(57)【要約】本明細書中提供されるのは、標的二本鎖または一本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法及びシステムである。本方法は、標的核酸を含む試料を増幅反応混合物と混合すること、標的核酸を増幅すること、ならびに等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、さらに標的核酸を増幅することを含む。増幅反応混合物は、増幅ＣＲＩＳＰＲ系、ヘリカーゼ、プライマー対、及びポリメラーゼを含む場合がある。増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む場合があり、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含む場合があり；第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む場合がある。【選択図】図２
2021528090.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的二本鎖核酸の増幅及び／または検出法であって、以下：
（ａ）前記標的二本鎖核酸を含む試料を、増幅反応混合物と混合すること、前記増幅反応混合物は、以下：
（ｉ）増幅ＣＲＩＳＰＲ系、前記増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含み、前記第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、前記第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を前記標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含み、及び前記第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、前記第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を前記標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む；
（ｉｉ）ヘリカーゼ；
（ｉｉｉ）第一プライマー及び第二プライマーを含むプライマー対、ただし、前記第一プライマーは、前記標的核酸の前記第一鎖と相補的な部分を含み、及び前記第二プライマーは、前記標的核酸の前記第二鎖と相補的な部分を含む；ならびに
（ｉｖ）ポリメラーゼ；を含み、
（ｂ）前記第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び前記第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて前記標的核酸のＲループを開口することにより前記標的核酸を増幅し、前記ヘリカーゼを用いて前記標的核酸の前記第一鎖と前記第二鎖を解きほぐし、前記プライマー対を用いて前記鎖をアニーリングし、及び前記ポリメラーゼを用いて前記鎖を延長すること；ならびに
（ｃ）等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、さらに前記標的核酸を増幅すること；ならびに
（ｄ）任意選択で、前記増幅された標的核酸を検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、失活Ｃａｓ９、失活Ｃａｓ１２ａ、失活Ｃａｓ１２ｂ、及び失活Ｃａｓ１２ｃからなる群より選択される失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインに変異を有する失活Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ及びＮ８６３ＡまたはＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａに相当する変異を有する失活Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．  ｃｏｌｉ；Ｎ．  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．  ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．  ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．  ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．  ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅからなる群より選択される細菌種由来の失活Ｃａｓ９タンパク質である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、失活Ｃａｓ１２タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記失活Ｃａｓ１２タンパク質は、ＲｕｖＣドメインに変異を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記失活Ｃａｓ１２酵素は、失活Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記失活Ｃａｓ１２ａは、ＡｓＣｐｆ１のＤ９０８ＡまたはＥ９９３Ａに相当する変異を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記失活Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）群菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｉｎｉｓ、ならびにＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｈｅｎｉｓｃｉからなる群より選択される細菌種に由来する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記失活Ｃａｓ１２は、Ｎｕｃドメインに変異を有する失活Ｃａｓ１２ｂタンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記失活Ｃａｓ１２ｂは、ＡａｃＣ２ｃ１のＤ５７０Ａ、Ｅ８４８Ａ、またはＤ９７７Ａに相当する変異を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記失活Ｃａｓ１２ｂタンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｓａｓｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ  ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ門菌ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ  ＷＯＲ＿２細菌ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ科菌ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ綱菌ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門菌ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門菌ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ科菌ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ種ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、及びＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓからなる群より選択される細菌種に由来する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と前記第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、同じである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と前記第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、異なる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ１２ａ、ｄＣａｓ１２ｂ、ｄＣａｓ１２ｃ、またはｄＣａｓ１４である、請求項１５に記載の方法
【請求項１７】
前記ポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ、全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、及びシーケナーゼＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘリカーゼは、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＶ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、ＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原、酵母菌ＲＡＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤｎａＢヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、パピローマウイルスＥ１ヘリカーゼ、古細菌ＭＣＭヘリカーゼ、真核生物ＭＣＭヘリカーゼ、及びＴ７  Ｇｐ４ヘリカーゼからなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的核酸の増幅は、約３７℃〜６５℃で行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的核酸の増幅は、約５０℃〜５９℃で行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸の増幅は、約６０℃〜７２℃で行われる、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的核酸の増幅は、室温で行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
中温性等温条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリメラーゼは、中温性ポリメラーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記中温性ポリメラーゼは、Ｓａｕ  ＬＦポリメラーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的核酸の増幅は、約３７℃で行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヘリカーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵｖｒＤヘリカーゼであり、任意選択で、ＤからＡへの置換、例えば、Ｄ４０３及びＤ４０４などでの置換を２つ以上有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヘリカーゼは、Ｄ４０９Ａ及びＤ４１０Ａに相当する１つまたは複数の変異を有するｐｃｒＡ（ＵｖｒＤ）型ヘリカーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヘリカーゼは、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ  Ｄ４０９Ａ／Ｄ４１０Ａである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的核酸配列は、長さが約２０〜３０、約３０〜４０、約４０〜５０、または約５０〜１００ヌクレオチドである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的核酸配列は、長さが約１００〜２００、約１００〜５００、または約１００〜１０００ヌクレオチドである、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的核酸配列は、長さが約１０００〜２０００、約２０００〜３０００、約３０００〜４０００、または約４０００〜５０００ヌクレオチドである、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第一プライマーまたは前記第二プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
クラウディング剤、補因子、一本鎖結合タンパク質、及び／またはアシストタンパク質から選択される１種または複数の添加剤を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記クラウディング剤は、ポリエチレングリコールである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記補因子は、ＡＴＰである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記一本鎖結合タンパク質は、Ｔ４  ｇｐ３２または好熱性ＳＳＢ（ＥＴ−ＳＳＢ）から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記アシストタンパク質は、ｄＣｐｆ１及び／またはＵｖｓＸリコンビナーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、ゲル電気泳動、挿入色素検出、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、質量分析、ラテラルフローアッセイ、比色アッセイ、及びＣＲＩＳＰＲに基づく検出システムからなる群より選択される方法により、前記増幅された核酸を検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記増幅された標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づくシステム、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づくシステム、またはそれらの組み合わせにより検出される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記増幅された標的核酸は、ＬｗａＣａｓ１３酵素を含むＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ−１３に基づくシステムにより検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記標的核酸は、アトモル感度で検出される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的核酸は、フェムトモル感度で検出される、請求項１から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、循環無細胞ＤＮＡ、環境ＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡからなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的核酸はＲＮＡであり、かつ前記ＲＮＡは、増幅の前にｃＤＮＡへと逆転写される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記反応は、約２時間未満、約９０分間未満、約６０分間未満、約３０分間未満、または約１５分間未満で行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料は、生体試料または環境試料である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記生体試料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌、漏出液、滲出液、または関節から得られる液体、あるいは皮膚または粘膜表面のスワブである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料は、ヒト患者から得られた血液、血漿、または血清である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料は、植物試料である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料は、未精製試料である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記試料は、精製試料である、請求項１から５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
標的一本鎖核酸の増幅及び／または検出法であって、以下：
（ａ）試料中の前記一本鎖核酸を標的二本鎖核酸に変換すること；及び
（ｂ）請求項１に記載の工程を行うこと、
を含む、前記方法。
【請求項５５】
前記標的一本鎖核酸は、ＲＮＡ分子である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＲＮＡ分子は、逆転写及び増幅工程により、前記二本鎖核酸に変換される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的一本鎖核酸は、一本鎖ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、合成一本鎖ＤＮＡ、長鎖非翻訳ＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、ウイルスｄｓＲＮＡ、及び非ウイルスｄｓＲＮＡからなる群より選択される、請求項５４から５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
さらに、前記プライマー対の前記第一プライマーに含まれる部分を含む増幅器プライマーを含み；ならびに、前記プライマー対の前記第一プライマーは、増幅の第一工程に介在し、及び前記増幅器プライマーは、前記プライマー対の前記第二プライマーと一緒に、増幅のその後の工程に介在する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
前記増幅器プライマー及び前記プライマー対の前記第一プライマーはそれぞれ、Ｔ７プロモーター配列を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記増幅器プライマーは、約２３〜約３５ヌクレオチドの長さを有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出するシステムであって、以下：
ａ）増幅ＣＲＩＳＰＲ系、前記増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含み、前記第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、前記第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を前記標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含み、及び前記第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、前記第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を前記標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含み；
ｂ）ヘリカーゼ；
ｃ）第一プライマー及び第二プライマーを含むプライマー対、ただし、前記第一プライマーは、前記標的核酸の前記第一鎖と相補的な部分を含み、及び前記第二プライマーは、前記標的核酸の前記第二鎖と相補的な部分を含み；
ｄ）ポリメラーゼ；ならびに、任意選択で
ｅ）前記標的核酸の増幅を検出する検出システム
を含む、前記システム。
【請求項６２】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、失活Ｃａｓ９酵素または失活Ｃａｓ１２酵素から選択される失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素である、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６３】
前記失活Ｃａｓ１２酵素は、失活Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、またはＣａｓ１２ｃ酵素である、請求項６２に記載のシステム。
【請求項６４】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２酵素である、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６５】
前記Ｃａｓ１２酵素は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、またはＣａｓ１２ｃ酵素である、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６６】
前記ポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ、全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、及びシーケナーゼＤＮＡポリメラーゼ、及びＳａｕ  ＬＦ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、請求項６１から６５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６７】
前記ヘリカーゼは、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ヘリカーゼ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＶ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、ＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原、酵母菌ＲＡＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤｎａＢヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、パピローマウイルスＥ１ヘリカーゼ、古細菌ＭＣＭヘリカーゼ、真核生物ＭＣＭヘリカーゼ、及びＴ７  Ｇｐ４ヘリカーゼからなる群より選択される、請求項６１から６６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６８】
前記ヘリカーゼは、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ  Ｄ４０９Ａ／Ｄ４１０Ａである、請求項６７に記載のシステム。
【請求項６９】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素、前記ヘリカーゼ、及び前記ポリメラーゼは、同一温度で、場合によっては、約３７℃で機能する、請求項６１から６８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７０】
試料中の標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出するシステムであって、以下：
ａ）前記標的一本鎖核酸を二本鎖核酸に変換する試薬：
ｂ）請求項６１に記載の構成要素
を含む、前記システム。
【請求項７１】
前記検出システムは、Ｃａｓ１２またはＣａｓ１３エフェクタータンパク質と、相当する標的分子に結合するように設計されたガイドＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ系；及びマスキング構築物を含む、請求項６１から７０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７２】
前記検出システムは、Ｃａｓ１３酵素ＬｗａＣａｓ１３を含む、請求項７１に記載のシステム。
【請求項７３】
さらに、前記プライマー対の前記第一プライマーとプロモーター配列同一性を有する追加の増幅器プライマーを含む、請求項６１に記載のシステム。
【請求項７４】
試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出するためのキットであって、請求項６１から６９のいずれか１項に記載の構成要素、及び使用説明書のセットを含む、前記キット。
【請求項７５】
さらに、前記試料中の前記二本鎖核酸を精製するための試薬を含む、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
試料中の標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出するためのキットであって、請求項７２に記載の構成要素、及び使用説明書のセットを含む、前記キット。
【請求項７７】
さらに、前記試料中の前記一本鎖核酸を精製するための試薬を含む、請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
前記ヘリカーゼは、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ  Ｄ４０９Ａ／Ｄ４１０Ａである、請求項６６に記載のシステム。
【請求項７９】
前記ヘリカーゼは、酵素中に、ＤからＡへの置換を１つまたは複数有する、請求項６６に記載のシステム。
【請求項８０】
さらに、クラウディング剤、補因子、一本鎖結合タンパク質、及び／またはアシストタンパク質から選択される１種または複数の添加剤を含む、請求項６６に記載のシステム。
【請求項８１】
前記クラウディング剤は、分子量２０Ｋのポリエチレングリコールであり、任意選択で、約２．５％〜約６．５％で提供される、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８２】
前記補因子は、ＡＴＰであり、任意選択で、０．７５〜約５ｍＭで提供される、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８３】
前記一本鎖結合タンパク質は、Ｔ４  ｇｐ３２または好熱性ＳＳＢ（ＥＴ−ＳＳＢ）から選択される、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８４】
前記アシストタンパク質は、ｄＣｐｆ１及び／またはＵｖｓＸリコンビナーゼである、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８５】
中温性ＤＮＡポリメラーゼ、詳細にはＳａｕ  ＬＦポリメラーゼを含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８６】
前記ヘリカーゼは、変異Ｄ４０３Ａ／Ｄ４０４Ａを持つＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｄ４０７Ａ／Ｄ４０８Ａ変異を持つＢａｃｉｌｌｕｓ種ＦＪＡＴ−２７２３１由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｄ４１５Ａ／Ｄ４１６Ａ変異を持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｄ４０７Ａ／Ｄ４０８Ａ変異を持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、またはＤ４０２Ａ／Ｄ４０３Ａ変異を持つＰａｅｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ由来のＰｃｒＡヘリカーゼである、請求項１に記載の方法または請求項６１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月２６日出願の米国仮出願第６２／６９０，２５７号、２０１８年１１月１４日出願の米国仮出願第６２／７６７，０５２号、及び２０１９年３月１４日出願の米国仮出願第６２／８１８，６５０号の優先権を主張する。上記特定される出願の全内容は、本明細書により全体として本明細書中参照として援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、認可番号ＭＨ１００７０６、ＭＨ１１００４９、及びＨＬ１４１２０１の下、国立衛生研究所により付与された政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
電子配列表の参照
電子配列表（ＢＲＯＤ＿２５９５ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ’’；ファイルサイズ１１，０１１バイト、ファイル作成日２０１９年４月１５日）の内容は、そのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【０００４】
技術分野
本明細書中開示される発明の対象は、概して、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系の使用と関連した、核酸増幅の方法、システム、及び迅速な診断方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
核酸は、生体情報の普遍的符号である。携帯型プラットフォームで、高感度かつ単一塩基特異性を持って核酸を迅速に検出できることは、多くの疾患の診断及びモニタリングに変革をもたらし、価値ある疫学的情報を提供し、一般化可能な科学ツールとして役立つ可能性がある。核酸検出の方法は数多く開発されてきたものの（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｐａｒｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｐａｒｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、それらは、感度、特異性、簡潔さ、及び速さの間で不可避のトレードオフを被っている。例えば、ｑＰＣＲアプローチは、高感度であるものの、高価な上に複雑な装置に依存しており、そのため実験室での高度に訓練されたオペレーターによる利用に限られている。核酸診断が様々な医療用途に適していることがますます明らかであることから、低費用で高特異性かつ高感度を提供する検出技術は、臨床及び基礎研究の場の両方で非常に有用であると思われる。
【０００６】
多くの核酸増幅アプローチは、様々な検出プラットフォームで利用可能である。その中でも、等温核酸増幅法は、極端な温度循環及び複雑な設備を用いない増幅のために開発されてきた。そのような方法として、核酸配列に基づく増幅法（ｎｕｃｌｅｉｃ−ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＰＡ）、ループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅法（ＨＤＡ）、またはニック酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）が挙げられる。しかしながら、これらの等温増幅アプローチは、依然として、最初の変性工程及び複数のプライマーセットを必要とする可能性がある。そのうえさらに、等温核酸増幅を携帯型プラットフォームと組み合わせた新規アプローチ（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；Ｐａｒｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）の場で高い検出感度を提供するものの、感度が低いために幾分用途が制限される。
【発明の概要】
【０００７】
１つの態様において、本発明は、標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法を提供する。本方法は、以下（ａ）標的二本鎖核酸を含む試料を、増幅反応混合物と混合すること、（ｂ）標的核酸を増幅すること、及び（ｃ）等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、さらに標的核酸を増幅すること、を含む。本方法は、任意選択で、標的核酸を検出する工程を含む。
【０００８】
増幅反応混合物は、以下（ｉ）増幅ＣＲＩＳＰＲ系、（ｉｉ）ヘリカーゼ、（ｉｉｉ）第一プライマー及び第二プライマーを含むプライマー対、ならびに（ｉｖ）ポリメラーゼ、を含む場合がある。増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む場合がある。第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含む場合がある。第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む場合がある。第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、活性酵素の場合も失活酵素の場合もある。第一プライマーは、標的核酸の第一鎖と相補的な部分を含む場合があり、第二プライマーは、標的核酸の第二鎖と相補的な部分を含む場合がある。標的核酸は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて標的核酸のＲループを開口し、ヘリカーゼを用いて標的核酸の第一鎖と第二鎖を解きほぐし、プライマー対を用いて鎖をアニーリングし、そしてポリメラーゼを用いて鎖を延長することにより、増幅する場合がある。
【０００９】
実施形態によっては、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、失活Ｃａｓ９、失活Ｃａｓ１２ａ、失活Ｃａｓ１２ｂ、及び失活Ｃａｓ１２ｃからなる群より選択される場合がある。実施形態によっては、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインに変異を有する失活Ｃａｓ９タンパク質である場合がある。
【００１０】
失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａ、またはＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａに相当する変異を有する失活Ｃａｓ９タンパク質である場合がある。失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．  ｃｏｌｉ；Ｎ．  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．  ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．  ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．  ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．  ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅからなる群より選択される細菌種に由来する失活Ｃａｓ９タンパク質である場合がある。
【００１１】
実施形態によっては、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、失活Ｃａｓ１２タンパク質である場合がある。失活Ｃａｓ１２タンパク質は、ＲｕｖＣドメインに変異を有する場合がある。失活Ｃａｓ１２酵素は、失活Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、またはＣａｓ１２ｃである場合がある。失活Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＡｓＣｐｆ１のＤ９０８ＡまたはＥ９９３Ａに相当する変異を有する場合がある。
【００１２】
失活Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）群菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｉｎｉｓ、ならびにＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｈｅｎｉｓｃｉからなる群より選択される細菌種に由来する場合がある。
【００１３】
失活Ｃａｓ１２酵素は、Ｎｕｃドメインに変異を有する失活Ｃａｓ１２ｂタンパク質である場合がある。失活Ｃａｓ１２ｂは、ＡａｃＣ２ｃ１のＤ５７０Ａ、Ｅ８４８Ａ、またはＤ９７７Ａに相当する変異を有する場合がある。
【００１４】
失活Ｃａｓ１２ｂタンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｓａｓｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ  ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ門菌ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ  ＷＯＲ＿２細菌ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ科菌ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ綱菌ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門菌ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門菌ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ科菌ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ種ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、及びＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓからなる群より選択される細菌種に由来する場合がある。
【００１５】
実施形態によっては、第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、同一である場合がある。代替実施形態において、第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、異なる場合がある。
【００１６】
実施形態によっては、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、触媒活性な酵素である。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ｂ、またはＣａｓ１２ｃ酵素である。
【００１７】
実施形態によっては、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ、全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、及びシーケナーゼＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される場合がある。
【００１８】
実施形態によっては、ヘリカーゼは、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＶ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原、酵母菌ＲＡＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤｎａＢヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、パピローマウイルスＥ１ヘリカーゼ、古細菌ＭＣＭヘリカーゼ、真核生物ＭＣＭヘリカーゼ、及びＴ７  Ｇｐ４ヘリカーゼからなる群より選択される場合がある。場合によっては、ヘリカーゼは、ヘリカーゼの処理能力及び／または活性を上昇させるように置換されている。
【００１９】
標的核酸の増幅は、約３７℃〜６５℃で行われる場合がある。標的核酸の増幅は、約５０℃〜５９℃で行われる場合がある。標的核酸の増幅は、約６０℃〜７２℃で行われる場合がある。標的核酸の増幅は、約３７℃で行われる場合がある。標的核酸の増幅は、室温でも行われる場合がある。室温は、２０℃〜２５℃で変化する場合がある。標的核酸の増幅は、一定温度で行われる場合がある。増幅は、中温性または好熱性等温条件下で行われる場合がある。
【００２０】
場合によっては、本明細書中開示される方法は、中温性等温条件下で行われ、中温性ポリメラーゼの使用を必要とする。場合によっては、中温性ポリメラーゼは、Ｓａｕ  ＬＦポリメラーゼである。同様に、増幅が中温性等温条件下で行われる場合、使用されるヘリカーゼは、中温性条件下で十分な活性を持って機能する。場合によっては、ヘリカーゼは、ＵｖｒＤ様ヘリカーゼ、野生型、またはスーパーヘリカーゼ変異を持つ変異型である。スーパーヘリカーゼ変異は、典型的には、ヘリカーゼの活性を上昇させるＤＤからＡＡへの置換である。場合によっては、ヘリカーゼは、Ｄ４０３Ａ及びＤ４０４Ａの置換を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＵｖｒＤヘリカーゼである。実施形態によっては、ヘリカーゼは、ｐｃｒＡ（ＵｖｒＤ）型ヘリカーゼ、例えば、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼであり、Ｄ４０９／Ｄ４１０Ａの変異を有する。場合によっては、ヘリカーゼは、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼであり、ＡＴＰ補因子を、ヘリカーゼと併せて使用することができる。場合によっては、ヘリカーゼは、Ｄ４０３Ａ／Ｄ４０４Ａ変異を持つＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｄ４０７Ａ／Ｄ４０８Ａ変異を持つＢａｃｉｌｌｕｓ種ＦＪＡＴ−２７２３１由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｄ４１５Ａ／Ｄ４１６Ａ変異を持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｄ４０７Ａ／Ｄ４０８Ａ変異を持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、またはＤ４０２Ａ／Ｄ４０３Ａ変異を持つＰａｅｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ由来のＰｃｒＡヘリカーゼである。
【００２１】
標的核酸配列は、長さが約２０〜３０、約３０〜４０、約４０〜５０、または約５０〜１００ヌクレオチドである場合がある。標的核酸配列は、長さが約１００〜２００、約１００〜５００、または約１００〜１０００ヌクレオチドである場合がある。標的核酸配列は、長さが約１０００〜２０００、約２０００〜３０００、約３０００〜４０００、または約４０００〜５０００ヌクレオチドである場合がある。場合によっては、標的核酸がゲノムＤＮＡ内に含まれる場合、触媒活性を有し、より小さな標的核酸配列を切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をさらなる増幅のために使用することができる。
【００２２】
増幅された核酸の検出は、ゲル電気泳動、挿入色素検出、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、質量分析、ラテラルフローアッセイ、比色アッセイ、及びＣＲＩＳＰＲに基づく検出システムからなる群より選択される方法により行われる場合がある。第一プライマーまたは第二プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む場合がある。増幅された核酸は、Ｃａｓ１３に基づくシステム、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づくシステム、またはそれらの組み合わせにより検出される場合がある。実施形態によっては、ＬｗＣａｓ１３が、検出に使用される。
【００２３】
標的核酸は、アトモル感度で検出される場合がある。標的核酸は、フェムトモル感度で検出される場合がある。
【００２４】
標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、循環無細胞ＤＮＡ、環境ＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡからなる群より選択される場合がある。
【００２５】
標的核酸がＲＮＡである実施形態において、ＲＮＡは、増幅前に、ｃＤＮＡへと逆転写される場合がある。増幅方法の例として、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）が挙げられる。実施形態によっては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために使用される。
【００２６】
実施形態によっては、増幅及び検出の方法は、１種または複数の添加剤を含むことができ、そのような添加剤として、クラウディング剤、補因子、一本鎖結合タンパク質、及び／またはアシストタンパク質（ａｓｓｉｓｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。添加剤は、例えば、信号対バックグラウンド比の測定に基づき選択することができる。場合によっては、ＡＴＰを、補因子として使用することができる。クラウディング剤として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの重合体を挙げることができる。実施形態によっては、ＰＥＧは、分子量が２０Ｋあるが、分子量及び分岐レベルは、本方法が適用される系の複雑さによって選択することができる。
【００２７】
一本鎖結合タンパク質も、本明細書に開示される方法及びシステムの一部で使用することが企図される。例えば、Ｔ４  ｇｐ３２または好熱性ＳＳＢ（ＥＴ−ＳＳＢ）が使用可能である。複雑なテンプレート用のアシストタンパク質も、特に複雑なテンプレートに利用可能である。実施形態によっては、ｄＣｐｆ１及び／またはＵｖｓＸリコンビナーゼが使用可能である。
【００２８】
試料は、生体試料または環境試料である場合がある。生体試料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌、漏出液、滲出液、または関節から得られる液体、あるいは皮膚または粘膜表面のスワブである場合がある。試料は、ヒト患者から得られた血液、血漿、または血清である場合がある。試料は、植物試料である場合がある。試料は、未精製試料である場合がある。試料は、精製試料である場合がある。
【００２９】
別の態様において、本発明は、標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法を提供する。本方法は、これまでに記載された工程を行う前に、試料中の一本鎖核酸を標的二本鎖核酸に変換することを含む。標的一本鎖核酸は、ＲＮＡ分子の場合がある。ＲＮＡ分子は、逆転写及び増幅工程により、二本鎖核酸へと変換される場合がある。
【００３０】
標的一本鎖核酸は、一本鎖ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、及び合成一本鎖ＤＮＡ、長鎖非翻訳ＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、ウイルスｄｓＲＮＡ、及び非ウイルスｄｓＲＮＡからなる群より選択される場合がある。
【００３１】
標的核酸がＲＮＡである場合において、ＲＮＡは、増幅の前に、ｃＤＮＡへと逆転写される場合がある。次いで、当該分野で既知である任意の適切な増幅法、例えば本明細書中記載されるいずれかの方法により、増幅が行われる場合がある。増幅方法の１つの例として、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を挙げることができる。
【００３２】
別の態様において、本発明は、試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出するシステムを提供する。本システムは、増幅ＣＲＩＳＰＲ系、ヘリカーゼ、第一プライマー及び第二プライマーを含むプライマー対、ポリメラーゼ、及び任意選択で、標的核酸の増幅を検出するための検出システムを含む場合がある。
【００３３】
実施形態によっては、本方法は、さらに、プライマー対を用いた第一増幅工程を仲介すること、及び続いてプライマー対の第一プライマーの一部分に対して配列同一性を有する増幅器プライマーを用いた増幅工程を仲介することを含む。場合によっては、増幅器プライマー、及びプライマーの第一プライマーはそれぞれ、Ｔ７プロモーター配列を含む。
【００３４】
増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む場合がある。第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含む場合がある。第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む場合がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、活性酵素の場合も失活酵素の場合もある。第一プライマーは、標的核酸の第一鎖と相補的な部分を含む場合があり、第二プライマーは、標的核酸の第二鎖と相補的な部分を含む場合がある。
【００３５】
失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、失活Ｃａｓ９酵素または失活Ｃａｓ１２酵素である場合がある。失活Ｃａｓ１２酵素は、失活Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、またはＣａｓ１２ｃ酵素である場合がある。
【００３６】
ポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ、全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、及びシーケナーゼＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される場合がある。
【００３７】
ヘリカーゼは、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＶ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原、酵母菌ＲＡＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤｎａＢヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、パピローマウイルスＥ１ヘリカーゼ、古細菌ＭＣＭヘリカーゼ、真核生物ＭＣＭヘリカーゼ、及びＴ７  Ｇｐ４ヘリカーゼからなる群より選択される場合がある。失活ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ酵素、ヘリカーゼ、及びポリメラーゼは、同一温度で機能する場合がある。
【００３８】
別の態様において、本発明は、試料中の標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出するシステムを提供する。本システムは、先行実施形態において記載された構成要素に加えて、標的一本鎖核酸を二本鎖核酸に変換する試薬を含む場合がある。
【００３９】
別の態様において、本発明は、試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出するためのキットを提供する。本キットは、先行実施形態において記載された全ての構成要素に加えて、使用説明書のセットも含む場合がある。本キットは、さらに、試料中の二本鎖核酸を精製する試薬も含む場合がある。
【００４０】
さらに別の態様において、本発明は、試料中の標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出するためのキットを提供する。本キットは、先行実施形態において記載された構成要素、及び使用説明書のセットを含む場合がある。本キットは、さらに、試料中の一本鎖核酸を精製する試薬も含む場合がある。
【００４１】
例示の実施形態のこれら及び他の態様、目的、特長、及び利点は、図解される例示の実施形態についての以下の詳細な説明を考慮することで当業者に明らかとなるだろう。
【００４２】
本発明の原理が利用されている場合がある例示の実施形態について説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより、本発明の特長及び利点が理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＨＤＡワークフローを説明する模式図である。
【００４４】
【図２】ＣＲＩＳＰＲ−ＨＤＡワークフローを説明する模式図である。
【００４５】
【図３Ａ】単一分子検出用の２工程好熱性ＣＲＩＳＰＲ  ＨＤＡ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ等温増幅方法の感度を図示するグラフである。このグラフは、２ｐＭ濃度での検出を示す。
【図３Ｂ】単一分子検出用の２工程好熱性ＣＲＩＳＰＲ  ＨＤＡ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ等温増幅方法の感度を図示するグラフである。このグラフは、２００ｆＭ、濃度での検出を示す。
【図３Ｃ】単一分子検出用の２工程好熱性ＣＲＩＳＰＲ  ＨＤＡ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ等温増幅方法の感度を図示するグラフである。このグラフは、２０ｆＭ、濃度での検出を示す。
【図３Ｄ】単一分子検出用の２工程好熱性ＣＲＩＳＰＲ  ＨＤＡ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ等温増幅方法の感度を図示するグラフである。このグラフは、２ｆＭ濃度での検出を示す。
【図３Ｅ】単一分子検出用の２工程好熱性ＣＲＩＳＰＲ  ＨＤＡ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ等温増幅方法の感度を図示するグラフである。このグラフは、２００ａＭ濃度での検出を示す。
【図３Ｆ】単一分子検出用の２工程好熱性ＣＲＩＳＰＲ  ＨＤＡ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ等温増幅方法の感度を図示するグラフである。このグラフは、２ａＭ濃度での検出を示す。
【図３Ｇ】単一分子検出用の２工程好熱性ＣＲＩＳＰＲ  ＨＤＡ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ等温増幅方法の感度を図示するグラフである。このグラフは、０ａＭ濃度での検出を示す。
【００４６】
【図４】ｄＡｓＣｐｆ１が２工程好熱性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）ＳＨＥＲＬＯＣＫの感度を改善することを示すグラフである。
【００４７】
【図５】効果がｄＡｓＣｐｆ１：ｃｒＲＮＡ複合体により引き起こされることを示すグラフである。
【００４８】
【図６】Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂが両方とも２工程ｔＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫを改善することを示すグラフである。
【００４９】
【図７】中温性ヘリカーゼの選択のチャートであり、左に温度範囲、右に大きさ（ａａ）が含まれる。
【００５０】
【図８】例示の等温ヘリカーゼレポーターアッセイを示す。
【００５１】
【図９】Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＵｖｒＤのＤ４０３及びＤ４０４をアラニン置換すると、ヘリカーゼの処理能力及び活性が上昇することを示す。コンセンサス同一性が提示されており、選択されたＵｖｒＤヘリカーゼ間で保存された部位は四角で囲まれている（配列番号１〜１４）。
【００５２】
【図１０】選択されたｐｃｒＡ（ＵｖｒＤ）型ヘリカーゼが幅広い活性スペクトルを有し、「スーパーヘリカーゼ」ＤＤ→ＡＡ置換が活性を向上させることを示す。
【００５３】
【図１１】ヘリカーゼレポーターアッセイが、補因子優先度及びヘリカーゼ基質解きほぐしの速度の推測に使用可能であることを示すグラフを含む。１番〜８番は、数字がヘリカーゼ濃度の２倍希釈系列を表し、１が最高濃度であり８がヘリカーゼなしである。
【００５４】
【図１２】プロトコル最適化の研究のチャートであり、１反応あたり５００ｎｇのＴ４  ｇｐ３２  ＳＳＢ及び１２５ｎｇのヘリカーゼが最高の成績を出した。
【００５５】
【図１３】信号対バックグラウンド比の最適化のグラフであり、クラウディング剤ＰＥＧ  ２０Ｋ及び補因子としてのＡＴＰを加えると信号対バックグラウンド比が上昇することを示す。
【００５６】
【図１４】従来のプライマー戦略及びアンカー型プライミング戦略を示す模式図である。
【００５７】
【図１５】「アンカー型」の量及び合計プライマー効率のグラフであり、「アンカー型」プライミングが増幅効率を高めることを示す。
【００５８】
【図１６】最適化ワンポットｍＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫが２ｆＭ（１０００コピー）を達成し（右）、それが２時間未満である（左）ことを示すグラフを含む。
【００５９】
【図１７】プラスミドＤＮＡでのワンポットｍＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫのグラフである。
【００６０】
本明細書中の図面は、例示のみを目的し、必ずしも縮尺どおりには描かれていない。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
一般的な定義
特に定義されない限り、本明細書中使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語と技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ４th  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１２）（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８７）（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）：  ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （１９９５）（Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ，  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．）：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．）：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３  （Ｅ．Ａ．  Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （１９８７）（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＩＸ，  出版元Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔ，  ２００８  （ＩＳＢＮ  ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  出版元Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  出版元ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５  （ＩＳＢＮ  ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４），  Ｍａｒｃｈ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９２）；及びＭａｒｔｅｎ  Ｈ．  Ｈｏｆｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｎ  ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１１）で見ることができる。
【００６２】
本明細書中使用される場合、単数形「ａ（不定冠詞）」、「ａｎ（不定冠詞）」、及び「ｔｈｅ（定冠詞）」は、文脈がそうではないと明確に指示しない限り、単数及び複数の指示対象の両方を含む。
【００６３】
「任意選択の」または「任意選択で」という用語は、その後に記載される事象、状況、または置き換えが発生する場合と発生しない場合があること、ならびにその記載にはその事象または状況が発生する場合及び発生しない場合が含まれることを意味する。
【００６４】
端点による数値範囲の列挙は、列挙された端点と同様に、それぞれの範囲内に包含される全ての数及び分数を含む。
【００６５】
「約」または「およそ」という用語は、本明細書中使用される場合、パラメーター、量、時間的持続期間などの測定可能な値を示す場合、その指定される値を基準にしたその値からの変動、例えば、指定される値を基準にしてその値から＋／−１０％以下、＋／−５％以下、＋／−１％以下、及び＋／−０．１％以下の変動を包含することを意味するが、ただし、そのような変動は、開示される本発明で生じるのに適切である場合に限る。当然のことながら、修飾語「約」または「およそ」が指す値は、それ自体も具体的であり、かつ好ましくは開示されている。
【００６６】
本明細書全体を通じて、「いくつかの実施形態」、「ある実施形態」、「実施形態の例」への言及は、実施形態に関連して記載された特定の特長、構造、または特性が本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における「実施形態によっては」、「ある実施形態において」、または「実施形態の例」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を示しているわけではないが、そうである場合もあり得る。さらに、特定の特長、構造、または特性は、本開示から当業者には明らかであると思われるとおり、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な様式で組み合わせられる場合がある。さらに、本明細書に記載される実施形態のあるものは、ある特長を含むが、他の実施形態に含まれる他の特長を含まないものの、異なる実施形態の特長の組み合わせは、本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のどれであっても、任意の組み合わせで使用され得る。
【００６７】
本明細書中使用される場合、「生体試料」は、全細胞及び／または生細胞及び／または細胞片を含有する場合がある。生体試料は、「体液」を含有する（またはそれに由来する）場合がある。本発明は、体液が、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（イヤーワックス）、乳糜、粥状液、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、女性射出液、胃酸、胃液、リンパ、粘液（鼻漏及び痰を含む）、心膜液、腹水、胸水、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（皮脂（ｓｋｉｎ  ｏｉｌ））、精液、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、吐瀉物、及びそれらの１種または複数の混合物から選択される実施形態を包含する。生体試料には、細胞培養物、体液、体液からの細胞培養物が含まれる。体液は、哺乳類生物から、例えば、穿刺により、または他の収集もしくは試料採取手技により、得ることができる。
【００６８】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書中同義で使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを示す。哺乳類として、マウス、サル、ヒト、家畜動物、スポーツ用動物、及びペットが挙げられるが、これらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏで得られたまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの子孫も、包含される。
【００６９】
「Ｃ２ｃ２」は、現在「Ｃａｓ１３ａ」と称されており、これらの用語は、特に記載がない限り、本明細書中同義で使用される。「グループ２９」、「グループ３０」、及びＣａｓ１３ｂという用語は、本明細書中同義で使用される。「Ｃｐｆ１」及び「Ｃａｓ１２ａ」という用語は、本明細書中同義で使用される。「Ｃ２ｃ１」及び「Ｃａｓ１２ｂ」という用語は、本明細書中同義で使用される。
【００７０】
「融解する」、「解きほぐす」、または「変性する」という用語は、核酸二本鎖の２つの相補性鎖の全部または一部が分離することを示す。
【００７１】
「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」は、本明細書中同義で使用され、ＤＮＡ切断のためのヌクレオチド鎖切断の触媒活性を保持する酵素を意味する。
【００７２】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書中「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称する）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書中「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称する）という用語は、当該分野で周知である。追加のガイダンスとして、本明細書中使用される場合、タンパク質の「ホモログ」とは、ホモログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、同じ種のタンパク質である。ホモログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。本明細書中使用される場合、タンパク質の「オルソログ」とは、オルソログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、異なる種のタンパク質である。オルソログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。ホモログ及びオルソログは、相同性モデリングによって同定可能である。（例えば、Ｇｒｅｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．  ２２８  （１９８５）  １０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｖｏｌ  １７２  （１９８８）、５１３）、または「構造的ＢＬＡＳＴ」（Ｄｅｙ  Ｆ，  Ｃｌｉｆｆ  Ｚｈａｎｇ  Ｑ，  Ｐｅｔｒｅｙ  Ｄ，  Ｈｏｎｉｇ  Ｂ．  Ｔｏｗａｒｄ  ａ  ‘‘ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＢＬＡＳＴ’’：  ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２０１３  Ａｐｒ；２２（４）：３５９−６６．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｐｒｏ．２２２５．を参照）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の分野における応用については、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）も参照。ホモログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。
【００７３】
様々な実施形態について、本明細書中以下に記載する。なお、特定の実施形態は、網羅的な説明であること、または本明細書で考察するよりも広範な態様に対する制限であることを意図しない。特定の実施形態に関連して記載される１つの態様は、必ずしもその実施形態に限定されるものではなく、他の任意の実施形態（複数可）で実施され得る。本明細書全体を通じて「１つの実施形態」、「ある実施形態」、「例示の実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特長、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて様々な箇所で「１つの実施形態において」、「ある実施形態において」、「例示の実施形態」という語句が出現する場合、必ずしも全てが同一の実施形態を示しているわけではないが、そうである場合もあり得る。さらに、その特定の特長、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において、本開示から当業者に明らかであると思われるとおり、任意の適切な様式で組み合わせることができる。さらに、本明細書中記載されるある実施形態は、ある特長を含むが他の実施形態に含まれる他の特長を含まないものの、異なる実施形態の特長の組み合わせは、本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のどれであっても、任意の組み合わせで使用可能である。
【００７４】
本明細書中引用される全ての刊行物、公開特許文書、及び特許出願は、個々の刊行物、公開特許文書、または特許出願が参照により援用されると具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、本明細書により参照として援用される。
【００７５】
概要
ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）では、二本鎖核酸を解きほぐしてプライマーハイブリダイゼーション及びその後のプライマー延長用のテンプレートを生成させるのに、ヘリカーゼ酵素が使用される。このプロセスは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、それぞれが、標的配列を含むセンス鎖または逆相補的標的配列を含むアンチセンス鎖のどちらかの３’末端とハイブリダイズする。ＨＤＡ反応は、ヘリカーゼ依存性核酸増幅の一般的方法である。
【００７６】
この方法をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと組み合わせた場合、標的核酸は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて標的核酸のＲループを開口することにより、増幅可能である。そうすると、標的核酸の第一鎖及び第二鎖は、ヘリカーゼを用いて解きほぐすことができ、等温条件下、プライマー及びポリメラーゼがＤＮＡに結合してこれを延長することができるようになる。標的核酸の検出は、ＨＤＡ技法に続いて行うことができ、好適な実施形態のいくつかにおいて、標的核酸の検出にＳＨＥＲＬＯＣＫ（特異的高感度酵素レポーターによるロック解除、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｕｎＬＯＣＫｉｎｇ）が使用可能である。
【００７７】
１つの態様において、本明細書中開示される実施形態は、試料中の標的核酸を増幅及び／または検出するシステムに関し、本システムは、増幅ＣＲＩＳＰＲ系、ヘリカーゼ、プライマー対、ポリメラーゼ、及び任意選択で標的核酸の増幅を検出する検出システムを含む。実施形態によっては、本システムは、二本鎖核酸を検出するが、標的核酸が一本鎖である場合、標的一本鎖核酸を二本鎖核酸に変換する試薬も、本システムとともに提供することができる。ある特定の例示の実施形態において、増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含み、第一複合体は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含み、第二複合体は、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む。ある特定の例示の実施形態において、本システムは、さらに、プライマー対の第一プライマーにも含まれているプロモーター配列を含む増幅器プライマーを含む。本システムは、さらに、クラウディング剤、補因子、一本鎖結合タンパク質、及び／またはアシストタンパク質から選択される１種または複数の添加剤を含む場合がある。特定の実施形態において、本システムは、さらに、検出システムを含み、検出システムは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出システムである場合がある。場合によっては、ＨＤＡに続いて、エフェクタータンパク質と、１つまたは複数の増幅された核酸に対応する１つまたは複数のガイド分子と、及びＲＮＡマスキング構築物とを含む検出システムが提供される。
【００７８】
標的二本鎖核酸の増幅及び／または検出方法
ある特定の実施形態において、本発明は、標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法を含み、本方法は、標的二本鎖核酸を含む試料を、増幅反応混合物と混合することを含み、増幅反応混合物は、以下：（ｉ）増幅ＣＲＩＳＰＲ系、増幅ＣＲＩＳＰＲ系は第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含み、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含み、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む；（ｉｉ）ヘリカーゼ；（ｉｉｉ）第一プライマー及び第二プライマーを含むプライマー対、ただし、第一プライマーは標的核酸の第一鎖と相補的な部分を含み、第二プライマーは標的核酸の第二鎖と相補的な部分を含む；ならびに（ｉｖ）ポリメラーゼ、を含む。本方法は、さらに、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて標的核酸のＲループを開口し、ヘリカーゼを用いて標的核酸の第一鎖と第二鎖を解きほぐし、プライマー対を用いて鎖をアニールし、及びポリメラーゼを用いて鎖を延長することにより、標的核酸を増幅することを含む場合がある。本方法は、さらに、等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、さらに標的核酸を増幅すること；及び任意選択で、増幅された標的核酸を検出することを含む場合がある。
【００７９】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を示し、標的配列とガイド配列の間でのハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、標的二本鎖または標的一本鎖核酸を含む場合がある。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含む場合がある。「標的ＤＮＡまたはＲＮＡ」あるいは「標的核酸」という用語は、標的配列であるもしくは標的配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを示す。言い換えると、標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、ｇＲＮＡ、すなわちガイド配列の一部が相補性を有するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体が介在するエフェクター機能がそれに向けられている、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドあるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部の場合がある。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に存在する。実施形態によっては、標的核酸は、一本鎖の場合も二本鎖の場合もある。実施形態によっては、標的核酸は、二本鎖である。
【００８０】
増幅ＣＲＩＳＰＲ系
特定の実施形態において、本明細書中想定される増幅反応混合物には、増幅ＣＲＩＳＰＲ系が含まれる。増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む場合がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、活性または失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の鎖に誘導するガイド分子とを含む場合がある。標的核酸が実際に長い、例えば、ゲノムＤＮＡなどの場合、活性Ｃａｓ酵素が有用である可能性がある。活性Ｃａｓ酵素は、ゲノムＤＮＡを切断して、二本鎖ＤＮＡの分断により生成した平滑末端にヘリカーゼ酵素が入ることを可能にする場合がある。
【００８１】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ系とは、本明細書中使用される場合、及びＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の文書で使用されているとおり、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現または活性の誘導に関与する転写物及び他の配列要素を総称的に示し、これに含まれるものとして、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直列反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分的な直列反復を含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも称する）、または本明細書で使用されるとおりの「ＲＮＡ（複数可）」という用語（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするＲＮＡ（複数可）、例えばＣＲＩＳＰＲＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物が挙げられる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する配列要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも称する）を特徴とする。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  ‘‘Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ’’，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，  ＤＯＩ：  ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８を参照。
【００８２】
ある特定の実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはＰＡＭ様モチーフは、本明細書中開示されるとおりのエフェクタータンパク質複合体が目的の標的遺伝子座に結合するように指示する。実施形態によっては、ＰＡＭは、５’ＰＡＭの場合がある（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）。他の実施形態において、ＰＡＭは、３’ＰＡＭの場合がある（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）。「ＰＡＭ」という用語は、「ＰＦＳ」または「プロトスペーサー隣接部位」または「プロトスペーサー隣接配列」と同義で使用される。
【００８３】
本発明に従って使用される追加のエフェクターは、それらとｃａｓ１遺伝子との近さにより同定可能であり、例えば、限定するものではないが、ｃａｓ１遺伝子の始まりから２０ｋｂ及びｃａｓ１遺伝子の終わりから２０ｋｂの領域内にある。ある特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、少なくとも１つのＨＥＰＮドメイン及び少なくとも５００のアミノ酸を有し、ただし、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、原核細胞ゲノムのＣａｓ遺伝子またはＣＲＩＳＰＲアレイの上流または下流２０ｋｂ以内に天然に存在する。Ｃａｓタンパク質の限定ではなく例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変型が挙げられる。ある特定の例示の実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、原核細胞ゲノムのＣａｓ１遺伝子の上流または下流２０ｋｂ以内に天然に存在する。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書中「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称する）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書中「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称する）という用語は、当該分野で周知である。追加のガイダンスとして、本明細書中使用される場合、タンパク質の「ホモログ」とは、ホモログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、同じ種のタンパク質である。ホモログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。本明細書中使用される場合、タンパク質の「オルソログ」とは、オルソログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、異なる種のタンパク質である。オルソログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。
【００８４】
ある特定の例示の実施形態において、組成物、システム、及びアッセイは、複数のＣａｓ１２オルソログあるいは１種または複数のオルソログを１種または複数のＣａｓ９オルソログと組み合わせて含む場合がある。ある特定の例示の実施形態において、Ｃａｓ１２オルソログは、Ｃｐｆ１オルソログ、Ｃ２ｃ１オルソログ、またはＣ２ｃ３オルソログである。
【００８５】
特定の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む属の生物に由来するものであり得る。
【００８６】
特定の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ属、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ科、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属を含む属の生物に由来する。
【００８７】
さらなる特定の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．  ｃｏｌｉ；Ｎ．  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．  ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．  ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．  ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．  ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉから選択される生物に由来する。特定の実施形態において、ニッカーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９から選択される生物由来のＣａｓ９ニッカーゼである。
【００８８】
より好適な実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．  ｃｏｌｉ；Ｎ．  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．  ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．  ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．  ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．  ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅからなる群より選択される細菌種に由来する。
【００８９】
Ｃｐｆ１遺伝子は、複数の多様な細菌ゲノムにおいて見られ、典型的には、同じ遺伝子座でｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ４遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲカセットとともに見られる（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｆｘ１のＦＮＦＸ１＿１４３１−ＦＮＦＸ１＿１４２８）。すなわち、この推定新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のレイアウトは、ＩＩ−Ｂ型のものと同様であるように見受けられる。そのうえさらに、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９と同様に、トランスポゾンＯＲＦ−Ｂとホモログの関係にある容易に同定可能なＣ末端領域を有し、また、活性ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びＺｎフィンガー（Ｃａｓ９には存在しない）を有する。しかしながら、Ｃａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓとは脈絡のない複数のゲノム中にも存在し、その相対的に高いＯＲＦ−Ｂ類似性は、これが、トランスポゾン構成要素である可能性を示唆する。仮にこれが本物のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であり、Ｃｐｆ１がＣａｓ９の機能的類似体であるとしたら、これは、新型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、いわゆるＶ型であるという可能性が示唆された（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｍａｋａｒｏｖａ  ＫＳ，  Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１５；１３１１：４７−７５を参照）。しかしながら、本明細書中記載される場合、Ｃｐｆ１は、Ｃ２ｃ１ｐと区別するためにサブタイプＶ−Ａにあるとして表される。Ｃ２ｃ１ｐは、同一のドメイン構造を有さず、したがってサブタイプＶ−Ｂにあるとして表される。
【００９０】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ属、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ科、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属を含む属の生物に由来する場合がある。
【００９１】
さらなる特定の実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．  ｃｏｌｉ；Ｎ．  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．  ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．  ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．  ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．  ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉから選択される生物に由来する。
【００９２】
より好適な実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）群菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｉｎｉｓ、ならびにＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｈｅｎｉｓｃｉから選択される細菌種に由来する場合がある。
【００９３】
本発明は、サブタイプＶ−Ｂで示されるＣ２ｃ１遺伝子座に由来するＣ２ｃ１に基づくヌクレアーゼの使用を包含する。本明細書中、そのようなエフェクタータンパク質は、「Ｃ２ｃ１ｐ」、例えば、Ｃ２ｃ１タンパク質とも称する（及びそのようなエフェクタータンパク質またはＣ２ｃ１タンパク質またはＣ２ｃ１遺伝子座に由来するタンパク質も「ＣＲＩＳＰＲ酵素」と称する）。現在、サブタイプＶ−Ｂ遺伝子座は、ｃａｓ１−Ｃａｓ４融合物、ｃａｓ２、Ｃ２ｃ１と示される別個の遺伝子、及びＣＲＩＳＰＲアレイを包含する。Ｃ２ｃ１（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃ２ｃ１）は、Ｃａｓ９の相当するドメインとホモログの関係にあるＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインをＣａｓ９の特徴的なアルギニンリッチクラスターのカウンターパートと合わせて有する巨大タンパク質（約１１００〜１３００のアミノ酸）である。しかしながら、Ｃ２ｃ１には、全てのＣａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインが欠けており、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃａｓ９とは対照的にＣ２ｃ１配列中で連続している。Ｃａｓ９では、このドメインには、ＨＮＨドメインを含む長い挿入が含まれている。したがって、特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
【００９４】
Ｃ２ｃ１（Ｃａｓ１２ｂとしても知られる）タンパク質は、ＲＮＡに誘導されるヌクレアーゼである。これによる切断は、ガイド配列及び直列反復を含むガイドＲＮＡを動員するｔｒａｃｒＲＮＡに依存しており、ガイド配列は、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖を形成する。現在の研究に基づくと、Ｃ２ｃ１ヌクレアーゼ活性も、ＰＡＭ配列の認識を必要とし、これに依存する。Ｃ２ｃ１のＰＡＭ配列はＴリッチ配列である。実施形態によっては、ＰＡＭ配列は、５’ＴＴＮ３’または５’ＡＴＴＮ３’であり、配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドである。特定の実施形態において、ＰＡＭ配列は、５’ＴＴＣ３’である。特定の実施形態において、ＰＡＭは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの配列中にある。
【００９５】
Ｃ２ｃ１は、標的遺伝子座においてねじれ型切断を作り、５’オーバーハング、すなわち「粘着末端」が、標的配列のＰＡＭ遠位側にできる。実施形態によっては、５’オーバーハングは、７ｎｔである。Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｋｅ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２０１７  Ｆｅｂ  ２；６５（３）：３７７−３７９を参照。
【００９６】
Ｃ２ｃ１遺伝子は、複数の多様な細菌ゲノムにおいて見られ、典型的には、同じ遺伝子座でｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ４遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲカセットとともに見られる。すなわち、この推定新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のレイアウトは、ＩＩ−Ｂ型のものと同様であるように見受けられる。そのうえさらに、Ｃ２ｃ１タンパク質は、Ｃａｓ９と同様に、活性ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びＺｎフィンガー（Ｃａｓ９には存在しない）を有する。
【００９７】
特定の実施形態において、Ｃ２ｃ１タンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ属、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ科、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ門、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ門、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ綱、ＰｈｙＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅ属、及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ科を含む属の生物に由来する場合がある。
【００９８】
さらなる特定の実施形態において、Ｃ２ｃ１タンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｓａｓｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ  ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ門菌ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ  ＷＯＲ＿２属菌ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ科菌ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ綱菌ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門菌ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門菌ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ科菌ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ種ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、及びＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓからなる群より選択される細菌種に由来するものが可能である。
【００９９】
本明細書中提供される方法及びツールは、ｔｒａｃｒＲＮＡを利用しないＩＩ型ヌクレアーゼであるＣａｓ１３の有無に関係なく使用されるように設計される場合がある。Ｃａｓ１３のオルソログは、本明細書中記載されるとおり異なる細菌種で同定されてきている。同様な特性を持つさらなるＩＩ型ヌクレアーゼは、当該分野で記載される方法を用いて同定可能である（Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５，  ６０：３８５−３９７；Ａｂｕｄａｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ５；３５３（６２９９））。特定の実施形態において、新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を同定するそのような方法は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ遺伝子座の存在を同定するシードをコードする配列をデータベースから選出する工程、選択された配列中シードの１０ｋｂ以内の位置で翻訳領域（ＯＲＦ）を含む遺伝子座を同定する工程、その中から、ＯＲＦを含む遺伝子座を選択する工程、ただしそのうち単一ＯＲＦのみが、７００超のアミノ酸を有し既知ＣＲＩＳＰＲエフェクターとの相同性が９０％以下である新規ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする、を含む場合がある。特定の実施形態において、シードとは、Ｃａｓ１などのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に共通するタンパク質である。さらなる実施形態において、新規エフェクタータンパク質を同定するのにＣＲＩＳＰＲアレイが使用される。
【０１００】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、その構成要素、及びそのような構成要素の送達（方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子を含む）、ならびにその調製及び使用（量及び製剤に関するものを含む）、ならびにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現真核細胞、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現真核生物（マウスなど）に関する一般的な情報に関しては、以下を参照：米国特許第８，９９９，６４１号、同第８，９９３，２３３号、同第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８９５，３０８号、同第８，９０６，６１６号、同第８，９３２，８１４号、及び同第８，９４５，８３９号；米国特許公開ＵＳ  ２０１４−０３１０８３０（米国出願第１４／１０５，０３１号）、同ＵＳ  ２０１４−０２８７９３８  Ａ１（米国出願第１４／２１３，９９１号）、同ＵＳ  ２０１４−０２７３２３４  Ａ１（米国出願第１４／２９３，６７４号）、同ＵＳ  ２０１４−０２７３２３２  Ａ１（米国出願第１４／２９０，５７５号）、同ＵＳ  ２０１４−０２７３２３１（米国出願第１４／２５９，４２０号）、同ＵＳ  ２０１４−０２５６０４６  Ａ１（米国出願第１４／２２６，２７４号）、同ＵＳ  ２０１４−０２４８７０２  Ａ１（米国出願第１４／２５８，４５８号）、同ＵＳ  ２０１４−０２４２７００  Ａ１（米国出願第１４／２２２，９３０号）、同ＵＳ  ２０１４−０２４２６９９  Ａ１（米国出願第１４／１８３，５１２号）、同ＵＳ  ２０１４−０２４２６６４  Ａ１（米国出願第１４／１０４，９９０号）、同ＵＳ  ２０１４−０２３４９７２  Ａ１（米国出願第１４／１８３，４７１号）、同ＵＳ  ２０１４−０２２７７８７  Ａ１（米国出願第１４／２５６，９１２号）、同ＵＳ  ２０１４−０１８９８９６  Ａ１（米国出願第１４／１０５，０３５号）、同ＵＳ  ２０１４−０１８６９５８（米国出願第１４／１０５，０１７号）、同ＵＳ  ２０１４−０１８６９１９  Ａ１（米国出願第１４／１０４，９７７号）、同ＵＳ  ２０１４−０１８６８４３  Ａ１（米国出願第１４／１０４，９００号）、同ＵＳ  ２０１４−０１７９７７０  Ａ１（米国出願第１４／１０４，８３７号）、及び同ＵＳ  ２０１４−０１７９００６  Ａ１（米国出願第１４／１８３，４８６号）、同ＵＳ  ２０１４−０１７０７５３（米国出願第１４／１８３，４２９号）、同ＵＳ  ２０１５−０１８４１３９（米国出願第１４／３２４，９６０号）、第１４／０５４，４１４号；欧州特許出願ＥＰ  ２  ７７１  ４６８（ＥＰ１３８１８５７０．７）、同ＥＰ  ２  ７６４  １０３（ＥＰ１３８２４２３２．６）、及び同ＥＰ  ２  ７８４  １６２（ＥＰ１４１７０３８３．５）；ならびにＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１４／０９３６６１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３）、同ＷＯ２０１４／０９３６９４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０）、同ＷＯ２０１４／０９３５９５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１）、同ＷＯ２０１４／０９３７１８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５）、同ＷＯ２０１４／０９３７０９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２）、同ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣ��／ＵＳ２０１３／０７４６６７）、同ＷＯ２０１４／０９３６３５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１）、同ＷＯ２０１４／０９３６５５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６）、同ＷＯ２０１４／０９３７１２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９）、同ＷＯ２０１４／０９３７０１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００）、同ＷＯ２０１４／０１８４２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８）、同ＷＯ２０１４／２０４７２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１７９０）、同ＷＯ２０１４／２０４７２４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００）、同ＷＯ２０１４／２０４７２５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３）、同ＷＯ２０１４／２０４７２６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４）、同ＷＯ２０１４／２０４７２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６）、同ＷＯ２０１４／２０４７２８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８）、同ＷＯ２０１４／２０４７２９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９）、同ＷＯ２０１５／０８９３５１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、同ＷＯ２０１５／０８９３５４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、同ＷＯ２０１５／０８９３６４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、同ＷＯ２０１５／０８９４２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、同ＷＯ２０１５／０８９４６２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１２７）、同ＷＯ２０１５／０８９４１９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００５７）、同ＷＯ２０１５／０８９４６５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１３５）、同ＷＯ２０１５／０８９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、同ＷＯ２０１５／０５８０５２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１０７７）、同ＷＯ２０１５／０７００８３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６４６６３）、同ＷＯ２０１５／０８９３５４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、同ＷＯ２０１５／０８９３５１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、同ＷＯ２０１５／０８９３６４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、同ＷＯ２０１５／０８９４２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、同ＷＯ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）、同ＷＯ２０１５／０８９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、同ＷＯ２０１６／０４９２５８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５１８３０）、同ＷＯ２０１６／０９４８６７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３８５）、同ＷＯ２０１６／０９４８７２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３９３）、同ＷＯ２０１６／０９４８７４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３９６）、同ＷＯ２０１６／１０６２４４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６７１７７）。
【０１０１】
同じく以下が参照される：２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，７０９号、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４５５号、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，７０８号、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４６２号、２０１４年１２月２３日出願の米国出願第６２／０９６，３２４号、２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，６８１号、及び２０１５年１０月５日出願の米国出願第６２／２３７，４９６号、ＤＥＡＤ  ＧＵＩＤＥＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＦＡＣＴＯＲＳ；２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４５６号及び２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，６９２号、ＥＳＣＯＲＴＥＤ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ  ＧＵＩＤＥＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４６１号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＯＭＥ  ＥＤＩＴＩＮＧ  ＡＳ  ＴＯ  ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  （ＨＳＣｓ）；２０１４年１２月１９日出願の米国出願第６２／０９４，９０３号、ＵＮＢＩＡＳＥＤ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＯＵＢＬＥ−ＳＴＲＡＮＤ  ＢＲＥＡＫＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＩＣ  ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ  ＢＹ  ＧＥＮＯＭＥ−ＷＩＳＥ  ＩＮＳＥＲＴ  ＣＡＰＴＵＲＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ；２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，７６１号、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＡＮＤ  ＧＵＩＤＥ  ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ；２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，０５９号、２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６４１号、及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６６７号、ＲＮＡ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ；２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，６５６号及び２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８１，１５１号、ＣＲＩＳＰＲ  ＨＡＶＩＮＧ  ＯＲ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＤＯＭＡＩＮＳ；２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，６９７号、ＣＲＩＳＰＲ  ＨＡＶＩＮＧ  ＯＲ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＡＡＶ；２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，１５８号、ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１５年４月２２日出願の米国出願第６２／１５１，０５２号、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＦＯＲ  ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＥＸＯＳＯＭＡＬ  ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ；２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，４９０号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ  ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＵＳＩＮＧ  ＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ；２０１４年２月１２日出願の米国出願第６１／９３９，１５４号、ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４８４号、ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，５３７号、ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，６５１号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＣＡＮＣＥＲ  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＶＩＶＯ；２０１４年１０月２３日出願の米国出願第６２／０６７，８８６号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＣＡＮＣＥＲ  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＶＩＶＯ；２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，６７５号及び２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８１，００２号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＮＥＵＲＯＮＡＬ  ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ；２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，５２８号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＥ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＯＲ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ；２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４５４号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＡＲＧＥＴ��ＮＧ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ  ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＵＳＩＮＧ  ＣＥＬＬ  ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  （ＣＰＰ）；２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４６０号、ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＬＩＮＫＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，４７５号及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６９０号、ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４８７号、ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，５４６号及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６８７号、ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＬＩＮＫＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；ならびに２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，２８５号、ＣＲＩＳＰＲ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲ  ＧＲＯＷＴＨ  ＡＮＤ  ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ。
【０１０２】
以下も参照される：２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６５９号及び２０１５年８月１９日出願の米国出願第６２／２０７，３１８号、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ，  ＥＮＺＹＭＥ  ＡＮＤ  ＧＵＩＤＥ  ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ  ＯＦ  ＣＡＳ９  ＯＲＴＨＯＬＯＧＳ  ＡＮＤ  ＶＡＲＩＡＮＴＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ。以下も参照される：２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６６３号及び２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２４５，２６４号、ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６７５号、２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２８５，３４９号、２０１６年２月１７日出願の米国出願第６２／２９６，５２２号、及び２０１６年４月８日出願の米国出願第６２／３２０，２３１号、ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１５年９月２４日出願の米国出願第６２／２３２，０６７号、２０１５年１２月１８日出願の米国出願第１４／９７５，０８５号、欧州出願第１６１５０４２８．７号、２０１５年８月１６日出願の米国出願第６２／２０５，７３３号、２０１５年８月５日出願の米国出願第６２／２０１，５４２号、２０１５年７月１６日出願の米国出願第６２／１９３，５０７号、及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，７３９号、各出願の名称ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ；ならびに２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２４５，２７０号、ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ。以下も参照される：２０１４年２月１２日出願の米国出願第６１／９３９，２５６号及び２０１４年１２月１２日出願のＷＯ  ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）、各出願の名称ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＷＩＴＨ  ＮＥＷ  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＵＲＥＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ。以下も参照される：２０１５年８月１５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４５５０４、２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，６９９号、及び２０１４年８月１７日出願の米国出願第６２／０３８，３５８号、各出願の名称ＧＥＮＯＭＥ  ＥＤＩＴＩＮＧ  ＵＳＩＮＧ  ＣＡＳ９  ＮＩＣＫＡＳＥＳ。検出法について、以下も参照される：２０１７年１２月２２日出願の米国出願第６２／６１０，０６６号、２０１８年１月２９日出願の同第６２／６２３，５４６号、及び２０１８年２月１４日出願の同第６２／６３０，８１４号、各出願の名称ＣＲＩＳＰＲ  ＥＦＦＥＣＴＯＲ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＡＳＥＤ  ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ。
【０１０３】
こうした特許、特許公開、及び出願のそれぞれ、ならびにその中で引用される文書またはその審査の間に生じる文書（「出願引用文書」）の全て、ならびに出願引用文書において引用または参照される文書の全てが、その中で言及される任意の製品に対する、またはその中に記載の参照として援用される任意の文書における、任意の説明、記載、製品仕様書、及び製品シートと併せて、本明細書中参照として援用され、本発明の実施の際に利用される場合がある。全ての文書（例えば、こうした特許、特許公開、及び出願、ならびに出願引用文書）は、個々の文書のそれぞれが参照として援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、本明細書中参照として援用される。
【０１０４】
失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素
特定の実施形態において、本明細書中定義されるとおりの改変Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９を利用することが目的となるが、ただしこのタンパク質は、ＲＮＡを含む核酸分子と複合体形成して、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ただし、ＣＲＩＳＰＲ複合体において、核酸分子が１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的とする場合、タンパク質は、非修飾Ｃａｓタンパク質と比較して少なくとも１つの修飾を有し、及び修飾タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、非修飾Ｃａｓタンパク質を含む複合体と比較した場合に活性が変化している。当然のことながら、本明細書中ＣＲＩＳＰＲ「タンパク質」と示す場合、Ｃａｓタンパク質は、好ましくは、修飾ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である（例えば、酵素活性が上昇または低下している（あるいはない）、例えば、限定するものではないが、Ｃａｓ９が挙げられる）。「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」という用語は、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質」と同義で使用することができ、野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に比べて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が改変されているかどうか、例えば酵素活性が上昇または低下している（あるいはない）などとは無関係である。本明細書中使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質に関して「修飾された」という用語は、概して、派生元となる野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、１つまたは複数の修飾または変異（点変異、トランケーション、挿入、削除、キメラ、融合タンパク質などを含む）を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を示す。由来するは、由来する酵素が、高度の配列相同性を有するという意味において、野生型酵素に多大に基づいているが、当該分野で既知のある種の方法でまたは本明細書中記載されるとおりに変異している（修飾されている）ことを意味する。あるいは、そのような修飾タンパク質で酵素活性を持たないものを、失活タンパク質、または失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と称する場合がある。
【０１０５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質の追加修飾は、機能の改変をもたらす場合もそうでない場合もある。例として、特にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質に関して、機能の改変をもたらさない修飾として、例えば、発現のための特定宿主へのコドン最適化、または特定マーカー（例えば、可視化用）を持つヌクレアーゼの提供が挙げられる。機能の改変をもたらす可能性がある修飾は、変異、ならびにキメラヌクレアーゼ（例えば、異なるオルソログまたはホモログ由来のドメインを含む）または融合タンパク質も含む場合があり、変異として、点変異、挿入、削除、トランケーション（開裂ヌクレアーゼを含む）などが挙げられる。融合タンパク質として、特に制限なく、例えば、異種ドメインまたは機能性ドメイン（例えば、局在化シグナル、触媒ドメインなど）との融合物を挙げることができる。ある特定の実施形態において、多種多様な修飾を組み合わせる場合がある（例えば、触媒的に不活性であり、例えばＤＮＡメチル化もしくは別の核酸修飾を誘導するためにさらに機能性ドメインと融合されている変異型ヌクレアーゼ、例えば、特に制限なく、切断（例えば、異なるヌクレアーゼ（ドメイン）によるもの）、変異、削除、挿入、置換、連結、消化、切断、または組換えが挙げられる）。本明細書中使用される場合、「機能の改変」として、特に制限なく、特異性の改変（例えば、標的認識の改変、特異性の上昇（例えば、「向上した」Ｃａｓタンパク質）または低下、あるいはＰＡＭ認識の改変）、活性の改変（例えば、触媒活性の上昇または低下、触媒不活性なヌクレアーゼまたはニッカーゼを含む）、及び／または安定性の改変（例えば、不安定化ドメインを持つ融合物）が挙げられる。適切な異種ドメインとして、特に制限なく、ヌクレアーゼ、リガーゼ、修復タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、（ウイルス）インテグラーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、アルゴノート、シチジンデアミナーゼ、レトロン（ｒｅｔｒｏｎ）、グループＩＩイントロン、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ、スルフリラーゼ（ｓｕｌｐｆｕｒｙｌａｓｅ）、キナーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼなどが挙げられる。こうした修飾の全ての例は、当該分野で既知である。当然のことながら、本明細書中称するとおりの「修飾」ヌクレアーゼ、特に「修飾」Ｃａｓまたは「修飾」ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または複合体は、好ましくは、ポリ核酸と相互作用するまたはそれと結合する能力を依然として有する（例えば、ガイド分子との複合体形成において）。そのような修飾Ｃａｓタンパク質は、本明細書中記載されるとおりのデアミナーゼタンパク質またはその活性ドメインと組み合わせることができる。
【０１０６】
ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、活性及び／または特異性の向上をもたらす１つまたは複数の修飾を含む場合があり、そのような修飾として、例えば、標的指向化または非標的指向化鎖を安定化させる残基の変異が挙げられる（例えば、ｅＣａｓ９；‘‘Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ’’，  Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３５１（６２６８）：８４−８８、本明細書によりそのまま全体が参照として援用される）。ある特定の実施形態において、改変ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性の改変または修飾は、標的指向性効率の上昇または標的外結合の減少を含む。ある特定の実施形態において、改変ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性の改変は、切断活性の修飾を含む。ある特定の実施形態において、活性の改変は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に対する切断活性の上昇を含む。ある特定の実施形態において、活性の改変は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に対する切断活性の低下を含む。ある特定の実施形態において、活性の改変は、標的外ポリヌクレオチド遺伝子座に対する切断活性の低下を含む。ある特定の実施形態において、修飾ヌクレアーゼの活性の改変または修飾は、ヘリカーゼ動態の改変を含む。ある特定の実施形態において、修飾ヌクレアーゼは、タンパク質と、ＲＮＡを含む核酸分子（Ｃａｓタンパク質の場合）、または標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖、または標的外ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖との会合を改変する修飾を含む。本発明の態様において、改変ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を改変する修飾を含む。ある特定の実施形態において、活性の改変は、標的外ポリヌクレオチド遺伝子座に対する切断活性の上昇を含む。したがって、ある特定の実施形態において、標的外ポリヌクレオチド遺伝子座と比較した場合に標的ポリヌクレオチド遺伝子座に対する特異性の上昇が存在する。他の実施形態において、標的外ポリヌクレオチド遺伝子座と比較した場合に標的ポリヌクレオチド遺伝子座に対する特異性の低下が存在する。ある特定の実施形態において、変異は、標的外効果（例えば、切断もしくは結合特性、活性、または動態）の低下をもたらし、例えば、Ｃａｓタンパク質の場合において、例えば、標的とガイドＲＮＡとの間のミスマッチ許容度の低下をもたらす。他の変異は、標的外効果（例えば、切断もしくは結合特性、活性、または動態）の上昇をもたらす場合がある。他の変異は、標的的中効果（例えば、切断もしくは結合特性、活性、または動態）の上昇または低下を招く場合がある。ある特定の実施形態において、変異は、ヘリカーゼ活性の改変（例えば、上昇または低下）、機能性ヌクレアーゼ複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体）の会合または形成の改変をもたらす。ある特定の実施形態において、変異は、ＰＡＭ認識の改変をもたらす、すなわち、非修飾Ｃａｓタンパク質と比較して、異なるＰＡＭが（追加でまたは代替で）認識される場合がある（例えば、‘‘Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ��ＡＭ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ’’，  Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５），  Ｎａｔｕｒｅ，  ５２３（７５６１）：４８１−４８５を参照、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。特に好適な変異は、特異性を向上させる目的で、正荷電残基及び／または（進化上）保存残基、例えば、保存された正荷電残基を含む。ある特定の実施形態において、そのような残基は、変異により、アラニンなど無電荷残基になる場合がある。
【０１０７】
特定の実施形態において、本明細書中定義されるとおりの改変Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９を利用することが目的となるが、ただしこのタンパク質は、ＲＮＡを含む核酸分子と複合体形成して、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ただし、ＣＲＩＳＰＲ複合体において、核酸分子が１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的とする場合、タンパク質は、非修飾Ｃａｓタンパク質と比較して少なくとも１つの修飾を有し、及び修飾タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、非修飾Ｃａｓ９タンパク質を含む複合体と比較した場合に活性が変化している。当然のことながら、本明細書中ＣＲＩＳＰＲ「タンパク質」と示す場合、Ｃａｓタンパク質は、好ましくは、修飾ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である（例えば、酵素活性が上昇または低下している（あるいはない）、例えば、限定するものではないが、Ｃａｓ９が挙げられる）。「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」という用語は、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質」と同義で使用することができ、野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に比べて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が改変されているかどうか、例えば酵素活性が上昇または低下している（あるいはない）などとは無関係である。
【０１０８】
特定の実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣａｓのホモログまたはオルソログは、Ｃａｓ９と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣａｓのホモログまたはオルソログは、野生型Ｃａｓと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。Ｃａｓが１つまたは複数の変異を有する（変異型である）場合、本明細書中称されるとおりの当該Ｃａｓのホモログまたはオルソログは、変異型Ｃａｓと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質の１つまたは複数の触媒ドメイン（例えば、Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、及びＲｕｖＣ  ＩＩＩ、またはＨＮＨドメイン）が変異して、標的配列の１つのＤＮＡ鎖のみを切断する変異型Ｃａｓタンパク質が生成する。
【０１１０】
追加のガイダンスとして、特に制限なく、例えば、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインにおいてアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）を行うと、Ｃａｓ９は、鎖を両方とも切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本の鎖を切断する）へと変換される。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例として、特に制限なく、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。追加のガイダンスとして、酵素がＳｐＣａｓ９ではない場合、変異は、ＳｐＣａｓ９の１０、７６２、８４０、８５４、８６３、及び／または９８６位に相当する残基のいずれかまたは全てで行うことが可能である（このことは、例えば、標準の配列比較ツールにより確認可能である）。詳細には、以下の変異のいずれかまたは全てが、ＳｐＣａｓ９において好適であり：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／またはＤ９８６Ａ；ならびに交換アミノ酸のいずれかについての保存的置換も想定されている。
【０１１１】
１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、触媒不活性なＨＮＨドメインを有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼである（例えば、Ｎ８６３Ａ変異を持つＳｐＣａｓ９ニッカーゼ）。別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、触媒不活性なＨＮＨドメインを有するＳａＣａｓ９である（例えば、Ｎ５８０Ａ変異を持つＳａＣａｓ９ニッカーゼ）。さらに別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＨＮＨドメインが部分的または完全に除去されたＳｐＣａｓ９ニッカーゼである。さらに別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＨＮＨドメインが部分的または完全に除去されたＳａＣａｓ９である。
【０１１２】
上記のＣａｓ９酵素のあるものにおいて、酵素は、１つまたは複数の残基の変異により修飾されており、そのような残基として、ＦｎＣａｓ９タンパク質または任意の相当するオルソログに従って、Ｄ９１７、Ｅ１００６、Ｅ１０２８、Ｄ１２２７、Ｄ１２５５Ａ、及びＮ１２５７位が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、本発明は、本明細書中検討される組成物を提供し、組成物中、Ｃａｓ９酵素は、ＦｎＣａｓ９タンパク質または任意の相当するオルソログに従って、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、及びＮ１２５７Ａからなる群より選択される１つまたは複数の変異を有する不活性化酵素である。ある態様において、本発明は、本明細書中検討される組成物を提供し、組成物中、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＦｎＣａｓ９タンパク質または任意の相当するオルソログに従って、Ｄ９１７、またはＥ１００６とＤ９１７、またはＤ９１７とＤ１２５５を有する。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、Ｃａｓ９の修飾または変異は、ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、ＲｕｖＣ  ＩＩＩ、またはＨＮＨドメインでの変異を含む。ある特定の実施形態において、修飾または変異は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸位置番号を参照して、１２、１３、６３、４１５、６１０、７７５、７７９、７８０、８１０、８３２、８４８、８５５、８６１、８６２、８６６、９６１、９６８、９７４、９７６、９８２、９８３、１０００、１００３、１０１４、１０４７、１０６０、１１０７、１１０８、１１０９、１１１４、１１２９、１２４０、１２８９、１２９６、１２９７、１３００、１３１１、及び１３２５位；好ましくは８５５位；８１０、１００３、及び１０６０位；または８４８、１００３位の１つまたは複数でのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態において、６３、４１５、７７５、７７９、７８０、８１０、８３２、８４８、８５５、８６１、８６２、８６６、９６１、９６８、９７４、９７６、９８２、９８３、１０００、１００３、１０１４、１０４７、１０６０、１１０７、１１０８、１１０９、１１１４、１１２９、１２４０、１２８９、１２９６、１２９７、１３００、１３１１、または１３２５位；好ましくは８５５位；８１０、１００３、及び１０６０位；８４８、１００３、及び１０６０位；あるいは４９７、６６１、６９５、及び９２６位での修飾または変異は、アラニン置換を含む。ある特定の実施形態において、修飾は、Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、及びＲ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ（ＳｐＣａｓ９を参照して）、及びＲ１０６０Ａを含む。ある特定の実施形態において、ある特定の実施形態において、修飾は、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、及びＱ９２６Ａ（ＳｐＣａｓ９を参照して）を含む。
【０１１４】
さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、及びＲｕｖＣ  ＩＩＩ、またはＨＮＨドメイン）を変異させて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った変異型Ｃａｓ９を生成させる場合がある。実施形態によっては、Ｄ１０Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った変異型Ｃａｓ９を生成させる。実施形態によっては、変異型酵素のＤＮＡ切断活性が、その非変異型を基準として約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％未満、またはそれより低い場合に、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失っていると見なされる。酵素がＳｐＣａｓ９ではない場合、変異は、ＳｐＣａｓ９の１０、７６２、８４０、８５４、８６３、及び／または９８６位に相当するいずれかまたは全てで行うことが可能である（このことは、例えば、標準の配列比較ツールにより確認可能である）。詳細には、以下の変異のいずれかまたは全てが、ＳｐＣａｓ９において好適であり：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／またはＤ９８６Ａ；ならびに交換アミノ酸のいずれかについての保存的置換も想定されている。他のＣａｓ９での相当する位置における同じ変異（またはそれら変異の保存的置換）も好適である。特に好適であるのは、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０である。しかしながら、他のＣａｓ９において、ＳｐＣａｓ９のＤ１０及びＨ８４０に相当する残基も好適である。
【０１１５】
ある特定の例示の実施形態において、組成物、システム、及びアッセイは、複数のＣａｓ１２オルソログあるいは１種または複数のオルソログを１種または複数のＣａｓ９オルソログと組み合わせて含む場合がある。ある特定の例示の実施形態において、Ｃａｓ１２オルソログは、Ｃｐｆ１オルソログ、Ｃ２ｃ１オルソログ、またはＣ２ｃ３オルソログである。
【０１１６】
本発明は、サブタイプＶ−Ａで示されるＣｐｆ１遺伝子座に由来する、野生型Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質の変異型に基づくニッカーゼの使用を包含する。本明細書中、そのようなエフェクタータンパク質は、「Ｃｐｆ１ｐ」、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質とも称する（及びそのようなエフェクタータンパク質またはＣｐｆ１タンパク質またはＣｐｆ１遺伝子座に由来するタンパク質も「ＣＲＩＳＰＲ酵素」と呼ぶ）。現在、サブタイプＶ−Ａ遺伝子座は、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｐｆ１で示される明確な遺伝子、及びＣＲＩＳＰＲアレイを包含する。Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１、サブタイプＰＲＥＦＲＡＮ）は、Ｃａｓ９の相当するドメインとホモログであるＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンリッチクラスターのカウンターパートと合わせて有する巨大タンパク質（約１３００のアミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１には、全てのＣａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインが欠けており、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃａｓ９とは対照的にＣｐｆ１配列中で連続している。Ｃａｓ９では、このドメインには、ＨＮＨドメインを含む長い挿入が含まれている。したがって、特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
【０１１７】
特定の実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣｐｆ１のホモログまたはオルソログは、Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣｐｆ１のホモログまたはオルソログは、野生型Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。Ｃｐｆ１が１つまたは複数の変異を有する（変異型である）場合、本明細書中称されるとおりの当該Ｃｐｆ１のホモログまたはオルソログは、変異型Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１１８】
ある実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、ある属の生物のオルソログである場合があり、そのような属の生物として、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、ある種の生物のオルソログである場合があり、そのような種の生物として、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣｐｆ１のホモログまたはオルソログは、本明細書中開示されるＣｐｆ１配列のうち１つまたは複数と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣｐｆ１のホモログまたはオルソログは、野生型ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、またはＬｂＣｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１１９】
特定の実施形態において、本発明のＣｐｆ１タンパク質は、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、またはＬｂＣｐｆ１と少なくとも６０％、より詳細には少なくとも７０、例えば少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣｐｆ１タンパク質は、野生型ＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１と少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より詳細には少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の実施形態において、本発明のＣｐｆ１タンパク質は、ＦｎＣｐｆ１との配列同一性が６０％未満である。当業者ならわかるだろうが、これには、Ｃｐｆ１タンパク質の切断型が含まれ、それにより配列同一性は、切断型の長さにわたり決定される。
【０１２０】
実施形態によっては、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｎｕｃドメインに変異を有する。実施形態によっては、Ｃｐｆ１タンパク質は、標的ＤＮＡ鎖とガイド分子の間のヘテロ二本鎖の形成により行き場を失った標的外ＤＮＡ鎖を、目的の標的遺伝子座において、ニッキングすることができる。実施形態によっては、Ｃｐｆ１タンパク質はＡｓＣｐｆ１のＲ１２２６Ａに相当する変異を有する。
【０１２１】
追加のガイダンスとして、特に制限なく、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＣｐｆ１のＮｕｃドメインにおいてアルギニンからアラニンへの置換（Ｒ１２２６Ａ）を行うと、Ｃｐｆ１は、鎖を両方とも切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本の鎖を切断する）へと変換される。当業者には当然のことながら、酵素がＡｓＣｐｆ１ではない場合、変異は、相当する位置の残基で行うことができる。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１はＦｎＣｐｆ１であり、変異は、Ｒ１２１８位のアルギニンで行われる。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１はＬｂＣｐｆ１であり、変異はＲ１１３８位のアルギニンで行われる。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１はＭｂＣｐｆ１であり、変異はＲ１２９３位のアルギニンで行われる。
【０１２２】
ある特定の例示の実施形態において、本発明は、ＲｕｖＣドメインに変異を有する触媒不活性Ｃ２ｃ１を含む。実施形態によっては、触媒不活性Ｃ２ｃ１タンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓのＣ２ｃ１のアミノ酸位置Ｄ５７０、Ｅ８４８、またはＤ９７７に相当する変異を有する。実施形態によっては、触媒不活性Ｃ２ｃ１タンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓのＣ２ｃ１のＤ５７０Ａ、Ｅ８４８Ａ、またはＤ９７７Ａに相当する変異を有する。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、Ｃａｓに基づくニッカーゼは、Ｎｕｃドメインに変異を有するＣ２ｃ１ニッカーゼである。実施形態によっては、Ｃ２ｃ１ニッカーゼは、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓのＣ２ｃ１のアミノ酸位置Ｒ９１１、Ｒ１０００、またはＲ１０１５に相当する変異を有する。実施形態によっては、Ｃ２ｃ１ニッカーゼは、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓのＣ２ｃ１のＲ９１１Ａ、Ｒ１０００Ａ、またはＲ１０１５Ａに相当する変異を有する。当業者には当然のことながら、酵素が上記のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素ではない場合、変異は、相当する位置の残基で行うことができる。
【０１２４】
変異は、隣接する残基、例えば、ヌクレアーゼ活性に関与する上記に示されるものの近くのアミノ酸で行うことができる。実施形態によっては、ＲｕｖＣドメインのみが不活性化され、他の実施形態において、別の推定ヌクレアーゼドメインが不活性化され、この場合、エフェクタータンパク質複合体は、ニッカーゼとして機能し、１つのＤＮＡ鎖のみを切断する。実施形態によっては、２種のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓバリアント（それぞれ異なるニッカーゼ）を用いて特異性を高め、２種のニッカーゼバリアントは、標的でＤＮＡを切断するのに用いられる（１つのＤＮＡ鎖のみが切断され続いて修復される標的外修飾は最小限に抑えつつまたは除外しながら、どちらのニッカーゼもＤＮＡ鎖を切断する）。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、Ｃ２ｃ１エフェクタータンパク質は、２つのＣ２ｃ１エフェクタータンパク質分子を含むホモ二量体として、目的の標的遺伝子座に関連した配列またはその遺伝子座で配列を切断する。好適な実施形態において、ホモ二量体は、それぞれ個別のＲｕｖＣドメインに異なる変異を有する２つのＣ２ｃ１エフェクタータンパク質分子を含む場合がある。
【０１２６】
特定の実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣ２ｃ１のホモログまたはオルソログは、Ｃ２ｃ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態において、本明細書中称されるとおりのＣ２ｃ１のホモログまたはオルソログは、野生型Ｃ２ｃ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。Ｃ２ｃ１が１つまたは複数の変異を有する（変異型である）場合、本明細書中称されるとおりの当該Ｃ２ｃ１のホモログまたはオルソログは、変異型Ｃ２ｃ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１２７】
特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素として、失活Ｃａｓ９、失活Ｃｐｆ１、失活Ｃ２ｃ１、または失活Ｃ２ｃ３が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインに変異を有する失活Ｃａｓ９タンパク質である場合がある。特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａ、またはＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａに相当する変異を有する失活Ｃａｓ９タンパク質である場合がある。特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＲｕｖＣドメインに変異を有する失活Ｃｐｆ１タンパク質である場合がある。特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＡｓＣｐｆ１のＤ９０８ＡまたはＥ９９３Ａに相当する変異を有する失活Ｃｐｆ１タンパク質である場合がある。特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ｎｕｃドメインに変異を有する失活Ｃ２ｃ１タンパク質である場合がある。特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＡａｃＣ２ｃ１のＤ５７０Ａ、Ｅ８４８Ａ、またはＤ９７７Ａに相当する変異を有する失活Ｃ２ｃ１タンパク質である場合がある。
【０１２８】
特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．  ｃｏｌｉ；Ｎ．  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．  ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．  ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．  ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．  ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅからなる群より選択される細菌種に由来する失活Ｃａｓ９タンパク質である場合がある。
【０１２９】
特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）群菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｉｎｉｓ、ならびにＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｈｅｎｉｓｃｉからなる群より選択される細菌種に由来するＣｐｆ１タンパク質である場合がある。
【０１３０】
特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｓａｓｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ  ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ門菌ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ  ＷＯＲ＿２細菌ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ科菌ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ綱菌ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門菌ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門菌ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ科菌ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ種ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、及びＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓからなる群より選択される細菌種に由来するＣ２ｃ１タンパク質である場合がある。
【０１３１】
ある特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、失活Ｃａｓ９、失活Ｃａｓ１２ａ、失活Ｃａｓ１２ｂ、または失活Ｃａｓ１２ｃである。
【０１３２】
ある特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインに変異を有する失活Ｃａｓ９タンパク質である。
【０１３３】
ある特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａ、またはＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａに相当する変異を有する失活Ｃａｓ９タンパク質である。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、失活Ｃａｓ１２タンパク質である。特定の実施形態において、失活Ｃａｓ１２タンパク質は、ＲｕｖＣドメインに変異を有する。
【０１３５】
ある特定の実施形態において、失活Ｃａｓ１２酵素は、失活Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃである。特定の実施形態において、失活Ｃａｓ１２ａは、ＡｓＣｐｆ１のＤ９０８ＡまたはＥ９９３Ａに相当する変異を有する。
【０１３６】
実施形態によっては、失活Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）群菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｉｎｉｓ、ならびにＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｈｅｎｉｓｃｉからなる群より選択される細菌種に由来する。
【０１３７】
特定の実施形態において、失活Ｃａｓ１２は、Ｎｕｃドメインに変異を有する失活Ｃａｓ１２ｂタンパク質である。特定の実施形態において、失活Ｃａｓ１２ｂは、ＡａｃＣ２ｃ１のＤ５７０Ａ、Ｅ８４８Ａ、またはＤ９７７Ａに相当する変異を有する。
【０１３８】
ある特定の実施形態において、失活Ｃａｓ１２ｂタンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｓａｓｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ  ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ門菌ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ  ＷＯＲ＿２細菌ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ科菌ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ綱菌ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門菌ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門菌ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ科菌ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ種ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、及びＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓからなる群より選択される細菌種に由来する。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、同じである。ある特定の実施形態において、第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、異なる。ある特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ１２ａ、ｄＣａｓ１２ｂ、ｄＣａｓ１２ｃ、またはｄＣａｓ１４である。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ、全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、及びシーケナーゼＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される。
【０１４１】
ある特定の実施形態において、ヘリカーゼは、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＶ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、ＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原、酵母菌ＲＡＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤｎａＢヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、パピローマウイルスＥ１ヘリカーゼ、古細菌ＭＣＭヘリカーゼ、真核生物ＭＣＭヘリカーゼ、及びＴ７  Ｇｐ４ヘリカーゼからなる群より選択される。
【０１４２】
ガイド配列
本明細書中使用される場合、「ガイド配列」、「ｃｒＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、または「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｇＲＮＡ」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズし、ガイド配列及びＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含むＲＮＡ標的指向性複合体の標的核酸配列に対する配列特異的結合を指示するのに十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを示す。いくつかの例示の実施形態において、相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に配列比較される場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上である。最適な配列比較は、配列の整列に適した任意のアルゴリズムを使用して決定される場合があり、その限定ではなく例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。核酸標的指向性複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指示するガイド配列（核酸標的指向性ガイドＲＮＡ内）の能力は、任意の適切なアッセイにより評価可能である。例えば、試験されるガイド配列を含む核酸標的指向性複合体を形成するのに十分な核酸標的指向性ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、核酸標的指向性複合体の構成要素をコードするベクターを用いるトランスフェクションなどにより、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供することができ、続いて、本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内の優先的標的指向性（例えば、切断）を評価することができる。同様に、標的核酸配列の切断は、試験管内で、標的核酸配列と、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的指向性複合体の構成要素とを提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で、標的配列での結合または切断速度を比較することにより評価可能である。他のアッセイも可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。任意の標的核酸配列を標的とするように、ガイド配列、したがって核酸標的指向性ガイドを選択することができる。標的配列はＤＮＡである場合がある。標的配列は、任意のＲＮＡ配列が可能である。実施形態によっては、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）���らなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかのより好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列である場合がある。
【０１４３】
実施形態によっては、核酸標的指向性ガイドは、核酸標的指向性ガイド内の二次構造の程度を低下するように選択される。実施形態によっては、核酸標的指向性ガイドのヌクレオチドのうち、最適にフォールディングされたときの自己相補的な塩基対形成に関与するヌクレオチドの割合は、約７５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、またはそれ未満の％である。最適なフォールディングは、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定可能である。いくつかのプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づくものである。そのようなアルゴリズムの１つの例は、ｍＦｏｌｄであり、ｍＦｏｌｄは、Ｚｕｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９  （１９８１），  １３３−１４８）によって説明されている。フォールディングアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄであり、これは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａで開発されたものである（例えば、Ａ．Ｒ．  Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｃｅｌｌ  １０６（１）：  ２３−２４；及びＰＡ  Ｃａｒｒ  ａｎｄ  ＧＭ  Ｃｈｕｒｃｈ，  ２００９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（１２）：１１５１−６２を参照）。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、直列反復（ＤＲ）配列とガイド配列またはスペーサー配列とを含む、本質的にそれらからなる、あるいはそれらからなる場合がある。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結された直列反復配列を含む、本質的にそれらからなる、あるいはそれらからなる場合がある。ある特定の実施形態において、直列反復配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流（すなわち５’）に位置する場合がある。他の実施形態では、直列反復配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流（すなわち、３’）に位置する場合がある。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。ある特定の実施形態において、直列反復配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１５〜３５ｎｔである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、スペーサー長は、１５〜１７ｎｔ、例えば１５、１６、または１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９、または２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３、または２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば２３、２４、または２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６、または２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９、または３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ、または３５ｎｔ以上である。
【０１４７】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、またはＣＲＩＳＰＲ系とは、ＷＯ  ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の文書で使用されているとおりのものであり、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現または活性の誘導に関与する転写物及び他の配列要素を総称的に示し、これに含まれるものとして、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、特にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の場合はＣａｓ９遺伝子、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする配列、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直列反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分的な直列反復を含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも称する）、または本明細書で使用されるとおりの「ＲＮＡ（複数可）」という用語（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ（複数可）、例えばＣＲＩＳＰＲＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物が挙げられる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する配列要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも称する）を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を示し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ガイド配列の中の、標的配列に対する相補性が切断活性に重要であるセクションは、本明細書中シード配列と呼ばれる。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含むことができる。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置し、細胞内に存在するミトコンドリア、オルガネラ、小胞、リポソーム、もしくは粒子の中にあるまたはそれに由来する核酸を含む場合がある。実施形態によっては、特に非核用途の場合、ＮＬＳは好ましくない。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つまたは複数の核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含む。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つまたは複数のＮＬＳ及び１つまたは複数のＮＥＳを含む。実施形態によっては、以下の基準のいずれかまたは全てを満たす反復モチーフを検索することにより、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで直列反復を同定することができる：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接するゲノム配列の２Ｋｂのウィンドウで見られる；２．２０〜５０ｂｐの範囲；及び３．２０〜５０ｂｐの間隔。実施形態によっては、これらの基準のうちの２つ、例えば１と２、２と３、または１と３が用いられる場合がある。いくつかの実施形態では、３つ全ての基準が用いられる場合がある。
【０１４８】
本発明の実施形態において、ガイド配列及びガイドＲＮＡ、すなわちＣａｓを標的ゲノム遺伝子座にガイドすることができるＲＮＡという用語は、ＷＯ  ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の引用文献のように同義で使用される。一般に、ガイド配列とは、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。実施形態によっては、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に配列比較された場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。最適な配列比較は、配列の整列に適した任意のアルゴリズムを使用して決定可能であり、そのようなアルゴリズムの限定ではなく例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−ＷｈｅｅｌｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。実施形態によっては、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれ以上のヌクレオチド長である。実施形態によっては、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価可能である。例えば、試験されるガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションなどにより、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供することができ、続いて、本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内の優先的切断を評価することができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管中で、標的配列と、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素とを提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で、標的配列での結合または切断速度を比較することによって、評価することができる。他のアッセイも可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。
【０１４９】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のいくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上、または約１００％であることが可能であり；ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれ以上のヌクレオチド長であることが可能であり；あるいは、ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、またはそれ未満のヌクレオチド長であることが可能であり；有利には、ｔｒａｃｒＲＮＡは、３０または５０ヌクレオチド長である。しかしながら、本発明のある態様は、標的外相互作用を低減すること、例えば、低い相補性を有する標的配列とのガイドの相互作用を低減することを目的とする。実際、そのような例では、本発明は、８０％超〜約９５％の相補性、例えば８３％〜８４％または８８〜８９％または９４〜９５％の相補性を有する標的配列と標的外配列をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が識別する（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と、１、２または３つのミスマッチを有する１８ヌクレオチドの標的外のものを識別する）ことができるようになる変異を含むことが示されている。したがって、本発明の文脈において、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％または９５％または９５．５％または９６％または９６．５％または９７％または９７．５％または９８％または９８．５％または９９％または９９．５％または９９．９％超、または１００％である。標的外では、配列とガイドとの間の相補性が１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％または９４％または９３％または９２％または９１％または９０％または８９％または８８％または８７％または８６％または８５％または８４％または８３％または８２％または８１％または８０％未満であり、標的外では配列とガイドとの間で１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％の相補性であることが有利である。
【０１５０】
ガイド修飾
ある特定の実施形態において、本発明のガイドは、非天然の核酸、及び／または非天然のヌクレオチド、及び／またはヌクレオチドアナログ、及び／または化学修飾を含む。非天然の核酸として、例えば、天然のヌクレオチドと非天然のヌクレオチドの混合物が挙げられる。非天然のヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び／または塩基部分で修飾されている場合がある。本発明のある実施形態において、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の１つにおいて、ガイドは、１つまたは複数のリボヌクレオチド及び１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態において、ガイドは、１つまたは複数の非天然のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオアート結合を有するヌクレオチド、ボラノリン酸連結を有するヌクレオチド、リボース環の２’炭素と４’炭素との間にメチレン架橋を有するロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または架橋型核酸（ＢＮＡ）を含む。修飾ヌクレオチドの他の例として、２’−Ｏ−メチルアナログ、２’−デオキシアナログ、２−チオウリジンアナログ、Ｎ６−メチルアデノシンアナログ、または２’−フルオロアナログが挙げられる。修飾塩基のさらなる例として、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン（Ψ））、Ｎ1−メチルシュードウリジン（ｍｅ1Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７−メチルグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。ガイドＲＮＡの化学修飾の例として、限定するものではないが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）、ホスホロチオアート（ＰＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を１つまたは複数の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。そのように化学修飾されたガイドは、非修飾ガイドと比較した場合に安定性の向上及び活性の増大を含む可能性があるが、標的外と比較しての標的的中特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３３（９）：９８５−９，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０、２０１５年６月２９日オンライン公開；Ｒａｇｄａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ０２１５，  ＰＮＡＳ，  Ｅ７１１０−Ｅ７１１１；Ａｌｌｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００５，  ４８：９０１−９０４；Ｂｒａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２０１２，  ３：１５４；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２０１５，  １１２：１１８７０−１１８７５；Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，  ２０１４，  ５：１４５４−１４７１；Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１５）  ３３（９）：  ９８５−９８９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２０１７，  １，  ００６６  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１−０１７−００６６を参照）。実施形態によっては、ガイドＲＮＡの５’末端及び／または３’末端は、さまざまな機能性部���によって修飾され、そのような機能性部分として、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが挙げられる。（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３３：７４−８３を参照のこと）。ある特定の実施形態において、ガイドは、標的ＤＮＡに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣ２ｃ１に結合する領域に１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある実施形態において、デオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、改変ガイド構造、例えば、限定するものではないが、５’及び／または３’末端、ステムループ領域、及びシード領域などに組み込まれる。ある特定の実施形態において、こうした修飾は、ステムループ領域の５’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の５’ハンドルを化学修飾するとガイドの機能が消失する場合がある（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１７，  １：００６６を参照）。ある特定の実施形態において、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５のヌクレオチドが化学的に修飾される。実施形態によっては、ガイドの３’末端または５’末端いずれかに位置する３〜５つのヌクレオチドが化学修飾される。実施形態によっては、シード領域にごく軽微な修飾、例えば２’−Ｆ修飾などが導入される。実施形態によっては、ガイドの３’末端に２’−Ｆ修飾が導入される。ある特定の実施形態において、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する３〜５ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）で化学的に修飾される。そのような修飾によってゲノム編集効率が向上する可能性がある（Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１５）  ３３（９）：９８５−９８９を参照）。ある特定の実施形態において、遺伝子破壊のレベルを向上させるために、ガイドのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオアート（ＰＳ）で置き換えられる。ある特定の実施形態において、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する５ヌクレオチド超が、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、またはＳ−拘束エチル（ｃＥｔ）で化学的に修飾される。そのように化学修飾されたガイドでは、介在する遺伝子破壊のレベルが向上する可能性がある（Ｒａｇｄａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ０２１５，  ＰＮＡＳ，  Ｅ７１１０−Ｅ７１１１を参照）。本発明のある実施形態において、ガイドは、その３’末端及び／または５’末端に化学部分を含むように修飾される。そのような部分として、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、またはローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、化学部分は、リンカー、例えばアルキル鎖などによってガイドに結合される。ある特定の実施形態において、修飾ガイドの化学部分は、ガイドを別の分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはナノ粒子などに付加するために使用することができる。そのように化学修飾されたガイドは、ＣＲＩＳＰＲ系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅＬｉｆｅ，  ２０１７，  ６：ｅ２５３１２，  ＤＯＩ：１０．７５５４を参照）。
【０１５１】
ある特定の実施形態において、本明細書中提供されるとおりのＣＲＩＳＰＲ系は、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡまたは類似ポリヌクレオチドを利用することができ、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの混合物であり、及び／またはポリヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含む。配列は、任意の構造を含むことができ、そのような構造として、天然ｃｒＲＮＡの構造、例えば、バルジ、ヘアピン、またはステムループ構造が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成し、第二のポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列であることが可能である。
【０１５２】
ある特定の実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡが使用される。ガイドＲＮＡの化学修飾の例として、限定するものではないが、１つまたは複数の末端ヌクレオチドへの２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオアート（ＭＳ）、または２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の組み込みが挙げられる。そのように化学修飾されたガイドＲＮＡは、非修飾ＲＮＡと比較した場合に安定性の向上及び活性の増大を含む可能性があるが、標的外と比較しての標的的中特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５−９，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，  ２０１５年６月２９日にオンライン公開、を参照）。化学修飾されたガイドＲＮＡは、さらに、限定するものではないが、ホスホロチオアート結合を有するＲＮＡ、及びリボース環の２’炭素と４’炭素との間にメチレン架橋を有するロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。
【０１５３】
実施形態によっては、ガイド配列は、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチドある、またはそれより長い。実施形態によっては、ガイド配列は、長さが、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチドある、またはそれより短い。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に対して配列特異的に結合するように指示するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価可能である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、試験されるガイド配列も含めて、例えばＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターを用いるトランスフェクションにより、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供することができ、続いてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内の優先的切断を評価することができる。同様に、標的ＲＮＡの切断は、試験管内で、標的配列と、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素とを提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で、標的配列での結合または切断速度を比較することにより評価可能である。他のアッセイも可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。
【０１５４】
実施形態によっては、ガイドに対する修飾は、化学修飾、挿入、削除、または分割である。実施形態によっては、化学修飾として、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）アナログ、２’−デオキシアナログ、２−チオウリジンアナログ、Ｎ６−メチルアデノシンアナログ、２’−フルオロアナログ、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ1−メチルシュードウリジン（ｍｅ1Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオアート（ＰＳ）、または２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を組み込むことが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態によっては、ガイドは、１つまたは複数のホスホロチオアート修飾を含む。ある特定の実施形態において、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２５個が化学修飾される。ある特定の実施形態において、シード領域の１つまたは複数のヌクレオチドが化学修飾される。ある特定の実施形態において、３’末端の１つまたは複数のヌクレオチドが化学修飾される。ある特定の実施形態において、５’ハンドルのヌクレオチドはいずれも、化学修飾されない。実施形態によっては、シード領域における化学修飾は、軽微な修飾、例えば、２’−フルオロアナログの組み込みなどである。特定の実施形態において、シード領域のヌクレオチドの１つが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。実施形態によっては、３’末端の５または１０個のヌクレオチドが化学修飾される。Ｃｐｆ１ＣｒＲＮＡの３’末端をそのように化学修飾することで、遺伝子切断効率が改善される（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２０１７，  １：００６６を参照）。特定の実施形態において、３’末端の５つのヌクレオチドが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。特定の実施形態において、３’末端の１０個のヌクレオチドが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。特定の実施形態において、３’末端の５つのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）アナログで置き換えられる。
【０１５５】
実施形態によっては、ガイドの５’ハンドルのループが修飾される。実施形態によっては、ガイドの５’ハンドルのループは、削除、挿入、分割、または化学修飾を有するように修飾される。ある特定の実施形態において、ループは、３つ、４つ、または５つのヌクレオチドを有する。ある特定の実施形態において、ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ、またはＵＧＵＵという配列を含む。
【０１５６】
ガイド配列、従って核酸標的指向性ガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的とするように選択可能である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を示し、標的配列とガイド配列の間でのハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む場合がある。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列であるまたは標的配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを示す。言い換えると、標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡ、すなわちガイド配列の一部が相補性を有するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体が介在するエフェクター機能がそれに向けられている、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部の場合がある。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に存在する。標的配列はＤＮＡである場合がある。標的配列は、任意のＲＮＡ配列である場合がある。実施形態によっては、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかのより好適な実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列である場合がある。
【０１５７】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２８ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１８ヌクレオチドあり、かつ２８ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１９〜２８ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１９〜２５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２３ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２５ヌクレオチドである。
【０１５８】
ある特定の実施形態において、切断効率の調節は、スペーサー／標的側にあるミスマッチの位置も含めて、スペーサー配列と標的配列の間にミスマッチを導入すること、例えば１つまたは複数のミスマッチ、例えば１つまたは２つのミスマッチを導入することにより活用可能である。例えば、より中心近く（すなわち、３’または５’ではない）にダブルミスマッチがあるほど、切断効率が受ける影響は大きくなる。したがって、スペーサー側でミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調節することができる。例として、標的の切断が１００％未満であることが望ましい場合（例えば、細胞集団において）、スペーサーと標的配列の間の１つまたは複数、例えば、好ましくは２つのミスマッチを、スペーサー配列に導入することができる。ミスマッチ位置がスペーサー側でより中心寄りであると、切断パーセンテージはより低くなる。
【０１５９】
ある特定の例示の実施形態において、切断効率は、単一ヌクレオチドで異なる２つ以上の標的、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、多様性、または（点）変異を識別することができる単一ガイドを設計することにより活用される場合がある。ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＳＮＰ（または他の単一ヌクレオチド多様性）に対する感度を低下させていながらも、継続してある一定レベルの効率でＳＮＰ標的を切断する場合がある。すなわち、２つの標的、または１組の標的に関して、標的のうちの１つに対して相補的であるヌクレオチド配列を持つようにガイドＲＮＡを設計する、すなわち標的的中ＳＮＰを設計することができる。ガイドＲＮＡは、さらに、合成ミスマッチを有するように設計される。本明細書中使用される場合、「合成ミスマッチ」は、天然のＳＮＰの上流または下流、例えば、最大で５ヌクレオチド上流または下流、例えば、４、３、２、または１ヌクレオチド上流または下流、好ましくは最大で３ヌクレオチド上流または下流、より好ましくは最大で２ヌクレオチド上流または下流、特に好ましくは１ヌクレオチド上流または下流（すなわちＳＮＰに隣接して）に導入される非天然のミスマッチを示す。ＣＲＩＳＰＲエフェクターが標的的中ＳＮＰに結合するとき、１つのミスマッチのみが合成ミスマッチとの間に形成されることになり、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは引き続き活性化されて検出可能なシグナルが生成することになる。ガイドＲＮＡが標的外ＳＮＰとハイブリダイズするとき、２つのミスマッチ、ＳＮＰによるミスマッチ及び合成ミスマッチによるミスマッチが形成されることになり、検出可能なシグナルが生成しない。すなわち、本明細書中開示されるシステムは、集団内のＳＮＰを識別するように設計することができる。例えば、本システムを使用して、単一ＳＮＰで異なる病原性株を識別する、またはある特定の疾患特異的ＳＮＰを検出することができ、そのようなＳＮＰとして、疾患関連ＳＮＰ、例えば特に限定されないが、がん関連ＳＮＰなどが挙げられるが、これに限定されない。
【０１６０】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、または９位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の２、３、４、５、６、または７位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の３、４、５、または６位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の３位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。
【０１６１】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチ（例えば、合成ミスマッチ、すなわちＳＮＰを除く追加ミスマッチ）がスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、または９位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の４、５、６、または７位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の５位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。
【０１６２】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがＳＮＰの２ヌクレオチド上流に位置する（すなわち１つのヌクレオチドを間に挟む）ように設計される。
【０１６３】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがＳＮＰの２ヌクレオチド下流に位置する（すなわち１つのヌクレオチドを間に挟む）ように設計される。
【０１６４】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の５位（５’末端から開始して）に位置し、ＳＮＰがスペーサー配列の３位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。
【０１６５】
本明細書中記載される実施形態は、本明細書中考察されるとおりの真核細胞に（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、すなわち単離された真核細胞に）１つまたは複数のヌクレオチド修飾を誘導することを包含し、細胞に本明細書中考察されるとおりのベクターを送達することを含む。変異（複数可）は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した細胞（複数可）の各標的配列での１つまたは複数のヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列での１〜７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した、当該細胞（複数可）の各標的配列における５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列での２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列での４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。
【０１６６】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列とハイブリダイズし、１つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）は、標的配列において、またはその付近（例えば、そこから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対内）での切断をもたらすが、例えば二次構造に依存する場合があり、特にＲＮＡ標的の場合などでそうである。
【０１６７】
特定の実施形態において、標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法が提供される。そのような方法は、標的二本鎖核酸を含む試料を、増幅反応混合物と混合することを含む場合がある。そのような増幅反応混合物は、増幅ＣＲＩＳＰＲ系を含む場合がある。増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む場合があり、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含み、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む。
【０１６８】
特定の実施形態において、第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、同じである場合がある。代替実施形態において、第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、異なる場合がある。
【０１６９】
特定の実施形態において、増幅反応混合物は、さらに、ヘリカーゼを含む場合がある。本実施形態で使用されるヘリカーゼの例は、以下のウェブアドレスでも見つけることができる：ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ（キーワード：ヘリカーゼによるＧｅｔ  Ｂｌｏｃｋｓ）。このサイトは、４９種のＨｅｒｐｅｓヘリカーゼ、２２４種のＤｎａＢヘリカーゼ、２５０種のＵｖｒＤ−ヘリカーゼ及びＵｖｒＤ／Ｒｅｐヘリカーゼ、２７６種のＤＥＡＨ＿ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ、１４７種のＰａｐｉｌｌｏｍ＿Ｅ１パピローマウイルス＿ヘリカーゼ／Ｅ１タンパク質、６０８種のウイルスヘリカーゼ１ウイルス（スーパーファミリー１）ＲＮＡヘリカーゼ、及び５５６種のＤＥＡＤ＿ＡＴＰ依存性ヘリカーゼを列挙している。５’から３’に向かう方向で一般に複製を行うヘリカーゼの例は、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、及びＲｈｏヘリカーゼであるが、３’−５’方向で複製を行うヘリカーゼの例として、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＰｃｒＡ、Ｒｅｐ、ＨＣＶのＮＳ３  ＲＮＡヘリカーゼが挙げられる。
【０１７０】
特定の実施形態において、ヘリカーゼとして、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ヘリカーゼ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、パピローマウイルスＥ１ヘリカーゼ、及びｇｐ４ヘリカーゼを挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１７１】
特定の実施形態において、増幅反応混合物は、さらに、標的核酸鎖とハイブリダイズすることができるプライマーを含む場合がある。「ハイブリダイゼーション」という用語は、オリゴヌクレオチドプライマーが一本鎖核酸テンプレート鎖の一方にあるその相補配列に対してのみ特異的に結合する条件下で、オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレートのある領域に結合し、テンプレートの他の領域には結合しないことを示す。ハイブリダイゼーションの特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さ、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度、イオン強度、及びｐＨにより影響を受ける場合がある。「プライマー」という用語は、標的核酸の一本鎖領域に結合して標的核酸鎖のポリメラーゼ依存性複製を促進することができる一本鎖核酸を示す。「相補的な」または「補体（複数可）」である核酸（複数可）とは、標準のワトソン・クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン結合相補性則に従って塩基対形成することができるものである。
【０１７２】
特定の実施形態において、増幅反応混合物は、さらに、第一プライマー及び第二プライマーを含む場合がある。第一プライマー及び第二プライマーは、標的核酸の第一鎖と相補的な部分を含む場合があり、第二プライマーは標的核酸の第二鎖と相補的な部分を含む。第一プライマー及び第二プライマーは、プライマー対と称する場合がある。実施形態によっては、第一プライマーまたは第二プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む場合がある。
【０１７３】
特定の実施形態において、増幅反応混合物は、さらに、ポリメラーゼを含む場合がある。ポリメラーゼは、処理能力及び鎖置換活性に基づいて、ＨＤＡ用に選択される。融解及びプライマーとのハイブリダイゼーションに続いて、核酸は、重合工程に供される。ＤＮＡポリメラーゼは、増幅しようとする核酸がＤＮＡである場合に選択される。当初の標的がＲＮＡである場合、最初に逆転写酵素を使用してＲＮＡ標的をｃＤＮＡ分子にコピーすることができ、それから選択したＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡをさらにＨＤＡにおいて増幅する。ＤＮＡポリメラーゼは、標的核酸に作用して、４種のｄＮＴＰの存在下、核酸テンプレートとハイブリダイズしたプライマーを延長して、核酸テンプレートのヌクレオチド配列と相補的なプライマー延長産物を形成する。
【０１７４】
ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたポリメラーゼの群から選択される場合があり、これらのポリメラーゼは、さらに、任意選択で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合がある。適切なＤＮＡポリメラーゼの例として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠失クレノー断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．））、エキソヌクレアーゼ欠失Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ；ＵＳＢ、（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ））、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．））、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの巨大断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．））、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、（ＳｔＬｏｕｉｓ、Ｍｏ．））、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，７１６，８１９号）、及びＰｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第６，５５５，３４９号）が挙げられる。鎖置換活性を保持するＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠失クレノー断片、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ巨大断片、及びシーケナーゼは、ヘリカーゼ依存増幅に好適である。Ｔ７ポリメラーゼは、誤り率が３．５×１０5という高度に忠実なポリメラーゼであり、この誤り率はＴａｑポリメラーゼより著しく低い（Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｉｌｌｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６，  ９２５３−９２５７（１９８９））。しかしながら、Ｔ７ポリメラーゼは、耐熱性がなく、したがって、昇温サイクルを必要とする増幅システムで使用するのに最適なものではない。等温で行うことが可能であるＨＤＡでは、Ｔ７シーケナーゼは、ＤＮＡの増幅に好適なポリメラーゼの１種である。
【０１７５】
特定の実施形態において、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ、全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓａｕ  ＬＦ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びシーケナーゼＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される場合がある。
【０１７６】
特定の実施形態において、標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法は、さらに、本明細書中記載されるとおりの第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて標的核酸のＲループを開口することにより、標的核酸を増幅することを含む場合がある。Ｒループは、ＲＮＡ分子が二本鎖核酸と共役結合せずに会合して、それにより二本鎖核酸内で局所変性が生じる場合に形成される（「バブル」形成）（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７６  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７３，  ２２９４）。本方法は、さらに、ヘリカーゼを用いて標的核酸の第一鎖と第二鎖を解きほぐすことを含む場合がある。本方法は、さらに、プライマー対及びポリメラーゼを用いて鎖をアニーリングして（結合して）延長することを含む場合がある。ハイブリダイズしたプライマー対の延長は、ポリメラーゼに適切な条件下で生じる。場合によっては、ハイブリダイゼーション及び延長は、同じ温度で行われ、他の場合では、ハイブリダイゼーションはプライマーに最適な温度で生じるが、延長はポリメラーゼに最適な温度で生じる。しかしながら、本明細書中開示されるとおり、プライマー及びポリメラーゼは、好熱性及び中温性用途について最適化されている。延長工程の長さは、生成する産物の大きさに応じて変更可能である。延長時間を長くするほど、より長い断片の生成をもたらすことになる。対照的に、短い延長時間は、短い産物のみを選択するために採用することができる。当業者ならわかるだろうが、延長時間の多様性を利用して、様々な大きさの産物を選択することができ、この多様性は、所望の長さの産物の増幅を改善するのに利用できる。
【０１７７】
複数の具体的な実施形態において、１回の反応あたり５００ｎｇのＳＳＢ及び約１２５ｎｇのヘリカーゼを用いて、理想的な成績条件を得ることができる。さらに、１回の反応あたり約２．５〜約７％のＰＥＧ  ２０Ｋ、及び約０．５〜約５ｍＭのＡＴＰを使用することができる。
【０１７８】
特定の実施形態において、標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法は、さらに、等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、標的核酸をさらに増幅することを含む場合がある。「等温条件」は、増幅が単一の温度で生じる条件、または増幅が最小限の温度変動しかない温度で生じる条件を示す。複数の実施形態において、温度変動は、約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃未満である。これには、増幅開始時の単発の短い時間（１５分未満）は含まれない。増幅開始は、増幅手順と同じ温度またはそれより高温で行われる場合がある。
【０１７９】
ヘリカーゼ
「ヘリカーゼ」という用語は、本明細書では、二本鎖核酸を酵素反応で解きほぐすことができる任意の酵素を示す。例えば、ヘリカーゼは、全ての生物において、核酸が関与する全ての過程、例えば、複製、組換え、修復、転写、翻訳、及びＲＮＡスプライシングなどにおいて見つかる酵素である。（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （２nd  ｅｄ．（１９９２））、特に第１１章）。ＤＮＡまたはＲＮＡに沿って５’→３’方向でまたは逆の３’→５’方向で転座させる任意のヘリカーゼが、本発明の本実施形態で使用可能である。このようなヘリカーゼとして、原核生物、ウイルス、古細菌、及び真核生物から得られるヘリカーゼ、または天然の酵素の組換え型、ならびに指定される活性を有する類似体または誘導体が挙げられる。天然のＤＮＡヘリカーゼの例として、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒが彼らの著書、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （２nd  ｅｄ．（１９９２））の第１１章に記載したもの、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ、Ｒｅｐ、ＤｎａＢ、ＰｒｉＡ、ＰｃｒＡ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原、酵母菌ＲＡＤが挙げられる。ＨＤＡで有用である可能性があるさらなるヘリカーゼとして、ＲｅｃＱヘリカーゼ（Ｈａｒｍｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：２３２−２４３  （２００１））、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来の耐熱性ＵｖｒＤヘリカーゼ、（本発明、実施例ＸＩＩに開示される）及びＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の耐熱性ＵｖｒＤヘリカーゼ（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ，  Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．  ７：３５−４１．  （２００３））、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の耐熱性ＤｎａＢヘリカーゼ（Ｋａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｔｚ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：６８８９−６８９７（１９９９））、ならびに古細菌及び真核生物由来のＭＣＭヘリカーゼ（（Ｇｒａｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：４８８８−４８９８（２００３））が挙げられる。ヘリカーゼのさらなる例として、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ由来のＤＮＡヘリカーゼＰｃｒＡ（例えば、ＷＰ＿００３８７０４８７．１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種ＦＪＡＴ−２７２３１由来のＰｃｒＡ（例えば、ＷＰ＿０３４６５４６８０．１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＰｃｒＡ（例えば、ＷＰ＿０３４６５４６８０．１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来のＰｃｒＡ（例えば、ＷＰ＿０９５３９０３５８．１）、及びＰａｅｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ由来のＰｃｒＡ（例えば、ＷＰ＿０５５３４３０２２．１）が挙げられる。
【０１８０】
ヘリカーゼの従来の定義は、エネルギー源としてヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）加水分解を用いて（ＡＴＰなど）、核酸二本鎖（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッド）のらせん構造を分裂／アンジップ／解きほぐして一本鎖構成要素にする反応を触媒する酵素である。しかしながら、注記すべきは、今や全てのヘリカーゼがこの定義に当てはまるわけではないことである。より広義の定義としては、ヘリカーゼは、一本鎖または二本鎖核酸に沿って動く（通常は、一方向で、３’→５’または５→３、あるいはその両方）モータータンパク質、すなわちトランスロカーゼであり、遭遇した二本鎖核酸を解きほぐすことが可能または不可能である、となる。また、ヘリカーゼのあるものは、二本鎖核酸構造に単に結合して「溶解」させるだけで、明らかなトランスロカーゼ活性を持たない。
【０１８１】
ヘリカーゼは、全ての生物に存在し、核酸代謝の全ての態様において機能する。ヘリカーゼは、アミノ酸配列、方向性、オリゴマー化状態、ならびに核酸の種類及び構造の優先性に基づき分類される。最も一般的な分類法は、モチーフと呼ばれるある特定のアミノ酸配列の存在に基づいて開発された。この分類によれば、ヘリカーゼは、６つのスーパーファミリーに分けられる：ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５及びＳＦ６である。ＳＦ１ヘリカーゼ及びＳＦ２ヘリカーゼは、核酸の周囲に環構造を形成しないが、ＳＦ３〜ＳＦ６は形成する。スーパーファミリー分類は、古典的分類学に依存しない。
【０１８２】
ＤＮＡヘリカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を解きほぐして、それらの各一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡ）形にする反応の触媒を担当している。構造及び生化学的研究は、様々なヘリカーゼがどのようにして、１ヌクレオチドあたり１ＡＴＰを消費して、ｓｓＤＮＡで指向的に転座させることができるかを示してきたものの、核酸の解きほぐしの機構及び解きほぐし活性がどのように調節されるのかは、不明のままであり議論の余地がある（Ｔ．  Ｍ．  Ｌｏｈｍａｎ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｔｏｍｋｏ，  Ｃ．  Ｇ．  Ｗｕ，  ‘‘Ｎｏｎ−Ｈｅｘａｍｅｒｉｃ  ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，’’  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：３９１−４０１（２００８））。ヘリカーゼは、遭遇した全ての核酸を解きほぐす可能性があるため、それらの解きほぐし活性がどのように調節されるのかを解明することで、バイオテクノロジー用途にヘリカーゼ機能を利用できるようになる可能性がある。
【０１８３】
「ＨＤＡ」という用語は、ヘリカーゼ依存増幅を示し、これは、二本鎖核酸を解きほぐしてプライマーハイブリダイゼーション用のテンプレートを生成させ引き続いてプライマー延長を行うためにヘリカーゼ製剤を使用することにより、核酸を増幅するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。このプロセスは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、それぞれが標的配列を含むセンス鎖または逆相補的標的配列を含むアンチセンス鎖どちらかの３’末端とハイブリダイズする。ＨＤＡ反応は、ヘリカーゼ依存性核酸増幅の一般的方法である。
【０１８４】
本発明は、当該分野で既知である任意の適切なヘリカーゼの使用を含む。そのようなヘリカーゼとして、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＶ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、ＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原、酵母菌ＲＡＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤｎａＢヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、パピローマウイルスＥ１ヘリカーゼ、古細菌ＭＣＭヘリカーゼ、真核生物ＭＣＭヘリカーゼ、及びＴ７  Ｇｐ４ヘリカーゼが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１８５】
ある特定の実施形態において、ヘリカーゼの選択は、増幅条件に基づく。例えば、中温性等温増幅条件は、中温性細菌種由来のＵｖｒＤ型のヘリカーゼが有利に働く場合がある。いくつかの例において、ヘリカーゼは、活性を高めるための置換を有する。特に好適な実施形態において、ヘリカーゼは、アラニンによるアスパラギン酸置換を２つ有している場合がある。ヘリカーゼＴｔｅ−ＵｖｒＤでは、Ｄ４０９Ａ及びＤ４１０Ａという置換が、ヘリカーゼ処理能力及び活性を高める。
【０１８６】
場合によっては、ヘリカーゼは、ＵｖｒＤ様ヘリカーゼ、野生型、またはスーパーヘリカーゼ変異を持つ変異体である。スーパーヘリカーゼ変異は、典型的には、ヘリカーゼの活性を高めるＤＤからＡＡへの置換である。場合によっては、ヘリカーゼは、Ｄ４０３Ａ及びＤ４０４Ａの置換を持つＥ．ｃｏｌｉ  ＵｖｒＤヘリカーゼである。実施形態によっては、ヘリカーゼは、ｐｃｒＡ（ＵｖｒＤ）型ヘリカーゼ、例えば、変異Ｄ４０９Ａ／Ｄ４１０Ａを持つＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼである。場合によっては、ヘリカーゼは、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼであり、ＡＴＰ補因子をヘリカーゼと合わせて使用することができる。実施形態によっては、ヘリカーゼは、ＤＮＡヘリカーゼｐｃｒＡヘリカーゼ、例えば、変異Ｄ４０３Ａ／Ｄ４０４Ａを持つＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ由来のｐｃｒＡヘリカーゼ（例えば、ＷＰ＿００３８７０４８７．１）、変異Ｄ４０７Ａ／Ｄ４０８Ａを持つＢａｃｉｌｌｕｓ種ＦＪＡＴ−２７２３１由来のｐｃｒＡヘリカーゼ（例えば、ＷＰ＿０３４６５４６８０．１）、変異Ｄ４１５Ａ／Ｄ４１６Ａを持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のｐｃｒＡヘリカーゼ（例えば、ＷＰ＿０３４６５４６８０．１）、変異Ｄ４０７Ａ／Ｄ４０８Ａを持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来のｐｃｒＡヘリカーゼ（例えば、ＷＰ＿０９５３９０３５８．１）、または変異Ｄ４０２Ａ／Ｄ４０３Ａを持つＰａｅｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ由来のｐｃｒＡヘリカーゼ（例えば、ＷＰ＿０５５３４３０２２．１）である。
【０１８７】
実施形態によっては、ヘリカーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵｖｒＤヘリカーゼであり、任意選択で２つ以上のＤからＡへの置換、例えば、Ｄ４０３及びＤ４０４での置換を有する。実施形態によっては、ヘリカーゼは、ｐｃｒＡ（ＵｖｒＤ）型ヘリカーゼであり、Ｄ４０９Ａ及びＤ４１０Ａに相当する変異を１つまたは複数有する。実施形態によっては、ヘリカーゼは、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ  Ｄ４０９Ａ／Ｄ４１０Ａである。
【０１８８】
増幅
ある特定の例示の実施形態において、標的一本鎖または二本鎖核酸は、等温増幅技法を用いて増幅される場合がある。ある特定の例示の実施形態において、等温増幅は、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＰＡ）、ループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅法（ＨＤＡ）、またはニック酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）である場合がある。
【０１８９】
「等温増幅」は、単一温度で生じる増幅を示す。これには、増幅開始時の単発の短い時間（１５分未満）は含まれない。増幅開始は、増幅手順と同じ温度またはそれより高温で行われる場合がある。
【０１９０】
中温性増幅及び好熱性増幅は、等温応用の２つの例である。中温性増幅は、典型的には、２０〜４０℃前後、または３５℃＋／−５℃前後の温度で行われ、好熱性増幅は、典型的には、５０〜７０℃前後、または５５℃〜６０℃前後で行われる。
【０１９１】
ＨＤＡは、核酸二本鎖の２つの鎖を分離させる（溶解させる、または解きほぐす）のに１種または複数のヘリカーゼを頼りにする。当該分野で既知である任意のヘリカーゼが使用可能である。ＨＤＡは、さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを利用してプライマーを延長し、このプライマーは一本鎖ヌクレオチド配列とハイブリダイズして相補的プライマー延長産物を形成する。このプロセスは、単一温度で指数関数的増幅が達成可能となるように、何度も繰り返される。先行技術の増幅手順に勝る本実施形態の利点のいくつかとして、ＤＮＡ及びＲＮＡの長い標的配列（約２００ヌクレオチドより長い、より詳細には、約５００ヌクレオチド超、より詳細には、約１０００ヌクレオチド超、より詳細には、２０００ヌクレオチド超、より詳細には、最長約５０，０００ヌクレオチド、より詳細には、約１００，０００ヌクレオチドもの多さ）を等温増幅する能力、及び最初から最後まで１つの温度で標的配列を増幅する能力が挙げられる。
【０１９２】
したがって、ある特定の例示の実施形態において、本明細書中開示されるシステムは、増幅試薬を含む場合がある。核酸の増幅に有用な種々の構成要素または試薬は、本明細書中記載される。例えば、本明細書中記載されるとおりの増幅試薬として、トリス緩衝剤などの緩衝剤を挙げることができる。トリス緩衝剤は、所望の用途または使用に適切な任意の濃度で使用可能であり、濃度として、例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１Ｍなどが挙げられるが、これらに限定されない。当業者なら、本発明で使用するのに適切な、トリスなどの緩衝剤の濃度を決定することができるだろう。
【０１９３】
塩、例えば、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が、核酸断片の増幅を改善する目的で、ＰＣＲなどの増幅反応に含まれている場合がある。塩濃度は特定の反応及び応用に依存することになるものの、実施形態によっては、特定の塩濃度で、特定の大きさの核酸断片が最適に産生される場合がある。生成物が大きくなると、所望の結果をもたらす目的で、必要とされる塩濃度も変化する可能性があり、典型的には低くなるが、生成物がより小さい場合の増幅は、塩濃度が高い方がより良い結果をもたらす可能性がある。当業者には当然のことながら、塩の存在及び／または濃度は、塩濃度の変更に合わせて、生物学的または化学反応のストリンジェンシーを変更する場合があり、したがって、本発明の方法に最適であり本明細書中記載されるとおりの条件を提供する任意の塩を使用することができる。
【０１９４】
生物学的または化学反応の他の成分として、細胞中の材料を分析するために細胞を破壊して開くまたは溶解させる目的で、細胞溶解成分を挙げることができる。細胞溶解成分として、界面活性剤、上記のとおりの塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム［（ＮＨ4）2ＳＯ4］、または他のものを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明に適切である可能性がある界面活性剤として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）、エチルトリメチルアンモニウム＝ブロミド、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）が挙げられる。界面活性剤の濃度は、特定の用途に依存する場合があり、場合によっては、反応に対して特異的である場合がある。増幅反応は、本発明に適切な任意の濃度で使用されるｄＮＴＰ及び核酸プライマーを含む場合があり、例えば、その濃度として、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭなどが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、本発明に従って有用なポリメラーゼは、当該分野で既知であり本発明にとって有用であれば、特定のポリメラーゼでも一般的なポリメラーゼでもどれでもよく、そのようなポリメラーゼとして、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｑ５ポリメラーゼなどが挙げられる。
【０１９５】
実施形態によっては、本明細書中記載されるとおりの増幅試薬は、ホットスタート増幅で使用するのに適切である場合がある。ホットスタート増幅は、実施形態によっては、アダプター分子またはオリゴの二量体化を削減または排除するのに、あるいはその他の望ましくない増幅産物またはアーチファクトを防いで所望の産物の最適な増幅を得るのに、有益である場合がある。本明細書中記載される増幅で使用される多くの成分は、ホットスタート増幅でも使用することができる。実施形態によっては、ホットスタート増幅で使用するのに適切な試薬または成分が、適宜、１種または複数の組成成分の代わりに使用される場合がある。例えば、特定の温度ではあるポリメラーゼが、他の反応条件では他の試薬が、そこで所望の活性を示すものが使用される場合がある。実施形態によっては、ホットスタート増幅用に設計されたまたは最適化された試薬が使用される場合があり、例えば、ポリメラーゼは、遺伝子転位後に、または特定温度に到達後に、活性化される場合がある。そのようなポリメラーゼは、抗体に基づくまたはアプタマーに基づく場合がある。本明細書中記載されるポリメラーゼは、当該分野で既知である。そのような試薬の例として、ホットスタートポリメラーゼ、ホットスタートｄＮＴＰ、及びフォトケージド（ｐｈｏｔｏ−ｃａｇｅｄ）ｄＮＴＰを挙げることができるが、これらに限定されない。そうした試薬は、当該分野で既知であり利用可能である。当業者なら、個別の試薬にとって適切なように最適温度を決定することができる。
【０１９６】
増幅は、等温であり、温度に合わせて選択することが可能である。１つの実施形態において、増幅は、３７℃で迅速に進行する。他の実施形態において、等温増幅の温度は、異なる温度で作動可能なポリメラーゼ（例えばＢｓｕ、Ｂｓｔ、Ｐｈｉ２９、クレノー断片など）の選択により、選択される場合がある。
【０１９７】
核酸の増幅は、特定の温度サイクル機械または設備を用いて行われる場合があり、単一反応またはバルクで行われる場合があり、例えば、任意の所望数の反応が同時に行われる場合がある。実施形態によっては、増幅は、マイクロ流体装置またはロボット装置を用いて行われる場合があり、あるいは所望の増幅を達成するために温度を手動で変化させて行われる場合がある。実施形態によっては、特定の応用または材料にとって最適な反応条件を得るために最適化が行われる場合がある。当業者なら、十分な増幅を得るために反応条件を最適化することは当然であり、最適化できる。しかしながら、本明細書中開示されるとおりの増幅は、等温条件下で行うことの利点を有しており、したがって、増幅を達成するための温度変化サイクルを必要としない。
【０１９８】
ある特定の実施形態において、本発明は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて標的核酸のＲループを開口し、ヘリカーゼを用いて標的核酸の第一鎖と第二鎖を解きほぐし、プライマー対を用いて鎖をアニーリングし、そしてポリメラーゼを用いて鎖を延長すること；ならびに、等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、さらに標的核酸を増幅することにより、標的核酸を増幅する方法を提供する。
【０１９９】
実施形態によっては、標的核酸の増幅は、約３７℃〜６５℃で行われる。実施形態によっては、標的核酸の増幅は、約５０℃〜５９℃で行われる。実施形態によっては、標的核酸の増幅は、約６０℃〜７２℃で行われる。実施形態によっては、標的核酸の増幅は、約３７℃で行われる。実施形態によっては、標的核酸の増幅は室温で行われる。
【０２００】
実施形態によっては、本明細書中記載される方法は、中温性等温条件下で行われる。実施形態によっては、ポリメラーゼは、中温性ポリメラーゼである。実施形態によっては、中温性ポリメラーゼは、Ｓａｕ  ＬＦポリメラーゼである。
【０２０１】
実施形態によっては、標的核酸配列は、長さが、約２０〜３０、約３０〜４０、約４０〜５０、または約５０〜１００ヌクレオチドである。実施形態によっては、標的核酸配列は、長さが、約１００〜２００、約１００〜５００、または約１００〜１０００ヌクレオチドである。実施形態によっては、標的核酸配列は、長さが、約１０００〜２０００、約２０００〜３０００、約３０００〜４０００、または約４０００〜５０００ヌクレオチドである。
【０２０２】
実施形態によっては、第一プライマーまたは第二プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。
【０２０３】
実施形態によっては、本明細書中記載される方法は、クラウディング剤、補因子、一本鎖結合タンパク質、及び／またはアシストタンパク質から選択される１種または複数の添加剤を含む場合がある。特定の実施形態において、クラウディング剤は、ポリエチレングリコールである。実施形態によっては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、大きさが約５００〜３０，０００Ｄａである。実施形態によっては、ＰＥＧは、大きさが２０，０００Ｄａである。
【０２０４】
実施形態によっては、補因子は、ＡＴＰである。
【０２０５】
実施形態によっては、一本鎖結合タンパク質は、Ｔ４  ｇｐ３２または好熱性ＳＳＢ（ＥＴ−ＳＳＢ）から選択される。
【０２０６】
実施形態によっては、アシストタンパク質は、ｄＣｐｆ１及び／またはＵｖｓＸリコンビナーゼである。
【０２０７】
実施形態によっては、増幅された標的核酸は、ＬｗａＣａｓ１３酵素を含むＣＲＩＳＰＲＣａｓ−１３に基づくシステムにより検出される。
【０２０８】
実施形態によっては、標的核酸は、アトモル感度で検出される。実施形態によっては、標的核酸は、フェムトモル感度で検出される。
【０２０９】
標的核酸がＲＮＡである場合、ＲＮＡは、増幅の前にｃＤＮＡへと逆転写される場合がある。次いで、増幅が、当該分野で既知である任意の適切な増幅方法、例えば、本明細書中記載される方法のいずれかにより、行われる場合がある。増幅方法の１つの例として、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）を挙げることができる。増幅方法の別の例として、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を挙げることができる。
【０２１０】
実施形態によっては、反応は、約２時間未満、約９０分間未満、約６０分間未満、約３０分間未満、または約１５分間未満行われる。
【０２１１】
実施形態によっては、標的核酸配列は、長さが、約２０〜３０、約３０〜４０、約４０〜５０、または約５０〜１００ヌクレオチドの場合がある。実施形態によっては、標的核酸配列は、長さが、約１００〜２００、約１００〜５００、または約１００〜１０００ヌクレオチドである場合がある。実施形態によっては、標的核酸配列は、長さが、約１０００〜２０００、約２０００〜３０００、約３０００〜４０００、または約４０００〜５０００ヌクレオチドである場合がある。
【０２１２】
特定の実施形態において、標的核酸として、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または合成二本鎖ＤＮＡを挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２１３】
特定の実施形態において、標的核酸として、一本鎖ウイルスＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、合成一本鎖ＤＮＡ、長鎖非翻訳ＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、ウイルスｄｓＲＮＡ、及び非ウイルスｄｓＲＮＡを挙げることができる。
【０２１４】
ある特定の実施形態において、本明細書中記載される方法は、標的二本鎖核酸を含む試料を、増幅反応混合物と混合することが関与する。
【０２１５】
本明細書中記載されるとおり、本発明で使用される試料は、生体試料または環境試料、例えば、食品試料（新鮮な果物または野菜、肉）、飲料試料、紙面、布面、金属面、木面、プラスチック面、土壌試料、新鮮な水試料、排水試料、生理食塩水試料、大気または他のガスと接触した試料、あるいはそれらの組み合わせである場合がある。例えば、任意の材料製の家庭／商業／産業的表面として、限定するものではないが、金属、木材、プラスチック、ゴムなどが挙げられるが、これらを拭き取り、汚染物質について検査する場合がある。土壌試料は、環境保護目的及び／またはヒト、動物、もしくは植物の病害検査の両方のため、病原菌または寄生虫、あるいは他の微生物の存在について検査する場合がある。水試料、例えば、新鮮な水試料、排水試料、生理食塩水試料は、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、または他の微生物汚染の存在を検出して、清浄度及び安全性、及び／または可搬性を評価することができる。さらなる実施形態において、生体試料は、試料源から得られる場合があり、試料源として、組織試料、唾液、血液、血漿、血清、糞便、尿、痰、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、漿液腫、膿、あるいは皮膚または粘膜表面のスワブが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、環境試料または生体試料は、未精製試料である場合があり、及び／または１種または複数の標的分子が、本方法の増幅前に試料から精製されて増幅されていない場合がある。微生物の同定は、多数の応用にとって有用及び／または必要である場合があり、したがって、当業者が適切だと見なす任意の試料源由来の任意の種類の試料が、本発明に従って使用される場合がある。
【０２１６】
実施形態によっては、生体試料として、血液、血漿、血清、尿、糞便、痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌、漏出液、滲出液、または関節から得られる液体、あるいは皮膚または粘膜表面のスワブを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２１７】
特定の実施形態において、試料は、ヒト患者から得られる血液、血漿、または血清である場合がある。
【０２１８】
実施形態によっては、試料は、植物試料である場合がある。実施形態によっては、試料は、未精製試料である場合がある。実施形態によっては、試料は、精製試料である場合がある。
【０２１９】
実施形態によっては、標的核酸の増幅は、約３７℃〜６５℃で行われる場合がある。実施形態によっては、標的核酸の増幅は、約５０℃〜５９℃で行われる場合がある。より具体的な実施形態において、標的核酸の増幅は、約６０℃〜７２℃で行われる場合がある。より具体的な実施形態において、標的核酸の増幅は、約３７℃で行われる場合がある。標的核酸の増幅は、室温でも行われる場合がある。室温は、２０℃〜２５℃で変化する場合がある。実施形態によっては、標的核酸の増幅は、一定温度で行われる場合がある。
【０２２０】
実施形態によっては、本方法は、さらに、プライマー対の第一プライマーに含まれる部分を含む増幅器プライマーを含み、ただし、プライマー対の第一プライマーは、増幅の第一工程に介在し、増幅器プライマーは、プライマー対の第二プライマーと一緒に、増幅のその後の工程に介在する。
【０２２１】
増幅器プライマー及びプライマー対の第一プライマーは、それぞれ、Ｔ７プロモーター配列を含む場合がある。
【０２２２】
増幅器プライマーは、長さが約２３〜約３５ヌクレオチドである場合がある。
【０２２３】
別の態様において、本発明は、標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法を提供し、本方法は、試料中の一本鎖核酸を標的二本鎖核酸に変換すること；ならびに標的二本鎖核酸を含む試料を、本明細書中記載されるとおりの増幅反応混合物と混合する工程、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を用いて標的核酸のＲループを開口し、ヘリカーゼを用いて標的核酸の第一鎖と第二鎖を解きほぐし、プライマー対を用いて鎖をアニーリングし、そしてポリメラーゼを用いて鎖を延長することにより標的核酸を増幅する工程を行うこと；さらに、等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、標的核酸を増幅すること；ならびに、任意選択で、本明細書中いずれかの箇所で記載されるとおり、増幅された標的核酸を検出することを含む。
【０２２４】
実施形態によっては、標的一本鎖核酸は、ＲＮＡ分子である。
【０２２５】
実施形態によっては、ＲＮＡ分子は、逆転写及び増幅工程により、二本鎖核酸へと変換される。
【０２２６】
実施形態によっては、標的一本鎖核酸は、一本鎖ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、合成一本鎖ＤＮＡ、長鎖非翻訳ＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、ウイルスｄｓＲＮＡ、及び非ウイルスｄｓＲＮＡからなる群より選択される。
【０２２７】
検出
実施形態によっては、本方法は、さらに、増幅された核酸をある方法により検出することを含み、方法として、ゲル電気泳動、挿入色素検出、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、質量分析、ラテラルフローアッセイ、比色アッセイ、及びＣＲＩＳＰＲに基づく検出システムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。比色アッセイとして、当該分野で既知である任意のものを挙げることができ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）アッセイ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイ、または金ナノ粒子に基づくアッセイなどがあるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２２８】
特定の実施形態において、増幅された核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づくシステムにより検出される場合がある。特定の実施形態において、増幅された核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づくシステムにより検出される場合がある（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６０：４３６−４３９  （２０１８）及びＧｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６０：４３９−４４４  （２０１８）を参照）。特定の実施形態において、増幅された核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づくシステムとＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づくシステムの併用により検出される場合がある。
【０２２９】
単一ヌクレオチドバリアントを含む核酸の検出、ｒＲＮＡ配列に基づく検出、薬剤耐性についてのスクリーニング、微生物激増のモニタリング、遺伝的摂動、及び環境試料のスクリーニングは、例えば、２０１８年１０月２２日出願のＰＣＴ／ＵＳ１８／０５４４７２の［０１８３］−［０３２７］に記載されるとおりのものが可能であり、この出願は本明細書中参照として援用される。以下も参照される：ＷＯ  ２０１７／２１９０２７、ＷＯ  ２０１８／１０７１２９、ＵＳ２０１８０２９８４４５、ＵＳ  ２０１８−０２７４０１７、ＵＳ  ２０１８−０３０５７７３、ＷＯ  ２０１８／１７０３４０、２０１８年３月１５日出願の米国出願第１５／９２２，８３７号、名称「Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ／ＵＳ１８／５００９１、名称「Ｍｕｌｔｉ−Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２０１８年１２月２０日出願のＰＣＴ／ＵＳ１８／６６９４０、名称「ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、２０１８年１０月４日出願のＰＣＴ／ＵＳ１８／０５４４７２、名称「ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ」、２０１８年１０月３日出願の米国仮出願第６２／７４０，７２８号、名称「ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｆｅｖｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、２０１８年６月２６日出願の米国仮出願第６２／６９０，２７８号及び２０１８年１１月１４日出願の米国仮出願第６２／７６７，０５９号、ともに名称「ＣＲＩＳＰＲ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｎｉｃｋａｓｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２０１８年６月２６日出願の米国仮出願第６２／６９０，１６０号及び２０１８年１１月１４日出願の米国仮出願第６２，７６７，０７７号、ともに名称「ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２０１８年６月２６日出願の米国仮出願第６２／６９０，２５７号及び２０１８年１１月１４日出願の米国仮出願第６２／７６７，０５２号、ともに名称「ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、２０１８年１１月１４日出願の米国仮出願第６２／７６７，０７６号、名称「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｖｉｒａｌ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ」、及び２０１８年１１月１４日出願の米国仮出願第６２／７６７，０７０号、名称「Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ」。さらに以下が参照される：ＷＯ  ２０１７／１２７８０７、ＷＯ  ２０１７／１８４７８６、ＷＯ  ２０１７／１８４７６８、ＷＯ  ２０１７／１８９３０８、ＷＯ  ２０１８／０３５３８��、ＷＯ  ２０１８／１７０３３３、ＷＯ  ２０１８／１９１３８８、ＷＯ  ２０１８／２１３７０８、ＷＯ  ２０１９／００５８６６、２０１８年１２月２１日出願のＰＣＴ／ＵＳ１８／６７３２８、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２０１８年１２月２１日出願のＰＣＴ／ＵＳ１８／６７２２５、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、及び２０１８年１２月２１日出願のＰＣＴ／ＵＳ１８／６７３０７、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２０１８年７月３１日出願のＵＳ６２／７１２，８０９、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２０１８年１０月１０日出願のＵ．Ｓ．  ６２／７４４，０８０、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｃａｓ１２ｂ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、及び２０１８年１０月２６日出願のＵ．Ｓ．  ６２／７５１，１９６、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｃａｓ１２ｂ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２０１８年８月７日出願のＵ．Ｓ．  ７１５，６４０、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、ＷＯ  ２０１６／２０５７１１、Ｕ．Ｓ．  ９，７９０，４９０、ＷＯ  ２０１６／２０５７４９、ＷＯ  ２０１６／２０５７６４、ＷＯ  ２０１７／０７０６０５、ＷＯ  ２０１７／１０６６５７、及びＷＯ  ２０１６／１４９６６１、ＷＯ  ２０１８／０３５３８７、ＷＯ  ２０１８／１９４９６３、Ｃｏｘ  ＤＢＴ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１７  Ｎｏｖ  ２４；３５８（６３６６）：１０１９−１０２７；  Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ＪＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｎｄ  ｐｏｒｔａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｗｉｔｈ  Ｃａｓ１３，  Ｃａｓ１２ａ，  ａｎｄ  Ｃｓｍ６．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１８  Ａｐｒ  ２７；３６０（６３８７）：４３９−４４４；  Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ＪＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１７  Ａｐｒ  ２８；３５６（６３３６）：４３８−４４２；  Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ＯＯ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１７  Ｏｃｔ  １２；５５０（７６７５）：２８０−２８４；  Ｓｍａｒｇｏｎ  ＡＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｓ１３ｂ  Ｉｓ  ａ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ−Ｂ  ＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＲＮａｓｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｓｘ２７  ａｎｄ  Ｃｓｘ２８．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２０１７  Ｆｅｂ  １６；６５（４）：６１８−６３０．ｅ７；  Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ＯＯ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃ２ｃ２  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１６  Ａｕｇ  ５；３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３；  Ｙａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｓｉｎｇ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１６  Ｎｏｖ  ２；７：１３３３０，  Ｍｙｒｖｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｉｅｌｄ  ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１８  ３６０，  ４４４−４４８；  Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．‘‘Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，’’  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１７  １５（３）：１６９−１８２、これらのそれぞれが、そのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【０２３０】
いくつかの具体的な実施形態において、堅固なＣＲＩＳＰＲに基づく検出を提供するためにＲＮＡ標的指向性エフェクターを利用することができる。本明細書中開示される実施形態は、同等の感度レベルでＤＮＡ及びＲＮＡの両方を検出することができ、開示されるＨＤＡ法及びシステムと併用して使用することができる。容易に参照できるように、本明細書中開示される実施形態は、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（特異的高感度酵素レポーターによるロック解除、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｕｎＬＯＣＫｉｎｇ）と称する場合もある。これは、実施形態によっては、本明細書中開示されるＨＤＡ法に続いて行われ、中温性及び好熱性等温条件下であることを含む。
【０２３１】
実施形態によっては、核酸標的指向性検出システムの１つまたは複数の配列要素は、内因性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ標的指向性系を含む特定生物に由来する。ある特定の例示の実施形態において、エフェクタータンパク質ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ標的指向性検出システムは、少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含み、ＨＥＰＮドメインとして、本明細書中記載されるＨＥＰＮドメイン、当該分野で既知であるＨＥＰＮドメイン、及びコンセンサス配列モチーフとの比較によりＨＥＰＮドメインであると認められるドメインが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなドメインのいくつかは、本明細書中提供される。限定ではない１つの例において、コンセンサス配列は、本明細書中提供されるＣ２ｃ２またはＣａｓ１３ｂオルソログの配列に由来することができる。ある特定の例示の実施形態において、エフェクタータンパク質は、単一ＨＥＰＮドメインを含む。ある特定の他の例示の実施形態において、エフェクタータンパク質は、２つのＨＥＰＮドメインを含む。
【０２３２】
１つの例示の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含むＨＥＰＮドメインを１つまたは複数含む。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、特に制限なく、本明細書中記載されるＨＥＰＮドメインまたは当該分野で既知であるＨＥＰＮドメインに由来するものが可能である。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、さらに、２つ以上のＨＥＰＮドメインの一部分を組み合わせることにより作製されたモチーフ配列を含む。上記のとおり、コンセンサス配列は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８１５４、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」の、例えば、２５６−２６４ページ及び２８５−３３６ページ、米国仮特許出願第６２／４３２，２４０号、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２０１７年３月１５日出願の米国仮特許出願第６２／４７１，７１０号、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、及び２０１７年４月１２日出願の米国仮特許出願第６２／４８４，７８６号、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」に開示されるオルソログの配列に由来することが可能である。
【０２３３】
本発明の実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、配列Ｒ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ（配列番号１５）を含むＲｘｘｘｘＨモチーフを少なくとも１つ含む。本発明の実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、配列Ｒ｛Ｎ／Ｈ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ（配列番号１６）を含むＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。本発明の実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、配列Ｒ｛Ｎ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ（配列番号１７）を含む。ある特定の実施形態において、Ｘ１は、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、Ｙ、またはＨである。ある特定の実施形態において、Ｘ２は、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＬである。ある特定の実施形態において、Ｘ３は、Ｌ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＡである。
【０２３４】
本発明に従って使用される追加のエフェクターは、ｃａｓ１遺伝子に対するそれらの近さによって特定可能であり、例えば、特に限定するものではないが、ｃａｓ１遺伝子の始まる前２０Ｋｂからｃａｓ１遺伝子の終わりより２０ｋｂまでの領域内にある。ある特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、少なくとも１つのＨＥＰＮドメイン及び少なくとも５００のアミノ酸を含み、ただし、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、原核生物ゲノム中に天然に存在するものであり、Ｃａｓ遺伝子またはＣＲＩＳＰＲアレイから２０ｋｂ上流または下流の範囲内にある。Ｃａｓタンパク質の限定ではなく例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの修飾型が挙げられる。ある特定の例示の実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、原核生物ゲノム中に天然に存在するものであり、Ｃａｓ１遺伝子から２０ｋｂ上流または下流の範囲内にある。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書中「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称する）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書中「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称する）という用語は、当該分野で周知である。追加のガイダンスとして、本明細書中使用される場合、タンパク質の「ホモログ」とは、ホモログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、同じ種のタンパク質である。ホモログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。本明細書中使用される場合、タンパク質の「オルソログ」とは、オルソログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、異なる種のタンパク質である。オルソログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。
【０２３５】
特定の実施形態において、ＶＩ型ＲＮＡ標的指向性Ｃａｓ酵素は、Ｃ２ｃ２である。他の例示の実施形態において、ＶＩ型ＲＮＡ標的指向性Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１３ｂである。特定の実施形態において、本明細書中示されるとおりのＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログまたはオルソログは、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質と（例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉのＣ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＡ２０２０のＣ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＮＫ４Ａ１７９のＣ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ  １０７１０）のＣ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ  ４８４７）のＣ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ（ＷＢ４）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ科菌（ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５）のＣ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ  １００３）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）のＣ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）のＣ２ｃ２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２のいずれかの野生型配列に基づいて）、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態において、本明細書中示されるとおりのＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログまたはオルソログは、野生型Ｃ２ｃ２と（例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉのＣ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＭＡ２０２０のＣ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科菌ＮＫ４Ａ１７９のＣ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ  １０７１０）のＣ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ  ４８４７）のＣ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ（ＷＢ４）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ科菌（ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５）のＣ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ  １００３）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）のＣ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）のＣ２��２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２のいずれかの野生型配列に基づいて）、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０２３６】
ある特定の他の例示の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ２の活性は、２つのＨＥＰＮドメインの存在に依存する場合がある。これらは、ＲＮＡを切断するＲＮＡ分解酵素ドメイン、すなわちヌクレアーゼ（詳細にはエンドヌクレアーゼ）であることが示されている。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮは、ＤＮＡを、または潜在的にＤＮＡ及び／またはＲＮＡを標的とする可能性もある。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮドメインが、それらの野生型において、ＲＮＡに結合してそれを切断する能力を少なくとも持つことを踏まえると、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質がＲＮＡ分解酵素機能を有することは好ましい。Ｃ２ｃ２  ＣＲＩＳＰＲ系に関しては、２０１６年６月１７日出願の米国仮出願第６２／３５１，６６２号、及び２０１６年８月１７日出願の米国仮出願第６２／３７６，３７７号を参照。同じく、２０１６年６月１７日出願の米国仮出願第６２／３５１，８０３号を参照。同じく、ブロード研究所番号第１００３５．ＰＡ４号及び代理人整理番号第４７６２７．０３．２１３３号を有する２０１６年１２月８日出願の米国仮出願、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｒｉｓｐｒ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」を参照。さらに、Ｅａｓｔ−Ｓｅｌｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＲＮａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃ２ｃ２  ｅｎａｂｌｅ  ｇｕｉｄｅ−ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ’’  Ｎａｔｕｒｅ  ｄｏｉ：１０／１０３８／ｎａｔｕｒｅ１９８０２及びＡｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｃ２ｃ２  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ’’  ｂｉｏＲｘｉｖ  ｄｏｉ：１０．１１０１／０５４７４２を参照。
【０２３７】
ＣＲＩＳＰＲ系におけるＲＮＡ分解酵素機能は既知であり、例えば、ｍＲＮＡ標的指向性が、ある特定のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系について報告されており（Ｈａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  ｖｏｌ．  ２８，  ２４３２−２４４３；  Ｈａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．  １３９，  ９４５−９５６；  Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ｖｏｌ．  ４３，  ４０６−４１７）、これは著しい利点を提供する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓのＩＩＩ−Ａ型系では、標的にわたる転写は、標的ＤＮＡ及びその転写物の切断をもたらし、これは、Ｃａｓ１０−Ｃｓｍリボ核タンパク質エフェクタータンパク質複合体内の独立活性部位が仲介する（Ｓａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．  １５１，  １１６４−１１７４を参照）。本エフェクタータンパク質を介してＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、組成物、または方法が、こうして提供される。
【０２３８】
ある実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ある属の生物のＣ２ｃ２オルソログである場合があり、そのような属として、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ属、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａ属が挙げられるが、これらに限定されない。そのような属の生物種は、本明細書中別途検討されるとおりのものが可能である。
【０２３９】
ある特定の例示の実施形態において、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質として、特に制限なく、以下の２１種のオルソログ種が挙げられる（複数のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＭＡ２０２０、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１７９、［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＳＭ  １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７（第二ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ  ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ  Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＳＢ  １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＤＥ４４２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ  Ｃ−１０１３−ｂ、Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＣＨＫＣＩ００４、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、及びＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種口腔分類群８７９株Ｆ０５５７。さらに１２種の限定ではなく例として、以下がある：Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１４４、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ種ＴＳＬ５−１、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＯＲ３７、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＹＡＢ３００１、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ３００７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｉｈｕａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ属菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｉｐａｒｉａ、及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ。
【０２４０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム酵素のオルソログを同定する方法によっては、関心対象のゲノム中のｔｒａｃｒ配列の同定が関与する場合がある。ｔｒａｃｒ配列の同定は、以下の工程が関係する場合がある：データベースから直列反復またはｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列を検索して、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ領域を同定する。センス方向及びアンチセンス方向の両方でＣＲＩＳＰＲ酵素に隣接するＣＲＩＳＰＲ領域においてホモログ配列を検索する。転写ターミネーター及び二次構造を探す。直列反復またはｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列ではないが、直列反復またはｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列と５０％超の同一性を有する任意の配列を、潜在的ｔｒａｃｒ配列として同定する。潜在的ｔｒａｃｒ配列を用いて、それと会合する転写ターミネーター配列を分析する。
【０２４１】
当然のことながら、本明細書中記載される機能のどれでも、他のオルソログからＣＲＩＳＰＲ酵素に操作して導入することができ、そのようなものとして、複数のオルソログ由来の断片を有するキメラ酵素が挙げられる。そのようなオルソログの例は、本明細書中いずれかの箇所に記載される。したがって、キメラ酵素は、ある生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログの断片を有する場合があり、そのような生物として、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ属、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属が挙げられるが、これらに限定されない。キメラ酵素は、第一断片及び第二断片を有することができ、これらの断片は、本明細書中言及される属または本明細書中言及される種の生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログのものであることが可能であり；有利なことに、断片は、異なる種のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログに由来する。
【０２４２】
複数の実施形態において、本明細書中示されるとおりのＣ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２の機能性バリアントまたはそのホモログもしくはオルソログも包含する。タンパク質の「機能性バリアント」は、本明細書中使用される場合、そのタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持する、そのタンパク質のバリアントを示す。機能性バリアントとして、多形などを含む変異体（これは、挿入、削除、または置換変異体の場合がある）を挙げることができる。同じく機能性バリアントとして挙げられるのは、そのようなタンパク質と、別のもの、通常は無関係の、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとの融合産物である。機能性バリアントは、天然に生じる場合もあれば、人造物である場合もある。有利な実施形態には、改変されたまたは非天然のＶＩ型ＲＮＡ標的指向性エフェクタータンパク質が関与可能である。
【０２４３】
ある実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログをコードする核酸分子（複数可）は、真核細胞での発現に関してコドン最適化されている場合がある。真核生物は、本明細書中検討されるとおりのものが可能である。核酸分子（複数可）は、改変されたまたは非天然のものであることが可能である。
【０２４４】
ある実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、１つまたは複数の変異を有する場合がある（したがって、それをコードする核酸分子（複数可）も変異（複数可）を有する場合がある）。変異は、人為的に導入された変異である場合があり、そのような変異として触媒ドメインにおける１つまたは複数の変異を挙げることができるが、これらに限定されない。Ｃａｓ９酵素に関して触媒ドメインの例として、ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、ＲｕｖＣ  ＩＩＩ、及びＨＮＨドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２４５】
ある実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、１つまたは複数の変異を有する場合がある。変異は、人為的に導入された変異である場合があり、そのような変異として触媒ドメインにおける１つまたは複数の変異を挙げることができるが、これらに限定されない。Ｃａｓ酵素に関して触媒ドメインの例として、ＨＥＰＮドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２４６】
ある実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、機能性ドメインと融合するまたはこれに作動的に連結する一般的核酸結合タンパク質として使用される場合がある。機能性ドメインの例として、翻訳イニシエーター、翻訳アクチベーター、翻訳リプレッサー、ヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導型／制御型ドメイン、または化学光誘導型／制御型ドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２４７】
ある特定の例示の実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、以下からなる群より選択される生物に由来する場合がある；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ属、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属。
【０２４８】
ある特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種のＣ２ｃ２ｐ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉａのＣ２ｃ２ｐ、より好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉａ血清型１／２ｂ株ＳＬＣＣ３９５４のＣ２ｃ２ｐである場合があり、ｃｒＲＮＡ配列は、長さが４４〜４７ヌクレオチドであり、５’の２９ｎｔ直列反復（ＤＲ）及び１５ｎｔ〜１８ｎｔのスペーサーを持つ場合がある。
【０２４９】
ある特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種のＣ２ｃ２ｐ、好ましくはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉのＣ２ｃ２ｐ、より好ましくはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ  ＤＳＭ  １９７５７のＣ２ｃ２ｐである場合があり、ｃｒＲＮＡ配列は、長さが４２〜５８ヌクレオチドである場合があり、５’に少なくとも２４ｎｔの直列反復、例えば５’に２４〜２８ｎｔの直列反復（ＤＲ）を持ち、及び少なくとも１４ｎｔのスペーサー、例えば１４ｎｔ〜２８ｎｔのスペーサー、または少なくとも１８ｎｔのスペーサー、例えば、１９、２０、２１、２２、またはそれ以上のｎｔ、例えば、１８〜２８、１９〜２８、２０〜２８、２１〜２８、または２２〜２８ｎｔのスペーサーを持つ場合がある。
【０２５０】
ある特定の例示の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ  Ｆ０２７９、またはＬｉｓｔｅｒｉａ種、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５のものである場合がある。
【０２５１】
ある特定の例示の実施形態において、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質として、特に制限なく、以下の２１種のオルソログ種が挙げられる（複数のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＭＡ２０２０、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１７９、［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＳＭ  １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７（第二ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ  ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ  Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＳＢ  １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＤＥ４４２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ  Ｃ−１０１３−ｂ、Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＣＨＫＣＩ００４、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、及びＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種口腔分類群８７９株Ｆ０５５７。さらに１２種の限定ではなく例として、以下がある：Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１４４、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ種ＴＳＬ５−１、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＯＲ３７、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＹＡＢ３００１、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ３００７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｉｈｕａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ属菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｉｐａｒｉａ、及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ。
【０２５２】
ある特定の実施形態において、本発明によるＣ２ｃ２タンパク質は、オルソログのうちの１種であるかそれに由来し、または本出願中記載されるとおりのオルソログ２種以上からなるキメラタンパク質であり、あるいはオルソログのうちの１種の変異体またはバリアント（またはキメラ変異体もしくはバリアント）であり、そのようなＣ２ｃ２タンパク質として、本明細書中いずれかの箇所で定義されるとおりの失活Ｃ２ｃ２、スプリットＣ２ｃ２、不安定化Ｃ２ｃ２、などが挙げられ、これらは、異種／機能性ドメインと融合している場合もしていない場合もある。
【０２５３】
ある特定の例示の実施形態において、ＲＮＡ標的指向性エフェクタータンパク質は、ＶＩ−Ｂ型エフェクタータンパク質、例えばＣａｓ１３ｂ及びグループ２９またはグループ３０タンパク質などである。ある特定の例示の実施形態において、ＲＮＡ標的指向性エフェクタータンパク質は、１つまたは複数のＨＥＰＮドメインを含む。ある特定の例示の実施形態において、ＲＮＡ標的指向性エフェクタータンパク質は、Ｃ末端ＨＥＰＮドメイン、Ｎ末端ＨＥＰＮドメイン、またはその両方を含む。本発明の文脈において使用可能なＶＩ−Ｂ型エフェクタータンパク質の例に関して、以下が参照される：２０１６年１０月２１日出願の米国出願第１５／３３１，７９２号、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２０１６年１０月２１日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３０２号、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、及びＳｍａｒｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｃａｓ１３ｂ  ｉｓ  ａ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ−Ｂ  ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＲＮａｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｓｘ２７  ａｎｄ  Ｃｓｘ２８’’  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，  ６５，  １−１３  （２０１７）；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３、及び２０１７年３月１５日出願の米国仮出願番号未定の名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｃａｓ１３ｂ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」。１つの好適な実施形態において、Ｃａｓ１３タンパク質は、ＬｗａＣａｓ１３である。
【０２５４】
マスキング構築物
本明細書中使用される場合、「マスキング構築物」は、本明細書中記載される活性化ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質により切断される、またはいずれにしろ不活性化される可能性がある分子を示す。「マスキング構築物」という用語は、別の方法では、「検出構築物」とも称する場合がある。ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、ＲＮＡ系マスキング構築物である。ＲＮＡ系マスキング構築物は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質により切断可能なＲＮＡ配列要素を含む。ＲＮＡ配列要素の切断は、作用剤を放出、または構造変化をもたらし、これにより検出可能なシグナルが生成される。ＲＮＡ配列要素を使用してどのように検出可能なシグナルの生成を防ぐまたはマスクすることができるかを実証する構築物の例を、以下に記載するが、本発明の実施形態は、その変異形態を含む。切断の前、またはマスキング構築物が「活性」状態にある場合、マスキング構築物は、陽性の検出可能なシグナルの生成または検出を遮断する。当然のことながら、ある特定の例示の実施形態において、活性ＲＮＡマスキング構築物の存在下、最小限のバックグラウンドシグナルが生成する場合がある。陽性の検出可能なシグナルは、光学的方法、蛍光法、化学発光法、電気化学的方法、または当該分野で既知である他の検出法を用いて検出可能な任意のシグナルが可能である。「陽性の検出可能なシグナル」という用語は、マスキング構築物の存在下で検出可能である可能性がある他の検出可能なシグナルと区別するために使用される。例えば、ある特定の実施形態において、第一のシグナルは、マスキング剤が存在する場合に検出される可能性があり（すなわち、陰性の検出可能なシグナル）、このシグナルは、次いで、活性化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質による標的分子の検出及びマスキング剤の切断または不活性化に際して、第二のシグナルへと変換される（例えば陽性の検出可能なシグナル）。
【０２５５】
ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、遺伝子産物の生成を抑制する場合がある。遺伝子産物は、試料に添加されるレポーター構築物によりコードされる場合がある。マスキング構築物は、ＲＮＡ干渉経路に関与する干渉ＲＮＡ、例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などである場合がある。マスキング構築物は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も含む場合がある。存在する間、マスキング構築物は、遺伝子産物の発現を抑制する。遺伝子産物は、蛍光タンパク質あるいは標識化プローブ、アプタマー、または抗体により別途検出可能となる他のＲＮＡ転写物もしくはタンパク質の場合があり、これらはマスキング構築物が存在すると検出可能とならない。エフェクタータンパク質の活性化の際、マスキング構築物は切断されるかいずれにしろサイレンシングされて、遺伝子産物が陽性の検出可能なシグナルとして発現し検出されるようになる。
【０２５６】
ある特定の例示の実施形態において、検出可能な陽性シグナルの発生に必要な１種または複数の試薬がマスキング構築物から放出された結果、検出可能な陽性シグナルが発生するように、マスキング構築物は、検出可能な陽性シグナルの発生に必要な１種または複数の試薬を隔離している場合がある。１種または複数の試薬は、組み合わさって、比色シグナル、化学発光シグナル、蛍光シグナル、または任意の他の検出可能なシグナルを生成する場合があり、また、そのような目的に適切であることが既知の任意の試薬を含む場合がある。ある特定の例示の実施形態において、１種または複数の試薬は、１種または複数の試薬に結合したＲＮＡアプタマーにより隔離されている。１種または複数の試薬は、標的分子が検出されてＲＮＡアプタマーが分解されるのに合わせてエフェクタータンパク質が活性化されたときに、放出される。
【０２５７】
本発明の他の実施形態において、ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能な陽性シグナルの生成を抑制するか、またはＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能な陽性シグナルをマスクすることにより、もしくは代わりに検出可能な陰性シグナルを生成させることにより、検出可能な陽性シグナルの生成を抑制するか、またはＲＮＡ系マスキング構築物は、レポーター型構築物によりコードされる遺伝子産物の生成を抑制するサイレンシングＲＮＡを含み、この遺伝子産物が、発現したときに検出可能な陽性シグナルを生成する。
【０２５８】
さらなる実施形態において、ＲＮＡ系マスキング構築物は、陰性の検出可能なシグナルを生成させるリボザイムであり、陽性の検出可能なシグナルは、リボザイムが不活性化されたときに生成される、またはリボザイムは、基質を第一の色に変化させ、基質は、リボザイムが不活性化されたときに第二の色に変化する。
【０２５９】
他の実施形態において、ＲＮＡ系マスキング構築物は、ＲＮＡアプタマーであり、またはアプタマーは酵素を隔離しており、この酵素が、アプタマーからの放出に際して基質に作用することにより検出可能なシグナルを生成し、またはアプタマーは１対の作用剤を隔離しており、この作用剤がアプタマーから放出されたときに、一緒になって検出可能なシグナルを生成する。
【０２６０】
別の実施形態において、ＲＮＡ系マスキング構築物は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、これに対して、検出可能な試薬及びマスキング構成要素が付加されている。別の実施形態において、検出可能な試薬は、フルオロフォアであり、マスキング構成要素は、クエンチャー分子、すなわち標的ＲＮＡ分子（ｓｕｃｈ  ａｓ）を増幅する試薬である。
【０２６１】
ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、別個の離散した体積で固相基質に固定されており（以下でさらに定義される）、単一試薬を隔離している場合がある。例えば、試薬は、色素を含むビーズである場合がある。固定された試薬により隔離されている場合、別個のビーズは、検出可能なシグナルを生成できないほど拡散しているが、マスキング構築物からの放出に際して、例えば、凝集または溶液濃度の単純上昇により、検出可能なシグナルを生成できる。ある特定の例示の実施形態において、固定されたマスキング剤は、標的分子の検出に際して活性化エフェクタータンパク質により切断される可能性があるＲＮＡ系アプタマーである。
【０２６２】
ある特定の他の例示の実施形態において、マスキング構築物は、溶液中の固定された試薬に結合し、それにより溶液中に遊離している分離した標識化結合パートナーと試薬が結合する能力を遮断する。したがって、試料の洗浄工程を行う際、標的分子の不在下では標識化結合パートナーを試料から洗い落とすことが可能である。しかしながら、エフェクタータンパク質が活性化した場合、マスキング構築物の試薬に結合する能力に干渉するのに十分な程度にマスキング構築物が切断されて、それにより、標識化結合パートナーが、固定された試薬に結合可能になる。したがって、標識化結合パートナーは、洗浄工程後も残存し、試料中の標的分子の存在を示す。ある特定の態様において、固定された試薬に結合するマスキング構築物は、ＲＮＡアプタマーである。固定された試薬は、タンパク質である場合があり、標識化結合パートナーは、標識化抗体である場合がある。あるいは、固定された試薬は、ストレプトアビジンである場合があり、標識化結合パートナーは、標識化ビオチンである場合がある。上記の実施形態で使用される結合パートナーの標識は、当該分野で既知である任意の検出可能な標識が可能である。また、他の既知の結合パートナーが、本明細書中記載される全体的な設計に従って使用される場合がある。
【０２６３】
ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、リボザイムを含む場合がある。リボザイムは、触媒特性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、天然及び改変型どちらにしても、本明細書中開示されるエフェクタータンパク質の標的となる可能性があるＲＮＡを含む、またはそれからなる。リボザイムは、陰性の検出可能なシグナルを生成させるまたは陽性の対照シグナルの生成を防ぐいずれかの反応を触媒するように、選択されるまたは操作される場合がある。活性化エフェクタータンパク質によるリボザイムの不活性化に合わせて、陰性の対照シグナルを生成するまたは陽性の検出可能なシグナルの発生を防ぐ反応は除外され、それにより、陽性の検出可能なシグナルが生成されるようになる。１つの例示の実施形態において、リボザイムは、溶液に第一色として呈色を引き起こす比色反応を触媒する場合がある。リボザイムが不活性化されたとき、溶液は、第二色に変色し、この第二色が検出可能な陽性シグナルである。リボザイムを使用してどのように比色反応を触媒させることができるかの例は、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｇｌｍＳ，’’  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．  ２０１４；１６：３３７−４２に記載されており、本明細書中開示される実施形態の文脈においてそのような系がどのように修飾されて機能し得るかの例も提供される。あるいは、リボザイムは、存在する場合、例えば、ＲＮＡ転写物などの切断産物を生成することができる。したがって、陽性の検出可能なシグナルの検出は、リボザイムが存在しない場合にのみ生成する非切断ＲＮＡ転写物の検出を含む場合がある。
【０２６４】
ある特定の例示の実施形態において、１種または複数の試薬は、検出可能なシグナル、例えば、比色シグナル、化学発光シグナル、または蛍光シグナルなどの生成を促進することができるタンパク質、例えば、酵素などであり、１つまたは複数のＲＮＡアプタマーがこのタンパク質に結合することによりこのタンパク質が検出可能なシグナルを生成することができないようにして、このタンパク質は阻害または隔離されている。本明細書中開示されるエフェクタータンパク質の活性化に際して、ＲＮＡアプタマーは、検出可能なシグナルを生成するタンパク質の能力をもはや阻害できない程度まで切断または分解される。ある特定の例示の実施形態において、アプタマーは、トロンビン阻害因子アプタマーである。ある特定の例示の実施形態において、トロンビン阻害因子アプタマーは、配列ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣ（配列番号１８）を有する。このアプタマーが切断されたとき、トロンビンは活性化されることになり、ペプチド比色または蛍光基質を切断することになる。ある特定の例示の実施形態において、比色基質は、トロンビンのペプチド基質と共役結合したパラ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）である。トロンビンによる切断に際して、ｐＮＡは放出されて、黄色を呈色し、容易に視認できるようになる。ある特定の例示の実施形態において、蛍光基質は、７−アミノ−４−メチルクマリンという青色フルオロフォアであり、蛍光検出器を用いて検出可能である。阻害アプタマーは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、または仔ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）に対しても使用される場合があり、上記に説明される一般原則に含まれる。
【０２６５】
ある特定の実施形態において、ＲＮＡ分解酵素活性は、酵素阻害アプタマーの切断を介して比色検出される。ＲＮＡ分解酵素活性を比色シグナルに変換する様式の１つとして可能性があるのは、ＲＮＡアプタマーの切断を、比色アウトプットを生成することができる酵素の再活性化と結びつけることである。ＲＮＡ切断が存在しない場合、インタクトアプタマーは、酵素標的に結合してその活性を阻害することになる。この読み出しシステムの利点は、酵素がさらなる増幅工程を提供することである：いったん付帯活性（例えばＣａｓ１３ａ付帯活性）を介してアプタマーから遊離すると、比色酵素は、比色産物を生成し続けることになり、シグナルの倍増を招く。
【０２６６】
ある特定の実施形態において、比色読み出しを伴って酵素を阻害する既存アプタマーが使用される。比色読み出しを伴うアプタマー／酵素対は複数存在し、例えば、トロンビン、タンパク質Ｃ、好中球エラスターゼ、及びサブチリシンなどがある。これらのプロテアーゼは、ｐＮＡに基づく比色基質を有し、市販されている。ある特定の実施形態において、一般的な比色酵素を標的とする新規アプタマーが使用される。一般的で堅固な酵素、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、または仔ウシ小腸アルカリホスファターゼなどを、ＳＥＬＥＸなどの選択戦略により設計された改変アプタマーの標的とすることが可能である。そのような戦略は、ナノモル結合効率を持つアプタマーの迅速な選択を可能にし、比色読み出し用のさらなる酵素／アプタマー対の開発に使用可能である。
【０２６７】
ある特定の実施形態において、ＲＮＡ分解酵素活性は、ＲＮＡテザー阻害剤の切断を介して、比色検出される。一般的な比色酵素の多くは、競合する可逆的阻害剤を有する：例えば、ベータ−ガラクトシダーゼは、ガラクトースにより阻害される可能性がある。こうした阻害剤の多くは、弱いものであるが、それらの効果は、局所濃度の上昇により増大する可能性がある。阻害剤の局所濃度をＲＮＡ分解酵素活性と結びつけることにより、比色酵素と阻害剤の対を操作して、ＲＮＡ分解酵素センサーにすることができる。小分子阻害剤に基づく比色ＲＮＡ分解酵素センサーには、３つの構成要素が関与する：比色酵素、阻害剤、ならびに阻害剤及び酵素の両方と共有結合した架橋ＲＮＡであり、これにより阻害剤を酵素に繋ぎとめる。未切断の配置では、酵素は、小分子の局所濃度が高いことにより阻害されている；ＲＮＡが切断されたとき（例えば、Ｃａｓ１３ａの付帯切断により）、阻害剤は放出されることになり、比色酵素は活性化されることになる。
【０２６８】
ある特定の実施形態において、ＲＮＡ分解酵素活性は、Ｇ四本鎖の形成及び／または活性化を介して比色検出される。ＤＮＡのＧ四本鎖は、ヘム（鉄（ＩＩＩ）−プロトポルフィリンＩＸ）と複合体形成して、ペルオキシダーゼ活性を持つＤＮＡザイムを形成することができる。ペルオキシダーゼ基質（例えばＡＢＴＳ：（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−ジアンモニウム塩））が補給されると、Ｇ四本鎖ヘム複合体は、過酸化水素の存在下、基質の酸化を引き起こし、そしてこれが溶液に緑色を呈色させる。Ｇ四本鎖形成ＤＮＡ配列の例は、：ＧＧＧＴＡＧＧＧＣＧＧＧＴＴＧＧＧＡ（配列番号１９）である。ＲＮＡ配列をこのＤＮＡアプタマーとハイブリダイズさせることにより、Ｇ四本鎖構造の形成は制限されることになる。ＲＮＡ分解酵素の付帯活性化（例えばＣ２ｃ２複合体付帯活性化）に際して、ＲＮＡの付着は切断されていき、Ｇ四本鎖が形成されるようになり、ヘムが結合するようになる。この戦略は、発色が酵素反応的である、すなわちＲＮＡ分解酵素活性化を超えてさらに増幅が存在することを意味することから、特に魅力的である。
【０２６９】
ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、別個の離散した体積で固相基質に固定されており（以下でさらに定義される）、単一試薬を隔離している場合がある。例えば、試薬は、色素を含むビーズである場合がある。固定された試薬により隔離されている場合、別個のビーズは、検出可能なシグナルを生成できないほど拡散しているが、マスキング構築物からの放出に際して、例えば、凝集または溶液濃度の単純上昇により、検出可能なシグナルを生成できる。ある特定の例示の実施形態において、固定されたマスキング剤は、標的分子の検出に際して活性化エフェクタータンパク質により切断される可能性があるＲＮＡ系アプタマーである。
【０２７０】
１つの例示の実施形態において、マスキング構築物は、検出剤が溶液中で凝集しているか分散しているかに応じて呈色を変化させる検出剤を含む。例えば、ある特定のナノ粒子、例えばコロイド金などは、それらが凝集物から分散した粒子へと動くにつれて視認できる紫色から赤色への色シフトを起こす。したがって、ある特定の例示実施形態において、そのような検出剤は、１つまたは複数の架橋分子により凝集物に固定されている場合がある。架橋分子の少なくとも一部分は、ＲＮＡを含む。本明細書中開示されるエフェクタータンパク質の活性化に際して、架橋分子のＲＮＡ部分が切断されて、検出剤を分散させ、それに対応する呈色変化がもたらされる。例えば図４６を参照。ある特定の例示の実施形態において、架橋分子は、ＲＮＡ分子である。ある特定の例示の実施形態において、検出剤は、コロイド金属である。コロイド金属材料として、水不溶性金属粒子、または液体に分散した金属化合物、ヒドロゾル、または金属ゾルをあげることができる。コロイド金属は、周期表のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＢ、及びＩＩＩＢ族の金属、ならびに遷移金属、特にＶＩＩＩ族のものから選択される場合がある。好適な金属として、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル、及びカルシウムが挙げられる。他の適切な金属として、以下のものが挙げられ、それらの取り得る様々な酸化状態の全てを含む：リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金、及びガドリニウム。金属は、好ましくは、適切な金属化合物に由来するイオン形で提供され、例えば、Ａｌ３＋、Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋、及びＣａ２＋イオンなどである。
【０２７１】
ＲＮＡ架橋が活性化ＣＲＩＳＰＲエフェクターにより切断されると、上述の色シフトが観察される。ある特定の例示の実施形態において、粒子はコロイド金属である。ある特定の他の例示の実施形態において、コロイド金属は、コロイド金である。ある特定の例示の実施形態において、コロイド状ナノ粒子は、１５ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）である。コロイド金ナノ粒子の独特の表面特性のため、溶液中に完全に分散しているときは、最大吸光度は５２０ｎｍで観察され、肉眼では赤色に呈色して見える。ＡｕＮＰが凝集すると、それらは、最大吸光度の赤方偏移を呈し、色がより暗くなり、最終的に暗紫色凝集物として溶液から沈殿する。ある特定の例示の実施形態において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面から延びるＤＮＡリンカーを有するように修飾される。個別の粒子は、ＲＮＡの各末端でＤＮＡリンカーの少なくとも一部とハイブリダイズする一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）架橋により互いに連結される。こうして、ナノ粒子は、連結された粒子と凝集物のウェブを形成することになり、暗色の沈殿として出現する。本明細書中開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターの活性化に際して、ｓｓＲＮＡ架橋は切断されることになり、ＡＵのＮＰＳが連結されていた網目から放出されて視認できる赤色を生成する。ＤＮＡリンカー及びＲＮＡ架橋配列の例を、以下にまとめる。ＤＮＡリンカーの末端にあるチオールリンカーは、ＡｕＮＰＳとの表面結合に使用される場合がある。他の結合形式も使用される場合がある。ある特定の例示の実施形態において、２つのＡｕＮＰ集団が生成する場合があり、各ＤＮＡリンカーにつき１つである。これは、ｓｓＲＮＡが適切な方向で適切に架橋するのを促進する助けとなる。ある特定の例示の実施形態において、第一のＤＮＡリンカーは、３’末端で結合しているが、第二のＤＮＡリンカーは、５’末端で結合している。
【表１】
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【０２７２】
ある特定の他の例示の実施形態において、マスキング構築物は、検出可能な標識を結合させたＲＮＡオリゴヌクレオチド及びその検出可能な標識のマスキング剤を含む。そのような検出可能な標識／マスキング剤対の例としては、フルオロフォアとフルオロフォアの消光剤がある。フルオロフォアの消光は、フルオロフォアと別のフルオロフォアまたは非蛍光分子との間で非蛍光複合体が形成された結果生じることが可能である。この機構は、基底状態複合体形成、静的消光、または接触消光として知られる。したがって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアと消光剤が接触して消光が生じるのに十分なほど近接しているように設計される。フルオロフォア及びそれらの同族の消光剤は、当該分野で既知であり、当業者はこの目的で選択することができる。本発明の文脈において特定のフルオロフォア／消光剤対が重要であるのではなく、フルオロフォア／消光剤対の選択は、フルオロフォアのマスキングを確実にするにすぎない。本明細書中開示されるエフェクタータンパク質の活性化に際して、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは切断され、それによりフルオロフォアと消光剤の間の接触消光効果を維持するのに必要な近さが断たれる。したがって、フルオロフォアの検出は、試料中に標的分子が存在することを確定するのに使用される場合がある。
【０２７３】
ある特定の他の例示の実施形態において、マスキング構築物は、１つまたは複数の金属ナノ粒子、例えば金ナノ粒子を結合させた１つまたは複数のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む場合がある。実施形態によっては、マスキング構築物は、複数のＲＮＡオリゴヌクレオチドにより架橋された複数の金属ナノ粒子を含み、それらは閉じたループを形成している。１つの実施形態において、マスキング構築物は、３つのＲＮＡオリゴヌクレオチドにより架橋された３つの金ナノ粒子を含み、それらは閉じたループを形成している。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるＲＮＡオリゴヌクレオチドの切断は、金属ナノ粒子による検出可能なシグナルの生成を招く。
【０２７４】
ある特定の他の例示の実施形態において、マスキング構築物は、１つまたは複数の量子ドットを結合させた１つまたは複数のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む場合がある。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるＲＮＡオリゴヌクレオチドの切断は、量子ドットによる検出可能なシグナルの生成を招く。
【０２７５】
１つの例示の実施形態において、マスキング構築物は、量子ドットを含む場合がある。量子ドットは、表面に複数のリンカー分子が結合されている場合がある。リンカー分子の少なくとも一部は、ＲＮＡを含む。リンカー分子は、一端で量子ドットに結合されており、及び量子ドットの消光が生じるのに十分な近さに消光剤が維持されるように、その長さに沿ってまたはリンカーの末端で１つまたは複数の消光剤に結合されている。リンカーは分岐している場合がある。上記のとおり、量子ドット／消光剤対が重要であるのではなく、量子ドット／消光剤対の選択は、フルオロフォアのマスキングを確実にするにすぎない。量子ドット及びそれらの同族／消光剤は、当該分野で既知であり、当業者はこの目的で選択することができる。本明細書中開示されるエフェクタータンパク質の活性化に際して、リンカー分子のＲＮＡ部分は切断され、それにより量子ドットと１つまたは複数の消光剤の間の消光効果を維持するのに必要な近さが排除される。ある特定の例示の実施形態において、量子ドットは、複合したストレプトアビジンである。ＲＮＡは、ビオチンリンカーを介して結合されており、配列／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号２３）または／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号２４）を持つ消光分子を利用している。式中、／５Ｂｉｏｓｇ／は、ビオチンタグであり、／３ｌＡｂＲＱＳｐ／は、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ消光剤である。切断に際して、本明細書中開示される活性化エフェクターにより、量子ドットは、視認できる蛍光を発するようになる。
【０２７６】
同様な様式で、検出可能な陽性シグナルを生成させるのに蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用する場合がある。ＦＲＥＴは、無放射プロセスであり、このプロセスにより、エネルギー励起したフルオロフォア（すなわち「ドナーフルオロフォア」）からのフォトンが、別の分子（すなわち「アクセプター」）の電子のエネルギー状態を、励起一重項状態のより高い振動レベルへと引き上げる。ドナーフルオロフォアは、そのフルオロフォアに特徴的な蛍光を発することなく基底状態に戻る。アクセプターは、別のフルオロフォアまたは非蛍光分子であることが可能である。アクセプターがフルオロフォアである場合、移動したエネルギーは、そのフルオロフォアに特徴的な蛍光として発せられる。アクセプターが非蛍光分子である場合、吸収されたエネルギーは、熱として失われる。したがって、本明細書中開示される実施形態の文脈において、フルオロフォア／消光剤対は、オリゴヌクレオチド分子に結合させたドナーフルオロフォア／アクセプター対に置き換えられる。インタクトであるとき、マスキング構築物は、アクセプターから発せられる蛍光または熱により検出されるとおりの第一シグナル（陰性の検出可能なシグナル）を生成する。本明細書中開示されるエフェクタータンパク質の活性化に際して、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは切断され、ドナーフルオロフォアの蛍光がそこで検出される（陽性の検出可能なシグナル）ようにＦＲＥＴが破壊される。
【０２７７】
ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、挿入色素の使用を含み、この色素は、長いＲＮＡが切断されて短いヌクレオチドになるのに反応して、その吸光度を変化させる。そのような色素は複数存在する。例えば、ピロニン−Ｙは、ＲＮＡと複合体形成し、５７２ｎｍに光吸収を有する複合体を形成する。ＲＮＡの切断により、光吸収が消失し、呈色が変化する。メチレンブルーを同様な様式で使用する場合があり、これは、ＲＮＡ切断に際して６８８ｎｍでの光吸収を変化させる。したがって、ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、本明細書中開示されるエフェクタータンパク質によるＲＮＡの切断に際して光吸収を変化させるＲＮＡと挿入色素の複合体を含む。
【０２７８】
ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、ＨＣＲ反応用のイニシエーターを含む場合がある。例えば、Ｄｉｒｋｓ  ａｎｄ  Ｐｉｅｒｃｅ．  ＰＮＡＳ  １０１，  １５２７５−１５７２８  （２００４）を参照。ＨＣＲ反応は、２つのヘアピン種の位置エネルギーを利用する。ヘアピンのうち一方の対応する領域と相補的な部分を有する一本鎖イニシエーターが、それまで安定だった混合物に放出されると、そのイニシエーターは、一方の種のヘアピンを開口する。このプロセスは、次いで、一本鎖領域を露出させ、これが他方の種のヘアピンを開口させる。このプロセスは、次いで、最初のイニシエーターと同一の一本鎖領域を露出させる。結果として生じる連鎖反応は、ニック二重らせんの形成を招く場合があり、らせんはヘアピンの供給が枯渇するまで成長する。得られる生成物の検出は、ゲル上でまたは比色で行われる場合がある。比色検出法の例として、例えば、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＡＣＳ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，  ２０１７，  ９（１）：１６７−１７５，  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．‘‘Ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｆｒｅｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｔ  ａｐｔａｍｅｒｓ’’  Ａｎａｌｙｓｔ  ２０１５，  １５０，  ７６５７−７６６２、及びＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｎｏｎ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．’’  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  ７０（４）：  ６８６−６９４（２０１６）に開示されるものが挙げられる。
【０２７９】
ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、ＨＣＲイニシエーター配列、及びイニシエーターがＨＣＲ反応を開始することを防ぐ切断可能な構造配列要素、例えばループまたはヘアピンなどを含む場合がある。活性化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質により構造配列要素が切断されると、次いで、イニシエーターが放出されて、ＨＣＲ反応を引き起こし、反応の検出は、試料中に１種または複数の標的が存在することを示す。ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、ＲＮＡループを持つヘアピンを含む。活性化ＣＲＩＳＲＰエフェクタータンパク質がＲＮＡループを切断すると、イニシエーターが放出されてＨＣＲ反応を引き起こすことができる。
【０２８０】
特定の実施形態において、標的核酸は、アトモル感度で検出される場合がある。特定の実施形態において、標的核酸は、フェムトモル感度で検出される場合がある。いくつかの具体的な実施形態において、本方法は、約２時間未満、約９０分間未満、約６０分間未満、約３０分間未満、または約１５分間未満行われる。いくつかの好適な実施形態において、増幅及び検出は、２ｆＭの検出を約２時間未満で行うワンポット方法で行うことが可能である。
【０２８１】
増幅及び検出用のシステム及びキット
増幅及び検出用システム
実施形態によっては、本発明は、試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出するシステムを提供する。本システムは、本明細書中記載されるとおりの増幅ＣＲＩＳＰＲ系を含む場合がある。増幅ＣＲＩＳＰＲ系は本明細書中記載されるとおりの第一ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む場合がある。第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含む場合がある。第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む場合がある。第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及び第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、活性酵素の場合も失活酵素の場合もある。標的核酸が実際に長い、例えばゲノムＤＮＡなどの場合、本明細書中記載されるとおり、例えば、活性Ｃａｓ酵素が有用である場合がある。
【０２８２】
失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素として、失活Ｃａｓ９、失活Ｃａｓ１２を挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。失活Ｃａｓ１２は、失活Ｃａｓ１２ａ、失活Ｃａｓ１２ｂ、または失活Ｃａｓ１２ｃである場合がある。
【０２８３】
本システムは、さらに、本明細書中記載されるとおり、ヘリカーゼ、プライマー対、ポリメラーゼ、及び任意選択で、標的核酸の増幅を検出するための検出システムを含む場合がある。プライマー対は、第一プライマー及び第二プライマーを含む場合があり、第一プライマーは、標的核酸の第一鎖と相補的な部分を有し、第二プライマーは、標的核酸の第二鎖と相補的な部分を有する。
【０２８４】
ポリメラーゼとして、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ、全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、及びシーケナーゼＤＮＡポリメラーゼを挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２８５】
ヘリカーゼは、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ヘリカーゼ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼＩＶ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰｒｉＡヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原、酵母菌ＲＡＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、耐熱性Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤｎａＢヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、パピローマウイルスＥ１ヘリカーゼ、古細菌ＭＣＭヘリカーゼ、真核生物ＭＣＭヘリカーゼ、及びＴ７  Ｇｐ４ヘリカーゼである場合があるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２８６】
特定の実施形態において、ヘリカーゼは、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ  Ｄ４０９Ａ／Ｄ４１０Ａである。
【０２８７】
特定の実施形態において、失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素、ヘリカーゼ、及びポリメラーゼは、同一温度下で機能する場合がある。特定の実施形態において、温度は、３７℃である場合があるが、必ずしもこれに限定されない。
【０２８８】
代替実施形態において、本発明は、試料中の標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出するシステムを提供する。本システムは、本明細書中記載されるとおりの標的一本鎖核酸を二本鎖核酸に変換する試薬を含む場合があるが、必ずしもこれに限定されない。本システムは、上述されるとおりの増幅ＣＲＩＳＰＲ系、ヘリカーゼ、プライマー対、ポリメラーゼ、及び任意選択で、本明細書中記載されるとおりの検出システムも含む場合がある。
【０２８９】
実施形態によっては、検出システムは、Ｃａｓ１２またはＣａｓ１３エフェクタータンパク質と、相当する標的分子に結合するように設計されたガイドＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ系、及びマスキング構築物を含む場合がある。
【０２９０】
他の実施形態において、本発明は、標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出する方法を含む。そのような一本鎖核酸として、一本鎖ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または合成一本鎖ＤＮＡを挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態において、標的一本鎖核酸は、ＲＮＡ分子である。一本鎖核酸は、これまでに記載された工程及び方法のいずれかを行う前に、標的二本鎖核酸へと変換される場合がある。そのような変換は、任意の既知の方法により、例えば、逆転写及び増幅により達成される場合がある。
【０２９１】
実施形態によっては、検出システムは、Ｃａｓ１３酵素ＬｗａＣａｓ１３を含む場合がある。
【０２９２】
実施形態によっては、検出システムは、さらに、プライマー対の第一プライマーとの間にプロモーター配列同一性を有する追加の増幅器プライマーを含む場合がある。
【０２９３】
実施形態によっては、検出システムのヘリカーゼは、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ  Ｄ４０９Ａ／Ｄ４１０Ａである。実施形態によっては、ヘリカーゼは、酵素中にＤからＡへの置換を１つまたは複数有する。
【０２９４】
実施形態によっては、本システムは、クラウディング剤、補因子、一本鎖結合タンパク質、及び／またはアシストタンパク質から選択される１種または複数の添加剤を含む場合がある。
【０２９５】
クラウディング剤は、分子量が２０Ｋのポリエチレングリコールである場合があり、任意選択で、約２．５％〜約６．５％で提供される。
【０２９６】
補因子は、ＡＴＰである場合があり、任意選択で、０．７５〜約５ｍＭで提供される。
【０２９７】
一本鎖結合タンパク質として、Ｔ４  ｇｐ３２または好熱性ＳＳＢ（ＥＴ−ＳＳＢ）を挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２９８】
アシストタンパク質は、ｄＣｐｆ１及び／またはＵｖｓＸリコンビナーゼである場合があるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２９９】
本システムは、中温性ＤＮＡポリメラーゼ、詳細にはＳａｕ  ＬＦポリメラーゼを含む場合がある。
【０３００】
本明細書中記載される方法またはシステムのいずれかにおいて、ヘリカーゼは、変異Ｄ４０３Ａ／Ｄ４０４Ａを持つＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、変異Ｄ４０７Ａ／Ｄ４０８Ａを持つＢａｃｉｌｌｕｓ種ＦＪＡＴ−２７２３１由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、変異Ｄ４１５Ａ／Ｄ４１６Ａを持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、変異Ｄ４０７Ａ／Ｄ４０８Ａを持つＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来のＰｃｒＡヘリカーゼ、または変異Ｄ４０２Ａ／Ｄ４０３Ａを持つＰａｅｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ由来のＰｃｒＡヘリカーゼである場合がある。
【０３０１】
増幅及び検出用キット
同じく本明細書中提供されるのは、試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び／または検出するためのキットである。そのようなキットは、本明細書中記載されるとおりの増幅ＣＲＩＳＰＲ系を含む場合があるが、必ずしもこれに限定されない。増幅ＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書中記載されるとおりの第一ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ複合体及び第二ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む場合がある。第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第一失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第一ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含む場合がある。第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、第二失活ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、第二ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む場合がある。
【０３０２】
キットは、さらに、本明細書中記載されるとおり、ヘリカーゼ、プライマー対、ポリメラーゼ、及び任意選択で、標的核酸の増幅を検出する検出システムを含む場合がある。プライマー対は、第一プライマー及び第二プライマーを含む場合があり、第一プライマーは、標的核酸の第一鎖と相補的な部分を有し、第二プライマーは、標的核酸の第二鎖と相補的な部分を有する。キットは、使用説明書のセットも含む場合がある。
【０３０３】
実施形態によっては、キットは、試料中の二本鎖核酸を精製するための試薬を含む場合がある。
【０３０４】
実施形態によっては、キットは、試料中の標的一本鎖核酸を増幅及び／または検出するためのキットである場合があり、試料中の一本鎖核酸を精製するための試薬を含む場合がある。キットは、使用説明書のセットも含む場合がある。
【０３０５】
キットは、さらに、検出システムを、好適な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ検出システムを含む場合がある。検出システムは、例えば、２０１６年１２月９日出願の米国出願第６２／４３２，５５３号、２０１７年２月８日出願の同６２／４５６，６４５号、２０１７年３月１５日出願の同６２／４７１，９３０号、２０１７年４月１２日出願の同６２／４８４，８６９号、２０１７年１０月４日出願の同６２／５６８，２６８号に記載されるとおりのものが可能であり、これらは全てそのまま全体が参照として援用される。同じく、２０１７年１２月８日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６５４７７、名称ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに記載されるとおりのもの、特に［０１４２］−［０２８９］の検出用ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素について記載されるとおりのものが可能であり、この出願は本明細書中参照として援用される。
【０３０６】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、実施例は、特許請求の範囲で記載される本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【０３０７】
実施例１：２工程ＣＲＩＳＰＲ  ｔＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫ
好熱性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）は、ＮＥＢが販売する市販のシステムを利用して、反応温度に６５℃を用いる。ｔＨＤＡと併用したＣＲＩＳＰＲ系のワークフローの例を、図２に示す。２工程プロセスでＳＨＥＲＬＯＣＫ検出と併せてＣＲＩＳＰＲ−ｔＤＡを利用することにより、単一分子検出において増幅システムにＣＲＩＳＰＲを加えることで結果の改善を得ることが可能になる（図３Ａ〜図３Ｇ）。図５は、改善がｄＡｓＣｐｆ１：ｃｒＲＮＡ複合体によりもたらされ、Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂの両方もまた、２工程ｔＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫを改善することを示す。しかしながら、ＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応をより低い温度での反応で完了させることも、改善といえる。
【０３０８】
実施例２：２工程ＣＲＩＳＰＲ  ｍＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫ
市販のステムとして、現在ＮＥＢが販売するｔＨＤＡがあるものの、３７℃での中温性ＨＤＡに利用可能な市販のシステムは存在しない。２工程プロセスは、９０分より長い時間を要し、ｔＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムは、高感度検出のためにＣａｓ１２ａまたはＣａｓ１２ｂなどの触媒不活性かつプログラム可能なＣＲＩＳＰＲ酵素を必要とすることで、感度を失う恐れがある。
【０３０９】
本発明者らは、最初に、中温性の温度でのＣＲＩＳＰＲ−ＨＤＡとＳＨＥＲＬＯＣＫの併用ワークフローの開発に取り掛かった。中温性ヘリカーゼ、好ましくは鎖分離のためのアクセサリータンパク質を必要としない中温性ヘリカーゼをスクリーニングし、中温性ＨＤＡとＳＨＥＲＬＯＣＫを併用するためのパラメーター最適化を行った。最初に、中温性細菌種由来のＵｖｒＤ型ヘリカーゼを選出することを行った（図７）。次に、活性を試験するためのレポーターアッセイを確立した（図８）。選択したヘリカーゼに変異誘発して、活性を高め（図９）、幅広い活性スペクトルを有し、活性を高める置換を持つｐｃｒＡ（ＵｖｒＤ）型ヘリカーゼを選択した（図１０）。最後に、図１１は、補因子優先度及びヘリカーゼ基質解きほぐしの動態を推測するのにレポーターアッセイが利用可能であることを示す。
【０３１０】
次に、中温性ＨＤＡとＳＨＥＲＬＯＣＫの併用について、最適酵素及びアクセサリータンパク質（Ｃａｓ１３、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＳＢ）の決定も含めてプロトコルを最適化した。酵素に関して、６種の異なる野生型ＵｖｒＤ様ヘリカーゼ及びスーパーヘリカーゼ変異を持つ変異体を評価したところ、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ  Ｄ４０９Ａ／Ｄ４１０Ａが堅固であることを示した。中温性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｓａｕ  ＬＦポリメラーゼであり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用である。ＬｗａＣａｓ１３は、シングルプレックス検出について、現在、第一選択のＣａｓ１３である。分子量２０Ｋのポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ２０Ｋ）及びＡＴＰ補因子の添加は、信号対雑音比を上昇させる（図１３）。一本鎖結合タンパク質Ｔ４  ｇｐ３２または好熱性ＳＳＢ（ＥＴ−ＳＳＢ）は、現在のところ、プロトコルの最適化において好適な添加剤である。ｄＣｐｆ１、ＵｖｓＸリコンビナーゼは、複合体テンプレートについてアシストタンパク質として使用可能である。Ｔ４  ｇｐ３２及びヘリカーゼを様々な濃度で試験して、１反応あたりそれぞれの量がどのくらいであると最良の成績が得られるかを特定した。図１２に示すとおり、複数の濃度で上手く行ったもの、１反応あたり５００ｎｇのＴ４  ｇｐ３２及び１２５ｎｇのヘリカーゼで最良の成績が得られた。添加剤は、信号対雑音比を最適化するためにも検討された（図１３）。クラウディング剤としてのＰＥＧ  ２０Ｋ及び補因子としてのＡＴＰを添加すると、信号対雑音比が上昇し、２．５％〜６．２５％のＰＥＧ分子量２０Ｋで、蛍光シグナルが向上し、０．７５ｍＭ〜３ｍＭのＡＴＰも蛍光を向上した。
【０３１１】
実施例３：ワンポットｍＨＤＡ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ
特に有利な増幅法は、以下の変数のうち１つまたは複数を含むと思われる：３７℃での操作、迅速（約１０分間）、高感度（約２ａＭ）、安価、多重化可能、ワンポットプロセスで行うことが容易、及び試料マトリクスに対して堅固。
【０３１２】
中温性ＨＤＡ（ｍＨＤＡ）法の最適化の一部として、プライマー戦略も最適化した。潜在的に２４〜３３ｎｔの長さが最適であるが、現行の用途において、フォワードプライマーは、転写用Ｔ７プロモーター配列のためにそれよりかなり長いと思われる。本明細書で開示されるとおり、長いフォワードプライマーを回避する１つのやり方は、図１４に示す「アンカー型プライミング」と称するプロセスにおいてより長いＨＤＡプライマーと一緒にプライミングするより短いＴ７プロモーターを添加することである。より長い「イニシエーター」プライマーを、最初のサイクルに介在する遺伝子特異的部位とともに用い、より短い「増幅器」プライマーを最適増幅用に使用することにより、多重ＤＮＡ増幅中の逆プライミング部位へと延びていくときのプライマー競合を防ぐことができる。このアプローチに基づいたところ、「アンカー型プライミング」は、増幅効率を高め、その結果、ワンポットｍＨＤＡ−ＳＨＥＲＬＯＣＫは、２時間未満で、２ｆＭ（１０００コピー）を達成することができた（図１６）。図１７に示すとおり、これは、プラスミドＤＮＡでも達成された。
【０３１３】
記載される本発明の方法、医薬組成物、及びキットの様々な修飾及び改変が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかとなるだろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたものの、当然のことながら、さらなる修飾が可能であり、特許請求されるとおりの本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではない。実際、本発明を実行するために説明された様式の様々な修飾で当業者に明らかであるものは、本発明の範囲内にあることが意図される。本出願は、概して、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野内で既知の慣行に含まれる本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の改変、使用、または応用を包含することを意図し、このことは、本明細書中明記される前の必須の特長にも適用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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