(57)【要約】  本発明は、遺伝子工学の技術分野に属し、モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその製造方法並びに応用を提供する。前記モノオキシゲナーゼ突然変異体は、（Ｉ）、（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列のいずれかを有し、モノオキシゲナーゼ活性を備える。（Ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、（ＩＩ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列の２３〜５０８番目のアミノ酸の、１又は数個のアミノ酸が修飾、置換、欠失または付加されたアミノ酸配列（前記置換は、１〜３４個のアミノ酸が置換されることである。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）、（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列のいずれかを有するモノオキシゲナーゼ突然変異体であって、
（Ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ＩＩ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列の２３〜５０８番目のアミノ酸の、１又は数個のアミノ酸が修飾、置換、欠失または付加されたアミノ酸配列（前記置換は、１〜３４個のアミノ酸が置換されることである。）
前記突然変異体は、モノオキシゲナーゼ活性を備える
ことを特徴とするモノオキシゲナーゼ突然変異体。
【請求項２】
前記置換は、２３番目、２５番目、４７番目、７５番目、９３番目、１０６番目、１１０番目、１１７番目、１３７番目、１５３番目、１５９番目、１６６番目、２６０番目、２６５番目、２８４番目、２８９番目、３３４番目、３５９番目、３６０番目、３７７番目、３８０番目、４２６番目、４２８番目、４３５番目、４３６番目、４３７番目、４３９番目、４５７番目、４７４番目、４７９番目、４９０番目、４９５番目、５００番目または５０８番目のうちのいずれか１つまたは少なくとも２つのアミノ酸が置換されることであり、
好ましくは、前記突然変異体の突然変異部位は、Ｍ２３Ｌ、Ｍ２５Ａ、Ａ７４Ｄ、Ｍ７５Ｌ、Ａ９３Ｅ、Ｐ１０６Ｒ、Ｌ１１０Ｆ、Ｍ１１７Ａ、Ｔ１３７Ｒ、Ｗ１５３Ｆ、Ｒ１５９Ｌ、Ｍ１６６Ｌ、Ｍ２６０Ｌ、Ａ２６５Ｅ、Ｍ２８４Ｉ、Ｃ２８９Ｓ、Ｃ３３４Ｌ、Ａ３５９Ｅ、Ｍ３６０Ｉ、Ｍ３７７Ｖ、Ｌ３８０Ｆ、Ｍ４２６Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｐ４３５Ｌ、Ｐ４３５Ａ、Ｆ４３６Ｌ、Ｆ４３６Ｙ、Ｆ４３６Ａ、Ｔ４３７Ｓ、Ｔ４３７Ａ、Ｔ４３７Ｙ、Ｌ４３９Ｇ、Ｌ４３９Ａ、Ｌ４３９Ｓ、Ｍ４５７Ｌ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５Ｆ、Ｉ４９５Ｖ、Ｉ４９５Ａ、Ｓ５００ＩまたはＭ５０８Ｌのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の突然変異体。
【請求項３】
前記置換は、２５番目、１０６番目、１５９番目、２６５番目、２８９番目、３７７番目、３８０番目、４３５番目、４３６番目、４３７番目、４３９番目、４７４番目、４７９番目、４９０番目、４９５番目または５００番目のうちのいずれか１つまたは少なくとも２つのアミノ酸が置換されることであり、
好ましくは、前記突然変異体の突然変異部位は、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ｒ１５９Ｌ、Ａ２６５Ｅ、Ｃ２８９Ｓ、Ｍ３７７Ｖ、Ｌ３８０Ｆ、Ｐ４３５Ｌ、Ｆ４３６Ｙ、Ｔ４３７Ａ、Ｌ４３９Ｓ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５ＡまたはＳ５００Ｉのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせであり、
好ましくは、前記突然変異体の突然変異部位が、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ｒ１５９Ｌ、Ａ２６５Ｅ、Ｃ２８９Ｓ、Ｍ３７７Ｖ、Ｌ３８０Ｆ、Ｐ４３５Ｌ、Ｆ４３６Ｙ、Ｔ４３７Ａ、Ｌ４３９Ｓ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５ＡまたはＳ５００Ｉのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせである場合、前記突然変異体モノオキシゲナーゼの形質転換率は４０％以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の突然変異体。
【請求項４】
前記置換は、２５番目、１０６番目、２６５番目、４７４番目、４９０番目または５００番目のうちのいずれか１つまたは少なくとも２つのアミノ酸が置換されることであり、
好ましくは、前記突然変異体の突然変異部位は、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ａ２６５Ｅ、Ａ４７４Ｅ、Ｑ４９０ＫまたはＳ５００Ｉ のうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせであり、
好ましくは、前記突然変異体の突然変異部位が、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ａ２６５Ｅ、Ａ４７４Ｅ、Ｑ４９０ＫまたはＳ５００Ｉのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせである場合、前記突然変異体モノオキシゲナーゼの形質転換率は４８％以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の突然変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５に記載のヌクレオチド配列を少なくとも１コピー含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項８】
（１）請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異体をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を作製するステップと、
（２）前記突然変異体の発現に適した培地で前記宿主細胞をインキュベートするステップと、
（３）ステップ（２）で前記宿主細胞によって発現された前記突然変異体のポリペプチドを前記培地から回収するステップと、
を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異体の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異体のポリペプチドを含む組成物であって、
前記組成物は、乾燥粉末、錠剤または液体のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであるのが好ましいことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
キラルな薬物の製造における請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異体の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の技術分野に関し、特に、モノオキシゲナーゼ突然変異体並びにその製造方法及び応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
キラルスルホキシドは、多くの重要な生理活性分子の構造単位として、自然界に広く存在しており、天然物やキラルな薬物を合成するための重要な中間体である。キラルスルホキシドはほとんど１つ又は複数のキラル中心を有する。異なるキラルな薬物は薬理活性、代謝プロセス、代謝速率及び毒性に差が大きく、通常、一方のエナンチオマーは有効であるが、もう一方のエナンチオマーは効果が薄いか無効であり、さらに有毒である場合もある。このため、如何にしてキラル中心を含む化合物を効率的かつ立体選択的に構築するかは、医薬品の研究開発において非常に重要である。
【０００３】
Baeyer Villigerモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯｓ）は、フラビン系モノオキシゲナーゼであり、通常、鎖状および環状のケトンを立体選択的に酸化し、対応するエステルまたはラクトンを生成するために使用され、硫黄、窒素およびリンの求電子酸化反応を触媒することもでき、同時に、ＢＶＭＯｓは、ケトンおよびホウ素の求核酸化反応を触媒することもできる。シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯｓ）は、最初に発見されたＢＶＭＯファミリーのメンバーである。ＣＮ１０５６９５４２５Ａには、ＣＨＭＯsがキラルな薬物の合成に広く応用され、硫黄含有キラル前駆体の酸化を触媒することができ、キラルな薬物であるモダフィニルおよびオメプラゾールの合成に使用され、一方、既存のＣＨＭＯsは酵素活性が低く、安定性が悪く、可溶性発現が劣り、選択性が低く、大量の酵素の添加量が多く、後処理が困難となることが開示された。
【０００４】
単胞菌Brachymonas petroleovorans由来のモノオキシゲナーゼＣＨＭＯは、チオエーテル化合物の形質転換を比較的高い選択性で触媒することができるが、しかし、その活性が低く、安定性が悪く、大腸菌における可溶性発現が劣り、反応時に大量の酵素が添加される。
【０００５】
ＣＮ１０７３８４８８０Ａには、フラビンモノオキシゲナーゼ突然変異体及びその製造方法において、エラープローンＰＣＲ技術により、野生型フラビンモノオキシゲナーゼをランダムに突然変異させ、酵素の比活性が野生型フラビンモノオキシゲナーゼの酵素の比活性よりも３５％高められたフラビンモノオキシゲナーゼ突然変異体を得たことが開示された。しかし、単に酵素の比活性を向上させただけであり、モノオキシゲナーゼの安定性、可溶性発現、選択性および酵素の使用量には寄与しなかった。
【０００６】
いくつかのＣＨＭＯsは商業的に応用されているが、ＣＨＭＯsは、可溶性発現が劣り、酵素活性が低く、酵素安定性が悪く、選択性が高くないなどの問題が一般的に存在している。一般的には、野生型酵素を、指向進化の手段により、酵素の様々な性質を向上させるように改良することで、生産に応用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術の欠陥および実際のニーズを考慮して、本発明は、形質転換効率や安定性を向上させ、製薬分野における応用に有利なモノオキシゲナーゼ突然変異体並びにその製造方法及び応用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
【０００９】
第１形態によれば、本発明は、（Ｉ）、（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列のいずれかを有し、モノオキシゲナーゼ活性を備えるモノオキシゲナーゼ突然変異体を提供する。
【００１０】
（Ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ＩＩ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列の２３〜５０８番目のアミノ酸の、１又は数個のアミノ酸が修飾、置換、欠失または付加されたアミノ酸配列（前記置換は、１〜３４個のアミノ酸が置換されることである。）
本発明では、本発明者らは、２３〜５０８番目のアミノ酸のうち複数の異なる部位の突然変異を設計することで、モノオキシゲナーゼの性質を調べた結果、これらの部位の突然変異は、モノオキシゲナーゼの活性、安定性、可溶性発現、選択性を向上させることができるとともに、酵素の使用量を減らすことができることを見出した。
【００１１】
本発明において、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるアミノ酸配列は以下の通りである。
2021512605.tif 000002
【００１２】
本発明の他の実施例において、モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示した配列を有し、かつモノオキシゲナーゼ活性を備える。
【００１３】
本発明のいくつかの実施例において、モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を示した配列を有し、かつモノオキシゲナーゼ活性を備える。
【００１４】
本発明のいくつかの実施例において、モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を示した配列を有し、モノオキシゲナーゼ活性を備える。
【００１５】
本発明のいくつかの実施例において、モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を示した配列を有し、モノオキシゲナーゼ活性を備える。
【００１６】
本発明において、前記修飾は、アミド化、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、グリコシル化またはカルボニル化のうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む。
【００１７】
前記置換は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個または３４個が置換されることであってもよい。
【００１８】
本発明において、前記モノオキシゲナーゼ突然変異体は、チオエーテル化合物の形質転換を触媒することができ、前記チオエーテル化合物は
2021512605.tif 000003
（ただし、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基若しくはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であるか、又は、Ｒ１およびＲ２は、カルボニル基の炭素と共にＣ５〜Ｃ１０ヘテロシクリル基、Ｃ５〜Ｃ１０カルボシクリル基若しくはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、前記Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロシクリル基およびＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基におけるヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素および硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、前記Ｃ５〜Ｃ１０アリール基におけるアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基におけるヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０カルボシクリル基におけるカルボシクリル基、またはＣ５〜Ｃ１０ヘテロシクリル基におけるヘテロシクリル基は、それぞれ独立して、非置換であるか、又は、ハロゲン、アルコキシ基若しくはアルキル基の少なくとも１つによって置換される）であり、好ましくは、前記チオエーテル化合物は式Ｉで示される。
【００１９】
具体的な反応式は以下の通りである。
2021512605.tif 000004
【００２０】
本発明によれば、前記置換は、２３番目、２５番目、４７番目、７５番目、９３番目、１０６番目、１１０番目、１１７番目、１３７番目、１５３番目、１５９番目、１６６番目、２６０番目、２６５番目、２８４番目、２８９番目、３３４番目、３５９番目、３６０番目、３７７番目、３８０番目、４２６番目、４２８番目、４３５番目、４３６番目、４３７番目、４３９番目、４５７番目、４７４番目、４７９番目、４９０番目、４９５番目、５００番目または５０８番目のうちのいずれか１つまたは少なくとも２つのアミノ酸が置換されることである。
【００２１】
本発明によれば、前記突然変異体の突然変異部位は、Ｍ２３Ｌ、Ｍ２５Ａ、Ａ７４Ｄ、Ｍ７５Ｌ、Ａ９３Ｅ、Ｐ１０６Ｒ、Ｌ１１０Ｆ、Ｍ１１７Ａ、Ｔ１３７Ｒ、Ｗ１５３Ｆ、Ｒ１５９Ｌ、Ｍ１６６Ｌ、Ｍ２６０Ｌ、Ａ２６５Ｅ、Ｍ２８４Ｉ、Ｃ２８９Ｓ、Ｃ３３４Ｌ、Ａ３５９Ｅ、Ｍ３６０Ｉ、Ｍ３７７Ｖ、Ｌ３８０Ｆ、Ｍ４２６Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｐ４３５Ｌ、Ｐ４３５Ａ、Ｆ４３６Ｌ、Ｆ４３６Ｙ、Ｆ４３６Ａ、Ｔ４３７Ｓ、Ｔ４３７Ａ、Ｔ４３７Ｙ、Ｌ４３９Ｇ、Ｌ４３９Ａ、Ｌ４３９Ｓ、Ｍ４５７Ｌ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５Ｆ、Ｉ４９５Ｖ、Ｉ４９５Ａ、Ｓ５００ＩまたはＭ５０８Ｌのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせである。
【００２２】
本発明において、本発明者らは、さらに実験検証することにより、これら４３個の部位の突然変異は、モノオキシゲナーゼの性質をさらに向上させることができ、そのうち、２５番目、１０６番目、１５９番目、２６５番目、２８９番目、３７７番目、３８０番目、４３５番目、４３６番目、４３７番目、４３９番目、４７４番目、４７９番目、４９０番目、４９５番目または５００番目の突然変異は、モノオキシゲナーゼの触媒活性、形質転換率およびイソプロパノールに対する耐性を大幅に向上させることができる一方、他の部位の突然変異は、モノオキシゲナーゼの可溶性発現および選択性を大幅に向上させることができることを見出した。
【００２３】
本発明によれば、前記置換は、２５番目、１０６番目、１５９番目、２６５番目、２８９番目、３７７番目、３８０番目、４３５番目、４３６番目、４３７番目、４３９番目、４７４番目、４７９番目、４９０番目、４９５番目または５００番目のうちのいずれか１つまたは少なくとも２つのアミノ酸が置換されることである。
【００２４】
本発明によれば、前記突然変異体の突然変異部位は、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ｒ１５９Ｌ、Ａ２６５Ｅ、Ｃ２８９Ｓ、Ｍ３７７Ｖ、Ｌ３８０Ｆ、Ｐ４３５Ｌ、Ｆ４３６Ｙ、Ｔ４３７Ａ、Ｌ４３９Ｓ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５ＡまたはＳ５００Ｉのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせである。
【００２５】
本発明によれば、前記突然変異体の突然変異部位が、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ｒ１５９Ｌ、Ａ２６５Ｅ、Ｃ２８９Ｓ、Ｍ３７７Ｖ、Ｌ３８０Ｆ、Ｐ４３５Ｌ、Ｆ４３６Ｙ、Ｔ４３７Ａ、Ｌ４３９Ｓ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５ＡまたはＳ５００Ｉのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせである場合、前記突然変異体モノオキシゲナーゼの形質転換率は４０％以上である。
【００２６】
本発明によれば、前記置換は、２５番目、１０６番目、２６５番目、４７４番目、４９０番目または５００番目のうちのいずれか１つまたは少なくとも２つのアミノ酸が置換されることである。
【００２７】
本発明によれば、前記突然変異体の突然変異部位は、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ａ２６５Ｅ、Ａ４７４Ｅ、Ｑ４９０ＫまたはＳ５００Ｉのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせである。
【００２８】
本発明によれば、前記突然変異体の突然変異部位が、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ａ２６５Ｅ、Ａ４７４Ｅ、Ｑ４９０ＫまたはＳ５００Ｉのうちのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせである場合、前記突然変異体モノオキシゲナーゼの形質転換率は４８％以上である。
【００２９】
本発明において、本発明者らは、さらなる調べにより、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｐ１０６Ｒ、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ−Ｐ１０６ＲおよびＳ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｑ４９０Ｋの５つの突然変異体は、収率が最も高く、８６％以上に達し、イソプロパノールにおける酵素の残存活性が６０％以上に達し、形質転換率が９０％以上に達することを見出した。
【００３０】
第２形態によれば、本発明は、第１形態に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００３１】
第３形態によれば、本発明は、第２形態に記載のヌクレオチド配列を少なくとも１コピー含む発現ベクターを提供する。
【００３２】
第４形態によれば、本発明は、第３形態に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３３】
第５形態によれば、本発明は、
（１）第１形態に記載の突然変異体をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を作製するステップと、
（２）前記突然変異体の発現に適した培地で前記宿主細胞をインキュベートするステップと、
（３）ステップ（２）で前記宿主細胞によって発現された前記突然変異体のポリペプチドを前記培地から回収するステップと、
を含む第１形態に記載の突然変異体の製造方法を提供する。
【００３４】
第６形態によれば、本発明は、第１形態に記載の突然変異体のポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００３５】
本発明によれば、前記組成物は、乾燥粉末、錠剤または液体のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせである。
【００３６】
第七形態によれば、本発明は、キラルな薬物の製造における第１形態に記載の突然変異体の応用を提供する。
【発明の効果】
【００３７】
従来技術に比べ、本発明は以下の有益な効果を有する
（１）本発明では、２３〜５０８番目のアミノ酸の複数の異なる部位における突然変異を設計することで、これらの突然変異体は、モノオキシゲナーゼの活性、安定性、可溶性発現、選択性を向上させたとともに、モノオキシゲナーゼの使用量を減らすことができることを見出した。
【００３８】
（２）本発明では、検証により、元のモノオキシゲナーゼに基づいて、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ｒ１５９Ｌ、Ａ２６５Ｅ、Ｃ２８９Ｓ、Ｍ３７７Ｖ、Ｌ３８０Ｆ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５ＡおよびＳ５００Ｉの１２個の部位を単独に突然変異させることで、モノオキシゲナーゼの活性を向上させることができ、また、これら１２個の部位の突然変異を組み合わせて得られる突然変異体のうち、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｐ１０６Ｒ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ−Ｐ１０６Ｒ突然変異体およびＳ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｑ４９０Ｋ突然変異体の５つの突然変異体は、収率が最も高く、８６％以上に達し、イソプロパノールにおける酵素の残存活性が６０％以上に達し、形質転換率が９０％以上に達することを見出した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明が採用する技術的手段及びその効果をより詳しく説明するために、以下、具体的な実施形態によって本発明の技術的構成をさらに説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００４０】
本発明は、遺伝子工学および分子生物学の分野で使用される通常の技術および方法を使用し、当業者が知っている定義および方法は一般的な参照文献によって提供される。ただし、当業者は、本発明の具体的な実施例に限定されることなく、本発明に記載された技術的構成に基づいて、本分野の他の通常の方法、実験プロトコルおよび試薬を使用することができる。
【００４１】
実施例において具体的な技術または条件が示されていない場合、本分野の文献に記載された技術または条件に従うか、又は、製品仕様書に従うものとする。使用される試薬または機器は生産メーカーが明記されていない場合、正規の市販ルートで購入できる通常の製品であるものとする。
【００４２】
実施例１  単一部位突然変異（Ｍ２５Ａ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
モノオキシゲナーゼ突然変異体遺伝子の構築：
単胞菌Brachymonas petroleovorans由来のモノオキシゲナーゼＣＨＭＯ（そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１であり、それをコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２である）の活性、安定性、可溶性発現、選択性を向上させ、酵素の使用量を減らすために、Ｍ２５Ａ部位をそれぞれ突然変異させ、具体的なステップは下記の通りである。
【００４３】
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で示されるヌクレオチド配列は、以下の通りである。
2021512605.tif 000005
【００４４】
（１）突然変異の導入：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で示されるヌクレオチドに基づいてプライマーを設計し、Ｍ２５Ａ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００４５】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）：gccggttttggcggcatgtatgcgctgcacaagc；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）：gcttgtgcagcgcatacatgccgccaaaaccggc；
プライマーと鋳型プラスミドを混合した後、ハイフィデリティＴａｑポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓを加え、フルプラスミドＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ終了後にＰＣＲ産物を電気泳動によって検出し、前記ＰＣＲ増幅システムは以下の通りである。
2021512605.tif 000006
【００４６】
前記ＰＣＲ反応の増幅条件は以下の通りである。
2021512605.tif 000007
【００４７】
（２）形質転換：Ｄｐｎ  I酵素を加え、鋳型を消化し、大腸菌コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、３７℃で一晩培養し、モノクローナル抗体を選び試験管に入れた。
【００４８】
（３）発現誘導：試験管から１．５Ｌの振とうフラスコに接種し、３７℃で培養してＯＤ６００が１になると、培養温度を２５℃に下げ、終濃度が０．１ｍＭのＩＰＴＧを加え、１６ｈ発現誘導した。
【００４９】
（４）反応の検証：１０ｍＬの反応瓶に（３−クロロベンジル）ジメチルスルフィド４０ｍｇを基質として加え、そして０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ９．０、イソプロパノール２０ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．４ｍｇ、アルコールデヒドロゲナーゼ４ｍｇをそれぞれ加え、それからモノオキシゲナーゼＣＨＭＯ（０．１ｗｔ）４ｍｇを加え、十分に混合し、総体積が１ｍＬであり、５０℃で２００回転数のシェーカーにて１６時間反応した。
【００５０】
実施例２  単一部位突然変異（Ｐ１０６Ｒ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
Ｐ１０６Ｒに対して部位特異的突然変異を行い、具体的なステップは以下の通りである。
【００５１】
突然変異の導入：Ｐ１０６Ｒ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００５２】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）：cgtctggatttacgccgtgacattcagctgaac；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）：gttcagctgaatgtcacggcgtaaatccagacg；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００５３】
実施例３  単一部位突然変異（Ｒ１５９Ｌ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｒ１５９Ｌ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００５４】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）：cgaacatcccgggccttgagtcttttcaagg；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）：ccttgaaaagactcaaggcccgggatgttcg；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００５５】
実施例４  単一部位突然変異（Ａ２６５Ｅ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ａ２６５Ｅ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００５６】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９）：gagcgttagcgaggaagaacgccagcgtg；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０）：cacgctggcgttcttcctcgctaacgctc；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００５７】
実施例５  単一部位突然変異（Ｃ２８９Ｓ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｃ２８９Ｓ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００５８】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１）：tttactatatgtttggcacctttagcgatatcgccacag；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２）：ctgtggcgatatcgctaaaggtgccaaacatatagtaaa；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００５９】
実施例６  単一部位突然変異（Ｍ３７７Ｖ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｍ３７７Ｖ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００６０】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３）：ggagcatgaactggacgtgctgattctggcaac；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４）：gttgccagaatcagcacgtccagttcatgctcc；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００６１】
実施例７  単一部位突然変異（Ｌ３８０Ｆ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｌ３８０Ｆ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００６２】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５）：agcatgaactggacatgctgattttcgcaaccggctac；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６）：gtagccggttgcgaaaatcagcatgtccagttcatgct；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００６３】
実施例８  単一部位突然変異（Ｐ４３５Ｌ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｐ４３５Ｌ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００６４】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７）：gggccctaacggcctgttcaccaatctgc；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８）：gcagattggtgaacaggccgttagggccc；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００６５】
実施例９  単一部位突然変異（Ｆ４３６Ｙ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｆ４３６Ｙ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００６６】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９）：gggccctaacggcccgtataccaatctgccg；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０）：cggcagattggtatacgggccgttagggccc；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００６７】
実施例１０  単一部位突然変異（Ｔ４３７Ａ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｔ４３７Ａ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００６８】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１）：taacggcccgttcgccaatctgccgcc；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２）：ggcggcagattggcgaacgggccgtta；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００６９】
実施例１１  単一部位突然変異（Ｌ４３９Ｓ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｌ４３９Ｓ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００７０】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３）：cctaacggcccgttcaccaattcgccgccgagta；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４）：tactcggcggcgaattggtgaacgggccgttagg；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００７１】
実施例１２  単一部位突然変異（Ａ４７４Ｅ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ａ４７４Ｅ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００７２】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５）：gcgatgccgaagatgagtggggtcgtacctg；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６）：caggtacgaccccactcatcttcggcatcgc；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００７３】
実施例１３  単一部位突然変異（Ｃ４７９Ｖ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｃ４７９Ｖ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００７４】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７）：gcctggggtcgtaccgttgcagagattgccga；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８）：tcggcaatctctgcaacggtacgaccccaggc；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００７５】
実施例１４  単一部位突然変異（Ｑ４９０Ｋ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｑ４９０Ｋ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００７６】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９）：agaccctgttcggcaaggtggaaagctgg；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０）：ccagctttccaccttgccgaacagggtct；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００７７】
実施例１５  単一部位突然変異（Ｉ４９５Ａ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｉ４９５Ａ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００７８】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１）：ccaggtggaaagctgggcctttggcgcaaacagc；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３２）：gctgtttgcgccaaaggcccagctttccacctgg；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００７９】
実施例１６  単一部位突然変異（Ｓ５００Ｉ）したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：Ｓ５００Ｉ部位が含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、前記フォワードとリバースのプライマーは以下の通りである。
【００８０】
フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３）：gctggatctttggcgcaaacatcccgggtaaga；
リバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３４）：tcttacccgggatgtttgcgccaaagatccagc；
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００８１】
形質転換率の検測
反応サンプルシステムにアセトニトリル３ｍＬを加え、十分に混合した後５ｍＬのＥＰチューブに入れ、１２０００回転数で３分間遠心分離し、上清を１００μＬ取って試薬ボトルに入れ、９０％のアセトニトリル９００μＬを加え、ＨＰＬＣ検測を行い、検測波長が２１０ｎｍであり、その結果を表１に示す。
【００８２】
安定性の検測
質量が４ｍｇのモノオキシゲナーゼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を２つ取り、一つに対して終濃度が１０％であるイソプロパノールを加え３０℃で１ｈ放置し、もう一つに対してイソプロパノールを加えずに３０℃で１ｈ放置し、そして以下のシステムに従って反応した。
【００８３】
１０ｍＬの反応瓶に（３−クロロベンジル）ジメチルスルフィド４０ｍｇを基質として加え、そして０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ９．０、イソプロパノール２０ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．４ｍｇ、アルコールデヒドロゲナーゼ４ｍｇをそれぞれ加え、それからモノオキシゲナーゼＣＨＭＯ  ４ｍｇを加え、十分に混合し、総体積が１ｍＬであり、５０℃で２００回転数のシェーカーにて１６時間反応した。反応サンプルシステムにアセトニトリル３ｍＬを加え、十分に混合した後５ｍＬのＥＰチューブに入れ、１２０００回転数で３分間遠心分離した。上清を１００μＬ取って試薬ボトルに入れ、９０％のアセトニトリル９００μＬを加え、ＨＰＬＣ検測を行い、検測波長が２１０ｎｍであった。
【００８４】
突然変異体の安定性は、イソプロパノールにて保温したモノオキシゲナーゼの形質転換率がイソプロパノールなしで保温したモノオキシゲナーゼの形質転換率に対して占めるパーセンテージとして表され、その結果を表１に示す。
2021512605.tif 000008
【００８５】
表１から分かるように、単一部位突然変異体の形質転換効果が親株に比べて向上したが、望ましい効果を達成しておらず、単一部位突然変異体のうち実施例４（Ａ２６５Ｅ）、実施例８（Ａ４７４Ｅ）、実施例１０（Ａ４９０Ｋ）のイソプロパノールにおける残存活性が６０％以上に向上された。一般的には、単一部位突然変異した突然変異体は親株に比べて特性に大きな差が生じにくく、突然変異部位の組み合わせによってより優れた突然変異体を得ることができる。
【００８６】
実施例１７  単一部位突然変異したモノオキシゲナーゼ突然変異体
突然変異の導入：その他の２３個の部位（Ｍ２３Ｌ、Ａ７４Ｄ、Ｍ７５Ｌ、Ａ９３Ｅ、Ｌ１１０Ｆ、Ｍ１１７Ａ、Ｔ１３７Ｒ、Ｗ１５３Ｆ、Ｍ１６６Ｌ、Ｍ２６０Ｌ、Ｍ２８４Ｉ、Ｃ３３４Ｌ、Ａ３５９Ｅ、Ｍ３６０Ｉ、Ｍ４２６Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｐ４３５Ａ、Ｆ４３６Ｌ、Ｆ４３６Ａ、Ｔ４３７Ｓ、Ｔ４３７Ｙ、Ｌ４３９Ｇ、Ｌ４３９Ａ、Ｍ４５７Ｌ、Ｉ４９５Ｆ、Ｉ４９５ＶまたはＭ５０８Ｌ）がそれぞれ含まれるフォワードとリバースのプライマーを設計し、具体的なプライマーを下記の表２に示す。
2021512605.tif 000009
2021512605.tif 000010
【００８７】
残りの方法及びステップは、実施例１と同様である。
【００８８】
活性の検証
培養した菌株を超音波破砕し、上清及び沈殿物中のタンパク質の発現量を検出し、その結果を表３に示す。
2021512605.tif 000011
【００８９】
表３から分かるように、これらの部位はモノオキシゲナーゼの形質転換率を向上させなかったが、モノオキシゲナーゼの可溶性発現を高めることができ、特に、Ａ７４Ｄ、Ｍ１５３Ｆは上清中の発現量を大幅に高めた。
【００９０】
実施例１８  マルチ部位突然変異したモノオキシゲナーゼ突然変異体
ＤＮＡ shuffling方法により突然変異部位をランダムに組み換え、突然変異ライブラを作成し、その後スクリーニングし、マルチ部位突然変異したモノオキシゲナーゼ突然変異体を調製した。具体的なステップは以下の通りである。
【００９１】
（１）ＰＣＲによりＭ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ａ２６５Ｅ、Ｍ３７７Ｖ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５ＡおよびＳ５００Ｉ突然変異部位を持つ相同遺伝子を得て、ＰＣＲ産物を精製した後、これらの遺伝子を等モル量で混合し、そしてヌクレアーゼＩによりランダムな断片になるように消化し、これらのランダムな断片は、ライブラリーを形成し、お互いにプライマー及び鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、一方の遺伝子コピー断片を他方の遺伝子コピーのプライマーとした場合に、鋳型交換及び遺伝子組換えが起こり、前記Ｎ−ＰＣＲの反応システムは以下の通りである。
2021512605.tif 000012
【００９２】
前記Ｎ−ＰＣＲ反応の増幅条件は以下の通りである。
2021512605.tif 000013
【００９３】
（２）形質転換及びスクリーニング：調製した産物を大腸菌に形質転換し、培養した。
【００９４】
（３）酵素溶液の調製：９６ウェルプレートにて遠心分離し、上清の培地を除去し、ウェルごとに２００μＬの酵素加水分解反応液（リゾチーム２ｍｇ/ｍＬ、ポリミキシン０．５ｍｇ/ｍＬ、ｐＨ＝７．０）を加え、３７℃で３ｈ保温破砕した。
【００９５】
（４）ハイスループットスクリーニング：２５０μＬの酵素活性測定用反応システム：基質である（３−クロロベンジル）ジメチルスルフィドの終濃度が２ｍＭ、ＮＡＤＰＨの終濃度が０．３ｍＭであり、破砕後の酵素溶液の添加量が１００μＬであり、ｐＨ＝９．０、温度３０℃でスクリーニングして得られた突然変異体を振とうフラスコにて培養し、それから増幅反応を行った。
【００９６】
（５）誘導発現：２５℃で、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧにより一晩誘導した。
【００９７】
（６）反応の検証：１０ｍＬの反応容器に基質４０ｍｇを加え、そして０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ９．０、イソプロパノール２０ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．４ｍｇ、アルコールデヒドロゲナーゼ４ｍｇをそれぞれ加え、それからモノオキシゲナーゼＣＨＭＯ（０．１ｗｔ）４ｍｇを加え、十分に混合し、総体積が１ｍＬであり、５０℃で２００回転数のシェーカーにて１６時間反応した。
【００９８】
形質転換率の検測
反応サンプルシステムにアセトニトリル３ｍＬを加え、十分に混合した後５ｍＬのＥＰチューブに入れ、１２０００回転数で３分間遠心分離し、上清を１００μＬ取って試薬ボトルに入れ、９０％のアセトニトリル９００μＬを加え、ＨＰＬＣ検測を行い、検測波長が２１０ｎｍであり、その結果を表２に示す。
【００９９】
安定性の検測
質量が４ｍｇのモノオキシゲナーゼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を２つ取り、一つに対して終濃度が１０％のイソプロパノールを加え３０℃で１ｈ放置し、もう一つに対してイソプロパノールを加えずに３０℃で１ｈ放置し、そして以下のシステムに従って反応した。
【０１００】
１０ｍＬの反応容器に基質４０ｍｇを加え、そして０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ９．０、イソプロパノール２０ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  ０．４ｍｇ、アルコールデヒドロゲナーゼ４ｍｇをそれぞれ加え、それからモノオキシゲナーゼＣＨＭＯ  ４ｍｇを加え、十分に混合し、総体積が１ｍＬであり、５０℃で２００回転数のシェーカーにて１６時間反応した。反応サンプルシステムにアセトニトリル３ｍＬを加え、十分に混合した後５ｍＬのＥＰチューブに入れ、１２０００回転数で３分間遠心分離した。上清を１００μＬ取って試薬ボトルに入れ、９０％のアセトニトリル９００μＬを加え、ＨＰＬＣ検測を行い、検測波長が２１０ｎｍであった。
【０１０１】
突然変異体の安定性は、イソプロパノールにて保温したモノオキシゲナーゼの形質転換率がイソプロパノールなしで保温したモノオキシゲナーゼの形質転換率に対して占めるパーセンテージとして表され、その結果を表４に示す。
2021512605.tif 000014
【０１０２】
表４から分かるように、単一部位突然変異に比べると、マルチ部位突然変異体はほとんど形質転換効果がさらに向上され、一部は形質転換効果が向上しなかったが、安定性が向上した。これから、マルチ部位突然変異はモノオキシゲナーゼの性質を一段と向上させることが分かる。マルチ部位突然変異体のうち、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｐ１０６Ｒ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ−Ｐ１０６Ｒ突然変異体およびＳ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｑ４９０Ｋ突然変異体は、形質転換率が９０％以上に達し、イソプロパノールにおける残存活性が６０％以上に達し、これら６つの突然変異体の増幅反応効果がさらに検証された。
【０１０３】
実施例１９  マルチ部位突然変異体の増幅反応の検証
調製したＳ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｐ１０６Ｒ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ−Ｐ１０６Ｒ突然変異体およびＳ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｑ４９０Ｋ突然変異体の収率をさらに検証し、具体的なステップは以下の通りである。
【０１０４】
（１）２５０ｍＬの反応容器に（３−クロロベンジル）ジメチルスルフィド１ｇを基質として加え、そして０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ９．０、イソプロパノール５００ｍｇ、ＮＡＤＰ＋  １０ｍｇ、アルコールデヒドロゲナーゼ１００ｍｇをそれぞれ加え、それからモノオキシゲナーゼＣＨＭＯ  １００ｍｇを加え、十分に混合し、総体積が２５ｍＬであり、５０℃で２００回転数のシェーカーにて１６時間反応した。
【０１０５】
（２）反応サンプルシステムから１ｍＬサンプリングし、アセトニトリル３ｍｌを加え、十分に混合した後５ｍｌのＥＰチューブに入れ、１２０００回転数で３分間遠心分離した。上清を１００μＬ取って試薬ボトルに入れ、９０％のアセトニトリル９００μＬを加え、ＨＰＬＣ検測を行い、検測波長が２１０ｎｍであった。
【０１０６】
（３）反応完了後、酢酸エチル５０ｍＬを加え、３回抽出し、抽出した有機相を合わせて後硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、回転蒸発乾固させ、計量し、その結果を表５に示す。
2021512605.tif 000015
【０１０７】
表５から分かるように、これら６つの突然変異体は、収率がいずれも８６％以上に達し、ｅ．ｅ．値がいずれも９９％であり、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５（Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ）突然変異体は、収率が９０．２％に達し、e．e．値が９９％であった。これから、マルチ部位突然変異は優れた効果を達成したことが分かる。
【０１０８】
以上のように、本発明では、元のモノオキシゲナーゼに基づいて、Ｍ２５Ａ、Ｐ１０６Ｒ、Ｒ１５９Ｌ、Ａ２６５Ｅ、Ｃ２８９Ｓ、Ｍ３７７Ｖ、Ｌ３８０Ｆ、Ａ４７４Ｅ、Ｃ４７９Ｖ、Ｑ４９０Ｋ、Ｉ４９５ＡおよびＳ５００Ｉの１２個の部位を単独に突然変異させることで、モノオキシゲナーゼの活性を向上させることができ、これら１２個の部位の突然変異を組み合わせた突然変異体のうち、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｐ１０６Ｒ突然変異体、Ｓ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ｑ４９０Ｋ−Ｐ１０６Ｒ突然変異体およびＳ５００Ｉ−Ａ２６５Ｅ−Ｍ２５Ａ−Ａ４７４Ｅ−Ｑ４９０Ｋ突然変異体の５つの突然変異体は、収率が最も高く、８６％以上に達し、イソプロパノールにおける酵素の残存活性が６０％以上に達し、形質転換率が９０％以上に達したことを検証により発見した。
【０１０９】
出願人は、本発明では上述した実施例によって本発明の詳細な方法を説明したが、しかし、本発明は上述した詳細な方法に限定されるものではなく、つまり本発明は上述した詳細な方法に従わなければ実施できないことを意味しないと言明する。当業者であれば、本発明のいかなる改善、本発明の製品の様々な原材料の同等の置換、補助成分の追加、具体的な方法の選択などは、いずれも本発明の保護範囲及び開示の範囲内にあることが分かるはずである。
【配列表】
2021512605000001.app
【国際調査報告】
2021512605.tif 000016
2021512605.tif 000017
2021512605.tif 000018
2021512605.tif 000019
2021512605.tif 000020
2021512605.tif 000021