(57)【要約】本開示は、複製する能力がない不活性化がん細胞、及びアジュバントを含むがんワクチン組成物を提供する。がんワクチン組成物を作製するための方法であって、がん細胞を光（例えばＵＶ光）に光増感剤（例えばリボフラビン）の存在下で接触させることを含む、方法も提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製する能力がない不活性化がん細胞を含む、がんワクチン組成物。
【請求項２】
前記がん細胞が、１つ以上のタイプのがんを患っている患者に由来する、請求項１に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３】
前記患者が、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、婦人科がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、膵がん、結腸がん、及び血液がんの１つ以上を患っている、請求項２に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４】
前記皮膚がんが、メラノーマである、請求項３に記載のがんワクチン組成物。
【請求項５】
前記血液がんが、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、請求項３に記載のがんワクチン組成物。
【請求項６】
前記白血病が、急性リンパ球性白血病又は急性骨髄性白血病である、請求項５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項７】
前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である、請求項５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項８】
前記骨髄腫が、多発性骨髄腫である、請求項５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項９】
前記患者が、良性腫瘍を患っている、請求項２に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１０】
前記がんが、転移がんである、請求項２に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１１】
前記がん細胞が、不死化細胞株に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１２】
前記がん細胞が、自家である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１３】
前記細胞が、同種である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、約１×１０５〜約１×１０８個のがん細胞を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１５】
前記がん細胞のＤＮＡが、修飾グアニン塩基を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントが、単球機能を修飾する、請求項１６に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１８】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウムを含む、請求項１６に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１９】
前記アジュバントが、ＣＬＤＣを含む、請求項１６に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２０】
前記アジュバントが、ポリＩＣ、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、又はイミキモドを含む、請求項１６に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２１】
前記アジュバントが、リポソームを含む、請求項１６に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２２】
前記リポソームが、アゴニストにコンジュゲートされる、請求項２１に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２３】
前記アゴニストが、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９の少なくとも１つのアゴニストである、請求項２２に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容できる担体をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２５】
前記薬学的に許容できる担体が、正常な生理食塩水、ブドウ糖食塩水、又はリン酸緩衝食塩水である、請求項２４に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２６】
前記がん細胞が、光処理を用いて不活性化される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２７】
前記光処理が、約１分〜約３分にわたって続く、請求項２６に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２８】
前記光処理により、前記がん細胞上の前記抗原タンパク質の構造が実質的に変化しない、請求項２６又は２７に記載のがんワクチン組成物。
【請求項２９】
前記光処理により、前記がん細胞のＤＮＡが改変されない、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３０】
前記光処理により、前記がん細胞のＤＮＡ中のグアニン塩基が選択的に酸化される、請求項２９に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３１】
前記光処理により、前記がん細胞の代謝過程、表現型、又は構造が実質的に変化しない、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３２】
前記光処理により、がん細胞における表面マーカーの発現又は活性が実質的に変化しない、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３３】
前記光処理により、前記細胞におけるＥｐＣＡＭ、ＣＤ３８、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ４４、ＣＤ２４、Ｓｃａ１、ＨＬＡ、Ｇｌｕｔ１、ＭＨＣクラスＩ、ＰＤＬ−Ｌ１、ＣＤ４５、ｇｐ７０、ＧＦＰ又はＣＤ９０の発現レベルが変化しない、請求項３２に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３４】
前記光処理により、前記細胞の細胞膜又は核膜の完全性が損なわれない、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３５】
前記光処理は、ＵＶ光による処理を含む、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３６】
前記ＵＶ光が、１７０〜４００ｎｍの波長を有する、請求項３５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３７】
前記ＵＶ光が、３１５〜４００ｎｍの波長を有する、請求項３５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３８】
前記ＵＶ光が、３１０〜３２０ｎｍの波長を有する、請求項３５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項３９】
前記ＵＶ光が、２８０〜３６０ｎｍの波長を有する、請求項３５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４０】
前記ＵＶ光が、２８０〜３１５ｎｍの波長を有する、請求項３５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４１】
前記ＵＶ光が、１８０〜２８０ｎｍの波長を有する、請求項３５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４２】
前記ＵＶ光が、１７０〜２００ｎｍの波長を有する、請求項３５に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４３】
ＵＶ光の線量が、約２００ジュール〜約６００ジュールである、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４４】
ＵＶ光の線量が、約２００ジュール〜４００ジュールである、請求項４３に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４５】
ＵＶ光の線量が、約３００ジュールである、請求項４４に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４６】
前記光処理が、前記がん細胞を光増感剤の存在下で光に接触させることにより実施される、請求項２６〜４５のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４７】
前記光増感剤の濃度が、約１μＭ〜約５０μＭである、請求項４６に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４８】
前記光増感剤の濃度が、約１０μＭ未満である、請求項４６又は４７に記載のがんワクチン組成物。
【請求項４９】
前記光増感剤が、リボフラビンである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項５０】
それを必要とする患者におけるがんを治療するための方法であって、請求項１〜４９のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項５１】
前記がんワクチン組成物が、ワクチン増強剤と同時に又は連続的に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ワクチン増強剤が、アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）又はβ遮断薬（ＢＢ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ワクチン増強剤が、ロサルタンである、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
ロサルタンの用量が、約５〜約１００ｍｇ／ｋｇの間である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ロサルタンの用量が、約６０ｍｇ／ｋｇである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ワクチン増強剤が、プロプラノロールである、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記がんワクチン組成物が、前記患者に１回投与される、請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記がんワクチン組成物が、前記患者に２回以上投与される、請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記がんワクチン組成物が、前記患者に２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記がんワクチン組成物が、前記患者に７日ごとに少なくとも１回投与される、請求項５８又は５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記がんワクチン組成物が、前記患者に１４日ごとに少なくとも１回投与される、請求項５８又は５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記がんワクチン組成物が、前記患者に６月ごとに少なくとも１回投与される、請求項５８又は５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記がんワクチン組成物が、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、舌下、頬側、吸入、皮内、腫瘍内、臓器内、経口、及び腹腔内から選択される経路により投与される、請求項５０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記がんワクチン組成物が、皮下注射により投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記がんワクチン組成物が、静脈内注射により投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記がんワクチン組成物が、筋肉内注射により投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記患者が、免疫適格性である、請求項５０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者が、易感染性である、請求項５０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記処置により、腫瘍成長が、ワクチン未接種の患者における腫瘍成長と比べて少なくとも１０％低減される、請求項５０〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記処置により、腫瘍成長が、ワクチン未接種の患者における腫瘍成長と比べて少なくとも２０％低減される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記処置により、腫瘍成長が、ワクチン未接種の患者における腫瘍成長と比べて少なくとも５０％低減される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記処置により、前記患者の生存が、ワクチン未接種の患者と比べて少なくとも１０％延長される、請求項５０〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記処置により、前記患者の生存が、ワクチン未接種の患者と比べて少なくとも２０％延長される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記処置により、前記患者の生存が、ワクチン未接種の患者と比べて少なくとも５０％延長される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記処置により、前記患者におけるＩｇＧ及び／又はＩｇＭが上方制御される、請求項５０〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記処置により、前記患者におけるＴ細胞が活性化される、請求項５０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記がんが、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、婦人科がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、膵がん、結腸がん、又は血液がんである、請求項５０〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記皮膚がんが、メラノーマである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記血液がんが、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記白血病が、急性リンパ球性白血病又は急性骨髄性白血病である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記骨髄腫が、多発性骨髄腫である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記がんが、転移がんである、請求項５０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記がんワクチン組成物が、１つ以上の追加的な治療薬と組み合わせて前記患者に投与される、請求項５０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記１つ以上の追加的な治療薬が、チェックポイント阻害剤、抗体治療薬、遺伝子改変樹状細胞、遺伝子改変Ｔ細胞、及び化学療法剤からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
がんワクチンを作製するための方法であって、がん細胞をリボフラビンの存在下でＵＶ光と接触させることを含む、方法。
【請求項８７】
前記ＵＶ光により、前記がん細胞のＤＮＡが改変される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＵＶ光により、前記がん細胞のＤＮＡ中のグアニン塩基が選択的に酸化される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記光処理により、前記がん細胞上の前記抗原タンパク質の構造が実質的に変化しない、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＵＶ光により、前記がん細胞の代謝過程、表現型、又は構造が実質的に変化しない、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＵＶ光により、前記がん細胞における表面マーカーの発現又は活性が実質的に変化しない、請求項８６〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＵＶ光により、前記細胞におけるＥｐＣＡＭ、ＣＤ３８、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ４４、ＣＤ２４、Ｓｃａ１、ＨＬＡ、Ｇｌｕｔ１、ＭＨＣクラスＩ、ＰＤＬ−Ｌ１、ＣＤ４５、ｇｐ７０、ＧＦＰ及び／又はＣＤ９０の発現レベルが実質的に変化しない、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記不活性化により、前記細胞の細胞膜及び核膜の完全性が損なわれない、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記がん細胞が、リボフラビンの存在下でＵＶ光に約１分〜約３分にわたり接触される、請求項８６〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＵＶ光が、１７０〜４００ｎｍの波長を有する、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＵＶ光が、３１５〜４００ｎｍの波長を有する、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＵＶ光が、３１０〜３２０ｎｍの波長を有する、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＵＶ光が、２８０〜３６０ｎｍの波長を有する、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＵＶ光が、２８０〜３１５ｎｍの波長を有する、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＵＶ光が、１８０〜２８０ｎｍの波長を有する、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＵＶ光が、１７０〜２００ｎｍの波長を有する、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
ＵＶ光の線量が、約２００ジュール〜約６００ジュールである、請求項８６〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
ＵＶ光の線量が、約２００ジュール〜約４００ジュールである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ＵＶ光の線量が、約３００ジュールである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記がん細胞が、単一細胞懸濁液中に存在する、請求項８６〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記リボフラビンが、前記単一細胞懸濁液に添加される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記がん細胞が、前記細胞を前記ＵＶ光に接触させる前、リボフラビンを含有する溶液中でプレインキュベートされる、請求項８６〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記溶液が、１０〜１００μＭのリボフラビンを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記溶液が、約１μＭ〜約５０μＭのリボフラビンを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記溶液が、約１０μＭ未満のリボフラビンを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
薬剤として使用するための、請求項１〜４９のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１１２】
がんを治療するための薬剤として使用するための、請求項１〜４９のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１１３】
がんを治療する方法における使用のための、請求項１〜４９のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物。
【請求項１１４】
がんを治療するための薬剤の製造における、請求項１〜４９のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物の使用。
【請求項１１５】
前記がんが、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、婦人科がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、膵がん、結腸がん、又は血液がんである、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物、又は請求項１１４に記載の使用。
【請求項１１６】
前記皮膚がんが、メラノーマである、請求項１１５に記載のがんワクチン組成物又は使用。
【請求項１１７】
前記血液がんが、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、請求項１１５に記載のがんワクチン組成物又は使用。
【請求項１１８】
前記白血病が、急性リンパ球性白血病又は急性骨髄性白血病である、請求項１１７に記載のがんワクチン組成物又は使用。
【請求項１１９】
前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である、請求項１１７に記載のがんワクチン組成物又は使用。
【請求項１２０】
前記骨髄腫が、多発性骨髄腫である、請求項１１７に記載のがんワクチン組成物又は使用。
【請求項１２１】
前記がんが、転移がんである、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載のがんワクチン組成物、又は請求項１１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７５５，７４１号明細書；２０１８年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／６８８，０５１号明細書；及び２０１８年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／６４５，９７５号明細書に対する優先権を主張し、それらの各々は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本開示は、一般に、腫瘍成長を阻害し、抗腫瘍免疫応答を促進するための組成物及び方法に関する。より詳細には、本開示は、腫瘍に対する免疫系の応答を活性化するがんワクチン組成物及び方法に関する。本開示はまた、がん細胞ワクチンを作製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
がん免疫療法は、がん細胞、又はがんの素因になる感染に対する個体自身の免疫系を誘発及び増強するための組成物及び方法の使用を含む。がんワクチンは、非発癌性形態で身体内に導入され、身体が免疫を与える又は永続的な「記憶」免疫応答を得るように誘導する、抗原（例えば、典型的には、タンパク質、ペプチド、又は炭水化物）に対して応答を開始するように免疫系を誘発することにより機能する。一旦免疫系応答が確立されると、（例えばがん性腫瘍の形態での）この抗原への免疫系の曝露の結果、迅速且つ強固な免疫応答が得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
がん免疫療法への１つの課題は、ある患者と別の患者との間で臨床応答が著しく変動することが多い点である。一部の患者が顕著で且つ耐久性のある応答を有し得る一方で、それ以外の患者は明白な臨床的有用性を導き出さない。したがって、当該技術分野では、がん免疫療法として免疫系を確実且つ有効に刺激し得る組成物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
複製する能力がない不活性化がん細胞を含む、がんワクチン組成物が本明細書に提供される。がん細胞は、１つ以上のタイプのがんを患っている患者から単離又は誘導されてもよい。
【０００６】
さらに、それを必要とする患者におけるがんを治療するための方法であって、本開示のがんワクチンを患者に投与することを含む方法が提供される。
【０００７】
さらに、がんワクチン組成物を作製するための方法であって、がん細胞を、光増感剤（例えばリボフラビン）の存在下で、光（例えばＵＶ光）で処理することを含む、方法が提供される。
【０００８】
さらに、がんを治療する方法における使用のためのがんワクチン組成物が提供される。
【０００９】
さらに、がんを治療するための薬剤としての使用のためのがんワクチン組成物、及びがんを治療するための薬剤の製造におけるがんワクチン組成物の使用が提供される。これら及び他の態様は、以下にさらに詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＣＡＭＡ細胞のリボフラビン及びＵＶ光による処理後の増殖を、処理日（０日目）、並びに処理後の２、４、６、及び８日目で図示する。細胞は、Ｍｉｒａｓｏｌ（登録商標）ＰＲＴ照明装置を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は１００％の照明強度で用いて処理された。ＵＶ光で処理された細胞（生）は、対照として含まれた。
【図２】リボフラビン及びＵＶ光による処理後のＣＡＭＡ細胞の生存率を示す。
【図３】リボフラビン及びＵＶ光による処理後のＣＡＭＡ細胞内での表面マーカーＥｐＣＡＭの発現を示す。
【図４】リボフラビン及びＵＶ光（２０％の照明強度）による処理後の、様々な時間間隔でのＣＡＭＡ細胞上の表面マーカー発現を比較する蛍光顕微鏡画像を提示する。
【図５】様々な線量のＵＶ光による処理後の、生存可能集団内の表面マーカーＥｐＣＡＭ（バーの前列）及びＣＤ３８（バーの後列）の相対的発現を示す。
【図６】リボフラビン及びＵＶ光による処理後の、ＣＡＭＡ細胞内のカスパーゼ−３濃度を示す。
【図７】リボフラビン及びＵＶ光による処理後の、ＣＡＭＡ細胞の表面マーカー発現と生存率との間の相関性を示す。
【図８】不活性化全細胞ワクチンを投与したマウス及びライセートワクチン（国際公開第２０１６／１６１３０９号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のような４Ｔ１スフェロイドライセートワクチン）を投与したマウスと比べての、生理食塩水が注射されたＰｙＭＴ乳がん腫瘍を有するマウス（対照、ワクチンなし）における腫瘍成長曲線を示す。結果は、注射後２３日目に開始した、不活性化全細胞ワクチン群における腫瘍細胞成長において、未処理対照群に対して統計学的に有意な減少が認められた（２３日目にｐ＝０．０２、及び２５日目にｐ＜０．００１）。
【図９】ＰｙＭＴ腫瘍を有するマウスのワクチン接種（不活性化全細胞ワクチン）群対未処置／生理食塩水（対照）群における全生存を示す。不活性化全細胞ワクチンを投与したマウスは、生理食塩水処置対照群と比べて、有意に延長された生存期間を有した（ｐ＝０．００９、マンテル・コックスログランク検定）。
【図１０】外科的除去前の、マウスにおける４Ｔ１腫瘍のサイズを示す。手術後、マウスは３群に配置され、各群が類似の平均腫瘍サイズ（ｐ＝０．９）及び伝播を有することが示された。ＰＢＳ（「対照」）、ｎ＝マウス５匹；アジュバント、ｎ＝マウス８匹；不活性化全細胞ワクチン、ｎ＝マウス８匹。
【図１１Ａ】マウスが、原発性腫瘍の外科的除去の２４時間後から毎週、ＰＢＳ（対照）、ロサルタン及びカチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体（ＣＬＤＣ）（アジュバント）、又は不活性化全細胞ワクチン（アジュバント＋ワクチン）で処置された実験の結果を示す。肺における転移性疾患は、ルシフェリン１００μｌの腹腔内注射後のＩＶＩＳイメージングを用いて定量化された。図１１Ａに示されるように、ワクチンで処置されたマウスでは、測定された転移性負荷において、アジュバント処置マウス（１４日目、ｐ＝０．０１５７）と比べて、また対照マウスとアジュバント処置マウスの双方（各々、１６日目、ｐ＝０．０１１９、及びｐ＝０．００２１）と比べて、有意な減少が認められた。図１１Ｂは、各群中の各マウスにおける光子束データを経時的に示す。
【図１１Ｂ】マウスが、原発性腫瘍の外科的除去の２４時間後から毎週、ＰＢＳ（対照）、ロサルタン及びカチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体（ＣＬＤＣ）（アジュバント）、又は不活性化全細胞ワクチン（アジュバント＋ワクチン）で処置された実験の結果を示す。肺における転移性疾患は、ルシフェリン１００μｌの腹腔内注射後のＩＶＩＳイメージングを用いて定量化された。図１１Ａに示されるように、ワクチンで処置されたマウスでは、測定された転移性負荷において、アジュバント処置マウス（１４日目、ｐ＝０．０１５７）と比べて、また対照マウスとアジュバント処置マウスの双方（各々、１６日目、ｐ＝０．０１１９、及びｐ＝０．００２１）と比べて、有意な減少が認められた。図１１Ｂは、各群中の各マウスにおける光子束データを経時的に示す。
【図１２】様々な処置群における、原発性腫瘍の不完全除去に起因する、原発性腫瘍の再成長の頻度を示す。
【図１３】不活性化全細胞ワクチンが投与された群において、マウスの生存が増強されたことを示す生存曲線である。マウスは、瀕死（即ち、体重減少＞１０％、発作、可動性減少、だらしのない外見など）時、安楽死させた。対照群及びアジュバント群の生存中央値が１７．５日である一方で、不活性化全細胞ワクチン処置群は２４日であった。生存におけるこの差は、統計学的に有意でなかった（ｐ＝０．１）が、生物学的に重要であり、４Ｔ１腫瘍の侵襲性が示された。
【図１４】実施例３に記載の通り、腫瘍サイズの倍加時間を示すグラフである。倍加時間は、不活性化全細胞ワクチンで処置されたマウスにおいてより長かった（ｐ＝０．０１）。
【図１５】皮下ルイス肺がん腫瘍（ＬＬＣ）を有し、ＰＢＳ対照又は不活性化ＬＬＣワクチンで処置されたマウスの、腫瘍注射後３、５、７、１０、１３、及び１９日目の腫瘍成長面積を示すグラフである。腫瘍細胞注射後１３日目（ｐ＝０．０２）及び１９日目（ｐ＝０．００１）、腫瘍成長は、不活性化ＬＬＣワクチンでワクチン接種されたマウスにおいて有意に減少した。
【図１６】ＬＬＣ試験からの対照及びワクチン接種マウスから得られた腫瘍内のＴ細胞のサブタイプを示すグラフである。図１６Ａは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（推定上のＴ制御性Ｔ細胞）又はＣＤ８＋ＣＤ２５＋のいずれかであったＴ細胞のパーセントを示す。ワクチン接種マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞において有意な減少が認められた。図１６Ｂは、免疫抑制性タンパク質ＰＤ−１、Ｌａｇ３又はＴｉｍ３を発現するパーセントＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図１６Ｃは、免疫抑制性タンパク質ＰＤ−１、Ｌａｇ３又はＴｉｍ３を発現するパーセントＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。図１６Ａ〜Ｃで示される各データセットにおいては、対照は左側に示され、ワクチンは右側に示される。
【図１７】（４Ｔ１マウス腫瘍細胞に由来する）不活性化全細胞ワクチンと様々な免疫アジュバントとでワクチン接種及び追加免疫された健常なナイーブＢ６マウスから脾細胞が単離された後のＩＦＮｇの産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。次に、インビトロで脾細胞が不活性化４Ｔ１腫瘍細胞で７２時間再刺激され、ＩＦＮｇがＥＬＩＳＡにより測定された。ＣＬＤＣアジュバント系は、最良のＩＦＮｇ応答を生成した。
【図１８】４Ｔ１生細胞に結合する、図１７に示されるマウスの血液由来の、１：１０００希釈での血清ＩｇＧ抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ワクチン／アジュバント系のすべてが、対照又は不活性化細胞単独よりも有意に高い結合性をもたらした。
【図１９】マウスに４Ｔ１乳房腫瘍細胞が注射され、次に外科的に除去され、不活性化全細胞ワクチンを作製するために用いられた後、肺における転移性疾患がＩＶＩＳイメージングを用いて定量化された実験の結果を示す。右パネルに示されるマウスは、不活性化全細胞ワクチンで処置され、左パネルに示されるマウスは、いずれのワクチンも投与されなかった。発光におけるスケールバーもまた提示される。ワクチン接種を受けたマウスの６２％が、同様の時点で肺転移について陰性であり、未処置マウスの８０％が、腫瘍細胞除去後１６日目、肺腫瘍を発現していた。
【図２０】ＵＶ光及びリボフラビンを用いて細胞を不活性化し、ワクチン組成物を調製し、それを必要とする患者を治療するための代表的スキームを示す。
【図２１】ＵＶ＋Ｒｆ（ＵＶ光＋リボフラビン）不活性化後のマウスＬＬＣ細胞の細胞表面染色を示す。
【図２２】ＵＶ＋Ｒｆ不活性化後のマウス４Ｔ１乳がん細胞の表面染色を示す。
【図２３】生体外でのＵＶ＋ＲＦ又はγ線いずれかによる不活性化後のマウスメラノーマＧＦＰ＋Ｂ１６腫瘍細胞のＧＦＰ発現を示す。
【図２４】マウス結腸がん、ＣＴ２６、腫瘍細胞のＵＶ＋Ｒｆ不活性化後のマウス腫瘍関連抗原ｇｐ７０の発現を示す。
【図２５】ＵＶ＋Ｒｆ不活性化の１時間後及び４８時間後の、不活性化された生体外イヌ腫瘍組織の表面タンパク質染色を示す。細胞は、不活性化後、４℃で４８時間維持された。
【図２６】２つの追加的な生体外イヌ腫瘍組織のＵＶ＋ＲＦ不活性化を示す。
【図２７】表面マーカーＧＬＵＴ１についての不活性化されたヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２の染色を示す。不活性化細胞は左パネルに示され、生細胞は右パネルに示される。以下のチャートは、ＨｅｐＧ２細胞が表面マーカーＧＬＵＴ１及びＨＬＡ１について染色されたときの抗体陽性細胞及び抗体陰性細胞のパーセントを示す。
【図２８】処置を受けなかった４Ｔ１腫瘍保有マウスの脾臓由来のＴ細胞の増殖を示す。Ｔ細胞は、不活性化された４Ｔ１腫瘍細胞とともに培養されたとき、生体外で増殖した。
【図２９】不活性化後の様々な時点における、培養下での不活性化された４Ｔ１マウス乳がん細胞の増殖の欠如を示す。
【図３０】不活性化されたヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２の増殖の欠如（左パネル）並びにＨｅｐＧ２及びヒト結腸がん細胞ＣＲＬ−２５７７の増殖の欠如についてのデータ（右パネル）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＵＶ光及びリボフラビンを用いて、細胞を不活性化し、それらの複製を阻止するための方法が本明細書に提供される。この化学プロセスは、細胞内に存在するＤＮＡ／ＲＮＡに特異的である。したがって、細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡが修飾される一方で、該プロセスにおいてタンパク質（細胞表面抗原、酵素などを含む）は非接触のままである。細胞の抗原及び表現型を保存しつつ複製プロセスを阻止することにより、処理されたがん細胞調製物は、ワクチン組成物として使用可能である。抗原がワクチン組成物の細胞上にその天然状態で存在するという事実により、免疫応答が、同じ応答を誘発するように意図された単一の抗原又はタンパク質製剤で認められたレベルを超える程度に増強されることがある。不活性化全細胞とアジュバントとの組み合わせにより、この免疫学的効果がさらに増強される。
【００１２】
この技術は、自家又は同種の方法で、即ち、患者から単離された腫瘍細胞、がん幹細胞製剤、又は培養系下で成長したものなどを用いて利用可能である。患者に投与されるとき、全細胞ワクチンは、腫瘍成長を低減し、転移を減少させ、生存期間を延長する。
【００１３】
したがって、本明細書に記載の技術は、がん細胞ワクチンを単離し、調製し、患者に投与し、標準の化学療法剤の使用と競合する患者における応答を生成するための迅速な方法を提供する。
【００１４】
特段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の発明を実施するための形態にて用いられる用語法は、あくまで特定の実施形態を説明することを目的とし、限定することが意図されていない。
【００１５】
定義
以下の用語は、本明細書中の説明及び貼付の特許請求の範囲の中で用いられる。
【００１６】
単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特段明示しない限り、同様に複数形を含むことが意図される。
【００１７】
さらに、用語「約」は、本明細書で用いられるとき、例えば、量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指すとき、特定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又はさらに±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００１８】
さらに、本明細書で用いられるとき、「及び／又は」は、関連する列挙項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、並びに選択肢（「又は」）において解釈されるとき、組み合わせの欠如を指し、包含する。
【００１９】
文脈上特段指示がない限り、本明細書に記載の様々な特徴を任意の組み合わせにおいて用いることができることが具体的に意図される。
【００２０】
本明細書で用いられるとき、用語「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低減する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低減」及び類似用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３５％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％又はそれ以上の減少を意味する。
【００２１】
本明細書で用いられるとき、用語「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強」及び類似用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％又はそれ以上の増加を示す。
【００２２】
用語「処理、処置（ｔｒｅａｔ）」、「処理、処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「〜の処理、処置」（及びそれらの文法的バリエーション）は、患者の状態の重症度が低減されるか、少なくとも部分的に改善されるか、若しくは安定化されること、及び／又は少なくとも１つの臨床症状における一部の軽減、緩和、低減若しくは安定化が達成されること、及び／又は疾患若しくは障害の進行において遅延が認められることを意味する。
【００２３】
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」及び「予防」（及びそれらの文法的バリエーション）は、患者における疾患、障害及び／若しくは臨床症状の発症の予防及び／若しくは遅延、並びに／又は、疾患、障害及び／又は臨床症状の発症の重症度における、本開示の方法を伴わない場合に生じることと比べての低減を指す。予防は、完全、例えば、疾患、障害及び／又は臨床症状が全く生じないことであり得る。予防はまた、患者における疾患、障害及び／若しくは臨床症状の発生及び／又は発症の重症度が本開示の不在下で生じる場合に満たない程度に、部分的であり得る。
【００２４】
「治療有効量」は、本明細書で用いられるとき、疾患、又は疾患の臨床症状の少なくとも１つを治療するために患者に投与されるとき、疾患又はその症状のかかる治療に影響するのに十分である量を指す。「治療有効量」は、例えば、疾患及び／又は疾患の症状、疾患及び／又は疾患若しくは障害の症状の重症度、治療対象の患者の年齢、体重、及び／又は健康、並びに処方医師の判断に応じて変動してもよい。任意の所与の例における適量は、当業者によって確認される、又は日常の実験により測定可能である場合がある。
【００２５】
がんワクチン組成物
がんワクチン組成物が、本明細書に提供される。該組成物は、任意選択的にはアジュバントと組み合わせて、不活性化がん細胞を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。がん細胞は、それらのＤＮＡ及び／又はＲＮＡを修飾し、それらを複製不全にすることにより、不活性化される。細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの修飾により、細胞は殺滅されない、即ちがんワクチンは、複製が不活性化された生ワクチンである。細胞生存率が維持されることから、ワクチンは、生きた抗原標的を患者の免疫系に提示する。末梢接種は、原発性腫瘍及び転移に対する免疫応答を刺激する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、タンパク質タイプと表現型を保存しながら腫瘍細胞ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ複製を不活性化させる光化学プロセスを用いて不活性化されたがん細胞を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、がん細胞ワクチン中のがん細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡは、修飾塩基を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ワクチン中のがん細胞のＤＮＡは、修飾グアニン塩基、例えば酸化グアニン塩基を含んでもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、自家がん細胞である。本明細書で用いられるとき、「自家」は、ワクチンが投与される同じ患者から除去又は誘導された細胞を指す。いくつかの実施形態では、がん細胞は、同種細胞である。本明細書で用いられるとき、「同種」は、ワクチンが投与される患者でないドナーから除去又は誘導された細胞を指す。
【００２８】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、１つ以上のタイプのがんを患っている患者に由来する。例えば、がん細胞は、がんを患っている患者から単離又は誘導されてもよい。がんは、固形腫瘍又は液体腫瘍であってもよい。がん細胞は、原発性腫瘍、又は転移性腫瘍から単離又は誘導されてもよい。がんは、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はステージＩＶであってもよい。いくつかの実施形態では、がん細胞は、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、婦人科がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、膵がん、結腸がん、又は血液がんを患っている患者から誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、皮膚がんは、メラノーマである。いくつかの実施形態では、血液がんは、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ球性白血病又は急性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態では、骨髄腫は、多発性骨髄腫である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、不死化がん細胞株から誘導される。本明細書で用いられるとき、「がん細胞株」は、がんサンプルから誘導される形質転換細胞株を指す。通常、がん細胞株は、適切な宿主への外植時、腫瘍を生成する能力がある。がん細胞株は通常、インビトロで、例えば分化の消失、接触阻害の消失を含む、その由来元であるがんに共通した特性を保持し、インビトロで本質的に無制限の細胞分裂を経ることになる。がん細胞株は、例えば細胞が抗原提示細胞を介してより十分に認識されることを可能にするタンパク質を発現するように遺伝子組換えされている細胞株を含んでもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、がん幹細胞である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、該細胞は、非がん性であるが異常な成長、即ち良性の腫瘍又は成長から誘導される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、白血球（例えば、腫瘍関連マクロファージ）、腫瘍関連内皮細胞、腫瘍関連線維芽細胞、又は腫瘍微小環境下に存在する任意の他の細胞型を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、がんワクチン組成物は、アジュバントをさらに含む。アジュバントの効果は、免疫学的応答を追加免疫することである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、単球機能を修飾する。
【００３４】
好適なアジュバントの例として、サポニン製剤、ビロソーム、ウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを有する免疫刺激オリゴヌクレオチド）、ミネラル含有組成物、油エマルジョン、ポリマー、ミセル形成アジュバント（例えば、リポソーム）、免疫賦活性複合体マトリクス（例えば、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、粒子、スクアレン、リン酸塩、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体（ＣＬＤＣ）、ＤＤＡ、ＤＮＡアジュバント、γ−インスリン、ＡＤＰリボシル化毒素、ＡＤＰリボシル化毒素の無毒化誘導体、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ポリＩＣ、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、イミキモド、アジュバント系ＡＳ０１、アジュバント系ＡＳ０２、アジュバント系ＡＳ０３、ＭＦ５９（登録商標）、及びアルミニウム又はアルミニウム塩（例えば、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム）が挙げられる。他の好適なアジュバントとして、ＴＬＲアゴニスト、ＮＯＤアゴニスト、及び脂質−ＤＮＡアゴニスト複合体が挙げられる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、がんワクチン組成物は、１つ以上のアゴニスト又はアンタゴニストをさらに含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、アゴニストは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、又はＴＬＲ１２のアゴニストである。特定の実施形態では、アゴニストは、ＴＬＲ３及び／又はＴＬＲ９アゴニストである。
【００３７】
いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、Ｃ−Ｃケモカイン受容体２型（ＣＣＲ２）アンタゴニストである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）、例えばロサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、アジルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、又はバルサルタンである。いくつかの実施形態では、ＡＲＢは、約５〜約１００ｍｇ／ｋｇの間、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、又は約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＴＬＲアゴニスト、ＣＣＲ２アンタゴニスト及びＡＲＢの少なくとも１つ（即ち、１つ、２つ、又は３つすべて）を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニスト（例えば、ＴＬＲ３及び／又はＴＬＲ９アゴニスト）は、リポソーム中に含有されるか又はリポソームに共役される。リポソームは、両親媒性脂質からなる球状の自己閉鎖小胞である。リポソームは、１つの脂質二重層膜を有する単層、又は２以上の同心円状に配置された二重層を有する多重層であってもよい。好適なリポソームは、約２００〜５００ｎｍの選択された平均粒径（直径）を有してもよい。リポソームを調製する様々な方法及びその中への治療薬のカプセル封入については、十分に文書化されている（例えば、米国特許第３，９３２，６５７号明細書、米国特許第４，３１１，７１２号明細書、及び米国特許第５，０１３，５５６号明細書を参照（それらのすべては参照により本明細書中に援用される））。公知の方法は、参照により本明細書中に援用される米国特許第４，２３５，８７１号明細書に記載のような逆相蒸発法を含む。
【００４１】
本明細書に記載のリポソームの形成に用いられる脂質は、２つの炭化水素鎖、典型的にはアシル鎖及び極性頭部基を有する小胞形成脂質を含む。このクラスには、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）が含まれ、ここで２つの炭化水素鎖は、典型的には約１４〜２２の間の炭素原子長であり、不飽和を様々な度合いで有する。脂質及び比率の選択は、所望される柔軟性又は剛性の度合いを達成する、安定性を制御する、且つ／又は封入薬剤の放出速度を制御するため、変更され得る。２以上の脂質タイプが用いられる場合、安定なリポソームを形成するため、適量の比較的不飽和な脂質（ＰＣなど）が用いられてもよい。一実施形態では、リポソームを形成するために用いられる脂質の少なくとも４５〜５０モル％は、ＰＣである。
【００４２】
リポソームはまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含んでもよい。好適な親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド、及び親水性ペプチド配列を含む。親水性ポリマーで誘導体化された脂質を調製する方法は公知である（例えば、米国特許第５，３９５，６１９号明細書を参照（参照により本明細書中に援用される））。
【００４３】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体（ＣＬＤＣ）を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、リボフラビン（ビタミンＢ２）などの光増感剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、光増感剤を実質的に含まない。
【００４５】
いくつかの実施形態では、がんワクチン組成物は、担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞及び／又は光増感剤は、担体中に懸濁される。いくつかの実施形態では、担体は、正常な生理食塩水（例えば、０．９％塩化ナトリウム）、ブドウ糖食塩水（例えば、０．９％塩化ナトリウム中のブドウ糖５％）、リン酸緩衝食塩水（例えば、１３７ミリモル／ＬのＮａＣｌ、２．７ミリモル／ＬのＫＣｌ、１０ミリモル／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、２ミリモル／ＬのＫＨ２ＰＯ４）を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、がんワクチン組成物は、当業者に周知の１つ以上の追加的な薬学的に許容できる成分、例えば限定はされないが、薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、フィラー、緩衝液、保存剤、抗酸化剤、滑沢剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば、浸潤剤）、マスキング剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤をさらに含む。好適な担体、希釈剤、賦形剤などは、標準的な薬学テキスト中に見出すことができる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ｅｄｓ．Ｍ．Ａｓｈ  ａｎｄ  Ｉ．Ａｓｈ），２００１（Ｓｙｎａｐｓｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４を参照のこと。
【００４７】
がん細胞ワクチンを作製する方法
本明細書に記載のがん細胞ワクチンは、抗原タンパク質構造を保ちながら細胞複製プロセスを阻止する選択的プロセスにおいて無害な化学薬品を用いて作製される。より詳細には、がん細胞ワクチンは、がん細胞を複製欠損にする一方で、処理される細胞及びタンパク質の他の生物学的機能を保持するための光増感剤と光との組み合わせ適用により作製される。がん細胞ワクチンの作製及び使用のための例示的なスキームが図２０に示される。本開示のがんワクチンを作製するためのプロセスが以下に詳述される。
【００４８】
最初にがん細胞が準備される。がん細胞は、自家、即ち、ワクチン接種されるべき対象から除去又は誘導されたものであってもよい。いくつかの実施形態では、がん細胞は、同種であってもよい。がん細胞はまた、がん細胞株から誘導されてもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、がん幹細胞である。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、白血球（例えば、腫瘍関連マクロファージ）、腫瘍関連内皮細胞、腫瘍関連線維芽細胞、又は腫瘍微小環境下で存在する任意の他の細胞型を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、不活性化中の単一の細胞懸濁液として提供される。いくつかの実施形態では、該細胞は、不活性化中に培地に懸濁される。使用してもよい例示的培地として、限定はされないが、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、ハムＦ１２、Ｍｅｄｉａ  １９９、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５１】
次いで、がん細胞は、光化学技術を用いて不活性化される。これは、電子移動剤として作用し得る光増感剤を用いて達成される。ＤＮＡ又はＲＮＡ構築物中のグアニン塩基の近傍に、励起状態に置くことができる光増感剤を適用することにより、これら塩基の選択的修飾（例えば、酸化、架橋、断片化、脱アミノ化）が可能になる。電子化学反応が専ら短い距離にわたって生じ得ることから、所望される化学反応を実施するため、光増感剤は核酸と結合又は会合（即ちインターカレート）される必要がある。
【００５２】
いくつかの実施形態では、光増感剤は、フラビン、例えば、リボフラビン（ビタミンＢ２）、フラビンモノヌクレオチド、又はフラビンアデニンジヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、光増感剤は、第三級脂肪族アミン（例えば、１，４−ジアザビシクロ（２，２，２）オクタン）、ピペラジン、（例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸及び１，４−ジメチルピペラジン）、アミノ酸（例えば、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン）、酵素（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）又はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）である。いくつかの実施形態では、光増感剤は、リボフラビンである。
【００５３】
該細胞は、光増感剤（例えばリボフラビン）を含有する溶液に添加される、又は光増感剤は、該細胞を含有する溶液（例えば、培地中の該細胞の単一細胞懸濁液）に添加される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、不活性化中に用いられる光増感剤の濃度は、約１０μＭ〜約１００μＭ、例えば、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０μＭ、約５５μＭ、約６０μＭ、約６５μＭ、約７０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約８５μＭ、約９０μＭ、約９５μＭ、又は約１００μＭである。いくつかの実施形態では、溶液は、光増感剤を、約１μＭ〜約５０μＭ、例えば、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、又は約５０μＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、光増感剤濃度は、約１０μＭ未満、例えば約９μＭ未満、約８μＭ、約７μＭ、約６μＭ、約５μＭ、約４μＭ、約３μＭ、約２μＭ、又は約１μＭである。
【００５５】
次に、光増感剤及び細胞（任意選択的には培地中）を含有する溶液は、光処理を受ける。光処理は、可視光、紫外線、及び／又は赤外光による処理を含んでもよい。光処理は、がん細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、これら核酸の塩基を修飾することにより不活性化する。いくつかの実施形態では、グアニン塩基は、選択的に修飾される。いくつかの実施形態では、グアニン塩基は、選択的に酸化される。酸化されたグアニン塩基は、天然酵素及び細胞修復機構により修復することができない。そのように、誘導された改変の、細胞が複製する能力を回復させることになる形態への復帰への可能性はない。
【００５６】
いくつかの実施形態では、光処理は、紫外（ＵＶ）光による処理を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。ＵＶ光は、ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ、又はＵＶ−Ｃ光であってもよい。ＵＶ光は、１７０〜４００ｎｍ、例えばそれらの間の全範囲及び部分範囲の波長を有してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＵＶ光は、３１５〜４００ｎｍ、３１０〜３２０ｎｍ、２８０〜３６０ｎｍ、２８０〜３１５ｎｍ、又は１８０〜２８０ｎｍの波長を有する。ＵＶ光は、当該技術分野で公知のＵＶ光源、例えばＭｉｒａｓｏｌ（登録商標）ＰＲＴ照明装置（ＴｅｒｕｍｏＢＣＴ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）により供されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、複数の波長の光で同時に処理されてもよい。
【００５７】
特定の実施形態では、リボフラビンが光増感剤として用いられるとき、３１０〜３２０ｎｍの波長を有するＵＶ光が用いられる。発明者は、この波長が、リボフラビンが自由溶液中で反応し、その結果、望ましくない酸素フリーラジカルを生成することを阻止することを判定している。これらの波長で、リボフラビンは、核酸にインターカレートされるとき、選択的に反応することになる。
【００５８】
ＵＶ光の線量は、処理されている溶液の体積に応じて変動してもよい。例えば、ＵＶ光の線量は、約１７０〜３７０ｍｌの溶液の体積に対して、２００〜４００ジュールの間（例えば３００ジュール）であってもよい。当業者によって理解されるであろうが、処理対象の体積がこの範囲を上回る又は下回る場合、該線量は上方又は下方に調節されてもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＵＶ光の線量は、約２００ジュール〜約６００ジュール、例えば、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、又は約６００ジュールであってもよい。いくつかの実施形態では、発光のためのがん細胞製剤の体積は、約２００ｍｌ〜約６００ｍｌ、例えば、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、又は約６００ｍｌであってもよい。いくつかの実施形態では、ＵＶ光の線量は、約０．５Ｊ／ｍｌ〜約３．０Ｊ／ｍｌであってもよい。例えば、ＵＶ光の線量は、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、又は約３．０ジュール／ｍｌであってもよい。
【００６０】
該細胞は、ＵＶ光で約１分〜約６０分、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、又は約６０分にわたり処理されてもよい。いくつかの実施形態では、該細胞は、ＵＶ光で約１分〜約１０分間、約１分〜約５分間、又は約１分〜約３分間処理される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、細胞に光処理を施す前、光増感剤（例えばリボフラビン）を含有する溶液中で所定期間にわたりプレインキュベートされる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、該細胞は、光処理後、いかなる追加的な精製又は修飾ステップを受けない。他の実施形態では、がん細胞は、光処理後、単離／又は洗浄される。例えば、該細胞は、光処理後、ペレット化され、任意選択的には洗浄されてもよい。細胞をペレット化及び／又は洗浄することにより、光増感剤（例えばリボフラビン）が該組成物から実質的に除去されてもよい。いくつかの実施形態では、がん細胞は、光処理後、濃縮される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、光処理後、上記のような１つ以上の追加的な薬学的に許容できる成分と再懸濁されるか、又は組み合わされる。いくつかの実施形態では、がん細胞は、光処理後、アジュバントを含む溶液中に再懸濁される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、細胞は、光処理後、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日間、生存可能性を維持する。いくつかの実施形態では、該細胞は、処理後の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日目、（例えばアポトーシス機構により）死滅する。
【００６５】
この方法を用いて作製された細胞は、複製プロセスの能力がないが、処理中の元の天然細胞又は抗原の抗原及びエピトープ特性を実質的に維持し、保存する。いくつかの実施形態では、不活性化プロセスは、がん細胞の代謝過程、表現型、又は構造を実質的に改変しない。例えば、いくつかの実施形態では、不活性化プロセスは、がん細胞内での細胞表面マーカーの発現を実質的に改変しない。いくつかの実施形態では、不活性化プロセスは、細胞内でのＥｐＣＡＭ、ＣＤ３８、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ４４、ＣＤ２４、Ｓｃａ１、ＨＬＡ、Ｇｌｕｔ１、ＭＨＣクラスＩ、ＰＤＬ−Ｌ１、ＣＤ４５、ｇｐ７０、ＧＦＰ及び／又はＣＤ９０などの細胞表面マーカーの発現レベルを実質的に改変しない。いくつかの実施形態では、不活性化プロセスは、細胞の細胞膜及び核膜の完全性を損なわない。
【００６６】
細胞が複製不全であるという事実により、疾患（がん）の天然形態又は腫瘍性病変の形成に関与する体内の改変細胞組成物に対する保護がなされる。したがって、化学物質の特異性が抗原特性及び細胞完全性を保存し、その天然状態におけるタンパク質構造を維持することから、このプロセスによって生成される不活性化細胞は、改善された供給源を抗原提示にもたらす。
【００６７】
治療方法
本明細書に記載のがん細胞ワクチン組成物は、がん患者における免疫応答を育成する免疫系のプライミング及び認識のためのワクチン剤又は刺激剤として用いることができる。この標的療法は、化学療法又は放射線などの伝統的治療と比べて、副作用の低減をもたらす。特に、ワクチンのがん細胞が正常な表現型を維持することから、それらが望まれない副作用を誘導する可能性は、極めて低いか又は存在しない。
【００６８】
いくつかの実施形態では、がん細胞ワクチンは、患者におけるがんを治療又は予防するため、患者に投与されてもよい。治療又は予防されるがんは、固形腫瘍又は液体腫瘍であってもよい。例えば、治療又は予防されるがんは、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、婦人科がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、膵がん、結腸がん、又は血液がんであってもよい。いくつかの実施形態では、皮膚がんは、メラノーマである。いくつかの実施形態では、血液がんは、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ球性白血病又は急性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態では、骨髄腫は、多発性骨髄腫である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、患者における非がん性であるが異常な成長、即ち良性腫瘍又は成長を治療又は予防するため、患者に投与されてもよい。大部分の良性腫瘍／成長が手術により治療可能である一方で、一部は、手術が不可能であり且つ／又は放射線が適切でない可能性がある位置に存在する。治療されてもよい非がん性成長の例として、限定はされないが、アデノーマ、線維腫、神経腫、血管腫、脂漏性角化症、黒色丘疹性皮膚病症、及び皮脂腺過形成が挙げられる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、患者は、がんワクチンの投与前、免疫機能及び免疫状態について評価される。かかる評価は、限定はされないが、ＤＴＨ皮膚試験、血液検査、リンパ節吸引検査、腫瘍組織検査、及び／又は患者がアネルギー性か否かの判定、Ｂ細胞応答性などを含んでもよい。いくつかの実施形態では、患者は、がんワクチンの投与前、免疫機能及び免疫状態について評価されない。
【００７１】
いくつかの実施形態では、患者は、免疫適格性であってもよい。他の実施形態では、患者は、易感染性であってもよい。任意選択的には、ワクチンは、免疫応答者、又は免疫非応答者の程度を定量するため、遺伝子検査と併用されてもよい。
【００７２】
がんワクチン組成物中の細胞の適切な数が患者間で変化し得ることは当業者によって理解されるであろう。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、約１×１０３、約１×１０４、約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、又は約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、約１×１０５〜約１×１０８個の細胞を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、１回投与あたり、約１×１０５〜約１×１０８個の細胞が、患者に投与される。例えば、１回投与あたり、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６、約５×１０６、約１×１０７、約５×１０７、又は約１×１０８個の細胞が、患者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、投与用量は、分割用量であり、ここで投与用の細胞の総数は、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の部分用量に分割される。１つ以上の部分用量は、患者の身体上の異なる位置で、末梢性に患者に投与されてもよい。各部分用量はほぼ同時点に投与されてもよい、又は部分用量の投与は時間をずらしてもよい。例えば、部分用量は、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、又は３時間の間隔で投与されてもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、患者に、１回、又は２回以上投与される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、患者に、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又は１０回投与される。
【００７５】
がんワクチンは、患者に、毎日、約３日ごと、約７日ごと、約１４日ごと、月に約１回、又は年に約１回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、週に少なくとも１回、少なくとも２週ごと、又は６か月ごとに少なくとも１回投与される。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、年に、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１２回、１５回、２０回、又は２５回投与される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、第１のがんワクチン及び第２のがんワクチンが患者に投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答を増強するため、第２のがんワクチンが第１のがんワクチンの後に投与される。いくつかの実施形態では、患者における免疫応答及び／又は腫瘍成長は、第１のワクチンの投与と第２のワクチンの投与との間に監視される。いくつかの実施形態では、第２のがんワクチンは、患者が第１のワクチンの投与後に十分な免疫応答を示していないと判定されるとき、又は腫瘍が第１のワクチンの投与後に成長若しくは転移し続けていると判定されるとき、投与される。いくつかの実施形態では、第１のがんワクチン及び第２のワクチンは、第１の腫瘍抽出物から単離又は誘導された細胞を含む。例えば、第１及び第２のワクチンを作製するため、患者から除去された腫瘍を用いてもよく、第１のワクチンの投与後、第２のワクチンは後の使用のために貯蔵される。いくつかの実施形態では、第１のワクチン及び第２のワクチンは、別々の腫瘍抽出物から単離又は誘導された細胞を含む。例えば、第１のワクチンを作製するため、患者から除去された腫瘍を用いてもよく、腫瘍の再発又は転移後、第２のワクチンを作製するため、反復性腫瘍又は転移性腫瘍が除去され、用いられる。
【００７７】
がんワクチンは、患者に、筋肉内、粘膜内、鼻腔内、皮下、腫瘍内、皮内、経皮、腟内、腹腔内、直腸内、関節内若しくはリンパ内、経口又は静脈内送達されてもよい。いくつかの実施形態では、投与は、舌下、頬側、臓器内（例えば、脾臓内）、又は吸入経路を介してもよい。静脈内、皮膚若しくは皮下注射、又は腫瘍部位への注射においては、がん細胞ワクチンは、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容できる水溶液の形態であってもよい。当業者は、好適な溶液を、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張媒体を用いて、十分に調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を含めてもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、患者に末梢投与される。いくつかの実施形態では、がんワクチンの複数のアリコートが、患者に、異なる位置にて末梢投与される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ワクチン増強剤と同時に又は連続的に（前又は後のいずれか）投与される。いくつかの実施形態では、ワクチン増強剤は、アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）又はβ遮断薬（ＢＢ）である。例示的なワクチン増強剤として、ロサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、アジルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、バルサルタン、プロプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、カルベジロール、エスモロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロールが挙げられる。いくつかの実施形態では、ワクチン増強剤は、ロサルタン及びプロプラノロールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ワクチン増強剤は、ロサルタンである。いくつかの実施形態では、ワクチン増強剤は、プロプラノロールである。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチン接種プロトコルは、不活性化された生がん細胞、並びにリポソームに付着されたＴＬＲ３及び／又はＴＬＲ９アゴニストを含む強力なアジュバントを含むがん細胞ワクチン組成物を投与することを含み、ワクチン接種時又はその前後に投与され、免疫抑制性骨髄系細胞の動員を低減する、ワクチン増強剤（例えばロサルタン）の連続又は同時投与をさらに含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチン接種プロトコルは、不活性化された生がん細胞を含むがん細胞ワクチン組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。アジュバントは、任意選択的にはワクチン接種時に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、アジュバントは、免疫応答を増強するため、ワクチン接種後、例えば、ワクチン接種後の約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、又は約７２時間に投与される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、リポソーム、例えばＣＬＤＣを含む。いくつかの実施形態では、ロサルタンなどのワクチン増強剤は、ワクチン接種時又はその前後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ロサルタンなどのワクチン増強剤は、ワクチン接種後、例えば、ワクチン接種後の約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、又は約７２時間に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ロサルタンなどのワクチン増強剤は、任意選択的にはワクチンが投与される日からの治療的に有効な日数にわたって毎日、患者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン増強剤（例えば、ロサルタン）は、約５〜約１００ｍｇ／ｋｇの間、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、又は約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、治療により、腫瘍の成長又は再成長が、ワクチン未接種の患者における腫瘍成長と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％低減される。いくつかの実施形態では、治療により、患者の生存が、ワクチン未接種の患者と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％延長される。いくつかの実施形態では、治療により、転移の発生率が、ワクチン未接種の患者と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％低減される。
【００８３】
がん細胞ワクチンは、患者における免疫応答を誘発することがある。いくつかの実施形態では、免疫応答は、（ｉ）免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の上方制御、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化（例えば、複数のがんネオ抗原にマッチする複数のＴ細胞の産生）、（ｉｉｉ）自然免疫細胞（例えば骨髄系細胞）の調節、及び（ｉｖ）「消耗」Ｔ細胞集団の回復、の１つ以上を含んでもよい。
【００８４】
好適な患者は、鳥類と哺乳類の双方を含む。用語「鳥類」は、本明細書で用いられるとき、限定はされないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコなどを含む。用語「哺乳類」は、本明細書で用いられるとき、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ類などを含む。ヒト対象は、新生仔、幼児、若年、成人及び老人対象を含む。用語「対象」及び「患者」は、本明細書中で互換可能に用いられる。
【００８５】
がん細胞ワクチンは、先行症状、例えば、放射線、化学療法、又は外科的切除などの他の治療法での治療を妨げることになった先行症状を有する患者に投与されてもよい。
【００８６】
併用療法
がん細胞ワクチンは、治療対象の状態に応じて、単独で又は他の治療／治療法と組み合わせて、同時に又は連続的に、投与されてもよい。治療及び治療法の例として、限定はされないが、化学療法（例えば薬剤、例えば化学療法剤を含む活性薬剤の投与）；手術；及び放射線療法が挙げられる。治療及び治療法のさらなる例として、免疫に基づく治療法、例えば抗体療法、養子細胞療法（ＡＣＴ）、及びワクチンに基づく治療法が挙げられる。いくつかの実施形態では、任意の残存する腫瘍細胞を除去するため、別の治療／治療法の後、本明細書に記載のがん細胞ワクチンが投与されてもよい。
【００８７】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、以下の治療法：チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１又はＰＤＬ−１阻害剤、抗体治療薬、遺伝子改変樹状細胞、又は遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）の１つ以上と組み合わせて投与されてもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、単独で又は化学療法剤と組み合わせて投与されてもよい。「化学療法剤」は、作用機構と無関係に、がんの治療において有用な化合物である。化学療法剤のクラスとして、限定はされないが、アルキル化剤、代謝拮抗薬、紡錘体毒植物アルカロイド、細胞傷害性／抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、光増感剤、及びキナーゼ阻害剤が挙げられる。化学療法剤は、「標的療法」及び通常の化学療法において用いられる化合物を含む。
【００８９】
好適な化学療法剤の例として、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標），Ｌｉｌｌｙ），ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９，Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（シス−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペントアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１，ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標），ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標），Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標），ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標），ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、Ａｋｔｉ−１／２、ＨＰＰＤ、及びラパマイシンが挙げられる。
【００９０】
化学療法剤のさらなる例として、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標），Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標），ＳＵ１１２４８，Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、国際公開第２００７／０４４５１５号パンフレット）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４，Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリニン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標），ＧＳＫ５７２０１６，Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標），ＳＣＨ６６３３６，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標），ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標），ＣＰＴ−１１，Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファルニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標），Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（クレモフォールフリー）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ，ＺＤ６４７４，ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｍｂｕｃｉｌ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンホスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標），Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標），ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；エチレニミン及びメチラメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシン及びビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフ���シン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、カリケアマイシンγ１Ｉ、カリケアマイシンωＩ１（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９４）３３：１８３−１８６）；ジネマイシン、ジネマイシンＡ；ビスホスホネート、クロドロネートなど；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、ネモルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補助剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブチル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシン及びアンサミトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モ��ダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ）；イバンドロン酸；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；並びに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸及び誘導体、が挙げられる。
【００９１】
さらに、「化学療法剤」の定義内に、（ｉ）腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン薬、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体修飾物質（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）；クエン酸タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフィン）；（ｉｉ）副腎におけるエストロゲン産生を制御する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタニエ（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；（ｉｉｉ）フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤（国際公開第２００７／０４４５１５号パンフレット）などのタンパク質キナーゼ阻害剤；（ｖ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ及びＨ−Ｒａｓ、例えばオブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標），Ｇｅｎｔａ  Ｉｎｃ．）；（ｖｉｉ）リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標））及びＨＥＲ２発現阻害剤；（ｖｉｉｉ）遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）などのトポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；（ｉｘ）ベバシズマブ（アバスチン（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの抗血管新生薬；並びに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸及び誘導体、が含まれる。
【００９２】
さらに、「化学療法剤」の定義内に、治療抗体、例えば、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標），Ｉｍｃｌｏｎｅ）；パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標），Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標），ＧＳＫ）、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（商標），ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標），２Ｃ４，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ，Ｃｏｒｉｘｉａ）、及び抗体薬剤コンジュゲートのゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）が含まれる。
【００９３】
本開示のワクチンと組み合わせた、化学療法剤として治療的可能性を有するヒト化モノクローナル抗体は、アレムツズマブ、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネオズマブ、ベバシズマブ、ビバツヅマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブ、及びビジリズマブを含む。
【００９４】
本発明の番号付けされた実施形態
１．複製する能力がない不活性化がん細胞を含む、がんワクチン組成物。
２．がん細胞が、１つ以上のタイプのがんを患っている患者に由来する、実施形態１のがんワクチン組成物。
３．患者が、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、婦人科がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、膵がん、結腸がん、及び血液がんの１つ以上を患っている、実施形態２のがんワクチン組成物。
４．皮膚がんが、メラノーマである、実施形態３のがんワクチン組成物。
５．血液がんが、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、実施形態３のがんワクチン組成物。
６．白血病が、急性リンパ球性白血病又は急性骨髄性白血病である実施形態５のがんワクチン組成物。
７．リンパ腫が、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である、実施形態５のがんワクチン組成物。
８．骨髄腫が、多発性骨髄腫である、実施形態５のがんワクチン組成物。
９．患者が、良性腫瘍を患っている、実施形態２のがんワクチン組成物。
１０．がんが、転移がんである、実施形態２のがんワクチン組成物。
１１．がん細胞が、不死化細胞株に由来する、実施形態１〜１０のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１２．がん細胞が、自家である、実施形態１〜１１のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１３．該細胞が、同種である、実施形態１〜１１のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１４．該組成物が、約１×１０５〜約１×１０８個のがん細胞を含む、実施形態１〜１３のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１５．がん細胞のＤＮＡが、修飾グアニン塩基を含む、実施形態１〜１４のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１６．該組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態１〜１５のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１７．アジュバントが、単球機能を修飾する、実施形態１６のがんワクチン組成物。
１８．アジュバントが、水酸化アルミニウムを含む、実施形態１６のがんワクチン組成物。
１９．アジュバントが、ＣＬＤＣを含む、実施形態１６のがんワクチン組成物。
２０．アジュバントが、ポリＩＣ、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、又はイミキモドを含む、実施形態１６のがんワクチン組成物。
２１．アジュバントが、リポソームを含む、実施形態１６のがんワクチン組成物。
２２．リポソームが、アゴニストにコンジュゲートされる、実施形態２１のがんワクチン組成物。
２３．アゴニストが、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９の少なくとも１つのアゴニストである、実施形態２２のがんワクチン組成物。
２４．薬学的に許容できる担体をさらに含む、実施形態１〜２３のいずれか一つのがんワクチン組成物。
２５．薬学的に許容できる担体が、正常な生理食塩水、ブドウ糖食塩水、又はリン酸緩衝食塩水である、実施形態２４のがんワクチン組成物。
２６．がん細胞が、光処理を用いて不活性化される、実施形態１〜２５のいずれか一つのがんワクチン組成物。
２７．光処理が、約１分〜約３分にわたって続く、実施形態２６のがんワクチン組成物。
２８．光処理により、がん細胞上の抗原タンパク質の構造が実質的に変化しない、実施形態２６又は２７のがんワクチン組成物。
２９．光処理により、がん細胞のＤＮＡが改変される、実施形態２６〜２８のいずれか一つのがんワクチン組成物。
３０．光処理により、がん細胞のＤＮＡ中のグアニン塩基が選択的に酸化される、実施形態２９のがんワクチン組成物。
３１．光処理により、がん細胞の代謝過程、表現型、又は構造が実質的に変化しない、実施形態２６〜３０のいずれか一つのがんワクチン組成物。
３２．光処理により、がん細胞における表面マーカーの発現又は活性が実質的に変化しない、実施形態２６〜３１のいずれか一つのがんワクチン組成物。
３３．光処理により、細胞におけるＥｐＣＡＭ、ＣＤ３８、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ４４、ＣＤ２４、Ｓｃａ１、ＨＬＡ、Ｇｌｕｔ１、ＭＨＣクラスＩ、ＰＤＬ−Ｌ１、ＣＤ４５、ｇｐ７０、ＧＦＰ又はＣＤ９０の発現レベルが変化しない、実施形態３２のがんワクチン組成物。
３４．光処理により、細胞の細胞膜又は核膜の完全性が損なわれない、実施形態２６〜３３のいずれか一つのがんワクチン組成物。
３５．光処理は、ＵＶ光による処理を含む、実施形態２６〜３４のいずれか一つのがんワクチン組成物。
３６．ＵＶ光が、１７０〜４００ｎｍの波長を有する、実施形態３５のがんワクチン組成物。
３７．ＵＶ光が、３１５〜４００ｎｍの波長を有する、実施形態３５のがんワクチン組成物。
３８．ＵＶ光が、３１０〜３２０ｎｍの波長を有する、実施形態３５のがんワクチン組成物。
３９．ＵＶ光が、２８０〜３６０ｎｍの波長を有する、実施形態３５のがんワクチン組成物。
４０．ＵＶ光が、２８０〜３１５ｎｍの波長を有する、実施形態３５のがんワクチン組成物。
４１．ＵＶ光が、１８０〜２８０ｎｍの波長を有する、実施形態３５のがんワクチン組成物。
４２．ＵＶ光が、１７０〜２００ｎｍの波長を有する、実施形態３５のがんワクチン組成物。
４３．ＵＶ光の線量が、約２００ジュール〜約６００ジュールである、実施形態３５〜４２のいずれか一つのがんワクチン組成物。
４４．ＵＶ光の線量が、約２００ジュール〜４００ジュールである、実施形態４３のがんワクチン組成物。
４５．ＵＶ光の線量が、約３００ジュールである、実施形態４４のがんワクチン組成物。
４６．光処理が、がん細胞を光増感剤の存在下で光に接触させることにより実施される、実施形態２６〜４５のいずれか一つのがんワクチン組成物。
４７．光増感剤の濃度が、約１μＭ〜約５０μＭである、実施形態４６のがんワクチン組成物。
４８．光増感剤の濃度が、約１０μＭ未満である、実施形態４６又は４７のがんワクチン組成物。
４９．光増感剤が、リボフラビンである、実施形態４６〜４８のいずれか一つのがんワクチン組成物。
５０．それを必要とする患者におけるがんを治療するための方法であって、実施形態１〜４９のいずれか一つのがんワクチン組成物を患者に投与することを含む、方法。
５１．がんワクチン組成物が、ワクチン増強剤と同時に又は連続的に投与される、実施形態５０の方法。
５２．ワクチン増強剤が、アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）又はβ遮断薬（ＢＢ）である、実施形態５１の方法。
５３．ワクチン増強剤が、ロサルタンである、実施形態５１又は５２の方法。
５４．ロサルタンの用量が、約５〜約１００ｍｇ／ｋｇの間である、実施形態５３の方法。
５５．ロサルタンの用量が、約６０ｍｇ／ｋｇである、実施形態５４の方法。
５６．ワクチン増強剤が、プロプラノロールである、実施形態５１又は５２の方法。
５７．がんワクチン組成物が、患者に１回投与される、実施形態５０〜５６のいずれか一つの方法。
５８．がんワクチン組成物が、患者に２回以上投与される、実施形態５０〜５６のいずれか一つの方法。
５９．がんワクチン組成物が、患者に２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回投与される、実施形態５８の方法。
６０．がんワクチン組成物が、患者に７日ごとに少なくとも１回投与される、実施形態５８又は５９の方法。
６１．がんワクチン組成物が、患者に１４日ごとに少なくとも１回投与される、実施形態５８又は５９の方法。
６２．がんワクチン組成物が、患者に６月ごとに少なくとも１回投与される、実施形態５８又は５９の方法。
６３．がんワクチン組成物が、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、舌下、頬側、吸入、皮内、腫瘍内、臓器内、経口、及び腹腔内から選択される経路により投与される、実施形態５０〜６２のいずれか一つの方法。
６４．がんワクチン組成物が、皮下注射により投与される、実施形態６３の方法。
６５．がんワクチン組成物が、静脈内注射により投与される、実施形態６３の方法。
６６．がんワクチン組成物が、筋肉内注射により投与される、実施形態６３の方法。
６７．患者が、免疫適格性である、実施形態５０〜６２のいずれか一つの方法。
６８．患者が、易感染性である、実施形態５０〜６２のいずれか一つの方法。
６９．処置により、腫瘍成長が、ワクチン未接種の患者における腫瘍成長と比べて少なくとも１０％低減される、実施形態５０〜６８のいずれか一つの方法。
７０．処置により、腫瘍成長が、ワクチン未接種の患者における腫瘍成長と比べて少なくとも２０％低減される、実施形態６９の方法。
７１．処置により、腫瘍成長が、ワクチン未接種の患者における腫瘍成長と比べて少なくとも５０％低減される、実施形態７０の方法。
７２．処置により、患者の生存が、ワクチン未接種の患者と比べて少なくとも１０％延長される、実施形態５０〜７１のいずれか一つの方法。
７３．処置により、患者の生存が、ワクチン未接種の患者と比べて少なくとも２０％延長される、実施形態７２の方法。
７４．処置により、患者の生存が、ワクチン未接種の患者と比べて少なくとも５０％延長される、実施形態７３の方法。
７５．処置により、患者におけるＩｇＧ及び／又はＩｇＭが上方制御される、実施形態５０〜７４のいずれか一つの方法。
７６．処置により、患者におけるＴ細胞が活性化される、実施形態５０〜７５のいずれか一つの方法。
７７．がんが、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、婦人科がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、膵がん、結腸がん、又は血液がんである、実施形態５０〜７６のいずれか一つの方法。
７８．皮膚がんが、メラノーマである、実施形態７７の方法。
７９．血液がんが、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、実施形態７７の方法。
８０．白血病が、急性リンパ球性白血病又は急性骨髄性白血病である、実施形態７９の方法。
８１．リンパ腫が、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である、実施形態７９の方法。
８２．骨髄腫が、多発性骨髄腫である、実施形態７９の方法。
８３．がんが、転移がんである、実施形態５０〜８２のいずれか一つの方法。
８４．がんワクチン組成物が、１つ以上の追加的な治療薬と組み合わせて患者に投与される、実施形態５０〜８３のいずれか一つの方法。
８５．１つ以上の追加的な治療薬が、チェックポイント阻害剤、抗体治療薬、遺伝子改変樹状細胞、遺伝子改変Ｔ細胞、及び化学療法剤からなる群から選択される、実施形態８４の方法。
８６．がんワクチンを作製するための方法であって、がん細胞をリボフラビンの存在下でＵＶ光と接触させることを含む、方法。
８７．ＵＶ光により、がん細胞のＤＮＡが改変される、実施形態８６の方法。
８８．ＵＶ光により、がん細胞のＤＮＡ中のグアニン塩基が選択的に酸化される、実施形態８７の方法。
８９．光処理により、がん細胞上の抗原タンパク質の構造が実質的に変化しない、実施形態８６の方法。
９０．ＵＶ光により、がん細胞の代謝過程、表現型、又は構造が実質的に変化しない、実施形態８６〜８９のいずれか一つの方法。
９１．ＵＶ光により、がん細胞における表面マーカーの発現又は活性が実質的に変化しない、実施形態８６〜９０のいずれか一つの方法。
９２．ＵＶ光により、細胞におけるＥｐＣＡＭ、ＣＤ３８、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ４４、ＣＤ２４、Ｓｃａ１、ＨＬＡ、Ｇｌｕｔ１、ＭＨＣクラスＩ、ＰＤＬ−Ｌ１、ＣＤ４５、ｇｐ７０、ＧＦＰ及び／又はＣＤ９０の発現レベルが実質的に変化しない、実施形態９１の方法。
９３．不活性化により、細胞の細胞膜及び核膜の完全性が損なわれない、実施形態８６〜９２のいずれか一つの方法。
９４．がん細胞が、リボフラビンの存在下でＵＶ光に約１分〜約３分にわたり接触される、実施形態８６〜９３のいずれか一つの方法。
９５．ＵＶ光が、１７０〜４００ｎｍの波長を有する、実施形態８６〜９４のいずれか一つの方法。
９６．ＵＶ光が、３１５〜４００ｎｍの波長を有する、実施形態８６〜９４のいずれか一つの方法。
９７．ＵＶ光が、３１０〜３２０ｎｍの波長を有する、実施形態８６〜９４のいずれか一つの方法。
９８．ＵＶ光が、２８０〜３６０ｎｍの波長を有する、実施形態８６〜９４のいずれか一つの方法。
９９．ＵＶ光が、２８０〜３１５ｎｍの波長を有する、実施形態８６〜９４のいずれか一つの方法。
１００．ＵＶ光が、１８０〜２８０ｎｍの波長を有する、実施形態８６〜９４のいずれか一つの方法。
１０１．ＵＶ光が、１７０〜２００ｎｍの波長を有する、実施形態８６〜９４のいずれか一つの方法。
１０２．ＵＶ光の線量が、約２００ジュール〜約６００ジュールである、実施形態８６〜１０１のいずれか一つの方法。
１０３．ＵＶ光の線量が、約２００ジュール〜約４００ジュールである、実施形態１０２の方法。
１０４．ＵＶ光の線量が、約３００ジュールである、実施形態１０３の方法。
１０５．がん細胞が、単一細胞懸濁液中に存在する、実施形態８６〜１０４のいずれか一つの方法。
１０６．リボフラビンが、単一細胞懸濁液に添加される、実施形態１０５の方法。
１０７．がん細胞が、細胞をＵＶ光に接触させる前、リボフラビンを含有する溶液中でプレインキュベートされる、実施形態８６〜１０６のいずれか一つの方法。
１０８．該溶液が、１０〜１００μＭのリボフラビンを含む、実施形態１０７の方法。
１０９．該溶液が、約１μＭ〜約５０μＭのリボフラビンを含む、実施形態１０７の方法。
１１０．該溶液が、約１０μＭ未満のリボフラビンを含む、実施形態１０７の方法。
１１１．薬剤として使用するための、実施形態１〜４９のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１１２．がんを治療するための薬剤として使用するための、実施形態１〜４９のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１１３．がんを治療する方法における使用のための、実施形態１〜４９のいずれか一つのがんワクチン組成物。
１１４．がんを治療するための薬剤の製造における、実施形態１〜４９のいずれか一つのがんワクチン組成物の使用。
１１５．がんが、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、婦人科がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、膵がん、結腸がん、又は血液がんである、実施形態１１１〜１１３のいずれか一つのがんワクチン組成物、又は実施形態１１４の使用。
１１６．皮膚がんが、メラノーマである、実施形態１１５のがんワクチン組成物又は使用。
１１７．血液がんが、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、実施形態１１５のがんワクチン組成物又は使用。
１１８．白血病が、急性リンパ球性白血病又は急性骨髄性白血病である、実施形態１１７のがんワクチン組成物又は使用。
１１９．リンパ腫が、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫である、実施形態１１７のがんワクチン組成物又は使用。
１２０．骨髄腫が、多発性骨髄腫である、実施形態１１７のがんワクチン組成物又は使用。
１２１．がんが、転移がんである、実施形態１１１〜１１３のいずれか一つのがんワクチン組成物、又は実施形態１１４の使用。
【実施例】
【００９５】
あくまで例示目的で本明細書に含まれる以下の実施例は、限定することを意図しない。
【００９６】
実施例１．腫瘍細胞株に由来する腫瘍細胞の不活性化
ＣＡＭＡ細胞（ヒト乳房腫瘍株）を、リボフラビンの存在下でＵＶ光処理を用いて不活性化した。細胞は、Ｍｉｒａｓｏｌ（登録商標）ＰＲＴ照明装置を１０％（１９０ジュール）、２０％（３８０ジュール）、３０％（５７０ジュール）、４０％（７６０ジュール）、５０％（９５０ジュール）又は１００％（１８９６ジュール）の照明強度で用いて処理した。ＵＶ光で処理しなかった細胞（生）は、対照として含めた。増殖（図１）、生存率（図２）、細胞表面マーカー発現（図３、図４、図５）、カスパーゼ活性（図６）、並びに細胞膜及び核膜の完全性について、（０日目）と、処理後の２、４、６、及び８日目に試験した。
【００９７】
図１に示すように、リボフラビン／ＵＶ光を用いた処理により、細胞は培養下で複製できなくなった。この効果は、たとえ１９０〜３８０ジュール（１０〜２０％の照明強度）程度に低い線量であっても、処理日に、直ぐに認められた。たとえそれらが不活性化されていたとしても、細胞は処理後、実質的に生存可能な状態を維持した（図３）。具体的には、該細胞は、インタクトで且つ代謝的・機能的な状態を維持した（図４）。４日後、アポトーシス機構による細胞死に合致し、カスパーゼ−３の濃度が有意に増加した（図６）。したがって、処理後、該細胞は、もはや増殖することなく、経時的に緩徐に死滅する。
【００９８】
細胞表面マーカー発現（ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３８）は、処理後、１９０〜３８０ジュール（１０〜２０％の照明強度）程度に低い線量から１８９６ジュール（１００％の照明強度）程度に高い線量にかけて、比較的一貫したレベルで維持された（図３、図５）。細胞生存率は、表面マーカー発現と正に相関した（図７）。これは、ＵＶ処理後、たとえ広範囲にわたるＵＶ線量であっても、免疫応答を生成するのに要求される細胞表面抗原を細胞が維持したことを示す。
【００９９】
このデータは、抗体産生を刺激するのに要求される細胞表面マーカータンパク質を損傷することなく不活性化細胞を調製するための動的な治療域を確立する。
【０１００】
実施例２．ワクチンの安全性：自家腫瘍細胞の不活性化及び健常試験マウスへの注射
ＰｙＭＴ腫瘍細胞を野生型Ｃ５７Ｂｌ６マウスに注射した。腫瘍が成長した後、腫瘍組織を収集し、がん細胞ワクチンを作製した。Ｃ５７Ｂｌ６マウス７匹から収集した全部で２×１０８個のＰｙＭＴ生体外腫瘍細胞を、（ｉ）２０％ウシ胎仔血清及びグルタミン（抗生物質なし）を添加したＤＭＥＭ培地２６５ｍｌと（ｉｉ）リボフラビン３５ｍｌとを含む溶液中に再懸濁した。該細胞を全体で３００ジュールの線量のＵＶ光で処理した。
【０１０１】
処理細胞の１×１０６個を培地中に置き、最適条件下でインキュベートした。培養下で１か月後、成長又は増殖の証拠は認められず、それは処理細胞における複製能力の１００％不活性化に対応した。
【０１０２】
加えて、全部で１０匹のＣ５７／Ｂｌ６マウスに、１×１０６個の不活性化細胞を皮下注射した。１週、２週及び３週後、追加的用量を投与した（全部で４用量、各投与に１×１０６個の細胞）。動物は、初回注射後１６０日間監視した。１６０日の監視期間中、いずれの試験対象においても腫瘍は認められず、注射の副作用は認められず、それは細胞の完全な不活性化に対応した。
【０１０３】
最後に、８匹の免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部に、１×１０６個の不活性化ＰｙＭＴ細胞を注射した。注射後５か月間、動物を監視した。この監視期間中、腫瘍成長は認められなかった。
【０１０４】
まとめると、これらのデータは、注射した細胞調製物について安全性の懸念がないことを示唆する。
【０１０５】
実施例３．ワクチンの有効性：乳がんを有する試験マウスへの不活性化された腫瘍細胞の注射により腫瘍成長が阻害される
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの乳房脂肪体に、２．５×１０５個の生存可能ＰｙＭＴ細胞を注射した。３日後、マウスを、生理食塩水（対照、ｎ＝１０）、不活性化された腫瘍細胞を有するワクチン（ｎ＝１０）、又は予め試験したライセートワクチン（陽性対照、ｎ＝６）のいずれかで処理した。ワクチンは、ＣＬＤＣアジュバント系（脂質＋ＴＬＲアゴニスト）と共混合した、１×１０６個の不活性化細胞／マウスを含み、麻酔下で両前肢に皮下投与した（典型的には１００〜１１０μｌ／肢）。さらにマウスに、ロサルタン（６０ｍｇ／ｋｇ）を、ワクチンを投与した日から、全部で３用量にわたり、１日１回で３日間、腹腔内注射により投与した。最後に、ワクチン投与の２４時間後、マウスにＣＬＤＣアジュバントの追加免疫を投与した（１００μｌ、腹腔内）。ワクチン接種は、全部で５回のワクチン／ロサルタン／ＣＬＤＣ追加免疫サイクルにわたり毎週反復した。ノギスを用いて、経時的に腫瘍成長を測定した（長さ×幅）。注射後２か月間にわたって認められた死亡率の程度も監視した。
【０１０６】
図８は、生理食塩水注射（対照、ワクチンなし）についての腫瘍成長曲線を、不活性化全細胞ワクチンを投与した場合とライセートワクチン（４Ｔ１  Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｖａｘ）を投与した場合と比較したものを示す。注射後２３日目に開始した、不活性化全細胞ワクチン群における腫瘍細胞成長において、未処理対照群に対して統計学的に有意な減少が認められた（２３日目にｐ＝０．０２、及び２５日目にｐ＜０．０００１）。
【０１０７】
図９は、全生存を示す。この実験では、最長の腫瘍直径が１５ｍｍを超えた時、マウスを安楽死させた。不活性化全細胞ワクチンを投与したマウスは、生理食塩水処置対照群と比べて有意に延長された生存期間を有した（ｐ＝０．００３８）。不活性化全細胞ワクチンを投与したマウスの全生存期間中央値は、２６日の対照と比べて３４日であった（約３０％の増加）。
【０１０８】
図１４は、倍加時間を示す。不活性化全細胞ワクチンで処置したマウスでは、腫瘍成長の倍加時間は、対照マウスと比べると有意により長かった（ｐ＝０．０１）。
【０１０９】
実施例４．ワクチンの有効性：侵襲性乳がんを有する試験マウスへの不活性化された腫瘍細胞の注射により、肺転移が減少し、腫瘍再成長が限局され、生存が増強される
４Ｔ１乳がんは、高度に腫瘍化され、浸潤性のある移植可能な腫瘍細胞株であり、大部分の腫瘍モデルと異なり、乳腺における原発性腫瘍からリンパ節、血液、肝臓、肺、脳及び骨を含む複数の遠隔部位に自発的に転移し得る。Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪体に、１×１０６個の４Ｔ１ルシフェラーゼ腫瘍細胞を注射した。注射の１１日後（平均腫瘍面積が５２ｍｍ２であったとき）、原発性腫瘍を測定し、次に外科的に除去した。手術中、マウス１匹が死亡した。残存するマウス２１匹を、手術前の腫瘍サイズに従い、平均腫瘍が等しいように大別した（図１０）。以下の群を決定した：ＰＢＳ（「対照」）、ｎ＝マウス５匹；アジュバント、ｎ＝マウス８匹；不活性化全細胞ワクチン、ｎ＝マウス８匹。
【０１１０】
次に、外科的に除去した腫瘍組織を、４℃で一晩、培地中に置いた。翌日、腫瘍組織を分割し、次にコラゲナーゼで処理した。細胞を濾過し、組織細片を除去し、次に定量化した。細胞の一部を用いて、第１のワクチンを作成した。マウスに、不活性化４Ｔ１腫瘍細胞（１．７×１０６個の細胞）＋アジュバントを週１回ワクチン接種し、ワクチン接種の２４時間後にアジュバントで追加免疫し、ワクチンを投与した日から、ロサルタンを３回の一日量として６０ｍｇ／ｋｇ供した。このサイクルは、毎週反復した。
【０１１１】
ＩＶＩＳ装置を用いてマウスを定期的に画像化し、転移性疾患の発生を検出した。マウスにルシフェリン１００μｌを注射し、次に１０分後、ＩＶＩＳを施した。ＩＶＩＳに基づくソフトウェアを用いて光子束数を計算し、群間比較した（図１１Ａ〜Ｂ）。
【０１１２】
原発性腫瘍の外科的除去の２４時間後から、マウスをＰＢＳ単独（対照）、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体（ＣＬＤＣ）及びロサルタン（アジュバント）、又は不活性化全細胞ワクチン（アジュバント＋ワクチン）で毎週処置した。ルシフェリン１００μｌの腹腔内注射後、ＩＶＩＳイメージングを用いて、肺における転移性疾患を定量化した（図１９）。図１１Ａに示すように、ワクチンで処置したマウスにおいて、アジュバント処置マウス（１４日目、ｐ＝０．０１５７）と比べて、また対照マウスとアジュバント処置マウスの双方（１６日目、各々、ｐ＝０．０１１９及びｐ＝０．００２１）と比べて、測定した転移性負荷における有意な減少が認められた。図１１Ｂは、各群中の各マウスの経時的な光子束データを示す。
【０１１３】
一部のマウスでは、不完全な切除に起因する原発性腫瘍の再成長が認められた。手術後１７日目、原発性再成長を有するマウスの数を記録した（図１２）。興味深いことに、不活性化全細胞ワクチンで処置したマウスにおいてそれらの原発性腫瘍の再成長を有したものは、他の処置群と比べてより少数であった。対照ではマウスの６０％、アジュバント単独群では６３％、また不活性化全細胞ワクチン群ではわずか３８％が、原発性腫瘍の再成長を有した。
【０１１４】
生存に対するワクチンの効果についても試験した。マウスは、罹患の徴候（体重の１０％以上の減少、低い活動性、てんかん発作など）を示した時、安楽死させ、手術後の日を評価した（図１３）。不活性化全細胞ワクチンで処置したマウスの生存期間中央値は、対照マウスにおける１８日、またアジュバント単独マウスにおける原発性腫瘍の外科的除去後の１７．５日と比べて、２４日であった。したがって、ワクチンでの処置により、生存中央値が約６日増加した。すべての群中のすべてのマウスが、最終的には転移性疾患に屈した。４Ｔ１転移性モデルが、極めて侵襲性であり、典型的には多くの従来の治療法に対して非応答性であることから、いずれの認められた効果は注目すべきである。
【０１１５】
実施例５．異なるマウスの腫瘍モデル（ＬＬＣ）における不活性化全細胞ワクチンの試験有効性
異なるマウスの腫瘍モデルにおける不活性化全細胞ワクチンの有効性を試験するため、健常Ｂ６マウスにルイス肺がん（ＬＬＣ）細胞を注射した。原発性腫瘍が成長するとき、それらを切除し、腫瘍細胞を３００Ｊで不活性化させた。別のＢ６マウス１９匹に対し、５×１０５個のＬＬＣ細胞を側腹部に皮下注射した。腫瘍細胞注射３日後、マウスに、それらの第１のワクチンとして１．７×１０６個の不活性化細胞／マウス／ワクチンを投与した。さらに、マウスに、ＣＬＤＣアジュバント、例えばロサルタン及びワクチン後２４時間にＣＬＤＣ追加免疫を投与した。マウスに、それらのワクチンを毎週、全部で３回のワクチン分、投与した。１９日目、マウスをすべて安楽死させ、腫瘍組織を収集し、免疫細胞について染色した。
【０１１６】
図１５に示すように、腫瘍成長は、不活性化全細胞ワクチン処置マウスにおいて有意に低減／遅延された（１３日目にｐ＝０．０２、及び１９日目にｐ＝０．００１）。ワクチン処置群におけるマウスの２匹は、１９日目、腫瘍を有しなかった（完全寛解＝２０％）。腫瘍を有するマウスの最終腫瘍重量は、ワクチン処置マウスにおいて減少したが、有意でなかった（ｐ＝０．０５４７）。腫瘍倍加時間についても減少が有意でなかったが、ワクチン処置マウスではより短かった（ｐ＝０．０５７０）。腫瘍においては、ワクチン接種マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞における有意な減少（ｐ＝０．００４、推定上の免疫抑制性の制御性Ｔ細胞）とともに、制御性Ｔ細胞の別のマーカーとしてＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞における減少（ｐ＝０．０２）が認められた（図１６Ａ）。それに関連して、ワクチン接種マウス腫瘍において、免疫抑制性タンパク質Ｌａｇ３（ｐ＝０．０１）及びＴｉｍ３（ｐ＝０．０５）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞における有意な減少（図１６Ｂ）、並びにタンパク質Ｌａｇ３（ｐ＝０．００５）及びＴｉｍ３（ｐ＝０．０２）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞における有意な減少（図１６Ｃ）が認められた。
【０１１７】
実施例６．生体外イヌ腫瘍組織がタンパク質の表面発現を維持する腫瘍細胞を有するか否かを判定する
２つの腫瘍組織を、処置を受けている自発性がんを有するイヌから外科的に得た。一方の組織を肛門腺がん（ＡＳＡ）から得て、他方を甲状腺がん（ＴＣ）から得た。組織をコラゲナーゼで消化し、得られた単一細胞懸濁液を複数のバイアル内で−８０℃で凍結させた。後に腫瘍細胞を解凍し、一方の細胞弾（ｂｕｌｌｅｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）は対照細胞として、他方は不活性化細胞として用いた。３００Ｊを用いてイヌ細胞を不活性化した。用いた細胞数は、腫瘍細胞を不活性化するために以前に用いた場合より少なかった。細胞の各群を不活性化するのに、１分３８秒かかった。次に、腫瘍細胞を、イヌＣＤ４４、ＣＤ９０、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ４５の発現について染色した。ＣＤ４５を用いて、すべての造血細胞をゲートアウトした（図２５Ａ〜Ｄ）。（腫瘍細胞、線維芽細胞、内皮細胞、及び他の細胞型を含む）ＣＤ４５陰性細胞に対し、「腫瘍」細胞の分析を実施した。
【０１１８】
ＡＳＡにおいては、不活性化の１時間後、細胞の１５％がＣＤ４４を発現し（対照の２０％と比較）、１％がＣＤ９０を発現し（０．３％と比較）、７．７％がＰＤ−Ｌ１を発現した（３．１％と比較）。ＴＣにおいては、不活性化後、７．１％がＣＤ４４を発現し（対照細胞の６．８％と比較）、０．６％がＣＤ９０を発現し（０．４％と比較）、０％がＰＤ−Ｌ１を発現した（０．２％と比較）。残存細胞を４８時間、４℃に置き、次に再び染色した。４８時間後、ＡＳＡにおいては、ＣＤ４４＝１０％（対照の１１％）、ＣＤ９０＝２％（対照の３．２％）、ＰＤ−Ｌ１＝９．５％（対照の３％）。ＴＣにおいては、ＣＤ４４＝５．８％（対照の８．９％）、ＣＤ９０＝３．１％（対照の３．２％）、及びＰＤ−Ｌ１＝３％（対照の２．９％）。
【０１１９】
さらなる他の腫瘍組織片を、手術を受けている異なるイヌ２匹から得た。一方はＧＩ集団であり、他方は肺集団であった。腫瘍組織を、コラゲナーゼを用いて消化し、洗浄し、次に染色し、単一細胞懸濁液を作製した。次に、細胞すべてを細胞凍結培地中で凍結させた。後に、細胞を解凍し、ＵＶ＋ＲＦ（ＵＶ光＋リボフラビン）プロトコルを用いて細胞の半数を不活性化させた。もう半数を氷上で維持した。次に、細胞を、イヌＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４４、ＣＤ９０、及びＰＤ−Ｌ１の表面発現について染色した（図２６）。
【０１２０】
まとめると、これらのデータは、表面マーカーが不活性化後に生体外イヌ腫瘍細胞上で維持されることを示す。
【０１２１】
実施例７．不活性化された腫瘍細胞に対する有意な細胞性及び体液性免疫応答を生成するための異なるアジュバントの試験
健常Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＰＢＳ若しくは不活性化細胞単独でワクチン接種したか、又はＣＬＤＣアジュバント系か、ワクチン接種前に皮膚に適用される局所イミキモド（２ｍｇ／ｋｇ）を伴う、若しくはＣｐＧ  ＯＤＮ（５０μｇ／ワクチン）と混合された、（実施例４に記載の転移性マウス腫瘍試験にて用いた）不活性化４Ｔ１ワクチンでワクチン接種したかのいずれかであった。ワクチンは、マウスの足に近い左前肢と右前肢の双方に等量で皮下投与した。マウスに、１．７×１０６個の細胞／マウス／ワクチンを投与した。ワクチンは、１日目に投与し、次いで１４日目に再投与した。マウスは、追加免疫ワクチンの投与後８日目に安楽死させ、脾臓及び血液を収集した。（複製を阻止するため）脾細胞を不活性化４Ｔ１細胞とともに培養し、７２時間後、ＩＦＮｇ産生を測定した（図１７）。脾細胞は、２５の脾細胞対１の不活性化４Ｔ１細胞の比で培養した。
【０１２２】
図１７に示すように、ＣＬＤＣアジュバント系は、ＩＦＮｇ産生の観点で最良のリコール応答を有した。これにＣｐＧ  ＯＤＮが続いた。ワクチン単独はまた、４匹中３匹のマウスにおいてある程度のＩＦＮｇを産生したが、対照と比べての有意差はなかった。
【０１２３】
実施例８．不活性化された腫瘍細胞に対する有意な細胞性及び体液性免疫応答を生成するためのアジュバントのさらなる試験
健常Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＰＢＳ若しくは不活性化細胞単独でワクチン接種したか、又はＣＬＤＣアジュバント系か、ワクチン接種前に皮膚に適用される局所イミキモド（２ｍｇ／ｋｇ）を伴う、若しくはＣｐＧ  ＯＤＮ（５０μｇ／ワクチン）と混合された、（実施例４に記載の転移性マウス腫瘍試験にて用いた）不活性化４Ｔ１ワクチンでワクチン接種したかのいずれかであった。ワクチンは、マウスの足に近い左前肢と右前肢の双方に等量で皮下投与した。マウスに、１．７×１０６個の細胞／マウス／ワクチンを投与した。ワクチンは、１日目に投与し、次いで１４日目に再投与した。マウスは、追加免疫ワクチンの投与後８日目に安楽死させ、脾臓及び血液を収集した。４Ｔ１生腫瘍細胞に対して、これらのマウス由来の血清を、血清を該細胞とともに１：５００若しくは１：１０００のいずれかの希釈でインキュベートし、蛍光標識ロバ抗マウス二次抗体で染色し、次にバックグラウンド染色を差し引くこと（１：５００及び１：１０００での正常なマウス血清）により、ＩｇＧ抗体結合についてスクリーニングした。
【０１２４】
図１８に示すように、ワクチン未接種及び不活性化全細胞ワクチン単独は、４Ｔ１腫瘍細胞に特異的なＩｇＧを全く産生しなかった。非常に高い染色を有する５匹中３匹のマウスで、イミキモドは可変量をもたらした。ＣｐＧ  ＯＤＮは、１：１０００の希釈で染色における信頼できる有意な増加をもたらした。バックグラウンドよりも大して高くない染色が、１：５００の希釈で検出された。
【０１２５】
実施例９．表面抗原の保存
マウス肺がん株ＬＬＣは、不活性化後、表面抗原の発現を維持した（図２１Ａ〜２１Ｂ）。ＬＬＣ細胞を、リボフラビン（ＲＦ、５０μＭ）及びＵＶ光（３００Ｊ）で処理し、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ４４及びＣＤ９０の表面発現について染色した。４つすべての抗原を、細胞の表面上に維持した。またマウス乳がん細胞株４Ｔ１は、ＵＶ＋ＲＦ不活性化の前と後に、ＣＤ４４、Ｓｃａ１、及びＥｐＣＡＭの表面マーカー発現について評価した（図２２）。
【０１２６】
緑色蛍光タンパク質でトランスフェクトしたマウスメラノーマ腫瘍細胞株Ｂ１６を、Ｃ５７Ｂｌ６マウスに注射し、マウスから除去し、単一細胞懸濁液に作り変え、次にＵＶ＋ＲＦ不活性化の前及び後とγ照射（１００Ｇｙ）後、ＧＦＰ＋腫瘍細胞の発現について分析した。細胞不活性化のいずれの形態も、生体外腫瘍組織内の腫瘍細胞によるＧＦＰの発現に対して負に影響しなかった（図２３）。
【０１２７】
最後に、マウス結腸がん細胞株ＣＴ２６をＵＶ＋ＲＦで不活性化させ、次に公知の腫瘍関連抗原ｇｐ７０の表面発現について分析した（図２４Ａ〜２４Ｂ）。ＵＶ＋ＲＦ不活性化により、ＣＴ２６細胞上のｇｐ７０の発現が増強された。
【０１２８】
さらに、ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２を不活性化させ、ＵＶ＋ＲＦ不活性化（３００Ｊ、図２７）後、ヒトＨＬＡ及びＧＬＵＴ１の発現について染色し、付着細胞サイトメーター上で画像化した。
【０１２９】
これら試験のすべてから得られた結果は、不活性化が、細胞表面上の細胞特異的抗原への有意な修飾を伴わずに実施可能であることを示す。さらに、これらのマーカーは、処置後の長い貯蔵期間にわたり形態学的にインタクトな細胞内で維持され、またこれらの観察結果は、試験対象の３種すべて（マウス、イヌ及びヒト）から誘導された細胞において認められている。
【０１３０】
実施例１０．不活性化細胞による免疫系の誘発
脾細胞を、４Ｔ１腫瘍の成長を有するが、全く治療を受けていないマウスから除去し、それらを培養下に置き、ＵＶ＋ＲＦ不活性化４Ｔ１細胞株由来の細胞と比べて、４Ｔ１生細胞株由来の細胞いずれかに対するＴ細胞免疫応答を試験した（図２８）。脾細胞を１×１０６細胞／ウェルで蒔き、次に４×１０５細胞／ウェルの（生又は不活性化）腫瘍細胞と７２時間にわたり共培養した。培養の４８時間後、増殖色素ＥｄＵを添加した。次に、脾細胞を収集し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖について染色した。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の双方の増殖においては、該細胞をＵＶ＋ＲＦ不活性化４Ｔ１腫瘍細胞と共培養したとき、有意な増加が認められた。
【０１３１】
実施例１１：薬物動態：インビトロ及びインビボでの腫瘍細胞の増殖及び持続性
不活性化プロセスの安全性及び有効性を試験するため、ＰｙＭＴ腫瘍細胞をＢ６マウス上の固形腫瘍から除去し、ＵＶ光（３００Ｊ）を用いて不活性化した。１．５×１０６個の「生存可能な」不活性化ＰｙＭＴ細胞を健常Ｂ６マウス５匹に皮下注射した。これを、７、１４、及び２１日目、全部で４用量にわたり反復した。初期の不活性化された腫瘍細胞注射の約１６０日後、マウスを安楽死させ、切除した。腫瘍成長の証拠は認められなかった。免疫不全マウスにおける不活性化細胞の安全性を試験するため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス８匹に対し、１×１０６個の不活性化ＰｙＭＴ細胞を右側腹部に皮下注射した。それ以来、マウスを監視していた。試験中、マウス３匹が、おそらくは無関係の原因（おそらくはウイルス又は細菌感染症）により死亡した。１匹に対して剖検を実施したが、腫瘍は認められず、他の２匹に対して皮膚分析を実施したが、腫瘍は認められなかった。腫瘍細胞注射の２５２日後、マウスを安楽死させ、残存するマウス５匹に腫瘍は認められなかった。
【０１３２】
不活性化後の培養下の細胞増殖についても評価した（図２９）。４Ｔ１細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの脂肪体に注射し、腫瘍の直径が約１０ｍｍに達するまで腫瘍成長を監視した。組織を除去し、コラゲナーゼを用いて消化し、洗浄し、ＵＶ＋Ｒｆで不活性化させ、次いで３７℃で２４及び７２時間培養した。不活性化から２４及び７２時間後、４Ｔ１細胞の増殖は認められなかった。これはまた、不活性化されていない生体外腫瘍細胞（一部増殖）及び４Ｔ１腫瘍細胞株（増殖）と比較した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２及びヒト結腸がん細胞株ＣＲＬ−２５７７を用いて、類似の試験を実施した（図３０）。新規に形成されたＤＮＡを標識するＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵを用いて、増殖試験を実施した。付着細胞サイトメーターを用いて、標識された新規ＤＮＡの蛍光を全ＤＮＡ染色と比較する。この試験により、ＣＲＬ−２５７７における生きた対照内の２０〜３５％もの高ＥｄＵ細胞、及びより長期間標識されたＨｅｐＧ２集団内の約７５％にのぼる幾千もの複製細胞が同定された。
【０１３３】
様々な適用、方法、及び組成に関して本開示の教示内容が記載されているが、本明細書中の教示内容及び以下の特許請求の範囲から逸脱しない限り、様々な変更及び修飾を設けることができることは理解されるであろう。前述の実施例は、本開示の教示内容をより十分に例示するために提供され、本明細書で提示される教示内容の範囲を限定することは意図されない。本教示内容が、これらの例示的な実施形態の観点で説明されている一方で、当業者は、これらの例示的な実施形態の極めて多数のバリエーション及び修飾が、過度の実験を行うことなく可能であることを容易に理解するであろう。すべてのかかるバリエーション及び修飾は、本教示内容の範囲内にある。
【０１３４】
本明細書中に引用されるすべての参照文献、例えば、特許、特許出願、論文、教科書、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）又は受入番号など、及びそれらの中に引用される参照文献は、それらがまだ援用されない限り、ここでそれら全体が参照により援用される。援用された文献及び類似の素材の１つ以上が、限定はされないが、定義された用語、用語の用法、説明された技術などを含む、本願と異なる又は矛盾するという場合、本願が優先する。
【０１３５】
以前の説明及び実施例は、本発明の特定の具体的な実施形態を詳述し、発明者によって検討されたベストモードを記載する。しかし、以前の説明及び実施例が本文中にいかに詳述されても、本発明が多くの方法で実施されてもよく、また本発明が貼付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈される必要があることは理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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