(57)【要約】  マイクロサテライト不安定性（MSI）を検出するための改良された方法と組成物がここに提供される。
2021513858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）ゲノムDNA中の野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、前記野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個のヌクレオチドを持ち、第1の標識とクエンチャに付着しているドロップオフプローブと；  b）ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、第2の標識とクエンチャに付着している参照プローブを含むキット。
【請求項２】
前記ドロップオフプローブが、前記野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも3個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも3個のヌクレオチドを有する、請求項1に記載のキット。
【請求項３】
前記ドロップオフプローブのクエンチャが前記マイクロサテライト反復配列内の部位に付着している、請求項1と2のいずれか1項に記載のキット。
【請求項４】
前記ドロップオフプローブのクエンチャが、前記第1の標識からヌクレオチド10個以内にある部位に付着している、請求項3に記載のキット。
【請求項５】
前記ドロップオフプローブが、前記マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも4個のヌクレオチドを持つ、請求項1〜4のいずれか1項に記載のキット。
【請求項６】
c）前記ドロップオフプローブと相補的でクエンチャを含むクエンチャオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のキット。
【請求項７】
前記ドロップオフプローブが50℃未満でヘアピン構造を形成する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のキット。
【請求項８】
前記参照プローブが、前記ドロップオフプローブの少なくとも6個のヌクレオチドと相補的な配列と、3'末端のクエンチャを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のキット。
【請求項９】
前記参照プローブが、前記ドロップオフプローブの少なくとも10個のヌクレオチドと相補的な配列と、3'末端のクエンチャを含む、請求項8に記載のキット。
【請求項１０】
ゲノムDNA中の異なる野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、前記野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個のヌクレオチドを持ち、異なる標識とクエンチャに付着している少なくとも1つの追加ドロップオフプローブを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１１】
ゲノムDNA中の異なる野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、前記野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個のヌクレオチドを持ち、異なる標識とクエンチャに付着している少なくとも4つの追加ドロップオフプローブを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１２】
ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、異なる標識とクエンチャに付着している少なくとも1つの追加参照プローブを含む、請求項10に記載のキット。
【請求項１３】
ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、異なる標識とクエンチャに付着している少なくとも4つの追加参照プローブを含む、請求項11に記載のキット。
【請求項１４】
前記ドロップオフプローブと前記参照プローブの結合部位の5'と3'の位置に増幅プライマーのセットをさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１５】
熱安定DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１６】
マイクロサテライト不安定性を検出する方法であって、  a）ゲノムDNAを、    i）ゲノムDNA中の野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、前記野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個のヌクレオチドを持ち、第1の標識とクエンチャに付着しているドロップオフプローブと；    ii）ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、第2の標識とクエンチャに付着している参照プローブと；    iii）前記ドロップオフプローブと前記参照プローブの結合部位の5'と3'に位置する増幅プライマーのセットに接触させ；  b）dPCRを実施することにより、ゲノムDNAへのドロップオフプローブと参照プローブの結合を増幅して検出し；  c）ゲノムDNAへの前記ドロップオフプローブの結合が対照値または閾値と比べて少ないときにマイクロサテライト不安定性を検出することを含む方法。
【請求項１７】
不安定性を2つ以上のマイクロサテライト反復配列の位置で検出するために配置した2つ以上のドロップオフプローブと、参照プローブと、増幅プライマーのセットを用いて多重に実施する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
不安定性を5つ以上のマイクロサテライト反復配列の位置で検出するために配置した5つ以上のドロップオフプローブと、参照プローブと、増幅プライマーのセットを用いて多重に実施する、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
a）ゲノムDNA中の野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、前記野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個のヌクレオチドを持ち、第1の標識とクエンチャに付着しているドロップオフプローブと；  b）ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、第2の標識とクエンチャに付着している参照プローブと；  c）前記ドロップオフプローブと前記参照プローブの結合部位の5'と3'に位置する増幅プライマーのセットと；  d）熱安定DNAポリメラーゼと；  e）ゲノムDNAを含む反応混合物。
【請求項２０】
ゲノムDNA中の異なる野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個のヌクレオチドを持ち、異なる標識とクエンチャに付着している少なくとも1つの追加ドロップオフプローブと；  ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、異なる標識とクエンチャが付着している少なくとも1つの追加参照プローブをさらに含む、請求項19に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
マイクロサテライトは、長さが1〜6個のヌクレオチドからなる反復領域であり、ゲノム全体に散在している。マイクロサテライト不安定性（MSI）は、アレルの一方または両方において、反復長の変化、すなわち延長または短縮として現われる。MSIは、ミスマッチ修復系の欠陥によって引き起こされ、その原因は、生殖系列の変異（リンチ症候群）、または体細胞のミスマッチ修復遺伝子内の散発的な遺伝子変化またはエピジェネティックな変化である。MSIはリンチ症候群をスクリーニングするための1つの重要な診断ツールである。なぜならミスマッチ修復遺伝子の中に変異を持つほぼすべての患者の腫瘍は、MSI表現型を持つからである。
【０００２】
ミスマッチ修復（MMR）欠損は、がんにおいて割合が多い変異ネオ抗原と関係しており、その変異ネオ抗原が、がんを、原発組織が何であるかに関係なく、免疫チェックポイント阻止に対して感受性にする（Le他（2017年）Science第357巻：409ページ）。したがってMSIは、多数のがん（例えば膠芽腫、大腸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、乳がん）において免疫チェックポイント療法に対する反応の予測バイオマーカーである。FDAは、MMRが欠損した固形腫瘍を持つ小児と成人の患者のためペムブロリズマブ（キートルーダ）を急いで承認した。初期段階のCRCでは、dMMRを持つ患者は生存率がより優れており、これはMSIが予後予測の価値も持つことを示している（Merok他（2013年）Annals Oncology第24巻：1274ページ； Roth他（2012年）J. Natl. Cancer Inst. 第104巻：1635ページ）。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書では、マイクロサテライト不安定性（MSI）を検出するためのオリゴヌクレオチド、キット、アッセイ、方法が提供される。
【０００４】
1つの側面では、サンプル中でマイクロサテライト不安定性（存在する場合）を検出するためのキットとして、個人からのゲノムDNA（例えばヒトからの腫瘍サンプル）を含むキットが提供される。いくつかの実施態様では、このキットは、a）ゲノムDNA中の野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、その野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個（例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、3〜7個、7個、8個、9個、10個、またはそれよりも多数）の相補的な追加ヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個（例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、3〜7個、7個、8個、9個、10個、またはそれよりも多数）の相補的な追加ヌクレオチドを持ち、第1の標識（例えば蛍光体）とクエンチャに付着しているドロップオフプローブと、b）ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、第2の標識（例えば蛍光体）とクエンチャに付着している参照プローブを含んでいる。
【０００５】
いくつかの実施態様では、検出されるマイクロサテライトが何であるかに応じ、ドロップオフプローブは、長さが少なくとも10〜80個または25〜50個のヌクレオチドである。例えばいくつかの実施態様では、ドロップオフプローブは、正常な最も一般的なマイクロサテライト反復配列の長さ＋そのドロップオフプローブの5'末端と3'末端にあってゲノム配列と相補的でそのマイクロサテライト反復配列に隣接した追加ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施態様では、参照プローブは、サイズがドロップオフプローブと同様であるか、ドロップオフプローブと同様の融解温度を持つ。
【０００６】
いくつかの実施態様では、参照プローブは、ドロップオフプローブの近傍（例えばドロップオフプローブの結合部位からヌクレオチド1〜5個以内、5〜10個以内、10〜50個以内、50〜100個以内、100〜500個以内）の保存された／不変のゲノム配列に結合する。
【０００７】
いくつかの実施態様では、キットはさらに、ドロップオフプローブと参照プローブの結合部位（すなわちゲノムDNAの中の野生型マイクロサテライト反復配列と参照配列）の5'と3'に位置する増幅プライマーのセットを含んでいる。いくつかの実施態様では、プライマーのセットは、両方の結合部位を増幅する設計にされている（例えばそれら結合部位がゲノムで互いに比較的近い場合）。いくつかの実施態様では、キットはさらに、熱安定DNAポリメラーゼを含んでいる。いくつかの実施態様では、キットはさらに、対照（例えば既知のマイクロサテライト不安定性を持つDNA（陽性対照）、または正常な（野生型）マイクロサテライト配列を持つDNA（陰性対照））を含んでいる。
【０００８】
いくつかの実施態様では、ドロップオフプローブ上のクエンチャは、ドロップオフプローブの内部（例えばマイクロサテライト反復配列の内部）に付着している。いくつかの実施態様では、クエンチャは、第1の標識からヌクレオチド4個以内、または5個以内、または6個以内、または7個以内、または8個以内、または9個以内、または10個以内、または11個以内、または12個以内、または13個以内、または14個以内、または15個以内に付着している。いくつかの実施態様では、ドロップオフプローブは、内部クエンチャと、マイクロサテライト反復配列の5'末端にある少なくとも4個、または5個、または6個、または7個、または8個、または9個、または10個の相補的な追加ヌクレオチドを有する。
【０００９】
いくつかの実施態様では、キットはさらに、ドロップオフプローブの少なくとも一部と相補的であってクエンチャを含むクエンチャオリゴヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、クエンチャは、クエンチャプローブの3'末端に位置するか、3'末端からヌクレオチド5個以内に位置する。いくつかの実施態様では、クエンチャプローブとドロップオフプローブの融解温度（二本鎖複合体の50％が融解して一本鎖DNAになる温度）は、20〜60℃、特に42〜55℃、または46〜52℃、または約50℃である。いくつかの実施態様では、融解温度は、PCR反応においてアニーリングのために選択される温度よりも低い。いくつかの実施態様では、クエンチャオリゴヌクレオチドは参照プローブと連続しているため、参照プローブは、（例えばマイクロサテライト反復配列に隣接した）マイクロサテライト反復配列と相補的ではない部分配列と、相補的な部分配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、参照プローブは、ドロップオフプローブと相補的な少なくとも6〜20個、8〜15個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれよりも多いヌクレオチドを含んでいて、クエンチャが3'末端の近傍にある。
【００１０】
いくつかの実施態様では、ドロップオフプローブは、20〜60℃で、または60℃未満で、または55℃未満で、または50℃未満で、またはPCR反応においてアニーリングのために選択される温度未満で、ヘアピン構造を形成する。いくつかの実施態様では、ドロップオフプローブは、ヘアピンの形成を改善するため（すなわちマイクロサテライト反復配列と相補的な配列の5'と3'のヌクレオチドの相補性を増大させるため）、マイクロサテライト反復配列に隣接して、ゲノム配列との少なくとも1つのミスマッチを含んでいる。
【００１１】
いくつかの実施態様では、キットは、多数のマイクロサテライト反復配列を検出するため複数のプローブを含んでいる。いくつかの実施態様では、キットは、ゲノムDNA内の異なる野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つ少なくとも2個、または3個、または4個、または5個、または6個、または7個、または8個、または9個、または10個の上記の、および本明細書に記載のドロップオフプローブを含んでいる（多数のドロップオフプローブ）。いくつかの実施態様では、その多数のドロップオフプローブは、別々の容器に収容されるか、同じ容器の中の2個、3個、4個、またはそれよりも多数のドロップオフプローブと組み合わされる。いくつかの実施態様では、上記の多数のドロップオフプローブは、それぞれ同じ標識（例えば同じ蛍光を出す標識）に付着され、対応する多数の参照プローブは、異なる標識に付着される。そのような場合には、参照プローブからのシグナルは、多重反応において検出される各マイクロサテライト反復配列のシグナルを識別する。いくつかの実施態様では、上記の多数のドロップオフプローブは、同じ容器内の他のドロップオフプローブとは異なる標識、または同じキット内の他のドロップオフプローブとは異なる標識に付着される。いくつかの実施態様では、キットはさらに、上記の、および本明細書に記載の多数の参照プローブおよび／または多数のプライマーセットを含んでいて、上記の多数のドロップオフプローブのそれぞれと対にされる。いくつかの実施態様では、その多数の参照プローブは、同じ容器内の他の参照プローブおよびドロップオフプローブとは異なる標識、または同じキット内の他の参照プローブおよびドロップオフプローブとは異なる標識に付着されている。
【００１２】
さらに別の1つの側面では、個人からのゲノムDNA（例えば腫瘍サンプル）の中に存在する場合にマイクロサテライト不安定性を検出するための反応混合物が提供される。いくつかの実施態様では、反応混合物は、ゲノムDNA中の野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個のヌクレオチドを持ち、第1の標識とクエンチャに付着しているドロップオフプローブと；b）ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、第2の標識とクエンチャに付着している参照プローブと；c）ドロップオフプローブと参照プローブの結合部位の5'と3'に位置する増幅プライマーのセットと；d）熱安定DNAポリメラーゼと；e）ゲノムDNAを含んでいる。ドロップオフプローブと参照プローブは、上記の、および本明細書に記載の特徴の任意のもの（例えば内部クエンチャ、重複配列など）を含むことができる。それに加え、反応混合物は、2つ以上のドロップオフプローブ、参照プローブ、プライマーセットを用いて多重化することができる。
【００１３】
さらに別の1つの側面では、個人または一群の個人からのゲノムDNAのサンプル（例えば腫瘍サンプル）の中に存在する場合にマイクロサテライト不安定性を検出するための方法が提供される。いくつかの実施態様では、この方法は、a）ゲノムDNAを、上記の、および本明細書に記載のキットの諸構成要素と接触させ；b）dPCRを実施することにより、ゲノムDNAへのドロップオフプローブと参照プローブの結合を増幅して検出し（例えば陽性シグナルが第1と第2の標識から検出される場合）；c）ゲノムDNAへのドロップオフプローブの結合が対照値または閾値と比べて少ないときにマイクロサテライト不安定性を検出することを含んでいる。いくつかの実施態様では、対照値は、同じ個人、または一群の個人（1つの集団に関するより広い範囲の平均値を得るため）からの正常な疾患のない組織から得られる。いくつかの実施態様では、マイクロサテライト不安定性は、ゲノムDNAへのドロップオフプローブの結合は減少するが、参照プローブの結合は変化しないままであるか、ドロップオフプローブの結合ほどは減少していないときに検出される。本明細書では、ドロップオフプローブと参照プローブは、上記の、および本明細書に記載の特徴の任意のもの（例えば内部クエンチャ、重複配列など）を含むことができる。それに加え、反応混合物は、2つ以上のドロップオフプローブ、参照プローブ、プライマーセットを用いて多重化することができる。
【００１４】
したがっていくつかの実施態様では、この方法は、a）ゲノムDNAを、i）ゲノムDNA中の野生型マイクロサテライト反復配列と相補的な配列を持つとともに、野生型マイクロサテライト反復配列の5'末端の少なくとも1個のヌクレオチドと3'末端の少なくとも1個のヌクレオチドを持ち、第1の標識とクエンチャに付着しているドロップオフプローブと；ii）ゲノムDNA中にあってマイクロサテライト反復配列ではない参照配列と相補的な配列を持ち、第2の標識とクエンチャに付着している参照プローブと；iii）ドロップオフプローブと参照プローブの結合部位の5'と3'に位置する増幅プライマーのセットに接触させ；b）dPCRを実施することにより、ゲノムDNAへのドロップオフプローブと参照プローブの結合を増幅して検出し；c）ゲノムDNAへのドロップオフプローブの結合が、対照値または閾値と比べて少ないときにマイクロサテライト不安定性を検出することを含んでいる。いくつかの実施態様では、この方法は、多数のマイクロサテライト反復配列の位置でマイクロサテライト不安定性を検出するため、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれよりも多数のドロップオフプローブを用いて多重に実施される。
【００１５】
いくつかの実施態様では、この方法はさらに、MSI（例えば1つ、2つ、3つ、またはそれよりも多数のマイクロサテライト反復配列の位置にMSI）を持つ個人に治療を指示する、または投与することを含んでいる。いくつかの実施態様では、治療は、免疫チェックポイント療法（例えばPD-1またはPD-L1を標的とする薬剤）を含んでいる。いくつかの実施態様では、例えば腫瘍療法をすでに受けている患者のため、治療は、使用中の治療剤の用量を減らすことを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、一般に検出されるマイクロサテライトとゲノム上の位置のリストを示している。反復モチーフ配列は、BAT-25については配列番号10、BAT-26については配列番号11、NR-21については配列番号12、NR-24については配列番号13、MONO-27については配列番号14、BAT-40については配列番号15、D2S123については配列番号16、S5S346については配列番号17、D17S250については配列番号18、PentaCについては配列番号19、PentaDについては配列番号20、MYCL1については配列番号21である。
【００１７】
【図２】図2は、現在の方法を利用した結果の一例を示している。正常なサンプル（上図）とMSI陽性腫瘍サンプル（下図）のマッチングを、MSI分析システムを利用して分析した。2ナノグラムのゲノムDNAを増幅した後、POP-4ポリマーと36 cmのキャピラリを用いてABI PEISM 3100 Genetic Analyserで分析した。正常なサンプルとMSI陽性サンプルのアレルのパターンを示してある。正常なサンプルに存在していなかった新たなアレル（矢印で表示）がMSI陽性サンプルの中に存在することが、MSIであることを示している。
【００１８】
【図３】図3は、マーカーBAT25の中のMSI欠失を検出するためのドロップオフアッセイの一例を示している。マイクロサテライト安定サンプル（MSS）では、ドロップオフプローブは、25 T/Aモノヌクレオチド反復配列と、いくつかの隣接した「アンカー」ヌクレオチドに結合する。MSI欠失サンプル（例えば23 T/Aモノヌクレオチド反復）では、ドロップオフプローブはもはやゲノム配列と完全に相補的ではないため、親和性が低下し、プローブの加水分解からの蛍光がより少なくなる（すなわち加水分解によって蛍光体とクエンチャが分離される）。この例では、蛍光体（FAMまたはHEX）はプローブの5'末端にあり、クエンチャは3'末端にある。
【００１９】
【図４】図4は、図3に示した設計のプローブからのdPCRの結果を示している。左側のプロットは、離れたクエンチャオリゴヌクレオチドなしの場合のBAT25マーカー（上）とBAT26マーカー（下）についての結果を示している。これらの結果は、MSIの存在下でドロップオフプローブの蛍光体からのシグナルが比較的大きいことを示している。右側のプロットは、離れたクエンチャオリゴヌクレオチドがある場合のBAT25（上）マーカーとBAT26マーカー（下）マーカーについての結果を示している。これらの結果は、ドロップオフプローブの蛍光体がより有効にクエンチされる結果としてMSSシグナルとMSIシグナルがより大きく分離されることを示している。
【００２０】
【図５】図5は、離れた16量体クエンチャオリゴヌクレオチドからの結果と、参照プローブに付着したクエンチャオリゴヌクレオチドからの結果の比較を示している。上のプロットは、クエンチャオリゴヌクレオチドが欠けているMSIアッセイからの結果を示している。左下のプロットは、離れた16量体クエンチャオリゴヌクレオチドを用いたMSIアッセイからの結果を示しており、このクエンチャオリゴヌクレオチドは、図4からわかるように、加水分解されていないドロップオフプローブからのバックグラウンド蛍光を減少させる。中央のプロットと右下のプロットは、参照プローブに付着したクエンチャオリゴヌクレオチド（それぞれ16量体と12量体（それぞれ配列番号27と28））が、離れたクエンチャオリゴヌクレオチドとして有効であることを示している。
【００２１】
【図６】図6は、50℃以下でヘアピンを形成するドロップオフプローブの設計を示す（配列番号3）。左のプロットは、クエンチャオリゴヌクレオチドなしで直線状ドロップオフプローブ（配列番号3）を用いたBAT25 MSIアッセイからの結果を示す。右のプロットは、ヘアピン状ドロップオフプローブを用いたBAT25 MSIアッセイからの結果を示す。ヘアピン構造だと、クエンチャと蛍光体がより近接しているため、プローブが加水分解される（すなわちゲノムマイクロサテライト反復配列に結合していない）ときにクエンチングがより有効である。
【００２２】
【図７】図7は、5'標識に対してさまざまな位置にある（すなわち3'末端または内部に位置する）クエンチャを有するドロップオフプローブを示している。BAT25 MSIアッセイのためのドロップオフプローブは配列番号4（上）であり、BAT26 MSIアッセイのためのドロップオフプローブは配列番号5（下）である。結果は、両方のアッセイにおいて、クエンチャがドロップオフプローブの内部に位置すると、加水分解されていないドロップオフプローブからのバックグラウンド蛍光を減らすのにより有効であることを示している。図7には、BAT25とBAT26のための内部クエンチャを有するドロップオフプローブ（それぞれ配列番号22と5）も開示されている。
【００２３】
【図８】図8は、本明細書に記載の方法を利用してマイクロサテライトのサイズの小さな変動を検出できることを示している。左側のプロットは、クエンチングオリゴヌクレオチドを用いたBAT26 MSIアッセイからの結果を示している。MSI細胞系におけるMSS状態または記載されている数のヌクレオチド欠失が、BT-549細胞系、Raji細胞系、Daudi細胞系、Molt-4細胞系、Jurkat細胞系、HCT-116細胞系について示されている。右側のグラフは、ドロップオフプローブ標識に関するプラスの平均蛍光振幅を示している（FAM）。いくつかの細胞系が異なる結果を示しており、これは、反復長が異なるアレルが存在することを示している。図8には、「16量体ポリA」が配列番号27として開示されている。
【００２４】
【図９】図9は、本明細書に記載の方法が、FFPETサンプルに由来する典型的な損傷と断片化を受けたDNAの中のMSIを検出するのに有効であることを示している。左側のプロットは、BAT25（上）とBAT26（下）マーカーの両方について非腫瘍MSS FFPETサンプルからの結果を示しており、右側のプロットは、腫瘍MSI FFPETサンプルからの結果を示している。クエンチャオリゴヌクレオチドを用いてMSIアッセイを実施し、バックグラウンド蛍光を減らした。
【００２５】
【図１０】図10は、本明細書に記載の方法を多重化できることを示している。最も左側の図は、2つのMSI陽性細胞系からのBAT25 MSIアッセイの結果を示しており、中央の図は、BAT26 MSIアッセイの結果を示しており、最も右側の図は、多重アッセイからの結果を示している。
【００２６】
【図１１】図11は、BT-549（MSS）細胞系とRKO（MSI-H）細胞系の中で一般に検出される5種類のMSIマーカーの2Dプロットからの結果を示している。マーカーは、BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、Mono-27である。
【００２７】
【図１２】図12は、欠失長の中のわずかな違いを検出する設計にされたNR-21アッセイが、BT-549細胞系（上の2つの図）とDaudi細胞系（下の2つの図）の間でMSIマーカーの2個のヌクレオチドの違いを識別するのに有効であることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
I．緒言  本開示により、現在の方法と比べて汚染のリスクが減っていて、コストがより少なく、合理化されたやり方でMSIを検出するための組成物と方法が提供される。本明細書に開示されている方法は、正常なゲノムマイクロサテライト反復配列に結合するように設計されたドロップオフプローブを利用しており、そのドロップオフプローブが結合する場合には、そのマイクロサテライト配列が増幅されて加水分解（切断、断片化）されることになる。切断によってドロップオフプローブに付着した標識とクエンチャが分離されるため、シグナルが発生する。MSIの場合には、ドロップオフプローブはマイクロサテライト配列にそれほど効果的に結合することはないため、同程度には切断されず、同程度のシグナルを発生させることはない。
【００２９】
II．定義  「バイオマーカー」という用語は、個々のサンプル（例えばがんサンプルと非がんサンプル）を区別するのに用いられる検出可能な任意のマーカーを意味する。バイオマーカーは、修飾（例えばDNAのメチル化、タンパク質のリン酸化）、発現差、変異またはバリアント（例えば単一ヌクレオチドバリエーション、挿入、欠失、スプライスバリアント、融合バリアント）を含んでいる。バイオマーカーは、DNAサンプル、および／またはRNAサンプル、および／またはタンパク質サンプルの中で検出することができる。
【００３０】
「多重化」という用語は、例えば同じ試験管、ウエル、液滴、マイクロチェンバーの中で2つ以上の標的が検出されるアッセイを意味する。
【００３１】
「器」、「容器」、「試験管」、「ウエル」、「チェンバー」。「マイクロチェンバー」などの用語は、試薬またはアッセイを維持することのできる含有空間を意味する。器がキットの中にあって試薬を保持しているか増幅反応に使用される場合には、汚染または蒸発を回避するため閉じるか封をすることができる。器がアッセイで使用されている場合には、少なくともそのアッセイを実施している間は開いておくかアクセス可能にしておくことができる。
【００３２】
マーカー遺伝子またはマーカー遺伝子産物に関する「個別に検出される」または「個別検出」という用語は、多重反応において各マーカーが検出されることを示す。すなわち各マーカーには異なる標識が関連付けられてい（て、異なる標識が付けられたプローブによって検出され）る。
【００３３】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」という用語はヌクレオチド（例えばリボヌクレオチドやデオキシリボヌクレオチド）のポリマーを意味し、その中には、天然の核酸（例えばアデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシル、チミジン）と非天然の（ヒトが改変した）核酸が含まれる。この用語は、ポリマーの長さ（例えばモノマーの数）によって制限されることはない。核酸は、一本鎖または二本鎖が可能であり、一般に5'-3'ホスホジエステル結合を含んでいるが、いくつかの場合には、ヌクレオチド類似体が他の結合を有する可能性がある。モノマーは典型的にはヌクレオチドと呼ばれる。「非天然のヌクレオチド」または「修飾されたヌクレオチド」という用語は、修飾された窒素性塩基、糖、リン酸基のいずれかを含むか、構造の中に非天然部分が組み込まれたヌクレオチドを意味する。非天然のヌクレオチドの例に含まれるのは、LNA、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化されたヌクレオチド、アミノ化されたヌクレオチド、脱アミノ化されたヌクレオチド、アルキル化されたヌクレオチド、ベンジル化されたヌクレオチド、蛍光体で標識されたヌクレオチドである。
【００３４】
本開示の文脈における「無細胞核酸」、「無細胞DNA」、「無細胞RNA」などの用語は、個人に由来し、大半の細胞を除去する処理がなされた非組織サンプル（例えば液体生検）を意味する。非組織サンプルの例に含まれるのは、血液と血液成分、尿、唾液、涙、粘液などである。
【００３５】
「LNA」はロックされた核酸を意味する。LNAは修飾されたRNAヌクレオチドであり、その中のリボース部分が、2'酸素と4'炭素を接続する追加の架橋で修飾されている。LNAヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの任意の位置でDNA残基またはRNA残基と混合することと、ワトソン-クリック塩基対形成規則に従ってDNAまたはRNAとハイブリダイズすることができる。ロックされたリボースの配置によってハイブリダイゼーション特性が増強される（例えば融解温度が上昇する）。
【００３６】
「プライマー」という用語は、適切な条件下で核酸ポリメラーゼによるポリヌクレオチド鎖合成の開始点として機能する短い核酸（オリゴヌクレオチド）を意味する。ポリヌクレオチドの合成反応と増幅反応は、典型的には、適切なバッファ、および／またはdNTP、および／またはrNTPと、1つ以上のオプションの補因子を含んでいて、適切な温度で実施される。プライマーは、典型的には標的にハイブリダイズする少なくとも1つの領域を含んでいて、その領域は、その標的配列と少なくとも実質的に相補的である（例えば0個、または1個、または2個のミスマッチを持つ）。本開示の目的では、この領域は、典型的には長さが約4個〜約10個のヌクレオチド（例えば5〜8個のヌクレオチド）である。「プライマー対」は、標的配列に対して逆方向を向いていて増幅条件において増幅産物を生成させる順プライマーと逆プライマーを意味する。「順」と「逆」という用語は、任意に割り当てられる。当業者は、順プライマーと逆プライマー（プライマー対）が増幅産物の境界を規定することを理解するであろう。いくつかの実施態様では、多数のプライマー対が、単一の共通する順プライマーまたは逆プライマーに依存している。例えば多数のアレル特異的順プライマーは、例えば多数のアレルが互いに近接している場合には、同じ共通の逆プライマーを持つプライマー対の一部と見なすことができる。「プライマーのセット」または「プライマーセット」は、1つのプライマー対、または単一の多重反応において同時に機能するように設計された2つ以上のプライマー対を意味することができる。
【００３７】
本明細書では、「プローブ」は、具体的に目的とする標的生体分子（例えばプローブにハイブリダイズする興味ある核酸配列）に選択的に結合することのできる任意の分子を意味する。プローブは、検出が可能な少なくとも1つの非ヌクレオチド部分で標識される。いくつかの実施態様では、プローブは、蛍光体とクエンチャで標識される。
【００３８】
「相補的」または「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドの中の1つの核酸が、第2のポリヌクレオチドの中の別の核酸と塩基対を形成する能力を意味する。例えば配列A-G-T（RNAではA-G-U）は、配列T-C-A（RNAではU-C-A）と相補的である。相補性は部分的であっても完全であってもよく、前者の場合にはいくつかの核酸だけが塩基対形成規則に従ってマッチし、後者の場合には、すべての核酸が塩基対形成規則に従ってマッチする。プローブまたはプライマーは、少なくとも一部が標的配列と相補的である場合に、標的配列に対して「特異的」であると見なされる。条件によって異なるが、標的配列に対する相補性の程度は、典型的には、プライマーなどのより短い核酸に対するほうが、より長い配列に対するよりも大きい（例えば80％超、90％超、95％超、98%超）。いくつかの実施態様では、プライマーおよび／またはプローブは、標的となる配列と100％相補的である。
【００３９】
「特異的に増幅する」という表現は、プライマーセットが標的配列を非標的配列よりも統計的に有意に高いレベルで増幅することを示す。「特異的に検出する」という表現は、プローブが標的配列を非標的配列よりも統計的に有意に高いレベルで検出することを示す。本分野では、特異的な増幅と検出は、陰性対照（例えば試験サンプルと同じ核酸を含むが標的配列は含まないサンプル、または核酸が欠けているサンプル）を用いて判断できることが理解されよう。例えば標的配列を特異的に増幅して検出するプライマーとプローブは、バックグラウンド（非標的配列）から容易に識別できるCt（例えばバックグラウンドよりも少なくとも2サイクル、または3サイクル、または4サイクル、または5サイクル、または5〜10サイクル、または10〜20サイクル、または10〜30サイクル少ないCt）になる。「アレル特異的な」PCRという用語は、標的配列の特定のアレルバリアントを特異的に増幅するプライマーを用いた標的配列の増幅を意味する。典型的には、順プライマーまたは逆プライマーは、その位置でアレルバリアントの正確な相補配列を含んでいる。
【００４０】
「一致」または「％一致」という用語は、2個以上の核酸または2個以上のポリペプチドの文脈では、BLASTまたはBLAST 2.0という配列比較アルゴリズムを用いてデフォルトパラメータで測定したとき、または手作業のアラインメントと目視によって測定したとき、ヌクレオチドまたはアミノ酸が同じである2つ以上の配列または部分配列か、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸が特定の割合（例えば特定の領域全体で約60％一致、例えば少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の一致）である2つ以上の配列または部分配列を意味する。例えばNCBIのウェブサイトのncbi.nlm.nih.gov/BLASTを参照されたい。そのためこのような配列は、「実質的に一致」と言われる。％一致は、典型的には、最適なアラインメントの配列で判断されるため、定義は、欠失および／または付加のほか、置換を有する配列に適用される。この分野で一般に利用されているアルゴリズムは、ギャップなどを考慮している。典型的には、一致は、少なくとも8〜25個のアミノ酸またはヌクレオチドの長さを持つ配列を含む領域、または50〜100個のアミノ酸またはヌクレオチドの長さを持つ領域、または参照配列の長さ全体に存在する。
【００４１】
「単離する」、「分離する」、「精製する」などの用語は、絶対的であることを想定していない。例えばDNAまたはゲノムDNAの単離は、非DNA分子を100％除去することを必要としない。当業者は、所与の状況で許容できる精製レベルを認識しているであろう。
【００４２】
「キット」という用語は、本明細書に記載されているように、RNAまたはDNAを特異的に増幅する、または捕獲する、タグ付け／変換する、または検出する少なくとも1つの試薬（核酸プローブまたはプローブプールなど）を含む任意の製作物（例えばパッケージまたは容器）を意味する。
【００４３】
「増幅条件」という用語は、プライマーのハイブリダイゼーションと鋳型依存性伸長を可能にする核酸増幅反応（例えばPCR増幅）における条件を意味する。「アンプリコン」または「増幅産物」という用語は、標的核酸配列のすべてまたは断片を含んでいて適切な任意の増幅法によってインビトロ増幅の産物として形成される核酸分子を意味する。「増幅産物を生成させる」という表現は、プライマーに適用するときには、プライマーが適切な条件下で（例えばヌクレオチドポリメラーゼとNTPの存在下で）規定された増幅産物を生成させることを意味する。さまざまなPCR条件が、『PCR Strategies』（Innis他、1995年、Academic Press社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）の第14章；『PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications』（Innis他、Academic Press社、ニューヨーク、1990年）に記載されている。
【００４４】
「増幅産物」という用語は、増幅反応の産物を意味する。増幅産物は、各ラウンドのポリヌクレオチド合成を開始させるのに用いるプライマーを含んでいる。「アンプリコン」は増幅の標的となる配列であり、この用語は、増幅産物を意味するのにも用いることができる。アンプリコンの5'と3'の境界は、順プライマーと逆プライマーによって規定される。「逆転写産物」、「RT産物」などの用語は、RNA鋳型上で、逆転写活性を持つポリメラーゼによるRTプライマーの伸長によって生成するcDNA分子を意味する。
【００４５】
「個人」、「対象」、「患者」という用語は、本明細書では交換可能に用いられる。個人は、診断前、診断後だが治療前、治療中、治療後のいずれかが可能である。本開示の文脈では、個人は典型的には医療を求めている。
【００４６】
「サンプル」または「生物サンプル」という用語は、核酸を含んでいるか、核酸を含むと考えられる任意の組成物を意味する。この用語には、細胞、組織、血液いずれかの精製または分離された成分（例えばDNA、RNA、タンパク質、無細胞部分、細胞ライセート）が含まれる。サンプルとして、例えば腫瘍または転移病巣からのFFPETが可能である。サンプルは、凍結された組織または新鮮な組織からのもの、または液体サンプル（例えば血液または血液成分（血漿または血清）、尿、精液、唾液、痰、粘液、涙、リンパ液、脳脊髄液、口／喉洗浄液、気管支肺胞洗浄液、スワブから洗浄した材料など）からのものも可能である。サンプルは、個人（細胞系を含む）から直接得られた細胞のインビトロ培養物の構成要素と構成成分も含むことができる。サンプルは、個人から直接得られたサンプルから部分的に処理したもの（例えば細胞ライセート、または赤血球細胞が枯渇した血液）も可能である。腫瘍サンプルは、腫瘍からの組織を含むこと、または腫瘍からのDNA（例えばがん患者の血液中のctDNA）を含むサンプルを含むことができる。
【００４７】
「個人からサンプルを取得する」という表現は、個人からの生物サンプルが試験のために提供されることを意味する。取得は、個人から直接取得すること、またはその個人からのサンプルを直接取得した第三者から取得することが可能である。
【００４８】
「個人に療法を提供する」という表現は、その療法がその個人に処方されること、または推薦されること、または利用可能になることを意味する。療法は、実際には、第三者が個人に投与すること（例えば入院して注射）、またはその個人が自分で投与することが可能である。
【００４９】
基準として機能する「対照」サンプルまたは「対照」値は、試験サンプルまたは試験条件と比較するための基準（通常は既知の基準）として機能する値を意味する。例えば試験サンプルを試験条件から（例えばがんを持つことが疑われる個人から）採取し、既知の条件から（例えばがんのない個人（陰性対照）から、またはがんまたは興味ある標的配列を持つことがわかっている個人（陽性対照）から）のサンプルと比較することができる。本開示の文脈では、試験サンプルは、典型的にはがん患者（例えば腫瘍サンプル）からのものである。対照は、多数の試験または結果（例えばMSSまたはMSIであることがわかっている多数の個人）から集めた平均値または範囲を表わすこともできる。例えば核酸の存在、および／または品質、および／または量のための対照（例えば内部対照）は、サンプルの中に存在することがわかっている配列（例えばハウスキーピング遺伝子であるベータアクチン、ベータグロビン、グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、リボソームタンパク質L37とL38、PPIアーゼ、EIF3、真核生物翻訳伸長因子2（eEF2）、DHFR、コハク酸デヒドロゲナーゼなど）を検出することになるプライマーまたはプローブを含むことができる。いくつかの実施態様では、内部対照は、一般にはバリアントではない同じ遺伝子の（例えば異なるエキソンの中の）領域からの配列が可能である。例えば指定された長さを持つ既知の追加ポリヌクレオチドも添加することができる。陰性対照の一例は、核酸なしの対照、またはサンプル中に存在していないと考えられる（例えば異なる種からの）配列に対して特異的なプライマーまたはプローブを含む対照である。当業者は、例えば対照が細胞のタイプと生物に適しているようにするため、対照の選択は個々のアッセイに依存することを理解するであろう。当業者は、任意の数のパラメータを評価する設計の対照にできることを認識しているであろう。例えば対照を工夫して、薬理学的データ（例えば半減期）または治療措置（例えば利益および／または副作用の比較）に基づいて治療の利益を比較できるようにすることができる。対照は、インビトロで適用するための設計にすることができる。当業者は、所与の状況でどの対照が重要であるかと、対照値との比較に基づいてデータを分析できるのがどの対照であるかを理解するであろう。対照は、データの有意性を判断するのにも役立つ。例えば所与のパラメータの値が対照の中で広く変動する場合には、試験サンプルの中の変動が有意であると見なされることはない。
【００５０】
「標識」、「タグ」、「検出可能な部分」などの用語は、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、他の物理的手段のいずれかによって検出することのできる組成物を意味する。例えば有用な標識に含まれるのは、蛍光染料（蛍光体）、発光剤、放射性同位体（例えば32P、3H）、高電子密度試薬、親和性に基づく部分（例えばポリAタグ（ポリTと相互作用する）またはポリTタグ（ポリAと相互作用する）、Hisタグ（Niと相互作用する）、またはストレプトアビジンタグ（ビオチンを用いて分離できる））である。当業者は、核酸に結合させる検出可能な標識が天然のものではないことを理解するであろう。
【００５１】
特に断わらない限り、本明細書で用いられている科学技術用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を持つ。例えばLackie、『DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY』、Elsevier社（第4版、2007年）； Sambrook他、『MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL』、Cold Springs Harbor Press（コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年）を参照されたい。「1つの」という用語は、「1つ以上」を意味するものとする。「含む」、「含んでいる」という用語は、1つの工程または要素の記載の後に置かれているとき、さらなる工程または要素が追加されることがあり、そうした工程または要素が除外されはしないことを意味するものとする。
【００５２】
III．マイクロサテライト不安定性（MSI）とミスマッチ修復（MMR）
【００５３】
マイクロサテライトは、ゲノム全体に散在しているDNAの短い反復（1〜6塩基対）である。マイクロの長さには個人間で正常ないくらかの変動が存在する。しかしマイクロサテライト不安定性（MSI）により、一人の個人のアレルの一方または両方の反復長に差が生じる。これは、ミスマッチ修復（MMR）系における欠陥によってもたらされる。
【００５４】
MSIの検出には、予測と予後の両方の価値がある。MSI-高（MSI-H）腫瘍は、免疫チェックポイント療法（例えばキートルーダなど、PD-1またはPD-L1を標的とする薬）に反応する可能性がより大きい。それに加え、MSI-H CRCを持つ患者は、生存率がより優れている。
【００５５】
5種類のモノヌクレオチド反復マーカーからなるパネルが、アメリカ国立がん研究所によって試験用に推奨されている（Suraweera他（2002年）Gastroenterology第123巻：1804ページ；Umar他（2004年）J. Natl. Cancer Inst. 第96巻：261ページ）。サンプルは、正常な対照サンプルと腫瘍サンプルの間で2つ以上のマーカーが反復長の違いを示す場合にMSI-高（MSI-H）と呼ばれる。一般的なMSIマーカーを図1に示してある（Zhang他（2008年）J. Mol. Diagnostics 第10巻：301ページ）。
【００５６】
MSIを検出するための現在の方法は、関係する領域を増幅する蛍光プライマーを用いた後に、正常なサンプルと腫瘍サンプルの間のサイズの違いを同定するためのキャピラリ電気泳動（CE）を利用する。5種類のモノヌクレオチド反復マーカー（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27）（と、潜在的なサンプル混合または汚染を検出するための2つのペンタヌクレオチドマーカー）の1ウエル多重検出のためのキットが市販されている（Bacher他（2004年）Disease Markers第20巻：237ページ）。典型的な読み出しを図2に示してある。この方法は、大きなコスト、手間のかかるプロトコル、汚染のリスク（試験管が開いている設計とPCR後の取り扱いに起因する）、分析感度の限界（腫瘍細胞が10％含まれる必要がある）という問題を抱えている。さらに、結果を再検討し、ブリード-スルー、スタッタ、CEスパイクのいずれかによって起こるアーチファクトのピークを除去せねばならない。
【００５７】
IV．核酸サンプル  バイオマーカーを検出するためのサンプルは、核酸を含むと考えられる任意の供給源（例えば組織（腫瘍組織またはFFPET組織が含まれる）、血液、皮膚、スワブ（例えば口腔、膣）、尿、唾液など）から取得することができる。
【００５８】
生物サンプルから核酸を単離する方法は知られていて例えばSambrookに記載されており、いくつかのキットが市販されている（例えばHigh Pure RNA Isolation Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit、MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit、DNA Isolation Kit for Cells and Tissues、DNA Isolation Kit for Mammalian Blood、High Pure FFPET DNA Isolation Kitがあり、Roche社から入手できる）。本開示の方法の文脈では、ゲノムDNAを回収して単離することができる。
【００５９】
V．増幅と検出  例えば核酸増幅を利用した検出と定量のため、例えばゲノムDNAを含む核酸サンプルを用いることができる。
【００６０】
いくつかの実施態様では、標的核酸は、逆転写活性とDNA鋳型依存性活性の両方を持つ熱安定ポリメラーゼを用いて増幅される。代表的な酵素に含まれるのは、Tth DNAポリメラーゼ、C. thermポリメラーゼ系、US 2014/0170730とUS 2014/0051126に開示されている酵素である。
【００６１】
本明細書に記載されているようにして用いられるプローブには、蛍光体と、場合によってはクエンチャを標識することができる（例えばTaqMan、LightCycler、Molecular Beacon、Scorpion、Dual Labeledというプローブ）。適切な蛍光体の非限定的な例に含まれるのは、FAM、JOE、TET、Cal Fluor Gold 540、HEX、VIC、Cal Fluor Orang 560、TAMRA、Cyanine 3、Quasar 570、Cal Fluor Red 590、Rox、Texas Red、Cyanine 5、Quasar 670、Cyanine 5.5である。適切なクエンチャの非限定的な例に含まれるのは、TAMRA（FAM、JOE、TET用）、DABCYL、BHQ1-3である。
【００６２】
いくつかの実施態様では、ディジタルPCR（dPCR）を利用してマイクロサテライト不安定性を検出することができる。例えばディジタル液滴PCR（ddPCR）を利用すると、非常に低い濃度でさえ、サンプル中の標的核酸の絶対的な測定値を求めることができる。dPCR法は、ディジタル希釈または液滴生成の工程と、PCR増幅の工程と、検出の工程と、（場合によっては）分析の工程を含んでいる。液滴を生成させる区画工程は、複数の個別の反応体積（例えば液滴またはパーティション）を生成させることを含んでおり、それぞれの反応体積には、核酸の増幅を実施するのに必要な試薬が含まれている。PCR増幅工程は、分割された体積を、核酸標的の増幅に適した熱サイクル条件にして、アンプリコンを生成させることを含んでいる。検出は、アンプリコンまたは蛍光シグナルを含む分割された体積と、それを含まない分割された体積を同定することを含んでいる。分析工程は、サンプル中の標的核酸の例えば濃度、または絶対量、または（別の標的と比べた）相対量を生成させる定量化を含んでいる。市販のdPCRシステムは、例えばBio-Rad社とThermoFisher社から入手することができる。dPCRに関する説明は、例えばUS 2014/0242582；Kuypers他（2017年）J Clin Microbiol 第55巻：1621ページ；Whale他（2016年）Biomol Detect Quantif 第10巻：15ページに見いだすことができる。
【００６３】
PCR検出装置は本分野で知られており、選択された標識に適したものを選択することができる。定量PCRに適した検出装置に含まれるのは、cobas（登録商標）システムとLight Cycler（登録商標）システム（Roche社）、PRISM 7000と7300リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems社）などである。6チャネル検出が、CFX96リアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad社）とRotorgene Q（Qiagen社）で利用でき、より高次の多重化が可能である。
【００６４】
VI．MSIと治療  本開示の方法は、MSIの検出と、MSI-H腫瘍およびリンチ症候群（ミスマッチ修復遺伝子の中の遺伝する変異）の治療に有用である。いくつかの実施態様では、標的とされる療法は、疾患関連バイオマーカー（少なくとも1つのMSIなど）の存在または不在に基づいて患者に処方、または提供、または投与される。特に、MSI-H腫瘍を持つ患者（2つ以上のマイクロサテライトの位置でMSI陽性）に免疫チェックポイント療法（例えばPD-1またはPD-L1を標的とする療法）を処方、または提供、または投与することができる。その例に含まれるのは、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、ニボルマブ（オプジーボ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンチオ）、デュルバルマブ（イミフィンジ）である。
【００６５】
いくつかの薬は、MSIと組み合わせて調べることのできる所定のバイオマーカープロファイルを持つ患者のために特別に設計されている（例えば所定のEGFR変異のためのタルセバとタグリッソ）。多数の特定の変異に対処するための新たな標的療法が開発中であるため、当業者は、現時点で個人のための標的療法を選択する最良の位置にいることになる。
【００６６】
それに加え、がん患者は、標準的な化学療法の恩恵を受けることができる。したがっていくつかの実施態様では、化学療法が、がん関連バイオマーカーの存在または不在に基づいて患者に処方、または提供、または投与される。化学療法の中には、CHOP（シクロホスファミド；ドキソルビシン；ビンクリスチン；プレドニゾロン）またはR-CHOP（リツキシマブおよび／またはエトポシドがさらに含まれる）が含まれる。このカクテルを、1セットの期間にわたって定期的に投与すること、または腫瘍のサイズおよび／または症状の軽減が検出されるまで投与することができる。例えばCHOPまたはR-CHOPは、2週間または3週間ごとに投与することができる。
【００６７】
MSI-H患者の場合には、生存率がMSS患者よりも優れていることが見いだされている。いくつかの実施態様では、治療は、例えば副作用を減らして生存がより長くなるように調整して処方、または提供、または投与される。
【００６８】
どの治療法を選択するかに関係なく、典型的には低用量から開始して副作用を明らかにした後、例えば副作用が出現するまで、または患者の忍容範囲内で、または臨床上の利益が観察されるまで用量を増やす。
【００６９】
VII．キット  本明細書では、マイクロサテライト不安定性（MSI）を実施するためのキットが提供される。
【００７０】
いくつかの実施態様では、キットは、サンプル回収容器（例えば試験管、バイアル、マルチウエルプレート、マルチ容器カートリッジ）を含んでいる。
【００７１】
いくつかの実施態様では、キットは、核酸を精製するための試薬および／または構成要素を含んでいる。例えばキットは、溶解バッファ（例えば洗浄剤、カオトロピック剤、緩衝剤など）、サンプル中のタンパク質または他の望ましくない材料を変性させるための酵素または試薬（例えばプロテイナーゼK）、核酸を保持するための酵素（例えばDNアーゼおよび／またはRNアーゼの阻害剤）を含むことができる。いくつかの実施態様では、キットは、核酸を分離するための構成要素（例えば固体または半固体のマトリックスであるクロマトグラフィ用マトリックス、磁性ビーズ、磁性ガラスビーズ、ガラスファイバー、シリカフィルタなど）を含んでいる。いくつかの実施態様では、キットは、固体または半固体のマトリックスから核酸を精製して放出させるための洗浄用および／または溶離用のバッファを含んでいる。例えばキットは、MagNA Pure LC 全核酸単離キット、哺乳動物用DNA単離キット、High Pure単離キットまたはMagNA Pure RNA単離キット（Roche社）、DNeasyキットまたはRNeasyキット（Qiagen社）、PureLink DNA単離キットまたはPureLink RNA単離キット（Thermo Fisher社）などからの構成要素を含むことができる。
【００７２】
いくつかの実施態様では、キットは、特定の核酸（例えばMSI、がん、または他の疾患と関連する標的核酸）を検出するための試薬を含んでいる。例えばキットは、マイクロサテライト配列、マイクロサテライト配列に隣接する配列、がん関連バイオマーカー（ある種のmiRNA、変異、がんでコピー数が変化することが知られている配列など）に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、検出試薬は、qPCR、dPCR、シークエンシング（サンガーまたはNGS）のためのものである。
【００７３】
キットはさらに、増幅のための試薬（例えば逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、dNTP、バッファ、および／または、逆転写および／または増幅に適した他の要素（例えば補因子またはアプタマー））を含むことができる。典型的には、試薬混合物が濃縮されて、アリコートが、サンプル（例えばRNAまたはDNA）、酵素、および／または水とともに最終反応体積に添加される。いくつかの実施態様では、キットはさらに、逆転写酵素（または逆転写活性を持つ酵素）、および／またはDNAポリメラーゼ（例えば熱安定DNAポリメラーゼであるTaq、ZO5と、これらの誘導体）を含んでいる。
【００７４】
いくつかの実施態様では、キットはさらに、少なくとも1つの対照サンプルを含んでいる（例えばMSSサンプル（またはプールされたサンプル）からの核酸、標的配列を含むことが知られているサンプル（またはプールされたサンプル）からの核酸）。いくつかの実施態様では、キットは、例えば核酸を欠いているか標的となる核酸配列を欠いている陰性対照を含んでいる。いくつかの実施態様では、キットはさらに、消費材（例えば核酸を調製するためのプレートまたは試験管、サンプルを回収するための試験管、PCRまたはqRT-PCRのためのプレート、試験管、マイクロチップ）を含んでいる。いくつかの実施態様では、キットはさらに、使用のための指示、ウェブサイトへの参照、ソフトウエアのいずれかを含んでいる。
【実施例】
【００７５】
VIII．実施例実施例1：MSIをディジタルPCRで検出するための設計戦略  われわれは、モノヌクレオチド反復のヌクレオチドの欠失を検出することを試みた。その目的で、BAT25マーカーとBAT26マーカー（それぞれ25個と27個のモノヌクレオチド反復）を検出するためのプローブとプライマーを設計した。このマーカーの位置のMSIは検出範囲が広く、1〜13個のヌクレオチドである。われわれは、ドロップオフdPCRアッセイ、すなわち野生型配列に結合するが、挿入または欠失のある配列に対する親和性は低下している「ドロップオフ」プローブを用いたアッセイを利用した。ドロップオフプローブは参照プローブと組み合わせて使用される。参照プローブは、マイクロサテライト配列に隣接しているかマイクロサテライト配列の近傍にある不変ゲノム配列にハイブリダイズする設計にされている。模式図を図3に示してある。この図は、ドロップオフプローブと参照（非マイクロサテライト）プローブの位置のほか、プローブ上の蛍光体とクエンチャの位置を示している。原則として、クエンチャは、プローブが完全な状態のときには蛍光を阻止するが、結合したプローブがPCRの間にポリメラーゼによって加水分解されると蛍光体がシグナルを出す。
【００７６】
挑戦課題には、（例えばFFPETサンプルから）アレルの長さの中の正常な変動と、損傷したDNAからのDNAは相変わらず検出しつつ、わずかな欠失（例えば1〜2個のヌクレオチド）だけを検出することが含まれる。
【００７７】
BAT25マーカー（22対25ポリT（それぞれ配列番号23と24））とBAT26マーカー（18対27ポリT（それぞれ配列番号25と26））の中の違いを検出するための図3に示した設計のプローブを利用して、効率的でないクエンチングと高いベースラインを見いだした。これは、一部は、モノヌクレオチドプローブの堅固さと、プローブの反対側の端部に位置するクエンチャを用いた非効率的なクエンチングに起因する。結果を図4に示す。このグラフは、鉛直軸にドロップオフプローブの蛍光体からのシグナルを、水平軸に参照プローブの蛍光体からのシグナルを示している。野生型（非MSI）シグナルは右上のクラスタに現われるのに対し、MSI（Jurkat）シグナルは下方の右下のクラスタにある。上部のグラフはBAT25に関するものであり、下部のグラフはBAT26（27T（配列番号26））に関するものである。
【００７８】
実施例2：ドロップオフプローブとともにクエンチャオリゴヌクレオチドを利用する  これらマーカーのためのドロップオフプローブは、ポリTの長いストレッチを含んでいて、それが堅固な構造を形成する。したがってクエンチャが蛍光体に十分に接近して効果的にクエンチすることはない。結合しないプローブのクエンチングを改善するため、ポリAクエンチングオリゴヌクレオチドを添加した。ドロップオフプローブとクエンチャオリゴヌクレオチドをそれぞれ配列番号1および2として下に示す。  ドロップオフプローブ：5’-FAM-TGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAG-BHQ2-3’  クエンチングオリゴ：3’-BHQ2-AAAAAAAAAAAAAAAAA16-20-5’
【００７９】
原則として、クエンチャオリゴは、切断されていないプローブに50℃未満（代表的なPCRアニーリング温度）で結合し、ハイブリダイゼーションによってその追加クエンチャを蛍光体により近く保持してクエンチングを改善する。この複合体は50℃超で融解するため、dPCR条件のもとでプローブが鋳型に結合するのを妨げない。ドロップオフプローブがポリメラーゼによって切断されると、5'-FAM断片は短いため、室温（または検出温度）でポリAクエンチャオリゴに再び結合することはなく、シグナルは維持される。
【００８０】
図4に示してあるように、クエンチャオリゴはBAT26マイクロサテライトでうまく機能してバックグラウンドを減らしたが、BAT25ではそうならなかった。ポリAクエンチャオリゴの長さをヌクレオチド16個まで短くすると、効果的なクエンチングと、両方のマイクロサテライトでのバックグラウンドの減少が見られた。
【００８１】
実施例3：クエンチング改善の代替法  図5に示してあるように、ドロップオフプローブのクエンチングを改良する代替アプローチを設計した。このアプローチでは、参照プローブがドロップオフプローブと部分的に重複しているため、参照プローブはより低温でドロップオフプローブにハイブリダイズし、蛍光体をクエンチする。図5は、16個または12個のヌクレオチドが重複しているこれらのアプローチが、独立した16量体クエンチャプローブのアプローチと同様にバックグラウンドを減らすことを示している。
【００８２】
実施例4：ヘアピンプローブ  ドロップオフプローブとしてヘアピン構造のプローブを用いることも試みた。この場合には、完全なプローブは分子内塩基対形成を通じてヘアピン構造を形成するため、クエンチャが蛍光体により近づく（例えば図6と配列番号3を参照されたい）。配列番号3に網がけで示されているヌクレオチドがヘアピンを形成して鋳型にハイブリダイズする。ヘアピンは50℃超で融解するため、プローブは標的に結合し、ポリメラーゼによって加水分解される。
【００８３】
実施例5：内部クエンチャ  バックグラウンドを減らす／ドロップオフプローブのクエンチングを改善する別のアプローチは、クエンチャをプローブ上で蛍光体により近づけることによる。図7は、BAT25マーカー（配列番号4）のためのドロップオフプローブとBAT26マーカー（配列番号5）のためのドロップオフプローブを示しており、クエンチャは3'末端または内部に位置する。左側のプロットは、3'クエンチャを有するBAT25（上）とBAT26（下）に関するMSIアッセイの結果を示しており、右側のプロットは、内部クエンチャ有するBAT25（上）とBAT26（下）に関するMSIアッセイの結果を示している。両方のアッセイにおいて、内部クエンチャのほうが、加水分解されないドロップオフプローブからのバックグラウンド蛍光を減らすのにより有効であった。
【００８４】
実施例6：小さい挿入／欠失の検出  大半の腫瘍がマイクロサテライト反復配列の中で数個のヌクレオチドのシフトを示すとはいえ、多くの割合は、ほんの1個または2個のヌクレオチドのシフトを有する。例えばCRC腫瘍は平均で6個のヌクレオチドのシフトだが、調べた腫瘍の12％はほんの1個のヌクレオチドのシフトしか示さなかった。EMCでは、シフトの平均が3個のヌクレオチドだが、調べたサンプルの76％は、ほんの1個のヌクレオチドのシフトしか示さない。
【００８５】
本発明の方法を用いて少数個のヌクレオチドのシフトを検出できるかどうかを調べることを試みた。図8は、この方法が、さまざまなサイズの欠失を有するいくつかの異なるMSI細胞系からのシグナルを識別するのに有効であったことを示している。
【００８６】
実施例7：FFPETサンプルの中のMSIの検出  ホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）サンプルからのDNAは損傷と断片化を受けていることがしばしばある。腫瘍組織はFFPETとして保存されることがしばしばあるため、われわれの方法は、損傷したDNAに対してさえ理想的に機能すると考えられる。
【００８７】
野生型（MSS）FFPETサンプルとMSI FFPETサンプルからのDNAでBAT25 MSIアッセイとBAT26 MSIアッセイを実施した。結果は、本明細書に記載のMSIアッセイがFFPET DNAに対してさえ機能することを示している。
【００８８】
実施例8：多重MSI検出  現在のキャピラリ電気泳動法と比べてわれわれのアッセイをさらに合理化するため、本明細書に記載のMSIアッセイを同じdPCR反応において実施できるかどうかを調べた。ドロップオフプローブと、参照プローブと、BAT25マイクロサテライトおよびBAT26マイクロサテライトのための増幅プライマーを組み合わせた。多重アッセイを、両方の部位にMSIを持つRAJI細胞系とJurkat細胞系で実施した。
【００８９】
図10は、プローブとプライマーが互いに干渉せず、結果が明確であったことを示している。左側の図と中央の図は、一重反応のそれぞれを示しており、各細胞系に2つのアレルが存在することを明らかにしている。二重反応の結果が右側に示されており、同じ結果を明らかにしている。
【００９０】
実施例9：内部クエンチャプローブを用いた5種類のMSIマーカーの検出  共通して検出される5種類のモノヌクレオチド反復マーカー（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、Mono-27）のためのディジタルPCRアッセイを設計した。5種類のマーカーすべてが、MSS細胞系（BT-549、上図、陽性クラスタは、ドロップオフプローブFAMチャネルと参照プローブHEXチャネルの両方で大きな蛍光を示した）とMSI-H細胞系（RKO細胞系、下図、陽性クラスタは、参照プローブHEXチャネルでだけ大きな蛍光を示した）からのゲノムDNAに対して試験したとき、2D散乱プロットで予想される表現型を示した（図11）。
【００９１】
BAT-25とBAT-26のためのドロップオフプローブの配列は、図7に示されているのと同じ内部クエンチャプローブである（それぞれ配列番号4と5）。配列番号6は、NR-21のための内部クエンチャドロップオフプローブの配列を示している（<FAM_Thr>CCTTTTTTT<BHQ_2>TTTTTTTTTTTTTTTAGCAAC<Phos>）。配列番号7は、NR-24のための内部クエンチャドロップオフプローブの配列を示している（<FAM_Thr>TCCTATTTTTT<BHQ_2>TTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAG<Phos>）。配列番号8は、Mono-27のための内部クエンチャドロップオフプローブの配列を示している（<FAM_Thr>ACTCTTTTTT<BHQ_2>TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAG<Phos>）。
【００９２】
実施例10：ヌクレオチド欠失におけるわずかな違いを検出するためのNR-21アッセイ  Daudi細胞は、BT549細胞と比べてNR-21 MSIマーカーがヘテロ接合またはホモ接合のヌクレオチド2個分短縮されている。ドロップオフプローブは、反復長のこのようにわずかな違いを識別できないことがときどきある。NR-21を検出するように設計された第1のドロップオフプローブは、Daudi細胞からのMSIマーカーとBT549細胞からのMSIマーカーを十分に識別しなかった。そこでわれわれは、NR-21 MSIマーカーの中のヌクレオチド2個の違いを識別するのに十分な感度のドロップオフプローブを設計するに至った。
【００９３】
図12は、BT549細胞（上部の2つの図）とDaudi細胞（下部の2つの図）からのDNAに対してプローブ1とプローブ5を用いた比較結果を示している。プローブ1は、配列<FAM_Thr>TGGCCTTTTTTT<BHQ_2>TTTTTTTTTTTTTTTAGCA<Phos>（配列番号9）を持つ第1のドロップオフプローブを表わす。プローブ5は、配列番号6としてすでに上に示されている。図12に示されているように、プローブ5は、野生型NR-21コピーに関するより高次のFAMシグナルを、欠失があるNR-21コピーからのより低次のFAMシグナルから識別する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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