(57)【要約】  本発明は、血液腫瘍および固形腫瘍を含む癌を治療する方法に関する。一実施形態では、方法は、免疫細胞、特に癌に罹患している患者のＴ細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を障害することを含む。アルギナーゼ発現は、アルギナーゼをコードする遺伝子の変異（欠失または切断を含む）によって、ＲＮＡ干渉によって、またはアルギナーゼ阻害剤の投与によって障害され得る。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）療法の枠内で改変される。本発明はまた、障害されたアルギナーゼ活性と、ネガティブ免疫チェックポイント調節因子（ＰＤＬ１−ＰＤ１およびＢ７−ＣＴＬＡ４阻害経路）の抗体媒介性遮断とを組み合わせた治療方法を提供する。
2021517454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
養子細胞移入により癌を治療するために、アルギナーゼ活性および／または発現が構成的または誘導的に障害された免疫細胞。
【請求項２】
前記障害されたアルギナーゼ活性および／または発現が、障害されたアルギナーゼ２活性および／または発現である、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項３】
白血病、リンパ腫および／または固形腫瘍からなる群から選択される１つ以上の癌を治療するための、請求項１または請求項２に記載の免疫細胞。
【請求項４】
前記アルギナーゼ活性が、例えば、
・前記アルギナーゼをコードする遺伝子を変異させるか、切断するか、欠失させること、
・前記アルギナーゼをコードする前記遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を投与するか、変異させるか、切断するか、欠失させること、
・前記アルギナーゼをコードするｍＲＮＡに結合することができるヌクレオチド配列をコードするか含むヌクレオチド配列を投与すること
によって、前記アルギナーゼの発現を障害することによって障害される、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項５】
前記アルギナーゼ活性が、前記アルギナーゼ活性および／または発現を障害するためのエクスビボ処理に前記細胞を曝すことによって障害される、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項６】
前記障害されたアルギナーゼ活性が、前記アルギナーゼをコードするｍＲＮＡに結合することができる核酸分子を前記免疫細胞にエクスビボで投与すること、またはそのような核酸分子をコードするベクターを投与することに起因する、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項７】
Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、自然リンパ球系細胞および樹状細胞から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項８】
ＣＤ３＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される、請求項７に記載の免疫細胞。
【請求項９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはトランスジェニックＴ細胞受容体をさらに含み、前記ＣＡＲが、リンカーを介してＴ細胞シグナル伝達ドメイン、好ましくはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合された抗原結合ドメインを好ましくは含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１０】
ネガティブ免疫チェックポイント調節因子を標的とするおよび／またはネガティブ免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する癌治療と組み合わせた、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１１】
前記癌治療が、免疫チェックポイント調節因子ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７ｘ／Ｂ７Ｓ１／ＶＴＣＮ１）、ＨＨＬＡ２（Ｂ７Ｈ７／Ｂ７−Ｈ５）、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ１Ｈ、ＤＤ１α、ｃ１０ｏｒｆ５４、Ｇｉ２４、Ｄｉｅｓ１、ＳＩＳＰ１）、ＶＳＩＧ、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＤ３９、ＣＤ７３、アデノシンＡ２受容体、ＣＤ４７、ブチロフィリン（ＢＴＮ）および／またはＴＩＭ−３（Ｔ細胞−免疫グロブリン−ムチンドメイン３）を標的とする、請求項１０に記載の免疫細胞。
【請求項１２】
前記癌治療が、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＤ３９、ＣＤ７３、アデノシンＡ２受容体、ＣＤ４７、ブチロフィリン（ＢＴＮ）および／またはＴＩＭ−３の群から選択される１つ以上に特異的に結合する抗体を含む、請求項１０および／または１１に記載の免疫細胞。
【請求項１３】
単離および／または精製されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１４】
特に養子細胞移入のための抗癌治療を調製する方法であって、
・免疫細胞を提供すること、および
・前記免疫細胞のアルギナーゼ活性および／または発現をエクスビボで障害することを含む方法。
【請求項１５】
養子細胞移入のための免疫細胞の抗癌活性を改善する方法であって、前記免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現をエクスビボで障害することを含む方法。
【請求項１６】
個体から、例えば治療される対象から以前に採取されている、請求項１から１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１７】
免疫細胞の抗癌活性を改善する方法であって、前記免疫細胞のアルギナーゼ活性および／または発現をエクスビボで障害することを含む方法。
【請求項１８】
養子細胞移入により癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された免疫細胞を投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記免疫細胞を投与する前に、前記免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現をエクスビボで障害することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１３および１６のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療、特に癌の免疫療法および／または養子細胞移入療法の分野で使用するための免疫細胞、キット、方法および組成物に関する。本発明はまた、細胞、キットおよび組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、悪性新生物の発生を抑制し、腫瘍進行を阻害し、腫瘍排除を促進する上で基本的な役割を果たす。免疫監視機構から逃れるために、腫瘍は多様な回避機構を備える傾向がある。免疫回避戦略には、抗炎症性サイトカインの産生、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む阻害細胞の動員、ネガティブＴ細胞共刺激分子の発現、ならびに免疫抑制性代謝経路（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）の活性化が含まれる。そのような回避機構を阻害することによって腫瘍を標的とした免疫応答を増強することは、重要な治療的有望性を有する戦略である。ネガティブ免疫チェックポイント調節因子の抗体媒介性遮断は、特に、今までのところ最も有望かつ成功している免疫療法アプローチの一つである。このような免疫チェックポイント経路は、通常、過剰なＴ細胞応答を停止または抑制することによって免疫病理を予防または緩和する。腫瘍細胞は、この機構を利用して、Ｔ細胞による攻撃を防ぐ。治療的介入によってこれらの「ブレーキ」を解放すると、効果的な抗腫瘍免疫応答を回復させることができる。しかし、ＰＤＬ１‐ＰＤ１およびＢ７‐ＣＴＬＡ４阻害経路を妨害することにより得られた前例のない成功にも関わらず、現在のチェックポイント遮断療法は、あらゆる患者に対して効果的な抗腫瘍免疫応答を誘導しないか、あらゆるタイプの癌に対して活性ではないか、部分的な効果を有するにとどまるか、腫瘍がチェックポイント遮断に対する耐性を生じる。
【０００３】
癌免疫療法の別の形態は、患者の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をエクスビボで増殖させ、腫瘍抗原に応答する活性化Ｔリンパ球集団を再注入するか、患者の末梢血Ｔリンパ球を除去し、既知の腫瘍抗原を標的とするトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるエクスビボ遺伝子改変を行った後、患者に再注入して癌細胞を破壊する形態の養子細胞療法を介して、患者の免疫細胞を利用して癌を根絶することからなる。ＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法は血液腫瘍では前例のない成功を示してきたが、ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した固形腫瘍の治療は、一つには免疫抑制腫瘍微小環境のために、これまでほとんど成功していない。さらに、インビトロ製造中のＣＡＲ  Ｔ細胞の過度の消耗または分化を防ぐためにかなりの注意が必要である。
【０００４】
したがって、単独で、または既存の治療と組み合わせて、強力な抗腫瘍応答を誘導することを目的とした新しい戦略の開発に対する満たされていない必要性がある。特に、他の補完療法とともに、様々な免疫療法剤を含む相乗的治療の組合せは、今後、成功につながる抗癌治療の基礎を構成する可能性がある。
【０００５】
さらに研究するのに値する一つの治療戦略が、抗腫瘍免疫応答を阻害することによって腫瘍増殖を促進する代謝経路を妨げることである。これらの中で、増加しつつある証拠は、Ｌ‐アルギニン代謝の治療的操作が抗腫瘍免疫応答の増強に役立つ可能性があることを示唆している。Ｌ−アルギニンは、特定の細胞、特にＴ細胞およびマクロファージなど、免疫系の特定の細胞によって細胞外環境から吸収される必要がある準必須アミノ酸である。これらの細胞の最適な機能のためには、十分なＬ−アルギニン利用能が不可欠である。Ｔ細胞の場合、Ｌ−アルギニンの枯渇により、ＣＤ３−ζ鎖の発現が低下し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達が損なわれ、抗原特異的Ｔ細胞の活性化、増殖および細胞毒性が抑制される。
【０００６】
Ｌ−アルギニンは、アルギナーゼ（ＡＲＧ）および一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の基質である。ＮＯＳによるＬ‐アルギニン異化はＮＯおよび他の反応性窒素中間体の産生をもたらし、これは、病原体に対するマクロファージの細胞毒性活性に寄与する重要な機構である。ＡＲＧはＬ−アルギニンを尿素およびＬ−オルニチンに変換するが、この反応は尿素サイクルによる肝臓のアンモニアの解毒に果たすその役割のために最もよく知られている。Ｌ−オルニチンはさらにポリアミンおよびプロリンに処理される。ＡＲＧ酵素およびＮＯＳ酵素の発現は、腫瘍細胞自体、またはマクロファージおよび骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）などの腫瘍浸潤細胞のいずれかにおいて、腫瘍内で増加することが見出されている。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）では、ＮＯＳ媒介性ＮＯ産生が腫瘍の血管新生および転移を促進するのに対して、ＡＲＧを介したプロリン利用能およびポリアミン合成の増加は、腫瘍細胞増殖を促進する。さらに、腫瘍内のＡＲＧおよびＮＯＳの発現により誘導されるＬ‐アルギニンの枯渇は、上記機構により抗腫瘍Ｔ細胞応答を損なう免疫抑制微小環境の生成に寄与する。
【０００７】
哺乳類は、２つの異なる遺伝子によってコードされる２つのＡＲＧ酵素、アルギナーゼ‐１（ＡＲＧ１）およびアルギナーゼ‐２（ＡＲＧ２）を有する。２つの酵素は同じ生化学反応を触媒し、それらの触媒部位で１００％の相同性を示し、現在利用可能なＡＲＧ阻害剤によって両方とも阻害される。ＡＲＧ１とＡＲＧ２とは、それらの細胞内局在および発現パターンに関して異なる。ＡＲＧ１は、主に肝臓に発現する細胞質酵素であるが、いくつかの非肝臓組織および細胞型にも発現する。ＡＲＧ２は、ミトコンドリアに位置し、多様な組織で広範囲な発現を示す。
【０００８】
Ｄｕｎａｎｄ−Ｓａｕｔｈｉｅｒ  Ｉ．らによる刊行物「Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎａｓｅ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１５５  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９３：１６９０−１７００（２０１４）では、ＡＲＧ２は樹状細胞（ＤＣ）に発現する主要なアルギナーゼであることが見出され、その対応するｍＲＮＡはＤＣ成熟の間ｍｉＲ１５５によって抑制されることが示された。活性化されたｍｉＲ１５５欠乏ＤＣでは、ＡＲＧ２の発現および活性の異常に高いレベルが観察された。逆に、ｍｉＲ１５５の過剰発現は、ＤＣ内のＡＲＧ２発現を阻害した。ｍｉＲ１５５が様々な細胞型で様々な遺伝子を制御することはよく知られているが、ｍｉＲ１５５がＴ細胞を含む他の細胞型でＡＲＧ２発現も制御するかどうかは報告されていない。
【０００９】
国際公開第２０１４０５９２４８号パンフレットは、対象から単離されたＴ細胞に、ｍｉＲ１５５転写物をコードする核酸分子をエクスビボで導入することにより、Ｔ細胞媒介免疫を増大させる方法を教示している。米国特許第２０１５／２７５２０９号明細書は同様に、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびマイクロＲＮＡ分子をコードする外因性核酸を含む単離または精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞を教示している。国際公開第２０１４０５９２４８号パンフレットも米国特許第２０１５／２７５２０９号明細書も、Ｔ細胞内のｍｉＲ−１５５の活性様式を開示していない。Ｇｒａｃｉａｓ  Ｄ．らによる刊行物「ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１５５  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５９３−６０２（２０１３）では、ｍｉＲ１５５がＣＤ８＋Ｔ細胞内で８４５遺伝子の発現を調節することが見出され、その大部分が２倍未満の差次的発現を示したことから、ｍｉＲ１５５が個々の標的に対してロバストな効果を有するのではなく、多数の転写物に中程度に影響を及ぼすことが示唆された。Ｇｒａｃｉａｓらは、その発現がｍｉＲ１５５により調節される８４５遺伝子の中でＡＲＧ２を同定していない。したがって、これらの参考文献は、Ｔ細胞ではＡＲＧ２がｍｉＲ１５５の標的となり得ること、およびＴ細胞ではｍｉＲ１５５の効果がＡＲＧ２阻害を介して媒介されることを示唆していない。
【００１０】
いくつかの特許文献は、アルギナーゼ阻害剤に関する。欧州特許第２７６８４９１Ｂ１号明細書は、心血管障害、性障害、創傷治癒障害、消化管障害、自己免疫障害、免疫障害、感染症、肺障害、線維性障害および溶血性障害などの多くの症状を治療するための小分子アルギナーゼ阻害剤を開示している。欧州特許第２０８３８１２Ｂ１号明細書は、アレルギー性喘息および非アレルギー性喘息ならびにアレルギー性鼻炎を治療するための６−ボロノ−Ｌ−ノルロイシン（ＡＢＨ）などの小分子アルギナーゼ阻害剤を開示している。国際公開第２００７／１１１６２６号パンフレットは、ＡＲＧ２をサイレンシングするためのｓｉＲＮＡを含め、治療またはアテローム性動脈硬化症のためのＡＲＧ２活性の調節を開示している。米国特許第９７８９１６９号明細書は、免疫系を調節すること、特に移植臓器の拒絶を予防することを目的として、血漿アルギニンレベルを枯渇させるための組換えＡＲＧ１タンパク質を開示している。
【００１１】
本発明の目的は、好ましくは造血器新生物および／または固形腫瘍に対して有効である、癌の治療を提供することである。
【００１２】
本発明の目的は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞および／またはトランスジェニックＴ細胞受容体Ｔ細胞に基づく治療の効果、および／または免疫チェックポイント調節因子との相互作用および／または免疫チェックポイント調節因子の遮断に基づく治療の効果を改善することである。例えば、既存の癌治療または既存の治療概念を改善する方法を提供することが目的である。
【００１３】
本発明の目的は、免疫療法剤を含む他の癌治療と相乗的に使用され得る癌の治療を提供することである。
【００１４】
本発明の目的は、癌を標的とした免疫応答を促進することにより癌を治療することである。特に、本発明の目的は、癌細胞が癌を標的とした免疫応答を回避するために利用する機構を阻害することである。
【００１５】
本発明は、上記の必要性および目的に対処する。
【発明の概要】
【００１６】
注目すべきことに、本発明者らは、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された免疫細胞の方が、固形腫瘍を含む癌の治療に対する効果が高いことを示す実験を行った。
【００１７】
一態様では、本発明は、固形腫瘍を含む癌を治療するために、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された免疫細胞を提供する。
【００１８】
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を提供し、該免疫細胞ではさらに、アルギナーゼ活性および／または発現が障害されている。
【００１９】
一態様では、本発明は、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を提供する。好ましくは、該ＴＩＬは、癌に罹患しているヒトまたは動物から単離されている。
【００２０】
一態様では、本発明は、養子細胞移入により癌を治療するために、構成的または誘導的に障害されたアルギナーゼ活性および／または発現を示す免疫細胞を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、癌を治療する方法を提供し、方法は、免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を障害することを含む。
【００２２】
一態様では、本発明は、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された免疫細胞を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、方法は、養子細胞移入により癌を治療する方法である。
【００２３】
一態様では、本発明は、癌を治療する方法であって、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法を提供し、該ＴＩＬではさらに、アルギナーゼ活性および／または発現が障害されている。
【００２４】
一態様では、本発明は、癌を治療する方法を提供し、方法は、ＣＡＲを発現する免疫細胞を投与することを含み、該免疫細胞では、アルギナーゼ活性および／または発現が障害されている。
【００２５】
一態様では、本発明は、癌を治療する方法を提供し、方法は、ＣＡＲおよび／またはＴＩＬを発現する細胞を提供すること、該細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を低下させるように好ましくはインビトロおよび／またはエクスビボで該細胞を処理すること、およびそれを必要とする対象、好ましくは癌に罹患している対象に該細胞を投与することを含む。
【００２６】
一態様では、本発明は、免疫細胞の抗癌活性を改善する方法を提供し、方法は、該免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を障害すること、好ましくはエクスビボで該免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を障害することを含む。
【００２７】
一態様では、本発明は、養子細胞移入のための免疫細胞の抗癌活性を改善する方法を提供し、方法は、好ましくはエクスビボで該免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を障害することを含む。
【００２８】
一態様では、本発明は、特に養子細胞移入のための抗癌治療を調製および／または製造する方法を提供し、方法は、免疫細胞を提供すること、およびエクスビボで該免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を障害することを含む。
【００２９】
一態様では、本発明は、癌を治療するための免疫細胞内のアルギナーゼ活性を低下させることができる作用物質を提供する。
【００３０】
一態様では、本発明は、癌を治療するためのキットを提供し、キットは、免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を障害するのに適した作用物質を含む。
【００３１】
一態様では、本発明は、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された免疫細胞と、ＰＤＬ１−ＰＤ１およびＢ７−ＣＴＬＡ４阻害経路などの免疫抑制経路を遮断する作用物質とを投与することを含む併用治療を提供する。好ましくは、該作用物質は、抗体（Ａｂ）、例えば、抗ＰＤ１  Ａｂまたは抗ＣＴＬＡ４  Ａｂである。
【００３２】
一態様では、本発明は、免疫細胞、特に本発明の免疫細胞を含む組成物を提供する。
【００３３】
一態様では、本発明は、腫瘍および／または癌に罹患している対象の腫瘍のサイズおよび／または体積を減少させるために、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された免疫細胞を提供する。一態様では、本発明は、癌に罹患している対象の生存率および／または生存時間を増加させるために、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された免疫細胞を提供する。
【００３４】
一態様では、本発明は、癌のための治療を生み出す方法であって、単離された免疫細胞を提供すること、およびアルギナーゼ活性および／または発現が障害されるように該免疫細胞を処理することを含む方法を提供する。
【００３５】
本発明のさらなる態様および好ましい実施形態は、本明細書中以下および添付の特許請求の範囲で定義される。本発明のさらなる特徴および利点は、以下に与えられる好ましい実施形態の説明から当業者に明らかになるであろう。
【００３６】
図では、本発明の実施形態および／または例を例示する目的のために実験セクションの結果が示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞またはＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍細胞を移植したＷＴマウスおよびＡｒｇ２−／−マウスにおける腫瘍増殖を示す。図は、Ａｒｇ２−／−マウスでは腫瘍増殖が障害されたことを示している。
【図１Ｂ】Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞またはＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍細胞を移植したＷＴマウスおよびＡｒｇ２−／−マウスにおける腫瘍増殖を示す。図は、Ａｒｇ２−／−マウスでは腫瘍増殖が障害されたことを示している。
【図２Ａ】図１Ａおよび図１Ｂについて記載されたマウスにおける抗腫瘍免疫を示す。図は、Ａｒｇ２−／−マウスでは抗腫瘍免疫が増強されたことを示している。
【図２Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂについて記載されたマウスにおける抗腫瘍免疫を示す。図は、Ａｒｇ２−／−マウスでは抗腫瘍免疫が増強されたことを示している。
【図３Ａ】ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたか（白丸および白四角）枯渇させなかった（黒丸および黒四角）ＷＴ（丸）マウスおよびＡｒｇ２−／−（四角）マウスにおけるＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍増殖を示す。これらの実験では、ＣＤ８＋細胞枯渇により腫瘍増殖が増加した。
【図３Ｂ】図３Ａに記載された、ＣＤ８＋細胞を枯渇させたマウスの動物生存率の低下を示す。
【図４Ａ】それぞれ、腫瘍注射後９日目、１１日目および１４日目（矢印）に、抗ＰＤ１  Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂを投与した（図４Ａ：白丸および白四角）または投与していない（図４Ａ：黒丸および黒四角）ＷＴ（図４Ａ：丸）マウスおよびＡｒｇ２−／−（図４Ａ：四角）マウスにおけるＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍増殖、腫瘍クリアランスおよび動物生存率を示す。結果は、腫瘍サイズ（図４Ａ：白四角）、腫瘍クリアランスおよび生存率に対する抗ＰＤ１  Ａｂ治療とＡｒｇ２欠乏との強力な組合せ効果を示している。
【図４Ｂ】それぞれ、腫瘍注射後９日目、１１日目および１４日目（矢印）に、抗ＰＤ１  Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂを投与した（図４Ａ：白丸および白四角）または投与していない（図４Ａ：黒丸および黒四角）ＷＴ（図４Ａ：丸）マウスおよびＡｒｇ２−／−（図４Ａ：四角）マウスにおけるＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍増殖、腫瘍クリアランスおよび動物生存率を示す。結果は、腫瘍サイズ（図４Ａ：白四角）、腫瘍クリアランスおよび生存率に対する抗ＰＤ１  Ａｂ治療とＡｒｇ２欠乏との強力な組合せ効果を示している。
【図４Ｃ】それぞれ、腫瘍注射後９日目、１１日目および１４日目（矢印）に、抗ＰＤ１  Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂを投与した（図４Ａ：白丸および白四角）または投与していない（図４Ａ：黒丸および黒四角）ＷＴ（図４Ａ：丸）マウスおよびＡｒｇ２−／−（図４Ａ：四角）マウスにおけるＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍増殖、腫瘍クリアランスおよび動物生存率を示す。結果は、腫瘍サイズ（図４Ａ：白四角）、腫瘍クリアランスおよび生存率に対する抗ＰＤ１  Ａｂ治療とＡｒｇ２欠乏との強力な組合せ効果を示している。
【図５】ＷＴマウスまたはＡｒｇ２−／−マウス由来の骨髄（ＢＭ）細胞を全４種の対の組合せで用いて、致死量未満の放射線を照射したＷＴマウスまたはＡｒｇ２−／−マウスを再構成することによって作製されたキメラマウスにおけるＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍増殖を示す。結果は、腫瘍増殖の減少が、主にＢＭ由来細胞のＡｒｇ２欠乏によるものであることを示している。その結果、Ａｒｇ２−／−マウス由来のＢＭ細胞を投与されたマウス（白丸および白四角）では、腫瘍サイズが小さくなる。
【図６Ａ】ＯＴＩ  ＷＴマウスから単離されたＴ細胞のインビトロ活性化（図６Ａ）および増殖（図６Ｂ）と、二重ホモ接合体Ａｒｇ２−／−ＯＴＩマウス由来のものとをそれぞれ比較する。結果は、Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞が、Ａｒｇ２＋／＋ＯＴＩ  Ｔ細胞と比較して、活性化および増殖の増加を示すことを示している。
【図６Ｂ】ＯＴＩ  ＷＴマウスから単離されたＴ細胞のインビトロ活性化（図６Ａ）および増殖（図６Ｂ）と、二重ホモ接合体Ａｒｇ２−／−ＯＴＩマウス由来のものとをそれぞれ比較する。結果は、Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞が、Ａｒｇ２＋／＋ＯＴＩ  Ｔ細胞と比較して、活性化および増殖の増加を示すことを示している。
【図７Ａ】本発明の実施形態による細胞療法に使用されるインビボ系の作製を示す。
【図７Ｂ】図７Ａに示されるように処置されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞を投与されたＷＴマウスは、有意に遅い腫瘍増殖を示す。
【図７Ｃ】図７Ａに示されるように処置されたマウスの動物生存率を示す。Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞を投与されたＷＴマウスは、顕著に増加した生存率を示す。
【図８Ａ】ＭＣ３８−ＯＶＡ担持ＷＴレシピエントでは、Ａｒｇ２欠乏養子移入ＣＤ８＋Ｔ細胞の方が、多くのＩＦＮγ（図８Ａ）を産生し、消耗しにくくなり（図８Ｂ）、長く持続する（図８Ｃ）ことを示す。
【図８Ｂ】ＭＣ３８−ＯＶＡ担持ＷＴレシピエントでは、Ａｒｇ２欠乏養子移入ＣＤ８＋Ｔ細胞の方が、多くのＩＦＮγ（図８Ａ）を産生し、消耗しにくくなり（図８Ｂ）、長く持続する（図８Ｃ）ことを示す。
【図８Ｃ】ＭＣ３８−ＯＶＡ担持ＷＴレシピエントでは、Ａｒｇ２欠乏養子移入ＣＤ８＋Ｔ細胞の方が、多くのＩＦＮγ（図８Ａ）を産生し、消耗しにくくなり（図８Ｂ）、長く持続する（図８Ｃ）ことを示す。
【図９Ａ】腹腔内注射によるＴ細胞移入後８日目、１１日目および１４日目（矢印）に、ＷＴ  ＯＴＩ  Ｔ細胞（図９Ａ：丸）またはＡｒｇ２欠乏ＯＴＩ  Ｔ細胞（図９Ａ：四角）を投与し、抗ＰＤ１  Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂを投与したか（図９Ａ：黒丸および黒四角）投与していない（図９Ａ：白丸および白四角）ＷＴマウスにおけるｄ６０でのＭＣ−３８−ＯＶＡ腫瘍体積、生存率および腫瘍クリアランスをそれぞれ示す。結果は、腫瘍体積、生存率および腫瘍クリアランスに対する、養子ＣＤ８＋Ｔ細胞における抗ＰＤ１  Ａｂ処置とＡｒｇ２欠乏との強力な組合せ効果を示している。
【図９Ｂ】腹腔内注射によるＴ細胞移入後８日目、１１日目および１４日目（矢印）に、ＷＴ  ＯＴＩ  Ｔ細胞（図９Ａ：丸）またはＡｒｇ２欠乏ＯＴＩ  Ｔ細胞（図９Ａ：四角）を投与し、抗ＰＤ１  Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂを投与したか（図９Ａ：黒丸および黒四角）投与していない（図９Ａ：白丸および白四角）ＷＴマウスにおけるｄ６０でのＭＣ−３８−ＯＶＡ腫瘍体積、生存率および腫瘍クリアランスをそれぞれ示す。結果は、腫瘍体積、生存率および腫瘍クリアランスに対する、養子ＣＤ８＋Ｔ細胞における抗ＰＤ１  Ａｂ処置とＡｒｇ２欠乏との強力な組合せ効果を示している。
【図９Ｃ】腹腔内注射によるＴ細胞移入後８日目、１１日目および１４日目（矢印）に、ＷＴ  ＯＴＩ  Ｔ細胞（図９Ａ：丸）またはＡｒｇ２欠乏ＯＴＩ  Ｔ細胞（図９Ａ：四角）を投与し、抗ＰＤ１  Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂを投与したか（図９Ａ：黒丸および黒四角）投与していない（図９Ａ：白丸および白四角）ＷＴマウスにおけるｄ６０でのＭＣ−３８−ＯＶＡ腫瘍体積、生存率および腫瘍クリアランスをそれぞれ示す。結果は、腫瘍体積、生存率および腫瘍クリアランスに対する、養子ＣＤ８＋Ｔ細胞における抗ＰＤ１  Ａｂ処置とＡｒｇ２欠乏との強力な組合せ効果を示している。
【図１０Ａ】ＡＲＧ阻害がインビトロでヒトＴ細胞活性化を増加させることを示す。ＰＢＭＣから精製したヒトＴ細胞を未処理のままにするか（−）、抗ＣＤ３  Ａｂおよび抗ＣＤ２８  Ａｂを用いてインビトロで活性化し（＋）、ＡＲＧ阻害剤の存在下または非存在下で９６ウェルプレート内のＲＰＭＩ中で培養し、活性化２４時間後の活性化（ＣＤ６９染色）を評価した。図は、示されたＡＲＧ阻害剤の存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞（図１０Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ｂ）内のＣＤ６９＋細胞の頻度の増加を示している。
【図１０Ｂ】ＡＲＧ阻害がインビトロでヒトＴ細胞活性化を増加させることを示す。ＰＢＭＣから精製したヒトＴ細胞を未処理のままにするか（−）、抗ＣＤ３  Ａｂおよび抗ＣＤ２８  Ａｂを用いてインビトロで活性化し（＋）、ＡＲＧ阻害剤の存在下または非存在下で９６ウェルプレート内のＲＰＭＩ中で培養し、活性化２４時間後の活性化（ＣＤ６９染色）を評価した。図は、示されたＡＲＧ阻害剤の存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞（図１０Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ｂ）内のＣＤ６９＋細胞の頻度の増加を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明を説明するために、本発明の範囲を限定することを意図することなく、本発明の好ましい実施形態を説明する。
【００３９】
いくつかの態様では、本発明は、癌を治療するために、アルギナーゼ活性および／または発現が障害された免疫細胞に関する。細胞は、好ましくは癌免疫療法に使用される。
【００４０】
「障害されたアルギナーゼ活性および／または発現」という表現での用語「障害された」は、例えば、本明細書に開示されるように、該障害されたアルギナーゼ活性および／または発現を有するように、処理、改変および／または操作されていない対応する野生型免疫細胞と比較して低下したアルギナーゼ活性および／または発現を意味することを意図する。好ましい実施形態では、該アルギナーゼ活性および／または発現は、アルギナーゼの活性および／または発現が検出されない程度まで障害される。好ましくは、該アルギナーゼ活性は完全に存在しない。
【００４１】
「障害されたアルギナーゼ活性および／または発現」という表現は、アルギナーゼをコードするｍＲＮＡの転写および／または翻訳が障害されたことによりアルギナーゼ活性が低下する状況を包含する。さらに、本明細書では、障害されたアルギナーゼ「活性」および／または「発現」が一緒に言及されることが多いが、障害されたアルギナーゼ発現は障害されたアルギナーゼ活性をもたらすため、「障害されたアルギナーゼ活性」という表現が、アルギナーゼ発現の低下によりそのような活性が障害される状況を包含することが理解される。好ましい実施形態では、免疫細胞の活性アルギナーゼ産生能は、好ましくは、免疫細胞の遺伝子発現プロセス（転写、ＲＮＡスプライシング、翻訳、翻訳後修飾などのプロセスを含む）、特にアルギナーゼをコードする１つ以上の遺伝子の発現に対する技術的干渉によって障害される。
【００４２】
該アルギナーゼは、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）および／またはアルギナーゼ２（ＡＲＧ２）であり得る。好ましい実施形態では、該障害されたアルギナーゼ活性および／または発現は、障害されたアルギナーゼ２（ＡＲＧ２）活性および／または発現である。上記のように、ＡＲＧ１とＡＲＧ２とは、それらの細胞内局在および発現パターンに関して異なる。ＡＲＧ２は、ミトコンドリアに位置し、多様な組織で広範囲な発現を示す。一実施形態では、ＡＲＧ１およびＡＲＧ２の両方の活性が障害される。
【００４３】
好ましい実施形態では、該免疫細胞は、Ｔ細胞、ＴＩＬ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）および樹状細胞から選択される。例えば、該ＩＬＣは、ＩＬＣ−１細胞およびＩＬＣ−２細胞から選択され得る。好ましい実施形態では、該免疫細胞は、好ましくはＣＤ３＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞から選択されるＴ細胞である。アルギナーゼ活性および／または発現が障害された２つ以上の異なるタイプの免疫細胞を含む組合せも使用され得る。
【００４４】
一実施形態では、該免疫細胞は樹状細胞である。別の実施形態では、該免疫細胞は樹状細胞ではなく、および／または樹状細胞を除外する。
【００４５】
本明細書の目的のために、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその様々な文法形式は、「とりわけ含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ａｍｏｎｇｓｔ  ｏｔｈｅｒ）」を意味することを意図する。これは、「のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｎｌｙ  ｏｆ）」を意味することは意図されない。
【００４６】
好ましい実施形態では、免疫細胞は、それを必要とする対象、特に癌に罹患している対象に投与するためのものである。一実施形態では、本発明は、癌を治療するための細胞療法に関する。好ましくは、該免疫細胞は、養子細胞移入（ＡＣＴ）によって、またはＡＣＴによる治療の枠内で投与される。ＡＣＴとは、自家癌免疫療法などの癌免疫療法の治療法である。用語「養子」は一般に、ＡＣＴが患者への細胞の移入であることを表すと理解されている。細胞は、例えば、その患者または別の個体に由来し得る。好ましい実施形態では、ＡＣＴとは、細胞の効果を高めるか、問題の症状、一般に癌を治療しやすくするように、一般に遺伝的に、および／または発現タンパク質に関して、選択、操作および／または改変された細胞の移入を指す。
【００４７】
好ましい実施形態では、該免疫細胞は単離および／または精製される。
【００４８】
該免疫細胞は、治療される患者である個体に由来し得る。その場合、自家免疫療法を指す。言い換えれば、患者の免疫細胞の機能および特徴は、患者が罹患している癌と戦うそれらの能力を改善するために改善される。
【００４９】
一実施形態では、該免疫細胞は患者の腫瘍から得られる。このようにして、ＴＩＬを得ることができる。
【００５０】
別の実施形態では、免疫細胞はドナーから採取される。この場合、同種免疫療法を指し得る。
【００５１】
さらに別の実施形態では、該免疫細胞は、幹細胞および／または前駆体免疫細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ）から得られる。
【００５２】
免疫細胞が患者および／またはドナーに由来する場合、本発明の方法は、該患者からもしくは該ドナーから、特に患者もしくはドナーの血液から、または例えばＴＩＬの場合ドナーの腫瘍から、該免疫細胞を採取および／または抽出することを含み得る。
【００５３】
別の実施形態では、該細胞は、個体から、例えば治療される対象から、またはドナーから、以前に採取および／または抽出されている。
【００５４】
免疫細胞がドナーに由来する場合、それらは好ましくは、患者の健康な組織を攻撃しないように選択または改変される。例えば、ドナーの免疫細胞は、好ましくは患者と適合性がある。例えば、ドナーは、患者の家族の一員であってよい。
【００５５】
ドナーが家族の一員であるかどうかを含むいくつかの実施形態では、ドナーの細胞は、免疫細胞が健康な患者組織を攻撃するのを防ぐために、不活性化された天然Ｔ細胞受容体（免疫細胞がＴ細胞である場合）を有する。細胞は、例えば、天然Ｔ細胞受容体を発現しないように、またはその不活性形態を発現するように改変および／または操作されることが好ましい。
【００５６】
示されるように、いくつかの実施形態では、免疫細胞は、幹細胞、例えば多能性幹細胞に由来し得る。したがって、免疫細胞は、好ましくは既製の細胞から調製され、本明細書に従ってさらに操作される。例えば、免疫細胞は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系に基づいて得ることができる。ＡＴＯ系は、胸腺環境を人工的に模倣してヒトＴ細胞の発生を繰り返すインビトロモデルである。ＡＴＯ系は、様々な供給源由来の造血幹細胞、ならびに胚性幹細胞および人工多能性幹細胞のような多能性幹細胞を使用して、正常なＴ細胞の効率的な分化と正の選択とを支援する。この技術はまた、その後の遺伝子工学に柔軟性を提供して、例えば、治療的使用のために同種異系間で操作された既製のＴ細胞製品を生産する。そのような技術は、例えば、国際公開第２０１６／１８７４５９号パンフレットおよび国際公開第２０１７／０７５３８９号パンフレットに開示されている。
【００５７】
本発明によれば、免疫細胞は、アルギナーゼ活性および／または発現が障害されている。該免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現は、任意の好適な方法で障害され得る。一実施形態では、該アルギナーゼ活性は、該アルギナーゼ活性および／または発現を障害するための処理および／または操作に該免疫細胞を曝すことによって障害される。好ましくは、該処理はエクスビボ処理である。例えば、細胞は、患者またはドナーなどの個体から抽出された後、処理に曝される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、アルギナーゼ阻害剤に細胞を曝露し、それによりアルギナーゼを直接遮断することを包含する。例えば、阻害剤は、例えば、活性部位などのタンパク質の関連部分と共有結合的に反応することにより、アルギナーゼを恒久的に不活性化することができる。アルギナーゼ阻害剤は、例えば、本出願の導入部で引用された文献に以前に開示されている。
【００５９】
好ましくは、該細胞は、遺伝的手段によって、および／または遺伝子またはその発現のレベルで改変されて、アルギナーゼ発現を遺伝的に防ぐ。
【００６０】
好ましい実施形態では、該アルギナーゼ活性は、例えば、
・該アルギナーゼをコードする遺伝子を変異させるか、切断するか、欠失させること、
・該アルギナーゼをコードする該遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を投与するか、変異させるか、切断するか、欠失させること、
・該アルギナーゼをコードするｍＲＮＡに結合することができるヌクレオチド配列をコードするか含むヌクレオチド配列を投与すること
によって、該アルギナーゼの発現を障害することによって障害される。例えば、この工程は、該アルギナーゼをコードするｍＲＮＡをコードするか該ｍＲＮＡに結合するヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与することを含み得る。
【００６１】
本明細書の目的のために、用語「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」、および「変異させる（ｍｕｔａｔｉｎｇ）」などのその様々な文法形式によって、遺伝子の切断および欠失が包含される。用語「変異」はさらに、例えば、点変異、点欠失（遺伝子のコード領域内の単一ヌクレオチドの欠失）、および遺伝子のコード領域内のヌクレオチドのストレッチの挿入または欠失を包含する。したがって、さらに一般には、用語「変異」は、変異を有しない細胞内の発現とは異なる遺伝子発現をもたらす任意の遺伝的変化を包含する。明確にするという唯一の理由から、一部の変異は遺伝子発現の変化をもたらさない可能性があり、そのようなサイレント変異はアルギナーゼ発現を障害するのに適した変異とは一般に考えられていないことが言及される。
【００６２】
例えば、細胞は、アルギナーゼ、特にアルギナーゼ２をコードする単数または複数の遺伝子が欠失するように改変され得る。例えば、細胞は、アルギナーゼ１および／または２に関してダブルノックアウトになるように（Ａｒｇ１−／−および／またはＡｒｇ２−／−）処理され得る。アルギナーゼをコードする遺伝子、または転写因子など、アルギナーゼ発現の制御に他の方法で関与する遺伝子の変異は、例えば、部位特異的変異誘発によって行われ得る。Ｋｕｎｋｅｌ法、カセット変異誘発またはＰＣＲ部位特異的変異誘発など、部位特異的変異誘発のための多数の方法が利用可能である。一実施形態では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用することによる遺伝子編集によって、アルギナーゼをコードする遺伝子、または転写因子が改変され得る。
【００６３】
アルギナーゼ発現は、アルギナーゼ遺伝子のリプレッサータンパク質の発現を促進することにより、例えば、細胞に挿入された際にそのようなリプレッサータンパク質を産生するように構築されたベクターを用いて免疫細胞をトランスフェクトすることにより、または遺伝子編集技術によって好適なリプレッサーをコードする遺伝子を挿入することにより、障害され得る。
【００６４】
好ましい実施形態では、該アルギナーゼ発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって低下される。一実施形態では、該障害されたアルギナーゼ活性は、該アルギナーゼをコードするｍＲＮＡに結合することができる核酸分子を該免疫細胞に投与すること、またはそのような核酸分子をコードするベクターもしくは発現系を投与することに起因する。該核酸分子または該ベクターの投与は、好ましくはエクスビボであり、すなわち、単離された細胞、例えば、個体から抽出された細胞に対するものである。
【００６５】
一実施形態では、本発明の方法は、遺伝子発現を阻害するＲＮＡを投与または転写するか、アルギナーゼのｍＲＮＡを中和することを含む。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、細胞、またはそのような干渉ＲＮＡから選択されるいずれか１つをコードするベクターに投与され得る。これらの分子は、細胞内に干渉ＲＮＡを送達することができるか、細胞に移入された際にそのような干渉ＲＮＡを転写することができる好適な送達系および／またはベクターによって細胞に送達され得る。
【００６６】
一実施形態では、本発明の方法は、遺伝子発現を特異的に阻害するかアルギナーゼのｍＲＮＡを中和するＲＮＡなどの核酸分子を投与または転写することを含む。例えば、特に調整された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、細胞、またはそのような阻害性ＲＮＡから選択されるいずれか１つをコードするベクターに投与され得る。これらの分子は、細胞内に阻害性ＲＮＡを送達することができるか、細胞に移入された際にそのような阻害性ＲＮＡを転写することができる好適な送達系および／またはベクターによって細胞に送達され得る。
【００６７】
一実施形態では、特に該免疫細胞では、他のタンパク質をコードする他のｍＲＮＡ分子にではなく、アルギナーゼをコードするｍＲＮＡのみに対して、および／または他のタンパク質の発現を調節するＲＮＡ分子にではなく、アルギナーゼ発現を調節するＲＮＡ分子のみに対して、干渉および／または阻害核酸分子の相補的塩基対形成によって、特異性が提供される。
【００６８】
一実施形態では、該阻害性および／または干渉核酸分子、好ましくはＲＮＡは、マイクロＲＮＡ−１５５ではなく、および／またはマイクロＲＮＡ−１５５を含まない。
【００６９】
他の実施形態では、例えば、アルギナーゼ発現および／またはアルギナーゼのｍＲＮＡの中和が非特異的に阻害される、および／または妨げられる場合、該阻害性および／または干渉核酸分子は、マイクロＲＮＡ−１５５を含んでもよく、および／またはマイクロＲＮＡ−１５５から本質的になってもよい。
【００７０】
好ましい実施形態では、細胞内で阻害性および／または干渉ＲＮＡを直接発現および／または転写するベクターが使用される。そのようなベクターは、長期的な遺伝子特異的サイレンシングを可能にする。例えば、アルギナーゼ１またはアルギナーゼ２をサイレンシングするためのそのようなベクターは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡプラスミドおよびｓｈＲＮＡレンチウイルス製品を含むＲＮＡｉ遺伝子サイレンサーの完全なラインを提供するＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡから商業的に入手することができる。したがって、干渉ＲＮＡをコードするプラスミドまたはベクターが投与され得るか、例えば、好適な送達ビヒクルを使用して細胞に干渉ＲＮＡが直接導入され得る。別の例によれば、ウイルス粒子を使用して、ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを投与してもよい。ヒトアルギナーゼ２  ｍＲＮＡに特異的な例示的なｓｉＲＮＡ分子の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１１７２で開示されているアルギナーゼ２のＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列から得ることができる。ＳｉＲＮＡ分子はまた、Ｓｅｔｔｙ  ＢＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｐｏｘｉｃ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  Ａｒｇｉｎａｓｅ  ＩＩ，Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９（２），８０２−８１３（２０１６）に開示されている。
【００７１】
本発明によれば、アルギナーゼ活性および／または発現の低下は、構成的であり得るか、誘導可能であり得る。いくつかの実施形態では、アルギナーゼ活性の低下は誘導可能であり、すなわち、例えば、養子細胞移入のための細胞の改変を行うスタッフによって制御され得る外部因子によって誘発され得る。アルギナーゼ発現の低下は、例えば、干渉ＲＮＡをコードするベクター上に好適なプロモーターが存在することにより誘導可能になり得る。プロモーターに基づいて、プロモーターが活性化されて初めて遺伝子サイレンシングが起こる。プロモーターは、例えば、細胞に、または細胞を投与した患者に別個に投与され得る特定の小分子によって活性化可能であるように、例えば選択され得る。
【００７２】
一方、構成的に活性なプロモーターを使用することにより、サイレンシングＲＮＡが構成的に発現し、アルギナーゼ発現が構成的に障害され得る。
【００７３】
さらに、アルギナーゼ活性の低下は一過性または安定であり得る。アルギナーゼ発現の一過性または安定な障害は、干渉ＲＮＡの選択と細胞の処理方法とによって決定され得る。例えば、適切なｓｉＲＮＡを用いて細胞を直接トランスフェクトすることにより、アルギナーゼ発現が一過性にサイレンシングされ得る。プロモーターの制御下で干渉ＲＮＡをコードするベクターを用いてトランスフェクションすることにより、細胞内でアルギナーゼ発現が（誘導可能にまたは構成的に）安定にサイレンシングされ得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、癌を治療するためのさらに有利な特徴および／または機能を含む。好ましくは、細胞は、癌治療機能が改善されるようにさらに改変される。上で詳述したようにアルギナーゼ活性を障害するのと同時に免疫細胞をさらに改変してもよいか、例えば、同じ免疫細胞を使用して、別個の前または後の工程で免疫細胞をさらに改変してもよい。本発明はまた、癌治療機能を改善するために他の免疫細胞が独立して操作されることを包含し、これらの他の細胞は、本発明による治療では、本発明の免疫細胞と同時に、または本発明の免疫細胞に連続して投与される。
【００７５】
一実施形態では、免疫細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり、および／または方法はＴＩＬを投与することを含む。好ましくは、該ＴＩＬは腫瘍浸潤Ｔ細胞である。好ましくは、該ＴＩＬは、構成的または誘導的に障害されたアルギナーゼ活性を示す。好ましくは、該ＴＩＬは、それを必要とする対象、特に癌に罹患している対象に投与される。好ましくは、該ＴＩＬは、該対象から以前に単離および／または精製されている。好ましくは、方法は、例えば、該ＴＩＬを単離および／または精製した後、および／または該ＴＩＬを投与する前に、好ましくはエクスビボで該ＴＩＬ内のアルギナーゼ活性を障害することを含む。
【００７６】
一実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含有および／または発現する。一実施形態では、該ＣＡＲは、リンカーを介してＴ細胞シグナル伝達ドメイン、特にＣＤ３ζ（ゼータ）シグナル伝達ドメインに融合された抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、好ましくは、抗体の１つ以上の可変ドメインを含む。好ましくは、該リンカーは膜貫通ドメインを含む。抗原結合ドメインは、ＣＡＲ細胞の表面に発現すると、この細胞の細胞外側にあるのに対して、シグナル伝達ドメインはこの細胞の細胞内側にある。
【００７７】
ＣＡＲの設計および機能に応じて、適切な細胞内ドメインを選択してもよい。細胞外ドメインが、癌細胞上の標的を認識する（それに結合する）ように選択される場合、細胞内ドメインは、好ましくは、細胞外ドメインの結合時に免疫細胞を活性化するように選択される。典型的には、ＣＡＲ  Ｔ細胞では、ＣＡＲの結合は一般に、例えば、Ｔ細胞の増殖およびサイトカインの産生をもたらす。ＣＤ１９などの標的部位にＣＡＲ  Ｔ細胞が結合すると、例えば、癌細胞にアポトーシスを誘導することによって、癌細胞が直接殺傷され得る。したがって、細胞外ドメインの結合から得られる特異的効果は、適切な細胞内ドメインの選択によって制御される。典型的には、ＣＡＲ免疫細胞は、ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメイン、および場合により追加のシグナル伝達ドメインを含む。ただし、本発明は、この免疫細胞によって発現され得る、ＣＡＲの細胞内ドメインまたは細胞外ドメインに関して限定されない。当業者は、標的とされる特定の癌細胞に応じて、および結合によって誘発されることが望まれる免疫応答に応じて、適切なドメインを選択することができる。
【００７８】
例えば、抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９に特異的であり得る。白血病およびリンパ腫などの血液癌に対する現在の養子細胞移入療法（アキシカブタゲンシロロイセル、チサゲンレクロイセル）は、ＣＡＲの抗体可変ドメインがＣＤ１９に特異的であるＣＡＲ  Ｔ細胞に基づいている。
【００７９】
ＣＡＲの抗体可変ドメインは、治療される癌に応じて、癌細胞の表面に発現する標的に特異的であることが好ましい。当技術分野では、以下の抗原結合ドメイン特異性が、ＣＡＲ療法による対応する癌の治療について試験されている。以下に対して特異的な抗原結合ドメイン：特に腎癌に対するＣＡＲ細胞療法のための炭酸脱水酵素；上皮増殖因子受容体、特に神経膠芽腫を治療するための変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ；前立腺癌に対するＣＡＲ療法における前立腺特異抗原（ＰＳＭＡ）および／または前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；卵巣癌、卵管癌および原発性腹膜癌から選択されるいずれか１つの治療における卵巣腫瘍抗原ムチン１６（ＭＵＣ１６）。
【００８０】
本発明の実施形態によれば、免疫細胞は、好ましくは、上記の抗原の群から選択される特異性を有するＣＡＲなどの１つ以上のＣＡＲを発現するように操作される。
【００８１】
一実施形態では、免疫細胞はＣＡＲを発現し、および／または方法は、ＣＡＲを発現する免疫細胞を投与することを含む。好ましくは、癌ＣＡＲ発現細胞は、構成的または誘導的に障害されたアルギナーゼ活性を示す。好ましくは、ＣＡＲ発現細胞は、それを必要とする対象、特に癌に罹患している対象に投与される。好ましくは、該対象から以前に単離および／または精製された該免疫細胞、および方法は、該ＣＡＲを発現するように、および／または患者または他のドナーから以前に単離された細胞と、該ＣＡＲを発現するように以前に処理された該細胞とを提供するように、細胞を処理する工程を含む。一実施形態では、方法は、該ＣＡＲ発現細胞内のアルギナーゼ活性を好ましくはエクスビボで障害することを含む。
【００８２】
本発明に従って包含される免疫細胞の別の改変は、内部シグナル伝達ドメインのスイッチングである。
【００８３】
一実施形態では、免疫細胞は、例えば、腫瘍微小環境によって誘発される阻害性ＩＬ−４シグナル伝達を低減、無効化および／または逆転させるように改変または不活性化されるＩＬ−４受容体を含み、および／または発現する。例えば、ＩＬ−４受容体のシグナル伝達ドメインは、阻害性ＩＬ−４シグナル伝達を逆転させるように、ＩＬ−７受容体のシグナル伝達ドメインにスイッチングされ得る。
【００８４】
一実施形態では、免疫細胞は２つのＣＡＲを発現する。第１のＣＡＲは、好ましくは、癌細胞によって発現されるＰＳＣＡなどの抗原に向けられる抗原結合ドメインを用いて、特定の癌細胞に対して免疫細胞を標的化する。第２のＣＡＲは、例えば、合成または外来化合物、例えば、小分子に結合することができる。化合物は、別個におよび／またはＣＡＲ細胞と一緒に患者に投与することができる。小分子は、投与されると第２のＣＡＲに結合する。免疫細胞が標的細胞と接触している場合、化合物との共刺激は、免疫細胞の効率的および／または強力な活性化をもたらす。２つのＣＡＲを共発現するＴ細胞、リミヅシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）（ホモ二量体化活性を有する脂質透過性タクロリムスアナログ）に対する第２の結合は、現在、第Ｉ相試験で試験されている。
【００８５】
一実施形態では、免疫細胞は、不活性なチェックポイントタンパク質を発現するように、または阻害性チェックポイントタンパク質を欠くように操作される。例示的な免疫チェックポイント調節因子は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７ｘ／Ｂ７Ｓ１／ＶＴＣＮ１）、ＨＨＬＡ２（Ｂ７Ｈ７／Ｂ７−Ｈ５）、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ１Ｈ、ＤＤ１α、ｃ１０ｏｒｆ５４、Ｇｉ２４、Ｄｉｅｓ１、ＳＩＳＰ１）、ＶＳＩＧ、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＤ３９、ＣＤ７３、アデノシンＡ２受容体、ＣＤ４７、ブチロフィリン（ＢＴＮ）および／またはＴＩＭ−３（Ｔ細胞−免疫グロブリン−ムチンドメイン）である。
【００８６】
免疫細胞の一実施形態では、チェックポイントタンパク質のシグナル伝達ドメインを阻害する免疫応答は、共刺激ドメインにより不活性化されるか、共刺激ドメインと交換（置換）される。例えば、ＰＤ１（プログラム細胞死タンパク質１）の抑制性ＣＤ２８ドメインは、不活性であるように変異され得るか、共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインまたはＣＤ１３７ドメインにスイッチングされ得る。
【００８７】
免疫細胞の免疫チェックポイントタンパク質を不活性化することにより、または細胞内ドメインを刺激ドメインに形質転換することにより（例えば、細胞内ドメインの置換により）、腫瘍細胞および／または腫瘍微小環境の免疫抑制活性を回避することが可能である。
【００８８】
一実施形態では、免疫細胞は、外部因子によって誘発されるとアポトーシスを誘導することができるタンパク質を組換え発現する。これは、例えば、患者に免疫細胞を投与した後に認められる望ましくない副作用の場合に、本発明の免疫細胞を標的化された方法で破壊することを可能にする安全対策と考えられ得る。例えば、シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインに結合するとアポトーシスをもたらすような方法で提供されてもよい。細胞外ドメインは、本明細書の他の箇所に記載されているように、小分子などの人工化合物に結合していてもよい。
【００８９】
免疫細胞は、適切なベクターを用いて細胞をトランスフェクトすることにより、または例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術などの遺伝子編集を使用してゲノムに受容体を発現するための遺伝子および／またはプロモーターを挿入することにより、ＣＡＲおよび／またはトランスジェニックＴ細胞受容体を発現するように操作されてもよい。
【００９０】
免疫細胞は、癌を治療するために、好ましくは、個体、例えば、癌治療を必要とする個体に投与される。個体は、好ましくは癌に罹患している患者である。免疫細胞は、任意の好適な方法で、好ましくは非経口的に投与され得る。好ましい実施形態では、免疫細胞は静脈内投与される。
【００９１】
好ましい実施形態では、免疫細胞は、別の癌治療に加えて投与される。好ましくは、免疫細胞は、別の癌治療と組み合わせて使用される。他の癌治療は、同時におよび／または別個に投与され得る。さらに、他の癌治療は、別個の組成物の形態で別個に投与されてもよいか、単一の組成物に組み合わされてもよい。
【００９２】
好ましい実施形態では、免疫細胞は、ネガティブ免疫チェックポイント調節因子を標的とするおよび／またはネガティブ免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する癌治療と組み合わせて使用および／または投与される。免疫チェックポイント調節因子は、本明細書の他の箇所に開示されている。一実施形態では、免疫細胞は、癌細胞によって発現され得る免疫チェックポイント調節因子に結合する細胞表面タンパク質、例えば受容体を発現し得る。例えば、上記のように、免疫細胞は免疫チェックポイント調節因子タンパク質に結合するＣＡＲを発現し得る。この実施形態によれば、免疫チェックポイント調節因子を遮断する実体は、非結合／遊離抗体の代わりに、免疫細胞上の細胞表面タンパク質の形態で発現され得る。
【００９３】
別の実施形態では、該（他のまたは追加の）癌治療は、抗癌剤および／または分子、例えば免疫チェックポイント調節因子阻害剤を含む。好ましくは、該癌治療は、抗体、好ましくは免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する抗体を含む。好ましい実施形態では、該癌治療は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＤ３９、ＣＤ７３、アデノシンＡ２受容体、ＣＤ４７、ブチロフィリン（ＢＴＮ）および／またはＴＩＭ−３の群から選択される１つ以上に特異的に結合する抗体を含む。
【００９４】
いずれもＰＤ−１に特異的に結合するニボルマブおよびペンブロリズマブなど、免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する抗体が市販されており、様々な異なる癌の治療に使用されている。
【００９５】
そのような抗体は、一般に、免疫チェックポイント調節因子阻害剤と呼ばれ得る。本発明者らは、本発明のアルギナーゼが障害された免疫細胞が、免疫チェックポイント調節因子阻害剤を含む治療と組み合わされると、相乗的な抗癌活性をもたらすことを観察した。一実施形態では、抗体は、癌細胞によって発現され、癌細胞の表面上に提供される免疫チェックポイント調節因子タンパク質に特異的に結合する。別の実施形態では、抗体は、タンパク質、例えば、本発明の免疫細胞の表面に発現する受容体に特異的に結合し、抗体は、免疫細胞のタンパク質が、癌細胞に発現する対応するタンパク質と接触するのを防ぐ。好ましい実施形態では、免疫チェックポイント調節因子阻害剤は、モノクローナル抗体である。
【００９６】
好ましい実施形態では、免疫細胞は、癌を治療および／または予防する方法に使用される。一実施形態では、治療のために選択される癌は、白血病、リンパ腫および／または固形腫瘍を含む群から選択される。本発明者らの１つの驚くべき発見は、免疫細胞が血液癌（ｂｌｏｏｄ  ｃａｎｃｅｒ）および／または血液癌（ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）を減少させるのに有効であるだけでなく、特に固形腫瘍のサイズおよび／または体積を減少させるのにも有効であることである。ＣＡＲ  Ｔ細胞に基づく現在使用されている養子細胞移入療法は、一般に固形腫瘍に対して十分な効果を得ることが困難なために血液癌の治療に使用されているため、これは驚くべきことである。現在のＣＡＲ  Ｔ細胞療法では、固形腫瘍の治療には時に重大な副作用と毒性問題とが伴う。本発明者らは、毒性副作用のない養子細胞移入による固形腫瘍の治療を開示する。
【００９７】
本発明は、癌を治療および／または予防する方法、免疫療法、細胞療法の方法、既存の免疫療法を改善する方法、癌の療法および予防に有用な免疫細胞を産生する方法、癌治療を調製および／または製造する方法、および／または免疫細胞の抗癌活性および／または効果を改善する方法を含むいくつかの方法に関する。本明細書に詳述されるように、免疫細胞は、好ましくは、改善された抗癌活性を有するように処理される。さらに具体的には、細胞は、好ましくは、固形腫瘍の細胞を含む癌細胞によって生成された免疫抑制環境では、増加した活性および／または生存率を有する。好ましくは、免疫細胞は、癌細胞の免疫抑制活性の少なくとも一部に対してある程度不活性であるままにすることにより、それらの抗癌活性および／または機能を保持する。
【００９８】
好ましくは、免疫細胞は、処理および／または操作されて、改善された抗癌活性を示す。本明細書に詳述されるように、治療は、好ましくはアルギナーゼ活性を低下させる。細胞の処理は、好ましくはエクスビボおよび／またはインビトロで、すなわち、好ましくはヒトまたは動物の体外で行われる。一実施形態では、本発明の方法は、個体から未処理または野生型の免疫細胞を抽出および／または採取することを含む。一実施形態では、本発明の方法は、該免疫細胞を投与する前に、該免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現をエクスビボで障害することを含む。一実施形態では、方法は、患者に対する免疫細胞の投与を含む。
【００９９】
本明細書の他の箇所に開示されるように、免疫細胞は、治療される患者に由来するか、ドナーに由来してもよいか、例えば、幹細胞から得られる培養物に由来してもよい。
【０１００】
免疫細胞は、好ましくは医薬組成物の形態で提供される。好ましくは、組成物は、好適な賦形剤および／または担体、例えば、細胞が懸濁されている、ほぼ生理的および／または等張性の溶液から選択される溶液、例えば生理食塩水を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、治療される患者またはドナーから得られる血清を含み得る。
【０１０１】
本発明はまた、癌を治療する方法に使用するためのキットを提供する。キットは、好ましくは、免疫細胞内のアルギナーゼ活性および／または発現を障害するのに適した作用物質を含む。いくつかの実施形態では、キットは、免疫細胞に投与された際にＲＮＡ干渉を誘発することができる作用物質を含み、該ＲＮＡｉは、アルギナーゼ発現を障害する。例えば、キットは、本明細書の他の箇所に開示されているような１つ以上の作用物質（ｓｉＲＮＡベクターなど）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、免疫細胞、例えば、アルギナーゼ活性が障害された既製の免疫細胞、例えば、Ａｒｇ２−／−免疫細胞を含む。
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態のいくつかを上記で説明し、具体的に例示してきたが、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、様々な修正を行うことができる。以下に、本発明の例を開示する。これらの例は、例示のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１０３】
例
例１：Ａｒｇ２−／−マウスにおける腫瘍増殖の障害および抗腫瘍免疫の増強
本例では、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手したＡｒｇ２欠乏（ダブルノックアウト）マウスを使用した。第１のアプローチとして、ＷＴマウスおよびＡｒｇ２−／−マウスの腫瘍増殖を比較した。２つの移植可能な腫瘍モデル、Ｂ１６メラノーマモデルおよびＭＣ３８結腸癌モデルを使用した。両モデルでは、代理腫瘍抗原としてオボアルブミン（ＯＶＡ）を発現する腫瘍変異体を使用した。
【０１０４】
第１の実験では、ＷＴマウスまたはＡｒｇ２−／−マウスの背中に０．５ｘ１０６のＢ１６−ＯＶＡ細胞またはＭＣ３８−ＯＶＡ細胞を皮下注射し、腫瘍増殖を２週間モニタリングした。Ｎ＝９であり、２つの独立した実験からデータをプールする。
【０１０５】
第２の実験では、第１の実験と同様に腫瘍細胞を移植した。腫瘍注射後１１日目（Ｂ１６−ＯＶＡ）または１３日目（ＭＣ３８−ＯＶＡ）に、高用量の細胞トレーサーバイオレット（ＣＴＶｈｉ）により蛍光標識したＯＶＡパルスＷＴ脾細胞および低用量の細胞トレーサーバイオレット（ＣＴＶｌｏ）により蛍光標識した非パルスＷＴ脾細胞を静脈内注射した。２４時間後、腫瘍を切除し、ＴｄＬＮおよびｎｄＬＮから得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。特異的インビボ殺傷を以下のように計算した：［１−（％ＣＴＶｈｉ  ＴｄＬＮ／％ＣＴＶｌｏ  ＴｄＬＮ）／（％ＣＴＶｈｉ  ｎｄＬＮ／％ＣＴＶｌｏ  ＴｄＬＮ）］ｘ１００。
【０１０６】
結果を図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂに示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。図１Ａおよび図１Ｂに示すように、Ａｒｇ２−／−マウスでは、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍およびＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍の両方の増殖が有意に障害された。障害された腫瘍増殖は、腫瘍流入リンパ節内のインビボＯＶＡ特異的腫瘍細胞殺傷の増加と関連していた（図２Ａおよび図２Ｂ）。Ｂ１６−ＯＶＡでは、２つの実験の代表が示されている。ＭＣ３８−ＯＶＡでは、２つの独立した実験からデータをプールした。
【０１０７】
その後の調査では、ＭＣ３８−ＯＶＡモデルに主に焦点を当てた。
【０１０８】
例２：腫瘍増殖および動物生存率を制御するためのＣＤ８＋Ｔ細胞の寄与
Ａｒｇ２−／−マウスの障害されたＭＣ３８−ＯＶＡ増殖がＣＤ８＋Ｔ細胞による増強された制御によるものであるかどうかを決定するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇実験を行った。
【０１０９】
ＷＴマウスまたはＡｒｇ２−／−マウスの背中に、０．５ｘ１０６のＭＣ３８−ＯＶＡ細胞を皮下注射し、腫瘍増殖および動物生存率を４週間モニタリングした。抗ＣＤ８ａ＋枯渇Ａｂ（αＣＤ８ａ）またはＩｇＧ２ａアイソタイプ対照Ａｂ（αＩｇＧ２Ａ）の数回の腹腔内注射により、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇を行った。
【０１１０】
図３Ａおよび図３Ｂに示すように、Ａｒｇ２−／−マウスの腫瘍増殖の減少および動物生存率の増加はそれぞれ、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇によって有意に回復し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を介した免疫制御の重要な役割が示された。ただし、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇Ａｒｇ２−／−マウスでの腫瘍増殖は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＷＴマウスに観察されたものまで完全には回復しなかったため、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、作用する唯一の機構ではない。
【０１１１】
例３：腫瘍増殖阻害および動物生存率に対する抗ＰＤ１療法とＡｒｇ２欠乏との相乗効果
ＭＣ３８腫瘍は、Ｔ細胞阻害性ＰＤＬ１−ＰＤ１チェックポイント軸を遮断する抗体による免疫療法に感受性である。ＰＤＬ１−ＰＤ１遮断によって誘導されるＭＣ３８腫瘍の増強された制御が、Ａｒｇ２欠乏から生じるＭＣ３８腫瘍の増強された制御に関与する機構と協働するかどうかを決定するために、ＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍を担持するＷＴマウスおよびＡｒｇ２−／−マウスを抗ＰＤ１抗体により処置した。
【０１１２】
ＷＴマウスまたはＡｒｇ２−／−マウスの背中に０．５ｘ１０６のＭＣ３８−ＯＶＡ細胞を皮下注射した。腫瘍注射後９日目、１１日目および１４日目（緑色の矢印）に、マウスに抗ＰＤ１（αＰＤ−１）ＡｂまたはＩｇＧ２ａアイソタイプ対照Ａｂ（αＩｇＧ２Ａ）を注射した。
【０１１３】
図４Ａから分かるように（２つの実験からプールしたデータ。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）、抗ＰＤ１抗体により処置したＷＴマウスの腫瘍増殖は、未処置のＡｒｇ２−／−マウスの腫瘍増殖の減少と同様の程度まで減少した。重要なことに、抗ＰＤ１抗体によるＡｒｇ２−／−マウスの処置は、腫瘍増殖のほぼ完全な消失をもたらした。図４Ｂに示すように、腫瘍は多くのマウスで実際に消失した。図４Ｃは、抗ＰＤ１抗体により処置したＡｒｇ２−／−マウスでは、動物生存率が大幅に増加したことを示している。したがって、抗ＰＤ１療法およびＡｒｇ２欠乏は、腫瘍増殖に対して強力な相乗効果を示す。
【０１１４】
例４：ＢＭ由来細胞のＡｒｇ２欠乏は腫瘍増殖の制御の改善に関与する
障害されたＭＣ３８‐ＯＶＡ増殖が、ＢＭ由来細胞または非造血起源の細胞のＡｒｇ２欠乏の結果であるかどうかを決定するために、相互骨髄（ＢＭ）キメラマウスを作製した。ＷＴマウスおよびＡｒｇ２−／−マウスに致死量未満の放射線を照射して、宿主ＢＭを破壊した。次いで、ＷＴマウスまたはＡｒｇ２−／−マウス由来のＢＭ細胞を全４種の対の組合せで移植することによって、造血作用を再構成した。
【０１１５】
ＢＭキメラマウスの背中に０．５ｘ１０６のＭＣ３８−ＯＶＡ細胞を皮下注射し、腫瘍増殖を４週間モニタリングした。Ｎ＝マウス１１匹。
【０１１６】
図５から分かるように（データは３つの独立した実験からプールしている。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）、Ａｒｇ２−／−マウス由来のＢＭ細胞を投与したキメラ（Ａｒｇ２−／−＞ＷＴおよびＡｒｇ２−／−＞Ａｒｇ２−／−）は、ＷＴマウス由来のＢＭ細胞を投与したキメラ（ＷＴ＞ＷＴおよびＷＴ＞Ａｒｇ２−／−）と比較して、腫瘍増殖の大幅な減少を示した。これらの結果は、腫瘍増殖の減少が、主にＢＭ由来細胞のＡｒｇ２欠乏によるものであることを示している。
【０１１７】
例５：Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ細胞はインビトロで活性化および増殖の増強を示す
ＣＤ８＋Ｔ細胞のＡｒｇ２欠乏が腫瘍増殖の制御の改善に関与するかどうかを決定するために、交配によりＯＴＩマウスにＡｒｇ２変異を付与して、二重ホモ接合Ａｒｇ２−／−ＯＴＩマウスを得た。
【０１１８】
ＯＴＩマウスは、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＯＶＡ特異的ＴＣＲをコードする導入遺伝子を発現するため、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のみを有する。これにより、Ａｒｇ２＋／＋およびＡｒｇ２−／−ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の機能的特性を比較することができた。
【０１１９】
交配させたマウスからＷＴ  ＯＴＩ  Ｔ細胞またはＡｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞を単離し、インビトロで抗ＣＤ３  Ａｂおよび抗ＣＤ２８  Ａｂを用いて活性化し、９６ウェルプレート内のＲＰＭＩ中で培養し、活性化後１日目、２日目および３日目に活性化（ＣＤ６９染色）を評価した。活性化後４日目に、Ｔ細胞増殖（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）希釈）を決定した。
【０１２０】
結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す（データは２つの独立した実験の代表である。＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【０１２１】
図６Ａおよび図６Ｂに示すインビトロＴ細胞活性化アッセイでは、Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ細胞が、Ａｒｇ２＋／＋ＯＴＩ細胞と比較して活性化および増殖の増加を示すことが実証された。
【０１２２】
例６：ＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍のＯＴＩ  Ｔ細胞療法
ＷＴバックグラウンドでのＡｒｇ２＋／＋ＯＴＩ細胞およびＡｒｇ２−／−ＯＴＩ細胞によるＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍増殖および動物生存率の制御を比較するために、インビボ系を開発した。
【０１２３】
インビボ系の作製を図７Ａに示す。最初に、Ｒａｇ２−／−マウス由来ＢＭとＡｒｇ２＋／＋ＯＴＩマウスまたはＡｒｇ２−／−ＯＴＩマウス由来ＢＭ細胞との９：１混合物を用いて、放射線照射したＷＴマウスを再構成し、混合ＢＭキメラを作製した。これらの混合ＢＭキメラでは、Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞およびＡｒｇ２＋／＋ＯＴＩ  Ｔ細胞は、正常なＡｒｇ２発現を示す環境で発達するため、それらの機能的特性の差は、Ａｒｇ２発現の細胞固有の差に帰することができる。Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ  ＢＭおよびＡｒｇ２＋／＋ＯＴＩ  ＢＭに由来するＢ細胞は、言うまでもなく、それらのＡｒｇ２状態に関しても異なるであろうが、これは、ＩｍｍＧｅｎコンソーシアムデータの調査ではＢ細胞がＡｒｇ２  ｍＲＮＡを発現しないことが示されることから、いかなる影響も及ぼさないであろうことに留意されたい。
【０１２４】
ＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍を担持するＷＴマウスに養子移入されたＡｒｇ２＋／＋ＯＴＩ  Ｔ細胞およびＡｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞のドナーとして、混合ＢＭキメラを使用した。さらに具体的には、混合ＢＭキメラから、０．５ｘ１０６のＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍細胞を５日前に注射したＷＴレシピエントに、１０６の脾リンパ節およびリンパ節のＡｒｇ２＋／＋ＯＴＩ  Ｔ細胞またはＡｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞を移入した。
【０１２５】
次いで、ＯＴＩ  Ｔ細胞移入の１日後に、ＣｐＧ−Ｂ＋ＯＶＡ１ペプチドを用いて腫瘍担持レシピエントを免疫し、腫瘍増殖をモニタリングした。
【０１２６】
結果を図７Ｂおよび図７Ｃに示す。ＯＴＩ細胞を投与していないマウスまたはＡｒｇ２＋／＋ＯＴＩ細胞を投与したマウスと比較して、Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞を投与したマウスでは、腫瘍増殖が著しく減少し（図７Ｂ）、動物生存率が増加した（図７Ｃ）。この実験的セットアップは、ＷＴ環境でのＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍の増殖を制御するには、Ａｒｇ２＋／＋ＯＴＩ細胞よりもＡｒｇ２−／−ＯＴＩ  Ｔ細胞の方が良好に態勢が整っていることを正式に実証した。
【０１２７】
例７：ＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍担持動物では、Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ細胞の方が、ＩＦＮγ産生の増強を示し、消耗が少なく、長く持続する
Ａｒｇ２欠乏がＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能に及ぼす影響をインビボでさらに調査するために、ＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍担持ＷＴマウスに、同数のナイーブＯＴＩ  ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＡｒｇ２−／−ＯＴＩ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を移入した。ＯＴＩ移入の１日後に、ＣｐＧ−Ｂ＋ＯＶＡ−１ペプチドを用いて腫瘍担持レシピエントを免疫し、免疫化の７日後に、フローサイトメトリーにより、流入ＬＮ（ｄＬＮ）および腫瘍内のＯＴＩ細胞を分析した。ｄＬＮおよび腫瘍内のＡｒｇ２−／−ＯＴＩ細胞ではともに、ＩＦＮγ＋細胞の頻度が高かった（図８Ａ）。腫瘍内のＡｒｇ２−／−ＯＴＩ細胞では、ＰＤ−１発現のレベルが有意に低かった（図８Ｂ）。
【０１２８】
腫瘍特異的Ｔ細胞応答の時空ダイナミクスに対するＡｒｇ２欠乏の影響を調査するために、ＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍担持マウスに同数のナイーブＯＴＩ  ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＡｒｇ２−／−ＯＴＩ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を移入し、ＯＶＡ２５７−２６４免疫化後の様々な時点で、ｄＬＮおよび腫瘍に対するフローサイトメトリーによって、宿主でのそれらの分布を評価した。ＣＤ４５．１マーカーを使用して、ＯＴＩ（ＣＤ４５．１＋／＋）細胞とＡｒｇ２−／−ＯＴＩ（ＣＤ４５．１＋／−）細胞とを区別した。１５日目までに、ｄＬＮおよび腫瘍ではともに、Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ細胞の方がＯＴＩ  ＷＴ細胞よりも著しく頻度が高く（図８Ｃ）、Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ細胞の方が持続性の高い抗腫瘍応答を起こすことが示唆された。
【０１２９】
例８：Ｔ細胞固有のＡｒｇ２欠乏はＰＤ−１遮断と相乗作用する
ＷＴ  ＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍担癌マウスを対象に、養子Ａｒｇ２−／−ＯＴＩ移入とＰＤ１遮断とを組み合わせる利点を調査した。ＷＴマウスにＭＣ３８−ＯＶＡ腫瘍を負荷し、５日後、腫瘍が触知可能になった際に、ドナーがキメラマウスでないことを除いて、図７Ａに示すように養子移入細胞をマウスに投与し、翌日免疫した。Ｔ細胞移入後８日目、１１日目および１４日目に、腹腔内注射によりマウスに２００μｇの関連抗体を投与した。この設定では、Ｔ細胞固有のＡｒｇ２欠乏とＰＤ１遮断との相乗効果を再び観察した。Ａｒｇ２−／−ＯＴ−Ｉ細胞または抗ＰＤ１抗体のみを投与されたマウスと比較して、併用処置を受けたマウスの方が、腫瘍増殖の大幅な減少（図９Ａ）、長期の生存期間（図９Ｂ）および増加した腫瘍クリアランスを示した（図９Ｃ）。
【０１３０】
例９：ＡＲＧ阻害はインビトロでヒトＴ細胞活性化を増加させる
次に、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＡＲＧ阻害が、それらのインビトロでの活性化に影響を与えるかどうかを決定した。ＰＢＭＣから精製したヒトＴ細胞を未処理のままにするか、抗ＣＤ３  Ａｂおよび抗ＣＤ２８  Ａｂを用いてインビトロで活性化し、ＡＲＧ阻害剤の存在下または非存在下で９６ウェルプレート内のＲＰＭＩ中で培養し、活性化２４時間後の活性化（ＣＤ６９染色）を評価した。ＡＲＧ酵素機能の阻害により、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１０Ａ）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ｂ）内のＣＤ６９＋細胞の頻度が増加し、ＡＲＧ阻害によりインビトロでのヒトＴ細胞活性化が増加することが実証された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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2021517454.tif 000027
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