(57)【要約】  本発明は、急性及び慢性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療並びに／又は予防のための方法、特に、死亡率を減少させ、特に長期生存を増加させるための方法；腸、肝臓、肺及び皮膚の微生物叢の正常化と粘膜防御に基づく下痢、体重減少及び敗血症などのＧＶＨＤに関連付けられる急性合併症；ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、１l−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３のサイトカインの生成の正常化による免疫系のバランスの再調整並びにサイトカインストームの予防及び／又は治療；閉塞性細気管支炎及び強皮症などのＧＶＨＤと関連付けられる慢性合併症のための方法であって、同種造血幹細胞移植を受けているか又は受けようとしている患者における、α−ディフェンシン及びβ−ディフェンシンの群から選択される１以上の哺乳類ディフェンシンの経口、皮下、肺内及び／又は皮膚／経皮投与を含む、方法に関する。【選択図】図５８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種造血幹細胞移植を受けたか又は受けようとしている患者における急性移植片対宿主病の予防又は治療のための方法であって、前記患者へのβ−ディフェンシン及びα−ディフェンシンからなる群からの少なくとも１種の哺乳類ディフェンシンの投与を含む、方法。
【請求項２】
前記ディフェンシンが、配列番号２、配列番号５、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号７並びに前記配列番号と５個未満、４個未満など、例えば３個未満、２個未満などのアミノ酸が異なる配列変異体から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類ディフェンシンが、ｈＢＤ２、ＨＤ５、ＨＤ６、ｈＢＤ１、短縮型ｈＢＤ２、ｈＢＤ３及びｈＢＤ４からなる群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ディフェンシンが、ｈＢＤ２、短縮型ｈＢＤ２、又はＨＤ５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項５】
前記ディフェンシンが、組成物に含まれ、前記組成物が、２以上のディフェンシン、２種のディフェンシンなど、３種のディフェンシンなど、４種のディフェンシンなど、５種のディフェンシンなどを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記２種のディフェンシンが、ｈＢＤ２及びＨＤ５である、請求項１５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者への前記ディフェンシンの投与が、同種造血幹細胞移植の日に開始される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記患者への前記ディフェンシンの投与が、同種造血幹細胞移植後にＧＶＤＨの症状が現れたときに開始される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ディフェンシンの投与が、少なくとも１週間など、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間など、例えば少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月など、例えば少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも６ヶ月の間、前記患者に同種造血幹細胞移植によって引き起こされる症状がなくなるまで継続される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、医薬組成物である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類ディフェンシンが、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、アルブミン結合部分（ＡＢＭ）、検出可能部分（Ｚ）、及び半減期延長ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの追加部分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記追加部分が、半減期延長ペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項１３】
前記半減期延長ペプチドが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、トランスフェリン、アルブミン（ＨＡＳ）、ＸＴＥＮ（登録商標）若しくはＰＥＧに結合できる分子、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリンアラニンセリンポリマー（ＰＡＳ）、又はエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、ヒアルロン酸、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）β鎖のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）などの負に帯電した高度にシアル化されたペプチド、ヒトＩｇＧ、及びＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−（ｎは８〜２２である）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類ディフェンシンが、プレバイオティクス、プロバイオティクス、トリプトファン、短鎖脂肪酸、グルココルチコイド、シクロスポリン、抗ＴＮＦ−α、インテグリン、抗生物質、免疫抑制剤、糞便移植、照射又はこれらの組み合わせと組み合わせて投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１日用量が、１日あたり０．１〜１０ｍｇのディフェンシン／ｋｇ、０．５〜５ｍｇのディフェンシン／ｋｇなど、１〜２ｍｇのディフェンシン／ｋｇなど、１．２ｍｇのディフェンシン／ｋｇなどである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ディフェンシンが、少なくとも１日１回、少なくとも１日２回など、少なくとも１日３回など、少なくとも１日４回など、少なくとも１日５回などで又は継続的に投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記投与が、経口、口腔、舌下、経腸、経膣、気管内、肺内、鼻腔内、頭蓋内、皮下、静脈内、皮膚又は経皮投与である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、経口、皮下、肺内又は皮膚／経皮投与である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記肺内、気管内又は鼻腔内投与が、吸入器、ネブライザー、又は気化器による、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、重度の腸及び肝臓の炎症（例えば腹痛、吐き気、嘔吐及び黄疸によって特徴付けられる）並びに粘膜防御の喪失、サイトカインストーム、体重減少、敗血症、皮膚の発疹、かゆみ、及び発赤から選択される１以上の症状を有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記症状の１以上が、治療後に改善される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療が、死亡率を減少させかつ長期生存を増加させる、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記治療が、免疫系のバランスを再調整しかつ前記組織サイトカイン生成の正常化を通じて前記サイトカインストームを予防する又は治療する、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
腸透過性及び敗血症が、前記腸における粘膜防御又はミエロペルオキシダーゼ活性の正常化を通じて治療される、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
呼吸器合併症、肺容量、肺炎症及び敗血症が、治療される、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
組織学的肺炎症、気管支周囲及び血管周囲の炎症並びに気管支肺胞洗浄液への炎症細胞の移動が、低下される、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
閉塞性細気管支炎及び強皮症などの、肺及び皮膚の炎症並びに線維症が、治療される又は予防される、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子の豊富さ、門の数、細菌の存在、細菌存在量及び／又は短鎖脂肪酸の生成、及び／又は酪酸生成が、増加されかつ／又は前記患者の腸若しくは肺の微生物叢からの酢酸生成が、減少される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記患者の腸若しくは肺若しくは皮膚における正常な微生物叢が、成熟され、維持され、又は安定化される、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記患者の腸又は肺におけるアロバキュラム、アロプレボテラ、アッカーマンシア、バルネシエラ、ビフィズス菌、フェカリバクテリウム、ラクノスピラ、ロチア及びベイロネラの存在量が、増加される、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記患者における食物摂取及び体重が、増加される、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれかに記載の治療方法での使用のためのディフェンシンポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれかで定義される障害の治療のための医薬品の調製のためのディフェンシンポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、１以上の哺乳類ディフェンシンの投与により、同種造血幹細胞移植を受けたか、又は受けようとしている患者における急性及び慢性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及びＧＶＨＤと関連付けられる合併症の治療並びに／又は予防のための方法に関する。本方法は、腸と肺の微生物叢の正常化及びサイトカインストームのリスクを排除する低下されたサイトカイン生成による免疫系のバランスの再調整に基づいて、下痢及び敗血症などのＧＶＨＤの症状を治療できる。
【背景技術】
【０００２】
背景
移植片対宿主病は依然として、同種造血幹細胞移植後の罹患率と死亡率の主要な原因である。胃腸のＧＶＨＤが死亡の主な原因である（Ｔｅｓｈｉｍａ、２０１６）。急性ＧＶＨＤの初期段階は、主に胃腸管での組織の損傷とそれに関連する粘膜バリア機能の喪失によって誘発される。これは、悪性疾患をその後の免疫制御に適する最小限の残存レベルにし既存の免疫機能を取り除き、未治療のドナーの接種材料の生着を可能にするのに必要とされる投与計画の調節によって引き起こされる。幹細胞移植は通常、これらの二重の目的を達成するために、全身照射、免疫抑制及び化学療法を用いる。しかしながら、それらはまた、ＧＩ管粘膜及び「サイトカインストーム」に寄与する他の細胞を損傷する。サイトカインストームは、炎症性サイトカイン；古典的には、Ｔｈ１サイトカイン：ＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αならびにＴｈ２サイトカイン：ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３の放出によって特徴付けられる（Ｈｅｎｄｅｎ、２０１５）。現在主流のＧＶＨＤ療法は、広範囲の免疫抑制に焦点を当てており、それは生着に影響を及ぼし、場合によっては、望ましい移植片対腫瘍活性を低下させ得る（Ｎａｌｌｅ、２０１５）。移植後の期間に抗菌除染を使用することによる細菌負荷の低減は、ＧＶＨＤの重症度を低下させることができる。肺及び皮膚は、線維症−閉塞性細気管支炎及び強皮症として現れる慢性ＧＶＨＤの主な標的臓器である（Ｈｅｎｄｅｎ、２０１５年）。急性ＧＶＨＤは、依然として治療の失敗の主な原因であり、その結果、２０％の受容者が死亡し、生存者の６０〜８０％がある程度の慢性ＧＶＨＤを経験する（Ｍａｒｋｅｙ、２０１４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者は、驚くべきことに、予防用量の経口ｈＢＤ２又はＨＤ５が死亡率を劇的に減少させ、最も一般的に使用されるＧＶＨＤの治療薬であるシクロスポリンよりも大幅に減少させることができることを、同種造血幹細胞移植から生じる急性移植片対宿主病のマウスモデルにおいて実証した。また、ｈＢＤ２が骨髄細胞（ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞及びＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＦＧ−細胞）においてＩＬ−１βの生成を減少させることができることも、このモデルで実証した。ＩＬ−１βは、腸のＧＶＨＤの主要なドライバーである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者はまた驚くべきことに、β−ディフェンシンが腸の健康の改善を通じて下痢と体重減少を軽減し、かつＧＶＨＤの予防及び／又は治療で全て日常的に使用されているプレドニゾロン／デキサメタゾン及びシクロスポリン並びに抗ＴＮＦ−αなどの標準的な免疫抑制剤と同等に疾患活動指数を減少させることを、重度の腸炎症（ＤＳＳ、ＴＮＢＳ、Ｔ細胞移植）の予防のマウスモデルと治療のマウスモデルの両方で実証した。
【０００５】
驚くべきことに、β−ディフェンシンは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３のサイトカイン生成の正常化を通じて免疫系のバランスを再調整できることが実証された。いくつかの薬物、例えば、抗ＴＮＦ−αは、１つ又はいくつかのサイトカインを正常化できるが、これらのサイトカインを全て正常化しサイトカインストームを防止できる他の薬物は確認されていない。炎症性サイトカイン放出又はサイトカインストームは、急性ＧＶＨＤの発生及び重症度の主要なメディエーターとして関与している（Ｂａｌｌ＆Ｅｇｅｌｅｒ、２００８）。
【０００６】
さらに、α−ディフェンシンとβ−ディフェンシンの両方が微生物叢の構成に強い影響を与えることが、予防のマウスモデルと治療のマウスモデルの両方で実証された。例えば、ディフェンシンは微生物の種類を増やす、すなわち、微生物叢を改善／正常化できるだけでなく、ディフェンシンは短鎖脂肪酸生成細菌の存在量を増やすことができる。結腸のＴ  ｒｅｇ細胞の恒常性に重要な役割を果たす短鎖脂肪酸は、急性ＧＶＨＤで乱される。ディフェンシンの効果はディフェンシンごとに異なり、α−ディフェンシンとβ−ディフェンシンの組み合わせはさらに、個々の効果とは異なる。
【０００７】
さらに驚くべきことに、ヒトベータディフェンシン２（ｈＢＤ２）の投薬は、経口投与であろうと又は鼻腔内投与であろうと、サイトカインストームの上昇及び喘息の発症を防ぎ、かつ肺機能を劇的に改善できることが、急性喘息のマウスモデルにおいて実証された。一般的な免疫抑制が目標である従来の喘息予防とは対照的に、ｈＢＤ２による予防は免疫系のバランスを再調整する。
【０００８】
さらに驚くべきことに、ヒトベータ−ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の投薬はまた、経口投与であろうと又は鼻腔内投与であろうと、喘息を治療し気道過敏性及びコンプライアンスを正常化できることが、急性喘息のマウスモデルにおいて実証された。
【０００９】
結論として、本発明者は、アルファ−ディフェンシン及びベータ−ディフェンシンが、同種造血幹細胞移植から生じる合併症の安全かつ効果的な治療となるのに必要な全ての特性を有することを実証した。これらのペプチドは、内因性の生理学的なヒトペプチドであるので、安全である。ディフェンシンは、満期新生児が受け取る初乳中に存在する量を超えない量で使用できる。ディフェンシンは、経口、皮下又は肺内投与により投与できる。ディフェンシンは、免疫系を抑制することなく、免疫系のバランスを再調整できる。ディフェンシンは、急性ＧＶＨＤの主な原因であるサイトカインストームを防ぐことができる。ディフェンシンは、微生物叢及びメタボロームを正常化し、結腸Ｔ  ｒｅｇ細胞の恒常性を維持する短鎖脂肪酸の生成を促進できる。ディフェンシンは、腸、肝臓及び肺の重篤な炎症を治療できる。
【発明の効果】
【００１０】
したがって、一態様では、本開示は、同種造血幹細胞移植を受けたか、又は受けようとしている患者における急性移植片対宿主病の予防又は治療のための方法であって、α−ディフェンシン及びβ−ディフェンシンからなる群からの少なくとも１種の哺乳類ディフェンシンを上記患者に投与することを含む、方法に関する。
【００１１】
患者は、腸及び肝臓の重篤な炎症（例えば、腹痛、吐き気、嘔吐、及び黄疸によって特徴付けられる）並びに粘膜防御の喪失、サイトカインストーム、体重減少、又は敗血症、皮膚の発疹、かゆみ、及び発赤を有する場合がある。
【００１２】
治療の効果は、免疫系のバランスの再調整、及び組織サイトカイン生成の正常化によるサイトカインストームの防止又は治療を含んでよい。
【００１３】
治療の効果は、腸における粘膜防御又はミエロペルオキシダーゼ活性の正常化による腸透過性及び敗血症の治療を含んでよい。
【００１４】
治療の効果は、呼吸器合併症、肺の炎症及び敗血症の治療を含んでよい。
【００１５】
治療の効果は、組織学的な肺の炎症、気管支周囲の炎症、及び血管周囲の炎症、並びに気管支肺胞洗浄液への炎症性細胞の移動の低減を含んでよい。
【００１６】
治療の効果は、閉塞性細気管支炎及び強皮症などの、肺と皮膚の炎症及び線維症の治療並びに／又は予防を含んでよい。
【００１７】
治療の効果は、上記患者の腸若しくは肺の微生物叢からの遺伝子の豊富さの増加、門の数の増加、存在する細菌の増加、細菌の存在量の増加及び／又は短鎖脂肪酸生成、酪酸生成の増加、及び／又は酢酸生成の減少を含んでよい。
【００１８】
治療の効果は、上記患者の腸若しくは肺若しくは皮膚における正常な微生物叢の成熟、維持及び／又は安定化を含んでよい。
【００１９】
治療の効果は、上記患者の腸又は肺におけるアロバキュラム、アロプレボテラ、アッカーマンシア、バルネシエラ、ビフィズス菌、フェカリバクテリウム、ラクノスピラ、ロチア及びベイロネラの存在量の増加を含んでよい。
【００２０】
治療の効果は、上記患者における食物摂取の増加及び体重増加を含んでよい。
【００２１】
哺乳類ディフェンシンは、ＨＤ５、ＨＤ６、ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３及びｈＢＤ４、好ましくはＨＤ５又はｈＢＤ２からなる群から選択されてよい。
【００２２】
ディフェンシンは、単独又は組成物で投与されてよく、上記組成物は、２種以上のディフェンシン、例えば、２種のディフェンシン、例えば、３種のディフェンシン、例えば、４種のディフェンシン、例えば、５種のディフェンシンを含む。好ましくは、２種のディフェンシンはｈＢＤ２及びＨＤ５である。
【００２３】
哺乳類ディフェンシンは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、アルブミン結合部分（ＡＢＭ）、検出可能部分（Ｚ）、及び半減期延長ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの追加部分をさらに含んでよい。
【００２４】
哺乳類ディフェンシンは、単独で投与されるか、又はプレバイオティクス、プロバイオティクス、トリプトファン、短鎖脂肪酸、グルココルチコイド、シクロスポリン、抗ＴＮＦ−α、インテグリン、抗生物質、免疫抑制剤、糞便移植、照射又はこれらの組み合わせと組み合わせて投与されてよい。
【００２５】
さらなる態様では、本開示は、本開示による治療方法で使用するための哺乳類ディフェンシンポリペプチド、及び本開示で定義される障害の治療のための医薬品を調製するための哺乳類ディフェンシンポリペプチドの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】大腸炎のデキストラン硫酸ナトリウム予防モデルにおけるディフェンシンの効果を調査するための実験設定の概略図。
【図２】大腸炎のデキストラン硫酸ナトリウム治療モデルにおけるディフェンシンの効果を調査するための実験設定の概略図。
【図３】高脂肪食マウスモデルでの微生物叢の構成に対する哺乳類ディフェンシン（ＨＤ５、ｈＢＤ２及びＨＤ５＋ｈＢＤ２）の影響を調査するための実験設定の概略図。
【図４】マウスをイエダニ（ＨＤＭ）＋フロイントアジュバントで免疫しＨＤＭを負荷する、喘息予防のためのステロイド感受性マウスモデルにおける哺乳類ディフェンシンの影響を調査するための実験設定の概略図。
【図５】マウスをイエダニ（ＨＤＭ）＋フロイントアジュバントで免疫しＨＤＭを負荷する、喘息治療のためのステロイド感受性マウスモデルにおける哺乳類ディフェンシンの影響を調査するための実験設定の概略図。
【図６ａ】ヒトベータディフェンシン１〜４のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（２．１）複数配列アライメント：Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメントにおいて：＊は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示す。：は、以下の「強力な」グループの１つが完全に保存されていることを示す−Ｓ、Ｔ、Ａ；Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ；Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｆ；Ｈ、Ｙ；Ｆ、Ｙ、Ｗ。．は、以下の「弱い」グループの１つが完全に保存されていることを示す−Ｃ、Ｓ、Ａ；Ａ、Ｔ、Ｖ；Ｓ、Ａ、Ｇ；Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｋ；Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ａ；Ｓ、Ｇ、Ｎ、Ｄ；Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｋ；Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ；Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ；Ｈ、Ｆ、Ｙ。
【図６ｂ】ＨＤ５及びＨＤ６のＣｌｕｓｔａｌアライメント。
【図６ｃ】ＨＤ５、ＨＤ６、並びにｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４のＣｌｕｓｔａｌアライメント。
【図７】大腸炎研究のための疾患活動指数スコアリングシステムの説明。
【図８】大腸炎研究のための組織学的スコアリングシステムの説明。
【図９】マウス抗ＴＮＦ−αを上回るＨＢＤ２（ＮＺ３９０００）の統計的に有意な優位性を示す、マウスの１０日間の予防的デキストラン硫酸ナトリウム誘発性結腸炎研究における遠位結腸の組織学的スコア及びＨＢＤ２の静脈内投与を上回る優位性を示す、皮下ｈＢＤ２投与。説明文：Ａ：１日１回の対照ビヒクルの静脈内投与Ｂ：抗ＴＮＦアルファ（３００μｇ／マウスの腹腔内投与  ３回）Ｃ：ｈＢＤ２（１日１回の０．１ｍｇ／ｋｇ  静脈内投与）Ｄ：ｈＢＤ２（１日１回の０．１ｍｇ／ｋｇ  皮下投与）Ｅ：ｈＢＤ２（１日２回の０．１ｍｇ／ｋｇ  静脈内投与＋皮下投与）Ｆ：ｈＢＤ２（１日２回の０．１ｍｇ／ｋｇ  皮下投与＋皮下投与）Ｋ：未治療動物。
【図１０】経口投与されるＨＢＤ２ｈＢＤ２の全用量対１ｍｇ／ｋｇの経口プレドニゾロンについての体重維持効果を示す、１０日間のデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの予防研究における動物の体重変化。治療グループ：Ａ：対照ビヒクルＰＢＳを１日２回経口投与、Ｂ：１ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンを１日２回経口投与、Ｃ：０．０５ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２を１日２回経口投与、Ｄ：０．５ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２を１日２回経口投与、Ｅ：５ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２を１日２回経口投与。対照（ビヒクル）グループの値との有意差は、＊＊ｐ＜０，０１、＊＊＊ｐ＜０，００１として示される（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定＋ノンパラメトリックデータのＤｕｎｎの事後検定）。
【図１１】プレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇを上回るｈＢＤ２の経口投与の統計的に有意な優位性を示す、１０日間のデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの予防研究における疾患活動指数スコア。図１０に示す治療グループ及び有意性。
【図１２】プレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇと同等の全ての用量の経口ＨＢＤ２の統計的に有意な効果を示す、１０日間のデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの予防研究における組織学的スコア。図１０に示す治療グループ及び有意性。
【図１３】プレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇと同等の０．０３及び０．１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２（グループＥ及びＦ）の統計的に有意な効果を示す、８日間のトリニトロベンゼンスルホン酸誘発性大腸炎の予防研究の組織学的スコア。Ａ：ビヒクル対照、１日１回皮下投与Ｂ：１０ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロン  １日１回皮下投与、Ｃ：ｈＢＤ２、皮下投与、１日１回＝１ｍｇ／ｋｇＤ：ｈＢＤ２、皮下投与、１日１回＝０．３ｍｇ／ｋｇＥ：ｈＢＤ２、皮下投与、１日１回＝０．１ｍｇ／ｋｇＦ：ｈＢＤ２、皮下投与、１日１回＝０．０３ｍｇ／ｋｇＧ：ｈＢＤ２、皮下投与、１日１回＝０．１ｍｇ／ｋｇ。
【図１４】シクロスポリンと同等のｈＢＤ２の統計的に有意な効果を示す、７日間のデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの予防研究における結腸の長さ。＊ＤＳＳに対してｐ＜０．０５、マンホイットニー検定。
【図１５】投与経路に関係なくシクロスポリンと同等のｈＢＤ２の統計的に有意な効果及び１日２回投与を上回るｈＢＤ２の１日３回投与の優位性を示す、７日間のデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの予防研究における臨床スコア（便スコア：０＝正常；１＝湿った／粘り気のある便；２＝軟便；３＝下痢；便の血液スコア：０＝血液なし；１＝便中又は肛門周囲の血液の証拠；２＝重度の出血；マウスの外観：０＝正常；１＝毛皮の波状又は姿勢の変化；２＝不活発）。＊ＤＳＳに対してｐ＜０．０５；二元配置分散分析及びボンフェローニ多重比較検定。
【図１６】１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンと同等でかつ３００μｇ／マウスのマウス抗ＴＮＦ−αよりも優れた０．１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２の統計的有意効果を示す、１４日間のデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの治療研究における組織学的スコア。
【図１７】１００μｇ／マウスの抗ＴＮＦ−αの週２回の皮下投与（エンブレル）及び０．３ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンの１日１回腹腔内投与と同等の１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２の１日１回皮下投与の効果を示す、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞移植ＳＣＩＤ大腸炎マウスモデルでの１４週間の治療における臨床スコア（体重減少、便の硬さ及び直腸周囲の血液の存在）。
【図１８】１００μｇ／マウスの抗ＴＮＦ−αの週２回の皮下投与（エンブレル）及び０．３ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンの１日１回腹腔内投与と同等の１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２の１日１回皮下投与の効果を示す、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞移植ＳＣＩＤ大腸炎マウスモデルでの１４週間の治療における結腸重量。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｔ検定によるビヒクルに対するｐ＜０．０１。
【図１９】１００μｇ／マウスの抗ＴＮＦ−αの週２回皮下投与（エンブレル）及び０．３ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンの１日１回腹腔内投与と同等の１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２の皮下投与の効果を示す、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞移植ＳＣＩＤマウスモデルでの１４週間の治療におけるミエロペルオキシダーゼ活性。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｔ検定によるビヒクルに対するｐ＜０．０１。
【図２０】マウス高脂肪食モデルにおける経口ＨＤ５、ｈＢＤ２及びＨＤ５＋ｈＢＤ２による予防的処置後の微生物の存在及び存在量の、重み付けされていないｕｎｉｆｒａｃ分析並びに重み付けされたｕｎｉｆｒａｃ分析。
【図２１】マウス高脂肪食モデルにおける経口ＨＤ５及びｈＢＤ２による予防的処置後の小腸におけるアロバキュラムの存在量。
【図２２】マウス高脂肪食モデルにおける経口ＨＤ５、ｈＢＤ２及びＨＤ５＋ｈＢＤ２による予防的処置後の微生物存在量の属分析。
【図２３】マウス高脂肪モデルにおける経口ｈＢＤ２による予防的処置後の結腸におけるラクトバシラス科の存在量。
【図２４】マウス高脂肪食モデルでの経口ｈＢＤ２による予防的処置の４週（左パネル）及び１０週（右パネル）後の結腸におけるバルネシエラの相対的存在量。
【図２５】マウス高脂肪食モデルにおけるＨＤ５又はｈＢＤ２による治療的処置後の微生物の存在及び存在量の重み付けされていないｕｎｉｆｒａｃ分析。上のパネルは０週目のデータを示す。下のパネルは１０週目のデータである。
【図２６】マウス高脂肪食モデルにおける経口ＨＤ５及びｈＢＤ２による治療的介入後の結腸におけるアロプレボテラの相対的存在量。
【図２７】マウス高脂肪食モデルにおけるＨＤ５又はｈＢＤ２による治療的介入後の小腸及び結腸におけるビフィズス菌の相対的存在量。図２８〜３１の図の凡例。生理食塩水のＩＮは、未負荷で未治療の対照である。ＨＤＭ／ビヒクルは、未治療であるが、ＨＤＭ負荷した動物である。ＨＤＭはイエダニで負荷した動物である。ＰＯは経口投与であり、ＩＮは鼻腔内投与である。＊のラベルが付いた列は、ビヒクル処置対照と統計的に有意に異なる。
【図２８】ｈＢＤ２の予防的鼻腔内投与及び経口投与後のそれぞれのイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおける気道過敏性。
【図２９】ｈＢＤ２の予防的鼻腔内投与及び経口投与後のそれぞれのイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおける肺コンプライアンス。
【図３０】ｈＢＤ−２の予防的経口投与後のイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおけるＢＡＬＦの好中球細胞数。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【図３１ａ−ｆ】ｈＢＤ−２の予防的経口投与後のイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルでの肺ホモジネート中のＴＮＦ−α（３１ａ）、ＩＬ−４（３１ｂ）、ＩＬ−５（３１ｃ）、ＩＬ−６（３１ｄ）、ＩＬ−９（３１ｅ）及びＩＬ−１３（３１ｆ）のサイトカイン濃度。＃ＨＤＭ／ビヒクルＰＯに対してｐ＜０．０５、マンホイットニー検定。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【図３２ａ−ｂ】ｈＢＤ２の治療的鼻腔内（図３２ａ）及び経口（図３２ｂ）投与後のそれぞれのイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおける気道過敏性。生理食塩水は、負荷されていない対照である。ＨＤＭ／ビヒクルは、ビヒクルで治療されたイエダニ負荷対照である。「ｈＢＤ２のＩＮ  １．２ｍｐｋ」は、１．２ｍｇ／ｋｇで鼻腔内投与されるｈＢＤ２である。５ｍｐｋは５ｍｇ／ｋｇである。
【図３３】ｈＢＤ２の治療的鼻腔内（図３３ａ）及び経口（図３３ｂ）投与後のそれぞれのイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおける肺コンプライアンス。
【図３４】ｈＢＤ２の治療的鼻腔内投与後のイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルでのＢＡＬＦ中の総数（３４ａ）、好中球（３４ｂ）及びマクロファージの細胞数（３４ｃ）。＊ビヒクルに対してｐ＜０．０５；マンホイットニー検定。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【図３５−４２】ｈＢＤ−２の治療的鼻腔内投与及び経口投与後のそれぞれのイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおける肺ホモジネート中のＩＦＮ−γ（図３５）、ＴＮＦ−α（図３６）、ＩＬ−４（図３７）、ＩＬ−５（図３８）、ＩＬ−６（図３９）、ＩＬ−９（図４０）、ＩＬ−１０（図４１）及びＩＬ−１３（図４２）のサイトカイン濃度。各図には、両方のアームが示されている図の左側に鼻腔内アーム及び右側に経口アームのデータがある。’対応するビヒクルに対するｐ＜０．０５；マンホイットニー検定。結果は平均±ＳＥＭとして示される。
【図４３】ｈＢＤ２の治療的鼻腔内投与及び経口投与後のそれぞれのイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおけるＨ＆Ｅ／ＰＡＳ調製物を用いた肺の組織診断。左上のパネル：未治療で未負荷の対照。右上のパネル：未治療のＨＤＭ負荷対照。左下のパネル：ｈＢＤ２  ＰＯで治療したＨＤＭ負荷。右下のパネル：ｈＢＤ２  ＩＮで治療したＨＤＭ負荷。５０倍拡大。
【図４４】ｈＢＤ２の治療的鼻腔内投与及び経口投与後のそれぞれのイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおける肺炎症の重症度。＊ビヒクルに対してｐ＜０．０５、マンホイットニー検定；＃ビヒクルに対してｐ＜０．０５、ウィルコックス符号順位検定。
【図４５】ｈＢＤ２の治療的鼻腔内投与及び経口投与後のそれぞれのイエダニステロイド感受性喘息マウスモデルにおける血管周囲及び気管支周囲の炎症。＊好酸球の血管周囲浸潤についてのビヒクルに対してｐ＜０．０５、マンホイットニー検定；＃好酸球及び単球の気管支周囲／気管支周囲浸潤についてのビヒクルに対してｐ＜０．０５、ウィルコックス符号順位検定。□単球；◆好酸球。
【図４６】１００μｇ／マウスの抗ＴＮＦ−αの週２回皮下投与（エンブレル）及び０．３ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンの１日１回の腹腔内投与と同等の１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２の皮下投与の効果を示す、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞移植ＳＣＩＤマウスモデルの１４週間の治療におけるミエロペルオキシダーゼ活性。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｔ検定によるビヒクルに対してｐ＜０．０１。
【図４７】０日目の幹細胞移植及び０日目〜１０日目に１．２ｍｇ／ｋｇ／日のｈＢＤ２又はビヒクル（ＰＢＳ  １００μＬ／日）での治療後のマウス移植片対宿主病モデルにおいて生存期間が劇的に増加したことを示す、カプラン・マイヤープロット（ｐ＜０．０００１）（ｎ＝１５）。
【図４８】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２で治療した１０匹のマウスにおける小腸、結腸及び肝臓の組織学的スコアの統計的に有意な減少。
【図４９】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２で治療したマウスにおけるベースラインからの割合（％）（ａ）及びグラム（ｂ）での体重減少。
【図５０】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２で治療した１０匹のマウスにおける結腸及び小腸の固有層へのＣＤ４５＋白血球細胞遊走の低下。
【図５１ａ−ｃ】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２で治療した１０匹のマウスにおける結腸及び小腸の固有層の腸のＴ細胞並びに骨髄細胞の浸潤低下。
【図５２ａ−ｃ】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２で治療した１０匹のマウスの血清中のＴＮＦ−α（ａ）、ＩＬ−６（ｂ）及びＩＬ−１０（ｃ）のサイトカイン濃度。
【図５３ａ−ｃ】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２で治療した１０匹のマウスの骨髄細胞におけるＩＬ−１β生成の低下。
【図５４ａ−ｆ】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２で治療した１０匹のマウス中の好中球の割合の低下（ａ）及びＴｈ  １サイトカイン生成の低下−ＣＤ４  Ｔ細胞（ｂ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（ｃ）及びＣＤ６９＋ＣＤ４  Ｔ細胞（ｄ）中のＩＦＮ−γ；ＣＤ４  Ｔ細胞（ｅ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（ｆ）中のＴＮＦ−α。
【図５５】幹細胞移植の日から１０日間、経口ＰＢＳで治療した１０匹のマウスの結腸における炎症、骨髄細胞と白血球の浸潤の増加及び組織修復の増加。
【図５６】シクロスポリン及びＰＢＳでそれぞれ治療した１３匹のマウスと比較した、幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２で治療した７匹のマウスにおける死亡率の統計的に有意な低下（ｐ＝０．０３）。
【図５７】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２、シクロスポリン、又はＰＢＳで治療したマウスにおけるベースラインからの体重減少（％）。
【図５８】幹細胞移植の日から１０日間、経口ｈＢＤ−２、経口ＨＤ５又はＰＢＳでそれぞれ治療した２２匹のマウスにおける死亡率の有意な低下。
【図５９】低脂肪食又は西洋食のマウスと比較したマウスにおける腸内膜から細菌集団（溶解ゾーン）までの距離（μｍ）として測定した経口投与ＨＤ５及びｈＢＤ−２によって発揮される細菌集団制御。この実験は、マウスに経口投与したヒトＨＤ５及びｈＢＤ−２が驚くべきことに、経口投与後に期待される主に腸の内腔でではなく、マウス自体の上皮細胞によって生成されたマウスディフェンシンであるかのように、上皮表面で微生物叢調節効果を発揮することを実証する。
【図６０】マウス高脂肪食モデルでのｈＢＤ２による予防的処置後の肝臓のヘマトキシリン／エオシン染色。低脂肪食を摂取したマウスでは肝細胞での脂肪の蓄積は認められないが、西洋高脂肪食を摂取したマウスでは広範囲の脂肪症（肝細胞での脂肪蓄積）が認められ、経口で１．２ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ−２の毎日の予防的投与を補足した西洋高脂肪食を摂取したマウスのグループでは最小限の肝細胞内脂肪蓄積が認められる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
定義：
ディフェンシン：本明細書で使用される「ディフェンシン」という用語は、抗菌ペプチドのディフェンシンクラスに属するポリペプチドを指す。ディフェンシンは、健康な微生物叢を維持し潜在的な病原体を追い払うのに役立つ、主要な先天性宿主防御の１つを代表する（Ｗｅｈｋａｍｐら、２００２及びＳａｌｚｍａｎら、２００７）。ディフェンシンは、グラム陽性菌及び陰性菌、真菌及び古細菌に対して抗菌作用を保有し、抗炎症活性を発揮するペプチドである。ヒトのディフェンシンは、それらの３つの分子内システインジスルフィド結合のトポロジーに基づいて、α−ディフェンシン及びβ−ディフェンシンに分けられる、小さなカチオン性ペプチドである（図６）。哺乳類ディフェンシンには明確な構造的特徴がある：成熟ペプチドは小さく（３〜６ｋＤａ、２８〜４２アミノ酸長）、カチオン性で（正味電荷＋１〜＋１１）、両親媒性であり、３つの逆平行鎖βシートの高度に保存された３次構造を有する。ディフェンシン間の構造の保存は、アミノ酸配列の変動性を考えるといくぶん驚くべきことであり、ディフェンシンファミリー全体で６つの保存されたシステイン残基による。これらの６つのシステイン残基は３つのジスルフィド結合を形成し、それは３本鎖βシートのコア構造を安定化させる（Ｄｏｒｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）、２０１５の中の哺乳類の抗菌ペプチド；ディフェンシン及びカテリシジン）。α−ディフェンシンは、小腸の陰窩（ＨＤ５とＨＤ６又はＤＥＦＡ５とＤＥＦＡ６）中でパネート細胞により発現されるものである。β−ディフェンシン（ＤＥＦＢｎ）は主に、皮膚、目、中耳、口、気管、肺、消化管、泌尿生殖器系、腎臓、膣、肝臓、膵臓及び乳腺を含む様々な組織並びに臓器で上皮細胞によって生成される。ディフェンシンの例は、ヒト腸アルファディフェンシン５（ＨＤ５；配列番号５）；ヒト腸アルファディフェンシン６（ＨＤ６；配列番号６）；どちらもアルファディフェンシンクラスに属する；また、ヒトベータディフェンシン１（ｈＢＤ１；配列番号１）；ヒトβディフェンシン２（ｈＢＤ２；配列番号２）；ヒトβディフェンシン３（ｈＢＤ３；配列番号３）；ヒトβディフェンシン４（ｈＢＤ４；配列番号４）；短縮型ヒトβディフェンシン２（配列番号７）を含む。ディフェンシンは前駆体として発現され、シグナルペプチド及び場合によってはプロペプチドの切断によってプロセシングされた後、細胞外空間に分泌される。ヒトのディフェンシンのいくつか、例えばｈＢＤ１は、構成的に生成されるが、他のもの、例えば、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３及びｈＢＤ４は、炎症性サイトカイン又は外因性微生物の生成物によって誘導される。上記の特定された配列は、予測される成熟生理活性ディフェンシンを表す。当業者なら、プロセシングは細胞ごとに異なる可能性があること、かつ生じる分泌成熟ペプチドは、Ｃ末端若しくはＮ末端の１個又は２個のアミノ酸が予測される配列と異なり、なお生物活性を維持し得ることを理解するであろう。
【００２８】
同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメーター「同一性」によって説明される。２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（Ｒｉｃｅら、２０００、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）、好ましくは、バージョン３．０．０又はそれ以降で実装されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメーターは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリクスである。「最長同一性」というラベルが付けられたＮｅｅｄｌｅの出力（ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性の割合として使用され、以下のように計算される：（同一残基×１００）／（アライメントの長さ−アライメントのギャップの総数）。
【００２９】
正常な微生物叢：「正常な微生物叢」という用語は、本明細書では、腸内菌共生バランス失調でない微生物叢を示すために使用される。正常な微生物叢は、遺伝子が非常に豊富であることによって特徴付けられる。正常な腸内細菌叢は、バクテロイデス属、フェカリバクテリウム属、ローズブリア属、ブラウティア属、ルミノコッカス属、コプロコッカス属、ビフィズス菌属、メタノブレビバクター属、ラクトバチルス属、コプロコッカス属、クロストリジウム属、アッカーマンシア属、ユーバクテリウム属に属する細菌を含むことによって特徴付けられる。
【００３０】
正常な肺微生物叢は、シュードモナス、ストレプトコッカス、プレボテラ、フソバクテリア、ベイロネラ、ヘモフィルス、ナイセリア、及びポルフィロモナスからなるコア微生物叢と共に、バクテロイド属、ファーミキューテス属、及びプロテオバクテリア属に属する細菌を含むことによって特徴付けられる。
【００３１】
治療：本明細書で使用される「治療」及び「治療する」という用語は、病態、疾患又は障害と闘うことを目的とした患者の管理及びケアを指す。この用語は、症状若しくは合併症を軽減又は緩和すること；病態、疾患若しくは障害の進行を遅らせること；病態、疾患若しくは障害を治癒又は排除すること；及び／又は病態、疾患若しくは障害を予防することの目的のための活性化合物の投与などの、患者が苦しんでいる所与の病態に対する全範囲の治療を含むことを意図し、「予防すること」又は「予防」は、症状若しくは合併症の発症を防止するか、又はそれらのリスクを低減するために、活性化合物を妨害、低減する目的のための患者の管理及びケアを指すと理解されるべきである。治療される患者は、好ましくは哺乳類、特にヒトである。
【００３２】
患者：患者は、同種造血幹細胞移植で治療されたか、又は移植を受けようとしている対象である。
【００３３】
哺乳類アルファディフェンシンと哺乳類ベータディフェンシン
この開示は、同種造血幹細胞移植で治療されているか、若しくは治療されようとしている対象の治療又は予防における、ヒトアルファディフェンシン及びベータディフェンシン、より好ましくはヒト科などの哺乳類アルファディフェンシン及び／又はベータディフェンシンの使用に関する。
【００３４】
一実施形態では、哺乳類アルファディフェンシン及び／又はベータディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。別の実施形態では、ディフェンシンは、配列番号１〜７の１つと、１０個未満、例えば、８個未満、例えば、５個未満、例えば、４個未満、例えば３個未満、例えば、２個未満のアミノ酸が異なる。
【００３５】
好ましい実施形態では、ヒトアルファディフェンシンは、アルファディフェンシン５（配列番号５）及び／又はアルファディフェンシン６（配列番号６）からなる。好ましい実施形態では、哺乳類ベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン１（配列番号１）、ヒトベータディフェンシン２（配列番号２）、切断型ヒトベータディフェンシン２（配列番号７）、ヒトベータディフェンシン３（配列番号３）及び／又はヒトベータディフェンシン４（配列番号４）からなる。好ましい実施形態では、ヒトアルファディフェンシンは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、かつ最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。好ましい実施形態では、ヒト哺乳類アルファディフェンシンは、アルファディフェンシン５（配列番号５）からなる。好ましい実施形態では、ヒトベータディフェンシンは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、かつ最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。好ましい実施形態では、ヒトベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン２（配列番号２）からなる。さらに別の実施形態では、哺乳類アルファディフェンシンは、ヒトアルファディフェンシン及び／又はマウスアルファディフェンシン、並びにそれらの機能的に同等な変異体を含む。好ましくは、哺乳類アルファディフェンシンは、ヒトアルファディフェンシン５、ヒトアルファディフェンシン６及びそれらの機能的に同等な変異体からなる。より好ましくは、哺乳類アルファディフェンシンは、ヒトアルファディフェンシン５、及びその機能的に同等な変異体又はオルソログからなる。
【００３６】
さらに別の実施形態では、哺乳類ベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン及び／又はマウスベータディフェンシン、及びそれらの機能的に同等な変異体からなる。好ましくは、哺乳類ベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン１、ヒトベータディフェンシン２、切断型ヒトベータディフェンシン２、ヒトベータディフェンシン３、ヒトベータディフェンシン４、及びそれらの機能的に同等な変異体からなる。より好ましくは、哺乳類ベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン２、及びその機能的に同等な変異体又はオルソログからなる。
【００３７】
哺乳類（例えば、ヒト）アルファディフェンシン又はベータディフェンシンの「機能的に同等な変異体」は、肺又は腸又は皮膚中の微生物叢に対して、親の哺乳類（例えば、ヒト）アルファディフェンシン及び／又はベータディフェンシンとほぼ同じ作用を示す改変された哺乳類（例えば、ヒト）アルファディフェンシン又はベータディフェンシンである。哺乳類（例えば、ヒト）ディフェンシンの機能的に同等な変異体は、哺乳類（例えば、ヒト）ディフェンシンアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜６のいずれか）と比較して、１〜５個のアミノ酸改変、好ましくは１〜４個のアミノ酸改変、より好ましくは１〜３個のアミノ酸改変、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸改変（複数可）、及び特に１個のアミノ酸改変を含んでよい。好ましくは、ベータ哺乳類ディフェンシンについては、配列番号２を有するヒトベータディフェンシン２と比較され、アルファディフェンシンについては、ＨＤ５（配列番号５）と比較される。
【００３８】
「改変」という用語は、本明細書では、哺乳類（例えば、ヒト）ディフェンシンの化学的改変を意味する。改変（複数可）は、アミノ酸（複数可）の置換（複数可）、欠失（複数可）及び／又は挿入（複数可）、並びにアミノ酸側鎖（複数可）の置き換え（複数可）であるか、又はアミノ酸配列における類似の特徴を有する非天然アミノ酸の使用であり得る。特に、改変（複数可）は、Ｃ末端のアミド化などのアミド化であり得る。好ましくは、アミノ酸改変はマイナーな性質のもの、すなわち、ポリペプチドのフォールディング及び／又は活性に著しく影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換又は挿入；単一欠失；小さなアミノ末端若しくはカルボキシル末端の伸長；又はポリヒスチジンタグ、抗原性エピトープ若しくは結合ドメインなどの、正味電荷又は別の機能を変更することによって精製を容易にする小さな伸長である。一実施形態では、ポリヒスチジンタグ、抗原性エピトープ又は結合ドメインなどの小さな伸長は、最大で約２０〜２５残基の小さなリンカーペプチドを介して哺乳類（例えば、ヒト）アルファディフェンシン又はベータディフェンシンに結合され、上記リンカーは、制限酵素切断部位を含んでよい。
【００３９】
図６のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメントを使用して、タンパク質の生物活性に実質的に影響を与えることなく、どのアミノ酸残基を置換できるかを予測できる。配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏ，ｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）及び以下の設定：ギャップオープンペナルティ：１０、ギャップ延長ペナルティ：０，０５、重量推移：ＮＯ、タンパク質の親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥ、親水性ギャップ：ＹＥＳ、重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ（タンパク質用）を使用して整列させた。以下のグループ（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、「強い」保存グループ）内の置換は、保存的置換と見なされる：−Ｓ、Ｔ、Ａ；Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｈ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ；Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｆ；Ｈ、Ｙ；Ｆ、Ｙ、Ｗ。以下のグループ（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、「弱い」保存グループ）内の置換は、半保存的な置換と見なされる：−Ｃ、Ｓ、Ａ；Ａ、Ｔ、Ｖ；Ｓ、Ａ、Ｇ；Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｋ；Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ａ；Ｓ、Ｇ、Ｎ、Ｄ；Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｋ；Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｋ；Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ；Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ；Ｈ、Ｆ、Ｙ。
【００４０】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）のグループ内で行われる置換である。一般に比活性を変化させないアミノ酸置換が当技術分野で知られている。最も一般的に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／ｌｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ｌｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００４１】
２０種類の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα−メチルセリンなど）が、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換されてよい。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされていないアミノ酸、及び非天然アミノ酸が、アミノ酸残基と置換されてよい。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に改変されているか、かつ／又は標準アミノ酸のそれとは異なる化学構造をそれらの側鎖（複数可）に有する。非天然アミノ酸は、化学的に合成でき、好ましくは、市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−メチルプロリン及び４−メチルプロリン、並びに３，３−ジメチルプロリンを含む。
【００４２】
哺乳類アルファディフェンシン及び／又はベータディフェンシン中の必須アミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニン走査変異誘発などの当技術分野で公知の手順に従って特定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の手法では、分子内の全ての残基で単一のアラニン変異を導入し、得られる変異分子を生物活性（すなわち、気道過敏反応又は抑制サイトカインに対する活性、例えば、ＴＮＦ−α活性）について試験して、分子の活性に重要なアミノ酸残基を特定する。Ｈｉｌｔｏｎら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照されたい。必須アミノ酸の特定は、哺乳類アルファディフェンシン及び／又はベータ−ディフェンシンに関連するポリペプチドとの同一性分析からも示唆できる（図５のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント参照）。
【００４３】
単一又は複数のアミノ酸置換は、変異誘発、組換え、及び／又はシャッフリングの既知の方法を使用して実行及び試験され、その後に、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ及びＳａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ及びＳａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；ＷＯ  ９５／１７４１３；又はＷＯ  ９５／２２６２５で開示されているものなどの関連するスクリーニング手順を行うことができる。使用できる他の方法は、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎら、１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ  ９２／０６２０４）、及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら、１９８６、Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒら、１９８８、ＤＮＡ  ７：１２７）を含む。所与の置換の結果を確実に予測できない場合、誘導体は、生物活性の有無を決定するために本明細書の上記の方法に従って容易にアッセイされ得る。
【００４４】
長時間作用型ディフェンシン
哺乳類のα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンの半減期は、α−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンを別の部分と融合又はコンジュゲートすることによって、すなわち、α−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンとして同じ方法で投与されるα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンのインビボ血漿半減期と比較して実質的に増加されるα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンのインビボ血漿半減期をもたらす医薬として許容される分子に結合された、長時間作用する生物活性のあるα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンを構築することによって、延長させることができる。
【００４５】
長時間作用する生物学的に活性なα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、トランスフェリン、アルブミン（ＨＡＳ）、ＸＴＥＮ（登録商標）若しくはＰＥＧに結合する分子、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリンアラニンセリンポリマー（ＰＡＳ）、又はエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、ヒアルロン酸、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）β鎖のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）などの負に帯電した高度にシアル化されたペプチド、ヒトＩｇＧ、及びＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−（ｎは８〜２２である）からなる群から選択される医薬として許容される分子に結合された哺乳類のα−ディフェンシン若しくはその類似体又は哺乳類のβ−ディフェンシン若しくはその類似体を含む。
【００４６】
α−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンの類似体は、非哺乳類起源であってもよく、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質から選択されてもよい。
【００４７】
α−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンのアゴニストは、限定されないが、アルブミン又はアルブミン類似体などの医薬として許容される分子への、二官能性リンカーを介する化学的カップリング、α−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンなどのディフェンシンのＮ末端又はＣ末端をカップリングすることにより遺伝子工学的に、などの、先行技術文献に記載されているような様々な方法で医薬として許容される分子に結合されてよい。特に、アルブミン又はアルブミン類似体、例えば、ヒトアルブミンのＮ末端は、α−ディフェンシン若しくはβ−ディフェンシンのＣ末端、又はα−ディフェンシン若しくはβ−ディフェンシンのＮ末端に結合されてよく、又は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンのＣ末端は、α−ディフェンシン若しくはβ−ディフェンシンのＣ末端、又はα−ディフェンシン若しくはβ−ディフェンシンのＮ末端に結合されてよい。リンカー配列が、アルブミンとα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンの鎖の間に挿入されてよい。α−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンのアゴニストは、安定なリンカー又はより柔軟なリンカーを介して医薬として許容される分子に結合されてよい。二官能性ＰＥＧ分子（例えば、Ｐａｉｇｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２巻、第１２版、１９９５参照）、加水分解性リンカー（Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５，１６：９１３−９２０及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１３巻，第１〜２版，Ｊｕｎｅ  ２００７及びＷ０２００９０９５４７９）、ＰＤＰＨ及びＥＭＣＨ（例えば、Ｗ０２０１００９２１３５を参照されたい）を含む、いくつかのリンカーが当技術分野で知られている。医薬として許容される分子へのα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンのアゴニストの化学的コンジュゲーション（２以上の分子の結合）が、機能的なα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンの活性を大幅に低下させる特別な場合では、機能的なα−ディフェンシン又はβ−ディフェンシンのアゴニストを放出できるより柔軟なリンカーを使用することが好ましい場合がある。
【００４８】
半減期の延長は、スペーサー、例えば、γ−Ｌ−グルタミルスペーサー及びＣ−１８脂肪二酸鎖を用いてリジンへのペプチド骨格のアシル化を通して達成されてよい。脂肪二酸部位鎖とスペーサーは、アルブミンへの強力だが可逆的な結合を媒介し、注射部位からの放出を遅らせ、腎クリアランスを低下させる。
【００４９】
方法と用途
ヒトのベータディフェンシン２及びＨＤ５を、重度の腸炎症及び腸内菌共生バランス失調（デキストラン硫酸ナトリウム、トリニトロベンゼンスルホン酸及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞移植）の予防の動物モデルと治療の動物モデルの両方で試験した。α−ディフェンシン及びβ−ディフェンシンは経口投与又は皮下投与にかかわらず、腸の健康を改善することにより、これらの化学物質によって引き起こされる下痢及び体重減少を軽減する。重要なことに、ディフェンシンは、全てＧＶＨＤの治療に日常的に使用されている、プレドニゾロン／デキサメタゾン及びシクロスポリンなどの強力で標準的なＧＶＨＤ免疫抑制剤並びに抗ＴＮＦ−αと同等に疾患活動指数と炎症マーカーとしてのミエロペルオキシダーゼ活性を減少させる。そのため、ディフェンシンは、同種造血幹細胞移植を受けたか、若しくは受けようとしている患者の予防的及び／又は治療的処置として強力な活性を示す。
【００５０】
β−ディフェンシンは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３の組織濃度の正常化により免疫系のバランスを再調整でき、ひいては急性ＧＶＨＤをもたらすサイトカインストームを防止又は治療し、したがって同種造血幹細胞移植を受けたか若しくは受けようとしている患者の予防的及び／又は治療的処置として強力な活性を示すことが実証されている。
【００５１】
α−ディフェンシンとβ−ディフェンシンの両方は、微生物叢の構成に強い影響を与え微生物の種類を増やす、すなわち、微生物叢を維持／正常化／再設置し及び重要な共生細菌の豊富さを促進することが、予防用と治療用の両方の高脂肪食マウスモデルにおいて実証されており、そのため、急性ＧＶＨＤの一般的な特徴である腸内菌共生バランス失調を治療する方法を提示する。β−ディフェンシンは、ミエロペルオキシダーゼ活性の減少を通じて腸の健康、炎症及び機能を正常化できることが実証されており、そのため、同種造血幹細胞移植を受けた患者の腸の健康を改善する方法を提示する。
【００５２】
ヒトβ−ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の投薬が経口投与又は鼻腔内投与にかかわらず、喘息の発症を予防できることが、急性アレルギー性喘息のマウスモデルにおいてさらに実証されており、そのため、急性及び慢性ＧＶＨＤに関連する場合が多い肺の合併症並びに肺容量の減少を予防する方法を提示する。
【００５３】
ヒトβ−ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の投薬が経口投与又は鼻腔内投与にかかわらず、喘息を治療できることも、急性アレルギー性喘息のマウスモデルにおいてさらに実証されており、そのため、急性及び慢性ＧＶＨＤに関連する場合が多い肺の合併症並びに肺容量の低下を治療する方法を提示する。
【００５４】
したがって、一態様では、重度の腸炎症及びサイトカインストームの治療方法であって、１以上の哺乳類ディフェンシンの経口投与又は皮下投与を含み対象が同種造血幹細胞移植で治療されたか若しくは治療されようとしている、方法が提供される。
【００５５】
したがって一態様では、重要な共生細菌、例えばビフィズス菌科の存在及び存在量の増加を包含する腸内細菌叢の維持／正常化／再設置の方法であって、１以上の哺乳類ディフェンシンの経口投与を含み対象が同種造血幹細胞移植で治療されたか若しくは治療されようとしている、方法が提供される。
【００５６】
他の態様では、閉塞性細気管支炎及び強皮症を予防する肺と腸の炎症及び線維症の治療並びに／又は予防の方法であって、少なくとも１種のディフェンシンの経口投与、皮下投与、肺内投与、皮膚投与又は経皮投与を含み、対象が同種造血幹細胞移植で治療されたか若しくは治療されようとしている、方法が提供される。
【００５７】
さらに、同種造血幹細胞移植で治療されたか又は治療されようとしている対象での肺組織における組織学的肺炎症、血管周囲及び気管支血管の炎症、ＢＡＬＦ炎症細胞数、並びに／又はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３の炎症性サイトカイン生成を低下させる方法であって、上記対象への少なくとも１種のディフェンシンの投与を含む、方法が提供される。
【００５８】
他の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによる治療方法で使用するためのディフェンシン、及び同種造血幹細胞移植で治療されたか又は治療されようとしている対象の障害を治療するための医薬品を調製するためのディフェンシンの使用に関する。
【００５９】
提供される方法は、同種造血幹細胞移植で治療されたか若しくは治療されようとしている対象において、転写レベルでの変化を介して細菌の表現型を変化させること並びに肺及び／若しくは腸及び／若しくは肝臓の微生物叢の構造及び構成又は肺及び／若しくは腸のメタボロームを変化させることにより、肺及び／若しくは腸の炎症並びに／又は肝臓の炎症を治療又は予防できる。
【００６０】
理論に縛られることなく、経口投与を用いて観察される効果は、いわゆる腸−肺軸を介して肺に影響を与える可能性のある腸内細菌叢及び腸メタボロームの変化に起因する可能性がある。喘息、ＣＯＰＤ及び慢性ＧＶＨＤなどの慢性肺障害は全て、腸疾患の症状の一部を呈し、人体のこれら２つの粘膜部位間に必須のクロストークがあり、かつ様々な呼吸器疾患が、気道微生物叢だけでなく腸内微生物叢の腸内菌共生バランス失調に関連付けられていることを示す。
【００６１】
共生微生物は、主に宿主と微生物の相互作用を媒介する小分子を生成することにより、自然免疫及び適応免疫応答を調整し、かつ病原性刺激の活性化しきい値に影響を与える（Ｄｏｎｉａ及びＦｉｓｈｂａｃｋ、２０１５）。上皮バリアは微生物の大部分が腸に閉じ込められることを保証するが、微生物代謝産物は上皮バリアに浸透でき、それらが宿主の循環系に侵入して蓄積するのを可能にし、それらはそこで免疫細胞によって感知される（Ｄｏｒｒｅｓｔｅｉｎ、２０１４）。Ｔｒｏｍｐｅｔｔｅ、２０１３は、食事中の発酵性繊維が腸微生物叢の構成だけでなく、肺微生物叢の構成、特にファーミキューテスとバクテロイデスの比率を変更したことをマウスで実証し、後者は、短鎖脂肪酸の局所レベル及び全身レベルの増加をもたらし、それが次に、樹状細胞の造血及び機能に影響を与え、それにより肺の免疫学的環境を形成し、アレルギー性炎症の重症度に影響を与えた。Ｓｃｈｉｒｍｅｒら（２０１６）はさらに、サイトカイン応答の個体間変動が特定の微生物や微生物の機能に関係していることを、ヒト機能的ゲノミクスプロジェクト（Ｈｕｍａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）で実証した。検出された関連の大部分はサイトカインと刺激の両方に特異的であり、免疫系が、高い特異性で微生物及び生成物を認識しかつそれらと相互作用すること、及びこれらの微生物因子が特定の免疫学的表現型に関連付けられることを示唆する。ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの生成能力は、マイクロバイオームの影響をより強く受けるようであるが、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴｈ１７由来のＩＬ−１７及びＩＬ−２２などの他のサイトカインは、より少ないが、より特異的な腸微生物叢との関連を示した。
【００６２】
本明細書に記載の治療の方法は、プレバイオティクス、プロバイオティクス、トリプトファン、グルココルチコイド、シクロスポリン、抗ＴＮＦ−α、インテグリン、抗生物質、免疫抑制剤、糞便移植又はこれらの組み合わせのいずれかと組み合わせた少なくとも１種の哺乳類α−ディフェンシン及び／又はβ−ディフェンシンを含む組成物の投与によって行うことができる。ディフェンシンは、個別に、又はこれらの治療法の１以上と共に投与できる。ディフェンシンはまた、同種造血幹細胞移植を受けたか、又は受けようとしている患者の治療に使用できる他の薬剤と共に投与できる。
【００６３】
重要なことに、開示される方法は、抗生物質治療、微生物除染又は免疫抑制療法、あるいは肺又は腸の微生物叢に悪影響を与える別の治療を行ったことがある、及び／若しくは行っている対象の腸及び／又は肺における腸内菌共生バランス失調の微生物叢／メタボロームの治療、再設置又は正常化に使用できる。
【００６４】
腸及び／又は肺の微生物叢の正常化は、酪酸又はトリプトファンを比較的多く、かつ酢酸を比較的少なく生産するものにメタボロームを変更することを伴ってもよい。
【００６５】
インビトロ合成
哺乳類アルファディフェンシン及び哺乳類ベータディフェンシンを含む哺乳類抗菌ペプチドは、当技術分野で知られている従来の方法を使用して、インビトロ合成によって調製されてよい。様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｂｅｃｋｍａｎなどの自動合成装置が利用可能である。合成装置を使用することにより、天然アミノ酸を非天然アミノ酸、特にＤ異性体（又はＤ型）、例えば、Ｄ−アラニン及びＤ−イソロイシン、ジアステレオ異性体、及び異なる長さ又は機能性を有する側鎖などで置換してよい。特定の順序及び調製の方法は、利便性、経済性、及び必要な純度などによって決定される。化学的結合は、アミド又は置換アミン形成のためのアミノ基、例えば還元的アミノ化、チオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基、及びアミド形成のためのカルボキシル基などの、結合に便利な機能を含む様々なペプチド又はタンパク質に提供されてよい。必要に応じて、様々な基を、合成中又は発現中にペプチドに導入してよく、それは他の分子又は表面への結合を可能にする。そのため、システインはチオエーテルを作製するために使用でき、ヒスチジンは金属イオン錯体に結合するため、カルボキシル基はアミド又はエステルを形成するため、及びアミノ基はアミドを形成するために使用できる、などである。
【００６６】
哺乳類アルファディフェンシン、哺乳類ベータディフェンシン又はそれらの機能的同等物を含む哺乳類抗菌ペプチドはまた、組換え合成の従来の方法に従って単離及び精製されてよい。組換え合成は、適切な発現ベクター及び真核生物又は原核生物の発現系を使用して行われてよい。溶液が、発現宿主及び培地から調製され、存在するディフェンシンが、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術を使用して精製されてよい。大腸菌におけるヒトβディフェンシン−２の組換え発現の方法は、ＷＯ  ２０１０／００７１６６（ＮｏＶｏｚｙｍｅｓ）に開示されている。
【００６７】
哺乳類アルファディフェンシン及びベータディフェンシンはまた、対応するｍＲＮＡの投与によって誘導されてもよい。
【００６８】
投薬量
ヒトのアルファディフェンシン又はヒトのベータディフェンシンなどの哺乳類アルファディフェンシン又は哺乳類ベータディフェンシンは、好ましくは患者に対して許容可能な毒性を伴い同種造血幹細胞移植を受けた患者の移植片対宿主病を予防又は治療するのに有効な量にて医薬組成物中で好ましく使用される。ヒトアルファディフェンシン及びヒトベータディフェンシンなどの哺乳類アルファディフェンシン及び哺乳類ベータディフェンシンはまた、好ましくは治療を必要とする患者に対して許容できる毒性を伴い、肺及び／若しくは腸で正常な微生物叢構成を維持するか、又は肺及び／若しくは腸での腸内菌共生バランス失調の微生物叢を治療又は正常化するのに有効な量にて医薬組成物中で好ましくは使用される。
【００６９】
そのような治療では、もちろん、適切な投薬量は、例えば、使用される化合物の化学的性質及び薬物動態データ、個々の宿主、投与様式並びに治療される病態の性質及び重症度に応じて変化する。
【００７０】
しかしながら、一般に、哺乳類、例えばヒトにおける満足のいく結果のために、ヒトアルファディフェンシンの示される日用量は、例えば、１日あたり最大で１回、２回又は３回の分割用量で投与される、好ましくは約０．１ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ〜約１０ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ、より好ましくは約０．５ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ〜約１０ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ；例えば、１ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ〜１０ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ、より好ましくは約１．２ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ〜約１０ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ、好ましくは約１．２ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ〜約５ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇ、さらにより好ましくは、１．２ｍｇのＨＤ５／体重ｋｇである。
【００７１】
一実施形態では、ヒトベータディフェンシンの示される日用量は、例えば、１日あたり最大で１回、２回又は３回の分割用量で投与される、好ましくは約０．１ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ〜約１０ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ、より好ましくは約０．５ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ〜約１０ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ；例えば、１ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ〜１０ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ、より好ましくは約１．２ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ〜約１０ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ、好ましくは約１．２ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ〜約５ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇ、さらにより好ましくは１．２ｍｇのｈＢＤ２／体重ｋｇである。
【００７２】
２種の異なるディフェンシンが１回の投薬量で投与される場合、投薬量は、重量ベース又はモルベースで決定される２種のディフェンシンの等しい又はほぼ等しい量を含んでよい。比率はまた、アルファディフェンシン対ベータディフェンシンの比率が重量ベース又はモルベースで決定される１０：１〜１：１０、例えば、５：１〜１：５、例えば、２：１〜１：２に変化するように異なる場合もある。
【００７３】
好ましい実施形態の化合物は、従来使用されているものと同様の投薬量にて同様の投与様式により、哺乳類、例えばヒトに投与できる。
【００７４】
一実施形態では、日用量が１日あたり０．１〜１０ｍｇのディフェンシン／ｋｇ、例えば、０．５〜５ｍｇのディフェンシン／ｋｇ、例えば、１〜２ｍｇのディフェンシン／ｋｇ、例えば、１．２ｍｇのディフェンシン／ｋｇである、本明細書に記載の方法が提供される。
【００７５】
特定の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトアルファディフェンシン及び／又はヒトベータディフェンシンなどの哺乳類アルファディフェンシン及び／又は哺乳類ベータディフェンシンを、単位剤形当たり約０．１ｍｇ以下〜約１５００ｍｇ以上、好ましくは約０．１、０．２、０．３、０．４、又は０．５ｍｇ〜約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｍｇ、より好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ｍｇ〜約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍｇの量で含んでよい。しかしながら、特定の実施形態では、上記のものよりも低い又は高い投薬量が好ましい場合がある。適切な濃度及び投薬量は、当業者が容易に決定できる。特定の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトアルファディフェンシンなどの哺乳類アルファディフェンシンを含む。他の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトベータディフェンシンなどの哺乳類ベータディフェンシンを含む。さらなる実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトアルファディフェンシン及びヒトベータディフェンシンなどの哺乳類アルファディフェンシン及び哺乳類ベータディフェンシンを含み、アルファディフェンシン及びベータディフェンシンがモルベース又はｍｇ／ｍＬベースの等しい量で存在する。
【００７６】
一実施形態では、哺乳類アルファディフェンシン及び／又は哺乳類ベータディフェンシンは、少なくとも１日１回、例えば、少なくとも１日２回、例えば、少なくとも１日３回又は連続的に投与される。
【００７７】
投与
一実施形態では、哺乳類ディフェンシンは、患者が同種造血幹細胞移植を受ける前のある期間、患者に投与される。この場合、ディフェンシンの投与は、移植の間継続されてよく、移植が完了した後にさらに投与されてよい。一実施形態では、本開示による哺乳類ディフェンシンは、同種造血幹細胞移植を受けるときに患者に投与される。例えば、ディフェンシンは移植と同じ日に投与されてよい。ディフェンシン投与を移植後に継続してよい。
【００７８】
一実施形態では、哺乳類ディフェンシンは、同種造血幹細胞移植後に投与される。この実施形態では、同種造血幹細胞移植が完了したら、ディフェンシンの投与を継続してよい。例えば、ディフェンシンは、移植と同じ日に投与され、移植に続く以降の各日に１回以上投与されてよい。一実施形態では、移植後、治療は毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと又は７日ごとなどの間隔での投与により続く。実施例１３に例示されるように、治療は、移植の日に開始して、移植後何日間か、例えば、移植後１日以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０日間継続されてよい。治療はまた、移植前に開始され、移植後何日間か、例えば、移植後１日以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０日間継続されてよい。
【００７９】
経口又は非経口投与のための製剤
哺乳類アルファディフェンシン及びベータディフェンシンは、任意の従来の経路による投与のために製剤化された組成物中で治療的に使用できる。
【００８０】
一実施形態では、投与は、経口、口腔内、舌下、経腸、経膣、気管内、肺内、鼻腔内、頭蓋内、皮下、静脈内、皮膚又は経皮投与である。好ましくは、投与は経口投与である。
【００８１】
一実施形態では、開示される方法による少なくとも１種の哺乳類α−ディフェンシン及び／又は少なくとも１種の哺乳類β−ディフェンシンの投与は、経口投与である。
【００８２】
一実施形態では、開示される方法による少なくとも１種の哺乳類β−ディフェンシンの投与は一般に、鼻腔内又は肺内投与である。鼻腔内及び肺内投与は、肺への薬物送達にとって標準である。
【００８３】
一実施形態では、開示される方法による少なくとも１種の哺乳類α−ディフェンシン及び／又は少なくとも１種の哺乳類β−ディフェンシンの投与は、皮下又は静脈内投与である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥物としての安定性を提供する適切な賦形剤を利用して、凍結乾燥物として製剤化され、その後再水和されてよい。ヒトアルファディフェンシン及び／又はヒトベータディフェンシンなどの哺乳類アルファディフェンシン及び／又は哺乳類ベータディフェンシンを含有する医薬組成物は、従来の方法に従って、例えば、混合、造粒、コーティング、溶解又は凍結乾燥プロセスによって製造できる。好ましい実施形態では、哺乳類アルファディフェンシン及び／又は哺乳類ベータディフェンシンを含有する医薬組成物は、無菌の等張溶液として製剤化される。
【００８５】
医薬として許容される担体及び／又は希釈剤は、当業者によく知られている。溶液として製剤化される組成物の場合、許容される担体及び／又は希釈剤は生理食塩水を含み、滅菌水が含まれるべきであり、組成物は、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び他の一般的な添加剤を含んでよい。
【００８６】
開示される化合物は、経口投与のための多種多様な製剤で製剤化されてよい。固形調製物は、粉末、錠剤、ドロップ、カプセル、カシェ剤、ロゼンジ、及び分散性顆粒を含んでよい。経口投与に適する他の形態は、エマルジョン、シロップ、エリキシル、水溶液、水性懸濁液を含む液体形態の調製物、練り歯磨き、ゲル歯磨剤、チューインガム、又は使用直前に溶液、懸濁液、及びエマルジョンなどの液体形態の調製物に変換されることが意図される固形調製物を含んでよい。
【００８７】
開示される組成物は、口腔、舌下、経口、直腸、膣、皮膚、経皮、頭蓋内、皮下又は静脈内投与のための多種多様な製剤で製剤化されてよい。製剤は、（哺乳類アルファディフェンシン及び／又は哺乳類ベータディフェンシン及び他の任意の活性成分に加えて）担体、充填剤、崩壊剤、流動調整剤、砂糖及び甘味料、香料、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝液、希釈剤、分散剤及び界面活性剤、結合剤、潤滑剤、及び／又は当技術分野で知られている他の医薬賦形剤を含有できる。当業者はさらに、適切な方法で、かつレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９０））に記載のものなどの容認された慣行に従って、哺乳類アルファディフェンシン、哺乳類ベータディフェンシンを製剤化してよい。
【００８８】
ヒトアルファディフェンシン又はヒトベータディフェンシンなどの哺乳類アルファディフェンシン又は哺乳類ベータディフェンシンは、単独で、又は１つ、２つ、又はそれ以上の他の医薬化合物又は薬物、例えば、プレバイオティクス、プロバイオティクス、グルココルチコイド、シクロスポリン、抗ＴＮＦ−α、インテグリン、抗生物質、免疫抑制剤又はこれらの組み合わせ及び／又は１以上の医薬として許容される賦形剤（複数可）との併用療法で使用できる。
【００８９】
気道投与
本発明の組成物を投与するために気道投与を使用してもよい。肺内投与とは、肺への局所投与を意味する。本明細書で使用される場合、「気管内、気管支内又は肺胞内投与」という用語は、安定剤又は他の賦形剤の添加の有無にかかわらず、ディフェンシンの溶液の点滴による、粉末形態でディフェンシンを適用することによる、又はエアロゾル化若しくは噴霧化された溶液若しくは懸濁液又は吸入される粉末若しくはゲルとしてのディフェンシンの吸入による気道の関連部分にディフェンシンを到達させることによるかにかかわらず、ディフェンシンが気管、気管支又は肺胞にそれぞれ適用されるような投与の全ての形態を含む。
【００９０】
気管支内／肺胞投与の方法は、洗浄液として、ディフェンシンが溶解している生理学的に許容される組成物を用いるか、又は実際に、賦形剤の有無にかかわらず、乾燥形態のディフェンシンを含有する吸入粉末の使用、又は気管支鏡検査中の溶液又は懸濁液又は粉末形態でのディフェンシンの直接適用を含む気管支内投与の任意の他の有効な形態による、当業者に周知の方法に従う気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を含むが、これに限定されない。気管内投与の方法は、溶解したディフェンシンの同様の溶液又はディフェンシン懸濁液、又は溶解したディフェンシンを含有する噴霧液滴の吸入又はこの目的に適する任意の噴霧装置の使用によって得られるディフェンシン懸濁液によるブラインド気管洗浄（ｂｌｉｎｄ  ｔｒａｃｈｅａｌ  ｗａｓｈｉｎｇ）を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
別の実施形態では、気管内、気管支内又は肺胞内投与は、生成物の吸入を含まないが、ディフェンシンの溶液又はディフェンシンを含有する粉末若しくはゲルを気管や下気道へ点滴又は適用することを含む。
【００９２】
他の好ましい投与方法は、以下のデバイスの使用を含んでよい：
１．圧縮空気／酸素混合物を使用する加圧ネブライザー
２．超音波ネブライザー
３．電子マイクロポンプネブライザー
４．定量吸入器（ＭＤＩ）
５．乾燥粉末吸入器システム（ＤＰＩ）。
【００９３】
エアロゾルは、ａ）フェイスマスクを介して、又はｂ）機械的換気中に挿管された患者の気管内チューブを介して送達されてよい（装置１、２及び３）。装置４及び５もまた、患者がエアロゾル装置を自己活性化できるという条件で、援助なしで患者が使用できる。
【００９４】
ディフェンシン及び／又はディフェンシンの機能的ホモログ若しくは変異体を含む溶液の好ましい濃度は、約０．１μｇ〜１０００μｇ／溶液ｍＬの範囲、例えば、約０．１μｇ〜２５０μｇ／溶液ｍＬの範囲である。
【００９５】
肺内投与用の医薬組成物
本開示で使用するための医薬組成物又は製剤は、医薬として許容される担体、好ましくは水性担体若しくは希釈剤と組み合わされた、好ましくはそれらに溶解されたディフェンシン、又はペグ化調製物として、又は吸入によるエアロゾルとして投与されるリポソーム若しくはナノ粒子調製物として、又は気管支肺胞洗浄液として若しくはブラインド気管内洗液又は洗浄液として気管支鏡を介して投与される洗浄液体として下気道に運ばれるディフェンシンを含む。０．９％生理食塩水、緩衝生理食塩水、及び生理学的に適合性のある緩衝液などを含むがこれらに限定されない様々な水性担体を使用してよい。組成物は、当業者によく知られている従来の技術によって滅菌されてよい。得られた水溶液は、使用のために包装されるか、又は無菌条件下で濾過され凍結乾燥されてよく、この凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水溶液に溶解される。
【００９６】
一実施形態では、凍結乾燥ディフェンシン調製物は、例えば、単回用量単位で事前包装されてよい。さらにより好ましい実施形態では、単回用量単位は患者に合わせて調整される。
【００９７】
組成物は、限定されないが、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのｐＨ調整剤及び緩衝剤及び／又は張度調整剤を含む、医薬として許容される補助物質又はアジュバントを含んでよい。
【００９８】
製剤は、ミクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、又はナノ粒子などを含む、医薬として許容される担体及び賦形剤を含んでよい。従来のリポソームは典型的には、リン脂質（中性又は負に帯電）及び／又はコレステロールで構成される。リポソームは、水性コンパートメントを取り囲む脂質２重層に基づく小胞構造である。それらは、サイズ、脂質組成、表面電荷並びにリン脂質２重層の数及び流動性などの生理化学的特性が異なり得る。リポソーム形成に最も頻繁に使用される脂質は、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（モノナトリウム塩）（ＤＭＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（モノナトリウム塩）（ＤＰＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（モノナトリウム塩）（ＤＯＰＡ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＧ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（ＤＰＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＳ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン）（ナトリウム塩）（ＤＰＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（グルタリル）（ナトリウム塩）及び１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピン（アンモニウム塩）である。他の脂質又はリポソームの改変因子と組み合わせたＤＰＰＣで構成される製剤は、例えば、コレステロール及び／又はホスファチジルコリンと組み合わせることが好ましい。
【００９９】
長期循環リポソームは、血管壁の透過性が増加する身体部位で血管外漏出する能力によって特徴付けられる。長期循環リポソームを生成する最も一般的な方法は、親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリポソームの外表面に共有結合させることである。好ましい脂質のいくつかは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（アンモニウム塩）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）である。
【０１００】
リポソームに適用できる脂質は、ＡＶａｎｔｉ，Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬによって供給され、リポソーム懸濁液は、貯蔵時のフリーラジカル及び脂質過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含んでよい。α−トコフェロールなどの親油性フリーラジカルクエンチャー及びフェリオキシアニンなどの水溶性鉄特異的キレート剤が好ましい。
【０１０１】
例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれるＳｚｏｋａら，Ａｎｎ．ＲｅＶ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号及び同第４，８３７，０２８号に記載されるような、リポソームを調製するための様々な方法が利用可能である。別の方法は、サイズが不均一な多層小胞を生成する。この方法では、小胞形成脂質を適切な有機溶媒又は溶媒系に溶解し、真空又は不活性ガス下で乾燥させて、薄い脂質膜を形成する。必要に応じて、フィルムを第３級ブタノールなどの適切な溶媒に再溶解し、次に凍結乾燥して、より容易に水和する粉末状の形態であるより均質な脂質混合物を形成させてもよい。このフィルムは、標的とされる薬物及び標的化成分の水溶液で覆われ、典型的には撹拌しながら１５〜６０分かけて水和される。得られる多層小胞のサイズ分布は、より激しい撹拌条件下で液体を水和させることにより、又はデオキシコール酸などの可溶化界面活性剤を添加することによってより小さいサイズにシフトさせることができる。
【０１０２】
ミセルは、水溶液中の界面活性剤（疎水性部分と１以上のイオン性基又はその他の強い親水性基を含有する分子）によって形成される。
【０１０３】
当業者に周知の一般的な界面活性剤を、本発明のミセルで使用できる。適切な界面活性剤は、ラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクタオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクトキシノール９及びＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７（Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を含む。好ましい界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ−８０、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、及びｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドなどのＩＶ注射に適合する非イオン性ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレン洗剤である。加えて、リポソームの生成での使用について記載されているものなどのリン脂質も、ミセル形成に使用されてよい。
【０１０４】
実施例
実施例１
１０日間の経口デキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの予防モデルにおける腹腔内マウス抗ＴＮＦ−αに対するｈＢＤ２の皮下投与と静脈内投与の抗炎症効果
治療の投薬計画：
図１は、研究計画を示す。
１ケージあたり５匹のグループで飼育された７０匹の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、７つの異なる治療グループに割り当てた。全ての動物にＤＳＳ  ２％を補充した飲料水を７日間与えて大腸炎を誘発し結腸組織に顕著な炎症と損傷をもたらした。これらの動物にｈＢＤ２を尾静脈に静脈内投与するか又は背側皮膚に皮下投与し、マウス抗ＴＮＦ−α又はビヒクルとしてＰＢＳを１０日間腹腔内投与した。
【０１０５】
試験：
疾患活動指数（ＤＡＩ）スコアリングシステムを臨床評価に適用した（図７）。１０日目に動物を屠殺し、結腸を、組織学的スコアリングシステムを使用する組織学的評価のために摘出した（図８）。
【０１０６】
結果：
最も重要な効果は、ｈＢＤ２が１日１回又は２回のいずれかで皮下経路により投与されたときに得られたが、ｈＢＤ２の静脈内投与もＤＡＩの大幅な減少をもたらした。抗ＴＮＦαとｈＢＤ２の両方が、ＤＡＩに対して同様の統計的に有意な効果を示した。ｈＢＤ２は、特に１日２回皮下投与した場合、組織学的スコアに対し非常に統計的に有意な効果を与えたが、抗ＴＮＦ−αはこのスコアに対し有意な影響を示さなかった（図９）。
【０１０７】
急性ＧＶＨＤは、陰窩細胞壊死によって特徴付けられ、重症例では腸全体の上皮の完全な喪失によって特徴付けられる。上皮の喪失を引き起こす、化学的に誘発されたマウスＤＳＳモデルは従って、ＧＶＨＤにおける化合物の予防効果を試験するのに適切であると思われる。実施例１の結果は、特にｈＢＤ２の皮下投与が抗ＴＮＦ−α治療と同じくらい効果的であることを実証している。いくつかの出版物は、ＧＶＨＤにおける抗ＴＮＦ−αの正の効果を報告している。
【０１０８】
実施例２
１０日間の経口デキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの予防モデルにおける経口プレドニゾロンに対するｈＢＤ２の経口投与の抗炎症効果
治療の投与計画：
ケージあたり５匹のグループで飼育された５０匹の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、５つの異なる治療グループに割り当てた。全ての動物にＤＳＳ  ２％を補充した飲料水を７日間与えて大腸炎を誘発し結腸組織に顕著な炎症と損傷をもたらした。これらの動物に、３つの異なる用量レベルでｈＢＤ２を１日２回経口投与するか、又はプレドニゾロンを１ｍｇ／ｋｇで１日２回投与するか、又はビヒクルとしてＰＢＳを１０日間投与した。
【０１０９】
試験：
疾患活動指数（ＤＡＩ）スコアリングシステムを臨床評価に適用した（図７）。１０日目に動物を屠殺し、結腸を、組織学的スコアリングシステムを使用する組織学的評価のために摘出した（図８）。
【０１１０】
結果：
これらの動物がより多く摂食し、より良い健康状態を経験したことを示す体重減少の大幅な低下が、３つのｈＢＤ２用量レベル全てで見られたが、５ｍｇ／ｋｇで１日２回投与した高用量グループで最も顕著であった（図１０）。ｈＢＤ２の２つの低用量レベルは、プレドニゾロンと同等にＤＡＩに対し統計的に有意な影響を及ぼしたが、高用量ｈＢＤ２（５ｍｇ／ｋｇの１日２回）は、これらよりもＤＡＩに対し有意に優れた影響を及ぼした（図１１）。プレドニゾロンとｈＢＤ２の両方が組織学的スコアに対し統計的に有意な効果を示したが、全３つのｈＢＤ２用量グループの効果はプレドニゾロンよりも有意に優れていた（図１２）。
【０１１１】
急性ＧＶＨＤは陰窩細胞壊死によって特徴付けられ、重症例では腸全体の上皮の完全な喪失によって特徴付けられる。上皮の喪失を引き起こす、化学的に誘発されたマウスＤＳＳモデルは従って、ＧＶＨＤにおける化合物の予防効果を試験するのに適切であると思われる。実施例２の結果は、経口ｈＢＤ２投与が経口プレドニゾロンによる標準的なＧＶＨＤ予防的処置と同じくらい効果的であることを実証する。
【０１１２】
実施例３
８日間のトリニトロベンゼンスルホン酸誘発性大腸炎マウスの予防モデルにおけるプレドニゾロンの皮下投与に対するｈＢＤ２の皮下投与の抗炎症効果
治療の投与計画：
ケージあたり５匹のグループで飼育された１０５匹の雄のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスを、７つの異なる治療グループに割り当てた。軽い麻酔下で０日目にトリニトロベンゼンスルホン酸の結腸内投与によって大腸炎を誘発し、結腸組織の顕著な炎症と損傷をもたらした。これらの動物に、１日１回の４つの異なる投与レベル（１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０３ｍｇ／ｋｇ）のｈＢＤ２又は１日１回のプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ又はビヒクルとしてのＰＢＳを背側皮膚下に７日間皮下投与した。
【０１１３】
試験：
疾患活動指数（ＤＡＩ）スコアリングシステムを臨床評価に適用した（図７）。１０日目に動物を屠殺し、結腸を、組織学的スコアリングシステムを使用する組織学的評価のために摘出した（図８）。
【０１１４】
結果：
これらの動物がより多く摂食し、より良好な健康状態を経験したことを示す、非常に統計的に有意な体重の増加が、２つの最低（０．０３及び０．１ｍｇ／ｋｇ  １日１回）ｈＢＤ２用量レベルについて観察された。プレドニゾロンとｈＢＤ２（０．１、０．３及び１ｍｇ／ｋｇ）の両方が、組織学的スコアに対し非常に統計的に有意な臨床効果を示した（図１３）。
【０１１５】
急性ＧＶＨＤは、陰窩細胞壊死によって特徴付けられ、重症例では腸全体の上皮の完全な喪失によって特徴付けられる。上皮の深刻な喪失を引き起こす、化学的に誘発されたマウスＴＮＢＳモデルは従って、ＧＶＨＤにおける化合物の予防効果を試験するのに適切であると思われる。実施例３からの結果は、ｈＢＤ２の皮下投与がプレドニゾロンによる標準的な予防的処置と同じくらい効果的であることを実証する。
【０１１６】
実施例４
７日間のデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの予防モデルにおける経口シクロスポリンに対するｈＢＤ２の経口投与と皮下投与の抗炎症効果
治療の投与計画：
ケージあたり５匹のグループで飼育された８０匹の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、７つの異なる治療グループに割り当てた。全ての動物に、ＤＳＳ  ３％を補充した飲料水を７日間与えて、上皮の損傷、陰窩構造の破壊によって特徴付けられる大腸炎、並びに粘膜と粘膜下組織における単核及び好中球の蓄積によって特徴付けられる中程度の炎症を誘発した。これらの動物に、０．６ｍｇ／ｋｇで１日２回又は０．４ｍｇ／ｋｇで１日３回の用量でｈＢＤ２を経口投与し；０．１５ｍｇ／ｋｇで１日２回又は０．１ｍｇ／ｋｇで１日３回の用量でｈＢＤ２を皮下投与するか、又は５０ｍｇ／ｋｇで１日１回のシクロスポリン又は水を７日間与えた。
【０１１７】
試験：
スコアリングシステム（０＝便に血液がない、１＝便に血液が存在する証拠及び２＝重度の出血）に従って臨床評価を実施した。７日目に動物を屠殺し、結腸を組織学的評価のために摘出した。
【０１１８】
結果：
結腸の長さの維持（図１４）と臨床スコア（図１５）における非常に統計的に有意な改善が、４つのｈＢＤ２投与グループ全てとシクロスポリンについて観察された。ｈＢＤ２の１日３回投与は、両方の投与経路での１日２回投与よりも効果的であり、皮下投与は経口投与よりも効果的であるように思われた（図１５）。
【０１１９】
急性ＧＶＨＤは、陰窩細胞壊死によって特徴付けられ、重症例では腸全体の上皮の完全な喪失によって特徴付けられる。上皮の深刻な喪失を引き起こす、化学的に誘発されたマウスＤＳＳモデルは従って、ＧＶＨＤにおける化合物の予防効果を試験するのに適切であると思われる。実施例４からの結果は、ｈＢＤ２の皮下投与と経口投与の両方が、特に臨床評価においてシクロスポリンを用いた標準的なＧＶＤＨの予防的処置と同じくらい有効であることを実証する。
【０１２０】
実施例５
１４日間のデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎マウスの治療モデルにおける腹腔内投与の抗ＴＮＦ−αと腹腔内投与のデキサメタゾンに対するｈＢＤ２の皮下投与の抗炎症効果
治療の投与計画：
１ケージあたり５匹のグループで飼育された７０匹の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、７つの異なる治療グループに割り当てた。全ての動物に、ＤＳＳ  ２％を補充した飲料水を１４日間与えて、大腸炎を誘発し、結腸組織の顕著な炎症と損傷をもたらした。これらの動物に、ｈＢＤ２を０．１ｍｇ／ｋｇで１日２回皮下投与し；８日目〜１４日目まで０．１ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下投与するか、又は１．２ｍｇ／ｋｇで１日１回静脈内投与するか、又は８、１０及び１３日目にマウス抗ＴＮＦαを２５０μｇ／マウスで腹腔内投与するか、又はデキサメタゾン１ｍｇ／ｋｇで１日１回腹腔内投与するか、又はビヒクルとしてＰＢＳを皮下投与した。
【０１２１】
試験：
疾患活動指数（ＤＡＩ）スコアリングシステムを臨床評価に適用した（図７）。１４日目に動物を屠殺し、結腸を、組織学的スコアリングシステムを使用する組織学的評価のために摘出した（図８）。
【０１２２】
結果：
ＤＡＩに対する統計的に有意な効果が、ｈＢＤ２の０．１ｍｇで１日１回皮下投与及びデキサメタゾンの１ｍｇ／ｋｇで１日１回腹腔内投与について観察された。同様に、組織学的スコアに対する統計的に有意な効果（図１６）が、ｈＢＤ２の０．１ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下投与とデキサメタゾンの両方で観察された。
【０１２３】
急性ＧＶＨＤは、陰窩細胞壊死によって特徴付けられ、重症例では腸全体の上皮の完全な喪失によって特徴付けられる。上皮の深刻な喪失を引き起こす、化学的に誘発されたマウスＤＳＳモデルは従って、ＧＶＨＤにおける化合物の治療効果を試験するのに適切であると思われる。実施例５からの結果は、ｈＢＤ２の皮下投与がデキサメタゾンによるＧＶＨＤの標準治療と同じくらい効果的であることを実証する。
【０１２４】
実施例６
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞移植誘発性大腸炎マウスモデルの１４週間の治療での抗ＴＮＦ−α（エンブレル）の皮下投与及びデキサメタゾンの腹腔内投与に対するｈＢＤ２の皮下投与の有効性
治療の投与計画：
１ケージあたり５匹のグループで飼育された７０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、７つの異なる治療グループに割り当てた。ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の移植によってＳＣＩＤマウスで大腸炎を誘発した。脾臓から単離したリンパ球及びＢＡＬＢ／ｃマウスからのリンパ節を、ＣＤ４＋Ｔ細胞のネガティブ選択に供した。その後、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞懸濁液からビーズへの結合によりポジティブに単離し、ＣＤ４＋ＣＤ２５−を上清から収集した。動物に、７日目から８６日連続でｈＢＤ２を０．１ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下投与するか、１ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下投与するか、又は３ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下投与するか、又はマウス抗ＴＮＦαを１００μｇ／マウスで週２回皮下投与するか、又はデキサメタゾンを０．３ｍｇ／ｋｇで１日１回腹腔内投与するか、又はビヒクルとしてＰＢＳを皮下投与した。
【０１２５】
試験：
臨床評価は、体重減少、便の硬さ及び直腸周囲の血液の存在に基づいた。９５日目に動物を屠殺し、結腸を、体重及びミエロペルオキシダーゼ活性を評価するために摘出した。
【０１２６】
結果：
臨床スコアに対する統計的に有意で類似した効果が、ｈＢＤ２の１ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下投与、デキサメタゾンの０．３ｍｇ／ｋｇで１日１回腹腔内投与及びエンブレルについて観察された（図１７）。同様に、これらの３つの投与計画は、結腸重量（図１８）とミエロペルオキシダーゼ活性（図１９）に対して統計的に有意で類似した効果を示した。
【０１２７】
急性ＧＶＨＤは、陰窩細胞壊死によって特徴付けられ、重症の場合には、腸全体の上皮の完全な喪失によって特徴付けられるＴ細胞性症候群（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）であると考えられており、特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ  ｒｅｇ細胞は、急性ＧＶＨＤの病因の一部として多くの注目を集めている（Ｂａｌｌ＆Ｅｇｅｌｅｒ、２００８）。上皮の重篤な喪失を引き起こす、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞移植マウスモデルは従って、重篤で持続的なＧＶＨＤにおける化合物の治療効果を試験するのに適切であると思われる。
【０１２８】
ミエロペルオキシダーゼは、炎症の開始と進行に重要な役割を果たすヒトの酵素であり、酸化ストレスと炎症のバイオマーカーであり、最近、ＧＶＨＤの潜在的なバイオマーカーとして報告されている（Ｇｅ及びＹｅ、２０１３）。実施例６からの結果は、ｈＢＤ２投与がデキサメタゾンによるＧＶＨＤの標準的な抗炎症治療と同じくらい効果的であるが、抗ＴＮＦ−αでの治療ほど確立されていないことも実証する。
【０１２９】
実施例７
ディフェンシンによる予防的処置による腸内細菌叢の保護と維持
マウス：マウスをグループごとに３匹ずつ、４つのケージで飼育した。餌の摂取量を、午後６時に照明が消される直前に毎日記録した。個々のマウスを、グループとケージの両方の順序を変更して実験手順に供した。マウスを、ＳＰＦ標準条件で１２時間の明／暗サイクル下で、室温で維持した。
【０１３０】
食事療法：投薬のために、平均体重をマウスあたり２５グラムと推定した。マウスは、マウスあたり１日約３グラムの飼料を食べる。
【０１３１】
治療の投与計画：マウスに、高脂肪食（ＨＦＤ）又は低脂肪（ＬＦ）対照食のいずれかを与えた。ＨＦＤは４つのサブグループ；１つのｈＢＤ２、１つのＨＤ５、１つのｈＢＤ２／ＨＤ５及び１つの標準ＨＦＤ（ディフェンシンの補充なし）を含んだ（図３）。ディフェンシン濃度は、１日あたりマウス１ｋｇあたり１．２ｍｇのｈＢＤ２であった。ＨＤ５を、ｈＢＤ２と等モル濃度で与えた。組み合わせグループには、５０％ｈＢＤ２＋５０％ＨＤ５を与えたため、ディフェンシンの総量は残りの試験グループと同等であった。
【０１３２】
試験：
微生物分析を行って腸の微生物叢を研究した。長期的な１６Ｓ特性評価を、６０匹のマウスからの４つのペアの試料、合計で２４０の試料に対して行った。各マウスを、食事変更の前、食事変更の１週間後、食事変更の４週間後及び終了時にサンプリングし、従ってディフェンシン治療の結果としての糞便微生物叢の完全な特性評価を保証した。
【０１３３】
結果
体重変化
食物摂取量は３つの実験の食事グループ全てで同様であったが、両方の高脂肪食（ＨＦＤ）グループは、１０週間の研究期間にわたって低脂肪食（ＬＦＤ）参照グループよりも有意に多く体重が増加した（＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキー事後検定）。しかしながら、ＨＦＤプラスｈＢＤ２グループは、ＨＦＤ参照グループよりも有意に少なく体重が増加した（＊ｐ＝０．００２８）。
【０１３４】
微生物叢
ｈＢＤ２は、主に微生物の存在に影響を与えたが、ＨＤ５及びｈＢＤ２＋ＨＤ５は主に微生物の存在量に影響を与えた（図２０）。アロバキュラム（Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ）の存在量の統計的に有意な増加が、ＨＤ５による予防後に小腸で観察された（ｐ＜０．０２；図２１）。アロバキュラムは、短鎖脂肪酸生成種である。短鎖脂肪酸は、ＧＰＣＲ４３を介する結腸Ｔｒｅｇ細胞の恒常性の調節に重要な役割を果たす。Ｔ細胞の低形成とＴ細胞の恒常性の混乱は、急性ＧＶＨＤと慢性ＧＶＨＤの両方の中心的な部分である。図２２は、異なる治療グループの種の相対的な存在量を示しｈＢＤ２とＨＤ５の腸内細菌叢に対する効果を示す、属分析である。結腸におけるバルネシエラの存在量の統計的に有意な増加が、ｈＢＤ２による予防的処置後に観察された（ｐ＜０．０３；図２４）。バルネシエラは、入院患者で観察され得る抗生物質耐性病原菌の腸内優勢を排除し、防ぐことができる細菌である。バルネシエラの存在量は、いくつかの免疫調節細胞の量に対応している。結腸でのバルネシエラのレベルが高いほど、脾臓と肝臓でより多くの辺縁帯Ｂ細胞とインバリアントナチュラルキラーＴ細胞が数えられた。ＩＬ−１０−／−マウスでの大腸炎の発症において、バルネシエラファイロタイプのより高いレベルは、疾患のより低い活動レベルと相関した。乳酸桿菌の存在量が減少する傾向が、ｈＢＤ２による予防的処置後に結腸で観察された（ｐ＝０．１；図２３）。マウスのＨＦＤグループは広範囲の脂肪症（肝内脂肪蓄積）を発症したが、ｈＢＤ−２で予防的に治療したＨＦＤグループのマウスは、最小限の脂肪症を発症した（図６０）。
【０１３５】
微生物叢は、特に幹細胞移植直後に行われる劇的な細菌除染後のＧＶＨＤの発症において重要な役割を果たすようである。特に、微生物叢は、特に幹細胞移植の直前に行われる劇的な細菌除染後のＧＶＨＤの発症において重要な役割を果たすようである。この実施例７は、ディフェンシンが、存在する種の数及び細菌の総数に関して微生物叢の構成に大きな影響を及ぼし、従って健康な微生物叢を保護及び維持するようであることを実証する。より具体的にディフェンシンは、結腸のＴｒｅｇ細胞の恒常性において重要な役割を果たす短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を生成する細菌を促進するようである。加えて、ディフェンシンは、肝臓の炎症及び脂肪症を防ぐようである。
【０１３６】
実施例８．ディフェンシンによる介入治療による腸内菌共生バランス失調の治療
マウスと食事療法
この実験は、食餌誘発性肥満マウスの微生物叢に対するｈＢＤ２とＨＤ５の効果を明らかにする。介入の前に、１３週間の慣らし期間として、マウスに非常に高いＨＦＤ（脂肪からのエネルギーが６０％）を与えた。慣らし期間中に最低１２グラムの体重増加（初期体重の約５０％）の基準を満たすマウスのみを最終分析に含めた。これらの基準を満たさなかったマウスは、階層「保持者」としてそれぞれのケージにとどめた。それらを、全ての実験的試験に供したが、分析から除外した。
【０１３７】
治療の投与計画
介入前に、全てのマウスをＭＲスキャンした。マウスのケージを、脂肪量に基づいて実験グループに割り当てた。その後の全ての測定は、介入前の同じマウスからのデータとペアにした。ＬＦＤ（低脂肪食）の参照グループの実験を並行して行った。介入の対照として、２つの追加グループを含めた：１つの非常に高いＨＦＤと１つのＬＦＤ。実験マウスを、介入の間非常に高いＨＦＤにとどめた（図３）。マウスは、１０週間、実験食であった。それらを、実験を通して、ケージあたり４匹のマウス、グループあたり３つのケージで共飼育した。全ての試験を３日間にわたり、１日１グループあたり１ケージで行った。
【０１３８】
試験
微生物分析を行って腸の微生物叢を研究した。長期的な１６Ｓ特性評価を、６０匹のマウスからの４つのペアの試料、合計で２４０の試料に対して行った。各マウスを、食事変更の前、食事変更の１週間後、食事変更の４週間後及び終了時にサンプリングし、従ってディフェンシン治療の結果としての糞便微生物叢の完全な特性評価を保証した。
【０１３９】
結果
体重変化−ｈＢＤ２
標準の高脂肪食（ＨＦＤ）を摂取したグループは、全研究期間を通じて等しい食物摂取量を有し、最初の１３週間は脂肪と除脂肪量が等しく同じ体重増加を示したため、食事介入前の開始点は同じであった。体重増加は、低脂肪食（ＬＦＤ）を摂取したグループよりも有意に大きかった（＊ｐ＜０．０５、二元配置分散分析）。食事療法の介入後に、ＨＦＤグループの体重は増加し続けたが、ＨＦＤプラスｈＢＤ２グループは食事介入後の最初の４週間により少なく体重が増加する傾向があったが、有意ではなかった（＊ｐ＝０．０７、二元配置分散分析）。４週目〜研究期間の終わりにＨＦＤプラスｈＢＤ２グループは、標準のＨＦＤグループと同様の体重を獲得した（＊ｐ＝０．８２、二元配置分散分析）。
【０１４０】
体重の変化−ＨＤ５
全てのＨＦＤ摂取グループは、研究期間中は同じ食物摂取量であり、１３週間の慣らし期間中の体重増加は等しかった。食事介入後にＨＦＤプラスＨＤ５を摂取したグループは、ＨＦＤ対照よりも有意に少なく体重が増加した（＊ｐ＜０．０５、二元配置分散分析）。加えて、ＨＦＤプラスＨＤ５グループで脂肪率が減少する傾向が観察され、ＨＦＤプラスＨＤ５においてＨＦＤ対照と比較して有意に低い脂肪率が、食事の変更後４週目に測定された（＊ｐ＝０．００９、二元配置分散分析）。
【０１４１】
微生物叢
両方のディフェンシンは、細菌の存在と細菌の不在に大きな影響を与えることが示された（図２５）。ＨＤ５は、結腸においてアロプレボテラの存在量を統計的に有意に増加させたが（ｐ＜０．０２）（図２６）、ｈＢＤ２はアロプレボテラの存在量に影響を与えなかった。ｈＢＤ２は、小腸と結腸の両方でビフィズス菌の相対的存在量を劇的かつ統計的に有意に増加させた（それぞれｐ＜０．０００１及びｐ＜０．０４；図２７）。ＨＤ５が小腸でビフィズス菌の存在量を増やす傾向があった（図２７）。微生物叢は、特に幹細胞移植直後に行われる劇的な細菌除染後のＧＶＨＤにおいて重要な役割を果たすようである。糞便移植による実験的治療は現在、世界中のいくつかのセンターで進行中であり、例えば、ドイツのレーゲンスブルクのホラー教授は、細菌の除染後に通常の微生物叢を再設置しようとしている。この実施例８は、ディフェンシンが、存在する種の数と細菌の総数の点で微生物叢の構成に対し大きな影響を及ぼし、従って腸内菌共生バランス失調の状態を整え、例えば、結腸Ｔ  ｒｅｇ細胞の恒常性を維持するのに重要である、正常微生物叢を再設置できるようであることを実証する。
【０１４２】
実施例９
イエダニによって促進されるアレルギー性喘息のマウスモデルにおける経口ディフェンシンに対する鼻腔内（ＩＮ）ディフェンシンによる予防的処置の有効性を決定及び評価すること
材料及び方法
治療の投与計画：７〜１０週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、研究開始の１日前に５つの研究グループに無作為に割り当て、イエダニ（２００μＬの生理食塩水中１００μｇのＨＤＭプラス０．９％生理食塩水中のフロイント完全アジュバント）を皮下（ＳＣ）に感作させた。マウスを、ｈＢＤ２の経口投与及び鼻腔内投与をそれぞれ１．２ｍｇ／ｋｇ／日（０．４ｍｇ／ｋｇ  １日３回）の用量で１２日目の午前に開始し、約６時間間隔で１日３回を継続した。最後の用量を、１４日目に、負荷の１時間前に投与した。総投与数は８回又は合計２ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２であった。次に、マウスを、１４日目にＨＤＭで鼻腔内（ＩＮ）負荷した（５０μＬの生理食塩水中２５μｇのＨＤＭ）（図４）。
【０１４３】
試験：
気道炎症：負荷の４８時間後に、気管支肺胞洗浄を、冷ＰＢＳの３つの容量（０．４；０．３及び０．３ｍＬ、合計１ｍＬ）で肺を洗浄して行った。白血球数の合計と差を、自動血液分析装置Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＴ−２０００ｉＶで決定した。
【０１４４】
肺機能：ＨＤＭ負荷後４８時間から始めて、肺抵抗及び肺コンプライアンスの測定をメタコリン（３．１２５  ＭＣＨ１；６．２５  ＭＣＨ２；１２．５  ＭＣＨ３及び２５ｍｇ／ｍＬのＭＣＨ４）負荷後に、マウスを麻酔し、ＤＳＩのＢｕｘｃｏ  Ｆｉｎｅｐｏｉｎｔ  ＲＣ  ｓｙｓｔｅｍを用いてカニューレを挿入することによって行った。データを、１０ｍｇ／ｋｇのメタコリンでの気道抵抗及び用量反応曲線として表す。
【０１４５】
サイトカイン分析のための肺のサンプリング：全てのＢＡＬの完了後に、肺を胸部から摘出し、液体窒素で瞬間凍結し、肺ホモジネート中のＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３及びＩＬ−３３のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにより分析するまで摂氏−８０度で凍結保存した。
【０１４６】
結果
生理食塩水負荷（非喘息）マウスと比較して、ＨＤＭ負荷ビヒクル処置動物において、肺抵抗値の増加及び肺コンプライアンスの値の減少が観察された。両方のビヒクル処置（経口及び鼻腔内）マウスグループで炎症反応を、ＨＤＭによる感作の１４日後に単回ＨＤＭ負荷によって誘発した。それは、生理食塩水負荷対照と比較した場合、ＢＡＬＦ中の総細胞数、好酸球、好中球、マクロファージ及びリンパ球数の統計的に有意な増加によって特徴付けられた（ｐ＜０．０５）。また、肺組織ホモジネート中の７種のサイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３及びＩＬ−３３の濃度の分析は、生理食塩水負荷対照と比較してＨＤＭ負荷動物での有意により高いレベルを明らかにした。
【０１４７】
ｈＢＤ２は、１２日目〜１４日目に投与される１日３回の経口と鼻腔内の両方の投与後に（８投与で合計２．０ｍｇ／ｋｇ）、ＨＤＭ負荷ビヒクル処置動物と比較して気道抵抗の増加（図２８）及び肺コンプライアンスの減少（図２９）を効果的に抑制した。ＢＡＬＦでの細胞流入に対する効果が経口投与後に観察され、それは好中球数を有意に阻害した（図３０）。肺組織ホモジネート中のサイトカイン濃度の完全な正常化を伴う免疫系のバランスの再調整が、経口投与後にＴＮＦ−α（図３１ａ）、ＩＬ−４（３１ｂ）、Ｌ−５（３１ｃ）、ＩＬ−６（３１ｄ）、ＩＬ−９（３１ｅ）及びＩＬ−１３（３１ｆ）サイトカインレベルで観察された。ｈＢＤ２の鼻腔内投与後に、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９及びＩＬ−１３が低下する傾向があったが、これは対照と統計的に有意差はなかった。得られた全ての結果は、イエダニによって促進されるアレルギー性喘息のマウスモデルにおけるｈＢＤ２の明確な予防効果と抗炎症効果を示す。
【０１４８】
肺は、腸、肝臓及び皮膚に続いて、ＧＶＨＤに関与する４番目の臓器である。この実施例は、ディフェンシンが無傷の免疫系を維持できるだけでなく、急性ＧＶＨＤの特徴である、全ての重要なＧＶＨＤサイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９及びＩＬ−１３のサイトカインストームの発生を決定的に防止できることを実証する。炎症性サイトカインの放出又はサイトカインストームは、急性ＧＶＨＤの発生と重症度の主要なメディエーターとして関与している（Ｂａｌｌ＆Ｅｇｅｌｅｒ、２００８）。
【０１４９】
実施例１０
イエダニによるアレルギー性喘息のマウスモデルにおけるディフェンシンによる経口に対するＩＮの治療的介入の有効性を決定及び評価すること
材料及び方法
治療の投与計画：７〜１０週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、研究開始の１日前に７つの研究グループに無作為に割り当て、イエダニ（２００μＬの生理食塩水中１００μｇのＨＤＭプラス０．９％の生理食塩水中フロイント完全アジュバント）を皮下（ＳＣ）に感作させた。次いで、１４日目に、マウスを、ＨＤＭで鼻腔内（ＩＮ）負荷した（５０μＬの生理食塩水中２５μｇのＨＤＭ）。デキサメタゾンを、１４日目に経口投与した（１ｍｇ／ｋｇで１日２回；５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））。ｈＢＤ２を、１４日目にＩＮ又は経口投与した（１．７ｍｇ／ｋｇで１日３回のＩＮ；０．４ｍｇ／ｋｇで１日３回のＩＮ；０．４ｍｇ／ｋｇで１日３回の経口投与、５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水）。最初の用量を、負荷の６０分前に投与し、その後の用量を約６時間間隔で投与した（図５）。
【０１５０】
試験：
気道炎症：負荷後４８時間に、気管支肺胞洗浄を、冷ＰＢＳの３つの容量（０．４；０．３及び０．３ｍＬ、合計１ｍＬ）で肺を洗浄して行った。白血球数の合計と差を、自動血液分析装置Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＴ−２０００ｉＶで決定した。
【０１５１】
肺機能：ＨＤＭ負荷後４８時間から始めて、肺抵抗及び肺コンプライアンスの測定をメタコリン（３．１２５  ＭＣＨ１；６．２５  ＭＣＨ２；１２．５  ＭＣＨ３及び２５ｍｇ／ｍＬのＭＣＨ４）負荷後に、マウスを麻酔し、ＤＳＩのＢｕｘｃｏ  Ｆｉｎｅｐｏｉｎｔ  ＲＣ  ｓｙｓｔｅｍを用いてカニューレを挿入することによって行った。データを、１０ｍｇ／ｋｇのメタコリンでの気道抵抗及び用量反応曲線として表す。サイトカイン分析のための肺のサンプリング：全てのＢＡＬの完了後に、肺を胸部から摘出し、液体窒素で瞬間凍結し、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＦＮγのサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにより分析するまで摂氏−８０度で凍結保存した。
【０１５２】
結果
生理食塩水負荷（非喘息）マウスと比較して、ＨＤＭ負荷ビヒクル処置動物において、肺抵抗値の増加及び肺コンプライアンスの値の減少が観察された。両方のビヒクル処置（経口及び鼻腔内）マウスグループで炎症反応を、ＨＤＭ及びアジュバントによる感作の１４日後に単回ＨＤＭ負荷によって誘発した。それは、生理食塩水負荷対照と比較した場合、ＢＡＬＦ中の総細胞数、好酸球、好中球、マクロファージ及びリンパ球数の統計的に有意な増加によって特徴付けられた（ｐ＜０．０５）。また、肺組織ホモジネート中の５種のサイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの濃度の分析は、生理食塩水負荷対照と比較してＨＤＭ負荷動物での有意により高いレベルを明らかにした。
【０１５３】
デキサメタゾン治療は、ＢＡＬＦでの総細胞数と好酸球数を有意に抑制したが、好中球、マクロファージ及びリンパ球数は抑制しなかった。細胞データと一致して、デキサメタゾンは、ＨＤＭ／ビヒクル対照と比較して、肺組織ホモジネート中のＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γのレベルに影響を与えなかった。しかしながら、それは好酸球数に関連するＡＨＲ測定値に影響を与えた。得られた結果は、このモデルがある程度ステロイド耐性であることを示す。
【０１５４】
ｈＢＤ２は、１日３回の経口と鼻腔内の両方の投与後に、ＨＤＭ負荷したビヒクル処置動物と比較して、１４日目に気道抵抗の増加（図３２ａ及び３２ｂ）及び肺コンプライアンスの減少（図３３ａ及び３３ｂ）を効果的に抑制した。より顕著な効果がＢＡＬＦ中の細胞流入などの鼻腔内投与後のいくつかの測定パラメーターに対して観察され、両方のＩＮ用量（０．４ｍｇ／ｋｇ／日で１日３回及び１．７ｍｇ／ｋｇ／日で１日３回）が好中球及びマクロファージ細胞の総数（図３４ａ、ｂ及びｃ）並びに好酸球の低下傾向を有意に抑制した一方で、ステロイド標準デキサメタゾンはそれらを抑制できなかった。同様に有意な効果が、両方の投与経路で肺組織ホモジネート中のＩＦＮ−γ（図３５）、ＩＬ−４（図３７）、ＩＬ−５（図３８）、ＩＬ−６（図３９）、ＩＬ−９（図４０）、及びＩＬ−１０（図４１）サイトカインレベルに対して観察された。経口投与されたｈＢＤ２はＴＮＦ−αを有意に低下させ（図３６）、一方で鼻腔内投与されたｈＢＤ２は対照と異なったが有意ではなかった。得られた全ての結果は、イエダニ／フロイント完全アジュバントに促進されるアレルギー性喘息のマウスモデルにおけるｈＢＤ２の明確な抗炎症効果を示す。肺は、腸、肝臓及び皮膚に続いてＧＶＨＤに関与する４番目の臓器である。この実施例１０は、ディフェンシンが、免疫系のバランスを再調整するだけでなく、急性ＧＶＨＤの特徴である主要なＧＶＨＤサイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６のサイトカインストームを決定的に治療又は予防できることを示す。実際に、炎症性サイトカインの放出又はサイトカインストームは、急性ＧＶＨＤの発生と重症度の主要なメディエーターとして関与している（Ｂａｌｌ＆Ｅｇｅｌｅｒ、２００８）。
【０１５５】
実施例１１
イエダニによるアレルギー性喘息のマウスモデルにおけるディフェンシン投与による経口に対するＩＮの治療的介入の有効性を決定及び評価すること
材料及び方法
治療の投与計画：７〜１０週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、研究開始の１日前に４つの研究グループに無作為に割り当て、イエダニ（２００μＬの生理食塩水中１００μｇのＨＤＭプラス０．９％生理食塩水中のフロイント完全アジュバント）を皮下（ＳＣ）に感作させた。マウスを、１４日目にＨＤＭで鼻腔内（ＩＮ）負荷した（５０μＬの生理食塩水中の２５μｇのＨＤＭ）。ｈＢＤ２を、１４日目にＩＮ投与又は経口投与した（０．４ｍｇ／ｋｇで１日３回のＩＮ；０．４ｍｇ／ｋｇで１日３回の経口、５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水）。最初の用量を、負荷の６０分前に投与し、その後の用量は約６時間間隔で投与した。
【０１５６】
試験：
肺組織のサンプリング：肺を胸部から摘出し、液体窒素で急速冷凍し、肺ホモジネート中のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８（ＫＣ）、ＩＬ−９及びＩＬ−１３のサイトカイン濃度のＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃で冷凍保存した。肺を１０％緩衝化ホルマリンでその場で膨らませ、胸部から摘出し、１０％緩衝化ホルマリンに個別に入れ、全体としてパラフィン包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ／ＰＡＳ染色した。
【０１５７】
採血：全ての末期血液試料を、頸静脈出血を介して採取した。血液をＬｉ−ヘパリンチューブに採取し、氷上に置き、すぐに４℃で遠心分離した。血漿を分離し、将来のＳＣＦＡ分析まで−８０℃で保存した。
【０１５８】
肺組織のサンプリング：肺を露出させ、胸部を静かに開き、胸骨と肋骨のいずれかの側を切り取り、トリミングすることによって切除した。グループごとに最初の６匹の動物からの肺を胸部から摘出し、液体窒素で急速冷凍し、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン濃度の分析まで、−８０℃で冷凍保存した。
【０１５９】
グループごとに他の８匹の動物からの肺を１０％緩衝化ホルマリンでその場で膨らませ、胸部から摘出し、１０％緩衝化ホルマリンに個別に入れ、全体としてパラフィン包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ／ＰＡＳ染色した。パラフィンブロックを、ＩＨＣ分析のために保持した。
【０１６０】
読み出し
・組織病理診断（Ｈ＆Ｅ；ＰＡＳ）（Ｎ＝８／グループ；合計Ｎ＝３２）
・肺組織ホモジネート中のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８（ＫＣ）、ＩＬ−９及びＩＬ−１３）（Ｎ＝６／グループ、合計Ｎ＝２４）
組織病理診断
細胞流入（単核、好酸球、好中球）を、以下のように、気管支／細気管支の周囲及び血管周囲の空間について、Ｈ＆Ｅ染色スライドで別々に半定量的に評価した：
０  なし
１  少数の点在する炎症性細胞
２  大きな凝集体
３  細胞の顕著な蓄積
炎症の全体的なスコアを、全ての個々のスコアの合計として計算した。
【０１６１】
杯細胞異形成を、大気道と遠位気道のレベルで別々に、以下のようにＰＡＳ染色スライドで評価した：
０  基底膜に沿った粘液含有細胞なし
１  ７５％未満の細胞質が染色された基底膜に沿った少数の陽性細胞
２  ７５％超の細胞質が染色された基底膜に沿った少数の陽性細胞
３  ７５％未満の細胞質が染色された基底膜に沿った多数の陽性細胞
４  ７５％超の細胞質が染色された基底膜に沿った多数の陽性細胞
【０１６２】
統計的評価
データをＭＳ  Ｅｘｃｅｌを使用して処理した。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０４）を用いて行った。グループ間の差は、ｐ＜０．０５のときに統計的に有意であると見なされる。
【０１６３】
選択した組織学的スコア値データの統計分析を、中央値及びノンパラメトリックのマンホイットニー検定を用いて行った。
【０１６４】
結果
両方のビヒクル処置マウスグループ（経口及び鼻腔内）で炎症反応を、ＨＤＭ及びアジュバントによる感作後１４日目の単回ＨＤＭ負荷によって誘発した。それは、生理食塩水負荷対照と比較して、肺組織ホモジネート中の５種のサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９及びＩＬ−１３の濃度の統計的に有意な増加と、ＨＤＭ負荷動物における肺組織の重度の組織学的炎症性変化によって特徴付けられた。
【０１６５】
ｈＢＤ２は、１日３回の経口と鼻腔内の両方の投与後に、ＨＤＭ負荷ビヒクル処置動物と比較して、１４日目に、肺組織の組織学的炎症の増加を効果的に抑制した（図４３、４４、４５）。有意な効果が、経口投与後の肺組織ホモジネート中のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９及びＩＬ−１３サイトカインレベル、並びにＩＮ投与後のＩＬ−９及びＩＬ−１３に対し観察された。全ての得られた結果は、イエダニ／フロイント完全アジュバントに促進されるアレルギー性喘息のマウスモデルでのｈＢＤ２の明確な抗炎症効果を示す。
【０１６６】
肺は、腸、肝臓及び皮膚に続いてＧＶＨＤに関与する４番目の臓器である。この実施例は、ディフェンシンが、免疫系のバランスを再調整するだけでなく、急性ＧＶＨＤの特徴である主要なＧＶＨＤサイトカインのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９及びＩＬ−１３のサイトカインストームを決定的に治療又は予防できることを示す。実際に、炎症性サイトカインの放出又はサイトカインストームは、急性ＧＶＨＤの発生と重症度の主要なメディエーターとして関与している（Ｂａｌｌ＆Ｅｇｅｌｅｒ、２００８）。
【０１６７】
実施例１２
配列
【表１】
2021504348.tif 000003
【０１６８】
実施例１３
幹細胞移植後の急性移植片対宿主病のマウスモデルにおける経口ｈＢＤ−２による予防的処置の有効性を決定及び評価すること
材料及び方法
治療の投与計画：１２匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に少なくとも４時間の間隔で４．５Ｇｙ（２×４９８秒）を照射した。骨髄を採取した：後肢を２匹のメスのＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスから無菌的に採取した。骨格筋を摘出し、骨端を切除した。骨の内腔をＰＢＳで洗い流し、細胞をペレット化して、取った。Ｔ細胞の採取：２匹のメスのＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓を、１００μＭのセルストレーナーを介してＰＢＳで満たされた皿にふるい分けした。細胞をＰＢＳに取り、５０ｍＬのファルコンチューブに移し、スピンダウンした。細胞を１ｍＬのＰＢＳに取り、脾臓あたり２０μＬのＣＤ４マイクロビーズ＋２０μＬのＣＤ８マイクロビーズを加えて、４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をポジティブに選択するために、ＭＡＣＳ分離に適用した。陽性選択されたＴ細胞を数え、取った。移植：第２回の照射の直後に、全てのＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスに、イソフルラン麻酔下で眼窩後静脈叢に５×１．０００．０００ＢＭ細胞（５０μＬ）を静注した。１５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０〜１０日目に、強制経口投与により１日あたり１００μＬのＰＢＳ中１．２ｍｇのｈＢＤ２／体重１ｋｇ／日で治療した。
【０１６９】
１５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、０〜１０日目に、強制経口投与により１日当たりビヒクルの１００μＬのＰＢＳを与えた。
【０１７０】
試験：
マウスの体重を最初の７日間毎日測定し、生存を１００日間監視した。
【０１７１】
結果
ビヒクルグループ中の１５匹のマウス全てが３５日までに死亡したのに対し、ｈＢＤ２治療マウスのわずか４匹又は３０％未満が３５日までに死亡し、８匹のマウスは１００日目まで生存していた（ｐ＜０．０００１）（図４７）。小腸、結腸及び肝臓の組織学的スコアは、ＰＢＳと比較して、ｈＢＤ−２治療グループでは全て統計的に非常に低かった（図４８）。ｈＢＤ２治療マウスは、骨髄移植後の最初の７日間、統計的に有意に体重減少が少なく、腸の健康と腸の完全性が改善されたことを示唆する（図４９）。ｈＢＤ２での治療は、ＣＤ４５＋白血球の浸潤（図５０のＦＡＣＳ分析）；結腸の固有層における腸Ｔ細胞及び骨髄細胞の浸潤（図５１ａ〜ｃ）を低下させた。ｈＢＤ２による予防的処置もまた、ＴＮＦ−αとＩＬ−６の濃度の低下及びＩＬ−１０の濃度の増加を示した（図５２ａ〜ｃ）。ｈＢＤ−２治療は、骨髄細胞からのＩＬ−１βの低下をさらに示した（図５３ａ〜ｃの脾臓のＦＡＣＳ分析）。脾臓のＦＡＣＳ分析もまた、好中球の数の低下（図５４ａ）；特にＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのＴｈ１サイトカイン生成の低下（図５４ｂ〜ｆ）を示した。結腸試料のマイクロアレイ分析は、ｈＢＤ−２治療グループ対ＰＢＳで炎症、白血球と骨髄細胞の遊走及び組織リモデリングの減少を示した（図５５）。
【０１７２】
結論
この実施例１３は、幹細胞移植の日から１０日間のｈＢＤ−２による予防的処置が死亡率を低下させ、長期生存を劇的に増加させることを実証する。
【０１７３】
実施例１４
幹細胞移植後の急性移植片対宿主病のマウスモデルにおけるシクロスポリンに対する経口ｈＢＤ−２による予防的処置の有効性を決定及び評価すること
材料及び方法
治療の投与計画：２０匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に少なくとも４時間の間隔で４．５Ｇｙ（２×４９８秒）を照射した。骨髄を採取した：後肢を２匹のメスのＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスから無菌的に採取した。骨格筋を摘出し、骨端を切除した。骨の内腔をＰＢＳで洗い流し、細胞をペレット化して、取った。Ｔ細胞の採取：２匹のメスのＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓を、１００μＭのセルストレーナーを介してＰＢＳで満たされた皿にふるい分けした。細胞をＰＢＳに取り、５０ｍＬのファルコンチューブに移し、スピンダウンした。細胞を１ｍＬのＰＢＳに取り、脾臓あたり２０μＬのＣＤ４マイクロビーズ＋２０μＬのＣＤ８マイクロビーズを加えて、４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をポジティブに選択するために、ＭＡＣＳ分離に適用した。陽性選択されたＴ細胞を数え、取った。移植：第２回の照射の直後に、全てのＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスに、イソフルラン麻酔下で眼窩後静脈叢に５×１．０００．０００ＢＭ細胞（５０μＬ）を静注した。２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０〜１０日目に１．２ｍｇのｈＢＤ２／体重１ｋｇ／日（ｎ＝７）；０、３、６及び９日目に強制経口投与により５０ｍｇのシクロスポリン／体重１ｋｇ（ｎ＝７）又は１日あたり１００μＬのＰＢＳで治療した。
【０１７４】
試験：
研究の間、マウスの体重を定期的に測定し、生存を９０日間監視した。
【０１７５】
結果
ＰＢＳ処置マウスの１匹を除く全てが９０日目までに死亡したが、ｈＢＤ−２治療動物の１匹だけが９０日目までに死亡し（ｐ＝０．０３、図５６）、シクロスポリン治療動物の３匹が死亡した（ｐ＝０．１６、図５６）。ｈＢＤ２及びシクロスポリン治療マウスは、ＰＢＳ処置マウスと比較して、骨髄移植後に統計的に有意に体重減少が少なく、腸の健康と腸の完全性が改善されたことを示唆する（図５７）。
【０１７６】
結論
この実施例１４は、幹細胞移植の日から１０日間のｈＢＤ−２による予防的処置が、シクロスポリンによる標準的な抗ＧＶＨＤ治療と少なくとも同等に死亡率を低下させることを実証するのに役立つ。
【０１７７】
実施例１５
幹細胞移植後の急性移植片対宿主病のマウスモデルにおける経口ＨＤ５による予防的処置の有効性を決定及び評価すること
材料及び方法
治療の投与計画：２２匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に少なくとも４時間の間隔で４．５Ｇｙ（２×４９８秒）を照射した。骨髄を採取した：後肢を２匹のメスのＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスから無菌的に採取した。骨格筋を摘出し、骨端を切除した。骨の内腔をＰＢＳで洗い流し、細胞をペレット化して、取った。Ｔ細胞の採取：２匹のメスのＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓を、１００μＭのセルストレーナーを介してＰＢＳで満たされた皿にふるい分けした。細胞をＰＢＳに取り、５０ｍＬのファルコンチューブに移し、スピンダウンした。細胞を１ｍＬのＰＢＳに取り、脾臓あたり２０μＬのＣＤ４マイクロビーズ＋２０μＬのＣＤ８マイクロビーズを加えて、４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をポジティブに選択するために、ＭＡＣＳ分離に適用した。陽性選択されたＴ細胞を数え、取った。移植：第２回の照射の直後に、全てのＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスに、イソフルラン麻酔下で眼窩後静脈叢に５×１．０００．０００ＢＭ細胞（５０μＬ）を静注した。２２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０〜１０日目に強制経口投与により１．２ｍｇのＨＤ５／体重１ｋｇ／日；１．２ｍｇのｈＢＤ−２／体重１ｋｇ／日又は１日あたり１００μＬのＰＢＳで治療した。
【０１７８】
試験：
生存を６０日間監視した。
【０１７９】
結果
ＰＢＳ処置マウスの８匹中６匹は６０日までに死亡したが、ＨＤ５で治療した動物の８匹のうち２匹は死亡し（ｐ＝０．０６、図５８）、ｈＢＤ−２で治療した動物はどれも６０日までに死亡しなかった（ｐ＝０．００８、図５８）。
【０１８０】
結論
この実施例１５は、幹細胞移植の日から１０日間のＨＤ５又はｈＢＤ−２のいずれかによる予防的処置が死亡率を劇的に低下させることを実証するのに役立つ。
【０１８１】
実施例１６
経口投与されたディフェンシンの抗菌効果（ＨＤ５及びｈＢＤ−２）
方法：
ＦＩＳＨによるムチンの免疫染色と細菌の局在
粘液免疫染色を、腸粘膜の表面での細菌の局在を分析するために以前に記載されているように、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）とペアにした。簡単に説明すると、糞便物質を含まない結腸組織（近位結腸、盲腸から２ｃｍ）を、メタノール−カルノワ固定液（６０％メタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸）中に室温で最低３時間置いた。組織を次いで、メタノールで２×３０分、エタノールで２×１５分、エタノール／キシレン（１：１）、１５分、及びキシレンで２×１５分洗浄した後、垂直方向にパラフィンに包埋した。５μｍの切片を作成し、６０℃で１０分間予熱した後、キシレン６０℃で１０分間、キシレンで１０分間、９９．５％エタノールで１０分間脱脂した。ハイブリダイゼーション工程を、ハイブリダイゼーション緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．９ＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、２０％のホルムアミド）中１０μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈したＥＵＢ３３８プローブ（アレクサ６４７を使用して５’標識した５’−ＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’）により５０℃で行った。洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．９ＭのＮａＣｌ）で１０分間、ＰＢＳで３×１０分間洗浄した後、ＰＡＰペン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して切片の周りに印をつけ、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ウシ胎児血清）を４℃で３０分間加えた。ムチン−２一次抗体（ウサギＨ−３００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）をブロッキング溶液で１：１５００に希釈し、４℃で一晩適用した。ＰＢＳで３×１０分間洗浄した後、１：１５００に希釈した抗ウサギアレクサ４８８二次抗体を含むブロッキング溶液、１μｇ／ｍＬのファロイジン−テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１０μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を切片に２時間適用した。ＰＢＳで３×１０分間洗浄した後、Ｐｒｏｌｏｎｇ退色防止マウンティングメディア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してスライドをマウントした。観察を、ソフトウェアＺｅｎ  ２０１１バージョン７．１を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００共焦点顕微鏡を用いて行った。このソフトウェアを使用して、細菌と上皮細胞単層の間の距離、及び粘液の厚さを決定した。
【０１８２】
結果：
腸壁と細菌集団の間の溶解ゾーンに非常に統計的に有意な差が観察された。距離は、低脂肪と西洋食の両方を摂取したマウスについて小さかったのに対し、ＨＤ５、特にｈＢＤ−２は距離に大きな影響を及ぼした（図５９）。
【０１８３】
結論
この実験は、マウスに経口投与したヒトＨＤ５及びｈＢＤ−２が、経口投与後に期待される主に腸の内腔でではなく、マウス自体の上皮細胞によって生成されたかのように、マウスの上皮表面で微生物叢調節効果を発揮することを実証する。
参考文献
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ＷＯ  ２０１０／００７１６６
ＷＯ  ９２／０６２０４
ＷＯ  ９５／１７４１３
ＷＯ  ９５／２２６２５
米国特許第５，２２３，４０９号
【図１】
2021504348.tif 000004
【図２】
2021504348.tif 000005
【図３】
2021504348.tif 000006
【図４】
2021504348.tif 000007
【図５】
2021504348.tif 000008
【図６ａ】
2021504348.tif 000009
【図６ｂ】
2021504348.tif 000010
【図６ｃ】
2021504348.tif 000011
【図７】
2021504348.tif 000012
【図８】
2021504348.tif 000013
【図９】
2021504348.tif 000014
【図１０】
2021504348.tif 000015
【図１１】
2021504348.tif 000016
【図１２】
2021504348.tif 000017
【図１３】
2021504348.tif 000018
【図１４】
2021504348.tif 000019
【図１５】
2021504348.tif 000020
【図１６】
2021504348.tif 000021
【図１７】
2021504348.tif 000022
【図１８】
2021504348.tif 000023
【図１９】
2021504348.tif 000024
【図２０−１】
2021504348.tif 000025
【図２０−２】
2021504348.tif 000026
【図２１】
2021504348.tif 000027
【図２２】
2021504348.tif 000028
【図２３】
2021504348.tif 000029
【図２４】
2021504348.tif 000030
【図２５】
2021504348.tif 000031
【図２６】
2021504348.tif 000032
【図２７】
2021504348.tif 000033
【図２８】
2021504348.tif 000034
【図２９】
2021504348.tif 000035
【図３０】
2021504348.tif 000036
【図３１ａ】
2021504348.tif 000037
【図３１ｂ】
2021504348.tif 000038
【図３１ｃ】
2021504348.tif 000039
【図３１ｄ】
2021504348.tif 000040
【図３１ｅ】
2021504348.tif 000041
【図３１ｆ】
2021504348.tif 000042
【図３２ａ】
2021504348.tif 000043
【図３２ｂ】
2021504348.tif 000044
【図３３ａ】
2021504348.tif 000045
【図３３ｂ】
2021504348.tif 000046
【図３４ａ】
2021504348.tif 000047
【図３４ｂ】
2021504348.tif 000048
【図３４ｃ】
2021504348.tif 000049
【図３５】
2021504348.tif 000050
【図３６】
2021504348.tif 000051
【図３７】
2021504348.tif 000052
【図３８】
2021504348.tif 000053
【図３９】
2021504348.tif 000054
【図４０】
2021504348.tif 000055
【図４１】
2021504348.tif 000056
【図４２】
2021504348.tif 000057
【図４３】
2021504348.tif 000058
【図４４】
2021504348.tif 000059
【図４５】
2021504348.tif 000060
【図４６】
2021504348.tif 000061
【図４７】
2021504348.tif 000062
【図４８】
2021504348.tif 000063
【図４９ａ−ｂ】
2021504348.tif 000064
【図５０】
2021504348.tif 000065
【図５１ａ】
2021504348.tif 000066
【図５１ｂ】
2021504348.tif 000067
【図５１ｃ】
2021504348.tif 000068
【図５２ａ】
2021504348.tif 000069
【図５２ｂ】
2021504348.tif 000070
【図５２ｃ】
2021504348.tif 000071
【図５３ａ】
2021504348.tif 000072
【図５３ｂ】
2021504348.tif 000073
【図５３ｃ】
2021504348.tif 000074
【図５４ａ−ｂ】
2021504348.tif 000075
【図５４ｃ−ｄ】
2021504348.tif 000076
【図５４ｅ−ｆ】
2021504348.tif 000077
【図５５】
2021504348.tif 000078
【図５６】
2021504348.tif 000079
【図５７】
2021504348.tif 000080
【図５８】
2021504348.tif 000081
【図５９−１】
2021504348.tif 000082
【図５９−２】
2021504348.tif 000083
【図６０】
2021504348.tif 000084
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月16日(2019.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口、口腔、舌下、経腸、経膣、気管内、肺内、鼻腔内、又は皮膚投与により投与される、同種造血幹細胞移植を受けたか又は受けようとしている患者における急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防又は治療での使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２】
配列番号２、配列番号５、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号７並びに前記配列番号と５個未満、４個未満など、例えば３個未満、２個未満などのアミノ酸が異なる配列変異体から選択される、請求項１に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項３】
ｈＢＤ２（配列番号２）、ＨＤ５（配列番号５）、ＨＤ６（配列番号６）、ｈＢＤ１（配列番号１）、切断型ｈＢＤ２（配列番号７）、ｈＢＤ３（配列番号３）及びｈＢＤ４（配列番号４）からなる群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項４】
ｈＢＤ２、短縮型ｈＢＤ２、又はＨＤ５である、請求項３に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項５】
２種以上のヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン、２種のヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンなど、３種のヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンなど、４種のヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンなど、５種のヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンなどが、投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項６】
前記２種のヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンが、ｈＢＤ２及びＨＤ５である、請求項５に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項７】
前記患者への前記ヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンの投与が、同種造血幹細胞移植の日に開始される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項８】
前記患者への前記ヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンの投与が、同種造血幹細胞移植後にＧＶＨＤの症状が現れたときに開始される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項９】
ヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンの投与が、少なくとも１週間など、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間など、例えば少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月など、例えば少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも６ヶ月の間、前記患者に同種造血幹細胞移植によって引き起こされる症状がなくなるまで継続される、請求項７又は８に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１０】
前記ヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシンが、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、アルブミン結合部分（ＡＢＭ）、検出可能部分（Ｚ）、及び半減期延長ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの追加部分をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１１】
前記追加部分が、半減期延長ペプチドである、請求項１０に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１２】
前記半減期延長ペプチドが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、トランスフェリン、アルブミン（ＨＡＳ）、ＸＴＥＮ（登録商標）若しくはＰＥＧに結合できる分子、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリンアラニンセリンポリマー（ＰＡＳ）、又はエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、ヒアルロン酸、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）β鎖のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）などの負に帯電した高度にシアル化されたペプチド、ヒトIｇＧ、及びＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−（ｎは８〜２２である）からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１３】
プレバイオティクス、プロバイオティクス、トリプトファン、短鎖脂肪酸、グルココルチコイド、シクロスポリン、抗ＴＮＦ−α、インテグリン、抗生物質、免疫抑制剤、糞便移植、照射又はこれらの組み合わせと組み合わせて投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１４】
前記１日用量が、１日あたり０．１〜１０ｍｇのディフェンシン／ｋｇ、０．５〜５ｍｇのディフェンシン／ｋｇなど、１〜２ｍｇのディフェンシン／ｋｇなど、１．２ｍｇのディフェンシン／ｋｇなどである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１５】
少なくとも１日１回、少なくとも１日２回など、少なくとも１日３回など、少なくとも１日４回など、１日５回などで又は継続的に投与される、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１６】
前記投与が、経口、肺内又は経皮投与である、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１７】
前記肺内、気管内又は鼻腔内投与が、吸入器、ネブライザー、又は気化器による、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１８】
前記投与が経口投与である、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項１９】
前記患者が、重度の腸及び肝臓の炎症（例えば腹痛、吐き気、嘔吐及び黄疸によって特徴付けられる）並びに粘膜防御の喪失、サイトカインストーム、体重減少、敗血症、皮膚の発疹、かゆみ、及び発赤から選択される１以上の症状を有する、請求項１〜１８のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２０】
前記症状の１以上が、治療後に改善される、請求項１９に記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２１】
前記治療が、死亡率を減少させかつ長期生存を増加させる、請求項１〜２０のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２２】
前記治療が、免疫系のバランスを再調整しかつ前記組織サイトカイン生成の正常化を通じて前記サイトカインストームを予防する又は治療する、請求項１〜２１のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２３】
腸透過性及び敗血症が、前記腸における粘膜防御又はミエロペルオキシダーゼ活性の正常化を通じて治療される、請求項１〜２２のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２４】
呼吸器合併症、肺容量、肺炎症及び敗血症が、治療される、請求項１〜２３のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２５】
組織学的肺炎症、気管支周囲及び血管周囲の炎症並びに気管支肺胞洗浄液への炎症細胞の移動が、低下される、請求項１〜２４のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２６】
閉塞性細気管支炎及び強皮症などの、肺及び皮膚の炎症並びに線維症が、治療される又は予防される、請求項１〜２５のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２７】
遺伝子の豊富さ、門の数、細菌の存在、細菌存在量及び／又は短鎖脂肪酸の生成、及び／又は酪酸生成が、増加されかつ／又は前記患者の腸若しくは肺の微生物叢からの酢酸生成が、減少される、請求項１〜２６のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２８】
前記患者の腸若しくは肺若しくは皮膚における正常な微生物叢が、成熟され、維持され、又は安定化される、請求項１〜２７のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項２９】
前記患者の腸又は肺におけるアロバキュラム、アロプレボテラ、アッカーマンシア、バルネシエラ、ビフィズス菌、フェカリバクテリウム、ラクノスピラ、ロチア及びベイロネラの存在量が、増加される、請求項１〜２８のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【請求項３０】
前記患者における食物摂取及び体重が、増加される、請求項１〜２９のいずれかに記載の使用のためのヒトβ−ディフェンシン及び／又はα−ディフェンシン。
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月14日(2020.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021504348000001.app
【国際調査報告】
2021504348.tif 000085
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