(57)【要約】  本発明は、アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１である合成ペプチドＳＰ４を提供する。該合成ペプチドＳＰ４は、抗腫瘍薬効試験において唯一の有効成分として、ヌードマウスヒト骨肉腫ＭＧ−６３の腫瘍体積と重量の何れに対しても抑制作用がある。該合成ペプチドＳＰ４と陽性対照群パクリタキセルの相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）は差異がない。静脈内注射投与時の最大耐用量は７００ｍｇ／ｋｇＢＷであり、体内薬効を有するとともに、腫瘍テロメラーゼを抑制する作用があり、腫瘍細胞周期に対してＧ１期停止効果を呈し、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１及びＣＤ４７の高発現に対して抑制効果を示す。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１である合成ペプチドＳＰ４。
【請求項２】
（１）腫瘍の予防及び／又は治療のための用途、（２）腫瘍細胞の増殖及び／又は成長及び／又は侵入の抑制のための用途、（３）抗腫瘍免疫応答の増強のための用途、（４）腫瘍細胞分化の誘導のための用途、（５）一類の抗腫瘍薬の製造のための用途、（６）腫瘍テロメラーゼ活性の抑制のための用途、（７）腫瘍細胞周期の制御のための用途、（８）腫瘍細胞周期を制御する製品の製造のための用途のいずれか１つにおける請求項１に記載の合成ペプチドＳＰ４の用途。
【請求項３】
前記（１）〜（８）のいずれか１つにおける腫瘍が、ヒト骨肉腫或はヒト食道がんである、ことを特徴とする請求項２に記載の合成ペプチドＳＰ４の用途。
【請求項４】
前記ヒト食道がんは、食道扁平上皮及び円柱上皮の悪性腫瘍を含む、ことを特徴とする請求項３に記載の合成ペプチドＳＰ４の用途。
【請求項５】
活性成分が、請求項１に記載の合成ペプチドＳＰ４である生物活性分子製品。
【請求項６】
唯一の有効活性成分が、請求項１に記載の合成ペプチドＳＰ４である生物活性分子製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医学の技術分野に属し、合成ペプチドＳＰ４（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−４）及びその用途に関し、特に一類の抗腫瘍新薬の製造のための用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は人間の健康と生命を深刻に脅かしている。骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ，ＯＳ）は骨形成肉腫とも呼び、最も一般的な原発性悪性腫瘍の一種で、非常に悪性の間葉系腫瘍であり、２１歳未満の青少年及び子供に発生し易い。骨肉腫は、局所における侵襲性成長を呈し、速い成長、極めて高い悪性度、転移し易い、救肢治療効果が低い、障害率と死亡率が高い等の特徴を有し、化学療法で転移巣を治療するのが非常に重要である。現在、臨床的には、主にパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，ＭＴＸ）、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，ＡＤＭ）、イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ，ＩＦＯ）等の細胞傷害性抗腫瘍薬を使用した併用薬物を採用しているが、その毒性と副作用による患者の傷害と痛苦は非常に大きい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｕｓｃａｎｃｅｒ）は、一般的な消化器系腫瘍の１つであり、併用化学療法も多く使用されているが、毒性と副作用が大きい。ペプチド化合物は、一類の重要な生物活性分子である。化学合成ペプチドＳＰ４は、ペプチド固相合成技術により合成された小ペプチドであり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による純化、質量分析による同定等のバイオテクノロジーによる処理は、ＳＰ４の薬物の製造、構造同定、品質調査等のための定量データを提供する。従来技術において、本案と類似の化学合成ペプチド及び抗腫瘍薬としての用途に関する報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明はアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１である合成ペプチドＳＰ４を提供する。天然の抗腫瘍ペプチドとは違い、化学合成により高純度のペプチド単体を得ることができる。従来技術において、類似の化合物が報告されていない。
【０００５】
本発明は、さらに、以下の（１）から（８）のいずれか１つにおける合成ペプチドＳＰ４の用途を保護する。（１）腫瘍の予防及び／又は治療のための用途、（２）腫瘍細胞の増殖及び／又は成長及び／又は侵入の抑制のための用途、（３）抗腫瘍免疫応答の増強のための用途、（４）腫瘍細胞分化の誘導のための用途、（５）一類の抗腫瘍薬の製造のための用途、（６）腫瘍テロメラーゼ活性の抑制のための用途、（７）腫瘍細胞周期の制御のための用途、（８）腫瘍細胞周期を制御する製品の製造のための用途。
【０００６】
更に、上記の合成ペプチドＳＰ４の用途（６）、即ち腫瘍テロメラーゼ活性の抑制のための用途において、腫瘍テロメラーゼ活性の抑制とは、腫瘍テロメラーゼの抑制ペプチドとしての用途を指す。前記合成ペプチドＳＰ４は、体外腫瘍細胞株及び体内腫瘍組織におけるテロメラーゼ活性に対して強い抑制作用を有する。
【０００７】
更に、上記の合成ペプチドＳＰ４の用途（８）、即ち腫瘍細胞周期を制御する製品の製造のための用途において、腫瘍細胞周期を制御する製品の製造とは、腫瘍細胞周期制御薬剤としての用途を指す。合成ペプチドＳＰ４は、Ｇ１期停止効果があり、テロメラーゼ活性の抑制に関わる可能性がある。
【０００８】
更に、上記の腫瘍は、ヒト骨肉腫或はヒト食道がんである。前記ヒト食道がんは、食道扁平上皮及び円柱上皮の悪性腫瘍を含む。
【０００９】
本発明は、さらに、生物活性分子製品を保護し、その活性成分は前記合成ペプチドＳＰ４である。更に、該製品の唯一の有効活性成分は前記合成ペプチドＳＰ４である。特に、本発明の実施形態において、前記合成ペプチドＳＰ４は、抗腫瘍薬の有効活性成分としてのよい用途が認められた。ＳＰ４は、その抗腫瘍作用の標的が明確であり、単一薬剤として使用可能である。つまり、唯一の有効活性成分として、治療効果が顕著である。
【００１０】
細胞傷害性抗腫瘍薬は悪性腫瘍の治療における一つの重要な手段であり、細胞傷害性抗腫瘍薬の毒性を軽減するために、常に様々な方式の併用薬方式を採用している。本発明は、単一投与で、治療効果が顕著であり、腫瘍細胞ＤＮＡテロメアのテロメラーゼ活性を標的とし、細胞周期制御に関与する非細胞毒性の化学合成ペプチドＳＰ４を提供する。前臨床抗腫瘍有効性研究は、被験物質の作用強度と、異なる種類の腫瘍に対する感受性を調査すること以外にも、被験物質と陽性対照薬物の試験結果の比較にも特に注意を払うべきである。本発明は、まず体外抗腫瘍活性に対するスクリーニング実験（ＣＣＫ−８法）において、ＳＰ４をＭＧ−６３細胞及びＥｃａ−１０９細胞と７２時間共培養した後、ＳＰ４がＭＧ−６３に対する抑制率が９３．８４％であり、Ｅｃａ−１０９に対する抑制率が７３．５８％であり、且つ明かな投与量ー効果関係があることが判明した。
【００１１】
体内試験は、被験物質の特定の種類の腫瘍細胞に対する殺傷又は抑制作用の有効性を評価する決定的な指標である。本発明の体内薬効試験において、ヌードマウス皮下ヒト癌異種移植腫瘍モデルを採用し、一日置きに腫瘍直径を測定する方法により、移植腫瘍の成長を動的に観察し、実験終了時に腫瘍の重量を量る。本発明において、ＳＰ４がヌードマウスの皮下ヒト骨肉腫ＭＧ−６３の異種移植腫瘍の腫瘍体積及び重量に対して明かな抑制作用があり、明かな投与量ー効果関係と時間―効果関係があり、相対腫瘍増殖率がＴ／Ｃ（％）＝１０．２７±１．８７であり、腫瘍成長抑制率が８８．３１％であり、統計処理の結果、ＳＰ４が強い抗腫瘍効果があることが判明した。また、ＳＰ４と陽性対照群パクリタキセルの相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）は有意差がなく（Ｐ＞０．０５）、これは、被験物質ＳＰ４が臨床試験に入る必要があるかどうかを評価する重要な指標の１つである。
【００１２】
本発明の安全性の測定は、急性毒性試験の最大耐用量の検出を採用しており、動物に７００ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でＳＰ４を静脈注射した後、２４時間以内に毒性反応と死亡は見られず、且つ連続観察の２週間以内に異常な行為と死亡は見られなかった。体内薬効試験において、各治療群の担癌ヌードマウスの体重増加データは、対照群と比べて差異がなく（Ｐ＞０．０５）、図１５に示すように、死亡も発生しなかった。ＳＰ４の最大耐用量を表２及び３に示す。
【００１３】
ヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０は、異なる濃度のＳＰ４を投与した後、Ｇ０／Ｇ１期細胞の発現量が増加し、Ｓ期細胞の発現量が減少し、Ｇ２期細胞の発現量が減少し、Ｇ１期の停止を呈しており、投与量‐反応関係がある。ヌードマウスの皮下ヒト骨肉腫異種移植腫瘍モデルにおいて、ＳＰ４の中、高用量群と陽性対照パクリタキセル群でも明かなＧ１期停止を示す。
【００１４】
テロメアは染色体の末端に位置する特別な構造であり、テロメアにより細胞分裂が維持できる。テロメラーゼは、テロメアＤＮＡの複製と伸長を促進することができ、これにより癌細胞の無限の分裂と増殖が引き起こされるので、抗テロメラーゼ活性は、抗腫瘍療法の重要な標的の１つである。ＳＰ４は、体外腫瘍細胞株及び体内腫瘍組織におけるテロメラーゼ活性のいずれに対しても顕著の抑制作用があり、両方とも明かな投与量―効果関係を示す。
【００１５】
細胞周期は細胞の生命活動の基本的なプロセスである。フローサイトメトリーを用いた細胞周期の検出により、ＳＰ４を処理した後、細胞がＧ１期で停止しているのがわかり、これはＳＰ４がテロメラーゼ活性を抑制することにより腫瘍細胞周期の制御に関与している可能性があることを示す。テロメラーゼ活性の抑制は、サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ抑制剤の抑制活性を増加させる。ＣＤＫ抑制剤はサイクリンＤ１と競合してＣＤＫ４に結合し、ＣＤＫ４活性の増加を抑制し、細胞がＧ１期からＳ期に入るのを防ぐ。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ＳＰ４のアミノ酸組成を示す図である。
【図１Ｂ】ＳＰ４のアミノ酸組成を示す図である。
【図２】ＳＰ４の化学合成プロセスを示す概略図である。
【図３】ＳＰ４クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】ＳＰ４質量スペクトルの結果を示す図である。
【図５】ＳＰ４の体外薬効図であり、図５ＡはＳＰ４のヒト食道癌Ｅｃａ１０９の体外増殖活性に対する抑制率を示し、図５ＢはＳＰ４のヒト骨肉腫ＭＧ６３の体外増殖活性に対する抑制率を示す。
【図６】ＳＰ４の体内抗腫瘍薬効−腫瘍成長曲線を示す図である。
【図７】ＳＰ４の体内抗腫瘍薬効−担癌ヌードマウスの腫瘍重量に対する抑制作用を示す図であり、異なる濃度のＳＰ４を投与した後、モデル群と比較すると、各群は統計学的差異がある変化があった。＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す。
【図８】ＳＰ４の尾静脈投与による抗腫瘍薬効の有効性評価実験の結果を示す写真である。写真における腫瘍体積のサイズを測定する撮像条件は同じであり、各群の腫瘍体積のサイズは、スケールにて図８に示す。
【図９】ＳＰ４の抗腫瘍効果の評価指標としての相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を示す図である。国家ＦＤＡ規制に準拠する細胞傷害性抗腫瘍薬のヌードマウス異種移植モデルにおける薬力学的評価基準は、Ｔ／Ｃ（％）＞４０％である場合は無効であり、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％且つ統計的処理によりＰ＜０．０５である場合は有効である。図９の結果によると、ＳＰ４薬物投与量が、低用量である場合、投与１９日目から有効性を表し、中用量である場合、投与１５日目から有効性を表し、高用量である場合、投与７日目から有効性を表す。
【図１０】ＳＰ４と陽性対照群パクリタキセルの体内抗腫瘍薬効の比較、即ち、ＳＰ４とパクリタキセルの腫瘍成長曲線の比較を示す図である。両者の間には有意差がなく（Ｐ＞０．０５）、垂直座標が腫瘍体積であり、横座標は投与日数である。
【図１１】ＳＰ４と陽性対照パクリタキセルの体内抗腫瘍効効評価指標、即ち、相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）の比較を示す図であり、両者の間には有意差がない。
【図１２】ＳＰ４の腫瘍細胞株ＭＧ−６３テロメラーゼ活性に対する抑制作用を示す図である。＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表し、抑制作用は用量依存関係を示す。
【図１３】ＳＰ４のヌードマウスヒト骨肉腫ＭＧ−６３テロメラーゼ活性に対する抑制作用を示す図である。＊＊は、ＭＧ−６３細胞皮下腫瘍モデル群と比べて、投与群のテロメラーゼ活性の変化は有意差（Ｐ＜０．０１）を表し、且つ用量依存関係を示す。
【図１４Ａ】ＳＰ４のＨＬ−６０腫瘍細胞周期の制御における関与を示す図であり、異なる用量のＳＰ４がＨＬ−６０細胞周期に対する影響を示す。Ａ：対照群、Ｂ：２００μＭ。
【図１４Ｂ】ＳＰ４のＨＬ−６０腫瘍細胞周期の制御における関与を示す図であり、異なる用量のＳＰ４がＨＬ−６０細胞周期に対する影響を示す。Ｃ：１００μＭ、Ｄ：５０μＭ。
【図１４Ｃ】ＳＰ４のＨＬ−６０腫瘍細胞周期の制御における関与を示す図であり、異なる用量のＳＰ４がＨＬ−６０細胞周期に対する影響を示す。Ｅ：２５μＭ。
【図１５】ＳＰ４を投与した後のヌードマウスの皮下ヒト骨肉腫の細胞周期の変化を示す図である。＊＊は、各群がモデル群に比べて、そのＧ０／Ｇ１期に有意差があることを示し、＃＃は、各群がモデル群に比べて、そのＧ２／Ｍ期に有意差があることを示す。
【図１６】ＳＰ４を静脈投与してから４週間の間の各群の担癌ヌードマウスの体重変化を示す図である。
【図１７】ＳＰ４が腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１の高発現を明らかに抑制するのを示す図である。＊は、モデル群と比べて差異がある（Ｐ値＜０．０５）ことを示し、＊＊は、モデル群と比べて有意差がある（Ｐ値＜０．０１）ことを示す。
【図１８】ＳＰ４が腫瘍細胞におけるＣＤ４７の高発現を明らかに抑制するのを示す図である。＊は、モデル群と比べて差異がある（Ｐ値＜０．０５）ことを示し、＊＊は、モデル群と比べて有意差がある（Ｐ値＜０．０１）ことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の実施例は、本発明の内容をさらに説明しており、本発明がさらに十分に理解できるように多くの具体的詳細を記載する。しかし、本発明は本明細書に記載されている形式以外の多くの形式により実施されることができるため、本発明は以下に開示する特定の実施形態により限定されるものではない。
【００１８】
（実施例１）
ＳＰ４のアミノ酸組成の分析：
１０．２ｍｇのサンプルを計量し、７ｍＬの６Ｎ  ＨＣｌに溶かし、窒素ガス雰囲気下において、１１０℃で酸加水分解を２２時間行い、冷却した後、１０ｍＬの容量フラスコに移して定量する。０．２ｍＬを取り、５５℃の窒素ガスを吹き付けて乾燥させ、１ｍＬの蒸留水を加えて再度乾燥させ、それを三回繰り返す。１．２ｍＬの脱イオン水（０．０２ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ）に溶かし、よく混ぜる。０．４５μｍフィルターで濾過し、２０μＬを日立Ｌ−８９００アミノ酸分析装置に注入し、測定を行う。
測定結果は以下の通りである。
【００１９】
ｎｍｏｌ／２０μＬ        アミノ酸の割合
Ｓｅｒ      セリン              ４．４５０                ２．５４
Ｇｌｙ      グリシン            １．７５３                １．００
Ａｌａ      アラニン            １．７５４                １．００
Ｉｌｅ      イソロイシン        ３．４０１                １．９４
Ｌｅｕ      ロイシン            ３．６１５                ２．０６
Ｐｈｅ      フェニルアラニン    ３．４０３                １．９４
Ｐｒｏ      プロリン            １．７５４                １．００
ＳＰ４は、ＳＧＡＩＬＦＰの７つのアミノ酸で構成され、以下の表と図１Ａ及びＢに示す。 
【００２０】
（実施例２）
ＳＰ４の固相化学合成、純度検出、分子量確認：
ＳＰ４の固相化学合成プロセスによる製造：既知のポリペプチドのアミノ酸配列のＣ末端からＮ末端の順にアミノ酸を繰り返し添加するプロセスである、ペプチドＦｍｏｃ固相合成技術を採用する。実験プロセスを図２に示す。先ず、標的ポリペプチドのＣ末端の一番目のアミノ酸のカルボキシル基を固相担体（樹脂）に共有結合させ、次に該アミノ酸のアミノ基が合成の開始点として隣接するアミノ酸のカルボキシル基とアシル化反応が発生し、ペプチド結合を形成する。標的ポリペプチドの合成が完了するまでこのプロセスを連続的に繰り返し、その後、標的ポリペプチドを樹脂から切断して取るとともに、側鎖の保護基を除去する。最後に、氷エーテルを加えて粗ペプチドを沈殿させ、高速液体クロマトグラフィーにて分離純化を行い、質量分析により生成物を同定する（図２−４）。
【００２１】
（実施例３）
抗腫瘍体外スクリーニング検査（ＣＣＫ−８法）：本技術は、南京欧際医薬技術サービス有限会社から提供される、ＥｎｏＧｅｎｅＣｅｌｌＴＭ  ＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（ＣＣＫ−８）細胞生存率検出キットを採用する。
【００２２】
生存細胞の比率が９０％以上である細胞を取り実験を行う。細胞増殖抑制試験において、細胞を消化、カウントして、濃度が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した細胞懸濁液を採用し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬの細胞懸濁液（ウェルあたり１×１０４個の細胞）を添加し、９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて２４時間培養する。各ウェルに１００μＬの相応の薬物含有培地を添加し、同時に、陰性対照群、溶媒対照群、陽性対照群を設定し、各群は５ウェルずつ設ける。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて７２時間培養した後、１０μＬのＣＣＫ−８溶液を各ウェルに加え、培養プレートをインキュベーターに置いて４時間培養し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおいてＯＤ値を測定し、ＳＰ４がＭＧ−６３及びＥｃａ−１０９腫瘍細胞株に対する抑制率とＩＣ５０値を計算する。評価基準として、同じサンプルの異なる濃度のＳＰ４の腫瘍細胞抑制率で用量効果曲線（図５）を取得し、その後、ロジット法を採用して半数有効濃度（ＩＣ５０値）を計算する。
【００２３】
（実施例４）
ＳＰ４の尾静脈への投与による体内抗腫瘍薬効評価試験：
１、細胞株と動物
細胞株：ＭＧ−６３（ヒト骨肉腫細胞）ＭＸＣ２４５、上海美軒生物技術有限会社から提供。
動物：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス。
【００２４】
２、細胞の準備段階
２−１、回復状態が良好なＭＧ−６３細胞株をＴ７５細胞培養フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
２−２、２〜３日置きに培地を一回交換し、細胞治癒度か約８０％に達すると、１：３の比率で継代培養し、約２０本のボトルが必要である。
２−３、細胞を継代培養して十分の数になると、消化及び遠心分離を行って細胞を収集し、生理食塩水で細胞濃度が５＊１０７／ｍＬになるように調整し、ヌードマウスへの接種に用いる。
【００２５】
３、動物の準備段階
３−１、約４週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを１週間適合化飼育を行った後、細胞の接種に用いる。
３−２、無菌状態で１ｍＬシリンジで細胞懸濁液を吸い上げる（その間中に揺りを繰り返して細胞の沈降を防ぐ）。
３−３、マウスにおける接種部位をアルコールで拭き（右前肢脇の下）、バイオセーフティキャビネットにおいて１００μＬの細胞懸濁液（約５＊１０６個／匹）をマウスに接種する。接種を行ったマウスは４０匹である。
【００２６】
３−４、細胞を接種した後、２５℃下、１２時間光／光なし、通常の餌及び水提供下で飼育する。
３−５、接種してから約５日後に接種部位をタッチして、小さな腫瘍塊があるかどうかを確認し、腫瘍塊がない場合、細胞接種量を２倍にして再接種する。
３−６、接種後８日目に、ノギスで移植腫瘍の直径を測定し、腫瘍体積を計算し、腫瘍体積が８０〜１００ｍｍ３になったら、群分けをし投与を行う。
【００２７】
４、動物投与及び処理
４−１、ヌードマウスを各群に６匹ずつなるようにランダムで５つの群に分け、即ちモデル群、陽性対照群、ＳＰ４の低用量群、ＳＰ４の中用量群、ＳＰ４の高用量群の５つの群に分ける。低用量群の投与量は４ｍｇ／ｋｇＢＷであり、中用量群の投与量は８ｍｇ／ｋｇＢＷであり、高用量群の投与量は１６ｍｇ／ｋｇＢＷであり、モデル群は等体積の生理食塩水を注射し、陽性対照群は１０ｍｇ／ｋｇＢＷのパクリタキセルを週２回投与する。
４−２、動物を群に分けた後、毎日午後４時に尾静脈注射を実施し、モデル群と投与群にそれぞれ生理食塩水と薬物を注射し、４週間連続して投与する。パクリタキセル群は週２回投与する。
【００２８】
４−３、動物を群に分けてから、当日及び一日おきに腫瘍のサイズと重量を測定し、ＴＶ＝０．５＊ａ＊ｂ２を計算した。ａは長径であり、ｂは短径である。
４−４、実験が完了した後、ヌードマウスを頸椎脱臼法により屠殺し、群別で写真を撮った後、脇下の腫瘍を剥離して群別で写真を撮った後腫瘍の重量を量る。
４−５、後続実験における異なる要件に従って、それぞれ−８０℃、４％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒドにおいて腫瘍を保存する。
４−６、腫瘍成長データに基づき、腫瘍成長曲線と相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％等について統計学的に分析を行う。
実験結果のデータは、Ｘ±ＳＤで表する（図６−１１）。
【００２９】
（実施例５）
ＳＰ４のＭＧ−６３細胞テロメラーゼ活性に対する効果の検出：実験方法及び手順は上海美軒生物技術有限会社から提供。
１、細胞の準備
１．１細胞の回復
１．２細胞の継代：細胞がいっぱいになった後、継代培養を行う。
１．３細胞の平板培養
２、全ＲＮＡの抽出
３、ＲＮＡ逆転写によりｃＤＮＡを生成
【００３０】
４、ＱＰＣＲ反応
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００を用いた操作方法：
１）通常、プライマーの最終濃度が０．２μＭであると、良い結果が得られる。なお、反応性が良くない場合は、０．１〜１．０μＭの範囲内でプライマーの濃度を調整してもよい。
【００３１】
２）ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ  ＩＩ（５０×）は、ＲＯＸ  ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅ（５０×）より濃度が低く、７５００Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ及び７５００Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる場合、ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ  ＩＩ（５０×）を使用し、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ＴＭを用いる場合、ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ（５０×）を使用する。
【００３２】
３）２０μＬの反応系において、ＤＮＡテンプレートの添加量は通常１００ｎｇ未満である。異なる種類のＤＮＡテンプレートに含まれる標的遺伝子のコピー数が異なるため、必要に応じて勾配希釈を行って、最適なＤＮＡテンプレートの添加量を決定する。この製品を用いて２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応の２番目のステップであるＰＣＲ増幅反応を行う場合、一番目のステップのＲＴ反応液をＤＮＡテンプレートとして使用する時の添加量は、ＰＣＲ反応液の総体積の１０％を超えないようにする。
４）各機器の推奨システムに従って反応液を調製する。
５）２ステップ法ＰＣＲ増幅の標準プログラムに従って、リアルタイムＰＣＲ反応を行う（図１２）。
【００３３】
（実施例６）
固形腫瘍テロメラーゼ活性の検出
１、サンプルの準備：ヌードマウスの体内抗腫瘍薬効実験が完了した時に採取した腫瘍サンプル
２、全ＲＮＡの抽出
３、ＲＮＡ逆転写によりｃＤＮＡを生成
【００３４】
４、ＱＰＣＲ反応：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００を用いた操作方法
１）ＰＣＲ反応液を調製する
通常、プライマーの最終濃度が０．２μＭであると、良い結果が得られる。０．１〜１．０μＭの範囲内でプライマー濃度を調整できる。
２）ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ  ＩＩ（５０×）は、ＲＯＸ  ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅ（５０×）よりも低濃度であり、７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ及び７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる場合、ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ  ＩＩ（５０×）を使用し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ＴＭを用いる使用する場合、ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ（５０×）を使用する。
３）２０μＬの反応系において、ＤＮＡテンプレートの添加量は通常に１００ｎｇ未満である。異なる種類のＤＮＡテンプレートに含まれる標的遺伝子のコピー数が異なるため、必要に応じて勾配希釈を行い、最適なＤＮＡテンプレートの添加量を決定する。
４）各機器の推奨システムに従って反応液を調製する。
５）リアルタイムＰＣＲ反応：２ステップ法はＰＣＲ増幅標準プログラムに従って行う。
６）実験結果の解析（図１３）。
【００３５】
（実施例７）
細胞周期の検出
（Ａ）ＨＬ−６０細胞周期の検出
ヨウ化プロピジウム（ＰｒｏｐｉｄｉｕｍをＰＩと略称する）は、二本鎖ＤＮＡの蛍光色素である。ヨウ化プロピジウムと二本鎖ＤＮＡの結合により蛍光が発生し、且つ蛍光強度は二本鎖ＤＮＡの含有量に比例する。細胞内のＤＮＡをヨウ化プロピジウムで染色した後、細胞のＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーで測定し、ＤＮＡ含有量の分布に従って細胞周期分析を行うことができる。
１、細胞培養
２、培養済の異なる群の細胞を０．２５％トリプシンで消化して単個細胞に分散させ、十分に打ち砕いて細胞懸濁液を完全に混ぜ合わせ、専用のフローチューブに収集する。
３、１０００Ｇで５分間遠心分離し、上清液を吸い取って除去し、１０％のウシ胎児血清を含む３００μＬのＰＢＳ溶液で懸濁して沈殿し、清潔な１．５ｍＬ遠心分離チューブに移す。
【００３６】
４、７００μＬの無水エタノールを加え、−２０℃の冷蔵庫で２４時間以上細胞を固定する。
５、固定したサンプルを取り出し、３，０００Ｇで３０秒間細胞を遠心分離し、上清液を吸い取って捨てる。
６、細胞沈殿は、濃度が１ｍｇ／ｍＬの１００μＬのＲＮａｓｅＡ溶液で懸濁し、３７℃のインキュベーターで細胞内のＲＮＡを消化する。
７、濃度が５０μｇ／ｍＬの４００μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｌｏｄｉｄｅ）溶液を加え、暗所で１０分間細胞核を染色する。フローサイトメトリーで細胞のＤＮＡ含有量を測定し、各細胞周期における細胞の割合を測定する。
【表１】
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【００３７】
対照群と比べて、ＳＰ４を作用させた後ＨＬ−６０のＧ０／Ｇ１期細胞の発現は顕著に増加し、Ｇ２／Ｍ期細胞の発現が減少し、Ｓ期細胞の発現が減少し、Ｇ１期停止を呈し、且つＧ１期細胞の割合は、用量の増加とともに増加する。これは、ＳＰ４は、ヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０細胞がＧ１期からＳ期に移行するのを防ぐことができ、これにより細胞周期にＧ１期停止が現れ、有糸分裂が減少し、細胞増殖が抑制され、且つＳＰ４の用量が多いほど、効果がより明らかであること（図１４Ａ〜１４Ｃ）を示す。
【００３８】
（Ｂ）ヌードマウスヒト骨肉腫ＭＧ−６３細胞周期の検出：
１、固形腫瘍単細胞懸濁液の調製
１．１、腫瘍塊をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、眼科手術用ハサミで腫瘍を小片（１〜２ｍｍ）に切断し、ＰＢＳで３回洗浄し、５０ｍＬの遠心分離チューブに移す。
１．２、０．２５％のトリプシンを加え、３７℃で２０〜４０分間消化し、５分間おきに静かに一回振って細胞を分離する。
１．３、血清を含む２〜５ｍＬの培地を加え、トリプシンの消化作用を停止させる。
１．４、２−３分間静置し、懸濁液を新しい遠心分離チューブに移し、２００メッシュのナイロンネットで懸濁液を二回濾過する。
１．５、濾過した懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液を除去する。
１．６、５ｍＬのＰＢＳ緩衝液を加え、再度遠心分離し、上清液を除去する。
１．７、細胞量に応じて１〜２ｍＬの培養液を加え、細胞を数え、予備する。
【００３９】
２、細胞周期検出
１）細胞培養液を一つの遠心分離チューブに集めて予備にする。ピペット或はピペットチップで細胞を容易に吹き出すことができるまで細胞をトリプシンで消化し、前に収集して予備した細胞培養液を加え、約１０００ｇで３〜５分間遠心分離して細胞を沈殿させる。上清液を吸い上げ、氷浴において予冷させた約１ｍＬのＰＢＳを加え、細胞を再懸濁し、１．５ｍＬの遠心分離チューブに移す。沈殿細胞を再度遠心分離し、上清液を除去し、遠心分離チューブの底を軽くタッチして、細胞を適切に分散させる。
２）細胞固定：氷浴において予冷させた１ｍＬの７０％エタノールに加え、軽く混合し、４℃で２時間固定し、１０００Ｇで３〜５分間遠心分離し、細胞を沈殿させる。上清液を除去し、氷浴において予冷させた約１ｍＬのＰＢＳを加え、細胞を再懸濁する。沈殿細胞を再度遠心分離し、遠心分離チューブの底を軽くタッチして細胞を適切に分散させる。
【００４０】
３）ヨウ化プロピジウム染色液の調製：検出待ちのサンプルの数量に応じて、適量のヨウ化プロピジウム染色液を調製する。調製済のヨウ化プロピジウム染色液は、４℃で短時間保存することができるが、当日使用するのがよい。
４）染色：０．５ｍＬのヨウ化プロピジウム染色液を各細胞サンプルに添加し、沈殿細胞をゆっくりと完全に再懸濁し、暗所で３７℃で３０分間インキュベートする。その後、４℃または氷浴において暗所で保存する。染色が完了した後、２４時間以内にフローサイトメトリー検出を完了するのがよい。
【００４１】
５）フローサイトメトリー検出と分析：フローサイトメトリーを使用して、４８８ｎｍの励起波長で赤色蛍光を検出し、同時に光散乱状況も検出する。分析ソフトウェアを使用して細胞ＤＮＡ含有量分析と光散乱分析を行う。
結果：モデル群と比較して、ＳＰ４の中用量群のＧ０／Ｇ１期が著しく増加し（Ｐ＜０．０１）、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期が減少した。
ＳＰ４の高用量群のＧ０／Ｇ１期が著しく増加し（Ｐ＜０．０１）、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期が減少し、Ｇ２／Ｍ期が著しく減少した（Ｐ＜０．０１）。ＳＰ４の低用量群のＧ０／Ｇ１期が著しく減少し（Ｐ＜０．０１）、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期が増加し、用量‐反応関係を示した（図１５）。
【００４２】
（実施例８）
動物急性毒性試験−最大耐用量検出
一、実験条件：ＧＬＰ
１、被験動物：ＩＣＲマウス、健康、成体、雄、体重１９−２０ｇ、ｎ＝１０
２、被験サンプル：ＳＰ４
３、被験サンプルの調製方法
４、投与経路：マウス尾静脈注射
５、投与量：０．５ｍＬ／回
【００４３】
６、投与回数、ＦＤＡガイドラインに基づく。
急性毒性（Ａｃｕｔｅｔｏｘｉｃｉｔｙ）とは、薬物を１回または２４時間以内に複数回投与した後、一定の期間内に引き起こされた毒性反応を指す。狭義の単回投与毒性研究（Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ）は、被験物質を単回投与した後発生された急性毒性反応を考察することである。このガイドラインは、広義の単回投与毒性研究に関するものであり、単回投与または２４時間以内に複数回投与する方法を採用して獲得してよい。
【００４４】
二、最大耐用量の検出：
即ち、被験動物の死亡を引き起こさない最高用量である。まず、試験動物の死亡を引き起こさない可能性のある最高用量の３つの濃度の作業溶液を調製し、１匹の動物（１．５ｍＬを３回に分ける）に尾静脈注射により投与する。第１用量は１１５０ｍｇ／ｋｇＢＷの作業溶液で、総量は１．５ｍＬであり、２４時間以内に３回尾静脈注射によりマウスに投与する。翌日に死亡が見られなかった場合、残りの９匹の動物にに同様に尾静脈注射を施し（合計ｎ＝１０）、最初の動物が死亡した場合、用量を一段階減らす。順次に実験を行い、７００ｍｇ／ｋｇＢＷ用量群のマウスが、２４時間以内に３回に分けて投与する過程において毒性反応及び死亡が現れないことがわかる（表２を参照）。ＩＣＲマウスへの尾静脈注射用量は７００ｍｇ／ｋｇＢＷのＳＰ４作業溶液である。
【表２】
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観察を続けると、投与後２週間以内に毒性と死亡が見られない（表３を参照）。
【表３】
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さらに、体内薬力学的試験において、各治療群の担癌ヌードマウスの体重増加データは対照群と比べて差異がなく（Ｐ＞０．０５）、死亡も発生してない。図１６。
【００４５】
（実施例９）
ＳＰ４がＰＤ−Ｌ１及びＣＤ４７に対する免疫蛍光試験
１、サンプル：ヌードマウス皮下ヒト骨肉腫ＭＧ−６３異種移植腫瘍組織
２．抗体
【表４】
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【００４６】
３、実験手順：
３−１、組織切片、プレーティング
３−２、組織脱ろう水和
３−３、抗原回復
切片をクエン酸塩緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．０）を含む容器に入れ、電子レンジ（３速ギア）で加熱して、容器内の液体の温度を約９８℃にし、１０−１５分間維持する。容器を取り出し、室温で２０〜３０分間冷却する。ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）で５分間ｘ３回洗浄し、抗原修復溶液は、２０分間熱蒸気で修復し、その後室温まで自然に冷却させる。
【００４７】
３−４、ＰＢＳを除去し、５％ＢＳＡ／０．０１ＭのＰＢＳで３０分間ブロッキングし、洗わずに、吸収紙で５％ＢＳＡブロッキング液を端縁から吸引して取り除く。希釈した抗体溶液（希釈溶液はＰＢＳで調製した５％ＢＳＡである）を滴下し、空白対照群は抗体をＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）に替え、湿気箱において４℃で一晩培養する。
３−５、翌日、冷蔵庫から湿気箱を取り出し、室温に１５分間放置して復温させる。ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）で５分間×５回洗浄する。余分のＰＢＳを取り除き、蛍光二次抗体を滴下し、室温、暗所で３０分間培養する。ＰＢＳで５分間×５回洗浄する。
３−６、ＤＡＰＩを滴下し、暗所で２分間培養して細胞核を染色する。染色された細胞核は青色蛍光を示す。ＰＢＳで１分間×３回洗浄し、ＤＡＰＩを除去する。
３−７、最後に、切片をグリセロールで密封し、すぐに蛍光顕微鏡下で観察する。
【００４８】
４、分析方法：
提供するデータは、平均光学密度（ＩＯＤ、ＩＯＤをＯＤと略称する）及び陽性面積比（陽性面積／総面積）である。結果分析は、陽性指数を採用して分析を行う。
陽性指数＝陽性面積比×ＯＤ
【００４９】
結果：ＳＰ４投与群のＣＤ４７の発現は、モデル群と比べて著しく減少し、ＳＰ４投与群のＰＤ−Ｌ１の発現はモデル群と比べて著しく減少する。これは、ＳＰ４が腫瘍細胞においてのＣＤ４７及びＰＤ−Ｌ１の高発現を著しく抑制することができることを示唆する。腫瘍細胞の表面のＣＤ４７は、大食細胞の表面のＳＩＲＰａと相互作用することにより免疫抑制信号を伝達し、これにより腫瘍細胞を大食細胞の貪食から保護する。腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１は、免疫細胞上のＰＤ−１分子に結合した後、Ｔ細胞の活性を抑制するため、ＳＰ４は、腫瘍細胞におけるＣＤ４７およびＰＤ−Ｌ１の高発現を著しく抑制し、腫瘍細胞を除去する免疫効果を強化する。大食細胞とＴ細胞が腫瘍細胞を認識する能力を回復する（図１７、図１８を参照）。
【００５０】
（実施例１０）
分化誘導実験：
１、ＨＥ染色法（浮遊細胞）
１）塗抹と固定
２）染色
ヘマトキシリン、エオシンで染色し、中性ゴムでシーリングする。
３）ＨＥ染色（懸濁細胞）の結果と分析
（２０）．顕微鏡の油浸レンズ下で写真を撮り、Ｌｅｃｉａ  Ａｐｐｌａｃｔｉｏｎ  Ｓｔｉｕｅ画像システムで収集し分析する。
【表５】
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【００５１】
２、テトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）還元反応
１）原理：ニトロブルーテトラゾリウムは、テトラゾリウムブルー（Ｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＮＢＴ）とも呼び、水溶性の淡黄色の活性染料であり、好中球酵素により還元された後、非水溶性の青黒色のホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）粒子になって、細胞質に沈殿する。
【００５２】
２）方法
２−１）細胞培養：
細胞：１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地を使用して３７０Ｃ、５％ＣＯ２の飽和湿度条件下でＨＬ−６０細胞株を培養する。対数増殖期の細胞を取り、実験を行う。
【００５３】
２−２）合成ペプチド原液の調製：
３０００μｇ／ボトルのＳＰ４凍結乾燥粉末を１．２０ｍＬの超純水（濃度は２０００μＭ、即ち、２５０２μｇ／ｍＬ）で完全に溶解させ、合成ペプチド原液を得る。該原液の濃度は、第１使用量群の作業液濃度（２００μＭ、即ち、２５０．２μｇ／ｍＬ）の１０倍に相当する。
【表６】
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【００５４】
当業者であれば、本発明の技術的手段の範囲から逸脱することなく、上記に開示した技術内容に基づき、本発明の技術案に対して様々な可能性の変更及び修飾を行い、または同等変形した同様な効果を奏する実施形態に修正することができる。そのため、本発明の技術的手段の内容から逸脱することなく、本発明の技術案の本質に従って上記の実施形態に対して行われたいかなる単純な修正、同等変形、修飾は、依然として本発明の技術案の保護範囲内にあるだろう。
【００５５】
（付記）
（付記１）
アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１である合成ペプチドＳＰ４。
【００５６】
（付記２）
（１）腫瘍の予防及び／又は治療のための用途、（２）腫瘍細胞の増殖及び／又は成長及び／又は侵入の抑制のための用途、（３）抗腫瘍免疫応答の増強のための用途、（４）腫瘍細胞分化の誘導のための用途、（５）一類の抗腫瘍薬の製造のための用途、（６）腫瘍テロメラーゼ活性の抑制のための用途、（７）腫瘍細胞周期の制御のための用途、（８）腫瘍細胞周期を制御する製品の製造のための用途のいずれか１つにおける付記１に記載の合成ペプチドＳＰ４の用途。
【００５７】
（付記３）
前記（１）〜（８）のいずれか１つにおける腫瘍が、ヒト骨肉腫或はヒト食道がんである、ことを特徴とする付記２に記載の合成ペプチドＳＰ４の用途。
【００５８】
（付記４）
前記ヒト食道がんは、食道扁平上皮及び円柱上皮の悪性腫瘍を含む、ことを特徴とする付記３に記載の合成ペプチドＳＰ４の用途。
【００５９】
（付記５）
活性成分が、付記１に記載の合成ペプチドＳＰ４である生物活性分子製品。
【００６０】
（付記６）
唯一の有効活性成分が、付記１に記載の合成ペプチドＳＰ４である生物活性分子製品。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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