(57)【要約】  疾患に特徴的である対象の血液からの７個以上の選択された遺伝子、例えば、遺伝子発現プロファイルを使用することにより、哺乳動物対象において肺癌を診断するための方法および組成物が提供される。遺伝子発現プロファイルには、本明細書の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの７個以上の遺伝子が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象における肺癌の存在を診断するまたはその進行を評価するための組成物であって、前記組成物が、少なくとも７個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドが、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする、組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドが、検出可能な標識に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドが、異なる検出可能な標識に結合する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記捕捉オリゴヌクレオチドが、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記捕捉オリゴヌクレオチドが、基質に結合する、請求項４または請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記捕捉オリゴヌクレオチドが結合する基質をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも２０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも２５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも４１個または少なくとも５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
表Ｉに列挙される各異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
表ＩＩに列挙される各異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
表ＩＩＩに列挙される各異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
表ＩＩに列挙される最初の１５個の遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現
産物の各々にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
表ＩＩＩに列挙される最初の１５個の遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物の各々にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
表ＩＶに列挙される最初の１５個の遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物の各々にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
表ＩＩＩに列挙される最初の５０個の遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物の各々にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物と、試料採取のための装置と、を含む、キット。
【請求項２０】
前記試料採取のための装置が、前記試料を安定させる試薬を含む、血液を保持するための試験管を備える、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記試薬が、前記試料中のｍＲＮＡを安定させる、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
哺乳動物対象における肺癌の存在を診断するまたはそれを評価するための方法であって、前記表Ｉの遺伝子または前記表ＩＩの遺伝子または前記表ＩＩＩの遺伝子または前記表ＩＶの遺伝子から選択される前記対象の前記試料における７個以上の遺伝子の前記発現の変化を特定することと、前記対象の遺伝子発現レベルを参照または対照における同じ遺伝子のレベルと比較することと、を含み、前記対象の遺伝子の発現の前記参照のものからの変化が、肺癌の診断または評価と相関する、方法。
【請求項２３】
前記診断または評価が、肺癌の診断、良性結節の診断、肺癌の病期の診断、肺癌の種類もしくは分類の診断、肺癌の再発の診断もしくは検出、肺癌の退行の診断もしくは検出、肺癌の予後、または外科的もしくは非外科的療法に対する肺癌の応答の評価のうちの１つ以上を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変化が、前記参照もしくは対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子の上方調節、または前記参照または対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子の下方調節を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象における肺結節のサイズを特定することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物を前記診断に使用することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記参照または対照が、少なくとも１つの参照対象の前記試料からの表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの７個以上の遺伝子を含み、前記参照対象が、（ａ）悪性疾患を有する喫煙者、（ｂ）非悪性疾患を有する喫煙者、（ｃ）非悪性疾患を有する元喫煙者、（ｄ）疾患を有しない健康な非喫煙者、（ｅ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、（ｆ）ＣＯＰＤを有する元喫煙者、（ｇ）固形肺腫瘍を、それを除去する
ための手術前に有する対象、（ｈ）固形肺腫瘍を、前記腫瘍を外科的に除去した後に有する対象、（ｉ）固形肺腫瘍を、それに対する治療前に有する対象、および（ｊ）固形肺腫瘍を、それに対する治療中または治療後に有する対象からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記参照または対照対象（ａ）〜（ｊ）が、時間的に早い時点の同じ試験対象である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、末梢血である、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料中の核酸が、前記遺伝子発現レベルの変化を特定する前に安定化されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
患者における肺癌の検出方法であって、
ａ．前記患者から試料を得ることと、
ｂ．前記試料を、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させること、および前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと、前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することによって、対照と比較して、前記患者試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される前記少なくとも７個の遺伝子における発現の変化を検出することと、を含む、方法。
【請求項３２】
対象における肺癌の診断方法であって、
ａ．対象から血液試料を得ることと、
ｂ．前記試料を、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させること、および前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと、前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することによって、対照と比較して、前記患者試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される前記少なくとも７個の遺伝子における発現の変化を検出することと、
ｃ．前記対象の遺伝子の発現において前記参照のものからの変化が検出される場合に、前記対象を癌と診断することと、を含む、方法。
【請求項３３】
腫瘍成長を有する対象における肺癌の診断および撃退方法であって、
ａ．対象から血液試料を得ることと、
ｂ．前記試料を、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させること、および前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することによって、対照と比較して、前記患者試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される前記少なくとも７個の遺伝子における発現の変化を検出することと、
ｃ．前記対象の遺伝子の発現において前記参照のものからの変化が検出される場合に、前記対象を癌と診断することと、
ｄ．前記腫瘍成長を除去することと、を含む、方法。
【請求項３４】
表ＩＸに列挙される最初の４１個の遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物の各々にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ドを含む、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【連邦支援による研究または開発に関する声明】
【０００１】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＣＡ０１０８１５、およびＰＡ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号４１０００５９２００（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ＰＡＸ  Ｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅｓ）の下で、政府の支援により成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、世界中で最もよく見られる、癌による死因である。米国において、肺癌は、男女ともに２番目に多い癌であり、年間１７４，０００例を超える新規症例および１６２，０００人を超える癌による死亡者を占める。実際に、肺癌は、毎年、乳癌、前立腺癌、および大腸癌の合計よりも多くの死亡者を構成する。
【０００３】
過去３０年で改善がほとんどまたは全く見られない高い死亡率（５年で８０〜８５％）により、所属リンパ節にまたは肺を越えて転移する前の早期の診断を促進するための新しく効果的なツールの必要性が強調される。
【０００４】
高リスク集団には、喫煙者、元喫煙者、および遺伝性素因と関連付けられるマーカーを有する個人が含まれる。早期腫瘍の外科的除去が依然として最も効果的な肺癌治療であるため、低線量スパイラルＣＴ（ＬＤＣＴ）による高リスク患者のスクリーニングに、大きな関心が寄せられている。この戦略により、高リスク個体の約３０〜７０％で非石灰化肺結節が特定されるが、最終的に肺癌と診断される結節の割合はわずか（０．４〜２．７％）である。これらの大量の結節が検出されると、過剰治療が生じ、医療システムに負担をかけることになる可能性が高い。現在、良性病因の肺結節を有する対象と悪性結節を有する対象とを区別する唯一の方法は、侵襲性生検、手術、またはスキャンを繰り返す長期間の観察である。最良の臨床アルゴリズムを使用しても、不確定肺結節に対する手術による肺生検を受けるために選択された患者の２０〜５５％は良性疾患であることが判明し、すぐに生検または切除を受けない患者については、連続的な画像検査を必要とする。この患者群における連続したＣＴの使用は、繰り返しのスキャンのコスト、微量ではない放射線量、および患者の不安とともに、可能性のある治癒可能な治療を遅らせるリスクを負う。
【０００５】
理想的には、診断試験は、簡単にアクセスでき、安価で、高い感度および特異性を示し、患者の転帰を（医学的にも経済的にも）改善するものである。その他、上皮細胞を利用する分類子の精度が高いことが示されている。しかしながら、これらの細胞を採取するには、侵襲性の気管支鏡検査が必要とされる。参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｊｕｌｙ  １６；３７３（３）：２４３−２５１を参照されたい。
【０００６】
痰、血液、または血清を使用する非侵襲性診断を開発し、腫瘍細胞、メチル化腫瘍ＤＮＡ、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）発現メッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質の産物について分析する取り組みが進められている。肺癌の早期診断に有用である可能性のあるこの幅広い分子検査は文献で考察されている。これらのアプローチにはそれぞれメリットがあるものの、高リスクグループであっても早期肺癌患者、または放射線学的および他の臨床的要因に基づく予備診断を有する患者を検出する取り組みにおいては、いずれも未だ調査段階を通過していない。定期的な来院に関連する日常検診である簡単な血液検査が、
理想的な診断検査であろう。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断または評価するための組成物またはキットは、少なくとも７個以上のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含み、患者試料中の各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。各遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物は、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される。一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識に結合する。一実施形態では、組成物またはキットは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子の各々の遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物を検出するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断または評価するための組成物またはキットは、少なくとも８個以上のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、患者試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、遺伝子は、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される。一態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断または評価するための組成物またはキットは、少なくとも１５個以上のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、患者試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される。一態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断または評価するための組成物またはキットは、少なくとも４１個以上のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、患者試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される。一態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断または評価するための組成物またはキットは、少なくとも５０個以上のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、患者試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される。
【０００８】
別の態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断または評価するための組成物またはキットは、７個以上のリガンドを含み、各リガンドは、患者試料中の異なる遺伝子発現産物にハイブリダイズする。各遺伝子発現産物は、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される。一実施形態では、少なくとも１つのリガンドは、検出可能な標識に結合する。一実施形態では、組成物またはキットは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸにおける遺伝子の各々の発現産物を検出するリガンドを含む。別の実施形態では、組成物またはキットは、少なくとも８個の遺伝子の発現産物を検出するリガンドを含む。別の実施形態では、組成物またはキットは、少なくとも１５個の遺伝子の発現産物を検出するリガンドを含む。別の実施形態では、組成物またはキットは、少なくとも４１個の遺伝子の発現産物を検出するリガンドを含む。別の実施形態では、組成物またはキットは、少なくとも５０個の遺伝子の発現産物を検出するリガンドを含む。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される。
【０００９】
本明細書に記載の組成物は、対象の遺伝子発現プロファイルにおける遺伝子中の発現の、参照遺伝子発現プロファイルのものからの変化の検出を可能にする。様々な参照遺伝子発現プロファイルを以下で説明する。一実施形態では、組成物は、癌性腫瘍を非癌性結節から区別する能力を提供する。
【００１０】
別の態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断または評価するための方法には、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される、対象の試料中の３個以上の遺伝子の発現における変化を特定することと、対象の遺伝子発現レベルを参照または対照における同じ遺伝子のレベルと比較することとが伴い、該遺伝子発現の発現における変化は、肺癌の診断または評価と相関する。一実施形態では、該遺伝子発現の発現における変化により、癌性腫瘍を非癌性結節から区別できるようになる。
【００１１】
別の態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断または評価するための方法には、対象の血液中の遺伝子発現プロファイルを特定することが伴い、この遺伝子発現プロファイルは、本明細書に記載される８個以上の情報提供性遺伝子の７個以上の遺伝子発現産物を含む。７個以上の情報提供性遺伝子が、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される。一実施形態では、８個以上の情報提供性遺伝子が、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される。一実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される１５個以上の遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される４１個の遺伝子を含む。対象の遺伝子発現プロファイルは、以下に記載の様々な供給源に由来する参照遺伝子発現プロファイルと比較される。情報提供性遺伝子の発現における変化は、肺癌の診断または評価と相関する。一実施形態では、該遺伝子発現の発現における変化により、癌性腫瘍を非癌性結節から区別できるようになる。
【００１２】
別の態様では、患者における肺癌を検出する方法が提供される。本方法は、患者から試料を得ることと、試料を、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも８個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させることによって、対照と比較して、患者試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される少なくとも７個の遺伝子における発現の変化を検出し、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することと、を含む。
【００１３】
また別の態様では、対象における肺癌を診断する方法が提供される。本方法は、対象から血液試料を得ることと、試料を、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させることによって、対照と比較して、患者試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される少なくとも８個の遺伝子における発現の変化を検出し、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと、遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することと、対象の遺伝子の発現における参照の発現からの変化が検出されるときに、対照を癌と診断することと、を含む。
【００１４】
別の態様では、腫瘍成長を有する対象における肺癌を診断および治療する方法が提供される。本方法は、対象から血液試料を得ることと、血液ＲＮＡを抽出し、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させることによって、対照と比較して、患者ＲＮＡ試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される少なくとも７個の遺伝子における発現の変化を検出し、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと、遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することと、対象の遺伝子の発現における参照の発現からの変化が検出されるときに、対照を癌と診断することと、腫瘍成長を除去することと、を含む。他の適当な治療も提供され得る。
【００１５】
これらの組成物および方法の他の態様および利点は、その好ましい実施形態の以下の詳細な説明においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−１Ｂ】ＳＶＭ−ＲＦＥプロセスの異なる反復にわたるＩｌｌｕｍｉｎａ遺伝子発現の性能を示す代表的なグラフである。図１Ａは、訓練セットの性能である。図１Ｂは、試験セットの性能である。
【図２Ａ−２Ｄ】ｎＬＮＣの分類精度を示す。図２Ａは、ＳＶＭ分類ですべての遺伝子を使用する、訓練セットおよび８〜２０ｍｍ病変検証セットＲＯＣ曲線である。図２Ｂは、ＲＦＥによって選択された上位１００個の遺伝子を使用する訓練および検証セットの性能である。図２Ｃは、上位５０個の遺伝子を使用する訓練および検証セットの性能である。図２Ｄは、上位１５個の遺伝子を使用する訓練および検証セットの性能である。
【図３】試験設計を示す。本試験では、合計８２１個の固有の試料を分析した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ１２ｖ４マイクロアレイおよびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＰＣＩパネルを使用して、全２８３個の試料を使用して候補バイオマーカープローブを選択した。マイクロアレイ上のバイオマーカー選択に２６４個の試料を使用し、２６４個のうちの２０１個＋１９個の新しい試料を使用して、ＰＣＩパネルからバイオマーカーを選択した。検証に使用した５１個の試料は、いずれのバイオマーカー選択においても使用しなかった。マイクロアレイおよびＰＣＩパネル分析から選択される５５９個のバイオマーカーを、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカスタムパネルのために設計することに成功した。新しいプラットフォームがマイクロアレイ結果を正常に再現することを保証するために、プローブ選択で使用される２３７個の試料と、以前にいずれのプラットフォームでもアッセイされなかった追加の３４６個の独立した試料とを用いて（合計５８３個）、カスタムパネルをアッセイした。５８３個の訓練試料を使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ肺結節分類子（ｎＰＮＣ）を創出した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプローブ選択に全く関与しなかった追加の１５８個の試料を、合計８２１個の独立した試料のためにＮａｎｏｓｔｒｉｎｇカスタムプラットフォームに使用した（訓練用３４６個、検証用１４１個）。
【図４Ａ−４Ｅ】ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ肺結節分類子の分類性能を示す。図４Ａ〜図４Ｄは、プローブの数を漸減させた、訓練および検証セット中のＲＯＣ−ＡＵＣの比較である。図４Ｅは、４１−プローブｎＰＮＣを使用した異なる分類得点についての個々の結節の悪性腫瘍の計算した確率である。
【図５Ａ−５Ｂ】６〜２０ｍｍの範囲にあるＢＮおよびＭＮの４１プローブｎＰＮＣの性能を示す。図５Ａは、Ｔｈｅ  Ｂｒｏｃｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、およびＶｅｔｅｒａｎ’ｓ  Ａｆｆａｉｒｓ（ＶＡ）の肺癌リスク臨床モデルに対する比較である。図５Ｂは、結節最大直径による分類に対する比較である。
【図６】異なる結節サイズ範囲にわたる分類性能を示す。性能値（左がＲＯＣ−ＡＵＣ、右が９０％感度での特異性）が、訓練（上のパネル）、検証（中間）、および組み合わせたデータセット（下）について付与される。各列は図の左側に表示を付けてあり、下限結節サイズ範囲は最小（任意のサイズ）から１０ｍｍである。下のカラム表示は、１０ｍｍ〜最大（任意のサイズ）の上限結節サイズ範囲に対応する。次いで、パネルの四角形の各々は、ＢＮクラスおよびＭＮクラスの両方について比較される結節の数とともに、ｍｍ単位で下限から上限サイズまでの範囲に収まる良性結節と悪性結節とを区別する分類性能を示す。色の強度は、視覚的なアクセントのために使用され、報告された性能値に比例し、カラースケールはパネルの上部に示される。例えば、ｎＰＮＣは、８〜１０ｍｍの結節（セットは６ＭＮおよび１４ＢＮを含む）を区別する際に、０．８７の最良のＲＯＣ−ＡＵＣ性能、および９０％感度で０．６４の特異性を示した。
【図７Ａ−７Ｄ】肺結節分類子の性能を示す。Ａ．ＳＶＭ−ＲＦＥプロセスの異なる反復にわたるＩｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイ訓練セットの性能。ボックスは、選択された最適な遺伝子数を強調するものである。Ｂ．試験セット性能。Ｃ．訓練セットと検証セットとの間の３１１個の遺伝子プローブの発現に基づくＩｌｌｕｍｉｎａ遺伝子発現分類子のＲＯＣ−ＡＵＣ性能の比較。Ｄ．訓練セットに対するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅパネルからの遺伝子発現の１０倍相互検証性能。ＡＵＣ＝ＲＯＣ曲線下面積、ＡＣＣ＝精度、ＳＥ＝感度、ＳＰ＝特異性。
【図８Ａ−８Ｂ】ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分類の比較を示す。図８Ａでは、プロットは、ＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームからＳＶＭによって選択された遺伝子を１０回使用して１０倍の交差検証再サンプリングに基づいて、ＳＶＭモデルからの個々の試料分類スコアを示す。図８Ｂは、ＳＶＭ−ＲＦＥによってＩｌｌｕｍｉｎａから選択される遺伝子を使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇおよびＩｌｌｕｍｉｎａの両方で実行した１９９個の試料を分類した結果生じるＲＯＣ曲線である。
【図９Ａ−９Ｃ】異なる数の遺伝子を使用して、訓練セット、試験セット、およびすべての試料セットに対するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ肺結節分類子の性能を示す。図９Ａ．訓練セット：訓練セットにおける１０倍の各回に行った再帰的特性除去である。フォールドを１０回再サンプリングした。１０回の再サンプリングからの得点の平均の性能を示す。Ｘ軸上に、フォールドあたりの残っている遺伝子の数が示される。図９Ｂ−検証セット。上位遺伝子を各反復時に全１００個の遺伝子リストから選択し、それらの性能を訓練セット上で評価した。図９Ｃ−組み合わせセット。７４１個すべての試料が、プローブをランク付けするためにＳＶＭ−ＲＦＥによって使用された。
【図１０】異なる数の遺伝子についてのＲＯＣ曲線比較としてのナノストリングカスタムパネル性能のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に記載の方法および組成物は、肺癌の検出および診断のための血液スクリーニングに遺伝子発現技術を応用する。本明細書に記載の組成物および方法により、哺乳動物、好ましくはヒト対象の血液の遺伝子の特徴的ＲＮＡ発現プロファイルを決定することによって、癌性腫瘍を非癌性結節から区別できるようになる。特徴的な遺伝子発現プロファイルを、同じクラスの１つ以上の対象（例えば、肺癌または非癌性結節を有する患者）または対照のプロファイルと比較して、遺伝子発現プロファイルがどのクラスに最も類似しているかを確認し、有用な診断を提供する。
【００１８】
これらの肺癌スクリーニング方法は、前立腺癌の診断およびその進行の追跡を助けるために前立腺特異的抗原を使用するのとほぼ同様の方法で、追加の胸部Ｘ線ＰＥＴもしくはＣＴスキャン、気管支鏡検査、または生検などのさらなる検査を行うように患者および医師に注意喚起し得る遺伝子発現プロファイリングを使用して、単純で費用効果の高い、非侵襲的な血液検査を実施するのに好適な組成物を用いる。これらのプロファイルを適用することで、疾患が悪性か非悪性かについての最初の試験から開始して、肺疾患の種類の重複診断および確認診断が得られる。
【００１９】
「患者」または「対象」は、本明細書で使用される場合、ヒト、獣医学的動物または農業用動物、家畜または愛玩動物、ならびに臨床研究に通常使用される動物を含む、哺乳動物を意味する。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、ヒトである。
【００２０】
「対照」または「対照対象」は、本明細書で使用される場合、参照遺伝子発現プロファイルのソース、ならびに本明細書に記載される対照対象の特定のパネルを指す。一実施形態では、対照または参照レベルは、単一の対象に由来する。別の実施形態では、対照または参照レベルは、特定の特徴を共有する個体の集団に由来する。
さらに別の実施形態では、対照または参照レベルは、特定の対照個体または集団のレベルと相関する割り当てられた値であるが、必ずしも試験対象の試料をアッセイする時点で測定されるとは限らない。一実施形態では、対照対象または参照は、非癌性結節を有する患者（または集団）に由来する。別の実施形態では、対照対象または参照は、癌性腫瘍を有
する患者（または集団）に由来する。他の実施形態では、対照対象は、肺癌を有する対象または集団、例えば、悪性疾患を有する現行または元喫煙者である対象、固形肺腫瘍を、それを除去するための手術前に有する対象、固形肺腫瘍を、該腫瘍を外科的に除去した後に有する対象、固形肺腫瘍を、それに対する治療前に有する対象、および固形肺腫瘍を、それに対する治療中または治療後に有する対象であり得る。
他の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法の目的のための対照には、肺癌を有しない参照ヒト対象の以下のクラスの任意のものが含まれる。そのような非健康対照（ＮＨＣ）には、非悪性疾患を有する喫煙者、非悪性疾患を有する元喫煙者（肺結節を有する患者を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、およびＣＯＰＤを有する元喫煙者が含まれる。また他の実施形態では、対照対象は、疾患を有しない健康な非喫煙者または疾患を有しない健康な喫煙者である。
【００２１】
「試料」は、本明細書で使用される場合、免疫細胞および／または癌細胞を含む任意の生体液または組織を意味する。本発明で使用するのに最も好適な試料としては、全血が挙げられる。他の有用な生体試料としては、末梢血単核細胞、血漿、唾液、尿、滑液、骨髄、脳脊髄液、膣粘液、頸管粘液、鼻汁、痰、精液、羊水、気管支鏡検査試料、気管支肺洗浄液、鼻擦過物、および癌を有する患者からの他の細胞滲出物が挙げられるが、これらに限定されない。そのような試料は、生理食塩水、緩衝液、または生理学的に許容される希釈剤でさらに希釈されてもよい。あるいは、そのような試料は、従来の手段によって濃縮される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、典型的には制御されていない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを説明する。より具体的には、本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、任意の肺癌を意味する。一実施形態では、肺癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。より具体的な実施形態では、肺癌は肺腺癌（ＡＣまたはＬＡＣ）である。別のより具体的な実施形態では、肺癌は肺扁平上皮癌（ＳＣＣまたはＬＳＣＣ）である。別の実施形態では、肺癌はＩ期またはＩＩ期のＮＳＣＬＣである。さらに別の実施形態では、肺癌は、早期および末期ならびに種類が混ざったＮＳＣＬＣである。
【００２３】
「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、悪性であるか良性であるかにかかわらず、すべての腫瘍細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。「結節」という用語は、悪性または良性であり得る組織の異常な蓄積を指す。「癌性腫瘍」という用語は、悪性腫瘍を指す。
【００２４】
「診断」または「評価」は、肺癌の診断、肺癌の段階の診断、肺癌の種類もしくは分類の診断、肺癌の再発の診断もしくは検出、肺癌の退行の診断もしくは検出、肺癌の予後、または外科的もしくは非外科的療法に対する肺癌の応答の評価を意味する。一実施形態では、「診断」または「評価」は、癌性腫瘍と良性肺結節とを区別することを指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「感受性」（真陽性率とも呼ばれる）は、陽性と正しく識別される陽性の割合（例えば、病態を有すると正しく識別される病人の割合）を測定する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「特異性」（真陰性率とも呼ばれる）は、陰性と正しく識別される陰性の割合（例えば、病態を有しないと正しく識別される健常者の割合）を測定する。
【００２７】
「発現の変化」は、参照もしくは対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子の上方調節、参照もしくは対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子の下方調節、またはある特
定の上方調節された遺伝子と下方調節された遺伝子との組み合わせを意味する。
【００２８】
「治療試薬」または「レジメン」は、化学療法医薬品、生物学的応答修飾剤、放射線、食事、ビタミン療法、ホルモン療法、遺伝子療法、外科的切除などを非限定的に含む、固形腫瘍の有無にかかわらない癌の治療に用いられる任意の種類の治療を意味する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「情報提供性遺伝子」は、発現が肺癌の存在下で特徴として変化する（上方制御または下方制御のいずれかで）遺伝子を意味する。したがって、統計的に有意な数のそのような情報提供性遺伝子は、本方法および組成物における使用に好適な遺伝子発現プロファイルを形成する。そのような遺伝子は、以下の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、および表ＩＸに示される。そのような遺伝子が「発現プロファイル」を構成する。
【００３０】
本発明の文脈における「統計的に有意な数の遺伝子」という用語は、観察される遺伝子発現の変化の程度に応じて異なる。遺伝子発現の変化の程度は、癌の種類、および癌または固形腫瘍のサイズまたは広がりによって異なる。変化の程度も個体の免疫応答によって異なり、個体ごとの検証に供される。例えば、本発明の一実施形態では、少数の遺伝子、例えば、約５〜８個の遺伝子における大きな変化、例えば、２〜３倍の増減は、統計的に有意である。別の実施形態において、約１５個以上の遺伝子におけるより小さな相対的変化は、統計的に有意である。
【００３１】
したがって、本明細書に記載の方法および組成物は、単一のプロファイルにおける５〜約５０個の遺伝子の範囲の「統計的に有意な数の遺伝子」の発現プロファイルの検討を企図する。一実施形態では、遺伝子は表Ｉから選択される。別の実施形態では、遺伝子は表ＩＩから選択される。別の実施形態では、遺伝子は表ＩＩＩから選択される。一実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の５個以上の遺伝子によって形成される。一実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の７個以上の遺伝子によって形成される。一実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の８個以上の遺伝子によって形成される。一実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の１０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の１５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の２０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の２５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の３０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の３５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の４０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の４１個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の４５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の５０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、表Ｉの１、２、３、４、５、６、７、または８個の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、表ＩＩの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、表ＩＩＩの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５
、４６、４７、４８、４９、または５０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、表ＩＶの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個によって形成される。別の実施形態では、遺伝子プロファイルは、表ＩＸの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１個の遺伝子によって形成される。
【００３２】
以下の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、および表ＩＸは、肺癌、例えばＮＳＣＬＣを有する対象と、良性（非悪性）肺結節を有する対象とを識別するのに有用な既知の遺伝子のコレクションに言及する。表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、および表ＩＸで特定される遺伝子の配列は、公開されている。当業者であれば、遺伝子の配列を使用することによって、本明細書に記載の組成物及および方法を容易に再現することができ、これらのすべては、ＧｅｎＢａｎｋなどの従来のソースから公開されている。各遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号が提供される。
【００３３】
「マイクロアレイ」という用語は、基質上のハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブの秩序配列を指す。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形または複数形で使用される場合、概して、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る任意のポリリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。このため、例えば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であってもよい、または一本鎖および二本鎖領域を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。加えて、本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域を指す。かかる領域における鎖は、同じ分子に由来しても異なる分子に由来してもよい。領域は、分子のうちの１つ以上のすべてを含み得るが、より典型的には、いくつかの分子のうち１つの領域のみを伴い得る。三重らせん領域の分子のうちの１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。「ポリヌクレオチド」という用語は、ｃＤＮＡを具体的に含む。本用語には、１つ以上の修飾された塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡが含まれる。このため、安定性または他の理由により骨格が修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるように、「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの独特な塩基またはトリチウム塩基などの修飾された塩基を含むＤＮＡおよびＲＮＡが、本明細書で定義される「ポリヌクレオチド」という用語に含まれる。概して、「ポリヌクレオチド」という用語は、非修飾ポリヌクレオチドのすべての化学的、酵素的および／または代謝的修飾形態、ならびに単純細胞および複雑細胞を含むウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。
【００３５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、限定するものではないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡを含む、比較的短いポリヌクレオチドを指す。一本鎖ＤＮＡプローブオ
リゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、多くの場合、例えば、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成器を使用して、化学的方法によって合成される。
しかしながら、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介技術を含む様々な他の方法、ならびに細胞および生物におけるＤＮＡの発現によって作製され得る。
【００３６】
互換的に使用される用語「差異的に発現された遺伝子」、「差異的な遺伝子発現」、およびそれらの同義語は、疾患、具体的には肺癌などの癌に罹患している対象における発現が、良性結節を有する対象などの対照対象における発現と比べて、より高いまたはより低いレベルに活性化される遺伝子を指す。これらの用語には、同じ疾患の異なる段階で発現がより高いまたはより低いレベルに活性化される遺伝子も含まれる。差異的に発現された遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化または阻害されてもよく、あるいは異なるポリペプチド産物をもたらすために代替的スプライシングに供されてもよい。そのような違いは、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌、または他の分割における変化によって証明され得る。差異的な遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物間の発現の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物間の発現の比率の比較、またはさらには通常の対象、疾患、具体的には癌に罹患している非健康対照および対象、または同じ疾患の様々な段階の間で異なる、同じ遺伝子で異なる処理をされた２つの遺伝子産物の比較を含んでもよい。差異的な発現には、例えば、正常細胞および罹患細胞間、または異なる疾患事象または病期を受けた細胞間の、遺伝子またはその発現産物における時間的または細胞発現パターンにおける量的差異と質的差異との両方が含まれる。本発明の目的では、対象試料と対照試料との間に統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）遺伝子発現の差がある場合、「差異的な遺伝子発現」が存在すると見なされる。
【００３７】
ＲＮＡ転写産物に関する「過剰発現」という用語は、標本または特定の参照ｍＲＮＡセット内のすべての測定された転写産物であり得る、参照ｍＲＮＡのレベルへの正規化によって決定される転写産物のレベルを指すために使用される。
【００３８】
「遺伝子増幅」という語句は、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞または細胞株内に形成されるプロセスを指す。重複領域（増幅ＤＮＡのストレッチ）は、多くの場合、「アンプリコン」と称される。通常、産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現のレベルは、発現される特定の遺伝子から作製されるコピー数の割合において増加する。
【００３９】
本明細書に記載の組成物および方法との関連で、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸに列挙される遺伝子の「７個以上」、「少なくとも７個」などへの言及は、列挙される遺伝子のいずれか１つまたはありとあらゆる組み合わせを意味する。例えば、好適な遺伝子発現プロファイルには、表ＩＩからの少なくとも７個〜５０個の間のいずれかの数の遺伝子を含むプロファイルが含まれる。別の例では、好適な遺伝子発現プロファイルには、表ＩＩＩからの少なくとも８個〜５０個の間のいずれかの数の遺伝子を含むプロファイルが含まれる。例えば、好適な遺伝子発現プロファイルには、表ＩＶからの少なくとも７個〜１００個の間のいずれかの数の遺伝子を含むプロファイルが含まれる。例えば、好適な遺伝子発現プロファイルには、表ＩＸからの少なくとも７個〜４１個の間のいずれかの数の遺伝子を含むプロファイルが含まれる。一実施形態では、表から選択される遺伝子によって形成される遺伝子プロファイルは、順位順に使用され、例えば、リストの上位にランク付けされた遺伝子は、試験においてより有意な差別的結果を示し、したがって、より低い順位の遺伝子よりもプロファイルにおいて有意であり得る。しかしながら、他の実施形態では、有用な遺伝子プロファイルを形成する遺伝子は、順位順である必要はなく、表からのいずれの遺伝子であってもよい。「表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸ」を参照する場合、それらを組み合わせて、本明細書で有用な分類子を提供し得
ることも企図される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「標識」または「レポーター分子」は、核酸（単一ヌクレオチドを含む）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質リガンド、例えば、アミノ酸または抗体の標識に有用な化学的または生化学的部分である。「標識」および「レポーター分子」には、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、クエンチ剤、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、阻害剤、磁性粒子、および当該技術分野で既知の他の部分が含まれる。「標識」または「レポーター分子」は、測定可能なシグナルを生成することができ、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド（例えば、非天然ヌクレオチド）またはリガンドに共有的または非共有的に接合または結合し得る。
【００４１】
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により、ならびに本出願に使用される用語の多くに対する一般的な指導を提供する刊行されている教書の参照により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４２】
Ｉ．遺伝子発現プロファイル
肺癌患者の全血の遺伝子発現プロファイルは、非癌性肺結節を有する患者において見られるものと有意に異なることが示された。例えば、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、および／または表ＩＸの遺伝子の遺伝子発現産物における変化が、早期固形肺腫瘍を有する患者の正常な循環血中で、本発明の方法によって観察および検出され得る。
【００４３】
本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルは、肺癌の早期検出のための新しい診断マーカーを提供し、患者が良性結節の手術または生検に関連する不要な処置を受けることを防止することができる。リスクが非常に低いので、リスク対効果比が非常に高い。一実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、肺結節を有する患者の管理方法について医師がより正確な決定を下すのを助けるために、臨床リスク因子と併せて使用されてもよい。本発明の別の利点は、診断が、早期肺癌においては失われていく少量でしか存在しない循環腫瘍細胞の検出に依存しないため、早期に行われ得ることである。
【００４４】
一態様では、哺乳動物対象において結節を癌性または良性として分類するための組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、少なくとも７個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＶに列挙される最初の７個の遺伝子である。一実施形態では、組成物は、少なくとも８個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、遺伝子は表Ｉのものである。別の実施形態では、組成物は、少なくとも１５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＩの最初の１５個の遺伝子である。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＩＩの最初の１５個の遺伝子である。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＶの最初の１５個の遺伝子である。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＸの最初の１５個の遺伝子である。別の実施形態では、組成物は、少なくとも４１個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、また
は表ＩＸの遺伝子から選択される試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＸの遺伝子である。別の実施形態では、組成物は、少なくとも５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＩの遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、表ＩＩＩの遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、表ＩＶの遺伝子である。一実施形態では、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、ｍＲＮＡにハイブリダイズする。
【表１】
2021506308.tif 000002
【表２】
2021506308.tif 000003
【表３】
2021506308.tif 000004
【表４−１】
2021506308.tif 000005
【表４−２】
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【表４−３】
2021506308.tif 000007
【表５】
2021506308.tif 000008
【００４５】
一実施形態では、新規の遺伝子発現プロファイルまたは特徴は、癌性腫瘍を有する患者を、良性結節を有する患者から識別および区別することができる。例えば、好適な遺伝子発現プロファイルを形成し得る、例えば、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、および表ＩＸで特定される遺伝子を参照されたい。別の実施形態では、表Ｉの遺伝子の一部が好適なプロファイルを形成する。さらに別の実施形態では、表ＩＩの遺伝子の一部が好適なプロファイルを形成する。さらに別の実施形態では、表ＩＩＩの遺伝子の一部が好適なプロファイルを形成する。さらに別の実施形態では、表ＩＶの遺伝子の一部が好適なプロファイルを形成する。さらに別の実施形態では、表ＩＸの遺伝子の一部が好適なプロファイルを形成する。本明細書で考察されるように、これらのプロファイルは、以下に例示されるように、遺伝子発現プロファイルの違いに基づいて判別スコアを生成することによって、癌性腫瘍と非癌性腫瘍とを区別するために使用される。これらの特徴の妥当性は、肺結節の診断を受けていない患者のコホート内の異なるグループによって異なる場所で収集された試料において確立された。実施例ならびに図１および２を参照されたい。本明細書で特定される肺癌の特徴または遺伝子発現プロファイル（すなわち、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸ）をさらに最適化して、必要な遺伝子発現産物の数を減少させ、診断の精度を増加させることができる。
【００４６】
一実施形態では、組成物は、約７個またはポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。別の実
施形態では、組成物は、約５〜約５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。別の実施形態では、組成物は、約５〜約５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩＩの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。別の実施形態では、組成物は、約５〜約５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。別の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、または８個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。別の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。別の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩＩの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。別の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。別の実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも３個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも７個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも８個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも１０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも１５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも２０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも２５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも３０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも３５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも４０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。
一実施形態では、組成物は、少なくとも４５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも５５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産
物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも６０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも６５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも７０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも７５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも８０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも８５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも９０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも９５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。一実施形態では、組成物は、少なくとも１００個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＶの遺伝子から選択された試料中の異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物、または発現産物にハイブリダイズする。
【００４７】
さらに別の実施形態では、発現プロファイルは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の３個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態では、発現プロファイルは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態では、発現プロファイルは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の８個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に、最初の１５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の２０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の２５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の３０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の３５個の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の４０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの順位順に最初の４１個の遺伝子によって形成される。別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表
ＩＩＩ、または表ＩＶの順位順に最初の４５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、または表ＩＶの順位順に最初の５０個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態では、発現プロファイルは、表ＩＶの順位順に最初の５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、
８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個の遺伝子によって形成される。
【００４８】
以下に考察されるように、本明細書に記載される組成物は、当該技術分野において既知である遺伝子発現プロファイリング方法と共に使用され得る。よって、組成物は、その使用が意図されている方法に合わせて適合させることができる。一実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、検出可能な標識に結合する。ある特定の実施形態では、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、各々独立して検出することができる異なる検出可能な標識に結合する。そのような試薬は、以下に記載されるようなｎＣｏｕｎｔｅｒなどのアッセイにおいて、および本明細書に記載される診断方法で有用である。
【００４９】
別の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドにハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドまたはリガンドを含む。一実施形態では、そのような捕捉オリゴヌクレオチドまたはリガンドは、目的の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドまたはリガンドの一部に特異的な核酸配列を含んでもよい。捕捉リガンドは、目的の遺伝子に対するリガンドに特異的なペプチドまたはポリペプチドであってもよい。一実施形態では、捕捉リガンドは、サンドイッチＥＬＩＳＡにあるような抗体である。
【００５０】
捕捉オリゴヌクレオチドは、基質との結合を可能にする部分も含む。そのような基質には、プレート、ビーズ、スライド、ウェル、チップ、またはチャンバが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、組成物は、目的の遺伝子に特異的な各異なるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの捕捉オリゴヌクレオチドを含む。各捕捉オリゴヌクレオチドは、同じ基質との結合を可能にする同じ部分を含んでもよい。一実施形態では、結合部分はビオチンである。
【００５１】
このため、本明細書に記載される哺乳動物対象におけるそのような診断または評価のための組成物は、キットまたは試薬であり得る。例えば、組成物の一実施形態は、基質を含み、この基質に、ｍＲＮＡを検出し定量化するために使用されるリガンドが固定される。試薬は、一実施形態では、ｍＲＮＡの核酸配列を増幅し検出する増幅核酸プライマー（ＲＮＡプライマーなど）またはプライマー対である。別の実施形態では、試薬は、標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブである。別の実施形態では、標的配列は表ＩＩＩに示される。別の実施形態では、試薬は、抗体または抗体の断片である。試薬は、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも１つの遺伝子、遺伝子断片、または発現産物に各々特異的な該プライマー、プローブ、または抗体を含み得る。任意選択で、試薬は、従来の検出可能な標識と関連し得る。
【００５２】
別の実施形態では、組成物は、関連する複数のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブまたはリガンド、それらのための任意選択の検出可能な標識、固定化基質、酵素標識のための任意選択の基質、および他の研究室用物品を含むキットである。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、検出可能な標識と関連する。ある特定の実施形態では、試薬は基質に固定される。例示的な基質には、マイクロアレイ、チップ、マイクロ流体カード、またはチャン
バが挙げられる。
【００５３】
一実施形態では、組成物は、以下でさらに考察されるように、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇシステムと共に使用するように設計されたキットである。
【００５４】
ＩＩ．遺伝子発現プロファイリング方法
本明細書に記載の組成物および方法に有用なプロファイルを生成するために、または本明細書に記載の組成物を使用して診断ステップを実行するために使用された遺伝子発現プロファイリングの方法は既知であり、米国特許第７，０８１，３４０号に十分に要約されている。そのような遺伝子発現プロファイリング方法には、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、およびプロテオミクスに基づく方法が挙げられる。試料中のｍＲＮＡ発現の定量化のために当該技術分野で既知の最も一般的に使用される方法としては、ノーザンブロッティングおよびin
situ ハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析、ならびにＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲに基づく方法が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識することができる抗体を用いてもよい。配列決定に基づく遺伝子発現分析の代表的な方法としては、遺伝子発現連鎖分析（ＳＡＧＥ）、および大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析が挙げられる。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイリングおよび／または診断の方法、ならびに当該技術分野で既知のものに使用するために適合される。
【００５６】
Ａ．患者試料
「試料」または「生体試料」は、本明細書で使用される場合、免疫細胞および／または癌細胞を含有する任意の生体液または組織を意味する。一実施形態では、好適な試料は全血である。別の実施形態では、試料は静脈血であってもよい。別の実施形態では、試料は動脈血であってもよい。別の実施形態では、本明細書に記載の方法における使用に好適な試料は、末梢血、より具体的には末梢血単核細胞を含む。他の有用な生体試料としては、血漿または血清が挙げられるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態では、試料は、唾液、尿、滑液、骨髄、脳脊髄液、膣粘液、頸管粘液、鼻汁、鼻擦過物、痰、精液、羊水、気管支肺洗浄液、および肺疾患を有する疑いのある対象からの他の細胞滲出物である。そのような試料は、生理食塩水、緩衝液、または生理学的に許容される希釈剤でさらに希釈されてもよい。あるいは、そのような試料は、従来の手段によって濃縮される。任意の１つの生体試料に対する本明細書全体にわたる使用または参照は、例示的なものに過ぎないことを理解されたい。例えば、本明細書において試料が全血と称される場合、他の試料、例えば、血清、血漿なども別の実施形態で用いられ得ることが理解される。
【００５７】
一実施形態では、生体試料は全血であり、本方法は、ＰａｘＧｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｋｆｌｏｗシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を採用する。このシステムは、血液採取（例えば、１回の採血）およびＲＮＡ安定化、続いて輸送および貯蔵、続いて総ＲＮＡの精製および分子ＲＮＡ試験の精製を伴う。このシステムは、即時のＲＮＡ安定化および一貫した採血量を提供する。血液は医師の診察室またはクリニックで採取することができ、検体は同じ試験管中で輸送および保管される。短期ＲＮＡ安定性は、１８〜２５℃で３日間、または２〜８℃で５日間である。長期ＲＮＡ安定性は、−２０〜−７０℃で４年間である。この試料収集システムは、使用者が全血中の遺伝子発現に関するデータを確実に取得することを可能にする。一実施形態では、生体試料は全血である。ＰＡＸｇｅｎｅシステムはＰＢＭＣを生体試料源として使用する場合よりもノイズが多いが、ＰＡＸｇｅｎｅ試料収集の利点は問題を補って余りある。ノイズは、当業者であれば、バイオインフォ
マティクスにより取り去ることができる。
【００５８】
一実施形態において、生体試料は、独自のＰａｘＧｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，ａ  Ｑｉａｇｅｎ，ＢＤ  ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して収集され得る。ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍは、２つの統合された構成要素、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ＴｕｂｅおよびＰＡＸｇｅｎｅ
Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔからなる。標準的な静脈切除技術により、血液試料をＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ試験管に直接採取する。これらの試験管には、直ちに細胞内ＲＮＡを安定させ、ＲＮＡ転写産物の体外分解または上方調節を最小限に抑える独自の試薬が含まれる。冷凍を排除し、試料をまとめ、収集後の試料処理の緊急性を最小限に抑えることができることにより、研究室効率が大幅に高まり、コストが削減される。
その後、様々なアッセイを使用してｍｉＲＮＡを検出および／または測定する。
【００５９】
Ｂ．Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析
本明細書に記載の組成物および方法との使用に好適な感度および順応性の高い定量的方法は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓシステム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）である。ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍは、遺伝子発現の直接多重測定に基づくデジタルの色分けされたバーコード技術を利用し、高レベルの精度および感度を提供する（細胞あたり１コピー未満）。この技術は、分子「バーコード」および単一の分子イメージングを使用して、単一の反応で何百もの固有の転写産物を検出し、計数する。各色分けされたバーコードは、目的の遺伝子、すなわち、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子に対応する単一の標的特異的プローブ（すなわち、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはリガンド）に結合する。これらは、対照と一緒に混合されると、多重のＣｏｄｅＳｅｔを形成する。一実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表Ｉの遺伝子の８個すべてを含む。一実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの最初の７個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩの５０個すべての遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩＩの５０個すべての遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも３個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも５個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも８個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも１０個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも１５個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも２０個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも２５個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも３０個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも４０個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも４１個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも５０個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも６０個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７０個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも８０個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも９０個の遺伝子を含む。別の実施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの１００個すべての遺伝子を含む。さらに別の実
施形態では、ＣｏｄｅＳｅｔは、本明細書に記載されるように、組み合わせを含む、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子の任意のサブセットを含む。
【００６０】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームは、溶液中でハイブリダイズするｍＲＮＡあたり２〜５０個の塩基プローブを用いる。レポータープローブは信号を運び、捕捉プローブは、データ収集のために複合体を固定することを可能にする。プローブは、患者試料と混合される。ハイブリダイゼーションの後、過剰なプローブが除去され、プローブ／標的複合体は、例えばｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ内の基質に整列し固定される。
【００６１】
表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、および表ＩＸの遺伝子の各々について以下の実施例で利用される標的配列は、以下の表Ｖに示され、配列表中に複写されている。これらの配列は、これらの遺伝子の公開された配列の一部である。当業者であれば好適な代替を容易に設計し得る。
【００６２】
試料カートリッジは、データ収集のためにデジタル分析器に置く。カートリッジ表面のカラーコードを標的分子ごとに計数し一覧にする。
【００６３】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒカウンターシステムを使用する利点は、検出および定量化を行うためにｍＲＮＡの増幅が必要でないことである。しかしながら、代替の実施形態では、他の好適な定量的方法が使用される。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｂｅ  ｐａｉｒｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
２００８  Ｍａｒ；２６（３）：３１７−２５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１３８５．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｆｅｂ  １７を参照されたい。
【００６４】
Ｃ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術
別の好適な定量的方法はＲＴ−ＰＣＲであり、これは、正常および腫瘍組織における異なる試料集団中のｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現のパターンを特徴付け、密接に関連するｍＲＮＡ間の区別を行い、ＲＮＡ構造を分析するために使用することができる。第１のステップは、標的試料（例えば、典型的には、ヒトＰＢＭＣから単離された総ＲＮＡ）からのｍＲＮＡの単離である。ｍＲＮＡは、例えば、凍結またはアーカイブされたパラフィン包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。
【００６５】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、当該技術分野、かかる分子生物学の標準的な教書において周知である。特に、ＲＮＡ単離は、製造業者の説明書に従って、商用製造業者からの精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを使用して行うことができる。例示的な市販製品としては、ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴ、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ−ｃｏｌｕｍｎｓ、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、およびＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）が挙げられる。塩化セシウム密度勾配遠心分離などの従来技術を用いることもできる。
【００６６】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第１のステップは、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写、続くＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅である。最も一般的に使用される２つの逆転写酵素は、アビロ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写ステップは、典型的には、状況および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的プライマー
、ランダムヘキサマー、またはオリゴｄＴプライマーを使用してプライミングされる。例えば、製品ＧＥＮＥＡＭＰ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）に添付の製造業者の説明書を参照されたい。次いで、得られたｃＤＮＡを、続くＲＴ−ＰＣＲ反応における鋳型として使用することができる。
【００６７】
ＰＣＲステップは、一般に、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を有しないＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。このため、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲは、典型的には、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有するいずれの酵素も使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンが生成される。一実施形態では、標的配列は、表Ｖに示される。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長不可能であり、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識される。レポーター色素からのレーザー誘起発光は、２つの色素がプローブ上にあるように近接して位置する場合に、クエンチング色素によってクエンチされる。増幅反応の間、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的な様式でプローブを切断する。得られたプローブ断片は、溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２のフルオロフォアのクエンチ効果を免れる。レポーター色素の１分子は、合成された新しい分子ごとに遊離され、クランチされていないレポーター色素の検出により、データの定量的解釈の基礎が提供される。
【００６８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販の装置を使用して実施することができる。好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼの手順は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）などのリアルタイム定量ＰＣＲ装置上で実行される。このシステムは、サーモサイクラー上、９６ウェルのフォーマットで試料を増幅する。増幅中、レーザー誘起蛍光シグナルは、すべての９６ウェルについて、光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで収集され、ＣＣＤで検出される。システムには、装置を動作させ、データを解析するためのソフトウェアが含まれる。５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔまたは閾値サイクルとして表される。上で考察したように、蛍光値は、各サイクル中に記録され、増幅反応におけるその時点まで増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録される時が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【００６９】
誤差および試料間の変動の影響を最小限に抑えるために、ＲＴ−ＰＣＲは、通常内部標準を用いて行われる。理想的な内部標準は、異なる組織間において一定レベルで発現され、実験治療の影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子のグリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【００７０】
リアルタイムＰＣＲは、各標的配列の内部競合物質が正規化に使用される定量的競合ＰＣＲと、試料中に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲとの両方と同等である。
【００７１】
別のＰＣＲ法、すなわち、Ｍａｓｓ  ＡＲＲＡＹベースの遺伝子発現プロファイリング法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）では、ＲＮＡの単離および逆転写の後、得られたｃＤＮＡを合成ＤＮＡ分子（競合物質）でスパイクし、これは、単一の塩基を除くすべての位置の標的とされたｃＤＮＡ領域と一致し、内部標準として働く。ｃＤＮＡ／競合物質の混合物は、ＰＣＲで増幅され、ＰＣＲ後のエビアルカリホスフ
ァターゼ（ＳＡＰ）酵素処理に供され、残りのヌクレオチドの脱リン酸化をもたらす。アルカリホスファターゼの不活性化の後、競合物質およびｃＤＮＡからのＰＣＲ産物は、プライマー伸長に供され、競合物質由来のＰＣＲ産物およびｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物のために個別の質量シグナルを生成する。精製後、これらの生成物は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）の分析を用いて、分析に必要な成分を予め装填したチップアレイ上に分配される。次いで、反応中に存在するｃＤＮＡは、生成されたマススペクトルにおけるピーク領域の比を分析することによって定量される。
【００７２】
当該技術分野で既知であり、遺伝子発現プロファイリングに使用され得るＰＣＲに基づく技術のさらに他の実施形態には、例えば、差動ディスプレイ、増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）、および遺伝子発現の迅速アッセイにおいて、市販されているＬｕｍｉｎｅｘ１００  ＬａｂＭＡＰシステムおよび複数の色分けされたマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ
Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）を使用する、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ならびにハイカバレージ発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）分析が含まれる。
【００７３】
Ｄ．マイクロアレイ
差次的遺伝子発現も、マイクロアレイ技術を使用して、特定または確認され得る。このため、肺癌関連遺伝子の発現プロファイルは、マイクロアレイ技術を使用して、新鮮な組織またはパラフィン包埋組織のいずれかで測定され得る。この方法では、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）は、マイクロチップ基質上にプレーティングまたはアレイ化される。次いで、アレイ化配列は、目的の細胞または組織由来の特定のＤＮＡプローブとハイブリダイズされる。本明細書の他の方法および組成物と同様に、ｍＲＮＡの供給源は、対照および患者対象の全血から単離された全ＲＮＡである。
【００７４】
マイクロアレイ技術の一実施形態において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅挿入物は、高密度アレイの基質に適用される。一実施形態では、表ＩＩＩからの５５９個のヌクレオチド配列すべてが基質に適用される。マイクロチップに固定されたマイクロアレイ化遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに好適である。目的の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの取り込みにより、蛍光標識されたｃＤＮＡプローブが生成され得る。チップに適用された標識されたｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異性をもってハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するために、ストリンジェントな洗浄を行った後、共焦点レーザー顕微鏡法またはＣＣＤカメラなどの別の検出方法によって、チップがスキャンされる。各アレイ化された要素のハイブリダイゼーションの定量化により、対応するｍＲＮＡ存在量の評価が可能となる。二色蛍光を用いて、２つのＲＮＡ源から生成された別々に標識されたｃＤＮＡプローブが、アレイに対でハイブリダイズされる。このようにして、各指定遺伝子に対応する２つの供給源からの転写産物の相対的存在量が同時に決定される。ハイブリダイゼーションの小型化により、多数の遺伝子の発現パターンの簡便で迅速な評価ができるようになる。そのような方法は、細胞あたり数コピーで発現する稀な転写産物を検出するために必要な感度を有し、発現レベルの少なくとも約２倍の差を再現可能に検出することが示されている。マイクロアレイ分析は、製造業者のプロトコルにしたがって、市販の装置によって行われ得る。
【００７５】
米国特許第７，０８１，３４０号によって要約され、参照により本明細書に組み込まれる他の有用な方法には、遺伝子発現連鎖分析（ＳＡＧＥ）、および大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）が含まれる。簡単に説明すると、遺伝子発現連鎖分析（ＳＡＧＥ）は、各転写産物に対して、個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なく
、多数の遺伝子転写産物の同時および定量分析を可能にする方法である。最初に、転写産物を独特に特定するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）が生成されるが、このタグは、各転写産物内の独特な位置から得られる。次いで、多くの転写産物が一緒に連結して長い連続分子を形成し、これが配列決定されて、複数のタグの身元が同時に明らかとなり得る。転写産物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を決定し、各タグに対応する遺伝子を特定することによって、定量的に評価され得る。詳細については、例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４４８７（１９９５）、およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８８：２４３  ５１（１９９７）を参照されたい。
【００７６】
Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：６３０６３４（２０００）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析は、非ゲルベースのシグネチャー配列決定と、別個の直径５μｍのマイクロビーズ上の何百万もの鋳型のインビトロクローニングとを組み合わせた配列決定のアプローチである。最初に、インビトロクローニングによって、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーが構築される。これに続いて、高密度（典型的には、３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２より大きい）で、フローセルにおける鋳型を含有しているマイクロビーズの平面アレイを組み立てる。ＤＮＡ断片分離を必要としない蛍光ベースのシグネチャー配列決定法を使用して、各マイクロビーズ上のクローン化された鋳型の遊離末端が同時に解析される。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリー由来の数十万個の遺伝子シグネチャー配列を、一回の操作で同時に正確に提供することが示されている。
【００７７】
Ｅ．免疫組織化学
免疫組織化学法は、本明細書における方法および組成物における使用について記載される情報提供性遺伝子の遺伝子発現産物の発現レベルを検出するのにも好適である。抗体または抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、および最も好ましくはモノクローナル抗体、または各マーカーに特異的な他のタンパク質結合リガンドを使用して、発現を検出する。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素で抗体自体を直接標識することによって検出され得る。あるいは、標識されていない一次抗体を、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体と併せて使用する。免疫組織化学分析のためのプロトコルおよびキットは、当該技術分野において周知であり、市販されている。
【００７８】
ＩＩＩ．本発明の組成物
定義された遺伝子発現プロファイルを利用する本明細書に記載の肺癌を診断するための方法により、非癌性結節に対して、肺癌、例えばＮＳＣＬＣを診断するための簡易診断ツールの開発が可能となる。このため、本明細書に記載の哺乳動物対象における肺癌を診断するための組成物は、キットまたは試薬であり得る。例えば、組成物の一実施形態は、基質を含み、この基質に、該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドまたはリガンドが固定される。別の実施形態では、組成物は、関連する５個以上のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンド、それらのための任意選択の検出可能な標識、固定化基質、酵素標識のための任意選択の基質、および他の研究室用物品を含むキットである。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、検出可能な標識と関連する。
【００７９】
一実施形態では、哺乳動物対象における肺癌を診断するための組成物は、７個以上のＰＣＲプライマープローブセットを含む。各プライマープローブセットは、対象の血液中に
見られる７個以上の情報提供性遺伝子の遺伝子発現産物とは異なるポリヌクレオチド配列を増幅する。これらの情報提供性遺伝子は、肺癌を有する対象と、非癌性結節を有する対象とで区別可能である遺伝子発現プロファイルまたは特徴を形成するように選択される。遺伝子発現プロファイルにおける遺伝子の発現の、参照遺伝子発現プロファイルのものからの変化は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌と相関する。
【００８０】
この組成物の一実施形態では、情報提供性遺伝子は、表Ｉに特定される遺伝子の中から選択される。この組成物の別の実施形態では、情報提供性遺伝子は、表ＩＩに特定される遺伝子の中から選択される。この組成物の別の実施形態では、情報提供性遺伝子は、表ＩＩＩに特定される遺伝子の中から選択される。
この組成物の別の実施形態では、情報提供性遺伝子は、表ＩＶに特定される遺伝子の中から選択される。この組成物の別の実施形では、情報提供性遺伝子は、表ＩＸに特定される遺伝子の中から選択される。この遺伝子のコレクションは、遺伝子産物発現が、参照対照（すなわち、非癌性結節を有する患者）の血液中の同じ遺伝子産物発現に対して改変される（すなわち、増加または減少する）ものである。一実施形態では、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンド、すなわち、プローブは、組成物中で使用するために、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、および／または表ＩＸからの７個以上の情報提供性遺伝子に対して生成される（ＣｏｄｅＳｅｔ）。このような組成物の一例は、表Ｉの遺伝子の標的部分へのプローブを含有する。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表Ｉからの８個すべての遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩからの最初の１５個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩＩからの最初の１５個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＸからの最初の４１個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩからの５０個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩＩからの５０個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＶからの最初の７個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表Ｉからの最初の１５個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＶからの最初の５０個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の３個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の５個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の１０個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の１５個の遺伝子に対して生成される。
別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の２０個の遺伝子に対して生成される。別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の２５個の遺伝子に対して生成される。
さらに別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の３０個の遺伝子に対して生成される。さらに別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の３５個の遺伝子に対して生成される。さらに別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の４０個の遺伝子に対して生成される。さらに別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の４５個の遺伝子に対して生成される。さらに別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するた
めに、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸからの最初の５０個の遺伝子に対して生成される。さらに別の実施形態では、プローブは、組成物中で使用するために、表ＩＶからの最初の５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の遺伝子に対して生成される。表からの選択された遺伝子は、順位順である必要はなく、むしろ、参照対照と罹患患者との間の発現の差を明確に示す任意の組み合わせが、そのような組成物において有用である。
【００８１】
上記の組成物の一実施形態では、参照対照は、上記のように、非健康対照（ＮＨＣ）である。他の実施形態では、参照対照は、「定義」で上述したいずれのクラスの対照であってもよい。
【００８２】
任意選択で検出可能な標識と関連した、本明細書に記載される表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される遺伝子に基づく組成物は、上記のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＱ  ＰＣＲ技術と共に使用するために適合されるマイクロ流体カード、チップもしくはチャンバ、またはキットの形式で提示され得る。一態様では、そのような形式は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ低密度アレイを使用する診断アッセイである。別の態様では、このような形式は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを使用する診断アッセイである。
【００８３】
上述の組成物中で使用するために、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、好ましくは、遺伝子発現プロファイルから選択される増幅される遺伝子（複数可）に存在するイントロン配列に基づいて設計される。例示的な標的配列が表ＩＶに示される。プライマーおよびプローブ配列の設計は、特定の遺伝子標的が選択されれば後は当業者の技術範囲内である。プライマーおよびプローブ設計のために選択される特定の方法、ならびに特定のプライマーおよびプローブ配列は、これらの組成物の非限定的な特徴である。当業者が利用可能なプライマーおよびプローブ設計技術の即時の説明は、一般ユーザーおよび生物学者プログラマーのためのワールドワイドウェブ上のＤＮＡ  ＢＬＡＳＴソフトウェア、Ｒｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラム（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  ＨｅｌｅｎＪ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３などの一般に利用可能なツールを参照して、米国特許第７，０８１，３４０号に要約されている。
【００８４】
一般に、本明細書に記載の組成物中で使用される最適なＰＣＲプライマーおよびプローブは、概して１７〜３０塩基長であり、例えば約５０〜６０％など、約２０〜８０％のＧ＋Ｃ塩基を含有する。５０〜８０℃、例えば、約５０〜７０℃の溶融温度が典型的に好ましい。
【００８５】
別の態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断するための組成物は、基質に固定された複数のポリヌクレオチドを含み、複数のゲノムプローブが、対象の血液における遺伝子発現プロファイルから選択される８個以上の情報提供性遺伝子の８個以上の遺伝子発現産物にハイブリダイズし、この遺伝子発現プロファイルは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される遺伝子を含む。別の態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断するための組成物は、基質に固定された複数のポリヌクレオチドを含み、複数のゲノムプローブが、対象の血液における遺伝子発現プロファイルから選択される８個以上の情報提供性遺伝子の８個以上の遺伝子発現産物にハイブリダイズし、この遺伝子発現プロファイルは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される遺伝子を含む。別の実施形態では、哺乳動物対象における肺癌を診断するための組成物は、基質に
固定された複数のポリヌクレオチドを含み、複数のゲノムプローブが、対象の血液における遺伝子発現プロファイルから選択される１５個以上の情報提供性遺伝子の１５個以上の遺伝子発現産物にハイブリダイズし、この遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される遺伝子を含む。この種の組成物は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ組成物について上で説明したものと同じ遺伝子プロファイルの認識に依存するが、ｃＤＮＡアレイの技術を用いる。患者対象の血液中に存在する遺伝子発現産物への組成物中の固定されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを用いて、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、および表ＩＸに特定される遺伝子の中から選択される情報提供性遺伝子の発現を定量化して、患者のための遺伝子発現プロファイルを生成し、次いでこれを、参照試料のものと比較する。上記のように、プロファイル（すなわち、表Ｉの遺伝子またはそのサブセットのもの、表ＩＩの遺伝子またはそのサブセットのもの、表ＩＩＩの遺伝子またはそのサブセットのもの、表ＩＶの遺伝子またはそのサブセットのもの）の特定に応じて、この組成物は、ＮＳＣＬＣ肺癌の診断および予後診断を可能にする。ここでも、組成物中で使用されるポリヌクレオチド配列、それらの長さおよび標識の選択は、どの遺伝子が肺癌の診断および予後診断に好適な遺伝子発現プロファイルを形成することができるかという教示を鑑みて、当業者によって行われる日常的な決定である。
【００８６】
また別の態様では、本明細書に記載の方法において有用な組成物またはキットは、対象の血液中の遺伝子発現プロファイルから選択される７個以上の情報提供性遺伝子の７個以上の遺伝子発現産物に結合する複数のリガンドを含む。別の実施形態では、本明細書に記載の方法において有用な組成物またはキットは、対象の血液中の遺伝子発現プロファイルから選択される８個以上の情報提供性遺伝子の８個以上の遺伝子発現産物に結合する複数のリガンドを含む。遺伝子発現プロファイルは、他の組成物について上に記載したように、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の方法において有用な組成物またはキットは、対象の血液中の遺伝子発現プロファイルから選択される１５個以上の情報提供性遺伝子の１５個以上の遺伝子発現産物に結合する複数のリガンドを含む。遺伝子発現プロファイルは、他の組成物について上に記載したように、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の方法において有用な組成物またはキットは、対象の血液中の遺伝子発現プロファイルから選択される５０個以上の情報提供性遺伝子の５０個以上の遺伝子発現産物に結合する複数のリガンドを含む。遺伝子発現プロファイルは、他の組成物について上に記載したように、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子を含む。この組成物により、示された表中の遺伝子によって発現されるタンパク質の検出が可能となる。好ましくは、リガンドは、プロファイル中の遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体であるが、様々な形態の抗体、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、ならびに断片および構成要素（例えば、ＣＤＲ、一本鎖可変領域など）を抗体の代わりに使用してもよいことが、当業者には明らかであろう。そのようなリガンドは、対象の血液との接触に好適な基質上に固定され、従来の様式で分析され得る。ある特定の実施形態では、リガンドは、検出可能な標識と関連する。また、これらの組成物により、遺伝子発現プロファイルにおける遺伝子によってコードされるタンパク質の、参照遺伝子発現プロファイルのものからの変化を検出することが可能となる。
そのような変化は、上記のＰＣＲおよびポリヌクレオチド含有組成物と類似の様式で肺癌と相関する。
【００８７】
診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてについて、遺伝子発現プロファイルは、一実施形態において、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの情報提供性遺伝子の少なくとも最初の７個または８個を含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、一実施形態において、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの情報提供性遺伝子の少なくとも最初１５個を含
み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの情報提供性遺伝子を５０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの情報提供性遺伝子を２０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの情報提供性遺伝子を３０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの情報提供性遺伝子を４０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの情報提供性遺伝子を５０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＶの情報提供性遺伝子を６０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＶの情報提供性遺伝子を７０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＶの情報提供性遺伝子を８０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＶの情報提供性遺伝子を９０個以上含み得る。診断用／予後診断用組成物の上記の形態のすべてに関する別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＶの情報提供性遺伝子を１００個すべて含み得る。
【００８８】
これらの組成物を使用して、Ｉ期またはＩＩ期のＮＳＣＬＣなどの肺癌を診断し得る。さらにこれらの組成物は、病因不明の肺結節を有する対象における補足的または元の診断を提供するのに有用である。
【００８９】
ＩＶ．本発明の診断方法
上記の組成物はすべて、対象における病態の血液ベースの非侵襲的評価を可能にする様々な診断ツールを提供する。胸部Ｘ線またはＣＴスキャンなどの他のスクリーニング検査と組み合わせてもよい、診断検査におけるこれらの組成物の使用は、診断精度を高め、かつ／または追加検査を導く。
よって、一態様では、哺乳動物対象における肺癌を診断するための方法が提供される。この方法は、哺乳動物、好ましくはヒト対象の血液中の遺伝子発現プロファイルを特定することを伴う。一実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、肺癌における発現が増加または減少した７、８、１５、４１、５０個以上の情報提供性遺伝子の７、８、１５、４１、５０個以上の遺伝子発現産物を含む。遺伝子発現プロファイルは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される７、８、１５、４１、５０個以上の情報提供性遺伝子の選択によって形成される。別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、肺癌における発現が増加または減少した７個以上の情報提供性遺伝子の７個以上の遺伝子発現産物を含む。遺伝子発現プロファイルは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子からの７個以上の情報提供性遺伝子の選択によって形成される。一実施形態では、遺伝子は、表ＩＶの最初の７個の遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、表ＩＶの最初の１５個の遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、表ＩＶの最初の５０個の遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子からの１５個以上の情報提供性遺伝子の選択によって形成される。対象の遺伝子発現プロファイルを参照遺伝子発現プロファイルと比較することで、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）と相関する情報提供性遺伝子の発現における変化が特定できる。この方法は、上記の組成物のうちのいずれかを使用して行われ得る。一実施形態では、本方法により、良性結節から癌性腫瘍を見分ける診断が可能となる。
【００９０】
別の態様では、対象における肺癌を診断するための本明細書に記載される組成物のいず
れかの使用が提供される。
【００９１】
本明細書に記載の診断組成物および方法は、現在の診断方法と比べて様々な利点を提供する。そのような利点の中には、以下のものがある。本明細書に例示されるように、癌性腫瘍を有する対象が良性結節を有する対象と区別される。これらの方法および組成物は、小さな結節を有して肺クリニックを訪れる患者が悪性疾患を有するかどうかの、実用的な診断問題に対する解決策を提供する。中リスクの結節を有する患者は、非常に低い可能性が非常に低い疾患リスクカテゴリーまたは可能性が非常に高い疾患リスクカテゴリーのいずれかに患者を移す非侵襲的検査から明らかに恩恵を受けるであろう。ゲノムプロファイルに基づいた正確な悪性度の推定（すなわち、所与の患者は癌を有する確率が９０％であるという推定、これに対して、患者は癌を有する確率が５％のみであるという推定）は、良性疾患の手術の減少、治癒可能なステージでの早期腫瘍の除去、経過観察のＣＴスキャンの減少、および結節の心配に対する深刻な心理的負担の削減につながる。肺癌のＣＴスクリーニングに関連する追加の健康管理の現在の推定コスト、すなわち、得られた質調整生存年につき１１６，０００ドルを削減するなど、経済的影響も大きい可能性がある。十分な感度および特異性を有する非侵襲的な血液ゲノミクス試験は、悪性腫瘍の検査後の確率、したがって、その後の臨床的ケアを大きく改変するであろう。
【００９２】
既存の方法と比べたこれらの方法の望ましい利点は、それらが低侵襲処置から、すなわち、血液試料を採取することによって、病態を特徴付けることができることである。対照的に、遺伝子発現プロファイルからの癌腫瘍の分類のための慣例は、組織試料、通常は腫瘍由来の試料に依存する。非常に小さな腫瘍の場合、生検は問題があり、明らかに、腫瘍が分かっていないまたは目に見えない場合、生検からの試料は不可能である。腫瘍試料が分析される場合のように、腫瘍の精製は必要とされない。最近公開された方法は、気管支鏡検査中に、肺由来の上皮細胞の擦過に依存し、これは血液試料の採取よりもかなり侵襲的である。血液試料は、後の分析のために材料が容易に調製され安定化されるというさらなる利点を有し、これは、メッセンジャーＲＮＡが分析される場合に重要である。
【００９３】
本明細書に記載の７、８、１５、４１、５０、および１００個の遺伝子分類子は、発明者らによって以前に報告された５５９個のマーカー分類子と同様に働いた。以下の実施例および表ＶＩＩを参照されたい。例えば、表ＩＶの最初の５０個の遺伝子からなる分類子は、５５９個の遺伝子からなる分類子と同様に働いた。これらの組成物および方法により、肺癌のより正確な診断および治療が可能となる。このため、一実施形態では、記載される方法は、肺癌の治療を含む。治療は、腫瘍成長の除去、化学療法、および／または当技術分野で既知であるか、もしくは本明細書に記載される他の治療であってもよい。
【００９４】
一実施形態では、哺乳動物対象における肺癌の存在を診断または肺癌を評価するための方法が提供され、本方法は、該対象の試料中の７個、８個、１５個、４１個、５０個以上の遺伝子の発現の変化を特定することを含み、該遺伝子は、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの遺伝子から選択される。対象の遺伝子発現レベルは、参照または対照における同じ遺伝子のレベルと比較され、対象の遺伝子の発現の、参照の発現からの変化は、肺癌の診断または評価と相関する。
【００９５】
一実施形態では、診断または評価は、肺癌の診断、良性結節の診断、肺癌の病期の診断、肺癌の種類もしくは分類の診断、肺癌の可能性のある再発の診断もしくは検出、肺癌の退行の診断もしくは検出、肺癌の予後、外科的もしくは非外科的療法に対する肺癌の応答の評価のうちの１つ以上を含む。
別の実施形態では、変化は、該参照もしくは対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子の上方調節、または該参照または対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子の下方調節を含む。
【００９６】
別の実施形態では、参照または対照は、少なくとも１つの参照対象の表Ｉ試料の３個以上の遺伝子を含む。参照対象は、（ａ）悪性疾患を有する喫煙者、（ｂ）非悪性疾患を有する喫煙者、（ｃ）非悪性疾患を有する元喫煙者、（ｄ）疾患を有しない健康な非喫煙者、（ｅ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、（ｆ）ＣＯＰＤを有する元喫煙者、（ｇ）固形肺腫瘍を、それを除去するための手術前に有する対象、（ｈ）固形肺腫瘍を、腫瘍を外科的に除去した後に有する対象、（ｉ）固形肺腫瘍を、それに対する治療前に有する対象、および（ｊ）固形肺腫瘍を、それに対する治療中または治療後に有する対象からなる群から選択されてもよい。一実施形態では、参照または対照対象（ａ）〜（ｊ）は、時間的に早い時点の同じ試験対象である。
【００９７】
試料は、本明細書に記載されるものから選択される。一実施形態では、試料は末梢血である。試料中の核酸は、いくつかの実施形態では、遺伝子発現レベルの変化を特定する前に安定化されている。そのような安定化は、例えば、本明細書に記載されるＰａｘ  Ｇｅｎｅ系を使用して達成されてもよい。
【００９８】
一実施形態では、患者における肺癌を検出する方法は、
ａ．患者から試料を得ることと、
ｂ．試料を、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させることによって、対照と比較して、患者試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される少なくとも７個の遺伝子における発現の変化を検出し、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することと、を含む。
【００９９】
別の実施形態では、対象における肺癌を診断する方法は、
ａ．対象から血液試料を得ることと、
ｂ．試料を、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させることによって、対照と比較して、患者試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される少なくとも７個の遺伝子における発現の変化を検出し、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することと、
ｃ．対象の遺伝子の発現において参照のものからの変化が検出される場合に、対象を癌と診断することと、を含む。
【０１００】
さらに別の実施形態では、本方法は、
ａ．対象から血液試料を得ることと、
ｂ．試料を、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸの少なくとも７個の遺伝子の各異なる遺伝子転写産物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドを含む組成物と接触させることによって、対照と比較して、患者試料中の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸから選択される少なくとも７個の遺伝子における発現の変化を検出し、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリガンドと遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することと、
ｃ．対象の遺伝子の発現において参照のものからの変化が検出される場合に、対象を癌と診断することと、
ｄ．腫瘍成長を除去することと、を含む。
【０１０１】
Ｖ実施例
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は例示のみを目的
として提供され、本発明はこれらの実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意のおよびすべての変形例を包含すると解釈されるべきである。
【０１０２】
実施例１：患者集団−分析Ａ
本明細書に記載される遺伝子分類子の開発のために、血液試料および臨床情報を様々な対象から収集した。以下の表で特定するように、数名は肺癌の診断を有し、数名は良性結節の診断を有した。患者の特徴を以下の表ＶＩに示す。
【０１０３】
良性肺または悪性肺のいずれかと診断された患者を５つの病院から募集した：Ｃｈｒｉｓｔｉａｎａ  Ｃａｒｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｎｇｏｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔｈｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ、およびＴｅｍｐｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ。対象を、ＬＤＣＴまたは胸部ｘ線によって肺癌の存在について評価、または偶発的に肺結節と診断した。高リスク個体の試験集団は、年齢が５０歳超、喫煙年数が２０年超であった。
【０１０４】
「対照」コホートは、良性肺結節（例えば、すりガラス陰影、単一結節、肉芽腫、または過誤腫）を有する患者から得た。これらの患者に、肺疾患クリニックで評価を受けさせるか、または肺結節の胸部手術を施した。すべての試料を手術前に採取し、生検、気管支鏡検査、または結節は、少なくとも２年間の画像診断フォローアップの後で検出可能なサイズの変化がない場合に非癌と分類した。
【０１０５】
以下で述べるように、Ｔ１は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍのための遺伝子を選択するためにマイクロアレイ上で実行された試料であり、ＶＩは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ紙で使用されるＮＹＵ試料検証セットであり、ＳＩは、遺伝子を選択するためにマイクロアレイで使用されない「クリーンな」試料のフルセットである（Ｖ１を含む）。
【表６−１】
2021506308.tif 000009
【表６−２】
2021506308.tif 000010
【０１０６】
実施例２：試料収集プロトコルおよび処理
組織採取技術者がクリニックで血液試料を採取した。標準的な静脈切除技術により、血液試料をＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ試験管に直接採取した。これらの試験管には、直ちに細胞内ＲＮＡを安定させ、ＲＮＡ転写産物の体外分解または上方調節を最小限に抑える独自の試薬が含まれる。冷凍を排除し、試料をまとめ、収集後の試料処理の緊急性を最小限に抑えることができることにより、研究室効率が大幅に高まり、コストが削減される。
【０１０７】
実施例３−ＲＮＡ精製および品質評価
ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡは、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの精製を可能にするＱｉａｇｅｎ（商標）製の標準的な市販キットを使用して調製する。得られた総ＲＮＡをｍＲＮＡプロファイリングに使用する。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、ＲＮＡの品質を決定する。ＲＮＡ完全性数が３を超える試料のみをｎＣｏｕｎｔｅｒ上で使用した。
【０１０８】
簡潔に述べると、ＲＮＡは以下のように単離する。シェーカーインキュベーターをオンにし、５５℃に設定してから開始する。別途記載がない限り、遠心分離ステップを含む本
プロトコルのすべてのステップは、室温（１５〜２５℃）で行うこと。本プロトコルは、試料が−８０℃で保存されていることを想定する。Ｑｉａｇｅｎプロトコルに従い最低２時間室温に置いた未凍結試料を同じように処理すること。
【０１０９】
プラスチックラック中、Ｐａｘｇｅｎｅ管を直立させて解凍する。試験管を少なくとも１０回を反転させて混合した後、単離を開始する。すべての必要な試験管を準備する。各試料には以下のものが必要である。番号をふった１．５ｍｌエッペンドルフ型試験管２つ、試料情報付きのエッペンドルフ試験管１つ（これは最終試験管である）、Ｌｉｌａｃ  Ｐａｘｇｅｎｅスピンカラム１つ、Ｒｅｄ  Ｐａｘｇｅｎｅスピンカラム１つ、および処理試験管５つ。
【０１１０】
Ｑｉａｇｅｎ遠心分離器中のスイングアウトローターを使用して、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅを５０００×ｇで１０分間遠心分離する。（Ｓｉｇｍａ４〜１５℃遠心分離器、ローター：Ｓｉｇｍａ  Ｎｒ．１１１４０、７／０１、５５００／分、ホルダー：Ｓｉｇｍａ  １３１１５、２８６ｇ  １４／Ｄ、内部試験管ホルダー：１８０１０、１２５ｇ）。注記：解凍後、血液細胞の完全な溶解を達成するために、血液試料がＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ内で室温（１５〜２５℃）で最低２時間インキュベートされていることを確認する。
【０１１１】
フード下で上清を漂白剤にデカントして除去する。上清をデカントしたら、ペレットを乱さないように注意し、試験管の縁を清潔なペーパータオルで乾燥させる。凝固血液を、袋に入れた後、感染性廃棄物に入れて、デカントした上清を廃棄し、流体部分を流しに捨て、大量の水で洗い流す。ペレットに４ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水を加え、新しい第２のＨｅｍｏｇａｒｄ閉鎖具を使用して試験管を閉じる。
【０１１２】
ペレットが目に見えて溶解するまでボルテックスする。再度、遠心分離ホルダー内で試験管を計量して、平衡であることを確認し、スイングアウトローターＱｉａｇｅｎ遠心分離器を使用して５０００×ｇで１０分間遠心分離する。ボルテックス後、遠心分離前に上清に残っている小さな残屑は、手順に影響しない。
【０１１３】
上清全体を除去して廃棄する。試験管を逆さまにして１分間放置し、すべての上清を流出させる。上清の除去が不完全であると、溶解が妨げられ、溶解物が希釈されるため、ＲＮＡをＰＡＸｇｅｎｅ膜に結合させるための条件に影響が出る。
【０１１４】
３５０μＬの緩衝液ＢＭ１を加え、上下にピペットし、ペレットを溶解させる。
【０１１５】
再懸濁した試料を、ラベル付けした１．５ｍｌマイクロ遠心分離管にピペットする。３００μｌの緩衝液ＢＭ２を加える。その後、４０μｌのプロテイナーゼＫを加える。５秒間ボルテックスして混合し、エッペンドルフサーモミキサー上、８００ｒｐｍ、最大速度でシェーカーインキュベーターを使用して、５５℃で１０分間インキュベートする。（サーモミキサーの代わりに振動水浴を使用する場合は、試料をインキュベーション中２〜３分おきに素早くボルテックスする。ボルテックス器をインキュベーターの横に置いておく）。
【０１１６】
溶解物を２ｍｌ処理試験管内に置いたＰＡＸｇｅｎｅ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム（ライラック試験管）に直接ピペットし、ＴＯＭＹ  Ｍｉｃｒｏｔｗｉｎ遠心分離器中、１８，５００ｘｇ、２４℃で、３分間遠心分離する。溶解物を慎重にスピンカラムにピペットし、溶解物が完全にスピンカラムに移されていることを目視確認する。カラムおよび試験管の損傷を防ぐため、２０，０００×ｇを超えないこと。
【０１１７】
流入部分の上清全体を、処理試験管内のペレットを乱すことなく、新たな１．５ｍｌマイクロ遠心分離管に慎重に移す。処理試験管内のペレットを廃棄する。
【０１１８】
７００μＬのイソプロパノール（１００％）を上清に加える。ボルテックスにより混合する。
【０１１９】
６９０μｌの試料を、２ｍｌ処理試験管内に置いたＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラム（赤色）にピペットし、１０，０００ｘｇで１分間遠心分離する。スピンカラムを新たな２ｍｌ処理試験管内に置き、素通り分を含む古い処理試験管を廃棄する。
【０１２０】
残りの試料をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラム（赤色）にピペットし、１８，５００ｘｇで１分間遠心分離する。スピンカラムを新たな２ｍｌ処理試験管内に置き、素通り分を含む古い処理試験管を廃棄する。試料を慎重にスピンカラムにピペットし、試料が完全にスピンカラムに移されていることを目視確認する。
【０１２１】
３５０μｌの緩衝液ＢＭ３をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムにピペットする。１０，０００ｘｇで１５秒間遠心分離する。スピンカラムを新たな２ｍｌ処理試験管内に置き、素通り分を含む古い処理試験管を廃棄する。
【０１２２】
ステップ１３のためにＤＮａｓｅ  Ｉインキュベーションミックスを調製する。１０μｌのＤＮａｓｅ  Ｉストック溶液を、１．５ｍｌマイクロ遠心分離管内の７０μｌの緩衝液ＲＤＤに加える。試験管を軽く振ることによって混合し、手短に遠心分離して、試験管の横から残留液を収集する。
【０１２３】
ＤＮａｓｅ  Ｉインキュベーションミックス（８０μｌ）をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラム膜に直接ピペットし、１５分間ベンチトップ（２０〜３０℃）に置く。ＤＮａｓｅ  Ｉインキュベーションミックスが膜に直接置かれていることを確認する。ミックスの一部がスピンカラムの壁またはＯリングに塗布されるかまたはその上に残っていると、ＤＮａｓｅの消化は不完全となる。
【０１２４】
３５０μｌの緩衝液ＢＭ３をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムにピペットし、１８，５００ｘｇで１５秒間遠心分離する。スピンカラムを新たな２ｍｌ処理試験管内に置き、素通り分を含む古い処理試験管を廃棄する。
【０１２５】
５００μｌの緩衝液ＢＭ４をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムにピペットし、１０，０００ｘｇで１５秒間遠心分離する。スピンカラムを新たな２ｍｌ処理試験管内に置き、素通り分を含む古い処理試験管を廃棄する。
【０１２６】
別の５００μｌの緩衝液ＢＭ４をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムに加える。１８，５００ｘｇで２分間遠心分離する。
【０１２７】
素通り分を含む試験管を廃棄し、ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムを新たな２ｍｌ処理試験管内に置く。１８，５００×ｇで１分間遠心分離する。
【０１２８】
素通り分を含む試験管を廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムを、ラベル付けした１．５ｍｌマイクロ遠心分離管（最終試験管）内に置き、４０μｌの緩衝液ＢＲ５をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラム膜に直接ピペットする。１０，０００ｘｇで１分間遠心分離して、ＲＮＡを溶出させる。最大限の溶出効率を達成するために、膜全体を緩衝液ＢＲ５で湿潤することが重要である。
【０１２９】
４０μＬの緩衝液ＢＲ５および同じマイクロ遠心分離管を使用して、記載のように溶出ステップを繰り返す。２０，０００×ｇで１分間遠心分離して、ＲＮＡを溶出させる。
【０１３０】
溶出物を、シェーカーインキュベーター内で、６５℃で５分間、振らずにインキュベートする。インキュベーション後、直ちに氷上で冷やす。この６５℃でのインキュベーションにより、下流用途のためにＲＮＡを変性させる。インキュベーター時間または温度を超えないこと。
【０１３１】
ＲＮＡ試料を直ちに使用しない場合は、−２０℃または−７０℃で保管する。ＲＮＡは繰り返し凍結および解凍すると変性したままとなるため、６５℃でのインキュベーションを繰り返す必要はない。
【０１３２】
実施例４：ＲＮＡレベルの測定
肺癌を診断するために臨床診療で使用され得るバイオマーカーシグネチャーを提供するため、表Ｉで特定される遺伝子の８個以上、および表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、または表ＩＸで特定される遺伝子の１５個以上、または表ＩＶで特定される７個以上の遺伝子を使用することにより、満足できる精度を維持する遺伝子の数が最も少ない遺伝子発現プロファイルが提供される。これらの遺伝子プロファイルまたはシグネチャーにより、標準的な臨床検査室で使用するのが簡単である、より単純で実用的な検査が可能となる。差別的遺伝子の数が十分に少ないので、これらの遺伝子発現プロファイルを使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームが開発される。
【０１３３】
Ａ．ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ  ＮＣＯＵＮＴＥＲ（登録商標）プラットフォーム遺伝子発現アッセイのプロトコル
上記のように、Ｐａｘｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡキットを使用して、全血から全ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ品質について試料を検査した。ＲＮＡ  Ｎａｎｏチップ上のＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、試料の完全性を確認する指標として、ＲＩＮスコアおよびエレクトロフェログラム画像を使用して、試料を分析した。また、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ−１０００分光光度計）で試料を定量すると、２６０／２８０および２６０／２３０の測定値が記録され、これをＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ適合性について評価した。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより得られた濃度から、ヌクレアーゼを含まない水を希釈剤として、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇが提供するチューブストリップに５μＬ中１００ｎｇを含むように、全ＲＮＡ試料を正規化した。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＣｏｄｅＳｅｔとハイブリダイゼーション緩衝液との混合物の８μＬのアリコート（７０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液、１２アッセイあたり４２μＬのＲｅｐｏｒｔｅｒ  ＣｏｄｅＳｅｔ）、および２μＬのＣａｐｔｕｒｅ  ＰｒｏｂｅＳｅｔを、各５μＬのＲＮＡ試料に加えた。サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で、試料を６５℃で１９時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの間、ユーザーにとって関心のある各ｍＲＮＡに特異的な蛍光バーコードを有するレポータープローブ、およびビオチン化捕捉プローブは、それらの関連する標的ｍＲＮＡに結合して、標的−プローブ複合体を創出する。ハイブリダイゼーションが完了した後、続いて、試料を標準プロトコル設定（実行時間：２時間３５分）を使用して、処理のためにｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎに移した。Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎロボットは、標準プロトコルの間に、試料を洗浄して、過剰なレポーターおよび捕捉プローブを除去する。試料をストレプトアビジンでコーティングしたカートリッジに移動させ、ここで、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒによるイメージングの準備のために、精製された標的−プローブ複合体を固定した。完了時、カートリッジを密封し、５５５で視野（ＦＯＶ）設定を使用して、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒに置いた。蛍光顕微鏡は、標的ｍＲＮＡに関連する各固有のバーコードの粗数を集計した。収集したデータは、．ｃｓｖファイルに保存し、製造業者の説明書にしたがって、分析のためにバイオインフ
ォマティクス施設に転送した。
【０１３４】
実施例５：バイオマーカーの選択
Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＳＶＭ）は、遺伝子機能の発見および分類のための遺伝子発現データセットに適用され得る。ＳＶＭは、より密接に関連する症例とそのマージンに存在する対照とを区別するのに最も効率的であることが判明している。主に、ＳＶＭ−ＲＦＥ（４８、５４）を使用して、臨床的に定義されたクラスの患者を、臨床的に定義されたクラスの対照（喫煙者、非喫煙者、ＣＯＰＤ、肉芽腫など）と区別する遺伝子発現分類子を開発した。ＳＶＭ−ＲＦＥは、再帰的に、分析される２つのクラスの間の識別に貢献することに基づいて、遺伝子を除去する当該分野で利用されるＳＶＭベースのモデルである。係数加重による最も低い得点の遺伝子を除去し、残りの遺伝子を再度採点し、少数の遺伝子のみが残るまで手順を繰り返した。この方法は、分類および遺伝子選択の作業を行うために、いくつかの研究で使用されてきた。しかしながら、アルゴリズムパラメータ（ペナルティパラメータ、カーネル関数など）の適切な値を選択することは、多くの場合、性能に影響し得る。
【０１３５】
ＳＶＭ−ＲＣＥは、ＳＶＭ−ＲＦＥのように、分類子への遺伝子の相対寄与を評価するという点で、関係のあるＳＶＭベースのモデルである。ＳＶＭ−ＲＣＥは、個々の遺伝子の代わりに、相関遺伝子のグループの寄与を評価する。加えて、両方法ともに、各ステップで最も重要でない遺伝子を除去するが、ＳＶＭ−ＲＣＥは、遺伝子クラスターを採点して除去し、一方、ＳＶＭ−ＲＦＥは、アルゴリズムの各ラウンドで単一または少数の遺伝子を採点して除去する。
【０１３６】
ここでは、ＳＶＭ−ＲＣＥ法について簡単に説明する。低発現遺伝子（平均発現は、２倍未満のバックグラウンド）を除去し、分位正規化を実施し、次いで、発現値の中央値がデータセットの中央値から３シグマ超異なる「外れ値」アレイを除去した。残りの試料は、アルゴリズムの１０倍相互検証の１０回の反復を使用するＳＶＭ−ＲＣＥに供した。遺伝子は、ｔ検定（訓練セットに適用）により、最終的な結果において、最高精度を生じる実験的に決定された最適値まで減少させた。これらの開始遺伝子は、Ｋ平均により、平均サイズが３〜５遺伝子である相関遺伝子のクラスターにクラスター化した。３倍の再サンプリングを５回繰り返して、各クラスターにＳＶＭ分類採点を行い、得点が最低であったクラスターを排除した。試料の残された１０％（試験セット）を使用して、生存している遺伝子プールについて精度を決定し、上位得点の１００個の遺伝子を記録した。この手順をクラスター化ステップから２クラスターの終点まで繰り返した。最適遺伝子パネルは、最も頻繁に選択された遺伝子から始まる、最大精度を付与する遺伝子の最小数であるように取った。このパネル内の個々の遺伝子のアイデンティティが決まっていないのは、順序が、所与の遺伝子が上位１００個の情報提供性遺伝子の中で選択された回数を反映しており、この順序はある程度の変動を受けるからである。
【０１３７】
Ａ．バイオマーカーの選択
良性結節から癌性腫瘍を識別する際に得点が最も高い（ＳＶＭによる）遺伝子を、臨床検査に対するそれらの有用性について試験した。考慮される要因には、クラス間の発現レベルのより高い差異、およびクラス内の低い変動性が含まれる。検証のためにバイオマーカーを選択するときには、相関遺伝子の選択を回避し、ＰＣＲおよび／または免疫組織化学を含む代替技術によって、堅牢な差次的発現レベルを有する遺伝子を特定するために、異なる発現プロファイルを有する遺伝子を選択する努力がなされた。
【０１３８】
Ｂ．検証
３つの検証方法を検討した。
【０１３９】
相互検証：データセット内のオーバーフィットを最小限に抑えるために、データセットをＫ個のパートにランダムに分割し、Ｋ−１個のパートを訓練用に、１個を試験用に使用する場合、Ｋ倍の相互検証（通常Ｋは１０に等しい）を使用した。このため、Ｋ＝１０の場合、アルゴリズムを、患者の９０％および対照の９０％のランダム選択で訓練し、次いで、残りの１０％で試験した。これを、すべての試料が試験対象として用いられ、累積された分類子がすべての試料を使用するまで繰り返したが、いずれの試料も、それが一部である訓練セットを使用しては試験しなかった。ランダム化の影響を軽減するために、Ｋ倍分離をＭ回行って、毎回Ｋ倍の各々において患者と対照との異なる組み合わせを生成した。したがって、個々のデータセットについて、訓練セットおよび試験セットの順列選択のＭ＊Ｋラウンドを、遺伝子の各セットについて使用した。
【０１４０】
独立した検証：データの再現性および分類子の一般性を推定するには、１つのデータセットを使用して構築された分類子を調べ、別のデータセットを使用して試験して、分類子の性能を推定する必要がある。性能を推定するために、元のデータセットで開発した分類子を使用して、第２のセットの検証を実行した。
【０１４１】
さらなる検証：このようにして開発された分類子の一般性を試験するために、これを、分類子の開発に使用されなかった独立した試料セットを分類するために使用した。順列分類子と元の分類子との相互検証精度を独立した試験セットで比較し、新しい試料の分類におけるその妥当性を確認した。
【０１４２】
Ｃ．分類子の性能
各分類子の性能を異なる方法によって推定し、いくつかの性能測定値を使用して、分類子を互いに比較した。これらの測定値には、精度、ＲＯＣ曲線下面積、感度、特異性、真陽性率、および真陰性率が含まれる。目的の分類の必要な特性に基づいて、異なる性能測定値を使用して、最適な分類子を選択することができ、例えば、集団全体のスクリーニングで使用する分類子は、疾患のわずかな（約１％）有病率を補い、したがって多数の偽陽性ヒットを回避するために、より良い特異性を必要とする一方で、入院中の患者の診断分類子はより感度が高くあるべきである。
【０１４３】
良性結節から癌性腫瘍を診断するには、患者が既に高リスクであるため、特異性より感度が高いことが望ましい。
【０１４４】
実施例６：分類子の試験
末梢血液試料をすべてＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ安定化試験管に採取し、ＲＮＡを製造業者に従って抽出した。試料を５５９個のプローブのカスタムパネル（表Ｖ）に対してＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）で試験した（上記のとおり）。
【０１４５】
５５９個の分類子について、４３２個は以前のマイクロアレイデータに基づいて選択し、１０７個のプローブはＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ試験から選択し、２０個はハウスキーピング遺伝子であった。ＱＣについては、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＮＡ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、試験した３６個の試料の各バッチに含めた。プローブ発現値を、２０個のハウスキーピング遺伝子、ならびにＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ（分類子に含まれる）によって供給されるスパイクイン陽性対照および陰性対照を使用して正規化した。Ｚｓｃｏｒｅｓ  ｗｅｒｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｅ  ｃｏｕｎｔ  ｖａｌｕｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｒｖｅｄ  ａｓ  ｔｈｅ  ｉｎｐｕｔ  ｔｏ  ａ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ  （ＳＶＭ）
ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ  ｋｅｒｎｅｌ．分類性能を、試料の１０倍の相互検証によって評価した。
【０１４６】
Ａ．分類子
以下の表ＶＩＩおよび図１Ａ〜ＩＢに示されるように、すべての試料上の開発された５５９の分類子が、訓練セット（図１Ａ）で０．８６、試験セット（図ＩＢ）で０．８５のＲＯＣ−ＡＵＣを示した。９０％に設定した感度では、特異性は、それぞれ、６２．９％および５５．１％である。
【０１４７】
訓練セット試料および試験セット試料からのデータを、パネル全体で達成された性能を維持するために必要な最小数のプローブを特定するために、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇプラットフォーム上でＷ５５９によって分析した。前述のように、プローブ選択にはＳＶＭ−ＲＦＥを使用した。以下の表ＶＩＩに示すように、試料を訓練セットおよび試験セットのためにランダムに選択した。試験セットで得られた精度を図ＩＢに示す。分類子のＲＯＣ曲線を図２に示す。
【０１４８】
表ＩＶの最初の１００個の遺伝子について、感度９０％で、訓練セットでは約６３％、検証セットでは約５８％の特異性が示された。
表ＩＶの最初の５０個の遺伝子について、感度９０％で、訓練セットでは約５８％、検証セットでは約５６％の特異性が示された。表ＩＶの最初の１５個の遺伝子について、感度９０％で、訓練セットでは約５１％、検証セットでは約４６％の特異性が示された。表ＩＶの最初の７個の遺伝子について、感度９０％で、訓練セットでは約６７％、検証セットでは約４６％の特異性が示された。
【表７】
2021506308.tif 000011
【０１４９】
Ｂ．さらなる分析
さらなる分析を行い、表Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩの遺伝子分類子を開発した。
【０１５０】
実施例７：１５マーカーパネル
肺癌は、依然として世界中で癌に関連した死亡の主因であり、これは、一部には十分な早期発見プロトコルが不足しているため、一部には一般的な早期症状が無視されやすいた
めである。低線量コンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）による肺癌スクリーニングが、高リスクの現喫煙者および元喫煙者（５０歳超、箱年３０超）の死亡率を低減することができるという実証（１、２）により、ＬＤＣＴ肺スクリーニングが顕著に増加している。ＬＤＣＴは従来のＸ線よりも著しく小さい結節を特定することができるが、この能力は、比率の小さい悪性の結節を比率の大きい良性の結節から区別するという後続の課題を伴う（３）。ＮＬＳＴは、患者５６の４０％において直径４ｍｍ以上の肺結節を検出し、陽性スキャンの９６．４％が偽陽性でスクリーニングした（４）。これは、４〜２０ｍｍの範囲の不定肺結節（ＩＰＮ）のクラスにとって特に問題である（４）。
ますます多くのＬＤＣＴスキャンによって検出されるＩＰＮＳは臨床的ジレンマを表すが、それらはまた、増殖の最初期段階で肺癌を発見し得る機会を提供する。発明者らによる以前の研究において、急速に精製された（２時間以内）ＰＢＭＣは、高精度で良性肺結節を悪性肺結節から正確に区別することができる遺伝子発現データを含んでいることが実証された（ＲＯＣ−ＡＵＣ０．８６）（５）。発明者らは、ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡ安定化チューブにより、試料収集時にＲＮＡプロファイルが捕捉されて、多くの異なる臨床環境で試料を収集できる可能性が提供されることをここに報告する。ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡは室温で５〜７日間安定であり、これにより、多くの他の日常的血液検査と同様に、中央検査施設に移すことができる（６〜８）。ＲＮＡが−２０℃〜−８０℃で７年超の間安定であることは、大型研究にとってさらなる利点である。この収集および安定化の容易さには、全血ＲＮＡが、ＰＢＭＣ試料に含まれない顆粒球および好中球を含むより広範な種類の血液細胞からの情報を含むこと、ならびに結果として、正確な遺伝子発現シグネチャーを識別することがより複雑であり得るという注意が伴う。この研究の主な目的は、（ｉ）全血由来のＰＡＸｇｅｎｅ安定化ＲＮＡが、ＬＤＣＴによって検出された悪性肺結節と良性肺結節とを正確に区別することができる遺伝子発現情報を取り出すことに成功することができるかどうかを実証すること、および（ｉｉ）全転写産物Ｉｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイ上で開発された診断シグネチャーが、Ｐｒｏｓｉｇｎａ（商標）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ予後アッセイのためにＦＤＡが承認したより堅牢で臨床的に確立されたＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームに移行することができるかどうかを判定することであった（９）。
発明者らは、独立した検証において０．８４７のＲＯＣ−ＡＵＣでＩｌｌｕｍｉｎａ全ゲノムマイクロアレイに基づく肺結節分類子（ＬＮＣ）の開発に成功したことをここに報告する。発明者らはさらに、そのマイクロアレイ分類子を、独立した検証において０．８４６の実証ＲＯＣ−ＡＵＣで、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）プラットフォームに移行させることに成功したことを記載する。このｎＬＮＣは、現在のＩＰＮジレンマに対処する可能性、および肺癌過剰治療に対する可能性を有する。
【０１５１】
全血遺伝子発現は悪性肺結節をＬＤＣＴによって検出された良性肺結節から区別する。
血液試料は、５つの臨床施設において、ＲＮＡ安定化ＰＡＸｇｅｎｅチューブに前向きに採取した。試料は、全員肺結節がＬＤＣＴまたはＸ線によって検出されている、肺癌のリスクが高い患者（５０歳超、箱年２０超）から得られた。結節を、気管支鏡検査、生検、および／もしくは肺切除によって、または少なくとも２年間のＬＤＣＴフォローアップによって、悪性（ＭＮ）または良性（ＢＮ）として確認した。精製されたＰＡＸｇｅｎｅ試料ＲＮＡ（方法を参照）をＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈ１２ｖ４マイクロアレイ上でアッセイし、ＰＢＭＣからのＲＮＡを使用して達成したものと同様の精度で、肺結節分類子を開発するためにＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡを使用することの実現可能性を評価した（５）。マイクロアレイ試験に使用した患者の人口統計を表ＶＩＩＩに示す。試験患者は、主に、喫煙歴が箱年２０超である５０歳超の喫煙者および元喫煙者である。モデルを開発するために使用した癌は早期であり、試験集団の８４％がＩ期およびＩＩ期の癌、検証セットの癌の１００％がＩ期である。データを、前述のようにＳＶＭ−ＲＦＥを使用して分析した（５、１０）。
【表８】
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【０１５２】
悪性および良性肺結節を最も正確に区別した遺伝子プローブ分類子を特定し、１０倍の１０再サンプリング相互検証ＳＶＭ−ＲＦＥ法を使用して、漸減する遺伝子プローブの数による分類性能の変化を評価するために、２６４個の試料の訓練セット（表ＶＩＩＩ）を分析した（５、１０）。分類の精度は広範囲のプローブ数にわたって安定していたが、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、プローブを排除するにつれてわずかに減少した。１０００個のプローブを使用すると、０．８８のＡＵＣが達成され、１５０個では、０．８５のＡＵＣが生成された。わずか１５個の遺伝子であっても、０．８超のＡＵＣで訓練セットを分類するのに十分であった。１０００個の遺伝子によって達成されたＡＵＣの１％以内にＡＵＣを維持する最小数の遺伝子プローブを選択し、０．８６６のＡＵＣを生成した３１１個の遺伝子プローブの分類子を特定した（データ図示せず）。この性能は、分類子を独立した患者検証セットに適用したときに維持され（表ＶＩＩＩ列右）、０．８４７のＡＵＣを達成して（データは図示せず）、肺癌の存在に関連する堅牢なシグナルが、発明者らの以前に公開したＰＢＭＣ結果と同様の全体的な性能で、ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡにおいて検出され得ることが確認された。
【０１５３】
ＰＡＸｇｅｎｅ試料からのＲＮＡが、高い精度で、イメージングによって検出された悪性肺結節と良性肺結節とを区別できることを検証した後、発明者らは、マイクロアレイに
基づくＬＮＣを臨床的により適切なＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームに移行させる戦略を開発した（９）。
【０１５４】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームへの移行
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ診断遺伝子発現パネルに対するプローブを選択するために、いくつかの検討事項を考慮した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現測定値がＩｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイプラットフォームの性能をどの程度再現するか分からないまま、プラットフォームの違いを克服することができるように十分な冗長性を含むように独自のカスタムパネルを設計し、異なる基準によって選択された遺伝子プローブを含めた。選択に使用した主な方法はＳＶＭ−ＲＦＥであった。ＳＶＭは分類モデルを開発するための強力なツールであるが、マイクロアレイ上で良好に性能を発揮するいくつかのプローブがＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォーム上では同等の性能を発揮しない可能性を考慮した。発明者らの関係のある遺伝子のプールを増大させるために、比較全体でｐ値が最小（ｐ＜１０−４）の５９個のプローブ、および分類においてｐ＜０．０１で倍数変化が最大である７６個のプローブも選択した。また、マイクロアレイのバックグラウンドの５倍超で発現した候補のハウスキーピング遺伝子を特定し、絶対値では変動係数が２０％未満、対数２スケールの発現値では２．５％未満であった。上位１２個の最小可変候補および８個の追加の既知のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇハウスキーピング遺伝子を、２０個のハウスキーピング遺伝子の最終リストに選択した。
【０１５５】
マイクロアレイとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームとの間の大きな違いの１つは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ上の遺伝子発現を評価するために酵素処理を必要としないことである。これは、逆転写、および遺伝子標的のＰＣＲ増幅が分析に関連しないことを意味する。この試料処理の最小化により、増幅バイアスの可能性が排除され、プラットフォームが臨床用途に魅力的となるが、選択されたバイオマーカーのいくつかは、ＰＣＲ増幅なしで検出するには低すぎるレベルで発現される可能性がある。この問題に対処するために、発明者らは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅパネル（カタログ番号ＸＴ−ＣＳＯ−ＨＩＰ１−１２）上のＩｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイ訓練セットからの試料の大部分を分析して、各プラットフォームによって検出され得る遺伝子発現のレベルを相関させた。１１５個のＭＮ試料および１０５個のＢＮ試料を含む２２０個の訓練試料を分析した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅパネルに示された７７０個の遺伝子のうち７５５個がマイクロアレイプラットフォームにも示されたが、遺伝子プローブは異なった。２つのプラットフォーム間で厳密なプローブは異なったが、この分析により、両方のプラットフォームで堅牢に検出することができる遺伝子発現レベルの推定が提供された。試験により、５倍のマイクロアレイのバックグラウンドレベルで検出されたプローブが、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ上で堅牢に検出されたことが示唆された。
また、これらのプローブがＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォーム上で良好に連携していることがすでに十分に検証されているため、ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅパネル試験を追加の発見プラットフォームとして使用した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅパネルパネルの性能精度を推定するために、１０倍の１０再サンプリングＳＶＭを使用した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇパネルは、ＡＵＣがマイクロアレイ訓練セットで達成された０．８６６と比較して０．７５４と低い性能を示したが、感度９０％では、特異性は依然として３７％であり、発明者らのカスタムパネルに含めるためにセットの１０６個のプローブを選択した。また、今後の試験で検討するために、発明者らの以前のＰＢＭＣ試験において、診断、転帰、および／または切除後遺伝子発現変化に関連していると特定された追加の５５個のプローブを追加した（１１、１３）。
【０１５６】
ＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームとを使用した分類間の類似性を評価するために、プローブの差異および２つのプラットフォーム技
術の差異を考慮して、２７６個のＳＶＭ−ＲＦＥプローブを使用して両方のプラットフォームで実行した２２２個の訓練セット試料。２７６個のＳＶＭ−ＲＦＥプローブのみを考慮して、両方のプラットフォームを使用してこれらの試料の相互検証ＳＶＭ得点を比較すると、プラットフォーム間で０．７２のスピアマン相関が観察され、これを新たな試料の評価に進むのに十分であるとみなした。４１４個の試料を５５９プローブカスタムＮａｎｏＳｔｒｉｎｇパネル上でアッセイした。目的のＩＰＮ集団を構成する範囲である８〜２０ｍｍの病変を有する１４２個の試料を利用した。残りの２７２個の試料をモデルの訓練に使用した。この訓練セット上で開発されたモデルは、０．８１３のＡｕｃを示し、検証セット上では０．８２０のＡＵＣを達成した（データ図示せず）。これにより、遺伝子選択アプローチが有効であったことが確認された。
【０１５７】
再帰的特徴排除（ＲＦＥ）を使用して、モデルをさらに精緻化した。ＳＶＭ−ＲＦＥを訓練セットに適用すると、分類子性能が１５のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプローブまで安定しており、ｎＬＮＣは訓練ＡＵＣ＝０．８６７を返すことが明らかになった（図２）。独立した検証セットに対して決定されるＡＵＣは、１５個の遺伝子についてＡＵＣ＝０．８４３で同様に安定しているが、分類において５０個未満のプローブを使用すると、ＡＵＣの検証可能性が増加し、９０％感度での特異性がわずかに低下し始める。一実施形態では、１５または５０個の遺伝子は、表ＩＩまたは表ＩＩＩの遺伝子から選択される。
【０１５８】
正規化された条件下で収集されたＰＢＭＣのＲＮＡにおける遺伝子発現に関する発明者らのこれまでの試験により、末梢血が、悪性肺結節を良性肺結節から区別するための情報を含んでいるだけでなく、予後と相関する情報も含んでいることが示された。現試験で、発明者らは、１）試料収集の簡素化、および２）アッセイを臨床的にアクセス可能なプラットフォームに移動するという２つの目標に取り組んだ。最初の目標に取り組むにあたって、ＰＡＸｇｅｎｅ収集チューブを使用した単純で正規化が容易な試料収集方法を実施した。これにより、大学センターだけでなく、これまでの試験では簡単には含められなかった地域センターでも試料の収集が可能となった。このパイロット試験により、ＰＡＸｇｅｎｅチューブに収集された全血ＲＮＡを使用して、悪性肺結節を有する患者を、ますます多くのスクリーニングプログラムによって検出された良性肺結節を有する多数の個体からを正確に区別することの実現可能性が確立される。Ｐａｘｇｅｎｅ試料収集が容易であることにより、肺癌の多様性に対処するために必要な大規模な試験を請け負うことができた。この試験では、主に、肺癌の中で最も一般的なＮＳＣＬＣ、より小さい早期癌、ならびにリスクの高い喫煙者および元喫煙者に焦点を当てた。
【０１５９】
設定した第２の目標は、ＬＮＣをマイクロアレイ発見プラットフォームから臨床的に適切な検出プラットフォームに移動させることであった。試料の扱いやすさ、ならびに発明者らのＰＢＭＣ試験で見出したバイアスおよびバッチ効果をもたらすことが知られている酵素ステップの多くを排除できることを根拠に、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを選択した。また、必要な試験試料の量も簡単に得られる。ここで報告するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイのすべてに１００ｎｇのＲＮＡを使用したが、わずか１０ｎｇでも可能である。より多くの量のＲＮＡがプラットフォームと適合性があるが、ＲＮＡの量を増加させるよりも、ＦＯＶ  ５５０のより高感度の走査設定を使用することのほうが、シグナルの増加により有効であることを見出した。
【０１６０】
試薬バッチ、担当者の変更、および試料供給源と関係したＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子パネルの安定性も試験し、顕著なバッチ効果は検出されなかった。
万能ヒトＲＮＡ標準を、最初に各１２個の試料カセットに含めた。スキャナおよびアッセイ性能を評価するために、これを週に１回に減らした。マイクロアレイ試験のためには、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）が７．５超である必要であり、かつＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＩＮは慣習的には８．０超であるが、解凍し、−８０℃の冷凍庫故障下で再凍結させたＰＡＸｇ
ｅｎｅ試料由来のＲＮＡもアッセイすることができた。ＲＩＮがわずか３．２である５個のＲＮＡ試料を評価した。全体的なシグナル強度は、十分にＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ品質制御パラメータ内であった。加えて、スキャントラブルが発生した場合、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇが推奨するように保管されていれば、情報の損失がほとんどまたは一切なく、カセットを２４時間以内に再度スキャンすることができる。
【０１６１】
実施例８：４１マーカーパネル（表ＩＸ）
タバコの喫煙が認められた根本原因であるため、肺癌は依然として世界中で癌に関連した死亡の主因である。これは、一部には早期発見プロトコルが十分でないこと、一部には早期症状が極めて潜行性であることに起因する。低線量コンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）による肺癌スクリーニングが、高リスクの現喫煙者および元喫煙者（５５歳超、箱年３０超）の死亡率を低減するという実証（１〜３）は、ＬＤＣＴスクリーニングプログラムにおける全体的な増加に繋がった。（４）ＬＤＣＴは確かに従来のＸ線に比べて著しく小さい結節を特定するが、この能力は、比率の小さい悪性の結節を比率の大きい良性と検出された結節から区別する課題を伴う（５）。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｒｉａｌ（ＮＬＳＴ）では、スクリーニングした患者の４０％において直径４ｍｍ以上の肺結節が検出され、３ラウンドのスクリーニングで９６．４％が偽陽性であった（６）。この高いＦＰＲを低減するために、最近の肺−ＲＡＤ分類（７）およびＦｌｅｉｓｃｈｎｅｒ群からの新しいガイドライン（８）は、６ｍｍ以上の結節の検出を陽性閾値として設定した。しかしながら、陽性ＣＴスキャンは、最良の臨床行動指針が明確に定められていない、サイズが６〜２０ｍｍの範囲のクラスの不定肺結節（ＩＰＮ）について特に問題が残っている（６）。
【０１６２】
発明者らによる以前の研究により、急速に精製された（２時間以内）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、高精度で良性肺結節を悪性肺結節から区別することができる遺伝子発現データを含んでいることが実証された（９）。本研究は、肺癌の初期段階であっても、悪性腫瘍を予測するＰＢＭＣにおける遺伝子発現が影響を受けることを示すことによって、結節診断における新たなパラダイムを確立した。しかしながら、このアプローチは、試料の一貫性およびＲＮＡの完全性を維持するために、血液試料からＰＢＭＣを迅速に精製する必要性によって制限された。これにより、ほとんどの地域のクリニックおよび診療所を含む、ＰＢＭＣの迅速な単離ができない環境での試料の収集が困難であった。加えて、診断開発に非常に有用であったマイクロアレイは、技術的に複雑であり、試薬バッチおよび酵素処理に関連する可変性を生じやすいため、臨床用途にあまり適していない。マイクロアレイ試験に必要な高品質のＲＮＡは、患者由来の試料を用いた試験にも問題となる可能性がある（１０）。本後向き／前向き研究は、発明者らのＰＢＭＣ試験（９）で達成したものと同様の精度を、ＲＮＡ安定化ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）チューブ内に収集した全血由来のＲＮＡで達成することができるかどうかを決定することを試みるものであった。ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡは、収集時に安定化され、直ちに遺伝子発現パターンを固定する。ＲＮＡは、１５〜２５℃で５日間、および−２０〜−７０℃で８年間安定である。これにより、貯蔵または細胞精製のための特別な機器を必要とせずに血液を採取する任意の臨床環境で試料を採取することができ（１１〜１３）、他の血液検査と同様に日常的に、試料を中央施設に移して検査することができるようになる。加えて、ＲＮＡの完全性を損なわない長期貯蔵により、システムが後向き分析に十分に適したものとなる。また、Ｉｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイ上で開発されたＰＡＸｇｅｎｅシグネチャーが、Ｐｒｏｓｉｇｎａ（商標）乳癌予後アッセイ（１４）のために既にＦＤＡにより承認され、より最近ではＰＤ−１チェックポイント遮断に対する臨床応答を予測する臨床グレードアッセイを開発するために使用されているＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームに移行させることができるかどうかも問うた。このＰＤ−１アッセイは、進行中のペムブロリズマブ臨床試験において現在評価されている（１５）。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイは、いずれの酵素反応または増幅ステップも含まないため、このシステムは、試料の取り扱い
を最小限に抑えることによって交差汚染の機会を減少させながら、可能性のある試薬バッチ効果およびＰＣＲバイアスを回避する。全血由来の遺伝子発現プロファイルがより複雑であり、重要な診断シグナルの低減をもたらす可能性があることは認識していたが、重要な追加の細胞型が分類子性能に貢献し得るという見込みもあった。
【０１６３】
ここでは、ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ安定化チューブを使用して収集された全血中の遺伝子発現が、独立した検証においてＬＤＣＴによって検出された良性肺結節と悪性肺結節とを高い精度で区別することができたこと、およびこの肺結節分類子をマイクロアレイ開発プラットフォームからＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）プラットフォームに移行させることに成功したことを報告する。
【０１６４】
試験設計
すべての研究にわたるバイオマーカーの選択および検証のプロセスを、図
３に要約する。悪性（ＭＮ）および良性（ＢＮ）の肺結節を有する患者からの合計８２１個の試料を、３つのプラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｐａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ（ＰＣＩ）パネル、および最後に特注のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカスタムパネルにわたって分析し、４臨床施設からの２６４個の患者試料由来のマイクロアレイデータ（表ＶＩＩＩ、表ＸＩＩＩ）をマイクロアレイモデル開発に使用した。性能の推定は、５１個の試料の独立した検証セットに基づいた。加えて、２６４個のマイクロアレイ試料のうちの２０１個を含む２２０個の試料を、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＰＣＩプラットフォーム上で分析し、カスタムＮａｎｏＳｔｒｉｎｇパネルに含める追加のバイオマーカーを選択した。バイオマーカー選択プロセスに含まれなかった第５の収集施設からの試料は、カスタムＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォーム上でのみ分析した。最終的なｎＰＮＣを、５８３個の訓練試料（元々マイクロアレイ訓練セットで使用した２１５個の試料、およびバイオマーカー選択に使用したことのない３６８個の試料（７０％）を含む）を使用してカスタムＮａｎｏｓｔｒｉｎｇパネルから生成されたデータ上で開発し、プローブ選択に関与したことのない１５８個の独立した試料のセットを使用して検証した。
【表９】
2021506308.tif 000013
【０１６５】
試験集団
試料は、Ｈｅｌｅｎ  Ｆ．Ｇｒａｈａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔｈｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔｅｍｐｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、およびＮｅｗ  Ｙｏｒｋ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｎｇｏｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒからの対象を含む５つの臨床施設からの陽性ＬＤＣＴを有する偶生対象から前向きに収集した。ＮＹＵ対象には、ＮＹＵでＥＤＲＮ肺スクリーニングプログラムの一部として組み入れられた患者が含まれた。この試験は、各参加施設でＩＲＢ承認され、ヘルシンキ宣言に示された原則に従って実施された。参加者全員が登録前にインフォームドコンセントに署名した。試験集団は、主として、５０歳超であり、箱年２０の喫煙歴を有し、過去５年に癌の病歴がない（非黒色腫皮膚癌を除く）喫煙者および元喫煙者であった。結節は、反復イメージングによりまたは気管支鏡検査、生検、および／もしくは肺切除を介した病理診断によって、悪性（ＭＮ）または良性（ＢＮ）であることを確認した。加えて、９７％の超の良性結節は４年以上の経過観察を有し、残りは分析時に２年以上の経過観察を有した。ＭＮに関
連する試料は、確定診断から３ヶ月以内に、または治癒手術を含む任意の侵襲的手術の前に採取した。少人数の参加者は、アッセイを受けた後、喫煙したことがないことが判明した。これらの試料を含むことによる分類子性能への影響を評価した。複数の結節が存在する場合、最大の結節の直径を報告した。
【０１６６】
ＲＮＡ精製、品質評価、およびマイクロアレイ
各収集施設には、Ｐｒｅａｎａｌｙｔｉｘによって指定された試料収集および保管のための標準的なプロトコルが提供された（ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ（ＩＶＤ）について、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅａｎａｌｙｔｉｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｌｏｏｄ／ｒｎａ）。試料は、施設で保管し、その後、ドライアイス上で一晩かけて一括移送したか、あるいは収集日に宅配便でＷｉｓｔａｒに移送し、処理まで−７０℃で保管した。ＰＡＸｇｅｎｅ  ｍｉＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを単離し、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを捕捉した。試料を、ＮａｎｏＤｒｏｐ
１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上のＲＮＡ完全性についてアッセイした。平均ＲＮＡ収率は、３μｇ／血液２．５ｍｌであり、平均ＲＩＮ数は、８超である。マイクロアレイ試験には、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）が７．５超である試料のみを使用した。定量（１００ｎｇ）の総ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａで承認されたＲＮＡ増幅キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を使用して増幅し（ａＲＮＡ）、ヒト−ＨＴ１２  ｖ４ヒト全ゲノムビーズアレイにハイブリダイズさせた。マイクロアレイを４８個セットで処理し、可能性のあるバッチ効果を最小限に抑えた。
【０１６７】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイ条件
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇハイブリダイゼーションを６５℃で一定した１９時間（推奨されている１２〜２５時間以内）実行した。ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎにおけるハイブリダイゼーション後の処理には、標準設定を使用した。カセット走査パラメータを高（５５５ＦＯＶ）に設定した。５５５ＦＯＶ設定により、全体の信号が大幅に増加する。（データは図示せず）。すべてのアッセイを、この設定を使用して行った。標準試料サイズは１００ｎｇで、これは、すべての試料において有すると予想した量であった。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  ＲＮＡ（ＵＨＲ）対照試料の複数の反復にわたるアッセイの安定性を見出した。（データは図示せず）。５０以上の検出カウントが遺伝子プローブの大部分について、５％未満の変動が観察された。大部分の試料のＲＩＮ数は８超であったが、ＲＩＮが３以下である試料であっても、４個のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ品質測定値のすべてを満たしたことが分かり、これにより、劣化したＲＮＡ試料でのプラットフォームの有用性が支持された。劣化したＲＮＡの全体的な発現プロファイルに顕著な影響は見られなかった。（データは図示せず）。
【０１６８】
データ分析
マイクロアレイ：マイクロアレイ生発現データを、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して、分析のためにエクスポートした。生データを分位正規化し、ログ２スケール化した。平均発現値がバックグラウンドレベルの２倍以上である遺伝子を使用して、ＳＶＭ−ＲＦＥおよび１０倍の１０再サンプリング相互検証を使用して、ＰＮＣを開発した（以下の詳細を参照されたい）。悪性結節を良性結節から最も正確に区別した上位順位のプローブ（ボルダ評点）をＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカスタムパネルの候補に選択した。また、ＳＶＭ訓練セットを、より小さな結節ならびにＩ期およびＩＩ期の癌を含むサブセットＡと、病変サイズについて平衡させた悪性および良性結節を含むサブセットＢとに層別化した（補足表ＳＩ）。セットＡおよびＢの追加の分析は、観察された遺伝子発現各々の線形回帰モデルにおける因子として、結節クラス単独（ＭＮまたはＢＮ）または試料クラスおよび収集施設のいずれかを考慮した。これにより、６つの異なる回帰モデルが得られ、以下のパラメータに基づいて、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇモデルに含めるために、これら
の分析から２つの追加の遺伝子セットを選択した：（ｉ）ｐ値＜１０−４閾値を用いた比較にわたって最小ｐ値を有する５９個の遺伝子、および（ｉｉ）ｐ値＜０．０１で最大回帰係数ｂ＞ｌｏｇ２（１．２）を有する７６個の遺伝子。ハウスキーピング（ＨＫ）遺伝子は、それぞれ、２０％未満および２．５％未満の絶対およびログ２スケール化発現についての変動係数（ＣＶ）を有する良好に発現された遺伝子（バックグラウンドの５倍以上）の候補プールから選択した。候補ＨＫ遺伝子２０個を最終的に選択した。ＣＶが最小のＨＫ候補遺伝子が１２個、および既存のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＨＫプローブと重複した候補遺伝子が８個であった。
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ：陰性対照の計数の幾何平均を差し引いて、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ
ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐａｎｅｌ試料に対してバックグラウンド補正を行った。すべての試料にわたる対照遺伝子計数の全幾何平均に対する試料対照の幾何平均の割合によって全値をスケーリングすることによって、試料計数を正規化した。これは、スパイクイン陽性対照とハウスキーピング遺伝子との両方に対して行った。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカスタムパネルを分位正規化し、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇの推奨に従って、コードセット間で複製されたサンプルの発現比を使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇコードセットのバッチ差を補正した。Ｚスコアをカスタムパネル計数の最終値から計算し、ＳＶＭ−ＲＦＥの入力として使用した。
ＳＶＭ−ＲＦＥデータ分析：再帰的特徴排除（ＲＦＥ）を有する線形カーネルＳｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＳＶＭ）を使用した監視下分類（１６）を使用して、ｚスコア変換遺伝子発現データセットを分析し、ＭＮ患者クラスとＢＮ患者クラスを区別することができる訓練セットに基づいてマイクロアレイ分類子を開発した。ＳＶＭが最も正確な分類子の開発に平衡入力を必要とすることが示されているため、平衡した症例対照セットを分類子開発に使用した（１７）。訓練において開発された分類子の妥当性を全く新しい試料セットで試験する独立した検証は、症例または対照のいずれかとしての試料の特定に左右されない。前述（９）のように、フォールドを１０回サンプリングする１０倍の相互検証アプローチを採用した（１００の訓練−試験スプリットモデル）。マイクロアレイデータの各スプリットについて、ｐ値によってランク付けされた上位１０００個のプローブ（９フォールドの両側ｔ検定）を選択し、線形カーネルＳＶＭを９フォールドで訓練し、残りのフォールドで試験した。各ＲＦＥ反復はＧｕｙ  ｏｎ  ｅｔ  ａｌによって説明されるように、各ラウンドにおいて、最小絶対モデル重量で特徴の１０％を排除した（１６）。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータ分析には、ＳＶＭ反復ごとに単一の特徴排除を使用した。最終平均点を以下のように計算した。訓練セット内の任意の試料の最終スコアは、すべての試験フォールド（１００個すべてのスプリットの中でそのようなフォールドは１０）においてその試料に生成されたスコアのうちの平均として計算する。検証セット内の任意の独立した試料の最終得点は、１００個すべてのスプリットモデルのうちの平均として計算する。次いで、各試料を、最終平均得点、および訓練セットから決定されたスコア閾値（偏りのない精度には０、または感度９０％に対応する固定閾値で）を使用してクラスに割り当て、感度、特異性、および精度を計算した。１００個すべてのスプリットにわたるプローブ順位を、ボルダ評点方式に基づいて以下の手順に従って組み合わせた。各順位リストＮ中、各遺伝子ｉにスコアを割り当てた。
【数１】
2021506308.tif 000014
式中、ｒｉ、ｎは、リストｎ中の遺伝子ｉの順位である。各遺伝子ｉの最終スコアＦＳは、１００個すべてのリストにわたる遺伝子ｉのスコアの合計をとることによって計算した。
【数２】
2021506308.tif 000015
次いで、各遺伝子について得られた最終スコアを使用して、分類子におけるそれらの順位を割り当てた。プローブの最終順位を、利用可能な７４１個すべてのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  試料を使用して生成した。
【０１６９】
マイクロアレイデータのためのプローブの最適数を、上位１０００個の遺伝子プローブによるＳＶＭによって達成されたＲＯＣ−ＡＵＣの１％以内のＲＯＣ−ＡＵＣを維持したプローブの最小数として決定した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカスタムパネルについて、追加の遺伝子／プローブの除去が分類性能の低下をもたらした点を決定することによって、遺伝子の最適数を選択した。平滑化ウィンドウサイズ５で移動平均を使用して、各遺伝子を除去した後のＲＯＣ−ＡＵＣを決定することによって、性能を評価した。ＲＯＣ−ＡＵＣが最大であったプローブ数を最終の最適分類子として選択した。
【０１７０】
結果
末梢血ＲＮＡを用いた肺癌関連遺伝子シグネチャーの検査
マイクロアレイ肺癌シグネチャーを開発および検証するために使用する３１５人の患者の人口学的特徴を表ＶＩＩＩに示す。モデル構築に使用する試料は、主に早期のＮＳＣＬＣであり、Ｉ期およびＩＩ期の癌が訓練セット集団の８４％を構成し、独立した検証セットの癌の１００％がＩ期であった。
【０１７１】
２６４個の試料（表ＶＩＩＩ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ訓練セット）からの遺伝子発現を使用して、ＳＶＭ−ＲＦＥを使用して悪性肺結節を良性肺結節から最も正確に区別したマイクロアレイ遺伝子シグネチャーを選択した（９、１６）。分類の精度は、広範囲のプローブ数にわたって安定であり（図７Ａ）、１０００個の最高順位のプローブのパネルは、０．８７８のＲＯＣ−ＡＵＣを達成した。より低い順位のプローブの排除とともに性能が徐々に低下するにつれて、上位１０００個のＳＶＭ遺伝子プローブによって達成された０．８７８の１％以内にＲＯＣ−ＡＵＣを維持した最小数のプローブを選択した。訓練セットにおいて０．８６６のＡＵＣ（９５％  ＣＩ：０．８２４〜０．９１０）を戻した３１１個のプローブを特定した（感度７７．９％、特異性７４．４％）。この性能は、独立した検証（表ＶＩＩＩ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ検証）で良好に維持され、０．８４７のＡＵＣ（９５％  ＣＩ：０．７４２〜０．９５１）を達成し（感度７２．７％、特異性８８．９％）、これは、訓練セットの性能と同様であった（図７Ｂ〜Ｃ）。この実証された予測精度は、発明者らの精製ＰＢＭＣ試験（９）から報告された２９個の遺伝子分類子の予測精度と同様であり、肺における癌の存在が、ＰＡＸｇｅｎｅで収集された血液ＲＮＡにおいても、等しく、または一部の場合にはより良好に検出され得ることを示す。重要なことに、プローブの数が減少するにつれて性能が維持され（図７Ａ〜Ｂ）、これは、堅牢なシグネチャーが異なる数の遺伝子にわたって維持されることを示す。
【０１７２】
マイクロアレイからのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＰｌａｔｆｏｒｍへのＰＮＣの移行
ＰＡＸｇｅｎｅ試料からのｍＲＮＡ発現が悪性肺結節を良性肺結節から区別できることを検証した結果、発明者らは、マイクロアレイに基づく肺結節分類子（ＰＮＣ）をＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームに移行させる戦略を開発した（１４）。マイクロアレイ発現測定値がＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォーム上でどのように複製されるかを先験的に知ることが困難であったため、プラットフォームの違いを軽減するのに十分な冗長性を含むようにカスタムパネルを設計した。ＳＶＭ−ＲＦＥ分析によって特定されたＩｌｌｕｍｉｎａ遺伝子パネルからの上位３００個のバイオマーカーを含めた。また、１０−４未満のｐ値で最も顕著に差異的に発現されたプローブ、および０．０
１未満のｐ値を維持しながらＭＮ群とＢＮ群との間で発現の最大倍数変化を呈した７９個のプローブを表す、５９個のマーカーの追加セットを含めた。マイクロアレイ上で最も一貫した発現を有する２０個のハウスキーピング（ＨＫ）遺伝子のセットも加えた（方法および材料を参照）。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォーム上で処理するｍＲＮＡ試料は、逆転写およびＰＣＲ増幅を受けなかったため、選択したマイクロアレイプローブのいくつかは、増幅なしで検出するには低すぎるレベルで発現される可能性があることを懸念した。性能基準を確立するために、ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ（ＰＣＩ）パネル（カタログＸＴ−ＣＳＯ−ＨＩＰ１−１２）を用いて２２０個のｍＲＮＡ試料（１１５個のＭＮ、１０５個のＢＮ）を分析した。実際のプローブはＩｌｌｕｍｉｎａプローブと同一ではなかったが、ＰＣＩパネルに表される７７０個の遺伝子のうち７５５個もマイクロアレイプラットフォームに表された。この試験により、２つのプラットフォーム間で検出可能なレベルの遺伝子発現を相関させることができるようになり、両方のプラットフォームで堅牢に検出することができる発現レベルの推定を得ることができた。結果は、マイクロアレイ上の２倍のバックグラウンドレベルで検出されたプローブが、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォーム上で堅牢に検出されたことを示唆した。
【０１７３】
１０倍の１０再サンプリング相互検証を伴うＳＶＭ−ＲＦＥを使用してＰＣＩデータも分析すると、ＰＣＩパネルは、マイクロアレイで達成された０．８６６と比較してＲＯＣ−ＡＵＣ＝０．７５４しか示さなかったが（図７Ｄ）、発明者らのカスタムパネルに含めるために１０６個の最も差別的なＰＣＩプローブを選択した。発明者らのＰＢＭＣマイクロアレイ試験（１８、１９）において転帰と関連していると特定された遺伝子に対する追加の５５個のプローブも加え、その数はＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカスタムパネルの可能性のあるプローブの数は６１９個となった。図１２は、カスタムＮａｎｏＳｔｒｉｎｇパネルに選択された候補バイオマーカーの最終リストのソースを要約する。次いで、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプローブを、可能な限り、Ｉｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイプローブによって標的となるものと同じまたは近接して位置するトランスクリプトーム領域を標的にするように設計した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ品質管理基準を満たしたプローブを、６１９個の選択されたバイオマーカーのうちの５５９個について設計することに成功した（データは図示せず）。
【０１７４】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ肺結節分類子の開発、精緻化、および検証
まず、マイクロアレイ訓練セットからの１９９個の試料を再アッセイすることによって、分類精度がＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームとの間でどの程度維持されていたかを評価した。分類精度の比較のために、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプローブとして設計に成功した２７６個のマイクロアレイバイオマーカーのみを使用した。２つのプラットフォーム間の試料分類得点について、０．７３のスピアマン相関ｒｈｏ（ｐ値＜１０−１２）が観察された（図８Ａ）。２７６個のプローブに基づくＲＯＣ−ＡＵＣは、マイクロアレイについて０．８８１、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇについて０．８３８であり（図８Ｂ）、プラットフォーム移行が成功したことを示す。
【０１７５】
カスタムパネルの性能の偏りのない評価を行うために、新しい５番目の収集施設からの試料を含む合計７４１個の患者試料を分析した。５８３試料の最終ｎＰＮＣ訓練セットおよび１５８試料の検証は、良好な感度および特異性を有する分類子を選択するための最良の条件を提供するように、バランスの取れた数のＭＮおよびＢＮ試料を有した（表ＸＩ）（１７）。
【０１７６】
表ＸＩ−カスタムパネルを用いてアッセイした試料の人口統計。連続値に対して中央値±ＩＱＲを付与し、ｐ値は悪性結節群と良性結節群との比較の意義を示す。
【表１０】
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【０１７７】
５５９個すべてのプローブを使用した分類モデルは、訓練セットで０．８３３のＲＯＣ−ＡＵＣ（９５％  Ｃｌ：０．７９９〜０．８６４）、独立した検証セットで０．８２６のＲＯＣ−ＡＵＣ（９５％  ＣＩ：０．７６０〜０．８９１）を示した（図４Ａ）。再帰的特徴排除処理中、訓練セットの性能は安定したままであった（図９Ａ）。漸減するプローブセットは、同様のＲＯＣ−ＡＵＣを達成した（図２Ｂ〜Ｄ、図９Ｂ）。感度、特異性、ならびに陽性および陰性予測値（ＰＰＶ、ＮＰＶ）も、訓練セットと検証セットとの両方において同様である（表ＸＩＩ）。
【表１１】
2021506308.tif 000017
【０１７８】
４１プローブ分類子（表ＩＸ）が、訓練について０．８３４（９５％  ＣＩ：０．８００〜０．８６５）、独立した検証について０．８２５のＡＵＣ（９５％  ＣＩ：０．７５９〜０．８９０）を達成した一方（図４Ｃ）、検証セット性能ではわずかな下降があったものの、わずか６個のプローブしか使用しなくても、ＲＯＣ−ＡＵＣが０．８超に維持された（図４Ｄ）。
【０１７９】
最適な４１遺伝子シグネチャー（表ＩＸ）は、それぞれ、６８．１％および８２．１％の偏りのない感度および特異性を有した。これは、訓練および検証の両方について９０％の感度で５１％の特異性を達成した。独立した検証について、ＮＰＶ値およびＰＰＶ値はそれぞれ０．９９および０．００６６であった。分類子は、Ｉ期については６４％の感度、末期の癌については７０％の感度で癌を検出した。様々なｎＰＮＣ分類得点にわたる悪性腫瘍の確率を図４Ｅに示す。分析には、喫煙歴のない悪性または良性肺結節を有する少数の個体が含まれていたことに留意されたい。これらの対象を試験から除去しても、４１プローブ分類子（ＡＵＣ差０．００１）または全５５９プローブ分類子（ＡＵＣ差０．０１０）のＡＵＣ検証性能は変化しなかった。追加の因子として、年齢、性別、人種、および喫煙歴を加えても、分類に影響はなく、遺伝子発現のみを使用した場合の０．８４０と比較して、０．８３７のＲＯＣ−ＡＵＣが生成された。
ｎＰＮＣ分類子の性能は既存の臨床モデルより優れている
【０１８０】
４１のバイオマーカーパネル分類子に焦点を当てて、評価が困難なサイズが６〜２０ｍｍの範囲にあるすべての試料に対するｎＰＮＣの性能を、高リスク集団中で開発したＢｒｏｃｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（２０、２１）、ならびにより偶生の結節集団からのデータを使用して開発したＭａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ（２２）およびＶＡ（２３）モデルという３つの臨床アルゴリズムの性能と比較した。これらのアルゴリズムは、結節のサイズおよび位置を含む多様な人口統計的および病理的パラメータに基づいて肺結節の癌リスクを評
価する（図５Ａ）。ｎＰＮＣは、直径６〜２０ｍｍの範囲の結節において、３つの臨床モデルすべてを上回る性能を有する。結節サイズは、臨床モデルの各々に含まれる広く認められている危険因子であるため、６〜２０ｍｍの範囲の試料のサイズのみを使用した分類と比較して、分類の増大した精度も実証する（図５Ｂ）。
【０１８１】
異なる結節サイズ範囲に対する分類子性能
結節のサイズは重要な危険因子であり、指針の変更により、ＩＰＮの定義はあまりよく定義されていない（６）ため、サイズ範囲が類似していた悪性結節と良性肺結節とを比較したときの性能を調べた。ＮＬＳＴ試験（２４）からの４ｍｍ、Ｆｌｅｉｓｃｈｎｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（８）およびＬｕｎｇ  Ｒａｄｓ（７）からの最近の報告において考察されている６ｍｍおよび８ｍｍのベースライン陽性閾値、ならびに１０ｍｍのベースライン閾値を使用して、様々な結節サイズ範囲にわたって４１プローブ分類子の性能を計算した。ＲＯＣ−ＡＵＣおよび感度が９０％の性能で保持されるときの特異性を、訓練セットおよび独立した検証セットに選択された閾値に対するすべての可能な範囲について計算した（図６）。全体として、訓練および検証セット性能は、より小さい検証セットにおいて明らかであるように、わずかな検証セット試料のみが特定のサイズ範囲内に入る場合を除いて、すべてのサイズ範囲にわたって高度に保存された。４１プローブｎＰＮＣは、結節が診断の困難な８〜１４ｍｍの範囲である独立した検証において特に性能が良好であり、９０％の感度で６４％の特異性を達成するが、より大きな組み合わせデータセットでは特異性は４８％に下降する。陽性スクリーンに使用された閾値が４ｍｍであっても６ｍｍであっても、発明者らの分類子は、組み合わせデータセットにおいてＲＯＣ−ＡＵＣがそれぞれ０．８３および０．８１であるすべての範囲にわたって良好な性能を発揮することによって、ＩＰＮの分類におけるその有用性を実証し、閾値８ｍｍのみがＡＵＣを０．８０に減少させる。感度９０％での特異性は同様に安定であり、４、６、および８ｍｍについてそれぞれ０．５０、０．４６、および０．４８として計算される。
【０１８２】
考察
ＬＤＣＴを用いた肺癌スクリーニングプログラムの全体的な利点は、患者生存率の２０％増加が報告されていることに明らかである。しかしながら、この成功には、検出される多数の主に良性のＩＰＮをどのように評価するかという関連する問題と、過剰管理の懸念が伴う（２５）。最近の肺−ＲＡＤ評価はまた、ＮＬＳＴ試験で使用される４ｍｍではなく６〜７ｍｍの陽性スクリーニング閾値の実施が肺癌スクリーニング結果の管理においてより適切であり得ること（７）、およびこの変化が、患者ケアへの影響を最小限にしてＩＰＮ問題の重大さを軽減し得ることを示唆している（８）。新たな指針をもってしても、米国内で毎年検出される１６０万と推定される肺結節の過剰管理の可能性は、悪性のリスクが約８〜６４％の範囲であり得る６ｍｍ以上２０ｍｍ以下未満の結節について特に顕著な課題のままである（２６）。臨床的に意義のある方法でこれらのＩＰＮを評価するための代替的な非侵襲的アプローチの開発が、呼吸器病学における重要な目標である。
【０１８３】
ほとんどの非侵襲的早期検出アプローチは、血液、血漿、血清、または痰中に存在する腫瘍由来核酸、抗体、またはタンパク質の特定に依存しているが（２７〜２９）、ただし、これらの分析物は、治癒手術に最も適しており、現在ではより容易にＬＤＣＴによって検出されている、より小さい早期癌の存在下で希少であることが多い。この問題を回避した追加の試験は、気管支鏡検査を、正常な気道上皮細胞における遺伝子発現または鼻擦過物と関連する遺伝子発現と組み合わせた。このアプローチは、腫瘍が悪性または良性肺結節の存在と異なる非病変呼吸器における遺伝子発現改変を誘発する「領域癌化」の概念に基づいている。これらのアプローチは、気管支鏡検査によってアクセスされる可能性が高い結節に対して良好に機能するが（２７、３０、３１）、より小さなＩＰＮではあまり有効ではなく、これは大きな管理上の懸念も表す。
【０１８４】
発明者らは、ＰＢＭＣ由来ＲＮＡにおける遺伝子発現が悪性肺結節を良性肺結節から効率的に区別するため、肺の悪性病変は肺癌分野を超えて末梢血に影響を及ぼし得ることを以前に示した（９）。この肺外効果の存在は、肺癌のマウスモデルからの初期の報告によって裏付けられ、肺の前悪性病変によって生成される可溶性因子が、骨髄マクロファージにおける特定の活性化マーカーの発現に影響を及ぼし、この効果が腫瘍の進行とともに増強されたことを実証している（３２〜３４）。ＰＢＭＣ研究は、余分な肺関与の原理の重要な証拠を提供したが、転写プロファイルを安定化するためにＰＢＭＣ試料の迅速な精製の必要性は、学術的環境以外の収集施設への拡大および堅牢な臨床プラットフォームの開発の妨げであった。発明者らは、ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ安定化チューブで容易に収集された全血由来ＲＮＡも、悪性肺結節を良性肺結節から区別する遺伝子発現情報のために取り出すことができることを実証した。この低侵襲性の２．５ｍｌ採血システムにより、主要な医療センターだけでなく、日常的に採血が行われている場所であればどこでも、試料を収集できるようになる。室温で５日間にわたるＲＮＡ安定性は、試料の完全性を維持するために特別な貯蔵システムを必要としないことを意味し、それにより、試料を収集すること、およびその後で遠隔地からであっても中央試験施設に移すことが容易になる。ＲＮＡの品質により、これは、高品質ＲＮＡを必要とする配列決定プラットフォームを含む多種多様なプラットフォームに対する分析に適切となる。
【０１８５】
４つの学術肺センターおよび地域病院で収集された試料を使用して、ＰＡＸｇｅｎｅ収集システムの有用性を検証した。試料は、一括して収集、貯蔵、および移送するか、またはプラットフォームの性能に何ら検出可能な影響を及ぼすことなく貯蔵および最終処理を行うために、毎日収集した後、発明者らの試験施設に宅配便で移送した。主にＩ期（６９％）およびＩＩ期（１７％）であった癌、ならびに１％未満〜６４％の悪性リスクの範囲にわたる、４ｍｍのＮＬＳＴ試験の閾値測定値から２０ｍｍまでのサイズ範囲の結節を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイ上でアッセイしたグローバル遺伝子発現から、診断モデルを構築した（８）。重要なことに、発明者らのＰＡＸｇｅｎｅマイクロアレイ分類子は、独立した検証で０．８４７（９５％  ＣＩ：０．７４２〜０．９５１）のＲＯＣ−ＡＵＣを維持し、これは、分類子開発に使用した訓練セットのものとほぼ同一であった。多くの試験において、検証セットの精度はやや低下しており、分類子開発に使用されるモデルが、可能性のある対象の多様性を十分に捕捉するために十分に大きくなかったことが示唆される（９、３５、３６）。マイクロアレイ開発プラットフォームから前進して、発明者らは、結節分類子をＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームに移行することに成功した。ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームは、最小限の試料の取り扱いが最低限でよく、技術的に単純であり、同じアッセイにおいて分解および非分解ＲＮＡを評価する能力を有する。ＰＡＭ  ５０遺伝子シグネチャーに基づいたＮａｎｏＳｔｒｉｎｇベースのＰｒｏｓｉｇｎａ（商標）乳癌予後アッセイ（１４）のＦＤＡ承認と、ＰＤ１遮断に対する臨床応答を予測するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇベースの免疫シグネチャーのより最近の開発（３７）は、このプラットフォームの臨床的有用性をさらに裏付ける。
【０１８６】
発明者らのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇベースの分類子の予備遺伝子パネルには５５９個のバイオマーカーが含まれていたが、その数は、ＲＯＣ−ＡＵＣを維持しながら４１個のプローブに減少させることができるため、試験プラットフォームを簡素化する可能性を示唆する。４１個のプローブに表される様々なプローブの寄与を評価する際に、上位ランクのプローブの４６％がＳＶＭ分析に由来し、２９％がＰＣＩパネルに由来し、最も少ない候補はｐ値によって選択された。ＰＭＢＣ試験における生存に関連する骨髄関連遺伝子（１８）は、４１のプローブ分類子には表されなかったが、上位１００個にランク付けされたプローブにおいてはよく表され、一方でＮＫ関連プローブは、大部分がプローブセットの下半分であり、これはＮＫシグナルがＰＡＸｇｅｎｅ試料中で著しく希釈されるためであろう。患者の転帰データが蓄積されると、発明者らの以前のＰＢＭＣ試験（１８、１９、３８）において再発／生存と関連性があるために選択された発明者らのパネルに含まれる予
後バイオマーカーの有用性をさらに評価することにする。
【０１８７】
堅牢な技術性能はどの臨床プラットフォームにとっても重要であるが、結果として生じる患者への利益が最も重要である。発明者らのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカスタムパネルのそのプラットフォーム上で分析された７４１個の試料に対する性能は、ＩＰＮの診断が困難ないくつかのクラスを評価するための侵襲的アプローチの使用に影響を及ぼす可能性がある重大な臨床的意義を有する。発明者らの研究は、存在がより進行した癌とより一致する循環腫瘍細胞、腫瘍タンパク質、または腫瘍ＲＮＡの存在に依存しない。この試験では、主に、直径６〜２０ｍｍであり、中〜高リスク（３９）であり、気管支鏡検査または細針生検のいずれによってもアクセスが容易でない不定肺結節のクラス、および外科的アプローチに最も適している早期癌に取り組んだ。また、悪性腫瘍のリスクは小さいが、依然としてその存在がある程度懸念され得る４〜６ｍｍの範囲の小さい結節での性能を評価した。
重要なことに、発明者らのｎＰＮＣは、Ｂｒｏｃｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（２０、２１）、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ（２２）、および６〜２０ｍｍの範囲のＶＡ（２３）の臨床モデルを含む治療または経過観察のためのＩＰＮを有する候補を層別化するために現在使用されている臨床アルゴリズムよりも高性能である。これらのアルゴリズムは、ほとんどがより小さい良性結節およびより大きい癌を含むデータセットに適用されると良好に働くが、問題のあるサイズ範囲のＭＮおよびＢＮのみに適用されると、性能がやや低下する。発明者らが分析した肺結節のサイズ範囲は重要であるものの、発明者らの試験において、ＭＮとＢＮとの間の中央サイズには大きな差がある。ＢＮおよびＭＮ結節のサイズがより密接に一致し、臨床アルゴリズムの性能が不良である可能性が高い場合、バイオマーカーおよび臨床アルゴリズムがどの程度機能するかに対処することが重要であろう。図４に示すように、この種類の比較を試みた。全体的なＡＵＣ、感度、および特異性は、４、６、または８ｍｍを陽性閾値として使用するかどうかにかかわらず、十分に保存されているが、比較がより細かくなるにつれて、いくつかの比較は、他のものよりも著しく正確であり、これは、試料数がより少ない検証試験において特に明らかである。８〜１４ｍｍのサイズ範囲のＢＮおよびＭＮについて感度９０％で６４％の特異性を達成し、これは６〜１４ｍｍの範囲で４０％に低下した。
【０１８８】
結節のサイズは、ＩＰＮの治療方法における主な考慮事項である（４０）。この研究は多数の患者試料を調べ、可能性のある有用性を実証してきたが、ＭＮおよびＢＮがよりサイズについてより密接に関連している試料を数多く用いるさらなる評価は、サイズが情報提供性でなくなるシナリオであるため、その有用性を拡大することになる。先に進むにあたって、問題の残る結節サイズの範囲にわたって同様のサイズのＢＮおよびＭＮを比較することによって、この問題により完全に対処することが重要であろう。様々な場所から一貫した品質の大量の試料を取得するための極めて簡素化され実績のある方法が、このプロセスを容易にする。また、広範な試験により、患者クラス間で検出されている差異の生物学的根拠に取り組み、それらの差異が治療上の意義を有し得るかどうかを評価することが可能となる。
【０１８９】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／３８５７１号を含む、ありとあらゆる特許、特許出願、刊行物、および本開示を通じて引用される一般に利用可能な遺伝子配列は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。優先権文書類である２０１７年１２月１９日に出願された米国特許出願第６２／６０７，７５６号および２０１８年１０月２９日に出願された米国特許出願第６２／７５２，１６３号もまた、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変形形態が当業者によって案出されることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および同等の変形を含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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