(57)【要約】  治療法に対する応答を予測する方法及び薬剤が開示される。より詳細には、本開示は癌細胞のプログラム死リガンド-1（PD-L1）の種々の形態を検出する方法及び薬剤に関する。前記方法及び薬剤は、癌細胞の細胞内区画（例えば核、細胞質、細胞膜）におけるPD-L1の場所を検出するため、免疫療法を含む治療法に対する癌細胞の応答の可能性を予測するため、ある治療法に対して可能性の高い応答者又は非応答者として癌患者を階層化するため、癌患者の治療を管理するため、及び臨床成果を予測するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞の細胞区画内におけるPD-L1の位置を決定する方法であって、PD-L1の核局在化配列内の翻訳後修飾を癌細胞において検出し、それによってPD-L1が位置する癌細胞の細胞区画を決定する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成る、前記方法。
【請求項２】
PD-L1-K263のアセチル化（本明細書では“PD-L1-K263Ac”とも称される）を癌細胞において検出し当該細胞区画が核であると決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
適切なコントロール（例えば正常細胞又は上皮性癌細胞）と対比してPD-L1-K263Acの上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、当該細胞区画が核であるということを示す、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
PD-L1-K263のメチル化（本明細書では“PD-L1-K263Me”とも称される）を癌細胞において検出し当該細胞区画が細胞質及び/又は細胞膜であると決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
適切なコントロール（例えば間葉性癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記工程が当該細胞区画が細胞質及び/又は細胞膜であるということを示す、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測する方法であって、PD-L1の核局在化配列の翻訳後修飾を癌細胞において検出し、それによって当該治療法に対する癌細胞の応答の可能性を予測する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成る、前記方法。
【請求項７】
PD-L1-K263のアセチル化（本明細書では“PD-L1-K263Ac”とも称される）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって癌細胞が当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有すると決定する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
PD-L1-K263のメチル化（本明細書では“PD-L1-K263Me”とも称される）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって癌細胞が当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有すると決定する、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定する方法であって、PD-L1-K263Acの存在を癌細胞において検出する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成り、それによって癌細胞が当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有すると決定する、前記方法。
【請求項１０】
適切なコントロール（例えば正常細胞又は上皮性癌細胞）と対比してPD-L1-K263Acの上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、癌細胞が当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有することを示す、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞を含むサンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに当該結合分子及びPD-L1-K263Acを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって癌細胞が当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有すると決定する、請求項9又は請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定する方法であって、PD-L1-K263Meの存在を癌細胞において検出する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成り、それによって癌細胞が当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有すると決定する、前記方法。
【請求項１３】
適切なコントロール（例えば間葉性癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、癌細胞が当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有することを示す、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
癌細胞を含むサンプルをPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに当該結合分子及びPD-L1-K263Meを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって癌細胞が当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有すると決定する、請求項12又は請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測する方法であって、PD-L1-K263Acのレベルを癌細胞において測定する工程；PD-L1-K263Meのレベルを前記癌細胞において測定する工程；前記癌細胞におけるPD-L1-K263AcとPD-L1-K263Meのレベルを比較する工程；並びに当該比較に基づいて当該治療法に対する前記癌細胞の応答を予測する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成り、ここで、PD-L1-K263MeレベルよりもPD-L1-K263Acのレベルが前記癌細胞において高ければ、当該癌細胞は当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有することを示し、PD-L1-K263AcレベルよりもPD-L1-K263Meのレベルが癌細胞において高ければ、当該癌細胞は当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有することを示す、前記方法。
【請求項１６】
癌細胞を含むサンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む第一の複合体のレベル、並びに第二の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む第二の複合体のレベルをサンプルにおいて測定する工程；並びに当該比較に基づいて治療法に対する癌細胞の応答の可能性を予測する工程を含み、ここで、第二の複合体よりも第一の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、当該癌細胞は当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有することを示し、第二の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、当該癌細胞は当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有することを示す、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
PD-L1-K263Ac及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記バイオマーカーは、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する応答及び/又は疾病負荷をモニターする、請求項6から16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーが、（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Acの無変化のレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、癌細胞が当該治療法に対して応答しないであろうことを示す、請求項6から18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比してPD-L1-K263Acの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、癌細胞が当該治療法に対して応答しないであろうことを示す、請求項6から18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比してPD-L1-K263Acの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、癌細胞が当該治療法に対しておそらく応答することを示す、請求項6から18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
PD-L1-K263Me及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記バイオマーカーは、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する応答及び/又は疾病負荷をモニターする、請求項6から18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーが、（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの無変化のレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、癌細胞が当該治療法に対しておそらく応答しないことを示す、請求項6から23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、癌細胞が当該治療法に対しておそらく応答することを示す、請求項6から23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの増加レベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、癌細胞が当該治療法に対しておそらく応答することを示す、請求項6から23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化する方法であって、患者から採取したサンプルにおいて、PD-L1の核局在化配列内に翻訳後修飾を含む癌細胞を検出する工程を含むか、前記工程から成るか又は本質的に前記工程から成り、それによって当該治療法に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化する、前記方法。
【請求項２８】
PD-L1-K263Acを癌細胞において検出する工程及び当該治療法に対して非応答者の可能性が高い者として患者を階層化する工程を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって当該治療法に対して非応答者として可能性が高い者として患者を階層化する、請求項27又は請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
PD-L1-K263Meを癌細胞において検出する工程及び当該治療法に対して応答者の可能性が高い者として患者を階層化する工程を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
サンプルをPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって当該治療法に対して応答者の可能性が高い者として患者を階層化する、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む第一の複合体のレベル、並びに第二の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む第二の複合体のレベルをサンプルにおいて測定する工程；並びに当該比較に基づいて応答者又は非応答者の可能性が高い者として患者を階層化する工程を含み、ここで、第二の複合体よりも第一の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、癌患者は非応答者の可能性が高い者として階層化され、第一の複合体よりも第二の複合体のレベルが高ければ、癌患者は応答者の可能性が高い者として階層化される、請求項27から31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理する方法であって、癌患者が当該治療法に対して応答者の可能性が高い者であるということに基づいて当該治療法で治療するために癌患者を選択する工程、又は癌患者が当該治療法に対して非応答者の可能性が高い者であるということに基づいて当該治療法で治療しないために癌患者を選択する工程、及び当該選択に基づいて当該治療法で患者を治療し又は治療しない工程を含み、ここで、当該選択が、患者から採取したサンプルにおいてPD-L1の核局在化配列内に翻訳後修飾を含む癌細胞を検出する工程を含み、それによって当該治療法に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として患者を階層化する階層化方法に基づく、前記方法。
【請求項３４】
癌細胞においてPDL1-K263Meを検出する工程及び治療法に対して応答者の可能性が高い者として患者を階層化する工程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
サンプルをPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって治療法に対して応答者の可能性が高い者として患者を階層化する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
階層化方法が、癌細胞においてPDL1-K263Acを検出する工程及び治療法に対して非応答者の可能性が高い者として患者を階層化する工程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３７】
サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって治療法に対して非応答者の可能性が高い者として患者を階層化する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む第一の複合体のレベル、並びに第二の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む第二の複合体のレベルをサンプルにおいて測定する工程；並びに当該比較に基づいて応答者又は非応答者の可能性が高い者として患者を階層化する工程を含み、ここで、第二の複合体よりも第一の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、患者は非応答者の可能性が高い者として階層化され、第一の複合体よりも第二の複合体のレベルが高ければ、患者は応答者の可能性が高い者として階層化される、請求項33に記載の方法。
【請求項３９】
PD-L1-K263Ac及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する患者の応答及び/又は疾病負荷をモニターする、請求項27から38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーが、（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞（前記はPD-L1-K263Acを発現する））と対比して、PD-L1-K263Acの無変化のレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、患者が治療法に対しておそらく応答しないこと、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく変化しないことを示す、請求項27から40のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比してPD-L1-K263Acの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、患者が治療法に対しておそらく応答しないこと、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく増加したことを示す、請求項27から40のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４３】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比してPD-L1-K263Acの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、患者が治療法に対しておそらく応答すること、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく低下したことを示す、請求項27から40のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４４】
PD-L1-K263Me及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する患者の応答及び/又は疾病負荷をモニターする、請求項27から38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーが、（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5を含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、患者が治療法に対しておそらく応答すること、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく低下したことを示す、請求項27から40のいずれか1項に記載の方法
【請求項４７】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの増加レベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、患者が治療法に対しておそらく応答しないこと、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく増加したことを示す、請求項27から40のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４８】
ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）で治療される癌患者に対する治療成果を予測する方法であって、患者から採取したサンプルにおいてPD-L1の核局在化配列内に翻訳後修飾を含む癌細胞を検出する工程を含むか、前記工程から成るか又は本質的に前記工程から成り、それによって患者に対する治療成果を予測する、前記方法。
【請求項４９】
癌細胞においてPD-L1-K263Acを検出する工程及び負の治療成果を予測する工程を含む、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
負の治療成果が増悪病状である、請求項48に記載の方法。
【請求項５１】
サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって患者に対する負の治療成果予測する、請求項48から50のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５２】
癌細胞においてPD-L1-K263Meを検出する工程及び正の治療成果を予測する工程を含む、請求項48に記載の方法。
【請求項５３】
正の治療成果が、治療法に対する部分又は完全応答並びに安定病状から選択される、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
サンプルをPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって患者に対する正の治療成果予測する、請求項48から53のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む第一の複合体のレベル、並びに第二の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む第二の複合体のレベルをサンプルにおいて測定する工程；並びに当該比較に基づいて患者に対する治療成果を予測する工程を含み、ここで、第二の複合体よりも第一の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、治療成果は負の治療成果と予測され、第一の複合体よりも第二の複合体のレベルが高ければ、治療成果は正の治療成果と予測される、請求項48から54のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５６】
PD-L1-K263Ac及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって患者に対する治療成果を予測する、請求項48から54のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーが、（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5を含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞（前記はPD-L1-K263Acを発現する））と対比して、PD-L1-K263Acの無変化のレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベル又は上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が、患者に対する負の治療成果の指標である、請求項48から57のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５９】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比してPD-L1-K263Acの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が患者に対する正の治療成果の指標である、請求項48から57のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６０】
PD-L1-K263Me及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する患者の応答及び/又は疾病負荷をモニターする、請求項48から59のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーが、（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5を含む、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が患者に対する正の治療成果の指標である、請求項48から57のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６３】
適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比してPD-L1-K263Meの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの増加レベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記が患者に対する負の治療成果の指標である、請求項48から57、60及び61のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６４】
予測される治療成果に基づいて癌患者に対する臨床成果を予測する工程を含む、請求項48から63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６５】
臨床成果が、腫瘍応答（TR）、全生存期間（OS）、無増悪生存期間（PFS）、無病生存期間、腫瘍再発までの期間（TTR）、腫瘍増悪までの期間（TTP）、相対リスク（RR）、有害性又は副作用から選択される、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
PD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子であって、適切には癌細胞の細胞区画（例えば核）内におけるPD-L1の位置を検出し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理するための、前記抗原結合分子。
【請求項６７】
PD-L1-K263Ac及びPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子を含む複合体。
【請求項６８】
PD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子であって、適切には癌細胞の細胞区画（例えば細胞質及び/又は細胞膜）内におけるPD-L1の位置を検出し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理するための、前記抗原結合分子。
【請求項６９】
PD-L1-K263Me及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子を含む複合体。
【請求項７０】
癌細胞の細胞区画（例えば核）内におけるPD-L1の位置を検出し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理するためのキットであって、PD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子及び/又はPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子を含む、前記キット。
【請求項７１】
さらにまた、陽性及び陰性コントロールを含む1つ以上のコントロールを含む、請求項70に記載のキット。
【請求項７２】
陽性コントロールが、PD-L1-K263Acポリペプチド又はPD-L1-K263Meポリペプチドから選択される、請求項71に記載のキット。
【請求項７３】
さらにまた、請求項1から65のいずれか1項に記載の方法を実施するための指示説明書を含む、請求項70から72のいずれか1項に記載のキット。
【請求項７４】
癌細胞の細胞区画内におけるPD-L1の位置を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）を用いて癌患者の治療を管理し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）で治療される癌患者に対して治療成果を予測する方法であって、前記方法が、（i）癌患者からサンプルを入手する工程（サンプルは癌細胞を含む）；（ii）サンプルをサンプル中のPD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子並びにサンプル中のP300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；及び（iii）サンプル中のPD-L1及びPD-L1結合パートナーを含む複合体と結合させるときに、第一及び第二の結合抗原結合分子を検出する工程を含むか、前記工程から成るか又は本質的に前記工程から成り、ここで、コントロールサンプル（例えば正常細胞又は上皮性癌細胞を含むもの）で検出される複合体のレベルと対比して、サンプルにおいて検出される複合体の上昇したレベルが、PD-L1の細胞区画が核であること、癌細胞が当該治療法に対する耐性の可能性の増加を有すること、癌患者が当該治療法に対しておそらく非応答者であること、癌患者が当該治療法で治療されないために選択されること、及び/又は患者に対する治療成果がおそらく負の治療成果であると予測されることを示す、前記方法。
【請求項７５】
癌細胞の細胞区画内におけるPD-L1の位置を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）を用いて癌患者の治療を管理し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）で治療される癌患者に対して治療成果を予測する方法であって、前記方法が、（i）癌患者からサンプルを入手する工程（サンプルは癌細胞を含む）；（ii）サンプルをサンプル中のPD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子並びにサンプル中のP300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；及び（iii）サンプル中のPD-L1及びPD-L1結合パートナーを含む複合体と結合させるときに、第一及び第二の結合抗原結合分子を検出する工程を含むか、前記工程から成るか又は本質的に前記工程から成り、ここで、コントロールサンプル（例えば正常細胞又は上皮性癌細胞を含むもの）で検出される複合体のレベルと対比して、サンプルにおいて検出される複合体の無変化又は低下したレベルが、PD-L1の細胞区画が細胞質及び/又は細胞膜であること、癌細胞が当該治療法に対する感受性の可能性の増加を有すること、癌患者が当該治療法に対しておそらく応答者であること、癌患者が当該治療法で治療されるために選択されること、及び/又は患者に対する治療成果はおそらく正の治療成果であると予測されることを示す、前記方法。
【請求項７６】
癌細胞の細胞区画（例えば核）内におけるPD-L1の位置を検出し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理するためのキットであって、（i）PD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子、（ii）P300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーと特異的に結合する第二の抗原結合分子；並びに（iii）第一及び第二の抗原結合分子と結合する第三の抗原結合分子を含む、前記キット。
【請求項７７】
第三の抗原結合分子が検出可能な標識を含む、請求項76に記載のキット。
【請求項７８】
PD-L1並びにP300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーを含む複合体、当該複合体のPD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子、当該複合体のPD-L1結合パートナーと結合する第二の抗原結合分子、並びに（iii）当該複合体の第一及び第二の抗原結合分子の各々と結合する第三の抗原結合分子。
【請求項７９】
PD-L1−PD-L1結合パートナー複合体の癌細胞内における位置が決定される、請求項78に記載の複合体。
【請求項８０】
第三の抗原結合分子が検出可能な標識を含む、請求項78又は請求項79に記載の複合体。
【請求項８１】
PD-L1並びにP300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーを含む複合体、当該複合体のPD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子、当該複合体のPD-L1結合パートナーと結合する第二の抗原結合分子、並びに（iii）当該複合体の第一及び第二の抗原結合分子の各々と結合する第三の抗原結合分子を含む、癌細胞。
【請求項８２】
第三の抗原結合分子が検出可能な標識を含む、請求項81に記載の癌細胞。
【請求項８３】
治療法が免疫療法である、請求項1から82に記載の方法、キット、抗原結合分子、複合体又は癌細胞。
【請求項８４】
免疫療法が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項83に記載の方法、キット、抗原結合分子、複合体又は癌細胞。
【請求項８５】
免疫チェックポイント阻害剤が、免疫チェックポイント分子と特異的に結合するアンタゴニスト抗原結合分子（例えば抗体）である、請求項84に記載の方法、キット、抗原結合分子、複合体又は癌細胞。
【請求項８６】
アンタゴニスト抗原結合分子（例えば抗体）が、PD-1及びCTLA4から選択される免疫チェックポイント分子と特異的に結合する、請求項85に記載の方法、キット、抗原結合分子、複合体又は癌細胞。
【請求項８７】
治療法が、細胞傷害療法、適切には化学療法剤を利用する細胞傷害療法である、請求項1から86に記載の方法、キット、抗原結合分子、複合体又は癌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2018年1月15日出願のオーストラリア仮特許出願No.2018900108（発明の名称：タンパク質性分子及びその使用）、及び2018年2月8日出願のオーストラリア仮特許出願No.2018900392（発明の名称：治療法に対する応答を予測する薬剤及び方法）（前記出願のそれぞれの内容は参照によってその全体が本明細書に含まれる）に対し優先権を主張する。
本発明は概ね治療法に対する応答を予測する方法及び薬剤に関する。より詳細には、本発明は、プログラム死リガンド-1（PD-L1）の種々の形態を癌細胞において検出するための方法及び薬剤に関し、前記は、癌細胞の細胞区画（例えば核、細胞質、細胞膜）内のPD-L1の位置を検出するために、免疫療法を含む治療法に対する癌細胞の応答の可能性を予測するために、ある治療法に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として患者を階層化するために、癌患者の治療を管理するために、及び臨床成果を予測するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
癌は全世界における疾病及び死亡の重要な原因である。多くの異なる癌タイプのための看護標準は数年にわたって大いに改善されてきたが、現在の看護標準は、癌治療を改善する効果的な治療法の要求を未だ満たしていない。細胞傷害Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）並びにプログラム細胞死受容体-1（PD-1）及びそのリガンドPD-L1を標的とする免疫腫瘍学的薬剤の臨床使用は、多くの癌タイプの治療のための看護標準の改善をもたらした。これらのチェックポイント阻害剤はある種の癌で臨床応答の改善をもたらしが、耐性を示す臨床応答が結局患者のおよそ10−45％で生じる。さらにまた、著しい数の腫瘍が耐性であるか又は難治性となる。例えば、メラノーマ及び肺癌の約20−50％が免疫療法に有意に応答するが、他のものは応答しないであろう。したがって、どの対象動物が免疫療法のより良い候補であるかを識別することは、健康管理及び患者の生活の質の予測の観点から大いに有益である。
PD-L1は細胞表面タンパク質であり、PD-1の2つの公知のリガンドの1つである。PD-L1の発現は多様な免疫細胞の表面で観察され、PD-L1 mRNAは、血管内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞を含む非リンパ系組織によって、並びに扁桃及び胎盤組織で発現される。PD-L1発現はまた人間の多様な癌で観察され、腫瘍細胞発現PD-L1とPD-1との相互作用は、腫瘍特異的T細胞の阻害又はアポトーシスを誘発できる。いくつかの癌（例えば卵巣、腎、結腸直腸、膵及び肝癌とともにメラノーマを含む）では、PD-L1発現は予後不良と相関性を有し、かつその後の治療とは関わりなく全生存期間を減少させることが示された。PD-L1とPD-1との結合を遮断する抗PD-1モノクローナル抗体（mAb）は、多様な腫瘍タイプに対して抗腫瘍活性を有することが示され、人間における初期臨床データは、腫瘍がPD-L1を発現する患者では抗PD-1療法に応答する可能性がより高いことが示唆された（例えば、国際特許出願公開WO 2014/165422で開示）。
腫瘍細胞上のPD-L1の免疫染色は複数の臨床試験で応答と関係することが報告されたが、PD-L1染色の全体的精度は1つの臨床試験でわずかに約62％であり（Topalian et al., 2012, N Engl. J Med 366(26):2443-2454）、陰性反応及び陽性反応的中率は不十分であった（Weber et al., 2013. J Clin Oncol 31(34):4311-4318）。
したがって、免疫療法を含む治療法に対する応答を改善された精度で予測することを助ける方法及び薬剤は当業界でなお希求されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は部分的には、PD-L1の癌細胞における種々の翻訳後修飾は、この糖タンパク質の異なる細胞区画への局在化をもたらし、このことは、癌細胞の治療法（細胞傷害療法及び免疫療法を含む）に対する感受性又は耐性に顕著に影響するという決定から生じる。特に、本発明者らは、PD-L1の核局在化配列（NLS）中のリジン（すなわちPD-L1-263K）の種々の翻訳後修飾が、PD-L1が核に局在化されるか又は細胞質/細胞膜に局在化されるかを制御することを見出した。注目すべきことには、PD-L1-263Kのメチル化（すなわちPD-L1-263KMe）は、実質的にPD-L1を癌細胞の細胞質及び/又は細胞膜に局在化させることが見出された（前記局在化は治療法に対する癌細胞の感受性と相関性を有する）。しかしながら、PD-L1-263Kのアセチル化（すなわちPD-L1-263KAc）は、主としてPD-L1を核に局在化させることもまた見出された（前記局在化は、上皮間葉転換（EMT）及び/又は癌細胞の幹性と関係し、かつ治療法に対する耐性と相関性を有する）。実際、核PD-L1の発現は、化学療法剤耐性、幹性及び/又は病状増悪のバイオマーカー（C-Cモチーフケモカインリガンド5（CCL5、RANTESとしても知られている）及びNODALを含む）の顕著なアップレギュレーションをもたらすことが決定された。加えて、本発明者らは、これらのPD-L1-263KAc及びPD-L1-263KMeバイオマーカー（これらは本明細書では“治療法応答”バイオマーカーとも称される）を、1つ以上の間葉及び/又は幹性バイオマーカーと組み合わせて用い、治療法に対する応答をモニターし、治療成果及び臨床成果を予測できることを見出した。前記バイオマーカーは薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えば、プロミニン-1（CD133）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA1（ALDH1A）、E1A結合タンパク質300kDa（P300）、DNA(シトシン-5)-メチルトランスフェラーゼ1（DNMT1）、SETドメイン分岐1（SETDB1）及びATP結合カセットサブファミリーBメンバー5（ABCB5）である。これらの発見を以下に記載するように転化させて、癌細胞の細胞区画内におけるPD-L1の位置を決定し、治療法に対する応答の予測及び/又はモニターでPD-L1の種々の形態を検出し、癌細胞で発現されるPD-L1の形態にしたがって患者を階層化し、当該階層化にしたがって患者の治療を管理し、さらに臨床成果を予測するための方法及び薬剤で実行した。
【０００４】
したがってある特徴では、本発明は、癌細胞の細胞区画内におけるPD-L1の位置を決定する方法を提供する。これらの方法は概して、癌細胞においてPD-L1の核局在化配列の翻訳後修飾を検出し、それによってPD-L1が位置する癌細胞の細胞区画を決定する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成る。いくつかの実施態様では、当該方法は、癌細胞においてPD-L1-K263のアセチル化（本明細書では“PD-L1-K263Ac”とも称される）を検出する工程を含み、それによって当該細胞区画が核であると決定する。このタイプの代表的な例では、当該方法は、適切なコントロール（例えば正常細胞又は上皮性癌細胞）と対比して、癌細胞においてPD-L1-K263Acの上昇したレベルを検出する工程を含み、前記上昇したレベルは当該細胞区画が核であることを示す。いくつかの実施態様では、当該方法は、癌細胞においてPD-L1-K263のメチル化（本明細書では“PD-L1-K263Me”とも称される）を検出する工程を含み、それによって当該細胞区画が細胞質及び/又は細胞膜であると決定する。このタイプの例示的な例では、当該方法は、適切なコントロール（例えば間葉性癌細胞）と対比して、癌細胞においてPD-L1-K263Meの上昇したレベルを検出する工程を含み、前記上昇したレベルは当該細胞区画が細胞質及び/又は細胞膜であることを示す。
【０００５】
本発明の別の特徴は、治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測する方法を提供する。これらの方法は概して、癌細胞においてPD-L1の核局在化配列の翻訳後修飾を検出し、それによって治療法に対する癌細胞の応答の可能性を予測する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成る。いくつかの実施態様では、当該方法は、癌細胞においてPD-L1-K263のアセチル化（本明細書では“PD-L1-K263Ac”とも称される）を検出する工程を含み、それによって癌細胞が当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有すると決定する。いくつかの実施態様では、当該方法は、癌細胞においてPD-L1-K263のメチル化（本明細書では“PD-L1-K263Me”とも称される）を検出する工程を含み、それによって癌細胞が当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有すると決定する。
関連する特徴では、本発明は、治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定する方法を提供する。これらの方法は概して、癌細胞においてPD-L1-K263Acの存在を検出する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成り、それによって癌細胞が当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有すると決定する。このタイプの代表的な例では、当該方法は、適切なコントロール（例えば正常細胞又は上皮性癌細胞）と対比して、癌細胞においてPD-L1-K263Acの上昇したレベルを検出する工程を含み、前記上昇したレベルは、癌細胞が当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有することを示す。
【０００６】
同じ及び他の実施態様のいくつかでは、当該方法は、癌細胞を含むサンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに当該結合分子及びPD-L1-K263Acを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって癌細胞が当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有すると決定する。
他の関連する特徴では、本発明は、治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定する方法を提供する。これらの方法は、概して、癌細胞においてPD-L1-K263Meの存在を検出する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成り、それによって癌細胞が当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有すると決定する。このタイプの例示的な例では、当該方法は、適切なコントロール（例えば間葉性癌細胞）と対比して、癌細胞においてPD-L1-K263Meの上昇したレベルを検出する工程を含み、前記上昇したレベルは、癌細胞が当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有することを示す。
同じ及び他の実施態様のいくつかでは、当該方法は、癌細胞を含むサンプルをPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに当該結合分子及びPD-L1-K263Meを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって癌細胞が当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有すると決定する。
【０００７】
さらに他の関連する特徴では、本発明は、治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測する方法を提供する。これらの方法は概して、癌細胞のPD-L1-K263Acのレベルを測定する工程、前記癌細胞のPD-L1-K263Meのレベルを測定する工程；前記癌細胞のPD-L1-K263AcとPD-L1-K263Meのレベルを比較する工程；並びに当該比較に基づいて治療法に対する前記癌細胞の応答を予測する工程を含むか、前記工程から成るか、又は本質的に前記工程から成り、ここで、前記癌細胞においてPD-L1-K263MeレベルよりもPD-L1-K263Acのレベルが高ければ、前記癌細胞は当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有することを示し、前記癌細胞においてPD-L1-K263AcレベルよりもPD-L1-K263Meのレベルが高ければ、前記癌細胞は当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有することを示す。
いくつかの実施態様では、当該方法は、癌細胞を含むサンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む第一の複合体のレベル、並びに第二の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む第二の複合体のレベルをサンプルにおいて測定する工程；並びに当該比較に基づいて治療法に対する癌細胞の応答の可能性を予測する工程を含み、ここで、第二の複合体よりも第一の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、癌細胞は当該治療法に対して耐性の可能性の増加を有することを示し、サンプルにおいて第二の複合体のレベルが高ければ、癌細胞は当該治療法に対して感受性の可能性の増加を有することを示す。
【０００８】
治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性（例えば感受性又は耐性）を予測する方法のいくつかの実施態様では、当該方法は、治療法に対する応答をモニターするために適切に用いられる。このタイプの非限定的な例では、当該方法は、PD-L1-K263Ac及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する応答及び/又は疾病負荷をモニターする。少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの非限定的な例には以下が含まれる：（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5。
【０００９】
いくつかの実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Acの無変化のレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、癌細胞が治療法に対しておそらく応答しないであろうことを示す。いくつかの実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Acの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、癌細胞が治療法に対しておそらく応答しないであろうことを示す。他の実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Acの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、癌細胞が治療法に対しておそらく応答するであろうことを示す。
治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性（例えば感受性又は耐性）を予測する方法のいくつかの実施態様では、当該方法は、治療法に対する応答をモニターするために適切に用いられる。このタイプの非限定的な例では、当該方法は、PD-L1-K263Me及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する応答及び/又は疾病負荷をモニターする。少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの非限定的な例には以下が含まれる：（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5。
【００１０】
いくつかの実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Meの無変化のレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、癌細胞が治療法に対しておそらく応答しないことを示す。いくつかの実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Meの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、癌細胞が治療法に対しておそらく応答することを示す。他の実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露されていない癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Meの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの増加レベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、癌細胞が治療法に対しておそらく応答することを示す。
【００１１】
さらに別の特徴では、本発明は、治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化する方法を提供する。これらの方法は概して、患者から採取したサンプルにおいて、PD-L1の核局在化配列内に翻訳後修飾を含む癌細胞を検出する工程を含むか、前記工程から成るか又は本質的に前記工程から成り、それによって当該治療法に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化する。いくつかの実施態様では、当該方法は、PD-L1-K263Acを癌細胞において検出する工程及び当該治療法に対して非応答者の可能性が高い者として当該患者を階層化する工程を含む。このタイプの例示的な例では、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、及び抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって当該治療法に対して非応答者として可能性が高い者として当該患者を階層化する。いくつかの実施態様では、当該方法は、PD-L1-K263Meを癌細胞において検出する工程及び当該治療法に対して応答者の可能性が高い者として当該患者を階層化する工程を含む。このタイプの例示的な例では、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、及び抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって当該治療法に対して応答者として可能性が高い者として当該患者を階層化する。さらに他の実施態様では、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む第一の複合体のレベル、並びに第二の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む第二の複合体のレベルをサンプルにおいて測定する工程；並びに当該比較に基づいて応答者又は非応答者の可能性が高い者として当該患者を階層化する工程を含み、ここで、第二の複合体よりも第一の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、癌患者は非応答者の可能性が高い者として階層化され、第一の複合体よりも第二の複合体のレベルが高ければ、癌患者は応答者の可能性が高い者として階層化される。
【００１２】
上記及び本明細書のその他の箇所で幅広く記載する予測及び階層化の方法は、医療従事者及び医師に癌療法を用いた治療に対する応答の可能性に関する情報を提供する。これらの方法の結果に基づいて、医療従事者又は医師は：（i）対象動物が治療法におそらく応答するということに基づいて、当該治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）で対象動物を治療できる；（ii）対象動物が治療法におそらく応答しないということに基づいて、当該治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）による対象動物の治療を回避できる；（iii）新規な治療法のための臨床試験に対象動物を加えることができる；（iv）治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）におそらく応答しない対象動物をまた別の治療法（例えば癌細胞の間葉上皮転換を刺激する治療法）で治療できる；及び/又は（v）可能性が高い治療及び成果のシナリオを対象と話し合うことができる。したがって、本発明の更なる特徴は、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）を用いて癌患者の治療を管理する方法を提供する。これらの方法は概して、以下の工程を含むか、以下の工程から成るか又は本質的に以下の工程から成る：患者が治療法に対して応答者である可能性が高いということに基づいて当該治療法による治療のために癌患者を選択する工程、又は患者が治療法に対して非応答者の可能性が高いということに基づいて当該治療法による治療のために患者を選択しない工程、及び当該選択に基づいて当該治療法で患者を治療又は治療しない工程。ここで、当該選択は、患者から採取したサンプルにおいてPD-L1の核局在化配列内に翻訳後修飾を含む癌細胞を検出する工程を含み、それによって治療法に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として患者を階層化する階層化方法に基づく。いくつかの実施態様では、階層化方法は、癌細胞においてPDL1-K263Meを検出する工程及び当該患者を治療法に対して応答者の可能性が高い者として階層化する工程を含む。このタイプの非限定的な例では、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって当該治療法に対して応答者の可能性が高い者として患者を階層化する。いくつかの実施態様では、階層化方法は、癌細胞においてPDL1-K263Acを検出する工程及び当該患者を治療法に対して非応答者の可能性が高い者として階層化する工程を含む。このタイプの例示的な例では、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって当該治療法に対して非応答者の可能性が高い者として患者を階層化する。さらに他の実施態様では、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む第一の複合体のレベル、並びに第二の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む第二の複合体のレベルをサンプルにおいて測定する工程；並びに当該比較に基づいて応答者又は非応答者の可能性が高い者として患者を階���化する工程を含み、ここで、第二の複合体よりも第一の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、患者は非応答者の可能性が高い者として階層化され、第一の複合体よりも第二の複合体のレベルが高ければ、患者は応答者の可能性が高い者として階層化される。
【００１３】
ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として患者を階層化し、さらにある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）を用いて癌患者の治療を管理する方法のいくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、PD-L1-K263Ac及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する患者の応答及び/又は疾病負荷をモニターする。少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの非限定的な例には以下が含まれる：（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5。
いくつかの実施態様では、これらの方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞（前記はPD-L1-K263Acを発現する））と対比して、PD-L1-K263Acの無変化のレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、患者が治療法に対しておそらく応答しないこと、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく変化しないことを示す。他の実施態様では、これらの方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Acの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、患者が治療法に対しておそらく応答しないこと、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく増加したことを示す。他の実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Acの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、患者が治療法に対しておそらく応答すること、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく低下したことを示す。
【００１４】
ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、さらにある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）を用いて癌患者の治療を管理する方法のいくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、PD-L1-K263Me及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する患者の応答及び/又は疾病負荷をモニターする。少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの非限定的な例には以下が含まれる：（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5。
いくつかの実施態様では、これらの方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Meの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、患者が治療法に対しておそらく応答すること、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく低下したことを示す。他の実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Meの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの増加したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は、患者が治療法に対しておそらく応答しないこと、及び/又は患者の疾病負荷がおそらく増加したことを示す。
【００１５】
本発明のさらにまた別の特徴は、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）で治療される癌患者に対する治療成果を予測する方法を提供する。これらの方法は概して、患者から採取したサンプルにおいて、PD-L1の核局在化配列内に翻訳後修飾を含む癌細胞を検出する工程を含むか、前記工程から成るか又は本質的に前記工程から成り、それによって患者に対する治療成果を予測する。いくつかの実施態様では、当該方法は、癌細胞においてPD-L1-K263Acを検出する工程及び負の治療成果を予測する工程を含む。このタイプの例示的な例では、負の治療成果は増悪病状である。同じ及び他の実施態様のいくつかでは、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって患者に対する負の治療成果を予測する。いくつかの実施態様では、当該方法は、癌細胞においてPD-L1-K263Meを検出する工程及び正の治療成果を予測する工程を含む。このタイプの例示的な例では、正の治療成果は、治療法に対する部分又は完全応答並びに安定病状から選択される。同じ及び他の実施態様のいくつかでは、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子と接触させる工程、並びに抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む複合体をサンプルにおいて検出する工程を含み、それによって患者に対する正の治療成果を予測する。さらに他の実施態様では、当該方法は、サンプルをPD-L1-K263Acと特異的に結合する第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；第一の抗原結合分子及びPD-L1-K263Acを含む第一の複合体のレベル、並びに第二の抗原結合分子及びPD-L1-K263Meを含む第二の複合体のレベルをサンプルにおいて測定する工程；並びに当該比較に基づいて患者に対する治療成果を予測する工程を含み、ここで、第二の複合体よりも第一の複合体のレベルがサンプルにおいて高ければ、治療成果は負の治療成果と予測され、第一の複合体よりも第二の複合体のレベルが高ければ、治療成果は正の治療成果と予測される。
【００１６】
ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）で治療される癌患者に対する治療成果を予測する方法のいくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、PD-L1-K263Ac及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって患者に対する治療成果を予測する。少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの非限定的な例には以下が含まれる：（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5。
いくつかの実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞（前記はPD-L1-K263Acを発現する））と対比して、PD-L1-K263Acの無変化のレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベル又は上昇したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は患者に対する負の治療成果の指標である。他の実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Acの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は患者に対する正の治療成果の指標である。
【００１７】
ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として患者を階層化し、さらにある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）を用いて癌患者の治療を管理する方法のいくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、PD-L1-K263Me及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（前記は、薬剤耐性及び/又は疾病負荷と適切に関係し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である）を癌細胞において検出する工程を含み、それによって治療法に対する患者の応答及び/又は疾病負荷をモニターする。少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの非限定的な例には以下が含まれる：（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5。
いくつかの実施態様では、これらの方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Meの上昇したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は患者に対する正の治療成果の指標である。他の実施態様では、当該方法は、適切なコントロール（例えば治療法に暴露する前の患者の癌細胞）と対比して、PD-L1-K263Meの低下したレベル及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの増加したレベルを癌細胞において検出する工程を含み、前記は患者に対する負の治療成果の指標である。
治療成果を予測する方法のいくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、予測される治療成果に基づいて癌患者に対する臨床成果を予測する工程を含む。臨床成果の非限定的な例には、腫瘍応答（TR）、全生存期間（OS）、無増悪生存期間（PFS）、無病生存期間、腫瘍再発までの期間（TTR）、腫瘍増悪までの期間（TTP）、相対リスク（RR）、有害性又は副作用が含まれる。
本発明の別の特徴は癌患者を治療する方法を提供する。これらの方法は概して、有効量の治療薬剤（例えば細胞傷害因子又は免疫療法薬剤）を癌患者に、当該癌患者が当該治療薬剤に対して応答者の可能性が高い者として階層化されることに基づいて投与する工程を含むか、前記工程から成るか又は本質的に前記工程から成る。ここで、当該階層化は、上記及び本明細書のその他の箇所で幅広く記載する階層化の方法によって実施される。
【００１８】
別の特徴では、本発明は、適切には癌細胞の細胞区画（例えば核）内のPD-L1の位置を検出し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理するための、PD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子を提供する。
関連する特徴では、本発明は、PD-L1-K263Ac及びPD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子を含む複合体を提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、適切には癌細胞の細胞区画（例えば細胞質及び/又は細胞膜）内のPD-L1の位置を検出し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理するための、PD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子を提供する。
関連する特徴では、本発明は、PD-L1-K263Me及びPD-L1-K263Meと特異的に結合する抗原結合分子を含む複合体を提供する。
【００１９】
関連する特徴では、本発明は、癌細胞の細胞区画（例えば核、細胞質及び/又は細胞膜）内のPD-L1の位置を検出し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理するためのキットを提供する。前記キットは、PD-L1-K263Acと特異的に結合する抗原結合分子及び/又はPD-L1-K263Me特異的に結合する抗原結合分子を含む。場合によって、前記キットは、1つ以上のコントロール（陽性及び陰性コントロールを含む）を含むことができる。このタイプの例示的な例では、陽性コントロールは、PD-L1-K263Acポリペプチド又はPD-L1-K263Meポリペプチドから選択できる。いくつかの実施態様では、キットは、上記及び本明細書のその他の箇所で幅広く記載する1つ以上の方法を実施するための指示説明書を含む。
上記及び本明細書のその他の箇所に開示する特徴のいずれかの具体的な実施態様では、抗原結合分子（例えば抗PD-L1-K263Ac抗原結合分子及び/又は抗PD-L1-K263Me抗原結合分子）は、検出可能な標識又はレポーター分子に直接又は間接的に結合される。
【００２０】
本発明はまた、PD-L1は、リジンアセチルトランスフェラーゼ、P300及びメチルトランスフェラーゼ、DNMT1及びSETDB1（前記は化学療法耐性、幹性及び/又は病状増悪のバイオマーカーである）と結合して複合体を形成することを開示する。前記複合体は、癌細胞のEMT及び/又は幹性の発達とともに治療法に対する耐性を刺激するか、或いはそれらと関係する。本発明者らは、PD-L1及びこれらの結合パートナーの複合体もまた上記及び本明細書のその他の箇所に記載する方法で用いることができると提唱する。したがって、本発明の更なる特徴は、癌細胞の細胞区画内におけるPD-L1の位置を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）を用いて癌患者の治療を管理し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）で治療される癌患者に対して治療成果を予測する方法を提供する。これらの方法は概して以下の工程を含むか、以下の工程から成るか又は本質的に以下の工程から成る：（i）癌患者からサンプルを入手する工程、ここで前記サンプルは癌細胞を含む；（ii）サンプルをサンプル中のPD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子並びにサンプル中のP300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；及び（iii）サンプル中のPD-L1及びPD-L1結合パートナーを含む複合体と結合させるときに第一及び第二の結合抗原結合分子を検出する工程。ここで、コントロールサンプル（例えば正常細胞又は上皮性癌細胞を含むもの）において検出される複合体のレベルと対比して、サンプルにおいて検出される複合体の上昇したレベルは、PD-L1の細胞区画が核であること、癌細胞が当該治療法に対する耐性の可能性の増加を有すること、癌患者が当該治療法に対しておそらく非応答者であること、癌患者が当該治療法による治療のために選択されないこと、及び/又は患者に対する治療成果はおそらく負の治療成果であると予測されることを示す。
【００２１】
さらに別の特徴では、本発明は、癌細胞の細胞区画内におけるPD-L1の位置を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）を用いて癌患者の治療を管理し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）で治療される癌患者に対して治療成果を予測する方法を提供する。これらの方法は概して以下の工程を含むか、以下の工程から成るか又は本質的に以下の工程から成る：（i）癌患者からサンプルを入手する工程、ここでサンプルは癌細胞を含む；（ii）サンプルをサンプル中のPD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子並びにサンプル中のP300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーと特異的に結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；及び（iii）サンプル中のPD-L1及びPD-L1結合パートナーを含む複合体と結合させるときに第一及び第二の結合抗原結合分子を検出する工程。ここで、コントロールサンプル（例えば正常細胞又は上皮性癌細胞を含むもの）で検出される複合体のレベルと対比して、サンプルにおいて検出される複合体の無変化又は低下したレベルは、PD-L1の細胞区画が細胞質及び/又は細胞膜であること、癌細胞が当該治療法に対する感受性の可能性の増加を有すること、癌患者が当該治療法に対しておそらく応答者であること、癌患者が当該治療法による治療のために選択されること、及び/又は患者に対する治療成果はおそらく正の治療成果であると予測されることを示す。
【００２２】
関連する特徴では、本発明は、癌細胞の細胞区画（例えば核）内のPD-L1の位置を検出し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性を予測し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の耐性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の感受性の可能性を決定し、ある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）に対して応答者又は非応答者の可能性が高い者として癌患者を階層化し、及び/又はある治療法（例えば細胞傷害療法及び/又は免疫療法）によって癌患者の治療を管理するためのキットを提供する。前記キットは、（i）PD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子、（ii）P300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーと特異的に結合する第二の抗原結合分子；並びに（iii）第一及び第二の抗原結合分子と結合する第三の抗原結合分子を含む。具体的な実施態様では、第三の抗原結合分子は検出可能な標識を含む。
関連する特徴では、本発明は、PD-L1並びにP300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーを含む複合体、当該複合体のPD-L1と特異的に結合する第一の抗原結合分子、当該複合体のPD-L1結合パートナーと結合する第二の抗原結合分子、並びに（iii）当該複合体の第一及び第二の抗原結合分子の各々と結合する第三の抗原結合分子を提供する。いくつかの実施態様では、PD-L1−PD-L1結合パートナー複合体の癌細胞内の位置が決定される。具体的な実施態様では、第三の抗原結合分子は検出可能な標識を含む。
【００２３】
さらに別の特徴では、本発明は、PD-L1並びにP300、DNMT1及びSETDB1から選択されるPD-L1結合パートナーを含む複合体、当該複合体のPD-L1と結合する第一の抗原結合分子、当該複合体のPD-L1結合パートナーと結合する第二の抗原結合分子、並びに（iii）当該複合体の第一及び第二の抗原結合分子の各々と結合する第三の抗原結合分子を含む癌細胞を提供する。具体的な実施態様では、第三の抗原結合分子は検出可能な標識を含む。
上記及び本明細書のその他の箇所に記載する特徴及び実施態様のいずれにおいても、治療法は適切には免疫療法であり、前記は例えば免疫チェックポイント阻害剤であり（ただし前記に限定されない）、免疫チェックポイント阻害剤には、免疫チェックポイント分子と特異的に結合するアンタゴニスト抗原結合分子（例えば抗体）が含まれる。このタイプの代表的な例では、アンタゴニスト抗原結合分子（例えば抗体）は、PD-1及びCTLA4から選択される免疫チェックポイント分子と特異的に結合する。他の実施態様では、治療法は細胞傷害療法、適切には化学療法剤を利用する細胞傷害療法である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、いくつかの転移癌から単離した間葉CTC及び化学療法剤耐性癌細胞でPD-L1が優勢であることとともに、PD-L1と活性マークH3k27ac及びH3k4me3との共同局在化を示すグラフ及び写真である。（A）MDA-MB-231又はMCF7細胞をウサギ抗PD-L1抗体でプローブし、さらにデジタル画像をイメージJ（ImageJ）ソフトウェア（ImageJ, NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて分析し、合計核蛍光強度（TNFI）又は合計細胞質蛍光強度（TCFI）を決定した（n＞20細胞/サンプル）。（B）原発腫瘍に由来するアブラキサン/ドセタキセル異種移植モデル単離癌細胞をウサギ抗PD-L1抗体でプローブし、さらにデジタル画像をイメージJソフトウェア（ImageJ, NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて分析し、TNFI又はTCFIを決定した（n＞20細胞/サンプル）。加えて、処理グループの各々における腫瘍体積の変化が提示される。（C）MDA-MB-231又はMCF7細胞を、ウサギ抗PD-L1抗体及びマウス抗H3K27ac抗体、H3k4me3抗体又はH3k9me3抗体でプローブし、さらにAlexa Fluor 488結合ロバ抗ウサギ二次抗体又はAlexa Fluor 568結合ロバ抗マウス二次抗体で標識した。自動閾値設定及び細胞核特異的対象領域（ROI）手動選別によりイメージJソフトウェアを用いて、各抗体ペアについてピアソン係数相関を計算した（n＞20細胞/サンプル）。
【図２】図2は、PD-L1の予測アセチル化/メチル化モチーフの野生型及び変異型並びに上皮性癌細胞における局在化に対するそれらの影響を示す模式図、写真及びグラフである。（A）PD-L1野生型配列並びに標的残基K263周辺のメチル化及びアセチル化のための重要な保存モチーフを示すPD-L1の3D模式図。この領域は、仮想的NLSドメインとオーバーラップするか又は前記に含まれる可撓性C-末端の部分である。3つのPD-L1プラスミドを構築した：1つは野生型カノニカル配列を有するもの、2つは以下の変異体である。変異体1（Mut1）は263位でリジンからグルタミンへの置換を有し、PD-L1のアセチル化型を模倣するために設計され、変異体2（Mut2）は同じ位置でリジンからアルギニンへの置換を有し、PD-L1の非アセチル化型を模倣するために設計された。これらのプラスミドは、PD-L1の核局在化におけるこの予測アセチル化/メチル化の重要性を試験するために設計された。（B）当該プラスミド構築物をトランスフェクトしたMCF7上皮性乳癌細胞株のPD-L1局在化の分析。固定しPD-L1に対する一次抗体でプローブした細胞で免疫蛍光顕微鏡検査を実施した。グラフは、核マイナスバックグラウンドを選択するためにイメージJを用いて測定された（n＞20細胞/サンプル）トランスフェクト細胞におけるPD-L1のTNFI、TCFI及び核/細胞質蛍光比（Fn/c）を表す。
【図３】図3は、Mut1が、間葉、化学療法剤耐性及び/又は幹性バイオマーカーの発現増加をもたらすことを示す写真及びフラフである。（A）図2に示したプラスミド構築物をトランスフェクトしたMCF7上皮性乳癌細胞株におけるCSV（EMTバイオマーカー）発現の分析。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査をこれら細胞で実施し、CSVに対する一次抗体を用いてプローブした。グラフは、核マイナスバックグラウンドを選択するためにイメージJを用いて測定された（n＞20細胞/サンプル）トランスフェクト細胞におけるTCFIを表す。（B）同じ構築物をトランスフェクトしたMCF7上皮性乳癌細胞株のCD133、EGFR及びSNAIL（幹性及び/又は間葉バイオマーカー）発現の分析。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査をこれら細胞で実施し、CD133、EGFR及びSNAILに対する一次抗体を用いてプローブした。グラフはトランスフェクト細胞におけるTCFI又はTNFIを表し、これらは、核マイナスバックグラウンドを選択するためにイメージJを用いて測定された（n＞20細胞/サンプル）。（C）WTS-1増殖アッセイを用いて、図2に示したプラスミド構築物よるMCF7上皮性乳癌細胞株のトランスフェクションの影響を、WST-1とそれぞれ2、3及び4時間インキュベートした後24時間及び48時間で細胞増殖について調査した。
【図４】図4は、PD-L1のアセチル化型（核PD-L1）が、エピジェネティック酵素SETDB1及びDMNT1と核内に共同局在することを示す写真及びグラフである。（A）図2に示したプラスミド構築物をトランスフェクトしたMCF7上皮性乳癌細胞株のEHTM2、DMNT1及びSETDB1（エピジェネティック酵素）発現の分析。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査をこれら細胞で実施し、EHTM2、DMNT1及びSETDB1に対する一次抗体を用いてプローブした。グラフはトランスフェクト細胞のTCFI又はTNFIを表し、前記は、核マイナスバックグラウンドを選択するためにイメージJを用いて測定された（n＞20細胞/サンプル）。自動閾値設定及び細胞核特異的対象領域（ROI）手動選別によりイメージJソフトウェアを用いて各抗体ペアについてPCCを計算し、PD-L1及びエピジェネティック酵素の共同局在化を定量した。（B）4T1転移性マウス癌モデルにおけるEHTM2、DMNT1及びSETDB1（エピジェネティック酵素）発現の分析（グループA＝コントロール、グループB＝アブラキサン処理）。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査をこれら細胞で実施し、EHTM2、DMNT1及びSETDB1に対する一次抗体を用いてプローブした。グラフは、核マイナスバックグラウンドを選択するためにイメージJを用いて測定された（n＞20細胞/サンプル）トランスフェクト細胞のTCFI又はTNFIを表す。自動閾値設定及び細胞核特異的対象領域（ROI）手動選別によりイメージJソフトウェアを用いて各抗体ペアについてPCCを計算した。
【図５】図5は、核PD-L1が、DNAメチル化（5-mC）及び薬剤耐性バイオマーカーABCB5を上皮性乳癌細胞において増加させることを示す写真及びグラフである。（A）MCF7上皮性乳癌細胞株に図2に示したプラスミド構築物をトランスフェクトした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査をこれら細胞で実施し、H3k9me3及びABCB5に対する一次抗体を用いてプローブした。グラフは、マイナスバックグラウンドを選択するためにイメージJを用いて測定された（n＞20細胞/サンプル）トランスフェクト細胞のTFI又はTNFIを表す。（B）MCF7上皮性乳癌細胞株に図2に示したプラスミド構築物をトランスフェクトした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査をこれら細胞で実施し、5-mC及びABCB5に対する一次抗体を用いてプローブした。グラフは、核マイナスバックグラウンドを選択するためにイメージJを用いて測定された（n＞20細胞/サンプル）トランスフェクト細胞のTFI又はTNFIを表す。
【図６】図6は、PD-L1-K263Ac又はPD-L1-K263Meに特異的なウサギポリクローナル抗体のELISA分析を示すグラフである。（A）非修飾K263を有するPD-L1、（B）K263にアセチルを有するPD-L1、及び（C）K263にメチル（特にトリメチル、Me3）を有するPD-L1。
【図７】図7は、MDA-MB-231細胞でPD-L1-K263-Ac（PDL1Ac）は核内に保持され核に限定されるが、PD-L1-K263-Me（PDL1Me3）は細胞質/細胞膜に限定されることを示す写真及びグラフである。（A）固定MDA-MB-231細胞を透過性にしてこれら細胞で免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、ウサギ抗PD-L1-WT、ウサギ抗PD-L1-K263-Ac、ウサギ抗PD-L1-K263-Me並びにコントロールとして市販のPD-L1抗体を用いてプローブした。グラフは、等式Fn/c＝(Fn- Fb)/(Fc - Fb)を用いたFn/cを示す。式中、Fnは核の蛍光、Fcは細胞質の蛍光、Fbはバックグラウンドの蛍光であり、イメージJを用いて核マイナスバックグラウンドを選択した（n＞20細胞/サンプル）。（B）固定MDA-MB-231細胞、メラノーマCTC（免疫療法応答者及び免疫療法非応答者に由来する）を透過性にしてこれら細胞で免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、ウサギ抗PD-L1-WT、ウサギ抗PD-L1-K263-Ac、ウサギ抗PD-L1-K263-Me及び抗CSV抗体を用いてプローブした。グラフはTCFI又はTNFIを表し、イメージJを用いて核マイナスバックグラウンドを選択した（n＞20細胞/サンプル）。
【図８】図8は、図2に示したプラスミド構築物をトランスフェクトし、ウサギ抗PD-L1-WT、ウサギ抗PD-L1-K263-Ac、ウサギ抗PD-L1-K263-Meで共同標識したMCF7上皮性乳癌細胞株における幹性及び薬剤耐性バイオマーカー（CD133、ABCB5）の分析を示す写真及びグラフである。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査をこれら細胞で実施し、CD133、ABCB5、PD-L1-WT、PD-L1-K263-Ac及びPD-L1-K263-Meに対する一次抗体を用いてプローブした。グラフは、核マイナスバックグラウンドを選択するためにイメージJを用いて測定された（n＞20細胞/サンプル）トランスフェクト細胞のTCFIを表す。
【図９】PD-L1はより高い疾病負荷で増加することを示す写真及びグラフである。（A）RECIST1.1にしたがって完全応答（CR）、部分応答（PR）、安定病状（SD）又は増悪病状（PD）のメラノーマ血液から単離したCTCを、PD-L1-K263-Ac並びに間葉/薬剤耐性バイオマーカーCD133及びABCB5に特異的な抗体を用いてスクリーニングした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、CD133、PD-L1-K263-Ac及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPI（DNAのA-T富裕領域に強く結合する蛍光染料）でプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された（n＝5患者/グループ）CD133についてTCFI値、PDL1についてTNFI、ABCB5についてTFIを表す。（B）2人の患者（患者A：免疫療法耐性者、及び患者B：免疫療法応答者）から単離したCTCを、（A）に記載した同じ抗体パネルを用いて複数時点で追跡した（3ヶ月毎に1サンプル）。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、CD133、PD-L1-K263-Ac（T53p）及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された、CD133についてTCFI値、PDL1についてTNFI、ABCB5についてTFIを表す。
【図１０】図10は、CTCにおけるPD-L1-263KAcの低レベル発現は応答表現型と相関性を有するが、PD-L1-K263Acの高レベル発現は非応答又は耐性CTC表現型と相関性を有することを示すグラフ及び写真である。（A）RECIST1.1にしたがって定義される耐性者コホート又は応答者コホートのメラノーマ血液から単離したCTCを、PD-L1 K263-Ac特異的並びに間葉/薬剤耐性バイオマーカーCD133及びABCB5に特異的なパネル抗体でスクリーニングした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、CD133、PD-L1-K263-Ac及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された（n＝5患者/グループ）、CD133についてTCFI値、PD-L1-K263-AcについてTNFI、ABCB5についてTFIを表す。液体生検に由来するメラノーマCTCをPD-L1-Aｃ発現に基づいて3つのシグネチャーに分けた。シグネチャー3は低発現（750より下）、シグネチャー2は中間域発現（1500より下）、シグネチャー1は高発現（1500を超える）である。（B）液体生検に由来するメラノーマCTCで見出される3シグネチャーの各々の計測合計細胞のパーセント集団。RESIST1.1による決定にしたがって、各シグネチャーの％集団はさらに耐性、応答者及び予想に分けられた。
【図１１】図11は、応答者のCTCサンプルと比較して非応答者又は耐性者のCTCサンプルにおいてPD-L1-K263-Meが低下することを示す写真及びグラフである。（A）RECIST1.1による免疫療法に対する応答者又は耐性者コホートのメラノーマ血液から単離したCTCを、PD-L1 K263-Me特異的並びに間葉/薬剤耐性バイオマーカーCD133及びABCB5に特異的な抗体でスクリーニングした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、CD133、PD-L1-K263-Me及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された（n＝5患者/グループ）、CD133についてTCFI値、PD-L1-K263-MeについてTCFI、ABCB5についてTFIを表す。（B）後期結腸直腸癌（CRC）又は肺癌の血液から単離したCTCを、PD-L1 K263-Ac特異的並びに間葉/薬剤耐性バイオマーカーCD133及びABCB5に特異的なパネル抗体でスクリーニングした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、CD133、PD-L1-263k-me3及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された（n＝5患者/グループ）、CD133についてTCFI値、PD-L1-K263-AcについてTCFI、ABCB5についてTFIを表す。
【図１２】図12は、PD-L1-K236-Acは、薬剤耐性転移乳癌（MBC）細胞株及びMBC患者サンプルにおいてアップレギュレートされることを示す写真及びグラフである。（A）薬剤耐性MBC細胞株を、PD-L1 K263-Ac特異的並びに間葉/薬剤耐性バイオマーカーCD133及びABCB5に特異的な抗体パネルでスクリーニングした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、CD133、PD-L1-K263-Ac及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された（n＝20細胞）、CD133についてTCFI値、PD-L1-K263-AcについてTNFI、ABCB5についてTFIを表す。（B）IV期MBC患者から単離したCTCを固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、CD133、PD-L1-K263-Ac（T53p）及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された、CD133についてTCFI値、PD-L1-K263-AcについてTNFI、ABCB5についてTFIを表す。
【図１３】図13は、PD-L1-236KAcは、化学療法剤耐性細胞株及びIV期MBC患者由来CTCの両方でアップレギュレートされることを示す写真及びグラフである。（A））RECIST1.1にしたがって完全応答（CR）、部分応答（PR）、安定病状（SD）又は増悪病状（PD）のメラノーマ血液から単離したCTCを、PD-L1 K263-Ac特異的並びに間葉/薬剤耐性バイオマーカーP300及びABCB5に特異的な抗体パネルでスクリーニングした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、P300、PD-L1-263kAc及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された（n＝5患者/グループ）、P300についてTNFI値、PD-L1-K263-AcについてTNFI、ABCB5についてTFIを表す。PCCは、P300対PD-L1 K263-Acについて決定された。PCCは、少なくとも20個の細胞について2つの蛍光色素シグナル間の関係の強度±SEを示す。
【図１４】図14は、P300とPD-L1-263KAcとの強い共同局在化及び薬剤耐性MBC細胞株における両者の強い発現を示す写真及びグラフである。薬剤耐性MBC細胞株を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、P300、PD-L1-263KAcに対する一次抗体及び抗ABCB5で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された（n＝5患者/グループ）、P300についてTNFI値、PD-L1-263KAcについてTNFI、ABCB5についてTFIを表す。PCCは、P300対PD-L1-263KAcについて決定された。PCCは、少なくとも20個の細胞について2つの蛍光色素シグナル間の関係の強度±SEを示す。
【図１５】図15は、MDA-MB-231トリプルネガティブMBC細胞のP300阻害剤による処理は、PD-L1 K263-Acを低下させかつPD-L1 K263-Meを増加させることを示す写真及びグラフである。MDA-MB-231トリプルネガティブ細胞株を濃度が増加するP300阻害剤で処理し、P300、PD-L1-K263-AC及びABCB5から成る間葉、耐性シグネチャーのための抗体パネルを用いてスクリーニングした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、P300、PD-L1-K263-Ac及びABCB5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された（n＝20細胞）、P300についてTNFI値、PD-L1-K263-AcについてTNFI、ABCB5についてTFIを表す。PCCは、少なくとも20個の細胞について2つの蛍光色素シグナル間の関係の強度±SEを示す。
【図１６】図16は潜在的なPD-L1シグネチャー遺伝子標的のリストである。*のマークの付いた上記シグネチャー由来の重要なタンパク質はまた転移メラノーマ患者のサンプルで実証されている。驚くべきことに、これら遺伝子標的のほとんど全てが転移、再発および薬剤耐性に関与する。
【図１７】図17は、PD-L1の過剰発現は、化学療法剤耐性、幹性及び/又は病状増悪バイオマーカーNODAL及びCCL5のアップレギュレーションをもたらすことを示す写真及びグラフである。RECIST1.1による免疫療法に対する応答者又は耐性者（非応答者）コホートのメラノーマ血液から単離したCTCを、CSV、NODAL又はCSV及びCCL5から成る間葉、耐性シグネチャーのためのパネルを用いてスクリーニングした。細胞を固定して免疫蛍光顕微鏡検査を実施し、CSV、NODAL又はCSV及びCCL5に対する一次抗体で、さらにDAPIでプローブした。各データセットについて代表的な画像を示す。グラフは、イメージJマイナスバックグラウンドを用いて測定された、CSVについてTCFI値、CCL5についてTCFI、NODALについてTNFI、TCFI、又は等式Fn/c＝(Fn- Fb)/(Fc - Fb)を用いた核/細胞質蛍光比（Fn/c）を示す（前記式中、Fnは核の蛍光、Fcは細胞質の蛍光、Fbはバックグラウンドの蛍光である）。
【図１８】図18は、提唱される核PD-L1のメカニズムを示すグラフである。このメカニズムでは、PD-L1-K263-Acは核で抑制的な役割及び活性化の役割の両方を持ち、核で、PD-L1-K263-Acは例えばDMNTI及びSETDB1のようなマーカーと抑制的複合体の部分を形成する。これに加えて、PD-L1-K263-Acはまた、エンハンサー/活性化ヒストンPTM、例えばH3k27acとともに間葉転写因子、例えばSNAI1及びHATタンパク質、例えばP300（前記はマPD-L1をアセチル化する）と強力な複合体を形成する。
【図１９】図19は、PD-L1-K263Ac、CD133及びABCB5の発現は、疾病負荷の増加とともに増加することを示すグラフである。（A）RECIST1.1による完全応答（CR）、部分応答（PR）、安定病状（SD）又は増悪病状（PD）のメラノーマ血液から単離したCTCを、CSV、PDL1-263-KAc及びABCB5から成る間葉、耐性シグネチャーのためのパネルを用いてスクリーニングした。細胞を固定し、サンプルを抗CD133、抗PDL1-263-K-Ac及び抗ABCB5に対する一次抗体でDAPIとともに標識した。標識CTCの合計％集団変化を定量した。ASIのmIFシステムジェネリックスキャン及び高処理IF顕微鏡検査のための多重免疫蛍光サンプル用分析系を用いて、細胞数及びIFシグナル強度を定量した。グラフのプロットは、間葉、化学療法剤耐性シグネチャーについてCD133及びABCB5マーカーを有するPDL1＋CTCの合計％変化を表す。グラフは％集団を表す（n＝40患者サンプル/グループ）。（B）（A）と同じサンプルから強度表現を計算した。グラフのプロットは、CD133について平均FI値、PDL1について平均NFI、ABCB5について平均FIを表し（n＝40患者サンプル/グループ）、前記は、ASIのmIFシステムジェネリックスキャン及び高処理IF顕微鏡検査のための多重免疫蛍光サンプル用分析系を用いて測定し、細胞数及びIFシグナル強度を定量した。  いくつかの図及び説明文は着色表示又は着色物を含む。着色図解は、要請により出願人から又は適切な特許局から入手可能である。特許局から入手する場合には、手数料が徴収されることがある。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
1．定義
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する業界の業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料と類似するか又は等価であるいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験に用いることができるが、好ましい方法及び材料を下記に定義する。
冠詞“a”及び“an”は、当該冠詞の文法上の目的語の1つ又は2つ以上（すなわち少なくとも1つ）を指すために本明細書では用いられる。例示すれば、“an element（要素）”は、1つの要素又は2つ以上の要素を意味する。
本明細書で用いられる“約”という用語は、この技術分野の業者によく知られている、対応する値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書である値又はパラメーターで“約”と言えば、当該値又はパラメーターそのものに向けられる具体的なものを含む（さらに前記を記述する）。
【００２６】
“同時投与”又は“同時に投与する”又は“共同投与”などという用語は、2つ以上の活性物を含む単一組成物の投与、又は、別々の組成物として及び/又は別々のルートによって、当該有効な結果がそのような活性物の全てが単一組成物として投与されるときに得られる結果と等価であるように十分に短い時間内に同時発生的に又は同時期に又は連続的にデリバリーされる各活性物の投与を指す。“同時期に”とは、活性薬剤が実質的に同じ時に、望ましくは同じ処方で一緒に投与されることを意味する。“同時発生的に”とは、活性薬剤が時間的に接近して投与されること、例えば、1つの薬剤が、別の薬剤の前後約1分以内から約1日以内に投与されることを意味する。いずれの同時発生的時間も有用である。しかしながら、同時期に投与されないとき、複数の薬剤が、約1分以内から約8時間以内に、適切には約1時間から約4時間以内に投与されることはよくある事例であろう。同時発生的に投与されるとき、薬剤は適切には対象動物の同じ部位に投与される。“同じ部位”という用語は、寸部の違いも無い位置を含むが、ただし約0.5から約15センチメートル以内、好ましくは約0.5から約5センチメートル以内であってもよい。本明細書で用いられる“別々に”という用語は、薬剤が、ある間隔で、例えば約1日から数週間又は数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。複数の活性薬剤はいずれの順序で投与されてもよい。本明細書で用いられる“連続的に”という用語は、薬剤が連続して、例えば数分、数時間、数日又は数週間の1つの間隔又は複数の間隔で投与されることを意味する。適切な場合には、活性薬剤は規則的な反復サイクルで投与され得る。
【００２７】
“薬剤”という用語は、任意の診断、治療、又は予防薬剤を指す。“薬剤”という用語は狭く解釈されるべきではなく、小分子、タンパク質性分子（例えばペプチド、ポリペプチド及びタンパク質）だけでなく、遺伝分子（例えばRNA、DNA及び模倣物並びにそれらの化学的アナローグ）とともに細胞性薬剤に及ぶ。“薬剤”という用語は、本明細書で言及するポリペプチドを産生及び分泌することができる細胞だけでなく、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。“薬剤”という用語はまた核酸構築物に及び、前記構築物は、ベクター（例えばウイルス性又は非ウイルス性ベクター、発現ベクター）並びに、ある細胞域で発現及び分泌させるためのプラスミドを含む。
本明細書で用いられるように、“増幅”は、一般的に所望の配列の複数のコピーを生成するプロセスを指す。“複数のコピー”は少なくとも2つのコピーを意味する。“コピー”は、必ずしも鋳型配列に対する完全な配列相補性又は同一性を意味しない。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナローグ（例えばデオキシイノシン）、意図的な配列改変（例えば、鋳型とハイブリダイズできるが相補的ではない配列を含むプライマーにより導入される配列改変）、及び/又は増幅中に生じる配列エラーを含むことができる。
バイオマーカーの“量”又は“レベル”はサンプルにおいて検出可能なレベル又は量である。これらは、当業者に公知であり本明細書でも開示される方法によって測定することができる。これらの用語は、定量的な量若しくはレベル（例えば重量又はモル）、半定量的な量又はレベル、相対的な量又はレベル（例えばクラス内の重量％又はモル％）、濃度などを包含する。したがって、これらの用語は、サンプル中のバイオマーカーの絶対的若しくは相対的な量又はレベル又は濃度を包含する。判定されるバイオマーカーの発現レベル又は量を用いて、治療に対する応答を決定することができる。
【００２８】
本明細書で用いられるように、“及び/又は”は、関連する列挙項目の1つ以上の任意の組合せ及び全ての可能な組合せだけでなく、また別に解釈されるときは組合せの欠如（又は）も指しかつ包含する。
“アンタゴニスト”又は“阻害剤”という用語は、別の分子（例えば受容体）の生物学的活性又は作用を防止、遮断、阻害、中和する、又は低下させる物質を指す。
“アンタゴニスト抗体”という用語は、標的に結合し、当該標的の生物学的作用を防止する又は低下させる抗体を指す。いくつかの実施態様では、前記用語は、抗体が結合する標的（例えばPD-L1、CTLA4など）が生物学的機能を発揮することを妨げる抗体を示すことができる。
本明細書で用いられるように、“抗免疫チェックポイント分子アンタゴニスト抗体”は、免疫チェックポイント分子によって媒介される生物学的活性及び/又は下流事象を阻害することができる抗体を指す。抗免疫チェックポイント分子アンタゴニスト抗体は、免疫チェックポイント分子の生物学的活性（免疫チェックポイント分子を介する阻害性シグナル伝達及び免疫チェックポイント分子によって媒介される下流の事象を含む）を（顕著な程度を含む任意の程度で）遮断、拮抗、抑制する又は低下させる抗体を包含する。前記生物学的活性は、例えば、免疫チェックポイント分子結合パートナーと免疫チェックポイント分子の結合および下流のシグナリング、腫瘍増殖を含む細胞増殖の阻害、T細胞増殖の阻害、T細胞活性化の阻害、サイトカイン分泌の阻害、及び抗腫瘍免疫応答の阻害である。本発明の目的のためには、用語“抗免疫チェックポイント分子アンタゴニスト抗体”（互換的に以下のようにも呼ばれる：“アゴニスト免疫チェックポイント分子抗体”、“アンタゴニスト抗免疫チェックポイント分子抗体”又は“免疫チェックポイント分子アンタゴニスト抗体”）は、それによって免疫チェックポイント分子そのもの、免疫チェックポイント分子の生物学的活性、又は生物学的活性の結果をいずれも意義のある程度に実質的に無効化し、低下させ、又は中和する、以前に識別された名称、タイトル、並びに機能的状態及び特徴の全てを包含することは明瞭に理解されるであろう。
【００２９】
“抗体”という用語は、本明細書ではもっとも広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マルチ特異性抗体（例えば二特異性抗体）、及び単可変ドメイン抗体をカバーするが、ただしそれらが望ましい生物学的活性を示す場合に限られる。“抗体”という用語は、4つのポリペプチド（ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重（H）鎖及び2つの軽（L）鎖）を含む免疫グロブリン分子だけでなく、そのマルチマー（例えばIgM）も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（HCVR又はVHと略することができる）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は3つのドメイン（CH1、CH2及びCH3）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（LCVR又はVLと略することができる）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は1つのドメイン（CL1）を含む。VH及びVL領域はさらにまた超可変領域に細分化される。前記は相補性決定領域（CDR）と呼ばれ、当該領域にはより保存された領域（フレーム領域（FR）と呼ばれる）が点在する。各VH及びVLは3つのCDR及び4つのFRを含み、前記は、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で並ぶ：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本発明の種々の実施態様では、抗体（又はその抗原結合部分）のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であるか、又は天然のまま若しくは人工的に改変されることがある。アミノ酸コンセンサス配列は2つ以上のCDRの並列分析に基づいて定義できる。任意のクラスの抗体、例えばIgG、IgA、又はIgM（又は前記のサブクラス）が“抗体”という用語の範囲内に含まれ、さらに抗体は必ずしもいずれか特定のクラスである必要はない。その重鎖定常領域の当該抗体アミノ酸配列にしたがって、免疫グロブリンは異なるクラスに割り振られる。5つの主要な免疫グロブリンクラス、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMが有り、これらのいくつかはさらにサブクラス（サブタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2に分けられる。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。
【００３０】
“抗原結合フラグメント”は、非抗体タンパク質の骨格に1つ以上のCDRを配置する手段によって提供され得る。本明細書で用いられる“タンパク質骨格”には、免疫グロブリン（Ig）骨格（例えばIgG骨格）が含まれる（ただし前記に限定されない）。前記骨格は、4鎖又は2鎖抗体であってもよく、又は抗体のFc領域のみを含んでいてもよく、又は1つの抗体に由来する1つ以上の定常領域を含んでいてもよく、前記定常領域はヒト若しくは霊長類起源であってもよく、又はヒト及び霊長類の定常領域の人工的キメラであってもよい。タンパク質骨格は、Ig骨格（例えばIgG又はIgA骨格）でもよい。IgG骨格は、抗体のいくつか又は全てのドメイン（すなわちCH1、VH2、CH3、VH、VL）を含むことができる。抗原結合タンパク質は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はIgG4PEから選択されるIgG骨格を含むことができる。例えば、骨格はIgG1であってもよい。骨格は、抗体のFc領域から成るか若しくはFc領域を含むことができ、又はその部分である。抗原結合フラグメントの非限定的な例には以下が含まれる：（i）Fabフラグメント；（ii）F(ab’)フラグメント；（iii）Fdフラグメント；（iv）Fvフラグメント；（v）単鎖Fv（scFv）分子；（vi）dAbフラグメント；及び（vii）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識ユニット（例えば単離された相補性決定領域（CDR）、例えばCDR3ペプチド）又は拘束FR3-CDR3-FR4ペプチド。他の操作分子、例えばドメイン特異的抗体、単ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュール免疫薬（SMIP）、及びサメ可変IgNARドメインもまた、本明細書で用いられる“抗原結合フラグメント”という表現に包含される。抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも1つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは任意のサイズ又はアミノ酸組成が可能であり、概して少なくとも1つのCDRを含み、前記CDRは、1つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか又はフレームワーク配列とインフレームである。VLドメインと結合したVHドメインを有する抗原結合フラグメントでは、当該VL及びVHドメインは、互いに対して任意の適切な配置で位置し得る。例えば、可変領域はダイマー性であり、VH-VH、VH-VL又はVL-VLダイマーであり得る。また別に、抗体の抗原結合フラグメントはモノマーVH又はVLドメインを含むことができる。ある種の実施態様では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも1つの定常ドメインに共有結合で連結された少なくとも1つの可変ドメインを含むことができる。本発明の抗体の抗原結合フラグメントで見出され得る非限定的な例示的立体配置には以下が含まれる：（i）VH-CH1；（ii）VH-CH2；（iii）VH-CH3；iv）VH-CH1-CH2；（v）VH-CH1-CH2-CH3；（vi）VH-CH2-CH3；（vii）VH-CL；（viii）VL-CH1；（ix）VL-CH2；（x）VL-CH3；（xi）VL-CH1-CH2；（xii）VL-CH1-CH2-CH3；（xiii）VL-CH2-CH3；及び（xiv）VL-CL。可変及び定常ドメインの任意の立体配置（上記に列挙した任意の例示的立体配置を含む）では、可変及び定常ドメインは互いに直接連結されても、完全若しくは部分的ヒンジ又はリンカー領域によって連結されてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも2つの（例えば5、10、15、20、40、60又は60を超える）��ミノ酸から成ることが可能であり、前記は、単一ポリペプチド分子の隣接する可変及び/又は定常ドメイン間で可撓性又は半可撓性結合を生じる。さらにまた、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、上記に列挙した可変及び定常ドメインのいずれかの、互いに及び/又は1つ以上のモノマーVH及びVLドメインと（例えばジスルフィド結合によって）非共有結合されたホモダイマー又はヘテロダイマー（又は他のマルチマー）を含むことができる。完全抗体と同じように、抗原結合フラグメントは、一特異性又はマルチ特異性（例えば二特異性）であり得る。抗体のマルチ特異性抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも2つの異なる可変ドメインを含み、ここで、各可変ドメインは、別々の抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる。いずれのマルチ特異性抗原結合分子様式も（本明細書に開示する例示的な二特異性抗原結合分子様式を含む）、当業界で利用可能な日常的技術を用いて本発明の抗体の抗原結合フラグメントの環境での使用に適合させることができる。
【００３１】
本明細書で用いられるように、“抗原”という用語及びその文法的に等価の表現（例えば“抗原性の”）は、特異的な液性又は細胞性免疫の生成物（例えば抗体分子又はT細胞受容体）が特異的に結合することができる化合物、組成物又は物質を指す。抗原は任意のタイプの分子であることができ、前記には、例えばハプテン、単純な中間代謝物、糖類（例えばオリゴ糖）、脂質、及びホルモンだけでなく、巨大分子、例えば複合炭水化物（例えば多糖類）、リン脂質、及びタンパク質が含まれる。抗原の一般的カテゴリーには以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物及び他の寄生動物性抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する抗原、毒素、並びに他の雑多な抗原。
“抗原結合分子”とは、標的抗原に対して結合親和性を有する分子を意味する。この用語は、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、及び抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークに及ぶことは理解されるであろう。本発明の実施に有用な代表的抗原結合分子には抗体及び抗原結合フラグメントが含まれる。
【００３２】
“抗原提示細胞”又は“APC”は、免疫系の特異的なエフェクター細胞（本明細書では“免疫エフェクター細胞”とも称される）によって認識され得るペプチド-MHC複合体の形で1つ以上の抗原を提示し、それによって、提示される1つの抗原又は複数の抗原に対する免疫応答を調整することができる細胞のクラスを指す。本発明の具体的な実施態様では、APCは、免疫エフェクター細胞、例えばTリンパ球（CD8+及び/又はCD4+リンパ球を含む）を活性化することができる。APCとして作用する潜在能力をin vivoで有する細胞には、例えば専門的APC（例えば樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、単球及びB細胞）だけでなく非専門的APCも含まれ、後者の例示的な例には活性化上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、膵ベータ細胞及び血管内皮細胞とともに癌細胞が含まれる。多くの細胞タイプが、それらの細胞表面に免疫エフェクター細胞（T細胞を含む）の認識のために抗原を提示することができる。
本明細書で用いられるように、“抗原特異的”という用語は、該当する抗原又は抗原のフラグメントの供給が特異的な細胞増殖、適切にはT細胞増殖を生じる細胞集団の特性を指し、前記増殖は例えば、損傷細胞、悪性疾患又は感染に適切に向けられるT細胞（例えばCTL及び/又はヘルパーT細胞）の活性化を特徴とする。
【００３３】
本明細書で用いられるように、“結合する”、“〜と特異的に結合する”又は“〜に特異的である”という用語は、測定可能でかつ再現性がある相互作用、例えば標的と抗体と間の結合を指し、前記は、生物学的分子を含む不均質な分子集団の存在下で標的の存在について決定力を有する。例えば、ある標的（前記はエピトープであり得る）と結合又は特異的に結合する抗体は、当該抗体が他の標的と結合するよりも強い親和性、アビディティでより容易に及び/又は長い期間結合する抗体である。ある実施態様では、抗体と無関係の標的との結合の程度は、例えば放射性免疫アッセイ（RIA）によって測定したとき、当該抗体と標的との結合の約10％未満である。ある種の実施態様では、標的と特異的に結合する抗体は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、又は0.1nM以下の解離定数（Kd）を有する。ある種の実施態様では、抗体は、異なる種に由来するタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープと特異的に結合する。別の実施態様では、特異的結合は排他的結合を含むことができるが、排他的結合を要求しない。
【００３４】
本明細書で用いられる“バイオマーカー”という用語は、サンプル中に検出することができるインジケーター（例えば予測薬、診断薬、及び/又は予後診断薬である）を指す。バイオマーカーは、疾患又は異常（例えば癌）の該当するサブタイプ（一定の、分子的、病理学的、組織学的及び/又は臨床的特色を特徴とする）のインジケーターとして役立ち得るか、及び/又は、該当する細胞タイプ又は状態（例えば上皮性、間葉性など）及び/又は治療法に対する応答のインジケーターとして役立ち得る。バイオマーカーには以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：ポリヌクレオチド（例えばDNA及び/又はRNA）、ポリヌクレオチドコピー数変化（例えばDNAコピー数）、ポリペプチド、ポリペプチド及びポリヌクレオチド修飾（例えば翻訳後修飾）、炭水化物、及び/又は糖脂質系分子マーカー。バイオマーカーは、その（症候を含む）生理学的又は病理生理学的状態（例えば原発癌、転移癌など）の開始前の対象動物から得られるサンプルに存在し得る。したがって、対象動物から得られるサンプルにおいてバイオマーカーが存在することは、対象動物がその生理学的若しくは病理学的状態又は症候を発達させるリスクが増加することの指標であり得る。また別には、或いはそれに加えて、バイオマーカーは個体で通常発現され得るが、その発現は、生理学的又は病理生理学的状態（その症候を含む）の開始前に変化し得る（すなわち、バイオマーカーは増加（アップレギュレーション、過剰発現）するか又は低下（ダウンレギュレーション、減少発現）する。したがって、バイオマーカーのレベルの変化は、対象動物がその生理学的若しくは病理学的状態又は症候を発達させるリスクが増加することの指標であり得る。また別に、或いはそれに加えて、バイオマーカーのレベルの変化は、該当する生理学的若しくは病理学的状態又はその症候の対象動物における変化を反映している可能性があり、それによって、生理学的若しくは病理学的状態又はその症候の本質をある期間にわたって追跡することを可能にする。このアプローチは、例えば、対象動物でその有効性を評価する目的のために（又は別の目的のために）治療レジメンをモニターするときに有用であり得る。本明細書に記載するように、バイオマーカーのレベルと言えば、バイオマーカーの濃度、バイオマーカーの発現のレベル、又はバイオマーカーの活性が含まれる。
【００３５】
“バイオマーカーシグネチャー”、“シグネチャー”、“バイオマーカー発現シグネチャー”又は“発現シグネチャー”という用語は本明細書では互換的に用いられ、その発現が指標、例えば予測指標、診断指標、及び/又は予後診断指標となる1つのバイオマーカー又はバイオマーカーの組合せを指す。バイオマーカーシグネチャーは、一定の分子的、病理学的、組織学的及び/又は臨床的特色を特徴とする、疾患又は異常の該当するサブタイプ（例えば原発癌、転移癌）、又はその症候（例えば治療法に対する応答、薬剤耐性、及び/又は疾病負荷）のインジケーターとして機能し得る。いくつかの実施態様では、バイオマーカーシグネチャーは“遺伝子シグネチャー”である。“遺伝子シグネチャー”という用語は、“遺伝子発現シグネチャー”と互換的に用いられ、その発現が指標、例えば予測指標、診断指標、及び/又は予後診指標となる1つのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組合せを指す。いくつかの実施態様では、バイオマーカーシグネチャーは“タンパク質シグネチャー”である。“タンパク質シグネチャー”という用語は、“タンパク質発現シグネチャー”と互換的に用いられ、その発現が指標、例えば予測指標、診断指標、及び/又は予後診断指標となる1つのポリペプチド又はポリペプチドの組合せを指す。バイオマーカーシグネチャーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、若しくは100又は100を超えるバイオマーカーを含むことができる。
【００３６】
“癌”又は“癌性”という用語は、典型的には無制御細胞増殖を特徴とし、局所的に及び/又は身体の他の部分に拡大して（転移する）侵襲するという潜在能力を有する、対象動物の生理学的状態を指すか又は表す。“癌”という用語は、本明細書では概ね“腫瘍”と互換的に用いられ（腫瘍が特に“良性”腫瘍（近傍の組織を侵襲し又は転移する能力を欠く異常な細胞塊）を指していない場合）、悪性固形腫瘍（例えば癌腫、肉腫）及び検出可能な固形腫瘍塊が存在し得ない悪性増殖（例えばある種の血液学的悪性疾患）を包含する。非限定的な癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性疾患が含まれるが、ただし前記に限定されない。そのような癌のより具体的な例には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：扁平細胞癌（例えば上皮性扁平細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む）、肺の腺癌及び肺の扁平細胞癌腫、腹膜の癌、肝細胞癌、胃に関する（gastric）癌又は胃癌（胃腸癌及び間質性胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿道の癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮の癌、唾液腺癌腫、腎又は腎臓に関する（renal）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓に関する（hepatic）癌、肛門癌、陰茎癌、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、ほくろ性悪性メラノーマ、末端性ほくろ性メラノーマ、結節性メラノーマ、多発性骨髄腫及びB細胞リンパ腫（以下を含む：低悪性度/濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）、小リンパ球性（SL）NHL、中悪性度/濾胞性NHL、中悪性度びまん性NHL、高悪性度免疫芽細胞性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度小型切れ込み細胞NHL、バルキー病変NHL、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、並びに移植後リンパ球増殖性疾患（PTLD）とともに、母斑症、浮腫（例えば脳腫瘍に付随するもの）、メイーグ症候群に付随する異常な血管増殖、頭頸部とともに脳の癌、並びに関連する転移疾患。ある種の実施態様では、本発明の抗体による治療に馴染みやすい癌には、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）、腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫が含まれる。いくつかの実施態様では、癌は以下から選択される：小細胞肺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳房癌腫、胃癌、結腸直腸癌（CRC）、及び肝細胞性癌腫。さらにいくつかの実施態様では、癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、神経膠芽腫及び乳房癌腫（前記癌の転移型を含む）から選択される。具体的な実施態様では、癌はメラノーマ又は肺癌、適切には転移メラノーマ又は転移肺癌である。
“細胞区画”という用語は、細胞小器官（例えばミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、リボソームなど）、核、細胞質（場合によって細胞小器官を含む）、核膜及び他の細胞領域を含む細胞の部分を含む。
“化学療法”という用語は、1つ以上の化学療法剤（細胞成長及び細胞分裂を阻害し停止させる）を用いる人間及び動物の治療法を指す。当該治療法は細胞増殖阻害を採用し、細胞死（細胞アポトーシス）を誘発するために用いられる。正常な細胞と比較して、癌細胞は無制御に成長し分裂し、したがって化学療法は癌細胞に対して一層効果的でなければならない。
【００３７】
“化学療法剤”という用語は、腫瘍の成長の阻害に有効な化合物を指す。化学療法剤の例には以下が含まれる：エルロチニブ（TARCEVA(商標)：Genentech/OSI Pharm.）、ボルテゾミブ（VELCADE(商標)：Millennium Pharm.）、ジスルフィラム、没食子酸エピガロカテキン、サリノスポラミドA、カルフィルゾミブ、17-AAG（ゲルダナマイシン）、ラディシコール、乳酸脱水素酵素A（LDH-A）、フルベストラント（FASLODEX(商標)：AstraZeneca）、スニチブ（SUTENT(商標)：Pfizer/Sugen）、レトロゾール（FEMARA(商標)：Novartis）、イマチニブメシル酸塩（GLEEVEC(商標)：Novartis）、フィナスネート（VATALANIB(商標)：Novartis）、オキサリプラチン（ELOXATIN(商標)：Sanofi）、5-FU（5-フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、RAPAMUNE(商標)：Wyeth）、ラパチニブ（TYKERB(商標)、GSK572016：Glaxo Smith Kline）、ロナファミブ（SCH 66336）、ソラフェニブ（NEXAVAR(商標)：Bayer Labs）、ゲフィチニブ（IRESSA(商標)：AstraZeneca）、AG1478、アルキル化剤、例えばチオテパ及びCYTOXAN(商標)シクロスフォスファミド；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ及びウレドパ；エチレンイミン及びメチラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロメラミンを含む）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（トポテカン及びイリノテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナローグを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8）；アドレノコルチコステロイド（プレドニソン及びプレドニゾロンを含む）；酢酸クリプロテロン；5α-レダクターゼ（フィナステリド及びドゥタステリドを含む）；ボリノスタート、ロミデプシン、パノビノスタート、バルプロ酸、モセチノスタートドラスタチン；アルデスロイキン、タルクドゥオカルマイシン（合成アナローグ、KW-2189及びCB1-TM1を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード（例えばクロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチン）；抗生物質、例えばエンジイン系抗生物質（例えばカリケアミシン、特にカリケアミシンγ1I及びカリケアミシンω1I（Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994 33:183-186）；ダイネミシン（ダイネミシンAを含む）；ビスホスホネート（例えばクロドロネート）；エスペラミシンとともにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連クロモタンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダ��ノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシンン、アドリアマイシン（ADRIAMYCIN(商標)）（ドキソルビシン）、モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝薬、例えばメトトレキセート及び5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸アナローグ、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトトレキセート；プリンアナローグ、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナローグ、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補液、例えば葉酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デモコルシン；ジアジクオン；エルフォミシン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグリコシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダムノール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK(商標)多糖類複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ヴェルラクリンA、ロリジンA及びアングイジン）；ウレタン；ヴィンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ara-C”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばTAXOL（パクリタキセル：Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、アブラキサン（ABRAXANE(商標)）（クレモフォール不含）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子処方物（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.）及びタキソテア（TAXOTERE(商標)）（ドセタキセル、ドクセタキセル：Sanofi-Aventis）；クロラムブシル；ゲムザー（GEMZAR(商標)）（ゲムシタビン）；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金アナローグ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；エトポシド（VP-16）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（NAVELBINE(商標)）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；��ミノプテリン；カペシタビン（XELODA(商標)；イバンドロネート；CPT-11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイド、例えばレチノイン酸；並びに上記のいずれかの医薬的に許容できる塩、酸、及び誘導体。
【００３８】
化学療法剤にはまた以下が含まれる：（i）腫瘍でホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節剤（SERM）、例えば以下を含む：タモキシフェン（NOLVADEX(商標)、クエン酸タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン及びファレストン（FARESTON(商標)）（トレミフェンクエン酸塩）；（ii）酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤（前記酵素は副腎でエストロゲン生成を調節する）、例えば、4(5)-イミダゾール、アミノグルテチミド、メガセ（MEGASE(商標)）（酢酸メゲストロール）、アロマシン（AROMASIN(商標)）（エクセメスタン：Pfizer）、フォルメスタニー、ファドロゾール、リビソル（RIVISOR(商標)）（ヴォロゾール）、フェマラ（FEMARA(商標)）（レトロゾール：Novartis）、及びアリミデクス（ARIMIDEX(商標)）（アナストロゾール：AstraZeneca）：（iii）抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；ブセレリン、トリプテレリン、メドロキシプロジェステロンアセテート、ジエチルスチルベストロール、プレマリン、フルオキシメステロン（いずれもトランスレチノイン酸）、フェンレチニドとともにトロキサシタビン（1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシンアナローグ）；（iv）タンパク質キナーゼ阻害剤；（v）脂質キナーゼ阻害剤；（vi）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖で示唆されるシグナリング経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例えばPKC-α、Ralf及びH-Ras；（vii）リボザイム、例えばVEGF発現阻害剤（例えばANGIOZYME(商標)）及びHER2発現阻害剤；（viii）ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン（例えばALLOVECTIN(商標)、LEUVECTIN(商標)及びVAXID(商標)）；PROLEUKIN(商標)、rIL-2；トポイソメラーゼ1阻害剤（例えばLURTOTECAN(商標)）；アバレリクス（ABARELIX(商標)）rmRH；及び（ix）上記のいずれかの医薬的に許容できる塩、酸及び誘導体。
【００３９】
化学療法剤にはまた、抗体、例えばアレムツズマブ（Campath）、ベバシズマブ（AVASTIN(商標)：Genentech）、セツキシマブ（ERBITUX(商標)：Imclone）、パニツムマブ（VECTIBIX(商標)：Amgen）、リツキシマブ（RITUXAN(商標)：Genentech/Biogen Idec）、ペルツズマブ（OMNITARG(商標)、2C4：Genentech）、トラスツズマブ（HERCEPTIN(商標)：Genentech）、トシツモマブ（Bexxar、Corixia）及び抗体薬複合化物、ゲムツズマブオゾガミシン（MYLOTARG(商標)：Wyeth）が含まれる。本発明の化合物と組み合わされる薬剤として治療的潜在能力を有する追加されるヒト化モノクローナル抗体には以下が含まれる：アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピノイズマブ、ビバツズマブメルトランシン、カンツズマブメルトランシン、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、イノツズマブオゾガミシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペクセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウロトキサズマブ、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、及び抗インターロイキン12（ABT-874/J695：Wyeth Research and Abbott Laboratories）（前記は、組換え体のもっぱらヒト配列の完全長IgGサブクラス1ラムダ抗体であり、遺伝的に改変されてインターロイキン12 p40タンパク質を認識する）
【００４０】
化学療法剤にはまた“EGFR阻害剤”が含まれる。EGFR阻害剤は、EGFRと結合するか、或いはEGFRと直接相互作用してそのシグナリング活性を妨げるか又は低下させ、また別には“EGFRアンタゴニスト”と称される化合物を指す。そのような薬剤の例には、EGFRと結合する抗体及び小分子が含まれる。EGFRと結合する抗体の例には以下が含まれる：MAb 579（ATCC CRL HB 8506）、MAb 455（ATCC CRL HB8507）、MAb 225（ATCC CRL 8508）、MAb 528（ATCC CRL 8509）（以下を参照：U.S. Pat. No. 4,943,533、Mendelsohn et al.）及び前記の変種、例えばキメラ化225（C225又はセツキシマブ；ERBUTIX(商標)）及び再形成ヒト225（H225）(以下を参照：WO 96/40210（Imclone Systems Inc.）；IMC-11F8、完全にヒト、EGFR-標的抗体（Imclone）；II型変異体EGFRと結合する抗体（U.S. Pat. No. 5,212,290）；U.S. Pat. No. 5,891,996に記載されたEGFRと結合するヒト化及びキメラ抗体；及びEGFRと結合するヒト抗体、例えばABX-EGF又はパニツムマブ（WO98/50433を参照、Abgenix/Amgen）；EMD 55900（Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640, 1996）；EMD7200（マツズマブ）、EGFRに対向するヒト化EGFR抗体であって、EGFR結合についてEGF及びTGF-αの両方と競合する（EMD/Merck）；ヒトEGFR抗体、HuMax-EGFR（GenMab）；完全にヒト抗体であって、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6. 3及びE7.6. 3として知られ、U.S. Pat. No. 6,235,883に記載されているもの；MDX-447（Medarex Inc）；及びmAb 806又はヒト化mAb 806（Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384, 2004）。抗EGFR抗体は細胞傷害性薬剤と複合物化させて免疫複合化物を作製できる（例えば以下を参照：EP659439A2、Merck Patent GmbH）。EGFRアンタゴニストには、例えば以下に記載された化合物である小分子が含まれる：U.S. Pat. Nos. 5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008、及び5,747,498とともに以下のPCT公開：WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016及びWO99/24037。該当する小分子EGFRアンタゴニストには以下が含まれる：OSI-774（CP-358774、エルロチニブ、タルセバ（TARCEVA(商標), Genentech/OSI Pharmaceuticals）；PD 183805（CI 1033、2-プロペンアミド、N-[4-[(3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ]-7-[3-(4-モルフォリニル)プロポキシ]-6-キナゾリニル]-,ジヒドロクロリド、Pfizer Inc.）；ZD1839、ゲフチニブ（IRESSA(商標)）4-(3'-クロロ-4'-フルオロアニリノ)-7-メトキシ-6-(3-モルフォリノプロポキシ)キナゾリン、AstraZeneca）；ZM 105180（(6-アミノ-4-(3-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン、Zeneca)；BIBX-1382（N8-(3-クロロ-4-フルオロ-フェニル)-N2-(1-メチル-ピペリジン-4-イル)-ピペリミド[5,4--d]ピリミジン-2,8-ジアミン、Boehringer Ingelheim）；PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-フェニルエチル)アミノ]-1H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-6-イル]-フェノール)-；(R)-6-(4-ヒドロキシフェニル)-4-[(1-フェニルエチル)アミノ]-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミ-ジン)；CL-387785 (N-[4-[(3-ブロモフェニル)アミノ]-6-キナゾリニル]-2-ブチンアミド)；EKB-569 (N-[4-[(3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ]-3-シアノ-7-エトキシ-6-キノリニル]-4-(-ジメチルアミノ)-2-ブテンアミド)（Wyeth）；AG1478（Pfizer）；AG1571（SU 5271、Pfizer）；二重EGFR/HER2チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ（TYKERB(商標)、GSK572016又はN-[3-クロロ-4-[(3フルオロフェニル)メトキシ]フェニル]-6[5[[[2メチルスルフォニル)エチル]アミノ]メチル]-2−フラニル]-4-キナゾ���ンアミン）。
【００４１】
化学療法剤にはまた、以下を含む“チロシンキナーゼ阻害剤”が含まれる：先行パラグラフに記載のEGFR標的薬；小分子HER2チロシンキナーゼ阻害剤、例えばTakedaから入手可能なTAK165；CP-724,714（ErbB2受容体チロシンキナーゼの経口選択性阻害剤）（Pfizer及びOSI）；二重HER阻害剤、例えばEKB-569（Wyethから入手可能）（前記は優先的にEGFRと結合するが、HER2及びEGFR過剰発現細胞を阻害する）；ラパチニブ（GSK572016、Glaxo-SmithKlineから入手可能）、経口用HER2及びEGFRチロシンキナーゼ阻害剤；PKI-166（Novartisから入手可能）；汎HER阻害剤、例えばカネルチニブ（CI-1033、Pharmacia）；Raf-1阻害剤、例えばアンチセンス薬剤ISIS-5132（ISIS Pharmaceuticalsから入手可能）、前記はRaf-1シグナリングを阻害する；非HER標的TK阻害剤、例えばイマチニブメシレート（GLEEVEC(商標)、Glaxo SmithKlineから入手可能）；マルチ標的チロシンキナーゼ阻害剤、例えばスヌチニブ（SUTENT(商標)、Pfizerから入手可能）；VEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばヴァタラニブ（PTK787/ZK222584、Novartis/Schering AGから入手可能）；MAPK細胞外調節キナーゼI阻害剤CI-1040（Pharmaciaから入手可能）；キナゾリン、例えばPD 153035、4-(3-クロロアニリノ)キナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ピロロピリミジン、例えばCGP 59326、CGP 60261及びCGP 62706；ピラゾロピリミジン、4-(フェニルアミノ)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、4,5-ビス(4-フルオロアニリノ)フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含むチルホスチン；PD-0183805（Warner-Lamber）；アンチセンス分子（例えばHERをコードする核酸と結合するもの）；キノキサリン（U.S. Pat. No. 5,804,396）；チルホスチン（U.S. Pat. No. 5,804,396）；ZD6474（Astra Zeneca）；PTK-787（Novartis/Schering AG）；汎HER阻害剤、例えばCI-1033（Pfizer）；アフィニタック（ISIS 3521、Isis/Lilly）；イマチニブメシレート（GLEEVEC(商標)；PKI 166（Novartis）；GW2016（Glaxo SmithKline）；CI-1033（Pfizer）；EKB-569（Wyeth）；セマキシニブ（Pfizer）；ZD6474（AstraZeneca）；PTK-787（Novartis/Schering AG）；INC-1C11（Imclone）、ラパマイシン（シロリムス、RAPAMUNE(商標)；又は以下の特許刊行物に記載されたもの：U.S. Pat. No. 5,804,396、WO 1999/09016（American Cyanamid）、WO 1998/43960（American Cyanamid）、WO 1997/38983（Warner Lambert）、WO 1999/06378（Warner Lambert）、WO 1999/06396（Warner Lambert）、WO 1996/30347（Pfizer, Inc）、WO 1996/33978（Zeneca）、WO 1996/3397（Zeneca）及びWO 1996/33980（Zeneca）。
【００４２】
化学療法剤にはまた以下が含まれる：デキサメタゾン、インターフェロン、コルヒチン、メトプリン、シクロスポリン、アンホテリシン、メトロニダゾール、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アミフォスチン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、BCG生、ベバクジマブ、ベキサロテン、クラドリビン、クロファラビン、ダルベポエチンα、デニロイキン、デキサラゾキサン、エポエチンα、エロチニブ、フィルグラスチム、酢酸ヒストレリン、イブリツモマブ、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、レナリドミド、レバミソール、メスナ、メトキシサレン、ナンドロロン、ネララビン、ノフェツモマブ、オプレルベキン、パリフェルミン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキシド二ナトリウム、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、キナクリン、ラスブリカーゼ、サルグラモスチム、テモゾロミド、VM-26、6-TG、トレミフェン、トレチノイン、ATRA、ヴァルルビシン、ゾレドロネート、及びゾレドロン酸、並びに前記の医薬的に許容できる塩。
【００４３】
化学療法剤にはまた以下が含まれる：ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、チキソコルロールピバル酸、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、モメタゾン、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸ナトリウム、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルオコルトロン、ヒドロコルチゾン-17-ブチレート、ヒドロコルチゾン-17バレレート、アクロメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾンバレレート、ベタメタゾンジプロピオネート、プレドニカルベート、クロベタゾン-17-ブチレート、クロベタゾール-17-プロピオネート、フルオコルトロンカプロン酸、フルオコルトロンピバル酸及びフルプレニデン酢酸；免疫選択性抗炎症ペプチド（ImSAID）、例えばフェニルアラニン-グルタミン-グリシン（FEG）及びそのD-異性体型（feG）（IMULAN BioTherapeutics, LLC）；抗リウマチ薬、例えばアザチオプリン、シクロスポリン（シクロスポリンA）、D-ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミデミノサイクリン、スルファサラジン、腫瘍壊死因子α（TNF-α）遮断剤、例えばエタネルセプト（Enbrel）、インフリキシマブ（Remicade）、アダリムマブ（Humira）、セルトリズマブペゴール（Cimzia）、ゴリムマブ（Simponi）、インターロイキン1（IL-1）遮断剤、例えばアナキンラ（Kineret）、T-細胞共同刺激遮断剤、例えばアバタセプト（Orencia）、インターロイキン6（IL-6）遮断剤、例えばトシリズマブ（ACTEMERA(商標)）；インターロイキン13（IL-13）遮断剤、例えばレブリキズマブ；インターフェロンα（IFN）遮断剤、例えばロンタリズマブ；ベータ7インテグリン遮断剤、例えばrhuMAb ベータ7；IgE経路遮断剤、例えば抗M1プライム；分泌ホモトリマーLTa3及び膜結合ヘテロトリマーLTa1/β2遮断剤、例えば抗リンホトキシンα（Lta）；放射性同位元素（例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素）；種々の研究中薬剤、例えばチオプラチン、PS-341、フェニルブチレート、ET-18-OCH3、又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（L-739749、L-744832）；ポリフェノール、例えばケルセチン、レスベラトロール、ピセアタンノール、没食子酸エピガロカテキン、テアフラビン、フラバノール、プロシアニジン、ベツリン酸及びその誘導体；オートファジー阻害剤、例えばクロロキン；デルタ-9-テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL(商標)）；ベータ-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、及び9-アミノカンプトテシン；ポドフィロトキシン；テガフール（UFTORAL(商標)）；ベキサロテン（TARGRETIN(商標)）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えばBONEFOS(商標)又はOSTAC(商標)）、エチドロネート（DIDROCAL(商標)）、NE-58095、ゾレドロン酸/ゾレドロネート（ZOMETA(商標)）、アレンドロネート（FOSAMAX(商標)）、パミドロネート（AREDIA(商標)）、チルドロネート（SKELID(商標)）、又はリソドロネート（ACTONEL(商標)）；及び上皮増殖因子受容体（EGF-R）；ワクチン、例えばテラトープ（THERATOPE(商標)）ワクチン；ペリフォシン、COX-2阻害剤（例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えばPS341）；CCI-779；チピファルニブ（R11577）；オラフェニブ、ABT510；Bcl-2阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム（GENASENSE(商標)）；ピキサントロン；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害税、例えばロナファルニブ（SCH 6636、SARASARTM）、並びに上記のいずれかの医薬的に許容できる塩、酸又は誘導体とともに上記の2つ以上の組合せ、例えばCHOP（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの併用療法の略語）、及びFOLFOX（5-FU及びロイコボリンを併用してオキサリプラチン（ELOXATINTM）を用いる治療レジメンの略語）。
【００４４】
化学療法剤にはまた、鎮痛、解熱及び抗炎症作用を有する非ステロイド系抗炎症薬が含まれる。NSAIDは酵素シクロオキシゲナーゼの非選択的阻害剤を含む。NSAIDの具体的な例には以下が含まれる：アスピリン、プロピオン酸誘導体、例えばイブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルブリプロフェン、オキサプロジン及びナプロキセン、酢酸誘導体、例えばインドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナク、エノール酸誘導体、例えばピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム及びイソシキカム、フェナム酸誘導体、例えばメフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、並びにCOX-2阻害剤、例えばセレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブ、ロフェコキシブ、及びバルデコキシブ。NSAIDは、症状、例えば関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節症、強直性脊椎症、乾癬性関節炎、ライター症候群、急性痛風、月経困難症、転移性骨痛、頭痛及び片頭痛、術後痛、炎症及び組織損傷に起因する軽度から中等度の痛み、発熱、腸閉塞及び腎疝痛の症候緩和のために適用され得る。
【００４５】
“臨床成果”又は“臨床終了点”という用語は、治療法に対する患者の反応に関する任意の臨床的観察又は測定を指す。臨床成果の非限定的な例には以下が含まれる：腫瘍応答（TR）、全生存期間（OS）、無増悪生存期間（PFS）、無病生存期間（DFS）、腫瘍再発までの期間（TTR）、腫瘍増悪までの期間（TTP）、相対リスク（PR）、有害性又は副作用。“全生存期間”（OS）は、ナイーブ若しくは無処置個体又は患者と比較して余命の延長を意図する。“無増悪生存期間”（PFS）又は“腫瘍増悪までの期間”（TPP）は、治療中又は治療後の癌が増殖しない期間の長さを示す。無増悪生存期間は、患者が完全応答又は部分応答を示す期間だけでなく患者が安定病状を示す期間を含む。本明細書で用いられ、かつ国立癌研究所が定義する“腫瘍再発”は、通常一定の期間（その間に癌は検出されない）の後で再発した（復活した）癌である。癌は、最初の（原発）腫瘍と同じ場所又は身体の別の場所に復活し得る。前記はまた再発癌と称される。“腫瘍再発までの期間”（TTR）は、癌と診断された日付から最初の再発、死亡、又は最後の接触（患者が最後の接触時に腫瘍再発を全く示さなかった場合）の日付までの期間と定義される。患者が再発を示さなかった場合には、TTRは死亡時又は最後の経過観察時に打ち切られた。“相対リスク”（RR）は、統計学又は数理疫学では、暴露に対する事象（又は疾患発達）のリスクを指す。相対リスクは、暴露グループ対非暴露グループにおける事象発生の確率比である。
本明細書で用いられるように、“複合体”という用語は、互いに直接的及び/又は間接的に接触している複数の分子の集合体又は凝集体を指す。具体的な実施態様では、“接触”、より詳細には“直接的接触”は、引きつける力を有する非共有結合的相互作用（例えばファンデルワールス力、水素結合、イオン性及び疎水性相互作用など）が複数の分子の相互作用を支配するために十分に2つ以上の分子が接近していることを意味する。そのような実施態様では、分子の複合体（ペプチド及びポリペプチド）は、当該複合体が（その成分分子の非凝集又は非複合化状態と比較して）熱力学的に有利であるような状態下で形成される。本明細書で用いられる“ポリペプチド複合体”又は“タンパク質複合体”という用語は、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー、ウンデカマー、ドデカマー、又はより高次のオリゴマーを指す。具体的な実施態様では、ポリペプチド複合体は、PD-L1とリジンアセチルトランスフェラーゼ（P300）及びDNMT1及びSETDB1の1つ以上との結合によって形成される。
【００４６】
本明細書を通して、文脈がそうでないことを要求しないかぎり、“含む（comprise, comprises, comprising）”という語は、記載の工程若しくは成分又は複数の工程若しくは複数の成分のグループを含有することを意味するが、任意の他の工程若しくは成分又は複数の工程若しくは複数の成分のグループを排除しないと理解されるであろう。したがって、“含む（comprisingなど）”という用語の使用は、列挙された成分が要求されるか又は必須であるが、他の成分は随意であり、存在することも存在しないこともあることを示す。“〜から成る（consisting）”とは、“〜から成る”と言う語句に続くものは何であれ含有することを意味し、かつそれらに限定される。したがって、“〜から成る”と言う語句は、列挙された成分が要求されるか又は必須であり、他の成分は存在しないことを示す。“本質的に〜から成る”とは、当該語句の後に列挙された任意の成分を含有すること、かつ、当該列挙された成分について本開示で指定された活性又は作用に干渉又は寄与しない他の成分に限定されることを意味する。したがって、“本質的に〜から成る”と言う語句は、列挙された成分は要求されるか又は必須であるが、他の成分は随意であり、それらが列挙された成分の活性又は作用に影響するか否かに応じて存在することもあり、存在しないこともあることを示す。
本明細書で用いられるように、“相関性を有する”又は“〜と相関性を有する”という用語は、“変数”と称される2つ以上の事柄（例えば事象、特徴、成果、数、データセットなど）間における統計的な関連を指す。当該事柄は種々のタイプであり得ることは理解されるであろう。当該変数はしばしば数（例えば測定量、値、可能性、リスク）として表現され、ここで、正の相関性は、一方の変数が増加するとき他方もまた増加することを意味し、負の相関性（反相関とも呼ばれる）は、一方の変数が増加するとき他方の変数は減少することを意味する。
“〜に対応する（corresponds to, corresponding to）”とは、参照アミノ酸配列と実質的な配列類似性又は同一性を示すアミノ酸配列を意味する。一般には、アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の少なくとも一部分に対して少なくとも約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は100％さえも配列類似性又は同一性を示すであろう。
【００４７】
本明細書で用いられる“細胞傷害因子”という用語は、細胞に有害である（例えば細胞死を引き起こすか、増殖を阻害するか、或いは細胞機能を妨げる）任意の因子を指す。細胞傷害因子には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：放射性同位元素（例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素）；化学療法剤；増殖阻害剤；酵素及びそのフラグメント、例えば核酸分解酵素；及び毒素、例えば小分子毒素又は酵素的に活性な毒素（細菌、真菌、植物又は動物起原）で前記のフラグメント及び/又は変種を含む。例示的な細胞傷害因子は以下から選択できる：抗微小管薬剤、白金錯体、アルキル化剤、抗生物質、トポイソメラーゼII阻害剤、抗代謝薬、トポイソメラーゼI阻害剤、ホルモン及びホルモンアナローグ、シグナル伝達経路阻害剤、非受容体チロシンキナーゼ血管形成阻害剤、免疫療法剤、アポトーシス促進剤、LDH-A阻害剤、脂肪酸生合成阻害剤、細胞周期シグナリング阻害剤、HDAC阻害剤、プロテアソーム阻害剤、及び癌代謝阻害剤。いくつかの実施態様では、細胞傷害因子はタキサンである。このタイプの代表的な例では、タキサンはパクリタキセル又はドセタキセルである。いくつかの実施態様では、細胞傷害因子は白金剤である。いくつかの実施態様では、細胞傷害因子はEGFRのアンタゴニストである。このタイプの代表的な例では、EGFRのアンタゴニストは、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン（例えばエルロチニブ）である。いくつかの実施態様では、細胞傷害因子はRAF阻害剤である。このタイプの非限定的な例では、RAF阻害剤はBRAF及び/又はCRAF阻害剤である。他の非限定的な例では、RAF阻害剤はベムラフェニブである。ある実施態様では、細胞傷害因子はPI3K阻害剤である。
本明細書で用いられるように、“細胞傷害療法”という用語は、細胞損傷を誘発する治療方法を指し、放射線、化学療法、光力学療法、ラジオ波焼灼、抗血管形成療法、及び前記の組合せが含まれるが、ただしそれらに限定されない。細胞傷害療法薬は、細胞に適用されたときDNA損傷を誘発し得る。
【００４８】
本明細書で用いられるように、“疾患の増悪を遅らせる”又は“疾患の増悪速度を低下させる”とは、疾患（例えば癌）の発達を遅らせ、妨げ、速度を低下させ、手間取らせ、安定化させ、及び/又は繰り延べることを意味する。この遅れは、期間の長さが多様であり、病歴及び/又は治療される個体に左右される。当業者には明白であるが、十分な又は有意な遅れは、個体が疾患を発達させないという点で実質的に予防を包含し得る。例えば、後期癌（例えば転移の発達）を遅らせることができる。
“検出”という用語は、任意の検出手段（直接及び間接検出を含む）を含む。
本明細書で用いられる“薬剤”という用語は、in vivoで生物学的又は検出可能な活性を有する任意の物質を指す。当該薬剤という用語は、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、抗血管形成剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法剤、標的誘導抗癌剤、生物学的応答改変剤、癌ワクチン、サイトカイン、ホルモン療法剤、抗代謝薬及び免疫療法剤を包含する。
“薬剤耐性”という用語は、疾患が1つの薬剤又は複数の薬剤に対して応答しない状態を指す。薬剤耐性は、本来備わっているもの（又は一次耐性）（当該疾患は当該1つの薬剤又は複数の薬剤に対して応答したことが無いことを意味する）であるか、又は後天的（当該疾患が以前に応答した1つの薬剤又は複数の薬剤への応答を停止することを意味する）（二次耐性）であり得る。ある種の実施態様では、薬剤耐性は本来備わっているものである。ある種の実施態様では、薬剤耐性は後天的である。
【００４９】
“有効量”は、該当する疾患の測定可能な改善又は予防を達成するために必要な少なくとも最少の量である。本明細書の有効量は、複数の要件、例えば患者の疾患の状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体で所望される応答を引き出す抗体の能力に応じて変動し得る。有効量はまた、治療の傷害的又は有害な作用を治療の有益な効果が上回る量である。予防的使用では、有益な又は所望される結果は例えば以下の結果を含む：リスクの排除若しくは軽減、重篤度の緩和、又は疾患（疾患の生化学的、組織学的及び/又は行動的症候、その合併症、及び疾患の発達中に提示される中間的な病理学的表現型を含む）の開始の延期。治療的使用では、有益な又は所望される結果は例えば以下の臨床結果を含む：疾患に起因する1つ以上の症候の減少、疾患罹患者の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の医薬の用量の減少、例えば標的誘導を介する別の医薬の効果の強化、疾患増悪の遅延、及び/又は延命。癌又は腫瘍の場合、薬剤の有効量は以下の効果を有することができる：癌細胞の数の減少、腫瘍サイズの低下、抹消器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度遅らせるか又は望ましくは停止させる）、腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度遅らせるか又は望ましくは停止させる）、腫瘍増殖をある程度阻害する、及び/又は癌又は腫瘍に関連する症候の1つ以上をある程度緩和する。有効量は1回以上の投与で達成することができる。本発明の目的のために、薬剤、化合物、又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的に予防的又は治療的処置を達成するために十分な量である。臨床環境では理解されるところであるが、薬剤、化合物、又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物、又は医薬組成物と併用して達成されることもあり、そうでないこともある。したがって、“有効量”は1つ以上の治療薬剤の投与環境で考えることが可能で、単一の薬剤が1つ以上の他の薬剤と併用して所望の結果を達成できるか又は達成するならば、有効量で投与されたと考えることができる。治療有効量は、癌治療評価で一般的に用いられる多様な終了点によって測定できる。前記には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：生存期間を延長する（全生存期間（OS）及び無増悪生存期間（PFS）を含む）；目的の応答が得られる（完全応答（CR）又は部分応答（PR）を含む）；腫瘍退縮、腫瘍重量又はサイズの縮小、疾患増悪までの期間の延長、生存期間の延長、PFSの延長、全生存率の改善、応答持続期間の増加及び生活の質の改善、及び/又は癌の徴候又は症候の改善。本明細書で用いられるように、“増悪病状”（PD）という用語は、標的病巣の直径の合計の少なくとも20％増加を指し、参照として試験の最少合計を用いる（もし合計が試験で最少である場合には、最少合計は基準合計を含む）。20％の相対増加に加えて、合計はまた少なくとも5mmの絶対増加を示す必要がある。1つ以上の新規病巣の出現もまた増悪とみなされる。本明細書で用いられるように、“部分応答”（PR）という用語は、標的病巣の直径の合計の少なくとも30％減少を指し、参照として基準合計直径を用いる。本明細書で用いられるように、“完全応答”（CR）という用語は、全ての非結節性標的病巣の消失を指し、任意の標的リンパ節の短軸は10mm未満に減少す���。本明細書で用いられるように、“安定病状”（SD）という用語は、PRには十分な退縮ではなくPDと定性化するには十分な増加でもないことを指し、参照として試験中の直径の最少合計を用いる。
【００５０】
“上皮性”、“上皮性表現型”などという用語は当業界では周知され、形態学的、分子的及び/又は機能的特徴によって識別され得る。例えば、上皮細胞は、概ね丸みを有するか又は玉石外観を有し、上皮マーカーE-カドヘリンを発現し、迅速に分裂し、及び/又は間葉性細胞と比較して相対的に低レベルの運動性、侵襲性及び/又は足場非依存性増殖を有する。
本明細書で用いられるように、“上皮間葉転換”（EMT）という用語は、上皮性から間葉性表現型への変換を指し、前記は胚発生の正常なプロセスである。EMTはまた、イオン及び液体の運搬体として機能する、損傷を受けた上皮細胞がマトリックス改造間葉性細胞となるプロセスでもある。癌腫では、この転換は、典型的には細胞形態の改変、間葉性タンパク質の発現及び侵襲性増加を生じる。in vitroでEMTを定義する基準は、上皮細胞の極性の喪失、個々の細胞への分離、及びその後に続く細胞運動性獲得後の分散を含む（Vincent-Salomon et al., Breast Cancer Res. 2003; 5(2): 101-106）。EMTの最中に発現、分布、及び/又は機能で変化を生じ、さらに必然的に必要とされる分子クラスには以下が含まれる：増殖因子（例えば、形質転換増殖因子-β（TGF-β）、wnt）、転写因子（例えばSnail、LEF、及び核β-カテニン）、細胞−細胞接着軸の分子（カドヘリン、カテニン）、細胞骨格調節因子（Rhoファミリー）、及び細胞外プロテアーゼ（マトリックスメタロプロテイナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子）（Thompson et al., Cancer Research 65, 5991-5995, Jul. 15, 2005）。具体的な実施態様では、EMTは、上皮性癌細胞が間葉性表現型を獲得するプロセスを指し、前記プロセスは転移と関連し得る。これらの間葉性細胞は、接着性の低下、運動性及び侵襲性の増加を示すことができ、免疫療法剤、化学療法剤及び/又は放射線（例えば迅速に分裂する細胞を標的とする治療）に対して相対的に耐性である。
【００５１】
“エピトープ”という用語は分子の部分を指し、前記は、抗体の抗原結合領域の1つ以上で抗体によって認識されかつ結合され得る。エピトープはしばしば分子の表面集団（例えばアミノ酸または糖側鎖）から成り、特異的な三次元構造的特徴だけでなく特異的な荷電特徴を有する。いくつかの実施態様では、エピトープはタンパク質エピトープであり得る。タンパク質エピトープは、線状又は立体構造的であり得る。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（例えば抗体）との間で相互作用する点の全てが、当該タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に出現する。“非線状エピトープ”又は“立体構造エピトープ”は、不連続ポリペプチド（又はアミノ酸）を、当該エピトープに特異的な抗体が結合する抗原性タンパク質内に含む。抗原上の所望のエピトープが決定されたら、例えば本明細書に記載する技術を用いて、当該エピトープに対する抗体を作製することができる。また別に、発見過程で、所望のエピトープについての情報は抗体の作製及び特徴付けによって明らかにされ得る。この情報から、同じエピトープとの結合について複数の抗体を競合的にスクリーニングすることができる。前記を達成するアプローチは、競合及び交差競合試験を実施して、標的抗原（例えばPD-L1-K263Ac、PD-L1-K263Meなど）との結合について互いに競合又は交差競合する抗体（例えば抗原との結合について競合する抗体）を見つけ出すことである（例えば当該抗体は抗原との結合について競合する）。
【００５２】
遺伝子配列に関して“発現”という用語は、RNA転写物（例えばmRNA、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA、miRNAなど）を生成する遺伝子の転写、及び適切な場合には、生じたmRNA転写物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、文脈から明瞭であろうが、コード配列の発現はコード配列の転写及び翻訳から生じる。逆に、非コード配列の発現は、非コード配列の転写から生じる。
本明細書で用いられるように、バイオマーカー又はバイオマーカー複合体レベルに関して“増加する”又は“増加”という用語は、別のバイオマーカー若しくはバイオマーカー複合体のレベル又はコントロールレベルと比較して、当該バイオマーカー若しくはバイオマーカー複合体レベルにおける統計的に有意で測定可能な増加を指す。増加は、好ましくは少なくとも約10％の増加、又は少なくとも約20％の増加、又は少なくとも約30％の増加、又は少なくとも約40％の増加、又は少なくとも約50％の増加である。
本明細書で用いられるように、バイオマーカー又はバイオマーカー複合体測定に関して“より高い”という用語は、別のバイオマーカー若しくはバイオマーカー複合体のレベル又はコントロールレベルと比較して、バイオマーカー又はバイオマーカー複合体測定のレベルにおける統計的に有意で測定可能な相違を指し、ここで、当該バイオマーカー又はバイオマーカー複合体測定は、他のバイオマーカー若しくはバイオマーカー複合体レベル又はコントロールレベルよりも大きい。相違は、好ましくは少なくとも約10％、又は少なくとも約20％、又は少なくとも約30％、又は少なくとも約40％、又は少なくとも約50％である。
本明細書で用いられるように、バイオマーカー又はバイオマーカー複合体レベルに関して“減少する”又は“減少”という用語は、別のバイオマーカー若しくはバイオマーカー複合体レベル又はコントロールレベルと比較して、当該バイオマーカー又はバイオマーカー複合体レベルにおける統計的に有意で測定可能な減少を指す。減少は、好ましくは少なくとも約10％の減少、又は少なくとも約20％の減少、又は少なくとも約30％の減少、又は少なくとも約40％の減少、又は少なくとも約50％の減少である。
本明細書で用いられるように、バイオマーカー又はバイオマーカー複合体測定に関して“より低い”という用語は、別のバイオマーカー若しくはバイオマーカー複合体レベル又はコントロールレベルと比較して、バイオマーカー又はバイオマーカー複合体測定のレベルにおける統計的に有意で測定可能な相違を指し、ここで、当該バイオマーカー又はバイオマーカー複合体測定は、他のバイオマーカー若しくはバイオマーカー複合体レベル又はコントロールレベルよりも小さい。相違は、好ましくは少なくとも約10％、又は少なくとも約20％、又は少なくとも約30％、又は少なくとも約40％、又は少なくとも約50％である。
【００５３】
一般的に“発現のレベル”又は“発現レベル”という用語は互換的に用いられ、概してサンプル中のバイオマーカーの量を指す。“発現”は、概して、情報（例えば遺伝子によってコードされる情報及び/又はエピジェネティックな情報）が、細胞に存在し稼働する構造物に変換されるプロセスを指す。したがって、本明細書で用いられるように、“発現”は、ポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、又はポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド修飾（例えばポリペプチドの翻訳後修飾）さえも指すことができる。転写ポリヌクレオチドのフラグメント、翻訳されたポリペプチド、又はポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド修飾（例えばポリペプチドの翻訳後修飾）もまた、それらがまた別のスプライシングによって生成された転写物若しくは分解転写物に由来しようと、又はポリペプチドの翻訳後プロセッシング（例えばタンパク質分解）に由来しようと発現とみなされであろう。“発現遺伝子”は、mRNAとしてポリヌクレオチドに転写されるもの、及びRNAに転写されるがポリペプチドに翻訳されないもの（例えばトランスファーRNA及びリボソームRNA）もまた含む。したがって、“上昇発現”、“上昇発現レベル”、又は“上昇したレベル”は、コントロール（例えば、治療法に応答する又は応答しない1つの細胞若しくは複数の細胞、又は治療法に応答する又は応答しない1人の個体若しくは複数の個体、又は内部コントロール（例えばハウスキーピングバイオマーカー））と対比して、細胞又は個体におけるバイオマーカーの増加発現又は増加レベルを指す。“低下発現”、“低下発現レベル”、又は“低下したレベル”は、コントロール（例えば、治療法に対応する又は対応しない1つの細胞若しくは複数の細胞、又は治療法に応答する又は応答しない1人の個体若しくは複数の個体、又は内部コントロール（例えばハウスキーピングバイオマーカー））と対比して、個体におけるバイオマーカーの低下発現又は低下したレベルを指す。いくつかの実施態様では、低下発現はわずかな発現又は無発現である。具体的な実施態様では、PD-L1-K263Acの上昇したレベルは、PD-L1の大半の核局在化又は細胞質及び/又は細胞膜よりも核で高い局在化と相関性を有するレベルを指す。他の実施態様では、PD-L1-K263Meの上昇したレベルは、PD-L1の大半の細胞質及び/又は細胞膜局在化又は核よりも細胞質及び/又は細胞膜で高い局在化と相関性を有するレベルを指す。
“ハウスキーピングバイオマーカー”という用語は、全ての細胞タイプで典型的には同様に存在する、バイオマーカー又はバイオマーカーグループ（例えばポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド）を指す。いくつかの実施態様では、ハウスキーピングバイオマーカーは、“ハウスキーピング遺伝子”である。“ハウスキーピング遺伝子”は、本明細書ではタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子グループを指し、その活性は細胞機能の維持に必須であり、かつそれらは典型的には全ての細胞タイプで同様に存在する。
【００５４】
本明細書で用いられるとき、“増殖阻害薬剤”は、細胞の増殖をin vitro又はin vivoで阻害する化合物又は組成物を指す。ある実施態様では、増殖阻害薬剤は増殖阻害抗体であり、前記は当該抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を妨げ又は低下させる。別の実施態様では、増殖阻害薬剤は、S期の細胞のパーセンテージを顕著に低下させるものであり得る。増殖阻害薬剤の例は、細胞周期進行を（S期以外の場所で）遮断する薬剤（例えばG1停止及びM期停止を誘発する薬剤）を含む。古典的M期遮断剤には、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びトポイソメラーゼII阻害剤（例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシン）が含まれる。G1を停止させる薬剤はまたS期停止にも波及し、例えばDNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、及びara-Cである。更なる情報は以下で見出すことができる：Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer（第1章、表題“Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs”（Murakami et al., 例えば13ページ）（W.B. Saunders, Philadelphia, 1995）。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は抗癌剤であり、ともにイチイの樹から得られる。ドセタキセル（TAXOTERE(商標)、Rhone-Poulenc Rorer）（ヨーロッパイチイから得られる）は、パクリタキセル（TAXOL(商標)、Bristol-Myers Squibb）の半合成アナローグである。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリンダイマーから微小管のアッセンブルを促進し、脱ポリマー化を妨げることによって微小管を安定させ、これは細胞の有糸分裂の阻害を生じる。
【００５５】
“免疫チェックポイント分子”という用語は、免疫チェックポイントとして機能する受容体及びリガンドの両方を含む。免疫チェックポイントは免疫回避メカニズムであり、免疫系がそれ自身の身体を攻撃することを防ぐ。免疫チェックポイント受容体は、T細胞上に存在し、抗原提示細胞上で発現される免疫チェックポイントリガンドと相互作用する。T細胞は、MHC分子上で提示される抗原を認識し、活性化されて免疫反応を生じる。一方、上記と並行して発生する免疫チェックポイント受容体とリガンドとの間の相互作用はT細胞の活性化を制御する。免疫チェックポイント受容体は共同刺激性受容体及び阻害性受容体を含み、T細胞活性化及び免疫反応は両受容体間の均衡によって制御される。遮断又は阻害のための標的となり得る例示的な免疫チェックポイント分子には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：CTLA-4、4-1BB（CD137）、4-1BBL（CD137L）、PD-L1、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4（CD2ファミリー分子に属し、全てのNK、γδ及びメモリーCD8+(αβ)T細胞で発現される）、CD160（BY55とも称される）及びCGEN-15049。
【００５６】
本明細書で用いられるように、“免疫チェックポイント阻害剤”又は“チェックポイント阻害剤”という用語は、1つ以上の免疫チェックポイント分子を全体的に又は部分的に減弱させ、阻害し、干渉し又は調整する任意の薬剤、分子、化合物、化学物質、タンパク質、ポリペプチド、巨大分子などを指す。そのような阻害剤は、小分子阻害剤を含むことができ、又は免疫チェックポイント受容体と結合してそれらを遮断若しくは阻害する抗原結合分子又は免疫チェックポイント受容体リガンドと結合してそれらを遮断若しくは阻害する抗体であり得る。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、抗免疫チェックポイント分子アンタゴニスト抗体、例えば以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：デュルバルマブ（抗PD-L1抗体；MEDI4736）、ペンブロリズマブ（抗PD-1モノクローナル抗体）、ニボルマブ（抗PD-1抗体）、ピジリズマブ（CT-011；ヒト化抗PD-1モノクローナル抗体）、AMP224（組換えB7-DC-Fc融合タンパク質）、BMS-936559（抗PD-1抗体）、アテゾリズマブ（MPLDL3280A；ヒトFc最適化抗PD-L1モノクローナル抗体）、アブエルマブ（MSB0010718C；ヒト抗PD-L1抗体）、イピリムマブ（抗CTLA-4チェックポイント阻害剤）、トレメリムマブ（CTLA-4遮断抗体）、及び抗OX40。
【００５７】
本発明の背景では“免疫エフェクター細胞”という用語は、免疫反応時にエフェクター機能を示す細胞と関係を有する。例えば、そのような細胞は、サイトカイン及び/又はケモカインを分泌し、微生物を殺滅し、抗体を分泌し、感染細胞又は癌細胞を認識し、場合によってそのような細胞を排除する。例えば、免疫エフェクター細胞は、T細胞（細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、腫瘍浸潤T細胞）、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。
“免疫応答”という用語は、宿主動物の免疫系による該当する物質（例えば抗原又は免疫原）との任意の検出可能な応答を指し、前記応答は例えば、自然免疫応答（例えばToll受容体シグナリングカスケードの活性化）、細胞媒介免疫応答（例えばT細胞（例えば抗原特異的T細胞）及び免疫系の非特異的細胞によって媒介される応答）、及び液性免疫応答（例えばB細胞によって媒介される応答、例えば抗体の生成及び血漿、リンパ及び/又は組織液へのその分泌）である。
“免疫療法”という用語は、人間又は動物の免疫系の1つ以上の成分を意図的に調節して、直接的又は間接的にいくつかの治療的利益（全身的及び/又は局所的効果を含む）及び予防的及び/又は治癒的効果を達成する任意の治療法を指す。免疫療法は、1つ以上の免疫療法剤を（単独で又は任意の組合せで）対象の人間又は動物に任意のルートで（例えば経口的に、静脈内に、皮膚に、注射、吸入などで）、全身的であれ局所的であれ又はその両方であれ投与する工程を含むことができる。免疫療法は、サイトカインの産生の惹起、増加、低下、停止、防止、遮断、或いはサイトカインの産生の調節、及び/又は1つ以上の治療物質若しくは診断物質の身体の該当する場所又は該当する細胞タイプ若しくは組織へのデリバリー、及び/又は該当する細胞若しくは組織の破壊に関与することができる。免疫療法を用いて、局所的効果、全身的効果又は両方の組合せを達成することができる。
【００５８】
本明細書で用いられる“免疫療法剤”という用語は、癌細胞に対する身体の免疫応答を直接的又は間接的に復元し、強化し、刺激し又は増加させるか、及び/又は他の抗癌療法の副作用を低下させる任意の薬剤、化合物又は生物製剤を指す。したがって、免疫療法は、直接的又は間接的に癌細胞に対する免疫系の応答を刺激又は強化するか、及び/又は他の抗癌剤が引き起こしたかもしれない副作用を軽減する治療法である。当業界では、免疫療法はまた、免疫学療法、生物学療法、生物学的応答修正療法及びバイオ療法と称される。当業界で一般的な免疫療法剤の例には、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体及び非サイトカインアジュバントが含まれる（ただし前記に限定されない）。また別には、免疫療法剤治療は、ある量の免疫細胞（T細胞、NK細胞、樹状細胞、B細胞など）を対象動物に投与する工程から成ることができる。免疫療法剤は非特異的であってもよく（すなわち、免疫系を全般的にブーストして癌細胞の成長及び/又は拡大の戦いで人間の体をより有効にする）、又は特異的であってもよい（すなわち癌細胞そのものに誘導される）。免疫療法レジメンは、非特異的及び特異的免疫療法剤の使用を組み合わせることができる。非特異的免疫療法剤は、免疫系を刺激するか又は間接的に改善する物質である。非特異的免疫療法剤は癌治療のための主要な治療法として単独で用いられるだけでなく、主要な治療法に加えて用いられてきた。後者の事例では、非特異的免疫療法剤はアジュバントとして機能し、他の治療法（例えば癌ワクチン）の有効性を強化する。この後者の関係では、非特異的免疫療法剤はまた、他の治療法の副作用（例えばある種の化学療法剤によって誘発される骨髄抑制）を軽減するために機能し得る。非特異的免疫療法剤は重要な免疫系細胞で機能し、二次応答（例えばサイトカインおよび免疫グロブリンの産生増加）を引き起こすことができる。また別には薬剤はそれ自体サイトカインを含むことができる。非特異的免疫療法剤は概ねサイトカイン又は非サイトカインアジュバントに分類される。多数のサイトカインが、免疫系をブーストするために設計された一般的な非特異的免疫療法剤として又は他の治療法とともに提供されるアジュバントとして癌治療で適用されてきた。適切なサイトカインには、インターフェロン、インターロイキン及びコロニー刺激因子が含まれる（ただしそれらに限定されない）。本発明で意図されるインターフェロン（IFN）には、IFNの一般的タイプ、IFN-アルファ（IFN-α）、IFN-ベータ（IFN-β）及びIFN-ガンマ（IFN-γ）が含まれる。IFNは、癌細胞に直接的に、例えばそれらの成長を遅らせ、より正常な行動を有する細胞へとそれらの発達を促し、及び/又はそれらの抗原産生を増加させ、それによって免疫系が癌細胞を認識及び破壊することをより容易にすることによって機能することができる。IFNはまた、癌細胞に間接的に、例えば血管形成を遅らせ、免疫系をブーストし、及び/又はナチュラルキラー（NK）細胞、T細胞及びマクロファージを刺激することによって機能することができる。組換えIFN-αは、ロフェロン（Roferon；Roche Pharmaceuticals）及びイントロンA（Intron A；Schering Corporation）として市場で入手できる。本発明で意図されるインターロイキンにはIL-2、IL-4、IL-11及びIL-12が含まれる。市場で入手できる組換えインターロイキンの例には、プロロイキン（Proleukin(商標)）（IL-2；Chiron Corporation）及びニューメガ（Neumega(商標)）（IL-12；Wyeth Pharmaceuticals）が含まれる。ザイモジェネティクス社（Zymogenetics, Inc., Seattle, Wash.）は現在IL-21の組換え型を試験している（前記もまた本発明の組合せでの使用が意図される）。本発明で意図されるコロニー刺激因子（CSF）には、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF又はフィルグラスチン）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF又はサルグラモスチン）及びエリスロポエチン（エポエチンアルファ、ダルポポエチン）が含まれる。1つ以上の増殖因子を用いる治療は、伝統的な化学療法を受けている対象動物で新しい血球の産生を刺激するために役立つ。したがって、CSFを用いる治療は、化学療法に関連する副作用の軽減に有用で、より高い用量の化学療法剤を用いることを可能にする。多様な組換えコロニー刺激因子が市場で入手できる。前記は、例えばニューポゲン（Neupogen（商標））（G-CSF；Amgen）、ニューラスタ（Neulasta）（ペルフィルグラスチム（pelfilgrastim）；Amgen）、ロイキン（Leukine）（GM-CSF；Berlex）、プロクリット（Procrit）（エリスロポエチン；Ortho Biotech）、エポゲン（Epogen）（エリスロポエチン；Amgen）、アラネスプ（Aranesp）（エリスロポエチン）である。特異的又は非特異的標的を有するということに加えて、免疫療法剤は能動的であることができ（すなわち、自身の免疫応答（液性及び細胞性応答を含む）を刺激する）、又は免疫療法剤は受動的であることができる（すなわち、身体外で生成された免疫系成分（例えば抗体、エフェクター免疫細胞、抗原提示細胞など）を含む）。具体的な実施態様では、受動免疫療法は、癌細胞又は免疫細胞の表面で見出される該当する抗原に対して特異的であるか、又は該当する細胞増殖因子に特異的である1つ以上のモノクローナル抗体の使用を必要とする。モノクローナル抗体を癌の治療に多数の方法で用いて、例えば、特定のタイプの癌に対する対象動物の免疫応答を強化することができ、特定の細胞増殖因子（例えば血管形成に必要とされるもの）を標的とすることによって、又は例えば化学療法剤、放射性粒子若しくは毒素のような薬剤に連結若しくは結合させたときに他の抗癌剤の癌細胞へのデリバリーを強化することによって癌細胞の増殖に干渉することができる。癌の免疫療法剤として従来用いられているモノクローナル抗体には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：アレムツズマブ（LEMTRADA(商標)）、ベバシズマブ（AVASTIN(商標)）、セツキシマブ（ERBITUX(商標)）、パニツムマブ（VECTIBIX(商標)）、ペルツズマブ（OMNITARG(商標)、2C4）、トラスツズマブ（HERCEPTIN(商標)）、トシツモマブ（Bexxar(商標)）、アブシキシマブ（REOPRO(商標)）、アダリムマブ（HUMIRA(商標)）、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピニューズマブ、バシリキシマブ（SIMULECT(商標)）、バビツキシマブ、ベリムマブ（BENLYSTA(商標)）、ブリアンキヌマブ、カナキヌマブ（ILARIS(商標)）、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール（CIMZIA(商標)）、シドフシツズマブ、シドツズマブ、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレネズマブ、ダシリズマブ（ZENAPAX(商標)）、ダロチズマブ、デノスマ���（PROLIA(商標)、XGEVA(商標)）、エクリズマブ（SOLIRIS(商標)）、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゴリムマブ（SIMPONI(商標)）、イピリムマブ、イムガツズマブ、インフリキシマブ（REMICADE(商標)）、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルリズマブペゴール、ルムレツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モガムリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ムロノマブ、ナタリズマブ（TYSABRI(商標)）、ネシツムマブ（PORTRAZZA(商標)）、ニモツズマブ（THERACIM(商標)）、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オロキズマブ、オマリズマブ（XOLAIR(商標)）、オナルツズマブ（MetMAbとしても知られている）、パリビズマブ（SYNAGIS(商標)）、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペンブロリズマブ（KEYTRUDA(商標)）、ペキセリズマブ、プリリキシマブ、ラルビズマブ、ラニビズマブ（LUCENTIS(商標)）、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロバツムマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズムマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、セリバンツマブ、シファリムマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ（SYLVANT(商標)）、シプリズマブ、ソンツズマブ、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ（ACTEMRA(商標)）、トラリズマブ、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（STELARA(商標)）、ベドリズマブ（ENTYVIO(商標)）、ビシリズマブ、ザノリムマブ、ザルツムマブ。
【００５９】
本明細書で用いられるように、“指示説明書”には刊行物、録音物、図表、又は本発明の組成物及び方法の有用性を伝えるために用いることができる任意の他の表現媒体が含まれる。本発明のキットの指示説明書は、例えば、本発明の治療薬若しくは診断薬を収納する容器に添付されるか、又は本発明の治療薬若しくは診断薬を収納する容器と一緒に輸送され得る。
本明細書で用いられるとき“標識”という用語は検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、典型的には試薬（例えばポリヌクレオチドプローブ又は抗体）と複合物化されるか、又は直接的若しくは間接的に融合され、当該標識が複合物化又は融合される試薬の検出を容易にする。標識そのものが検出可能であってもよく（例えば放射性同位元素標識又は蛍光標識）、酵素標識の場合は、標識は基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒し、検出可能な生成物を生じることができる。
本明細書で用いられる“白血球（leucocytes, white blood cell）”という用語は、任意の免疫細胞（単球、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球を含む）を指す。
本明細書で用いられるように、“局在化する”という用語及びその文法的に等価な語は、特定の若しくは限定された空間又は領域（例えば特定の細胞、組織、細胞小器官又は細胞内領域（例えば細胞区画、例えば核、細胞質、核膜、細胞膜など））に蓄積すること又は拘束されることを意味する。
本明細書で用いられる“リンパ球”という用語は、白血球の一タイプである、免疫系の細胞を指す。リンパ球は、T細胞（細胞傷害性及びヘルパーT細胞）、B細胞、及びナチュラルキラー細胞（NK細胞）を含むが、ただしこれらに限定されない。本明細書で用いられる“腫瘍浸潤細胞”という用語は、固形腫瘍に存在するリンパ球を指す。本明細書で用いられる“循環リンパ球”という用語は、循環中に存在する（例えば血中に存在する）リンパ球を指す。
【００６０】
“間葉性”、“間葉性表現型”などという用語は当業界では認識され、形態学的、分子的及び/又は機能的特徴によって識別され得る。例えば、間葉性細胞は、概ね伸長した紡錘形の外観を有し、間葉マーカー（ビメンチン、フィブロネクチン及びN-カドヘリン）を発現し、ゆっくりと分裂するか又は非分裂性であり、及び/又は上皮細胞と比較して比較的高レベルの運動性、侵襲性及び/又は固着非依存性増殖を有する。
本明細書で用いられるように、“間葉上皮転換”（MET）という用語は可逆的な生物学的プロセスであり、前記は、運動性を有し多極性又は紡錘形間葉性細胞から上皮と呼ばれる分極化細胞の平面的な配列への移行を含む。METはEMTの逆のプロセスである。METは正常な発達、癌転移、及び人工多能性幹細胞再プログラミングで生じる。具体的な実施態様では、METは、EMTを経て（例えば上記に記載の）1つ以上の上皮性特徴を獲得した細胞の再プログラミングを指す。例えば、そのような細胞は典型的には、運動性及び/又は侵襲性の低下を示し、及び/又は迅速に分裂し、それによって免疫療法剤及び/又は細胞傷害性薬剤に対して感受性を獲得する。
【００６１】
“多重PCR”という用語は、単一供給源（例えば1つの個体）から得られる核酸で実施される単一PCR反応であって、単一反応で2つ以上のDNA配列させるために2つ以上のプライマーセットが用いられるものを指す。
本明細書で互換的に用いられる“患者”、“対象動物”、“宿主”又は“個体”という用語は、治療又は予防が所望される任意の対象動物、特に脊椎動物の対象動物、より詳しくは哺乳動物の対象動物を指す。本発明の範囲内に入る適切な脊椎動物の対象動物には以下を含む脊索動物亜門の任意のメンバーが含まれる（ただしそれらに限定されない）：霊長動物（例えばヒト、サル及び類人猿であり、さらに以下のサルの種を含む：例えばマカカ（Macaca）属（例えばカニクイザル（例えばマカカ・ファシクラリス（Macaca fascicularis）及び/又はアカゲザル（マカカ・ムラッタ（Macaca mulatta））及びヒヒ（パピオ・ウルシヌス（Papio ursinus））だけでなくマーモセット（カリトリクス（Callithrix）属由来の種）、リスザル（サイミリ（Saimiri）属由来の種）及びタマリン（サグイヌス（Saguinus）属由来の種）とともに類人猿の種（例えばチンパンジー（パン・トログロダイテス（Pan troglodytes））、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット）、ウサギ類（例えばウサギ、ノウサギ）、ウシ類（例えば畜牛）、ヒツジ類（例えばヒツジ）、ヤギ類（例えばヤギ）、ブタ類（例えばブタ）、ウマ類（例えばウマ）、イヌ類（例えばイヌ）、ネコ類（例えばネコ）、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カモ、愛玩鳥類（例えばカナリア、インコなど））、海洋哺乳動物（例えばイルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲ）、並びに魚類。好ましい対象動物は癌治療の必要がある人間であり、前記治療は、癌細胞の増殖又は生存活性の阻害及び/又は癌細胞に対する免疫応答（例えばT細胞活性化による免疫応答）の誘発を介するものを含む。しかしながら、前述の用語は、症候が存在することを示唆しないことは理解されるであろう。
【００６２】
“医薬組成物”又は“医薬処方物”という用語は調製物を指し、前記調製物は、活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にする形態にあり、かつ当該組成物又は処方物が投与される対象動物にとって許容できないほど有害な付加成分を含まない。そのような処方物は無菌的である。“医薬的に許容できる”賦形剤（ビヒクル、添加物）は、対象哺乳動物に常識的に投与して、用いられる活性成分の有効な用量を提供することができるものである。
本明細書で用いられるように、“薬力学（PD）活性”は、対象動物に対する治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法）の効果を指すことができる。PD活性の例は、本明細書に記載するように、治療法に対する少なくとも1つの応答バイオマーカーの局在化及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの発現の調節を含むことができる。理論に拘束されないが、PD活性を、例えば治療法に対する少なくとも1つの応答バイオマーカーの局在化及び場合によって本明細書に記載する少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの発現を決定することによってモニターすることは、治療法を試験する臨床試験で有益であり得る。PD活性のモニターは、例えば治療に対する応答、毒性などをモニターするために用いることができる。
“予測薬”という用語及びその文法形は概して、治療法に応答する患者の可能性を直接的若しくは間接的に識別する手段、又は治療法に応答して臨床成果を得る手段を提供するバイオマーカー又はバイオマーカーシグネチャーを指す。
【００６３】
“予後診断”という用語及びその文法形は概して、個体の疾患若しくは症状の進行の可能性又は重篤度に関する情報を提供する薬剤又は方法を指す。いくつかの実施態様では、予後診断はまた、対象動物の疾患若しくは症状のための治療法又は他の治療レジメンに対する正若しくは負の応答を提示する能力を指す。いくつかの実施態様では、予後診断は、疾患/症状関連症候の存在又は減弱を予測する能力を指す。予後診断薬又は方法は、対象動物又は対象動物から入手したサンプルを複数のカテゴリーの1つに分類する工程を含むことができる。ここで、カテゴリーは、対象動物が個々の成果を示す種々の可能性と相関性を有する。例えば、カテゴリーは低リスク及び高リスクであり、ここで、低リスクカテゴリーの対象動物は、高リスクカテゴリーの対象動物よりも貧弱な成果を（例えば既定の期間（例えば5年又は10年）内に）示す可能性が低い。貧弱な成果は、例えば病状増悪、病状再発又は当該疾患に起因する死亡であり得る。
“放射線療法”とは、細胞に十分な損傷を誘発して正常に機能する能力を制限するか、又は完全に細胞を破壊するための誘導ガンマ線またはベータ線の使用を意味する。線量及び治療期間を決定するために当業界には公知の多くの方法があることは理解されるであろう。典型的な治療は1回投与として提供され、典型的な線量は1日に付き10から200ユニット（グレイ）の範囲である。
【００６４】
本明細書で用いられるように、ある治療法で既に治療を受けている癌患者は、当該対象者が業界で認証された客観的基準セット又はその合理的修正にしたがって、抗癌効果の証拠（臨床的に重要な利益（例えば癌の症候の予防若しくは重篤度の軽減又は増悪の遅延）を含む）を示すならば、当該治療法に“応答する”、“応答”を有する、“正の応答”を有する、又は“応答性”であるとみなされる。上述の用語はまた癌に関して用いられることは理解されるであろう。癌に対する抗癌治療の効果を評価するために多様な異なる客観的基準が当業界で公知である。世界保健機構（WHO）基準（Miller, A B, et al., Cancer 1981; 47(1):207-14）及びその修正版（固形腫瘍の応答評価基準（RECIST）（Therasse P, et al., J Natl Cancer Inst 2000; 92:205-16））並びにその改訂版（Eisenhauer E A：固形腫瘍における新規な応答基準：改訂RECISTガイドライン（version 1.1）；Eur J Cancer 2009; 45(2):228-47）は客観的基準セットであり、前記は、例えばコンピュータ断層写真技術（CT）、磁気共鳴画像化法（MRI）又は通常のX線写真から得られる、腫瘍病巣のサイズ及び数の画像測定並びに新規病巣の検出に基づく。選択病巣（標的病巣と称される）の寸法を用いて、異なる時点の画像間における腫瘍負荷の変化を計算する。計算した応答を続いて、完全応答（CR）、部分応答（PR）、安定病状（SD）、又は増悪病状（PD）として分類する。CRは腫瘍の完全な消失であり（−100％）、PDは、約20％−25％又は前記を超える（該当する基準による）増加及び/又は新規な病巣の出現である。PRは、腫瘍病巣サイズの顕著な（少なくとも約30％の）減少であるが（新規な病巣は出現しない）、ただしサイズの減少は完全応答より小さい。SDはPRとPDとの間に存在する（詳細については表1及び2を参照されたい）。これらの基準は、抗癌剤の有効性を評価するフェースIIの一次終了点として、例えば全生存期間の代用として広く用いられる。しかしながら、WHO、RECIST及びRECIST 1.1基準を用いる単独解剖画像化が、細胞傷害因子の初期効果の検出のために設計されたが、一定の制限が、特に病状を安定化させるより新規な癌療法の評価で生じた。免疫療法抗癌剤又は分子標的抗癌剤で治療される患者の臨床応答パターンは細胞傷害剤のパターンを超えることがあり、腫瘍負荷の最初の増加又は新規病巣の出現の後で明らかとなり得る。例えば、免疫チェックポイント阻害剤に対する有意義な腫瘍応答は、遅れて、いくつかの症例ではWHO又はRECIST定義PDの後で出現することがある。免疫関連応答基準（irRC）と呼ばれる基準は、免疫療法で観察される追加の好ましい応答パターンを捕捉しようとして定義された（Wolchok, J D, et al., 2009；固形腫瘍における免疫療法活性の評価のためのガイドライン：免疫関連応答基準（Clin. Care Res. 15, 7412-7420））。好ましい生存に関連する4つのパターンが識別された、すなわち、基準病巣が減少し新規病巣が存在しない；持続性の病状安定；総腫瘍負荷は初期に増加するが最終的には応答する；及び新規病巣の出現中又は出現後に総腫瘍負荷が減少する。前記のうちで後者の2つは、WHO又はRECIST基準で好ましいと考えられる応答パターンとは全く異なる。irRCは、完全応答（irCR）、部分応答（irPR）、安定病状（irSD）、及び増悪病状（irPD）のための基準を含む。とりわけ、irRCは、測定可能���新規病巣を“総腫瘍負荷”に取り込み、この変数を基準測定と比較し、新規病巣は必然的に増悪病状を表すとは考えない。要約すると、免疫関連応答基準にしたがえば、irCRは、測定可能であれ測定不能であれ全ての病巣の完全な消失及び無新規病巣であり；irPRは、基準線と対比して50％以上の腫瘍負荷の減少であり；irSDは、irCR又はirPRの基準に適合せず増悪病状（irPD）が存在しない病状であり；irPDは、どん底（最少記録の腫瘍負荷）と対比して総腫瘍負荷の25％.gtoreq.の増加である（上掲書（Wolchok））。irCR、irPR及びirPDは、最初の文書記録から少なくとも4週間の反復連続評価による確認を必要とする。irCR、irPR及びirPDは、WHO基準でCR、PR又はSDの全ての患者だけでなく、これらのirRCカテゴリーにWHO PDからシフトする患者を含む。しかしながら、WHO又はRECIST基準によればPDと分類されるようないくらかの患者は、irRCによればむしろPR又はSDと分類され、彼らを好ましい生存を示す可能性が高いと識別する。irRCは、免疫チェックポイント阻害剤及び他の免疫療法剤に適用できる。当業界では追加の応答基準が知られていることは当業者には理解されるであろう。それらは、多様な因子を考慮する。多様な因子は、例えば腫瘍生命維持組織のインジケーターとしての腫瘍動脈の強化度及び/又は腫瘍密度の変化であり、動脈強化の低下及び腫瘍密度の低下は生命維持腫瘍組織の（例えば腫瘍壊死による）減少のインジケーターである。例えば、修正RECIST基準（mRECIST）は腫瘍動脈強化度の変化を考慮する（Lencioni R and Llovet J M. Semin Liver Dis 30: 52-60, 2010）。Choi基準及び修正Choi基準は、CTによる腫瘍密度の減少を考慮する（Choi H, et al., J Clin Oncol 25: 1753-1759, 2007；Nathan P D, et al., Cancer Biol Ther 9: 15-19, 2010；Smith A D, et al., Am J Roentgenol 194: 157-165, 2010）。そのような基準は、ある種の癌タイプ及び/又はある種の治療薬剤クラスで特に有用であり得る。例えば、有効な治療にもかかわらず、複数の腫瘍（例えばリンパ腫、肉腫、ヘパトーマ、中皮腫、及び胃腸の基質性腫瘍）では、腫瘍サイズの変化は最小限である。CTによる腫瘍密度、コントラスト強化、又はMRIによる特徴付けはサイズよりも情報量が多いように思われる。ある種の実施態様では、機能性画像化、例えば陽電子放出断層撮影（PET）を用いることができる。例えば、固形腫瘍におけるPET応答基準（PERCIST）を用いることが可能で、前記基準では、治療応答は、(18)F-FDG PET画像化で評価される代謝性変化によって評価され、トレーサーの取り込みの低下が指標である（Wahl R L, et al., J Nucl Med 2009; 50, Suppl 1:122S-50S）。種々の固有の癌タイプ（例えばメラノーマ、乳癌、及び肺癌）のために開発された応答基準が当業界で知られていることもまた理解されよう。対照的に、ある治療法で既に治療を受けている癌患者は、当該治療法が臨床的に有意な利益（例えば症候の予防又は重篤度の軽減）を提供しないか、又は癌の進行速度を増加させる場合には、当該治療法に対して“応答しない”、“応答を欠く”、“負の応答を有する”又は“非応答性”であるとみなされる。
【００６５】
本開示の目的のためには、免疫療法（単独療法として又は1つ以上の活性薬剤（例えば補完阻害剤、追加の抗癌剤、又はその両方）と併用される）で治療される癌患者は、当該患者が、少なくとも免疫関連応答基準にしたがって完全応答、部分応答、又は安定病状を有する場合には、当該治療に対して“応答する”、“応答”を有する、又は“応答性”であるとみなされる。（癌患者はまた、RECIST、RECIST 1.1、WHO、及び/又は他の基準（例えば上記に記載したもの）にしたがって応答することもあり得る）。同様に、そのような症例の癌は、当該治療に対して“応答する”、又は“応答性”であると称される。癌患者は、当該患者が免疫関連応答基準にしたがって増悪病状を有する場合には、当該治療に対して“応答しない”、“応答”を示さない、又は“非応答性”であるとみなされる。（癌患者はまた、RECIST、RECIST 1.1、WHO、及び/又は他の基準（例えば上記に記載したもの）にしたがって応答しないこともあり得る）。同様に、そのような症例の癌は、当該治療に対して“応答しない”、又は“非応答性”、“非感受性”又は“耐性”であると称される。（癌が最初は応答するが、患者がその後で当該治療の存在下で増悪病状を示す場合には、当該癌はまた当該治療に対して耐性になったとみなされる）。したがって、例えば、癌の治療に対する応答に関連する本明細書に記載の方法（例えば応答の可能性を予測する方法、予測される応答にしたがって患者を分類する方法、応答の可能性を高める方法）及び製品について、応答は、irCR、irPR、又はirSDと定義され、無応答は、別に指定されなければirPDと定義される。ある種の実施態様では、任意の有用な応答基準を指定することができる。当該応答基準は、利益（例えば全生存期間の増加又は他の臨床的に有意義な利益）と相関性を有することが既に示されているかもしれない。既存の応答基準の改良又は改訂（例えば、免疫チェックポイント阻害剤に適用できる臨床活性の追加の好ましいパターンを包含するか、又は別の態様で有用である）が、将来開発され得ることは理解されるであろう。ある種の実施態様では、そのような応答基準のいずれも本明細書に記載の方法で使用するために指定できる。
【００６６】
本明細書で用いられる“サンプル”という用語は任意の生物学的標本を含み、前記標本は、対象動物から抽出されるか、処理されないか、処理されるか、希釈されるか又は濃縮されることがある。サンプルはその範囲内に以下を含む：対象動物から単離された類似する液体、細胞又は組織の収集物（例えば外科切除した腫瘍組織、生検、（微細針吸引を含む））の他に、対象動物内に存在する液体、細胞又は組織。いくつかの実施態様では、サンプルは生物学的液体である。生物学的液体は、典型的には生理学的温度の液体であり、さらに天然に存在する液体を含むことができ、それら液体は、対象動物又は生物学的供給源に存在するか、それらから引き出されるか、それらで発現されるか、或いはそれらから抽出される。ある種の生物学的液体は、該当する組織、器官又は局在領域から誘導され、さらにある種の他の生物学的液体は、対象動物又は生物学的供給源でより包括的に又は全身的に存在し得る。生物学的液体の例には、血液、血清及び漿液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、喀痰、分泌組織及び器官の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水（例えば非固形腫瘍に付随するもの）、胸膜腔、心膜腔、腹膜腔、腹腔及び他の身体腔の液体、気管支肺胞洗浄によって収集される液体などが含まれる。生物学的液体はまた、対象動物又は生物学的供給源と接触させた流動性溶液を含むことができ、前記は、例えば細胞及び器官培養液（細胞又は器官条件付け培養液を含む）、洗浄液などである。本明細書で用いられる“サンプル”という用語は、対象動物から除去された素材又は対象動物に存在する素材を包含する。
【００６７】
本明細書で用いられる、“参照サンプル”、“参照細胞”、“参照組織”、“コントロールサンプル”、“コントロール細胞”、又は“コントロール組織”は、比較の目的のために用いられるサンプル、細胞、組織、標準物、又はレベルを指す。ある実施態様では、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織は、同じ対象動物又は個体の身体（例えば組織又は細胞）の健康な及び/又は無病部分から得られる。例えば、有病細胞又は組織に隣接する健康な及び/又は無病細胞又は組織（例えば腫瘍に隣接する細胞又は組織）である。別の実施態様では、参照サンプルは、同じ対象動物又は個体の身体の無処理組織及び/又は細胞から得られる。さらに別の実施態様では、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織は、当該対象動物又は個体ではない個体の身体（例えば組織又は細胞）の健康な及び/又は無病部分から得られる。さらに別の実施態様では、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織は、当該対象動物又は個体ではない個体の身体の無処理組織及び/又は細胞から得られる。
本明細書で用いられるように、“小分子”は、3キロダルトン（kDa）未満、典型的には1.5キロダルトン未満、より好ましくは約1キロダルトン未満の分子量を有する化合物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）又は無機分子であり得る。本開示に基づいて、化学及び/又は生物学的混合物（おそらく真菌、細菌又はラン藻類抽出物）の広範囲ライブラリーを本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングし、生物活性を調節する化合物を識別できることは、当業者には理解されよう。“小さな有機分子”は、3キロダルトン未満、1.5キロダルトン未満、又は約1キロダルトン未満ですらある分子量を有する、有機化合物（又は無機化合物（例えば金属）と複合化された有機化合物）である。
【００６８】
本発明の多様な方法論はある工程を含み、前記工程は、“適切な（suitable）コントロール”（本明細書では“適当な（appropriate）コントロール”、“コントロールサンプル”又は“参照”と互換的に称される）に対して値、レベル、特色、特徴、特性などを比較することを必要とする。“適切なコントロール”、“適当なコントロール”、“コントロールサンプル”又は“参照”は、比較の目的で有用な当業者に良く知られている任意のコントロール又は標準物である。いくつかの実施態様では、“適切なコントロール”又は“適当なコントロール”は、細胞、器官又は患者で決定される値、レベル、特色、特徴、特性などであり、前記細胞、器官又は患者は、例えば、該当するバイオマーカープロファイル（例えば、上皮細胞バイオマーカープロファイル、間葉細胞バイオマーカープロファイル、治療法耐性癌細胞バイオマーカープロファイル、治療法感受性癌細胞バイオマーカープロファイル、正常及び/又は非癌細胞バイオマーカープロファイル）を示すコントロール細胞、細胞集団、器官又は患者である。他の実施態様では、“適切なコントロール”又は“適当なコントロール”は、癌細胞又は癌細胞を含む細胞集団をある治療法に暴露する前に決定される値、レベル、特色、特徴、特性、速度など（例えば該当するバイオマーカープロファイルと相関性を有するバイオマーカーレベル）である。いくつかの実施態様では、転写速度、mRNAレベル、翻訳速度、タンパク質レベル/比、生物学的活性、細胞の特徴又は特性、表現型などは、癌細胞又は癌細胞を含む細胞集団をある治療法に暴露する前、暴露中、又は暴露後に決定することができる。“適切なコントロール”は、本発明の1つ以上のバイオマーカーのレベル/比のパターンであり得る。前記パターンは、癌細胞サンプルをそれに対して比較することができる該当するバイオマーカープロファイル（例えば、上皮細胞バイオマーカープロファイル、間葉細胞バイオマーカープロファイル、治療法耐性癌細胞バイオマーカープロファイル、治療法感受性癌細胞バイオマーカープロファイル、正常及び/又は非癌細胞バイオマーカープロファイル）と相関性を有する。癌細胞サンプルはまた陰性コントロールと比較することができる。そのような参照レベルはまた、生物学的サンプル中のバイオマーカーのレベルの測定に用いられる固有の技術（例えばLC-MS、GC-MS、ELISA、PCRなど）に合わせて調整することができ、ここで、バイオマーカーのレベルは用いられる固有の技術に基づいて相違し得る。
【００６９】
本明細書で用いられるように、“階層化する”及び“分類する”という用語は、本明細書では互換的に用いられ、該当する生理学的又は病理学的状態又は症状の特色に基づいて、異なる階層又はクラスへ対象動物を仕分けることを指す。例えば、対象動物がある治療法（例えば化学療法又は免疫療法）に応答する可能性が高いか否かにしたがって、対象動物の集団を階層化する工程は、場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーと組み合わせて、癌細胞の治療法バイオマーカー（PD-L1-263Kme及びPD-L1-263KAcを含む）に対する応答のレベルに基づいて対象動物を割り振る工程を必要とする。前記間葉及び/又は幹性バイオマーカーは、適切には薬剤耐性及び/又は疾病負荷と関連する（例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5）。
本明細書で用いられるように、“治療”という用語は、治療される個体又は細胞の臨床病変過程の際の自然な過程を変更するために設計された臨床的介入を指す。所望される治療効果には、病状増悪速度の低下、症状の緩和又は軽減、及び寛解又は予後の改善が含まれる。例えば、癌に関連する1つ以上の症候が緩和又は除去されるならば、当該個体は首尾よく“治療される”。前記症候の緩和又は除去には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：癌細胞の増殖の低下（又は癌細胞の破壊）、病原体感染の低下、当該疾患から生じる症候の軽減、当該疾患に罹患した者の生活の質の向上、当該疾患の治療に要求される他の医薬の用量の減少、及び/又は個体の延命。“ある治療法による治療”、“ある治療法で治療する”、“ある薬剤による治療”、“ある薬剤で治療する”などは、有効量の治療法又は薬剤（癌療法又は薬剤（例えば細胞傷害因子又は免疫療法薬剤）を含む）の患者への投与、又は、有効量の2つ以上の治療法又は薬剤（複数の癌療法又は薬剤（例えば複数の細胞傷害因子又は免疫療法薬剤から選択される2つ以上の薬剤）を含む）の患者への同時投与を指す。
【００７０】
本明細書で用いられるように、“治療成果”は、選択した治療法又は治療に対する癌患者の応答の予測（該当する治療により患者が正の又は負の成果を有する可能性を含む）を指す。本明細書で用いられるように、“正の治療成果を示す”又は同様な用語は、患者が有益な結果を選択治療から受ける可能性が高いことを指す。前記有益な結果は、例えば完全又は部分応答、完全又は部分寛解、腫瘍サイズの低下、安定病状などである。対照的に、“負の治療成果を示す”又は同様な用語は、潜在する癌の進行に関して患者が選択治療から有益な結果を受けない可能性が高いことを意味しようとする（例えば病状増悪、病状再発、腫瘍サイズ増加など）。
本明細書に用いられる“腫瘍”は、悪性又は良性にかかわらず全ての新形成細胞の成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。“癌”、“癌性”、“細胞増殖性疾患”、“増殖性疾患”、“過剰増殖性疾患”及び“腫瘍”は、本明細書で示されるように互いに排他的ではない。
本明細書で用いられるように、遺伝子の名称の下線又は斜字体は、そのタンパク質生成物とは対照的に遺伝子を指し、タンパク質生成物は、下線又は斜字体がいずれも存在しないその遺伝子の名称によって示される。例えば“PD-L1”はPD-L1遺伝子を意味し、一方、“PD-L1”は、PD-L1遺伝子の転写及び翻訳及び/又はまた別のスプライシングから生成されるタンパク質生成物又は複数の生成物を示す。
本明細書に記載する各実施態様は、特段の記載がなければ各実施態様及び全ての実施態様に準用される。
【００７１】
2．検出、診断及び予後診断の方法
本発明は、PD-L1ポリペプチド配列の263位のリジンの種々の翻訳後修飾（前記はPD-L1のNLSとオーバーラップするか又はその中に含まれる）は、PD-L1の核又は細胞質及び/又は細胞膜への局在化を刺激又は強化することを開示する。代表的なPD-L1ポリペプチドは下記のアミノ酸配列を含み：
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEME DKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET（配列番号:1）、ここで、263位のリジン（すなわち263K）は下線で強調される。
本発明者らは、このリジンのメチル化（すなわちPD-L1-263KMe）（トリメチル化（Me3）を含む）は、癌細胞の細胞質及び/又は細胞膜にPD-L1を実質的に局在化させ、さらに当該リジンのアセチル化（すなわちPD-L1-263KAc）は、PD-L1を癌細胞の核にほぼ局在化させることを見出した。注目すべきことに、癌細胞の細胞質及び/又は細胞膜へのPD-L1の局在化は、治療法に対する癌細胞の感受性と相関性を有し、さらにPD-L1の核への局在化は、癌細胞のEMT及び/又は幹性とともに治療法（例えば化学療法及び/又は免疫療法）に対する耐性と相関性を有することが見出された。
PD-L1翻訳後修飾（PTM）（すなわちPD-L1-263KAc及びPD-L1-263KMe）のこれらのバイオマーカー（本明細書では“治療法応答”バイオマーカーとも称される）を場合によって1つ以上の間葉及び/又は幹性バイオマーカーと組み合わせて用い、治療法に対する応答をモニターしさらに治療成果を予測できることもまた見出された。前記間葉及び/又は幹性バイオマーカーは、適切には薬剤耐性及び/又は疾病負荷と関連し、例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5である。
【００７２】
したがって、本発明によれば、PD-L1-263KAc及びPD-L1-263KMeをバイオマーカーとして用いて、PD-L1の細胞局在を決定し、ある治療法（例えば化学療法及び/又は免疫療法）に対する癌細胞の応答の可能性（治療法に対する癌細胞の耐性又は感受性の可能性を含む）を予測し、ある治療法に対する応答者又は非応答者の可能性にしたがって癌患者を階層化し、ある治療法で癌患者の治療を管理し、さらにある治療法で治療される癌患者について治療成果を予測することができる。
本発明の実施のための癌細胞は任意の適切な癌細胞含有患者サンプルから入手でき、その例示的な例には、腫瘍生検、循環腫瘍細胞、腫瘍から誘導された若しくは腫瘍様特性を示す初代細胞培養又は細胞株だけでなく、保存された腫瘍サンプル、例えばホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍サンプル、又は凍結腫瘍サンプルが含まれる。いくつかの実施態様では、サンプルはある治療法による治療前に入手される。他の実施態様では、サンプルはある治療法による治療後に入手される。いくつかの実施態様では、サンプルは組織サンプルを含み、前記サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋、アーカイブ、新鮮又は凍結サンプルであり得る。いくつかの実施態様では、サンプルは全血である。いくつかの実施態様では、全血は免疫細胞、循環腫瘍細胞及びこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００７３】
バイオマーカー（例えば、PD-L1-263KAc、PD-L1-263KMe並びに場合によってPD-L1-WT、CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5）の存在及び/又はレベル/量を、当業界で公知の任意の適切な基準（タンパク質及びタンパク質フラグメントを含むがただしそれらに限定されない）に基づいて定性的及び/又は定量的に決定することができる。ある種の実施態様では、第一のサンプルのバイオマーカーの存在及び/又は発現レベル/量は、第二のサンプル（例えば治療法による治療前）の存在及び/又は発現レベル/量と比較して増加又は上昇する。ある種の実施態様では、第一のサンプルのバイオマーカーの存在及び/又は発現レベル/量は、第二のサンプルの存在及び/又は発現レベル/量と比較して低下又は減少する。ある種の実施態様では、第二のサンプルは、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織である。遺伝子の有無及び/又はレベル/量を決定するための追加の開示は本明細書に記載される。
当該方法のいずれかのいくつかの実施態様では、上昇したレベルは、（標準的技術の公知の方法（例えば本明細書に記載するもの）によって検出したとき）、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織と比較して、バイオマーカー（例えばタンパク質又はタンパク質フラグメント）のレベルで約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又はそれより大きい任意の全体的な増加を指す。ある種の実施態様では、上昇したレベルはサンプル中のバイオマーカーのレベル/量の増加を指し、ここで、当該増加は、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織中のそれぞれのバイオマーカーのレベル/量の少なくとも約1.5ｘ、1.75ｘ、2ｘ、3ｘ、4ｘ、5ｘ、6ｘ、7ｘ、8ｘ、9ｘ、10ｘ、25ｘ、50ｘ、75ｘ、又は100ｘの増加である。いくつかの実施態様では、上昇したレベルは、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、コントロール組織、又は内部コントロール（例えばハウスキーピング遺伝子）と比較して、約1.5倍、約1.75倍、約2倍、約2.5倍、約2.75倍、約3.0倍、又は約3.25倍より大きい全体的な増加を指す。
【００７４】
当該方法のいずれかのいくつかの実施態様では、低下したレベルは、（標準的技術の公知の方法（例えば本明細書に記載するもの）によって検出したとき）、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織と比較して、バイオマーカー（例えばタンパク質又は核酸（例えば遺伝子又はmRNA））のレベルで約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又はそれより大きい任意の全体的な低下を指す。ある種の実施態様では、低下したレベルはサンプル中のバイオマーカーのレベル/量の減少を指し、ここで、当該減少は、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織中のそれぞれバイオマーカーのレベル/量の少なくとも約0.9ｘ、0.8ｘ、0.7ｘ、0.6ｘ、0.5ｘ、0.4ｘ、0.3ｘ、0.2ｘ、0.1ｘ、0.05ｘ、又は0.01ｘの減少である。
サンプル中の多様なバイオマーカーの存在及び/又はレベル/量は多数の方法論によって分析でき、その多くは当業界で公知であり、かつ当業者に理解されている。前記には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：免疫組織化学（“IHC”）、ウェスタンブロット分析、免疫沈澱、分子結合アッセイ、ELISA、ELIFA、蛍光活性化細胞仕分け（“FACS”）、MassARRAY、プロテオミクス、定量血液依拠アッセイ（例として血清ELISA）、生化学的酵素活性アッセイ、in situハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（“PCR”）（定量リアルタイムPCR（“qRT-PCR”）及び他の増幅型検出方法（例えば分枝DNA,SISBA、TMAなど）を含む）、RNA-Seq、FISH、マイクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリング、及び/又は遺伝子発現の連続分析（“SAGE”）とともに、タンパク質、遺伝子、及び/又は組織アレー分析によって実施できる広範囲のアッセイのいずれか1つ。遺伝子及び遺伝子生成物のステータスを評価するための典型的なプロトコルは、例えば以下で見出される：Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unit 2（ノーザンブロッティング）、Unit 4（サザンブロッティング）、Unit 15（免疫ブロッティング）及びUnit 18（PCR分析）。多重免疫アッセイ（例えばRules Based Medicine又はMeso Scale Discovery（“MSD”）から入手できるもの）もまた用いることができる。
【００７５】
いくつかの実施態様では、バイオマーカー、特に非PTMバイオマーカー（例えば本明細書に開示の間葉及び/又は幹性バイオマーカー）の存在及び/又はレベル/量は、以下の工程を含む方法を用いて決定される：（a）遺伝子発現プロファイリング、PCR（例えばRT-PCR又はqRT-PCR）、RNA-seq、マイクロアレイ分析、SAGE、MassARRAY技術、又はFISHをサンプル（例えば対象動物の癌サンプル）で実施する工程；及び（b）サンプル中のバイオマーカーの存在及び/又は発現レベル/量を決定する工程。いくつかの実施態様では、マイクロアレー方法はマイクロアレイチップの使用を含む。前記チップは、1つ以上の核酸分子（上記に記載の遺伝子をコードする核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる）を有するか、又は1つ以上のポリペプチド（例えばペプチド又は抗体）（上記に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質の1つ以上と結合できる）を有する。ある実施態様では、PCR方法はqRT-PCRである。ある実施態様では、PCR方法は多重PCRである。いくつかの実施態様では、遺伝子発現はマイクロアレイによって測定される。いくつかの実施態様では、遺伝子発現はqRT-PCRによって測定される。いくつかの実施態様では、発現は多重PCRによって測定される。
細胞中のmRNAの評価の方法は周知であり、例えば以下が含まれる：相補性DNAプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、1つ以上の遺伝子に特異的な標識リボプローブを用いるin situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連技術）、及び多様な核酸増幅アッセイ（例えば、1つ以上の遺伝子に特異的な相補性プライマーを用いるRT-PCR、及び他の増幅型検出方法（例えば分枝DNA、SISBA、TMAなど））。
【００７６】
哺乳動物のサンプルは、ノーザン分析、ドットブロット分析又はPCR分析を用いてmRNAについて都合よくアッセイすることができる。加えて、そのような方法は、（例えば“ハウスキーピング”遺伝子（例えばアクチンファミリーメンバー）の比較コントロールmRNA配列のレベルを同時に吟味することによって）、生物学的サンプル中の標的mRNAのレベルの決定を可能にさせる1つ以上の工程を含むことができる。場合によって、増幅された標的cDNAの配列を決定することが可能である。
場合によって選択される方法は、組織又は細胞サンプルでマイクロアレイ技術によってmRNA（例えば標的mRNA）を吟味及び検出するプロトコルを含む。核酸マイクロアレイを用いて、試験及びコントロール組織サンプル由来の試験及びコントロールmRNAサンプルを逆転写及び標識して、cDNAプローブを作製する。前記プローブを続いて固相に固定した核酸アレーとハイブリダイズさせる。当該アレーは、アレーの各メンバーの配列及び位置が分かるように構成される。例えば、その発現がある治療法に対する臨床的利益の増加又は低下と相関性を有する遺伝子の選択物を固相に並べることができる。標識プローブと特定のアレーメンバーとのハイブリダイゼーションは、当該プローブが得られたサンプルは当該遺伝子を発現することを示す。
【００７７】
好ましい実施態様では、存在及び/又はレベル/量はタンパク質を観察することによって測定される。ある種の実施態様では、当該方法は以下の工程を含む：生物学的サンプルを少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー（例えばPD-L1-263KAc及び/又はPD-L1-263KMe）に対する抗体と、場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及び/又はABCB5）と組み合わせて、当該バイオマーカーの結合を許容する条件下で接触させる工程；及び複合体が当該抗体（1つ又は複数）と当該バイオマーカーとの間で形成されるか否かを検出する工程。そのような方法はin vitro又はin vivo方法であり得る。いくつかの実施態様では、1つ以上の抗バイオマーカー抗体を用いて、治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法）に対して適格である対象動物を選択する。
ある種の実施態様では、サンプル中のバイオマーカータンパク質の存在及び/又は発現レベル/量は、IHC及び染色プロトコルを用いて吟味される。組織切片のIHC染色は、サンプル中のタンパク質の存在を決定又は検出する信頼できる方法であることが示されている。いくつかの実施態様では、ある個体のサンプル中の治療法応答バイオマーカー（例えばPD-L1-263KAc及び/又はPD-L1-263KMe）及び/又は間葉及び/又は幹性バイオマーカーのレベルは上昇したレベルであり、さらに別の実施態様では、前記はIHCを用いて決定される。ある実施態様では、バイオマーカーのレベルは、以下の工程を含む方法を用いて決定される：（a）抗体を用いてサンプル（例えば対象動物の癌サンプル）のIHC分析を実施する工程；及び（b）サンプル中のバイオマーカーのレベルを決定する工程。いくつかの実施態様では、IHC染色強度が参照と対比して決定される。いくつかの実施態様では、参照は参照値である。いくつかの実施態様では、参照は、参照サンプル（例えば、コントロール細胞株染色サンプル又は非癌性患者の組織サンプル）である。
【００７８】
いくつかの実施態様では、少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー（例えばPD-L1-263KAc及び/又はPD-L1-263KMe）及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及び/又はABCB5）の発現は、腫瘍又は腫瘍サンプルで評価される。本明細書で用いられるように、腫瘍又は腫瘍サンプルは、腫瘍領域の部分又は全部が腫瘍細胞によって占められるものを包含することができる。いくつかの実施態様では、腫瘍又は腫瘍サンプルは、さらにまた腫瘍関連腫瘍内細胞及び/又は腫瘍関連間質（例えば連続する腫瘍周囲の線維形成間質）によって占められる腫瘍領域を包含することができる。腫瘍関連腫瘍内細胞及び/又は腫瘍関連間質は、主要な腫瘍塊と直接隣り合う及び/又は前記に連続する免疫浸潤物（例えば、本明細書に記載する腫瘍浸潤免疫細胞）の領域を含むことができる。いくつかの実施態様では、治療法応答バイオマーカー発現及び場合によって間葉及び/又は幹性バイオマーカー発現は腫瘍細胞で評価される。
また別の方法では、サンプルを前記バイオマーカーに特異的な抗体と抗体-バイオマーカー複合体の形成に十分な条件下で接触させ、続いて前記複合体を検出できる。バイオマーカーの存在は多数の方法で、例えば、多様な組織及びサンプル（血漿および血清を含む）をアッセイするウェスタンブロッティング及びELISA手順によって検出することができる。そのようなアッセイ様式を用いる広範囲の免疫アッセイ技術が利用可能であり、例えば以下を参照されたい：U.S. Pat. No. 4,016,043、4,424,279及び4,018,653。これらは、非競合タイプとともに伝統的な競合結合アッセイの一ヵ所及び二ヵ所又は“サンドイッチ”アッセイの両方を含む。これらのアッセイはまた標識抗体と標的バイオマーカーとの直接結合を含む。
【００７９】
ある種の実施態様では、サンプルは、アッセイされるバイオマーカーの量及び用いられるサンプルの品質の変動性の両方の相違、並びに実施されるアッセイ間の変動性について正規化される。そのような正規化は、ある種の正規化バイオマーカー（周知のハウスキーピング遺伝子の発現生成物を含む）の発現を検出し取り入れることによって達成できる。また別には、正規化は、アッセイされる複数の遺伝子又はその大きなサブセットの全ての平均若しくは中央値シグナルを基にすることができる（全体的正規化アプローチ）。対象動物の腫瘍mRNA又はタンパク質の測定した正規化量を、参照セットで見出される量と一遺伝子ずつ比較する。対象動物毎の被検腫瘍当たりの各mRNA又はタンパク質の正規化発現レベルは、参照セットで測定した発現レベルのパーセンテージとして表すことができる。分析されるべき該当する対象動物のサンプルで測定した存在及び/又は発現レベル/量は、この範囲内のいずれかのパーセンタイルに当てはまるであろう。前記は当業界で周知の方法によって決定できる。
いくつかの実施態様では、サンプルは臨床サンプルである。いくつかの実施態様では、サンプルは原発腫瘍又は転移腫瘍から入手される。代表的な腫瘍組織片を得るために、組織生検がしばしば用いられる。また別には、腫瘍細胞は、問題の腫瘍細胞を含むことが判明しているか又は含むと考えられる組織又は液体の形で間接的に入手できる。例えば、肺癌病巣のサンプルは、切除術、気管支鏡検査法、微細針吸引、気管支擦過、又は喀痰、胸膜液若しくは血液から入手できる。遺伝子又は遺伝子生成物は、癌若しくは腫瘍組織から、又は他の身体サンプル（例えば尿、喀痰、血清又は血漿）から検出することができる。癌性サンプルの標的遺伝子又は遺伝子生成物の検出のために上記で考察した同じ技術を、他の身体サンプルに適用することができる。癌細胞は癌病巣から脱落し、そのような身体サンプルに出現し得る。そのような身体サンプルをスクリーニングすることによって、単純で早期の診断をこれらの癌について達成することができる。加えて、そのような身体サンプルを標的遺伝子又は遺伝子生成物について試験することによって、治療法の進行をより容易にモニターすることができる。
【００８０】
ある種の実施態様では、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、コントロール組織は、単一サンプルであるか、又は同じ対象動物若しくは個体由来の組合せ多重サンプルで、試験サンプル入手時とは異なる1つ以上の時点で入手される。例えば、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織は、同じ対象動物又は個体から試験サンプル入手時よりも早い時点で入手される。そのような参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、又はコントロール組織は、当該参照サンプルが最初の癌の診断時に得られ、試験サンプルが癌が転移したときより遅くに得られるならば有用であり得る。
ある種の実施態様では、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、コントロール組織は、1人以上の健康な個体（対象動物又は個体ではない）に由来する複数のサンプルの組合せである。ある種の実施態様では、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、コントロール組織は、疾患又は異常（例えば癌）を有する1人以上の個体（対象動物又は個体ではない）に由来する複数のサンプルの組合せである。ある種の実施態様では、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、コントロール組織は、1人以上の個体（対象動物又は個体ではない）に由来する、正常組織由来のプールされたRNAサンプル又はプールされた血漿若しくは血清サンプルである。ある種の実施態様では、参照サンプル、参照細胞、参照組織、コントロールサンプル、コントロール細胞、コントロール組織は、疾患又は異常（例えば癌）を有する1人以上の個体（対象動物又は個体ではない）に由来する、腫瘍組織由来のプールされたRNAサンプル又はプールされた血漿若しくは血清サンプルである。
【００８１】
いくつかの実施態様では、サンプルは個体由来の組織サンプルである。いくつかの実施態様では、組織サンプルは腫瘍組織サンプル（例えば生検組織）である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは肺組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは腎組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは皮膚組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは膵臓組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは胃の組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは膀胱組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは食道組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは中皮組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは乳房組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは甲状腺組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは結腸直腸組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは頭頸部組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは骨肉腫組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは前立腺組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは、卵巣組織、HCC（肝臓）、血液細胞、リンパ節、及び/又は骨/骨髄組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは結腸組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは子宮内膜組織である。いくつかの実施態様では、組織サンプルは脳組織（例えば神経膠芽腫、神経芽腫など）である。
【００８２】
いくつかの実施態様では、腫瘍組織サンプル（“腫瘍サンプル”という用語が本明細書では互換的に用いられる）は、腫瘍領域の部分又は全部が腫瘍細胞によって占められるものを包含することができる。いくつかの実施態様では、腫瘍又は腫瘍サンプルはさらにまた、腫瘍関連腫瘍内細胞及び/又は腫瘍関連間質（例えば連続する腫瘍周囲の線維形成間質）によって占められる腫瘍領域を包含することができる。腫瘍関連腫瘍内細胞及び/又は腫瘍関連間質は、主要な腫瘍塊と直接隣り合う及び/又は前記と連続する免疫浸潤物の領域を含むことができる。
いくつかの実施態様では、腫瘍細胞染色は、任意の強度の染色（例えば膜染色、細胞質染色又は核染色）を示す全ての腫瘍細胞のパーセントとして表現される。浸潤免疫細胞染色は、任意の強度の染色を示す免疫細胞によって占められる総腫瘍領域のパーセントとして表現される。総腫瘍領域は、悪性細胞だけでなく腫瘍関連間質（主要な腫瘍塊と直接隣り合う及び前記と連続する免疫浸潤物の領域を含む）を包含する。加えて、浸潤免疫細胞染色は、全ての腫瘍浸潤免疫細胞のパーセントとして表現される。
【００８３】
いくつかの実施態様では、腫瘍は悪性癌性腫瘍（例えば癌）である。いくつかの実施態様では、腫瘍及び/又は癌は固形腫瘍又は非固形若しくは軟組織腫瘍である。軟組織腫瘍の例には、白血病（例えば慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、成熟B細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病、又は有毛細胞白血病）又はリンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、又はホジキン病）が含まれる。固形腫瘍には、血液、骨髄、又はリンパ系以外の身体組織の任意の癌が含まれる。固形腫瘍はさらにまた、上皮細胞起原のもの及び非上皮細胞起原のものに分けることができる。上皮細胞固形腫瘍の例には、胃腸管、結腸、結腸直腸（例えば結腸直腸類基底癌腫）、乳房、前立腺、肺、腎、肝、膵、卵巣（例えば卵巣内膜癌腫）、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器官、泌尿器官（例えば尿路上皮癌腫、異形成尿路上皮癌腫、移行上皮癌腫）、膀胱、及び皮膚の腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。いくつかの実施態様では、癌は非小細胞肺癌（NSCLC）である。いくつかの実施態様では、癌は、セカンドライン又はサードライン局所進行性又は転移性非小細胞肺癌である。いくつかの実施態様では、癌は腺癌である。いくつかの実施態様では、癌は扁平上皮細胞癌腫である。いくつかの実施態様では、癌は、非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠芽腫、神経芽腫、メラノーマ、乳房癌腫（例えばトリプルネガティブ乳癌）、胃癌、結腸直腸癌（CRC）、又は肝細胞癌腫である。いくつかの実施態様では、癌は原発腫瘍である。いくつかの実施態様では、癌は、上記の癌タイプのいずれかに由来する第二の部位における転移腫瘍である。
【００８４】
いくつかの実施態様では、少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーは、以下から成る群から選択される方法を用いてサンプル中に検出される：FACS、ウェスタンブロット、ELISA、免疫沈澱、免疫組織化学、免疫蛍光、放射性免疫アッセイ、ドットブロッティング、免疫検出法、HPLC、表面プラズモン共鳴、分光分析法、質量分析法、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR又はRT-qPCR、RNA-seq、マイクロアレイ分析、SAGE、MassARRAY技術、及びFISH、並びに前記の組合せ。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーは、FACS分析を用いて検出される。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーは、血液サンプルにおいて検出される。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーは、血液サンプル中の循環腫瘍細胞において検出される。そのような細胞集団を単離/濃縮する任意の適切な方法を用いることができ、前記にはセルソーティング（前記に限定されない）が含まれる。いくつかの実施態様では、ある治療法、適切には免疫療法（例えば抗免疫チェックポイント分子抗体（その例示的な例には抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体が含まれる）を含むもの）による治療に応答する個体に由来するサンプルにおいて、PD-L1-263KAc発現が低下する。いくつかの実施態様では、PD-L1-263KAc発現は、ある治療法、適切には免疫療法（例えば抗免疫チェックポイント分子抗体（その例示的な例には抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体が含まれる）を含むもの）による治療に応答しないか又は弱く応答する個体に由来するサンプルにおいて上昇する。いくつかの実施態様では、PD-L1-263Me発現は、ある治療法、適切には免疫療法（例えば抗免疫チェックポイント分子抗体（その例示的な例には抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体が含まれる）を含むもの）による治療に応答しないか又は弱く応答する個体に由来するサンプルにおいて低下する。いくつかの実施態様では、PD-L1-263KMe発現は、ある治療法、適切には免疫療法（例えば抗免疫チェックポイント分子抗体（その例示的な例には抗PD-1抗体及び抗CTLA4抗体が含まれる）を含むもの）による治療に応答する個体に由来するサンプルにおいて上昇する。
【００８５】
本明細書で提供されるものはまた予測/予後診断方法及びキットであり、前記キットは、PD-L1-263KAcは核内でPD-L1結合パートナー（P300、DNMT1及びSETDB1から選択される）と共同局在し、さらにこの共同局在は、癌細胞のEMT及び治療法に対する耐性又は非応答性に少なくとも部分的に寄与するという決定に基づく。当該診断方法は適切には以下の工程を含む：（i）対象動物からサンプルを入手する工程、ここで、当該サンプルは癌細胞（例えばCTC）を含む；（ii）当該サンプルを、サンプル中のPD-L1-263KAcと結合する第一の抗原結合分子、及びサンプル中のPD-L1結合パートナーと結合する第二の抗原結合分子と接触させる工程；及び（iii）癌細胞の核おける第一及び第二の抗原結合分子の局在化を検出する工程、ここで、第一及び第二の抗原結合分子の癌細胞核内の局在化は、癌細胞が当該治療法に対し耐性の可能性の増加を有すること、癌患者が当該治療法に対しておそらく非応答者であること、癌患者が当該治療法で治療されないために選択されること、及び/又は当該患者の治療成果はおそらく負の治療成果であると予測されることを示す。
癌細胞核内のPD-L1-263KAc及びPD-L1結合パートナーの局在化は、任意の適切な局在化決定技術、例えばIHCによって実施することができる。前記IHCは、典型的には、抗PD-L1結合パートナー抗体とは異なる検出可能部分又は標識を有する抗PD-L1-263KAc抗体を用いる。いくつかの実施態様では、空間近接アッセイ（“近接アッセイ”とも称される）を利用し、前記アッセイを用いて、PD-L1-263KAc及びPD-L1結合パートナーとの間の複合体の形成を評価することができる。近接アッセイは“近接プロービング”の原理に依拠し、ここでは、分析物（典型的には抗原）は、複数の（例えば2つ以上、概ね2つ、3つ、又は4つ）結合因子又はプローブの同時発生結合によって検出される。前記プローブは、分析物との結合によって近接するとき（したがって“近接プローブ”）、シグナルを発生させる。
【００８６】
いくつかの実施態様では、近接プローブの少なくとも1つは、当該プローブの分析物結合ドメイン（又は部分）に連結された核酸ドメイン（又は部分）を含み、さらに、シグナル発生は、当該核酸分子及び/又は更なる機能性部分（他のプローブによって運ばれる）との間の相互作用が関与する。シグナル発生はプローブ間の相互作用に（より具体的には核酸又はそれらによって運ばれる他の機能性部分/ドメインによって）依存し、したがって、必要な2つ（又は3つ以上）のプローブの両方が分析物と結合したときにのみシグナルが発生し、それにより検出系に改善された特異性を与える。近接プロービングの概念は近年開発され、この原理に基づく多くのアッセイが今では当業界で周知である。
典型的には、近接アッセイを用いて、2つの特定のタンパク質（例えば、互いに結合するタンパク質、融合タンパク質、及び/又は近接して配置されるタンパク質）又はその部分が近接しているか否かを評価する。近接結合アッセイ（PLA）として知られ、本発明のいくつかの実施態様で用いられるそのような1つのアッセイは、問題の標的に結合された2つの抗体（異なる種で作製される）を特色とする（以下の論文（Nature Methods 3, 995-1000, 2006）の方法3を参照されたい）。PLAプローブ（固有のオリゴヌクレオチド鎖が結合された種特異的二次抗体）を続いて適当な一次抗体に結合させる。標的が近接する場合には、PLAプローブのオリゴヌクレオチド鎖は付加されたssDNA及びDNAリガーゼと相互作用し、したがってそれらは環状化されて、ローリングサークル増幅（RCA）により増幅され得る。高度にプロセッシブなDNAポリメラーゼ（例えばPhi29 DNAポリメラーゼ）が用いられるとき、環状DNA鋳型は何百倍も何千倍も長く複製され、結果として長さが数百ナノメーターから数ミクロンのssDNAを生じることができる（例えば以下を参照されたい：Angewandte Chemie International Edition, 2008, 47, 6330-6337）。増幅後、複製されたDNAを検出系により検出することができる。したがって、可視化されたシグナルは、問題の標的が近接していることを示す。これらのアッセイは、いくつかのDNA-抗体結合物とともに酵素（例えばDNAリガーゼ及びDNAポリメラーゼ）の使用を特色とする。
【００８７】
他の実施態様では、二重結合因子アッセイが用いられる。前記アッセイは、可撓性リンカーと結合させた迅速なオフ速度カイネティクスを有する2つのFabフラグメントから成る二特異性検出薬剤を利用する（Van dieck et al., 2014 Chemistry & Biology Vol.21(3):357-368）。原則として、二重結合因子は迅速なオフ速度カイネティクスを有するFabフラグメントを含むので、Fabフラグメントの一方だけがそのエピトープに結合する場合、当該二重結合因子は洗い流される（当該二重結合因子の両Fabフラグメントの同時協調結合が当該二重結合因子の解離を防ぎ、陽性染色/可視性をもたらす）。
国際公開WO2014/139980（本発明の実施に包含される）に開示された別のアプローチによれば、近接アッセイ及びツールが記載され、前記はビオチンリガーゼ基質及び酵素を利用して近接アッセイを実施する。前記方法は、サンプルの細胞性背景を維持しながら、標的分子及び近接性の検出を提供する。ビオチンリガーゼ（例えば大腸菌（E. coli）由来酵素）及びペプチド基質（例えば当該酵素のための基質）の使用は、FFPEサンプルにおけるタンパク質-タンパク質相互作用の鋭敏で特異的な検出を提供する。ビオチンリガーゼは、ビオチンの存在下で適当なペプチド基質を効率的にビオチン化することができ、さらに当該反応は、酵素が当該ペプチド基質と物理的に接触するときにのみ生じ得るので、ビオチンリガーゼ及び基質は、問題の標的をそれぞれ認識する2つの抗体に別々に結合され得る。
【００８８】
さらにまた、ある治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法）の薬力学活性をモニターする方法が本明細書で提供される。前記方法は、対象動物（当該対象動物は当該治療法で既に治療を受けている）から入手した癌細胞を含むサンプルで、本明細書に記載するようにPD-L1の区画内における位置、及び/又は少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー（例えばPD-L1-K263Ac及び/又はPD-L1-K263Me）及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5）のレベル又は量を決定し、さらに、対象動物から入手したサンプルの少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの参照比較発現レベルに基づく薬力学活性を提示する治療を決定することによって実施され、ここで、（1）適切なコントロール（例えば当該治療法暴露前の患者の癌細胞（PD-L1-K263Acを発現する））と対比して、癌細胞のPD-L1-K263Acの無変化のレベル及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの無変化のレベルは、当該治療法に対する無又は弱い薬力学活性を示す；（2）適切なコントロール（例えば当該治療法暴露前の患者の癌細胞）と対比して、癌細胞のPD-L1-K263Acの上昇したレベル及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの上昇したレベルは、当該治療法に対する無又は弱い薬力学活性を示す；（3）適切なコントロール（例えば当該治療法暴露前の患者の癌細胞）と対比して、癌細胞のPD-L1-K263Acの低下したレベル及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルは、当該治療法に対する有意又は強い薬力学活性を示す；（4）適切なコントロール（例えば当該治療法暴露前の患者の癌細胞）と対比して、癌細胞のPD-L1-K263Meの上昇したレベル及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの低下したレベルは、当該治療法に対する有意な又は強い薬力学活性を示す；及び（5）適切なコントロール（例えば当該治療法暴露前の患者の癌細胞）と対比して、癌細胞のPD-L1-K263Meの低下したレベル及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの増加レベルは、当該治療法に対する無又は弱い薬力学活性を示す。バイオマーカーの発現レベル及び/又は細胞組成は、本明細書に記載する1つ以上の方法によって測定され得る。
【００８９】
いくつかの実施態様では、1つ以上のバイオマーカー遺伝子、タンパク質の発現レベル及び/又は細胞組成を参照と比較することができ、前記参照は、治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法）を受けていない対象動物のサンプルを含むことができる。いくつかの実施態様では、参照は、治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法）を受ける前の同じ対象動物のサンプルを含むことができる。いくつかの実施態様では、参照は、治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法）を受けている他の対象動物の1つ以上のサンプルに由来する参照値を含むことができる。例えば、患者集団を治療し、少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーの発現レベルについて算術平均、代表値、又は中央値を全体として当該集団から作成することができる。ある集団に由来する、共有の特徴（例えば同じ癌タイプ及び/又は病期、又は共通治療法への暴露）を有する癌から得られたサンプルセットを、例えば臨床成果調査で吟味することができる。前記セットを用いて、それに対して対象動物のサンプルを比較し得る参照（例えば参照数）を誘導することができる。本明細書に記載する参照のいずれもPD活性をモニターするための参照として用いることができる。
【００９０】
本開示のある種の特徴は、サンプル中の1つ以上のバイオマーカー（例えば、mRNA及びタンパク質を含む遺伝子発現生成物）の発現レベルの測定に関する。いくつかの実施態様では、サンプルは癌細胞を含むことができる。いくつかの実施態様では、サンプルは、（例えば腫瘍を有する患者の）末梢血サンプルであり得る。いくつかの実施態様では、サンプルは腫瘍サンプルである。腫瘍サンプルは、癌細胞、リンパ球、白血球、間質、血管、結合組織、基底層、及び腫瘍に付随するに任意の他の細胞タイプを含むことができる。いくつかの実施態様では、サンプルは、腫瘍浸潤白血球を含む腫瘍組織サンプルである。いくつかの実施態様では、サンプルは、1つ以上の細胞タイプ（例えば白血球）を分離又は単離するために処理され得る。いくつかの実施態様では、サンプルは、細胞タイプを分離又は単離することなく用いられ得る。
腫瘍サンプルは、当業界で公知の任意の方法（生検、内視鏡検査、又は外科手順を含むがただし前記に限定されない）によって対象動物から入手できる。いくつかの実施態様では、腫瘍サンプルは、複数の方法、例えば凍結、固定（例えばホルマリン又は類似の固定液を用いる）、及び/又はパラフィンワックス包埋によって調製できる。いくつかの実施態様では、腫瘍サンプルは切片にすることができる。いくつかの実施態様では、新鮮な腫瘍サンプル（すなわち、上記に記載した方法によって調製されていないもの）を用いることができる。いくつかの実施態様では、腫瘍サンプルを溶液中でインキュベートすることによって調製し、mRNA及び/又はタンパク質の完全性を保存することができる。
【００９１】
いくつかの実施態様では、サンプルは末梢血サンプルであり得る。末梢血サンプルは、白血球、PBMCなどを含むことができる。末梢血サンプルから白血球を単離する当業界で公知の任意の技術を用いることができる。例えば、血液サンプルを引き出し、赤血球を溶解し、さらに、白血球ペレットを単離してサンプルに用いることができる。別の例では、密度勾配分離を用いて、赤血球から白血球（例えばPBMC）を分離することができる。いくつかの実施態様では、新鮮な末梢血サンプル（すなわち、上記に記載した方法によって調製されていないもの）を用いることができる。いくつかの実施態様では、末梢血サンプルは、溶液中でインキュベートすることによって調製し、mRNA及び/又はタンパク質の完全性を保存することができる。
【００９２】
いくつかの実施態様では、治療法に対する応答性は以下の任意の1つ以上を指すことができる：延命（全生存期間及び無増悪生存期間を含む）；客観的応答（完全応答又は部分応答を含む）をもたらす；又は癌の徴候若しくは症候の改善。いくつかの実施態様では、応答性は、癌患者における腫瘍のステータス（すなわち応答、安定化又は増悪）を決定する公開RECISTガイドラインセットの1つ以上の要件の改善を指すことができる。これらのガイドラインのより詳細な考察については以下を参照されたい：Eisenhauer et al., 2009, Eur J Cancer 45: 228-47；Topalian et al., 2012, N Engl J Med 366:2443-54；Wolchok et al., 2009, Clin Can Res 15:7412-20；及びTherasse et al., 2000, J. Natl. Cancer Inst. 92:205-16。応答性対象動物は、その癌が、例えばRECIST基準に基づいて1つ以上の要件に関して改善を示す対象動物を指すことができる。非応答性対象動物は、その癌が、例えばRECIST基準に基づいて1つ以上の要件に関して改善を示さない対象動物を指すことができる。
【００９３】
従来の応答基準は、本発明の治療薬剤の抗腫瘍活性の特徴付けには適切ではないかもしれない。本発明の治療薬剤は、最初の明白な放射線医学的増悪（新規病巣の出現を含む）に続く遅延した応答をもたらす傾向がある。したがって、新規病巣が出現する可能性を考慮し、放射線医学的増悪をその後の評価で確認できる、修正応答基準が開発された。したがって、いくつかの実施態様では、応答性は、免疫関連応答基準（irRC）にしたがってより多くの要件の1つの改善を指すことができる。例えば上掲書（Wolchok et al., 2009）を参照されたい。いくつかの実施態様では、新規病巣は定義した腫瘍負荷に加えられ、その後の評価で放射線医学的増悪に関して追跡される。いくつかの実施態様では、非標的病巣の存在は完全応答の評価に含まれ、放射線医学的増悪の評価には含まれない。いくつかの実施態様では、放射線医学的増悪は、測定可能な病状をベースにする場合にのみ決定され得るか、及び/又は、放射線医学的増悪は、最初の記録の日付から4週間以上の連続評価によって確認され得る。
いくつかの実施態様では、応答性は免疫活性化を含むことができる。いくつかの実施態様では、応答性は治療有効性を含むことができる。いくつかの実施態様では、応答性は免疫活性化及び治療有効性を含むことができる。
【００９４】
3．バイオマーカパネル
本発明のバイオマーカーを予測及び/又は予後診断試験に用いて、患者の治療法応答シグネチャーステータスを評価し、決定し、及び/又は定性化し（本明細書では互換的に用いることができる）、したがって患者の治療を指令することができる。“治療法応答シグネチャーステータス”という語句は、高治療法応答シグネチャー（RT高）及び低治療法応答シグネチャー（RT低）を含む。このステータスに基づいて、更なる手順（追加される試験又は治療手順又はレジメンを含む）を示すことができる。
これら及び他のバイオマーカーが本明細書で開示されるが、これらのバイオマーカーの組合せ、サブセット、相互作用、グループなどが開示され、その間、これら多様な化合物の個々の及び包括的な組合せ並びに並べ替えのそれぞれの具体的な言及が明白には開示されないときにも、本明細書では各々が意図されかつ記載されていることは理解されよう。したがって、バイオマーカーA、B及びCのパネルがバイオマーカーD、E及びFのクラスとともに開示され、さらに組合せパネルA−Dの例が開示される場合、たとえ各々が個々に列挙されなくても、各々は、個々にかつ包括的に組合せA−E、A−F、B−D、B−E、B−F、C−D、C−E、及びC−Fを意味することが意図されそれらが開示されたとみなされる。同様に、これらの任意のサブセット又は組合せもまた開示される。したがって、例えば、A−E、B−F及びC−Fのサブグループが開示されたとみなされよう。この概念は本出願の全ての局面（開示されるバイオマーカーの使用方法における工程を含むが、ただし前記に限定されない）に適用される。したがって、実施可能な種々の追加の工程が存在する場合、これらの追加の工程の各々は、開示された方法の任意の具体的な実施態様又は実施態様の組合せを用いて実施され得る。
【００９５】
治療法応答シグネチャーパネルは、適切にはPD-L1-K263Ac、PD-L1-K263Me、及び少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（適切には薬剤耐性及び/又はCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5から選択される疾病負荷と関連する）の1つ以上を含む。これらシグネチャーの非限定的な例は、PD-L1-K263Ac及びPD-L1-K263Meの一方又は両方、並びに以下のバイオマーカー組合せから選択される少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカー（（a）CD133；（b）CD133:ALDH1A；（C）CD133:ALDH1A:P300；（d）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1；（e）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（f）CD133:ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（g）ALDH1A；（h）ALDH1A:P300；（i）ALDH1A:P300:DNMT1；（j）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1；（k）ALDH1A:P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（l）P300；（m）P300:DNMT1；（n）P300:DNMT1:SETDB1；（o）P300:DNMT1:SETDB1:ABCB5；（p）DNMT1；（q）DNMT1:SETDB1；（r）DNMT1:SETDB1:ABCB5；（s）SETDB1；（t）SETDB1:ABCB5；及び（u）ABCB5）を含む。
治療に対する応答を正しく予測するアッセイ能力は、アッセイの感受性、アッセイの特異性又は受信者操作特性（“ROC”）曲線下の面積として通常のように測定される。感受性は試験によって陽性と予測される真の陽性のパーセンテージで、一方、特異性は試験によって陰性と予測される真の陰性のパーセンテージである。ROC曲線は1−特異性の関数として試験の感受性を提供する。ROC曲線下の面積が大きくなればなるほど、試験の予測値はより強力になる。試験の有用性の他の有用な測定は正の予測値及び負の予測値である。陽性予測値は、検査の結果が陽性で実際に陽性である人々のパーセンテージである。陰性予測値は、検査の結果が陰性で実際に陰性である人々のパーセンテージである。
該当する実施態様では、本発明のバイオマーカーシグネチャーは、種々の治療法応答ステータスで、少なくともp＜0.05、p＜10-2、p＜10-3、p＜10-4又はp＜10-5の統計的相違を示すことができる。これらのバイオマーカーを用いる予測又は予後診断試験は、少なくとも0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.8、又は少なくとも約0.9のROCを示すことができる。
【００９６】
ある種の実施態様では、バイオマーカーは、本明細書に記載の方法を用いて患者サンプルで測定され、治療法応答シグネチャーステータスが計算される。該当する実施態様では、当該測定を、関連する予測又は予後診断量、カットオフ、又は多変量モデルスコア（前記は、高治療法応答シグネチャー（RT高）ステータスを低治療法応答シグネチャー（RT低）ステータスから区別する）と比較することができる。当該予測又は予後診断量はバイオマーカー測定量を表し、前記の量より上又は下の患者は該当する治療法応答シグネチャーを有すると分類される。当業界ではよく知られていることであるが、アッセイで用いられる特定の予測又は予後診断カットオフを調節することによって、アッセイの感受性又は特異性を当業者の好みに合わせて高めることができる。該当する実施態様では、特定の予測又は予後診断カットオフは、例えば、種々の治療法応答シグネチャーステータスを有する患者に由来する統計的に有意な数のサンプルのバイオマーカーのレベル又は量を測定し、望ましいレベルの特異性及び感受性に適合するカットオフを引き出すことによって決定することができる。
【００９７】
さらにまた、ある種の実施態様では、あるバイオマーカーパネルのバイオマーカーについて測定される値は数学的に組み合わされ、当該組み合わされた値は、高又は低治療法応答シグネチャーの基本的な予測又は予後診断の問題と相関性を有する。バイオマーカーの値は当業界で公知の適当な数学的方法によって組合わせることができる。バイオマーカー組合せを疾患ステータスと相関させるための周知の数学的方法は、例えば以下の方法を利用する：判別分析（DA）（例えば線形DA、二次DA、正規化DA）、判別機能分析（DFA）、例えばカーネル（Kernel）法（例えばSVM）、多次元スケーリング（MDS）、非パラメトリック法（例えばK近傍分類）、PLS（部分的最小二乗）、ツリー型方法（例えばロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング/バギング法）、普遍化線形法（例えばロジスティック回帰）、主成分型方法（例えばSIMCA）、普遍化付加モデル、ファジィロジック型方法、ニューラルネットワーク及び遺伝的アルゴリズム型方法。適当な方法を選択して本発明のバイオマーカー組合せを評価する際に、当業者には何の問題もないであろう。ある実施態様では、本発明のバイオマーカー組合せを相関させる際に用いられる方法は以下から選択される：DA（例えば線形、二次、正規化判別分析）、DFA、カーネル法（例えばSVM）、MDS、非パラメトリック法（例えばK近傍分類）、PLS（部分的最小二乗）、ツリー型方法（例えばロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング法）、又は普遍化線形法（例えばロジスティック回帰）、及び主成分分析。これらの統計的方法に関する詳細は以下の文献で見出される：Ruczinski et al., 12 J. OF COMPUTATIONAL AND GRAPHICAL STATISTICS 475-511, 2003；Friedman, J. H., 84 J. OF THE AMERICAN STATISTICAL ASSOCIATION 165-75, 1989；Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics（2001）；Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A., Stone, C. J. Classification and regression trees, California: Wadsworth, 1984；Breiman, L., 45 MACHINE LEARNING 5-32, 2001；Pepe, M. S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28, 2003；及びDuda, R. O., Hart, P. E., Stork, D. G., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2nd Edition（2001）。
【００９８】
4．治療応答シグネチャーステータスを定性化する分類アルゴリズムの作製
いくつかの実施態様では、サンプル（例えば“既知サンプル”）を用いて作製されるデータを続いて用いて、分類モデルを“学習”させることができる。“既知サンプル”は、予め分類されてあるサンプルである。分類モデルを形成するために用いられるデータは、“学習用データセット”と呼ぶことができる。分類モデルを形成するために用いられる学習用データセットは、生データ又は予め処理されたデータを含むことができる。いったん学習すると、当該分類モデルは、既知サンプルを用いて作製されたデータのパターンを認識することができる。続いて当該分類モデルを用いて、未知のサンプルを複数のクラスに分類することができる。これは、例えば特定の生物学的サンプルがある種の生物学的状態と関連するか否かの予測で有用であり得る。  
分類モデルは、任意の適切な統計分類又は学習方法（データに存在する目的のパラメーターに基づいてデータ本体を複数のクラスに分離しようとする）を用いて形成できる。分類方法は教師ありのものでも教師なしのものでもよい。教師あり又は教師なし分類プロセスの例は以下に記載されている：Jain, “Statistical Pattern Recognition: A Review”, IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, No. 1, January 2000（前記の教示は参照によって本明細書に含まれる）。
教師あり分類では、既知カテゴリーの例を含む学習用データが学習メカニズムに提示され、学習メカニズムは既知クラスの各々の範囲を明確にする関係性の1つ以上のセットを学習する。続いて、新しいデータが当該学習メカニズムに適用され、当該メカニズムは続いてこの新しいデータを既に学習した関係性を用いて分類する。教師あり分類プロセスの例には以下が含まれる：線形回帰プロセス（例えばマルチ線形回帰（MLR）、部分的最小二乗（PLS）回帰及び主成分回帰（PCR）、二元性決定ツリー（例えば再帰分割プロセス、例えばCART）、人工ニューラルネットワーク、例えば逆伝播ネットワーク、判別分析（例えばベイズ分類器又はフィッシャー分析）、ロジスティック分類器、及びサポートベクタークラシファイアー（サポートベクターマシン）。
別の教師あり分類方法は再帰分割プロセスである。再帰分割プロセスは再帰分割ツリーを用いて未知サンプル由来のデータを分類する。再帰分割プロセスの更なる詳細は、米国特許出願No. 2002 0138208 A1（Paulse et al., “Method for analyzing mass spectra”）で提供される。
【００９９】
他の実施態様では、作製される分類モデルは教師なし学習を用いて形成できる。教師なし分類は、標的データセット内の類似性に基づいて分類を学習しようとし、学習用データセットが由来するスペクトルを予め分類することを必要としない。教師なし学習方法にはクラスター分析が含まれる。クラスター分析は、データを“クラスター”又はグループ（それらは互いに非常に類似するメンバーを有し、他のクラスターのメンバーとは非常に非類似であるはずである）に分割しようとする。続いて、類似性を何らかのディスタンスメトリック（データ体間の距離を測定する）を用いて測定し、互いにより近いデータ体をクラスターにまとめる。クラスター化技術には、マックィーンのK平均アルゴリズム及びコホネンの自己組織化マップアルゴリズムが含まれる。
生物学情報の分類で使用されると主張する学習アルゴリズムは例えば以下に記載されている：PCT国際公開No. WO 01/31580（Barnhill et al., “Methods and devices for identifying patterns in biological systems and methods of use thereof”）；米国特許出願公開No. 2002/0193950（Gavin et al., “Method or analyzing mass spectra”）；米国特許出願公開No. 2003/0004402（Hitt et al., “Process for discriminating between biological states based on hidden patterns from biological data”）；及び米国特許出願公開2003/0055615（Zhang and Zhang, “Systems and methods for processing biological expression data”）。
【０１００】
分類モデルは任意の適切なデジタルコンピュータで作製し前記で用いることができる。適切なデジタルコンピュータには、マイクロコンピュータ、ミニコンピュータ、又は大型コンピュータが含まれ、前記は任意の標準又は特殊化オペレーティングシステム、例えばユニックス、ウインドウズ（Windows(商標)）又はリナックス（Linux(商標)）系オペレーティングシステムを用いる。質量分析計を利用する実施態様では、使用されるデジタルコンピュータは、問題の関連連続物を作製するために用いられる質量分析計とは物理的に分離されるか、又は質量分析計と結合され得る。
本発明の実施態様の学習用データセット及び分類モデルは、デジタルコンピュータで実行されるか、又は前記によって用いられるコンピュータコードによって具体化され得る。コンピュータコードは任意の適切なコンピュータ読み出し可能媒体（光学又は磁気ディスク、スティック、テープなどを含む）に保存することができ、任意の適切なコンピュータプログラム言語（R、C、C++、ビジュアルベーシックなどを含む）で書き込むことができる。
上記に記載した学習アルゴリズムは、既に発見されたバイオマーカーのための分類アルゴリズムの開発、及び新規なバイオマーカーの発見の両方で有用である。分類アルゴリズムは、単独で又は組み合わせて用いられるバイオマーカーのための診断値（例えばカットオフ点）を提供することによって診断試験のための基礎を順次形成する。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載する分類方法のいずれも、少なくとも部分的に1つ以上のコンピュータによって実行でき、及び/又は非一時的コンピュータ媒体に保存することができる。いくつかの実施態様では、本明細書に開示する分類方法のいずれも、コンピュータ読み出し可能媒体（コンピュータ実行可能命令を有する）で少なくとも部分的に実行又は保存することができる。いくつかの実施態様では、コンピュータ読み出し可能媒体は、任意の非一時的及び/又は有形コンピュータ読み出し可能媒体を含む。
【０１０１】
5．抗体及び細胞株
本発明は、PTMバイオマーカー、特にPD-L1-K263Ac及びPD-L1-K263Meに特異的に結合する抗原結合分子を用いて、これらのバイオマーカーの局在化、検出及び定量化を開示する。そのような抗原結合分子は、典型的には単離されたアセチル化又はメチル化部位特異的抗原結合分子であり、前記分子はK263がそれぞれアセチル化又はメチル化されるときにのみPD-L1に特異的に結合する。そのような抗原結合分子は、標準的な抗体生成方法（例えば抗ペプチド抗体方法）により、本明細書で提供するアセチル化及びメチル化部位配列情報を用い、例えば実施例の記載にしたがって生成することができる。例えば、PD-L1-K263Ac又はPD-L1-K263Meに特異的に結合する抗体は、それぞれアセチル化又はメチル化残基を包含するアミノ酸配列の全部又は部分を含むペプチド抗原（例えば配列番号:3又は4に示される配列を含むペプチド抗原（PD-L1の263位のアセチル化又はメチル化（適切にはトリメチルリジン）リジンを包含する））で動物を免疫して、前記部位でアセチル化又はメチル化されたときのPD-L1にのみ結合する抗体を産生させることによって生成できる。
本発明のポリクローナル抗体は、標準的技術にしたがい、問題のタンパク質アセチル化又はメチル化部位に対応するペプチド抗原で適切な動物（例えばウサギ、ヤギなど）を免疫し、免疫血清を当該動物から収集し、さらにポリクローナル抗体を当該免疫血清から分離することによって標準的手順で作製することができる。263Kでアセチル化又はメチル化されたときにのみPD-L1に結合する抗体が所望される場合には、ペプチド抗原はリジンのアセチル化又はメチル化形（例えばそれぞれK(Ac)又はK(Me3)）を含む。263Kでアセチル化又はメチル化されていないときにのみPD-L1と結合する抗体が所望される場合には、ペプチド抗原はリジンの通常の非アセチル化型又は非メチル化型を含む。
本発明の抗体を生成するために適切なペプチド抗原は、周知の技術にしたがって設計、構築及び利用することができる。例えば以下を参照されたい：ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 5, p.75-76, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory（1988）；Czernik, Methods In Enzymology, 201: 264-283, 1991；Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:21-49, 1962。
【０１０２】
より長いか若しくは短いアセチルペプチド又はメチルペプチドも利用できることは、当業者には理解されよう。例えば、ペプチド抗原は配列番号:3又は4に示されるアミノ酸配列を含むことができ、又は当該抗原は当該配列にフランキングする追加のアミノ酸を含むことができ、又はアセチル化され得る若しくはメチル化され得るリジンに直接フランキングする開示配列の一部分のみを含むことができる。典型的には、所望されるペプチド抗原は、アセチル化され得る又はメチル化され得るアミノ酸の各側にフランキングし、かつ前記アミノ酸を包含する4つ以上のアミノ酸を含むであろう。本明細書の記載にしたがって生成されるポリクローナル抗体は、下記の更なる説明にしたがってスクリーニングできる。
本発明のモノクローナル抗体は、コーラーとミルシュタインの周知の技術にしたがってハイブリドーマ細胞で生成することができる。以下を参照されたい：Kohler and Milstein, Nature 265:495-97, 1975；Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976；さらにまた、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. Eds., 1989。そのようにして生成されたモノクローナル抗体は高度に特異性で、本発明によって提供される診断アッセイ方法の選択性及び特異性を改善する。例えば、適当な抗原を含む溶液をマウス又は他の種に注射し、十分な期間（通常の技術で維持した）後に、当該動物をサクリファイスし、脾臓細胞を得る。続いてミエローマ細胞と典型的にはポリエチレングリコールの存在下で当該脾臓細胞を融合させることによってそれらを不死化して、ハイブリドーマ細胞を作製する。例えばウサギ融合ハイブリドーマは、1997年10月7日発行の米国特許5,675,063号（C. Knight）の記載にしたがって作製され得る。続いて、ハイブリドーマ細胞を適切な選別培地（例えばヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT））で増殖させ、所望の特異性を有するモノクローナル抗体について上清をスクリーニングする。分泌された抗体を組織培養上清から通常の方法（例えば沈澱、イオン交換又はアフィニティクロマトグラフィーなど）によって回収することができる。
【０１０３】
モノクローナルFabフラグメントもまた、当業者に公知の組換え技術によって大腸菌で生成できる。例えば以下を参照されたい：W. Huse, Science 246:1275-81, 1989；Mullinax et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 87: 8095, 1990。1つのアイソタイプのモノクローナル抗体が特定の適用のために好ましい場合、特定のアイソタイプは、最初の融合物から選別することによって直接的に調製するか、又は種々のアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマからsib選別技術を用いてクラススイッチ変種を単離することによって二次的に調製することができる（Steplewski, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 82: 8653, 1985；Spira et al., J. Immunol. Methods, 74: 307, 1984）。
本発明のアセチル化部位特異的抗体又はメチル化部位特異的抗体の好ましいエピトープは、アセチル化され得る又はメチル化され得るリジンを含む約8から17のアミノ酸から本質的に成るペプチドフラグメントであり、ここで、約3から8つのアミノ酸はアセチル化され得るリジンの各側に位置し、したがって、本発明の抗体は、そのようなエピトープ配列を含む翻訳後修飾PD-L1ポリペプチドに特異的に結合する。本発明の抗体が結合する特に好ましいエピトープは、アセチル化され得る又はメチル化され得る部位の配列の全て若しくは部分（アセチル化され得る又はメチル化され得るアミノ酸を含む）を含む。
本発明の範囲内に含まれるものは、等価の非抗体分子、例えば、本発明のアセチル特異的又はメチル特異的抗原結合分子が結合するエピトープと本質的に同じアセチル化され得る又はメチル化され得るエピトープに、アセチル特異的又はメチル特異的態様で結合する抗原結合フラグメントである。例えば以下を参照されたい：Neuberger et al., Nature 312: 604, 1984。そのような等価の非抗体試薬は、以下でさらに説明する本発明の方法で適切に利用され得る。
【０１０４】
本発明で意図される抗原結合分子は、免疫グロブリン（IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを含む）を含む任意のタイプの抗体及びその抗原結合フラグメントであり得る。抗体はモノクローナル又はポリクローナル抗体でよく、さらに任意の種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ又はヒトを含む）起原でよく、又はキメラ抗体でもよい。例えば以下を参照されたい：M. Walker et al., Molec. Immunol. 26: 403-11, 1989；Morrision et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 81: 6851, 1984；Neuberger et al., Nature 312:604, 1984。抗体は、米国特許4,474,893号（Reading）又は米国特許4,816,567号（Cabilly et al.）に開示された方法にしたがって生成される組換えモノクローナル抗体でもよい。抗体はまた、米国特許4,676,980号（Segel et al.）に開示された方法にしたがって作製される特異抗体によって化学的に構築されてもよい。
本発明はまた、本発明の抗体を産生する不死化細胞株を提供する。例えば、上記の記載にしたがって構築されたハイブリドーマ（本明細書に開示したPD-L1アセチル化又はメチル化部位に対するモノクローナル抗体を産生する）もまた提供される。同様に、本発明は、本発明の抗体を産生する組換え細胞を含み、前記細胞は、例えば以下の周知技術によって構築され得る：モノクローナル抗体の抗原結合部位をPCRによってクローニングし、単鎖抗体をファージディスプレー組換え抗体又は可溶性抗体として大腸菌で生成することができる（例えば以下を参照されたい：ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor）。
【０１０５】
本発明のアセチル化又はメチル化部位特異的抗体は（ポリクローナル抗体であれモノクローナル抗体であれ）、標準的技術にしたがってエピトープ及びアセチル及びメチル特異性についてスクリーニングすることができる。例えば以下を参照されたい：Czemik et al., Methods in Enzymology, 201: 264-283, 1991。例えば、抗体は、ELISAによってアセチル及び非アセチルペプチドライブラリーに対してスクリーニングし、所望の抗原に対する特異性及び当該抗原のアセチル化又はメチル化（又は非アセチル化、非メチル化）形との専一反応性の両方について担保することができる。ペプチド競合アッセイを実施して、与えられたタンパク質アセチル化シグナリングタンパク質により他のアセチルエピトープとの反応性の欠如を確認することができる。抗体はまた、シグナリングタンパク質を含む細胞調製物（例えば標的タンパク質を過剰発現する細胞株）に対してウェスタンブロッティングによって試験し、所望のアセチル化エピトープ/標的との反応性を確認することができる。
所望のアセチル化又はメチル化エピトープに対する特異性もまた以下によって吟味することができる：アセチル化されることが判明している所望のエプトープの外側の位置にアセチル化され得る又はメチル化され得る残基を欠く変異体を構築するか、又は所望のアセチルエピトープ若しくはメチルエピトープを変異させて、反応性を欠くことを確認する。本発明のアセチル化又はメチル化部位特異的抗原結合分子は、非標的タンパク質の関連エピトープに対していくらかの限定的交差反応性を示し得る。このことは予想されないことではない。なぜならば、ほとんどの抗原結合分子はある程度の交差反応性を示し、抗ペプチド抗体は、当該免疫ペプチドに対して高い相同性を有するエピトープとはしばしば交差反応するからである。例えば上掲書（Czemik）を参照されたい。非標的タンパク質との交差反応性は、公知の分子量を有するマーカーと一緒のウェスタンブロッティングによって容易に特徴づけられる。交差反応性タンパク質のアミノ酸配列を吟味して、本発明の抗原結合分子が特異性を有するPD-L1-263Kに対して高度に相同性である部位を識別することができる。
【０１０６】
ある種の事例では、ポリクローナル抗血清は、アセチルリジン又はメチルリジン（適切にはトリメチルリジン）そのものといくらかの望ましくない普遍的交差反応を示すことがあり、前記は抗血清の更なる精製によって、例えばアセチルチラミン又はメチルチラミンカラムで除去することができる。本発明の抗原結合分子は、263Kにおいてアセチル化されたときにのみ又はメチル化されたときにのみ（又は場合に応じて、アセチル化されていないときにのみ又はメチル化されていないときにのみ）PD-L1と特異的に結合し、（当該抗原結合分子に特異的ではない形態と比較して）他の形態とは（実質的に）結合しない。
抗原結合分子は、正常な又は病的細胞若しくは組織を用いIHC染色により更なる特徴づけを実施して、PD-L1アセチル化若しくはメチル化及び病的細胞若しくは組織の治療法に対する応答を吟味することができる。IHCは周知の技術にしたがって実施することができる。例えば以下を参照されたい：ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 10, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988。簡単に記せば、パラフィン包埋組織（例えば腫瘍組織）を以下の工程によって免疫組織化学染色のために準備する：キシレンに続いてエタノールを用いて組織切片を脱パラフィンし；水に続いてPBSで水和し；クエン酸ナトリウム緩衝液中でスライドを加熱することによって抗原を露呈させ；過酸化水素中で切片をインキュベートし；遮断溶液中で遮断し；一次抗体及び二次抗体中でスライドをインキュベートし；最後に製造業者の指示にしたがってABCアビジン/ビオチン法を用いて検出する。
【０１０７】
抗原結合分子は、さらにまた標準的な方法にしたがって実施されるフローサイトメトリーによって特徴付けることができる。以下を参照されたい：Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 7205-238, 2001。簡単にかつ例示として記せば、サイトメトリー分析のために以下のプロトコルを利用することができる：サンプルをフィコールグラジエントで遠心分離して赤血球を除去できる。続いて、細胞を2％パラホルムアルデヒドで10分間、37°Cで固定し、その後90％メタノールで30分間氷上で透過処理することができる。続いて、本発明の一次アセチル化又はメチル化部位特異的抗原結合分子（それぞれPD-L1-K263Ac又はPD-L1-K263Meを検出する）で細胞を染色し、洗浄し、蛍光標識二次抗体で標識することができる。追加の蛍光色素結合バイオマーカー抗体（例えばCD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5）もまたこの時に添加して、細胞の間葉及び/又は幹性ステータスの識別を助けることができる。続いて、フローサイトメーター（例えばBeckman Coulter FC500）で使用装置の指定のプロトコルにしたがい細胞を分析することができる。
抗原結合分子は、抗間葉及び/又は幹性バイオマーカー抗体と一緒にマルチパラメーター分析で使用するために、有利には蛍光色素（例えばAlexa Fluor 488）に結合させることができる。
本発明のアセチル化又はメチル化部位特異的抗原結合分子は、開示部位（263K）でアセチル化又はメチル化されたときのみヒトPD-L1ポリペプチドに特異的に結合するが、ヒトの種とだけ結合するというわけではない。本発明は、ヒトアセチル化若しくはメチル化部位との結合に加えて、他の種（例えばマウス、ラット、サル、酵母）に由来するそれぞれのPTM PD-L1の、保存されかつ高度に相同な又は同一のアセチル化若しくはメチル化部位にもまた結合する抗原結合分子を含む。他の種で保存される高度に相同な又は同一の部位は、本明細書に開示するヒトPD-L1アセチル化及びメチル化部位との標準的な配列比較によって（例えばBLASTを用いて）容易に識別することができる。
【０１０８】
6．キット
本発明は、バイオマーカー（本明細書に開示する治療法応答バイオマーカー及び場合によって間葉及び/又は幹性バイオマーカーを含む）の発現を決定するためのキットに及び、前記キットは、当該バイオマーカーの検出及び/又は定量を可能にする試薬を含む。そのような試薬には、例えば化合物若しくは材料、又は化合物若しくは材料のセットを含み、前記は当該バイオマーカーの定量を可能にする。具体的な実施態様では、当該化合物、材料又は化合物若しくは材料のセットは、遺伝子（例えば間葉及び/又は幹性バイオマーカー遺伝子）の発現レベルの決定を許容し、前記には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：RNA材料の抽出、対応するRNAなどのレベルの決定、対応するcDNAの合成のためのプライマー、DNA増幅のためのプライマー、及び/又は当該遺伝子によってコードされるRNA（又は対応するcDNA）と特異的にハイブリダイズできるプローブ、TaqManプローブ、近接アッセイプローブ、リガーゼ、抗体など。
【０１０９】
キットはまた場合によって、標識の検出のために適当な試薬、陽性及び陰性コントロール、洗浄溶液、ブロッティング膜、マイクロタイタープレート、希釈緩衝液などを含むことができる。例えば、核酸系検出キットは、（i）間葉及び/又は幹性バイオマーカーポリヌクレオチド（陽性コントロールとして用いることができる）、（ii）間葉及び/又は幹性バイオマーカーポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプライマー及びプローブを含むことができる。さらに、核酸の増幅に適切な酵素を含むことができ、前記には以下が含まれる：多様なポリメラーゼ（逆転写酵素、Taq、シーケナーゼ（SequenaseTM）、DNAリガーゼなど（用いられる核酸増幅技術に左右される））、増幅に必要な反応混合物を提供するデオキシヌクレオチド及び緩衝剤。そのようなキットはまた、概ね、個々の試薬及び酵素の各々のためだけでなく各プライマー又はプローブのための別個の容器を含むであろう。また別には、タンパク質系キットは以下を含むことができる：（i）少なくとも1つのPD-L1ポリペプチド、前記は適切には、PD-L1-K263Ac、PD-L1-K263Me、K263Acを含むPD-L1-K263Acのフラグメント又はK263Meを含むPD-L1-K263Meのフラグメント、アセチル化又はメチル化されていないPD-L1ポリペプチド（陽性コントロールとして用いることができる）から選択される；（ii）PD-L1ポリペプチドに特異的に結合する1つ以上の抗原結合分子（PD-L1ポリペプチドは適切には、PD-L1-K263Ac、PD-L1-K263Me、及びアセチル化又はメチル化されていないPD-L1ポリペプチドから選択される）；（iii）CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5から選択される少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーポリペプチド又は前記のフラグメント；及び/又は（iv）CD133、ALDH1A、P300、DNMT1、SETDB1及びABCB5から選択される間葉及び/又は幹性バイオマーカーポリペプチドに特異的に結合する1つ以上の抗原結合分子。抗原結合分子は適切には検出できるように標識される。キットはまた、本明細書に記載のアッセイの1つを実施するための多様な（例えば1つ以上の）装置及び（例えば1つ以上の）試薬；及び/又はT細胞機能バイオマーカー遺伝子の発現の定量にキットを使用するための印刷指示説明書を特色とすることができる。本明細書に記載の試薬（場合によって検出可能な標識と結合させることができる）は、マイクロ溶液カード、チップ若しくはチャンバー、マイクロアレイ又はキットの様式で提示することができ、前記は、例又は下記に記載するアッセイ、例えばRT-PCR又は本明細書に記載のQ PCRを用いて使用するために適合される。
診断キットの成分を梱包するために適切な材料には、クリスタル、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、瓶、バイアル、紙、封筒などが含まれ得る。加えて、本発明のキットは、キットに収納されている種々の成分の同時、連続又は別々の使用についての指示説明書を含むことができる。指示説明書は、印刷物の形態であっても、又は対象者が読み出すことができるように指示を保存することができる電子的支持体（例えば電子的保存媒体（例えば磁気ディスク、テープなど））、光学媒体（CD-ROM、DVD）などの形態であってもよい。また別に或いは前記に加えて、媒体は、指示説明書を提供するインターネットアドレスを含むことができる。
【０１１０】
7．患者の分類及び治療の管理
本発明は、癌治療のために、ある治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法など）による治療に適当な候補者である個体を選別又は識別する方法に及ぶ。そのような個体には、異なる特徴（例えば治療法に対する非応答性）を有する他の患者と対比して、当該治療法に応答すると予測され、したがって当該治療の実施から利益を得る可能性が高い患者が含まれる。ある種の実施態様では、適当な候補者は、治療から利益を受ける可能性が合理的に高いか、又は治療のリスク及び副作用を考慮して利益を受ける可能性が治療の実施を正当化するために少なくとも十分に高い候補者である。本発明はまた、癌治療のために、ある治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法など）による治療に適当な候補者でない個体を選別又は識別する方法を包含する。そのような個体には、異なる特徴（例えば治療法に対する応答性）を有する他の患者と対比して、当該治療法に非応答又は弱く応答すると予測され、したがって当該治療の実施から利益を得る可能性が低い患者、又はそのような治療から利益を受ける可能性が低いか又は実質的に可能性が無く、したがって異なる若しくは追加の治療を使用することが所望され得る患者が含まれる。いくつかの実施態様では、対象者がある治療法による治療法のための適当な候補者であるか否かは、当該対象者又は当該対象者から得られたサンプルにおける少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーのアッセイに基づいて決定される。
【０１１１】
いくつかの特徴では、本明細書に記載される方法は、例えば少なくとも1つの治療法応答バイオマーカー及び場合によって少なくとも1つの間葉及び/又は幹性バイオマーカーのアッセイに基づいて、癌治療の必要がある対象者がある治療法（例えば細胞傷害療法又は免疫療法など）による治療に応答する可能性を決定する方法、及び/又はそのような治療を受けるべき対象者を識別及び/又は選別する方法である。具体的な実施態様では、当該治療法は、免疫療法、適切には抗免疫チェックポイント阻害剤による免疫療法である。“免疫チェックポイント阻害剤による治療”という語句はまた、“免疫チェックポイント阻害剤治療”、“免疫チェックポイント阻害剤による治療法”、又は“免疫チェックポイント阻害剤治療法”を指し、単一免疫チェックポイント阻害剤による治療に関する実施態様及び2つ以上の免疫チェックポイント阻害剤の併用による治療に関する実施態様を包含する。いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤治療は、単一薬剤を用いて、又は2つ以上の別々の薬剤を用いて2つ以上の異なる免疫チェックポイント経路を阻害することを含む。
本発明の理解を容易にし、さらに実際に効果を発揮させるために、以下の非限定的な例によって、詳細で好ましい実施態様がこれから説明されるであろう。
【実施例１】
【０１１２】
核PD-L1は重要な活性化ヒストンマークとともに局在する
PD-L1に対する市販抗体を用いて、本発明者らは、核PD-L1は、図1A、Bに示すように、転移結腸直腸癌、転移膵臓癌及び転移乳癌の患者サンプルから単離された間葉CTC及び薬剤耐性癌細胞（すなわち化学療法薬及び免疫療法薬）だけでなく、いくつかの乳癌細胞株に広まっていることを決定した。彼らはまた、核PD-L1がクロマチンと密接な関係を有するか否かを精査し、前記は活性化マークH3k27ac及びH3k4me3と強力に共同局在するが抑制性マークH3k9me3とは共同局在しないことを見出した（図1C）。
次に、本発明者らは、翻訳後修飾（PTM）がPD-L1の核への局在化（本明細書ではまた核PD-L1と称される）に役割を果たすか否かを調べ、特にアセチル化/メチル化モチーフについてPD-L1を吟味した。この分析は、リジン-263（K263）に有意に高いスコアのアセチル化/メチル化モチーフが存在することを明らかにし、前記は標準的な核局在配列（NLS）を含んでいた。
この分析に基づいて、NLS領域の野生型（WT）バージョンを有するLSD1及びNLSの2つの変異体型の発現のために個々のプラスミドを設計した。前記変異型のMut1は、リジンがグルタミンに置換（K263Q）されているアセチル化模倣物を含み、Mut2はリジンがアルギニンに置換（K263R）されているアセチル化又はメチル化できない残基を含む。興味深いことに、Mut1発現プラスミドは、PD-L1の局在化をWT PD-L1発現プラスミドよりも偏向させた（図2A）。
【実施例２】
【０１１３】
核PD-L1は間葉マーカー、幹性マーカー発現を駆動する
WT-PD-L1及びMut1-PDL1発現プラスミドのMCF7乳癌細胞株へのトランスフェクションは、薬剤耐性、幹性、間葉及びアグレッシブ癌シグネチャーを増加させ、当該上皮性細胞株を、より基底性、増殖低下を示す、トリプルネガティブ表現型（MDA-MB-231）に押しやる（図2B）。薬剤耐性癌幹細胞は、複数の耐性癌タイプに存在する、低下したほぼ休眠中の細胞周期を有する（Ebinger et al., 2016, Cancer Cell 30, 849-862）。これは、幹性、間葉性腫瘍細胞の休眠、治療耐性表現型の調節におけるPD-L1の重要性を示している。
間葉マーカー（例えばCSV、EGFR、SNAIL及びABCB5）の発現増加は間葉、薬剤耐性、幹様シグネチャーの証明であるので（Wang et al., 2016, Genes & Diseases, 2016, 3, 3e6；van der Toom et al., 2016, Oncotarget. 7(38), 62754-62766）、これらのマーカーの発現が本発明者らのPD-L1プラスミドトランスフェクションモデルで吟味された。前記試験は、Mut1構築物の発現（前記は核へのPD-L1の局在化を制限する）はCSV、CD133、EGFR及びSNAILの各々の発現を有意に増加させることを明らかにした（図3A、3B）。さらにまた、核PD-L1の発現はエピジェネティック酵素、例えばメチルトランスフェラーゼSETDB1、EHTM2及びDNMT1の発現を増加させることも見出された（図4A及び4B）。核PD-L1のSETDB1及びDNMT1発現に対する影響が提示されたので、SETDB1、ヒストンPTM H3k9me3及び一般的なDNA-メチル化（5-mC）のための酵素の読出しにおける影響を吟味することが決定された。驚くべきことに、MCF7細胞株の核PD-L1は、H3k9me3発現に対して最小限の影響を有するか又は全く影響を示さないことが見出され、SETDB1に対するタンパク質-タンパク質相互作用の役割が提唱された。対照的に、5-mC及び耐性マーカーABCB5はともに劇的に増加し、核PD-L1はこれらのエピジェネティック酵素をアグレッシブな癌で調節することができ、したがってDNAメチル化で役割を果たすことが示唆された（図５）。
【実施例３】
【０１１４】
抗PD-L1抗体は重要なリジンNLSモチーフを標的とする
次にカスタム抗体を設計してK263の非修飾型、トリメチル化（me3）型又はアセチル化型を含むNLSモチーフに対する抗体を作製し、アセチル化及びメチル化の核内標的誘導における役割を試験した。図6はELISAアフィニティ結合アッセイを表し、カスタム抗体は対応する抗体標的（すなわち非修飾K263（図6A）、アセチル化K263（図6B）又はメチル化K263（図6C））に特異的であることを示す。
この試験は、MDA-MB-231細胞において、263Kにてアセチル化されたPD-L1は核内に保持され核に拘束されるが、一方、263Kにてメチル化されたPD-L1は細胞質/細胞膜に拘束されることを明らかにした（図7A）。本発明者らはまた、透過処理されていないメラノーマサンプル及び転移乳癌（MBC）サンプルの両方で、アセチル化標的抗体及びme3標的抗体の表示を吟味した。彼らは、PD-L1-K263me3抗体はこれら細胞の細胞質を首尾よく標識できるが、PD-L1-K263Ac抗体は標識できないことを見出し、PD-L1のこのPTMの核内嗜好性が示された（図7B）。
これら抗体の特異性は、図8に示されるように、WT及びMut1プラスミドに対しても確認された。
【実施例４】
【０１１５】
PD-L1 K263はより高い疾病負荷で増加する
薬剤耐性、幹性（DRS）シグネチャーに特異的な抗体パネル（すなわち、抗CD133、抗PD-L1-K263Ac及び抗ABCB5）を用いて、種々のメラノーマ患者がある治療法に対して完全応答（CR）又は部分応答（PR）を有するか否か、及び彼らが安定病状（SD）又は増悪病状（PR）を有するか否かにしたがって彼らを階層化することができるか否かを調べた。この試験は、核PDL1-K263Acの発現増加は疾病負荷の増加と相関性を有すること、及びPDコホートはPDL1-K263Acの最高発現を示すことを明らかにした（図9A）。
本発明者らはまた、2人の患者を詳細に吟味し、DRSシグネチャーもまた薬剤又は耐性難治性疾患に対する応答性を予測できると決定した。注目すべきことには、当該結果はまた、CTCにおけるPD-L1-K263Acの低レベル発現は応答性表現型と関連付けられるが、PD-L1-K263Acの高レベル発現は耐性CTC表現型と強い相関性を表すことを示した（図10）。
加えて、PD-L1-K263Meの発現は、応答者のCTCサンプルと比較して耐性CTCサンプルにおいて有意に低下することが見出された（図11A）。
DRSシグネチャー抗体パネルはまた、進行した末期結腸直腸癌及び肺癌患者のCTCサンプルの吟味に用いられ、両症例でPD-L1-K263Acの高発現が存在することが見出された（図11B）。
【実施例５】
【０１１６】
PD-L1 K263Ac発現は薬剤耐性MBC細胞株で増加する
3つの薬剤耐性乳癌細胞株及びP-糖タンパク質ポンプメカニズムを標的とする薬剤で処理したナイーブコントロールをDRSシグネチャー抗体パネルでプローブし、PD-L1-K263Acは、薬剤耐性細胞株及びP-糖タンパク質ポンプメカニズム処理細胞の両方でアップレギュレートされることが見出された。これらの結果は、PD-L1は薬剤回避において役割を果たすことを示唆する（図12A）。DRSシグネチャーの有意な発現はまた、同じ抗体パネルを用いてIV期MBC患者由来のCTCで見出された（図12B）。
【実施例６】
【０１１７】
PD-L1 K263Acは疾病負荷の増加とともにP300と共同局在する
タンパク質の核局在化及び相互作用の制御におけるタンパク質アセチル化PTMの重要性のために、P300とPD-L1-K263Acとの間の相互影響もまた吟味され、強い結びつきが、薬剤耐性サンプル中のこれらのタンパク質間で見出された（図13）。P300とPD-L1-K263Acとの間の相互作用もまたMBC薬剤耐性株で試験され、P300は、耐性株での高発現とともにPD-L1-K263Acと強く共同局在することが見出された（図14）。P300の重要性を更に吟味するために、P300阻害剤で処理したMDA-MB-231細胞をDRSシグネチャー抗体パネルでプローブし、P300阻害剤の濃度が増加するにつれて、PD-L1-K263Ac増加は下降し、PD-L1-K263Meは上昇した（図15）。
【実施例７】
【０１１８】
核PD-L1はアグレッシブ性、薬剤耐性、間葉性トランスクリプトームシグネチャーを促進する
実施例1に記載のプラスミド構築物を上皮性乳癌細胞株（MCF7）にトランスフェクトして、PD-L1の核での役割及びエピジェネティックな役割を吟味した。この試験は、WT-PD-L1構築物は細胞質及び核の両方で作用を発揮するが、Mut1-PD-L1構築物は核でのみ作用を発揮することを示した。これらの相違を汎癌免疫チップ（免疫系及び癌に関連する700遺伝子を分析する）を用いてトランスクリプトームのナノストリング分析によって吟味し、どの転写物が変異体及びWT構築物のそれぞれによって有意にアップレギュレートされるかを識別した。核PD-L1発現によって有意にアップレギュレートされる遺伝子は図16に示される。
次に、RECIST 1.1に関して免疫療法応答者又は耐性者コホートのメラノーマ血液から単離したCTCを、CSV、NODAL又はCSV及びCCL5から成る間葉性、免疫療法耐性シグネチャーに特異的な抗体パネルでスクリーニングした。注目すべきことに、PD-L1の過剰発現によってNODAL及びCCL5はともに高度にアップレギュレートされ、図17に提示した結果は、これらタンパク質もまた免疫療法耐性患者コホートで有意にアップレギュレートされることを示している。CSVはCTCのためのマーカーとして含まれていた。これは、PD-L1構築物のトランスクリプトーム作用と免疫療法耐性メラノーマ患者由来CTCに存在するメカニズムとの間の強い相関性を示している。
核PD-L1モデルに関する提唱メカニズム
何れの特定の理論又は作動態様にも拘束されないが、本発明者らは、PD-L1は癌細胞の核のクロマチンと結びついて、転写抑制性複合体及び転写を活性化する複合体の両方を形成すると提唱する。この考えは、実施例7で考察したナノストリング分析によって裏付けられる（前記分析は、間葉、幹様耐性タンパク質のアップレギュレーション及び抗腫瘍遺伝子のダウンレギュレーションを示す（図18参照））。
【実施例８】
【０１１９】
高処理顕微鏡検査は、PD-L1 K263-Ac陽性CTCはより高い疾病負荷患者コホートのメラノーマで有意に増加することを明らかにした
ASI mIFデジタル病理学システム（Applied Spectral Imaging 5315, Avenida Encinas, Suite 150 Carlsbad, CA 92008, USA）を用いて、本発明者らは、重要な化学物質耐性、幹様シグネチャーをPD-L1-Acでメラノーマ患者サンプルにおいて試験した。注目すべきことに、彼らは、これらのバイオマーカーの発現は、疾病負荷とともに増加すること（図19A）、及びPDコホートは、幹様マーカーCD133及び化学物質耐性幹様マーカーABCB5と一緒にPD-L1-K263Acの最高の発現を示すことを見出した（図19B）。CRコホートは、PD-L1-K263Ac+/CD133+/ABCB5+を発現する全CTCのうち約2％を有することが見出された。これはPRで約5％、SDで19％に増加したが、この増加は有意ではなかった。驚くべきことに、最高の疾病負荷を有するPD患者のCTC集団％は約96％に増加することが明らかにされ、これは他の全てのコホートよりも顕著に高かった。したがって、PD-L1-K263Ac+/CD133+/ABCB5の％集団は、増加及び増悪病状の両方を明らかにし、さらにまた用いられる特定の治療法に対して患者が応答性又は耐性であるか否かを全体的CTC集団数に基づいて示すことができる。
材料と方法
循環腫瘍細胞の単離
転移メラノーマ生検をロゼットセップ（RosetteSepTM）法を用いて予め濃縮し、ロゼットセップヒトCD45枯渇キット(15162, Stemcell Technologies)を利用し、CD45+細胞を除去し、密度勾配遠心分離を用いて赤血球を除去してCTCを単離した。密度勾配遠心分離には、セップメイト-15（SepMateTM-15）（IVD）密度勾配チューブ（85420, Stemcell Technologies）及びリンホプレップ（LymphoprepTM）密度勾配メジウム（07861, Stemcell Technologies）を用いた。続いて、濃縮細胞をポリリジン前処理カバースリップ上でサイトスピンし、その後染色のためにPBS中で保存した。
免疫蛍光顕微鏡検査
顕微鏡検査のための細胞を1％トリトンX-100で20分間インキュベートして透過処理した。細胞を以下を含む種々の抗体でプローブした：ウサギ又はヤギ抗PDL1、マウス抗H3K27ac、H3k4me3又はH3k9me3。マウス抗CSV、ウサギ抗EGFR、ヤギ抗SNAIL。ウサギ-EHTM2、マウス抗DMNTI、ヤギ抗SETDB1。我々のカスタム-ウサギ宿主PDL1-263k-Ac、PDL1-263k-me3又はPDL1-263k。マウス抗5-mC、マウス抗CD133、ヤギ抗ABCB5又はマウス抗P300。その他に、マクロファージマーカーヤギ抗F4/80又はマウス抗CD38若しくはCD206。アグレッシブ、転移シグネチャーのマーカーはまたヤギ抗Nodal及びヤギ抗CCL5を含んでいた。一次抗体は、Alexa Fluor 488結合ロバ抗ウサギ二次抗体、抗マウス二次抗体568又は抗ヤギ二次抗体647を用いて可視化された。カバースリップは、ガラスの顕微鏡スライド上に試薬（ProLong Diamond Antifade reagent（Life Technologies））を用いてマウントさせた。タンパク質標的の場所は、共焦点レーザー走査顕微鏡検査によって突き止められた。LAXソフトウェアを使用し100ｘ油浸レンズ付きライカDM18顕微鏡を用いて、0.5μmの単一切片を得た。同じ切片の4枚の連続画像の平均化によって最終画像を得た。イメージJソフトウェア（ImageJ software（ImageJ, NIH, Bethesda, MD, USA））を用いてデジタル画像を分析し、合計核蛍光強度（TNFI）、合計細胞質蛍光強度（TCFI）のどちらかを決定した。マン-ホイットニーノンパラメトリック検定(GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA)を用いてデータセット間の有意差を決定した。
【０１２０】
共同局在化
イメージJソフトウェアを自動閾値化及び細胞核に特異的な関心領域の（ROI）手動選別と共に用いて、各抗体対のピアソン係数相関（PCC）を計算した。PCC値は、-1＝共同局在化の反対から、0＝共同局在化無し、+1＝完全な共同局在化の範囲である。合計核蛍光強度はまた、各サンプルセットについて最小限n＝20細胞で測定された。核強度はイメージJソフトウェアを用いて分析し、各細胞の核及びソフトウェアによって計算される合計核蛍光マイナスバックグラウンドを用いた。マン-ホイットニーノンパラメトリック検定(GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA)を用いてデータセット間の有意差を決定した。
細胞培養
用いた全ての乳癌細胞株はATCCから供給されたが、ただしドセタキセル耐性株はDr Sikic（Standford University）から贈与された。細胞株は、10％ FBS、2mM L-グルタミン及び1％ PSNを補充したDMEM（Invitrogen）で維持及び培養された。MCF-7細胞は、1.29ng/mLのホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）（Sigma-Aldrich）又は5ng/mLの組換えTGF-β1（R&D Systems）で60時間刺激された。
PD-L1-WT、PD-L1-K263Ac及びPD-L1-K263Me3抗体の作製
抗体はペプチド2803201、2803204及び2803213に対して作製された(表1)。短いペプチドは一般的に自分自身の能力では免疫原性ではないので、しばしばそれらを免疫原性担体タンパク質と結合させることが必要である。この結合を促進するために、システインをペプチドのC-末端に取り込んで、当該ペプチドを免疫原性担体タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）と結合させるために反応させた。抗トリメチル化又は抗アセチル化ペプチド抗体の作製のために特別な免疫プロトコルは必要とされなかった。各ペプチド配列について2匹のウサギを数週間離して免疫した。最初の免疫は当該ペプチド結合物をフロイントの完全アジュバントと一緒に用い、2回目はフロイントの不完全アジュバントを用いた。強力な抗ペプチド血清が、数週間後に得られる（以下を参照されたい：Palfreyman, et al. (1984) J Immunol Meth, 75:383）。
【０１２１】
表1：抗体作製に用いられたペプチド配列
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トリメチル化及びアセチル化ペプチド抗血清の試験は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて実施された（前記アッセイでは、非トリメチル化ペプチド及びトリメチル化ペプチド又は非アセチル化及びアセチル化ペプチド被覆マイクロタイタープレートで血清は滴定される）。
抗体増強は、免疫のために用いたペプチドの非トリメチル化、非アセチル化アナローグを利用可能なシステイン残基を用い、ゲル、スルホリンクカップリング樹脂（Sulfo Link Coupling Resin（Thermo Scientific, Catalogue number 20401））に製造業者の指示にしたがい結合させることによって実施される。得られたゲルを適量の抗血清とインキュベートして、非トリメチル化、非アセチル化ペプチド特異抗体を吸着させる。得られた抗血清は、トリメチル化ペプチド又はアセチル化ペプチド配列に対して増強された特異性を有するであろう。
トリメチル化又はアセチル化ペプチドにのみ特異的なアフィニティ精製抗体を作製するためには、最初に増強手順を実施して、非トリメチル化及び非アセチル化ペプチドに特異的な血清を抗体から除去することが必要である。アフィニティ精製抗体の特異性は、非トリメチル化及びトリメチル化ペプチド又は非アセチル化及びアセチル化ペプチド被覆プレートの両方でELISAによって試験される。作製された抗体は、残基263でトリメチル化されたPD-L1及びアセチル化されたPD-L1に対して高い特異性を示した。
【０１２２】
4T1マウスモデル
マウス当たり合計2ｘ105細胞を乳腺に50μLのPBSで注射した。4T1細胞の接種後15日で処置を開始した。処置グループは以下のとおりである：A−コントロール、B−30mg/kgアブラキサン。ノギスを用いて腫瘍を測定し、腫瘍体積（mm3）は公式（長さｘ幅の二乗）を用いて計算した。腫瘍は外部ノギスを用いて測定し、修正楕円体公式（1/2(a/b2)（式中a＝最長経、b＝最短経））を用いて計算した。処置開始前、およそ50mm3まで腫瘍を増殖させた(およそ15日)。全ての処置をアブラキサン(30mg/kg)のIP注射によって実施した。腫瘍を摘出し、2.5％FCS補充DMEMに収集した。続いて、メスを用いて腫瘍を細切し、DMEM 2.5％FCS及びコラゲナーゼタイプ4（Worthington-Biochem）（コラゲナーゼ1mg/腫瘍1mg）中で37°C、1時間インキュベートした。消化腫瘍を遠心分離し、DMEM 2.5％FCSに再懸濁した後、0.2μmフィルターを通して蛍光顕微鏡検査に用いた。
【０１２３】
ASIシステム法（高処理高解像顕微鏡検査）
ASIのmIFシステムは、多岐にわたる免疫蛍光サンプルのための汎用スキャン及び分析システムである。前記は、DAPI及び6抗体までの染色スライドをスキャンし、自動蛍光除去、フィルター間のアンミキシングの解決、及び獲得データに基づく細胞ベース分析のために設計された。タッチ細胞は自動的に区分けされ、シグナル発現は定量的に測定され、細胞毎及び全スキャン領域にわたる結果が表示される。以下を含む多様な自動化及び半自動化スキャンモードが支援される：
1．懸濁サンプルについての有効密度に基づくスキャン−最速細胞スコアリングのために細胞集団に基づいてサンプルをスキャンする；
2．選択領域/エリアをスキャンする；及び
3．関心のある特定の場所を相互スキャンする。
全てのモードで、抗体の共同局在化を示す何千、何万もの細胞の完全な統計を数分で得ることができる。3Dスタッキング、自動露光、自動焦点及び他の画像化パラメーターは各スキャンの固有部分である。これらの画像を用いて、平均核蛍光強度（NFI）又は全体的蛍光強度（FI)が決定された。規定領域内の細胞総数は、細胞を自動的に選別し蛍光強度を測定するために用いられる自動化ステージ及びASIソフトウェアを用いて計測された。続いて、得られたデータを利用して、合計細胞集団の％として表されるCTC集団ダイナミクスが計算された。
本明細書に引用する全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は参照によってその全体が本明細書に含まれる。
本明細書のいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の“先行技術”として利用可能であることを容認するものと解釈されてはならない。
本明細書を通して、その目的は、本発明をいずれか1つの実施態様又は特定の特色の集合に限定することなく、本発明の好ましい実施態様を説明することである。したがって、本開示に照らして、具体化された該当する実施態様で本発明の範囲から離れることなく多様な修正及び変更を実行できることは当業者には理解されよう。全てのそのような修正及び変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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