(57)【要約】  真核細胞におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む導入遺伝子と組み合わされた、ＲＮＡ不安定化エレメント（ＲＤＥ）、およびＲＮＡ制御デバイスを含む制御デバイスが開示される。ＲＤＥは、リガンド媒介制御を含むＲＤＥを作るためにＲＮＡ制御デバイスと組み合わせることができる。これらのｓｍａｒｔ  ＲＤＥおよび他のＲＤＥは、例えば、エフェクター機能が最適化されるように、真核細胞における導入遺伝子、例えばＣＡＲの発現を最適化するのに使用することができる。ＣＡＲおよび導入遺伝子ペイロードはまた、導入遺伝子ペイロードが真核細胞から所望の時点で発現および送達されるように、真核細胞に改変することもできる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体と、第１の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および第１のＲＤＥをコードするポリヌクレオチドを含む第１の異種核酸と、第２の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および第２のＲＤＥをコードするポリヌクレオチドを含む第２の異種核酸とを含む真核細胞を得るステップであり、ここで、第１及び第２の異種核酸が転写されて、第１のＲＤＥに作動可能に連結された第１の導入遺伝子をコードする第１の転写物と、第２のＲＤＥに作動可能に連結された第２の導入遺伝子をコードする第２の転写物とを作製し、第１のＲＤＥが第１の時点で第１の最大ダイナミックレンジをもたらし、第２のＲＤＥが第２の時点で第２の最大ダイナミックレンジをもたらす、上記ステップ；
受容体のためのリガンドに該真核細胞を曝露するステップであり、ここで、受容体によるリガンドの結合が該細胞を活性化する、上記ステップ；ならびに
複数の導入遺伝子を発現させるステップであり、ここで、第１の導入遺伝子が第１の時点で第１の最大ダイナミックレンジに達し、第２の導入遺伝子が第２の時点で第２の最大ダイナミックレンジに達する、上記ステップ；
を含む、複数の導入遺伝子を発現させる方法。
【請求項２】
第１の導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、レポーター、またはチェックポイント阻害剤をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、レポーター、またはチェックポイント阻害剤をコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の導入遺伝子が真核細胞から分泌される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
分泌ポリペプチドが標的細胞に作用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第２の導入遺伝子によってコードされるポリペプチドが真核細胞から分泌される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第２の導入遺伝子からの分泌ポリペプチドが標的細胞に作用する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
真核細胞が免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
免疫細胞がＴ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的細胞ががん細胞または細菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的細胞を死滅させるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
受容体が、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
受容体と、第１の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および第１のＲＤＥをコードするポリヌクレオチドを含む第１の異種核酸と、第２の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、および第２のＲＤＥをコードするポリヌクレオチドを含む第２の異種核酸とを含む真核細胞を得るステップであり、ここで、第１及び第２の異種核酸が転写されて、第１のＲＤＥに作動可能に連結された第１の導入遺伝子をコードする第１の転写物と、第２のＲＤＥに作動可能に連結された第２の導入遺伝子をコードする第２の転写物とを作製し、第１のＲＤＥが第１の発現動態をもたらし、第２のＲＤＥが第２の発現動態をもたらす、上記ステップ；
受容体のためのリガンドに該真核細胞を曝露するステップであり、ここで、受容体によるリガンドの結合が該細胞を活性化する、上記ステップ；ならびに
複数の導入遺伝子を発現させるステップであり、ここで、第１の導入遺伝子が第１の発現動態で発現され、第２の導入遺伝子が第２の発現動態で発現される、上記ステップ；
を含む、複数の導入遺伝子を発現させる方法。
【請求項１４】
発現動態が、発現量、ダイナミックレンジ、曲線下面積、Ｃｍａｘ、およびＴｍａｘからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
発現動態が最大発現率である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
受容体と、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、ＲＤＥをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸とを含む真核細胞を得るステップであり、ここで、異種核酸が転写されて、ＲＤＥに作動可能に連結された導入遺伝子をコードする転写物を作製し、ＲＤＥが所望の量の基底発現を可能にする、上記ステップ；
受容体のためのリガンドに該真核細胞を曝露するステップであり、ここで、受容体によるリガンドの結合が該細胞を活性化する、上記ステップ；ならびに
導入遺伝子を発現させるステップであり、ここで、導入遺伝子から作られるポリペプチドの量が、細胞の活性化後、所望の時点で所望の量だけ増加される、上記ステップ；
を含む、導入遺伝子を発現させる方法。
【請求項１７】
真核細胞において、最大ダイナミックレンジまでの時間後、導入遺伝子の発現が減少し、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が減少する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
基底発現の所望の量が少量である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
基底発現の所望の量が多量である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、チェックポイント阻害剤、またはレポーターをコードする、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
免疫細胞を、転写物をＲＤＥと結合させるために利用可能な阻害性ＲＤＥ結合タンパク質の量を増加させる因子に曝露するステップと、これにより、より多くの阻害性ＲＤＥ結合タンパク質が転写物中でＲＤＥに結合し、転写物からの発現を低下させるステップとを含む、免疫細胞における発現を低下させる方法。
【請求項２２】
因子が解糖阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
解糖阻害剤が、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２−デオキシグルコース、３−ブロモピルビン酸、ヨード酢酸、フッ化物、オキサメート、プログリタゾン、ジクロロ酢酸、またはキノンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
第１の導入遺伝子をコードする第１のポリヌクレオチド、および第１のＲＤＥをコードするポリヌクレオチドと、第２の導入遺伝子をコードする第２のポリヌクレオチド、および第２のＲＤＥをコードするポリヌクレオチドとを含む核酸であって、第１及び第２のポリヌクレオチドが転写されて、第１のＲＤＥに作動可能に連結された第１の導入遺伝子をコードする第１の転写物と、第２のＲＤＥに作動可能に連結された第２の導入遺伝子をコードする第２の転写物とを作製し、第１のＲＤＥが第１の時点で第１の最大ダイナミックレンジをもたらし、第２のＲＤＥが第２の時点で第２の最大ダイナミックレンジをもたらす、核酸。
【請求項２５】
第１の導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、レポーター、またはチェックポイント阻害剤をコードする、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
請求項２４に記載の核酸を含む、真核細胞。
【請求項２７】
真核細胞がＴ細胞である、請求項２７に記載の真核細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
[0001]配列表の正式な写しが、ファイル名「ＣＢＩＯ０３０＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１８年２月１１日、サイズ９キロバイトのＡＳＣＩＩフォーマットテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で出願された配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]キメラ抗原受容体は、ＣＡＲによって認識された標的を攻撃するようＴ細胞に指示することができるヒト改変受容体である。例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、急性リンパ芽球性白血病および他のＢ細胞関連悪性腫瘍に対する完全奏功の誘導に有効であることが示されており、ならびに難治性／再発急性リンパ芽球性白血病の寛解の達成および持続に有効であることが示されている（Ｍａｕｄｅら、ＮＥＪＭ、３７１：１５０７、２０１４）。しかし、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、Ｂ細胞形成不全、およびｏｎ−ｔｕｍｏｒ、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ毒性に関連する危険な副作用が一部の患者で認められている。
【０００３】
[0003]現在、ＣＡＲ技術を制御する２つの戦略が存在する。１つ目は、誘導性「キルスイッチ（ｋｉｌｌ  ｓｗｉｔｃｈ）」である。このアプローチでは、アポトーシス経路を惹起する１つまたは複数の「自殺」遺伝子がＣＡＲ構築物に組み込まれる（Ｂｕｄｄｅら  ＰＬｏＳｌ、２０１３  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２）。これらの自殺遺伝子の活性化は、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ１２（Ｆｖ）のホモ二量体化を惹起する脂質透過性タクロリムス類似体であるＡＰ１９０３（リミデュシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）としても知られる）の添加によって惹起され、アポトーシス誘導性タンパク質はＡＰ１９０３に翻訳的に融合される。理想的なシナリオでは、これらのキルスイッチは、ＣＡＲ技術の長期監視の利点を犠牲にして毒性から守ろうとする。しかし、インビボでは、これらの自殺スイッチはこの目標を実現しそうにない。その理由は、これらの自殺スイッチが、ＡＰ１９０３に応答しないＣＡＲ  Ｔ細胞に対する強力な選択圧に不利に働いており、患者Ｔ細胞への安定な導入遺伝子の挿入と関連する有害な、エラーを起こしやすいレトロウイルスの複製によって状況が悪化するためである。このシナリオでは、非応答性ＣＡＲ  Ｔ細胞クローンが増殖し続け、抗原依存的に標的細胞を死滅させるであろう。故に、キルスイッチ技術は、毒性に対する十分な防衛手段を提供しそうにない。
【０００４】
[0004]２つ目のＣＡＲ制御アプローチは、いくつかの方法で達成され得る一過性ＣＡＲ発現である。１つのアプローチでは、Ｔ細胞が非血縁ドナーから採取され、ＨＬＡ遺伝子がゲノム編集技術によって欠失され、ＣＡＲコード導入遺伝子がこれらの細胞のゲノムに挿入される。養子移入すると、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞はレシピエントの免疫系によって異物として認識され、破壊される。故に、この系におけるＣＡＲ曝露は一過性となる。別の一過性ＣＡＲ曝露アプローチでは、ＣＡＲコード遺伝子のｍＲＮＡが採取された患者Ｔ細胞に導入される（Ｂｅａｔｔｙ、ＧＬ  ２０１４．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２（２）：１１２〜２０頁  ｄｏｉ：  １０．  １１５８／２３２６−６０６６．ＣＩＲ−１３−０１７０）。ｍＲＮＡは半減期が短く、細胞中で複製されないかまたは安定に維持されないことから、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の永続的な変化はなく、故にＣＡＲ発現および活性は短期間となるであろう。しかし、キルスイッチアプローチと同様に、これらの一過性ＣＡＲ曝露アプローチはＣＡＲの監視の利点を犠牲にする。さらに、これらの一過性の系を用いると、急性毒性は制御が困難な場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]一態様において、本記載は、ＲＮＡ不安定化エレメント（ＲＤＥ）の制御下でＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、または他の標的化ポリペプチドおよび導入遺伝子を含む真核細胞を開示する。ＲＤＥは複数の導入遺伝子を制御し得、または複数のＲＤＥが複数の導入遺伝子を制御し得る。複数の導入遺伝子は、連続的におよび／またはコンカテマーとしておよび／または他の配置で配置されてもよい。複数のＲＤＥは、導入遺伝子を制御するのに使用することができ、これらの複数のＲＤＥは、コンカテマーとして構成されてもよく、転写物の領域内に分散されてもよく、または転写物の異なる部分に位置していてもよい。複数の導入遺伝子は、ＲＤＥまたはＲＤＥの組み合わせによって制御されてもよい。ＲＤＥは、３’−ＵＴＲ、５’−ＵＴＲおよび／またはイントロンに局在化されてもよい。ＲＤＥには、例えば、ＡＵ  １（ＣＤ４０Ｌ）、ＡＵ  ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ  ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ  ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ  ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ  ６（ＩＬ２ＲＡ）、ＡＵ  ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ  ８（ＴＲＡＣ）、ＡＵ  ９（ＣＤ２７４）、ＡＵ  １０（Ｍｙｃ）、ＡＵ  １１（ＣＤ１９）、ＡＵ  １２（ＩＬ４）、ＡＵ  １３（ＩＬ５）、ＡＵ  １４（ＩＬ６）、ＡＵ  １５（ＩＬ９）、ＡＵ  １６（ＩＬ１０）、ＡＵ  １７（ＩＬ１３）、ＡＵ  １８（ＦＯＸＰ３）、ＡＵ  １９（ＴＭＥＭ−２１９）、ＡＵ  ２０（ＴＭＥＭ−２１９ｓｎｐ）、ＡＵ  ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ  ２２（ＳＥＭ−Ａ４Ｄ）、ＡＵ  ２３（ＣＤＣ４２−ＳＥ２）、ＡＵ  ２４（ＣＤ８）、ＡＵ  ２７（ｂＧＨ）、および／またはＡＵ  １０１（インターフェロンガンマまたはＩＦＮｇ）由来のＲＤＥが含まれてもよい。他のＲＤＥは、以下の記載に開示される。
【０００６】
[0006]一態様において、ＲＤＥはＲＮＡ制御デバイスの制御下にあってもよい。そのため、Ｓｍａｒｔ  ＲＤＥは、ＲＤＥ制御を、ＲＤＥにリガンド制御を導入するＲＮＡ制御デバイスの制御下に置く。ＲＮＡ制御デバイスは、リガンドが結合されると（または結合されないと）ＲＤＥを破壊し、ＲＤＥ制御の喪失をもたらし得、リガンドが添加（または除去）されると、ＲＮＡ制御デバイスは阻害され、ＲＤＥ構造がＲＮＡ結合タンパク質との相互作用に利用可能となる。ＲＮＡ制御デバイスは、ＲＤＥを破壊する転写物の部分に作用することもでき（例えば、転写物の部分は、ＲＮＡ結合タンパク質がＲＤＥに結合するのを阻害する、ＲＤＥとの二次構造を形成し得る）、ＲＮＡ制御デバイスがリガンドに結合すると（またはリガンドから遊離していると）、ＲＮＡ制御デバイスは転写物の阻害性部分を破壊し、そのためＲＤＥとの相互作用に利用することができず、ＲＤＥは今やＲＮＡ結合タンパク質との相互作用に利用可能となる。このＲＮＡ制御デバイス制御により、ＲＮＡ制御デバイスの動作を通じてＲＤＥの活性をリガンド制御できるようになる。
【０００７】
[0007]一態様において、ＲＤＥ、ＲＤＥの組み合わせ、および／または修飾ＲＤＥは、例えば、発現量、定常状態濃度、ＣｍａＸ（得られた遺伝子産物の最大濃度）、ＴｍａＸ（ＣｍａＸに達するまでの時間）、ベースライン発現、誘導スピード（加速）、誘導速度（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）（速度（ｖｅｌｏｃｉｔｙ））、制御倍率（ｆｏｌｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）としても知られるダイナミックレンジ（誘導発現／基底発現）、最大ダイナミックレンジ（ＤＲｍａＸ）、ＤＲｍａＸまでの時間、曲線下面積（ＡＵＣ）等を含む、遺伝子産物の制御に対する所望の動態パラメータを提供するのに使用されてもよい。所望される制御のレベル、程度、時間、および量を提供する動態パラメータの所望のセットを有するＲＤＥ構築物が製造されてもよい。さらに、構築物の動態性能を変更するのにＲＤＥコンカテマーが使用されてもよい。
【０００８】
[0008]ＲＤＥの組み合わせは、２つ以上の導入遺伝子間で時間的制御をするのに使用することができる。ＲＤＥは、細胞の活性化（または発現の誘導）後異なる時間に、最大発現率（および異なる最大発現量）をもたらすように選択されてもよい。この時間的制御により、第１の導入遺伝子コードポリペプチドは、より遅くに発現をもたらすＲＤＥを含む第２の導入遺伝子によってコードされる第２のポリペプチドによって作用を受けるように細胞が調製されるよう、細胞の状態を変更できるようになる。この時間的制御は、細胞の活性化後、２つ、３つまたはそれ以上の導入遺伝子の発現の時間を調整するのに使用することもできる。導入遺伝子コードポリペプチドが分泌される場合、それらは標的細胞に一時的に作用し得る。例えば、第１の導入遺伝子ポリペプチド（早期発現ＲＤＥを含む）は分泌され、状態を変化させる（例えば、受容体の発現を誘導する）ように標的細胞に作用し得る。第２の導入遺伝子ポリペプチドは後で発現され（後期発現ＲＤＥの制御下で）、変化した状態の標的細胞に作用する（例えば、第２のタンパク質は、誘導された受容体のリガンドであってもよい）。
【０００９】
[0009]一態様において、ＲＤＥは、ＲＤＥと相互作用するＲＮＡ結合タンパク質の結合親和性を増加または減少させるように改変されてもよい。ＲＮＡ結合タンパク質の親和性を変更することは、ＲＮＡ結合タンパク質によって制御されるときの導入遺伝子発現のタイミングおよび応答を変化させ得る。一態様において、ＲＤＥで結合するＲＮＡ結合タンパク質は細胞の代謝状態によって変更され、ＲＮＡ結合タンパク質に対するＲＤＥの結合親和性を変化させることは、細胞の代謝状態により導入遺伝子発現に対する応答および／または導入遺伝子発現のタイミングを変更する。一態様において、ＲＤＥで結合するＲＮＡ結合タンパク質は、細胞のレドックス状態によって変更され、ＲＮＡ結合タンパク質に対するＲＤＥの結合親和性を変化させることは、細胞のレドックス状態により導入遺伝子発現に対する応答および／または導入遺伝子発現のタイミングを変更する。
【００１０】
[00010]一態様において、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体、または他の標的化受容体もしくは標的化ポリペプチドは、標的部位（例えば、腫瘍細胞または他の病変組織／細胞）で抗原を認識し、これが細胞を活性化する。導入遺伝子は、標的部位で第２の抗原を認識する別のＣＡＲであってもよく、第１のＣＡＲ、Ｔ細胞受容体または他の標的化ポリペプチドによる細胞の活性化は、第２のＣＡＲを誘導し、第２の抗原によって真核細胞が標的部位を認識できるようにする。一態様において、真核細胞は、標的部位で抗原を認識する第１のＣＡＲを有し、これが、細胞の活性化状態を直接または間接的に低下させるポリペプチドをコードする導入遺伝子を（ＲＤＥを通じて）活性化する。例えば、導入遺伝子は、第１のＣＡＲが非標的細胞で抗原と反応する場合、（標的部位に存在しない、または低下した量で存在する）健康な細胞抗原との第２のＣＡＲ相互作用によって真核細胞が不活性化されるように、健康な組織の抗原を認識する第２のＣＡＲをコードしてもよい。
【００１１】
[00011]いくつかの態様において、真核細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞である。これらの態様において、ＣＡＲによる細胞の活性化、または他の方法で免疫細胞の代謝状態を変化させることは、ＲＤＥを通じた導入遺伝子の発現を誘導し得る。導入遺伝子を制御するＲＤＥは、マイクロＲＮＡ結合部位を有する場合があり、１つまたは複数のこれらのマイクロＲＮＡ結合部位を除去するように改変され得る。ＲＤＥは、Ｈｕタンパク質Ｒ（ＨｕＲ）によって結合され得る。理論に縛られることを望むものではないが、ＨｕＲは一部のＲＤＥに結合し、ｍＲＮＡを安定化するように作用し、翻訳の増強をもたらし得ることが予想される。一部のＲＤＥは、真核細胞が活性化されていない（解糖活性が低い）、静止状態である、または休止しているとき、ＲＤＥに結合することができる酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、他のデヒドロゲナーゼ、他の酸化還元酵素、または他の解糖系酵素を通じて、真核細胞の解糖状態につながることができる。ＧＡＰＤＨまたは他の酵素がＲＤＥに結合する場合、これは、ＲＤＥを含むＲＮＡの半減期を減少させ得る。この態様において、真核細胞（例えば、Ｔリンパ球）のＣＡＲ活性化は、ＲＮＡのＧＡＰＤＨ結合を低下させ、ＲＮＡの半減期を増加させる解糖を細胞で誘導し得、これが、ＲＮＡにコードされ、ＲＤＥによって制御される導入遺伝子の発現の増加をもたらす。理論に縛られることを望むものではないが、ＧＡＰＤＨがＲＤＥを明け渡すことから、ＨｕＲまたは他のＲＤＥ結合タンパク質は、その後同じＲＤＥ、または以前は近づくことができなかったＲＤＥ（ＧＡＰＤＨの存在によって立体的に妨げられた）のどちらかを結合し得、ｍＲＮＡをさらに安定化させ、ｍＲＮＡの半減期を増加させ、ＲＮＡによってコードされおよび前記ＲＤＥによって制御される導入遺伝子の発現のさらなる増加をもたらし得る。故に、ＣＡＲ活性化は、導入遺伝子の発現を誘導することができる。他の態様において、免疫細胞の他の活性化がＧＡＰＤＨを解糖に関与させ、そのようにしてＲＤＥの制御下で導入遺伝子の発現を誘導させ得る。
【００１２】
[00012]ＲＤＥを含む転写物からの発現は、細胞の代謝状態に応答し得る。例えば、ＲＤＥは、代謝酵素または解糖系酵素によって結合されてもよく、これがこれらの代謝酵素または解糖系酵素を通じて導入遺伝子の発現を細胞の活性化状態に結び付ける。いくつかの代謝酵素または解糖系酵素は転写物中のＲＤＥに結合し、転写物を分解する、または転写物の分解を標的化する。それらの代謝酵素または解糖系酵素が活性になると、酵素はもはやＲＤＥに結合せず、転写物はより長期間安定であり、転写物はこのより長い期間にわたって翻訳され得る。そのようなＲＤＥの制御下で導入遺伝子を発現する細胞は、所望の時点で細胞の代謝状態を変更し、所望の時点で導入遺伝子の発現をもたらすことができるＣＡＲを発現するように改変することもできる。あるいは、真核細胞の代謝状態を変更し、導入遺伝子の発現をもたらすのに、他の刺激が使用されてもよい。例えば、細胞の代謝状態は、例えば、小分子（例えば、ＰＭＡ／イオノマイシン）、サイトカイン、ＴＣＲおよびリガンドとの共刺激ドメイン結合、酸素レベル、細胞ストレス、温度、または光／放射線を含む刺激によって、導入遺伝子発現を引き起こす（または発現を阻害する）ように変更されてもよい。
【００１３】
[00013]ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合は、例えば、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２−デオキシグルコース、３−ブロモピルビン酸、ヨード酢酸、フッ化物、オキサメート、プログリタゾン（ｐｌｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ジクロロ酢酸、または他の代謝阻害剤（例えば、デヒドロエピアンドロステロンなど）などの解糖を阻害する小分子を細胞に導入することによって増加され得る。ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合を低下させるのに、他の小分子が使用されてもよい。例えば、ＣＧＰ  ３４６６Ｂマレエートまたはヘプテリジン酸（両方ともＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．により販売されている）、ペンタレノラクトン、または３−ブロモピルビン酸を含むそのような小分子は、ＧＡＰＤＨのＲＤＥ結合部位を遮断することができる。他の小分子は、他の酵素またはポリペプチドがＲＤＥに結合するのを同様に阻害するのに使用されてもよい。他の小分子は、ＧＡＰＤＨのレドックス状態を変化させ、ＲＤＥに対するＧＡＰＤＨの親和性の変更をもたらすのに使用されてもよい。ＧＡＰＤＨ機能と相互作用することが知られている、ビタミンＣ、サフラマイシン、サリチル酸、インスリン、ビタミンｄ３、メトホルミン、またはスラミンなどの他の小分子は、ＲＤＥに対するＧＡＰＤＨの結合を修飾することができる。トレハロース、ガラクトースおよび他の糖類を含む他の分子が、ＲＤＥに対するＧＡＰＤＨの結合を修飾してもよい。ＧＡＰＤＨ構造を変更することが知られている、一酸化窒素および硫化水素を含む他の分子が、ＲＤＥに対するＧＡＰＤＨの結合を修飾してもよい。
【００１４】
[00014]一態様において、免疫細胞の活性化は、標的（活性化）部位へ送達されるべきペイロードをコードし得る導入遺伝子の発現を誘導する。導入遺伝子は、ＣＡＲ活性化および／または免疫細胞活性化および／または他の受容体活性化の部位へ送達するためのペイロードをコードすることができる。ペイロードは、サイトカイン、抗体、レポーター（例えば、画像化用の）、受容体（ＣＡＲなど）、または標的部位で所望の効果を与え得る他のポリペプチドであってもよい。ペイロードは、細胞中、または細胞表面にとどまって細胞の挙動を修飾することができる。ペイロードは、キナーゼ、ホスファターゼ、代謝酵素、エピジェネティック修飾酵素、遺伝子編集酵素などの細胞内タンパク質であってもよい。ペイロードは、例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１５５）、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなどの遺伝子制御ＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲシステムを用いて使用するガイドＲＮＡであってもよい。ペイロードは、核酸（例えば、ベクター、またはヒト人工染色体（ＨＡＣ））であってもよい。ペイロードは、ＧＰＣＲ、トランスポーターなどの膜結合タンパク質でもあってもよい。ペイロードは、標的部位を画像化できるようにするイメージング剤であってもよい（標的部位は、ＣＡＲによって結合された所望の量の標的抗原を有する）。ペイロードは、チェックポイント阻害剤であってもよく、ＣＡＲおよび／または他の結合タンパク質（例えば、Ｔ細胞受容体、抗体または自然免疫受容体）は腫瘍関連抗原を認識することができるため、真核細胞はチェックポイント阻害剤を腫瘍へ優先的に送達する。ペイロードは、例えば、グランザイム、アポトーシス誘導因子、細胞傷害性小分子、または補体を含む細胞傷害性化合物であってもよい。ペイロードは、例えば、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体（抗ＣＤ１３７抗体）、抗ＩＬ  １ｂ抗体（抗炎症性）、抗ＣＤ２９／抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ）、または抗ＣＤ１１ｂ抗体などの抗体であってもよい。ペイロードは、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１２）、パーフォリン、グランザイム、および他の免疫ポリペプチドを含む免疫ポリペプチドであってもよい。ペイロードは、例えば、ヒアルロニダーゼ、またはヘパリナーゼを含む酵素であってもよい。ペイロードは、例えば、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＢｉＴＥ（免疫抑制Ｔ細胞を活性化する）、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＨＳＰ７０、およびＨＳＰ６０を含むポリペプチドであってもよい。ペイロードは、ウイルスをペイロードとして送達する導入遺伝子であってもよい。例えば、ＲＤＥは、複製およびコート／エンベロープタンパク質のためのウイルス遺伝子の発現を制御するマスター制御エレメントを制御してもよい。あるいは、Ｒｅｐおよびコート／エンベロープタンパク質は、制御タンパク質によって制御される誘導性プロモーターの制御下にあってもよく、その制御タンパク質がＲＤＥによって制御されてもよい。さらにあるいは、ウイルスＲｅｐタンパク質がＲＤＥの制御下にあってもよく、および／またはウイルスのコート／エンベロープタンパク質がＲＤＥの制御下にあってもよい。他のペイロードと同様に、この複合体ペイロードは、細胞において解糖を誘導するＣＡＲ  Ｔ細胞制御または任意の他の制御を使用してもよい。Ｔ細胞中のヘルパー構築物、または他の送達細胞が、ウイルス複製およびウイルスパッケージングに必要な遺伝子をコードしてもよい。
【００１５】
[00015]ウイルスカプシドのためのウイルスコート／エンベロープポリペプチド、およびウイルス複製（Ｒｅｐタンパク質）、宿主細胞の溶解等のための酵素をコードする追加の構築物が使用されてもよい。パッケージングおよび他のヘルパー構築物には、例えば、レンチウイルスパッケージング（ヘルパー）系（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａおよびａｄｄｇｅｎｅから入手可能）、クローニングベクターがＰＳＶ７ｄである、ＭＬＶ  ＬＴＲおよびＳＶ起点に連結された両種指向性マウス白血病ウイルスｅｎｖ遺伝子を含有するｐＳＶ−Ａ−ＭＬＶ−ｅｎｖ（ＮＩＨカタログ番号：１０６５）；ｐＢＳ  ＫＳ（＋／−）のＨｉｎｃＩＩ−Ｘｂａｌ  ｓｉｔにクローニングされたプロウイルスおよびフランキング細胞配列を含有するＸｂａＩ−Ｈｐａｔ  ｐＨＸＢ２ｇｐｔ断片（Ａ．  ＦｉｓｈｅｒおよびＦ．  Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ博士）である、ＨＩＶｇｐｔ（ＮＩＨカタログ番号：１０６７）；ＥｃｏＲ１部位でＳＶ４０発現ベクターｐＳＶ７ｄにクローニングされたΨ−モロニーマウス白血病ウイルスＤＮＡ（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍａｎｎからの）である、ＰｓＶ−Ψ−ＭＬＶ−ｅｎｖ（ＮＩＨカタログ番号：３４２２）；およびプラスミドがＨＩＶ−１に由来するＧａｇ／Ｐｒｏ／Ｐｏｌ遺伝子をコードする、ｐｓＰＡＸ２（ｐＣＭＶ  δＲ８．９１に相当）が含まれ得るが、これらに限定されない。プロモーターはニワトリベータアクチンプロモーターであり、ポリアデニル化シグナルはウサギベータグロビンポリＡである。
【００１６】
[00016]ヘルパー構築物（例えば、Ｒｅｐ構築物および／またはコート／エンベロープタンパク質構築物）またはウイルス（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）からの発現は、ＲＤＥの制御下にある。ＲＤＥは、受容体が宿主細胞を活性化すると（例えば、受容体結合が、解糖または他のエネルギー経路を活性化することによって細胞のエネルギー状態を変更し得ると）、発現が活性化されるものであり得る。例えば、ウイルス（またはヘルパー構築物）のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子は、宿主細胞の受容体活性化（例えば、解糖の誘導）後に発現をもたらすＲＤＥの制御下にあってもよい。転写を制御するマスタースイッチポリペプチドをコードするもの、例えば、（アデノウイルスの）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６および／またはＶＡＲＮＡなどの他のウイルス遺伝子も、宿主細胞の受容体活性化（または上記に記載の他の系）後に発現をもたらすＲＤＥの制御下にあってもよい。ウイルスポリペプチドを含むＲＤＥのこのような方法での使用は、受容体（標的部位でリガンドを結合する）を通じて宿主細胞におけるウイルス産生を宿主細胞の活性化に結び付ける。
【００１７】
[00017]完全なウイルスからトランスファー構築物（パッケージングシグナルおよび導入遺伝子を含有する）に及ぶ様々な構築物が、ウイルスペイロードとして送達され得る。感染性構築物は、所望の導入遺伝子もコードすることができ、非感染性構築物は、感染細胞を死滅させるが感染性ウイルスを産生しないポリペプチドをコードすることができる（例えば、構築物は感染細胞を溶解するウイルス機能を含み得、または構築物は、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはナチュラルキラー細胞による認識のために感染細胞上に提示されるウイルスタンパク質をコードし得る）。非感染性構築物は、標的細胞の遺伝子型および／または表現型を変更する導入遺伝子を標的細胞に送達することもできる。例えば、非感染性トランスファー構築物は、遺伝子療法のための導入遺伝子を送達してもよい。トランスファー構築物は、トランスファープラスミドとしてａｄｄｇｅｎｅから入手可能である。ウイルスペイロードは、細胞形質転換および発現を評価するマーカータンパク質、融合タンパク質として機能するポリペプチド、所望の生物活性を有するポリペプチド、遺伝的欠陥を補完することができる遺伝子産物、ＲＮＡ分子、転写因子、制御および／または発現における目的の他の遺伝子産物、ならびに本明細書に記載された他のペイロードを含有してもよい。ペイロードは、所望の効果または制御機能をもたらすヌクレオチド配列を含有することもできる（例えば、トランスポゾン、転写因子）。
【００１８】
[00018]ウイルスペイロードは、遺伝子療法産物をコードする導入遺伝子であってもよい。遺伝子療法産物には、ポリペプチド、ＲＮＡ分子、または標的細胞で発現されると所望の効果をもたらす他の遺伝子産物が含まれ得るが、これらに限定されない。遺伝子療法産物は、標的細胞で欠如または変異した非機能性遺伝子の代替物を含有してもよい。ウイルスペイロードは、免疫系（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞）による死滅のために細胞を標的化する導入遺伝子であってもよい。例えば、導入遺伝子は、感染細胞の表面に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞が死滅されるべき標的として認識する異種ポリペプチドをコードし得る。例えば、異種ポリペプチドは、宿主と不適合性の異種ＭＨＣポリペプチド、または免疫応答の引き金を引いて感染細胞を破壊する（免疫系が感染細胞をウイルス感染していると認識し、該細胞を死滅させる）ウイルスポリペプチドであり得る。導入遺伝子はまた、例えば、Ｆａｓ、ＴＮＦαＲ、ＤＲ３、ＤＲ４、またはＤＲ５ポリペプチド（アポトーシス受容体として作用することができる）の１つでもあり得る。
【００１９】
[00019]ペイロードをコードするウイルスペイロード構築物は、選択可能なマーカーを含有またはコードしてもよい。選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーを発現し得るまたはし得ない細胞の集団からの宿主細胞の同定、選択、および／または精製を可能にする遺伝子配列または宿主細胞で発現される遺伝子配列によってコードされるタンパク質を含んでもよい。選択可能なマーカーは、抗生物質による処理などの、さもなければ宿主細胞を死滅させることになる選択プロセスを生き延びるための耐性を提供する。抗生物質選択可能なマーカーは、ネオマイシン耐性（例えば、ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性、カナマイシン耐性、および／またはピューロマイシン耐性を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の抗生物質耐性因子を含有することができる。
【００２０】
[00020]ペイロードをコードするペイロード構築物は、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼを含むがこれらに限定されない選択可能なマーカー、またはＣＤ４もしくは切断神経成長因子（ＮＧＦＲ）などの細胞表面マーカーを含む、その用語が当技術分野で理解されるようなレポーター遺伝子を含有してもよい（ＧＦＰについては、ＷＯ  ９６／２３８１０；Ｈｅｉｍら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２：１７８〜１８２頁（１９９６）；Ｈｅｉｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，（１９９５）；またはＨｅｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７３：６６３〜６６４頁（１９９５）を参照のこと；β−ラクタマーゼについては、ＷＯ  ９６／３０５４０を参照のこと）；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
[00021]標的細胞で発現するための核酸を含有するウイルスペイロードは、２つのＩＴＲ配列の間に位置する、または２つのＤ領域で改変された非対称ＩＴＲのどちらかの側に位置するウイルスゲノムに組み込むことができる。標的細胞で発現するための１つまたは複数のペイロードをコードするペイロード構築物は、少なくとも１つの標的細胞適合性プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数のペイロードまたは非ペイロードヌクレオチド配列を含有してもよい。そのようなペイロード構築物は、ａｄｄｇｅｎｅから入手可能なトランスファープラスミドから製造することができる。当業者は、種特異的、誘導性、組織特異的、または細胞周期特異的なプロモーターを含むがこれらに限定されない特異的プロモーターを標的細胞が必要とすることを認識するであろう（Ｐａｒｒら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ３：１１４５〜９頁（１９９７）。
【００２２】
[00022]導入遺伝子またはペイロードは、ａｄｄｇｅｎｅから入手可能なトランスファープラスミドなどの、宿主細胞に送達される任意の適切なベクター、例えば、プラスミドに担持されてもよい。プラスミドは、複製および、場合により、原核細胞、哺乳動物細胞または両方への組み込みに適するように改変することができる。これらのプラスミドは、真核生物および／または原核生物における導入遺伝子の複製を可能にする配列、ならびにこれらの系に対する選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子は、とりわけ、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性をコードする配列を含んでもよい。プラスミドは、アンピシリン耐性などの、細菌細胞中のベクターの存在をシグナル伝達するのに使用され得る特定の選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子を含有することもできる。プラスミドの他の成分は、複製起点ならびに、エプスタイン・バーウイルス核抗原を使用するアンプリコン系などのアンプリコンを含んでもよい。このアンプリコン系、または他の同様のアンプリコン成分は、細胞における高コピーエピソーム複製を可能にする。
【００２３】
[00023]導入遺伝子またはペイロードを担持する構築物は細胞にトランスフェクトされ、そこで一時的に存在してもよい。あるいは、導入遺伝子は、染色体にまたはエピソームとしてのどちらかで、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれてもよい。導入遺伝子は、複数のコピーで、場合により頭−頭、頭−尾、または尾−尾コンカテマーで存在してもよい。
【００２４】
[00024]いくつかの態様において、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドの発現は、ＲＤＥ結合活性を有する解糖系酵素、例えばＧＡＰＤＨと相互作用するＲＤＥによって少なくとも部分的に制御される。解糖系酵素は、ＲＤＥに結合し、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチド、および／または他の導入遺伝子産物の産生を低下させることができる。ポリペプチド産生のこの低下は、翻訳の阻害および／またはｍＲＮＡ分解の速度の増加のために生じ得る（ＲＤＥ結合はｍＲＮＡの半減期を短縮し得る）。いくつかのＲＤＥ結合タンパク質は、翻訳を低下させ、ＲＮＡの分解を増強して作られるポリペプチドのレベルを低下させ得る。ＲＤＥは、転写物（例えば、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γをコードする転写物）の３’ＵＴＲ由来のＡＵリッチエレメントであってもよく、または１つもしくは複数のマイクロＲＮＡ部位を除去するように改変されている修飾３’ＵＴＲ（例えば、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γの修飾３’−ＵＴＲ）であってもよい。一態様において、解糖系酵素、例えばＧＡＰＤＨによって結合されたＲＤＥの制御下の導入遺伝子、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドの発現は、解糖を行う上での酵素の活性を増加させることによって増加される。解糖における酵素の活性は、細胞培地で増加したグルコースを細胞に提供すること、細胞中のトリオースイソメラーゼ活性を増加させること、または細胞中の解糖を増加させる化合物、例えば、タモキシフェンもしくはグルコースを細胞に提供することによって増加され得る。ＲＤＥは、Ｈｕタンパク質Ｒ（ＨｕＲ）に結合してもよい。理論に縛られることを望むものではないが、ＨｕＲは、いくつかのＡＵリッチＲＤＥおよびＵリッチＲＤＥに結合すること、およびｍＲＮＡを安定化し、翻訳の増強をもたらすように作用し得ることが予想される。故に、ＨｕＲ発現の増加をもたらす細胞状態は、適当なＡＵリッチエレメントおよび／またはＵリッチエレメントを含む導入遺伝子の発現を増加させることができ、ＨｕＲ発現を低下させる状態は、これらの導入遺伝子の発現を減少させることができる。導入遺伝子（または天然遺伝子）の３’ＵＴＲとのＨｕＲ相互作用は、ＨｕＲ結合部位を含有する組換え転写物を発現させることによって変更することもできる。これらの転写物の発現は、導入遺伝子転写物または天然ＨｕＲ制御転写物への結合に利用可能なＨｕＲの量を減少させ、これらの転写物の半減期を減少させ、発現の減少をもたらすであろう。
【００２５】
[00025]一態様において、ＲＤＥ制御は、対象におけるＣＡＲ発現を下げるために使用されてもよく、免疫反応に関するＣＡＲポリペプチドの利用可能性を低下させ得る。これは、ＣＡＲを含む導入遺伝子免疫細胞の免疫原性を下げることができる。一部分において、このより低い免疫原性は、ＣＡＲペプチドの免疫系への曝露が低下するために生じる。
【００２６】
[00026]一態様において、免疫細胞の刺激時の免疫細胞の応答をブーストするのに、核酸が使用され得る。例えば、免疫細胞は、より速い産生動態でより多量の免疫ポリペプチド（より大きなＣｍａｘ）を産生することができる。免疫ポリペプチドには、例えば、サイトカイン、パーフォリン、グランザイム、アポトーシス誘導ポリペプチド等が含まれ得る。核酸がＲＮＡの中に発現すると、ＲＮＡ中のＲＤＥが、ポリペプチド、例えば、サイトカイン、パーフォリン、グランザイム、および他の免疫ポリペプチドの発現を抑制するＲＤＥ結合タンパク質を結合できるように、免疫応答をブーストする核酸は、選択されたＲＤＥ結合タンパク質に対するＲＤＥをコードする核酸に作動可能に連結された制御領域を含んでもよい。ＲＤＥを含むＲＮＡの発現は、ＲＤＥによって制御されるポリペプチドの発現に対して真核細胞を準備することができる。例えば、ＲＤＥを含むＲＮＡの発現は、免疫細胞を刺激したときの免疫ポリペプチドの発現に対して細胞を準備するために免疫細胞で行われてもよい。
【００２７】
[00027]一態様において、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチド、および／または他の受容体は、例えば、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１５７、ＣＬＬ−１、ＣＸＣＲ４、ＬｅＹ、ＰＲ１、ＲＨＡＭＭ（ＣＤ１６８）、ＴＩＭ−３、および／またはＷＴ１を含む、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）細胞で見出される抗原を対象にしてもよい。モノクローナル抗体２９３Ｃ３−ＳＤＩＥは、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドの細胞外エレメントとして使用することができる（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｒｏｔｈｆｅｌｄｅｒら、２０１５、ａｔ  ａｓｈ．  ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１５／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ８１１２１．ｈｔｍｌ）。ＡＭＬの他の抗原は当技術分野で公知であり、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または他の受容体の標的となり得る。腫瘍シアリル化（ｏｎｃｏ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）ＣＤ４３は、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）と関連しており、この腫瘍シアリル化ＣＤ４３は、正常な細胞および組織では見出されない。この腫瘍シアリル化ＣＤ４３は、モノクローナル抗体ＡＴ１４−０１３によって結合され、この抗体の可変領域は、抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３  ＣＡＲを製造するのに使用される。ＡＴ１４−０１３は、この腫瘍シアリル化ＣＤ４３で見出される固有のシアリル化エピトープを認識する。このＣＡＲは、ＡＭＬに特異的であり、対象における正常組織との副反応性を持たない。一態様において、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチド、および／または他の受容体は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ５、ＣＤ１０、およびＣＤ４３を含む、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞で見出される抗原を対象にし得る。ＤＬＢＣＬの他の抗原は当技術分野で公知であり、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または他の受容体の標的となり得る。
【００２８】
[00028]ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ｓｉｄｅ−ＣＡＲまたは他の受容体によって標的化され得る他の抗原には、例えば、ＤＬＬ３、ＨＥＲ２、ＰＳＣＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＦＡＰ、ＭＵＣ１６（ＣＡ−１２５）、ＣＥＡ、ＣＤ１３３（ＰＲＯＭ１）、ＩＬｌ３Ｒａ、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、（ＩＬ３Ｒ）、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ３）、ＬｅＹ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＢＣＭＡおよび／またはＥＰＨＡ２が含まれる。これらの抗原を標的化するＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ｓｉｄｅ−ＣＡＲまたは他の受容体を含む真核細胞は、例えば、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、および／またはＣＤ４０リガンドの１つまたは複数などのペイロードを含むことができる。
【００２９】
[00029]ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチド、および／または他の受容体は、例えば、αｎβ６などのインテグリン（多数の固形腫瘍（例えば、口腔扁平細胞がん、結腸がん、膵臓がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん等を含む）で見出される）などの固形腫瘍で見出される抗原を対象としてもよい。
【００３０】
[00030]一態様において、ＲＤＥを結合するためのＧＡＰＤＨまたは他のＲＤＥ結合タンパク質の利用可能性に影響を与える小分子および他の分子が、ＧＡＰＤＨ、他のＲＤＥ結合解糖系酵素、ならびに／またはエネルギーおよび細胞代謝に関与する他のＲＤＥ結合酵素によって遺伝子発現を制御するのに使用されてもよい。細胞における解糖を増加させる分子は、ＲＤＥへの結合に利用可能なＧＡＰＤＨの量を減少させ得、ＧＡＰＤＨ制御下の転写物からの翻訳を増加させ得る。同様に、他の解糖系酵素および代謝酵素がＲＤＥに結合してもよく、細胞における解糖および他のエネルギー経路の活性化は、対応するＲＤＥを結合するために利用可能なこれらの酵素の量を減少させ得る。結合のこの低下は、これらのＲＤＥ結合タンパク質によって制御される転写物からの翻訳を増加させ得（ＲＤＥに結合する酵素が発現を減少させる）、または酵素結合が発現に対してプラスの効果を与えるならば翻訳を減少させ得る。これらの分子は、炎症および／または自己免疫疾患と関連する特定のタイプの神経変性の治療においても有用であり得る。これらの分子は、ＲＤＥが結合され、免疫細胞がＲＤＥ制御遺伝子の発現を低下させるように、免疫細胞中のＧＡＰＤＨの量を変更するのに使用されてもよい。免疫細胞中のＲＤＥ制御下のいくつかの遺伝子は炎症と関連しており、そのため、炎症関連転写物を阻害するＲＤＥ結合タンパク質の量を増加させる分子は、炎症を低下させ得る。
【００３１】
[00031]選択されたＲＤＥを含む転写物をコードする核酸構築物は、免疫細胞、例えば、Ｔリンパ球で発現され得る。選択されたＲＤＥを含む組換え転写物は、Ｔリンパ球中のＲＤＥ結合タンパク質に結合し、該タンパク質のレベルを枯渇させることができ、その結果、枯渇されたＲＤＥ結合タンパク質によって制御されるポリペプチドをコードする転写物は、他の細胞シグナルに対して活性化の異なる閾値点で発現される。ＲＤＥ構築物の使用は、ＲＤＥによって発現が制御されるポリペプチドの発現動態および／または発現のＣｍａｘを増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】[00032]図１は、３つの変数が、ＣＡＲコピー数、標的エピトープコピー数、およびＣＡＲ結合親和性である場合の、最適なＣＡＲ活性の図を示す。
【図２】[00033]図２は、休止しているＴ細胞の生物発光と比較した、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＲＤＥによって制御されるルシフェラーゼを含むＴ細胞からの生物発光に関するグラフを示す。
【図３】[00034]図３は、休止しているＴ細胞の生物発光と比較した、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＲＤＥ  Ｇｏｌｄ１、Ｇｏｌｄ２、またはＧｏｌｄ３によって制御されるルシフェラーゼを含むＴ細胞からの生物発光に関するグラフを示す。
【図４】[00035]図４は、休止しているＴ細胞のＩＬ−１２発現と比較した、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＩＬ−１２発現がＲＤＥによって制御されるＴ細胞からのＩＬ−１２発現に関するグラフを示す。
【図５】[00036]図５は、ジャーカット細胞における制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。
【図６】[00037]図６は、初代Ｔ細胞における制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。
【図７】[00038]図７は、制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、１、３、６、および８日後の活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ発現を示す。
【図８】[00039]図８は、制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。
【図９】[00040]図９は、制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、活性化後１、３／４、６、および８日に測定されたダイナミックレンジ（活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）を示す。
【図１０】[00041]図１０は、制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、活性化後１、３／４、６、および８日に測定されたダイナミックレンジ（活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）を示す。
【図１１】[00042]図１１は、グルコースおよびガラクトースの存在下で制御エレメントとしてＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、ルシフェラーゼ発現に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
[00043]様々な実施形態が記載される前に、本開示の教示は記載された特定の実施形態に限定されず、そのため、当然ながら変わり得ることが理解されるべきである。また、本教示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００３４】
[00044]特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料も本教示の実施または試験において使用され得るが、いくつかの例示的な方法および材料がこれより記載される。
【００３５】
[00045]本明細書でおよび添付の特許請求の範囲で使用される場合、その内容が特に明確に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。特許請求の範囲は、いかなる随意的な要素も排除するように起草され得ることにさらに留意されたい。そのため、この記述は、請求項要素の列挙に関連した「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」等のような排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行詞としての役割を果たすことが意図される。物質の濃度またはレベルに関して与えられる数値限定は、その内容が特に明確に指示しない限り、近似であることが意図される。故に、濃度が（例えば）１０μｇと示される場合、濃度は少なくともおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）または約（ａｂｏｕｔ）１０μｇと理解されることが意図される。
【００３６】
[00046]本開示を読むと当業者に明らかになるように、本明細書に記載および図示される個々の実施形態の各々は、本教示の範囲または趣旨から逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離または組み合わされ得る別々の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。
定義
[00047]本開示に関して、本明細書の記載において使用される専門用語および科学用語は、特に具体的に定義されない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。
【００３７】
[00048]本明細書で使用される場合、「アクチュエータエレメント」は、ＲＮＡ制御デバイスの系制御機能をコードするドメインと定義される。アクチュエータドメインは、場合により遺伝子制御機能をコードすることができる。
【００３８】
[00049]本明細書で使用される場合、「抗体」は、リガンド結合タンパク質として機能的に定義され、および免疫グロブリンの可変領域に由来すると当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むと構造的に定義されたタンパク質と定義される。抗体は、免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子の断片、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子（異なる動物由来の遺伝情報を組み合わせて作られる）、または合成免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされた１つまたは複数のポリペプチドからなり得る。認識されている天然の免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子および複数のＤセグメントおよびＪセグメントが含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのどちらかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらが次に、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定義する。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、様々なペプチダーゼによる消化によって産生されるいくつかの十分に特徴付けられた断片として、または組換えＤＮＡ技術によって製造される様々な断片として存在する。抗体は、多くの異なる種（例えば、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、ヒト、またはマウスもしくはラットなどのげっ歯類）に由来してもよく、または合成であってもよい。抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒューマニア（ｈｕｍａｎｅｅｒ）化抗体であってもよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、多重鎖または一本鎖抗体、断片またはインタクトな免疫グロブリンであってもよい。
【００３９】
[00050]本明細書で使用される場合、「抗体断片」とは、インタクトな抗体、またはその組換えバリアントの少なくとも１つの部分と定義され、抗原などの標的に対する抗体断片の認識および特異的結合を与えるのに十分な抗原結合ドメイン、例えば、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬまたはＶＨのどちらか）、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、および重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質と定義され、軽鎖および重鎖可変領域は、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現されることができ、ｓｃＦｖは、これが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。指定のない限り、本明細書で使用される場合ｓｃＦｖは、どちらかの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を有し得る。例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでもよく、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
【００４０】
[00051]本明細書で使用される場合、「抗原」は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のどちらか、またはその両方を伴い得る。当業者は、グリコシル化ポリペプチド、リン酸化ポリペプチド、および脂質で修飾されたポリペプチドを含む他の翻訳後修飾ポリペプチドを含む、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含むがこれらに限定されない任意の巨大分子が、抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、その用語が本明細書で使用される場合の「抗原」をそれ故にコードすることを当業者は理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。限定されるものではないが、本発明が、１つを超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が合成されてもよく、または生体試料に由来してもよく、またはポリペプチド以外の巨大分子であってもよいことは容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または他の生物学的成分を含む体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４１】
[00052]本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体」および用語「ＣＡＲ」は互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ」は、抗原認識部分および細胞活性化エレメントを含む融合タンパク質と定義される。
【００４２】
[00053]本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」または「ＣＡＲ  Ｔリンパ球」は互換的に使用され、実際の発現レベルに関係なく、ＣＡＲポリペプチドを産生する能力を含有するＴ細胞と定義される。例えば、ＣＡＲを発現することができる細胞は、細胞においてＣＡＲを発現するための核酸配列を含有するＴ細胞である。
【００４３】
[00054]本明細書で使用される場合、「共刺激エレメント」または「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ポリペプチド」は、共刺激ポリペプチドの細胞内部分と定義される。共刺激ポリペプチドは、以下のタンパク質ファミリーに代表され得る：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ナチュラルキラー細胞受容体。そのようなポリペプチドの例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＭｙＤ８８等が含まれる。
【００４４】
[00055]本明細書で使用される場合、「Ｃｍａｘ」は、細胞がポリペプチドを産生するように刺激または活性化された後に、細胞によって産生されるポリペプチドの最大濃度を意味するように定義される。
【００４５】
[00056]本明細書で使用される場合、「サイトカインＣｍａｘ」は、サイトカインを産生するための刺激または活性化後に、免疫細胞によって産生されるサイトカインの最大濃度を意味するように定義される。
【００４６】
[00057]本明細書で使用される場合、「細胞傷害性ポリペプチドＣｍａｘ」は、細胞傷害性ポリペプチドを産生するための刺激または活性化後に、免疫細胞によって産生される細胞傷害性ポリペプチドの最大濃度を意味するように定義される。
【００４７】
[00058]本明細書で使用される場合、「不安定化エレメント」または「ＤＥ」または「デグロン」は互換的に使用され、リガンドの添加または除去によって、細胞文脈における分解に対する誘導性耐性を示すまたは感受性であり、これがシスで融合される同時翻訳ポリペプチドに対してこの安定性調節を与えるポリペプチド配列と定義される。
【００４８】
[00059]本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療的有効量」は互換的に使用され、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書に記載の化合物、製剤、材料、または組成物の量と定義される。
【００４９】
[00060]本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、免疫応答を誘発することができる抗原の部分、または抗体に結合する抗原の部分と定義される。エピトープは、抗体によって認識されるタンパク質配列または部分配列であり得る。
【００５０】
[00061]本明細書で使用される場合、「発現ベクター」および「発現構築物」は互換的に使用され、両方とも、細胞でのタンパク質発現のために設計されたプラスミド、ウイルス、または他の核酸と定義される。ベクターまたは構築物は、遺伝子を宿主細胞に導入するのに使用され、これによりベクターは、細胞中のポリメラーゼと相互作用してベクター／構築物にコードされたタンパク質を発現することになる。発現ベクターおよび／または発現構築物は、細胞において染色体外に存在し得、または染色体に組み込まれて存在し得る。染色体に組み込まれる場合、発現ベクターまたは発現構築物を含む核酸が発現ベクターまたは発現構築物となるであろう。
【００５１】
[00062]本明細書で使用される場合、「細胞外エレメント」は、キメラ抗原受容体の抗原結合または認識エレメントとして定義される。
[00063]本明細書で使用される場合、「造血細胞」は、造血幹細胞から生じる細胞と定義される。これには、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、巨核球、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、マクロファージ、血小板、単球、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および形質細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
[00064]本明細書で使用される場合、「異種」は、核酸および／またはポリペプチドが宿主細胞に対して同種でないことを意味するように定義される。例えば、構築物が宿主細胞で見出されない形で配置されたいくつかの相同配列を含有し、および／または構築物が宿主細胞で見出されないいくつかの異種配列を含有するならば、構築物は宿主細胞に対して異種である。
【００５３】
[00065]本明細書で使用される場合、「細胞内エレメント」は、真核細胞の細胞質膜の細胞質側に存在し、シグナルを真核細胞に伝達するキメラ抗原受容体の部分として定義される。「細胞内シグナル伝達エレメント」は、特殊化された機能を果たすよう真核細胞に指示するエフェクター機能シグナルを伝達する、細胞内エレメントのその部分である。
【００５４】
[00066]本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ不安定化エレメント」または「ＲＤＥ」は互換的に使用され、両方とも、タンパク質によって結合され、そのタンパク質結合がＲＮＡの安定性および／または翻訳を変化させる、ＲＮＡ中の核酸配列として定義される。ＲＤＥの例には、クラスＩ  ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、クラスＩＩ  ＡＲＥ、クラスＩＩＩ  ＡＲＥ、Ｕリッチエレメント、ＧＵリッチエレメント、およびステムループ不安定化エレメント（ＳＬＤＥ）が含まれる。理論に縛られることを望むものではないが、ＲＤＥは、ＨｕＲのようなＲＮＡ安定化ポリペプチドも結合することができる。
【００５５】
[00067]本明細書で使用される場合、「ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ基質」は、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼによって認識および切断されるＲＮＡ配列モチーフと定義される。
【００５６】
[00068]本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ基質」は、アルゴノートファミリーのエフェクターエンドヌクレアーゼに複合体化された短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって結合および／または切断されるＲＮＡ配列と定義される。
【００５７】
[00069]本明細書で使用される場合、「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、抗原結合活性において機能を有する免疫グロブリン分子として定義される。ｓｃＦｖ（一本鎖断片可変）形式の抗体は、柔軟なペプチドリンカーによって結合された重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域からなる。
【００５８】
[00070]本明細書で使用される場合、「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、胸腺で通常は発生する造血細胞と定義される。Ｔリンパ球またはＴ細胞には、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞および粘膜インバリアントＴ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
[00071]本明細書で使用される場合、「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」は、外因性核酸が宿主細胞に移されるまたは導入されるプロセスと定義される。「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入されている細胞である。該細胞には、初代被験細胞およびその子孫が含まれる。
【００６０】
[00072]本明細書で使用される場合、「膜貫通エレメント」は、細胞外エレメントと細胞内エレメントの間のエレメントとして定義される。膜貫通エレメントの部分は細胞膜内に存在する。
不安定化エレメント
[00073]不安定化エレメント（ＤＥ）は、小分子リガンドと相互作用することができる安定性に影響を与えるポリペプチドであり、このリガンドの存在、非存在、または量は、目的のＤＥ−ポリペプチドの安定性を調節するのに使用される。目的のポリペプチドは、免疫調節性ポリペプチドであってもよい。目的のポリペプチドはまた、ＣＡＲでもあってもよい。ＤＥ−ＣＡＲによるリガンドの結合は、真核細胞におけるＤＥ−ＣＡＲポリペプチドの分解速度を低下させることができる。ＤＥ−ＣＡＲによるリガンドの結合は、真核細胞におけるＤＥ−ＣＡＲの分解速度を増加させることもできる。
【００６１】
[00074]例示的な不安定化エレメントまたはＤＥは、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、これらはいずれも、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【００６２】
[00075]ＤＥのリガンドは、例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されているように、治療的魅力に関する特定の特質を最適化するために選択されてもよい。
ＲＮＡ制御デバイス
[00076]本明細書に開示されたリボ核酸（ＲＮＡ）制御デバイスは、遺伝子発現の調節可能な制御、モジュール式設計、および標的特異性を示し得る。ＲＮＡ制御デバイスは、細胞ネットワークを通じた情報の流れを組み替えるように作用し、細胞環境の変化に応答して細胞の挙動をリプログラミングし得る。ポリペプチド発現の制御において、ＲＮＡ制御デバイスは、多様な入力分子のレベルで時間的および空間的変動を監視する合成的細胞センサーとして機能し得る。ＲＮＡ制御デバイスは、様々な生体系で標的ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲ構築物のＲＮＡ調節を可能にする特定のエフェクター分子に応答して、本発明のＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドの発現を調節するようにオーダーメイドされた、リガンド制御された遺伝子制御系を構築するための強力なツールとなる。
【００６３】
[00077]本明細書に開示されたＲＮＡ制御デバイスは、制御エレメントおよびセンサーエレメントを含む。本明細書に開示されたＲＮＡ制御デバイスは、制御機能および知覚機能の両方を備えた単一エレメントを含んでもよい。本明細書に開示されたＲＮＡ制御デバイスは、制御機能および知覚機能を含んでもよい。本明細書に開示されたＲＮＡ制御デバイスは、制御エレメント、センサーエレメント、および制御エレメントとセンサーエレメントを機能的に結合させる情報伝送エレメント（ＩＴＥ）を含んでもよい。ＩＴＥは、例えば、鎖置換機構、静電相互作用、コンフォメーション変化、または立体効果に基づいてもよい。ＲＮＡ制御デバイスの感知機能は、ＲＮＡ制御デバイスにおける構造変化をもたらし、作用中の機能の活性の変更につながる。これらの構造変化が生じ得るいくつかの機構には、立体効果、疎水性駆動効果（ｌｏｇ  ｐ）、静電的駆動効果、ヌクレオチド修飾効果（メチル化、シュードウリジン化など）、二次リガンド相互作用効果、および他の効果が含まれる。鎖置換機構は、ＲＮＡ制御デバイスの一般的な伝達領域（例えば、アプタマーのベースステム）に対する２つの核酸配列（例えば、競合鎖とＲＮＡ制御デバイス鎖）の競合的結合を使用して、センサーエレメントへのリガンド結合に応答した制御エレメントの破壊または修復をもたらすことができる。
【００６４】
[00078]ＲＮＡ制御デバイスは、センサーエレメントおよび制御エレメントを含んでもよい。センサーエレメントは、ＲＮＡアプタマーであってもよい。ＲＮＡ制御デバイスは、１つを超えるセンサーエレメントを有してもよい。いくつかの態様において、制御エレメントはリボザイムであってもよい。リボザイムは、ハンマーヘッド型リボザイムであってもよい。リボザイムは、ヘアピンリボザイム、または肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、またはＶａｒｋｕｄ  Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ（ＶＳ）リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、および／または当技術分野で公知の他のリボザイムでもあってもよい。
【００６５】
[00079]ＲＮＡ制御デバイスは、ＤＮＡ配列内に埋め込まれてもよい。ＲＮＡ制御デバイスは、メッセンジャーＲＮＡにコードされてもよい。複数のＲＮＡ制御デバイスが、導入遺伝子コードｍＲＮＡによりシスにコードされてもよい。複数のＲＮＡ制御デバイスは同じであってもよく、および／または異なるＲＮＡ制御デバイスの混合物が反復されてもよい。ＲＮＡ制御デバイスをコードするのに使用される核酸は反復されてもよい。複数のＲＮＡ制御デバイスを含めることによって、感受性および用量反応がオーダーメイドまたは最適化され得る。複数のＲＮＡ制御デバイスは、それぞれ、異なるリガンドに特異的であってもよい。これは、センサーエレメントと相互作用する内因性に産生されるリガンドによる意図しない発現を軽減することができる。
ＲＮＡ制御デバイス：センサーエレメント
[00080]例示的なセンサーエレメントは、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、これらはいずれも、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。センサーエレメントは、アプタマーに由来してもよい。「アプタマー」は、高い親和性および特異性で特定の分子に結合することができるＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸分子である（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６、８１８〜２２頁（１９９０）；およびＴｕｅｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、５０５〜１０（１９９０）、これらは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。小分子を認識するアプタマーの概説については、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｍｕｌｏｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：３２４〜９頁（１９９９）を参照のこと。
ＲＮＡ制御デバイスのリガンド
[00081]ＲＮＡ制御デバイスは、外因性リガンドの添加、または所望の結合特性、動態、生体利用能等（例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されているような）を有する内因性リガンドの合成（または添加）により制御され得る。
ＲＮＡ制御デバイス：制御エレメント
[00082]制御エレメントは、リボザイム、またはアンチセンス核酸、またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを生じさせるＲＮＡｉ配列もしくは前駆体、またはｓｈＲＮＡもしくはその前駆体、またはＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ基質、または選択的スプライシングエレメント、または転写ターミネーター、またはリボソーム結合部位、またはＩＲＥＳ、またはポリＡ部位を含んでもよい。本発明において有用な制御エレメントは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、このいずれもが、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
ＲＮＡ不安定化エレメント
[00083]ＲＮＡ不安定化エレメント（ＲＤＥ）は、ＲＮＡ分子の安定性またはＲＮＡ分子の翻訳動態に影響を与えるまたは維持する核酸である。いくつかのＲＤＥは、ＲＮＡを不安定化（例えば、切断）するかまたは翻訳を妨げ、ＲＮＡの機能の喪失をもたらすポリペプチドによって結合される。一部のＲＤＥ結合ポリペプチドは、ＲＮＡを安定化し、ＲＮＡの半減期を増加させる。ＲＤＥは、導入遺伝子、例えば、キメラ抗原受容体をコードする導入遺伝子の発現を制御するのに使用することができる。ＲＤＥは、導入遺伝子の発現を制御するのにＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、および／またはＳｉｄｅ  ＣＡＲと共に使用されてもよい。ＲＤＥは、ＣＡＲ以外のポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現を制御するのに使用することもできる。他の導入遺伝子は、例えば、サイトカイン、抗体、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導因子、補体、細胞傷害性小分子、他の細胞傷害性化合物、画像化用のポリペプチド、または所望の効果を与え得る他のポリペプチドをコードしてもよい。ＲＤＥは、導入遺伝子ペイロードの送達を制御することができる。ＲＤＥの例には、例えば、ＡＵリッチエレメント、Ｕリッチエレメント、ＧＵリッチエレメント、および特定のステムループエレメントが含まれる。例示的なＲＤＥは、Ｋｏｖａｒｉｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８９：２１〜２６頁（２０１７）；Ｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４９９：１７２〜１７７頁（２０１３）；Ｃａｓｔｅｌｌｏら、Ｃｅｌｌ  １４９：１３９３〜１４０６頁（２０１２）；Ｖｌａｓｏｖａら、Ｍｏｌｃ．Ｃｅｌｌ．  ２９：２６３〜２７０頁（２００８）；Ｂａｒｒｅａｕら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３巻、ｄｏｉ：１０．  １０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ１０１２（２００６）；Ｍｅｉｓｎｅｒら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ５：１４３２〜１４４７頁（２００４）；Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉら、Ｇｅｎｅ  ２６５：１１〜２３頁（２００１）に記載されており、これらの全てがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【００６６】
[00084]ＲＤＥは、クラスＩ  ＡＵリッチエレメント（Ｕに富む文脈での分散ＡＵＵＵＡ（配列番号１））、クラスＩＩ  ＡＵリッチエレメント（重複（ＡＵＵＵＡ）ｎ）、クラスＩＩＩ  ＡＵリッチエレメント（Ｕリッチストレッチ）、ステムループ不安定化エレメント（ＳＬＤＥ）、サイトカイン３’ＵＴＲ（例えば、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２、Ｔ細胞受容体α鎖、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ等）、およびＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡの配列（配列番号２）であってもよい。Ｋｈａｂａｒ、ＷＩＲＥｓ  ＲＮＡ  ２０１６、ｄｏｉ：１０．１００２／ｗｒｎａ．１３６８（２０１６）；Ｐａｌａｎｉｓａｍｙら、Ｊ．  Ｄｅｎｔ．  Ｒｅｓ．  ９１：６５１〜６５８頁（２０１２）、これらはいずれも、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。ＲＤＥはまた、例えば、ＵＵＧＵＵ（配列番号３）、ＵＧＧＧＧＡＵ（配列番号４）、またはＧＵＵＵＧ（配列番号５）の１つまたは複数からなるＧＵリッチエレメントでもあってもよい。ＲＤＥは、例えば、ＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号６）、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ（配列番号７）、ＵＵＵＡＵＵＵ（配列番号８）、ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号９）、ＵＵＡＧＡ（配列番号１０）、またはＡＧＵＵＵ（配列番号１１）の１つまたは複数からなるＵリッチエレメントであってもよい。いくつかの態様において、制御ユニットを製造するために複数のＲＤＥが組み合わされてもよく、例えば、同じ配列を有する複数のＲＤＥがコンカテマーに配置されてもよく、または介在配列がいくつかのまたは全てのＲＤＥ間にある状態で配置されてもよい。ＲＤＥ配列は、ＲＤＥに対するＲＮＡ結合タンパク質の親和性を増加または減少させるように修飾されてもよい。例えば、ＲＤＥに対するグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の親和性を変更するように、ＡＵリッチＲＤＥが変えられてもよい。親和性のこの変化は、ＧＡＰＤＨが結合するＲＤＥによって制御される導入遺伝子の発現に関するＧＡＰＤＨ活性化閾値を変更し得る。
【００６７】
[00085]本開示は、いくつかのＲＤＥにＡＵ＃名称を指定しており、これらのＲＤＥは、ＡＵ＃または、ＲＤＥが由来する遺伝子名によって呼ばれる場合がある。いくつかのＡＵ＃および、ＲＤＥが由来する対応する遺伝子には、例えば、ＡＵ  １（ＣＤ４０ＬＧ）、ＡＵ  ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ  ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ  ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ  ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ  ６（ＩＬ２ＲＡ）、ＡＵ  ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ  ８（ＴＲＡＣ）、ＡＵ  ９（ＣＤ２７４）、ＡＵ  １０（Ｍｙｃ）、ＡＵ  １１（ＣＤ１９）、ＡＵ  １２（ＩＬ４）、ＡＵ  １３（ＩＬ５）、ＡＵ  １４（ＩＬ６）、ＡＵ  １５（ＩＬ９）、ＡＵ  １６（ＩＬ１０）、ＡＵ  １７（ＩＬ１３）、ＡＵ  １８（ＦＯＸＰ３）、ＡＵ  １９（ＴＭＥＭ−２１９）、ＡＵ  ２０（ＴＭＥＭ−２１９ｓｎｐ）、ＡＵ  ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ  ２２（ＳＥＭ−Ａ４Ｄ）、ＡＵ  ２３（ＣＤＣ４２−ＳＥ２）、ＡＵ  ２４（ＣＤ８）、ＡＵ  ２７（ｂＧＨ）、およびＡＵ  １０１（ＩＦＮｇ）が含まれる。
【００６８】
[00086]ＲＤＥは、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧ  Ｆ、ＰＧＥ２、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ｂＦＧＦ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ベータ１−ＡＲ、ＰＴＨ、インターフェロン−ガンマ、ＭｙｏＤ、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ＰＡＩ−２、ＮＯＳ  ＨＡＮＯＳ、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロン−アルファ、ｂｃｌ−２、インターフェロン−ベータ、ｃ−ｊｕｎ、ＧＬＵＴ１、ｐ５３、ミオゲニン、ＮＦ−Ｍ、またはＧＡＰ−４３、リンパ球抗原９６、ＳＵＰＶ３Ｌ１、ＳＦｔＰＡ２、ＢＬＯＣ１Ｓ２、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ８Ｄ１、ＴＲＰＴ１、ＣＩＰ２９、ＥＰ４００、ＰＬＥ２、Ｈ３ＳＴ３Ａ１、ＺＮＦ５７１、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＳＰＡＧ４Ｌ、ＯＲ１０Ａ６およびＫＩＲ３ＤＬをコードする遺伝子の３’ＵＴＲ由来であってもよい。他のＲＤＥは、例えば、ＧＬＭＮ、ＡＭＹ２Ｂ、ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ１Ａ、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３３、ＣＳＲＰ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ、ＫＣＮＨ１、レティキュロン４、ＭＲＰＬ３０、Ｎａｖ１．２、組織因子経路インヒビター、ＥＥＦ１Ｂ２、ＣＲＹＧＢ、ＡＲＭＣ９、ＲＰＬ１５、ＥＡＦ２、ＭＲＰＳ２２、ＭＲＰＳ２２、ＣＯＰＢ２、ＰＤＣＤ１０、ＲＥ１サイレンシング転写因子、アンフィレギュリン、ＡＰ１ＡＲ、ＴＬＲ３、ＳＫＰ２、ペプチジルグリシンアルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ、ＴＮＦＡＩＰ８、インターロイキン９、ＰＣＤＨＡ２、ＰＣＤＨＡ１２、アルデヒドデヒドロゲナーゼ５ファミリーメンバーＡ１、ＫＣＮＱ５、ＣＯＸ７Ａ２、モノカルボン酸トランスポーター１０、ＭＬＬＴ４、ＰＨＦ１０、ＰＴＰＮ１２、ＭＲＮＡ（グアニン−Ｎ７−）−メチルトランスフェラーゼ、ＷＨＳＣ１Ｌ１、毛髪鼻指節骨症候群１型、インターフェロンアルファ−１、ＺＣＣＨＣ６、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子、ＭＥＤ１４、ＣＬＣＮ５、ＤＮＡ２Ｌ、ＯＲ５２Ｄ１、ＮＥＬＬ１、ＳＬＣ２２Ａ２５、ＳＬＣ２２Ａ１０、ＴＲＰＣ６、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＥＰＳ８、ＣＴ２（遺伝子）、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ４２、ＴＡＯＫ３、ＮＵＰＬ１、エンドセリン受容体Ｂ型、運動ニューロンタンパク質相互作用タンパク質１の生存（Ｓｕｒｖｉｖａｌ＿ｏｆ＿ｍｏｔｏｒ＿ｎｅｕｒｏｎ＿ｐｒｏｔｅｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿１）、ＰＯＬＥ２、肝性リパーゼ、ＴＰＳＧ１、ＴＲＡＰ１、ＲＰＳ１５Ａ、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＣＲＯＰ（遺伝子）、アポリポタンパク質Ｈ、ＧＲＢ２、ＣＥＰ７６、ＶＰＳ４Ｂ、インターロイキン２８Ｂ、ＩＺＵＭＯ１、ＦＧＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＬＩＮ７Ｂ、およびＣＤＣ４５関連タンパク質由来の３’−ＵＴＲに見出される。
【００６９】
[00087]さらに他のＲＤＥは、例えば、ＳＣＦＤ１、ＭＡＬ２、ＫＨＳＲＰ、ＩＱＣＢ１、ＣＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター、ＭＦＡＰ５、ＳＢＦ２、ＦＫＢＰ２、ＰＤＣＤ１０、ＵＢＥ２Ｖ２、ＮＤＵＦＡＢ１、コイルドコイルドメイン含有タンパク質、ＡＬＧ１３、ＴＰＴＥ、エナプチン、サイモポエチン、デルタ様１、Ｃ１１ｏｒｆ３０、アクチニンアルファ４、ＴＭＥＭ５９、ＳＰ１１０、ダイサー、ＴＡＲＤＢＰ、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１４、ＺＭＹＭ３、インターロイキン９、Ｉ型（ｔｙｐｅ＿Ｉ）、ＯＰＮ１ＳＷ、ＴＨＳＤ１、ＥＲＧＩＣ２、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＷＤＲ８、ＦＸＲ１、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ＯＳＢＰＬ３、Ｒａｎ、ＧＹＰＥ、ＡＫＡＰ４、ＬＯＣ６４２６５８、Ｌ２ＨＧＤＨ、ＡＫＡＰ１、ジンクフィンガータンパク質３３４、ＴＣ２Ｎ、ＦＫＢＰＬ、ＧＲＢ１４、ＣＸｏｒｆ６７、ＣＸｏｒｆ６６、ＣＥＰ７６、ガストリシン、ＣＥＰ７０、ＣＹＰ２６Ａ１、ＮＡＡ３５、アリール炭化水素受容体核内輸送体、ＫＬＣ４、ＧＰＲ１１２、ＬＡＲＰ４、ＮＯＶＡ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＩＴＧＡ６、ＧＰＲ１８、ＭＧＳＴＡ型、ＲＥ１サイレンシング転写因子、ＡＳＰＭ、ＺＮＦ４５２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＡＨＳＡ１、ＴＭＴＣ４、ＶＳＸ１、Ｐ１６、ＭＲＰＬ１９、ＣＣＬ２０、ＴＲＰＴ１、肝性リパーゼ、ＰＤＬＩＭ５、ＣＣＤＣ５３、‘ＣＣＤＣ５５、ＧＡＰＶＤ１、ＨＯＸＢ２、ＫＣＮＱ５、ＢＲＣＣ３、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＣＤＫ５ＲＡＰ３、転写因子ＩＩ  Ｂ、ＺＥＢ１、ＩＲＧＭ、ＳＬＣ３９Ａ６、ＲＨＥＢ、ＰＳＩＰ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ウロキナーゼ受容体、ＧＦＭ１、ＤＮＡＪＣ７、ホスホイノシチド依存性キナーゼ１、ＬＭＯＤ３、ＴＴＣ３５、ＲＲＰ１２、ＡＴＸＮ２、ＡＣＳＭ３、ＳＯＡＴ１、ＦＧＦ８、ＨＮＲＰＨ３、ＣＴＡＧＥ５、ＰＯＬＧ２、ＤＹＲＫ３、ＰＯＬＫ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｃ、ＣＤ１３７、カルモジュリン１、ＺＮＦ５７１、ＣＮＯＴ２、ＣＲＹＺＬ１，ＳＭＣ３、ＳＭＣ４、ＳＬＣ３６Ａ１、デコリン、ＨＫＲ１、ＥＲＣ１、Ｓ１００Ａ６、ＲＩＭＳ１、ＴＭＥＭ６７、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ４２、ＭＥＣＰ２、ＲＮＦ１１１、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＭＹＬＫ３、ＴＩＮＡＧ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＧＰＤ５、ＵＢＥ２Ｖ１、ＳＡＲ１Ｂ、ＳＬＣ２７Ａ６、ＺＮＦ６３８、ＲＡＢ３３Ａ、ＴＲＩＯＢＰ、ＭＵＣＬ１、ＣＡＤＰＳ２、ＭＣＦ２Ｌ、ＴＢＣＡ、ＳＬＣ１７Ａ３、ＬＥＯ１、ＩＦＮＡ２１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＰＲＫＤ２、ＡＴＰ１１Ｂ、ＭＯＲＣ２、ＲＢＭ６、ＫＬＲＤ１、ＭＥＤ３１、ＰＰＨＬＮ１、ＨＭＧＢ２、ＤＮＡ修復および組換えタンパク質ＲＡＤ５４様、ＲＢＭ９’、ＡＲＬ１１、ＨｕＤ、ＳＰＥＦ２、ＣＢＬＬ１、ＳＬＣ３８Ａ１、カスパーゼ１、Ｓ１００Ｇ、ＣＡ１＿、ＣＥＬＡ１、ＰＴＳ、ＩＴＭ２Ｂ、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ、ＴＲＰＰ３、ＩＭＰＤＨ２、ＤＰＹＳ、ＣＤＣＡ３、ＥＦＣＡＢ６、ＳＬＩＴ２、ＳＩＰＡ１Ｌ１、ＦＩＰ１Ｌ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＨＳＤ１７Ｂ７、ＮＤＵＦＣ１、ＣＲＯＰ、ＣＤ４８、ＡＰＰＢＰ１、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ヒストンデアセチラーゼ２  ＸＩ型、インター���イキン４、毛髪鼻指節骨症候群１型、ＳＥＣ６１Ｇ、ＴＲＩＰ１２、ＰＬＥＫＨＯ１、ＳＥＣ６１Ｂ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ＣＰＶＬ、Ｅ２Ｆ７、ＵＴＰ２０、Ｅ２Ｆ５、ＰＡＲＤ３、ＥＸＯＣ７、ＨＥＸＢ、カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質８、ＭＢＤ４、ＰＰＰ４Ｃ、ヘリカーゼ、ホスデューシン、ＳＰＧ１１、ＣＧＧＢＰ１、ＰＳＫＨ１、カテプシンＳ、オレキシン、ＩＭＭＰ２Ｌ、Ｃ２ｏｒｆ２８、ラミニン、ＥＩＦ３Ｓ６、ＬＲＲＣ４１  ＸＩＩ型、カテプシンＣ、ＨＰＳ６、ＡＲＡＦ、ジンクフィンガーおよびＢＴＢドメイン含有タンパク質１６、性ホルモン結合グロブリン、ＦＢＬＮ２、サイトカインシグナル伝達抑制因子１、ＴＭＥＭ１２６Ａ、ＤＯＭ３Ｚ、ＴＳＦＭ  ＰＯＬＱ様、ＤＹＮＬＴ３、ＣＤＨ９、ＥＡＦ２、ＭＩＰＥＰ、ＮＤＵＦＡ１２、ＨＤＡＣ８、ＭＫＫＳ、ＦＧＧ、ＩＬ３６Ｇ、ＣＤＣＡ７、ＣＲＩＳＰＬＤ２、オルファクトメジン様２ｂ、ＭＲＰＬ３２、ＭＲＰＬ３３、ＡＨＩ１、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＵＴＰ１４Ａ、ＳＳＨ２、ジストニン、コンタクチン６、ＰＰＦＩＢＰ１、ＴＨＯＣ１、ＣＮＯＴ１、ＲＨＣＥ、ＳＬＣ４１Ａ３、ＳＬＣ２Ａ９、ＳＮＡＰ２３、ＲＦＸ３、ＧＮＧ４、ＭＲＰＬ４０、ＬＳＲ、アンジオゲニン、ＴＲＩＰ４、ＶＲＫ１、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ、ＦＯＸＰ２、ＳＮＸ２、ヌクレオポリン８５、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ２７Ａ、ＳＥＣ６２、カルシウム活性化カリウムチャネルサブユニットアルファ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＲＰＬ１７、ＣＥＰ１０４、ＣＥＰ２９０、ＶＰＳ２９、ＡＮＸＡ４、ジンクフィンガータンパク質７３７、ＤＤＸ５９、ＳＡＰ３０、ＮＥＫ３、エキソソーム成分９、活性化Ｃキナーゼ受容体１、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ、ＴＩＮＰ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＤＩＳＣ１、ＬＲＲＴＭ１、ＰＯＰ１ラミンＢ１、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質、ＣＯＸ６Ｃ、ＴＬＲ１、ＡＲＩＤ２、ＬＡＣＴＢ、ＭＭＳ２２Ｌ、ＵＢＥ２Ｅ３、ＤＡＰ３、ＺＮＦ２３、ＳＫＰ２、ＧＰＲ１１３、ＩＲＦ９グレリンＯ−アシルトランスフェラーゼ、ＮＥＩＬ３、ＥＥＦ１Ｅ１、ＣＯＸ１７、ＥＳＤ、象牙質シアロホスホタンパク質、ＨＤＡＣ９、ＲＦＣ４、ＣＹＬＤ、ＲＰＬＰ０、ＥＩＦ２Ｂ３、ＵＧＴ２Ａ１、ＦＡＢＰ７、ＴＲＩＰ１１、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＩＮＴＳ１２、ＭＹＨ１、ＺＢＴＢ１７、ＭＹＨ４、ＮＬＲＰ２、ＭＥＣＯＭ、ＭＹＨ８、サーモゲニン受容体２、ＩＦＩ１６、ＴＨＹＮ１、ＲＡＢ１７、ＥＴＦＡ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子、Ｆ１３Ｂ、ＲＡＢ６Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＡＴＢ２、ＳＡＴＢ１、ＨＭＧ２０Ｂ、ＵＨＲＦ１、ＣＮＯＴ３、プロスタグランジンＥＰ２受容体、ＦＡＭ６５Ｂ、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、ＫｖＬＱＴ２、ＧＲＩＫ５、ＳＨＯＣ２、コルタクチン、ＦＡＮＣＩ、ＫＩＡＡ１１９９、キヌレニナーゼ、デコイ受容体１、ＮＥＵ３、ＰＨＦ１０、メチルＣｐＧ結合ドメインタンパク質２、ＲＡＢＧＡＰ１、ＣＥＰ５５、ＳＦ３Ｂ１、ＭＳＨ５、ＭＳＨ６、ＣＲＥＢ結合タンパク質、ＬＩＭＳ１、ＳＬＣ５Ａ４、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＲＮＦ３４、ＳＯＲＢＳ２、ＵＩＭＣ１、ＳＯＸ５、ＹＷＨＡＺ、ＩＣＯＳＬＧ、ＮＯＰ５８、ジンクフィンガータンパク質６７９、ＰＨＫＢ、ＭＥＤ１３、ＡＢＣＢ７、ＣＯＱ９、Ｃ１４ｏｒｆ１０４、ジンクフィンガータンパク質５３０、ＫＬＲＣ２、ＬＳＭ８、ＮＢＲ１、ＰＲＫＣＤ、長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＭＴＳＳ１、ソマトスタチン、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼＬ５、ＷＤＲ７２、ＦＥＲＭＴ３、核内受容体関連１タンパク質、クエン酸シンターゼ、ＶＰＳ１１、ＫＩＺ、ＺＦＹＶＥ２７、ＢＣＫＤＨＢ、ヒポクレチン、ＣＡＣＮＧ２、ＰＴＣＨ１、カルボニックアンヒドラーゼ４、ヌクレオポリン１０７、ＬＤＬ受容体、ＬＥＫＴＩ、ＦＢＸＯ１１、ＮＤＵＦＢ３、ＦＣＨＯ２、ＣＥＰ７８、ＲＡＰＧＥＦ６、ＰＰＩＬ３、ＮＩＮ、ＲＡＰＧＥＦ２、成長ホルモン１、成長ホルモン２、ＭＮＡＴ１、Ｎａｖ１、ＭＡＰ３Ｋ８、ＳＵＧＴ１、ＬＡＩＲ１、ヒアルロナン媒介性運動受容体、ＭＡＰ３Ｋ２、ＭＰＰ２、ＴＦＢ２Ｍ、ＣＲＢ３、ＭＰＰ５、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＤＬＧＡＰ２、ＩＮＨＢＡ、ＭＡＧＩ２、ＣＩＰ２９、ＳＥＴＤＢ１、チトクロムｂ５、ＴＲＰＶ２、インターロイキン１受容体、ＨＯＸＤ８、ＴＩＭＭ１０、ＡＴＸＮ２Ｌ、ＣＬＣＮ２、ＣＲＥＢ１、ＴＮＩＰ１、ＣＢＬＢ、第Ｖ因子、ＵＳＰ３３、ＳＯＮ、ＲＢＢＰ８、ＳＬＣ２２Ａ１８、ＰＴＰＮ１２、ＡＤＣＹ８、ＭＹＬＫ、ＫＩＦ２３、ＲＥＸＯ２、ＢＳＴ１、ＴＯＰ３Ｂ、ＣＯＰＢ１、ＡＸＩＮ２、ＣＯＰＢ２、ＴＮＲＣ６Ｂ、グアニジノ酢酸Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡチオエステラーゼ９、Ｃ４ｏｒｆ２１、ＴＳＨＢ、ＦＲＳ３、ＥＰＢ４１、サイクリンＴ２、ＬＡＩＲ２、ヌクレオポリン４３、ＡＰＬＰ２、ＴＮＦＲＳＦ１９、細胞死関連タンパク質６、上皮細胞接着分子、ＣＬＥＣ７Ａ、ゲフィリン、ＣＬＤＮＤ１、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＣＤＨＡＣ２、骨形成タンパク質４、ＮＶＬ、ＲＢＭ３３、ＲＮＦ１３９、精子関連抗原５、ＰＬＣＢ１、グリア細胞由来神経栄養因子、ＰＡＲＰ４、ＰＡＲＰ１、ＭＡＮ２Ａ１、骨形成タンパク質１、ＰＡＸ４、ＢＣＣＩＰ、ＭＭＰ７、デコイ受容体３、ＲＡＭＰ２、ＮＣＡＰＤ３、ＬＲＲＣ３７Ａ、ＲＷＤＤ３、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｃ、ＳＬＣ３Ａ１、ＭＲＰＳ２２、ＣＤＣ１４Ａ、ＩＴＳＮ１、ＰＯＬＥ２、ＭＹＣ誘導性核抗原、ＴＭＬＨＥ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、ＧＰＲ１７７、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＫＩＡＡ１３３３、ＲＰＰ３８、ＭＹＯ１Ｆ、ファルネソイドＸ受容体、カルデスモン、ＦＢＸＯ４、ＦＢＸＯ５、ＯＰＮ１ＭＷ、ＰＩＧＮ、ＡＲＮＴＬ２、ＢＣＡＳ３、Ｃ６ｏｒｆ５８、ＰＨＴＦ２、ＳＥＣ２３Ａ、ＮＵＦＩＰ２、ＯＡＺ１、オステオプロテゲリン、ＡＮＡＰＣ４、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＳＰＡＭ１、ＰＳＭＡ６、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＲＡＢＥＰ１、ＤＰＭ３、ＳＬＣ６Ａ１５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＡＲＨＧＡＰ２４、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、ＥＲＣＣ５、転写開始タンパク質ＳＰＴ３ホモログ、ＯＲ１Ｅ１、ＺＮＲＦ１、ＧＭＥＢ１、ＣＣＴ２  ＧＮＡＱ、ムチン６、ムチン４、ＬＲＰ５、ＰＤＥ９Ａ、Ｃ２ｏｒｆ３、ＥＺＨ２、上皮増殖因子受容体、ＴＭＴＣ２、ＰＤＥ４Ａ、ＥＰＨ受容体Ａ４、ＰＰＩＢ、ＤＥＮＮＤ４Ａ、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ���、ヌクレオポリン８８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＣＯＧ８、ＲＢＭＳ１、ＭＡＰ７、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＡＥＢＰ２、ＤＣＬＲＥ１Ａ、ＲＰＬ２４、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２３、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＡＴＧ７、ＳＥＲＰＩＮＩ２、ＧＹＬＴＬ１Ｂ、ＡＴＰ５Ｇ２、ＤＩＰ２Ａ、ＡＭＹ２Ａ、ＣＥＰ６３、ＴＤＲＤ７、ＰＩＥＺＯ１、ＣＬＤＮ２０、ＧＲＸＣＲ１、ＰＭＥＬ、ＮＩＦ３Ｌ１、ＭＣＣ＿、ＰＣＮＸ、ＴＭＢＩＭ４、ＤＵＳＰ１２、ＺＭＹＮＤ８、ＧＯＳＲ１、インターフェロンガンマ受容体１、ＬＤＢ３、ＰＯＮ３、Ｃ１Ｄ、ＡＢＣＣ８、ＣＯＱ７、ＣＯＱ６、ＡＭＥＬＹ、ＨＡＶＣＲ１、ＰＩＣＡＬＭ、シェーグレン症候群抗原Ｂ、ＰＬＫ４、ＨＢＢ、ＡＫＴ１、ＰＣＤＨＧＢ７、Ｃ６ｏｒｆ１０、ＵＢＲ１、網膜芽細胞腫様タンパク質１、ＧＲＫ６、ＷＷＣ２、ＧＲＫ４、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＳＬＣ３４Ａ１、ＧＯＬＧＡ２、ＭＹＣＢＰ２、ＰＴＰ４Ａ２、ＮＵＣＢ２、ＭＡＧＯＨ、ＲＰＰ４０、アルファ−２Ａアドレナリン受容体、ＳＰＡＧ１１Ｂ、ヌクレオポリン２０５、ＣＯＧ１、運動精子ドメイン含有３、ＫＣＮＭＢ３、運動精子ドメイン含有１、ＫＬＨＬ７、ＫＣＮＮ２、ＴＳＰＡＮ８、ＧＰＲ２１、輸送体タンパク質、ＨＮＲＮＰＬＬ、ＡＢＨＤ５、ＣＡＢ３９Ｌ、アンフィレギュリン、ＧＰＲ１、インターロイキン１８、ＥＩＦ４Ｇ３、インターロイキン１５、ＣＣＤＣ８０、ＣＤ２ＡＰ、ＮＦＳ１、ＧＲＢ２、ＵＬＢＰ２、血管内皮増殖因子Ｃ、ＲＰＳ３、ＴＬＲ８、ＢＣＬ２関連タンパク質Ａ１、ＲＨＯＴ１、コラーゲン、セントロメアタンパク質Ｅ、ＳＴＭＮ２、ＨＥＳＸ１、ＲＰＬ７、カリリン（Ｋａｌｉｒｉｎ）、ＰＣＭＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＳＵＭＯ２、ＮＯＸ３、ＥＰ４００、ＤＮＭ３、ＥＥＤ、ＮＧＬＹ１、
ＮＰＲＬ２、ＰＬＡＣ１、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有タンパク質３、Ｃ７ｏｒｆ３１、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＨＡＵＳ３、ＩＦＮＡ１０、ＭＹＳＴ４、ＤＣＨＳ１、ＳＩＲＴ４、ＥＦＥＭＰ１、ＡＲＰＣ２、ＭＥＤ３０、ＩＦＴ７４、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＤＹＮＣ１ＬＩ２、ＰＯＬＲ２Ｂ、ＰＯＬＲ２Ｈ、ＫＩＦ３Ａ、ＰＲＤＭ１６、ＰＬＳＣＲ５、ＰＥＸ５、副甲状腺ホルモン１受容体、ＣＤＣ２３、ＲＢＰＭＳ、ＭＡＳＴ１、ＮＲＤ１、ＢＡＴ５、ＢＡＴ２、Ｄｏｃｋ１１、ＧＣＳＨ、ＰＯＦ１Ｂ、ＵＳＰ１５、ＰＯＴ１、ＭＵＴＹＨ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＦＡＭ１２２Ｃ、Ａ１ポリペプチド、フラビン含有モノオキシゲナーゼ３、ＨＰＧＤ、ＬＧＡＬＳ１３、ＭＴＨＦＤ２Ｌ、生存運動ニューロンドメイン含有１、ＰＳＭＡ３、ＭＲＰＳ３５、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ、ＳＧＣＥ、ＲＥＰＳ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ、ＰＡＢＰＣ１、ＭＡＰＫ８、ＰＤＣＤ５、ホスホグルコムターゼ３、ユビキチンＣ、ＧＡＢＰＢ２、ミトコンドリア翻訳放出因子１、ＰＦＤＮ４、ＮＵＢ１、ＳＬＣ１３Ａ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ガレクチン３、ＣＣ２Ｄ２Ａ、ＧＣＡ、組織因子経路インヒビター、ＵＣＫＬ１、ＩＴＦＧ３、ＳＯＳ１、ＷＷＴＲ１、ＧＰＲ８４、ＨＳＰＡ１４、ＧＪＣ３、ＴＣＦ７Ｌ１、マトリックスメタロペプチダーゼ１２、ＩＳＧ２０、ＬＩＬＲＡ３、血清アルブミン、ホスデューシン様、ＲＰＳ１３、ＵＴＰ６、ＨＰ１ＢＰ３、ＩＬ１２Ａ、ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ２、ＬＡＴＳ１、ＢＭＦ＿、チモシンベータ−４、Ｂ細胞リンカー、ＢＣＬ２Ｌ１１、凝固因子ＸＩＩＩ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＰＲＰＦ１９、ＳＦＲＳ５、インターロイキン２３サブユニットアルファ、ＮＲＡＰ、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１４、Ｃ９ｏｒｆ６４、テスチン、ＶＰＳ１３Ａ、ＤＧＫＤ、ＰＴＰＲＢ、ＡＴＰ５Ｃ１、ＫＣＮＪ１６、ＫＡＲＳ、ＧＴＦ２Ｈ２、ＡＭＢＮ、ＵＳＰ１３、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＴＲＯ＿、ＲＴＦ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ２、ＳＳＢＰ１、ＳＮＲＰＮ上流リーディングフレームタンパク質、ＲＰＳ２９、ＳＮＲＰＧ、ＡＢＣＣ１０、ＰＴＰＲＵ、ＡＰＰＬ１、ＴＩＮＦ２、ＴＭＥＭ２２、ＵＮＣ４５Ａ、ＲＰＬ３０、ＰＣＤＨ７、ガラクトサミン６スルファターゼ、ＵＰＦ３Ａ、ＡＣＴＬ６Ａ、ＡＣＴＬ６Ｂ、ＩＬ３ＲＡ、ＳＤＨＢ、カテプシンＬ２、ＴＡＳ２Ｒ７、カテプシンＬ１、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、ＲＰＮ２、ＤＹＮＬＬ１、ＫＬＫ１３、ＮＤＵＦＢ３、ＰＲＰＦ８、ＳＰＩＮＴ２、ＡＨＳＡ１、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、ＤＲＡＰ１、ＲＮＡＳＥ１、オルファクトメジン様２ｂ、ＶＲＫ１、ＩＫＫ２、ＥＲＧＩＣ２、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＣＡＭＫ２Ｂ、エストロゲン受容体ベータ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＲＰＬ１９、ＮＵＣＢ２、ＫＣＴＤ１３、ユビキノン、Ｈ２ＡＦＹ、ＣＥＰ２９０、ＰＡＢＰＣ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＤＨＸ３８、ＫＩＡＡ０９２２、ＭＰＨＯＳＰＨ８、ＤＤＸ５９、ＭＩＢ２＿、ＺＢＰ１、Ｃ１６ｏｒｆ８４、ＵＡＣＡ、Ｃ６ｏｒｆ１４２、ＭＲＰＬ３９、サイクリン依存性キナーゼ７、遠位上流エレメント結合タンパク質１、ＳＧＯＬ１、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＡＴＧ１０、ダームシジン、ＥＰＳ８Ｌ２、デコリン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＤＣ２０、ＭＹＢ、ＷＮＴ５Ａ、ＲＢＰＪ、ＤＥＦＢ１０３Ａ、ＲＰＳ１５Ａ、ＡＴＰ５Ｈ、ＲＰＳ３、ＦＡＢＰ１、ＳＬＣ４Ａ８、血清アミロイドＰ成分、ＡＬＡＳ１、ＭＡＰＫ１、ＰＤＣＤ５、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＣＨＲＮＡ３、ＡＴＸＮ１０、ＭＮＡＴ１、ＡＬＧ１３、アタキシン３、ＬＲＲＣ３９、ＡＤＨ７、デルタ−サルコグリカン、ＴＡＣＣ１、ＩＦＮＡ４、胸腺間質リンホポエチン、ＬＧＴＮ、ＫＩＡＡ１３３３、ＭＳＨ６、ＭＹＯＴ、ＲＩＰＫ５、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＲＰＬ２７、Ｒｎｄ１、血小板因子４、ＨＳＤ１７Ｂ７、ＬＳＭ８、ＣＥＰ６３、ＩＮＴＳ８、ＣＴＮＳ、ＡＳＡＨＬ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＨＥＸＢ、ＳＬＣ１６Ａ５、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＦＲＭＤ６の３’ＵＴＲに見出され得る。
【００７０】
[00088]ＲＤＥは、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ベータ１−ＡＲ、ＰＴＨ、インターフェロン−ガンマ、ＭｙｏＤ、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ＰＡＩ−２、またはＮＯＳ  ＨＡＮＯＳをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じるクラスＩ  ＡＵリッチエレメントであってもよい。ＲＤＥはまた、クラスＩＩ  ＡＵリッチエレメントでもあってもよく、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロン−アルファ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｂｃｌ−２、インターフェロン−ベータ、またはＶＥＧ−Ｆをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じる。ＲＤＥは、例えば、ｃ−ｊｕｎ、ＧＬＵＴ１、ｐ５３、ｈｓｐ  ７０、ミオゲニン、ＮＦ−Ｍ、またはＧＡＰ−４３をコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じるクラスＩＩＩ  ＡＵリッチエレメントであってもよい。他のＲＤＥは、Ｔ細胞受容体サブユニット（α、β、γ、またはδ鎖）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ−１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびリンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、および他のチェックポイント阻害剤の３’−ＵＴＲから得られ得る。さらに他のＲＤＥは、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｃｏｐｐｅら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ５：９９〜１１８頁（２０１０）に開示された、老化関連分泌現象遺伝子の３’−ＵＴＲから得られ得る（例えば、表１を参照のこと）。
【００７１】
[00089]ＲＤＥは、例えば、ＡＲＥポリ（Ｕ）結合／分解因子（ＡＵＦ−１）、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）、ヒト抗原関連タンパク質（ＨｕＲ）、酪酸反応因子１（ＢＲＦ−１）、酪酸反応因子２（ＢＲＦ−２）、Ｔ細胞拘束性細胞内抗原１（ＴＩＡ−１）、ＴＩＡ−１関連タンパク質（ＴＩＡＲ）、ＣＵＧトリプレットリピート、ＲＮＡ結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ−１）、ＣＵＧトリプレットリピート、ＲＮＡ結合タンパク質２（ＣＵＧＢＰ−２）、ヒトニューロン特異的ＲＮＡ結合タンパク質（Ｈｅｌ−Ｎ１、Ｈｅｌ−Ｎ２）、ＲＮＡ結合タンパク質ＨｕＡ、ＨｕＢおよびＨｕＣ、ＫＨ型スプライシング制御タンパク質（ＫＳＲＰ）、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＡＵＨ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）、熱ショックタンパク質１０（Ｈｓｐ１Ｏ）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰ  Ａ１）、異種核リボ核タンパク質Ａ２（ｈｎＲＮＰ  Ａ２）、異種核リボ核タンパク質Ａ３（ｈｎＲＮＰ  Ａ３）、異種核リボ核タンパク質Ｃ（ｈｎＲＮＰ  Ｃ）、異種核リボ核タンパク質Ｌ（ｈｎＲＮＰ  Ｌ）、Ｂｃｌ−２  ＡＵリッチエレメントＲＮＡ結合タンパク質（ＴＩＮＯ）、ポリ（Ａ）結合タンパク質相互作用タンパク質２（ＰＡＩＰ２）、ＩＲＰ１、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、およびアルドラーゼを含む特定のポリペプチドによって結合されてもよい。ＲＤＥ結合タンパク質はまた、例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、エノラーゼ（ＥＮＯ１またはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ−２）、または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などの解糖または糖代謝に関与する酵素でもあってもよい。ＲＤＥ結合タンパク質は、例えば、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）またはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）を含む、ペントースリン酸シャントに関与する酵素であってもよい。追加の例示的なＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓｔｅｌｌｏら、Ｍｏｌｃ．Ｃｅｌｌ  ６３：６９６〜７１０頁（２０１６）；Ｋｏｖａｒｉｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８９：２１〜２６頁（２０１７）；Ｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４９９：１７２〜１７７頁（２０１３）；Ｃａｓｔｅｌｌｏら、Ｃｅｌｌ  １４９：１３９３〜１４０６（２０１２）；Ｖｌａｓｏｖａら、Ｍｏｌｃ．Ｃｅｌｌ．  ２９：２６３〜２７０頁（２００８）；Ｂａｒｒｅａｕら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３巻、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ１０１２（２００６）；Ｍｅｉｓｎｅｒら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ５：１４３２〜１４４７頁（２００４）；Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉら、Ｇｅｎｅ  ２６５：１１〜２３頁（２００１）に記載されているものであり、これらの全てがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【００７２】
[00090]ＲＤＥ結合タンパク質は、例えば、１つもしくは複数のＵＵＡＵＵＵＡＵＵ（配列番号１２）およびＡＵＵＵＡ（配列番号１）を含むＲＤＥに結合することができるＴＴＰ、またはＡＵリッチＲＤＥを結合するＫＳＲＰ、または例えば、１つもしくは複数のＵＵＧＡ（配列番号１３）、ＡＧＵＵＵ（配列番号１１）、もしくはＧＵＵＵＧ（配列番号５）を含むＲＤＥを結合するＡｕｆ１、または例えば、１つもしくは複数のＵＵＧＵＵ（配列番号３）を含むＲＤＥを結合するＣＥＬＦ−１、または例えば、１つもしくは複数のＵＵＵＡＵＵＵ（配列番号８）、ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号９）、もしくはＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号６）を含むＲＤＥを結合するＨｕＲ、または例えば、１つもしくは複数のＵＧＧＧＧＡＵ（配列番号１４）を含むＲＤＥを結合するＥＳＲＰ１もしくはＥＳＲＰ２、または例えば、１つもしくは複数のＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号６）を含むＲＤＥを結合するＥＬＡＶであってもよい。ＲＤＥ結合タンパク質は、例えば、例えば、１つもしくは複数のＡＵＵＵＡ（配列番号１）エレメントを含むＡＵリッチエレメントを結合するＧＡＰＤＨ、または例えば、１つもしくは複数のＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号１５）を含むＲＤＥを結合するＥＮＯ３／ＥＮＯ１、または例えば、１つもしくは複数のＡＵＵＧＡ（配列番号１６）を含むＲＤＥを結合するＡＬＤＯＡを含む、解糖に関与する酵素であってもよい。
【００７３】
[00091]一態様において、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスと組み合わされてＲＤＥリガンド誘導性によって制御を行ってもよい。例えば、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスに作動可能に連結されてもよく、ＲＮＡ制御デバイスによるリガンド結合は、ＲＤＥを阻害する制御エレメント（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ）を活性化する（例えば、リボザイムはＲＤＥを切断し、そのためＲＤＥ結合タンパク質はもはや結合せず、またはリボスイッチは二次構造を変更する）。これは、ＲＤＥおよびＲＮＡ制御デバイスを含む転写物をＲＤＥからの２種類の制御下に置く。第１に、ＲＤＥは、細胞中の条件によって支配されるときＲＤＥ結合タンパク質の結合の対象となる転写物を制御することができ、第２に、ＲＤＥ制御は、ＲＮＡ制御デバイスをリガンドで誘導することによって取り除くことができる。リガンドが添加されると、ＲＮＡ制御デバイスはＲＤＥを結合に利用できなくさせ、ＲＤＥ制御が取り除かれる。リガンドが除去されると、転写された新たな転写物はＲＤＥに制御され得る（ＲＮＡ制御デバイスが活性化されないため）。あるいは、ＲＤＥは、リガンド結合が制御エレメント（例えば、リボザイム）をオフにするＲＮＡ制御デバイスに作動可能に連結されてもよい。この例では、リガンドの存在がＲＮＡ制御デバイスを阻害し、転写物はＲＤＥによって制御され得る。リガンドが除去されると、ＲＮＡ制御デバイスは、ＲＤＥ結合タンパク質への結合にＲＤＥを利用できなくさせ、転写物のＲＤＥ制御が取り除かれる。ＲＮＡ制御デバイスはまた、ＲＤＥに結合して、ＲＤＥタンパク質がＲＤＥに結合するのを阻害する構造（例えば、ヘリックス）を形成するポリヌクレオチドも切断し得る。この例では、ＲＮＡ制御デバイスは、次いでＲＤＥを結合しない、またはＲＤＥへの結合が阻害される阻害性ポリヌクレオチドを切断し得る。ＲＮＡ制御デバイスによるこの切断は、リガンド結合によって刺激されてもよく、またはリガンド結合によって阻害されてもよい。
【００７４】
[00092]異なるＲＤＥは、例えば、異なる定常発現レベル、異なるＴｍａｘ（最大発現レベルまでの時間）、異なるＣｍａｘ（最大発現レベル）、異なるダイナミックレンジ（発現／基底発現）、異なるＡＵＣ、異なる誘導動態（発現率（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）の加速および発現率の速度）、発現量、ベースライン発現、最大ダイナミックレンジ（ＤＲｍａｘ）、ＤＲｍａｘまでの時間、曲線下面積（ＡＵＣ）などの、異なる動態パラメータを有する。さらに、ＲＤＥのこれらの速度論的特性は、同じＲＤＥのコンカテマーを作ること、または異なるＲＤＥを制御ユニットに組み合わせることによって変更され得る。作動可能に連結されたＲＮＡ制御デバイスの制御下にＲＤＥを置くことも、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、またはＲＤＥ組み合わせの速度論的特性を変更し得る。また、ＲＤＥを結合するためのＲＤＥ結合タンパク質の利用可能性に影響を与える小分子および他の分子も、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせの速度論的応答を変更するのに使用され得る。ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせの速度論的応答は、転写物において競合的ＲＤＥを発現する構築物を使用して変えられ得る。１つまたは複数の競合するＲＤＥを含むそのような転写物は、ＲＤＥ結合タンパク質を巡って競合することができ、そのためＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせによる所望の遺伝子の制御を変更することができる。これらの競合的ＲＤＥ転写物は、ＲＤＥ結合タンパク質に結合し、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせへの結合に利用可能なＲＤＥ結合タンパク質の量を減少させることができる。故に、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせは、導入遺伝子の発現に所望の速度論的応答をもたらすように選択され、および／または他の条件（上で論じた）と組み合わされてもよい。
【００７５】
[00093]実施例２０の表２は、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）が異なる発現動態をもたらしたことを示している。例えば、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、異なる時点で最大誘導（誘導倍率としても知られる最大ダイナミックレンジ）に達する。ＲＤＥ  ＡＵ  ２およびＡＵ  １０１は、１日目に最大ダイナミックレンジ（ＤＲｍａｘ）に達し、次いでダイナミックレンジ（ＤＲ）は減少し、基底発現と比べて発現の低下を示した。ＲＤＥ  ＡＵ  ５およびＡＵ  ２１はＤＲｍａｘが３／４日目であり、この発現は８日目まで維持された。ＲＤＥ  ＡＵ  ３、ＡＵ  ７、ＡＵ  １０、ＡＵ  ２０およびＡＵ  ２３はＤＲｍａｘが６日目であり、発現は８日目に減少した。ＲＤＥ  ＡＵ  １９およびＡＵ  ２２は、ＤＲｍａｘが８日目であった。ＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）はまた、ＡＵ  ７の発現をＡＵ  １０と比べると、約５５００倍の範囲にわたる発現量の違いがあった（表１を参照のこと）。故に、ＲＤＥ（ＡＵエレメント）は、所望の時点で最大発現率をもたらし、およびその時点で所望の量のポリペプチドをもたらすように選択することができる。
【００７６】
[00094]いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥへの結合後のＲＮＡ分解速度を増加させる。いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥへの結合後、ＲＮＡの分解速度を減少させる。１つを超えるＲＮＡ結合タンパク質がＲＤＥに結合してもよい。いくつかのＲＤＥ制御ユニットでは、１つを超えるＲＮＡ結合タンパク質が１つを超えるＲＤＥに結合する。１つまたは複数のＲＤＥへの１つまたは複数のＲＮＡ結合タンパク質の結合は、ＲＮＡの分解速度を増加させることができる。１つまたは複数のＲＮＡ結合タンパク質の結合は、ＲＮＡの分解速度を減少させることができる。分解を増加させるＲＮＡ結合タンパク質は、分解を減少させるＲＮＡ結合タンパク質とＲＤＥへの結合を競合することができ、その結果、ＲＮＡの安定性は２つのＲＮＡ結合タンパク質の相対的結合に依存する。他のタンパク質がＲＤＥ結合タンパク質に結合してもよく、ＲＤＥを含むＲＮＡに対するＲＮＡ結合タンパク質の効果を調節してもよい。ＲＮＡ結合タンパク質へのタンパク質の結合は、ＲＮＡ安定性を向上させ得、またはＲＮＡ安定性を低下させ得る。ＲＮＡは、タンパク質ＨｕＲおよびＴＴＰによって結合される複数のＲＤＥを有することができる。ＨｕＲタンパク質はＲＮＡを安定化することができ、ＴＴＰタンパク質はＲＮＡを不安定化することができる。ＲＮＡは、タンパク質ＫＳＲＰ、ＴＴＰおよび／またはＨｕＲと相互作用する少なくとも１つのＲＤＥを有することができる。ＫＳＲＰは、ＲＮＡを不安定化することができ、ＲＮＡを安定化することができるＨｕＲタンパク質と結合を競合することができる。ＫＳＲＰタンパク質はＲＤＥに結合することができ、ＲＮＡを不安定化し、ＴＴＰタンパク質はＫＳＲＰに結合し、ＲＮＡの分解を妨げることができる。異なるタンパク質が同じ転写物に結合されてもよく、分解および安定化速度に対する競合効果を与えてもよい。異なるタンパク質が同じ転写物に結合されてもよく、分解および安定化速度に対する協同効果を与えてもよい。異なるタンパク質が異なる時点で同じ転写物に結合され、分解および安定化に対して異なる効果を与えてもよい。
【００７７】
[00095]ＲＤＥはクラスＩＩ  ＡＵリッチエレメントであってもよく、およびＲＮＡ結合タンパク質はＧＡＰＤＨであってもよい。ＧＡＰＤＨによって結合されるクラスＩＩ  ＡＵリッチエレメントは、ＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡ（配列番号２）であってもよい。クラスＩＩ  ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲの発現を制御するのに使用することができる。クラスＩＩ  ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨはまた、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲのＴリンパ球での発現を達成するのに使用することもできる。クラスＩＩ  ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲのＣＤ８＋  Ｔリンパ球での発現を達成するのに使用することができる。クラスＩＩ  ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲのＣＤ４＋  Ｔリンパ球での発現を達成するのに使用することができる。クラスＩＩ  ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲのナチュラルキラー細胞での発現を達成するのに使用することができる。
【００７８】
[00096]ＲＤＥは、マイクロＲＮＡ結合部位を有してもよい。ＲＤＥは、１つまたは複数のこれらのマイクロＲＮＡ結合部位を除去するように改変されてもよい。マイクロＲＮＡ結合部位の除去は、ＲＤＥを含む構築物からのオン発現を少なくとも５、１０、１５、２０、５０または１００倍増加させ得る。マイクロＲＮＡ部位を含むＲＤＥは、ＧＡＰＤＨによって結合されるＲＤＥであってもよい。ＧＡＰＤＨによって結合されるＲＤＥからのマイクロＲＮＡ部位の除去は、ＧＡＰＤＨ感受性ＲＤＥを含む構築物のオン発現を少なくとも５〜１０倍増加させることができる。ＲＤＥを通じたこのＧＡＰＤＨ制御は、ペイロードを標的部位に送達するのに使用することができる。ＧＡＰＤＨ制御は、標的部位で優先的に見出される抗原を認識するＣＡＲによる真核細胞の活性化と結び付けることができる。
【００７９】
[00097]ＲＤＥは、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γの３’−ＵＴＲであってもよく、マイクロＲＮＡ部位の除去は、ＲＤＥを含む導入遺伝子ＲＮＡからの発現の速度および／または発現のダイナミックレンジを増加させることができる。ＲＤＥは、ＩＬ−２の３’−ＵＴＲであってもよく、除去されるマイクロＲＮＡ部位は、ＭＩＲ−１８６部位であってもよく、その欠失は発現動態を向上させ、発現のダイナミックレンジを約５０倍向上させる。ＲＤＥはまた、ＩＦＮ−γの３’−ＵＴＲでもあってもよく、除去されるマイクロＲＮＡ部位は、ＭＩＲ−１２５部位であってもよい。
キメラ抗原受容体
[00098]キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合／認識エレメント、受容体を細胞膜に固定する膜貫通エレメント、および少なくとも１つの細胞内エレメントを含む、融合タンパク質であってもよい。これらのＣＡＲエレメントは、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、特許出願ＵＳ２０１４０２４２７０１に記載されているように、当技術分野で公知である。ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合エレメント、膜貫通エレメント、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含む構築物から発現される、組換えポリペプチドであってもよい。刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と結合されたゼータ鎖であってもよい。細胞質シグナル伝達エレメントは、さらに、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つまたは複数の機能的シグナル伝達エレメントを含んでもよい。共刺激分子は、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選択することができる。ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメント、膜貫通エレメント、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含む、キメラ融合タンパク質であってもよい。ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメント、膜貫通エレメント、ならびに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメント、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含む、キメラ融合タンパク質を含んでもよい。ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメント、膜貫通エレメント、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達エレメント、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含む、キメラ融合タンパク質であってもよい。ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメント、膜貫通エレメント、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達エレメント、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含む、キメラ融合タンパク質を含んでもよい。ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意選択のリーダー配列を含んでもよい。ＣＡＲは、さらに、細胞外抗原認識エレメントのＮ末端にリーダー配列を含んでもよく、該リーダー配列は、細胞プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の間に抗原認識エレメント（例えば、ｓｃＦｖ）から場合により切断される。
キメラ抗原受容体−細胞外エレメント
[00099]ＣＡＲの製造において有用な例示的な細胞外エレメントは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、これらはいずれも、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【００８０】
[000100]細胞外エレメントは、例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されているような疾患に対して免疫になっている対象の免疫細胞から得られた抗体のレパートリーから得ることができる。
【００８１】
[000101]細胞外エレメントは、それらの全てがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号、米国特許第５，３５９，０４６号、第５，６８６，２８１号および第６，１０３，５２１号に記載されているような、リガンド結合および／またはシグナル伝達と関連する多種多様な細胞外エレメントまたは分泌タンパク質のいずれかから得られてもよい。
細胞内エレメント
[000102]細胞内エレメントは、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲの細胞外エレメントが抗原に結合する（相互作用する）と、シグナルを細胞に伝達することができる分子であり得る。細胞内シグナル伝達エレメントは、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲが導入されている免疫細胞の通常のエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に一般に関与し得る。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってもよい。故に、用語「細胞内シグナル伝達エレメント」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化された機能を果たすよう細胞に指示するタンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用されてもよいが、多くの場合、細胞内エレメントまたは細胞内シグナル伝達エレメントは、ドメイン全体からなる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分が使用される程度において、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、そのような切断された部分が使用され得る。用語細胞内シグナル伝達エレメントは、故にまた、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのいかなる切断された部分も含むことも意図される。本発明のＳｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達エレメントの例には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および抗原受容体結合後にシグナル伝達を惹起するように同時に作用する共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が含まれる。
【００８２】
[000103]細胞内エレメントおよび、細胞内エレメントと共にまたは細胞内エレメントとして有用なポリペプチドの組み合わせは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
膜貫通エレメントおよびスペーサーエレメント
[000104]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲは、膜貫通エレメントを含んでもよい。膜貫通エレメントは、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲの細胞外エレメントに付着することができる。膜貫通エレメントは、膜貫通領域に隣接する１つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通エレメントが由来したタンパク質の細胞外領域と会合する１つもしくは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５アミノ酸）、および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合する１つもしくは複数の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５アミノ酸）を含んでもよい。膜貫通エレメントは、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲで使用される他のエレメントの１つと会合してもよい。膜貫通エレメントは、そのようなエレメントが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通エレメントに結合するのを避けるために、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、アミノ酸置換によって選択または修飾されてもよい。膜貫通エレメントは、細胞表面の別のＳｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲとホモ二量体化することができる。膜貫通エレメントのアミノ酸配列は、同じ細胞に存在する天然の結合パートナーの結合エレメントとの相互作用を最小限にするように修飾または置換されてもよい。
【００８３】
[000105]本発明において有用な膜貫通エレメントは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
キメラ抗原受容体：Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ
[000106]ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲは、会合して機能性ＣＡＲまたはＤＥ−ＣＡＲを形成する少なくとも２つの部分からなってもよい。細胞外抗原結合エレメントは、ＣＡＲの膜貫通エレメント、任意選択のスペーサー、および細胞内エレメントとは別個の部分として発現されてもよい。別個の細胞外結合エレメントは、宿主細胞膜と会合されてもよい（膜貫通ポリペプチド以外の手段により）。細胞内エレメントが、細胞外エレメント、膜貫通エレメント、および場合によりスペーサーとは別個の部分として発現されてもよい。細胞外エレメントおよび細胞内エレメントは別個に発現されてもよく、各々が膜貫通エレメント、および場合によりスペーサーを有してもよい。ＣＡＲまたはＤＥ−ＣＡＲの各部分は、２つの部分を結び付けて機能性ＣＡＲまたはＤＥ−ＣＡＲを形成するための会合エレメント（「Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ」）を有してもよい。
【００８４】
[000107]Ｓｉｄｅ  ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ  ＣＡＲの選択、およびテザーありまたはなしでのその使用は、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
受容体
[000108]ＣＡＲは、細胞およびＲＤＥ−導入遺伝子と共に受容体として使用することができる。ＣＡＲは上記に記載されている。ＣＡＲに加えて、ＲＤＥの制御下の導入遺伝子が発現されるように細胞中の状態を活性化するまたはさもなければ変化させるのに、他の受容体が使用されてもよい。化学シグナルを認識および応答する受容体は、ＲＤＥを通じて導入遺伝子の発現と共役することができる。例えば、イオンチャネル連結型（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質連結型（代謝型）受容体、および酵素連結型受容体が、導入遺伝子の発現と共役され得る。
【００８５】
[000109]導入遺伝子発現と共役することができる受容体の１つのクラスは、例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体（抗原受容体または免疫グロブリン受容体としても知られる）、および自然免疫受容体などの免疫受容体である。
【００８６】
[000110]Ｔ細胞受容体は、２つの異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体である。ヒトでは、ほとんどのＴ細胞がアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖でできたＴ細胞受容体を有し、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖でできた（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）Ｔ細胞受容体を有する。リンパ球由来のＴ細胞受容体鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって商業的に販売されているＳＭＡＲＴｅｒ  Ｈｕｍａｎ  ＴＣＲ  ａ／ｂ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔｓ、Ｂｏｒｉａら、ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：５０〜５８頁（２００８）；Ｍｏｏｎｋａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６９：４１〜５１頁（１９９４）；Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３７３３８頁（２０１２）；Ｓｅｉｔｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０３：１２０５７〜６２頁（２００６）に記載されており、これらの全てがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。ＴＣＲレパートリーは、抗原結合ドメインを形成するのに別個の鎖として使用されてもよい。ＴＣＲレパートリーは、一本鎖抗原結合ドメインに変換されてもよい。一本鎖ＴＣＲは、例えば、それらの全てがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／０２５２７４２号、Ｓｃｈｏｄｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３３：８１９〜８２９頁（１９９６）；Ａｇｇｅｎら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校博士論文（２０１０）（そのコピーは、ｉｄｅａｌｓ．  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ．  ｅｄｕ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／２１４２／１８５８５／Ａｇｇｅｎ＿Ｄａｖｉｄ．ｐｄｆ？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１に見出される）に記載されているものを含む当技術分野で周知の手法を使用して、ヒトアルファおよびベータ鎖をコードする核酸から製造することができる。
【００８７】
[000111]Ｂ細胞受容体には、膜結合性である免疫グロブリン、シグナル伝達部分、ＣＤ７９、およびＩＴＡＭが含まれる。ヒト抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、ＰｒｏＧｅｎ’ｓ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩｇＭ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ、カタログ番号Ｆ２０００；Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２０１１；Ｌｉｍら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１：１０８〜１１７頁（２０１０）；Ｓｕｎら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２８：３８１〜３８６頁（２０１２）；Ｃｏｒｏｎｅｌｌａら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２８：ｅ８５頁（２０００）に記載されており、これらの全てがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。マウス抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第８，１４３，００７号；Ｗａｎｇら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．  ７（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ９頁（２００６）に記載されており、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。抗体レパートリーは、抗原結合ドメインにおいて別個の鎖として使用されてもよく、または一本鎖抗原結合ドメインに変換されてもよい。一本鎖抗体は、例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｐａｎｓｒｉら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９：６頁（２００９）；Ｐｅｒａｌｄｉ−Ｒｏｕｘ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌｃ．  Ｂｉｏｌ．  ９０７：７３〜８３頁（２０１２）に記載されているものを含む当技術分野で周知の手法を使用して、ヒト軽鎖および重鎖をコードする核酸から製造することができる。一本鎖抗体は、例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｉｍａｉら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．  ２９：１３２５〜１３３０頁（２００６）；Ｃｈｅｎｇら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ２７４０６頁（２０１１）に記載されているものを含む当技術分野で周知の手法を使用して、マウス軽鎖および重鎖をコードする核酸から製造することができる。
【００８８】
[000112]自然免疫受容体には、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリー（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ）、２Ｂ４受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫｐ８０受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＲＰ１０５）が含まれる。
【００８９】
[000113]７回膜貫通ドメイン受容体としても知られるＧタンパク質連結型受容体は、Ｇタンパク質を通じてリガンドの受容体結合を細胞応答に共役させる受容体の大きなファミリーである。これらのＧタンパク質は、ＧＴＰに結合されると活性になり、ＧＤＰに結合されると不活性になる、α、β、およびγサブユニット（それぞれ、Ｇα、Ｏβ、およびＧγとして知られる）の三量体である。受容体はリガンドを結合するとコンフォメーション変化を受け、Ｇタンパク質をアロステリックに活性化してＧＴＰを結合ＧＤＰと交換する。ＧＴＰ結合後、Ｇタンパク質は受容体から解離してＧα−ＧＴＰ単量体およびＧβγ二量体を生じる。Ｇタンパク質連結型受容体は、例えば、ロドプシン様受容体、セクレチン受容体、代謝型グルタミン酸／フェロモン受容体、真菌交配フェロモン受容体、環状ＡＭＰ受容体、およびｆｒｉｚｚｌｅｄ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体を含むクラスにグループ化されている。Ｇタンパク質受容体は、電磁放射線の検出、味覚（味）、嗅覚、神経伝達、免疫系制御、増殖、細胞密度感知等を含む、多種多様な生理学的プロセスで使用される。
【００９０】
[000114]触媒型受容体としても知られる酵素連結型受容体は、細胞外リガンドの結合が細胞内側で酵素活性をもたらす膜貫通受容体である。酵素連結型受容体は、ポリペプチドの膜貫通部分（またはドメイン）によって結合された２つのドメインを有する。２つの末端ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインおよび触媒機能を有する細胞内ドメインである。例えば、Ｅｒｂ受容体ファミリー、グリア細胞由来神経栄養因子受容体ファミリー、ナトリウム利尿ペプチド受容体ファミリー、ｔｒｋニューロトロフィン受容体ファミリー、およびｔｏｌｌ様受容体ファミリーを含む酵素連結型受容体の複数のファミリーがある。
【００９１】
[000115]リガンド開口型イオンチャネルとしても知られるイオンチャネル連結型受容体は、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋およびＣｌ−などのイオンが、受容体へのリガンドの結合に応答して膜を通過できるようにする受容体である。例えば、カチオン性ｃｙｓループ受容体、アニオン性ｃｙｓループ受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ受容体、ＮＭＤＡ受容体）、ＧＡＢＡ受容体、５−ＨＴ受容体、ＡＴＰ開口型チャネル、およびＰＩＰ２開口型チャネルを含む、リガンド開口型イオンチャネルの複数のファミリーがある。
真核細胞
[000116]様々な真核細胞が、本発明の真核細胞として使用され得る。真核細胞は、動物細胞であってもよい。真核細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ、またはイヌなどの哺乳動物細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、サル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトを含むがこれらに限定されない霊長類の細胞であってもよい。マウスは、他の哺乳動物、とりわけヒトのモデルとして日常的に機能していることから、哺乳動物細胞はマウス細胞であってもよい（例えば、Ｈａｎｎａ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９２０〜２３頁、２００７；Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０３（６）：Ｒ１５〜Ｒ２１頁、１９９９；Ｗａｒｒｅｎ、Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１７８９〜１７９７頁、１９９５を参照のこと；各刊行物は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる）。動物細胞には、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（例えば、腎臓、乳腺、前立腺、肺）、ケラチン生成細胞、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、および造血細胞が含まれる。動物細胞は、成体細胞（例えば、最終分化、分裂または非分裂）または胚細胞（例えば、胚盤胞細胞等）または幹細胞であってもよい。真核細胞はまた、動物または他の供給源に由来する細胞株でもあってもよい。
【００９２】
[000117]真核細胞は、幹細胞であってもよい。例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮神経堤幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、嗅覚成体幹細胞、精巣細胞、および前駆細胞（例えば、神経、血管芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、膵臓、上皮等）を含む、様々な幹細胞タイプが当技術分野で公知であり、真核細胞として使用され得る。幹細胞は、対象から採取された細胞に由来する幹細胞株であってもよい。
【００９３】
[000118]真核細胞は、ヒトを含む哺乳動物の循環系に見出される細胞であってもよい。例示的な循環系細胞には、とりわけ、赤血球、血小板、形質細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球等、およびこれらの前駆細胞が含まれる。グループとして、これらの細胞は、本発明の循環真核細胞と定義される。真核細胞は、これらの循環真核細胞のいずれかに由来してもよい。導入遺伝子は、これらの循環細胞または循環細胞に由来する真核細胞のいずれかを用いて使用されてもよい。真核細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、または上述の細胞の前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラー細胞の前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、Ｂ細胞、またはＢ細胞前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、好中球または好中球前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、巨核球または巨核球の前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、マクロファージまたはマクロファージの前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。
【００９４】
[000119]真核細胞は、植物細胞であってもよい。植物細胞は、アルファルファ、アーモンド、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ブラックベリー、アブラナ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、チェリー、チコリ、柑橘類、コーヒー、ワタ、キュウリ、ユーカリ、大麻、レタス、レンズマメ、トウモロコシ、マンゴー、メロン、カラスムギ、パパイヤ、エンドウマメ、ピーナッツ、パイナップル、プラム、ジャガイモ（サツマイモを含む）、カボチャ、ダイコン、ナタネ、ラズベリー、イネ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、ホウレンソウ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、タバコ、トマト、カブ、コムギ、ズッキーニ、および他の結実菜類（例えばトマト、コショウ、チリ、ナス、キュウリ、南瓜等）、他の鱗茎菜類（例えばニンニク、タマネギ、ニラネギ等）、他の仁果類（例えばリンゴ、ナシ等）、他の核果（例えばピーチ、ネクタリン、アプリコット、ナシ、プラム等）、シロイヌナズナ、木本植物、例えば針葉樹および落葉樹など、観賞植物、多年生牧草、飼料作物、花、他の野菜、他の果物、他の農業作物、ハーブ、草、または多年生植物部分（例えば、球根；塊茎；根；樹冠；茎；走根；ひこばえ；シュート；根無し挿し木、根付き挿し木、およびカルス挿し木またはカルス生成小植物を含む挿し木；頂端分裂組織）を含むがこれらに限定されない、単子葉または双子葉植物の細胞であってもよい。用語「植物」とは、種子、苗木、若木、根、塊茎、茎、柄、葉および果実を含む、植物の全ての物理的部分を指す。
【００９５】
[000120]真核細胞はまた、クロレラ属、クラミドモナス属、セネデスムス属、イソクリシス属、ドナリエラ属、テトラセルミス属、ナノクロロプシス属、またはプロトテカ属の藻類を含むがこれらに限定されない、藻類でもあってもよい。真核細胞は、サッカロミセス属、クロイベロミセス属、カンジダ属、ピキア属、デバリオマイセス属、ハンゼヌラ属、ヤロウイア属、ジゴサッカロミセス属、またはシゾサッカロミセス属の真菌を含むがこれらに限定されない、真菌細胞であってもよい。
【００９６】
[000121]真核細胞は、対象から得ることができる。対象は、任意の生命体であってもよい。細胞は、対象から得られた細胞に由来してもよい。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。当技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株も使用することができる。Ｔ細胞は、フィコール分離などの当業者に公知の任意の数の手法を使用して対象から収集された血液単位から得ることができる。個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス産物は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を典型的には含有する。アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿分画を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適当な緩衝液または培地に入れるために洗浄されてもよい。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄されてもよい。代わりの態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、およびマグネシウムを欠いてもよく、または全てではないとしても多くの二価カチオンを欠いてもよい。カルシウムの非存在下での最初の活性化ステップは、活性化の拡大をもたらすことができる。
【００９７】
[000122]負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせにより達成することができる。細胞は、細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択によって濃縮されてもよい。例えば、ＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を典型的には含む。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を典型的には発現する制御性Ｔ細胞を濃縮することが望ましい場合がある。あるいは、特定の態様において、制御性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇されてもよい。
【００９８】
[000123]Ｔ細胞は、例えば、その各々があらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されているような方法を使用して、一般に活性化および拡大することができる。
【００９９】
[000124]ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ−１５および４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）を発現するように遺伝的に修飾されている骨髄細胞株の存在下で拡大することができる。このようにして修飾された、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を持たない細胞株は、ＮＫ細胞溶解に対して高度に感受性であり、ＮＫ細胞を活性化する。例えば、Ｋ５６２骨髄細胞は、ヒトＣＤ８αおよびＧＦＰのシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインに融合されたヒトＩＬ−１５成熟ペプチドからなるキメラタンパク質構築物を形質導入することができる。形質導入された細胞は、次いで限界希釈によって単一細胞クローニングされ、ＧＦＰ発現および表面ＩＬ−１５が最も高いクローンが選択され得る。このクローンに、次いでヒトＣＤ１３７Ｌを形質導入し、Ｋ５６２−ｍｂ１５−１３７Ｌ細胞株を作出することができる。ＮＫ細胞を優先的に拡大するために、ＮＫ細胞を含有する末梢血単核細胞培養物が、１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２の存在下、ＮＫ細胞の集団を活性化および濃縮するのに十分な期間、Ｋ５６２−ｍｂ１５−１３７Ｌ細胞株と培養される。この期間は、２〜２０日、好ましくは約５日に及び得る。拡大されたＮＫ細胞に、次いで抗ＣＤ１９−ＢＢ−ζキメラ受容体を形質導入することができる。
核酸
[000125]また、本明細書に記載された個々のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびＲＮＡ制御デバイスを少なくとも部分的にコードする核酸も本開示に記載される。核酸は、天然、合成またはその組み合わせであってもよい。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。
【０１００】
[000126]本発明の核酸にはまた、プラスミド、またはウイルスベクター、または直鎖状ベクター、または染色体ＤＮＡに組み込まれるベクターなどの発現ベクターも含まれる。発現ベクターは、１つまたは複数の選択された宿主細胞でベクターが複製できるようにする核酸配列を含有することができる。そのような配列は、様々な細胞に関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適している。真核生物宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞では、発現ベクターは宿主細胞染色体に組み込まれ、次いで宿主染色体を用いて複製することができる。同様に、ベクターは、原核細胞の染色体に組み込むことができる。
【０１０１】
[000127]発現ベクターは、一般に、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子も含有する。本発明の宿主細胞を含む原核および真核細胞のための選択可能なマーカーは、当技術分野で周知である。一般に、選択遺伝子は、選択培地で増殖される形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されない宿主細胞は、培地で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。例示的な選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用し得る。異種遺伝子で成功裏に形質転換されるそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、故に選択レジメンを生き延びるであろう。細菌または真核生物（哺乳動物を含む）系において使用するための他の選択可能なマーカーは、当技術分野で周知である。
【０１０２】
[000128]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ  ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲ導入遺伝子を哺乳動物Ｔ細胞で発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然のＥＦ１ａプロモーターは、リボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの酵素送達に関与する、伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのＣＡＲ発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １７（８）：１４５３〜１４６４頁（２００９）を参照のこと。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる、該配列に作動可能に連結された強力な恒常性プロモーター配列である。限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを含む修飾ＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｌｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８９巻、５６〜６４頁（２０１０）を参照のこと）、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに限定されるものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含む他の恒常性プロモーター配列も使用することができる。さらに、本発明は、恒常性プロモーターの使用に限定されない。
【０１０３】
[000129]誘導性または抑制性プロモーターも、本開示における使用に企図される。誘導性プロモーターの例には、活性化Ｔ細胞の核因子誘導性プロモーター（ＮＦＡＴ）、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、テトラサイクリンプロモーター、ｃ−ｆｏｓプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターからの発現をテトラサイクリンオペレーターの制御下に置くＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＴ−ＲＥｘ系、およびＩｎｔｒｅｘｏｎのＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。Ｍａｃｉａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：２４７６〜２４８９頁（２００１）；Ｋａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｉｑｕｅｓ  ３９：１９１〜１９６頁（２００５）；Ｄａｉ，Ｘら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ  ４２：２３６〜２４５頁（２００５）；Ｐａｌｌｉ，Ｓ．  Ｒ．ら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０：１３０８〜１５１５頁（２００３）；Ｄｈａｄｉａｌｌａ，Ｔ．  Ｓ．ら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  ４３：５４５〜５６９頁（１９９８）；Ｋｕｍａｒ，Ｍ．  Ｂら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：２７２１１〜２７２１８頁（２００４）；Ｖｅｒｈａｅｇｅｎｔ，Ｍ．ら、Ａｎｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７４：４３７８〜４３８５頁（２００２）；Ｋａｔａｌａｍ，Ａ．  Ｋ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：Ｓ１０３頁（２００６）；およびＫａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：Ｓ１９４頁（２００６）、米国特許第８，８９５，３０６号、第８，８２２，７５４号、第８，７４８，１２５号、第８，５３６，３５４号、これらの全ては、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【０１０４】
[000130]発現ベクターは、典型的には、転写開始の頻度を制御するプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーを有する。典型的には、これらは、開始部位の領域３０〜１１０  ｂｐ上流に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも同様に機能性エレメントを含有することが示されている。エレメントが互いに対して反転または移動される場合にプロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメント間のスペーシングはしばしば柔軟である。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減退しはじめる前に、プロモーターエレメント間のスペーシングは５０ｂｐ離れるまで増加され得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協同してまたは独立に機能して転写を活性化することができるようである。
【０１０５】
[000131]発現ベクターは、二シストロン性構築物または多シストロン性構築物であってもよい。２つのシストロンは反対の方向に配向されてもよく、シストロンの制御領域は２つのシストロンの間に位置する。構築物が２つを超えるシストロンを有する場合、シストロンは２つのグループに配置されてもよく、２つのグループは転写に関して反対の方向に配向される。例示的な二シストロン性構築物は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ａｍｅｎｄｏｌａら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１０８〜１１６頁（２００５）に記載されている。一方のシストロンに対する制御領域は高い転写活性能力があってもよく、他方は使用条件下で低い転写活性を有してもよい。一方または両方の制御領域は誘導性であってもよい。高い転写活性制御領域の例には、例えば、場合によりＣＭＶ初期エンハンサーを含む、ＭＮＤ、ＥＦ１−アルファ、ＰＧＫ１、ＣＭＶ、ユビキチンＣ、ＳＶ４０初期プロモーター、テトラサイクリン応答性エレメントプロモーター、細胞特異的プロモーター、ヒトベータアクチンプロモーター、およびＣＢＧ（ニワトリベータ−グロビン）が含まれる。低い転写活性制御領域の例には、例えば、ＴＲＥ３Ｇ（基底発現を低下させる変異を有するテトラサイクリン応答性エレメントプロモーター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって商業的に販売されている）、Ｔ−ＲＥｘ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって商業的に販売されている）、および最小ＴＡＴＡプロモーター（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｋｉｒａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １４２：３６４〜３７６頁（２００６））、ＨＳＰ６８、および最小ＣＭＶプロモーターが含まれる。誘導性制御領域の例には、例えば、ＮＦＡＴ制御領域（Ｍａｃｉａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：２４７６〜２４８９頁（２００１））、および上記に記載された誘導性制御領域が含まれる。
【０１０６】
[000132]二シストロン性構築物は、ＣＡＲおよび、標的部位に送達されるべきペイロードである（またはペイロードを作る）ポリペプチドをコードすることができる。例示的なペイロードは、上記および以下に記載される。ＣＡＲをコードする核酸は、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または誘導性プロモーターに作動可能に連結されてもよく、場合により、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、または前述のものの組み合わせに作動可能に連結されてもよい。ＣＡＲは、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ形式で核酸によってコードされてもよい。ポリペプチドをコードする核酸は、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または誘導性プロモーターに作動可能に連結されてもよい。ペイロードである（またはペイロードを作る）ポリペプチドをコードする核酸は、ＲＤＥの制御下にあってもよい。ＲＤＥは、例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、エノラーゼ（ＥＮＯ１またはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）、またはホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１）などの例えば解糖系酵素を通じて、細胞の活性化状態に応答するものであってもよい。ＲＤＥはまた、例えば、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ２）、スクシニルＣｏＡシンテターゼ（ＳＵＧＬＧ１）、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１／２）などの他のエネルギー代謝酵素によって結合および制御することもできる。宿主細胞は、対象における標的部位でその抗原に結合するＣＡＲを発現してもよい。標的部位での抗原のこの結合は細胞を活性化し、細胞に解糖を増加させ、（解糖系酵素または他のエネルギー代謝酵素によって結合された）ＲＤＥの制御下で、ポリペプチドをコードする核酸の発現を誘導する。
【０１０７】
[000133]多シストロン性構築物は、各々が制御領域（場合により誘導性）、および導入遺伝子のいくつかまたは全てに作動可能に連結されたＲＤＥを有する、３つ以上のシストロンを有することができる。これらのカセットは、構築物において反対の方向に転写される２つのグループで構成されてもよい。２つ以上の導入遺伝子が同じ制御領域から転写されてもよく、２つ以上の導入遺伝子が、下流の導入遺伝子に作動可能に連結されたＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列を有してもよい。あるいは、２つ以上の導入遺伝子が、ｂｌｏｇ．  ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｌａｓｍｉｄｓ−１０１−ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｎｉｃ−ｖｅｃｔｏｒｓに見出されるＰｌａｓｍｉｄｓ  １０１：  Ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒｓに記載されている２Ａエレメントによって作動可能に一緒に連結される。一般的に使用される２Ａ配列には、例えば、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）（配列番号１７）、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｐ２Ａ）（配列番号１８）；ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（Ｅ２Ａ）（配列番号１９）；およびＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（Ｆ２Ａ）（配列番号２０）が含まれ、これらの全てが場合により配列ＧＳＧをアミノ末端に含み得る。これにより、複数の導入遺伝子が、ＲＤＥ（または複数のＲＤＥ）を含む３’−ＵＴＲによって制御される単一の転写物に転写できるようになる。
【０１０８】
[000134]二シストロン性／多シストロン性ベクターは、２つ以上のシストロンの全体の発現を増加させることができる（別個の構築物にシストロンを導入することに比べて）。二シストロン性／多シストロン性構築物は、レンチウイルスベクターに由来してもよい。二シストロン性／多シストロン性構築物は、ＣＡＲおよび、導入遺伝子にコードされるポリペプチド（例えば、ペイロード）をコードすることができ、細胞がＣＡＲによって活性化されると、二シストロン性構築物は、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を増加することができる。
【０１０９】
[000135]本明細書に記載されたポリペプチドを修飾することが望ましい場合がある。当業者は、所与の核酸構築物において変更を生じさせてバリアントポリペプチドを生成する多くの方法を認識するであろう。そのような周知の方法には、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅、核酸を含有する細胞の変異誘発剤または放射線への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、大きな核酸を生成するためのライゲーションおよび／またはクローニングと併用した）、および他の周知の手法（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、ＧｉｌｌａｍおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  ８：８１〜９７頁、１９７９；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１〜７３４頁、１９８７を参照のこと）が含まれる。本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸は、選択された生物での核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを提供するように修飾されてもよい。
【０１１０】
[000136]ポリヌクレオチドには、本明細書に記載された他のポリヌクレオチドと実質的に同等のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含まれ得る。ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有してもよい。核酸は、本明細書に列挙されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの相補体も提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）またはＲＮＡであってもよい。そのようなポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは当業者に周知であり、例えば、所望の配列同一性のポリヌクレオチドを日常的に単離することができるハイブリダイゼーション条件を決定する方法が含まれ得る。
【０１１１】
[000137]タンパク質類似体またはバリアント（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸が、野生型ポリペプチドとは異なるように設計された）をコードする核酸は、部位特異的変異誘発、またはプライマーが所望の点変異を有するＰＣＲ増幅を使用して産生することができる。適切な変異誘発法の詳細な説明については、その各々があらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ（１９９４）を参照のこと。Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ  Ｅｄ．  ２８：７１６〜３４頁、１９８９（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる）によって記載されたものなど、当技術分野で周知の方法を使用する化学合成も、そのような核酸を調製するのに使用することができる。
【０１１２】
[000138]バリアントを作出するためのアミノ酸「置換」は、好ましくは、１個のアミノ酸を類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果である。アミノ酸置換は、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または関与する残基の両親媒の類似性に基づき行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；および負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【０１１３】
[000139]また、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲをコードする核酸も本明細書に開示される。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲをコードする核酸は、従来の方法によってＲＮＡ制御デバイスの配列と組み合わされた指定されたＣＡＲのアミノ酸配列から容易に調製することができる。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、各エレメントのアミノ酸配列に関する上述のＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号から入手でき、本発明の核酸は、標準的な分子生物学および／または化学的手順を使用して調製することができる。例えば、塩基配列に基づき、核酸が合成されてもよく、本発明の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してｃＤＮＡライブラリーから得られるＤＮＡ断片を組み合わせて調製されてもよい。
【０１１４】
[000140]核酸は、適切なプロモーターの制御下で発現されるように、別の核酸に連結されてもよい。核酸はまた、核酸の効率的な転写を達成するために、プロモーターまたは転写開始部位と協同する他の制御エレメント、例えば、エンハンサー配列、ポリＡ部位、またはターミネーター配列を含む核酸に連結されてもよい。本発明の核酸に加えて、核酸の発現を確認するためのマーカーであり得る遺伝子（例えば、薬物耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）が組み込まれてもよい。
【０１１５】
[000141]核酸がエクスビボで細胞に導入される場合、の核酸は、上述の賦形剤に加えて、細胞への核酸の移動を促進する物質、例えば、リポソームまたはカチオン性脂質などの核酸を導入するための試薬と組み合わされてもよい。あるいは、本発明の核酸を担持するベクターも有用である。特に、適切なベクターによって担持された本発明の核酸を含有する、生命体への投与に適した形態での組成物は、インビボ遺伝子療法に適している。
真核細胞への核酸の導入
[000142]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／またはＲＤＥに作動可能に連結された導入遺伝子を発現する細胞を産生するプロセスは、本明細書に記載されたＳｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥをコードする核酸を真核細胞に導入するステップを含む。このステップは、エクスビボで実施することができる。核酸を真核細胞に導入するための例示的な方法は、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
ウイルスペイロード
[000143]ウイルスは、導入遺伝子を標的細胞に送達するのに使用することができる。ウイルスは、核酸構築物（例えば、トランスファープラスミド）をペイロードとして担持することができ、そのため、標的細胞遺伝子型および／または表現型を修飾する（一過性または安定に）ための所望の核酸を標的細胞に送達することができる。これらの形質導入用途の多くにおいて、ウイルスによって担持される核酸はウイルスゲノムの全てを含むわけではなく、ウイルスゲノムの残りのほとんどまたは全てを含むことなく、核酸構築物をウイルスにパッケージングするのに必要なウイルスゲノムシグナルを含む場合が多い。例えば、標的細胞の形質導入のためレンチウイルスヘルパープラスミドおよびトランスファープラスミド系は、ａｄｄｇｅｎｅから入手可能である。他のヘルパーおよびトランスファープラスミド系は、いくつかの供給源（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ）から市販されている。
【０１１６】
[000144]ペイロードとして使用される場合、ウイルスカプシドの合成、ペイロード核酸のパッケージング、およびペイロード核酸を含むウイルスの放出は、複製のためのウイルス遺伝子およびコートタンパク質の発現のタイミングを、標的部位での受容体によるリガンドの結合に合わせることによって標的部位に限定することができる。そのような制御は、細胞が代謝状態の変化（例えば、標的への受容体結合後の解糖の活性化）を受けると発現を誘導するＲＤＥを使用して達成することができる。このＲＤＥ制御は、ウイルス遺伝子発現のマスタースイッチ因子の発現を制御することができる。例えば、転写制御因子が適切なＲＤＥの制御下に置かれてもよく、複製のためのウイルス遺伝子、コートタンパク質等がこの転写因子の制御下に置かれてもよい。宿主細胞が、標的部位で適当な受容体（例えば、ＣＡＲ）を通じてリガンドに結合すると、これは細胞を活性化し、適当なＲＤＥによる転写因子の発現を誘導し、ウイルス複製タンパク質、コートタンパク質等の発現をもたらす。
【０１１７】
[000145]ヘルパー構築物では、ウイルス遺伝子は様々な転写因子の制御下に置かれ得る。そのような転写因子には、例えば、単純ヘルペス由来のＩＣＰ４、ＶＰ１６もしくはＶＰ６４、またはエボラ由来のＶＰ３０またはアデノ随伴ウイルス由来のＴＦＥＢが含まれ得る。転写因子は、例えば、アデノウイルスのＥ１Ａタンパク質、またはエプスタイン・バーウイルスのＰａｘ５、またはインフルエンザ由来のＮＳ１、Ｃ型肝炎由来のＮＳ５Ａなどのウイルスマスタースイッチであってもよい。あるいは、複製タンパク質およびコートタンパク質が、細胞のエネルギー状態の変化（例えば、リガンドの受容体結合後の解糖の活性化）時に発現をもたらすＲＤＥの制御下にあるように、ウイルスのＣａｐおよびＲｅｐ機能が、適当なＲＤＥの制御下に置かれてもよい。
【０１１８】
[000146]同様に、ウイルスペイロード構築物は、ウイルスＲｅｐ、Ｃａｐ遺伝子および他のウイルス遺伝子を含んでもよい。これらの例では、ＲＤＥは、ウイルスのマスタースイッチ転写因子（ヘルパー構築物と似た）の発現を制御するのに使用され得る。これは、所望の核酸を含むウイルスの合成を、標的部位での宿主細胞受容体によるリガンドの結合に結び付けることができる。ウイルスマスタースイッチ転写因子の例には、アデノウイルス由来のＥ４Ｆまたはエプスタイン・バーウイルス由来のＢＺＬＦ１が含まれる。
【０１１９】
[000147]ウイルスはまた、腫瘍溶解性ウイルス療法（「ＯＶＴ」）を通じた多くのタイプのがんに対する非常に有望な治療プラットフォームとしても浮上している（Ｈｏｗｅｌｌｓら、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂａｔｔｌｅ  ｔｏ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｆｒｏｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ．、（２０１７）；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１７．００１９５）。これらの適用において、ウイルスは、宿主、特に標的内で効果的に複製し、標的細胞を溶解し、頑強な長期にわたる標的細胞特異的免疫を誘導することができる。腫瘍溶解性ウイルス（「ＯＶ」）には、天然に腫瘍選択的であるか、または腫瘍細胞を特異的に標的化し、排除するように修飾され得るウイルスが含まれる。さらに、これらのＯＶは、様々な方法によって選択的に修飾することができ、これには、例えば、ＯＶの有効性および安全性プロファイルの改善を目的として、特定の遺伝子の挿入（ＩＬ−１２のような免疫刺激因子またはキルスイッチを含み得る）および欠失（チミジンキナーゼ（「ＴＫ」）を含み得る）が含まれる。
【０１２０】
[000148]天然に存在する腫瘍溶解特性を保持するＯＶ、または特定の腫瘍細胞を特異的に溶解するように改変されているＯＶが利用され得る。例えば、腫瘍細胞および健康でない細胞で上方制御される経路を利用し、ならびに感染の成功のためにそのような経路に依存するウイルスを改変し、それによってウイルスを健康な組織に感染できなくすることによって、ＯＶの特異性を改善するために、様々な方法が使用され得る。ＯＶＴの大きな利点は、ウイルス感染は腫瘍細胞を直接溶解し得るが、結果として生じる免疫応答は、ウイルス抗原だけでなく腫瘍細胞抗原に対しても生成されるという事実にある。さらに、ウイルスの有効性を最大にし、生成される抗腫瘍応答を改善するために、このようにしてＯＶに組み込むことができる多数の抗がん遺伝子がある。
【０１２１】
[000149]異なるウイルスが細胞を感染させることができる様々な方法がある。ワクシニアウイルス（「ＶＶ」）またはニューカッスル病ウイルス（「ＮＤＶ」）のようないくつかのウイルスは、付着のための特異的受容体を欠き、エンドサイトーシス（細胞の活性代謝、例えば、がん細胞に有利に働く）を介して細胞に侵入する。他のウイルスは、宿主細胞に侵入するのに使用する特異的受容体を有する；例えば、アデノウイルスは、ＣＡＲ（Ｂ群コクサッキーウイルスによる感染も媒介する４６ｋＤタンパク質）、および特定のＲＧＤ結合インテグリン、または表面抗原分類４６（ＣＤ４６）を結合することができる。麻疹もＣＤ４６を侵入に使用することができ、一方、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ネクチンまたはヘルペスウイルス侵入メディエーターを使用する（Ｄｏｒｉｇら、Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４６  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｓ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ  ｓｔｒａｉｎ）、Ｃｅｌｌ、７５（２）：２９５〜３０５頁（１９９３）；Ｂａｄｒｉｎａｔｈら、Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、１１  ：４８３５〜４８４７頁（２０１６））。
【０１２２】
[000150]ウイルスを標的細胞に対して標的化させ得る様々な方法がある。これらの方法には、例えば、改変ウイルスが、異常なレベルの特定の遺伝子を有する細胞において増殖性感染のみできることを確保するための、標的細胞で異常に発現される特定の経路の利用が含まれる。ウイルスコートタンパク質は、ウイルス感染が、特定の受容体、例えば、標的細胞で主に見出される受容体を含む細胞でのみ生じることを確保するように操作することもできる。例えば、コート／エンベロープタンパク質が、ウイルス用の抗体提示技術（例えば、ファージディスプレイに似た）を使用して、所望の標的細胞結合抗原に特異的な一本鎖抗体を含むように改変されてもよい。あるいは、他のリガンドが、標的結合受容体と相互作用するコート／エンベロープタンパク質と融合されてもよい。
【０１２３】
[000151]ウイルスコートタンパク質、すなわち、カプシドは、ウイルス感染を標的細胞に明確に向けるように修飾することができる。これを達成するための様々な方法、例えば、ウイルス受容体を「被覆する」ポリマーでウイルス表面を覆うこと、および標的細胞と結合するウイルスへの分子、例えば、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）の添加（例えば、いくつかの腫瘍細胞はＥＧＦ受容体（「ＥＧＦＲ」）発現が上方制御される）がある（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｃｌｏａｋｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１６（２）：２４４〜２５１頁（２００８））。この特定のアプローチは、既存のウイルス受容体によって付与される幅広い指向性を低下させるだけでなく、これを標的細胞特異的受容体と置き換えて、ウイルス感染を標的細胞に向け、健康な組織を無傷のままにする。
【０１２４】
[000152]標的化ウイルスの追加のアプローチは、標的細胞に対してウイルスを標的化する抗体を使用する。この戦略の例として、Ｗａｔｋｉｎｓらは、抗体とウイルスコートタンパク質の間の融合がＥＧＦＲを標的化し得ることを示した。これは、上方制御されたＥＧＦＲを発現する細胞へのウイルスの標的化を容易にする（Ｗａｔｋｉｎｓら、Ｔｈｅ  ‘ａｄｅｎｏｂｏｄｙ’  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、４（１０）：１００４〜１０１２頁（１９９７））。この抗体重視アプローチは、ウイルスカプシドタンパク質に組み込まれたｓｃＦｖなどの抗体断片も使用することができる（抗体のファージディスプレイに似た）。例えば、ＨＳＶ１型（「ＨＳＶ−１」）は、細胞への侵入のために様々な糖タンパク質に依存しており、これらの糖タンパク質の１つ（「ｇＤ」）は、ウイルス侵入受容体との相互作用に関与している。ｓｃＦｖ標的化ＥＧＦＲは、この糖タンパク質に融合することができ、ウイルスは次いで、標的細胞に対する選択性を改善する侵入受容体としてＥＧＦＲを使用することができる（Ｃｏｎｎｅｒら、Ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ＨＳＶ１７１６：  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｓ  ａ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１５（２４）：１５７９〜１５９２頁（２００８））。一般に、コートタンパク質と融合またはさもなければ会合された抗体は、任意の標的細胞結合抗原に対して標的化することができる。例えば、抗ＣＤ１９および／または抗ＣＤ２０抗体は、ウイルスペイロードをＢ細胞（健康なまたは病変）に対して標的化することができ、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１１７および／または抗ＣＤ１３３抗体は、骨髄腫幹細胞を含むがん幹細胞に対してウイルスペイロードを標的化することができる。
【０１２５】
[000153]上記に列挙したように、健康な細胞と比較した標的細胞での特定の表面マーカーの差次的発現は、標的細胞選択的ウイルスを産生するのに利用することができる。例えば、遺伝子が欠失されて、ＭＥＫを過剰発現する特定の腫瘍タイプのみを成功裏に感染させることができるウイルスをもたらすことができる（Ｖｅｅｒａｐｏｎｇら、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ（ｇａｍｍａ１）３４．５−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−１  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｓ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｉｇｈ  ＭＥＫ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６７（１７）：８３０１〜８３０６頁（２００７））。このアプローチはＨＳＶで使用することもでき、これにより、遺伝子が欠失されて、健康な細胞とは異なり、恒常的に活性化されたＲａｓ経路を有する傾向がある腫瘍細胞で優先的に複製するウイルスを産生することができる（Ｆｕら、Ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ  ２  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＣＰ１０  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１３（５）：８８２〜９０頁（２００６））。このウイルスは、感染細胞およびバイスタンダー細胞でアポトーシスを惹起し、腫瘍細胞を優先的に感染させることから、この欠失による腫瘍溶解剤として使用することができる（Ｆｕら、Ａｎ  ＨＳＶ−２−ｂａｓｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＫ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＣＰ１０  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１４（１６）：１２１８〜１２２５頁（２００７））。さらに、抗体は、表面マーカーを発現する（またはより多量の表面マーカーを発現する）細胞にウイルスを向けるように、コートタンパク質（例えば、ウイルスカプシドタンパク質）に改変され得る他の分子である。
【０１２６】
[000154]ウイルスは、標的細胞に対してウイルスを標的化し、健康な細胞における感染力を阻害するように、特定の遺伝子欠失により修飾されてもよい。この戦略の例は、ＶＶ由来のチミジンキナーゼ（「ＴＫ」）欠失である。野生型ウイルスは、このキナーゼを典型的にはコードするため、健康な細胞で複製することができるが、遺伝子が欠失されると、ウイルスは、もはや健康な細胞で効率的に複製することができない。腫瘍細胞は、たとえ遺伝子が欠失されてもより高レベルのＴＫを産生するため、ウイルスは依然としてこれらの細胞で複製することができる（ＭｃＣａｒｔら、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６１（２４）：８７５１〜８７５７（２００１）；Ｈｕｇｈｅｓら、Ｌｉｓｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｔｒａｃｔａｂｌｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ    ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２２（６）：４７６〜４８４頁（２０１５））。
【０１２７】
[000155]別のアプローチでは、標的細胞において所望の効果をもたらすように、ウイルスゲノム中の遺伝子を欠失させることができる。欠失遺伝子は、ウイルスによって送達されるウイルス構築物中に存在してもよく、または標的細胞中に存在してもよい。標的細胞を溶解する（またはさもなければ標的細胞を死滅させる）ことはできるが、他の細胞の感染のための新たなウイルス粒子をウイルスが作出しないように、例えば、ウイルスゲノムが改変されてコートタンパク質または他の因子の遺伝子を欠失させてもよい。標的細胞欠失において、ウイルスによって送達される構築物は、標的細胞のゲノムに欠失を引き起こす核酸を含む。そのようなアプローチは、例えば、アポトーシス抑制遺伝子を欠失させるのに使用することができる。
【０１２８】
[000156]遺伝子欠失戦略は、宿主免疫系からの干渉なしで標的細胞にウイルスを送達するように設計されるウイルス送達系の効率を改善するのに使用することもできる。ウイルスは、免疫攻撃からのシェルターを提供し、ウイルスが標的細胞に達する前の（中和抗体による）ウイルスのクリアランスの問題を打ち破る宿主細胞（例えば、間葉系幹細胞）内に送達されてもよい。この方法は、ウイルスをＭＳＣでより感染性に、および腫瘍細胞の死滅により効率的にするようにウイルスを修飾することによって、Ａｄで改善されている。
【０１２９】
[000157]導入遺伝子が標的細胞で優先的に発現されるようにウイルスによって担持される導入遺伝子の発現を制御する、非標的細胞と比べて標的細胞でより高度に活性化されるプロモーターが使用されてもよい（Ｚｈａｎｇら、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｍａｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＡＦＰ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｅ１Ａ  ａｎｄ  ａｎ  Ｅ１Ｂ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｒｉｖｅ  ＩＬ−２４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９（９）：６１９〜６２９頁（２０１２）；Ｃｈｅｎｇら、Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）、９３（２）：２１１〜２２３頁（２０１５））。
【０１３０】
[000158]ＯＶおよび他のウイルスは、対象がウイルス療法に曝露された後で免疫反応およびウイルスのクリアランスを増強するマーカー（例えば、コートタンパク質融合）を担持するように改変することもできる。マーカーは、ウイルス粒子、感染細胞、またはその両方において利用可能であってもよい。そのようなマーカーは、対象の免疫系を動員して、ウイルスによる一定期間の治療後にウイルスおよび／または感染細胞を取り除くことができる。ＯＶは、ＯＶペイロードで治療された対象におけるウイルス感染を止めるために活性化され得るキルスイッチを有するように改変することもできる。例えば、ＯＶは、所望のシグナルによってオフにすることができる誘導性プロモーターの制御下に特定の機能（例えば、ウイルスコートタンパク質）を置くように改変され得る。さらに、またはこれとは別に、ＯＶは、免疫系に細胞（例えば、宿主と不適合性である異種ＭＨＡ）を破壊するよう指示する感染細胞の表面のタンパク質を提示する誘導性制御下で、異種タンパク質をコードするように改変され得る。あるいは、ＯＶは、感染細胞が新たなウイルスを産生するのを止めるよう、コートタンパク質発現をオフにするように改変されてもよい。
【０１３１】
[000159]多くの異なるウイルスまたはウイルスヘルパー系が、ウイルスペイロードを作るのに使用され得る。ウイルスペイロードは、ウイルス全体、改変ウイルス、または導入遺伝子、所望の制御エレメント、およびウイルスパッキング配列を含む構築物であってもよい。使用され得るウイルス（または基づき得るウイルスヘルパー系）には、ＡＡＶ、ＶＶ、アデノウイルス、ＨＳＶ、ＮＤＶ、レンチウイルス、レトロウイルス、ＭＶ、レオウイルス等が含まれ得る。
【０１３２】
[000160]複数のＡＡＶ血清型は他のベクターに勝る重要な利点を有するため、遺伝子送達の有望な手段として同定されている。具体的には、これらはヒトにおいて病原性を示さず、有意に長い導入遺伝子発現ももたらし得る（Ｂｅｒｎｓら、Ｔｈｅ  Ｃｒｙｐｔｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｔｙｌｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、（１７）：２３７〜２４５頁（１９９５）；Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉら、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＡＶ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  １−９  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｏｐｉｓｍ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｆｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａ．、１６（６）：１０７３〜１０８０頁（２００８）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００８．７６．）。
【０１３３】
[000161]  ＶＶは、Ｉ型インターフェロンに対するその感受性のために、腫瘍細胞に対する天然の指向性を有する天然腫瘍溶解性ウイルスである（Ｗａｎｇら、Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｒｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｓ  ｔｈｅ  ｍｙｘｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂａｒｒｉｅｒ、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５（１２）：１２６６〜１２７４頁（２００４））。ＶＶは、ポックスウイルス科ファミリーの二本鎖ＤＮＡウイルスである。多くの異なるウイルス株があり、これらには、例えば、Ｌｉｓｔｅｒ株、Ｗｙｅｔｈ株およびウェスタンリザーブ株がある。ＶＶは、極めて短いライフサイクル（およそ８時間）および低酸素条件で複製する能力（Ｈｉｌｅｙら、Ｌｉｓｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ，  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１７（２）：２８１〜２８７頁（２０１０））を含む多くの理由のために、極めて有望な細胞死滅剤である（Ａｌ  Ｙａｇｈｃｈｉら、Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ，  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、７（１２）：１２４９〜１２５８頁（２０１５））。さらに、ＶＶは、特異的受容体を持たず、細胞膜とのウイルス融合が侵入を容易にし（Ｃｈｕｎｇら、Ａ２７Ｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、７２（２）：１５７７〜１５８５頁（１９９８））、これがＶＶを全ての標的細胞タイプの治療に対する潜在的候補にしている。さらに、ＶＶは、ｍＲＮＡ転写を宿主細胞に依存せず、そのライフサイクル全体が細胞質で生じ、ゲノム組み込みのリスクを排除する（Ｂｒｏｙｌｅｓ  ＳＳ、Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、８４（パート９）：２２９３〜２３０３頁（２００３））。ＶＶの抗腫瘍有効性を改善することができる修飾には、例えば、抗腫瘍免疫を低下させることなく抗ウイルス免疫を弱める（ウイルス感染を長引かせる）ことにより、ＶＶの腫瘍溶解活性を改善するＩＬ−１０の添加が含まれる（Ｃｈａｒｄら、Ａ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ａｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２１（２）：４０５〜４１６頁（２０１５））。
【０１３４】
[000162]Ａｄは、２００５年に中国で国家食品薬品監督管理局による規制上の承認を受けた（Ｇａｒｂｅｒ  Ｋ．、Ｃｈｉｎａ  ａｐｐｒｏｖｅｓ  ｗｏｒｌｄ’ｓ  ｆｉｒｓｔ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、９８（５）：２９８〜３００頁（２００６））。Ａｄは、アデノウイルス科ファミリーの非エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスである。Ａｄの複数の株が存在し、これには例えば、Ａｄ５が含まれる。Ａｄ５は広く研究されており、有効性を改善することが示されている多数の様々な修飾が当技術分野には存在する。例えば、腫瘍増殖を抑制するｐ５３添加と、アポトーシス経路を誘導するＧＭ−ＣＳＦ添加との組み合わせは、肝細胞がん幹細胞と戦う上で有効な相乗効果を誘発する（Ｌｖら、１１Ｒ−Ｐ５３  ａｎｄ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８（２）：１９９〜２０６頁（２０１７））。
【０１３５】
[000163]Ａｄは、ダイサー（ウイルス関連ＲＮＡのプロセシングにおいて役割があるエンドリボヌクレアーゼ）を下方制御する機能を果たすショートヘアピンＲＮＡの組み込みによって改善され得る。このタンパク質の下方制御はウイルスＲＮＡの破壊を阻害し、Ａｄを効率的に複製させ、それ故にこのＯＶの有効性を改善できるようにする（Ｍａｃｈｉｔａｎｉら、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｉｃｅｒ、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、１６（１）：２５１〜９頁（２０１７））。
【０１３６】
[000164]遺伝子サイレンシング法も、標的細胞での遺伝子発現を下方制御するのに使用することができる。例えば、ＥｐｈＡ３発現は、ウイルスから発現されるこの遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡによって下方制御され得る。このアプローチは、標的細胞での他の所望の遺伝子の発現を下方制御するのに使用することができる。
【０１３７】
[000165]細胞傷害性Ｔ細胞がウイルス感染標的細胞を死滅させることから、腫瘍溶解性ウイルス感染に対するＴ細胞免疫応答は標的細胞の死滅に有効となり得る（例えば、Ｌｉら、Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎ  Ｓｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｍｏｄｅｌ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２３（１）：２３９〜２４９頁（２０１７））。
【０１３８】
[000166]さらに、本明細書に記載されたウイルスペイロードは、例えば、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導ポリペプチド等を含む、本明細書に記載された導入遺伝子によってコードされる他のペイロードのいずれかを含んでもよい。
【０１３９】
[000167]本発明はさらに、２つ以上の抗原性の異なるウイルスが使用される治療アプローチを提供する。１つの方法は、例えば、アデノウイルス療法の初回投与後にＶＶを使用して達成される。このアプローチでは、有効性の向上がＴ細胞活性に依存したことが観察されている（Ｔｙｓｏｍｅら、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｔｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１８（２４）：６６７９〜６６８９頁（２０１２））。別の例には、腫瘍溶解性Ａｄおよびニューカッスル病ウイルス（「ＮＤＶ」）の連続送達が含まれる。単独で投与される場合、各ウイルスは腫瘍に対して限られた有効性を示すにしても、これらはいずれも、有意な抗腫瘍応答をもたらす免疫刺激性サイトカインを発現するように改変される（Ｎｉｓｔａｌ−Ｖｉｌｌａｎら、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ  ｉｎ  ａ  Ｓｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ、１４：２１０頁（２０１５））。
【０１４０】
[000168]ウイルスの腫瘍溶解能力は、腫瘍溶解療法をオートファジー経路の誘導と組み合わせることによって増加され得る。オートファジー経路はウイルス抗原提示に関与しており、それ故にその上方制御は細胞表面でのウイルス送達腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）の提示を増加させて、単独での抗原送達より強力な抗腫瘍免疫応答を誘導することができる（Ｋｌｅｉｎら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１１（４）：ｅ０１５３８１４（２０１６））。
【０１４１】
[000169]腫瘍塊におけるウイルス拡散に対する潜在的障害は、間質マトリックス（細胞外ＤＮＡを含む）である。ウイルスは、細胞外ＤＮＡを分解するＤＮａｓｅ  Ｉの発現と一緒に間質マトリックスを分解し、それ故に標的細胞塊全体にわたるウイルスのより効率的な拡散を可能にするタンパク質をコードするように修飾されてもよい（Ｔｅｄｃａｓｔｌｅら、Ａｃｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｔｓ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｓｐｒｅａｄ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２４（４）：７９６〜８０４頁（２０１６））。
【０１４２】
[000170]ウイルスは、１つを超える方法を使用して薬物の担体として利用することもできる。例えば、ウイルスカプシドと薬物分子自体の間の静電引力が、腫瘍溶解性アデノウイルス療法と次いで相乗的に作用することになる抗がん薬物を送達するための効率的な方法であったことが最近報告されている（Ｇａｒｏｆａｌｏら、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌｏａｄｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｌ−ｃａｒｎｏｓｉｎｅ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、１５（４）：６５１〜６０頁（２０１６））。
【０１４３】
[000171]ヘルペスウイルス科ファミリーに属する二本鎖ＤＮＡウイルス、単純ヘルペスウイルス１型も使用することができる。ＨＳＶ−１は、ＴＫ遺伝子変異が改変された最初のウイルスであった。１９９１年、Ｍａｒｔｕｚａらは、ヒトグリア芽腫細胞が、ＴＫ領域に変異を担持するＨＳＶ−１によって破壊され得、これが細胞培養およびヌードマウスで観察されたことを示した（Ｍａｒｔｕｚａら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２（５００７）：８５４〜８５６頁（１９９１））。以来、ＨＳＶを腫瘍細胞に対してより活性に、正常な細胞にとってより安全にするための多大な努力が注がれ、２０１５年、最終的に、メラノーマの治療のための改変ＨＳＶ−１、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）（「Ｔ−Ｖｅｃ」）の承認へとつながった（Ｃｏｆｆｉｎ  Ｒ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ  ｗｉｔｈ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃｏｆｆｉｎ、ｉｎｖｅｎｔｏｒ  ｏｆ  Ｔ−Ｖｅｃ：Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、８（２）：１０３〜１０６頁（２０１６））。Ｔ−Ｖｅｃは、２つのウイルス遺伝子欠失を有し（１つはγ３４．５遺伝子および１つはα４７遺伝子に）、欠失γ３４．５遺伝子の代わりに挿入されたヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有する。γ３４．５の機能は、ウイルス感染時に感染細胞がタンパク質合成のスイッチをオフにするのを防ぐことである。
【０１４４】
[000172]ペイロードとして使用され得る別のＨＳＶは、３つの異なる変異を含む第三世代ＨＳＶ−１、Ｇ４７Δである。ＮＶ１０２０ウイルスは、ペイロードとして使用され得るＨＳＶである。ＮＶ１０２０ウイルスは、Ｍｅｉｇｎｉｅｒらによって開発されたＲ７０２０構築物に基づく（Ｍｅｉｇｎｉｅｒら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｒ７０１７  ａｎｄ  Ｒ７０２０：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１５８（３）：６０２〜１４頁（１９８８））。ＮＶ１０２０ウイルスは、ＩＣＰ０およびＩＣＰ４遺伝子領域に欠失を有し、γ３４．５遺伝子の１つのコピーのみを有する。さらに、ＴＫ発現を制御するα４プロモーターが挿入されており、ウイルスを一般的な薬物、例えば、アシクロビルに対して感受性にする。
【０１４５】
[000173]ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）も、ウイルスペイロードとして使用され得る。ＮＤＶが、様々な腫瘍細胞タイプを効果的に死滅させ得ること、およびこの活性が免疫原性細胞死の誘導によって生じ、次に適応抗腫瘍免疫をもたらすことが見出されている（Ｋｏｋｓら、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｇｌｉｏｍａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１３６（５）：Ｅ３１３〜２５（２０１５））。ＮＤＶの特定の株は、標的細胞でアポトーシスを誘導することができ（Ｌａｚａｒら、Ｔｈｅ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ＮＤＶ−ＨＵＪ  ｏｎ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｖｉｎ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８４（１）：６３９〜４６頁（２０１０））、感染腫瘍細胞で刺激されたアポトーシス経路はｐ５３非依存性であり、おそらく小胞体ストレスによって引き金を引かれる（Ｆａｂｉａｎら、ｐ５３−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８１（６）：２８１７〜３０頁（２００７））。感染細胞のアポトーシスは、主に内因性ミトコンドリア経路により生じ、カスパーゼ依存性であることが発見されている（Ｅｌａｎｋｕｍａｒａｎら、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｅｒｔｓ  ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｂｏｔｈ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｃａｓｐａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８０（１５）：７５２２〜３４頁（２００６））。アポトーシスのこの誘導が腫瘍細胞死をもたらす。
【０１４６】
[000174]免疫刺激因子によるウイルスの武装と同様に、他の治療的遺伝子もウイルス療法の抗標的細胞効果を増加させることができる。例えば、ＴＮＦ受容体Ｆａｓをコードするように改変されたＮＤＶは、より大きな腫瘍溶解効果を示す。その理由は、Ｆａｓが、内因性および外因性アポトーシス経路の両方を介して感染細胞のアポトーシスの増加に関与しており、それによって細胞死を増加させ、次に抗腫瘍有効性を高めるためである（Ｃｕａｄｒａｄｏ−Ｃａｓｔａｎｏら、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、１４（５）：１２４７〜５８頁（２０１５））。ＮＤＶの天然腫瘍溶解特性は、ウイルスをＧＭ−ＣＳＦで武装することによって増大させることもできる（Ｊａｎｋｅら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）ｗｉｔｈ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ＧＭ−ＣＳＦ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１４（２３）：１６３９〜４９頁（２００７））。
【０１４７】
[000175]レトロウイルスは、ペイロードとして有用なさらに別のウイルスである。複製能を保持するレトロウイルス粒子を送達することができ、増殖している細胞（例えば、腫瘍細胞）、および自然免疫応答の引き金を引く能力が障害された細胞でのみ選択的に複製することができる方法が開発されている。宿主ゲノムに組み込まれ、細胞の溶解を引き起こすことなく複製するこれらの粒子の能力により、増殖性ウイルス感染の結果をもたらすことなく、該粒子は送達している治療的タンパク質の効率的なおよび長期にわたる産生者になる（Ｌｏｇｇら、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、５０７：１９９〜２２８頁（２０１２））。
【０１４８】
[000176]伝統的な腫瘍溶解性ウイルス療法の場合と同様に、この方法は、様々なレトロウイルスを使用し、様々な治療的遺伝子を添加して設計することができる。例えば、細胞死の引き金を引く自殺遺伝子が、様々な白血病ウイルス由来の粒子により腫瘍細胞に送達されてもよい（Ｌｕら、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ、２８（１）：２１〜２６頁（２０１２））。
【０１４９】
[000177]治療的遺伝子の送達と同様に、レトロウイルスのベクターの複製も抗標的細胞薬物療法に対する応答を増強するのに使用することができる。例えば、複製コンピテントレトロウイルスベクターによる治療薬の活性化因子の送達は、悪性中皮腫のマウスモデルにおいて有意な抗腫瘍効果および生存時間の延長をもたらした（Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１８（８）：５７１〜８頁（２０１１））。これらのベクターは、「ｇｕｔｔｅｄ」Ａｄゲノム内に送達することもでき、この組み合わせの成果は、腫瘍組織へのレトロウイルスのゲノムの導入効率の改善と、それ故に治療的遺伝子の産生の増加である（Ｋｕｂｏら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１９（１）：７６〜８２頁（２０１１））。
【０１５０】
[000178]ＭＶは、別の有用なウイルスペイロードである。ＭＶは、パラミクソウイルス科ファミリーの一本鎖マイナス鎖エンベロープＲＮＡウイルスである。ＣＤ１５０、ＣＤ４６、およびネクチン−４を含む細胞を成功裏に感染させるのに、ＭＶによって利用され得るいくつかの受容体がある。これらのうち、ＣＤ４６は、健康な細胞と比較して増加したレベルのこの受容体を発現する特定の標的細胞に対する、ＭＶの特異性の増加に起因している。この発現の増加は、健康な組織と比較して標的細胞の感染時に細胞溶解のレベルの増加をもたらす（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｈｉｇｈ  ＣＤ４６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４（１４）：４９１９〜２６頁（２００４））。通常の受容体に対して目隠しされ、標的抗原としての特異的標的細胞マーカーを認識するように再指示されるＭＶを改変することによって、選択性も増加され得る（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｒｅｓｃｕｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３（２）：２０９〜１４（２００５））。ＭＶ選択性を向上させる別の方法は、特定のｍｉＲＮＡが下方制御された細胞（例えば、がん細胞）のみを成功裏に感染させることができるｍｉＲＮＡ感受性ウイルスを改変することである。例えば、特異的ｍｉＲＮＡ標的部位をウイルスゲノムに挿入することにより、３つの宿主ｍｉＲＮＡに感受性を示すウイルスが開発されており、ウイルスを、これらのｍｉＲＮＡの１つまたは複数を発現する健康な細胞を感染させることはできないが、これらのｍｉＲＮＡのレベルが下方制御された特定のがん細胞は依然として感染させることができるようにする（Ｂａｅｒｔｓｃｈら、ＭｉｃｒｏＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉ−ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２１（９）：３７３〜８０（２０１４））。
【０１５１】
[000179]レオウイルスは、レオウイルス科ファミリーの二本鎖非エンベロープＲＮＡウイルスであり、天然に存在するＯＶと考えられている。レオウイルスは、その腫瘍溶解機能が、形質転換細胞で上方制御される傾向があるＲａｓ経路の活性化に依存するため、腫瘍細胞を選択的に感染させると考えられている（Ｓｔｒｏｎｇら、Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ：  ｕｓｕｒｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ｒｅｏｖｉｒｕｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ、１７（１２）：３３５１〜６２頁（１９９８））。ペイロードされ得る２つの追加のウイルスには、例えば、コクサッキーウイルスおよびエコーウイルスが含まれる。
ウイルス標的化を増加させるための標的細胞遺伝子の操作
[000180]標的細胞遺伝子は、標的細胞へのウイルスの標的化において役割を果たすことができる。例えば、特定のウイルス（ウシヘルペスウイルス−１）は、特定のタンパク質のレベルが増加した細胞（例えば、ＫＲＡＳ腫瘍細胞）をより良好に感染させることができることがＣｕｄｄｉｎｇｔｏｎらによって発見された（Ｃｕｄｄｉｎｇｔｏｎら、Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｒｔ  ｂｙ  ＫＲＡＳ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８８（１２）：６８８５〜９５頁（２０１４））。
【０１５２】
[000181]標的細胞中のＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の成分の異常な発現も、Ａｄ受容体の制御と、それ故にウイルス感染力のレベルに影響を与えることができる。この経路は、健康な細胞と比較していくつかの潜在的な標的細胞（例えば、腫瘍細胞）で上方制御される傾向があるため、ウイルス療法に有意な効果を与え得る。
【０１５３】
[000182]変異と同様に、マイクロＲＮＡを使用した特定の遺伝子の制御も、標的細胞のウイルス特異性を増強するのに使用することができる。例えば、標的細胞で下方制御されるｍｉＲＮＡ（腫瘍細胞中のｌｅｔ−７ａなど）を使用して、ＶＶにおける必須ウイルス遺伝子（病原性および腫瘍溶解活性の両方を増加させるＢ５Ｒなど）の発現を制御すると、ｌｅｔ−７ａ発現のレベルが低い細胞、すなわち、腫瘍細胞でのみ十分な量のＢ５Ｒを発現し得るウイルスをもたらす（Ｈｉｋｉｃｈｉら、ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ５Ｒ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｖｉｒａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｍｐａｉｒｉｎｇ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１９（６）：１１０７〜１５頁（２０１１））。
【０１５４】
[000183]ウイルス療法に影響を与え得る、腫瘍細胞で見出された別の遺伝子は、ＶＥＧＦである。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＶ内部移行と、次に複製レベルを増加させることが示されている（Ｈｉｌｅｙら、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、８７（５）：２７８１〜９０頁（２０１３））。したがって、ＶＶは、標的細胞によるＶＥＧＦの発現の増加を利用して治療的遺伝子の送達を増加させ、次に治療の有効性および効力を増加させることができる。
【０１５５】
[000184]これに加えて、ＶＶに感染したときのＶＥＧＦ発現の増加が、ＰＲＤ１−ＢＦ１（転写抑制因子）の上方制御をもたらし、１型インターフェロン抗ウイルスシグナル伝達の抑制を介して、ワクシニア感染に対する腫瘍血管内皮細胞の感受性を増加させることが発見されている。ウイルス指向性のこの増加は、腫瘍を通じてＯＶをより効率的に拡散できるようにし、それ故にこの腫瘍溶解療法の有効性を高める（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、ＶＥＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＲＤ１−ＢＦ１／Ｂｌｉｍｐ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｔｏ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２８（２）：２１０〜２４（２０１５））。インターフェロンシグナル伝達のこの天然の抑制は、インターフェロン阻害剤を使用して腫瘍溶解性ウイルス療法の有効性を高める可能性を浮き彫りにする（Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、９（１１）：ｅ１１２０１４（２０１４））。
【０１５６】
[000185]正しく機能する宿主のインターフェロン応答経路が、悪性胸膜中皮腫の麻疹感染における極めて重要な要素であることも示されている。細胞株では、麻疹感染に対する細胞の感受性と、ＭＶの存在下で細胞が完全なインターフェロン応答を誘発できないことの間に相関があることが認められた（Ａｃｈａｒｄら、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｔｏ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、６（４２）：４４８９２〜９０４頁（２０１５））。ＶＶ感染は、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ（ＪＮＫ）の下方制御を通じて大幅に増加されることも示されている。ＪＮＫシグナル伝達カスケードの阻害は、より低レベルの二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼをもたらし、これが次にＶＶゲノムの複製の増加を可能にする（Ｈｕら、ＪＮＫ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１５（９）：６１６〜２４頁（２００８））。
【０１５７】
[000186]腫瘍細胞（ＣＥＡＣＡＭ６）で見出される別の遺伝子も、腫瘍溶解性ウイルス療法に影響を与える。この腫瘍関連遺伝子は、例えば、数ある要因の中でも特に、腫瘍接着および侵入の促進における役割を含む、様々な機能を有する（Ｄｕｘｂｕｒｙら、Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＥＡＣＡＭ６  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２３（３４）：５８３４〜４２頁（２００４））。
Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲを発現する真核細胞
[000187]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する細胞は、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥをコードする核酸が、導入および発現される細胞であってもよい。
【０１５８】
[000188]真核細胞は、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドを介して特異的抗原に結合し、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドにシグナルを真核細胞へ伝達させることができ、その結果、真核細胞が活性化され得る。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲを発現する真核細胞の活性化は、真核細胞の種類ならびにＳｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲの細胞内エレメントに応じて異なり得、例えば、指標としてのサイトカインの放出、細胞増殖速度の改善、細胞表面分子の変化等に基づき確認され得る。例えば、活性化細胞からの細胞傷害性サイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシン等）の放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊を引き起こす。さらに、サイトカインの放出または細胞表面分子の変化は、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、および／またはマクロファージを刺激する。
【０１５９】
[000189]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞は、疾患を治療するための治療剤として使用されてもよい。この治療剤は、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞を活性成分として含むことができ、適切な賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤の例には、組成物のための薬学的に許容される賦形剤が含まれる。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞が投与される疾患は、疾患が真核細胞に対する感受性を示す限り、特に限定されない。本発明の疾患の例には、がん（血液のがん（白血病）、固形腫瘍（卵巣がん）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎、ならびに原因が、インフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染症、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、および深在性真菌症が含まれる。自己免疫疾患（例えば、尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ）は、自己免疫疾患を引き起こす免疫タンパク質に結合するＳｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞で治療することができる。例えば、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞は、自己免疫疾患を引き起こす抗体を作る細胞を標的化することができる。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞は、自己免疫疾患を引き起こすＴリンパ球を標的化し得る。
【０１６０】
[000190]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥは、アレルギーを治療するための治療剤として使用されてもよい。そのような治療剤は、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞を活性成分として含むことができ、適切な賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤の例には、組成物のための薬学的に許容される賦形剤が含まれる。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞で治療され得るアレルギーの例には、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対するアレルギーが含まれる。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞は、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対してアレルギー反応を引き起こす抗体を作る細胞を標的化することができる。標的化される細胞は、Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、プレＢ細胞、および前駆Ｂ細胞の１つまたは複数であってもよい。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞は、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対してアレルギー反応を引き起こすＴリンパ球を標的化することができる。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥは、抗体またはＴ細胞受容体のイディオタイプ決定基に結合することができる。
【０１６１】
[000191]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞は、疾患または状態の治療のために投与されてもよい。これらの真核細胞は、骨髄移植または放射線への曝露、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸血等後の感染症の予防に利用することができる。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥを発現する真核細胞を含む治療剤は活性成分であってもよく、投与経路は限定されないが、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内に、または輸入リンパ管へ、例えば注射もしくは注入による非経口投与によって、投与されてもよい。
【０１６２】
[000192]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥは、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｐｅｇｒａｍら、ＣＤ２８ｚ  ＣＡＲｓ  ａｎｄ  ａｒｍｏｒｅｄ  ＣＡＲｓ、２０１４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  ２０（２）：１２７〜１３３頁に記載されているものなどの、攻撃的な抗腫瘍特性を有するＴリンパ球と共に使用されてもよい。ＲＮＡ制御デバイスは、Ｔリンパ球中の武装化ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドと共に使用することができる。
医薬組成物
[000193]本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥ発現細胞、例えば、複数のＳｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥ発現細胞を、１つまたは複数の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含んでもよい。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化物質；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、１つの態様において静脈内投与用に製剤化される。
【０１６３】
[000194]医薬組成物は、治療（または予防）されるべき疾患に適した方法で投与され得る。適正な投与量は臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度といった要因によって決定されるであろう。
【０１６４】
[000195]適切な薬学的に許容される賦形剤は、当業者に周知である。薬学的に許容される賦形剤の例には、リン酸緩衝生理食塩水（例えば０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの鉱酸塩を含有する水溶液、生理食塩水、グリコールまたはエタノールの溶液、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれる。湿潤剤または乳化剤などのアジュバント、およびｐＨ緩衝剤も使用され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．  １９９１）（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された薬学的に許容される賦形剤が、適正に使用されてもよい。組成物は、非経口投与、例えば、注射または注入に適した公知の形態に製剤化することができる。組成物は、懸濁化剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤、ならびに貯蔵中の有効期間を延長するための保存剤などの製剤添加剤を含んでもよい。
【０１６５】
[000196]本明細書に記載された真核細胞を活性成分として含む組成物は、例えば、がん（血液のがん（白血病）、固形腫瘍（卵巣がん）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、湿疹）、肝炎、ならびに原因がインフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染症、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、または深在性真菌症などの疾患の治療のために、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドが結合する抗原に応じて投与することができる。
【０１６６】
[000197]対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置または移植によるものを含む、任意の好都合な方法で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、患者に対し、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内、鼻腔内、動脈内、腫瘍内に、輸入リンパ管へ、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与されてもよい。１つの態様において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。１つの態様において、本発明のＴ細胞組成物はｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射されてもよい。投与は、養子移入によって行われてもよい。
【０１６７】
[000198]「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療的量」が示される場合、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍径、感染または転移の程度、および状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載された真核細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、一部の場合には１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の投与量（それらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与することができる。真核細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与することもできる。真核細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入法を使用して投与することもできる（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  ３１９：１６７６頁、１９８８を参照のこと）。
真核細胞の使用
[000199]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子−ＲＤＥをコードする核酸は、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子ポリペプチドを真核細胞で発現させるのに使用することができる。真核細胞は、例えばヒト細胞またはマウス細胞を含む、哺乳動物細胞であってもよい。真核細胞はまた、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、またはマクロファージを含む、例えば、造血細胞でもあってもよい。
【０１６８】
[000200]Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）またはナチュラルキラー細胞は、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを用いて改変することもできる。ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、またはＳｉｄｅ  ＣＡＲのリガンドがＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）またはナチュラルキラー細胞に添加され、エフェクター機能の所望の量を得るために漸増量で添加され得る。エフェクター機能の所望の量は、標的細胞上の標的抗原の既知の量（および／または密度）によるエフェクター機能の最適化された量であってもよい。エフェクター機能は、標的細胞死滅、宿主免疫細胞の活性化、サイトカイン分泌、グランザイムの産生、アポトーシス誘導リガンドの産生、免疫系を調節する他のリガンドの産生等であってもよい。エフェクター機能は、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、および／またはＩＬ−１０などのサイトカインの分泌であってもよい。エフェクター機能は、標的細胞の死滅であってもよい。標的細胞は、グランザイムで死滅されてもよい。標的細胞は、アポトーシスを受けるように誘導されてもよい。ＣＡＲを含む真核細胞は、アポトーシスおよびグランザイムにより標的細胞を死滅させることができる。
【０１６９】
[000201]ＲＤＥ、ＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、またはＳｉｄｅ  ＣＡＲ制御エレメントは、導入遺伝子の発現を制御するのに使用されてもよい。この導入遺伝子発現は、ペイロードを標的部位に送達することができる。これらの導入遺伝子は、ウイルス構築物、またはペイロードがウイルスである場合はウイルスによって担持されることもできる。導入遺伝子の発現は、真核細胞で所望の変化を引き起こすことができる。ＧＡＰＤＨによって制御されるＲＤＥは、ペイロード送達に使用されてもよく、真核細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞）は、標的部位に達すると活性化され得る（例えば、ＣＡＲによって）。ＣＡＲによる標的部位での真核細胞の活性化時に、該細胞は解糖およびＲＤＥからのＧＡＰＤＨ放出を誘導し、ペイロード発現および送達を可能にした。標的部位は、腫瘍または感染であってもよく、導入遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、抗体、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導因子、補体、細胞傷害性小分子を作るための酵素、ペプチドもしくは糖類を切断する酵素（例えば、バイオフィルムを消化するために）、他の細胞傷害性化合物、または標的部位で所望の効果を与え得る他のポリペプチドをコードし得る。チェックポイント阻害剤には、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ−１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびリンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）を含む、免疫チェックポイントで作用する薬剤が含まれる。ペイロードとして使用され得るチェックポイント阻害剤の例には、例えば、ニボルマブ（オプジーボ）、ペンブロリズマブ（キイトルーダ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、イピリムマブ（ヤーボイ）、リリルマブ、およびＢＭＳ−９８６０１６が含まれる。ニボルマブ、アテゾリズマブおよびペンブロリズマブは、チェックポイントタンパク質ＰＤ−１で作用し、抗腫瘍免疫細胞のアポトーシスを阻害する。いくつかのチェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１とそのリガンド  ＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を妨げる。イピリムマブはＣＴＬＡ４で作用し、ＣＴＬＡ４が腫瘍中の活性化Ｔ細胞を下方制御するのを妨げる。リリルマブはＫＩＲで作用し、ナチュラルキラー細胞の活性化を容易にする。ＢＭＳ−９８６０１６はＬＡＧ３で作用し、抗原特異的Ｔリンパ球を活性化し、腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞媒介溶解を増強する。サイトカインには、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、および／またはＩＬ−１０が含まれ得る。細胞傷害性物質には、例えば、グランザイム、アポトーシス誘導因子、補体、または細胞傷害性小分子が含まれ得る。標的部位（例えば、非腫瘍標的部位）に送達されるペイロードは、標的部位を保護する因子、例えば、抗炎症性因子、Ｔ制御性細胞を該部位に引きつける因子、または免疫活性の抑制および低下を引き起こすサイトカインもしくは他の因子であってもよい。ペイロードは、ペプチドまたは糖類を切断する酵素、例えばヒアルロニダーゼ、ヘパラナーゼ、メタロプロテイナーゼおよび、例えば、望ましくないバイオフィルムを消化するのに使用され得る他のプロテイナーゼであってもよい。ペイロードは、標的部位を画像化できるようにするイメージング剤であってもよい。ペイロードは、直接画像化され得るポリペプチドであってもよく、または基質と相互作用して画像化され得る産物を作るポリペプチドであってもよく、イメージングポリペプチドには、例えば、チミジンキナーゼ（ＰＥＴ）、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、ヨウ化ナトリウムトランスポーター（ＮＩＳ）、デオキシシチジンキナーゼ、ソマトスタチン受容体サブタイプ２、ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）、カンナビノイド受容体、グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）、チロシナーゼ、ヨウ化ナトリウムトランスポーター、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、修飾ハロアルカンデハロゲナーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびソマトスタチン受容体２が含まれる。これらのレポーターペイロードは、例えば、光学イメージング、超音波イメージング、コンピュータ断層撮影イメージング、光干渉断層イメージング、Ｘ線撮影イメージング、核医学イメージング、陽電子放出断層撮影イメージング、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、熱イメージング、蛍光透視イメージング、生物発光イメージング、および蛍光イメージングを使用して画像化することができる。これらのイメージング方法には、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が含まれる。
【０１７０】
[000202]標的細胞を直接死滅させ得る複数の系が、使用のために想定される。これらには、例えば、標的細胞へのウイルスまたは細菌遺伝子の導入が含まれる。このアプローチは、非毒性プロドラッグを毒性のものに変える。広範に研究されている系、すなわち、プロドラッグ５−フルオロシトシン（「５−ＦＣ」）を５−フルオロウラシル（「５−ＦＵ」）に変換する大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子（「ＣＤ」）；およびガンシクロビル（「ＧＣＶ」）を、がん細胞の酵素によってガンシクロビル三リン酸に変換されるガンシクロビル一リン酸に変換する、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（「ＨＳＶ−ｔｋ」）がある。腫瘍細胞を直接死滅させるのに有用なＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶ系は、腫瘍細胞へのＨＳＶ−ｔｋアデノウイルス導入と、その後のガンシクロビルの投与を伴う。具体的には、組換え複製欠損アデノウイルスが、チミジン、ＨＳＶ−ｔｋを肝細胞癌（「ＨＣＣ」）細胞に導入してガンシクロビルに対する感受性を付与するのに使用される。３つの有用なＨＣＣ細胞株には、例えば、ｌａｃＺレポーター遺伝子を担持する組換えアデノウイルス（「Ａｄ−ＣＭＶｌａｃＺ」）によって、インビトロで効率的に感染させることができるＨｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５およびＨｅｐＧ２が含まれる。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（「ＡｄＣＭＶｔｋ」）を担持する組換えアデノウイルスに感染したＨＣＣ細胞でのＨＳＶ−ｔｋの発現は、ガンシクロビルに対する感受性を用量依存的に誘導する（Ｑｉａｎら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２２：１１８〜１２３頁（１９９５））ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｈｅｐ．１８４０２２０１１９。
【０１７１】
[000203]チミジンキナーゼは、例えば、［１８Ｆ］９−（４−［１８Ｆ］−フルオロ−３−ヒドロキシメチルブチル）−グアニン、チミジンキナーゼ（ＴＫ）によってリン酸化されると細胞内に保持されるようになるフッ素−１８−標識ペンシクロビル類似体、または５−（７６）Ｂｒ−ブロモ−２’−フルオロ−２’−デオキシウリジンなどのＰＥＴレポータープローブと共に使用されてもよい。ＰＥＴレポーターごとの適切なレポータープローブは当業者に周知である。ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体の例示的なレポータープローブは、３−（２’−［１８Ｆ］フルオロエチル）スピペロン（ＦＥＳＰ）である（ＭａｃＬａｒｅｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ６（５）：７８５〜９１頁（１９９９））。ヨウ化ナトリウムトランスポーターの例示的なレポータープローブは、トランスポーターによる輸送後に細胞中に保持される１２４Ｉである。デオキシシチジンキナーゼの例示的なレポータープローブは、２’−デオキシ−２’−１８Ｆ−５−エチル−１−β−ｄ−アラビノフラノシルウラシル（１８Ｆ−ＦＥＡＵ）である。ソマトスタチン受容体サブタイプ２の例示的なレポータープローブは、１１１Ｉｎ−、９９ｍ／９４ｍＴｃ−、９０Ｙ−、または１７７Ｌｕ標識オクトレオチド類似体、例えば９０Ｙ−、または１７７Ｌｕ標識ＤＯＴＡＴＯＣ（Ｚｈａｎｇら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．５０（ｓｕｐｐｌ  ２）：３２３頁（２００９））；６８Ｇａ−ＤＯＴＡＴＡＴＥ；および１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡＢＡＳＳである（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒａｄｅｒら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．  ５４（２）：１６７〜１７２頁（２０１３）を参照のこと）。ノルエピネフリントランスポーターの例示的なレポータープローブは、１１Ｃ−ｍ−ヒドロキシエフェドリン（Ｂｕｕｒｓｍａら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．  ４６：２０６８〜２０７５頁（２００５））である。カンナビノイド受容体の例示的なレポータープローブは、１１Ｃ−標識ＣＢ２  リガンド、１１Ｃ−ＧＷ４０５８３３である（Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．  ５２（７）：１１０２〜１１０９頁（２０１１））。グルコーストランスポーターの例示的なレポータープローブは、［１８Ｆ］フルオロ−２−デオキシ−ｄ−グルコースである（Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ，Ｈ．Ｒ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ５１：１９１〜２０４頁（２００４））。チロシナーゼの例示的なレポータープローブは、Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−１８Ｆ−５−フルオロピコリンアミドである（Ｑｉｎら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ３：１４９０頁（２０１３））。他のレポータープローブは、当技術分野で、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｇｈｏｕｂｉら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ２（４）：３７４〜３９１頁（２０１２）に記載されている。
【０１７２】
[000204]β−ガラクトシダーゼの例示的な光音響レポータープローブは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）である（Ｌｉら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ．  １２（２）：０２０５０４頁（２００７））。例示的なＸ線受容体には、とりわけ、ソマトスタチン受容体２、または受容体ベースの結合剤の他のタイプが含まれる。レポータープローブは、レポータープローブに結合され、例えば、Ｘ線またはコンピュータ断層撮影によって画像化される放射線不透過性標識部分を有してもよい。例示的な放射線不透過性標識は、ヨウ素、特にポリヨウ素化化学基（例えば、米国特許第５，１４１，７３９号を参照のこと）、および常磁性標識（例えば、ガドリニウム）であり、これらは従来の手段によってレポータープローブに付着することができる。光学イメージング剤には、例えば、蛍光ポリペプチドが含まれる。蛍光ポリペプチドには、例えば、オワンクラゲまたはウミシイタケ由来の緑色蛍光タンパク質、およびその活性バリアント（例えば、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質等）；ヒドロイドクラゲ（Ｈｙｄｒｏｉｄ  ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）、カイアシ類（Ｃｏｐｅｐｏｄ）、クシクラゲ類（Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ）、花虫綱（Ａｎｔｈｒｏｚｏａｓ）、およびサンゴイソギンチャク（Ｅｎｔａｃｍａｅａ  ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）由来の蛍光タンパク質、およびその活性バリアント；ならびにフィコビリタンパク質およびその活性バリアントが含まれる。光学イメージング剤はまた、生物発光ポリペプチドでもあってもよい。これらには、例えば、エクオリン（および他のＣａ＋２制御光タンパク質）、ルシフェリン基質に基づくルシフェラーゼ、セレンテラジン基質に基づくルシフェラーゼ（例えば、レニラ、ガウシア、およびメトリディア（Ｍｅｔｒｉｄｉｎａ））、ならびにウミホタル由来のルシフェラーゼ、およびその活性バリアントが含まれる。
【０１７３】
[000205]Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲおよび／またはユニバーサル−ＣＡＲは、細菌、真菌またはウイルス起源である抗原に対する受容体を含むように設計されてもよい。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲは、免疫無防備状態の患者における毒性の供給源である感染と戦うために利用することができるため、そのような抗病原体Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲは、ＴＡＡに特異的なＳｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲ  Ｔ細胞療法と併用して使用されてもよい。
【０１７４】
[000206]真核細胞は、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドを介して特異的抗原に結合し、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲポリペプチドにシグナルを真核細胞へ伝達させることができ、その結果、真核細胞が活性化され、そのため適当なＲＤＥ−導入遺伝子を発現し得る。Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲを発現する真核細胞の活性化は、真核細胞の種類ならびにＳｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲの細胞内エレメントに応じて異なる。真核細胞は、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ−ＣＡＲを通じて真核細胞を刺激したときのエフェクター機能に対して細胞を準備するＲＤＥ転写物を発現することができる。
【０１７５】
[000207]ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／もしくは他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、疾患を治療するための治療剤として使用されてもよい。治療剤は、ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／もしくは他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞を活性成分として含むことができ、適切な賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤の例には、組成物のための薬学的に許容される賦形剤が含まれる。ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／もしくは他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞が投与される疾患は、疾患が真核細胞および／またはＲＤＥ−導入遺伝子の産物に対する感受性を示す限り、特に限定されない。
【０１７６】
[000208]治療され得る疾患の例には、がん（血液のがん（白血病）、固形腫瘍（卵巣がん）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎、ならびに原因が、インフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染症、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、および深在性真菌症、他の免疫介在性疾患、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経変性疾患、ならびに糖尿病のような代謝疾患が含まれる。受容体（例えば、ＣＡＲ）は、真核細胞を病変細胞に標的化させることができ、病変細胞で受容体がその標的に結合すると、受容体はシグナルを真核細胞に送り、ＲＤＥ−導入遺伝子の発現をもたらすことができる。ＲＤＥ−導入遺伝子は、病変細胞を治療するまたは死滅させる上で有用なポリペプチドをコードする。がんおよび／または固形腫瘍は、上記に記載されたものなどの腫瘍関連（またはがん関連）抗原に結合する受容体を発現する真核細胞で治療され得る。受容体が腫瘍関連抗原に結合すると、受容体は、ＲＤＥ−導入遺伝子を発現させる細胞にシグナルを送る（例えば、シグナルは、ＲＤＥ−転写物の発現につながるＲＤＥ結合タンパク質をもたらす）。ＲＤＥ−転写物は、真核細胞ががんを治療するように、および／または自体ががんを治療するポリペプチド（例えば、細胞傷害性ポリペプチド）をＲＤＥ−転写物がコードするように、真核細胞を活性化するポリペプチドをコードすることができる。
【０１７７】
[000209]自己免疫疾患（例えば、尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ、複数の硬化症、クローン病）は、自己免疫疾患と関連する免疫タンパク質に結合するＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／もしくは他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞で治療することができる。受容体または標的化ポリペプチドは、自己免疫疾患の治療において有用なポリペプチドをコードするＲＤＥ−導入遺伝子の発現の引き金を引くことができる（例えば、ポリペプチドは、自己免疫疾患を引き起こす細胞を制御する、またはこれらの細胞を死滅させることができる）。ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、自己免疫疾患と関わる抗体を作る細胞を標的化することができる（例えば、ＲＤＥ−導入遺伝子は、抗体産生細胞を死滅させる、またはこれらの細胞による抗体の産生を阻害するポリペプチドをコードすることができる）。ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、自己免疫疾患と関わるＴリンパ球を標的化することができる（例えば、ＲＤＥ−導入遺伝子は、標的Ｔリンパ球を死滅させる、またはＴリンパ球の活性を制御するポリペプチドをコードすることができる）。
【０１７８】
[000210]ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／もしくは他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、アレルギーを治療するための治療剤として使用されてもよい。治療され得るアレルギーの例には、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対するアレルギーが含まれる。ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対してアレルギー反応を引き起こす抗体を作る細胞を標的化することができる。標的化される細胞は、Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、プレＢ細胞、および前駆Ｂ細胞の１つまたは複数であってもよい。標的化される細胞には、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対してアレルギー反応を引き起こすＴリンパ球も含まれ得る。ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、抗体またはＴ細胞受容体のイディオタイプ決定基に結合することができる。
【０１７９】
[000211]ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／もしくは他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、疾患または状態の治療のために投与されてもよい。例えば、真核細胞は、感染症を治療するために利用されてもよい。真核細胞は、感染症病原体またはそのような病原体に感染した細胞で見出される抗原に結合する受容体または標的化ポリペプチドを発現することができる。受容体または標的化ポリペプチドは、感染症と関連する抗原を結合し、ＲＤＥ−導入遺伝子の発現をもたらす真核細胞にシグナルを送る。ＲＤＥ−導入遺伝子は、感染症を治療するために真核細胞を活性化することができる産物をコードする（例えば、真核細胞は、細胞傷害性ポリペプチドまたは免疫細胞を活性化するサイトカインを産生することができる）。ＲＤＥ−導入遺伝子は、自体が細胞傷害性ポリペプチドまたはサイトカインであるポリペプチドもコードすることができる。真核細胞は、例えば、骨髄移植または放射線への曝露、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸血等後に、感染症の予防に利用する（予防的に使用する）こともできる。
【０１８０】
[000212]ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／もしくは他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞を活性成分として含む治療剤は、投与経路は限定されないが、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内に、または輸入リンパ管へ、例えば注射もしくは注入による非経口投与によって、投与されてもよい。
【０１８１】
[000213]ＲＤＥ−導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ−ＤＥ−ＲＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／もしくは他の受容体または標的化ポリペプチドは、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｐｅｇｒａｍら、ＣＤ２８ｚ  ＣＡＲｓ  ａｎｄ  ａｒｍｏｒｅｄ  ＣＡＲｓ、２０１４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  ２０（２）：１２７〜１３３頁に記載されているものなどの、攻撃的な抗腫瘍特性を有するＴリンパ球と共に使用されてもよい。ＲＤＥ転写物は、攻撃的な抗腫瘍特性をＴリンパ球にもたらすポリペプチドをコードすることができる。
【０１８２】
[000214]導入遺伝子、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ  ＣＡＲポリペプチドは、ＩＬ−２をコードする遺伝子の３’−ＵＴＲまたはＩＦＮ−γの３’−ＵＴＲ由来のＲＤＥによって制御されてもよい。これらのＲＤＥは、ＲＤＥで見出されるマイクロＲＮＡ部位を不活性化するように修飾されてもよい。これらの制御エレメントの使用は、ＲＤＥとグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）との相互作用により、宿主細胞の解糖状態の変化に対してＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子の発現を感受性にする。宿主細胞が静止状態にある場合、ＧＡＰＤＨの大部分は解糖に関与せず、ＲＤＥに結合することができ、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、および／または導入遺伝子ポリペプチドをコードする転写物の翻訳の低下をもたらす。例えば、宿主細胞にグルコース、または解糖活性を増加するであろう他の小分子を提供することによって、宿主細胞が解糖を増加するように誘導されると、ＧＡＰＤＨは酵素的に活性になり、ＲＤＥに結合することができない。ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合の低下は、ＣＡＲ、ＤＥ−ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ−ＣＡＲ、または他の導入遺伝子をコードする転写物の翻訳を増加させる（例えば、転写物の半減期を増加させる、および／または翻訳速度を増加させることによって）。ＧＡＰＤＨの解糖活性は、トリオースイソメラーゼの量および／または活性を増加させることによって増加されてもよい。宿主細胞は、組換えトリオースイソメラーゼを過剰発現するように誘導されてもよく、この過剰発現はＧＡＰＤＨの解糖活性を増加させる。ＲＤＥを含む転写物の発現を減少させるために、解糖阻害剤が添加されてもよく、そのような解糖阻害剤には、例えば、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２−デオキシグルコース、３−ブロモピルビン酸（ｂｒｏｍｏｐｈｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ）、ヨード酢酸、フッ化物、オキサメート、プログリタゾン、ジクロロ酢酸、キノン、または例えば、デヒドロエピアンドロステロンなどの他の代謝阻害剤が含まれる。ＲＤＥ制御転写物からの発現は、ＧＡＰＤＨ（または他のＲＤＥ結合タンパク質）によるＲＤＥの結合を阻害するＧＡＰＤＨ（または他のＲＤＥ結合タンパク質）阻害剤の添加によって増加されてもよい。そのようなＧＡＰＤＨ阻害剤には、例えば、ＣＧＰ  ３４６６Ｂマレエートまたはヘプテリジン酸（両方ともＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．により販売されている）、ペンタレノラクトン、または３−ブロモピルビン酸が含まれる。
【０１８３】
[000215]ＲＤＥを含む転写物をコードする構築物は、真核細胞で発現されて、ＲＤＥ結合タンパク質に結合し、そのため細胞中の天然の転写物と相互作用するそれらのＲＤＥ結合タンパク質の能力を低下させることができる。組換え転写物は、ＲＤＥ結合タンパク質の結合を競合し得、これが、ＲＤＥ結合タンパク質による真核細胞内の天然の転写物の阻害および／または活性化を低下させ得る。ＲＤＥを含む転写物をコードする構築物はこのように使用されて、天然の転写物が真核細胞でいつおよびどのように発現されるかを変化させ得る。真核細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはＢ細胞であってよく、組換え転写物は、サイトカインまたは細胞傷害性転写物と共有されるＲＤＥを（例えば、それらの３’非翻訳領域に）有する。組換え転写物は、サイトカインまたは細胞傷害性ポリペプチドの発現を制御し、サイトカインまたは細胞傷害性ポリペプチドを発現するために必要とされる閾値（例えば、ＧＡＰＤＨの解糖活性）を変化させるＲＤＥ結合タンパク質（例えば、ＧＡＰＤＨおよび／または上記に記載された他の解糖系酵素）と結合を競合し得る。これは、免疫細胞の刺激（例えば、ＣＡＲまたはＴ細胞受容体を通じた）に応答してより多量のサイトカインおよび／または細胞傷害性タンパク質を分泌する（より大きなＣｍａｘ）スーパーＴ細胞（別名、アングリーＴ細胞（Ａｎｇｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ）またはスズメバチＴ細胞（Ｈｏｒｎｅｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ））を作出するのに使用され得る。Ｔ細胞がそのＴ細胞受容体によって刺激されるとき、Ｔ細胞がより多くのＩＬ−２および他のエフェクターポリペプチドをより速い動態で産生するように、Ｔ細胞は、ＩＬ−２転写物由来のＲＤＥをコードする組換え転写物によりリプログラミングされ得る。これらのリプログラミングＴ細胞は、他の炎症性サイトカインおよび細胞傷害性ポリペプチド（例えば、グランザイムおよび／またはパーフォリン）をより大量におよびより速い動態で産生し得る。Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞をそのようなアングリー／スズメバチ状態にリプログラミングすることは、例えば、腫瘍、他のがん、および感染症を含む疾患および障害に治療に有用であり得る。
【０１８４】
[000216]ＲＤＥは、免疫細胞が標的によってまたは所望の時点で活性化されるまで、それらの免疫細胞でのＣＡＲ発現を低下させるのに使用されてもよい。これは、ＣＡＲへの対象の全身曝露を減少する一方で、治療効果にとって所望の時点でＣＡＲの発現をもたらす。全身性曝露の減少は、対象の免疫系が時間とともに減少するＣＡＲを経験することになるため、ＣＡＲに対する免疫応答の発生を減少および／または阻害し得る。
【０１８５】
[000217]いくつかの神経変性疾患および症候群は、多くの他の非神経疾患および症候群と同じように炎症と関連している。そのような炎症関連疾患は、免疫細胞内の阻害性ＲＤＥ結合タンパク質の利用可能性を高める小分子（または他の分子）を対象に提供することによって、少なくとも部分的に治療され得る。そのような小分子には、例えば、解糖阻害剤（例えば、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２−デオキシグルコース、３−ブロモピルビン酸（ｂｒｏｍｏｐｈｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ）、ヨード酢酸、フッ化物、オキサメート、プログリタゾン、ジクロロ酢酸）、他の代謝阻害剤（例えば、デヒドロエピアンドロステロン）等が含まれる。例えば、解糖阻害剤は、細胞における解糖を低下させ、ＲＤＥに結合する遊離ＧＡＰＤＨ（解糖に関与しない）の量を増加させ、これらの転写物の発現を低下させることができる。免疫細胞中のいくつかの炎症性遺伝子産物（例えば、免疫系を活性化する遺伝子産物）は、ＧＡＰＤＨを結合することができるＲＤＥによって制御される。解糖の減少は、ＲＤＥ結合のための遊離ＧＡＰＤＨの量を増加させ、これらの炎症性遺伝子のＲＤＥに結合されるＧＡＰＤＨの量を増加させ、これらの炎症性遺伝子の発現を低下させる。炎症性遺伝子には、例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−ｇ、およびＧＭ−ＣＳＦなどの炎症誘発性サイトカインが含まれる。これらのサイトカインは、ＲＤＥ結合タンパク質（ＧＡＰＤＨを含む）を結合してその発現を制御することができるＲＤＥを含む３’−ＵＴＲを有する。増加したＧＡＰＤＨはこれらのＲＤＥに結合し、これらの炎症誘発性サイトカインの発現を減少させることができる。炎症誘発性サイトカインの発現の低下は、これらの対象における免疫系の活性を低下させ、炎症を低下させ得る。炎症の低下は、プラスの治療効果を与え、これらの炎症関連神経疾患、ならびに他の炎症関連疾患および症候群の症状を軽減し、および／または基礎病態を治療し得る。
【０１８６】
[000218]ＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、所望の時点で最大発現をもたらすように、およびその時点でポリペプチドの所望の量をもたらすように選択することができる。ＲＤＥは、ポリペプチドの所望の曲線下面積をもたらすように選択することもできる。実施例２０の表２に示されているように、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、異なる時点で最大発現率に達した。また、表１に示されているように、異なるＲＤＥは、時間とともに異なるＡＵＣを示す異なるプロファイルを有する、異なる発現量を示した。これらのＲＤＥを異なる導入遺伝子と組み合わせて使用することは、細胞の活性化後、異なる導入遺伝子が、互いとの関連でいつ最大発現率に達するかという時間的プログラミングを可能にする。さらに、異なるＲＤＥを使用することで、導入遺伝子コードポリペプチドの所望の量、および／または導入遺伝子によってコードされるポリペプチドのＡＵＣもしくは該ポリペプチドへの曝露の所望の量を発現するように、導入遺伝子をプログラミングすることができるようになる。故に、ＲＤＥは、異なる導入遺伝子ポリペプチドの所望の量を、異なる（または同じ）所望の時点で産生する制御を提供するように使用されてもよい。
【０１８７】
[000219]この時間的制御は、細胞内での異なる導入遺伝子ポリペプチドの産生に所望のタイミングを提供するのに使用されてもよい。この時間的制御を使用して、後で発現される第２の導入遺伝子のポリペプチドによって影響を受ける準備ができるよう細胞の状態を変更する第１の導入遺伝子を発現するように、細胞がプログラミングされてもよい。例えば、第１の発現ポリペプチドは、細胞傷害性ポリペプチド（例えば、グランザイムおよび／またはパーフォリン）を作り、貯蔵するように細胞を誘導し得、第２の発現ポリペプチドは、細胞傷害性ポリペプチドの放出に関与し得る。時間的発現の別の例は、２つ以上の遺伝子産物の時間的発現を必要とする変化（例えば、分化または細胞の状態の変化）を受けるように細胞をプログラミングするための使用を含む。ＲＤＥは、この時間的発現を模倣し、細胞がいつその状態を変化させるかまたは分化するか（例えば、幹細胞のプログラム化された分化）を制御できるようにするために使用されてもよい。幹細胞例では、時間的制御および誘導制御は、幹細胞を所望の細胞タイプに分化させることが望ましい時（および場所）で分化するように、幹細胞をプログラミングするのに使用され得る。
【０１８８】
[000220]時間的制御は、細胞の外側で異なる導入遺伝子ポリペプチドを産生する所望のタイミングを提供するのに使用することもできる。この時間的制御を使用して、標的細胞が第２の導入遺伝子から後で発現されるポリペプチドによって作用される準備ができるように、細胞は活性化され得、標的細胞を調節および／または変更する第１の導入遺伝子ポリペプチドを分泌することができる。例えば、第１のポリペプチドは、標的細胞表面（例えば、ＦａｓＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１等）で受容体を、または細胞中でポリペプチドを発現するように標的細胞を誘導し得る。第１の導入遺伝子はまた、標的細胞の状態を変化させるように該細胞を誘導する因子を分泌するように細胞を誘導することもできる（例えば、第１の導入遺伝子は、標的細胞に標的細胞表面でＯＸ４０を発現させるＣｐＧを分泌する細胞を誘導し得る）。後で最大発現率に達する第２の導入遺伝子は、誘導された表面受容体（例えば、ＦａｓＬ、ハーセプチン、リツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、抗ＯＸ４０抗体等）で作用するポリペプチドをコードすることができる。時間的制御および誘導制御は、第２のポリペプチド（等。後で最大発現率に達する追加の導入遺伝子ポリペプチドに関する）によって標的細胞が作用され得るように、第１のポリペプチドが標的細胞を誘導してその状態（例えば、分化）を変更させるタイミングでポリペプチドを標的細胞に提供することによって、標的細胞の状態または分化を変化させるのに使用することもできる。
【０１８９】
[000221]動態パラメータが異なるＲＤＥ（Ｇｏｌｄエレメント）（例えば、細胞の活性化後早期の急速な発現と、その後の急速な発現の低下をもたらすＲＤＥ、または細胞活性化後２〜３日間にわたり発現を遅らせるＲＤＥ）を使用して治療され得る疾患およびペイロードのいくつかの例には、以下が含まれる：抗ＤＬＬ３  ＣＡＲならびに、１つまたは複数の抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、および／またはＣＤ４０リガンドのペイロードを使用するＤＬＬ３陽性がん（ＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマ、メラノーマ、およびＳＣＬＣなど）。抗ＣＤ１９  ＣＡＲならびに、ＩＬ−１２、または１つもしくは複数の抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、および／もしくはＣＤ４０リガンドのペイロードを使用するＣＤ１９陽性リンパ腫（例えば、ＮＨＬ）。変異シアリル化を認識する抗ｏｎｃｏ−ＣＤ４３  ＣＡＲならびに、１つもしくは複数の抗ＣＸＣＬ１２抗体、抗抗ＣＸＣＲ４抗体、もしくはＩＬ−１２、または１つもしくは複数の抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、および／またはＣＤ４０リガンドのペイロードを使用する、ｏｎｃｏ−ＣＤ４３（シアリル化変異体）を有するＡＭＬ。抗ＰＳＣＡ  ＣＡＲならびに、ヘパリナーゼもしくはＩＬ−１２、または１つもしくは複数の抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、および／もしくはＣＤ４０リガンドのペイロードを使用するＰＳＣＡ陽性前立腺がん、膀胱がんまたは膵臓がん。がん精巣抗原、ミスフォールドまたは変異体ＥＧＦＲ（トリプルネガティブ乳がんと関連する）、および／または葉酸受容体アルファペプチドを認識するＣＡＲならびに、ＩＬ−１２または１つもしくは複数の抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、および／もしくはＣＤ４０リガンドのペイロードを用いるトリプルネガティブ乳がん。
【０１９０】
[000222]本明細書に開示された本発明は、以下の実験詳細からより良く理解されるであろう。しかし、その後に続く特許請求の範囲により十分に記載されるように、論じられる特定の方法および結果は本発明の例証にすぎないことを当業者は容易に理解するであろう。特に指示のない限り、本開示は、そのようなもの自体異なり得るため、特定の手順、材料等に限定されない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【実施例】
【０１９１】
実施例１
ＲＤＥ−ＣＡＲによるＴ細胞エフェクター活性の制御
[000223]ＷＯ  ２０１２／０７９０００、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された第三世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセット、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の３’−ＵＴＲ（ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＭ＿０００５８６．３）、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、ＲＤＥ  Ｃａｒを製造する。ＩＬ−２  ３’−ＵＴＲをコードする核酸を、適当な発現ベクターの抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットに改変する。使用するＩＬ−２、３’−ＵＴＲ配列は：
【０１９２】
【化１】
2021518747.tif 000003
【０１９３】
であった。
[000224]抗ＣＤ１９  ＲＤＥ  ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物を、日常的な方法によってＴ細胞の異なる集団（初代ヒトＴ細胞）にトランスフェクトし、適当な抗生物質（または他の選択スキーム）を使用してＴ細胞の安定な集団を選択する。抗ＣＤ１９  ＲＤＥ  ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９−／ＣＤ２２−／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９−／ＣＤ２２−／ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共インキュベーションして活性化し、脱ビーズ化後に静止状態に戻す。
【０１９４】
[000225]静止抗ＣＤ１９  ＲＤＥ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３−  Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥ  ＣＡＲ  Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。解糖活性化因子グルコースを、１．０ｍＭ〜１０ｍＭ（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。ＲＤＥ−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を２４時間一緒に増殖させる。培養物を洗浄し、次いで抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色し、その後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉ標的細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）をカウントする。これらの測定は、ＲＤＥ−ＣＡＲ発現の異なるレベルでのＲＤＥ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的細胞死滅速度（例えば、半減期）および増殖速度を同定するであろう。
【０１９５】
[000226]活性化抗ＣＤ１９  ＲＤＥ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３−  Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥ  ＣＡＲ  Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。解糖活性化因子グルコースを、１．０ｍＭ〜１０ｍＭ（１ｍＭ、２、ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。ＲＤＥ−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を２４時間一緒に増殖させる。培地からの試料を採取し、ＩＬ−２についてＥＬＩＳＡによってテストする。
【０１９６】
[000227]対照として活性化抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３−  Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲ  Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。解糖活性化因子グルコースを、１．０ｍＭ〜１０ｍＭ（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を２４時間一緒に増殖させる。培養物を洗浄し、次いで抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色し、その後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉ標的細胞）およびＣＤ３＋細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）をカウントする。
【０１９７】
[000228]対照として、活性化抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３−  Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲ  Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。解糖活性化因子グルコースを、１．０ｍＭ〜１０ｍＭ（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を４８時間一緒に増殖させる。培地からの試料を採取し、ＩＬ−２についてＥＬＩＳＡによってテストする。
【０１９８】
実施例２
ＲＤＥからのマイクロＲＮＡ結合部位の除去
[000229]ＩＬ−２の３’−ＵＴＲ由来のＡＵリッチエレメントは、ｍｉｒ１８１およびｍｉｒ１８６マイクロＲＮＡ結合部位を有する。マイクロＲＮＡ部位の異なる組み合わせをＩＬ−２の３’−ＵＴＲから除去した。ＭＩＲ１８６マイクロＲＮＡ部位をＩＬ−２の３’−ＵＴＲから除去した場合、このＵＴＲを含む構築物からの発現のダイナミックレンジは、５０倍増加した。修飾ＩＬ−２、３’−ＵＴＲは配列中のＣＴＴをＧＡＡと置き換え、以下に示される（配列中、新たなＧＡＡが下線を引かれている）：
【０１９９】
【化２】
2021518747.tif 000004
【０２００】
[000230]ＩＦＮｇの３’ＵＴＲ由来のＡＵリッチエレメントも、ｍｉｒ１２５として特徴付けられるマイクロＲＮＡ結合部位を有する。ＩＦＮｇ  ＲＤＥの配列は：
【０２０１】
【化３】
2021518747.tif 000005
【０２０２】
である。
[000231]マイクロＲＮＡ部位の異なる組み合わせをＩＦＮｇの３’ＵＴＲから除去し、発現の増加についてテストした。ｍｉｒ１２５  マイクロＲＮＡ部位をＩＦＮ−γの３’−ＵＴＲから除去した場合、このＵＴＲを含む構築物からの発現率は増加する。
【０２０３】
[000232]ＲＤＥ−ＧＦＰとマイクロＲＮＡ部位でトランスフェクトしたＴ細胞中のＧＦＰの発現を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化後に、マイクロＲＮＡ部位を除去してあるＲＤＥ−ＧＦＰを含むＴ細胞中のＧＦＰの発現と比べる。マイクロＲＮＡ部位の除去は、マイクロＲＮＡ部位を含む細胞と比べて、２４時間後、ＧＦＰの発現を２〜５倍増加させた。
【０２０４】
実施例３
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用したＤＬＢＣＬへのペイロード送達
[000233]実施例６の抗ＣＤ１９  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球および抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞リンパ球をこの例で使用する。これらのＣＡＲ  Ｔリンパ球を、ＭＩＲ１８６部位の除去によって修飾してあるＩＬ２の３’−ＵＴＲの制御下でＰＤ−１阻害剤をコードする構築物を含むようにさらに改変する。構築物によって発現されるＰＤ−１阻害剤には、例えば、ペンブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、アテゾリズマブ（テセントリク（登録商標））、ＢＭＳ−９３６５５８、ランブロリズマブ、またはこれらの薬物に由来するポリペプチドが含まれる。構築物によって発現され得る他のＰＤ−１阻害剤には、Ｈｅｒｂｓｔら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、３１：３０００頁（２０１３）；Ｈｅｅｒｙら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、３２：５ｓ、３０６４頁（２０１４）；Ｐｏｗｌｅｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、３２：５ｓ、５０１１頁（２０１４）；Ｓｅｇａｌら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、３２：５ｓ、３００２頁（２０１４）、または米国特許第８，７３５，５５３号；第８，６１７，５４６号；第８，００８，４４９号；第８，７４１，２９５号；第８，５５２，１５４号；第８，３５４，５０９号；第８，７７９，１０５号；第７，５６３，８６９号；第８，２８７，８５６号；第８，９２７，６９７号；第８，０８８，９０５号；第７，５９５，０４８号；第８，１６８，１７９号；第６，８０８，７１０号；第７，９４３，７４３号；第８，２４６，９５５号；および第８，２１７，１４９号に開示されているものが含まれる。
【０２０５】
[000234]抗ＣＤ１９  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ／ＰＤ−１を含むＴ細胞集団（ＣＤ１９−／ＣＤ２２−／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９  ＣＡＲ／ＰＤ−１を含むＴ細胞集団（ＣＤ１９−／ＣＤ２２−／ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共インキュベーションして活性化する。抗ＣＤ１９  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤または抗ＣＤ１９  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤を含むＴ細胞を、テオフィリンと０．７５および２５０μＭで７２時間インキュベートした。活性化抗ＣＤ１９  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ／ＰＤ−１  Ｔ細胞または抗ＣＤ１９  ＣＡＲ／ＰＤ−１  Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３−  Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔ  ＣＡＲ／ＰＤ−１  Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養した。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、０μＭ、７５μＭ、および２５０μＭの濃度で培地で維持する。Ｓｍａｒｔ−ＣＡＲ／ＰＤ−１  Ｔ細胞またはＣＡＲ／ＰＤ−１  Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を１８時間一緒に増殖させる。培養物を洗浄し、次いで抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色し、その後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉ標的細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）をカウントする。また、培地からの試料を６、１２および１８時間で採取し、ＰＤ−１阻害剤についてＥＬＩＳＡによってテストする。
【０２０６】
実施例４
抗ＣＤ１３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用したＡＭＬへのペイロード送達
[000235]抗ＣＤ２０細胞外ドメインを置き換え、抗ＣＤ１３３  ｍＡｂ  ２９３Ｃ３−ＳＤＩＥを細胞外エレメントに使用して（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｒｏｔｈｆｅｌｄｅｒら、２０１５、ａｓｈ．  ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１５／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ８１１２１．ｈｔｍｌ）、Ｂｕｄｄｅ  ２０１３（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｄｄｅら  ＰＬｏＳ１、２０１３  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２）に記載された抗ＣＤ２０  ＣＡＲカセットを使用して、ＣＡＲを製造する。抗ＣＤ１３３  ＣＡＲもＲＮＡ制御デバイス、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９をコードすることができる（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷｉｎおよびＳｍｏｌｋｅ  ２００７  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０４（３６）：１４２８３〜８８頁）。抗ＣＤ２０  ＣＡＲカセットをコードする核酸を改変して、抗ＣＤ２０細胞外ドメインを抗ＣＤ１３３エレメントと置き換え、場合によりＲＮＡ制御デバイスもカセットに改変する。ＲＮＡ制御デバイスを含むまたは含まない抗ＣＤ１３３  ＣＡＲを、適当な発現ベクターにクローニングする。
【０２０７】
[000236]これらの抗ＣＤ１３３  ＣＡＲおよび抗ＣＤ１３３  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ構築物を、日常的な方法によってＴリンパ球（ジャーカット細胞および／または初代ヒトＴリンパ球）によってトランスフェクトし、適当な抗生物質（または他の選択スキーム）を使用してＴリンパ球の安定な集団を選択する。
【０２０８】
[000237]これらのＣＡＲ  Ｔリンパ球を、ＭＩＲ１８６部位の除去によって修飾してあるＩＬ２の３’−ＵＴＲ由来のＲＤＥの制御下でＰＤ−１阻害剤をコードする構築物を含むようにさらに改変する。構築物によって発現されるＰＤ−１阻害剤には、例えば、ペンブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、アテゾリズマブ（テセントリク（登録商標））、ＢＭＳ−９３６５５８、ランブロリズマブ、またはこれらの薬物に由来するポリペプチドが含まれる。構築物によって発現され得る他のＰＤ−１阻害剤には、Ｈｅｒｂｓｔら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、３１：３０００頁（２０１３）；Ｈｅｅｒｙら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、３２：５ｓ、３０６４頁（２０１４）；Ｐｏｗｌｅｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、３２：５ｓ、５０１１頁（２０１４）；Ｓｅｇａｌら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、３２：５ｓ、３００２頁（２０１４）、または米国特許第８，７３５，５５３号；第８，６１７，５４６号；第８，００８，４４９号；第８，７４１，２９５号；第８，５５２，１５４号；第８，３５４，５０９号；第８，７７９，１０５号；第７，５６３，８６９号；第８，２８７，８５６号；第８，９２７，６９７号；第８，０８８，９０５号；第７，５９５，０４８号；第８，１６８，１７９号；第６，８０８，７１０号；第７，９４３，７４３号；第８，２４６，９５５号；および第８，２１７，１４９号に開示されているものが含まれる。
【０２０９】
[000238]抗ＣＤ１３３  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤または抗ＣＤ１３３  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤を含むＴリンパ球集団（ＣＤ２０−／ＣＤ２２−／ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共インキュベーションして活性化する。
【０２１０】
[000239]活性化抗ＣＤ１３３  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤または抗ＣＤ１３３  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤Ｔリンパ球を、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３−  ＡＭＬ標的細胞（例えば、Ｕ９３７、ＭＶ４−１１、ＭＯＬＭ−１４、ＨＬ−６０および／またはＫＧｌａ）と、２：１、５：１、および１０：１の抗ＣＤ１３３  ＣＡＲおよび／または抗ＣＤ１３３  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球：ＡＭＬ標的比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、５００μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で培地に添加する（より低いまたはより大きな濃度を使用して、Ｓｍａｒｔ−ＣＡＲ活性を所望のレベルに滴定することができる）。抗ＣＤ１３３  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤および／または抗ＣＤ１３３  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤  Ｔリンパ球およびＡＭＬ細胞を４８時間一緒に増殖させる。培養物を洗浄し、次いで抗ＣＤ１３３および抗ＣＤ３試薬で染色し、その後、ＣＤ１３３＋（ＡＭＬ標的細胞）およびＣＤ３＋細胞（抗ＣＤ１３３  ＣＡＲ、抗ＣＤ１３３  ＤＥ−ＣＡＲ、抗ＣＤ１３３  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ、および／または抗ＣＤ１３３  ＤＥ−Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球）をカウントする。これらの測定は、ＣＡＲ発現の異なるレベルでの抗ＣＤ１３３  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤および／または抗ＣＤ１３３  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ／ＰＤ−１阻害剤Ｔリンパ球の標的細胞死滅速度（例えば、半減期）および増殖速度を同定するであろう。また、培地からの試料を１２、２４、２６および４８時間で採取し、ＰＤ−１阻害剤についてＥＬＩＳＡによってテストする。
【０２１１】
実施例５
第２の導入遺伝子を発現させるためのＲＤＥ構築物
[000240]ＷＯ  ２０１２／０７９０００、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ−ＲＤＥ１（ＩＦＮｇ由来の３’−ＵＴＲ）インサートを使用して、構築物を製造した。これらの２つのインサート／カセットを、同じレンチウイルス構築物に入れた。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットおよびＧＦＰ−ＲＤＥを含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は２つのインサート／カセットの間に位置する。ＧＦＰ−ＲＤＥインサートの制御領域はＭｉｎＰであり、ＲＤＥはＩＦＮｇの内因性３’−ＵＴＲであった。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤ（上記に記載の）であった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、二シストロン性構築物で形質導入した。
【０２１２】
[000241]形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻し、次いで刺激後、以下のようにテストした。「非刺激」セットについては、形質導入されたＴ細胞を単独で培地で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」セットおよび「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」セットについては、ＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ  Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入されたＴ細胞と２４時間インキュベートした。２４時間時点で、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９についてＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中のこれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定した。
【０２１３】
[000242]形質導入されたＴ細胞は、１．０％〜６．５％のＲａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）と共に培養した場合、蛍光の増加を示し（約６．５倍）、１．０％〜４．４％のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）と共に培養した場合、蛍光の増加を示した（約４．４倍）。形質転換されたＴ細胞は、０．９％〜８４．８％のＲａｊｉ細胞と共に培養した場合、および０．９％〜９０．８％のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共に培養した場合に、集団中の活性化細胞の変化を示した。
【０２１４】
実施例６
第２の導入遺伝子を発現させるための修飾ＲＤＥ２構築物
[000243]実施例１１および１２に記載される抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ−ＲＤＥ２．１（ＩＬ−２  ＲＤＥ）インサートを使用して、構築物を製造した。ＲＤＥ２．１を修飾してＭＩＲ１８６マイクロＲＮＡ部位を除去し、ＲＤＥ２として使用したＩＬ−２の３’−ＵＴＲ由来のヌクレオチドを変更した。
【０２１５】
[000244]これらの２つのインサート／カセットを、同じレンチウイルス構築物に入れた。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットおよびＧＦＰ−ＲＤＥを含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は２つのインサート／カセットの間に位置する。ＧＦＰ−ＲＤＥインサートの制御領域はＭｉｎＰであった。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤ（上記に記載の）であった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、二シストロン性構築物で形質導入した。
【０２１６】
[000245]形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻し、次いで刺激後、以下のようにテストした。「非刺激」セットについては、形質導入されたＴ細胞を単独で培地で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」セットおよび「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」セットについては、ＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ  Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入されたＴ細胞と２４時間インキュベートした。２４時間時点で、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９についてＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中のこれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定した。
【０２１７】
[000246]形質導入されたＴ細胞は、３．９％〜１２．１％のＲａｊｉ細胞と共に培養した場合、および３．９％〜１１．１％のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共に培養した場合、集団中の活性化細胞の変化を示した。
【０２１８】
実施例７
ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現させるためのＲＤＥ構築物
[000247]ＷＯ  ２０１２／０７９０００、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ−ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’−ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ１）インサートまたはルシフェラーゼ−３’−ＵＴＲ（細胞の代謝状態に応答した示差的導入遺伝子翻訳を付与しない３’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ）を使用して、構築物を製造した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットおよびルシフェラーゼ−ＲＤＥ１を含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は２つのインサート／カセットの間に位置する。ルシフェラーゼ−ＲＤＥ１インサートおよびルシフェラーゼ−３’−ＵＴＲの制御領域は：
【０２１９】
【化４】
2021518747.tif 000006
【０２２０】
の配列を有するＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのどちらかであった。
抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、二シストロン性構築物で形質導入した。
【０２２１】
[000248]形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻し、次いで刺激後、以下のようにテストした。「非刺激」セットについては、形質導入されたＴ細胞を単独で培地で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」セットおよび「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」セットについては、ＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ  Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入されたＴ細胞と２４時間インキュベートした。２４時間時点で、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９についてＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中のこれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定した。
【０２２２】
[000249]図２は、休止しているＴ細胞の生物発光と比較して、形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）と共に培養した場合、またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）と共に培養した場合、生物発光が増加することを示している。ＮＦＡＴプロモーターおよびＩＦＮｇの３’−ＵＴＲ（Ｇｏｌｄ１）を含むＴ細胞は、ＴＣＲ刺激と比べてＣＡＲ刺激からのより大きなオン−オフ応答を示した。全ての条件下で、Ｇｏｌｄ１を含むＴ細胞は、ＩＦＮｇの３’ＵＴＲ（３’−ＵＴＲ）によって制御されないルシフェラーゼを用いた同じ条件（および同じプロモーター）下のＴ細胞より生物発光の量が低かった。
【０２２３】
実施例８
ルシフェラーゼを制御するＲＤＥの比較
[000250]ＷＯ  ２０１２／０７９０００、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ−ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’−ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ１）インサート、ルシフェラーゼ−ＲＤＥ２（ＩＬ−２の３’−ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ２）インサート、ルシフェラーゼ−ＲＤＥ３（ｍｉｒ１８６部位を除去するために上記に記載のように修飾されたＩＬ−２の３’−ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ３）、またはルシフェラーゼ−３’−ＵＴＲ（細胞の代謝状態に応答した示差的導入遺伝子翻訳を付与しない３’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ）を使用して、構築物を製造した。図３に示されたこれらのインサート／カセットの組み合わせを、類似のレンチウイルス構築物に入れた。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットおよびルシフェラーゼ−ＲＤＥを含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は２つのインサート／カセットの間に位置する。ルシフェラーゼ−ＲＤＥインサートおよびルシフェラーゼ−３’−ＵＴＲの制御領域は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのどちらかであった。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットの制御領域はＭＮＤプロモーターであり、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、二シストロン性構築物で形質導入した。
【０２２４】
[000251]形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻し、次いで刺激後、以下のようにテストした。「非刺激」セットについては、形質導入されたＴ細胞を単独で培地で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」セットについては、ＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ  Ｂ細胞を、形質導入されたＴ細胞と２４時間インキュベートした。２４時間時点で、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９についてＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中のこれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定した。
【０２２５】
[000252]図３は、ＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）、ＲＤＥ２（Ｇｏｌｄ２）、またはＲＤＥ３（Ｇｏｌｄ３）を含む構築物に関して、休止しているＴ細胞の生物発光と比較して、形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）と共に培養した場合、生物発光が増加したことを示している。ＮＦＡＴプロモーターおよびＲＤＥ１を含むＴ細胞は、ＭｉｎＰプロモーターおよび対応するＲＤＥを含むＴ細胞より大きなオン−オフ応答を示した。全ての条件下で、ルシフェラーゼを制御するＲＤＥを含むＴ細胞は、ＲＤＥによって制御されないルシフェラーゼカセットを含むＴ細胞より生物発光量が低かった。ＭｉｎＰプロモーターと組み合わせると、ＲＤＥ１はＣＡＲ刺激により生物発光における４．１倍の増加を示し、ＲＤＥ２は生物発光における１．８倍の増加を示し、ＲＤＥ３は１．４倍の増加を示した。ＮＦＡＴプロモーターと組み合わせると、ＲＤＥ１はＣＡＲ刺激により生物発光における８．５倍の増加を示し、ＲＤＥ２は生物発光における３．１倍の増加を示し、ＲＤＥ３は１．３倍の増加を示した。どちらのプロモーターでも、ＲＤＥ３構築物は最も高い生物発光量を示し、ＲＤＥ１構築物は最も低い生物発光量を示し、ＲＤＥ２構築物はＲＤＥ３とＲＤＥ１の間の生物発光量を示した。
【０２２６】
実施例９
ＩＬ−１２を発現するためのＲＤＥ構築物
[000253]ＷＯ  ２０１２／０７９０００、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセット、およびＩＬ−１２−ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’−ＵＴＲ）インサートまたはＩＬ−１２  ３’−ＵＴＲ（細胞の代謝状態に応答した示差的導入遺伝子翻訳を付与しない３’−ＵＴＲ）を使用して、構築物を製造した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットおよびＩＬ−１２−ＲＤＥ１を含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は２つのインサート／カセットの間に位置する。ＩＬ−１２−ＲＤＥ１インサートおよびＩＬ−１２  ３’−ＵＴＲの制御領域は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのどちらかであった。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットの制御領域はＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、二シストロン性構築物で形質導入した。
【０２２７】
[000254]形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻し、次いで刺激後、以下のようにテストした。「非刺激」セットについては、形質導入されたＴ細胞を単独で培地で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ  共培養」セットについては、ＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ  Ｂ細胞を、形質導入されたＴ細胞と２４時間インキュベートした。２４時間時点で、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９についてＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーに供してこれらのマーカーを測定した。Ｔ細胞でのＩＬ−１２発現をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２２８】
[000255]図４は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターによって制御される構築物を使用すると、休止しているＴ細胞のＩＬ−１２発現と比較して、形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）と共に培養した場合、ＩＬ−１２発現が増加したことを示している。ＮＦＡＴプロモーターおよびＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）を含むＴ細胞は、ＣＡＲ刺激に対して休止から１６８倍のＩＬ−１２発現における変化を示した。ＮＦＡＴプロモーターおよび３’−ＵＴＲ（ＣＡＲ刺激に応答性でない、３’−ＵＴＲ）を含むＴ細胞は、発現における５０倍の変化を示し、ＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）を含むｍｉｎＰプロモーターは発現における６．３倍の変化を示した。
【０２２９】
実施例１０
ＡＵエレメントおよび定常状態発現
[000256]ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを含む構築物を製造した。使用した異なるＲＤＥは、ＡＵ  ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ  １３（ＩＬ−５）、ＡＵ  １４（ＩＬ−６）、ＡＵ  １５（ＩＬ−９）、ＡＵ  １６（ＩＬ−１０）、ＡＵ  １７（ＩＬ−１３）、およびＡＵ  １０１（ＩＦＮｇ）であった。これらのルシフェラーゼ−ＡＵ構築物を初代Ｔ細胞に形質導入した。細胞を休止段階に戻した後、細胞を播種し、偽誘導し（基底）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で誘導（活性化）した。活性化後２４時間時点で、各々におけるルシフェラーゼ単位の量を測定した。これらの量を図５の棒グラフにプロットする。
【０２３０】
[000257]この例でのＡＵエレメントは、異なる基底発現レベル、異なる誘導発現レベル（２４時間時点）、および異なる誘導倍率レベルを有した。ＡＵ構築物は、異なる基底発現量、異なる誘導発現量および異なる量の誘導倍率（またはダイナミックレンジ）を示した。
【０２３１】
実施例１１
ＡＵエレメントおよび発現パラメータ
[000258]ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを含む構築物を製造した。使用した異なるＲＤＥは、ＡＵ  ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ  ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ  ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ  ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ  １０（Ｍｙｃ）、ＡＵ  １９（ＴＭＥＭ−２１９）、ＡＵ  ２０（ＴＭＥＭ−２１９ｓｎｐ）、ＡＵ  ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ  ２２（ＳＥＭ−Ａ４Ｄ）、ＡＵ  ２３（ＣＤＣ４２−ＳＥ２）、およびＡＵ  １０１（ＩＦＮｇ）であった。これらのルシフェラーゼ−ＡＵ構築物を初代Ｔ細胞に形質導入した。細胞を休止段階に戻した後、細胞を播種し、処理しないか（基底）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化（活性化）した。活性化後２４時間時点で、各々におけるルシフェラーゼ単位の量を測定した。これらの量を図６の棒グラフにプロットする。あるいは、細胞を休止段階に戻した後、各時点：１日、３日、６日および８日で測定するために、細胞を９６ウェルプレートに４通りに播種した。細胞を処理しないかまたは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化し、ルシフェラーゼ活性を１日、３日、６日および８日時点で測定した。これらの結果を図７の棒グラフにプロットし、以下の表１に示す。図８は、棒グラフにプロットした選択されたデータを示している。以下の表１の括弧の中の数は、１日目のルシフェラーゼ単位で割った３、６、および８日目のルシフェラーゼ単位である。
【０２３２】
【表１】
2021518747.tif 000007
【０２３３】
[000259]図６、図７および表１のＡＵエレメントは、異なる基底発現レベル、異なる誘導発現レベル（２４時間時点）、および異なる誘導倍率レベルを有した。基底発現レベルは、これらのＡＵエレメント（ＡＵ  ７〜ＡＵ  ２０）に関して約２０００倍の範囲にわたって異なり、誘導発現レベルは、約５５００倍の範囲にわたって異なった（ＡＵ  ７〜ＡＵ  １０）。構築物の基底発現は、ＡＵ  ７（ＳＬＣ２Ａ１）の１３９０からＡＵ  ２０（ＴＭＥＭ−２１９ｓｎｐ）の２，９２７，０００にわたった。活性化発現は、ＡＵ  ７（１日目）の４９１４からＡＵ  １０（８日目）の２７，８００，００００にわたった。図８および表１は、いくつかのＡＵエレメント、例えば、ＡＵ  １０１（ＩＦＮｇ）、ＡＵ  ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ  ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ  ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ  ２１（ＣＣＲ７）、およびＡＵ  ２３（ＣＤＣ４２−ＳＥ２）は、より低レベルの産出を有したことを示している。いくつかのＡＵエレメントは、中間の産出量を有した：ＡＵ  １９（ＴＭＥＭ−２１９）およびＡＵ  ２２（ＳＥＭ−Ａ４Ｄ）。そしていくつかのＡＵエレメントは、高い産出を有した：ＡＵ  ２０（ＴＭＥＭ−２１９ｓｎｐ）およびＡＵ  １０（Ｍｙｃ）。
【０２３４】
[000260]ルシフェラーゼデータは、各ルシフェラーゼ−ＡＵ構築物のダイナミックレンジ（誘導倍率または活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）についても分析した。１、３／４（活性化発現は３日目に測定し、基底発現は４日目に測定した）、６および８日時点の各ＡＵ構築物のダイナミックレンジ（誘導倍率）。このデータを以下に表２に示し、図９および図１０の棒グラフにプロットする。
【０２３５】
【表２】
2021518747.tif 000008
【０２３６】
[000261]１日時点でダイナミックレンジ（誘導倍率＝活性化／基底）は、約１（ＡＵ  ２２）〜約１７（ＡＵ  １０１）にわたった。３／４日時点で、ダイナミックレンジは、約４．５（ＡＵ  ２２）〜約２７（ＡＵ２１）まで異なった。６日時点で、ダイナミックレンジは約７（ＡＵ  ２２）〜約２９（ＡＵ  ２１）まで異なった。８日目、ダイナミックレンジは、約７（ＡＵ２２）〜約３０（ＡＵ  ２１）まで異なった。ＡＵ構築物は、いくつかの関連パターンを示した。ＡＵ  ２およびＡＵ  １０１は、１日目にダイナミックレンジの急速な増加を示し、次いでダイナミックレンジは６および８日目に減少した。ＡＵ  ５およびＡＵ  ２１は、０日目から３／４日目まで増加するダイナミックレンジを示し、次いでダイナミックレンジは６から８日目まで維持される。ＡＵ  ３、ＡＵ  ２０、ＡＵ  １０、ＡＵ  ７およびＡＵ  ２３は、０日目から６日目まで上昇するダイナミックレンジを示し、次いでダイナミックレンジは８日目に減少した。ＡＵ  １９、およびＡＵ  ２２は、０日目から８日目まで上昇するダイナミックレンジを示した。
【０２３７】
[000262]ＡＵ  ２１およびＡＵ  ２３は、加速するダイナミックレンジを示し、これらのＡＵ構築物は基底発現も低かった（１日目＝それぞれ、４８６５および２７３６３）。ＡＵ  ２およびＡＵ  １０１は、２４時間から７２時間まで減少するダイナミックレンジを示し、これらのＡＵエレメントは基底発現も低かった。ＡＵ  ５およびＡＵ  ２０も、１日目から３／４日目まで減少するダイナミックレンジを示し（ＡＵ  ２およびＡＵ  １０１より発現は多かったが）、ＡＵ  ５が低い基底発現を有したのに対し、ＡＵ  ２０は高い基底発現を有した。ＡＵ  １０、ＡＵ  １９およびＡＵ  ２２は、１日目から３／４日目まで一貫したダイナミックレンジを示し、高い基底レベルの発現を有した。ＡＵ  ３およびＡＵ  ７も、１日目から３／４日目まで一貫したダイナミックレンジを有し、低い基底発現レベルを有した。
【０２３８】
[000263]上記のデータは、異なるＡＵエレメントが、１〜８日目の発現に対し異なる時間的効果を有することを示している。いくつかのＡＵエレメントは、時間範囲の異なる部分にわたって加速するダイナミックレンジを示す。ＡＵエレメントは、異なる総発現量（Ｃｍａｘ）および異なる最大発現までの時間（Ｔｍａｘ）を示す。ＡＵエレメントはまた、異なる最大ダイナミックレンジおよびこれらの最大に達するまでの時間も示す。これらの異なる発現動態は、カスタマイズされた基底、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ダイナミックレンジ、および最大ダイナミックレンジまでの時間を所望の導入遺伝子に提供するのに使用することができる。これらの異なる動態はまた、細胞の活性化後の細胞において時間的に異なる発現を２つの導入遺伝子に提供するのに使用することもできる。
【０２３９】
実施例１２
グルコースおよびガラクトースによるＡＵエレメント制御
[000264]ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを用いて、構築物を製造した。ＲＤＥは、細胞の解糖状態に応答性のＡＵエレメントであった。ＡＵエレメント−ルシフェラーゼ構築物をＴ細胞に形質導入した。細胞が休止状態に達した後、細胞をウェルに分け、グルコースまたはガラクトースのどちらかを含む培地を送液した。ルシフェラーゼ活性を３および５日目に測定した。これらの結果を図１１の棒グラフに示す。結果は、ガラクトースと比べて、グルコースはルシフェラーゼの発現を増加させ、発現量は３〜５日目に増加したことを示している。３日目、グルコース処理細胞は、５日目にガラクトース処理細胞より１５Ｘ多いルシフェラーゼ発現を有し、これは２７Ｘ多い発現にまでなった。
【０２４０】
実施例１３
ウイルスペイロードの送達および設計
[000265]ＷＯ  ２０１２／０７９０００、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された第三世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセット、およびＲＮＡ制御デバイス、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷｉｎおよびＳｍｏｌｋｅ  ２００７  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０４（３６）：１４２８３〜８８頁）を使用して、Ｓｍａｒｔ  Ｃａｒを製造する。３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９制御デバイスをコードする核酸を、適当な発現ベクターの抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットに改変する。抗ＣＤ１９  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物を、日常的な方法によってＴ細胞の異なる集団（ジャーカット細胞および／または初代ヒトＴ細胞）にトランスフェクトし、適当な抗生物質（または他の選択スキーム）を使用してＴ細胞の安定な集団を選択する。抗ＣＤ１９  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９−／ＣＤ２２−／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９−／ＣＤ２２−／ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共インキュベーションして活性化する。
【０２４１】
[000266]第三世代のレンチウイルスパッケージング、エンベロープ、およびトランスファープラスミドをａｄｄｇｅｎｅから入手する。パッケージングプラスミドをコードするＲｅｖを改変して、Ｒｅｖの３’−ＵＴＲにＡＵ１０１（ＩＮＦｇ）ＲＤＥを含める。修飾Ｒｅｖパッケージングプラスミド、Ｇａｇ  Ｐｏｌパッケージングプラスミド、およびエンベローププラスミドを、抗ＣＤ１９  Ｔリンパ球細胞にトランスフェクトする。トランスファープラスミドを改変して、トランスファープラスミドに導入遺伝子としてのＧＦＰを含める。このトランスファープラスミドも、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔリンパ球細胞にトランスフェクトする。
【０２４２】
[000267]抗ＣＤ１９  Ｓｍａｒｔ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３−  Ｒａｍｏｓ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔ  ＣＡＲ  Ｔリンパ球：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、２μＭ〜２ｍＭ（２μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、１ｍＭ、および２ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。Ｓｍａｒｔ−ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を４８時間一緒に増殖させる。
【０２４３】
[000268]インキュベーション期間の最後に、培地をＴリンパ球およびＲａｊｉ細胞から分離する。上清中のウイルス力価を、抗レンチウイルス抗体試薬を用いたＥＬＩＳＡを使用して測定する。ウイルスによる感染力およびペイロード送達を、ウイルスでＨＥＫ２９３細胞を感染させてテストし、適切なインキュベーション時間後に、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞からのＧＦＰ蛍光を測定する。
【０２４４】
実施例１４
マウスリンパ腫モデルにおけるＧｏｌｄを使用するペイロード送達
[000269]ＷＯ  ２０１２／０７９０００、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ−ＡＵ（ＩＬ−６の３’ＵＴＲ）インサートを使用して、構築物を製造した。これらの構築物を、二シストロン性レンチウイルス構築物に入れた。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットおよびルシフェラーゼ−ＲＤＥを含むインサートは、二シストロン性ベクターで反対方向に転写され、各々の制御領域は２つのインサート／カセットの間に位置する。ルシフェラーゼ−ＲＤＥインサートの制御領域はＭｉｎＰプロモーターであった。抗ＣＤ１９  ＣＡＲカセットの制御領域はＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、二シストロン性構築物で形質導入した。
【０２４５】
[000270]形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻し、次いで刺激後、以下のようにテストした。「非刺激」セットについては、形質導入されたＴ細胞を単独で培地で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」セットについては、ＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ  Ｂ細胞を、形質導入されたＴ細胞と２４時間インキュベートした。２４時間時点で、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９についてＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中のこれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定した。これらのインビトロ結果は、ＣＡＲによるＴ細胞の活性化後に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞がルシフェラーゼを作ることを示した。
【０２４６】
[000271]これらの抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞もリンパ腫のマウスモデルでテストした。ＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ細胞をＮＳＧマウスの側腹部に移植した。腫瘍形成後、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞をマウスに注射し、マウスを発光についてスキャンした。マウスの画像化は、ＣＤ１９陽性腫瘍によって活性化されている抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞からの腫瘍部位の発光を示した。発光量は、Ｔ細胞が活性化されるにつれて時間とともに増加した。
【０２４７】
実施例１５
αｖβ６陽性固形腫瘍へのペイロード送達
[000272]あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３８５：１０６４〜７５頁（２００９）およびＫｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７７：３５９〜６９頁（２００９）に記載されるｋｎｏｔｔｉｎをコードする核酸を、ＣＡＲ成分ＣＤ４３ｚ、ＣＤ８Ｈｉｎｇｅ、ＣＤ８膜貫通、４１ＢＢ（ＣＤ２８または他のｃｏｓｔｉｍ）、およびＣＤ３ｚをコードする核酸に作動可能に連結して、抗αｖβ６  ＣＡＲをコードする核酸を作る。
【０２４８】
[000273]抗αｖβ６  ＣＡＲをコードする核酸を、日常的な方法によってＴ細胞（ジャーカット細胞および／または初代ヒトＴ細胞）にトランスフェクトし、適当な抗生物質（または他の選択スキーム）を使用してＴ細胞の安定な集団を選択する。抗αｖβ６  ＣＡＲを含むＴ細胞集団を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共インキュベーションして活性化する。これらの細胞も、ＩＮＦｇまたはＡＵ  ２１（ＣＣＲ７）由来のＧｏｌｄエレメントに作動可能に連結されたＩＬ−１２をコードする発現カセットをプロモーターＭｉｎ  Ｐの制御下に置いて改変する。
【０２４９】
[000274]抗αｖβ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、αｖβ６腫瘍細胞と共にウェル中でインキュベートする。インキュベーション後、抗αｖβ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞からのＩＬ−１２の分泌についてウェルをテストする。抗αｖβ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、αｖβ６腫瘍細胞とインキュベートするとＩＬ−１２を分泌し、対照は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が刺激されない場合、低分泌を示すかまたは分泌を示さない。
【０２５０】
実施例１６
ＡＭＬに対する抗Ｏｎｃｏ  ＣＤ４３  ＣＡＲ
[000275]腫瘍シアリル化ＣＤ４３の一本鎖抗体を、抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３抗体を使用して製造した。この一本鎖抗体をコードする核酸を、ＣＡＲ成分ＣＤ４３ｚ、ＣＤ８Ｈｉｎｇｅ、ＣＤ８膜貫通、４１ＢＢ（ＣＤ２８または他のｃｏｓｔｉｍ）、およびＣＤ３ｚをコードする核酸と組み合わせて、抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３  ＣＡＲをコードする核酸を作った。
【０２５１】
[000276]抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３  ＣＡＲをコードする核酸を、日常的な方法によってＴ細胞（ジャーカット細胞および／または初代ヒトＴ細胞）にトランスフェクトし、適当な抗生物質（または他の選択スキーム）を使用してＴ細胞の安定な集団を選択する。抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３  ＣＡＲを含むＴ細胞集団を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共インキュベーションして活性化する。
【０２５２】
実施例１７
ＣＤ４３陽性ＡＭＬへのペイロード送達
[000277]ＩＮＦｇまたはＡＵ  ２１（ＣＣＲ７）由来のＧｏｌｄエレメントに作動可能に連結されたＩＬ−１２をコードする発現カセットをプロモーターＭｉｎ  Ｐの制御下に置き、抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３  ＣＡＲ  Ｔ細胞に改変する。
【０２５３】
[000278]抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＡＭＬ細胞と共にウェル中でインキュベートする。インキュベーション後、抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３  ＣＡＲ  Ｔ細胞からのＩＬ−１２の分泌についてウェルをテストする。抗腫瘍シアリル化ＣＤ４３  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＡＭＬ細胞とインキュベートするとＩＬ−１２を分泌し、対照は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が刺激されない場合、低分泌を示すかまたは分泌を示さない。
【０２５４】
[000279]本明細書に論じられ、引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。記載された特定の方法論、プロトコルおよび材料は異なり得るため、開示される発明は、これらに限定されないことが理解される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【０２５５】
[000280]当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、またはこれを確認することができる。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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