(57)【要約】本発明は、医薬として使用するための、放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子との組み合わせに関する。医薬は、非ホジキンリンパ腫（NHL）に対するものであり得る。2021504341.tif 000020
2021504341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、
A：モノクローナルHH1抗体および放射性核種を含む放射性免疫複合体と
B：BCL2阻害剤と
の組み合わせ。
【請求項２】
A：モノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と
B：BCL2阻害剤と
を含む組成物。
【請求項３】
医薬として使用するための、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
モノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体がキメラIgG1 HH1（chHH1.1）またはマウスHH1（HH1、リロトマブ）である、請求項1記載の使用のための組み合わせ、請求項2記載の組成物、または請求項3記載の使用のための組成物。
【請求項５】
放射性核種が177Luまたは212Pbである、請求項1および4のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜4のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項６】
モノクローナルHH1抗体および放射性核種がキレートリンカーによって連結されている、請求項1および4〜5のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4〜5のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜5のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項７】
キレートリンカーがp-SCN-ベンジル-DOTA、DOTA-NHSエステル、p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-ベンジル-TCMC、およびCHX-A''-DTPAからなる群より選択される、請求項6記載の使用のための組み合わせ、請求項6記載の組成物、または請求項6記載の使用のための組成物。
【請求項８】
キレートリンカーがサテトラキセタン（p-SCN-ベンジル-DOTA）である、請求項1および4〜7のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4〜7のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜7のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項９】
Aが177Lu-chHH1.1である、請求項1および4〜8のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4〜8のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜8のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
Aが177Lu-リロトマブである、請求項1および4〜8のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4〜8のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜8のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
Aが212Pb-chHH1.1である、請求項1および4〜8のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4〜8のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜8のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
BCL2阻害剤がベネトクラクス（ABT-199、GDC-0199）、オバトクラクスメシル酸塩（GX15-070）、HA14(1)、ABT-263（ナビトクラクス）、ABT-737、TW-37、AT101、サブトクラクス、WEHI-539、A-1155463、ゴシポルクおよびAT-101、アポゴシポール、S1、2-メトキシアンチマイシンA3、BXI-61、BXI-72、TW37、MIM1、UMI-77、ならびにガンボギン酸からなる群より選択される、請求項1および4〜11のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4〜11のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜11のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
BCL2阻害剤がベネトクラクス（ABT-199、GDC-0199）である、請求項1および4〜12のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4〜12のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜12のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記組成物が薬学的組成物として製剤化されている、請求項1および4〜13のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、請求項2および4〜13のいずれか一項記載の組成物、または請求項3〜13のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
薬学的組成物が1種または複数種の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む、請求項14記載の使用のための組み合わせ、請求項14記載の組成物、または請求項14記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
医薬が非ホジキンリンパ腫（NHL）に対するものである、請求項1および4〜15のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、または請求項3〜15のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
NHLが、形質転換濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、移植によって誘導されたリンパ腫からなる群より選択される、請求項16記載の使用のための組み合わせ、または請求項16記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
前記使用が、組成物の後に抗体治療、免疫複合体治療、またはそれらの組み合わせによる同時処置または後処置が続く組み合わせ治療のためのものである、請求項1および4〜17のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、または請求項3〜17のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
組成物の後に抗CD20抗体治療が単回投与または反復投与のパターンで続く、請求項1および4〜18のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ、または請求項3〜18のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
抗CD20抗体がリツキシマブ、オビヌツズマブ、またはオファツムマブである、請求項19記載の使用のための組み合わせ、または請求項19記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬として使用するための、放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子との組み合わせに関する。医薬は、非ホジキンリンパ腫（NHL）に対するものであり得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
B細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）は、前駆細胞から成熟期まで、様々な分化段階のBリンパ球に起因する。現在、NHLを有する患者は、化学療法と組み合わせて、モノクローナル抗体（mAb）リツキシマブによる免疫治療によって処置されている。
【０００３】
リツキシマブは、大部分の悪性B細胞および正常B細胞（プレリンパ球からプレ形質細胞まで）の表面に発現されている33〜37kDaの膜貫通タンパク質、CD20に対するキメラIgG1 mAbである。リツキシマブの効力は、アポトーシス、シグナル伝達経路、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、抗体依存性細胞貪食（ADCP）、および補体依存性細胞傷害（CDC）のような複数の細胞死機序によって媒介される。
【０００４】
しかしながら、単独のリツキシマブに対する応答率は、非常に控えめであり、処置の多くの繰り返しの後、一部の患者は、この治療に対して難治性になる。例えば、リツキシマブおよび化学療法に対する抵抗性を発症する再発性濾胞性リンパ腫（FL；NHLの一種）を有する患者、ならびに一次治療後2年以内に疾患進行を経験する患者は、新しい処置アプローチを最も必要としている。リツキシマブ難治性FLを有するかまたは早期疾患進行を有する患者についての5年全体生存率は、FLを有する全ての患者についてのおよそ90％に対して、58％および50％である。
【０００５】
放射線および抗体の細胞傷害特性を組み合わせるため、放射標識された抗体が使用される放射免疫治療（RIT）は、NHL処置において有意な効力を示す。2種の抗CD20 mAb、イットリウム-90によって放射標識されたイブリツモマブチウキセタン（Zevalin、Spectrum Pharmaceuticals,USA）およびヨウ素-131によって放射標識されたトシツモマブ（Bexxar、GlaxoSmithKline,UK）は、それぞれ、2002年および2003年に、FDAによってNHL処置のために承認された。しかしながら、ZevalinおよびBexxarは、リツキシマブによる数回の処置の後に使用され、循環血中に残留するリツキシマブが、その後の抗CD20治療の効力を損なう可能性がある。
【０００６】
従って、異なる抗原を標的とするコンジュゲートが、望ましい可能性がある。ルテチウム-177[177Lu]-リロトマブ・サテトラキセタン（以前には177Lu-DOTA-HH1として公知であったBetalutin（登録商標））は、マウスmAbリロトマブが、悪性B細胞上に発現されたCD37受容体を標的とし、177Luが、0.133MeVの平均βエネルギー（水中β飛程の平均値および最大値：0.23mmおよび1.9mm）を有するベータ放射体である、新規のコンジュゲートである。CD37は、テトラスパニンファミリーに属する31kDa膜貫通タンパク質である。それは、ホスファチジルイノシトール3'-キナーゼ（PI3K）/AKT生存経路および体液性免疫における二価の役割を有している。CD37は、NHL細胞において高度に発現されているため、標的治療のための魅力的な分子を表す。
【０００７】
177Lu-リロトマブは、再発した低悪性度B細胞NHLの処置のため、第2b相臨床試験において現在試験されており、特に、FLを有する患者において、有望な安全性および効力のデータが得られている。177Lu-リロトマブの効果の増強は、極めて有益であろう。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、177Lu-リロトマブのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質または分子とを含む組成物、177Lu-リロトマブのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質または分子とを含む組成物、177Lu-リロトマブのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、ポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）を阻害することができるタンパク質または分子とを含む組成物、および177Lu-リロトマブのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、BCL2タンパク質阻害剤とを含む組成物に関する。
【０００９】
これらの組成物は、医薬として使用され得る。
【００１０】
本発明の一局面は、医薬として使用するための、177Lu-リロトマブのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、またはG2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子との組み合わせにも関する。
【００１１】
本発明の一局面は、177Lu-リロトマブのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、ポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）を阻害することができるタンパク質または分子との組み合わせにも関する。PARPの阻害は、損傷を受けたDNAを修復する細胞の能力を減少させ、かつ電離放射線に対する細胞の感受性を増加させる。
【００１２】
医薬は、非ホジキンリンパ腫（NHL）に対するものであり得、NHLは、形質転換濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、移植によって誘導されたリンパ腫からなる群より選択され得る。
【００１３】
本発明の一つの態様は、組成物の後に抗体治療、免疫複合体治療、またはそれらの組み合わせによる同時処置または後処置が続く組み合わせ治療における使用である。組成物の後に抗CD20抗体治療が単回投与または反復投与のパターンで実施されてよく、抗CD20抗体は、リツキシマブ、オビヌツズマブ、またはオファツムマブであり得る。
【００１４】
177Lu-リロトマブのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体は、p-SCN-ベンジル-DOTA、DOTA-NHSエステル、p-SCN-Bn-DTPA、およびCHX-A''-DTPAからなる群より選択され得るキレートリンカーによって連結されていてよい。
【００１５】
タンパク質または分子は、G2/M細胞周期停止に関与するタンパク質の阻害剤であり得る。
【００１６】
本発明の一つの態様において、タンパク質または分子は、MK-1775、PD-166285、AMG 900、AT7519、AZD7762、CYC116、フラボピリドール、GSK461364、アリセルチブ、BI2536、JNJ-7706621、LY2603618、NSC 23766、NU6027、PHA-793887、トシル-L-アルギニンメチルエステル（TAME）、BI6727（ボラセルチブ）、ON-01910（リゴセルチブ）、HA-1077（ファスジル）、SCH727965（ディナシクリブ）、LY2835219、LEE011、サリラシブ（Salirasib）、K-115（リパスジル）、PD0332991（パルボシクリブ）からなる群より選択される。
【００１７】
組成物は、1種または複数種の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含んでいてよい薬学的組成物として製剤化され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体に対する治療的応答に関与する分子機序を同定して、（i）この処置から最も大きい利益を得ることができるNHL型および（ii）関連する組み合わせパートナーを同定することである。
【００１９】
従って、本発明は、特定のNHL型癌の処置において使用するための、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体を含む組成物に関する。
【００２０】
本発明は、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物とを含む組成物にも関する。
【００２１】
さらなる局面は、医薬として使用するための、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせに関する。
【００２２】
放射性免疫複合体
本発明の放射性免疫複合体は、抗体および放射性核種を含む。これらは、リンカーを通して連結されていてよい。
【００２３】
モノクローナル抗体（mAbまたはmoAb）であるリロトマブは、以前にはテツロマブ（tetulomab）またはHH1として公知であり、177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンは、以前には177Lu標識HH1抗体として、または177Lu-テツロマブという名称、またはBetalutinという商品名で公知であった。
【００２４】
HH1の具体的なバリアントは、参照によって本明細書に組み入れられるPCT/IB2012/057230およびPCT/EP2011/051231に開示されており、本発明に含まれる具体的な態様として開示される。HH1の可変配列は、PCT/IB2012/057230の30〜31頁（SEQ ID No:1〜4）に開示されている。
【００２５】
従って、前述の開示に基づき、本発明の放射性免疫複合体に含まれるHH1のバリアントを調整することが可能であろう。本発明の好ましい態様には、HH1のマウスバリアントまたはキメラバリアントが含まれる。本発明のもう一つの態様には、PCT/IB2012/057230の実施例1に開示されたようなキメラHH1アイソタイプIgG1であるHH1 chHH1.1、またはR435H変異を含むキメラHH1アイソタイプIgG3であるchHH1.3Hのキメラバリアントが含まれる。
【００２６】
従って、177Lu-リロトマブとは、抗体がマウスHH1であるBetalutinをさすことができるが、もう一つの態様において、抗体がキメラバリアントchHH1.1であるものをさすこともできる。
【００２７】
177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンは、関心対象の抗原に結合するかまたはそれを標的とすることができる、抗体放射性核種コンジュゲート（ARC）としても公知の、放射性免疫複合体（RIC）である。本ケースにおいて、この抗原はCD37である。サテトラキセタンは、DOTAの誘導体、p-SCN-ベンジル-DOTAである。
【００２８】
177Lu-リロトマブは、キレートリンカーを通して連結されていてよい。キレートリンカーは、p-SCN-ベンジル-DOTA、DOTA-NHSエステル、p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-ベンジル-TCMC、およびCHX-A''-DTPAからなる群より選択される。一つの態様において、キレートリンカーは、p-SCN-ベンジル-DOTAとしても公知のサテトラキセタンである。この具体的な態様において、177Lu-リロトマブは、薬物Betalutinである。
【００２９】
本発明の一態様において、放射性免疫複合体は、177Lu-chHH1.1である。本発明のもう一つの態様において、放射性免疫複合体は、212Pb-chHH1.1である。この具体的な態様において、p-SCN-ベンジル-TCMCが、キレーターである。chHH1.1は、HH1（リロトマブ）抗体のキメラIgG1バージョンである。
【００３０】
従って、放射性核種は、177Luまたは212Pbであり得る。
【００３１】
従って、本発明の一つの態様は、本発明による使用のための、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせに関し、ここで、177Lu-リロトマブは、キレートリンカーを通して連結されている。
【００３２】
本発明のもう一つの態様は、本発明による使用のための、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせに関し、ここで、キレートリンカーは、p-SCN-ベンジル-DOTA、DOTA-NHSエステル、p-SCN-Bn-DTPA、CHX-A''-DTPA、およびp-SCN-ベンジル-TCMCからなる群より選択される。
【００３３】
ベネトクラクスは、抗アポトーシス性のB細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）2（Bcl-2）タンパク質を阻止してプログラム細胞死をもたらす。いくつかのリンパ系悪性疾患におけるBcl-2の過剰発現は、化学療法に対する抵抗性の増加に関連していることが時に示されている。従って、BCL2阻害剤は、ベネトクラクスであり得る。
【００３４】
キレーターp-SCN-ベンジル-DOTA、DOTA-NHSエステル、p-SCN-Bn-DTPA、CHX-A''-DTPAは、177Luのキレート化のために好ましく、p-SCN-ベンジル-TCMCは、212Pbのキレート化のために好ましい。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、本発明による使用のための、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせに関し、ここで、キレートリンカーは、p-SCN-ベンジル-DOTAとしても公知のサテトラキセタンである。
【００３６】
投与ルートおよびパターン
放射性免疫複合体の投与とは、静脈内注入または静脈内注射を意味する。より具体的には、本発明の放射性免疫複合体および抗体は、空気栓塞を防止し、患者への流速の推定を可能にするドリップチャンバーに接続された末梢カニューレによって、静脈に直接投与されてよい。一つの態様において、放射性免疫複合体および/または抗体は、反復投与されてよい。
【００３７】
もう一つの態様において、放射性免疫複合体およびその後のモノクローナル抗体（または免疫複合体）は、両方とも、反復投与されてよい。
【００３８】
本発明の一態様は、他の治療と組み合わせて、または他の治療に加えて投与される、本発明の放射性免疫複合体の使用に関する。
【００３９】
本発明の一態様において、他の治療は、リロトマブによる前処置、解熱薬および抗ヒスタミン薬の前投薬、化学療法、免疫チェックポイント阻害剤、モノクローナル抗体治療、手術、放射線治療、ならびに/または光線力学的治療より選択される。
【００４０】
本発明のもう一つの態様において、他の治療は、骨髄移植または幹細胞移植および/もしくは幹細胞治療である。
【００４１】
本発明の一つの態様には、本発明による使用のための組成物が含まれ、ここで、使用は、組成物の後に抗体治療、免疫複合体治療、またはそれらの組み合わせによる同時処置または後処置が続く組み合わせ治療のためのものである。組成物の後に抗CD20抗体治療が単回投与または反復投与のパターンで実施され得る。
【００４２】
抗CD20抗体は、リツキシマブであり得る。抗CD20抗体は、オビヌツズマブ、またはオファツムマブ、またはRixathonもしくはTruximaのようなリツキシマブバイオシミラーであってもよい。
【００４３】
投与投薬量
本発明において、非ホジキンリンパ腫の処置において使用され得る医薬において、177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体が使用される。本発明の一態様は、10MBq/kg、12.5MBq/kg、15MBq/kg、17.5MBq/kg、20MBq/kg、25MBq/kg、30MBq/kg、35MBq/kg、40MBq/kg、45MBq/kg、50MBq/kgからなる群より選択される濃度で投与される177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンに関する。
【００４４】
本発明の一つの態様において、濃度は、15MBq/kgである。
【００４５】
本発明のもう一つの態様において、濃度は、17.5MBq/kgである。
【００４６】
本発明のさらなる態様において、濃度は、20MBq/kgである。
【００４７】
G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質または分子
G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質または分子は、G2/Mチェックポイントに直接または間接的に影響を及ぼす能力を有する。これは、例えば、細胞周期移行に関与する重要タンパク質のリン酸化または脱リン酸によるものであり得る。
【００４８】
本発明の一つの態様において、タンパク質または分子は、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のWEE-1によって媒介されるリン酸化の減少、およびG2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行、または有糸分裂における進行の阻害をもたらす。本発明のもう一つの態様において、タンパク質または分子が、サイクリン依存性キナーゼ-1（CDK1）のMYT-1によって媒介されるリン酸化の減少、およびG2/M細胞周期停止における細胞周期の進行をもたらす、本発明による組成物。本発明のさらなる態様において、タンパク質または分子は、サイクリン依存性キナーゼ-1（CDK1）のCDK7含有CAKキナーゼによって媒介されるリン酸化の増加をもたらす。タンパク質または分子は、オーロラキナーゼ（AURA、AURB、AURC、またはポロ様キナーゼPLK1、2、3、4）の阻害剤であってもよい。
【００４９】
タンパク質または分子は、G2期からM期への移行に関与するタンパク質のようなG2/M細胞周期停止に関与するタンパク質の阻害剤であってもよい。しかしながら、タンパク質または分子は、G2/M細胞周期移行における制限因子であるタンパク質の活性化剤であってもよい。
【００５０】
本発明による使用のための、177Lu-リロトマブのようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるか、もしくはM期における細胞周期の進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子との組み合わせ、またはそれらを含む組成物は、1種または数種のタンパク質または分子を含み得る。これらは、MK-1775、PD-166285、AMG 900、AT7519、AZD7762、CYC116、フラボピリドール、GSK461364、JNJ-7706621、LY2603618、NSC 23766、NU6027、PHA-793887、トシル-L-アルギニンメチルエステル（TAME）、BI6727（ボラセルチブ）、ON-01910（リゴセルチブ）、HA-1077（ファスジル）、SCH727965（ディナシクリブ）、LY2835219、LEE011、サリラシブ、K-115（リパスジル）、PD0332991（パルボシクリブ）、BI2536、MLN8237（アリセルチブ）、またはジフォペイン（difopein）のようなタンパク質14-3-3阻害剤からなる群より選択され得る。
【００５１】
従って、タンパク質または分子は、MK-1775であり得る。タンパク質または分子は、PD-166285であってもよい。タンパク質または分子は、AMG 900であってもよい。タンパク質または分子は、AZD7762であってもよい。タンパク質または分子は、JNJ7706621であってもよい。タンパク質または分子は、CYC116であってもよい。タンパク質または分子は、AT7519であってもよい。タンパク質または分子は、LY2603618であってもよい。タンパク質または分子は、フラボピリドールであってもよい。タンパク質または分子は、GSK461364であってもよい。タンパク質または分子は、NSC 23766であってもよい。タンパク質または分子は、NU6027であってもよい。タンパク質または分子は、PHA-793887であってもよい。タンパク質または分子は、トシル-L-アルギニンであってもよい。タンパク質または分子は、メチルエステル（TAME）であってもよい。タンパク質または分子は、BI6727（ボラセルチブ）であってもよい。タンパク質または分子は、ON-01910（リゴセルチブ）であってもよい。タンパク質または分子は、HA-1077（ファスジル）であってもよい。タンパク質または分子は、SCH727965（ディナシクリブ）であってもよい。タンパク質または分子は、LY2835219であってもよい。タンパク質または分子は、LEE011であってもよい。タンパク質または分子は、サリラシブであってもよい。タンパク質または分子は、K-115（リパスジル）であってもよい。タンパク質または分子は、PD0332991（パルボシクリブ）であってもよい。タンパク質または分子は、14-3-3阻害剤であってもよい。タンパク質または分子は、ジフォペインであってもよい。タンパク質または分子は、PLK1阻害剤BI2536であってもよい。タンパク質または分子は、オーロラキナーゼ阻害剤MLN8237（アリセルチブ）であってもよい。
【００５２】
PARP阻害剤（PARPi）であるタンパク質または分子
PARP阻害剤は、酵素ポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）の薬理学的阻害剤の群である。これらの阻害剤は、癌を含む数種の適応症のために有効である。
【００５３】
本発明による使用のための、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/もしくは212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、PARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子との組み合わせ、またはそれらを含む組成物は、1種または数種のタンパク質または分子を含み得る。これらは、オラパリブ（AZD2281、Ku-0059436）、ベリパリブ（ABT-888）、ルカパリブ（AG-014699、PF-01367338）、タラゾパリブ（BMN 673）、AG-14361、INO-1001（3-アミノベンズアミド）、A-966492、PJ34 HCl、ニラパリブ（MK-4827）、UPF 1069、ME0328、NMS-P118、E7449、ピコリンアミド、ベンズアミド、ニラパリブ（MK-4827）トシル酸塩、NU1025、イニパリブ（BSI-201）、AZD2461、およびBGP-15 2HClからなる群より選択され得る。
【００５４】
従って、タンパク質または分子は、オラパリブ（AZD2281、Ku-0059436）であり得る。タンパク質または分子は、ベリパリブ（ABT-888）であってもよい。タンパク質または分子は、ルカパリブ（AG-014699、PF-01367338）であってもよい。タンパク質または分子は、タラゾパリブ（BMN 673）であってもよい。タンパク質または分子は、AG-14361であってもよい。タンパク質または分子は、INO-1001（3-アミノベンズアミド）であってもよい。タンパク質または分子は、A-966492であってもよい。タンパク質または分子は、PJ34 HClであってもよい。タンパク質または分子は、ニラパリブ（MK-4827）であってもよい。タンパク質または分子は、UPF 1069であってもよい。タンパク質または分子は、ME0328であってもよい。タンパク質または分子は、NMS-P118であってもよい。タンパク質または分子は、E7449であってもよい。タンパク質または分子は、ピコリンアミドであってもよい。タンパク質または分子は、ベンズアミドであってもよい。タンパク質または分子は、ニラパリブ（MK-4827）トシル酸塩であってもよい。タンパク質または分子は、NU1025であってもよい。タンパク質または分子は、イニパリブ（BSI-201）であってもよい。タンパク質または分子は、AZD2461であってもよい。タンパク質または分子は、BGP-15 2HClであってもよい。
【００５５】
本発明による使用のための、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/もしくは212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子との組み合わせ、またはそれらを含む組成物は、1種または数種のタンパク質または分子を含み得る。これらは、ベネトクラクス（ABT-199、GDC-0199）、オバトクラクスメシル酸塩（GX15-070）、HA14(1)、ABT-263（ナビトクラクス）、ABT-737、TW-37、AT101、サブトクラクス、WEHI-539、A-1155463、ゴシポルクおよびAT-101、アポゴシポール、S1、2-メトキシアンチマイシンA3、BXI-61、BXI-72、TW37、MIM1、UMI-77、ならびにガンボギン酸からなる群より選択され得る。
【００５６】
従って、タンパク質または分子は、ベネトクラクス（ABT-199、GDC-0199）であり得る。タンパク質または分子は、オバトクラクスメシル酸塩（GX15-070）であってもよい。タンパク質または分子は、HA14(1)であってもよい。タンパク質または分子は、ABT-263（ナビトクラクス）であってもよい。タンパク質または分子は、TW-37であってもよい。タンパク質または分子は、AT101であってもよい。タンパク質または分子は、サブトクラクスであってもよい。タンパク質または分子は、ガンボギン酸であってもよい。タンパク質または分子は、WEHI-539であってもよい。タンパク質または分子は、A-1155463であってもよい。タンパク質または分子は、ゴシポールおよびAT-101であってもよい。タンパク質または分子は、アポゴシポールであってもよい。タンパク質または分子は、S1であってもよい。タンパク質または分子は、2-メトキシアンチマイシンA3であってもよい。タンパク質または分子は、BXI-61であってもよい。タンパク質または分子は、BXI-72であってもよい。タンパク質または分子は、TW37であってもよい。タンパク質または分子は、MIM1であってもよい。タンパク質または分子は、UMI-77であってもよい。
【００５７】
薬学的組成物
抗体、放射性免疫複合体、およびその他の薬物は、一般的には、薬学的組成物に製剤化されて、疾患の処置において適用される。そのような組成物は、生理学的許容度および有効期間のようなパラメータについて最適化される。
【００５８】
従って、本発明の一つの態様において、本発明の放射性免疫複合体および/または組成物は、1種または複数種の薬学的組成物として製剤化される。
【００５９】
本発明の一態様は、1種または複数種の付加的な治療剤をさらに含む、前記のような薬学的組成物に関する。本発明のもう一つの態様において、1種または複数種の付加的な治療剤は、アポトーシスを誘導する薬剤より選択される。一般的には、薬学的組成物の重要な要素は、放射性免疫複合体の化学的な完全性を実質的な程度に維持し、患者への注入のために生理学的に許容される、緩衝溶液である。
【００６０】
本発明の一つの態様において、薬学的組成物は、1種または複数種の薬学的に許容される担体および/またはアジュバントを含む。許容される薬学的担体には、無毒の緩衝液、増量剤、等張溶液等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。より具体的には、薬学的担体は、通常の生理食塩水（0.9％）、半生理食塩水、乳酸リンゲル液、5％デキストロース、3.3％デキストロース/0.3％生理食塩水であり得るが、これらに限定されるわけではない。生理学的に許容される担体は、保管中および出荷中の放射性医薬品の完全性を保護する放射線分解安定剤、例えば、アスコルビン酸を含有していてもよい。
【００６１】
好ましくは、リン酸二水素ナトリウム一水化物、塩化ナトリウム、組換えヒトアルブミン、アスコルビン酸ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、および水酸化ナトリウムが、製剤緩衝液中の賦形剤として使用される。好ましくは、有効期間中の最終生成物のpHを維持するため、リン酸が製剤緩衝液に含まれる。
【００６２】
好ましくは、リロトマブ・サテトラキセタンコンジュゲートのための安定剤として、組換えヒトアルブミンが製剤緩衝液に含まれる。アルブミンは、放射線保護剤としても機能する。酵母に由来するヒト血清アルブミンと構造的に同一の組換えヒトアルブミンが使用される。ヒトまたは動物に由来する原料は、その製造において含まれない。賦形剤は、周知であり、ヒトにおいて使用するための薬学的生成物において使用されている。
【００６３】
好ましくは、生成物の有効期間中のBetalutinの安定性を確実にするため、放射線分解スカベンジャーとして機能するため、アスコルビン酸ナトリウムが製剤に含まれる。好ましくは、遊離の177Lu3+イオンをキレート化し、この不純物を骨における蓄積から迅速な腎クリアランスにルート変更するため、DTPAが、賦形剤としてBetalutin製剤に導入される（Li et al 2001、Breeman et al 2003）。Betalutinは、12mL中に9.3μmol DTPAを含有しており、適用される無担体（n.c.a）177Lu3+（＞3,000GBq/mg）の最大量（6.9GBq）は、15nmol Luイオン未満に相当する。これはLu3+イオンに対して1000倍モル過剰を超えるDTPAを与える。さらに、Lu3+イオンの大半（≧95％）がリロトマブ・サテトラキセタンにキレート化されることを考慮すると、モル過剰は、ほぼ100,000倍である。従って、DTPAは、定量的に全ての遊離の177Lu3+イオンをキレート化すると予想され、従って、177Lu-DTPAは本明細書において放射化学的不純物として特定される。
【００６４】
好ましくは、製剤緩衝液は、pH6.9〜7.0の水性溶液であり、従って、原体と製剤緩衝液との間の不適合は予想されない。本発明の一つの態様は、本発明の薬学的組成物と、1種または複数種の付加的な抗体または放射性免疫複合体とを含む。
【００６５】
本発明の一局面は、（1mL当たり）0.75mgのルテチウム（177Lu）リロトマブ・サテトラキセタン、0.46mgの酢酸アンモニウム、および微量のHCl3を含む薬学的組成物に関する。本発明のもう一つの局面は、（1mL当たり）30.86mgのアスコルビン酸ナトリウム、0.31mgのDTPA、0.17mgのNaOH、60.82mgの組換えヒトアルブミン、3.32mgのリン酸二水素ナトリウム一水化物、および4.34mgの塩化ナトリウムを含み、pHが6.9〜7.0に調整されている薬学的組成物に関する。
【００６６】
本発明のさらなる局面は、薬学的組成物の14％が、（1mL当たり）0.75mgのルテチウム（177Lu）リロトマブ・サテトラキセタン、0.46mgの酢酸アンモニウム、および微量のHCl3を含み、薬学的組成物の86％が、（1mL当たり）30.86mgのアスコルビン酸ナトリウム、0.31mgのDTPA、0.17mgのNaOH、60.82mgの組換えヒトアルブミン、3.32mgのリン酸二水素ナトリウム一水化物、および4.34mgの塩化ナトリウムを含み、pHが6.9〜7.0に調整されている薬学的組成物に関する。
【００６７】
本発明は、本実施例の薬学的組成物および本明細書中に提示された投薬量投与パターンにも関する。これには、非ホジキンリンパ腫の処置において使用するための本発明の薬学的組成物の使用が含まれる。
【００６８】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、ベネトクラクス、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明に従って使用され得、ここで、177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体と、タンパク質または分子とは、1種または複数種の薬学的組成物に製剤化され得る。
【００６９】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明に従って使用され得、ここで、薬学的組成物は、1種または複数種の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む。
【００７０】
医学的適用
177Lu-リロトマブ・サテトラキセタン、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体を含む放射性免疫複合体による処置を必要とする者は、CD37関連疾患、典型的には、非ホジキンリンパ腫（NHL）のようなB細胞リンパ腫に罹患している。
【００７１】
NHLは、ホジキンリンパ腫以外の全ての型のリンパ腫を含む血液癌の群である。症状には、リンパ節腫大、発熱、寝汗、体重減少、および疲労感が含まれる。他の症状には、骨痛、胸痛、または掻痒が含まれ得る。緩徐成長性の型もあるし、急速成長性の型もある。いくつかの型のNHLが存在する。従って、本発明のもう一つの態様は、濾胞性グレードI〜IIIA、辺縁帯、小細胞型リンパ球性、リンパ形質細胞性、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、およびマントル細胞からなる群より選択される亜型であるリンパ腫に関する。
【００７２】
従って、本発明の放射性免疫複合体、組成物、および/または本発明の組み合わせは、医薬として使用され得る。医薬は、非ホジキンリンパ腫（NHL）に対するものであり得る。
【００７３】
NHLは、形質転換濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、移植によって誘導されたリンパ腫からなる群より選択され得る。
【００７４】
従って、本発明による使用のための組成物について、または本発明による使用のための組み合わせについて、NHLは、形質転換濾胞性リンパ腫であり得る。本発明による使用のための組成物について、または本発明による使用のための組み合わせについて、NHLは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫であり得る。本発明の一つの態様において、NHLは、マントル細胞リンパ腫である。本発明のもう一つの態様において、NHLは、辺縁帯リンパ腫である。本発明のさらなる態様において、NHLは、慢性リンパ性白血病である。本発明のさらにもう一つの態様において、NHLは、皮膚T細胞リンパ腫である。本発明の一つの態様において、NHLは、リンパ形質細胞性リンパ腫である。本発明の一つの態様において、NHLは、辺縁帯B細胞リンパ腫である。本発明のもう一つの態様において、NHLは、MALTリンパ腫である。本発明のさらにもう一つの態様において、NHLは、小細胞型リンパ球性リンパ腫である。本発明の一つの態様において、NHLは、バーキットリンパ腫である。本発明のもう一つの態様において、NHLは、未分化大細胞リンパ腫である。本発明の一つの態様において、NHLは、リンパ芽球性リンパ腫である。本発明のもう一つの態様において、NHLは、末梢性T細胞リンパ腫である。本発明のさらなる態様において、NHLは、移植によって誘導されたリンパ腫である。
【００７５】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明による使用のためのものであり得、ここで、医薬は、非ホジキンリンパ腫に対するものである。
【００７６】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明による使用のためのものであり得、ここで、使用は、組成物の後に抗体治療、免疫複合体治療、またはそれらの組み合わせによる同時処置または後処置が続く組み合わせ治療のためのものである。
【００７７】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明による使用のためのものであり得、ここで、組成物の後に抗CD20抗体治療が単回投与または反復投与のパターンで続く。抗CD20抗体は、リツキシマブまたはオビヌツズマブまたはオファツムマブであり得る。
【００７８】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、または有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明による使用のためのものであり得、ここで、タンパク質または分子は、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のWEE-1によって媒介されるリン酸化の減少をもたらす。
【００７９】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、または有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明による使用のためのものであり得、ここで、タンパク質または分子は、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のMYT-1によって媒介されるリン酸化の減少をもたらす。
【００８０】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、または有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明による使用のためのものであり得、ここで、タンパク質または分子は、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のCDK7含有CAKキナーゼによって媒介されるリン酸化の増加をもたらす。
【００８１】
177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1のような放射性免疫複合体と、G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物との組み合わせは、本発明による使用のためのものであり得、ここで、タンパク質または分子は、G2/M細胞周期停止の阻害剤、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子である。
【００８２】
G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質または分子は、CDK1 T14リン酸化に関与する酵素を特異的に標的とするものであってよい。G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質または分子は、CDK1 Y15リン酸化に関与する酵素を特異的に標的とするものであってよい。G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質または分子は、CDK1 Y161リン酸化に関与する酵素を特異的に標的とするものであってよい。
【００８３】
組み合わせは、同一の組成物に含まれていてもよいし、または化合物が別々に投与される組み合わせ処置として見られてもよい。
【００８４】
ある種の型の癌は、放射性免疫複合体の使用が有益であり得る特異的な形質を有する。これらには、G2/M細胞周期停止が阻害される癌型が含まれる。癌型は、G1細胞周期停止が阻害されるものであってもよい。
【００８５】
従って、本発明の一つの局面は、阻害性CDK1リン酸化の低下を示す非ホジキンリンパ腫の処置において使用するための177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンを含む組成物に関する。阻害性CDK1リン酸化の低下は、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のWEE-1によって媒介されるリン酸化の減少に由来し得る。阻害性CDK1リン酸化の低下は、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のMYT-1によって媒介されるリン酸化の減少に由来し得る。
【００８６】
本発明のもう一つの局面は、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のCDK7含有CAKキナーゼによって媒介されるリン酸化の増加を示す非ホジキンリンパ腫の処置において使用するための177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンを含む組成物に関する。
【００８７】
一般
本発明による化合物に関して以前に記述された任意の特色および/または局面が、本明細書中に記載された方法に類推によって当てはまることが理解されるべきである。
【００８８】
以下の図面および例は、本発明を例示するために以下に提供される。それらは、例示的なものであって、決して限定的なものとして解釈されないものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図1は、未標識mAbへの18時間の曝露（処理期間：X軸の下のバー）の後の、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞におけるアポトーシス測定を示す。
【図２】図2は、6MBq/mLの放射標識mAbへの18時間の曝露（処理期間：X軸の下のバー）の後の、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞におけるアポトーシス測定を示す。
【図３】図3は、0MBq/mLまたは6MBq/mLの177Lu-リロトマブまたは177Lu-リツキシマブへの18時間の曝露（処理期間：X軸の下のバー）の後の、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞の細胞周期分布を示す。
【図４】図4は、0μg/mLまたは40μg/mLのリロトマブまたはリツキシマブへの18時間の曝露（処理期間：X軸の下のバー）の後の、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞の細胞周期分布を示す。
【図５】図5は、6MBq/mLの177Lu-リロトマブへの18時間の曝露の後の異なる時点におけるRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞におけるCDK1の発現およびそのリン酸化を示す。
【図６】図6は、6MBq/mLの177Lu-リロトマブへの18時間の曝露の後の異なる時点におけるRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞におけるp345-Chk1、Wee-1、Myt-1、およびCDK7の発現を示す。
【図７】図7は、G2/M停止の阻害剤の細胞増殖に対する効果を示す。
【図８】図8は、177Lu-リロトマブ＋MK-1775または177Lu-リロトマブ＋PD-166285による18時間の処理の後のRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞におけるp14-CDK1およびp15-CDK1の発現を示す。
【図９】図9は、処理された細胞と未処理の細胞との間のG2/M期細胞数の比を示す。処理は、単独の、またはMK-1775もしくはPD-166285と組み合わせた177Lu-リロトマブであった。
【図１０】図10は、177Lu-リロトマブの提唱された作用機序を示す。
【図１１】図11は、RIT（処理期間：X軸の下のバー）の後のRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞の表面におけるCD133およびCD44の定量化を示す。
【図１２】図12は、0.5μg/mlまたは1μg/ml Humalutinの、異なる用量のオラパリブとの組み合わせについての、Chou-Talalay法を使用して計算されたコンビネーションインデックス（Combination Index）を示す。
【図１３】図13は、未処理の（-Betalutin）U2932細胞（A、B）およびRIVA細胞（C、D）、ならびに、それぞれ、1μg/ml（U-2932）および0.5μg/ml（RIVA）Betalutinによって処理された、Betalutinによって処理された（+Betalutin）U2932細胞（A、B）およびRIVA細胞（C、D）の増殖を示す。播種から3日後に、RealTimeGloを培地に添加し、3日目に開始して3日連続で相対発光単位（RLU）を測定した（A、C）。エラーバーは、リプリケートの標準偏差を示す。アッセイは、生細胞によるMT細胞生存性基質（cell viability substrate）の連続的な還元およびNanoLucルシフェラーゼによる迅速な代謝回転に依存する発光シグナルを測定する。パネルBおよびDは、観察期間の開始時（3日目）に対して正規化された、測定された相対発光を示す。
【図１４】図14は、それぞれ、3日目、4日目、5日目、および6日目における、処理されたU-2932（2A）およびRIVA（2B）の相対増殖（相対細胞成長）を示す。
【図１５】図15は、3日目、4日目、5日目、および6日目における、未処理の対照細胞に対する、処理されたU-2932細胞（A、B）およびRIVA細胞（C、D）の相対増殖を示す。AG-14361は、10nMで使用された時、Betalutinの非存在下で、U-2932細胞またはRIVA細胞の細胞増殖に対して軽微な阻害効果しか有していなかった（A、B）。AG-14361は、U-2932細胞において、1μM f.c.で同時投与された時、Betalutinの増殖阻害効果を強化し（C）、RIVA細胞においては、100nM f.c.で強化した（D）。
【図１６】図16は、3日目、4日目、5日目、および6日目における、未処理の対照細胞に対する、処理されたU-2932細胞（A、B）およびRIVA細胞（C、D）の相対増殖を示す。ルカパリブは、試験された全ての濃度で、Betalutinの非存在下で、U-2932細胞またはRIVA細胞の細胞増殖に対して阻害効果を有していなかった。ルカパリブは、U-2932細胞において、1μM f.c.で同時投与された時、Betalutinの増殖阻害効果を強化し（C）、RIVA細胞においては、100nM f.c.で強化した（D）。
【図１７】図17は、U-2932（A）およびRIVA（B）における、BetalutinとPARP阻害剤AG-14361（右の柱）またはルカパリブ（中央の柱）との組み合わせについてのブリススコアを示す。左の柱は、示された日に測定されたBetalutin単剤処理の効果の2標準偏差である任意カットオフを示す。
【図１８】図18は、0.5μg/mlおよび1μg/ml Humalutinの、異なる用量のベネトクラクスとの組み合わせについての、Chou-Talalay法を使用して計算されたコンビネーションインデックスを示す。
【図１９】図19は、G2/M停止の阻害剤の、インビトロの細胞周期およびインビボの腫瘍進行に対する効果を示す。（A）177Lu-リロトマブまたは177Lu-リロトマブ＋1μM MK-1775（WEE-1阻害剤）もしくはPD-166285（WEE-1およびMYT-1の阻害剤）への曝露時の、G2/M細胞周期のRamos細胞、DOHH2細胞、Rec-1細胞、およびOCI-Ly8細胞の、未処理の細胞（対照；1に設定）に対する比を決定した。データは、トリプリケートでの3回の独立した実験の平均値±SDである。（B）Ramos腫瘍異種移植片を保持する胸腺欠損マウスが、（i）250MBq/kgまたは500MBq/kgの177Lu-リロトマブの単回静脈内注射、（ii）注射後1日目から5日目まで、30mg/kg MK-1775（1日2回）、（iii）注射後1日目から5日目まで、250MBq/kgの177Lu-リロトマブ＋30mg/kg MK-1775の組み合わせ（1日2回）を受容した。腫瘍成長（左パネル）を、異種移植後の時間の関数としてモニタリングし、カプランマイヤー生存曲線を確立した（右パネル）（n＝6〜9/群）。（C）OCI-Ly8腫瘍異種移植片を保持する胸腺欠損マウスが、（i）250MBq/kgまたは500MBq/kgの177Lu-リロトマブの単回静脈内注射、（ii）注射後1日目から5日目まで、30mg/kg MK-1775（1日2回）、（iii）注射後1日目から5日目まで、250MBq/kgの177Lu-リロトマブ＋30mg/kg MK-1775の組み合わせ（1日2回）、（iv）未標識mAb（0.5mg/kg）を受容した。腫瘍成長（左パネル）を、異種移植後の時間の関数としてモニタリングし、カプランマイヤー生存曲線を確立した（右パネル）（n＝6〜8/群）。
【図２０】図20は、患者の生検材料から成長した細胞における、G2/M細胞周期停止阻害剤と組み合わせたまたは組み合わせない177Lu-リロトマブの効力を示す。（A）DLBCLまたはFLを有する患者の生検材料中のCD3-/CD20+細胞の割合の蛍光活性化細胞選別分析。細胞を、18時間、177Lu-リロトマブに曝し、3日後（4日目）に分析を行った。（B）18時間の細胞曝露の後の177Lu-リロトマブとMK-1775またはPD-166285との相加的な抗増殖効果の（ブリス独立性数学モデルを使用した）理論値および実験値。処理後1日目または4日目に分析を行った。
【図２１Ａ】単独の、または示された用量のJNJ-7706621と組み合わせたBetalutinによって処理されたU-2932細胞およびRIVA細胞の増殖可能性。未処理の対照細胞に対して正規化された増殖可能性が与えられる（実施例2も参照すること）。
【図２１Ｂ】示された組み合わせのブリス独立性スコアを示す棒グラフ（観察された効果サイズから予想される相加効果サイズを差し引いたもの）。薄灰色のバーは、単独のBetalutinの効果の標準偏差の2倍より大きい超越（surpass）として定義される、相加性の有意な超越についてのカットオフを示す。
【図２２】（A）単独の、または示された用量のPLK1阻害剤GSK461364（A）もしくはBI2536（B）と組み合わせたBetalutinによって処理されたU-2932細胞およびRIVA細胞の増殖可能性。未処理の対照細胞に対して正規化された増殖可能性が与えられる（実施例2も参照すること）。（C、D）示された組み合わせのブリス独立性スコアを示す棒グラフ（観察された効果サイズから予想される相加効果サイズを差し引いたもの）。各日についての右のバーは、単独のBetalutinの効果の標準偏差の2倍より大きい超越として定義される、相加性の有意な超越についてのカットオフを示す。
【図２３】（A）単独の、または示された用量のオーロラBキナーゼ阻害剤MLN8237（アリセルチブ）と組み合わせたBetalutinによって処理されたU-2932細胞およびRIVA細胞の増殖可能性。未処理の対照細胞に対して正規化された増殖可能性が与えられる（実施例2も参照すること）。（B）示された組み合わせのブリス独立性スコアを示す棒グラフ（観察された効果サイズから予想される相加効果サイズを差し引いたもの）。右の薄灰色のバーは、単独のBetalutinの効果の標準偏差の2倍より大きい超越として定義される、相加性の有意な超越についてのカットオフを示す。
【図２４】0.5μg/ml、1μg/ml、もしくは2μg/ml Betalutinによって処理されたU-2932細胞、または未処理のU-2932細胞の、3〜6日目の絶対増殖曲線（左パネル）および相対増殖曲線（右パネル）。エラーバーは、標準偏差を示す（n＝3）。
【図２５】BetalutinとBI2536（A）またはGSK461364（B）との示された組み合わせによって処理されたU-2932細胞の平均効果（Fa）-コンビネーションインデックスプロットおよび用量応答曲線。増殖は、5日目に査定され、未処理の対照細胞に対して正規化された。エラーバーは、標準偏差を示す（n＝3）。
【図２６】BetalutinとMLN8237（アリセルチブ）との示された組み合わせによって処理されたU-2932細胞の平均効果（Fa）-コンビネーションインデックスプロットおよび用量応答曲線。増殖は、5日目に査定され、未処理の対照細胞に対して正規化された。エラーバーは、標準偏差を示す（n＝3）。
【図２７】BetalutinとJNJ-7706621との示された組み合わせによって処理されたU-2932細胞の平均効果（Fa）-コンビネーションインデックスプロットおよび用量応答曲線。増殖は、5日目に査定され、未処理の対照細胞に対して正規化された。エラーバーは、標準偏差を示す（n＝3）。
【図２８】BetalutinとJNJ-7706621とによって処理されたU-2932細胞の3回の独立の実験の平均効果（Fa）-コンビネーションインデックスプロット。U-2932バリデーションプロットは、図27と同様であり、確認実験からのプロットとの比較のために示される。拮抗作用（CI＞1.1）、相加性（CI 0.9〜1.1）、および相乗作用（CI＜0.9）の範囲。灰色の陰影の度合いは、極めて強力な相乗作用（CI＜0.1）、強力な相乗作用（CI 0.3〜0.1）、相乗作用（CI 0.7〜0.3）、中程度の相乗作用（CI 0.85〜0.7）の範囲を定義する。
【図２９】単独のベネトクラクスおよびhumalutin、ならびに両方の処理の組み合わせの薬物応答曲線および適合。
【図３０】単独のオラパリブおよびhumalutin、ならびに両方の処理の組み合わせの薬物応答曲線および適合。
【実施例】
【００９０】
実施例1
B細胞非ホジキンリンパ腫におけるリツキシマブと比べた177Lu-リロトマブの利点は、放射線によって媒介されるG2/M細胞周期停止のモジュレーションを含む。
【００９１】
材料および方法
I．B細胞リンパ腫モデル、モノクローナル抗体、および動物モデル
A．細胞株
Ramos細胞株、DOHH2細胞株、およびRec-1細胞株は、ATCC（American type culture collection）およびECACC（European collection of authenticated cell cultures）から得られた。それらは、CD20抗原およびCD37抗原を発現しており、従って、それぞれ、リツキシマブおよびリロトマブによって標的とされ得る。細胞を、10％熱不活化胎仔ウシ血清、100μg/mlのL-グルタミン、ならびに抗生物質（0.1U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン）が補足されたRPMIにおいて、95％空気/5％CO2の加湿された雰囲気において、37℃で、2〜10×105細胞/mLに成長させた。それらを、Mycotestアッセイ（Life Technologies）を使用して、マイコプラズマ混入についてルーチンに試験した。Ramos細胞株は、3歳男児のバーキットリンパ腫から収集された。これらの細胞は、IgMλの発現、およびc-Myc癌遺伝子を過剰発現するt(8,14)転座の存在を特徴とする。DOHH2細胞株は、濾胞性中心芽細胞性/中心細胞性リンパ腫（GCに由来する濾胞性リンパ腫）から進行した難治性免疫芽球性B細胞リンパ腫を有する60歳男性の胸水から確立された。この細胞株は、IgGλの分泌、ならびにc-Mycの過剰発現をもたらしBcl-2の過剰発現ももたらすt(14;18)(q32;q21)転座およびt(8;14)(q24;q32)転座の異例の存在を特徴とする。この異常性は、DOHH2細胞株が形質転換DLBCL（びまん性大細胞型B細胞リンパ腫）に進行する形質転換FL（濾胞性リンパ腫）であることを誘導する。Rec-1細胞株は、形質転換マントルリンパ腫に進行する終末DLBCLを有する61歳男性のリンパ節または末梢血から確立された。この細胞株は、サイクリンD1を過剰発現するt(11;14)(q13;q32)の存在を特徴とする。
【００９２】
B．抗体
リツキシマブは、ナノモル平衡解離定数でエピトープ(170)ANPS(173)および(182)YCYSI(186)を認識するキメラ抗CD20 IgG1である。このmAbは、ヨーロッパにおいてMabThera（登録商標）という商品名でRoche（Basel,Switzerland）によって開発されたものである。
リロトマブは、ナノモル平衡解離定数を有する、CD37受容体のエピトープ206HLARSRH212に対するマウス抗CD37 IgG1 mAbである。このmAbは、Nordic Nanovector ASA（Oslo,Norway）によって開発され、ルテチウム-177[177Lu]リロトマブ・サテトラキセタン（以前には177Lu-DOTA-HH1として公知であったBetalutin（登録商標））として市販されている。
セツキシマブ（Erbitux（登録商標）、Merck KGaA,Darmstadt,Germany）は、非特異的mAbとして使用されている。このmAbは、多くの癌において高発現されているが、NHL細胞においてはそうでない上皮増殖因子受容体（EGFR）に対するものである。このプロジェクトにおいて、それは、使用された3種のB細胞リンパ腫モデルのいずれにも結合しなかったため、単独の177Luの放射線によって誘導される効果を調査するため、177Luによって放射標識されて使用された。
【００９３】
C．動物モデル
Envigo（Gannat,France）からの胸腺欠損Nude-Foxn1マウス（6週齢雌）およびC.B-17/IcrHanHsd-Prkdc-scidマウス（6週齢雌）が使用された。マウスは、実験的使用の前に1週間順化させられた。それらは、12時間の明暗サイクルで、22℃および55％の湿度で収容された。それらは、病原体除去条件下で維持され、食物および水を自由に摂取した。
【００９４】
II．インビトロ研究
A．モノクローナル抗体の放射標識
p-SCN-ベンジル-DOTAとコンジュゲートされたMAb（リツキシマブ、リロトマブ、および非特異的なセツキシマブ）は、10mg/mLの濃度でNordic Nanovectorから得られ、4℃で維持された。177LuCl3は、8μLの0.05M HCl中370MBqという体積当たりの放射能で、＞740GBq/mgの比放射能で、Perkin Elmerから得られた。放射化学的純度は、＞97％であり、放射性核種純度は＞99.94％であった。任意で、mAbを200MBq/mgの比放射能で177Luによって標識した。典型的には、10μlの10mg/mL DOTA-mAbを、25μlの0.25M NH4OAc（pH5.5）と混合し、37℃で5分間予熱した。1μlの177LuCl3を、反応混合物に添加し（200MBq/mg）、37℃で45分間さらにインキュベートした。製剤緩衝液（100μL）（PBS、7.5％BSA、1mM DTPA、pH7.5）を添加することによって反応を中止した。溶出液としてPBSを用いて、PD-10カラム（GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshire,England）によって、反応混合物を精製した。1μlの反応液を薄層クロマトグラフィ（TLC）に適用することによって、放射化学的純度を決定し、1mlのPBSを含有しているミグレーション（migration）バイアルにおいて分離を行った。ストリップを2個に切断し、各部分の放射能をγ検出器において測定した。下方部分についての値を、全体の値で割ることによって、放射標識収率を得た。それは、一般に、99％を超えていた。添加された177Luの放射能と、収集された177Lu-mAbの放射能との比として、収率を決定した。177Lu-mAbの免疫反応性を、結合アッセイを使用して決定した。典型的には、200μL PBS/BSA（0.5％）中に少なくとも16×106個のRamos細胞を含有している4本の計数管を使用した。2本の管を、20μgの未標識mAbによって処理した。15分後に、10ngの放射標識mAbを4本の管に添加し、室温で1時間インキュベートした。放射能を、洗浄（PBS-BSA 0.5％で3回）の前後に、γカウンターによって測定した。免疫反応性を、結合放射能/全放射能の比（％）として定義した。
【００９５】
B．Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞の表面におけるCD20受容体およびCD37受容体の数の決定
Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞の表面におけるCD20受容体およびCD37受容体の数を、スキャッチャード結合アッセイを使用して決定した。典型的には、100μL培養培地を含有している管において成長した1×106個のRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞を、室温で1時間、増加する量（0〜6.25nM；200MBq/mgの平均比放射能）の放射標識mAb（リロトマブまたはリツキシマブ）と共にインキュベートした。次に、放射能をγ計数し、未結合の放射能を除去するため、細胞をPBSで2回洗浄した。次に、細胞を1mLの培養培地に再懸濁させ、アリコート画分を細胞数決定のために使用し、次に、結合放射能を決定した。結合放射能と遊離放射能との間の比を決定した。次に、それを、結合放射能の関数として表した。
【００９６】
スキャッチャード法は、解離定数（Kd）および抗原の総数の計算を可能にする。実際、決定された数の細胞が、増加する濃度の放射標識mAbの存在下に置かれる。各濃度について、結合放射能/遊離放射能の比が計算される。最後に、結合放射能/遊離放射能の比の関数としての結合放射能に相当するスキャッチャードプロットがトレースされる。各ウェル内の細胞の数、およびmAb放射標識の特徴（mAb 1個当たりの177Luの数）を知ることによって、1細胞当たりの受容体の数およびKdを計算することができる。
【００９７】
C．B細胞リンパ腫に対する177Lu-mAbの治療効力の決定
177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、および177Lu-セツキシマブの治療効力を、クローン原性アッセイを使用して調査した。細胞が懸濁液中にあったため、本発明者らは、ヒト細胞のための組換えサイトカインおよびEPOを含むメチルセルロース培地であるMethoCult（登録商標）培地（H4435、Stemcell technologies）を使用したプロトコルを開発した。1×106個/mLの濃度のRamos細胞およびDOHH2細胞を、1mLのRPMI培地を含有している12穴マイクロプレートにおいて成長させた後、37℃/5％CO2で、18時間、増加する放射能（0MBq/mL；0.5MBq/mL；1MBq/mL；2MBq/mL；4MBq/mL、および6MBq/mL）の177Lu標識mAb（リロトマブ、リツキシマブ、または無関係のセツキシマブ）と共にインキュベートした。次に、細胞を収集し、遠心分離し、培地で2回洗浄した後、5mLのRPMI培地に再懸濁させ、計数した。1500〜45000個の細胞を、4.5mLのMethoCult（登録商標）培地と混合し、播種した（1.5mL/ディッシュ）。播種された細胞の数/ディッシュは、mAbおよび試験放射能に依って、500〜15000の範囲である。次に、ペトリ皿を、コロニー数を決定するため、12〜16日間維持した。50個以上の細胞を含有しているコロニーをスコアリングし、生存画分を計算した。全ての実験を、トリプリケートで少なくとも3回反復した。このアプローチを使用して、最初の18時間以内に細胞を死滅させることができたmAbまたは放射標識mAbの細胞傷害性は、考慮に入れなかった。
【００９８】
D．RIT後の細胞応答に関与する分子機序
1．細胞周期分析
12穴プレートにおいて成長させられ、0MBq/mL、2MBq/mL（示されないデータ）、および6MBq/mLの177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、および177Lu-セツキシマブ、または対応する量（0μg/mL、15μg/mL、および40μg/mL）の未標識mAbに18時間曝された1×106個/mLのRamos細胞、DOHH2細胞、またはRec-1細胞において、細胞周期停止を査定した。RITの0日目、2時間目、18時間目、1日目、2日目、3日目に細胞を採集し、次いで、20℃で70％エタノールで3時間固定し、室温で30分間、暗所で、Merck Milliporeからの（PIを含む）Cell Cycleキット試薬によって染色した後、Muse（登録商標）フローサイトメーターを使用して分析した。次いで、G0/G1期、S期、およびG2/M期の細胞の百分率を計算した（トリプリケートでの3回の実験の平均値）。
【００９９】
2．アポトーシス誘導
12穴プレートにおいて成長させられ、0MBq/mL、2MBq/mL（示されないデータ）、および6MBq/mLの177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、177Lu-セツキシマブ、または対応する量（0μg/mL、15μg/mL、および40μg/mL）の未標識mAbに18時間曝された1×106個/mLのRamos細胞、DOHH2細胞、またはRec1細胞において、アポトーシス誘導を査定した。RITの0時間目、2時間目、18時間目、1日目、2日目、3日目に、細胞を採集した。各時点で、室温で30分間、暗所で、Merck Milliporeからの細胞周期キット試薬（7-AADを含むAnnexin Vキット）によってアポトーシスを検出した後、Muse（登録商標）フローサイトメーターを使用して分析した。
【０１００】
3．ウエスタンブロットによるタンパク質発現の分析
12穴プレートにおいて成長させられ、0MBq/mLおよび6MBq/mLの177Lu-リロトマブに18時間曝された1×106個/mLのRamos細胞、DOHH2細胞、またはRec-1細胞において、タンパク質発現を査定した。RITの0時間目、2時間目、18時間目、1日目、2日目、および3日目に、細胞を採集した。各時点で、細胞を濯ぎ、4℃で30分間、RIPA緩衝液（Santa Cruz）においてインキュベートした。細胞を遠心分離し、（タンパク質を含有している）上清を収集した。タンパク質を12％ポリアクリルアミドゲルを使用したSDS-PAGEで電気泳動し、ニトロセルロース膜に電気泳動転写した。ブロットを、抗CDK1、抗p-CDK1（Tyr15）（クローン10A11）、抗p-CDK1（Thr14）、抗p-CDK1（Thr161）、抗CDK7、抗Wee-1（クローンD10D2）、抗Myt-1、抗p-CHK1（Ser345）、および抗ヒトGAPDH（1/1000、Cell Signaling Technologies,Leiden,The Netherlands）の一次抗体と共にインキュベートした。ブロットを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスlg（115-036-072、Jackson ImmunoResearch）または西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギlg（7074、Cell Signaling）と共にインキュベートした。イムノブロットのシグナル検出を、製造業者の説明書（Clarity（商標）Western ECLブロッティング基質、1705061、BioRad）に従って、増強化学発光プロトコルを使用して実施した。PXi分析機（Ozyme）を、タンパク質発現のレベルを測定するために使用した。
【０１０１】
4．Wee-1およびMyt-1の阻害剤
Ramos細胞、Rec-1細胞、およびDOHH2細胞について、それぞれ、単独の、または6MBq/mL、2MBq/mL、および0.5MB/mLの177Lu-リロトマブと組み合わせた、1μMの選択的Wee-1キナーゼ阻害剤MK-1775（Selleckchem,Houston,USA）または二重Wee-1/Myt-1阻害剤PD-166285（EMD Merck Millipore/Calbiochem,Molsheim,France）によって、18時間、細胞を処理した。インキュベーション開始後の異なる時点で、CDK1リン酸化レベルを測定するためにタンパク質を抽出し、平行して、増殖を決定し、インキュベーション開始後、18時間目および24時間目に、G2/M期細胞の百分率を査定した（細胞周期分析を除き、実験は3回実施された）。
【０１０２】
5．幹細胞マーカー：CD44およびCD33の発現
12穴プレートにおいて成長させられ、0MBq/mLおよび6MBq/mLの177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、または177Lu-セツキシマブに18時間曝された1×106個/mLのRamos細胞、DOHH2細胞、またはRec-1細胞において、幹細胞マーカー（CD133およびCD44）を査定した。RITの0時間目、2時間目、18時間目、および1日目から10日目までの各日に細胞を採集した。各時点で、細胞をPFA 4％で10分間固定し、PBSで2回洗浄し、4℃でPBSにおいて無菌的に保管した。幹細胞マーカーを抗CD133-FITC（クローン：AC133、Milteniy）および抗CD44-APC（クローン：IM7、Merck Millipore）によって検出した。0.5×106個の細胞を、PBS-BSA 0.5％中に1時間飽和させた。次に、細胞を遠心分離し、暗所で室温で1時間、抗CD133-FITC（2μL）および抗CD44-APC（0.125μg）と共にインキュベートした。最後に、細胞を2回濯ぎ、Gallios（登録商標）フローサイトメーター（Beckman Coulter）を使用して分析した。
【０１０３】
E．細胞線量測定
1．細胞の放射能取り込みおよび細胞数決定
細胞線量測定に向けた予備工程として、177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、または177Lu-セツキシマブのいずれかに18時間曝されたRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞において放射能の取り込みを決定した。典型的には、1×106個/mL培養培地のRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞を、増加する放射能（0MBq/mL；0.5MBq/mL；1MBq/mL；2MBq/mL；4MBq/mL、および6MBq/mL）の177Lu標識mAbと共に18時間インキュベートした。次いで、細胞を培養培地で2回洗浄し、200×103細胞/mLの濃度で、1mLの培養培地を含有している12穴マイクロプレートに播種した。様々な時点（2時間目、18時間目、24時間目、48時間目、72時間目、および144時間目）で、細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、1mlのPBSに再懸濁させ、γ計数した（Hewlett Packard,Palo Alto,CA）。アリコート画分（8μL）を、セルカウンター（Muse、Merck Millipore）を使用した細胞数決定のために使用した。1細胞当たりの放射能（Bq/細胞）を計算し、時間（h）の関数として、1細胞当たりの放射能の取り込み（Bq/細胞）を表すグラフとしてプロットした。全ての細胞株および各mAbについて、実験は、トリプリケートで行われ、少なくとも3回繰り返された。
【０１０４】
2．フラスコ培養における細胞の幾何学および挙動
Ramos細胞のヨウ化プロピジウム染色および蛍光顕微鏡分析の後に、Ramos細胞の細胞および核の寸法を決定した。細胞および核の両方について、最大および最小の直径に対応する面積およびサイズを決定した。DOHH2細胞およびRec-1細胞については、細胞寸法を、Scepter（商標）2.0 Cell Counter（Merck）で決定し、核寸法を、Dapi染色および蛍光顕微鏡分析の後に決定した。放射性医薬品とのインキュベーション中に、細胞は、培養物の中心に蓄積し、異なるサイズのクラスタを形成する傾向を示した。（単離された）細胞の密度およびクラスタは、培養ウェル内で極めて不均一であったため、これらのパラメータの予備決定を、光学顕微鏡法によって取得された画像に基づき実施した。177Lu-リツキシマブおよび177Lu-リロトマブによって処理されたRamos細胞およびDOHH2細胞に対応する4セットの画像を取得した。培養ウェル内の3種の領域を同定した:中心、途中、および端。各領域について、4種の細胞/抗体組み合わせの各々について、各領域における細胞密度を測定するため、2枚の写真を50倍および200倍で撮った。
【０１０５】
III．インビボ研究
A．最大許容放射能（MTA）の決定
a．胸腺欠損ヌードマウスにおいて
100μLのNaCl中の177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、または177Lu-セツキシマブをマウスに静脈内注射した。異なる3種の放射能：400MBq/kg、500MBq/kg、または600MBq/kgを査定し（各試験放射能について各mAbについてn＝4）、177Lu-リツキシマブについては、さらに、300MBq/kgおよび350MBq/kgを査定した。次いで、処理の可能性のある毒性を評価するため、マウスを3日毎に計量した（終点は、20％を超える体重減少、または疾病もしくは不調の何らかの兆候であった）。
【０１０６】
b．Scidマウスにおいて
177Lu-mAbによる処理の1日前に、10mg/kgのマウス非特異的IgG2a（M7769、Sigma-Aldrich,Saint-Louis USA）をマウスに腹腔内注射した。次いで、100μLのNaCl中の177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、または177Lu-セツキシマブをマウスに静脈内注射した。異なる3種の放射能、75MBq/kg、125MBq/kg、または150MBq/kgを査定した（各試験放射能について各モノクローナル抗体についてn＝4）。最後に、処理の可能性のある毒性を評価するため、マウスを3日毎に計量した（終点は、20％を超える体重減少、または疾病もしくは不調の何らかの兆候であった）。
【０１０７】
B．生存実験
a．胸腺欠損ヌードマウスにおいて
100μLの新鮮な無血清培地に再懸濁した10×106個のRamos NHL細胞を、マウスの右側腹部に皮下異種移植した。腫瘍体積が100〜200mm3に達した異種移植の13日後に、マウスを処理した。対照群においては、100μLのNaCl、RITにおいて使用されたのと同一の量の高濃度（10mg/kg）のリロトマブmAbまたはリツキシマブmAbを、マウス（n＝8/処理群）に静脈内注射した。RIT実験のため、177Lu-リロトマブmAb、177Lu-リツキシマブmAb、または177Lu-セツキシマブmAbのいずれかのMTAを、マウス（n＝6〜9/処理群）に静脈内注射した（100μL）。ノギスで腫瘍体積を測定することによって腫瘍成長を評価し（以下の式において、a、b、cは3個の直径を表す）、週に2回または3回、動物の体重を決定した。腫瘍体積は、以下の式：
2021504341.tif 000003
を使用して計算された。腫瘍体積が2000mm3に達した時、または体重減少が20％を超えるか、または疾病もしくは不調の何らかの兆候があった時、CO2窒息または頚部脱臼を使用してマウスを屠殺した。
【０１０８】
b．Scidマウスにおいて
100μLの新鮮な無血清培地中の10×106個のDOHH2 NHL細胞を、マウスの右側腹部に皮下異種移植した。処理の前日（異種移植後+6日目）に、10mg/kgの非特異的IgG2a（M7769、Sigma-Aldrich,Saint-Louis USA）をマウスに腹腔内注射した。マウスを異種移植後7日目に処理し（n＝7/処理群）、対照群においては、100μLのNaCl、RIT実験において使用されたのと同一の量で高濃度（10mg/kg）でリロトマブまたはリツキシマブmAbをマウスに静脈内注射した。RIT実験のため、177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、または177Lu-セツキシマブのMTAをマウスに静脈内注射した（100μL）。腫瘍成長を、ノギスを使用して腫瘍体積を測定することによって査定し（前記式において、a、b、cは3個の直径を表す）、動物の体重を週に2回または3回決定した。腫瘍体積を以前の方程式を使用して計算した。腫瘍体積が2000mm3に達した時、または体重減少が20％を超えるか、または疾病もしくは不調の何らかの兆候があった時、CO2窒息を使用してマウスを屠殺した。
【０１０９】
c．血液毒性
処理後の最初の1ヶ月間、週2回、尾静脈から血液試料（約12μL）を収集した。血液毒性を決定するため、それらをScil Vet abc系（SCIL Animal Care Co., Altorf）を使用して分析した。
【０１１０】
C．インビボ線量測定
1．体内分布実験
a）胸腺欠損ヌードマウスにおいて
治療的実験と同様に、1000万個のRamos細胞をマウスに皮下異種移植した。13日後に、生存実験において使用された治療的実験を、マウスに静脈内注射した。次いで、2種のプロトコルを実施した。
- 第1のプロトコル:25匹のマウスを177Lu-リロトマブによって処理した。処理後の各時点（1時間目、1日目、2日目、3日目、および6日目）において、SPECT-CT画像を5匹のマウスにおいて実施し、これらのマウスを剖検した。各器官を収集し、計量し、放射能取り込みをγ計数を通して測定した。このプロトコルは、エクスビボの計数と、インビボの画像に基づく体内分布との間の比較を可能にする。
- 第2のプロトコル:177Lu-リツキシマブまたは177Lu-セツキシマブをマウスに静脈内注射した（1処理当たり5匹のマウス）。処理後の異なる時点（1時間目、1日目、2日目、3日目、および6日目）において、各マウスをSPECT-CTによって画像化し、最後の時点において、マウスを剖検した。このプロトコルは、（剖検されるマウスの数を低下させるため）インビボ体内分布を実施するためであった。
【０１１１】
a．Scidマウスにおいて
1000万個のDOHH2細胞を75匹のマウスに皮下異種移植した。6日後に、10mg/kgのIgG2a（M7769、Sigma-Aldrich,Saint-Louis USA）をマウスに腹腔内注射した。翌日、生存実験において使用された治療的放射能の177Lu-リロトマブ、177Lu-リツキシマブ、または177Lu-セツキシマブをマウスに静脈内注射した（各放射標識mAbにつき25匹のマウス）。次いで、処理の後の異なる時点（1日目、2日目、3日目、および6日目）において、致死量のケタミン（26mg/mL）/メデトミジン（0.30mg/mL）の注射（2.5mL/kg）によってマウスを屠殺した（n＝5マウス/解剖時）。最後に、器官を収集し、計量し、放射能取り込みを測定した。各器官について、組織1グラム当たりの注射された放射能に対する百分率を、時間の関数としてプロットした（補正された減衰）。
【０１１２】
2．Sファクター（S-factor）決定
Sファクター、S（t←s）は、標的領域tにおける平均吸収線量を、線源領域sにおける放射性崩壊で割ったものに相当する。Sファクターは、線源によって放射された粒子の全ての型および物質の組成の寄与を考慮に入れる。このプロジェクトにおいて使用されたS値は、177LuによってMOBYボクセルファントムにおいてモンテカルロシミュレーションによって得られた。
【０１１３】
IV．統計分析
統計分析は、ICM Val d'Aurelle（Montpellier）のDepartment of statisticsによって実施された。データは、中央値、平均値、および標準偏差を使用して記載された。インビボ実験において、腫瘍成長と移植後日数との間の関係を決定するため、線形混合回帰モデルが使用された。カプランマイヤー法を使用して、異種移植日から関心対象のイベント（即ち、2000mm3の腫瘍体積）の日まで、生存率が推定された。群間で生存曲線を比較するため、ログランク検定が使用された。インビトロデータ（細胞周期および阻害剤の効果）を、ノンパラメトリック・クラスカル-ウォリス検定によって比較した。有意水準は、p＜0.05に設定された。統計分析は、Stataソフトウェアv13.0（Stata Corporation College Station,USA）を使用して実施された。
【０１１４】
結果および考察
これは、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞における177Lu-リロトマブおよび177Lu-リツキシマブの細胞傷害効果に関与する分子機序をインビトロで調査することを目標としていた。
【０１１５】
周期進行、アポトーシス誘導、細胞シグナリングタンパク質の発現、および幹細胞マーカー発現を、177Lu-mAbに曝された細胞において調査した。177Lu-セツキシマブを、非特異的抗体、即ち、非特異的照射の対照として使用した。
【０１１６】
A．アポトーシス誘導
放射線によって誘導される血液細胞の細胞死およびリツキシマブに対する細胞応答におけるアポトーシスの役割が、広範に強調されているため、本発明者らは、未標識mAbまたは放射標識mAbとのインキュベーションの後のRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞におけるアポトーシスを測定した。DOHH2のリツキシマブとのインキュベーションは、18時間目にプラトー（52±1％）に達し、2日目まで持続する、強力なアポトーシスの誘導を伴っていた。アポトーシスレベルは、Ramos細胞においてより低く（24時間後のピーク時に22±3％）、Rec-1細胞については中間であった（24時間後のピーク時に42±12％）。リロトマブによる処理の後には、アポトーシスは誘導されなかった（図1）。
【０１１７】
アポトーシスは、放射標識mAbで処理された3種の細胞株において誘導された（図2）。177Lu-リツキシマブへの曝露の後、最も高いアポトーシスのレベルは、DOHH2細胞において測定され（72時間後のピーク時に97±3％）、最低は、Ramos細胞において観察され（72時間後のピーク時に56±12％）、中間はRec-1細胞において観察された（72時間後のピーク時に79±16％）。DOHH2細胞においては、3種の177Lu-mAbについて類似した傾向が観察された。Ramos細胞においては、アポトーシスが、177Lu-リロトマブおよび177Lu-セツキシマブへの曝露の後、類似したレベルで72時間目に最大レベルに達した（それぞれ、33±8％および27±10％）。Rec-1細胞において、アポトーシスのピークは、177Lu-リツキシマブ、177Lu-リロトマブ、および177Lu-セツキシマブへの曝露の後、それぞれ、79±16％、67±18％、および60±19％の値で72時間目に測定された。
【０１１８】
B．Ramos細胞株、DOHH2細胞株、およびRec-1細胞株における細胞周期効果
0MBq/mL、2MBq/mL（示されないデータ）、および6MBq/mLの177Lu-mAbへの曝露の後のRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞の細胞周期分布を調査した。
【０１１９】
1．放射標識mAbへの曝露の後
図3は、曝されていないRamos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞について、細胞周期分布が、G0/G1期が39〜48％、S期が25〜35％、G2/M期が23〜40％であったことを示す。細胞が6MBq/mLの177Lu-リロトマブに曝された時、24時間目にG2/M細胞周期停止を示す細胞の割合は、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞について、それぞれ、64±16％、45±11％、および44±11％であった。未処理の細胞における対応する値は、それぞれ、30％、30％、および25％であった。さらに、細胞が6MBq/mLの177Lu-リツキシマブに曝された時、24時間目にG2/M細胞周期停止を示す細胞の割合は、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞について、それぞれ、56±13％、38±2％、および40±11％であった。
【０１２０】
2．未標識mAbへの曝露の後
3種の細胞株を40μg/mLリロトマブに曝した時（図4）、細胞の細胞周期分布は、未処理の細胞のものに類似していた。さらに、細胞を40μg/mLリツキシマブに曝した時、18時間目にG1/G0細胞周期停止を示す細胞の割合は、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞について、それぞれ、51±9％、52±9％、および43±7％であった。未処理の細胞についての対応する値は、それぞれ、31±2％、35±6％、および42±3％であった。
【０１２１】
3．キーポイント
mAbまたは177Lu-mAbによる処理に対する細胞の放射線生物学的応答を査定した：
- アポトーシスは、3種の細胞株において、リツキシマブによる処理の後に誘導されたが、リロトマブ処理の後には誘導されなかった。
- 177Lu-mAbは、3種の細胞株においてアポトーシスを誘導したが、放射線感受性DOHH2細胞株においては、より高レベル、放射線抵抗性Ramos細胞株においては、より低レベルであった。
- 177Lu-リロトマブは、放射線感受性DOHH2細胞株において、177Lu-リツキシマブと同等のアポトーシスを誘導したが、他の2種の細胞株における誘導は、より低かった。
- 177Lu-mAbは、未処理の細胞と比較して、G2/M期Ramos細胞の数の増加（2倍）をもたらしたが、この増加は、放射線感受性DOHH2細胞株においては起こらなかった（1.1倍）（Rec-1は両者の間；1.7倍であった）。
- G1期における細胞周期停止が、Ramos（1.6倍）およびDOHH2（1.5倍）においてリツキシマブによる処理の後に観察されたが、Rec-1細胞株においては観察されなかった。
アポトーシス誘導は、G2/M細胞周期停止と反比例していた。実際、最も放射線抵抗性のモデルであるRamos細胞株は、177Lu-mAbによる処理の後にアポトーシスの弱い誘導を示したが、G2/M期細胞の最も高い蓄積を示した。反対に、最も放射線感受性のモデルであるDOHH2細胞株は、177Lu-mAbによる処理の後に最も高レベルのアポトーシスの誘導を示すのみならず、最も低いG2/Mにおける停止も示した。本発明者らは、G2/M細胞周期停止が細胞放射線感受性の主成分であると仮定した。この停止に関与するタンパク質を調査した。
【０１２２】
C．G2/M細胞蓄積に関与するタンパク質
CDK1キナーゼは、G2/M移行の調節に関与する主要なタンパク質である。このキナーゼは、それぞれ、Myt-1キナーゼおよびWee-1キナーゼによるThr14残基およびTyr15残基における阻害性のリン酸化によって、また、CDK活性化キナーゼによるThr161における活性化リン酸化によって、厳格に制御されている。CDK1キナーゼの発現およびそのリン酸化を調査した（図5）。
【０１２３】
CDK1レベルは、Ramos細胞およびRec-1細胞において非常に安定していたが、DOHH2においては、177Lu-リロトマブ添加後48時間目および72時間目に減少した。Ramos細胞においては、高い持続的なレベルの阻害性のpTyr15およびpThr14 CDK1リン酸化が存在したが、活性化pThr161リン酸化の一過性の低レベルが、177Lu-リロトマブへの曝露後18〜24時間目に観察された。類似した結果が、Rec-1細胞において示されたが、pThr161-CDK1は検出不可であった。反対に、DOHH2細胞においては、逆のことが観察された。Tyr15およびThr14のリン酸化レベルが、それぞれ、177Lu-リロトマブ曝露後24時間目および48時間目に低下した。阻害性リン酸化のレベルのこの減少は、活性化pThr161リン酸化の発現の持続性の増加と関連していた。
【０１２４】
Thr161残基におけるCDK1のリン酸化に関与する複合体の一部であるCDK7のレベルは、Ramos細胞と比較して、DOHH2細胞およびRec-1細胞において、安定しているかまたは増加していた（図6）。また、G2/M停止をもたらすTyr15におけるCDK1リン酸化を媒介するWee-1の発現は、18〜48時間目に対照ならびに処理されたRamos細胞およびRec-1細胞において比較可能であった。反対に、DOHH2細胞においては、基線が低く、処理後24時間目に検出不可になった。これらの観察は、177Lu-リロトマブへの曝露後に、G2/M細胞周期Ramos細胞が蓄積するが、DOHH2細胞はそうでないという本発明者らの以前の結果を支持した。細胞照射後のWee-1およびMyt-1の活性化に関与する、リン酸化されたCHK1（Ser345）のレベルは、18〜24時間目にRamos細胞およびDOHH2細胞において増加したが、Rec-1細胞においては、18時間目まで安定したままであり、その後、次第に減少した。G2/M停止に寄与するThr14-CDK1リン酸化に関与するキナーゼMyt-1の発現は、処理後18時間目に3種全ての細胞株において減少した。
【０１２５】
D．Wee-1およびMyt-1の阻害剤
Wee-1キナーゼおよびMyt-1キナーゼが、177Lu-リロトマブに曝されたRamos細胞におけるG2/M細胞周期蓄積に関与しているようであったため、細胞を、177Lu-リロトマブと組み合わせて、これらのキナーゼの薬理学的阻害剤MK-1775およびPD-166285によって処理した。MK-1775は、Wee-1触媒活性を阻害し、その後、pTyr15-CDK1リン酸化を阻害する。PD-166285は、Wee-1およびMyt-1の両方を阻害し、その後、Tyr15およびThr14の両方におけるCDK1のリン酸化を阻害する。
【０１２６】
1．増殖研究
図7は、処理開始の6日後の、単独の177Lu-リロトマブもしくは阻害剤または組み合わせに18時間曝された細胞の数と、未処理の細胞の数との間の比を示す。177Lu-リロトマブによる処理のために使用された放射能は、未処理の細胞と比較して、3種の細胞株について約50％まで増殖を減少させるよう選択された。
【０１２７】
Ramos細胞において、両方の阻害剤が、70％への増殖の減少を誘導し、RITとMK-1775またはRITとPD-166285の組み合わせは、ほぼ10％への類似した減少を誘導した。増殖のこれらの減少は、単独の177Lu-リロトマブまたは阻害剤を使用した処理と統計的に異なっていたが（p＝0.0495）、2種の組み合わせの間には差が観察されなかった（p＝0.5127）。DOHH2細胞については、PD-166285のみが、強力な減少（18％）によって、増殖を修飾することが示された。177Lu-リロトマブの抗増殖効果は、2種の阻害剤の存在下でより明瞭であったが、単独の阻害剤（p＝0.1213）または単独の177Lu-リロトマブ（p＝0.1213）と比較して、統計的な差は示されなかった。増殖の有意な低下が、阻害剤に曝されたRec-1細胞についても観察された（p＝0.0495）。しかしながら、177Lu-リロトマブとMK-1775との組み合わせのみが、単独の阻害剤（p＝0.0495）または単独の177Lu-リロトマブ（p＝0.0495）と比較して、増殖を統計的に低下させた。
【０１２８】
2．CDK1のリン酸化
両方の組み合わせ（RIT＋MK1775またはRIT＋PD166285）の治療効力は、3種の細胞株におけるCDK1のリン酸化を確証した。
【０１２９】
177Lu-リロトマブに曝されたRamos細胞におけるpTyr15-CDK1およびpThr14-CDK1の比較的高い持続性のレベルは、次いで、2時間目および18時間目に、対応する阻害剤の存在下で減少し、その後、再び増加した（図8）。DOHH2細胞において、pTyr15-CDK1について、18時間後のこの再増加は、より不明瞭であるか、またはさらには観察可能でなかった；pThr14-CDK1については、基底レベルが低すぎたため、モジュレートされ得ず検出され得なかった。Rec-1細胞については、pThr14-CDK1の基底レベルが低かったため、阻害剤はリン酸化発現に対する効果を示さなかったが、pTyr15-CDK1の発現は、処理中に減少し、48時間目に増加した。
【０１３０】
3．G2/M細胞周期停止の阻害
図9は、単独の、またはMK-1775もしくはPD-166285と組み合わせた177Lu-リロトマブによる処理後の細胞と、未処理の細胞との間の、G2/M期細胞の数の変動を示す。以前に示されたように、G2/M期のRamos細胞およびRec-1細胞の割合は、177Lu-リロトマブによる処理の後に増加した。阻害剤を177Lu-リロトマブと組み合わせた時、G2/M期細胞の割合は減少した。Ramos細胞において、両方の組み合わせによる処理の後、G2/M細胞の割合は、未処理の細胞のものに類似したものになった。Rec-1細胞について、両方の組み合わせは、G2/M期細胞の割合を半減させた。DOHH2細胞において、177Lu-リロトマブとPD-166285との組み合わせによって誘導されたG2/M細胞の割合の減少は、MK-1775との組み合わせによって誘導されたものより高い。
【０１３１】
4．キーポイント
- 両方の組み合わせが、G2/M細胞の割合の減少をもたらすCDK1リン酸化の低下に関連したRamos細胞の増殖の強力な減少を示した。Ramos細胞株において、177Lu-リロトマブとMK-1775または177Lu-リロトマブとPD-166285の組み合わせによって処理された細胞の増殖の差は観察されず、そのことから、G2/M細胞周期停止において役割を果たす主要なリン酸化が、pTyr15-CDK1であることが示された。DOHH2細胞において、2種の阻害性リン酸化（p14およびp15）の基底レベルは弱かった。阻害剤が使用された時、（特に、PD-166285について）細胞増殖が減少したが、これは、統計的に有意でなく、Ramos細胞株より低い程度であった。Rec-1細胞株について、主要な阻害性リン酸化は、P-Tyr15-CDK1であった。阻害剤が177Lu-リロトマブと関連していた時、MK-1775は、細胞増殖の低下においてPD-166285と同等に効率的であり、このことから、Rec-1細胞応答におけるP-Tyr15-CDK1の重要性が確証された。
【０１３２】
E．考察
このパートにおいて、本発明者らは、177LuリロトマブがRamos細胞よりDOHH2細胞において効率的であり、Rec-1細胞が中間の応答を示す理由を説明し得る生物学的機序を調査した。さらに、本発明者らは、パートIにおいて、放射線とリツキシマブとの間の相乗性が、程度は異なるが、Ramos細胞およびDOHH2細胞の両方において観察され、177Lu-リロトマブについては、DOHH2細胞においてのみ、相乗性が観察されることを示した。後者の結果は、DOHH2腫瘍異種移植モデルにおいて、未標識リツキシマブはリロトマブより効率的であったが、177Lu-リロトマブは177Lu-リツキシマブと同等に効率的であったインビボデータによって支持された。
【０１３３】
177Lu-mAbによる処理の後のアポトーシス誘導は放射線感受性DOHH2モデルにおいてより高い
血液疾患はアポトーシスを通して照射に応答することが公知であるため、Ramos細胞、DOHH2細胞、およびRec-1細胞において、未標識mAbまたは放射標識mAbによる処理の後のアポトーシス誘導を測定した。以前の研究と一致して、リツキシマブは、3種の細胞株において強力なアポトーシス誘導を誘導するが、リロトマブはそうでないことが示された。しかしながら、mAbが放射標識された時、アポトーシスレベルは、3種の細胞株において増加し、177Lu-リロトマブおよび177Lu-リツキシマブの両方について同様に、DOHH2細胞について最も増加した。アポトーシスレベルは、Ramos細胞においてより低く、Rec-1細胞について中間であった。これらの結果は、177Lu-リロトマブおよび177Lu-リツキシマブの治療効力が、DOHH2モデルにおいてより高く、観察された細胞の放射線感受性と相関し得ることを示す、インビトロおよびインビボの結果と一致している。
【０１３４】
放射線抵抗性Ramosモデルは177Lu-mAbによる処理の後のG2/M期細胞の数の増加を特徴とする
アポトーシスは、細胞周期チェックポイントによって厳格に調節されているため、処理された細胞の細胞周期分布（G0/G1、S、およびG2/M）を分析した。G2/M期細胞の数は、177Lu-mAb処理に応答して、放射線抵抗性細胞株においては、未処理の細胞と比較して強く増加したが、最も放射線感受性の細胞株においてはそうでなかった。G2期において、CDK1は、サイクリンA2およびBに結合することによって活性化される。M期に入る時、サイクリンA2は分解され、CDK1-サイクリンB複合体は残存し、有糸分裂後期においてさらに分解される。CDK1のサイクリンとの会合に加えて、G2/M細胞周期進行は、CDK1がThr161においてリン酸化された時に促進される。反対に、Wee-1によるTyr15および/またはMyt-1によるThr14のリン酸化は、G2/Mにおいて細胞をブロックする。放射線感受性DOHH2細胞において、177Lu-リロトマブによる処理の後、pTyr15-CDK1およびpThr14-CDK1のレベルは減少し、pThr161-CDK1のレベルは増加する。反対に、Ramos細胞およびRec-1細胞においては、pTyr15-CDK1およびpThr14-CDK1の発現が高く、pThr161-CDK1の発現が低い。これらのタンパク質リン酸化は、細胞周期分析と一致している。従って、G2/M停止は、細胞株の放射線感受性に影響する主要なチェックポイントであろう。G2/M停止は、177Lu-mAb処理に応答してDNA損傷を修復するための時間を細胞に提供し、その後、細胞周期が進行する。DOHH2細胞において、G2/M停止の欠如は、強力なアポトーシス誘導を伴う。G2/M停止の役割を確認するため、Thr14およびTyr15におけるCDK1のリン酸化の阻害剤を使用した。Wee-1の特異的阻害剤MK-1775、ならびにWee-1およびMyt-1の両方を阻害するPD-166285を使用した。これらの阻害剤を、177Lu-リロトマブと組み合わせて使用した。まず、ウエスタンブロットによって、CDK1リン酸化の減少が、3種の処理された細胞株において観察されたため、Wee-1キナーゼおよびMyt-1キナーゼの活性の阻害が確認された。その後、G2/M期細胞の百分率は、全ての細胞株において、177Lu-リロトマブのみによって処理された細胞と比較して、組み合わせによって処理された細胞において減少することが示された。次に、177Lu-リロトマブに曝された細胞に対する、これらの阻害剤の抗増殖効果が示され、効果は、放射線抵抗性Ramos細胞株においてより顕著であった。結果は、放射標識mAbによる処理の後の細胞応答におけるCDK1リン酸化の意義を確認する。
【０１３５】
G2/M細胞周期停止の阻害は放射線抵抗性Ramosモデルを放射線感作する
次に、177Lu-リロトマブに対する応答におけるMK-1775またはPD-166285の役割を調査するため、ブリス独立性数学モデルを使用した。理論上の治療効力を、3種の細胞株において、2種の組み合わせ（MK-1775またはPD-166285）について計算した。そして、実験曲線と理論曲線との間の比較を行った。
理論上の効力RIT＋阻害剤＝効力RIT + 効力阻害剤 - (効力RIT×効力阻害剤)
阻害剤と177Lu-リロトマブとの間の相乗性（p＝0.0495）が、Ramos細胞において示された。DOHH2細胞およびRec-1細胞においては、組み合わせが、相加的でしかないことが示された。これは、おそらく、G2/M細胞周期停止が、Rec-1細胞において比較的顕著でなく、DOHH2細胞には存在しないという事実によって説明され得る。
【０１３６】
最後に、図10に記載された177Lu-リロトマブの作用機序が提唱された。
【０１３７】
結論および展望
このプロジェクトは、腫瘍細胞応答の基礎をなす分子機序を調査することを目標としていた。177Lu-リロトマブは、形質転換濾胞性リンパ腫前臨床モデルにおいてリツキシマブより効率的であった。177Lu-リロトマブは、バーキットリンパ腫細胞においても効率的であったが、はるかに高い用量が必要とされた。さらに、CDK1によって媒介されるG2/M細胞周期停止の低下は、177Lu-リロトマブ効力を予測することが示された。Wee-1の薬理学的阻害剤（MK-1775）を使用したG2/M細胞周期停止からのRamos細胞およびRec-1細胞の開放は、これらの細胞を177Lu-リロトマブに対して感作した。これらの結果は、177Lu-リロトマブが、再発した低悪性度リンパ腫において特に活性であったことを示す臨床研究を支持する。最後に、本発明者らの実験アプローチにおいては、免疫不全マウスを使用したため、免疫学的応答が低下したが、NK細胞が両方のマウス系統において活性であるため、いくらかのADCC効果が予想され得ることに注意しなければならない。臨床環境において、ADCCを活性化することができるリロトマブのキメラバージョンを使用することによって、免疫学的応答が増強される可能性がある。
【０１３８】
処理後の放射線感受性DOHH2細胞における幹細胞マーカーの存在
細胞が如何にして処理を生き延びることができるかを決定する予備研究を実施した。癌幹細胞は、American Association of Cancer Researchによって、「自己再生し腫瘍を維持する排他的な能力を有する自己持続性細胞の貯蔵所を構成する」細胞として説明されている。放射標識mAb処理が、放射線感受性細胞株においてすら、ペトリ皿内の腫瘍細胞を根絶しなかった理由をよりよく理解するため、処理された細胞の表面における癌幹細胞マーカーの発現を、処理開始時から処理の9日後まで分析した。
【０１３９】
乳癌、前立腺癌、膵臓癌、および頭頸部癌を含むますます多くの上皮腫瘍において、多様な癌幹細胞が同定されており、それらの大半が、細胞表面糖タンパク質CD44を発現している。もう一つの細胞表面マーカーCD133糖タンパク質は、脳癌および結腸癌の腫瘍開始細胞を定義した。リンパ腫において、第1の研究は、高度に腫瘍原性であり、インビボで自己再生能力を示すCD45+/CD19-亜集団が、マントルリンパ腫において存在することを示すことができた。
【０１４０】
予備研究のため、6MBq/mL 177Lu-リロトマブおよび177Lu-リツキシマブによって18時間処理された細胞の表面におけるCD133およびCD44の発現の調査を行った。図11は、処理された細胞の表面における受容体の数と、未処理の細胞の表面における受容体の数との間の比を示す。
【０１４１】
CD44およびCD133を発現する細胞の割合は、177Lu-リロトマブまたは177Lu-リツキシマブに曝された放射線感受性DOHH2細胞株において、RITの9日後まで強く増加し、Rec-1細胞においてもより低い程度に増加したが、Ramos細胞においては増加しなかった。これらの結果は、放射線感受性細胞株におけるRITの後、生存細胞の集団が修飾されることを示唆する。仮説は、この集団が処理に対して抵抗性であり、腫瘍の新たな形成を可能にするというものである；放射線抵抗性細胞株において、処理は、細胞集団の修飾を示すために十分な幹細胞集団を選択しなかった。さらに進めて、この新しい集団（CD133+/CD44+）が一次集団より放射線抵抗性であるか否かを決定し、この新しい集団と一次集団との間の特徴（培養物成長、異種移植片成長の時間、処理に対する応答等）の違いを決定することは、興味深いであろう。最後に、もう一つの疑問は、集団がCD133+/CD44+になるのか、それとも既に存在する細胞CD133+/CD44+を処理が選択するのかを知ることである。
【０１４２】
臨床におけるRITとWee-1阻害剤との組み合わせ
いずれにせよ、臨床的処置のために組み合わせ（RIT＋細胞周期停止阻害剤）を考慮することは興味深いであろう。実際、全ての細胞株において、組み合わせは、常に、単独のRITより細胞増殖に対して効率的である。臨床において、結果は類似するであろうと考えることができる。腫瘍の放射線感受性に関するデータがなくても：
- 腫瘍が放射線抵抗性である場合、177Lu-リロトマブおよび細胞周期停止阻害剤の組み合わせは、177Lu-リロトマブの効果を強化し、腫瘍を放射線感作し；
- 腫瘍が放射線感受性である場合にも、組み合わせは、前ケースより低い程度ではあるが、少なくとも効果の相加性のため、単独のRITより有効である。
【０１４３】
さらに、CD4/CDK6阻害剤、汎CDK阻害剤、およびWee-1阻害剤のような細胞周期進行のために必要とされタンパク質の阻害剤は、血液腫瘍の癌治療のために関心を集めており、臨床試験において査定されているため、この関連は、特に興味深い。特に、MK-1775は、バーキットリンパ腫におけるSRC阻害剤の効力を増強し、CHK1阻害剤およびWee-1阻害剤の組み合わせは、マントル細胞リンパ腫において相乗的である。
【０１４４】
さらに、CHK1は、Wee-1およびMyt-1のリン酸化に関与しているため、腫瘍細胞をDNA損傷に対して感作するためのCHK1薬理学的阻害剤が、臨床試験によって査定されている。しかしながら、本発明者らの実験モデルにおいて、P-CHK1発現は177Lu-mAbへの曝露によって修飾されなかったことに注意しなければならない。
【０１４５】
細胞の放射線感受性におけるタンパク質14-3-3の意義とは?
177Lu-リロトマブの効果を強化するため、他のタンパク質を標的とすることができるかもしれない。例えば、タンパク質14-3-3も、RITにおいて標的とするための優れた候補であり得る。癌における14-3-3タンパク質の重大な役割は、特に、乳癌、肺癌、および頭頸部癌において研究されている。14-3-3の優勢な役割を支持して、14-3-3の高い発現は、乳癌患者の予後不良に関連している。このタンパク質は、CDC25Cの細胞質隔離に関係しており、CDC25Cによる14位および15位におけるCDK1の脱リン酸を通して有系分裂開始を防止する。さらに、Badは、Bcl-xLまたはBcl-2の不活化を通してシトクロムCの放出を促進し、アポトーシス誘導をもたらすため、14-3-3は、そのアポトーシス促進機能を阻害するため、リン酸化されたタンパク質Badにも結合する。結論付けると、RIT処理中の14-3-3の阻害は、細胞周期停止を減少させ、アポトーシス誘導を増加させ、細胞を放射線障害に対してさらに感受性にするかもしれない。
【０１４６】
上記研究におけるこの考えを支持するため、ヒト神経膠腫細胞に対するジフォペイン（14-3-3アンタゴニスト）の治療効力を研究した。著者らは、この14-3-3アンタゴニストが、Bcl-2のダウンレギュレーション、Baxのアップレギュレーション、ならびにカスパーゼ9およびカスパーゼ3の活性化を通して、神経膠腫細胞アポトーシスを誘導する強力な効果を有することを示した。さらに、処理された細胞は、G2/M期細胞の百分率の低下を示し、この阻害剤は、対照と比較して腫瘍異種移植片成長を減少させた。
【０１４７】
実施例2
177Lu-サテトラキセタン-リロトマブ（Betalutin）と細胞周期タンパク質を阻害することによって細胞周期の進行を制御する種々の薬物との組み合わせの効果の測定
材料および方法
細胞および試薬
DLBCL細胞株U2932およびRIVAを、5％CO2を含有している加湿された雰囲気において、37℃で、5％ウシ胎仔血清（Biowest）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）が補足されたRPMI 1640-GlutaMAX培地（Gibco）において維持した。細胞を、週2回、細胞密度に依って1:3〜1:5に分割した。37℃で20分間、177Luをp-SCN-ベンジル-DOTAコンジュゲートリロトマブと共にインキュベートすることによって、600MBq/mgの比放射能を有するBetalutinを調製した。Real Time Gloは、Promegaから購入された。384穴プレートは、Greiner Bio-Oneから購入された。
【０１４８】
Betalutin処理
振とうしながら、6穴細胞培養プレートにおいて、1μg/mlおよび2μg/mlの最終濃度のBetalutinによって、18〜20時間、細胞を処理した。処理後、PBSを細胞に添加し、細胞をペレット化した。細胞を、まず、1ml PBSに再懸濁させ、次いで、PBSで2回洗浄し、最後に、成長培地で所望の濃度に希釈した。全ての細胞株が、2.5*106細胞/mlの細胞濃度で処理された。
【０１４９】
細胞周期制御タンパク質の阻害剤による処理およびReal Time Glo生存性アッセイ
細胞密度測定を播種の前日に実施し、これらの測定に基づき、100nMまたは1μMのいずれかの最終濃度をもたらすため、選択された薬物が予め負荷された384穴プレートの各ウェルに、2000個の細胞を播種した。細胞数に関わらず、培養体積は25μlであった。Real Time Gloのため、Cell Viability SubstrateおよびNanoLuc（登録商標）酵素を、成長培地で1:500に希釈し、25μLの希釈された試薬を各ウェルに添加した。全ての試薬を37℃に平衡化した。細胞を、37℃で1時間、反応混合物と共にインキュベートした後、最初の発光測定を行った。試薬を添加した後72時間以内に、必要とされる頻度で、測定を反復した。死細胞のバックグラウンド発光を記録するため、ジギトニンを200μg/mlで細胞に添加した。Tecan SPARK 10Mプレートリーダーを、1秒に設定された積分時間で、発光を測定するために使用した。
【０１５０】
データ分析
処理開始後の各測定日について、処理された細胞の発光シグナルを対照細胞の発光シグナルで割ることによって、成長阻害を計算した［表1］。1という値は、対照細胞と比較して成長の変化がないことを意味し、より高い値は、成長の増加を表し、より低い値は、成長の阻害を意味する。
【０１５１】
単独の薬物［(-)Betalutin］およびBetalutinとの組み合わせ［(+)Betalutin］の効果を評価するため、本発明者らは、各試料についてZスコア（Z薬物X＝1 - (+)Betalutin薬物X / (-)Betalutin薬物X）を計算した。ここで、(+)Betalutin薬物Xおよび(-)Betalutin薬物Xは、それぞれ、Betalutinの存在下および非存在下で、薬物Xについて測定された発光強度値である。各プレートについての別々のZスコア値の計算は、全体シグナル強度のプレート間変動にも関わらず、プレート間で結果を比較することを可能にした。連続する4日のうちの1日において、単独のBetalutin（Z対照＝1 - (+)Betalutin対照 / (-)Betalutin対照）の平均効果より2×STDEVだけ高いZスコアを有する薬物を、ヒットと見なした［Zスコア表2］。
【０１５２】
Betalutinと薬物との間の相加効果を超える効果を同定するため、本発明者らは、予想される相加効果を測定された効果と比較するため、予想される相加効果を計算した（ブリス独立性検定；予想される相加効果：FBetalutin&薬物＝FBetalutin + F薬物 - FBetalutin × F薬物）。連続する4日のうちの1日において、単独のBetalutinの平均効果より2×STDEVだけ高いスコア（「測定された効果 - 予想される相加効果」）を有する薬物を、ヒットと見なした［ブリススコア表2］。
【０１５３】
結果
【０１５４】
（表１）単独のBetalutinおよび細胞周期阻害剤ならびに組み合わせによる処理の後のU2932細胞およびRIVA細胞の成長阻害
Dy＝処理の開始後の日にち
2021504341.tif 000004
【０１５５】
（表２）Betalutinと細胞周期阻害剤との組み合わせについての相乗性の概要
ブリス＝ブリス法によって相乗性が示される。Zスコア＝Zスコア法によって相乗性が示される。ブリス＋Zスコア＝両方の方法によって相乗性が示される。
2021504341.tif 000005
【０１５６】
結論
WEE1キナーゼ、CHK1キナーゼ、CDKキナーゼ、およびオーロラキナーゼのような細胞周期制御酵素の特異的阻害剤による阻害は、2種の侵襲性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株において、Betalutinの細胞増殖阻害効果を有意に強化する。
【０１５７】
従って、Betalutinと組み合わせた細胞周期制御酵素の阻害は、処置が困難なB細胞リンパ腫の処置のための、調査すべき新規で有望な道であると考えられる。
【０１５８】
実施例3 - Humalutinとオラパリブとの組み合わせは相乗性であり得る
目的
外照射による処置とPARP阻害剤オラパリブとの組み合わせは、相乗的であり得る。本実施例における目標は、放射線を腫瘍細胞に選択的に送達する媒体としての放射性免疫複合体Humalutin（177Luによって標識されたchHH1.1-サテトラキセタン）と、PARP阻害剤オラパリブとの組み合わせも、相乗的であるか否かを探究することである。
【０１５９】
材料および方法
細胞株
Glutamax（Gibco,Paisley,UK）、10％熱活性化FBS（Gibco）、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）が補足されたRPMI 1640培地およびDMEM培養培地において、細胞を成長させた。37℃および5％CO2で細胞を培養した。細胞懸濁液を、週2回、予熱された培地で1:3、1:4、または1:5に希釈し、実験の開始時に指数関数的に成長中であることを確実にするため、実験開始の2〜4日前に希釈した。
【０１６０】
（表１）使用された細胞株、詳細、および培養条件
2021504341.tif 000006
MCL：マントル細胞リンパ腫
GCB：胚中心B細胞
ABC：活性化B細胞
DLBCL：びまん性大細胞型B細胞リンパ腫
FL：濾胞性リンパ腫
【０１６１】
177LuによるchHH1.1-サテトラキセタンの標識
キレーターp-SCN-Bn-DOTA（サテトラキセタン、Macrocyclics,TX,USA）を、0.005M HClに溶解させ、6:1比で抗体に添加し、炭酸緩衝液を使用して、およそ8.5にpHを調整した。37℃での45分間のインキュベーションの後、Ab 1mg当たり50μlの0.2Mグリシン溶液の添加によって、反応を中止した。遊離のサテトラキセタンを除去するため、コンジュゲート抗体を、NaCl 0.9％で4〜5回、Vivaspin 20遠心管（Sartorius Stedim Biotech,Gottingen Germany）を使用して洗浄した。177Luによる標識の前に、0.25M酢酸アンモニウム緩衝液を使用して、pHを5.3±0.3に調整した。およそ200MBqの177Lu（ITG,Garching,Germany）を0.25mgのサテトラキセタン-chHH1に添加し、37℃で15〜30分間インキュベートした。コンジュゲートの放射化学的純度（RCP）をインスタント薄層クロマトグラフィを使用して評価したところ、95％より高かった。比放射能を600MBq/mgに設定した（必要に応じて、冷chHH1-サテトラキセタンによる希釈を行った）。
【０１６２】
Humalutinの免疫反応性画分
放射性免疫複合体の免疫反応性を、Ramos細胞およびワンポイント改変Lindmo法を使用して測定した。使用された細胞濃度は、7500万細胞/mlであった。コンジュゲートの免疫反応性は、70％より高かった。
【０１６３】
細胞傷害性研究
細胞を、Humalutin、オラパリブのいずれか、または両方の組み合わせによって処理し、96穴プレートに播種した。処理後の各時点で、細胞の増殖および生存性を査定するため、細胞をAlamar Blue（Thermo Fisher,DALL1100）と共に4時間インキュベートし、マルチプレートリーダーFluoroskan ascent FLを使用して、蛍光測定を実施した。全ての実験を、各実験において2個の試料を使用してデュプリケートで行った。データを未処理の対照に対して正規化した。対数スケール変換、および最大値100％、最低値0％の非線形適合を使用して、IC50を計算した。
【０１６４】
Humalutinによる処理
細胞を、細胞培養フラスコにおいて、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、または5μg/mlのHumalutinと共にインキュベートし、37℃/5％CO2でインキュベートした。18〜20時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させた。細胞に結合した放射能を、洗浄後、較正されたγ検出器（Cobra II auto-gamma detector、Packard Instrument Company,Meriden,CT,USA）を使用して測定した。細胞がインキュベーション後にどの程度生存しているかを決定するため、細胞の濃度および生存性も、洗浄後、フローサイトメトリー用のGuava ViaCount Cell Dispersal試薬（Merck GaA,Darmstadt,Germany）を使用して測定し、Guava EasyCyte 12HT（Merck KGaA,Darmstadt,Germany）において測定した。細胞は96穴プレートに播種された。
【０１６５】
オラパリブによる処理
0.2ml培地中1〜100μMオラパリブによって予めコーティングされた96穴プレートに、細胞を播種し、37℃/5％CO2で72時間インキュベートした後、alamar blue細胞生存性アッセイを使用して細胞傷害効果を測定した。
【０１６６】
Humalutinおよびオラパリブによる処理
細胞を、0μg/ml、0.5μg/ml、または1μg/mlのいずれかのHumalutinと共にインキュベートし、単独のhumalutinおよび単独のオラパリブによる処理について以前に記載されたのと同一の手法に従った。使用されたオラパリブの濃度は、1〜100μMであった。
【０１６７】
統計
Compusynソフトウェアを使用した相乗性計算のため、Chou-Talalayモデルを使用した。R（適合度）を、個々の処理について計算した。計算されたコンビネーションインデックス（CI）を使用するためには、Rが、インビトロ培養実験において0.90を超えているべきである。CIは相乗性の指標であり：0〜0.9が相乗性と見なされる。WO2006004917A2に記載されるような相乗作用グレード分類を使用した。
【０１６８】
結果および考察
単独のHumalutinおよびオラパリブ
Humalutinおよびオラパリブに対する感受性は、異なる細胞株の間で変動した（表2）。オラパリブに対して最も感受性のものには、Rec-1およびSDUHL4が含まれ、DOHH2およびGranta 519は、最も抵抗性のものに含まれた。Humalutinに対して最も感受性の細胞株には、Granta 519およびSUDHL4が含まれ、最も放射線抵抗性のものには、WSU-DLCL2およびRec-1が含まれた。
【０１６９】
（表２）播種後の72時間のインキュベーション時間の後のHumalutinおよびオラパリブについてのIC50値
2021504341.tif 000007
【０１７０】
Humalutinとオラパリブとの組み合わせ
Chou Talalay法によるコンビネーションインデックス（CI）の計算は、大部分の細胞株について相乗作用を示した（図12）。U2932およびGranta 519は、全てのオラパリブ濃度について極めて強力な相乗作用を示した。残りの細胞株は、使用されたオラパリブの用量に依って変動する相乗作用の程度を示した。さらに、SUDHL4は、試験されたオラパリブ濃度のうちの一つについて中程度の拮抗作用を示した。単独の処理についてのR値は、細胞株のうちのいくつかにおいて0.9未満であり、即ち、Chou Talalay法からの結果は留意して考慮されるべきであることに注目することが重要である。独立した処理についてのより高いR値に達するため、実験のさらなる反復が、今後実施されるであろう。
【０１７１】
ATM機能性の部分的な喪失を有するMCLであるGranta 519は、単独のオラパリブに対して低い感受性を示し、Humalutinとオラパリブとの間の相乗性は強力であった。他方で、DLBCL細胞株U2932は、Humalutinに対して極めて感受性ではなく、オラパリブとの相乗作用は極めて強力であった。これらの結果は、同一の相乗性がインビボでも見られるか否かを調査するための動物モデルにおけるさらなる研究を保証する。
【０１７２】
結論
HumalutinとPARP阻害剤オラパリブとの間の相乗性は、試験された全ての細胞株において観察され、オラパリブ濃度が低いほど相乗作用が強力である傾向があった。結果は、放射免疫治療による処理が、PARP阻害剤に対してリンパ腫を感作することができることを示す。動物モデルにおけるさらなる研究が保証される。
【０１７３】
実施例4 - BetalutinとPARP阻害剤AG-14361およびルカパリブとの組み合わせは侵襲性ABC様びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株U-2932およびRIVAにおいてBetalutin抵抗性を逆転させることができる
目的
びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）は、非ホジキンリンパ腫（NHL）の侵襲性の型である。出願人は、現在、抗体-放射性核種コンジュゲート（ARC）Betalutinによる再発性NHLのための可能性のある標的治療を開発中である。U-2932およびRIVAは、臨床的に適切な用量でのBetalutin処理に対して抵抗性を示す、2種の活性化B細胞様DLBCL細胞株である。本発明者らは、以前の実施例において、外照射およびPARP阻害剤オラパリブによる組み合わせ処置が相乗的であり得ることを見出した。本研究において、本発明者らは、放射線を腫瘍細胞に選択的に送達する媒体としての放射性免疫複合体Betalutinと、選択された他のPARP阻害剤との組み合わせが、Betalutin処理に対する抵抗性を逆転させることができるか否かを探究することを目標とする。このため、細胞を、Betalutinによって前処理した後（または前処理せず）、過剰のBetalutinを除去し、Selleck Cancer Compoundライブラリーから選択された薬物が予め負荷された384穴プレートに播種する。本発明者らは、Real Time Gloによって測定される生存性を低下させるため、薬物がBetalutinと相乗作用するか否かを決定することを目標とする。
【０１７４】
材料および方法
細胞株
DLBCL細胞株U2932およびRIVAを、5％CO2を含有している加湿された雰囲気において、37℃で、15％ウシ胎仔血清（Biowest）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）が補足されたRPMI 1640-GlutaMAX培地（Gibco）において維持した。細胞を、週2回、1:7に分割し、実験開始時に指数関数的に成長中であることを確実にするため、実験開始の2〜4日前に希釈した。
【０１７５】
（表１）使用された細胞株
2021504341.tif 000008
ABC-DLBCL：活性化B細胞様びまん性大細胞型B細胞リンパ腫
【０１７６】
177LuによるchHH1-サテトラキセタンの標識
キレーターp-SCN-Bn-DOTA（サテトラキセタン、Macrocyclics,TX,USA）を、0.005M HClに溶解させ、6:1比で抗体に添加し、炭酸緩衝液を使用して、およそ8.5にpHを調整した。37℃での45分間のインキュベーションの後、Ab 1mg当たり50μlの0.2Mグリシン溶液の添加によって反応を中止した。遊離のサテトラキセタンを除去するため、コンジュゲート抗体を、NaCl 0.9％で4〜5回、Vivaspin 20遠心管（Sartorius Stedim Biotech,Gottingen Germany）を使用して洗浄した。177Luによる標識の前に、0.25M酢酸アンモニウム緩衝液を使用して、pHを5.3±0.3に調整した。およそ200MBqの177Lu（ITG,Garching,Germany）を、0.25mgのサテトラキセタン-chHH1に添加し、37℃で15〜30分間インキュベートした。コンジュゲートの放射化学的純度（RCP）をインスタント薄層クロマトグラフィを使用して評価したところ、95％より高かった。比放射能を600MBq/mgに設定した（必要に応じて、冷chHH1-サテトラキセタンによる希釈を行った）。
【０１７７】
Betalutinの免疫反応性画分
放射性免疫複合体の免疫反応性を、Ramos細胞およびワンポイント改変Lindmo法を使用して測定した。使用された細胞濃度は、7500万細胞/mlであった。コンジュゲートの免疫反応性は、70％より高かった。
【０１７８】
細胞傷害性研究
Betalutin処理
細胞を、U2932については1μg/ml、RIVAについては0.5μg/mlの最終濃度のBetalutinによって、18時間、振とうすることなく、6穴プレートにおいて処理した。処理後、PBSを細胞に添加し、細胞をペレット化した。細胞を、まず、1mlのPBSに再懸濁させ、次いで、PBSで2回洗浄し、最後に、2.5*106細胞/mlの最終濃度に成長培地で希釈した。
【０１７９】
Real Time Glo生存性アッセイ
細胞密度測定を播種の前日に実施した。これらの測定に基づき、ロボットを使用して、（出発力価：120000細胞/mlをもたらす）25μlの培養体積で、1ウェル当たり3000細胞の密度で、384穴プレートに細胞を播種した。Real Time Glo（Promega,WI,USA）を使用して生存性を測定するため、Cell Viability SubstrateおよびNanoLuc（登録商標）酵素を、成長培地で1:500に希釈し、希釈された試薬25μLを、ロボットによって、各ウェルに分配した。全ての試薬が37℃に平衡化された。細胞を、37℃で1時間、反応混合物と共にインキュベートした後、最初の発光測定を行った。試薬を添加した後72時間以内に、必要とされる頻度で、測定を反復した。Tecan SPARK 10Mプレートリーダー（Tecan、SUI）を、1秒に設定された積分時間で、発光を測定するために使用した。
【０１８０】
プレートセットアップ
SelleckChem（Selleckchem,TX,USA）から取得された、選択されたPARP阻害剤（DMSO中のストック溶液10mM）により、384穴プレートで、スクリーニングを実施した。非薬物対照を含めるため、薬物パネル（表2）を2枚のプレートに分けた。プレートの端に位置するウェルにおいては細胞の成長が不良であるとの以前の観察のため、最も外側の2列および2行は使用しなかった。以前に言及されたように、3種の異なる薬物濃度、U2932については10nMおよび1μM、RIVAについては10nMおよび100nMを、スクリーニングにおいて使用した。
【０１８１】
（表２）
2021504341.tif 000009
【０１８２】
データ分析
相乗性についてのブリス独立性検定を使用して、候補ヒットを同定した。各濃度での単独の各薬物の効果を、対照細胞と比較して、死細胞の画分として計算し（Fa＝1 - (RLU薬物 / 平均RLU対照））、単独のBetalutinの効果について、類似の計算を実施した（Fb＝1 - (平均RLUBetaltuin / 平均RLU対照））。以下の方程式を通して、本発明者らは、薬物＋Betalutinの組み合わせの予想される相加効果を見出した：予想される効果(E)Fab＝(Fa + Fb - Fa * Fb)。本発明者らは、測定された効果が、組み合わせの予想される相加効果とどの程度異なるかを表す値(Diff)Fabを得るため、測定された効果(M)Fab＝1 - (RLU薬物＋Betalutin / 平均RLU対照)から、この予想される効果を差し引いた。この値を、単独の薬物の生存画分に対して正規化した：(Diff)Fab#＝(Diff)Fab / (1 - Fa)。さらに、ウェル間変動がどの程度大きいかの尺度を得るため、本発明者らは、各プレートにおいて48個の対照ウェルにおいて単独のBetalutinの効果について標準偏差を計算した：(STDEV)Fb＝(RLUBetalutin / RLU対照) - (平均RLUBetaltuin / 平均RLU対照)。Betalutinによって処理された対照の標準偏差(STDEV)Fbの2倍より高い値(Diff)Fab#を有する薬物を、ヒットとしてスコアリングした。
【０１８３】
結果および考察
単独のBetalutin
Betalutinに対する感受性は、U-2932細胞とRIVA細胞との間で異なっていた。U-2932細胞は、RIVA細胞よりBetalutinに対して抵抗性であった（図1）。U-2932細胞は、1μg/ml［600MBq/mg］によって処理された時、未処理のU2932細胞のレベルの80％を超えるレベルで増殖した（図1A）。RIVA細胞は、Betalutinに対してU-2932より高い感受性を有していたのみならず、4〜6日の観察ウィンドウを通して、未処理の細胞の速度の40％を超える速度で増殖した（処理0.5μg/ml［600MBq/mg］）（図13B）。図14は、それぞれの日における、未処理の細胞の増殖速度に対して正規化された、Betalutinによって処理された細胞の相対増殖（発光）を示す。
【０１８４】
単独のAG-14361またはルカパリブおよびBetalutinとの組み合わせ
10nMのAG-14361によるU-2932細胞またはRIVA細胞の処理は、単独で与えられた時、成長阻害効果を有しておらず、Betalutinの成長阻害効果を増強しなかった（図15A、C）。対照的に、それぞれ、1μMおよび100nMで、AG-14361は、U-2932細胞およびRIVA細胞の増殖を阻害した。AG-14361のBetalutinとの組み合わせは、単独のAG-14361より強力な成長阻害を示した（図15B、D）。単独のルカパリブによるU-2932細胞またはRIVA細胞の処理は、試験された濃度で成長阻害効果を有していなかった（図16）。ルカパリブのBetalutinとの組み合わせは、単独のBetalutinより強力な成長阻害を示した（図16B、D）。
【０１８５】
Betalutinと組み合わせた試験されたPARP阻害剤（RIVA 100nM；U2932 1μM）の得られた成長阻害は、それらの予想される相加効果より大きい。AG-14361は、4日目、5日目、および6日目に最も強力な組み合わせ効果およびスコアを示し、効果サイズは、単独のBetalutinによって処理された細胞の2標準偏差より大きい（ブリス検定、図17）。
【０１８６】
結論
BetalutinとPARP阻害剤AG-14361との組み合わせは、ABC様びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の2種の細胞株においてBetalutin抵抗性を克服し、相乗作用の指標である予想される相加効果より大きい成長阻害をもたらす。Betalutinとルカパリブとの組み合わせも、予想される相加効果より大きい程度に成長阻害効果を増加させたが、効力は、試験された濃度においてAG-14361より低かった。
【０１８７】
これらの結果は、PARP阻害剤とBetalutin放射免疫治療との組み合わせ処理が、Betalutin抵抗性の侵襲性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の感受性を増加させ得ることを示す。動物モデルにおけるさらなる研究が保証される。
【０１８８】
実施例5 Humalutinとベネトクラクスとの組み合わせは相乗的であり得る
目的
外照射およびBH3模倣薬ベネトクラクスによる組み合わせ処理は、相乗的であり得る。本実施例における目標は、放射線を腫瘍細胞に選択的に送達する媒体としての放射性免疫複合体Humalutin（177Luによって標識されたchHH1-サテトラキセタン）と、BH3模倣薬ベネトクラクスとの組み合わせも、相乗的であるか否かを探究することである。
【０１８９】
材料および方法
細胞株
細胞を、Glutamax（Gibco,Paisley,UK）、10％熱活性化FBS（Gibco）、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）が補足されたRPMI 1640培地およびDMEM培養培地において成長させた。細胞を、37℃および5％CO2で培養した。
【０１９０】
細胞懸濁液を、週2回、予熱された培地で1:3、1:4、または1:5に希釈し、実験の開始時に指数関数的に成長中であることを確実にするため、実験開始の2〜4日前に希釈した。
【０１９１】
（表１）使用された細胞株、詳細、および培養条件
2021504341.tif 000010
MCL：マントル細胞リンパ腫
GCB：胚中心B細胞
ABC：活性化B細胞
DLBCL：びまん性大細胞型B細胞リンパ腫
FL：濾胞性リンパ腫
【０１９２】
177LuによるchHH1-サテトラキセタンの標識
キレーターp-SCN-Bn-DOTA（サテトラキセタン、Macrocyclics,TX,USA）を、0.005M HClに溶解させ、6:1比で抗体に添加し、炭酸緩衝液を使用して、およそ8.5にpHを調整した。37℃での45分間のインキュベーションの後、Ab 1mg当たり50μlの0.2Mグリシン溶液の添加によって反応を中止した。遊離のサテトラキセタンを除去するため、コンジュゲート抗体を、NaCl 0.9％で4〜5回、Vivaspin 20遠心管（Sartorius Stedim Biotech,Gottingen Germany）を使用して洗浄した。177Luによる標識の前に、0.25M酢酸アンモニウム緩衝液を使用して、pHを5.3±0.3に調整した。およそ200MBqの177Lu（ITG,Garching,Germany）を、0.25mgのサテトラキセタン-chHH1に添加し、37℃で15〜30分間インキュベートした。コンジュゲートの放射化学的純度（RCP）をインスタント薄層クロマトグラフィを使用して評価したところ、95％より高かった。比放射能を600MBq/mgに設定した（必要に応じて、冷chHH1-サテトラキセタンによる希釈を行った）。
【０１９３】
Humalutinの免疫反応性画分
放射性免疫複合体の免疫反応性を、Ramos細胞およびワンポイント改変Lindmo法を使用して測定した（1、2）。使用された細胞濃度は、7500万細胞/mlであった。コンジュゲートの免疫反応性は、70％より高かった。
【０１９４】
細胞傷害性研究
細胞を、Humalutin、ベネトクラクスのいずれか、または両方の組み合わせによって処理し、96穴プレートに播種した。処理後の各時点で、細胞の増殖および生存性を査定するため、細胞をAlamar Blue（Thermo Fisher,DALL1100）と共に4時間インキュベートし、マルチプレートリーダーFluoroskan ascent FLを使用して、蛍光測定を実施した。全ての実験を、各実験において2個の試料を使用してデュプリケートで実施した。データを、未処理対照に対して正規化した。対数スケール変換、および最大値100％、最低値0％の非線形適合を使用して、IC50を計算した。
【０１９５】
Humalutinによる処理
細胞を、細胞培養フラスコにおいて、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、または5μg/mlのHumalutinと共にインキュベートし、37℃/5％CO2でインキュベートした。18〜20時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させた。細胞に結合した放射能を、洗浄後、較正されたγ検出器（Cobra II auto-gamma detector、Packard Instrument Company,Meriden,CT,USA）を使用して測定した。細胞がインキュベーション後にどの程度生存しているかを決定するため、細胞の濃度および生存性も、洗浄後、フローサイトメトリー用のGuava ViaCount Cell Dispersal試薬（Merck GaA,Darmstadt,Germany）を使用して測定し、Guava EasyCyte 12HT（Merck KGaA,Darmstadt,Germany）において測定した。細胞は96穴プレートに播種された。
【０１９６】
ベネトクラクスによる処理
0.2ml培地中の0μM、0.5μM、1μM、2μM、および2.5μMベネトクラクスによって予めコーティングされた96穴プレートに細胞を播種し、37℃/5％CO2で72時間インキュベートした後、alamar blue細胞生存性アッセイを使用して細胞傷害効果を測定した。
【０１９７】
Humalutinおよびベネトクラクスによる処理
細胞を、0μg/ml、0.5μg/ml、または1μg/mlのいずれかのHumalutinと共にインキュベートし、単独のHumalutinおよび単独のベネトクラクスによる処理について以前に記載されたのと同一の手法に従った。ベネトクラクスの濃度は、0μM、0.5μM、1μM、2μM、および2.5μMに設定された。
【０１９８】
統計
Compusynソフトウェアを使用した相乗性計算のため、Chou-Talalayモデルを使用した。R（適合度）を、個々の処理について計算した。計算されたコンビネーションインデックス（CI）を使用するためには、Rが、インビトロ培養実験において0.90を超えているべきである。CIは相乗性の指標であり：0〜0.9が相乗性と見なされる。WO2006004917A2に記載されるような相乗作用グレード分類を使用した。
【０１９９】
結果および考察
単独のHumalutinおよびベネトクラクス
humalutinおよびベネトクラクスに対する感受性は、異なる細胞株の間で変動した（表2）。Granta 519が、両方の処理に対して最も感受性の細胞株であり、U2932が、両方の処理に対して最も抵抗性の細胞株であった。
【０２００】
（表２）播種後の72時間のインキュベーションの後のHumalutinおよびベネトクラクスについてのIC50値
2021504341.tif 000011
【０２０１】
Humalutinとベネトクラクスとの組み合わせ
Chou Talalay法によるコンビネーションインデックス（CI）の計算は、全ての細胞株について相乗作用を示した。
【０２０２】
大部分の細胞株が、極めて強力〜強力な相乗作用を示し、ベネトクラクス濃度が低いほど相乗作用が強力である傾向があった。最も高い相乗性は、Granta 519細胞株およびSUDHL4細胞株について観察された。U2932は、両方の処理に対して最も抵抗性の細胞株であったが、組み合わせについて強力な相乗性を示したことに注目することは興味深い。これらの結果は、放射線による処理が、BH3模倣薬に対してDLBCL細胞およびMCL細胞を感作することができることを示す。
【０２０３】
結論
HumalutinとBH3模倣薬ベネトクラクスとの間の相乗性は、試験された全ての細胞株において観察され、ベネトクラクス濃度が低いほど相乗作用が強力である傾向があった。結果は、放射免疫治療による処理が、BH3模倣薬に対してリンパ腫を感作することができることを示す。
【０２０４】
実施例6 - BetalutinとMK-1775およびPD-166285との組み合わせ
目的
種々のインビトロ細胞株、動物モデル、およびB細胞起源のヒト腫瘍生検材料において、177Lu-リロトマブ・サテトラキセタン（Betalutin）とG2/Mチェックポイント阻害剤MK-1775およびPD-166285との組み合わせを探究すること。
【０２０５】
材料および方法
細胞株
Ramos（バーキットリンパ腫、BL）細胞株、DOHH2（形質転換濾胞性リンパ腫、FL）細胞株、およびRec-1（マントル細胞リンパ腫）細胞株は、ATCC/ECACCおよびDSMZから得られた。OCI-Ly8（DLBCL）細胞株は、Institute of Oncology Research（Bellinzona,Switzerland）から得られた。10％熱不活化胎仔ウシ血清ならびに抗生物質（0.1U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン）が補足されたRPMIにおいて、95％空気/5％CO2の加湿された雰囲気において、37℃で、細胞を成長させた。マイコプラズマ混入を、Life Technologies（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA）からのMycotestアッセイを使用して、ルーチンに試験した。
【０２０６】
抗体の放射標識
p-SCN-ベンジル-DOTA（Macrocyclics,Plano,Tx,USA）とコンジュゲートされたリロトマブ（Nordic Nanovector,Oslo,Norway）を、200MBq/mgの比放射能の177Lu（177Lu-mAb）によって標識した。
【０２０７】
動物および腫瘍異種移植片
Envigo（Gannat,France）からの胸腺欠損Nude-Foxn1マウス（以後、胸腺欠損マウス）（6週齢雌）を、病原体除去条件下で12時間の明暗サイクルで、22℃および55％の湿度で収容し、食物および水を自由に摂取させた。1週間の順応の後、10×106個のRamos細胞またはOCI-Ly8細胞を、100μLの新鮮な無血清培地に再懸濁させた後、胸腺欠損マウスの側腹部に皮下注射した。全ての動物実験を、French government guidelinesおよびINSERM standards for experimental animal studies (agreement B34-172-27)に従って実施した。それらは、Institut de Recherche en Cancerologie de Montpellier (IRCM/INSERM) ethics committeeおよびEthics Committee of the Languedoc Roussillon region (CEEA LR France No.36) for animal experiments (reference number：1094)によって承認された。
【０２０８】
腫瘍異種移植片を有するマウスの処理
100〜200mm3 Ramos細胞腫瘍を保持する胸腺欠損マウスは、異種移植の13日後に、100〜200mm3 OCI-Ly8細胞腫瘍を保持するマウスは、異種移植の8日後に、（i）250MBqまたは500MBq/kgの177Lu-リロトマブ；（ii）2.5mg/kgリツキシマブまたはリロトマブの単回静脈内注射（100μL）を受容し、（iii）注射後1日目から5日目まで、胃管栄養による250MBqの177Lu-リロトマブ＋30mg/kg MK-1775（1日2回）、（iv）注射後1日目から5日目まで、胃管栄養による30mg/kg MK-1775（1日2回）を受容した。各処理群は、6〜9匹のマウスを含んでいた。
【０２０９】
週2回、ノギスで腫瘍体積を測定することによって腫瘍成長を評価し、動物の体重を決定した。腫瘍体積が2000mm3に達した時、または体重減少が20％を超えた時、または疾病もしくは不調が起こった時、CO2窒息によってマウスを屠殺した。
【０２１０】
細胞周期分析
12穴プレートにおいて成長させられ、0MBq/mLおよび6MBq/mLの177Lu-リロトマブ、またはわずかに過大に見積もられた対応する範囲（040μg/mLおよび40μg/mL）のリロトマブもしくはリツキシマブに18時間曝された1×106個のRamos細胞、DOHH2細胞、Rec-1細胞、およびOCI-Ly8細胞において細胞周期を査定した。細胞を、0時間目、2時間目、18時間目、1日目、2日目、3日目に採集し、-20℃で70％エタノールで少なくとも3時間固定した。室温で暗所でヨウ化プロピジウムを使用して30分間、Muse（登録商標）Cell Cycle Assay Kit（Merck Millipore,Molsheim,France）によって染色した後、細胞周期分布をMuse（登録商標）フローサイトメーターを使用して分析した。G0/G1期、S期、およびG2/M期の細胞の百分率を計算し（トリプリケートでの3回の実験の平均値）、細胞周期に対するWEE-1キナーゼ阻害剤およびMYT-1キナーゼ阻害剤の効果を査定した。
【０２１１】
単独の、またはMK-1775もしくはPD-166285と組み合わせた177Lu-リロトマブによるヒト生検材料の処理
DLBCLまたはFLを有する患者に由来する凍結ヒト生検材料を、CHU de Montpellier Plateforme CRB/Hemodiagから得た。典型的には、細胞を解凍し、95％空気/5％CO2の加湿された雰囲気において、37℃で、12穴プレートにおいて、0.5×106細胞/mLに成長させた。培養培地は、20％熱不活化ウシ胎仔血清、抗生物質（0.1U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン）、50ng/mL CD40L（Hisタグ付き；R&D system）、ならびに5μg/mL抗hisタグ抗体（R&D system,Abingdon,UK）が補足されたRPMI培地からなっていた。5時間後、それらを、MK-1775もしくはPD-166285（1μM）と組み合わせた、または組み合わせない、増加する量の177Lu-リロトマブ（0〜6MBq/mL）によって18時間処理した。インキュベーション終了後、細胞の50％を、フローサイトメトリーによって分析し、残りの細胞を、収集し、遠心分離し、培地で2回洗浄した後、3日間以上、12穴プレートに播種した。3日後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。Live/Dead固定可能死細胞染料（Fisher scientific）、抗CD45 mAb、抗CD3 mAb、抗CD19 mAb、抗CD20 mAb、および抗CD10 mAb（BD Pharmigen,Le pont de Claix,France）、ならびに抗κmAb（DAKO,Les Ulis,France）を使用し、生存している腫瘍細胞および非腫瘍細胞の量および割合を決定するため、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２１２】
結果および考察
G2/Mチェックポイントの阻害剤は177Lu-リロトマブによって誘導されるG2/M停止から細胞を開放する
処理/未処理のG2/M期細胞の増加によって、全ての細胞株について図19Aに示されたように、細胞は、177Lu-リロトマブによって処理された場合、細胞周期のG2/M期において停止する。4種全ての細胞株において、MK-1775またはPD-166285と177Lu-リロトマブとのコインキュベーションは、単独の177Lu-リロトマブに曝された細胞と比較して、G2/M細胞の画分の低下をもたらす（図19A）。本発明者らのインビトロデータは、177Lu-リロトマブに対する抵抗性が、照射による細胞周期のG2/M期における細胞の停止に主に関連していることを示した。停止は、Ramos細胞において強力であり、次いで、U2932、Rec-1細胞、OCI-Ly8において順に低くなり、DOHH2細胞においては有意でなかった。G2/M細胞周期停止は、177Lu-リロトマブによって観察される強力なアポトーシス誘導を担っている可能性が高く、リツキシマブによって誘導されるアポトーシスは、主に、G1停止を含む。
【０２１３】
細胞周期のG2期において、CDK1活性（G2/M移行を調節するマスターキナーゼ）は、A型およびB型のサイクリンによって活性化される。G2/M細胞周期進行は、CDK7、サイクリンH、およびMAT1からなる三量体タンパク質複合体であるCDK7含有CAKキナーゼによる（活性化ループに位置する）Thr161におけるCDK1リン酸化によって促進される。反対に、それぞれ、WEE-1およびMYT-1によるTyr15およびThr14におけるCDK1リン酸化は、G2/Mにおいて細胞をブロックする。CDK1細胞は、これらの残基のプロテインホスファターゼによって媒介される脱リン酸によって、このブロックから開放され得る。これらのキナーゼは、DNA修復経路を通したDNA損傷応答およびDNA修復中に細胞周期進行を阻害する細胞周期チェックポイントに関与している。放射線感受性DOHH2細胞において、177Lu-リロトマブとのインキュベーションによって、Tyr15およびThr14におけるCDK1リン酸化は減少し、Thr161におけるリン酸化は増加した。反対に、Ramos細胞、Rec-1細胞、OCI-Ly8細胞、U2932細胞においては、Tyr15およびThr14におけるCDK1リン酸化が高いままであり、Ramos細胞およびRec-1細胞において測定された時、Thr161におけるリン酸化は低かった。
【０２１４】
G2/Mチェックポイントの阻害剤は177Lu-リロトマブに対してRamos腫瘍異種移植片およびOCI-Ly8腫瘍異種移植片を感作する
Ramos腫瘍異種移植片において、250MBq/kg 177Lu-リロトマブとMK-1775との組み合わせは、単独の250MBq/kg 177Lu-リロトマブと比較して、腫瘍成長を有意に遅延させた（p＝0.001）（図19B）。生存期間の中央値は、40日から47日に、有意に増加した（p＝0.0156）。
【０２１５】
OCI-Ly8異種移植片において、リロトマブは、対照と比較して治療効力を有していなかった（p＝0.475）（MK-1775も同様、p＝0.625）。放射標識された時、177Lu-リロトマブ（250MBq/kg）は、腫瘍成長遅延（p＝0.015）および生存期間の中央値（p＝0.0062）を有意に改善した。これは、177Lu-リロトマブ（250MBq/kg）をMK-1775処理と組み合わせた時、増強され、腫瘍成長遅延は、単独の177Lu-リロトマブによるものより有意に大きかった（p＝0.05）。組み合わせが、単独の500MBq/kg 177Lu-リロトマブと同等に効率的であった（p＝0.7070）ことに注意しなければならない（図19C）。
【０２１６】
DLBCおよびFLのヒト生検材料における177Lu-リロトマブの治療的細胞傷害性はG2/Mチェックポイントの阻害剤との組み合わせによって改善される
4人の患者の生検材料から単離され、177Lu-リロトマブ、または組み合わせ177Lu-リロトマブ＋MK-1775もしくは177Lu-リロトマブ＋PD-166285に18時間曝された生細胞において、細胞表面マーカー（CD3-およびCD20）のフローサイトメトリー分析を実施した（図20A）。本発明者らは、CD3陰性（CD3-）かつCD20陽性である細胞の初期の割合が、DLBC（0.36〜0.52％）よりFL（27.1〜29.9％）について高いことを観察した。177Lu-リロトマブは、4日目に、全ての腫瘍において腫瘍細胞の割合を低下させた（図20A）。
【０２１７】
177Lu-リロトマブの細胞傷害性に対するG2/M細胞周期停止阻害剤の効果は、細胞の細胞周期進行能力に依存することが示された。次いで、曝露の終了時（1日目）または3日後（4日目）のいずれかに、分析を行った（図20B）。4個の生検材料について、本発明者らは、単独で得られたMK-1775（またはPD-166285）の細胞傷害効果と177Lu-リロトマブの細胞傷害効果との間の相加効果を考慮して、理論上の増殖速度であろうものを計算した。MK-1775およびPD-166285は、相乗的な細胞傷害機序を通して、177Lu-リロトマブの細胞傷害性を増加させることが示された（図20B）。
【０２１８】
結論
本発明者らは、インビトロで、インビボのRamosおよびOCI-Ly8の異種移植モデルにおいて、そして4個のヒト生検材料において、WEE-1阻害剤およびMYT-1阻害剤を使用することによって、G2/M細胞周期停止および細胞死におけるTyr15およびThr14におけるCDK1リン酸化の役割を確認した。具体的には、（MK-1775による）WEE-1阻害は、177Lu-リロトマブに対してRamos細胞、Rec-1細胞、およびOCI-Ly8細胞を感作し、（PD-166285による）WEE-1およびMYT-1の同時阻害は、相加効果を有していなかった。ヒト生検材料から単離されたCD3-/CD20+細胞を考慮した時、類似した傾向が観察された。これは、放射線感受性の増加が、WEE-1活性によって主に決定されることを示唆する。生検材料において得られた結果については、放射線感受性が、生検材料から単離された細胞についての限界である増殖指数に密接に関連していることに留意しなければならない。
【０２１９】
177Lu-リロトマブとG2/M細胞周期停止阻害剤との組み合わせは、その治療効力を増強し、注射される放射能の量の減少を可能にし得る。
【０２２０】
実施例7 - 細胞周期キナーゼ阻害剤は侵襲性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株の処理における177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンの効果を強化する
目的
本発明者らは、177Lu-リロトマブ・サテトラキセタン（Betalutin）による処理に対するヒトびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）細胞株のディファレンシャルな感受性プロファイルを以前に報告した（実施例2を参照すること）。U-2932およびRIVAは、臨床的に適切な用量でのBetalutin処理に対して抵抗性を示す、活性化B細胞様サブタイプの2種の侵襲性DLBCL細胞株である。本発明者らは、放射線を腫瘍細胞に選択的に送達する媒体としての放射性免疫複合体Betalutinと、有系分裂細胞周期キナーゼの選択された阻害剤との組み合わせが、Betalutin処理に対する抵抗性を逆転させることができるか否かを探究した。このため、細胞をBetalutinによって前処理した後（または前処理せず）、過剰のBetalutinを除去し、Cancer Compoundライブラリー（Selleck）からの選択された薬物が予め負荷された384穴プレートに播種した。生存性を、発光アッセイ（RealTimeGlo）を使用してモニタリングした。スクリーニングにおいて、本発明者らは、Betalutinと組み合わせられた時、増殖の阻害において相加効果を超える効果を有する薬物を同定した（実施例2および4）。この実施例においては、選択された候補ヒットを、Betalutinとの相乗的相互作用の評価のため、拡張された用量応答実験において試験した。
【０２２１】
材料および方法
細胞株
DLBCL細胞株U2932およびRIVAを、5％CO2を含有している加湿された雰囲気において、37℃で、15％ウシ胎仔血清（Biowest）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）が補足されたRPMI 1640-GlutaMAX培地（Gibco）において維持した。細胞を、週2回、1:7に分割し、実験開始時に指数関数的に成長中であることを確実にするため、実験開始の2〜4日前に希釈した。
【０２２２】
（表１）使用された細胞株
2021504341.tif 000012
【０２２３】
177Luによるリロトマブの標識
キレーターp-SCN-Bn-DOTA（サテトラキセタン、Macrocyclics,TX,USA）を、0.005M HClに溶解させ、6:1比で抗体に添加し、炭酸緩衝液を使用して、およそ8.5にpHを調整した。37℃での45分間のインキュベーションの後、Ab 1mg当たり50μlの0.2Mグリシン溶液の添加によって反応を中止した。遊離のサテトラキセタンを除去するため、コンジュゲート抗体を、NaCl 0.9％で4〜5回、Vivaspin 20遠心管（Sartorius Stedim Biotech,Gottingen Germany）を使用して洗浄した。177Luによる標識の前に、0.25M酢酸アンモニウム緩衝液を使用して、pHを5.3±0.3に調整した。およそ200MBqの177Lu（ITG,Garching,Germany）を、0.25mgのリロトマブ-サテトラキセタンに添加し、37℃で15〜30分間インキュベートした。コンジュゲートの放射化学的純度（RCP）をインスタント薄層クロマトグラフィを使用して評価したところ、95％より高かった。比放射能を600MBq/mgに設定した（必要に応じて、冷リロトマブ-サテトラキセタンによる希釈を行った）。
【０２２４】
Betalutinの免疫反応性画分
放射性免疫複合体の免疫反応性を、Ramos細胞およびワンポイント改変Lindmo法を使用して測定した。使用された細胞濃度は、7500万細胞/mlであった。コンジュゲートの免疫反応性は、70％より高かった。
【０２２５】
細胞傷害性研究
Betalutin処理
U2932については1μg/ml、RIVAについては0.5μg/mlの最終濃度のBetalutinによって、18時間、振とうすることなく、6穴プレートにおいて、細胞を処理した。処理後、PBSを細胞に添加し、細胞をペレット化した。細胞を、まず、1mlのPBSに再懸濁させ、次いで、PBSで2回洗浄し、最後に、2.5*106細胞/mlの最終濃度に成長培地で希釈した。
【０２２６】
Real Time Glo生存性アッセイ。
細胞密度測定を播種の前日に実施した。これらの測定に基づき、ロボットを使用して、（出発力価：120000細胞/mlをもたらす）25μlの培養体積で、1ウェル当たり3000細胞の密度で、384穴プレートに細胞を播種した。Real Time Glo（Promega,WI,USA）を使用して生存性を測定するため、Cell Viability SubstrateおよびNanoLuc（登録商標）酵素を、成長培地で1:500希釈し、希釈された試薬25μLを、ロボットによって、各ウェルに分配した。全ての試薬が37℃に平衡化された。細胞を、37℃で1時間、反応混合物と共にインキュベートした後、最初の発光測定を行った。試薬を添加した後72時間以内に、必要とされる頻度で測定を反復した。Tecan SPARK 10Mプレートリーダー（Tecan、SUI）を、1秒に設定された積分時間で、37℃で、発光を測定するために使用した。
【０２２７】
プレートセットアップ
SelleckChem（Selleckchem,TX,USA）から取得された、選択された細胞周期キナーゼ阻害剤（DMSO中のストック溶液10mM）により、384穴プレートにおいてスクリーニングを実施した。非薬物対照を含めるため、薬物パネル（表2）を2枚のプレートに分けた。プレートの端に位置するウェルにおいては細胞の成長が不良であるとの以前の観察のため、最も外側の2列および2行は使用しなかった。一次スクリーニングのため、3種の異なる薬物濃度、U2932については10nMおよび1μM、RIVAについては10nMおよび100nMを使用した。バリデーションスクリーニング実験においては、1nM、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM、160nM、320nM、640nM、および1280nMで薬物を使用した。JNJ-7706621とBetalutinとの付加的な組み合わせ実験については、細胞を前記のようにBetalutinによって前処理し、新鮮な培地で希釈し、384穴プレートに播種した。次いで、JNJ-7706621を、Tecan D300eマイクロディスペンサー（Tecan,SUI）を使用して細胞に添加した。
【０２２８】
（表２）
2021504341.tif 000013
【０２２９】
データ分析
薬物相互作用についてのブリス独立性検定を使用して、候補ヒットを同定した。各濃度での単独の各薬物の効果を、対照細胞と比較して、死細胞の画分として計算し（Fa＝1 - (RLU薬物 / 平均RLU対照)）、単独のBetalutinの効果について、類似の計算を実施した（Fb＝1 - (平均RLUBetaltuin / 平均RLU対照)）。以下の方程式を通して、本発明者らは、薬物＋Betalutinの組み合わせの予想される相加効果を見出した：予想される効果(E)Fab＝(Fa + Fb - Fa * Fb)。本発明者らは、測定された効果が組み合わせの予想される相加効果とどの程度異なるかを表す値(Diff)Fabを得るため、測定された効果(M)Fab＝1 - (RLU薬物+Betalutin / 平均RLU対照)から、この予想される効果を差し引いた。この値を、単独の薬物の生存画分に対して正規化した：(Diff)Fab#＝(Diff)Fab / (1 - Fa)。さらに、ウェル間変動のサイズの尺度を得るため、本発明者らは、各プレートにおいて48個の対照ウェルにおける単独のBetalutinの効果についての標準偏差を計算した：(STDEV)Fb＝(RLUBetalutin / RLU対照) - (平均RLUBetaltuin / 平均RLU対照)。Betalutinによって処理された対照の標準偏差(STDEV)Fbの2倍より高い値(Diff)Fab#を有する薬物を、ヒットとしてスコアリングした。
【０２３０】
Compusynソフトウェアを使用した相乗性計算のため、Chou-Talalayモデルを使用した。R（中央値効果曲線に対する適合度）を、個々の処理について計算した。計算されたコンビネーションインデックス（CI）を使用するためには、Rが、インビトロ培養実験において0.90を超えているべきである。CIは相乗性の指標であり：0〜0.9が相乗性と見なされる。WO2006004917A2に記載されるような相乗作用グレード分類を使用した。
【０２３１】
結果および考察
本発明者らは、2種の侵襲性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株U-2932およびRIVAのBetlautin処理に対する抵抗性を以前に報告した（実施例2；図13〜14）。ここでは、本発明者らは、単独のまたはBetalutinと組み合わせた細胞周期キナーゼ阻害剤の効果を試験するため、これらの細胞株モデルを使用した。
【０２３２】
U-2932およびRIVA細胞を、Betalutinによって18時間前処理するかまたは前処理することなく、洗浄し、細胞周期キナーゼ阻害剤が予めプリンティングされたマイクロタイタープレートに播種した。3日目〜6日目まで、増殖能力をモニタリングするため、RealTimeGloを3日目に添加した。5日目および6日目における発光読み取りを、単独処理および組み合わせ処理の効果サイズの比較統計分析のために使用した。これらの時点で、Betalutinによる単独処理は、U-2932細胞およびRIVA細胞の増殖能力を、それぞれ、10％未満および約50％阻害した。
【０２３３】
汎CDK/AURA/AURB阻害剤JNJ-7706621によるU-2932細胞またはRIVA細胞の単独処理は、それぞれ、10nMおよび100nMの用量で、成長阻害効果を有していなかった（図21A）。U-2932細胞の成長は、1μMのJNJ-7706621による処理に入って5日目に約40％阻害された。U-2932のBetalutin前処理は、60％を超える組み合わせ成長阻害をもたらした。ブリス分析は、組み合わせの成長阻害効果が、個々の薬物の予想される相加効果より有意に大きいことを示した（図3B）。有意性を、単独のBetalutin処理の効果の標準偏差の2倍より大きい効果サイズとしてスコアリングした。
【０２３４】
U-2932細胞またはRIVA細胞は、PLK1の阻害に対して高度に感受性であった（図22）。試験されたPLK1阻害剤GSK461364およびBI2536は、いずれも、最も高い試験された濃度（U-2932：1μM；RIVA：100nM）で、90％超、増殖を阻止した。両方の細胞株において、10nM濃度で試験された時、GSK461364（図22A）は、BI2536（図22B）より低い効力を示した。このスクリーニングアッセイにおいて、単独のBI2536は、80％超、増殖を阻害した。ブリス分析は、両方の細胞株について、BetalutinとGSK461364との組み合わせ処理の成長阻害効果が、個々の単独処理の予想される相加効果より有意に大きいことを明らかにした（図22C）。BetalutinとBI2536との組み合わせによる処理についても、類似した結果が見出されたが、有意性はU-2932細胞においてのみ達した（図22D）。
【０２３５】
オーロラBキナーゼ阻害剤MLN8237（アリセルチブ）は、10nMで添加された時、U2932細胞またはRIVA細胞の増殖を阻害するのに不十分であった（図23A）。成長阻害は、より高い薬物濃度で両方の細胞株において明白であり、RIVA細胞において約60％（6日目、100nM）、U-2932細胞において約40％（6日目、1μM）であった。成長阻害は、Betalutinによる同時処理によって両方の細胞株において増強された。RIVA細胞において、100nMのMLN8237とBetalutinとの組み合わせは、組み合わせの予想される相加効果より有意に大きい効果を有した（図23B）。
【０２３６】
結論付けると、2種のBetalutin処理抵抗性のU-2932細胞およびRIVA細胞における限定されたスクリーニングは、Betalutinと選択された細胞周期キナーゼ阻害剤との組み合わせ処理が、その組み合わせの予想される相加効果より大きい効果を有する例を同定した。これらの例は、細胞周期キナーゼ阻害剤がBetalutinの処理効果を強化することができるという結論を支持する。
【０２３７】
バリデーションスクリーニング
一次スクリーニングの結果をバリデートするため、本発明者らは、最も抵抗性の細胞株U-2932において、精密化された組み合わせ処理スクリーニングを実施した。ここで、Betalutinの異なる3種の用量の組み合わせを、単独で、または異なる11種の用量の選択された細胞周期キナーゼ阻害剤と組み合わせて試験した。用量応答曲線を4日連続で記録し、5日目における組み合わせ処理の効果を、Chou-Thalaly定理を使用して、相乗性について試験した。
【０２３８】
U-2932細胞を、0.5μg/ml、1μg/ml、または2μg/mlのBetalutinによって18時間前処理し、細胞を洗浄した後、0nMから1280nMまでの範囲の最終濃度の12段階の勾配で、細胞周期キナーゼ阻害剤が予めプリントされたマイクロタイターウェルに（トリプリケートで）播種した。Betalutinによって処理されていない細胞を、対照として使用した。RealTimeGloを3日目に添加し、発光を6日目まで毎日読み取った。Betalutin前処理は、用量依存性の成長阻害効果を有していたが、最も高い用量ですら、細胞は、未処理の細胞と比較して約70％の増殖可能性を維持していた（図24）。
【０２３９】
PLK1阻害剤BI2536またはGSK461364によるU-2932細胞の単独処理は、40nMを超える濃度で増殖をほぼ完全に阻止した（図25）。一次スクリーニングの結果を確認して、U-2932細胞は、GSK461364よりBI2536に対して感受性であった。全ての3種のBetalutin用量とBI2536（1〜20nMの範囲）またはGSK461364（1〜40nMの範囲）との組み合わせについて、それぞれ、CIを計算した。BetalutinとBI2536との相乗作用は、40nM濃度でのみ明白であった（図25A；r＝0.87）。BetalutinとGSK461364との相乗作用は、20nMおよび40nMの濃度で明白であった（図5B；r＝0.98）。
【０２４０】
オーロラBキナーゼ阻害剤MLN8237（アリセルチブ）によるU-2932細胞の単独処理は、160nMまでの濃度で増殖を損なった（図26）。160nMを超える濃度のMLN8237の添加は、阻害効果を逆転させたが、それは、抗増殖機能の二次標的の阻害による可能性が高い。組み合わせ指標を、10〜80nMの範囲で、BetalutinとMLN8237との組み合わせについて計算した。相乗作用は、20〜80nMの範囲のMLN8237と組み合わせて試験された全てのBetalutin濃度について明白であった（r＝1.00）。
【０２４１】
一次スクリーニングの結果に類似して、より低い濃度のJNJ-7706621は、U-2932細胞の増殖を阻害しなかった（図27）。成長障害は、160nM未満の濃度では明白でなく、最も高い試験された用量（1280nM）で30％に達した。対照的に、Betalutin前処理と汎CDK阻害剤JNJ-7706621との組み合わせは、160nMを超えるJNJ-7706621用量で強力な成長阻害効果を有し、640nMでほぼ80％の阻害に達した。0.5μg/ml、1μg/ml、または2μg/mlのいずれかのBetalutinと組み合わせた、80〜1280nMの範囲のJNJ-7706621用量について、コンビネーションインデックスを計算した。全ての試験された組み合わせについて、相乗性が見出された（図27；r＝1.00）。
【０２４２】
この結果は、2回の付加的な独立した実験において確認された。ここでは、U-2932細胞を、0.5μg/ml、1μg/ml、および2.5μg/ml（確認1）または1μg/ml、2.5μg/ml、および5μg/ml（確認2）のいずれかの濃度のBetalutinによって前処理した。洗浄の代わりに、細胞を新鮮な培地で希釈した後、マイクロタイターウェルにトリプリケートで播種した。次いで、JNJ-7706621を、100nM、266nM、707nM、1800nM、および5000nMの最終濃度で、Tecan D300eディスペンサーを使用して添加した。増殖を、以前の実施例と同様に、RealTimeGloを使用して査定し、5日目に読み取られた全てのデータ点についてコンビネーションインデックスを計算した（図28）。BetalutinとJNJ-7706621との相乗的相互作用は、2種の組み合わせ（r＝0.99およびr＝0.96）を除く全てについて観察された。これらの例外は、相加効果を示し、最も高い効果サイズで起こった。
【０２４３】
結論
包括的なバリデーション実験は、一次スクリーニングの結果を確認する。さらに、Betalutinと試験された細胞周期キナーゼ阻害剤との異なる組み合わせの集合効果の統計分析は、相乗作用が明白である薬物濃度範囲を同定した。これらの結果は、CDK、PLK1、および/またはオーロラキナーゼを標的とする細胞周期キナーゼ阻害剤の添加が、侵襲性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の細胞株モデルにおいて、Betalutinの処理効果を強化し、抵抗性を逆転させることができるという主張を強力に支持する。
【０２４４】
実施例8：DLBCL細胞株におけるHumalutinとベネトクラクスとの間の相乗性
目的
本研究は、放射線を腫瘍細胞に選択的に送達する媒体としての抗CD37放射性免疫複合体Humalutin（177Lu-chHH1.1）と、BCL-2阻害剤ベネトクラクスとの組み合わせが、細胞生存が処理の5日後に測定される時、相乗的であるか否かを探究することを目標とする。以前の研究は、細胞生存が処理の3日後に測定された時、種々のマントル細胞（MC）およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）において強力な相乗性を示した。本研究は、3種のDLBCL細胞株：SUDHL-4、SUDHL-6、およびU2932に焦点を当てる。
【０２４５】
材料および方法
細胞株
Glutamax（Gibco,Paisley,UK）、10〜20％熱活性化FBS（Gibco）、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）が補足されたRPMI 1640培養培地において細胞を成長させた。細胞を37℃および5％CO2で培養した。細胞懸濁液を、週2回、予熱された培地で1:3〜1:5に希釈し、実験の開始時に指数関数的に成長中であることを確実にするため、実験開始の2〜4日前に希釈した。
【０２４６】
（表１）使用された細胞株、詳細、および培養条件
2021504341.tif 000014
GCB：胚中心B細胞
DLBCL：びまん性大細胞型B細胞リンパ腫
ABC：活性化B細胞
FL：濾胞性リンパ腫
【０２４７】
177LuによるchHH1-サテトラキセタンの標識
キレーターp-SCN-Bn-DOTA（サテトラキセタン、Macrocyclics,TX,USA）を、0.005M HClに溶解させ、6:1比で抗体に添加し、炭酸緩衝液を使用して、およそ8.5にpHを調整した。37℃での45分間のインキュベーションの後、Ab 1mg当たり50μlの0.2Mグリシン溶液の添加によって反応を中止した。遊離のサテトラキセタンを除去するため、コンジュゲート抗体を、NaCl 0.9％で4〜5回、Vivaspin 20遠心管（Sartorius Stedim Biotech,Gottingen Germany）を使用して洗浄した。177Luによる標識の前に、0.25M酢酸アンモニウム緩衝液を使用して、pHを5.3±0.3に調整した。およそ200MBqの177Lu（ITG,Garching,Germany）を、0.25mgのサテトラキセタン-chHH1に添加し、37℃で15〜30分間インキュベートした。コンジュゲートの放射化学的純度（RCP）をインスタント薄層クロマトグラフィを使用して評価したところ、95％より高かった。比放射能を600MBq/mgに設定した（必要に応じて、冷chHH1-サテトラキセタンによる希釈を行った）。
【０２４８】
Humalutinの免疫反応性画分
放射性免疫複合体の免疫反応性を、Ramos細胞およびワンポイント改変Lindmo法を使用して測定した。使用された細胞濃度は、7500万細胞/mlであった。コンジュゲートの免疫反応性は、70％より高かった。
【０２４９】
細胞傷害性研究
細胞を、Humalutin、ベネトクラクスのいずれか、または両方の組み合わせによって処理し、96穴プレートに播種した。処理後の各時点で、細胞の増殖および生存性を査定するため、細胞をAlamar Blue（Thermo Fisher,DALL1100）と共に4時間インキュベートし、マルチプレートリーダーFluoroskan ascent FLを使用して、蛍光測定を実施した。全ての実験を、各実験において2個の試料を使用してデュプリケートで実施した。データを未処理の対照に対して正規化した。Graphpad Prism 8ソフトウェア（Graphpad Software,San Diego,California）を使用して、対数スケール変換、および最大値100％、最低値0％の非線形適合を使用して、IC50を計算した。
【０２５０】
Humalutinによる処理
細胞を、細胞培養フラスコにおいて、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、または5μg/mlのHumalutinと共にインキュベートし、37℃/5％CO2でインキュベートした。18〜20時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させた。細胞に結合した放射能を、洗浄後、較正されたγ検出器（Cobra II auto-gamma detector、Packard Instrument Company,Meriden,CT,USA）を使用して測定した。細胞がインキュベーション後にどの程度生存しているかを決定するため、細胞の濃度および生存性も、洗浄後、フローサイトメトリー用のGuava ViaCount Cell Dispersal試薬（Merck GaA,Darmstadt,Germany）を使用して測定し、Guava EasyCyte 12HT（Merck KGaA,Darmstadt,Germany）において測定した。細胞は96穴プレートに播種された。Alamar blue生存性測定を播種の120時間後に実施した。
【０２５１】
ベネトクラクスによる処理
0.2ml培地中の0μM、0.5μM、1μM、2μM、および2.5μMベネトクラクスで予めコーティングされた96穴プレートに細胞を播種し、37℃/5％CO2で120時間インキュベートした後、alamar blue細胞生存性アッセイを使用して細胞傷害効果を測定した。
【０２５２】
Humalutinおよびベネトクラクスによる処理
細胞を、0μg/ml（対照）、0.5μg/ml、または1μg/mlのいずれかのHumalutinと共に18〜20時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させた。細胞に結合した放射能を、洗浄後、較正されたγ検出器（Cobra II auto-gamma detector、Packard Instrument Company,Meriden,CT,USA）を使用して測定した。細胞がインキュベーション後にどの程度生存しているかを決定するため、細胞の濃度および生存性も、洗浄後、フローサイトメトリー用のGuava ViaCount Cell Dispersal試薬（Merck GaA,Darmstadt,Germany）を使用して測定し、Guava EasyCyte 12HT（Merck KGaA,Darmstadt,Germany）において測定した。次いで、細胞を、0.2ml培地中0.5〜2.5μMの濃度でベネトクラクスによって予めコーティングされた96穴プレートに播種し、37℃/5% CO2で120時間インキュベートした。細胞傷害効果を、Alamar blue細胞生存性アッセイを使用して測定した。
【０２５３】
統計
Compusynソフトウェアを使用した相乗性計算のため、Chou-Talalayモデルを使用した。R（適合度）を、個々の処理について計算した。計算されたコンビネーションインデックス（CI）を信頼性を持って使用するためには、Rが、インビトロ培養実験において0.90を超えているべきである。CIは相乗性の指標であり：0〜0.9が相乗性と見なされる。表3、WO2006004917A2に記載されるような相乗作用グレード分類を使用した。
【０２５４】
結果および考察
単独のHumalutinおよびベネトクラクス
Humalutinおよびベネトクラクスに対する感受性は、SUDHL-6とU2932との間で極めて類似しており、SUDHL-4は、両方の薬物に対してより抵抗性であった（表2、図1）。
【０２５５】
（表２）播種後の120時間のインキュベーション時間の後のHumalutinおよびベネトクラクスについてのIC50値
2021504341.tif 000015
Graphpad Prism 8によって報告されたIC50値；Compusynソフトウェアによって報告されたR値。
【０２５６】
Humalutinとベネトクラクスとの組み合わせ
図29は、両方の処理の組み合わせ（および単独の各処理）の薬物応答曲線を示す。Chou Talalay法によるコンビネーションインデックス（CI）の計算は、細胞株、ならびに使用されたベネトクラクスおよびHumalutinの用量に依って変動する相乗作用の程度を示した（表3）。単独の処理についてのR値が、U2932細胞株におけるHumalutin IC50の適合について0.9未満であり、即ち、Chou Talalay法からの結果が留意して解釈されるべきであることに注目することが重要である。
【０２５７】
SUDHL-4が、（BH3非感受性であることと一致して）Humalutinおよびベネトクラクスの両方に対して最も抵抗性の細胞株であり、より強力な相乗性を示したことに注目することは興味深い。
【０２５８】
（表３）0.5μg/mlまたは1μg/ml Humalutinと異なる用量のベネトクラクスとの組み合わせについてChou-Talalay法を使用して計算されたコンビネーションインデックス
2021504341.tif 000016
【０２５９】
結論
HumalutinとBCL-2阻害剤ベネトクラクスとの間の相乗性は、Humalutinによる処理の5日後に試験された3種のDLBCL細胞株：SUDHL-4、SUDHL-6、およびU2932において観察された。結果は、放射免疫治療による処理が、BCL-2阻害剤に対してリンパ腫を感作し得ることを示す。動物モデルにおけるさらなる研究が保証される。
【０２６０】
実施例9：DLBCL細胞株におけるHumalutinとオラパリブとの間の相乗性
目的
本研究は、放射線を腫瘍細胞に選択的に送達する媒体としての放射性免疫複合体Humalutin（177Lu-chHH1.1）と、PARP阻害剤オラパリブとの組み合わせが、細胞生存が処理の5日後に測定される時、相乗的であるか否かを探究することを目標とする。以前の研究は、細胞生存が処理の3日後に測定された時、種々のマントル細胞（MCL）およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）において、強力な相乗性を示した。本研究は、3種のDLBCL細胞株：DOHH2、SUDHL-4、およびU2932、ならびにMCL細胞株Granta 519に焦点を当てた。
【０２６１】
材料および方法
細胞株
Glutamax（Gibco,Paisley,UK）、10％熱活性化FBS（Gibco）、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）が補足されたRPMI 1640培地またはDMEM培地において細胞を成長させた。細胞を37℃および5％CO2で培養した。細胞懸濁液を、週2回、予熱された培地で1:3〜1:5に希釈し、実験の開始時に指数関数的に成長中であることを確実にするため、実験開始の2〜4日前に希釈した。
【０２６２】
（表１）使用された細胞株、詳細、および培養条件
2021504341.tif 000017
MCL：マントル細胞リンパ腫
GCB：胚中心B細胞
DLBCL：びまん性大細胞型B細胞リンパ腫
ABC：活性化B細胞
FL：濾胞性リンパ腫
【０２６３】
177LuによるchHH1-サテトラキセタンの標識
キレーターp-SCN-Bn-DOTA（サテトラキセタン、Macrocyclics,TX,USA）を、0.005M HClに溶解させ、6:1比で抗体に添加し、炭酸緩衝液を使用して、およそ8.5にpHを調整した。37℃での45分間のインキュベーションの後、Ab 1mg当たり50μlの0.2Mグリシン溶液の添加によって反応を中止した。遊離のサテトラキセタンを除去するため、コンジュゲート抗体を、NaCl 0.9％で4〜5回、Vivaspin 20遠心管（Sartorius Stedim Biotech,Gottingen Germany）を使用して洗浄した。177Luによる標識の前に、0.25M酢酸アンモニウム緩衝液を使用して、pHを5.3±0.3に調整した。およそ200MBqの177Lu（ITG,Garching,Germany）を、0.25mgのサテトラキセタン-chHH1に添加し、37℃で15〜30分間インキュベートした。コンジュゲートの放射化学的純度（RCP）をインスタント薄層クロマトグラフィを使用して評価したところ、95％より高かった。比放射能を600MBq/mgに設定した（必要に応じて、冷chHH1-サテトラキセタンによる希釈を行った）。
【０２６４】
Humalutinの免疫反応性画分
放射性免疫複合体の免疫反応性を、Ramos細胞およびワンポイント改変Lindmo法を使用して測定した。使用された細胞濃度は、7500万細胞/mlであった。コンジュゲートの免疫反応性は、70％より高かった。
【０２６５】
細胞傷害性研究
細胞を、Humalutin、オラパリブのいずれか、または両方の組み合わせによって処理し、96穴プレートに播種した。処理後の各時点で、細胞の増殖および生存性を査定するため、細胞をAlamar Blue（Thermo Fisher,DALL1100）と共に4時間インキュベートし、マルチプレートリーダーFluoroskan ascent FLを使用して、蛍光測定を実施した。全ての実験を、各実験において2個の試料を使用してデュプリケートで実施した。データを未処理の対照に対して正規化した。Graphpad Prism 8ソフトウェア（Graphpad Software,San Diego,California）を使用して、対数スケール変換、および最大値100％、最低値0％の非線形適合を使用して、IC50を計算した。
【０２６６】
Humalutinによる処理
細胞を、細胞培養フラスコにおいて、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、または5μg/mlのHumalutinと共にインキュベートし、37℃/5％CO2でインキュベートした。18〜20時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させた。細胞に結合した放射能を、洗浄後、較正されたγ検出器（Cobra II auto-gamma detector、Packard Instrument Company,Meriden,CT,USA）を使用して測定した。細胞がインキュベーション後にどの程度生存しているかを決定するため、細胞の濃度および生存性も、洗浄後、フローサイトメトリー用のGuava ViaCount Cell Dispersal試薬（Merck GaA,Darmstadt,Germany）を使用して測定し、Guava EasyCyte 12HT（Merck KGaA,Darmstadt,Germany）において測定した。細胞は96穴プレートに播種された。Alamar Blue生存性測定を播種の120時間後に実施した。
【０２６７】
オラパリブによる処理
1〜100μMの範囲の濃度のオラパリブによって予めコーティングされた96穴プレートに、0.2mlの培地で細胞を播種し、37℃/5％CO2で120時間インキュベートした後、Alamar blue細胞生存性アッセイを使用して細胞傷害効果を測定した。
【０２６８】
Humalutinおよびオラパリブによる処理
細胞を、0（対照）、0.5μg/ml、または1μg/mlのいずれかのHumalutinと共に18〜20時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させた。細胞に結合した放射能を、洗浄後、較正されたγ検出器（Cobra II auto-gamma detector,Packard Instrument Company,Meriden,CT,USA）を使用して測定した。細胞がインキュベーション後にどの程度生存しているかを決定するため、細胞の濃度および生存性も、洗浄後、フローサイトメトリー用のGuava ViaCount Cell Dispersal試薬（Merck GaA,Darmstadt,Germany）を使用して測定し、Guava EasyCyte 12HT（Merck KGaA,Darmstadt,Germany）において測定した。次いで、細胞を、1〜100μMの濃度でオラパリブによって予めコーティングされた96穴プレートに、0.2mlの培地で播種し、37℃/5％CO2で120時間インキュベートした。細胞傷害効果を、Alamar blue細胞生存性アッセイを使用して測定した。
【０２６９】
統計
Compusynソフトウェアを使用した相乗性計算のため、Chou-Talalayモデルを使用した。R（適合度）を、個々の処理について計算した。計算されたコンビネーションインデックス（CI）を信頼性を持って使用するためには、Rが、インビトロ培養実験において0.90を超えているべきである。CIは相乗性の指標であり：0〜0.9が相乗性と見なされる。表3、WO2006004917A2に記載されるような相乗作用グレード分類を使用した。
【０２７０】
結果および考察
単独のHumalutinおよびオラパリブ
Humalutinおよびオラパリブに対する感受性は、異なる細胞株の間で変動した（表2、図30）。DOHH2は、Humalutinに対して最も抵抗性で、オラパリブに対して最も感受性の細胞株であった。U2932は、Humalutinに対して最も感受性で、オラパリブに対して最も抵抗性であった。
【０２７１】
（表２）播種後の120時間のインキュベーション時間の後のHumalutinおよびオラパリブについてのIC50値
2021504341.tif 000018
Graphpad Prism 8によって報告されたIC50値；Compusynソフトウェアによって報告されたR値。
【０２７２】
Humalutinとオラパリブとの組み合わせ
図1は、両方の処理の組み合わせ（および単独の各処理）の薬物応答曲線を提示する。Chou Talalay法によるコンビネーションインデックス（CI）の計算は、細胞株ならびに使用されたオラパリブおよびHumalutinの用量に依って変動する相乗作用の程度を示した（表3）。単独の処理についてのR値が、U2932細胞株においてHumalutin IC50の適合について0.9未満であり、即ち、Chou Talalay法からの結果は不正確である可能性があることに注目することは重要である。Humalutinとオラパリブとの少数の組み合わせについて、SUDHL-4細胞株、DOHH2細胞株、およびGranta細胞株において、異なるレベルの拮抗作用が観察されたことに注意すること。最も高い相乗性は、1μg/ml Humalutinによって処理されたSUDHL-4について見出された。
【０２７３】
（表３）0.5μg/mlまたは1μg/ml Humalutinと異なる用量のオラパリブとの組み合わせについてChou-Talalay法を使用して計算されたコンビネーションインデックス
2021504341.tif 000019
【０２７４】
結論
HumalutinとPARP阻害剤オラパリブとの間の相乗性は、Humalutinによる処理の5日後に試験された全ての細胞株：SUDHL-4、SUDHL-6、およびU2932（DLBCL）、ならびにGranta 519（MCL）において観察された。結果は、放射免疫治療による処理が、PARP阻害剤に対してリンパ腫を感作し得ることを示す。動物モデルにおけるさらなる研究が保証される。
【０２７５】
項
1．A：177Lu-chHH1.1、177Lu-リロトマブ、および/または212Pb-chHH1.1のようなモノクローナルHH1抗体および放射性核種を含む放射性免疫複合体と
B：G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物と
を含む組成物。
【０２７６】
2．177Lu-chHH1.1、177Lu-リロトマブ、および/または212Pb-chHH1.1がキレートリンカーによって連結されている、項1による組成物。
【０２７７】
3．キレートリンカーがp-SCN-ベンジル-DOTA、DOTA-NHSエステル、p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-ベンジル-TCMC、およびCHX-A''-DTPAからなる群より選択される、項1〜2による組成物。
【０２７８】
4．キレートリンカーがp-SCN-ベンジル-DOTAとしても公知のサテトラキセタンである、項1〜3による組成物。
【０２７９】
5．Aが177Lu-chHH1.1である、項1〜4による組成物。
【０２８０】
6．Aが177Lu-リロトマブである、項1〜5による組成物。
【０２８１】
7．Aが212Pb-chHH1.1である、項1〜6による組成物。
【０２８２】
8．BがG2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子または有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子である、項1〜7による組成物。
【０２８３】
9．タンパク質または分子がサイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のWEE-1によって媒介されるリン酸化の減少およびG2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらす、項1〜8による組成物。
【０２８４】
10．タンパク質または分子がサイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のMYT-1によって媒介されるリン酸化の減少およびG2/M細胞周期停止における細胞周期の進行をもたらす、項1〜8による組成物。
【０２８５】
11．タンパク質または分子がサイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のCDK7含有CAKキナーゼによって媒介されるリン酸化の増加をもたらす、項1〜8による組成物。
【０２８６】
12．タンパク質または分子がオーロラキナーゼの阻害剤である、項1〜8による組成物。
【０２８７】
13．タンパク質または分子がタンパク質14-3-3の阻害剤である、項1〜8による組成物。
【０２８８】
14．タンパク質または分子がG2/M細胞周期停止に関与するタンパク質の阻害剤または有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子である、項1〜13による組成物。
【０２８９】
15．タンパク質または分子がMK-1775、PD-166285、AMG 900、AT7519、AZD7762、CYC116、フラボピリドール、GSK461364、JNJ-7706621、LY2603618、NSC 23766、NU6027、PHA-793887、トシル-L-アルギニンメチルエステル（TAME）、BI6727（ボラセルチブ）、ON-01910（リゴセルチブ）、HA-1077（ファスジル）、SCH727965（ディナシクリブ）、LY2835219、LEE011、サリラシブ、K-115（リパスジル）、PD0332991（パルボシクリブ）、BI2536、MLN8237、またはジフォペインのようなタンパク質14-3-3阻害剤からなる群より選択される、項1〜14による組成物。
【０２９０】
16．BがPARP阻害剤であるタンパク質または分子である、項1〜7による組成物。
【０２９１】
17．PARP阻害剤がオラパリブ（AZD2281、Ku-0059436）、ベリパリブ（ABT-888）、ルカパリブ（AG-014699、PF-01367338）、タラゾパリブ（BMN 673）、AG-14361、INO-1001（3-アミノベンズアミド）、A-966492、PJ34 HCl、ニラパリブ（MK-4827）、UPF 1069、ME0328、NMS-P118、E7449、ピコリンアミド、ベンズアミド、ニラパリブ（MK-4827）トシル酸塩、NU1025、イニパリブ（BSI-201）、AZD2461、およびBGP-15 2HClからなる群より選択される、項1〜7および16による組成物。
【０２９２】
18．BがBCL2阻害剤であるタンパク質または分子である、項1〜7による組成物。
【０２９３】
19．薬学的組成物として製剤化されている、項1〜17による組成物。
【０２９４】
20．薬学的組成物が1種または複数種の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む、項19による組成物。
【０２９５】
21．医薬として使用するための、項1〜20による組成物。
【０２９６】
22．医薬が非ホジキンリンパ腫（NHL）に対するものである、項21による使用のための組成物。
【０２９７】
23．NHLが、形質転換濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、移植によって誘導されたリンパ腫からなる群より選択される、項22による使用のための組成物。
【０２９８】
24．使用が、組成物の後に抗体治療、免疫複合体治療、またはそれらの組み合わせによる同時処置または後処置が続く組み合わせ治療のためのものである、項22〜23による使用のための組成物。
【０２９９】
25．組成物の後に抗CD20抗体治療が単回投与または反復投与のパターンで続く、項22〜24による使用のための組成物。
【０３００】
26．抗CD20抗体がリツキシマブ、オビヌツズマブ、またはオファツムマブである、項25による使用のための組成物。
【０３０１】
27．医薬として使用するための、
A：177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1と
B：G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物と
の組み合わせ。
【０３０２】
28．項27による使用のための、
A：177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1と
B：G2/Mチェックポイントにおける細胞周期の進行をもたらすことができるタンパク質もしくは分子、有糸分裂における進行を阻害することができるタンパク質もしくは分子、BCL2阻害剤であるタンパク質もしくは分子、またはPARP阻害剤であるタンパク質もしくは分子であり得る付加的な薬物と
の組み合わせであって、医薬が非ホジキンリンパ腫に対するものである、組み合わせ。
【０３０３】
29．NHLが、形質転換濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、移植によって誘導されたリンパ腫である、項28による使用のための組み合わせ。
【０３０４】
30．使用が、組成物の後に抗体治療、免疫複合体治療、またはそれらの組み合わせによる同時処置または後処置が続く組み合わせ治療のためのものである、項27〜29による使用のための組み合わせ。
【０３０５】
31．組成物の後に抗CD20抗体治療が単回投与または反復投与のパターンで続く、項27〜30のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３０６】
32．抗CD20抗体がリツキシマブ、オビヌツズマブ、またはオファツムマブ、またはRixathonもしくはTruximaのようなリツキシマブバイオシミラーである、項31による使用のための組み合わせ。
【０３０７】
33．177Lu-リロトマブ、177Lu-chHH1.1、および/または212Pb-chHH1.1がキレートリンカーによって連結されている、項27〜32のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３０８】
34．キレートリンカーがp-SCN-ベンジル-DOTA、DOTA-NHSエステル、p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-ベンジル-TCMC、およびCHX-A''-DTPAからなる群より選択される、項26〜32による使用のための組み合わせ。
【０３０９】
35．キレートリンカーがp-SCN-ベンジル-DOTAとしても公知のサテトラキセタンである、項27〜34のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１０】
36．タンパク質または分子がサイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のWEE-1によって媒介されるリン酸化の減少をもたらす、項27〜35のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１１】
38．タンパク質または分子がサイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のMYT-1によって媒介されるリン酸化の減少をもたらす、項27〜35のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１２】
39．タンパク質または分子がサイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のCDK7含有CAKキナーゼによって媒介されるリン酸化の増加をもたらす、項27〜35のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１３】
40．タンパク質または分子がG2細胞周期停止の阻害剤またはM期進行の阻害剤である、項27〜37のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１４】
41．タンパク質または分子がMK-1775、PD-166285、AMG 900、AT7519、AZD7762、CYC116、フラボピリドール、GSK461364、JNJ-7706621、LY2603618、NSC 23766、NU6027、PHA-793887、トシル-L-アルギニンメチルエステル（TAME）、BI6727（ボラセルチブ）、ON-01910（リゴセルチブ）、HA-1077（ファスジル）、SCH727965（ディナシクリブ）、LY2835219、LEE011、サリラシブ、K-115（リパスジル）、PD0332991（パルボシクリブ）、BI2536、MLN8237（アリセルチブ）、またはジフォペインのようなタンパク質14-3-3阻害剤からなる群より選択される、項27〜40のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１５】
42．タンパク質または分子がMK-1775である、項27〜41のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１６】
43．タンパク質または分子がPD-166285である、項27〜41のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１７】
44．AおよびBが1種または複数種の薬学的組成物に製剤化される、項27〜43のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１８】
45．薬学的組成物が1種または複数種の薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む、項27〜44のいずれかによる使用のための組み合わせ。
【０３１９】
46．阻害性CDK1リン酸化の低下を示す非ホジキンリンパ腫の処置において使用するための177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンを含む組成物。
【０３２０】
47．阻害性CDK1リン酸化の低下がサイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のWEE-1によって媒介されるリン酸化の減少に由来する、項45による組成物。
【０３２１】
48．阻害性CDK1リン酸化の低下がサイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のMYT-1によって媒介されるリン酸化の減少に由来する、項45による組成物。
【０３２２】
49．サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）のCDK7含有CAKキナーゼによって媒介されるリン酸化の増加を示す非ホジキンリンパ腫の処置において使用するための、177Lu-リロトマブ・サテトラキセタンを含む組成物。
【０３２３】
50．NHLが、形質転換濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、慢性リンパ性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、移植によって誘導されたリンパ腫である、項44〜50による使用のための組成物。
【０３２４】
51．タンパク質または分子がMK-1775である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３２５】
51．タンパク質または分子がPD-166285である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３２６】
53．タンパク質または分子がAMG 900である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３２７】
54．タンパク質または分子がAZD7762である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３２８】
55．タンパク質または分子がJNJ7706621である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３２９】
56．タンパク質または分子がCYC116である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３０】
57．タンパク質または分子がAT7519である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３１】
58．タンパク質または分子がLY2603618である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３２】
59．タンパク質または分子がフラボピリドールである、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３３】
609．タンパク質または分子がGSK461364である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３４】
61．タンパク質または分子がNSC 23766である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３５】
62．タンパク質または分子がNU6027である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３６】
63．タンパク質または分子がPHA-793887である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３７】
64．タンパク質または分子がトシル-L-アルギニンである、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３８】
65．タンパク質または分子がメチルエステル（TAME）である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３３９】
66．タンパク質または分子がBI6727（ボラセルチブ）である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４０】
67．タンパク質または分子がON-01910（リゴセルチブ）である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４１】
68．タンパク質または分子がHA-1077（ファスジル）である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４２】
69．タンパク質または分子がSCH727965（ディナシクリブ）である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４３】
70．タンパク質または分子がLY2835219である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４４】
71．タンパク質または分子がLEE011である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４５】
72．タンパク質または分子がサリラシブである、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４６】
73．タンパク質または分子がK-115（リパスジル）である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４７】
74．タンパク質または分子がPD0332991（パルボシクリブ）である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４８】
75．タンパク質または分子がタンパク質14-3-3阻害剤である、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３４９】
76．タンパク質または分子がジフォペインである、項14による組成物または項41による組み合わせ。
【０３５０】
77．PARP阻害剤がオラパリブ（AZD2281、Ku-0059436）である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５１】
78．PARP阻害剤がベリパリブ（ABT-888）である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５２】
79．PARP阻害剤がルカパリブ（AG-014699、PF-01367338）である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５３】
80．PARP阻害剤がタラゾパリブ（BMN 673）である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５４】
81．PARP阻害剤がAG-14361である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５５】
82．PARP阻害剤がINO-1001（3-アミノベンズアミド）である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５６】
83．PARP阻害剤がA-966492である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５７】
84．PARP阻害剤がPJ34 HClである、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５８】
85．PARP阻害剤がニラパリブ（MK-4827）である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３５９】
86．PARP阻害剤がUPF 1069である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６０】
87．PARP阻害剤がME0328である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６１】
88．PARP阻害剤がNMS-P118である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６２】
89．PARP阻害剤がE7449である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６３】
90．PARP阻害剤がピコリンアミドである、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６４】
91．PARP阻害剤がベンズアミドである、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６５】
92．PARP阻害剤がニラパリブ（MK-4827）トシル酸塩である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６６】
93．PARP阻害剤がNU1025である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６７】
94．PARP阻害剤がイニパリブ（BSI-201）である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６８】
95．PARP阻害剤がAZD2461である、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３６９】
96．PARP阻害剤がBGP-15 2HClである、項16による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３７０】
97．タンパク質または分子がBI2536である、項16による組成物または項41による組み合わせ。
【０３７１】
98．タンパク質または分子がMLN8237（アリセルチブ）である、項16による組成物または項41による組み合わせ。
【０３７２】
99．BCL2阻害剤がベネトクラクス（ABT-199、GDC-0199）、オバトクラクスメシル酸塩（GX15-070）、HA14(1)、ABT-263（ナビトクラクス）、ABT-737、TW-37、AT101、サブトクラクス、WEHI-539、A-1155463、ゴシポルクおよびAT-101、アポゴシポール、S1、2-メトキシアンチマイシンA3、BXI-61、BXI-72、TW37、MIM1、UMI-77、ならびにガンボギン酸からなる群より選択される、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３７３】
100．BCL2阻害剤がベネトクラクス（ABT-199、GDC-0199）である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３７４】
101．BCL2阻害剤がオバトクラクスメシル酸塩（GX15-070）である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３７５】
102．BCL2阻害剤がHA14(1)である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３７６】
103．BCL2阻害剤がABT-263（ナビトクラクス）である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３７７】
104．BCL2阻害剤がTW-37である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３７８】
105．BCL2阻害剤がAT101である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３７９】
106．BCL2阻害剤がサブトクラクスである、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８０】
107．BCL2阻害剤がガンボギン酸である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８１】
108．BCL2阻害剤がWEHI-539である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８２】
109．BCL2阻害剤がA-1155463である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８３】
110．BCL2阻害剤がゴシポールおよびAT-101である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８４】
111．BCL2阻害剤がアポゴシポールである、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８５】
112．BCL2阻害剤がS1である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８６】
113．BCL2阻害剤が2-メトキシアンチマイシンA3である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８７】
114．BCL2阻害剤がBXI-61である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８８】
115．BCL2阻害剤がBXI-72である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３８９】
116．BCL2阻害剤がTW37である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３９０】
117．BCL2阻害剤がMIM1である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３９１】
118．BCL2阻害剤がUMI-77である、項18による組成物または項27〜28による使用のための組み合わせ。
【０３９２】
119．NHLが形質転換濾胞性リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０３９３】
120．NHLがびまん性大細胞型B細胞リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０３９４】
121．NHLがマントル細胞リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０３９５】
122．NHLが辺縁帯リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０３９６】
123．NHLが慢性リンパ性白血病である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０３９７】
124．NHLが皮膚T細胞リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０３９８】
125．NHLがリンパ形質細胞性リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０３９９】
126．NHLが辺縁帯B細胞リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０４００】
127．NHLがMALTリンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０４０１】
128．NHLが小細胞型リンパ球性リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０４０２】
129．NHLがバーキットリンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０４０３】
130．NHLが未分化大細胞リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０４０４】
131．NHLがリンパ芽球性リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０４０５】
132．NHLが末梢性T細胞リンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【０４０６】
133．NHLが移植によって誘導されたリンパ腫である、項23もしくは50による使用のための組成物または項28による使用のための組み合わせ。
【図１】
2021504341.tif 000021
【図２】
2021504341.tif 000022
【図３】
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【図４】
2021504341.tif 000024
【図５】
2021504341.tif 000025
【図６】
2021504341.tif 000026
【図７】
2021504341.tif 000027
【図８】
2021504341.tif 000028
【図９】
2021504341.tif 000029
【図１０】
2021504341.tif 000030
【図１１】
2021504341.tif 000031
【図１２】
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【図１３Ａ】
2021504341.tif 000033
【図１３Ｂ】
2021504341.tif 000034
【図１３Ｃ】
2021504341.tif 000035
【図１３Ｄ】
2021504341.tif 000036
【図１４】
2021504341.tif 000037
【図１５Ａ】
2021504341.tif 000038
【図１５Ｂ】
2021504341.tif 000039
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
2021504341.tif 000041
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
2021504341.tif 000044
【図１６Ｄ】
2021504341.tif 000045
【図１７】
2021504341.tif 000046
【図１８】
2021504341.tif 000047
【図１９】
2021504341.tif 000048
【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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