(57)【要約】  ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの組み合わせを対象に投与することにより、脱髄疾患に罹患している対象における髄鞘再形成を促進する方法が本明細書に記載される。薬剤の組み合わせを投与する方法も記載されており、薬剤の組み合わせは、経鼻投与に適合された組成物である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄鞘再形成の促進を必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量のステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ステロイドホルモンが、テストステロンなどのアンドロゲン受容体リガンド、プロゲステロンもしくはアロプレグナノロンなどのプロゲステロン受容体リガンド、エストラジオールなどのエストロゲン受容体リガンドであるか、またはデヒドロエピアンドロステロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステロイドホルモンが、選択的アンドロゲン受容体モジュレータ、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、または選択的プロゲステロン受容体モジュレータなどの選択的ホルモン受容体モジュレータである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステロイドホルモンが、テストステロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、平滑化（Ｓｍｏ）アゴニストである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｓｍｏアゴニストが、３−クロロ−Ｎ−［トランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［［３−（４−ピリジニル）フェニル］メチル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド（ＳＡＧ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、Ｇｌｉアンタゴニストなどのヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストが、２，２’−［［ジヒドロ−２−（４−ピリジニル）−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−ピリミジンジイル］ビス（メチレン）］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンアミン（ＧＡＮＴ−６１）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、ＳｍｏアゴニストおよびＧｌｉアンタゴニストの両方を投与することを含む、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｓｍｏアゴニストが、ＳＡＧである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｇｌｉアンタゴニストが、ＧＡＮＴ−６１である、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、実質的に同時にまたは順次、別々の組成物で投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、同じ組成物で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方が、（ａ）前記製剤の約６０重量％〜約９８重量％の量で存在する少なくとも１つの親油性もしくは部分的に親油性の担体と、（ｂ）前記製剤の約１重量％〜約２０重量％の量で存在する表面張力低下活性を有する少なくとも１つの化合物と、（ｃ）前記製剤の約０．５重量％〜約１０重量％の量で存在する少なくとも１つの粘度調整剤と、をさらに含む、鼻腔内医薬組成物で鼻腔内投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記鼻腔内医薬組成物が、前記ステロイドホルモンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記鼻腔内医薬組成物が、前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記鼻腔内医薬組成物が、前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記鼻腔内医薬組成物が、前記ステロイドホルモン、Ｓｍｏアゴニスト、およびＧｌｉアンタゴニストを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方が、多孔性賦形剤を含む鼻腔内医薬組成物で鼻腔内投与され、前記ステロイドホルモンおよび／または前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、前記多孔性賦形剤の細孔内に位置する前記多孔性賦形剤の表面に積載される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステロイドホルモンが、前記多孔性賦形剤の細孔内に位置する前記多孔性賦形剤の表面に積載される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、前記多孔性賦形剤の細孔内に位置する前記多孔性賦形剤の表面に積載される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの両方が、前記多孔性賦形剤の細孔内に位置する前記多孔性賦形剤の表面に積載される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステロイドホルモン、Ｓｍｏアゴニスト、およびＧｌｉアンタゴニストが、前記多孔性賦形剤の細孔内に位置する前記多孔性賦形剤の表面に積載される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、またはラットである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が、脱髄疾患に罹患している、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、デビック病、炎症性脱髄疾患、中枢神経系神経障害、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄症、脊髄癆、梅毒性脊髄症、進行性多巣性白質脳症のような白質脳症、白質萎縮症、およびアルツハイマー病から選択される中枢神経系の脱髄疾患に罹患している、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象が、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、抗ＭＡＧ末梢神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、圧迫性麻痺に易罹病性の遺伝性神経障害、末梢神経障害、脊髄症、視神経症、および進行性炎症性神経障害から選択される末消神経系の脱髄疾患に罹患している、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
髄鞘再形成の促進を必要とする対象においてそれを行う方法で使用するための、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項２９】
前記ステロイドホルモンが、テストステロンなどのアンドロゲン受容体リガンド、プロゲステロンもしくはアロプレグナノロンなどのプロゲステロン受容体リガンド、エストラジオールなどのエストロゲン受容体リガンドであるか、またはデヒドロエピアンドロステロンである、請求項２８に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３０】
前記ステロイドホルモンが、選択的アンドロゲン受容体モジュレータ、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、または選択的プロゲステロン受容体モジュレータなどの選択的ホルモン受容体モジュレータである、請求項２８に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３１】
前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、３−クロロ−Ｎ−［トランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［［３−（４−ピリジニル）フェニル］メチル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド（ＳＡＧ）などの平滑化アゴニストである、請求項２８に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３２】
前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、２，２’−［［ジヒドロ−２−（４−ピリジニル）−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−ピリミジンジイル］ビス（メチレン）］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンアミン（ＧＡＮＴ−６１）などのＧｌｉアンタゴニストである、請求項２８に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３３】
前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、３−クロロ−Ｎ−［トランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［［３−（４−ピリジニル）フェニル］メチル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド（ＳＡＧ）などのＳｍｏアゴニスト、および２，２’−［［ジヒドロ−２−（４−ピリジニル）−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−ピリミジンジイル］ビス（メチレン）］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンアミン（ＧＡＮＴ−６１）などのＧｌｉアンタゴニストの両方を含む、請求項２８に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３４】
前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが、実質的に同時にまたは順次、別々の組成物で投与されるか、または同じ組成物で投与される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３５】
前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方が、（ａ）前記製剤の約６０重量％〜約９８重量％の量で存在する少なくとも１つの親油性もしくは部分的に親油性の担体と、（ｂ）前記製剤の約１重量％〜約２０重量％の量で存在する表面張力低下活性を有する少なくとも１つの化合物と、（ｃ）前記製剤の約０．５重量％〜約１０重量％の量で存在する少なくとも１つの粘度調整剤と、をさらに含む、鼻腔内医薬組成物で鼻腔内投与される、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３６】
前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方が、多孔性賦形剤を含む鼻腔内医薬組成物で鼻腔内投与され、前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方が、前記多孔性賦形剤の細孔内に位置する前記多孔性賦形剤の表面に積載される、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３７】
前記対象が、脱髄疾患に罹患している、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の使用のためのステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ。
【請求項３８】
治療を必要とする対象における脱髄を治療するための薬剤の調製におけるステロイドホルモンおよび／またはヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの使用であって、前記方法が、前記ステロイドホルモンおよび前記ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを前記対象に投与することを含む、ステロイドホルモンおよび／またはヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの使用。
【請求項３９】
前記対象が、脱髄疾患に罹患している、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
オリゴデンドログリア細胞を産生する方法であって、ステロイドホルモンおよび平滑化アゴニストを含む培地中で初代混合グリア細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４１】
前記ステロイドホルモンが、テストステロンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記平滑化アゴニストが、３−クロロ−Ｎ−［トランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［［３−（４−ピリジニル）フェニル］メチル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド（ＳＡＧ）である、請求項４０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
オリゴデンドログリア細胞をミエリン産生細胞に分化させる方法であって、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストを含む培地中でオリゴデンドログリア細胞をインキュベートすることを含む、方法。
【請求項４４】
前記ステロイドホルモンが、テストステロンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストが、２，２’−［［ジヒドロ−２−（４−ピリジニル）−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−ピリミジンジイル］ビス（メチレン）］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンアミン（ＧＡＮＴ−６１）である、請求項４３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条に基づき、２０１８年１月１１日に出願された米国仮出願第６２／６１６，１７３号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ステロイドホルモンおよびソニックヘッジホッグシグナル伝達経路調節剤を使用して脱髄疾患を治療するための組成物および方法が本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００３】
ミエリンは、いくつかの神経細胞の軸索を取り囲み、電気絶縁層を形成する脂肪質の白い物質である。ヒトでは、脳の約４０％に密に詰まった線維を含む白質が含まれており、その主な構成成分はミエリン（白質の５０〜６０％乾燥重量）である。ミエリンは、中枢神経系（ＣＮＳ）のオリゴデンドロサイト（ＯＬ）によって合成および維持される。オリゴデンドロサイトは、ＣＮＳの軸索に補助および絶縁を提供するように機能する神経膠の一種である。オリゴデンドロサイトは、オリゴデンドロサイトの前駆細胞（ＯＰＣ）から生成され、ＣＮＳでのみ見られる。
【０００４】
脱髄疾患において、神経系のニューロンのミエリン鞘が損傷する。この損傷は、影響を受けた神経における信号の伝導を損ない、例えば、関与する神経に応じて、感覚、運動、認知、および他の機能の欠如につながる可能性がある。多数の脱髄疾患の中で、多発性硬化症（ＭＳ）は、世界中で最も一般的な若年成人の障害性神経学的状態である。多発性硬化症財団（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、米国で４０万人以上、世界中で約２５０万人がＭＳを患っていると推定している。米国では、毎週約２００件の新たな症例が診断されている。これは治療するのに高価な病気であり、直接的および間接的な医療費は、米国では年間患者あたり８，５２８ドル〜５４，２４４ドルの範囲である。
【０００５】
多発性硬化症は、神経系の一部が伝達する能力を破壊し、その結果、さまざまな身体的、精神的、および時には精神医学的問題を引き起こす。ＭＳに対して既知の治療法はないが、現在の治療は、発作後の機能を改善し、新たな発作を防ぐことを試みている。ＭＳの治療に使用されるほとんどの薬剤は、再発寛解型の疾患では有効であるが、軸索の慢性的な脱髄を特徴とする進行型では一般的に有効ではない。最近、免疫調節剤オクレリズマブが進行性型において有効であることが示されたが、オクレリズマブは、主要な潜在的な副作用と関連しており、忍容性が低い。Ｍｏｎｔａｌｂａｎ  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｐｌａｃｅｂｏ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，”Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７６  ２０９−２２０（２０１７）を参照されたい。
【０００６】
別のアプローチでは、ＵＳ２０１３／０２２６１３３が、ステファグラブリン硫酸（ｓｔｅｐｈａｇｌａｂｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）を使用して神経線維のミエリン鞘を回復させる方法を記載している。別のアプローチでは、ＵＳ２００４／０１４１９４７が、コロニー刺激因子またはサルグラモスチムなどのコロニー刺激因子様リガンド、１型インターフェロン同族体、および少なくとも１つの追加の治療薬を使用して、脱髄性ＣＮＳ疾患を治療する方法を開示している。別のアプローチでは、ＵＳ２００４／００５３８５０が、トリペプチドｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｕおよびＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）／カイニン酸アンタゴニスト化合物を共投与することにより、ＣＮＳの脱髄疾患を治療する方法を記載している。別のアプローチでは、米国特許第４，７６０，０９２号が、コルヒチンまたはコルヒセインを使用して多発性硬化症などの脱髄疾患を治療する方法を主張している。別のアプローチでは、ＵＳ２０１３／０３０２４１０が、フマル酸ジメチルまたはフマル酸モノメチルを使用した脱髄疾患における神経保護のための方法を記載している。別のアプローチでは、ＵＳ２０１３／０１０８６４３が、マクロファージスカベンジャー受容体クラス１  ＭＳＲ１の阻害剤を使用して自己免疫または炎症性疾患を治療する方法を記載している。別のアプローチでは、ＥＰ０４２３９４３が、脱髄疾患を治療するための酵素の哺乳動物コラゲナーゼファミリーのメンバーの阻害剤の使用を記載している。
【０００７】
これらの提案されたアプローチにもかかわらず、ＭＳなどの脱髄疾患に罹患している対象における髄鞘再形成を促進する方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、髄鞘再形成の促進を必要とする対象においてそれを行う方法が提供され、これには、有効量のステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを対象に投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンは、テストステロンなどのアンドロゲン受容体リガンド、プロゲステロンまたはアロプレグナノロンなどのプロゲステロン受容体リガンド、エストラジオールなどのエストロゲン受容体リガンドであるか、またはデヒドロエピアンドロステロンであるか、または選択的アンドロゲン受容体モジュレータ、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、もしくは選択的プロゲステロン受容体モジュレータなどの選択的ホルモン受容体モジュレータである。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、３−クロロ−Ｎ−［トランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［［３−（４−ピリジニル）フェニル］メチル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド（ＳＡＧ）などの平滑化（Ｓｍｏ）アゴニストである。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、Ｇｌｉアンタゴニストなどのヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストは、２，２’−［［ジヒドロ−２−（４−ピリジニル）−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−ピリミジンジイル］ビス（メチレン）］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンアミン（ＧＡＮＴ−６１）である。いくつかの実施形態では、本方法は、ＳｍｏアゴニストおよびＧｌｉアンタゴニストの両方を投与することを含み、例えば、ＳｍｏアゴニストはＳＡＧであり、ＧｌｉアンタゴニストはＧＡＮＴ−６１である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、実質的に同時にまたは順次、別々の組成物で投与される。他の実施形態では、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、同じ組成物で投与される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方は、（ａ）製剤の約６０重量％〜約９８重量％の量で存在する少なくとも１つの親油性もしくは部分的に親油性の担体と、（ｂ）製剤の約１重量％〜約２０重量％の量で存在する表面張力低下活性を有する少なくとも１つの化合物と、（ｃ）製剤の約０．５重量％〜約１０重量％の量で存在する少なくとも１つの粘度調整剤と、をさらに含む、鼻腔内医薬組成物で鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、鼻腔内医薬組成物は、ステロイドホルモンを含む。いくつかの実施形態では、鼻腔内医薬組成物は、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを含む。いくつかの実施形態では、鼻腔内医薬組成物は、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを含む。いくつかの実施形態では、鼻腔内医薬組成物は、ステロイドホルモン、Ｓｍｏアゴニスト、およびＧｌｉアンタゴニストを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方は、多孔性賦形剤を含む鼻腔内医薬組成物で鼻腔内投与され、ステロイドホルモンおよび／またはヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、多孔性賦形剤の細孔内に位置する多孔性賦形剤の表面に積載される。いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンは、多孔性賦形剤の細孔内に位置する多孔性賦形剤の表面に積載される。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、多孔性賦形剤の細孔内に位置する多孔性賦形剤の表面に積載される。いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、多孔性賦形剤の細孔内に位置する多孔質性賦形剤の表面に積載される。いくつかの実施形態では、ステロイドホルモン、Ｓｍｏアゴニスト、およびＧｌｉアンタゴニストは、多孔性賦形剤の細孔内に位置する多孔性賦形剤の表面に積載される。
【００１２】
任意の実施形態によれば、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、またはラットであり得る。
【００１３】
任意の実施形態によれば、対象は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、デビック病、炎症性脱髄疾患、中枢神経系神経障害、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄症、脊髄癆、梅毒性脊髄症、進行性多巣性白質脳症のような白質脳症、白質萎縮症、およびアルツハイマー病から選択される中枢神経系の脱髄疾患などの脱髄疾患、またはギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、抗ＭＡＧ末梢神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、圧迫性麻痺に易罹病性の遺伝性神経障害、末梢神経障害、脊髄症、視神経症、および進行性炎症性神経障害から選択される末消神経系の脱髄疾患に罹患している可能性がある。
【００１４】
髄鞘再形成の促進を必要とする対象においてそれを行うために、本明細書に記載される方法で使用するための、本明細書に記載されるステロイドホルモンおよび本明細書に記載されるヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータも提供される。
【００１５】
治療を必要とする対象において脱髄を治療するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるステロイドホルモンおよび／または本明細書に記載されるヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの使用も提供され、本方法は、本明細書に記載されるように、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを対象に投与することを含む。
【００１６】
他の実施形態によれば、本明細書に記載されるステロイドホルモンおよび本明細書に記載される平滑化アゴニストを含む培地中で初代混合グリア細胞を培養することを含む、オリゴデンドログリア細胞を産生する方法が提供される。
【００１７】
他の実施形態によれば、オリゴデンドログリア細胞をミエリン産生細胞に分化させる方法が提供され、これには、本明細書に記載されるステロイドホルモンおよび本明細書に記載されるヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストを含む培地中でオリゴデンドログリア細胞をインキュベートすることが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ−Ｄ】ヘッジホッグおよびアンドロゲンホルモンシグナル伝達構成成分が、生後初期の背側終脳において、オリゴデンドロサイト新生（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）の最終波および髄鞘形成プロセス中に動的に転写されることを示す。図１Ａは、ミエリン塩基性タンパク質（Ｍｂｐ）をコードする転写物の相対的発現を示す。図１Ｂは、ヘッジホッグシグナル伝達Ｓｈｈリガンドの相対的発現を示す。図１Ｃは、ヘッジホッグシグナル伝達構成成分転写因子Ｇｌｉ１の相対的発現を示す。図１Ｄは、アンドロゲンシグナル伝達（ＡＲ）を媒介する主要な受容体の相対的発現を示す。発現は、０、３、８、または１５日齢のオス（灰色の棒）またはメス（黒色の棒）の仔マウスからの背側終脳における定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定される、ＧＡＰＤＨに対して報告される。性的二型は、ＡＲ発現についてのみ検出される。報告される値は、３匹の仔／性別／年齢の平均±ＳＥＭである。＊、ｐ≦０．０５。
【図２Ａ−Ｂ】ＯＰＣの増殖および分化の制御についてのインビトロでのヘッジホッグとテストステロンのシグナル伝達経路との間の機能的相互作用を示す。図２Ａは、培養終了の２時間前に増殖マーカーＢｒｄＵを組み込んだＯｌｉｇ２+細胞の定量化を示し、ＳＡＧ（０．１μＭ）およびテストステロン（１μＭ）の相乗効果を示す。図２Ａはまた、ＳｍｏアンタゴニストであるＳＡＮＴ−１（ＳＡＮＴ−１、０．１μＭ）が、Ｏｌｉｇ２+ＢｒｄＵ+細胞においてテストステロン誘導性の増加を遮断することも示す。図２Ｂは、初代混合グリア細胞から分化し、したがってＳＡＧ、ＳＡＮＴ−１、またはテストステロン（Ｔ）の不在下（対照）または存在下で評価されたミエリンマーカーＭｂｐを共発現する、Ｐｌｐ+ＧＦＰ+オリゴデンドログリア細胞の数を示す。報告される値は、３〜４つの独立した培養物の平均±ＳＥＭである。＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；＊＊＊、対照と比較してｐ≦０．００１。示されるように、異なる薬物間の比較は以下のとおりである：#、ｐ≦０．０５；##、ｐ≦０．０１；###、ｐ≦０．００１；$$$、ｐ≦０．００１。
【図３Ａ−Ｄ】ヘッジホッグシグナル伝達の遮断が、背側前脳において、オリゴデンドロサイト新生の最終波中にインビボでテストステロンによって誘導されるＯＰＣの分化を増強することを示す。生後１０日のオスの仔を、ＳｍｏアゴニストＳＡＧ、ＳｍｏアンタゴニストＳＡＮＴ−１、ステロイドホルモンのテストステロン（Ｔ）、ＳＡＧおよびＴ、ＳＡＮＴ−１およびＴで処置するか、または担体（対照）で処置した。図３Ａは、転写因子Ｏｌｉｇ２の免疫染色に基づく、示されるように処置されたマウスの脳スライスにおけるオリゴデンドログリアおよびアストログリア細胞の数の定量化を示す。図３Ｂは、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲα）の免疫染色に基づく、示されるように処置されたマウスの脳スライスにおけるオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の定量化を示す。図３Ｃは、大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）の免疫染色に基づく、示されるように処置されたマウスの脳スライスにおける成熟オリゴデンドロサイト（ＯＬ）の定量化を示す。図３Ｄは、示されるように処置されたマウスの脳スライスにおける、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を発現する髄鞘形成ＯＬの定量化を示す。注目すべきことに、テストステロンによって誘導される軸索ラッピングおよびセグメント伸長に必要なＭＢＰ+ＯＬへの成熟は、ヘッジホッグシグナル伝達の遮断によって増強される。報告される値は、３〜５匹の動物／条件の平均±ＳＥＭである。＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；＊＊＊、対照と比較してｐ≦０．００１。異なる薬物間の比較は示されるとおりである：#、ｐ≦０．０５。
【図４Ａ−Ｅ】Ｓｍｏの薬理学的活性化が、ＯＰＣ／成熟ＯＬの密度を高め、特に中枢神経系の脱髄のマウスモデルにおいて、ミクログリア活性化における早熟スイッチを再生促進（ｐｒｏ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）表現型へと促進することを示す。図４Ａは、ＳＡＧの不在下（対照、白い棒）または存在下（黒い棒）で脳梁にリゾレシチン（ＬＰＣ）を注射した１０日後のオスの成体マウス由来の脳スライスの免疫染色に基づく、ＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣ／単位表面の定量化を視覚化するヒストグラムを示す。図４Ｂは、ＳＡＧの不在下（対照、白い棒）または存在下（黒い棒）で脳梁にリゾレシチン（ＬＰＣ）を注射した１０日後のオスの成体マウス由来の脳スライスの免疫染色に基づく、Ｏｌｉｇ２+／ＡＰＣ+成熟ＯＬ／単位表面積の定量化、およびＡＰＣマーカーを共発現するＯｌｉｇ２＋オリゴデンドログリア系列細胞の割合を視覚化するヒストグラムを示す。報告される値は、ｎ＝４〜６匹の動物／条件の平均±ＳＥＭである。図４Ｃは、ＳＡＧの不在下（対照、白い棒）または存在下（黒い棒）で脳梁にリゾレシチン（ＬＰＣ）を注射した２日後のオスの成体マウス由来の脳スライスの免疫染色に基づく、Ｋｉ６７＋／ＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣ／単位表面積を定量化するヒストグラムを示す。図４Ｃはさらに、Ｋｉ６７およびＰＤＧＦＲα免疫染色（左側のパネル）に基づき、ＳＡＧ処置条件ではより多くの増殖ＯＰＣが観察されるが、ＰＤＧＦＲα＋細胞の数は、この初期の時点で、ＳＡＧの処置（右側のパネル）によって変化しないことを示す。図４Ｄは、ＧＦＡＰ＋アストロサイトの定量化を全領域の割合として視覚化したヒストグラムを示す。図４Ｅは、ＳＡＧの不在下（対照、白い棒）または存在下（黒い棒）で脳梁にリゾレシチン（ＬＰＣ）を注射した２日後のオスの成体マウス由来の脳スライスの免疫染色に基づく、Ｉｂａ１＋、Ａｒｇ１＋細胞／表面単位（左側のパネル）、およびＩｂａ１＋細胞の割合としてのＡｒｇ１＋細胞（右側のパネル）の定量化を視覚化したヒストグラムを示す。図４Ｅは、はるかに多くのＡｒｇ−１+再生促進ミクログリアがＳＡＧ処置動物の病変で検出されることをさらに示す。
【図５Ａ−Ｆ】Ｓｍｏ媒介Ｈｈシグナル伝達およびアンドロゲンシグナル伝達の同時薬理学的活性化に基づく併用療法が、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の経過を非常に緩和することを示す。図５Ａは、ビヒクル投与と比較して、別々にまたは同時に使用されたＳＡＧおよびテストステロンの治療的投与後のＥＡＥ臨床スコアを示す。図５Ｂは、ビヒクル（対照）、テストステロン（Ｔ）、ＳＡＧ、およびＳＡＧ＋Ｔ処置ＥＡＥマウスの腰髄の電子顕微鏡写真を示す。正常な髄鞘形成された軸索（右端の矢印）に加えて、脱髄軸索（下端の矢印）、および異常な軸索（左端の矢印）は、対照条件でより高いレベルで観察される。図５Ｃは、ｇ比の分析（軸索直径／軸索＋ミエリン直径）を示し、テストステロンおよびＳＡＧを別々にまたは同時に使用した場合、対照と比較して値が有意に低いことを示す。ＳＡＧ単独またはテストステロンとの併用は、テストステロン単独の場合よりも、ｇ比に対して有意に高い効果を表す。図５Ｄは、まだ圧縮されているが軸索から分離しているミエリン、二重ミエリン鞘、または軸索内部が閉塞された多層ミエリンを呈する軸索を含む、異常な軸索の定量化を示す。軸索の総数中の異常の割合は、対照と比較して処置条件下で大幅に減少する。図５Ｆ〜５Ｆは、ビヒクル（対照）、または別々にもしくは同時に使用された薬物のテストステロンおよびＳＡＧによって処置されたＥＡＥ動物の腰髄のＩｂａおよびＡｒｇ１の免疫染色に基づく画像の病変の全領域の割合として表される、Ｉｂａ１+（図５Ｅ）およびＡｒｇ１+（図５Ｆ）細胞が占める領域の定量化を示す。図５Ｇは、テストステロンおよびＳＡＧで別々にまたは同時に処置されたＥＡＥ動物の脊髄における病変領域の割合としてのＧＦＡＰ陽性領域の定量化を示す。図５Ｈは、テストステロンおよびＳＡＧで別々にまたは同時に処置されたＥＡＥ動物の病変領域の割合としてのクローディン陽性領域の定量化を示す。報告されるデータは、平均±ＳＥＭである（ｎ＝１０匹のマウス／条件）。＊、ｐ≦０．０５、＊＊、ｐ≦０．０１、＊＊＊、ｐ≦０．００１、＃＃、ｐ＝０．００１、＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、テューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において、有効量のステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを対象に投与することを含む、髄鞘再形成の促進を必要とする対象においてそれを行う方法が記載される。いくつかの実施形態では、本方法は、ＭＳなどの脱髄疾患を治療するためのものである。また、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの関連する組成物および使用についても記載する。さらに、ステロイドホルモン、平滑化アゴニスト、およびヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストを使用する組成物および方法が記載される。また、ステロイドホルモンおよびＳｍｏアゴニストを含む培地中で初代混合グリア細胞を培養することを伴う、増殖オリゴデンドログリア細胞を産生するインビトロ方法も記載する。ステロイドホルモンおよびＳｍｏアンタゴニストを含む培地中でオリゴデンドログリア細胞をインキュベートすることを伴う、オリゴデンドログリア細胞をミエリン産生細胞に分化させるインビトロ方法も記載される。
【００２０】
本明細書で使用される技術的および科学的用語は、別途定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の説明および実施例において参照される材料、試薬などは、特記しない限り、商業的供給源から入手可能である。
【００２１】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数形のみを示すように明示的に述べられていない限り、単数形および複数形の両方を示す。
【００２２】
「約」という用語は、理解される数が本明細書に記載される正確な数に限定されず、本発明の範囲から逸脱することなく、実質的におおよその列挙された数を指すことが意図されることを意味する。本明細書で使用される場合、「約」は、当業者によって理解され、使用される文脈に応じてある程度変動する。当業者に明確ではない用語が使用されている場合、使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「平滑化」または「Ｓｍｏ」は、活性化されると、細胞内小胞の膜または原形質膜に主に位置する７−膜貫通型ＧＰＣＲ様受容体である。Ｓｍｏは、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）シグナル伝達経路の構成成分である。Ｓｈｈ経路は、胚発生中のオリゴデンドロサイトの発生を制御するように作用する。例えば、Ｔｒａｉｆｆｏｒｔ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｅｄｇｅｈｏｇ：Ａ  ｋｅｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ，”Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４：２８（２０１６）、Ｆｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｉｆｆｏｒｔ，“Ｈｅｄｇｅｈｏｇ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐａｔｈｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｓｈａｐｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ，”Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２１：３５６−７１（２０１５）を参照されたい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトを含む、脱髄疾患または状態の治療を必要とする、または髄鞘再形成の促進を必要とする任意の哺乳動物を意味する。例えば、対象は、脱髄疾患または状態に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある可能性がある。
【００２５】
本明細書で使用される「投与する」という用語は、本明細書に開示される薬剤の別の直接投与、自己投与、および薬剤の投与の処方または指示を含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「有効量」および「治療有効量」という句は、それぞれ、活性薬剤がこのような治療を必要とする対象に投与される特定の薬理学的効果を提供する、対象におけるその活性薬剤の投薬量または血漿濃度を意味する。このような投薬量が当業者によって有効量であるとみなされるとしても、活性薬剤の有効量は、本明細書に記載される状態／疾患の治療において常に有効であるとは限らないことが強調される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と共に製剤化された１つ以上の活性薬剤を指す。
【００２８】
「医薬的に許容される」という句は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を伴わず、合理的な利益／リスク比に見合った、インビボでの使用に好適である、それらの化合物、材料、組成物、および／または投薬形を指すように使用される。
【００２９】
髄鞘再形成を促進する方法
本明細書に記載の方法は、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータでの治療が、オリゴデンドロサイトおよびミエリン産生細胞の数を劇的に増加させるという驚くべき発見に基づいている。ステロイドホルモンのみまたはヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータのみを使用する療法が開示されているが（例えば、Ｅｌ−Ｅｔｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｆｏｒ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ，”Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ６８：４７−５１（２０１１）、Ｂｉｅｌｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１３：１４８２９−１４８３４（２０１６）、Ｓａｍａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｉ１  ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  １５：４４８−５２（２０１５）；ＵＳ  ２０１５／００１１６１０、Ｆｅｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３３：１７５９−７２（２０１３）を参照されたい）、本発明者らは、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータと一緒にステロイドホルモンを使用すると、オリゴデンドロサイトおよびミエリン産生細胞の産生を相乗的に増強し、髄鞘再形成の促進を改善し、脱髄疾患により効果的な治療を提供することにつながることを見出した。
【００３０】
これに関して、本発明者らは、オリゴデンドロサイトの初期発生中に、Ｓｈｈシグナル伝達構成成分およびアンドロゲン受容体の重複する発現パターンを発見した。実施例１、図１を参照されたい。これらの発現パターンは、髄鞘形成プロセス中のＳｈｈシグナル伝達とステロイドホルモンとの間の機能的相互作用の最初の実証と一致しているように思われた。実際、本発明者らは、アンドロゲン（テストステロンなど）での治療が、Ｓｍｏアゴニストの不在下と比較して、Ｓｍｏアゴニストの存在下でオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖をより高いレベルで促進することができることを発見した。さらに、Ｓｍｏアンタゴニストおよびテストステロンの併用により、ミエリン産生細胞の分化が相乗的に促進されることがわかった。実施例１、図２、および実施例１、図３を参照されたい。これらの結果は、本明細書に記載の方法を支持する。
【００３１】
本発明者らはまた、驚くべきことに、ミエリン修復との関連で、以下に報告される実施例で示されるように、Ｓｍｏアゴニストがミクログリア活性化における早熟スイッチを再生促進表現型へと促進し、ステロイドホルモン（テストステロンなど）と相乗的に作用して髄鞘再形成を促進することができることも発見した。これらの結果も、本明細書に記載の方法を支持する。
ステロイドホルモン
【００３２】
本明細書に記載の組成物および方法に有用なステロイドホルモンには、プロゲストーゲン、エストロゲン、およびアンドロゲンファミリーのステロイドホルモン、合成ステロイドホルモン、および選択的ホルモン受容体モジュレータが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンは、アンドロゲン受容体リガンド（例えば、アンドロゲン）である。アンドロゲンは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の結合および活性化を介してその効果を媒介するステロイドホルモン群である。本明細書で使用される場合、アンドロゲンには、テストステロンおよびジヒドロテストステロンが含まれる。特定の実施形態では、ステロイドホルモンは、アンドロゲンテストステロンである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンは、プロゲストーゲンである。プロゲストーゲンは、プロゲストーゲン受容体（ＰＲ）の結合および活性化を介してその効果を媒介するステロイドホルモン群である。いくつかの特定の実施形態では、プロゲストーゲンは、プロゲステロンまたはアロプレグナノロンであり、これは、プロゲステロンに由来し、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体を活性化する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンは、エストロゲン受容体リガンド（例えば、エストロゲン）である。エストロゲンは、エストロゲン受容体（ＥＲ）の結合および活性化を介してその効果を媒介するステロイドホルモン群である。本明細書で使用される場合、エストロゲンには、エストラジオールが含まれる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンは、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）である。ＤＨＥＡは、アンドロゲン性およびエストロゲン性の両方のステロイドの前駆体として機能する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンは、合成ステロイドである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、選択的ホルモン受容体モジュレータは、本明細書に記載の方法において「ステロイドホルモン」として使用される。選択的ホルモン受容体モジュレータは、ステロイドホルモンと同様に機能するが、一般的にステロイド自体よりも選択的である。本明細書で使用される場合、「選択的ホルモン受容体モジュレータ」には、選択的アンドロゲン受容体モジュレータ、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、および選択的プロゲステロン受容体モジュレータが含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ
本明細書に記載の組成物および方法に有用なヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータには、Ｓｈｈシグナル伝達を増加させるＳｍｏアゴニストおよびＳｈｈシグナル伝達を減少させるＳｍｏアンタゴニスト、ならびにＧｌｉアンタゴニストが含まれる。
【００４０】
したがって、いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、平滑化（Ｓｍｏ）アゴニストである。Ｓｍｏアゴニストは、Ｓｍｏ受容体と相互作用して、下流のＧｌｉ転写因子を活性化する。例えば、Ｈａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｇｏｎｉｓｍ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”Ｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：２７−３７（２０１４）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１４０７１−１４０７６（２００２）を参照されたい。平滑化アゴニストの例としては、３−クロロ−Ｎ−［トランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［［３−（４−ピリジニル）フェニル］メチル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド（ＳＡＧ）、３−クロロ−４，７−ジフルオロ−Ｎ−（４−（メチルアミノ）シクロヘキシル）−Ｎ−（３−（ピリジン−４−イル）ベンジル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド（Ｈｈ  Ａｇ−１．５）、グルココルチコイド、９Ｈ−プリン−６−アミン、９−シクロヘキシル−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−（１−ナフタレニルオキシ）（プルモルファミン）、プロピル４−（１−ヘキシル−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド）ベンゾエート（ＧＳＡ−１０）、コレステロール、および骨形成性（１Ｈ）−キノロン系化合物、例えば、ＧＳＡ−１０様化合物２０および２５が挙げられる（Ｍａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２１：７４７−７５７（２０１６））。特定の実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、Ｓｍｏアゴニスト３−クロロ−Ｎ−［トランス−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［［３−（４−ピリジニル）フェニル］メチル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド（ＳＡＧ）である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、Ｇｌｉアンタゴニストである。Ｇｌｉアンタゴニストには、Ｌａｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＬＩ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４：８４５５−６０（２００７）に開示される、２，２’−［［ジヒドロ−２−（４−ピリジニル）−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−ピリミジンジイル］ビス（メチレン）］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンゼンアミン（ＧＡＮＴ６１）および２，３，４，５−テトラ（４−ピリジル）チオフェン、４，４‘，４’’，４’‘‘−チエン−２，３，４，５−テトライルテトラピリジン（ＧＡＮＴ５８）などの小分子Ｇｌｉ１アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。ＧＡＮＴ６１およびＧＡＮＴ５８はどちらも核内でＧｌｉ機能を阻害するように作用すると考えられており、ＧＡＮＴ６１は、Ｇｌｉ１のＤＮＡ結合を妨げると考えられている。特定の実施形態では、ヘッジホッグモジュレータは、ＧｌｉアンタゴニストＧＡＮＴ６１である。
【００４２】
他のヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチレン）−アミン（ＳＡＮＴ−１）、Ｎ−［３−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−４−クロロフェニル］−３，４，５−トリエトキシベンズアミドＳＡＮＴ−２、および（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチレン）−アミン（ＳＡＮＴ−３）、および以下の構造を有するＳＡＮＴ−４を含む、Ｃｈｅｎ（２００２）（上記）およびＲｉｍｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ａｎｄ  Ｇｌｉ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，”Ｃａｎｃｅｒｓ  ８：ｐｉｉ：Ｅ２２（２０１６）に開示されるものなどのＳｍｏアンタゴニストである。
【化１】
2021510372.tif 000003
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＳｍｏアゴニストおよびＧｌｉアンタゴニストの両方がヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータとして使用される。すなわち、いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、ＳｍｏアゴニストおよびＧｌｉアンタゴニストの両方を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ステロイドホルモン、Ｓｍｏアゴニスト、およびＧｌｉアンタゴニストが、本明細書に記載されるように使用または投与される。
【００４４】
医薬組成物
ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、別々の組成物で（実質的に同時にまたは順次）投与され得るか、またはそれらは同じ組成物で投与され得る。
【００４５】
本組成物（複数可）は、任意の投与経路用に製剤化された、ステロイドホルモンおよび／またはヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータを投与するために好適な任意の医薬組成物であり得る。好適な投与経路には、例えば、筋肉内、皮下、および髄内注射、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、心臓内、例えば、右もしくは左心室腔、総冠動脈、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む、経口、直腸、経粘膜、特に鼻腔内、腸内または非経口送達が含まれ得る。いくつかの実施形態は、経口投与を伴う。いくつかの実施形態は、鼻腔内投与を伴う。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンおよび／またはヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、鼻腔内医薬組成物に製剤化される。本明細書で使用される場合、「鼻腔内組成物」は、鼻腔内送達に好適な、またはそれに適合された組成物を意味する。このような実施形態は、ステロイドホルモンおよび／またはヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの増強された取り込みを提供し得る。
【００４７】
テストステロンの例示的なオレオゲル型鼻腔内医薬組成物は、例えば、米国特許第８，５７４，６２２号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路の一方または両方は、米国特許第８，５７４，６２２号に記載されている鼻腔内医薬組成物、例えば、活性薬剤（複数可）を含み、（ａ）製剤の約６０重量％〜約９８重量％の量で存在する少なくとも１つの親油性もしくは部分的に親油性の担体と、（ｂ）製剤の約１重量％〜約２０重量％の量で存在する表面張力低下活性を有する少なくとも１つの化合物と、（ｃ）製剤の約０．５重量％〜約１０重量％の量で存在する少なくとも１つの粘度調整剤と、をさらに含む組成物に製剤化される。
【００４８】
このようなオレオゲルの実施形態では、親油性または部分的に親油性の担体は、油、例えば、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、大豆油、ごま油、もしくはピーナッツ油などの植物油などの経鼻用医薬組成物の担体もしくはビヒクルとして好適な任意のこのような担体、または親油性もしくは部分的に親油性である以下で考察される任意のビヒクル、または任意の他の好適な親油性もしくは部分的に親油性の担体であり得る。
【００４９】
このようなオレオゲルの実施形態では、表面張力低下活性を有する化合物（複数可）は、レシチン、多価アルコールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチルソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル、スクロースの脂肪酸エステル、ポリグリセロールの脂肪酸エステルなどの１つ以上の界面活性剤、および／またはソルビトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、およびマクロゴールグリセロール脂肪酸エステルなどの１つ以上の保湿剤、または１つ以上のオレオイルマクロゴールグリセリド（ＬＡＢＲＡＦＩＬ（登録商標）Ｍ  １９４４  ＣＳなど、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手可能）、または以下で考察される任意の界面活性剤、または任意の他の好適な界面活性剤であり得る。
【００５０】
このようなオレオゲルの実施形態では、粘度調整剤（複数可）は、セルロースおよびセルロース誘導体、多糖類、カルボマー、ポリビニルアルコール、ポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、セチルアルコール、ステアリン酸、蜜蝋、ワセリン、トリグリセリド、およびラノリンなどの増粘剤およびゲル化剤、または以下で考察される任意の粘度調整剤、または任意の他の好適な界面活性剤から選択される１つ以上であり得る。
【００５１】
他の例示的な鼻腔内医薬組成物には、米国特許出願第１５／６１２，４５４号に記載されているものが含まれ、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。米国特許出願第１５／６１２，４５４号は、活性薬剤が多孔性剤に積載されている鼻腔内医薬組成物を記載している。したがって、いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方が、多孔性剤を含む組成物などの米国特許出願第１５／６１２，４５４号に記載される鼻腔内医薬組成物に製剤化され、ステロイドホルモンおよび／またはヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、多孔性剤の細孔内に位置する多孔性剤の表面に積載される。ＵＳ１５／６１２，４５４に記載されるように、活性薬剤を積載した多孔性剤は、それ自体、米国特許第８，５７４，６２２号に記載されるようなオレオゲル組成物に製剤化され得る。
【００５２】
このような多孔性剤の実施形態では、多孔性剤は、コロイド状二酸化ケイ素、マイクロ多孔性二酸化ケイ素、メソ多孔性二酸化ケイ素、マクロ多孔性二酸化ケイ素、ポリオルガノシロキサン、医薬用粘土、二酸化ケイ素ナノチューブ、二酸化ケイ素ゲル、マグネシウムアルモシリケート（限定されないが、Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＬＬＣのＶＥＥＧＵＭ（登録商標）など）、活性炭、無水リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、およびそれらの任意の２つ以上の組み合わせなどの無機多孔性材料を含む。例示的な無機多孔性材料には、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．のＳＹＬＯＩＤ（登録商標）商標で市販されている多孔性二酸化ケイ素（限定されないが、ＳＹＬＯＩＤ（登録商標）２４４ＦＰ、７２ＦＰ、ＸＤＰ６０３５（ＳＩＬＳＯＬ（商標）６０３５としても知られる）、ＸＤＰ３０５０、ＸＤＰ３１５０、ＡＬ−１ＦＰ、およびそれらの任意の２つ以上の組み合わせ）、Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．のＡＥＲＯＰＥＲＬ（登録商標）商標で入手可能な多孔性二酸化ケイ素（限定されないが、ＡＥＲＯＰＥＲＬ（登録商標）３００（表面積約２６０〜３２０ｍ2／ｇ（約３００ｍ2／ｇなど）、細孔容積約１．５〜１．９ｍｌ／ｇ、および平均粒径約２０〜約６０μｍを有する）など）、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの二酸化ケイ素ＰＡＲＴＥＣＫ（登録商標）ＳＬＣ、Ｆｕｊｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＩｎｄｕｓｔｒｙのＮＥＵＳＩＬＩＮ（登録商標）（合成の非晶形のメタケイ酸アルミン酸マグネシウム）、Ｚｅｏｌｉｔｅ  Ｓｏｃｏｎｙ  Ｍｏｂｉｌ−５、Ｍｏｂｉｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｔｅｒ  Ｎｏ．４１、ＳＢＡ−１５、ＦＤＵ−１１、ＯＭＳ−７、ＯＭＳ−Ｌｅｍｏｎ−７、およびＩＩＴＭ−５６が含まれる。いくつかの実施形態では、多孔性剤は、例えば、表面に化学的に結合される基に応じて、疎水性または親水性であり得るシリコン系粉末を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、多孔性剤は、金属有機構造体（ＭＯＦ）など有機−無機ハイブリッドを含む。例示的なハイブリッド材料は、多座性架橋配位子および金属連結点の自己組織化によって形成することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、多孔性剤は、マイクロ多孔性有機ポリマー、ポリスチレン、セルロース、および／またはポリ（メタクリル酸メチル）などの有機ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、マイクロ多孔性有機ポリマーは、炭素−炭素結合反応により形成され、炭素、水素、酸素、窒素、および／またはホウ素などの非金属元素で構成される。いくつかの実施形態では、有機ポリマーは、犠牲ＳｉＯ2コアのエマルジョン重合および超架橋、続いて化学エッチングによって生成される。いくつかの実施形態では、有機ポリマーのネットワークは、小有機ビルディングブロックから構築される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、多孔性剤は、イオン交換樹脂（限定されないが、架橋ポリスチレンなど）または吸着体（限定されないが、β−シクロデキストリン系多孔性シリカ、α−シクロデキストリン系多孔性シリカ、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン系多孔性シリカ、および他の吸着体樹脂をベースとする多孔性材料）などの錯化剤をベースとする多孔性材料を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、多孔性剤の表面（内部細孔表面を含む）を官能化して、活性薬剤（複数可）に結合させ、かつ／またはある特定の時間量の後または刺激に応答して活性薬剤（複数可）の放出を制御する。
【００５７】
活性薬剤を積載した多孔性剤は、経鼻用医薬組成物のビヒクルとして好適な任意のビヒクルに製剤化され得る。いくつかの実施形態では、多孔性剤のビヒクルは、親水性ビヒクルである。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、１つ以上の脂肪、油、ワックス、リン脂質、ステロイド（例えば、コレステロール）、スフィンゴ脂質、セラミド、スフィンゴシン、プロスタグランジン、および／または脂肪−油ビタミンを含むビヒクルなどの親油性または部分親油性ビヒクルである。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、植物油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、大豆油、ごま油、またはピーナッツ油などの油または油の混合物；オレイン酸エチルおよびオレイン酸オレイル、ミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸エステル；中鎖トリグリセリド；脂肪酸のグリセロールエステル；ポリエチレングリコール；リン脂質；白色軟パラフィン；またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む。
【００５８】
ビヒクルは、経鼻投与のための所望の特性、所望の物理的特性、所望の放出特性、所望の薬物動態などを提供するのに有効な量などの任意の好適な量で存在し得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、組成物の総重量に基づいて、約１５重量％〜約９８重量％、約３０重量％〜約９８重量％、約５０重量％〜約９５重量％、約７５重量％〜約９５重量％、約８０重量％、または約９０重量％の量でビヒクルを含む。いくつかの実施形態では、本組成物は、組成物の総重量に基づいて、１５重量％〜９８重量％、３０重量％〜９８重量％、５０重量％〜９５重量％、７５重量％〜９５重量％、８０重量％、または９０重量％の量でビヒクルを含む。
【００５９】
活性薬剤を積載した多孔性剤は、表面低下活性を有する１つ以上の化合物、例えば界面活性剤と共に製剤化されてもよい。界面活性剤は、存在する場合、経鼻用医薬組成物において界面活性剤としての使用に好適な任意の界面活性剤であり得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、限定されないが、レシチン、多価アルコールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル、スクロースの脂肪酸エステル、ポリグリセロールの脂肪酸エステル、オレオイルポリオキシルグリセリド（限定されないが、杏仁油ＰＥＧ−６−エステルなど）、オレオイルマクロゴールグリセリド、および／またはソルビトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、マクロゴールグリセロール脂肪酸エステルなどの保湿剤、およびそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む、アニオン性、カチオン性、両性、および非イオン性界面活性剤から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、オレオイルマクロゴールグリセリド（ＬＡＢＲＡＦＩＬ（登録商標）Ｍ  １９４４  ＣＳ（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ，Ｓａｉｎｔ−Ｐｒｉｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅ））またはオレオイルマクロゴールグリセリドの混合物を含む。
【００６０】
活性薬剤を積載した多孔性剤は、経鼻用医薬組成物における粘度調整剤としての使用に好適な任意の粘度調整剤であり得る１つ以上の粘度調整剤と共に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、粘度調整剤は、メソ多孔性シリカ（活性薬剤が積載されているか、または積載されていない場合がある）を含む。いくつかの実施形態では、粘度調整剤は、セルロース、セルロース含有物質、多糖、カルボマー、ポリビニルアルコール、ポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、セチルアルコール、ステアリン酸、蜜ロウ、ペトロラタム、トリグリセリド、ラノリン、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、粘度調整剤は、コロイド状二酸化ケイ素（限定されないが、ＡＥＲＯＳＩＬ（登録商標）２００（Ｅｖｏｎｉｋ）および／またはＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）など）を含む。いくつかの実施形態では、粘度調整剤は、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．のＳＹＬＯＤＥＮＴ（登録商標）（圧縮かさ密度約１１０ｋｇ／ｍ3、比表面積約１９０ｍ2／ｇ、および平均粒径約１８μｍを有する沈降シリカ）またはＳＹＬＯＢＬＡＮＣ（登録商標）シリカ（細孔容積約１．６ｍｌ／ｇおよび平均粒径約３μｍを有する多孔性シリカゲル）などの合成シリカを含む。いくつかの実施形態では、粘度調整剤は、ＡＥＲＯＳＩＬ（登録商標）２００などの親水性ヒュームドシリカ、および／またはＡＥＲＯＳＩＬ（登録商標）Ｒ９７２（ジメチルジクロロシランで処理された後のヒュームドシリカであり、表面積約９０〜約１３０ｍ2／ｇを有する）などの親油性二酸化ケイ素を含む。理論に拘束されるものではないが、親水性ヒュームドシリカを使用して、他の粘度調整剤で生成された同等のゲルと比較して高温安定性を有するチキソトロピーゲル組成物を調製することができると考えられる。
【００６１】
粘度調整剤は、存在する場合、組成物の粘度を所望のレベルに調整するのに有効な量で存在し得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、組成物の総重量に基づいて、約０．５〜約２０重量％、約０．５〜約１０重量％、約０．５〜約７重量％、約１〜約４重量％、約４重量％、または約２重量％の粘度調整剤を含む。いくつかの実施形態では、本組成物は、組成物の総重量に基づいて、０．５〜２０重量％、０．５〜１０重量％、０．５〜７重量％、１〜４重量％、４重量％、または２重量％の粘度調整剤を含む。
【００６２】
使用される特定の製剤に関係なく、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、片方または両方の鼻孔への投与に好適な組成物の容量、経口投与に好適な容量、または静脈内、皮下、もしくは筋肉内投与に好適な容量など、投与経路に好適な用量で、治療有効量の活性薬剤を提供するように製剤化される。
【００６３】
使用方法
上記のように、本明細書に記載の方法および使用によれば、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、髄鞘再形成の促進を必要とする対象および／または脱髄疾患または状態の治療を必要とする対象などの、それを必要とする対象に投与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、またはラットなどの任意の哺乳動物であってよい。
【００６４】
脱髄疾患は、中枢神経系に影響を与える疾患と、末梢神経系に影響を与える疾患とに分けることができ、これらは異なる脱髄状態を示す。いくつかの実施形態では、対象は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、デビック病、炎症性脱髄疾患、中枢神経系神経障害、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄症、脊髄癆、梅毒性脊髄症、白質脳症（進行性多巣性白質脳症を含む）、白質萎縮症、およびアルツハイマー病などのＣＮＳの脱髄疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、抗ミエリン関連糖タンパク質末梢神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、圧迫性麻痺に易罹病性の遺伝性神経障害、末梢神経障害、脊髄症、視神経症、および進行性炎症性神経障害などの末消神経系の脱髄疾患に罹患している。
【００６５】
上記のように、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、別々の組成物で（実質的に同時にまたは任意の順序で順次）投与され得るか、または同じ組成物で投与され得る。また上記のように、任意の実施形態では、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、鼻腔内、経口、静脈内、皮下、および筋肉内を含む任意の好適な投与経路によって投与され得る。ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータが異なる組成物で投与される場合、それらは、経口または鼻腔内などの同じまたは異なる投与経路によって投与され得る。特定の実施形態では、ステロイドホルモンは、経口または鼻腔内投与される。独立して、特定の実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、経口または鼻腔内投与される。
【００６６】
また上記のように、ステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータは、髄鞘再形成を促進するのに有効な量で投与される。本明細書で使用される場合、「髄鞘再形成」という用語は、新たなミエリン鞘の生成を指す。髄鞘再形成は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して白質の質量を測定することにより、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）の脳スキャンを使用してミエリン線維の厚さを測定することにより、または任意の他の直接的な手段（例えば、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、拡散強調画像法（ＤＷ−Ｉ、またはＤＷ−ＭＲＩ）、拡散テンソル画像、脊髄造影、磁化移動など）などの、対象のミエリンの状態を直接決定するなどの方法で評価することができる。さらにまたはあるいは、髄鞘再形成は、患者に存在する炎症性病変（すなわち、硬化症）の大きさまたは数の減少を検出し、例えば、（ｉ）ミエリンの小さな断片などの異常なタンパク質、（ｉｉ）リンパ球のレベルもしくは特定の種類の上昇、および／または（ｉｉｉ）免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子の異常なレベルの存在もしくは量の減少について患者の脳脊髄液（例えば、腰椎穿刺によって得ることができる）を監視する；神経心理学におけるポジティブな変化（例えば、記憶力、算術、注意力、判断力、および推論などのさまざまな能力の状態）について患者を監視する；かつ／あるいはミエリン塩基性タンパク質様物質（ＭＢＰＬＭ）のレベルの減少について患者の尿を監視することによって評価することができる。これらの方法論のうちのいずれか１つ以上を使用して、髄鞘再形成が評価され得るか、または代替の方法が使用され得る。本明細書に記載の方法は、髄鞘再形成を評価するためのこれらまたは他の特定の方法論によって限定されない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンはテストステロンであり、約０．１〜約０．３ｍｇ／日（約０．２ｍｇ／日を含む）を含む、約０．０５〜約０．５ｍｇ／日の用量で投与される。異なるアンドロゲン受容体リガンドを使用する実施形態では、対応するモル量のアンドロゲン受容体リガンドを使用することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータはＳＡＧであり、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ（１５ｍｇ／ｋｇを含む）を含む、約５〜約２５ｍｇ／対象のｋｇ体重の用量で投与される。異なるＳｍｏアゴニストを使用する実施形態では、対応するモル量のＳｍｏアゴニストを使用することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータはＧＡＮＴ−６１であり、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ（約１５ｍｇ／ｋｇを含む）を含む、約５〜約２５ｍｇ／対象のｋｇ体重の用量で投与される。異なるヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストを使用する実施形態では、対応するモル量のヘッジホッグシグナル伝達経路アンタゴニストを使用することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、投与されるステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの一方または両方の量は、他方の髄鞘再形成促進活性を増強するのに有効である。したがって、いくつかの実施形態では、所与の量のヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータと共に投与されるステロイドホルモンの量は、同量のヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータ単独の場合よりも髄鞘再形成を促進するのに有効である。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、所与の量のステロイドホルモンと共に投与されるヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの量は、同量のステロイドホルモン単独よりも髄鞘再形成を促進するのに有効である。
【００７１】
上記のように、髄鞘再形成の促進を必要とする対象においてそれを行う方法に使用するため、または脱髄疾患もしくは状態を治療するための、本明細書に記載されるステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータも提供される。
【００７２】
上で考察されるように、髄鞘再形成の促進を必要とする対象においてそれを行う方法に使用するため、または脱髄疾患もしくは状態を治療するための、本明細書に記載される薬剤の調製における、本明細書に記載されるステロイドホルモンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレータの使用も提供される。
【００７３】
上記および実施例に示されるように、本発明者らは、ステロイドホルモン（テストステロンなど）およびＳｍｏアゴニスト（ＳＡＧなど）を使用することにより、オリゴデンドロサイトの産生が相乗的に促進され、実験モデルにおける自己免疫性脳脊髄炎の経過が緩和されることを見出した。さらに、ステロイドホルモン（テストステロンなど）およびＧｌｉアンタゴニスト（ＧＡＮＴ６１など）を使用することにより、ミエリン産生細胞の産生が相乗的に促進され得る。
【００７４】
以下の実施例は本発明を図示するために提供されるが、本発明はこれらの実施例の特定の条件または詳細に限定されないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００７５】
材料および方法
動物の取り扱い。野生型の性腺的に無傷または去勢されたオスのＣ５７Ｂｌ／６のマウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ（フランス）から８〜１２週齢で購入した。インビトロ実験では、同腹仔を、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した、適時交配されたＣ５７Ｂｌ／６のメスから得たか、社内で飼育し、Ｗｅｎｄｙ  Ｍａｃｋｌｉｎ博士（コロラド大学、アメリカ）から得たＰｌｐ−ＥＧＦＰマウスと交配させた。Ｍａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：８７６−８８５（２００２）を参照されたい。すべての動物を、食物および水を自由に与えて１２時間の明暗サイクルを含む標準的な条件下で収容した。すべての手順は、実験動物の管理と使用に関する欧州共同体理事会指令（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）（８６／８０６／ＥＥＣ）に従って行われ、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ＣＥＥＡ２６、Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ  ｄｅ  ｌ’Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ、ｄｅ  ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｅｍｅｎｔ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅによって承認された。
【００７６】
活性薬剤製剤の調製。使用されたＳｍｏアゴニスト（ＳＡＧ）およびアンタゴニスト（ＳＡＮＴ）は、Ｄ＆Ｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（中国）から購入した、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１４０７１−１４０７６（２００２）に記載のものであった。（ＳＡＧ、製品番号：ＤＣ−８２２５；ＳＡＮＴ−１、製品番号ＤＣ−８３２７）活性薬剤をジメチルスルホキシド（１０ｍＭ）に溶解し、その後、培養培地または０．９％のＮａＣｌのいずれかで希釈して、適切な濃度にした。テストステロンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（フランス）によって提供された。テストステロンをごま油（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、その後、希釈して所望のステロイドホルモン濃度を得た。
【００７７】
免疫染色実験。免疫染色に使用された一次抗体は次のとおりであった：オリゴデンドサイト（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｃｙｔｅ）転写因子２（Ｏｌｉｇ２）（ウサギ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；マウス、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、（ウサギ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；抗ＮＧ２（ウサギ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；大腸ポリポーシス（Ａｄｅｎｏｍａｔｕｓ  Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  Ｃｏｌｉ）（ＡＰＣ／ＣＣ１）（マウス、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＢｒｄＵ抗体（ラット、Ａｂｃａｍ）；グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、（ウサギ、Ｄａｋｏ；マウス、Ｓｉｇｍａ）；イオン化カルシウム結合アダプタ分子１（Ｉｂａ１、ウサギ、Ｗａｋｏ）；アルギナーゼ−１（ヤギ、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）、プロトリピドタンパク質（ＰＬＰ）、（マウス、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）（マウス、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；ニューロフィラメント２００（ＮＦ２００）、（ニワトリ、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ）；Ｋｉ６７（マウスモノクローナル；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。使用された二次抗体は、コンジュゲートされたヤギ抗ウサギシアニン３（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）；ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８、抗ウサギＡｌｅｘａ  ６３３、抗ニワトリＡｌｅｘａ  ５４６；ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ  ５４６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。
【００７８】
画像の取得および分析。顕微鏡分析システムＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ４．２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、共焦点Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０−Ｍｅｔａ  Ｃｏｎｆｏｃｏｒ  ２、およびＣａｓｅＶｉｅｗｅｒソフトウェアを備えたスキャナイメージャを使用して画像を撮影した。分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行われた。少なくとも１０個の切片／マウスを分析し、データは３〜５匹のマウスの平均である。リゾレシチン（ＬＰＣ）を注射した動物に由来する脳の場合、免疫蛍光陽性細胞または領域が、マウスごとに脱髄病変全体を通して５つの切片ごとの１つにおいて決定され、各動物の平均がとられた。病変表面は、脱髄病変全体を通して５つのスライスごとに１つの核緻密化（ＭＢＰまたはＰＬＰ染色によって可視化されたミエリン喪失と相関する）の領域を測定することによって決定された。
【００７９】
電子顕微鏡法。Ｇａｔａｎデジタルカメラを搭載した透過型電子顕微鏡（１０１１  ＪＥＯＬ）を使用して、腰髄の超薄切片を調べた。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して各軸索の最小および最大軸索径ならびに線維径を測定することにより、ｇ比（ミエリン鞘に対応する軸索径と線維径の比率＋軸索径）を推定した。無作為に選択された少なくとも３００個の髄鞘形成された軸索を各動物について評価した。
【００８０】
ＲＴ−ｑＰＣＲ分析。性別および年齢ごとに少なくとも４匹の動物を断頭により屠殺した。背側終脳を解剖し、さらなる処理のために液体窒素で凍結した。Ｔｒｉｚｏｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、逆転写を行った。ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲを実行し、参照遺伝子ＧＡＰＤＨに正規化された７３００  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で遺伝子発現を分析した。ＴａｑＭａｎプローブは次のとおりである：ＧＡＰＤＨ、Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１；ＭＢＰ、Ｍｍ０１２６６４０２＿ｍ１；Ｓｈｈ、Ｍｍ００４３６５２８＿ｍ１；Ｇｌｉ１、Ｍｍ００４９４６５４；ＡＲ、Ｍｍ００４４２６８８。
【００８１】
統計分析。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表される。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．０を使用して行われた。一元配置ＡＮＯＶＡは、統計的有意性評価に使用した。有意水準は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【００８２】
実施例１：
ヘッジホッグとアンドロゲンシグナル伝達との間の機能的相互作用
生後初期の髄鞘形成中
本発明者らは、生後の終脳の髄鞘形成の初期の間におけるヘッジホッグ（Ｈｈ）とアンドロゲンシグナル伝達との間の機能的相互作用を同定した。これに関して、ミエリン塩基性タンパク質（Ｍｂｐ）、Ｈｈシグナル伝達構成成分（Ｓｈｈ、Ｇｌｉ１）、およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）をコードする転写物の発現プロファイルは、出生から生後１５日目（Ｐ１５）までのオスおよびメスのマウスの背側前脳を使用して研究した。この期間には、オリゴデンドロサイト新生の新生児波、生成されたオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＬＰ）の成熟、および背側前脳における髄鞘形成の生理学的プロセスが含まれる。Ｋｅｓｓａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９：１７３−１７９（２００６）。図１Ａに示すように、Ｍｂｐ転写は、Ｐ３で非常に低いレベルで検出され、その後、Ｐ８およびＰ１５でそれぞれ約１０倍および６０倍の増加を示した。図１Ｂに示すように、Ｓｈｈ  ｍＲＮＡは、わずかであるが、プラトーに達する前のＰ８まで有意に増加した。予想外に、図１Ｃに示すように、Ｇｌｉ１は、Ｐ０〜Ｐ１５で徐々に減少した。対照的に、図１Ｄに示すように、アンドロゲン受容体（ＡＲ）転写は、出生時に低レベルで検出されたが、Ｐ１５まで急激に増加し、オスおよびメスでそれぞれ１０〜２４倍高いレベルに達した。Ｓｈｈ、Ｇｌｉ１、およびＭｂｐの転写は、研究した時点で、動物の性別による有意差はなかった。対照的に、図１Ｄに示すように、ＡＲの発現は、出生時のメスと比較してオスで有意に高かったが、ＡＲは、Ｐ３およびＰ８で動物の性別に関係なく同等の様式で転写され、ＡＲ発現は、Ｐ１５でオスと比較して、メスで予想外にわずかであるが有意に高いレベルを示した。これらの結果は、アンドロゲンおよびヘッジホッグシグナル伝達経路が髄鞘形成プロセスを制御するために通信する可能性があることを示す。
【００８３】
ＳＡＧ＋Ｔは発生的髄鞘形成中のオリゴデンドロサイトの増殖を促進する
【００８４】
ＳＡＮＴ＋Ｔは、ミエリン産生オリゴデンドロサイトの分化を促進する
【００８５】
発生的髄鞘形成中
初代グリア細胞培養物は、Ｆｅｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｊｉｍｐｙ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ”，２４：８６５−８７７（２００１）に以前に記載されるように、新生（Ｐ１）のオスの仔マウスの背側終脳から調製した。簡潔に、髄膜を取り除き、背側終脳を顕微解剖し、１０％の仔ウシ血清、ペニシリン（５０  Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）を補充したＤＭＥＭにおいて機械的に分離した。細胞懸濁液を、３０μｇ／ｍｌのポリ−ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた０．５ｍｌの培養培地を含む２４ウェルプレートに蒔く。次に、アストロサイト、オリゴデンドロサイト（ＯＬ）、およびミクログリア細胞を含む培養物を、３７℃の加湿雰囲気（９０％）内で、５％のＣＯ２および９５％の空気中でインキュベートする。
【００８６】
インビトロでの５日目（ＤＩＶ）に、混合初代グリア細胞の培養培地を、（ｉ）ＳｍｏアゴニストＳＡＧ（０．１または１μＭ）、（ｉｉ）ＳＡＮＴ−１（０．１μＭ）、（ｉｉｉ）テストステロン（Ｔ、１μＭ）、（ｉｖ）ＳＡＧ（０．１または１μＭ）、およびテストステロン（１μＭ）、（ｖ）ＳＡＮＴ−１（０．１μＭ）およびテストステロン（１μＭ）、または（ｖｉ）対照としての薬物担体のうちの１つを補充した新たな培地に交換した。補充された培養培地は、隔日で新たな溶液と交換された。１２ＤＩＶに、細胞を、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２０分間固定し、０．０２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理し、Ｓｅａ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間遮断した。
【００８７】
細胞を、ＢｒｄＵおよびＯｌｉｇ２について免疫染色した。免疫染色に関して、４℃で一次抗体と一晩インキュベートした後、続いてＰＢＳで３回洗浄し、細胞を適切な二次抗体と２時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、封入培地としてＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ，ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加した。画像は、上述のように免疫蛍光顕微鏡で取得した。（データ示さず）。Ｏｌｉｇ２＋ＢｒｄＵ＋の定量化は、各試験条件について３〜４つの独立した培養物を分析することにより評価され、これらの結果は図２Ａ〜２Ｂに報告される。
【００８８】
図２Ａは、培養終了の２時間前に増殖マーカーＢｒｄＵを取り込んだＯｌｉｇ２+細胞の定量化を示し、ＳＡＧ（０．１μＭ）およびテストステロン（１μＭ）との相乗効果を示す。図２Ａはまた、活性薬剤の不在下で、Ｏｌｉｇ２+ＢｒｄＵ+増殖グリア細胞が、Ｏｌｉｇ２+細胞の総数の２．０±０．４％を表し、一方で、増殖細胞の割合は、対照と比較して、ＳＡＧ（１μＭ）またはテストステロン（１μＭ）で有意に増加し、それぞれ、総Ｏｌｉｇ２細胞の８．４±０．５（ｐ＝６．９３Ｅ−０９）および３．８±０．６％（ｐ＝０．０４）に達したことを示す。
【００８９】
ミエリン産生細胞の分化を分析するために、初代混合グリア細胞は、Ｐｌｐ−ＥＧＰマウスに由来し、上述のように培養された。ＭＢＰを共発現するＰＬＰ＋細胞の検出は、Ｐｌｐ−ＥＧＰマウス由来の初代混合グリア細胞を使用し、Ｍｂｐについて免疫染色することにより行われた。上述のように免疫蛍光画像を取得し、ＭＢＰを共発現するＰＬＰ+細胞の数を評価した。図２Ｂは、初代混合グリア細胞に一緒に投与されたＳＡＮＴおよびテストステロンが、単独で使用された各活性薬剤によって誘導されたものよりも有意に高いレベルのＭＢＰ発現を誘導することを示す（ｐ＝０．００１）。免疫染色データ（示さず）は、テストステロン（１μＭ）およびＳＡＮＴ（０．１μＭ）が、Ｍｂｐを共発現するｐｌｐ+ＧＦＰ+細胞の数を非常に増加させることを明らかにする。ＳｍｏアゴニストＳＡＧ（０．１μＭまたは１μＭ）を単独で使用した場合、Ｍｂｐの発現は変化しなかった。しかしながら、両濃度のＳＡＧは、テストステロン媒介ＯＬの分化をわずかであるが有意に減少させた。注目すべきことに、テストステロンおよびＳＡＮＴ媒介分化作用は、薬物を併用した場合、相加的であるように思われる。ＳＡＮＴ（０．１μＭ）またはテストステロン（Ｔ、１μＭ）によるＳｍｏの阻害は、対照条件と比較して、ＭＢＰを共発現するＰＬＰ+細胞の割合において４倍の増加をもたらした（ＳＡＮＴ１については１２．４±０．８、ｐ＝６．０９Ｅ−０７およびテストステロンについては１１．７±１．５、ｐ＝０．０００５）。
【００９０】
図２Ｂは、ＳＡＮＴおよびテストステロンを併用した場合、対照と比較して、成熟ＯＬの割合に７倍の増加が観察されることを示す（２２．３±２．１対３．０±０．９；ｐ＝２．２２Ｅ−０６）。一方、ＳｍｏアゴニストＳＡＧ（０．１μＭまたは１μＭ）を単独で使用した場合、Ｍｂｐの発現は変化しなかった。しかしながら、両濃度のＳＡＧは、テストステロン媒介ＯＬの分化をわずかであるが有意に減少させた。注目すべきことに、テストステロンおよびＳＡＮＴ媒介分化作用は、薬物を併用した場合、相加的であるように思われる。理論に拘束されるものではないが、これらの結果は、ヘッジホッグシグナル伝達遮断がオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）のＭＢＰ＋髄鞘形成ＯＬへのテストステロン誘導性成熟を増強することを示唆する。
【００９１】
ＳＡＮＴ＋Ｔが発生的髄鞘形成中にミエリン産生オリゴデンドロサイトの分化を促進するかどうかをさらに調査するために、Ｐ３のオスの仔を、生後３日から１０日まで、隔日でＳＡＮＴおよび／またはテストステロンで皮下により処置した（ｎ＝３〜５匹の動物／群）。２０μｇ／仔体重ｇの濃度でＳＡＮＴを使用し、各投与に対して２０μｇでテストステロンを使用した。生後３日目から隔日で薬物を皮下注射した。Ｐ１０に、仔に深く麻酔をかけ、ＰＦＡ  ４％で灌流した。脳を取り出し、ＰＦＡ  ４％で１時間後固定し、３０％のスクロースに凍結保存した後、凍結し、クリオスタットで薄切にした（１４μｍ）。その後、脳スライスのＯｌｉｇ２、Ｏｌｉｇ２／ＡＰＣ、Ｏｌｉｇ２／ＰＤＧＦＲα、およびＭＢＰ／ＮＦ２００の免疫染色を、ＳｍｏアゴニストＳＡＧ、ＳｍｏアンタゴニストＳＡＮＴ、およびステロイドホルモンのテストステロン（Ｔ）で処置した生後１０日のオスの仔の脳室下帯および隣接する脳梁（ｃｃ）のレベルで行った。画像は、上述のように免疫蛍光顕微鏡で取得し（データは図示せず）、図３Ａ〜３Ｄに示すように、異なる細胞集団を定量化した。
【００９２】
図３Ｄは、テストステロンとＳＡＮＴ−１との併用治療が、Ｐ１０のオスの仔のミエリン鞘の産生を促進したことを示す。活性薬剤の不在下で、ＭＢＰ（髄鞘形成された領域）が占める領域は、ニューロフィラメントタンパク質ＮＦ２００を発現する軸索が占める全領域の６２．４±２．２％に相当した。図３Ｄを参照されたい。ＳＡＮＴまたはテストステロンの存在下で、髄鞘形成された領域の割合は、７５．１±４．３（ＳＡＮＴ）（ｐ＝０．０４）および７８．０±４．１％（Ｔ）（ｐ＝０．０１）の有意に高い値に達した。図３Ｄを参照されたい。ＳＡＮＴおよびテストステロンが同時に仔に注射された場合、髄鞘形成されたＮＦ２００+ＭＢＰ+軸索が占める領域は８８．９±２．７％に達し、ＳＡＮＴまたはテストステロン単独で得られた値よりも有意に大きかった（ｐ＝０．０３対ＳＡＮＴ、ｐ＝０．０５対テストステロン）。
【００９３】
したがって、これらのデータは、ヘッジホッグおよびアンドロゲンのシグナル伝達経路が、オリゴデンドロサイト前駆細胞産生の新生児波の間、およびこれらの細胞の髄鞘形成オリゴデンドロサイトへのその後の分化中に機能的に相互作用することを示す。
【００９４】
全体として、結果は、ＳＡＧおよびテストステロンの組み合わせはオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するが、ＳＡＧはこれらの細胞のミエリン産生オリゴデンドロサイトへのテストステロン誘導性成熟を阻害することを示す。
【００９５】
実施例２：
ＳＡＧによるＳｍｏの活性化は、脱髄のＬＰＣモデルにおける新たな成熟オリゴデンドロサイトの産生および再生促進ミクログリアの早熟な増加を促進する。
脱髄に対するＳｍｏアゴニストＳＡＧによるＳｍｏ活性化の効果を以下のように調査した。ＬＰＣ誘導脱髄は、若いオスの成体マウスにおいて、ＳＡＧの不在下または存在下で、Ｆｅｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３３：１７５９−１７７２（２０１３）に以前に記載されるように行われた。簡潔に、特に神経外科専用のハミルトンシリンジ（ＮＨ  ＢＩＯ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ＬＰＣ１％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む溶液２μｌを、ＳＡＧ（０．２μＭ）または対応するビヒクルと共に右脳梁に定位注射して、片側に脱髄病変を誘導した。注射は次の座標で（ブレグマに対して）行われた：前後（ＡＰ）＋１ｍｍ、外側＋１ｍｍ、背腹（ＤＶ）−２．２ｍｍ。深く麻酔したマウスから脳を取り出し、４％のＰＦＡを経心的に灌流した。組織を新たな４％のＰＦＡ溶液で４時間後固定した後、３０％のスクロースに凍結保存し、液体窒素で凍結し、クリオスタットで薄切にした（１４μｍ）。各治療条件の各時点で４〜５匹のマウスを使用した。病変後２日目および１０日目（ｄｐｌ）にマウスを屠殺し、ＰＤＧＦＲα、Ｏｌｉｇ２／ＡＰＣ、Ｋｉ６７／ＰＤＧＦＲα、ＧＦＡＰ、およびＩｂａ１／Ａｒｇ１の免疫染色のために調製した。免疫染色の画像は、免疫蛍光顕微鏡を使用して取得し（データ示さず）、結果は、ＰＤＧＦＲα（図４Ａ）、Ｏｌｉｇ２／ＡＰＣ（図４Ｂ）、Ｋｉ６７／ＰＤＧＦＲα（図４Ｃ）、ＧＦＡＰ（図４Ｄ）、Ｉｂａ１／Ａｒｇ１（図４Ｅ）について細胞の数／表面単位を評価することによって定量化された。
【００９６】
注目すべきことに、１０ｄｐｌで、ＳＡＧ処置動物は、対照と比較してＰＤＧＦＲα＋細胞が２倍に増加することがわかった（１２１±１１対６５±５、ｐ＝０．００８；図４Ａ）。さらに、Ｏｌｉｇ２＋ＡＰＣ＋成熟ＯＬの密度は、ＳＡＧの存在下で、対照条件よりも有意に高いことがわかった（８３±７対５９±１、ｐ＝０．０２７、図４Ｂ）。成熟ＯＬの割合は、ＳＡＧ処置動物と対照動物との間で有意差がないように思われたため、ＳＡＧはＯＰＣ分化を促進する可能性がないように思われる。
【００９７】
初期の時点（２ｄｐｌ）で、新たなＯＰＣが動員され始め、病変内で非常に増殖するが、組織はすでに高い炎症レベルを示す。ＳＡＧ処置は、対照条件と比較して、増殖Ｋｉ６７＋ＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣの密度の増加を引き起こすことがわかった（３９±２対２８±２、ｐ＝０．００７、図４Ｃ、左側のパネル）。興味深いことに、ＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣの総数は変化せず、ＳＡＧがＯＰＣを細胞周期に入るように誘導することを示した。図４Ｃ、右側のパネル。
【００９８】
炎症細胞への効果の可能性を調査するために、アストロサイトおよびミクログリアを同じ時点で分析した。ＧＦＡＰ＋アストロサイトが占める領域は、有意な様式ではないものの、ＳＡＧの存在下で減少する傾向にあった。図４Ｄを参照されたい。Ｉｂａ１＋ミクログリアは、ＳＡＧの存在によっても影響を受けないことがわかった。しかしながら、「再生促進」と呼ばれ、アルギナーゼ−１（Ａｒｇ１）の発現を特徴とするミクログリアの亜集団の密度は、ＳＡＧ処置マウスでは２倍増強されたことがわかった（１０３±７対５４±８、ｐ＝０．０３５、図４Ｅ、左側のパネル）。さらに、Ａｒｇ１を共発現するＩｂａ１ミクログリアの割合は、ＳＡＧの処置によって２倍増加した（５８±５対２５±２、ｐ＝０．０１７；図４Ｅ、右側のパネル）。これらの結果は、Ｓｍｏアゴニストによるヘッジホッグシグナル伝達の活性化が、活性化ミクログリアの再生促進能力を促進することを示す。
【００９９】
実施例３：
ＳＡＧ＋Ｔは実験的自己免疫性脳脊髄炎を緩和する。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の前に、９〜１０週齢の去勢したオスのマウスを馴化のために１週間維持した（ｎ＝１０匹の動物／条件）。病状は、提供者（Ｈｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）の指示に従って誘導された。簡潔に、マウスを、完全フロイントアジュバント中のＭＯＧ35-55ペプチド（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質／ＭＢＰ断片３５−５５）のエマルジョンを皮下注射し（各部位に前条件付け混合物０．１ｍｌを使用して２つの部位に）、続いて、同じ日（０日目）に、１回目のＰＢＳ中の百日咳毒素、および１日目に２回目（２５０ｎｇ／用量）を腹腔内注射することによって免疫化した。マウスを、免疫後７日目から３０日目まで、１日１回盲目的に次の尺度に従ってスコアリングした：０．０＝運動機能の明らかな変化なし；０．５＝尾の先端が下垂；１．０＝尾の下垂；１．５＝尾の下垂および後肢抑制；２．０＝尾の下垂および後肢の衰弱または頭部後屈の兆候；２．５＝尾の下垂および後肢の引きずり、または頭部後屈の兆候；３．０＝尾の下垂および後肢の完全麻痺または前肢片側と後肢片側の麻痺を伴う尾の下垂；３．５＝尾の下垂および後肢の完全麻痺、また動物は横にされた場合、自身で直立することができない；４．０＝尾の下垂、最小限の移動および摂食を伴う完全な後肢および部分的な前肢の麻痺；４．５＝完全な後肢および部分的な前肢の麻痺、ケージの周りの移動はなく、動物は警戒心がないように思われる；５．０＝動物の安楽死を必要とする極度の麻痺。
【０１００】
ＥＡＥの発症時間が類似し、発症スコアが類似した群を構成するために、ＥＡＥを発症したマウスを、無作為にビヒクル、ＳＡＧ、テストステロン、またはＳＡＧ＋テストステロン処置群に割り当てた（ｎ＝１０匹／群）。活性薬剤は、免疫化後３０日目まで臨床症状の発症時に投与された。テストステロンは、上述のようにオレオゲル組成物において鼻腔内経路（各鼻孔に２．５μｌの容量で０．２ｍｇ／日）を介して投与された。ＳＡＧは、隔日で経管栄養（１５μｇ／マウスのｇ体重）により経口投与された。
【０１０１】
動物をケタミンの過剰摂取により屠殺した。脊髄／椎骨を取り出し、腰髄／椎骨サンプルをさまざまな組織学的手順の要件に従って処理した。免疫染色のために、脊髄／椎骨の断片をＰＦＡ  ４％で２４時間後固定した。脊髄を脊柱から取り出し、エタノール／キシレン浴で処理し、パラフィンブロックに包埋した。その後、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して７μｍの切片を得、スライドガラス上で３７℃で一晩乾燥させた。電子顕微鏡法のために、脊髄／椎骨の断片をＰＦＡ  ２％およびグルタルアルデヒド２％の混合物に５日間後固定した。脊髄を脊柱から取り出し、カコジル酸緩衝液１％四酸化オスミウムで４℃で１時間、２％の酢酸ウラニルで室温で１時間後固定し、エタノールの系列希釈により脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。超薄切片は、飽和酢酸ウラニル溶液と対比させた。
【０１０２】
図５Ａは、各活性薬剤を別々に用いた処置と比較して、ＳＡＧおよびテストステロンの両方を用いた処置後に観察された、改善された臨床スコアを示す。１８〜１９日目に、３つの群の動物は、スコア１．０に達し、これは各処置の２１日目まで維持された。２１日目から３０日目までの間に、テストステロン処置動物は再発を示し、臨床スコアは２．０に近い値に達した。対照的に、ＳＡＧ処置された動物は、１．０の有意に低いスコアあたりで安定した。注目すべきことに、薬物の組み合わせは最低臨床スコアの０．５と１．０の間で変動し、これらの薬物を単独で使用する場合と比較して、ＳＡＧとテストステロンとの組み合わせによる臨床スコアの改善を示唆した。図５Ａを参照されたい。
【０１０３】
ＥＡＥの緩和に関与する機構を調査するために、各条件におけるＥＡＥ誘導３０日後にミエリンレベルおよび軸索病理を調べた。電子顕微鏡画像は、ＳＡＧおよびテストステロンを単独で、または組み合わせて処置した動物の脊髄には、はるかに高い密度の髄鞘形成された軸索があり、異常な構造はたまにしか観察されなかったことを示した。図５Ｂを参照されたい。次に、動物ごとの少なくとも３００個の小口径軸索（≦２．５μｍ）（各条件でｎ＝３）のｇ比（軸索径／髄鞘形成された線維の全外径）が決定され、図５Ｃに示されることを示す。対照ＥＡＥ動物に由来する脊髄では、ｇ比値（０．８３４±０．００４）は、テストステロン（０．７７３±０．００３、ｐ＜１０-10）、ＳＡＧ（０．７３７±０．００５、ｐ＜１０-10）、または薬物の組み合わせ（０．７４３±０．００５、ｐ＜１０-10）により処置された動物について決定された値よりも有意に高かった。興味深いことに、図５Ｃはさらに、ＳＡＧ単独で、またはテストステロンと組み合わせて投与すると、テストステロン単独よりもｇ比が大幅に低下することを示し（ｐ＜１０-5）、一方、ＳＡＧ単独の効果は、薬物の組み合わせによって誘導された効果と有意差はなかった。次に、異常構造の数（上述）を評価した。図５Ｄを参照されたい。高い割合の異常な軸索が、テストステロン（１５．８±１．４、ｐ＝０．０００４）、ＳＡＧ（１４．０±１．７、ｐ＝０．０００２）、またはＳＡＧ＋テストステロン（１１．８±２．６、ｐ＝０．０００１）処置マウスよりも、対照ＥＡＥ動物（３６．４±４．０）の脊髄において検出された。
【０１０４】
結論として、別々にまたは実質的に同時に投与されたＳＡＧおよびテストステロンは、ミエリンの再生および神経保護に関連する機能回復を促進する。
【０１０５】
併用処置で観察されたさまざまな効果は、ＳＡＧ単独の効果よりも高い傾向にあったため、ミクログリア細胞に対する活性薬剤の影響を調査した。ＥＡＥ動物の脊髄スライスをＩｂａ１抗体およびＡｒｇ１抗体で免疫染色し、これにより活性化ミクログリア全体およびその再生促進表現型をそれぞれ視覚化することができる。免疫蛍光顕微鏡を使用して画像を取得し（データ示さず）、活性化されたミクログリア領域を定量化し、図５Ｅ〜Ｆのヒストグラムとして視覚化した。対照ＥＡＥマウスは脊髄に存在する多量の活性化Ｉｂａ１+ミクログリアを有していたが、これらの細胞は、それらの再生促進表現型に極性化されなかったことがわかった。図５Ｅに示すように、テストステロンもＳＡＧも、脊髄の活性化ミクログリアの総密度を有意に変化させないことがわかった。しかしながら、図５Ｆに示すように、ＳＡＧ（１０．９±１．７、ｐ＝０．０３）ではなく、テストステロン（６．８±１．４）は、対照（４．８±０．５）と比較して、Ａｒｇ１＋抗炎症および再生促進表現型へとミクログリア極性化を促進した。予想外に、活性薬剤が同時に使用された場合、対照と比較して、活性化ミクログリアは、全体として崩壊し（１．８±０．２、ｐ＝０．０３、図５Ｆ）、組み合わせが病理学的ミクログリア活性化を解決するように思えることを示した。
【０１０６】
アストロサイトにおけるテストステロンおよびＳＡＧ単独または組み合わせの効果を評価するために、ＥＡＥ動物の脊髄もＧＦＡＰ抗体で免疫染色した。免疫蛍光顕微鏡画像で行われた定量化は、テストステロンおよびＳＡＧがそれぞれＧＦＡＰ陽性領域を増加または減少させる傾向にあることを示した。テストステロン、ＳＡＧ、またはテストステロンとＳＡＧとの組み合わせで処置されたＥＡＥ動物のＧＦＡＰ陽性領域は、対照群のＧＦＰＡ陽性領域と有意差がなかった。しかしながら、テストステロン（３８．８±１．８）は、ＳＡＧ（２５．１±２．２、ｐ＝０．００１）よりも有意に高いＧＦＡＰ染色を誘導した。図５Ｇに示すように、テストステロンおよびＳＡＧの共投与は、対照群のＧＦＡＰ陽性領域に匹敵するＧＦＡＰ陽性領域をもたらし、テストステロンおよびＳＡＧが併用療法の有益な効果に潜在的に関与するＧＦＡＰ陽性アストロサイトの異なるサブセットを制御し得ることを示唆した。
【０１０７】
血液脳関門の血管内皮細胞を横切る脳へのリンパ球の動員は、ＥＡＥモデルおよび多発性硬化症自体の病因における重要な事象を表すため、血液脳関門の透過性に単独でまたは組み合わせて使用されるテストステロンおよびＳＡＧの効果が評価された。血液脳関門の透過性を評価するために、このファミリーのタンパク質が血液と中枢神経系との間に可溶性および細胞性要素の通路を厳密に制御する能力を内皮細胞に付与するため、タイトジャンクションタンパク質のクローディン５に対する抗体を使用した。図５Ｈに示すように、免疫蛍光顕微鏡画像で行われた定量化は、テストステロン（２，５３±０．０９、ｐ＜０．０００１）、ＳＡＧ（２．３５±０．２７、ｐ＜０．０００１）、および併用療法（２．０３±０．１５、ｐ＜０．０００３）が、対照条件（０．６５±０．１１）と比較してクローディン５の発現において非常に有意な増加を誘導し、治療間で有意差がないことを示した。したがって、単独でまたは組み合わせて使用されるテストステロンおよびＳＡＧは、血液脳関門の効率を回復させることに対して有益な活性を示すように思われる。
【０１０８】
全体として、結果は、Ｓｍｏアゴニストおよびステロイドホルモンの併用治療が、ＭＳの最も関連性の高いモデルのうちの１つで相乗的な治療効果があることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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