(57)【要約】  本明細書では、Ｇ３Ｐを３ＰＧ（例えば、B. methanolicus  gapN）および／またはフルクトース−１，６−ビスホスファターゼに変換することができるＮＡＤＨ依存性酵素、ならびに／またはヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロースイソメラーゼ、ホスホケトラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む合成メチロトロフィーを有するものを含む、組換え細胞を記載する。本開示の組換え細胞はリン酸化されたＣ３および／またはＣ４化合物の適切なプールサイズを有益に維持し、そして／またはＮＡＤＰＨの増加したレベルを提供する。そのようなものとして、改変はＣ１（例えば、メタノール供給原料）およびＣ５化合物からのＣ６化合物の生成、炭素転位によるＣ６化合物からのＣ５化合物の再生、ならびにＣ５化合物の再生とより低い解糖との間の改善されたバランスを可能にする。次に、これにより、組換え微生物はバイオプロダクト経路で使用することができる十分な量の代謝前駆体（例えば、アセチルＣｏＡ）を生成することができ、操作された細胞は、所望のバイオプロダクトの生成を可能にするこれらの経路酵素に対するさらなる改変を含むことができる。
2021528977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成または増強されたメチル栄養を有する組換え微生物であって、
（ａ）外因性酵素Ａと、
（ｂ）外因性酵素Ｂと、
を含み、
前記外因性酵素Ａは、
（ａｉ）グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換することができるか、
（ａｉｉ）配列番号１（B. methanolicus  gapN）と少なくとも５０％の配列同一性を有するか、または
（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであり、
ここで、前記（ａｉ）または（ａｉｉ）の外因性酵素Ａの場合には、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができ、
前記外因性酵素Ｂは、
（ｂｉ）ホスホケトラーゼであるか、
（ｂｉｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、
（ｂｉｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、または
前記（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組み合わせである、
組換え微生物。
【請求項２】
（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂｉ）外因性ホスホケトラーゼを含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
（ａ）外因性酵素Ａを含むとともに、（ｂｉ）外因性ホスホケトラーゼ、（ｂｉｉ）外因性ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、および（ｂｉｉｉ）外因性６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼを含む、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
（ａ）外因性酵素Ａ、および（ｂｉｉ）外因性ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、ならびに（ｂｉｉｉ）外因性６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼを含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
外因性酵素を含む組換え微生物であって、
前記外因性酵素は、
（ｉ）グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換することができるか、または
（ｉｉ）配列番号１（B. methanolicus  gapN）と少なくとも５０％の配列同一性を有し、
酵素Ａは、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができ、
（ｂ）外因性酵素Ｂであって、外因性酵素Ｂが、（ｂｉ）ホスホケトラーゼ、（ｂｉｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、（ｂｉｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、または（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組み合わせである。
【請求項６】
グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換することができる前記外因性酵素（外因性酵素Ａ）か、配列番号１（B. methanolicus  gapN）と少なくとも５０％の配列同一性を有する前記外因性酵素（外因性酵素Ａ）か、または、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼである前記外因性酵素（外因性酵素Ａ）は、Bacillus、Virgibacillus、およびLentibacillusからなる群より選択される生物由来である、先述の請求項のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記外因性酵素ＡがBacillus由来である、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記外因性酵素Ａが、前記（ａｉｉ）の外因性酵素であり、配列番号１（B. methanolicus gapN）と少なくとも６０％の配列同一性を有する、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記外因性酵素Ａが、配列番号１（B. methanolicus  gapN）と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記ホスホケトラーゼが、
（１）外因性フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼであるか、
（２）外因性キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼであるか、または
前記（１）および（２）の両方である、
請求項１〜３および６〜９のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記外因性ホスホケトラーゼが、Bifidobacterium、Leuconostoc、Clostridium、Aspergillus、およびLactobacillusからなる群より選択される生物に由来する、
請求項１〜３および６〜１０のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記ホスホケトラーゼは、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼであり、
前記組換え微生物が、さらに、
（ａ）ホスホトランスアセチラーゼ、または
（ｂ）アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセチルＣｏＡシンテターゼ、またはアセチルＣｏＡリガーゼ
を含む、
請求項１〜３および６〜１１のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記ホスホケトラーゼは、キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼであり、
前記組換え微生物が、さらに、
（ａ）ホスホトランスセチラーゼ、または
（ｂ１）酢酸キナーゼ欠失、および（ｂ２）アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、またはアセチル−ＣｏＡリガーゼ、
を含む、
請求項１〜３および６〜１２のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記ヘキスロース−６−リン酸シンターゼが、Bacillus、Methylomonas、Mycobacterium、Methylobacillus、Aminomonas、Methylovorus、およびGeobacillusからなる群より選択される生物由来である、
請求項１、３、４、および６〜１３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記ホスホケトラーゼが、配列番号２（Bacillus methanolicus  MGA  HPS）と５０％以上の同一性を有するヘキスロース−６−リン酸シンターゼを含む、
請求項１、３、４、および６〜１４に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼが、Bacillus、Methylomonas、Mycobacterium、Methylobacillus、Methylovorus、およびGeobacillusからなる群より選択される生物由来である、
請求項１、３、４、および６〜１３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１７】
前記６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼが、配列番号３（Bacillus methanolicus  MGA3  PHI）と５０％以上の同一性を有する、
請求項１、３、４、６〜１３および１６のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１８】
ＮＡＤ＋−依存性メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を含む、
請求項１〜１７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１９】
前記ＮＡＤ＋−依存性ＭＤＨが、非天然ＭＤＨである、
請求項１８に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
前記ＮＡＤ＋−依存性ＭＤＨは、Bacillus由来である、
請求項１９に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記ＭＤＨが、
Bacillus methanolicus MGA3（配列番号４）、または
Bacillus methanolicus PB1メタノールデヒドロゲナーゼ
に対して、４５％以上、６５％以上、８５％以上、または９５％以上の配列同一性を有する、
請求項１８〜２０のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２２】
ｘｙｕｌｏｓｅ−５−リン酸（Ｘｕ５Ｐ）からフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）への経路、または
リブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）からＦ６Ｐへの経路を含む、
請求項１〜２１のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２３】
Ｘｕ５ＰまたはＲｕ５ＰからＦ６Ｐへの前記経路が、ジヒドロキシアセトンシンターゼおよびフルクトース−６−リン酸アルドラーゼをさらに含む、
請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
酵素Ａは、（ａｉｉｉ）外因性フルクトース−１，６−ビスホスファターゼである、
請求項１〜２３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２５】
フルクトース−１，６−ビスホスファターゼには、セドヘプツロース−１，７−ビホスファターゼ活性も有する、
請求項２４に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
（ａ）グリセルアルデヒド−３−リン酸からホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に至る経路における内因性酵素活性を減弱または排除する、１つ以上の修飾を含む、
請求項１〜２５のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２７】
（ａ）グリセラルアルデヒド−３−リン酸を１，３−ビスホスホグリセライトに変換する内生的なＮＡＤ依存性グリセラルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を減衰または排除する、１つ以上の修飾を含む、
請求項１〜２６のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２８】
（ａ）１，３−ビスホスホグリセリン酸を３−ホスホグリセリン酸に変換する内因性ホスホグリセリン酸キナーゼ活性（ｐｇｋ）を減弱または排除する、１つ以上の修飾を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２９】
（ａ）３−ホスホグリセリン酸を２−ホスホグリセリン酸に変換する内因性ホスホグリセリン酸ムターゼ活性を減弱または排除する、１つ以上の修飾を含む、
請求項１〜２８のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項３０】
（ａ）２−ホスホグリセリン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する内因性エノラーゼ活性を減弱または排除する、１つ以上の修飾を含む、
請求項１〜２９のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項３１】
ｇａｐＡ、ｐｇｋ、ｇｐｍＡ、ｇｐｍＭ、またはｅｎｏに１つ以上の欠失または変異を含む、
請求項２６〜３０のいずれかに記載の非組換え微生物。
【請求項３２】
グリセラルデヒド−３−リン酸およびセドヘプタロース−７−リン酸を、エリトロース−４−リン酸およびフルクトース−６−リン酸に変換する内因性トランスアルドラーゼ活性を減衰または排除する修飾をさらに含む、
請求項１〜３１のいずれかに記載の非組換え微生物。
【請求項３３】
トランスアルドラーゼ活性を減弱または排除する修飾が、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ、およびｔａｌＣのうちの少なくとも１つをコードする核酸に対する欠失または突然変異である、
請求項３２に記載の組換え微生物。
【請求項３４】
Ｄ−フルクトース６−リン酸をフルクトース１，６−ビスリン酸に変換する内因性ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼを減弱または排除する修飾をさらに含む、
請求項１〜３３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項３５】
トランスアルドラーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ｐｆｋＡをコードする核酸に対する欠失または突然変異である、
請求項３４に記載の組換え微生物。
【請求項３６】
Ｄ−フルクトース６−リン酸をフラクトース２，６−ビスリン酸に変換する外因性ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼをさらに含む、
請求項１〜３５のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項３７】
前記ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼが、Bacillus methanolicus  PB1  pfk2（配列番号５）に対して５０％以上の配列同一性を有する、
請求項３６に記載の組換え微生物。
【請求項３８】
Ｄ−リブロース５−リン酸をＤ−キシルロース５−リン酸に変換する内因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼを減弱または排除する修飾をさらに含む、
請求項１〜３７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項３９】
前記リブロース−リン酸３−エピメラーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ｒｐｅをコードする核酸に対する欠失または突然変異である、
請求項３８に記載の組換え微生物。
【請求項４０】
Ｄ−フルクトース６−リン酸をフルクトース２，６−ビスリン酸に変換する外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼをさらに含む、
請求項１〜３９のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項４１】
前記リブロース−リン酸３−エピメラーゼが、Bacillus methanolicus  MGA3  rpe（配列番号６）に対して３０％以上の配列同一性を有する、
請求項４０に記載の組換え微生物。
【請求項４２】
リボース−５−リン酸をリブロース５−リン酸に変換する内因性リボース−５−リン酸イソメラーゼを減弱または排除する修飾をさらに含む、
請求項１〜４１のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項４３】
リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ｒｐｉＡをコードする核酸に対する欠失または突然変異である、
請求項４２に記載の組換え微生物。
【請求項４４】
リボース−５−リン酸をリブロース５−リン酸に変換する外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼをさらに含む、
請求項１〜４３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項４５】
前記リボース−５−リン酸イソメラーゼが、Bacillus methanolicus  MGA3  rpiB（配列番号７）に対して３０％以上の配列同一性を有する、
請求項４４に記載の組換え微生物。
【請求項４６】
セドヘプツロース７−リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を、Ｄ−リボース５−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸に変換する内因性トランスケトラーゼを減弱または排除する修飾をさらに含む、
請求項１〜４５のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項４７】
リボース−５−リン酸イソメラーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ｔｋｔＡをコードする核酸、ｔｋｔＢをコードする核酸、またはその両方に対する欠失または突然変異である、
請求項４６に記載の組換え微生物。
【請求項４８】
セドヘプツロース７−リン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を、Ｄ−リボース５−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸に変換する外因性内因性トランスケトラーゼをさらに含む、
請求項１〜４７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項４９】
前記トランスケトラーゼが、Bacillus methanolicus  PB1  tkt（配列番号８）に対して５０％以上の配列同一性を有する、
請求項４８に記載の組換え微生物。
【請求項５０】
ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）をグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）で変換してフルクトース１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）を形成するフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼを減弱または排除する修飾をさらに含む、
請求項１〜４９のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項５１】
フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ｆｂａＡコードする核酸、ｆｂａＢコードする核酸、またはその両方に対する欠失または変異である、
請求項５０に記載の組換え微生物。
【請求項５２】
ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）をグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）で変換してフルクトース１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）を形成する外因性内因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼをさらに含む、
請求項１〜５１のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項５３】
前記フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼが、Bacillus methanolicus  PB1  fba2（配列番号９）に対して５０％以上の配列同一性を有する、
請求項５２に記載の組換え微生物。
【請求項５４】
グルコース６−リン酸の６−ホスホグルコノラクトンへの酸化を触媒するグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ活性、または２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸（ＫＤＰＧ）をピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸に変換する２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸（ＫＤＰＧ）アルドラーゼを減弱または除去する修飾を含む、
請求項１〜５３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項５５】
グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ｚｗｆ遺伝子に対する欠失または突然変異である、
請求項５４に記載の組換え微生物。
【請求項５６】
グルコース６−リン酸から６−ホスホグルコノラクトンへの酸化を触媒する外因性内因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ活性をさらに含む、
請求項１〜５５のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項５７】
前記外因性内因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ活性が、Bacillus methanolicus  MGA3  zwf2（配列番号１０）に対して５０％以上の配列同一性を有する、
請求項５６に記載の組換え微生物。
【請求項５８】
メチルグリオキサールシンターゼ活性を減弱または排除する修飾をさらに含む、
請求項１〜５７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項５９】
トランスアルドラーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ｍｇｓＡをコードする核酸に対する欠失または突然変異である、
請求項５８に記載の組換え微生物。
【請求項６０】
デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を減弱または排除する修飾を含む、
請求項１〜５９のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項６１】
デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ｄｅｏＣ遺伝子に対する欠失または突然変異である、
請求項６０に記載の組換え微生物。
【請求項６２】
アセテートキナーゼ活性を減弱または排除する修飾をさらに含む、
請求項１〜６１のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項６３】
トランスアルドラーゼ活性を減弱または排除する前記修飾が、ａｃｋＡをコードする核酸に対する欠失または突然変異である、
請求項６２に記載の組換え微生物。
【請求項６４】
アセチルｃｏＡシンセターゼ活性を増加させる修飾をさらに含む、
請求項１〜６３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項６５】
アセチルｃｏＡシンセターゼ活性を増加させる前記修飾が、ａｃｓの発現または活性のアップレギュレーションである、
請求項６４に記載の組換え微生物。
【請求項６６】
リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加させる修飾をさらに含む、
請求項１〜６５のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項６７】
アセチルｃｏＡシンセターゼ活性を増加させる前記修飾が、ｐｔａの発現または活性のアップレギュレーションである、
請求項６６に記載の組換え微生物。
【請求項６８】
生体由来化合物を生成することができる経路、またはアセチルＣｏＡまたはアミノ酸前駆体を代謝産物として使用する生体由来化合物への経路をさらに含む、
請求項１〜６７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項６９】
前記生物由来化合物が、アルコール、グリコール、有機酸、アルケン、ジエン、イソプレノイド、有機アミン、有機アルデヒド、ビタミン、栄養補助食品または医薬品である、
請求項６８に記載の組換え微生物。
【請求項７０】
前記アルコールが、
（ｉ）第一級アルコール、第二級アルコール、Ｃ３〜Ｃ１０の炭素原子を含むジオールまたはトリオールと、
（ｉｉ）ｎ−プロパノール又はイソプロパノールと、
（ｉｉｉ）脂肪アルコールであって、Ｃ４〜Ｃ２７炭素原子、Ｃ８〜Ｃ１８炭素原子、Ｃ１２〜Ｃ１８炭素原子、またはＣ１２〜Ｃ１４炭素原子を含む脂肪アルコールと、
からなる群より選択される、
請求項６９に記載の組換え微生物。
【請求項７１】
アルコールが、１−プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンテノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、３−メチル−１−ペンタノール、１−ヘプタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、および５−メチル−１−ヘキサノールである、
請求項７０に記載の組換え微生物。
【請求項７２】
前記生物由来化合物が、
（ｉ）１，４−ブタンジオールまたはその中間体であって、前記中間体は任意に４−ヒドロキシブタン酸（４−ＨＢ）またはガンマ−ブトリオラクトンである、
（ｉｉ）ブタジエン（１，３−ブタジエン）またはその中間体であって、前記中間体は任意に、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、クロチルアルコール、３−ブテン−２−オール（メチルビニルカルビノール）、イソプレン、または３−ブテン−１−オールである、
（ｉｉｉ）１，３−ブタンジオールまたはその中間体であって、任意に３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）、３−ヒドロキシペント−４−エノエート、２，４−ペンタジエノエート、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールである
（ｉｖ）アジピン酸、６−アミノカプロン酸、カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、レブリン酸またはそれらの中間体であって、前記中間体は任意にアジピル−ＣｏＡまたは４−アミノブチリル−ＣｏＡである、
（ｖ）メタクリル酸またはそのエステル、３−ヒドロキシイソ酪酸塩、２−ヒドロキシイソ酪酸塩、またはそれらの中間体であって、前記エステルが任意にメタクリル酸メチル又はポリ（メタクリル酸メチル）である、
（ｖｉ）１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１，３−プロパンジオール、グリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、ビスフェノールＡまたこれらの中間体、
（ｖｉｉ）コハク酸またはその中間体、
（ｖｉｉｉ）Ｃ４〜Ｃ２７の炭素原子、Ｃ８〜Ｃ１８の炭素原子、Ｃ１２〜Ｃ１８の炭素原子、またはＣ１２〜Ｃ１４の炭素原子を含む、脂肪アルコール、脂肪アルデヒドまたは脂肪酸であって、前記脂肪アルコールが任意にドデカノール（Ｃ１２；ラウリルアルコール）、トリデシルアルコール（Ｃ１３；１−トリデカノール、トリデカノール、イソトリデカノール）、ミリスチルアルコール（Ｃ１４；１−テトラデカノール）、ペンタデシルアルコール（Ｃ１５；１−ペンタデカノール、ペンタデカノール）、セチルアルコール（Ｃ１６；１−ヘキサデカノール）、ヘプタデシルアルコール（Ｃ１７；１−ｎ−ヘプタデカノール、ヘプタデカノール）およびステアリルアルコール（Ｃ１８；１−オクタデカノール）、または、パルミトレイルアルコール（Ｃ１６不飽和；ｃｉｓ−９−ヘキサデセン−１−オール）、
（ｉｘ）イソプレノイドであって、任意にはイソプレノイドはイソプレンまたはその中間体、
からなる群より選択される、
請求項６８に記載の組換え微生物。
【請求項７３】
メタクリル酸メチルまたはメタクリル酸経路を含む、
請求項７２に記載の組換え微生物。
【請求項７４】
前記メタクリル酸メチルまたはメタクリル酸経路が、
（ａ）３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼと、
（ｂ）３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および、３−ヒドロキシイソブチレートデヒドラターゼ、
（ｃ）アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ、および、メタクリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはメタクリリル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリル−ＣｏＡシンテターゼ、
（ｄ）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼあるいは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、
（ｅ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドラターゼ、
（ｆ）メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡ還元酵素、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸トランスアミナーゼ、および、３−アミノ−２−メチルプロピオン酸アンモニアリアーゼと、
（ｇ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼまたは３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、および、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、
（ｈ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸ムターゼ、３メチルアスパルターゼ、および、メサコン酸脱炭酸酵素、
（ｉ）α−ケトグルタル酸還元酵素、２−ヒドロキシグルタミン酸ムターゼ、３−メチルリンゴ酸デヒドラターゼ、およびメサコン酸デカルボキシラーゼ、
（ｊ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、ビニルアセチルＣｏＡ△−イソメラーゼ、クロトナーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、および、メタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼのいずれか、あるいは
（ｋ）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、およびメタクリリルＣｏＡシンテターゼまたはメタクリリルＣｏＡヒドロラーゼまたはメタクリリルＣｏＡトランスフェラーゼ、
を含む、
請求項７３に記載の組換え微生物。
【請求項７５】
１，３−ブタンジオール経路を含む、
請求項７２に記載の組換え微生物。
【請求項７６】
クロチルアルコール経路を含む、
請求項７２に記載の組換え微生物。
【請求項７７】
１，４−ブタンジオール経路を含む、
請求項７２に記載の組換え微生物。
【請求項７８】
前記組換え微生物は、細菌、真菌、または酵母である、
請求項１〜７７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項７９】
前記組換え微生物は、Escherichia、Corynebacterium、Bacillus、Ralstonia、Staphylococcus、PichiaまたはSaccharomycesである、
請求項１〜７８のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項８０】
前記組換え微生物は、Escherichia coliである、
請求項１〜７９のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項８１】
前記生物由来化合物を産生するための条件下および十分な期間、請求項６８〜８０のいずれかに記載の組換え微生物を培養することを含む、
生物由来化合物を産生するための方法。
【請求項８２】
請求項１〜８０のいずれかに記載の組換え微生物を、メタノールを含む炭素含有原料油を含む培地中で培養することを含む、非天然微生物を増殖させるための方法。
【請求項８３】
前記方法が、培養物中の他の構成要素から生物由来化合物を分離することをさらに含む、
請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記分離することが、抽出、連続液−液抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー、または限外濾過を含む、
請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権主張）
本出願は、グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換する酵素および／またはフルクトース−１，６−ビスホスファターゼを有する組換え微生物（合成メチロトロフィーまたは増強メチロトロフィーを有するものを含む）と題する、２０１８年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／６９０，２０９号の利益を主張する。また、２０１９年６月２５日に作成された「ＧＮＯ００８８ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容全体（２９．２キロバイトのサイズを有する）が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、合成または増強されたメチロトロフィーを有する組換え微生物、ならびにＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはフルクトース−１，６−ビスホスファターゼを利用する組換え微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
メチロトロフィー（メチル栄養）は、エネルギー源および炭素源として、メタノールおよびメタンなどの単一炭素（Ｃ１）化合物を使用する微生物の能力に関する。天然ガスから利用可能なメタン、およびそれを酸化する生成物であるメタノールを含む炭素原料は広く入手可能になり、現在では比較的安価である。したがって、Ｃ１供給原料を使用することは、Ｃ６またはＣ５糖を典型的に使用する高価な伝統的な供給原料と比較して、バイオプロダクツの生産のための発酵技術にとって魅力的になっている。
【０００４】
従前、多くのメチル栄養微生物は厳格な好気性要件を有し、比較的少ない代謝中間体しか生成しないことから、工業プロセスに適さない。さらに、これまでのところ、容易な遺伝子操作には適していない。従って、工業的に有用な微生物における合成メチロトロフィーの開発は興味深い。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの実施形態において、本発明は、合成または改良されたメチロトロフィーを有する組換え微生物、該組換え微生物を使用してバイオプロダクトを産生するための方法、該微生物を含む組成物、およびまた該微生物を使用して調製されたバイオプロダクト含有組成物を提供する。本発明の組換え微生物は、下部解糖（ＥＭＰ）経路（ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）を導く酵素に関連する少なくとも１つの修飾、およびリブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）サイクルの酵素に関連する少なくとも１つの修飾を含む。
【０００６】
メチロトロフィーを行うことができないE. coliのような天然生物は、典型的にはＥＭＰ経路を通る比較的高いフラックスを有することが見出されている。合成メチロトロフィーを達成するために、本開示の組換え微生物はＲｕＭＰサイクルの１つ以上の酵素を利用し、そしてまた、１つ以上のリン酸化された３および／または４炭素種（例えば、グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）、およびエリトロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ））の適切なプールサイズを有益に維持するように操作される。本開示の１つの態様において、これはグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換する酵素を使用して、組換え生物において達成され得、ここで、この酵素はＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する（そしてまた、本明細書中で議論されるような非リン酸化酵素とも呼ばれ得る）、B. methanolicus GapN、またはその機能的等価物である。本開示の別の態様では、これはB. methanolicus GlpNなどのフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、またはその機能的等価物を使用して、組換え生物において達成することができる。
【０００７】
したがって、本発明の実施形態において提供する組換え微生物は、合成または増強されたメチル栄養を有する組換え微生物であって、（ａ）外因性酵素Ａと、（ｂ）外因性酵素Ｂと、を含む。そして、前記外因性酵素Ａは、（ａｉ）グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換することができるか、（ａｉｉ）配列番号１（B. methanolicus gapN）と少なくとも５０％の配列同一性を有するか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼである。ここで、前記（ａｉ）または（ａｉｉ）の外因性酵素Ａの場合には、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる。また、前記外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ホスホケトラーゼであるか、（ｂｉｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、または前記（ｂｉｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組み合わせである。
【０００８】
微生物に対する修飾は、Ｃ１およびＣ５化合物からのＣ６化合物の生成、炭素転位によるＣ６化合物からのＣ５化合物の再生、およびＣ５化合物の再生とより低い解糖との間の改善されたバランスを可能にする。次に、これにより、組換え微生物は標的化合物を生成するためにバイオプロダクト経路において使用され得る代謝前駆体（例えば、アセチルＣｏＡ）を十分な量生成することができ、同時に、発酵法の間の増殖のための良好な状態の細胞を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、組換え微生物は任意に、生物の低解糖経路のネイティブの遺伝子に対する１つ以上の改変を含み得る。例えば、修飾は、生物のネイティブのＮＡＤ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＧａｐＡ）、ネイティブのホスホグリセリン酸キナーゼ活性（ｐｇｋ）を減弱または排除するものであり得る。ｇａｐＮ修飾と共に、このような欠失は、１つ以上のリン酸化された３および／または４炭素種のプールサイズを増強して、本明細書中に記載されるような細胞利益を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、組換え微生物は、外因性のＭＤＨなどのＮＡＤ＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を任意に含むことができる。当該微生物は、増強された酵素活性（例えばＭＤＨ変異体を用いる）あるいは増強された発現、またはその両方を用いることで、高いＭＤＨ活性を有することができる。ＭＤＨ活性はＣ１化合物（ホルムアルデヒド）のプールの増加を実現し、細胞修飾は、ＲｕＭＰ酵素を使用するＣ６化合物への増加したフラックスのために、Ｃ５化合物の生成を提供することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、組換え微生物は、以下を、１つ以上任意に含み得る。（ａ）エリトロース４−リン酸のプールサイズを増加させるためのトランスケトラーゼ活性の発現または増加をおこなうための修飾、（ｂ）組換え生物におけるＲｕＭＰサイクルのＳＢＰａｓｅ変異体を操作するためのセドヘプツロース１，７ビスホスファターゼ（ＳＢＰａｓｅまたはＧｌｐＸ）活性の発現または増加をおこなうための修飾；生物の天然のトランスアルドラーゼ活性（例えば、ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、ｔａｌＣ）を減弱または排除する修飾。
【００１２】
実施形態において、本開示は、以下の修飾を含む組換え微生物を提供する：
Ｉ．    （１）外因性酵素Ａ（例えば、ＧａｐＮ）、（２）外因性Ｈｐｓ、（３）外因性Ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ＧｌｐＸ、および（６）任意の外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）；
ＩＩ．    （７）ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（Ｐｆｋ）、（８）リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（Ｒｐｅ）、（９）リボース−５−リン酸イソメラーゼ（Ｒｐｉ）、（１０）トランスケトラーゼ（Ｔｋｔ）、（１１）フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（Ｆｂａ）、（１２）グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、について１つ以上の欠失または減弱を引き起こす任意の修飾、および（７）−（１１）のいずれかを、Bacillusなどの外因性対応酵素と任意に置換；および
ＩＩＩ．    （１２）ＮＡＤ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、（１３）トランスアルドラーゼ（ＴａｌＢ、ＴａｌＡ、および／またはＴａｌＣなど）、（１４）ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、（１５）ホスホグリセリン酸ムターゼ（Ｇｐｍ）、（１６）エノラーゼ（Ｅｎｏ）、（１７）デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ＤｅｏＣ）、（１８）メチルグリオキサールシンターゼ（ＭｇｓＡ）、（１９）ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡおよびｐｆｋＢ）、について１つ以上の内因性酵素の欠失または減弱を引き起こす任意の修飾。
【００１３】
他の実施形態では、本発明が、（ａｉ）グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換することができるか、または（ａｉｉ）配列番号１（B. methanolicus GapN）に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる外因性酵素Ａを含む、組換え微生物（合成または改善されたメチロトロフィーが必ずしも必要ではない）を提供する。このような修飾は、ＮＡＤＰＨを酸化還元源として利用する所望の化学的な生成物への経路の場合に、代謝的に組換えられた生物に有用である。実施形態において、ＮＡＤＰＨの生成はより少ない細胞反応がＮＡＤＰＨを利用し、次いで、これらの電子が、他の細胞反応よりもむしろ生成経路に向けられ得るという点で、酸化還元源としての利点を提供し得る。さらに、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の細胞比はＮＡＤＨ対ＮＡＤ＋比よりも高くすることができ、これは、生成経路に追加の熱力学的駆動力を提供することができる。例えば、酵素Ａ（例えば、ＧａｐＮまたはその機能的等価物）を含む組換え微生物は、増加した細胞量のＮＡＤＰＨを利用する生成経路（例えば、アミノ酸経路、特に、Ｇ３ＰおよびＥ４Ｐのような高レベルのＣ３およびＣ４−リン酸）を必要とする芳香族アミノ酸への経路）を含み得る。さらに、ＧａｐＡを弱化または欠失させたＧａｐＮの使用は、１，３ブタンジオール（１，３ＢＤＯ）などのＮＡＤＰＨ集約的生成物（NADPH intensive products）の産生を改善するために使用することができる。
【００１４】
実施形態において、組換え微生物は標的生成物またはその中間体の生成物を促進する代謝経路のタンパク質をコードする１つ以上の導入遺伝子を任意に含み得、ここで、代謝経路は細胞によるメタノール消費から生じる化合物を使用する。いくつかの実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は、１−ブタノール、イソブタノール、１，４−ブタンジオール、または１，３−ブタンジオールなどのアルコールを形成する経路の一部であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は酸または酸エステル（例えば、メタクリル酸（ＭＡＡ）またはメチルメタクリレート（ＭＭＡ））を形成する経路の一部であり得る。
【００１５】
他の実施形態は、細胞培養組成物などの、本開示の組換え微生物を含む組成物、および組換え微生物から産生された１つまたは複数の産物を含む組成物を対象とする。例えば、組成物は組換え微生物によって産生される標的生成物を含み得、ここで、組成物は細胞培養に有用な細胞または他の成分を除去するために精製されている。組成物は、標的生成物またはその中間体を濃縮または精製するために処理されてもよい。
【００１６】
本開示の他の実施形態は、組換え微生物を使用する方法から得られた標的生成物から作製された生成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、外因性ｇａｐＮで修飾され、且つｇａｐＡ欠失を有する細胞でのｇａｐＮおよびＮＡＤＰ＋を用いたＧ３Ｐから３ＰＧへの直接変換と比較した、ｇａｐＡおよびｐｇｋを用いた１，３−ＢＰＧ（３−ホスホグリセロイル−Ｐとも呼ばれる）を介するＧ３Ｐから３ＰＧへの変換（天然／親細胞内での）を示す。大腸菌に固有の反応１および２は「親」として表示し、欠失または弱化されたｇａｐＡとともにｇａｐＮが発現した本発明のＧａｐＮバイパスの反応３は「ΔｇａｐＡを有するｇａｐＮ」として表示している。
【図２】図２は、ｇａｐＡおよびｐｇｋを有する細胞におけるグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）から導く代謝経路を示す。反応１は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）によって触媒され；反応２がホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）によって触媒される。
【図３】図３は、合成メチロトロフィーを有する細胞において、ＭｅＤＨ、ＨＰＳ、およびＰＨＩを使用してメタノールからフルクトース−６−リン酸に至る代謝経路を示す。メタノールｅｘは、炭素供給原料として添加される外部メタノールである。反応１はメタノールデヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）、反応２はヘキスロース−６−リン酸シンターゼ（ｈｐｓ）、反応３はホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼによって触媒される。
【図４】図４は、代替的なホルムアルデヒド同化経路（ＲｕＭＰおよびＤＨＡ）および生成経路において使用され得る各々からの代謝中間体を示す。各反応を触媒する酵素は、（１）メタノールデヒドロゲナーゼ（例えばＥＣ１．１．１）、（２）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ（例えばＥＣ４．１．２．４３）、（３）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（例えばＥＣ５．３．１．２７）、（６）ＤＨＡ（ジヒドロキシアセトン）シンターゼ（例えばＥＣ２．２．１．３）、（７）Ｆ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）アルドラーゼ（例えばＥＣ４．１．２）、（８）ＤＨＡキナーゼ（例えばＥＣ２．７．１．１２１）、（９）フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（例えばＥＣ４．１．２．１３）。本明細書に記載の融合は、２つ以上の反応を触媒することができる。
【図５】図５は、合成メチロトロフィーを有する細胞において、グリセラルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）、ジヒドロキシアセトン−リン酸、エリトロース４−リン酸、リブロース５−リン酸、リブロース５−リン酸、キシルロース５−リン酸、フルクトース６−リン酸、およびフルクトース１，６−重リン酸を含む、種々の３、４、５、および６の炭素代謝産物に至る、およびそれらからの代謝経路を図示する。反応１は、６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ、好ましくはｐｆｋＡＢ）によって触媒される。反応２は、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、好ましくはｆｂａＡＢ）によって触媒される。反応３は、トリオース−リン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ、好ましくはｔｐｉＡ）によって触媒される。反応４は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ、好ましくはｔｋｔＡＢ）によって触媒される。反応５は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ、好ましくはｔｋｔＡＢ）によって触媒される。反応６は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ、好ましくはｒｐｉＡＢ）によって触媒される。反応７は、リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）によって触媒される。
【図６】図６は、合成メチロトロフィーを有する細胞において、ジヒドロキシアセトン−リン酸、エリトロース４−リン酸、セドヘプツロース−１，７−重リン酸、およびセドヘプツロース−７−リン酸に至る代謝経路を示す。反応１はフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）によって触媒される。反応２はフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ｇｌｐＸ）によって触媒される。
【図７】図７は例示的な標的生成経路、１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）生成経路を図示し、これは、本明細書中に開示されるように、メタノール同化から入手可能なアセチル−ＣｏＡを利用し得る。各々の生合成反応を触媒する酵素は、次の通りである。（１）スクシニルＣｏＡ合成酵素、（２）ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、（３）α−ケトグルタル酸脱水素酵素、（４）グルタミン酸：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、（５）グルタミン酸脱炭酸酵素、（６）ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、（７）４−ヒドロキシブタン酸脱水素酵素、（８）α−ケトグルタル酸脱炭酸酵素、（９）４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチルＣｏＡ転移酵素、（１０）酪酸キナーゼ、（１１）ホスホトランスブチリラーゼ、（１２）アルデヒド脱水素酵素、（１３）アルコール脱水素酵素。
【図８】図８は例示的な標的生成経路、アセチルＣｏＡ／メチルメタクリレート（ＭＭＡ）由来の２−ヒドロキシイソ酪酸およびメタクリル酸を示し、これは本明細書に開示されるようなメタノール同化から入手可能なアセチルＣｏＡを利用することができ、２−ヒドロキシイソ酪酸およびメタクリル酸産生は以下の酵素によって実施することができる。Ａ）アセチルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ケトン還元）、Ｃ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ、Ｄ）２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ）メタクリリルＣｏＡシンセターゼ、ヒドロラーゼ、またはトランスフェラーゼ、Ｆ）２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンセターゼ、ヒドロラーゼ、またはトランスフェラーゼ。
【図９】図９は、対応するタンパク質の配列番号を列挙する表である。
【図１０】図１０は合成メチロトロフィーについてのメタノール上での増殖を実証し、そして増殖特性（６００ｎｍでのＯＤとしての光学密度；１時間あたりの比増殖）を示す。パネルＡは、メタノール上での増殖を示さない制御ｇａｐＡ発現株についての増殖データを示す。パネルＢは、メタノール上での増殖を示すｇａｐＮ発現株の増殖データを示す。パネルＣは、ｇａｐＮ発現株のメタノール上での増殖速度を示す。点線は、増殖なし（希釈）について予想される線である。黒い点を有する実線は、実際の実験データである。
【図１１】図１１は、異なる細胞密度でのホルムアルデヒド消費（マイクロモル）に対する酵素Ｆｂａ、Ｆｂａ２、ＧｌｐＸおよびＴｋｔの過剰発現の影響を示す。E. coli親株と比較してプラスミドから発現されたさらなるＧｌｐＸを有するｃｏｌｉ株を、ＮＡＳＨアッセイを使用して、他の炭素源の非存在下でのホルムアルデヒド消費について分析した。ＧｌｐＸはアクセッションＷＰ＿００３３５２２４８．１、ＦｂａはアクセッションＥＩＪ７７６１６．１、Ｆｂａ２はアクセッションＥＩＪ８０２８６．１、ＴｋｔはアクセッションＥＩＪ７７６１５．１である。ＥＶは対照である。ＲｕＭＰサイクル酵素を介して同化されるホルムアルデヒド消費は、ＲｕＭＰサイクル活性を測定するためのプロキシである。６００ｎｍでのＯＤとしての光学密度は、細胞密度のインジケータである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で説明される説明の実施形態は、網羅的であること、または以下の詳細な説明で開示される正確な形態に本開示を限定することを意図しない。むしろ、実施形態は、他の当業者が説明の原理および実践を理解し理解することができるように選択され、説明される。
【００１９】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される刊行物および特許は、それらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、本発明者が、本明細書中に引用されるいかなる出版物および／または特許を含む、いかなる出版物および／または特許にも先行する権利を有さないことを容認するものと解釈されるべきではない。
【００２０】
「合成メチロトロフィー」というタームは、Ｃ１炭素（メタノールまたはメタンなど）をエネルギー源として利用することを可能にする、微生物細胞におけるエンジニアリングを指す。合成メチロトロフィーに遺伝子操作された宿主細胞は、そうでなければ、Ｃ１炭素源上で増殖することができない。合成メチロトロフィーを提供するために微生物を操作することは、一般に、細胞における少なくとも１つの外因性（すなわち、「非天然」）酵素、および細胞におけるより典型的には２つ以上、または３つ以上の外因性酵素の発現を含む。他の修飾は、天然遺伝子の欠失、またはそわなければ天然遺伝子活性の弱化を引き起こす修飾（単数または複数）を含むことができる。外因性酵素は１つ以上の内因性（すなわち、「天然」）酵素を用いて、細胞内の天然代謝産物経路に取り込むことができ、ここで、外因性酵素は、１Ｃ炭素に由来する代謝産物を、細胞増殖またはバイオプロダクト生産のためなど、細胞の天然酵素によって利用され得る代謝産物に変換することができる。非メチロトロフィーであり、そして本開示の外因性酵素で操作され得る微生物は本明細書中に記載されるように、E. coliならびに他の原核生物および真核生物を含む。
【００２１】
用語「強化メチロトロフィー」は１Ｃ炭素（メタノールまたはメタンなど）のエネルギー源としての利用を改善するメチロトロフィック微生物細胞をエンジニアリングすることを意味し、「強化メチロトロフィー」を有する細胞は、天然のメチロトロフィック微生物細胞よりも細胞増殖または生物生成物生産の強化を実証することができる。非メチロトロフィックであり、そして本開示の外因性酵素で操作され得る微生物は本明細書中に記載されるように、E. coliならびに他の原核生物および真核生物を含む。
【００２２】
本開示の局面は、下部解糖（ＥＭＰ）サイクルをもたらす産物に影響を及ぼす少なくとも１つの改変（すなわち、「酵素Ａ」）を有する組換え微生物を対象とする。１つの実施形態において、酵素Ａはグリセルアルデヒド３−リン酸を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換する酵素であるか、または配列番号１（B. methanolicus  ｇａｐＮ）に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する酵素であり、ここで、酵素Ａは、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元し得る。別の実施形態において、酵素Ａはフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、例えば、B. methanolicus  ＧｌｐＮ、またはその機能的等価物である。
【００２３】
組換え微生物はまた、リブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）サイクルの１つ以上の外因性酵素（すなわち、「酵素Ｂ」）を有し得る。１つ以上のＲｕＭＰサイクル酵素にはヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、ホスホケトラーゼ、またはこれらの酵素の任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
好ましい実施形態において、組換え微生物はまた、野生型配列と比較して１つ以上の変異体アミノ酸を有するメタノールデヒドロゲナーゼのような外因性のメタノールデヒドロゲナーゼを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組換え微生物がＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの還元を使用して、グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に不可逆的に変換することができる酵素（「酵素Ａ」）、または配列番号１（B. methanolicus  ｇａｐＮ）に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する酵素を含む。Ｇ３Ｐの１３ＢＰＧへの酸化的リン酸化を触媒するために補因子ＮＡＤを使用するE. coli  ｇａｐＡ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡ；  Ｐ０Ａ９Ｂ２）とは異なり、本開示の酵素Ａは、Ｇ３Ｐの３ＰＧへの変換を触媒するためにＮＡＤＰを使用する（以下に示す）。ＮＡＤＰを利用するＧ３Ｐの３ＰＧへの変換は変換のために検出可能な量のリン酸塩を必要としないよい、したがって「非リン酸化」酵素と呼ぶことができ、これは、その酵素活性を、酸化的リン酸化を別の方法で担持するE. coli  ｇａｐＡからさらに区別する。さらに、酵素Ａ（例えば、ＧａｐＮ）は、E. coli  ＧａｐＡによるＧ３Ｐから１３ＢＰＧへの変換と比較して、ＧａｐＮによるＧ３Ｐから３ＰＧへの変換を比較することに基づいて、より遅い速度でＧ３Ｐを変換する。図１は、ｇａｐＮおよびＮＡＤＰ＋を使用したＧ３Ｐの３ＰＧへの直接変換と比較した、ｇａｐＡおよびｐｇｋを使用した１，３−ＢＰＧによるＧ３Ｐの３ＰＧへの変換を示す。
【００２６】
例えば、ｇａｐＮの酵素動態は、次のとおり：
【００２７】
【化１】
2021528977.tif 000003
【００２８】
である。
【００２９】
１つの例示的な酵素Ａ配列は、Bacillus methanolicus  ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐＮ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿００３３４６７３８、４８１アミノ酸長；配列番号１）に基づく。本開示の組換え微生物は、Bacillus methanolicus  ｇａｐＮ相同体のような、Bacillus methanolicus  ｇａｐＮに関連する配列を有する酵素Ａを発現することができる。例えば、酵素Ａは配列番号１に対して５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を有する配列を有し得る。配列番号１の相同体は配列同一性検索（例えば、当業者に周知のアルゴリズム、例えば、本明細書中に記載されるようなＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）によって同定され得る。
【００３０】
例示的な酵素Ａ配列は以下の表１に見出されるものを含み、これは、種々のBacillus種由来の多くの配列を含む。
【００３１】
【表１】
2021528977.tif 000004
【００３２】
【表２】
2021528977.tif 000005
【００３３】
【表３】
2021528977.tif 000006
【００３４】
【表４】
2021528977.tif 000007
【００３５】
本開示はまた、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含む、本開示の組換え微生物における酵素Ａの変異体の使用を意図する。変異体は無作為に、または酵素Ａ配列の配列アラインメント（例えば、表１に記載されるもの）を使用することによる標的化置換のいずれかによって生成され得る。酵素Ａの酵素的機能のために保存および／または重要な領域は、この情報に基づいて操作された変異体を用いて決定することができる。従って、酵素Ａは配列を天然配列（例えば、配列番号１）から変化させる１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を有し得る。
【００３６】
必要に応じて、組換え微生物は、宿主細胞の低解糖経路の遺伝子の１つ以上の改変を含む。細胞の解糖経路（Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ−Ｐａｒｎａｓ（ＥＭＰ）経路として知られる）は、上部および下部を有する。上部のグルコース（ヘキソース糖）は２分子のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によるリン酸化によって「活性化」される。次いで、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ＦＢＡ）を使用して、２つの３炭素（トリオース）リン酸分子への切断のための調製において再配置される。下部においては、３つの炭素（トリオース）リン酸分子が、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）によって触媒される反応においてリン酸化され、（ＮＡＤ＋を介して）酸化される。その後、さらにリン酸化されると４個のＡＴＰと２個のピルビン酸分子が供給される。
【００３７】
外因性のｇａｐＮの導入に加えて、組換え微生物は、ＮＡＤ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする細胞の天然遺伝子に対する改変を含み得る。図２参照この修飾によって、ＮＡＤ依存性グリセラルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を減衰または消滅させることができる。活性を減弱または消失させるために改変または欠失させることができるそのような遺伝子の例は、Ｇ３Ｐの１３ＢＰＧへの酸化的リン酸化を触媒するために補因子ＮＡＤおよびリン酸を使用するE. coli  ｇａｐＡ遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡ；  Ｐ０Ａ９Ｂ２をコードする）である。ｇａｐＡが欠失しているか、またはそわなければその発現が低下している操作されたE. coliはΔｇａｐＡと呼ぶことができ、または酵素活性を低下させる任意の修飾は、そのようなものとして表記することができる。
【００３８】
ＧａｐＡの欠失、減少した発現、または減少した酵素活性は、外因性のＧａｐＮが基質としてのグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）に対してより効果的に競合することを可能にし得る。ＧａｐＮはE. coli  ＧａｐＡによるＧ３Ｐから１，３−ＢＰＧへの変換と比較して、Ｇ３Ｐから３−ＰＧへの変換が遅いことから、１つ以上のリン酸化された３および／または４つの炭素種のプールサイズを高める方法を提供することができる。次いで、これは、Ｃ５化合物の再生とより低い解糖との間のバランスを改善し、そしてこれらの改変を有する細胞における合成メチロトロフィーを可能にするかまたは強化する。
【００３９】
本開示の１つの態様において、合成メチロトロフィーは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡまたはＧａｐＮ）を介した下部解糖と、ＲｕＭＰサイクル（Ｆｂａ、ＧｌｐＸ）によるＣ５再生との間の所望のバランスを提供するように細胞を操作することによって促進される。図５および図６を参照されたい。所望のバランスを提供する、本開示に記載される遺伝子改変はＮＡＤＨレベルによって調節され、ＮＡＤＨを生成する外因性のメタノールデヒドロゲナーゼの使用を考慮に入れる（さもなければ、このバランスを達成するためのさらなる課題を提示する）、天然のE. coliにおいてなされ得る。したがって、実施形態では、ＧａｐＮの使用がその動力学的活性によって合成メチロトロフィーを促進するだけでなく、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元するその独特の特性によっても促進する。下部解糖経路の一部であり、ＧａｐＡの「下流」にある１つ以上の遺伝子もまた、それらの活性を減弱または排除するように改変され得る。例えば、組換え微生物は、（ａ）グリセルアルデヒド−３−リン酸からホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に至る経路において酵素を弱化または排除する１つ以上の修飾を有することができる。
【００４０】
図２を参照すると、いくつかの実施形態では、組換え微生物が（ａ）ホスホグリセリン酸キナーゼ活性（例えば、E. coli  ｐｇｋ、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０Ａ７９９）を減弱または排除する１つ以上の改変を有し得る。Ｐｇｋは３‐ホスホ‐Ｄ‐グリセロイルりん酸を３‐ホスホ‐Ｄ‐グリセリン酸に変換し、一方、基質レベルのリン酸化を経てＡＤＰからＡＴＰを生成する。いくつかの実施形態では、組換え微生物が（ａ）ホスホグリセリン酸ムターゼ活性を減弱または排除する１つまたは複数の修飾を有することができる。
【００４１】
別態様において、本開示の操作された細胞はまた、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼ、または（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組み合わせである外因性酵素Ｂを含む。
【００４２】
メタノトロフィック細菌において、メタンおよびメタノール酸化から作られるホルムアルデヒドは、細胞産物の形成を導く経路において代謝中間体を形成するために使用される（Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｃ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：７９−１０９）。セリンおよびＤ−リブロース５−リン酸（ＲｕＭＰ）経路はホルムアルデヒドを使用して、炭素含有中間体化合物を生成し、これは、その後、他の下流の生成物に変換される。
【００４３】
図３を参照すると、ＲｕＭＰ経路ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ（ＨＰＳ）は、ホルムアルデヒドとＤ−リブロース５−リン酸（ＲｕＭＰ）とを酵素的に縮合してヘキスロース６−リン酸（ＨｕＭＰ）を形成する。６‐ホスホ‐３‐ヘキスルオイソメラーゼ（ＰＨＩ）はＨｕＭＰをβ‐Ｄ‐フルクトフラノース６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）に酵素的に変換する。ＨＰＳおよびＰＨＩは、ＲｕＭＰ経路を有する天然生物に特有である。同化されたホルムアルデヒドの１分子毎に、１分子のＦ６Ｐが生成される。次に、Ｆ６Ｐは、２つの経路のいずれかによって３−炭素化合物に切断され得る。これらの他の経路の酵素は、ＨＰＳおよびＨＰＩを発現するメタノトローフ細菌に限定されない。
【００４４】
１つの経路では、６−ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）がＦ６Ｐをリン酸化してフルクトース１，６−ビスリン酸（ＦＤＰ）にする。フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）は、ＦＤＰをジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）に切断する。
【００４５】
別のルートグルセ−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．９）では、ＦＭＰをグルコース６−リン酸塩（Ｇ６Ｐ）にイソマライズする。グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４９）は次にＧ６ＰをＤ−グルコノ−１，５−ラクトン６−リン酸に脱水素し、これはさらに６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ  ３．１．１．３１）によって６−ホスホ−グルコン酸に脱水素される。次に、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１２）は、６−ホスホ−グルコン酸を２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸（ＫＤＰＧ）に変換する。続いて、ＫＤＰＧアルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１４）は、ＫＤＰＧをグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）およびピルビン酸に切断する。この経路を介して形成されるピルビン酸およびＤＨＡＰは、生体分子の合成のための細胞経路において使用され得る。
【００４６】
３−ヘキスロース−６−リン酸シンターゼは、酵素クラス（ＥＣ）４．１．２．４３のものである。酵素３‐ヘキスロース‐６‐リン酸シンターゼ（ＨＰＳ）はｄ‐アラビノ‐３‐ヘキスロース‐６‐リン酸（Ｈｕ６Ｐ）を形成するために、リブロース５‐リン酸（Ｒｕ５Ｐ）によるホルムアルデヒドの固定を行うことができる。図２参照。
【００４７】
１つの例示的なＨＰＳ配列は、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ  ＨＰＳ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ３９３９２．１、２１１アミノ酸長、配列番号２）に基づく。組換え微生物は、例えば、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ  ＨＰＳ相同体のような、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ  ＨＰＳに関連するＨＰＳ配列を発現する。例えば、ＨＰＳの配列は、配列番号２に対し、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有することができる。配列番号２の相同体は、配列同一性検索によって識別される（本明細書に記載のアルゴリズムは、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗなどの当業者によく知られているアルゴリズム）。
【００４８】
例示的なＨＰＳ配列には、以下の表２Ａおよび表２Ｂに見出されるものが含まれる。例えば、３−ヘキスロース−６−リン酸シンターゼは、以下に限るものではないが、次のものを含む。Methylobacillus flagellatus HPS (YP 544362.1); Methylobacillus flagellatus HPS (YP 544363.1); Bacillus subtilis HPS (NP_388228.1); Methylophilus methylotrophus HPS (WP_018986666.1); Methylophilus methylotrophus ATCC 53528 HPS (WP_018985298.1); Aminomonas aminovorus HPS (AAG29505.1), Amycolatopsis methanolica 239 HPS (AIJ24611.1); Geobacillus sp. GHH01 HPS (YP_007402409.1); Geobacillus sp. M10EXG HPS (AAR91478.1); Geobacillus sp. Y4.1MC1 HPS (YP_003990382.1); Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 HPS (WP_008879217.1); Methylomonas aminofaciens HPS (BAA83096.1); Methylovorus glucosetrophus SIP3-4 HPS (YP_003050044.1); Methylovorus sp. MP688 HPS (YP_004038706.1); および Mycobacterium gastri HPS (BAA90546.1).。
【００４９】
【表５】
2021528977.tif 000008
【００５０】
【表６】
2021528977.tif 000009
【００５１】
本開示はまた、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含む、本開示の組換え微生物におけるＨＰＳ酵素の変異体の使用を意図する。変異体は無作為に、またはＨＰＳ配列の配列アラインメント（例えば、表２Ａおよび２Ｂに記載されるもの）を使用することによる標的化置換のいずれかによって生成され得る。ＨＰＳ酵素の酵素的機能のために保存および／または重要な領域は、この情報に基づいて操作された変異体を用いて決定することができる。従って、ＨＰＳ酵素は配列を天然配列（例えば、配列番号２）から変化させる１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を有し得る。
【００５２】
６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼは、酵素クラス（ＥＣ）５．３．１．２７のものである。６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼは、酵素クラス（ＥＣ）５．３．１．２７のものである。６‐ホスホ‐３‐ヘキスロイソメラーゼ活性（ＰＨＩ）は、ｄ‐アラビノ‐３‐ヘキスロース‐６‐リン酸（Ｈｕ６Ｐ）をフルクトース６‐リン酸（Ｆ６Ｐ）へ異性化することができる。１つの例示的なＰＨＩ配列は、Bacillus methanolicu  ＭＧＡ３  ＰＨＩ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ３９３９３．１、１８４アミノ酸長、配列番号３）に基づく。組換え微生物は、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ３  ＰＨＩに関連するＰＨＩ配列（例えば、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ  ＰＨＩ相同体）を発現する。例えば、ＰＨＩ配列は、配列番号３と、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上のアイデンティティをもつ。配列番号３の相同体は、配列同一性検索によって識別することができる（本明細書に記載のアルゴリズムは、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗなどの当業者によく知られているアルゴリズム）。
【００５３】
例示的なＰＨＩ配列としては、以下の表３Ａおよび表３Ｂに見出されるものが挙げられる。例えば、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ配列としては、以下に限定されないが、例えば次のようなものを含む。Bacillus methanolicus PB1 PHI (EIJ81376.1); Mycobacterium gastri PB1 PHI (BAA90545.1); Methylobacillus flagellatus KT PHI (YP 545762.1); Bacillus subtilis PHI (NP_388227.1); Methylophilus methylotrophus ATCC 53528 HPS (WP_018985297.1); Amycolatopsis methanolica 239 PHI (AIJ24609.1); Geobacillus sp. GHH01  PHI (YP_007402408.1); Geobacillus sp. Y4.1MC1  PHI (YP_003990383.1);  Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 PHI (WP_011887353.1); Methylomonas aminofaciens PHI (BAA83098.1); Methylovorus glucosetrophus SIP3-4 PHI (YP_003051269.1); およびMethylovorus sp. MP688 PHI (ADQ84715.1)。
【００５４】
【表７】
2021528977.tif 000010
【００５５】
【表８】
2021528977.tif 000011
【００５６】
本開示はまた、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含む、本開示の組換え微生物におけるＰＨＩ酵素の変異体の使用を意図する。変異体は無作為に、またはＰＨＩ配列の配列アラインメント（例えば、表３Ａおよび３Ｂに記載されるもの）を使用することによる標的化置換のいずれかによって生成され得る。ＰＨＩ酵素の酵素的機能のために保存され、および／または重要な領域は、この情報に基づいて操作された改変体を用いて決定され得る。従って、ＰＨＩ酵素は配列を天然配列（例えば、配列番号３）から変化させる１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を有し得る。
【００５７】
本開示の工学的細胞は、ＨＰＳ−ＰＨＩ融合タンパク質、またはその変異体を発現することもできる。操作された融合タンパク質は、Methylococcus capsulatas (YP_115138.1);  Methylomicrobium album BG8 (EIC30826.1);  Pyrococcus abyssi (NP_127388.1);  Pyrococcus furiosus (NP_577949.1);  Pyrococcus horikoshii OT3 (NP_143767.1)、またはThermococcus kodakaraensis (YP_182888.1)からの融合物のような、天然のＨＰＳ−ＰＨＩ融合物に基づくポリペプチド配列を含み得る。ＨＰＳ−ＰＨＩ配列を含む例示的な融合タンパク質はＷＯ２０１７／０７５２０８（Ｂａｒｔｏｎら）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５８】
組換え微生物は、フルクトース−６−リンそのようなホスホケトラーゼまたはキシルロース−５−リンそのようなホスホケトラーゼなどのホスホケトラーゼである外因性酵素（「酵素Ｂ」）を含むことができる。
【００５９】
フルクトース−６−リン酸およびリン酸から、アセチル−リン酸およびエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）への変換は、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）によって行われる。フルクトース−６−リン酸およびリン酸から、アセチル−リン酸およびエリトロース−４−リン酸への変換は、Bifidobacteriumシャント（shunt）における重要な反応の一つである。Bifidobacteriumにおける２つの異なるホスホケトラーゼ酵素の存在の証拠がある（Ｓｇｏｒｂａｔｉら、１９７６、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、４２（１−２）  ４９−５７；  Ｇｒｉｌｌら、１９９５、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３１（１）；  ４９−５４）。Bifidobacterium dentium由来の酵素はフルクトース‐６‐リン酸（ＥＣ：  ４．１．２．２２）にのみ特異的であると思われたが、Bifidobacterium pseudolongum  ｓｕｂｓｐ．globosum由来の酵素は、フルクトース−６−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸の両方を利用することができる（ＥＣ：  ４．１．２．９）（Ｓｇｏｒｂａｔｉら、１９７６、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，４２（１−２）４９−５７）。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｌａｃｔｉｓにおいて最初に発見されたｘｆｐ遺伝子によってコードされる酵素は二重特異性酵素である（Ｍｅｉｌｅら、２００１、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８３、２９２９−２９３６；  Ｙｉｎら、２００５、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、２４６（２）；  ２５１−２５７）。さらなるホスホケトラーゼ酵素は、Leuconostoc mesenteroides (Lee et al, Biotechnol Lett. 2005 Jun;27(12):853-8), Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Servinsky et al, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39, 1859-1867), Aspergillus nidulans (Kocharin et al, 2013, Biotechnol Bioeng, 110(8),  2216-2224; Papini, 2012, Appl Microbiol Biotechnol, 95 (4), 1001-1010), Bifidobacterium breve (Suziki et al, 2010, Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun., 66(Pt 8):941-3), Lactobacillus paraplantarum  (Jeong et al, 2007, J Microbiol Biotechnol, 17(5), 822-9)に見出され得る。
【００６０】
キシルロース−５−リン酸およびリン酸から、アセチル−リン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸への変換は、キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９）によって行うことができる。bifidobacteriaにおける２つの異なるホスホケトラーゼ酵素の存在の証拠がある（Ｓｇｏｒｂａｔｉら、１９７６、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、４２（１−２）  ４９−５７；  Ｇｒｉｌｌら、１９９５、Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３１（１）；  ４９−５４）。Bifidobacterium dentium由来の酵素は、フルクトース‐６‐リン酸（ＥＣ：  ４．１．２．２２）にのみ特異的であると思われたが、Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosumはフルクトース−６−リン酸およびＤ−キシルロース５−リン酸の両方を利用することができる（ＥＣ：  ４．１．２．９）（Ｓｇｏｒｂａｔｉら、１９７６、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，４２（１−２）４９−５７）。多くの酵素はキシルロース−５−リン酸とフルクトース−６−リン酸の二重特異性をもっている。Bifidobacterium animalis lactisにおいて最初に発見されたｘｆｐ遺伝子によってコードされる酵素は二重特異性酵素である（Ｍｅｉｌｅら、２００１、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８３、２９２９−２９３６；  Ｙｉｎら、２００５、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、２４６（２）；  ２５１−２５７）。さらなるホスホケトラーゼ酵素は、Leuconostoc mesenteroides (Lee et al, Biotechnol Lett. 2005 Jun;27(12):853-8), Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Servinsky et al, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39, 1859-1867), Aspergillus nidulans (Kocharin et al, 2013, Biotechnol Bioeng, 110(8),  2216-2224; Papini, 2012, Appl Microbiol Biotechnol, 95 (4), 1001-1010), Bifidobacterium breve (Suziki et al, 2010, Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun., 66(Pt 8):941-3), および Lactobacillus paraplantarum  (Jeong et al, 2007, J Microbiol Biotechnol, 17(5), 822-9)がある。
【００６１】
例示的なホスホケトラーゼ酵素には、以下の表４に見出されるものが含まれる。
【００６２】
【表９】
2021528977.tif 000012
【００６３】
いくつかの実施形態において、操作された生物は、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ、および任意にホスホトランスアセチラーゼを含む。いくつかの実施形態において、操作された生物は、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ、および場合によりアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンセターゼ、またはアセチル−ＣｏＡリガーゼを含む。
【００６４】
アセチル−リン酸からのアセチルＣｏＡの形成は、ホスホトランスセチラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）によって触媒される。E. coli由来のｐｔａ遺伝子は、アセチル−ＣｏＡをアセチル−リン酸に可逆的に変換する酵素をコードする（Ｓｕｚｕｋｉ、Ｔ．、ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ  １９１：５５９−５６９（９６９））。ほかのアセチルトランスフェラーゼ酵素は、Bacillus subtilis (Rado and Hoch, Biochim. Biophys. Acta 321:114-125 (1973), Clostridium kluyveri (Stadtman, E., Methods Enzymol. 1:5896-599 (1955)), および Thermotoga maritima (Bock et al., J. Bacteriol. 181:1861-1867 (1999))において特徴付けられている。この反応はまた、Clostridium acetobutylicumからのｐｔｂ遺伝子産物を含む、いくつかのホスホトランスブチリラーゼ酵素（ＥＣ  ２．３．１．１９）によって触媒され得る（Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら、アプリＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：３１７−３２２（１９８９）；  Ｗａｌｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  １３４：１０７−１１１（１９９３））。さらなるｐｔｂ遺伝子は酪酸産生細菌Ｌ２−５０（Ｌｏｕｉｓら、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２０９９−２１０６（２００４））およびBacillus megaterium（Ｖａｚｑｕｅｚら、ＣｕｒｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：３４５−３４９（２００１））において見出される。E. coli  ｐｔａ遺伝子に対する相同体は、Salmonella entericaおよびChlamydomonas reinhardtiiを含むいくつかの他の生物に存在する。
【００６５】
例示的なホスホトランスアセチラーゼ酵素には、以下の表５に見出されるものが含まれる。
【００６６】
【表１０】
2021528977.tif 000013
【００６７】
アセチルＣｏＡへの酢酸のアシル化は、アセチルＣｏＡシンテターゼ、リガーゼまたはトランスフェラーゼ活性をもつ酵素によって触媒される。この反応を触媒できる２つの酵素は、ＡＭＰ生成アセチルＣｏＡシンテターゼまたはリガーゼ（ＥＣ  ６．２．１．１）とＡＤＰ生成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ  ６．２．１．１３）である。ＡＭＰ生成アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）は、酢酸からアセチルＣｏＡへの活性化のための主要な酵素である。例示的なＡＣＳ酵素は次の通りである。E. coli (Brown et al., J. Gen. Microbiol. 102:327-336 (1977))、Ralstonia eutropha (Priefert and Steinbuchel, J. Bacteriol. 174:6590-6599 (1992))、Methanothermobacter thermautotrophicus (Ingram-Smith and Smith, Archaea 2:95-107 (2007))、Salmonella enterica (Gulick et al., Biochemistry 42:2866-2873 (2003))、および、Saccharomyces cerevisiae (Jogl and Tong, Biochemistry 43:1425-1431 (2004))。ＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼは、一般に広い基質範囲を有する可逆的酵素である（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ。１８４：６３６−６４４  （２００２））。Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓゲノムにコードされているＡＤＰ形成アセチルＣｏＡシンテターゼの２つのアイソザイムは、ＡＦ１２１１およびＡＦ１９８３によってコードされている（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、前出（２００２））。Haloarcula marismortui（スクシニルＣｏＡシンテターゼとして注釈されている）由来の酵素も基質として酢酸を受け入れ、酵素の可逆性が示された（Ｂｒａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｎｈｅｉｔ、ＡｒｃｈＭｉｃｒｏｂｉｏｌ。１８２：２７７−２８７（２００４））。超好熱性クレナンケオンＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＰＡＥ３２５０によってコードされるＡＣＤは特徴付けられたすべてのＡＣＤの最も広い基質範囲を示し、酢酸、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチル−ＣｏＡ（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、前出（２００４））と反応する。指向性進化または操作を用いて、この酵素を修飾して宿主生物の生理学的温度で操作することができる。A. fulgidus, H. marismortuiおよびP. aerophilum由来の酵素はすべて、E. coliにおいてクローニングされ、機能的に発現され、特徴付けられている（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、前出（２００４）；  ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ、前出（２００２））。追加の候補には、E. coli中のｓｕｃＣＤによってコードされるサクシニル−ＣｏＡシンテターゼ（Ｂｕｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のアシル−ＣｏＡリガーゼ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら、ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１１４９−１１５４（１９９３））を含む。上記タンパク質を以下の表６に示す。
【００６８】
【表１１】
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【００６９】
いくつかの実施形態において、操作された生物は外因性のアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、外因性のメタノールデヒドロゲナーゼ）を含む。
【００７０】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨｓ；ＥＣ１．１．１．１）は典型的にはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋からＮＡＤＨ）の還元と共に、アルコールのアルデヒドまたはケトンへの変換を促進する。ＡＤＨは、様々な代謝産物の生合成中にアルデヒド、ケトン、およびアルコール基を有する重要な化合物の生成に役立つ。
【００７１】
アルコールデヒドロゲナーゼの一つのクラスはメタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）である。ＭＤＨはメタノール（ＭｅＯＨ）をホルムアルデヒド（Ｆａｌｄ）に変換し、唯一の炭素源として、または他の供給原料との共炭素源としてＭｅＯＨを可能にするために、本開示の微生物に操作される酵素経路において使用され得る。図３参照。本開示の操作された細胞は、天然または非天然のＮＡＤ＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、特にＥＣ  １．１．１．２４４クラスの酵素を含むことができる。
【００７２】
ＭＤＨ配列の一例としては、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号EIJ77596.1、GI 番号: 387585261、MDH 2315、３８２アミノ酸長、配列番号４）由来のＮＡＤ（Ｐ）＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼがある。ＭＤＨ  ２３１５は、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ３由来のＮＡＤ（Ｐ）＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼとして文献に報告されており、その配列はＢｒａｕｔａｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ、「Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈｎｏｌｉｃｕｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８６、ｐｐ１２２９−１２３８  （２００４）に記載されている。これはまた、Ｂｒａｕｔａｓｅｔに対するＷＯ２０１３／１１０７９７およびＫｒｏｇら、「Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  Ｅｎｃｏｄｅｓ  Ｔｗｏ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｎｄ  ＯＮＥ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｂｏｒｎ  ＮＡＤ＋  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｐａｒａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ、ｐｐ．１−１１（２０１３）においてＭＤＨ  ＭＧＡ３と呼ばれ、これは、さらなる野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＭＤＨを報告する。
【００７３】
組換え微生物は、例えばBacillus methanolicus  ＭＧＡ  ＭＤＨ相同体のようなBacillus methanolicus  ＭＧＡ３  ＭＤＨに関連するＭＤＨ配列を発現する。例えば、ＰＨＩ配列は、配列番号４に対して２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の同一性であり得る。配列番号４の相同体は配列同一性検索（例えば、当業者に周知のアルゴリズム、例えば、本明細書中に記載されるようなＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）によって同定され得る。
【００７４】
例示的なＭＤＨ酵素には、以下の表７に見出されるものが含まれる。
【００７５】
【表１２】
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【００７６】
【表１３】
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【００７７】
本開示の操作された細胞はまた、ＭＤＨ変異体を発現し得る。いくつかの場合において、配列番号４の１００％未満の同一性を有する改変体は、配列番号４と他の公知のメタノールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼとの配列アラインメントによって生成され得、タンパク質の酵素的機能のために保存された領域および／または重要な領域を同定する。一旦これらの領域が同定されると、メタノールデヒドロゲナーゼは、これらの保存された領域の外側の１つ以上のアミノ酸位置で改変され得る。従って、メタノールデヒドロゲナーゼは特定の配列特徴を保持しながら、天然のメタノールデヒドロゲナーゼから配列を変化させる１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を有し得る。表８は、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ３  ＭｅＤＨ（配列番号４）を含む種々のメタノールデヒドロゲナーゼの対配列同一性の表である。
【００７８】
【表１４】
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【００７９】
このような変異体は、例えばメタノールからホルムアルデヒドへの変換のような触媒活性を増加させる。Bacillus methanolicus  ＭＧＡ３  ＭｅＤＨ  （配列番号１）の例示的な変異体は国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５９１３５に記載されており、その開示は本明細書に組み込まれる。配列番号４の例示的なアミノ酸置換としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：S11T, D38N, H42Q, E48D, N53I, E56K, D60E, V61A, I63F, P65Q, D70N, P71I, P71T, P71V, T74S, D81G, K84R, E86K, N87K, I94V, S99P, S99T, A103V, I106L, G107S, L108V, L108W, V109Y, N112K, N112R, R115H, I116F, N117D, N117Q, N117Y, Q120H, Q120R, G121A, G121D, G121E, G121L, G121M, G121R, G121S, G121T, G121V, G121W, G121Y, V122A, V122P, N123D, N123I, N123L, N123R, N123Y, S124I, S124L, S124R, V125C, V125G, V125W, E126G, E126V, K127C, K127R, P128A, P128R, P128S, V129A, V129M, V129P, V129S, V130F, V130I, V130Y, A134T, S143T, T145M, T146N, S147R, L148A, L148F, L148G, L148I, L148T, L148V, L148W, A149L, A149M, A149T, A149V, V150A, V150I, T152M, A155V, K157N, V158E, V158H, V158K, V158W, P161A, P161G, P161Q, P161S, P161V, I163F, I163N, I163Q, I163T, D164G, D164N, E165G, K181R, A184T, L186M, T190A, T190S, I199V, Q217K, L226M, G256C, Q267H, G269S, G270M, G270S, G270Y, T296S, R298H, A300T, I302V,G312V, A316V, I323M, F333L, P336L, S337C, G343D, V344A, V344G, K345E, E350K, K354M, N355D, N355I, N355K, E358G, V360A, V360G, V360K, V360R, V360S, C361N, C361R, Q363K, および K379M。
【００８０】
配列番号１の他の例示的なアミノ酸置換には、次のもの含まれる。D38N, D60E, P71I, P71V, N87K, S99T, A103V, G107S, L108V, L108W, V109Y, R115H, I116F, N117D, N117Q, G121D, G121E, G121L, G121M, G121R, G121S, G121T, G121V, G121W, G121Y, V122P, N123D, N123I, N123L, N123R, N123Y, S124I, S124L, V125C, V125G, V125W, E126G, K127C, K127R, P128A, P128R, P128S, V129A, V129M, V129P, V129S, V130F, V130I, V130Y, A134T, S143T, T146N, A149L, A149M, A149T, A149V, V150A, K157N, V158E, V158H, V158K, V158W, I163Q, D164N, Q267H, G270M, G270S, G270Y, K345E, N355D, V360G, V360K, V360R, V360S, C361R。
【００８１】
本開示の操作された細胞はまた、ＭｅＤＨアクチベータータンパク質を発現し得る。ＭｅＤＨアクチベータータンパク質は、ＮＡＤ補因子のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）部分の加水分解除去を提供することによって、ＭｅＤＨ酵素を活性化することができる。ＭｅＤＨアクチベーターはマグネシウムイオンの存在下で活性であり、ＡＤＰ−リボースを使用することもできる。（Ｋｌｏｏｓｔｅｒｍａｎ、Ｈ．、ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ。２７７：３４７８５−３４７９２）．。
【００８２】
操作された融合タンパク質は、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ３（ＷＰ＿００４４３５４４１．１）およびBacillus methanolicus  ＰＢ１（ＷＰ＿００４４３７５６０．１）のアクチベーターなどのＭｅＤＨアクチベータータンパク質に基づくポリペプチド配列を含むことができる。
【００８３】
本開示の操作された細胞はまた、メタノールデヒドロゲナーゼ活性およびホルムアルデヒド固定を促進する少なくとも１つの他の活性を含む融合タンパク質を発現し得る。例えば、融合タンパク質は、メタノールのホルムアルデヒドへの変換、次いでホルムアルデヒドからヘキスロース６−リン酸、またはフルクトース−６−リン酸などのケトースリン酸への変換を促進する活性を含むことができる。あるいは例えば、融合タンパク質はメタノールのホルムアルデヒドへの変換、次いでホルムアルデヒドからジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）およびグリセラデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）、次いでフルクトース−６−リン酸への変換を促進する活性を含み得る。ＭｅＤＨ含有融合タンパク質としては、以下のような配列の１つまたは複数を含み得る。すなわち、ＨＰＳ配列、ＰＨＩ配列、および／またはＭｅＤＨアクチベーター配列（ＡＣＴ）である。このような融合タンパク質の使用は、融合の結果としてのホルムアルデヒドのケトースリン酸化合物への固定の効率の増加などによって、メタノール取り込みを促進することができる。
【００８４】
具体例としては、MeDH-ACT-PHI、MeDH-ACT-HPS、HPS-MeDH-ACT、ACT-MeDH-PHI-HPS、ACT-MeDH-HPS-PHI、HPS-PHI-MeDH-ACT、PHI-HPS-MeDH-ACT、およびACT-MeDH(P1)-HPS-MeDH(P2)を挙げることができ、そのような融合タンパク質についてはＷＯ２０１７／０７５２０８（Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載している。
【００８５】
図４を参照すると、メタノールの酸化から生成されるホルムアルデヒドの解毒および同化を含む別の例示的な経路は、ジヒドロキシアセトンを介して進行する。ジヒドロキシアセトンシンターゼはまずグリコールアルデヒド群をキシルロース‐５‐リン酸からホルムアルデヒドに転写、その結果、グリセラルデヒド‐３‐リン酸（Ｇ３Ｐ）が生成し、これがグリコール分解の中間体である。次いで、ＤＨＡシンターゼから得られたＤＨＡをさらにリン酸化して、ＤＨＡキナーゼによってＤＨＡリン酸を形成することができる。ＤＨＡＰは例えば、Ｇ３Ｐへの異性化、およびいくつかの他の経路を介して解糖に同化され得る。あるいは、ＤＨＡとＧ３Ｐをフルクトース６−リン酸アルドラーゼで変換し、フルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）に変えることもできる。
【００８６】
Candida boidiniiのジヒドロキシアセトンシンターゼ酵素は補因子としてチアミンピロリン酸とＭｇ２＋を使用し、ペルオキシソームに局在する。メタノール増殖カルボキシドバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＪＣ１  ＤＳＭ  ３８０３株）由来の酵素はまた、ＤＨＡシンターゼおよびキナーゼ活性を有することが見出された（Ｒｏら、１９９７、ＪＢａｃ  １７９（１９）：６０４１−７）。この生物由来のＤＨＡシンターゼも、C. boidinii由来の酵素と同様の補因子要求性を有する。ホルムアルデヒドおよびキシルロース５−リン酸のＫｍは、それぞれ１．８６ｍＭおよび３３．３マイクロＭであると報告された。Mycobacterium tuberculosisのみを除くいくつかの他のマイコバクテリアは炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてメタノールを使用することができ、ジヒドロキシアセトンシンターゼを使用することが報告されている（Ｐａｒｔ  ｅｔ  ａｌ、２００３、ＪＢａｃ  １８５（１）：１４２−７）。
【００８７】
【表１５】
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【００８８】
フルクトース‐６‐リン酸アルドラーゼ（Ｆ６Ｐアルドラーゼ）は、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）とグリセルアルデヒド‐３‐リン酸（Ｇ３Ｐ）の組合せを触媒してフルクトース‐６‐リン酸を形成することができる。この活性は、最近E. coliで発見され、対応する遺伝子候補はｆｓａと呼ばれている（Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｅｎｇｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１、２７６（１４）、１１０５５−１１０６１）。この酵素は狭い基質特異性を有し、フルクトース、フルクトース１−リン酸、フルクトース１，６−ビスリン酸、またはジヒドロキシアセトンリン酸を利用することができない。しかし、ＤＨＡの代わりにヒドロキシブタノンおよびアセトールを使用することができる。精製した酵素は、フルクトース６−リン酸開裂（５０ｍｍグリシルグリシン緩衝液中、３０℃、ｐＨ８．５）について、７ユニット／ｍｇタンパク質のＶｍａｘを示した。アルドール化反応（aldolization reaction）では、４５ユニット／ｍｇタンパク質のＶｍａｘが見出された；基質のＫｍ値がフルクトース６−リン酸では９ｍＭ、ジヒドロキシアセトンでは３５ｍＭ、およびグリセルアルデヒド３−リン酸では０．８ｍＭであった。酵素は、開裂反応よりもアルドール形成を好む。
【００８９】
ＤＨＡに対するE. coli酵素の選択性は、点突然変異を導入することによって改善することができる。例えば、突然変異Ａ１２９Ｓは、Ｋｃａｔ／Ｋｍに関してＤＨＡに対する反応性を１７倍以上改善した（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）、２０１１、４７（２０）、５７６２−５７６４）。同じ突然変異はヒドロキシアセトンに対する触媒効率を３倍以上低下させ、グリコールアルデヒドに対する親和性を野生型酵素のそれと比較して３倍以上低下させた（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、３５２（６）、１０３９−１０４６）。ｆｓａに似た遺伝子は、配列相同性によって他のゲノムにも見つかっている。いくつかの例示的な遺伝子候補を以下の表１０に列挙した。
【００９０】
【表１６】
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【００９１】
以下に記載するように、ＤＨＡ経路においてＦ６Ｐアルドラーゼを使用することにはエネルギー的利点がある。メタノールの酸化によって形成されるホルムアルデヒドの同化は、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）経路またはリブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）経路のいずれかを介して進行し得る。ＲｕＭＰ経路では、ホルムアルデホルドはリブロース‐５‐リン酸と結合してＦ６Ｐを形成する。次いで、Ｆ６Ｐは、解糖によって代謝されるか、またはリブロース−５−リン酸の再生に使用されて、さらなるホルムアルデヒド同化を可能にするかのいずれかである。特に、ＡＴＰ加水分解は、ＲｕＭＰ経路を介してホルムアルデヒドおよびリブロース−５−リン酸からＦ６Ｐを形成するために必要とされない。
【００９２】
対照的に、ＤＨＡ経路では、ホルムアルデヒドはキシルロース‐５‐リン酸（Ｘ５Ｐ）と結合してジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）とグリセルアルデヒド‐３‐リン酸（Ｇ３Ｐ）を形成する。ＤＨＡとＧ３Ｐの一部は、キシルロース‐５‐リン酸の再生を可能にするためにＦ６Ｐに代謝されなければならない。標準的なＤＨＡ経路において、ＤＨＡおよびＧ３Ｐは、３つの酵素：  ＤＨＡキナーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、およびフルクトースビスホスファターゼによってＦ６Ｐに変換される。ＤＨＡおよびＧ３ＰのＦ６Ｐへの正味の変換は以下に記載されるように、ＡＴＰ加水分解を必要とする。第１に、ＤＨＡは、ＡＴＰを犠牲にしてＤＨＡキナーゼによってリン酸化されてＤＨＡリン酸（ＤＨＡＰ）を形成する。次いで、ＤＨＡＰおよびＧ３Ｐをフルクトースビスリン酸アルドラーゼによって合わせて、フルクトース−１，６−ジリン酸（ＦＤＰ）を形成する。ＦＤＰは、フルクトースビスホスファターゼによってＦ６Ｐに変換され、したがって、高エネルギーリン酸結合を浪費する。
【００９３】
ＤＨＡシンターゼがＤＨＡキナーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、フルクトースビスホスファターゼとの組合せとは対照的に、Ｆ６Ｐアルドラーゼと組合せて機能するならば、よりＡＴＰ効率のよい一連の反応が可能になる。Ｆ６Ｐアルドラーゼは、ＡＴＰ加水分解の必要性を回避して、ＤＨＡおよびＧ３ＰのＦ６Ｐへの直接変換を可能にする。全体として、ＤＨＡシンターゼは、Ｆ６Ｐアルドラーゼと組み合わされた場合、ＲｕＭＰ経路に対するエネルギー需要が同一である。これらのホルムアルデヒド同化選択肢（すなわち、ＲｕＭＰ経路、ＤＨＡシンターゼ＋Ｆ６Ｐアルドラーゼ）の両方は、ＤＨＡキナーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、およびフルクトースビスホスファターゼ（外因性のｇｌｐＸ）と組み合わされたＤＨＡシンターゼよりも、ＡＴＰ需要の点で優れている。
【００９４】
トランスアルドラーゼ（ＥＣ  ２．２．１．２）は、ペントース−リン酸経路における代謝産物のバランスに役割を果たしている。E. coliにはｔａｌＡとｔａｌＢによってコードされる２つの密接に関連したトランスアルドラーゼ遺伝子が存在する。Ｅｃｏｌｉでは、ＴａｌＢ（Ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ  Ｂ；  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０Ａ８６７）はセドヘプタロース７‐リン酸塩とＤ‐グリセラルデヒド３‐リン酸塩のＤ‐エリトロース４‐リン酸塩＋Ｄ‐フルクトース６‐リン酸塩への相互変換を触媒する。これらの遺伝子の相同体は、C. glutamicum、S. cerevisiae、Pseudomonas putida、Bacillus subtilisを含む他の微生物で見つけることができる。
【００９５】
本開示の実施形態では、合成メチロトロフィーのための自己触媒ＲｕＭＰサイクルの構成要素がセドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）およびＣ３グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）の形態のＣ７からのＣ５の再生を含む。Ｃ７化合物Ｓ７Ｐがどのように生成されるかに基づいて、ＲｕＭＰサイクルの変異体が存在し得る。１つはＲｕＭＰサイクルのトランスアルドラーゼ変異体であり、トランスアルドース遺伝子ｔａｌＡ、ｔａｌＢ、および／またはｔａｌＣを用いてＳ７Ｐを生成する。もう一つの変異体はセドヘプツロースビスホスファターゼ（ＳＢＰアーゼ）変異体であり、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）を用いてＤＨＡＰとＥ４Ｐをセドヘプツロース−１，７−ビスリン酸（ＳＢＰ）に縮合させ、次に遺伝子ｇｌｐＸによってコードされるＳＢＰアーゼ酵素を用いてＳ７Ｐに脱リン酸化される。図５および図６を参照されたい。ＲｕＭＰサイクルのトランスアルドラーゼ変異体はＲｕＭＰサイクルのＳＢＰａｓｅ変異体よりもエネルギー的利点を提供するが、ＳＢＰａｓｅ変異体はｇｌｐＸ反応が非常に熱力学的に有利であるという実質的な熱力学的利点を提供する。ＲｕＭＰサイクルのＳＢＰａｓｅ変異体の例示的な候補には、Bacillus methanolicus由来のｆｂａ（ＥＩＪ７７５９３．１、ＥＩＪ７７６１６．１）およびｇｌｐＸ遺伝子（ＺＰ＿１１５４８８９４、ＷＰ＿００３３５２２４８．１）が含まれる。
【００９６】
この熱力学的利点のために、および本開示の好ましい局面において、組換え微生物は、外因性のｆｂａおよびｇｌｐＸ遺伝子が過剰発現され、そして天然トランスアロドラーゼ遺伝子（ｔａｌＡ、ｔａｌＢ、ｔａｌＣ）が弱化または排除される、ＲｕＭＰサイクルのＳＢＰａｓｅ変異体を含む。図５および図６を参照されたい。これはまた、細胞中で発現される外因性のｇａｐＮの導入および活性、ならびに場合によりＧａｐＡ活性の欠失または弱化と組み合わせることができる。このような操作された細胞において、ｇａｐＮの導入はＲｕＭＰサイクル代謝産物のプールサイズを改善し得、そしてｔａｌＡ、ｔａｌＢ、ｔａｌＣの欠失または弱化をそのような外因性のｆｂａおよびｇｌｐＸの形態のＲｕＭＰサイクルのＳＢＰａｓｅ変異体は自己触媒ＲｕＭＰサイクルを達成するための熱力学的駆動力を提供する。
【００９７】
実施形態において、組換え微生物は、外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ２）の過剰発現と組み合わされたフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼの内因性活性を減弱または排除する修飾を含み得る。
【００９８】
酵素フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼは、フルクトース１，６−ビスリン酸の、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰまたはグリセロン−リン酸）およびグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）である２つのＣ３リン酸化合物への変換を触媒する。E. coliでは、この活性は２つの遺伝子ｆｂａＡまたはｆｂａＢのどちらか一方によって触媒される。E. coliｆｂａＡおよびｆｂａＢは、そのＣ３生成物Ｇ３ＰおよびＤＨＡＰの高レベルによって阻害されることが知られている。しかしながら、本開示によれば、Ｇ３ＰおよびＤＨＡＰの高いプールサイズは、合成メチロトロフィーのために維持されることが望ましい。このバランスを達成するために、組換え微生物の実施形態は天然のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ活性を欠失または弱化するための改変、および外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（例えば、Bacillus由来のもの）の導入を含み得る。
【００９９】
例えば、Bacillus methanolicus ＰＢ１由来のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼｆｂａ２、またはその相同体もしくは変異体を、組換え微生物に導入することができる。組換え微生物は、例えばBacillus methanolicus  ＰＢ１  ｆｂａ２相同体または変異体のようなBacillus methanolicus  ＰＢ１  ｆｂａ２に関連するｆｂａ配列を発現する。例えば、そのようなｆｂａ配列は、Bacillus methanolicus  ＰＢ１  ｆｂａ２（配列番号９）に対して５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性であり得る。これは、外因性のＧａｐＮおよび弱化／欠失ＧａｐＡ活性を有する微生物と組み合わせることができる。
【０１００】
組換え微生物に導入され得る他の例示的なフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子は、以下の表１１；
【０１０１】
【表１７】
2021528977.tif 000020
【０１０２】
【表１８】
2021528977.tif 000021
【０１０３】
に列挙される。
【０１０４】
実施形態において、組換え微生物はフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼの内因性活性を弱めるかまたは排除し、そして外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼを導入する修飾を含む。
【０１０５】
実施形態において、組換え微生物は、トリオース−リン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ、例えばｔｐｉＡ）の外因性の活性を導入する修飾を含むことができる。組換え微生物に導入され得る例示的なトリオース−リン酸イソメラーゼ遺伝子は、以下の表２２；
【０１０６】
【表１９】
2021528977.tif 000022
【０１０７】
【表２０】
2021528977.tif 000023
【０１０８】
【表２１】
2021528977.tif 000024
【０１０９】
【表２２】
2021528977.tif 000025
【０１１０】
【表２３】
2021528977.tif 000026
【０１１１】
【表２４】
2021528977.tif 000027
【０１１２】
に列挙される。
【０１１３】
メチルグリオキサールシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．３）はグリセロン−リン酸ホスホ−リアーゼとしても知られており、ジヒドロキシアセトンリン酸からのメチルグリオキサールおよびリン酸の形成を触媒する酵素である。E. coliでは、メチルグリオキサールシンターゼはｍｇｓＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０Ａ７３１）によってコードされている。
【０１１４】
必要に応じて、組換え微生物はメチルグリオキサールシンターゼ（例えば、E. coli  ｍｇｓＡ）の活性を弱めるかまたは排除そのような修飾を含み得る。次いで、これはジヒドロキシアセトンリン酸のプールの増加をもたらし得、これは次いで、Ｇ３Ｐまたはセドヘプツロース１，７に変換され得、これは細胞において発現される外因性のｇａｐＮの導入および活性、ならびに任意に、ｇａｐＡ活性の欠失または弱化を補完し得る。
【０１１５】
デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）はアセトアルデヒドとＤ‐グリセルアルデヒド３‐リン酸との間の可逆的アルドール反応を触媒し、２‐デオキシ‐Ｄ‐リボース５‐リン酸を生成する。E. coliではＤｏｘｙｒｉｂｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅはｄｅｏＣ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０Ａ６Ｌ０）によってコードされている。
【０１１６】
必要に応じて、組換え微生物はデオキシリボースリン酸アルドラーゼ（例えば、E. coli  ｄｅｏＣ）の活性を弱めるかまたは排除そのような修飾を含み得る。次いで、これはＧ３Ｐのプールの増加をもたらし得、これは細胞において発現される外因性のｇａｐＮの導入および活性、ならびに任意に、ｇａｐＡ活性の欠失または弱化を補完し得る。
【０１１７】
図５を参照すると、実施形態において、組換え微生物は、ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼの内因性活性を減弱または排除する修飾を含むことができる。この酵素はＡＴＰによるＤ‐フルクトース６‐リン酸のフルクトース１，６‐ビスリン酸へのリン酸化を触媒することができる。E. coliでは、ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼアイソザイム１はｐｆｋＡによってコードされており、これを修飾してホスホフルクトキナーゼ酵素活性を欠失または減弱させることができる。
【０１１８】
実施形態において、組換え微生物は外因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（例えば、Bacillus由来のもの）を導入する改変を含み得る。
【０１１９】
例えば、Bacillus methanolicus MGA3由来のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼＰｆｋ２、またはその相同体もしくは変異体を、組換え微生物に導入することができる。組換え微生物は、例えばBacillus methanolicus MGA3  ｐｆｋ２相同体または変異体のようなBacillus methanolicus MGA3  ｐｆｋ２に関連するｐｆｋ配列を発現する。そのようなｐｆｋ配列は、Bacillus methanolicus MGA3  ｐｆｋ２（配列番号５）に対して５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性であり得る。
【０１２０】
組換え微生物に導入され得る他の例示的なＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ遺伝子は、以下の表１２；
【０１２１】
【表２５】
2021528977.tif 000028
【０１２２】
に列挙される。
【０１２３】
実施形態において、組換え微生物はＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼの内因性活性を減弱または排除し、外因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼを導入する修飾を含む。任意に、これらの修飾は、外因性のＧａｐＮの過剰発現およびＧａｐＡの減弱／欠失と組み合わせることができる。
【０１２４】
図５を参照すると、実施形態において、組換え微生物は、リブロース−リン酸３−エピメラーゼの内因性活性を減弱または排除する修飾を含むことができる。
【０１２５】
この酵素は、Ｄ−リブロース５−リン酸のＤ−キシルロース５−リン酸への可逆的エピマー化を触媒することができる。E. coliでは、リブロース−リン酸３−エピメラーゼはｒｐｅにコードされており、これを修飾してリブロース−リン酸３−エピメラーゼ活性を欠失させたり減弱させたりすることができる。
【０１２６】
実施形態において、組換え微生物は外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（例えば、Bacillus由来のもの）を導入する改変を含み得る。
【０１２７】
例えば、Bacillus methanolicus  ＰＢ１由来のリブロース−リン酸３−エピメラーゼｒｐｅ、またはその相同体もしくは変異体を、組換え微生物に導入することができる。組換え微生物は、例えば、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ  ｒｐｅ相同体または変異体のようなBacillus methanolicus  ＭＧＡ３  ｒｐｅに関連するｒｐｅ配列を発現する。そのようなｒｐｅ配列は、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ３  ｒｐｅ（配列番号６）に対して３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性であり得る。
【０１２８】
組換え微生物に導入され得る例示的なリブロース−リン酸３−エピメラーゼ遺伝子は、以下の表１３；
【０１２９】
【表２６】
2021528977.tif 000029
【０１３０】
に列挙される。
【０１３１】
実施形態において、組換え微生物はリブロース−リン酸３−エピメラーゼの内因性活性を減弱または排除し、外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼを導入する修飾を含む。
【０１３２】
図５を参照すると、実施形態において、組換え微生物は、リボース−５−リン酸イソメラーゼの内因性活性を減弱または排除する修飾を含むことができる。
【０１３３】
この酵素はリボース‐５‐リン酸からリブロース５‐リン酸への可逆的変換を触媒することができる。E. coliでは、イソメラーゼ‐５‐リン酸異性体Ａ酵素がｒｐｉＡによってエンコードされ、イソメラーゼ‐５‐リン酸異性体Ｂ酵素がｒｐｉＢによってエンコードされ、ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢのいずれかまたは両方を修飾してイソメラーゼ‐５‐リン酸異性体活性を消去または減衰させることができる。
【０１３４】
実施形態において、組換え微生物は外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（例えば、Bacillus由来のもの）を導入する改変を含むことができる。
【０１３５】
例えば、Bacillus methanolicus  ＰＢ１由来のリボース−５−リン酸イソメラーゼｒｐｉＢ、またはその相同体もしくは変異体を、組換え微生物に導入することができる。組換え微生物は、例えば、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ  ｒｐｉＢ相同体または変異体のようなBacillus methanolicus  ＭＧＡ３  ｒｐｉＢに関連するｒｐｉ配列を発現する。そのようなｒｐｉ配列は、Bacillus methanolicus  ＭＧＡ３  ｒｐｉＢ（配列番号７）に対して３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性であり得る。組換え微生物に導入され得る他の例示的なリボース−５−リン酸イソメラーゼ遺伝子は、以下の表１４；
【０１３６】
【表２７】
2021528977.tif 000030
【０１３７】
に列挙される。
【０１３８】
実施形態において、組換え微生物はリボース−５−リン酸イソメラーゼの内因性活性を弱めるかまたは排除し、そして外因性のリボース−５−リン酸イソメラーゼを導入する修飾を含む。
【０１３９】
図５を参照すると、実施形態において、組換え微生物は、トランスケトラーゼの内因性活性を減弱または排除する修飾を含むことができる。この酵素はセドヘプツロース‐７‐リン酸からグリセルアルデヒド‐３‐リン酸への二炭素ケトール群の可逆的転写を触媒し、キシルロース‐５‐リン酸とリボース‐５‐リン酸を生成する。E. coliでは、トランスケトラーゼ１酵素はｔｋｔＡによってコードされ、トランスケトラーゼ２酵素はｔｋｔＢによってコードされ、ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢのいずれかまたは両方を修飾して、トランスケトラーゼ活性を欠失または弱めることができる。
【０１４０】
実施形態において、組換え微生物は外因性のトランスケトラーゼ（例えば、Bacillus由来のもの）を導入する改変を含み得る。例えば、Bacillus methanolicus  ＰＢ１由来のトランスケトラーゼｔｋｔ２、またはその相同体もしくは変異体を、組換え微生物に導入することができる。組換え微生物は、Bacillus methanolicus  ＰＢ１  ｔｋｔ２相同体または変異体のような、Bacillus methanolicus  ＰＢ１  ｔｋｔ２に関連するｔｋｔ配列を発現することができる。例えば、ｔｋｔ配列は、Bacillus methanolicus  ＰＢ１  ｔｋｔ２（配列番号８）に対して５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性であり得る。組換え微生物に導入され得る他の例示的なトランスケトラーゼ遺伝子は、以下の表１５；
【０１４１】
【表２８】
2021528977.tif 000031
【０１４２】
に列挙される。
【０１４３】
実施形態において、組換え微生物はトランスケトラーゼの内因性活性を減弱または排除し、外因性のトランスケトラーゼを導入する修飾を含む。
【０１４４】
１つの経路では、６−ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）がＦＭＰをリン酸化してフルクトース１，６−ビスリン酸（ＦＤＰ）にする。フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）は、次いで、ＦＤＰをジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）およびグリセルアルデヒド３−リン酸に切断する。
【０１４５】
別のルートでは、グルコース‐６‐リン酸イソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．９）が、ＦＭＰをグルコース６‐リン酸塩（ＧＭＰ）に異性化する。グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４９）はＧＭＰをＤ−グルコノ−１，５−ラクトン６−リン酸に脱水素し、これはさらに６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ  ３．１．１．３１）によって６−ホスホ−グルコン酸に脱水素される。次に、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１２）は、６−ホスホ−グルコン酸を２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸（ＫＤＰＧ）に変換する。続いて、ＫＤＰＧアルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１４）は、ＫＤＰＧをグリセルアルデヒド３−リン酸およびピルビン酸に切断する。この経路を介して形成されるピルビン酸およびＤＨＡＰは、生体分子の合成のための細胞経路において使用され得る。
【０１４６】
必要に応じて、組換え微生物は、ＫＨＧ／ＫＤＰＧアルドラーゼの活性を弱めるかまたは除去することができる修飾を含むことができる。E. coliでは、ＫＨＧ／ＫＤＰＧアルドラーゼはｅｄａ遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０Ａ９５５）によってコードされている。必要に応じて、組換え微生物は、グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼの活性を減弱または排除し得る修飾を含み得る。E. coliでは、グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼはｚｗｆ遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０ＡＣ５３）によりエンコードされる。ｚｗｆ遺伝子によりコードされるグルコース‐６‐リン酸１‐デヒドロゲナーゼ反応はＧＮＤ反応により触媒される脱炭酸による異化経路を提供し、その結果、メタノールからの生合成経路の最適以下の収率をもたらす。しかしながら、ｚｗｆを介する異化ＲｕＭＰ経路は、同化ＲｕＭＰを介するホルムアルデヒド同化のバランスをとるためのホルムアルデヒド解毒のための経路を提供し得る。ペントースリン酸経路（ｚｗｆ）を介するホルムアルデヒド異化に加えて、バクテリアはまた、ホルムアルデヒドが酸化されてギ酸塩になり、次いでＣＯ２になる線形ホルムアルデヒド異化経路を有する。この経路はE. coliの内因性遺伝子ｆｒｍＲ、ｆｒｍＡ、ｆｒｍＢによってコードされている。さらに、一部のメチロトロフィーは、この線形異化経路をコードするｆｏｌＤ、ｆｈｓ、ｆｄｈＡなどの遺伝子も持っている。ペントースリン酸経路を介するホルムアルデヒド異性化の利点はそれがＲｕＭＰサイクルのためにリブロース−５−リン酸を再生し、ＲｕＭＰ経路（ＨｐｓおよびＰｈｉ活性）に依存することである。合成メチロトロフィーは、ＲｕＭＰサイクルを介してホルムアルデヒドの異化と同化のバランスをとることによって促進することができる。これは、E. coliにおける内因性遺伝子ｆｒｍＲ、ｆｒｍＡ、ｆｒｍＢによってコードされるホルムアルデヒド異化の直線経路の欠失または弱化、またはB. methanolicus由来のｆｏｌＤ、ｆｈｓ、およびｆｄｈＡによってコードされる外因性のホルムアルデヒド異化経路の導入によって達成することができる。
【０１４７】
あるいは、修飾がE. coliにおける内因性ｚｗｆ遺伝子の弱化または欠失を含み得る。E. coliの内因性ｚｗｆは、高いＮＡＤＨレベルと高いプールサイズのＦ６Ｐによって阻害される。阻害は、E. coliの内因性ｚｗｆを、非天然に調節され、ホルムアルデヒド濃度に応答する外因性のｚｗｆ２で置き換えることによって対処することができる。例示的な外因性遺伝子候補は、B. methanolicus  ＰＢ１およびＭＧＡ３由来のｚｗｆ２である。組換え微生物は、例えばBacillus methanolicus  ＰＢ１またはＭＧＡ３  ｚｗｆ２相同体または変異体のようなBacillus methanolicus  ＰＢ１またはＭＧＡ３  ｚｗｆ２に関連するｔｋｔ配列を発現する。そのようなｚｗｆ配列は、Bacillus methanolicus  ＰＢ１またはＭＧＡ３  ｚｗｆ２（配列番号１０）に対して５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性であり得る。
【０１４８】
必要に応じて、組換え微生物は、内因性ｚｗｆの活性を弱め得るかまたは排除し得、そしてBacillus methanolicus由来の外因性のｚｗｆ２の活性を導入し得る修飾を含み得る。これはまた、ｇａｐＮの導入および内因性ＧａｐＡ活性の減弱または欠失と組み合わせることができる。
【０１４９】
【表２９】
2021528977.tif 000032
【０１５０】
ホルムアルデヒド異化および同化のバランスをとるための導入のための候補外因性遺伝子には、表１７のもの； 
【０１５１】
【表３０】
2021528977.tif 000033
【０１５２】
が含まれる。
【０１５３】
酢酸キナーゼは酢酸とＡＴＰからアセチルリン酸の形成を触媒する。E. coli酢酸キナーゼはａｃｋＡ（ＳｋａｒｓｔｅｄｔおよびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：６７７５−６７８３（１９７６））によってコードされ、酢酸に加えてプロピオネートをリン酸化する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：４７７−４９２（１９９８））。任意に、組換え微生物は、アセテートキナーゼの活性を減弱または排除することができる修飾を含むことができる。例えば、E. coli酢酸ａｃｋＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０ＡＣ５３）を欠失させるか、またはその活性を弱めることができる。ａｃｋＡの欠失または弱化は、ホスホケトラーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼが過剰発現される場合など、種々の株の実施形態において有益であり得る。ホスホケトラーゼはアセチル＿リン酸を形成し、これはアセテートに変換され得るので、ａｃｋＡの欠失および過剰発現ホスホトランスアセチラーゼは、得られるアセチル＿リン酸のアセチルＣｏＡへの変換を促進し得る。
【０１５４】
一実施形態では、組換え微生物が、（１）（ａｉ）グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換することができるか、または（ａｉｉ）配列番号１（B. methanolicus  ｇａｐＮ）に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、酵素ＡがＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる外因性酵素Ａ、（２）外因性ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ（ｈｐｓ）、（３）外因性６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ｐｈｉ）、（４）外因性メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭｅＤＨ）、および（５）外因性フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ｇｌｐＸ）、を含む。
【０１５５】
実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、および（６）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１５６】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、および（６）外因性ＰＫ、ならびに（７）内因性メチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓＡ）欠失または弱化。
【０１５７】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、および（６）内因性ＮＡＤ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ）欠失または弱化。
【０１５８】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性トランスアルドラーゼ活性（ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ）欠失または弱化、（８）外因性ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ２）、および（９）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）。
【０１５９】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはタルク欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、および（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）。
【０１６０】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（８）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（９）外因性リブロース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１２）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１３）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化。
【０１６１】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性の酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性のｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１２）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１５）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１６）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化。
【０１６２】
一実施形態によると、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、および（７）内因性メチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓＡ）欠失または弱化。
【０１６３】
実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、および（８）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化。
【０１６４】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、および（１２）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化。
【０１６５】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（８）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１２）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、および（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化。
【０１６６】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性の酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）内因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１２）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１５）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１６）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、および（２０）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化。
【０１６７】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１６８】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（９）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１６９】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性トランスアルドラーゼ活性（ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ）欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１２）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（１３）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７０】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｇｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（８）内因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１３）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、おおび（１８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７１】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性の酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性のリブローす−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１２）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１５）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１６）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（２０）内因性ｍｇｓＡの欠失または弱化、および（２１）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７２】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）欠失または弱化、（７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７３】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｐｇｋ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７４】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｐｇｋ欠失または弱化、（７）内因性トランスアルドラーゼ活性（ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ）欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１２）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（１３）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７５】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｐｇｋ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（８）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１２）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１３）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（１８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７６】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１２）外因性のリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１６）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸  １−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（２０）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（２１）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７７】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ホスホグリセリン酸変異体（ｇｐｍ）欠失または弱化、（７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７８】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇｐｍ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（９）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１７９】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇｐｍ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１２）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（１３）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１８０】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｇｐｍ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（８）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１２）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１３）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（１８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１８１】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性のｈｐｓ、（３）外因性のｐｈｉ、（４）外因性のＭｅＤＨ、（５）外因性のｇｌｐＸ、（６）内因性ｇｐｍ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性のＡＴＰ依存６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１２）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１５）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１６）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（２０）内因性ｍｇｓＡの欠失または弱化、および（２１）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１８２】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性エノラーゼ（ｅｎｏ）欠失または弱化、（７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１８３】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｅｎｏ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（９）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１８４】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｅｎｏ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１２）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（１３）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１８５】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ），（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｅｎｏ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（８）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１２）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１３）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（１８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１８６】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性の酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性のｈｐｓ、（３）外因性のｐｈｉ、（４）外因性のＭｅＤＨ、（５）外因性のｇｌｐＸ、（６）内因性ｅｎｏ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化，（８）ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１２）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１５）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１６）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（２０）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（２１）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０１８７】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ｄｅｏＣ）欠失または弱化、（７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（９）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化。
【０１８８】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（９）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１０）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化。
【０１８９】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１２）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（１３）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１４）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化。
【０１９０】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（８）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１２）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１３）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（１８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１９）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化。
【０１９１】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性のｈｐｓ、（３）外因性のｐｈｉ、（４）外因性のＭｅＤＨ、（５）外因性のｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１２）内因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１５）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１６）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（２０）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（２１）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（２２）内因性ｇａｐＡ欠失または弱化。
【０１９２】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ｄｅｏＣ）欠失または弱化、（７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（９）内因性ｐｇｋ欠失または弱化。
【０１９３】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（９）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１０）内因性ｐｇｋ欠失または弱化。
【０１９４】
１つの実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１２）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（１３）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１４）内因性ｐｇｋ欠失または弱化。
【０１９５】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（８）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１２）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１３）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（１８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１９）内因性ｐｇｋ欠失または弱化。
【０１９６】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性の酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性のｈｐｓ、（３）外因性のｐｈｉ、（４）外因性のＭｅＤＨ、（５）外因性のｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性のリボース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１５）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１６）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（２０）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（２１）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（２２）内因性ｐｇｋ欠失または弱化。
【０１９７】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ｄｅｏＣ）欠失または弱化、（７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（９）内因性ｇｐｍ欠失または弱化。
【０１９８】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（９）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１０）内因性ｇｐｍ欠失または弱化。
【０１９９】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１１）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１２）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（１３）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１４）内因性ｇｐｍ欠失または弱化。
【０２００】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性ｈｐｓ、（３）外因性ｐｈｉ、（４）外因性ＭｅＤＨ、（５）外因性ｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、８）内因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１０）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１１）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１２）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１３）外因性フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１４）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（１８）外因性ホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（１９）内因性ｇｐｍ欠失または弱化。
【０２０１】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性の酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性のｈｐｓ、（３）外因性のｐｈｉ、（４）外因性のＭｅＤＨ、（５）外因性のｇｌｐＸ、（６）内因性ｄｅｏＣ欠失または弱化、（７）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（８）ＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（９）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（１０）外因性リブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（１１）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１２）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１３）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１４）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１５）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１６）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１７）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１８）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１９）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（２０）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（２１）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）、および（２２）内因性ｇｐｍ欠失または弱化。一実施形態において、組換え微生物は、以下の修飾を含む：（１）外因性のｈｐｓ、（２）外因性のｐｈｉ、（３）外因性のＭｅＤＨ、（４）外因性のｇｌｐＸ、（５）内因性トランスアルドラーゼ活性（ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ）欠失または弱化、（６）外因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ２）、および（７）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）。
【０２０２】
一実施形態において、組換え微生物は以下の修飾を有する：（１）外因性のｈｐｓ、（２）外因性のｐｈｉ、（３）外因性のＭｅＤＨ、（４）外因性のｇｌｐＸ、（５）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（６）外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（７）外因性のリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（８）外因性のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、および（９）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）。
【０２０３】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性のｈｐｓ、（２）外因性のｐｈｉ、（３）外因性のＭｅＤＨ、（４）外因性のｇｌｐＸ、（５）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（６）外因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（７）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（８）外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１０）外因性のリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１１）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１２）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１３）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１４）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１５）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１６）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１７）内因性ｚｗｆ欠失または弱化。
【０２０４】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を含む：（１）外因性のｈｐｓ、（２）外因性のｐｈｉ、（３）外因性のＭｅＤＨ、（４）外因性のｇｌｐＸ、（５）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（６）外因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、（７）内因性ｐｆｋ欠失または弱化、（８）外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１０）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１１）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１２）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１３）外因性のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１４）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１５）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１６）外因性グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１７）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１８）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（１９）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０２０５】
一実施形態において、組換え微生物は、以下の修飾を含む：（１）外因性のｈｐｓ、（２）外因性のｐｈｉ、（３）外因性のＭｅＤＨ、（４）外因性のｇｌｐＸ、（５）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（６）内因性ｍｇｓＡの欠失または弱化、（７）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０２０６】
一実施形態において、組換え微生物は、以下の修飾を含む：（１）外因性のｈｐｓ、（２）外因性のｐｈｉ、（３）外因性のＭｅＤＨ、（４）外因性のｇｌｐＸ、（５）内因性トランスアルドラーゼ活性（ｔａｌＢ、ｔａｌＡ、および／またはｔａｌＣ）欠失または弱化、（６）外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（７）外因性のリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（８）外因性のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（９）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１０）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、および（１１）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０２０７】
一実施形態では、組換え微生物が以下の修飾を有する：（１）外因性の酵素Ａ（例えば、ｇａｐＮ）、（２）外因性のｈｐｓ、（３）外因性のｐｈｉ、（４）外因性のＭｅＤＨ、（５）外因性のｇｌｐＸ、（６）内因性ｔａｌＢ、ｔａｌＡおよび／またはｔａｌＣ欠失または弱化、（７）外因性のＡＴＰ依存性６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡおよびｐｆｋＢ）、（８）外因性のリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、（９）内因性ｒｐｅ欠失または弱化、（１０）外因性リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）、（１１）内因性ｒｐｉ欠失または弱化、（１２）内因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）欠失または弱化、（１３）外因性トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、（１４）外因性のフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、（１５）内因性ｆｂａ欠失または弱化、（１５）外因性のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、および（１６）内因性ｚｗｆ欠失または弱化、（１７）内因性ｍｇｓＡ欠失または弱化、（１８）外因性のホスホケトラーゼ（ＰＫ）。
【０２０８】
本明細書中に提供される教示およびガイダンスを考慮すると、当業者はまた、酵素活性または発現が、周知の方法を使用して弱化され得ることを理解する。酵素の活性または量の減少は、その減少が酵素の活性を、経路が機能するために通常必要とされる臨界レベル未満に低下させる場合、遺伝子の完全な破壊を模倣し得る。遺伝子破壊の使用ではなく、種々の技術による酵素活性の減少は、生物の生存率にとって重要であり得る。遺伝子破壊の類似または同一の効果をもたらす酵素活性を低下させる方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：遺伝子転写または翻訳を低下させること；ｍＲＮＡ、タンパク質または触媒ＲＮＡを不安定化すること；および酵素活性または動態に影響を及ぼす遺伝子を変異させること（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９）を参照のこと）。天然または課された調節制御はまた、以下を含む酵素弱化を達成し得る：プロモーター置換（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２（２）：３００−３０８（２０１２）を参照のこと）；転写因子の喪失または改変（Ｄｉｅｔｒｉｃｋら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：５６３−５９０（２０１０）；およびＳｉｍｉｃｅｖｉｃら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．６（３）：４６２−４６８（２０１０）；  阻害性ＲＮＡまたはペプチド、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド／小分子結合アプタマー、リボザイム、アプタザイムおよびリボスイッチの導入（Ｗｉｅｌａｎｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６（３）：３５１−３５７（２０１２）；Ｏ´Ｓｕｌｌｉｖａｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３７２（１）：４４−４８（２００２）；およびＬｅｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：５０５−５１１（２００３）；および酵素阻害剤、抗生物質または標的特異的薬物のような酵素活性を減少または破壊する薬物または他の化学物質の添加。
【０２０９】
当業者はまた、酵素の弱化が種々のレベルで行われ得ることを理解および認識する。例えば、遺伝子レベルでは、遺伝子破壊のような部分的または完全なヌル（null）表現型を引き起こす突然変異、または遺伝子産物（Ｍｉｋｏ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  １（１）（２００８））の活性をマスクするエピスタティックな遺伝子効果を引き起こす突然変異を用いて、酵素を減弱させることができる。遺伝子発現レベルでは、弱化のための方法がイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような内因性または外因性のインデューサーに転写をカップリングし、次いで、生産期の間に低量のインデューサーを添加するか、またはインデューサーを添加しないことを含む（Ｄｏｎｏｖａｎら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（３）：１４５−１５４（１９９６）；およびＨａｎｓｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６（６）：３４１−３４７（１９９８））；  遺伝子のポジティブまたはネガティブのレギュレーターを導入または改変する；遺伝子が組み込まれる真核生物染色体領域におけるヒストンアセチル化／脱アセチル化を修飾する（Ｙａｎｇら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１３（２）：１４３−１５３（２００３）およびＫｕｒｄｉｓｔａｎｉら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４（４）：２７６−２８４（２００３）））；プロモーターまたは調節遺伝子を破壊する転位を導入する（Bleykasten-Brosshans et al., C. R. Biol. 33(8-9):679-686 (2011)；およびMcCue et al., PLoS Genet. 8(2):e1002474 (2012)；隣接遺伝子の遺伝子発現を調節するために転移因子またはプロモーター領域の方位を反転させる（Wang et al., Genetics 120(4):875-885 (1988); Hayes, Annu. Rev. Genet. 37:3-29 (2003)）；二倍体生物において、ヘテロ接合性の喪失を生じる１つの対立遺伝子を欠失させる（Daigaku et al., Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 600(1-2)177-183 (2006)）；ＲＮＡ分解を増加させる核酸を導入する（Houseley et al., Cell, 136(4):763-776 (2009)）；または細菌において、例えば、ＲＮＡ分解およびリボソーム停止を導き得るトランスファーメッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）タグの導入（Sunohara et al., RNA 10(3):378-386 (2004)；およびSunohara et al., J. Biol. Chem. 279:15368-15375 (2004)）。翻訳レベルでは、弱化が翻訳を制限するための希少コドンの導入（Angov, Biotechnol. J. 6(6):650-659 (2011)）；翻訳をブロックするＲＮＡ干渉分子の導入（Castel et al., Nat. Rev. Genet. 14(2):100-112 (2013)；およびKawasaki et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 7(2):125-131 (2005)）；二次構造を非翻訳領域（ＵＴＲ）に導入して翻訳をブロックするか、または翻訳効率を低下させるなど、コード配列の外側の領域を改変すること（Ringner et al., PLoS Comput. Biol. 1(7):e72 (2005)）；迅速な転写劣化のためのＲＮＡａｓｅ部位を付加すること（Pasquinelli, Nat. Rev. Genet. 13(4):271-282 (2012)；およびArraiano et al., FEMS Microbiol. Rev. 34(5):883-932 (2010)）；アンチセンスＲＮＡオリゴマーまたはアンチセンス転写物の導入（Nashizawa et al., Front. Biosci. 17:938-958 (2012)）；ＲＮＡまたはペプチドアプタマー、リボザイム、アプタザイム、リボスイッチの導入（Wieland et al., Methods 56(3):351-357 (2012); O’Sullivan, Anal. Bioanal. Chem. 372(1):44-48 (2002); およびLee et al., Curr. Opin. Biotechnol. 14(5):505-511 (2003)）；または小分子の存在または非存在によ���て制御され得る翻訳調節エレメントを含むＲＮＡ構造を導入すること（Araujo et al., Comparative and Functional Genomics, Article ID 475731, 8 pages (2012)）。酵素局在化および／または寿命のレベルで、酵素弱化はより速いタンパク質代謝回転のための劣化タグを添加すること（Hochstrasser, Annual Rev. Genet. 30:405-439 (1996)；およびYuan et al., PLoS One 8(4):e62529 (2013)）；または酵素がその正常な基質と反応することができない真核細胞中の細胞内コンパートメントに酵素が分泌または局在化されることをもたらす局在化タグを添加すること（Nakai et al. Genomics 14(4):897-911 (1992);およびRussell et al., J. Bact. 189(21)7581-7585 (2007)）を含み得る。翻訳後調節のレベルでは、酵素弱化が既知のインヒビターの細胞内濃度の増加；または翻訳後修飾部位の修飾を含み得る（Mann et al., Nature Biotech. 21:255-261 (2003)）。酵素活性のレベルでは、酵素弱化が酵素活性を低下させるために、酵素阻害剤、抗生物質、または標的特異的薬物などの内因性または外因性阻害剤を添加すること；酵素活性に必要な金属イオンをキレート化すること；またはドミナントネガティブ突然変異を導入することを含むことができる。上記の弱化のための技術の適用可能性は所与の宿主微生物が原核生物であるか真核生物であるかに依存し得、そして所与の宿主に適切な技術が何であるかの決定は当業者によって容易になされ得ることが理解される。
【０２１０】
発現ベクターは、宿主生物において機能的な発現制御配列に作動可能に連結された、本明細書中に例示されるような１つ以上の外因性タンパク質コード核酸を含むように構築され得る。提供される微生物宿主生物での使用に適用可能な発現ベクターには、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が含まれ、これらにはベクターおよび宿主染色体への安定した組み込みのために操作可能な選択配列またはマーカーが含まれる。さらに、発現ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含み得る。例えば、抗生物質または毒素に対する耐性を提供する、栄養要求性欠損を補完する、または培養培地にない重要な栄養素を供給する、選択可能なマーカー遺伝子も含めることができる。発現制御配列は、当技術分野で周知の構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含むことができる。
【０２１１】
外因性タンパク質は、中間体を変換するために有用な酵素をコードし得る１つ以上のさらなる核酸と同時発現され得る。２つ以上の外因性のコード核酸が同時発現される場合、両方の核酸は例えば、単一の発現ベクター中に、または別個の発現ベクター中に挿入され得る。単一ベクター発現のために、コード核酸は１つの共通の発現制御配列に操作的に連結され得るか、または異なる発現制御配列（例えば、１つの誘導性プロモーターおよび１つの構成的プロモーター）に連結され得る。代謝経路または合成経路に関与する外因性核酸配列の形質転換は、当技術分野で周知の方法を使用して確認することができる。このような方法は例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のような核酸分析、または遺伝子産物の発現のためのイムノブロット、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の適切な分析方法を含む。外因性核酸は、所望の産物を産生するのに十分な量で発現されることが当業者によって理解され、発現レベルは当技術分野で周知の方法を使用して、および本明細書に開示されるように、十分な発現を得るために最適化され得ることがさらに理解される。
【０２１２】
用語「外因性」は、参照される分子または参照される活性が宿主微生物に導入されることを意味することが意図される。この分子は例えば、宿主染色体への組み込みによるような宿主遺伝物質へのコード核酸の導入によって、またはプラスミドのような非染色体遺伝物質として導入され得る。したがって、コード核酸の発現に関して使用されるタームは、発現可能な形態のコード核酸の微生物への導入を指す。生合成活性に関して使用される場合、このタームは、宿主参照生物に導入される活性をいう。供給源は例えば、宿主微生物への導入後に参照される活性を発現する同種または異種コード核酸であり得る。したがって、「内因性」というタームは宿主中に存在する参照分子または活性を指す。同様に、コード核酸の発現に関して使用される場合、タームは微生物内に含まれるコード核酸の発現を指す。ターム「非相同の」（“heterologous”）が参照種以外の供給源に由来する分子または活性を指し、一方、「相同の」（“homologous”）は、宿主微生物に由来する分子または活性を指す。従って、コード核酸の外因性発現は、非相同または相同のコード核酸のいずれかまたは両方を利用し得る。
【０２１３】
２つ以上の外因性の核酸が微生物に含まれる場合、２つ以上の外因性の核酸は上記で議論されるように、参照されるコード核酸または生合成活性をいうことが理解される。本明細書中に開示されるように、２つ以上の外因性の核酸が、別々の核酸分子上、ポリシストロン性核酸分子上、またはそれらの組み合わせ上で宿主微生物に導入され得、そしてなお、２つ以上の外因性の核酸として考慮され得ることがさらに理解される。例えば、本明細書中に開示されるように、微生物は所望の経路酵素またはタンパク質（例えば、本開示の外因性のタンパク質を発現する外因性の核酸）、およびメチロトロフィー経路から生成される中間体を所望の生物産物に変換する１つ以上の他の酵素をコードする２つ以上の外因性の核酸を発現するように操作され得る。
【０２１４】
所望の活性をコードする２つの外因性の核酸が宿主微生物に導入される場合、２つの外因性の核酸は単一の核酸として、例えば、単一のプラスミド上で、別々のプラスミド上で導入され得、単一の部位または複数の部位で宿主染色体に組み込まれ得、そしてなお２つの外因性の核酸と考えられることが理解される。同様に、３つ以上の外因性の核酸が任意の所望の組み合わせで、例えば、単一のプラスミド上で、別々のプラスミド上で宿主生物に導入され得、単一の部位または複数の部位で宿主染色体に組み込まれ得、そしてなお、２つ以上の外因性の核酸（例えば、３つの外因性の核酸）として考慮され得ることが理解される。したがって、参照される外因性核酸または生合成活性の数は、宿主生物に導入される別個の核酸の数ではなく、コード核酸の数または生合成活性の数を指す。
【０２１５】
外因性酵素をコードする核酸配列は結合、エレクトロポレーション、化学的形質転換、形質導入、トランスフェクション、トランスフェクション、および超音波形質転換を含むが、これらに限定されない、当該分野で周知の技術を使用して、宿主細胞に安定にまたは一時的に導入され得る。必要に応じて、E. coliまたは他の原核生物細胞における外因性発現のために、真核生物核酸の遺伝子またはｃＤＮＡ中のいくつかの核酸配列はＮ端末ミトコンドリアまたは他の標的化シグナルのような標的化シグナルをコードし得、これは所望される場合、原核生物宿主細胞への変換の前に除去され得る。例えば、ミトコンドリアリーダー配列の除去はE. coliにおける発現の増加をもたらした（Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)）。酵母または他の真核細胞における外因性発現のために、遺伝子をリーダー配列を加えずにサイトゾルで発現させることができ、またはミトコンドリアターゲティングまたは宿主細胞に適した分泌シグナルのような適当なターゲティング配列を加えることにより、ミトコンドリアまたは他のオルガネラにターゲティングし、または分泌の標的とすることができる。したがって、標的化配列を除去または含むための核酸配列への適切な改変が、所望の特性を付与するために外因性核酸配列に組み込まれ得ることが理解される。さらに、遺伝子はタンパク質の最適化された発現を達成するために、当該分野で周知の技術を用いてコドン最適化に供され得る。
【０２１６】
用語「微生物」（microbial）、「微生物」（microbial organism）または「微生物」（microorganism）は、古細菌、細菌または真核生物のドメイン内に含まれる、顕微鏡的細胞として存在する任意の生物を意味することを意図する。したがって、このタームは顕微鏡サイズを有する原核または真核細胞または生物を包含することを意図し、すべての種の細菌、古細菌および真正細菌ならびに酵母および真菌などの真核微生物を包含する。このタームはまた、生化学物質の産生のために培養され得る任意の種の細胞培養物を含む。
【０２１７】
本明細書中で議論されるように、エネルギー源および細胞性炭素としてメタノールなどのＣ１化合物を利用できないこと、または利用する能力に関して、微生物は記載され得る。合成メチロトロフィーを生成するために外因性酵素が導入される宿主細胞は「非メチロトロフィー」と記載することができ、すなわち、操作なしの宿主細胞は、エネルギー源として１Ｃ炭素を利用することができない。非メチロトロフィーであり、そして本開示の外因性酵素で操作され得る微生物は本明細書中に記載されるように、E. coliならびに他の原核生物および真核生物を含む。
【０２１８】
用語「単離された」は微生物に関して使用される場合、参照された微生物が天然に見出されるように、少なくとも１つの構成要素を実質的に含まない生物を意味することが意図される。このタームはその天然環境において見出されるように、いくつかのまたは全ての成分から除去される微生物を含む。このタームはまた、微生物が天然に存在しない環境において見出されるとき、いくつかのまたは全ての成分から除去される微生物を含む。
【０２１９】
いくつかの態様において、本開示の外因性酵素をコードする核酸は、遺伝子破壊を伴う細胞に導入される。用語「遺伝子破壊」、またはその文法的等価物は、コードされた遺伝子産物を不活性または弱化させる遺伝子改変を意味することを意図する。遺伝的改変は例えば、遺伝子全体の欠失、転写または翻訳に必要な調節配列の欠失、切断された遺伝子産物をもたらす遺伝子の一部の欠失、またはコードされた遺伝子産物を不活性化または減弱させる様々な突然変異戦略のいずれかであり得る。遺伝子破壊の１つの特に有用な方法は、遺伝的復帰突然変異の発生を減少または排除するので、完全な遺伝子欠失である。遺伝子破壊の表現型への影響はヌル変異であり得、不活性化点突然変異、遺伝子の全欠失、染色体断片または染色体全体の欠失など、多くのタイプの突然変異から生じる可能性がある。特定アンチセンス核酸化合物および酵素阻害剤（例えば、抗生物質）はまた、ヌル変異体表現型を産生し得、したがって、遺伝子破壊と同等である。
【０２２０】
代謝修飾は、その天然に存在する状態から変化した生化学反応を指す。従って、微生物は、代謝ポリペプチドをコードする核酸、またはその機能的断片に対する遺伝子改変を有し得る。例示的な代謝修飾が本明細書に開示される。
【０２２１】
本明細書中に提供される微生物は安定な遺伝子改変を含み得、これは改変を失うことなく５世代を超えて培養され得る微生物をいう。一般に、安定な遺伝子改変は１０世代を超えて持続する改変を含み、特に安定な改変は約２５世代を超えて持続し、より詳細には、安定な遺伝子改変が無期限を含む５０世代を超える。
【０２２２】
当業者は、本明細書に例示される代謝修飾を含む遺伝子改変がE. coliなどの適切な宿主生物およびそれらの対応する代謝反応、または所望の代謝経路のための遺伝子などの所望の遺伝物質のための適切な供給源生物を参照して記載されることを理解するのであろう。しかし、多種多様な生物の完全なゲノム配列決定およびゲノム学の分野における高レベルの技術が与えられると、当業者は、本明細書中に提供される教示およびガイダンスを、本質的に全ての他の生物に容易に適用し得る。例えば、本明細書に例示されるE. coli代謝改変は、参照される種以外の種由来の同一または類似のコード核酸を組み込むことによって、他の種に容易に適用され得る。このような遺伝的変化には、例えば、一般的に、および特に、オルソログ、パラログまたはそのようなオルソログ遺伝子置換の、種相同体の遺伝的変化が含まれる。
【０２２３】
種々の微生物が、細胞が合成または増強されたメチロトロフィーを有することを可能にするタンパク質をコードする１つ以上の核酸を組み込むために適切であり得る。そのような生物には古細菌および真正細菌を含む細菌、ならびに酵母、プラント、昆虫、動物、およびヒトを含む哺乳動物を含む真核生物を含むが、これらに限定されない、原核生物および真核生物の両方が含まれる。代表的な種は米国特許公報に報告されている。例えば、Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Candida boidinii, Clostridium kluyveri, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium tetanomorphum, Clostridium tetani, Clostridium propionicum, Clostridium aminobutyricum, Clostridium subterminale, Clostridium sticklandii, Ralstonia eutropha, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Porphyromonas gingivalis, Arabidopsis thaliana, Thermus thermophilus, Pseudomonas species, including Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Oryctolagus cuniculus, Rhodobacter spaeroides, Thermoanaerobacter brockii, Metallosphaera sedula, Leuconostoc mesenteroides, Chloroflexus aurantiacus, Roseiflexus castenholzii, Erythrobacter, Simmondsia chinensis, Acinetobacter species, including Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter baylyi, Porphyromonas gingivalis, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, Bacillus pumilus, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Euglena gracilis, Treponema denticola, Moorella thermoacetica, Thermotoga maritima, Halobacterium salinarum, Geobacillus stearothermophilus, Aeropyrum pernix, Sus scrofa, Caenorhabditis elegans, Corynebacterium glutamicum, Acidaminococcus fermentans, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus, Enterobacter aerogenes, Candida, Aspergillus terreus, Pedicoccus pentosaceus, Zymomonas mobilus, Acetobacter pasteurians, Kluyveromyces lactis, Eubacterium barkeri, Bacteroides capillosus, Anaerotruncus colihominis, Natranaerobius thermophilusm, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Serratia marcescens, Citrobacter amalonaticus, Myxococcus xanthus, Fusobacterium nuleatum, Penicillium chrysogenum, marine gamma proteobacterium, butyrate-producing bacterium, Nocardia iowensis, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Schizosaccharomyces pombe, Geobacillus thermoglucosidasius, Salmonella typhimurium, Vibrio cholera, Heliobacter pylori, Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Haloferax mediterranei, Agrobacterium tumefaciens, Achromobacter denitrificans, Fusobacterium nucleatum, Streptomyces clavuligenus, Acinetobacter baumanii, Mus musculus, Lachancea kluyveri, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma brucei, Pseudomonas stutzeri, Bradyrhizobium japonicum, Mesorhizobium loti, Bos taurus, Nicotiana glutinosa, Vibrio vulnificus, Selenomonas ruminantium, Vibrio parahaemolyticus, Archaeoglobus fulgidus, Haloarcula marismortui, Pyrobaculum aerophilum, Mycobacterium smegmatis MC2 155, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10, Mycobacterium marinum M, Tsukamurella paurometabola DSM 20162, Cyanobium PCC7001, Dictyostelium discoideum AX4、ならびに本明細書中に開示されるか、または対応する遺伝子の供給源生物として利用可能な他の例示的な種。
【０２２４】
特定の実施形態において、適当な生物はAcinetobacter baumannii Naval-82, Acinetobacter sp. ADP1, Acinetobacter sp. strain M-1, Actinobacillus succinogenes 130Z, Allochromatium vinosum DSM 180, Amycolatopsis methanolica, Arabidopsis thaliana, Atopobium parvulum DSM 20469, Azotobacter vinelandii DJ, Bacillus alcalophilus ATCC 27647, Bacillus azotoformans LMG 9581, Bacillus coagulans 36D1, Bacillus megaterium, Bacillus methanolicus MGA3, Bacillus methanolicus PB1, Bacillus methanolicus PB-1, Bacillus selenitireducens MLS10 , Bacillus smithii, Bacillus subtilis , Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia multivorans, Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia stabilis, Burkholderia thailandensis E264, Burkholderiales bacterium Joshi_001, Butyrate-producing bacterium L2-50, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida boidinii, Candida methylica, Carboxydothermus hydrogenoformans, Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901, Caulobacter sp. AP07, Chloroflexus aggregans DSM 9485, Chloroflexus aurantiacus J-10-fl, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri ATCC BAA-895, Citrobacter youngae , Clostridium, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Clostridium acidurici, Clostridium aminobutyricum, Clostridium asparagiforme DSM 15981, Clostridium beijerinckii , Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, Clostridium bolteae ATCC BAA-613, Clostridium carboxidivorans P7, Clostridium cellulovorans 743B, Clostridium difficile, Clostridium hiranonis DSM 13275, Clostridium hylemonae DSM 15053, Clostridium kluyveri, Clostridium kluyveri DSM 555, Clostridium ljungdahli, Clostridium ljungdahlii DSM 13528, Clostridium methylpentosum DSM 5476 , Clostridium pasteurianum, Clostridium pasteurianum DSM 525, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens ATCC 13124, Clostridium perfringens str. 13, Clostridium phytofermentans ISDg, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4, Clostridium tetani, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium glutamicum R, Corynebacterium sp. U-96, Corynebacterium variabile, Cupriavidus necator N-1, Cyanobium PCC7001, Desulfatibacillum alkenivorans AK-01, Desulfitobacterium hafniense, Desulfitobacterium metallireducens DSM 15288, Desulfotomaculum reducens MI-1, Desulfovibrio africanus str. Walvis Bay, Desulfovibrio fructosovorans JJ, Desulfovibrio vulgaris str. Hildenborough, Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F', Dictyostelium discoideum  AX4, Escherichia coli, Escherichia coli K-12 , Escherichia coli K-12 MG1655, Eubacterium hallii DSM 3353 , Flavobacterium frigoris, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 , Geobacillus sp. Y4.1MC1, Geobacillus themodenitrificans NG80-2, Geobacter bemidjiensis Bem, Geobacter sulfurreducens, Geobacter sulfurreducens PCA, Geobacillus stearothermophilus DSM 2334, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobacter thermophilus TK-6, Hyphomicrobium denitrificans ATCC 51888, Hyphomicrobium zavarzinii, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, Lactobacillus brevis ATCC 367, Leuconostoc mesenteroides, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus sphaericus, Mesorhizobium loti MAFF303099, Metallosphaera sedula, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina acetivorans C2A, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei Tuc01, Methylobacter marinus, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium extorquens AM1, Methylococcus capsulatas, Methylomonas aminofaciens, Moorella thermoacetica, Mycobacter sp. strain JC1 DSM 3803, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium gastri , Mycobacterium marinum M, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium smegmatis MC2 155, Nitrosopumilus salaria BD31, Nitrososphaera gargensis Ga9.2, Nocardia farcinica IFM 10152, Nocardia iowensis (sp. NRRL 5646), Nostoc sp. PCC 7120, Ogataea angusta, Ogataea parapolymorpha DL-1 (Hansenula polymorpha DL-1), Paenibacillus peoriae KCTC 3763, Paracoccus denitrificans, Penicillium chrysogenum, Photobacterium profundum 3TCK, Phytofermentans ISDg, Pichia pastoris, Picrophilus torridus DSM9790, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas gingivalis W83, Pseudomonas aeruginosa PA01, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas knackmussii, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, Pyrobaculum islandicum DSM 4184, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii OT3, Ralstonia eutropha, Ralstonia eutropha H16, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas palustris CGA009, Rhodopseudomonas palustris DX-1, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum rubrum ATCC 11170, Ruminococcus obeum ATCC 29174, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae S288c, Salmonella enterica, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2, Salmonella enterica typhimurium , Salmonella typhimurium, Schizosaccharomyces pombe, Sebaldella termitidis ATCC 33386 , Shewanella oneidensis MR-1, Sinorhizobium meliloti 1021, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350, Sulfolobus acidocalarius, Sulfolobus solfataricus P-2, Synechocystis str. PCC 6803, Syntrophobacter fumaroxidans, Thauera aromatica, Thermoanaerobacter sp. X514, Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus litoralis, Thermoplasma acidophilum, Thermoproteus neutrophilus, Thermotoga maritima, Thiocapsa roseopersicina, Tolumonas auensis DSM 9187, Trichomonas vaginalis G3, Tsukamurella paurometabola DSM  20162, Vibrio harveyi ATCC BAA-1116, Xanthobacter autotrophicus Py2,  and Yersinia intermedia。
【０２２５】
したがって、合成または増強されたメチロトロフィーを有する組換え細胞は、酵素Ａおよび（ｂ）外因性の構成Ｂを含む。酵素Ａは、（ａｉ）グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）に変換することができる酵素Ａであるか、（ａｉｉ）配列番号１（B. methanolicus  gapN）と少なくとも５０％の配列同一性を有する酵素Ａであるか、酵素ＡはNADPを還元してNADPHすることができ、（ａｉｉｉ）酵素Ａは、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、もしくは（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、もしくは（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼである酵素Ｂであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼである酵素Ｂであるか、もしくは（ｂｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、そのような（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組み合わせである。また、１つ以上の中間体そのようなその製品のレベルを増加させるために所望される、挿入された導入遺伝子、欠失、突然変異などの、１つ以上のさらなる遺伝子改変を含み得る。米国特許公開第２０１４／００５８０５６号（Ｂｕｒｇａｒｄら）に記載されているような遺伝子修飾にはＷＯ２００９／１３５０７４（Ｂｕｒｋら）に記載されているような遺伝子修飾が含まれ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２６】
特に興味深いのは、ピルビン酸とアセチルＣｏＡを製品経路の進入点前駆体として用いて得られた標的産物である。これは一部には新規酵素を用いたメタノール代謝経路がメタノールの炭素をピルビン酸とアセチルＣｏＡへの経路に固定することを可能にしているためである。目的生成物には、（ａ）１，４−ブタンジオールおよびその中間体、例えば４−ヒドロキシブタン酸（４−ヒドロキシブタノエート、４−ＨＢ）、（ｂ）ブタジオール、１，３−ブタンジオール、３−ブテン−２−オール（メチルビニルカルビノール）および３−ブテン−１−オール、（ｃ）１，３−ブタンジオールおよびその中間体、例えば２，４−ペンタジエノエート、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール、（ｄ）アジペート、６−アミノカプロラクタム、ヘキサメチレンジアミンおよびそれらの中間体が含まれる。４−アミノブチリル−メタクリル酸（２−メチル−２−プロペン酸）及びそのエステル（メタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、３−ヒドロキシイソブチレート及び／又は２−ヒドロキシイソブチレート等）、（ｆ）１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、ｎ−プロパノール、１，３−プロパンジオール及びグリセロール並びにこれらの中間体、（ｇ）コハク酸及びその中間体、を含む。
【０２２７】
いくつかの態様では、（ａ）酵素Ａおよび（ｂ）酵素Ｂを含む。酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができ、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するか、または（ａｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉ）または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、もしくは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）うちの任意の組み合わせある。また、そのような組換え細胞が、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）またはヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）の増加したレベルのための産物経路と共に使用される。当業者は本明細書中に提供される教示およびガイダンスを特定の種に適用することにより、代謝改変の同定が、オルソログの同定および包含または不活性化を含み得ることを理解する。類似または実質的に類似の代謝反応を触媒する酵素をコードするパラログおよび／または非オルソロジー遺伝子置換が、参照される微生物中に存在する程度まで、当業者はまた、これらの進化的に関連する遺伝子を利用し得る。
【０２２８】
３９５種の微生物ゲノムおよび種々の酵母、真菌、プラントおよび哺乳動物ゲノムを含む現在５５０種を超えるゲノム配列（そして、これらの半数以上がＮＣＢＩなどの公的データベース上で利用可能である）とともに、必要なＢＤＯまたは４−ＨＢ生合成経路ならびに１，３−ブタンジオール（１３ＢＤＯ）、６−アミノカプロン酸（６ＡＣＡ）、アジピン酸またはその誘導体、クロイトルアルコール、メチルビニルカルビノール、３−ブテン−１−オール、コハク酸またはその誘導体、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、メタクリル酸またはその誘導体、メタノール代謝および／またはホルムアルデヒド同化活性をコードする遺伝子の同定（例えば、同族体、オルソログを含む）既知の遺伝子のパラログおよび非オルソログ遺伝子置換、ならびに生物間の遺伝的変化の交換は、当技術分野において日常的かつ周知である。したがって、１，３−ブタンジオール（１３ＢＤＯ）、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）、４−ＨＢ、ブタジエン、６−アミノカプロン酸（６ＡＣＡ）、ヘキサメチルジアミン（ＨＭＤＡ）、アジピン酸またはその誘導体、クロイチルアルコール、メチルビニルカルビノール、３−ブテン−１−オール、コハク酸またはその誘導体、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、プロピレン、メタクリル酸またはその誘導体を含む種々の標的生成物の生合成を可能にする代謝変化、メタノールの代謝および／またはE. coliなどの特定の生物を参照して本明細書に記載されるホルムアルデヒドの同化は、原核生物および真核生物を含む他の微生物にも同様に容易に適用することができる。本明細書中に提供される教示およびガイダンスを考慮すると、当業者は、１つの生物において例示される代謝改変が他の生物に等しく適用され得ることを知る。
【０２２９】
例示的なアルコール代謝経路遺伝子（例えば米国の特許公開２０１４／００５８０５６号明細書に記述されているようなもの）は、次の群から選択されるタンパク質をコードし、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂとともに組換え細胞内で発現する。当該群としては、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒド活性化酵素、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｓ−（ヒドロキシメチル）グルタチオンシンターゼ、グルタチオン依存性ホルムアルデヒドロゲナーゼ、Ｓ−ホルミルグルタチオンヒドロラーゼ、ギ酸水素リアーゼ、およびヒドロゲナーゼから少なくともなる。ここで、外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元でき、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、（ａｉ）および（ａｉｉ）であるか、または、（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また、外因性酵素Ｂは、組換え細胞内において、（ｂ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼ、または（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組み合わせとして機能する。
【０２３０】
他の例示的なアルコール代謝経路遺伝子（例えば米国の特許公開２０１４／００５８０５６号明細書に記述されているようなもの）は、次の群から選択されるタンパク質をコードし、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂとともに組換え細胞内で発現する。当該群としては、スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、４−ヒドロキシ酪酸（４−ＨＢ）デヒドロゲナーゼ、４−ＨＢキナーゼ、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、コハク酸レダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼ、４−ＨＢレダクターゼ、および４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、およびスクシニルＣｏＡシンテターゼから少なくともなる。ここで、外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元でき配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性をもつか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１、６−ビスホスファターゼであるか、（ａｉ）および（ａｉｉｉ）であるか、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、または（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。
【０２３１】
４−ヒドロキシ酪酸（４−ヒドロキシブタン酸、４−ヒドロキシブチレート、４−ＨＢ）といった１，４−ブタンジオールおよびその中間体は、標的生成物であり、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを、本明細書において説明する生成経路あるいは、以下に例示する文献において説明する生成経路に沿って発現する。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また、外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉ）のいずれかの組み合わせである。適切な生成物経路および酵素、スクリーニングのための方法および単離のための方法は、以下の文献において開示されており、本書でも援用する。「１、４−ブタンジオールおよびその前駆体の生合成のための組成物および方法」と題するＷＯ２００８１１５８４０Ａ２、「発酵ブロスの構成要素を分離する工程」と題するＷＯ２０１０１４１７８０Ａ１、「１、４−ブタンジオールおよび関連方法の製造のための微生物」と題するＷＯ２０１０１４１９２０Ａ２、２０１０年３月１８日に公開された  ２０１０年６月２４日に発行された「合成ガス及びその他の炭素源の有用な製品への変換のための微生物及び方法」、２００９年７月３０日に発行された「合成ガス又はその他のガス状炭素源及びメタノールの使用のための方法及び生物」、２００９年２月１９日に発行された「１，４−ブタンジオールの増殖カップル生産のための方法及び生物」、２００８年９月２５日に発行された「１，４−ブタンジオール及びその前駆体の組成及び方法」、及び２０１３年８月２７日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／５６７２５号「微生物、メタノール存在下での同等物の利用可能性を高める方法及びそれに関連する１，４−ブタンジオールの製造方法」。
【０２３２】
１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコール、３−ブテン−２−オール（メチルビニルカルビノール）、および３−ブテン−１−オールのようなブタジエンおよびその中間体は、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを、本明細書において説明する生成経路あるいは、以下に例示する文献において説明する生成経路に沿って共発現することによって生成することができる標的生成物である。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは、（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）のいずれかの組み合わせである。ブタジエンを製造するための直接発酵に加えて、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、クロチルアルコール、３−ブテン−２−オール（メチルビニルカルビノール）および３−ブテン−１−オールを分離し、精製し（任意の使用のために）、次いで、金属ベースの触媒を含む第２の工程においてブタジエンに脱水することができる。適切な生成経路や酵素、および単離方法は、以下の文書に見出され、参照により本明細書に組み込まれる。「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene」と題する２０１１年１１月１０日に公開されたＷＯ２０１１１４０１７１Ａ２、「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Aromatics, 2,4-Pentadienoate and 1,3-Butadiene」と題する２０１２年２月９日に公開されたＷＯ２０１８６２４Ａ２、「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene」と題する２０１１年１１月１０日に公開されたＷＯ２０１１１４０１７１Ａ２、「Microorganisms and Methods for Producing Alkenes」と題する２０１３年３月２１日に公開されたＷＯ２０１３０４０３８３Ａ１、「Microorganisms for Producing Butadiene and Methods Related thereto」と題する２０１２年１２月２７日に公開されたＷＯ２０１２１７７１０Ａ１、「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene」と題する２０１２年８月９日公開のＷＯ２０１２１０６５１６Ａ１、「Microorganisms and Methods for Producing 2,4-Pentadienoate, Butadiene, Propylene, 1,3-Butanediol and Related Alcohols」と題する２０１３年２月２８日公開のＷＯ２０１３０２８５１９Ａ１、および米国特許出願公開第２０１５／００５０７０８号明細書。
【０２３３】
１，３−ブタンジオール及びその中間体（例えば２，４−ペンタジエノエート、クロチルアルコール又は３−ブテン−１−オール）は、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを、本明細書において説明する生成経路あるいは、以下に例示する文献において説明する生成経路に沿って共発現することによって生成することができる標的生成物である。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。適切な生成経路や酵素、および単離方法は、以下の文書に見出され、参照により本明細書に組み込まれる。「Methods and Organisms for Converting Synthesis Gas or Other Gaseous Carbon Sources and Methanol to 1, 3-Butanediol」と題する２０１１年６月１６日公開のＷＯ２０１１０３１８９７Ａ、「Microorganisms and Methods for the Co-Production of Isopropanol with Primary Alcohols, Diols and Acids」と題する２０１１年３月１７日公開のWO2011031897A、「Organisms for the Production of 1,3-Butanediol」と題する２０１０年１１月４日公開のＷＯ２０１０１２７３１９Ａ２、「Eukaryotic Organisms and Methods for Increasing the Availability of Cytosolic Acetyl-CoA, and for Producing 1,3-Butanediol」と題する２０１３年５月１６日公開のＷＯ２０１３０７１２２６Ａ１、「Microorganisms and Methods for Producing 2,4-Pentadienoate, Butadiene, Propylene, 1,3-Butanediol and Related Alcohols」と題する２０１３年２月２８日公開のＷＯ２０１３０２８５１９Ａ１、「Eukaryotic Organisms and Methods for Producing 1,3-Butanediol」と題する２０１３年３月１４日公開のＷＯ２０１３０３６７６４Ａ１、「Methods for Increasing Product Yields」と題する２０１３年１月２４日公開のＷＯ２０１３０１２９７５Ａ１、「Microorganisms for Producing 1, 3-Butanediol and Methods Related Thereto」と題する２０１２年１２月２７日公開のＷＯ２０１２１７７６１９Ａ２、および米国特許出願公開第２０１５／００５０７０８号明細書。
【０２３４】
アジピン酸、６−アミノカプロン酸、カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン及びレブリン酸、並びにこれらの中間体（例えば４−アミノブチリル−ＣｏＡ）は、標的生成物であり、例えばナイロンポリマーを作る際に有用であるものである。この標的生成物は、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを、本明細書において説明する生成経路あるいは、以下に例示する文献において説明する生成経路に沿って共発現することによって生成することができる。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。適切な生成経路および酵素、スクリーニングのための方法、ならびに単離のための方法は、本明細書中に参考として援用される。「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Adipate, Hexamethylenediamine and 6-Aminocaproic Acid」と題する２０１０年１１月１１日公開のＷＯ２０１０１２９９３６Ａ１、「Methods for Increasing Product Yields」と題する２０１３年１月２４日公開のＷＯ２０１３０１２９７５Ａ１、「Microorganisms for Producing 6-Aminocaproic Acid」と題する２０１２年１２月２７日公開のＷＯ２０１２１７７７２１Ａ１、「Methods for Increasing Product Yields」と題する２０１２年７月２６日公開のＷＯ２０１２０９９６２１Ａ１、および「Microorganisms an Methods for Enhancing the Availability of Reducing Equivalents in the Presence of Methanol, and for Producing Adipate, 6-Aminocaproate, Hexamethylenediamine or Caprolactam Related Thereto」と題する米国特許出願公開第２０１４/０３２９９１６号明細書。
【０２３５】
メタクリル酸（２−メチル−２−プロペン酸；集合的にメタクリル酸メチルとして知られる、ポリマーの調製において最も顕著に使用される）、メタクリル酸エステル（例えばメタクリル酸メチル、３−ヒドロキシイソブチレートおよび／または２−ヒドロキシイソブチレート）、およびそれらの中間体は、標的生成物であり、例えばポリマーを作る際に有用であるものである。この標的生成物は、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを、本明細書において説明する生成経路あるいは、以下に例示する文献において説明する生成経路に沿って共発現することによって生成することができる。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。適切な生成経路および酵素、スクリーニングのための方法および単離のための方法は、本明細書中ならびに以下の文書（参照により本明細書中に援用される）に見出される。「Microorganisms for Producing Methacrylic Acid and Methacrylate Esters and Methods Related Thereto」と題する２０１２年１０月４日公開のＷＯ２０１２１３５７８９Ａ２、「Microorganisms for the Production of Methacrylic Acid」と題する２００９年１１月５日公開のＷＯ２００９１３５０７４Ａ２、および「Microorganisms an Methods for Enhancing the Availability of Reducing Equivalents in the Presence of Methanol, and for Producing 3-Hydroxyisobutyate or Methacrylic Acid Related Thereto」と題する米国特許出願公開第２０１４／０２８８２５４号明細書。
【０２３６】
図８は例示的な標的生成物経路、アセチルＣｏＡ／メチルメタクリレート（ＭＭＡ）から２−ヒドロキシイソ酪酸およびメタクリル酸への生成経路を示す。これは本明細書に開示されるようなメタノール同化から入手可能なアセチルＣｏＡを利用することができる。２−ヒドロキシイソ酪酸およびメタクリル酸の産生は、以下の酵素によって実施することができる。Ａ）アセチルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ケトン還元）、Ｃ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡムターゼ（3-hydroxybutyrl-CoA mutase）、Ｄ）２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（2-hydroxyisobutyryl-CoA dehydratase）、Ｅ）メタクリリルＣｏＡシンセターゼ（methacrylyl-CoA synthetase）、ヒドロラーゼ、またはトランスフェラーゼ、Ｆ）２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡシンセターゼ（methacrylyl-CoA synthetase）、ヒドロラーゼ、またはトランスフェラーゼ。
【０２３７】
１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、ｎ−プロパノール、１，３−プロパンジオール、およびグリセロール、並びにそれらの中間体は、標的生成物であり、例えばポリマーを作る際に有用であるものである。この標的生成物は、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを、本明細書において説明する生成経路あるいは、以下に例示する文献において説明する生成経路に沿って共発現することによって生成することができる。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。適切な生成経路および酵素、スクリーニングのための方法、ならびに単離のための方法は、本明細書中、ならびに参照により本明細書中に援用される。「Primary Alcohol Producing Organisms」と題する２００９年１１月９日に公開されたＷＯ２００９１１１６７２Ａ１、「Microorganisms and Methods for the Co-Production of Isopropanol with Primary Alcohols, Diols and Acids」と題する２０１１年３月１７日ＷＯ２０１１０３１８９７Ａ１、「Microorganisms for Producing N-Propanol 1, 3-Propanediol, 1, 2-Propanediol or Glycerol and Methods Related Thereto」と題する２０１２年１２月２７日に公開されたＷＯ２０１２１７７５９９Ａ２、および「Microorganisms an Methods for Enhancing the Availability of Reducing Equivalents in the Presence of Methanol, and for Producing 1,2-Propanediol, n-Propanol, 1,3-Propanediol, or Glycerol Related Thereto」と題する米国特許公開第２０１４／０３０２５７５号明細書。
【０２３８】
コハク酸およびその中間体は、標的生成物であり、例えばＰＢＳ、１，４−ブタンジオール、テトラヒドロフラン、ピロリドン、塗料、除氷剤、合成樹脂、燃料添加剤、溶剤、織物、カーペット、顔料、および洗剤といったポリマーを含む生成物を製造するのに有用である。この標的生成物は、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを、本明細書において説明する生成経路あるいは、以下に例示する文献において説明する生成経路に沿って共発現することによって生成することができる。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。適切な生成経路および酵素、スクリーニングのための方法、ならびに単離のための方法は、本明細書中、ならびに参照により本明細書中に援用される。「Methods and Organisms for the Growth-Coupled Production of Succinate」と題する２００８年７月２日公開のＥＰ１９３７８２１Ａ２、および「Microorganisms and Methods for Enhancing the Availability of Reducing Equivalents in the Presence of Methanol, and for Producing Succinate Related Thereto」と題する米国特許公開第２０１４／０３０２５７５号明細書。
【０２３９】
（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを宿主細胞において共発現して得られる標的生成物と、その好適な生成方法は、以下の文献に記載されている。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。例えば１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコール、３−ブテン−２−オール（メチルビニルカルビノール）、および３−ブテン−１−オールなどのブタジエンおよびそれらの中間体は、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを、本明細書において説明する生成経路あるいは、以下に例示する文献において説明する生成経路に沿って共発現することによって生成することができる。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。加えて、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、クロチルアルコール、３−ブテン−２−オール（メチルビニルカルビノール）、および３−ブテン−１−オールは、あらゆる用途で精製され、その後に、金属ベースの触媒反応を含む第２のステップにおいて脱水されてブタジエンになる。適切な生成経路および酵素、スクリーニングのための方法、ならびに単離のための方法は、本明細書中、ならびに参照により本明細書中に援用される。「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene」と題する２０１１年１１月１０日公開のＷＯ２０１１１４０１７１Ａ２、「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Aromatics, 2, 4-Pentadienoate and 1, 3-Butadiene」と題する２０１２年２月９日公開のＷＯ２０１２０１８６２４Ａ２、「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene」と題する２０１１年１１月１０日に公開されたＷＯ２０１１１４０１７１Ａ２、「Microorganisms and Methods for Producing Alkenes」と題する２０１３年３月２１日に公開されたＷＯ２０１３０４０３８３Ａ１、「Microorganisms for Producing Butadiene and Methods Related thereto」と題する２０１２年１２月２７日に公開されたＷＯ２０１２１７７７１０Ａ１、「Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene」と題する２０１２年８月９日に公開されたＷＯ２０１２１０６５１６Ａ１、「Microorganisms and Methods for Producing 2,4-Pentadienoate, Butadiene, Propylene, 1,3-Butanediol and Related Alcohols」と題する２０１３年２月２８日に公開されたＷＯ２０１３０２８５１９Ａ１、および米国特許公開第２０１５／００５０７０８号。
【０２４０】
アセチル−ＣｏＡ、サシニル−ＣｏＡからＢＤＯなどの種々の生成物へのエンジニアリング経路の酵素、遺伝子および方法は、現在、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許公開２０１１／０２０１０８９号明細書参照）。例えば、コハク酸またはα−ケトグルタル酸をＢＤＯに変換することができる一群の酵素を表したＢＤＯ経路酵素のセットを、図７に示す。例えば、ＢＤＯは以前に開示された経路を介して、スクシニル−ＣｏＡから産生することができる（例えば、Ｂｕｒｋら、ＷＯ２００８／１１５８４０参照）。図７は一次代謝産物、例えば、本明細書に記載されるように、メタノールを炭素源として使用することによって利用可能にされるアセチル−ＣｏＡを使用することができる例示的な経路を示す。図７において、生物は、ＢＤＯを産生するのに十分な量で発現されるＢＤＯ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。特定の実施形態において、ＢＤＯ経路酵素は、（１）スクシニル−ＣｏＡシンセターゼ、（２）ＣｏＡ非依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、（３）α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、（４）グルタミン酸：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、（５）グルタミン酸デカルボキシラーゼ、（６）ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（７）４−ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ、（８）α−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ、（９）４−ヒドロキシブチルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、（１０）酪酸キナーゼ、（１１）ホスホトランスブチリラーゼ、（１２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ、および（１３）アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される。好ましい経路には、α−ケトグルタル酸からの経路、例えば、工程８、７、９、１２および１３；工程３、６、７、９、１２および１３；ならびに工程１、６、７、９、１２、１３が含まれる。あるいは、単一のタンパク質が工程１２および１３の活性を含み得る。特定の酵素、酵素のクラスおよび酵素の供給源ならびにそれらの遺伝子は例えば、ＷＯ２００８１１５８４０に見出すことができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを含み、標的生成物分子の製造に使用することができる還元当量の度合いを向上させるために操作された生物を提供するものである。ここで、（ａ）外因性酵素Ａは、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。その生産において還元当量を利用する任意の産物分子は他の生合成経路を介して増強された生産を示し得ることが、当業者によって認識される。
【０２４２】
多くの操作された経路において、炭水化物供給原料に基づく最大生成物収率の実現は、不十分な還元当量によって、または副生成物に対する還元当量の損失によって妨げられる。メタノールは、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂ、並びに１つ以上の代謝酵素を用いことによって還元当量を生成するために使用することができる比較的安価な生物のフィードストックである。ここで（ａ）外因性酵素Ａは、、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また、（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。メタノールの代謝によって生産される還元当量は、次いで、図７に示すように、グルコースをＢＤＯ生成経路に動かすために使用され得る。
【０２４３】
図７は一次代謝産物、例えば、本明細書に記載されるように、メタノールを炭素源として使用することによって利用可能にされるアセチル−ＣｏＡを使用することができる例示的な経路を示す。図７において、生物は、ＢＤＯを産生するのに十分な量で発現されるＢＤＯ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。特定の実施形態において、ＢＤＯ経路酵素は、（１）スクシニル−ＣｏＡシンセターゼ；（２）ＣｏＡ非依存性こはく酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（３）α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ；（４）グルタミン酸：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ；（５）グルタミン酸デカルボキシラーゼ；（６）ＣｏＡ依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（７）４−ヒドロキシブタン酸デヒドロゲナーゼ；（８）α−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；（９）４−ヒドロキシブチルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ；（１０）酪酸キナーゼ；（１１）ホスホトランスブチリラーゼ；（１２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ；および（１３）アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される。好ましい経路には、α−ケトグルタル酸からの経路、例えば、工程８、７、９、１２および１３；工程３、６、７、９、１２および１３；ならびに工程１、６、７、９、１２、１３が含まれる。あるいは、単一のタンパク質が工程１２および１３の活性を含み得る。特定の酵素、酵素のクラスおよび酵素の供給源ならびにそれらの遺伝子は例えば、ＷＯ２００８１１５８４０Ａ２に見出すことができる。
【０２４４】
コハク酸塩およびスクシニルＣｏＡからＢＤＯなどの種々の生成物へのエンジニアリング経路の、微生物への酵素、遺伝子および方法は、現在、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許公開２０１１／０２０１０８９号明細書参照）。例えば、コハク酸またはα−ケトグルタル酸をＢＤＯに変換することができる一群の酵素を表したＢＤＯ経路酵素のセットを、図７に示す。加えて、ＭｅＤＨ経路から得られる還元当量は、本明細書に開示するように、炭水化物ベースの供給原料を利用する場合、これらの製品すべての収率を改善する。例えば、ＢＤＯは以前に開示された経路を介してスクシニル−ＣｏＡから産生することができる（例えば、Ｂｕｒｋら、ＷＯ２００８／１１５８４０参照）。
【０２４５】
他の実施形態では、生物が、（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂ、およびそれらだけかあるいはＢＤＯまたはメタクリル酸経路と組み合わせて有する。ここでの経路とは、第２のホルムアルデヒド同化経路（ＦＡＰ）をさらに含む。ここで（ａ）外因性酵素Ａは、、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる酵素Ａにおいて、配列番号１に少なくとも５０％の配列同一性を有しているか、または（ａｉｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼであるか、または（ａｉ）および（ａｉｉｉ）、または（ａｉｉ）および（ａｉｉｉ）である。また、（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、あるいは（ｂｉ）、（ｂｉｉ）及び（ｂｉｉｉ）の任意の組合せである。第２のＦＡＰはまた、例えばバイオマスの形成において使用され得る特定の中心代謝経路の中間体の形成において、一次経路によって利用されないホルムアルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド）を利用し得る。
【０２４６】
図４を参照すると、第２のホルムアルデヒド同化経路において、生物は、ｇａｐＮ、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロースイソメラーゼ、およびホスホケトーラーゼタンパクタンパク質とは異なる、ホルムアルデヒド同化経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む。第２のホルムアルデヒド同化経路の酵素は、バイオマスの形成において使用され得る解糖の中間体および／または代謝経路を産生するのに十分な量で発現され得る。一実施形態では、第２のホルムアルデヒド同化経路酵素が解糖の中間体を産生するのに十分な量で発現される。別の実施形態において、第２のホルムアルデヒド同化経路酵素は、バイオマスの形成において使用され得る代謝経路の中間体を産生するのに十分な量で発現される。いくつかの実施形態では、第２のホルムアルデヒド同化経路がジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）シンターゼまたはＤＨＡキナーゼを含む。好ましいＤＨＡ経路は図４のＤＨＡ経路１であり、これはＤＨＡ（ジヒドロキシアセトン）シンターゼの組み合わせ、例えばＥＣ２．２．１．３（工程６）およびＦ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）アルドラーゼ（工程７）である。一実施形態では、中間体がＤＨＡ、ＤＨＡリン酸塩、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、生物がそれぞれが第２のホルムアルデヒド同化経路酵素をコードする２つの外因性核酸を含む。
【０２４７】
（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを有する組換え微生物細胞は、加えて、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を通って進行する経路を有することができる。ここで、先の（ａ）外因性酵素は、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するか、または（ａｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、または（ａｉ）および（ａｉｉ）または（ａｉｉ）および（ａｉｉ）である。また、先の（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、（ｂｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、または（ｂｉｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組み合わせである。酵素のＲｕＭＰ経路およびＤＨＡ経路の両方は、ホルムアルデヒドの解毒および同化のためであり得る。図４に示すように、トランスケトラーゼは、まず、グリコールアルデヒド群をキシルロース−５−リン酸からホルムアルデヒドに転写させ（工程６、図４）、その結果、解糖の中間体であるＤＨＡおよびＧ３Ｐが形成される。次いで、ＤＨＡシンターゼから得られたＤＨＡは、ＤＨＡキナーゼによってさらにリン酸化されてＤＨＡリン酸（ＤＨＡＰ）を形成する。ＤＨＡＰは、解糖およびいくつかの他の経路に同化され得る。あるいは、ＤＨＡおよびＧ３Ｐがフルクトース−６−リン酸アルドラーゼによって変換されて、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）を形成し得る（図４、工程７）。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、少なくとも（ａ）外因性酵素Ａおよび（ｂ）外因性酵素Ｂを有する組換え微生物細胞は、加えて、図４に示すように、ヘキソース−６−リン酸（Ｈ６Ｐ）を通って進行する経路を有することもでき、ヘキソース−６−リン酸（Ｈ６Ｐ）を通って進行する経路は任意選択でＭｅＤＨを使用することができる。例えば、本開示の操作された細胞はＤＨＡ経路のＭｅＤＨ酵素およびＲｕＭＰ経路のＭｅＤＨ酵素を含み得、これはホルムアルデヒドの解毒および同化のためであり得る。ここで、先の（ａ）外因性酵素は、（ａｉ）Ｇ３Ｐを３ＰＧに変換することができるか、（ａｉｉ）ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができる配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するか、または（ａｉｉ）フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、または（ａｉ）および（ａｉｉ）または（ａｉｉ）および（ａｉｉ）である。また、先の（ｂ）外因性酵素Ｂは、（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼであるか、（ｂｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼであるか、（ｂｉｉ）ホスホケトラーゼであるか、または（ｂｉｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）の任意の組み合わせである。
【０２４９】
当業者は、メタノール単独または他の炭水化物と組み合わせたような炭素源上で増殖させた場合に生合成化合物を分泌する生物を操作することができることを理解するのであろう。このような化合物には、例えば、メタクリル酸、ＢＤＯ、およびメタクリル酸またはＢＤＯ経路における中間代謝産物のいずれかが含まれる。必要なことは、例えば、メタクリル酸またはＢＤＯ生合成経路の一部または全部の包含を含む、所望の化合物または中間体の生合成を達成するために、必要な酵素またはタンパク質活性の１つ以上を操作することだけである。したがって、本明細書では、炭水化物または他の炭素源上で増殖させた場合にメタクリル酸またはＢＤＯを産生および／または分泌し、炭水化物または他の炭素源上で増殖させた場合に製品経路に示される中間代謝製品のいずれかを産生および／または分泌する生物が提供される。本明細書中に提供されるメタクリル酸またはＢＤＯ産生微生物は、中間体からの合成を開始することができる。ホルムアルデヒド同化における中間体についても同様である。
【０２５０】
一実施形態では、炭素源はメタノールまたはギ酸塩である。特定の実施形態では、メタノールが炭素源として使用される。他の実施形態では、ギ酸塩が炭素源として使用される。特定の実施形態では、メタノールが単独で、または本明細書中に提供される製品経路と組み合わせて、本明細書中に提供される生物における炭素源として使用される。
【０２５１】
一実施形態では、炭素源がメタノール、および糖（例えば、グルコース）または糖含有バイオマスを含む。別の実施形態では、炭素源がギ酸塩、および糖（例えば、グルコース）または糖含有バイオマスを含む。一実施形態では、炭素源がメタノール、ギ酸塩、および糖（例えば、グルコース）または糖含有バイオマスを含む。特定の実施形態では、発酵飼料中のメタノールもしくはギ酸塩、またはその両方は糖（例えば、グルコース）または糖含有バイオマスとの混合物として提供される。特定の実施形態において、糖は、十分な株増殖のために提供される。いくつかの実施形態において、糖（例えば、グルコース）は、２００：１〜１：２００のメタノール対糖のモル濃度比で提供される。特定の実施形態において、炭素源はギ酸塩および糖（例えば、グルコース）を含む。いくつかの実施形態では糖（例えば、グルコース）はギ酸塩対糖のモル濃度比２００：１〜１：２００で提供される。特定の実施形態では、炭素源がメタノールとギ酸塩との混合物、および糖（例えば、グルコース）を含む。特定の実施形態において、糖は、十分な株増殖のために提供される。いくつかの実施形態において、糖（例えば、グルコース）は、２００：１〜１：２００のメタノールおよびギ酸塩対糖のモル濃度比で提供される。
【０２５２】
例えば、メタクリル酸またはＢＤＯの産生について試験するための適切な精製および／または分析は、周知の方法を使用して実施され得る。３連の培養物のような適切な複製物は、試験される各操作された株について増殖され得る。例えば、人工生産宿主における生成物および副生成物の形成をモニターすることができる。最終生成物および中間体、ならびに他の有機化合物は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）などの方法、または当技術分野で周知の通常の方法を使用する他の適切な分析方法によって分析することができる。発酵ブロス中の生成物の放出はまた、培養上清を用いて試験され得る。副産物および残留グルコースは例えば、グルコースおよびアルコールについての屈折率検出器、および有機酸についてのＵＶ検出器（Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)）、または当技術分野で周知の他の適切なアッセイおよび検出方法を使用するＨＰＬＣによって定量され得る。外因性ＤＮＡ配列由来の個々の酵素またはタンパク質活性はまた、当該分野で周知の方法を使用して分析され得る。
【０２５３】
メタクリル酸またはＢＤＯまたは他の標的分子は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して、培養物中の他の構成要素から分離され得る。このような分離方法としては、例えば、連続液抽出、パーベーパレーション、蒸発、濾過、膜濾過（逆浸透、ナノ濾過、限外濾過、および精密濾過を含む）、透析濾過による膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、抽出蒸留、反応蒸留、共沸蒸留、結晶化および再結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、炭素吸着、水素化、および限外濾過を含む方法ならびに抽出手順が挙げられる。上記の方法の全ては、当該分野で周知である。
【０２５４】
標的分子単離プロセスの実施例としては１３ＢＤＯ、１４ＢＤＯ、ブタジエン、メチルビニルカルビノール、３−ブテン−１−オール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、プロピレン、およびクロチルアルコールの蒸留；６ＡＣＡの結晶化（あるいはカプロラクタムに変換され、次いで最終工程として蒸留によって精製され得る）；ＨＭＤＡ、アジピン酸もしくはその誘導体、コハク酸もしくはその誘導体、またはメタクリル酸もしくはその誘導体の結晶化、蒸留、または抽出のいずれかが挙げられる。
【０２５５】
１３ＢＤＯ、１４ＢＤＯ、ブタジエン、メチルビニルカルビノールｎ−プロパノール、イソプロパノール、プロピレン、クロチルアルコール；  ３−ブテン−１−オール、６ＡＣＡ、ＨＭＤＡ、アジピン酸もしくはその誘導体、コハク酸もしくはその誘導体、またはメタクリル酸もしくはその誘導体などの標的分子は、商業的および工業的用途に使用される化学物質である。いくつかの実施形態では、ＢＤＯおよび／または４−ＨＢが様々な商業的および工業的用途で使用される。このような用途の非限定的な例としては、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリエステル（Ｐ４ＨＢのようなポリヒドロキシアルカノエートまたはその共重合体を含む）、ＰＴＭＥＧおよびポリウレタン−ポリ尿素共重合体（スパンデックス（spandex）、エラスタン（elastane）またはLycraＴＭと呼ばれる）、ナイロンなどの生産が挙げられる。さらに、ＢＤＯおよび／または４−ＨＢはまた、プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリエステル（ポリヒドロキシアルカノエート（例えば、Ｐ４ＨＢまたはそのコポリマー）を含む）、ＰＴＭＥＧおよびポリウレタン−ポリ尿素コポリマー（スパンデックス（spandex）、エラスタン（elastane）またはLycraＴＭと呼ばれる）、ナイロンなどを含む）を含む、広範囲の製品の製造における原料として使用される。
【０２５６】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される、そのような本明細書で開示される方法を使用して生成される生物によって産生される、１つそのような複数の生体由来ＢＤＯおよび／そのような４−ＨＢそのようなその生体由来ＢＤＯおよび／そのような４−ＨＢ中間体を含む、バイオベースのプラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリエステル（Ｐ４ＨＢなどのポリヒドロキシアルカノエートを含む）、ＰＴＭＥＧおよびポリウレタン−ポリ尿素共重合体（スパンデックス（spandex）、エラスタン（elastane）そのようなLycraＴＭと呼ばれる）、ナイロンなどが提供される。
【０２５７】
本明細書において、「生物由来」手段というタームは生物学的生物に由来するか、または生物学的生物によって合成されるものであり、生物学的生物によって生成されることができるため、再生可能資源とみなすことができる。このような生物学的生物、特に本明細書に開示される微生物は農業、プラント、細菌、または動物源から得られる糖または炭水化物などの供給原料またはバイオマスを利用することができる。あるいは生物学的生物が大気炭素を利用することができる。本明細書において、「生物由来」というタームは本開示の生物由来の組成物の全体または一部を含む、上記のような生成物を意味する。バイオベースまたは生物由来の生成物は、天然に産出する産物とは対照的であり、このような産物は、石油または石油化学原料から誘導または合成される。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、生物由来ＢＤＯを含む培養培地が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、生物由来ＢＤＯは酵素Ａを有する生物を培養することにより、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元することができ、（ｂ）（ｂｉ）ヘキスロース−６−リン酸シンターゼである外因性酵素Ｂ、（ｂｉｉ）６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、（ｂｉｉｉ）ホスホケトラーゼ、または（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）、および（ｂｉｉ）の任意の組み合わせである。特定の実施形態では、生物由来ＢＤＯが大気中の二酸化炭素取り込み源を反映する炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４同位体比を有する。一実施形態では、培養培地が融合タンパク質およびＢＤＯ経路を有する生物から分離される。
【０２５９】
他の実施形態において、本明細書中に提供されるのは、生物由来ＢＤＯである。いくつかの実施形態において、生物由来ＢＤＯは本明細書中に提供されるように、融合タンパク質およびＢＤＯ経路を有する生物を培養することによって産生される。いくつかの実施形態では、生物由来ＢＤＯが少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のＦｍ値を有する。特定の実施形態では、生体由来ＢＤＯが培養培地の構成要素である。
【０２６０】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるように、本明細書で提供される生物由来ＢＤＯ、例えば、ＭｅＤＨ融合タンパク質およびＢＤＯＰ（ＢＤＯ経路）を有する生物を培養することによって産生される生物由来ＢＤＯを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物が前記生体由来ＢＤＯ以外の化合物をさらに含む。特定の実施形態では、前記生物由来ＢＤＯ以外の化合物が本明細書で提供されるように、融合タンパク質およびＢＤＯ経路を有する生物の微量の細胞部分である。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される生物由来ＢＤＯを含む生物由来製品が本明細書で提供される。特定の実施形態では、バイオベースの産物が塑性、弾性繊維、ポリウレタン、ポリエステル、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ−４−ＨＢ、ポリ−４−ＨＢのコポリマー、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール、ポリウレタン−ポリ尿素コポリマー、スパンデックス、エラスタン、LycraＴＭ、またはナイロンである。特定の実施形態では、バイオベース製品が少なくとも５％の生物由来ＢＤＯを含む。特定の実施形態ではバイオベースの産物が（ｉ）ポリマー、ＴＨＦもしくはＴＨＦ誘導体、またはＧＢＬ誘導体；（ｉｉ）プラスチック、弾性繊維、ポリウレタン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ−４−ＨＢ、ポリ（テトラメチレンエーテル）グリコール、ポリウレタン−ポリウレタンコポリマー、エラスタン、LycraＴＭ、またはナイロンのコポリマー；（ｉｉｉ）ポリマー、繊維、ビーズ、ペレット、プラスチック、ポリエステル、熱可塑性ポリエステル、成形品、射出成形品、自動車部品、押出樹脂、電気部品；およびケースであり；（ｉｖ）バイオベースの産物は強化または充填されており、さらに、（ｉｖ）ポリマーである。式中、ポリマーはポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）を含む。バイオベース製品が樹脂、繊維、ビーズ、顆粒、チップ、プラスチック、ポリエステル、熱可塑性ポリエステル、成形品、射出成形品、射出成形品、自動車部品、押出樹脂、電気部品、およびケーシングを含み、任意選択で、バイオベース製品が強化または充填され、さらに、バイオベース産物がガラス強化または充填または鉱物強化または充填されている場合、（ｖｉ）ＴＨＦまたはＴＨＦ誘導体であり、ＴＨＦ誘導体はポリテトラメチレンエーテルグリコール（ＰＴＭＥＧ）、ポリエステルエーテル（ＣＯＰＥ）または熱可塑性ポリウレタンで（ｖｉｉ）ＴＨＦ誘導体を含み、ＴＨＦ誘導体は繊維を含む、または（ｉｘ）ＧＢＬまたはＧＢＬ誘導体であり、ＧＢＬ誘導体はピロリドンである。特定の実施形態では、バイオベース産物が少なくとも１０％の生物由来ＢＤＯを含む。ある実施形態において、バイオベースの製品は、少なくとも２０％の生物由来ＢＤＯを含む。他の実施形態において、バイオベースの産物は、少なくとも３０％の生物由来ＢＤＯを含む。ある実施形態において、バイオベースの製品は、少なくとも４０％の生物由来ＢＤＯを含む。他の実施形態において、バイオベースの製品は、少なくとも５０％の生物由来ＢＤＯを含む。一実施形態では、バイオベースの製品が反復単位として前記バイオ由来ＢＤＯの一部を含む。別の実施形態において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供されるバイオベースの製品を成形することによって得られる成形製品である。他の実施形態では、本明細書で提供される生体由来ＢＤＯをそれ自体または別の化合物と、前記生体由来製品を生成する反応において化学的に反応させることを含む、本明細書で提供される生体由来製品を生成するためのプロセスが本明細書で提供される。特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは生体由来ＢＤＯを変換することを含むか、または変換することによって得られるポリマーである。他の実��形態では、生体由来ＢＤＯをポリマーに化学的または酵素的に変換することを含む、ポリマーを製造するための方法が本明細書に提供される。さらに他の実施形態では、生体由来ＢＤＯ、またはその細胞溶解物もしくは培養上清を含む組成物が本明細書に提供される。
【０２６２】
ＢＤＯは、高性能ポリマー、溶剤、およびファインケミカルの製造に有用な化学物質である。それは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびガンマ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）のような他の高価値化学物質を製造するための拠点である。バリューチェーンは、（１）ポリマー、（２）ＴＨＦ誘導体、および（３）ＧＢＬ誘導体を含む３つの主要セグメントから構成される。ポリマーの場合、ＢＤＯは、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）生産のためのコモノマーである。ＰＢＴは、自動車、電気、水道システム、および小型電気器具用途に使用される中性能エンジニアリング熱可塑性樹脂である。ＴＨＦ化、その後ポリテトラメタキシレンエーテルグリコール（ＰＴＭＥＧ）に変換し、LYCRA（登録商標）繊維等のスパンデックス製品の製造に使用される中間体を提供する。ＰＴＭＥＧはまた、特殊ポリエステルエーテル（ＣＯＰＥ）の製造においてＢＤＯと組み合わされる。ＣＯＰＥは優れた機械的特性および耐油性／耐環境性を有する高弾性率エラストマーであり、それらを高温および低温極端で操作することを可能にする。ＰＴＭＥＧおよびＢＤＯはまた、標準的な熱可塑性押出、カレンダー加工、および成形装置で加工された熱可塑性ポリウレタンを製造し、それらの優れた靭性および耐摩耗性を特徴とする。ＢＤＯから製造されたＧＢＬはピロリドンを製造するための供給原料を提供するとともに、農薬市場に役立つ。ピロリドンは例えば、エレクトロニクス産業および医薬品製造を含む、使用が増加している抽出プロセスのための高性能溶媒として使用される。したがって、本明細書中に記載される方法に従って産生される生物由来ＢＤＯ、および生物由来ＢＤＯを含むか、またはそれを使用して得られる生物ベースの産物が本明細書中に提供される。
【０２６３】
いくつかの実施形態では炭素供給原料およびリン酸塩、アンモニア、硫酸塩、塩化物および他のハロゲンなどの他の細胞取り込み源はＢＤＯおよび／または４−ＨＢ、または任意のＢＤＯおよび／または４−ＨＢ経路中間体に存在する原子の同位体分布を変化させるように選択することができる。上に列挙された種々の炭素供給源および他の取り込み源は本明細書では集合的に「取り込み源」と呼ばれ、取り込み源は生成物ＢＤＯおよび／または４−ＨＢもしくはＢＤＯおよび／もしくは４−ＨＢ経路中間体中に存在する任意の原子、またはＢＤＯおよび／もしくは４−ＨＢ経路から逸脱する反応で生成される副生成物の同位体濃縮を提供することができる。同位体濃縮は例えば、炭素、水素、酸素、窒素、硫黄、リン、塩化物または他のハロゲンを含む任意の標的原子について達成することができる。同じことが、本明細書に提供されるＭＭＰおよびＦＡＰ、ならびにそれらの中間体にも当てはまる。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、取り込み源が炭素−１２、炭素−１３、および炭素−１４比を変更するように選択することができる。いくつかの実施形態では、取り込み源が酸素−１６、酸素−１７、および酸素−１８比を変更するように選択することができる。いくつかの実施形態では、取り込み源が水素、重水素、およびトリチウム比を変更するように選択することができる。いくつかの実施形態では、取り込み源が窒素−１４および窒素−１５比を変更するように選択することができる。いくつかの実施形態では、取り込み源が硫黄−３２、硫黄−３３、硫黄−３４、および硫黄−３５の比を変えるように選択することができる。いくつかの実施形態では、取り込み源がリン−３１、リン−３２、およびリン−３３の比を変更するように選択することができる。いくつかの実施形態では、取り込み源が塩素−３５、塩素−３６、および塩素−３７比を変えるように選択することができる。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、標的原子の同位体比は、１つ以上の取り込み源を選択することによって、所望の比に変化され得る。取り込み源は天然に見出されるような天然源から、または人工源から誘導することができ、当業者は標的原子の所望の同位体比を達成するために、天然源、人工源、またはそれらの組み合わせを選択することができる。人工摂取源の例としては、例えば、化学合成反応から少なくとも部分的に誘導される摂取源が挙げられる。このような同位体濃縮取り込み源は、商業的に購入するか、実験室で調製するか、および／または任意に取り込み源の天然源と混合して、所望の同位体比を達成することができる。ある実施形態において、取り込み源の標的同位体比は、天然に見出されるような取り込み源の所望の起源を選択することによって得ることができる。例えば、本明細書中で議論されるように、天然の供給源は、生物学的生物に由来するか、またはそれによって合成される生物ベースの供給源、または石油ベースの産物もしくは大気などの供給源であり得る。いくつかのそのような実施形態では、炭素源が例えば、比較的炭素１４を枯渇させることができる化石燃料由来の炭素源、または石油由来の対応物よりも多量の炭素１４を有することができるＣＯ２などの環境または大気炭素源から選択することができる。
【０２６６】
同位体濃縮は、安定同位体比質量分析（ＳＩＲＭＳ）および核磁気共鳴による部位特異的自然同位体分画（ＳＮＩＦ−ＮＭＲ）などの当技術分野で知られている技法を使用する質量分析によって容易に評価される。このような質量スペクトル技術は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）および／または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分離技術と統合することができる。
【０２６７】
したがって、いくつかの実施形態では、環境炭素とも呼ばれる大気炭素を反映する炭素−１２、炭素−１３、および炭素−１４比を有するＢＤＯおよび／または４−ＨＢ、またはそのＢＤＯおよび／または４−ＨＢ経路中間体が提供される。
【０２６８】
さらに、本開示は部分的には本明細書に開示されるような生物学的に製造されたＢＤＯおよび／または４−ＨＢもしくはＢＤＯおよび／またはその４−ＨＢ中間体、ならびにそこから誘導された製品に関し、ここで、ＢＤＯおよび／または４−ＨＢもしくはそのＢＤＯおよび／または４−ＨＢ中間体は、環境中で生じるＣＯ２とほぼ同じ価値の炭素−１２、炭素−１３、および炭素−１４同位体比率を有する。
【０２６９】
当業者は、メタノール単独または他の炭水化物と組み合わせたような炭素源上で増殖させた場合に生合成化合物を分泌する生物を操作することができることを理解するのであろう。このような化合物には、例えば、ＢＤＯおよびＢＤＯＰ中の中間代謝産物のいずれかが含まれる。必要とされるのは、所望の化合物または中間体の生合成を達成するために必要とされる酵素またはタンパク質活性の１つ以上を操作することだけであり、例えば、ＢＤＯ生合成経路のいくつかまたはすべての包含が挙げられる。したがって、本明細書では、炭水化物または他の炭素源上で増殖させた場合にＢＤＯを産生および／または分泌し、炭水化物または他の炭素源上で増殖させた場合にＢＤＯＰに示される中間代謝産物のいずれかを産生および／または分泌する生物が提供される。本明細書中に提供されるＢＤＯ産生微生物は、中間体からの合成を開始することができる。ホルムアルデヒド同化における中間体についても同様である。
【０２７０】
（実施例１−ＧａｐＮ対ＧａｐＡ速度論的比較）
E. coli  ＧａｐＡおよびB. methanolicus  ＧａｐＮの接触定数を測定し、表１８に示す。
【０２７１】
【表３１】
2021528977.tif 000034
【０２７２】
（実施例２−細胞内代謝産物プロファイルはｇａｐＮ発現により達成される）
B. methanolicus  ＧａｐＮ酵素（アクセッションＷＰ＿００３３５１７９８；配列番号１に対する同一性９５％）をヘキスロース−６−リン酸シンターゼ（Ｈｐｓ）（配列番号２）および６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（Ｐｈｉ）（配列番号３）と組み合わせて発現させたE. coli株の細胞内代謝産物プロファイルを、同じＨｐｓおよびＰｈｉ酵素を発現および発現するｇａｐＡを有する株と比較した。この株はまた、ｇａｐＡの欠失を有し、メタノールデヒドロゲナーゼを発現し、そしてB. methanolicus由来のｆｂａ、ｇｌｐＸ、ｒｐｅおよびｔｋｔを発現する。ｇａｐＮの発現は、ｇａｐＮのないｇａｐＡ発現株と比較して、関連するＲｕＭＰサイクル代謝産物の代謝産物レベルの増加をもたらした。これは、ＲｕＭＰサイクル活性およびメチロトロフィーに対するｇａｐＮ発現の利点を示す。表１９はメチロトロフィーに関与し、必要とされる主要なＲｕＭＰサイクル代謝産物の増加の倍数変化を示す。
【０２７３】
【表３２】
2021528977.tif 000035
【０２７４】
（実施例３−培養物中で実証された合成メチロトロフィー）
E. coli株（ｇａｐＮの過剰発現（アクセッションＷＰ＿００３３５１７９８；配列番号１に対する同一性９５％））、ｇａｐＡの欠失、他の酵素の発現、メタノールデヒドロゲナーゼ、Ｈｐｓ（配列番号２）、Ｐｈｉ（配列番号３）、Ｆｂａ、ＧｌｐＸ、Ｔｋｔ）およびｇａｐＡを発現するその親を、グルコースおよびメタノールを含むケモスタット培養物中で培養した。ケモスタットバイオリアクターをバッチ培養モードとして開始し、炭素源としてグルコースを用い、温度を３５℃に制御し、溶存酸素を２０％以上に制御しながら、気流および撹拌を変化させながら好気性条件で操作した。必要に応じて塩基または酸を自動的に添加することにより、ｐＨを６．９５に一定に制御した。メタノール増殖期への移行は、唯一の炭素源としてメタノールを含有する培地を、０．１ｈ−１の希釈速度を目標として供給することによって、発酵槽を連続的に操作して行った。メタノール供給はグルコース枯渇前に開始し、残留グルコースが完全に消費された後にのみメタノール増殖速度を測定した。発酵中の細胞増殖を、分光光度計を使用して６００ｎｍでの培養物の光学密度を測定することによってモニターした。
【０２７５】
唯一の炭素源のメタノールへの供給の移行に際して、ｇａｐＮではなくｇａｐＡを有する株は増殖を示さなかったが、ｇａｐＮの発現を有する株はメタノール上で３０時間の増殖を示した。ｇａｐＡを用いた株の希釈パターンは、増殖なしの予想に適合するが（図１０Ａ）、ｇａｐＮ株は合成メチロトロフィーを示す（図１０Ｂ）。この株について観察された増殖速度を図１０Ｃに示す。さらに、１３Ｃ−メタノールを用いて計算された細胞内流量分布は、複数完全に１３Ｃ標識されたＲｕＭＰサイクル代謝産物の存在を通して完了ＲｕＭＰサイクルの活性を確認する（データ不図示）。
【０２７６】
さらに、別のＨｐ（配列番号２に対して同一性４１％；アクセッション番号ＷＰ＿０５４００９７４８．１）およびＰｈｉ（配列番号３に対して同一性３３％；アクセッション番号ＷＰ＿０１２２９８８２２．１）を発現する上記のＧａｐＮ発現E. coli株はまた、ホルムアルデヒド消費ならびに１３Ｃ−メタノールからの完全に標識されたＲｕＭＰサイクル代謝産物によって証明される完了ＲｕＭＰサイクル活性を実証した。
【０２７７】
（実施例４−Ｆｂａ、Ｆｂａ２、ＧｌｐＸの過剰発現）
合成メチロトロフィーに対するＧｌｐＸの過剰発現（アクセッションＷＰ＿００３３５２２４８．１）の効果は図１１において実証され、ここで、親株と比較してプラスミド上で発現されたさらなるＧｌｐＸを有する株は他の炭素源の非存在下で増加したホルムアルデヒド消費を示した。このホルムアルデヒド消費速度はＦｂａ（アクセッションＥＩＪ７７６１６．１）、Ｆｂａ２（アクセッションＥＩＪ８０２８６．１）、およびＴｋｔ（アクセッションＥＩＪ７７６１５．１）のさらなる発現によってさらに増強され、ＮＡＳＨアッセイを用いて測定されたホルムアルデヒド消費はＲｕＭＰサイクル活性を測定するためのプロキシとして役立つ。ホルムアルデヒド消費を測定するために、細菌細胞を、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈおよび２％グルコース中、３５℃で、２ｍＬの２４−ディープウェルプレート中で５．５時間増殖させた。続いて、細胞を２％グルコースおよび４ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む最小培地に移し、２ｍＬの４８深ウェルプレート中で一晩増殖させた。細胞をＯＤ  ０．５に正規化し、１．２ｍＬの２４深ウェルプレート中の最小培地２％グルコース、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４および１ｍＭホルムアルデヒドに再懸濁した。試料を採取し、最大ｒｐｍで１０分間遠心分離した。７５ｕＬのＮＡＳＨ  Ｂ試薬を７５ｕＬの上清に添加し、９６ウェルＣｏｓｔａｒプレート中で混合し、３７℃で４０分間インキュベートした。吸光度値を４１２ｎＭで測定し、ホルムアルデヒド濃度を得た。
【０２７８】
（実施例５−ｔａｌＡＢＣの欠失）
本明細書中で議論されるように、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡＢＣ）またはｆｂａおよびｇｌｐＸによってコードされるＳＢＰａｓｅのいずれかを介する、ＲｕＭＰサイクルを通る炭素フラックスのための２つの可能な経路が存在する。ＲｕＭＰサイクルのトランスアルドラーゼ使用変異体は０．７ｋＪ／モルの標準デルタＧを有する臨界セドヘプツロース−７−リン酸塩の生成のための熱力学的上り坂を作り出し、一方、ＳＢＰａｓｅ使用変異体は、セドヘプツロース−７−リン酸塩の生成のための非常に有意な熱力学的利点（−３５．３ｋＪ／モルの標準デルタＧ）を提供するＧｌｐＸ反応を使用する。ＲｕＭＰサイクルを完了させ、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸からリブロース−５−リン酸を再生するために、Ｆｂａ（例えば、アクセッションＥＩＪ７７６１６．１）およびＧｌｐＸ（例えば、アクセッションＷＰ＿００３３５２２４８．１）によって提供されるＳＢＰａｓｅ変異体のこの熱力学的利点は、おそらくｃｒｔｉｃａｌである。この重要性は、天然のメチロトロフィー（B. methanolicus）ならびにＧａｐＮ（配列番号１に対して同一性９５％；アクセッションＷＰ＿００３３５１７９８）、Ｈｐｓ（配列番号２）、Ｐｈｉ（配列番号３）を発現する操作されたＥｃｏｌｉにおける測定された細胞内代謝産物レベルからのΔＧ´の計算によってさらに強調される。トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡＢＣ）の存在下では熱力学は非常に好ましくないが、ｔａｌＡＢＣの欠失およびｇｌｐＸおよびｆｂａの過剰発現はより好ましい熱力学を示す（表２０）。
【０２７９】
【表３３】
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【０２８０】
（実施例６− B. methanolicus由来のｒｐｉ、ｒｐｅ、ｔｋｔ、ｔｋｔ２の発現）
表２１に示されるように、B. methanolicusのトランスケトラーゼ（Ｔｋｔ）は、最高速度の半分の場合に反応速度である基質濃度であるミカエリス定常Ｋｍが有意に低いことが決定された。本明細書中に開示されるように、B. methanolicusトランスケトラーゼは、メタノールおよびホルムアルデヒド同化に必須であると思われる、リブロース５−リン酸再生のためのＲｕＭＰサイクルフラックスに動力学的に有利である。あるいは、所望のＫｍを有する他のトランスケトラーゼを操作または発見することができる。
【０２８１】
リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲｐｉＡＢ）およびリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（Ｒｐｅ）のようなＲｕＭＰサイクルの他の可逆的酵素について、同様の考察が発見され、適用された、すなわち、対応するB. methanolicus酵素は、E. coli相同体よりも良好な速度論的特性を有する。E. coliにはリボース５−リン酸イソメラーゼＡ（ＲｐｉＡ）とＢ（ＲｐｉＢ）の２つのアイソザイムがあり、そこではＲｐｉＡがE. coliの主要な酵素である。その基板リボース５−リン酸についてのミカエリス定数はＲｐｉＡについては４．４ｍＭであり、ＲｐｉＢについては０．８３ｍＭである［１］。したがって、ｒｐｉＡの欠失およびB. methanolicusまたはE. coli由来のｒｐｉＢの過剰発現は、リブロース５−リン酸である生成物形成に動力学的に有利に働くはずである。本項および表２１に引用した参考文献は以下のとおりである：［１］ＥｓｓｅｎｂｅｒｇおよびＣｏｏｐｅｒ、「E. coliＫ１２由来の２つのリボース‐５‐リン酸イソメラーゼ：酵素の部分的特性評価およびその生理学的役割の考えられる考察」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．５５、ｎｏ．２、ｐｐ．３２３−３２、１９７５；［２］Ｍａｒｋｅｒｔら、「通性リブロース一リン酸サイクルメチロトロフィーBacillus methanolicus,の染色体およびプラスミドｐＢＭ１９上にコードされている２つのトランスケトラーゼの特性評価」、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１４、ｎｏ．７、２０１４；および［３］Ｓｐｒｅｎｇｅｒら、「大腸菌Ｋ１２のトランスケトラーゼＡ」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、。２３０，  ｎｏ．２、ｐｐ．。５２５−３２，  １９９５．
【０２８２】
【表３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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