(57)【要約】  本発明は、自然早産のプロテオミクスバイオマーカー、満期産のプロテオミクスバイオマーカー、およびそれらの使用方法に関する。特に、本発明は、妊娠中の対象が早産のリスクが高いかどうかを決定するためのツール、ならびに妊娠中の対象の早産のリスクを減少させるためのツールを提供する。特定の態様において、未経産の妊娠中の対象における妊娠第１三半期中の自然早産を検出するために、高度に予測可能な検査を提供し、出産歴に関係なく、妊娠中の対象の妊娠第１三半期中の自然早産を検出するために、他の高度に予測可能な検査を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の対象の自然早産のリスクを評価する方法であって、
ａ．該妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
ｂ．該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定し、ここで、該パネルは、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４およびＬＣＡＴを含む、工程
を含む、方法。
【請求項２】
該パネルが第４のタンパク質をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該第４のタンパク質がＴＲＦＥである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該パネルが、タンパク質ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該パネルが、タンパク質ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
妊娠中の対象が初産婦である、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
妊娠中のヒト対象が妊娠１０〜１２週のとき、該妊娠中の対象から血液サンプルを採取する、請求項１から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
血液サンプルが、妊娠第１三半期にある妊娠中の対象から採血される、請求項１から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
該方法により、妊娠３５週以前に自然早産する可能性が高い妊娠中の対象のリスクを評価する、請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
妊娠中の対象の自然早産のリスクを評価する方法であって、
ａ．該妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
ｂ．該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定し、ここで、該パネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ１またはＩＴＩＨ２から選択される１つのタンパク質を含む、工程
を含む、方法。
【請求項１１】
該パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ１を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
該パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ１からなる、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
該パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
妊娠中の対象が経産婦である、請求項１０から１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
妊娠中の対象が初産婦である、請求項１０から１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
妊娠中の対象が初妊婦である、請求項１０から１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
妊娠中の対象が経妊婦である、請求項１０から１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
妊娠中のヒト対象が妊娠１０〜１２週のとき、該妊娠中の対象から血液サンプルを採取する、請求項１０から１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
血液サンプルが、妊娠第１三半期にある妊娠中の対象から採血される、請求項１０から１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
該方法により、妊娠３５週以前に自然早産する可能性が高い妊娠中の対象のリスクを評価する、請求項１０から２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
妊娠中の対象について妊娠３５週以前に自然早産する可能性を評価する方法であって、
ａ．該妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
ｂ．該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定し、ここで、該パネルは、（ｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか、または（ｉｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなる、いずれかである、工程
を含み、
ここで、該妊娠中の対象が初産婦であり、妊娠中のヒト対象が妊娠１０〜１２週のとき、該妊娠中の対象から血液サンプルを採取する、
方法。
【請求項２３】
妊娠中の対象について妊娠３５週以前に自然早産する可能性を評価する方法であって、
ａ．該妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
ｂ．該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定し、ここで、該パネルは、（ｉ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含むか、または（ｉｉ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、いずれかである、工程
を含み、
ここで、該妊娠中の対象が初産婦であり、妊娠中のヒト対象が妊娠１０〜１２週のとき、該妊娠中の対象から血液サンプルを採取する、
方法。
【請求項２４】
該方法の工程が、妊娠中の対象から第１三半期に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠中の対象から第２三半期に採取された第二のサンプルに対して繰り返される、請求項１から６、８から１８、２０および２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
該方法の工程が、妊娠中の対象から妊娠８〜１２週の間に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠中の対象から妊娠１８週〜２４週の間に採取された第二のサンプルに対して繰り返される、請求項１から６、８から１８、２０および２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
該方法の工程が、妊娠中の対象から妊娠１０〜１２週の間に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠中の対象から第２三半期に採取された第二のサンプルに対して繰り返される、請求項１から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
該方法の工程が、妊娠中の対象から妊娠１０〜１２週の間に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠中の対象から妊娠１８週〜２４週の間に採取された第二のサンプルに対して繰り返される、請求項１から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
血液サンプルが血清サンプルである、請求項１から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
血液サンプルが血漿サンプルである、請求項１から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
マイクロ粒子に富む画分が、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて調製される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
サイズ排除クロマトグラフィーが、水による溶出を含む、請求項３０に記載の方法
【請求項３２】
サイズ排除クロマトグラフィーが、アガロース固相および水性液相を用いて行われる、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
調製工程が、限外ろ過または逆相クロマトグラフィーをさらに含む、請求項３０から３２のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
調製工程が、サイズ排除クロマトグラフィーの前に、尿素を用いる変性、ジチオスレイトールを用いる還元、ヨードアセトアミンを用いるアルキル化、およびトリプシンを用いた消化をさらに含む、請求項３０から３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定することが、表１４Ａに示すペプチドのいずれか１以上の検出を含むか、または表１４Ｂに示すペプチドのいずれか１以上の検出を含む、請求項１から３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定することが、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４に示されるペプチドを検出することを含み、ここで、妊娠中の対象が初産婦であり、血液サンプルが、妊娠中のヒト対象から妊娠１０〜１２週の間に採取される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定することが、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２に示されるペプチドを検出することを含み、ここで、妊娠中の対象が初産婦または経産婦であり、血液サンプルが、妊娠中のヒト対象から妊娠１０〜１２週の間に採取される、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定することが、質量分析を含む、請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定することが、液体クロマトグラフィー／質量分析を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
質量分析が、多重反応モニタリングを含み、液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルを含む溶媒を用いて行われ、および／または検出工程が、タンパク質に保持時間指標を割り当てる工程を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定することが、質量分析／多重反応モニタリング（ＭＳ／ＭＲＭ）を含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
ＭＳ／ＭＲＭが、複数の安定同位体標準の使用を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＭＳ／ＭＲＭが、表１５Ａまたは表１５Ｂに記載の複数の安定同位体標準の使用を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
決定工程が、自然早産のリスクがある対象を分類する分類ルールを実行することを含み、ここで、該分類ルールの実行が、少なくとも０．０５未満のｐ値で早産または満期産の間の相関を生じる、請求項１から４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
決定工程が、自然早産のリスクがある対象を分類する分類ルールを実行することを含み、ここで、該分類ルールの実行が、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、該ＲＯＣ曲線が、少なくとも０．６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、請求項１から４４のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
分類ルールが対象を分類する値が、母体年齢、母体の肥満度指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１から４５のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
分類ルールが、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の特異性を有するように構成されている、請求項１から４６のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される処置工程をさらに含む、請求項１から４７のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
妊娠中の対象の自然早産のリスクを減少させる方法および／または自然早産の新生児合併症を軽減させる方法であって、
ａ．請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法により、妊娠中の対象の自然早産のリスクを評価すること；および、
ｂ．自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項５０】
治療剤が、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
治療剤が、プロゲステロン膣用坐剤またはカプロン酸１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンエステル非経腸製剤を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
自然早産の増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルを有することを特徴とする妊娠中の対象に、自然早産のリスクを減少させるように設計された有効量の処置剤を投与することを含み、ここで、該パネルが、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか、またはＦ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含む、方法。
【請求項５３】
自然早産の増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルを有することを特徴とする妊娠中の対象に、自然早産のリスクを減少させるように設計された有効量の処置剤を投与することを含み、ここで、該パネルが、ＩＣ１、ＩＴＩＨ4、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなるか、またはＦ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、方法。
【請求項５４】
処置剤が、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される、請求項５２または５３記載の方法。
【請求項５５】
処置剤が、プロゲステロン膣用坐剤またはカプロン酸１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンエステル非経腸製剤を含む、請求項５２または５３記載の方法。
【請求項５６】
妊娠中の対象が初産婦である、請求項５２から５５のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
血液サンプルが、妊娠中のヒト対象から妊娠１０〜１２週の間に採取される、請求項５２から５６のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
妊娠中の対象の自然早産のリスクを減少させる方法および／または自然早産の新生児合併症を軽減させる方法であって、
ａ．請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法により、妊娠中の対象の自然早産のリスクを評価すること；および、
ｂ．自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項５９】
ａ．妊娠８〜１４週目の妊娠中の対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
ｂ．選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中のタンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、該パネルが、（ｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか、（ｉｉ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含むか、（ｉｉｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなるか、または（ｉｖ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、工程；および
ｃ．定量値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類システムの分類ルールを実行する工程であって、ここで、該分類システムが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線において、少なくとも０．６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する工程
を含む、方法。
【請求項６０】
自然早産のリスクを減少させる、および／または新生児合併症を軽減させる方法であって、
ａ．請求項１から４７のいずれか一項記載の方法により、対象を自然早産のリスクがあると決定する工程；および
ｂ．自然早産のリスクを減少させる、および／または新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与する工程
を含む、方法。
【請求項６１】
ａ．妊娠８〜１４週に得られた複数の妊娠中の対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程であって、ここで、該複数の対象には、以前に早産を経験した複数の対象および以前に満期産を経験した複数の対象が含まれる、工程；
ｂ．選択された反応モニタリング質量分析を用いて、画分中のタンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、該パネルが、（ｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか、（ｉｉ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含むか、（ｉｉｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなるか、または（ｉｖ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、工程；
ｃ．各サンプルについて、以下を示す値を示す学習データセットを準備する工程：
（ｉ）早産クラスまたは満期産クラスに属するとするサンプルの分類；および
（ｉｉ）複数のタンパク質バイオマーカーの定量値；ならびに、
ｄ．該学習データセットに機械学習アルゴリズムを学習する工程であって、ここで、該学習が、早産クラスまたは満期産クラスに属するとしてサンプルを分類する１つまたは複数の分類ルールを作成する、工程
を含む、方法。
【請求項６２】
タンパク質パネルを測定する方法であって、
ａ．血液サンプルのマイクロ粒子に富む画分からタンパク質を含むサンプルを調製する工程；
ｂ．タンパク質をプロテアーゼ消化してペプチドフラグメントを産生する工程；
ｃ．ペプチドフラグメントを、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１を含むかまたはそれらからなる複数の同位体標識対照ペプチドと接触させる工程；および
ｄ．画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含むか、またはそれらからなる、工程
を含む、方法。
【請求項６３】
該方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
血液サンプルが血漿サンプルを含む、請求項６２または６３記載の方法。
【請求項６５】
血液サンプルが血清サンプルを含む、請求項６２または６３記載の方法。
【請求項６６】
血液サンプルが対象由来であり、対象が妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である、請求項６２から６５のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
血液サンプルが対象由来であり、対象が妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である、請求項６２から６５のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
血液サンプルが対象由来であり、対象が初産婦である妊娠中の対象である、請求項６２から６５のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
タンパク質パネルを測定する方法であって、
ａ．血液サンプルのマイクロ粒子に富む画分からタンパク質を含むサンプルを調製する工程；
ｂ．タンパク質をプロテアーゼ消化してペプチドフラグメントを産生する工程；
ｃ．ペプチドフラグメントを、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９を含むかまたはそれらからなる複数の同位体標識対照ペプチドと接触させる工程；および
ｄ．画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含むか、またはそれらからなる、工程
を含む、方法。
【請求項７０】
該方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
血液サンプルが血漿サンプルを含む、請求項６９または７０記載の方法。
【請求項７２】
血液サンプルが血清サンプルを含む、請求項６９または７１記載の方法。
【請求項７３】
血液サンプルが対象由来であり、対象が妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である、請求項６２から６５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
血液サンプルが対象由来であり、対象が妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である、請求項６２から６５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
血液サンプルが対象由来であり、対象が初産婦である妊娠中の対象である、請求項６２から６５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
タンパク質パネルを測定する方法であって、
ａ．対象の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
ｂ．画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含むかまたはそれらからなり、決定工程が、タンパク質のサロゲートペプチドを測定することを含む、工程
を含む、方法。
【請求項７７】
配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２のサロゲートペプチド配列のレベルを測定することを含む、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
該方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む、請求項７６または７７記載の方法。
【請求項７９】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識対照ペプチドを用いることをさらに含む、請求項７６から７８のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
血液サンプルが血漿サンプルを含む、請求項７６から７９のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
血液サンプルが血清サンプルを含む、請求項７６から７９のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
対象が妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である、請求項７６から８１のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
対象が妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である、請求項７６から８１のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
対象が初産婦である妊娠中の対象である、請求項７６から８３のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
対象が経産婦である妊娠中の対象である、請求項７６から８３のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
タンパク質パネルを測定する方法であって、
ａ．対象の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
ｂ．画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含むかまたはそれらからなり、決定工程が、タンパク質のサロゲートペプチドを測定することを含む、工程
を含む、方法。
【請求項８７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のサロゲートペプチド配列のレベルを測定することを含む、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
該方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む、請求項８６または８７記載の方法。
【請求項８９】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の同位体標識対照ペプチドを用いることをさらに含む、請求項８６から８８のいずれか一項記載の方法。
【請求項９０】
血液サンプルが血漿サンプルを含む、請求項８６から８９のいずれか一項記載の方法。
【請求項９１】
血液サンプルが血清サンプルを含む、請求項８６から８９のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
対象が妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である、請求項８６から９１のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
対象が妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である、請求項８６から９１のいずれか一項記載の方法。
【請求項９４】
対象が初産婦である妊娠中の対象である、請求項７６から８３のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
タンパク質パネルを測定する方法であって、
ａ．対象の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
ｂ．画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含むかまたはそれらからなり、決定工程が、タンパク質のサロゲートペプチドを測定することを含む、工程
を含む、方法。
【請求項９６】
配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２のサロゲートペプチド配列のレベルを測定することを含む、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
該方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む、請求項９５または９６記載の方法。
【請求項９８】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識対照ペプチドを用いることをさらに含む、請求項９５から９７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
血液サンプルが血漿サンプルを含む、請求項９５から９８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１００】
血液サンプルが血清サンプルを含む、請求項９５から９８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
対象が妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である、請求項９５から１００のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
対象が妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である、請求項９５から１００のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０３】
対象が初産婦である妊娠中の対象である、請求項９５から１０２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０４】
対象が経産婦である妊娠中の対象である、請求項９５から１０２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
妊娠中の対象における自然早産を測定するための、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の同位体標識対照ペプチドならびに使用説明書を含む、キット。
【請求項１０６】
妊娠中の対象における自然早産を測定するための、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識対照ペプチドならびに使用説明書を含む、キット。
【請求項１０７】
複数のタンパク質ペプチドおよび複数の同位体標識対照ペプチドを含む組成物であって、ここで、該タンパク質ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含むか、それらからなり、同位体標識対照ペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１を含むか、またはそれらからなる、組成物。
【請求項１０８】
複数のタンパク質ペプチドおよび複数の同位体標識対照ペプチドを含む組成物であって、ここで、該タンパク質ペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２を含むか、それからなり、同位体標識対照ペプチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９を含むか、またはそれらからなる、組成物。
【請求項１０９】
ａ．プロセッサ；および
ｂ．該プロセッサに接続されたメモリであって、
（ｉ）画分中のタンパク質バイオマーカーのパネルの定量値を示す値を含む、対象由来のサンプルの試験データ、ここで、該パネルが、(i) ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか；(ii) Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含むか；(iii) ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなるか；または、(iv) Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなり；
（ｉｉ）測定値を含む値に基づいて、対象を早産のリスクがあると分類する分類ルール、ここで、該分類ルールが、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９５％の感度を有するように作成され；および
（ｉｉｉ）試験データに対して分類ルールを実行するためのコンピューター実行可能命令
を含むモジュールを装備している、メモリ
を含む、コンピューターシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１８年１月３１日出願の米国仮特許出願第６２／６２４，７１３号、および２０１９年１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／７９６，５５７号に基づく優先権の利益を主張する。これらの特許出願の内容はその全体を引用により本明細書中に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
背景
早産は、新生児の罹病および５歳未満の小児の死亡の主な原因であり、在胎期間が短いほど、顕著にリスクが増すことが示されている（Liu et al., Lancer, 385:61698−61706, 2015; および、Katz et al., Lancet, 382:417−425, 2013）。在胎３８週後に生まれた乳児と比較して、複合新生児罹病率は、マーチ・オブ・ダイムズによると、在胎週数が１週短い毎に倍増する。自然早産（ＳＰＴＢ）のおよそ３分の２は自然発生的であり、このことは医学的介入と関連しないことを意味する（Goldenberg et al., Lancet, 371:75−84, 2008; および、McElrath et al., Am J Epidemiol, 168:980−989, 2008）。しかしながら、この状態の切実さにもかかわらず、ＳＰＴＢの原因についての理解には進展がほとんどない。ＳＰＴＢは、単一の病態というよりむしろ症候群であるとするのが大多数の意見となってきているが、胎児−胎盤間インターフェイスの病態生理を研究することは、倫理面および物理的にも困難である（Romero et al., Science, 345:760−765, 2014)。循環マイクロ粒子（ＣＭＰ）生物学の分野の発展は、これらの粒子が胎児−胎盤環境のサンプリングを提示するために、これらの困難に対する解決策を提供し得る。さらに、これらの粒子の含有量を研究することにより、新規の血液ベースの、かつ臨床的に有用なバイオマーカーの同定を可能にすることが期待できる。
【０００３】
マイクロ粒子は、５０〜３００ｎｍの範囲のサイズであり、多くの種類の細胞によって放出される膜結合小胞である。マイクロ粒子の命名法は様々であるが、一般的には、５０〜１００ｎｍのマイクロ粒子はエキソソームと呼ばれ、１００ｎｍを超えるものは、微小小胞体（microvesicle）と呼ばれたり、微小凝集物（microaggregate）などの他の用語が文献でよく用いられる。特記しない限り、マイクロ粒子なる用語は、これらの種類の全てに対する一般的な言及である。マイクロ粒子は、ますます、生理的状況、病態生理的状況およびアポトーシスにおいて、細胞間のコミュニケーションの重要な手段として認識されている。異なるタイプのマイクロ粒子の含有量は、細胞タイプによって異なるが、それらは、核、細胞質ゾルおよび膜タンパク質、ならびに脂質およびメッセンジャーＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含み得る。細胞タイプの起源の状態に関する情報は、マイクロ粒子含有量の試験から得られ得る。従って、マイクロ粒子は、別の方法ではサンプリングすることが困難であり得る細胞、組織および臓器の活性をリアルタイムに固有のウィンドウに示す。
【０００４】
周産期合併症（adverse pregnancy outcome）の高い割合が、妊娠初期の胎児−胎盤間インターフェイスでそれらの病態生理学的起源を有する（Romero et al., supra, 2014; Gagnon, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 110:S99−S107, 2003; および、Masoura et al., J. Obstet Gynaecol, 32:609−616, 2012）。関連する組織および細胞集団の状態を評価するための能力は、切迫した合併症を予測することが予期される。満期産の妊娠と比較してかなり高い新生児罹病率が示される早産（３４週未満または３５週未満）の妊娠とを区別するための非侵襲的ツールは、タイムリーな治療薬の投与が早期分娩を阻止し、あるいは妊娠を延長できることを考慮すると、特に望ましい。
【０００５】
妊娠している女性が早産のリスクが高いかどうかを決定するためのツール、ならびに妊娠中の対象の早産のリスクを低下させるためのツールが特に必要とされている。本発明はかかるツールを提供する。
【０００６】
本明細書中に引用される、特許、特許出願、特許出願公開公報、文献およびプロトコールは、引用によりここに包含される。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＳＰＴＢのプロテオミクスバイオマーカー、満期産のプロテオミクスバイオマーカー、およびそれらの使用方法に関する。特に、本発明は、妊娠中の対象が早産のリスクが高いかどうかを決定するためのツール、ならびに妊娠中の対象の早産のリスクを低下させるためのツールを提供する。
【０００８】
一側面において、本発明は、妊娠中の対象の自然早産のリスクを評価する方法であって、（ａ）妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および、（ｂ）該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値（quantitative measure）を決定する工程（ここで、該パネルが、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４およびＬＣＡＴを含む）、を含む方法を提供する。ある態様において、該パネルは、第４のタンパク質をさらに含む。ある態様において、該第４のタンパク質はＴＲＦＥである。ある態様において、該パネルは、タンパク質ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含む。ある態様において、該パネルは、タンパク質ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなる。ある態様において、妊娠中の対象は初産婦である。ある態様において、血液サンプルは、妊娠中のヒト対象が妊娠１０週〜１２週のとき、該妊娠中の対象から採取される。ある態様において、血液サンプルは、妊娠第１三半期(trimester)中に妊娠中の対象から採取される。ある態様において、該方法は、妊娠３５週以前に自然早産を起こす可能性が高い妊娠中の対象のリスクを評価する。
【０００９】
別の面において、本発明は、妊娠中の対象の自然早産のリスクを評価する方法であって、
（ａ）妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
（ｂ）該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定し、ここで、該パネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴと、ＩＴＩＨ１またはＩＴＩＨ２から選択される１つのタンパク質を含む、工程
を含む、方法を提供する。
【００１０】
ある態様において、該パネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ１を含む。ある態様において、該パネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含む。ある態様において、該パネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ１からなる。ある態様において、該パネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる。ある態様において、妊娠中の対象は経産婦(multiparous)である。ある態様において、妊娠中の対象は初産婦(primiparous)である。ある態様において、妊娠中の対象は初妊婦(primigravida)である。ある態様において、妊娠中の対象は経妊婦(multigravida)である。ある態様において、血液サンプルは、妊娠ヒト対象が、妊娠１０週〜１２週のとき、該妊娠中の対象から採取される。ある態様において、血液サンプルは、妊娠第１三半期中に妊娠中の対象から採取される。ある態様において、該方法は、妊娠３５週以前に自然早産を起こす可能性が高い妊娠中の対象のリスクを評価する。
【００１１】
別の面において、本発明は、妊娠中の対象について妊娠３５週以前に自然早産する可能性を評価する方法であって、
（ａ）該妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
（ｂ）該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定し、ここで、該パネルは、（ｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか、または（ｉｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなる、いずれかである、工程
を含み、
ここで、該妊娠中の対象が初産婦であり、妊娠中のヒト対象が妊娠１０〜１２週のとき、該妊娠中の対象から血液サンプルを採取する、
方法を提供する。
【００１２】
関連する面において、本発明は、妊娠中の対象の妊娠３５週以前に自然早産する可能性を評価するための方法であって、
（ａ）該妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
（ｂ）該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定し、ここで、該パネルは、（ｉ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含むか、または（ｉｉ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、のいずれかである、工程
を含み、ここで、該妊娠中の対象が初産婦であり、血液サンプルが、妊娠ヒト対象が妊娠１０週〜１２週であるとき、該妊娠中の対象から採取される、
方法を提供する。
【００１３】
上記の２つの面のいずれかのある態様において、該方法の工程は、妊娠中の対象から妊娠第１三半期に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠中の対象から妊娠第２三半期に採取された第二のサンプルに対して繰り返される。ある態様において、該方法の工程は、妊娠中の対象から妊娠８週〜１２週に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠中の対象から妊娠１８週〜２４週に採取された第二のサンプルに対して繰り返される。ある態様において、該方法の工程は、妊娠中の対象から妊娠１０週〜１２週に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠中の対象から妊娠第２三半期に採取された第二のサンプルに対して繰り返される。ある態様において、該方法の工程は、妊娠中の対象から妊娠１０週〜１２週に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠中の対象から妊娠１８週〜２４週に採取された第二のサンプルに対して繰り返される。ある態様において、血液サンプルは血清サンプルである。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルである。ある態様において、マイクロ粒子に富む画分は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて調製される。いくつかの態様において、サイズ排除クロマトグラフィーは、水による溶出を含む。いくつかの態様において、サイズ排除クロマトグラフィーは、アガロース固相および水性液相を用いて行われる。いくつかの態様において、調製工程は、限外ろ過または逆相クロマトグラフィーをさらに含む。ある態様において、調製工程は、サイズ排除クロマトグラフィーの前に、尿素を用いる変性、ジチオスレイトールを用いる還元、ヨードアセトアミンを用いるアルキル化、およびトリプシンを用いた消化をさらに含む。ある態様において、画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程は、表１４Ａに示されるペプチドのいずれか１以上の検出、または表１４Ｂに示されるペプチドのいずれか１以上の検出を含む。ある態様において、画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程が、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４に示されるペプチドを検出することを含み、ここで、妊娠中の対象は初産婦であり、血液サンプルは、妊娠中の対象から、該妊娠ヒト対象が妊娠１０週〜１２週のときに採取される。ある態様において、画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程が、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２に示されるペプチドを検出することを含み、ここで、妊娠中の対象は初産婦または経産婦であり、血液サンプルは、妊娠中の対象から、該妊娠ヒト対象が妊娠１０週〜１２週のときに採取される。ある態様において、画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程が、質量分析を含む。ある態様において、画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程が、液体クロマトグラフィー／質量分析を含む。ある態様において、質量分析が、多重反応モニタリングを含み、液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルを含む溶媒を用いて行われ、および／または検出工程が、タンパク質に保持時間指標を割り当てる工程を含む。ある態様において、画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程が、質量分析／多重反応モニタリング（ＭＳ／ＭＲＭ）を含む。ある態様において、ＭＳ／ＭＲＭが、複数の安定な同位体標準の使用を含む。ある態様において、ＭＳ／ＭＲＭが、表１５Ａまたは表１５Ｂに記載の複数の安定な同位体標準の使用を含む。ある態様において、決定工程が、自然早産のリスクがある対象を分類する分類ルールを実行することを含み、ここで、該分類ルールの実行が、少なくとも０．０５未満のｐ値で早産または満期産の間の相関を生じる。ある態様において、決定工程が、自然早産のリスクがある対象を分類する分類ルールを実行することを含み、ここで、該分類ルールの実行が、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、該ＲＯＣ曲線が、少なくとも０．６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する。ある態様において、分類ルールが対象を分類する値が、母体年齢、母体の肥満度指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む。ある態様において、分類ルールが、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の特異性を有するように構成されている。ある態様において、該方法が、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される処置工程をさらに含む。
【００１４】
別の面において、本発明は、妊娠中の対象の自然早産のリスクを減少させる方法および／または自然早産の新生児合併症を軽減させる方法であって、
（ａ）本明細書に記載のいずれかの方法により、妊娠中の対象の自然早産のリスクを評価すること；および、
（ｂ）自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与すること
を含む、方法を提供する。
【００１５】
ある態様において、治療剤は、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。ある態様において、治療剤は、プロゲステロン膣用坐剤またはカプロン酸１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンエステル非経腸製剤を含む。
【００１６】
別の面において、本発明は、自然早産の増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルを有することを特徴とする妊娠中の対象に、自然早産のリスクを減少させるように設計された有効量の処置剤を投与することを含む方法であって、ここで、該パネルが、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか、またはＦ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含む、方法を提供する。
【００１７】
別の面において、本発明は、自然早産の増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルを有することを特徴とする妊娠中の対象に、自然早産のリスクを減少させるように設計された有効量の処置剤を投与することを含む方法であって、ここで、該パネルが、ＩＣ１、ＩＴＩＨ4、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなるか、またはＦ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、方法を提供する。ある態様において、処置剤は、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。ある態様において、処置剤は、プロゲステロン膣用坐剤またはカプロン酸１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンエステル非経腸製剤を含む。ある態様において、妊娠中の対象は初産婦である。ある態様において、血液サンプルは、妊娠中の対象から、該妊娠ヒト対象が妊娠１０〜１２週のときに採取される。
【００１８】
別の面において、本発明は、妊娠中の対象の自然早産のリスクを減少させる方法および／または自然早産の新生児合併症を軽減させる方法であって、
（ａ）本明細書に記載のいずれかの方法により、妊娠中の対象の自然早産のリスクを評価すること；および、
（ｂ）自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与すること
を含む、方法を提供する。
【００１９】
別の面において、本発明は、
（ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠中の対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
（ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中のタンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、該パネルが、（ｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか、（ｉｉ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含むか、（ｉｉｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなるか、または（ｉｖ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、工程；および
（ｃ）定量値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類システムの分類ルールを実行する工程であって、ここで、該分類システムが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線において、少なくとも０．６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、工程
を含む、方法を提供する。
【００２０】
別の面において、本発明は、自然早産のリスクを減少させる、および／または新生児合併症を軽減させる方法であって、
（ａ）本明細書に記載のいずれかの方法により、対象を自然早産のリスクがあると決定する工程；および
（ｂ）自然早産のリスクを減少させる、および／または新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与する工程
を含む、方法を提供する。
【００２１】
別の面において、本発明は、
（ａ）妊娠８〜１４週に得られた複数の妊娠中の対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を提供する工程であって、ここで、該複数の対象には、以前に早産を経験した複数の対象および以前に満期産を経験した複数の対象が含まれる、工程；
（ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、画分中のタンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、該パネルが、（ｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか、（ｉｉ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含むか、（ｉｉｉ）ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなるか、または（ｉｖ）Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなる、工程；
（ｃ）各サンプルについて、以下を示す値を示す学習(training)データセットを準備する工程：
（ｉ）早産クラスまたは満期産クラスに属するとするサンプルの分類；および
（ｉｉ）複数のタンパク質バイオマーカーの定量値；ならびに、
（ｄ）該学習データセットに機械学習アルゴリズムを学習する工程であって、ここで、該学習が、早産クラスまたは満期産クラスに属するとしてサンプルを分類する１つまたは複数の分類ルールを作成する、工程
を含む、方法を提供する。
【００２２】
別の面において、本発明は、タンパク質パネルを測定する方法であって、
（ａ）血液サンプルのマイクロ粒子に富む画分からタンパク質を含むサンプルを調製する工程；タンパク質をプロテアーゼ消化してペプチドフラグメントを産生する工程；ペプチドフラグメントを、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１を含むかまたはそれらからなる複数の同位体標識対照ペプチドと接触させる工程；
（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、該パネルが、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含むか、またはそれらからなる、工程
を含む、方法を提供する。ある態様において、該方法は、方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む。ある態様において、血液サンプルは、血漿サンプルを含む。ある態様において、血液サンプルは血清サンプルを含む。ある態様において、血液サンプルは対象由来であり、対象は、妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である。ある態様において、血液サンプルは対象由来であり、対象は、妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である。ある態様において、血液サンプルは対象由来であり対象は、初産婦である妊娠中の対象である。
【００２３】
別の面において、本発明は、タンパク質パネルを測定する方法であって、
（ａ）血液サンプルのマイクロ粒子に富む画分からタンパク質を含むサンプルを調製する工程；
（ｂ）タンパク質をプロテアーゼ消化してペプチドフラグメントを産生する工程；
（ｃ）ペプチドフラグメントを、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９を含むかまたはそれらからなる複数の同位体標識対照ペプチドと接触させる工程；および
（ｄ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含むか、またはそれらからなる、工程
を含む、方法を提供する。ある態様において、該方法は、方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルを含む。ある態様において、血液サンプルは血清サンプルを含む。ある態様において、血液サンプルは対象由来であり、対象は、妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である。ある態様において、血液サンプルは対象由来であり、対象は、妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である。ある態様において、血液サンプルは対象由来であり、対象は、初産婦である妊娠中の対象である。
【００２４】
別の面において、本発明は、タンパク質パネルを測定する方法であって、
（ａ）対象の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含むかまたはそれらからなり、決定工程が、タンパク質のサロゲートペプチドを測定することを含む、工程
を含む、方法を提供する。
【００２５】
ある態様において、方法は、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２のサロゲートペプチド配列のレベルを測定することを含む。ある態様において、方法は、該方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む。ある態様において、方法は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識対照ペプチドを用いることをさらに含む。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルを含む。ある態様において、血液サンプルは血清サンプルを含む。ある態様において、対象は、妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である。ある態様において、対象は、妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である。ある態様において、対象は、初産婦である妊娠中の対象である。ある態様において、対象は、経産婦である妊娠中の対象である。
【００２６】
別の面において、本発明は、タンパク質パネルを測定する方法であって、
（ａ）対象の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含むかまたはそれらからなり、決定工程が、タンパク質のサロゲートペプチドを測定することを含む、工程
を含む、方法を提供する。ある態様において、方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のサロゲートペプチド配列のレベルを測定することを含む。
【００２７】
ある態様において、方法は、該方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む。ある態様において、方法は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の同位体標識対照ペプチドを用いることをさらに含む。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルを含む。ある態様において、血液サンプルは血清サンプルを含む。ある態様において、対象は、妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である。ある態様において、対象は、妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である。ある態様において、対象は、初産婦である妊娠中の対象である。
【００２８】
別の面において、本発明は、タンパク質パネルを測定する方法であって、
（ａ）対象の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および
（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程であって、ここで、パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含むかまたはそれらからなり、決定工程が、タンパク質のサロゲートペプチドを測定することを含む、工程
を含む、方法を提供する。
【００２９】
ある態様において、方法は、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２のサロゲートペプチド配列のレベルを測定することを含む。ある態様において、方法は、該方法を実施するためにＭＳ／ＭＲＭを用いることを含む。ある態様において、方法は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識対照ペプチドを用いることをさらに含む。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルを含む。ある態様において、血液サンプルは血清サンプルを含む。ある態様において、対象は、妊娠８〜１４週の妊娠中の対象である。ある態様において、対象は、妊娠１０〜１２週の妊娠中の対象である。ある態様において、対象は、初産婦である妊娠中の対象である。ある態様において、対象は、経産婦である妊娠中の対象である。
【００３０】
別の面において、本発明は、妊娠中の対象における自然早産を測定するための、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の同位体標識対照ペプチドならびに使用説明書を含む、キットを提供する。
【００３１】
別の面において、本発明は、妊娠中の対象における自然早産を測定するための、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識対照ペプチドならびに使用説明書を含む、キットを提供する。
【００３２】
別の面において、本発明は、複数のタンパク質ペプチドおよび複数の同位体標識対照ペプチドを含む組成物であって、ここで、該タンパク質ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含むか、それらからなり、同位体標識対照ペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１を含むか、またはそれらからなる、組成物を提供する。
【００３３】
別の面において、本発明は、複数のタンパク質ペプチドおよび複数の同位体標識対照ペプチドを含む組成物であって、ここで、該タンパク質ペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２を含むか、それからなり、同位体標識対照ペプチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９を含むか、またはそれらからなる、組成物を提供する。
【００３４】
別の面において、本発明は、プロセッサ；および該プロセッサに接続されたメモリを含むコンピューターシステムであって、該メモリが、以下：
（ｉ）画分中のタンパク質バイオマーカーのパネルの定量値を示す値を含む、対象由来のサンプルの試験データ、ここで、該パネルが、(i) ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥを含むか；(ii) Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２を含むか；(iii) ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴおよびＴＲＦＥからなるか；または、(iv) Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２からなり；
（ｉｉ）測定値を含む値に基づいて、対象を早産のリスクがあると分類する分類ルール、ここで、該分類ルールが、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９５％の感度を有するように作成され；および
（ｉｉｉ）試験データに対して分類ルールを実行するためのコンピューター実行可能命令
を含むモジュールを装備している、コンピューターシステムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、満期産症例（term case）からＳＰＴＢ症例を検出するためのタンパク質を選択するためのブートストラップＲＯＣ分析のグラフである。各タンパク質を、ブートストラップＲＯＣ分析からのＡＵＣの平均およびＳＤをそれぞれｘ軸値およびｙ軸値として、青色の点でプロットした。同じ分析からの結果でありながらサンプルラベル順列（permutation）を有する結果を、赤色の点としてプロットした。マゼンタ縦線（赤色点のｘ値の平均＋ＳＤ）およびグリーン横線（青色点のｙ値の平均＋ＳＤ）で区切られた右下の４分の１区画内の合計６２個のタンパク質（青色点）を、それらが比較的安定で、かつ顕著な識別能を有するために選択した。比較に際して、ラベル順列分析からのタンパク質のうちたった１２個のみ（赤色点）が、この４分の１区画に存在した。従って、推定偽陽性率は、２０％未満であった（１２／６２）。
【図２】図２は、ＳＴＰＢに関連する同時発現パターンを有すると同定された選択されたタンパク質の示差的依存性ネットワーク（ＤＤＮ）分析を示す。プロットでは、赤色線は、ＳＴＰＢ間でタンパク質ペア間の共発現が観察されたことを示し、一方、緑色線は、ＴＥＲＭケース間でタンパク質ペア間の共発現が観察されたことを示す。線の太さは、関連の統計的有意性に比例する。
【図３】図３は、表７（上）のＡＵＣまたは表８（下）の８０％の一定感度での特異性に基づく、上位２０個の多変量モデルにおけるＤＤＮ選択タンパク質の頻度を示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、３つのタンパク質を組み合わせた例示的線形モデルのＲＯＣ曲線を示す。ブートストラップ再サンプリングによるＲＯＣ分析は、学習データの性能の推定範囲を提供した。図４Ｃは、５〜８個のマイクロ粒子関連タンパク質の上位１００個のパネルにおけるマーカー編入（inclusion）の頻度を示す。
【図５】図５は、ＳＰＴＢと対照との間の差異情報を含む、２つの時点（Ｄ１＝妊娠約１０〜１２週；Ｄ２＝妊娠約２２〜２４週）にわたるタンパク質発現における時間的パターンを示す。
【図６】図６は、ＳＰＴＢ検出のためのタンパク質の選択を示す。
【図７】図７は、統計的に一貫した性能を有するタンパク質を示す。
【図８】図８は、実施例２のサンプルからのＳＥＣデータの２つのプールが高い分析精度（変動係数が小さい）を示すことを示す。
【図９】図９は、実施例２で用いたサンプルから、対照からＳＰＴＢを検出する際に有益な複数のタンパク質に対するNeXosome（登録商標）サンプル調製工程（ＳＥＣ）を示す。
【図１０】図１０は、豊富なタンパク質ＡＬＢＵの濃度に対するＳＥＣの効果を示す。
【００３６】
【図１１】図１１は、妊娠２２〜２４週に採取したサンプル中のバイオマーカーＩＴＩＨ４を区別する際に、ＳＥＣがＳＰＴＢと対照との区別を改善したことを示す。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、出産歴（parity status）または胎児の性別などの他の因子に関わらず、全ての対象に対して最適化された、１つの例示的な５個のタンパク質マーカーパネルの性能を示す。図１２Ｃは、出産歴または胎児の性別などの他の因子に関わらず、全ての対象に対して最適化された、別の例示的な５個のタンパク質マーカーパネルの性能を示す。図１２Ｄは、試験性能が胎児の性別および出産回数(parity)に基づいて変化したことを示している。
【図１３】図１３は、複数回の繰り返しに亘るマーカーの一貫性および安定性を示し、これは、例示的な５個のタンパク質マーカーパネル、例えば図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃに示されるものの選択をサポートする。
【図１４】図１４は、４個のタンパク質マーカーパネルを用いて、出産回数＝０に対して最適化された多変量モデルの性能を示す。
【図１５】図１５は、胎児の性別による４個のタンパク質マーカーパネルの性能を示す。
【図１６】図１６は、図１５の初産（出産回数＝０）の母親に対して選択されたマルチマーカーパネルを用いて、試験セット全体で妊娠を高リスク層と低リスク層に分類した、妊娠週ごとの妊娠生存率のカプラン・マイヤー曲線を示す。
【図１７】図１７は、予め定められた（prefixed）特異性（０．６５）での感度および予め定められた感度（０．７５）での特異性で、ＡＵＣの平均および標準偏差の観点から、５つのマーカーパネルおよび上位の性能パネルのいくつかの学習／交差検証性能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、３８週より以前（例えば、３５週以前）に自然早産となった女性のうち、妊娠１０〜１２週でそれらの発現プロフィールにおいて既にユニークである、妊娠に関連する生物学的プロセスに関連する統計学的に有意なＣＭＰ関連（循環マイクロ粒子−関連）タンパク質バイオマーカーおよびマルチプレックスパネルを提供する。これらのバイオマーカーは、臨床所見のかなり前にＳＰＴＢのリスクのある患者の臨床的に分類するのに有用である。このような同定は、観察の増加の必要性を示し、結果として、これらの患者の管理を顕著に改善しつつ、予防的療法の適用をもたらし得る。
【００３８】
タンパク質バイオマーカーパネル
本発明は、ＳＰＴＢのリスクを評価し低減させるためのツールを提供する。本明細書に記載の方法は、生物学的サンプルにおいて、少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００３９】
マイクロ粒子とは、約５０〜約５０００ｎｍの流体力学直径を有する細胞外微小胞または脂質ラフトタンパク質凝集を意味する。したがって、用語マイクロ粒子は、同一寸法の、エキソソーム（約５０〜約１００ｎｍ）、微小胞（約１００〜約３００ｎｍ）、エクトソーム（約５０〜約１０００ｎｍ）、アポトーシス小体（約５０〜約５０００ｎｍ）および脂質タンパク質凝集体が包含する。値に関して本明細書中で用いられる、用語“約”は、その値の９０〜１１０％を意味する。例えば、約１０００ｎｍの直径は、９００ｎｍ〜１１００ｎｍの範囲内の直径である。
【００４０】
マイクロ粒子関連タンパク質とは、哺乳動物（例えば、ヒト）対象からのマイクロ粒子に富むサンプル中で検出され得るタンパク質またはそのフラグメント（例えば、ポリペプチド）を意味する。そのようなマイクロ粒子関連タンパク質としては、検出時にマイクロ粒子と物理的に結合しているタンパク質またはそのフラグメントに限定されず、該タンパク質またはフラグメントは、マイクロ粒子間に取り込まれるか、または検出の前のある時期にマイクロ粒子と結合されていてよい。
【００４１】
特に断らない限り、タンパク質なる用語は、ポリペプチドおよびそのフラグメントを包含する。“フラグメント”には、目的の完全長タンパク質または成熟タンパク質よりも短いポリペプチドが含まれる。タンパク質の長さがｘアミノ酸であるとき、フラグメントは、そのタンパク質のｘ−１アミノ酸である。フラグメントは、これよりも短くてもよく（例えば、ｘ−２、ｘ−３、ｘ−４、…）、好ましくは１００アミノ酸以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０アミノ酸以下）である。フラグメントは、４アミノ酸程の短さであってもよいが、好ましくはより長くてもよい（例えば、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００アミノ酸）。例示的態様において、バイオマーカーセットの存在を示す複数のサロゲートペプチドが定量化される。
【００４２】
本発明は、少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質の、より好ましくは少なくとも３つ、４つまたは５つのタンパク質のレベルを検出するためのツールを提供する。しかしながら、本発明は、未経産の妊娠中の対象におけるＳＰＴＢを高度に予測する４個のタンパク質パネルの例示的な組み合わせと、妊娠中の対象の出産回数に関係なくＳＰＴＢを高度に予測する５個のタンパク質パネルの別の例示的な組み合わせに注目している。
【００４３】
本明細書中で用いる、少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質の“レベルの検出”は、タンパク質の発現レベルの検出、タンパク質の絶対濃度の検出、対照標準との関係でのタンパク質レベルの増加または減少の検出、閾値レベルとの関係でのタンパク質レベルの増加または減少の検出、タンパク質濃度の測定、タンパク質濃度の定量、定量値の決定、妊娠中の対象からのサンプル中の少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質の存在（例えば、閾値または検出可能なレベルを超えるレベル）の検出、あるいは、妊娠中の対象由来のサンプル中の少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質の不存在（例えば、閾値未満レベルまたは検出不可能なレベル）の検出を包含する。いくつかの態様において、定量値は、絶対値、比、平均、中央値、または範囲数であり得る。
【００４４】
本明細書で用いる、“タンパク質の検出”および“１以上のタンパク質の定量値の決定”タンパク質のフラグメントを検出するＭＳ法による検出を含む任意の手段を包含する。表および図面に開示されたデータは、検出のための親タンパク質のペプチドフラグメントをサロゲートとして選択することによりタンパク質を検出する、ＭＲＭ−ＭＳによって得られた−本発明の例示的なサロゲートペプチドを表１４Ａおよび１４Ｂに示す。
【００４５】
本発明の方法の開発中、多数のマイクロ粒子関連タンパク質が、（満期産であった対象からのサンプルと比較して）早産を経験した対象からのサンプルにおいて変化していると判定され、それ故に“早産バイオマーカー”と称される。さらに、本発明の方法の開発中、多数のマイクロ粒子関連タンパク質が、（満期産であった対象からのサンプルと比較して）早産を経験した対象からのサンプルにおいて変化していないと判定され、それ故に“満期産バイオマーカー”と称される。より具体的には、個別の４個のバイオマーカー（ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴ）は、驚くべきことに、未経産の妊娠中の対象でSPTBを予測することが見いだされた。同様に驚くべきことに、個別の５個のバイオマーカーパネル（Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴ）は、出産回数に関係なく、妊娠中の対象のＳＰＴＢを予測することが見いだされた。
【００４６】
従って、いくつかの例示的な態様において、本発明の方法は、妊娠８〜１４週または妊娠１０〜１２週の未経産の妊娠中の試験対象由来の生物学的サンプルにおけるマイクロ粒子関連タンパク質のパネルのレベルを検出する工程を含み、ここで、マイクロ粒子関連タンパク質がＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含む。いくつかの例示的な態様において、本発明の方法は、未経産の妊娠中の試験対象由来の生物学的サンプルにおけるマイクロ粒子関連タンパク質のパネルのレベルを検出する工程を含み、ここで、マイクロ粒子関連タンパク質は、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴからなる。
【００４７】
したがって、いくつかの例示的な態様において、本発明の方法は、妊娠８〜１４週または妊娠１０〜１２週の未経産または経産の妊娠中の試験対象由来の生物学的サンプルにおけるマイクロ粒子関連タンパク質のパネルのレベルを検出する工程を含み、ここで、マイクロ粒子関連タンパク質が、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含む。いくつかの例示的な態様において、本発明の方法は、未経産または経産の妊娠中の試験対象由来の生物学的サンプルにおけるマイクロ粒子関連タンパク質のパネルのレベルを検出する工程を含み、マイクロ粒子関連タンパク質は、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴからなる。
【００４８】
他の態様において、本発明の方法は、妊娠試験対象由来の生物学的サンプルにおけるマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該マイクロ粒子関連タンパク質は表１のものである。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠試験対象由来の生物学的サンプルにおける少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該少なくとも１つのタンパク質は表１から選択される。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠試験対象由来の生物学的サンプルにおける少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該少なくとも１つのタンパク質は表１から選択される。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠試験対象由来の生物学的サンプルにおける５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該タンパク質は表１から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠試験対象由来の生物学的サンプルにおいて６つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該６つのタンパク質は表１から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠試験対象由来の生物学的サンプルにおいて７つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該７つのタンパク質は表１から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠試験対象由来の生物学的サンプルにおいて８つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該８つのタンパク質は表１から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠試験対象由来の生物学的サンプルにおいて９つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該９つのタンパク質は表１から選択される。
【００４９】
ある態様において、サンプルがおよそ妊娠１０〜１２週で得られるとき、マイクロ粒子関連タンパク質は、表１の最後のカラムに示される方向性（＋または−）を示し得る。表１の最後のカラムにおいて、（−）は、ＳＰＴＢ症例 対 ＴＥＲＭ対照において、バイオマーカーが下方制御されていることを示し、（＋）は、ＳＰＴＢ症例 対 ＴＥＲＭ対照において、バイオマーカーが上方制御されていることを示す。
【００５０】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００５１】
ある態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいてマイクロ粒子関連タンパク質のパネルのレベルを検出する工程を含み、ここで、該マイクロ粒子関連タンパク質は表２のものである。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該少なくとも１つのタンパク質は、表２から選択される。表２に列記されたタンパク質は、満期産対照からＳＰＴＢを差異付ける統計的に一貫した性能を有するタンパク質に対応する。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該少なくとも１つのタンパク質は、表２から選択される。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該タンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて５つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該５つのタンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて６つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該６つのタンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて７つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該７つのタンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて８つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該８つのタンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて９つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該９つのタンパク質は表２から選択される。
【００５２】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【００５３】
別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４、表５、表７または表８のタンパク質から選択される３つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥが含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＡ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２が含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥが含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧから選択される少なくとも３つのタンパク質が含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧが含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳが含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、表７または表８に示される複数のトリプレックスのいずれか１つが含まれる。
【００５４】
別の態様において、本発明の方法は、少なくとも３つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。ある態様において、少なくとも３つのタンパク質は、ＩＣ１、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ４を含む。ある態様において、少なくとも３つのタンパク質は、必要に応じて第４のタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、第４のタンパク質はＴＲＦＥである。ある態様において、サンプルは妊娠ヒト対象から採取される。ある態様において、妊娠ヒト対象は初産婦である。ある態様において、妊娠中のヒト対象は、前に満期産の子供がいなくてよい。ある態様において、妊娠ヒト対象は、妊娠８〜１４週であるか、または妊娠１０〜１２週である。
【００５５】
例示的な態様において、本発明の方法は、ＩＣ１、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ４のレベルを検出する工程を含み、対象は初産婦である。ある態様において、妊娠ヒト対象は、妊娠８〜１４週であるか、または妊娠１０〜１２週である。
【００５６】
例示的な態様において、本発明の方法は、ＩＣ１、ＬＣＡＴ、ＴＲＦＥおよびＩＴＩＨ４のレベルを検出する工程を含み、対象は初産婦である。ある態様において、妊娠ヒト対象は、妊娠８〜１４週であるか、または妊娠１０〜１２週である。
【００５７】
別の態様において、本発明の方法は、少なくとも４つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。ある態様において、少なくとも４つのタンパク質は、ＴＲＦＥ、ＩＣ１、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ４を含む。ある態様において、サンプルは妊娠ヒト対象から採取される。ある態様において、妊娠ヒト対象は初産婦である。ある態様において、妊娠中のヒト対象は、前に満期産の子供がいなくてよい。ある態様において、妊娠ヒト対象は、妊娠８〜１４週であるか、または妊娠１０〜１２週である。
【００５８】
別の態様において、本発明の方法は、少なくとも５つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。ある態様において、少なくとも５つのタンパク質は、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＬＣＡＴおよび第５のタンパク質である。ある態様において、第５のタンパク質は、ＩＴＩＨ１またはＩＴＩＨ２である。ある態様において、５つのタンパク質は、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ１である。ある態様において、５つのタンパク質は、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＬＣＡＴおよびＩＴＩＨ２である。ある態様において、サンプルは、妊娠ヒト対象から採取される。ある態様において、妊娠中のヒト対象は経産婦である。ある態様において、妊娠ヒト対象は初産婦である。ある態様において、妊娠中のヒト対象は初妊婦である。ある態様において、妊娠ヒト対象は経妊婦である。ある態様において、妊娠ヒト対象は、妊娠８〜１４週であるか、または妊娠１０〜１２週である。
【００５９】
別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される４つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される５つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。別の態様において、本発明の方法は、タンパク質s of 表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される６つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される７つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００６０】
別の態様において、本発明の方法は、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００６１】
別の態様において、本発明の方法は、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００６２】
別の態様において、本発明の方法は、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。いくつかの態様において、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質は、妊娠中の対象のＳＰＴＢのリスクを長期的にモニタリングするのに使用される。いくつかの態様において、第１のサンプルは、妊娠８〜１４週（例えば、１０〜１２週）に採取され、第２のサンプルは、妊娠１８〜２４週（例えば、２２〜２４週）に採取される。評価時に、対象がもはやＳＰＴＢのリスクを有しないことが２回目の測定後に判明した場合、残りの妊娠期間の管理は、医療従事者によって適宜調整され得る。同様に、評価時に、対象がＳＰＴＢのリスクを有し続けているか、または以前に判定されたよりもＳＰＴＢのリスクが高いと判定された場合、残りの妊娠の管理は、医療従事者によって適宜調整され得る。
【００６３】
別の態様において、本発明の方法は、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００６４】
別の態様において、本発明の方法は、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００６５】
別の態様において、本発明の方法は、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００６６】
別の態様において、本発明の方法は、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００６７】
別の態様において、本発明の方法は、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００６８】
本明細書において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルを提供する。いくつかの態様において、ＳＰＴＢの増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、表１または表２のタンパク質から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、マイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、表４のタンパク質から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、マイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、表５のタンパク質から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、表７の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表８の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、およびＴＲＹ３からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＡ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２を含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＦ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳを含む。
【００６９】
ある態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質の第１のパネル（例えば、妊娠第１三半期のパネル、妊娠８〜１２週のパネル、または妊娠１０〜１２週のパネル）を提供する。いくつかの態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質の第２のパネル（例え、妊娠第２三半期のパネル、妊娠１８〜２４週のパネル、または妊娠２２〜２４週のパネル）を提供する。いくつかの態様において、妊娠中の対象は、妊娠第１期の間、妊娠８〜１２週の間、または妊娠１０〜１２週の間、およびその後の妊娠第２期の間、妊娠１８〜２４週の間、または妊娠２２〜２４週の間のリスクを評価される。かかる態様において、有用なパネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含み得る。
【００７０】
本明細書中に提示されるパネルのいくつかの態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、または５以下のマイクロ粒子関連タンパク質を含む。例示的な態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、５個以下のタンパク質を含む。別の例示的態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、６個以下のタンパク質を含む。別の例示的態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、７個以下のタンパク質を含む。別の例示的態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、８個以下のタンパク質を含む。
【００７１】
本明細書中に提示されるパネルの例示的な態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、４個以下または５個以下のタンパク質を含む。
【００７２】
ある態様において、初産婦対象におけるＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質の第１の４つのバイオマーカーパネル（例えば、第１三半期のパネル、８−１４週のパネルまたは１０−１２週のパネル）を提供する。ある態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質の第２のパネル（例えば、第２三半期のパネル、１８−２４週のパネルまたは２２−２４週のパネル）を提供する。ある態様において、妊娠中の対象は、第１三半期中、妊娠８〜１２週または妊娠１０〜１２週の間のリスクについて評価され、次いで、第２三半期中、妊娠１８〜２４週または妊娠２２〜２４週の間のリスクについて評価される。かかる態様において、有用なパネルは、少なくともＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含み得る。かかる態様において、有用なパネルは、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴからなり得る。
【００７３】
ある態様において、初産婦または経産婦対象におけるＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質の最初の４つのバイオマーカーパネル（例えば、第１三半期のパネル、８−１４週のパネルまたは１０−１２週のパネル）を提供する。ある態様において、ＳＰＴＢのリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質の第２のパネル（例えば、第２三半期のパネル、１８−２４週のパネルまたは２２−２４週のパネル）を提供する。ある態様において、妊娠中の対象は、第１三半期中、妊娠８〜１２週または妊娠１０〜１２週の間のリスクについて評価され、次いで、第２三半期中、妊娠１８〜２４週または妊娠２２〜２４週の間のリスクについて評価される。かかる態様において、有用なパネルは、少なくともＦ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含み得る。かかる態様において、有用なパネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴからなり得る。
【００７４】
ある態様において、本発明は、妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および、本明細書に記載のマイクロ粒子関連タンパク質のいずれか１つのパネルの定量値を決定する工程、を含む方法を提供する。
【００７５】
妊娠中の対象
本明細書に記載のツールおよび方法は、妊娠している対象におけるＳＰＴＢのリスクを評価するために使用することができ、ここで、該対象は、任意の種の哺乳動物であり得る。本明細書に記載のいくつかの態様において、妊娠している対象は、ヒトの女性である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠第１三半期（例えば、妊娠第１〜１２週）、妊娠第２三半期（例えば、妊娠第１３〜２８週）または妊娠第３三半期（例えば、妊娠第２９〜３７週）である。いくつかの態様において、妊娠ヒト対象は、妊娠初期（例えば、妊娠８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０週から、妊娠２１週より前まで；妊娠８週以降、妊娠２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９週まで）である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠中期（例えば、妊娠２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０週から、妊娠３１週より前まで；妊娠２０週以降だが、妊娠３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２または２１週まで）である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠後期（例えば、妊娠３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７週から、妊娠３８週より前まで；妊娠３０週以降だが、妊娠３７、３６、３５、３４、３３、３２または３１週まで）である。いくつかの態様において、妊娠ヒト対象は、妊娠１７週未満、妊娠１６週未満、妊娠１５週未満、妊娠１４週未満または妊娠１３週未満であり；妊娠８週以降であるが、妊娠２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９週までである。ある態様において、妊娠ヒト対象は、およそ妊娠８〜１２週である。ある態様において、妊娠ヒト対象は、およそ妊娠８〜１４週である。ある態様において、妊娠ヒト対象は、およそ妊娠１８〜２４週である。例示的態様において、妊娠ヒト対象は、妊娠１０〜１２週である。ある態様において、妊娠ヒト対象は、およそ妊娠２２〜２４週である。妊娠ステージは、妊娠している対象の最後の正常な月経の最初の日から計算することができる。
【００７６】
本明細書に記載の方法の妊娠中の対象は、初産婦（分娩した以前の子供がいない）または経産婦（少なくとも１名の、少なくとも妊娠２０週を経過した以前の子供を有する）、初妊婦（最初の妊娠、初めて母親になる）または経妊婦（２回以上の以前の妊娠）を含む、１以上のクラスまたは状態に属し得る。初産婦の出産経歴（parity status）は、出産回数０（出産回数＝０）と記載され得る；初産婦の経歴は、未経産（nulliparous）とも称され得て、これらの用語は互換的に用いられ得る。経産婦の出産経歴は、出産回数≧１または出産回数＞０と記載され得て、これらの用語は互換的に用いられ得る。
【００７７】
ある態様において、妊娠ヒト対象は初産婦であり、すなわち、出産回数＝０である。他の態様において、妊娠中の対象は経産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は、出産前に子供がいなくてよい。他の態様において、妊娠中の対象は、前回少なくとも妊娠２０週の、少なくとも１名の子供を有したことがあってよい。
【００７８】
ある態様において、妊娠ヒト対象は初妊婦である。他の態様において、妊娠中の対象は経妊婦である。ある態様において、妊娠中の対象は、少なくとも１回の以前のＳＰＴＢ（例えば、妊娠３８週以前の出産）を有していてよい。ある態様において、妊娠ヒト対象は無症状である。ある態様において、対象は、妊娠前高血圧、真性糖尿病、腎疾患、既知の血栓症および／または他の顕著な既存の医学的状態（例えば、子宮頚管が短い）の病歴などのＰＴＢのリスク因子を有し得る。
【００７９】
サンプル
本発明の方法で使用するためのサンプルは、妊娠している対象から得られた生物学的サンプルである。好ましい態様において、該サンプルは、上記のセクションに記載した妊娠ステージの間に採取される。いくつかの態様において、サンプルは、血液、唾液、涙、汗、鼻分泌物、尿、羊水または子宮膣液サンプルである。いくつかの態様において、サンプルは、血液サンプルであり、好ましい態様においては、血清または血漿である。いくつかの態様において、サンプルは、冷凍（例えば、−２０℃または−８０℃）で貯蔵されている。
【００８０】
自然早産（ＳＰＴＢ）のリスクを評価する方法
本明細書で用いる語句“自然早産の増加したリスク”とは、妊娠している対象が、１以上の早産マーカーが検出されるとき、ＳＰＴＢの増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質の特定のパネルが検出されるとき、および／または１以上の満期産マーカーが検出されないとき、ＳＰＴＢ（妊娠３８週以前）を有する可能性がより高いことを示す。いくつかの態様において、ＳＰＴＢのリスクを評価することは、早産のリスクに確率を割り当てることを含む。いくつかの態様において、ＳＰＴＢのリスクを評価することは、妊娠している対象を、ＳＰＴＢのリスクが高い、中程度または低いと層別化することを含む。いくつかの態様において、ＳＰＴＢのリスクを評価することは、集団全体、または特定の特性（年齢、体重、病歴、地域性（geography）、および／または他の因子）における集団と比較して、妊娠している対象のリスクが増加しているか、または減少しているかを判定することを含む。いくつかの態様において、ＳＰＴＢのリスクを評価することは、ＳＰＴＢのリスク割合を割り当てることを含む。
【００８１】
ある態様において、本発明の方法は、妊娠中の対象が、妊娠３７〜３８週の間のＳＰＴＢを有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠中の対象が、妊娠３７週またはそれ以前にＳＰＴＢを有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠中の対象が、妊娠３６週またはそれ以前にＳＰＴＢを有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠中の対象が、妊娠３５週またはそれ以前にＳＰＴＢを有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠中の対象が、妊娠３４週またはそれ以前にＳＰＴＢを有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠中の対象が、妊娠３３週またはそれ以前にＳＰＴＢを有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠中の対象が、妊娠３２週またはそれ以前にＳＰＴＢを有する可能性が高いことを示す。
【００８２】
数値的に増加したリスクは、早産について、１．０を超えるハザード比、好ましくは１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３．０を超えるハザード比に関連する。
【００８３】
タンパク質バイオマーカーの検出
バイオマーカーは、当技術分野で公知の何らかの方法によって検出および定量することができる。これには、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、質量分析、電気泳動および表面プラズモン共鳴が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
ある態様において、ＳＰＴＢバイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方のレベルを検出すること（例えば、存在を検出することを含む）は、抗体ベースの方法を用いて行われる。好適な抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ウェスタンブロットおよび抗体マイクロアレイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
ある態様において、ＳＰＴＢバイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方のレベルを検出すること（例えば、存在を検出することを含む）は、無傷のタンパク質の検出、またはペプチドフラグメントなどのタンパク質のサロゲートの検出を含む。ある態様において、（例えば、サンプルが初産婦である妊娠中の対象由来であるとき）表１４Ａに示すペプチドフラグメントの１以上が検出される。ある態様において、表１４Ｂに示すペプチドフラグメントの１以上が検出される。
【００８６】
イムノアッセイ法は、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチアッセイおよびウェスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、抗体マイクロアレイ、ドットブロッティングおよびＦＡＣＳを含む。
【００８７】
クロマトグラフィー法は、例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー／ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを含む。
【００８８】
ある態様において、マイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出することは、質量分析（ＭＳ）ベースのプロテオーム分析（例えば、液体クロマトグラフィー質量分析ＬＣ／ＭＳ）を用いて行われる。例示的態様において、この方法は、サンプルに対してサイズ排除クロマトグラフィーを行い、高分子量画分を集めて（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより）、マイクロ粒子に富むサンプルを得ることを含む。その後、該マイクロ粒子に富むサンプルを（例えば、カオトロピック試薬、変性剤、還元剤および／またはアルキル化剤を用いて）破壊し、放出された内容物をタンパク質分解する。分解された調製物は、複数のペプチドを含む。
【００８９】
サンプル中のタンパク質は、質量分析により検出され得る。質量分光計は、一般的に、分析対象物をイオン化するためのイオン源と、質量を決定するための１以上の質量分析器を備えている。イオン化法には、とりわけ、エレクトロスプレー法またはレーザー脱離法が含まれる。
【００９０】
選択された反応モニタリング法は、第一の質量分析器で目的のポリペプチド（前駆体）を選択し、衝突セルでポリペプチドを生成ペプチドフラグメントに断片化し、第２の質量分析器で１つ以上のペプチドフラグメントを検出する質量分析方法である。ポリペプチドの複数のフラグメントを分析する場合、この方法は多重反応モニタリング質量分析（ＭＲＭ／ＭＳ）と称される。通常、タンパク質サンプルは、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で消化し、ペプチドフラグメントを生成する。これらのペプチドのいくつかの重同位体標識類縁体を、同位体標準として合成される（例えば、表１５Ａおよび１５Ｂ）。同位体標識参照ペプチド（本明細書中、互換的に同位体標準、安定同位体標準ペプチド、安定同位体標準、およびＳＩＳと称される）を、プロテアーゼ処理したサンプルと混合する。混合物を質量分析にかける。安定同位体標準（ＳＩＳ）の娘イオンに対応するペプチドおよび目的のペプチドを、時間領域または質量領域のいずれかで高精度に検出する。通常、親イオンの存在を明確に識別するために複数の娘イオンが用いられ、通常、最も豊富な娘イオンの１つを定量に用いる。ＳＩＳペプチドは、注文に応じて合成することも、または例えば、ThermoFisher (Waltham、MA)もしくはBiognosys (Zurich、Switzerland)などの供給者から市販キットとして入手することもできる。
【００９１】
アッセイは、目的の分析物（例えば、分析物ペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチド）に対応するが、安定同位体を含むことによって異なる、標準物質を含み得る。安定同位体標準物質を、正確なレベルでアッセイに組み込み、対応する未知の分析物の定量に用い得る。特異性のさらなるレベルは、未知の分析物とその対応するＳＩＳの共溶出、およびそれらの遷移の特性（例えば、分析物の２つの遷移レベルの比率とその対応するＳＩＳの２つの遷移の比率の類似性）によってもたらされる。
【００９２】
従って、ＭＲＭ−ＭＳによるタンパク質標的の検出は、一般的には、ペプチドフラグメントが比較される安定同位体参照ペプチドの検出を介して、タンパク質の１以上のペプチドフラグメントの検出を含む。一般的に、ＳＩＳはそれ自体、元の消化されたフラグメントと同様に、衝突セルで断片化され、これらのフラグメントの１以上が質量分析計によって検出される。
【００９３】
バイオマーカーペプチド分析に適する質量分析アッセイ、機器およびシステムには、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦポストソース分解（ＰＳＤ）;ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ；表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）；ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）n（ｎはゼロより大きい整数）；ＥＳＩ ３Ｄまたは線形（２Ｄ）イオントラップＭＳ；ＥＳＩトリプル四重極型ＭＳ；ＥＳＩ四重極直交型ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）；ＥＳＩフーリエ変換ＭＳシステム；シリコン上の脱離/イオン化（ＤＩＯＳ）法；二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）；大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）；ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ；イオン移動度分析（ＩＭＳ）；誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）；ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ；および、ＡＰＰＩ−（ＭＳ）ｎが含まれるが、これらに限定されない。タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）配置におけるペプチドイオン断片化は、例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）などの当技術分野で既知の技術を用いて達成することができる。本明細書に記載のように、質量分析によるバイオマーカーの検出および定量化は、とりわけ、Ｋｕｈｎらの、Proteomics 4:1175-1186(2004)により記載される複数反応モニタリング（ＭＲＭ）を含み得る。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析中に計画された複数反応モニタリング（計画されたＭＲＭ）モード取得により、ペプチド定量の感度および精度が向上する。Anderson and Hunter (2006) Mol. Cell. Proteomics 5(4):573-588。質量分析に基づくアッセイは、例えば本明細書に記載のタンデムカラムシステムなどの上流のペプチドまたはタンパク質の分離または分画法と有利に組み合わせることができる。
【００９４】
ある態様において、ＳＰＴＢバイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方のレベルを検出すること（例えば、存在を検出することを含む）は、質量分析（ＭＳ）ベースのプロテオミクス分析、例えば液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）ベースのプロテオミクス分析を用いて行われる。例示的態様において、該方法は、サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供し、高分子量画分を収集して、マイクロ粒子に富むサンプルを得る工程を含む。次に、マイクロ粒子に富むサンプルを抽出してから、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）で消化して、複数のペプチドを含む消化されたサンプルを得る。次いで、消化されたサンプルをペプチド精製／濃縮工程に付し、その後、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を行い、サンプルのプロテオミクスプロファイルを得ることができる。ある態様において、精製／濃縮工程は、逆相クロマトグラフィー（例えば、Millipore Corporation（Billerica, MA）より市販の０．２μＬのＣ１８樹脂を含むＺＩＰＴＩＰピペットチップ）を含む。
【００９５】
表１４Ａは、検出され得る例示的なペプチドを示し、本明細書に記載の例示的な４つのタンパク質パネル（ＴＲＦＥ、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４およびＬＣＡＴ）または各個々のタンパク質を検出する。ある態様において、パネルは、ＭＳ／ＭＲＭを用いて検出される。ある態様において、パネルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭを用いて検出される。
【００９６】
例示的態様において、本発明は、妊娠中の対象のＳＰＴＢのリスクを評価する方法であって、（ａ）妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製し；および、（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定すること（ここで、パネルは、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含む）を含む方法を提供する。ある態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のペプチドは、ＭＳ、ＭＳ／ＭＲＭまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭを用いて検出される。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルである。ある態様において、サンプルは、妊娠８−１４週または１０−１２週、または妊娠第１三半期にある妊娠中の対象から採取される。ある態様において、妊娠中の対象は初産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は初妊婦である。
【表７】
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【００９７】
表１４Ｂは、検出され得る例示的なペプチドを示し、本明細書に記載の例示的な５つのタンパク質パネル（Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＩＴＩＨ２およびＬＣＡＴ）または各個々のタンパク質を検出する。ある態様において、パネルは、ＭＳ／ＭＲＭを用いて検出される。ある態様において、パネルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭを用いて検出される。
【００９８】
１つの例示的態様において、本発明は、妊娠中の対象のＳＰＴＢのリスクを評価するための方法であって、（ａ）妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製すること；および、（b）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定すること（ここで、該パネルが、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含む）を含む方法を提供する。ある態様において、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２に示されるペプチドは、ＭＳ、ＭＳ／ＭＲＭまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭを用いて検出される。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルである。ある態様において、サンプルは、妊娠８−１４週または１０−１２週、または妊娠第１三半期にある妊娠中の対象から採取される。ある態様において、妊娠中の対象は初産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は初妊婦である。ある態様において、妊娠中の対象は経産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は経妊婦である。
【００９９】
【表８】
2021512318.tif 000010
【０１００】
本明細書で提供される、ＭＳ、ＭＳ／ＭＲＭまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭによるバイオマーカーの検出は、一般的には、ペプチドフラグメントが比較される安定同位体対照ペプチドの検出を介して、タンパク質の１以上のペプチドフラグメントの検出を含む。
【０１０１】
表１５Ａは、本発明の４つのタンパク質パネル（ＴＲＦＥ、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４およびＬＣＡＴ）を検出するためのＬＣ−ＭＣＳ ＭＲＭモードで用いられる例示的な同位体標識された対照ペプチド（同位体標準）を示す。
【０１０２】
例示的態様において、本発明は、タンパク質パネルを測定するための方法であって、（ａ）対象の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程、および（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程（ここで、パネルは、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含み、決定工程は、タンパク質のサロゲートペプチドを測定することを含む）、を含む方法を提供する。ある態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のペプチドは、例えばＭＳ、ＭＳ／ＭＲＭまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭを用いて検出される。ある態様において、該方法は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の同位体標識された対照ペプチドを用いることをさらに含む。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルである。ある態様において、サンプルは、妊娠８〜１４週、または１０〜１２週目、または妊娠第１三半期の妊娠中の対象から採取される。ある態様において、妊娠中の対象は、初産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は初妊婦である。
【０１０３】
例示的態様において、本発明は、妊娠中の対象のＳＰＴＢのリスクを評価する方法であって、（ａ）妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および、（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程（ここで、パネルは、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ４、ＴＲＦＥおよびＬＣＡＴを含み、決定工程は、タンパク質のサロゲートペプチドを測定することを含む）、を含む方法を提供する。ある態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のペプチドは、ＭＳ、ＭＳ／ＭＲＭまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭを用いて、ならびに配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の同位体標識された対照ペプチドを用いて検出される。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルである。ある態様において、サンプルは、妊娠８−１４週または１０−１２週、または妊娠第１三半期にある妊娠中の対象から採取される。ある態様において、妊娠中の対象は初産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は初妊婦である。
【０１０４】
【表９】
2021512318.tif 000011
【０１０５】
表１５Ｂは、本発明の５つのタンパク質パネル（Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＩＴＩＨ２およびＬＣＡＴ）を検出するためのＬＣ−ＭＣＳ ＭＲＭモードで用いられる例示的な同位体標識された対照ペプチド（同位体標準）を示す。
【０１０６】
例示的態様において、本発明は、タンパク質パネルを測定するための方法であって、（ａ）妊娠中の対象の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程、および（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程（ここで、パネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含む）、を含む方法を提供する。ある態様において、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２のペプチドは、ＭＳ、ＭＳ／ＭＲＭまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭを用いて検出される。ある態様において、該方法は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識された対照ペプチドを用いることをさらに含む。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルである。ある態様において、サンプルは、妊娠８〜１４週、または１０〜１２週目、または妊娠第１三半期の妊娠中の対象から採取される。ある態様において、妊娠中の対象は、初産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は初妊婦である。ある態様において、妊娠中の対象は経産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は経妊婦である。
【０１０７】
例示的態様において、本発明は、妊娠中の対象のＳＰＴＢのリスクを評価する方法であって、（ａ）妊娠中の対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および、（ｂ）画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量値を決定する工程（ここで、パネルは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣＩ、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含む）、を含む方法を提供する。ある態様において、配列番号５、配列番号６、配列番号１、配列番号７および配列番号２のペプチドは、ＭＳ、ＭＳ／ＭＲＭまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭを用いて、ならびに配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識された対照ペプチドを用いて検出される。ある態様において、血液サンプルは血漿サンプルである。ある態様において、サンプルは、妊娠８−１４週または１０−１２週、または妊娠第１三半期にある妊娠中の対象から採取される。ある態様において、妊娠中の対象は初産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は初妊婦である。ある態様において、妊娠中の対象は経産婦である。ある態様において、妊娠中の対象は経妊婦である。
【０１０８】
【表１０】
2021512318.tif 000012
【０１０９】
ある態様において、本発明は、ペプチドバイオマーカー、例えば、バイオマーカータンパク質のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）消化により産生されたペプチドに対応する１以上の安定同位体対照ペプチドを含むキットである。 
【０１１０】
例示的な態様において、本発明は、初産婦である妊娠中の対象においてＳＰＴＢの検出に用いるためのキットであって、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の同位体標識された対照ペプチドおよび取扱説明書を含むキットを提供する。
【０１１１】
例示的態様において、本発明は、初産婦または経産婦である妊娠中の対象においてＳＰＴＢの検出に用いるためのキットであって、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９の同位体標識された対照ペプチドおよび取扱説明書を含むキットを提供する。
【０１１２】
例示的態様において、本発明は、複数のタンパク質ペプチドおよび複数の同位体標識された対照ペプチドを含む組成物であって、ここで、該タンパク質ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４を含むか、またはそれらからなり、該同位体標識された対照ペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１を含むか、またはそれらからなる、組成物を提供する。
【０１１３】
別の例示的態様において、本発明は、複数のタンパク質ペプチドおよび複数の同位体標識された対照ペプチドを含む組成物であって、ここで、該タンパク質ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６および配列番号７を含むか、またはそれらからなり、該同位体標識された対照ペプチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９を含むか、またはそれらからなる、組成物を提供する。
【０１１４】
例示的態様において、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の早産のタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数のそれぞれの１つまたは複数のペプチドフラグメント、および（ｉｉ）１つまたは複数のペプチドフラグメントのそれぞれに対するアミノ酸配列を有する１つまたは複数の同位体標識された対照ペプチド（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に対応する標準ペプチド；または、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９に対応する標準ペプチド）を含み、ここで、各ペプチドフラグメントおよび同位体標識された対照ペプチドが、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのプロテアーゼ消化によって産生されたペプチドフラグメントに対応するアミノ酸配列を有する、組成物を提供する。一態様において、組成物は、マイクロ粒子に富み、プロテアーゼ消化されたサンプルからのペプチドフラグメントを含む。別の態様において、同位体標識された対照ペプチドのうちの１以上は、表１５Ａおよび表１５Ｂから選択される。さらに、本発明は、（ａ）生物学的サンプルのマイクロ粒子に富む画分からタンパク質を含むサンプルを提供すること；（ｂ）タンパク質のプロテアーゼ消化により、ペプチドフラグメントを産生すること；および、（ｃ）ペプチドフラグメントを、１つまたは複数のペプチドフラグメントのそれぞれに対するアミノ酸配列を有する１つまたは複数の同位体標識された対照ペプチド（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に対応する標準ペプチド；または、配列番号１２、配列番号１３、配列番号８、配列番号１４および配列番号９に対応する標準ペプチド）に接触させること、ここで、各同位体標識された対照ペプチドは、本明細書に記載の１つまたは複数の早産のタンパク質バイオマーカーのプロテアーゼ消化により産生されたペプチドフラグメントに対応するアミノ酸配列を有する、を含む方法を提供する。
【０１１５】
分類アルゴリズム
ＳＰＴＢのリスクを評価する方法は、本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーの少なくとも１つの定量値を含む情報に基づいて、ＳＰＴＢのリスクが高い対象を分類することを含み得る。分類には、分類アルゴリズムまたはモデルを用いることができる。線形および非線形モデル（例えば、ＣＡＲＴ分類および回帰木などのプロセス）、バックプロパゲーションネットワークなどの人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、Bayesian分類器またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類器およびサポートベクター分類器（例えば、サポートベクター機器）などの多くのタイプの分類アルゴリズムが、この目的に好適である。カットオフなどの特定の分類値（classifier）は、ヒトの検査によって実行することができる。多変量分類などの他の分類値は、コンピューターに分類アルゴリズムを実行させる必要がある。
【０１１６】
分類アルゴリズムは、１つまたは別のグループに分類された対象から導出されたバイオマーカー測定のデータセットの分析を実行する機械学習アルゴリズムを含む、数学的分析によって作成され得る。上記の分類アルゴリズムのタイプを作成するものを含む、多くの機械学習アルゴリズムが当技術分野で公知である。
【０１１７】
診断検査は、感度（真の陽性である、陽性と分類された割合）および特異性（真の陰性である、陰性と分類された割合）により特徴付けられる。診断検査の相対的な感度と特異性には、トレードオフが関係している可能性があり、感度が高いほど特異性が低くなり、特異性が高いほど、感度が低くなることを意味する。これらの相対値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線上に表示することができる。バイオマーカーなどの一連の変数の診断力は、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）によって反映される。
【０１１８】
いくつかの態様において、本明細書に記載の分類は、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、または少なくとも９９%の感度を有する。本明細書に記載の分類値は、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９または少なくとも０．９５のＡＵＣを有する。
【０１１９】
自然早産のリスクを低減する方法
一態様において、妊娠している対象が、ＳＰＴＢのリスクが高いと判定されたとき、適切な処置プランが用いられ得る。例として、頚管縫縮術のような外科的介入およびプロゲステロン補充は、早産を予防するのに有効であることが示されている（Committee on Practice Bulletins, Obstetrics ＆ Gynecology, 120:964−973, 2012)。いくつかの態様において、ヘルスケアの専門家によって、外来回数の増加のような有リスク・プロトコールへの切り替え、および／または高リスク患者に対処するために特別に訓練された医師への患者の紹介などの他の手段が取られる。いくつかの態様において、妊娠している対象が、ＳＰＴＢのリスクが高いと判定されたとき、妊娠している対象が、ＮＩＣＵ施設にアクセスし、地方の患者のためのそのような施設へのアクセス計画を立てることのようなステップが取られ得る。さらに、妊娠している対象および家族は、胎児フィブロネクチン検査（診断）およびコルチコステロイド（例えば、乳児の肺発達）および硫酸マグネシウム（例えば、乳児の神経保護の目的）などの急性期症候性介入のより詳しい知識を得ることができる。さらに、妊娠している対象は、食事療法、禁煙および医師からの他の助言に従うようにモニターされ得る。
【０１２０】
ある態様において、妊娠している対象は、プロゲステロン補充療法を受ける。現在、再発性ＳＰＴＢの予防のためのプロゲステロン補充は、単胎妊娠かつＳＰＴＢの既往を有する女性；およびＳＰＴＢの既往がなく、偶発的に検出された顕著に短い子宮頸管長（１５ｍｍ未満）の女性に適用される。本発明は、プロゲステロン補充が有益であり得る、さらなる妊婦を同定するためのツールを提供する。これらの対象には、リスクの既往がなく、偶発的に検出された顕著に短い子宮頸管長の初妊婦である妊婦；および、経妊婦であるが、以前にＳＰＴＢはなかった妊婦が含まれる。
【０１２１】
早産のリスクが高いと判定された妊娠中の対象は、妊娠３６週まで（例えば、同定時、または妊娠１６週までの間、０日から２０週までの間、６日から妊娠３６週まで)、プロゲステロンを受容するよう勧められるか、またはプロゲステロンを投与される。いくつかの態様において、プロゲステロン補充は、毎週２５０ｍｇの筋肉内注射を含む。例示的態様において、毎週のプロゲステロン補充は、ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステルの注射による投与を含む。他の態様において、プロゲステロン補充は、毎日５０〜３００ｍｇ、７５〜２００ｍｇまたは９０〜１１０ｍｇの用量で、プロゲステロンを経膣投与することを含む。
【０１２２】
別の態様において、早産のリスクが高いと判定された単胎妊娠女性で、妊娠３４週未満でのＳＰＴＢの既往、かつ妊娠２４週より前に短い子宮頸管長（２５ｍｍ未満）が記録されている女性では、頚管縫縮術（頚椎縫合または子宮頸部縫合としても公知）を受けるか、または行われることが推奨される。いくつかの態様において、頚部の外科手術は、マクドナルド外科手術であり、他の態様では、Shirodkarの外科手術または腹部外科手術である。
【０１２３】
従って、本発明は、妊娠している対象のＳＰＴＢのリスクを低減する、および／またはＳＰＴＢの新生児合併症を軽減する１つの方法であって、本発明の方法に従い妊娠している対象のＳＰＴＢのリスクを評価し、ＳＰＴＢのリスクを減少させる、および／またはＳＰＴＢの新生児合併症を軽減するために、治療剤を投与すること、改善されたケア管理プロトコールを処方すること、胎児フィブロネクチン検査を実施すること、コルチコステロイドを投与すること、硫酸マンガンを投与すること、あるいは対象のモニタリングおよび監視を有効な回数に増加させること、を含む方法を提供する。いくつかの態様において、治療剤は、ホルモン剤およびコルチコステロイドからなる群より選択される。いくつかの態様において、治療剤は、経膣プロゲステロンまたはカプロン酸１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンエステル非経腸製剤を含む。
【０１２４】
キット
別の態様において、サンプル中の、ＳＰＴＢバイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方を検出可能とする試薬のキットを提供する。タンパク質バイオマーカーを検出することができる試薬には、抗体が含まれるが、これに限定されない。タンパク質バイオマーカーを検出することができる抗体はまた、一般的に、フルオロフォアまたは酵素などの分子に直接的または間接的に結合されて、それは検出可能な反応を触媒することができ、試薬のそれぞれの標的への結合を示す。
【０１２５】
いくつかの態様において、キットはさらに、血漿からのマイクロ粒子に富むサンプルの迅速な調製のために、低容量（例えば、１ｍｌ）の垂直カラム中の高分子量ゲル濾過組成物を含むサンプル処理材（例えば、セファロースのようなアガロース）を含む。例えば、マイクロ粒子に富むサンプルは、凍結およびさらなる処理のための分析施設への輸送の前の準備段階で、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより、調製され得る。
【０１２６】
いくつかの態様において、キットは、ＳＰＴＢのリスクを評価するための指示書をさらに含む。本明細書で用いる用語“指示書”とは、対象からのサンプル中の目的のタンパク質（複数可）の存在を検出するための（発現レベルを判定することを含む）キットに含まれる試薬の使用に関する指示を意味する。目的のタンパク質は、ＳＰＴＢバイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方を含み得る。いくつかの態様において、指示書は、インビトロでの診断製品を標識する際に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって要求される目的用途に関する記述をさらに含む。ＦＤＡは、インビトロ診断を医療機器として分類し、５１０（ｋ）申請で承認されることを要求している。５１０（ｋ）申請に必要な情報には、以下のものが含まれる：１）機器の商品名または商標名、一般名または通常名、および分類名を含む、インビトロ診断製品名；２）製品の使用目的；３）該当する場合、５１０（ｋ）申請書を提出した所有者または事業者の施設登録番号；ＦＤ＆Ｃ法のセクション５１３に該当する場合にはインビトロ診断製品のクラス、既知の場合は適切なパネル、または所有者もしくは事業者が、その機器がかかるセクションに分類されていないと判断した場合は、その決定状況およびインビトロ診断製品がそのように分類されていないと判断するための根拠；４）適用可能な場所に、写真または製品図面を含む、インビトロ診断製品を記述するのに十分な要求される添付文書および製品広告、その使用用途、ならびに使用説明書；５）その機器が、米国における商品流通において同等なタイプの他のインビトロ診断製品と類似している、および／または異なることを示す文書、該文書を支持するデータを添付；６）実質的等価性判定の基礎となる安全性および有効性データの５１０（ｋ）概要；または、実質的同等性に関するＦＤＡの承認を支持する該５１０（ｋ）安全性および有効性情報が、書面による請求から３０日以内に利用可能となる旨の書面；７）提出者が、彼らが知る限り、上市前報告書で提出された全てのデータおよび情報が真実かつ正確であり、重大な事実が省略されていないと、宣誓する書面；ならびに、８）ＦＤＡが実質的同等の判断を下すのに必要なインビトロ診断製品に関するさらなる情報。
【０１２７】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに完全に理解され得る。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例および態様は、例示の目的のみであることが理解される。
【実施例】
【０１２８】
実施例
略語：ＡＵＣ（曲線下面積）；ＣＩ（信頼区間）；ＣＭＰ（循環マイクロ粒子）；ＤＤＮ（Differential Dependency Network）；ＦＤＲ（偽発見率）；ＬＣ（液体クロマトグラフィー）；ＬＭＰ（最後の月経期間）；ＭＲＭ（多重反応モニタリング）；ＭＳ（質量分析）；ＲＯＣ（受信者動作特性）；ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）；ＳＰＴＢ（自然早産）；およびＴＥＲＭ（満期産）。
【０１２９】
実施例１：試験１−妊娠１０〜１２週の間に得られたサンプル中のＳＰＴＢバイオマーカーの同定
この実施例は、前向き研究で集められた出産コホートの一部として妊娠１０〜１２週の間に得られた血漿サンプルを利用する研究を記載している。３４週以前のＳＰＴＢの単胎ケースを、３７週以降の合併症のない出産と、サンプリング時の母体年齢、人種および妊娠期間を合わせた。妊娠第１期サンプルからの循環マイクロ粒子（ＣＭＰ）を単離し、その後、タンパク質バイオマーカーを同定するために多重反応モニタリング質量分析法（ＭＲＭ−ＭＳ）により分析した。３４週より前のＳＰＴＢを、その妊娠期間中における新生児罹患率の増加を考慮して評価した。
【０１３０】
材料および方法
臨床データおよび試料片採取。臨床データおよび母体のＫ２−ＥＤＴＡ血漿サンプル（妊娠１０〜１２週）が、前向き研究で集められたLIFECODES出産コホートの一部として、２００９−２０１４年にBrigham and Women's Hospital（BWH）（Boston、MA）で採取され、−８０℃で貯蔵された。適格基準には、妊娠１５週未満で妊婦管理を開始し、ＢＷＨでの出産を計画している、１８歳以上の患者が含まれる。除外基準には、既存の医学的障害および胎児の異常が含まれた。妊娠期間は、妊娠１２週以前の超音波スキャンで確認された。最後の月経周期（ＬＭＰ）と一致するとき、ＬＭＰを用いて妊娠期間を決定した。一致しないとき、妊娠期間は最も早く利用可能な超音波検査によって設定された。満期産は妊娠３７週より後と定義され、この調査の目的のための早産は、３４週以前のＳＰＴＢと定義された。全ての症例は独立して検討され、２人の母体胎児認定専門医によって検証された。妊娠結果または特徴の不一致が生じたとき、その症例は再検討され、最終的な特徴付けを決定するためのコンセンサス会議が開かれた。３４週以前のＳＰＴＢの２５例の単胎症例は、サンプリングの母体の年齢、人種および妊娠期間（±２週間）による２つの対照出産と一致させた。
【０１３１】
ＣＭＰ富化。血漿サンプルを、David H マードック研究所（DHMRI, Kannapolis, NC）にドライアイスで冷却しながら輸送し、サンプル処理および症例／対照状態を試験する実験者も盲検化するために無作為化した。ＣＭＰを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって富化し、水（ＲＮＡｓｅ不含有、ＤＮＡｓｅ不含有、蒸留水）を用いて均一濃度（isocratically）で溶出した。要するに、ＰＤ−１０カラム（GE Healthcare Life Sciences）に、ＡＢＴ（Miamim, FL）の２％アガロースビーズ標準（孔径５０−１５０ｕｍ）１０ｍＬを充填し、洗浄し、最短で２４時間４℃にて貯蔵し、３日以内に使用した。使用する日に、カラムを再度洗浄し、１ｍＬの解凍されたそのまま（neat）の血漿サンプルをカラムに適用した。すなわち、血漿サンプルは、ＳＥＣの前に濾過、希釈または処理されなかった。
【０１３２】
循環マイクロ粒子はカラムのボイドボリューム中に捕捉され、高濃度のタンパク質ピークから一部分分離された（Ezrin et al., Am J Perinatol, 32:605−614, 2015）。サンプルは、個々のサンプル処理間の変動性を最小にするために４日間に亘って１５〜２０バッチで処理された。２００μｇの総タンパク質（ＢＣＡによって決定される）を含む各臨床標本からの集められたＣＭＰカラム画分の１つのアリコートを２ｍＬの微量遠心管（ＶＷＲ）に移し、プロテオーム分析のためにドライアイスで冷却しながらBiognosys（Zurich、Switzerland）に輸送した。
【０１３３】
液体クロマトグラフィー−質量分析。定量的プロテオーム液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を、Biognosys AGによって行った。要するに、各サンプルについて、２０μｇの全タンパク質を凍結乾燥させ、次いで８Ｍ 尿素で変性させ、ジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシン（Promega）で一晩消化した。得られたサンプルペプチドを、SpeedVacシステムを用いて乾燥させて、４５μＬのBiognosys ＬＣ溶媒中に再溶解し、Biognosys iRTキットを含むBiognosys PlasmaDive （拡張バージョン２．０）安定同位体標識対照ペプチド混合物と混合した。
【０１３４】
その後、全タンパク質１μｇを、インハウスパックＣ１８カラム（内径７５μｍ、カラム長１０ｃｍ、New Objective)に注入した；カラム材料は、Thermo Scientific Easy nLC ナノ液体クロマトグラフィーシステム上のMagic AQ（Michromの、３μｍ粒径、２００Å孔サイズ）であった。ＬＣ−ＭＳ−ＭＲＭアッセイを、標準ナノエレクトロスプレー供給源を備えたThermo Scientific TSQ Vantage トリプル四重極質量分光計で測定した。ＬＣ−ＭＳ−ＭＲＭのＬＣ勾配は、５−３５％溶媒Ｂ（０．１％ ＦＡ含有、９７％アセトニトリル水溶液）で３０分、その後３５−１００％溶媒Ｂで２分、および１００％溶媒Ｂで８分であった（全勾配の長さは４０分であった）。サンプル間のペプチドの定量化のために、ＴＳＱ Vantageを、３．２５分の捕捉ウィンドウ長を含むスケジュールされたＭＲＭモードで実行した。ＬＣ溶離剤を、１．９ｋＶでエレクトロスプレーし、Ｑ１を単位分解能（０．７Ｄａ）で実行した。シグナル処理およびデータ分析を、mProphet （Reiter et al., Nature Methods, 8:430−435, 2011）に基づく多重化ＭＲＭデータ分析のためのSpectroDive（商標） Biognosyのソフトウェアを用いて行った。１％のＱ値フィルターを適用した。タンパク質濃度を、ＬＣ／ＭＳに注入された標準化タンパク質１μgに基づいて決定した。
【０１３５】
統計分析。ＳＰＴＢと満期産対照（term delivery）とを区別する有益な分析物を選択するために、処理されたタンパク質定量データを、初めに、単変量受信者作動特性（ＲＯＣ）曲線分析にかけた（Fawcett, Pattern Recognition Letters, 27:861−874, 2006；および、Robin et al., BMC Bioinformatics, 19:12:77, 2011)。サンプルラベルパーミュテーション（Sample Label Permutation）により得られた０（null）に対するブートストラップ再サンプリングを、偽発見率（ＦＤＲ）を管理するために用いた（Carpenter and Bithell, Statistics in Medicine, 19:1141−1164, 2000；および、Xie et al., Bioinformatics, 21:4280−4288, 2005）。要するに、各タンパク質について、元データからのブートストラップサンプルについてＲＯＣ分析を繰り返し、面積下曲線（ＡＵＣ）の平均および標準偏差（ＳＤ）を推定した。その後、ブートストラップ手順を、同じデータに再度適用したが、サンプルＳＰＴＢステータスラベルは無作為に並べ替えられて適用した。permutation分析は、ＦＤＲを制御し、候補タンパク質バイオマーカーの選択中に複数の比較を調整するために０結果を提供した。次いで、タンパク質間でＳＰＴＢ表現型依存性高次同時発現パターンを抽出するために、Differential Dependency Network （ＤＤＮ） バイオインフォマティクスツールを適用した（Tian et al., Bioinformatics, 32:287−289, 2015）。さらなるバイオインフォマティクスツールであるBiNGOを用いて、観察されたプロテオーム脱調節とＳＰＴＢとの間の機能的関連を探索するために、ＤＤＮサブネットワークにおいて過剰に提示された遺伝子オントロジーカテゴリーを同定した（Maere et al., Bioinformatics, 21:3448−3449, 2005）。選択されたタンパク質間の相補的な値および潜在的な臨床的に関連する性能の範囲を評価するために、多変量線形モデルを導出し、ブートストラップ再サンプリングを用いて評価した。
【０１３６】
結果
サンプルセットの特性および臨床的特徴を表３に示す。妊婦の年齢、人種、ボディマス指数（ＢＭＩ）、公的保険の使用、妊娠中の喫煙、入院時の妊娠週数は両群で同等であった。母親の教育レベルは対照群で高く、ＳＰＴＢ症例の大部分は初産である傾向があった。
【０１３７】
【表１１】
2021512318.tif 000013
【０１３８】
標的とされたＭＲＭを介して評価された１３２個のタンパク質を、ＳＰＴＢと満期産とを区別する能力について個別に評価した。各候補タンパク質の平均ブートストラップＡＵＣが、０より顕著に大きく（ラベルパーミュテーションで推定される平均ブートストラップＡＵＣの平均＋ＳＤ以上であり）、ブートストラップＡＵＣの分散が大きいタンパク質を排除することを必要とすることにより、１３２個のタンパク質のうち６２個は、ＳＰＴＢの検出に対するロバスト(robust)性を実証した（図１の右下部分)。対照的に、サンプルラベルパーミュテーションと同じ基準を用いて、たった１２個のタンパク質が選択された。従って、タンパク質選択の推定ＦＤＲは、２０％未満であった（１２／６２）。これらの６２個のタンパク質を、さらなる多変量分析の候補として考慮した。表４は、ＳＰＴＢ症例 対 ＴＥＲＭ対照において下方制御（−）されたタンパク質、またはＳＰＴＢ症例 対 ＴＥＲＭ対照において上方制御（＋）されたタンパク質の性能値を提供する。ｐ値、ＡＵＣおよび感度が６５％に固定されたときの特異性は、ＡＵＣでランク付けされたバイオマーカーについて最高から最低まで示される。
【０１３９】
【表１２】
2021512318.tif 000014
【表１３】
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【０１４０】
個別に、６２個中２５個のタンパク質が、ＳＰＴＢと満期産対照とを区別するために、最も低いｐ値（≦０．１０）および最も高いＡＵＣ（≧０．６１８）を有していた（表５）。
【０１４１】
【表１４】
2021512318.tif 000016
【０１４２】
６２個の選択されたタンパク質間のDifferential Dependency Network（ＤＤＮ）分析は、多くのＳＰＴＢ表現型関連共発現パターンを同定した（図２）。炎症、創傷治癒、凝固カスケード、およびステロイド代謝のような多くの遺伝子オントロジーカテゴリーが、ＤＤＮ分析共発現サブネットワーク間で過剰に提示された。表６は、識別可能な対相関の上位のリストを提供する（ｐ値＜０．００１−０．０６９）。ＤＤＮサブネットワークを形成する合計２０個のユニークなタンパク質が存在した。対相関のいくつか（CBPN−TRFE、CPN2−TRFE、A1AG1−MBL2）は、ＳＰＴＢ症例よりむしろＴＥＲＭ対照に包含されるマーカーであり、ＳＰＴＢに対する防御を示唆していた。
【０１４３】
【表１５】
2021512318.tif 000017
【０１４４】
利用可能なサンプルサイズに基づいて、かつ過学習を避けるために、臨床的に関連する性能を評価するために線形モデルのみを評価し、変数は、表６の２０個のタンパク質のうち２個または３個のタンパク質の全ての可能な組合せに限定された（１３３０モデル）。各モデルは、８０％の固定された感度でＲＯＣ ＡＵＣの中央値（９０％ＣＩ）および特異性を推定するために、２００ブートストラップ再サンプリングデータを用いて導き出され、評価された。ＡＵＣおよび特異性の９０％ ＣＩの下限に関して、上位２０のモデルをそれぞれ表７および表８に示す。サンプルサイズによって制限が与えられた場合、モデルは、独立したサンプルセットで試験できなかった。これを補うために、学習データセットにおけるパネルの性能に関するＣＩを、反復ブートストラップ分析によって推定した。表７は、感度を８０％に設定したときに、最良の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する複数のトリプレックスを示す。表８は、感度を８０％に設定したときに、最良の特異性を有する試験１の複数のトリプレックスを示す。
【０１４５】
【表１６】
2021512318.tif 000018
【０１４６】
【表１７】
2021512318.tif 000019
【０１４７】
上位２０モデルのパネルに含まれるＤＤＮ分析からの個々のタンパク質の頻度を評価した。最も頻出したタンパク質バイオマーカーは、ＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥであった（図３）。２つの３タンパク質パネルを用いた例示的な線形モデルについての感度および特異性をプロットすることにより、ＲＯＣ曲線およびＡＵＣを決定した（図４Ａおよび図４Ｂ）：Ａ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２（図４Ａ）ならびにＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥ（図４Ｂ）。
【０１４８】
明らかな単一分析物ＡＵＣを有するタンパク質バイオマーカー（複数）を、多重化候補として評価するためにも選択した：ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥ。上位２０の５〜８個のマーカーパネルは、線形モデルおよびブートストラップ再サンプリングを用いて推定された７５％感度でのＡＵＣおよび特異性に基づいた。
【０１４９】
【表１８】
2021512318.tif 000020
【０１５０】
性能基準には、ｐ値、７５％感度での特異性およびＲＯＣ分析からのＡＵＣが含まれる。各基準について、ブートストラップ推定９５％信頼区間（５％ＣＩ、９５％ＣＩ）および中央値（５０％ＣＩ）に対応する３つの数がある。
【０１５１】
図４Ｃは、２０ＤＤＮマーカー（＝２５７７５４パネル）の５〜８バイオマーカーパネル（５〜８タンパク質のマルチプレックス)×２００ブートストラップ試行からの上位１０００パネル（８０％感度での、特異性の５％に基づく）における、マーカー編入頻度を示す。Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥの、６つのマーカーは、最高の頻度を示す。
【０１５２】
結論
ＳＰＴＢ症例において妊娠１０〜１２週までに特徴的な発現プロフィールを示す、いくつかの臨床的に関連する生物学的プロセスに関与する多数のタンパク質バイオマーカーが同定された。同定されたタンパク質バイオマーカーは、凝固、線維素溶解、免疫調節および補体系に関連する相互関連生物学的ネットワークに主に関与している（表１０）。これらのシステムは、順々に、獲得免疫との相互作用および成功裏の妊娠を継続するのに必要な炎症プロセスの介在を有すると考えられている。
【０１５３】
【表１９】
2021512318.tif 000021
【０１５４】
免疫調節不全、異常凝固および子宮内炎症が多くのＳＰＴＢ症例分に共通することがますます理解されている（Romero et al., Science、345:760−765, 2014)。妊娠の有害転帰の高い割合は、妊娠初期において病態生理的原因を有すると考えられている。早期の胎盤形成および栄養芽細胞機能の異常は、高血圧を伴う妊娠だけでなく、ＳＰＴＢを経験した妊婦の約３０％にも観察されている（Kim et al., Am J Obstet Gynecol, 189:1063−1069, 2003）。この重要な時期に母体と胎児との間の障壁にある細胞の状態、条件および機能は、既に、妊娠の有害転帰をもたらしやすい性質がある。他には、胎盤特異的マイクロ粒子の濃度が、妊娠経過に伴って有意に増加することが観察された（Sarker et al., J Transl Med, 12:204, 2014）。マイクロ粒子介在シグナル伝達における初期の撹乱（perturbation）は、妊娠が進行するにつれて徐々に拡大する可能性がある。結局、妊婦と胎児のクロストークにおける異常は、忍容を促進していたシステムのネットワーククラッシュを引き起こし、自然早産に至る可能性がある。
【０１５５】
ＳＰＴＢの根本原因をより深く理解することの従来の障害の１つは、母体と胎児との間の障壁自体およびヒト胎盤のユニークな性質を調べることの難しさである。子宮内スペースは、物理的にも、倫理的にも、遠く隔絶されている。このように、おそらく超音波による子宮頸管長の測定を除いて、ＳＰＴＢのリスクに応じて患者を層別化するための有用なバイオマーカーの開発にはほとんど進歩が見られていない（Conde−Agudelo et al., BJOG, 118:1042−1054, 2011）。マイクロ粒子中のタンパク質含有量の違いは、母体と胎児との障壁の生物学に関する未利用であった情報を表す。本発明の開発中に決定されるとおり、改善された特異性（ＡＵＣの増加によって示されるような）は、ＣＭＰ濃縮血漿画分に関連する複数のタンパク質バイオマーカーの同時の考察により得られ得る。
【０１５６】
実施例２：妊娠２２週〜２４週の間に得られたサンプル中のＳＰＴＢバイオマーカーの同定
この実施例は、妊娠２２〜２４週の間に、実施例１の同じ妊娠対象から得られた血漿サンプルを利用する試験を記載している。サンプル調製、分析および統計方法は、実施例１に記載のものと同じである。
【０１５７】
例として、実施例１で分析した３つのバイオマーカー（ＩＴＩＨ４、ＡＡＣＴおよびＦ１３Ａ）の測定値（時間点Ｄ１）を、この実施例の後の時間点（時間点Ｄ２）での該タンパク質の対応する測定値に対してプロットした。これを図５に示す。ＳＰＴＢと対照との区別を改善するために用いることができる個々のバイオマーカーについて、Ｄ１とＤ２の測定値の間には異なっているが明確なパターンがある。破線は、２つの時間点測定を用いた、ＳＰＴＢと対照との間の可能な分類境界を示す。
【０１５８】
以下のタンパク質は、１０〜１２週（時間点Ｄ１、実施例１）および２２〜２４週（時間点Ｄ２、本実施例）のＳＰＴＢを予測する安定した性能を示した：ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１。
【０１５９】
実施例３：妊娠１０〜１２週の間に得られたサンプル中のＳＰＴＢバイオマーカーのサブセットの同定
本実施例は、妊娠１０−１２週の間に得られた血漿サンプルを利用する試験を記載する。実施例１のものとは独立したコホートを用いて、１０〜１２週の間に得られたとき、３５週未満のＳＰＴＢを予測するマーカーセットを検証した。
【０１６０】
方法：
１０〜１２週の間に得られた、前向き研究で集められた血漿サンプルを有する７５名の単胎妊婦における産科学的結果を、３５週未満のＳＰＴＢについての医師である評価者（reviewer）によって検証した。これらは、１５０例の合併症のない単胎満期産と一致した。対象群は、サンプリング時の妊娠週数（±２週間）、母体年齢（±２歳）、人種および出産回数（parity）で一致した。これらの標本からのＣＭＰを分離し、３５週未満の出産リスクを予測する能力について、以前の試験から選択された既知のタンパク質バイオマーカーの多重反応モニタリング質量分析により分析した。組み合わせた機能的プロファイリング／経路分析によるこれらの分析物の生物学的関連性もまた調べた。
【０１６１】
データ分析および結果：
症例群および対照群は、ＢＭＩ（２６ 対 ２５ ｋｇ／ｍ２；Ｐ＝０．３７）または体外受精（１７％ 対 １０％；Ｐ＝０.１０）の状態のそれぞれで異ならなかった。出産時の平均妊娠週数は３３対３９週であった（Ｐ＜１０−５）。以前の試験で同定されたＣＭＰマーカーは、再びＳＰＴＢについて異なるKaplan-Meier曲線を示したことが観察された。
【０１６２】
図６に示すように、ＳＰＴＢ患者および対照サンプルを、置換（ブートストラップサンプリング）を５０回行って無作為にサンプリングした。毎回、レシーバー−オペレーティング特性（ＲＯＣ）曲線をコンピューター計算し、対応する曲線下面積（ＡＵＣ）を推定した。５０回のブートストラップサンプリングの実行から推定されたＡＵＣの平均（垂直（Y)軸）および標準偏差（水平（X)軸）を、各候補タンパク質バイオマーカー（黒丸）でプロットした。同じ手順を、サンプルの患者／対照ラベルが無作為にスクランブルされている（ラベルパーミュテーション：label permutation）間に繰りかえし、タンパク質バイオマーカーが識別能を有さないとき、結果がどのように現れるかをシミュレートして、該結果を白抜きの四角でプロットした。水平の線は、両方ともラベルパーミュテーションの結果から推定される、平均値より１標準偏差上の値を示す。垂直の線は、両方とも正しく標識された結果から推定される、平均値より１標準偏差上の値に相当する。左上の四分の一区分中の黒丸は、比較的高い、かつ統計的に安定した識別能を有するタンパク質である。ブートストラップサンプリングおよびラベルパーミュテーション分析を用いて、上記の表２に列記したタンパク質のセットは、ＳＰＴＢを対照群から区別する統計的に一貫した識別能（ＲＯＣ分析によって証明される）を示した。黒丸は、ブートストラップＲＯＣ分析においてＳＰＴＢを対照群から区別するためのタンパク質のＡＵＣの平均（ｙ軸）およびＳＤ（ｘ軸）を表す。白抜きの四角は、同じブートストラップＲＯＣ分析であるが、無作為に再配置されている（パーミュテーションされた：permutated）サンプルのＳＰＴＢ／対照ラベルからのタンパク質のＡＵＣの平均およびＳＤを表す。図７に示すとおり、統計的に一貫した性能を有するタンパク質は、プロットの左上の四分の一区分中の黒丸として示される。
【０１６３】
以下のタンパク質は、実施例１のサンプルセットと実施例３のサンプルセットとの間で一貫した性能を示したことを特記する。これらのタンパク質は、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、  ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３である。
【０１６４】
実施例４：サンプル調製法
サンプル調製法をさらに検討した。
【０１６５】
図８は、実施例２のサンプルからのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）データにおける２ＱＣプールが、高い分析精度（変動係数が小さい）を示すことを示す。２つの集められたサンプルを、実施例２のデータ作成のために用いられたサンプルセット（２２〜２４週のサンプル）において用いた。分析精度の数値である変動係数（ＣＶ）は、ＱＣデータを技術的複製物として用いて、全てのタンパク質について推定された。全てのタンパク質に亘るＣＶの分布を、ヒストグラムとしてプロットした。プールＡ：影付き棒グラフ、プールＢ：白抜き棒グラフ。分析精度は、バイオマーカー発見研究にとって適切であった。
【０１６６】
図９は、実施例２で用いた２２〜２４週のサンプルから、対照群からＳＰＴＢを検出するのに有益な多数のタンパク質に関するNeXosome（登録商標）サンプル調製工程（ＳＥＣ）を示す。サンプルブートストラップバイオマーカー選択手順を用いて、同じ患者から得られたNeXosomeサンプル調製工程での試料片および血漿試料片から直接、データ作成を行った。結果は、多数の有益なタンパク質が、ＳＥＣでの試料片のデータから同定されたことを示す。NeXosome サンプル調製工程（ＳＥＣ）により、高価値のマイクロ粒子が富化され、その結果、ＳＰＴＢのための臨床的に有益かつ生物学的に関連するバイオマーカーの同定が改善された。
【０１６７】
図１０は、豊富なタンパク質アルブミン（ＡＬＢＵ）の濃度に対するＳＥＣの効果を示す。ボックスプロットは、ＳＥＣ調製によるサンプル中および血漿サンプル中のアルブミン定量の分布を直接示す。NeXosome サンプル調製工程（ＳＥＣ）は、血漿を直接使用するのと比較して、顕著にアルブミン濃度を減少させた。
【０１６８】
図１１は、ＳＥＣが、Ｄ２ ＩＴＩＨ４における、ＳＰＴＢと対照群との区別を改善したことを示す。ボックスプロットは、NeXosome サンプル調製工程（ＳＥＣ）を用いるとき、および用いないときのサンプル中のＳＰＴＢと対照群との間のバイオマーカー ＩＴＩＨ４の分布の差異を比較する。ＳＥＣは、ＳＰＴＢと対照群の間のバイオマーカーＩＴＩＨ４についての区別を顕著に改善した（ＳＥＣ調製サンプルからのデータではＰ＜０．０００４に対して、Mann−Whitney−Wilcoxon検定での血漿からの直接のデータではＰ＝０．３１４５であった）。
【０１６９】
実施例５：試験２−妊娠１０−１２週の間に得られたサンプルにおけるＳＰＴＢバイオマーカーの同定
この試験は、本研究は、多施設集団におけるＣＭＰタンパク質のマルチマーカーアプローチをさらに調査し、出産回数および胎児性別による検査特性を追加的に調査したものである。
【０１７０】
材料および方法
臨床検体収集：母体のＥＤＴＡ血漿サンプル（平均妊娠週数１０．２週）を、Brigham and Women's Hospital（ＢＷＨ）、Boston MA；Magee-Women's Research Institute、Pittsburgh PA；および、Global Alliance to Prevent Prematurity and Stillbirth (GAPPS)、Seattle WAから入手した。適格基準には、１８歳以上で、妊娠１５週以前に出生前ケアを開始し、それぞれの施設で出産を予定している患者が含まれた。除外基準には、既往症（糖尿病の既往、現在のがん診断、ＨＩＶおよび肝炎）および胎児の異常が含まれた。分析は単胎妊娠に限定した。母体の人種は自己確認により決定した。在胎週数は妊娠１２週以下で超音波検査により確認した。最終月経期間（ＬＭＰ）の日付と一致している場合は、ＬＭＰを用いて予定日を決定した。一致していない場合は、妊娠１２週以下の最も早い利用可能な超音波検査で予定日を決定した。満期産は妊娠３７週以上と定義され、早産は、本実施例の目的のために、妊娠３５週以前でのｓＰＴＢと定義された。この分析で考慮した在胎週数の下限は２２週とした。妊娠３５週以下での妊娠終了を、少なくとも以下の２つの理由で注目した：第一に、ｓＰＴＢの表現型は、一般的に、この在胎週数範囲でより均一であり、かつより均質な先行病理学的過程と関連している可能性が高いこと、第二に、新生児の疾病率が、一般的に、この妊娠期間で高く、将来の予防のためのより高い目標性を表していること。
【０１７１】
各施設の患者の症例は、それぞれの施設の医師によって独立して報告され、検証された。ボストンのｓＰＴＢの６８例、Ｍａｇｅｅの９例およびＧＡＰＰＳの１０例を、それぞれ同じ施設の２つの対照期（control term）と無作為に一致させた。各施設では、症例は母体年齢（±２歳）およびサンプリング時の在胎週数（±２週）で一致させた。最終的なサンプルサイズは、８７症例と１７４対照例であり、これには新たに収集された６２症例および１２４対照例と、以前の分析からの２５症例および５０対照例が含まれていた（Cantonwine et al. Evaluation of proteomic biomarkers associated associated with circulating microparticles associated as a effective means to stratify of SPTB risk of SPTB. Am J Obstet Gynecol. 2016;214(5):631.e1-631.e11）。本実施例では、一致を確実にし、可能性のあるバッチ効果を最小にするために、記載の治験からのサンプルの新鮮な分配された血漿を、統一されたアッセイプロトコル下で新たに取得されたサンプルと共に再分析した。治験計画書は各機関の審査委員会によって承認され、参加したすべての女性から書面によるインフォームドコンセントを得た。
【０１７２】
ＣＭＰ濃縮：ＭａｇｅｅおよびＧＡＰＰＳからの血漿サンプルを、ドライアイス上でＢＷＨに運び、その後、症例／対照状態を知らされていない試験員により無作為に配置した。次に、２６１個のサンプルすべてをドライアイス上でDavid H. Murdock Research Institute (DHMRI、Kannapolis、NC)に運び、そこでＣＭＰをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で濃縮し、NeXosome Elution Reagentを用いて定組成的に溶出した。すなわち、ＰＤ−１カラム（GE Healthcare Life Sciences、Pittsburgh、PA）に、GE Healthcare Bio-Sciences Corporation（Marlborough、MA）から購入したセファロース２Ｂアガロースビーズ標準（２％ストック溶液から）を１０ｍＬ詰めた。カラムを、溶出試薬で洗浄し、使用前に、４℃にて最短２４時間から３日以上以内、保存した。使用の日に、カラムを再度、溶出試薬で洗浄し、解凍した血漿サンプル１ｍＬをカラムに適用した。ＣＭＰをカラムのボイドボリューム（void volume）で捕捉し、記載のように豊富なタンパク質ピークから分離した（Ezrin AM et al. Circulating serum-derived microparticles provide novel proteomic biomarkers of SPTB. Am J Perinatol. 2015;32(6):605-14.)。処理間のばらつきを最小限にするために、個々のサンプルの処理を無作為なバッチで行った。２００ｕｇの総タンパク質（ＢＣＡ反応により測定）を含む、各臨床検体から由来のプールされたＣＭＰカラム画分のアリコートを、２ｍＬのマイクロ遠心チューブ（VWR、Radnor、PA）に移し、ドライアイス上でBiognosys（Zurich、Switzerland）に送り、プロテオミクス分析した。
【０１７３】
液体クロマトグラフィー−質量分析：定量的、プロテオミクス、ＬＣ−ＭＳ分析を、Biognosys AGにより実施した。すなわち、各サンプルについて、上記のように、合計２０ｕｇのタンパク質を凍結乾燥し、次いで８Ｍ尿素で変性させ、ジチオトレイトールを用いて還元し、Biognosysアルキル化溶液でアルキル化し、トリプシン（Promega、Madison、WI)で一晩消化した。(Ezrin AM et al. Circulating serum-derived microparticles provide novel proteomic biomarkers of SPTB. Am J Perinatol. 2015;32(6):605−14.)。得られたサンプルペプチドを、SpeedVacシステムを用いて乾燥させ、４５μｌのBiognosys LC溶媒に再溶解させ、混合した後、Biognosys iRTキットを含むBiognosys PlasmaDive（拡張バージョン2.0）の安定同位体標識された対照ペプチドミックスと混合した。
【０１７４】
その後、１μｇの全タンパク質を、自社充填Ｃ１８カラム（内径７５μｍおよびカラム長１０ｃｍ、New Objective、Woburn、MA)に注入した。カラム材料は、Magic AQ、粒子径３μm、細孔サイズ２００Å（Michrom、Auburn、CA）であった。このカラムは、Thermo Scientific Easy nLCナノ液体クロマトグラフィーシステムで用いられた。ＬＣ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイを、標準的ナノエレクトロスプレーソースを備えたThermo Scientific （Waltham、MA） TSQ Vantage、トリプル四重極質量分光計で測定した。ＬＣ−ＭＲＭのＬＣ勾配は、３０分以上の、溶媒Ｂ（０．１％ＦＡ含有９７％アセトニトリル水溶液）の５−３５％勾配、次いで、２分以上の、溶媒Ｂの３５−１００％勾配、その後８分間の１００％溶媒Ｂであった（合計の勾配処理は４０分）。
【０１７５】
サンプル間でのペプチドの定量のために、TSQ Vantageを３．２５分の取得ウィンドウ長で計画されたＭＲＭモードで操作した。ＬＣ溶離液を１．９ｋＶでエレクトロスプレーし、Ｑ１四重極を単位分解能（０．７Ｄａ）で操作した。シグナル処理およびデータ解析を、SpectroDive（商標）−多重化ＭＲＭデータ解析用のBiognosys社の独自ソフトウェアを用いて行った。１％のＱ値フィルターを適用した。タンパク質濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置に注入した正規化された１ｕｇのタンパク質に基づいて決定した。
【０１７６】
統計分析：統計分析に先立ち、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭアッセイからのタンパク質定量データをｚスコアに正規化した。次に、データを学習セットおよびテストセットに分けた。学習セットは、事前の分析（Cantonwine et al., 2016）に関与したすべてのサンプル、ならびにブロックランダム化（block randomization）によって選択された新しいコレクションからの６０サンプルで構成された。残りの新しいコレクションサンプルをテストセットとして用いた。ブロックランダム化を用いることで、学習セットおよびテストセットの症例：対照の比率を維持した。その後、テストセットを分析のステップ３（下記）まで置いておいた。
【０１７７】
一変量解析（ステップ１）：学習セット内で、タンパク質分析物の候補セットを、最初に、ｓＰＴＢを満期産から区別する能力について一変量選択に供した。すなわち、各タンパク質について、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を、学習データを置き換えて、ブートストラップされたサンプルで１０回繰り返し実行した。ブートストラップＲＯＣ分析からの曲線下面積（ＡＵＣ）の平均値と標準偏差（ＳＤ）を、それぞれ性能のレベルおよび統計的安定性の尺度として用いて、ｓＰＴＢを満期産から区別する能力について推定分析物をランク付けした。分析物の客観的な選択基準を確立し、ランダムチャンスによる誤検出を最小限に抑えるために、全く同じブートストラップＲＯＣ分析手順を、サンプルラベル（すなわち、ｓＰＴＢ対対照）を順列化してランダムにシャッフルした状態で、再び学習データセットに適用した。このパーミュテーション（permutation）分析手順は、ランダムチャンスの効果を機能的にモデル化し、候補タンパク質マーカーを選択する際の“陰性対照”として機能する。平均ＡＵＣおよびＳＤに同じカットオフを用いて、“実際のラベル”分析からのものよりもパーミュテーション分析から選択された分析物の数の相対比により、複数の比較の影響を制御しながら、偽発見率を推定することができた。
【０１７８】
多変数解析（ステップ２）：次いで、一変量解析で最も性能の高い候補分析物（すなわち、最も高い平均ＡＵＣおよび比較的低いＳＤを有する）を、学習セット内のｓＰＴＢリスク予測のための多変量解析パネルの一部として、それらの相補的な値について評価した。これを行うために、５つの分析物パネルの全ての可能な組合せを、学習セット内交差検証を１０回繰り返して多変量分類モデルを用いて評価した（毎回、モデルは無作為に選択された６０％の学習サンプルを用いて導出され、残りの４０％の学習サンプルで評価された）。各パネルを、３つの性能指標：（１）平均ＡＵＣ、(2)固定７０％の特異性での平均感度、（３）固定７０％の感度における平均特異性、によって評価し、これらはすべて学習セット内交差検証から得られた。次に、３つの性能評価基準のそれぞれの上位１％パネルのメンバーとなる個々の分析物の頻度を計算した。これらの推定頻度は、ｓＰＴＢと満期産を区別することに関してタンパク質分析物が互いに補完し合う能力の尺度として、また、候補バイオマーカーの数をさらに減らすための客観的基準として役立った。５つの分析物パネルのみを網羅的に評価し、特定の保守的な多変量モデルを用いるという選択は、ｓＰＴＢリスクについて分析物における多変量関係を明らかにするのに十分なバイオマーカーの例示的な最小数と、データにオーバーフィットさせない所望データ、および計算の複雑さの実際的な制約に基づいている。具体的には、保守的なモデル構造は、半径基底関数カーネルを有するサポートベクターマシン（ＳＶＭ）である。半径は、分析物の標準偏差の２倍になるよう選択した。そのため、結果として得られたＳＶＭは厳しく制約され、線形カーネルを有するＳＶＭと同様に動作した。
【０１７９】
候補分析物とそれらに関連するパネルの数を大幅に減らすと、機械学習アルゴリズムのパラメータを微調整するための計算アプローチが用いられ、最も性能の高いマーカーパネルと関連する多変量予測モデルを最終的に決定して選択するために、広範な学習内データリサンプリング／交差検証を行うことができた。
【０１８０】
テストセットでの評価（ステップ３）：この分析の第３の部分では、上位性能モデルを、テストセットからのデータで評価し、関連する推定信頼区間、感度および特異性とともにＡＵＣの観点で報告した。
【０１８１】
出産０回のサブセットの評価：出産０回の母集団におけるこれらの分析物の有用性を評価するために、学習セットおよびテストセットを初産婦の母親（初めての母親）に限定した。上記の手順を再適用した。この層別化によって課せられたサンプルサイズの制限を考慮して、４つの分析物パネルを対象とした。上記のように、これはデータのオーバーフィットのリスクを減らすためであった。ＲＯＣ分析に加えて、４つの分析物モデルのアウトプットを用いて、対象を高リスク群と低リスク群に分けた。２つのグループを、妊娠週別のKaplan-Meier曲線を用いて比較した。このテストセットは、症例−対照サンプルセットを表すため、比較の目的は、個々のKaplan-Meier曲線の実際の形状ではなく、その顕著な違いをグラフ化して示すことであった。
【０１８２】
統計およびモデル開発の計算を、Ｒ３.２.４統計計算環境(１７)およびMatlab R2017b（Mathworks, Natick, MA）を用いて行った。
【０１８３】
結果
多施設コホート全体における症例群および対照群の臨床的および人口統計学的特徴を表１１に示す。それらの母体年齢、出産回数および妊娠前のＢＭＩ（body mass index）のベースライン連続変数は、同様の平均を有した。人種、保険の種類、喫煙および胎児の性別の母体カテゴリー変数は、症例群と対照群で差がなかった。治験デザインを考慮すると、出産時の在胎週数（ｐ＜０．０００１）と出生体重（ｐ＜０．０００１）の間には予想される差があった。重要なことに、サンプル採取時の平均在胎週数は、症例群と対照群間で差がなかった。
【０１８４】
【表２０】
2021512318.tif 000022
【０１８５】
全２６１例のサンプルセットを学習セットおよびテストセットに無作為に分けた。ｓＰＴＢの４５症例および９０例の対照で、学習セットを構成し、残りのｓＰＴＢの４２症例および８４例の対照で、テストセットを構成した。新しい学習セットおよびテストセットの特徴を表１２で比較する。
【０１８６】
【表２１】
2021512318.tif 000023
【０１８７】
３６個のタンパク質分析物の最初の編入（inclusion）は、事前の分析における識別性能に基づいていた（Cantonwine et al., 2016）。定量化の対象となった３５個のタンパク質分析物を、以下の表１３に示す。
【０１８８】
【表２２】
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【０１８９】
学習セット内で、これらの３６個の分析物を、上位性能パネルにおける相補的寄与についての多変量解析を通して上記のようにさらに選択した。図１３は、５個の分析物パネルのすべての可能な３７６，９９２通りの組合せのうち、ＲＯＣ−ＡＵＣ分析に関して、個々の分析物が、７０％の固定感度で決定された特異性と７０％の固定特異性で決定された感度で、性能の高いパネルの上位１％のメンバーであった頻度を示している。その結果に基づいて、対象となる分析物のパネルを交差検証し、最終的なパネルを作成した。個々のマーカーとしては、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＩＴＩＨ２、ＬＣＡＴを含むＣＭＰ関連タンパク質が、学習データ内で反復交差検証評価を行った結果、最も安定した性能を示した。ＡＵＣを濃い灰色バーで示し、７０％固定特異性での特異性を黒色バー、７０％固定感度での感度を薄い灰色バーで示す。モデルを、感度または特異性のいずれかを固定し、それらの場合のパネル性能に最適なマーカーの組合せを決定することによって実行した。これらのデータは、出産状態や他の要因を考慮することなく、上記５個のタンパク質パネルの選択を支持している。
【０１９０】
これらの個々のマーカーを組み合わせて、マルチマーカーパネルとしてテストデータに適用すると、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＩＴＩＨ２およびＬＣＡＴの組合せは、ＲＯＣ分析から０．７４のＡＵＣ（９５％ ＣＩ ０．６３−０．８１）を示した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。感度および特異性の両方を最大化するスコアのカットオフにより、それぞれ０．７０と０．８１の値が得られる。正の尤度比は２．７０であり、負の尤度比は０．２７である。仮説上の母集団を１０００と仮定すると、９５％信頼区間はそれぞれ２．２９−３．１９および０．１５−０．４８となる。テスト性能は、ＢＭＩによって変化しなかった。この５個のタンパク質マーカーパネルは、出産状態や胎児の性別などの他の因子に関係なく、すべての対象での使用に最適化された。
【０１９１】
図１２Ｃは、Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＩＴＩＨ１およびＬＣＡＴを含む５個のタンパク質パネルのＲＯＣを示し、関連するＡＵＣは０．７３（９５％ＣＩ：０．５７−０．８６）であった。テスト性能は、ＢＭＩによって変化しなかった。この５個のタンパク質マーカーパネルはまた、出産状態や胎児の性別などの他の要因に関係なく、すべての対象での使用に最適化された。図１２Ｄは、テスト性能が女性胎児（ＡＵＣ ０．７９）  対  男性胎児（ＡＵＣ ０．６４）で増加し、経産婦（出産回数≧１)(ＡＵＣ ０．６６)に対して未出産（出産回数＝０)（ＡＵＣ ０．７８）で増加したことを示している。
【０１９２】
図１７は、予め固定した特異性での感度（０．６５）および予め固定した感度での特異性（０．７５）での、他の５個のマーカーパネルおよびＡＵＣの平均値および標準偏差の点で上位性能を有するパネルのいくつかの学習／交差検証性能を示す。
【０１９３】
同じワークフローを、学習セットに再び用いたが、今回は初産婦の母親の間でのみｓＰＴＢのリスクを識別するために分析物の組合せを選択する目的で用いた。学習セットでの交差検証を通じた上記のプロセスにより、ＴＲＦＥ、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４、ＬＣＡＴタンパク質の組合せが、初産婦の母親を分類するマルチマーカーパネルの中で最も高い性能を示すことが分かった。試験データでは、図１４に示されるように、この４−プレックスの組合せは、ＡＵＣが０．７７（９５％ ＣＩ：０．６１−０．９０）であった。特異性が０．８６の場合、対応する感度は０．６３となる。正の尤度比は４．５０で、負の尤度比は０．４３である。仮説上の母集団を１０００人と仮定すると、９５％信頼区間はそれぞれ３．４５−５．８７および０．３０−０．６３となる。このデータセットでは、ＴＲＦＥ、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４およびＬＣＡＴからなる多変量４タンパク質パネルを、出産回数＝０の対象由来のサンプルに対して最適化した。出産回数が０のサンプルでは、ＡＵＣは０．７７である（実線で示す）。４タンパク質パネルを試験し、（１）出産回数が１を超える対象（経産婦）からのサンプルについてはＡＵＣが０．６７であり（破線で示す）、（２）出産回数に関係なく対象からのサンプルについてはＡＵＣが０．６９であった（点線で示す）。
【０１９４】
初産婦（出産回数＝０）の母親に選択されたマルチマーカーパネルを用い、テストセット全体で妊娠を高リスク層と低リスク層に分類して、図１６に、妊娠週数毎の妊娠生存率のカプラン−マイヤー曲線を示す。対数順位検定は、曲線が有意に異なること（ｐ＜０．００００１）を示し、陽性マーカーパネルが、３５週以下で終了するものだけでなく、すべての在胎週数の短い妊娠に関連していることを示している。
【０１９５】
図１５は、同じ４つのタンパク質パネル（ＴＲＦＥ、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４およびＬＣＡＴ）の胎児の性別による性能を示す。女性胎児は０．７３（９５％ＣＩ：０．５８−０．８５）のＡＵＣを示し、男性胎児は０．６４（９５％ＩＣ：０．４３−０．８１）のＡＵＣを示している。女性は実線で示され、男性は破線で示されている。
【０１９６】
考察
学習セットでは、ＣＭＰ関連タンパク質分析物（Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＩＴＩＨ２およびＬＣＡＴ）の５プレックスの組合せが定義されており、テストセットではＡＵＣが０．７４（９５％ＣＩ ０．６３−０．８１）であった。ベイズ論理を用いて、米国では３５週齢以下での出産について一般化されたベースラインリスク（テスト前確率）が４．９％であるとすると、１０〜１２週齢で陽性となった者は、テスト後のリスク（テスト後確率）が１３％となり、陰性となった者は、リスクが１％まで低下すると予想される。母体の特徴に基づく臨床リスクスコア付けの追加とともに、マルチマーカーパネルがこれらの性能指標を改善すると期待される。
【０１９７】
さらに、初産婦間の妊娠３５週の終わり前にＳＰＴＢを予測するためのＣＭＰ関連タンパク質分析物の予測的特徴を説明する。この集団では、ＣＭＰタンパク質マーカーの別のセットを用いて、０．７７（９５％ＣＩ ０．６１〜０．９０）のＡＵＣが観察された。感度０．６３で、これは特異性０．８６を示している。ここでもベイズ論理を当てはめると、３５週以下での出産のテスト前のリスク確率が４．９％であるのは、陽性の場合、テスト後のリスク確率は２０％になり、陰性の場合は２％であることを意味している。出産歴がないこの患者集団において、これらの結果は、３５週終了前のＳＰＴＢのリスクの層別化が臨床的に有用である可能性を示唆している。
【０１９８】
表１４Ａは、４つのタンパク質パネル（ＴＲＦＥ、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４およびＬＣＡＴ）を検出するためのＬＣ−ＭＣＳ ＭＲＭモードで検出可能なペプチドを示す。
【０１９９】
表１４Ｂは、５つのタンパク質パネル（Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＩＴＩＨ２およびＬＣＡＴ）を検出するためにＬＣ−ＭＣＳ ＭＲＭモードで検出可能なペプチドを示す。
【０２００】
表１５Ａは、４つのタンパク質パネル（ＴＲＦＥ、ＩＣ１、ＩＴＩＨ４およびＬＣＡＴ）を検出するためにＬＣ−ＭＣＳ ＭＲＭモードで用いられる同位体標識された対照ペプチド（同位体標準）を示す。
【０２０１】
表１５Ｂは、５つのタンパク質パネル（Ｆ１３Ａ、ＦＢＬＮ１、ＩＣ１、ＩＴＩＨ２、およびＬＣＡＴ）を検出するためにＬＣ-ＭＣＳ ＭＲＭモードで用いられた同位体標識された対照ペプチド（ＳＩＳ、同位体標準）を示す。
【０２０２】
第１三半期終了時に利用可能な既存のリスク層別化方法は限られている。そのような方法は、主に個人の妊娠歴に基づいている。今日まで、出産歴が、患者の出産可能性を評価するための最も重要な１つの指標となっている。
【０２０３】
本実施例では、第１三半期の終わりに採取されたＣＭＰ関連タンパク質分析物が、妊娠３５週以下での出産リスクを予測する能力を有することが実証されている。
【０２０４】
上記の発明は、その特定の態様を参照して記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更が行われ、均等物が置換され得ることは、当業者に理解されるべきである。上記の種々の態様は、さらなる態様を提供するために組み合わせることができる。加えて、記載された発明の目的の精神および範囲に対して、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの１または複数工程を適用するために、多くの改変が行われてよい。このような改変は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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