(57)【要約】ヘプタメチンシアニンフルオロフォアコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体を開示する。コンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の使用方法も開示する。開示のコンジュゲートは、中性双性イオン分子であり、ほとんど凝集しないか、全く凝集しない。本開示は、ヘプタメチンシアニンコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体、ならびに前述のコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の作製方法および使用方法に関する。好都合なことに、開示のヘプタアミンシアニンコンジュゲートのいくつかの実施形態は、標的剤（例えば、抗体または受容体リガンドなどの生体分子）にコンジュゲートしたときに凝集に対して高い耐性を示す。
2021513968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＡ：
【化４０】
2021513968.tif 000043
のコンジュゲートもしくはコンジュゲート前駆体またはその立体異性体であって、
式中、ｐは、２、３、または４であり；
Ｒａは−（Ｒ１）ｑＣ（Ｏ）Ｒｃであり、ここで、ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
各Ｒｂは、独立して、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族であり；
Ｒｃは、標的剤含有基、
【化４１】
2021513968.tif 000044
（式中、ｙは１以上の整数である）、または−ＯＨであり；
Ｒ１は−ＣＲ２２−であり、ここで、各Ｒ２は、独立して、Ｈ、ハロ、必要に応じて置換された脂肪族、または必要に応じて置換されたアリールであり；
Ｒ３およびＲ４は、独立して脂肪族であり；
Ｒ１３〜Ｒ１６は、独立して脂肪族である、コンジュゲートもしくはコンジュゲート前駆体またはその立体異性体。
【請求項２】
各Ｒｂは、独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり；
Ｒ１は−ＣＲ２２−であり、ここで、各Ｒ２は、独立して、Ｈ、ハロ、必要に応じて置換されたアルキル、または必要に応じて置換されたアリールであり；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、アルキルであり；
Ｒ１１およびＲ１２は−ＳＯ３−であり；
Ｒ１３〜Ｒ１６は、独立して、アルキルである、請求項１に記載のコンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体。
【請求項３】
Ｒ１は−ＣＨ２−である、請求項１または請求項２に記載のコンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体。
【請求項４】
各Ｒｂは同一であり；
Ｒ３およびＲ４は同一であり；
Ｒ１３〜Ｒ１６は同一である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体。
【請求項５】
ｑは、２、３、または４である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体。
【請求項６】
（ｉ）Ｒ３およびＲ４はメチルであり；または
（ｉｉ）Ｒ１３〜Ｒ１６はメチルであり；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体。
【請求項７】
各Ｒｂはメチルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体。
【請求項８】
Ｒａは−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）Ｒｃであり、ここで、Ｒｃは標的剤含有基であり、前記コンジュゲートは、
【化４２】
2021513968.tif 000045
である、請求項１に記載のコンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体。
【請求項９】
Ｒｃは−Ｎ（Ｈ）Ａｂであり、ここで、Ａｂは抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｒｃは
【化４３】
2021513968.tif 000046
であり、前記コンジュゲート前駆体は、
【化４４】
2021513968.tif 000047
である、請求項１に記載のコンジュゲート前駆体またはコンジュゲート前駆体。
【請求項１１】
式ＩＩＡ：
【化４５】
2021513968.tif 000048
のコンジュゲートであって、
式中、ｐは、２、３、または４であり；
ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｘは、２、３、４、５、６、７、または８であり；
Ｒ１は−ＣＲ２２−であり、ここで、各Ｒ２は、独立して、Ｈ、ハロ、必要に応じて置換された脂肪族、または必要に応じて置換されたアリールであり；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族であり；
Ｒ１３〜Ｒ１６は、独立して、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族であり；
各Ｒｂは、独立して、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族であり；
Ｒｃは標的剤含有基である、コンジュゲート。
【請求項１２】
前記コンジュゲートは、
【化４６】
2021513968.tif 000049
であり、式中、ｘは、２、３、４、５、６、７、または８であり；
Ｒｃは−Ｎ（Ｈ）Ａｂであり、ここで、Ａｂは抗体である、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート；および
薬学的に許容され得るキャリア
を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
標的を含むか、含むと疑われる生物試料を、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲートと接触させる工程であって、Ｒｃが標的剤含有基であり、前記標的剤が前記標的を認識して結合することができる、接触させる工程；
その後に、選択された波長および選択された強度を有する光の量で前記生物試料を照射して前記コンジュゲートの蛍光を誘起する、照射する工程；および
照射した前記生物試料の蛍光を検出する工程であって、蛍光が前記生物試料中の前記標的の存在を示す、検出する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
前記生物試料の蛍光を検出する工程をｅｘ  ｖｉｖｏで実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物試料を前記コンジュゲートと接触させる工程を、前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物を被験体に投与することによってｉｎ  ｖｉｖｏで実施する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物試料を照射する工程が、前記被験体の標的領域を照射することを含み；
蛍光を検出する工程が、照射された前記標的領域の画像を得ることを含み、ここで、前記画像中の蛍光が前記標的領域中の前記標的の存在を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的が腫瘍であり、前記標的領域が前記腫瘍が位置する領域である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的剤が前記腫瘍の細胞を認識して結合することができ、前記生物試料を照射する工程が、前記被験体の標的領域を照射することを含み、蛍光を検出する工程が、前記標的領域中の腫瘍細胞の存在を示し、前記方法が、前記標的領域由来の蛍光腫瘍細胞を励起する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的剤が抗体である、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年２月１５日に出願された米国仮出願第６２／６３１，３９０号に対して先の出願日の利益を主張し、この米国仮出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は、ヘプタメチンシアニンフルオロフォアコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体に関する。フルオロフォアコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の作製方法および使用方法も開示する。
【０００３】
政府支援の謝辞
本発明は、政府支援を使用し、国立衛生研究所の国立がん研究所によるプロジェクト番号Ｚ０１  ＺＩＡ  ＢＣ０１１５０６の下で実施した。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
近赤外（ＮＩＲ）波長は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的過程の視覚化を容易にすることができる。フルオロフォア標識生体高分子の使用は、永続的戦略として基礎科学から応用生物医科学までの広い領域で使用されている。しかし、フルオロフォアコンジュゲーションは、フルオロフォアおよびフルオロフォアに結合した分子の両方の性質を変化させることが多い。具体的には、輝度、標的結合、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、および薬物動態学（ＰＫ）などの重要なパラメーターに影響を及ぼすことが多い。これらの問題の重要な要素は、色素凝集体の形成である。特に、フルオロフォア生体コンジュゲーションの一般的な結果としてＨ凝集体が生じ、これは、浅色（青方偏移）吸収帯の出現および蛍光強度の低下を特徴とする。
【０００５】
凝集を回避する一般的戦略は、複数のアニオン性スルホナート基を導入することである。しかし、色素のスルホン化は可視域のフルオロフォアでは非常にうまくいく戦略であるが、過スルホン化近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォアは、中程度の標識密度でさえも依然として凝集体を形成する傾向がある。ＮＩＲフルオロフォアは可視域の対応物より本質的に低発光なので、非発光性の凝集体の形成を回避する戦略が依然として差し迫って必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本開示は、ヘプタメチンシアニンコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体、ならびに前述のコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の作製方法および使用方法に関する。好都合なことに、開示のヘプタアミンシアニンコンジュゲートのいくつかの実施形態は、標的剤（例えば、抗体または受容体リガンドなどの生体分子）にコンジュゲートしたときに凝集に対して高い耐性を示す。
【０００７】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートもしくはコンジュゲート前駆体またはその立体異性体は、式ＩＡ：
【化１】
2021513968.tif 000003
の構造を有し、式中、ｐは、２、３、または４であり；Ｒａは−（Ｒ１）ｑＣ（Ｏ）Ｒｃであり、ここで、ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；各Ｒｂは、独立して、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族であり；Ｒｃは、標的剤含有基、
【化２】
2021513968.tif 000004
（式中、ｙは１以上の整数である）、または−ＯＨであり；Ｒ１は−ＣＲ２２−であり、ここで、各Ｒ２は、独立して、Ｈ、ハロ、必要に応じて置換された脂肪族、または必要に応じて置換されたアリールであり；Ｒ３およびＲ４は、独立して脂肪族であり；Ｒ１３〜Ｒ１６は、独立して脂肪族である。ある特定の実施形態では、各Ｒｂは同一であり；Ｒ３およびＲ４は同一であり；Ｒ１３〜Ｒ１６は同一である。前述の実施形態のいずれかでは、ｑは、２、３、または４であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、Ｒａは−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）Ｒｃであり得、ここで、ｑは、２、３、または４である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、Ｒｃは標的剤含有基であり、コンジュゲートは、以下の式ＩＩＡ（式中、ｘは、２、３、４、５、６、７、または８である）の構造を有する：
【化３】
2021513968.tif 000005
【０００９】
前述の実施形態のいずれかでは、（ｉ）Ｒ３およびＲ４はメチルであり得る；または（ｉｉ）Ｒ１３〜Ｒ１６はメチルであり得る；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、各Ｒｂはメチルであり得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｒａは−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）Ｒｃであり、ここで、Ｒｃは標的剤含有基であり、コンジュゲートは、
【化４】
2021513968.tif 000006
である。
【００１１】
前述の実施形態のいずれかでは、Ｒｃは−Ｎ（Ｈ）Ａｂであり得、ここで、Ａｂは抗体である。
いくつかの実施形態では、Ｒｃは
【化５】
2021513968.tif 000007
であり、コンジュゲート前駆体は、
【化６】
2021513968.tif 000008
である。
【００１２】
本開示のコンジュゲートの実施形態は、蛍光用途に有用である。いくつかの実施形態では、方法は、標的を含むか、含むと疑われる生物試料を、開示のコンジュゲートと接触させる工程であって、Ｒｃが標的剤含有基であり、標的剤が標的を認識して結合することができる、接触させる工程；その後に、選択された波長および選択された強度を有する光の量で生物試料を照射してコンジュゲートの蛍光を誘起する、照射する工程；および照射した生物試料の蛍光を検出する工程であって、蛍光が生物試料中の標的の存在を示す、検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、標的剤は抗体である。
【００１３】
生物試料を前記コンジュゲートと接触させる工程は、コンジュゲートまたはコンジュゲートを含む薬学的組成物を被験体に投与することによってｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。そのような実施形態では、生物試料を照射する工程は、被験体の標的領域を照射することを含み；蛍光を検出する工程は、照射された標的領域の画像を得ることを含み、ここで、画像中の蛍光が標的領域中の標的の存在を示す。ある特定の実施形態では、標的は腫瘍であり、標的領域は腫瘍が位置する領域である。いくつかの実施形態では、標的剤は腫瘍の細胞を認識して結合することができ、生物試料を照射する工程は、被験体の標的領域を照射することを含み、蛍光を検出する工程は、標的領域中の腫瘍細胞の存在を示し、方法は、標的領域由来の蛍光腫瘍細胞を励起する工程をさらに含む。
【００１４】
本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照することにより、以下の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【００１５】
本特許書類または本出願書類には、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または本特許出願の複製は、米国特許商標庁に必要な料金を支払って請求すれば得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本明細書中に開示のコンジュゲート前駆体の１つの実施形態の例示的な合成スキームである。
【００１７】
【図２】図２は、コンジュゲートの被験体への注射およびその後の被験体の標的化領域への所望の波長の光の標的化送達による、開示のヘプタメチンシアニンコンジュゲートの使用法の１つの実施形態を例示する概要図である。
【００１８】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中に開示のコンジュゲート前駆体（ＦＮＩＲ−タグ）（３Ａ）および市販の色素ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ色素（３Ｂ）の光酸化動態を示す。遊離色素を丸で示し、暗色コントロールを四角で示す。
【００１９】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブ（４Ａ）およびＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−パニツムマブ（４Ｂ）コンジュゲートの吸光度スペクトルである。
【００２０】
【図５】図５は、（１）ＦＮＩＲ−タグ（標識度（ＤＯＬ）４）、（２）ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ色素（ＤＯＬ４）、（３）ＦＮＩＲ−タグ（ＤＯＬ２）、および（４）ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ（ＤＯＬ２）で標識したパニツムマブのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００２１】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、１０％ウシ胎児血清／リン酸緩衝生理食塩水中における５００ｎＭのタンパク質濃度のＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブＤＯＬ４（６Ａ）およびＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−パニツムマブＤＯＬ４（６Ｂ）の吸収スペクトル（実線）および発光スペクトル（破線）を示す。
【００２２】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＰＢＳ（７Ａ）および５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳ（７Ｂ）中におけるＤＯＬ１、２、および４のＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブコンジュゲート（５００ｎＭ）の吸収スペクトルを示す。
【００２３】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＰＢＳ（８Ａ）および５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳ（８Ｂ）中におけるＤＯＬ１、２、および４のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−パニツムマブコンジュゲート（５００ｎＭ）の吸収スペクトルを示す。
【００２４】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ＰＢＳ（９Ａ）および５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳ（９Ｂ）中におけるＤＯＬ１、２、および４とのＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブコンジュゲート（５００ｎＭ）の発光スペクトルを示す。
【００２５】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＰＢＳ（１０Ａ）および５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳ（１０Ｂ）中におけるＤＯＬ１、２、および４のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−パニツムマブコンジュゲート（５００ｎＭ）の発光スペクトルを示す。
【００２６】
【図１１】図１１は、ＰＢＳ中における図７〜１０のコンジュゲートの蛍光（２５０ｎＭ有効色素濃度）の絶対量子収率を示す。
【００２７】
【図１２】図１２は、５０ｍＭでｐＨ７．４のＰＢＳ中におけるＦＮＩＲ−タグおよびＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷを用いたＤＯＬ４−パニツムマブコンジュゲートのＰｈａｎｔｏｍ  ＩＶＩＳ（登録商標）システムでのｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を示す。
【００２８】
【図１３】図１３は、尾部注射によって１００μｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグのパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕａｂ）コンジュゲート（ＤＯＬ２および４）で処置したマウスの腹部蛍光画像を示す。
【００２９】
【図１４】図１４は、尾部注射によって１００μｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグのパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕａｂ）コンジュゲート（ＤＯＬ２および４）で処置したマウスの背部蛍光画像を示す。
【００３０】
【図１５】図１５は、ＤＯＬ２（上のパネル）およびＤＯＬ４（下のパネル）についての腫瘍サイズに対して正規化した腫瘍シグナル（全波長照射輝度、全ての値×１０１０）を示す。
【００３１】
【図１６】図１６は、尾静脈注射によって１００μｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグのコンジュゲート（ＤＯＬ２および４）で処置したマウスの腹部画像の肝臓対バックグラウンド比を定量しているグラフである。
【００３２】
【図１７】図１７は、尾静脈注射によって１００μｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグのコンジュゲート（ＤＯＬ２および４）で処置したマウスの背部画像の腫瘍対バックグラウンド比を定量しているグラフである。
【００３３】
【図１８】図１８は、注射前、１００μｇ、１０μｇ、５μｇ、および１μｇのＤＯＬ４のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグの注射から４時間後、１日後、２日後、および７日後の時点のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスの背部蛍光画像を示す。
【００３４】
【図１９】図１９は、注射前、１００μｇ、１０μｇ、５μｇ、および１μｇのＤＯＬ４のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグの注射から４時間後、１日後、２日後、および７日後の時点のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスの腹部蛍光画像を示す。
【００３５】
【図２０】図２０は、１０μｇ、５μｇ、および１μｇのＤＯＬ４のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグのコンジュゲートの注射から４時間後、１日後、２日後、および７日後のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスについての腫瘍シグナル（全波長照射輝度、全ての値×１０９、腫瘍サイズに対して正規化）を示す一連のグラフである（＊ｐ＞０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３６】
【図２１】図２１は、１０μｇ、５μｇ、および１μｇのＤＯＬ４のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグのコンジュゲートの注射から４時間後、１日後、２日後、および７日後のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスについての腫瘍対バックグラウンド比を示す一連のグラフである（＊ｐ＞０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３７】
【図２２】図２２は、１０μｇ、５μｇ、および１μｇのＤＯＬ４のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグのコンジュゲートの注射から４時間後、１日後、２日後、および７日後のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスについての肝臓対バックグラウンド比を示す一連のグラフである（＊ｐ＞０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
本開示は、ヘプタメチンシアニンコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体、ならびに前述のコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の作製方法および使用方法に関する。好都合なことに、開示のヘプタアミンシアニンコンジュゲートのいくつかの実施形態は、標的剤（例えば、抗体または受容体リガンドなどの生体分子）にコンジュゲートしたときに凝集に対して高い耐性を示す。ある特定の実施形態では、コンジュゲートはまた、従来のヘプタメチンシアニンと比較して例外的に明るいｉｎ  ｖｉｖｏシグナルを示す。
【００３９】
Ｉ．定義および略語
以下の用語および略語の説明は、本開示をより的確に説明し、本開示の実施において当業者をガイドするために提供される。本明細書中で使用される場合、文脈上そうでないと明確に示されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、単数形「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、複数の参照事項を含む。用語「または」は、文脈上そうでないと明確に示されない限り、記述された代替の要素のうちの単一要素または２つもしくはそれより多くの要素の組み合わせをいう。
【００４０】
別段説明が無い限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示に属する当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似するかまたはそれらと等価である方法および材料を、本開示の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は、単なる例示に過ぎず、制限するものであることを意図していない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００４１】
別段の記述がない限り、数値範囲の開示は、終点を含め範囲内のそれぞれの個別の点に言及していると理解すべきである。別段の指示が無い限り、明細書または特許請求の範囲で使用される成分、分子量、百分率、温度、および時間などの量を表す全ての数値は、用語「約」で修飾されていると理解すべきである。したがって、暗示的または明示的に別段の指示が無い限り、あるいは、当業者が文脈を適切に理解して構成がより決定的であるとする場合を除き、記載される数値パラメーターは近似値であり、その近似値は、求められる所望の特性および／または当業者に公知の標準的な試験条件／方法下での検出限度に依存し得る。実施形態を考察した先行技術と直接的かつ明示的に区別する場合、用語「約」を記載しない限り、実施形態の数値は近似値ではない。
【００４２】
本明細書中に記載の種々の成分、パラメーター、操作条件などには代替物があるが、これらの代替物は必ずしも等価である、かつ／または等しく良好に実施されることを意味しない。別段の記載がない限り、代替物は好ましい順序で列挙されていることも意味しない。
【００４３】
化学分野の一般用語の定義を、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．  Ｌｅｗｉｓ，Ｓｒ．（ｅｄ．），Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．出版，２０１６（ＩＳＢＮ  ９７８−１−１１８−１３５１５−０）に見出すことができる。分子生物学における共通用語の定義を、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００（ＩＳＢＮ  ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  ０４７１１８６３４１）；ならびに他の類似の参考文献に見出すことができる。
【００４４】
本開示の種々の実施形態の再検討を容易にするために、特定の用語を以下に説明する。
【００４５】
脂肪族：実質的に炭化水素系の化合物、またはそのラジカル（例えば、ヘキサンラジカルについてはＣ６Ｈ１３）であり、脂肪族としては、アルカン、アルケン、アルキンが挙げられ、それらは、その環式バージョンを含み、さらに、直鎖および分枝鎖配置を含み、ならびに全ての立体異性体および位置異性体も含む。明確な別段の記載が無い限り、脂肪族基は、１〜２５個の炭素原子（例えば、１〜１５個、１〜１０個、１〜６個、または１〜４個の炭素原子）を含む。脂肪族鎖は、置換されていても、非置換であってもよい。「非置換脂肪族」と明確に言及しない限り、脂肪族基は、非置換であるまたは置換されているのいずれかであり得る。脂肪族基は、１つまたは複数の置換基（脂肪族鎖中の各メチレン炭素に対して最大２個までの置換基、または、脂肪族鎖中の−Ｃ＝Ｃ−二重結合の各炭素に対して最大１個までの置換基、または、末端メチン基の炭素に対して最大１個までの置換基）で置換されてよい。例示的な置換基には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシル、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノアルキル、アリール、アリールアルキル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、ジアルキルアミノ、ハロ、ハロ脂肪族、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール、ヘテロ環状脂肪族、ヒドロキシル、オキソ、スルホンアミド、スルフヒドリル、チオアルコキシ、または他の官能基が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
アルキル：飽和炭素鎖を有する炭化水素基。前記鎖は、分岐鎖、非分岐鎖、または環状鎖（シクロアルキル）であり得る。別段の指定が無い限り、アルキルという用語は、置換および非置換のアルキルを含む。
【００４７】
抗体：イムノグロブリン遺伝子またはイムノグロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされている１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。認識されているイムノグロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらに基づいて順に、イムノグロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥがそれぞれ定められる。鳥類および爬虫類では、ＩｇＹ抗体は、哺乳動物のＩｇＧと同等である。
【００４８】
イムノグロブリン（抗体）の基本構造単位は、一般に、四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う、約１００〜１１０個またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を定める。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００４９】
ＩｇＹ抗体の構造は、哺乳動物ＩｇＧの構造と類似し、２つの重鎖（「ν」鎖；およそ６７〜７０ｋＤａ）および２つの軽鎖（２２〜３０ｋＤａ）を有する。ＩｇＹ分子の分子量は約１８０ｋＤａであるが、しばしば、ゲル上では約３％の炭水化物の存在に起因してスメアとして泳動される。ＩｇＹ抗体の重鎖（Ｈ）は、４つの定常ドメインと、抗原結合部位を含む１つの可変ドメインから構成される。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」には、完全な（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリンおよびいくつかの十分に特徴づけられたフラグメントが含まれる。例えば、標的タンパク質（またはタンパク質もしくは融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂ、Ｆｖ、および一本鎖Ｆｖ（ＳＣＦｖ）もまた、前述のタンパク質（またはエピトープ）への特異的結合剤であろう。これらの抗体フラグメントを、以下のように定義する：（１）Ｆａｂ、抗体全体を酵素パパインで消化して完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を得ることによって生成された、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント；（２）Ｆａｂ’、抗体全体をペプシンで処理し、その後に還元して、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生成することによって得た抗体分子のフラグメント；１抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、その後の還元を行わないことによって得た抗体のフラグメント；（４）Ｆ（ａｂ’）２、２つのジスルフィド結合によって相互に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体；（５）Ｆｖ、２本の鎖として発現された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメント；および（６）単鎖抗体、遺伝的に融合した一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子。これらのフラグメントの作製方法は、ルーティンである（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」には、部位特異的コンジュゲーションを容易にするための１つまたは複数の非天然（すなわち、天然に存在しない）アミノ酸（例えば、ｐ−アセチル−フェニルアラニン）を含む抗体が含まれる。
【００５１】
本開示の方法で用いる抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル工程であり得、例えば、標的抗原などの標的に特異的に結合する。単なる例として、モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎの古典的方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７，１９７５）またはその派生的方法にしたがって、マウスハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体生成の詳細な手順は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
【００５２】
抗原：動物内での抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質（動物内に注射または吸収される組成物が含まれる）。抗原は、特異的な体液性免疫または細胞性免疫の生成物と反応する（異種免疫原によって誘導される生成物が含まれる）。本明細書中で使用される場合、「標的抗原」は、標的剤によって認識および結合される抗原（抗原のエピトープを含む）である。「特異的結合」は、排他的結合を必要としない。いくつかの実施形態では、抗原を、細胞または組織の抽出物から得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上の抗原である。抗原は、全長タンパク質である必要はない。使用が意図される抗原には、タンパク質の任意の免疫原性フラグメント（例えば、抗体が特異的に結合することができる少なくとも１つのエピトープを有する任意の抗原など）が含まれる。
【００５３】
アリール：別段の指定が無い限り、単一の環（例えば、フェニル）または少なくとも１つの環が芳香族である縮合多環（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｒｉｎｇｓ）（例えば、キノリン、インドール、およびベンゾジオキソールなど）（但し、結合点がアリール基の芳香族部分の原子を介し、且つ、結合点の芳香族部分がその芳香環内に炭素のみを含むことを条件とする）を有する６〜１５個の炭素原子の一価の芳香族炭素環式基。任意の芳香環部分がヘテロ原子を含む場合、前記基はヘテロアリールであり、アリールではない。アリール基は、単環式、二環式、三環式、または四環式である。別段の指定が無い限り、アリールという用語は、置換および非置換アリールを含む。
【００５４】
生物試料：本明細書中で使用される場合、「生物試料」は、被験体（例えば、ヒト被験体または動物被験体など）または他のタイプの生物（例えば、植物、細菌、または昆虫など）から得た試料をいう。被験体由来の生物試料には、細胞、組織、血清、血液、血漿、尿、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、または他の体液が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に開示の方法の特定の例では、生物試料は組織試料である。
【００５５】
コンジュゲート：直接または間接的に相互に連結されている２つまたはそれより多くの部分。例えば、第１の部分は、第２の部分に共有結合により連結されていてもよい。間接的な結合が、例えば、「リンカー」（２つの部分の間に配置された分子または原子群）の使用などによって、可能である。
【００５６】
有効量：本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、例えば蛍光によって、生物試料における検出に十分な量をいう。
【００５７】
エピトープ：抗原決定基。エピトープは、抗原性である、すなわち、特異的な免疫応答を惹起する、分子上の特定の化学基または連続もしくは不連続なペプチド配列である。抗体は、抗体の三次元構造および適合する（または同族）エピトープに基づいて、特定の抗原性エピトープに結合する。
【００５８】
Ｈ凝集：低蛍光または無蛍光である浅色性（すなわち、青色）スペクトルシフトをもたらす凝集（複数の分子の１つのクラスターへの形成）。
【００５９】
ハロゲン：ハロゲンおよびハロという用語は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、およびそのラジカルをいう。
【００６０】
リガンド：受容体に結合する分子であって、生物学的効果を有する分子。
【００６１】
近赤外（近ＩＲ、ＮＩＲ）：６５０〜２５００ｎｍの範囲内の波長。別段の指定が無い限り、本明細書中で使用される用語「近赤外」および「ＮＩＲ」は、６５０〜９００ｎｍの範囲内の波長をいう。
【００６２】
薬学的に許容され得るキャリア：本開示において有用な薬学的に許容され得るキャリア（ビヒクル）は従来存在する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ
ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００５）は、本明細書中に開示される１つまたは複数の標的剤−薬物コンジュゲートの薬学的送達に適切な組成物および製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を記載している。
【００６３】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして薬学的におよび生理学的に許容され得る流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなど）を含む注射用流体を含む。いくつかの例では、薬学的に許容され得るキャリアは、被験体への投与（例えば、非経口、筋肉内、または皮下注射による）に適切なように無菌であり得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与すべき薬学的組成物は、少量の非毒性補助剤（湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラート））を含むことができる。
【００６４】
薬学的に許容され得る塩：開示のコンジュゲートの生物学的に適合可能な塩であり、この塩は、当該分野で周知の種々の有機および無機の対イオンに由来し、例に過ぎないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびテトラアルキルアンモニウムなどが挙げられ；分子が塩基性官能基を含む場合、有機酸または無機酸の塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、およびシュウ酸塩など）の塩が挙げられる。薬学的に許容され得る酸付加塩は、生物学的にも他の点でも望ましくない酸パートナーにより形成されている一方で、遊離塩基の生物学的有効性を保持している塩（例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸など）および有機酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸など））である。薬学的に許容され得る塩基付加塩には、無機塩基由来の塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、およびアルミニウム塩など）が含まれる。例示的な塩は、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩である。薬学的に許容され得る非毒性有機塩基に由来する塩には、第一級、第二級、および第三級アミン、置換アミン（天然に存在する置換アミンを含む）、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、およびポリアミン樹脂など）の塩が含まれるが、これらに限定されない。例示的な有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７；６６：１−１９（本明細書において参考として援用される）を参照のこと）。
【００６５】
前駆体：中間体化合物。前駆体は、別の化合物を形成するための化学反応に関与する。本明細書中で使用される場合、用語「コンジュゲート前駆体」は、コンジュゲート（例えば、ヘプタメチンシアニン分子と標的剤とのコンジュゲート）の形成に有用な官能基を含む化合物をいう。
【００６６】
特異的結合パートナー：関与する分子の三次元構造に依存する特異的な非共有結合性相互作用によって相互作用する一対の分子のメンバー。特異的結合パートナーの例示的な対には、抗原／抗体、ハプテン／抗体、受容体／リガンド、核酸鎖／核酸相補鎖、基質／酵素、インヒビター／酵素、炭水化物／レクチン、ビオチン／アビジン（例えば、ビオチン／ストレプトアビジンなど）、およびウイルス／細胞受容体が含まれる。
【００６７】
置換基：反応の結果として分子内の別の原子と置き換わる、原子または原子群。用語「置換基」は、典型的には、親炭化水素鎖または親炭化水素環上の１つの水素原子または置換基が二重結合を介して結合する場合に２つの水素原子と置き換わる、原子または原子群をいう。用語「置換基」はまた、分子に対して複数の結合点を有する原子群を包含し得る（例えば、親炭化水素鎖または親炭化水素環上の２つまたはそれより多くの水素原子と置き換わる）。かかる例では、置換基を、別段の指定が無い限り、親炭化水素鎖または親炭化水素環に対して任意の空間的配向で結合させることができる。例示的な置換基には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルチオ基、アシル基、アルデヒド基、アミド基、アミノ基、アミノアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アリールアミノ基、カルボナート基、カルボキシル基、シアノ基、シクロアルキル基、ジアルキルアミノ基、ハロ基、ハロ脂肪族基（例えば、ハロアルキル基）、ハロアルコキシ基、ヘテロ脂肪族基、ヘテロアリール基、ヘテロ環状脂肪族基、ヒドロキシル基、イソシアノ基、イソチオシアノ基、オキソ基、スルホンアミド基、スルフヒドリル基、チオ基、およびチオアルコキシ基が含まれる。
【００６８】
置換された：１つまたは複数の置換基が基本化合物に連結されている、基本化合物（例えば、アリールまたは脂肪族化合物など）またはそのラジカルであって、各置換基が典型的には基本化合物上の水素原子と置き換えられている、基本化合物またはそのラジカル。単なる例示であり、制限ではないが、置換されたアリール化合物は、アリール基礎の閉じられた環に連結されている脂肪族基を有し得る（例えば、トルエンなど）。さらに、単なる例示であり、制限ではないが、長鎖炭化水素は、この炭化水素に結合したヒドロキシル基を有し得る。
【００６９】
スルホナート含有基：ＳＯ３−を含む基。スルホナート含有基という用語には、−ＳＯ３−基および−ＲＳＯ３−基（式中、Ｒは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである）が含まれる。
【００７０】
標的：開示の標的剤を含むコンジュゲートが特異的に結合することができる目的分子。標的の例には、組織試料中に存在するタンパク質および核酸配列が含まれる。標的領域は、標的分子が位置するか、または位置する可能性がある領域である。
【００７１】
標的剤：標的部位（例えば、被験体の体内の標的にされた位置（例えば、特定の器官、オルガネラ、生理学的系、組織、または病変部位（例えば、腫瘍、感染領域、または組織損傷領域など）など））への優先的または標的化された送達を促進する剤。標的剤は、種々の機序（例えば、標的部位内の選択的濃度など）または特異的結合パートナーへの結合により機能する。適切な標的剤には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質および他のグリコシル化分子、オリゴヌクレオチド、リン脂質、リポタンパク質、アルカロイド、ステロイドおよびナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標的剤には、抗体、抗体フラグメント、アフィボディ、アプタマー、アルブミン、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、ホルモン、酵素、免疫調節薬、受容体タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アビジン、およびナノ粒子などが含まれる。標的剤のうち特に有用なものは、抗体、核酸配列、および受容体リガンドであるが、特異的結合パートナーの任意の対をこの目的で容易に使用することができる。
【００７２】
ＩＩ．コンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体
ヘプタメチンシアニンフルオロフォアおよび標的剤または標的剤とのコンジュゲートの形成に適切な官能基を含むコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の実施形態を本明細書中に開示する。コンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体は、式Ｉまたはその立体異性体の化学構造を有する。
【化７】
2021513968.tif 000009
【００７３】
式Ｉに関して、ｍは、３、４、または５であり；ｎは、１、２、または３であり；各ｐは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。Ｒ１は−ＣＲ２２−であり、ここで、各Ｒ２は、独立して、Ｈ、ハロ、必要に応じて置換された脂肪族、または必要に応じて置換されたアリールである。Ｒ３およびＲ４は、独立して、脂肪族である。Ｒ５〜Ｒ１０は、独立して、Ｈまたは脂肪族である。Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、スルホナート含有基である。Ｒ１３〜Ｒ１６は、独立して、脂肪族である。Ｒａは−（Ｒ１）ｑＣ（Ｏ）Ｒｃであり、ここで、ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、Ｒｃは、標的剤含有基、
【化８】
2021513968.tif 000010
（式中、ｙは１以上の整数である）、または−ＯＨである。各Ｒｂは、独立して、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族である。前述の実施形態のいずれかでは、脂肪族は、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族であり得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、ｐ、Ｒａ、およびＲｃは上記のとおりであり；Ｒ１は−ＣＲ２２−であり、ここで、各Ｒ２は、独立して、Ｈ、ハロ、必要に応じて置換されたアルキル、または必要に応じて置換されたアリールであり；Ｒ３およびＲ４は、独立して、アルキルであり；Ｒ５〜Ｒ１０は、独立して、Ｈまたはアルキルであり；Ｒ１１およびＲ１２は−ＳＯ３−であり；Ｒ１３〜Ｒ１６は、独立して、アルキルであり；各Ｒｂは、独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキルである。前述の実施形態のいずれかでは、アルキルはＣ１〜Ｃ５アルキルであり得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、分子はコンジュゲートであり、Ｒｃは標的剤含有基である。標的剤は、抗体、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、ハプテン、または受容体リガンドであり得る。
【００７６】
ある特定の実施形態では、標的剤は抗体である。Ｒｃは、例えば、−Ｎ（Ｈ）Ａｂであり得、ここで、Ａｂは抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍バイオマーカー（例えば、腫瘍細胞内もしくは腫瘍細胞上でのみ見出されるタンパク質、または１つまたは複数のがんに関連する細胞表面受容体に対するタンパク質など）を認識して結合することができる。例えば、パニツムマブは、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）を認識して結合するヒトモノクローナル抗体であり；ＨＥＲ１は、多数の腫瘍型で過剰発現され、いくつかの炎症性疾患にも関連する。トラスツズマブおよびペルツズマブは、いくつかの乳がんで過剰発現される、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に結合するモノクローナル抗体である。ブレンツキシマブは、古典的ホジキンリンパ腫および全身性未分化大細胞リンパ腫で発現される細胞膜タンパク質ＣＤ３０を標的とするモノクローナル抗体である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、分子はコンジュゲート前駆体であり、Ｒｃは、
【化９】
2021513968.tif 000011
（式中、ｙは、１以上の整数である）、または−ＯＨである。
【００７８】
コンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体は、対称的に置換され得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は同一であり、Ｒ５およびＲ８は同一であり、Ｒ６およびＲ９は同一であり、Ｒ７およびＲ１０は同一であり、Ｒ１１およびＲ１２は同一であり、Ｒ１３〜Ｒ１６は同一である。
【００７９】
前述の実施形態のいずれかでは、Ｒ５〜Ｒ１０−はＨであり得、Ｒ１１およびＲ１２はスルホナート（−ＳＯ３−）であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、（ｉ）ｎは２であってよく、（ｉｉ）ｐは２、３、または４であってよく、（ｉｉｉ）ｑは２、３、または４であってよく、（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせであてよい。
【００８０】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体は、以下の式ＩＡの構造を有する。
【化１０】
2021513968.tif 000012
【００８１】
式ＩＡに関して、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３〜Ｒ１６、Ｒａ、およびＲｂは、前に定義したとおりであり；ｐは、２、３、または４である。
【００８２】
前述の実施形態のいずれかでは、（ｉ）Ｒ３およびＲ４はメチルであってよく、（ｉｉ）Ｒ１３〜Ｒ１６はメチルであってよく、（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方であってよい。前述の実施形態のいずれかでは、各Ｒｂはメチルであり得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体は、以下の式ＩＢの構造を有する。
【化１１】
2021513968.tif 000013
【００８４】
前述の実施形態のいずれかでは、Ｒａは−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）Ｒｃであり得、ここで、ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。ある特定の実施形態では、ｑは、２、３、または４である。
【００８５】
１つの実施形態では、化合物はコンジュゲート前駆体であり、ここで、Ｒｃはスクシンイミジル基を含み、コンジュゲート前駆体は、以下のＦＮＩＲ−タグである：
【化１２】
2021513968.tif 000014
。
【００８６】
いくつかの実施形態では、化合物はコンジュゲートであり、Ｒｃは標的剤含有基である。ある特定の例では、Ｒａは−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）Ｒｃであり、コンジュゲートは、以下である。
【化１３】
2021513968.tif 000015
【００８７】
いくつかの例では、Ｒｃは−Ｎ（Ｈ）Ａｂであり、ここで、Ａｂは抗体である。他の例では、Ｒｃは、ペプチド、核酸、またはナノ粒子を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、Ｒｃが本明細書中に開示の標的剤含有基である場合、１つを超えるヘプタメチンシアニンを、各標的剤にコンジュゲートすることができる。例えば、コンジュゲートの標識度（ＤＯＬ）は、１〜８（１〜６、１〜４、または２〜４など）であり得、ここで、ＤＯＬは、標的剤にコンジュゲートしたヘプタメチンシアニン部分の数である。標識度が２またはそれを超える場合、コンジュゲートは、以下の式ＩＩ、ＩＩＡ、またはＩＩＢの構造を有し得、式中、ｘは、２、３、４、５、６、７、または８である。
【化１４】
2021513968.tif 000016
【００８９】
例えば、ｘが３である場合、コンジュゲートは、以下の構造を有し得る。
【化１５】
2021513968.tif 000017
【００９０】
前述のコンジュゲートでは、Ｒｃは、本明細書中に開示の任意の標的剤であり得る。いくつかの例では、Ｒｃは−Ｎ（Ｈ）Ａｂであり、ここで、Ａｂは抗体である。他の例では、Ｒｃは、ペプチド、核酸、またはナノ粒子を含む。
【００９１】
多くのフルオロフォアと同様に、ヘプタメチンシアニンは、標的剤へのコンジュゲーションの際に非発光性の凝集体を形成する傾向がある。先行技術において過スルホン化戦略が使用されてきたが、一部の成功に終わっている。しかし、開示のコンジュゲートのいくつかの実施形態は、都合の良いことに、ほとんどまたは全く凝集しない。インドレニン窒素上の短いポリエチレングリコー鎖ルとＣ４’位の置換第四級アミンアルキルエーテルとの組み合わせ（正味で中性の双性イオン色素が得られる）により、高凝集耐性フルオロフォアが得られる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の対称的なコンジュゲートを、簡潔なシークエンスで調製することができ、このコンジュゲートは、モノクローナル抗体を中性ｐＨで効率的に標識し、標識密度が高い場合でさえＨ凝集しない。ある特定の実施形態では、コンジュゲートはまた、従来のヘプタメチンシアニン（市販のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷフルオロフォアなどの過スルホン化ヘプタメチンシアニンが含まれる）と比較した場合に、例外的に明るいｉｎ  ｖｉｖｏシグナルを示す。
【化１６】
2021513968.tif 000018
【００９２】
ある特定の例では、ＦＮＩＲ−タグの抗体コンジュゲートは、ＥＧＦＲ＋腫瘍担持マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ画像化研究において、同様に標識したＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷコンジュゲートと比較した場合に、優れた腫瘍取り込みおよび輝度を示した。さらに、開示のコンジュゲートの一定の実施形態は、従来のヘプタメチンシアニンコンジュゲート（ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ系コンジュゲートなど）と比較して肝臓取り込みが低い。概して、開示のコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の実施形態は、複雑かつ／または高密度の標識の用途のために優れた性質を示す。
【００９３】
ＩＩＩ．合成
開示のコンジュゲートおよびコンジュゲート前駆体の実施形態は、シアニンフルオロフォアから短く調整可能な（０．５ｇまで）合成シークエンスにて合成され、様々な用途のために官能化することができる。図１は、ＦＮＩＲ−タグ（コンジュゲート可能なスクシンイミジル基を含むコンジュゲート前駆体）の調製のための例示的な合成スキームを示す。アミン２（実施例１に記載のように、市販の材料から３工程で合成される）を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下で４’−クロロヘプタメチンシアニン１と反応させて、深青色のＣ４’−Ｎ結合ヘプタメチンシアニン３を得る。ワンポット反応では、ＦＮＩＲ−タグを、トリフルオロ酢酸中でヘプタメチンシアニン３を６０℃で撹拌し、それによりｔ−ブチルエステル基が除去され、Ｃ４’のＮ−からＯ−への転位を誘導することによって調製する。一般的なＮ−からＯ−への転位反応を以下に示し、ここで、ｘは整数であり、Ｒは、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、Ｙはヒドロキシルであり、Ｅは求電子剤であり、Ｂは塩基である。
【化１７】
2021513968.tif 000019
【００９４】
その後にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の過剰量のＮａＨＣＯ３およびヨウ化メチルを用いて完全アルキル化して、カルボン酸４およびメチルエステル５を収率２０〜３０％で形成させる。メチルエステル５をけん化して更なるカルボン酸４を得る。その後のコンジュゲーションのために、カルボン酸４をコンジュゲート可能な基に変換する。図１のスキームでは、カルボン酸４を、標準的な条件下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換し、これを本明細書中でＦＮＩＲ−タグと呼ぶ。
【００９５】
開示のコンジュゲート前駆体の実施形態を、分子コンジュゲートの調製分野の当業者に公知の従来の方法によって標的剤にコンジュゲートする。例えば、ＦＮＩＲ−タグを、コンジュゲート前駆体と抗体とを混合することによって抗体にコンジュゲートし、得られた溶液を、（例えば、室温で）コンジュゲーションさせるのに十分な時間インキュベートする。１つの例では、１０ｍＭのＦＮＩＲ−タグのＤＭＳＯ溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合し、２０ｍｇ／ｍＬのパニツムマブのＰＢＳ溶液と合わせる。合わせた溶液を、室温で１時間インキュベートした。いくつかの実施形態では、コンジュゲート前駆体は、抗体に対して標識度（ＤＯＬ）１を超えるようなモル過剰量で存在する。例えば、コンジュゲート前駆体を、平均ＤＯＬ２となるように２〜２．５モル過剰で抗体と組み合わせることができる。
【００９６】
ＩＶ．薬学的組成物
本開示はまた、本明細書中に開示の少なくとも１つのコンジュゲートを含む薬学的組成物を含む。薬学的組成物のいくつかの実施例は、薬学的に許容され得るキャリアおよび少なくとも１つのコンジュゲートを含む。有用な薬学的に許容され得るキャリアおよび賦形剤は、当該分野で公知である。
【００９７】
１つまたは複数のコンジュゲートを含む薬学的組成物を、例えば、投与様式および／または画像化すべき位置に応じた種々の方法で製剤する（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）ことができる。非経
口製剤は、薬学的および生理学的に許容され得る流体ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなど）である注射用流体を含み得る。賦形剤には、例えば、非イオン性可溶化剤（例えば、ポリオキシエチレン化ヒマシ油など）またはタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物など）が含まれ得る。所望する場合、投与すべき薬学的組成物はまた、非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラート）など）を含み得る。
【００９８】
薬学的組成物の形態は、選択される投与様式によって決定される。開示の薬学的組成物の実施形態は、実質的に任意の投与様式（例えば、局所、眼球、経口、口内、全身、経鼻、注射、経皮、直腸、膣などが含まれる）に適切な形態または吸入もしくはガス注入による投与に適切な形態を取り得る。一般に、開示の薬学的組成物の実施形態は、注射、全身、または経口で投与される。
【００９９】
有用な注射用調製物には、水性または油性ビヒクル中のコンジュゲートの無菌の懸濁液、溶液、または乳濁液が含まれる。組成物はまた、製剤用剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤など）を含み得る。注射用製剤は、単位剤形（例えば、アンプルまたは複数回用量容器）で与えられてよく、また、添加された保存剤を含んでいてよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態を取ってよく、また、製剤用剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）（例えば、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤など）を含んでいてよい。例えば、ボーラス注射または連続注入によって非経口投与を行うことができる。あるいは、コンジュゲートは、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌水）で再構成するための粉末形態であり得る。
【０１００】
全身用製剤には、注射（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内への注射）による投与のためにデザインされた製剤および経皮、経粘膜、経口、または肺への投与のためにデザインされた製剤が含まれる。
【０１０１】
経口用製剤は、液体（例えば、シロップ、溶液、または懸濁液）または固体（例えば、散剤、錠剤、またはカプセル）であり得る。経口用製剤を、内皮バリアを横断するための標的化リガンドと連結することができる。いくつかのコンジュゲート製剤を、例えば、ジサッカリドを使用した噴霧乾燥によって乾燥させて、コンジュゲートの粉末を形成することができる。固体組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤（例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など）を使用した従来の手段によって調製される。錠剤を、当該分野で周知の方法によって、例えば、糖、薄膜、または腸溶コーティングを使用してコーティングすることができる。かかる剤形の実際の調製方法は、当業者に公知であるか、明らかである。
【０１０２】
経口投与のための液体調製物は、例えば、エリキシル、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取り得る。かかる液体調製物を、薬学的に許容され得る添加物（例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ポリオキシエチレン化ヒマシ油、または分別植物油（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌｓ））；および保存剤（例えば、メチルｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）など）を使用した従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、緩衝塩、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤、および甘味剤を適宜含むことができる。経口投与用調製物を、周知のとおりに、フルオロフォアの制御放出をもたらすように適切に製剤することができる。
【０１０３】
直腸および膣の投与経路のために、コンジュゲートを、溶液（停留浣腸用）の坐剤または従来の坐剤基剤（例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなど）を含む軟膏として製剤することができる。
【０１０４】
経鼻投与または吸入もしくはガス注入による投与のために、コンジュゲートを、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フッ化炭素、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用した圧縮パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーまたはミストの形態で都合よく送達することができる。圧縮エアロゾルの場合、投薬単位を、定量を送達するための弁を提供することによって決定することができる。
【０１０５】
本明細書中に記載のコンジュゲートを含む薬学的組成物のある特定の実施形態を、正確な投薬量の個別投与に適切な単位剤形で製剤することができる。薬学的組成物は、所望する場合、１つまたは複数の、コンジュゲートを含む単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで与えられてよい。パックは、例えば、金属またはプラスチックの箔（例えば、ブリスターパックなど）を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスに、投与のための説明書を添付することができる。コンジュゲートの投与量は、少なくとも一部が、処置される被験体、標的（例えば、腫瘍のサイズ、位置、および特徴）、および投与様式に依存し、これは当業者に公知である。これらの範囲内で、投与すべき製剤は、コンジュゲートにＮＩＲ光を照射する場合に、検出可能（例えば、蛍光画像化によって）であるのに有効な量で、本明細書中に開示のコンジュゲートのある量を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、コンジュゲート以外の第２の治療剤を含む。前記第２の剤は、例えば、抗腫瘍剤または血管形成インヒビターであり得る。
【０１０７】
Ｖ．使用
開示のコンジュゲートの実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に適切である。都合の良いことに、蛍光を誘起するのに有効な量の、選択された波長および選択された強度を有する光で標的化のために照射した場合に、コンジュゲートは蛍光を発する。コンジュゲートのＤＯＬが１を超える場合、都合の良いことに、ＤＯＬ１のコンジュゲートと比較して蛍光が増加する。
【０１０８】
生物試料を、本明細書に開示される通りのコンジュゲートと、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることができる。コンジュゲートとの接触後、蛍光を誘起するために、生物試料に近赤外線を照射する。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの投与と近赤外照射の利用との間にある期間の時間を経過させ、それにより、コンジュゲートが標的部位に蓄積して標的部位に結合する時間を提供する。前記期間の時間は、数時間から数日（例えば、１〜７日間または１２時間〜２日間など）であり得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、生物試料中に存在するか、または存在すると疑われる標的（例えば、抗原または受容体）をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで直接または間接的に認識して結合することができる標的剤を含む。１つの実施形態では、生物試料を、コンジュゲートが生物試料中に存在する場合に近赤外蛍光を生じさせるのに適切な条件下で視覚化する。蛍光により、生物試料中の標的の存在も確認される。蛍光を検出するために試料を視覚化する前に、過剰な、結合していないコンジュゲートを、（例えば、組織試料を洗浄することによって）生物試料から除去することができる。
【０１１０】
１つの非限定的な例では、標的を含み得る生物試料（例えば、組織試料）を、標的を認識して結合することができる抗体を含コンジュゲートと接触させる。別の非限定的な例では、標的を含み得る生物試料を、標的を認識して結合することができる第１の抗体と合わせ；その後に、生物試料を、抗抗体抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含むコンジュゲートと接触させる。別の非限定的な例では、生物試料を、受容体に結合することができるリガンドを含むコンジュゲートと接触させる。例えば、置換基Ｒｃは、細胞表面上の受容体に結合することができる受容体リガンドを含み得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される通りのコンジュゲート、または該コンジュゲートを含む薬学的組成物の有効量を被験体に投与する。コンジュゲートの有効量は、被験体の標的化部分への近赤外範囲の波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用によって照射した場合に、検出可能（例えば、蛍光画像化によって）であるのに十分な量である。照射した場合にコンジュゲートがより多くの蛍光を生成することができるので、コンジュゲートが１を超えるＤＯＬを有する場合に、コンジュゲートの有効量を減少させることができる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、光源は、６５０〜９００ｎｍの範囲内の波長（例えば、６５０〜８００ｎｍまたは６８０〜７５０ｎｍの波長など）および１〜１０００ｍＷ／ｃｍ２の強度（例えば、３００〜７００ｍＷ／ｃｍ２など）を有する光を提供する。１つの実施形態では、光は、６９０ｎｍの波長および５００ｍＷ／ｃｍ２の強度を有する。別の実施形態では、光は、７４０ｎｍの波長および５００ｍＷ／ｃｍ２の強度を有する。有効量は、１０〜２５０Ｊの範囲（例えば、１０〜２００Ｊ、１０〜１５０Ｊ、または１０〜１００Ｊなど）であり得る。
【０１１３】
１つの実施形態では、被験体は腫瘍を有し、コンジュゲートは、腫瘍の抗原またはリガンド結合受容体を認識して結合することができる標的剤を含む。適切な腫瘍には、固形腫瘍塊（例えば、腹腔内腫瘍（例えば、卵巣、前立腺、結腸直腸）、乳房腫瘍、または頭頸部腫瘍など）が含まれるが、これらに限定されない。標的剤は、例えば、腫瘍抗原を認識して結合する抗体であり得る。有効量のコンジュゲート、その薬学的に許容され得る塩、または前記コンジュゲートを含む薬学的組成物は、任意の適切な手段（非経口投与、静脈内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、膣投与、または局所投与が含まれるが、これらに限定されない）によって被験体に投与される。投与されたコンジュゲートに、腫瘍の位置に隣接する領域へのＮＩＲ光の標的化利用によって照射する。
【０１１４】
図２を参照して、腫瘍１１０を有する被験体１００を、腫瘍細胞表面上の抗原または受容体を認識して結合することができる抗体またはリガンドを含むコンジュゲートを投与することができる。コンジュゲートの被験体への投与が、腫瘍の可視化および／または局在化を促進し得る。図２に示す例では、コンジュゲート１２０が、静脈内注射によって投与される。ある期間の時間を経過させ、その間に、抗体部分またはリガンド部分が腫瘍に結合するので、コンジュゲートが腫瘍部位に優先的に蓄積する。その後、被験体の標的部分に、外部光アプリケーター１３０を使用して、有効量の所望の波長のＮＩＲ光エネルギーを選択的に照射する。光アプリケーター１３０は、腫瘍１１０の領域に限定された標的領域に光活性化エネルギーを当てて、それにより、腫瘍の可視化を可能にする。いくつかの例では、光へ腫瘍を曝露する前に外科的切除によって腫瘍部位を露出させる。ガイダンスとして蛍光の領域を使用して、腫瘍を切除する。
【０１１５】
１つの実施形態では、前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物の有効量を被験体に投与する前に、腫瘍の少なくとも一部を被験体から切除する。１つの独立した実施形態では、前記コンジュゲートまたは前記コンジュゲートを含む薬学的組成物の有効量が、腫瘍またはその一部の外科的切除前に被験体に投与される。
【０１１６】
治療有効量の第２の剤を、コンジュゲートと共投与することができる。コンジュゲートおよび第２の剤を、個別に、または単一の組成物中で一緒に投与することができる。第２の剤を、同一の経路または異なる経路によって投与することができる。同時に投与する場合、コンジュゲートおよび第２の剤を、単一の薬学的組成物中で組み合わせてもよく、２つの薬学的組成物として同時に投与してもよい。第２の剤は、例えば、化学療法剤（例えば、抗腫瘍剤または血管形成インヒビターなど）、抗炎症剤、抗感染症剤、抗酸化剤、またはその任意の組み合わせであり得る。
【０１１７】
別の実施形態では、本明細書に開示される通りの特定のコンジュゲートは、被験体から得た組織試料に有効に結合する。コンジュゲートは、標的分子に結合することまたは標的分子と会合することができると考えられる標的剤をＲｃにおいて含む。１つの非限定的な例では、Ｒｃは、標的受容体に結合することができる受容体リガンドまたは抗体を含む。コンジュゲートを組織試料と合わせ、その後に試料に有効量の近赤外光を照射する。１つの実施形態では、組織試料を洗浄して過剰な、結合していないコンジュゲートを除去し、組織試料の蛍光を評価する。蛍光は、コンジュゲートが組織試料に結合していることを示す。
【０１１８】
式Ｉ、ＩＡまたはＩＢ（式中、Ｒｃは、スクシンイミジル基、マレイミジル基、またはジベンゾシクロオクチニル基を含む）のコンジュゲートの実施形態は、最適な標的剤へのカスタマイズされたコンジュゲーションに適切である。１つの非限定的な例では、腫瘍試料を被験体から得る。腫瘍上の抗原を特異的に認識して結合する抗体または腫瘍上の受容体を特異的に認識して結合するリガンドを、当業者に公知の方法によって調製する。次いで、調製した抗体またはリガンドを、選択されたコンジュゲート前駆体のＲｃと反応させて、被験体への投与に適切なカスタマイズされたコンジュゲートを得る。
【０１１９】
式Ｉ、ＩＡまたはＩＢのコンジュゲート前駆体は、選択された標的剤へのカスタマイズされたコンジュゲーションに適切である。１つの実施形態では、コンジュゲート前駆体を製薬会社が使用して、所望の標的剤を有するコンジュゲートが開発される。別の実施形態では、コンジュゲート前駆体を研究者または臨床研究者が使用して、研究目的で、または被験体を処置するためのカスタマイズされたコンジュゲートを開発するのに有用な所望の標的剤を有するコンジュゲートが開発される。
【０１２０】
ＶＩＩ．キット
キットも本開示の特徴である。キットの実施形態は、少なくとも１つの本明細書中に開示のコンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体を含む。１つの実施形態では、キットは、コンジュゲートを含み、ここで、Ｒｃは、標的剤（例えば、抗体またはリガンド）を含む。別の実施形態では、キットは、コンジュゲート前駆体を含み、ここで、Ｒｃは、
【化１８】
2021513968.tif 000020
（式中、ｙは１以上の整数である）、または−ＯＨを含み、
キットを、所望の標的剤を含むコンジュゲートを調製するために使用することができ、ここで、標的剤は、コンジュゲート前駆体と反応して、標的剤を含むコンジュゲートを提供することができる。いくつかの例では、コンジュゲート前駆体はＦＮＩＲ−タグである。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、キットはまた、コンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体を溶解または懸濁させることができる少なくとも１つの溶液を含む。キットはまた、１つまたは複数の容器（例えば、使い捨ての試験管またはキュベットなど）を含み得る。キットは、式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、またはＩＩＢのコンジュゲートを使用するための、および／または式Ｉ、ＩＡまたはＩＢのコンジュゲート前駆体から所望の標的剤を含むコンジュゲートを調製するための説明書をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、コンジュゲート前駆体または標的剤をコンジュゲートするために適切な試薬をさらに含む。
【０１２２】
キットのいくつかの実施形態では、コンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体を固体として提供し、溶液を液体形態で提供する。１つの実施形態では、溶液は、溶解したコンジュゲートを被験体に投与することができるように式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、またはＩＩＢのコンジュゲートを溶解させるのに適切である。１つの独立した実施形態では、溶液は、標的剤へのその後のコンジュゲーションのために式Ｉ、ＩＡまたはＩＢのコンジュゲート前駆体を溶解させるのに適切である。意図する用途に適切な濃度で溶液を提供することができる。あるいは、後で使用前に希釈される濃縮液として溶液を提供することができる。ある特定の実施形態では、コンジュゲートまたはコンジュゲート前駆体を、１つまたは複数の容器（例えば、バイアル、シリンジ、試験管またはキュベット）中に予め計量して入れる。
【０１２３】
ＶＩＩＩ．蛍光マーカーとして用いるためのヘプタメチンシアニン
蛍光マーカーとして用いるためのヘプタメチンシアニンの代表的な実施形態を、以下の番号をつけた項目に記載する。
【０１２４】
１．式ＩＩＩ：
【化１９】
2021513968.tif 000021
の化合物またはその立体異性体であって、
式中、ｍは、３、４、または５であり；ｎは、１、２、または３であり；各ｐは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｒ１は−ＣＲａ２−であり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロ、必要に応じて置換されたアルキル、または必要に応じて置換されたアリールであり；各Ｒ２は、独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはイソプロピルであり；Ｒ３およびＲ４は、独立して、アルキルであり；Ｒ５〜Ｒ１０は、独立して、Ｈまたはアルキルであり；Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、スルホナート、Ｈ、またはアルキルであり；Ｒ１３〜Ｒ１６は、独立して、アルキルである、化合物またはその立体異性体。
【０１２５】
２．Ｒ３およびＲ４は同一であり；Ｒ５およびＲ８は同一であり；Ｒ６およびＲ９は同一であり；Ｒ７およびＲ１０は同一であり；Ｒ１１およびＲ１２は同一であり；Ｒ１３〜Ｒ１６は同一である、項目１に記載の化合物。
【０１２６】
３．ｐは、２、３、または４である、項目１または項目２に記載の化合物。
【０１２７】
４．式ＩＩＩＡ：
【化２０】
2021513968.tif 000022
の項目１に記載の化合物であって、Ｒ１は−ＣＨ２−であり；ｍは３であり；ｐは、２、３、または４である、化合物。
【０１２８】
５．（ｉ）Ｒ３およびＲ４はメチルであり；（ｉｉ）Ｒ１３〜Ｒ１６はメチルであり；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、項目１〜４のいずれか１つに記載の化合物。
【０１２９】
６．式ＩＶ：
【化２１】
2021513968.tif 000023
の化合物またはその立体異性体であって、
式中、ｍは、２、３、４、または５であり；ｎは、１、２、または３であり；各ｐは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；Ｒ１は−ＣＲａ２−であり、ここで、各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロ、必要に応じて置換されたアルキル、または必要に応じて置換されたアリールであり；Ｒ２はＣ１〜Ｃ３アルキルであり；Ｒ５〜Ｒ１２は、独立して、Ｈまたはアルキルであり；Ｒ１３〜Ｒ１６は、独立して、アルキルであり；Ｒ１７はＣ１〜Ｃ３アルキルであり；Ｚは単原子イオンである、化合物またはその立体異性体。
【０１３０】
７．Ｒ５およびＲ８は同一であり；Ｒ６およびＲ９は同一であり；Ｒ７およびＲ１０は同一であり；Ｒ１１およびＲ１２は同一であり；Ｒ１３〜Ｒ１６は同一である、項目６に記載の化合物。
【０１３１】
８．ｐは、３、４、または５である、項目６または項目７に記載の化合物。
【０１３２】
９．式ＩＶＡ：
【化２２】
2021513968.tif 000024
の項目６に記載の化合物であって、Ｒ１は−ＣＨ２−であり；ｍは２であり；ｐは、３、４、または５である、化合物。
【０１３３】
１０．（ｉ）Ｒ１７はメチルまたはエチルであり；（ｉｉ）Ｒ１３〜Ｒ１６はメチルであり；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、項目６〜９のいずれか１つに記載の化合物。
【０１３４】
１１．各Ｒ２は、独立して、メチルまたはエチルである、項目１〜１０のいずれか１つに記載の化合物。
【０１３５】
１２．化合物が、
【化２３】
2021513968.tif 000025
である、項目１に記載の化合物。
【０１３６】
１３．化合物が、
【化２４】
2021513968.tif 000026
である、項目６に記載の化合物。
【０１３７】
１４．項目１〜１３のいずれか１つに記載の化合物；および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
【実施例】
【０１３８】
ＩＸ．実施例
一般的な材料と方法。別段の記載がない限り、オーブン乾燥させたガラス器具中で窒素またはアルゴン雰囲気下にて無水溶媒（活性アルミナカラムに通す）を使用して反応させた。全ての市販の試薬を、購入時の状態で使用した。Ｎ−［（３−（アニリノメチレン）−２−クロロ−１−シクロヘキセン−１−イル）メチレン］アニリン一塩酸塩ＸＸをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−ＣＯＯＨ色素およびＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−ＮＨＳ色素をＬＩ−ＣＯＲ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）から購入した。フラッシュカラムクロマトグラフィを、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆ  ２００ｉ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．）において逆相（１００Å、粒径２０〜４０ミクロン、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｒｆ  Ｇｏｌｄ（登録商標）逆相Ｃ１８またはＣ１８Ａｑ）およびシリカを使用して行った。高分解能ＬＣ／ＭＳ分析を、陰イオンモードのＩｏｎ  ＭＡＸ  ＡＰＩエレクトロスプレーイオン源を備えたＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＸＬハイブリッド質量分析計システムで行った。分析ＬＣ／ＭＳを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．から入手したＫｉｎｅｔｅｘ  ２．６μｍ  Ｃ１８  １００Å（２．１×５０ｍｍ）カラムを使用してＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳ−２０２０シングル４重極にて行った。運転には、０→９０％ＭｅＣＮ／０．１％ギ酸水溶液の勾配にて流速０．２ｍＬ／分で４．５分間を使用した。１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲのスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ分光計（４００もしくは５００ＭＨｚまたは１００もしくは１２５ＭＨｚ）で記録し、重水素化溶媒シグナルと比較して報告する。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのデータを、以下の通り報告する：化学シフト（δｐｐｍ）、多重度、結合定数（Ｈｚ）、および積分。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルのデータを、化学シフトに関して報告する。ＩＲスペクトルを、Ｊａｓｃｏ  ＦＴ／ＩＲ−４１００分光計で記録し、吸収の周波数（ｃｍ−１）に関して報告する。量子収率の測定値の吸収曲線を、ＵＶＰｒｏｂｅ  ２．３２ソフトウェアで操作するＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−２５５０分光光度計で実施した。蛍光軌跡を、ＦｅｌｉｘＧＸ  ４．２．２ソフトウェアで操作するＰＴＩ  ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ定常状態分光蛍光光度計にて、励起側スリット幅および発光側スリット幅５ｎｍ、積分速度０．１秒、および発光補正ありで記録した。データ解析およびカーブフィッティングを、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１１およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を使用して行った。Ｓ１２０ＶＣ標準Ｓｉ光ダイオードパワーセンサ（２００〜１１００ｎｍ、５０ｎＷ〜５０ｍＷ）を取り付けたＴｈｏｒｌａｂｓ  ＰＭ２００光強度・光エネルギー測定器を用いて光強度を測定した。フローサイトメトリーをＣＣＲ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）で行い、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）で顕微鏡法を行った。略語については、ＪＯＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｃ��ｏｎｙｍｓ  ｆｏｒ  ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｕｓｅｒｉｍａｇｅｓ／ＣｏｎｔｅｎｔＥｄｉｔｏｒ／１２１８７１７８６４８１９／ｊｏｃｅａｈ＿ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ．ｐｄｆ）を参照のこと。
【０１３９】
モル吸収係数および絶対蛍光量子収率の決定：  モル吸収係数（ε）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）または１：１（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、ベールの法則を使用して、吸光度対濃度のプロットから決定した。２５℃に維持した経路長１０ｍｍの石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ  １１１−ＱＳ）にて測定し、最高濃度での吸光度は０．２０以下であった。
【０１４０】
絶対量子収率（ΦＦ）を、Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−ＱＹ分光計（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，モデルＣ１１３７４）を使用して測定した。この機器は、試料によって吸収され、放出された光子を測定するための積分球を備えている。ＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中にて濃度５００ｎＭで測定し、機器のソフトウェアを使用して自己吸収を補正した。
【０１４１】
細胞培養：  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ過剰発現）ヒト乳がん細胞株を、ＮＣＩ  ＤＴＰ，ＤＣＴＤ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手した。細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１１ｍＭ  Ｄ−グルコース、２４ｍＭ重炭酸ナトリウム、１０％熱失活ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢを補充したＤＭＥＭで培養した。細胞を、２０％Ｏ２および５％ＣＯ２の雰囲気下にて３７℃で成長させ、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを含むＰＢＳでのトリプシン処理後に継代した。生物材料の分子試験のためにＦｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの動物健康診断研究所が細胞を評価した。その結果、細胞内に以下の病原因子は確認されなかった：エクトロメリアウイルス（ＥＣＴ）、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＨＶ）、マウスアデノウイルス（ＭＡＤ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．（ＭＹＣＯ）、ポリオーマウイルス（ＰＯＬＹ）、マウス肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、レオウイルス３（ＲＥＯ３）、センダイウイルス（ＳＥＮ）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）。
【０１４２】
動物腫瘍モデル：  ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインにしたがって行った。蛍光を、ＩＶＩＳ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｉｍａｇｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して長期的にモニタリングした。画像の取得および解析のためにＩｍａｇｅｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用した。麻酔導入室、画像化テーブル、および手順後回復ケージの下に加熱パッドを配置して、マウスの体温を画像化手順中３７℃に一定に維持した。全てのマウスを、導入室にて流速１リットル／分の濾過空気（０．２μｍ）を用いた３〜４分間の３％イソフルランで麻酔し、次いで、画像化のためにキャリアとしてＯ２を用いて流速１リットル／分で２％に改変した。以下のパラメーターを用いて、二次元静止画を取得した：励起フィルター７４５±１５ｎｍ、発光フィルター８００±１０ｎｍ、ｆ／ｓｔｏｐ２、中ビニング（８×８）、および自動曝露（典型的には、１〜６０秒）。５週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）から購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（５×１０６）を含む１００μＬのハンクス平衡塩類溶液を、マウスの右背側に皮下注射した。腫瘍サイズを４〜６ｍｍに到達するまで継続的にモニタリングした。マウスへの細胞注射１０日後からｉｎ  ｖｉｖｏ研究を開始した。
【０１４３】
データ解析：  ８００ｎｍ蛍光チャネルを使用したＰｅａｒｌ  Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して画像を得た。白色光画像を使用して、腫瘍を同定し、腫瘍、肝臓、および頸部（バックグラウンドとして使用）に関心領域（ＲＯＩ）を位置付けた。ＲＯＩの強度を、蛍光画像を使用した全波長照射輝度効率に基づいて測定し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して解析した。Ｐｒｉｓｍ８を使用して統計処理（対応のないｔ検定）を行った。
【０１４４】
実施例１
ヘプタメチンシアニンの合成および特徴づけ
【化２５】
2021513968.tif 000027
（３）：磁気撹拌棒を備えたマイクロ波バイアルに、インドレニン１（３．０ｇ、１０．８ｍｍｏｌ；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１２，２３：３５０）、ＭｅＣＮ（１２ｍＬ）、およびヨウ化物２（３．０ｇ、１０．８ｍｍｏｌ；Ｌａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９，２１：５５）を添加した。容器をアルゴン下で密封し、淡褐色スラリーを砂浴中で２２時間１２０℃まで加熱し、その間に反応物が深赤色／桃色に変化した。反応物を冷却し、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去した。水（１０ｍＬ）を赤色粗生成物に添加し、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ、０→３０％ＭｅＣＮ／水）によって精製した。生成物含有画分を合わせ、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去して、３（２．１ｇ、収率４５％）を粘着性の赤色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６では、エナミン：イミン互変異性体比９３：７として存在する）δ  ７．３８  −  ７．２９  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５２  −  ３．４３  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．４１  −  ３．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．２２  （ｓ，  ３Ｈ），  １．２６  （ｓ，  ６Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １６０．６，  １４５．７，  １３９．３，  １３５．７，  １２５．３，  １１９．４，  １０４．２，  ７４．７，  ７１．２，  ７０．１，  ６９．８，  ６９．６，  ６６．４，  ５８．０，  ４３．５，  ４１．９，  ２９．７；  ＩＲ  （薄膜）  ２９２１，  １７１５，  １６５０，  １６０４，  １４８６，  １３８２，  １１８２  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ１８Ｈ２８ＮＯ６Ｓ  （Ｍ＋Ｈ）＋の計算値３８６．１６３２、実測値３８６．１６３２。
【化２６】
2021513968.tif 000028
【０１４５】
（５、塩化物１）：磁気撹拌棒を備えたマイクロ波管に、インドレニン３（２．０７ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を含むエタノール（１４ｍＬ）および塩化物４（０．４５ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加した。容器を密封し、アルゴンでフラッシュした。次いで、トリエチルアミン（１．３７ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ）、および無水酢酸（１．８５ｍＬ、１９．６ｍｍｏｌ）を、シリンジによって連続的に添加した。黄色溶液を１２０℃まで３０分間加熱し、その間に反応物が深緑色に移行した。反応物を冷却し、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１７ｍＬ）を添加し、緑色残渣を逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８、０→３０％ＭｅＣＮ／水）によって精製した。生成物含有画分を凍結乾燥させて、５（１．０４ｇ、収率４６％）を緑色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．４９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．９１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．６０  −  ３．５７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５３  −  ３．５０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４８  −  ３．４４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４１  −  ３．３７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．２８  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．７５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．００  −  １．９１  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７７  （ｓ，  １２Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  １７５．６，  １５１．４，  １４５．７，  １４５．３，  １４３．６，  １４２．４，  １２９．０，  １２８．０，  １２１．３，  １１２．４，  １０４．２，  ７２．９，  ７２．１，  ７１．７，  ７１．４，  ６９．２，  ５９．１，  ５０．７，  ４６．１，  ２８．３，  ２７．４，  ２２．１．；  ＩＲ  （薄膜）  ２８６４，  １５４６，  １５０９，  １４２７，  １３８７，  １２３４，  １１５１  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）    Ｃ４４Ｈ６０ＣｌＮ２Ｏ１２Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ）＋の計算値９０７．３２７１、実測値９０７．３２６８。
【０１４６】
実施例２
コンジュゲート前駆体の合成および特徴づけ
【化２７】
2021513968.tif 000029
磁気撹拌棒を備えた２０ｍＬマイクロ波管に、ｔｅｒｔ−ブチル４−ブロモブチラート（４．８４ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）、３−アミノプロパノール（１０．０ｍＬ、１３１．６ｍｍｏｌ、６当量）、および乾燥ＴＨＦ（５．０ｍＬ）をアルゴン下で添加した。反応物を室温で２時間撹拌し、その時点で、ＬＣ−ＭＳ分析は出発物質の消費を示した。二相性反応混合物をブライン（１００ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮して、アルキル化生成物の粗混合物を得た。撹拌棒およびセプタムを備えた１００ｍＬ丸底フラスコ中の粗油状物質（３．８１ｇ）に、乾燥ＴＨＦ（１７ｍＬ）、Ｋ２ＣＯ３（２．７２ｇ、１９．７ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、アルゴンでフラッシュした。Ｃｂｚ−Ｃｌ（７．６ｍＬ、５３．７ｍｍｏｌ、３当量）を含むＴＨＦ（３．０ｍＬ）をアルゴン下で滴下し、反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。次いで、黄色懸濁液をロータリーエバポレーションによって濃縮し、水（５０ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）との間で分配した。層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で再度抽出した。有機層を合わせ、水およびブラインで洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。透明溶液をロータリーエバポレーションによって濃縮し、カラムクロマトグラフィ（４０ｇシリカ、０→６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、Ｃｂｚ保護リンカーＳ１を黄色油状物質として収率３６％（２．７３ｇ）で得た：１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  ７．３７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ７．３２  （ｍ，  １Ｈ），  ５．０９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．３２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．２５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１７  （ｔ，  ２Ｈ），  １．７６  （ｐ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．６７  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．４１  （ｓ，  ９Ｈ）    ｐｐｍ；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １７２．３４，  １５７．５６，  １３６．６５，  １２８．６６，  １２８．２１，  １２７．９９，  ８０．６１，  ６７．５８，  ５８．４６，  ４６．２６，  ４３．３９，  ３２．７３，  ３０．６０，  ２８．２０，  ２３．９７  ｐｐｍ；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）    Ｃ１９Ｈ３０ＮＯ５  （Ｍ＋Ｈ）＋  の計算値３５２．２１１８、実測値３５２．２１０８。
【０１４７】
Ｃｂｚ脱保護（２）：磁気撹拌棒を備えたマイクロ波管に、Ｐｄ／Ｃ（１０重量％、２７３ｍｇ）を添加し、次いで、密封し、アルゴンでフラッシュした。ＭｅＯＨ（２０ｍＬ、０．４Ｍ）に溶解したＳ１（２．７３ｇ、７．８ｍｍｏｌ）をアルゴン下で添加した。反応混合物を排気し、Ｈ２バルーンを用いて４回バックフィルし、次いで、Ｈ２雰囲気下で１時間撹拌し、その時点で、ＬＣ−ＭＳ分析はＳ１の完全消費を示した。反応混合物をセライトで濾過し、濃縮して、２を透明油状物質として収率５９％（９９３ｍｇ）で得、これを静置して固化した：１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ３．７８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．８５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．６１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．２４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．７４  （ｐ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．７０  −  １．６３  （ｍ，  ２Ｈ），  １．４２  （ｓ，  ９Ｈ）．  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  １７２．７，  ８０．２，  ６４．３，  ４９．９，  ４９．０，  ３３．２，  ３０．７，  ２８．０，  ２５．２．；  ＩＲ  （薄膜）  ３４１０，  １７２５，  １５００，  １３２２，  １２５４  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ１１Ｈ２３ＮＯ３  （Ｍ＋Ｈ）＋の計算値２１８．１７５１、実測値２１８．１７４２。
【化２８】
2021513968.tif 000030
【０１４８】
（３）：マイクロ波バイアルに、塩化物１（実施例１の化合物５）（９１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（０．５ｍＬ）を添加した。ｔｅｒｔ−ブチル４−（（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタノアート、２、（２６７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（９２μＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液にアルゴンを２分間噴霧した。反応物を１２０℃まで２５分間加熱し、その間に反応物は緑色から暗青色に移行した。反応物を冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（４ｍＬ）で希釈し、溶液を逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ  ｇｏｌｄ、０→４０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥させて、３（９１ｍｇ、収率４７％）を青色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．７１  −  ７．４８  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．１９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．５６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．３０  −  ４．１７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．８０  −  ３．５８  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．５３  −  ３．４６  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．４６  −  ３．３７  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．１７  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．４７  −  ２．４４  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．９４  −  １．８４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８６  −  １．７８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７７  −  １．６９  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５８  （ｓ，  １２Ｈ），  １．４２  −  １．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．３４  （ｓ，  ９Ｈ）．；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７３．０，  １７１．４，  １６９．７，  １４４．０，  １４２．９，  １４１．５，  １３９．３，  １２５．９，  １２４．６，  １１９．４，  １０９．５，  ９７．６，  ７９．８，  ７１．２，  ７０．３，  ６９．８，  ６９．７，  ６７．４，  ５８．１，  ５８．０，  ５４．４，  ５２．６，  ４７．６，  ４３．７，  ３２．１，  ３１．９，  ２８．５，  ２７．７，  ２４．５，  ２４．２，  ２１．６．；  ＩＲ  （薄膜）  ３４１３，  ２９２７，  ２８６９，  １７２２，  １５０７，  １３６４，  １２５４，  １１５５  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）    Ｃ５５Ｈ８２Ｎ３Ｏ１５Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ）＋の計算値１０８８．５１８２、実測値１０８８．５１３９。
【化２９】
2021513968.tif 000031
【０１４９】
（４）：丸底フラスコに、シアニン３（３４１ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（４．０ｍＬ）を添加した。赤色溶液を、アルゴン下で６０℃まで５分間加熱した。ＴＦＡを真空中で除去し、残渣を真空下に（０．１Ｔｏｒｒ未満）５分間おいた。ＤＭＦ（８．０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（１．３７ｇ）、およびヨウ化メチル（１．０μＬ）を添加し、反応物を６０℃まで４時間加熱した。反応物を冷却し、水で希釈し、溶液を逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ  ｇｏｌｄ、０→４０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥させて、４（１１０ｍｇ、収率３３％）および５（１００ｍｇ、収率３０％）を緑色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  １．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．２  ２Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．４４  −  ４．３０  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．０８  −  ３．９７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．７１  −  ３．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５３  −  ３．４７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４３  −  ３．３７  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．３４  −  ３．２７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．２３  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．１８  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．６３  −  ２．５３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４２  −  ２．３２  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．０６  −  １．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８６  −  １．７５  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６９  （ｓ，  １２Ｈ）；    １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７３．６，  １７２．２，  １６８．５，  １４５．２，  １４２．４，  １４０．１，  １３９．５，  １２６．０，  １２２．３，  １１９．７，  １１０．６，  １００．８，  ７３．５，  ７１．２，  ７０．３，  ６９．８，  ６９．７，  ６７．５，  ６２．２，  ６０．２，  ５８．０，  ５０．７，  ４８．６，  ４４．２，  ３０．８，  ２７．８，  ２３．９，  ２３．８，  ２０．７，  １８．０．；  ＩＲ  （薄膜）  ２８７４，  １７２１，  １５５７，  １５０６，  １３９２，  １３６０，  １２４８，  １１５１  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ５３Ｈ７９Ｎ３Ｏ３Ｓ２  （Ｍ＋２Ｈ）２＋の計算値５３０．７４７１、実測値５３０．７４４７。
【０１５０】
５のけん化。（１８２ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌棒および穿刺可能なセプタムを備えたシンチレーションバイアル中で１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏに溶解した。緑色溶液を０℃に冷却し、１Ｍ  ＮａＯＨ（５４０μＬ、４０当量）を滴下した。反応混合物を撹拌し、室温まで加温すると（２時間）、次第に黄色に変色した。次いで、反応混合物をギ酸（１．３ｍＬ）でクエンチし、その後に水（５．０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）を添加した。緑色溶液を逆相カラムクロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ  ｇｏｌｄ、１０→３０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製して、４を緑色固体として収率５６％（９８ｍｇ）で得た。
【化３０】
2021513968.tif 000032
【０１５１】
（ＦＮＩＲ−タグ）：１ドラムのバイアルに、シアニン４（２．２ｍｇ、０．００２１ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（０．５ｍＬ）を添加した。ＤＩＰＥＡ（０．７μＬ、０．００４ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（１．２ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を連続的に添加した。室温で３０分後、ＬＣ／ＭＳによってＮＨＳエステルへの完全な変換が認められた。反応物をジエチルエーテル（２ｍＬ）に逆に添加して、緑色沈殿物を得た。遠心分離後に固体を真空下に（０．１Ｔｏｒｒ未満）１時間おいて、ＦＮＩＲ−タグ（２．１ｍｇ、収率８８％）を緑色固体として得た。Ｃ５７Ｈ８２Ｎ４Ｏ１７Ｓ２（Ｍ＋２Ｈ）２＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値５７９．２５５５、実測値５７９．２５２５。
【０１５２】
ＦＮＩＲ−タグおよびＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷの性質を、以下の表１に示す。予想通り、Ｃ４’Ｏ−アルキルシアニンは、ＮＩＲ領域内にＩＲ−８００ＣＷ（７７４／７９５ｎｍ）に類似する吸収／発光極大（７６５／７８８ｎｍ）を十分に示す。両方の色素は、ＰＢＳ溶液中で類似の吸収係数（ε）、絶対量子収率（ΦＦ）、および輝度（ε×ΦＦ）を有し、遊離ＩＲ−８００ＣＷはわずかに輝度が高い。
【表１】
2021513968.tif 000033
【０１５３】
５ｍＭ  ＦＮＩＲ−タグおよびＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷのＤＭＳＯ保存液を、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈して１μＭ溶液にした。光安定性を、以前に記載の手順を使用して、光強度２０ｍＷ／ｃｍ２で７８０ｎｍ＋／−２０ｎｍ  ＬＥＤを使用して決定した（Ｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｃｉ  ２０１７，３：３２９）。図３Ａおよび３Ｂは、ＦＮＩＲ−タグのｔ１／２は１６．２２分、ｋ＝０．０４２７４（３Ａ）であり、ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷのｔ１／２は１５．５３分、ｋ＝０．０４４６３（３Ｂ）であることを示す。予想通り、両方の遊離色素は、類似の光安定性を有する。
【０１５４】
実施例３
ＦＮＩＲ−タグのパニツムマブとのコンジュゲーション
ＦＮＩＲ−タグと抗ＥＧＦＲｍＡｂであるパニツムマブとを、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にて２．２、４．４、および８．１のモル過剰でコンジュゲートして、標識度（ＤＯＬ）がそれぞれ１、２、および４（±０．２）の所望のリジン標識パニツムマブコンジュゲートを得た。全ての工程を、減光下で行った。１．５ｍＬ微量遠心管中の１００μＬの５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、２００μＬのパニツムマブ（２０ｍｇ／ｍＬの市販の保存液）を添加した。個別の１．５ｍＬ微量遠心管中に、ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−ＮＨＳ（ＤＯＬ１、２、および４についてそれぞれ１．５、２．９、６．１当量）またはＦＮＩＲ−タグ（ＤＯＬ１、２、および４についてそれぞれ２．２、４．４、８．１当量）の１０ｍＭ  ＤＭＳＯ保存液を１００μＬ  ＰＢＳと迅速に事前混合し、直ちにパニツムマブ溶液に移した。得られた混合物を穏やかにピペット操作し、反転し、室温で１時間インキュベートした。溶液を、ｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化したＺｅｂａ  ｓｐｉｎ  ＤＳカラム（７Ｋ  ＭＷＣＯ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶出して未反応の遊離色素を除去した。タンパク質から非特異的に結合した色素を除去するために、コンジュゲート溶液を２５℃にて暗所で１８時間インキュベートし、Ｚｅｂａ  ｓｐｉｎ  ＤＳカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィによって再度精製し（図４Ａ〜４Ｂ）、それにより、標識が若干減少した。ＮＨＳ−エステル標識研究のためにより塩基性のｐＨが従来使用されているが、特に、ｐＨ７．４で標識した場合により高い効率で標識が進行し、次いでｐＨ８．５であった。この所見は、ＦＮＩＲ−タグＮＨＳ−エステルの化学反応性の向上に起因し得、この向上はおそらく、電子求引性の第四級アミンの誘導効果が強いことに起因する。ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷコンジュゲート（ＤＯＬ１、２、および４）を用いた標識化試料を、１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ８．５）を使用して標識することによって得た。
【０１５５】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施して、色素の抗体との共有結合の存在を確認した。５μｇの各コンジュゲートした抗体を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に、１×ＭＥＳ  ＳＤＳ緩衝液中での非還元条件下でＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液および５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）の１：４（ｖ／ｖ）溶液を用いて２００Ｖで３５分間ロードした。ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、分子量比較のために使用した。蛍光画像を、Ｃｙ５励起を使用したＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）ＬＡＳ  ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カメラシステムを使用して得た。暴露時間は５０秒間であった。徹照（露光時間１秒間）を使用して白色画像を得、ＩｍａｇｅＪを使用して解析した。図５は、（１）ＦＮＩＲ−タグ（ＤＯＬ４）、（２）ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ色素（ＤＯＬ４）、（３）ＦＮＩＲ−タグ（ＤＯＬ２）、および（４）ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ（ＤＯＬ２）で標識したパニツムマブの結果を示す。
【０１５６】
これらのコンジュゲートの光化学的性質を、いくつかの方法によって解析した。タンパク質濃度が５００ｎＭの溶液が得られるように５０ｍＭ  ＰＢＳで希釈した後に吸収／発光曲線を得た。図６Ａおよび６Ｂは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液における５００ｎＭのタンパク質濃度のＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブＤＯＬ４（６Ａ）およびＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−パニツムマブＤＯＬ４（６Ｂ）の吸収スペクトル（実線）および発光スペクトル（破線）を示す。取得前に室温での３時間のインキュベーション時間が経過していた。コンジュゲートを１：１のＭｅＯＨ：５０ｍＭ  ＰＢＳで４０倍に希釈し、その吸収スペクトルを、２８０ｎｍの範囲で透明な３８４ウェルプレート（すなわち、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ＯｎｅのＵＶ  Ｃｏ−Ｓｔａｒ  μｃｌｅａｒ  ３８４ウェルプレート）を使用して、プレートリーダーにて記録した。図７Ａおよび７Ｂは、ＰＢＳ（７Ａ）および５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳ（７Ｂ）中におけるＤＯＬ１、２、および４のＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブコンジュゲート（５００ｎＭ）の吸収スペクトルを示す。図８Ａおよび８Ｂは、ＰＢＳ（８Ａ）および５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳ（８Ｂ）中におけるＤＯＬ１、２、および４（５００ｎＭ）のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−パニツムマブコンジュゲートの吸収スペクトルを示す（λ励起＝７３０ｎｍ）。図９Ａおよび９Ｂは、ＰＢＳ（９Ａ）および５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳ（９Ｂ）中におけるＤＯＬ１、２、および４のＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブコンジュゲート（５００ｎＭ）の発光スペクトルを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＰＢＳ（１０Ａ）および５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳ（１０Ｂ）中におけるＤＯＬ１、２、および４のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷ−パニツムマブコンジュゲート（５００ｎＭ）の発光スペクトルを示す（λ励起＝７４０ｎｍ）。図１１は、ＰＢＳ中におけるコンジュゲートの蛍光（２５０ｎＭ有効色素濃度）の絶対量子収率を示す。
【０１５７】
ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷコンジュゲートでは、ＤＯＬ１でさえも吸収スペクトルでの顕著なＨ凝集体ピーク（約７０５ｎｍ）の形成が明らかであり、これはより高いＤＯＬ２および４で悪化する（図８Ａ）。対照的に、ＦＮＩＲ−タグは、この標識密度範囲を通して顕著なＨ凝集体バンドを形成しない（図７Ａ）。注目すべきことに、この傾向は、血清タンパク質の存在下でも持続する（図６Ａ〜６Ｂ）。
【０１５８】
これらのコンジュゲートの蛍光発光に及ぼすＨ凝集の影響は劇的である。ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷの場合、ＰＢＳ中での抗体コンジュゲートの蛍光発光は、標識密度範囲にわたってほぼ一定であり、これは、フルオロフォアを付加しても個別の抗体コンジュゲートの輝度を増加させないことを意味している（図１０Ａ）。対照的に、ＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブコンジュゲートの発光は、標識密度が高いほど増加する（図９Ａ）。ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷコンジュゲートを５０：５０  ＭｅＯＨ：ＰＢＳで希釈してタンパク質を変性させることで、Ｈ凝集体ピークが消失し、コンジュゲートの発光が増加したことから（図８Ｂ、１０Ｂ）、この効果がＨ凝集の結果であることが実証される。
【０１５９】
これらのコンジュゲートの発光特性に及ぼす凝集の影響を、これらの異なって標識されたコンジュゲートの蛍光の絶対量子収率（ΦＦ）を測定することによって理解することもできる（図１１）。ＩＲ−８００ＣＷ−抗体コンジュゲートの場合、量子収率は、標識増加の関数として約９％から約２．５％まで減少した。対照的に、ＦＮＩＲ−タグのコンジュゲートの量子収率は、標識密度を増加させても遊離色素の値（１０％）をほぼ維持した。ｉｎ  ｖｉｖｏシステムでこれらのコンジュゲートの相対輝度を試験するために、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＩＶＩＳ（登録商標）画像化システムでファントム画像化を行った。図１２は、５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＤＯＬ４−パニツムマブコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を示す。ＦＮＩＲ−タグのＤＯＬ−４抗体コンジュゲートは、同様に標識されたＩＲ−Ｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷのコンジュゲートに必要な濃度（１〜５μｇ／ｍＬ）より低い濃度（０．５μｇ／ｍＬ）で容易に視覚化することができた。
【０１６０】
実施例４
マウスにおけるＦＮＩＲ−タグ−パニツムマブコンジュゲートの生体内分布
上記のデータは、ＦＮＩＲ−タグがｉｎ  ｖｉｖｏでＩＲ−８００ＣＷと比較して好ましい蛍光特性を有し得ることを示唆した。色素凝集の減少は、薬物動態に影響を及ぼすことが推測された。２つのコンジュゲートの輝度を比較するために、右側腹部にＥＧＦＲ＋腫瘍を移植した胸腺欠損ヌードマウスを使用してｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を行った（ｎ＝５／群）。マウスの尾部に、１００μｇのＤＯＬ２または４のパニツムマブのＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷまたはＦＮＩＲ−タグコンジュゲートのいずれかを注射した。背部および腹部の蛍光画像を、注射から０時間後、１０分後、２４時間後、４８時間後、および１週間後に記録した。ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷの腹部および背部の蛍光画像を、図１３および１４に示す。
【０１６１】
図１５は、ＤＯＬ２（上のパネル）およびＤＯＬ４（下のパネル）についての腫瘍サイズに対して正規化した腫瘍シグナル（全波長照射輝度、全ての値×１０１０）を示す。全ての対の列は、統計的に差がある（ｐ＜０．００１）。腫瘍内の両フルオロフォアのピーク蓄積では（４８時間）、ＦＮＩＲ−タグの放射輝度アウトプットは、ＤＯＬ２で２．５倍、ＤＯＬ４で７．１倍であった。最初の１０分の時点で、ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷコンジュゲートの肝臓取り込みは、ＦＮＩＲ−タグコンジュゲートよりも有意に高かった（図１６）。しかし、１００μｇの用量では、腫瘍対バックグラウンド比（ＴＢＲ、頸部で取得）は、この時間経過にわたって識別不可能であった（図１７）。この用量は、この新規のより明るい色素のコンジュゲートのためではなく、ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷコンジュゲートのために以前に最適化されたものであったので、後者の所見はおそらく驚くべきものではない。
【０１６２】
ＦＮＩＲ−タグコンジュゲートの最適用量を画定することを目的とした用量漸減研究を行った。以前の研究で使用された用量の下限にまたがる３つの用量（１０μｇ、５μｇ、および１μｇ）を試験した。腫瘍担持マウスの背部および腹部の画像（それぞれ図１８および１９）を、１０、５、および１μｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷおよびＦＮＩＲ−タグのコンジュゲート（ＤＯＬ４）（ｎ＝４／群）の尾部注射前、０、４時間後、１日後、２日後、および７日後に収集した。この投薬量範囲にわたってＦＮＩＲ−タグコンジュゲートを使用したシグナルは明確に識別可能であった一方で、ＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷコンジュゲートの腫瘍シグナルは、５μｇ未満では視覚化できなかった。画像の定量化では、図２０のほぼ全ての研究においてＦＮＩＲ−タグコンジュゲートからは有意により高い蛍光強度が認められた（全波長照射輝度、全ての値×１０９、腫瘍細胞に対して正規化）（＊ｐ＞０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。２日目から開始して、１０μｇ、５μｇ、および１μｇの用量のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷコンジュゲートと比較したＦＮＩＲ−タグコンジュゲートの腫瘍対バックグラウンド比は有意な改善が観察され、その値は、用量５μｇで７日目に５．７８に到達した（図２１（＊ｐ＞０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１））。４時間時点および１日時点での１０μｇおよび５μｇの用量のＩＲＤｙｅ（登録商標）−８００ＣＷのコンジュゲートでは、肝臓対バックグラウンド比は劇的により高いことが観察された（図２２（＊ｐ＞０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１））。ＦＮＩＲ−タグ抗体コンジュゲートが肝胆汁取り込みを受けにくいという所見は、特にこの領域での事象を視覚化しようとする例において、顕著な利用価値がある可能性が高い。
【０１６３】
実施例５
開示のコンジュゲートでの腫瘍可視化
腫瘍を有する被験体を同定し、選択する。被験体を、臨床所見に基づき、そして／または腫瘍の存在を証明するための試験を行うことによって選択することができる。
【０１６４】
本明細書に開示される通りのコンジュゲート、その薬学的に許容され得る塩、またはその薬学的組成物を臨床医によって腫瘍可視化のために有効であると判断された用量で投与することによって被験体を処置する。コンジュゲートを、任意の適切な手段（例えば、非経口注射、静脈内注射、または皮下注射など）によって投与する。いくつかの例では、コンジュゲートを、腫瘍内に直接注射する。いくつかの例では、コンジュゲートの位置を、シアニンフルオロフォアの蛍光を誘起するのに適切な波長を有する光に曝露し、それにより、シアニンフルオロフォアを励起させ、コンジュゲートの蛍光を検出することによってモニタリングする。コンジュゲートの腫瘍への結合を可能にするのに十分な期間を経た後にモニタリングを実施することができる。投与したコンジュゲートは、被験体の標的化部分への近赤外範囲の波長および選択された強度を有する有効量の光の標的化利用によって照射してもよい。照射を外部または内部に行う。外部照射が望ましい場合、表面領域は適切な光アプリケーター（例えば、マイクロレンズ、フレネルレンズ、または散光器）を使用して制御することができる。内部照射が望ましい場合、内視鏡または光ファイバーカテーテルを使用することができる。被験体の標的化部分が腫瘍に近接していることが有利である。いくつかの例では、コンジュゲートの投与から数時間後〜数日後（例えば、コンジュゲートの投与から１〜７日後など）に照射を実施することができる。
【０１６５】
腫瘍の少なくとも一部を、コンジュゲートの投与後に外科的に切除することができる。蛍光よって導かれる手術を使用して、組織切除の位置および範囲を決定する。
【０１６６】
いくつかの場合、被験体は腫瘍を有すると疑われ、腫瘍の存在を、被験体へのコンジュゲートの投与および疑われる腫瘍部位でのコンジュゲートの蛍光のモニタリングによって確認する。疑われる腫瘍部位でのコンジュゲートおよび蛍光の蓄積により、腫瘍が存在すると診断される。
【０１６７】
治療有効量の第２の剤を、コンジュゲートまたはその塩と共投与することができる。コンジュゲートおよび第２の剤を、個別にまたは単一の組成物中で一緒に投与することができる。第２の剤を、同一の経路または異なる経路によって投与することができる。同時に投与する場合、コンジュゲートおよび第２の剤を、単一の薬学的組成物中で組み合わせてもよく、２つの薬学的組成物として同時に投与してもよい。第２の剤は、例えば、抗腫瘍剤または血管形成インヒビターであり得る。
【０１６８】
実施例６
化合物の合成および特徴づけ
【化３１】
2021513968.tif 000034
（３）：磁気撹拌棒を備えたマイクロ波バイアルに、インドレニン１（３．０ｇ、１０．８ｍｍｏｌ；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１２，２３：３５０）、ＭｅＣＮ（１２ｍＬ）、およびヨウ化物２（３．０ｇ、１０．８ｍｍｏｌ；Ｌａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９，２１：５５）を添加した。容器をアルゴン下で密封し、淡褐色スラリーを砂浴中で２２時間１２０℃まで加熱し、その間に反応物が深赤色／桃色に変化した。反応物を冷却し、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去した。水（１０ｍＬ）を赤色粗生成物に添加し、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ、０→３０％ＭｅＣＮ／水）によって精製した。生成物含有画分を合わせ、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去して、３（２．１ｇ、収率４５％）を粘着性の赤色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６では、エナミン：イミン互変異性体比９３：７として存在する）  δ  ７．３８  −  ７．２９  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５２  −  ３．４３  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．４１  −  ３．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．２２  （ｓ，  ３Ｈ），  １．２６  （ｓ，  ６Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １６０．６，  １４５．７，  １３９．３，  １３５．７，  １２５．３，  １１９．４，  １０４．２，  ７４．７，  ７１．２，  ７０．１，  ６９．８，  ６９．６，  ６６．４，  ５８．０，  ４３．５，  ４１．９，  ２９．７；  ＩＲ  （薄膜）  ２９２１，  １７１５，  １６５０，  １６０４，  １４８６，  １３８２，  １１８２  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ１８Ｈ２８ＮＯ６Ｓ  （Ｍ＋Ｈ）＋  の計算値３８６．１６３２、実測値３８６．１６３２。
【化３２】
2021513968.tif 000035
【０１６９】
（５）：磁気撹拌棒を備えたマイクロ波管に、インドレニン３（２．０７ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を含むエタノール（１４ｍＬ）および塩化物４（０．４５ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加した。容器を密封し、アルゴンでフラッシュした。次いで、トリエチルアミン（１．３７ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ）、および無水酢酸（１．８５ｍＬ、１９．６ｍｍｏｌ）を、シリンジによって連続的に添加した。黄色溶液を１２０℃まで３０分間加熱し、その間に反応物が深緑色に移行した。反応物を冷却し、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１７ｍＬ）を添加し、緑色残渣を逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８、０→３０％ＭｅＣＮ／水）によって精製した。生成物含有画分を凍結乾燥させて、５（１．０４ｇ、収率４６％）を緑色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．４９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．９１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．６０  −  ３．５７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５３  −  ３．５０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４８  −  ３．４４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４１  −  ３．３７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．２８  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．７５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．００  −  １．９１  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７７  （ｓ，  １２Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  １７５．６，  １５１．４，  １４５．７，  １４５．３，  １４３．６，  １４２．４，  １２９．０，  １２８．０，  １２１．３，  １１２．４，  １０４．２，  ７２．９，  ７２．１，  ７１．７，  ７１．４，  ６９．２，  ５９．１，  ５０．７，  ４６．１，  ２８．３，  ２７．４，  ２２．１．；  ＩＲ  （薄膜）  ２８６４，  １５４６，  １５０９，  １４２７，  １３８７，  １２３４，  １１５１  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ４４Ｈ６０ＣｌＮ２Ｏ１２Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ）＋  の計算値９０７．３２７１、実測値９０７．３２６８。
【化３３】
2021513968.tif 000036
【０１７０】
（６）：磁気撹拌棒を備えた１ドラムのバイアルに、塩化物５（１００ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１．０ｍＬ）を添加した。２−（メチルアミノ）−エタノール（３５μＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を７５℃まで１５分間加熱し、その間に、反応物は緑色から暗青色に移行した。反応物を冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７ｍＬ）で希釈し、溶液を、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ  ｇｏｌｄ、０→２５％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥させて、６（９０ｍｇ、収率８５％）を青色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ７．８９  −  ７．６４  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．０５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．２７  −  ４．１１  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．０１  −  ３．９２  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．８９  −  ３．８１  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．６１  −  ３．５７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５７  −  ３．５１  （ｍ，  ７Ｈ），  ３．５１  −  ３．４６  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４５  −  ３．４０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３０  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．６３  −  ２．４５  （ｍ，  ４Ｈ），  １．９２  −  １．７９  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６７  （ｓ，  １２Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７６．１，  １６８．１，  １４３．２，  １４３．２，  １４０．７，  １３９．１，  １２５．７，  １２３．３，  １１９．３，  １０８．７，  ９５．９，  ７１．２，  ７０．３，  ６９．８，  ６９．７，  ６７．３，  ５９．６，  ５８．５，  ５８．０，  ４７．２，  ４４．１，  ４３．３，  ２８．７，  ２４．４，  ２１．５；  ＩＲ  （薄膜）  ３４０９，  ２９２７，  ２８７０，  １５４６，  １５０９，  １３６５，  １２７９，  １１５８  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ４７Ｈ６８Ｎ２Ｏ１３Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ）＋の計算値９４６．４１８８、実測値９４６．４１８６。
【化３４】
2021513968.tif 000037
【０１７１】
（７）：磁気撹拌棒を備えた１ドラムのバイアルに、塩化物５（６４０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１８ｍＬ）を添加した。３−（メチルアミノ）−１−プロパノール（２５０μＬ、２．５４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１００℃まで２５分間加熱し、その間に、反応物は緑色から暗青色に移行した。反応物を冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１８ｍＬ）で希釈し、溶液を、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ  ｇｏｌｄ、０→４０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥させて、７（６１６ｍｇ、収率７４％）を青色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．２，  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ５．９８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．６１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２４  −  ４．１４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．９０  −  ３．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７８  −  ３．６９  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５３  −  ３．５０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４９  −  ３．３９  （ｍ，  １４Ｈ），  ３．３３  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．１８  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．４９  −  ２．４６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．９１  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．７４  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．５８  （ｓ，  １２Ｈ）．；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７４．９，  １６８．２，  １４３．３，  １４３．２，  １４０．４，  １３９．０，  １２５．８，  １２３．３，  １１９．４，  １０８．８，  ９６．０，  ７１．２，  ７０．３，  ６９．８，  ６９．７，  ６７．３，  ５８．１，  ５８．０，  ５５．６，  ４７．２，  ４４．８，  ４３．４，  ３１．５，  ２８．７，  ２４．３，  ２１．４；  ＩＲ  （薄膜）  ３４１０，  ２９２６，  ２８７０，  １５４３，  １３６６，  １２７９，  １１６０  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ４８Ｈ７０Ｎ３Ｏ１３Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ）＋の計算値９６０．４３４５、実測値９６０．４３４３。
【化３５】
2021513968.tif 000038
【０１７２】
（８）：磁気撹拌棒を備えたマイクロ波バイアルに、シアニン６（７０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（６１ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＭＦ（１．５ｍＬ）およびヨウ化メチル（４５μＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を９５℃まで２時間加熱し、その間に、反応物は青色から緑色に移行した。反応物を冷却し、水（１０ｍＬ）で希釈し、溶液を、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ  ｇｏｌｄ、０→３０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥させて、８（６０ｍｇ、収率８６％）を緑色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７４  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．６７  −  ７．５９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．２９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．９５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．５４  −  ３．４８  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４５  −  ３．３５  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．３１  （ｓ，  ９Ｈ），  ３．１８  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．６０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ４Ｈ），  １．８５  −  １．７３  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６７  （ｓ，  １２Ｈ）．；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７２．２，  １６７．９，  １４５．３，  １４２．４，  １４０．１，  １３９．１，  １２６．０，  １２２．４，  １１９．５，  １１０．７，  １０１．０，  ７１．２，  ７０．３，  ６９．８，  ６９．６，  ６９．４，  ６７．５，  ６４．１，  ５８．０，  ５３．４，  ４８．６，  ４４．３，  ２７．８，  ２４．２，  ２０．５．；  ＩＲ  （薄膜）  ２８６８，  １５５６，  １５０４，  １３９２，  １３５７，  １２４９，  １１４８  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ４９Ｈ７２Ｎ３Ｏ１３Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ）＋の計算値９７４．４５０１、実測値９７４．４５０６。
【化３６】
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【０１７３】
（９、ＵＬ−７６６）：磁気撹拌棒を備えた丸底フラスコに、シアニン７（６２０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（６ｍＬ）を添加した。赤色溶液を、アルゴン下で６０℃まで５分間加熱した。ＴＦＡを真空中で除去し、残渣を真空下に（０．１Ｔｏｒｒ未満）５分間おいた。ＤＭＦ（２０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（２．６ｇ）、およびヨウ化メチル（２ｍＬ）を添加し、反応物を６０℃まで３時間加熱した。反応物を冷却し、水（４０ｍＬ）で冷却し、溶液を、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８  Ａｑ  ｇｏｌｄ、０→４０％ＭｅＣＮ／水）によって直接精製した。生成物含有画分を凍結乾燥させて、９（４２０ｍｇ、収率６７％）を緑色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．１，  １．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．３７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ４．０３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．７６  −  ３．７０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５３  −  ３．４９  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．４４  −  ３．３６  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．３３  −  ３．３０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．２６  （ｓ，  ９Ｈ），  ３．１８  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．６２  −  ２．５４  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．４４  −  ２．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８４  −  １．７６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６９  （ｓ，  １２Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７２．２，  １６８．５，  １４５．２，  １４２．４，  １４０．１，  １３９．５，  １２６．０，  １２２．３，  １１９．７，  １１０．６，  １００．８，  ７３．４，  ７１．２，  ７０．３，  ６９．８，  ６９．７，  ６７．５，  ６２．９，  ５８．０，  ５２．４，  ４８．６，  ４４．２，  ３９．５，  ２７．９，  ２４．２，  ２３．８，  ２０．７；  ＩＲ  （薄膜）  ２８７４，  １５５７，  １５０６，  １３９２，  １３５９，  １２４８，  １１５１  ｃｍ−１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ｃ５０Ｈ７４Ｎ３Ｏ１３Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ）＋の計算値９８８．４６５８、実測値９８８．４６６０。
【０１７４】
化合物８および９の分光学的特性を評価し、別のヘプタメチンシアニン−ＦＮＩＲ−７７４と比較した。結果を表１に示す。化合物８および９はまた、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に最大５ｍＭの優れた水溶液を示した。
【化３７】
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【０１７５】
【化３８】
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【０１７６】
ＢＬ−７６０中間体。市販のＩＲ  Ｄｙｅ７８３（１２０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌棒を備えたマイクロ波管中の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、密封した。溶液をアルゴンで２分間フラッシュし、その後に２−（メチルアミノ）エタノール（６５μｌ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を砂浴中で８０℃まで加熱し、その間に緑色から青色に変色し、ＬＣ−ＭＳは所望の生成物の形成を示した。反応混合物を冷却し、Ｅｔ２Ｏに沈殿させ、４５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。水（２ｍＬ）およびＮａＨＣＯ３水溶液（２ｍＬ）をペレットに添加し、残渣を、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８、０→４０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製した。生成物含有画分を合わせ、凍結乾燥させて、ＢＬ−７６０中間体（９９ｍｇ、収率７９％）を青色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ７．７７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１  −  ４．０    （ｍ，  ４Ｈ），  ３．９５  −  ３．８５  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５３  −  ３．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．８７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．５５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．０５  −  １．８６  （ｍ，  ８Ｈ），  １．８５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．６５  （ｓ，  １２Ｈ）  ｐｐｍ．
【化３９】
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【０１７７】
ＢＬ−７６０。ＨＡＴＵ（６１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、酢酸（１０μｌ、０．１７ｍｍｏｌ）、および乾燥ＤＭＦ（２．８ｍＬ）を、１ドラムのバイアルに添加し、アルゴンでフラッシュした。ＤＩＰＥＡ（３１μｌ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で１０分間撹拌した。個別の１ドラムのバイアル中で、ＢＬ−７６０中間体を乾燥ＤＭＦ（２．１ｍＬ）に溶解し、アルゴンでフラッシュした。この溶液に、１．４ｍＬの活性化エステル溶液を添加し、溶液を砂浴中で３５℃まで一晩加熱し、その間に青色から緑色に変色した。溶液を冷却し、Ｅｔ２Ｏに沈殿させ、４５００ＲＰＭで３分間遠心分離した。ペレットを水（５ｍＬ）に溶解し、溶液を、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８、０→４０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって直接精製した。生成物含有画分を合わせ、凍結乾燥させて、ＢＬ−７６０（５３ｍｇ、収率８０％）を帯青緑色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４、化合物は回転異性体の混合物として存在し、多い方の回転異性体を＊で示し、少ない方の回転異性体を§で示す）δ  ８．１４（２つの重複ｄ，Ｊ  ＝  １４．２  Ｈｚ，２Ｈ＊，２Ｈ§）、７．４９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．５，  １．１  Ｈｚ，  ２Ｈ＊，  ２Ｈ§），  ７．４４  −  ７．３７  （ｍ，  ２Ｈ＊，  ２Ｈ§），  ７．３５  −  ７．３１  （ｍ，  ２Ｈ＊，  ２Ｈ§），  ７．２４  （ｔｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．４，  １．９，  １．０  Ｈｚ，  ２Ｈ＊，  ２Ｈ§），  ６．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  ２Ｈ＊），  ６．１９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  ２Ｈ§），  ４．２５  −  ４．０８  （ｍ，  ６Ｈ＊，  ６Ｈ§），  ４．０７  −  ３．８７  （ｍ，  ２Ｈ＊，  ２Ｈ§），  ３．２９  （ｓ，  ３Ｈ＊），  ３．２０  （ｓ，  ３Ｈ§），  ２．８８  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ７．２，  １．７  Ｈｚ，  ４Ｈ＊，  ４Ｈ§），  ２．６６  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．７  Ｈｚ，  ４Ｈ＊，  ４Ｈ§），  ２．２９  （ｓ，  ３Ｈ＊），  ２．２２  （ｓ，  ３Ｈ§），  ２．０３  −  １．８９  （ｍ，  １０Ｈ＊，  １０Ｈ§），  １．７４  （ｓ，  １２Ｈ＊），  １．７０  （ｓ，  １２Ｈ§）  ｐｐｍ．    
【０１７８】
開示の発明の原理を適用することができる実施形態が多数存在する可能性を考慮して、例示の実施形態は本発明の好ましい例であることのみを目的とし、本発明の範囲を制限すると解釈されないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、本発明の全てがこれらの特許請求の範囲の範囲および意図に帰属すると主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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