(57)【要約】本発明は、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有する野生型タンパク質の発現が低下している双子葉類の植物細胞、植物組織、又は植物に関する。さらに、本発明は、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質及び／又は切り詰め型タンパク質を含む植物細胞、植物組織、又は植物であって、上記改変型タンパク質が、上記改変を含まず又は上記切り詰めを含まない上記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。本発明はさらに、上記改変型又は切り詰め型タンパク質をコードする核酸構築物に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記野生型タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは、前記野生型タンパク質が、前記植物細胞、植物組織、又は植物に発現しておらず、
前記植物細胞、植物組織、又は植物が、前記野生型タンパク質の発現が低下していないがその他の点では同一の対照植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科の少なくとも１つの二分節型メンバーに対する抵抗性が増加している、植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項２】
ジェミニウイルス科の少なくとも１つの二分節型メンバー及び少なくとも１つの一分節型メンバーに対する抵抗性が増加している、請求項１に記載の植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項３】
ジェミニウイルス科がベゴモウイルス（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）の属である、請求項１又は２に記載の植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項４】
双子葉類であり、好ましくはトウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、及びマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項５】
前記植物がトウガラシ属、好ましくは、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）であり、野生型タンパク質の発現の低下が、ペッパー黄化葉巻インドネシアウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｃｕｒｌ  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  Ｖｉｒｕｓ）及び／又はペッパー葉巻ウイルスに対する抵抗性を増加させる、請求項４に記載の植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項６】
前記植物細胞、植物組織、又は植物が、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質をさらに発現し、
ａ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含むか；又は
ｂ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質であり、
前記改変型タンパク質の発現が、前記改変を含まないか、又は前記切り詰めを含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項７】
前記改変が、少なくとも１個、２個、又は３個のアミノ酸残基の欠失であり、好ましくは前記改変が、配列番号１の位置７１、７２、又は７３における少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失である、請求項６に記載の植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項８】
請求項６のａ）に記載のタンパク質が、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３７８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約９５％の配列同一性を有する、請求項６又は７に記載の植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項９】
請求項６のａ）に記載の改変型タンパク質が、配列番号４と少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の植物細胞、植物組織、又は植物。
【請求項１０】
配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質であって、
ｉ）前記タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含み、好ましくは、前記タンパク質が配列番号３の配列を有するか；又は
ｉｉ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質が配列番号５の配列を有する、
改変型タンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載のタンパク質をコードする配列を含む核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む核酸構築物であって、前記核酸が、好ましくは、植物細胞における発現のためのプロモーターと作動可能に連結している、核酸構築物。
【請求項１３】
植物細胞、植物組織、又は植物においてジェミニウイルス科の少なくとも二分節型メンバーに対する抵抗性を増加させるための方法であって、
ｉ）植物細胞、植物組織、又は植物を用意するステップ；
ｉｉ）野生型タンパク質の発現を低下させるステップであり、前記タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは前記野生型タンパク質が発現しない、ステップ；及び
ｉｉｉ）任意選択で、ジェミニウイルス科の少なくとも二分節型メンバーに対する抵抗性の増加について前記植物細胞、植物組織、又は植物をスクリーニングするステップ
を含む方法。
【請求項１４】
ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している植物細胞、植物組織、又は植物を作製するための方法であって、
ｉ）植物細胞、植物組織、又は植物を用意するステップ；
ｉｉ）野生型タンパク質の発現を低下させるステップであり、前記タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは前記野生型タンパク質が発現しない、ステップ；
ｉｉｉ）任意選択で、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質の発現を導入するステップであり、
ａ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含むか；又は
ｂ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質であり、
好ましくは、前記改変型タンパク質の発現が、前記野生型タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列を改変することにより導入される、ステップ；
ｉｖ）任意選択で、前記改変型タンパク質を発現する植物細胞、植物組織、又は植物を選択するステップ；及び
ｉｖ）前記植物を再生させるステップ
を含む方法。
【請求項１５】
前記植物が、双子葉類であり、好ましくはトウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、トマト、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、及びマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）からなる群から選択され、並びに／又は好ましくは、ジェミニウイルス科がベゴモウイルスの属である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物育種及び分子生物学の分野に関する。本発明は、ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）に対する抵抗性を与える変異を有する植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
虫媒伝染性ウイルスは、作物植物の最も有害で経済的に重大な病気のいくつかを引き起こす。独特な双子の正二十面体ウイルス粒子を有する一本鎖ＤＮＡウイルスの群であるジェミニウイルスは、これらの病気の多くの原因である。
【０００３】
ジェミニウイルスは、以下の特性を共有するウイルスの生物学的及び遺伝学的に多様な科（ジェミニウイルス科）を構成する：大きさが約１８×３０ナノメートルである双子の準正二十面体ウイルス粒子（ビリオン）、及び約２．９〜５．２キロベース（ｋｂ）の小さい環状一本鎖ＤＮＡゲノム。ゲノム構造、系統的関係、媒介昆虫、及び宿主範囲に基づいて、以下の７つの属が認められている：ベゴモウイルス属（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、マストレウイルス属（Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）、クルトウイルス属（Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ）、トポクウイルス属（Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓ）、ベクルトウイルス属（Ｂｅｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ）、ツルンクルトウイルス属（Ｔｕｒｎｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ）、及びエラグロウイルス属（Ｅｒａｇｒｏｖｉｒｕｓ）。ジェミニウイルスは、複合病に存在する場合が多く、個々の植物は、複数のウイルスに感染し得る。ジェミニウイルスゲノムは、高率の変異、組換え、及び再集合を起こして、ウイルス多様性を増加させることができる。それらのゲノムは、ウイルス複製、移動、伝染、及び病原性に関与する５〜７個のタンパク質をコードする１つ（一分節）又は２つ（二分節）のＤＮＡ成分からなる。
【０００４】
天然では、ジェミニウイルスは、ヨコバイ、ツノゼミ、及びコナジラミの様々な種を含む師部摂食昆虫によって伝搬される。ジェミニウイルスに感染した植物は、単子葉植物における発育阻害；歪んだ生長；及び葉の線条と条線、並びに双子葉植物における葉の縮れ、巻き、歪み、金光色と緑黄色のモザイク／斑点、葉脈間黄化、黄斑、及び葉脈膨張、紫化、及び黄化を含む幅広い症状を示す。
【０００５】
特に重要なのは、ベゴモウイルス属である、コナジラミ（タバココナジラミ（Ｂｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ））により伝搬されるジェミニウイルスである。これは、植物ウイルスの（種の数に関して）最も大きい属であり、いくつかは、世界中の野菜及び繊維作物における多くの壊滅的な病気の原因である。ベゴモウイルスの管理は難しく、それの媒介コナジラミ集団が膨大な数に達し得るからである。それゆえに、ベゴモウイルス抵抗性作物を育種することは、そのウイルスによって負わされる収量損失を低下させるための魅力的で、環境と調和したストラテジーを提供する。ベゴモウイルスは、Ａ成分が５つ若しくは６つのタンパク質をコードし、Ｂ成分が２つのタンパク質をコードし、各成分が、サイズが２．５〜２．８ｋｂである二分節ゲノム（南米起源のほとんど）か、又はサテライトＤＮＡ成分有り若しくは無しの、６つのタンパク質をコードする一分節ゲノムかのいずれかを有する。
【０００６】
ベゴモウイルスの例は、栽培トマトの最も壊滅的なウイルスの一つである、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）である。トマトＰｅｌｏ遺伝子の発現をサイレンシングすることが、トランスジェニック植物にＴＹＬＣＶに対する抵抗性を与えることが、以前、当技術分野において示されている（国際公開第２０１４／０４５２０６号；Ｌａｐｉｄｏｔら、Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｏｕｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐｅｌｏｔａ，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１５）１１（１０）：ｅ１００５５３８）。しかしながら、トマトにおいてＰｅｌｏ遺伝子の発現をサイレンシングすることはまた、全収量の低下及び果実サイズの低下も生じる（Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｍら、上記）。加えて、トマトＰｅｌｏ遺伝子のサイレンシングは、ジェミニウイルス科の一分節型メンバーに対する抵抗性を与え得るが、二分節型ジェミニウイルス科メンバーに対して少しの抵抗性も与えない（Ｈｕｔｔｏｎ及びＳｃｏｔｔ、２０１５；ｈｔｔｐ：／／ｓｗｆｒｅｃ．ｉｆａｓ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／ｄｏｃｓ／ｐｄｆ／ｖｅｇ−ｈｏｒｔ／ｔｏｍａｔｏ−ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ／ｔｉ２０１５／ｔｉ２０１５＿Ｈｕｔｔｏｎ．ｐｄｆ）。したがって、トマトにおいてＰｅｌｏ遺伝子をサイレンシングすることの使用は、限定されるように思われる。
【０００７】
ジェミニウイルス感染はまた、ペッパーにも出現しており、アジアにおいてペッパー栽培の深刻な問題を引き起こしている。ペッパー黄化葉巻ウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｃｕｒｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＰＹＬＣＶ）（Ｄｅ  Ｂａｒｒｏら（２００８）  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｖｅｃｔｏｒ，  ｐｅｐｐｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｂｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ，  ｔｗｏ  ｎｅｗ  ｉｎｖａｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎｓ  １０巻（４）、ｐ４１１〜４３３）及びチリ葉巻ウイルス（Ｃｈｉｌｌｉ  Ｌｅａｆ  Ｃｕｒｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＣｈｉＬＣＶ）の大発生は、作物を壊滅させており、一方、メキシコ及び米国南部において、ウアステコ葉脈黄化ウイルス（ｈｕａｓｔｅｃｏ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｅｉｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＰＨＹＶＶ）とペッパーゴールデンモザイクウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  Ｇｏｌｄｅｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＰｅｐＧＭＶ）（Ｒｅｎｔｅｒｉａ−Ｃａｎｅｔｔら、２０１１）でのペッパー混合感染が出現している。これまで、ペッパー遺伝資源において適した抵抗源は同定されていない。
【０００８】
したがって、ジェミニウイルスは、特に熱帯地方及び亜熱帯地方において、壊滅的病原体として出現しており、莫大な経済的損失をもたらし、作物生産を脅かしている。再出現した、及び新しく出現したジェミニウイルスにより引き起こされるエピデミックは、以前にはこれらのウイルスが存在しなかった地域においてさえも頻繁になりつつある。そのウイルスの伝播は、植物材料の世界的移動及び媒介コナジラミの流布によりさらに拡大することが予想される。特に、ジェミニウイルスに対して抵抗性を示すペッパー植物が強く必要とされている。加えて、そのような抵抗性植物を作製する効果的な方法が必要とされている。
【０００９】
〔発明の概要〕
第１の態様において、本発明は、野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記野生型タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは、前記野生型タンパク質が、前記植物細胞、植物組織、又は植物に発現していない、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。
【００１０】
好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、前記野生型タンパク質の発現が低下していないがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科の少なくとも１つの二分節型メンバーに対する抵抗性が増加している。
【００１１】
好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、ジェミニウイルス科の少なくとも１つの二分節型メンバー及び少なくとも１つの一分節型メンバーに対する抵抗性が増加している。
好ましくは、本明細書に定義されているような植物細胞、植物組織、又は植物はさらに、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質を発現し、
ａ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含み；又は
ｂ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質であり、
前記改変型タンパク質の発現が、前記改変を含まず、又は前記切り詰めを含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較してジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる。
【００１２】
好ましくは、発芽能は、前記改変を含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物の発芽能と類似したままである。
【００１３】
好ましい実施形態において、改変は、少なくとも１個、２個、又は３個のアミノ酸残基の欠失であり、好ましくは前記改変は、配列番号１の位置７１、７２、又は７３における少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失である。
【００１４】
好ましくは、改変は、配列番号１の位置７１、７２、及び７３におけるアミノ酸残基の欠失である。
【００１５】
好ましくは、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含む改変型タンパク質は、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３７８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００１６】
さらなる実施形態において、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含む改変型タンパク質は、配列番号４と少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされる。
【００１７】
好ましくは、ジェミニウイルスは、ベゴモウイルスの属である。
【００１８】
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような植物細胞、植物組織、又は植物は、双子葉植物であり、好ましくはトウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）（例えば、ペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）、及びキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ））、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、及びマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）からなる群から選択される。
【００１９】
好ましくは、植物は、トウガラシ属、好ましくは、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）であり、前記改変は、ペッパー黄化葉巻インドネシアウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｃｕｒｌ  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  Ｖｉｒｕｓ）及び／又はペッパー葉巻ウイルスに対する抵抗性を増加させる。
第２の態様において、本発明は、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質であって、
ｉ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含み、好ましくは、前記タンパク質が配列番号３の配列を有し；又は
ｉｉ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質が配列番号５の配列を有する、
改変型タンパク質に関する。
【００２０】
第３の態様において、本発明は、本明細書に定義されているようなタンパク質をコードする配列を含む核酸に関する。
【００２１】
第４の態様において、本発明は、本明細書に定義されているような核酸を含む核酸構築物であって、前記核酸が、好ましくは、植物細胞における発現のためのプロモーターと作動可能に連結されている、核酸構築物に関する。
第５の態様において、本発明は、
ｉ）植物細胞、植物組織、又は植物を用意するステップ；
ｉｉ）野生型タンパク質の発現を低下させるステップであって、前記タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは前記野生型タンパク質が発現しない、ステップ；
ｉｉｉ）前記野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物を選択するステップであって、好ましくは、前記野生型タンパク質が発現していない、ステップ；及び
ｉｖ）前記選択された植物を再生するステップ
を含む、ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している植物細胞、植物組織、又は植物を作製するための方法に関する。
【００２２】
好ましくは、ステップｉｉ）は、野生型タンパク質をコードする遺伝子を改変し、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含む改変型タンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である改変型タンパク質をコードする遺伝子を結果として生じることにより実施される。
【００２３】
本発明の好ましい方法において、植物は、双子葉類であり、好ましくはトウガラシ属、トマト、キャッサバ、ワタ属、ウリ科、ナス、オクラ、及びマメ科からなる群から選択される。
【００２４】
さらなる好ましい方法において、ジェミニウイルス科はベゴモウイルスの属である。
【００２５】
第６の態様において、本発明は、本明細書に定義されているような本発明の方法によって取得可能な植物に関する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、植物細胞、植物組織、又は植物においてジェミニウイルス科の少なくとも二分節型メンバーに対する抵抗性を増加させるための方法であって、
ｉ）植物細胞、植物組織、又は植物を用意するステップ；
ｉｉ）野生型タンパク質の発現を低下させるステップであり、前記タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは前記野生型タンパク質が発現しない、ステップ；及び
ｉｉｉ）任意選択で、ジェミニウイルス科の少なくとも二分節型メンバーに対する抵抗性の増加について前記植物細胞、植物組織、又は植物をスクリーニングするステップ
を含む方法に関する。
【００２７】
定義
本発明の方法、組成物、使用、及び他の態様に関する様々な用語が、本明細書及び特許請求の範囲を通して用いられている。そのような用語は、他に指示がない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味を与えられるものとする。他の具体的に定義された用語は、本明細書に提供された定義と一致するように解釈されるべきである。本明細書に記載されたものと類似した又は等価の任意の方法及び材料を、本発明の試験のための実施に用いることができるが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載されている。
【００２８】
本発明の方法に用いられる通常の技術を行う方法は、当業者に明らかであろう。分子生物学、生化学、コンピュータ化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シーケンシング、及び関連分野における通常の技術の実施は、当業者によく知られており、例えば、以下の参考文献に論じられている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７及び定期的更新；並びにｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ。
【００２９】
単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に規定しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組合せを含むなどである。このように、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００３０】
用語「及び／又は」は、述べられた事例の１つ又は複数が、単独で、又は述べられた事例の全部に至るまでの、述べられた事例の少なくとも１つと組み合わせて、存在し得る状況を指す。
【００３１】
本明細書に用いられる場合、用語「約」は、わずかな変動を記載及び説明するために用いられる。例えば、その用語は、±（＋又は−）１０％以下、例えば、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％、又は±０．０５％以下を指し得る。追加として、量、比率、及び他の数値は、本明細書において範囲形式で提示される場合がある。そのような範囲形式は、便利さと簡潔さのために用いられ、範囲の限界として明確に特定された数値を含むだけでなく、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分的範囲もまた、あたかも各数値及び部分的範囲が明確に特定されているかのように、含まれることは、柔軟に理解されるべきである。例えば、約１〜約２００の範囲における比率は、約１及び約２００の明確に列挙された限界を含むだけでなく、約２、約３、及び約４などの個々の比率、並びに約１０〜約５０、約２０〜約１００などの部分的範囲もまた含むことは理解されるべきである。
【００３２】
用語「含むこと」は、包括的且つオープンエンドであって、排他的ではないと解釈される。具体的には、その用語及びそのバリエーションとしては、特定された特徴、ステップ、又は成分が挙げられることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、又は成分の存在を排除すると解釈されるべきではない。
【００３３】
用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、交換可能に用いられ、特定の作用様式にもサイズにも３次元構造にも起源にも関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。したがって、タンパク質の「断片」又は「一部」は、まだなお「タンパク質」と呼ばれ得る。「単離されたタンパク質」は、もはやそれの天然の環境にはなく、例えば、インビトロに、又は組換え細菌若しくは植物宿主細胞内にあるタンパク質を指すように用いられる。
【００３４】
「植物」は、植物全体か、又は植物の部分、例えば、植物から取得可能な細胞、組織、若しくは器官（例えば、花粉、種子、配偶子、根、葉、花、花蕾、葯、果実など）かのいずれか、加えて、これら及び自家受粉又は交配によるそのような植物に由来する子孫のいずれかの派生物を指す。
【００３５】
「植物細胞（複数可）」としては、単離された、又は組織、器官、若しくは生物体内での、プロトプラスト、配偶子、懸濁培養物、マイクロスフェア、花粉粒子などが挙げられる。植物細胞は、例えば、カルスの部分又は成長点であり得る。
【００３６】
植物を栽培するための「類似した条件」とは、とりわけ、類似した温度、湿度、栄養、及び光条件、並びに類似した灌水及び昼／夜のリズムの使用を意味する。
【００３７】
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書で交換可能に用いられる。配列同一性は、本明細書では、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列、又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間での、その配列を比較することにより決定される場合の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」はまた、アミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の、場合によっては、そのような配列の一続きの間での一致によって決定される場合の、程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びそれの保存アミノ酸置換を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に計算することができる。
【００３８】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列の、その２つの配列の長さに依存してグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを用いるアラインメントにより、決定することができる。類似した長さの配列は、好ましくは、配列を全長に渡って最適にアラインメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を用いてアラインメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を用いてアラインメントされる。その後、配列は、それらが、（例えば、プログラムＧＡ又はＢＥＳＴＦＩＴによりデフォルトパラメータを用いて最適にアラインメントされた時）（下記で定義されているように）配列同一性の少なくともある特定の最小パーセンテージを共有する場合、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ばれ得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、２つの配列をそれらの全長（完全長）に渡って、一致の数を最大にし、ギャップの数を最小にしながら、アラインメントする。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似した長さを有する場合に配列同一性を決定するために適切に用いられる。一般的に、ＧＡＰデフォルトパラメータが用いられ、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドについて、用いられるデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコアリングマトリックスＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９）。パーセンテージ配列同一性についての配列アラインメント及びスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手できるＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３などのコンピュータプログラムを用いて、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１０．０におけるプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いる）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いる）などのオープンソースソフトウェアを用いて、上記のＧＡＰについて同じパラメータを用い、又はデフォルト設定を用い（「ｎｅｅｄｌｅ」と「ｗａｔｅｒ」の両方について、及びタンパク質アラインメントとＤＮＡアラインメントの両方について、デフォルトギャップ開始ペナルティは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてＢｌｏｓｓｕｍ６２、ＤＮＡについてＤＮＡＦｕｌｌである）、決定され得る。配列が実質的に異なる全長を有する場合、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いたものなどのローカルアラインメントが好ましい。
【００３９】
或いは、パーセンテージ類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを用いて、公開データベースに対して検索することにより決定され得る。したがって、本発明の核酸及びタンパク質配列をさらに、「クエリ配列」として用いて、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公開データベースに対して検索を実施することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。比較のためのギャップドアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載されているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／におけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照。
【００４０】
用語「核酸構築物」及び「核酸ベクター」は、本明細書で交換可能に用いられ、本明細書では、組換えＤＮＡテクノロジーの使用から生じる人工の核酸分子として定義される。したがって、核酸構築物は天然に存在する核酸分子（の部分）を含み得るが、用語「核酸構築物」及び「核酸ベクター」は、天然に存在する核酸分子を含まない。
【００４１】
用語「遺伝子」は、適切な制御領域（例えば、プロモーター）と作動可能に連結した、細胞においてＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）へ転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、通常、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）などのいくつかの作動可能に連結した断片を含む。「遺伝子の発現」は、適切な制御領域、特にプロモーターと作動可能に連結しているＤＮＡ領域が、生物学的活性がある、すなわち、生物学的活性のタンパク質又はペプチドへ転写される能力があるＲＮＡへ転写される過程を指す。
【００４２】
「プロモーター」は、１つ又は複数の核酸の転写を調節するように機能する核酸断片を指す。プロモーター断片は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流（５’）に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼへの結合部位、転写開始部位（複数可）の存在によって構造的に同定され、任意の他のＤＮＡ配列をさらに含むことができ、他のＤＮＡ配列としては、転写因子結合部位、抑制及び活性化タンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写の量を制御するように直接的又は間接的に作用することが当業者に知られた任意の他のヌクレオチド配列が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４３】
任意選択で、用語「プロモーター」はまた、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）も含み得る（例えば、プロモーターとしては、本明細書では、転写領域の翻訳開始コドンの上流に１つ又は複数の部分が挙げられ得、この領域が、転写及び／又は翻訳を制御することに役割を果たし得るからである）。「構成的」プロモーターは、たいていの組織において、たいていの生理的及び発生的条件下で、活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、（例えば、ある特定の化合物の外部適用により）生理的に、又は発生的に制御されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の型の組織又は細胞においてのみ活性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ｄＴＰ遺伝子のイントロン−エクソン境界である、内因性ヌクレオチド配列を、スプライス部位を変化させるように改変することができ、その結果として、オルタナティブアクセプター部位の使用を生じることを示す図である。上部パネルは、改変されていない野生型ｄＴＰ遺伝子のイントロン−エクソン境界予測を示す。下部パネルは、エクソン４の上流の改変の例を示し、その改変が、結果として、エクソン４の５’末端における９個のヌクレオチドの欠失を生じる。
【図２】ビートカーリートップウイルス罹病性を示す図である。ＢＣＴＶに感染していないか又は感染しているかのいずれかである、Ｃｏｌ−０及びＳＡＬＫ＿１２４４０３．２１．４５ｘ植物におけるＢＣＴＶの相対力価。Ｔ−ＤＮＡ植物においてウイルス複製は起きていない。
【図３】ｄＴＰ補完によるビートカーリートップウイルス罹病性を示す図である。ＢＣＴＶに感染していないか又は感染しているかのいずれかである、Ｃｏｌ−０及びＳＡＬＫ＿１２４４０３．２１．４５ｘ植物におけるＢＣＴＶの相対力価。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記野生型タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有する、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。本発明者らは、そのような植物細胞、植物組織、又は植物が、前記野生型タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加していることを発見した。より詳細には、本発明者らは、本明細書でさらに詳述されているような改変型タンパク質をコードする核酸配列を生じる、この野生型タンパク質をコードする遺伝子を改変することが、ジェミニウイルス科の一分節型メンバーにも、二分節型にも対する抵抗性を提供することを発見した。加えて、本発明者らは、本明細書に定義されているような改変型タンパク質の発現が、植物の発芽能を維持することを発見した。したがって、本発明は、作物防御の重要な進歩を表している。
【００４６】
このように、第１の態様において、本発明は、野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記タンパク質が、配列番号１と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。
【００４７】
野生型タンパク質は、植物細胞、植物組織、又は植物に通常（すなわち、天然で）存在する遺伝子によりコードされ、例えばそれが天然に存在している場合の、特定の環境条件下で少なくとも特定の発生段階に発現するタンパク質として本明細書に定義される。このように、野生型タンパク質は、それの天然環境で自然に発現するタンパク質である。加えて、本明細書で理解されているような野生型タンパク質はまた、例えば、そのタンパク質をノックアウトすることにより、最初、遺伝的に不活性化されている、天然に存在するタンパク質であり得、その後、その同じタンパク質が植物細胞、植物組織、又は植物へ再導入される。したがって、そのような通常天然に存在するタンパク質は、それが以前、植物へ再導入された場合でさえも、野生型タンパク質と見なされる。
【００４８】
好ましくは、野生型タンパク質は、配列番号１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。さらなる実施形態において、野生型タンパク質は、配列番号１を含み、又はそれからなる。好ましくは、野生型タンパク質は、配列番号１及び１１〜１８からなる群から選択され、さらにより好ましくは、配列番号１及び１１〜１６からなる群から選択される配列を含み、又はそれからなる。実施形態において、野生型タンパク質は、配列番号１７ではなく、及び／又は配列番号１８ではない。
【００４９】
発現の低下は、好ましくは、対照植物における発現レベルと比較される。対照植物は、配列番号１と少なくとも約７５％の配列同一性を有するタンパク質の発現が低下するように改変されていないがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物として定義され、例えば、その植物細胞、植物組織、又は植物は、そのタンパク質、好ましくは本明細書に定義されているような野生型タンパク質の野生型発現レベルを有する。加えて、対照植物はまた、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を発現しない。
【００５０】
好ましくは、対照植物は、植物細胞、植物組織、又は植物に通常存在する野生型タンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましくは、対照の植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属、好ましくは、トウガラシ（Ｃ．ａｎｎｕｕｍ）、アヒ・アマリージョ（Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ）、Ｃ．シネンゼ（Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、キダチトウガラシ（Ｃ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、又はロコト（Ｃ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）である。好ましくは、対照の植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ（Ｃ．ａｎｎｕｕｍ）、好ましくは、トウガラシ（Ｃ．ａｎｎｕｕｍ）品種Ｍａｏｒ植物である。植物は、トウガラシ（Ｃ．ａｎｎｕｕｍ）品種Ｍａｏｒ  Ｍ２植物であり得る。
【００５１】
実施形態において、発現は、対照植物と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は約１００％低下している。
【００５２】
本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現の低下は、当業者に知られた任意の通常の手段によって達成され得る。野生型タンパク質の発現を低下させる（例えば、ノックダウンする）ための非限定的例としては、ゲノム制御配列のｓｉＲＮＡ、エピジェネティックサイレンシング、改変、及び／又は野生型タンパク質をコードする内因性配列の少なくとも１つのアレル、好ましくは２つのアレルの少なくとも１個のヌクレオチドの改変若しくは欠失が挙げられる。好ましくは、野生型タンパク質をコードする配列は、配列番号２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。
【００５３】
好ましい実施形態において、野生型タンパク質は発現せず、すなわち、その発現はノックアウトされている。結果として、野生型タンパク質は、植物細胞においてもはや検出されない。野生型タンパク質の発現の代わりに、変化した、非機能的な及び／又は切り詰められたタンパク質が発現することができる。野生型タンパク質の発現をノックアウトすることは、当業者に知られた任意の通常の手段により達成され得る。そのような通常の手段としては、野生型タンパク質をコードする全ての内因性配列の少なくとも１個のヌクレオチドの改変又は欠失が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、野生型タンパク質をコードする配列は、配列番号２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。或いは、又は加えて、野生型タンパク質の欠如は、１つ又は複数の制御配列を改変し、又は（部分的に）欠失させることにより達成され得る。
【００５４】
コード配列及び／又は制御配列を改変し、又は欠失させる非限定的例は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲテクノロジーの使用である。
【００５５】
野生型タンパク質の発現は、ゲノム制御配列の改変により低下し、又はノックアウトされ得る。非限定的例として、野生型タンパク質の発現は、配列番号８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する配列の遺伝子改変により、低下し、又はノックアウトされ得る。
【００５６】
遺伝子改変は、変異、例えば、非限定的に、１つ又は複数の塩基対の挿入、欠失、又は置換のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも１〜５００個、１〜４００、１〜３００個、１〜２５０個、１〜２００個、１〜１５０個、１〜１００個、１〜５０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、又は少なくとも１〜１０個の塩基対の挿入、欠失、又は置換のうちの少なくとも１つであり得る。
【００５７】
さらなる実施形態において、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、野生型タンパク質の発現が低下しており、前記野生型タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、前記植物細胞、植物組織、又は植物がジェミニウイルス科に対する（ウイルス）抵抗性が増加しており、好ましくは、ジェミニウイルス科がベゴモウイルス属である。
【００５８】
好ましくは、ジェミニウイルス科は、少なくとも１つ又は複数の一分節型メンバーを含む。好ましくは、ジェミニウイルス科は、少なくとも１つ又は複数の二分節型メンバーを含む。好ましくは、ジェミニウイルス科は、少なくとも１つ又は複数の一分節型及び二分節型メンバーを含む。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明は、野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記野生型タンパク質が配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、前記植物細胞、植物組織、又は植物が、前記野生型タンパク質の発現が低下していないがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科の少なくとも１つの二分節型メンバーに対する抵抗性が増加している、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。好ましくは、前記植物細胞、植物組織、又は植物は、ジェミニウイルス科の少なくとも１つの二分節型メンバー及び少なくとも１つの一分節型メンバーに対する抵抗性が増加している。好ましくは、野生型タンパク質は、前記植物細胞、植物組織、又は植物において発現していない。
【００６０】
好ましくは、ジェミニウイルス科の一分節型及び／又は二分節型メンバーが、本明細書に特定されているような植物に感染する能力があるウイルスである。
【００６１】
好ましくは、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、野生型タンパク質を発現しない。
【００６２】
好ましくは、ジェミニウイルス科は、一分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つ又は複数のメンバーを含む。好ましくは、ジェミニウイルス科は、二分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つ又は複数のメンバーを含む。好ましくは、ジェミニウイルス科は、一分節型及び二分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つ又は複数のメンバーを含む。
【００６３】
実施形態において、一分節型及び／又は二分節型ベゴモウイルスは、本明細書で特定されているような植物に感染する能力があるウイルスである。
【００６４】
一実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属、好ましくはトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）であり、又はそれから取得可能であり、前記植物細胞、植物組織、又は植物が、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性が増加している。その抵抗性は、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型ベゴモウイルスの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のメンバーについて増加し得る。
【００６５】
さらなる実施形態において、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属、好ましくはトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）であり、又はそれから取得可能であり、前記植物細胞、植物組織、又は植物が、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性が増加しており、前記植物細胞、植物組織、又は植物がまた、トウガラシ属植物に感染する能力がある二分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性も増加している。その抵抗性は、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型ベゴモウイルスの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のメンバーについて、及び／又はトウガラシ属植物に感染する能力がある二分節型ベゴモウイルスの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のメンバーについて増加し得る。
【００６６】
一実施形態において、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属、好ましくはトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）であり、又はそれから取得可能であり、前記植物細胞、植物組織、又は植物が、トウガラシ属植物に感染する能力がある二分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性が増加している。その抵抗性は、トウガラシ属植物に感染する能力がある二分節型ベゴモウイルスの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のメンバーについて増加し得る。
【００６７】
一実施形態において、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型及び／又は二分節型ベゴモウイルスのメンバーは、ペッパー黄化葉巻ウイルス、ペッパー葉巻ウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス、ペッパーゴールデンモザイクウイルス、ペッパー黄化葉巻インドネシアウイルス、チリ葉巻ウイルス、シナロアトマト葉巻ベゴモウイルス（Ｓｉｎａｌｏａ  ｔｏｍａｔｏ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ペッパー葉巻ラホールウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  Ｌａｈｏｒｅ  ｖｉｒｕｓ）、カーリートップウイルス（Ｃｕｒｌｙ  ｔｏｐ  ｖｉｒｕｓ）、ペッパーマイルドティグレウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  ｍｉｌｄ  ｔｉｇｒｅ  ｖｉｒｕｓ）、ペッパー葉巻バングラデシュウイルス（ｐｅｐｐｅｒ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  Ｂａｎｇｌａｄｅｓｈ  ｖｉｒｕｓ）、ペッパー葉捲ウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  ｌｅａｆｒｏｌｌ  ｖｉｒｕｓ）、ペッパー葉脈黄化マリウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｅｉｎ  Ｍａｌｉ  ｖｉｒｕｓ）、ペッパーテキサスベゴモウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  Ｔｅｘａｓ  ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ペッパーゴールデンモザイクベゴモウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  ｇｏｌｄｅｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）；ペッパーウアステコベゴモウイルス（ｐｅｐｐｅｒ  ｈｕａｓｔｅｃｏ  ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）；ペッパーウアステコビジェミニウイルス（ｐｅｐｐｅｒ  ｈｕａｓｔｅｃｏ  ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ペッパーウアステコウイルス（ｐｅｐｐｅｒ  ｈｕａｓｔｅｃｏ  ｖｉｒｕｓ）、ペッパーウアステコ葉脈黄化ベゴモウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  ｈｕａｓｔｅｃｏ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｅｉｎ  ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ペッパー葉巻バングラデシュベゴモウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  Ｂａｎｇｌａｄｅｓｈ  ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ペッパー葉巻ベゴモウイルス（ｐｅｐｐｅｒ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ペッパーマイルドティグレベゴモウイルス（ｐｅｐｐｅｒ  ｍｉｌｄ  ｔｉｇｒｅ  ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ペッパーマイルドティグレビジェミニウイルス（ｐｅｐｐｅｒ  ｍｉｌｄ  ｔｉｇｒｅ  ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、及びペッパーマイルドティグレジェミニウイルス（ｐｅｐｐｅｒ  ｍｉｌｄ  ｔｉｇｒｅ  ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）からなる群から選択される。
【００６８】
好ましい実施形態において、本発明の植物細胞、植物組織、又は植物は、ペッパー黄化葉巻ウイルス、ペッパー葉巻ウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス、ペッパーゴールデンモザイクウイルス、及び／又はペッパー黄化葉巻インドネシアウイルスのうちの少なくとも１つに対する抵抗性が増加している。
【００６９】
好ましくは、本発明の植物細胞、植物組織、又は植物は、ペッパー黄化葉巻ウイルス、ペッパー葉巻ウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス、及びペッパーゴールデンモザイクウイルスのうちの少なくとも１つに対する抵抗性が増加している。
【００７０】
好ましくは、本発明の植物細胞、植物組織、又は植物は、ペッパー黄化葉巻ウイルス及びペッパー葉巻ウイルスのうちの少なくとも１つに対する抵抗性が増加している。
【００７１】
好ましくは、本発明の植物細胞、植物組織、又は植物は、ペッパー葉巻ウイルス、好ましくはＭ１５６株（ＰＬＣＶ  Ｍ１５６）、黄化葉巻インドネシアウイルス（ＰｅｐＹＬＣＩＶ）、ウアステコ葉脈黄化ウイルス（ＰＨＹＶＶ）、ペッパーゴールデンモザイクウイルス、及びビートカーリートップウイルス（Ｂｅｅｔ  ｃｕｒｌｙ  ｔｏｐ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＣＴＶ）のうちの少なくとも１つに対する抵抗性が増加している。
【００７２】
好ましい実施形態において、本発明は、野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記タンパク質が配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは前記野生型タンパク質が発現せず、前記植物細胞、植物組織、又は植物が改変型タンパク質を発現する、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。改変型タンパク質は、好ましくは、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する配列を有する。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明は、野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記タンパク質が配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは前記野生型タンパク質が発現せず、並びに、前記植物細胞、植物組織、又は植物が、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有するタンパク質を発現し、及び前記タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含む、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。実施形態において、改変型タンパク質の発現が、前記改変を含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる。
【００７４】
本明細書に定義されているような改変型タンパク質の発現は、内因性プロモーター、例えば、非限定的に、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現を調節するプロモーターにより調節され得る。好ましくは、プロモーターは、配列番号８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。
【００７５】
好ましくは、改変を含むタンパク質は、配列番号１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は約９９％の配列同一性を有する。好ましくは、前記タンパク質は、配列番号１と約９９．２％の配列同一性を有する。好ましくは、配列番号１はＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿０１６５７２２８１．１に対応する。
【００７６】
好ましい実施形態において、本発明は、野生型タンパク質の発現が低下している植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記タンパク質が配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは前記野生型タンパク質が発現しない、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。
【００７７】
植物、植物組織、又は植物細胞は、好ましくは、切り詰め型タンパク質である改変型タンパク質を発現する。切り詰め型タンパク質は、野生型タンパク質のＮ末端配列、好ましくは、少なくとも１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、又は３５０個のＮ末端アミノ酸を含み、又はそれからなり得る。好ましくは、植物、植物組織、又は植物細胞は、配列番号１と少なくとも約７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質を発現し、前記タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である。好ましくは、植物、植物組織、又は植物細胞は、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質を発現し、前記タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である。実施形態において、切り詰め型タンパク質の発現は、前記切り詰めを含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる。
【００７８】
好ましくは、切り詰め型タンパク質は、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜２９８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有し、前記タンパク質が、２９９〜３７８、３００〜３７８、３０１〜３７８、３０２〜３７８、３０３〜３７８、３０４〜３７８、３０５〜３７８、３０６〜３７８、３０７〜３７８、３０８〜３７８、３０９〜３７８、３１０〜３７８、３１１〜３７８、３１２〜３７８、３１３〜３７８、３１４〜３７８、３１５〜３７８、３１６〜３７８、３１７〜３７８、３１８〜３７８、３１９〜３７８、及び３２０〜３７８からなる群から選択される配列番号１の位置に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である。好ましくは、切り詰め型タンパク質は、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０４に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有し、前記タンパク質が、３０５〜３７８、３０６〜３７８、３０７〜３７８、３０８〜３７８、３０９〜３７８、３１０〜３７８、３１１〜３７８、３１２〜３７８、及び３１３〜３７８からなる群から選択される配列番号１の位置に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である。
【００７９】
好ましくは、切り詰めは、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、又は３１９からなる群から選択される配列番号１の位置に対応するアミノ酸残基から、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、及び３７８からなる群から選択される配列番号１の位置に対応するアミノ酸残基を含むそれまでの欠如である。
【００８０】
好ましくは、切り詰めは、切り詰め型タンパク質をコードするＤＮＡ分子における停止コドンの存在による。好ましくは、配列番号２と、位置１〜９１５（好ましくは、位置１〜９２４）に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ分子において停止コドンがあり、停止コドンが、９１６〜９１８、９１９〜９２１、９２２〜９２４、９２５〜９２７、９２８〜９３０、９３１〜９３３、及び９３４〜９３６からなる群から選択される位置に対応する位置に存在する。好ましくは、停止コドンは、配列番号２の位置９２５〜９２７に対応する位置に存在する。
【００８１】
好ましくは、切り詰め型タンパク質は、配列番号１の位置１〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【００８２】
好ましくは、改変型タンパク質は、本明細書に定義されているような切り詰めのみを含む。
【００８３】
好ましい実施形態において、改変を含まず、及び／又は切り詰めを含まない、タンパク質は、野生型タンパク質の同じアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。したがって、野生型タンパク質は、本明細書に定義されているような改変を含まないタンパク質と同じタンパク質であり得る。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質を発現する植物細胞、植物組織、又は植物であって、前記タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含み；又は前記改変型タンパク質が配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質であり、前記改変又は切り詰めが、前記改変を含まず又は前記切り詰めを含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させ、前記改変を含まず又は前記切り詰めを含まない前記タンパク質が、前記タンパク質の野生型バージョンである、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。好ましくは、改変型タンパク質を発現する植物細胞、植物組織、又は植物は、前記タンパク質の野生型バージョンを発現しない。
【００８４】
本明細書に定義されているような植物細胞、植物組織、又は植物は、改変型タンパク質を含み得、前記改変型タンパク質が、ｉ）配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含み、又はｉｉ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置１〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有する切り詰め型タンパク質であり、前記切り詰め型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する。
【００８５】
或いは、本明細書に定義されているような植物細胞、植物組織、又は植物は、少なくとも２つの異なる改変型タンパク質を含み得、ｉ）１つの改変型タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、前記改変型タンパク質が配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含み、及びｉｉ）第２の改変型タンパク質が、配列番号１の位置１〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも７５％の配列同一性を有する切り詰め型タンパク質であり、前記切り詰め型タンパク質が配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する。
【００８６】
改変型タンパク質は、本明細書において、
ｉ）配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有するタンパク質であって、前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含む、タンパク質；並びに
ｉｉ）配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有する切り詰め型タンパク質であって、前記切り詰め型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する、切り詰め型タンパク質
のうちの少なくとも１つとして理解され、ただし、前記改変を含むタンパク質のみ、又は前記切り詰めを含むタンパク質のみが意図されることが、文章に明らかに示されている場合を除く。
【００８７】
実施形態において、改変型タンパク質を含む植物細胞、植物組織、又は植物は、前記改変型タンパク質を発現しない同じ植物細胞、植物組織、又は植物、例えば、その他の点では同一の植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している。好ましくは、前記改変型タンパク質を発現する植物細胞、植物組織、又は植物は、その他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と同じ条件下で生育する。
【００８８】
実施形態において、前記タンパク質は、配列番号１の位置６８〜７６、６９〜７５、７０〜７４、好ましくは位置７１〜７３における１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含む。好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号１の位置６８〜７６、６９〜７５、７０〜７４、好ましくは位置７１〜７３における１つ又は複数のアミノ酸残基の改変のみを含む。１つ又は複数のアミノ酸改変は、改変型タンパク質が配列番号１の位置６７〜７７に対応する残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸改変を含み得ることと本明細書では理解される。したがって、配列番号１の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、及び７７のうちの少なくとも１つにおいて改変がある。
【００８９】
改変は、前記領域における１つ又は複数のアミノ酸残基の、異なる天然に存在し、又は天然に存在しないアミノ酸残基での置換であり得る。したがって、１個のアミノ酸残基が、１個の他の天然に存在し、又は天然に存在しないアミノ酸残基で置換され得る。或いは、又は加えて、配列番号１の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、及び／又は７７に対応する位置の少なくとも１つにおける、少なくとも１個のアミノ酸残基が、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の天然に存在し、又は天然に存在しないアミノ酸残基によって置換され得る。加えて、改変は、前記領域におけるアミノ酸残基の欠失であり得る。例えば、配列番号１の位置７１におけるアミノ酸の改変が、位置７１におけるアミノ酸残基の欠失であり得る。
【００９０】
植物細胞、植物組織、又は植物が、ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加しているかどうかは、当業者に知られた任意の通常の方法を用いて容易に決定することができる。
【００９１】
非限定的例として、ジェミニウイルス科の１つ又は複数のメンバーに対する抵抗性の増加は、対照植物を、野生型タンパク質の発現が低下している植物と、前記対照植物においてある特定の期間後、病気の少なくとも１つの徴候が観察され得るように選択された調節条件下で、比較することにより決定することができ、前記野生型タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有する。そのような調節条件としては、例えば、本明細書に定義されているようなジェミニウイルス科の１つ又は複数のメンバーなどの、感染及び／又は外寄生する能力がある１つ又は複数のジェミニウイルス科ウイルスでの植物の感染又は外寄生が挙げられる。
【００９２】
さらなる非限定的例として、ジェミニウイルス科の１つ又は複数のメンバーに対する抵抗性の増加は、対照植物を、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を与えられた植物と、前記対照植物においてある特定の期間後、病気の少なくとも１つの徴候が観察され得るように選択された調節条件下で、比較することにより決定することができる。そのような調節条件としては、例えば、本明細書に定義されているようなジェミニウイルス科の１つ又は複数のメンバーなどの、感染及び／又は外寄生する能力がある１つ又は複数のジェミニウイルス科ウイルスでの植物の感染又は外寄生が挙げられる。
【００９３】
実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下している植物は、ジェミニウイルス科の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、又は全部のメンバーに対する抵抗性が増加している。好ましくは、前記植物は、ジェミニウイルス科の１つ又は複数の二分節型メンバーに対する抵抗性が増加している。
【００９４】
さらなる実施形態において、改変型タンパク質を発現する植物は、ジェミニウイルス科の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、又は全部のメンバーに対する抵抗性が増加している。好ましくは、前記植物は、ジェミニウイルス科の１つ又は複数の二分節型メンバーに対する抵抗性が増加している。
【００９５】
選択された調節条件下で、対照植物は、好ましくは、病気の少なくとも１つの徴候（すなわち、１つの症状）を示す。病気の症状は、当業者によく知られている。そのような症状には、ある特定の期間後の、発育阻害、歪んだ生長、葉の縮れ、巻き、歪み、金光と緑黄モザイク／斑点、葉脈間黄化、変色（例えば、黄斑）、葉脈膨張、紫化、及び／又は黄化が挙げられるが、それらに限定されない。病気の症状としては、少なくとも葉の巻き及び／又は変色が挙げられ得る。対照植物は、ある特定の期間後、病気の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの徴候を示し得る。或いは、対照植物は、ある特定の期間後、病気の１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、５つ以下、６つ以下、７つ以下、又は８つ以下の徴候を示す場合がある。
【００９６】
本明細書で用いられる場合のある特定の期間は、好ましくは、対照植物において病気の少なくとも１つ、２つ、又は３つの徴候を観察する前の任意の期間であり、この期間は、実験設定に依存し得る。そのような期間は、当業者により容易に決定することができる。好ましくは、病気の少なくとも１つ、２つ、又は３つの徴候を観察する前のそのような期間は、少なくとも約２０日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、５０日間、６０日間、又は約７０日間である。好ましくは、症状を観察する前の期間は、約２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、又は６ヶ月間である。
【００９７】
好ましくは、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下している植物は、本明細書に定義されているようなある特定の期間後、対照植物と比較して病気のより少ない、及び／又は低下した徴候を示すだろう。
【００９８】
好ましくは、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を含む植物は、本明細書に定義されているようなある特定の期間後、対照植物と比較して病気のより少ない、及び／又は低下した徴候を示すだろう。
【００９９】
非限定的例として、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに含む植物は、対照植物と比較して、低下した、発育阻害、歪んだ生長、葉の縮れ、巻き、歪み、金光と緑黄モザイク／斑点、葉脈間黄化、変色（例えば、黄斑）、葉脈膨張、紫化、及び黄化のうちの少なくとも１つを示し得る。病気の症状としては、少なくとも葉の巻き及び／又は変色が挙げられ得る。或いは、又は加えて、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに含む植物は、本明細書に定義されているような病気の１つ又は複数の徴候を、対照植物と類似した又は同じ重症度で示すことがあるが、その病気の１つ又は複数の徴候は、対照植物と比較して、より後の時点におけるものであり、例えば、病気の１つ又は複数の症状の遅延があるだろう。非限定的例として、対照植物と比較して、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、又は８週間の遅延があり得る。当業者は、例えば、本明細書の下記で詳述された実施例セクションに用いられた調節条件などの適切な条件を選択する方法を知っている。
【０１００】
ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している場合、その植物がジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーの感染に曝された時、植物は、好ましくは、正常な生長及び／又は正常な発育を維持する能力があり、その感染は、そうでなければ、その植物の生長の低下及び／又は発育の低下を生じていたであろう。したがって、ジェミニウイルス科に対する抵抗性の増加は、植物を比較することにより決定することができる。非限定的例として、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物は、１つの対照植物と比較することができる。或いは、又は加えて、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の郡は、対照植物の群と比較され得る。各群は、例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、又は１００個の個々の植物を含み得る。
【０１０１】
当業者は、ジェミニウイルス科に対する抵抗性の増加を決定するための適切な条件を選択する方法、及び感染の徴候を測定する方法をよくわかっている。非限定的例として、ジェミニウイルス科のメンバーに対する抵抗性は、例えば、変色及び／又は葉の巻きについて、目視検査により測定することができる。
【０１０２】
実施形態において、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性は、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーの感染後、好ましくは本明細書に定義されているような条件下で、変色した葉の数を数えることにより決定される。本明細書に定義されているような対照植物と比較して、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物において、変色した葉の数はより少なく、又は（ウイルス起因性の）変色した葉は存在しない。
【０１０３】
当業者は、ウイルス感染後の葉の変色を評価する方法を知っている。非限定的例として、変色の量は、目視検査により、又は変色を示す葉を数えることにより、決定することができる。非限定的例として、葉が少なくとも１個の（ウイルス起因性の）変色斑点を有するならば、葉は、変色したとして数えられる。或いは、葉が少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、又は７個のウイルス起因性変色斑点を有するならば、葉は変色を示している。変色斑点の直径は、好ましくは、少なくとも１０ｍｍ、２５ｍｍ、５０ｍｍ、１ｃｍ、又は少なくとも５ｃｍであり得る。別の実施形態において、変色斑点の表面は、少なくとも１０ｍｍ、２５ｍｍ、５０ｍｍ、１ｃｍ、又は少なくとも５ｃｍである。
【０１０４】
感染した対照植物は、少なくとも１枚の葉のウイルス起因性変色を有し得る。或いは、感染した対照植物は、少なくとも１枚、２枚、３枚、４枚、５枚、６枚、７枚、８枚、９枚、又は１０枚の変色した葉を有する。本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物は、好ましくは、（ウイルス起因性の）変色した葉を少しも示さない。或いは、前記野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、前記改変型タンパク質をさらに発現する植物は、感染した対照植物の葉の数と比較して、より少ない変色した葉を有し得る。好ましくは、（ウイルス起因性の）変色した葉の数は、感染した対照植物の変色した葉の数の８０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、又は１％未満である。
【０１０５】
或いは、又は加えて、対照植物の葉は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の葉と比較して、１枚の葉あたりより多い変色斑点を有する。対照植物の全ての葉の変色の程度は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の全ての葉の変色と比較することができる。全ての植物葉の変色の程度は、目視検査により、又は本明細書の上記で定義されているような変色斑点の数を数え、斑点の数を植物あたりの葉の数で割ることにより、決定することができる。
【０１０６】
代替として、又は追加として、ジェミニウイルス科のメンバーに対する抵抗性は、葉の巻きについての目視検査により測定することができる。実施形態において、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性は、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーの感染後、好ましくは本明細書に定義されているような条件下で、巻かれた葉の数を数えることにより決定される。本明細書に定義されているような対照植物と比較して、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物において、巻かれた葉の数はより少なく、又は（ウイルス起因性の）巻かれた葉は存在しない。
【０１０７】
当業者は、ウイルス感染後の葉の巻きを評価する方法を知っている。非限定的例として、巻きの程度は、巻かれた葉の数を数えることにより決定することができる。感染した対照植物は、少なくとも１つの葉のウイルス起因性巻きを有し得る。或いは、感染した対照植物は、少なくとも１枚、２枚、３枚、４枚、５枚、６枚、７枚、８枚、９枚、又は１０枚の巻かれた葉を有する。本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物は、好ましくは、（ウイルス起因性の）巻かれた葉を少しも示さない。或いは、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、前記改変型タンパク質をさらに発現する植物は、感染した対照植物の葉の数と比較して、より少ない巻かれた葉を有し得る。好ましくは、（ウイルス起因性の）巻かれた葉の数は、感染した対照植物の変色した葉の８０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、又は１％未満である。
【０１０８】
抵抗性植物のパーセンテージは、病気をもたない植物の数を数えることにより決定することができる。実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、前記改変型タンパク質をさらに発現する、病気をもたない植物の数が決定される。好ましくは、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、前記改変型タンパク質をさらに発現する植物が、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーに曝露され、病気をもたない植物の数は、ジェミニウイルス科のメンバーでの曝露前の植物の数の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％である。さらなる実施形態において、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性は、実施例２により記載されているように、ジェミニウイルス科の（１つ又は複数の）メンバーのＰＣＲに基づいた検出により決定することができる。
【０１０９】
実施形態において、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーの相対力価は、外寄生された罹病性植物において決定することができる。加えて、ジェミニウイルス科の同じ少なくとも１つのメンバーの相対力価は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する、外寄生された植物において決定することができる。罹病性植物から得られた力価は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で、前記改変型タンパク質をさらに発現する植物から得られた力価と比較することができる。好ましい実施形態において、罹病性植物から得られた力価は、１００％に設定され、好ましくは、抵抗性植物から得られた力価は、罹病性植物から得られた力価と比較して高くとも（せいぜい）約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、又は約０．１％である。
【０１１０】
相対力価は、当技術分野において知られた任意の通常の方法を用いて決定することができ、その方法としては、ｑＰＣＲに基づいた検出が挙げられるが、それに限定されない。
【０１１１】
実施形態において、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性は、Ｓｃｏｔｔら（Ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｗｈｉｔｅｆｌｙ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ  ｔｏ  ｔｏｍａｔｏ（１９９６）、３５７〜３６７ページ、Ｇｅｒｌｉｎｇ，Ｄ．及びＲ．Ｔ．Ｍａｙｅｒ（編）、Ｂｅｍｉｓｉａ  １９９５：Ｔａｘｏｎｏｍｙ，ｂｉｏｌｏｇｙ，ｄａｍａｇｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ，ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｌｔｄ．、Ａｎｄｏｖｅｒ、Ｈａｎｔｓ、ＵＫ）、及び／又はＬａｐｉｄｏｔら（「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｍａｔｏ  ｙｅｌｌｏｗ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００６）９６（１２）：１４０４〜８により記載されているように決定することができる。抵抗性は、病気重症度を０〜４の病気重症度指数スケールで評価することにより測定することができる。例えば、病気重症度が０と採点されたならば、その植物は、抵抗性であると見なされる。スケールは、表１に提示されているように分類される。
【０１１２】
【表１】
2021507691.tif 000003
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、対照植物の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が３〜４と採点される同じ条件下で生育した場合、０〜２、好ましくは０〜１と採点される。
【０１１３】
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、対照植物の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が４と採点される同じ条件下で生育した場合、３と採点される。
【０１１４】
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、対照植物の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が４と採点される同じ条件下で生育した場合、２と採点される。
【０１１５】
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、対照植物の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が４と採点される同じ条件下で生育した場合、１と採点される。
【０１１６】
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、対照植物の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が４と採点される同じ条件下で生育した場合、０と採点される。
【０１１７】
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の多くとも約０％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は多くとも約６０％が、対照植物の少なくとも約９０％、９５％、又は１００％が３又は４と採点される同じ条件下で生育した場合、３又は４と採点される。
【０１１８】
別の実施形態において、対照植物の少なくとも約９０％、９５％、又は１００％が３又は４と採点され、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で前記改変型タンパク質をさらに発現する植物の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％が、０又は１と採点される同じ条件下で生育した場合、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の多くとも約０％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は多くとも約６０％が、３又は４と採点される。
【０１１９】
さらに別の実施形態において、ジェミニウイルス科の少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性は、例えば、参照により本明細書に組み入れられているＯｂａｉａｈら、（２０１３）Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｂｌａｃｋｇｒａｍ（Ｖｉｇｎａｍｕｎｇｏ（Ｌ．）Ｈｅｐｐｅｒ）ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｔｉｃａ  ７（１＆２）：９６〜１００ページ）に記載されているように、病気重症度を１〜９のスケール（「９」と分類された植物は十分に罹病性が高く、「１」に分類された植物は無症状である）で評価することにより決定される。好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、対照植物の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が６〜９、好ましくは７〜９又は８〜９と採点される同じ条件下で生育した場合、１〜３、好ましくは１〜２と採点される。
【０１２０】
さらなる実施形態において、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに含み、及び発芽能が、前記改変を含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物の発芽能と類似したままである、植物細胞、植物組織、又は植物である。好ましくは、前記改変型タンパク質は、本明細書に定義されているような配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変である。
【０１２１】
用語「発芽能」又は「発芽率」は、本明細書で交換可能に用いることができ、所定の期間中、発芽する可能性が高い、特定の植物種、品種、又は種ロットの種子の数として本明細書に定義される。それは、発芽の時間経過の尺度であり、通常、パーセンテージとして表され、例えば、８５％発芽率は、与えられた発芽期間中に適切な条件下で１００個の種子のうち約８５個がおそらく発芽するだろうことを示す。本発明の関連において用いられる場合、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の発芽能は、好ましくは、対照植物、例えば、前記改変を含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物の発芽能と類似したままである。類似した発芽能は、好ましくは、対照植物の発芽パーセンテージと比較して、約０．１％以下、０．５％以下、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、又は２０％以下だけ異なる発芽パーセンテージとして本明細書で理解される。好ましくは、対照植物の種子、及び本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の種子は、同じ条件下で保存される。好ましくは、対照植物の種子、及び本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現する植物の種子を、与えられた同じ条件及び／又は同じ発芽期間の下で発芽させる。
【０１２２】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下し、任意選択で本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに含む植物細胞、植物組織、又は植物であって、少なくとも１つの改変が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する位置における１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失である、植物細胞、植物組織、又は植物に関する。さらなる実施形態において、改変型タンパク質は、配列番号１の位置６８〜７６、６９〜７５、７０〜７４、好ましくは、位置７１〜７３に対応する位置における１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失を含む。１つ又は複数のアミノ酸欠失は、前記改変型タンパク質が配列番号１の位置６７〜７７に対応する残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸欠失を含み得ると、本明細書で理解される。
【０１２３】
好ましい実施形態において、改変は、本明細書に示された位置における少なくとも１個、２個、又は３個のアミノ酸残基の欠失である。好ましくは、改変は、配列番号１の位置７１、７２、又は７３に対応する少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失である。より好ましくは、改変は、配列番号１の位置７１、７２、又は７３に対応する少なくとも２個のアミノ酸残基の欠失、すなわち、位置７１と７２；７２と７３；又は７１と７３に対応する残基の欠失である。さらにより好ましくは、改変は、配列番号１の位置７１、７２、及び７３に対応する３個のアミノ酸残基の欠失である。
【０１２４】
さらなる実施形態において、改変型タンパク質は、配列番号１の位置１〜６６に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。加えて、又は或いは、本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、配列番号１の位置７８〜３７８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０１２５】
さらに別の実施形態において、本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、配列番号４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされる。したがって、本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、好ましくは、配列番号４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む核酸から発現する。
【０１２６】
実施形態において、前記改変を含まない前記タンパク質は、配列番号２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。改変を含まない前記タンパク質は、野生型タンパク質であり得るため、改変を含まない前記タンパク質のヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡへ変換されている内因性ｍＲＮＡ配列と対応し得る。
【０１２７】
実施形態において、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をコードする核酸は、配列番号２と少なくとも約７５％、８０％、８１．５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．２％の配列同一性を有する配列を含む。加えて、又は或いは、前記改変を含まない前記タンパク質をコードする核酸は、配列番号４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の配列同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態において、前記改変型タンパク質は切り詰め型タンパク質であり、前記切り詰め型タンパク質が、配列番号１の位置１〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０１２８】
さらに別の実施形態において、本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、切り詰め型タンパク質であり、配列番号５と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされる。したがって、本明細書に定義されているような切り詰め型タンパク質は、好ましくは、配列番号６と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む核酸から発現する。
【０１２９】
さらなる実施形態において、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下しており、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を含み、前記改変型タンパク質がジェミニウイルス科に対する（ウイルス）抵抗性を増加させ、好ましくは、ジェミニウイルス科がベゴモウイルス属である。
【０１３０】
一実施形態において、改変型タンパク質は、一分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つ又は複数のメンバーに対する抵抗性を増加させる。さらなる実施形態において、改変型タンパク質は、一分節型及び二分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つ又は複数のメンバーに対する抵抗性を増加させる。好ましくは、本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、ベゴモウイルスの少なくとも１つ又は複数の二分節型メンバーに対する抵抗性を増加させる。実施形態において、一分節型及び／又は二分節型ベゴモウイルスは、本明細書に特定されているような植物に感染する能力があるウイルスである。好ましくは、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、本発明の改変型タンパク質をホモ接合性にコードする。
【０１３１】
一実施形態において、改変型タンパク質は、一分節型ジェミニウイルス科の少なくとも１つ又は複数のメンバーに対する抵抗性を増加させる。
【０１３２】
好ましくは、本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、ジェミニウイルス科の少なくとも１つ又は複数の二分節型メンバーに対する抵抗性を増加させる。さらなる実施形態において、改変型タンパク質は、一分節型及び二分節型ジェミニウイルス科の少なくとも１つ又は複数のメンバーに対する抵抗性を増加させる。実施形態において、ジェミニウイルス科の一分節型及び／又は二分節型メンバーは、本明細書に特定されているような植物に感染する能力があるウイルスである。
【０１３３】
好ましくは、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を発現する植物細胞、植物組織、又は植物は、双子葉作物である。用語「双子葉類の」及び「双子葉類」は、本明細書で交換可能に用いられる。好ましくは、双子葉作物は、トウガラシ属、トマト、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、キャッサバ、ワタ属、ウリ科、ナス、オクラ、マメ科、及びアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からなる群から選択される。
【０１３４】
本発明は、いかなる特定の植物細胞、植物組織、又は植物にも限定されない。本発明は、他の植物細胞、植物組織、又は植物に同等に適用され、すなわち、本明細書で詳述されているような「トウガラシ属」へのいかなる言及も、任意の他の双子葉作物へ同等に適用され、好ましくは、ダイズ、トマト、キャッサバ、ワタ属、ウリ科、ナス、オクラ、マメ科、及びアラビドプシス属のうちの少なくとも１つにも適用されると、本明細書では理解される。好ましくは、本明細書で詳述されているような「トウガラシ属」へのいかなる言及も、ダイズ、キャッサバ、ワタ属、及びウリ科のうちの少なくとも１つに同等に適用される。好ましくは、本明細書で詳述されているような「トウガラシ属」へのいかなる言及も、少なくともキャッサバ及びワタ属に同等に適用される。いくつかの実施形態において、本明細書で詳述されているような「トウガラシ属」への言及は、トマト及びアラビドプシス属に適用されない。
【０１３５】
本明細書に定義されているような本発明がトマトに適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号１８と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有し、本発明がキャッサバに適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号１２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有し、本発明がワタ属に適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号１３及び１４のうちの少なくとも１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有し、本発明がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号１７と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有し、本発明がウリ科に適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号１１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有し、本発明がダイズに適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号１５及び１６のうちの少なくとも１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有すると、本明細書で理解されるものとする。
【０１３６】
本明細書に定義されているような本発明がトマトに適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号２６と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する配列によりコードされ、本発明がキャッサバに適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号２０と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する配列によりコードされ、本発明がワタ属に適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号２１及び２２のうちの少なくとも１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する配列によりコードされ、本発明がシロイヌナズナに適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号２５と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する配列によりコードされ、本発明がウリ科に適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号１９と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する配列によりコードされ、本発明がダイズに適用される場合、野生型タンパク質は、好ましくは、配列番号２３及び２４のうちの少なくとも１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する配列によりコードされると、さらに本明細書で理解されるものとする。
【０１３７】
一実施形態において、植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属植物であり、又はそれから取得可能であり、好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属植物細胞、植物組織、又は植物である。好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ（Ｃ．ａｎｎｕｕｍ）、アヒ・アマリージョ、Ｃ．シネンゼ、キダチトウガラシ、又はロコトであり、又はそれから取得可能である。より好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ（Ｃ．ａｎｎｕｕｍ）であり、又はそれから取得可能である。
【０１３８】
同様に、一実施形態において、植物細胞、植物組織、又は植物は、ワタ属植物であり、又はそれから取得可能であり、好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、ワタ属植物細胞、植物組織、又は植物である。好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、ケブカワタ（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、カイトウメン（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ナンキンワタ（Ｇ．ａｒｂｏｒｅｔｕｍ）、又はレバントワタ（Ｇ．ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）であり、又はそれから取得可能である。好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、ケブカワタ（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）であり、又はそれから取得可能である。
【０１３９】
一実施形態において、植物細胞、植物組織、又は植物は、ウリ科植物であり、又はそれから取得可能であり、好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、ウリ科植物細胞、植物組織、又は植物である。好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、ペポカボチャ、ニホンカボチャ、メロン、又はキュウリであり、又はそれから取得可能である。より好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、ペポカボチャであり、又はそれから取得可能である。
【０１４０】
一実施形態において、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属、好ましくはトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）である（又はそれから取得可能である）。好ましくは、植物は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下しており、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現し、前記改変型タンパク質が、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性を増加させる。前記改変型タンパク質は、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型ベゴモウイルスの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のメンバーに対する抵抗性を増加させ得る。
【０１４１】
さらなる実施形態において、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属、好ましくはトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）であり（又はそれから取得可能であり）、前記植物が、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現が低下しており、任意選択で、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をさらに発現し、及び前記改変型タンパク質が、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性を増加させ、前記改変型タンパク質がまた、トウガラシ属植物に感染する能力がある二分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性を増加させる。前記改変型タンパク質は、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型ベゴモウイルスの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のメンバー及び／又はトウガラシ属植物に感染する能力がある二分節型ベゴモウイルスの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のメンバーに対する抵抗性を増加させ得る。
【０１４２】
一実施形態において、本発明による植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属、好ましくはトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）であり、又はそれから取得可能であり、前記改変型タンパク質が、トウガラシ属植物に感染する能力がある二分節型ベゴモウイルスの少なくとも１つのメンバーに対する抵抗性を増加させる。前記改変型タンパク質は、トウガラシ属植物に感染する能力がある二分節型ベゴモウイルスの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のメンバーに対する抵抗性を増加させ得る。
【０１４３】
一実施形態において、トウガラシ属植物に感染する能力がある一分節型及び／又は二分節型ベゴモウイルスのメンバーは、ペッパー黄化葉巻ウイルス、ペッパー葉巻ウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス、ペッパーゴールデンモザイクウイルス、ペッパー黄化葉巻インドネシアウイルス、チリ葉巻ウイルス、シナロアトマト葉巻ベゴモウイルス、ペッパー葉巻ラホールウイルス、カーリートップウイルス、ペッパーマイルドティグレウイルス、ペッパー葉巻バングラデシュウイルス、ペッパー葉捲ウイルス、ペッパー葉脈黄化マリウイルス、ペッパーテキサスベゴモウイルス、ペッパーゴールデンモザイクベゴモウイルス；ペッパーウアステコベゴモウイルス；ペッパーウアステコビジェミニウイルス、ペッパーウアステコウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ベゴモウイルス、ペッパー葉巻バングラデシュベゴモウイルス、ペッパー葉巻ベゴモウイルス、ペッパーマイルドティグレベゴモウイルス、ペッパーマイルドティグレビジェミニウイルス、及びペッパーマイルドティグレジェミニウイルスからなる群から選択される。
【０１４４】
好ましい実施形態において、本発明の植物細胞、植物組織、又は植物は、ペッパー黄化葉巻ウイルス、ペッパー葉巻ウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス、ペッパーゴールデンモザイクウイルス、及び／又はペッパー黄化葉巻インドネシアウイルスのうちの少なくとも１つに対する抵抗性が増加している。
【０１４５】
好ましくは、前記改変型タンパク質は、ペッパー黄化葉巻ウイルス、ペッパー葉巻ウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス、及びペッパーゴールデンモザイクウイルスのうちの少なくとも１つに対する抵抗性を増加させる。
【０１４６】
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、ペッパー黄化葉巻ウイルス、ペッパー葉巻ウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス、ペッパーゴールデンモザイクウイルス、及び／又はペッパー黄化葉巻インドネシアウイルスのうちの少なくとも１つに対する抵抗性を増加させる。より好ましい実施形態において、前記改変型タンパク質は、ペッパー黄化葉巻ウイルス、ペッパー葉巻ウイルス、ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス、及びペッパーゴールデンモザイクウイルスのうちの少なくとも１つに対する抵抗性を増加させる。さらにより好ましい実施形態において、前記改変型タンパク質は、ペッパー黄化葉巻ウイルス及び／又はペッパー葉巻ウイルスに対する抵抗性を増加させる。
【０１４７】
好ましくは、本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、ペッパー葉巻ウイルス、好ましくはＭ１５６株（ＰＬＣＶ  Ｍ１５６）、黄化葉巻インドネシアウイルス（ＰｅｐＹＬＣＩＶ）、ウアステコ葉脈黄化ウイルス（ＰＨＹＶＶ）、ペッパーゴールデンモザイクウイルス、及びビートカーリートップウイルス（ＢＣＴＶ）のうちの少なくとも１つに対する抵抗性を増加させる。
【０１４８】
第２の態様において、本発明は、本明細書に定義されているような改変型タンパク質に関する。
【０１４９】
一実施形態において、改変型タンパク質は、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、本明細書に定義されているような、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含む。
【０１５０】
好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有し、前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含む。好ましくは、改変型タンパク質は、本明細書に定義されているような植物細胞、植物組織、又は植物に発現している場合、前記改変を含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる。
【０１５１】
好ましくは、改変型タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ａ０Ａ０６８ＴＵＨ６を含まず、又はそれからならない。加えて、又は或いは、改変型タンパク質は、国際公開第２０１４／０４５２０６号に開示されているような配列番号９も１０も含まず、又はそれらからならない。
【０１５２】
好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号３と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、単離されたタンパク質であり得、又は前記タンパク質は、細胞、例えば、本明細書に定義されているような植物細胞に存在し得る。好ましくは、改変型タンパク質は、トウガラシ属細胞に存在する。本明細書に定義されているような改変型タンパク質は、前記細胞に存在する核酸から発現し得る。好ましくは、核酸は、前記細胞のゲノムへ、例えば安定的に組み込まれて、存在する。
【０１５３】
さらなる実施形態において、改変型タンパク質は切り詰め型タンパク質である。好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、又は８１．５％の配列同一性を有する。好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号１の位置１〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し、前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である。
【０１５４】
好ましくは、改変型タンパク質は、本明細書に定義されているような植物細胞、植物組織、又は植物に発現している場合、前記切り詰めを含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる。好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号５と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
好ましくは、前記タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、又はそれからなる。
【０１５６】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様の改変型タンパク質をコードする配列を含む核酸に関する。
【０１５７】
好ましくは、前記核酸は、配列番号４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。或いは、前記核酸は、配列番号６と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１５８】
好ましくは、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を発現する核酸は、本明細書に定義された植物細胞、植物組織、又は植物に存在する。核酸は、植物細胞へ、例えば、プラスミドの一過性トランスフェクションにより、一過性に導入することができる。或いは、又は加えて、核酸は、植物細胞のゲノムに安定的に存在し得る。非限定的例として、核酸は、植物細胞のゲノムへ安定的に組み込まれ得る。或いは、又は加えて、核酸は、改変された内因性核酸、すなわち、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をコードするように改変された内因性核酸であり得る。好ましくは、内因性核酸は、コードされたタンパク質が配列番号１の位置６９〜７７に対応するアミノ酸残基において改変されているように、１つ又は複数の位置において改変されている。好ましくは、配列番号２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する内因性コード配列が、配列番号４又は配列番号６と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有するコード配列へ改変され、好ましくは、配列番号４又は配列番号６を有する配列へ改変される。
【０１５９】
好ましくは、前記改変型コード配列から発現したタンパク質は、配列番号３と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。或いは、前記改変型配列から発現したタンパク質は、配列番号５と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有し得る。
【０１６０】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号７と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸であって、前記配列が、配列番号７の位置５９７２又は５９７３に対応する位置に改変を有し、結果として、エクソン４の前に機能障害性アクセプタースプライス部位を生じる、核酸に関する。配列番号７は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質についてのコード配列を含むゲノム配列である。好ましくは、位置５９７３におけるグアノシンがアデノシンへ改変されている。好ましくは、前記改変型配列から発現したタンパク質は、本明細書に定義されているような１つ又は複数のアミノ酸の改変（例えば、欠失）を含むタンパク質である。好ましくは、前記改変型配列から発現したタンパク質は、配列番号３と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。
【０１６１】
加えて、本発明は、配列番号７と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約９９．５％の配列同一性を有する核酸であって、前記配列が、本明細書に定義されているような初期停止コドンを含む、核酸に関する。前記配列から発現した改変型タンパク質は、好ましくは、本明細書に定義されているような切り詰め型タンパク質である。好ましくは、前記配列から発現したタンパク質は、配列番号５と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。
【０１６２】
第４の態様において、本発明は、本明細書に定義されているような核酸を含む核酸構築物に関する。好ましくは、核酸は、細胞における発現のための転写制御エレメントと作動可能に連結されている。好ましくは、転写制御エレメントは、プロモーターエレメントである。したがって、一実施形態において、核酸構築物は、細菌細胞又は植物細胞などの細胞における発現のためのプロモーターと作動可能に連結されている、本明細書に定義されているような核酸を含む。好ましくは、本発明による核酸は、植物細胞における発現のためのプロモーターと作動可能に連結されている。用語「作動可能に連結される」は、ポリヌクレオチドエレメントの機能的関係での連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係へ置かれた場合、「作動可能に連結されている」。例として、プロモーター、又はもっと正確に述べれば、転写制御配列が、それがコード配列の転写に影響するならば、そのコード配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結されるとは、連結されることになっているＤＮＡ配列が近接していることを意味し得る。
【０１６３】
本発明の関連において、本明細書に定義されているような核酸は、好ましくは、プロモーターエレメントと機能的関係で連結されている。植物細胞における発現のためのプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは構成的プロモーターである。植物細胞における発現のためのプロモーターは、植物又は植物細胞において活性があるプロモーターとして本明細書で理解され、すなわち、プロモーターは、植物又は植物細胞内で転写を駆動する一般的な能力を有する。
【０１６４】
本明細書に定義されているような改変型タンパク質の発現は、内因性プロモーターによって調節され得、その内因性プロモーターは、例えば、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現を調節するプロモーターであるが、それに限定されない。好ましくは、プロモーターは、配列番号８と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。
【０１６５】
第５の態様において、本発明は、ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している植物細胞、植物組織、又は植物を作製するための方法に関する。好ましくは、方法は、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現を低下させるステップを含む。好ましくは、方法は、本明細書に定義されているような改変型タンパク質の発現を導入するステップを含む。
実施形態において、方法は、
ｉ）植物細胞、植物組織、又は植物を用意するステップ；及び
ｉｉ）野生型タンパク質の発現を低下させるステップであって、前記タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ステップ
を含む。好ましくは、方法は、野生型タンパク質の発現をノックアウトするステップを含む。
【０１６６】
好ましくは、方法は、一分節型及び／又は二分節型ジェミニウイルス科メンバー、好ましくは、ベゴモウイルス属の一分節型及び／又は二分節型メンバーの少なくとも１つ又は複数に対する抵抗性が増加している、植物細胞、植物組織、又は植物を作製する。
【０１６７】
植物細胞、植物組織、又は植物は、当業者に知られた任意の方法を用いて用意することができる。用意される植物細胞、植物組織、又は植物は、野生型細胞、組織、又は植物であり得る。或いは、植物細胞、植物組織、又は植物は、栽培品種であり得、若しくはそれに由来し得、及び／又は遺伝子改変された細胞、組織、又は植物であり得、若しくはそれに由来し得る。好ましくは、用意される植物細胞、植物組織、又は植物は、本明細書に定義されているような細胞、組織、又は植物である。好ましくは、植物は双子葉類であり、好ましくはトウガラシ属、トマト、キャッサバ、ワタ属、ウリ科、ナス、オクラ、及びマメ科からなる群から選択される。好ましくは、植物細胞、植物組織、又は植物は、トウガラシ属植物由来である（又はそれから取得可能である）。
【０１６８】
本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現を低下させ、又は無効にする（ノックアウトする）ステップは、当技術分野において知られた任意の通常の方法を用いて達成することができ、その方法としては、ｓｉＲＮＡ、エピジェネティックサイレンシング、及び／又はゲノム変異を導入することが挙げられるが、それらに限定されない。変異は、例えば、野生型タンパク質のコード領域及び／又は野生型タンパク質の発現を調節する制御エレメントに導入され得る。変異としては、１つ又は複数のヌクレオチドの変化又は欠失が挙げられ得る。野生型タンパク質の発現を無効にする変異は、野生型タンパク質のコード配列の少なくとも約５０％、７５％、又は１００％の欠失を構成し得る。本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現をノックアウトすることは、ＣＲＩＳＰＲ−テクノロジー、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１を用いることなどの、当技術分野において知られたゲノム編集ツールを用いて達成することができる。
【０１６９】
実施形態において、方法は、本明細書に定義されているような改変型タンパク質の発現を導入するステップをさらに含む。好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有し、
ａ）前記タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の変異を含み；又は
ｂ）前記タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である。
【０１７０】
実施形態において、改変型タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質の発現を導入するように植物へ導入することができる。本明細書に定義されているような改変型タンパク質を発現するヌクレオチド配列は、当技術分野において知られた任意の通常の方法を用いて植物細胞へ導入することができる。非限定的例として、これは、植物組織のアグロバクテリウム形質転換、微粒子銃、エレクトロポレーション、トランスフェクション、又は当業者に知られた多くの方法のいずれか一つなどの直接的形質転換方法によって起こり得る。同様に、本明細書に定義されているような改変型タンパク質の発現を導入することは、前記改変型タンパク質の浸透性交雑によって実施することができる。そのような育種技術は当業者によく知られている。植物への直接的形質転換は、当業者に知られた多くの技術の一つによって起こり得、選択された様式は、本発明の実施に必須ではない。当業者に利用可能な、発現ベクターを植物組織へ導入するための方法は様々であり、選択された植物に依存する。幅広い種類の植物種を形質転換するための手順はよく知られており、文献を通して記載されている。
【０１７１】
一実施形態において、本発明による方法は、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有し、配列番号１の位置６８〜７６、６９〜７５、７０〜７４、好ましくは、位置７１〜７３に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含む、改変型タンパク質の発現を導入する。１つ又は複数のアミノ酸改変は、改変型タンパク質が配列番号１の位置６７〜７７に対応する残基に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸改変を含み得ることを意味する。好ましい実施形態において、本発明による方法は、関心対象となるタンパク質における１つ又は複数のアミノ酸の欠失である改変を含むタンパク質の発現を導入する。さらなる実施形態において、方法は、配列番号１の位置６８〜７６、６９〜７５、７０〜７４、好ましくは、位置７１〜７３における１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失を含むタンパク質を導入するステップを含む。１つ又は複数のアミノ酸欠失は、その改変されたタンパク質が、配列番号１と比較して、位置６７〜７７に対応する残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸欠失を含み得ると、本明細書で理解される。好ましい実施形態において、改変は、少なくとも１個、２個、又は３個のアミノ酸残基の欠失である。好ましくは、改変は、配列番号１の位置７１、７２、又は７３における少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失である。より好ましくは、改変は、配列番号１の位置７１、７２、又は７３における少なくとも２個のアミノ酸残基の欠失である。さらにより好ましくは、改変は、配列番号１の位置７１、７２、又は７３における少なくとも３個のアミノ酸残基の欠失である。
【０１７２】
実施形態において、本発明による方法は、改変型タンパク質の発現を導入するステップであって、前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である、ステップを含む。
【０１７３】
或いは、又は加えて、改変型タンパク質の発現は、野生型タンパク質をコードする内因性コードヌクレオチド配列を改変することにより導入される。好ましくは、内因性コード配列は、配列番号２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。好ましくは、内因性ヌクレオチド配列は、植物細胞のゲノムに存在するコード配列である。ゲノム配列は、配列番号７と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有し得、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を発現するように改変することができる。
【０１７４】
一実施形態において、内因性コード配列は、本明細書に定義されているような改変型タンパク質、例えば、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有するタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基の改変を含み、前記改変が、前記改変を含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較して、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる、タンパク質を発現するように改変される。
【０１７５】
内因性配列の改変は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失及び／又は改変であり得る。例えば、内因性コード配列は、配列番号２の位置２０１〜２３１に対応する少なくとも１つの位置において、改変され得る。或いは、又は加えて、少なくとも２個又は３個のヌクレオチドが、配列番号２の位置２０１〜２３１に対応する位置において改変され得る。非限定的例として、少なくとも３個のヌクレオチドが欠失し、又は３個のヌクレオチドのサブセットが欠失する。例えば、少なくとも３個のヌクレオチドが、２０１〜２０３、２０４〜２０６、２０７〜２０９、２１０〜２１２、２１３〜２１５、２１６〜２１８、２１９〜２２１、２２２〜２２４、２２５〜２２７、及び２２８〜２３１からなる群から選択される配列番号２の位置に対応する位置において欠失し得る。
【０１７６】
或いは、又は加えて、内因性ゲノムヌクレオチド配列は、スプライス部位を変化させるように、すなわち、ドナー及び／又はアクセプター部位の配列を変化させるように、改変することができる。好ましくは、スプライス部位の改変は、結果として、本明細書に定義されているような改変型タンパク質の発現を生じる。非限定的例として、アクセプター部位における変異があり得、好ましくは改変は、エクソン１、２、３、４、４、５、６の上流、好ましくはエクソン４の上流のアクセプター部位にある。
【０１７７】
好ましくは、ドナー及び／又はアクセプター部位の変異は、オルタナティブドナー又はアクセプター部位の使用を生じる。非限定的例として、エクソン４の上流のアクセプター部位の変異は、（図１に例示されているような）エクソン４のコード配列におけるアクセプター部位の使用を生じ得る。エクソン４の上流のアクセプター部位の変異は、好ましくは、エクソン４の５’末端における９個のヌクレオチドの欠失を生じる。
【０１７８】
ドナー又はアクセプター部位の変異は、前記ドナー又はアクセプター部位内の、ヌクレオチドの欠失又はヌクレオチドの改変であり得る。非限定的例として、変異は、一つのヌクレオチドから別のヌクレオチドへの改変、例えば、ＧからＡへの移行であり得る。
【０１７９】
１つ又は複数の内因性ヌクレオチドの改変又は欠失は、当技術分野において知られた任意の通常の手段を用いて行うことができる。非限定的例として、改変又は欠失は、ＣＲＩＳＰＲ−テクノロジーを用いて、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１を用いて、実施することができる。
【０１８０】
実施形態において、内因性配列は、本明細書に定義されているような改変型タンパク質、例えば、配列番号１の位置１〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有するタンパク質であって、前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質であり、前記改変が、前記切り詰めを含まない前記タンパク質を発現するがその他の点では同一の植物細胞、植物組織、又は植物と比較した場合、ジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させる、タンパク質を発現するように改変される。
【０１８１】
停止コドンを生じる変異は、当業者に知られた任意の通常の方法を用いて導入することができる。非限定的例として、変異は、ランダム変異誘発を用いて導入することができる。或いは、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−テクノロジーなどのゲノム編集ツールを用いて導入することができる。
【０１８２】
本明細書に定義されているようなジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している植物細胞、植物組織、又は植物を作製するための方法は、ｉｉｉ）前記改変型タンパク質を発現する植物細胞、植物組織、又は植物を選択するステップをさらに含み得る。
【０１８３】
改変型タンパク質の発現は、当業者に知られた任意の通常の方法を用いて決定することができる。そのような方法としては、転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）を検出すること、又は前記タンパク質を検出することが挙げられる。転写産物を検出するための非限定的例としては、例えば、ＰＣＲ、ｑ−ＰＣＲ、及びノーザンブロッティングが挙げられる。改変型タンパク質の存在を検出するための非限定的例としては、例えば、ウェスタンブロッティングが挙げられる。方法は、前記植物組織又は植物細胞を植物へ再生させるステップをさらに含み得る。
【０１８４】
方法は、例えば、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を発現する植物細胞、植物組織、又は植物の子孫を産生するステップをさらに含み得る。方法は、本明細書に定義されているような改変型タンパク質を発現している植物から種子を産生するさらなるステップを含み得る。方法は、例えば、前記種子を、ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している植物へ生育させるステップをさらに含み得る。
【０１８５】
方法は、例えば、ジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加していることについて植物、植物組織、又は植物細胞を試験するステップをさらに含み得る。ジェミニウイルス科に対する抵抗性を試験するための方法としては、葉の古典的接種により、又はジェミニウイルス科を有するコナジラミにより植物に外寄生させ、例えば、外寄生から３〜８週間後、病気症状について植物を検査することが挙げられるが、それに限定されない。本明細書に記載された本発明の追加の態様は、本明細書に定義されているようなジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している植物によって産生された種子に関する。
【０１８６】
本明細書に記載された本発明の追加の態様は、本明細書に定義されているような本発明のタンパク質、本明細書に定義されているような本発明の核酸、及び／又は本明細書に定義されているような本発明の構築物を含む、前記種子から生育した、又は前記植物細胞から再生した植物に関する。
【０１８７】
本明細書に記載された本発明の追加の態様は、本明細書に特定されているようなジェミニウイルス科に対する抵抗性が増加している、すなわち、本明細書に定義されているような本発明のタンパク質、本明細書に定義されているような本発明の核酸、及び／又は本明細書に定義されているような本発明の構築物を含む前記植物の子孫であって、前記子孫が、自殖又は育種及び選択によって取得することができ、前記選択された子孫が、親植物のジェミニウイルス科に対する増加した抵抗性を保持し、及び／又は本明細書に記載されているような改変型タンパク質の発現を保持する、前記植物の子孫に関する。
【０１８８】
本発明のさらなる態様は、本明細書に定義されているような本発明のタンパク質、本明細書に定義されているような本発明の核酸、及び／又は本明細書に定義されているような本発明の構築物を含む、本明細書に詳述されているような方法により取得された、又は取得可能な植物に関する。
【０１８９】
さらなる態様において、本発明は、植物細胞、植物組織、又は植物においてジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させるための方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
ｉ）植物細胞、植物組織、又は植物を用意するステップ；
ｉｉ）野生型タンパク質の発現を低下させるステップであり、前記タンパク質が、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは、前記野生型タンパク質が発現しない、ステップ。
【０１９０】
好ましくは、抵抗性は、ジェミニウイルス科の少なくとも１つの二分節型メンバーに対して増加している。好ましくは、抵抗性は、ジェミニウイルス科の少なくとも１つの二分節型メンバー及び少なくとも１つの一分節型メンバーに対して増加している。
【０１９１】
方法は、
ｉｉｉ）配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有する改変型タンパク質の発現を導入するステップであって、好ましくは、
ａ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含み；又は
ｂ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である、
ステップ、
ｉｉｉ）前記改変型タンパク質を発現する植物細胞、植物組織、又は植物を選択するステップ；及び
ｉｖ）前記選択された植物を再生させるステップ
をさらに含み得、好ましくは、前記改変型タンパク質の発現が、前記野生型タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列を改変することにより導入される。
【０１９２】
好ましくは、ジェミニウイルス科に対する抵抗性は、本明細書に定義されているような対照植物と比較して増加している。
【０１９３】
好ましくは、ジェミニウイルス科は、ジェミニウイルス科の少なくとも二分節型メンバーである。好ましくは、ジェミニウイルス科は、ジェミニウイルス科の二分節型メンバーである。
【０１９４】
方法は、ジェミニウイルス科に対する抵抗性の増加について前記植物細胞、植物組織、又は植物をスクリーニングするステップをさらに含み得る。植物細胞、植物組織、又は植物をスクリーニングするために、非限定的に下記の実施例セクションに記載された方法など、当技術分野において知られた任意のスクリーニング方法を用いることができる。
【０１９５】
本発明はさらに、植物細胞、植物組織、又は植物においてジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させるためのベクターの使用であって、前記ベクターが、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現を低下させ、又はノックアウトする、ベクターの使用に関する。好ましくは、野生型タンパク質は、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも７５％の配列同一性を有する。
【０１９６】
好ましくは、ベクターは、野生型タンパク質の転写産物をターゲットする１つ若しくは複数のｓｉＲＮＡ及び／又は１つ若しくは複数のｍｉＲＮＡを含み、又はコードする。
【０１９７】
好ましくは、ベクターは、本明細書に定義されているような核酸をさらに含み、前記核酸が、本明細書に定義されているような改変型タンパク質をコードする配列を含む。ベクターは、好ましくは、改変型タンパク質の発現を調節するための制御エレメントを含む。
【０１９８】
好ましくは、ジェミニウイルス科に対する抵抗性は、本明細書に定義されているような対照植物と比較して増加している。
【０１９９】
好ましくは、ジェミニウイルス科は、ジェミニウイルス科の少なくとも二分節型メンバーである。好ましくは、ジェミニウイルス科は、ジェミニウイルス科の二分節型メンバーである。
【０２００】
或いは、又は加えて、ベクターは、ｇＲＮＡ  −  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ複合体をコードし得、前記複合体が、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現を低下させ、又はノックアウトする。
【０２０１】
本発明はさらに、植物細胞、植物組織、又は植物においてジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させるためのｇＲＮＡ  −  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ複合体の使用であって、前記複合体が、本明細書に定義されているような野生型タンパク質の発現を低下させ、又はノックアウトする、使用に関する。好ましくは、野生型タンパク質は、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも７５％の配列同一性を有する。
【０２０２】
好ましくは、ｇＲＮＡ  −  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ複合体におけるｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳを、本明細書に定義されているような野生型タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは内因性遺伝子へ導く。好ましくは、野生型タンパク質は、配列番号１とその完全長に渡って少なくとも７５％の配列同一性を有する。
【０２０３】
好ましくは、ジェミニウイルス科に対する抵抗性は、本明細書に定義されているような対照植物と比較して増加している。
【０２０４】
好ましくは、ジェミニウイルス科は、ジェミニウイルス科の少なくとも二分節型メンバーである。好ましくは、ジェミニウイルス科は、ジェミニウイルス科の二分節型メンバーである。
【０２０５】
本発明はさらに、植物細胞、植物組織、又は植物においてジェミニウイルス科に対する抵抗性を増加させるための本明細書に定義されているような改変型タンパク質の使用に関する。好ましくは、改変型タンパク質は、配列番号１の位置１〜６６及び位置７８〜３０８に対応する位置に渡って計算した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を有し、好ましくは、
ａ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置６７〜７７に対応する１つ若しくは複数のアミノ酸残基の改変を含み；又は
ｂ）前記改変型タンパク質が、配列番号１の位置３０９〜３７８に対応する欠失を有する切り詰め型タンパク質である。
【０２０６】
好ましくは、ジェミニウイルス科に対する抵抗性は、本明細書に定義されているような対照植物と比較して増加している。
【０２０７】
好ましくは、ジェミニウイルス科は、ジェミニウイルス科の少なくとも二分節型メンバーである。好ましくは、ジェミニウイルス科は、ジェミニウイルス科の二分節型メンバーである。
【０２０８】
本発明はまた、本発明の方法によって取得される、又は取得可能な植物に由来した植物部分及び植物産物であって、本明細書に定義されているような本発明のタンパク質、本明細書に定義されているような本発明の核酸、及び／又は本明細書に定義されているような本発明の構築物を含む植物部分及び植物産物に関する。そのような部分及び／又は産物は、種子若しくは果実及び／又はそれに由来した産物であり得る。そのような部分、産物、及び／又はそれらに由来した産物はまた、非増殖性材料であってもよい。
【実施例】
【０２０９】
方法
変異を、ランダム変異誘発を用いて導入した。ｄＴＰ遺伝子（配列番号１）において改変を有するＭａｏｒ  Ｍ１ペッパー植物を同定し、これらの植物について、２つの改変がさらに確認された。理論によって縛られるつもりはないが、配列番号３によって表されるような改変は、結果として、スプライス部位バリエーションを生じ、一方、配列番号５によって表されるような改変は、停止コドンを導入する。配列番号３及び配列番号５によって表されるような改変を有する植物の確認されたＭ１苗条を、種子収穫へと繁殖させた。Ｍ１植物を、報告された改変の存在について（サンガーシーケンシングにより）確認した。これらの変異体植物のＭ２種子を収穫し、生育させた。ホモ接合性Ｍ２植物を、種子繁殖のために選択し、それらの種子から、Ｍ３植物を生育させた。
【０２１０】
ペッパー葉巻ウイルスＭ１５６株は、一分節型ウイルスである。黄化葉巻インドネシアウイルス（ＰｅｐＹＬＣＩＶ）は二分節型ウイルスである。ウアステコ葉脈黄化ウイルスは二分節型ウイルスであり、ペッパーゴールデンモザイクウイルス（ＰＧＭＶ）は二分節型ウイルスである。
【０２１１】
実施例１
ホモ接合性ｄＴＰ変異について選択されたペッパー種子（トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）；栽培品種Ｍａｏｒ）を、ポット用土壌を含むトレイに播種し、ロックウールブロックへ植え替えた。並行して、未変異型罹病性Ｍａｏｒ対照及び追加の罹病性ペッパー植物（市販品種）を生育させた。全ての植物を制御温室で生育させた。３週間後、植物にペッパー葉巻ウイルスＭ１５６株（ＰＬＣＶ  Ｍ１５６）を、葉への古典的接種を用いて週に１度、３回、外寄生させた。ウイルス症状の存在についての最終評価を、最後の感染から３週間後、実施した。症状を、新しく出現した葉において、ウイルス症状の存在対抵抗性（症状の非存在）という２つのクラスで採点した（結果は表２に提示されている）。
【０２１２】
【表２】
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【０２１３】
実施例２
ホモ接合性ｄＴＰ変異について選択されたペッパー種子（トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）；栽培品種Ｍａｏｒ）を、２００ウェル細胞トレイ（２６×２６ｍｍ）に播種し、５０ウェル細胞トレイ（５０×５０ｍｍ）に植え替えた。植物を、昆虫が存在しない隔離された制御温室で生育させた。１２週間後、茎が２番目の本葉と３番目の本葉の間で切断された試験植物上に、数枚の葉と共に成長点を接ぎ木した。試験植物を、前もって、ペッパー黄化葉巻インドネシアウイルス（ＰｅｐＹＬＣＩＶ）に外寄生させた。接ぎ木の成功から２ヶ月後、症状を評価した。症状を、新しく出現した葉において、ウイルス症状の存在対非存在という２つのクラスで目視検査により採点し、その結果は表３に提示されている。
【０２１４】
【表３】
2021507691.tif 000005
【０２１５】
さらに、ウイルス力価を、ＰＣＲに基づいた検出方法により決定した。ＰｅｐＹＬＣＩＶの相対力価を、ＰｅｐＹＬＣＩＶに特異的なｑＰＣＲプライマーを用いて決定した。変異体植物の罹病性野生型ＭａｏｒバックグラウンドにおけるＰｅｐＹＬＣＩＶのレベルを１００％に設定し、続いて、配列番号３又は配列番号５を発現する外寄生された植物のウイルス力価と比較した。その結果は表４に提示されている。
【０２１６】
【表４】
2021507691.tif 000006
【０２１７】
実施例３
配列番号３及び配列番号５の改変の発芽への効果を分析した。Ｍ２段階において、ｄＴＰ遺伝子における任意の改変は、メンデル形式で分離することが予想される（すなわち、全ての植物の２５％が、変異体アレルをホモ接合性状態で有することが予想される）。しかしながら、配列番号５により表されているような改変を有する植物について、偏った分離が観察された：発芽した植物の１５．７％だけが、配列番号５によって表されているような改変についてホモ接合性であった。ホモ接合性変異体Ｍ２植物を生育させ、自家受粉したＭ３種子を取得した。これらのＭ３種子の播種は、非常にわずかな発芽実生（約４％）を生じた。対照的に、配列番号３を有する植物についてのＭ２段階における分離は正常であり、２７．５％のホモ接合性変異体アレルが観察された。Ｍ３種子発芽パーセンテージは４８％であった。したがって、ジェミニウイルス抵抗性を与えるアレルを同定したが、それは、極めて低い発芽パーセンテージによって阻まれている。その結果は表５に要約されている。
【０２１８】
【表５】
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【０２１９】
実施例４
ホモ接合性ｄＴＰ変異について選択されたペッパー種子（トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）；栽培品種Ｍａｏｒ）を、ポット用土壌を含むトレイに播種し、土壌へ植え替えた。並行して、未変異型Ｍａｏｒを対照として生育させた。全ての植物を制御温室で生育させた。１２週間後、二分節型ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス（ＰＨＹＶＶ）を有するコナジラミによって外寄生させた。ウイルスを有するコナジラミによる外寄生は、Ｈｕｔｔｏｎら（Ｈｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ  ４７（３）：３２４〜３２７  ２０１２）に記載されている。簡単に述べれば、子葉期から３週間経過した実生（２〜３枚の葉）を、栽培箱において、ウイルスを有するコナジラミに２週間、曝露した。接種後、コナジラミを、殺虫性石鹸及びＡｄｍｉｒｅ（イミダクロプリド）で植物を処理することにより死滅させ、植物を、圃場／温室へ植え替えた。ウイルス症状の存在についての最終評価を、最後の感染から４０日後に実施した。植物を、３つのクラス、抵抗性（Ｒ）、中間（Ｉ）、又は罹病性（Ｓ）で採点した。無症状の植物の試料を、ＰＨＹＶＶの存在について、通常のＰＣＲを用いてさらに評価した。結果は表６に提示されている。
【０２２０】
【表６】
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【０２２１】
実施例５
ホモ接合性ｄＴＰ変異について選択されたペッパー種子（トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）；栽培品種Ｍａｏｒ）を、ポット用土壌を含むトレイに播種し、ポット用土壌を含むポットへ植え替えた。並行して、未変異型罹病性対照Ｍａｏｒ、追加の罹病性対照Ｍｏｎｅｔ及びＹｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒ並びに抵抗性対照を生育させた。全ての植物を非制御温室で生育させた。実施例４に記載されているように、植物を、二分節型ペッパーウアステコ葉脈黄化ウイルス（ＰＨＹＶＶ）及びペッパーゴールデンモザイクウイルス（ＰＧＭＶ）を有するコナジラミによって外寄生させた。ウイルス症状の存在についての最終評価を、最後の感染から４０日後に実施した。植物を４つのクラスで採点した。
【０２２２】
【表７】
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【０２２３】
実施例６
未変異型及びｄＴＰ変異体バリアントの発芽パーセンテージを試験するために、変異体植物（配列番号４又は配列番号６についてホモ接合性）を、未変異誘発型Ｍａｏｒ植物と交雑させる。対応するＦ１（ヘテロ接合性）を、その後、自家受粉させて、Ｆ２種子を取得し、そのＦ２種子は、配列番号３又は配列番号５を含む意図されたバリアントとして分離する。４０個の分離したＦ２種子を播種し、発芽パーセンテージを決定する。発芽実生由来のＤＮＡを抽出し、ホモ接合性ｄＴＰ変異とヘテロ接合性ＷＴとホモ接合性ＷＴとの間の比を、標準ジェノタイピング技術を用いて決定する。１：２：１の正常な分離が予想される配列番号４を含む植物と比較して、配列番号６を含む種子に由来した発芽Ｆ２植物において偏った分離を観察することができ、ホモ接合性変異体アレルの代わりにｄＴＰの野生型アレルのヘテロ接合性の方が好まれるように分離が偏っており、配列番号５によって表されるようなタンパク質を発現する切り詰め型植物が、望ましくない多面効果を生じ、その結果として、発芽パーセンテージの減少を生じることを示している。これらの望ましくない効果は、配列番号３についてホモ接合性の変異体植物においては観察されないだろう。
【０２２４】
実施例７
アラビドプシス属において、ｄＴＰ遺伝子の発現異常又はそのタンパク質の変化が、ジェミニウイルスに対する抵抗性の増加をもたらすかどうかを試験するために、以下の実験を実行した。ｄＴＰ遺伝子にＴ−ＤＮＡ挿入を有するシロイヌナズナの種子（ＡＴ４Ｇ２７６５０）を、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＮＡＳＣ）から入手した。以下の２つのＳＡＬＫ  Ｔ−ＤＮＡ挿入系統を入手した：ＳＡＬＫ＿１２１６６７．１７．５５ｘ及びＳＡＬＫ＿１２４４０３．２１．４５ｘ。ｄＴＰ遺伝子におけるＴ−ＤＮＡ挿入についてホモ接合性の植物を選択し、ポット用土壌中、３週間、生育させた。その後、植物に、バイナリープラスミドからビートカーリートップウイルス（ＢＣＴＶ）を発現するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を感染させた。アグロバクテリウムを一晩、増殖させ、小口径（２２〜２５）シリンジを用いて各アラビドプシス植物の数枚の葉の葉柄にアプライした。この一分節型ジェミニウイルスは、アラビドプシス属を含む、広範囲の（作物）植物に感染することが示されている。病気症状（葉の巻き）は、感染後１０日以内に生じたが、野生型（Ｃｏｌ−０）及びＴ−ＤＮＡアラビドプシス植物におけるウイルス力価を決定するために、感染した及び感染していない植物材料から単離されたＤＮＡにＱＰＣＲを実施した。ＢＴＣＶを検出するために以下のプライマーを用いた：ＢＣＴＶ１：ＣＴＡＣＡＣＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴ（配列番号９）及びＢＣＴＶ２：ＴＧＡＣＧＴＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＧ（配列番号１０）（Ｌｕｎａら、２０１７  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１７；９８：２６０７〜２６１４に記載されている）。図２は、野生型アラビドプシス（Ｃｏｌ−０）におけるＢＣＴＶ感染が、ウイルス複製及び病気を生じることを示している。対照的に、ｄＴＰ遺伝子におけるＴ−ＤＮＡ挿入系統のＢＣＴＶ感染は、ウイルス複製も病気も引き起こさなかった。
【０２２５】
その後の実験は、他の作物植物種由来の相同タンパク質がジェミニウイルスに対する抵抗性において類似した機能をもつことを証明することを目的とした。この目的を達成するために、作物相同体を同定した（表８）。
【０２２６】
【表８】
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【０２２７】
同定の後、これらの相同性遺伝子をクローニングし、アラビドプシスＴ−ＤＮＡ系統へ形質転換した。コード配列の発現を３５Ｓプロモーターによって駆動させた。ｄＴＰの作物相同体を過剰発現するトランスジェニックアラビドプシス系統を、ＢＣＴＶ感染に供し、３５Ｓ：ＧＵＳ構築物を発現するｄＴＰにおけるＴ−ＤＮＡ挿入系統と比較した。図３は、その補完系統の相対ウイルス力価を示す。ＢＣＴＶに対する罹病性を示す系統は、これらの系統において発現させた特定の作物相同体が、ｄＴＰ機能を補完することができ、したがって、それを改変して、ジェミニウイルスに対して抵抗性である植物を作出し得ることを示す。特に、図３は、キャッサバ、ズッキーニ、ペッパー、アラビドプシス、及びワタ由来のｄＴＰについての補完を示す。明らかに、Ｔ−ＤＮＡ植物においてウイルス複製は起きていない。ｄＴＰの作物相同体で補完されたＴ−ＤＮＡ系統は、罹病性の増加を示し、これらの遺伝子／タンパク質がそれらのそれぞれの作物植物において類似した機能をもつことを示している。
【０２２８】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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