(57)【要約】  本明細書に記載されるのは、生体試料からの総ＬＩＦの定量化に有用なアッセイである。
2021528411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）複合体であって、ＬＩＦ、ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ捕捉抗体、ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ検出抗体、及び任意に、ＬＩＦと特異的に結合するＬＩＦ治療用抗体を含み、ここで前記ＬＩＦ検出又はＬＩＦ捕捉抗体は、Ａ４又はそのＬＩＦ結合断片を含む、複合体。
【請求項２】
前記ＬＩＦ捕捉抗体又は前記ＬＩＦ検出抗体が、結合についてＬＩＦ治療用抗体と競合しない、請求項１に記載のＬＩＦ複合体の使用。
【請求項３】
前記ＬＩＦ治療用抗体が、
ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；
ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；
ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
ｆ）配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）
を含む、請求項１又は２に記載のＬＩＦ複合体。
【請求項４】
前記ＬＩＦ治療用抗体が、
ａ）配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び
ｂ）配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列
を含む、請求項１又は２に記載のＬＩＦ複合体。
【請求項５】
前記ＬＩＦ治療用抗体が、
ａ）配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び
ｂ）配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列
を含む、請求項１又は２に記載のＬＩＦ複合体。
【請求項６】
前記ＬＩＦ捕捉抗体が、ある表面に結合され、前記表面が導電性物質を含むか、又は前記導電性物質が電極である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＬＩＦ複合体。
【請求項７】
前記ＬＩＦ検出抗体が、検出可能な部分に結合され、前記検出可能な部分が、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、若しくは蛍光シグナルを生じるか、又は前記検出可能な部分が電気化学シグナルを生じる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＬＩＦ複合体。
【請求項８】
前記ＬＩＦ検出抗体及びＬＩＦ捕捉抗体が、ｇｐ１３０と物理的に相互作用するＬＩＦの領域に結合しない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＬＩＦ複合体。
【請求項９】
前記ＬＩＦ捕捉抗体又はＬＩＦ検出抗体が、
ａ）配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び
ｂ）配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＬＩＦ複合体。
【請求項１０】
前記複合体が、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有され、前記複合体が、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１５３６ウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有されるか、又は前記複合体が、１ミリリットルあたり１ナノグラムのレベルで検出可能である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＬＩＦ複合体。
【請求項１１】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む個人からの試料中のＬＩＦを定量化する方法であって、
ａ）前記ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦに特異的に結合する捕捉抗体と接触させることと；
ｂ）前記ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦと特異的に結合する検出抗体と接触させることと；
ｃ）前記捕捉抗体及び前記検出抗体に結合されている前記試料中のＬＩＦを検出することと、
を含み、ここで前記ＬＩＦ検出又は前記ＬＩＦ捕捉抗体は、Ａ４又はそのＬＩＦ結合断片を含む、
方法。
【請求項１２】
前記個人が、ＬＩＦ治療用抗体で治療されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＬＩＦ治療用抗体が、
ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；
ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；
ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
ｆ）配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）
を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＩＦ治療用抗体が、
ａ）配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び
ｂ）配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列
を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＩＦ治療用抗体が、
ａ）配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び
ｂ）配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列
を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＬＩＦ捕捉抗体が、ある表面に結合され、前記表面が導電性物質を含むか、又は前記導電性物質が電極である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＬＩＦ検出抗体が、検出可能な部分に結合され、前記検出可能な部分が、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、若しくは蛍光シグナルを生じるか、又は前記検出可能な部分が電気化学シグナルを生じる、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＬＩＦ捕捉抗体及び前記ＬＩＦ検出抗体が、ｇｐ１３０と物理的に相互作用するＬＩＦの領域に結合しない、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＬＩＦ捕捉抗体又は前記ＬＩＦ検出抗体が、
ａ）配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び
ｂ）配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列
を含む、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＬＩＦを含む試料が、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有されるか、又は前記ＬＩＦを含む試料が、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１５３６ウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有される、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）結合抗体又はその断片であって、
ａ）配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域；及び
ｂ）配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、ＬＩＦ結合抗体又はその断片。
【請求項２２】
免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含み；
ａ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む、
請求項２１に記載のＬＩＦ結合抗体又はその断片。
【請求項２３】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号４１に示したアミノ酸配列を含み；
ａ）前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４２に示したアミノ酸配列を含む、
請求項２１又は２２に記載のＬＩＦ結合抗体又はその断片。
【請求項２４】
前記ＬＩＦ結合抗体が、検出可能な部分に結合され、前記検出可能な部分が、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、若しくは蛍光シグナルを生じるか、又は前記検出可能な部分が電気化学シグナルを生じる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のＬＩＦ結合抗体又はその断片。
【請求項２５】
前記ＬＩＦ結合抗体が、ＬＩＦに特異的に結合する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のＬＩＦ結合抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１８年６月１８日に出願された欧州特許出願第１８３８２４３３．３号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、サイトカインのインターロイキン６（ＩＬ−６）ファミリーのメンバーである。ＬＩＦの公知の生理活性、ＬＩＦ欠乏の臨床的特徴、及び健康な組織及び腫瘍におけるＬＩＦ発現の非臨床研究に基づいて、ＬＩＦの阻害が、良好な耐容性を示すこと、また、限定はされないが非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、卵巣癌、及び多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）を含めた様々な固形腫瘍における抗腫瘍有効性をもたらすことが期待されている。
【０００３】
ＬＩＦは、ＬＩＦＲに結合することによってシグナルを送り、次いでｇｐ１３０を動員して、細胞内ＪＡＫ−ＳＴＡＴ活性化を開始することが可能な三元複合体を形成する。したがって、ＬＩＦは、ＬＩＦＲとｇｐ１３０の両方のための結合部位を有し、ＬＩＦシグナル伝達を阻害するための複数の選択肢を提供する。１つの戦略は、ＬＩＦＲへのＬＩＦサイトカイン結合を直接的に阻止することであろう。或いは、ＬＩＦシグナル伝達を阻害するためのさらなる戦略は、ｇｐ１３０へのＬＩＦ結合を阻止することである。このシナリオでは、ＬＩＦのｇｐ１３０結合部位と重複するエピトープと結合するｍＡｂが、ＬＩＦ／ＬＩＦＲ複合体へのｇｐ１３０の動員を阻害することによって、シグナル変換に必要である下流シグナル伝達を妨げる。
【０００４】
通常の健康な個人におけるＬＩＦの典型的な血漿又は血清中濃度は、０〜１０ｐｇ／ｍである。しかし、抗体／リガンド複合体のクリアランスは、遊離のリガンドのクリアランスよりも遅いので、いったんサイトカインが抗体に結合すると、血漿中の総ＬＩＦのレベルは増大する可能性がある。例えば、Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  Ａ，Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ  Ｓ，Ｒｏｒｄｏｒｆ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ，ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．５１：ｅ１−ｅ１８；Ｄｕｄａｉ  Ｓ，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｋ，Ｆｌａｎｄｒｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ，ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＣＬ２１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ”ｍＡｂｓ．７：８２９−８３７を参照されたい。したがって、薬物−リガンド複合体又は総リガンドの蓄積、及び飽和の期間を、標的結合及び末梢における有効性の予測のためのＰＫ−ＰＤモデルに組み込むことができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、抗白血病抑制因子のｇｐ１３０結合部位に又は近くに結合する治療用抗体の投与後の、血液、血漿、又は血清などの患者試料における総ＬＩＦレベルの検出のための、ＬＩＦ抗体の使用に関する。本明細書に記載されるサンドイッチ方法を使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）では、ＬＩＦは、固定された捕捉抗体と、検出可能な標識物質（検出抗体）に結合させた別の抗体との間に挟むことによって定量的に検出することができ、ここでこれらの抗体は、ＬＩＦの非重複エピトープに結合する。本開示では、ＬＩＦの捕捉抗体エピトープと検出抗体エピトープは、さらに、どちらも治療用ｍＡｂ  ｈ５Ｄ８の結合部位と非重複である。したがって、３つの抗体（捕捉、検出、及び治療用）がＬＩＦと同時に結合できるように、ＬＩＦの３つの別の非重複エピトープが特定されている。この方式の利点は、治療用抗体に結合されているかどうかに関わりなくＬＩＦを検出できる、したがって、試料中に存在する「総ＬＩＦ」（結合しているものとしていないものの両方）を定量化することである。このアッセイは、限定はされないが２０ｐｇ／ｍｌ（１ｐＭ）と２ｎｇ／ｍｌ（１００ｐＭ）の間の総ＬＩＦレベルを正確に測定することが可能である。総ＬＩＦレベルは、重要な治療指標としての役割を果たすことができ、臨床医が個人におけるＬＩＦ治療用抗体のＰＫ／ＰＤ動態を綿密に観察することを可能にする。
【０００６】
ある種の態様では、本明細書に記載されるのは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）複合体であって、ＬＩＦ、ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ捕捉抗体、ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ検出抗体、及び任意に、ＬＩＦと特異的に結合するＬＩＦ治療用抗体を含む複合体を含み、ここでＬＩＦ検出又はＬＩＦ捕捉抗体は、Ａ４又はそのＬＩＦ結合断片を含む、複合体である。ある種の実施形態では、ＬＩＦ複合体の用途は、ＬＩＦを定量化するためのインビトロアッセイである。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体又はＬＩＦ検出抗体は、結合についてＬＩＦ治療用抗体と競合しない。ある種の実施形態では、ＬＩＦは、ヒトＬＩＦである。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；（ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；（ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；（ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；（ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び（ｆ）配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び（ｂ）配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び（ｂ）配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体は、ある表面に結合される。ある種の実施形態では、その表面は導電性物質を含む。ある種の実施形態では、導電性物質は電極である。ある種の実施形態では、ＬＩＦ検出抗体は、検出可能な部分に結合される。ある種の実施形態では、検出可能な部分は、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、若しくは蛍光シグナルを生じる。ある種の実施形態では、検出可能な部分は、電気化学シグナルを生じる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ検出抗体及びＬＩＦ捕捉抗体は、ｇｐ１３０と物理的に相互作用するＬＩＦの領域に結合しない。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体又はＬＩＦ検出抗体は、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。ある種の実施形態では、複合体は、流体中にある。ある種の実施形態では、複合体は、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有される。ある種の実施形態では、複合体は、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１５３６ウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有される。ある種の実施形態では、複合体は、１ミリリットルあたり１ナノグラムのレベルで検出可能である。ある種の実施形態では、アッセイは、２０％又は１０％未満の内的変動（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を有する。
【０００７】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む個人からの試料中の白血病抑制因子を定量化する方法であって、（ａ）ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦに特異的に結合する捕捉抗体と接触させることと；（ｂ）ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦと特異的に結合する検出抗体と接触させることと；（ｃ）捕捉抗体及び検出抗体に結合されている、試料中のＬＩＦを検出することとを含む方法である。ある種の実施形態では、この方法は、インビトロで実施される。ある種の実施形態では、ＬＩＦは、ヒトＬＩＦである。ある種の実施形態では、個人は、ＬＩＦ治療用抗体で治療されている。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；（ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；（ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；（ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；（ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び（ｆ）配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び（ｂ）配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び（ｂ）配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体は、ある表面に結合される。ある種の実施形態では、表面は導電性物質を含む。ある種の実施形態では、導電性物質は電極である。ある種の実施形態では、ＬＩＦ検出抗体は、検出可能な部分に結合される。ある種の実施形態では、検出可能な部分は、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、若しくは蛍光シグナルを生じる。ある種の実施形態では、検出可能な部分は、電気化学シグナルを生じる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体及びＬＩＦ検出抗体は、ｇｐ１３０と物理的に相互作用するＬＩＦの領域に結合しない。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体又はＬＩＦ検出抗体は、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦを含む試料は、流体中にある。ある種の実施形態では、ＬＩＦを含む試料は、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有される。ある種の実施形態では、ＬＩＦを含む試料は、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１５３６ウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有される。ある種の実施形態では、ＬＩＦは、１ミリリットルあたり１ナノグラムのレベルで検出可能である。ある種の実施形態では、アッセイは、２０％未満の内的変動を有する。ある種の実施形態では、個人は、ヒト個人である。ある種の実施形態では、この方法は、試料中のＬＩＦを定量化することをさらに含む。ある種の実施形態では、この方法は、試料中のＬＩＦの量に関する情報を含む報告を伝えることをさらに含む。
【０００８】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、癌を有する個人を治療する方法であって、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の初回投与を個人に施すことと；（ｂ）癌を有する個人からの試料中の白血病抑制因子（ＬＩＦ）の初回投与後レベルを決定することとを含む方法である。ある種の実施形態では、この方法は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する後続用量の抗体を投与することをさらに含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルを決定することは、本開示による方法によって実施される。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；（ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；（ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；（ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；（ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び（ｆ）配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び（ｂ）配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び（ｂ）配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して増大せず、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して増大せず、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される。ある種の実施形態では、初回投与は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の最初の投与である。ある種の実施形態では、初回投与は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の複数の投与におけるいずれかの投与である。
【０００９】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、癌を有する個人を治療する方法であって、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体を含む初回投与を個人に施すことと；（ｂ）癌を有する個人からの試料における白血病抑制因子（ＬＩＦ）の初回投与後レベルを得ることとを含む方法である。ある種の実施形態では、この方法は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する後続用量の抗体を投与することをさらに含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルを決定することは、本開示による方法によって実施される。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；（ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；（ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；（ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；（ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び（ｆ）配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び（ｂ）配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、（ａ）配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び（ｂ）配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して増大せず、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して増大せず、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される。ある種の実施形態では、初回投与は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の最初の投与である。ある種の実施形態では、初回投与は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の複数の投与におけるいずれかの投与である。
【００１０】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）結合抗体又はその断片であって、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含むＬＩＦ結合抗体又はその断片である。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ結合抗体又はその断片は、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ結合抗体又はその断片は、配列番号４１に示したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ結合抗体の用途は、ＬＩＦを定量化するためのインビトロアッセイである。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ結合抗体は、検出可能な部分に結合される。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、若しくは蛍光シグナルを生じる。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、電気化学シグナルを生じる。
【００１１】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるものは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）複合体であって、ＬＩＦ、ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ捕捉抗体、ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ検出抗体、及び任意に、ＬＩＦと特異的に結合するＬＩＦ治療用抗体を含む複合体を含み、ここでＬＩＦ検出又はＬＩＦ捕捉抗体は、Ａ４又はそのＬＩＦ結合断片を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体又はＬＩＦ検出抗体は、結合についてＬＩＦ治療用抗体と競合しない。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列を含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体は、表面に結合され、ここでは、その表面は、導電性物質を含む、又は、導電性物質は、電極である。ある種の実施形態では、ＬＩＦ検出抗体は、検出可能な部分に結合され、ここでは、検出可能な部分は、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、又は蛍光シグナルを生じる、又は、検出可能な部分は、電気化学シグナルを生じる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ検出抗体及びＬＩＦ捕捉抗体は、ｇｐ１３０と物理的に相互作用するＬＩＦの領域に結合しない。ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体又はＬＩＦ検出抗体は、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。ある種の実施形態では、複合体は、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有され、ここでは、複合体は、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１５３６ウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有される、又は、複合体は、１ミリリットルあたり１ナノグラムのレベルで検出可能である。
【００１２】
別の態様では、本明細書に記載されるものは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む個人からの試料中のＬＩＦを定量化する方法であって、ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦに特異的に結合する捕捉抗体と接触させることと；ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦと特異的に結合する検出抗体と接触させることと；捕捉抗体及び検出抗体に結合されている、試料中のＬＩＦを検出することとを含み、ここでＬＩＦ検出又はＬＩＦ捕捉抗体は、Ａ４又はそのＬＩＦ結合断片を含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、個人は、ＬＩＦ治療用抗体で治療されている。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ治療用抗体は、配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体は、表面に結合され、ここでは、その表面は、導電性物質を含む、又は、導電性物質は、電極である。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ検出抗体は、検出可能な部分に結合され、ここでは、検出可能な部分は、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、又は蛍光シグナルを生じる、又は、検出可能な部分は、電気化学シグナルを生じる。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体及びＬＩＦ検出抗体は、ｇｐ１３０と物理的に相互作用するＬＩＦの領域に結合しない。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体又はＬＩＦ検出抗体は、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＦを含む試料は、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有される、又は、ＬＩＦを含む試料は、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１５３６ウェルプレートの少なくとも１つのウェルに含有される。
【００１３】
別の態様では、本明細書に記載されるものは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）結合抗体又はその断片であって、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むＬＩＦ結合抗体又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含み；免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４１に示したアミノ酸配列を含み；免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４２に示したアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ結合抗体は、検出可能な部分に結合され、ここでは、検出可能な部分は、化学シグナル、電気化学シグナル、発光シグナル、又は蛍光シグナルを生じる、又は、検出可能な部分は、電気化学シグナルを生じる。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ結合抗体は、ＬＩＦに特異的に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】異なる抗ＬＩＦヒト化抗体のＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を示すウエスタンブロットを表す。
【図２Ａ】ヒト化された親５Ｄ８抗体のＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を示すウエスタンブロットを表す。
【図２Ｂ】ヒト化された親５Ｄ８抗体のＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を示すウエスタンブロットを表す。
【図３Ａ】ｈ５Ｄ８抗体を使用するＵ−２５１細胞におけるＬＩＦ阻害についてのＩＣ５０を示す。
【図３Ｂ】内在性ＬＩＦ刺激条件下でのｐＳＴＡＴ３のｒ５Ｄ８及びｈ５Ｄ８阻害の代表的なＩＣ５０用量反応曲線を示す。示したのは、代表的な曲線である（ｎ＝１  ｈ５Ｄ８、ｎ＝２  ｒ５Ｄ８）。
【図４】この開示に記載した異なるモノクローナル抗体のＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を示すウエスタンブロットを表す。
【図５】ヒト患者からの多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、卵巣癌、結腸直腸癌腫瘍、及び膵腫瘍における、ＬＩＦ発現の免疫組織化学染色及び定量化を表す。バーは、平均値＋／−ＳＥＭを表す。
【図６】ヒト化５Ｄ８抗体を使用して、非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて行われた実験を示すグラフである。
【図７Ａ】ＧＢＭの同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）マウスモデルにおけるＵ２５１細胞の阻害に対するｒ５Ｄ８の効果を示す。第２６日での定量化が示される。
【図７Ｂ】ルシフェラーゼ発現ヒトＵ２５１  ＧＢＭ細胞を接種し、且つその後１００、２００、又は３００μｇのｈ５Ｄ８又は賦形剤で週２回治療されたマウスからのデータを示す。腫瘍サイズは、第７日に、生物発光（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）によって決定した。このグラフは、平均値±ＳＥＭを示す水平なバーと共に、個々の腫瘍測定値を示す。統計的有意性は、対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を使用して算出した。
【図８Ａ】同系移植（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）マウスモデルにおける卵巣癌細胞の増殖の阻害に対するｒ５Ｄ８の効果を示す。
【図８Ｂ】第２５日での腫瘍の個々の測定値を示す。
【図８Ｃ】ｈ５Ｄ８が、週２回２００μｇ／マウスで投与された場合に腫瘍増殖の有意な低下を示す（ｐ＜０．０５）ことを図示する。記号は、平均値±ＳＥＭであり、統計的有意性は、（対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を用いて）賦形剤と比較した。
【図９Ａ】同系移植マウスモデルにおける結腸直腸癌細胞の増殖の阻害に対するｒ５Ｄ８の効果を示す。
【図９Ｂ】第１７日での腫瘍の個々の測定値を示す。
【図１０Ａ】ＣＣＬ２２＋細胞の代表的な画像及び定量化を用いて、ＧＢＭの同所移植マウスモデルにおける腫瘍部位へのマクロファージ浸潤の減少を示す。
【図１０Ｂ】ヒト器官型組織片培養モデルにおけるマクロファージ浸潤の減少を示す。代表的な画像（左）及び定量化（右）が示されている。
【図１０Ｃ】ＣＣＬ２２＋細胞の代表的な画像及び定量化を用いて、卵巣癌の同系移植マウスモデルにおける腫瘍部位へのマクロファージ浸潤の減少を示す。
【図１０Ｄ】ＣＣＬ２２＋細胞の代表的な画像及び定量化を用いて、結腸直腸癌の同系移植マウスモデルにおける腫瘍部位へのマクロファージ浸潤の減少を示す。
【図１１Ａ】ｒ５Ｄ８での治療後の卵巣癌の同系移植マウスモデルにおける非骨髄性エフェクター細胞の増加を示す。
【図１１Ｂ】ｒ５Ｄ８での治療後の結腸直腸癌の同系移植マウスモデルにおける非骨髄性エフェクター細胞の増加を示す。
【図１１Ｃ】ｒ５Ｄ８での治療後のＮＳＣＬＣ癌のマウスモデルにおけるＣＤ４＋ＴＲＥＧ細胞のパーセンテージの低下を示す。
【図１２】抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８枯渇抗体の存在又は非存在下で腹腔内に投与されるＰＢＳ（対照）又はｒ５Ｄ８で週２回治療された、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスからのデータを示す。このグラフは、平均腫瘍体積＋ＳＥＭとして表される第１３日での個々の腫瘍測定値を示す。群間の統計的有意差は、対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定によって決定した。Ｒ５Ｄ８は、ＣＴ２６腫瘍の増殖を阻害した（＊ｐ＜０．０５）。ｒ５Ｄ８による腫瘍増殖阻害は、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８枯渇抗体の存在下で有意に低下した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図１３Ａ】ＬＩＦとの複合体におけるｈ５Ｄ８  Ｆａｂの共結晶構造の全体像を図示する。ｇｐ１３０相互作用部位の位置を、ＬＩＦの表面上に示す（濃く色付けされている）。
【図１３Ｂ】塩橋を形成する残基と１００Å２を超える埋没した表面積を有するｈ５Ｄ８残基を示す、ＬＩＦとｈ５Ｄ８との間の詳細な相互作用を図示する。
【図１４Ａ】５つのｈ５Ｄ８  Ｆａｂ結晶構造の重ね合わせを図示し、また、異なる化学的条件で結晶化されているにもかかわらず高度の類似性を示す。
【図１４Ｂ】不対のＣｙｓ１００によって媒介されるファンデルワールス相互作用の広範なネットワークを図示する。この残基は、秩序立っており、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ３の立体構造を形作るのに加わり、所望されないジスルフィドスクランブリングには関与しない。残基間の距離は、破線として示され、標識が付けられている。
【図１５Ａ】ＥＬＩＳＡによる、ｈ５Ｄ８  Ｃ１００変異体のヒトＬＩＦへの結合を図示する。
【図１５Ｂ】ＥＬＩＳＡによる、ｈ５Ｄ８  Ｃ１００変異体のマウスＬＩＦへの結合を図示する。
【図１６Ａ】Ｏｃｔｅｔによって、ｈ５Ｄ８が、ＬＩＦとＬＩＦＲとの間の結合を阻止しないことを示す。ｈ５Ｄ８のＬＩＦへの結合の後、ＬＩＦＲへの連続した結合が続く。
【図１６Ｂ】固定化されたＬＩＦＲ又はｇｐ１３０に対するＬＩＦ／ｍＡｂ複合体結合のＥＬＩＳＡ分析を図示する。固定化されたＬＩＦＲ（図１６Ｂ）又はｇｐ１３０（図１６Ｃ）コーティングプレートと結合するｍＡｂ／ＬＩＦ複合体の抗体部分を検出する、種特異的なペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ抗体（（−）及びｈ５Ｄ８については抗ヒト、ｒ５ｄ８及びＢ０９については抗ラット）のシグナル。
【図１６Ｃ】固定化されたＬＩＦＲ又はｇｐ１３０に対するＬＩＦ／ｍＡｂ複合体結合のＥＬＩＳＡ分析を図示する。固定化されたＬＩＦＲ（図１６Ｂ）又はｇｐ１３０（図１６Ｃ）コーティングプレートと結合するｍＡｂ／ＬＩＦ複合体の抗体部分を検出する、種特異的なペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ抗体（（−）及びｈ５Ｄ８については抗ヒト、ｒ５ｄ８及びＢ０９については抗ラット）のシグナル。
【図１７Ａ】７２個の異なるヒト組織におけるＬＩＦ（図１７Ａ）又はＬＩＦＲ（図１７Ｂ）のｍＲＮＡ発現を図示する。
【図１７Ｂ】７２個の異なるヒト組織におけるＬＩＦ（図１７Ａ）又はＬＩＦＲ（図１７Ｂ）のｍＲＮＡ発現を図示する。
【図１８】本明細書に記載される総ＬＩＦアッセイの模式図を示す。
【図１９Ａ】治療用抗体に結合された広範囲の濃度にわたる総ＬＩＦの、総ＬＩＦアッセイのシグナル検出曲線を示す。
【図１９Ｂ】限定はされないが、治療用抗ＬＩＦ抗体を与えられた患者のヒト血漿又は血清中の総ＬＩＦの潜在的レベルの範囲と重なる、治療用抗体に結合された２０ｐｇ／ｍｌから１．２５ｎｇ／ｍｌまでの総ＬＩＦの、総ＬＩＦレベルアッセイのシグナル検出曲線を表す。
【図２０Ａ】６人の異なるドナーからのヒト血清中の、治療用抗体に結合された２０ｐｇ／ｍｌから１．２５ｎｇ／ｍｌまでの総ＬＩＦの、総ＬＩＦレベルアッセイの均一性（個別（図２０Ａ）と重ね合わせられたもの（図２０Ｂ）の両方）を示す。
【図２０Ｂ】６人の異なるドナーからのヒト血清中の、治療用抗体に結合された２０ｐｇ／ｍｌから１．２５ｎｇ／ｍｌまでの総ＬＩＦの、総ＬＩＦレベルアッセイの均一性（個別（図２０Ａ）と重ね合わせられたもの（図２０Ｂ）の両方）を示す。
【図２１】総ＬＩＦアッセイが、ＬＩＦのｇｐ１３０結合部位と重複するエピトープと結合する治療用抗ＬＩＦ  ｍＡｂ（ｈ５Ｄ８）の１０μｇ／ｍｌ〜８１０μｇ／ｍｌの様々な濃度にわたって安定であることを示す。
【図２２Ａ】いくつかの血清試料で観察されるＨＡＭＡ干渉を低下させるかもしれない希釈剤についての最適化試験を表す。ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）は、捕捉及び検出試薬と交差反応して偽陽性シグナル、又は高バックグラウンドを生じる抗動物抗体である。
【図２２Ｂ】アッセイ開発の最適化段階中の、２種の候補希釈剤の性能比較を示す。
【図２３】異なるスポットコーティング（ｓｐｏｔ−ｃｏａｔｉｎｇ）濃度の捕捉抗体の最適化試験を示す。
【図２４】異なる捕捉抗体の最適化試験を示す。ｍＡｂ１＝ウサギモノクローナルＡ４抗体；ｍ  ｍＡｂ２＝Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；ラットモノクローナル抗体、クローンＪＮＨ４０Ｏ８Ｅ２１；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＣＡＢＨ−３３６７；ｍＡｂ３＝キメラウサギ／ヒトＡ４抗体。
【図２５】固定されたＬＩＦＲ又はｇｐ１３０へのＬＩＦ／ｍＡｂ複合体結合のＥＬＩＳＡ分析を示す。（図２５Ａ及びＢ）固定されたＬＩＦＲ（図２５Ａ）又はｇｐ１３０（図２５Ｂ）コーティングプレートと結合しているｍＡｂ／ＬＩＦ複合体の抗体部分を検出する、種特異的ペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ抗体のシグナル。（図２５Ｃ及びＤ）固定されたＬＩＦＲ（図２５Ｃ）又はｇｐ１３０（図２５Ｄ）コーティングプレートと結合しているｍＡｂ／Ｂｔ−ＬＩＦ複合体のＢｔ−ＬＩＦ部分を検出する、アビジン−ＨＲＰのシグナル。［１Ｃ７はＬＩＦＲと結合し、且つＬＩＦ結合を阻止する。２８１０５はｇｐ１３０と結合し、且つＬＩＦ結合を阻止する。Ｂ０９はＬＩＦＲ及びｇｐ１３０結合部位の外部のＬＩＦのエピトープと結合する。］
【図２６Ａ】３人の対象：対象Ａ（図２６Ａ）、対象Ｂ（図２６Ｂ）、対象Ｃ（図２６Ｃ）における、初回投与の時間に対するＬＩＦレベルを示す。
【図２６Ｂ】３人の対象：対象Ａ（図２６Ａ）、対象Ｂ（図２６Ｂ）、対象Ｃ（図２６Ｃ）における、初回投与の時間に対するＬＩＦレベルを示す。
【図２６Ｃ】３人の対象：対象Ａ（図２６Ａ）、対象Ｂ（図２６Ｂ）、対象Ｃ（図２６Ｃ）における、初回投与の時間に対するＬＩＦレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一態様では、本明細書に記載されるのは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）複合体であって、ＬＩＦ；ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ捕捉抗体；ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ検出抗体：及び任意に、ＬＩＦと特異的に結合するＬＩＦ治療用抗体を含む複合体である。
【００１６】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、個人からの試料中の白血病抑制因子（ＬＩＦ）を定量化する方法であって、（ａ）ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦに特異的に結合する捕捉抗体と接触させることと；（ｂ）ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦと特異的に結合する検出抗体と接触させることと；（ｃ）捕捉抗体及び検出抗体に結合されている、試料中のＬＩＦを検出することとを含む方法である。
【００１７】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、癌を有する個人を治療する方法であって、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の初回投与を個人に施すことと；（ｂ）癌を有する個人からの試料中の白血病抑制因子（ＬＩＦ）の治療後レベルを決定することとを含む方法である。
【００１８】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、癌を有する個人を治療する方法であって、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体を含む初回投与を個人に施すことと；（ｂ）癌を有する個人からの試料における白血病抑制因子（ＬＩＦ）の治療後レベルを得ることとを含む方法である。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「個人」、「対象」、及び「患者」は、互換的に使用され、腫瘍、癌、又は他の新生物と診断された又は腫瘍、癌、又は他の新生物を患っている疑いがあるヒトが含まれる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、他に指示されない限り、用語「抗体」には、抗体の抗原結合断片、すなわち、全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持する断片が含まれる。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体；重鎖抗体、単鎖抗体分子、例えば単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、及び二重特異性抗体などの別の特異性を有する抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。ある種の実施形態では、抗体は、その抗体に対する個人の免疫応答を低下させるようにヒト化されている。例えば、抗体は、キメラ、例えばヒト定常領域を有する非ヒト可変領域、又はＣＤＲグラフトされたもの、例えばヒト定常領域及び可変領域のフレームワーク配列を有する非ヒトＣＤＲ領域であり得る。ある種の実施形態では、抗体は、ヒト化後に脱免疫原性化される。脱免疫原性化は、抗体の定常領域内の１つ以上のＴ細胞エピトープを除去する又は変異させることを含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、モノクローナルである。本明細書で使用する場合、「組換え抗体」は、２つの異なる種又は２つの異なる供給源由来のアミノ酸配列を含む抗体であり、合成の分子、例えば、非ヒトＣＤＲ及びヒトフレームワーク又は定常領域を含む抗体が含まれる。ある種の実施形態では、本発明の組換え抗体は、組換えＤＮＡ分子から産生される、又は合成される。用語「癌」及び「腫瘍」は、無秩序な細胞増殖を特徴とする、哺乳類における生理学的状態に関する。癌は、一群の細胞が、制御されない増殖又は望まれない増殖を呈する類の疾患である。癌細胞は、他の位置に拡散する可能性もあり、これが、転移の形成をもたらす可能性がある。体内の癌細胞の拡散は、例えば、リンパ又は血液を介して起こる可能性がある。制御されない増殖、侵入、及び転移形成は、癌の悪性特性とも呼ばれる。これらの悪性特性は、癌を、一般的には浸潤も転移もしない良性腫瘍と区別する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「治療用抗体」は、個人に投与され、且つ癌の治療に有用な１つ以上の有益な効果をもたらすことが意図されるものである。本開示の治療用抗体には、ｈ５Ｄ８と同一のＣＤＲ配列、又はｈ５Ｄ８とは異なるが類似の結合特性（エピトープ、親和性、又は生物学的効果）を有するＣＤＲを有し、且つ癌の治療に有用な１つ以上の有益な効果をもたらすことができる抗体が含まれる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「基準レベル」は、標的（例えばＬＩＦ）との治療用抗体結合と一致する、上昇したレベルに相当するＬＩＦのレベルに相当する、生体試料中で検出されるＬＩＦタンパク質のレベルを指す。基準レベルは、治療されている個人の集団に基づいて定義することができ、集団内の個人の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％における最大標的結合を示すレベルに相当する。
【００２３】
参照ポリペプチド又は抗体配列に関する配列同一性のパーセント（％）は、配列同一性の最大のパーセントを得るために、必要であれば配列を整列させてギャップを導入した後の、且つ配列同一性の一部としてのいかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチド又は抗体配列内のアミノ酸残基と同一である、候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸配列同一性のパーセントを決定する目的のアラインメントは、公知である様々な方式で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、実現することができる。比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを実現するために必要とされるアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することが可能である。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸配列同一性の値（％）は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用してもたらされる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９に、ユーザ文書と共に保管されており、ここでは、これは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に利用可能であるし、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ｄｉｇｉｔａｌ  ＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更しない。
【００２４】
ＡＬＩＧＮ−２が、アミノ酸配列比較のために用いられる場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂと対照する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性（％）（これは、代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、アミノ酸配列Ｂと、又はアミノ酸配列Ｂと対照して、あるアミノ酸配列同一性（％）を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、次の通りに算出される：１００×分数Ｘ／Ｙ（ここでは、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、ＡとＢのプログラムのアラインメントについて同一のマッチとして記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性（％）は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性（％）と等しくないこととなるということを理解されたい。他に具体的に規定されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性の値（％）は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載した通りに得られる。
【００２５】
用語「エピトープ」には、抗体などの抗原結合タンパク質によって結合されることが可能であるあらゆる決定基が含まれる。エピトープは、その抗原を標的にする抗原結合タンパク質によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合タンパク質と直接的に接触する特異的なアミノ酸が含まれる。エピトープは、タンパク質上に存在することが最も多いが、糖類又は脂質などの他の種類の分子上に存在する場合もあり得る。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニル基などの分子の、化学的に活性な表面集団（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含むことができ、特異的な三次元構造特性及び／又は特異的な電荷特性を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質及び／又は高分子の複合混合物における標的抗原上のエピトープを優先的に認識することとなる。
【００２６】
本明細書に記載される抗体の構造的特質
相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は、主として抗体の抗原結合特異性の原因である、免疫グロブリン（抗体）可変領域の一部である。ＣＤＲ領域は、抗体が同じ標的又はエピトープに特異的に結合する場合でも、抗体ごとに高度に変動する。重鎖可変領域は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３と省略される３つのＣＤＲ領域を含み；軽鎖可変領域は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３と省略される３つのＣＤＲ領域を含む。これらのＣＤＲ領域は、可変領域内に連続して並んでおり、ＣＤＲ１が最もＮ末端側であり、ＣＤＲ３が最もＣ末端側である。ＣＤＲは、構造に寄与し且つＣＤＲ領域よりもかなり低い変動性を呈するフレームワーク領域の間に挿入されている。重鎖可変領域は、ＶＨ−ＦＲ１、ＶＨ−ＦＲ２、ＶＨ−ＦＲ３、及びＶＨ−ＦＲ４と省略される４つのフレームワーク領域を含み；軽鎖可変領域は、ＶＬ−ＦＲ１、ＶＬ−ＦＲ２、ＶＬ−ＦＲ３、及びＶＬ−ＦＲ４と省略される４つのフレームワーク領域を含む。２本の重鎖と軽鎖を含む完全なフルサイズの二価抗体は、３つの特有の重鎖ＣＤＲと３つの特有の軽鎖ＣＤＲを含む１２個のＣＤＲ；４つの特有の重鎖ＦＲ領域と４つの特有の軽鎖ＦＲ領域を含む１６個のＦＲ領域を含むこととなる。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、３つの重鎖ＣＤＲを最小限含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲを最小限含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを最小限含む。所与のＣＤＲ又はＦＲの厳密なアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６），“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，”（「Ｃｏｎｔａｃｔ」ナンバリングスキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，”ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３  Ｊａｎ；２７（１）：５５−７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）；及びＨｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  Ａ，“Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ，”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００１  Ｊｕｎ  ８；３０９（３）：６５７−７０，（「Ａｈｏ」ナンバリングスキーム）によって記載されているものを含めた、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。ＣＤＲは、異なるナンバリングシステムを使用して、本明細書ではＫａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステム、又は３つの任意の組み合わせを用いて提供される可変の配列から、本明細書で特定される。所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、特定のために使用されるスキームに応じて変わり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づいているのに対して、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づいている。ＫａｂａｔスキームとＣｈｏｔｈｉａスキームのどちらについてのナンバリングも、いくつかの抗体に現れる、挿入（挿入文字、例えば「３０ａ」によって対応される）及び欠失と共に、最も一般的な抗体領域配列長に基づいている。２つのスキームは、ある種の挿入及び欠失（「インデル」）を、異なる位置に配置し、その結果、異なるナンバリングがもたらされる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複合体結晶構造の解析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームと似ている。
【００２７】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体が抗原に結合することに関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つのＣＤＲを含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい）。たった１つのＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体を、抗原と結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい）。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ラット起源の可変領域を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ラット起源のＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、マウス起源の可変領域を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、マウス起源のＣＤＲを含む。
【００２８】
例えば抗体親和性を向上させるために、ＣＤＲに変更（例えば置換）を施すことができる。こうした変更は、体細胞成熟中に高い変異率を有するＣＤＲコードコドンに施すことができ（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、得られたバリアントを、結合親和性について試験することができる。親和性成熟（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、ＣＤＲのランダム化、又はオリゴヌクレオチド指定変異誘発を使用する）を使用して、抗体親和性を向上させることができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（２００１）を参照されたい）。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、具体的に特定することができる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）を参照されたい）。具体的には、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的にされる。或いは、又はさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原の間の接触点が特定される。こうした接触残基及び隣接残基は、置換のための候補として標的にする又は排除することができる。バリアントをスクリーニングして、そのバリアントが所望される特性を含有するかどうかを決定することができる。
【００２９】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、配列番号４１又は配列番号４２のいずれか１つ以上から選択されるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステム、又は３つの任意の組み合わせを使用する配列から選択される。所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、特定のために使用されるスキームに応じて変わり得る。
【００３０】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、可変領域に加えて定常領域を含む。重鎖定常領域（ＣＨ）は、完全な重鎖ポリペプチドのＣ末端、可変領域に対してＣ末端側に位置する、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４と省略される４つのドメインを含む。軽鎖定常領域（ＣＬ）は、ＣＨよりもかなり小さく、完全な軽鎖ポリペプチドのＣ末端、可変領域に対してＣ末端側に位置する。定常領域は、高度に保存され、わずかに異なる機能及び特性と関連する異なるアイソタイプを含む。ある種の実施形態で定常領域は、標的抗原への抗体結合にとって不必要である。ある種の実施形態では、抗体の定常領域、重鎖と軽鎖は両方とも、抗体結合にとって不必要である。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、１つ以上の軽鎖定常領域、重鎖定常領域、又はこれらの両方を欠いている。最も多いモノクローナル抗体は、ＩｇＧアイソタイプのものであり；これは、さらに、４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分類される。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、あらゆるＩｇＧサブクラスを含む。ある種の実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ１を含む。ある種の実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ２を含む。ある種の実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ３を含む。ある種の実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ４を含む。
【００３１】
抗体は、補体及びＦｃ受容体への結合を担うフラグメント結晶化可能領域（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）（Ｆｃ領域）を含む。Ｆｃ領域は、抗体分子のＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域を含む。抗体のＦｃ領域は、補体及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化を担う。Ｆｃ領域はまた、抗体の血清半減期に寄与する。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、補体介在性の細胞溶解を促進する１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、ＡＤＣＣを促進する１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、補体介在性の細胞溶解を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、抗体のＦｃ受容体への結合を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、又はこれらのあらゆる組み合わせを含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、抗体の血清半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、治療用抗体の血清半減期を増大させる１つ以上のアミノ酸置換は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する抗体の親和性を増大させる。
【００３２】
診療現場において有用な抗体は、ヒト個人における免疫原性を低下させるために、しばしば「ヒト化」されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体療法の安全性及び有効性を向上させる。ある一般的なヒト化の方法は、いずれかの好適な動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）においてモノクローナル抗体を産生し、定常領域をヒト定常領域と置き換えることであり、このようにして遺伝子操作で作られた抗体は、「キメラ」と称される。別の一般的な方法は、非ヒトＶ−ＦＲをヒトＶ−ＦＲと置き換える「ＣＤＲグラフティング」である。ＣＤＲグラフティング方法では、ＣＤＲ領域を除くすべての残基が、ヒト起源のものである。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒト化されている。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、キメラである。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤＲグラフトされている。
【００３３】
総ＬＩＦレベルを決定する方法
結合されていない状態では、大抵の可溶性サイトカインは、血液中で短い半減期を有し、これにより、定常状態では低いレベルとなる。しかし、抗体によって結合される場合、この半減期は増大し、より高い定常状態レベルをもたらすことができる。患者試料中の総ＬＩＦのレベルについて分析することは、末梢の標的結合（例えば、治療用抗ＬＩＦ抗体によるＬＩＦ結合）を定義するために、また、ＬＩＦ−結合治療用抗体のさらなる用量を知らせるために使用することができる。したがって、本明細書に記載される方法は、ＬＩＦと結合する治療用抗体の１回以上の投与後に治療に反応する個人におけるＬＩＦレベルを決定するのに有用である。この方法は、治療に対する反応を決定することにおいて、また、その後の治療を調整するために使用することができる。ある種の実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ベースラインＬＩＦレベルとしての役割を果たすために、ＬＩＦ治療用抗体での治療前に決定することができ、ここでは、治療は、患者におけるＬＩＦレベルを増大させることが期待される。ある種の実施形態では、ベースラインは得ず、ＬＩＦの絶対的レベルに基づいて治療の変更を行うことができる。
【００３４】
本明細書に記載されるＬＩＦアッセイは、治療用抗体によって結合されているＬＩＦと結合されていないＬＩＦの両方を測定し、したがって、総ＬＩＦレベルを決定する。図１８に示す通り、このアッセイは、検出抗体によって生成される電気信号を測定できるように任意選択で導電性物質１８０５を含む表面１８０４に固定されている捕捉抗体１８０２によって結合されるＬＩＦ  １８０１を含む分子複合体１８００を構成する。次いで、検出抗体１８０６が添加される。この検出抗体は、検出可能な部分に直接的又は間接的に結合することができる。この複合体においては、治療用抗体１８０３をＬＩＦ  １８０１に結合させることができる。捕捉抗体１８０２と検出抗体１８０６は、ＬＩＦ分子の別の部分に結合するので、このアッセイは、治療用抗体によって結合されている又は結合されていない総ＬＩＦを測定する。現在のアッセイの目的では、治療用抗体は、５Ｄ８のＣＤＲ残基を有する、又は５Ｄ８  ＣＤＲをもつ抗体と類似の結合領域を有するものである。このアッセイはまた、ＬＩＦの同じ又は実質的に同じ部分と結合する他の治療用抗体に適合する。５Ｄ８  ＣＤＲをもつ抗体によって結合されるＬＩＦの領域は、本明細書に詳述される。本明細書の５Ｄ８によって結合される残基は、結晶構造によって決定されるが、結合について５Ｄ８と競合するいずれの抗体も、治療用抗体が結合について捕捉抗体又は検出抗体と競合しない限り、治療用抗体としての役割を果たすことができる。さらに、いずれの所与の治療用抗体も、結合されるＬＩＦアミノ酸残基が、５Ｄ８エピトープの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個、又はそれ以上の残基が結合することができるように、５Ｄ８と比較した場合にわずかに異なる可能性がある。
【００３５】
このアッセイを行う一般的なステップは、１）捕捉抗体を基質に吸着又は結合させることと；２）捕捉抗体と結合した基質を、ＬＩＦを含む生体試料と共にインキュベートすることと；３）形成された捕捉抗体−ＬＩＦ複合体をＬＩＦ検出抗体と共にインキュベートすることと；４）検出抗体から生じたシグナルを測定することとを含む。次いで、ＬＩＦレベルを、公知のＬＩＦ濃度の標準曲線との比較によって定量化することができる。厳密なインキュベーションパラメータは、変動するが、一般に、室温で３０分から１２０分、又は４℃で２時間から一晩の範囲となる。しかし、より長いインキュベーション時間も、このアッセイに適合する。いくつかの実施形態では、インキュベーションパラメータは、３７℃で１分から３０分、室温で１分から３０分、室温で１２０分から２４０分、４℃で３０分から２時間、又は４℃で８時間から２４時間の範囲であり得る。これらのステップのいずれかの後に、洗浄ステップを追加して、結合していない過剰な抗体又は血漿／血清成分を除去することができる。ある種の実施形態では、洗浄緩衝液は、非特異的結合を減少させる洗剤又は塩濃度を含む。ある種の実施形態では、検出可能な部分に応じて、測定ステップは、検出可能なシグナルに転換するための検出可能な部分のための基質を添加する追加のステップを含むことができる。
【００３６】
ある種の実施形態では、ＬＩＦ捕捉抗体は、ある表面に結合される。ある種の実施形態では、その表面は、導電性物質を含む。ある種の実施形態では、導電性物質は、電極である。ある種の実施形態では、表面は、基質である。いくつかの実施形態では、基質は、天然源由来である。いくつかの実施形態では、基質は、合成である。いくつかの実施形態では、天然源由来の基質は、細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）である。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、ヒドロゲルを含む。ある種の実施形態では、合成の基質は、ポリ−Ｌ−リジンを含む。
【００３７】
本明細書に記載されるアッセイは、治療用抗体で治療された又は治療用抗体で治療されることとなる個人から収集された、様々な種類の生体試料に対して実施することができる。生体試料は、組織試料、腫瘍生検試料、血液試料、又は尿試料であり得る。ある種の実施形態では、試料は、血液試料である。ある種の実施形態では、試料は、血漿試料である。ある種の実施形態では試料は、血清試料である。試料は、アッセイへの添加の前に希釈することができる。
【００３８】
本明細書に記載されるアッセイは、治療用抗体での治療に対する個人の反応を決定するために使用することができる。このアッセイは、治療用抗体が投与される前の、治療用抗体が投与される後の、又は治療用抗体が投与される前と後の両方の、個人からの生体試料に対して行うことができる。このアッセイは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の初回投与の前に行うことができる。このアッセイは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の初回投与の後に行うことができる。このアッセイは、ＬＩＦと結合する抗体の初回投与後の後に行うことができる。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、ＬＩＦの初回投与前レベルからの、２倍以下の増大を示す。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、ＬＩＦの初回投与前レベルから、２倍から１０倍増大する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、ＬＩＦの初回投与前レベルから、２倍から３倍、２倍から４倍、２倍から５倍、２倍から６倍、２倍から７倍、２倍から８倍、２倍から９倍、２倍から１０倍、３倍から４倍、３倍から５倍、３倍から６倍、３倍から７倍、３倍から８倍、３倍から９倍、３倍から１０倍、４倍から５倍、４倍から６倍、４倍から７倍、４倍から８倍、４倍から９倍、４倍から１０倍、５倍から６倍、５倍から７倍、５倍から８倍、５倍から９倍、５倍から１０倍、６倍から７倍、６倍から８倍、６倍から９倍、６倍から１０倍、７倍から８倍、７倍から９倍、７倍から１０倍、８倍から９倍、８倍から１０倍、又は９倍から１０倍増大する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、ＬＩＦの初回投与前レベルから、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍増大する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、ＬＩＦの初回投与前レベルから、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍増大する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの初回投与後レベルは、ＬＩＦの初回投与前レベルから、最大で３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍増大する。
【００３９】
治療後にアッセイが行われ、治療前試料と比較して又は基準レベルと比較してＬＩＦレベルの増大が観察されないならば、より多い量の、又はより短期のスケジュールで、後続用量を投与することができる。ある種の実施形態では、生体試料中で検出されるＬＩＦの量が、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｐｇ／ｍＬ未満、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｎｇ／ｍＬ未満であるならば、以前の投与と比較して増大した量の後続用量を投与することができる。ある種の実施形態では、生体試料中で検出されるＬＩＦの量が、約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｇ／ｍＬ未満であるならば、以前の投与と比較して、より短期のスケジュールで、後続用量を投与することができる。ある種の実施形態では、生体試料中で検出されるＬＩＦの量が、約１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｎｇ／ｍＬ未満であるならば、以前の投与と比較して増大した量の後続用量を投与することができる。ある種の実施形態では、生体試料中で検出されるＬＩＦの量が、約１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ｎｇ／ｍＬ未満であるならば、以前の投与と比較して、より短期のスケジュールで、後続用量を投与することができる。
【００４０】
ある種の実施形態では、以前の投与（又は投与なし）の前に観察されたレベルと比較した場合の、生体試料中で検出されるＬＩＦの増大が、約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍未満であるならば、以前の投与と比較して増大した量の後続用量を投与することができる。ある種の実施形態では、以前の投与（又は投与なし）の前に観察されたレベルと比較した場合の、生体試料中で検出されるＬＩＦの増大が、約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍未満であるならば、以前の投与と比較して、より短期のスケジュールで、後続用量を投与することができる。
【００４１】
捕捉及び検出抗体
本開示の捕捉抗体は、固体支持体に固定され、且つ検出抗体及び／又は治療用抗体とは別のＬＩＦのエピトープ又は領域に特異的に結合する場合に有用である。固体支持体は、プレート、カラム、樹脂、又はビーズ（溶液中）であり得る。好適なプレートには、いくつかの試料を同時に分析するために使用できるようなウェルプレート、例えば９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１，５３６ウェルプレートなどが含まれる。一般的なプレートには、ポリスチレンプレート（例えば、中又は高結合ポリスチレン）が含まれる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、解析用タンパク質アレイ、例えば、捕捉抗体が配列された抗体アレイである。プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、アミンカップリング樹脂、又はスルフヒドリルカップリング樹脂を含む樹脂又はカラムマトリックスも使用することができる。ビーズは、重力、遠心分離、又は磁場による分離を可能にする大きさのアガロースビーズ又は磁気ビーズであり得る。プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、カップリングのためのアミン基、又はカップリングのためのスルフヒドリル基を含むビーズを使用することができる。固体支持体に固定される場合、捕捉抗体の少なくとも一部が、この抗体がＦａｂを介してしてＬＩＦと結合し、且つ適切に標識された検出抗体と対をなした場合にシグナルを生じることができるように固定される。この抗体の付着は、共有結合性相互作用、例えば、チオール架橋、Ｎ−オキシスクシンイミド、マレイミド、及びヒドラジド基など；又は非共有結合性相互作用、例えば、ストレプトアビジン−ビオチン結合、受動吸収（ｐａｓｓｉｖｅ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、又は親和性相互作用などを介するものであり得る。ある種の実施形態では、固体支持体は、電気化学シグナルを誘導することが可能な導電性物質（例えば、ＭＳＤプレート；Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ１５ＸＡ−３）を含む。固体支持体は、試料の添加、抗体を検出すること、及び洗浄を、シリンジポンプ、ぜん動装置（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）、若しくはマイクロ流体デバイスなどのプレートウォッシャー又は流体デバイスなどの自動システムの使用を介して行うことができるように設計することができる。
【００４２】
本開示の検出抗体は、捕捉抗体及び／又は治療用抗体とは別のＬＩＦのエピトープ又は領域に結合することが可能な場合に有用である。検出抗体は、標識された二次抗体によって特異的に結合され得る改変されていない抗体であり得る。検出抗体は、検出可能な部分に結合することができる。つまり、検出可能な部分は、共有結合的に又は小分子親和性相互作用（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）によって抗体に結合される。検出抗体は、小分子と結合することが可能な標識された分子によって特異的に結合され得る、小分子によって標識される抗体であり得る。例えば、検出抗体は、適切な検出可能な部分に結合したストレプトアビジンによって結合され得るビオチンに結合することができる。いくつかの実施形態では、検出抗体は、検出可能な部分に直接的に結合される。検出抗体は、酵素、発光、化学発光、蛍光、リン光、放射性、又は核酸標識部分で標識することができる。酵素標識部分としては、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼが含まれる。蛍光標識部分としては、限定はされないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ヘキスト、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、スルホローダミン１０１酸クロリド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒシリーズ色素、及びその組み合わせが含まれる。放射性標識部分としては、限定はされないが、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１４Ｃが含まれる。核酸検出可能な部分は、増幅又はシークエンシングによって定量化することができる、固有の核酸配列（バーコード）であり得る。電気化学発光検出部分としては、限定はされないが、トリス−ビピリジンルテニウム（ＩＩ）、及びトリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン酸）ルテニウム（ＩＩ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステルを介して抗体に結合されるトリス−ビピリジン（４−メチルスルホン酸）ルテニウム（ＩＩ）が含まれる。
【００４３】
抗体Ａ４は、総ＬＩＦレベルを決定する現在の方法において有用に採用することができる一抗体である。捕捉抗体としての使用のために例示されるが、この抗体はまた、異なる捕捉抗体（例えば、本開示の７Ｃ３）と対をなすならば、検出抗体としての使用のためにも利用可能である。Ａ４抗体は、ウサギモノクローナル抗体である。Ａ４抗体は、ｈ５Ｄ８の結合を邪魔しない。本明細書に記載されるある種の実施形態では、Ａ４抗体は、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号４１に示したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する抗体である。Ａ４抗体はまた、他のフレームワーク領域（例えば、ヒト化、マウス化など）；又は他の種の定常領域とつなぎ合わせた可変領域（例えば、キメラ抗体）に遺伝子操作される、本開示における方法のいずれかによって詳述した通りに定義された、Ａ４抗体のＣＤＲの使用も包含する。さらに、Ａ４抗体と同じ又は類似のエピトープと結合する抗体も使用することができる。Ｅ２１は、こうした抗体の一つ、ラットモノクローナルクローンＪＮＨ４０Ｏ８Ｅ２１（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）である。Ｅ２１は、Ａ４と類似のエピトープと結合し、本明細書に記載されるアッセイに適合する。
【００４４】
現在の方法において有用に採用することができる別の抗体は、７Ｃ３抗体である。７Ｃ３は、マウスモノクローナル抗体、クローンＭ０１７Ｃ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）である。検出抗体としての使用のために例示されるが、この抗体はまた、異なる検出抗体（例えば、本開示のＡ４）と対をなすならば、捕捉抗体としての使用のためにも利用可能である。７Ｃ３抗体はまた、他のフレームワーク領域（例えば、ヒト化、マウス化など）；又は他の種の定常領域とつなぎ合わせた可変領域（例えば、キメラ抗体）に遺伝子操作される、本開示における方法のいずれかによって詳述した通りに定義された、７Ｃ３抗体のＣＤＲの使用も包含する。さらに、７Ｃ３抗体と同じ又は類似のエピトープと結合する抗体も使用することができる。これらの抗体には、ＬＩＦ受容体と相互作用するＬＩＦの領域中でヒトＬＩＦと結合するものが含まれる。こうした抗体の一つは、Ｂ７抗体、すなわち、配列番号４３（重鎖可変領域）及び４４（軽鎖可変領域）に示したウサギモノクローナル抗体である。本明細書に記載されるある種の実施形態では、Ｂ７抗体は、配列番号４３に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号４４に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する抗体である。別のこうした抗体は、Ｄ７抗体、すなわち、配列番号４５（重鎖可変領域）及び４６（軽鎖可変領域）に示したウサギモノクローナル抗体である。本明細書に記載されるある種の実施形態では、Ｄ７抗体は、配列番号４５に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号４６に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する抗体である。
【００４５】
本開示の検出及び捕捉抗体の望ましい形質は、どちらの抗体も、ＬＩＦとの結合について互いに邪魔しないこと、また、治療用抗体（例えば、ｈ５Ｄ８）がＬＩＦに結合されているかどうかに関わりなく各抗体がＬＩＦと結合することができることである。ある種の実施形態では、捕捉抗体と検出抗体のどちらも、ｈ５Ｄ８によって結合されるエピトープと重複するエピトープと結合しない。ある種の実施形態では、捕捉抗体と検出抗体のどちらも、ｈ５Ｄ８によって結合されるエピトープの５、１０、１５、又は２０オングストローム以内にあるエピトープと結合しない。ある種の実施形態では、捕捉抗体と検出抗体のどちらも、ＬＩＦ共受容体ｇｐ１３０と相互作用するエピトープと結合しない。
【００４６】
本明細書に記載されるアッセイの一つの利点は、感度である。健康な個人では、ＬＩＦは、定常状態で低レベルで存在する。ある種の実施形態では、このアッセイは、血漿又は血清中のＬＩＦについて、少なくとも約２０ｐｇ／ｍｌ（例えば１ｐＭ）、３０ｐｇ／ｍＬ、４０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、６０ｐｇ／ｍＬ、７０ｐｇ／ｍＬ、８０ｐｇ／ｍＬ、９０ｐｇ／ｍＬ、又は１００ｐｇ／ｍＬまでの検出閾値を有する。本明細書に記載されるアッセイの別の利点は、低い内的変動である。ある種の実施形態では、内的変動は、約２０％、１５％、１０％、５％、４％、又は３％未満である。
【００４７】
治療用抗体
本明細書に記載される５Ｄ８抗体は、ヒトＬＩＦをコードするＤＮＡで免疫化されたラットから産生された。この抗体の親ラット型は、ｒ５Ｄ８と称され、ヒト化型は、ｈ５Ｄ８と称される。
【００４８】
５Ｄ８
本明細書に記載される抗体は、ヒトＬＩＦをコードするＤＮＡで免疫化されたラットから産生された。あるこうした抗体（５Ｄ８）をクローン化及び配列決定した。これは、次のアミノ酸配列：配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に相当するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に相当するＶＨ−ＣＤＲ２、配列番号６（ＴＣＷＥＷＤＬＤＦ）に相当するＶＨ−ＣＤＲ３、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に相当するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に相当するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に相当するＶＬ−ＣＤＲ３を含むＣＤＲ（ＫａｂａｔとＩＭＧＴ  ＣＤＲナンバリング方法の組み合わせを使用する）を含む。この抗体は、ＣＤＲグラフティングによってヒト化されており、ヒト化型はｈ５Ｄ８と称される。ｈ５Ｄ８抗体のヒト化可変領域は、配列番号１５及び配列番号１９に示している。
【００４９】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に示したものと少なくとも８０％、９０％、又は９５％同一のＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号６（ＴＣＷＥＷＤＬＤＦ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＨ−ＣＤＲ３を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に示したものと少なくとも８０％同一のＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＬ−ＣＤＲ３を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に示したＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に示したＶＨ−ＣＤＲ２、配列番号６（ＴＣＷＥＷＤＬＤＦ）に示したＶＨ−ＣＤＲ３、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に示したＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に示したＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に示したＶＬ−ＣＤＲ３を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。この開示のＣＤＲのアミノ酸配列中の、ある程度の保存的アミノ酸置換が想定される。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号１、４、６、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号１、４、６、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なり、且つ結合親和性に１０％、２０％、又は３０％を超える影響を与えないＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦと特異的に結合する抗体は、１つ以上のヒト重鎖フレームワーク領域を含む。
【００５０】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に示したものと少なくとも８０％、９０％、又は９５％同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８（ＴＳＷＥＷＤＬＤＦ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に示したものと少なくとも８０％同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に示したＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に示したＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号８（ＴＳＷＥＷＤＬＤＦ）に示したＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に示したＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に示したＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に示したＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。この開示のＣＤＲのアミノ酸配列中の、ある程度の保存的アミノ酸置換が想定される。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号１、４、８、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号１、４、８、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なり、且つ結合親和性に１０％、２０％、又は３０％を超える影響を与えないＣＤＲを含む。
【００５１】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１４、１５、又は１７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１４、１５、及び１７のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、抗体は、ヒトＬＩＦと特異的に結合する。
【００５２】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１５に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域；及び配列番号１９に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１５に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域；及び配列番号１９に示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００５３】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３８に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域と；配列番号１９に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３８に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域と；配列番号１９に示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００５４】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３０〜３３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖と；配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３０〜３３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖と；配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００５５】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖と；配列番号３５に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖と；配列番号３５に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３９に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖と；配列番号３５に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３９に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；及び配列番号３５に示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００５６】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号７に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；及び配列番号１１に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と特異的に結合する組換え抗体である。
【００５７】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号５に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号６に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号１０に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；及び配列番号１２に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と特異的に結合する組換え抗体である。この開示のＣＤＲのアミノ酸配列中の、ある程度の保存的アミノ酸置換が想定される。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号２、５、６、１０、１２、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号２、５、６、１０、１２、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なり、且つ結合親和性に１０％、２０％、又は３０％を超える影響を与えないＣＤＲを含む。
【００５８】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号７に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；及び配列番号１１に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と特異的に結合する組換え抗体である。この開示のＣＤＲのアミノ酸配列中の、ある程度の保存的アミノ酸置換が想定される。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号３、４、７、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号３、４、７、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なり、且つ結合親和性に１０％、２０％、又は３０％を超える影響を与えないＣＤＲを含む。
【００５９】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２２〜２５のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；及び配列番号２６〜２９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２２〜２５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；及び配列番号２６〜２９のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００６０】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２３に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；及び配列番号２７に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２３に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；及び配列番号２７のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００６１】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３９に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖と；配列番号２７に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３９に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖と；配列番号２７のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する抗体である。
【００６２】
治療的に有用なＬＩＦ抗体によって結合されるエピトープ
本明細書に記載されるのは、結合された場合にＬＩＦの生物学的活性（例えば、ＳＴＡＴ３リン酸化）を阻害する、且つインビボで腫瘍増殖を阻害し、治療効果をもたらす、ヒトＬＩＦの固有のエピトープである。本開示の治療用抗体は、ｈ５Ｄ８のＣＤＲを含まないが、ｈ５Ｄ８と同じ又は類似のエピトープ（アミノ酸残基）に結合する、治療用抗体であり得る。類似のエピトープは、特定されるエピトープの範囲内で結合するものである。本明細書に記載されるエピトープは、ヒトＬＩＦタンパク質の２つの別のトポロジカルドメイン（αヘリックスＡ及びＣ）中に存在する、（ヒトＬＩＦの残基１３から残基３２まで、及び残基１２０から１３８までの）アミノ酸の２つの不連続な伸長からなる。この結合は、弱い（ファンデルワールス引力）、中程度の（水素結合）、及び強い（塩橋）相互作用の組み合わせである。ある種の実施形態では、接触残基は、抗ＬＩＦ抗体上の残基と共に水素結合を形成するＬＩＦ上の残基である。ある種の実施形態では、接触残基は、抗ＬＩＦ抗体上の残基と共に塩橋を形成するＬＩＦ上の残基である。ある種の実施形態では、接触残基は、抗ＬＩＦ抗体上の残基と共にファンデルワールス引力をもたらし、且つ抗ＬＩＦ抗体上の残基の少なくとも５、４、又は３オングストローム以内である、ＬＩＦ上の残基である。治療用抗体は、このエピトープと結合する、又はこのエピトープのより小さい部分に結合する、又はこのエピトープと重複し、本明細書に記載されるアッセイに利用することができる。
【００６３】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療法抗体は、次の配列番号４０の残基：Ａ１３、Ｉ１４、Ｒ１５、Ｈ１６、Ｐ１７、Ｃ１８、Ｈ１９、Ｎ２０、Ｑ２５、Ｑ２９、Ｑ３２、Ｄ１２０、Ｒ１２３、Ｓ１２７、Ｎ１２８、Ｌ１３０、Ｃ１３１、Ｃ１３４、Ｓ１３５、又はＨ１３８のうちのいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個と結合する、単離された抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、次の配列番号４０の残基：Ａ１３、Ｉ１４、Ｒ１５、Ｈ１６、Ｐ１７、Ｃ１８、Ｈ１９、Ｎ２０、Ｑ２５、Ｑ２９、Ｑ３２、Ｄ１２０、Ｒ１２３、Ｓ１２７、Ｎ１２８、Ｌ１３０、Ｃ１３１、Ｃ１３４、Ｓ１３５、又はＨ１３８のうちのすべてと結合する、単離された抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、次の配列番号４０の残基：Ａ１３、Ｉ１４、Ｒ１５、Ｈ１６、Ｐ１７、Ｃ１８、Ｈ１９、Ｎ２０、Ｑ２５、Ｑ２９、Ｑ３２、Ｄ１２０、Ｒ１２３、Ｓ１２７、Ｎ１２８、Ｌ１３０、Ｃ１３１、Ｃ１３４、Ｓ１３５、又はＨ１３８のうちのすべてと結合する、単離された抗体である。ある種の実施形態では、抗体は、強い又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基とのみ結合する。ある種の実施形態では、抗体は、強い相互作用で抗体と関与する残基とのみ結合する。ある種の実施形態では、抗体は、ＬＩＦのヘリックスＡ及びＣと相互作用する。ある種の実施形態では、抗体は、ｇｐ１３０と共にＬＩＦ相互作用を阻止する。
【００６４】
治療適応症
ある種の実施形態では、本明細書に開示した治療用抗体は、細胞におけるＬＩＦシグナル伝達を阻害する。ある種の実施形態では、Ｕ−２５１細胞における血清飢餓条件下での抗体の生物学的阻害についてのＩＣ５０は、約１００、７５、５０、４０、３０、２０、１０、５、又は１ナノモル濃度以下である。ある種の実施形態では、Ｕ−２５１細胞における血清飢餓条件下での抗体の生物学的阻害についてのＩＣ５０は、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、又は１００ナノモル濃度以下である。
【００６５】
ある種の実施形態では、本明細書に開示した治療用抗体は、ＬＩＦを発現する腫瘍及び癌を治療するのに有用である。ある種の実施形態では、この開示の抗体で治療される個人は、ＬＩＦ陽性腫瘍／癌を有する場合の治療について選択されている。ある種の実施形態では、腫瘍は、ＬＩＦ陽性である、又は上昇したレベルのＬＩＦを生じる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ陽性は、基準値、又は一連の病理学的基準と比較して決定される。ある種の実施形態では、ＬＩＦ陽性腫瘍は、その腫瘍が由来する非形質転換細胞よりも２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍大きい、又はそれよりも大きいＬＩＦを発現する。ある種の実施形態では、腫瘍は、ＬＩＦの異所性発現を受けている。ＬＩＦ陽性腫瘍は、例えば抗ＬＩＦ抗体を用いる免疫組織化学を使用して組織学的に；一般的に使用される分子生物学方法、例えばリアルタイムＰＣＲ若しくはＲＮＡ−ｓｅｑによるｍＲＮＡ定量化；又は、例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、若しくは同種タンパク質定量化アッセイ（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標））によるタンパク質定量化などによって決定することができる。ある種の実施形態では、この抗体は、癌と診断された患者を治療するために使用することができる。ある種の実施形態では、癌は、１つ以上の癌幹細胞を含む、又は１つ以上の癌幹細胞である。
【００６６】
ある種の実施形態では、本明細書に開示した抗体は、ＬＩＦ受容体（ＣＤ１１８）を発現する癌における腫瘍を治療するのに有用である。ＬＩＦ受容体陽性の腫瘍は、病理組織学又はフローサイトメトリーによって決定することができ、ある種の実施形態では、アイソタイプ対照よりも２×、３×、４×、５×、１０×又はそれよりも多いＬＩＦ受容体抗体と結合する細胞を含む。ある種の実施形態では、腫瘍は、ＬＩＦ受容体の異所性発現を受けている。ある種の実施形態では、癌は、癌幹細胞である。ある種の実施形態では、ＬＩＦ陽性の腫瘍又は癌は、抗ＬＩＦ及び抗ＬＩＦ抗体を使用する免疫組織化学によって決定することができる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ陽性の腫瘍は、腫瘍の最高１０％、２０％、３０％、４０％、又は最高５０％におけるＬＩＦレベルを用いるＩＨＣ分析によって決定される。
【００６７】
ある種の実施形態では、癌は、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、及び肝臓腫瘍を含む。ある種の実施形態では、本発明の抗体で治療することができる腫瘍は、腺腫、腺癌、血管肉腫、星細胞腫、上皮癌、胚細胞腫、膠芽腫、神経膠腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫及び／又は奇形腫を含む。ある種の実施形態では、腫瘍／癌は、末端黒子型黒色腫、日光角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管カルチノイド（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｉｄ）、癌腫、癌肉腫、胆管癌、軟骨肉腫、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣肉腫（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、スウィング肉腫（Ｓｗｉｎｇ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、限局性結節性過形成、ガストロノーマ（ｇａｓｔｒｏｎｏｍａ）、生殖系列腫瘍、膠芽腫、グルカゴノーマ、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝細胞癌、インスリナイト（ｉｎｓｕｌｉｎｉｔｅ）、上皮内腫瘍、上皮内扁平上皮癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、浸潤性扁平上皮癌、大細胞癌、脂肪肉腫、肺癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、神経鞘腫、髄芽腫、髄上皮腫、中皮腫、粘表皮癌、骨髄性白血病、神経芽腫、神経上皮腺癌、結節性型黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、漿液性乳頭状腺癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、前立腺癌、肺芽腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、有棘細胞癌、小細胞癌、軟部組織癌（ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ソマトスタチン産生腫瘍（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ）、扁平上皮癌、有棘細胞癌、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、疣状癌、膣／外陰癌、ＶＩＰ産生腫瘍、及びウィルムス腫瘍の群から選択される。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の抗体で治療されるべき腫瘍／癌は、脳癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病、プレＢ細胞急性リンパ性白血病、膀胱癌、星細胞腫、好ましくはグレードＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ星細胞腫、膠芽腫、多形神経膠芽腫、小細胞癌、及び非小細胞癌、好ましくは非小細胞肺癌、肺腺癌、転移性黒色腫、アンドロゲン非依存性転移性前立腺癌、アンドロゲン依存性転移性前立腺癌、前立腺腺癌、及び乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、好ましくは乳管癌、及び／又は乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む。ある種の実施形態では、この開示の抗体で治療される癌は、膠芽腫を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、膵癌を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、卵巣癌を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、肺癌を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、前立腺癌を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、結腸癌を含む。ある種の実施形態では、治療される癌は、膠芽腫、膵癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、又は肺癌を含む。ある種の実施形態では、癌は、他の治療に対して抵抗性である。ある種の実施形態では、治療される癌は、再発性である。ある種の実施形態では、癌は、再発した／抵抗性の膠芽腫、膵癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、又は肺癌である。ある種の実施形態では、癌は、進行した固形腫瘍、膠芽腫、胃癌、皮膚癌、前立腺癌、膵癌、乳癌、精巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、食道癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、リンパ腫、又は軟部組織癌を含む。ある種の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、卵巣上皮癌、又は膵臓腺癌を含む。ある種の実施形態では、癌は、進行した固形腫瘍を含む。ある種の実施形態では、癌は、虫垂癌、直腸癌、転移性粘液性脂肪肉腫、及び傍神経節腫を含む。
【００６８】
治療方法
ある種の実施形態では、治療用抗体は、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、又は脳内などの、抗体含有医薬組成物の投与に適したあらゆる経路によって投与することができる。ある種の実施形態では、抗体は、静脈内に投与される。ある種の実施形態では、抗体は、好適な投薬スケジュールで（例えば、毎週、週２回、毎月、月２回など）投与される。ある種の実施形態では、抗体は、３週に１回投与される。抗体は、あらゆる治療有効量で投与することができる。ある種の実施形態では、治療的に許容される量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇである。ある種の実施形態では、治療的に許容される量は、約１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇである。ある種の実施形態では、治療的に許容される量は、約５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇである。治療用抗体は、ｈ５Ｄ８抗体が投与される個人の重量又は質量とは無関係に、一定の用量で投与することができる。ｈ５Ｄ８抗体は、個人が少なくとも約３７．５キログラムの質量を有するという条件で、治療用抗体が投与される個人の重量又は質量とは無関係に、一定の用量で投与することができる。約７５ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約２２５ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、約７５０ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、約１１２５ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、又は約１５００ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約７５ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約２２５ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約７５０ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約１１２５ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約１５００ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約２０００ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。
【００６９】
治療用抗体の他の投薬量も企図される。約５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０、１９７５、２０２５、２０５０、２０７５、又は２１００ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。これらの用量のいずれかを、週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回投与することができる。
【００７０】
治療用抗体は、治療用抗体が投与される個人の重量又は質量に基づく用量で投与することができる。約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約３ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、約１０ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、約１５ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、又は約２０ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約１ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量のｈ５Ｄ８を投与することができる。約３ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約１０ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約１５ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約２０ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約２５ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。
【００７１】
本明細書に記載されるアッセイは、治療用抗体での治療を受けている個人における標的結合をモニタリングするために使用することができる。例えば、個人が、複数の投与を受けているならば、総ＬＩＦレベルは、治療用抗体での標的結合を確認するために、定期的に測定することができる。ある種の実施形態では、このアッセイは、１クールの治療全体を通して定期的に、例えば毎週、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回、６週に１回、７週に１回、又は８週に１回実施される。総ＬＩＦのレベルが、基準レベルよりも上に維持される、又は個人の治療前レベルと比較して上昇されるならば、より短期のスケジュール又は投薬量の増大などの治療変更は施されない。ある種の実施形態では、基準レベルは、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｎｇ／ｍＬを超える。
【００７２】
このアッセイはまた、総ＬＩＦレベルが基準レベルよりも低くなる又は治療前レベルと比較して増大されない場合に投薬量を増大させる又は投薬スケジュールを短縮するために使用することもできる。ある種の実施形態では、基準レベルは、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｎｇ／ｍＬである。
【００７３】
本明細書に記載されるアッセイが、個人における総ＬＩＦが、以前の投与後に、ある種の基準レベル未満である又はある種の基準量よりも増大が小さいことを示す結果を返すならば、抗体投与のスケジュールを、最初のスケジュールが３週に１回であった場合には週１回又は２週に１回に短縮することができる。本明細書に記載されるアッセイが、個人における総ＬＩＦが、以前の投与後に、ある種の基準レベル未満である又はある種の基準量よりも増大が小さいことを示す結果を返すならば、抗体投与のスケジュールを、最初のスケジュールが４週に１回であった場合には１、２、又は３週に１回に短縮することができる。
【００７４】
本明細書に記載されるアッセイが、個人における総ＬＩＦが、以前の投与後に、ある種の基準レベル未満である又はある種の基準量よりも増大が小さいことを示す結果を返すならば、投与される抗体の量を、以前の投与と比較して約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、又は３００％増大させることができる。
【００７５】
本明細書に記載されるアッセイが、個人における総ＬＩＦが、以前の投与後に、ある種の基準レベル未満である又はある種の基準量よりも増大が小さいことを示す結果を返すならば、抗体投与の量を、以前の投与が約１５００ミリグラム、約１１２５、約７５０ミリグラム、約２２５ミリグラム、又は約７５ミリグラムであった場合には約２０００ミリグラムまで増大させることができる。
【００７６】
本明細書に記載されるアッセイが、個人における総ＬＩＦが、以前の投与後に、ある種の基準レベル未満である又はある種の基準量よりも増大が小さいことを示す結果を返すならば、投与される抗体の量を、以前の投与が約１１２５、約７５０ミリグラム、約２２５ミリグラム、又は約７５ミリグラムであった場合には約２０００ミリグラム又は約１５００ミリグラムまで増大させることができる。
【００７７】
本明細書に記載されるアッセイが、個人における総ＬＩＦが、以前の投与後に、ある種の基準レベル未満である又はある種の基準量よりも増大が小さいことを示す結果を返すならば、投与される抗体の量を、以前の投与が約７５０ミリグラム、約２２５ミリグラム、又は約７５ミリグラムであった場合には約２０００ミリグラム、約１５００ミリグラム、又は約１１２５ミリグラムまで増大させることができる。
【００７８】
本明細書に記載されるアッセイが、個人における総ＬＩＦが、以前の投与後に、ある種の基準レベル未満である又はある種の基準量よりも増大が小さいことを示す結果を返すならば、投与される抗体の量を、以前の投与が約２２５ミリグラム、又は約７５ミリグラムであった場合には約２０００ミリグラム、約１５００ミリグラム、又は約１１２５ミリグラム、又は約７５０ミリグラムまで増大させることができる。
【００７９】
本明細書に記載されるアッセイが、個人における総ＬＩＦが、以前の投与後に、ある種の基準レベル未満である又はある種の基準量よりも増大が小さいことを示す結果を返すならば、投与される抗体の量を、以前の投与が約７５ミリグラムであった場合には約２０００ミリグラム、約１５００ミリグラム、又は約１１２５ミリグラム、又は約７５０ミリグラム、又は約２２５ミリグラムまで増大させることができる。
【００８０】
本明細書に記載されるアッセイはまた、抗ＬＩＦ治療用抗体での治療について患者を選択するために使用することもできる。ある種の実施形態では、抗ＬＩＦ治療用抗体で治療されていない個人を、生体試料中の総ＬＩＦレベルが約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｐｇ／ｍＬ、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｎｇ／ｍＬを超えるならば、抗ＬＩＦ治療用抗体で治療することができる。ある種の実施形態では、生体試料は、血液、血清、又は血漿である。ある種の実施形態では、抗ＬＩＦ治療用抗体は、ｈ５Ｄ８である。
【００８１】
本明細書で詳述した用量のいずれかを、少なくとも約６０分という時間をかけてｉ．ｖ．投与することができる；しかし、この時間は、それぞれ個々の投与に関する条件に基づいて、いくらか変動する可能性がある。
【００８２】
薬学的に許容し得る補形薬、担体、及び希釈剤
ある種の実施形態では、本開示の抗体は、無菌の溶液に懸濁して投与される。ある種の実施形態では、この溶液は、生理学的に適切な塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）を含む。ある種の実施形態では、この溶液は、約０．６％〜１．２％のＮａＣｌを含む。ある種の実施形態では、この溶液は、約０．７％〜１．１％のＮａＣｌを含む。ある種の実施形態では、この溶液は、約０．８％〜１．０％のＮａＣｌを含む。ある種の実施形態では、抗体の高度に濃縮されたストック溶液を、約０．９％のＮａＣｌに希釈することができる。ある種の実施形態では、溶液は、約０．９％のＮａＣｌを含む。ある種の実施形態では、溶液は、緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸、ヒスチジン、コハク酸、リン酸、炭酸水素、及びヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）；界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート及びポロクサマー１８８；ポリオール／二糖／多糖、例えば、グルコース、デキストロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、及びデキストラン４０；アミノ酸、例えば、ヒスチジン、グリシン、又はアルギニン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン；並びにキレート剤、例えば、ＥＧＴＡ又はＥＧＴＡのうちの１種以上をさらに含む。ある種の実施形態では、本開示の抗体は、凍結乾燥して輸送／保管され、投与前に再構成される。ある種の実施形態では、凍結乾燥される抗体製剤は、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、及びデキストラン４０などの充填剤を含む。ある種の実施形態では、この開示の抗ＬＩＦ抗体は、使用される治療場所で希釈されることとなる濃縮されたストック溶液として輸送及び保管することができる。ある種の実施形態では、このストック溶液は、約２５ｍＭのヒスチジン、約６％のスクロース、約０．０１％のポリソルベート、及び約２０ｍｇ／ｍＬの抗ＬＩＦ抗体を含む。ある種の実施形態では、この溶液のｐＨは、約６．０である。ある種の実施形態では、個人に投与される形態は、約２５ｍＭのヒスチジン、約６％のスクロース、約０．０１％のポリソルベート８０、及び約２０ｍｇ／ｍＬのｈ５Ｄ８抗体を含む水溶液である。ある種の実施形態では、この溶液のｐＨは、約６．０である。
【００８３】
実施形態
以下の実施形態は、本開示の態様のさらなる具体例である。１．癌を有する個人を治療する方法であって、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の初回投与を個人に施すことと；（ｂ）癌を有する個人からの試料中の白血病抑制因子（ＬＩＦ）の初回投与後レベルを決定することとを含む方法。２．白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する後続用量の抗体を投与することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。３．ＬＩＦの初回投与後レベルを決定することが、実施形態１から２のいずれか１つに記載の方法によって実施される、実施形態１に記載の方法。４．ＬＩＦ治療用抗体が、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；（ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；（ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；（ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；（ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び（ｆ）配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、実施形態１の方法。５．ＬＩＦ治療用抗体が、（ａ）配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び（ｂ）配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む、実施形態１の方法。６．ＬＩＦ治療用抗体が、（ａ）配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び（ｂ）配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列を含む、実施形態１の方法。７．ＬＩＦの初回投与後レベルは、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して増大せず、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される、実施形態２から６のいずれか１つの方法。８．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される、実施形態２から６のいずれか１つの方法。９．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される、実施形態２から６のいずれか１つの方法。１０．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して増大せず、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される、実施形態２から６のいずれか１つの方法。１１．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される、実施形態２から６のいずれか１つの方法。１２．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される、実施形態２から６のいずれか１つの方法。１３．初回投与が、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の最初の投与である、実施形態１から１２のいずれか１つの方法。１４．初回投与が、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の複数の投与におけるいずれかの投与である、実施形態１から１２のいずれか１つの方法。１５．癌を有する個人を治療する方法であって、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体を含む初回投与を個人に施すことと；（ｂ）癌を有する個人からの試料における白血病抑制因子（ＬＩＦ）の初回投与後レベルを得ることとを含む方法。１６．白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する後続用量の抗体を投与することをさらに含む、実施形態１５の方法。１７．ＬＩＦ治療用抗体が、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；（ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；（ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；（ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；（ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及びｆ．配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、実施形態１５の方法。１８．ＬＩＦ治療用抗体が、（ａ）配列番号１４、１５、１７、又は３８のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）配列；及び（ｂ）配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む、実施形態１５の方法。１９．ＬＩＦ治療用抗体が、（ａ）配列番号３０〜３３又は３９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖配列；及び（ｂ）配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖配列を含む、実施形態１５の方法。２０．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの初回治療前レベルと比較して増大せず、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される、実施形態１６から１９のいずれか１つの方法。２１．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される、実施形態１６から１９のいずれか１つの方法。２２．ＬＩＦの初回投与後レベルが、検出可能であり、且つ１ミリリットルあたり２ナノグラム未満であり、ここでは、初回用量と比較して増大させた量の後続用量が投与される、実施形態１６から１９のいずれか１つの方法。２３．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの治療前レベルと比較して増大せず、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される、実施形態１６から１９のいずれか１つの方法。２４．ＬＩＦの初回投与後レベルが、個人におけるＬＩＦの初回投与前レベルと比較して２倍以下の増大を示し、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される、実施形態１６から１９のいずれか１つの方法。２５．ＬＩＦの初回投与後レベルが、検出可能であり、且つ１ミリリットルあたり２ナノグラム未満であり、ここでは、後続用量は、治療スケジュールにおけるより早い時点で投与される、実施形態１６から１９のいずれか１つの方法。２６．初回投与が、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の最初の投与である、実施形態１５から２５のいずれか１つの方法。２７．初回投与が、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と結合する抗体の複数の投与におけるいずれかの投与である、実施形態１５から２５のいずれか１つの方法。２８．ＬＩＦ、ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ捕捉抗体、ＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ検出抗体、及び任意に、ＬＩＦと特異的に結合するＬＩＦ治療用抗体を含むＬＩＦ複合体（ここでは、ＬＩＦ検出又はＬＩＦ捕捉抗体は、Ａ４又はそのＬＩＦ結合断片を含む）の使用であって、ＬＩＦを定量化するためのインビトロアッセイである使用。２９．流体中にある、実施形態２８のＬＩＦ複合体。３０．アッセイが、２０％未満の内的変動を有する、実施形態２８の複合体。３１．ＬＩＦを含む個人からの試料中の白血病抑制因子（ＬＩＦ）を定量化する方法であって、ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦに特異的に結合する捕捉抗体と接触させることと；ＬＩＦを含む試料を、ＬＩＦと特異的に結合する検出抗体と接触させることと；捕捉抗体及び検出抗体に結合されている、試料中のＬＩＦを検出することとを含み、ここでＬＩＦ検出又はＬＩＦ捕捉抗体は、Ａ４又はそのＬＩＦ結合断片を含む、インビトロで実施される、方法。３２．ＬＩＦがヒトＬＩＦである、実施形態３１の方法。３３．ＬＩＦが、１ミリリットルあたり１ナノグラムのレベルで検出可能である、実施形態３１の方法。３４．アッセイが、２０％未満の内的変動を有する、実施形態３１の方法。３５．個人がヒト個人である、実施形態３１の方法。３６．試料中のＬＩＦを定量化することをさらに含む、実施形態３１の方法。３７．ＬＩＦを含む試料が、流体中にある、実施形態３６の方法。３８．試料中のＬＩＦの量に関する情報を含む報告を伝えることをさらに含む、実施形態３１の方法。３９．白血病抑制因子（ＬＩＦ）結合抗体又はその断片であって、配列番号４１に示したアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列；及び配列番号４２に示したアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含むＬＩＦ結合抗体又はその断片。４０．ＬＩＦを定量化するためのインビトロアッセイにおける、実施形態３９のＬＩＦ結合抗体の使用。
【実施例】
【００８４】
次の実例は、本明細書に記載される組成物及び方法の実施形態を代表するものであり、決して制限的であることが意図されない。
【００８５】
実施例１−ＬＩＦに特異的なラット抗体の産生
ヒトＬＩＦのアミノ酸２３〜２０２をコードするｃＤＮＡを、発現プラスミド（Ａｌｄｅｖｒｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングした。実験用ラット（Ｗｉｓｔａｒ）の群に、微粒子撃ち込み（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（「遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）」）のための手持ち型装置を使用するＤＮＡコーティングされた金粒子の皮内適用によって、免疫化した。一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞上の細胞表面発現を、ＬＩＦタンパク質のＮ末端に付加されたタグを認識する抗タグ抗体を用いて確認した。一連の免疫化後に、血清試料を収集し、前述の発現プラスミドを用いて一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対してフローサイトメトリーで試験した。抗体産生細胞を単離し、標準の手順に従って、マウス骨髄腫細胞（Ａｇ８）と融合させた。上に記載した通りにフローサイトメトリー分析においてスクリーニングを行うことによって、ＬＩＦに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを特定した。ＲＮＡ保護剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＲＮＡｌａｔｅｒ，ｃａｔ．＃ＡＭ７０２０）を使用して、陽性のハイブリドーマ細胞の細胞ペレットを調製し、抗体の可変ドメインの配列決定のためにさらに処理した。
【００８６】
実施例２−ＬＩＦに特異的なマウス抗体の産生
ヒトＬＩＦのアミノ酸２３〜２０２をコードするｃＤＮＡを、発現プラスミド（Ａｌｄｅｖｒｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングした。実験用マウス（ＮＭＲＩ）の群に、微粒子撃ち込み（「遺伝子銃」）のための手持ち型装置を使用するＤＮＡコーティングされた金粒子の皮内適用によって、免疫化した。一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞上の細胞表面発現を、ＬＩＦタンパク質のＮ末端に付加されたタグを認識する抗タグ抗体を用いて確認した。一連の免疫化後に、血清試料を収集し、前述の発現プラスミドを用いて一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対してフローサイトメトリーで試験した。抗体産生細胞を単離し、標準の手順に従って、マウス骨髄腫細胞（Ａｇ８）と融合させた。上に記載した通りにフローサイトメトリー分析においてスクリーニングを行うことによって、ＬＩＦに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを特定した。ＲＮＡ保護剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＲＮＡｌａｔｅｒ，ｃａｔ．＃ＡＭ７０２０）を使用して、陽性のハイブリドーマ細胞の細胞ペレットを調製し、抗体の可変ドメインの配列決定のためにさらに処理した。
【００８７】
実施例３−ＬＩＦに特異的なラット抗体のヒト化
それに続くヒト化のために、ラット免疫化（５Ｄ８）からの１つのクローンを選択した。ヒト化は、標準のＣＤＲグラフティング方法を使用して行った。重鎖及び軽鎖領域を、標準の分子クローニング技術を使用して、５Ｄ８ハイブリドーマからクローニングし、サンガー法によって配列決定した。次いで、ヒト重鎖及び軽鎖可変配列に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行い、それぞれからの４つの配列を、ヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択した。これらのアクセプターフレームワークを脱免疫原性化して、Ｔ細胞応答エピトープを除去した。５Ｄ８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、４つの異なる重鎖アクセプターフレームワーク（Ｈ１からＨ４）、及び４つの異なる軽鎖フレームワーク（Ｌ１からＬ４）にクローニングした。次いで、１６個の異なる抗体をすべて、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｓｅｌｅｘｉｓ）における発現；ＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害；及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合親和性について試験した。これらの実験を、以下にまとめて示す。
【００８８】
【表１】
2021528411.tif 000003
【００８９】
トランスフェクトした細胞の発現性能を、エルレンマイヤーフラスコ（３×１０５細胞／ｍＬ播種、２００ｍＬ培養体積）中で、流加培養で、１０日の細胞培養後に、比較した。この時点で、細胞を回収し、分泌された抗体をプロテインＡカラムを使用して精製し、次いで定量化した。Ｈ３重鎖を使用するものを除いて、すべてのヒト化抗体が発現した。Ｈ２及びＬ２可変領域は、他の可変領域と比較して、良い成果を果たした（配列番号１５及び配列番号１９）。
【００９０】
チロシン７０５でのＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を、ウエスタンブロットによって決定した。Ｕ２５１神経膠腫細胞を、１００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、あらゆる処理の前に、完全培地で２４時間培養し、その後、細胞を、８時間、血清飢餓状態にした。その後、細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度の指示された抗体で、一晩処理した。処理後、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液中でタンパク質を得、定量化し（ＢＣＡ−タンパク質定量法、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウエスタンブロットに使用した。ウエスタンブロットについては、メンブレンを、５％脱脂粉乳−ＴＢＳＴ中で１時間ブロッキングし、一次抗体と共に一晩（ｐ−ＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１４５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ若しくはＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１３２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は３０分（β−アクチン−ペルオキシダーゼ、ｃａｔａｌｏｇ＃Ａ３８５４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）インキュベートした。次いで、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、再び洗浄した。タンパク質を、化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ｃａｔａｌｏｇ＃３４０７６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。これらの結果を、図１に示す。ｐＳＴＡＴ３バンドの色が濃いほど、存在する阻害が小さい。阻害は、５Ｄ８（非ヒト化ラット）、Ａ（Ｈ０Ｌ０）、Ｃ（Ｈ１Ｌ２）、Ｄ（Ｈ１Ｌ３）、及びＧ（Ｈ２Ｌ２）と標識が付けられたレーンでは高かった；阻害は、Ｈ（Ｈ２Ｌ３）、Ｏ（Ｈ４Ｌ２）、及びＰ（Ｈ４Ｌ３）では中程度であった；阻害は、Ｂ（Ｈ１Ｌ１）、Ｅ（Ｈ１Ｌ４）、Ｆ（Ｈ２Ｌ１）、Ｉ（Ｈ２Ｌ４）、Ｎ（Ｈ４Ｌ１）、及びＱ（Ｈ４Ｌ４）では存在しなかった。
【００９１】
次いで、ＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を呈する抗体を、ＳＰＲによって分析して、結合親和性を決定した。簡単に言うと、アミンカップリングｈＬＩＦに対するＡ（Ｈ０Ｌ０）、Ｃ（Ｈ１Ｌ２）、Ｄ（Ｈ１Ｌ３）、及びＧ（Ｈ２Ｌ２）、Ｈ（Ｈ２Ｌ３）及びＯ（Ｈ４Ｌ２）ヒト化抗体の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２００２装置を使用して観察した。速度定数及び親和性を、６つのリガンド濃度でのすべてのセンサーチップ表面上でもたらされたすべてのセンサーグラムの数学的センサーグラムフィッティング（ラングミュア相互作用モデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ］）によって決定した。各濃度の最も適合する曲線（最小カイ二乗）を、速度定数及び親和性の算出のために使用した。表１を参照されたい。
【００９２】
実験手順は、検体として二価抗体を使用したので、ヒト化抗体の標的結合機構へのより詳細な洞察を得るために、最も適合するセンサーグラムをまた、二価検体フィッティングモデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ；ＡＢ＋Ｂ＝ＡＢ２］に基づいて分析した。二価フィッティングモデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ；ＡＢ＋Ｂ＝ＡＢ２］を使用するセンサーグラム動態解析によって、ｍＡｂ試料の相対的親和性順位が確認された。
【００９３】
その高い結合親和性、及び回分培養からの高い収率により、より掘り下げた分析のために、Ｈ２及びＬ２を含むヒト化５Ｄ８を選択した。
【００９４】
実施例４−クローン５Ｄ８のヒト化はＬＩＦに対する結合を向上させる
さらなる分析のために、Ｈ２Ｌ２クローン（ｈ５Ｄ８）を選択し、ＳＰＲによって、結合を、親ラット５Ｄ８（ｒ５Ｄ８）及びマウスクローン１Ｂ２と比較した。１Ｂ２抗体は、以前にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５４）に寄託された、以前に開示されたマウス抗ＬＩＦ抗体であり、比較目的で含められた。それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＨＥＫ−２９３細胞から精製された組換え型ヒトＬＩを、リガンドとして使用した。ヒト又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）起源からのＬＩＦを、アミンカップリング化学を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ光学センサーチップの表面に共有結合させ、速度定数から結合親和性を算出した。
【００９５】
材料及び方法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のヒトＬＩＦは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（参照記号ＬＩＦ  １０１０）から入手し；ＨＥＫ−２９３細胞由来のヒトＬＩＦは、ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（参照記号ＬＩＦ−Ｈ５２１ｂ）から入手した。ＬＩＦを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＲ−１０００−５０；ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ）を使用して、センサーチップにカップリングさせた。試料は、ＣＭ５光学センサーチップ（ＢＲ−１０００−１２；ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ）を使用するＢｉａｃｏｒｅ（商標）２００２装置に流した。機械の稼働中、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を使用した（ＢＲ−１００１−８８；ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ）。結合センサーグラムの動態解析を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアを使用して実施した。速度定数及び親和性を、漸増する検体濃度でのすべてのセンサーチップ表面上でもたらされたすべてのセンサーグラムの数学的センサーグラムフィッティング（ラングミュア相互作用モデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ］）によって決定した。決定されたラングミュア抗体−標的親和性に対する二価の寄与（例えば、結合活性の寄与）についての見積もりをもたらすために、センサーグラムをまた、主成分分析を含めて、二価検体センサーグラムフィッティングモデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ；ＡＢ＋Ｂ＝ＡＢ２］に基づいて分析した。各濃度の最も適合する曲線（最小カイ二乗）を、速度定数及び親和性の算出のために使用した。これらの親和性実験の概要を、表２（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において作られたヒトＬＩＦ）及び表３（ＨＥＫ２９３細胞において作られたヒトＬＩＦ）に示す。
【００９６】
【表２】
2021528411.tif 000004
【００９７】
【表３】
2021528411.tif 000005
【００９８】
この一連の実験から、ラングミュア１：１センサーグラムフィッティングモデルは、ヒト化５Ｄ８（ｈ５Ｄ８）抗体が、マウス１Ｂ２及びｒ５Ｄ８よりも約１０〜２５倍高い親和性で、ヒトＬＩＦに結合したことを示す。
【００９９】
次に、ｈ５Ｄ８抗体を、ＳＰＲによって、複数の種のＬＩＦに対して試験した。ｈ５Ｄ８  ＳＰＲ結合速度解析を、異なる種及び発現系由来の組換え型ＬＩＦ検体：ヒトＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＨＥＫ２９３細胞）；マウスＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ細胞）；ラットＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））；カニクイザルＬＩＦ（酵母、ＨＥＫ２９３細胞）について実施した。
【０１００】
材料及び方法
ｈ５Ｄ８抗体を、非共有結合性の、Ｆｃ特異的な捕捉によって、センサーチップ表面に固定した。ＬＩＦ検体に対する抗ＬＩＦ抗体の立体的に均一且つフレキシブルな提示を可能にする、組換え型の、Ｉｇ（Ｆｃ）特異的な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ／Ｇを、捕捉剤として使用した。ＬＩＦ検体の供給源は、次の通りである：ヒトＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）より；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ参照記号ＬＩＦ  １０５０）；ヒトＬＩＦ（ＨＥＫ細胞よりＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＩＦ−Ｈ５２１）；マウスＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ  ＮＦ−ＬＩＦ２０１０）；マウスＬＩＦ（ＣＨＯ細胞より；Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ  Ｃａｔａｌｏｇ＃  ＲＣＰ０９０５６）；サルＬＩＦ（酵母  Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ＃  ＲＰ１０７４Ｙ）；ＨＥＫ−２９３細胞において産生されるサルＬＩＦ。全ｈ５Ｄ８が、いくつかの種由来のＬＩＦに対する結合を呈した。この親和性実験の概要を、表４に示す。
【０１０１】
【表４】
2021528411.tif 000006
【０１０２】
実施例５−ヒト化クローン５Ｄ８は、ＳＴＡＴ３のＬＩＦ誘発リン酸化をインビトロで阻害する
ｈ５Ｄ８の生物学的活性を決定するために、ＬＩＦ活性化の細胞培養モデルにおいて、ヒト化及び親型を試験した。図２Ａは、神経膠腫細胞株をヒトＬＩＦと共にインキュベートした場合に、ヒト化クローンが、ＳＴＡＴ３リン酸化（Ｔｙｒ  ７０５）の阻害の増大を呈したことを示す。図２Ｂは、異なる希釈のｈ５Ｄ８抗体を用いて再び行った、図２Ａと同じ手順を用いた実験を示す。
【０１０３】
方法
Ｕ２５１神経膠腫細胞を、１５０，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、あらゆる処理の前に、完全培地で２４時間培養した。その後、細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度のｒ５Ｄ８抗ＬＩＦ抗体又はｈ５Ｄ８抗ＬＩＦ抗体で、一晩処理した、又はしなかった（対照細胞）。
【０１０４】
処理後、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液中でタンパク質を得、定量化し（ＢＣＡ−タンパク質定量法、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウエスタンブロットに使用した。ウエスタンブロットについては、メンブレンを、５％脱脂粉乳−ＴＢＳＴ中で１時間ブロッキングし、一次抗体と共に一晩（ｐ−ＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１４５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ若しくはＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１３２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は３０分（β−アクチン−ペルオキシダーゼ、ｃａｔａｌｏｇ＃Ａ３８５４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）インキュベートした。次いで、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、必要であれば二次抗体と共にインキュベートし、再び洗浄した。タンパク質を、化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ｃａｔａｌｏｇ＃３４０７６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。
【０１０５】
実施例６−Ｕ−２５１細胞における内在レベルのＬＩＦに対するｈ５Ｄ８抗体処理のＩＣ５０値
Ｕ−２５１細胞において、血清飢餓条件下で、ｈ５Ｄ８についての生物学的阻害に対する４９０ピコモル濃度（図３Ａ）と低いＩＣ５０も決定された。代表的な結果図３Ａ及び３Ｂ及び表５を参照されたい。
【０１０６】
【表５】
2021528411.tif 000007
【０１０７】
方法
Ｕ−２５１細胞を、（条件あたり）６ｃｍプレートあたり６００，０００細胞で蒔いた。細胞を、対応する濃度（段階希釈（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ））のｈ５Ｄ８で、血清飢餓（０．１％  ＦＢＳ）下で３７℃で一晩処理した。ｐＳＴＡＴ３についての陽性対照として、組換え型ＬＩＦ（Ｒ＆Ｄ  ＃７７３４−ＬＦ／ＣＦ）を使用して、１．７９ｎＭで、３７℃で１０分間、細胞を刺激した。ｐＳＴＡＴ３の陰性対照として、ＪＡＫ  Ｉ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＃４２００９９）を、１μＭで、３７℃で３０分間使用した。次いで、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｏｔａｌ  ＳＴＡＴ３（Ｃａｔ＃  Ｋ１５０ＳＮＤ−２）及びＰｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｃａｔ＃  Ｋ１５０ＳＶＤ−２）キットのプロトコルに従って、細胞を、ライセートのために氷上に回収して、ＭＳＤ  Ｍｅｓｏ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｓ６００によって、検出可能なタンパク質レベルを測定した。
【０１０８】
実施例７−ヒトＬＩＦに特異的に結合する追加の抗体
ヒトＬＩＦと特異的に結合する他のラット抗体クローン（１０Ｇ７及び６Ｂ５）を特定し、その結合特性の概要を、下の表６に示す（クローン１Ｂ２は比較としての役割を果たす）。
【０１０９】
方法
検体として、組換え型ＬＩＦ標的タンパク質［ヒトＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＩＦ  １０１０及びヒトＬＩＦ（ＨＥＫ２９３細胞）；ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＩＦ−Ｈ５２１ｂ］を適用して、ＣＭ５光学センサーチップの表面上に固定された抗ＬＩＦ  ｍＡｂｓ  １Ｂ２、１０Ｇ７、及び６Ｂ５について、リアルタイム結合動態解析を実施した。
【０１１０】
速度定数及び親和性は、グローバルフィッティング（センサーグラムセットの同時フィッティング）並びに単一曲線フィッティングアルゴリズムを適用して、ラングミュア１：１結合モデルを使用する数学的センサーグラムフィッティングによって得た。グローバルフィットの妥当性を、ｋｏｂｓ解析によって評価した。
【０１１１】
【表６】
2021528411.tif 000008
【０１１２】
実施例８−ＳＴＡＴ３のＬＩＦ誘発リン酸化をインビトロで阻害する追加の抗ＬＩＦ抗体
追加のクローンを、細胞培養において、ＳＴＡＴ３のＬＩＦ誘発リン酸化を阻害するその能力について試験した。図４に示す通り、クローン１０Ｇ７及び以前に詳述したｒ５Ｄ８は、１Ｂ２クローンと比較して、ＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の高い阻害を呈した。抗ＬＩＦポリクローナル抗血清（ｐｏｓ．）は、陽性対照として含まれていた。６Ｂ５は、阻害を呈さなかったが、これは、この実験で使用された非グリコシル化ＬＩＦに対する６Ｂ５結合が存在しない可能性によって説明することができる。
【０１１３】
方法
患者由来の神経膠腫細胞を、１５０，０００細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、あらゆる処理の前に、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２［ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ］）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から構成されるＧＢＭ培地中で、２４時間培養した。次の日、細胞を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生された組換え型ＬＩＦ、又は組換え型ＬＩＦプラス指示された抗体の混合物で、１５分間処理した、又はしなかった（抗体については１０μｇ／ｍｌの最終濃度、及び２０ｎｇ／ｍｌの組換え型ＬＩＦ）。処理後、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液中でタンパク質を得、定量化し（ＢＣＡ−タンパク質定量法、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウエスタンブロットに使用した。ウエスタンブロットについては、メンブレンを、５％脱脂粉乳−ＴＢＳＴ中で１時間ブロッキングし、一次抗体と共に一晩（ｐ−ＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１４５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は３０分（β−アクチン−ペルオキシダーゼ、ｃａｔａｌｏｇ＃Ａ３８５４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）インキュベートした。次いで、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、必要であれば二次抗体と共にインキュベートし、再び洗浄した。タンパク質を、化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ｃａｔａｌｏｇ＃３４０７６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。
【０１１４】
実施例９−ＬＩＦは複数の腫瘍型にわたって高度に過剰発現される
複数のヒト腫瘍型に対して免疫組織化学を行って、ＬＩＦ発現の程度を決定した。図５に示す通り、ＬＩＦは、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）において高度に発現される。
【０１１５】
実施例１０−ヒト化クローンｈ５Ｄ８は非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
ヒト化５Ｄ８クローンがＬＩＦ陽性癌をインビボで阻害する能力を決定するために、この抗体を、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウスモデルにおいて試験した。図６は、この抗体で治療されたマウスにおける、賦形剤の陰性対照と比較した腫瘍増殖の減少を示す。
【０１１６】
方法
高いＬＩＦレベルを有するマウス非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＫＬＮ２０５を、インビボでの生物発光モニタリングのために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するレンチウイルスに安定に感染させた。マウスモデルを発病させるために、５×１０５個のＫＬＮ２０５非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞を、８週齢の免疫適格性の同系移植ＤＢＡ／２マウスの左肺に、肋間穿刺によって同所性移植した。マウスを、対照賦形剤で又は１５ｍｇ／ｋｇ若しくは３０ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｄ８抗体で（週２回、腹腔内に）治療し、腫瘍増殖を生物発光によってモニタリングした。生物発光画像化のために、マウスは、１〜２％吸入イソフルラン麻酔下で０．２ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−ルシフェリンの腹腔内注射を受けた。生物発光シグナルは、高感度冷却ＣＣＤカメラから構成されるＩＶＩＳシステム２０００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してモニタリングした。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、画像化データをグリッド処理し、囲まれた各領域内の全生物発光シグナルを統合した。データは、対象領域（ＲＯＩ）内の全光子束放射（光子／秒）を使用して解析した。結果は、ｈ５Ｄ８抗体での治療が、腫瘍退縮を促進することを実証する。データは、平均値±ＳＥＭとして示される。
【０１１７】
実施例１１−ｈ５Ｄ８は多形神経膠芽腫のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
ルシフェラーゼ発現ヒト細胞株Ｕ２５１を使用する、同所移植ＧＢＭ腫瘍モデルでは、腹腔内（ＩＰ）注射によって３００μｇ  ｒ５Ｄ８及びｈ５Ｄ８を週２回投与したマウスにおいて、ｒ５Ｄ８は、腫瘍体積を有意に低下させた。この研究の結果を、図７Ａに示す（治療後第２６日に定量化）。この実験をまた、２００μｇ又は３００μｇで治療されるヒト化ｈ５Ｄ８マウスを使用して行い、治療の７日後の腫瘍の統計的に有意な低下が示された。
【０１１８】
方法
ルシフェラーゼを安定に発現するＵ２５１細胞を収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁し、自動セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて計数した。最適な生存能を維持するために、細胞を氷上に維持した。マウスを、ケタミン（Ｋｅｔｏｌａｒ５０（登録商標））／キシラシン（Ｘｙｌａｃｉｎｅ）（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））（それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与で麻酔した。各マウスを、注意深く定位装置に入れ、固定した。脱毛クリームを用いて頭部から毛を除去し、メスで頭部皮膚を切断して、頭蓋骨を露出させた。ラムダに対して横方向１．８ｍｍ且つ前方向１ｍｍの座標に、穿孔器を用いて小さい切開部を注意深く作成した。右線条体に、２．５ｍｍの深さでＨａｍｉｌｔｏｎ  ３０Ｇシリンジを使用して、５μＬの細胞を接種した。Ｈｙｓｔｏａｃｒｙｌ組織接着剤（Ｂｒａｕｎ）を用いて頭部切開部を閉じ、マウスに皮下鎮痛薬メロキシカム（Ｍｅｔａｃａｍ（登録商標））（１ｍｇ／ｋｇ）を注射した。各マウスに移植された最終細胞数は、３×１０５個であった。
【０１１９】
マウスを、腹腔内に投与されるｈ５Ｄ８で週２回治療した。治療は、腫瘍細胞接種の直後、第０日に開始した。マウスは、ｈ５Ｄ８又は賦形剤対照の合計２回の投与を受けた。
【０１２０】
体重及び腫瘍体積：体重は、２回／週、測定し、腫瘍増殖は、第７日に生物発光（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）によって定量化した。生物発光活性をインビボで定量化するために、マウスを、イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を使用して麻酔し、ルシフェリン基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（１６７μｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。
【０１２１】
生物発光（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）によって求められた腫瘍サイズを、第７日に評価した。個々の腫瘍測定値、及び各治療群についての平均値±ＳＥＭを算出した。統計的有意性は、対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定によって決定した。
【０１２２】
実施例１２−ｈ５Ｄ８は卵巣癌のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
ｒ５Ｄ８の有効性を、２つの他の同系移植腫瘍モデルにおいて評価した。卵巣同所移植腫瘍モデルＩＤ８では、３００μｇ  ｒ５Ｄ８（週２回）のＩＰ投与は、腹部体積によって測定された場合に、腫瘍増殖を有意に阻害した（図８Ａ及び８Ｂ）。図８Ｃにおける結果は、ｈ５Ｄ８はまた、２００μｇ以上の用量でも腫瘍体積を低下させたことを示す。
【０１２３】
方法
ＩＤ８細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４０Ｕ／ｍＬペニシリン及び４０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び０．２５μｇ／ｍＬプラスモシン（Ｐｌａｓｍｏｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を添加した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。
【０１２４】
ＩＤ８細胞を収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁した。最適な生存能を維持するために、細胞を氷上に維持し、２００μＬの細胞懸濁液を、２７Ｇ針を用いて腹腔内に注射した。マウスに移植された最終細胞数は、５×１０６個であった。
【０１２５】
マウスは、指示された通りの異なる用量でｉｐ投与されるｈ５Ｄ８で週２回治療した。体重は、２回／週、測定し、腫瘍増悪は、ノギス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して腹囲を測定することによってモニタリングした。
【０１２６】
実施例１３−ｒ５Ｄ８は結腸直腸癌のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
皮下結腸ＣＴ２６腫瘍を有するマウスでは、ｒ５Ｄ８（週２回３００μｇをＩＰ投与される）は、腫瘍増殖を有意に阻害した（図９Ａ及び９Ｂ）。
【０１２７】
方法
ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４０Ｕ／ｍＬペニシリン及び４０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）、及び０．２５μｇ／ｍＬプラスモシン（Ｐｌａｓｍｏｃｉｎ）を添加した、ロズウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＲＰＭＩ［Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）中で培養した。
【０１２８】
ＣＴ２６細胞（８×１０５）を、トリプシン処理し、ＰＢＳですすぎ、４００ｇで５分間遠心分離し、１００μＬ  ＰＢＳに再懸濁した。細胞は、細胞死を回避するために氷上に維持した。ＣＴ２６細胞を、２７Ｇ針を使用する皮下注射を介して、マウスに投与した。
【０１２９】
３００μｇ  ｒ５Ｄ８、又は賦形剤対照を、ＣＴ２６細胞移植後、第３日から、週２回、腹腔内注射（ＩＰ）を介してマウスに投与した。
【０１３０】
体重及び腫瘍体積は、１週間に３回測定した。腫瘍体積は、ノギス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。
【０１３１】
実施例１４−ｒ５Ｄ８は腫瘍モデルにおいて炎症性浸潤を減少させる  
Ｕ２５１  ＧＢＭ同所移植モデルでは、ＣＣＬ２２、すなわちＭ２極性化マクロファージのマーカーの発現は、図１０Ａに示した通り、ｒ５Ｄ８で治療された腫瘍において有意に低下した。この所見はまた、ｒ５Ｄ８を使用する、生理学的に関連する器官型組織片培養モデルにおいても確認され、ここでは、３つの患者試料は、図１０Ｂに示した通り、治療後に、ＣＣＬ２２及びＣＤ２０６（ＭＲＣ１）発現（同様にＭ２マクロファージのマーカー）の有意な低下を示した（ＭＲＣ１とＣＣＬ２２の両方について、左上（対照）を右下（治療）と比較されたい）。さらに、ｒ５Ｄ８はまた、免疫適格性マウスにおける同系移植ＩＤ８（図１０Ｃ）及びＣＴ２６（図１０Ｄ）腫瘍において、ＣＣＬ２２＋Ｍ２マクロファージを減少させた。
【０１３２】
実施例１５−ｒ５Ｄ８は非骨髄性エフェクター細胞を増加させる
さらなる免疫機構を調べるために、腫瘍微小環境内でのＴ細胞及び他の非骨髄性免疫エフェクター細胞に対するｒ５Ｄ８の効果を評価した。卵巣同所移植ＩＤ８同系移植モデルでは、ｒ５Ｄ８治療は、図１１Ａに示した通り、腫瘍内ＮＫ細胞の増加及び全部の及び活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増加をもたらした。同様に、結腸同系移植ＣＴ２６腫瘍モデルでは、ｒ５Ｄ８は、図１１Ｂに示した通り、腫瘍内ＮＫ細胞を増加させ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、また、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ−ｒｅｇ細胞を減少させる傾向があった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ−ｒｅｇ細胞の減少の傾向はまた、図１１Ｃに示した通り、ｒ５Ｄ８治療後の同系移植同所移植ＫＬＮ２０５腫瘍モデルにおいても観察された。有効性を媒介するためのＴ細胞の必要性と一致して、ＣＴ２６モデルにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、図１２に示した通り、ｒ５Ｄ８の抗腫瘍有効性を阻害した。
【０１３３】
Ｔ細胞枯渇のための方法
ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ［Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）、４０Ｕ／ｍＬペニシリン及び４０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ［Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）、及び０．２５μｇ／ｍＬプラスモシン（Ｐｌａｓｍｏｃｉｎ）を添加した、ＲＰＭＩ培養培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＣＴ２６細胞（５×１０５）を、収集し、ＰＢＳですすぎ、４００ｇで５分間遠心分離し、１００μＬ  ＰＢＳに再懸濁した。細胞は、細胞死を回避するために氷上に維持した。ＣＴ２６細胞を、２７Ｇシリンジを使用する皮下注射を介して、マウスの両側腹部に投与した。マウスは、研究デザインにおいて指示された通り、腹腔内投与されるｒ５Ｄ８で週２回治療した。賦形剤対照（ＰＢＳ）、ラットｒ５Ｄ８、及び／又は抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８を、研究デザインにおいて記述した通り、週２回、腹腔内注射（ＩＰ）を介してマウスに投与した。すべての抗体治療は、同時に施された。
【０１３４】
実施例１６−ヒトＬＩＦとの複合体におけるｈ５Ｄ８の結晶構造
ｈ５Ｄ８の結晶構造を、ｈ５Ｄ８が結合するＬＩＦ上のエピトープを決定する、また、結合に関与するｈ５Ｄ８の残基を決定するために、３．１オングストロームの分解能に対して解析した。共結晶構造から、ＬＩＦのＮ末端ループが、ｈ５Ｄ８の軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間の中心に位置することが明らかになった（図１３Ａ）。さらに、ｈ５Ｄ８は、ＬＩＦのヘリックスＡ及びＣ上の残基と相互作用し、それによって、不連続且つ立体構造的エピトープを形成する。結合は、いくつかの塩橋、Ｈ結合、及びファンデルワールス相互作用によって推進される（表７、図１３Ｂ）。ＬＩＦのｈ５Ｄ８エピトープは、ｇｐ１３０との相互作用の領域に及ぶ。Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｎｋｏｖｉｃｈ，Ｊ．，Ｋｏｒｔｅｍｍｅ，Ｔ．，Ｂａｋｅｒ，Ｄ．＆Ｇａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．  Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｐ１３０．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  １２，５７７−５８９（２００３）を参照されたい。これらの結果を、下の表７にまとめて示し、また、図１３に表す。
【０１３５】
【表７】
2021528411.tif 000009
【０１３６】
方法
ＬＩＦは、ＨＥＫ  ２９３Ｓ（Ｇｎｔ  Ｉ−／−）細胞において一過性発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー、それに続いてゲル濾過クロマトグラフィー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中）を使用して精製した。組換え型ｈ５Ｄ８  Ｆａｂは、ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞において一過性発現させ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティクロマトグラフィー、それに続いて陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。精製されたｈ５Ｄ８  ＦａｂとＬＩＦを、１：２．５のモル比で混合し、室温で３０分間インキュベートし、その後ＥｎｄｏＨを使用して脱グリコシル化を行った。続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、複合体を精製した。この複合体を、２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、低密度マトリックススクリーン（ｔｅｓｐａｒｓｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｒｅｅｎ）を使用する結晶化試行のために準備した。１９％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、１９％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０９５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．６）を含有する条件で、４℃で結晶を形成させた。この結晶を、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＣＬＳ）の０８ＩＤ−１ビームラインで、３．１Åの分解能まで回折させた。データを収集し、Ｋａｂｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｘｄｓ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，１２５−１３２（２０１０）の通りにＸＤＳを使用して処理及びスケーリングした。構造は、ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４０，６５８−６７４（２００７）の通りに、Ｐｈａｓｅｒを使用して、分子置換によって決定した。構造が許容されるＲｗｏｒｋ及びＲｆｒｅｅに収束するまで、Ｃｏｏｔ及びｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅを使用して、数回繰り返されるモデル構築及び精密化を実施した。Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｏｔ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，４８６−５０１（２０１０）；及びＡｄａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．ＰＨＥＮＩＸ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，２１３−２２１（２０１０）をそれぞれ参照のこと。図は、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）で作成した。
【０１３７】
実施例１７−ｈ５Ｄ８はＬＩＦに対する高い特異性を有する
ｈ５Ｄ８の他のＬＩＦファミリーメンバーに対する結合を試験して、結合特異性を決定しようとした。Ｏｃｔｅｔ９６解析を使用すると、ヒトＬＩＦに対するｈ５Ｄ８結合は、ＬＩＦと最も高い相同性のＩＬ−６ファミリーメンバーオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）に対する結合よりもおよそ１００倍強い（どちらのタンパク質も大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生される場合）。どちらのタンパク質も哺乳類系において産生される場合、ｈ５Ｄ８は、ＯＳＭに対する結合は呈しない。データを、表８にまとめて示す。
【０１３８】
【表８】
2021528411.tif 000010
【０１３９】
方法
Ｏｃｔｅｔ結合実験：試薬は、製造者によって提供されたマニュアルの通りに使用及び調製した。基本の速度解析実験（Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）は、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒ．９．０．０．２６を次の通りに使用して実施した：センサー／プログラムの設定：ｉ）平衡化（６０秒）；ｉｉ）負荷（１５秒）；ｉｉｉ）ベースライン（６０秒）；ｉｖ）結合（１８０秒）；及びｖ）解離（６００秒）。
【０１４０】
サイトカインに対するｈ５Ｄ８のＯｃｔｅｔ親和性：基本の速度解析実験（Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）は、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒ．９．０．０．２６を次の通りに使用して実施した：アミン反応性第２世代バイオセンサー（Ａｍｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ２ｎｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）（ＡＲ２Ｇ）を水中で最低１５分間含水させた。バイオセンサーに対するｈ５Ｄ８のアミン結合を、アミンカップリング第２世代キット（Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を使用して、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  ２６（参考文献を参照されたい）に従って実施した。浸漬ステップは、３０℃、１０００ｒｐｍで、次の通りに実施した：ｉ）水中での６０秒の平衡化；ｉｉ）２０ｍＭ  ＥＣＤ、１０ｍＭスルホ−ＮＨＳ（水中）中での３００秒の活性化；ｉｉｉ）１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中での１０μｇ／ｍｌ  ｈ５Ｄ８の６００秒の固定化；ｉｖ）１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）中での３００秒の反応停止（Ｑｕｅｎｃｈ）；ｖ）水中での１２０秒のベースライン。次いで、３０℃、１０００ｒｐｍでの次の浸漬及び読み取りステップを伴う速度解析実験を実施した：ｖｉ）１Ｘ速度解析緩衝液中での６０秒のベースライン；ｖｉｉ）サイトカインの１Ｘ速度解析緩衝液中での適切な段階希釈物の１８０秒の結合；ｖｉｉｉ）１Ｘ速度解析緩衝液中での３００秒の解離；ｉｘ）それぞれ１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）と１Ｘ速度解析緩衝液とを交代させる３回の再生／中和サイクル（３回のサイクルについてそれぞれ５秒）。再生後、バイオセンサーを、その後の結合分析のために再利用した。
【０１４１】
哺乳類細胞から産生されるヒト組換え型ＬＩＦは、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＬＩＦ−Ｈ５２１ｂ）によるものであった；哺乳類細胞において産生されるヒト組換え型ＯＳＭは、Ｒ＆Ｄ（８４７５−ＯＭ／ＣＦ）によるものであった；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において産生されるヒト組換え型ＯＳＭは、Ｒ＆Ｄ（２９５−ＯＭ−０５０／ＣＦ）によるものであった。
【０１４２】
実施例１８−ｈ５Ｄ８  ｆａｂの結晶構造
広範囲の化学的条件下でのｈ５Ｄ８  Ｆａｂの５つの結晶構造を決定した。これらの構造の高い分解能は、ＣＤＲ残基の立体構造が、わずかな自由度しか伴っておらず、異なる化学環境でも高度に類似であることを示す。この抗体の固有の特徴は、可変重鎖領域の第１００位における非カノニカルなシステインの存在である。構造分析により、システインが不対であり、溶媒に大いに近づきにくいことが示される。
【０１４３】
Ｈ５Ｄ８  Ｆａｂは、そのＩｇＧのパパイン消化、それに続く、標準のアフィニティ、イオン交換、及びクロマトグラフィー技術を使用する精製によって得た。結晶は、蒸気拡散法を使用して得、分解能が１．６５Å〜２．０Åの範囲である５つの結晶構造を決定することが可能になった。５つの異なるｐＨレベル：５．６、６．０、６．５、７．５、及び８．５にわたる範囲である結晶化条件にもかかわらず、すべての構造が、同じ結晶学的空間群内で、且つ類似の単位格子寸法を伴って（Ｐ２１２１２１、ａ  約５３．８Å、ｂ  約６６．５Å、ｃ  約１４３．３Å）解析された。したがって、これらの結晶構造は、人工産物を詰め込んだ結晶によって邪魔されない、また、広範囲の化学的条件にわたる、ｈ５Ｄ８  Ｆａｂの三次元配置の比較が可能である。
【０１４４】
すべての相補性決定領域（ＣＤＲ）残基について、電子密度を観察し、続いて、これをモデル化した。注目すべきことに、ＬＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２は、細長い立体構造をとり、これは、浅いＬＣＤＲ３及びＨＣＤＲ３領域と共に、パラトープの中心の結合溝を形成していた（図１４Ａ）。５つの構造は、すべての残基にわたって高度に類似であり、すべての原子の平均二乗偏差は、０．１９７Å〜０．３２７Åの範囲である（図１４Ａ）。これらの結果は、ＣＤＲ残基の立体構造が、５．６〜８．５の範囲であるｐＨレベル及び１５０ｍＭ〜１Ｍの範囲であるイオン強度を含めた様々な化学環境において維持されることを示した。ｈ５Ｄ８パラトープの静電表面の分析から、正及び負に帯電した領域が、親水特性に等しく寄与し、広く行きわたる疎水性パッチは存在しないことが明らかになった。ｈ５Ｄ８は、ＨＣＤＲ３の基部に（Ｃｙｓ１００）、非カノニカルなシステインというあまり見られない特徴を有する。５つすべての構造において、この遊離のシステインが配列され、ジスルフィドスクランブルをまったく形成しない。さらに、これは、Ｃｙｓ（システイン付加（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ））又はグルタチオン（グルタチオン付加（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ））の付加によって改変されず、重鎖のＬｅｕ４、Ｐｈｅ２７、Ｔｒｐ３３、Ｍｅｔ３４、Ｇｌｕ１０２、及びＬｅｕ１０５の主鎖及び側鎖原子と共にファンデルワールス相互作用（３．５〜４．３Å距離）を生じる（図１４Ｂ）。最後に、Ｃｙｓ１００は、ＣＤＲ１及びＨＣＤＲ３の立体構造を媒介するのに関与するように見える圧倒的に埋没した構造の残基である。したがって、本発明者らの５つの結晶構造におけるこの領域の均一な配置によって観察される場合に、他のシステインとの反応性を有する可能性が低い。
【０１４５】
方法
Ｈ５Ｄ８−１  ＩｇＧは、Ｃａｔａｌｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手し、２５ｍＭヒスチジン、６％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０中でｐＨ６．０で調製した。調製されたＩｇＧを、１０Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、大規模にＰＢＳに緩衝液交換し、その後、３７℃で１時間、１：１００マイクログラムのパパイン（Ｓｉｇｍａ）（ＰＢＳ、１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭシステイン中）を用いて消化を行った。パパインで消化されたＩｇＧを、ＡＫＴＡ  Ｓｔａｒｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流した。ｈ５Ｄ８  Ｆａｂを含有するプロテインＡ素通り画分を回収し、１０Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）に緩衝液交換した。得られた試料を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｍｏｎｏ  Ｓ陽イオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。１Ｍ塩化カリウムのグラジエントを用いる溶離は、顕著なｈ５Ｄ８  Ｆａｂピークをもたらし、これを回収し、濃縮し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中で、ｐＨ８．０で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製して、大きさを均一にした。還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、高純度のｈ５Ｄ８  Ｆａｂが確認された。
【０１４６】
精製されたｈ５Ｄ８  Ｆａｂを、１０Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｏｒｙｘ  ４ディスペンサー（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、２０℃で低密度マトリックス９６−コンディションズ（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）市販のスクリーンＪＣＳＧ  ＴＯＰ９６（Ｒｉｇａｋｕ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）及びＭＣＳＧ−１（Ａｎａｔｒａｃｅ）を用いる蒸気拡散結晶化実験の準備をした。次の５つの結晶化条件：１）０．０８５Ｍクエン酸ナトリウム、２５．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、０．１７Ｍ酢酸アンモニウム、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ５．６）；２）０．１Ｍ  ＭＥＳ、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ６０００、１Ｍ塩化リチウム（ｐＨ６．０）；３）０．１Ｍ  ＭＥＳ、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、０．６Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）；４）０．０８５Ｍ  ＨＥＰＥＳナトリウム、１７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、８．５％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ７．５）；及び５）０．０８Ｍ  Ｔｒｉｓ、２４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、０．１６Ｍ塩化マグネシウム、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ８．５）において、４日後に結晶を得、収集した。液体窒素中で瞬間凍結させる前、結晶を含有する母液を、必要に応じて５〜１５％（ｖ／ｖ）グリセロール又は１０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールと共に添加した。結晶に、先端放射光施設（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）でのＸ線シンクロトロン放射、ビームライン２３−ＩＤ−Ｄ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を施し、回折パターンを、Ｐｉｌａｔｕｓ３  ６Ｍ検出器で記録した。ＸＤＳを使用してデータを処理し、Ｐｈａｓｅｒを使用して分子置換によって構造を決定した。Ｃｏｏｔでのモデル構築と共に、ＰＨＥＮＩＸでの精密化を実施した。図は、ＰｙＭＯＬで作成した。すべてのソフトウェアは、ＳＢＧｒｉｄを通してアクセスした。
【０１４７】
実施例１９−ｈ５Ｄ８のシステイン１００での変異は結合を維持する
ｈ５Ｄ８の分析から、重鎖の可変領域における第１００位での遊離のシステイン残基（Ｃ１００）が明らかになった。ヒト及びマウスＬＩＦに対する結合及び親和性を特徴付けるために、Ｃ１００をそれぞれ天然に存在するアミノ酸と置換することによって、Ｈ５Ｄ８バリアントを作製した。ＥＬＩＳＡ及びＯｃｔｅｔアッセイを使用して、結合を特徴付けた。結果を表９にまとめて示す。ＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０曲線は、図１５に示す（図１５Ａ  ヒトＬＩＦ及び図１５Ｂ  マウスＬＩＦ）。
【０１４８】
【表９】
2021528411.tif 000011
【０１４９】
方法
ＥＬＩＳＡ：ヒト及びマウスＬＩＦに対するｈ５Ｄ８  Ｃ１００バリアントの結合を、ＥＬＩＳＡによって決定した。組換え型ヒト又はマウスＬＩＦタンパク質を、１μｇ／ｍＬで、４℃で一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ３８４ウェルプレート上にコーティングした。プレートを、室温で２時間、１×ブロッキング緩衝液でブロッキングした。各ｈ５Ｄ８  Ｃ１００バリアントの段階希釈物（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を添加し、室温で１時間結合させた。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを添加し、室温で３０分間結合させた。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１×ＴＭＢ基質を使用して顕色させた。１Ｍ  ＨＣｌを用いて反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸収を測定した。図の作成及び非線形回帰分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して実施した。
【０１５０】
Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６：ヒト及びマウスＬＩＦに対するｈ５Ｄ８  Ｃ１００バリアントの親和性を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システムを使用して、ＢＬＩによって決定した。ｈ５Ｄ８  Ｃ１００バリアントを、１×速度解析緩衝液中での３０秒のベースライン後に、７．５μｇ／ｍＬで、抗ヒトＦｃバイオセンサーに負荷した。ヒト又はマウスＬＩＦタンパク質の段階希釈物（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を、９０秒間、負荷されたバイオセンサーに結合させ、３００秒間、１×速度解析緩衝液中で解離させた。ＫＤは、１：１グローバルフィットモデルを使用して、データ分析ソフトウェアによって算出した。
【０１５１】
実施例２０−ｈ５Ｄ８はＬＩＦのｇｐ１３０への結合をインビトロで阻止する
ｈ５Ｄ８が、ＬＩＦがＬＩＦＲと結合するのを妨げるかどうかを決定するために、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６  プラットフォームを使用する分子結合アッセイを実施した。Ｈ５Ｄ８を、抗ヒトＦｃ捕捉によってＡＨＣバイオセンサーに負荷した。次いで、バイオセンサーをＬＩＦに浸漬させ、予想通り、結合が観察された（図１６Ａ、３分割の中央）。続いて、バイオセンサーを、異なる濃度のＬＩＦＲに浸漬させた。用量依存性の結合が観察された（図１６Ａ、３分割の右側）。対照実験は、この結合がＬＩＦ特異的であり（図示していない）、ＬＩＦＲとｈ５Ｄ８との、又はバイオセンサーとの非特異的な相互作用に起因しないことを実証した。
【０１５２】
ｈ５Ｄ８とＬＩＦとの結合をさらに特徴付けるために、一連のＥＬＩＳＡ結合実験を行った。Ｈ５Ｄ８とＬＩＦをプレインキュベートし、次いで、組換え型ヒトＬＩＦＲ（ｈＬＩＦＲ）又はｇｐ１３０でコーティングしたプレートに導入した。ｈ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体とコーティング基質との間の結合の欠如は、ｈ５Ｄ８が、ＬＩＦの受容体への結合を何らかの方法で妨害したことを示すであろう。さらに、ＬＩＦと結合しない対照抗体（（−）で示されるアイソタイプ対照）、又は知られている結合部位でＬＩＦと結合する対照抗体（Ｂ０９は、ＬＩＦ結合について、ｇｐ１３０ともＬＩＦＲとも競合しない；ｒ５Ｄ８は、ｈ５Ｄ８のラット親型である）も使用した。ＥＬＩＳＡ結果は、ｈ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体が、ｈＬＩＦＲと結合することが可能である（ｒ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体もそうである）ことを実証し、これらの抗体がＬＩＦ／ＬＩＦＲ結合を妨げないことが示された（図１６Ａ）。対照的に、ｈ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体（及びｒ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体）は、組換え型ヒトｇｐ１３０と結合することが可能ではなかった（図１６Ｂ）。これは、ＬＩＦがｈ５Ｄ８に結合した場合に、ＬＩＦのｇｐ１３０結合部位が影響を受けたことを示す。
【０１５３】
実施例２１−ヒト組織におけるＬＩＦ及びＬＩＦＲ発現
ＬＩＦ及びＬＩＦＲの発現レベルを決定するために、多くの異なる種類のヒト組織に対して、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。図１７Ａ及び１７Ｂに示した平均発現レベルは、１００ｎｇの全ＲＮＡあたりのコピー数として示される。ほとんどの組織は、１００ｎｇの全ＲＮＡあたり少なくとも１００コピーを発現した。ＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現は、ヒト脂肪組織（腸間膜−回腸［１］）、血液−血管組織（脈絡膜−神経叢［６］及び腸間膜［８］）、及び臍帯［６８］組織において最も高く、脳組織（皮質［２０］及び黒質［２８］）において最も低かった。ＬＩＦＲ  ｍＲＮＡ発現は、ヒト脂肪組織（腸間膜−回腸［１］）、血管組織（肺［９］）、脳組織［１１−２８］、及び甲状腺［６６］組織において最も高く、ＰＢＭＣ［３１］において最も低かった。カニクイザル組織におけるＬＩＦ及びＬＩＦＲ  ｍＲＮＡ発現レベルは、ヒト組織において観察されるものと同様であり、ここでは、ＬＩＦ発現は、脂肪組織において高く、また、ＬＩＦＲ発現は、脂肪組織において高く、ＰＢＭＣにおいて低かった（データは示していない）。
【０１５４】
図１７Ａ及び図１７Ｂについての組織番号付けは、以下である：１−脂肪（腸間膜−回腸）；２−副腎；３−膀胱；４−膀胱（三角部）；５−血液−血管（大脳：中大脳−動脈）；６−血管（脈絡膜−神経叢）；７−血管（冠動脈）；８−血管（腸間膜（結腸））；９−血管（肺）；１０−血管（腎臓）；１１−脳（扁桃体）；１２−脳（尾状核）；１３−脳（小脳）；１４  脳−（皮質：帯状皮質−前）；１５−脳（皮質：帯状皮質−後）；１６−脳（皮質：前頭皮質−外側部）；１７−脳（皮質：前頭皮質−内側部）；１８−脳（皮質：後頭）；１９−脳（皮質：頭頂葉）；２０−脳（皮質：側頭）；２１−脳（背側縫線核）；２２−脳（海馬）；２３−脳（視床下部：前部）；２４−脳（視床下部：後部）；２５−脳（青斑核）；２６−脳（延髄）；２７−脳（側坐核）；２８−脳（黒質）；２９−乳房；３０−盲腸；３１−末梢血単核球（ＰＢＭＣ）；３２−結腸；３３−後根神経節（ＤＲＧ）；３４−十二指腸；３５−ファロピウス管；３６−胆嚢；３７−心臓（左心房）；３８−心臓（左心室）；３９−回腸；４０−空腸；４１−腎臓（皮質）；４２−腎臓（髄質）；４３−腎臓（骨盤）；４４−肝臓（実質）；４５−肝臓（気管支：主）；４６−肝臓（気管支：３次）；４７−肺（実質）；４８−リンパ腺（扁桃）；４９−筋肉（骨格筋）；５０−食道；５１−卵巣；５２−膵臓；５３−松果体；５４−脳下垂体；５５−胎盤；５６−前立腺；５７−直腸；５８−皮膚（包皮）；６９−脊髄；６０−脾臓（実質）；６１−胃（前庭部）；６２−胃（体部）；６３−胃（底部）；６４−胃（幽門管）；６５−精巣；６６−甲状腺；６７−気管；６８−臍帯；６９−尿管；７０−子宮（頸部）；７１−子宮（筋層）；及び７２−精管。
【０１５５】
実施例２２−用量選択、用量増大、及び一定投薬
抗ＬＩＦ抗体の用量選択、用量増大、及び一定投薬を、以下に記載する。ｈ５Ｄ８の安全性評価については、マウス及びカニクイザルを使用した。
【０１５６】
１００ｍｇ／ｋｇまでのＩＶ投薬を毎週受けたマウス及びサルにおける４週のＧＬＰ毒性研究において、非治療関連有害作用が認められた。したがって、重篤な毒性が発現しない最大用量（ｈｉｇｈｅｓｔ  ｎｏｎ−ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｔｏｘｉｃ  ｄｏｓｅ）（ＨＮＳＴＤ）は、＞１００ｍｇ／ｋｇであり、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、この研究の条件下で、どちらの種においても１００ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）として確立された。投薬量をスケール調節して、ヒト等価用量（ＨＥＤ）を確立した。ＨＥＤの推定については、体表面積（ＢＳＡ）に基づくスケール調節手法を採用した。これらのＧＬＰ毒性研究に基づくと、推奨される最大開始用量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ）（ＭＲＳＤ）は、以下に示した通りに推定された：
・マウスＮＯＡＥＬからの１０倍の安全係数を用いた０．８１ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）ＨＥＤ
・マウスにおける重篤な毒性が発現する用量（ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｔｏｘｉｃ  ｄｏｓｅ）の１／１０に基づいた＞１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）
・カニクイザルＮＯＡＥＬからの１０倍の安全係数を用いた３．２ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）ＨＥＤ
・ＨＮＳＴＤの１／６に基づいた＞１６．７ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）
毒性研究に基づき、また、第１相研究における進行癌患者集団について保守的な手法を取り、１ｍｇ／ｋｇ（又は７５ｍｇ一定用量）（ＩＶ）のＭＲＳＤを、データによって裏付けた。
【０１５７】
ＭＲＳＤの設定においては、薬理学的作用量（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）（ＰＡＤ）も考慮されている。今日までに利用可能なマウス薬理学モデルにおける薬理学、ＰＫ、及びＬＩＦレベルデータに基づいて、次の手法を使用して、ＰＡＤを推定した。Ｕ２５１マウス異種移植モデルにおける用量反応に基づくと、最適な有効用量は、約３００μｇ（ＩＰ  週２回）であると考えられ；この用量レベルは、約２３０μｇ／ｍＬの最終投与の前のトラフ血清レベルと関連していた。血清ＬＩＦレベルの最大レベルが、このモデルにおけるこの３００μｇ用量で得られるという証拠が存在しており、これはまた、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇの用量でのマウスＧＬＰ毒性研究における血清ＬＩＦレベルデータによって裏付けられた。サルＰＫデータに適合させ、ヒトのためにスケール調節した２−コンパートメントモデルに基づくＰＫモデルを使用すると、３週ごとの１５００ｍｇの臨床用量は、約５００μｇ／ｍＬのＣトラフを提供するであろう。同様に、このＵ２５１マウス異種移植モデルにおける２０μｇ（週２回）の最小有効量は、約２０μｇ／ｍＬの最終投与の前のトラフ血清レベルと関連していた；マウスＰＫ−忍容性研究における０．５ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の用量での最小ＬＩＦレベルの証拠によって裏付けられる、最大血清ＬＩＦレベルのわずか約５０％が、この２０μｇ用量で得られるという証拠が存在していた。３週ごとの７５ｍｇの臨床用量は、約２５μｇ／ｍＬのＣトラフを提供するであろう。マウス同系移植モデルから入手できる追加のＰＫ−ＰＤ（ＬＩＦレベル）データによって、Ｕ２５１マウス異種移植モデルから得られるＰＡＤが裏付けられた。
【０１５８】
したがって、７５ｍｇ（ｉ．ｖ．）の開始用量は、マウス及びサルにおける毒性データとマウス異種移植モデルにおける最小有効用量との両方に基づいて、適切であると考えられた。１５００から２０００ｍｇの最大臨床用量は、毒性データによって裏付けられた。試験物関連の有害所見がないことと併せて、動物モデルにおける線形ＰＫの知見に基づくと、一定投薬手法が適切であった。
【０１５９】
実施例２３−白血病抑制因子のレベルを決定するためのアッセイ
ＭＳＤプレートの調製
ＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ９３ＢＡ−１）を、新たに希釈したウサギＡ４モノクローナル捕捉抗体（９６ウェルプレートの１ウェルあたり５μｌの１００μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）＋０．０３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）でスポットコーティングし、室温で一晩インキュベートする。翌日、プレートを、ブロッキング溶液でブロッキングし、試料調製を実施する。プレートは、すぐに使用することも、後で使用するために乾燥させる及び冷蔵庫に入れることもできる。
【０１６０】
試料調製及び標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ）
品質対照（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を、飽和量のｈ５Ｄ８治療用抗体（２０μｇ／ｍｌ）及び組換え型ヒトＬＩＦ（ｒｈＬＩＦ；ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＩＦ−Ｈ５２１ｂ）を含有する１００％正常ヒト血清又は血漿（ＮＨＳ又はＮＨＰ）プール（マトリックス）中で、バルクで調製し、−８０℃で保管して、使用前に解凍することができる。標準物質を、幾何学的希釈系列のｒｈＬＩＦと共に飽和量の治療用抗体を含有する正常ヒト血清又は血漿中で調製する（２倍濃縮）。標準物質を、−８０℃で保管し、使用前に解凍することができる。解凍した品質対照及び標準物質系列を、ピペットでディープウェルプレートのウェルに入れる。以前に凍結されているならば、血漿又は血清の対象試料を解凍する。標準物質、品質対照、及び試料を、最終濃度５０％マトリックスの且つ１０μｇ／ｍｌ治療用抗体を含有する希釈剤２（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ５１ＢＢ−４）で１：２希釈し、室温で３０分間インキュベートする。
【０１６１】
アッセイ
品質対照及び試料を、３連で、コーティング及びブロッキングされたＭＳＤプレートに移す。室温での１時間のインキュベーション後、ＭＳＣ−１／ＬＩＦ複合体を、洗浄ステップによって除去する。Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）マウスモノクローナル検出抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；クローンＭ０１７Ｃ３；Ｃａｔ．Ｎｏ．５３０３０１）を添加し、インキュベーション後、結合しなかった材料を、さらなる洗浄ステップで除去する。結合したＭＳＣ−１／ＬＩＦ複合体を、ＭＳＤ  Ｓ６００装置によってＳｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）によって検出する。このシステムによって定量化される強度は、結合した抗体複合体の量に比例し、ＲＬＵ（相対発光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ））として表される。総ＬＩＦ濃度は、標準曲線に対する補間によってｐｇ／ｍｌで算出され、希釈係数２を乗じて、血漿又は血清試料中の総ＬＩＦ濃度に到達する。
【０１６２】
このアッセイは、図１９Ａ及び１９Ｂに示す通りの広いダイナミックレンジ；図２０Ａ及びＢに示す通りの高い均一性を有し；図２１に示す通りに高い濃度の治療用抗体濃度にわたって安定である。
【０１６３】
このアッセイを、図２２Ａ及び２２Ｂに示す通りに使用される希釈剤；図２３に示す通りの捕捉抗体のスポットコーティング濃度；及び図２４に示す通りに使用される検出抗体を含めた、多くの最適化にかけた。
【０１６４】
実施例２４−治療用抗体及び検出抗体によって結合されるエピトープ
捕捉ＥＬＩＳＡを利用して治療用抗体による標的の結合を測定するために、捕捉抗体及び検出抗体は、標的の別の領域に結合しなければならない。さらに、全標的（治療用抗体によって結合されているものと結合されていないものの両方）が測定されるべきであるならば、関与する３つすべての抗体（治療用、検出、及び捕捉）は、標的と結合しなければならず、且つ他の２つの抗体の結合を邪魔してはならない。この目的のために、本発明者らは、あらかじめ形成されたＬＩＦ／抗体複合体の、ＥＬＩＳＡアッセイにおける結合を決定しようと努めた。図２５Ａ及び２５Ｂに示す通り、７Ｃ３と複合体形成したＬＩＦは、ｇｐ１３０コーティングプレートに結合し、ＬＩＦ受容体コーティングプレートに結合しないので、検出抗体Ｍ０１７Ｃ３は、ＬＩＦ受容体と相互作用するＬＩＦの部分に結合する可能性が高い。ｈ５Ｄ８と複合体形成したＬＩＦは、ＬＩＦ受容体コーティングプレートに結合し、ｇｐ１３０コーティングプレートに結合しないので、治療用抗体ｈ５Ｄ８は、ｇｐ１３０と相互作用するＬＩＦの部分に結合する可能性が高い。図２５Ｃ及び２５Ｄに示す通り、ＬＩＦがビオチン標識され、アビジン標識されたＨＲＰを使用して検出される場合、同様の結果が見られる。
【０１６５】
捕捉抗体Ａ４（配列番号４１及び４２に示したもの）を、ＬＩＦに対する競合結合アッセイを使用して可能性のある抗体をスクリーニングすることによって決定した。これらの実験により、抗体Ａ４が、ＬＩＦに対する高い結合を呈し、且つ治療用抗体ｈ５Ｄ８又はＭ０１７Ｃ３による結合を邪魔しないことが明らかになった。
【０１６６】
実施例２５−患者におけるＬＩＦレベルを決定すること
実施例２３に記載した通りのＬＩＦレベルアッセイを使用して、異なる癌を有する３人のヒト対象におけるＬＩＦレベルを決定した。対象Ａは、粘液性脂肪肉腫と診断された５７歳の白人男性である。対象は、約４か月間のネオアジュバント：アドリアマイシン及びイホスファミド、並びに約３５日間の右ふくらはぎへのネオアジュバント放射線療法（５０００ｃＧｙ）で治療した。次いで、対象は、右ふくらはぎの治療的な広範切除、右の後脛骨神経、並びに膝窩、前脛骨及び後脛骨、及び腓骨血管の切開を受けた。対象は、胸部に胸膜疾患及び悪性リンパ節腫脹を再発した。対象を、ゲムシタビン及びタキソテールで約４１日間治療し、最良効果（ｂｅｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）：病態進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）であった。次いで、対象を、ダカルバジンで４か月間治療し、部分奏功という最良効果であった。対象は、２２日後に放射線学的に増悪し、ｈ５Ｄ８試験に入った。対象は、ｈ５Ｄ８  １１２５ｍｇの初回投与を受け、約１３６日後に最近の投与（Ｃ６）（１５００ｍｇ）を受けた。対象は、ベースライン時に、臨床的に有意な検査異常を有しておらず、ＥＣＯＧ全身状態（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｔｕｓ）は１であった。患者は、末梢の腫瘍マーカーを有しない。２つの胸膜腫瘤を、標的病変として選択し、３つの非標的病変を選択した（１つの胸膜腫瘤及び２つのＬＮＳ）。転移性肺部位から生検試料を収集して、ｈ５Ｄ８治療についてのバイオマーカーを決定した。生検試料を採取した時、対象は、ＬＩＦレベル上昇の証拠を示していた。対象ＡのＬＩＦレベルを、図２６Ａに示す。
【０１６７】
対照Ｂは、ステージＩＶ黒色腫と診断された６６歳の男性である。対象は、ｈ５Ｄ８試験の前に、１つの治療を施した。最良効果は、評価可能ではなく、結果は示さない（ニボルマブ；４か月）。失敗したニボルマブ治療は、重度の腫瘍免疫抑制を示した。対象は、治療レジメン（１１２５ｍｇ）（６週）を受けており、記録された最良効果は、「病態進行」である。転移性皮膚部位から生検試料を収集した。生検試料が収集された時、概して高いレベルのＬＩＦが、総ＬＩＦアッセイによって対象において認められた。総ＬＩＦアッセイの結果を、図２６Ｂに示す。
【０１６８】
対象Ｃは、卵巣癌と診断された６６歳の白人女性である。１２週での対象のｈ５Ｄ８  Ｃ５評価は、ＣＡ１９−９の増大（４１２から１０７２Ｕ／ｍｌ）を示したが、標的病変は、ＲＥＣＩＳＴ基準による有意な増大を示さなかった（１０７から１０９ｍｍ）。対象は、治療レジメン（１５００ｍｇ）（＋１６週）を受けており、記録された最良効果は、「病態安定（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）」である。転移性リンパ節部位から生検試料を収集して、ｈ５Ｄ８治療についてのバイオマーカーを決定した。生検試料を採取した時、対象は、ｈ５Ｄ８投与の結果としてのＬＩＦレベル上昇の証拠を示していた。対象ＣのＬＩＦレベルを、図２６Ｃに示す。
【０１６９】
本発明の好ましい実施形態を、本明細書に提示及び記載してきたが、こうした実施形態が、ほんの一例として提供されるに過ぎないことが、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱しない多数の変更、改変、及び置換が、当業者には直ちに思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物を、本発明を実施する際に用いることができることが理解されよう。
【０１７０】
本明細書において言及したすべての刊行物、特許出願、発行された特許、及び又は文書は、それぞれ個々の刊行物、特許出願、発行された特許、及び他の文書が、あたかも具体的且つ個々にその全体を参照によって組み込まれることが示されるがごとく、参照により本明細書に組み込む。参照によって組み込まれる本文に含有される定義は、それらがこの開示における定義と矛盾する限りは除外される。
【０１７１】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本発明が属する分野の技術者当分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によってそうではないと明確に指示されない限り、複数の指示物が含まれる。本明細書での「又は」に対するあらゆる言及は、他に規定されない限り、「及び／又は」を包含することが意図される。
【０１７２】
本明細書で使用する場合、他に示されない限り、用語「約」は、少なくとも１０％の差の、規定した量に近い量を指す。
【０１７３】
本明細書で使用する場合、用語「を治療する」又は「を治療すること」は、個人の生理学的又は病的状態に関連する少なくとも１つの徴候又は症状を回復させるように設計された又は意図された、前記生理学的又は病的状態への介入を指す。癌に関する本明細書に記載される治療する又は治療することは、完全寛解、部分奏功、治療されている癌又は腫瘍の進行の遅延、腫瘍サイズ若しくは腫瘍負荷の低下、又は腫瘍若しくは腫瘍負荷の増殖の遅延を誘発することが意図される介入を指す。治療することはまた、癌又は腫瘍の転移又は悪性度を低下させることが意図される介入を指す。当業者は、すべての個人とは限らない、疾患を患っている所与の不均一な個人の集団が、所与の治療に等しく反応する、又は全く反応しないこととなることを認識するであろう。しかし、これらの個人は、治療されたとみなされる。不成功の治療は、一般に、疾患の進行、及び異なる治療薬での追加の治療の必要性をもたらす。ある種の態様では、本明細書に記載される抗体及び方法は、癌の寛解を維持する又は治療された癌に関連する同じ癌若しくは異なる癌の再発を予防するために使用することができる。
【０１７４】
本明細書で使用する場合、用語「総ＬＩＦ」は、治療用抗体に結合しているＬＩＦと治療用抗体に結合していないＬＩＦの両方を指す。本明細書で使用する場合、用語「総ＬＩＦレベル」は、総ＬＩＦの定量化を指す。本明細書に記載される通り、総ＬＩＦレベルを測定するアッセイは、治療用抗体に結合しているＬＩＦと治療用抗体に結合していないＬＩＦの両方を測定する。本明細書に記載される通り、総ＬＩＦレベルは、限定はされないが、血液、血漿、又は血清を含めた、様々な患者試料について決定することができる。
【０１７５】
【表１０】
2021528411.tif 000012
【０１７６】
【表１１】
2021528411.tif 000013
【０１７７】
【表１２】
2021528411.tif 000014
【図１】
2021528411.tif 000015
【図２Ａ】
2021528411.tif 000016
【図２Ｂ】
2021528411.tif 000017
【図３Ａ】
2021528411.tif 000018
【図３Ｂ】
2021528411.tif 000019
【図４】
2021528411.tif 000020
【図５】
2021528411.tif 000021
【図６】
2021528411.tif 000022
【図７Ａ】
2021528411.tif 000023
【図７Ｂ】
2021528411.tif 000024
【図８Ａ】
2021528411.tif 000025
【図８Ｂ】
2021528411.tif 000026
【図８Ｃ】
2021528411.tif 000027
【図９Ａ】
2021528411.tif 000028
【図９Ｂ】
2021528411.tif 000029
【図１０Ａ】
2021528411.tif 000030
【図１０Ｂ】
2021528411.tif 000031
【図１０Ｃ】
2021528411.tif 000032
【図１０Ｄ】
2021528411.tif 000033
【図１１Ａ】
2021528411.tif 000034
【図１１Ｂ】
2021528411.tif 000035
【図１１Ｃ】
2021528411.tif 000036
【図１２】
2021528411.tif 000037
【図１３Ａ】
2021528411.tif 000038
【図１３Ｂ】
2021528411.tif 000039
【図１４Ａ】
2021528411.tif 000040
【図１４Ｂ】
2021528411.tif 000041
【図１５Ａ】
2021528411.tif 000042
【図１５Ｂ】
2021528411.tif 000043
【図１６Ａ】
2021528411.tif 000044
【図１６Ｂ】
2021528411.tif 000045
【図１６Ｃ】
2021528411.tif 000046
【図１７Ａ】
2021528411.tif 000047
【図１７Ｂ】
2021528411.tif 000048
【図１８】
2021528411.tif 000049
【図１９Ａ】
2021528411.tif 000050
【図１９Ｂ】
2021528411.tif 000051
【図２０Ａ】
2021528411.tif 000052
【図２０Ｂ】
2021528411.tif 000053
【図２１】
2021528411.tif 000054
【図２２Ａ】
2021528411.tif 000055
【図２２Ｂ】
2021528411.tif 000056
【図２３】
2021528411.tif 000057
【図２４】
2021528411.tif 000058
【図２５】
2021528411.tif 000059
【図２６Ａ】
2021528411.tif 000060
【図２６Ｂ】
2021528411.tif 000061
【図２６Ｃ】
2021528411.tif 000062
【配列表】
2021528411000001.app
【国際調査報告】
2021528411.tif 000063
2021528411.tif 000064
2021528411.tif 000065