(57)【要約】本明細書中提供されるのは、標的核酸配列を検出するための方法及びシステムである。本方法は、標的核酸配列を含むオリゴヌクレオチドをトランスポゾン複合体と接触させること；トランスポザーゼを用いて、１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターをオリゴヌクレオチドに挿入すること；及び（ｃ）標的核酸配列を増幅すること、を含む。トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターを含むトランスポゾン配列とを含む場合がある。標的核酸配列は、挿入された１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターからの転写を介して、標的核酸配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成させることにより、増幅される場合がある。増幅された標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムを用いて検出可能である。【選択図】図１
2021528975.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列の検出法であって、以下：
（ａ）前記標的核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、トランスポゾン複合体と接触させること、ただし、前記トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むトランスポゾン配列とを含む；
（ｂ）前記トランスポザーゼを用いて、前記１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを、前記オリゴヌクレオチドに挿入すること；
（ｃ）前記挿入された１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからの転写を介して、前記標的核酸配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成させることにより、前記標的核酸配列を増幅すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
さらに、前記増幅された標的核酸を検出することを含む、請求項１に記載の方法．
【請求項３】
前記増幅された標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムを用いて検出される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、またはＴｎ７トランスポザーゼである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスポゾン配列は、１９塩基対のモザイクエンド（ＭＥ）Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列を２つ含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスポザーゼは、改変トランスポザーゼである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記改変トランスポザーゼは、３０〜４５℃で機能するように最適化されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記改変トランスポザーゼは、３５〜４０℃で機能するように最適化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較してより速い速度で前記オリゴヌクレオチドから放出するように最適化されている、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの前記オリゴヌクレオチドへの挿入は、無作為である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの前記二本鎖オリゴヌクレオチドへの挿入は、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのＧＣリッチ領域で生じる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムは、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａからなる群より選択される属の生物に由来するＣａｓ１３酵素を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃａｓ１３酵素は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＭＡ２０２０、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１７９、［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＳＭ  １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７（第二ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ  ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＦＳＬＭ６−０６３５、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ  Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＳＢ  １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＤＥ４４２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ  Ｃ−１０１３−ｂ、Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＣＨＫＣＩ００４、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種口腔分類群８７９株Ｆ０５５７、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１４４、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ種ＴＳＬ５−１、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＯＲ３７、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＹＡＢ３００１、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ３００７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｉｈｕａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ属菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｉｐａｒｉａ、及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍからなる群より選択される生物に由来するものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅された標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づく検出システムを用いて検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ１２に基づく検出システムは、Ｃａｓ１２ａまたはＣａｓ１２ｂ酵素を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃａｓ１２に基づく検出システムは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）属菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｉｎｉｓ、及びＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｈｅｎｉｓｃｉからなる群より選択される属の生物に由来するＣａｓ１２酵素を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、前記オリゴヌクレオチドを加熱することを必要としない、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的核酸配列の増幅は、一定温度で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸配列は、長さが、約２０〜３０、約３０〜４０、約４０〜５０、または約５０〜１００ヌクレオチドである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的核酸配列は、長さが、約１００〜２００、約１００〜５００、または約１００〜１０００ヌクレオチドである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的核酸配列は、長さが、約１０００〜２０００、約２０００〜３０００、約３０００〜４０００、または約４０００〜５０００ヌクレオチドである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、ゲル電気泳動、挿入色素検出、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、質量分析、リアルタイムＲＰＡ、リアルタイムＬＡＭＰ、リアルタイムＮＥＡＲ、リアルタイムＨＤＡ、リアルタイムＴＭＡ、リアルタイムＮＡＳＢＡ、及びＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫからなる群より選択される方法により、前記増幅された核酸を検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的核酸は、フェムトモル感度で検出される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的核酸は、アトモル感度で検出される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的核酸を含む前記オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及び合成二本鎖ＤＮＡからなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸を含む前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、かつ前記方法は、前記オリゴヌクレオチドを前記トランスポゾン複合体と接触させる前に逆転写工程を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的核酸配列は、試料に由来するものであり、かつ前記試料は、生体試料または環境試料である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記生体試料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液試料、あるいは任意の体分泌、漏出液、滲出液、または関節から得られる液体、あるいは皮膚または粘膜表面のスワブである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料は、ヒト患者から得られた血液、血漿、または血清である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料は、植物試料である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料は、未精製試料である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料は、精製試料である、請求項１から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
試料中の標的核酸配列を検出するシステムであって、以下：
ａ．トランスポゾン複合体、ただし前記トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むトランスポゾン配列とを含み、ただし前記トランスポザーゼは、前記１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを、前記標的核酸配列を含むオリゴヌクレオチドに挿入し；
ｂ．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ただし前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、前記挿入された１つまたは複数のＴ７プロモーターから前記標的核酸を転写し；ならびに
ｃ．前記転写された標的核酸を検出するＣＲＩＳＰＲに基づく検出システム、
を含む、前記システム。
【請求項３６】
前記ＣＲＩＳＰＲに基づく検出システムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３に基づく検出システムである、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３８】
前記トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼのバリアントである、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３９】
前記トランスポゾン配列は、１９塩基対のＭＥ  Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列を２つ含む、請求項３５から３８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４０】
前記ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムは、Ｃａｓ１３に基づくＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムである、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４１】
前記ＣＲＩＳＰＲに基づく検出システムは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づく検出システムである、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４２】
さらに、核酸増幅試薬を含む、請求項３５から４１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４３】
さらに、逆転写試薬を含む、請求項３５から４２のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月２６日出願の米国仮出願第６２／６９０，１６０号、及び２０１８年１１月１４日出願の米国仮出願第６２／７６７，０７７号の優先権を主張する。上記特定される出願の全内容は、本明細書により全体として本明細書中参照として援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により付与された認可番号ＭＨ１００７０６、ＭＨ１１００４９、及びＨＬ１４１２０１の下、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本明細書中開示される発明の対象は、概して、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系の使用と関連した、核酸増幅の方法、システム、及び迅速な診断方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
核酸は、生体情報の普遍的符号である。携帯型プラットフォームで、高感度かつ単一塩基特異性を持って核酸を迅速に検出できることは、多くの疾患の診断及びモニタリングに変革をもたらし、価値ある疫学的情報を提供し、一般化可能な科学ツールとして役立つ可能性がある。核酸検出の方法は数多く開発されてきたものの（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｐａｒｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｐａｒｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、それらは、感度、特異性、簡潔さ、及び速さの間で不可避のトレードオフを被っている。例えば、ｑＰＣＲアプローチは、高感度であるものの、高価な上に複雑な装置に依存しており、そのため実験室での高度に訓練されたオペレーターによる利用に限られている。核酸診断が様々な医療用途に適していることがますます明らかであることから、低費用で高特異性かつ高感度を提供する検出技術は、臨床及び基礎研究の場の両方で非常に有用であると思われる。
【０００５】
多くの核酸増幅アプローチは、様々な検出プラットフォームで利用可能である。その中でも、等温核酸増幅法は、極端な温度循環及び複雑な設備を用いない増幅のために開発されてきた。そのような方法として、核酸配列に基づく増幅法（ｎｕｃｌｅｉｃ−ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＰＡ）、ループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅法（ＨＤＡ）、またはニック酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）が挙げられる。しかしながら、これらの等温増幅アプローチは、依然として、最初の変性工程及び複数のプライマーセットを必要とする可能性がある。そのうえさらに、等温核酸増幅を携帯型プラットフォームと組み合わせた新規アプローチ（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；Ｐａｒｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）の場で高い検出感度を提供するものの、感度が低いために幾分用途が制限される。
【発明の概要】
【０００６】
１つの態様において、本発明は、標的核酸配列を検出する方法を提供する。本方法は、以下（ａ）標的核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、トランスポゾン複合体と接触させること、（ｂ）トランスポザーゼを用いて、１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターをオリゴヌクレオチドに挿入すること、及び（ｃ）標的核酸配列を増幅すること、を含む。トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むトランスポゾン配列とを含むことができる。標的核酸配列は、挿入された１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターからの転写を介して、標的核酸配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成することにより、増幅させることができる。
【０００７】
実施形態によっては、本方法は、さらに、増幅された標的核酸を検出することを含む。増幅された標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムを用いて検出することができる。代替実施形態において、標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づく検出システムを用いて検出することができる。
【０００８】
実施形態によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ、または改変トランスポザーゼの場合がある。Ｔｎ５トランスポザーゼは、１９塩基対のモザイクエンド（ＭＥ）Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列を２つ有する場合がある。改変トランスポザーゼは、３０℃〜４５℃で機能するように最適化されている場合がある。改変トランスポザーゼは、３５℃〜４０℃で機能するように最適化されている場合がある。改変トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼよりも速い速度でオリゴヌクレオチドから放出されるように最適化されている場合がある。
【０００９】
１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターの二本鎖ポリヌクレオチドへの挿入は、無作為の場合もあれば、ＧＣリッチ領域で生じる場合もある。
【００１０】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムは、以下からなる群より選択される属の生物に由来するＣａｓ１３酵素を含む場合がある：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａ。
【００１１】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムは、以下からなる群に由来するＣａｓ１３酵素を含む場合がある：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＭＡ２０２０、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１７９、［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＳＭ  １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７（第二のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ  ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＦＳＬＭ６−０６３５、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ  Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＳＢ  １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＤＥ４４２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ  Ｃ−１０１３−ｂ、Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＣＨＫＣＩ００４、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種口腔分類群８７９株Ｆ０５５７、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１４４、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ種ＴＳＬ５−１、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＯＲ３７、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＹＡＢ３００１、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ３００７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｉｈｕａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ属菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｉｐａｒｉａ、及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ。
【００１２】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づく検出システムは、Ｃａｓ１２ａまたはＣａｓ１２ｂ酵素を含む場合がある。Ｃａｓ１２に基づく検出システムは、以下からなる群より選択される属の生物に由来するＣａｓ１２酵素を含む場合がある：Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）属菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｉｎｉｓ、及びＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｈｅｎｉｓｃｉ。
【００１３】
ある特定の実施形態において、本方法は、オリゴヌクレオチドを加熱する必要がない場合がある。
【００１４】
ある特定の実施形態において、標的核酸配列の増幅は、一定温度で行われる場合がある。
【００１５】
実施形態によっては、標的核酸配列は、長さが約２０〜３０、約３０〜４０、約４０〜５０、または約５０〜１００ヌクレオチドである。標的核酸配列は、長さが約１００〜２００、約１００〜５００、または約１００〜１０００ヌクレオチドの場合がある。標的核酸配列は、長さが約１０００〜２０００、約２０００〜３０００、約３０００〜４０００、または約４０００〜５０００ヌクレオチドの場合がある。
【００１６】
実施形態によっては、本方法は、さらに、ゲル電気泳動、挿入色素検出、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、質量分析、リアルタイムＲＰＡ、リアルタイムＬＡＭＰ、リアルタイムＮＥＡＲ、リアルタイムＨＤＡ、リアルタイムＴＭＡ、リアルタイムＮＡＳＢＡ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく検出法からなる群より選択される方法により、増幅された核酸を検出することを含む。
【００１７】
本方法は、フェムトモル感度で標的核酸の検出を可能にする場合がある。本方法は、アトモル感度で標的核酸の検出を可能にする場合がある。
【００１８】
標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または合成二本鎖ＤＮＡの場合がある。
【００１９】
標的核酸を含むオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである場合があり、本方法は、オリゴヌクレオチドをトランスポゾン複合体と接触させる前に、逆転写工程を含む場合がある。
【００２０】
実施形態によっては、試料は、生体試料または環境試料である場合がある。生体試料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌、漏出液、滲出液試料、または関節から得られる液体、あるいは皮膚または粘膜表面のスワブである場合がある。特定の実施形態において、試料は、ヒト患者から得られた血液、血漿、または血清である。
【００２１】
実施形態によっては、試料は、植物試料である場合がある。実施形態によっては、試料は、未精製試料である場合がある。実施形態によっては、試料は、精製試料である場合がある。
【００２２】
別の態様において、本発明は、試料中の標的核酸配列を検出するシステムを提供する。システムは、トランスポゾン複合体、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、及び転写された標的核酸を検出するためのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムを含む場合がある。代替実施形態において、検出システムは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づく検出システムである場合がある。
【００２３】
実施形態によっては、トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターを含むトランスポゾン配列とを含む場合がある。トランスポザーゼは、１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターを、標的核酸配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドに挿入する場合がある。
【００２４】
実施形態によっては、Ｔ７ポリメラーゼは、挿入された１つまたは複数のＴ７プロモーターから標的核酸を転写する場合がある。
【００２５】
特定の実施形態において、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼまたはそのバリアントである場合がある。実施形態によっては、トランスポゾン配列は、１９塩基対のＭＥＴｎ５トランスポザーゼ認識配列を２つ含む場合がある。
【００２６】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムは、Ｃａｓ１３に基づく検出システムである場合がある。
【００２７】
実施形態によっては、標的核酸配列を検出するためのシステムは、さらに、核酸増幅試薬を含む場合がある。実施形態によっては、システムは、さらに、逆転写を行うための試薬を含む場合がある。
【００２８】
例示の実施形態のこれら及び他の態様、目的、特長、及び利点は、図解される例示の実施形態についての以下の詳細な説明を考慮することで当業者に明らかとなるだろう。
【００２９】
本発明の原理が利用されている場合がある例示の実施形態について説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより、本発明の特長及び利点が理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−トランスポザーゼ増幅のワークフロー例の模式図である。
【００３１】
【図２】増幅された標的配列の様々な濃度及び温度での検出を示すグラフである。
【００３２】
本明細書中の図面は、例示のみを目的し、必ずしも縮尺どおりには描かれていない。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
一般的な定義
特に定義されない限り、本明細書中使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語と技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ４th  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１２）  （Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８７）  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）：  ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （１９９５）  （Ｍ．  Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．）：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）  （Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．）：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３  （Ｅ．  Ａ．  Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （１９８７）  （Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＩＸ、出版元Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔ、２００８（ＩＳＢＮ  ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、出版元Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、１９９４（ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、出版元ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．、１９９５（ＩＳＢＮ  ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４），  Ｍａｒｃｈ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９２）；及びＭａｒｔｅｎ  Ｈ．  Ｈｏｆｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｎ  ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１１）で見ることができる。
【００３４】
本明細書中使用される場合、単数形「ａ（不定冠詞）」、「ａｎ（不定冠詞）」、及び「ｔｈｅ（定冠詞）」は、文脈がそうではないと明確に指示しない限り、単数及び複数の指示対象の両方を含む。
【００３５】
「任意選択の」または「任意選択で」という用語は、その後に記載される事象、状況、または置き換えが発生する場合と発生しない場合があること、ならびにその記載にはその事象または状況が発生する場合及び発生しない場合が含まれることを意味する。
【００３６】
端点による数値範囲の列挙は、列挙された端点と同様に、それぞれの範囲内に包含される全ての数及び分数を含む。
【００３７】
「約」または「およそ」という用語は、本明細書中使用される場合、パラメーター、量、時間的持続期間などの測定可能な値を示す場合、その指定される値を基準にしたその値からの変動、例えば、指定される値を基準にしてその値から＋／−１０％以下、＋／−５％以下、＋／−１％以下、及び＋／−０．１％以下の変動を包含することを意味するが、ただし、そのような変動は、開示される本発明で生じるのに適切である場合に限る。当然のことながら、修飾語「約」または「およそ」が指す値は、それ自体も具体的であり、かつ好ましくは開示されている。
【００３８】
本明細書全体を通じて、「いくつかの実施形態」、「ある実施形態」、「実施形態の例」への言及は、実施形態に関連して記載された特定の特長、構造、または特性が本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における「実施形態によっては」、「ある実施形態において」、または「実施形態の例」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を示しているわけではないが、そうである場合もあり得る。さらに、特定の特長、構造、または特性は、本開示から当業者には明らかであると思われるとおり、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な様式で組み合わせられる場合がある。さらに、本明細書に記載される実施形態のあるものは、ある特長を含むが、他の実施形態に含まれる他の特長を含まないものの、異なる実施形態の特長の組み合わせは、本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のどれであっても、任意の組み合わせで使用され得る。
【００３９】
本明細書中使用される場合、「生体試料」は、全細胞及び／または生細胞及び／または細胞片を含有する場合がある。生体試料は、「体液」を含有する（またはそれに由来する）場合がある。本発明は、体液が、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血液血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（イヤーワックス）、乳糜、粥状液、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、女性射出液、胃酸、胃液、リンパ、粘液（鼻漏及び痰を含む）、心膜液、腹水、胸水、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（皮脂（ｓｋｉｎ  ｏｉｌ））、精液、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、吐瀉物、及びそれらの１種または複数の混合物から選択される実施形態を包含する。生体試料には、細胞培養物、体液、体液からの細胞培養物が含まれる。体液は、哺乳類生物から、例えば、穿刺により、または他の収集もしくは試料採取手技により、得ることができる。
【００４０】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書中同義で使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを示す。哺乳類として、マウス、サル、ヒト、家畜動物、スポーツ用動物、及びペットが挙げられるが、これらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏで得られたまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの子孫も、包含される。
【００４１】
「融解する」、「ほどける」、または「変性する」という用語は、核酸二本鎖の２つの相補性鎖の全部または一部が分離することを示す。
【００４２】
「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」は、本明細書中同義で使用され、ＤＮＡ切断のためのヌクレオチド鎖切断の触媒活性を保持する酵素を意味する。
【００４３】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書中「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称する）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書中「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称する）という用語は、当該分野で周知である。追加のガイダンスとして、本明細書中使用される場合、タンパク質の「ホモログ」とは、ホモログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、同じ種のタンパク質である。ホモログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。本明細書中使用される場合、タンパク質の「オルソログ」とは、オルソログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、異なる種のタンパク質である。オルソログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。ホモログ及びオルソログは、相同性モデリングによって同定可能である。（例えば、Ｇｒｅｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．  ２２８  （１９８５）  １０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｖｏｌ  １７２  （１９８８），  ５１３）、または「構造的ＢＬＡＳＴ」（Ｄｅｙ  Ｆ，  Ｃｌｉｆｆ  Ｚｈａｎｇ  Ｑ，  Ｐｅｔｒｅｙ  Ｄ，  Ｈｏｎｉｇ  Ｂ．  Ｔｏｗａｒｄ  ａ  ‘‘ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＢＬＡＳＴ’’：  ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２０１３  Ａｐｒ；２２（４）：３５９−６６．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｐｒｏ．２２２５．を参照）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の分野における応用については、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）も参照。ホモログタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。
【００４４】
「Ｃ２ｃ２」は、現在「Ｃａｓ１３ａ」と称されており、これらの用語は、特に記載がない限り、本明細書中同義で使用される。「グループ２９」、「グループ３０」、及びＣａｓ１３ｂという用語は、本明細書中同義で使用される。「Ｃｐｆ１」及び「Ｃａｓ１２ａ」という用語は、本明細書中同義で使用される。「Ｃ２ｃ１」及び「Ｃａｓ１２ｂ」という用語は、本明細書中同義で使用される。
【００４５】
様々な実施形態について、本明細書中以下に記載する。なお、特定の実施形態は、網羅的な説明であること、または本明細書で考察するよりも広範な態様に対する制限であることを意図しない。特定の実施形態に関連して記載される１つの態様は、必ずしもその実施形態に限定されるものではなく、他の任意の実施形態（複数可）で実施され得る。本明細書全体を通じて「１つの実施形態」、「ある実施形態」、「例示の実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特長、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて様々な箇所で「１つの実施形態において」、「ある実施形態において」、「例示の実施形態」という語句が出現する場合、必ずしも全てが同一の実施形態を示しているわけではないが、そうである場合もあり得る。さらに、その特定の特長、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において、本開示から当業者に明らかであると思われるとおり、任意の適切な様式で組み合わせることができる。さらに、本明細書中記載されるある実施形態は、ある特長を含むが他の実施形態に含まれる他の特長を含まないものの、異なる実施形態の特長の組み合わせは、本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のどれであっても、任意の組み合わせで使用可能である。
【００４６】
本明細書中引用される全ての刊行物、公開特許文書、及び特許出願は、個々の刊行物、公開特許文書、または特許出願が参照により援用されると具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、本明細書により参照として援用される。
【００４７】
概要
本明細書中開示される実施形態は、標的核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドをトランスポゾン複合体と接触させることによる、標的核酸配列の等温増幅のシステム及び方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドの場合がある。トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むランスポゾン配列とを含む。トランスポザーゼは、１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターをオリゴヌクレオチドに挿入することを促進する。そうすると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、挿入された１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターから標的核酸配列を転写することができる。このシステムの１つの利点は、二本鎖ＤＮＡテンプレートを加熱または融解させる必要がないことである。なぜなら、ＲＮＡポリメラーゼポリメラーゼは、二本鎖テンプレートを必要とするからである。そのような等温増幅は、迅速かつ簡潔であり、変性及び冷却用の複雑かつ高価な装置の必要性を排除する。ある特定の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、修飾Ｔ７  ＲＮＡプロモーターの母体である。
【００４８】
標的核酸配列の検出法
ある特定の例示実施形態において、本発明は、標的核酸配列を検出する方法を提供し、本方法は、以下を含む：（ａ）標的核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを、トランスポゾン複合体と接触させること、ただし、トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むトランスポゾン配列とを含む；（ｂ）トランスポザーゼを用いて、１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターをオリゴヌクレオチドに挿入すること；及び（ｃ）挿入された１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターからの転写を介して標的核酸配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成させることにより、標的核酸配列を増幅すること。
【００４９】
本明細書中提供される方法は、標的核酸配列を含むオリゴヌクレオチドをトランスポゾン複合体と接触させることを含む場合がある。「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中使用される場合、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列と特異的にハイブリダイズするように設計された核酸ポリマーを示す場合があるが、必ずしもそれに限定されない。「接触させる」という用語は、本明細書中記載される場合、直接の物理的な会合にある配置を示し、固体及び液体の両方を含む。「トランスポゾン」という用語は、本明細書中使用される場合、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素により認識され、遺伝子転移の能力がある機能性核酸タンパク質複合体（すなわちトランスポソーム）の必須の構成要素である、核酸セグメントを示す。「トランスポザーゼ」という用語は、本明細書中使用される場合、遺伝子転移の能力がある機能性核酸タンパク質複合体の構成要素であり、遺伝子転移に介在する、酵素を示す。「トランスポザーゼ」という用語は、レトロトランスポゾン由来またはレトロウイルス起源のインテグラーゼも示す。トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼ酵素と、「トランスポゾン末端」と呼ばれる酵素の特異的結合配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片との間で形成される。トランスポゾン結合部位の配列は、トランスポゾン複合体が持つ、効率的に標的ＤＮＡへと転置することができる安定構造を形成する能力に影響することなく、ある特定の位置において、他の塩基で修飾することができる。
【００５０】
「標的核酸配列」または「標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ」または「標的核酸」という用語は、標的配列であるまたは標的配列を含むＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドを示す。言い換えると、標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、ｇＲＮＡ、すなわちガイド配列の一部が相補性を有するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体が介在するエフェクター機能がそれに向けられている、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドの一部の場合がある。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に存在する。実施形態によっては、オリゴヌクレオチドは、二本鎖の場合がある。実施形態によっては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの二本鎖オリゴヌクレオチドへの挿入は、二本鎖オリゴヌクレオチドのＧＣリッチ領域で生じる。
【００５１】
実施形態によっては、標的核酸配列は、試料に由来する場合がある。ある特定の実施形態において、試料として、生体試料または環境試料を挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。生体試料として、血液、血漿、血清、尿、糞便、痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌、漏出液、滲出液、または関節から得られる液体、あるいは皮膚または粘膜表面のスワブを挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態において、試料は、ヒト患者から得られた血液、血漿、または血清である場合がある。実施形態によっては、試料は、植物試料である場合がある。実施形態によっては、試料は、未精製試料である場合がある。実施形態によっては、試料は、精製試料である場合がある。
【００５２】
実施形態によっては、標的核酸を含むオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または合成二本鎖ＤＮＡである場合がある。実施形態によっては、標的核酸を含むオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである場合があり、本方法は、オリゴヌクレオチドをトランスポゾン複合体と接触させる前に、逆転写工程を含む場合がある。
【００５３】
本明細書中提供される実施形態において、トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むトランスポゾン配列とを含む場合がある。「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始させることに関与するＤＮＡの領域を示す。特定の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである場合がある。Ｔ７  ＲＮＡプロモーターは、トランスポザーゼを用いて、二本鎖ポリヌクレオチドに挿入される場合がある。実施形態によっては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのオリゴヌクレオチドへの挿入は、無作為である場合がある。
【００５４】
遺伝子転位の頻度は、大部分のトランスポゾンに関して非常に低く、トランスポゾンは、活性を制限するために複雑な機構を用いている。例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼは、最適ではないＤＮＡ結合配列を利用し、しかもトランスポザーゼのＣ末端は、ＤＮＡ結合に干渉する。Ｔｎ５遺伝子転位に関与する機構は、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ及び同僚らにより、慎重に特性分析がなされている。Ｔｎ５は、カットアンドペースト機構により遺伝子転位を行う。トランスポゾンは、トランスポザーゼが利用する１９ｂｐの配列要素の対、外側配列（ＯＥ）及び内側配列（ＩＥ）、を２つ有する。１つのトランスポザーゼ単量体は、利用される２つの配列要素のそれぞれと結合する。単量体がトランスポゾンの各末端に結合した後、２つの単量体が二量体化し、シナプスを形成する。少なくとも２００ｂｐあるが、１０００ｂｐ未満のドナー骨格を持つベクターが、細菌の遺伝子転位について最も機能が高い。トランスポゾン切断は、トランス触媒作用により生じ、各ＤＮＡ末端に結合した単量体がシナプス複合体中に存在する場合に限り生じる。Ｔｎ５は、緩和された標的部位選択性で遺伝子転位を起こし、したがって、標的配列特異性をほとんどまたは全く持たずに標的ＤＮＡに挿入することができる。
【００５５】
Ｔｎ５遺伝子転位の自然な下方制御は、活動亢進性トランスポザーゼの選択により、及びトランスポザーゼ結合配列の最適化により、克服可能である［Ｙｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８］。野生型ＯＥの３つの塩基の修飾により作製されたモザイク配列（ＭＥ）は、細菌ならびに無細胞系において、遺伝子転位事象の５０倍の増加を招いた。最適化ＭＥ及び活動亢進性変異型トランスポザーゼを組み合わせた効果は、遺伝子転位活性の１００倍の上昇をもたらすと見積もられる。Ｇｏｒｙｓｈｉｎらは、予め形成されたＴｎ５遺伝子転位複合体を、電気穿孔法により細菌または酵母菌に機能的に導入することができることを示した［Ｇｏｒｙｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００］。ＤＮＡを直線化してトランスポゾンの両末端に正確に配置された逆方向反復を持たせることにより、Ｇｏｒｙｓｈｉｎ及び同僚らは、遺伝子転位の切断工程を迂回し、したがって、遺伝子転位効率を向上させることができた。
【００５６】
実施形態によっては、トランスポザーゼは、標的配列を含むオリゴヌクレオチド配列のタグメンテーションに使用される場合がある。「タグメンテーション」という用語は、記載されるとおりの網羅的オープンクロマチン領域解析（Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）における工程を示す。（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｇｉｒｅｓｉ，  Ｐ．  Ｇ．，  Ｚａｂａ，  Ｌ．  Ｃ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．，  Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｅｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ，  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３；１０（１２）：１２１３−１２１８を参照）。具体的には、高処理ＤＮＡ配列決定用のアダプターとともにｉｎ  ｖｉｔｒｏでロードされた活動亢進性Ｔｎ５トランスポザーゼは、ゲノムをフラグメント化し配列決定アダプターでタグ付けすることを同時に実行可能である。１つの実施形態において、アダプターは、本明細書中記載される方法と適合性がある。
【００５７】
実施形態によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼである場合がある。実施形態によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼの変異型、または改変トランスポザーゼである場合がある。トランスポザーゼは、当該分野で既知である任意の方法を用いて操作されている場合がある。改変トランスポザーゼは、３０℃〜４５℃、３５℃〜４０℃の範囲の温度、またはその間の任意の温度で機能するように最適化されている場合がある。改変トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼに比べて速い速度でオリゴヌクレオチドから放出するように最適化されている場合がある。
【００５８】
実施形態によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、またはＴｎ７トランスポザーゼである場合がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子転位効率は、使用されるトランスポゾン系によって変化する可能性がある。一般に、Ｔｎ５及びＭｕトランスポザーゼは、遺伝子転位効率をより高いレベルで実現する。実施形態によっては、挿入は、無作為である。実施形態によっては、挿入は、標的配列のＧＣリッチ領域で生じる場合がある。
【００５９】
実施形態によっては、トランスポゾン配列は、１９塩基対のモザイクエンド（ＭＥ）Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列を２つ含む。Ｔｎ５トランスポザーゼが、一般に、そのように短い１９塩基対のＭＥ  Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列間で含まれる任意のＤＮＡ配列の遺伝子転位に使用されることになる。
【００６０】
実施形態によっては、トランスポザーゼの使用により、加熱または融解させることなく、二本鎖ポリヌクレオチドの分離ができる。
【００６１】
増幅
ある特定の例示の実施形態において、本発明は、標的核酸配列を増幅する方法を提供する。本明細書中いずれかの箇所で記載されるとおり、「標的核酸配列」または「標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ」または「標的核酸」という用語は、標的配列であるまたは標的配列を含むＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドを示す。言い換えると、標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、ｇＲＮＡ、すなわちガイド配列の一部が相補性を有するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体が介在するエフェクター機能がそれに向けられている、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドの一部の場合がある。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に存在する。
【００６２】
本明細書中提供される実施形態において、標的核酸配列を検出する方法は、さらに、任意の挿入されたＴ７  ＲＮＡプロモーターを用いて、標的核酸配列を転写することを含む場合がある。標的核酸配列は、標的核酸配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成することにより増幅される場合がある。
【００６３】
本発明の１つの実施形態は、標的核酸配列を増幅することを含む場合がある。増幅は、等温にして温度を選択することができる。１つの実施形態において、増幅は、３７℃で迅速に進行する。他の実施形態において、等温増幅の温度は、異なる温度で作動可能なポリメラーゼを選択することにより、選択される場合がある。ポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ、全長Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択することができる。特定の実施形態において、標的核酸配列の増幅は、一定温度で行われる。
【００６４】
本増幅は、長さの異なる標的核酸配列を増幅するのに使用することができる。例えば、標的核酸配列は、長さが、約１０〜２０、約２０〜３０、約３０〜４０、約４０〜５０、約５０〜１００、約１００〜２００、約１００〜５００、約１００〜１０００、約１０００〜２０００、約２０００〜３０００、約３０００〜４０００、または約４０００〜５０００ヌクレオチドであることが可能である。標的核酸は、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または合成二本鎖ＤＮＡであることが可能である。標的核酸は、一本鎖核酸、例えば、ＲＮＡ分子であることが可能である。一本鎖核酸は、ベースとなる増幅の前に二本鎖核酸に変換することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、増幅の前に、逆転写により二本鎖ＤＮＡに変換することができる。一本鎖核酸は、一本鎖ウイルスＤＮＡ、ウルスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、及び合成一本鎖ＤＮＡからなる群より選択することができる。
【００６５】
等温増幅法は、様々な検出方法と組み合わせて、増幅された核酸産物を検出することができる。例えば、検出方法は、ゲル電気泳動、挿入色素検出、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、質量分析、リアルタイムＲＰＡ、リアルタイムＬＡＭＰ、リアルタイムＮＥＡＲ、リアルタイムＨＤＡ、リアルタイム転写増幅（ＴＭＡ）、リアルタイムＮＡＳＢＡ、及びＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫを含むことができる。増幅と検出を組み合わせることで、アトモル感度またはフェムトモル感度を達成することができる。
【００６６】
増幅方法として、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、またはニック酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）を挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００６７】
したがって、ある特定の例示の実施形態において、本明細書中開示されるシステムは、増幅試薬を含む場合がある。核酸の増幅に有用な様々な要素または試薬は、本明細書中記載される。例えば、本明細書中記載されるとおりの増幅試薬として、トリス緩衝液などの緩衝液を挙げることができる。トリス緩衝液は、所望の応用または用途に適切な任意の濃度で使用可能であり、例えば、濃度として、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１Ｍなどが挙げられるが、これらに限定されない。当業者なら、本発明で使用するのに適切な、トリス緩衝液などの緩衝液の濃度を決定できる。
【００６８】
塩、例えば、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が、核酸断片の増幅を改善する目的で、ＰＣＲなどの増幅反応に含まれている場合がある。塩濃度は特定の反応及び応用に依存することになるものの、実施形態によっては、特定の塩濃度で、特定の大きさの核酸断片が最適に産生される場合がある。生成物が大きくなると、所望の結果をもたらす目的で、必要とされる塩濃度も変化する可能性があり、典型的には低くなるが、生成物がより小さい場合の増幅は、塩濃度が高い方がより良い結果をもたらす可能性がある。当業者には当然のことながら、塩の存在及び／または濃度は、塩濃度の変更に合わせて、生物学的または化学反応のストリンジェンシーを変更する場合があり、したがって、本発明の方法に最適であり本明細書中記載されるとおりの条件を提供する任意の塩を使用することができる。
【００６９】
生物学的または化学反応の他の要素として、細胞中の材料を分析するために細胞を破壊して開くまたは溶解させる目的で、細胞溶解成分を挙げることができる。細胞溶解成分として、界面活性剤、上記のとおりの塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム［（ＮＨ4）2ＳＯ4］、または他のものを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明に適切である可能性がある界面活性剤として、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）、エチルトリメチルアンモニウム＝ブロミド、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）が挙げられる。界面活性剤の濃度は、特定の用途に依存する場合があり、場合によっては、反応に対して特異的である場合がある。増幅反応は、本発明に適切な任意の濃度で使用されるｄＮＴＰ及び核酸プライマーを含む場合があり、例えば、その濃度として、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭなどが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、本発明に従って有用なポリメラーゼは、当該分野で既知であり本発明にとって有用であれば、特定のまたは一般的なポリメラーゼのどれでもよく、そのようなポリメラーゼとして、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｑ５ポリメラーゼなどが挙げられる。
【００７０】
実施形態によっては、本明細書中記載されるとおりの増幅試薬は、ホットスタート増幅で使用するのに適切である場合がある。ホットスタート増幅は、実施形態によっては、アダプター分子またはオリゴの二量体化を削減または排除するのに、あるいはその他の望ましくない増幅産物またはアーチファクトを防いで所望の産物の最適な増幅を得るのに、有益である場合がある。本明細書中記載される増幅で使用される多くの成分は、ホットスタート増幅でも使用することができる。実施形態によっては、ホットスタート増幅で使用するのに適切な試薬または要素が、適宜、１種または複数の組成成分の代わりに使用される場合がある。例えば、特定の温度ではあるポリメラーゼが、他の反応条件では他の試薬が、そこで所望の活性を示すものが使用される場合がある。実施形態によっては、ホットスタート増幅用に設計されたまたは最適化された試薬が使用される場合があり、例えば、ポリメラーゼは、遺伝子転位後に、または特定温度に到達後に、活性化される場合がある。そのようなポリメラーゼは、抗体に基づくまたはアプタマーに基づく場合がある。本明細書中記載されるポリメラーゼは、当該分野で既知である。そのような試薬の例として、ホットスタートポリメラーゼ、ホットスタートｄＮＴＰ、及びフォトケージド（ｐｈｏｔｏ−ｃａｇｅｄ）ｄＮＴＰを挙げることができるが、これらに限定されない。そうした試薬は、当該分野で既知であり利用可能である。当業者なら、個別の試薬にとって適切なように最適温度を決定することができる。
【００７１】
核酸の増幅は、特定の温度サイクル機械または設備を用いて行われる場合があり、単一反応またはバルクで行われる場合があり、例えば、任意の所望数の反応が同時に行われる場合がある。実施形態によっては、増幅は、マイクロ流体装置またはロボット装置を用いて行われる場合があり、あるいは所望の増幅を達成するために温度を手動で変化させて行われる場合がある。実施形態によっては、特定の応用または材料にとって最適な反応条件を得るために最適化が行われる場合がある。当業者なら、十分な増幅を得るために反応条件を最適化することは当然であり、最適化できる。
【００７２】
ある特定の実施形態において、本発明の方法またはシステムを用いてＤＮＡを検出することは、検出の前に（増幅された）ＤＮＡをＲＮＡに転写することを必要とする。
【００７３】
ある特定の実施形態において、標的核酸配列は、挿入された１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡプロモーターからの転写を介して標的核酸配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成させることにより、増幅される場合がある。
【００７４】
ある特定の実施形態において、標的核酸配列は、ＲＮＡを含む場合がある。そのような場合、本方法は、標的オリゴヌクレオチドをトランスポゾン複合体と接触させる前に、標的配列を逆転写することを含む場合がある。
【００７５】
本発明の検出方法には、様々な組み合わせで核酸増幅及び検出手順が関与する可能性があることが明らかだろう。検出対象の核酸は、任意の天然のまたは合成核酸が可能であり、そのような核酸として、ＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されず、これらは、任意の適切な方法により増幅されて、検出可能な中間産物を提供することができる。中間産物の検出は、任意の適切な方法によることができ、そのような方法として、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の結合及び活性化が挙げられるが、これに限定されない。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、直接または付帯活性により検出可能なシグナル部分を生成する。
【００７６】
検出
ある特定の例示の実施形態において、増幅された標的核酸は、さらに、検出方法を用いて検出される場合がある。増幅された核酸の検出は、挿入色素、ＰＣＴ、リアルタイムＰＣＲ、蛍光プローブ、ＦＲＥＴ、または質量分析を用いる検出を含む場合がある。ある特定の例示の実施形態において、増幅された標的核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓに基づく検出システムにより検出される場合がある。ある特定の例示の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓに基づく検出システムは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムを含む場合がある。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３に基づく検出システムの例は、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６０，  ４３９−４４４  （２０１８）及び国際特許出願第ＷＯ／２０１８／１０７１２９号に記載されており、これらは本明細書中参照として援用される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３に基づく検出システムの例は、国際特許出願第ＷＯ  ２０１８／１７０３４０号にも記載されており、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用されるが、特に段落［０１５７］〜［０２６１］に重点が置かれる。
【００７７】
ＣＲＩＳＰＲ系
一般に、微生物のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）またはＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）または系は、本明細書中及びＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの文書中使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現もしくはその活性の指示に関与する転写物及び他の配列要素を総称的に示し、そのような配列として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈における「直列反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分直列反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも称する）、または本明細書中使用される用語としての「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするＲＮＡ（複数可）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））あるいはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写物が挙げられる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する配列要素を特徴とする（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも称する）。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣｐｆ１タンパク質である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要とされない。
【００７８】
本明細書中提供される実施形態は、アトモル感度を備えたＣＲＩＳＰＲに基づく堅固な検出方法を提供するためにＲＮＡ標的指向性エフェクターを利用する。本明細書中開示される実施形態は、同等の感度レベルでＲＮＡを検出することができ、単一塩基対の差異に基づき、標的を標的以外と識別することができる。容易に参照できるように、本明細書中開示される実施形態は、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（特異的高感度酵素レポーターによるロック解除、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｕｎＬＯＣＫｉｎｇ）と称する場合もある。
【００７９】
本明細書中記載される実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫ法を用いた、転写された標的核酸の検出を提供する。
【００８０】
Ｃａｓ９及びＣｐｆ１は両方ともＤＮＡを標的とするものの、単一エフェクターＲＮＡ誘導型ＲＮＡ分解酵素が、最近になって発見され（Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）、特性決定された（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｓｍａｒｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）。その中にはＣ２ｃ２も含まれており、これらは、特異的ＲＮＡセンシングのためのプラットフォームを提供する。ＲＮＡ誘導型ＲＮＡ分解酵素は、標的ＲＮＡを切断するように、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を用いて容易にかつ都合よく再プログラミングできる。ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ９及びＣｐｆ１は、そのＤＮＡ標的のみを切断するが、これらとは異なり、Ｃ２ｃ２のようなＲＮＡ誘導型ＲＮＡ分解酵素は、そのＲＮＡ標的を切断した後も活性を保ち、近接する非標的ＲＮＡの「付帯」切断を招く（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。このｃｒＲＮＡプログラム化付帯ＲＮＡ切断活性は、読み出し情報となる可能性があるｉｎ  ｖｉｖｏプログラム細胞死またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ非特異的ＲＮＡ分解を引き起こすことにより特定ＲＮＡの存在を検出するためのＲＮＡ誘導型ＲＮＡ分解酵素の利用機会をもたらす（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｅａｓｔ−Ｓｅｌｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。
【００８１】
ある特定の実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはＰＡＭ様モチーフは、本明細書中開示されるとおりのエフェクタータンパク質複合体が目的の標的遺伝子座に結合するように指示する。実施形態によっては、ＰＡＭは、５’ＰＡＭの場合がある（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）。他の実施形態において、ＰＡＭは、３’ＰＡＭの場合がある（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）。「ＰＡＭ」という用語は、「ＰＦＳ」または「プロトスペーサー隣接部位」または「プロトスペーサー隣接配列」と同義で使用される。
【００８２】
好適な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、３’ＰＡＭを認識する場合がある。ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、５’Ｈである３’ＰＡＭを認識する場合があり、Ｈは、Ａ、Ｃ、またはＵである。ある特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉのＣ２ｃ２ｐ、より好ましくはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ  ＤＳＭ  １９７５７のＣ２ｃ２の場合があり、３’ＰＡＭは、５’Ｈである。
【００８３】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を示し、標的配列とガイド配列の間でのハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む場合がある。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列であるまたは標的配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを示す。言い換えると、標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡ、すなわちガイド配列の一部が相補性を有するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体が介在するエフェクター機能がそれに向けられている、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部の場合がある。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に存在する。
【００８４】
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、詳細にはＣ２ｃ２をコードする核酸分子は、有利なことに、コドン最適化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である。コドン最適化配列の例は、この例では、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化された配列（すなわち、ヒトでの発現に最適化されている）、または本明細書中考察されるとおりの別の真核生物、動物、または哺乳類に最適化された配列である；例えば、ＷＯ  ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照。これが好適であるものの、他の例も可能であり、ヒト以外の宿主種のコドン最適化、または特定の器官のコドン最適化が知られていることがわかるだろう。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現にコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物、例えば植物または哺乳類であるか、あるいはそれに由来する場合があり、そのような生物として、ヒト、あるいは本明細書中考察されるとおりの非ヒト真核生物、または動物または哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、犬、家畜、または非ヒト哺乳類または霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態によっては、人間もしくは動物への実質的な医学的利益なしに、ヒトの生殖細胞系列の遺伝的同一性を変更するプロセス及び／または罹患する可能性がある動物の遺伝的同一性を変更するプロセスが、ならびにこのようなプロセスから生じる動物も、除外される場合がある。一般に、コドン最適化は、天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０またはそれ以上のコドン）を、その天然のアミノ酸配列を維持したままで、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に用いられるコドンで置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を高めるために核酸配列を修飾するプロセスを示す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の違い）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは、同じく、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般的に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、コドン最適化に基づいて、所定の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することが可能である。コドン使用表は、例えばｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にある「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合可能である。Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００’’  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２９２  （２０００）を参照。特定の宿主細胞で発現させるために特定の配列をコド���最適化するコンピューターアルゴリズムも利用可能であり、例えばＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）なども利用可能である。実施形態によっては、Ｃａｓをコードする配列中の１つまたは複数のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸で最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
【００８５】
１つの例示の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含むＨＥＰＮドメインを１つまたは複数含む。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、特に制限なく、本明細書中記載されるＨＥＰＮドメインまたは当該分野で既知であるＨＥＰＮドメインに由来するものが可能である。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、さらに、２つ以上のＨＥＰＮドメインの一部分を組み合わせることにより作製されたモチーフ配列を含む。上記のとおり、コンセンサス配列は、米国暫定特許出願第６２／４３２，２４０号、名称「Ｎｏｖｅｌ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、米国暫定特許出願第６２／４７１、７１０号、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ  ａｎ  ｄＳｙｓｔｅｍｓ」、２０１７年３月１５日出願、及び代理人整理番号４７６２７−０５−２１３３が付された２０１７年４月１２日出願の米国暫定特許出願、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」に開示されるオルソログの配列に由来することが可能である。
【００８６】
特定の実施形態において、ＶＩ型ＲＮＡ標的指向性Ｃａｓ酵素は、Ｃ２ｃ２であるか、またはＣａｓ１３ａである。他の例示の実施形態において、ＶＩ型ＲＮＡ標的指向性Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１３ｂである。特定の実施形態において、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質の本明細書中称されるとおりのホモログまたはオルソログは、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質と、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する（例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉのＣ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＭＡ２０２０のＣ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１７９のＣ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ  １０７１０）のＣ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ  ４８４７）のＣ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ（ＷＢ４）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌（ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５）のＣ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ  １００３）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）のＣ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）のＣ２ｃ２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２のいずれかの野生型配列に基づき）。さらなる実施形態において、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質の本明細書中称されるとおりのホモログまたはオルソログは、野生型Ｃ２ｃ２と、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する（例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉのＣ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＭＡ２０２０のＣ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１７９のＣ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ  １０７１０）のＣ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ  ４８４７）のＣ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ（ＷＢ４）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌（ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５）のＣ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５）のＣ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ  １００３）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）のＣ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）のＣ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）のＣ２ｃ２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２のいずれかの野生型配列に基づき）。
【００８７】
ある特定の他の例示の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ２の活性は、２つのＨＥＰＮドメインの存在に依存する場合がある。これらは、ＲＮＡを切断するＲＮＡ分解酵素ドメイン、すなわちヌクレアーゼ（詳細にはエンドヌクレアーゼ）であることが示されている。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮは、ＤＮＡを、または潜在的にＤＮＡ及び／またはＲＮＡを標的とする可能性もある。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮドメインが、それらの野生型において、ＲＮＡに結合してそれを切断する能力を少なくとも持つことを踏まえると、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質がＲＮＡ分解酵素機能を有することは好ましい。Ｃ２ｃ２  ＣＲＩＳＰＲ系に関しては、２０１６年６月１７日出願の米国暫定第６２／３５１，６６２号、及び２０１６年８月１７日出願の米国暫定第６２／３７６，３７７号を参照。同じく、２０１６年６月１７日出願の米国暫定第６２／３５１，８０３号を参照。同じく、ブロード研究所番号第１００３５．ＰＡ４号及び代理人整理番号第４７６２７．０３．２１３３号を有する２０１６年１２月８日出願の米国暫定、名称「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｒｉｓｐｒ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」を参照。さらに、Ｅａｓｔ−Ｓｅｌｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＲＮａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃ２ｃ２  ｅｎａｂｌｅ  ｇｕｉｄｅ−ＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ’’  Ｎａｔｕｒｅ  ｄｏｉ：１０／１０３８／ｎａｔｕｒｅ１９８０２及びＡｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  ‘‘Ｃ２ｃ２  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ’’  ｂｉｏＲｘｉｖ  ｄｏｉ：１０．１１０１／０５４７４２を参照。
【００８８】
ある実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ある属の生物のＣ２ｃ２オルソログである場合があり、そのような属として、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａが挙げられるがこれらに限定されない。そのような属の生物の種は、本明細書中で別段検討されるとおりであることが可能である。
【００８９】
ある特定の例示の実施形態において、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質として、特に制限なく、以下の２１種のオルソログ種が挙げられる（複数のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＭＡ２０２０、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１７９、［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＳＭ  １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７（第二ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ  ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ  Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＳＢ  １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＤＥ４４２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ  Ｃ−１０１３−ｂ、Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属菌ＣＨＫＣＩ００４、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、及びＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種口腔分類群８７９株Ｆ０５５７。さらに１２種の限定ではなく例として、以下がある：Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌ＮＫ４Ａ１４４、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ種ＴＳＬ５−１、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＯＲ３７、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種ＹＡＢ３００１、Ｂｌａｕｔｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ種Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ３００７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｉｈｕａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ属菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｉｐａｒｉａ、及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ。
【００９０】
複数の実施形態において、本明細書中示されるとおりのＣ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２の機能性バリアントまたはそのホモログもしくはオルソログも包含する。タンパク質の「機能性バリアント」は、本明細書中使用される場合、そのタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持する、そのタンパク質のバリアントを示す。機能性バリアントとして、多形などを含む変異体（これは、挿入、削除、または置換変異体の場合がある）を挙げることができる。同じく機能性バリアントとして挙げられるのは、そのようなタンパク質と、別のもの、通常は無関係の、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとの融合産物である。機能性バリアントは、天然に生じる場合もあれば、人造物である場合もある。有利な実施形態には、改変されたまたは非天然のＶＩ型ＲＮＡ標的指向性エフェクタータンパク質が関与可能である。
【００９１】
ある実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログをコードする核酸分子（複数可）は、真核細胞での発現に関してコドン最適化されている場合がある。真核生物は、本明細書中検討されるとおりのものが可能である。核酸分子（複数可）は、改変されたまたは非天然のものであることが可能である。
【００９２】
ある実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、１つまたは複数の変異を有する場合がある（したがって、それをコードする核酸分子（複数可）も変異（複数可）を有する場合がある）。変異は、人為的に導入された変異である場合があり、そのような変異として触媒ドメインにおける１つまたは複数の変異を挙げることができるが、これらに限定されない。Ｃａｓ９酵素に関して触媒ドメインの例として、ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、ＲｕｖＣ  ＩＩＩ、及びＨＮＨドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９３】
ＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫ法は、Ｃａｓ１３に基づくＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫ法である場合がある（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５６（６３３６）：４３８−４４２  （２０１７）；Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６０：４３９−４４４（２０１８）；Ｍｙｈｒｖｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６０：４４４−４４８  （２０１８）；ＰＣＴ／ＵＳ１７／６５４７７を参照）。
【００９４】
実施形態によっては、増幅された標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１２に基づく検出システムを用いて検出される場合もある。Ｃａｓ１２に基づく検出システムは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、またはＣａｓ１２ｃ酵素を含む場合がある。
【００９５】
Ｃａｓ１２に基づく検出システムは、以下からなる群より選択される属の生物に由来するＣａｓ１２酵素を含む場合がある：Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ属菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属菌、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）属菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｉｎｉｓ、及びＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ  ｓｐｈｅｎｉｓｃｉ。
【００９６】
ガイド配列
本明細書中使用される場合、「ガイド配列」、「ｃｒＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、または「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｇＲＮＡ」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズし、ガイド配列及びＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含むＲＮＡ標的指向性複合体の標的核酸配列に対する配列特異的結合を指示するのに十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを示す。いくつかの例示の実施形態において、相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に配列比較される場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上である。最適な配列比較は、配列の整列に適した任意のアルゴリズムを使用して決定される場合があり、その限定ではなく例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。核酸標的指向性複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指示するガイド配列（核酸標的指向性ガイドＲＮＡ内）の能力は、任意の適切なアッセイにより評価可能である。例えば、試験されるガイド配列を含む核酸標的指向性複合体を形成するのに十分な核酸標的指向性ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、核酸標的指向性複合体の構成要素をコードするベクターを用いるトランスフェクションなどにより、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供することができ、続いて、本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内の優先的標的指向性（例えば、切断）を評価することができる。同様に、標的核酸配列の切断は、試験管内で、標的核酸配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的指向性複合体の構成要素、を提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で、標的配列での結合または切断速度を比較することにより評価可能である。他のアッセイも可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。任意の標的核酸配列を標的とするように、ガイド配列、したがって核酸標的指向性ガイドを選択することができる。標的配列はＤＮＡである場合がある。標的配列は、任意のＲＮＡ配列が可能である。実施形態によっては、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）か���なる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかのより好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列である場合がある。
【００９７】
実施形態によっては、核酸標的指向性ガイドは、核酸標的指向性ガイド内の二次構造の程度を低下するように選択される。実施形態によっては、核酸標的指向性ガイドのヌクレオチドのうち、最適にフォールディングされたときの自己相補的な塩基対形成に関与するヌクレオチドの割合は、約７５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、またはそれ未満の％である。最適なフォールディングは、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定可能である。いくつかのプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づくものである。そのようなアルゴリズムの１つの例は、ｍＦｏｌｄであり、ｍＦｏｌｄは、Ｚｕｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．９（１９８１）、１３３−１４８）によって説明されている。フォールディングアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄであり、これは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａで開発されたものである（例えば、Ａ．Ｒ．  Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｃｅｌｌ  １０６（１）：  ２３−２４；及びＰＡ  Ｃａｒｒ  ａｎｄ  ＧＭ  Ｃｈｕｒｃｈ，  ２００９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（１２）：  １１５１−６２を参照）。
【００９８】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、直列反復（ＤＲ）配列とガイド配列またはスペーサー配列とを含む、本質的にそれらからなる、あるいはそれらからなる場合がある。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結された直列反復配列を含む、本質的にそれらからなる、あるいはそれらからなる場合がある。ある特定の実施形態において、直列反復配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流（すなわち５’）に位置する場合がある。他の実施形態では、直列反復配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流（すなわち、３’）に位置する場合がある。
【００９９】
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。ある特定の実施形態において、直列反復配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
【０１００】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１５〜３５ｎｔである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、スペーサー長は、１５〜１７ｎｔ、例えば１５、１６、または１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９、または２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３、または２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば２３、２４、または２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６、または２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９、または３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ、または３５ｎｔ以上である。
【０１０１】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、またはＣＲＩＳＰＲ系とは、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の文書で使用されているとおりのものであり、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現または活性の誘導に関与する転写物及び他の配列要素を総称的に示し、これに含まれるものとして、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、特にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の場合はＣａｓ９遺伝子、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする配列、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直列反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分的な直列反復を含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも称する）、または本明細書で使用されるとおりの「ＲＮＡ（複数可）」という用語（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ（複数可）、例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物が挙げられる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する配列要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも称する）を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を示し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ガイド配列の中の、標的配列に対する相補性が切断活性に重要であるセクションは、本明細書中シード配列と呼ばれる。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含むことができる。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置し、細胞内に存在するミトコンドリア、オルガネラ、小胞、リポソーム、もしくは粒子の中にあるまたはそれに由来する核酸を含む場合がある。実施形態によっては、特に非核用途の場合、ＮＬＳは好ましくない。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つまたは複数の核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含む。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つまたは複数のＮＬＳ及び１つまたは複数のＮＥＳを含む。実施形態によっては、以下の基準のいずれかまたは全てを満たす反復モチーフを検索することにより、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで直列反復を同定することができる：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接するゲノム配列の２Ｋｂのウィンドウで見られる；２．２０〜５０ｂｐの範囲；及び３．２０〜５０ｂｐの間隔。実施形態によっては、これらの基準のうちの２つ、例えば１と２、２と３、または１と３が用いられる場合がある。いくつかの実施形態では、３つ全ての基準が用いられる場合がある。
【０１０２】
本発明の実施形態において、ガイド配列及びガイドＲＮＡ、すなわちＣａｓを標的ゲノム遺伝子座にガイドすることができるＲＮＡという用語は、ＷＯ  ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の引用文献のように同義で使用される。一般に、ガイド配列とは、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。実施形態によっては、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に配列比較された場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。最適な配列比較は、配列の整列に適した任意のアルゴリズムを使用して決定可能であり、そのようなアルゴリズムの限定ではなく例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。実施形態によっては、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれ以上のヌクレオチド長である。実施形態によっては、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価可能である。例えば、試験されるガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションなどにより、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供することができ、続いて、本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内の優先的切断を評価することができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管中で、標的配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素を提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で、標的配列での結合または切断速度を比較することによって、評価することができる。他のアッセイも可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。
【０１０３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のいくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上、または約１００％であることが可能であり；ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれ以上のヌクレオチド長であることが可能であり；あるいは、ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、またはそれ未満のヌクレオチド長であることが可能であり；有利には、ｔｒａｃｒＲＮＡは、３０または５０ヌクレオチド長である。しかしながら、本発明のある態様は、標的外相互作用を低減すること、例えば、低い相補性を有する標的配列とのガイドの相互作用を低減することを目的とする。実際、そのような例では、本発明は、８０％超〜約９５％の相補性、例えば８３％〜８４％または８８〜８９％または９４〜９５％の相補性を有する標的配列と標的外配列をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が識別する（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と、１、２または３つのミスマッチを有する１８ヌクレオチドの標的外のものを識別する）ことができるようになる変異を含むことが示されている。したがって、本発明の文脈において、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％または９５％または９５．５％または９６％または９６．５％または９７％または９７．５％または９８％または９８．５％または９９％または９９．５％または９９．９％超、または１００％である。標的外では、配列とガイドとの間の相補性が１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％または９４％または９３％または９２％または９１％または９０％または８９％または８８％または８７％または８６％または８５％または８４％または８３％または８２％または８１％または８０％未満であり、標的外では配列とガイドとの間で１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％の相補性であることが有利である。
【０１０４】
ガイド修飾
ある特定の実施形態において、本発明のガイドは、非天然の核酸、及び／または非天然のヌクレオチド、及び／またはヌクレオチドアナログ、及び／または化学修飾を含む。非天然の核酸として、例えば、天然のヌクレオチドと非天然のヌクレオチドの混合物が挙げられる。非天然のヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び／または塩基部分で修飾されている場合がある。本発明のある実施形態において、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の１つにおいて、ガイドは、１つまたは複数のリボヌクレオチド及び１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態において、ガイドは、１つまたは複数の非天然のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオアート結合を有するヌクレオチド、ボラノリン酸連結を有するヌクレオチド、リボース環の２’炭素と４’炭素との間にメチレン架橋を有するロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または架橋型核酸（ＢＮＡ）を含む。修飾ヌクレオチドの他の例として、２’−Ｏ−メチルアナログ、２’−デオキシアナログ、２−チオウリジンアナログ、Ｎ６−メチルアデノシンアナログ、または２’−フルオロアナログが挙げられる。修飾塩基のさらなる例として、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン（Ψ））、Ｎ1−メチルシュードウリジン（ｍｅ1Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７−メチルグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。ガイドＲＮＡの化学修飾の例として、限定するものではないが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）、ホスホロチオアート（ＰＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を１つまたは複数の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。そのように化学修飾されたガイドは、非修飾ガイドと比較した場合に安定性の向上及び活性の増大を含む可能性があるが、標的外と比較しての標的的中特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３３（９）：９８５−９，  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，  ２０１５年６月２９日オンライン公開；Ｒａｇｄａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ０２１５，  ＰＮＡＳ，  Ｅ７１１０−Ｅ７１１１；Ａｌｌｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００５，  ４８：９０１−９０４；Ｂｒａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２０１２，  ３：１５４；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２０１５，  １１２：１１８７０−１１８７５，  Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，  ２０１４，  ５：１４５４−１４７１；Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１５）  ３３（９）：９８５−９８９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２０１７，  １，  ００６６ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１−０１７−００６６を参照）。実施形態によっては、ガイドＲＮＡの５’末端及び／または３’末端は、さまざまな機能性��分によって修飾され、そのような機能性部分として、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが挙げられる。（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３３：７４−８３を参照のこと）。ある特定の実施形態において、ガイドは、標的ＤＮＡに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣ２ｃ１に結合する領域に１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある実施形態において、デオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、改変ガイド構造、例えば、限定するものではないが、５’及び／または３’末端、ステムループ領域、及びシード領域などに組み込まれる。ある特定の実施形態において、こうした修飾は、ステムループ領域の５’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の５’ハンドルを化学修飾するとガイドの機能が消失する場合がある（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２０１７，  １：００６６を参照）。ある特定の実施形態において、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、または７５個のヌクレオチドが化学的に修飾される。実施形態によっては、ガイドの３’末端または５’末端いずれかに位置する３〜５ヌクレオチドが化学修飾される。実施形態によっては、シード領域にごく軽微な修飾、例えば２’−Ｆ修飾などが導入される。実施形態によっては、ガイドの３’末端に２’−Ｆ修飾が導入される。ある特定の実施形態において、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する３〜５ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）で化学的に修飾される。そのような修飾によってゲノム編集効率が増進する可能性がある（Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１５）  ３３（９）：９８５−９８９を参照）。ある特定の実施形態において、遺伝子破壊のレベルを向上させるために、ガイドのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオアート（ＰＳ）で置き換えられる。ある特定の実施形態において、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する５ヌクレオチド超が、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、またはＳ−拘束エチル（ｃＥｔ）で化学的に修飾される。そのように化学修飾されたガイドでは、介在する遺伝子破壊のレベルが向上する可能性がある（Ｒａｇｄａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ０２１５，  ＰＮＡＳ，  Ｅ７１１０−Ｅ７１１１を参照）。本発明のある実施形態において、ガイドは、その３’末端及び／または５’末端に化学部分を含むように修飾される。そのような部分として、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、またはローダミンが挙��られるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、化学部分は、リンカー、例えばアルキル鎖などによってガイドに結合される。ある特定の実施形態において、修飾ガイドの化学部分は、ガイドを別の分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはナノ粒子などに付加するために使用することができる。そのように化学修飾されたガイドは、ＣＲＩＳＰＲ系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅＬｉｆｅ，  ２０１７，  ６：ｅ２５３１２、ＤＯＩ：１０．７５５４を参照）。
【０１０５】
ある特定の実施形態において、本明細書中提供されるとおりのＣＲＩＳＰＲ系は、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡまたは類似ポリヌクレオチドを利用することができ、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの混合物であり、及び／またはポリヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含む。配列は、任意の構造を含むことができ、そのような構造として、天然ｃｒＲＮＡの構造、例えば、バルジ、ヘアピン、またはステムループ構造が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成し、第二のポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列であることが可能である。
【０１０６】
ある特定の実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡが使用される。ガイドＲＮＡの化学修飾の例として、限定するものではないが、１つまたは複数の末端ヌクレオチドへの２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル＝３’ホスホロチオアート（ＭＳ）、または２’−Ｏ−メチル＝３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の組み込みが挙げられる。そのように化学修飾されたガイドＲＮＡは、非修飾ＲＮＡと比較した場合に安定性の向上及び活性の増大を含む可能性があるが、標的外と比較しての標的的中特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３３（９）：９８５−９，  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，  ２０１５年６月２９日にオンライン公開、を参照）。化学修飾されたガイドＲＮＡは、さらに、限定するものではないが、ホスホロチオアート結合を有するＲＮＡ、及びリボース環の２’炭素と４’炭素との間にメチレン架橋を有するロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。
【０１０７】
実施形態によっては、ガイド配列は、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチドある、またはそれより長い。実施形態によっては、ガイド配列は、長さが、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチドある、またはそれより短い。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に対して配列特異的に結合するように指示するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価可能である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、試験されるガイド配列も含めて、例えばＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターを用いるトランスフェクションにより、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供することができ、続いてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内の優先的切断を評価することができる。同様に、標的ＲＮＡの切断は、試験管内で、標的配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素、を提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で、標的配列での結合または切断速度を比較することにより評価可能である。他のアッセイも可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。
【０１０８】
実施形態によっては、ガイドに対する修飾は、化学修飾、挿入、削除、または分割である。実施形態によっては、化学修飾として、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）アナログ、２’−デオキシアナログ、２−チオウリジンアナログ、Ｎ６−メチルアデノシンアナログ、２’−フルオロアナログ、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ1−メチルシュードウリジン（ｍｅ1Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオアート（ＰＳ）、または２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を組み込むことが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態によっては、ガイドは、１つまたは複数のホスホロチオアート修飾を含む。ある特定の実施形態において、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２５個が化学修飾される。ある特定の実施形態において、シード領域の１つまたは複数のヌクレオチドが化学修飾される。ある特定の実施形態において、３’末端の１つまたは複数のヌクレオチドが化学修飾される。ある特定の実施形態において、５’ハンドルのヌクレオチドはいずれも、化学修飾されない。実施形態によっては、シード領域における化学修飾は、軽微な修飾、例えば、２’−フルオロアナログの組み込みなどである。特定の実施形態において、シード領域のヌクレオチドの１つが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。実施形態によっては、３’末端の５または１０個のヌクレオチドが化学修飾される。Ｃｐｆ１  ＣｒＲＮＡの３’末端をそのように化学修飾することで、遺伝子切断効率が改善される（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２０１７，  １：００６６を参照）。特定の実施形態において、３’末端の５つのヌクレオチドが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。特定の実施形態において、３’末端の１０個のヌクレオチドが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。特定の実施形態において、３’末端の５つのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）アナログで置き換えられる。
【０１０９】
実施形態によっては、ガイドの５’ハンドルのループが修飾される。実施形態によっては、ガイドの５’ハンドルのループは、削除、挿入、分割、または化学修飾を有するように修飾される。ある特定の実施形態において、ループは、３つ、４つ、または５つのヌクレオチドを有する。ある特定の実施形態において、ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ、またはＵＧＵＵという配列を含む。
【０１１０】
ガイド配列、従って核酸標的指向性ガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的とするように選択可能である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を示し、標的配列とガイド配列の間でのハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む場合がある。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列であるまたは標的配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを示す。言い換えると、標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡ、すなわちガイド配列の一部が相補性を有するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体が介在するエフェクター機能がそれに向けられている、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部の場合がある。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に存在する。標的配列はＤＮＡである場合がある。標的配列は、任意のＲＮＡ配列である場合がある。実施形態によっては、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列である場合がある。いくつかのより好適な実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列である場合がある。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２８ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１８ヌクレオチドあり、かつ２８ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１９〜２８ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１９〜２５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２３ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２５ヌクレオチドである。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、切断効率の調節は、スペーサー／標的側にあるミスマッチの位置も含めて、スペーサー配列と標的配列の間にミスマッチを導入すること、例えば１つまたは複数のミスマッチ、例えば１つまたは２つのミスマッチを導入することにより活用可能である。例えば、より中心近く（すなわち、３’または５’ではない）にダブルミスマッチがあるほど、切断効率が受ける影響は大きくなる。したがって、スペーサー側でミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調節することができる。例として、標的の切断が１００％未満であることが望ましい場合（例えば、細胞集団において）、スペーサーと標的配列の間の１つまたは複数、例えば、好ましくは２つのミスマッチを、スペーサー配列に導入することができる。ミスマッチ位置がスペーサー側でより中心寄りであると、切断パーセンテージはより低くなる。
【０１１３】
ある特定の例示の実施形態において、切断効率は、単一ヌクレオチドで異なる２つ以上の標的、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、多様性、または（点）変異を識別することができる単一ガイドを設計することにより活用される場合がある。ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＳＮＰ（または他の単一ヌクレオチド多様性）に対する感度を低下させていながらも、継続してある一定レベルの効率でＳＮＰ標的を切断する場合がある。すなわち、２つの標的、または１組の標的に関して、標的のうちの１つに対して相補的であるヌクレオチド配列を持つようにガイドＲＮＡを設計する、すなわち標的的中ＳＮＰを設計することができる。ガイドＲＮＡは、さらに、合成ミスマッチを有するように設計される。本明細書中使用される場合、「合成ミスマッチ」は、天然のＳＮＰの上流または下流、例えば、最大で５ヌクレオチド上流または下流、例えば、４、３、２、または１ヌクレオチド上流または下流、好ましくは最大で３ヌクレオチド上流または下流、より好ましくは最大で２ヌクレオチド上流または下流、特に好ましくは１ヌクレオチド上流または下流（すなわちＳＮＰに隣接して）に導入される非天然のミスマッチを示す。ＣＲＩＳＰＲエフェクターが標的的中ＳＮＰに結合するとき、１つのミスマッチのみが合成ミスマッチとの間に形成されることになり、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは引き続き活性化されて検出可能なシグナルが生成することになる。ガイドＲＮＡが標的外ＳＮＰとハイブリダイズするとき、２つのミスマッチ、ＳＮＰによるミスマッチ及び合成ミスマッチによるミスマッチが形成されることになり、検出可能なシグナルが生成しない。すなわち、本明細書中開示されるシステムは、集団内のＳＮＰを識別するように設計することができる。例えば、本システムを使用して、単一ＳＮＰで異なる病原性株を識別する、またはある特定の疾患特異的ＳＮＰを検出することができ、そのようなＳＮＰとして、疾患関連ＳＮＰ、例えば特に限定されないが、がん関連ＳＮＰなどが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１４】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、または９位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の２、３、４、５、６、または７位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の３、４、５、または６位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の３位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。
【０１１５】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチ（例えば、合成ミスマッチ、すなわちＳＮＰを除く追加ミスマッチ）がスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、または９位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の４、５、６、または７位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の５位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。
【０１１６】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがＳＮＰの２ヌクレオチド上流に位置する（すなわち１つのヌクレオチドを間に挟む）ように設計される。
【０１１７】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがＳＮＰの２ヌクレオチド下流に位置する（すなわち１つのヌクレオチドを間に挟む）ように設計される。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の５位（５’末端から開始して）に位置し、ＳＮＰがスペーサー配列の３位（５’末端から開始して）に位置するように設計される。
【０１１９】
本明細書中記載される実施形態は、本明細書中考察されるとおりの真核細胞に（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、すなわち単離された真核細胞に）１つまたは複数のヌクレオチド修飾を誘導することを包含し、細胞に本明細書中考察されるとおりのベクターを送達することを含む。変異（複数可）は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した細胞（複数可）の各標的配列での１つまたは複数のヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列での１〜７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した、当該細胞（複数可）の各標的配列における５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列での２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列での４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの導入、削除、または置換を含むことができる。
【０１２０】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列とハイブリダイズし、１つまたは複数のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）は、標的配列において、またはその付近（例えば、そこから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対内）での切断をもたらすが、例えば二次構造に依存する場合があり、特にＲＮＡ標的の場合などでそうである。
【０１２１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、その構成要素、及びそのような構成要素の送達（方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子を含む）、ならびにその調製及び使用（量及び製剤に関するものを含む）、ならびにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現真核細胞、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現真核生物（マウスなど）に関する一般的な情報に関しては、以下を参照：米国特許第８，９９９，６４１号、同第８，９９３，２３３号、同第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８９５，３０８号、同第８，９０６，６１６号、同第８，９３２，８１４号、及び同第８，９４５，８３９号；米国特許公開ＵＳ  ２０１４−０３１０８３０（米国出願第１４／１０５，０３１号）、同ＵＳ  ２０１４−０２８７９３８  Ａ１（米国出願第１４／２１３，９９１号）、同ＵＳ  ２０１４−０２７３２３４  Ａ１（米国出願第１４／２９３，６７４号）、同ＵＳ  ２０１４−０２７３２３２  Ａ１（米国出願第１４／２９０，５７５号）、同ＵＳ  ２０１４−０２７３２３１（米国出願第１４／２５９，４２０号）、同ＵＳ  ２０１４−０２５６０４６  Ａ１（米国出願第１４／２２６，２７４号）、同ＵＳ  ２０１４−０２４８７０２  Ａ１（米国出願第１４／２５８，４５８号）、同ＵＳ  ２０１４−０２４２７００  Ａ１（米国出願第１４／２２２，９３０号）、同ＵＳ  ２０１４−０２４２６９９  Ａ１（米国出願第１４／１８３，５１２号）、同ＵＳ  ２０１４−０２４２６６４  Ａ１（米国出願第１４／１０４，９９０号）、同ＵＳ  ２０１４−０２３４９７２  Ａ１（米国出願第１４／１８３，４７１号）、同ＵＳ  ２０１４−０２２７７８７  Ａ１（米国出願第１４／２５６，９１２号）、同ＵＳ  ２０１４−０１８９８９６  Ａ１（米国出願第１４／１０５，０３５号）、同ＵＳ  ２０１４−０１８６９５８（米国出願第１４／１０５，０１７号）、同ＵＳ  ２０１４−０１８６９１９  Ａ１（米国出願第１４／１０４，９７７号）、同ＵＳ  ２０１４−０１８６８４３  Ａ１（米国出願第１４／１０４，９００号）、同ＵＳ  ２０１４−０１７９７７０  Ａ１（米国出願第１４／１０４，８３７），及び同ＵＳ  ２０１４−０１７９００６  Ａ１（米国出願第１４／１８３，４８６号）、同ＵＳ  ２０１４−０１７０７５３（米国出願第１４／１８３，４２９号）、同ＵＳ  ２０１５−０１８４１３９（米国出願第１４／３２４，９６０号）、第１４／０５４，４１４号；欧州特許出願ＥＰ  ２  ７７１  ４６８（ＥＰ１３８１８５７０．７）、同ＥＰ  ２  ７６４  １０３（ＥＰ１３８２４２３２．６）、及び同ＥＰ  ２  ７８４  １６２（ＥＰ１４１７０３８３．５）；ならびにＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１４／０９３６６１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３）、同ＷＯ２０１４／０９３６９４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０）、同ＷＯ２０１４／０９３５９５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１）、同ＷＯ２０１４／０９３７１８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５）、同ＷＯ２０１４／０９３７０９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２）、同ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ��ＵＳ２０１３／０７４６６７）、同ＷＯ２０１４／０９３６３５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１）、同ＷＯ２０１４／０９３６５５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６）、同ＷＯ２０１４／０９３７１２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９）、同ＷＯ２０１４／０９３７０１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００）、同ＷＯ２０１４／０１８４２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８）、同ＷＯ２０１４／２０４７２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１７９０）、同ＷＯ２０１４／２０４７２４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００）、同ＷＯ２０１４／２０４７２５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３）、同ＷＯ２０１４／２０４７２６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４）、同ＷＯ２０１４／２０４７２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６）、同ＷＯ２０１４／２０４７２８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８）、同ＷＯ２０１４／２０４７２９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９）、同ＷＯ２０１５／０８９３５１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、同ＷＯ２０１５／０８９３５４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、同ＷＯ２０１５／０８９３６４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、同ＷＯ２０１５／０８９４２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、同ＷＯ２０１５／０８９４６２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１２７）、同ＷＯ２０１５／０８９４１９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００５７）、同ＷＯ２０１５／０８９４６５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１３５）、同ＷＯ２０１５／０８９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、同ＷＯ２０１５／０５８０５２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１０７７）、同ＷＯ２０１５／０７００８３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６４６６３）、同ＷＯ２０１５／０８９３５４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、同ＷＯ２０１５／０８９３５１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、同ＷＯ２０１５／０８９３６４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、同ＷＯ２０１５／０８９４２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、同ＷＯ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）、同ＷＯ２０１５／０８９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、同ＷＯ２０１６／０４９２５８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５１８３０）、同ＷＯ２０１６／０９４８６７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３８５）、同ＷＯ２０１６／０９４８７２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３９３）、同ＷＯ２０１６／０９４８７４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３９６）、同ＷＯ２０１６／１０６２４４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６７１７７）。
【０１２２】
同じく以下が参照される：２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，７０９号、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４５５号、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，７０８号、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４６２号、２０１４年１２月２３日出願の米国出願第６２／０９６，３２４号、２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，６８１号、及び２０１５年１０月５日出願の米国出願第６２／２３７，４９６号、ＤＥＡＤ  ＧＵＩＤＥＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＦＡＣＴＯＲＳ；２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４５６号及び２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，６９２号、ＥＳＣＯＲＴＥＤ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ  ＧＵＩＤＥＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４６１号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＯＭＥ  ＥＤＩＴＩＮＧ  ＡＳ  ＴＯ  ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  （ＨＳＣｓ）；２０１４年１２月１９日出願の米国出願第６２／０９４，９０３号、ＵＮＢＩＡＳＥＤ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＯＵＢＬＥ−ＳＴＲＡＮＤ  ＢＲＥＡＫＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＩＣ  ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ  ＢＹ  ＧＥＮＯＭＥ−ＷＩＳＥ  ＩＮＳＥＲＴ  ＣＡＰＴＵＲＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ；２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，７６１号、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＡＮＤ  ＧＵＩＤＥ  ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ；２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，０５９号、２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６４１号、及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６６７号、ＲＮＡ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ；２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，６５６号及び２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８１，１５１号、ＣＲＩＳＰＲ  ＨＡＶＩＮＧ  ＯＲ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＤＯＭＡＩＮＳ；２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，６９７号、ＣＲＩＳＰＲ  ＨＡＶＩＮＧ  ＯＲ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＡＡＶ；２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，１５８号、ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１５年４月２２日出願の米国出願第６２／１５１，０５２号、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＦＯＲ  ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＥＸＯＳＯＭＡＬ  ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ；２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，４９０号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ  ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＵＳＩＮＧ  ＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ；２０１４年２月１２日出願の米国出願第６１／９３９，１５４号、ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４８４号、ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，５３７号、ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，６５１号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＣＡＮＣＥＲＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＶＩＶＯ；２０１４年１０月２３日出願の米国出願第６２／０６７，８８６号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＣＡＮＣＥＲ  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＶＩＶＯ；２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，６７５号及び２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８１，００２号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＮＥＵＲＯＮＡＬ  ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ；２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，５２８号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＥ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＯＲ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ；２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４５４号、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＡＲＧＥＴＩ���Ｇ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ  ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＵＳＩＮＧ  ＣＥＬＬ  ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ（ＣＰＰ）；２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４６０号、ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＬＩＮＫＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，４７５号及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６９０号、ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４８７号、ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，５４６号及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６８７号、ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＬＩＮＫＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；ならびに２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，２８５号、ＣＲＩＳＰＲ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲ  ＧＲＯＷＴＨ  ＡＮＤ  ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ。
【０１２３】
以下も参照される：２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６５９号及び２０１５年８月１９日出願の米国出願第６２／２０７，３１８号、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ，  ＥＮＺＹＭＥ  ＡＮＤ  ＧＵＩＤＥ  ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ  ＯＦ  ＣＡＳ９  ＯＲＴＨＯＬＯＧＳ  ＡＮＤ  ＶＡＲＩＡＮＴＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ。以下も参照される：２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６６３号及び２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２４５，２６４号、ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６７５号、２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２８５，３４９号、２０１６年２月１７日出願の米国出願第６２／２９６，５２２号、及び２０１６年４月８日出願の米国出願第６２／３２０，２３１号、ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ；２０１５年９月２４日出願の米国出願第６２／２３２，０６７号、２０１５年１２月１８日出願の米国出願第１４／９７５，０８５号、欧州出願第１６１５０４２８．７号、２０１５年８月１６日出願の米国出願第６２／２０５，７３３号、２０１５年８月５日出願の米国出願第６２／２０１，５４２号、２０１５年７月１６日出願の米国出願第６２／１９３，５０７号、及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，７３９号、各出願の名称ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ；ならびに２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２４５，２７０号、ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ。以下も参照される：２０１４年２月１２日出願の米国出願第６１／９３９，２５６号及び２０１４年１２月１２日出願のＷＯ  ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）、各出願の名称ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＷＩＴＨ  ＮＥＷ  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＵＲＥＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ。以下も参照される：２０１５年８月１５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４５５０４、２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，６９９号、及び２０１４年８月１７日出願の米国出願第６２／０３８，３５８号、各出願の名称ＧＥＮＯＭＥ  ＥＤＩＴＩＮＧ  ＵＳＩＮＧ  ＣＡＳ９  ＮＩＣＫＡＳＥＳ。
【０１２４】
こうした特許、特許公開、及び出願のそれぞれ、ならびにその中で引用される文書またはその審査の間に生じる文書（「出願引用文書」）の全て、ならびに出願引用文書において引用または参照される文書の全てが、その中で言及される任意の製品に対する、またはその中に記載の参照として援用される任意の文書における、任意の説明、記載、製品仕様書、及び製品シートと併せて、本明細書中参照として援用され、本発明の実施の際に利用される場合がある。全ての文書（例えば、こうした特許、特許公開、及び出願、ならびに出願引用文書）は、個々の文書のそれぞれが参照として援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、本明細書中参照として援用される。
【０１２５】
標的核酸配列を検出するシステム
ある特定の例示の実施形態において、本発明は、試料中の標的核酸配列を検出するシステムを提供する。本システムは、本明細書中記載されるとおりのトランスポゾン複合体を含む場合がある。トランスポゾン複合体は、トランスポザーゼと、本明細書中記載されるとおりの１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むトランスポゾン配列とを含む場合がある。トランスポザーゼは、１つまたは複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを、標的核酸配列を含むオリゴヌクレオチドに挿入する場合がある。
【０１２６】
実施形態によっては、本システムは、さらに、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む場合がある。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、挿入された本明細書中記載されるとおりのＴ７プロモーターのうちの１つから標的核酸を転写する場合がある。
【０１２７】
本システムは、さらに、本明細書中記載されるとおりの転写された標的核酸を検出するための、ＣＲＩＳＰＲに基づく検出システムを含む場合がある。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲに基づく検出システムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３に基づく検出システムである場合がある。ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ１３に基づく検出システムは、ＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出システムである場合がある。実施形態によっては、ＣＲＩＳＰＲに基づく検出システムは、本明細書中記載されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２に基づく検出システムである場合がある。
【０１２８】
ある特定の例示の実施形態において、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼまたはそのバリアントである場合がある。トランスポザーゼは、本明細書中記載されるとおりの改変トランスポザーゼである場合がある。ある特定の例示の実施形態において、トランスポゾン配列は、本明細書中記載されるとおり、１９塩基対のＭＥ  Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列を２つ含む場合がある。
【０１２９】
ある特定の例示の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムは、本明細書中記載されるとおりのＣａｓ１３に基づくＣＲＩＳＰＲ−ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムである場合がある。
【０１３０】
ある特定の例示の実施形態において、標的核酸配列を検出するシステムは、さらに、本明細書中記載されるとおりの核酸増幅用試薬を含む場合がある。
【０１３１】
ある特定の例示の実施形態において、標的核酸配列を検出するシステムは、さらに、ＲＮＡを含む標的配列の逆転写用試薬を含む場合がある。
【０１３２】
記載される本発明の方法、医薬組成物、及びキットの様々な修飾及び改変が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかとなるだろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたものの、当然のことながら、さらなる修飾が可能であり、特許請求されるとおりの本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではない。実際、当業者に明らかである本発明を実行するために説明された様式の様々な修飾は、本発明の範囲内にあることが意図される。本出願は、概して、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野内で既知の慣行に含まれる本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の改変、使用、または応用を包含することを意図し、このことは、本明細書中明記される前の必須の特長にも適用され得る。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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