(57)【要約】本発明は、偏光光による毛髪の顕微鏡写真に基づく改善された毛髪分析方法に関する。本方法は、ポリエチレン又は摩擦電気系列でポリエチレンよりも低い位置にあるポリマーで作製された容器内で実施される毛髪コンディショニングフェーズにより特徴付けられ、この後、テレビン油に接触させた毛髪の偏光光顕微鏡画像を取得し、毛髪中に存在する分析物の量に関する情報を得るために分離を用いて処理する毛髪試験フェーズが行われる。有利なことに、本方法は、毎日の実験室作業時に起こりうるような顕微鏡／分析対象サンプルに適用される偶発的移動の存在下でさえも高確度を示す。また有利なことに、さまざまなオペレーターが手順に関与したときに高確度が維持されので、毛髪サンプルの操作／準備／写真撮影の手段が異なっても実質的に影響を受けない。したがって、高確度及び手作業実用性向上の商業要件を満たして、偏光光ベース毛髪分析手順の新法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛髪サンプルの偏光光による顕微鏡ディジタル写真から得られる光パターンを処理することに基づく毛髪組成の分析方法であって、前記毛髪サンプル中に存在する各分析物の量が分離により計算され、前記方法が、
ａ）純粋な分析物（エンドメンバー）の光パターンを生成するキャリブレーションフェーズと、
ｂ）前記毛髪サンプルの光パターンを生成する測定フェーズと、
ｃ）ａ）及びｂ）の光パターンを比較してソフトウェア支援分離により精緻化することにより、前記毛髪サンプル中に存在する各分析物の相対寄与を決定し、前記相対寄与から前記分析物の絶対量又は濃度を決定する決定フェーズと、
を含み、
（ｉ）前記測定フェーズｂ）の前に、ポリエチレン又は摩擦電気系列でポリエチレンよりも低い位置にあるポリマーで作製された密閉容器内に前記毛髪サンプルを貯蔵することを含むコンディショニングフェーズが実施され、
（ｉｉ）前記測定フェーズｂ）が、前記容器を開けて毛髪の組を取り出すことと、前記毛髪セットとテレビン油とを接触させることと、前記毛髪の組の偏光光による顕微鏡ディジタル写真を１枚以上撮影することと、その後、前記ディジタル写真の光パターンを処理し前記フェーズｃ）に移って分析物量情報を得ることと、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
摩擦電気系列でポリエチレンよりも低い位置にある前記ポリマーが、ポリプロピレン、ポリジフェニルプロパンカーボネート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリトリフルオロクロロエチレン、ポリテトラフルオロエチレンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記テレビン油が、モミテレビン（カナダバルム）又はパインウッドテレビンから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記コンディショニングフェーズが、少なくとも半日、好ましくは１〜５日の持続時間を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記コンディショニングフェーズが、１５〜３５℃に含まれる温度で実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記容器が、小容積のエンベロープ、バッグ、チューブ、又はボックスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
毛髪の組が、１〜２０本の毛髪、好ましくは６〜８本の毛髪からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記顕微鏡ディジタル写真の処理が、分離により実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
同一の毛髪の組の少なくとも６つの測定値の相対標準偏差として表される確度が、５〜２０％、好ましくは８〜１８％の範囲内である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析物が、金属、アミノ酸、薬剤、ホルモン、ビタミン、汚染物質、毒物を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記金属が、アルカリ金属又はアルカリ土類金属を含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、偏光光による毛髪の顕微鏡ディジタル写真からの毛髪分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪分析は、ヒト全身における金属元素のレベルを評価するために長年にわたり使用されてきた。毛髪は、毒性元素暴露及び必須金属レベルの評価において広く受け入れられている。分析データと疾患、代謝障害、及び栄養状態との相関は、日常の診断、予後予測、及び治療処置に毛髪分析を使用することを目指して、依然として広範な研究の対象である。
【０００３】
他のタイプの臨床検体と比較して、毛髪は、異なる用途を有するとともに、血液、尿、及び唾液よりも優れたいくつかの利点さえも有する。後者の流体が現在又は最近の身体状態を示す傾向にある一方で、毛髪は、長期代謝に厳密に関係付けられたより長いタイムフレームを表す（Ｗａｔｔｓ  Ｄ．，Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，ＩｎｔｅｒＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３）。
【０００４】
同じ配慮は獣医学にも当てはまり、その場合、毛髪中のミネラル濃度は動物体内のミネラル状態の評価に使用される（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｕｔｔｌｅ  Ｎ．Ｆ．，Ｔｈｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅｓｔｏｃｋ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９９）。
【０００５】
毛髪ミネラル分析は、通常、組織ミネラル分析又はサーモミネラログラム分析（ＴＭＡ）を利用して行われるが、異なる研究では、ＴＭＡは信頼できる試験ではないことが判明している（Ｓｃｈａｍｂｅｒｇｅｒ  Ｒ．Ｊ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８７，１−２８，２００２、Ｄｒａｓｃｈ  Ｇ．ａｎｄ  Ｒｏｉｄｅｒ  Ｇ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，２７−３１，２００２、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｉｎｓｂｅｒｇ  Ｆ．，Ｖｅｒｓｉｃｈｅｒｕｎｇｓｍｅｄｉｚｉｎ，５６，１３６−１４０，２００４、Ｓｅｉｄｅｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ，２８５，６７−７２，２００１）。ＴＭＡは、多数の個体及び環境の影響因子並びに分析方法の誤差源により、一般に個体診断に使用できない。さらに、ＴＭＡは、熱揮発性又は熱不安定性の有機化合物、たとえば、毛髪中に存在し且つ代謝及び栄養に必要不可欠な役割を果たすアミノ酸、ビタミン、ホルモンなどを検出できない。
【０００６】
ＴＭＡにより与えられた限界を克服するために代替法が提案されてきた。そのうち、欧州特許第２，５１８，４７４号には、毛髪に偏光光を照射することと、屈折偏光光の顕微鏡ディジタルピクセルベース画像（パターン）を得ることと、デコンボリューション（分離）法によりパターンを精緻化して毛髪サンプル中に存在する各分析物の量を計算することと、により毛髪の化学組成を決定する方法が開示されている。
【０００７】
毛髪の顕微鏡ディジタルピクセルベース画像又は画像パターンは、偏光光の照射・屈折下における毛髪の顕微鏡写真である。画像は、市販のカメラ（たとえば、旧世代のネガテープカメラではない）を顕微鏡の接眼レンズに好適に接続して、ディジタルベース写真として収集される。
【０００８】
この方法は、毛髪中の多数の分析物、たとえば、金属、アミノ酸、薬剤、ホルモン、ビタミン、汚染物質、毒物などの決定を可能にして、患者の生理学的及び病理学的状態に関する有用な情報並びに血液や尿などの標準的診断以外に人体機能のさまざまな「解読」及び予測を提供する。欧州特許第２，５１８，４７４号と同一の原理は、動物、主に、ハウスペット（イヌ、ネコ）及び競争動物（ウマ）の毛髪分析の獣医学でも当てはまる。
【０００９】
欧州特許第２，５１８，４７４号に教示されるように、デコンボリューション又は分離は、記録されたデータに対する畳み込み効果の逆に使用されるアルゴリズムベースプロセスである。分離の目的は、次の形：
【数１】
2021504725.tif 000002
のコンボリューション式の解を見いだすことである。式中、ｙ（λ）は、記録されたシグナルを表すとともにｋ個のピュアエレメント又はエンドメンバーの参照関数ｅｋ（λ）の線形ミキシングであり、且つａｋは、各ピュアエレメントの相対正加重であり、その和は１に等しくなければならない。
【００１０】
その場合、分離は、各ピュアエレメントの参照関数ｅｋ（λ）が分かれば、通常の最小二乗統計法を利用して、
【数２】
2021504725.tif 000003
としてＥ関数を最小化するａｋ加重を決定することである。
【００１１】
したがって、分離アルゴリズムの適用は、毛髪サンプルのディジタル写真全体への単一の分析物毎の相対寄与を決定し、絶対量又は濃度（ｐｐｍ、μｇ／ｍｇなど）として毛髪サンプル中の分析物の評価を提供する。
【００１２】
欧州特許第２，５１８，４７４号の実施例７は、この方法の実際の適用を示しており、それによると、偏光光を用いた顕微鏡のガラス上に単一の毛髪を注加し、６回写真撮影（フォーカス）し、次いで、各写真を分離により精緻化する。前記特許文書に記載の手順は、観測される毛髪の安定化が不十分であるという欠点を伴うため、同一の毛髪の異なる写真が異なる品質／画像分解能、異なる発光光パターンをもたらすおそれがあり、評価される分析物の量の有意な変動を引き起こす危険性がある。再現性を確保するために、オペレーターは、空気安定性環境中で非常に注意深く作業し、顕微鏡又は顕微鏡ガラスのいずれの偶発的移動も回避し、且つサンプルの偶発的移動の危険性を最小限に抑えるためにできる限り迅速に繰返し写真を撮らなければならないが、顕微鏡ガラス上に単一の毛髪を注加し、それを安定化させ、且つその１つ以上の連続写真を撮ることは、精密で時間を要する操作である。送風や呼気などの外的条件又はたとえ最小限であっても不用意な突風は、毛髪をガラス基材上で安定な位置から移動させる可能性があるので、焦点の合った写真を得るために操作を再開する必要があり、さらに、操作上の理由で顕微鏡からガラスを取り出す必要もありうるので、結果的に元の位置からサンプルが実質的に移動する可能性があり、操作を新たに再開する必要を生じる。結果の確度に影響を及ぼすさらなる変数は、サンプルを準備したり、写真撮影のために顕微鏡で毛髪に焦点を合わせたりするなどのさまざまなオペレーターの手作業の能力である。
【００１３】
こうした欠点により、欧州特許第２，５１８，４７４号に記載の手順は望ましくないほど時間のかかるものとなり確度のレベルを変動させるので、高速で信頼できる毛髪分析との商業的な要求を満たさない。手順を改善する方法は明確に見いだされておらず、たとえば、実験の部に示されるように、顕微鏡観察用の通常の固定液を使用しても、偏光光に暴露される毛髪サンプルの場合、分析の再現性／確度を改善できなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、毛髪の偏光光写真に基づく毛髪分析の確度、スピード、及び実行可能性を改善可能な新しい手順の必要性は、感じられるが満たされずに残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、このたび予想外なことに、顕微鏡試験フェーズの前に特定の高分子材料で作製された容器内で毛髪のコンディショニング手順を実施してから特定の固定液を用いて試験フェーズを実施した場合、毛髪の偏光光ベース分析の分析確度を実質的に改善可能であることを見いだした。実験的に見いだされるように、以上の２つの手段はいずれも、それ自体では分析確度の改善に有効でなく、これは、２つの手段を組み合わせて、容器の成分として特定の高分子材料及び試験フェーズで支持体系として特定の液体を限定的に使用することによってのみ達成可能である。したがって、以上の知見に基づいて、本発明に係る新しい方法は、確度の改善に相乗的に協働する以下の工程：
（ｉ）ポリエチレン又は摩擦電気系列でポリエチレンよりも低い位置にあるいずれかの他のポリマーで作製された密閉容器内に毛髪サンプルを貯蔵するコンディショニングフェーズ、
（ｉｉ）容器を開けて毛髪セットを取り出すことと、前記毛髪セットとテレビン油とを接触させることと、前記毛髪セットの偏光光による顕微鏡ディジタル写真を１枚以上撮影することと、前記写真をさらに処理して分析物量情報を得ることと、を含む試験フェーズ、
により本質的に特徴付けられる。
【００１６】
有利なことに、毛髪を含有するガラス支持体に意図的に移動を適用しても本方法は高確度である。このことから、新しい方法は、実質的に「移動耐性」があることが示される。すなわち、日常の実験室での作業時に不注意で顕微鏡／分析対象サンプルが偶発的に移動する場合でさえも、分析物決定の高い再現性を確保する。また、有利なことに、かかる高確度は、さまざまなオペレーターが手順に関与しても得られたことから、本方法は、毛髪サンプルの操作／準備／写真撮影の方法が異なっても実質的に影響を受けないことが示される。したがって、高確度及び手作業実用性向上との商業的な要求を満たして、偏光光ベース毛髪分析手順の新法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、欧州特許第２，５１８，４７４号に記載の毛髪分析の方法を実施するための新しく改善された条件を開示する。この出願によれば、毛髪の化学組成は、毛髪に偏光光を照射することと、屈折偏光光の顕微鏡ディジタルピクセルベース画像（パターン）を得ることと、デコンボリューション（分離）法によりパターンを精緻化して毛髪サンプル中に存在する各分析物の量を計算することと、により決定される。
【００１８】
工程順に、欧州特許第２，５１８，４７４号の方法は、
ａ）［キャリブレーションフェーズ］：各純粋な分析物（エンドメンバー）に対する光パターンの生成、
ｂ）［測定フェーズ］：分析下における毛髪サンプルの光パターンの生成、
ｃ）［決定フェーズ］：ａ）で得られたパターンと工程ｂ）で得られたパターンとの比較及びソフトウェア支援分離処理による毛髪サンプル中の各分析物の相対寄与の決定、
を含む。
【００１９】
キャリブレーションフェーズａ）は、毛髪サンプルの分析前に毎回実施する必要はない。それを１回実施した後、純粋な分析物（エンドメンバー）の得られた光パターンをリファレンスとして回数を制限することなく毛髪サンプルの分析に使用すれば一般に十分であり、その場合、これらは工程ｂ）及びｃ）のみを含む。
【００２０】
キャリブレーションフェーズ及び測定フェーズａ）及びｂ）は、同一の方法を必要とし、異なるのは、試験されるサンプル、それぞれ、分析すべき純粋な分析物又は毛髪サンプルである。前記方法は、
−  分析物／毛髪サンプルを介して入射偏光光ビームを屈折させることと、
−  分析物／毛髪サンプルの顕微鏡ディジタル写真を撮影することと、
−  前記ディジタル写真のピクセルごとにその波長及び吸光度を決定することと、
−  前記写真のピクセルの波長及び吸光度の値により各点を特徴付けて、各ディジタル写真からスペクトルパターン（点のマトリックス）を生成することと、
を必要とする。たとえば、７００万ピクセルベースディジタル写真は、７００万点を有するマトリックスに変換され、その各々は、波長及び吸光度の数値の組合せにより特徴付けられる。
【００２１】
純粋な分析物の薄層（５０μｍ）のピクセルベース写真及び相対スペクトルパターン、又は純粋な分析物（たとえば、ナトリウム、カリウム）が取り扱いできないものであれば最も化学的に類似した化合物（たとえば、酸化物）をその純粋な分析物のエンドメンバーとして用いる。５０μｍは毛球の平均直径である。
【００２２】
純粋な分析物（又は毛髪サンプル）が顕微鏡ガラス上に配置される。顕微鏡には、典型的には波長３５０〜８００ｎｍの可視領域で動作する偏光光の光源が設けられており、偏光光のビームを観察中のサンプルを通過させて顕微鏡の観察ガラス上に投影する。偏光光を得るために、多色白色光をランプにより発生させ、標準的な偏光フィルターにより偏光させる。
【００２３】
典型的には、純粋な分析物及び毛髪サンプルの観察には５〜１００倍、好ましくは１０〜３０倍の倍率が使用される。顕微鏡はまた、観察中の純粋な分析物及び毛髪サンプル（毛球領域）の写真を撮影する少なくとも７００万ピクセルのスクリーン容量を有するディジタルカメラを備える（又はそれに接続される）。その場合、波長及び透過強度は、写真のピクセルごとに決定される。
【００２４】
工程ｃ）では、周知の分離アルゴリズムを使用可能である。例えば、市販品のＵｎｍｉｘｉｎｇ＿ＭＣＳＵ、ＰｏｉｓｓｏｎｓＮＭＦ、Ｆａｒｓｉｇｈｔ、Ｃｈｒｙｓａｌｉｓ、又はＩＤＬ（Ｓｏｃｉｅｔａ  Ｉｔａｌｉａｎａ  ｄｅｇｌｉ  Ａｕｔｏｒｉ  ｅｄ  Ｅｄｉｔｏｒｉ、登録番号００６０９１）である。分離アルゴリズムは、ピクセルごとに波長及び吸光度を評価し、次いで、その単一波長値ですべての純粋な分析物の吸光度を比較する。分離アルゴリズムはソフトウェア支援処理により適用される。ソフトウェア支援処理により適正な時間で最終結果に到達できる。たとえば、欧州特許第２５１８４７４号には、分離処理が、各検出波長において最も偏光光を吸収する分析物の相対的な重みを考慮するだけで実行されることが教示されている。したがって、吸光度の降順に分析物の対応するリストが作成され、このリスト内で、分析物の一部すなわち最も高い吸光度を有するもののみが、分離による処理で考慮される。欧州特許第２，５１８，４７４号では、典型的には、分析中の分析物の全数の約１５％で閾値が設定される。なぜなら、他の分析物からの吸光度の寄与は無視しうるか又はゼロであるからである（たとえば、７０種の分析物のリストでは、最初の１０種のみが分離処理で考慮される）。
【００２５】
サンプルは、ｎ回（たとえば４〜１０回）写真撮影されてｎ個のプレマトリックスを生成し、次いで、そのデータは平均されて実際の最終マトリックスを生成する。
【００２６】
診断試験では、各毛髪写真は、そのピクセル成分すなわち波長及び吸光度にて解析される。次いで、ＩＤＬソフトウェアは、すべてのそのエンドメンバー（純粋な分析物）の中からその波長で吸光度に効果的に寄与するものを選択することにより、ピクセルに分離精緻化を自動的に適用する。次いで、すべてのピクセルの自動精緻化により、各エンドメンバーの寄与ひいては毛髪中のこれらの分析物の定性・定量的組成が提供される。
【００２７】
本発明は、欧州特許第２，５１８，４７４号にて知られているような上記の毛髪分析方法を実施する新しい改善された手法を提供する。実際、発明者は、驚くことに、毛髪と特定の高分子材料との持続的な接触を閉じられた環境内で十分な時間続けることが、それを特定の油中で懸濁後に、偏光光の照射を受けた毛髪から発生する光パターンを一定にするように毛髪の構造に影響しうることを発見した。つまり、観察ガラス上における毛髪の特定の位置、及び／又は、偏光光の光源に対する毛髪の向きによる影響を受けにくいことが分かった。したがって、改善された本方法は、２つの本質的なフェーズ、すなわち、（ｉ）毛髪と高分子材料との接触を確保するコンディショニングフェーズ、及び（ｉｉ）毛髪が前記特定の油に接触する／それにより支持される観察フェーズを必要とする。
【００２８】
コンディショニングフェーズ（ｉ）は、欧州特許第２，５１８，４７４号の毛髪分析方法のフェーズｂ）の前に実施される。前記フェーズ（ｉ）では、容器を構成する高分子材料がきわめて重要である。実際、ポリエチレン又は摩擦電気系列（正帯電性から負帯電性の方向に材料が順序付けられたもの）でポリエチレンよりも低い位置にあるポリマーのみが、本油との組合せで要求される再現性の向上を得るのに有効であることが見いだされた。
【００２９】
周知のように、摩擦電気系列は、その摩擦電気効果の関数として高分子材料をランク付けする。摩擦電気効果又は摩擦電気帯電は、ある特定の材料が異なる材料との摩擦接触後にそれらの間の電子交換により帯電状態になるタイプの接触である。異なる材料間の電子移動はただちに逆転可能ではないので、一方の材料の過剰電子はそのままの状態で残り、他方の材料では電子欠損を生じる。したがって、材料は、材料の分離後に散逸する正帯電又は負帯電を発生しうる。摩擦により生成される帯電の極性及び強度は、材料によって異なる。したがって、材料は、他の物体に接触したときの帯電分離の極性の順序、すなわち摩擦電気系列で列挙しうる。摩擦電気系列では、系列の下端方向の材料は、リスト中のより高い材料に接触したときに負帯電を得る。帯電の強度は、摩擦電気系列中の材料の距離が大きくなるほど高くなる。摩擦電気系列の下端の材料は「負帯電」と呼ばれ、一方、上端の材料は「正帯電」と呼ばれる。本発明で参照される高分子材料の摩擦電気の性質についての広範な考察は、Ｚ．Ｌ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  “Ｔｒｉｂｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｎａｎｏｇｅｎｅｒａｔｏｒｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２０１６，ＸＸＸＩＩＩ，ＩＢＳＮ９７８−３−３１９−４００３８−９に提示されており、この刊行物の１０〜１１頁には、正から負の方向に帯電性の性質に従って順序付けられた材料及びポリマーの摩擦電気系列が含まれる。この系列に基づいて、本発明の枠内で使用可能なポリマーは、ポリエチレン及びそれよりも低い位置にあるもの、たとえば、ポリプロピレン、ポリジフェニルプロパンカーボネート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリトリフルオロクロロエチレン、ポリテトラフルオロエチレンなどである。
【００３０】
従来の用語によれば、「ポリエチレン及び摩擦電気系列でそれよりも低い位置にあるポリマー」はまた、摩擦電気系列中の「負帯電ポリマー」として定義可能であるが、摩擦電気効果の根底にある「帯電性」は、高分子材料のものであり、その構成分子のものではないことを明確にすべきである。すなわち、それは、分子レベルでポリマーが帯電しうる正電荷又は負電荷と相関関係にない。典型的な例はポリアクリレートであり、ポリアクリレートの分子は負電荷を帯びる高分子電解質であるが、ポリアクリレートは摩擦電気系列においてポリエチレンよりも高位置にあるので、ポリエチレンで摩擦したときに正帯電される弱い傾向を有する。
【００３１】
本発明によれば、「容器を構成する高分子材料」という表現は、前記材料のみで容器のバルクを作製可能であるか、又は代替的に前記高分子材料が容器の大部分、たとえば容器の重量の５０％超、好ましくは７０％超、さらにより好ましくは９０％超を占めることを意味し、「容器を構成する高分子材料」という表現はまた、高分子材料を容器の表面上、好ましくはその内表面上に層状化する可能性を含み、かかる場合には、前記高分子材料は、層の大部分、たとえば層の重量の５０％超、好ましくは７０％超、さらにより好ましくは９０％超を占め、かかる場合には、容器の残りの部分は、層状化高分子材料と適合可能である限り、いずれの材料でも差別なく作製可能である。
【００３２】
フェーズ（ｉ）で使用される容器は、１本以上の毛髪、典型的には５０〜２００本などのさまざまな本数の毛髪を含みうる毛髪サンプルを入れることが可能なように構成される。また、容器は、毛髪（又は毛髪サンプル）の導入及び続いて取出しを行いうる気密シール可能な開口を有する。一回使用された後に、シーリングは可逆的であっても不可逆的であってもよい。前者の場合、同じ容器を何回も開閉でき、異なる毛髪サンプルを繰り返し貯蔵できる。一方、シーリングが不可逆的な場合は毛髪を取り出すためにそれを破壊する必要があり、この場合、容器を一回使用後に廃棄することとなる。容器の形態に関して特定の制限は存在せず、これは、たとえば、小さなバッグ、エンベロープ、チューブ、ボックスとできる。ここで、「小さな」とは、５０〜２００本の毛髪を含有するのに好適な容器、たとえば数ｍｍ３、たとえば１〜３０ｍｍ３の内部容積を有するものに対して定義される。比例的により大きな容器は、比例的により大きな毛髪サンプルに使用可能である。
【００３３】
貯蔵時間もまた、毛髪の十分なコンディショニングを可能にするうえで重要であり、時間は、典型的には半日超であり、典型的には半日〜５日の間である。貯蔵温度もまた、影響を有し、好ましくは１５〜３５℃の間であり、容器内の圧力は、通常、大気圧であるが、真空下又は圧力下での貯蔵であってもよい。
【００３４】
本フェーズ（ｉｉ）は、欧州特許第２，５１８，４７４号の毛髪分析方法のフェーズｂ）を実施する新しい特定の手法となる。前記フェーズ（ｉｉ）では、使用される支持液体はきわめて重要である。実際、各種固定液のうち、テレビン油のみが、工程（ｉ）の材料／条件に従ってあらかじめ貯蔵された毛髪に適用した場合にのみ、本方法の確度を有意に向上させることが見いだされた。フェーズ（ｉｉ）では、容器を開けて、１本以上の毛髪、典型的には１〜２０本の毛髪、たとえば６〜８本の毛髪を取り出し、分析目的に使用する。次いで、毛髪と好適量のテレビン油とを接触させる。テレビン油は、たとえば、モミテレビン（カナダバルムとしても知られる）又はパインウッドテレビンから選択可能である。毛髪と油との接触は、好ましくは顕微鏡ガラス上で直接行われ、２つの成分は、順序の差別なく配置可能であり、代替的に、２つの成分は、互いに異なる場所で接触され、次いで、標準的手段、たとえば、小さなスプーン、ピペットなどを用いて顕微鏡ガラス上に移される。任意に可能であれば、本フェーズ（ｉｉ）で使用される支持液体はまた、純粋な分析物（エンドメンバー）の光パターンが分析される毛髪分析方法の初期キャリブレーションフェーズでも支持液体として使用可能である。
【００３５】
次いで、本フェーズ（ｉｉ）から得られたディジタル写真（光パターン）及び初期キャリブレーションフェーズで得られた純粋な分析物（エンドメンバー）の対応する光パターンは、分析物量に関する実際の情報を得るために欧州特許第２，５１８，４７４号の毛髪分析方法のフェーズｃ）に従って処理される。
【００３６】
偏光光分析及び分析物決定を実施するためのパラメーター及び方法は、当技術分野で周知である。具体的には、毛髪のディジタル写真（光パターン）は、たとえば、欧州特許第２，５１８，４７４号に記載のソフトウェア支援分離により処理され、毛髪サンプル中に存在する各分析物の相対寄与が決定され、光パターンは、典型的には毛髪の写真画像のピクセル数に対応するポイントの行列である。本方法のさらなる詳細については、欧州特許第２，５１８，４７４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００３７】
本方法は、決定可能な分析物のタイプ及び数に関してなんら特定の制限を有していない。それは、毛髪中の分析物、たとえば、金属、アミノ酸、薬剤、ホルモン、ビタミン、汚染物質、毒物などの定量を可能にして、患者の生理学的及び病理学的状態に関する有用な情報並びに血液や尿などの標準的診断以外に人体機能のさまざまな「解読」及び予測を提供する。試験可能な分析物の例は、以下の通りである。
−  金属、たとえば、銀、カルシウム、コバルト、クロム、鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、カドミウム、カリウム、セレン、ナトリウム、ストロンチウム、銅、スズ、バナジウム、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、バリウム、カドミウム、水銀、ニッケル、鉛、ウランなど、
−  非金属元素、たとえば、リン、フッ素、ヨウ素、シリカ（ｓｉｌｉｃａ）、硫黄など、
−  アミノ酸、たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、アルギニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ヒスチジン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、タウリン、チロシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、それらの誘導体など、
−  ビタミン、たとえば、葉酸、ナイアシン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ５又はパントテン酸、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＨ又はビオチン、ビタミンＫ、それらの誘導体など、
−  ホルモン、たとえば、エストロゲン、プロゲステロン、オキシトシン、ドーパミン、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、テストステロン、それらの誘導体など。
【００３８】
好ましい分析物の例は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、とくに、カリウム、リチウム、マグネシウムである。
【００３９】
次に、以下の実施例を参照して本発明を説明する。
【００４０】
実験の部
顕微鏡観察のためのサンプルの準備によく使用される液体か、又は、最適光学特性、すなわち、顕微鏡観察で使用されるガラスの屈折率（ｎ＝１．５３〜１．５５）に類似した屈折率を有する液体（表１を参照）について試験した。目的は、欧州特許第２，５１８，４７４号の偏光光による分析目的に最も好適な液体を選択するにあった。
【００４１】
【表１】
2021504725.tif 000004
【００４２】
液体を顕微鏡ガラス上に広げ、分析のために毛髪を液体中に沈め、そして欧州特許第２，５１８，４７４号の実施例７のようにさまざまなオペレーターにより写真撮影した。相対標準偏差（ＲＳＤ）、とりわけ、最も高いＲＳＤを示した最も重要な分析物、たとえば、リチウム、カリウム、マグネシウムのＲＳＤを決定した。
【００４３】
また、毛髪のサンプリングから写真撮影までの操作工程を考慮して測定の確度を注意深くチェックするためにさらなるパラメーターを試験した。これらの工程は、５０〜１００本の毛髪をサンプリングセンターでサンプリングすることと、それらを小さなバッグ又は容器に注加することと、安定化液を用いて顕微鏡ガラス上にそれらを準備することと、それらを実験室に送ることと、偏光光によりそれらのピクセルベース写真を撮ることと、を含む。次いで、分析物の定量に関連して先に記載したように分離により写真を精緻化する。
【００４４】
【表２】
2021504725.tif 000005
【００４５】
実施例１
志願者の頭部の側頭頂領域から約５０〜１００本の毛髪をサンプリングし、まとめてプールする。第１のオペレーター（Ａ）が、プールから採取した１本の毛髪をあらかじめ顕微鏡ガラス上に広げられた表１の支持液体に浸漬する。次いで、偏光フィルター（ニコン）を備えた顕微鏡（オリンパスＢＨ２）内にガラスを配置する。ディジタルカメラ（ニコンＤ７０Ｓ）を用いて屈折偏光光の８枚のディジタル写真を撮影する。各写真撮影後、ガラスを取り出して再び顕微鏡内に配置する。分析物は、欧州特許第２，５１８，４７４号のように分離アルゴリズムベースプロセスを利用して評価される。
【００４６】
次いで、続くオペレーター（Ｂ）が、ガラスから毛髪を取り出して同一の支持液体及びガラスを用いて以上と同一の操作を繰り返す。同様に、続くオペレーター（Ｃ〜Ｆ）が１人ずつ同一の操作を行う。
【００４７】
第２の毛髪をプールから採取して、以上の６名のオペレーターによる第２の液体を用いた試験に供する。プールから新しい毛髪を採取して異なる支持液体で試験することにより、全手順を繰返し行う。
【００４８】
支持液体を用いない毛髪サンプルで全手順をさらに繰り返し、得られた結果をリファレンスとする。
【００４９】
支持体として使用した各液体ごとに、
ＲＳＤ＝（ＳＤ／Ｍｅａｎ）×１００
を利用して、６つの最も重要な元素（リチウム、カリウム、及びマグネシウム）の相対標準偏差（ＲＳＤ）を決定する。
式中、ＳＤは、同一の毛髪の６回の測定からの各試験元素（リチウム、カリウム、及びマグネシウム）の標準偏差であり、Ｍｅａｎは、同一の毛髪の６回の測定からの各試験元素（リチウム、カリウム、及びマグネシウム）の平均値である。
【００５０】
結果（表３）は、試験したすべての異なる支持液体で同程度のＲＳＤを示す。テレビン油のみは、リファレンスと対比してわずかに低いＲＳＤを示すが、明確な統計的意味はない。したがって、この知見は、単に定性的観測とみなさなければならない。
【００５１】
【表３】
2021504725.tif 000006
【００５２】
実施例２
志願者の頭部の側頭頂領域から約５０〜１００本の毛髪をサンプリングし、まとめてプールする。毛髪サンプルを分けて異なる材料で作製された小さなバッグ（パウチ）に入れる。すべてのバッグを密封し、約２０〜３０°Ｃの温度で１日貯蔵する。コンディショニング期間の終了時、バッグを開けて、顕微鏡分析のためにそれらの各々から一本の毛髪を採取する。
【００５３】
次いで、いかなる支持液体も用いることなく毛髪を顕微鏡ガラス上に置き、次いで、偏光フィルター（ニコン）を備えた顕微鏡（オリンパスＢＨ２）内に配置する。ディジタルカメラ（ニコンＤ７０Ｓ）を用いて屈折偏光光の８枚のディジタル写真を撮る。各写真撮影後、ガラスを静かに取り出して再び顕微鏡内に配置する。分析物は、欧州特許第２，５１８，４７４号のように分離アルゴリズムベースプロセスを利用して評価される。
【００５４】
次いで、続くオペレーター（Ｂ）が、ガラスから毛髪を取り出して同一のガラスを用いて以上と同一の操作を繰り返す。同様に、続くオペレーター（Ｃ〜Ｆ）が１人ずつ同一の操作を行う。
【００５５】
次いで、新しい毛髪をサンプリングして異なるバッグ（容器）材料を用いて以上の手順を繰返し行う。
【００５６】
材料ごとに３つの最も重要な元素（リチウム、カリウム、及びマグネシウム）の相対標準偏差（ＲＳＤ）を決定する。
【００５７】
結果（表４）は、試験したすべての異なる材料でＲＳＤの統計的に意味のある差をなんら示さなかった。
【００５８】
【表４】
2021504725.tif 000007
【００５９】
実施例３
志願者の頭部の側頭頂領域から約１００〜２００本の毛髪をサンプリングし、まとめてプールする。小さなバッグ（パウチ）に毛髪を注加する。小さなバッグは、紙、レーヨン、ナイロン、アルミニウム（Ａｌ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、及びポリビニルクロライド（ＰＶＣ）で作製されたものを用いた。すべてのバッグを密封し、２０〜３０°Ｃの温度で１日貯蔵する。コンディショニング期間の終了時、バッグを開けて、顕微鏡分析のためにそれらの各々から１本の毛髪を採取する。
【００６０】
第１のオペレーター（Ａ）が、第１のバッグからの毛髪を支持液体に浸漬する。次いで、偏光フィルター（ニコン）を備えた顕微鏡（オリンパスＢＨ２）内にガラスを配置する。ディジタルカメラ（ニコンＤ７０Ｓ）を用いて屈折偏光光の８枚のディジタル写真を撮る。各写真撮影後、ガラスを取り出して再び顕微鏡内に配置する。分析物は、欧州特許第２，５１８，４７４号のように分離アルゴリズムベースプロセスを利用して評価される。
【００６１】
次いで、続くオペレーター（Ｂ）が、ガラスから毛髪を除去して同一の支持液体及びガラスを用いて以上と同一の操作を繰り返す。同様に、続くオペレーター（Ｃ〜Ｆ）が１人ずつ同一の操作を行う。
【００６２】
第２の毛髪を同一のプールから採取して、以上の６名のオペレーターによる第２の支持液体を用いた試験に供する。プールから新しい毛髪を採取して異なる支持液体で試験することにより、全手順を繰返し行う。支持液体は、ヒマシ油、グリセロール、エチレングリコール、ＤＰＸ包埋剤、Ｎｅｏ−Ｍｏｕｎｔ（登録商標）、モミテレビン（カナダバルサム）、及びパインウッドテレビンである。
【００６３】
異なる小さなバッグから採取した毛髪を用いて以上と同一の操作を繰り返す。
【００６４】
支持体として使用した液体ごとに、３つの最も重要な元素（リチウム、カリウム、及びマグネシウム）の相対標準偏差（ＲＳＤ）を決定する。
【００６５】
結果（表５）は、ＰＥ、ＰＰ、及びＰＶＣとテレビン油との組合せが試験した他の組合せよりもかなり良好に機能することを明確に示す。ＰＥ、ＰＰ、及びＰＶＣとテレビン油との組合せの相対標準偏差は、他のものよりも顕著に小さい。
【００６６】
【表５】
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【国際調査報告】
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