(57)【要約】  少なくともQS-21主ピーク及び2018成分を含有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物、そのような抽出物を得るための方法、並びに関連する態様。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともQS-21主ピーク及び2018成分を含有するキラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)の粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物。
【請求項２】
2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.064である、請求項1に記載の粗水性抽出物。
【請求項３】
2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.005である、請求項1又は2に記載の粗水性抽出物。
【請求項４】
2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.01である、請求項3に記載の粗水性抽出物。
【請求項５】
先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.45以下である、請求項1から4のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項６】
先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.4以下である、請求項5に記載の粗水性抽出物。
【請求項７】
先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.05以上である、請求項1から6のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項８】
先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.1以上である、請求項7に記載の粗水性抽出物。
【請求項９】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも1g/Lである、請求項1から8のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項１０】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2g/Lである、請求項9に記載の粗水性抽出物。
【請求項１１】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2.5g/Lである、請求項10に記載の粗水性抽出物。
【請求項１２】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2.8g/Lである、請求項11に記載の粗水性抽出物。
【請求項１３】
QS-21AV1
【化１】
2021504429.tif 000023
QS-21AV2
【化２】
2021504429.tif 000024
1856成分
【化３】
2021504429.tif 000025
及び
2002成分
【化４】
2021504429.tif 000026
(QS-21主ピーク成分と総称される)、
並びに2018成分
【化５】
2021504429.tif 000027
を含有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物。
【請求項１４】
2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.064である、請求項13に記載の粗水性抽出物。
【請求項１５】
2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.005である、請求項13又は14に記載の粗水性抽出物。
【請求項１６】
2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.01である、請求項15に記載の粗水性抽出物。
【請求項１７】
先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.45以下である、請求項13から16のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項１８】
先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.4以下である、請求項17に記載の粗水性抽出物。
【請求項１９】
先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.05以上である、請求項13から18のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項２０】
先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.1以上である、請求項19に記載の粗水性抽出物。
【請求項２１】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも1g/Lである、請求項13から20のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項２２】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2g/Lである、請求項21に記載の粗水性抽出物。
【請求項２３】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2.5g/Lである、請求項22に記載の粗水性抽出物。
【請求項２４】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2.8g/Lである、請求項23に記載の粗水性抽出物。
【請求項２５】
キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮から得られる、請求項1から24のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項２６】
殺菌されている、請求項1から25のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項２７】
実質的に無菌であり、特に無菌である、請求項1から26のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項２８】
抗微生物剤、例えば抗菌剤を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項２９】
抗微生物剤が、安息香酸ナトリウムである、請求項28に記載の粗水性抽出物。
【請求項３０】
3.0から4.5のpHを有する、請求項1から29のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項３１】
3.6から4.0のpHを有する、請求項30に記載の粗水性抽出物。
【請求項３２】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を調製するための方法であって、
a)適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップ、
b)2018成分の生成が制御される条件下で、該材料から水性抽出物を調製するステップ
を含む、方法。
【請求項３３】
ステップa)の、適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップが、キラヤ・サポナリア・モリナ材料の2018成分含有量を分析するステップを含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
ステップa)の、適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップが、キラヤ・サポナリア・モリナからの水性抽出中に得られる2018成分含有量を決定するステップを含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
ステップa)の、キラヤ・サポナリア・モリナからの水性抽出中に得られる2018成分含有量を決定するステップが、小規模な抽出を行うステップ、及び生じた抽出物における2018成分含有量を決定するステップを含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
小規模な抽出が、500g未満、例えば50g未満のキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
ステップb)が、少なくとも25kg、例えば50から500kgのキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、請求項32から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップb)が、100から400kgのキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
ステップb)が、200から300kgのキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が、ポリビニルポリピロリドン(PVPP)で処理される、請求項32から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、PVPP処理中のpH範囲内で維持される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を殺菌する、さらなるステップc)を含む、請求項32から41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
殺菌が、40から95℃で行われる、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
殺菌が、60から90℃で行われる、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
殺菌が、約86℃で行われる、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、殺菌中のpH範囲内で維持される、請求項42から45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
抗微生物剤、例えば抗菌剤が、殺菌前にキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物に添加される、請求項42から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
殺菌が、10分から1時間行われる、請求項42から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
殺菌が、40から50分行われる、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
殺菌後、粗抽出物が能動的に冷却される、請求項42から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
殺菌後、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が濾過される、請求項42から50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、濾過中のpH範囲内で維持される、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
殺菌後、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が濃縮される、請求項42から52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、濃縮中のpH範囲内で維持される、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
pH範囲が、3.0から4.5である、請求項41から54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
pH範囲が、3.6から4.0である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
キラヤ・サポナリア・モリナ材料が、キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮である、請求項32から56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
請求項1から31のいずれか一項に記載の粗水性抽出物を調製するための、請求項32から57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物における、2018成分/QS-21主ピークの比を決定するための方法であって、
(i)キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物における2018成分含有量を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ
(ii)キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物におけるQS-21主ピーク含有量を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ、及び
(iii)2018成分含有量をQS-21主ピーク含有量と比較して、2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項６０】
精製サポニン抽出物の製造に使用するためのキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を同定するための方法であって、
(i)2018成分/QS-21主ピークの比を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ、及び
(ii)≦0.075の2018成分/QS-21主ピークの比を有する粗水性抽出物を選択するステップ
を含む、方法。
【請求項６１】
ステップ(ii)で選択される粗水性抽出物が、≦0.064の2018成分/QS-21主ピークの比を有する、請求項60に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、一般的に、サポニン抽出物、特にキラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)の粗水性抽出物、それを製造するための方法、及び関連した態様に関する。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントは、特に免疫原性が低いサブユニットワクチンのケースでは、体液性及び細胞性免疫応答を改善するワクチンに含まれる。病原体による自然感染と同様に、アジュバントは、先天性免疫系の活性化に依存して、長時間持続する適応免疫を促進する。
【０００３】
アジュバント系01(AS01)は、2つの免疫刺激剤、3-O-デスアシル-4'-モノホスホリル脂質A(3D-MPL)及びQS-21を含有するリポソーム系アジュバントである(Garcon及びVan Mechelen、2011年、Didierlaurentら、2017年)。3D-MPLは、TLR4アゴニストである、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)に由来するリポ多糖の非毒性誘導体であり、また、QS-21は、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮から得られる天然のサポニン抽出物である(Kensilら、1991年、Ragupathiら、2011年)。AS01は、最近開発されたマラリア用(RTS,S - Mosquirix(登録商標))及び帯状疱疹用(HZ/su - Shingrix(登録商標))のワクチン、並びに、病原体、例えばヒト免疫不全ウイルス及び結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に対する開発中の複数の候補ワクチンに含まれる。
【０００４】
AS01注入により、動物モデルにおける先天性免疫の活性化が急速且つ一過性になる。好中球及び単球は、免疫化されると、流入領域リンパ節(dLN)に急速に補充される。さらに、AS01は、T細胞活性化に必要なMHCIIhigh樹状細胞(DC)の補充及び活性化を誘導する(Didierlaurent A.M.ら、2014年)。一部のデータは、AS01の成分の作用機構にも利用できる。3D-MPLは、ヒト及びマウスの両方で、NF-κB転写活性及びサイトカイン生成を刺激するTLR4を経由してシグナル伝達し、抗原提示細胞(APC)を直接活性化する(De Beckerら、2000年、Ismailiら、2002年、Martinら、2003年、Mata-Haroら、2007年)。QS-21は、マウスでは高い抗原特異的抗体反応及びCD8+T-細胞反応を促進し(Kensil及びKammer、1998年、Newmanら、1992年、Soltysikら、1995年)、ヒトでは抗原特異的抗体反応を促進する(Livingstonら、1994年)。その物理的特性のため、QS-21は、in vivoの危険シグナルとして作用し得ると考えられる(Lambrechtら、2009年、Liら、2008年)。QS-21は、ASC-NLRP3インフラマソームを活性化し、後続してIL-1β/IL-18が放出されると示されている(Marty-Roix、R.ら、2016年)が、サポニンのアジュバント効果に関与する正確な分子経路は、まだ明確に定められていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒト医薬として承認されている製品の任意の成分のように、QS-21の製造は、承認された製造プロセスの使用、及び、必要とされる仕様を満たすことを確実にするように最終組成の慎重な制御を必要とする。既存プロセスの変更は、コスト及び時間消費の再検証を必要とするが、仕様から逸脱しても意味がない。QS-21を製造するための堅実な方法、及び規定の組成のQS-21材料に対する継続した必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第1の態様では、本発明は、少なくともQS-21主ピーク及び2018成分を含有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物を提供する。
【０００７】
第2の態様では、本発明は、
QS-21AV1
【０００８】
【化１】
2021504429.tif 000002
QS-21AV2
【０００９】
【化２】
2021504429.tif 000003
1856成分
【００１０】
【化３】
2021504429.tif 000004
及び
2002成分
【００１１】
【化４】
2021504429.tif 000005
(QS-21主ピーク成分と総称される)、
並びに2018成分
【００１２】
【化５】
2021504429.tif 000006
を含有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物を提供する。
【００１３】
第3の態様では、本発明は、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を調製するための方法であって、
a)適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップ、
b)2018成分の生成が制御される条件下で、該材料から水性抽出物を調製するステップ
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】粗水性キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮抽出物のHPLCクロマトグラムである。
【図２】粗水性キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮抽出物のHPLC-UVクロマトグラムである。
【図３】粗水性キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮抽出物のUPLC-UVクロマトグラムである。
【図４】実験条件及び観察された2018成分/QS-21主ピーク比に対する影響の一覧表である。
【図５】pH及び温度条件から生じる、観察された2018成分/QS-21主ピーク比に対する影響の表面プロットである。
【図６】pH3.8での2018成分とQS-21主ピークの比に対する経時的な温度の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以前に言及されているように、ヒト医薬として承認されている製品の任意の成分は、承認された製造プロセスの使用、及び、必要とされる仕様を満たすことを確実にするように最終組成の慎重な制御を必要とする。仕様からの逸脱は意味がない。しかし、安全性及び効能の検査は、規定の組成の試験に依存するので、成分仕様の変更は危険を招く。既存プロセスの変更は、コスト及び時間のかかる再検証を必要とする。
【００１６】
本発明者らは、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物は、組成、特に本明細書で2018成分と呼ばれる成分に関する組成が異なること、及び、既存の承認された製造プロセスの適用では、過剰な2018成分を分離するのは困難なことを見出した。結果として、本発明は、安定した精製抽出物の調製、その後のさらなる加工に好適な、規定の組成のキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を獲得する方法を提供する。
【００１７】
組成の変化は、原料における自然な差異によることがあり、且つ/又は、粗水性抽出物を得るためにサポニンを抽出する際に適用される条件によることがある。
【００１８】
本発明者らは、特に、主要な対象成分の含有量と比較して2018成分含有量の観点から、規定の組成のキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を開発した。前記粗水性抽出物により、有利には、抗原と製剤化され、対象に投与された場合に、効率的免疫応答及び許容できるレベルの反応原性を生じる免疫刺激剤としての使用に特に好適な精製サポニン抽出物を得るための好適な出発材料が得られる。
【００１９】
Quil Aは、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナから単離されるサポニン調製物であり、1974年にDalsgaardらによりアジュバント活性を有すると最初に記載された(「Saponin adjuvants」、Archiv.  fur die gesamte Virusforschung、第44巻、Springer Verlag、Berlin、243〜254頁)。Quil Aの精製画分は、HPLCにより単離されており、これは、Quil Aに関連する毒性を有さずにアジュバント活性を保つ(例えば、EP0362279を参照されたい)。様々な画分、例えばQS-7、QS-17、QS-18及びQS-21が、アジュバント活性を有することが見出されているが、それらの毒性は大幅に異なっている。
【００２０】
本明細書で使用されている「サポニン抽出物」という用語は、キラヤ・サポナリア・モリナの抽出物を意味する。
【００２１】
本明細書で使用されている「トリテルペノイドグリコシド」という用語は、グリコシド結合を介して結合している、糖により誘導体化されたトリテルペノイドコアを有する物質(複数可)を意味する。
【００２２】
「2018成分」という用語は、図3で「2018」と同定されているトリテルペノイドグリコシドを意味する。好適には、本明細書で記載されているUPLC-UV法における2018成分は、約5.8分の保持時間で同定され得、ピークの主な成分は、2017.9のモノアイソトピック分子量を有する。主な2018成分は、MS/MSにより、推定構造
【００２３】
【化６】
2021504429.tif 000007
を有すると同定されている。
【００２４】
「1988成分」という用語は、図3におけるQS-21主ピークの一部と同定されており、1987.9のモノアイソトピック分子量を有するトリテルペノイドグリコシドを意味する。1988成分は、QS-21A V1
【００２５】
【化７】
2021504429.tif 000008
及びQS-21A V2
【００２６】
【化８】
2021504429.tif 000009
からなり得る。
【００２７】
「1856成分」という用語は、図3におけるQS-21主ピークの一部と同定されており、1855.9のモノアイソトピック分子量を有するトリテルペノイドグリコシドを意味する。1856成分は、
【００２８】
【化９】
2021504429.tif 000010
からなり得る。
【００２９】
「2002成分」という用語は、図3におけるQS-21主ピークの一部と同定されており、2001.9のモノアイソトピック分子量を有するトリテルペノイドグリコシドを意味する。2002成分は、MS/MSにより、推定構造
【００３０】
【化１０】
2021504429.tif 000011
を有すると同定されている。
【００３１】
ある分岐、立体化学及び異性体の糖種(例えばアピオース及びキシロース)を区別する際にMS/MS技術が制限されることは、一部の構造が推定であり、仮定の保存コアに基づくことを意味する。したがって、推定構造は、推定構造が不正確な場合は、別の方法で同定されている物質の実際の構造を意味すると解釈されるべきである。
【００３２】
モノアイソトピック分子量は、陰イオンエレクトロスプレー質量分析により決定される。
【００３３】
「QS-21主ピーク」という用語は、図2又は図3で「QS-21」及び「QS-21主」とそれぞれ同定されているトリテルペノイドグリコシドを意味する。好適には、QS-21は、1855.9、1987.9及び2001.9m/zの主要な分子量成分を有する。QS-21主ピークは、主にQS-21A V1
【００３４】
【化１１】
2021504429.tif 000012
QS-21A V2
【００３５】
【化１２】
2021504429.tif 000013
1856成分
【００３６】
【化１３】
2021504429.tif 000014
及び
2002成分
【００３７】
【化１４】
2021504429.tif 000015
からなり得る。
【００３８】
「先行するピーク」という用語は、本明細書で記載されているHPLC-UV法におけるQS-21主ピークの直前のピークを意味する(図2を参照されたい)。
【００３９】
「乾燥した」という用語は、実質的にすべての溶媒が除去されていることを意味する。乾燥抽出物は、典型的には、溶媒を5w/w%未満(例えば水を5w/w%未満)含有する。好適には、乾燥抽出物は、100ppm(w/w)以下のアセトニトリルを含有する。
【００４０】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物は、水性抽出により得られる(しかし、水性形態である必要はなく、例えば、これは、続いて乾燥させ、溶媒交換を施しても、又は異なる溶媒へと再構成してもよい)。
【００４１】
第1の態様では、本発明は、少なくともQS-21主ピーク及び2018成分を含有し、2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を提供する。好適には、2018成分/QS-21主ピークの比は、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.064である。望ましくは、2018成分/QS-21主ピークの比は、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.005、例えば少なくとも0.01である。
【００４２】
好適には、先行するピークとQS-21主ピークの比は、0.45以下、特に0.4以下(214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合)である。先行するピークとQS-21主ピークの比は、0.05以上、特に0.1以上(214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合)であり得る。
【００４３】
典型的には、粗抽出物は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮抽出物である。したがって、好適には、粗抽出物は、キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮から得られる。
【００４４】
好適には、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量は、少なくとも1g/L、例えば少なくとも2g/L、とりわけ少なくとも2.5g/L、特に少なくとも2.8g/L(例えば既知の濃度の対照試料に対するUV吸光度により決定される場合)である。
【００４５】
第2の態様では、本発明は、
QS-21AV1
【００４６】
【化１５】
2021504429.tif 000016
QS-21AV2
【００４７】
【化１６】
2021504429.tif 000017
1856成分
【００４８】
【化１７】
2021504429.tif 000018
及び
2002成分
【００４９】
【化１８】
2021504429.tif 000019
(QS-21主ピーク成分と総称される)、
並びに2018成分
【００５０】
【化１９】
2021504429.tif 000020
を含有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物を提供する。
【００５１】
好適には、2018成分/QS-21主ピーク成分の比は、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.064である。望ましくは、2018成分/QS-21主ピーク成分の比は、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.005、例えば少なくとも0.01である。
【００５２】
好適には、先行するピークとQS-21主ピークの比は、0.45以下、特に0.4以下(214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合)である。先行するピークとQS-21主ピークの比は、0.05以上、特に0.1以上(214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合)であり得る。
【００５３】
典型的には、粗抽出物は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮抽出物である。したがって、好適には、本発明の粗水性抽出物は、キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮から得られる。
【００５４】
好適には、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量は、少なくとも1g/L、例えば少なくとも2g/L、とりわけ少なくとも2.5g/L、特に少なくとも2.8g/L(例えば既知の濃度の対照試料に対するUV吸光度により決定される場合)である。
【００５５】
サポニン抽出
第3の態様では、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を調製するための方法であって、以下のステップ
a)適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップ、
b)2018成分の生成が制御される条件下で、該材料から水性抽出物を調製するステップ
を含む、方法が提供される。
【００５６】
好適には、キラヤ・サポナリア・モリナ材料は、キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮である。
【００５７】
典型的には、抽出前に、キラヤ・サポナリア・モリナ植物材料は、乾燥させ、粉砕する。採取した植物材料は、放置して自然乾燥させ、且つ/又は、加熱を施すことにより部分的に、若しくは完全に乾燥させてよい。好適には、加熱を施す場合、乾燥温度は、30〜100℃の範囲、例えば約80℃であり、数時間から8時間持続させてよい。乾燥させたら、前記植物材料を粉砕する。
【００５８】
任意の水性抽出プロセスを適用して、本発明によるキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性サポニン抽出物を得ることができる。抽出に使用される溶媒は、実質的に水であるが、少量の他の材料を含んでよい。溶媒は、典型的には、本質的に水からなり、望ましくは、溶媒は水である。抽出は、連続するステップで遂行してよく、50℃〜80℃の範囲の温度で行ってよく、数時間から20時間、例えば2から20時間持続させてよい。サポニン粗抽出物は、典型的には、サポニン種及び非サポニン化合物、例えば糖、塩、ポリフェノール(タンニン)、懸濁状態の固体及び他の低分子量化合物の混合物を含む。異なる成分を分離する前に、望ましいサポニンプロファイルを有する精製サポニン抽出物を得るために、典型的には、一連の異なるクロマトグラフィー精製ステップにより、サポニン粗抽出物は、非サポニン化合物でできている不純物を除去するために清澄化を施され得る。好適には、ポリマー吸着剤、例えば、ポリフェノールと複合体化することが公知のポリビニルポリピロリドン(PVPP)、及び/又はクレイから生じた材料、例えばベントナイトを、サポニン粗抽出物に添加することができる。サポニン粗抽出物は、例えばナノ濾過又は限外濾過により、さらに濃縮することができる。保存可能期間がより長いサポニン粗抽出物を得るために、前記抽出物は、例えば40℃から95℃、好適には60から90℃の範囲、とりわけ約86℃の高温を使用して殺菌することもできる。好適には、殺菌は、10分から1時間、より好適には40から50分行われる。抗微生物剤を使用してもよい。抗微生物剤の例は、抗菌剤、例えば安息香酸ナトリウムである。防腐剤もまた使用してもよい。好適には、粗水性抽出物は、実質的に無菌であり、より好適には無菌である。
【００５９】
好適には、ステップa)の、適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップは、キラヤ・サポナリア・モリナ材料の2018成分含有量を分析するステップ、及び/又は、キラヤ・サポナリア・モリナからの水性抽出中に得られる2018成分含有量を決定するステップを含む。典型的には、キラヤ・サポナリア・モリナからの水性抽出中に得られる2018成分含有量を決定するステップは、小規模な抽出を行うステップ、及び生じた抽出物における2018成分含有量を決定するステップを含む。好適には、小規模な抽出は、500g未満、例えば50g未満のキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる。
【００６０】
好適には、ステップb)は、少なくとも25kg、例えば50から500kg、例えば100から400kg、特に200から300kgのキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる。
【００６１】
本発明によるキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の調製に好適なプロセスを開発する一方、本発明者らは、高温、例えば殺菌する際の高温と組み合わせた、プロセスに沿ったpHは、綿密にモニターし、制御すべきであることを観察した。特に、本発明者らは、低pHと高温の組合せは、サポニンの安定性に影響を及ぼし、ひいては、処理される抽出物のサポニンプロファイルに影響を及ぼすおそれがあるが、高温自体は、限定的な影響を誘発させるのみであることを観察した。したがって、pHと温度との間のバランスは、望ましいサポニンプロファイルに応じて、サポニン粗抽出物を調製する場合に、実現する必要がある。特に、本発明者らは、2018成分/QS-21主ピークの比は、高温を低pHと組み合わせた場合に上昇することを観察した。したがって、例えば殺菌中に、低pHと組み合わせて高温を使用する場合、例として安息香酸ナトリウムのような防腐剤を使用する場合、高温での経過時間は、可能な最大限までに限定すべきである。例えば、殺菌温度に迅速に到達するために、熱交換器を使用してよく、且つ/又は、キラヤ・サポナリア・モリナの殺菌した粗水性抽出物を例えば冷水に浸漬させて急速に冷却してもよい。好適には、粗水性抽出物は、3から4.5、より好適には3.6から4.0のpHを有する。
【００６２】
粗水性抽出物の分析
本発明の第4の態様では、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物における2018成分/QS-21主ピークの比を決定するための方法が提供され、前記方法は、
(i)キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物における2018成分含有量を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ
(ii)キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物におけるQS-21主ピーク含有量を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ、及び
(iii)2018成分含有量をQS-21主ピーク含有量と比較して、2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ
を含む。
【００６３】
本発明の第5の態様では、精製サポニン抽出物の製造に使用するためのキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を同定するための方法が提供され、前記方法は、
(i)2018/QS-21主ピークの比を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ、及び
(ii)≦0.075の2018成分/QS-21主ピークの比を有する粗水性抽出物を選択するステップ
を含む。
【００６４】
一実施形態では、ステップ(ii)で選択される粗水性抽出物は、≦0.064の2018成分/QS-21主ピークの比を有する。
【００６５】
以下の非限定的な例への言及により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００６６】
実施例1:分析法
HPLC-UV
設備
Waters Alliance 2690/2695  分離モジュール
Waters 2487 UV検出器又は2996 PDA検出器
Vydac Protein C4 4.6×250mm 5umカラム
移動相A(MPA) -  水/アセトニトリル(70:30 v/v)中0.15%トリフルオロ酢酸
移動相B(MPB) -  アセトニトリル中0.15%トリフルオロ酢酸
直線グラジエント条件
【００６７】
【表１】
2021504429.tif 000021
【００６８】
10ulの試料を注入する。UV検出は214nMに設定する。
【００６９】
参照用としてブランク注入を使用し、クロマトグラムにおけるピークの積分値から、全体の吸光度が示される。対象のピーク(例えばQS-21主ピーク)は、全体の吸光度と比較して、ピーク含有量を百分率として決定する。
UPLC-UV
設備
Waters Acquity UPLC
Waters Acquity可変UV検出器
Waters Acquity BEH C18 2.1×100mm 1.7umカラム
移動相A(MPA) -  水/アセトニトリル(70:30 v/v)中0.025%酢酸
移動相B(MPB) -  水/アセトニトリル(30:70 v/v)中0.025%トリフルオロ酢酸
直線グラジエント条件
【００７０】
【表２】
2021504429.tif 000022
【００７１】
カラム温度28℃。10ulの試料を注入する。UV検出は214nMに設定する。
【００７２】
参照用としてブランク注入を使用し、クロマトグラムにおけるピークの積分値から、全体の吸光度が示される。対象のピーク(例えばQS-21主ピーク)は、全体の吸光度と比較して、ピーク含有量を百分率として決定する。
【００７３】
実施例2:キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物
粗水性樹皮抽出物を、C4カラム及びグラジエント溶出:移動相A-0.15%トリフルオロ酢酸を有する水/アセトニトリル、7/3 v/vと、移動相B-0.15%トリフルオロ酢酸を有するアセトニトリルとを使用した逆相HPLCにより分離した。UV検出は214nMに設定した。
【００７４】
粗水性樹皮抽出物試料は、必要に応じて精製水で希釈する。PVPP(60mg/mL)を添加し、混合物を約30分撹拌し、次いで遠心分離して、上澄みからPVPP樹脂を分離した。
【００７５】
上澄みを次いで分析して、HPLC-UVクロマトグラムを得る。
【００７６】
図1は、HPLC-UVクロマトグラムの代表的な例を示す。QS-21画分に対応するピークが指し示されている。
【００７７】
実施例3:キラヤ・サポナリア・モリナ樹木の粗水性サポニン樹皮抽出物のUPLC-UV
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性樹皮抽出物の試料は、実施例1に記載されているHPLC-UV及びUPLC-UV法により分析した。
【００７８】
図2は、HPLC-UVの結果を示し、図3は、UPLC-UVの結果を示す。
【００７９】
特定の成分(QS-21主ピーク、2018成分又は先行するピーク)に対するピーク面積を決定することにより、粗抽出物における成分の比を計算することが可能である。
【００８０】
実施例4:2018成分/QS-21比に対するpH及び温度の影響
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の複数の試料を、本明細書に記載されている方法に従って調製した。それぞれの状況に応じて、温度、pH又は安息香酸ナトリウムの量を殺菌フェーズ中に変更し、3時間後に2018成分/QS-21主ピーク比の変化を測定した。結果は、図4で示されている。pH及び温度変化の影響は、図5においてグラフで表されている。一定のpH3.8での経時的な異なる温度の影響は、図6で示されている。
【００８１】
温度は、試験されたこの3時間の範囲中における40℃以下を除いて、2018成分/QS-21主ピーク比に正比例することが見出されたが、この比は、pH又は安息香酸ナトリウム条件にかかわらず、変化しないようであった。pHは、とりわけ低いpHで2018成分/QS-21主ピーク比に反比例することが見出された。
【００８２】
安息香酸ナトリウムは、高温で、2018成分/QS-21主ピーク比に対してわずかな影響しか有していなかった。
【００８３】
要約すれば、pH及び温度の変化は、2018成分/QS-21主ピーク比に対してかなりの影響を有し、高温及び低いpHで比が上昇することが見出された。
【００８４】
結果として、適切なレベルの2018成分を有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を得るために、キラヤ・サポナリア・モリナ原料の慎重な選択、及び過剰な2018成分の生成を限定する手段での処理が必須である。
【００８５】
実施例5:規定の2018成分の組成を有する、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の大規模生成
樹皮の選択
約37gの試料ロットを、様々なキラヤ・サポナリア・モリナ樹皮材料のバッチから取った。試料に、水性抽出を約65℃で約5時間別々に施した。抽出物をPVPPで処理し、濾過し、濃縮した。pHを、3.9に調整してから、安息香酸ナトリウム(0.1%)を添加し、殺菌を86℃で45分行った。
【００８６】
2018成分(UPLC-UVを使用)及び先行ピーク(HPLC-UVを使用)の含有量を、次いで決定した。結果に基づき、フルスケール抽出に使用するためのキラヤ・サポナリア・モリナ樹皮材料のバッチを選択した。
【００８７】
個々のバッチは、目標仕様を満たしていなくてよいが、収率を最大限にするために、目標仕様外の個々のバッチと、他のバッチを組み合わせて(例えば高い含有量と低い含有量)、目標仕様内の総合平均を達成することが可能である。
【００８８】
主な抽出
2018成分含有量のために選択された約280kgのキラヤ・サポナリア・モリナ樹皮材料に、約70℃で少なくとも2時間水性抽出を施した。抽出に続いて、pHを3.8に調整した。抽出物を、PVPPで処理し、濾過し、濃縮した。pHを確かめ、必要な場合は再度調整してから、安息香酸ナトリウム(0.1%)を添加し、殺菌を86℃で45分行った。殺菌した材料を迅速に冷却して、高温での時間を最小限にし、それによりキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の溶液を得た。
【００８９】
粗水性抽出物を、HPLC-UV(先行するピーク/QS21主ピーク比)及びUPLC-UV(2018成分/QS21主ピーク比)により分析した。
【００９０】
樹皮の選択、並びにpH及び温度曝露の制御により、粗樹皮抽出物は、望ましい仕様を一貫して満たすことが確実になった。樹皮の選択、並びにpH及び温度曝露の制御がないと、粗水性抽出物は、仕様を満たさないことが多かった。
【００９１】
実施例5に記載されているプロセスの使用により、2018成分/QS-21主ピークの規定の比、例えば一貫して≦0.075を有し、図3で示されているクロマトグラムと同等のクロマトグラフィーのプロファイルを提示する、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性樹皮抽出物が一貫して得られる。
【００９２】
参考文献
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【図１】
2021504429.tif 000028
【図２】
2021504429.tif 000029
【図３】
2021504429.tif 000030
【図４】
2021504429.tif 000031
【図５】
2021504429.tif 000032
【図６】
2021504429.tif 000033
2021504429.tif 000034
2021504429.tif 000035
2021504429.tif 000036
2021504429.tif 000037
2021504429.tif 000038
2021504429.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月30日(2020.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともQS-21主ピーク及び2018成分を含有するキラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)の粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物。
【請求項２】
2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.005である、請求項1に記載の粗水性抽出物。
【請求項３】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも1g/Lである、請求項1又は2に記載の粗水性抽出物。
【請求項４】
QS-21AV1
【化１】
2021504429.tif 000040
QS-21AV2
【化２】
2021504429.tif 000041
1856成分
【化３】
2021504429.tif 000042
及び
2002成分
【化４】
2021504429.tif 000043
(QS-21主ピーク成分と総称される)、
並びに2018成分
【化５】
2021504429.tif 000044
を含有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物。
【請求項５】
2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.005である、請求項4に記載の粗水性抽出物。
【請求項６】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも1g/Lである、請求項4又は5に記載の粗水性抽出物。
【請求項７】
キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮から得られる、請求項1から6のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項８】
殺菌されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項９】
抗微生物剤、例えば抗菌剤を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項１０】
3.0から4.5のpHを有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の粗水性抽出物。
【請求項１１】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を調製するための方法であって、
a)適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップ、
b)2018成分の生成が制御される条件下で、該材料から水性抽出物を調製するステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
ステップa)の、適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップが、キラヤ・サポナリア・モリナからの水性抽出中に得られる2018成分含有量を決定するステップを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
ステップa)の、キラヤ・サポナリア・モリナからの水性抽出中に得られる2018成分含有量を決定するステップが、小規模な抽出を行うステップ、及び生じた抽出物における2018成分含有量を決定するステップを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
小規模な抽出が、500g未満、例えば50g未満のキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ステップb)が、少なくとも25kg、例えば50から500kgのキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、請求項11から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が、ポリビニルポリピロリドン(PVPP)で処理される、請求項11から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、PVPP処理中のpH範囲内で維持される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を殺菌する、さらなるステップc)を含む、請求項11から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
殺菌が、40から95℃で行われる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、殺菌中のpH範囲内で維持される、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
抗微生物剤、例えば抗菌剤が、殺菌前にキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物に添加される、請求項18から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
殺菌が、10分から1時間行われる、請求項18から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
殺菌後、粗抽出物が能動的に冷却される、請求項18から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
殺菌後、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が濾過される、請求項18から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、濾過中のpH範囲内で維持される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
殺菌後、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が濃縮される、請求項18から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、濃縮中のpH範囲内で維持される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
pH範囲が、3.0から4.5である、請求項17から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
キラヤ・サポナリア・モリナ材料が、キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮である、請求項11から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項1から10のいずれか一項に記載の粗水性抽出物を調製するための、請求項11から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物における、2018成分/QS-21主ピークの比を決定するための方法であって、
(i)キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物における2018成分含有量を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ
(ii)キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物におけるQS-21主ピーク含有量を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ、及び
(iii)2018成分含有量をQS-21主ピーク含有量と比較して、2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項３２】
精製サポニン抽出物の製造に使用するためのキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を同定するための方法であって、
(i)2018成分/QS-21主ピークの比を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ、及び
(ii)≦0.075の2018成分/QS-21主ピークの比を有する粗水性抽出物を選択するステップ
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
参考文献
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以下は、本発明の実施形態の一つである。
（１）少なくともQS-21主ピーク及び2018成分を含有するキラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)の粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物。
（２）2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.064である、（1）に記載の粗水性抽出物。
（３）2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.005である、（1）又は（2）に記載の粗水性抽出物。
（４）2018成分/QS-21主ピークの比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.01である、（3）に記載の粗水性抽出物。
（５）先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.45以下である、（1）から（4）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（６）先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.4以下である、（5）に記載の粗水性抽出物。
（７）先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.05以上である、（1）から（6）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（８）先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.1以上である、（7）に記載の粗水性抽出物。
（９）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも1g/Lである、（1）から（8）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（１０）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2g/Lである、（9）に記載の粗水性抽出物。
（１１）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2.5g/Lである、（10）に記載の粗水性抽出物。
（１２）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2.8g/Lである、（11）に記載の粗水性抽出物。
（１３）QS-21AV1
【化２０】
2021504429.tif 000045
QS-21AV2
【化２１】
2021504429.tif 000046
1856成分
【化２２】
2021504429.tif 000047
及び
2002成分
【化２３】
2021504429.tif 000048
(QS-21主ピーク成分と総称される)、
並びに2018成分
【化２４】
2021504429.tif 000049
を含有するキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物であって、2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.075である、粗水性抽出物。
（１４）2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、≦0.064である、（13）に記載の粗水性抽出物。
（１５）2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.005である、（13）又は（14）に記載の粗水性抽出物。
（１６）2018成分/QS-21主ピーク成分の比が、214nmのUV吸光度により測定される場合、少なくとも0.01である、（15）に記載の粗水性抽出物。
（１７）先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.45以下である、（13）から（16）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（１８）先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.4以下である、（17）に記載の粗水性抽出物。
（１９）先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.05以上である、（13）から（18）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（２０）先行するピークとQS-21主ピークの比が、214nmの吸光度のHPLC-UVにより決定される場合、0.1以上である、（19）に記載の粗水性抽出物。
（２１）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも1g/Lである、（13）から（20）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（２２）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2g/Lである、（21）に記載の粗水性抽出物。
（２３）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2.5g/Lである、（22）に記載の粗水性抽出物。
（２４）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物の水溶液におけるQS-21主ピーク含有量が、少なくとも2.8g/Lである、（23）に記載の粗水性抽出物。
（２５）キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮から得られる、（1）から（24）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（２６）殺菌されている、（1）から（25）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（２７）実質的に無菌であり、特に無菌である、（1）から（26）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（２８）抗微生物剤、例えば抗菌剤を含む、（1）から（27）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（２９）抗微生物剤が、安息香酸ナトリウムである、（28）に記載の粗水性抽出物。
（３０）3.0から4.5のpHを有する、（1）から（29）のいずれかに記載の粗水性抽出物。
（３１）3.6から4.0のpHを有する、（30）に記載の粗水性抽出物。
（３２）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を調製するための方法であって、
a)適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップ、
b)2018成分の生成が制御される条件下で、該材料から水性抽出物を調製するステップ
を含む、方法。
（３３）ステップa)の、適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップが、キラヤ・サポナリア・モリナ材料の2018成分含有量を分析するステップを含む、（32）に記載の方法。
（３４）ステップa)の、適切な2018成分含有量を有するキラヤ・サポナリア・モリナ材料を選択するステップが、キラヤ・サポナリア・モリナからの水性抽出中に得られる2018成分含有量を決定するステップを含む、（32）に記載の方法。
（３５）ステップa)の、キラヤ・サポナリア・モリナからの水性抽出中に得られる2018成分含有量を決定するステップが、小規模な抽出を行うステップ、及び生じた抽出物における2018成分含有量を決定するステップを含む、（34）に記載の方法。
（３６）小規模な抽出が、500g未満、例えば50g未満のキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、（35）に記載の方法。
（３７）ステップb)が、少なくとも25kg、例えば50から500kgのキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、（32）から（36）のいずれかに記載の方法。
（３８）ステップb)が、100から400kgのキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、（37）に記載の方法。
（３９）ステップb)が、200から300kgのキラヤ・サポナリア・モリナ材料で行われる、（38）に記載の方法。
（４０）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が、ポリビニルポリピロリドン(PVPP)で処理される、（32）から（39）のいずれかに記載の方法。
（４１）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、PVPP処理中のpH範囲内で維持される、（40）に記載の方法。
（４２）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を殺菌する、さらなるステップc)を含む、（32）から（41）のいずれかに記載の方法。
（４３）殺菌が、40から95℃で行われる、（42）に記載の方法。
（４４）殺菌が、60から90℃で行われる、（43）に記載の方法。
（４５）殺菌が、約86℃で行われる、（44）に記載の方法。
（４６）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、殺菌中のpH範囲内で維持される、（42）から（45）のいずれかに記載の方法。
（４７）抗微生物剤、例えば抗菌剤が、殺菌前にキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物に添加される、（42）から（46）のいずれかに記載の方法。
（４８）殺菌が、10分から1時間行われる、（42）から（47）のいずれかに記載の方法。
（４９）殺菌が、40から50分行われる、（48）に記載の方法。
（５０）殺菌後、粗抽出物が能動的に冷却される、（42）から（49）のいずれかに記載の方法。
（５１）殺菌後、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が濾過される、（42）から（50）のいずれかに記載の方法。
（５２）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、濾過中のpH範囲内で維持される、（51）に記載の方法。
（５３）殺菌後、キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物が濃縮される、（42）から（52）のいずれかに記載の方法。
（５４）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物のpHが、濃縮中のpH範囲内で維持される、（53）に記載の方法。
（５５）pH範囲が、3.0から4.5である、（41）から（54）のいずれかに記載の方法。
（５６）pH範囲が、3.6から4.0である、（55）に記載の方法。
（５７）キラヤ・サポナリア・モリナ材料が、キラヤ・サポナリア・モリナ樹皮である、（32）から（56）のいずれかに記載の方法。
（５８）（1）から（31）のいずれかに記載の粗水性抽出物を調製するための、（32）から（57）のいずれかに記載の方法。
（５９）キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物における、2018成分/QS-21主ピークの比を決定するための方法であって、
(i)キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物における2018成分含有量を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ
(ii)キラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物におけるQS-21主ピーク含有量を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ、及び
(iii)2018成分含有量をQS-21主ピーク含有量と比較して、2018成分/QS-21主ピークの比を決定するステップ
を含む、方法。
（６０）精製サポニン抽出物の製造に使用するためのキラヤ・サポナリア・モリナの粗水性抽出物を同定するための方法であって、
(i)2018成分/QS-21主ピークの比を、214nmの吸光度のUPLC-UVにより決定するステップ、及び
(ii)≦0.075の2018成分/QS-21主ピークの比を有する粗水性抽出物を選択するステップ
を含む、方法。
（６１）ステップ(ii)で選択される粗水性抽出物が、≦0.064の2018成分/QS-21主ピークの比を有する、（60）に記載の方法。
【国際調査報告】
2021504429.tif 000050
2021504429.tif 000051
2021504429.tif 000052