(57)【要約】  人工バイオインターフェースを製造するための技法は、流体透過性フェンスによって中央領域及び２つの側部チャネルに分割されたチャンバと、中央領域及び２つの側部チャネルのうちの１つにわたってそれぞれ延びる少なくとも３つの流体経路とを有するパターン形成されたマイクロ流体チップを提供することを含む。硬質ビーズの多孔性充填物は、中央領域内に配置されてビーズ床を画定し、ビーズは、フェンスによって保定することができるサイズのものである。中央領域を１つの側部チャネルから隔てるフェンスの少なくとも１つのセグメントでバイオウォールを成長させることができ、バイオウォールは、ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成される。細胞の付着及び成長を改良するためにビーズを改質、コーティング、又は機能化することができ、レポート又は投与のために、粒子又は分子をビーズ床に好適に追加することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオインターフェースをモデル化するための方法であって、
パターン形成されたマイクロ流体チップを提供するステップであり、前記チップが、
中央領域と、前記中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたチャンバで、前記分割が、流体透過性フェンスによって提供される、チャンバと、
前記チャンバの両端にある少なくとも２つのポート、並びに前記中央領域及び前記２つの側部チャネルのうちの１つのそれぞれにある少なくとも１つのポートを含む、少なくとも３つのマイクロ流体ポートと、を備える、ステップと、
ビーズ床を画定するために前記中央領域内に硬質ビーズの多孔性充填物を局在化させるステップであり、前記ビーズが、前記フェンスに流体が浸透する間に前記フェンスが前記ビーズを保定するのに十分な２〜３００μｍの平均サイズを有する、ステップと、
前記マイクロ流体ポートの対を通して細胞に栄養供給することによって、前記中央領域を１つの側部チャネルから隔てる前記フェンスの少なくとも１つのセグメントでバイオウォールを成長させるステップであり、前記バイオウォールが、前記ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成される、ステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記中央領域及び前記２つの側部チャネルのうちの１つのそれぞれが、前記チャンバの両端に位置する少なくとも２つのポートを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビーズが、ポリマー、ガラス、金属、又はセラミックから構成されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビーズが、スチレン系ポリマー又はシリカから構成されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
細胞の付着若しくは成長を改良するように、
標的分子若しくは粒子と選択的に結合するように、
標的分子若しくは粒子との結合をレポートするように、
分子若しくは粒子を選択的に放出するように、
光学的、熱的、電気的、磁気的、化学的、若しくは機械的な刺激に応答して、標的分子若しくは粒子を選択的に結合する、結合をレポートする、若しくは選択的に放出するように、又は
標的分子若しくは粒子を時間依存で選択的に結合する、結合をレポートする、又は選択的に放出するように、
前記ビーズの少なくとも第１の画分が処理される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記フェンスが、前記側部チャネル側から前記中央領域への貫通穴を有し、前記貫通穴は、前記ビーズのうち最も小さい１０％の平均直径よりも小さい、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フェンスが、天然組織の幾何形状を模倣するのに適した形状を画定するように前記ビーズの充填物の境界を定めるための１次元、２次元、又は３次元の湾曲部を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記硬質ビーズの充填物が、最大２５％の非硬質ビーズ、粒子、又は物体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記チャンバを細胞付着促進コーティングでコーティングするステップと、前記ビーズの混合物を前記チャンバに導入することによって前記多孔性充填物を局在化させるステップと、少なくとも１つの細胞培養物を前記側部チャネルの少なくとも１つを通して播種するステップと、前記少なくとも１つの細胞培養物に栄養供給しながらインキュベートするステップとをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビーズの前記混合物を前記チャンバに導入するステップが、前記中央領域の前記ポートの１つを通して前記ビーズ混合物を液体キャリアに注入すると共に、他のポートの１つで流体を抽出することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ビーズの前記混合物を前記チャンバに導入するステップが、前記マイクロ流体チップのカバーが取り外された状態で、前記ビーズの圧縮された混合物を前記中央領域に配置することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビーズの前記混合物を前記チャンバに導入するステップが、少なくとも２つの相を前記中央領域のそれぞれの部分に導入することを含み、各相が、前記ビーズ、又はそのようなビーズと任意の非硬質のビーズ、粒子、若しくは物体との混合物の部分集団の平均サイズ、平均形状、表面テクスチャ、機能化、組成、若しくはコーティングのうちの少なくとも１つに関して異なる特性を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記中央領域の前記それぞれの部分が、前記フェンスに平行な層で、又は前記中央領域の１対のポート間の流れに垂直なラインで前記中央領域を区分する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記中央領域のそれぞれの部分に追加のポートが提供される場合、前記中央領域の前記それぞれの部分が追加のフェンスによって分離される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記中央領域が、２つの反対側のポート間の長さを有する前記パターン形成されたマイクロ流体チップを通る細長い流路であり、前記長さは、前記中央領域のエッチング深さ寸法よりも少なくとも２桁大きく、前記中央領域の幅の少なくとも２倍である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
人工バイオインターフェースを製造するためのキットであって、
パターン形成されたマイクロ流体表面であり、前記パターンが、中央領域と、前記中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたチャンバを画定し、前記分割が、流体透過性フェンスによって提供されている、マイクロ流体表面と、
前記中央領域内にビーズ床を形成するように構成された硬質ビーズ源であり、前記ビーズが、前記フェンスに流体が浸透する間に前記ビーズを前記フェンスが保定するのに十分である２〜３００μｍの平均サイズを有する、硬質ビーズ源と、
前記マイクロ流体表面のためのカバーであり、前記チャンバを囲むように寸法設定され、前記チャンバを周囲から封止するように構成されたカバーと、を備え、
前記パターン形成されたマイクロ流体表面及びカバーのうちの少なくとも１つが、少なくとも３つのマイクロ流体ポートを提供し、前記少なくとも３つのマイクロ流体ポートが、前記チャンバの両端にある２つのポートと、前記中央領域及び前記２つの側部チャネルのそれぞれにある少なくとも１つのポートとを含む、
キット。
【請求項１７】
前記中央領域及び前記２つの側部チャネルがそれぞれ、前記チャンバの両端に位置する少なくとも２つのポートを有する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記ビーズが、ポリマー、シリカ、金属、又はセラミックから構成されている、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ビーズが、スチレン系ポリマー又はシリカから構成されている、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項２０】
細胞の付着若しくは成長を改良するように、
標的分子若しくは粒子と選択的に結合するように、
標的分子若しくは粒子との結合をレポートするように、又は
分子若しくは粒子を選択的に放出するように、
前記ビーズの少なくとも第１の画分が処理される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
前記標的分子又は粒子が、光学的、熱的、電気的、磁気的、化学的、又は機械的な刺激に応答して結合される、結合をレポートされる、又は放出される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記標的分子又は粒子が、時間依存して、結合される、結合をレポートされる、又は放出される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記フェンスが、前記側部チャネル側から前記中央領域への貫通穴を有し、前記貫通穴は、前記ビーズのうち最も小さい１０％の平均直径よりも小さい、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記フェンスが、天然組織の幾何形状を模倣するのに適した形状を画定するように前記ビーズの充填物の境界を定めるための１次元、２次元、又は３次元の湾曲部を有する、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記硬質ビーズの充填物が、最大２５％の非硬質ビーズ、粒子、又は物体を含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記硬質ビーズの充填物が、少なくとも２つの相を有し、各相が、前記ビーズ、又はそのようなビーズと任意の非硬質のビーズ、粒子、若しくは物体との混合物の部分集団の平均サイズ、平均形状、表面テクスチャ、機能化、組成、若しくはコーティングのうちの少なくとも１つに関して異なる特性を有する、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
前記中央領域内に形成された前記ビーズ床、及び前記チャンバを囲んで封止する前記カバーと共に組み立てられる、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記中央領域を１つの側部チャネルから隔てる前記フェンスのセグメントに沿って位置して形成されたバイオウォールを備え、前記バイオウォールが、前記ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成され、前記バイオウォールが、前記マイクロ流体ポートによって栄養供給される、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
中央領域と、前記中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたマイクロ流体チャンバであって、前記分割が、フェンスによって提供され、
前記中央領域が、硬質ビーズを含む多孔性充填物で満たされ、前記ビーズが、前記フェンスに流体が浸透する間に前記ビーズを前記フェンスが保定するのに十分な２〜３００μｍの平均サイズを有する、マイクロ流体チャンバと、
前記中央領域を１つの側部チャネルから隔てる前記フェンスのセグメントに沿って位置するバイオウォールであって、前記ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成される、バイオウォールと、
少なくとも３つのマイクロ流体経路であって、前記経路がそれぞれ、前記それぞれの側部チャネル又は中央領域に流体を供給するため及び前記それぞれの側部チャネル又は中央領域から流体を抽出するために、前記２つの側部チャネル及び前記中央領域のうちの１つにわたって延在する、マイクロ流体経路と、を備える人工バイオインターフェース。
【請求項３０】
前記経路がそれぞれ、前記それぞれの側部チャネル又は中央領域の両端にあるマイクロ流体ポート間に延在する、請求項２９に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３１】
前記ビーズが、ポリマー、シリカ、金属、又はセラミックから構成されている、請求項２９又は３０に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３２】
前記ビーズが、スチレン系ポリマー又はシリカから構成されている、請求項２９又は３０に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３３】
細胞の付着若しくは成長を改良するように、
標的分子若しくは粒子と選択的に結合するように、
標的分子若しくは粒子との結合をレポートするように、又は
分子若しくは粒子を選択的に放出するように、
前記ビーズの少なくとも第１の画分が処理される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３４】
光学的、熱的、電気的、磁気的、化学的、又は機械的な刺激に応答して、前記標的分子又は粒子を結合する、結合をレポートする、又は放出するように、前記ビーズが処理される、請求項３３に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３５】
前記標的分子若しくは粒子を時間依存して結合する、結合をレポートする、又は放出するように、前記ビーズが処理される、請求項３３に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３６】
前記フェンスが、前記側部チャネル側から前記中央領域への貫通穴を有し、前記貫通穴は、前記ビーズのうち最も小さい１０％の平均直径よりも小さい、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３７】
前記フェンスが、天然組織の幾何形状を模倣するのに適した形状を画定するように前記ビーズの充填物の境界を定めるための１次元、２次元、又は３次元の湾曲部を有する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３８】
前記硬質ビーズの充填物が、最大２５％の非硬質ビーズ、粒子、又は物体を含む、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の人工バイオインターフェース。
【請求項３９】
前記硬質ビーズの充填物が、少なくとも２つの相を有し、各相が、前記ビーズ、又はそのようなビーズと任意の非硬質のビーズ、粒子、若しくは物体との混合物の部分集団の平均サイズ、平均形状、表面テクスチャ、機能化、組成、若しくはコーティングのうちの少なくとも１つに関して異なる特性を有する、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の人工バイオインターフェース。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
[0001]本発明は、概して、生体組織がバイオインターフェースをモデル化するように生体組織を形成して維持するために細胞を支持するための技法に関し、特に、多孔床又は制御された多孔性を有する硬質ビーズの充填物の形態をした支持体、及びこの支持体を組み込んだマイクロ流体デバイスに関する。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]臓器オンチップ（Ｏｒｇａｎｓ  ｏｎ  Ｃｈｉｐ：ＯｏＣ）は、マイクロ流体デバイスプラットホーム及び組織工学における発展を活用して、動物及び場合によっては植物の器官、組織、及び機序のいくつかの側面の機能をエミュレートする、現在集中的に研究されているモデルである。細胞バリア、器官境界、又はホストバリアインターフェースなどの重要なバイオインターフェースはすべて、生物学、薬理学、免疫学、及び医学の理解をさらに深めるためにそれぞれの役割を担う。バイオインターフェースは、この用語を本明細書で使用するとき、少なくとも１つのバイオウォール（組織又は器官の壁とマイクロ流体構造とを区別するために本明細書で使用される用語）を含む遺伝子操作又は切除された組織若しくは器官、又は培養された組織を含み、バイオウォールは、バイオウォールを取り囲む領域間部分からモデル組織又は器官（例えば、胎盤、脳、腺）の内部を分ける組織バリアを形成する相互接続された細胞を含む。上記のバイオウォールとは反対の側から第２のバイオウォールが領域間部分に面して、２つのバイオウォールを有するバイオインターフェースを形成することができ、又は領域間部分は、例えば無菌ではない環境に面する粘膜でもよい。したがって、バイオウォールに対向する領域間部分は、液体環境（例えば、腎臓、胎盤、血液脳関門）であることも、気体（肺、食道、胃）環境であることもある。バイオインターフェースは、シグナル伝達分子、栄養素、及び老廃物の複雑な交換をサポートする、形式上の細胞界面を画定する。石灰化組織（歯又は骨格組織）と境界を画している細胞のモデル化も、典型的には、ゼラチン状又は液体の界面領域を含む。例えば、そのような界面は、それぞれ栄養素移動又は感覚活性化の分析のために、内皮細胞又は有髄／無髄神経細胞との骨芽細胞／破骨細胞の共培養物を含むことができる。
【０００３】
[0003]ＯоＣバイオインターフェースの１つの用途は、薬物スクリーニングに先立って候補薬物に対してインテリジェント低コスト試験［１］を行って薬物開発を導くことである。薬物開発は、承認までに通常は１０〜１５年かかり、全体の成功率が低く［２］、新薬をスクリーニングするコストが過去１０年で劇的に上昇してきた［３］。したがって、スクリーニングのための薬物候補の選択を改善するために、低コストのプレスクリーニング試験が求められている。生理学的条件を試験によってより正確にモデル化できるようになればなるほど、薬物開発者は、スクリーニングのための候補薬物の順位付けの決定をより高い信頼性で行えるようになる。ＯоＣバイオインターフェースは、この点において明らかな利点を提供する。
【０００４】
[0005]薬物開発パイプラインを改善できる可能性に加えて、他の用途としては、化学毒性の試験、及び細胞プロセス、組織応答、器官機能の研究などが挙げられる。ＯоＣバイオインターフェースが、より現実的なインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のヒトモデルを提供し、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の動物モデルに代わる、より低コストであり動物に優しく及び／又はよりヒト中心の手段を提供する限り、ＯоＣバイオインターフェースは、研究のための魅力的なプラットホームである。
【０００５】
[0006]マイクロ流体力学及びマイクロ技術は、臓器又は組織オンチップ用途を構築するための優れたツールを提供する。細胞の長さスケール（１０〜１００μｍ）で作製し、低流量で正確に粒子及び流体工学的特性を操作することができる性能が、細胞組織の培養及び栄養のための環境を作成するのに必須である。微視的な流れ制御及び微細構造化は、ＯｏＣの用途に活用される重要な設計機能である。文献に、いくつかのＯｏＣデモンストレーションが示されている［４］。材料適合性、細胞の栄養供給及び成長、並びに人工環境での細胞の性質の維持という観点から、様々な障害が克服されてきた。
【０００６】
[0007]処理及び構造化を行わずに細胞成長を自然にサポートするプラスチックがほとんどないため、細胞成長との材料適合性は長年の問題であった。プラスチックマイクロ流体チップを処理して細胞成長を可能にするためのプロセスは、概して、高価であり、時間がかかり、時間依存性があり、エラーを起こしやすく、及び／又は不便である。例えば、（多くの処理に必要とされる）ポリマーの表面の活性を促進するいくつかの酸素プラズマ処理により、後でポリマー表面を結合してマイクロ流体チャネルを封止することが難しくなり、一方の組織の細胞成長を可能にするポリマー構造が他方の細胞の成長を必ずしも可能にしないことが知られている。
【０００７】
[0008]バイオインターフェースの発展には、少なくとも１つのバイオウォールの細胞成長のための足場又は支持体が必要である。足場は、細胞を固定し、栄養素の供給及び老廃物の排出を可能にするために提供される。この足場を形成するためにコラーゲンのシート、例えばガラス化コラーゲンシートを使用することは、いくつかの組織環境では高い生物模倣性があるので一般的である。例えば、「Ｐｌａｃｅｎｔａ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ」という題名のＪｉ  Ｓｏｏ  Ｌｅｅらの論文には、マイクロ流体チャネルどうしが重なる隣り合うパターン形成されたＰＤＭＳフィルムにおいて、上側マイクロ流体チャネルを下側マイクロ流体チャネルから分離するコラーゲンのゲル化及びガラス化によって形成されたコラーゲン膜が教示されている。コラーゲン膜は、上側及び下側チャネルへの独立した流体アクセスを可能にする。上側及び下側チャネルは、チューブを介してそれぞれの細胞培養培地リザーバに結合され、それぞれの細胞培養物（共培養物）は、コラーゲン膜の各側で成長したが、コラーゲン膜は、最終的には両タイプの細胞がほぼ均質に分散された状態で注入される。
【０００８】
[0009]細胞の内殖及び移動は、平行に面する第１及び第２の対面バイオウォールを形成するために共培養細胞の定期的な分離を必要とする、又は組織によって天然では制御されない粘膜の最小厚さを必要とするいくつかのバイオインターフェースモデルに起こり得る問題を示す。薄いガラス状のコラーゲン膜は、この目的には十分でないことがある。
【０００９】
[0010]細胞成長をサポートするための足場としてヒドロゲル構造を使用することも知られている。これは、ヒドロゲルが、ヒドロゲルの水性画分中で運ばれる分子種の流体輸送及び分散を可能にするからである。Ｋａｍｍ他の米国特許第９，２３１，４９６号は、１つ又は複数のゲルケージ領域を有するマイクロ流体デバイスを教示しており、各領域が、１つ又は複数の流体チャネルによって側部を定められて、ゲルケージ領域と流体チャネルとの界面を作成する。ゲルは、ヒドロゲルを保定するための特性を有するピラーからなる多孔壁によって含有される。ゲルケージ領域は、ヒドロゲル及びバイオウォールの裏側と相互作用するための比較的小さい表面積を提供するこれらの界面を介して以外は、マイクロ流体チャネルにアドレス可能ではないことに留意されたい。バイオウォールの裏側に達する唯一の方法は、ゲル入口ポートを介してであり、残念ながら、個別の異なる栄養供給及び老廃物チャネル又は送達チャネルを他の形で界面領域に提供することができない。
【００１０】
[0011]Ｐａｎｔ他による米国特許出願公開第２０１５／０３７７８６１号は、生理学的忠実度が高められた、高スループットの細胞ベースアッセイのための細胞培養アッセイデバイスを教示している。図８のデバイス（［００６１］参照）は、直線流れチャネル１１４によって取り囲まれた組織空間１３を分離するマイクロ流体壁１１５を含む。壁１１５は、水性緩衝液に対して透過性があり、ギャップ１１５ａ（０．２〜５μｍ）によって分離されたプラスチック構造体１１５ｂによって形成されるが、これらの壁は、代替として、０．２〜３０μｍの多孔性を有する多孔壁でもよい。段落［００６５］に、「ＳＭＮ、ＩＭＮ、分岐、及び組織空間の管腔表面を形成するチャネルを」、様々な「分子でコーティングして、粒子との関連性に関してアッセイする又は細胞の成長を促進することができる」と記載されている。材料のリストには、細胞用の既知のヒドロゲル足場及び「アルギン酸ビーズ」が含まれている。アルギン酸ビーズは、材料を封入するために知られており、それ自体は概して液体コアを有するゲルビーズであり、リストでのゲル材料すべてと合致する。これらのチャネルは、細胞成長が意図される組織空間１３内のチャネルに限定されると理解することが妥当であり得る。これらの教示による「直線流れチャネル１１４」を取り囲むゲルビーズの具体的な提案はない。［００６２］で説明されているように、成長すべき細胞の「単層」は界面１１４に縁部で接続され、Ｐａｎｔらは、バイオインターフェースを生成しておらず、バイオインターフェースをモデル化することも提案していない。
【００１１】
[0012]動物細胞増殖を拡大するために非マイクロ流体溶液が求められる、細胞分泌生成物の大量生産の非類似分野において、例えばＢｌｉｅｍらの米国特許第５，１０２，７９０号から、ガラスビーズなどの担体粒子の充填床に動物細胞（バイオインターフェースの設定に概して付随的又は無関係である足場非依存性細胞を含む）を成長させることが知られている。ビーズ床を選択する目的は、すべての細胞をサポートするために領域全体にわたる定期的な栄養供給を依然として促進しながら、動物細胞のためのニッチの数を増やすことである。
【００１２】
[0013]これらの教示を考慮しても、寸法及び流体分布メカニズムが実質的に異なり、培養すべき細胞がバイオインターフェースに特定的であるようなマイクロ流体環境においては、ガラスビーズが、バイオインターフェースのモデルとして機能するために必要とされるバイオウォールを生成するかどうかは決して明らかでない。
【００１３】
[0014]したがって、細胞培養を支持して栄養供給するための多孔壁及び構造を有するマイクロ流体デバイスは存在するが、細胞培養の前面及び裏面に留まらない個別の流体アクセスを可能にする、細胞培養を支持するために教示された構造はなく、Ｋａｍｍらのケージ領域−流体チャネル界面は、ヒドロゲルと相互作用するための非常に限られた表面積しか提供しない。したがって、改良された細胞培養物支持構造体、特に細胞培養物との相互作用を改良するものが、特に共培養物の間で必要とされる。
【発明の概要】
【００１４】
[0015]本出願人は、硬質ビーズの充填物（ビーズ床）が、異なる細胞培養物の成長を可能にし、充填物の表面又は表面付近で１つ又は複数のバイオウォールを形成することを発見した。硬質ビーズは、この役割においてゲル及びコラーゲンのネットワークに勝る以下のような多くの利点を有する。
【００１５】
充填前の硬質ビーズは、細胞成長を促進するためにエクスシチュ（ｅｘ  ｓｉｔｕ）でコーティング又は処理することができ、これは、プラスチックマイクロチャネルのコーティングに伴う問題を克服する。
【００１６】
硬質ビーズの複数のサブセットは、異なるそれぞれの組成、形態（サイズ、表面組織、及び球状、ハーフシェル、ロッド、立方体、星形などの表面形状）、表面処理、又はコーティングを有することができ、マイクロ流体壁とは異なり、全体として、任意の１種類の硬質ビーズよりも良好な細胞成長及び付着性を提供することができる。
【００１７】
硬質ビーズの各サブセットは個別に機能化することができ、バッチ処理では、離散相又は濃度勾配に関して所定の比率で混合し、異なる濃度のビーズ濃度で注入することができる。
【００１８】
硬質ビーズの充填物は、信頼できる床厚さと、２つのバイオウォールを分離するため又は粘膜を画定若しくは支持するための細胞足場構造体とを容易に形成し、ビーズ床を支持するマイクロ流体チップの設計によって、器官又は組織モデルに適した任意の曲線又は輪郭に従うように配置することができる。
【００１９】
この分離は、バイオウォールの内側への栄養供給とは別に、又は第２のバイオウォールを通して領域間部分又は粘膜の栄養供給を可能にする拡張領域を提供する。
【００２０】
ビーズ床は、別個のレポータ、センサ、又は送達ビーズ、粒子、若しくは物体を、確実な固定力でコスト及び手間をかけずに組み込むことを可能にし、それにより、領域間部分へのこれらのビーズ、粒子、又は物体のインサイチュアクセスが可能になる。
【００２１】
そのようなビーズ、粒子、若しくは物体、又はビーズのコーティングは、放出制御、例えば、領域間部分内でインサイチュで感知される、又は外部駆動される、又は時間に伴う、トリガに応じた選択的放出（ｐＨ、化学的、熱的、圧力、超音波、光、電気的、又は磁気的）を提供することができる。
【００２２】
ビーズ、粒子、若しくは物体、又はビーズのコーティングは、栄養供給ストリームと相互作用して、老廃物ストリームへのシグナル伝達体の排出を促す；反応を吸収若しくは触媒する；又は生物分解、生体吸収、若しくは分解を行うことができる。
【００２３】
相互作用により、レポート、感知、又は化学的放出を促進又は抑制することができる。
【００２４】
老廃物を監視することにより、バイオウォール、領域間部分、粘膜、又は環境の様々な栄養供給に関するフィードバックを提供することができる。
【００２５】
[0016]細胞亜集団間の生存可能なバリアを支持するための形状、多孔性、及び表面構造を有する足場を生成するためのビーズ床の使用を本明細書で以下に示す。これらの利点を活用して、制御された灌流による機能と、空間及び時間局在性の表面改質とを統合し、生存可能な細胞（組織）の共培養を可能にし、それと同時に、誘導された生化学的刺激に応答する細胞間コミュニケーションのアッセイを行うことができるようにする。例えば、細胞間コミュニケーションに関する様々なバイオマーカを標的とする抗体修飾ビーズの逐次的集団（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）の多相ビーズ床が有用となり得る。ビーズ床の制御された相は、放出されたマーカのインサイチュ検出及びバイオインターフェースの時間的進化のための較正相としてさらに使用することができる。１つ又は複数のバイオウォールはそれぞれ、それぞれの培養物を有することができ、又は上述のビーズ床に隣り合ってビーズ床によって支持される２つ以上の細胞株を含むことができる。界面領域、及びバイオウォールの非対向面、又は粘膜に対向する、バイオウォールの非対向面へ栄養供給するそのようなシステムは、生理学的に重要な細胞相互作用のバイオインターフェース研究を発展させることができるモデルを実現する。バイオインターフェースモデルは、界面での生体分子捕捉と、分離ビーズ床バリアを介する生物学的要因の放出制御とのどちらも含むことができ、細胞間シグナル伝達をさらに解明して人工的に刺激する。
【００２６】
[0017]したがって、バイオインターフェースをモデル化するための方法であって、マイクロ流体チップを提供するステップであり、チップが、中央領域と、中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたチャンバで、分割が、流体透過性フェンスによって提供される、チャンバと、チャンバの両端にある少なくとも２つのポート、並びに中央領域及び２つの側部チャネルの１つずつにある少なくとも１つのポートを含む、少なくとも３つのマイクロ流体ポートとを画定するようにパターン形成される、ステップと、ビーズ床を画定するために中央領域内に硬質ビーズの多孔性充填物を局在化させるステップであり、ビーズが、フェンスに流体が浸透する間にフェンスがビーズを保定するのに十分な２〜３００μｍの平均サイズを有する、ステップと、マイクロ流体ポートの対を通して細胞に栄養供給することによって、中央領域を１つの側部チャネルから隔てるフェンスの少なくとも１つのセグメントでバイオウォールを成長させるステップであり、バイオウォールが、ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成される、ステップと、を含む方法が提供される。中央領域並びに第１及び第２の側部チャネルはそれぞれ、チャンバの両端に２つのポートを有することが好ましい。
【００２７】
[0018]この方法は、チャンバを細胞付着促進コーティングでコーティングするステップと、ビーズの混合物をチャンバに導入することによって多孔性充填物を局在化させるステップと、少なくとも１つの細胞培養物を側部チャネルの少なくとも１つを通して播種するステップと、少なくとも１つの細胞培養物に栄養供給しながらインキュベートするステップとをさらに含むことがある。
【００２８】
[0019]ビーズの混合物をチャンバに導入するステップは、中央領域のポートの１つを通してビーズ混合物を液体キャリアに注入すると共に、他のポートの１つで流体を抽出すること、又はマイクロ流体チップのカバーが取り外された状態で、ビーズの圧縮された混合物を中央領域に配置することを含むことがある。ビーズの混合物をチャンバに導入するステップは、少なくとも２つの相を中央領域のそれぞれの部分に導入することを含むことがあり、各相が、ビーズ、又はそのようなビーズと任意の非硬質のビーズ、粒子、若しくは物体との混合物の部分集団の平均サイズ、平均形状、表面テクスチャ、機能化、組成、若しくはコーティングのうちの少なくとも１つに関して異なる特性を有する。中央領域のそれぞれの部分は、フェンスに平行な層で、又は中央領域の１対のポート間の流れに垂直なラインで中央領域を区分することができる。中央領域のそれぞれの部分に追加のポートが提供される場合、これらのそれぞれの部分を追加のフェンスによって分離することができる。
【００２９】
[0020]中央領域は、中央領域のエッチング深さ寸法よりも少なくとも２桁大きい２つの反対側のポート間の長さを有する、パターン形成されたマイクロ流体チップを通る細長い流路であることが好ましい。
【００３０】
[0021]人工バイオインターフェースを製造するためのキットも提供される。このキットは、パターン形成されたマイクロ流体表面であり、パターンが、中央領域と、中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたチャンバを画定し、分割が、流体透過性フェンスによって提供されている、マイクロ流体表面と、中央領域内にビーズ床を形成するように構成された硬質ビーズ源であり、ビーズが、フェンスに流体が浸透する間にビーズをフェンスが保定するのに十分である２〜３００μｍの平均サイズを有する、硬質ビーズ源と、マイクロ流体表面のためのカバーであり、チャンバを囲むように寸法設定され、チャンバを周囲から封止するように構成されたカバーと、を備え、パターン形成されたマイクロ流体表面及びカバーのうちの少なくとも１つが、少なくとも３つのマイクロ流体ポートを提供し、少なくとも３つのマイクロ流体ポートが、チャンバの両端にある２つのポートと、中央領域及び２つの側部チャネルのそれぞれにある少なくとも１つのポートとを有する。中央領域並びに２つの側部チャネルはそれぞれ、チャンバの両端に少なくとも２つのポートを有することが好ましい。
【００３１】
[0022]キットは、中央領域内に形成されたビーズ床、及びチャンバを囲んで封止するカバーと共に組み立てられる。組み立てられたキットは、中央領域を１つの側部チャネルから隔てるフェンスのセグメントに沿って形成されたバイオウォールを有することができ、バイオウォールは、ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成され、バイオウォールは、マイクロ流体ポートによって栄養供給される。
【００３２】
[0023]本発明によれば、人工バイオインターフェースがさらに提供される。バイオインターフェースは、中央領域と、中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたマイクロ流体チャンバを含み、分割は、フェンスによって提供され、中央領域は、硬質ビーズの多孔性充填物で満たされる。ビーズは、フェンスに流体が浸透する間にビーズをフェンスが保定するのに十分な２〜３００μｍの平均サイズを有する。また、バイオインターフェースは、中央領域を１つの側部チャネルから隔てるフェンスのセグメントに沿って位置するバイオウォールを含む。バイオウォールは、ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成される。少なくとも３つのマイクロ流体の流体経路が提供され、経路はそれぞれ、それぞれの側部チャネル又は中央領域に流体を供給するため及びそれぞれの側部チャネル又は中央領域から流体を抽出するために、２つの側部チャネル及び中央領域のうちの１つにわたって延在する。
【００３３】
[0024]ビーズは、ポリマー、シリカ、金属、又はセラミック、好ましくはスチレン系ポリマー若しくはシリカから構成することができ、細胞の付着若しくは成長を改良する；標的分子若しくは粒子と選択的に結合する；標的分子若しくは粒子との結合をレポートする；又は分子若しくは粒子を選択的に放出するようにビーズを処理することができる。標的分子又は粒子の結合、放出、又は結合のレポートは、時間依存性でもよく、又は光学的、熱的、電気的、磁気的、化学的（ｐＨを含む）、若しくは機械的（超音波を含む）な刺激に応答するものでもよい。硬質ビーズの充填物は、最大で２５％、又は好ましくは最大で２０％、１５％、又は１２％、又は１０％、又は７％、又は５％の非硬質ビーズ、粒子、又は物体を含むことができる。硬質ビーズの充填物は、少なくとも２つの相を有することがあり、各相は、ビーズ、又はそのようなビーズと任意の非硬質のビーズ、粒子、若しくは物体との混合物の部分集団の平均サイズ、平均形状、表面テクスチャ、機能化、組成、若しくはコーティングのうちの少なくとも１つに関して異なる特性を有する。
【００３４】
[0025]フェンスは、側部チャネル側から中央領域への貫通穴を有することがあり、貫通穴は、ビーズのうち最も小さい１０％の直径よりも小さい。フェンスは、天然組織の幾何形状を模倣するのに適した形状を画定するようにビーズの充填物の境界を定めるための１Ｄ（１次元）、２Ｄ（２次元）、又は３Ｄ（３次元）の湾曲部を有することができる。
【００３５】
[0026]本発明のさらなる特徴は、以下の詳細な説明の過程で述べる、又は明らかになる。特許請求の範囲を、参照によりそのまま本明細書に援用する。
【００３６】
[0027]本発明をより明確に理解できるようにするために、以下、本発明の実施形態を、例として添付図面を参照して詳細に述べる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明のストリップチャネル実施形態による、細胞培養又は共培養用の基質を生成するためのマイクロ流体デバイスの主要構成要素を画定するための、パターン形成されたフィルムの概略図である。
【図１Ａ】分割された中央エリアと、１つの分割での山形の流れ制御特徴部とを示す、図１のパターン形成されたフィルムの変形形態の概略図である。
【図１Ｂ】Ｕ字形の中央エリアと、内側部チャネル内の不透過壁とを示す、図１のパターン形成されたフィルムの変形形態の概略図である。
【図１Ｃ】アクティブバルブにより側部チャネル内の改良された流体制御を可能にした、図１のパターン形成されたフィルムの変形形態の部分概略図である。
【図１Ｄ】本発明の実施形態による等軸の人工バイオインターフェース用の基質を形成するための、フィルムの第２の例及びビーズ床を備えるアセンブリ用のパターン形成フィルムの上側及び底側パターンの概略図である。
【図２Ａ】ポートを通した注入によって、本発明の実施形態による人工バイオインターフェースを生成するための方法の概略図である。
【図２Ｂ】ビーズ床の配置によって、本発明の実施形態による人工バイオインターフェースを生成するための方法の概略図である。
【図３】両方の側部チャネルに対するフェンスに沿って、ビーズ床充填物及び単独培養バイオウォールを有する図１のパターン形成されたフィルムの概略図である。
【図４】（Ａ）チャンバを拡大して示した、分割されたチャンバを有するチップパターンの概略図と、（Ｂ）本発明を実証するために生成された、このパターンを有するチップの画像と、（Ｃ）３対のポート間の６つの圧力制御ラインを有するチップとを示すパネルである。
【図５】（Ａ）チャンバ全体及びポートへのリードと、（Ｂ）チャンバ全体と、（Ｃ）チャンバの下流端部でのフェンスと、フェンスの拡大図を示す、それぞれ拡大した４つの顕微鏡画像のパネルである。
【図６Ａ】成長及び培養中にバイオウォールのインキュベーション及び撮像のために使用されるセットアップの概略図である。
【図６Ｂ】成長及び培養中にバイオウォールのインキュベーション及び撮像のために使用されるセットアップの写真である。
【図７】播種中に最適な流量を決定するために使用した実験の３つの画像のパネルである。
【図８Ａ】第１の側の細胞播種（８Ａ）及び両側の細胞播種（８Ｂ）に関する細胞播種手順を示す顕微鏡画像である。
【図８Ｂ】第１の側の細胞播種（８Ａ）及び両側の細胞播種（８Ｂ）に関する細胞播種手順を示す顕微鏡画像である。
【図９】細胞壁成長、及び生成された生存可能な培養物を示す、シーケンスタイムラプス顕微鏡画像である。
【好ましい実施形態の説明】
【００３８】
[0028]本明細書では、組織領域、領域間部分、及び環境又は第２の組織領域の個別の栄養供給を可能にする人工バイオインターフェース、並びに人工バイオインターフェースをモデリングする方法、及びキットが開示される。人工バイオインターフェースは、マイクロ流体デバイスに提供することができる。マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの流体透過性フェンスを備えたマイクロ流体チャンバを含み、流体透過性フェンスがチャンバを少なくとも３つの体積に分割する。これらの体積の少なくとも１つは、（少なくとも７５体積％、より好ましくは、少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９７％、９５％）の硬質粒子（ビーズ）の多孔床を含む。多孔床の少なくとも１つの周面が細胞培養のための足場を提供し、流体のために（少なくとも）３つのマイクロ流体経路が画定され、つまり３つの体積それぞれにマイクロ流体経路が１つずつ画定される。人工バイオインターフェースは、足場で成長した組織のバイオウォールをさらに備える。
【００３９】
[0029]当技術分野でよく知られているように、マイクロ流体デバイスを形成するための簡便な方策は、箔又はフィルムにレリーフパターンを生成し、このレリーフパターンの頂部に渡る層を結合して、パターン形成された表面を囲むことであり、それにより、レリーフパターンの凹部領域が、マイクロ流体成分のためのチャネル、キャビティ、及び開口部になり、パターンは、これらのチャネル及びキャビティの相互接続を定める。
【００４０】
[0030]図１は、本発明の一実施形態による、人工バイオインターフェースの形成に用いるフィルム１０のためのパターンの概略平面図である。フィルム１０のパターンは、人工バイオインターフェース用の凹形チャンバ１１を画定する。フィルム１０は、実質的に任意の適切な材料から形成することができる。低コストのプロセスによって永続的にパターン形成され、平坦なカバー表面と容易に結合され、平坦性が高くない表面又はよく合致した輪郭を有さない表面でさえ最小限の圧力、温度、及び時間で流体封止シールを形成する、非反応性プラスチック、金属、セラミックス、ガラス、及びそれらの材料の組合せが特に好ましい。さらなる有利な材料は、ガス透過性である又は選択的にガス透過性である。例えば、フィルム１０は、以下のものからなることがある。生体適合性ポリマー、例えばシロキサンベースのエラストマー、シロキサンベースのエラストマーの混合物、熱可塑性エラストマーＴＰＥ（オイルフリーのスチレンブロックコポリマーが好ましい）、ＴＰＥの混合物、１つ又は複数のＴＰＥと１つ又は複数の硬質熱可塑性相との混合物、環状オレフィンコポリマー、又はポリテトラフルオロエチレン；溶融シリカや石英ガラスなどのガラス；チタニア（すなわち二酸化チタン）などのセラミック；又は、遷移金属二カルコゲナイド（ＴＭＤ）、窒化ホウ素、若しくはグラフェンなどの原子的に薄い半導体。例えば粒子をドープする若しくは埋め込む、又は生体適合性ポリマー若しくは非生体適合性ポリマーを表面処理することによって、生体適合性ポリマー内部の金属、セラミックス、及びガラスの組合せも適用可能であり得る。パターン形成深さは、培養すべき細胞の平均直径の少なくとも２〜３倍（例えば２０〜５００μｍ）であることが好ましく、フィルム１０の厚さは、パターン深さの１．２〜１０倍であることが好ましい。
【００４１】
[0031]チャンバ１１の中央領域１２は、３つの側面をフェンス１４によって取り囲まれて示されているが、チャンバ１１を分割するためには２つの長手方向フェンスのみが必要とされる。チャンバ１１の端部にあるフェンス１４は、流体として導入される場合にビーズ床の堆積を制御するのに有用である。フェンス１４は、水性緩衝液、溶媒、細胞培地、及び同伴ガスマイクロバブル（例えばＣＯ２やＯ２）に透過性があるが、硬質ビーズ（ここでは「ビーズ床」）からなる充填材料を保定する。中央領域１２は、低い表面積と周長との比を有し、例えば、図示されている長方形の中央領域１２におけるように、幅又は高さ（エッチング深さによって定義される）の５倍超から２００倍超の長さで提供される。
【００４２】
[0032]フェンス１４は、チャンバ１１を、ストリップの形で、２つの側部チャネル１６ａ、ｂと中央領域（ＣＲ）１２とに分離する。側部チャネル１６ａ、ｂ及びＣＲ１２は、１組の２つの流体ポート１７（入口／出口）をそれぞれ有する。側部チャネル１６ａ、ｂの流体ポート１７は反転可能である（プロセスでの一時点での入口が、次の時点で出口になり得る）が、ビーズがポート１７を通してＣＲ１２に装填される場合、流体の圧力によるビーズの同伴を防ぐために（これは、床内でのビーズの保持の緩さに応じて必要とされることがあり、ビーズ床の侵食を回避する）、ＣＲ１２を通る一方向（図示されるように左から右へ）の流れを維持するのが好ましいことがある。代替として、ビーズ床がセットされた後、ＣＲ１２のポート１７にフィルタが結合されることがあり、ポートを双方向性にする。それぞれチャンバの両端にある３対のポートが示されているが、例示されるプロセスはいずれも、６つのポートすべてを必要とはしないことを理解されたい。
【００４３】
[0033]フェンス１４は、単一の接続されたフェンスとして例示されているが、３つのフェンスセグメントに相当し、１つはＣＲ１２と側部チャネル１６ａを分離し、１つはＣＲ１２と側部チャネル１６ｂを分離し、１つはＣＲ１２の端部をマークすることを理解されたい。同様に、端部フェンス１４は、ＣＲ１２と出口ポート１７（右）との間の連絡ライン内に設けることができ、例えば多孔性プラグとして取外し可能であり得る。フェンス１４の各フェンスセグメントは、同じビーズ床を保定するために提供されるので、共通の多孔性、組成、及び構造を有することができるが、１つの細胞培養物のために意図されたバイオウォールが細胞成長に関して特定の嗜好を有する場合、又は他のフェンスよりも高い流体力学抵抗を必要とする場合には、それに応じて各フェンスセグメントを提供することができる。ビーズ床とのアンカー細胞の一体化が様々な度合いで必要とされる場合、又は細胞のサイズが様々である場合、ビーズ床と、場合によってはフェンスとの両方を調整することが有利であり得る。
【００４４】
[0034]フェンス１４は、フィルム１０に適用されるレリーフパターンの一部であり、全深度ピラーのトラックからなることがある。例えば、各ピラーは同じ断面で、底部から頂部まで均一なプロファイルを有することがあり、（底部からの高さに応じて長さ及び幅を単調減少させた）先細りの断面を有する実質的に長方形の底部断面にすることができる。その理由は、先細りの断面をより簡単に且つ確実に形成することができるからである。しかし、形成が簡便であり、ビーズ床を保定するのに十分であり、十分に透過性のある任意の他の形状を代替として使用することもできる。フェンス１４の要素は、好ましくは０．１〜１０００μｍ、より好ましくは０．５〜２００μｍ、最も好ましくは０．５〜５０μｍの平均細孔相当直径を有するギャップを含む。フェンスギャップサイズは、パターン形成されたフィルムが使用されるビーズ直径を定め、平均ビーズ直径は、平均細孔直径よりも少なくとも５％大きいことが好ましいが、これらのビーズを保定するのに十分であり得るときには、ビーズのサイズの範囲、粒子のアスペクト比、及びフェンスギャップなどに応じて他の差が好ましいことがある。特に挿入方法がマイクロ流体的なものである場合、ビーズの直径は、最も小さい１０％が細孔又はギャップの等価直径よりも大きい直径を有する分散であることが好ましい。いくつかの用途では、フェンスギャップは、そのようなビーズの充填物（すなわちビーズ床）の流体力学的抵抗よりも大幅に低い、フェンス１４にわたる流体力学的抵抗を保証するように選択される。ビーズ床内への細胞のインターカレーションのために、平均細孔サイズは細胞の最小寸法よりも大きいことが好ましい。
【００４５】
[0035]図１Ａは、図１の第１の変形形態の一部を概略的に示す。本明細書では、異なる変形形態の同様の特徴は同じ参照番号で識別され、それらの特徴の説明は繰り返さない。変形形態どうしの相違点を示す場合にのみ、それらの特徴についてさらに説明する。各変形形態は独立した特徴であり、変形形態の各サブセットが、本発明の対応する実施形態である。
【００４６】
[0036]図１は、分割されていないＣＲ１２を示しているが、それぞれの機能化、サイズ、形態、又は他の特性を有するビーズを制御下で分布させるために、分割されたＣＲが望ましいこともあることを理解されたい。例えばＣＲの片側への送達を制御するために、均質なビーズ床が望まれる場合でさえ、分割されたＣＲ１２が望ましいことがあり、また、４つのポート１７でのタイミング制御した圧力変化によって、送達される流体の循環をより連続的に且つより良い分布で実現する場合にも、分割されたＣＲ１２が有利であり得る。フェンスで囲まれた領域の間に追加のフェンス１４及び追加のポート１７を提供することによって、コア及びシェル構造又は層状ビーズ床をセットすることができる。図１Ａの変形形態は、フェンス１４によって分離された２つの部分１２ａ、ｂに分割されたＣＲを特徴とするパターン形成されたフィルム１０の部分図である。ＣＲ１２ａ、ｂの分離により、２つの隣り合うビーズ床の形成が可能になり、各ビーズ床は、それぞれ異なるサイズ、形態、密度、表面処理、又は他の機能特性（の組合せ）のビーズを受け取ることができる。当然、３つ以上のビーズ床を形成することもできる。ＣＲを分割するフェンス１４は、ＣＲを取り囲むフェンス１４と同じ多孔性、組成、若しくは構造を有することがあり、又はより高い流体力学的バリアを提供することがある。
【００４７】
[0037]図１はチャンバ１１の滑らかな底面を示しているが、キャリア液体中で供給されるビーズのさらに大きな乱流を促すことが、ＣＲ１２（又はその一部）へのビーズの均一な充填に有利であり得る。様々な質量密度、サイズ、又は形態／流体抵抗を有するビーズの混合物が提供される場合、乱流はビーズ床の均質性を改良することができる。図１Ａには、ＣＲの部分１２ａでの流れ制御デバイスとして山形特徴部１８が示されている。山形特徴部１８は、乱流を促すために特に有用であり、これは、ビーズ床の充填のランダム化を改良することができる。特定の充填構成には乱流が有利であり得るが、粒子を所望の配置で分布させるためには、層流での粒子の自然な沈降及び選別を設計することもできることを理解されたい。代替として、山形１８と同様の流れ制御要素を使用して、流れ中の粒子の選別を高めることができる。山形１８及び他の流れ制御特徴部は、レリーフ高さが低い特徴部でよく、又は部分１２ａの全深度に延在することができ、例えばチャンバ１１の深さの０．５倍〜１倍である。
【００４８】
[0038]図１は、等しい寸法の２つの側部チャネル１６ａ、ｂを有する直線状の構成を示しているが、ＣＲ１２及び側部チャネル１６ａ、ｂに関して多様な構造的形状を提供することができることを理解されたい。図１Ｂは、外側部チャネル１６ａ及び内側部チャネル１６ｂを有する略Ｕ字形のＣＲ１２を備える変形形態を概略的に示す。本発明の各実施形態は、概して、ポート間に細長い流路を画定するＣＲを提供し、これらのポート間の長さは、他の２つの（平均）寸法よりも少なくとも２桁大きい。
【００４９】
[0039]図１は、等しい寸法の２つの側部チャネル１６ａ、ｂを示すが、ＣＲ１２及び側部チャネル１６ａ、ｂに関して多様な構造的形状を提供することができることを理解されたい。図１の実施形態は、側部チャネル１６ａ、ｂを画定する平行なフェンス１４を有するストリップを示すが、いくつかのバイオインターフェースは、対向するバイオウォール間の蛇行経路によって提供される変動性、又は周縁に沿った様々な点で厚さが変化する粘膜支持を必要とすることを理解されたい。図１Ｂに示される変形形態は、片側に沿って間隔が変化するそのような蛇行経路の概略的な例を示す。
【００５０】
[0040]図１Ｂはまた、側部チャネル１６ｂの中央空間から離れるように流れを向け、フェンス１４に当たる側部チャネル１６ｂの周縁に沿った流れを促す不浸透性壁１９の形態で、内側部チャネル１６ｂ内の流れ制御特徴部を含む変形形態を示す。他の図とは異なり、ＣＲにビーズ床２０が充填されて示されている。ＣＲ内に提供されるフェンスセグメントは、ポート１７への流体接続部に提供される。
【００５１】
[0041]図１Ｃは、側部チャネル１６ａ内に弁を組み込んだ変形形態を示す。２つの弁１５ａが示され、一方は伸張位置にあり、他方は収縮姿勢にある。軟質ＴＰＥの貫通穴を提供することによるサイドバルブ構成が当技術分野で知られており、例えば本出願人の国際公開第２０１７／０６６８６９号及び米国特許第９，４３５，４９０号で教示されている。可変の作動圧により、弁が側部チャネル１６ａを様々な程度で遮断し、これらの弁を使用して、側部チャネルを通過する流れ、及びフェンスのセグメント（又は培養後にフェンスと隣り合うバイオウォール）との相互作用を変えることができる。
【００５２】
[0042]図１の実施形態は、ＣＲ１２と側部チャネル１６ａ、ｂとの間に、パターン深さによって一方向で限定されるフェンス１４を提供するが、これは、所望のバイオウォールに十分な表面積を提供しないことがあり、又は人工バイオインターフェースの所望のアスペクト比、若しくは表面積と周長との比を提供しないことがある。図１Ｄは、図１の実施形態のさらなる変形形態による、パターン形成されたフィルム１０の上面及び底面を示す。図１Ｄでは、フィルムの片面１０ａが、表面の凹部として側部チャネル１６を提供する。凹部は多孔性フェンス１４で終端する。フェンス１４は、マイクロ多孔性膜又はナノ多孔性膜の形態で提供されることが好ましく、例えば本出願人の米国特許第９，４９８，９１４号又は国際公開第２０１７／０６６８６９号に教示されているように形成することができる。代替として、硬質ＴＰＥ膜を提供して所定のサイズにカットし、すでにパターン形成されている又は結合後にパターン形成される軟質ＴＰＥフレームに結合することができる。フレームは、膜の上面及び下面を部分的に覆うことができるが、少なくとも膜の大半を、フェンス１４として機能するように露出させたままにする。
【００５３】
[0043]フィルム１０又は意図された被覆層が柔らかすぎて変形を避けられない場合、１つ又は複数のスペーサ２２のアレイを提供して、側部チャネル１６が潰れないことを保証することができる。代替として、被覆層にスペーサ２２を設けることができる。いくつかの実施形態では、低圧での圧送及び流体再循環を提供するために、制御された量の潰れが望まれることがある。
【００５４】
[0044]２つのポート１７が、側部チャネル１６のための入口又は出口として機能するように面１０ａに設けられる。第３のポート１７は、フィルム１０の貫通穴であり、したがって凹部１２として画定されるＣＲと接続し、凹部１２は、面１０ｂからのみ見え、フェンス１４を介してアクセス可能である。面１０ｂのパターン形成は、ポート１７と流体連通する凹部１２を示す。凹部１２は、意図されるビーズ床の厚さの約半分であり、フィルム１０の第２の例は、２つの被覆層で組み立てられ、人工バイオインターフェースを支持するためのマイクロ流体チップを生成することを意図される。２つのパターン形成されたフィルム１０を組み立てるために、面１０ｂどうしが対面するが、ポート１７は凹部１２の両側にある。したがって、凹部１２を通る全流体経路は、第１のフィルム１０の面１０ａから始まり、第１のフィルム１０を通過して第１のフィルム１０の面１０ｂに進み、第１のフィルムと第２のフィルムの両方（それぞれの面１０ｂ）の凹部によって形成される凹部１２を渡り、次いで第２のフィルムの面１０ｂから面１０ａに進み、第２のフィルムの面１０ａから出る。その結果、どちらの側部チャネルも、側部チャネルをその片側で画定する単一のフィルムによって提供される両端に２つのポートを有し、中央領域は、各フィルムに画定された１つのポートを有する。２つの被覆プレートが必要とされ、ポートは、従来のように、組み立てられたチップの両側でチップの縁部に画定される。代替構成は、さらに多くのビアを使用し、（異なるパターンが形成された）フィルムを慎重に位置合わせして、すべてのポートをチップの片側に設ける。
【００５５】
[0045]上で例示したＣＲ及びその一部は、その両端に２つのポートのみを有するが、同伴される粒子による流体圧力を制御することが困難になるほどＣＲが長い場合、又はＣＲの異なる部分に粉末を注入することが好ましい場合には３つ以上のポートを設けることができることを理解されたい。そのような場合、ポートを入口又は出口のいずれかとして使用することができるように、粉末を伴わずに流体を抽出する働き又は粉末を注入する働きをするように、取外し可能な多孔性プラグをポート内で使用することが好ましいことがある。
【００５６】
[0046]図２Ａ、Ｂは、本発明によるパターン形成されたフィルムを使用したマイクロ流体構造を用いて人工バイオインターフェースを製造するための２つのプロセスの概略的な流れ図である。同一の方法ステップは同じ参照符号で識別し、それらの説明は繰り返さない。どちらの方法も、バイオインターフェースの製造で終了する。
【００５７】
[0047]図２Ａは、フェンスによって２つの側部チャネル（ＦＣ）及びＣＲに区分されたマイクロ流体チャンバを有するマイクロ流体チップの供給から始まる（ステップ３０）。フェンスは流体透過性であるがビーズを保定し、したがって平均細孔直径は０．８〜１００μｍであり、より好ましくは１〜２０μｍ、最も好ましくは５〜１０μｍである。チップは、図１又はその変形形態に記載されるようにフィルムにパターンを形成し、少なくともＦＣ及びＣＲを覆ってカバーを結合して、チャンバを囲むことによって提供することができる。カバーは、フィルムのパターンのポートに合致するように間隔を空けられた貫通穴又は再封止可能な穿孔対応の注入エリアを有することができ、この場合、ポートとこれらの特徴部との間で位置合わせが行われる。代替として、構造化されていないカバーを使用することができ、カバーにドリルで穴を開けることによってポートへのアクセスを提供することができる。
【００５８】
[0048]ビーズ床（大半が硬質粉末からなる充填物であって、少なくとも４分の３の粒子が少なくとも４つの隣り合う粒子に接触するように粒子密度が十分であり、細胞の平均直径と合致する平均直径を有する少なくとも１０％の細孔を有する）を、布地、官能化プラスチック、及びコラーゲンマットの上で細胞培養を支持するための足場として使用する利点の１つは、ビーズ床全体に様々なビーズを分布させる機能である。ビーズは、細胞付着、細胞栄養供給、及び細胞成長という主目的、又は細胞活性、シグナル伝達、若しくは排出のレポート、若しくはシグナル伝達分子や粒子を放出したり選択的に捕捉することによる細胞活性への変化の誘発という副次的な目的を達成する任意の機能により異なることがある。任意選択的なステップ３２で、少なくとも１つの粉末が提供され、この粉末は、既知のサイズ分布、組成、形態、及び充填密度を有する。粉末は少なくとも２つのセグメントに分割され、各セグメント（又は異なる粉末のセグメントの任意の混合）は、例えば、タンパク質、ポリマー、並びに生体適合性のある及び／又は細胞付着を促進する他の生化学若しくは有機生成物、検出プローブ（タンパク質、ＤＮＡ、アプタマー）、刺激剤（タンパク質、化学物質、薬物）の表面堆積によって独立して処理される。例えば、選択的成長阻害剤、成長調整剤、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、細胞発現の標的化された受容のための表面機能化、及び生体分子又は粒子の適時放出、遅延放出、又はトリガ放出である。トリガ放出処理は、ｐＨ、温度、照明、又は化学反応の変化に応じて、医薬製剤などの生体分子又は粒子の放出をもたらすことがある。独立して処理された粉末セグメントを（水性緩衝液などの）キャリア流体と混合することによって、様々な機能化された粒子を均一に且つランダムに分布させることができる。各粉末は異なる機能又は処理を提供することができるので、複数の粉末の複数のセグメントを提供することができる。処理（複数可）により、セグメントの表面形態（マイクロ／ナノ構造）を変えることができ、床は、生理環境をより良く再現する、又は細胞の付着及び構造化（バイオウォールを形成するための細胞の一次元、二次元、又は三次元配置）を促進する。
【００５９】
[0049]混合体の粒子の最大２５％は、ビーズ床によって提供される足場の安定性を損なうことなく他の機能性を提供することができる非硬質の（すなわちゼラチン状である、有意な液相若しくは気相を含む、又はマイクロ流体力学的せん断の下で変形するような軟質のエラストマー粒子を含む）粒子でもよい。混合体中の非硬質粒子（又は代替としてビーズ床の硬質粒子）は、レポータ、センサ、又は送達ビーズ、粒子、又は物体（機能成分）を含むことができる。ビーズ床は、バイオインターフェースの領域間部分において、これらの機能成分を所要の固定力によってインサイチュで確実に保定することができるようにする。機能成分は、領域間部分でインサイチュで感知される、外部から与えられる、又は時間と共に生じるｐＨ、化学的、熱的、圧力、又は同様のトリガなどによる放出制御又は選択的放出を提供することができる。ビーズ床の機能成分は、栄養供給ストリーム又は老廃物と相互作用して、シグナル伝達体を老廃物ストリームに放出し、又は反応物を吸収若しくは触媒して、例えば、レポート、感知、又は化学的放出を促進、調節、又は抑制することができる。細胞形態変化、タンパク質分泌及び放出、並びに遺伝子改変を検出するためのセンサが知られている。老廃物を監視することによって、実験の目的に応じて、バイオウォール、領域間部分、粘膜、又は環境の栄養供給の変化に関してフィードバックを提供することができる。
【００６０】
[0050]ステップ３４で、硬質粉末が、液体キャリア中で、ＣＲのポートを通してＣＲに供給される。チャンバのそれぞれのポートで圧力を遮断及び制御することによって、フェンス又はフィルタ付きのＣＲポートを通して液体キャリアを抽出して、粉末の損失を防止することができる。充填されたビーズ床を形成するためにＣＲを十分に満たすために、粉末の含有量が制御及び計量されることが好ましい。ビーズ床を有するＣＲの流体力学的抵抗を試験して、ビーズ床の密度を確認し、栄養補給に必要な圧力を確立することができる。
【００６１】
[0051]ステップ３６で、細胞培地において、未付着の生細胞がＦＣの少なくとも１つに供給される。培地は、反対側のＦＲのポート、又はＣＲのフィルタ付きのポートを通して（少なくとも部分的に）抽出することができ、フェンス付近のビーズ床の壁への未付着生細胞の堆積を促進する。代替として、流体を供給することができ、ビーズ床面（足場）への細胞の沈殿を時間通りに提供することができる。粉末の少なくとも１つのセグメントは、細胞の付着及び成長を促進するために選択的に選ばれた化合物で処理されることが好ましい。ステップ３８で、培地及び栄養素の循環によって細胞の栄養供給を提供することができる。細胞は成長し、連絡経路及び好ましくは天然の細胞応答を維持するバイオウォールを形成する。栄養供給は、チャンバの任意のポートを使用して提供することができ、有利には、ＣＲポート及びＦＣポートからの様々な培地又は栄養素を含むことができる。細胞の付着が確立されるまで、又はバイオウォールがある程度形成されるまで、細胞が足場に向かって連続的に引き寄せられることを保証するために、ＣＲ内ではＦＣよりもわずかに低い圧力を維持することが好ましいことがある。バイオウォールが１つのＦＣで形成された後、このプロセスを繰り返して、反対側のＦＣに第２のバイオウォールを生成することができる。両方のバイオウォールを同時に生成することもできる。
【００６２】
[0052]フェンスは、細胞成長のための足場としてではなく、ビーズ床のための境界として機能し、したがってビーズを保定する以外には最小限の要件を有することに留意されたい。細胞培養物が提供された後、境界は、ほぼ無意味になることがあり、又は流体圧力に対する安定性を保証するために依然として必要なこともある。したがって、フェンスを形成するために生体吸収性材料を使用することができる。
【００６３】
[0053]バイオウォールが形成された後、バイオウォールを薬剤、毒素、又は他の生体分子若しくは粒子にさらすなど、様々な実験を行うことができる。試験は、例えば循環する細胞培地をサンプリングすることによって実質的に非侵襲性でよく、細胞を変化させることなくシグナル伝達分子の産生を観察することができる。当然、検出された細胞シグナル伝達の変化に応じて、フィードバックプロセスに栄養供給レジームへの変更を加えることができる。撮像法又は他の方法でバイオウォールを検査して、細胞内成分細胞によるものか細胞外成分細胞によるものであるかをさらに決定することができる。いくつかの透明なマイクロ流体材料を用いると、インサイチュ撮像が可能になり得る。最後に、実験の終了時にバイオウォール又はその細胞を溶解させることができる。
【００６４】
[0054]図２Ｂは、図２Ａの方法の変形形態を示す流れ図であり、ビーズ床が異なる様式でセットされる。関連するチャンバを有する完全なマイクロ流体チップから開始するのではなく、関連するパターンを有するフィルムが提供される（ステップ４０）。ステップ４２で、任意選択的な粉末混合体が提供される。このステップはステップ３２と同一でもよいが、少量の粉末の凝集防止及び流量制御に流体搬送が便利であるにもかかわらず、流体キャリア内の混合体として提供されないこともある。粉末は、所望の寸法を有する平坦なテーブル若しくはモールドなどの成形ツールで予備成形する、若しくは部分的に固化することができ、又は押出機によって粉末をプレスすることができる。予備成形されたビーズ床は、エアポケットを回避し、配置中のビーズ床の付着性及び操作性を高めるために、液体で満たすことができる。予備成形は、表面処理の前又は後に行うことができ、表面処理により、粉末は、溶媒にさらされるまで容易に固化するのに十分な粘性を有することができ、又はより永続的に付着性を有することができる。予備成形された床としてＣＲに配置されるか、粉末の緩い床としてＣＲに配置されるかどうかにかかわらず、また、温度、圧力、若しくは任意の硬化剤の適用、又は任意の液体若しくは他のキャリアの除去が配置操作に含まれているかどうかにかかわらず、ステップ４６でＣＲにビーズ床がセットされる。その後、チャンバのポートにアクセスできるように少なくともチャンバを覆ってカバーを結合することによって、チャンバがカバーで封止される（ステップ４８）。カバーを結合する前にＣＲにアクセスすることは、特定のビーズ床及びビーズの形状に応じて、いくつかの利点及び欠点を有することに留意されたい。いくつかの実施形態では、ビーズ床は、カバーになるプラスチックフィルムに形成又は担持されることがあり、その場合、ステップ４６はステップ４８と同時である。
【００６５】
[0055]なお、いずれかのプロセスのステップ３６の前に、不混和性の流体をＣＲ及びＦＣに供給することによってビーズ床の表面を所望の深さまで機能化するために、制御下で処理を供給することができ、それにより、ＣＲ及びＦＣのポートでの圧力を変化させることで２種類の不混和性流体間の界面を制御する。これは、ビーズ床が予備成形されておらず、細胞が付着するビーズ床の表面を選択的に処理する機会が事前にない図２Ａの方法には特に好ましいことがある。
【００６６】
[0056]図２Ａ又は２Ｂの方法に従ってバイオインターフェースのための支持体を形成するために、パターン形成されたフィルム１０の任意の変形形態を同様に使用することができることに留意されたい。図１、１Ａ、１Ｂの例では、チャンバ１１のレリーフの深さが概して１ｍｍ未満であり、これにより、予備成形されたビーズ床の挿入がより困難になり得ることに留意されたい。図１Ａの特徴部１８は、ビーズ床が予備成形体として挿入される場合には不要であり、図２Ｂの方法で使用される可能性が低い。さらに、図１Ａに示されるように、分割された床の２つの部分を隔てるフェンス１４は、片側又は両側に予備成形ビーズ床が提供される場合には重要でないことがある。図１Ｂに示されるように、ＣＲが不均一の厚さを有する場合、予備成形体を位置合わせすることは特に困難になり得る。図１の実施形態は、長方形断面の粉末のリボン又はロッドの形態での予備成形体を必要とする。十分な機械的凝集力及び柔軟性を得るのは難しいことがあり、予備成形体を所定の位置に移動することは、流体注入に比べて難しいことがある。したがって、図２Ｂの方法は、概して図１Ｄの実施形態に最も良く適している。
【００６７】
[0057]図１〜１Ｃの例示された実施形態及び変形形態は平面状のマイクロ流体デバイスを示しているが、いくつかのバイオインターフェースは、理想的に平面状ではない領域間部分を有することを理解されたい。マイクロ流体デバイス（すなわち、パターン形成されたフィルム又はカバー）の少なくとも片側に関してエラストマー材料が使用され、カバーするフィルムの可塑性が高いと仮定すると、フィルムの平面状パターンをカバーの輪郭に適合させることができ、又はフィルムがカバーに結合された後にカバーを変形させることができる。パターンが非平面状（曲線状、二段曲線状、多段曲線状）の表面に適用される場合、エラストマーカバーは、その表面に適合して、封止されたマイクロ流体チャネルを形成することができる。平面状マイクロ流体チップの変形は、ビーズ床が設置される前又は後に行うことができる。
【００６８】
[0058]図３は、細胞の共培養物を有する人工バイオインターフェースの概略図である。特に、図３は、図２Ａ又は２Ｂの方法に従って、図１のパターン形成により形成されたチップ（カバーを取り外した状態）を示す。細胞５０ａ、ｂは、それぞれのバイオウォールを画定するビーズ床の各側で成長する。それぞれ機能化された５つの粉末２０ａ〜２０ｅを有するビーズ床が示されている。各部分は、細胞の付着及び成長を向上させるためにコーティングされた粒子、及びそれぞれ１組の抗体でコーティングされたレポートビーズを有することができる。
【実施例】
【００６９】
[0059]多様な人工バイオインターフェースを、バイオインターフェース基質（ビーズ床及びカバーを有するパターン形成されたフィルム）に生成することができる。例えば、（ｉ）血液脳関門のための初代脳微小血管内皮細胞及び星状細胞、（ｉｉ）胎盤−胎児インターフェースのための栄養膜及び臍帯静脈内皮細胞、（ｉｉｉ）肺の肺胞−毛細血管インターフェースのための肺胞上皮細胞及びヒト肺微小血管内皮細胞、（ｉｖ）幹細胞への内皮細胞の細胞質輸送、（ｖ）恒常性、組織修復及び発生のための任意の自己分泌及び傍分泌の細胞間相互作用など。
【００７０】
[0060]特に、本発明を、胎盤オンチップバイオインターフェースとして実証した。さらに、図３は、細胞共培養物のための胎盤オンチップバイオインターフェースの概略図とみなすことができる。細胞５０ａは、胎盤栄養膜細胞（ＪＥＧ−３）であり、細胞５０ｂは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。それぞれのビーズ床部分に関連するバイオマーカとしては、β−ｈＣＧ、ＧＬＵＴ１、ＩＧＦ１／２、及びＶＥＧＦが挙げられ、これらは、栄養素の移送に関する胎盤の機能性及び有効性を示す。第５の部分は、実験特有のモニタリング用に取っておく。したがって、上側の側部チャネル（ＦＣ）は胎児の流れをエミュレートし、下側のＦＣは母体の流れをエミュレートする。
【００７１】
[0061]パターン形成されたチップを作製するために、マイクロ流体力学的なパターン形成表面を生成し、適切な流れパラメータを決定するために特徴付けた。チャンバ、ポート、及び相互接続部を、硬質の多環式オレフィンポリマーであるＺｅｏｎｏｒ（商標）基質にパターン形成する。カバーは、オイルフリーのＭｅｄｉｐｒｅｎｅ（商標）から構成されており、これは、様々な基質への付着性に優れた熱可塑性エラストマーである。図４は、胎盤オンチップバイオインターフェースを生成するために、本発明を実証するために製造及び使用されたマイクロ流体チップを示すパネルである。具体的には、図４Ａは、分割されたチャンバ内のバイオインターフェースの拡大図を含むチップのコンピュータ援用設計（ＣＡＤ）であり、図４Ｂは、チャンバの２つのＦＣ及びＣＲの光学顕微鏡写真であり、図４Ｃは、６つの供給チューブに接続された６つのポートを有するチップの写真である。チップは側面を設けられ、すべての入口が左側にあり、すべての出口が右側にある。チャンバの長さは約１ｍｍであり、深さは約５０μｍである。
【００７２】
[0062]図５は、チップの４つの拡大図を示すパネルである。図５Ａは、チップ全体を１ｍｍスケール（倍率３０倍）で示し、図５Ｂは、領域間部分全体を５００μｍスケール（倍率１００倍）で示し、図５Ｃは、領域間部分の半分を１００μｍスケール（倍率４００倍）で示し、図５Ｄは、側部チャネルの流れ制御特徴部、及びフェンスの広がりを２０μｍスケール（倍率２０００倍）で示す。図５Ｂで最も良く見られる流れ制御特徴部は、ＦＣに沿って分散され、フェンスに向けて流れを方向付けることに留意されたい。図示されているフェンスは、長さが約２５μｍ、幅が約１０μｍ、及びピラー間の間隔が約５μｍの長方形ピラーからなる。ポートを、１／３２インチのＰＴＦＥチューブで接続する。
【００７３】
[0063]マイクロ流体デバイスを組み立てるために、パターン形成されたＺｅｏｎｏｒ基質をＥＣＭコーティングし、次いでＭｅｄｉｐｒｅｎｅ  ＯＦのパターン形成されていないフィルム（カバー）で封止し、そのフィルムに穴を開けて、ポートへの流体アクセスを可能にする。組み立てた後、ビーズの装填を行い、ＣＲを通してビーズ床を形成する。直径１０μｍのビーズを装填した。シリカビーズ又はポリスチレンビーズを使用し、性能面で顕著な相違はなかった。単分散ビーズを、Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．又はＢａｎｇｓ  Ｌａｂｓ．から購入した。
【００７４】
[0064]図６Ａは、１）細胞播種、２）図２Ａの方法によるビーズ床配置、３）細胞成長、及び４）実験のための流体供給のシステム図である。このシステムは、４つのコンピュータ制御されたシリンジポンプインジェクタ、２つのリザーバ、及びチップを含む。具体的には、この実施例では、ｅｎＭＥＳＩＳ（商標）ポンプシステム（ＣＥＴＯＮＩ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して、図４Ｃに示されるように、チューブによるチップのポートへのナノリットル量の流体の送達を制御した。図６Ａは、動作の制御及びステップの検証に有用な蛍光撮像装置を概略的に示し、図６Ｂは、蛍光顕微鏡の（温度／ＣＯ２制御された）細胞培養インキュベータ内のチップ及び流体供給システムを備える撮像システムを示す。
【００７５】
[0065]ＣＲを通したローダミンの流れの蛍光可視化を使用して、上側及び下側のＦＣを５ｎＬ／分で一定に保ちながら、ＣＲを通して供給されるＥＣＭコーティングのための十分な物質移動条件（５〜３０ｎＬ／分で変動）を決定し、最大流量は約１０ｎＬ／分であることが判明した。
【００７６】
[0066]上側及び下側の区画で細胞密度をより良好に制御するために、両方の集団の細胞播種を別々に行う。まず、ＥＭＥＭ培地（１×１０６細胞／ｍＬの濃度）内の胎盤ＪＥＧ−３細胞を、１０ｎＬ／分の流量で下側チャネル入口から装填し、ＰＢＳ及びＦ−１２培地を、１０ｎＬ／分でそれぞれ中央及び上側チャネルに流す。十分な細胞がピラーに固定された後、流れを１時間停止して、細胞をより良好に付着させる。その後、下側チャネルの流れを再開し、細胞を含まないＥＭＥＭ培地を入口から導入する。次いで、胎盤のＨＵＶＥＣ細胞を装填するときに、同じ手順を上側チャネルに適用する。細胞を、１×１０６細胞／ｍＬでＦ−１２培地に懸濁し、１０ｎＬ／分で上側チャネル入口を通して導入する。一方、１０ｎＬ／分での進入／放出操作により、中央チャネルを通してＰＢＳを流し、下側チャネルを通してＥＭＥＭを流す。十分なＨＵＶＥＣ細胞を装填した後（反対側のチャンバでのＪＥＧ−３細胞と同様）、上側チャネルで、細胞を含まないＦ−１２培地の流れが再開され、下側チャネルで、細胞を含まないＥＭＥＭ培地の流れが再開される。
【００７７】
[0067]同様に、図７に示されるように、（ＣＲを通る流れをゼロに保って）上側及び下側ＦＣの様々な流量でのローダミン灌流の蛍光可視化を検査して、領域間部分にわたる一定の栄養素濃度を維持するための十分な物質移動条件を特定した。上側ＦＣを通して１０ｎＬ／分、及び下側ＦＣを通して２ｎＬ／分が最適であることが判明した。
【００７８】
[0068]ＪＥＧ−３及びＨＵＶＥＣの細胞播種に続いて、ＣＲを静的に保持した状態で、胎盤側では１０ｎＬ／分、及び胎児側では２ｎＬ／分で、決定された流れプロファイルを実現する。次いで、細胞培養を、顕微鏡のＣＯ２インキュベータ内で進行させ、タイムラプス顕微鏡で２４時間監視した。得られた共培養物が図９に明確に示されており、ＨＵＶＥＣがピラー上に広がって、よく封止された単層を形成している。これは内皮生理学の典型例である。ＪＥＧ−３細胞は、より球状の形態を維持し、ＨＵＶＥＣとは反対側にあるそれぞれのピラーにも単層を形成した。また、圧密されたビーズ床は、より良好な細胞固定のための細胞培養面を提供し、どちらの細胞株も、ピラー構造から約５〜１０μｍの距離にある開いた細孔を通ってわずかに横切ったことは興味深い。これにより、従来の２Ｄ（２次元）平面培養とは対照的に、細胞によってインターカレートされた３Ｄ（３次元）共培養界面が得られた。実際、これにより、生化学的な刺激に応答した細胞間コミュニケーションを分析するための、より生理学的に重要な界面が得られる。
【００７９】
[0069]図８Ａ、Ｂは、２ステップ細胞播種プロセスの顕微鏡画像である。図８Ａは、下側チャネルに装填されたＪＥＧ−３細胞を示す。図８Ｂは、その後の灌流培養を可能にする、上側ＦＣに装填されたＨＵＶＥＣ細胞を示す。これらの実験は、充填されたビーズ床が存在しないときでさえ細胞装填を効果的に行うことができることを実証するために行ったので、ＣＲは空で示されている。前の図とは異なり、図８Ａ、Ｂは、流れが右から左に方向付けられて示されていることに留意されたい。
【００８０】
[0070]図９は、０時間、１２時間、２４時間の３つの時間ステップでのバイオウォール構築を示す３つの顕微鏡画像のパネルである。タイムラプス画像は、ビーズ床の足場にある細胞共培養物を示す。図９は、２４時間の期間全体にわたる健康で生存可能な培養物を示す。
【００８１】
[0071]抗体機能化されたビーズ床バイオインターフェースは、細胞間シグナル伝達バイオマーカの捕捉及び検出のためのバリア及び基質として働く。その後、本出願人は、ビーズ床内にレポータコーティングされた粒子を埋め込んで実験した。ビーズを抗ｈＣＧ抗体でコーティングした後、デバイスに装填した。Ｊｅｇ−３及びＨＵＶＥＣ細胞の細胞共培養に続いて、実験の過程中に、Ｊｅｇ−３によって放出されたｈＣＧをビーズ表面で捕捉する。共培養期間に続いて、その後、ＣＲを通して蛍光標識二次抗ｈＣＧ抗体でビーズ床を灌流する。得られる蛍光信号は、実験的刺激に応答した細胞間ビーズ床バリアへのｈＣＧ放出と相関している。
【００８２】
[0072]以下のそれぞれの内容全体を参照により本明細書に組み込む。
【００８３】
[0073]構造に固有の他の利点は、当業者には自明である。本明細書において実施形態を例示的に述べたが、特許請求される本発明の範囲を限定する意図はない。前述の実施形態の変形形態は、当業者には明らかになり、添付の特許請求の範囲によって包含されるように本発明者によって意図されている。
【図１】
2021513856.tif 000003
【図１Ａ】
2021513856.tif 000004
【図１Ｂ】
2021513856.tif 000005
【図１Ｃ】
2021513856.tif 000006
【図１Ｄ】
2021513856.tif 000007
【図２Ａ】
2021513856.tif 000008
【図２Ｂ】
2021513856.tif 000009
【図３】
2021513856.tif 000010
【図４Ａ】
2021513856.tif 000011
【図４Ｂ】
2021513856.tif 000012
【図４Ｃ】
2021513856.tif 000013
【図５】
2021513856.tif 000014
【図６Ａ】
2021513856.tif 000015
【図６Ｂ】
2021513856.tif 000016
【図７】
2021513856.tif 000017
【図８Ａ】
2021513856.tif 000018
【図８Ｂ】
2021513856.tif 000019
【図９】
2021513856.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月20日(2020.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオインターフェースをモデル化するための方法であって、
パターン形成されたマイクロ流体チップを提供するステップであり、前記チップが、
中央領域と、前記中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたチャンバで、前記分割が、流体透過性フェンスによって提供される、チャンバと、
前記チャンバの両端にある少なくとも２つのポート、並びに前記中央領域及び前記２つの側部チャネルのうちの１つのそれぞれにある少なくとも１つのポートを含む、少なくとも３つのマイクロ流体ポートと、を備える、ステップと、
ビーズ床を画定するために前記中央領域内に硬質ビーズの多孔性充填物を局在化させるステップであり、前記ビーズが、前記フェンスに流体が浸透する間に前記フェンスが前記ビーズを保定するのに十分な２〜３００μｍの平均サイズを有する、ステップと、
前記マイクロ流体ポートの対を通して細胞に栄養供給することによって、前記中央領域を１つの側部チャネルから隔てる前記フェンスの少なくとも１つのセグメントでバイオウォールを成長させるステップであり、前記バイオウォールが、前記ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成される、ステップと、
を含む方法。
【請求項２】
細胞の付着若しくは成長を改良するように、
標的分子若しくは粒子と選択的に結合するように、
標的分子若しくは粒子との結合をレポートするように、
分子若しくは粒子を選択的に放出するように、
光学的、熱的、電気的、磁気的、化学的、若しくは機械的な刺激に応答して、標的分子若しくは粒子を選択的に結合する、結合をレポートする、若しくは選択的に放出するように、又は
標的分子若しくは粒子を時間依存で選択的に結合する、結合をレポートする、又は選択的に放出するように、
前記ビーズの少なくとも第１の画分が処理されるか、
前記硬質ビーズの少なくとも第１の画分が、スチレン系ポリマーなどのポリマー、ガラス、金属、又はシリカなどのセラミックから構成されているか、又は
前記ビーズが、最大２５％の非硬質ビーズ、粒子、又は物体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チャンバを細胞付着促進コーティングでコーティングするステップと、前記ビーズの混合物を前記チャンバに導入することによって前記多孔性充填物を局在化させるステップと、少なくとも１つの細胞培養物を前記側部チャネルの少なくとも１つを通して播種するステップと、前記少なくとも１つの細胞培養物に栄養供給しながらインキュベートするステップとをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
硬質ビーズの多孔性充填物を局在化させるステップが、前記中央領域の前記ポートの１つを通して前記ビーズを液体キャリアに注入すると共に、他のポートの１つで流体を抽出することを含むか、
前記マイクロ流体チップのカバーが取り外された状態で、前記ビーズの圧縮された混合物を前記中央領域に配置することを含むか、
少なくとも２つの相を前記中央領域のそれぞれの部分に導入することを含み、各相が、前記ビーズ、又はそのようなビーズと任意の非硬質のビーズ、粒子、若しくは物体との混合物の部分集団の平均サイズ、平均形状、表面テクスチャ、機能化、組成、若しくはコーティングのうちの少なくとも１つに関して異なる特性を有するか、又は
異なる相を有する、前記フェンスに平行な層で、又は前記中央領域の１対のポート間の流れに垂直なラインで前記中央領域を区分する充填物を製造することを含み、前記区分は、それぞれの区分に追加のポートが提供される場合、フェンスによって更に分離されてもよい、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
人工バイオインターフェースを製造するためのキットであって、
パターン形成されたマイクロ流体表面であり、前記パターンが、中央領域と、前記中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたチャンバを画定し、前記分割が、流体透過性フェンスによって提供されている、マイクロ流体表面と、
前記中央領域内にビーズ床を形成するように構成された硬質ビーズ源であり、前記ビーズが、前記フェンスに流体が浸透する間に前記ビーズを前記フェンスが保定するのに十分である２〜３００μｍの平均サイズを有する、硬質ビーズ源と、
前記マイクロ流体表面のためのカバーであり、前記チャンバを囲むように寸法設定され、前記チャンバを周囲から封止するように構成されたカバーと、を備え、
前記パターン形成されたマイクロ流体表面及びカバーのうちの少なくとも１つが、少なくとも３つのマイクロ流体ポートを提供し、前記少なくとも３つのマイクロ流体ポートが、前記チャンバの両端にある２つのポートと、前記中央領域及び前記２つの側部チャネルのそれぞれにある少なくとも１つのポートとを含み、
前記フェンスは、平均細孔相当直径を有するギャップを含み、前記硬質ビーズの平均サイズは、前記平均細孔相当直径よりも少なくとも５％大きい、キット。
【請求項６】
例えば、光学的、熱的、電気的、磁気的、化学的、又は機械的な刺激に応答して、
細胞の付着若しくは成長を改良するように、
標的分子若しくは粒子と選択的に結合するように、
標的分子若しくは粒子との結合をレポートするように、又は
分子若しくは粒子を選択的に放出するように、
前記ビーズの少なくとも第１の画分が処理されるか、
前記ビーズの少なくとも第１の画分が、スチレン系ポリマーなどのポリマー、ガラス、金属、又はシリカなどのセラミックから構成されているか、
前記硬質ビーズの充填物が、少なくとも２つの相を有し、各相が、前記ビーズ、又はそのようなビーズと任意の非硬質のビーズ、粒子、若しくは物体との混合物の部分集団の平均サイズ、平均形状、表面テクスチャ、機能化、組成、若しくはコーティングのうちの少なくとも１つに関して異なる特性を有するか、又は
前記硬質ビーズの充填物が、最大２５％の非硬質ビーズ、粒子、又は物体を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記フェンスが、前記側部チャネル側から前記中央領域への貫通穴を有し、前記貫通穴は、前記ビーズのうち最も小さい１０％の平均直径よりも小さいか、
前記フェンスが、天然組織の幾何形状を模倣するのに適した形状を画定するように前記ビーズの充填物の境界を定めるための１次元、２次元、又は３次元の湾曲部を有するか、又は
前記フェンスが、２つの反対側のポート間の長さを有する前記パターン形成されたマイクロ流体チップを通る細長い流路としての前記中央領域を画定し、前記長さは、前記中央領域のエッチング深さ寸法よりも少なくとも２桁大きく、前記中央領域の幅の少なくとも２倍である、請求項５又は６に記載のキット。
【請求項８】
前記中央領域内に形成された前記ビーズ床、及び前記チャンバを囲んで封止する前記カバーと共に組み立てられる、請求項５〜７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
中央領域と、前記中央領域の側方に位置する第１及び第２の側部チャネルとに分割されたマイクロ流体チャンバであって、前記分割が、フェンスによって提供され、
前記中央領域が、硬質ビーズを含む多孔性充填物で満たされ、前記ビーズが、前記フェンスに流体が浸透する間に前記ビーズを前記フェンスが保定するのに十分な２〜３００μｍの平均サイズを有する、マイクロ流体チャンバと、
前記中央領域を１つの側部チャネルから隔てる前記フェンスのセグメントに沿って位置するバイオウォールであって、前記ビーズに培養された生細胞によって少なくとも部分的に形成される、バイオウォールと、
少なくとも３つのマイクロ流体経路であって、前記経路がそれぞれ、前記それぞれの側部チャネル又は中央領域に流体を供給するため及び前記それぞれの側部チャネル又は中央領域から流体を抽出するために、前記２つの側部チャネル及び前記中央領域のうちの１つにわたって延在する、マイクロ流体経路と、を備える人工バイオインターフェース。
【請求項１０】
前記フェンスが、前記側部チャネル側から前記中央領域への貫通穴を有し、前記貫通穴は、前記ビーズのうち最も小さい１０％の平均直径よりも小さいか、
前記フェンスが、天然組織の幾何形状を模倣するのに適した形状を画定するように前記ビーズの充填物の境界を定めるための１次元、２次元、又は３次元の湾曲部を有するか、又は
前記フェンスが、２つの反対側のポート間の長さを有する前記パターン形成されたマイクロ流体チップを通る細長い流路としての前記中央領域を画定し、前記長さは、前記中央領域のエッチング深さ寸法よりも少なくとも２桁大きく、前記中央領域の幅の少なくとも２倍である、請求項９に記載の人工バイオインターフェース。
【国際調査報告】
2021513856.tif 000021
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