(57)【要約】本開示は、例えば、ウィルソン病に対する療法を提供するために、ＡＴＰ７Ｂエクソン６または隣接イントロンを標的とし、それにより、ＡＴＰ７Ｂ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節して、エクソン６を有するＡＴＰ７Ｂ  ｍＲＮＡ分子のレベルを増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、及び方法を提供する。本開示は、エクソン６、５'−隣接イントロン、３'−隣接イントロン、またはエクソン６及び５'−隣接もしくは３'−隣接イントロンの組み合わせにあるＡＴＰ７Ｂ標的配列と少なくとも７０％相補的な核酸塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクソン６、５'−隣接イントロン、３'−隣接イントロン、またはエクソン６及び前記５'−隣接もしくは３'−隣接イントロンの組み合わせにあるＡＴＰ７Ｂ標的配列と少なくとも７０％相補的な核酸塩基配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、前記５'−隣接または３'−隣接イントロンにあるイントロンスプライシングサイレンサーとのスプライシング因子の結合を低下させる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６７２〜５４６８０の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６９１〜５４７０１の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４４９２〜５４５０６の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４４７２〜５４５１６、５４５２２〜５４５９３、及び５４６６５〜５４７１８の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記核酸塩基配列は、前記５'−隣接イントロン内の配列と相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４５１７までの間の前記５'−隣接イントロン内に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記核酸塩基配列は、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記核酸塩基配列は、配列番号１２２と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４５２２から５４５８１の間の前記５'−隣接イントロン内に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記核酸塩基配列は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、または１０と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、前記５'−隣接イントロン及びエクソン６の前記組み合わせ内に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４５６２から５４５９３の間の前記５'−隣接イントロン及びエクソン６の前記組み合わせ内に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記核酸塩基配列は、配列番号１１と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、エクソン６または前記３'−隣接イントロン及びエクソン６の前記組み合わせ内に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６３１から５４６７７の間に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記核酸塩基配列は、配列番号２２、２３、２４、または２５と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、前記３'−隣接イントロン内に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６５５から５４７３８の間に位置する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドの前記５'−末端ヌクレオチドは、配列番号１の位置５４６９５または位置５４６９６のいずれとも相補的でない、請求項５、６、１９、または２０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記核酸塩基配列は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、または１５５と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記核酸塩基配列は、配列番号３９、４８、４９、５０、６１、６３、６４、６５、６６、６７、７６、７７、７８、７９、８０、８１、９０、９１、９２、９３、９４、９５、１００、１０３、１０４、１２１、及び１４９と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記配列同一性は、少なくとも９０％である、請求項９、１０、１２、１５、１８、２２、または２３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記配列同一性は、１００％である、請求項２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、請求項１から２５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１から２６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合である、請求項２７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記ホスホロチオアート結合は、立体化学的に濃縮されたホスホロチオアート結合である、請求項２８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が独立して前記修飾ヌクレオシド間結合である、請求項２７から２９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合の少なくとも７０％は、独立して前記修飾ヌクレオシド間結合である、請求項３０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシド間結合は、独立して前記修飾ヌクレオシド間結合である、請求項３１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖ヌクレオシドを含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
少なくとも１つの修飾糖ヌクレオシドは、２'−修飾糖ヌクレオシドである、請求項３３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
少なくとも１つの２'−修飾糖ヌクレオシドは、２'−フルオロ、２'−メトキシ、及び２'−メトキシエトキシからなる群から選択される２'−修飾を含む、請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
前記２'−修飾糖ヌクレオシドは、前記２'−メトキシエトキシ修飾を含む、請求項３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
少なくとも１つの修飾糖ヌクレオシドは、架橋型核酸である、請求項３３から３６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記架橋型核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）、またはｃＥｔ核酸である、請求項３７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシドは、独立して前記修飾糖ヌクレオシドである、請求項３３から３８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノオリゴマーである、請求項１から２６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
標的化部分をさらに含む、請求項１から４０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記標的化部分は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記５'末端に共有結合している、請求項４１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記標的化部分は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記３'末端に共有結合している、請求項４１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記標的化部分は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合に共有結合している、請求項４１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記標的化部分は、リンカーにより共有結合している、請求項４２から４４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
前記リンカーは、切断可能なリンカーである、請求項４５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
前記標的化部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含む、請求項４２から４６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
前記標的化部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミンクラスターである、請求項４７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２のヌクレオシドを含む、請求項１から４８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１６のヌクレオシドを含む、請求項４９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計５０以下のヌクレオシドを含む、請求項１から５０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計３０以下のヌクレオシドを含む、請求項１から５０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計２０以下のヌクレオシドを含む、請求項１から５０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計１６から２０のヌクレオシドを含む、請求項１から４８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計１６から１９のヌクレオシドを含む、請求項１から４８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項１から５５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項５７】
異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子を発現する細胞においてエクソン６含有ＡＴＰ７Ｂ  ｍＲＮＡ分子のレベルを増加させる方法であって、前記細胞を請求項１から５５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、方法。
【請求項５８】
前記細胞は、対象内にある、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子を有する対象のウィルソン病を処置する方法であって、治療有効量の請求項１から５５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項５６に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６０】
前記投与するステップは、非経口的に実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子は、配列番号１にｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ変異を有するＡＴＰ７Ｂである、請求項５７から６０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の処置のためのオリゴヌクレオチド及びその使用の分野に関する。特に、本発明は、ウィルソン病の処置に使用することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルソン病は、一般に５から３５歳の間の患者で診断される命にかかわる銅恒常性障害であり、遊離銅蓄積のために肝臓及び神経症状に至る。ウィルソン病の有病率は、３０，０００人に１人と推定される。銅の肝胆汁排出障害は、肝細胞におけるトランスゴルジ銅トランスポーターＡＴＰ７Ｂの異常によって引き起こされる場合がある。ＡＴＰ７Ｂは、細胞質から内膜コンパートメントへの銅の輸送に必要とされ、それに、ゴルジからの小胞輸送を介した胆汁への銅の放出及び／または血流輸送のためのアポセルロプラスミン（ＣＰ）への銅の積み込みが続く。遊離銅蓄積は、生体分子（ＤＮＡ、脂質、ミトコンドリア）に対して直接的な酸化的損傷及び酸化的損傷／ストレス誘発アポトーシスを引き起こす。
【０００３】
ウィルソン病に対する現在の治療ガイドラインは、キレート剤による初期治療を推奨し、これは、遊離銅を封鎖し、その排出に導き、続いてキレート剤または腸管内の吸収をブロックする亜鉛塩による維持治療を行う。キレート剤による初期治療（２〜１２か月）は、従来、患者から過剰な銅を除去するために必要とされる。肝臓状態の悪化は、死んだ肝細胞からの銅放出を増加させることがあるため、維持治療は、安定した肝臓状態になった場合にのみ、開始することができる。しかしながら、亜鉛塩による維持治療は、アドヒアランスの難しさ及び胃腸の副作用によって複雑になる。キレート療法による有害作用は、さらに２０〜３０％の患者において中止の原因となる。キレート療法は、免疫反応、創傷治癒の低下、好中球減少症または血小板減少症、リンパ節症、タンパク尿及び腎毒性、長期の肝臓への鉄蓄積、ならびに遊離銅の急激な上昇の結果として生じる神経損傷と関連づけられる。
【０００４】
ウィルソン病と関連づけられるＡＴＰ７Ｂ変異は、アミノ酸６４５におけるメチオニンからアルギニンへの対応する変化をもたらす、エクソン６におけるアデノシンからシトシンへの単一の塩基対変化である（Ｍ６４５Ｒ）：ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］；ＮＣＢＩ参照配列ＮＧ＿００８８０６．１（配列番号１）：ｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ；ＮＭ＿００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．１９３４Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｍｅｔ６４５Ａｒｇ）。Ｍ６４５Ｒ変異は、遺伝学的証拠に基づいて部分的から完全な機能喪失をもたらすと推定され、短縮型バリアントを有する複合ヘテロ接合体は、一般に、４〜１５歳の間にウィルソン病を発症する。
【０００５】
ｃＤＮＡコードプラスミドを使用して発現させたＭ６４５Ｒ変異ＡＴＰ７Ｂタンパク質の最近の分析は、変異タンパク質が、変異タンパク質のみを発現するｓｆ９昆虫細胞のミクロソーム画分において銅を取り込む同様の能力を有するが、試験されたその他のすべての病原性変異は能力の低下を示したことを示した。さらなる研究は、数々の細胞アッセイにおいて生化学的欠陥のないＭ６４５Ｒ変異ＡＴＰ７Ｂタンパク質を用いて同様の結果を見出した。
【０００６】
しかしながら、Ｍ６４５Ｒ及び関連する変異の以前の分析は、スプライシングに対するそのような変異の影響を検討するのに失敗した可能性もある。スプライシングは、ヒト細胞内で起こる自然な生物学的機構である。スプライシングは、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される前に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から転写される一次メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を処理するために使用される場合もある。スプライシングは、ｍＲＮＡの１つ以上の隣接するセグメント（イントロン）を除去して、５'スプライス部位及び３'スプライス部位の組によって範囲が定められた残りのセグメント（エクソン）を結合することを含む場合もある。選択的スプライシングは、エクソンの異なる組み合わせを合わせたスプライシングである可能性もあるが、単一遺伝子から複数のｍＲＮＡ転写物をもたらすこともある。
【０００７】
（例えば、点変異などの遺伝子異常によって引き起こされる）特定のヒト遺伝子疾患は、異常なスプライシングによって引き起こされる場合もある。したがって、異常なスプライシングによって引き起こされる疾患を処置するためのスプライシングメディエーターが必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
概して、本発明は、ＡＴＰ７Ｂエクソン６、隣接イントロン、またはその組み合わせ内の配列と相補的な核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、エクソン６、５'−隣接イントロン、３'−隣接イントロン、またはエクソン６及び５'−隣接もしくは３'−隣接イントロンの組み合わせにあるＡＴＰ７Ｂ標的配列と少なくとも７０％相補的な核酸塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、５'−隣接または３'−隣接イントロンにあるイントロンスプライシングサイレンサーとのスプライシング因子の結合を低下させる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６７２〜５４６８０の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６９１〜５４７０１の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４４９２〜５４５０６の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４４７２〜５４５１６の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４５２２〜５４５９３の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６６５〜５４７１８の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、核酸塩基配列は、５'−隣接イントロン内の配列と相補的である。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４５１７までの間の５'−隣接イントロン内に位置する。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列は、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４と少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列は、配列番号１２２と少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４５２２から５４５８１の間の５'−隣接イントロン内に位置する。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、または１０と少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、５'−隣接イントロン及びエクソン６の組み合わせ内に位置する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４５６２から５４５９３の間の５'−隣接イントロン及びエクソン６の組み合わせ内に位置する。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列は、配列番号１１と少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、エクソン６または３'−隣接イントロン及びエクソン６の組み合わせ内に位置する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６３１から５４６７７の間に位置する。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列は、配列番号２２、２３、２４、または２５と少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、３'−隣接イントロン内に位置する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂ標的配列は、配列番号１の位置５４６５５から５４７３８の間に位置する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの５'−末端ヌクレオチドは、配列番号１の位置５４６９５または位置５４６９６のいずれとも相補的でない。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、または１５５と少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列は、配列番号３９、４８、４９、５０、６１、６３、６４、６５、６６、６７、７６、７７、７８、７９、８０、８１、９０、９１、９２、９３、９４、９５、１００、１０３、１０４、１２１、及び１４９と少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、任意の核酸塩基配列の配列同一性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％、例えば、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態において、配列同一性は、１００％である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合である。いくつかの実施形態において、ホスホロチオアート結合は、立体化学的に濃縮されたホスホロチオアート結合である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％は、独立して修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合の少なくとも７０％は、独立して修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシド間結合は、独立して修飾ヌクレオシド間結合である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾糖ヌクレオシドは、２'−修飾糖ヌクレオシドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２'−修飾糖ヌクレオシドは、２'−フルオロ、２'−メトキシ、及び２'−メトキシエトキシからなる群から選択される２'−修飾を含む。いくつかの実施形態において、２'−修飾糖ヌクレオシドは、２'−メトキシエトキシ修飾を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシドは、独立して修飾糖ヌクレオシドである。
【００２２】
本発明の特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートジエステル結合であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシドは、２'−メトキシエトキシ修飾リボースヌクレオシドである。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはそのクラスターなどの標的化部分をさらに含んでもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾糖ヌクレオシドは、架橋型核酸である。いくつかの実施形態において、架橋型核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）、またはｃＥｔ核酸である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノオリゴマーである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５'末端に共有結合している。いくつかの実施形態において、標的化部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３'末端に共有結合している。いくつかの実施形態において、標的化部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合に共有結合している。
【００２６】
いくつかの実施形態において、標的化部分は、リンカーにより共有結合している。いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカー（例えば、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＳＣ（Ｏ）−を含む、リンカー）である。
【００２７】
標的化部分の例としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グリシルレチン酸、グリチルリチン、ラクトビオン酸、ラクトフェリン、ＩｇＡ、胆汁酸（例えば、リトコリルタウリンまたはタウロコール酸）、及びそのクラスターが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的化部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミンクラスターである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１６のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計５０以下のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計３０以下のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計２０以下のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計１６から２０のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合計１６から１９のヌクレオシドを含む。
【００２９】
別の態様において、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
さらに別の態様において、本発明は、細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることによって、異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子を発現する細胞においてエクソン６含有ＡＴＰ７Ｂ  ｍＲＮＡ分子のレベルを増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、対象内にある。
【００３１】
さらに別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子を有する対象のウィルソン病を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、投与するステップは、非経口的に実施される。いくつかの実施形態において、異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子は、配列番号１にｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ変異を有するＡＴＰ７Ｂである。
【００３２】
基となる遺伝子異常に起因する異常なスプライシングによって引き起こされる可能性がある疾患を処置するための組成物及び方法に対する必要性が本明細書において認識される。ある場合には、産生される遺伝子産物を変えるために、オリゴヌクレオチドなどのアンチセンス核酸分子を使用して、遺伝子疾患における標的遺伝子のスプライシングを効果的に調節してもよい。このアプローチは、遺伝子疾患に関与する遺伝子に関する発現及び遺伝子産物組成を選択的に調節するために療法に利用することができる。
【００３３】
本開示は、ＡＴＰ７Ｂをコードする核酸分子を標的とし、それにハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを有利に使用することができる組成物及び方法を提供する。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰ７Ｂの１つ以上のエクソンまたはイントロンにある１つ以上のスプライシング調節エレメントを標的としてもよい。こうしたスプライシング調節エレメントは、ＡＴＰ７Ｂリボ核酸（ＲＮＡ）のスプライシングを調節する。
【００３４】
一態様において、本開示は、ＡＴＰ７Ｂのエクソンに隣接する１つ以上のスプライシング調節エレメントを標的とする配列を有するＡＴＰ７Ｂ  ＲＮＡスプライシング調節アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂの遺伝子異常は、Ｍ６４５Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｍ６４５Ｒ変異は、ＡＴＰ７Ｂ  ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］（配列番号１のｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ）に起因する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスプライシング調節エレメントは、エクソンスプライシングサイレンサーエレメントまたはイントロンスプライシングサイレンサーエレメントを含む。いくつかの実施形態において、配列は、異常にスプライシングされるエクソンを標的とする。いくつかの実施形態において、配列は、異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンを標的とする。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、バリアントスプライシングを調節して、エクソン含有の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から２０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００３５】
別の態様において、本開示は、対象の細胞、組織、または器官におけるＡＴＰ７Ｂ  ＲＮＡのスプライシングを調節するための方法であって、細胞、組織、または器官を、異常にスプライシングされるエクソンまたは異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンの１つ以上のスプライシング調節エレメントを標的とする１つ以上の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂの遺伝子異常は、Ｍ６４５Ｒを含む。いくつかの実施形態において、Ｍ６４５Ｒは、ＡＴＰ７Ｂ  ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］（配列番号１のｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ）に起因する。いくつかの実施形態において、スプライシング調節エレメントは、エクソンスプライシングサイレンサーエレメントまたはイントロンスプライシングサイレンサーエレメントである。いくつかの実施形態において、配列は、異常にスプライシングされるエクソンを標的とする。いくつかの実施形態において、配列は、異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンを標的とする。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、バリアントスプライシングを調節して、エクソン含有の増加（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理をしていないエクソン６スキッピング変異を有するＡＴＰ７Ｂ遺伝子を含む細胞におけるＡＴＰ７Ｂ転写物分子の総数に対するエクソン６含有ＡＴＰ７Ｂ転写物の比率と比較した場合に、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％、例えば、最大１００％、最大９０％、最大８０％、最大７０％、最大６０％、最大５０％のエクソン６含有の増加）をもたらす。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から２０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から５０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、例えば、ウィルソン病を有するか、または有する疑いがあり、対象は、細胞、組織、または器官を組成物と接触させたのに応じた疾患の進行または後退について監視される。
【００３６】
別の態様において、本開示は、対象のウィルソン病を処置するための方法であって、対象に異常にスプライシングされるエクソンまたは異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンのスプライシング調節エレメントを標的とする配列を含む治療有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、方法を提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰ７Ｂ  ＲＮＡのスプライシングを調節する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂの遺伝子異常は、Ｍ６４５Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｍ６４５Ｒ変異は、ＡＴＰ７Ｂ  ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］（配列番号１のｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ変異体）に起因する。いくつかの実施形態において、スプライシング調節エレメントとしては、エクソンスプライシングサイレンサーエレメントまたはイントロンスプライシングサイレンサーエレメントが挙げられる。いくつかの実施形態において、配列は、ＡＴＰ７Ｂの異常にスプライシングされるエクソンを標的とする。いくつかの実施形態において、配列は、ＡＴＰ７Ｂの遺伝子異常の異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンを標的とし、これは、ＡＴＰ７Ｂ  ＲＮＡのバリアントスプライシングを調節する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシングを調節して、エクソン含有の増加（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置をしていないエクソン６スキッピング変異を有するＡＴＰ７Ｂ遺伝子を含む細胞におけるＡＴＰ７Ｂ転写物分子の総数に対するエクソン６含有ＡＴＰ７Ｂ転写物の比率と比較した場合に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％；例えば、最大１００％、最大９０％、最大８０％、最大７０％、最大６０％、最大５０％の増加）をもたらす。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から２０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から５０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、対象は、対象に治療有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することに応じたウィルソン病の進行または後退について監視される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、対照の対象と比較した場合に、２４時間、対象における尿中の銅レベルを、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％；例えば、最大９０％、最大８０％、最大７０％、最大６０％、最大５０％低下させる。いくつかの実施形態において、対照の対象は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の前の対象であるか、またはウィルソン病を患っており、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを与えられていない対象である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２４時間、対象における尿中の銅レベルを＜１００μｇ／２４時間（＜１．６μｍｏｌ／２４時間）（例えば、≦４０μｇ／２４時間（≦０．６μｍｏｌ／２４時間））に低下させる。
【００３７】
別の態様において、本開示は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される担体を含む、ウィルソン病の処置のための医薬組成物を提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、異常にスプライシングされるエクソンまたは異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンのスプライシング調節エレメントを標的とする配列を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰ７Ｂ  ＲＮＡのスプライシングを調節する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ７Ｂの遺伝子異常は、Ｍ６４５Ｒを含む。いくつかの実施形態において、Ｍ６４５Ｒ変異は、ＡＴＰ７Ｂ  ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］（配列番号１のｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ変異体）に起因する。
【００３８】
定義
本明細書全体をとおして使用されるさまざまな用語は、文脈が他のことを示さない限り以下のとおり読み取り、理解することができる。全体をとおして使用される「または」は、「及び／または」と書かれるかのように包括的である。全体をとおして使用される単数冠詞及び代名詞は、その複数形を含み、逆もまた同様である。同様に、性別を反映した代名詞は、その対のもう片方の代名詞を含むため、代名詞が１つの性別によって使用、実装、性能などに対して本明細書に記載されているいかなるものも限定するものと理解されるべきではない。「例となる」は、「実例となる」または「例示すること」と理解されるべきであり、必ずしも他の実施形態を超えて「好ましい」という訳ではない。用語に関するさらなる定義が、本明細書に記載されている場合もあり、これらは、本明細書の読み取りから理解されるであろうとおり、それらの用語の前及び後の事例に適用される場合もある。
【００３９】
「アシル」という用語は、本明細書中で使用される場合、式−Ｃ（Ｏ）−Ｒの化学置換基を表し、式中、Ｒは、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキルである。任意に置換されたアシルは、各基Ｒに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたアシルである。
【００４０】
「アシルオキシ」という用語は、本明細書中で使用される場合、式−ＯＲの化学置換基を表し、式中、Ｒは、アシルである。任意に置換されたアシルオキシは、アシルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたアシルオキシである。
【００４１】
「アルカンテトライル」という用語は、本明細書中で使用される場合、他に指定がない限り、１から１６個の炭素を有する四価の非環式直鎖または分岐鎖飽和炭化水素基を表す。アルカンテトライルは、アルキルに関して記載されるとおり任意に置換されてもよい。
【００４２】
「アルカントリイル」という用語は、本明細書中で使用される場合、他に指定がない限り、１から１６個の炭素を有する三価の非環式直鎖または分岐鎖飽和炭化水素基を表す。アルカントリイルは、アルキルに関して記載されるとおり任意に置換されてもよい。
【００４３】
「アルカノイル」という用語は、本明細書中で使用される場合、式−Ｃ（Ｏ）−Ｒの化学置換基を表し、式中、Ｒは、アルキルである。任意に置換されたアルカノイルは、アルキルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたアルカノイルである。
【００４４】
「アルコキシ」という用語は、本明細書中で使用される場合、式−ＯＲの化学置換基を表し、他に指定がない限り、式中、Ｒは、Ｃ１〜６アルキル基である。任意に置換されたアルコキシは、アルキルに関して本明細書中で定義されるとおり任意に置換されたアルコキシ基である。
【００４５】
「アルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、非環式直鎖または分岐鎖飽和炭化水素基を指し、これは、非置換の場合、他に指定がない限り、１から１２個の炭素を有する。特定の好適な実施形態において、非置換アルキルは、１から６個の炭素を有する。アルキル基は、メチル；エチル；ｎ−及びイソプロピル；ｎ−、ｓｅｃ−、ｉｓｏ−及びｔｅｒｔ−ブチル；ネオペンチルなどが例示され、価数が可能であれば、以下からなる群から独立して選択される１、２、３または、２つ以上の炭素のアルキル基の場合は４つ以上の置換基で任意に置換されてもよい：アルコキシ；アシルオキシ；アミノ；アリール；アリールオキシ；アジド；シクロアルキル；シクロアルコキシ；ハロ；ヘテロシクリル；ヘテロアリール；ヘテロシクリルアルキル；ヘテロアリールアルキル；ヘテロシクリルオキシ；ヘテロアリールオキシ；ヒドロキシ；ニトロ；チオール；シリル；シアノ；＝Ｏ；＝Ｓ；及びＲ'がＨ、アルキル、アリール、もしくはヘテロシクリルである＝ＮＲ'。いくつかの実施形態において、置換アルキルは、２つの置換基（オキソ及びヒドロキシ、またはオキソ及びアルコキシ）を含み、基−Ｌ−ＣＯ−Ｒを形成し、式中、Ｌは、結合または任意に置換されたＣ１〜１１アルキレンであり、Ｒは、ヒドロキシルまたはアルコキシである。置換基のそれぞれは、それ自体が非置換であってもよく、または価数が可能であれば、各それぞれの基に関して本明細書において定義された非置換置換基（複数可）で置換されてもよい。
【００４６】
「アルキレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、価数で置き換えられた１つの水素原子を有する一価のアルキルである二価の置換基を表す。任意に置換されたアルキレンは、アルキルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたアルキレンである。
【００４７】
「アリール」という用語は、本明細書中で使用される場合、１または２つの芳香族環を有する単環式、二環式、または多環式炭素環系を表す。アリール基は、６から１０個の炭素原子を含んでもよい。非置換炭素環式アリール基内のすべての原子は、炭素原子である。炭素環式アリール基の非限定例としては、フェニル、ナフチル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどが挙げられる。アリール基は、非置換であってもよく、またはアルキル；アルコキシ；アシルオキシ；アミノ；アリール；アリールオキシ；アジド；シクロアルキル；シクロアルコキシ；ハロ；ヘテロシクリル；ヘテロアリール；ヘテロシクリルアルキル；ヘテロアリールアルキル；ヘテロシクリルオキシ；ヘテロアリールオキシ；ヒドロキシ；ニトロ；チオール；シリル；及びシアノからなる群から独立して選択される１、２、３、４、もしくは５つの置換基で置換されてもよい。置換基のそれぞれは、それ自体が非置換であってもよく、または各それぞれの基に関して本明細書において定義された非置換置換基（複数可）で置換されてもよい。
【００４８】
「アリールアルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、アリール基で置換されたアルキル基を表す。アリール及びアルキル部分は、本明細書に記載されるとおり個々の基として任意に置換されてもよい。
【００４９】
「アリーレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、価数で置き換えられた１つの水素原子を有するアリールである二価の置換基を表す。任意に置換されたアリーレンは、アリールに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたアリーレンである。
【００５０】
「アリールオキシ」という用語は、本明細書中で使用される場合、基−ＯＲを表し、式中、Ｒは、アリールである。アリールオキシは、任意に置換されたアリールオキシであってもよい。任意に置換されたアリールオキシは、アリールに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたアリールオキシである。
【００５１】
「ＡＴＰ７Ｂ」という用語は、本明細書中で使用される場合、インビボにおいてＡＴＰアーゼ銅輸送ベータタンパク質に翻訳される、ゲノムＤＮＡの場合、最初に転写される、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）を表す。ヒトＡＴＰ７Ｂ遺伝子を含む例となるゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８８０６．１）によって示される。配列番号１は、ＡＴＰ７ＢのゲノムＤＮＡのアンチセンス鎖（配列番号１の位置５００１〜８３８２６）及びその他の近くの遺伝子に関する配列を提供する。当業者は、ＲＮＡ配列が一般にチミジンの代わりにウリジンを含むことを認識するであろう。「ＡＴＰ７Ｂ」という用語は、本明細書中で使用される場合、野生型及び変異型を表す。例となる変異核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）は、エクソン６が欠如したＡＴＰアーゼ銅輸送ベータタンパク質をもたらす。
【００５２】
「二環式糖部分」という用語は、本明細書中で使用される場合、２つの縮合環を含む修飾糖部分を表す。特定の実施形態において、二環式糖部分は、フラノシル環を含む。
【００５３】
「Ｃｘ〜ｙ」という表現は、本明細書中で使用される場合、名称がこの表現の直後に続く基が、非置換の場合、全部でｘからｙ個の炭素原子を含むことを示す。基が複合基（例えば、アリールアルキル）である場合、Ｃｘ〜ｙは、名称がこの表現の直後に続く部分が、非置換の場合、全部でｘからｙ個の炭素原子を含むことを示す。例えば、（Ｃ６〜１０−アリール）−Ｃ１〜６−アルキルは、アリール部分が、非置換の場合、全部で６から１０個の炭素原子を含み、アルキル部分が、非置換の場合、全部で１から６個の炭素原子を含む基である。
【００５４】
「相補的な」という用語は、本明細書中で核酸塩基配列に関して使用される場合、生理的条件下において核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが別のオリゴヌクレオチドまたは核酸とハイブリダイズして、二本鎖構造を形成するのを可能にする連続的な核酸塩基のパターンを有する核酸塩基配列を指す。相補的な配列としては、天然及び／または修飾核酸塩基から形成されるワトソン・クリック塩基対が挙げられる。相補的な配列は、ゆらぎ塩基対（グアノシン・ウラシル、ヒポキサンチン・ウラシル、ヒポキサンチン・アデニン、及びヒポキサンチン・シトシン）及びフーグスティーン型塩基対などの非ワトソン・クリック塩基対も含む場合がある。
【００５５】
「連続的な」という用語は、本明細書中でオリゴヌクレオチドの文脈において使用される場合、互いに直接隣接するヌクレオシド、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合を指す。例えば、「連続的な核酸塩基」とは、配列中に互いに直接隣接する核酸塩基を意味する。
【００５６】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、他に指定がない限り、３から１０個の炭素を有する環式アルキル基を指す（例えば、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）。シクロアルキル基は、単環式または二環式であってもよい。二環式シクロアルキル基は、ビシクロ［ｐ．ｑ．０］アルキル型であってもよく、この場合、ｐ及びｑのそれぞれは、独立して、１、２、３、４、５、６、または７であり、ただし、ｐ及びｑの合計が２、３、４、５、６、７、または８である。あるいは、二環式シクロアルキル基は、架橋型シクロアルキル構造、例えば、ビシクロ［ｐ．ｑ．ｒ］アルキルを含んでもよく、この場合、ｒは、１、２、または３であり、ｐ及びｑのそれぞれは、独立して、１、２、３、４、５、または６であり、ただし、ｐ、ｑ、及びｒの合計が３、４、５、６、７、または８である。シクロアルキル基は、スピロ環基、例えば、スピロ［ｐ．ｑ］アルキルであってもよく、この場合、ｐ及びｑのそれぞれは、独立して、２、３、４、５、６、または７であり、ただし、ｐ及びｑの合計が４、５、６、７、８、または９である。シクロアルキル非限定例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、１−ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル、２−ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル、５−ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル、７−ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル、及びデカリニルが挙げられる。シクロアルキル基は、非置換であってもよく、またはアルキル；アルコキシ；アシルオキシ；アミノ；アリール；アリールオキシ；アジド；シクロアルキル；シクロアルコキシ；ハロ；ヘテロシクリル；ヘテロアリール；ヘテロシクリルアルキル；ヘテロアリールアルキル；ヘテロシクリルオキシ；ヘテロアリールオキシ；ヒドロキシ；ニトロ；チオール；シリル；シアノ；＝Ｏ；＝Ｓ；Ｒ'がＨ、アルキル、アリール、もしくはヘテロシクリルである＝ＮＲ'からなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５つの置換基で置換されてもよい（例えば、任意に置換されたシクロアルキル）。置換基のそれぞれは、それ自体が非置換であってもよく、または各それぞれの基に関して本明細書において定義された非置換置換基（複数可）で置換されてもよい。
【００５７】
「シクロアルキレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、価数で置き換えられた１つの水素原子を有するシクロアルキルである二価の置換基を表す。任意に置換されたシクロアルキレンは、シクロアルキルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたシクロアルキレンである。
【００５８】
「シクロアルコキシ」という用語は、本明細書中で使用される場合、基−ＯＲを表し、式中、Ｒは、シクロアルキルである。シクロアルコキシは、任意に置換されたシクロアルコキシであってもよい。任意に置換されたシクロアルコキシは、シクロアルキルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたシクロアルコキシである。
【００５９】
「二本鎖」という用語は、本明細書中で使用される場合、相補的な核酸塩基のハイブリダイゼーションにより対になった２つのオリゴヌクレオチドを表す。
【００６０】
「エクソン６」という用語は、本明細書中で使用される場合、配列番号１の位置５４５８２から５４６５８（ｈｇ１９／ｂ３７座標  ｃｈｒ１３：５２５３５９７３〜５２５３６０４９）に対応するＡＴＰ７Ｂ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、例えば、配列番号２のエクソン６、またはその変異型（例えば、配列番号１のｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ）を指す。
【００６１】
「隣接イントロン」という用語は、本明細書中で使用される場合、エクソン６またはその変異体の５'末端または３'末端に隣接するイントロンを指す。隣接イントロンは、５'−隣接イントロンまたは３'−隣接イントロンである。５'−隣接イントロンは、エクソン６の５'末端に隣接する隣接イントロン（例えば、配列番号１のエクソン５とエクソン６との間のイントロン位置）に対応する。３'−隣接イントロンは、エクソン６の３'末端に隣接する隣接イントロン（例えば、配列番号１のエクソン６とエクソン７との間のイントロン位置）に対応する。
【００６２】
「遺伝子異常」という用語は、本明細書中で使用される場合、一般に遺伝子における変異またはバリアントを指す。遺伝子異常の例としては、点変異（１つのヌクレオチドバリアントもしくは１つの塩基置換）、挿入もしくは欠失（インデル）、トランスバージョン、転座、逆位、または切断を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングにエクソン６をスキップさせる１つ以上の変異を含む。
【００６３】
「ハロ」という用語は、本明細書中で使用される場合、臭素、塩素、ヨウ素、及びフッ素から選択されるハロゲンを表す。
【００６４】
「ヘテロアルカンテトライル」という用語は、本明細書中で使用される場合、１回１つのヘテロ原子によって；２回、各回が独立して１つのヘテロ原子によって；３回、各回が独立して１つのヘテロ原子によって；または４回、各回が独立して１つのヘテロ原子によって中断されたアルカンテトライル基を指す。それぞれのヘテロ原子は、独立して、Ｏ、Ｎ、またはＳである。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は、ＯまたはＮである。非置換ＣＸ〜Ｙヘテロアルカンテトライルは、ＸからＹ個の炭素原子ならびに本明細書中で定義されるとおりのヘテロ原子を含む。ヘテロアルカンテトライル基は、非置換であってもよく、またはヘテロアルキルに関して記載されるとおり置換されてもよい（例えば、任意に置換されたヘテロアルカンテトライル）。
【００６５】
「ヘテロアルカントリイル」という用語は、本明細書中で使用される場合、１回、１つのヘテロ原子によって；２回、各回が独立して１つのヘテロ原子によって；３回、各回が独立して１つのヘテロ原子によって；または４回、各回が独立して１つのヘテロ原子によって中断されたアルカントリイル基を指す。それぞれのヘテロ原子は、独立して、Ｏ、Ｎ、またはＳである。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は、ＯまたはＮである。非置換ＣＸ〜Ｙヘテロアルカントリイルは、ＸからＹ個の炭素原子ならびに本明細書中で定義されるとおりのヘテロ原子を含む。ヘテロアルカントリイル基は、非置換であってもよく、またはヘテロアルキルに関して記載されるとおり置換されてもよい（例えば、任意に置換されたヘテロアルカントリイル）。
【００６６】
「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、各回が１または２つのヘテロ原子によって１回以上中断されたアルキル基を指す。それぞれのヘテロ原子は、独立してＯ、Ｎ、またはＳである。ヘテロアルキル基のいずれも２つの連続した酸素原子を含まない。ヘテロアルキル基は、非置換であってもよく、または置換されてもよい（例えば、任意に置換されたヘテロアルキル）。ヘテロアルキルが置換され、置換基がヘテロ原子に結合している場合、置換基は、ヘテロ原子の性質及び価数により選択される。このように、ヘテロ原子に結合した置換基は、価数が可能であれば、＝Ｏ、−Ｎ（ＲＮ２）２、−ＳＯ２ＯＲＮ３、−ＳＯ２ＲＮ２、−ＳＯＲＮ３、−ＣＯＯＲＮ３、Ｎ保護基、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはシアノからなる群から選択され、式中、各ＲＮ２は、独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロシクリルであり、各ＲＮ３は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロシクリルである。これらの置換基のそれぞれは、それ自体が非置換であってもよく、または各それぞれの基に関して本明細書において定義された非置換置換基（複数可）で置換されてもよい。ヘテロアルキルが置換され、置換基が炭素に結合している場合、ヘテロ原子に結合した炭素原子上の置換基がＣｌ、Ｂｒ、またはＩではないという条件で、置換基は、アルキルに関して記載されるものから選択される。いくつかの実施形態において、炭素原子は、ヘテロアルキル基の末端に見られる。いくつかの実施形態において、ヘテロアルキルは、ＰＥＧである。
【００６７】
「ヘテロアルキレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、価数で置き換えられた１つの水素原子を有するヘテロアルキルである二価の置換基を表す。任意に置換されたヘテロアルキレンは、ヘテロアルキルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたヘテロアルキレンである。
【００６８】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書中で使用される場合、単環式５、６、７、もしくは８員環系、または縮合もしくは架橋二環、三環、もしくは四環系を表し、環系は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３または４つのヘテロ原子を含み、環の少なくとも１つは、芳香族環である。ヘテロアリール基の非限定例としては、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、フリル、イミダゾリル、インドリル、イソインダゾリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピロリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、キナゾリニル、キノリニル、チアジアゾリル（例えば、１，３，４−チアジアゾール）、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジヒドロインドリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリルなどが挙げられる。二環式、三環式、及び四環式ヘテロアリールという用語は、上記のとおりの少なくとも１つのヘテロ原子及び少なくとも１つの芳香族環を有する少なくとも１つの環を含む。例えば、少なくとも１つのヘテロ原子を有する環は、１、２、または３つの炭素環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、または別の単環式複素環と縮合していてもよい。縮合ヘテロアリールの例としては、１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジン；２，３−ジヒドロベンゾフラン；２，３−ジヒドロインドール；及び２，３−ジヒドロベンゾチオフェンが挙げられる。ヘテロアリールは、以下からなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５つの置換基で任意に置換されてもよい：アルキル；アルコキシ；アシルオキシ；アリールオキシ；アミノ；アリールアルコキシ；シクロアルキル；シクロアルコキシ；ハロゲン；ヘテロシクリル；ヘテロシクリルアルキル；ヘテロアリール；ヘテロアリールアルキル；ヘテロシクリルオキシ；ヘテロアリールオキシ；ヒドロキシル；ニトロ；チオール；シアノ；＝Ｏ；各Ｒが、独立して水素、アルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールである−ＮＲ２；ＲＡが水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールである−ＣＯＯＲＡ；及び各ＲＢが、独立して、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールである−ＣＯＮ（ＲＢ）２。置換基のそれぞれは、それ自体が非置換であってもよく、または各それぞれの基に関して本明細書において定義された非置換置換基（複数可）で置換されてもよい。
【００６９】
「ヘテロアリーレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、価数で置き換えられた１つの水素原子を有するヘテロアリールである二価の置換基を表す。任意に置換されたヘテロアリーレンは、ヘテロアリールに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたヘテロアリーレンである。
【００７０】
「ヘテロアリールオキシ」という用語は、本明細書中で使用される場合、Ｒがヘテロアリールである構造−ＯＲを指す。ヘテロアリールオキシは、ヘテロアリールに関して定義されたとおり任意に置換されてもよい。
【００７１】
「ヘテロシクリル」という用語は、本明細書中で使用される場合、他に指定がない限り、縮合または架橋４、５、６、７、または８員環を有する単環、二環、三環、または四環系を表し、環系は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４つのヘテロ原子を含む。ヘテロシクリルは、芳香族であっても、または非芳香族であってもよい。芳香族ヘテロシクリルは、本明細書に記載されるとおりのヘテロアリールである。非芳香族５員ヘテロシクリルは、０または１つの二重結合を有し、非芳香族６及び７員ヘテロシクリル基は、０から２つの二重結合を有し、非芳香族８員ヘテロシクリル基は、０から２つの二重結合及び／または０または１つの炭素・炭素三重結合を有する。ヘテロシクリル基は、他に指定がない限り、１から１６個の炭素原子の炭素数を有する。特定のヘテロシクリル基は、炭素数最大９個の炭素原子を有する場合もある。非芳香族ヘテロシクリル基としては、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピペラジニル、ピリダジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリルなどが挙げられる。「ヘテロシクリル」という用語は、１つ以上の炭素及び／またはヘテロ原子が単環式環の２つの隣接していない環原子と架橋する架橋型多環式構造を有する複素環式化合物、例えば、キヌクリジン、トロパン、またはジアザ−ビシクロ［２．２．２］オクタンも表す。「ヘテロシクリル」という用語は、任意の上記の複素環が１、２、または３つの炭素環、例えば、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、または別の複素環と縮合する二環式、三環式、及び四環式基を含む。縮合ヘテロシクリルの例としては、１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジン；２，３−ジヒドロベンゾフラン；２，３−ジヒドロインドール；及び２，３−ジヒドロベンゾチオフェンが挙げられる。ヘテロシクリル基は、非置換であってもよく、または以下からなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５つの置換基で置換されてもよい：アルキル；アルコキシ；アシルオキシ；アリールオキシ；アミノ；アリールアルコキシ；シクロアルキル；シクロアルコキシ；ハロゲン；ヘテロシクリル；ヘテロシクリルアルキル；ヘテロアリール；ヘテロアリールアルキル；ヘテロシクリルオキシ；ヘテロアリールオキシ；ヒドロキシル；ニトロ；チオール；シアノ；＝Ｏ；＝Ｓ；各Ｒが、独立して水素、アルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールである−ＮＲ２；ＲＡが水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールである−ＣＯＯＲＡ；及び各ＲＢが、独立して、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールである−ＣＯＮ（ＲＢ）２。
【００７２】
「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヘテロシクリル基で置換されたアルキル基を表す。任意に置換されたヘテロシクリルアルキルのヘテロシクリル及びアルキル部分は、それぞれヘテロシクリル及びアルキルに関して記載されるとおり任意に置換される。
【００７３】
「ヘテロシクリレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、価数で置き換えられた１つの水素原子を有するヘテロシクリルである二価の置換基を表す。任意に置換されたヘテロシクリレンは、ヘテロシクリルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたヘテロシクリレンである。
【００７４】
「ヘテロシクリルオキシ」という用語は、本明細書中で使用される場合、Ｒがヘテロシクリルである構造−ＯＲを指す。ヘテロシクリルオキシは、ヘテロシクリルに関して記載されるとおり任意に置換されてもよい。
【００７５】
「ヘテロ有機」という用語は、本明細書中で使用される場合、（ｉ）各回が１または２つのヘテロ原子によって１回以上中断された非環式炭化水素、または（ｉｉ）１つ以上（例えば、１、２、３、または４つ）の環内ヘテロ原子を含む環式炭化水素を指す。それぞれのヘテロ原子は、独立してＯ、Ｎ、またはＳである。ヘテロ有機基のいずれも２つの連続する酸素原子を含まない。任意に置換されたヘテロ有機基は、アルキルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換されたヘテロ有機基である。
【００７６】
「炭化水素」という用語は、本明細書中で使用される場合、非環式分岐もしくは非環式直鎖化合物もしくは基、または単環式、二環式、三環式、もしくは四環式化合物もしくは基を指す。炭化水素は、非置換の場合、炭素及び水素原子からなる。他に指定がない限り、非置換炭化水素は、全部で１から６０個の炭素原子（例えば、１から１６個、１から１２個、または１から６個の炭素原子）を含む。任意に置換された炭化水素は、任意に置換された非環式炭化水素または任意に置換された環式炭化水素である。任意に置換された非環式炭化水素は、アルキルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換される。任意に置換された環式炭化水素は、任意に置換された芳香族炭化水素または任意に置換された非芳香族炭化水素である。任意に置換された芳香族炭化水素は、アリールに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換される。任意に置換された非芳香族環式炭化水素は、シクロアルキルに関して本明細書に記載されるとおり任意に置換される。いくつかの実施形態において、非環式炭化水素は、アルキル、アルキレン、アルカントリイル、またはアルカンテトライルである。特定の実施形態において、環式炭化水素は、アリールまたはアリーレンである。特定の実施形態において、環式炭化水素は、シクロアルキルまたはシクロアルキレンである。
【００７７】
「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」という用語は、本明細書において同義に使用される場合、−ＯＨを表す。
【００７８】
「疎水性部分」という用語は、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチド骨格に共有結合した一価基を表し、この場合、一価基は、胆汁酸（例えば、コール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、オレイルリトコール酸、またはオレオイルコレン酸）、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、イソプレノイド、ビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、トリグリセリド、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンチン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ジコキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素、ソラレン、またはイブプロフェンである。一価基の非限定例としては、エルゴステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、カンペステロール、フコステロール、サリンゴステロール、アベナステロール、コプロスタノール、コレステロール、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、カルジオリピン、及びカロテノイドが挙げられる。一価基をオリゴヌクレオチドと連結するリンカーは、任意に置換されたＣ１〜６０炭化水素（例えば、任意に置換されたＣ１〜６０アルキレン）または任意に置換されたＣ２〜６０ヘテロ有機（例えば、任意に置換されたＣ２〜６０ヘテロアルキレン）であってもよく、リンカーは、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、及び任意に置換されたシクロアルキレンからなる群から独立して選択される１、２、または３つの例で任意に中断されてもよい。リンカーは、例えば、５'末端炭素原子、３'末端炭素原子、５'末端ホスファートもしくはホスホロチオアート、３'末端ホスファートもしくはホスホロチオアート、またはヌクレオシド間結合に結合した酸素原子によりオリゴヌクレオチドと結合されてもよい。
【００７９】
「ヌクレオシド間結合」という用語は、本明細書中で使用される場合、二価基またはオリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオシド間に共有結合を形成する共有結合を表す。ヌクレオシド間結合は、未修飾ヌクレオシド間結合または修飾ヌクレオシド間結合である。「未修飾ヌクレオシド間結合」は、ホスファート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−）ヌクレオシド間結合（「ホスファートホスホジエステル」）である。「修飾ヌクレオシド間結合」は、ホスファートホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合である。修飾ヌクレオシド間結合の２つの主なクラスは、リン原子の有無によって定義される。リン含有ヌクレオシド間結合の非限定例としては、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオアートジエステル結合、ホスホロチオアートトリエステル結合、ホスホロジチオアート結合、ボラノホスホナート結合、モルホリノヌクレオシド間結合、メチルホスホナート、及びホスホルアミダートが挙げられる。非リンヌクレオシド間結合の非限定例としては、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカーバマート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）、シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）、及びＮ，Ｎ'−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられる。ホスホロチオアート結合は、ホスホジエステル結合及びホスホトリエステル結合であり、その中の非架橋酸素原子の１つが硫黄原子で置換されている。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド間結合は、以下の構造：
2021513851.tif 000002
の基であり、
式中、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｂ、またはＳｅであり；
Ｙは、−Ｘ−Ｌ−Ｒ１であり；
各Ｘは、独立して−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（−Ｌ−Ｒ１）−、またはＬであり；
各Ｌは、独立して共有結合またはリンカー（例えば、任意に置換されたＣ１〜６０炭化水素リンカーもしくは任意に置換されたＣ２〜６０ヘテロ有機リンカー）であり；
各Ｒ１は、独立して、水素、−Ｓ−Ｓ−Ｒ２、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ２、−Ｓ−ＣＯ−Ｒ２、任意に置換されたＣ１〜９ヘテロシクリル、疎水性部分、または標的化部分であり；
各Ｒ２は、独立して、任意に置換されたＣ１〜１０アルキル、任意に置換されたＣ２〜１０ヘテロアルキル、任意に置換されたＣ６〜１０アリール、任意に置換されたＣ６〜１０アリール  Ｃ１〜６アルキル、任意に置換されたＣ１〜９ヘテロシクリル、または任意に置換されたＣ１〜９ヘテロシクリルＣ１〜６アルキルである。
Ｌが共有結合であり、Ｒ１が水素であり、Ｚが酸素であり、すべてのＸ基が−Ｏ−である場合、ヌクレオシド間の基は、ホスファートホスホジエステルとして知られている。Ｌが共有結合であり、Ｒ１が水素であり、Ｚが硫黄であり、すべてのＸ基が−Ｏ−である場合、ヌクレオシド間の基は、ホスホロチオアートジエステルとして知られている。Ｚが酸素であり、すべてのＸ基が−Ｏ−であり、（１）Ｌがリンカーであるか、または（２）Ｒ１が水素でないかのいずれかの場合、ヌクレオシド間の基は、ホスホトリエステルとして知られている。Ｚが硫黄であり、すべてのＸ基が−Ｏ−であり、（１）Ｌがリンカーであるか、または（２）Ｒ１が水素でないかのいずれかの場合、ヌクレオシド間の基は、ホスホロチオアートトリエステルとして知られている。ホスホロチオアートトリエステル結合及びホスホトリエステル結合の非限定例は、ＵＳ２０１７／００３７３９９に記載されており、その開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８０】
「モルホリノ」という用語は、オリゴヌクレオチドのクラスに関して本明細書中で使用される場合、モルホリノヌクレオシド間結合によって相互に連結した少なくとも１０個のモルホリノモノマー単位のオリゴマーを表す。モルホリノは、５'基及び３'基を含む。例えば、モルホリノは、以下の構造：
2021513851.tif 000003
であってもよく、
式中、
ｎは、少なくとも１０（例えば、１２から５０）の整数であり、これは、モルホリノ単位の数を示し；
各Ｂは、独立して、核酸塩基であり；
Ｒ１は、５'基であり；
Ｒ２は、３'基であり；
Ｌは、（ｉ）モルホリノヌクレオシド間結合であるか、または（ｉｉ）ＬがＲ２と結合している場合、共有結合である。
モルホリノの５'基は、例えば、ヒドロキシル、疎水性部分、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、ホスホロチオアート、ジホスホロチオアート、トリホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ジスホロジチオアート、トリホスホロジチオアート、ホスホナート、ホスホルアミダート、細胞膜透過性ペプチド、エンドソーム脱出部分、または中性有機ポリマーであってもよい。モルホリノの３'基は、例えば、水素、疎水性部分、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、ホスホロチオアート、ジホスホロチオアート、トリホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ジスホロジチオアート、トリホスホロジチオアート、ホスホナート、ホスホルアミダート、細胞膜透過性ペプチド、エンドソーム脱出部分、または中性有機ポリマーであってもよい。
【００８１】
「モルホリノヌクレオシド間結合」という用語は、本明細書中で使用される場合、以下の構造：
2021513851.tif 000004
の二価基を表し、
式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり；
Ｘ１は、結合、−ＣＨ２−、または−Ｏ−であり；
Ｘ２は、結合、−ＣＨ２−Ｏ−、または−Ｏ−であり；
Ｙは、−ＮＲ２であり、式中、各Ｒは、独立して、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル）であるか、または両方のＲが、結合した窒素原子とともに結合して、Ｃ２〜９ヘテロシクリル（例えば、Ｎ−ピペラジニル）を形成し；
ただし、Ｘ１及びＸ２の両方が同時に結合ではない。
【００８２】
「核酸塩基」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオシドのリボフラノース／２'−デオキシリボフラノースの１'位に見られる窒素含有複素環を表す。核酸塩基は、未修飾であるか、または修飾される。本明細書中で使用される場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン、ならびに合成及び天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−アルキル（例えば、６−メチル）アデニン及びグアニン、２−アルキル（例えば、２−プロピル）アデニン及びグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−トリフルオロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニンが挙げられる。特定の核酸塩基、例えば、５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ２−、Ｎ６−、及び／またはＯ６−置換プリンは、核酸の結合親和性を高めるために特に有用である。核酸二本鎖安定性は、例えば、５−メチルシトシンを使用して向上させることができる。核酸塩基の非限定例としては、以下が挙げられる：２−アミノプロピルアデニン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−Ｎ−メチルグアニン、６−Ｎ−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−リボシルウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、８−アザ及びその他の８−置換プリン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、５−ハロウラシル、及び５−ハロシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−Ｎ−イソブチリルグアニン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、ユニーバーサル塩基、疎水性塩基、非特異的塩基、サイズ拡大塩基、及びフッ素化塩基。さらなる修飾核酸塩基としては、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン及び９−（２−アミノエトキシ）−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｇクランプ）などの三環式ピリミジンが挙げられる���修飾核酸塩基としては、プリンまたはピリミジン塩基が他のヘテロ環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、２−アミノピリジン、または２−ピリドンで置換されたものも挙げられ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．  Ｉ．，  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９０，  ８５８−８５９；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，  ３０，  ６１３；Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  Ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３，  ２７３−２８８；及びｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  １５，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｒｏｏｋｅ  Ｓ．  Ｔ．，  Ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００８，  １６３−１６６及び４４２−４４３において開示されているものが挙げられる。
【００８３】
「ヌクレオシド」という用語は、本明細書中で使用される場合、当該技術分野において既知の糖・核酸塩基化合物及び基（例えば、当該技術分野において既知の修飾または未修飾リボフラノース核酸塩基及び２'−デオキシリボフラノース核酸塩基化合物及び基）を表す。糖は、リボフラノースであってもよい。糖は、修飾であっても、または未修飾であってもよい。未修飾糖ヌクレオシドは、核酸塩基に結合したアノマー炭素を有するリボフラノースまたは２'−デオキシリボフラノースである。未修飾ヌクレオシドは、未修飾核酸塩基に結合したアノマー炭素を有するリボフラノースまたは２'−デオキシリボフラノースである。未修飾ヌクレオシドの非限定例としては、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン、２'−デオキシアデノシン、２'−デオキシシチジン、２'−デオキシグアノシン、及びチミジンが挙げられる。修飾化合物及び基としては、本明細書に記載されている核酸塩基修飾及び糖修飾からなる群から選択される１つ以上の修飾が挙げられる。核酸塩基修飾は、未修飾核酸塩基の修飾核酸塩基による置換である。糖修飾は、例えば、２'−置換、ロック、炭素環化、またはアンロックであってもよい。２'−置換は、リボフラノース中の２'−ヒドロキシルの２'−フルオロ、２'−メトキシ、または２'−（２−メトキシ）エトキシによる置換である。ロック修飾は、リボフラノースの４'−炭素原子と２'−炭素原子との間の橋の組み込みである。ロック修飾を有するヌクレオシドは、当該技術分野において架橋型核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）、及びｃＥｔ核酸として知られている。架橋型核酸は、一般に親和性を高めるヌクレオシドとして使用される。
【００８４】
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオシド間結合または以下の構造−Ｘ１−Ｐ（Ｘ２）（Ｒ１）２の一価基に結合したヌクレオシドを表し、式中、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、Ｘ２は、なし、＝Ｏ、または＝Ｓであり、各Ｒ１は、独立して−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ２）２、または−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり、式中、各Ｒ２は、独立して任意に置換されたアルキルであるか、または両方のＲ２基が、結合した窒素原子とともに結合して、任意に置換されたヘテロシクリルを形成する。
【００８５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオシド間結合によってともに共有結合した、１０個以上（例えば、１０から５０個）の連続したヌクレオシドを含有する構造を表す。オリゴヌクレオチドは、５'末端及び３'末端を含む。オリゴヌクレオチドの５'末端は、例えば、ヒドロキシル、標的化部分、疎水性部分、５'キャップ、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、ホスホロチオアート、ジホスホロチオアート、トリホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ジホスホロジチオアート、トリホスホロジチオアート、ホスホナート、ホスホルアミダート、細胞膜透過性ペプチド、エンドソーム脱出部分、または中性有機ポリマーであってもよい。オリゴヌクレオチドの３'末端は、例えば、ヒドロキシル、標的化部分、疎水性部分、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、ホスホロチオアート、ジホスホロチオアート、トリホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ジスホロジチオアート、トリホスホロジチオアート、ホスホナート、ホスホルアミダート、細胞膜透過性ペプチド、エンドソーム脱出部分、または中性有機ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）であってもよい。５'−ヒドロキシルまたは５'−ホスファートを有するオリゴヌクレオチドは、未修飾５'末端を有する。５'−ヒドロキシルまたは５'−ホスファート以外の５'末端を有するオリゴヌクレオチドは、修飾５'末端を有する。３'−ヒドロキシルまたは３'−ホスファートを有するオリゴヌクレオチドは、未修飾３'末端を有する。３'−ヒドロキシルまたは３'−ホスファート以外の３'末端を有するオリゴヌクレオチドは、修飾３'末端を有する。
【００８６】
「オキソ」という用語は、本明細書中で使用される場合、二価の酸素原子を表す（例えば、オキソの構造は、＝Ｏと示されてもよい）。
【００８７】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書中で使用される場合、妥当な利益／リスク比に見合う過度の毒性、刺激、アレルギー反応及びその他の問題となる障害がなく、個体（例えば、ヒト）の組織との接触に適した化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指す。
【００８８】
「保護基」という用語は、本明細書中で使用される場合、化学合成中の１つ以上の望ましくない反応に関係することから官能基（例えば、ヒドロキシル、アミノ、またはカルボニル）を保護することが意図される基を表す。「Ｏ保護基」という用語は、本明細書中で使用される場合、化学合成中の１つ以上の望ましくない反応に関係することから酸素含有（例えば、フェノール、ヒドロキシルまたはカルボニル）基を保護することが意図される基を表す。「Ｎ保護基」という用語は、本明細書中で使用される場合、化学合成中の１つ以上の望ましくない反応に関係することから窒素含有（例えば、アミノまたはヒドラジン）基を保護することが意図される基を表す。一般的に使用されるＯ及びＮ保護基は、Ｗｕｔｓ，  "Ｇｒｅｅｎｅ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，"  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００６）に開示されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。例となるＯ及びＮ保護基としては、アルカノイル、アリーロイル、またはカルバミル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリルオキシメチル、４，４'−ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、４−イソプロピルペヘノキシアセチル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｅｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｙｌ）、ジメチルホルムアミジノ、及び４−ニトロベンゾイルが挙げられる。
【００８９】
カルボニル含有基を保護するための例となるＯ保護基としては、アセタール、アシラール、１，３−ジチアン、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、及び１，３−ジチオランが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
その他のＯ保護基としては、置換アルキル、アリール、及びアリールアルキルエーテル（例えば、トリチル；メチルチオメチル；メトキシメチル；ベンジルオキシメチル；シロキシメチル；２，２，２，−トリクロロエトキシメチル；テトラヒドロピラニル；テトラヒドロフラニル；エトキシエチル；１−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］エチル；２−トリメチルシリルエチル；ｔ−ブチルエーテル；ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、及びニトロベンジル）；シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル；トリエチルシリル；トリイソプロピルシリル；ジメチルイソプロピルシリル；ｔ−ブチルジメチルシリル；ｔ−ブチルジメチルシリル；トリベンジルシリル；トリフェニルシリル；及びジフェニルメチルシリル）；カーボネート（例えば、メチル、メトキシメチル、９−フルオレニルメチル；エチル；２，２，２−トリクロロエチル；２−（トリメチルシリル）エチル；ビニル、アリル、ニトロフェニル；ベンジル；メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；及びニトロベンジル）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
その他のＮ保護基としては、キラル補助基、例えば、保護または無保護Ｄ、ＬまたはＤ、Ｌ−アミノ酸、例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンなど；スルホニル含有基、例えば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなど；カルバマート形成基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドロキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノオキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど、アリールアルキル基、例えば、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなど、及びシリル基、例えば、トリメチルシリルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
「ピリド−２−イルヒドラゾン」という用語は、本明細書中で使用される場合、構造：
2021513851.tif 000005
の基を表し、式中、各Ｒ'は、独立して、Ｈまたは任意に置換されたＣ１〜６アルキルである。ピリド−２−イルヒドラゾンは、非置換であってもよい（すなわち、各Ｒ'は、Ｈである）。
【００９３】
「スプライス部位」という用語は、本明細書中で使用される場合、一般に、スプライシング進行に関与することもあるイントロンの末端の対応するゲノム中の部位を指す。スプライス部位は、５'スプライス部位（例えば、イントロンの５'末端）または３'スプライス部位（例えば、イントロンの３'末端）であってもよい。所与の５'スプライス部位は、１つ以上の候補３'スプライス部位と関連づけることができ、そのそれぞれがスプライシング操作においてその対応する５'スプライス部位と対にされ得る。
【００９４】
「スプライシングエンハンサー」という用語は、本明細書中で使用される場合、エクソン含有に対してプラスの効果（例えば、増加させる）を有するモチーフを指す。
【００９５】
「スプライシングサイレンサー」という用語は、本明細書中で使用される場合、エクソン含有に対してマイナスの効果（例えば、低下させる）を有するモチーフを指す。
【００９６】
「立体化学的に濃縮された」という用語は、本明細書中で使用される場合、列挙された基の一方のエナンチオマーが同じ基の反対のエナンチオマーよりも局所的に立体化学的に選択されることを指す。したがって、立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、所定の立体化学のステレオジェニックなヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオアート）が、所定の立体化学の反対のものである立体化学のステレオジェニックなヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオアート）に優先して存在するオリゴヌクレオチドである。この選択性は、所定の立体化学のステレオジェニックなヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオアート）に関するジアステレオマー比を使用して数値的に表すことができる。所定の立体化学のステレオジェニックなヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオアート）に関するジアステレオマー比は、所定の立体化学の反対のものである立体化学を有する特定のステレオジェニックなヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオアート）を有するジアステレオマーに対する、所定の立体化学を有する特定のステレオジェニックなヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオアート）を有するジアステレオマーのモル比である。所定の立体化学のホスホロチオアートに関するジアステレオマー比は、１．１以上（例えば、４以上、９以上、１９以上、または３９以上）であってもよい。
【００９７】
「対象」という用語は、本明細書中で使用される場合、対象からのサンプル（複数可）の当該技術分野において既知の臨床検査（複数可）を用いて、または用いずに、資格のある専門家（例えば、医師または上級看護師）によって判断されたときに、疾患、障害、または状態を患っているか、またはそのリスクがあるヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を表す。疾患、障害、または状態の非限定例としては、ウィルソン病（例えば、エクソン６スキッピングと関連づけられるウィルソン病）が挙げられる。
【００９８】
「糖」または「糖部分」としては、フラノース環またはヌクレオシドのフラノース環を置換することができる構造を有する天然に存在する糖が挙げられる。本発明のヌクレオシドに含まれる糖は、非フラノース（または４'−置換フラノース）環または環系または開環系であってもよい。そのような構造は、天然のフラノース環（例えば、六員環）に対して簡単な変化を含む。代替的な糖は、糖代用物も含んでもよく、この場合、フラノース環が例えば、モルホリノまたはヘキシトール環系などの別の環系で置換されている。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれてもよい有用な糖部分の非限定例としては、β−Ｄ−リボース、β−Ｄ−２'−デオキシリボース、置換糖（例えば、２'、５'、及びビス置換糖）、４'−Ｓ−糖（例えば、４'−Ｓ−リボース、４'−Ｓ−２'−デオキシリボース、及び４'−Ｓ−２'−置換リボース）、二環式糖部分（例えば、２'−Ｏ−ＣＨ２−４'または２'−Ｏ−（ＣＨ２）２−４'架橋型リボース誘導二環式糖）及び糖代用物（リボース環がモルホリノまたはヘキシトール環系で置換されている場合）が挙げられる。
【００９９】
「標的化部分」という用語は、本明細書中で使用される場合、レセプターと特異的に結合するか、もしくは反応的に結びつけられるか、もしくは複合体を形成する部分（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはそのクラスター）または所与の標的細胞集団と結びつけられるその他の受容部分を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化部分を含んでもよい。標的化部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、本明細書においてコンジュゲートとも呼ばれる。標的化部分は、１つ以上のリガンド（例えば、１から６つのリガンド、１から３つのリガンド、または１つのリガンド）を含んでもよい。リガンドは、抗体または抗原結合フラグメントまたは操作されたその誘導体（例えば、Ｆｃａｂまたは融合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ））が可能である。あるいは、リガンドは、小分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）であってもよい。
【０１００】
「治療有効量」という用語は、本明細書中で使用される場合、疾患または障害の症状を回復させる、処置する、または少なくとも部分的に阻止する（例えば、エクソン６を含むＡＴＰ７Ｂ  ｍＲＮＡ分子のレベルを増加させる）のに必要な本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの量を表す。この使用に有効な量は、例えば、疾患の重症度ならびに対象の体重及び全身状態によって決まる場合もある。一般に、インビトロにおいて使用される投与量は、医薬組成物のインビボ投与に有用な量の有用な指針を提供することができ、動物モデルは、特定の障害の処置に有効な投与量を決定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量は、２４時間、対象における尿中の銅レベルを＜１００μｇ／２４時間（＜１．６μｍｏｌ／２４時間）（例えば、≦４０μｇ／２４時間（≦０．６μｍｏｌ／２４時間））に低下させる。
【０１０１】
「チオカルボニル」という用語は、本明細書中で使用される場合、Ｃ（＝Ｓ）基を表す。「チオカルボニル」を含有する官能基の非限定例としては、チオエステル、チオケトン、チオアルデヒド、チオ無水物、チオアシルクロリド、チオアミド、チオカルボン酸、及びチオカルボキシラートが挙げられる。
【０１０２】
「チオヘテロシクリレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、二価基−Ｓ−Ｒ'−を表し、式中、Ｒ'は、本明細書中で定義されるとおりのヘテロシクリレンである。
【０１０３】
「チオール」という用語は、本明細書中で使用される場合、−ＳＨ基を表す。
【０１０４】
「トリアゾロシクロアルケニレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、８員環と縮合した１，２，３−トリアゾール環を含有するヘテロシクリレンを指し、その環内原子のすべてが炭素原子であり、橋頭原子は、ｓｐ２混成炭素原子である。トリアゾシクロアルケニレンは、ヘテロシクリルに関して記載される様式で任意に置換することができる。
【０１０５】
「トリアゾロヘテロシクリレン」という用語は、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する８員環と縮合した１，２，３−トリアゾール環を含有するヘテロシクリレンを指す。トリアゾロヘテロシクリレン中の橋頭原子は、炭素原子である。トリアゾロヘテロシクリレンは、ヘテロシクリルに関して記載される様式で任意に置換することができる。
【０１０６】
オリゴヌクレオチド及び核酸内の位置の列挙は、本明細書中で使用される場合、他に指定がない限り、５'末端ヌクレオシドを１として開始し、３'方向へ進行する。
【０１０７】
本明細書に記載される化合物は、他に記載がない限り、同位体的に濃縮された化合物（例えば、重水素化合物）、互変異性体、及びすべての立体異性体及び配座異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、Ｅ／Ｚ異性体、アトロプ異性体など）ならびにそのラセミ体、及びエナンチオマーもしくはジアステレオマーのさまざまな割合の混合物、または任意の前述の形態の混合物ならびに塩（例えば、薬学的に許容される塩）を包含する。
【０１０８】
本開示のさらなる態様及び利点は、以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。ここでは、本開示の単なる実例となる実施形態が示され、記載されている。理解されるであろうとおり、本開示は、他のさまざまな実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく、さまざまな明らかな点において改変が可能である。したがって、図及び説明は、本質的に実例と見なされるべきであり、限定と見なされるべきではない。
【０１０９】
参照による組み込み
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが具体的に個別に参照により組み込まれることが示されていると同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物及び特許または特許出願が本明細書に含まれる開示に矛盾する限り、本明細書は、あらゆるそのような矛盾した材料に取って代わる、及び／またはそれより優先されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】Ａ及びＢは、ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ  ［ｈｇ１９／ｂ３７］バリアントがＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子におけるエクソン６含有を低下させることを示す。Ａは、ＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。野生型ミニ遺伝子（ＷＴ）及びｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］（Ｍ６４５Ｒ）バリアントミニ遺伝子の両方に関するエクソン含有（４４５ｂｐ）及び除外（３６８ｂｐ）フラグメントを黒抜きの矢印によって示す。１００ｂｐ  ＤＮＡラダーをサイズ参照のために示す。Ｂは、Ａで確認されたＲＴ−ＰＣＲフラグメントの定量によって算出されたＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子におけるエクソン６含有のパーセンテージを示す。
【図２Ａ】ＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子の粗いタイリングによるアンチセンスオリゴヌクレオチド標的（「ホットスポット」）特定を示す。エクソン６及び隣接イントロン全域を粗くタイリングした、配列番号３〜３４に記載される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのセットの相対的な場所の略図である。
【図２Ｂ】ＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子の粗いタイリングによるアンチセンスオリゴヌクレオチド標的（「ホットスポット」）特定を示す。ＡＴＰ７Ｂ野生型及びＭ６４５Ｒ  ＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子ならびに配列番号３〜３４に記載される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＲＴ−ＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動を示す。４４５ｂｐにおけるエクソン６含有バンド及び３６８ｂｐにおける除外バンドとのサイズ参照のために１００ｂｐ  ＤＮＡラダーを示す。
【図２Ｃ】ＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子の粗いタイリングによるアンチセンスオリゴヌクレオチド標的（「ホットスポット」）特定を示す。図２Ｂにおいて観察されたＲＴ−ＰＣＲフラグメントの定量によって算出された配列番号３〜３４に記載される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてコトランスフェクションされたＡＴＰ７Ｂ野生型及びＭ６４５Ｒ  ＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子におけるエクソン６含有のパーセンテージを示す。含有パーセンテージは、フラグメントサイズ（ＷＴに関してｎ＝４、Ｍ６４５Ｒに関してｎ＝５）に準じて正規化した。
【図３】ＡＴＰ７Ｂ転写物に対する逆相補鎖（すなわち、アンチセンス）であるＡＴＰ７Ｂ遺伝子のエクソン６周辺のヒトゲノムのフォワード鎖の図である。（配列番号１６３  ＣＣＡＧＧＴＡＧＡＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＣＴＡＣＣＴＡＣ及び配列番号１６４  ＣＴＴＧＴＣＡＴＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＡＧＡＡＡＧ）（下線）。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの位置及び配列は、配列番号２８〜３３、４７〜５１、６０、６１、６３〜６７、７６〜８１、９３〜９５、１２０、１２１、１３０、１３２〜１３７、１４７、及び１５０ならびにスプライシングされてエクソン６を含むパーセント（ｄＰＳＩ）に対するそれらの対応する効果も示される。
【図４】Ａ及びＢは、配列番号２９に記載される配列を有するスプライシング調節アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理時における銅耐性及びＡＴＰ７Ｂタンパク質レベルの回復を示す。Ａは、ＨｅｐＧ２野生型（Ｗｔ）及び２Ｆ３細胞の両方ならびに対応する非トランスフェクション（ＮＴ）対照を使用した銅感受性アッセイの結果を示す。２Ｆ３細胞は、一方の対立遺伝子がＭ６４５Ｒ変異を含み、他方の対立遺伝子がプラスミド配列の挿入によって不活性化された複合ヘテロ接合体である。Ｍ６４５Ｒバリアント（２Ｆ３）は、野生型細胞と比較した場合、銅濃度の増加に伴ってより低い細胞生存率を有する。この表現型は、エクソン６の含有を増加させる、オリゴヌクレオチド（配列番号２９）によるトランスフェクションによって部分的にレスキューされる（エラーバーは、３回行った実験の標準偏差を示す）。Ｂは、ＨｅｐＧ２野生型（Ｗｔ）及び２Ｆ３細胞の両方ならびに対応する非トランスフェクション（ＮＴ）対照を使用したＡＴＰ７Ｂに対するウエスタンブロットを示す。変異体（２Ｆ３）は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質レベルの低下を示している。この表現型は、エクソン６の含有を増加させる、オリゴヌクレオチド（配列番号２９）によるトランスフェクションによって部分的にレスキューされる。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
概して、本発明は、ＡＴＰ７Ｂエクソン６または隣接イントロンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物、及び方法を提供する。驚くべきことに、本発明者らは、転写物中にエクソン６を含むよう、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子スプライシングを変えることを、ウィルソン病を処置するために使用することができること及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、エクソン６を含むよう、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子のスプライシングを変えるために使用することができることを発見した。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン６を有するＡＴＰ７Ｂ  ｍＲＮＡ分子のレベルを増加させるよう、ＡＴＰ７Ｂ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節することができる。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウィルソン病の処置を必要とする対象のウィルソン病を処置するために使用することができる。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン６、５'−隣接イントロン、３'−隣接イントロン、またはエクソン６及び５'−隣接イントロンもしくは３'−隣接イントロンの組み合わせにあるＡＴＰ７Ｂ標的配列と少なくとも７０％相補的な核酸塩基配列を含む。
【０１１２】
遺伝子バリアントは、転写及び／またはスプライシングにおける変化または改変に対応する場合もある。ＲＮＡは、初めにＤＮＡからイントロンによって分離されたタンパク質コーディングエクソン及び５'ＵＴＲ／３'ＵＴＲエクソンを有するｐｒｅ−ｍＲＮＡとして転写される。スプライシングは、一般に、イントロンを除去することができ、エクソンを接合して、成熟ｍＲＮＡ配列を産生するスプライセオソーム複合体によって行われる分子プロセスを指し、成熟ｍＲＮＡ配列は、その後、リボソームによって読み取られ、タンパク質に翻訳される。スプライセオソームによって触媒される分子反応は、（ｉ）最も離れたエクソンドナー塩基３'ＯＨの放出が結果として生じる、イントロンドナージヌクレオチドの最も離れた塩基に対する分枝部位アデノシン２'ＯＨの求核攻撃；及び（ｉｉ）イントロンラリアット及びスプライシングされたエクソンの放出が結果として生じる、最も離れたエクソンアクセプター塩基に対するエクソンドナー３'ＯＨの求核攻撃を含む場合もある。
【０１１３】
スプライシング配列変化は、以下のカテゴリー：（ａ）遺伝子産物の適切な組成に必要とされるスプライス部位（正規スプライス部位と呼ばれる）またはエクソン認識配列の変更、及び（ｂ）誤ったスプライス部位（隠れたスプライス部位と呼ばれる）の活性化及び使用、またはイントロン配列のエクソンとしての誤った認識（偽エクソンと呼ばれる）を含む場合もあり、両方とも遺伝子産物の不適切な組成をもたらすことがある。スプライス部位認識シグナルが、スプライセオソーム構築に必要とされる場合もあり、以下の構造：（ｉ）エクソン・イントロン境界に直接隣接する高度に保存されたイントロンジヌクレオチド（ＡＧ、ＧＴ）、及び（ｉｉ）イントロンジヌクレオチド（ドナー部位に関しては３エクソン及び６イントロンヌクレオチド、アクセプター部位に関しては３エクソン及び２０イントロンヌクレオチドに範囲が定められる場合が多い）及び分枝部位（イントロンアクセプター側の可変位置）周辺のコンセンサス配列を含むことがあり、両方とも保存が低く、配列多様性が高い。
【０１１４】
スプライス部位認識に加えて、エクソン認識シグナルは、スプライシング因子及び他のＲＮＡ結合タンパク質によって認識される多くのモチーフを含むことがあり、その一部は遍在的に発現される場合もあり、組織特異的である場合もある。これらのモチーフは、エクソン本体にわたって、さらに隣接するイントロン配列内に分散している場合もある。「スプライシングエンハンサー」という用語は、エクソン含有に対してプラスの効果を有する（例えば、増加させる）モチーフを指し、「スプライシングサイレンサー」という用語は、エクソン含有に対してマイナスの効果を有する（例えば、低下させる）モチーフを指す。エクソン認識シグナルは、弱いコンセンサス配列の存在下において正しいスプライシングに特に重要である場合もある。バリアントがスプライス部位認識を弱める場合、エクソンがスキップされることがあり、及び／またはすでに相当に強い近くの隠れたスプライス部位が使用されることがあり、特に短いイントロンの存在下では、全イントロンの保持も起こり得る結果である。特に、イントロンジヌクレオチドの変更は、スプライシング変更をもたらすことが多いが、コンセンサス配列の変更は、平均して、影響が少なく、より状況依存的であり得る。エクソン認識シグナルが弱まると、エクソンスキッピングがより可能性の高い結果であり得るが、特に非常に弱いコンセンサス配列の存在下では隠れたスプライス部位の使用も起こり得る。バリアントはまた、正規スプライス部位に近接した弱い隠れたスプライス部位を強化する場合があり、その使用を顕著に増加させる結果として不適切なスプライシング及び誤った遺伝子産物（アミノ酸挿入／欠失、フレームシフト、及びストップゲインを含む影響を有する）を生じる。最後に、正規スプライス部位からより離れたバリアントは、エクソン配列のイントロンとしての認識を誘導することがあり、これも結果として不適切な遺伝子産物組成を生じ、特に、これらのバリアントは、スプライス部位またはエクソン認識シグナルの強さを増加させることがある。
【０１１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（例えば、遺伝子のスプライシング調節エレメントを標的とすることによって）遺伝子スプライシングを調節するために使用することができる。
【０１１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライススイッチオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を含む場合もあり、これは、スプライセオソーム構築またはスプライシング因子とＲＮＡ結合タンパク質の結合を妨害する立体的な妨害物によってスプライシングを（例えば、エクソン６の含有を増大させるよう）調節することができる。スプライセオソーム構築タンパク質の妨害を、治療的に使用して、エクソンスキッピングを引き起こすこともできる。阻害効果を有する特定スプライシング因子またはＲＮＡ結合タンパク質の結合の妨害を使用して、エクソン含有の増加をもたらすこともできる。特定の立体的ブロッカーアンチセンスオリゴヌクレオチド化学としては、糖修飾（例えば、２'−修飾）を伴うホスホロチオアート骨格（ＰＳ）及びホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）を有する修飾ＲＮＡ化学を挙げることができる。例となるＰＳ骨格糖修飾としては、２'−Ｏ−メチル（２'ＯＭｅ）及び２'−メトキシエトキシとしても知られている２'−Ｏ−メトキシエチル（２'−ＭＯＥ）を挙げることができる。例えば、完全長のオリゴヌクレオチドに対して、または特定の塩基に対して他のヌクレオチド修飾が使用されてもよい。オリゴヌクレオチドは、残りのオリゴヌクレオチドとは異なる標的化部分（例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター）、またはペプチド（例えば、細胞膜透過性ペプチド）、または別の分子または多分子基（例えば、疎水性部分または中性ポリマー）と共有結合していてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つの立体異性体または立体異性体の組み合わせとして使用されてもよい。
【０１１７】
ＡＴＰ７Ｂ遺伝子（ＡＴＰアーゼ銅輸送ベータ、ＯＭＩＭ：６０６８８２）は、ウィルソン病（ウィルソンの疾患としても知られている）の病原性に重要な役割を果たす可能性がある。ＡＴＰ７Ｂは、細胞内トランスゴルジ銅トランスポーターをコードする遺伝子である。この遺伝子は、肝細胞で発現される場合もあり、血流から胆汁への銅排出及びセルロプラスミンの銅の積み込みに必要とされる場合もある。不完全な銅排出及び／またはセルロプラスミンの銅の積み込みは、肝臓及び中枢神経系に毒の影響をもたらす可能性がある。ＡＴＰ７Ｂホモ接合型または複合ヘテロ接合型機能喪失は、常染色体劣性ウィルソン病（ＯＭＩＭ：２７７９００）をもたらす場合もある。
【０１１８】
ウィルソン病などの疾患に対する効果的なスプライシング調節療法の必要性を認識して、本開示は、ＡＴＰ７Ｂの異常にスプライシングされるエクソンまたは異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンのスプライシング調節エレメントを標的とする配列を含む、ＡＴＰ７Ｂスプライシング調節アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本開示はまた、細胞、組織、または器官を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることによって、対象の細胞、組織、または器官におけるＡＴＰ７Ｂ  ＲＮＡのスプライシングを調節する方法も提供する。ＡＴＰ７Ｂスプライシング調節アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰ７Ｂの異常にスプライシングされるエクソンまたは異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンのスプライシング調節エレメントを標的とする核酸塩基配列を含んでもよい。さらに、本開示は、対象に治療有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによって対象のウィルソン病を処置するための方法を提供する。ＡＴＰ７Ｂスプライシング調節アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰ７Ｂの異常にスプライシングされるエクソンまたは異常にスプライシングされるエクソンに隣接するイントロンのスプライシング調節エレメントを標的とする配列を含んでもよい。
【０１１９】
スプライシング調節エレメントとしては、例えば、エクソンスプライシングサイレンサーエレメントまたはイントロンスプライシングサイレンサーエレメントを挙げることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰ７Ｂ  ＲＮＡのバリアントスプライシングを調節するエクソンまたはＡＴＰ７Ｂのエクソンに隣接するイントロンを標的とする配列を含んでもよい。スプライシングの調節は、エクソン含有の増加をもたらす場合もある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、全部で８から５０ヌクレオチド（例えば、８から１６ヌクレオチド、８から２０ヌクレオチド、１２から２０ヌクレオチド、１２から３０ヌクレオチド、または１２から５０ヌクレオチド）を含んでもよい。
【０１２０】
ＡＴＰ７Ｂ遺伝子の遺伝子異常は、病原性に重要な役割を果たす可能性がある。特に、ＡＴＰ７Ｂ  Ｍ６４５Ｒ遺伝子異常、ＡＴＰ７Ｂ  ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］（ｈｇ１９座標）（配列番号１のｇ．５４６４６Ｔ＞Ｇ変異体）は、エクソン６のＮＭ＿００００５３．３  ｃＤＮＡ変化  １９３４Ｔ＞Ｇ及びタンパク質配列Ｍｅｔ６４５Ａｒｇ（Ｍ６４５Ｒ）をもたらす場合もある。ゲノム座標は、例えば、ヒトゲノム参照ｈｇ１９／ｂ３７に対して表されてもよい。例えば、このバリアントは、ウィルソン病の患者において病原性であると報告された。
【０１２１】
エクソン６含有の低下を引き起こすことがインシリコで予測され、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤ）において観察された他の例となる遺伝子異常としては、ｃｈｒ１３：５２５３５９６４：Ｔ：Ｃ（配列番号１の位置５４６６７；ＨＭＧＤ  ＩＤ：ＣＳ０７６５９６）及びｃｈｒ１３：５２５３５９９４：Ｔ：Ｃ（配列番号１の位置５４６３７；ＨＭＧＤ  ＩＤ：ＣＭ１６４０２０）が挙げられる。
【０１２２】
これらの例となる遺伝子異常は、エクソン含有のレベルを増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とされてもよく、スプライシング調節エレメントにおける他の類似した変異は、同様の様式で標的とされてもよい。
【０１２３】
ＡＴＰ７Ｂのエクソン６の含有を増加させるために、さまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチドが組み合わされてもよい。同じか、もしくは異なる領域またはホットスポットを標的とする２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、３つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、４つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または５つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせが本発明の方法に使用されてもよい。
【０１２４】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、適した技術及び当該技術分野において既知の方法を使用して間接的に投与されてもよい。それは、例えば、個体または個体の細胞、組織もしくは器官に発現ベクターの形態で提供されてもよく、その場合、発現ベクターは、上記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする。発現ベクターは、好ましくは、遺伝子送達ビヒクルにより細胞、組織、器官または個体に導入される。ある実施形態において、本明細書において特定されるとおりのアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセットを含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するウイルスベクターを提供する。
【０１２５】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、適した技術及び当該技術分野において既知の方法を使用して、例えば、本明細書に記載されているコンジュゲートを使用して直接投与されてもよい。
【０１２６】
コンジュゲート
本発明のオリゴヌクレオチドは、補助部分、例えば、標的化部分、疎水性部分、細胞膜透過性ペプチド、またはポリマーを含んでもよい。補助部分は、５'末端修飾（例えば、５'末端ヌクレオシドに共有結合している）、３'末端修飾（例えば、３'末端ヌクレオシドに共有結合している）、またはヌクレオシド間結合（例えば、ヌクレオシド間結合中のホスファートまたはホスホロチオアートに共有結合している）として存在してもよい。
【０１２７】
標的化部分
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的化部分を含んでもよい。
【０１２８】
標的化部分は、本発明のオリゴヌクレオチドを、選択された標的化部分に対する対応する結合パートナー（例えば、対応するレセプターまたはリガンドのいずれか）を発現する所望のまたは選択された細胞集団に向ける能力に基づいて選択される。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む標的化部分を選択することによってアシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰ−Ｒ）を発現する肝細胞を標的とすることができるであろう。
【０１２９】
標的化部分は、１つ以上のリガンド（例えば、１から９個のリガンド、１から６個のリガンド、１から３個のリガンド、３個のリガンド、または１個のリガンド）を含んでもよい。リガンドは、アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰ−Ｒ）、ＩｇＡレセプター、ＨＤＬレセプター、ＬＤＬレセプター、またはトランスフェリンレセプターを発現する細胞を標的としてもよい。リガンドの非限定例としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グリシルレチン酸、グリチルリチン、ラクトビオン酸、ラクトフェリン、ＩｇＡ、または胆汁酸（例えば、リトコリルタウリンまたはタウロコール酸）が挙げられる。
【０１３０】
リガンドは、小分子、例えば、アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰ−Ｒ）を発現する細胞を標的とする小分子であってもよい。アシアロ糖タンパク質レセプターを標的とする小分子の非限定例は、Ｎ−アセチルガラクトサミンである。あるいは、リガンドは、抗体または抗原結合フラグメントまたは操作されたその誘導体（例えば、Ｆｃａｂまたは融合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ））が可能である。
【０１３１】
標的化部分は、−ＬｉｎｋＡ（−Ｔ）ｐであってもよく、式中、ＬｉｎｋＡは、多価リンカーであり、各Ｔは、リガンド（例えば、アシアロ糖タンパク質レセプター標的リガンド（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン））であり、ｐは、１から９の整数である。各ＴがＮ−アセチルガラクトサミンである場合、標的化部分は、ガラクトサミンクラスターと呼ばれる。本発明のオリゴヌクレオチドに使用することができるガラクトサミンクラスターは、当該技術分野において知られている。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれてもよいガラクトサミンクラスターの非限定例は、ＵＳ５，９９４，５１７；ＵＳ７，４９１，８０５；ＵＳ９，７１４，４２１；ＵＳ９，８６７，８８２；ＵＳ９，１２７，２７６；ＵＳ２０１８／０３２６０７０；ＵＳ２０１６／０２５７９６１；ＷＯ２０１７／１００４６１；及びＳｌｉｅｄｒｅｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ４２：６０９−６１８，  １９９９に示されている。ＧａｌＮＡｃ以外のリガンドもガラクトサミンクラスターに関して本明細書に記載されるとおりクラスターに使用されてもよい。
【０１３２】
標的化部分−ＬｉｎｋＡ（−Ｔ）ｐは、式（Ｉ）：
−Ｑ１−Ｑ２（［−Ｑ３−Ｑ４−Ｑ５］ｓ−Ｑ６−Ｔ）ｐ
（Ｉ）
の基であってもよく、
式中、
各ｓは、独立して０から２０の整数（例えば、０から１０）であり、式中、繰り返し単位は、同じか、または異なり；
Ｑ１は、コンジュゲーションリンカー（例えば、［−Ｑ３−Ｑ４−Ｑ５］ｓ−ＱＣ−、式中、ＱＣは、任意に置換されたＣ２〜１２ヘテロアルキレン（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ−Ｓ−を含むヘテロアルキレン）、任意に置換されたＣ１〜１２チオヘテロシクリレン（例えば、
2021513851.tif 000006
）、任意に置換されたＣ１〜１２ヘテロシクリレン（例えば、１，２，３−トリアゾール−１，４−ジイルまたは
2021513851.tif 000007
）、シクロブタ−３−エン−１，２−ジオン−３，４−ジイル、ピリド−２−イルヒドラゾン、任意に置換されたＣ６〜１６トリアゾロヘテロシクリレン（例えば、
2021513851.tif 000008
）、任意に置換されたＣ８〜１６トリアゾロシクロアルケニレン（例えば、
2021513851.tif 000009
）、あるいはジヒドロピリダジン基（例えば、
2021513851.tif 000010
）である）であり；
Ｑ２は、ｐが１である場合、直鎖基（例えば、［−Ｑ３−Ｑ４−Ｑ５］ｓ−）、またはｐが２から９の整数である場合、分岐基（例えば、［−Ｑ３−Ｑ４−Ｑ５］ｓ−Ｑ７（［−Ｑ３−Ｑ４−Ｑ５］ｓ−（Ｑ７）ｐ１）ｐ２、式中、ｐ１は、０、１、または２であり、ｐ２は、０、１、２、または３である）であり；
各Ｑ３及び各Ｑ６は、独立して、なし、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、または−ＯＣＨ２−であり；
各Ｑ４は、独立して、なし、任意に置換されたＣ１〜１２アルキレン、任意に置換されたＣ２〜１２アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜１２アルキニレン、任意に置換されたＣ２〜１２ヘテロアルキレン、任意に置換されたＣ６〜１０アリーレン、任意に置換されたＣ１〜９ヘテロアリーレン、または任意に置換されたＣ１〜９ヘテロシクリレンであり；
各Ｑ５は、独立して、なし、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−ＣＨ（Ｒａ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−、または−ＯＰ（Ｓ）（ＯＨ）Ｏ−であり；
各Ｑ７は、独立して、任意に置換された炭化水素または任意に置換されたヘテロ有機（例えば、Ｃ１〜６アルカントリイル、任意に置換されたＣ１〜６アルカンテトライル、任意に置換されたＣ２〜６ヘテロアルカントリイル、または任意に置換されたＣ２〜６ヘテロアルカンテトライル）であり；
各Ｒａは、独立して、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
ただし、Ｑ３、Ｑ４、及びＱ５の少なくとも１つが存在する。
【０１３３】
ある場合には、［−Ｑ３−Ｑ４−Ｑ５］ｓ−のそれぞれの存在に関して、Ｑ３、Ｑ４、及びＱ５の少なくとも１つが存在する。
【０１３４】
ある場合には、Ｑ７は、
2021513851.tif 000011
2021513851.tif 000012
2021513851.tif 000013
2021513851.tif 000014
からなる群から選択される構造であってもよく、
【０１３５】
式中、ＲＡは、Ｈまたはオリゴヌクレオチドであり、Ｘは、ＯまたはＳであり、Ｙは、ＯまたはＮＨであり、残りの変数は、式（Ｉ）に関して記載されているとおりである。
【０１３６】
基−ＬｉｎｋＡ−は、ポリ（アルキレンオキシド）（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリ（トリメチレンオキシド）、ポリブチレンオキシド、ポリ（テトラメチレンオキシド）、及びそのジブロックまたはトリブロックコポリマー）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、−ＬｉｎｋＡ−は、１ｋＤａ未満の分子量を有するポリエチレンオキシド（例えば、ポリ（エチレンオキシド））を含む。
【０１３７】
疎水性部分
有利にも、疎水性部分を含むオリゴヌクレオチドは、疎水性部分のないオリゴヌクレオチドと比較した場合に優れた細胞取り込みを示すこともある。したがって、疎水性部分を含むオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション剤を実質的に含まない組成物に使用されてもよい。疎水性部分は、オリゴヌクレオチド骨格（例えば、５'−末端）に共有結合した一価基（例えば、胆汁酸（例えば、コール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、オレイルリトコール酸、またはオレオイルコレン酸）、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、イソプレノイド、ビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、トリグリセリド、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンチン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ジコキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチジメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素、ソラレン、またはイブプロフェン）である。一価基の非限定例としては、エルゴステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、カンペステロール、フコステロール、サリンゴステロール、アベナステロール、コプロスタノール、コレステロール、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、カルジオリピン、及びカロテノイドが挙げられる。一価基をオリゴヌクレオチドと連結するリンカーは、任意に置換されたＣ１〜６０炭化水素（例えば、任意に置換されたＣ１〜６０アルキレン）または任意に置換されたＣ２〜６０ヘテロ有機（例えば、任意に置換されたＣ２〜６０ヘテロアルキレン）であってもよく、リンカーは、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、及び任意に置換されたシクロアルキレンからなる群から独立して選択される１、２、または３つの例で任意に中断されてもよい。リンカーは、例えば、５'末端炭素原子、３'末端炭素原子、５'末端ホスファートもしくはホスホロチオアート、３'末端ホスファートもしくはホスホロチオアート、またはヌクレオシド間結合に結合した酸素原子によりオリゴヌクレオチドと結合されてもよい。
【０１３８】
細胞膜透過性ペプチド
１つ以上（例えば、１から６つまたは１から３つ）の細胞膜透過性ペプチドは、補助部分として本明細書中で開示されているオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。ＣＰＰは、本明細書中で開示されているとおりジスルフィド結合によりオリゴヌクレオチドに連結することができる。したがって、細胞への送達時に、ＣＰＰは、例えば、細胞内酵素（例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、チオレドキシン、またはチオエステラーゼ）によって細胞内で切断され、それにより、ポリヌクレオチドを放出してもよい。
【０１３９】
ＣＰＰは、当該技術分野において知られている（例えば、ＴＡＴまたはＡｒｇ８）（Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，  ２００５，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２，  ４３−５１）。本明細書中で開示されているオリゴヌクレオチドに結合するのに適した部分を含むＣＰＰの特定の例は、例えば、ＷＯ２０１５／１８８１９７に示されており、これらのＣＰＰの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
ＣＰＰは、生物学的カーゴの細胞への送達を容易にすることができる正の電荷を持つペプチドである。ＣＰＰのカチオン電荷がその働きに不可欠だと考えられている。さらに、これらのタンパク質の形質導入は、細胞タイプによる影響を受けないようであり、これらのタンパク質は、明らかな毒性もなく培養物中のほぼすべての細胞に効率的に形質導入することができる。完全長タンパク質に加えて、ＣＰＰもＤＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、小分子、及びさらには無機４０ｎｍ鉄粒子の細胞内取り込みを誘導するために首尾よく使用されてきており、このことは、このプロセスでは粒子径に相当な柔軟性があることを示唆する。
【０１４１】
一実施形態において、本発明の方法及び組成物に有用なＣＰＰとしては、相当なアルファ−ヘリシティを特徴とするペプチドが挙げられる。ＣＰＰが大幅なアルファ−ヘリシティを示す場合に、トランスフェクションが最適化されることが発見された。別の実施形態において、ＣＰＰは、ペプチドの少なくとも１つの面に沿って実質的に整列した塩基性アミノ酸残基を含む配列を含む。本発明に有用なＣＰＰは、天然に存在するペプチドまたは合成ペプチドであってもよい。
【０１４２】
ポリマー
本発明のオリゴヌクレオチドは、共有結合した中性ポリマーベースの補助部分を含んでもよい。中性ポリマーとしては、ポリ（Ｃ１〜６アルキレンオキシド）、例えば、ポリ（エチレングリコール）及びポリ（プロピレングリコール）ならびにそのコポリマー、例えば、ジ及びトリブロックコポリマーが挙げられる。ポリマーのその他の例としては、エステル化ポリ（アクリル酸）、エステル化ポリ（グルタミン酸）、エステル化ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアルコール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（アルキルアクリラート）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（カプロラクトン）、スチレン・マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル・無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリウレタン、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、及びポリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド）が挙げられる。例となるポリマー補助部分は、１００、３００、５００、１０００、または５０００Ｄａ未満（例えば、１００Ｄａ超）の分子量を有してもよい。その他のポリマーが当該技術分野において知られている。
【０１４３】
核酸塩基修飾
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を含んでもよい。未修飾核酸塩基としては、プリン塩基、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン、ならびに合成及び天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−アルキル（例えば、６−メチル）アデニン及びグアニン、２−アルキル（例えば、２−プロピル）アデニン及びグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−トリフルオロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニンが挙げられる。特定の核酸塩基、例えば、５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ２−、Ｎ６−、及び／またはＯ６−置換プリンは、核酸の結合親和性を高めるために特に有用である。核酸二本鎖安定性は、例えば、５−メチルシトシンを使用して向上させることができる。核酸塩基の非限定例としては、以下が挙げられる：２−アミノプロピルアデニン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−Ｎ−メチルグアニン、６−Ｎ−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−リボシルウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、８−アザ及びその他の８−置換プリン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、５−ハロウラシル、及び５−ハロシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−Ｎ−イソブチリルグアニン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、ユニーバーサル塩基、疎水性塩基、非特異的塩基、サイズ拡大塩基、及びフッ素化塩基。さらなる修飾核酸塩基としては、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン及び９−（２−アミノエトキシ）−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｇクランプ）などの三環式ピリミジンが挙げられる。修飾核酸塩基としては、プリンまたはピリミジン塩基がその他のヘテロ環で置換されたもの、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンも挙げることができる。さらなる核酸塩基としては、Ｍｅｒｉｇａｎら、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．  Ｉ．，  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９０，  ８５８−８５９；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，  ３０，  ６１３；Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  Ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３，  ２７３−２８８に開示されているもの；ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  １５，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｒｏｏｋｅ  Ｓ．  Ｔ．，  Ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００８，  １６３−１６６及び４４２−４４３に開示されているものが挙げられる。
【０１４４】
５−メチルシチジンによるシチジンの置換は、オリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧ単位を有するオリゴヌクレオチドの免疫原性を低下させることができる。
【０１４５】
例えば、７−デアザグアノシンまたは６−チオグアノシンによる１つ以上のグアノシンの置換は、アンチセンス活性を阻害して、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のＧ四重鎖形成を低減する場合もある。
【０１４６】
糖修飾
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドに１つ以上の糖修飾を含んでもよい。未修飾糖を有するヌクレオシドは、リボヌクレオシド及び２'−デオキシリボヌクレオシドに見られるフラノース環である糖部分を含む。
【０１４７】
本発明のヌクレオシドに含まれる糖は、非フラノース（または４'−置換フラノース）環または環系または開環系であってもよい。そのような構造は、天然のフラノース環（例えば、六員環）に対して簡単な変化を含む。代替的な糖は、糖代用物も含んでもよく、この場合、フラノース環が例えば、モルホリノまたはヘキシトール環系などの別の環系で置換されている。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれてもよい有用な糖部分の非限定例としては、β−Ｄ−リボース、β−Ｄ−２'−デオキシリボース、置換糖（例えば、２'、５'、及びビス置換糖）、４'−Ｓ−糖（例えば、４'−Ｓ−リボース、４'−Ｓ−２'−デオキシリボース、及び４'−Ｓ−２'−置換リボース）、架橋型糖、（例えば、２'−Ｏ−ＣＨ２−４'または２'−Ｏ−（ＣＨ２）２−４'架橋型リボース誘導二環式糖）及び糖代用物（リボース環がモルホリノまたはヘキシトール環系で置換されている場合）が挙げられる。
【０１４８】
一般に、糖修飾は、例えば、２'−置換、ロック、炭素環化、またはアンロックであってもよい。２'−置換は、リボフラノース中の２'−ヒドロキシルの２'−フルオロ、２'−メトキシ、または２'−（２−メトキシ）エトキシによる置換である。ロック修飾は、リボフラノースの４'−炭素原子と２'−炭素原子との間の橋の組み込みである。ロック修飾を有する糖を有する、ヌクレオシドは、架橋型核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）、及びｃＥｔ核酸として当該技術分野において知られている。架橋型核酸は、一般に親和性を高めるヌクレオシドとして使用される。
【０１４９】
ヌクレオシド間結合修飾
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシド間結合修飾を含んでもよい。ヌクレオシド間結合の２つの主なクラスは、リン原子の有無によって定義される。リン含有ヌクレオシド間結合の非限定例としては、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオアートジエステル結合、ホスホロチオアートトリエステル結合、モルホリノヌクレオシド間結合、メチルホスホナート、及びホスホルアミダートが挙げられる。非リンヌクレオシド間結合の非限定例としては、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカーバマート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）、シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）、及びＮ，Ｎ'−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられる。天然のホスホジエステル結合と比較して、修飾された結合は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を変えるため、一般に増加させるために使用することができる。リン含有及び非リン含有ヌクレオシド間結合の作製の方法は、当該技術分野において知られている。
【０１５０】
ヌクレオシド間結合は、立体化学的に濃縮されてもよい。例えば、ホスホロチオアートベースのヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオアートジエステルまたはホスホロチオアートトリエステル）は、立体化学的に濃縮されてもよい。不斉リンを含む立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間結合は、リン原子の絶対立体化学を特定するために一般にＳＰまたはＲＰと指定される。オリゴヌクレオチド内のＳＰホスホロチオアートは、以下の構造：
2021513851.tif 000015
を示す。
オリゴヌクレオチド内のＲＰホスホロチオアートは、以下の構造：
2021513851.tif 000016
を示す。
【０１５１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の中性ヌクレオシド間結合を含んでもよい。中性ヌクレオシド間結合の非限定例としては、ホスホトリエステル、ホスホロチオアートトリエステル、メチルホスホナート、メチレンメチルイミノ（５'−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−３'）、アミド−３（５'−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−３'）、アミド−４（５'−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−３'）、ホルムアセタール（５'−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−３'）、及びチオホルムアセタール（５'−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−３'）が挙げられる。さらなる中性ヌクレオシド間結合としては、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボキシラートエステル、カルボキサミド、スルフィド、スルホナートエステル、及びアミドを含む、非イオン性結合が挙げられる（例えば：Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｙ．  Ｓ．  Ｓａｎｇｈｖｉ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄ．  Ｃｏｏｋ，  Ｅｄｓ．，  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３  ａｎｄ  ４，  ４０−６５を参照）。
【０１５２】
末端修飾
本発明のオリゴヌクレオチドは、末端修飾、例えば、５'末端修飾または３'末端修飾を含んでもよい。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドの５'末端は、例えば、ヒドロキシル、疎水性部分、標的化部分、５'キャップ、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、ホスホロチオアート、ジホスホロチオアート、トリホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ジホスホロジチオアート、トリホスホロジチオアート、ホスホナート、ホスホルアミダート、細胞膜透過性ペプチド、エンドソーム脱出部分、または中性有機ポリマーであってもよい。未修飾５'−末端は、ヒドロキシルまたはホスファートである。５'−ヒドロキシルまたは５'−ホスファート以外の５'末端を有するオリゴヌクレオチドは、修飾５'末端を有する。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドの３'末端は、例えば、ヒドロキシル、標的化部分、疎水性部分、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、ホスホロチオアート、ジホスホロチオアート、トリホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ジスホロジチオアート、トリホスホロジチオアート、ホスホナート、ホスホルアミダート、細胞膜透過性ペプチド、エンドソーム脱出部分、または中性有機ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）であってもよい。未修飾３'末端は、ヒドロキシルまたはホスファートである。３'−ヒドロキシルまたは３'−ホスファート以外の３'末端を有するオリゴヌクレオチドは、修飾３'末端を有する。
【０１５５】
末端修飾（例えば、５'末端修飾）は、例えば、本明細書に記載されるとおりの標的化部分であってもよい。
【０１５６】
末端修飾（例えば、５'末端修飾）は、例えば、本明細書に記載されるとおりの疎水性部分であってもよい。
【０１５７】
相補性
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたってＡＴＰ７Ｂ標的配列と相補的である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＡＴＰ７Ｂ標的配列と少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７０％相補的である。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたってＡＴＰ７Ｂ標的配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％または少なくとも９５％）相補的であり、ＡＴＰ７Ｂ標的配列と完全に相補的な核酸塩基配列を含む。完全に相補的な核酸塩基配列は、例えば、６から２０個、１０から１８個、または１８から２０個の連続的な核酸塩基の長さであってもよい。
【０１５８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に対する１つ以上（例えば、１、２、３、または４つ）のミスマッチ核酸塩基を含んでもよい。特定の実施形態において、標的に対するスプライシングスイッチ活性は、そのようなミスタッチによって低減されるが、非標的に対する活性は、さらに大きな量で低減される。したがって、オリゴヌクレオチドのオフターゲット選択性は、改善することができる。
【０１５９】
組成物を調製するための方法
本開示は、本明細書中で示される組成物を調製または生成するための方法を提供する。標的配列を含むオリゴヌクレオチドなどの核酸分子は、例えば、さまざまな核酸合成アプローチによって生成することができる。例えば、スプライス部位を標的とする配列を含む核酸分子は、修飾及び／または未修飾ヌクレオシドのオリゴマー形成によって生成され、それにより、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、固相合成によって調製することができる。そのような固相合成は、例えば、マルチウェルプレートにおいて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などの供給業者から入手可能な装置を使用して実施することができる。ホスホロチオアート及びアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することは周知である。オリゴヌクレオチドは、当業者に既知の方法を使用した精製及び／または分析に供されてもよい。例えば、分析方法としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びエレクトロスプレー質量分析を挙げることができる。
【０１６０】
医薬組成物
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬組成物に含まれてもよい。医薬組成物は、一般に薬学的に許容される希釈剤または担体を含む。医薬組成物は、例えば、滅菌生理的食塩水及び本発明のオリゴヌクレオチドを含んでもよい（例えば、それらからなってもよい）。滅菌生理的食塩水は、一般に医薬品グレードの生理的食塩水である。医薬組成物は、例えば、滅菌水及び本発明のオリゴヌクレオチドを含んでもよい（例えば、それらからなってもよい）。滅菌水は、一般に医薬品グレードの水である。医薬組成物は、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）及び本発明のオリゴヌクレオチドを含んでもよい（例えば、それらからなってもよい）。滅菌ＰＢＳは、一般に医薬品グレードのＰＢＳである。
【０１６１】
医薬組成物は、１つ以上のオリゴヌクレオチド及び１つ以上の賦形剤を含んでもよい。賦形剤は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンから選択されてもよい。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、オリゴヌクレオチドの薬学的に許容されるあらゆる塩を包含する。オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、対象（例えば、ヒト）への投与時、生物学的に活性な代謝産物またはその残分（直接的または間接的に）もたらすことができる。したがって、例えば、本開示は、オリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩にも向けられる。適した薬学的に許容される塩としては、ナトリウム及びカリウム塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、プロドラッグは、オリゴヌクレオチドに結合した１つ以上のコンジュゲート基を含み、この場合、コンジュゲート基は、体内の内在酵素によって切断される。
【０１６３】
脂質部分は、核酸療法にさまざまな方法で使用されてきた。特定のそのような方法において、オリゴヌクレオチドなどの核酸は、予め生成されるリポソームまたはカチオン性脂質及び中性脂質の混合物から作られたリポプレックスに導入される。モノまたはポリカチオン性脂質とのＤＮＡ複合体は、例えば、中性脂質が存在していなくても形成することができる。脂質部分は、例えば、特定の細胞または組織への医薬品の分布を増加させるために選択されてもよい。脂質部分は、例えば、脂肪組織への医薬品の分布を増加させるために選択されてもよい。脂質部分は、例えば、筋肉組織への医薬品の分布を増加させるために選択されてもよい。
【０１６４】
医薬組成物は、送達系を含んでもよい。送達系の例としては、リポソーム及びエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。疎水性化合物を含むものなどの特定の医薬組成物を調製するために特定の送達系が有用である。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒が使用されてもよい。
【０１６５】
医薬組成物は、１つ以上の本発明の医薬品を特定の組織または細胞タイプに送達するために設計された１つ以上の組織特異的な送達分子を含んでもよい。例えば、医薬組成物は、本明細書に記載されるとおりの標的化部分でコーティングされたリポソームを含んでもよい。
【０１６６】
医薬組成物は、共溶媒系を含んでもよい。特定の共溶媒系としては、例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、及び水相が挙げられる。そのような共溶媒系は、例えば、疎水性化合物に対して使用されてもよい。共溶媒系の非限定例は、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（商標）及び６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００を含む無水エタノールの溶液であるＶＰＤ共溶媒系である。そのような共溶媒系の割合は、その溶解性及び毒性特性を著しく変えることなく大幅に変化する場合もある。さらに、共溶媒構成成分の同一性は、変化する場合もあり、例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（商標）の代わりにその他の界面活性剤が使用されてもよく、ポリエチレングリコールの分割量は変化することもあり、他の生体適合性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンが、ポリエチレングリコールに取って代わってもよく、デキストロースを他の糖またはポリサッカライドで置換してもよい。
【０１６７】
医薬組成物は、注射または輸液（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、脳室内など）による投与用に調製されてもよい。医薬組成物は、例えば、担体を含んでもよく、例えば、水溶液、例えば、水または生理学的に適合したバッファー、例えば、ハンクス液、リンゲル液、もしくは生理的食塩緩衝液中で製剤化されてもよい。その他の成分（例えば、溶解性を促進する成分、または保存料として働く成分）も含まれてもよい。例えば、適切な液体担体、懸濁化剤などを使用して注射可能な懸濁液が調製されてもよい。特定の注射用医薬組成物は、単位剤形として、例えば、アンプルに入れてまたは複数用量容器に入れて提供される。特定の注射用医薬組成物は、例えば、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンであってもよく、賦形剤（例えば、懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤）を含んでもよい。注射用医薬組成物に使用するのに適した特定の溶媒としては、親油性溶媒及び脂肪油、例えば、ゴマ油、合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）、及びリポソームが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
本発明の方法
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。
【０１６９】
本発明の方法は、細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることによって異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子を発現する細胞におけるエクソン６含有ＡＴＰ７Ｂ  ｍＲＮＡ分子のレベルを増加させる方法であってもよい。
【０１７０】
本発明の方法は、治療有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによって異常なＡＴＰ７Ｂ遺伝子を有する対象のウィルソン病を処置する方法であってもよい。
【０１７１】
本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物は、当該技術分野において既知の方法を使用して対象に投与されてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物は、対象（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮的、鼻腔内、または肺内）に非経口投与されてもよい。
【０１７２】
投薬は、一般に、例えば、処置される疾患状態の重症度及び反応性を含むさまざまな要素に左右される。処置過程は、例えば、数日から数か月、または回復がもたらされるか、もしくは疾患状態の軽減が達成されるまで継続されてもよい。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定値から算出することができる。したがって、最適な投与量、投薬法及び繰り返し率は、必要に応じて確立することができる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に応じて変化する場合もあり、一般にインビトロ及びインビボ動物モデルにおいて効果的だとわかったＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１ｇであってもよく、１日に１回以上、週に１回、月に１回、２か月に１回、３か月に１回、６か月に１回、１年に１回、または１年に２回与えられてもよい。投与の頻度は、変化する場合もある。投薬の繰り返し率は、例えば、測定された滞留時間及び体液または組織中の薬物の濃度に基づいて確立されてもよい。成功した処置に続いて、疾患状態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせるのが望ましい場合もあり、この場合、オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１ｇの範囲の維持用量で、例えば、１日に１回、１日に２回、１日に３回、１日おき、週に１回、２週に１回、月に１回、２か月に１回、３か月に１回、６か月に１回、１年に１回または１年に２回投与される。
【０１７３】
ウィルソン病の処置を必要とする対象のウィルソン病を処置する方法はまた、対象に薬学的に許容されるキレート剤または薬学的に許容される亜鉛の塩を投与することを含んでもよい。薬学的に許容される亜鉛の塩の非限定例としては、酢酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、及び硫酸亜鉛が挙げられる。薬学的に許容されるキレート剤の非限定例としては、Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、メルカプトコハク酸ナトリウム、ジメルカプトコハク酸、及びテトラチオモリブダートが挙げられる。いくつかの実施形態において、本方法は、対象に薬学的に許容される亜鉛の塩（例えば、酢酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、または硫酸亜鉛）を投与することを含む。一例において、本発明のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容されるキレート剤または亜鉛の塩は、同じ医薬組成物として一緒に投与される。別の例において、本発明のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容されるキレート剤または亜鉛の塩は、別々にほぼ同時に（例えば、１分以下あけて、または５分以下あけて）投与される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容されるキレート剤または亜鉛の塩は、同じ投与経路（例えば、静脈内注射）により別々に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容されるキレート剤または亜鉛の塩は、異なる投与経路（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの静脈内注射及び薬学的に許容されるキレート剤または亜鉛の塩の経口投与）により別々に投与される。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩に先立って投与される。さらに別の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の１時間以内（例えば、前、例えば、１５分、３０分、または１時間前）に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の１２時間以内（例えば、前、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間前）に投与される。特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の２４時間以内（例えば、前、例えば、１２または２４時間前）に投与される。特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の１週間以内（例えば、前、例えば、１、２、３、４、５、または６日前）に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の１か月以内（例えば、前、例えば、１、２、３、または４週前）に投与される。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の後に投与される。さらに別の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の１時間以内（例えば、後、例えば、１５分、３０分、または１時間後）に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の１２時間以内（例えば、後、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間後）に投与される。特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の２４時間以内（例えば、後、例えば、１２または２４時間後）に投与される。特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の１週間以内（例えば、後、例えば、１、２、３、４、５、または６日後）に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、キレート剤または亜鉛の塩の投与の１か月以内（例えば、後、例えば、１、２、３、または４週後）に投与される。
【実施例】
【０１７６】
以下の材料、方法、及び例は、実例に過ぎず、限定することを意図しない。
【０１７７】
材料及び方法
一般に、本発明の実施は、別に指示がある場合を除いて、化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術の従来の技術、及び電気泳動における標準的な技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９９２）を参照のこと。
【０１７８】
オリゴヌクレオチド。使用したすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手した。アンチセンスオリゴヌクレオチド中のすべての塩基は、完全なホスホロチオアート骨格を伴い、２'−Ｏ−メトキシエチル修飾されている（ＭＯＥ）。
【０１７９】
ＡＴＰ７Ｂミニ遺伝子の構築。ＡＴＰ７Ｂエクソン６に対するミニ遺伝子プラスミドを、完全なイントロン配列を含む、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子のゲノム遺伝子座のエクソン５から７と対応するフラグメントを含むよう設計した。転写されるｍＲＮＡフラグメントの異常なスプライシングを最小限にするために、エクソン５のコンセンサススプライスアクセプター配列をエクソン５の５'末端から９ヌクレオチドを欠失することによって除去し、同様にエクソン７のコンセンサススプライスドナー配列をエクソン７の３'末端から４０ヌクレオチドを欠失することによって除去した。ミニ遺伝子は、ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してＨＥＫ２９３ＴゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲフラグメントのＤＮＡ構築によって構築した。野生型ミニ遺伝子に関しては、プライマーＰ４６１（ＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＧＣＧＴＣＣＴＧＴＧＴＣ）（配列番号１６５）及びＰ４６３（ＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧ）（配列番号１６６）を用いて完全なフラグメントを増幅した。変異ミニ遺伝子に関しては、ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．１９３４Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｍｅｔ６４５Ａｒｇ）バリアントを、それぞれプライマーの組み合わせＰ４６１（配列番号１６５）及びＰ４６５（ＣＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＣ）（配列番号１６７）ならびにプライマーの組み合わせＰ４６４（ＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＡＧＧＴＡＧＡＡＣＡＣ）（配列番号１６８）及びＰ４６３（配列番号１６６）を用いて増幅した２つの重複するフラグメントの部位特異的変異誘発によって導入した。ＰＣＲフラグメントを、製造業者の説明書に従ってＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してプライマーＰ４５９（ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ）（配列番号１６９）及びＰ４６０（ＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＧＡＴ）（配列番号１７０）を用いて、直線化したｍＣｌｏｖｅｒ２プラスミドにクローン化した。Ｐｒｅｓｔｏ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅａｉｄ）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した。
【０１８０】
ＨｅｐＧ２変異株、２Ｆ３。この株は、一般的に使用される分子生物学技術に従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ９を使用してＭ６４５Ｒバリアントを挿入することによってＨｅｐＧ２細胞から作製した。得られた２Ｆ３株は、対立遺伝子の一方にＭ６４５Ｒバリアント及び他方に大きなプラスミド挿入を持つ。この挿入は、その対立遺伝子が機能的なタンパク質を産生できなくさせるため、ウィルソン病患者に見られるものと一致する複合ヘテロ接合体と類似した状況を作り出すようであった（Ｍａｒｇａｒｉｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．，  ６８：６１−６８，  ２００５）。
【０１８１】
細胞培養。３７℃、５％  ＣＯ２の加湿されたインキュベーターにおいて１０％（ｖ／ｖ）Ｃｏｓｍｉｃ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生剤（１００−Ｕ／ｍｌペニシリンＧ及び１００−ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）を加えたＩｓｃｏｖｅ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を増殖させた。コンフルエント状態に達したとき、細胞をリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、続いてトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）分離によって継代し、１０から２０倍希釈で播いた。ＨｅｐＧ２野生型及び変異２Ｆ３細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２の加湿されたインキュベーターにおいて１０％熱失活ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。コンフルエント状態に達したとき、細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、続いてＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）分離によって継代し、培養フラスコに２から４倍希釈で播いた。
【０１８２】
ミニ遺伝子プラスミドによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション。ミニ遺伝子プラスミドによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションのために、３００，０００細胞を、１２ウェル組織培養物プレート中の抗生剤を含む１ｍｌの完全培地に播き、３７℃及び５％  ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。プラスミドトランスフェクションミックスは、５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ低血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中に希釈された１，０００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（約５μｌ）を３．０μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液（Ｒｏｃｈｅ）と混合することによって生成した。プラスミドトランスフェクションミックスを、室温で２０分間インキュベーションした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加し、それを、その後、３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベーションした。トランスフェクションの２４時間後、培地を２，０００μｌの完全培地と交換した。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ分析のために細胞を溶解させた。
【０１８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びミニ遺伝子プラスミドによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクション。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びミニ遺伝子プラスミドを、９６ウェル形式でＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした。アンチセンスオリゴヌクレオチドストック液（１００μＭ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ低血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中で５μＭに希釈した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む各ウェル当たり５０ｐｍｏｌのアンチセンスオリゴヌクレオチドの絶対量でトランスフェクションした。このために、５μＭアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液の１０μｌのアリコートを９６ウェル組織培養物プレートのウェルに移し、９．７μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ及び０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１０μｌの脂質トランスフェクション試薬溶液をウェルに添加した。ピペッティング２回により穏やかに混合し、それに続いてプレートを軽くたたいた後、室温で２０分間インキュベーションすることによって、混合物中にアンチセンスオリゴヌクレオチド・脂質複合体を形成した。次に、抗生剤を含まない１００μｌの完全培地溶液中の５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチド・脂質複合体に添加し、３７℃及び５％  ＣＯ２で５時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をミニ遺伝子プラスミドでトランスフェクションした。このために、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに希釈された２００ｎｇのプラスミドを含む５μｌを０．６μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液（Ｒｏｃｈｅ）と混合することによってプラスミドトランスフェクションミックスを生成した。プラスミドトランスフェクションミックスを、室温で２０分間インキュベーションした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加し、それを、その後、３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベーションした。トランスフェクションの２４時間後、培地を２００μｌの完全培地と交換した。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ分析のために細胞を溶解させた。
【０１８４】
トランスフェクションＨｅｐＧ２野生型及び変異２Ｆ３細胞。すべての試薬は、製造業者の推奨に従って使用した。ＴｒｙｐＬＥとの１５〜２０分間のインキュベーションによって細胞を懸濁させ、１０％熱失活ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ中で１ミリリットル当たり２５００００〜５０００００細胞に希釈した。ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を含むトランスフェクション培地中の５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを、上記培養懸濁液からの２５０００〜５００００細胞と混合した。別に明記されない限り、トランスフェクションの４８時間後にＲＮＡを回収した。
【０１８５】
ＲＮＡ調製。製造業者の推奨に従ってＳｉｎｇｌｅＳｈｏｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）またはＲＮｅａｓｙ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによってＲＮＡを調製し、あるいは、５００μＬの体積を用いたすべての洗浄に対して３００μＬだけ使用し、９００ｒｐｍのすべてのｒｐｍ速度に対して１０５０ｒｐｍを使用したことを除いて、製造業者の推奨に従ってＤｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ  ＴＭ−９６  ＭａｇＢｅａｄ  ＲＮＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。
【０１８６】
ＲＴ−ＰＣＲ分析。製造業者の推奨に従い、軽微な変更を伴いＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により第一鎖ｃＤＮＡの合成を実施した。５０〜３００ｎｇの精製ＲＮＡを９６ウェルＰＣＲプレートにおいて１μｌのＯｌｉｇｏ−ｄＴ−ＶＮプライマー（１００μＭ、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＶＮ）とともに７０℃で５分間インキュベーションし、続いて４℃で５分間急速冷却した。２０単位のＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、反応バッファー、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＦｒｏｇｇａＢｉｏ）及び４０単位のＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｂｉｏｓｈｏｐ）を含む１４．５μｌの逆転写酵素混合物を、ＲＮＡオリゴｄＴ−ＶＮ反応に添加し、２５℃で５分間、４２℃で６０分間インキュベーションし、最後に１２℃に冷却した。標的特異的なスプライシングフラグメントをＰＣＲによって増幅させた。ＨｅｐＧ２野生型及び変異２Ｆ３細胞実験用のＰＣＲプライマーは、ＣＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号１５６）及びＧＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴＣＡＧ（配列番号１５７）とした。ミニ遺伝子実験用のＰＣＲプライマーは、ＧＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣ（配列番号１５８）及びＧＴＴＴＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧ（配列番号１５９）とした。ＰＣＲ反応は、５μｌの第一鎖ｃＤＮＡ生成物、０．４μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、３００μＭの各ｄＮＴＰ、２５ｍＭトリシン、７．０％グリセロール（ｍ／ｖ）、１．６％ＤＭＳＯ（ｍ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８５ｍＭ  ＮＨ４−アセタート（ｐＨ８．７）、及び１単位  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＦｒｏｇｇａＢｉｏ）を２５μｌの総体積で含んでいた。フラグメントをタッチダウンＰＣＲプログラムによって増幅させた（９５℃で１２０秒間；９５℃で２０秒間、１サイクル毎に１℃低下させる６８℃で３０秒間、及び７２℃で６０秒間の１０サイクル；続いて９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、及び７２℃で６０秒間の３０サイクル；７２℃で１８０秒間）。
【０１８７】
キャピラリー電気泳動。ＤＮＡ  １Ｋ  Ｈｉ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＬａｂＣｈｉｐ及び関連する試薬（ＧＥ）を製造業者の推奨に従って使用し、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ）を使用してサンプルを分析した。
【０１８８】
ウエスタンブロッティング。上記のとおり、細胞を増殖させ、トランスフェクションした。４８時間後に培地を除去し、細胞をＤＰＢＳですすいだ。その細胞をＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）で懸濁させ、ペレット状にした。ＴｒｙｐＬＥを除去し、１５０μｌの氷冷ＲＩＰＡバッファー（ＳＩＧＭＡ）を１×ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにウェルに添加した。その溶液を氷上に１０分間置き、その後、１５０００ｒｃｆ、４℃で遠心分離した。上清を新しいチューブに入れ、ペレットを捨てた。タンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質濃度を求めた。２０から３０μｇのライセートタンパク質を、７０℃でＮｕｐａｇｅバッファー（Ｎｏｖｅｘ）とともに加熱し、１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填した。１×ＭＯＰＳバッファー（Ｎｏｖｅｘ）中、２００Ｖで約４０分間ゲルの泳動を行った。ゲルを取り除き、氷上のＰＶＤＦ膜（ＧＥ）に３５０ｍＡの定電流で９０分間転写した。転写後、ＴＢＳＴ−５％ミルク中、室温で６０分間膜をブロッキングした。ブロッキング後、ＴＢＳＢ−１％ミルク中のＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ）及びＡＴＰ７Ｂ（Ａｂｃａｍ）に対する一次抗体を添加し、４℃で一晩冷却した。その後、その膜を、ＴＢＳＴで５分間５回すすいだ。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を室温で６０分間溶液に添加した。その後、その膜を、ＴＢＳＴで５分間５回すすいだ。画像をＧＥ  ＡＩ６００ＲＧＢ装置で記録した。
【０１８９】
銅感受性アッセイ。上で明記したとおりに細胞を増殖させ、トランスフェクションした。その後、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションするか、または対照に関してはトランスフェクションしなかった。トランスフェクションの４８時間後、ＣｕＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を脱イオン化水中において０．５Ｍの濃度で調製した。これを、その後、１０％ウシ胎仔血清を加えたＤＭＥＭ中で希釈して、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１．０ｍＭ、及び１．２５ｍＭの最終濃度とした。その後、培地＋ＣｕＣｌ２を使用して細胞に対して培地変更を行った。４８時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｆｌｕｏｒ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＮｅｏ２機器（Ｂｉｏｔｅｋ）により細胞生存率を読み取った。データは、郡内で銅なし処理に対して正規化した。
【０１９０】
実施例１  ＡＴＰ７Ｂエクソン６のスプライシングは、ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］バリアントにおいて撹乱されており、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用により部分的にレスキューすることができる
ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］（Ｍ６４５Ｒ）バリアントにおいてエクソン６スキッピングを確認するために、エクソン５〜７及び対応するイントロン５及び６を含む、ミニ遺伝子を含む野生型及びバリアントを構築した。その後、ミニ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、スプライシングに対するＭ６４５Ｒバリアントの影響を調べた。図１Ａに見られるとおり、野生型ミニ遺伝子は、上側のバンドによって表されるエクソン６含有、及び除外の両方を示した。しかしながら、Ｍ６４５Ｒ変異体は、エクソン６含有を示さず、これは、ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］変異がエクソン６スキッピングを誘導することを示す。図１Ａに実験の結果を再現し、定量した。図１Ｂに見られるとおり、ｃｈｒ１３：５２５３５９８５：Ａ：Ｃ［ｈｇ１９／ｂ３７］変異による確固としたエクソン６含有の低下（野生型及びＭ６４５Ｒミニ遺伝子に関してそれぞれ５．７％及び１．３％の標準偏差）が示されている。
【０１９１】
Ｍ６４５Ｒバリアントにおけるエクソン６含有を促進するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を調べるために、上記ミニ遺伝子を配列番号３〜３４に記載される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてコトランスフェクションした（表１を参照）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、エクソン６及び周辺のイントロンに沿ってタイリングした。図２Ａは、エクソン６及び周辺のイントロンに対する標的化ＡＳＯの位置を示す。図２Ｂは、キャピラリー電気泳動によって測定されたＲＴ−ＰＣＲサンプルを示す。４４５ｂｐにおけるエクソン６含有バンド及び３６８ｂｐにおける除外バンドとのサイズ参照のために１００ｂｐ  ＤＮＡラダーを示す。これらの結果を数量化し、図２Ｃに示す。図２Ｂ及び２Ｃの両方を観察して、エクソン６周辺のイントロン領域を標的とすることにより野生型及びＭ６４５Ｒバリアントのミニ遺伝子の両方のエクソン６含有が誘導されることは明らかである。こうした観察は、これらの領域または「ホットスポット」（配列番号１の位置５４５２２〜５４５９３及び５４６６５〜５４７１８；ｃｈｒ１３：５２５３６０３８〜５２５３６１０９及びｃｈｒ１３：５２５３５９６６〜５２５３５９１３）、例えば、ホットスポット１に関する配列番号３〜１２及びホットスポット２に関する配列番号２８〜３４の核酸塩基配列と相補的なものを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、エクソン６スキッピングと関連づけられるウィルソン病（例えば、Ｍ６４５Ｒ変異が原因となるウィルソン病）の処置に特に有用である可能性があることを示唆する。
【０１９２】
表１
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【０１９３】
実施例２  ＡＴＰ７Ｂエクソン６の含有を増加させるための標的領域（ホットスポット）の特徴づけ
Ｍ６４５Ｒバリアントを持つウィルソン病患者に対する処置としてのスプライススイッチオリゴヌクレオチドの可能性のある使用を調査するために、この変異を持つ肝細胞株ＨｅｐＧ２、２Ｆ３を誘導した。２Ｆ３株は、対立遺伝子の一方にＭ６４５Ｒバリアント及び他方に大きなプラスミド挿入を持つ。この挿入は、その対立遺伝子が機能的なタンパク質を産生できなくさせるため、ウィルソン病患者に見られるものと一致する複合ヘテロ接合体と類似した状況を作り出すようである。
【０１９４】
表２に列挙されているオリゴヌクレオチドを２Ｆ３細胞にトランスフェクションし、ＲＴ−ＰＣＲ産物を、キャピラリー電気泳動を使用して分析した。これらのオリゴヌクレオチドを、上で特定されるホットスポットとハイブリダイズするよう、さらにさらなるホットスポットの検索を拡大するよう設計した。その後、エクソン６に関してスプライシングされて含まれるパーセント（ＰＳＩ）、ならびに不活性対照アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較したスプライシングされて含まれるパーセントの変化（ｄＰＳＩ）を算出した（表２）。表２に見られるとおり、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、意図される効果と反対のエクソン６除外の増加を示すマイナスのｄＰＳＩを有している（例えば、配列番号１１５〜１１８）。エクソン６の片側のイントロン領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有効であり、プラスのｄＰＳＩを示す。
【０１９５】
高いｄＰＳＩを有する特定のオリゴヌクレオチドを、参照ゲノムｃｈｒ１３：５２５３５９１４〜５２５３６１４６［ｈｇ１９／ｂ３７］と整列させた（配列番号２８〜３３、４７〜５１、６０、６１、６３〜６７、７６〜８１、９３〜９５、１２０、１２１、１３０、１３２、１３３〜１３７、１４７、及び１５０）。図３に見られるとおり、配列番号３〜１２に記載される配列（ゲノムアンチセンス：配列番号１の位置５４５２２〜５４５９３；ｃｈｒ１３：５２５３６０３８〜５２５３６１０９）及び配列番号２８〜３４（ゲノムアンチセンス：配列番号１の位置５４６６５〜５４７１８；ｃｈｒ１３：５２５３５９１３〜５２５３５９６６）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる領域に加えて、配列番号１１９〜１２４に記載される配列（ゲノムアンチセンス：配列番号１の位置５４４７２〜５４５１６；ｃｈｒ１３：５２５３６１１５〜５２５３６１５９）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる領域に及ぶ、ＡＴＰ７Ｂ  Ｍ６４５Ｒ変異体においてエクソン６含有を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチド結合に対する第３のホットスポットを発見した。３つの例となる中心配列も、これらの領域：配列番号１６０（ゲノムセンス：ＴＴＡＴＣＴＴＴＴ；ゲノムアンチセンス：配列番号１の位置５４６７２〜５４６８０）、配列番号１６１（ゲノムセンス：ＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＡ；ゲノムアンチセンス：配列番号１の位置５４６９１〜５４７０１）、及び配列番号１６２（ゲノムセンス：ＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡ；ゲノムアンチセンス：位置５４４９２〜５４５０６）において特定した。
【０１９６】
表２
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【０１９７】
実施例４  スプライシング調節アンチセンスオリゴヌクレオチドによる２Ｆ３細胞の処理は、タンパク質レベル及び銅耐性を増加させる
ウィルソン病に対する可能性のある処置として、エクソン６含有を誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性をモデル化するために、インビトロ銅感受性アッセイを使用した。図４Ａに見られるとおり、Ｍ６４５Ｒ変異は、ＡＴＰ７Ｂ変異の結果として細胞が銅を処理できないウィルソン病をまねた２Ｆ３細胞における銅耐性を低下させる。配列番号２９に記載される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクションは、２Ｆ３細胞における銅耐性を高め、このことは、エクソン６の含有を増加させる本明細書に示されたオリゴヌクレオチドによるトランスフェクションによって、銅高感受性表現型が少なくとも部分的にレスキューできることを実証する。２Ｆ３細胞が産生するＡＴＰ７Ｂタンパク質が、野生型ＨｅｐＧ２細胞よりも著しく少ないため、ＡＴＰ７Ｂタンパク質に対するウエスタンブロットは、これらの結果と一致する（図４Ｂ）。配列番号２９に記載される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクションは、この表現型を部分的にレスキューし、２Ｆ３細胞におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質レベルを増加させる。このＡＴＰ７Ｂタンパク質レベル及び機能の増加は、エクソン６の含有を増加させることがわかっているアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理が、インビトロモデルにおけるウィルソン病表現型を部分的にレスキューすることを示す。
【０１９８】
その他の実施形態
本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本記載の発明のさまざまな改変物及び変形物が当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して記載したが、当然のことながら、特許請求されるとおりの本発明は、そのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではない。実際に、当業者には明らかな本発明を実施するための記載の形態のさまざまな改変物は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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