープリング：Jackson  et  al.,  Am.  Chem.  Soc.,113:9391-9392  (1991)、オキシムステープリング：Haney  et  al.,  Chem.  Commun.,  47:10915-10917  (2011)、チオエーテルステープリング：Brunel  and  Dawson,  Chem.  Commun.,  552-2554  (2005)、光スイッチング可能ステープリング：J.  R.  Kumita  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.,  97:3803-3808  (2000)、ダブルクリックステープリング：Lau  et  al.,  Chem.  Sci.,  5:1804-1809  (2014)、ビス−ラクタムステープリング：J.  C.  Phelan  et  al.,,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  119:455-460  (1997)、およびビス−アリール化ステープリング：A.  M.  Spokoyny  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  135:5946-5949  (2013)を参照されたい）。
【０１０５】
テザーの長さが変わる場合がある点が更に想定される。例えば、二次性アルファ−ヘリックス構造に対して比較的高度の拘束を与えることが望ましい場合、長さが短いテザーを使用することができるが、一部の場合では、二次性アルファ−ヘリックス構造に対して拘束は低いことが望ましく、したがって長いテザーが望まれる場合がある。
【０１０６】
さらに、主にアルファヘリックスの片面上にあるテザーを与えるために、アミノ酸ｉからｉ＋３個目、ｉからｉ＋４個目、およびｉからｉ＋７個目までのテザー全長は共通であるが、テザーは、アミノ酸の数の任意の組合せに及ぶように合成することができ、複数のテザーを導入するように組み合わせて使用することもできる。
【０１０７】
一部の場合では、本明細書において記載する炭化水素テザー（すなわち、架橋）は、更に操作することができる。一例では、（例えば、ルテニウム触媒による閉環メタセシス（ＲＣＭ）を使用して合成されるような）炭化水素アルケニルテザーの二重結合を酸化し、（例えば、エポキシ化、アミノヒドロキシル化またはジヒドロキシル化を介して）、以下の化合物のうちの１つを提供することができる。
【化８】
2021506800.tif 000012
【０１０８】
エポキシド部分か、または遊離ヒドロキシル部分のうちの１つのいずれかは、さらに官能基化することができる。例えば、エポキシドは、例えば、治療剤に結合するために使用することができる追加の官能性を与える求核試薬で処置することができる。あるいはそのような誘導体化は、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端の合成操作によってまたはアミノ酸側鎖を介して達成することができる。他の薬剤、例えばポリペプチドが細胞中に侵入するのを促進する薬剤を、官能基化テザーに結合させることができる。
【０１０９】
一部の場合では、アルファ二置換アミノ酸は、アルファヘリックス二次構造の安定性を改善するためにポリペプチドにおいて使用する。しかし、アルファ二置換アミノ酸は必須ではなく、（例えば、テザーされたアミノ酸において）モノ−アルファ置換基を使用した場合も想定される。
【０１１０】
ステープルポリペプチドは、薬物、毒素、ポリエチレングリコール誘導体；第２のポリペプチド；炭水化物などを含んでいてもよい。ポリマーまたは他の薬剤がステープルポリペプチドに連結している場合、組成物は実質的に均質であることが望ましい場合がある。
【０１１１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子が付加すると、ポリペプチドの薬物動態および薬力学特性が改善される場合がある。例えば、ＰＥＧ化を行うと、腎クリアランスを低下させることができ、より安定な血漿濃度をもたらす場合がある。ＰＥＧは水溶性ポリマーであり、
式：ＸＯ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
（式中、ｎは２から１０，０００であり、Ｘは、Ｈまたは末端改変、例えばＣ１〜４アルキルであり；Ｙは、ポリペプチドのアミン基（これらに限定されないが、リシンのイプシロンアミン、またはＮ末端を含む）への、アミド、カルバメートまたは尿素連結である）としてポリペプチドへ連結しているとして表すことができる。Ｙはまた、チオール基（これらに限定されないがシステインのチオール基を含む）へのマレイミド連結であってもよい。ＰＥＧをポリペプチドに直接的にまたは間接的に連結するための他の方法は、当業者であれば公知である。ＰＥＧは、直鎖状または分岐状とすることができる。さまざまな官能基化誘導体を含むＰＥＧのさまざまな形態が市販されている。
【０１１２】
分解可能な連結を骨格において有するＰＥＧを使用することができる。例えば、ＰＥＧは、加水分解するための対象であるエステル連結を用いて調製することができる。分解可能なＰＥＧ連結を有するコンジュゲートは、ＷＯ９９／３４８３３、ＷＯ９９／１４２５９、およびＵ．Ｓ．６，３４８，５５８に記載されている。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、高分子ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、中間体リンカーを介して本明細書において記載する薬剤に結合している。ある特定の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１から２０個のアミノ酸で構成されており（made  up  of）、アミノ酸は、２０種類の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のうちの一部は、当業者であれば十分に理解しているようにグリコシル化されていてもよい。他の実施形態では、１から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。他の実施形態では、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のない大部分のアミノ酸で構成されている。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、アルキルリンカー、例えば−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−（式中、ｎ＝２〜２０）を使用することができる。これらのアルキルリンカーは、任意の立体障害のない基、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等でさらに置換されていてもよい。米国特許第５，４４６，０９０号では、二官能性ＰＥＧリンカー、および各ＰＥＧリンカー末端でペプチドを有するコンジュゲートの形成におけるその使用が記載されている。
【０１１４】
ステープルペプチドはまた、一部の実施形態では、たとえば、さらに細胞内取り込みを促進するためまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を増加させるために、改変することができる。たとえば、ペプチド模倣大環状分子のアシル化またはＰＥＧ化は、細胞内取り込みを促進する、バイオアベイラビリティを増加させる、血液循環を促進する、薬物動態を変化させる、免疫原性を減少させる、および／または必要とされる投与頻度を減少させる。
【０１１５】
一部の実施形態では、本明細書において開示されるステープルペプチドは、（例えば、非ステープルペプチドと比較して）細胞膜を貫通するための強化された能力を有する。
【０１１６】
本明細書において記載する安定化ペプチドを合成する方法は当技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用する場合がある。さまざまなステップを、代替の配列または順序で行い、所望の化合物を得てもよいことは理解されるであろう。本明細書において記載する化合物の合成において有用である合成化学的変換および官能基を保護する方法論（保護および脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えば、R.  Larock,  Comprehensive  Organic  Transformations,  VCH  Publishers  (1989)；T.W.  Greene  and  P.G.M.  Wuts,  Protective  Groups  in  Organic  Synthesis,  3d.  Ed.,  John  Wiley  and  Sons  (1999)；L.  Fieser  and  M.  Fieser,  Fieser  and  Fieser's  Reagents  for  Organic  Synthesis,  John  Wiley  and  Sons  (1994)；およびL.  Paquette,  ed.,  Encyclopedia  of  Reagents  for  Organic  Synthesis,  John  Wiley  and  Sons  (1995)、ならびにこれらのその後の版に記載されているものを含む。
【０１１７】
本発明のペプチドは、当業者に周知の化学合成方法によって、作製することができる。たとえば、Fields  et  al.,  Chapter  3  in  Synthetic  Peptides:  A  User's  Guide,  ed.  Grant,  W.  H.  Freeman  &  Co.,  New  York,  N.Y.,  1992,  p.  77を参照されたい。したがって、ペプチドは、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａまたは４３１において、側鎖が保護されたアミノ酸を使用して、ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学のいずれかによって保護されたα−ＮＨ２を用いた固相合成の自動化されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技法を使用して、合成することができる。
【０１１８】
本明細書において記載するペプチドを作製する一様式は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用することである。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子を用い、酸に不安定な結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合させる。この樹脂は、合成のために使用する溶媒に不溶性であり、過剰な試薬および副生成物を洗い流すのを比較的単純にかつ迅速にする。Ｎ末端は、酸において安定なＦｍｏｃ基で保護されるが、塩基によって取り外し可能である。任意の側鎖官能基は、塩基で安定であり、酸に不安定な基で保護される。
【０１１９】
長いペプチドは、ネイティブケミカルライゲーションを使用して個々の合成ペプチドを連接させることによって作製してもよい。あるいは、長い合成ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。そのような技術は、詳細なプロトコール含む周知の標準的なマニュアルとして提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳し、好ましくは遺伝子が発現される生物に最適なコドンを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的には必要に応じてペプチドおよび任意の調節性エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製する。合成遺伝子を、好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞中にトランスフェクトする。次いで、ペプチドを、選択された発現系および宿主に適切な好適な状態下で発現させる。ペプチドは精製し、標準的な方法によって特徴付ける。
【０１２０】
ペプチドは、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈから入手可能なハイスループットマルチチャンネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用したハイスループット組合せ様式で作製することができる。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を高めるために、レトロインベルソ結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメチレン結合（Ｓ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランス−オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換トランス−オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ）またはＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である）；およびフルオロケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ３である）で置き換えることができる。
【０１２１】
ポリペプチドは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によってさらに改変することができる。上記で示すように、ペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０直鎖状または分岐状アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびこれらの組合せにコンジュゲートすることができる。さまざまな長さのオレフィン側鎖を含むα、α−二置換非天然アミノ酸は、公知の方法で合成することができる（Williams  et  al.  J.  Am.  Chem.  Soc.,  113:9276,  1991；Schafmeister  et  al.,  J.  Am.  Chem  Soc.,  122:5891,  2000；およびBird  et  al.,  Methods  Enzymol.,  446:369,  2008；Bird  et  al,  Current  Protocols  in  Chemical  Biology,  2011）。ペプチドに関しては、ｉ＋７個目のステープルに連結したｉ個目を使用する（ヘリックス２回転が安定化される）場合、ａ）１個のＳ５アミノ酸および１個のＲ８を使用するか、またはｂ）１個のＳ８アミノ酸および１個のＲ５アミノ酸を使用する。Ｒ８は、出発キラル助剤がＲ−アルキル−立体異性体をもたらすことを除いて、同様の経路を使用して合成する。また、８−ヨードオクテンを５−ヨードペンテンの代わりに使用する。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂上での固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して固体支持体上で合成する（例えば、ＷＯ２０１０／１４８３３５を参照のこと）。
【０１２２】
Ｆｍｏｃ−保護されたα−アミノ酸（オレフィンアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｓ５−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓ８−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｒ５−ＯＨ以外）、２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、およびＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡは、例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびピペリジンは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。オレフィンアミノ酸合成は、当技術分野において報告されている（Williams  et  al.,  Org.  Synth.,  80:31,  2003）。
【０１２３】
本明細書において開示されるステープル化され、精製されたペプチドを得る（例えば、合成する）のに好適な方法もやはり、当技術分野において公知である（例えば、Bird  et.  al.,  Methods  in  Enzymol.,  446:369-386  (2008)；Bird  et  al,  Current  Protocols  in  Chemical  Biology,  2011；Walensky  et  al.,  Science,  305:1466-1470  (2004)；Schafmeister  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  122:5891-5892  (2000)；２０１０年３月１８日に出願された米国特許出願公開第１２／５２５，１２３号；および２０１０年５月２５日に登録された米国特許第７，７２３，４６８号を参照されたく、これらそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２４】
一部の実施形態では、ペプチドは、非ステープルペプチド混入物質を実質的に含まないか、または単離されている。ペプチドを精製するための方法としては、例えば、固相支持体上でのペプチド合成がある。環化後、固相支持体は、単離し、溶媒溶液、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物中に懸濁してもよい。ＤＭＳＯ／ジクロロメタンまたはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、約３０％、４０％、５０％または６０％のＤＭＳＯを含んでいてもよい。特定の実施形態では、５０％／５０％ＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液を使用する。溶液は、１、６、１２または２４時間インキュベートしてもよく、その後、樹脂は、例えばジクロロメタンまたはＮＭＰで洗浄してもよい。一実施形態では、樹脂はＮＭＰで洗浄する。振盪および溶液中への不活性ガスのバブリングを行ってもよい。
【０１２５】
本発明のステープル（架橋した）ポリペプチドの特性は、たとえば、以下に記載される方法を使用してアッセイすることができる。
【０１２６】
α−らせん度を判定するためのアッセイ：化合物を、水溶液中に（例えばｐＨ７の５ｍＭリン酸カリウム溶液または蒸留Ｈ２Ｏ中で２５〜５０μＭの濃度に）溶解する。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０、Ａｖｉｖ）で標準的な測定パラメーター（例えば温度、２０℃；波長、１９０〜２６０ｎｍ；ステップ分解、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；アキュムレーション（accumulations）、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；光路長、０．１ｃｍ）を使用して得る。各ペプチドのα−ヘリックス含有量は、残基平均楕円率を、モデルヘリックスのデカペプチドに関する報告値で除算することによって算出する（Yang  et  al.,  Methods  Enzymol.  130:208  (1986)）。
【０１２７】
融解温度（Ｔｍ）を判定するためのアッセイ：架橋または非改変の鋳型ペプチドを、蒸留Ｈ２Ｏまたは他の緩衝液または溶媒中に（例えば、５０μＭの最終濃度で）溶解し、Ｔｍを、温度範囲（例えば４から９５℃）にわたる楕円率における変化を標準的なパラメーター（例えば波長２２２ｎｍ；ステップ分解、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；アキュムレーション、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；温度上昇速度：１℃／分；光路長、０．１ｃｍ）を使用した分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０、Ａｖｉｖ）で測定することによって判定する。
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼ抵抗性アッセイ
ペプチド骨格のアミド結合は、プロテアーゼによる加水分解に対する影響を受けやすく、その結果、ペプチド化合物はｉｎ  ｖｉｖｏでの急速な分解に対して脆弱になる。しかし、典型的には、ペプチドヘリックスが形成されると、アミド骨格が埋まり、および／またはねじれ、および／または遮蔽され、その結果、タンパク質の分解的切断が阻止されるかまたは実質的に遅れる。本発明のペプチド模倣大員環は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素タンパク質（例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン）分解を行い、分解速度における任意の変化に関して匹敵する非架橋またはその代わりとなるステープルポリペプチドと比較して評価してもよい。例えば、ペプチド模倣大員環および匹敵する非架橋ポリペプチドは、トリプシンアガロースとインキュベートし、遠心分離によってさまざまな時点において反応をクエンチし、その後、ＨＰＬＣ注入し、２８０ｎｍにおける紫外線吸収によって残留基質を定量化する。簡潔には、ペプチド模倣大員環およびペプチド模倣前駆体（５ｍｃｇ）をトリプシンアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｓ／Ｅ〜１２５）と０、１０、２０、９０、および１８０分間インキュベートする。反応を卓上遠心分離によって高速でクエンチし、単離された上澄み中の残りの基質を、ＨＰＬＣをベースとした２８０ｎｍにおけるピーク検出によって定量化する。タンパク質分解反応は一次反応を示し、速度定数ｋは時間に対するｌｎ［Ｓ］のプロットから判定される。
【０１２９】
ペプチド模倣大員環および／または匹敵する非架橋ポリペプチドは、新鮮なマウス、ラットおよび／またはヒト血清（例えば１〜２ｍＬ）と、３７℃で、例えば、０、１、２、４、８、および２４時間それぞれインキュベートしてもよい。異なる濃度の大員環試料は、血清を用いた連続希釈によって調製してもよい。完全なままの化合物のレベルを判定するために、以下の手順を使用してもよい：例えば、２ｍｌの遠心分離管に血清１００μＬを移すことによって試料を抽出し、続いて５０％ギ酸１０μＬおよびアセトニトリル５００μＬを添加し、１４，０００ＲＰＭ、４＋／−２℃で１０分間遠心分離する。次いで上澄みを新鮮な２ｍｌの管に移し、Ｎ２下、１０ｐｓｉ未満、３７℃のＴｕｒｂｏｖａｐで蒸発させる。試料を、５０：５０アセトニトリル：水の１００μＬ中で再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行う。ｅｘ  ｖｉｖｏ安定性を試験するための同様のまたは類似の手順は公知であり、血清中の大員環の安定性を判定するために使用してもよい。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏプロテアーゼ抵抗性アッセイ：鍵となるペプチドをステープル化する利点は、プロテアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抵抗性が、ｉｎ  ｖｉｖｏで明らかに改善された薬物動態へ変換されることである。
【０１３１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ：ペプチド模倣大員環およびペプチド模倣薬前駆体のアクセプタータンパク質に対する結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を使用することができる。ＦＰＡ技術によって、偏光および蛍光トレーサーを使用した分子配向および移動性が測定される。偏光で励起された場合、見かけの分子量が大きい分子（例えば、大きいタンパク質に結合するＦＩＴＣ標識ペプチド）に結合している蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）は、小さい分子（例えば、溶液中で遊離しているＦＩＴＣ−標識ペプチド）結合している蛍光トレーサーと比較してその回転速度が低いために、高レベルの偏光蛍光を放出する。
【０１３２】
安定化されたＮＯＸＡペプチドバリアント
本開示はまた、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドバリアントも提供する。これらのバリアントは、配列番号３９に記載されるアミノ酸配列とは、１つまたは複数のアミノ酸が異なり得る。アミノ酸置換に加えて、Ｃ末端および／またはＮ末端欠失も想起される。
【０１３３】
一部の実施形態では、内部架橋したペプチドは、配列番号３９のポリペプチドを改変することによって（たとえば、アミノ酸置換によって）作製することができる。そのようなＮＯＸＡ  ＳＡＨＢバリアントは、配列番号３９のペプチドと比べて、またはバリアントペプチドのステープル対応物（すなわち、配列番号３９からの変動を有さない、ペプチドのステープルバージョン）と比べて、疎水性および／または全体的な正電荷が低減されたペプチドを含み得る。一部の実施形態では、内部ステープルは、２つのアミノ酸の側鎖と置き換わる、すなわち、それぞれのステープルは、たとえば、３、４、または６アミノ酸離間している２つのアミノ酸の間にある。一部の実施形態では、内部ステッチは、３つのアミノ酸の側鎖と置き換わる、すなわち、ステッチは、たとえば、３および６アミノ酸離間している３つのアミノ酸の間における一対の架橋である。一部の実施形態では、内部ステープルおよび／または内部ステッチは、少なくとも２つの内部ステープルを含む（４つのアミノ酸の側鎖と置き換わる、すなわち、それぞれのステープルは、たとえば、３アミノ酸離間している２つのアミノ酸の間にある）。一部の実施形態では、内部ステープルおよび／または内部ステッチは、少なくとも１つの内部ステープルと内部ステッチとの組合せを含む。一部の実施形態では、内部ステッチは、第１のアミノ酸ならびに第２および第３のアミノ酸の側鎖と置き換わり、それによって、第１のアミノ酸（第２のアミノ酸と第３のアミノ酸との間にある）を、内部架橋によって第２および第３のアミノ酸と架橋させ、ここで、第１および第２のアミノ酸は、２、３、または６アミノ酸離間しており、第１および第３のアミノ酸は、２、３、または６アミノ酸離間しており、第２および第３のアミノ酸は、異なるアミノ酸である。一部の実施形態では、本開示の内部架橋したポリペプチドの４つのアミノ酸の側鎖は、２つの異なる内部ステープルによって置き換えられる。一部の実施形態では、２つの異なる内部ステープルのうちの第１のものが、２、３、または６アミノ酸離間したアミノ酸の第１の対を架橋し、少なくとも２つの異なる内部ステープルのうちの第２のものが、２、３、または６アミノ酸離間したアミノ酸の第２の対を架橋する。一部の実施形態では、本開示の内部架橋したＮＯＸＡポリペプチドバリアントは、配列番号３９のポリペプチドから調製され、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸置換を有する（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸が、保存的または非保存的に置換されている）。例示的なＮＯＸＡステープルペプチドバリアントは、図６および図１０に提供される。
【０１３４】
一部の事例では、安定化されたペプチドは、安定化されたＮＯＸＡペプチドのヘリックスの非相互作用面（すなわち、ＢＦＬ−１と相互作用しないＮＯＸＡ  ＢＨ３ヘリックスの一部）に、１〜８個のアミノ酸置換（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、または８個）を有し得る。本明細書に記載されるポリペプチドの「相互作用面」は、ＢＦＬ−１タンパク質と相互作用する（たとえば、特異的に相互作用するかまたは特異的に結合する）アルファヘリックスのアミノ酸残基を含む。ある特定の事例では、ペプチドは、ペプチドのヘリックスの相互作用面に、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ置換を有する。一部の事例では、配列番号２〜３８のペプチドうちのいずれか１つの相互作用面にあるアミノ酸を、別のアミノ酸、たとえば、Ａｌａ、もしくはＤ−Ａｌａなどの誘導体、またはα−アミノイソ酪酸と置き換えることが有用であり得る。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の事例では、本明細書に記載されるペプチドは、１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、もしくは１〜１２個）の保存的アミノ酸置換を有する配列番号２〜３８のうちの１つを含み得る。本明細書に記載されるペプチドのヘリックスの相互作用面にないアミノ酸には、有意な変動性が許容される。たとえば、これらのアミノ酸は、すべてではなくてもほぼすべてが、置換されていてもよい（たとえば、保存的アミノ酸で）。「保存的アミノ酸置換」とは、置換により、１つのアミノ酸が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基と置き換わることを意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【０１３５】
一部の事例では、本開示のペプチドは、配列番号２〜３８のアミノ酸配列に対して、少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはまたは９７％の同一性を有する配列を含む。ある特定の場合には、アミノ酸配列における変動性は、ヘリックスの非相互作用面にある。一部の場合には、アミノ酸配列における変動性は、ヘリックスの相互作用面にある。ある特定の場合には、アミノ酸配列における変動性は、ヘリックスの非相互作用面および相互作用面の両方にある。ある特定の事例では、Ａ−１、Ｔ−２、Ｑ−３、Ｒ−５、Ｒ−６、Ｆ−７、Ｇ−８、Ｋ−１０、Ｌ−１１、Ｎ−１２、Ｆ−１３、Ｒ−１４、およびＱ−１５（番号付けは配列番号３９による）のうちの１つまたは複数が、置換されている。一部の事例では、置換は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、またはα−アミノイソ酪酸へのものである。一部の事例では、Ｃ末端および／またはＮ末端における１〜５個（たとえば、１、２、３、４、または５個）のアミノ酸が、欠失している。アミノ酸配列間の同一性パーセントを判定するための方法は、当該技術分野において公知である。たとえば、配列は、最適な比較の目的でアライメントされる（たとえば、最適なアライメントのために、ギャップが、第１および第２のアミノ酸または核酸配列のうちの一方または両方に導入されてもよく、非相同配列は、比較目的で、無視してもよい）。好ましい実施形態では、比較目的でアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次いで、比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されている場合、分子は、その位置において同一である。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントの判定は、ＢＬＡＳＴ  ２．０プログラムを使用して達成される。配列比較は、ギャップなしのアライメントを使用して、ならびにデフォルトのパラメーター（Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス、ギャップ存在コスト１１、残基ごとのギャップコスト１、およびラムダ比０．８５）を使用して、行われる。ＢＬＡＳＴプログラムにおいて使用される数学的アルゴリズムは、Altschul  et  al.  (Nucleic  Acids  Res.  25:3389-3402,  1997)に記載されている。
【０１３６】
ステープルポリペプチドは、内部分子内架橋（または「ステープル」）によって結合された少なくとも２つの改変されたアミノ酸を含み、ここで、この少なくとも２つのアミノ酸は、２、３、または６アミノ酸離間している。本明細書における安定化されたペプチドは、２つのステープルを有するペプチドを含む、ステープルペプチド、および／またはステッチペプチドを含む。少なくとも２つの改変されたアミノ酸は、非天然のアルファ−アミノ酸（α，α−二置換およびＮ−アルキル化アミノ酸を含むがこれらに限定されない）であってもよい。多数の公知の非天然のアミノ酸が存在し、それらのいずれも、本発明のペプチドに含めることができる。非天然のアミノ酸の一部の例は、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ−アミノ酪酸、ベータ−シアノアラニン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−２−フェニル−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、４−アミノ−シクロペンテンカルボン酸、３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、４−ピペリジル酢酸、４−アミノ−ｌ−メチルピロール−２−カルボン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２−アミノヘプタン二酸、４−（アミノメチル）安息香酸、４−アミノ安息香酸、オルト、メタ、および／パラ置換フェニルアラニン（たとえば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ハロ、−ＮＯ２、ＣＨ３で置換されている）、二置換フェニルアラニン、置換チロシン（たとえば、−Ｑ＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ハロ、−ＮＯ２、ＣＨ３でさらに置換されている）、およびスタチンである。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、ステープルＮＯＸＡポリペプチドバリアントは、配列番号２２〜３４のうちのいずれか１つに記載されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる（Ｎ末端ニペコチン酸を含むことなく）。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、ステープルＮＯＸＡポリペプチドバリアントは、配列番号３５〜３８のうちのいずれか１つに記載されているアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる（Ｎ末端ニペコチン酸を含むことなく）。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、ステープルＮＯＸＡポリペプチドバリアントは、配列番号９４〜１０９のうちのいずれか１つに記載されているアミノ酸配列の構造安定化バージョンを含むかまたはそれからなる。これらのペプチドの構造安定化の非限定的な例は、これらの配列における２、３、または６アミノ酸離間した位置に非天然のアミノ酸を導入することによる炭化水素ステープリングによって達成される。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、
【化９】
2021506800.tif 000013
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
ここで、Ｘ１およびＸ２は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸である。
【０１４１】
一部の実施形態では、ステープルポリペプチドバリアントは、
【化１０】
2021506800.tif 000014
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。
【０１４２】
弾頭部を有する安定化されたＮＯＸＡペプチド
本開示は、弾頭部、すなわち、求電子性基を有する非天然のアミノ酸などの反応基を含む、安定化されたＮＯＸＡペプチドを特徴とする。重要なことに、ＮＯＸＡペプチドとＢＦＬ−１との間の相互作用は、求電子体とＢＦＬ−１の５５位におけるシステインとの間における共有結合での結合によって強固となるため、これらの弾頭部を含むペプチドは、会合するＮＯＸＡペプチドのアミノ酸配列における有意な変動性を可能にする（弾頭部が存在しない場合よりも高い）。したがって、ＮＯＸＡヘリックスのＢＦＬ−１相互作用面における置換を含め、配列番号３９に置換および／または欠失が存在する場合であっても、これらの弾頭部を有するペプチドは、ＢＦＬ−１への結合に有効である可能性が高い。さらに、弾頭部の存在により、ＮＯＸＡペプチド（たとえば、配列番号３９〜５９のうちのいずれか１つ）のサイズは、長さが低減され得る（たとえば、１５個から１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個のアミノ酸へ）。
【０１４３】
求電子体は、非天然のアミノ酸に関連して導入され得るだけでなく、安定化された（たとえば、架橋した）ＮＯＸＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端への化学的キャップとしても導入され得る。一部の事例では、求電子体は、安定化されたペプチド内に導入され得る。そのような弾頭部を有する安定化されたペプチドは、それらが相互作用するタンパク質の少なくとも一部と共有結合による結合を形成することができる。たとえば、そのような弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＢＦＬ−１を共有結合で改変し得る（たとえば、ＢＦＬ−１のＣ５５と共有結合で結合することにより）、ＢＦＬ−１と非共有結合で相互作用し得る、および／またはＭＣＬ−１と非共有結合で相互作用し得る。
【０１４４】
弾頭部は、Ｎ末端にあってもよく、Ｃ末端にあってもよく、またはポリペプチド配列内にあってもよい。一部の場合には、弾頭部は、非天然の求電子体を有するアミノ酸である。ある特定の実施形態では、弾頭部は、アクリルアミドの末端にある３Ｓ−１−ピロリジン−３−カルボン酸、アクリルアミドの末端にあるＤ−ホモプロリン、アクリルアミドの末端にあるＬ−ホモプロリン、アクリルアミドの末端にあるイソニペコチン酸、アクリルアミドの末端にあるＤ−ニペコチン酸、アクリルアミドの末端にあるＬ−ニペコチン酸、アクリルアミドの末端にあるＤ−プロリン、アクリルアミドの末端にあるＬ−プロリン、トランス−４−ジメチルアミノクロトン酸、およびアクリル酸からなる群から選択される。
【０１４５】
一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。他の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、弾頭部は、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−３−カルボキサミド、１−アクリロピペリジン−４−カルボキサミド、（Ｒ）−１  アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピペリジン−３−カルボキサミド、（Ｓ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｒ）−１−アクリロイルピロリジン−２−カルボキサミド、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、およびアクリルアミドからなる群から選択される、求電子性基を有する非天然のアミノ酸である。他の実施形態では、弾頭部は、アミノ酸ではない。たとえば、求電子性部分およびペプチドは、飽和窒素含有複素環（アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパン）または不飽和窒素含有複素環（アジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピン）を介して連結される。ペプチドおよび求電子体はまた、置換アミノ官能化環（たとえば、Ｎ−アリールアクリルアミド）、たとえば、フェニル（アニリン）によって、またはより複雑な二環式環もしくは多環式環、たとえば、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドールによって、連結されていてもよい。一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、アクリルアミド、またはより一般的にはα，β−不飽和カルボニルとして定義されるもの、たとえば、α−シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、トランス４−ジメチルアミノ−２−ブテンアミド、もしくはトランス４−ピペリジニル−２−ブテンアミド、または任意の他の置換アクリルアミド、またはＮ官能化ビニルスルホニル、アルファ−フルオロアセチル、アルファ−クロロアセチル、アルファ−ブロモアセチル、およびアルファ−ヨードアセチル、または他の求電子性部分である。求電子体は、非天然のアミノ酸に関連して導入され得るだけでなく、架橋した（たとえば、ステープル、ステッチ）ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端への化学的キャップとしても導入され得る。
【０１４７】
一態様では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列番号９４〜１０９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有する。別の態様では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列番号９４〜１０９のうちのいずれか１つに記載される配列の５個またはそれを超える（たとえば、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４個の）アミノ酸を含む、アミノ酸配列を有する。別の態様では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列番号９４〜１０９のうちのいずれか１つに記載される配列のＣ末端またはＮ末端における１〜５個の欠失（たとえば、１、２、３、４、５個）を含む、アミノ酸配列を有する。一部の事例では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端にある。他の事例では、求電子性弾頭部は、ペプチド内にある。
【０１４８】
一実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、以下に記載される配列から選択される配列を有する。
【化１１】
2021506800.tif 000015
【０１４９】
ある特定の事例では、上記の弾頭部を有する配列は、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化することができる。たとえば、２、３、または６アミノ酸離間した、配列の少なくとも２つのアミノ酸（たとえば、２、３、４、５個）を、ステープルおよび／またはステッチを形成することができる非天然のアミノ酸と置き換えることができる。一部の実施形態では、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。他の実施形態では、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分である。
【０１５０】
一部の実施形態では、ステープルポリペプチドは、
【化１２】
2021506800.tif 000016
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る））。特定の実施形態では、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。別の特定の実施形態では、「Ｊ」は、システイン反応性部分である。
【０１５１】
一部の実施形態では、ステープルポリペプチドは、上記または配列番号２〜２１に列挙されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、非相互作用面における複数の残基（たとえば、１、２、３、４、５、６個）が、Ａｌａ（アラニン）、Ｄ−Ａｌａ（Ｄ−アラニン）、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ−メチルグリシン）、およびＳｅｒ（セリン）、他の置換アラニン、ならびにグリシン誘導体からなる群から選択される残基と置き換えられ得る。加えて、これらの残基のうちの１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６個）は、ペプチドのＣ末端に付加され得る。一部の事例では、上記のペプチド（配列番号６０〜７５）または配列番号２〜２１のもののＣ末端における０〜５個のアミノ酸は、Ａｌａ（アラニン）、Ｄ−Ａｌａ（Ｄ−アラニン）、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ−メチルグリシン）、およびＳｅｒ（セリン）、他の置換アラニン、ならびにグリシン誘導体からなる群から選択される残基と置き換えられる。
【０１５２】
一部の実施形態では、ステープルポリペプチドは、
【化１３】
2021506800.tif 000017
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である。特定の実施形態では、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である。別の特定の実施形態では、「Ｊ」は、システイン反応性部分である。
【０１５３】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６０〜７９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一である、弾頭部を有するＮＯＸＡステープルペプチドを特徴とし、ここで、改変されたペプチドは、ＢＦＬ−１に共有結合で結合する。一部の実施形態では、これらの改変されたペプチドはまた、ＢＦＬ−１および／またはＭＣＬ−１に非共有結合で結合する。一部の実施形態では、これらの改変されたペプチドは、アミノ酸変動の前のステープルＮＯＸＡペプチドと比べて低減された疎水性および／または全体的な正電荷を有する。一部の実施形態では、疎水性または正電荷は、独立して、細胞浸透性を最適化するように増強される。一部の実施形態では、これらの改変されたペプチドは、配列番号１６のペプチドと比べて低減された疎水性および／または全体的な正電荷を有する。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号６０〜７９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と比べて、１〜１０個（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸置換を有する、弾頭部を有するＮＯＸＡステープルペプチドを特徴とし、ここで、改変されたペプチドは、ＢＦＬ−１に共有結合で結合する。一部の実施形態では、これらの改変されたペプチドはまた、ＢＦＬ−１および／またはＭＣＬ−１に非共有結合で結合する。一部の実施形態では、これらの改変されたペプチドは、アミノ酸置換の前のステープルＮＯＸＡペプチドと比べて低減された疎水性および／または全体的な正電荷を有する。一部の実施形態では、これらの改変されたペプチドは、配列番号１６のペプチドと比べて低減された疎水性および／または全体的な正電荷を有する。一部の実施形態では、疎水性または正電荷は、独立して、細胞浸透性を最適化するように増強される。
【０１５５】
例示的な安定化されたＮＯＸＡペプチドバリアントおよび弾頭部を有する安定化されたＮＯＸＡペプチド
具体的な実施形態では、ステープルペプチドは、０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有するアミノ酸配列ＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４６）を含み、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。特定の実施形態では、ステープルペプチドは、上記の「ＮＯＸＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の節に記載される改変のうちの１つまたは複数をさらに含む。別の特定の実施形態では、ステープルペプチドは、アミノ酸配列ＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４６）からなり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸によって置換される配列番号４６の０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸は、配列番号４６のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１非相互作用面にある。一部の実施形態では、配列番号４６における０〜３個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されるか、または除去され、アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１〜６個のアミノ酸と置き換えられる。一部の実施形態では、配列番号４６の非相互作用面にある０〜６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号４６の以下のアミノ酸Ａ１、Ｌ４、Ｒ５、Ｆ７、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、アルファ−メチル化またはアルファ−エチル化された天然のアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号４６の以下のアミノ酸Ａ１、Ｌ４、Ｒ５、Ｆ７、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号４６の以下のアミノ酸Ｔ２、Ｒ６、Ｆ１３、およびＲ１４のうちの１つまたは複数は、アルファ−メチル化またはアルファ−エチル化された天然のアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号４６の以下のアミノ酸Ｔ２、Ｒ６、Ｆ１３、およびＲ１４のうちの１つまたは複数は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号４６の以下のアミノ酸Ａ１、Ｔ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｆ７、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、Ｆ１３、Ｒ１４、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、アルファメチルもしくはエチルで改変されているか、またはＬ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の事例では、別のアミノ酸によって置換される配列番号４６の１〜６個��アミノ酸は、配列番号４６のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１相互作用面にある。他の事例では、別のアミノ酸によって置換される配列番号４６の１〜６個のアミノ酸は、配列番号４６のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１非相互作用面および相互作用面にある。ある特定の実施形態では、配列番号４６の１〜６個のアミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている。
【０１５６】
別の具体的な実施形態では、ステープルペプチドは、０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有するアミノ酸配列ＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４４）を含み、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。特定の実施形態では、ステープルペプチドは、上記の「ＮＯＸＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の節に記載される改変のうちの１つまたは複数をさらに含む。別の特定の実施形態では、ステープルペプチドは、アミノ酸配列ＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４４）からなり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸によって置換される配列番号４４の０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸は、配列番号４４のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１非相互作用面にある。一部の実施形態では、配列番号４４における０〜３個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されるか、または除去され、アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１〜６個のアミノ酸と置き換えられる。一部の実施形態では、配列番号４４の非相互作用面にある０〜６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号４４の以下のアミノ酸Ａ１、Ｌ４、Ｒ５、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、アルファ−メチル化またはアルファ−エチル化された天然のアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号４４の以下のアミノ酸Ａ１、Ｌ４、Ｒ５、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号４４の以下のアミノ酸Ｔ２、Ｒ６、Ｆ１３、およびＲ１４のうちの１つまたは複数は、アルファ−メチル化またはアルファ−エチル化された天然のアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号４４の以下のアミノ酸Ｔ２、Ｒ６、Ｆ１３、およびＲ１４のうちの１つまたは複数は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号４４の以下のアミノ酸Ａ１、Ｔ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｇ８、Ｌ１１、Ｎ１２、Ｆ１３、Ｒ１４、およびＱ１５のうちの１つまたは複数は、アルファメチルもしくはエチルで改変されているか、またはＬ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の事例では、別のアミノ酸によって置換される配列番号４４の１〜６個のアミノ酸は、��列番号４４のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１相互作用面にある。他の事例では、別のアミノ酸によって置換される配列番号４４の１〜６個のアミノ酸は、配列番号４４のヘリックスのＢＦＬ−１／Ａ１非相互作用面および相互作用面にある。ある特定の実施形態では、配列番号４４の１〜６個のアミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、セリン、置換アラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている。
【０１５７】
別の具体的な実施形態では、ペプチドは、本明細書に記載される、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドである。たとえば、上記の配列番号４６、４４のペプチド、またはそれらのバリアントは、非天然の求電子体含有アミノ酸またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）（たとえば、システイン反応性部分、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分）を含むように改変されている。
【０１５８】
具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失（上述の通り）を有する配列ＪＡＴＱＬＲＥＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２８）を含み、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失（上述の通り）を有する配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を含み、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分である、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失（上述の通り）を有する配列ＪＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７８）を含み、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」はシステイン反応性部分である、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチド（配列番号６２または７８または１２８）は、上記の「ＮＯＸＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の節に記載される改変のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【０１５９】
具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失（上述の通り）を有する配列ＪＡＴＱＬＲＥＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２８）からなり、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失（上述の通り）を有する配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）からなり、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分である、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、０〜６個（すなわち、０、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失（上述の通り）を有する配列ＪＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７８）からなり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」はシステイン反応性部分である、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。
【０１６０】
別の具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＲＡＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２６）を含み、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を含み、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７６）を含み、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチド（配列番号６０または７６または１２６）は、上記の「ＮＯＸＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の節に記載される改変のうちの１つまたは複数をさらに含む。別の具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＲＡＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２６）からなり、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）からなり、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７６）からなり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。
【０１６１】
処置の方法
本開示は、がん、自己免疫疾患、または炎症性疾患の予防および／または処置に、本明細書に記載される安定化されたペプチド（または安定化されたペプチドを含む医薬組成物）のうちのいずれかを使用する方法を特徴とする。「処置する」または「処置すること」という用語は、本明細書で使用される場合、対象が罹患している疾患または状態を軽減、阻害、または緩和することを指す。
【０１６２】
本明細書に記載されるペプチドは、ＢＦＬ−１を発現するがんを有するヒト対象を処置するのに有用であり得る。本明細書に記載されるペプチドはまた、ＢＦＬ−１依存性のがんを有するヒト対象を処置するのにも有用であり得る。ある特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍または液性腫瘍である。ある特定の実施形態では、ＢＦＬ−１依存性のがんは、黒色腫、白血病、リンパ腫、または他の造血系悪性腫瘍もしくは固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、造血系悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、または多発性骨髄腫である。ある特定の実施形態では、ＢＦＬ−１依存性のがんは、乳がん、自律神経節がん、膵臓がん、皮膚がん、ＣＮＳがん、造血系もしくはリンパ系のがん、肺がん、大腸がん、胃がん、軟組織肉腫、または骨がんである。ある特定の事例では、固形腫瘍は、黒色腫、乳がん、または肺がんである。一部の実施形態では、ＢＦＬ−１を発現するかまたはそれに依存性の細胞は、細胞過剰性疾患に特徴的な自己免疫疾患または他の炎症性状態を引き起こす。ある特定の事例では、自己免疫疾患は、自己免疫性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、脈管炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、またはシェーグレン病である。一部の事例では、炎症性疾患は、喘息、乾癬、炎症性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、または脈管炎である。具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１依存性のがんは、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、または多発性骨髄腫である。
【０１６３】
本明細書に記載されるペプチドは、ＭＣＬ−１を発現するがんを有するヒト対象を処置するのに有用であり得る。本明細書に記載されるペプチドはまた、ＭＣＬ−１依存性のがんを有するヒト対象を処置するのにも有用であり得る。ある特定の実施形態では、ＭＣＬ−１依存性のがんは、黒色腫、白血病、リンパ腫、または他の造血系悪性腫瘍もしくは固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、造血系悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、または多発性骨髄腫である。ある特定の事例では、固形腫瘍は、黒色腫、乳がん、または肺がんである。一部の実施形態では、ＢＦＬ−１を発現するかまたはそれに依存性の細胞は、細胞過剰性疾患に特徴的な自己免疫疾患または他の炎症性状態を引き起こす。ある特定の事例では、自己免疫疾患は、自己免疫性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、脈管炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、またはシェーグレン病である。一部の事例では、炎症性疾患は、喘息、乾癬、炎症性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、または脈管炎である。具体的な実施形態では、ＭＣＬ−１依存性のがんは、急性骨髄性白血病である。
【０１６４】
本明細書に記載されるペプチドは、ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１を共発現するがんを有するヒト対象を処置するのに有用であり得る。本明細書に記載されるペプチドはまた、ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１依存性のがんを有するヒト対象を処置するのにも有用であり得る。ある特定の実施形態では、ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１依存性のがんは、黒色腫、白血病、リンパ腫、または他の造血系悪性腫瘍もしくは固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、造血系悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、または多発性骨髄腫である。ある特定の事例では、固形腫瘍は、黒色腫、乳がん、または肺がんである。一部の実施形態では、ＢＦＬ−１を発現するかまたはそれに依存性の細胞は、細胞過剰性疾患に特徴的な自己免疫疾患または他の炎症性状態を引き起こす。ある特定の事例では、自己免疫疾患は、自己免疫性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、脈管炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、またはシェーグレン病である。一部の事例では、炎症性疾患は、喘息、乾癬、炎症性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、または脈管炎である。具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１依存性のがんは、急性骨髄性白血病である。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６および配列番号６０〜７９からなる群から選択されるペプチドが投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号６２のペプチドが投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号６０のペプチドが投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６および配列番号６０〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるペプチドが投与される。
【０１６６】
具体的な実施形態では、それを必要とするヒト対象に、ペプチドＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４６）が投与され、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、それを必要とするヒト対象に、ペプチドＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４４）が投与され、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、それを必要とするヒト対象に、本明細書に記載されるＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドが投与される。具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＥＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２８）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７８）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＲＡＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２６）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７６）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。当業者であれば、閉環メタセシス反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、２つの非天然のアミノ酸を含むペプチドについて、閉環メタセシス反応は、ペプチド（すなわち、安定化されたペプチド）を、処置を必要とする対象に投与する前に、ペプチドに行われていることを理解するであろう。換言すると、２つの非天然のアミノ酸の共有結合での結合により産生された架橋した環が、安定化されたペプチドを対象に投与する前に、安定化されたペプチドに存在しているであろう。
【０１６７】
一部の事例では、それを必要とするヒト対象に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤が、共投与される。ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの非限定的な例としては、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）キナーゼ、血管拡張性失調症およびｒａｄ３関連（ＡＴＲ）キナーゼ、チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＫ１）、チェックポイントキナーゼ２（ＣＨＫ２）、およびポリ（ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が挙げられる。一部の事例では、それを必要とするヒト対象に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＡＴＭキナーゼまたはＡＴＲキナーゼ阻害剤が、共投与される。ＡＴＭおよびＡＴＲキナーゼ阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、Weber  et  al.,  Pharmacology  &  Therapeutics,  149:124-0138  (2015)、Awasthi  et  al.,  J  Cell  Sci  2015  128:  4255-4262を参照されたい）。ＡＴＭ阻害剤の非限定的な例としては、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６が挙げられる。一部の事例では、それを必要とするヒト対象に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、チェックポイントキナーゼ１／チェックポイントキナーゼ２（ＣＨＫ１／２）阻害剤が、共投与される。ＣＨＫ１／２阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、Zabludoff  et  al.,  2008;  Anderson,  V.  E.  et  al.  Cancer  Res  71,  463-472,  doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-1252  (2011)、Scagliotti,  G.  et  al.  Invest  New  Drugs  34,  625-635,  doi:10.1007/s10637-016-0368-1  (2016)、Hong,  D.  et  al.  J  Clin  Oncol  34,  1764-1771,  doi:10.1200/JCO.2015.64.5788  (2016)、Jobson,  A.  G.  et  al.  Pharmacol  72,  876-884,  doi:10.1124/mol.107.035832  (2007)、Smaill,  J.  B.  et  al.  Eur  J  Med  Chem  43,  1276-1296,  doi:10.1016/j.ejmech.2007.07.016  (2008)、Jackson,  J.  R.  et  al.  Cancer  Res  60,  566-572  (2000)、Teng,  M.  et  al.  J  Med  Chem  50,  5253  (2007)、Booth,  L.  et  al.  786-796  (2018)を参照されたい）。ＣＨＫ１／２阻害剤の非限定的な例としては、ＡＺＤ７７６２（ＣＨＫ１／２）、ＣＣＴ  ２４１５３３（ＣＨＫ２）、ＬＹ  ２６０３６１８（ＣＨＫ１）、ＬＹ  ２６０６３６８（ＣＨＫ１／２）、ＮＳＣ  １０９５５５ジトシレート（ＣＨＫ２）、ＰＤ  ４０７８２４（ＣＨＫＥ１）、ＰＦ４７７３６（ＣＨＥＫ１）、ＳＢ  ２１８０７８（ＣＨＫ１）、ＴＣＳ  ２３１２（ＣＨＫ１）、およびＳＲＡ７３７（ＣＨＫ１）が挙げられる。一部の事例では、それを必要とするヒト対象に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＰＡＲＰ阻害剤が、共投与される。ＰＡＲＰ阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、Menear  et  al.,  2008、Penning,  T.  D.  et  al.  J  Med  Chem  53,  3142-3153,  doi:10.1021/jm901775y  (2010)、Donawho,  C.  K.  et  al.  Clin  Cancer  Res  13,  2728-2737,  doi:10.1158/1078-0432.CCR-06-3039  (2007)、Daniel,  R.  A.  et  al.  Clin  Cancer  Res  15,  1241-1249,  doi:10.1158/1078-0432.CCR-08-1095  (2009)、Curtin,  N.  J.  e.  a.  Clin  Cancer  Res  10,  881-889  (2004)、Liu,  X.  et  al.  Clin  Cancer  Res  18,  510-523,  doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-1973  (2012)、Brock,  W.  A.  et  al.  Cancer  Lett  205,  155-160,  doi:10.1016/j.canlet.2003.10.029  (2004)、Bridges,  B.  A.  et  al.  Oncotarget  5,  5076-5086  (2014)、Laird,  J.  H.  et  al.  Clin  Cancer  Res  24,  5143-5152,  doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-0401  (2018)、Oplustil  O’Connor,  L.  et  al.  Cancer  Res  76,  6084-6094,  doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-3240  (2016)、McGonigle,  S.  et  al.  Oncotarget  6,  41307-41323  (2015)を参照されたい）。ＰＡＲＰ阻害剤の非限定的な例としては、オラパリブ、Ａ−９６６４９２、ベリパリブ、ルカパリブ、ＡＧ−１４３６１、イニパリブ、ＩＮＯ−１００１、ニラパリブ、タラゾパリブ、ＡＺＤ２４６１、２Ｘ−１２１、ＢＭＮ  ６７３（タラゾパリブ）、およびＥ７４４９が挙げられる。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるペプチド、ならびにＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤が、投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるペプチド、ならびにＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤が、投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるペプチド、ならびにＡＴＭ阻害剤またはＡＴＲキナーゼ阻害剤が、投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるペプチド、ならびにＡＴＭキナーゼまたはＡＴＲキナーゼ阻害剤が、投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるペプチド、ならびにＣＨＫ１／２阻害剤またはＰＡＲＰ阻害剤が、投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるペプチド、ならびにＣＨＫ１／２阻害剤またはＰＡＲＰ阻害剤が、投与される。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤（たとえば、ＡＴＭ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤）とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４６）であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤（たとえば、ＡＴＭ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤）とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４４）であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＤＮＡ損傷応答経路メンバーの阻害剤（たとえば、ＡＴＭ阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害剤、ＣＨＫ１／２阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤）とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、本明細書に記載されるＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドである。具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＥＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２８）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７８）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＲＡＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２６）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７６）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。当業者であれば、閉環メタセシス反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、２つの非天然のアミノ酸を含むペプチドについて、閉環メタセシス反応は、ペプチド（すなわち、安定化されたペプチド）を、処置を必要とする対象に投与する前に、ペプチドに行われていることを理解するであろう。換言すると、２つの非天然のアミノ酸の共有結合での結合により産生された架橋した環が、安定化されたペプチドを対象に投与する前に、安定化されたペプチドに存在しているであろう。
【０１７０】
一部の事例では、それを必要とするヒト対象（たとえば、ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１の両方を発現するかまたはそれに依存性のがんを有するヒト対象）に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＭＣＬ−１の阻害剤が、共投与される。ＭＣＬ−１阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２９７９３６６、Kotschy  et  al.  Nature,  538(7626):477-482  (2016)、Ayaz  et  al.  ACS  Chem  Biol,  11(6):1710-1719  (2016)、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２９９２４８３、臨床試験識別番号ＮＣＴ０３４６５５４０、Caenepeel  et  al.,Proceedings:  AACR  Annual  Meeting  2017,  DOI:  10.1158/1538-7445.AM2017-2027を参照されたい）。ＭＣＬ−１阻害剤の非限定的な例としては、Ｓ６４３１５、Ｓ６３８４５、ＢＡＹ  １０００３９４、ＭＩＫ６６５、ＡＭＧ３９７、およびＡＭＧ１７６が挙げられる。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるペプチド、ならびにＭＣＬ−１阻害剤が投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるペプチド、ならびにＭＣＬ−１阻害剤が投与される。ある特定の実施形態では、ＭＣＬ−１阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４６）、であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＭＣＬ−１阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４４）、であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＭＣＬ−１阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、本明細書に記載されるＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドである。具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＥＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２８）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体が、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ��は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７８）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＲＡＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２６）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体が、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７６）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体を含むアミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。当業者であれば、閉環メタセシス反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、２つの非天然のアミノ酸を含むペプチドについて、閉環メタセシス反応は、ペプチド（すなわち、安定化されたペプチド）を、処置を必要とする対象に投与する前に、ペプチドに行われていることを理解するであろう。換言すると、２つの非天然のアミノ酸の共有結合での結合により産生された架橋した環が、安定化されたペプチドを対象に投与する前に、安定化されたペプチドに存在しているであろう。
【０１７１】
一部の事例では、それを必要とするヒト対象（たとえば、ＢＦＬ−１およびＢＣＬ−２の両方を発現するかまたはそれに依存性のがんを有するヒト対象）に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＢＣＬ−２の阻害剤が、共投与される。ＢＣＬ−２阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、Roberts  et  al.  N  Engl  J  Med  374(4):311-322  (2016)を参照されたい）。ＢＣＬ−２阻害剤の例は、ベネトクラックスである。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるペプチド、ならびにＢＣＬ−２阻害剤が投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるペプチド、ならびにＢＣＬ−２阻害剤が投与される。ある特定の実施形態では、ＢＣＬ−２阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４６）、であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＢＣＬ−２阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４４）、であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＢＣＬ−２阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、本明細書に記載されるＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドである。具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＥＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２８）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体が、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７８）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＲＡＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２６）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体が、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７６）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体を含むアミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。当業者であれば、閉環メタセシス反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、２つの非天然のアミノ酸を含むペプチドについて、閉環メタセシス反応は、ペプチド（すなわち、安定化されたペプチド）を、処置を必要とする対象に投与する前に、ペプチドに行われていることを理解するであろう。換言すると、２つの非天然のアミノ酸の共有結合での結合により産生された架橋した環が、安定化されたペプチドを対象に投与する前に、安定化されたペプチドに存在しているであろう。
【０１７２】
一部の事例では、それを必要とするヒト対象（たとえば、ＢＦＬ−１およびＢＣＬ−ＸＬの両方を発現するかまたはそれに依存性のがんを有するヒト対象）に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＢＣＬ−ＸＬの阻害剤が、共投与される。ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、Zhu  et  al.  Aging  Cell;  15(3):428-35  (2016)を参照されたい）。ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤の例は、ナビトクラックスである。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるペプチド、ならびにＢＣＬ−ＸＬ阻害剤が投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％同一であるペプチド、ならびにＢＣＬ−ＸＬ阻害剤が投与される。ある特定の実施形態では、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４６）、であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４４）、であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、本明細書に記載されるＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドである。具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＥＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２８）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体が、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７８）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＲＡＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２６）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体が、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７６）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体を含むアミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。当業者であれば、閉環メタセシス反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、２つの非天然のアミノ酸を含むペプチドについて、閉環メタセシス反応は、ペプチド（すなわち、安定化されたペプチド）を、処置を必要とする対象に投与する前に、ペプチドに行われていることを理解するであろう。換言すると、２つの非天然のアミノ酸の共有結合での結合により産生された架橋した環が、安定化されたペプチドを対象に投与する前に、安定化されたペプチドに存在しているであろう。
【０１７３】
一部の事例では、それを必要とするヒト対象（たとえば、ＢＦＬ−１、ならびにＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、および／またはＭＣＬ−１を発現するかまたはそれに依存性のがんを有するヒト対象）に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、および／またはＭＣＬ−１の阻害剤が、共投与される。一部の事例では、それを必要とするヒト対象（たとえば、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、およびＭＣＬ−１のそれぞれを発現するかまたはそれに依存性のがんを有するヒト対象）に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、およびＭＣＬ−１の阻害剤が、共投与される。一部の事例では、それを必要とするヒト対象（たとえば、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＢＣＬ−２のそれぞれを発現するかまたはそれに依存性のがんを有するヒト対象）に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−２の阻害剤が、共投与される。一部の事例では、それを必要とするヒト対象（たとえば、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＭＣＬ−１のそれぞれを発現するかまたはそれに依存性のがんを有するヒト対象）に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＢＣＬ−ＸＬおよびＭＣＬ−１の阻害剤が、共投与される。一部の事例では、それを必要とするヒト対象（たとえば、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−２、およびＭＣＬ−１のそれぞれを発現するかまたはそれに依存性のがんを有するヒト対象）に、本明細書に開示されるＮＯＸＡ安定化ペプチド、ＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１の阻害剤が、共投与される。ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、Zhu  et  al.  Aging  Cell;  15(3):428-35  (2016)を参照されたい）。ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤の例は、ナビトクラックスである。ＢＣＬ−２阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、Roberts  et  al.  N  Engl  J  Med  374(4):311-322  (2016)を参照されたい）。ＢＣＬ−２阻害剤の例は、ベネトクラックスである。ＭＣＬ−１阻害剤は、当該技術分野において公知である（たとえば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２９７９３６６、Kotschy  et  al.  Nature,  538(7626):477-482  (2016)、Ayaz  et  al.  ACS  Chem  Biol,  11(6):1710-1719  (2016)、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２９９２４８３、臨床試験識別番号ＮＣＴ０３４６５５４０、Caenepeel  et  al.,Proceedings、AACR  Annual  Meeting  2017,  DOI:  10.1158/1538-7445.AM2017-2027を参照されたい）。ＭＣＬ−１阻害剤の非限定的な例としては、Ｓ６４３１５、Ｓ６３８４５、ＢＡＹ  １０００３９４、ＭＩＫ６６５、ＡＭＧ３９７、およびＡＭＧ１７６が挙げられる。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるペプチド、ならびにＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ−２阻害剤、および／またはＭＣＬ−１阻害剤が、投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象に、配列番号１６、ならびに配列番号６０〜７９、１５１、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも１４％、１５％、２０％、２７％、３４％、４０％、４７％、５０％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、��たは９７％同一であるペプチド、ならびにＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ−２阻害剤、および／またはＭＣＬ−１阻害剤が投与される。ある特定の実施形態では、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ−２阻害剤、および／またはＭＣＬ−１阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４６）、であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ−２阻害剤、および／またはＭＣＬ−１阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、ＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号４４）、であり、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンである。具体的な実施形態では、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ−２阻害剤、および／またはＭＣＬ−１阻害剤とともにそれを必要とするヒト対象に共投与されるペプチドは、本明細書に記載されるＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドである。具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＥＦＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２８）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＸ１ＬＲＥＦＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６２）を有し、ここで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＥＦＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７８）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の具体的な実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴＱＬＲＲＡＧＤＫＬＮＦＲＱ（配列番号１２６）を有し、ここで、ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によって構造安定化されており、求電子性弾頭部（Ｊ）は、システイン反応性部分（たとえば、Ｄ−ニペコチン酸部分）である。特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、ＪＡＴＸ１ＬＲＲＡＧＤＸ２ＬＮＦＲＱ（配列番号６０）を有し、��こで、「Ｘ１」および「Ｘ２」は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、非天然のアミノ酸であり、「Ｊ」は、非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部（求電子体は、化学的キャップとしての機能を果たし得る）である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。別の特定の実施形態では、ＢＦＬ−１に結合する弾頭部を有するＮＯＸＡペプチドは、配列ＪＡＴ８ＬＲＲＡＧＤＸＬＮＦＲＱ（配列番号７６）を有し、ここで、「８」＝Ｒ−オクテニルアラニンであり、「Ｘ」＝Ｓ−ペンテニルアラニンであり、「Ｊ」＝非天然の求電子体含有アミノ酸であるか、またはアミノ酸ではない部分に関連して提示される求電子性弾頭部である（たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性部分であり、たとえば、「Ｊ」は、システイン反応性Ｄ−ニペコチン酸部分である）。当業者であれば、閉環メタセシス反応を使用して共有結合で結合（「一緒にステープル」）して、架橋した環を形成することができる、２つの非天然のアミノ酸を含むペプチドについて、閉環メタセシス反応は、ペプチド（すなわち、安定化されたペプチド）を、処置を必要とする対象に投与する前に、ペプチドに行われていることを理解するであろう。換言すると、２つの非天然のアミノ酸の共有結合での結合により産生された架橋した環が、安定化されたペプチドを対象に投与する前に、安定化されたペプチドに存在しているであろう。
【０１７４】
一部の実施形態では、ヒト対象は、ＭＣＬ−１および／またはＢＦＬ−１発現／依存性のがん（たとえば、黒色腫、白血病、リンパ腫、または他の造血系悪性腫瘍もしくは固形腫瘍、または本明細書に記載される別のがんを有する。一部の場合には、固形腫瘍は、黒色腫、乳がん、または肺がんである。一部の実施形態では、ＢＦＬ−１を発現するかまたはそれに依存性の細胞は、細胞過剰性疾患に特徴的な自己免疫疾患または他の炎症性状態を引き起こす。）ある特定の事例では、自己免疫疾患は、自己免疫性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、脈管炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、またはシェーグレン病である。一部の事例では、炎症性疾患は、喘息、乾癬、炎症性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、腎炎、皮膚炎、または脈管炎である。具体的な実施形態では、ヒト対象は、ＡＭＬを有する。
【０１７５】
一般に、方法は、対象を選択すること、ならびにがん、たとえば、黒色腫またはリンパ腫の予防または処置のために、対象に、有効量の、本明細書のペプチドのうちの１つまたは複数を、たとえば、医薬組成物においてまたは医薬組成物として、投与すること、ならびに必要に応じて投与を適宜繰り返すことを含み、これは、経口、静脈内、または局所で投与され得る。対象は、たとえば、対象が、ＢＦＬ−１を発現するがんを有することの判定、対象が、ＭＣＬ−１を発現するがんを有することの判定、または対象がＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１の両方を発現するがんを有することの判定に基づいて、処置に選択され得る。本開示のペプチドは、対象のがんがＢＦＬ−１を発現するかを判定するため、または対象のがんがＢＦＬ−１に依存性であるかを判定するために、使用することができる。
【０１７６】
任意の特定の患者に関する特異的投薬量および処置レジメンは、さまざまな因子に左右されることになり、その因子としては、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患に対する患者の傾向、状態または症状、ならびに処置する医師の判断がある。
【０１７７】
有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬として投与してもよい。治療有効量の治療化合物（すなわち、有効投薬量）は、選択される治療化合物に依存する。組成物は、１日当たり１回または複数回から１週当たり１回または複数回、投与することができ、隔日で１回を含む。当業者であれば、これらに限定されないが、疾患または障害の重症度、治療歴、対象の全身的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むある特定の因子が、対象を効果的に処置するために必須の投薬量およびタイミングに影響を与える場合があることは理解するであろう。更に、本明細書において記載する治療有効量の治療化合物を用いた対象の処置は、単回の処置または一連の処置を含んでいてもよい。例えば、有効量を、少なくとも一回投与してもよい。
【０１７８】
医薬組成物
本明細書に記載される安定化されたペプチドのいずれかのうちの１つまたは複数（たとえば、配列番号２〜３８、ならびに６０〜７９、１５１、および１５３のうちの１つまたは複数）は、使用のために、医薬組成物としてまたは医薬組成物において製剤化することができる。医薬組成物は、本明細書に記載される処置の方法（上記を参照されたい）において使用することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸置換、挿入、または欠失を除き、配列番号２〜３８および６０〜７９に記載されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列に対するこれらの変化は、これらのペプチドのＢＦＬ−１非相互作用アルファヘリックス面および／またはＢＦＬ−１相互作用アルファヘリックス面において行われ得る。そのような組成物は、任意の経路、たとえば、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によって承認されている任意の経路を介した対象への投与のために製剤化または適合され得る。例示的な方法は、ＦＤＡのＣＤＥＲ  Ｄａｔａ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、バージョン番号００４（ｆｄａ．ｇｉｖｅ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｔｍにおいて入手できる）に記載されている。たとえば、組成物は、吸入による投与（たとえば、経口および／もしくは鼻内吸入（たとえば、ネブライザーもしくはスプレーによる））、注射による投与（たとえば、静脈内、動脈内、真皮下、腹腔内、筋肉内、および／もしくは皮下）、ならびに／または経口投与、経粘膜投与、および／もしくは局所投与（局所（たとえば、鼻内）スプレーおよび／もしくは溶液を含む）のために製剤化または適合され得る。
【０１７９】
一部の場合では、医薬組成物は、有効量の１個または複数の安定化ペプチドを含んでいてもよい。「有効量」および「処置に有効な」という用語は、本明細書で使用される場合、意図する効果または生理学的アウトカムをもたらすためのその投与（例えば、感染症の処置）の背景内で有効な期間（急性または慢性投与および周期的または連続的投与を含む）で利用される、本明細書において記載する１個または複数の化合物または医薬組成物の量または濃度を指す。
【０１８０】
本発明の医薬組成物は、１つまたは複数のペプチドと、任意の薬学的に許容される担体および／またはビヒクルとを含み得る。一部の事例では、医薬は、１つまたは複数の追加の治療剤を、疾患または疾患症状のモジュレーションを達成するのに有効な量で、さらに含み得る。たとえば、医薬組成物は、ＡＴＭまたはＡＴＲ阻害剤を含み得る。ＡＴＭキナーゼ阻害剤の非限定的な例としては、ＫＵ−５５９４０３、ＫＵ−５５９３３、ＫＵ−６００１９、ＣＰ−４６６７２２、ＣＧＫ７３３、およびＡＺＤ０１５６が挙げられる。ＡＴＲキナーゼ阻害剤の非限定的な例としては、シサンドリンＢ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＶＥ−８２１、ＶＥ−８２２／ＶＸ−９７０、ＡＺ２０、およびＡＺＤ６７３８が挙げられる。
【０１８１】
「薬学的に許容される担体またはアジュバント」という用語は、本発明の化合物とともに患者に投与してもよく、その薬理学的活性を破壊せず、治療量の化合物を送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性である担体またはアジュバントを指す。
【０１８２】
本発明の医薬組成物において使用してもよい薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとしては、これらに限定されるものではないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達系（ＳＥＤＤＳ）、例えばｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート、医薬品投薬形態において使用する界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）または他の同様の高分子送達マトリックス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂がある。シクロデキストリン、例えばα−、β−、およびγ−シクロデキストリンも、本明細書において記載する製剤の化合物の送達を強化するために有利に使用してもよい。
【０１８３】
本発明の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含んでいてもよい。一部の場合では、製剤のｐＨは、製剤化化合物またはその送達形態の安定性を強化するための薬学的に許容される酸、塩基または緩衝剤を用いて調整してもよい。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変部内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
【０１８４】
医薬組成物は、吸入および／または経鼻投与のための液剤または散剤の形態であってもよい。そのような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）および懸濁化剤を使用して、当技術分野において公知の技術に従って製剤化してもよい。注射可能な滅菌調製物はまた、非毒性非経口で許容される希釈剤または溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として注射用滅菌液剤または懸濁剤としてもよい。用いてもよい許容されるビヒクルおよび溶媒のうちの１つは、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌、固定油を、溶媒または懸濁媒体として慣例的に用いる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無菌固定油を用いてもよい。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注射可能な調製物において有用であり、天然の薬学的に許容される油、例えば特にそのポリオキシエチル化型のオリーブ油またはヒマシ油も同様である。これらの油性液剤または懸濁剤には、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース、または薬学的に許容される投薬形態の製剤、例えばエマルションおよび／もしくは懸濁剤において通常使用する同様の分散剤も含まれる場合がある。他の通常使用する界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）またはＳｐａｎおよび／または薬学的に許容される固形剤、液剤、もしくは他の投薬形態の製造において通常使用する他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ促進剤も、製剤の目的で使用してもよい。
【０１８５】
医薬組成物は、任意の経口で許容される投薬形態で、経口で投与することができ、その投薬形態としては、これらに限定されないが、カプセル剤、錠剤、エマルション剤および水性懸濁剤、分散剤および液剤がある。経口使用のための錠剤の場合、通常使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチがある。滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムも通常添加される。カプセル剤形態での経口投与に関しては、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチがある。水性懸濁剤および／またはエマルション剤が経口で投与される場合、活性成分は、乳化剤および／または懸濁化剤と組み合わせて油性相中に懸濁するかまたは溶解してもよい。必要に応じて、ある特定の甘味料および／または香味料および／または着色剤を添加してもよい。
【０１８６】
あるいはまたは更に、医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、医薬品製剤の技術分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野において公知の他の可溶化または分散剤を用いて、生理食塩水中の液剤として調製してもよい。
【０１８７】
一部の場合では、本明細書において開示される１個または複数のペプチドは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。そのようなコンジュゲート組成物は、一価または多価であってもよい。例えば、コンジュゲート組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートしている本明細書において開示される１個のペプチドを含んでいてもよい。あるいは、コンジュゲート組成物は、担体にコンジュゲートしている２個またはそれを超える本明細書において開示されるペプチドを含んでいてもよい。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、２個の実体が互いに「コンジュゲート」している場合、これらは直接的または間接的な共有または非共有相互作用によって連結している。ある特定の実施形態では、会合は共有性である。他の実施形態では、会合は非共有性である。非共有相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、静電的相互作用などがある。間接的共有相互作用は、２個の実体が共有的に連結されている場合、必要に応じてリンカー基を介する。
【０１８９】
担体タンパク質は、対象における免疫原性を増加させるかまたは強化する任意のタンパク質を含んでいてもよい。例示的な担体タンパク質は、当技術分野において記載されている（例えば、Fattom  et  al.,  Infect.  Immun.,  58:2309-2312,  1990；Devi  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:7175-7179,  1991；Li  et  al.,  Infect.  Immun.  57:3823-3827,  1989;Szu  et  al.,  Infect.  Immun.  59:4555-4561,1991；Szu  et  al.,  J.  Exp.  Med.  166:1510-1524,  1987；およびSzu  et  al.,  Infect.  Immun.  62:4440-4444,  1994を参照のこと）。高分子担体は、１個または複数の第１級および／または第２級アミノ基、アジド基、またはカルボキシル基を含む天然または合成材料であってもよい。担体は、水溶性であってもよい。
【実施例】
【０１９０】
以下の例は、特許請求する発明を更に例示するために提供され、発明の範囲を限定するものとして判断されるべきではない。特定の材料が言及されている範囲で、それは例示を目的とするにすぎず、本発明を限定することを意図しない。当業者であれば、発明の能力を行使することなくかつ発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を発展させることができる。
【０１９１】
（実施例１）
強力な選択的細胞透過性システイン反応性のＢＦＬ−１のステープルＮＯＸＡ  ＢＨ３阻害剤の開発
本発明者らは、これまでに、天然のＢＨ３ドメインヘリックスの高親和性非共有結合的相互作用を、求電子性弾頭部の共有結合反応により得られる不可逆的遮断と組み合わせて、ＢＩＭ  ＢＨ３の配列に基づいて、ＢＦＬ−１の選択的共有結合的ステープルペプチド阻害剤を開発した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢＦＬ−１の抗アポトーシス活性を選択的に中和し、ＢＦＬ−１により作動される黒色腫に関してアポトーシスを効果的にトリガーする共有結合的ＢＩＭ  ＳＡＨＢの設計および特徴付けが成功した（Huhn  et  al.,  Cell  Chem  Biol.,  23(9):1123-1134  (2016)）。このシステイン反応性ＢＩＭ  ＳＡＨＢは、ＢＦＬ−１のみを共有結合により標的とするが、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ−１、および可能性としてＢＡＸを含む広範なＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質と非共有結合的相互作用を形成する能力を保持している。ＢＨ３オンリーのタンパク質であるＮＯＸＡは、しかしながら、ＢＣＬ−２タンパク質結合活性のスペクトルがより狭く、ＭＣＬ−１およびＢＦＬ−１の二重選択性を呈する（Stewart  et  al.,  Nature  Chemical  Biology,  6,  595-601  (2010)）。本明細書では、そのようなステープルペプチドが、最終的な治療的使用のために十分に強力となるかまたは細胞透過性となるように、ＮＯＸＡ  ＢＨ３鋳型を使用して、弾頭部を有するＳＡＨＢの、ＢＦＬ−１に対する共有結合的および非共有結合的な選択性を微調整した。これらの新しい構築物は、それらが、ＢＦＬ−１のみを標的とするか（共有結合的および／もしくは非共有結合的手段による）、またはＢＦＬ−１（共有結合的および／もしくは非共有結合的手段による）ならびにＭＣＬ−１（非共有結合的手段による）の排他的な二重標的化を呈するかのいずれかであるという点で、固有である。
【０１９２】
臨床使用のための薬物の開発を可能にする特定の結合選択性、細胞浸透特性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性、および生物学的活性を有する構築物を生成するために、まず、ステープルスキャニング手法を使用して、システイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢのライブラリーを生成して、結合効力、選択性、および細胞浸透度を最適化した。重要なことに、構造データに基づくと、タンパク質標的との重要な接触を行うとは考えられていなかった、古典的なＢＨ３ドメイン配列のＮ末端およびＣ末端の残基が欠如した、新規な短縮された鋳型ＮＯＸＡ配列を設計した（図１）。ペプチド鋳型の長さにわたって（ｉ、ｉ＋４）および（ｉ、ｉ＋７）ステープルを連続的に配置し、一方でＮ末端Ｄ−ニペコチン酸（Ｄ−ＮＡ）反応性基は一定に保つことによって、ステープルスキャニングを達成した（図２）。それぞれのペプチドを、ＢＦＬ−１ΔＣとともにインキュベートし、還元および変性ゲル電気泳動により高分子量のコンジュゲートを検出し、クーマシー染色することによって、このＮＯＸＡライブラリーの反応性を測定した（図３）。ＢＦＬ−１との共有結合反応が可能なペプチドを、ペプチド取り込みに関する細胞試験へと進めた。ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、ペプチド（２０μＭ、６時間）で処置し、次いで、採取し、ライセートを抗ＨＡウエスタンブロッティングによって分析した（図４）。ＢＦＬ−１ダブレットの存在は、弾頭部を有するペプチドが、細胞内アクセスを獲得することおよびＢＦＬ−１に共有結合で結合することの両方を行うことができることを示した。１５位に（ｉ、ｉ＋７）ステープルを有するＮＯＸＡペプチドは、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ−３と比較して、共有結合的標的化効率に劇的な増加を示した。しかしながら、Ａ３７５Ｐ細胞におけるＬＤＨ放出試験では、このペプチドは、予想外なことに、膜の破壊を引き起こすことが見出された（図５）。
【０１９３】
この欠点を補うために、ＮＯＸＡ  １５構築物を、溶解挙動を軽減することができる組成の変化を特定する目的で、アラニンスキャニング変異誘発に供した（図６）。特に、疎水性内容物を減少させることにより溶解特性を排除するための１つの設計戦略として、疎水性残基を、アラニンに変換した。実際に、ＮＯＸＡ配列の長さにわたるアラニンの連続的な変異により、溶解活性がほとんどないかまったくない、弾頭部を有するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢが３つ得られた（図７）。注目すべきことに、溶解を低減させた変異のそれぞれが、全体的なペプチドの疎水性を低下させた。驚くべきことに、ＮＯＸＡの配列に沿った変異の大半は、共有結合的ＢＦＬ−１結合活性に対して負の影響を有さなかった。但し「ＬＸＸＸＧＤＥ」最小コンセンサスＢＨ３ドメイン結合モチーフの２つの残基であるＬｅｕ２９およびＡｓｐ３４（図８）は除く（Day  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  380(5):958-971  (2008)）。これらのデータにより、ＢＦＬ−１のＣ５５標的化のための求電子性弾頭部を有するステープルペプチドは、それらがＮＯＸＡヘリックスのＢＦＬ−１相互作用表面に存在する場合であっても、特定のアミノ酸残基の改変に対して極めて感受性が低いことが示される。システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２ＡおよびＮＯＸＡ−１５  Ｌ３６Ａ  ＳＡＨＢは、いずれも、細胞透過性であり、ＢＦＬ−１を共有結合で標的化した（図９）。
【０１９４】
システイン反応性ＮＯＸＡ−１５ペプチドの溶解活性を中和するための代替的な反復的アプローチにおいて、ペプチドの全体的な正電荷を低減させることを目標として、２つの異なるアルギニンを、ＮＯＸＡ配列内で、グルタミン酸残基に変異させた（図１０）。実際に、いずれのペプチドも全体的な電化が＋２から０に低減され、ＢＦＬ−１に対する共有結合活性を保持しており（図１２）、細胞溶解をほとんどまたはまったく示さず（図１１）、細胞取り込みの改善を達成した（図１３）。
【０１９５】
したがって、２つの異なるアプローチを使用して、生化学的特徴付けおよび細胞研究へと進めるための非溶解性細胞透過性システイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢを、発明的に生成した。
【０１９６】
（実施例２）
細胞透過性システイン反応性ステープルＮＯＸＡペプチドの選択性の生化学的特徴付けは、ＢＦＬ−１に対する共有結合的選択性の保持とともに、ＭＣＬ−１に対する非共有結合的親和性の減少を示す
ネイティブなＮＯＸＡ  ＢＨ３配列に、ペプチドの長さ、ステープルの配置、および変異誘発を含め、有意な変更を行った後、次に、２つのリード細胞透過性ペプチド、システイン反応性Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２ＡおよびＲ３１Ｅの選択性に対するこれらの改変の作用を判定しようと試みた。まず、システイン反応性求電子体の付加と合わさったこれらの変更が、抗アポトーシスタンパク質混合物に関して、非共有結合的および共有結合的ＳＡＨＢ相互作用のバランスにどのように影響を及ぼしたかを試験した。ビオチン化Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａ  ＳＡＨＢまたは対応するアセチル化構築物を、組換えＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＭＣＬ−１との等モル混合物においてインキュベートし、次いで、ストレプトアビジンプルダウンに供した。アセチル化（Ａｃ−）ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａ  ＳＡＨＢは、ネイティブＢＨ３配列の大幅な短縮を特徴とする新しい設計と一致して、ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬへの結合を示さず、ＭＣＬ−１とは検出可能ではあるが最小限の直接的な相互作用を示した（図１４）。しかしながら、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａ  ＳＡＨＢは、相互作用傾向にＢＦＬ−１へのシフトを呈し、共有結合的ＢＦＬ−１ΔＣコンジュゲーションの結果として、注目すべき多くのＢＦＬ−１結合があった（図１４）。同じ共有結合的相互作用と非共有結合的相互作用の対比が、同じ実験の状況で、Ａｃ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥとＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅとの対比で観察された（図１５）。加えて、これらのペプチドの優先的な相互作用を、Ａ３７５Ｐ黒色腫細胞株に由来するライセートにおいて内在性タンパク質を用いて評価した。ストレプトアビジンプルダウンに供したとき、ビオチン化Ａｃ−およびＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２ＡまたはＲ３１Ｅ  ＳＡＨＢは、およそ同等なＭＣＬ−１への結合を示したが、一方で、弾頭部を有する構築物は、ここでも、ＢＦＬ−１の結合の著しい増加を示した（図１６および１７）。
【０１９７】
リードＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  ＳＡＨＢの、抗アポトーシスタンパク質への直接的な結合を研究することに加えて、阻害性ＢＦＬ−１複合体を競合的に破壊するそれらの能力もまた、評価した。臨床的に有用な生物学的活性について、アポトーシス閾値を低下させるために、占有されていない抗アポトーシスタンパク質を阻害すること、およびアポトーシスを誘導するために、アポトーシス促進性タンパク質を抗アポトーシス複合体から競合的に変位させることの能力は、２つの異なった望ましい機能性である。競合実験のために、ｔＢＩＤを、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に由来するライセートに添加し、混合物を、ビオチン化ＡｃまたはＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａ  ＳＡＨＢとともにインキュベートし、抗ＨＡ免疫沈降を行い、ＨＡおよびｔＢＩＤについてブロッティングした。アセチル化ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａは、ＨＡ−ＢＦＬ−１への結合について、ｔＢＩＤと競合することができなかったが、一方で、弾頭部を有するＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａ構築物は、タンパク質の高分子量種への完全な変換およびｔＢＩＤ共免疫沈降のほぼすべての阻害によって例証されるように、ＨＡ−ＢＦＬ−１を共有結合で捕捉した（図１８、左）。顕著なことに、ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１を一過的に発現する２９３Ｔ細胞に由来するライセートを使用して実験を繰り返した場合、いずれのＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａペプチドも、ｔＢＩＤ／ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１共免疫沈降を非共有結合的に破壊することができ（図１８、右）、ＮＯＸＡ−１５  Ｆ３２Ａ  ＳＡＨＢのＢＦＬ−１への結合選択性の明確なシフトが示された。この結果は、Ａｃ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥとＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅとの対比で行った場合に、同一であり（図１９）、この構築物について、同じ機能的結合優先性が確立された。
【０１９８】
抗アポトーシスタンパク質への結合について、ＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３ペプチドと競合する、アセチル化ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢの能力とシステイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢの能力とを比較する蛍光偏光実験により、同様の効果が示された（図２０〜２３）。弾頭部を有するＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢのみが、ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓへの結合についてＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３と競合することができ（図２０）、この作用はＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ／Ｃ５５Ｓでは観察されなかったため、この活性は、ＢＨ３結合ポケットにおけるＣｙｓ５５の存在に依存性であった（図２１）。Ａｃ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥペプチドもＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅペプチドも、ＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３の、ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（図２２）またはＢＣＬ−ＸＬΔＣ（図２３）のいずれかとの相互作用を、有意に解離することはできなかった。これらの生化学的実験により、細胞取り込みを付与し、溶解活性を低減させるためにＮＯＸＡ  ＢＨ３配列に行った様々な改変が、競合的結合に関連して、ＢＦＬ−１に対する強力な共有結合的選択性およびＭＣＬ−１に対する減少した非共有結合的親和性を有するステープルペプチドをもたらしたことが示された。
【０１９９】
（実施例３）
システイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢは、ＢＦＬ−１依存性ＡＭＬ細胞株において、ＡＴＭ阻害と相乗作用する
ＢＦＬ−１に対するシステイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢの選択性を考慮し、その細胞活性を試験するための理想的な環境は、生存が特にＢＦＬ−１の発現に依存性であるがん細胞株におけるものであろうと仮定した。数百のがん細胞株にわたる遺伝的依存性をマッピングするために、大規模な全ゲノムＲＮＡｉスクリーニングの試みが行われている（Tsherniak,  Cell,  170(3):564-576  (2017)）。がん細胞株の次世代ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９スクリーニングデータセット、特に、ＡＭＬに焦点を当てたものを、クエリし、その細胞がＢＦＬ−１への依存性を示すかについて試験した（図２４）。より正方向の依存性Ｚ−スコア値を有する細胞株は、ＢＦＬ−１に対する依存性をほとんどまたはまったく示さないが（たとえば、ＭＶ４−１１、上部右）、一方で、より負方向の依存性Ｚ−スコア値は、ＢＦＬ−１に対する依存性の増加を表す（たとえば、Ｕ９３７、下部左）。ほとんどのがん細胞株は、ある範囲の抗アポトーシスタンパク質を発現するため、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢと第２の依存性とを組み合わせることにより、特に、ＢＦＬ−１依存性が中等度の範囲である（Ｚ−スコア値が−４〜−２の場合に）、細胞傷害性を増強することができる可能性があると、さらに仮定した。この試みを行うために、ＢＦＬ−１依存性との有意な共依存性を示した遺伝子を、評価した。ＤＮＡ二本鎖切断によって活性化されるセリン／スレオニンキナーゼであるＡＴＭが、ＡＭＬにおけるもっとも相関性の高い共依存性遺伝子であった（図２５）。ＢＦＬ−１に対してもっとも高い依存性を示したＡＭＬ細胞株Ｕ９３７の、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢと小分子ＡＴＭ阻害剤ＫＵ−５５９３３との共処置により、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアによって分析した場合に、高度に相乗的な細胞傷害性（ＣＩ＜０．３、強い相乗作用）がもたらされた（図２６）。加えて、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１ＥおよびＫＵ−５５９３３単独および組合せで処置した場合、Ｕ９３７細胞は、単剤処置と比較して、組合せ処置では、経時的に、有意に増加したカスパーゼ−３／７活性化を示し（図２７）、細胞傷害性作用の原因としてアポトーシス誘導における相乗作用が示唆された。これに対応して、ＢＦＬ−１に対して依存性がもっとも低いＡＭＬ細胞株であるＭＶ４−１１は、上記で適用した同じ用量範囲にわたり、システイン反応性ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢ単独には本質的に非感受性であり、ＡＴＭ阻害剤と組み合わせた場合、細胞傷害性相乗作用をほとんどまたはまったく示さず（図２８）、組合せ処置について、単剤処置と比較してカスパーゼ−３／７活性化の増加を示さなかった（図２９）。
【０２００】
（実施例４）
抗アポトーシスＢＦＬ−１、および共有結合的ステープルペプチド阻害剤とのその複合体の結晶構造
ＢＨ３ヘリックスとの複合体における抗アポトーシス標的およびその模倣体の構造は、分子精製および治療薬開発のロードマップを提供し得るため、ＢＦＬ−１の構造を、単独で、および共有結合的ステープルペプチド阻害剤との複合体において、初めて、解明することを試みた。ａｐｏ  ＢＦＬ−１の構造は、リガンド非結合型抗アポトーシスタンパク質構造を比較する機会を提供し、また、システイン反応性ステープルペプチド阻害剤によるＢＦＬ−１の共有結合的標的化の立体構造的重要性および分子特徴を明らかにする。
【０２０１】
Ａｐｏ  ＢＦＬ−１の構造
リガンド非結合型ＢＦＬ−１の構造を、Ｘ線結晶構造解析によって１．６９Åの分解能で解読し（図３０、ＰＤＢ識別子：５ＷＨＩ）、典型的にはヘリックスを切断するグリシンまたはプロリンを含むループによって結合される、一連のα−ヘリックスから構成される球状タンパク質が明らかとなった（図３１Ａ〜Ｂ）。ＢＦＬ−１は、α−ヘリックス１〜４および７〜８によって囲まれたコアα５〜α６ヘアピンを含む、マルチドメインＢＣＬ−２ファミリータンパク質の保存された構造のすべての重要なエレメントを共有している。抗アポトーシスタンパク質の発現および結晶化を促進するために行われるα９短縮の部位には、α−ヘリックス２〜４に由来する残基が並んだカノニカルな表面の溝（groove）がある。特に、抗アポトーシスタンパク質ＭＣＬ−１およびＢＣＬ−ＸＬの無比の他のａｐｏ構造に関して、溝の相対的な位置、アクセス可能性、および立体構造は、差異を示す。３つすべての構造のオーバーレイは、α−ヘリックス１、５、６、７、および８のほぼ完全なオーバーラップを示すが、α３ならびに隣接するα２の遠位部分およびα４の近位部分の配向は著しく保存性が低い（図３１Ｃ）。後者は、変動性のある傾斜度のカノニカル溝をもたらし、ＢＣＬ−ＸＬのものが、もっとも下方向に変位しており、これに続いて、ＭＣＬ−１およびＢＦＬ−１では水平方向へと進行的にシフトする。これらの未結合状態の構造において、溝のルーフおよびフロアにおける保存された残基の間の距離を測定することによって評価した場合、結合ポケットの幅もまた、異なっている。空のＢＨ３結合ポケットの幅は、複数の測定値にわたり、ＭＣＬ−１およびＢＦＬ−１で本質的に同じであるが、ＢＣＬ−ＸＬの溝は、特に、α−ヘリックス３および４の中間点間において、より狭い（図３１Ｄ）。後者は、ＢＣＬ−ＸＬにおいては互いに逆平行で配置され、ＭＣＬ−１およびＢＦＬ−１においては進行的によりＶ字型で配置される、これらのα−ヘリックスの相対的な配置における顕著な差異から生じる。抗アポトーシス阻害剤の構造に基づく設計は、大部分が、ＢＨ３に結合したタンパク質複合体から生じたものであるが、ａｐｏ構造間のそのような立体構造の違いにより、分子標的化の代替的なトポグラフィーが判明する。
【０２０２】
リガンド非結合型抗アポトーシスタンパク質の構造間におけるもっとも興味深い差異のうちの１つは、ａｐｏ  ＢＦＬ−１のＢＨ３結合溝内における溶媒に曝露されるシステインの存在である（図３１Ｂ）。ａｐｏ  ＭＣＬ−１にもＢＣＬ−ＸＬにも、さらにはいずれの他のＢＣＬ−２ファミリータンパク質構造にも、そのようなシステインは見出されない（図３１Ｅ〜Ｆ）。このシステインは、実際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞におけるＢＦＬ−１の、ステープルＢＩＭおよびＮＯＸＡ  ＢＨ３に基づく共有結合的標的化に利用することができる。システイン反応性弾頭部を、ＢＣＬ−２またはＭＣＬ−１阻害剤を模した小分子に組み込むことにより、ＢＦＬ−１阻害に有利な標的特異性のスイッチが可能となり得る。そのような小分子開発の構造計画を提供するため、また、共有結合でのＢＨ３との結合の立体構造的重要性を分析するために、ＢＦＬ−１との複合体におけるシステイン反応性ステープルＢＨ３ペプチドの結晶構造を、次に、研究した。
【０２０３】
Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢによるＢＦＬ−１  Ｃ５５の共有結合的標的化
ヒトＮＯＸＡ  ＢＨ３のＢＨ３ドメインの後に、配列組成、ステープルの種類、および位置を改変して、モデル化した一連のＤ−ニペコチン酸（Ｄ−ＮＡ）誘導体化したＢＣＬ−２ドメインの安定化アルファヘリックス（ＳＡＨＢ）を生成し、構築物を、結晶化スクリーニングに供した。ＢＦＬ−１ΔＣを、アミノ酸２６〜４０および２８、３５位に挿入されたｉ、ｉ＋７ステープルを含むＮＯＸＡ  ＳＡＨＢと複合体化した後に、有望な再生可能な結晶が形成された（本明細書において以降Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢと称する）（図３２Ａ）。Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢによるＢＦＬ−１の部位選択的な誘導体化の効果を検証するために、一連のＢＦＬ−１構築物（ＷＴ、Ｃ５５Ｓ、Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ、Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ／Ｃ５５Ｓ）を、アセチルまたはＤ−ＮＡキャップＮＯＸＡ  ＳＡＨＢのいずれかとともにインキュベートし、ＢＦＬ−１の架橋を、電気泳動およびクーマシー染色によってモニタリングした。分子量の個別の増加をもたらしたペプチドおよびタンパク質の組合せは、Ｃ５５を有するＢＦＬ−１構築物、すなわち、野生型およびＣ４Ｓ／Ｃ１９ＳとのＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢであった（図３２Ａ）。実際に、インタクト質量分析法により、ペプチドインキュベーションにより、ＢＦＬ−１  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓから、適切にサイズ決定されたＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ付加物への完全な変換が認められた（図３２Ｂ）。ビオチン化Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢのＢＦＬ−１標的化能力を、すべてがシステイン含有である組換えＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＢＦＬ−１タンパク質の混合物を使用して、競合的ストレプトアビジンプルダウンアッセイにおいて検証した。Ａｃ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢおよびＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢのいずれも、類似の少量のＭＣＬ−１をプルダウンしたが、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢだけが、インプットレーンにおいて見出されるような強固なＢＦＬ−１の誘導体化、およびＢＦＬ−１の実質的なプルダウンの両方を引き起こした（図３２Ｃ）。最後に、複合タンパク質ライセートに関してこの活性を検証するために、Ａｃ−およびＤ−ＮＡ誘導体化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢを、ＢＦＬ−１を発現するＡ３７５Ｐ黒色腫細胞に由来するライセートとともにインキュベートすると、ここでも、弾頭部を有するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢには、ネイティブＢＦＬ−１タンパク質のプルダウンの顕著な増加が認められた（図３２Ｄ）。
【０２０４】
／ＢＦＬ−１／Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ複合体の結晶構造
Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの強力なＢＦＬ−１標的化能力を文書化した後、そのＢＦＬ−１ΔＣ（Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓ）との複合体の結晶構造を、２．３８Åの分解能で解読した（図３３Ａ〜Ｂ、図３０、ＰＤＢ識別子：５ＷＨＨ）。すべてのリガンド原子が、優れた電子密度をもたらし、α２〜α４によって定められる溝に結合したステープルペプチドを、分子当たりの計算された界面積７７１Å２で示した。両親媒性α−ヘリックスの親水性残基Ｒ３０、Ｄ３４、およびＮ３７は、それぞれ、ＢＦＬ−１表面のＥ８０／Ｄ８１、Ｒ８８、およびＫ１４７と、相補的な静電結合および水素結合での相互作用を行う（図３３Ａ）。Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの疎水性面の残基Ｌ２９、Ｆ３２、およびＬ３６は、カノニカル疎水性溝のそれぞれの残基Ｆ９５、Ｖ４４／Ｖ４８、およびＶ４０／Ｖ９０と直接的に結合する（図３３Ｃ）。ｉ、ｉ＋７ステープルは、シス構成で観察され、これが、主として溶媒に曝露されている（図３３Ａ〜Ｃ）。加えて、Ｃ５５とＤ−ＮＡのアクリルアミド部分との間の共有結合での結合は、容易に視覚化される（図３３Ｄ）。アクリルアミド部分は、ＢＦＬ−１  Ｃ５５に対してＮＯＸＡ  ＢＨ３  Ｃ２５と同様の配向を維持するが（図３３Ｅ〜Ｆ）、Ｄ−ＮＡのピペリジン基は、偶然にも、ＢＦＬ−１表面における残基Ｌ５２、Ｌ５６、Ｖ７４、およびＦ９５によって形成される相補的な疎水性ポケットに結合する（図３３Ｆ〜３Ｇ）。したがって、導入されたアクリルアミドを有する部分自体の化学構造は、疎水性溝において、さらなるＢＦＬ−１相互作用を促進する機会を提供する。
【０２０５】
ＢＦＬ−１のａｐｏおよびＳＡＨＢ誘導体化の両方の構造を解析することにより、リガンド非結合型およびリガンド結合型の立体構造の比較が可能となった。ＢＦＬ−１相互作用により、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢは、溝の立体構造的「開放」を誘導し、それによって、たとえば、ａｐｏ形態およびＢＨ３結合形態の残基５５および７０のα炭素間の距離を比較したときに、α２／α３およびα４が、互いから２．８Å変位される（図３４Ａ〜Ｂ）。この個別の構造的変化を、ＢＦＬ−１／Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢとａｐｏ  ＢＦＬ−１とを対比した距離差行列によって定量的に示す（図３４Ｃ〜Ｄ）。２つのＢＦＬ−１構造のすべての保存されたα炭素間における比較のＲＭＳＤ値０．８９７は、立体構造的変化の重要性を強調する。
【０２０６】
観察されたＳＡＨＢにより誘導されるＢＦＬ−１カノニカル溝のリモデリングは、ＢＦＬ−１  Ｃ５５に下接する新しい表面ポケットの形成に注目すべきである（図３４Ｅ）。この表面変化はまた、ＢＦＬ−１の非ステープルＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドとの相互作用の際にも明らかであり、この発見の、炭化水素ステープルまたはアクリルアミド部分への立体構造適応を越えた一般的な関連性が強調される（図３５Ａ）。重要なことに、ＮＯＸＡ  ＢＨ３相互作用時の溝のトポグラフィーにおけるこの変化は、リガンド非結合型とＮＯＸＡ  ＢＨ３結合型とのＭＣＬ−１の構造の比較が、そのようなリモデリングを示しておらず、溝の上部および下部における残基間の距離測定値が大幅に変化しないという点で、ＢＦＬ−１に固有である（図３４Ｂ、３５Ｂ）。実際に、ＢＨ３結合アクセス可能性を反映する未結合構造と結合構造との間でのＭＣＬ−１溝の類似性は、多様なＢＨ３ドメインヘリックスに対するＭＣＬ−１の比較的高い親和性を説明し得る。ＭＣＬ−１とＢＦＬ−１との間のこの立体構造の違いは、同様に、ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢのＡｃ誘導体化形態およびＤ−ＮＡ誘導体化形態の両方が、ＭＣＬ−１に非共有結合で結合することができるが、短縮型のＡｃ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢが、システイン反応性弾頭部を備えない限りＢＦＬ−１との相互作用をほとんどまたはまったく有さない理由を説明し得る。ポケット開放と関連する潜在的なエネルギー要件を考慮すると、ＢＦＬ−１の表面アクセス可能なＣ５５残基との共有結合的反応の不可逆的な性質は、実質的な結合の有利性を提供し得る。最終的に、Ｃ２５領域においてＮＯＸＡ  ＢＨ３を模倣し、この特徴的なポケットの形成を誘導する化合物（図３３Ｆ〜Ｇ、３４Ｅ）は、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢによって例証されるように、ＭＣＬ−１よりもＢＦＬ−１に対する優先的な選択性を有する新規な薬剤をもたらし得る（図３２Ｃ）。
【０２０７】
結論
ａｐｏ  ＢＦＬ−１の構造を解析することにより、ＢＦＬ−１のＢＨ３−リガンド結合型形態およびリガンド非結合型形態を比較する初の機会が得られ、その表面溝における構造の違いが明らかとなった。重要なことに、リガンド非結合型溝の特徴的なトポグラフィーは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングによる小分子発見に利用することができ、ＢＦＬ−１との複合体における推定ヒットの構造は、目的の分子をａｐｏ結晶に浸漬することによって得られる。占有されていないＢＦＬ−１溝は、同様に、システイン反応性ステープルペプチドおよび可能性としてはその小分子模倣体による選択的な共有結合的標的化に利用することができる、固有に位置付けられたシステイン残基の表面アクセス可能性を示す。実際に、ｉ、ｉ＋７ステープルによって強化された、Ｄ−ニペコチン酸誘導体化ＮＯＸＡ  ＢＨ３  α−ヘリックスとの複合体におけるＢＦＬ−１の構造により、リガンドに誘導される表面ポケットの開放および補助的な疎水性相互作用に適したジスルフィド結合に下接する細孔の形成の両方が明らかとなる。
【０２０８】
ＢＦＬ−１とステープルＢＨ３ペプチドとの間の共有結合的複合体のこの第１の構造において、導入されたｉ、ｉ＋７ステープルは、ヘリックスの非相互作用面に局在化しており、ＮＯＸＡ  ＢＨ３とＢＦＬ−１との間のネイティブな相互作用を保存し、リガンド−標的の結合を最大化するように溝のトポグラフィーをリモデリングすることが示された。ＢＦＬ−１のカノニカル溝内に位置するＣ５５と不可逆的に反応するアクリルアミドを有する部分を導入することによって、この短縮型ｉ、ｉ＋７ステープルＮＯＸＡ  ＢＨ３構築物のＭＣＬ−１に対する非共有結合的結合優先性が、ＢＦＬ−１の強力な共有結合的阻害剤へと変換された。合わせると、これらの構造的および生化学的結果は、臨床使用のための高度に選択的なＢＦＬ−１標的化剤およびＢＦＬ−１／ＭＣＬ−１二重阻害剤を開発する新しい機会をもたらす。
【０２０９】
（実施例５）
ＢＦＬ−１依存性ＡＭＬ細胞株において細胞死を再活性化することにおける、システイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢおよびＤＮＡ損傷応答経路の標的化阻害の選択的相乗作用のさらなる検証
ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢがＤＮＡ損傷応答経路メンバーと相乗作用する能力を調査するために、Ｕ９３７細胞またはＭＶ４；１１細胞を、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢおよび／またはＡＴＭ阻害剤ＡＺＤ０１５６で処置し、細胞生存率およびカスパーゼ−３／７活性化を測定した。ＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢは、ＡＺＤ０１５６と組み合わせたときに、Ｕ９３７細胞（これは、ＢＦＬ−１依存性である）において、選択的細胞傷害性および相乗作用を示したが、ＭＶ４；１１細胞（これは、ＢＦＬ−１依存性ではない）においては示さなかった（図４０〜４３）。
【０２１０】
ＢＦＬ−１依存性Ｕ９３７細胞株にはあるがＭＶ４；１１細胞株にはない、ＡＺＤ０１５６と組み合わせたときのＮＯＸＡ−１５  Ｒ３１Ｅ  ＳＡＨＢの選択的細胞傷害性および相乗作用（図４０〜４３）をさらに検証するために、本発明者らは、一連の確認研究を行った。本発明者らは、ＢＦＬ−１に対する依存性を示す別のがん細胞株、たとえば、ＯＣＩ−ＡＭＬ−３  ＡＭＬおよびＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病細胞（Kim  et  al.,  2005、Meyers  et  al.,  2017）に、上述の細胞傷害性研究を行い、Ｕ９３７細胞において見られたものと類似の薬理学的相乗作用が観察された（図４４〜４５）。次に、本発明者らは、２つの追加のＡＴＭ阻害剤、Ｋｕ−６００１９（Golding  et  al.,  2009）およびＫｕ−５５９３３（Hickson  et  al.,  2004）を試験し、ＡＺＤ０１５６で観察されたものと同じパターンの相乗作用が、Ｕ９３７細胞において認められたが（図４６〜４７）、ＭＶ４；１１細胞（図４８〜４９）では認められなかった。本発明者らは、ＣＨＫ１／２阻害剤ＡＺＤ７７６２（Zabludoff  et  al.,  2008）およびＰＡＲＰ阻害剤オラパリブ（Menear  et  al.,  2008）を含むＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）経路の別の阻害剤が、Ｕ９３７（図５０〜５１）とＭＶ４；１１（図５２〜５３）とを対比した相乗作用分析において、ＡＴＭ阻害剤と類似して挙動したことを見出した。特異性のさらなる尺度として、ＫＧ−１  ＡＭＬ細胞において化合物を試験したが、この細胞は、アポトーシス促進性刺激に対するＡＴＭ阻害剤の添加に比較的不応答性であることがこれまでに示されている（Boehrer  et  al.,  2009）。本発明者らは、ＢＦＬ−１依存性と一致して、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１Ｅでの単剤処置に応答して、用量応答性の細胞傷害性を観察したが、組み合わせて適用した場合に、ＡＺＤ０１５６の相乗作用は観察されなかった（図５４）。最後に、本発明者らは、ＭＣＬ−１選択的阻害剤Ｓ６３８４５が、ＭＣＬ−１に依存性であるＭＶ４；１１細胞において、単剤活性およびＡＴＭ阻害との組合せでの相乗作用の両方を示すが（Kotschy  et  al.  2016）、ＢＦＬ−１依存性であり、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１Ｅに応答性であるＵ９３７細胞においては、活性を示さなかったことを見出した（図５５）。実際に、ＭＶ４；１１細胞とＵ９３７細胞との対比における、Ｓ６３８４５およびＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１Ｅの対照的な活性は、２つの抗アポトーシス阻害剤の、それぞれ、ＭＣＬ−１およびＢＦＬ−１に対する強力な機能的特異性を強調する。
【０２１１】
（実施例６）
処置細胞におけるＢＦＬ−１およびＤＮＡ損傷応答経路阻害剤の細胞内および機械的活性
本発明者らのリード構築物のいずれも、がん細胞においてカノニカルＢＨ３結合ポケットにおける相互作用について、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢと競合し得る可能性のあるＣ末端ヘリックスを有する、全長ＢＦＬ−１タンパク質に、共有結合で架橋し得ることを確認した。本発明者らは、２９３Ｔ細胞において、組換え全長ＢＦＬ−１および発現させたＨＡタグ付加全長ＢＦＬ−１を生成し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび処置細胞において、それぞれ、架橋分析を行った。本発明者らは、一貫して、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５のＦ３２ＡおよびＲ３１Ｅ類似体の両方について、組換えおよび発現させた全長ＢＦＬ−１への共有結合での架橋を観察したが、対応するＣ末端短縮種の処置と比較して、効率性はいくらか低減されていた（図５６Ａ〜Ｂ）。したがって、ＡＭＬにおけるネイティブなＢＦＬ−１の効果的な標的化を確認し、計画されている一連の細胞傷害性分析のための優れた化合物を特定するために、もっとも強いＢＦＬ−１依存性スコアを示したＡＭＬ細胞株であるＵ９３７に由来するライセートを、ビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｆ３２ＡおよびＲ３１Ｅペプチドで処置した後、ストレプトアビジンプルダウンおよびＢＦＬ−１ウエスタン分析を行った。上記に示された架橋の結果（たとえば、実施例１〜３）と一致して、アクリルアミド部分をＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５ペプチドに組み込むことにより、ＢＦＬ−１標的化、この事例では、Ｕ９３７  ＡＭＬ細胞に由来するネイティブなＢＦＬ−１タンパク質の標的化が、顕著に増強された（図５６Ｃ）。この実験により、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１Ｅが、２つの構築物間で、ネイティブなＢＦＬ−１タンパク質のより有効なバインダーとして、さらに特定され、したがって、一連のがん細胞試験に選択した。
【０２１２】
機械論的観点から、本発明者らは、Ｕ９３７細胞をＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１ＥおよびＡＺＤ０１５６の組合せで処置した場合の細胞傷害性作用、相乗作用、および観察されたカスパーゼ３／７活性化が、ＴＭＲＥ染色によって測定した場合に、同様に、ミトコンドリア膜脱分極をもたらしたことをさらに確認した（図５７）。ＡＺＤ０１５６が、適用される用量で、ＡＴＭを効果的に標的化することを示すために、本発明者らは、Ｕ９３７細胞を、ＡＴＭ阻害剤で２時間処置し、Ｓ１９８１におけるＡＴＭ自己リン酸化およびＳ３３／３５における下流のＣＨＫ２リン酸化を、ウエスタンブロッティングによってモニタリングした。実際、Ｕ９３７細胞において通常であれば構成的に上昇しているはずのＳ１９８１自己リン酸化の用量応答性阻害、およびもっとも低い処置用量においてさえもＣＨＫ２リン酸化の強力な遮断が観察された（図５８）。観察された相乗作用の潜在的な機械論的原則を評価するときに、本発明者らは、ＡＺＤ０１５６処置に応答して、アポトーシス促進性ＢＡＸのタンパク質レベルの時間依存性増加を認め（図５９）、Ｕ９３７細胞におけるＢＡＸに媒介されるアポトーシスの関連抗アポトーシス阻害剤であるＢＦＬ−１の薬理学的遮断と組み合わせされたＢＡＸの上方調節が、増強された細胞傷害性を説明し得ることが示唆された。最後に、本発明者らは、Ｕ９３７細胞を、単剤処置および組合せ処置において使用したＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ−１５  Ｒ３１Ｅの連続希釈物で処置したときに、ＬＤＨ放出アッセイを行い、３０分および４時間の時点で測定したときに、非特異的な細胞膜溶解活性は観察されなかった（図６０）。選択的な標的タンパク質の結合（たとえば、ＢＦＬ−１）、膜の破壊を伴わない細胞浸透性、および機序による細胞傷害活性について、ステープルペプチドを最適化するために必要とされる上述の一連の実験は、治療薬開発のための、ステープルペプチド、たとえば、システイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの設計の非自明性を強調する。さらなる例として、Ｄ−ニペコチン酸弾頭部を有する一連の構築物は、２０μＭのペプチドで２時間処置したＨｅＬａ細胞において、０〜約６０％の範囲の非特異的膜溶解の様々な傾向を示した（図６１）。全体として、ＢＦＬ−１遺伝子依存性および共依存性分析（図６２）により、システイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの選択的ＢＦＬ−１標的化活性、ならびにＤＮＡ損傷応答経路の阻害剤と組み合わせた場合のそれらの相乗作用を効果的に適用および検証するための、がん細胞サブタイプの選定が示された。
【０２１３】
実施例において使用した材料および方法
ステープルペプチドの合成
アセチル、ＦＩＴＣ−βＡｌａ、もしくは求電子性弾頭部でのＮ末端誘導体化、またはＬｙｓ−ビオチンもしくはＬｙｓ−ＦＩＴＣでのＣ末端誘導体化のいずれかを行った、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のＢＨ３ドメインに対応する炭化水素ステープルペプチドを、本発明者らのこれまでに報告した方法を使用して、合成し、精製し、定量した（Bird  et  al.,  Methods  Enzymol.,  446:369-86  (2008)、Bird  et  al.,  Curr.  Protoc.  Chem.  Biol.,  3(3):99-117  (2011)）。アクリルアミドを有するペプチドを、アクリル酸もしくはトランス−クロトン酸をペプチドのＮ末端にカップリングするか、または標準的なＦｍｏｃカップリングおよび脱保護方法を使用して、Ｆｍｏｃ保護環状アミノ酸（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をまずカップリングした後に、Ｆｍｏｃの脱保護およびアクリル酸でのアシル化を行うかのいずれかによって、合成した（Huhn  et  al.,  Cell  Chem  Biol.,  23(9):1123-1134  (2016)）。
【０２１４】
組換えタンパク質の発現および精製
組換え抗アポトーシスＢＦＬ−１ΔＣ（アミノ酸１〜１５１）およびそのシステインからセリンへの変異体を、ＰＥＴ１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ）にクローニングし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＬＯＢＳＴＲ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｋｅｒａｆａｓｔ）において発現させ、連続的なＮｉ親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーによって、記載されるように精製した（Pitter  et  al.,  Methods  Enzymol.,  446:387-408  (2008)）。組換え抗アポトーシスＢＣＬ−ＸＬΔＣ（アミノ酸１〜２１２）およびＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（アミノ酸１７２〜３２９）を、ＰＧＥＸ−４Ｔ−１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎ末端ＧＳＴタグ）発現ベクターにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）において発現させ、以前に記載されたように精製した（Huhn  et  al.,  2016  （上記）、Pitter  et  al.,  2008  （上記））。ＢＣＬ−ＸＬΔＣを精製するときに、ストレプトアビジンプルダウン実験における銀染色による容易なタンパク質の特定のために、ＧＳＴタグを、トロンビン（１２〜１５単位）を使用して切断して、ＢＣＬ−ＸＬΔＣとＧＳＴ−ＭＣＬ−１ΔＮΔＣとの間にサイズの違いをもたらした。
【０２１５】
Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを含む組換え全長ＢＦＬ−１（アミノ酸１７５）を、ＰＴＹＢ１ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングし、上述のように精製したが、ただし、キチン親和性クロマトグラフィーおよびＤＴＴ溶離ステップの追加を除く。タンパク質の純度および同一性を、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ６タグ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して、クーマシー染色およびウエスタンブロッティング分析によって確認した。
【０２１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの共有結合的コンジュゲーションアッセイ
Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓタンパク質（５μＭ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌで、室温において３０分間、前処置し（最終体積９．５μＬ）、次いで、室温におけるさらに１時間のインキュベーションのために、モル比１０：１のシステイン反応性ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢと合わせた。試料を、次いで、ＤＴＴを有する３倍ローディング緩衝液において煮沸し、１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにおいて電気泳動にかけた後、クーマシー染色に供した。
【０２１７】
細胞取り込み
細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン−ストレプトマイシンを含有する標準的な培養培地を使用して培養した（２９３Ｔ、Ａ３７５Ｐ：ＤＭＥＭ；Ｕ９３７、ＭＶ４−１１；ＲＭＰ１）。システイン反応性ペプチドの取り込みのために、２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミンＬＴＸ  Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを含む２μｇのｐＣＭＶプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を、５％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中、２０μＭの示されているＳＡＨＢで、８時間処置した。細胞を採取し、１％  ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＤＴＴ）とのインキュベーションによって、溶解させた。可溶性画分のタンパク質濃度を、ＢＣＡキットを製造業者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用して、測定した。試料を、次いで、ＬＤＳ緩衝液中で煮沸し、抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、番号１２ＣＡ５）および抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ａ１９７８）の１：１０００希釈物を使用して、ウエスタン分析に供した。
【０２１８】
ストレプトアビジンプルダウン
野生型Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ、ＢＣＬ−ＸＬΔＣ（タグなし）、およびＧＳＴ−ＭＣＬ−１ΔＮΔＣ（それぞれ１μＭ）を合わせ、ＰＢＳ中の３ｍＭ  ＤＴＴとともに、室温で３０分間インキュベートした。混合物を、ビヒクルまたは示されているＣ末端ビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ（１μＭ）で、４時間処置し、次いで、３０μＬのＰＢＳで洗浄した高性能ストレプトアビジン（ＳＡ）アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐｉｅｒｃｅ）に添加し、室温で２時間、回転させながらインキュベートした。ビーズを、次いで、ＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。結合したタンパク質を溶離するために、ビーズを、１０ｍｇ／ｍＬビオチンを含有する１０％  ＳＤＳで１０分間煮沸した。溶離後に、試料を、３倍ＬＤＳおよび２Ｍ  ＤＴＴで２０分間煮沸した。インプット（２％）および溶離液（５μＬ）に、１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用してゲル電気泳動を行い、ゲルを、Ｐｉｅｒｃｅ銀染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して展開した。
【０２１９】
がん細胞ライセートにおけるＢＦＬ−１標的化
培養したＡ３７５Ｐ細胞およびＵ９３７細胞を、それぞれ、トリプシン処理または採取し、ＰＢＳで洗浄し、１％  ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（１％  ＣＨＡＰＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４、１００μＭ  ＤＴＴ）とともにインキュベートすることによって、溶解させた。可溶性画分のタンパク質濃度を、ＢＣＡキットを製造業者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用して、測定した。ライセート試料（１ｍｇ）を、１％  ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液中、４℃で一晩、ビヒクルまたはＣ末端ビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ（３０μＭ）とともにインキュベートした。ビオチン捕捉は、高性能ＳＡアガロース（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との混合物を、４℃で２時間インキュベートし、続いて、遠心分離し、ペレット化したビーズを溶解緩衝液（１ｍＬ）で３回洗浄することによって、達成した。ビーズに結合したタンパク質を、１０ｍｇ／ｍＬビオチンを含有する１０％  ＳＤＳにおいて、１０分間煮沸することによって溶離し、次いで、ＢＦＬ−１抗体（Ａｂｃａｍ、番号１２５２５９）およびＭＣＬ−１抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、番号６００−４０１−３９４Ｓ）を使用して、電気泳動およびウエスタンブロッティングに供した。
【０２２０】
ＢＦＬ−１／ＢＨ３複合体の破壊
ＢＦＬ−１およびＭＣＬ−１との相互作用について、ｔＢＩＤと競合するビオチン化ＳＡＨＢの能力を評価するために、上述のように、２９３Ｔ細胞に、ｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１０ベクター（Ｓｉｇｍａ）において、ＨＡ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９ＳまたはＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１のいずれかをトランスフェクトした。２４時間後に、細胞を、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、１％  ＣＨＡＰＳ緩衝液に溶解させ、ＢＣＡキットによるタンパク質濃度の判定のために、上清を採取した。ライセート試料（０．５ｍｇ）を、０．２５μＭ組換えｔＢＩＤ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および５μＭビオチン化ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢとともに、室温で６時間インキュベートした。この混合物を、ＨＡまたはＦＬＡＧ免疫沈降に供した後、ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、番号１２ＣＡ５）、ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ７４２５）、およびＢＩＤ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−１１４２３）の１：１０００希釈物を使用して、ウエスタン分析を行った。
【０２２１】
競合的蛍光偏光結合アッセイ
蛍光偏光（ＦＰ）アッセイを、以前に説明されているように行った（Pitter  et  al.,  2008  （上記））。簡単に述べると、抗アポトーシスタンパク質の連続希釈物を用いて、ＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３（２５ｎＭ）によって直接結合曲線を、まず生成し、５分の時点で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において、ＦＰを測定した。競合アッセイのために、アセチル化または弾頭部を有するＮＯＸＡ  ＳＡＨＢの連続希釈物を、直接結合アッセイによって判定される、およそのＥＣ７５濃度で、示される組換えタンパク質に添加した。ＦＩＴＣ−ＢＩＤ  ＢＨ３（２５ｎＭ）を、次いで、添加し、蛍光偏光を、平衡で測定した。ＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、競合的結合曲線の非線形回帰分析によって、ＩＣ５０値を計算した。
【０２２２】
ＬＤＨ放出アッセイ。
Ａ３７５ＰおよびＵ９３７がん細胞を、それぞれ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭおよびＲＰＭＩにおいて培養し、９６ウェルプレートに播種した（１ウェル当たり５×１０３個の細胞）。Ａ３７５Ｐ細胞については終夜のインキュベーションの後、またはＵ９３７細胞については播種の直後に、細胞を、５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ中、示される濃度のＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢで、示される期間（３０分間、４時間）処置した。プレートを、４℃で５分間、１，５００ｒｐｍで遠心分離した後（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｆｏｕｒ−Ｐｌａｃｅ  Ｓｗｉｎｇｉｎｇ  Ｂｕｃｋｅｔ  Ｒｏｔｏｒ［７５００６４４５］、４７８×ｇ）、１００μＬの細胞培養培地を透明なプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、１００μＬのＬＤＨ試薬（Ｒｏｃｈｅ）とともに３０分間、振盪させながらインキュベートし、次いで、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４９０ｎｍで吸光度を測定することによって、ＬＤＨ放出を定量した。
【０２２３】
細胞生存率およびカスパーゼ−３／７活性化アッセイ。
１０％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩにおいて培養したＵ９３７、ＭＶ４；１１、ＯＣＩ−ＡＭＬ−３、Ｊｕｒｋａｔ、およびＫＧ−１細胞を、９６ウェルプレートに播種し（１ウェル当たり５×１０３個の細胞）、一晩インキュベートした後、５％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中、示される濃度のＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢおよび／またはＡＺＤ０１５６、Ｋｕ−６００１９、Ｋｕ−５５９３３、ＡＺＤ７７６２、オラパリブ、もしくはＳ６３８４５（すべてＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手）で、示される期間、処置した。細胞生存率およびカスパーゼ−３／７活性化を、それぞれ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏおよびカスパーゼ−Ｇｌｏ  ３／７化学発光試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定し、発光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーによって検出した。薬物相互作用の相乗作用を、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使用して計算した。
【０２２４】
ＳＡＨＢとコンジュゲートしたＢＦＬ−１の調製
ＢＦＬ−１ΔＣ（３０μＭ）を、４℃で３０分間、ＤＴＴ（２０ｍＭ）で処置し、続いて、ペプチド：タンパク質モル比１．２ｘ、１．２ｘ、および１ｘで、Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢペプチドとともに、それぞれ４℃で１時間連続的にインキュベートすることによって、ＢＦＬ−１ΔＣ／Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢコンジュゲートを調製した。結果として得られたコンジュゲートを、次いで、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動およびインタクト質量分析法によって、コンジュゲーション効率を評価した。
【０２２５】
Ｘ線結晶構造解析
Ａｐｏ  Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを、上述のように発現および精製し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  グリセロール、５０ｍＭ  アルギニン、および１ｍＭ  ＤＴＴ中に緩衝液交換した。等体積（１００ｎＬ）の６．３ｍｇ／ｍＬ（３４０μＭ）  ａｐｏ  ＢＦＬ−１ΔＣを、リザーバ溶液（３５％  ＰＥＧ１５００および０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム  ｐＨ６）と混合し、結晶を、２０℃において懸滴で調製した。結晶を、短時間で２５％  グリセロールを含有する結晶化緩衝液中に移した後、液体窒素中で瞬間凍結させた。ａｐｏ  ＢＦＬ−１ΔＣ結晶から得られた回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）においてＮＥ−ＣＡＴのビームライン２４ＩＤ−Ｃで収集し、データセットを統合し、ＸＩＡ２パッケージを使用してスケーリングした（Evans,  Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  62,  72-82  (2006)、Kabsch,  Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  66,  133-144  (2010)、Winter,  J  Appl  Crystallogr  43,  186-190  (2010)）。構造を、プログラムＰｈａｓｅｒ（McCoy  et  al.,  J  Appl  Crystallogr  40,  658-674  (2007)）および検索モデルＰＤＢエントリー１ＮＢ８を使用した分子置き換えによって解読した。Ｐｈｅｎｉｘ（Adams  et  al.,  Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  66,  213-221  (2010)）およびＣｏｏｔ（Emsley  and  Cowtan,  Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr  60,  2126-2132,  (2004)）を使用した反復的なマニュアルモデル構築および精緻化により、最大回折１．６９Åを含む、優れた統計量を有するモデル（ＰＤＢ：５ＷＨＩ）が得られた。
【０２２６】
Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢとの複合体におけるＨｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ  Ｃ４Ｓ／Ｃ１９Ｓを、上述のように生成し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＤＴＴ中に緩衝液交換した。等体積（２００ｎＬ）の（４００μＭ）Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ／Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ複合体を、リザーバ溶液（２０％  ＰＥＧ３３５０および０．２Ｍ  マロン酸ナトリウム）と混合し、結晶を、２０℃において懸滴で形成した。結晶を、短時間で２５％グリセロールを含有する結晶化緩衝液中に移した後、液体窒素中で瞬間凍結させた。Ｈｉｓ−ＢＦＬ−１ΔＣ／Ｄ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ結晶から得られた回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）においてＮＥ−ＣＡＴのビームライン２４ＩＤ−Ｃで収集した。最初の分子置き換えの後、リガンドを、ＢｕｓｔｅｒおよびＲｈｏｆｉｔ（Smart  et  al.,  2012）を使用して配置し、予備的に精緻化した。結晶学的データのモデル（ＰＤＢ：５ＷＨＨ、最大回折２．３８Å）を、上述のように生成した。
【０２２７】
距離差行列のプロット
ヒートマップを生成するために、構造間で保存されているアルファ炭素座標を、ＰＤＢファイルから抽出した。距離差行列プロットを、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）のＤＤＭＰプログラムを使用して生成した。
【０２２８】
定量化および統計学的分析
構造分析のために、結合の長さおよび距離差行列プロットの定量化を、ｐｙｍｏｌおよびＤＤＭＰプログラムを使用して行った。Ｘ線構造の精緻化統計量を、Ｐｈｅｎｉｘソフトウェアパッケージによって生成した。生化学的データおよび細胞データは、技術的三連物において行い、少なくとも２回繰り返して、同じ結果であった、実験の平均±標準偏差である。０．０５よりも低いｐ値を、対応のない両側スチューデントｔ検定によって統計学的に有意であると考え、アスタリスクで示す。データは、Ｐｒｉｓｍソフトウェア７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）およびＣａｌｃｕＳｙｎ（Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使用して分析した。
【０２２９】
データおよびソフトウェアの利用可能性
Ｘ線結晶構造解析データを、受託番号５ＷＨＩ（ａｐｏ  ＢＦＬ−１）および５ＷＨＨ（ＢＦＬ−１／Ｄ−ＮＡ  ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢ）のもとに、ＰＤＢに寄託した。
【０２３０】
ミトコンドリア膜電位アッセイ
Ｕ９３７細胞を、６ウェルプレートに播種し（１ウェル当たり２×１０６個の細胞）、示される濃度のＤ−ＮＡ−ＮＯＸＡ  ＳＡＨＢおよび／またはＡＺＤ０１５６で処置した。２４時間後に、細胞を、ＴＭＲＥ（１μＭ）とともに、製造業者の説明書（ＴＭＲＥ−ミトコンドリア膜電位アッセイキット、Ａｂｃａｍ）に従って、３０分間インキュベートした。細胞を、次いで、ＰＢＳ中の０．２％  ＢＳＡに再懸濁させ、１ウェル当たり２×１０５個の細胞で、黒色の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。ＴＭＲＥ−ミトコンドリア膜電位を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーにおいて蛍光（励起／放出＝５４９／５７５ｎｍ）を測定することによって、読み取った。
【０２３１】
ホスホシグナル伝達分析。
１０％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩにおいて培養したＵ９３７細胞を、６ウェルプレートに播種し（１ウェル当たり２×１０６個の細胞）、示される濃度のＡＺＤ０１５６で２時間処置した。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１％ＣＨＡＰＳ緩衝液中に溶解させ、ＢＣＡキットによるタンパク質濃度の判定のために、上清を採取した。試料を、ホスホ−ＡＴＭ（Ｓ１９８１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号４５２６）、ＡＴＭ（Ａｂｃａｍ、番号ａｂ７８）、ホスホ−ＣＨＫ２（Ｓｅｒ３３／３５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号２６６５）、ＣＨＫ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号２６６２）、およびアクチン（Ｓｉｇｍａ、番号Ａ１９７８）抗体の１：１０００希釈物を使用して、電気泳動およびウエスタン分析に供した。
【０２３２】
ＢＡＸタンパク質レベルの動的評価
Ｕ９３７細胞を、６ウェルプレートに播種し（１ウェル当たり２×１０６）、ＡＺＤ０１５６（５μＭ）で処置し、細胞を、示される時点で、採取し、溶解させた。細胞ライセートを、次いで、ＢＡＸ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−４９３）およびアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ、番号Ａ１９７８）を用いて、電気泳動およびウエスタンブロッティングに供した。
【０２３３】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに併記してきたが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2021506800.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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